(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトチロシナーゼ（hTyr）抗原または抗原決定基をコードするコード配列を含有し、発現することができる組換えMVAウイルス。
【請求項２】
請求項１に記載の組換えMVAウイルスであって、当該ヒトチロシナーゼ（hTyr）抗原または抗原決定基をコードするコード配列がワクシニアウイルス初期／後期プロモーターP7.5の転写制御下にある組換えMVAウイルス。
【請求項３】
ヒトチロシナーゼ（hTyr）抗原または抗原決定基をコードするコード配列がヒトチロシナーゼをコードする遺伝子である、請求項１または２に記載の組換えMVAウイルス。
【請求項４】
ヒト細胞中で複製可能なウイルスを実質的に含まない、請求項１から３の何れか１項に記載の組換えMVAウイルス。
【請求項５】
請求項１から４の何れか１項に記載の組換えMVAウイルスに感染した真核細胞。
【請求項６】
組換えhTyrタンパク質を製造する方法であって、以下を含む方法：
a）請求項５に記載の細胞を適切な条件下で培養すること、および
b）当該hTyrタンパク質を単離すること。
【請求項７】
請求項１から４に記載の組換えMVAウイルスを生理的に許容される担体中に含有するワクチン。
【請求項８】
請求項１から４に記載のMVAウイルスのワクチンの製造のための使用。
【請求項９】
ヒトを含む動物生体を免疫化するための請求項１から４の何れか１項に記載の組換えMVAウイルスまたは請求項７に記載のワクチン。
【請求項１０】
黒色腫の予防または治療のための請求項９に記載の組換えMVAウイルスまたはワクチン。
【請求項１１】
請求項１から４の何れか１項に記載の組換えMVAまたは請求項７に記載のワクチンの細胞へのex vivo遺伝子導入のための使用。
【請求項１２】
組換えhTyrタンパク質の製造のための請求項１から４に記載の組換えMVAウイルスの使用。
【請求項１３】
ヒトを除く動物生体を免疫化する方法であって、前記動物生体に請求項１から４の何れか１項に記載の組換えMVAウイルスまたは請求項７に記載のワクチンを接種することを具備する方法。
【請求項１４】
ヒトを除く動物生体を免疫化する方法であって、請求項１から４に記載の組換えMVAまたは請求項７に記載のワクチンを細胞に対して投与し、その後、ヒト以外の動物生体に再導入することを具備する方法。
【請求項１５】
黒色腫の予防または治療のための請求項１３または１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクシニアウイルスアンカラ（Ankara）（MVA）ゲノム内の天然に存在する欠失部位に挿入された外来遺伝子を含有し、その発現能を有する、修飾されたMVAに由来する組換えワクシニアウイルス、およびポリペプチド（例えば、抗原若しくは治療剤）または遺伝子治療用ウイルスベクターを製造するためのそのような組換えMVAウイルスの使用、および抗原をコードするそのような組換えMVAウイルスのワクチンとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ポックスウイルス科オルトポックスウイルス属の一員であるワクシニアウイルスは、ヒト痘瘡疾患に対する免疫化のための生ワクチンとして使用された。ワクシニアウイルスによる予防接種の世界的な成功により、痘瘡の原因因子である痘瘡ウイルスがついに根絶された（The global eradication of smallpox. Final report of the global commission for the certification of smallpox eradication. History of Public Health, No. 4, Geneva: World Health Organization, 1980）。そのWHOの宣言以来、ポックスウイルス感染症に対してハイリスクの人々（例えば、研究所員）を除き、一般には予防接種は中断されている。
【０００３】
その後、ワクシニアウイルスは、組換え遺伝子発現用ウイルスベクターの設計、および組換え生ワクチンとしての潜在的使用に使用されている（Mackett, M., Smith, G.L.およびMoss, B. [1982] P.N.A.S. USA 79, 7415-7419; Smith, G.L., Mackett, M.およびMoss, B. [1984] Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 2, 383-407）。これには、ＤＮＡ組換え技術の助けによりワクシニアウイルスのゲノム中へ導入される外来抗原をコードするＤＮＡ配列（遺伝子）が必要となる。ウイルスの生活環に必須でないウイルスＤＮＡ中の部位にその遺伝子が組込まれた場合、新しく産生された組換えワクシニアウイルスが感染性となる、すなわち、外来細胞に感染し、そして組込まれたＤＮＡ配列を発現することが可能である（欧州特許出願第83,286号および第110,385号）。このようにして製造される組換えワクシニアウイルスは、一方では、感染性疾患の予防のための生ワクチンとして、他方では、真核細胞における異種タンパク質の製造のために使用することができる。
【０００４】
バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスにより、哺乳動物細胞中での組換えタンパク質合成に広く適用可能な発現系を確立させることができた（Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W.A.およびFuerst T.R. [1990] Nature 348, 91-92）。すべてのプロトコールにおいて、組換え遺伝子発現は、真核細胞の細胞質中でのT7 RNAポリメラーゼの合成に依存する。一過性発現のためのプロトコールが最も一般的となった（Fuerst, T.R., Niles, E.G., Studier, F.W.およびMoss, B. [1986] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126および米国特許出願第7.648.971号）。まず第１に、関心のある外来遺伝子を、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下でプラスミド中に挿入する。ついで、このプラスミドを、標準的なトランスフェクション法を用いて、T7 RNAポリメラーゼを産生する組換えワクシニアウイルスに感染した細胞の細胞質中に導入する。
【０００５】
このトランスフェクションプロトコールは、新たな組換えウイルスの作製を必要としないため簡便であり、80％を超す細胞が関心のある遺伝子を発現し、非常に効率的である（Elroy-Stein, O.およびMoss, B. [1990] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6743-6747）。他の一過性発現系に対するワクシニアウイルス／T7 RNAポリメラーゼハイブリッド系の利点は、おそらく、それが細胞核へのプラスミドの輸送に依存しない点であろう。これまでのところ、この系は、ウイルス学および細胞生物学における分析目的に非常に有用となっている（Buonocore, L.およびRose, J.K. [1990] Nature 345, 625-628, Pattnaik, A.K.およびWertz, G.W. [1991] Proc Natl. Acad. Sci. USA 88, 1379-1383, Karschin, A., Aiyar, J., Gouin, A., Davidson, N.およびLester, H.A. [1991] FEBS Lett. 278, 229-233, Ho, B.Y., Karschin, A., Raymond, J., Branchek, T., Lester, H.A.およびDavidson, N. [1992] FEBS Lett. 301, 303-306, Buchhoiz, C.J., Retzler C., Homann, H.E.およびNeubert, W.J. [1994] Virology 204, 770-776）。しかしながら、ワクシニアウイルス／T7 RNAポリメラーゼハイブリッド系の重要な将来的適用（例えば、ヒトにおける新規治療または予防的アプローチのための組換えタンパク質または組換えウイルス粒子の製造）は、組換えワクシニアベクターの生産的複製により妨げられる可能性がある。
【０００６】
ワクシニアウイルスはヒトに感染性であり、痘瘡根絶運動中の予防接種の際には、時々、重篤な合併症が認められた。合併症の発生に関する最良の概要説明は、ニューヨーク市衛生委員会のワクシニアウイルス株（New York City Board of Health strain of vaccinia virus）に基づくワクチンによる約1200万人の予防接種を監視した米国における全国調査から得られている（Lane, J., Ruben, F., Neff, J.およびMillar, J. [1969] New Engl. J. Med. 281, 1201-1208）。したがって、組換え生ワクチン開発用のベクターとしてワクシニアウイルスを使用するという最も興味深い可能性は、安全性に対する懸念および規制に影響されている。さらに、文献に記載されている組換えワクシニアウイルスのほとんどは、ワクシニアウイルスのウエスタン・リザーブ（Western Reserve）株に基づく。一方、この株は高い神経毒性を有し、したがって、ヒトおよび動物での使用にあまり適さないことが知られている（Moritaら, Vaccine 5, 65-70 [1987]）。
【０００７】
ベクターの適用では、高度に弱毒化されたワクシニアウイルス株の使用により、健康に対する危険性は減少するであろう。特に、痘瘡予防接種の望ましくない副作用を避けるために、そのようないくつかのワクシニアウイルス株が開発された。例えば、修飾されたワクシニアウイルスアンカラ（Ankara）（MVA）は、ワクシニアウイルス（CVA）のアンカラ株をニワトリ胚繊維芽細胞上で長期にわたり連続継代することにより作製された（概説としては、Mayr, A., Hochstein-Mintzel, V.およびStickl, H. [1975] Infection 3, 6-14; スイス国特許第568,392号を参照されたし）。MVAウイルスは、ブダペスト条約の要求に応じて、CNCM（Institut Pasteur, Collection Nationale de Cultures de Microorganisms, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15）に1987年12月15日に受託番号I-721として寄託されている。MVAは、その高度な弱毒化、すなわち、優れた免疫原性を維持しつつ、毒性または感染力が減少していることにより特徴づけられる。MVAウイルスは、野生型CVA株に対するゲノム変化を決定するために分析されており、合計31,000塩基対になるゲノムＤＮＡの６つの主要な欠失（欠失Ｉ、II、III、IV、ＶおよびVI）が同定されている（Meyer, H., Sutter, G.およびMayr A. [1991] J. Gen. Virol. 72, 1031-1038）。得られたMVAウイルスは、宿主細胞がニワトリ細胞に厳格に限局したものとなった。
【０００８】
さらに、MVAは、その極端な弱毒化により特徴づけられる。種々の動物モデルで試験した場合、MVAは、免疫抑制されている動物においてさえも無毒であることが判明した。さらに重要なことは、MVA株の優れた特性が、広範な臨床試験において証明されていることである（Mayrら, Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 [1987], Sticklら, Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392 [1974]）。ハイリスク患者を含む120,000人を超える人々において行われたこれらの研究では、MVAワクチンの使用に伴う副作用はなかった。
【０００９】
ヒト細胞中でのMVA複製は、感染後期に遮断され、成熟した感染性ビリオンへの集合が妨げられることが判明した。それにもかかわらず、MVAは、非許容細胞においてさえも、ウイルスおよび組換え遺伝子を高レベルで発現する能力を有しており、効率的で著しく安全な遺伝子発現ベクターとして使用することが提案されている（Sutter, G.およびMoss, B. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851）。最近、TK遺伝子内またはMVAゲノム内の欠失III部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を有する新規ワクシニアベクター系が、MVAに基づいて確立された（Sutter, G.およびMoss, B. [1995] Dev. Biol. Stand. Basel, Karger 84, 195-200および米国特許第5,185,146号）。
【００１０】
MVAの使用をさらに開発するために、ワクシニアウイルスのMVA株中にＤＮＡ組換えにより外来遺伝子を導入するための可能な新規方法が探索されている。その意図はMVAウイルスのゲノムを変化させることではないため、この要求に応じた方法を用いる必要があった。本発明においては、外来ＤＮＡ配列を、ウイルスＤＮＡ中の、MVAゲノム内の天然に存在する欠失部位に正確に再結合させた。
【発明の開示】
【００１１】
発明の目的
効率的で非常に安全な発現ベクターとして使用しうる組換えMVAウイルスを提供することが本発明の目的である。
【００１２】
本発明のもう１つの目的は、ポリペプチド（例えば、抗原または治療剤）、ワクチン用組換えウイルスおよび遺伝子治療用ウイルスベクターの簡便で効率的で安全な製造法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらにもう１つの目的は、T7 RNAポリメラーゼを発現する組換えMVAウイルスに基づく発現系、およびこの発現系に基づくポリペプチド（例えば、抗原または治療剤）および遺伝子治療用またはワクチン用のウイルスベクターの製造法を提供することである。
【００１４】
発明の概要
したがって、本発明は、とりわけ、以下のものを単独でまたは組み合わせて含んでなる：
MVAゲノム内の天然に存在する欠失部位に挿入された少なくとも１つの外来遺伝子を含有し、その発現能を有する組換えMVAウイルス；
MVAゲノム内の欠失II部位に挿入された少なくとも１つの外来遺伝子を含有し、その発現能を有する、前記組換えMVAウイルス；
該外来遺伝子が、マーカー、治療剤または抗原決定基をコードする、前記組換えMVAウイルス；
該外来遺伝子が、病原性ウイルス、細菌または他の微生物からの、または寄生生物または腫瘍細胞からの抗原決定基をコードする、前記組換えMVAウイルス；
該外来遺伝子が、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium Falciparum）、マイコバクテリア、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、肝炎またはヒト免疫不全ウイルスからの抗原決定基をコードする、前記組換えMVAウイルス；
該抗原決定基がHIV nefまたはヒトチロシナーゼである、前記組換えMVAウイルス；
MVA-LAInefまたはMVA-hTYRである、前記組換えMVAウイルス；
該外来遺伝子がT7 RNAポリメラーゼをコードする、前記組換えMVAウイルス；
MVA-T7 polである、前記組換えMVAウイルス；
該外来遺伝子が、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターP7.5の転写制御下にある、前記組換えMVAウイルス；
ヒト細胞中で複製可能なウイルスを実質的に含まない、前記組換えMVAウイルス；
T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下でのＤＮＡ配列の転写のための、前記組換えMVAウイルスの使用；
前記のいずれかの組換えMVAウイルスに感染した真核細胞；
該外来遺伝子がT7 RNAポリメラーゼをコードする、前記組換えMVAウイルスに感染した細胞；
該外来遺伝子がT7 RNAポリメラーゼをコードする前記の組換えMVAウイルスに感染した細胞であって、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの転写制御下の１以上の外来遺伝子を保持する１以上の発現ベクターをさらに含有する細胞；
前記外来遺伝子にコードされるポリペプチドの製造のための、前記細胞の使用であって、
a）前記細胞を適当な条件下で培養し、そして
b）前記外来遺伝子にコードされるポリペプチドを単離することを含んでなる使用；
該外来遺伝子がT7 RNAポリメラーゼをコードする前記の組換えMVAウイルスに感染した細胞であって、ウイルス遺伝子を保持する発現ベクターおよび／またはT7 RNAポリメラーゼプロモーターの転写制御下のウイルスベクターのゲノムをコードするウイルスベクターコンストラクトをさらに含有する細胞；
ウイルス粒子の製造のための、前記細胞の使用であって、
a）前記細胞を適当な条件下で培養し、そして
b）該ウイルス粒子を単離することを含んでなる使用；
該外来遺伝子がT7 RNAポリメラーゼをコードする前記の組換えMVAウイルスに感染した細胞であって、
a）標的細胞に感染する能力と、前記レトロウイルスベクターコンストラクトにより保持される１以上の外来遺伝子の標的細胞における発現を指令する能力とを有するレトロウイルスベクターコンストラクトを保持する発現ベクター、および
b）前記レトロウイルスベクターコンストラクトのゲノムがパッケージングされるのに必要なポリペプチドをコードする遺伝子をT7 RNAポリメラーゼプロモーターの転写制御下で保持する１以上の発現ベクターをさらに含有する細胞；
レトロウイルス粒子の製造のための、前記細胞の使用であって、
a）前記細胞を適当な条件下で培養し、そして
b）該レトロウイルス粒子を単離することを含んでなる使用；
生理的に許容される担体中に、該外来遺伝子が抗原決定基をコードする前記組換えMVAウイルスを含有するワクチン；
ワクチンの製造のための、該外来遺伝子が抗原決定基をコードする前記組換えMVAウイルスの使用；
動物（ヒトを含む）生体の免疫化のための、前記ワクチンの使用；
HIV感染若しくはエイズの予防または治療のための、MVA-LAInefを含有する前記ワクチンの使用；
黒色腫の予防または治療のための、MVA-hTYRを含有する前記ワクチンの使用；
該外来遺伝子がT7 RNAポリメラーゼをコードする前記組換えMVAウイルスを生理的に許容される担体中に第１成分として、そしてT7 RNAポリメラーゼプロモーターの転写制御下で抗原決定基を保持するＤＮＡ配列を生理的に許容される担体中に第２成分として含んでなり、それらの２成分が一緒にまたは別々に含有されているワクチン；
動物（ヒトを含む）生体の免疫化のための前記ワクチンの使用であって、前記動物（ヒトを含む）生体に、該ワクチンの第１成分および第２成分を同時にまたは一定の時間間隔で同じ接種部位に接種することを含んでなる使用。
【００１５】
「遺伝子」なる語は、タンパク質またはペプチドをコードする如何なるＤＮＡ配列をも意味する。
【００１６】
「外来遺伝子」なる語は、ＤＮＡ配列中に挿入されている、通常は該配列中に存在しない遺伝子を意味する。
【００１７】
外来遺伝子は、例えば、マーカー遺伝子、治療用遺伝子、抗原決定基をコードする遺伝子、またはウイルス遺伝子であってもよい。そのような遺伝子は、当該分野でよく知られている。
【００１８】
本発明
宿主範囲が限定されている高度に弱毒化されたワクシニアウイルス株である修飾されたワクシニアウイルスアンカラ（MVA）は、ヒトおよび試験された他のほとんどの哺乳動物細胞系において増殖能を有さない。しかし、ウイルス遺伝子発現は、非許容細胞においては損なわれていないため、本発明の組換えMVAウイルスは、非常に安全で効率的な発現ベクターとして使用することができる。
【００１９】
抗原決定基をコードする組換えMVAウイルス
１つの実施態様では、本発明は、外来抗原（好ましくは、病原体のもの）をコードする遺伝子を含有する組換えMVAワクシニアウイルス、および生理的に許容される形態中にそのようなウイルスを含有するワクチンに関する。本発明はまた、そのような組換えMVAワクシニアウイルスまたはワクチンの製造法、およびそのような病原体が引き起こす感染症の予防のためのこれらのワクチンの使用に関する。
【００２０】
本発明の好ましい実施態様においては、MVAウイルスに挿入される外来遺伝子は、HIV nefをコードする遺伝子である。
【００２１】
本発明者らは、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターP7.5の制御下でHIV-1 nef遺伝子の発現を可能とする組換えMVAウイルスを構築した。
【００２２】
霊長類レンチウイルスの調節性Nefタンパク質は、ウイルス複製サイクルの初期に合成され、高力価のウイルスの複製およびインビボでの疾患誘導に必須であることが示されている。これは、HIV Nefが、エイズ病原において非常に重要な役割を果たしているかもしれないことを示唆している。Nefがウイルス感染力の増大およびHIVの病原性に寄与する分子メカニズムについては、さらに解明されねばならない。しかしながら、Nefは免疫原性であり、Nef特異的抗原は、HIV感染およびエイズに対するワクチンとして使用することができる。
【００２３】
このような状況において、HIV nef遺伝子を発現する組換えMVAウイルスは、一方では、ヒトHIVに対する予防ワクチンとしてヒトの免疫化に、他方では、HIV感染者またはエイズ患者の免疫療法に使用することができる。さらに、HIV nef遺伝子を発現する組換えMVAウイルスは、組換えHIV Nefタンパク質の製造に使用することができる。
【００２４】
本発明のもう１つの好ましい実施態様では、MVAウイルス中に挿入される外来遺伝子は、ヒトチロシナーゼをコードする遺伝子である。
【００２５】
本発明者らは、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターP7.5の制御下でヒトチロシナーゼ遺伝子の発現を可能とする組換えMVAウイルスを構築した。最近、ヒトチロシナーゼは、抗腫瘍細胞溶解性Ｔリンパ球を産生する黒色腫特異的腫瘍抗原として同定された（Brichard, V.ら [1993] J. Exp. Med. 178, 489-495）。正常細胞のうち、メラノサイトのみがチロシナーゼ遺伝子を発現すると考えられるため、チロシナーゼは、黒色腫の免疫療法のための有用な標的抗原である。したがって、ヒトチロシナーゼ遺伝子を発現する組換えMVAウイルスを黒色腫の患者で使用して、腫瘍拒絶を惹起するか又は転移を防ぐ免疫応答を誘導することができる。ヒトチロシナーゼ遺伝子を発現する組換えMVAウイルスは、抗黒色腫ワクチンとして直接使用することができるし、あるいは、該ウイルスは、抗黒色腫ワクチンの製造にも使用することができる。１つの具体例では、ヒトチロシナーゼ遺伝子を発現する組換えMVAウイルスは、ワクチン調製物中の抗原として使用される組換えチロシナーゼタンパク質の製造に使用することができる。もう１つの具体例では、ヒトチロシナーゼ遺伝子を発現する組換えMVAウイルスを発現ベクターとして使用することにより、腫瘍患者由来の細胞を、チロシナーゼを発現するようインビトロで修飾し、患者に再導入して、抗腫瘍免疫応答を誘導することができる。ヒトチロシナーゼ遺伝子を発現する組換えMVAに基づいて調製されたワクチンは、非経口的にまたは局所的に腫瘍部位で使用して、腫瘍の転移を防ぐため、または腫瘍の表現型（例えば、サイズ、形状、堅さ、血管新生または他の特徴）を変化させるために使用することができる。ヒトチロシナーゼ遺伝子を発現する組換えMVAに基づいて調製されたワクチンは、腫瘍の外科的切除の前、手術中またはその後に使用することができる。
【００２６】
ワクチンの製造では、本発明のMVAワクシニアウイルスを、生理的に許容される形態に変換する。これは、痘瘡に対する予防接種に使用されるMVAワクチンの製造における経験に基づいて行なうことができる（Stickl, H.ら, [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392に記載されているとおりである）。典型的には、約106〜108個の組換えMVA粒子を、リン酸緩衝食塩水（PBS）100ml中２％ペプトンおよび１％ヒトアルブミンの存在下、アンプル、好ましくはガラスアンプル中で凍結乾燥する。該凍結乾燥物は、非経口投与に適した増量剤（例えば、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースまたはポリビニルピロリドン）または他の補助物質（例えば、抗酸化剤、安定化剤など）を含有していてもよい。ついで、そのガラスアンプルを封管する。それは、好ましくは−20℃未満の温度で数ヶ月保存することができる。
【００２７】
予防接種または治療には、該凍結乾燥物を、0.1〜0.5mlの水溶液、好ましくは生理食塩水に溶解し、例えば筋肉内接種により非経口的に、あるいは例えば腫瘍中または腫瘍部位への接種により局所的に投与することができる。本発明のワクチンまたは治療剤は、好ましくは筋肉内に注射する（Mayr, A.ら, [1978] Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. B 167, 375-390）。当業者であれば、投与方法、投与の用量および回数を公知方法で最適化することができる。場合によっては、外来抗原に対する適当な免疫応答を得るために、非常に長期にわたりワクチンを数回投与するのが好都合である。
【００２８】
異種ポリペプチドの製造のための組換えMVAウイルスの使用
本発明の組換えMVAワクシニアウイルスは、真核細胞における異種ポリペプチドの製造にも使用することができる。これには、該組換えワクシニアウイルスに感染する細胞が必要となる。外来ポリペプチドをコードする遺伝子を該細胞中で発現させ、発現された異種ポリペプチドを単離する。そのような異種ポリペプチドの製造に使用する方法は、当業者に一般に公知である（EP-A-206,920およびEP-A-205,939）。組換えMVAウイルスの助けにより製造されるポリペプチドは、MVAウイルスの特別な特性のため、ヒトおよび動物で薬物として使用するのに一層適したものである。
【００２９】
T7 RNAポリメラーゼをコードする組換えMVAウイルス、およびT7 RNAポリメラーゼプロモーターの転写制御下でのＤＮＡ配列の発現のためのその使用
本発明のさらに別の実施態様では、本発明者らは、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターP7.5の制御下でバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の発現を可能とする組換えMVAウイルスを構築した。発現系としてのMVA-T7pol組換えウイルスの有用性は、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下で組換え遺伝子の発現を誘導する一過性トランスフェクションアッセイにおいて既に試験されている。大腸菌（E. coli）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子をレポーター遺伝子として使用して、本発明者らは、MVA-T7polが、複製可能なワクシニアウイルスWR株に由来するワクシニア／T7pol組換えウイルスと同等に有効にCAT遺伝子発現を誘導することを見出した。
【００３０】
したがって、本発明のMVA／T7ポリメラーゼハイブリッド系は、生産的ワクシニアウイルス複製の不存在下でポリペプチドを製造するための簡便で効率的で安全な哺乳動物発現系として使用することができる。
【００３１】
また、この発現系は、ウイルス粒子（例えば、MVA粒子またはレトロウイルス粒子）の産生に必要な遺伝子、ゲノムまたは組換えゲノムのすべてまたはいくつかをT7 RNAポリメラーゼプロモーターの転写制御下で含有するＤＮＡコンストラクトにより、T7 RNAポリメラーゼを発現する組換えMVAに感染した細胞系を形質転換することにより、予防接種または遺伝子治療用の組換えウイルス粒子を産生させるために使用することができる。
【００３２】
レトロウイルスベクター系は、以下の２つの成分よりなる。
【００３３】
１）該レトロウイルスベクター自体は、ウイルスタンパク質をコードする遺伝子が標的細胞に導入すべき治療用遺伝子およびマーカー遺伝子で置換されている修飾されたレトロウイルス（ベクタープラスミド）である。ウイルスタンパク質をコードする遺伝子の置換は、該ウイルスを有効に欠損させるため、それは、該修飾レトロウイルスに該欠損ウイルスタンパク質を付与する該系の第２成分によりレスキューされる必要がある。
【００３４】
第２成分は、
２）大量のウイルスタンパク質を産生するが、複製可能なウイルスを産生する能力を欠く細胞系である。この細胞系は、パッケージング細胞系として公知であり、該修飾レトロウイルスベクターのパッケージングを可能にする遺伝子（gag、polおよびenvポリペプチドをコードする遺伝子）を保持する１以上のプラスミドでトランスフェクションされた細胞系よりなる。
【００３５】
このパッケージングされたレトロウイルスベクターを得るために、該ベクタープラスミドをパッケージング細胞系にトランスフェクションする。これらの条件下で、挿入された治療用遺伝子およびマーカー遺伝子を含む修飾されたレトロウイルスゲノムが該ベクタープラスミドから転写され、該修飾レトロウイルス粒子（組換えウイルス粒子）中にパッケージングされる。ついで、この組換えウイルスを使用して標的細胞に感染させると、ベクターゲノムおよび保持されている任意のマーカーまたは治療用遺伝子が標的細胞のＤＮＡ中に組込まれるようになる。そのようなウイルス粒子が感染した細胞中にはウイルスタンパク質が存在しないため、該細胞は新たなベクターウイルス粒子を産生できない。しかしながら、該治療用遺伝子およびマーカー遺伝子を保持するベクターのＤＮＡは、該細胞のＤＮＡ中に組込まれ、該感染細胞中で発現されうる。
【００３６】
T7 RNAポリメラーゼを発現する本発明の組換えMVAウイルスを使用して、レトロウイルスベクターのパッケージングに必要なタンパク質を製造することができる。これを行なうためには、レトロウイルス（例えば、ネズミ白血病ウイルス（MLV））のgag、polおよびenv遺伝子を、１以上の発現ベクター（例えば、プラスミド）においてT7 RNAポリメラーゼプロモーターの転写制御下に置く。ついで、この発現ベクターを、おそらくT7 RNAポリメラーゼプロモーターの転写制御下でレトロウイルスベクターコンストラクトを保持する発現ベクターと共に、T7 RNAポリメラーゼを発現する組換えMVAウイルスが感染した細胞中に導入する。
【００３７】
WO94/29437、WO89/11539およびWO96/07748は、前記のパッケージング系を用いてパッケージングされうる種々の型のレトロウイルスベクターコンストラクトを記載している。
【００３８】
T7 RNAポリメラーゼを発現する組換えMVAウイルスのさらなる使用は、ワクチンまたは治療剤の製造のための組換えタンパク質、非感染性ウイルス粒子または感染性突然変異ウイルス粒子の製造である（Buchholzら, Virology, 204, 770-776 (1994)およびEP-B1-356695）。これを行なうためには、ウイルス遺伝子（例えば、HIV-1のgag-polおよびenv遺伝子）を、発現ベクター（例えば、プラスミドまたは別の組換えMVAウイルス）中のT7プロモーターの転写制御下に置く。ついでこのコンストラクトを、T7 RNAポリメラーゼを発現する組換えMVAウイルスに感染した細胞中に導入する。この組換えウイルス遺伝子は、高い効率で転写され、大量の組換えタンパク質が得られ、それを精製することができる。さらに、発現された組換えウイルスタンパク質（例えば、HIV-1 env, gag）が集合して、該細胞から出芽するウイルス偽粒子になることがあり、組織培養液からそれを単離することができる。もう１つの実施態様では、MVA-T7pol系により発現されるウイルスタンパク質（例えば、HIV、SIV、麻疹ウイルスからのもの）が、付着および感染、アンコーティング、核酸の複製、ウイルス遺伝子発現、集合、出芽またはウイルス増殖の他の過程の欠損を克服することにより、追加的に導入された突然変異ウイルス（例えば、HIV、SIV、麻疹ウイルスからのもの）をレスキューして、前記突然変異ウイルスの産生および精製を可能とするかもしれない。
【００３９】
MVA-T7polは、免疫化のため関心のある抗原（例えば、HIVの遺伝子、nef、tat、gag、polまたはenvまたはその他）の遺伝子を保持するＤＮＡ配列と共に使用することができる。まず第１に、標準的な実験プロトコールを用いて、与えられた抗原（例えば、HIV、HCV、HPV、HSV、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルスまたはその他）のコード配列を、T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下、好ましくはプラスミドベクター中にクローニングし、得られたＤＮＡコンストラクトを増幅し精製する。第２に、ベクターＤＮＡを、MVA-T7polと共に、同時にあるいは適当な時間間隔をあけて接種する。関心のある組換え遺伝子を、接種部位で、ベクターＤＮＡおよびMVA-T7polを共に含有する細胞中で一過性発現させ、対応する抗原を宿主免疫系に提示させ、抗原特異的免疫応答を刺激する。非複製性ワクシニアウイルスMVA-T7polを使用するこのプロトコールは、与えられた抗原を一過性発現させるが構造的遺伝子発現の潜在的危険性を回避する核酸予防接種の有望な新規アプローチを代表するものである。
【００４０】
組換えMVAワクシニアウイルスは、以下のとおり製造することができる。
【００４１】
MVAゲノム内の天然に存在する欠失（例えば、欠失II）の隣のMVA ＤＮＡ配列に隣接した外来ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有するＤＮＡコンストラクトを、MVAに感染した細胞中に導入して、相同的組換えさせる。
【００４２】
該ＤＮＡコンストラクトを真核細胞中に導入し、外来ＤＮＡをウイルスＤＮＡと再結合させたら、自体公知の方法で、好ましくはマーカーの助けにより、所望の組換えワクシニアウイルスを単離することが可能である（Nakanoら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 1593-1596 [1982], Frankeら, Mol. Cell. Biol. 1918-1924 [1985], Chakrabartiら, Mol. Cell. Biol. 3403-3409 [1985], Fathiら, Virology 97-105 [1986]と比較されたし）。
【００４３】
挿入すべきＤＮＡコンストラクトは、線状であっても環状であってもよい。環状ＤＮＡ、特にプラスミドが好ましい。該ＤＮＡコンストラクトは、MVAゲノム内の天然に存在する欠失（欠失II）の左右に隣接した配列(フランク)を含有する（Altenburger, W., Suter, C.P.およびAltenburger J. (1989) Arch. Virol. 105, 15-27）。その天然に存在する欠失に隣接した配列の間に、外来ＤＮＡ配列を挿入する。外来ＤＮＡ配列は、治療用ポリペプチド（例えば、t-PAまたはインターフェロン）または病原体からの抗原決定基をコードする遺伝子であってもよい。病原体は、疾患を引き起こしうるウイルス、細菌、寄生生物、および器官中で無制限に増殖し病理的増殖につながりうる腫瘍細胞であってもよい。そのような病原体の具体例は、Davis, B.D.ら（Microbiology, 第３版, Harper International Edition）に記載されている。病原体の好ましい抗原は、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、HIV-1およびHIV-2）、結核を引き起こすマイコバクテリア、寄生生物である熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、および黒色腫のものである。
【００４４】
ＤＮＡ配列または遺伝子の発現のためには、該遺伝子の転写に必要な調節配列が該ＤＮＡ上に存在することが必要である。そのような調節配列（プロモーターと称される）は当業者に公知であり、それには、例えば、EP-A-198,328に記載されているワクシニア11kDa遺伝子、7.5kDa遺伝子（EP-A-110,385）のものが含まれる。
【００４５】
該ＤＮＡコンストラクトは、例えば、リン酸カルシウム沈殿法（Grahamら, Virol. 52, 456-467 [1973]; Wiglerら, Cell 777-785 [1979]）、エレクトロポレーション（Neumannら, EMBO J. 1, 841-845 [1982]）、マイクロインジェクション（Graessmannら, Meth. Enzymology 101, 482-492 (1983)）、リポソーム（Straubingerら, Methods in Enzymology 101, 512-527 (1983)）、スフェロプラスト（Schaffner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 2163-2167 (1980)）または当業者に公知の他の方法によりトランスフェクションすることにより、MVA感染細胞中に導入することができる。リン酸カルシウム沈殿法によるトランスフェクションが好ましい。
【００４６】
以下の詳細な実施例は、本発明のよりよい理解に寄与するものであるが、本発明が実施例の内容に限定されるとの印象を与えるものではない。
【００４７】
実施例
１．ウイルスの増殖および精製
1.1  MVAウイルスの増殖
MVAウイルスは、初代ニワトリ胚繊維芽細胞（CEF）培養上で長期にわたり連続継代することにより高度に弱毒化された、ワクシニアウイルス株アンカラ（CVA）由来のワクシニウイルスである。MVA株の産生の歴史、特性および使用の一般的な概説は、MayrらによりInfection 3, 6-14 [1975]において公開されている抄録を参照することができる。CEF中での弱毒化により、MVAウイルスは、このニワトリ宿主細胞中では高力価になるまで増殖する。しかしながら、哺乳動物細胞では、MVAは厳しく増殖が制限され、該ウイルスによる典型的なプラーク形成は検出不可能である。したがって、CEF細胞上でMVAウイルスを増殖させた。CEF細胞を調製するために、インキュベートされた鶏卵から11日齢の胚を単離し、肢を取り、胚を細かく刻み、0.25％トリプシンよりなる溶液中に37℃で20分間解離させた。得られた細胞懸濁液を濾過し、Sorvall RC-3B遠心機中2000rpm、室温で５分間遠心することにより細胞を沈降させ、10容量の培地Ａ（MEM Eagle、例えば、Life Technologies GmbH, Eggenstein, Germanyから入手可能なもの）に再懸濁し、Sorvall RC-3B遠心機中2000rpm、室温で５分間遠心することにより再沈降させた。10％ウシ胎児血清（FCS）、ペニシリン（100単位/ml）、ストレプトマイシン（100mg/ml）および２mMグルタミンを含有する培地Ａ中で該細胞ペレットを再構成して、500000細胞/mlを含有する細胞懸濁液を得た。このようにして得たCEF細胞を細胞培養皿上に広げた。それを、37℃のCO2インキュベーター中の培地Ａ中で、所望の細胞密度に応じて１〜２日間成長させ、それを直接またはさらに１細胞継代した後、感染に使用した。初代培養の調製の詳細な説明は、R.I. Freshneyの著書（”Culture of animal cell”, Alan R. Liss Verlag, New York [1983] 第11章, 99頁以下参照）に記載されている。
【００４８】
以下のとおり、MVAウイルスを感染に使用した。CEF細胞を175cm2細胞培養ボトル中で培養した。密集度90〜100％で、該培地を除去し、培地Ａ中、MVAウイルス懸濁液（0.01感染単位(IU)/細胞、0.02ml/cm2）と共に該細胞を１時間インキュベートした。ついで、さらに培地Ａを加え（0.2ml/cm2）、該ボトルを37℃で２〜３日間インキュベートした（約90％の細胞が細胞変性効果を示すまで）。細胞単層を該培地中にかき取り、Sorvall RC-3B遠心機中3000rpm、４℃で５分間遠心して該細胞物質をペレット化することにより、粗製ウイルスストックを調製した。該粗製ウイルス調製物を、さらに加工（例えば、ウイルスの精製）するまで−20℃で保存した。
【００４９】
1.2  ウイルスの精製
宿主細胞特異的成分を含まない可能な限り純粋なウイルス調製物を得るために行なった精製工程は、Joklik（Virology 18, 9-18 [1962]）により記載されているものと同様であった。−20℃で保存されている粗製ウイルスストックを融解し、PBS（該沈降物の容量の10〜20倍）に１回懸濁し、該懸濁液を前記のとおり遠心した。新たな沈降物を10倍容量のトリス緩衝液１（10mMトリス−HCl、pH9.0）に懸濁し、該懸濁液を超音波（Labsonic L, B. Braun Biotech International, Melsungen Germany；60ワットおよび室温で2×10秒）で短時間処理して、さらに細胞デブリスを分解し、該細胞物質からウイルス粒子を放出させた。該細胞核およびより大きな細胞デブリスを、後続の該懸濁液の短時間遠心分離（DuPont Co.から入手可能なSorvall GSAローターD-6353 Bad Nauheim, FRG；3000rpmおよび10℃で３分）で除去した。前記のとおり、該沈降物をトリス緩衝液１に再懸濁し、超音波処理し、遠心した。遊離ウイルス粒子を含有する集めた上清を合わせ、10mMトリス−HCl（pH9.0）中の36％ショ糖10mlのクッション上に重層し、Beckman SW27/SW28ローター中、13,500rpm、４℃で80分間遠心した。該上清を捨て、ウイルス粒子を含有する沈降物を１mMトリス−HCl（pH9.0）10ml中に取り、短時間の超音波処理（室温で２×10秒、装置は前記のとおり）によりホモジナイズし、さらに精製するために20〜40％ショ糖勾配（１mMトリス−HCl(pH9.0)中のショ糖）に適用した。該勾配をBeckman SW41ローター中、13,000rpm、４℃で50分間遠心した。遠心後、ウイルス粒子を含有する分離したバンドの収穫を、バンドを超える容量を吸引した後にピペッティングすることにより行なった。得られたショ糖溶液を３容量のPBSで希釈し、遠心（Beckman SW27/28、13,500rpm、４℃で60分）により該ウイルス粒子を再沈降させた。該ペレットは、この段階で大部分が純粋なウイルス粒子からなり、それをPBSに再懸濁し、平均１〜５×109IU/mlに対応するウイルス濃度にまで平衡化させた。精製されたウイルスストック溶液を−80℃で保存し、直接使用するか、あるいは後続の実験のためにPBSで希釈した。
【００５０】
1.3  MVAウイルスのクローニング
均一なストックウイルス調製物を得るために、Anton Mayr博士から得たMVAウイルスを、96ウェル組織培養プレート上で培養されたCEF中で３連続継代する間に限界希釈によりクローニングした。MVAクローンF6を選択し、CEF中で増幅して、本特許出願に記載されている組換えMVAウイルスを得るため、および既に記載されている（Sutter, G.およびMoss, B. [1992] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851; Sutter, G., Wyatt, L.. Foley, P., Bennink, J.およびMoss, B. [1994] Vaccine 12, 1032-1040; Hirsch, V., Fuerst, T., Sutter, G., Carroll, M., Yang, L., Goldstein, S., Piatak, M., Elkins, W., Alvord, G., Montefiori, D., Moss, B.およびLifson, J. [1996] J. Virol. 70, 3741-3752）組換えMVAウイルスを得るための出発物質として使用するウイルスの実施ストックを得た。
【００５１】
２．組換えMVAウイルスの構築および特徴づけ
2.1  ベクタープラスミドの構築
組換えMVAウイルスを産生させるために、新規ベクタープラスミドを構築した。MVAゲノム中への外来遺伝子の挿入は、MVAゲノム内の天然に存在する欠失II部位へ正確に標的化した。MVAゲノムのHindIIIＮ断片中の2500bpの欠失部位に隣接するMVA ＤＮＡの配列（Altenbuger, W., Suter, C.P.およびAltenburger, J. [1989], J. Arch. Virol. 105, 15-27）をPCRにより増幅し、プラスミドpUC18のマルチプルクローニング部位中にクローニングした。左側の600bpのＤＮＡフランクのプライマーは、5’-CAG CAG GGT ACC CTC ATC GTA CAG GAC GTT CTC-3’および5’-CAG CAG CCC GGG TAT TCG ATG ATT ATT TTT AAC AAA ATA ACA-3’（制限酵素KpnIおよびSmaIの部位に下線を付している）であった。右側の550bpのＤＮＡフランクのプライマーは、5’-CAG CAG CTG CAG GAA TCA TCC ATT CCA CTG AAT AGC-3’および5’-CAG CAG GCA TGC CGA CGA ACA AGG AAC TGT AGC AGA-3’（制限酵素PstIおよびSphIの部位に下線を付している）であった。pUC18中に挿入されたMVA ＤＮＡのこれらのフランクの間に、ワクシニアウイルス後期プロモーターP11の制御下の大腸菌（Echerichia coli）lacZ遺伝子（pIII LZから制限消化により調製された(Sutter, G.およびMoss, B. [1992] PNAS USA 89, 10847-10851)）を、BamHI部位を使用することにより挿入して、MVA挿入ベクターpUCII LZ（図１）を得た。ついで、クローニング用のSmaI部位と共にワクシニアウイルス初期−後期プロモーターP7.5を含有する289bp断片（プラスミドベクターpSC11[Chakrabartiら, 1985, Molecular and Cellular Biology 5, 3403-3409]からEcoRIおよびXbaIで制限消化することにより調製した）を、pUCII LZのSmaI部位中に挿入して、MVAベクターpUCII LZ P7.5を得た（図２）。レポーター酵素β−ガラクトシダーゼの一過性合成を介して組換えMVAウイルスの単離を可能とするベクタープラスミドを構築するために、大腸菌（E. coli） LacZオープンリーディングフレームの３’末端からの330bpのＤＮＡ断片を、PCR（プライマーは5’-CAG CAG GTC GAC CCC GAC CGC CTT ACT GCC GCC-3’および5’-GGG GGG CTG CAG ATG GTA GCG ACC GGC GCT CAG-3’であった）により増幅し、pUCII LZ P7.5のSalIおよびPstI部位中にクローニングして、MVAベクターpUCII LZdel P7.5を得た（図３）。SmaI部位を用いて、このベクタープラスミドを使用して、ワクシニアウイルスプロモーターP7.5の転写制御下で外来遺伝子をコードするＤＮＡ配列をMVAゲノム中に挿入することができる。β−ガラクトシダーゼ活性の発現に関してスクリーニングすることにより所望の組換えウイルスを単離した後、該組換えウイルスをさらに増殖させて、相同的組換えにより、再操作されたP11-LacZ発現カセットの自己欠失が得られる。
【００５２】
2.2  組換えウイルスMVA T7polの構築および特徴づけ
ワクシニアウイルス前期／後期プロモーターP7.5の制御下でバクテリオファージT7 RNAポリメラーゼの完全な遺伝子を含有する3.1kbpのＤＮＡ断片を、プラスミドpTF7-3（Fuerst, T.R., Niles, E.G., Studier, F.W.およびMoss, B., 1986, P.N.A.S. USA 83, 8122-8126）からEcoRIで切り出し、クレノウＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートすることにより修飾して平滑末端を作り、pUCII LZの唯一のSmaI制限部位中にクローニングして、プラスミド導入ベクターpUCII LZ T7polを作製した（図４）。T7 RNAポリメラーゼ遺伝子の発現用の転写調節体として、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターP7.5を選択した。より強力なワクシニアウイルス後期プロモーター（例えば、P11）と異なり、このプロモーター系は、標的細胞に感染した直後に組換え遺伝子を発現させる。MVAゲノムの欠失II部位中への外来遺伝子の挿入を指令するプラスミドpUC II LZ T7polを使用して、組換えウイルスMVAT7polを得た。
【００５３】
0.05 TCID50/細胞の多重度でMVAに感染したCEF細胞を、既に記載されているとおりに（Sutter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J.およびMoss, B. (1994) Vaccine 12, 1032-1040）、プラスミドpUC II LZ T7polのＤＮＡでトランスフェクションした。T7 RNAポリメラーゼを発現し、β−D−ガラクトシダーゼ（MVA P7.5-T7pol）と共に共発現する組換えMVAウイルスを、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル β−D−ガラクトシド（300μg/ml）で染色されたCEF細胞における５回の連続したプラーク精製により選択した。ついで、組換えウイルスをCEF単層への感染により増幅し、該ＤＮＡをPCRにより分析して、該ウイルスストックの遺伝的等質性を確認した。MVA-T7polウイルスＤＮＡのサザンブロット分析は、MVAゲノム内の欠失II部位での該組換え遺伝子の安定な組込みを示した（図５）。
【００５４】
組換えMVA T7polによるT7 RNAポリメラーゼの発現をモニターするために、ウイルスに感染した組織培養からの[35S]メチオニン標識ポリペプチドを分析した。12ウェルプレート中で成長させたサル腎細胞系CV-1の単層に、20 TCID50/細胞の多重度でウイルスを感染させた。感染の３〜５時間後、該培地を除去し、メチオニンを含まない培地（無メチオニン培地）１mlで培養液を１回洗浄した。各ウェルへ、[35S]メチオニンの50μCiで補足された無メチオニン培地0.2mlを加え、37℃で30分間インキュベートした。各ウェルを0.5％Nonidet P-40溶解緩衝液0.2ml中37℃で10分間インキュベートすることにより、感染細胞の細胞質抽出物を調製し、SDS-PAGEによりサンプルを分析した。MVA T7polによるCV-1細胞の代謝標識から、以下の２つの追加的ポリペプチドの合成が示された：（i）組換えウイルスのスクリーニングを可能とする共発現された大腸菌（E. coli）β−ガラクトシダーゼを表す約116,000Daの一部、および（ii）バクテリオファージT7 RNAポリメラーゼの予想サイズを有する98,000Daのタンパク質（図６）。MVA T7polにより産生された大量のβ−ガラクトシダーゼは、注目に値する。インビボ標識実験の結果、MVAゲノム中の欠失II部位に挿入された場合に、P11-LacZ遺伝子コンストラクトの非常に強力な発現が示されたが、このことは、MVAベクターウイルス中の組換え遺伝子が、MVAゲノムのこの遺伝子座内に挿入された場合に、より効率的に発現されうることを示すものである。
【００５５】
WR-T7pol組換えウイルスvTF7-3（Fuerstら, 1986）と比べたMVA-T7pol組換えウイルスの発現系としての有用性は、pTM1（Moss, B., Elroy-Stein, O., Mizukami, T., Alexander, W.A.およびFuerst T.R. (1990) Nature 348, 91-92）に由来しT7 RNAポリメラーゼプロモーター（PT7）の制御下で大腸菌（E. coli）クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）遺伝子を含有する（pTM1マルチプルクローニング部位のNcoIおよびBamHI部位中にクローニングされた）プラスミドベクターのＤＮＡのコトランスフェクションにより試験した。トランスフェクションされ感染したCV-1細胞を、0.25mlの0.25Mトリス−HCl（pH7.5）に懸濁した。３サイクルの凍結−融解の後、該ライゼートを遠心分離により清澄化し、該上清のタンパク質含量を測定し、0.5、0.25、0.1μgの合計タンパク質を含有するサンプルを、Mackett, M., Smith, G.L.およびMoss, B. (1984) J. Virol. 49, 857-864に記載されているとおりに、酵素活性に関してアッセイした。オートラジオグラフィーの後、標識されたスポットをフジイメージング分析系を用いて定量した。
【００５６】
その結果から、高度に弱毒化されたワクシニアベクターMVAを使用することにより、完全に複製可能なワクシニアウイルス組換え体を使用した場合と同程度に効率的なワクシニアウイルス−T7 RNAポリメラーゼ系の開発が可能であることが示される（図７）。
【００５７】
2.3  組換えウイルスMVA-LAInefの構築および特徴づけ
HIV-1 LAIの完全なnef遺伝子を含有する648bpのＤＮＡ断片を、プラスミドＤＮＡ（M.-P. Kieny, Transgene S.A., Strasbourgから贈呈されたpTG1166；PCRプライマーは、5’-CAG CAG GGA TCC ATG GGT GGC AAG TGG TCA AAA AGT AGT-3’および5’-CAG CAG GGA TCC ATG TCA GCA GTT CTT GAA GTA CTC CGG-3’であった）からPCRにより調製し、制限エンドヌクレアーゼBamHIで消化し、クレノウＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートすることにより修飾して平滑末端を作り、pUCII LZdel P7.5のSmaI部位中にクローニングして、ベクターpUCII LZdel P7.5-LAInefを作製した（図８）。このプラスミドを使用して、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターP7.5の制御下でHIV-1 LAIのnef遺伝子を発現するMVA組換えウイルスを操作することができた。
【００５８】
0.05 TCID50/細胞の多重度でMVAに感染したCEF細胞を、既に記載されているとおりに（Sutter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J.およびMoss, B. [1994] Vaccine 12, 1032-1040）、プラスミドpUC II LZdel P7.5-LAInefのＤＮＡでトランスフェクションした。nef遺伝子を含有し、大腸菌（E. coli）LacZマーカー遺伝子を一過性に共発現する組換えMVAウイルスを、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル β−D−ガラクトシド（300μg/ml）で染色されたCEF細胞における連続したプラーク精製により選択した。ついで、nef遺伝子を含有しLacZマーカー遺伝子が欠失している組換えMVAウイルスを、CEF細胞において5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル β−D−ガラクトシド（300μg/ml）の存在下で未染色なウイルスフォーカスに関してさらに３回の連続したプラーク精製スクリーニングを行なうことにより単離した。ついで、組換えウイルスをCEF単層への感染により増幅し、該MVA-LAInefウイルスＤＮＡをPCRにより分析して、該ウイルスストックの遺伝的等質性を確認した。ウイルスＤＮＡのサザンブロット分析から、MVA-LAInefの遺伝的安定性が確認され、該ウイルスゲノム内の欠失II部位でのnef遺伝子の組込みおよび大腸菌（E. coli）LacZマーカー遺伝子の欠失が明確に示された。
【００５９】
組換えNefタンパク質の効率的発現が、HIV-1 Nefに対するマウスモノクローナル抗体（K. Krohnから贈呈され、Ovod, V., Lagerstedt, A., Ranki, A., Gombert, F., Spohn, R., Tahtinen, M., Jung, G.およびKrohn, K. [1992] AIDS 6, 25-34に記載されているとおりに使用された）を用いて、MVA-LAInefに感染したCEF細胞からのタンパク質ライゼートのウエスタンブロット分析により確認された。
【００６０】
2.4  組換えウイルスMVA-hTYRの構築および特徴づけ
ヒトチロシナーゼをコードする完全な遺伝子を含有する1.9kbのＤＮＡ断片［患者SK29(AV)の黒色腫細胞系SK29-MELから単離されたチロシナーゼc-DNAクローン123.B2, GenBank Acc. no. UO1873; Brichard, V., Van Pel, A., Wolfel, T., Wolfel, C., De Plaen, E., Lethe, B., Coulie, P.およびBoon, B. (1993), J. Exp. Med. 178, 489-495］を、プラスミドpcDNAI/Amp-Tyr［Wolfel, T., Van Pel, A., Brichard, V., Schneider, J., Seliger, B., Meyer zum Buschenfelde, K.およびBoon, T. (1994) Eur. J. Immunol 24, 759-764］からEcoRI消化により調製し、クレノウＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートすることにより修飾して平滑末端を作り、pUCII LZdel P7.5のSmaI部位中にクローニングして、ベクターpUCII LZdel P7.5-TYRを作製した（図９）。このプラスミドを使用して、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターP7.5の制御下でヒトチロシナーゼ遺伝子を発現するMVA組換えウイルスを操作することができた。
【００６１】
0.05 TCID50/細胞の多重度でMVAに感染したCEF細胞を、既に記載されているとおりに（Sutter, G., Wyatt, L., Foley, P., Bennink, J.およびMoss, B. (1994) Vaccine 12, 1032-1040）、プラスミドpUC II LZdel P7.5-TYRのＤＮＡでトランスフェクションした。ヒトチロシナーゼの遺伝子を安定に発現し大腸菌（E. coli）LacZマーカー遺伝子を一過性に共発現する組換えMVAウイルスを、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル β−D−ガラクトシド（300μg/ml）で染色されたCEF細胞における連続したプラーク精製により選択した。ついで、ヒトチロシナーゼをコードする遺伝子を発現しLacZマーカー遺伝子が欠失している組換えMVAウイルスを、CEF細胞において5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル β−D−ガラクトシド（300μg/ml）の存在下で未染色なウイルスフォーカスに関してさらに３回の連続したプラーク精製スクリーニングを行なうことにより単離した。ついで、組換えウイルスをCEF単層への感染により増幅し、該MVA-hTYRウイルスＤＮＡをPCRにより分析して、該ウイルスストックの遺伝的等質性を確認した。ウイルスＤＮＡのサザンブロット分析から、MVA-hTYRの遺伝的安定性が確認され、該ウイルスゲノム内の欠失II部位での組換えチロシナーゼ遺伝子の組込みおよび大腸菌（E. coli）LacZマーカー遺伝子の欠失が明確に示された。
【００６２】
組換えヒトチロシナーゼの効率的な発現が、チロシナーゼに対するウサギポリクローナル抗体（V. Hearingにより贈呈され、Jimenez, M., Kameyama, K., Maloy, L., Tomita, Y.およびHearing, V. [1988] P.N.A.S. USA 85, 3830-3834に記載のとおりに使用された）またはマウスモノクローナル抗体（L. Oldにより贈呈され、Chen, Y., Stockert, E., Tsang, S., Coplan, K.およびOld, L. [1995] P.N.A.S. USA 92, 8125-8129に記載されているとおりに使用された）を用いて、MVA-hTYRに感染したCEF細胞からのタンパク質ライゼートのウエスタンブロット分析により確認された。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】図１：MVAのゲノム、および相同的組換えによる外来ＤＮＡの挿入のためのプラスミドの地図を示す。MVAのゲノム内のHindIII制限部位を上部に示す。MVAゲノム内の欠失IIの結合と重複する900bpのHindIII-HindIIIのＮ末端を示す。欠失IIに隣接するMVA ＤＮＡ配列（フランク１およびフランク２）を、PCRにより増幅し、挿入プラスミドpUC II LZの構築に使用した。
【図２】図２：pUC II LZ P7.5：欠失II中へ挿入するためMVAベクタープラスミドであり、これは、P11-LacZ発現カセットと、該プラスミドのSmaI部位中へクローニングすることができる関心のある遺伝子を発現させるためのワクシニアウイルス初期／後期プロモーターP7.5とを含有する。
【図３】図３：pUCII LZdel P.7.5：MVAゲノム内の欠失II部位に外来遺伝子を挿入するためのMVAベクタープラスミドであり、これは、自己欠失性P11-LacZ発現カセットと、該プラスミドのSma1/Not1クローニング部位中にクローニングすることができる関心のある遺伝子を発現させるためのワクシニアウイルス初期／後期プロモーターP7.5とを含有する。
【図４】図４：組換えウイルスMVA-T7polの構造：MVAゲノム（HindIII制限エンドヌクレアーゼ部位）、およびMVAゲノムのHindIIIＮ断片内の欠失II部位へのT7 RNAポリメラーゼ遺伝子の挿入を可能とするベクタープラスミドpUC II LZ T7polの地図を示す。
【図５】図５：MVA-T7polウイルスＤＮＡのサザンブロット分析。
【図６】図６：［35S］メチオニンを用いるタンパク質の代謝標識。SDS PAGE分析。レーン１：MVA-T7pol、レーン２：MVA、レーン３：CV-1細胞。
【図７】図７：CATアッセイ：T7 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下でCAT遺伝子を含有するプラスミドでトランスフェクションされ、MVA-T/polまたはWR-T7polに感染したCV-1細胞。ライゼートをCAT活性に関して試験した。Ｃはクロラムフェニコールを意味し、1-AcCおよび3-AcCはクロラムフェニコールのモノおよびトリアセチル化体を意味する。Cat活性は、60分で生じたアセチル化産物の割合（％）として表されている。
【図８】図８：MVA-LAInefの構造：MVAゲノム（HindIII制限エンドヌクレアーゼ部位）、およびMVAゲノムのHindIIIＮ断片内の欠失II部位でのHIV-1 LAIのnef遺伝子の挿入を可能とするベクタープラスミドpUC II LZdel P7.5-LAInefの地図を示す。
【図９】図９：MVA-hTYRの構造：MVAゲノム（HindIII制限エンドヌクレアーゼ部位）、およびMVAゲノムのHindIIIＮ断片内の欠失II部位でのヒトチロシナーゼ遺伝子の挿入を可能とするベクタープラスミドpUC II LZdel P7.5-TYRの地図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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