(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラセミ体の２−メチル酪酸に、（Ｓ）−２−メチル酪酸資化能を有するシュードモナス（Pseudomonas）属FERM  P−20018菌株を作用させることを特徴とする（Ｒ）−２−メチル酪酸の製造方法。
【請求項２】
ラセミ体の２−メチルペンタン酸に、（Ｓ）−２−メチルペンタン酸資化能を有するシュードモナス（Pseudomonas）属FERM  P−20018菌株を作用させることを特徴とする（Ｒ）−２−メチルペンタン酸の製造方法。
【請求項３】
（Ｓ）−２−メチル酪酸および（Ｓ）−２−メチルペンタン酸資化能を有するシュードモナス（Pseudomonas）属FERM  P−20018菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、香料素材などとして有用な（Ｒ）−２−メチル酪酸および（Ｒ）−２−メチルペンタン酸を、微生物を用いて製造する方法及びそれに用いる微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
２−メチル酪酸は食品の発酵風味やフルーツ様の特徴を付与する香料素材として非常に有用な化合物である。また、２−メチル酪酸はイチゴ、リンゴなどのフルーツ類や納豆などの様々な天然物中に見いだされていることが報告されている。これらの天然物中から見いだされているものの大部分は（Ｓ）−体であることが知られており、（Ｒ）−体に関しては唯一カカオ中から見いだされているのみである。このように天然物ではそのほとんどが鏡像体過剰で存在している可能性が高いことから、フレーバーの製造に関しても光学活性体を用いることが天然感を増強するという観点から重要であると考えられている。２−メチル酪酸の光学活性体の香気特性については、（Ｒ）−体は鋭いチーズ様で汗様のノートがあり、一方、（Ｓ）−体の香気特性は、快く甘い上品なフルーツノートを有することが開示されており（非特許文献１参照）、それぞれ特徴的な香気特性を有することが知られている。現在、（Ｓ）−２−メチル酪酸については入手が容易であるものの、（Ｒ）−２−メチル酪酸については市販されておらず、入手が困難である。
一方、２−メチルペンタン酸（２−メチル吉草酸）も刺激的な酸臭を有し、ココア、チョコレートなどのフレーバーとして使用されている。２−メチルペンタン酸は、コーヒー、ワイン、ラム肉、チーズ等の天然物から見いだされている。非特許文献1には、２−メチルペンタン酸の光学活性体の香気特性について、（Ｒ）−体は快く甘いフルーツノートがあり、一方、（Ｓ）−体の香気特性は、甘く、苦い、重い香気を有することが開示されており、それぞれ特徴的な香気特性を有することが知られている。現在、２−メチルペンタン酸の光学活性体については市販されておらず、入手が困難である。
【０００３】
（Ｒ）−２−メチル酪酸および（Ｒ）−２−メチルペンタン酸の製法に関しては、これまで種々の方法が提案されており、例えば、リパーゼを用いた不斉エステル化反応により２−メチル酪酸では、79.5％eeの（Ｒ）−体を生成し、２−メチルペンタン酸では、76.2％eeの（Ｒ）−体を生成することが開示されている（非特許文献２参照）。また例えば、チグリン酸を原料としてBINAP触媒による不斉水素化反応により高光学純度を有する（Ｒ）−２−メチル酪酸の合成が報告されている（非特許文献３、特許文献１参照）。さらに例えば、（Ｒ）−２−メチルコハク酸−４−tert−ブチルエステルを原料として６工程を経て高光学純度の（Ｒ）−２−メチル酪酸を合成する方法が報告されている（非特許文献４参照）。
【０００４】
【非特許文献１】Tetrahedron：Asymmetry Vol．2，No．10，965−968（1991）
【非特許文献２】Tetrahedron：Asymmetry Vol．2，No．3，165−168（1991）
【非特許文献３】J．Org．Chem．，Vol．52，No．14，3174−3176（1987）
【特許文献１】特開昭６３−２３９２４５号公報
【非特許文献４】Flavour and Fragrance J．，18，305−308（2003）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記した従来提案されている（Ｒ）−２−メチル酪酸および（Ｒ）−２−メチルペンタン酸の製造方法は、必ずしも満足できる光学純度でなかったり、高圧下での反応が必須であったり、反応工程が長く厳密な反応条件をコントロールする必要があったり、また、コストが高くなるなどの不都合な問題があった。
【０００６】
従って、本発明の目的は、簡便、かつ安価な方法で、高収率、高光学純度で製造することができる（Ｒ）−２−メチル酪酸および（Ｒ）−２−メチルペンタン酸の製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記のごとき課題を解決すべく、鋭意研究を行った結果、今回、土壌中からスクリーニングして得られたシュードモナス属に属する微生物を、ラセミ体の２−メチル酪酸を添加した培地中、あるいはラセミ体の２−メチルペンタン酸を添加した培地中に接種・培養することにより、（Ｓ）−体が優先的に資化消費されることを発見し、その後、培地中に残存する（Ｒ）−２−メチル酪酸、あるいは（Ｒ）−２−メチルペンタン酸を単離、精製することにより高光学純度を有する（Ｒ）−２−メチル酪酸および（Ｒ）−２−メチルペンタン酸を得ることができることを見いだし本発明を完成するに至った。
【０００８】
かくして、本発明によれば、ラセミ体の２−メチル酪酸に（Ｓ）−２−メチル酪酸資化能を有する微生物、特にシュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物を作用させることを特徴とする（Ｒ）−２−メチル酪酸の製造方法、ラセミ体の２−メチルペンタン酸に（Ｓ）−２−メチルペンタン酸資化能を有する微生物、特にシュードモナス（Pseudomonas）属に属する微生物を作用させることを特徴とする（Ｒ）−２−メチルペンタン酸の製造方法を提供することができる。
【０００９】
また、本発明は、（Ｓ）−２−メチル酪酸および（Ｓ）−２−メチルペンタン酸資化能を有するシュードモナス（Pseudomonas）属FERM  P−20018菌株を提供することができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、香料化合物として有用な（Ｒ）−２−メチル酪酸および（Ｒ）−２−メチルペンタン酸を、簡便、かつ安価な方法で、高収率、高光学純度で製造することができる。また、本発明の（Ｒ）−２−メチル酪酸の製造方法、および（Ｒ）−２−メチルペンタン酸の製造方法は、微生物を用いるものであり、環境に対する負荷の少ない安全な製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の（Ｒ）−２−メチル酪酸の製造方法は、ラセミ体の２−メチル酪酸に、（Ｓ）−２−メチル酪酸資化能を有する微生物を作用させることを特徴とする。
また、本発明の（Ｒ）−２−メチルペンタン酸の製造方法は、ラセミ体の２−メチルペンタン酸に、（Ｓ）−２−メチルペンタン酸資化能を有する微生物を作用させることを特徴とする。
本発明に用いられるラセミ体の２−メチル酪酸は、例えば、ｓ−ブチルマグネシウム塩化物に二酸化炭素を作用させた後加水分解することにより合成することもできるし、市販品を用いることもできる。
また、本発明に用いられるラセミ体の−２−メチルペンタン酸は、例えば、２−メチル−２−ペンテン酸を水素化することにより合成することもできるし、市販品を用いることもできる。
【００１２】
本発明において用いる微生物は、（Ｓ）−２−メチル酪酸資化能、（Ｓ）−２−メチルペンタン酸資化能を有する微生物であれば特に制限されないが、シュードモナス属に属する微生物が好ましい。これらの微生物の中でも、優れた（Ｓ）−２−メチル酪酸資化能および（Ｓ）−２−メチルペンタン酸資化能を有する特に好ましく用いられる微生物としては、本発明者によって初めて見いだされたシュードモナス属に属する菌株を挙げることができる。本菌株を微生物学的に同定した結果を以下に示す。
【００１３】
（１）コロニーの形態
普通寒天培地に本菌株を接種し、培養温度30℃で２日間培養し、形成されるコロニーを観察した。
直径：0.5〜1.0ｍｍ、色調：淡黄色、形：円形、隆起状態：扁平状、周縁：鋸歯状、表面の形状：スムーズ、透明度：半透明、粘稠度：粘稠性。
【００１４】
（２）科学的性質及び分類学上の位置
（科学的性質）
桿菌（0.5〜0.6×1.5〜2.0）、グラム染色：陰性、コロニー色調：淡黄色、運動性：＋、酸素要求：好気性、カタラーゼ：＋、オキシダーゼ：＋、グルコースからの酸生成：＋、OFテスト：酸化的。16S rDNA塩基配列相同率98.66％でPseudomonas alcaligenesに対し、最も高い相同性を示した。
（分類学上の位置）
Pseudomonas sp．
以上のように、本菌株はPseudomonas属に属する微生物であることが判明した。この微生物は、シュードモナス属菌株TH−252−１株（以下、「Pseudomonas sp．TH−252−１株」とする）と命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、受託番号FERM  P−20018として寄託されている。
【００１５】
本発明の（Ｒ）−２−メチル酪酸の製造方法は、上記した微生物を、ラセミ体の２−メチル酪酸が添加された培地中に接種・培養し、（Ｓ）−２−メチル酪酸を資化消費させ、残存する（Ｒ）−２−メチル酪酸を回収することにより実施される。
また、本発明の（Ｒ）−２−メチルペンタン酸の製造方法は、上記した微生物を、ラセミ体の２−メチルペンタン酸が添加された培地中に接種・培養し、（Ｓ）−２−メチルペンタン酸を資化消費させ、残存する（Ｒ）−２−メチルペンタン酸を回収することにより実施される。以下、培地組成、培養条件について詳細に説明する。
【００１６】
前記の如き微生物を使用してラセミ体の２−メチル酪酸から（Ｒ）−２−メチル酪酸、およびラセミ体の２−メチルペンタン酸から（Ｒ）−２−メチルペンタン酸を製造する方法としては、例えば、炭素源、窒素源、無機塩類などを含む培地にラセミ体の２−メチル酪酸、ラセミ体の２−メチルペンタン酸を添加して該微生物を培養する方法；炭素源、窒素源、無機塩類などを含む培地に該微生物を１日〜３日程度前培養した後、ラセミ体の２−メチル酪酸、ラセミ体の２−メチルペンタン酸を添加してさらに培養する方法；該微生物を炭素源、窒素源、無機塩類などを含む培地で培養した後、遠心分離等の手段により菌体を集め、該菌体を緩衝液等に分散させ、ラセミ体の２−メチル酪酸、ラセミ体の２−メチルペンタン酸を添加して反応させる方法；該微生物をそれ自体既知の方法で固定化し、ラセミ体の２−メチル酪酸、ラセミ体の２−メチルペンタン酸を添加して反応させる方法等を挙げることができる。
【００１７】
培地に配合しうる炭素源としては、例えば、グルコース、フルクトースなどの糖類；クエン酸、リンゴ酸等の有機酸類；エタノール、グリセロール等のアルコール類等が挙げられ、また、窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素化合物；ペプトンなどの有機窒素源を利用することができ、さらに、無機塩類としては、各種のリン酸塩、硫酸塩などを使用することができ、そしてさらに必要に応じて、微量の金属（鉄塩、カルシウム塩など）等を含有させてもよい。
【００１８】
ラセミ体の２−メチル酪酸、およびラセミ体の２−メチルペンタン酸の培養液に対する添加濃度は、用いる培養方法等により異なり、厳密には限定されないが、一般には１ｇ／Ｌ〜100ｇ／Ｌの範囲内を例示することができる。
【００１９】
培養方法としては、振盪培養、深部通気撹拌培養などの方法を採用することができ、培養温度は、通常、20〜40℃程度、そしてpHは５〜９の範囲内が好ましい。また、培養日数は特に限定されないが、例えば、１日から７日間程度とすることができる。
【００２０】
本発明の方法において、ラセミ体の２−メチル酪酸から（Ｒ）−２−メチル酪酸を製造する好ましい１実施態様を例示すると、上記に例示した微生物を、pH約５〜約９の無機窒素源を主体とする無機塩培地又はブイヨン培地などの天然培地100重量部に対して、ラセミ体の２−メチル酪酸約0.1〜約10重量部を加えた培地中で、約20℃〜約40℃、好ましくは約25℃〜約35℃にて、約24時間〜約96時間振盪もしくは撹拌条件下に培養処理することにより高収率、高光学純度で（Ｒ）−２−メチル酪酸を得ることができる。
上記態様において、ラセミ体の２−メチル酪酸をラセミ体の２−メチルペンタン酸とすることにより、ラセミ体の２−メチルペンタン酸から（Ｒ）−２−メチルペンタン酸を製造する好ましい１実施態様が同様に例示される。
【００２１】
上記の培養処理で得ることのできる（Ｒ）−２−メチル酪酸を含有する培養処理液、あるいは（Ｒ）−２−メチルペンタン酸を含有する培養処理液は、所望により遠心分離、ろ過等の適宜な分離手段を採用して菌体を除去した後、培養液を塩酸、硫酸等の無機酸またはクエン酸等の有機酸を添加して培養液のpHを１〜５に調整し、食塩を添加することで塩析を行い、例えば、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒により培養液中に残存する（Ｒ）−２−メチル酪酸、あるいは（Ｒ）−２−メチルペンタン酸を抽出し、更に蒸留、カラムクロマトグラフィーなどの手段を用いて精製することにより高光学純度・高品質の（Ｒ）−２−メチル酪酸および（Ｒ）−２−メチルペンタン酸を容易に取得することができる。
【００２２】
本発明のPseudomonas sp．TH−252−１株を利用する方法により得ることのできる（Ｒ）−２−メチル酪酸は、持続性のあるシャープな酸臭を有するバター、チーズ様の香気、また、軽さのあるシトラス様の香気・香味を有しており、嗜好性の高い各種の香料組成物の調合素材として利用することができる。
一方、本発明のPseudomonas sp．TH−252−１株を利用する方法により得ることのできる（Ｒ）−２−メチルペンタン酸は、特徴的なメタリックでオイリーな香気があり、嗜好性の高い各種の香料組成物の調合素材として利用することができる。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明の態様を更に具体的に説明する。
【００２４】
［実施例１］
２リットル容のジャーファーメンターに基礎培地（培地組成は下記に示す）１リットルを仕込み、４Ｎ−NaOHでpHを7.2に調整後、120℃にて15分間滅菌した。
（基礎培地）
リン酸水素二カリウム（K2HPO4）         1.0ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム（MgSO4・７H2O）       0.2ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（NaCl）                 0.1ｇ／Ｌ
塩化カルシウム（CaCl2）                0.1ｇ／Ｌ
塩化鉄（FeCl2）                       0.02ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム（（NH4）2SO4）        1.0ｇ／Ｌ
ラセミ体２−メチル酪酸                12.0ｇ／Ｌ
【００２５】
冷却後、あらかじめ前培養したPseudomonas sp．TH−252−１株の基礎培地培養物50ｇを加え、30℃にて48時間撹拌通気培養後、ラセミ体の２−メチル酪酸を更に12ｇ追加して仕込み、30℃にて48時間培養を続けた。培養終了後、遠心分離（×3,000ｇ、10分）を行い、菌体を分離後、培養物に希塩酸を注意深く加え、pHを１〜２に調整した。これに食塩100gを加え、塩析した後、エーテル50mlで抽出した。有機層を分離後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、ろ過してエーテルを回収後、粗製物を減圧蒸留により精製し、（Ｒ）−２−メチル酪酸5.2ｇを得た。このものをキラミックス（長谷川香料（株）製）を光学活性な固定相として用いたキャピラリーカラムによるガスクロマトグラフィー分析を行った結果、得られた２−メチル酪酸の立体配置は（Ｒ）−体であり光学純度は99％ee以上であった。ガスクロマトグラムを図１に示し、ガスクロマトグラフィー分析条件を以下に示す。
（ガスクロマトグラフィー分析条件）
オーブン：開始８分間は60℃、140℃まで0.7℃／分、180℃まで５℃／分昇温
カラム：CHIRAMIX（長谷川香料（株）製）、50ｍ×0.25ｍｍ
検出器：MSD5973N（Agilent Technologies社製）
【００２６】
（官能評価）
実施例１で得られた（Ｒ）−２−メチル酪酸、市販の（Ｓ）−２−メチル酪酸（ロベルテ社製、98.6％ee）およびラセミ体２−メチル酪酸（井上香料製造所社製）について良く訓練された５名のパネラーにより香気評価を行った。５名のパネラーの平均的な香気評価を表１に示す。
【００２７】
【表１】
0004656636.tif 000002
【００２８】
［実施例２］
２リットル容のジャーファーメンターに基礎培地（培地組成は下記に示す）１リットルを仕込み、４Ｎ−NaOHでpHを7.2に調整後、120℃にて15分間滅菌した。
（基礎培地）
リン酸水素二カリウム（K2HPO4）           1.0ｇ／Ｌ
硫酸マグネシウム（MgSO4・７H2O）         0.2ｇ／Ｌ
塩化ナトリウム（NaCl）                   0.1ｇ／Ｌ
塩化カルシウム（CaCl2）                  0.1ｇ／Ｌ
塩化鉄（FeCl2）                         0.02ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム（（NH4）2SO4）          1.0ｇ／Ｌ
ラセミ体２−メチルペンタン酸            6.09ｇ／Ｌ
イーストペプトン                        1.09ｇ／Ｌ
【００２９】
冷却後、あらかじめ前培養したPseudomonas sp．TH−252−１株の基礎培地培養物50ｇを加え、30℃にて96時間撹拌通気培養を行った。培養終了後、遠心分離（×3,000ｇ、10分）を行い、菌体を分離後、培養物に希塩酸を注意深く加え、pHを１〜２に調整した。これに食塩100gを加え、塩析した後、エーテル50mlで抽出した。有機層を分離後、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで脱水後、ろ過してエーテルを回収後、粗製物を減圧蒸留により精製し、（Ｒ）−２−メチルペンタン酸2.0ｇを得た。このものを実施例１と同様にガスクロマトグラフィー分析を行った結果、得られた２−メチルペンタン酸の立体配置は（Ｒ）−体であり光学純度は99％ee以上であった。ガスクロマトグラムを図２に示す。
【００３０】
（官能評価）
実施例２で得られた（Ｒ）−２−メチルペンタン酸とラセミ体２−メチルペンタン酸（東京化成社製）について良く訓練された５名のパネラーにより香気評価を行った。５名のパネラーの平均的な香気評価を表２に示す。
【００３１】
【表２】
0004656636.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ラセミ体２−メチル酪酸（標準品）及び（Ｒ）−２−メチル酪酸のガスクロマトグラムを示す図である。
【図２】ラセミ体２−メチルペンタン酸（標準品）及び（Ｒ）−２−メチルペンタン酸のガスクロマトグラムを示す図である。
【図１】
0004656636.tif 000004
【図２】
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