(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、核酸ライブラリーを製造するための方法：
（a）一本鎖核酸鋳型の集団を提供する段階であって、各々の鋳型がコード配列及び機能的に連結したプロモーター配列を含む段階；
（b）該一本鎖核酸鋳型よりも長さが短い実質的に相補的な一本鎖核酸断片の混合物と、該一本鎖核酸鋳型の集団とをハイブリダイズさせる段階；
（c）該断片が、該核酸鋳型と実質的に相補的な第二の核酸鎖を完成させるためのプライマーとして作用するような条件下で、段階（b）の各ハイブリダイゼーション産物を、鎖置換活性を欠くDNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼの両方と接触させる段階；並びに
（d）該第二の核酸鎖から転写されるRNAライブラリーを製造するため、段階（c）の産物をRNAポリメラーゼと接触させる段階。
【請求項２】
一つ又は複数の変異をライブラリーに導入するために用いられる、請求項1記載の方法。
【請求項３】
以下の段階を含む、核酸分子の集団における配列の多様性を減少させるための方法：
（a）様々な配列を有する一本鎖核酸鋳型の第一の集団を提供する段階であって、実質的に全ての鋳型の各々が、コード配列と機能的に連結したプロモーター配列とを含む段階、
（b）該核酸鋳型よりも長さが短くかつ該核酸鋳型に実質的に相補的である一本鎖核酸断片の第二の集団と、該第一の集団のメンバーとをハイブリダイズさせる段階であって、該第二の集団のサブ集団が実質的に同一の配列を有しかつさまざまな配列のある領域にハイブリダイズする段階；
（c）該断片が、該核酸鋳型と実質的に相補的な第二の核酸鎖を完成させるためのプライマーとして作用するような条件下で、段階（b）のハイブリダイゼーション産物を、鎖置換活性を欠くDNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼの両方と接触させる段階；並びに
（d）該第二の核酸鎖から転写され、かつ該一本鎖核酸鋳型の第一の集団と比較して配列の多様性が減少したRNA分子の第三の集団を製造するため、段階（c）の産物をRNAポリメラーゼと接触させる段階。
【請求項４】
一本鎖核酸鋳型の第一の集団から一つ又は複数の変異を取り除くために用いられる、請求項3記載の方法。
【請求項５】
実質的に相補的な一本鎖核酸断片の混合物が、二本鎖核酸分子の切断又はランダム・オリゴヌクレオチドの合成により製造される、請求項1又は3記載の方法。
【請求項６】
実質的に相補的な一本鎖核酸断片の混合物が、少なくとも約100個の異なる種類の核酸断片を含む、請求項1又は3記載の方法。
【請求項７】
第二の核酸鎖から相補鎖を製造する段階、該相補鎖を一本鎖核酸鋳型の集団又は第一の集団として提供する段階、および段階(b)および(c)を一回もしくは複数回繰り返し、続いて段階(d)を繰り返す段階をさらに含む、請求項1又は3記載の方法。
【請求項８】
一本鎖核酸鋳型とホモ二重鎖を形成する一つ又は複数の一本鎖核酸断片を提供する段階、及び該ホモ二重鎖形成断片の存在下で段階（b）を実施する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
プロモーターがT7プロモーターである、請求項1又は3記載の方法。
【請求項１０】
DNAポリメラーゼがT4 DNAポリメラーゼである、請求項1又は3記載の方法。
【請求項１１】
接触段階（d）の前に段階（c）の産物を増幅させる段階をさらに含む、請求項1又は3記載の方法。
【請求項１２】
（e）タンパク質ライブラリーを製造するためRNAライブラリーを翻訳する段階をさらに含む、請求項1又は3記載の方法。
【請求項１３】
（e）RNAライブラリーの実質的に全ての各メンバーのコード配列の3’末端に、アミノ酸アクセプター分子を連結させる段階；および任意で（f）RNA−タンパク質融合体ライブラリーを製造するためRNAライブラリーを翻訳する段階をさらに含む、請求項1又は3記載の方法。
【請求項１４】
一本鎖核酸鋳型が、該核酸鋳型を保持するM13ファージの使用、遺伝子VIエキソヌクレアーゼもしくはラムダ・エキソヌクレアーゼを用いた二本鎖核酸鋳型の一方の鎖の分解、ビオチン化された一本鎖核酸のストレプトアビジンを用いた捕捉、又はRNAの逆転写により製造される、請求項1又は3記載の方法。
【請求項１５】
段階（b）が、一本鎖核酸鋳型1個当たり1個からおよそ1000個までの、様々な配列を有する一本鎖核酸分子又は一本鎖核酸断片を用いて実施される、請求項1又は3記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
概して、本発明は、組換えライブラリーを製造する方法及び改変する方法に関する。
【０００２】
所望の核酸又はアミノ酸配列の単離を可能にするためには、特定の種がライブラリーに集められており、一つ又は複数のスクリーニング技術により同定されうるように、十分な数及び多様性を有する組換えライブラリーの利用可能性が必要とされる。そのようなライブラリーは、治療用、研究診断用、及び農業用の試薬、並びにそれらのコード配列を含む、有用な化合物の単離を容易にする。
【０００３】
さらに、所望のライブラリーは、単一の化合物の多数の可能な変異体を含有するよう特別に設計されうる。この型のライブラリーは、改良された形態の化合物、例えば最適化された治療効力を有する化合物変異体をスクリーニングするために用いられうる。
【０００４】
これら又はその他の任意の適用のため、ライブラリーの多様性を増加させるための一般的な手法は、極めて有用であり、タンパク質設計産業の重要な焦点となっている。
【０００５】
発明の概要
概して、本発明は、（a）各々がコード配列及び機能的に連結したプロモーター配列を含む、一本鎖核酸鋳型の集団を調製する段階、（b）核酸鋳型よりも長さが短い実質的に相補的な一本鎖核酸断片の混合物と、一本鎖核酸鋳型の集団とをハイブリダイズさせる段階、（c）断片が、核酸鋳型と実質的に相補的な第二の核酸鎖を完成させるためのプライマーとして作用するような条件下で、段階（b）の各ハイブリダイゼーション産物を、鎖交換活性を欠くDNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼの両方と接触させる段階、並びに（d）第二の核酸鎖から転写されるRNAライブラリーを製造するため、段階（c）の産物をRNAポリメラーゼと接触させる段階を含む、核酸ライブラリーを製造するための方法を特徴とする。
【０００６】
好ましい態様において、本方法は、一つ又はそれ以上の変異をライブラリーに導入するために用いられ；実質的に相補的な一本鎖核酸断片の混合物は、二本鎖核酸分子の切断により製造され；実質的に相補的な一本鎖核酸断片の混合物は、ランダム・オリゴヌクレオチドの合成により作製され；一本鎖核酸鋳型は、核酸を保持するM13ファージの使用、遺伝子VIエキソヌクレアーゼもしくはラムダ・エキソヌクレアーゼを用いた二本鎖核酸鋳型の一方の鎖の分解、ストレプトアビジンを用いたビオチン化一本鎖核酸の捕捉、又はRNAの逆転写により作製され；実質的に相補的な一本鎖核酸断片の混合物は、少なくとも約100個の異なる核酸断片の種を含み；段階（b）は、一本鎖核酸鋳型1個当たり1個からおよそ1000個の断片を用いて実施され；段階（c）の産物の一本鎖は核酸鋳型として用いられ、段階（b）及び段階（c）は反復され；段階（b）及び段階（c）は、各々の回において、段階（c）の産物を核酸鋳型として用いて反復され；方法は、一本鎖核酸鋳型とホモ二重鎖を形成する一つ又は複数の一本鎖核酸断片を調製する段階、及びホモ二重鎖形成断片の存在下で段階（b）を実施する段階をさらに含み；プロモーターはT7プロモーターであり；DNAポリメラーゼはT4 DNAポリメラーゼであり；本方法は、接触段階（d）の前に段階（c）の産物を増幅させる段階をさらに含み；本方法は、（e）タンパク質ライブラリーを製造するためRNAライブラリーを翻訳する段階をさらに含み；本方法は、（e）RNAライブラリーのメンバーの実質的に全部の各コード配列の3'末端に、アミノ酸アクセプター分子を連結させる段階をさらに含み；本方法は、（f）RNA-タンパク質融合体ライブラリーを製造するためRNAライブラリーを翻訳する段階をさらに含む。
【０００７】
第二の局面において、本発明は、（a）様々な配列を有する一本鎖核酸鋳型の第一の集団を調製する段階であって、実質的に全ての鋳型の各々がコード配列及び機能的に連結したプロモーター配列を含む段階、（b）核酸鋳型よりも長さが短く、かつ実質的に同一の配列を有する実質的に相補的な一本鎖核酸断片の第二の集団と、第一の集団のメンバーとをハイブリダイズさせる段階、（c）断片が、核酸鋳型と実質的に相補的な第二の核酸鎖を完成させるためのプライマーとして作用するような条件下で、段階（b）のハイブリダイゼーション産物を、鎖交換活性を欠くDNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼの両方と接触させる段階、並びに（d）第二の核酸鎖から転写され、かつ一本鎖核酸鋳型の第一の集団と比較して配列の多様性が減少したRNA分子の集団を作製するため、段階（c）の産物をRNAポリメラーゼと接触させる段階を含む、核酸分子の集団において配列の多様性を減少させるための方法を特徴とする。
【０００８】
好ましい態様において、本方法は、一本鎖核酸鋳型の第一の集団から一つ又は複数の変異を取り除くために用いられ；段階（b）は、一本鎖核酸鋳型の第一の集団を、実質的に相補的な一本鎖核酸断片の二つまたはそれ以上の異なる集団とをハイブリダイズさせる段階を含み；実質的に相補的な一本鎖核酸断片の第二の集団は、二本鎖核酸分子の切断により作製され；実質的に相補的な一本鎖核酸断片の第二の集団は、ランダム・オリゴヌクレオチドの合成により作製され；一本鎖核酸鋳型は、核酸を保持するM13ファージの使用、遺伝子VIエキソヌクレアーゼもしくはラムダ・エキソヌクレアーゼを用いた二本鎖核酸鋳型の一方の鎖の分解、ビオチン化された一本鎖核酸のストレプトアビジンを用いた捕捉、又はRNAの逆転写により作製され；段階（b）は、一本鎖核酸鋳型1個当たり1個からおよそ1000個の断片を用いて実施され；段階（c）の産物の一本鎖は核酸鋳型として用いられ、段階（b）及び段階（c）は反復され；段階（b）及び段階（c）は、各々の回において、段階（c）の産物を核酸鋳型として用いて反復され；プロモーターはT7プロモーターであり；DNAポリメラーゼはT4 DNAポリメラーゼであり；本方法は、接触段階（d）の前に段階（c）の産物を増幅させることをさらに含み；本方法は、（e）タンパク質ライブラリーを製造するためRNA分子の集団を翻訳する段階をさらに含み；本方法は、（e）RNA分子の集団のメンバーの実質的に全部の各コード配列の3'末端に、アミノ酸アクセプター分子を連結させる段階をさらに含み；本方法は、（f）RNA-タンパク質融合体ライブラリーを製造するためRNA分子の集団を翻訳する段階をさらに含む。
【０００９】
第三の局面において、本発明は、（a）コード配列を各々が含む、一本鎖核酸鋳型の集団を調製する段階、（b）様々な配列を有する一本鎖核酸分子の集団を調製する段階であって、一本鎖核酸鋳型の集団と様々な配列を有する一本鎖核酸分子の集団とは実質的に相補的である段階、（c）二重鎖を形成するために十分な条件下で、一本鎖核酸鋳型の集団と、様々な配列を有する一本鎖核酸分子の集団とをハイブリダイズさせる段階、並びに（d）酵素が二重鎖内のミスマッチ塩基対を修正することを可能にする条件下で、一つ又は複数の除去／修復酵素と二重鎖を接触させる段階を含む、核酸ライブラリーを製造するための方法を特徴とする。
【００１０】
好ましい態様において、本方法は、段階（d）の産物に由来する一本鎖鋳型の集団を調製する段階、並びに段階（c）及び段階（d）を反復する段階をさらに含み；各々の回において、段階（d）の産物に由来する一本鎖鋳型の集団を用いて、段階（c）及び段階（d）が反復される。
【００１１】
第四の局面において、本発明は、（a）コード配列を各々が含む、一本鎖核酸鋳型の集団を調製する段階、（b）核酸鋳型よりも長さが短い実質的に相補的な一本鎖核酸断片の混合物と、一本鎖核酸鋳型の集団とをハイブリダイズさせる段階、（c）断片が、核酸鋳型と実質的に相補的な第二の核酸鎖を完成させるためのプライマーとして作用するような条件下で、段階（b）の各ハイブリダイゼーション産物を、鎖交換活性を欠くDNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼの両方と接触させる段階、並びに（d）酵素が産物内のミスマッチ塩基対を修正することを可能にする条件下で、一つ又は複数の除去／修復酵素と段階（c）の産物を接触させる段階を含む、核酸ライブラリーを製造するための方法を特徴とする。
【００１２】
好ましい態様において、本方法は、段階（d）の産物に由来する一本鎖鋳型の集団を調製する段階、並びに段階（b）〜（d）を反復する段階をさらに含み；各々の回において、段階（d）の産物に由来する一本鎖鋳型の集団を用いて、段階（b）〜（d）が反復される。
【００１３】
本発明の第三及び第四の局面の好ましい態様において、除去／修復酵素との接触は、インビボ（例えば、細菌細胞内）で実施され；除去／修復酵素との接触は、インビトロで実施され；一本鎖核酸鋳型は、核酸を保持するM13ファージの使用、遺伝子VIエキソヌクレアーゼもしくはラムダ・エキソヌクレアーゼを用いた二本鎖核酸鋳型の一方の鎖の分解、ビオチン化された一本鎖核酸のストレプトアビジンを用いた捕捉、又はRNAの逆転写により作製され；段階（b）は、一本鎖核酸鋳型1個当たり1個からおよそ1000個の様々な配列を有する一本鎖核酸分子又は一本鎖核酸断片を用いて実施され；本方法は、段階（d）の産物を増幅させる段階をさらに含み；各コード配列はプロモーター配列と機能的に連結しており；本方法は、（e）RNAライブラリーを製造するため段階（d）の産物を転写する段階をさらに含み；本方法は、（f）タンパク質ライブラリーを製造するためRNAライブラリーを翻訳する段階をさらに含み；本方法は、（f）RNAライブラリーのメンバーの実質的に全部の各コード配列の3'末端に、アミノ酸アクセプター分子を連結させる段階をさらに含み；本方法は、（g）RNA-タンパク質融合体ライブラリーを製造するためRNAライブラリーを翻訳する段階をさらに含む。
【００１４】
本明細書において用いられるように、「ライブラリー」とは、核酸及び／又はアミノ酸構成要素を有する少なくとも108個、好ましくは少なくとも1010個、より好ましくは少なくとも1012個、最も好ましくは少なくとも1014個の分子を意味する。
【００１５】
核酸断片の「混合物」とは、少なくとも100個、好ましくは少なくとも500個、より好ましくは少なくとも1000個、最も好ましくは少なくとも1500個の核酸断片を意味する。
【００１６】
「プロモーター配列」とは、機能的なRNAポリメラーゼ結合部位を提供し、近傍のコード配列の転写を可能にするために十分である、任意の核酸配列を意味する。
【００１７】
「実質的に相補的な」とは、核酸鎖が、2つの核酸の間に一つ又は複数の二本鎖状態の領域を生じるため、第二の核酸鎖と対合したワトソン−クリック塩基対を形成することができる十分な数のヌクレオチドを有することを意味する。実質的に相補的であるために、核酸分子内の各々のヌクレオチドが、対向鎖内のヌクレオチドと対合したワトソン−クリック塩基対を形成する必要はなく、「実質的に相補的な一本鎖核酸断片の混合物」中の断片の相当部分が、「一本鎖核酸鋳型」とのミスマッチ塩基対を形成する一つ又は複数のヌクレオチドを含有すると思われる。
【００１８】
「鎖交換活性」とは、2つの核酸鎖の間の塩基対形成を破壊するポリメラーゼ又はその関連へリカーゼの能力を意味する。
【００１９】
「変異」とは、任意のヌクレオチドの変化を意味し、表現型の差異及びサイレンス変化をもたらす配列の改変を含む。
【００２０】
「二重鎖」とは、安定なハイブリダイゼーション複合体を維持するために十分な配列相補性が鎖間に存在する、2つのアニール化した核酸鎖の間に形成された構造を意味する。二重鎖は、第一鎖内のヌクレオチドの全部が、第二の対向鎖内のヌクレオチドの全部と適切に塩基対を形成している「ホモ二重鎖」であってもよいし、又はヘテロ二重鎖であってもよい。「ヘテロ二重鎖」とは、一つ又は複数のミスマッチのために、第一鎖内の一つ又は複数のヌクレオチドが、第二の相補的な対向鎖内の一つ又は複数のヌクレオチドと適切に塩基対を形成しないか、又は形成することができない、2つのアニール化した核酸鎖の間に形成された構造を意味する。ヘテロ二重鎖の異なる型の例には、一つ又はいくつかのヌクレオチドの交換、及び挿入又は欠失変異を示すものが含まれる。
【００２１】
「ランダム・オリゴヌクレオチド」とは、一つ又は複数のヌクレオチド部位に配列の多様性を有するオリゴヌクレオチドの混合物を意味する。ランダム・オリゴヌクレオチドは、完全にランダム又は部分的にランダムな合成手法を用いて、又は定方向の様式でオリゴヌクレオチドを意図的に改変することにより、作製されうる。
【００２２】
「アミノ酸アクセプター分子」とは、リボソームのペプチジル・トランスフェラーゼ機能の触媒活性により、成長中のタンパク質鎖のC末端に追加されうる任意の分子を意味する。典型的には、そのような分子は、（i）ヌクレオチド又はヌクレオチド様部分（例えば、アデノシン又はアデノシン・アナログ（N-6アミノ位におけるジメチル化が受容可能である））、（ii）アミノ酸又はアミノ酸様部分（例えば、20個のD-アミノ酸もしくはL-アミノ酸のうちの任意のもの、又はそれらのアミノ酸アナログ（例えば、O-メチルチロシン又はEllmanら、Meth.Enzymol.202:301,1991により記載されたアナログのうちの任意のもの）、並びに（iii）2つの間の結合（例えば、3'位における、又は好ましくはないが2'位におけるエステル、アミド、又はケトン結合）を含有する。好ましくは、この結合は、天然のリボヌクレオチドのコンフォメーションからの環のパッカー（pucker）を有意に妨害しない。アミノ酸アクセプターは、これらに限定されないが、アミノ基、水酸基、又はスルフヒドリル基でありうる求核原子も有しうる。さらに、アミノ酸アクセプターは、ヌクレオチド類似体、アミノ酸類似体、又は組み合わされたヌクレオチド−アミノ酸構造の類似体を含みうる。
【００２３】
コード配列の「3'末端に」連結したアミノ酸アクセプターとは、アミノ酸アクセプター分子がコード配列の最後のコドンの後に位置することを意味する。この用語には、これらに限定されることはないが、コード配列の3'末端に正確に位置するアミノ酸アクセプター分子、及び介在するコード配列又は非コード配列（例えば、休止部位（pause site）に相当する配列）により最後のコドンから隔離されているアミノ酸アクセプター分子が含まれる。この用語には、コード配列又は非コード配列が、アミノ酸アクセプターの後ろに位置する（即ち3'側にある）構築物も含まれる。さらに、この用語には、これらに限定されることはないが、（直接的に、又は介在アミノ酸配列を介して間接的に）コード配列と共有結合したアミノ酸アクセプター分子、及び何らかの非共有手段、例えばコード配列の3'末端、又はその近傍に結合し、それ自体がアミノ酸アクセプター分子と結合している第二の核酸分子を用いたハイブリダイゼーションによりコード配列と接合されたアミノ酸アクセプター分子が含まれる。
【００２４】
「RNA-タンパク質」融合体とは、アミド結合によりタンパク質と共有結合したリボ核酸を含む任意の分子を意味する。この共有結合は、リボソームによる切断に耐性である。
【００２５】
「タンパク質」とは、一つ又は複数のペプチド結合により接合された任意の2個又はそれ以上の天然に存在するアミノ酸又は改変されたアミノ酸を意味する。「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に用いられる。
【００２６】
「様々な配列を有する一本鎖鋳型の集団」とは、集団の核酸種が一つ又は複数のヌクレオチド位において異なっている配列を有することを意味する。
【００２７】
「除去／修復酵素」とは、ミスマッチ塩基対又はループを標準的な塩基対（即ち、A：T又はG：C）と置換するために十分な酵素の任意の組み合わせを意味する。
【００２８】
詳細な説明
本発明は、遺伝子の改変が導入されているDNAライブラリー、RNAライブラリー、及びタンパク質ライブラリーの製造を容易にする、核酸配列のランダム組み換えのための多数の新規の関連する方法を含む。以下により詳細に記載されるように、一つの好ましい態様において、この技術はインビトロで実施され、伝統的なタンパク質ライブラリー又はRNA-タンパク質融合体ライブラリーを製造するために用いられる。それらライブラリーは、その後、ライブラリー集団から所望のタンパク質又はペプチド（又はそれらに対応するコード配列）を選択するための多様な方法のうちのいずれかと組み合わせて用いられうる。この一般的な手法は、偏りのない様式でタンパク質ライブラリーへ変異を導入するための手段を提供し、好ましくない変異をライブラリーもしくは選択されたプールから取り除くか、又はその後の選択ラウンドにおいて分子の集団から「戻し交雑（backcross）」することができる技術も提供する。
【００２９】
断片の組み換え
本発明の好ましい方法によると、ライブラリーは変異型断片の作製及びこれらの断片と非変異型（典型的には野生型）配列とのランダム組み換えにより製造される。この一般的な手法の一例が、図1に示されている。この図中に示されているように、まず変異が初期二本鎖DNA配列（「dsDNA(init)」と呼ぶ）にランダムに導入される。これにより、図1において「dsDNA(mut)」と記載されている変異型二本鎖DNA配列の集団が作製される。これらの変異は、（Taqポリメラーゼのエラー校正メカニズムの不足に依存した）PCR突然変異誘発法、部位特異的突然変異誘発法、又は鋳型特異的突然変異誘発法（例えば、JoyceおよびInoue,Nucl.Acids.Res.17:171,1989）を含む任意の技術により導入されうる。この変異含有集団内のDNAは、その後、多様な標準的な方法のうちのいずれかを用いて断片化される。例えば、DNAを、（DNaseI、ミクロコッカス・ヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、もしくはP1ヌクレアーゼのような）一つ又は複数のヌクレアーゼを用いて部分的に分解することもできるし、又は例えばFe・EDTAを用いて化学的に断片化することもできる。又は、変異含有断片は、重合（例えばPCR増幅）の間の限定されたヌクレオチド消費、又は単純な物理的剪断（例えば、超音波処理）により、作製されうる。好ましい断片のサイズは、25〜1000塩基対の範囲であり、最も好ましくは50〜150塩基対の範囲である。
【００３０】
その後、DNA断片を加熱し、続いて配列が初期DNAと同一であり、そのDNAの非コード（即ちマイナス）鎖である全長一本鎖DNA鋳型とアニール化させる。さらに、このハイブリダイゼーション混合物には、「ターミネーター断片」（JoyceおよびInoue,Nucl.Acids.Res.17:171,1989）とも呼ばれる第二の型の断片が含まれる。このターミネーター断片は、一本鎖鋳型の3'末端と相補的であり、ランダムにアニール化した変異含有断片の数又は性質とは比較的無関係な様式で鋳型と結合する重合プライマーを提供する。
【００３１】
一本鎖鋳型は、任意の標準的な技術、例えばDNA配列を保持するM13ファージの使用、遺伝子VIエキソヌクレアーゼ（Nikiforovら、PCR Methods Appl.3:285,1994）又はラムダ・エキソヌクレアーゼ（HiguchiおよびOchman,Nucl.Acids Res.17:5865,1989）を用いたdsDNA(init)分子のコード鎖の分解、ビオチン化DNA鎖における固定化ストレプトアビジンを用いた捕捉（JoyceおよびInoue,Nucl.Acids Res.17:171,1989）、又はRNAの逆転写により作製されうる。鋳型−断片ハイブリダイゼーションを実施するため、鋳型分子1個当たり1個以上およそ1000個以下の断片分子を用いて、鋳型が断片と混合される。断片と鋳型との比率が低い場合には、鋳型と密接に類似している子孫鎖が作製され、比率が高いほど、作製される子孫は断片とより類似するようになる。ハイブリダイゼーション条件は、標準的な方法により決定され、鋳型と断片とのヘテロ二重鎖の形成を可能にするよう設計される。例示的なハイブリダイゼーション法は、例えば、Stemmerの米国特許第5,605,793号に記載されている。
【００３２】
鋳型とアニール化させた後、断片を鎖交換活性を欠くDNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼの両方による処理により、互いに接合させる。この目的のために有用なDNAポリメラーゼには、これらに限定されることはないが、T4 DNAポリメラーゼ及び再構築された大腸菌由来のDNA polII（例えば、Hughesら、J.Biol.Chem.266:4568,1991を参照のこと）が含まれる。任意のDNAリガーゼ（例えば、T4 DNAリガーゼ）が使用されうる。この段階においては、DNA二重鎖を、まずDNAポリメラーゼにより処理し、次にDNAリガーゼにより処理してもよいし、または両酵素により同時に処理してもよく、この段階は、例えばJoyce及びInoue（Nucl.Acids.Res.17:171,1989）に記載されたようにして実施されうる。図1に示されたように、この段階により、二本鎖DNAの集団（「dsDNA(lib)」と呼ばれる）が作製され、その各メンバーに含まれる鎖の一方は、典型的には一つ又は複数の導入された変異を有する。最初に導入された変異と、アニール化された断片の数及び性質との両方がランダムであるため、集団内の異なる二重鎖は、異なる変異配列を含有する。
【００３３】
二本鎖DNAライブラリーを製造するためのこの一般的な手法の別法が、図2に示されている。この別の手法によると、初期二本鎖DNA分子のコード鎖の一部に相当する一本鎖オリゴヌクレオチド断片が合成される。これらのオリゴヌクレオチド断片は、好ましくは5〜2000ヌクレオチド長であり、最も好ましくは20〜100ヌクレオチド長であり、例えば核酸合成における任意の標準的な技術を用いて作製される。これらのオリゴヌクレオチドは、任意の標準的な技術により、完全にランダムな、又は半ランダムな変異を含むよう合成されうる。好ましくは、そのようなオリゴヌクレオチドは、20ヌクレオチド・セグメント1個当たり最大3個の導入されたミスマッチを含み、インフレームの停止コドンを欠いている。さらに、いくつかの場合には、C-5プロピン・ウリジン又はC-5プロピン・シチジンのような非天然の親和性増強塩基対の導入により、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション能を増加させることが望ましいか、又は必要である。これらの技術は、例えば、Wagnerら、Science 260:1510,1993に記載されている。
【００３４】
これらの変異含有オリゴヌクレオチド断片を、次に、前記のように初期DNAの非コード（即ちマイナス）鎖と配列が同一な全長鎖である一本鎖鋳型とアニール化させる。二本鎖DNAライブラリー（dsDNA(lib)）を作製するため、断片を、やはり前記のように、DNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼを用いて互いに接合させる。このライブラリーも、数、位置、及び同一性が異なる変異を有する異なるコード鎖のアレイを含有する二重鎖分子の集団を含有している。
【００３５】
望ましい場合には、様々な数の変異をDNA分子に導入するため、断片手法においてもオリゴヌクレオチド手法においても、前記の段階を反復することができる。特に、変異した鎖を初期一本鎖鋳型とし、変異型断片又は変異型オリゴヌクレオチドをこれらの鎖とアニール化させ、重合し、ライゲーションさせる。
【００３６】
戻し交雑の方法
前記の概説のように、本発明の方法は、初期DNA配列に変異を導入するために用いられる。さらに、これらの技術は、DNAライブラリーから不要な変異を取り除くか、又は頻度を減少させるために用いられうる。この手法によると、dsDNA(mut)の断片化の後、野生型配列のオリゴヌクレオチド又は非変異型もしくは野生型DNA（wtDNA）の特異的断片を、dsDNA(mut)断片又はオリゴヌクレオチドと共に一本鎖鋳型に追加することができる。断片を、（必要に応じて）鎖分離させ、全長一本鎖鋳型とアニール化させ、前記のように、DNAポリメラーゼ及びDNAリガーゼを用いて互いに接合させる。対応する変異型断片と比較して高濃度の非変異型オリゴヌクレオチド又は断片を使用することにより、不要な変異が最少限に抑えられたライブラリー、又は排除されたライブラリーの製造が可能となる。
【００３７】
さらに、この手法は、不要な配列を同様に減少させるか又は排除するため、既存の変異含有ライブラリーと共に用いられうる。この手法は、変異型配列を有する初期ライブラリー、並びに前記の概説のような野生型配列の断片又はオリゴヌクレオチドのアニール化、重合、及びライゲーションを含む。
【００３８】
RNA、タンパク質、及びRNA-タンパク質ライブラリー
本発明の一つの好ましい態様において、前記のDNAライブラリーは、例えばT7ポリメラーゼ又はSP6ポリメラーゼのためのRNAポリメラーゼ結合部位をさらに含む。そのような結合部位は、例えば、Milliganら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:696,1990に記載されている。この部位は、コード配列上流の配列の転写を可能にする位置に位置する。典型的には、そのような部位は、コード配列の5〜2000塩基対上流に位置する。
【００３９】
RNAポリメラーゼ結合部位を含有するライブラリーを、前記のように改変することができる。重合及びライゲーションの後、RNAライブラリーを製造するため、dsDNA(lib)を直接的に、例えばインビトロ転写系を用いて転写することができる。又は、タンパク質ライブラリーを製造するため、dsDNA(lib)を直接的に、例えばインビトロ転写翻訳系を用いて転写及び翻訳することができる。例示的なインビトロ転写系及びインビトロ翻訳系には、T7転写系、並びにウサギ網状赤血球、コムギ胚、酵母、及び大腸菌の翻訳系が含まれる。
【００４０】
望ましい場合には、転写の前に鎖特異的増幅段階を含めることにより、ライブラリー中の各RNA又はタンパク質のコピー数を増加させることができる。例えば、重合及びライゲーションの段階中に、特有のプライマー結合配列を変異鎖に組み込むことにより、PCR増幅を実施することができる。これらの配列は、DNAの一方の端又は両端でのミスマッチ又は配列伸長として組み込まれ、鋳型鎖を増幅することなく新たに合成された鎖を増幅することを可能にする。又は、新たに合成された鎖の3'末端に相補的な単一のオリゴヌクレオチド・プライマーのアニーリング及び伸長を複数回繰り返すことにより、直線的な増幅が達成されうる。その後のPCR及び転写の段階により、極少ない割合の鋳型由来配列と共に、大多数の変異型配列に対応するRNAが作製される。
【００４１】
一つの好ましい手法において、変異を導入するため、又は不要な変異を戻し交雑するための前記の方法は、多様性の高いRNA-タンパク質ライブラリーを製造するために用いられうる。そのようなライブラリーは、ピューロマイシンのような非加水分解性アミノ酸アクセプター分子を含有するリンカーを、（例えば、前記のようにして製造された）ライブラリー中のRNAの3'末端にライゲーションすることにより構築されうる。RNA-タンパク質融合体を作製するための例示的な技術は、例えば、SzostakのU.S.S.N.09/007,005、及びRobertsら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12297,1997に記載されている。これらのRNAのその後の翻訳により、RNA-タンパク質融合分子のライブラリーが製造され、続いてそれがインビトロ選択実験において用いられうる。
【００４２】
さらに、望ましい場合には、RNA分子又はRNA-タンパク質融合分子は、選択された後、対応するコード配列を得るための標準的なPCR反応において鋳型として用いられうる。従って、この方法は、断片組み換え、分子的戻し交雑、タンパク質及び／又はペプチドの選択、並びにそれらの対応するコード配列の選択を全てインビトロ系で実施するための手段を提供する。
【００４３】
除去／修復
断片組み換え手法に加え、除去／修復を、ライブラリー配列を改変するため用いることもできる。この手法は、DNAライブラリー、RNAライブラリー、及びRNA-タンパク質融合体ライブラリーを製造するために用いられうる。この技術は、前記の方法のいずれかにより作製されたdsDNA(lib)が、本来、若干数のミスマッチ塩基対を含有しているという事実に依存している。多様性を有するライブラリー配列を作製するため、これらのミスマッチを除去／修復酵素によりインビトロで修復する。これは、任意の除去／修復系（例えば、Jaiswalら、Nucl.Acids Res.26:2184,1998又はFortiniら、Biochemistry 37:3575,1998に記載）を用いて実施されうる。
【００４４】
又は、除去／修復段階は、dsDNA(lib)を細菌株又は酵母株に形質転換し、かつ細菌又は酵母のインビボの修復系を活用することにより実施されうる。この段階も、ライブラリーを任意の標準的なインビボ除去／修復系に形質転換することにより実施されうる。例示的な系は、これらに限定されることはないが、Campbellら、Mutat.Res.211:181,1989、BishopおよびKolodner,Mol.Cell Biol.6:3401,1986、Fishelら、J.Mol.Biol.188:147,1986、及びWestmorelandら、Genetics 145:29,1997に記載されている。
【００４５】
前記の修復過程はランダムであるため、この除去／修復法は、ライブラリー配列への変異の導入をもたらす場合もあるし、コード配列への野生型配列改変の戻し交雑をもたらす場合もある。
【００４６】
前記の手法の代わりに、インビトロ又はインビボの除去／修復を、（例えば、前記のようにして作製された）dsDNA(mut)とdsDNA(init)又はwtDNAとの混合物を基質として用い、多様なライブラリーを製造するために直接的に用いることもできる。この技術においては、混合物を、鎖分離させ、再アニール化させ、次に除去／修復酵素と共にインビトロでインキュベートするか、又は（例えば、前記のような）細菌の除去／修復系を利用するため細菌に形質転換する。このようにして、変異が配列内にランダムに導入され、野生型配列がdsDNA(mut)分子に戻し交雑されうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  多様性の高いRNA-タンパク質融合体ライブラリーを製造するための例示的な断片組み換え法の概略図である。この方法において、断片は、配列多様性が導入された二本鎖DNA分子に由来する。
【図２】  第二の例示的な断片組み換え法の初期段階の概略図である。この方法において、断片は、配列多様性が導入された合成オリゴヌクレオチドである。
【図１】
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【図２】
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