(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で表わされる塩基配列の５′側に配列番号２で表わされる塩基配列を１〜４個含有するポリヌクレオチドからなるプロモーター。
【請求項２】
請求項１記載のプロモーターを含むベクター。
【請求項３】
請求項１記載のプロモーターの３′側にレポーター遺伝子および／または抗生剤耐性遺伝子が連結されている請求項２記載のベクター。
【請求項４】
（ａ）請求項１記載のプロモーターの３′側にレポーター遺伝子および抗生剤耐性遺伝子が連結されているベクターを、未分化細胞に導入する工程、
（ｂ）（ａ）で得られたベクター含有未分化細胞をインスリン産生細胞に分化誘導する工程、
（ｃ）レポーター遺伝子の発現により、インスリン産生細胞への分化を確認する工程、および
（ｄ）抗生剤耐性遺伝子に対応する抗生剤を添加することにより、インスリン産生細胞を選択する工程
を含むインスリン産生細胞の選択方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なインスリン産生細胞特異的プロモーターおよびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
本邦では、糖尿病患者は増加の一途を辿っており、糖尿病が強く疑われる人が６９０万人、その可能性を否定できない人を含めると１，３７０万人である(１９９７年糖尿病実態調査）。現在わが国で、インスリン療法施行者は約４１万人である。その内の腎不全などの重症合併症を有する５％の２万人がバイオ人工膵臓の治療対象となる。また、国民医療費の概況（厚生省実施１９９８年）によると、糖尿病患者の直接医療費が日本で１兆３２５億円である。また、世界の糖尿病人口は現在１億５千万人で、２０１０年にはその数は１．４倍になると予測されており市場は今後ますます増加する。【０００３】
インスリン投与療法では、厳格な監視下でも合併症（失明、四肢切断、腎不全など）の発症防止は極めて困難である。そこで、生きた細胞を利用した糖尿病治療は、廃絶した血糖降下の生理的システムを再び獲得させることができ、患者のＱＯＬの著名な改善（飲食の制限、頻回な血糖測定、インスリン投与の副作用である低血糖の恐怖から解放）、長期合併症の予防ができる。本研究の成功は、糖尿病という慢性疾患の完全治癒を可能とし、さらにはかつて天然痘、ポリオなどの感染症に対して人類がなしえた撲滅宣言を糖尿病に対しても果たし得る大きな原動力となる。臓器移植に伴うドナー不足の問題がなく、万人がその恩恵を受けることができる。２０００年にアルバータ大学から良好な膵島移植の成績が報告され、糖尿病治療に関して膵島移植は理想的な治療法であるとの認識が広まった。しかし提供元となる膵臓の絶対的不足が大きな課題となっており、移植用細胞源の候補として、ヒトＥＳ細胞、肝幹細胞、間葉系幹細胞などのヒト由来の未分化細胞からヒトβ細胞を分化誘導する研究が行われている（たとえば、モリトウら、DIABETES, VOL. 2003 May 52(5):1163-1168、ルメルスキー（Lumelsky）ら、Science, 2001 May 18;292(5520):1389-1394、ザルツマン（Zalzman）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003 Jun. 10;100(12):7253-7258およびマシマら、J. Clin. Invest. 1996 Apr. 1;97(7):1647-1654参照）。これらの方法によってβ細胞が誘導される確率は、あまり高いものではなく、むしろその母集団となる未分化細胞から誘導された少数のβ細胞を選定する操作が重要となる。【０００４】
一般的に選別前の複数のバックグラウンドを持つ細胞集団（バルクの状態）から目的の集団を選別する場合、１）リングクローニング法、２）限界希釈法、３）単一細胞選別法、４）抗体を用いた細胞選別法、および５）プロモーターを用いた選別法などが用いられている。しかしながら、１）〜３）の方法では、選別の過程において細胞を増殖させることを前提に選別を行なうものであり、ヒトＥＳ細胞、間葉系幹細胞などのヒト由来の未分化細胞は増殖能を持っているものの、分化誘導を行うと増殖能を失うためこのような方法を適用することができない。また、４）の方法では、選別対象とする細胞集団がその表面に特異的膜タンパク質（レセプター類）を発現していることを前提としている。したがって、そのような特異的レセプターを細胞表面に提示していないインスリン産生細胞には好適に使用することができない。【０００５】
一方、前記５）の方法は、目的タンパク質を発現する細胞を含む細胞集団に対して、目的タンパク質発現に関与するプロモーター領域とその下流にレポーター遺伝子とを含有するプラスミドをバルク細胞集団にトランスフェクションし、レポーター遺伝子発現陽性細胞をセルソーターや抗生剤耐性遺伝子などを用いて選別する方法である（たとえば、ソリア（Soria）ら、Diabetologia (2001) 44: 407-415参照）。この方法は、インスリン産生細胞の選別に適用可能であるが、天然のプロモーター配列をそのまま使用した場合、インスリン産生細胞非特異的転写活性部位により特異度が落ち、より厳密な細胞の選定を行なうことはできない。そのため、より目的タンパク質特異的な転写活性を有するプロモーター領域を同定、使用する必要があり初期実験に時間を要する。また、特異度があってもプロモーター活性が微弱であった場合、レポーター遺伝子等、下流に挿入された配列を充分に発現できないという問題点がある。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の目的は、インスリン産生細胞の選択を効率よく行なうために、特異性が高く、転写活性の強い新規なプロモーターを提供することである。
【０００７】
前記問題点に鑑み鋭意検討した結果、ヒトインスリンプロモーターの転写開始部位（＋１）の上流−１から−３６３番目の５′フランキング領域（配列番号１、以下、−３６３／−１領域ともいう。）の５′側に、該−３６３／−１領域からＴＡＴＡボックスを含む−３１／−１領域を削除した−３６３／−３２領域（配列番号２）を挿入することにより、インスリン産生細胞に特異性が高く、転写活性の強い新規プロモーターが得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、ａ）配列番号１で表わされる塩基配列の５′側に配列番号２で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド、または
ｂ）前記ａ）のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、インスリン産生細胞においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチド
からなるプロモーターに関する。
【０００９】
本発明はまた、前記プロモーターを含むベクターに関する。
【００１０】
前記ベクターにおいて、前記プロモーターの３′側にレポーター遺伝子および／または抗生剤耐性遺伝子が連結されていることが好ましい。
【００１１】
本発明はさらに、（ａ）前記プロモーターの３′側にレポーター遺伝子および抗生剤耐性遺伝子が連結されているベクターを、未分化細胞に導入する工程、
（ｂ）（ａ）で得られたベクター含有未分化細胞をインスリン産生細胞に分化誘導する工程、
（ｃ）レポーター遺伝子の発現により、インスリン産生細胞への分化を確認する工程、および
（ｄ）抗生剤耐性遺伝子に対応する抗生剤を添加することにより、インスリン産生細胞を選択する工程
を含むインスリン産生細胞の選択方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】天然のヒトインスリンプロモーターの主要転写因子の結合部位を示す図である。
【図２】本発明のインスリン産生細胞の選別方法の一実施態様を示す図である。
【図３】本発明のインスリン産生細胞の選別方法の一実施態様を示す図である。
【図４】本発明のサブクローニングの一実施態様を示す図である。
【図５】電気泳動写真である。Ｍは分子量マーカーを示し、レーン１〜６はそれぞれ、ｐＧＬ３、phINS−３６３／−１・Luc、phINS−３６３／−１＋（ｈＩＮＳ−３６３／−３２）×１〜４・Lucの制限酵素HindIIIおよびKpnＩによる処理物を示す。
【図６】低グルコース条件における、各プラスミドの各細胞におけるプロモーター活性を示すグラフである。
【図７】高グルコース条件における、各プラスミドの各細胞におけるプロモーター活性を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明のプロモーターは、ａ）配列番号１で表わされる塩基配列の５′側に配列番号２で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチド、またはｂ）前記ａ）のポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、インスリン産生細胞においてプロモーター活性を有するポリヌクレオチドである。【００１４】
ここで、配列番号１の塩基配列は、天然のヒトインスリンプロモーターの転写開始部位（＋１）の上流−１から−３６３番目までの５′フランキング領域（−３６３／−１領域）を示し、ＰＤＸ１、ＮｅｕｒｏＤ、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１およびＨＮＦ４ａといった転写因子の結合部位と、グルコース依存性転写活性を担うＣ１〜Ａ２領域を有する（図１）（Germanら、J. Biol. Chem., 1996、Bartoov-Shifmanら、J. Biol. Chem.,2002、Watadaら、Proc. Natl. Acad. Sci.,2000、Harringtonら、J. Biol. Chem., 2001、Watadaら、J. Biol. Chem., 2000）。これらの転写因子またはその組み合せは、膵臓β細胞特異的である。また、配列番号２の塩基配列は、前記配列番号１の塩基配列からＴＡＴＡボックスを除いた領域（−３６３／−３２）である。【００１５】
本発明のプロモーターにはさらに配列番号２の塩基配列がタンデムに挿入されていることが好ましい。本発明のプロモーターに含まれる配列番号２で表される塩基配列の数は、特に制限されるものではないが、１〜１５が好ましく、１〜４がより好ましく、２が最も好ましい。配列番号１で表わされる塩基配列のみでは、プロモーター活性が低く、効率的なインスリン細胞の選定を行なうことができない。また、配列番号２で表わされる塩基配列の数が１６以上になると、ベクターに挿入した場合に全体の分子量が大きくなり過ぎ、細胞への導入効率が低下する傾向がある。【００１６】
本明細書において、「タンデムに挿入する」とは、同じ配列を同じ方向で繰り返し挿入することを意味する。【００１７】
本発明のプロモーターは、一般的にはＰＣＲサブクローニング法などにより製造することができる。たとえば、ヒトゲノムを鋳型としＰＣＲにより配列番号１の塩基配列を増幅し、適当なベクターに挿入する。つぎにこのベクターを鋳型として配列番号２の塩基配列を増幅する。配列番号１の塩基配列が挿入されたベクターの上流（５′側）に任意の数の配列番号２の塩基配列を挿入して目的のプロモーターを製造する方法があげられる。【００１８】
したがって、本発明のプロモーターは、前記配列番号１の塩基配列と配列番号２の塩基配列のほかに、これら塩基配列間に制限酵素切断部位などの付加的な塩基配列が挿入されていてもよい。また、配列番号１および２の塩基配列において、ＴＡＴＡボックスや、主要転写因子の結合部位以外においては、本発明のプロモーター活性を減少させるものでない限り、数個の塩基が欠失・置換または挿入されているものも、本発明のプロモーターに包含される。さらに、それらのＴＡＴＡボックスや主要転写因子の結合部位においても、ＴＡＴＡボックス結合因子または転写因子の結合を妨げない限り、数個の塩基が欠失・置換または挿入されているものも、本発明のプロモーターに包含される。【００１９】
本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリッドの形成およびその後の洗浄における条件を意味し、ハイブリダイゼーションを、たとえば、高イオン濃度（たとえば、６×ＳＳＣ（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする））、５０％フォルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させ、低イオン濃度下（例えば、２×ＳＳＣ）で５０℃にて洗浄するような条件や、高イオン濃度（例えば、６×ＳＳＣ）溶液中で６５℃にてハイブリッドを形成させ、低イオン濃度下（例えば、０．１×ＳＳＣ）で６５℃にて洗浄するような条件などを挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、たとえば、温度を５０℃に設定した場合、２×ＳＳＣ（低ストリンジェンシーな条件）から０．２×ＳＳＣ（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、たとえば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６５℃（高ストリンジェンシーな条件）までの温度から選択することができる。また、もちろん塩濃度と温度の両方を変化させることもできる。【００２０】
ハイブリダイゼーションは、「モレキュラークローニング第３版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University（1995）”などに記載されている方法に準じてコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法又はサザンブロットハイブリダイゼーション法などを行なうことができる。【００２１】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、ＮＣＢＩ（ナショナル  センター  フォア  バイオテクノロジー（National Center for Biotechnology））−ＢＬＡＳＴ（インフォメーション  ベーシック  ローカル  アラインメント  サーチ  ツール（Information Basic Local Alignment Search Tool））などの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルト（初期設定）のパラメータを用いて計算したときに、配列番号１で表わされる塩基配列の５′側に配列番号２で表わされる塩基配列を含有するポリヌクレオチドと少なくとも７０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。【００２２】
本発明のプロモーターを組み込むベクターとしては、プラスミドベクターが好ましく、元ベクターの何らかのプロモーターが制限酵素処理で切り出されるものであれば、どのようなものでも使用することができる。また、外来遺伝子を挿入するための制限酵素部位を複数有しているものが好ましい。そのようなベクターとしては、レポーター遺伝子を含有し、その上流にプロモーターをもたず、複数の制限酵素認識部位を有する、もともと任意のプロモーターのレポーターアッセイ用に調製されているベクター、たとえば、ｐＧＬ２  ベーシック  ベクター（Basic vector）（プロメガ社製）、ｐＧＬ３  ベーシック  ベクター（プロメガ社製）、ｐＧＬ４  ベーシック  ベクター（プロメガ社製）などが市販されており、好適に使用できる。【００２３】
また、本発明のプロモーターを含有するベクターは、本発明のプロモーターの活性を評価するために、本発明のプロモーターの３′側下流にレポーター遺伝子が連結されたものであることが好ましく、細胞へのトランスフェクションを考慮すると、最終的なベクターサイズが１０Ｋｂｐ程度以下であることが好ましい。【００２４】
プロモーターの活性を評価する方法としては、一般的に最も現在使われている方法がルシフェラーゼアッセイ法である。もちろん、従来より使用されている他のレポーターアッセイを使用することもできる。ルシフェラーゼアッセイ法はきわめて微細な活性をも測定でき、かつ簡単な方法であるため活性の評価という目的において好ましい。【００２５】
このようなレポーター遺伝子としては、該遺伝子産物の検出方法が知られているものであれば特に限定はなく、たとえば、ルシフェラーゼ遺伝子およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(ＣＡＴ)遺伝子などの酵素遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子および赤色蛍光タンパク質（ＤＳ-ＲＥＤ）遺伝子などの蛍光タンパク質遺伝子などを使用することができる。【００２６】
また、本発明のプロモーターは、インスリン産生細胞において特異的に機能するため、インスリン産生細胞を選別するためには、３′側下流に抗生剤耐性遺伝子を連結して使用することができ、さらにレポーター遺伝子と抗生剤耐性遺伝子を共に連結して使用することが好ましい。【００２７】
本発明に使用される抗生剤耐性遺伝子としては、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ブラヂィスチジン耐性遺伝子などが有用であり、細胞種および選別のデザインにより適切なものを適宜選択することができる。その他、本発明のベクターには、異なる選別を行なうためにさらに他のプロモーターによる他の耐性遺伝子を連結することも可能である。【００２８】
さらには、本発明のプロモーターの下流にレポーター遺伝子と抗生剤耐性遺伝子とを共に連結する場合、ＧＦＰとハイグロマイシン耐性遺伝子融合遺伝子（ＧＦＰ−ＨｙｇｒｏＲ融合）またはＲＥＤとハイグロマイシン耐性遺伝子融合遺伝子（ＤＳ−ＲＥＤ−ＨｙｇｒｏＲ融合）などのレポーター遺伝子と抗生剤耐性遺伝子の融合物を連結することもできる。このような融合物を使用することにより、インスリン産生細胞への分化誘導の程度をレポーター遺伝子で確認し、また抗生剤を加えることによって発色しない細胞を削除することができる。この際のレポーター遺伝子としては、蛍光顕微鏡で容易に検出でき、色の認識がし易いことから、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子が好ましい。【００２９】
このようなレポーター遺伝子や抗生剤耐性遺伝子、またはレポーター遺伝子と抗生剤耐性遺伝子との融合遺伝子（以下、融合遺伝子ともいう）の本発明のプロモーターへの連結方法としては、当該分野で既知の様々な方法を使用することができる。たとえば、前述したようなレポーターアッセイ用ベクターを使用して本発明のプロモーターを作製した場合、該ベクターに存在するレポーター遺伝子と、連結したいレポーター遺伝子や抗生剤耐性遺伝子、または融合遺伝子を入れ替えることができる。具体的には、前述のｐＧＬ３  ベーシック  ベクターでは、Nco1およびXba1という、２つの制限酵素でルシフェラーゼ遺伝子を切り出すことができ、そこへNco1およびXba1切断部位をそれぞれ付加したプライマーペアにより目的遺伝子のＯＲＦをＰＣＲで増幅し当該制限酵素処理した挿入断片をライゲーションすれば遺伝子の入れ替えができる。【００３０】
得られたベクターを細胞内に導入する方法としては、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法などを使用することができる。作製したベクターのサイズが１０ｋｂｐを超える場合や、目的細胞がＥＳ細胞、間葉系幹細胞、骨髄細胞などリポフェクション法で入りにくい細胞の場合には、エレクトロポレーション法が好ましい。【００３１】
本発明のプロモーターは、インスリン産生細胞において特異的に機能するため、インスリン産生細胞の選定に使用することができる。その方法としては、たとえば、配列番号１で表わされる塩基配列の５′側に配列番号２で表わされる塩基配列をｎ個含有する本発明のプロモーター：ｐｈＩＮＳ−３６３／−１＋（ｈＩＮＳ−３６３／−３２）×ｎの上流にハイグロマイシン耐性遺伝子を融合させた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を連結したプラスミドベクター：ｐｈＩＮＳ−３６３／−１＋（ｈＩＮＳ−３６３／−３２）×ｎ・ＧＦＰ−ＨｙｇｒｏＲを構築する。ヒトＥＳ細胞または間葉系幹細胞などの未分化細胞を培養増殖させ、至適量の前記プラスミドをエレクトロポレーションにより導入する。培養液を交換したのち分化誘導を行なう。前記プラスミドが導入されたインスリン産生細胞は蛍光顕微鏡下で緑色に発色するため、経時的に観察し緑色細胞の割合および蛍光強度が最大になった時点でハイグロマイシンを培養液中に添加し、ＧＦＰ陽性細胞の選定を行い、インスリン産生細胞を得ることができる（図２）。【００３２】
プラスミドの導入が達成されなかった未分化細胞がインスリン産生細胞に分化誘導された場合は、インスリン産生細胞であってもＧＦＰ−ＨｙｇｒｏＲが発現せず、これを選別できないことになる。したがって、インスリン産生細胞に分化誘導された細胞を効率よく得るため、分化誘導に供する細胞をプロモーター含有プラスミドが導入されている細胞のみに限定することが好ましい。その方法としては、プラスミド:ｐｈＩＮＳ−３６３／−１＋（ｈＩＮＳ−３６３／−３２）×ｎ・ＧＦＰ−ＨｙｇｒｏＲに、ＳＶ４０プロモータードライブ型ネオマイシン耐性遺伝子カセットを挿入し、プラスミド:ｐｈＩＮＳ−３６３／−１＋（ｈＩＮＳ−３６３／−３２）×ｎ・ＧＦＰ−ＨｙｇｒｏＲ／ＳＶ４０・Ｎｅｏを使用することができる。このプラスミドを使用することにより、インスリン産生細胞への分化誘導前にプラスミドを導入した細胞をネオマイシン処理により選別することができる(図３）。もちろん使用する抗生剤耐性遺伝子は、ハイグロマイシンやネオマイシン以外の前述の抗生剤耐性遺伝子などに適宜変更することができ、レポーター遺伝子も、ＧＦＰ以外の前述の遺伝子などに適宜変更することができる。【００３３】
プラスミドを導入する至適量は、２×１０7〜５×１０7個の細胞に対してプラスミド２μｇ〜２０μｇが好ましい。分化誘導は、高グルコース濃度で行なうことが好ましく、培養期間は２〜６週間が好ましい。【００３４】
本発明を以下の実施例によりさらに詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３５】
（Ａ）ヒトインスリンプロモーターの−３６３／−１領域の調製
ヒトインスリンプロモーターの転写開始部位（＋１）の上流−１から−３６３番目までの５′フランキング領域（配列番号１）を、ヒト正常肺線維芽細胞株（ＮＨＬＦ）より精製したヒトゲノム１００ｎｇを鋳型とし、反応条件（９４℃、１５秒、６２．５℃、３０秒、６８℃、１分）×３５サイクルで、ＰＣＲ産物１（以下、XhoI／−３６３／−１／HindIIIとも言う）として得た。プライマーとしては、５′側にXhoI切断部位を組み込んだフォワードプライマー１（配列番号３）と、３′側にHindIII切断部位を組み込んだリバースプライマー１（配列番号４）をヒトインスリンプロモーターの−３６３／−１領域の両端に設定した。ＰＣＲ反応液の組成を表１に示す。
フォアワードプライマー１:
５′−TATCTCGAGACAGCAGCGCAAAGAGCCCCGCCCTGCAG−３′（配列番号３）
リバースプライマー１：
５′−ATAAAGCTTTGAGGGCTGCTGGGCCCCCGCTGGCTTTATA−３′（配列番号４）【００３６】
【表１】
0004825978.tif 000002
【００３７】
（Ｂ）前記ＰＣＲ産物１のルシフェラーゼ構築物へのサブクローニング
前記（Ａ）で得られたＰＣＲ産物１(XhoI／−３６３／−１／HindIII)の全量を制限酵素XhoIおよびHindIII各１０Ｕにて３７℃で１６時間処理した。ルシフェラーゼ発現プラスミドであるｐＧＬ３  ベーシック  ベクター(プロメガ社製)５μｇを同じ２種の制限酵素各１５Ｕにて３７℃で３時間処理し、クイックライゲーションキット（Quick ligation kit）（Ｍ２２００Ｓ：ニューイングランドバイオラボ（New England Biolab）社製）を用いてライゲーションを行なった（図４）。ライゲーションは、５０ｎｇのベクターＤＮＡに対しモル比で３倍量のインサートＤＮＡを混和し、核酸不含水で希釈し１０μｌとしたのち、キットに付属の２×クイックライゲーション緩衝液と１μｌのクイックＴ４ＤＮＡリガーゼを加えて、室温で５分間インキュベートして行なった。得られたライゲーション産物のうち１μｌを、溶解後３０分間氷上においた１００μｌのコンピテントセル（ＤＨ５ａ、東洋紡績株式会社製）に添加し、３７℃で４５秒処理したのち、２分間氷上に静置し、ついでＬＢ培地を９００μｌ添加し、３７℃で１時間振とう培養後、１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ寒天培地に播種した。３７℃で１４時間培養し、多数のコロニーを得た。複数のコロニーをピックアップし、同様の培地で小スケール培養を行なった後、ミニプレップキット（miniprep kit）（キアゲン（Qiagen）社製）を用いて、そのプロトコールにしたがってプラスミドを精製した。得られたプラスミドをXhoIおよびHindIIIで処理し、目的配列がインサートとして切り出されることをエチジウムブロマイド含有１％アガロースゲルにて電気泳動後確認し（図５、レーン２）、目的のプラスミド１（以下、phINS−３６３／−１・Lucとも言う。）を得た。【００３８】
（Ｃ）ヒトインスリンプロモーターの−３６３／−３２領域の調製
（Ｂ）で得られたプラスミド：phINS−３６３／−１・Luc５０ｎｇを鋳型とし、ヒトインスリンプロモーター領域−３６３／−３２を（１）制限酵素SmaＩ切断部位を付加したフォアワードプライマー２（配列番号５）およびXhoＩ切断部位を付加したリバースプライマー２（配列番号６）、（２）制限酵素NheＩ切断部位を付加したフォアワードプライマー３（配列番号７）およびSmaＩ切断部位を付加したリバースプライマー３（配列番号８）、（３）制限酵素MluＩ切断部位を付加したフォアワードプライマー４（配列番号９）およびNheＩ切断部位を付加したリバースプライマー４（配列番号１０）、（４）制限酵素KpnＩ切断部位を付加したフォアワードプライマー５（配列番号１１）およびMluＩ切断部位を付加したリバースプライマー５（配列番号１２）を使用し、（Ａ）と同様の方法でＰＣＲによる増幅を行ない、制限酵素切断部位を有する−３６３／−３２領域をＰＣＲ産物２〜５として４種類（以下、それぞれ、SmaＩ／−３６３／−３２／XhoＩ、NheＩ／−３６３／−３２／SmaＩ、MluＩ／−３６３／−３２／NheＩおよびKpnＩ／−３６３／−３２／MluＩともいう。）得た。
フォアワードプライマー２:
５′−TATCCCGGGACAGCAGCGCAAAGAGCCCCG−３′（配列番号５）
リバースプライマー２：
５′−ATACTCGAGTCTCAGAGCCCATCTCCCCTACCTG−３′（配列番号６）
フォアワードプライマー３:
５′−ATAGCTAGCACAGCAGCGCAAAGAGCCCCG−３′（配列番号７）
リバースプライマー３：
５′−ATACCCGGGTCTCAGAGCCCATCTCCCCTACCTGTCAACCC−３′（配列番号８）
フォアワードプライマー４:
５′−TATACGCGTACAGCAGCGCAAAGAGCCCCG−３′（配列番号９）
リバースプライマー４：
５′−ATAGCTAGCTCTCAGAGCCCATCTCCCCTACCTGTCAAC−３′（配列番号１０）
フォアワードプライマー５:
５′−TATGGTACCACAGCAGCGCAAAGAGCCCCG−３′（配列番号１１）
リバースプライマー５：
５′−ATAACGCGTTCTCAGAGCCCATCTCCCCTACCTGTC−３′（配列番号１２）【００３９】
（Ｄ）プロモーターの作製
（Ｂ）で得られたプラスミド１：phINS−３６３／−１・Lucと、（Ｃ）で得られたＰＣＲ産物２：SmaI／−３６３／−３２／XhoＩとを、制限酵素SmaIおよびXhoＩにて処理したのち、以下（Ｂ）と同様の方法にて、ライゲーションを施行し、phINS−３６３／−１・LucのSmaIおよびXhoＩ部位に−３６３／−３２領域が１つ組み込まれた目的のプラスミド２（phINS（−３６３／−３２）×１・Lucとも言う。）を得た。この方法を繰り返し、phINS−３６３／−１・LucのNheＩおよびSmaI部位、MluＩおよびNheＩ部位、KpnＩおよびMluＩ部位に、（Ｃ）で得られたＰＣＲ産物３〜５を組み込み、それぞれ、プラスミド３〜５（phINS−３６３／−１＋（ｈＩＮＳ−３６３／−３２）×２〜４・Lucとも言う。）を作製した。【００４０】
（Ｅ）各プロモーターの確認
各プラスミド：phINS−３６３／−１＋（ｈＩＮＳ−３６３／−３２）×１〜４・Lucをそれぞれの長さの挿入断片を一度に切り出せる制限酵素：HindIIIおよびKpnＩにて処理。目的配列がインサートとして切り出されることをエチジウムブロマイド含有１％アガロースゲルにて電気泳動により確認した（図５、レーン３〜６）。
【実施例２】
【００４１】
プロモーター活性測定
各プロモーターの活性を評価するために、レポーターアッセイを以下の通り実施した。
（Ａ）各細胞へのプラスミドの導入
表３の各プラスミド１〜６（６μｇ）と、内部標準としてサイトメガロウイルスプロモーターの下流にβ−ガラクトシダーゼを連結したプラスミド：ｐＣＭＶβ−ｇａｌ（６μｇ）との計１２μｇを、それぞれ１．５ｍｌキャップ付き小チューブ（エッペンドルフ社製）内で混合し、これにリポフェクション専用培養液Opti-men(ギブコ（Gibco）ＢＲＬ社製)を添加し、総量を３００μｌとした。陰性対照としては、ｐＣＭＶβ−ｇａｌ（６μｇ）とｐＧＬ３ベーシックベクター（６μｇ）とを混合したものを使用した。一方で１４ｍｌクリアチューブ（ファルコン（Falcon）社製）内にリポフェクション試薬：リポフェクチン（Lipofectin）（インビトロゲン（Invitrogen）社製）を２１μｌ入れ、これにOpti-menを加え総量を３００μｌとした。４５分静置したのち、小チューブ内の各プラスミドを培地ごとクリアチューブに加え、リポフェクション試薬と混和し、さらに１５分静置した。血清含培養液（２ｍＭまたは１６ｍＭのＬ−グルコース添加ダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)）を２．４ｍｌ添加して総量を３．０ｍｌとし、よく混和してリポフェクション用調製液を作成した。【００４２】
リポフェクションの２４時間前に播いていた表２記載の各細胞（細胞培養用６ウェルプレートに各ウェル４０万細胞個ずつ）から培養液を除いたのち、前記で得られたリポフェクション用調製液を各ウェルに１．０ｍｌずつ計３ウェルに添加し（実験を三重で行なうため）、ＣＯ2インキュベータに入れ、リポフェクションを行なった。５時間静置したのち培養液を更新した（２ｍｌ）。本実験を行なうのにｐＣＭＶβ‐ｇａｌ＋各種プラスミドで計７種類の組み合わせがあり、各細胞に対して計２４ウェル(６ウェルプレートで４枚)が必要であり、さらに、実験を低グルコース濃度（２ｍＭ）および高グルコース濃度（１６ｍＭ）に分けるためこの倍、すなわち総計４８ウェル(６ウェルプレートで８枚)を使用した。【００４３】
試験細胞とその由来を表２に示す。【００４４】
【表２】
0004825978.tif 000003
【００４５】
試験プラスミドを表３に示す。【００４６】
【表３】
0004825978.tif 000004
【００４７】
（Ｂ）ルシフェラーゼアッセイ
リポフェクション工程終了から３６時間後、各ウェルの培養液を除き、これにレポーター細胞融解緩衝液（プロメガ社製）を４００μｌずつ添加し５分間静置したのちスクレーパーを用いて、完全に細胞を剥がした。各ウェルより内容物をエッペンドルフ社製キャップ付き１．５ｍｌチューブに移し、軽く遠心して不溶解物を底に落とした。この上清１００μｌとBright-Glo ルシフェラーゼアッセイ基質（プロメガ社製）１００μｌを混和し、ルミノメーターを用いて発光量（ＲＬＵ）を測定した。【００４８】
β−ｇａｌ値測定のために、同上清３０μｌを１９０μｌのβ−ｇａｌ溶液（１ｍＭ ＭｇＣｌ２、４５ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．８８ｍｇ／ｍｌ ＯＮＰＧ、６７ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ ７．５）と混和し、１０分後プレートリーダーにてＯＤ＝４０５ｎｍ値を測定した。各ウェルのＲＬＵ／β−ｇａｌ値を測定し、陰性対照として用いたｐＧＬ３＋ｐＣＭＶβ−ｇａｌの３ウェルのＲＬＵ／β−ｇａｌ値の平均値を求め、この値を倍率（fold value）１．０としたときの各ウェルのＲＬＵ／β−ｇａｌ値を算出した。各組み合わせでの誘導倍率（Fold Induction）：Luc（ＲＬＵ）／β−ｇａｌ値からその平均、ＳＤを計算。解析を行なった。【００４９】
結果を図６および７に示す。【００５０】
プラスミド２〜６は、内肺葉以外の他胚葉由来のヒト細胞においては活性が認められなかった（ＭＣＦ７および２９３Ｔ）。また内胚葉由来膵癌細胞（ＭＩＡＰＡＣＡ２）およびα細胞由来グルカゴン産生細胞（αＴＣ１）を含め、β細胞を除く他の内胚葉由来細胞においても同様になんら活性は認められなかった。β細胞由来でインスリン産生細胞であるＭＩＮ６においては、低グルコース条件において、プラスミド１では４．３倍のプロモーター活性を示し、プラスミド２〜５では漸増した（７４．４〜１０２．８倍）（図６）。さらに、高グルコース条件においては、これらの活性はさらに増強された（図７）。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のプロモーターは、インスリン産生細胞に非常に強い特異性を示し、転写活性が高いため、たとえば、本発明のプロモーターの下流に、ルシフェラーゼ、ＧＦＰなどのレポーター遺伝子や抗生剤耐性遺伝子などを連結させた配列を含むベクターを使用することにより、効率のよいインスリン産生細胞の選択方法を提供できる。【００５２】
さらに、本発明のプロモーターは、グルコース濃度応答性であり、高濃度グルコース条件で培養することでより厳格にインスリンプロモーター活性を持つ細胞集団を選別することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００５３】
配列番号３：ヒトインスリンプロモーターの−３６３／−１領域の５′側にXhoI制限部位を組み込んだフォワードプライマー
配列番号４：ヒトインスリンプロモーターの−３６３／−１領域の３′側にHindIII制限部位を組み込んだリバースプライマー
配列番号５：ヒトインスリンプロモーターの−３６３／−３２領域の５′側にSmaＩ制限部位を組み込んだフォワードプライマー
配列番号６：ヒトインスリンプロモーターの−３６３／−３２領域の３′側にXhoＩ制限部位を組み込んだリバースプライマー
配列番号７：ヒトインスリンプロモーターの−３６３／−３２領域の５′側にNheＩ制限部位を組み込んだフォワードプライマー
配列番号８：ヒトインスリンプロモーターの−３６３／−３２領域の３′側にSmaＩ制限部位を組み込んだリバースプライマー
配列番号９：ヒトインスリンプロモーターの−３６３／−３２領域の５′側にMluＩ制限部位を組み込んだフォワードプライマー
配列番号１０：ヒトインスリンプロモーターの−３６３／−３２領域の３′側にNheＩ制限部位を組み込んだリバースプライマー
配列番号１１：ヒトインスリンプロモーターの−３６３／−３２領域の５′側にKpnＩ制限部位を組み込んだフォワードプライマー
配列番号１２：ヒトインスリンプロモーターの−３６３／−３２領域の３′側にMluＩ制限部位を組み込んだリバースプライマー
【図２】
0004825978.tif 000005
【図３】
0004825978.tif 000006
【図６】
0004825978.tif 000007
【図７】
0004825978.tif 000008
【図１】
0004825978.tif 000009
【図４】
0004825978.tif 000010
【図５】
0004825978.tif 000011
【配列表】
0004825978000001.app