(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
凹部及び凸部からなる凹凸部を表面に有し、前記凸部表面に選択結合性物質が固定化され、少なくとも前記凹部底面は粗面化されており、粗面化された領域の表面粗さは、Ｒａ値（中心線平均粗さ）が０．０１μｍ以上、１μｍ以下であり、Ｒｚ値（最大高さ）が０．１μｍ以上、３０μｍ以下である選択結合性物質固定化基材と、
該基材の表面を覆い該基材と接着されたカバー部材とを備え、
該基材と該カバー部材との間に空隙を有し、
前記凹凸部の凹部に、移動可能に格納された微粒子を含むことを特徴とする分析チップ。
【請求項２】
前記カバー部材が、前記基材と前記カバー部材との間の空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有する、請求項１に記載の分析チップ。
【請求項３】
請求項２に記載の分析チップと、前記カバー部材に貼付し前記貫通孔を封止する封止部材とをさらに備えることを特徴とする分析用キット。
【請求項４】
凹部及び凸部からなる凹凸部を表面に有し、前記凸部表面に選択結合性物質が固定化され、少なくとも前記凹部底面は粗面化されており、粗面化された領域の表面粗さは、Ｒａ値（中心線平均粗さ）が０．０１μｍ以上、１μｍ以下であり、Ｒｚ値（最大高さ）が０．１μｍ以上、３０μｍ以下であり、前記凹凸部の凹部に移動可能に格納された微粒子を含む選択結合性物質固定化基材に、被検物質を含む溶液を前記微粒子により攪拌して調製された被検溶液を接触させ、前記被検物質を前記選択結合性物質に選択的に結合させ、前記基材上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質の量を測定することを特徴とする、被検物質の分析方法。
【請求項５】
請求項１に記載の分析チップの選択結合性物質固定化基材に、被検物質を含む溶液を前記分析チップに含まれる微粒子により攪拌して調製された被検溶液を接触させ、前記被検物質を前記選択結合性物質に選択的に結合させ、前記基材上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質の量を測定することを特徴とする、被検物質の分析方法。
【請求項６】
請求項２に記載の分析チップに、前記貫通孔から被検物質をアプライし、前記カバー部材に封止部材を貼付して前記貫通孔を封止し、前記被検物質を前記分析チップを構成する前記選択結合性物質に選択的に結合させ、更に前記基材上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質の量を測定することを特徴とする、被検物質の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、選択的結合性物質固定化基材に関し、詳しくは、被検物質と選択的に結合する物質（本明細書において「選択結合性物質」という。）を固定化した基材を備え、被検物質が含まれる溶液と選択結合性物質との反応による分析を行う際に用いうる分析チップ、並びに当該分析チップを用いた分析方法及び分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
各種生物の遺伝情報解析の研究が始められている。ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能は、各種の方法で調べることができる。主なものとして、核酸は、ノーザンブロッティング、あるいはサザンブロッティングのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用した方法により、各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。一方、蛋白質は、ウエスタンブロッティングに代表される蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。
【０００３】
近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法として、ＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法が開発され、注目を集めている。これらの方法は、いずれも、核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には従来の方法と同じである。これらの方法は、蛋白質／蛋白質間あるいは糖鎖／糖鎖間や糖鎖／蛋白質間の特異的な反応に基づく蛋白質や糖鎖検出・定量に応用が可能である。これらの技術は、マイクロアレイ又はＤＮＡチップと呼ばれるガラスの平面基材片上に、多数のＤＮＡ断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。ＤＮＡチップの具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基材片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を高解像度検出装置（スキャナー）で高速に読み取る方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。このようして、サンプル中のそれぞれの遺伝子量を迅速に推定できる。また、ＤＮＡチップの応用分野は、発現遺伝子の量を推定する遺伝子発現解析のみならず、遺伝子の一塩基置換（ＳＮＰ）を検出する手段としても大きく期待されている。
【０００４】
核酸等の選択結合性物質を基材上に固定化する技術として、スライドガラス等の平坦な基材の上に、ポリ−Ｌ−リシン、アミノシラン等をコーティングして、スポッターと呼ばれる点着装置を用い、各核酸を固定化する方法などが開発されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
また、最近は、ＤＮＡチップに用いられる選択結合性物質としての核酸プローブ（基材上に固定化された核酸）として、従来の数百〜数千塩基の長さのｃＤＮＡおよびその断片に代わり、被検物質とのハイブリダイゼーション時のエラーを下げうるという点、及び合成機で容易に合成できるという点から、オリゴＤＮＡ（オリゴＤＮＡとは塩基数が１０〜１００塩基までのものをいう）が用いられるようになっている。この際、オリゴＤＮＡとガラス基材とは共有結合にて結合しうる（例えば、特許文献２参照）。
【０００６】
現在、ＤＮＡチップは、チップ上に数万から数千種類の多数の遺伝子を載せ、一度に大量の遺伝子の発現を調べる研究用として用いられていることが多い。一方、今後は、診断用途においても、ＤＮＡチップが使用されることが期待されている。そのため、従来のものより、簡便に被検物質の溶液（以下、単に「検体溶液」ということがある。）のアプライを行うことができ、且つ感度の高いＤＮＡチップが求められている。
【０００７】
ＤＮＡチップを用いる検出は、一般に、検体物質を蛍光物質等で標識しておいた後に、チップ上の核酸プローブに結合反応させて、チップ表面に測定用のレーザー等の照射光（実線の矢印）を照射して検体物質に標識した蛍光物質を励起し、その蛍光を受光して行うことが多い。しかし、従来のＤＮＡチップは平滑な表面にプローブが固定されていることから、チップ表面で反射したレーザー照射光がそのまま受光部に届いてしまい、バックグラウンドが高くなるという問題があった。
【０００８】
また、ＤＮＡチップによる検出の際は、調製した検体溶液を、ＤＮＡチップ上の選択結合性物質と反応させることが必要であるが、このような反応を促進させる方法も開発されている。例えば、特許文献３には、ＤＮＡ溶液上にビーズ状の微粒子を検体ＤＮＡ溶液に添加しておいた微粒子分散溶液をＤＮＡチップにアプライして、ビーズを用いて前記溶液を撹拌しながらハイブリダイゼーションを行う方法が記載されている。
しかしながら、特許文献３記載の方法では、ＤＮＡチップの表面が平滑であるため、微粒子は直線的な動きをするにとどまり、検体溶液の撹拌効率が低いという問題があった。
【０００９】
【特許文献１】特表平１０−５０３８４１号公報
【特許文献２】特開２００１−１０８６８３号公報
【特許文献３】特許第３５５７４１９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、前記課題を解決するものであり、被検物質と固定化された選択結合性物質との選択的な反応を安定して検出することができ、且つ、検体溶液の撹拌効率の高い選択結合性物質結合基材およびその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題を解決するため、本発明によれば、下記のものが提供される：
〔１〕  選択結合性物質がその表面に固定される基材であって、該基材表面のうち、選択結合性物質が固定化される領域以外の少なくとも一部が、粗面化されてなることを特徴とする選択結合性物質固定化基材。
〔２〕  前記基材は、凹部及び凸部からなる凹凸部を表面に有し、凹部底面又は凸部上面のいずれか一方が粗面化されてなることを特徴とする前記〔１〕に記載の選択結合性物質固定化基材。
〔３〕  前記凹凸部のうち、凹部底面が粗面化されてなることを特徴とする、前記〔１〕又は〔２〕に記載の選択結合性物質固定化基材。
〔４〕  前記凹凸部のうち、凸部上面に選択結合性物質が固定化されてなることを特徴とする、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質固定化基材。
〔５〕  前記基材表面の表面粗さは、Ｒａ値（中心線平均粗さ）が０．０１μｍ以上、１μｍ以下であることを特徴とする、前記〔１〕〜〔４〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質固定化基材。
〔６〕  前記基材表面の表面粗さは、Ｒｚ値（最大高さ）が０．１μｍ以上、３０μｍ以下であることを特徴とする、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質固定化基材。
〔７〕  前記基材は、少なくとも一部が黒色であることを特徴とする、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質固定化基材。
〔８〕  前記凹凸部の凹部に移動可能に格納された微粒子を更に含むことを特徴とする、前記〔１〕〜〔７〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質固定化基材。
〔９〕  前記選択結合性物質が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、糖、糖鎖または脂質であることを特徴とする、前記〔１〕〜〔８〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質固定化基材。
〔１０〕  前記〔１〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質固定化基材の表面を覆い前記基材と接着されたカバー部材を更に備え、前記基材と前記カバー部材との間に空隙を有することを特徴とする分析チップ。
〔１１〕  前記〔１〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質固定化基材に、被検物質を接触させて選択的に結合させ、前記選択結合性物質固定化基材上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定することを特徴とする、被検物質の分析方法。
〔１２〕  前記選択結合性物質固定化基材に被検物質を接触させるにあたり、前記基材と被検物質が含まれる溶液とを撹拌することを特徴とする、前記〔１１〕に記載の分析方法。
〔１３〕  前記〔１０〕に記載の分析チップに、前記貫通孔から被検物質をアプライし、前記カバー部材に封止部材を貼付して前記貫通孔を封止し、前記被検物質を前記分析チップを構成する選択結合性物質固定化基材に選択的に結合させ、更に前記選択結合性物質固定化基材上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定することを特徴とする、被検物質の分析方法。
〔１４〕  前記貫通孔から被検物質をアプライするにあたり、被検物質が含まれる溶液を貫通孔から注入するとともに、前記被検物質を前記分析チップを構成する選択結合性物質結合基材に選択的に結合させるにあたり、前記注入された溶液を撹拌することを特徴とする、前記〔１３〕に記載の分析方法。
〔１５〕  前記〔１〕〜〔９〕のいずれか一項に記載の選択結合性物質固定化基材と、前記選択結合性物質固定化基材の表面を覆い前記選択結合性物質固定化基材と接着されたカバー部材と、前記カバー部材に貼付し前記貫通孔を封止する封止部材とを含むことを特徴とする分析キット。
〔１６〕  前記〔１０〕に記載の分析チップと、前記カバー部材に貼付し前記貫通孔を封止する封止部材とを含むことを特徴とする分析キット。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の選択結合性物質固定化基材によれば、核酸等のハイブリダイゼーションに代表される、被検物質と固定化された選択結合性物質との選択的な反応を安定して検出することができ、且つ、検体溶液を高効率で撹拌し反応を促進することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の選択結合性物質固定化基材は、選択結合性物質がその表面に固定される基材であって、該基材表面のうち、選択結合性物質が固定化される領域以外の少なくとも一部が、粗面化されてなることを特徴とする。
【００１４】
粗面化とは、基材表面に所望の粗さを付与する処理を意味する。本発明において、基材表面の選択結合性物質が固定化される領域以外の少なくとも一部が、粗面化されてなることにより、被検物質の結合量を検出する際に、レーザーが乱反射してバックグラウンドが下がり、Ｓ／Ｎを向上させることができる。また、後述のように、基材に微粒子を格納した構成とする場合には、被検物質を基材に結合させる際に、本基材に回転または振動等を加えて微粒子を上下左右に運動させることにより被検物質を含む溶液を攪拌することができるが、基材表面に所望の粗さを付与することで微粒子の動きを乱して高めることができるため、基材の撹拌効果を向上させることができる。
【００１５】
本発明の選択結合性物質固定化基材の一例を図１に、従来の表面が平滑化された基材の一例を図２に示す。図１に示す例において、基材１の表面は、凹部１０及び凸部１１からなる凹凸部により構成されている。凹部１０表面は粗面化されており、凸部１１の上面には、選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている。一方、図２の従来の基材においては、基材１の表面に凹部１０及び凸部１１からなる凹凸部により構成されている点および、凸部１１の上面には、選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている点では図１に示す例と同様であるが、凹部１０の表面が平滑である（粗面化されていない）点で、図１に示す例とは相違する。
【００１６】
図２においては、検出装置Ｄ１から基材の表面に測定用のレーザー等の照射光（実線の矢印）を照射すると、凹部１０では表面が平滑であることによりレーザー光が良く反射して反射光（破線の矢印）が受光部に届くため、バックグラウンドが高く、結果的に凸部１１の選択結合性物質に結合した被検物質を明瞭に検出することが困難である。これに対し、図１において、検出装置Ｄ１から基材の表面に測定用のレーザー等の照射光（実線の矢印）を照射すると、凹部１０では表面が粗であることによりレーザー光が乱反射して反射光（破線の矢印）が受光部に届かないため、バックグラウンドが低下し、結果的に凸部１１に結合した被検物質の分析が容易である。
【００１７】
一方、本発明の選択結合性物質固定化基材に微粒子を格納した構成とする場合の一例を図３に、従来の平滑化された基材の一例を図４に示す。図３に示す例においては、前述の図１の基材において、更に微粒子２が格納されている。一方、図４の従来例においては、図３に示す例と凹部１０の表面が平滑である（粗面化されていない）点においてのみ相違する。
【００１８】
図４においては、凹部１０の表面が平滑であることにより微粒子が直線的な動き（図４中の矢印参照）をするにとどまるので、被検物質を含む溶液と気体を接触させた際の撹拌効率に限界があるのに対し、図３の基材においては、凹部１０の表面が粗であることにより微粒子２がランダム方向に運動し（図３中の矢印参照）、結果的に撹拌効率を上昇させることができる。
【００１９】
粗面化の程度は、表面粗さを表す各種のパラメータで測定することができ、特に、ＪＩＳ  Ｂ０６０１：２００１で規定された粗さ曲線の算術平均粗さであるＲａ値（中心線平均粗さ）、ＪＩＳ  Ｂ０６０１：２００１で規定された粗さ曲線の最大高さであるＲｚ値（最大高さ）またはＪＩＳ  Ｂ０６０１：２００１で規定された粗さ曲線の十点平均粗さであるＲZJIS値（１０点平均粗さ）で以下のように表すことができる。
【００２０】
Ｒａ値（中心線平均粗さ）は０．０１μｍ以上、１μｍ以下であることが好ましく、０．０１μｍ以上、０．７μｍ以下であることがより好ましく、特に０．０１μｍ以上、０．１μｍ以下であることが好ましい。Ｒａ値がこの範囲より小さいと、レーザーの乱反射によって反射光が受光部に届かなくなるため、バックグラウンドが上昇してしまう。この範囲より大きいと、微粒子の動きをかえって妨げ、攪拌効果が低下してしまう。
【００２１】
Ｒｚ値（最大高さ）は、０．１μｍ以上、３０μｍ以下であることが好ましく、０．１μｍ以上、２０μｍ以下であることがより好ましく、特に０．１μｍ以上、１０μｍ以下であることが好ましい。Ｒｚ値がこの範囲より小さいと、微粒子の動きが不規則になることによる攪拌効果が十分得られず、この範囲より大きいと、微粒子の動きを妨げてしまい、攪拌効果が不十分になってしまう。
【００２２】
ＲZJIS値（１０点平均粗さ）は、０．０５μｍ以上、３０μｍ以下であることが好ましく、特に０．０５μｍ以上、１０μｍ以下であることが好ましい。ＲZJIS値がこの範囲より小さいと、微粒子の動きが不規則になることによる攪拌効果が十分得られず、この範囲より大きいと、微粒子の動きを妨げてしまい、攪拌効果が不十分になってしまう。
本発明においては、Ｒａ値、Ｒｚ値及びＲZJIS値がいずれも上述の数値範囲の範囲内であることがもっとも好ましい。
【００２３】
尚、上記Ｒａ値、Ｒｚ値及びＲZJIS値は、ＪＩＳ  Ｂ  ０６０１：２００１に規定されている表面粗さパラメータであり、以下のように触針法により測定されることが規定されている。測定には、触針電気式表面粗さ測定機が使用される。本装置は、ＪＩＳ  Ｂ０６５１  ２００１に従って作られている。本装置は、測定する対象面と触針先端との接触に関係する機械的各要素（位置決め装置、対象物の固定具、測定スタンド、送り装置、プローブ）から成る。測定は対象表面をプローブ先端の触針で曲線的になぞり、触針が対称面の粗さに従って曲線に対して上下方向に動くことを電気信号に変換し、「粗さ曲線」を描くことから始まる。このとき、測定距離（曲線の長さ）はＪＩＳ  Ｂ０６５１  ２００１によって規定されており、それを基準長さｌ（エル）と呼称する。粗さ曲線の算術平均粗さＲａ値は、基準長さｌ内の任意の位置ｘにおける粗さ曲線の高さＺ（ｘ）の絶対値の平均である。同じく規定された粗さ曲線の最大高さＲｚ値は、「粗さ曲線」の基準長さｌ内の最低谷底と最大山頂との高低差によって求められる。粗さ曲線の十点平均粗さＲZJIS値は、基準長さｌ内の山頂の高い方から５点、谷底の低い方から５点を選らび、その平均値によって求められる。
【００２４】
本発明の選択結合性物質固定化基材において、粗面化される領域は、選択結合性物質が固定化される領域以外の少なくとも一部であることが必要である。すなわち、選択結合性物質が固定化される領域以外であれば、基材のいずれの部分が粗面化されてなるものであっても良い。特に、基材表面のうち、選択結合性物質が固定化される領域が存在するのと同じ面であることが望ましい。当該選択結合性物質が固定化される領域は、後述のように基材表面に凹部及び凸部からなる凹凸部が設けられている場合には、凸部上面とすることが好ましい。尚、選択結合性物質の定義については、後述する。
【００２５】
基材表面を粗面化する方法としては、基材材質が樹脂である場合には、例えば射出成型金型に対する機械加工による方法、Ｘ線リソグラフィと電鋳およびモールディングを組み合わせてアスペクト比の大きな形状を作る製法であるＬＩＧＡ（Lithographie, Galvanoformung, Abformung）プロセスによる方法など公知の方法を用いることができ、所望の粗さを有する金型から基材を成型する方法が挙げられる。基材材質がガラスまたは樹脂の場合は、サンドブラスト法などの公知の方法を用いることができる。
【００２６】
本発明の選択結合性物質固定化基材は、その表面に、凹部及び凸部からなる凹凸部を有することが好ましい。このような構造をとることにより、検出の際、非特異的に吸着した被検物質を検出することがないので、ノイズが小さく、結果的によりＳ／Ｎが良好な結果を得ることができる。ノイズが小さくなる具体的な理由は、以下の通りである。すなわち、凸部上面に選択結合性物質を固定化した基材をスキャナーと呼ばれる装置を用いてスキャンすると、凹凸部の凸部上面にレーザー光の焦点が合っているため、凹部では、レーザー光がぼやけ、凹部に非特異的に吸着した被検物質の望まざる蛍光（ノイズ）を検出しがたいという効果があるためである。
【００２７】
凹凸部の凸部の高さに関しては、それぞれの凸部の上面の高さが略同一であることが好ましい。ここで、高さが略同一とは、多少高さの違う凸部の表面に選択結合性物質を固定化し、これと蛍光標識した被検物質とを反応させ、そして、スキャナーでスキャンした際、その信号レベルの強度差が問題とならない高さをいう。具体的に高さが略同一とは、高さの差が５０μｍ以下であることをいう。高さの差は３０μｍ以下であることがより好ましく、高さが同一であればなお好ましい。なお、本願でいう同一の高さとは、生産等で発生するばらつきによる誤差も含むものとする。最も高い凸部上面の高さと、最も低い凸部上面の高さの差が５０μｍより大きいと、高さのずれた凸部上面でのレーザー光がぼやけてしまい、この凸部上面に固定化された選択結合性物質と反応した被検物質からのシグナル強度が弱くなる場合があるため好ましくない。
また、凸部分の上面は、実質的に平坦であることが好ましい。ここで凸部上面が実質的に平坦とは、２０μｍ以上の凹凸がないことを意味する。
【００２８】
本発明において、粗面化される領域は、選択結合性物質が固定化される領域以外の少なくとも一部であれば良い。具体的には、上述した凹凸部のうち凹部底面又は凸部上面のいずれか一方が粗面化されてなることが好ましく、中でも、凹部底面が粗面化されてなることが特に好ましい。
【００２９】
本発明の選択結合性物質固定化基材において、選択結合性物質（プローブ）が固定化される領域は、該基材の表面であり、上述のような粗面化がなされていない領域であれば、特に限定されないが、具体的には、上述した凹凸部のうち凸部の上面（上端面）であることが好ましい。選択結合性物質の固定化は、予めなされるものであっても良いし、固定化しないで基材のみを用意しておき、被検物質の分析の際に所望の被検物質に応じた選択結合性物質を適宜選択し固定することもできる。
凸部の上面に固定化できる選択結合性物質（例えば核酸）は、データとして必要なものを適宜選択することができるが、単なるダミーの選択結合性物質であっても良い。また、すべての凸部上面に選択結合性物質を結合する必要は無く、何も固定化していない凸部上面を有していても良い。
【００３０】
本発明の基材において、凸部上面に選択結合性物質が固定化される場合、当該凸部の上面の面積は略同一であることが好ましい。凸部の上面の面積が略同一であることにより、多種の選択結合性物質が固定化される部分の面積を同一にできるので、後の解析に有利である。ここで、凸部の上部の面積が略同一とは、凸部の中で最も大きい上面面積を、最も小さい上面面積で割った値が１．２以下であることを言う。
【００３１】
選択結合性物質が固定化された凸部の上面の面積は、特に限定されるものではないが、選択結合性物質の量を少なくすることができる点とハンドリングの容易さの点から、１ｍｍ2以下、１０μｍ2以上が好ましい。
【００３２】
本発明の基材において、さらに好ましくは、その基材における選択結合性物質が固定化された領域を有する面の周囲がさらに凹凸部の凸部上端と略同一の高さの平坦部で囲まれていることが好ましい。このような構造とすることにより、凹凸部に被検物質を含む溶液をアプライすることが容易となり、攪拌用の微粒子を選択結合性物質に接触させること無く凹部に保持することが可能となる。
凹凸部の凸部の上面の高さと平坦部の高さは、略同一であることが好ましい。すなわち、平坦部の高さと凸部上面の高さの差は、５０μｍ以下であることが好ましい。凸部上面の高さと平坦部の高さの差が５０μｍを超えると、検出できる蛍光強度が弱くなる場合があるため好ましくない。平坦部の高さと凸部上面の高さの差は、より好ましくは３０μｍ以下であり、最も好ましくは、平坦部の高さと凸部の高さは同一である。
【００３３】
本発明で好ましく用いられる基材の凹凸部における凸部の高さ、即ち凸部上面と凹部底面との高さの差は、１０μｍ以上、５００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以上、３００μｍ以下が特に好ましい。凸部の高さが１０μｍより低いと、スポット以外の部分の非特異的に吸着した検体試料を検出してしまうことがあり、結果的にＳ／Ｎが悪くなることがあるため好ましくない。また、凸部の高さが５００μｍより高いと、凸部が折れて破損しやすいなどの問題が生じる場合があり好ましくない。
【００３４】
本発明の選択結合性物質固定化基材の具体例を、図５及び図６に例示する。
図５及び図６に示す例において、基材１の表面には、複数の凸部１１を含む凹凸部１２により構成されており、その周りに平坦部１３が設けられている。凸部１１の上面には、選択結合性物質（例えば核酸）が固定化されている。この平坦部を使って、容易にスキャナーの励起光等の測定用の光線の焦点を凸部の上面に合わせることが可能となる。より具体的に説明すると、基材の表面に測定用のレーザー等の照射光（実線の矢印）を照射するにあたり焦点を合わせる際には、図７に示すように、バネ４０で付勢して治具４１に基材１を突き当て、この治具の突き当て面４２の高さにレーザー光４４が合焦するようレンズ４３等により予め焦点を調整しておくことが多い。本発明の分析チップの基材の平坦部を治具の面２３に突き当てることにより、容易に基材の凸部上面にスキャナーのレーザー光の焦点を合わせることが可能となる。なお、図７の例においては、基材１は、選択結合性物質が固定化された面が下側になるよう固定されている。
【００３５】
本発明の基材は、上記凹凸部の凹部に移動可能に格納された微粒子を更に含むことが好ましい。当該微粒子を含むことにより、被検物質が含まれる溶液をアプライした後に分析チップを揺動、回転等させることで、空隙内で微粒子を運動させ、検体溶液と本発明の選択結合性物質固定化基材との十分な撹拌を達成し、より精密な分析を行うことができる。
【００３６】
前記微粒子の形状は、特に限定されず、球状の形状以外に、多角形でも良く、円筒形、角柱形などのマイクロロッド状（微細な棒状）など任意の形状とすることができる。また、微粒子のサイズも特に限定されないが、例えば球状の微粒子の場合、０．１〜３００μｍの範囲とすることができ、また、円筒形の微粒子の場合、長さ５０〜５０００μｍ、底面直径１０〜３００μｍの範囲とすることができる。前記微粒子の材質も、特に限定されないが、ガラス、セラミック（例えばイットリウム部分安定化ジルコニア）、金属（例えば金、白金、ステンレス）、プラスチック（例えばナイロンやポリスチレン）等を用いることができる。
上述の微粒子は、本発明の選択結合性物質固定化基材に予め格納した態様とすることができるが、被検物質が含まれる溶液に微粒子を混入させて該溶液のアプライと同時に微粒子を格納してもよく、または被検物質が含まれる溶液のアプライの前又は後に、微粒子を別途格納してもよい。
【００３７】
本発明の分析チップの基材の材質は、特に限定されないが、ガラス、セラミック、シリコンなどの無機材料、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、シリコーンゴム等のポリマーなどを挙げることができる。この中でも、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマー、ガラス及びシリコンを特に好ましく用いることができる。
【００３８】
本発明の選択結合性物質固定化基材は、少なくとも一部が黒色であることが好ましい。このようにすることにより、基材からの自家蛍光を低減することができる。基材の黒色にする部分としては、凹凸部が設けられた基材の本体でも良いし、凸部の側面、凹部に設けられた疎水的な材料や絶縁層でも良いし、これらの全部でも良い。
【００３９】
ここで、基材が黒色であるとは、可視光（波長４００ｎｍ〜８００ｎｍ）において、基材の黒色部分の分光反射率が特定のスペクトルパターン（特定のピークなど）を持たず、一様に低い値であり、かつ、基材の黒色部分の分光透過率も、特定のスペクトルパターンを持たず、一様に低い値であることを意味する。
この分光反射率、分光透過率の値としては、可視光（波長４００ｎｍ〜８００ｎｍ）の範囲の分光反射率が７％以下であり、同波長範囲での分光透過率が２％以下であることが好ましい。尚、ここで言う分光反射率は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃに適合した、照明・受光光学系で、基材からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を言う。
【００４０】
黒色にする手段としては、本発明の選択結合性物質固定化基材に黒色物質を含有させることにより達成しうる。この黒色物質は、光を反射したり透過し難いものであれば、特に制限はないが、好ましいものを挙げると、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、およびＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、ＺｒおよびＣｒの炭化物などの黒色物質が使用できる。
【００４１】
これらの黒色物質は単独で含有させる他、２種類以上を混合して含有させることもできる。例えば、ポリエチレンテレフタレート、シリコーン樹脂などのポリマーの場合は、この中の黒色物質の中でも、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラックを好ましく含有させることができ、特にカーボンブラックを好ましく用いることができる。ガラス、セラミックの無機材料の場合は、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、およびＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、ＺｒおよびＣｒの炭化物を好ましく含有させることができる。
【００４２】
本発明の選択結合性物質固定化基材は、各種製法にて製造することができる。例えば、材質がポリマー等の場合、射出成形法、ホットエンボス法、鋳型内で重合させる方法等により成型することができる。また、材質がガラスやセラミック等の無機物の場合、サンドブラスト法、シリコンの場合は公知の半導体プロセスなどで成型することができる。
成型した基材は、選択結合性物質をその表面に固定化するのに先立ち、必要に応じて各種の表面処理を施すことができる。かかる表面処理としては、具体的には例えば特開２００４−２６４２８９号公報に記載されるものなどを挙げることができる。
【００４３】
本発明の基材は、被検物質を分析するための分析チップとして用いることができる。
本発明において、分析チップとは、被検物質が含まれる溶液を当該チップにアプライし、被検物質の存在の有無や、被検物質の量や、被検物質の性状等を測定するために用いるチップをいう。具体的には、基材表面に固定化された選択結合性物質と被検物質との反応により、被検物質の量や、被検物質の有無を測定するバイオチップが挙げられる。より具体的には、核酸を基材表面に固定化したＤＮＡチップ、抗体に代表されるタンパク質を基材表面に固定化したタンパク質チップ、糖鎖を基材表面に固定化した糖鎖チップ、及び基材表面に細胞を固定化した細胞チップ等が挙げられる。
【００４４】
本発明において、選択結合性物質とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る各種の物質を意味する。基材の表面に結合しうる選択結合性物質の代表的な例としては、核酸、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質を挙げることができる。
核酸としては、ＤＮＡやＲＮＡでも良く、またＰＮＡでも良い。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。
核酸は、生細胞等天然物由来のものであっても良いし、核酸合成装置により合成されたものであっても良い。生細胞からのＤＮＡ又はＲＮＡの調製は、公知の方法、例えばＤＮＡの抽出については、Ｂｌｉｎらの方法（Blin et al., Nucleic Acids Res. 3: 2303 (1976)）等により、また、ＲＮＡの抽出については、Ｆａｖａｌｏｒｏらの方法（Favaloro et al., Methods Enzymol.65: 718 (1980)）等により行うことができる。固定化する核酸としては、更に、鎖状若しくは環状のプラスミドＤＮＡや染色体ＤＮＡ、これらを制限酵素により若しくは化学的に切断したＤＮＡ断片、試験管内で酵素等により合成されたＤＮＡ、又は化学合成したオリゴヌクレオチド等を用いることもできる。
【００４５】
また、蛋白質としては、抗体及びＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ´）2フラグメントのような、抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原を挙げることができる。抗体やその抗原結合性断片は、対応する抗原と選択的に結合し、抗原は対応する抗体と選択的に結合するので、「選択結合性物質」に該当する。
糖類としては、各種単糖のほか、オリゴ糖や多糖などの糖鎖を挙げることができる。
脂質としては、単純脂質の他、複合脂質であっても良い。
更に、上記核酸、蛋白質、糖類、脂質以外の抗原性を有する物質を固定化することもできる。また、選択結合性物質として、基材の表面に細胞を固定化してもよい。
これらの選択結合性物質のうち特に好ましいものとして、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ペプチド、糖、糖鎖または脂質を挙げることができる。
【００４６】
本発明の基材を分析チップとして用いる場合には、該基材の表面を覆い前記基材と接着されたカバー部材を更に備えるものであっても良い。カバー部材を備えることにより、被検物質が含まれる溶液を簡便に密閉保持することができ、その結果、被検物質と、基材の領域（図６中の１２）に固定化された選択結合性物質との反応を、安定して行うことができる。また、特に本発明の基材が、前記したような微粒子を更に含む場合には、前記基材とカバー部材とが接着され一体となっていることにより、予め微粒子を封入しておくことができ、検体溶液をアプライする作業を容易に行うことが可能である。そして、検体溶液をアプライした後の貫通孔を塞ぐ作業においてもテープやシール剤が検体溶液と接触することがないので、バックグラウンドノイズが上昇しないという利点もある。
【００４７】
図８は、前記基材に加え、更にカバー部材、接着部材、貫通孔及び液面駐止用チャンバーを有する本発明の分析チップの概略的な態様の例を示す斜視図であり、図９は図８の分析チップを矢印Ａ１に沿った面で切断した断面図である。図８及び図９に示す例においては、基材１が、接着部材３０を介してカバー部材３で覆われ、選択結合性物質が固定化された領域Ｒ１を含む空隙３１を形成している。空隙３１は、複数の貫通孔３２を介して外部と連通する他は、外部と連通しない閉じた空間である。
【００４８】
前記カバー部材は、前記基材の表面の少なくとも一面の一部を覆い、基材と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されることができる。そして、基材は、好ましくはその表面であって前記空隙内に位置する領域上に固定化された選択結合性物質を有する。即ち、好ましくは、前記選択結合性物質が固定化された領域が、当該空隙内に存在するように、前記カバー部材は前記基材に接着される。前記カバー部材は、前記空隙が形成される限りにおいて、どのような態様で接着されてもよいが、好ましくは、両面テープ、樹脂組成物等の接着部材を介して接着される。
【００４９】
前記カバー部材は、前記空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有するものとすることができ、複数の貫通孔を有することが好ましい。より具体的には、貫通孔は、一つの空隙に対して複数あることが好ましく、中でも３個から６個とすることにより、被検物質が含まれる溶液の充填が容易となるので特に好ましい。なお、後述するように、空隙が、互いに連通しない複数の空間に分かれている場合は、各空間あたりに複数個、より好ましくは３〜６個の貫通孔を有することが好ましい。カバー部材が複数の貫通孔を有する場合、それらの孔径は、同一でも異なっていてもよいが、複数の貫通孔のうちの一つをアプライ口とし、他の貫通孔を空気の抜け口として機能させる場合、検体溶液のアプライの容易さ及び該溶液の密閉保持性の点から、アプライ口のみをアプライに必要な広い孔径としその他の貫通孔をより狭い孔径とすることが、好ましい。具体的には、アプライ口の貫通孔サイズは上記の通り直径０．０１から２．０ｍｍの範囲内とし、その他の貫通孔の直径を０．０１〜１．０ｍｍとすることが好ましい。
【００５０】
貫通孔３２は、その少なくとも１つが、その径を変化させて、上端に径の広い部分、いわゆる液面駐止用チャンバー３３を備えるものとしても良い。液面駐止用チャンバーを備えることにより、貫通孔３２からアプライされ空隙３１に充填された検体溶液７の液面の上昇を抑え、貫通孔を封止部材３４で封止する際の封止を容易かつ確実に行うことが可能となるとともに、検体溶液の中に多数の気泡が入ったり、検体溶液の流出を防ぐことができるので好ましい。液面駐止用チャンバーの形状は特に限定されるものではなく、円柱形、角柱形、円錐形、角錐形、半球形、又はこれに近似した形状とすることができる。これらのうち、製造の容易さ及び検体溶液の上昇を抑制する効果の高さ等の観点から、円柱形が特に好ましい。
【００５１】
貫通孔の孔径サイズについては特に限定されるわけではないが、図１０に示す縦断面形状の円筒形の貫通孔３２及び液面駐止用チャンバー３３との組み合わせの場合を例に挙げると、貫通孔３２の孔径サイズ（直径）は、０．０１から２．０ｍｍが好ましく、０．３から１．０ｍｍがより好ましい。孔径を０．０１ｍｍ以上とすることにより、検体溶液のアプライを容易に行うことができる。一方、貫通孔３２の直径を１．５ｍｍ以下とすることにより、アプライ後封止前の検体溶液の蒸発などをより効果的に抑制することができる。液面駐止用チャンバー３３の孔径サイズ（直径）については、１．０ｍｍ以上が好ましい。１．０ｍｍ以上とすることにより、貫通孔３２とのサイズの差を十分に得ることができ、十分な液面駐止効果が得られ好ましい。液面駐止用チャンバー３３の直径の上限は、特に限定されないが、１０ｍｍ以下とすることができる。また、液面駐止用チャンバー３３の深さは、特に限定されないが、０．１〜５ｍｍの範囲内とすることができる。
【００５２】
このようなカバー部材は、前述の基材に、脱離可能に接着されていることが好ましい。本発明の分析チップをＤＮＡチップとして用いる場合、通常、ＤＮＡチップを専用スキャナーで読み取ることが必要であるが、カバー部材が接着された状態では、専用スキャナーにセットすることが難しく、セットされたとしてもスキャン操作を実施するとカバー部材とスキャナーの光学系部品が接触し、故障の原因となることがある。また、カバー部材を介しての読み取りが可能であっても、読み取り値が不正確となりうる。そのため、読み取りの工程においてカバー部材を取り外せるよう、カバー部材が脱離可能であることが好ましい。
【００５３】
カバー部材を基材に脱離可能に接着する態様は、特に限定されないが、カバー部材と基材が損傷されることなく脱離することが可能である態様が好ましい。例えば、両面テープ、樹脂組成物等の接着部材を介して接着することができる。
【００５４】
接着部材として両面テープを用いる場合、両面で接着力の異なる両面テープを用いることが好ましく、具体的には、該両面テープの接着力の弱い面を基材側に接着し、接着力の強い面をカバー部材側に接着することが好ましい。このような態様とすることにより、カバー部材を剥離する際に、両面テープがカバー部材に接着した状態で同時に基材より脱離し易く、それにより、基材上への接着部材の残存による読み取りの工程における不都合を回避することができる。このような両面テープとしては、日東電工株式会社製の製品番号Ｎｏ．５３５Ａ、住友スリーエム株式会社製の製品番号９４１５ＰＣ及び４５９１ＨＬ、並びに株式会社寺岡製作所製の製品番号Ｎｏ．７６９１等が挙げられる。
【００５５】
接着部材として樹脂組成物を用いる場合、当該樹脂組成物としては、アクリル系ポリマー、シリコーン系ポリマー、及びこれらの混合物からなる群より選択されるポリマーを含む樹脂組成物等を用いることができる。これらの樹脂組成物を利用することにより、両面テープに比べて密閉性を高めることが可能となるとともに、両面テープに比べて、長期間のインキュベーションに対しても安定であるため、そのような長期間のインキュベーションが必要な分析系においては特に好ましい。特に、接着部材としてシリコーン系のエラストマーを用いると、密閉性が良好であり、しかも、容易に脱離が可能な状態でカバーを接着することができる。このようなエラストマーとしては、具体的には、シルガード（シルガードはダウコーニング社の登録商標）や、信越化学工業社製の二液型ＲＴＶゴム（型取り用）を挙げることができる。
【００５６】
上記カバー部材の形状は、前記基材の表面の少なくとも一面の一部を覆い、基材と、カバー部材との間に空隙を有するよう接着されうるものであれば特に限定されないが、その外周部分において、基材に近い部分より基材に遠い部分において突出した部分を有する構造、すなわちオーバーハング構造が設けられたものとすることができる。オーバーハング構造を設けることにより、基材を損傷せずにカバー部材を脱離することが容易となるので、好ましい。
【００５７】
また、本発明の選択結合性物質固定化基材には、カバー部材及び任意に接着部材を含む構造により規定される空隙を有するが、当該空隙は、１つの空間でもよく、複数の仕切られた空間であってもよい。複数の仕切られた空間は、例えば図１１に示すような仕切り構造により設けることができる。図１１に示す例においては、カバー部材の凸部３Ａ及び基材１が接着部材３０Ａを介して接着することにより、複数の仕切られた空間３１を設けている。複数の仕切られた空間を設ける別の例として、例えば図１２に示すような仕切り構造を設けることもできる。図１２に示す例においては、基材の凸部１４及びカバー部材３が接着部材３０Ｂを介して接着することにより、複数の仕切られた空間３１を設けている。また、さらに別の例として、図１３に示すように、基材及びカバー部材に特に仕切り構造を設けるための凸部を設けず、接着部材３０Ａのみで空隙を仕切り、複数の仕切られた空間を設けることもできる。これらの例においては、空間３１は、互いに連通せず、それぞれが別々に、１以上の貫通孔３２及び液面駐止用チャンバー３３を有することになる。このように、複数の仕切られた空間を設けることによって、１枚の分析チップに複数種の検体溶液をアプライすることが可能となり、従って複数種の被検物質を同時に１枚の分析チップで測定することができる。
【００５８】
本発明の分析チップは、一枚の基材あたり一枚のカバー部材を有していてもよく、二枚以上のカバー部材を有していてもよい。具体的には、図１４及び図１５に示す通り、一枚の基材１上に、複数のカバー部材３Ｂを有することができる。複数のカバー部材３Ｂのそれぞれは、それぞれ別の接着部材３０Ｃを介して基材１上に設けることができる。好ましくは、複数のカバー部材３Ｂのそれぞれが、基材１との間に空隙３１を有し、且つ各空隙に連通する１つ以上の貫通孔を有することができ、そして、各カバー部材３Ｂがそれぞれ別の、選択結合性物質が固定化された領域１２を有することができる。このような態様をとることによって、上記複数の仕切られた空間を有する態様と同様に、複数種の被検物質を同時に１枚の分析チップで測定する等の効果を得ることができる。さらに、このような態様をとることにより、それぞれの領域１２についてカバー部材を独立して脱離させることができるので、例えば一つの領域１２について分析を行った後に他の領域Ｒ１を用いて分析を行うといった、独立した使用を行いうる。
【００５９】
本発明の分析チップを構成するカバー部材の材料としては、特に限定されるものではないが、検体溶液をアプライした際に、溶液の様子を観察可能とするために、透明な材料が好ましい。そのような材質としては、ガラス又はプラスチックが挙げられる。特に、貫通孔や液面駐止チャンバー等の構造を容易に作製可能という点から、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート等の透明樹脂を好ましく用いることができる。カバー部材の作製方法も特に限定されるものではなく、切削加工や射出成型法による加工が可能である。大量生産が可能という観点から、射出成型法を好ましく用いることができる。
【００６０】
本発明の分析チップにおける、凹凸部、カバー部材及び微粒子の関係の好ましい例を、図１６を参照して説明する。図１６に示した例では、ＤＮＡ等の選択結合性物質４５は、基材１の凸部上面１０上に固定化されている。そして、微粒子（この場合は球状のビーズ）２は、基材１の凹部の空隙内に載置されている。選択結合性物質４５及び微粒子２は、被検物質であるＤＮＡが含まれる溶液（図示せず）に触れることになる。検体溶液は、基材１、接着部材３０及びカバー部材３により規定される空隙内で保持されることになる。図１６の例においては、基材の凸部上面１１とカバー部材３との間隔の最短距離が、微粒子２の直径未満となっている。それにより、微粒子が凸部上面１１に接触できなくなり、凸部上面１１上の選択結合性物質４５を傷つけることを防ぐことができる。微粒子が、例えば楕円形等の非球状の形状である場合は、凸部上面と容器との最短距離が微粒子の最小径未満であれば、同様に凸部上面１１と微粒子との接触を防ぎ、選択結合性物質４５の損傷を防ぐことが可能となる。
【００６１】
このような本発明の選択結合性物質が固定化された基材は、各種被検物質の分析に利用することができる。
すなわち、本発明の選択結合性物質固定化基材に、被検物質を接触させて選択的に結合させ、前記選択結合性物質固定化基材上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定することにより、被検物質を分析することができる。
【００６２】
本発明の基材を用いた測定方法に供せられる被検物質としては、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの被検物質が含まれる検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、被検物質となる核酸は、血液や細胞から常法により抽出した核酸を標識してもよいし、該核酸を鋳型として、ＰＣＲ等の核酸増幅法によって増幅したものであってもよい。後者の場合には、測定感度を大幅に向上させることが可能である。核酸増幅産物を被検物質とする場合には、蛍光物質等で標識したヌクレオシド三リン酸の存在下で増幅を行うことにより、増幅核酸を標識することが可能である。また、被検物質が抗原又は抗体の場合には、被検物質である抗原や抗体を常法により直接標識してもよいし、被検物質である抗原又は抗体を選択結合性物質と結合させた後、基材を洗浄し、該抗原又は抗体と抗原抗体反応する標識した抗体又は抗原を反応させ、基材に結合した標識を測定することもできる。
【００６３】
本発明の被検物質の分析方法においては、まず、前記本発明の選択結合性物質固定化基材に被検物質を接触させて選択的に結合させる。すなわち、本発明の選択結合性物質固定化基材に上述のような標識、増幅等を施した被検物質を水溶液や適当な緩衝液等に溶解させた溶液とし、基材に接触させれば良い。
選択結合性物質結合基材への接触は、マイクロロッドが上記選択結合性物質固定化基材の凹凸部に検体を水溶液や適当な緩衝液等の溶液とし、ピペット等の通常の器具で注入することにより行うことができる。
【００６４】
また、本発明の分析チップを利用する場合には、前記カバー部材の貫通孔から検体をアプライし、前記カバー部材に封止部材を貼付して前記貫通孔を封止し、前記検体を前記分析チップを構成する前記基材に選択的に結合させることができる。
貫通孔からの検体のアプライは、例えば、前記貫通孔からピペット等の通常の器具で注入して行うことができる。
【００６５】
カバー部材への封止部材の貼付は、貫通孔の一部又は全て、好ましくは全てを封止する態様にて行うことができる。前記封止部材としては、例えばカプトン（商標、ポリイミドフィルム、東レ・デュポン社製）、ポリエステル、セロハン、又は塩化ビニル製の粘着テープ等の可とう性のテープを好ましく挙げることができるが、これに限らず、非可とう性の板状の接着可能な任意の部材を用いることもでき、非定型のシーリング剤を用いることもできるが、液面駐止用チャンバーによる本発明の効果をより良好に得るという観点からは、可とう性のテープ及び板状の部材が好ましく、操作の簡便性などの観点から、可とう性のテープがさらに好ましい。封止部材としてテープ又は板状の部材を用いる場合、その使用枚数は任意である。具体的には、カバー部材上の全ての貫通孔を一枚の封止部材で封止してもよく、複数の封止部材を用いてそれぞれで複数の貫通孔の一部を封止してもよい。また、前記の通り一枚の基材上に複数のカバー部材が設けられている場合、カバー部材のそれぞれに別々の封止部材を用いてもよく、複数のカバー部材上の貫通孔をまとめて一枚の封止部材で封止してもよい。通常は、一枚のカバー部材あたり一枚の封止部材を用いることが、簡便且つ確実な封止を達成しうることから好ましい。
【００６６】
封止の具体例を、再び図１６を参照して説明する。図１６の例では、検体溶液（図示せず）を貫通孔３２よりアプライした後、可とう性の粘着テープ３４を、液面駐止用チャンバー３３の全面を覆うように貼付し、貫通孔を封止している。このような態様により、簡便で且つ検体溶液の漏出や測定誤差を招かない封止を達成できる。
【００６７】
本発明の分析方法において、選択的な結合とは、選択結合性物質と検体とを相互作用させ、前記検体を前記選択結合性物質を介して前記選択結合性物質固定化基材に結合させることを意味する。本発明の選択結合性物質固定化基材や分析チップの場合には、前記基材又はチップを揺動、回転させることにより、重量、振動、遠心力によってマイクロロッドが検体溶液中を移動するので、選択的結合を効率よく進めることができる。
選択的結合の際の反応温度及び時間は、ハイブリダイズさせる検体の核酸の鎖長や、免疫反応に関与する抗原及び／又は抗体の種類等に応じて適宜選択されるが、核酸のハイブリダイゼーションの場合、通常、５０℃〜７０℃程度で１分間〜十数時間、免疫反応の場合には、通常、室温〜４０℃程度で１分間〜数時間程度である。また、必要に応じて、選択結合性物質固定化基材を揺動、回転等させ、選択的結合を促進することができる。
選択的結合が終了した後、通常はカバー部材を脱離させた後、次の工程に供することができる。
【００６８】
本発明の分析方法においては、上述の選択的結合の後、前記基材上に前記選択結合性物質を介して結合した前記検体の質量を測定する。この測定も、従来の分析チップにおける操作と全く同様に行うことができる。例えば、適宜蛍光標識され、選択結合性物質と結合した検体の質量について、公知のスキャナ等により、その蛍光量を読み取ることにより測定することができる。
【００６９】
本発明の分析方法において、選択結合性物質として核酸を固定化した場合には、この核酸又はその一部と相補的な配列を有する核酸を測定することができる。また、選択結合性物質として抗体又は抗原を固定化した場合には、この抗体又は抗原と免疫反応する抗原又は抗体を測定することができる。なお、本明細書でいう「測定」には検出と定量の両者の意味が含まれる。
【００７０】
本発明の選択結合性物質固定化基材、及び分析チップは、分析用キットとして提供されることも可能である。
すなわち、本発明の分析用キットは、上記選択結合性物質固定化基材と、前記選択結合性物質固定化基材の表面を覆い前記基材と接着されたカバー部材と、前記カバー部材に貼付し前記貫通孔を封止する封止部材とを含むか、或いは、上記分析チップと、前記カバー部材に貼付し前記貫通孔を封止する封止部材とを含むことを特徴とする。
本発明の分析用キットにおいて含まれうる前記カバー部材に関しては、本発明の分析チップにおいて述べたとおりである。また、前記封止部材に関しては、前記本発明の分析方法において説明したものと同様のものを含むことができる。
このような本発明の分析用キットは、前記本発明の分析方法に従って使用することができる。
【実施例】
【００７１】
本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。本発明は下記実施例に限定されない。
【００７２】
参考例１（基材の作製）
公知の方法を用いて、射出成形用の型を作製し、射出成型法によりＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）製の基材を得た。用いたＰＭＭＡの平均分子量は５万であり、ＰＭＭＡ中には１重量％の割合で、カーボンブラック（三菱化学製  ＃３０５０Ｂ）を含有させており、基材は黒色である。この黒色基材の分光反射率と分光透過率を測定したところ、分光反射率は、可視光領域（波長が４００ｎｍから８００ｎｍ）のいずれの波長でも５％以下であり、また、同範囲の波長で透過率は０．５％以下であった。分光反射率、分光透過率とも、可視光領域において特定のスペクトルパターン（ピークなど）はなく、スペクトルは一様にフラットであった。なお、分光反射率の測定に用いた規格は、ＪＩＳ  Ｚ  ８７２２の条件Ｃである。この規格に適合した照明・受光光学系を搭載した装置（ミノルタカメラ製、ＣＭ−２００２）を用いて、基材からの正反射光を取り込んだ場合の分光反射率を測定した。
【００７３】
作成した基材の形状は、大きさが縦７６ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍであり、基材の中央部分を除き表面は平坦であった。基材の中央には、直径１０ｍｍ、深さ０．２ｍｍの凹んだ部分が設けてあり、この凹みの中に、直径０．２ｍｍ、高さ０．２ｍｍの凸部を６４（８×８）箇所設けた。凹凸部分の凸部上面の高さ（６４箇所の凸部の高さの平均値）と平坦部分との高さの差を測定したところ、３μｍ以下であった。また、６４個の凸部上面の高さのばらつき（最も高い凸部上面の高さと最も低い凸部上面との高さの差）、及び凸部上面の高さの平均値と平坦部上面の高さの差を測定したところ、それぞれ３μｍ以下であった。さらに、凹凸部凸部のピッチ（凸部中央部から隣接した凸部中央部までの距離）は０．６ｍｍであった。
【００７４】
実施例１
＜粗面化された基材の作製＞
参考例１で得た基材表面を紙やすりで処理して、粗さの調節を行ったものを基材１とした。
基材１の、選択結合性物質固定化面以外の粗さ、すなわち凹部の粗さを測定した。粗さの測定には、触針電気式表面粗さ測定機ＳＵＲＦＣＯＭ１４００Ｄ−６４を使用した。該測定機の固定具に基材１を固定し、凹部底面に針径は２μｍの触針を触れさせ、触針を触れさせたままで該測定機の固定具を速度０．３０ｍｍ／ｓで１．０ｍｍ平行移動させた。この平行移動距離１．０ｍｍを基準長さｌ（エル）とした。基材表面の粗さは、触針の垂直方向の動きとして電気信号により記録され、この記録を用いて「粗さ曲線」を作成した。粗さ曲線の算術平均粗さＲａ値は、基準長さｌ内の任意の位置ｘにおける粗さ曲線の高さＺ（ｘ）の絶対値の平均である。同じくＲｚ値（規定された粗さ曲線の最大高さ）は、「粗さ曲線」の基準長さｌ内の最低谷底と最大山頂との高低差によって求められる。ＲZJIS値（粗さ曲線の十点平均粗さ）は、基準長さｌ内の山頂の高い方から５点、谷底の低い方から５点を選らび、その平均値によって求められる。
【００７５】
測定の結果、基材１のＲａ値は０．０３７４〜０．０８３０μｍ、Ｒｚ値は０．３１００〜２．８１２９μｍ、ＲZJIS値は０．２４００〜２．４４８０μｍであった。
【００７６】
＜粗面化基材のバックグラウンドノイズの測定＞
基材１にレーザーを当てて、基材１が発するシグナル強度を上記蛍光測定装置により測定した。ここでは選択結合性物質の固定化前なので、シグナル測定値はバックグラウンドノイズに相当する。蛍光測定装置としてオリンパス製ＧｅｎｅＰｉｘを使用し、該装置のレーザー波長５３２ｎｍ、レーザー強度を３３％、ＰＭＴ  ｇａｉｎ値を５００として基板１のシグナル強度の測定を行った。測定の結果、基材１のシグナル強度は６０であった。この数値が低いほどバックグラウンドノイズが低いことを意味する。該蛍光測定装置は、その測定蛍光範囲が３０〜６５０００であるので、この値はその範囲の下限付近である。
【００７７】
実施例２
上記基材１について、粗面化よる攪拌の効果について確認を行った。
【００７８】
＜選択結合性物質の固定化＞
基材１に対し、以下の条件でそれぞれ選択結合性物質としてオリゴヌクレオチドを固定化した。オリゴヌクレオチドとしては、配列番号１で表される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（６０塩基）を用いた。該オリゴヌクレオチドを、純水に０．３ｎｍｏｌ／μｌの濃度で溶かして、ストックソリューションとした。担体に点着する際は、ＰＢＳ（ＮａＣｌを８ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4・１２Ｈ2Ｏを２．９ｇ、ＫＣｌを０．２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4を０．２ｇ純水に溶かし１ｌにメスアップしたものにｐＨ調整用の塩酸を加えたもの、ｐＨ５．５）でプローブＤＮＡの終濃度を０．０３ｎｍｏｌ／μｌとし、かつ、担体表面のカルボン酸とプローブＤＮＡの末端のアミノ基とを縮合させるため、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を加え、この終濃度を５０ｍｇ／ｍｌとした。そして、これらの混合溶液をガラスキャピラリーで担体凸部上面に点着した。次いで、担体を密閉したプラスチック容器入れて、３７℃、湿度１００％の条件で２０時間程度インキュベートして、純水で洗浄した。
【００７９】
＜検体ＤＮＡの調製＞
検体ＤＮＡとして、上記ＤＮＡ固定化担体に固定化されたプローブＤＮＡとハイブリダイズ可能な塩基配列を持つ配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡ（９６８塩基）を用いた。調製方法を以下に示す。
【００８０】
配列番号２で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、配列番号２のＤＮＡと記載することがある）と配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、配列番号３のＤＮＡと記載することがある）を合成した。これを純水にとかして濃度を１００μＭとした。次いで、ｐＫＦ３  プラスミドＤＮＡ（タカラバイオ（株）製品番号；３１００）（配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡ：２２６４塩基、以下、配列番号５のＤＮＡと記載することがある）を用意して、これをテンプレートとし、配列番号２および配列番号３のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲ反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）により増幅を行った。
【００８１】
ＰＣＲの条件は以下の通りである。すなわち、ＥｘＴａｑ  ２μｌ、１０×ＥｘＢｕｆｆｅｒ  ４０μｌ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ３２μｌ（以上はタカラバイオ（株）製  製品番号ＲＲ００１Ａに付属）、配列番号２のＤＮＡ溶液を２μｌ、配列番号３のＤＮＡ溶液を２μｌ、  テンプレート（配列番号５のＤＮＡ）を０．２μｌ加え、純水によりトータル４００μｌにメスアップした。これらの混合液を、４つのマイクロチューブに分け、サーマルサイクラーを用いてＰＣＲ反応を行った。これを、エタノール沈殿により精製し、４０μｌの純水に溶解した。ＰＣＲ反応後の溶液の一部をとり電気泳動で確認したところ、増幅したＤＮＡの塩基長は、およそ９６０塩基であり配列番号４のＤＮＡ（９６８塩基）が増幅されていることを確認した。
【００８２】
次いで、９塩基のランダムプライマー（タカラバイオ（株）製；製品番号３８０２）を６ｍｇ／ｍｌの濃度に溶かし、上記のＰＣＲ反応後精製したＤＮＡ溶液に２μｌ加えた。この溶液を１００℃に加熱した後、氷上で急冷した。これらにＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（タカラバイオ（株）製；製品番号２１４０ＡＫ）付属のバッファーを５μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰの濃度はそれぞれ２．５ｍＭ、ｄＣＴＰの濃度は４００μＭ）を２．５μｌ加えた。さらに、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク製；製品番号ＰＡ５３０２１）を２μｌ加えた。この溶液に１０ＵのＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔを加え、３７℃で２０時間インキュベートし、Ｃｙ３で標識された検体ＤＮＡを得た。なお、標識の際ランダムプライマーを用いたので検体ＤＮＡの長さには、ばらつきがある。最も長い検体ＤＮＡは配列番号４のＤＮＡ（９６８塩基）となる。なお、検体ＤＮＡの溶液を取り出して、電気泳動で確認したところ、９６０塩基に相当する付近にもっとも強いバンドが現れ、それより短い塩基長に対応する領域に薄くスメアがかかった状態であった。そして、これをエタノール沈殿により精製し、乾燥した。
【００８３】
この標識化された検体ＤＮＡを、１重量％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、５×ＳＳＣ（５×ＳＳＣとは、２０×ＳＳＣ（シグマ製）を純水にて４倍に希釈したものである。また、２０×ＳＳＣを純水で２倍に希釈したものを１０×ＳＳＣと表記し、２０×ＳＳＣの２倍希釈液を１０×ＳＳＣ、１００倍希釈液を０．２×ＳＳＣと表記する。）、０．１重量％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡの溶液（各濃度はいずれも終濃度）、４００μｌに溶解し、ハイブリダイゼーション用のストック溶液とした。
【００８４】
以下の実施例、比較例において、ハイブリダイゼーションの際の検体溶液は、特に断りのない限り、上記で調製したストック溶液を、１重量％ＢＳＡ、５×ＳＳＣ、０．０１重量％サケ精子ＤＮＡ、０．１重量％ＳＤＳの溶液（各濃度はいずれも終濃度）で２００倍に希釈したものを用いた。なお、この溶液の検体ＤＮＡの濃度を測定したところ、１．５ｎｇ／μＬであった
【００８５】
＜攪拌用微粒子の調製＞
ハイブリダイゼーション反応液を攪拌するための微粒子として、直径１５０μｍのガラスビーズを使用した。該ガラスビーズ１０ｇを１０Ｎ  ＮａＯＨ溶液に浸漬した後、純水で洗浄した。このガラスビーズに対し、ＤＮＡの非特異的吸着を防ぐために、次のように表面処理を行った。
【００８６】
ＡＰＳ（３−アミノプロピルトリエトキシシラン；信越化学工業（株）製）を２重量％の割合で純水に溶解した後、上記のガラスビーズを１時間浸漬し、この溶液から取り出した後に１１０℃で１０分間乾燥した。このようにしてガラスビーズ表面にアミノ基を導入した。ついで、５．５ｇの無水コハク酸を１−メチル−２−ピロリドン３３５ｍｌに溶解させた溶液と、１Ｍホウ酸ナトリウム水溶液（ホウ酸３．０９ｇとｐＨ調整用の水酸化ナトリウムを加えて、純水で５０ｍｌにメスアップしたもの。ｐＨ８．０）５０ｍｌとのの混合液に、上記のガラスビーズを２０分間浸漬した。浸漬後、純水で洗浄および乾燥した。このようにして、ガラスビーズの表面のアミノ基と無水コハク酸を反応させて、ガラスビーズ表面にカルボキシル基を導入した。
【００８７】
＜ハイブリダイゼーション反応＞
上記で得られたプローブＤＮＡを固定化した担体に上記検体ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。具体的には、マイクロピペットを用いてハイブリダイゼーション用の溶液５０μｌを貫通孔より注入する。その後、カプトンテープ（アズワン  ５−５０１８−０１）で貫通孔を塞ぎ、これをマイクロチューブローテーター（アズワン製、商品番号：１−４０９６−０１）の回転面に設けたプラスチック容器内に固定し、４２℃、４時間インキュベートした。さらに担体のプローブＤＮＡ固定化面は、ローテーターの回転面に対し直角となるようにした。その際、ローテーターの回転数は３ｒｐｍとし、ローテーターの回転面は、水平面と直角となるようにした。インキュベート後、担体からカバー部材と両面テープを脱離後に担体を洗浄、乾燥した。
【００８８】
＜シグナル強度の測定＞
ハイブリダイゼーション反応を行った基材１の表面にレーザーを照射して、基材が発するシグナル強度を上記の蛍光測定装置で測定した。ここでは選択結合性物質の固定化後なので、この測定値からハイブリダイゼーション反応の効率を評価できる。測定の結果、粗面化した基材１のシグナル強度の平均値は約２４０００であった。該蛍光測定装置は、その測定蛍光範囲が０〜６５０００であるので、この値はその範囲の中心付近である。上記のバックグラウンドノイズ（Ｎ＝６０）とシグナル値（Ｓ＝２４０００）との比率（Ｓ／Ｎ比）は４００となった。
【００８９】
比較例１
参考例１で得た射出成型された基材をそのまま表面粗面化の処理を加えず、基材２として使用した。
実施例１と同じ方法で凹部表面の粗さを測定した結果、基材２のＲａ値は０．００４０〜０．００７５μｍ、Ｒｚ値は０．０５００〜０．０９６０μｍ、ＲZJIS値は０（検出限界値以下）〜０．１２８０μｍであった。
【００９０】
実施例１と同様の方法で、選択結合性物質を固定化する前の基材２にレーザーを当てて、基材が発するシグナル値をバックグラウンド値を測定した。測定の結果、シグナル値は７５であった。この値は、実施例１よりも２５％高いバックグラウンド値であった。
【００９１】
比較例２
基材２に対し、実施例２と同じ方法・条件で、同じオリゴヌクレオチドを選択結合性物質として固定化し、同じ標識検体を用い、攪拌用微粒子として同じカラスビーズを用いて攪拌して、同じ条件でハイブリダイゼーション反応を行った。
ハイブリダイゼーション反応させた基材２の表面にレーザーを照射して、基板が発するシグナル強度を上記の蛍光測定装置により測定した。その結果、シグナル強度の平均値は約２００００であった。この値は、実施例２に比べて２０％低い。ノイズ（Ｎ＝２００００）とシグナル値（Ｓ＝７５）との比率（Ｓ／Ｎ比）は２６７となった。
【００９２】
以上の結果から、基材表面へ粗さを付与することは、基材のバックグラウンドノイズのシグナル強度低減と、ハイブリダイゼーション反応効率の向上に有効であることが示され、本発明の基材はこれらに優れた選択結合性物質固定化基材であることがわかった。実施例１と比較例１との比較において、２５％のバックグラウンドノイズ低減効果、実施例２と比較例２との比較において、２０％のハイブリダイゼーション効率増加効果が示された。また、シグナル値とノイズ値の比率（Ｓ／Ｎ比）は、粗さの付与前の２６７から付与後の４００へと約５０％倍増加しており、この基材を用いた測定における検出感度が５０％上昇することを示唆するものである。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、本発明の選択結合性物質固定化基材の一例を概略的に示す斜視図である。
【図２】図２は、従来の基材の一例を概略的に示す斜視図である。
【図３】図３は、本発明の選択結合性物質固定化基材の一例を概略的に示す斜視図である。
【図４】図４は、従来の基材の一例を概略的に示す斜視図である。
【図５】図５は、本発明の選択結合性物質固定化基材の一例を概略的に示す斜視図である。
【図６】図６は、図５に例示される基材の縦断面図である。
【図７】図７は、本発明の選択結合性物質固定化基材を用いた反応の結果を読み取る治具及びスキャナーの一例を概略的に示す縦断面図である。
【図８】図８は、本発明の分析チップの一例を概略的に示す斜視図である。
【図９】図９は、図８に示される本発明の分析チップを矢印Ａ１に沿った面で切断した部分断面図である。
【図１０】図１０は、本発明の分析チップにおける貫通孔及び液面駐止チャンバーの一例を示す部分断面図である。
【図１１】図１１は、仕切り構造を有する本発明の分析チップの一例を概略的に示す縦断面図である。
【図１２】図１２は、仕切り構造を有する本発明の分析チップの別の一例を概略的に示す縦断面図である。
【図１３】図１３は、本発明の分析チップの別の一例を概略的に示す縦断面図である。
【図１４】図１４は、本発明の分析チップの別の一例を概略的に示す斜視図である。
【図１５】図１５は、図１４に示される本発明の分析チップを矢印Ａ２に沿った面で切断した部分断面図である。
【図１６】図１６は、本発明の分析チップの別の一例を概略的に示す縦断面図である。
【符号の説明】
【００９４】
１  選択結合性物質結合基材
１０  凹部
１１  凸部
１２  選択結合性物質が固定化された領域（凹凸部）
１３  平坦部
１４  基材凸部
２  微粒子
３、３Ｂ  カバー部材
３Ａ  カバー部材凸部
３０、３０Ｃ  接着層（接着部材）
３０Ａ、３０Ｂ  仕切り構造の接着層（接着部材）
３１  空隙（空間）
３２、３２Ａ、３２Ｂ  貫通孔
３３  液面駐止用チャンバー
３４  封止部材（テープ）
３５  基材とカバー部材との隙間
４０  マイクロアレイを治具に突き当てるためのバネ
４１  治具
４２  治具突き当て面
４３  対物レンズ
４４  レーザー励起光
４５  基材に固定化された選択結合性物質（ＤＮＡ）
Ｌ１  凸部ピッチ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
0004797619000001.app