(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸１〜１４６において、２つのグリコシル化部位を有するよう変更されたグリコシル化レプチン蛋白であって、その２つの部位が（配列番号１の番号割り付けに関して）
４７＋６９；
４８＋６９；
６９＋１０１；
６９＋１０２；
６９＋１０３；
６９＋１１８；および
１００＋１０２
からなる群より選択される、グリコシル化レプチン蛋白。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸１〜１４６において、３つのグリコシル化部位を有するよう変更されたグリコシル化レプチン蛋白であって、その３つの部位が（配列番号１の番号割り付けに関して）
２＋４７＋６９；
２３＋４７＋６９；
４７＋６９＋１００；
４７＋６９＋１０２；
４８＋６９＋１１８；
６９＋１０２＋１１８；および
６９＋１０３＋１１８
からなる群より選択される、グリコシル化レプチン蛋白。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸１〜１４６において、４つのグリコシル化部位を有するよう変更されたグリコシル化レプチン蛋白であって、その４つの部位が（配列番号１の番号割り付けに関して）
２＋４７＋６９＋９２；
２＋４７＋６９＋１０２；
２３＋４７＋６９＋９２；
２３＋４７＋６９＋１０２；および
４７＋６９＋１００＋１０２
からなる群より選択される、グリコシル化レプチン蛋白。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸１〜１４６において、５つのグリコシル化部位を有するよう変更されたグリコシル化レプチン蛋白であって、その５つの部位が（配列番号１の番号割り付けに関して）
２＋２３＋４７＋６９＋９２；
２＋４７＋６９＋９２＋１０２；および
２３＋４７＋６９＋９２＋１０２
からなる群より選択される、グリコシル化レプチン蛋白。
【請求項５】
アミノ酸位置２、４７および６９にＮ位を含み、下記のアミノ酸配列（配列番号２６）を含むグリコシル化レプチン。
【化１】
0004841037.tif 000051
【請求項６】
アミノ酸位置２、４７、６９および９２にＮ位を含み、下記のアミノ酸配列（配列番号２８）を含むグリコシル化レプチン。
【化２】
0004841037.tif 000052
【請求項７】
アミノ酸位置２、４７、６９および１０２にＮ位を含み、下記のアミノ酸配列（配列番号３０）を含むグリコシル化レプチン。
【化３】
0004841037.tif 000053
【請求項８】
アミノ酸位置４７、６９および１０２にＮ位を含み、下記のアミノ酸配列（配列番号３２）を含むグリコシル化レプチン。
【化４】
0004841037.tif 000054
【請求項９】
アミノ酸位置２、４７、６９、９２および１０２にＮ位を含み、下記のアミノ酸配列（配列番号３４）を含むグリコシル化レプチン。
【化５】
0004841037.tif 000055
【請求項１０】
アミノ酸位置４７、６９、９２および１０２にＮ位を含み、下記のアミノ酸配列（配列番号３６）を含むグリコシル化レプチン。
【化６】
0004841037.tif 000056
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれかに記載のグリコシル化レプチン蛋白をコードする核酸。
【請求項１２】
下記の核酸配列（配列番号２５）を含む、アミノ酸位置２、４７および６９にＮ位を含むグリコシル化レプチンをコードする核酸。
【化７】
0004841037.tif 000057
【請求項１３】
下記の核酸配列（配列番号２７）を含む、アミノ酸位置２、４７、６９および９２にＮ位を含むグリコシル化レプチンをコードする核酸。
【化８】
0004841037.tif 000058
【請求項１４】
下記の核酸配列（配列番号２９）を含む、アミノ酸位置２、４７、６９および１０２にＮ位を含むグリコシル化レプチンをコードする核酸。
【化９】
0004841037.tif 000059
【請求項１５】
下記の核酸配列（配列番号３１）を含む、アミノ酸位置４７、６９および１０２にＮ位を含むグリコシル化レプチンをコードする核酸。
【化１０】
0004841037.tif 000060
【請求項１６】
下記の核酸配列（配列番号３３）を含む、アミノ酸位置２、４７、６９、９２および１０２にＮ位を含むグリコシル化レプチンをコードする核酸。
【化１１】
0004841037.tif 000061
【請求項１７】
下記の核酸配列（配列番号３５）を含む、アミノ酸位置４７、６９、９２および１０２にＮ位を含むグリコシル化レプチンをコードする核酸。
【化１２】
0004841037.tif 000062
【請求項１８】
請求項１１ないし１７のいずれかに記載の核酸を含むベクター。
【請求項１９】
発現ベクターである請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１ないし１０のいずれかに記載のグリコシル化レプチン蛋白をコードする核酸を含む宿主細胞。
【請求項２１】
原核細胞および真核細胞から選択される請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
細菌細胞である請求項２１に記載の原核宿主細胞。
【請求項２３】
哺乳動物細胞、酵母細胞および昆虫細胞から選択される請求項２１に記載の真核宿主細胞。
【請求項２４】
ヒト細胞、サル細胞、ＢＨＫ細胞およびＣＨＯ細胞から選択される請求項２３に記載の哺乳動物宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１ないし１０のいずれかに記載のグリコシル化レプチン蛋白の製造方法であって、
（ａ）発現に好適な条件下に前記グリコシル化レプチン蛋白をコードする核酸を含む細胞を培養する段階、ならびに
（ｂ）前記蛋白を得る段階を有してなる請求項１ないし１０のいずれかに記載のグリコシル化レプチン蛋白の製造方法。
【請求項２６】
非経口注射、静脈注射、皮下注射、硬膜内投与、経鼻投与、肺投与および浸透圧ポンプ投与用の医薬組成物であって、医薬的に許容される担体中に請求項１ないし１０のいずれかに記載のグリコシル化レプチン蛋白を含む医薬組成物。
【請求項２７】
肥満、糖尿病および高血中脂質含有量効果から選択される状態に関してヒトを治療するための医薬組成物であって、
治療上有効量の請求項１ないし１０のいずれかに記載のグリコシル化ヒトレプチンを含む、前記組成物。
【請求項２８】
肥満、糖尿病および高血中脂質含有量効果から選択される状態に関してヒトを、治療上有効量のグリコシル化ヒトレプチンを用いて治療するための医薬組成物であって、請求項１１ないし１７のいずれかに記載の核酸を含む、前記組成物。
【請求項２９】
グリコシル化レプチン蛋白の製造方法において、
（ａ）発現に好適な条件下に、５’から３’の方向で（ｉ）シグナルペプチドおよび（ｉｉ）請求項１ないし１０のいずれかに記載のグリコシル化レプチン蛋白をコードするＤＮＡ配列を有する宿主細胞を培養する段階、ならびに
（ｂ）前記グリコシル化レプチン蛋白を取得する段階
を有することを特徴とする方法。
【請求項３０】
前記シグナルペプチドが
【化１３】
0004841037.tif 000063
から選択される請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、グリコシル化レプチン組成物および関連する方法に関する。本発明には、特性の改善を可能とするストークス半径を有するグリコシル化レプチン蛋白ならびにグリコシル化のための選択部位を有するグリコシル化レプチン蛋白、そのような蛋白をコードする核酸、関連する宿主細胞、ベクター、製造方法、ならびにそのような組成物の使用方法が含まれる。グリコシル化蛋白の新規な製造方法も提供される。
【０００２】
（背景技術）
肥満の分子的基礎はあまり解明されていないが、「ＯＢ遺伝子」およびコードされる蛋白（「ＯＢ」蛋白、本明細書では「レプチン」とも称する）が同定されたことで、身体が身体の脂肪沈着を調節するのに使用する機序について解明の端緒が得られた（Zhang et al., Nature 372: 425-432 (1994)（引用によって本明細書に含まれる）；the Correction at Nature 374: 479 (1995)も参照（これも引用によって本明細書に含まれる）。）。ＯＢ蛋白は、ｏｂ／ｏｂ突然変異マウス（ＯＢ遺伝子産生物の産生に欠陥があることが原因のマウス肥満）と正常な野生型のマウスの両方でin vivoにて活性である。その生理活性はそれ自体特に、減量において発現される（Barinaga, ”Obese” Protein Slims Mice, Science 269: 475-476 (1995)参照。ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９６／０５３０９、「Modulators of Body Weight, Corresponding Nucleic Acids and Proteins, and Diagnostic and Therapeutic Uses Thereof」（引用によってその全体が本明細書に含まれる）参照。さらに、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９６／４０９１２、ＷＯ９７／０６８１６、ＷＯ９７／１８８３３、ＷＯ９７／３８０１４、ＷＯ９８／０８５１２およびＷＯ９８／２８４２７（これらはいずれもＯＢ法および組成物についてかなり詳細に記載したものであり、引用によってその全体が本明細書に含まれるものとする）参照。）。
【０００３】
ＯＢ蛋白の他の生理効果については十分には特性決定されていない（レプチンと哺乳動物における体重調節についての総覧に関してFriedman et al., Nature 395: 763-770 (1998年10月)参照（引用によって本明細書に含まれる）。）。例えば、ｏｂ／ｏｂ突然変異マウスにおいて、ＯＢ蛋白を投与することで、血清インシュリン濃度と血清グルコース濃度に低下が生じることが知られている。さらに、ＯＢ蛋白投与によって体脂肪の減少が生じることも知られている。それは、ｏｂ／ｏｂ突然変異マウスだけでなく、非肥満正常マウスにおいても認められた（Pelleymounter e t al., Science 269: 540-543 (1995); Halaas et al., Science 269: 543-549 (1995)。Campfield et al., Science 269: 546-549 (1995)（ミクログラム用量のＯＢ蛋白の末梢および中枢投与によって、ｏｂ／ｏｂおよび食事誘発肥満マウスの飼料摂取および体重が低下したが、ｄｂ／ｄｂ肥満マウスではそのような低下はなかった。）参照。）。これらの報告で、最高用量であっても毒性が認められたものはなかった。
【０００４】
組換えレプチンは、ヒトにおいて減量させる上で有効である（Greenberg AS, Heymsfield SB, Fujioka K, et al., Preliminary safety and efficacy of recombinant methionyl human leptin (rL) administered by SC injection in lean and obese subjects。イリノイ州シカゴでの１９９８年６月１４日における米国糖尿病協会の学会（58th Annual Meeting and Scientific Sessions of the American Diabetes Association）で発表のポスター（引用によって本明細書に含まれる）。）。これまで明らかになっているように、肥満ヒトに組換えメチオニルヒトレプチンを投与することで、毒性を伴わずに減量が生じている。さらに、失われる体重は主として脂肪である（Heymsfield et al., Weight and body composition changes in lean and obese subjects treated with recombinant methionyl human leptin。フランスのパリで開催された１９９８年８月２９日〜９月３日の国際肥満会議（International Congress on Obesity）で発表のポスター（引用によって本明細書に含まれる）。）。
【０００５】
天然ヒトレプチンは、ヒトにおいて比較的早い半減期を有することが知られている（Lau et al., Pharmacokinetics of recombinant methionyl human leptin and the effect of antibody formation in lean and obese subjects following subcutaneous dosing。フランスのパリで開催された１９９８年８月２９日〜９月３日の国際肥満会議（International Congress on Obesity）で発表のポスター（引用によって本明細書に含まれる）。）。全身循環において、当該蛋白を比較的大きい用量で、あるいは比較的高頻度で投与することで蓄積させることができる。報告では、外因性ならびに内因性のレプチンは、少なくとも部分的に腎臓によって循環から除去されることが示されている（例えば、Cumin et al., Journal of Endocrinology, 155: 577-585 (1997)およびCumin et al., Internal Journal of Obesity 21: 495-504 (1997)参照（いずれも引用によって本明細書に含まれるものとする）。）。
【０００６】
腎臓は、尿中で特定の物質を濃縮することでその物質を血漿から除去する機能を有する（例えば、Harth, The Function of the Kidneys, In: Human Physiology, Schmidt et al., eds., Springer-Verlag New York, Heidelberg, Berlin, 1983, pp. 610-642（引用によって本明細書に含まれる）参照。）。血清蛋白が腎臓を通過し得る速度または程度を推算することは困難であるが、概して腎臓の解剖学から、水や小さい溶質は自由に通過するが、血漿蛋白の通過に対しては障壁が加わる。物質が異なると「濾過可能性」、腎臓クリアランス速度が異なる（Anderson et al., Renal and Systemic Manifestations of Glomerular Disease, In: The Kidney, Brener et al., eds., Harcort Brace Joanovich, Inc., Philadelphia, PA 1991, pp.1831-1843参照（引用によって本明細書に含まれる）。）。
【０００７】
レプチンは、浸透圧ポンプによるものなどの連続投与や循環時間を延長するような蛋白の化学的誘導体化によって、レプチンを全身循環中に蓄積させることができる（例えば、１９９６年１２月１９日公開のＰＣＴ  ＷＯ９６／４０９１２（引用によって全体が本明細書に含まれる）参照。）。しかしながら、組換えで産生される蛋白の化学的誘導体化には、通常２段階が必要であり、段階１で蛋白を製造し、段階２で化学部分（ポリエチレングリコールまたはデキストラン部分など）を付加させる（例えば、Ｎ−末端誘導体化レプチンについての説明に関しては、上記のＰＣＴ  ＷＯ９６／４０９１２の８頁以降参照（その明細書ではＯＢ蛋白と称している）。）。
【０００８】
組換えＤＮＡ系における「１段階」法については、融合蛋白（別途、「キメラ」蛋白と称される）をコードすることができ、その場合には別のポリペプチド部分を所望の蛋白とともにコードして、両方が発現されるようにする。その蛋白を延長することで、循環時間を延長することもできる。抗体の「Ｆｃ」部分またはアルブミンなどのポリペプチドがそれに関しては用いられている（例えば、「OB Fusion Protein Compositions and Methods」を発明の名称するＰＣＴ  ＷＯ９８／２８４２７参照（引用によって本明細書に含まれる）。）。製造における一般的な欠点は、相対的に大きい発現産生物は、適切な配置に畳み込むことが困難になるために、相対的に小さい産生物の場合より収率が低下する可能性があるという点である。さらに、用量当たりの蛋白総負荷量が増加すると、治療蛋白の割合が小さくなり、さらに大きい融合蛋白を使用することになる。
【０００９】
蛋白上に炭水化物が存在すると、それのクリアランス速度に影響がある場合があり、in vivoでの効力が改善される場合があると同時に、それが蛋白の固有の活性、溶解度、安定性および免疫原性に影響を与える場合がある（例えば、発明の名称「Erythropoietin analogs with additional glycosylation sites」という１９９５年３月１日公開の欧州特許公開０６４０６１９号（引用によって本明細書に含まれる）ならびに発明の名称「MPL Ligand Analogs」という１９９６年８月２２日公開のＰＣＴ特許公開ＷＯ９６／２５４９８参照（これらはいずれも引用によって本明細書に含まれる）。）。
【００１０】
さらに、炭水化物を真核細胞産生によって加えて、２段階プロセスを行わずに済ますことができる（例えば、１９９６年１１月１４日公開のＰＣＴ／ＵＳ９６／０６６０９では、哺乳動物細胞からのｏｂ蛋白分泌のための各種哺乳動物信号配列が提案されている（例えば１１〜１２頁）。さらに、発明の名称「Mutational Variants of Mammalian OB Gene Proteins」という１９９７年６月１２日公開のＰＣＴ  ＷＯ９７／２０９３３（特に、ＯＢ蛋白グリコシル化を提案している１１頁）参照。）。グリコシル化は、ポリペプチド骨格方向の特定の位置で起こる。通常は２種類のグリコシル化があり、配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘはプロリン以外のアミノ酸であることができる）の一部である場合に、Ｏ−連結オリゴ糖はセリンまたはトレオニン残基に結合し、Ｎ−連結オリゴ糖はアスパラギン残基に結合している。Ｎ−連結およびＯ−連結オリゴ糖の構造ならびに各種類で認められる糖残基の構造は異なっている。両方で共通に認められる１種類の糖は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（以下、シアル酸と称する）である。シアル酸は通常、哺乳動物細胞におけるＮ−連結およびＯ−連結オリゴ糖の両方の末端残基であり、負電荷を有することから、糖蛋白に酸性を与えることができる。天然ヒトレプチン（ヒト細胞中で提供される）の支配的な形はグリコシル化されていない。成熟蛋白の位置２８にグルタミンがない天然蛋白の変種（配列番号２、以下参照）は、グリコシル化のための部位を２つ有する。これらの部位はいずれもＯ−連結グリコシル化のためのものである。しかしながら、この形はヒトにおいてはごく微量しか産生されず、in vivoで支配的な活性型ではないと考えられている。
【００１１】
レプチンの全身循環時間が延長し、上記のような第２の誘導体化段階を必要としない方法を使えることが望ましいと考えられる。さらには、免疫原性その他の有害効果を引き起こしたり増悪することなく、レプチンの固有活性と溶解度を高めることも望ましい。
【００１２】
（発明の開示）
本発明は、未変化の天然組換えヒトレプチンと比較して、グリコシル化レプチン蛋白がin vivoで機能性であり、さらにはある種の形のグリコシル化レプチン蛋白が毒性を伴うことなくin vivoで相対的に長い全身循環時間を有するという所見に基づいたものである。
【００１３】
驚くべきことに、しかも重要な点として、１個のＮ−連結グリコシル化部位を有するグリコシル化ヒトレプチンはin vitroだけでなくin vivoでも生理活性を有することが認められている。さらにその生理活性は、組換えヒト天然レプチン蛋白と同等または若干強力である。上記で示したように、肥満に対するレプチンの効果は一部には、脳における作用によるものと考えられる。上記で示したように、レプチンは天然にグリコシル化された分子ではない（ヒト血清で支配的な形であると考えられている配列番号１のＱ＋２８型（下記参照）で）。さらに、グリコシル化蛋白（糖蛋白）は、血液−脳関門を通過できないために、脳に入ることができない。グリコシル化レプチンによって同等（または若干良好な）の生理活性が示されることは、（ａ）グリコシル化レプチンが脳に進入するか、あるいは（ｂ）進入しなくとも、グリコシル化レプチンが天然組換えヒトレプチンより末梢組織（内臓領域の脂肪組織など）における生理活性が高いことを示している。
【００１４】
さらに、３つの部位でＮ−グリコシル化されたヒトレプチンが、天然ヒトレプチンまたは１ヶ所でＮ−グリコシル化されたレプチンと比較して循環時間および効力がはるかに長いことも認められている。以下の実施例で示すように、各種の２ヶ所、３ヶ所、４ヶ所および５ヶ所グリコシル化レプチンを製造し、in vitroでの活性試験と場合によってはin vivoでの活性試験を行った。
【００１５】
本発明のグリコシル化レプチンは、所望の比較的長い血漿半減期を有することができる。ストークス半径が３０Å以上である本発明のグリコシル化レプチンは、膜を通過する上での濾過可能性の率が低下しているため、腎臓での分解率が低下している。
【００１６】
ストークス半径は各種方法によって示すことができるが、本発明で好ましい方法は、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いるというものである（標準として用いるための各種蛋白のストークス半径を求めるためのゲル濾過クロマトグラフィーに関する概論としては、Le Maire et al., Analytical Biochemistry 154: 525-535 (1986)参照（引用によって本明細書に含まれる）。）。従って、本発明のグリコシル化レプチンは、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて測定した場合にストークス半径が約３０Åであるものである。
【００１７】
本発明のグリコシル化レプチンはまた、肝臓におけるクリアランスを実質的に回避するものであることが好ましい。肝臓は、ガラクトースに結合する受容体を有することが知られている。ガラクトースは糖類であり、本発明のグリコシル化レプチン上の炭水化物部分の構成要素であることができる。シアル酸は代表的には、ガラクトース部分を「キャッピング」し、肝臓中のガラクトース受容体とそれとの反応性を防止する。さらに、シアル酸部分は負電荷を与える。本発明のグリコシル化レプチンの負電荷が大きいほど、肝臓および腎臓の負に帯電した膜と「反発」する。従って、本発明のグリコシル化レプチン蛋白は好ましくは、ガラクトース受容体への結合には使えない少なくとも大半のガラクトース部分を有する、より好ましくはシアル化に利用可能な少なくとも大半の部位にあるシアル酸部分を有するものである。
【００１８】
本明細書で説明するように、１つの部位または３つの部位にＮ−連結グリコシル化のための部位を有するよう変更された組換えヒトレプチンは、グリコシル化レプチン蛋白が機能性であり得ること、ならびに天然ヒトと同様に機能性であり得ることを示していた。グリコシル化は、細胞培養において宿主細胞機関（machinery）を介して行われたことから、相対的に長い血清半減期という所望の特性を得るための特別な工程段階（蛋白を誘導体化する上で必要なもの）を必要としなかった。
【００１９】
従って１態様において本発明は、配列番号２の天然グリコシル化ヒトレプチン（ｒＨｕ−レプチン１〜１４５、下記）のものより大きいストークス半径を有するグリコシル化レプチン蛋白に関するものである。別の態様において本発明は、１個のＮ−連結グリコシル化部分を有するグリコシル化レプチン蛋白と比較して、ストローク半径を有するグリコシル化レプチン蛋白に関する。さらに別の態様において本発明は、ゲル濾過によって測定して、３０Å以上のストークス半径を有するグリコシル化レプチン蛋白に関するものである。
【００２０】
本発明はさらに、１以上の別のグリコシル化部位を有するレプチン蛋白に関するものである。さらに別の形において本発明は、５以上のシアル酸部分を有するグリコシル化レプチン蛋白に関するものである。天然ヒトレプチン変異体（配列番号２、下記）はＯ−連結グリコシル化のための２つの部位を有することから、４つのシアル酸部分を有することができる。本明細書の実施例では、より多くグリコシル化されたレプチン蛋白は循環時間がかなり改善されていることが示される。さらに本発明は、５個、６個または７個のシアル酸部分を有するグリコシル化レプチン蛋白に関するものである。
【００２１】
他の態様において本発明は、本明細書に記載のグリコシル化レプチン蛋白をコードする核酸、ならびに本発明の開示によるグリコシル化レプチン蛋白をコードする核酸を含むベクターに関するものである。
【００２２】
そこでさらに別の態様において本発明は、本発明の開示によるグリコシル化レプチン蛋白をコードする核酸を含む宿主細胞に関する。
【００２３】
本発明はさらに、遺伝子治療での本発明の核酸の使用に関するものでもある。さらに本発明は、グリコシル化レプチン蛋白の製造方法に関するものである。
【００２４】
本発明はさらに、本発明のグリコシル化レプチン蛋白に選択的に結合する抗体などの選択的結合分子に関するものである。
【００２５】
以下にさらに詳細に記載の他の態様において本発明は、医薬的に許容される担体中に本発明のグリコシル化レプチン蛋白を含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、肥満、糖尿病および高脂血効果から選択される状態に関してヒトを治療する方法であって、有効量の本発明によるグリコシル化ヒトレプチンを投与する段階を有する方法に関するものである。
【００２６】
本発明はさらに、グリコシル化レプチン蛋白の改良された製造方法、ならびに一般にグリコシル化蛋白の改良された製造方法に関するものでもある。本明細書の実施例は、本発明のグリコシル化レプチン蛋白に関して、天然ヒトレプチン信号ペプチド以外の信号ペプチドの使用がグリコシル化効率を高めることを示している。その場合、グリコシル化効率が高められることで、加えられる炭水化物鎖の数および大きさの両方の上昇という望ましい性質が得られる。そこで本発明の組成物および方法は、天然レプチン信号ペプチド以外の信号ペプチドの使用を含むものである。天然ヒトレプチン信号は別として、いずれも天然に認められることが知られている特定の信号ペプチド（すなわち、天然信号ペプチドとは、人為的に、相同組換え、組換えＤＮＡ法その他の核酸配列構成物を変えることが知られているか期待される手段などの手段によって遺伝子的に操作されていないものである。ただし、それを含む細胞は、培養されていてもよいか、あるいはそれの天然のin vivo環境から除去されていても良い。）、ならびに天然には認められないもの（すなわち、非天然信号ペプチドとは、上記のように人為的に遺伝子操作されたものを指す）について以下に記載する。
【００２７】
本発明はさらに、信号ペプチドならびに成熟蛋白の処理で除去される他の蛋白の変更によってグリコシル化蛋白の収率が高くなるという所見に関するものもである。信号ペプチド変更は、開裂の正確さを改善する（従って、予想されるＮ末端アミノ酸配列を有する所望のグリコシル化蛋白を比較的高収率で製造する）ためのペプチダーゼ開裂部位の変更を含むものである。信号ペプチド変更はさらに、あるいは別法として、前駆配列からの成熟蛋白の「正確な」開裂がない場合であっても、グリコシル化効率を大きく高めることができる（「正確な」とは、Ｎ−末端上の第１のアミノ酸が信号蛋白その他の前駆配列上で認められるアミノ酸を持たない予想される成熟蛋白におけるものであることを示している）。他の変更には、やはり開裂されるが、グリコシル化効率を高める「前駆配列」の付加などがある。天然ならびに非天然信号ペプチドは、それ自体変更させることができる。本明細書には具体例が示してある。
【００２８】
従って本発明は、グリコシル化蛋白の改良された製造方法であって、
（ａ）発現およびグリコシル化のための好適な条件下に、５’から３’の方向に（ｉ）信号ペプチドおよび（ｉｉ）グリコシル化蛋白をコードするＤＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む宿主細胞を培養する段階、ならびに
（ｂ）前記グリコシル化蛋白を得る段階を有し、
前記改良が、前記グリコシル化蛋白の収量を最大とするために至適化されたペプチダーゼ開裂部位を有する信号ペプチドの使用ならびに適宜に前駆配列の付加を含む方法に関するものでもある。
【００２９】
（図面の簡単な説明）
図１は、各種用量の１部位グリコシル化レプチン（「グリコシル化ＣＨＯレプチン」）および非グリコシル化ｒｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６（「レプチン」）を投与した動物についての、緩衝液対照と比較した体重減少を示すグラフである。
【００３０】
図２は、以下の実施例５および６で詳細に説明されるウェスタンブロットであって、グリコシル化部位のアミノ酸配列の変化によってグリコシル化の種類や量が変化し得ることを示す図である。
【００３１】
図３は、実施例７で詳細に説明される、雄ＣＤ−１マウスにおいて１．０ｍｇ／ｋｇのｒｍｅｔＨｕ−レプチンまたは３部位グリコシル化レプチン蛋白を皮下投与した後の血清レプチン濃度のグラフである。
【００３２】
図４は、実施例７で詳細に説明される、雄ＣＤ−１マウスにおいて１．０ｍｇ／ｋｇのｒｍｅｔＨｕ−レプチンまたは３部位グリコシル化レプチン蛋白を静脈投与した後の血清レプチン濃度のグラフである。
【００３３】
図５は、実施例８で詳細に説明される、３部位グリコシル化レプチン蛋白（「ＧＥ−レプチン」）投与時の体重減少のグラフである。
【００３４】
図６は、実施例９で詳細に説明される、３部位グリコシル化レプチン蛋白（「ＧＥ−レプチン」）投与時の飼料摂取のグラフである。
【００３５】
図７は、実施例１４で詳細に説明される、３部位グリコシル化レプチン蛋白の発現およびグリコシル化に対する各種信号ペプチドの効果を示すウェスタンブロットである。
【００３６】
図８は、実施例１４で詳細に説明される、３部位グリコシル化レプチン蛋白のグリコシル化に対する各種信号ペプチドならびに他のペプチドの効果を示すウェスタンブロットである。
【００３７】
図９は、実施例１４で詳細に説明される、３部位グリコシル化レプチン蛋白のグリコシル化に対するペプチダーゼ開裂部位の効果を示すウェスタンブロットである。
【００３８】
図１０は、実施例１４で詳細に説明される、３部位グリコシル化レプチン蛋白のグリコシル化に対する各種信号ペプチドおよび他のペプチドの効果を示すウェスタンブロットである。
【００３９】
図１１は、以下の実施例１５に記載のウェスタンブロットであって、少なくとも５部位までグリコシル化部位数を増加させることで、ＣＨＯ細胞で発現する際にレプチン蛋白上で認められるグリコシル化の量が上昇することを示している。
【００４０】
（発明を実施するための最良の形態）
以上で示したように、本発明は１態様において、天然グリコシル化ヒトレプチンのものより大きいストークス半径を有するグリコシル化レプチン蛋白に関するものである。好ましくは全身循環での治療組成物の半減期を延長するには、ストークス半径は腎臓における濾過性を低下させるだけのものとする。その大きさのストークス半径を有することの効果は、その有効な大きさを持たないグリコシル化その他のレプチン蛋白について考えられる以上の長期間にわたって全身循環でグリコシル化レプチン蛋白が維持されるというものである。本発明のグリコシル化レプチン蛋白についてのストークス半径の経験的な測定によれば、その大きさは、以下に詳細に説明する方法によって測定した場合に３０Å以上でなければならない。個々のグリコシル化レプチン蛋白分子に関して用いる場合、「約」という用語は、個々のグリコシル化レプチン蛋白分子についての期間にわたる平均ストークス半径を意味する。
【００４１】
本明細書で示されるように、天然レプチン蛋白より大きいストークス半径を有するグリコシル化レプチン蛋白は、改良された特性を有する。治療上有効な用量で存在するものなどのグリコシル化レプチン蛋白分子の群における好ましいストークス半径は、約３０Å以上のものである。ここでの「約」という用語は、グリコシル化レプチン蛋白分子の群において、一部は相対的に大きいストークス半径を有し、一部は相対的に小さいストークス半径を有するが、所定のグリコシル化レプチン蛋白の群の平均ストークス半径は３０Å以上であることを示している。
【００４２】
ストークス半径が約３０Åから大きくなるに連れて、グリコシル化レプチン蛋白分子の有効径が大きくなる。有効径が大きくなるに連れて、すなわちオリゴ糖付加によって得られる流体力学的容量が大きくなるに連れて、身体全体における基底膜を通る有効移動が遅くなる。レプチンが分解を受ける尿細管に達するには、最初に糸球体の基底膜を通過しなければならない。そこで、流体力学的大きさが大きくなると、糸球体膜を通る濾過が遅くなることから分解が遅くなり、従って近位細管でのポリペプチドの最終的なクリアランスが遅くなる。例えば、本発明の３−グリコシル化部位レプチンすなわち４７位、６９位および１０２位にグリコシル化部位を有するｒＨｕ−レプチン１〜１４６（すなわち、４７位、６９位および１０２位で置換されたアスパラギン残基ならびに２９位、７１位および１０４位で置換されたトレオニン残基を有する）は、３２．１Åという平均ストークス半径を有する（３１．９Åおよび３２．３Åという２つのゲル濾過測定値に基づいた値）。以下の実施例では、このグリコシル化レプチンがｒｍｔＨｕ−レプチンと比較して、４〜５倍の全身クリアランスにおける低下および半減期延長を示したことが明らかになっている。
【００４３】
やはり上記で示したように、分子のストークス半径を測定するにはいくつかの方法がある。本発明のグリコシル化レプチン蛋白に関しては、そのストークス半径は、ゲル濾過を用いて測定する（Le Maire et al., supra参照。さらに、Kyte, Structure in Protein Chemistry, Garland Publishing, Inc., New York and London, 1995, pp.293-316参照（引用によって本明細書に含まれる）。）。現在のところ、ストークス半径を測定するのに使用されるゲル濾過は、デキストランが共有結合的に結合したポリマー（アガロース）ビーズである。市販の製造品には、スーパーデックス（Superdex（商標））２００ＨＲ１０／３０（Pharmacia）およびセファクリル（Sephacryl（登録商標））Ｓ−２００高分解能（Pharmacia）などがある。これら２種類の製造品を二者択一で用いて、本発明のグリコシル化レプチン蛋白のストークス半径を測定した。
【００４４】
カラムはいかなる径であっても良いが、取り扱いの容易さという点で、約１×３０ｃｍの大きさが好ましい。上記ゲル濾過物質それぞれについてのカラム製品の取扱説明書は、引用によってその全体が本明細書に含まれる（文書番号は、スーパーデックス（商標）については７１−７０５９−００  ＡＢ版であり、セファクリル（登録商標）については５２−２０８６−００−０３である）。
【００４５】
使用される緩衝液は、分子の溶液配座をほとんど変化させず、蛋白分子のサイズ分離を妨害しない生理的緩衝液にかなり近いものでなければならない。リン酸緩衝生理食塩水が好ましく、本発明のグリコシル化レプチン蛋白のストークス半径測定に用いた。
【００４６】
ゲル濾過を行う方法は、上記で本明細書に組み込まれた取扱説明書に従わなければならない。ストークス半径を測定する特定のグリコシル化レプチン蛋白をカラムに負荷しなければならない。例えば０．４  Ａ２８０／ｍＬという濃度（約０．４５ｍｇ／ｍＬ）以下を、３部位グリコシル化レプチン（４７、４９、１０２）に用いた。ここで使用の緩衝液はＰＢＳであったが、他の緩衝液も使用可能である。負荷用の緩衝液は、ゲル濾過の規範に適合するものでなければならず、理論上は高量の塩ならびに当業者が適切であると考えるものと適合する他の材料を含むことができると考えられる。負荷または保存緩衝液は、ストークス半径測定を妨害するものであってはならない（それがカラムに当たる際に沈殿したり、あるいはそれが溶出する際に変更したり再折畳みを必要とすることで）。以前には使用していないゲル濾過物質のカラムが好ましい。リン酸緩衝生理食塩水などの洗浄緩衝液は、０．２５ｍＬ／分の流量または０．３ｃｍ／ｍＬの線形流量で加えなければならない。この値は、ゲルの特性によって決まるものであり、基本的には製造業者の説明に従う。溶出する分画には、ゲル濾過物質によって捕捉されないグリコシル化レプチン蛋白分子が含まれる。
【００４７】
ストークス半径を測定するには、被験グリコシル化レプチン蛋白を、ゲル濾過カラムの較正に使用される既知の蛋白と比較する必要がある。ゲル濾過較正キット取扱説明書（Pharmacia Biotech文書１１−Ｂ−０３３−０７、改訂２版）における方法が、引用によって本明細書に含まれる。一般に、既知のストークス半径の特定の蛋白をカラム濾過し、それぞれ溶出した分画を記録する。対象のグリコシル化レプチン蛋白を含む分画を、較正蛋白の分画と比較する。
【００４８】
そこで、グリコシル化レプチン蛋白は、ゲル濾過での測定で３０Å以上のストークス半径を有するものである（以下に示すようにさらに行うことができる化学的誘導体化を行っていない、グリコシル化レプチン蛋白部分単独のもの）。ゲル濾過は、上記で説明したスーパーデックス（商標）またはセファルクリル（登録商標）などのデキストランコーティングアガロースゲル濾過物質を用いて行うことができる。緩衝液はリン酸緩衝生理食塩水であることができる。
【００４９】
レプチンのアミノ酸配列
１．グリコシル化部位
一般に、本発明のグリコシル化レプチン組成物を製造するには、特定のアミノ酸配列から開始して、その配列を修飾することで、Ｎ−連結またはＯ−連結グリコシル化のための部位を付加する。以下の式は、Ｎ−連結グリコシル化のための部位を付加する上で好ましい（概論については、Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company, N. Y., (1984), p.498およびpp.76-78の索引（引用によって本明細書に含まれる）参照）。
【００５０】
【数１】
0004841037.tif 000002
【００５１】
式中、「Ｎ」はアスパラギンであり；「Ｘ」はプロリン以外のアミノ酸であり；「Ｔ／Ｓ」はトレオニンまたはセリンである。好ましいものとしては「Ｎ−Ｘ−Ｔ」であり、それによって、最初のレプチンアミノ酸配列に関しての変更が、「Ｘ：が最初のレプチン配列（好ましくは配列番号１または２、以下参照）についてのものと同じままであり、直後の下流側のアミノ酸（Ｃ−末端方向）がトレオニンであるというものである。その蛋白の外側表面にあるＮ−連結部位が好ましい。グリコシル化に好適な表面残基は、３次元構造またはモデルを調べることで、あるいは核磁気共鳴または結晶構造（以下で説明）によって確認することができる。さらに、いくつかのグリコシル化部位におけるアスパラギン残基に関して−１位にあるプロリン（すなわちＮ−末端方向）が悪影響を与え得ること、ならびにそのような部位でのプロリン残基を回避するようにすることが可能であることが確認されている。実施例５および６では、Ｎ−Ｘ−ＳとＮ−Ｘ−Ｔならびに隣接するアミノ酸類のグリコシル化部位占有の効果が示してある。
【００５２】
Ｏ−連結グリコシル化部位は、プロリン残基付近またはそれに隣接する蛋白の外表面で認められる。Ｏ−連結部位は、プロリン残基の付近またはそれに隣接したセリンまたはトレオニン残基を含めることで認めることができるか導入することができる。一般にトレオニン残基が好ましい。例えば配列番号１（以下）は９９位にプロリンを有しており、１００位にトレオニンが導入されている。このレプチンは、ＣＨＯ細胞およびＣＯＳ細胞で発現されており、Ｏ−連結グリコシル化された。
【００５３】
さらに、本発明のグリコシル化レプチン蛋白においてＮ−連結およびＯ−グリコシル化部位を組み合わせるように選択することができる。前述のように、１以上のＯ−連結グリコシル化部位を加えることができ、さらには、１以上のＮ−連結グリコシル化部位を加えることができる。
【００５４】
２．グリコシル化の部位
一般に、上記式を用いて蛋白骨格を変更させることで、Ｎ−連結またはＯ−連結グリコシル化部位を加える。
【００５５】
Ｎ−グリコシル化用の蛋白骨格方向で部位を選択するための一般則は、アスパラギン残基が蛋白の外表面に負荷されていることで、炭水化物部分を付加する上で利用可能でなければならないというものである。例えばレプチンの２次元構造に関して、アスパラギン残基は、ループ、β−ターンまたはα−ヘリックスの外側表面になければならない。この分析は、レプチンの現在の構造およびいくつかのサイトカイン類の構造−機能相関に基づいたものである。
【００５６】
グリコシル化用の部位を選択する場合、レプチンの３次元配座を考慮することができる。レプチンの最初の７個のアミノ酸が乱れており、それは一定量の可撓性を示す。トポロジー的には、レプチン構造（Zhang et al., Nature 387: 206-209 (1997)；肥満蛋白レプチンＥ−１００の結晶構造を報告、引用によって本明細書に含まれる）は、サイトカインである顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）（例えば、結晶ｒｍｅｔＨｕＧ−ＣＳＦの３次元構造を開示しているオスルンド（Osslund）の米国特許５５８１４７６号参照）の構造と類似している。
【００５７】
ヘリックスＡの見かけの可撓性および見かけの生理的意義の欠落を考慮すると、配列番号１を変更させて、残基Ｖａｌ１またはＰｒｏ２にグリコシル化部位を設けることができる。
【００５８】
Ａｓｐ２３（配列番号１のもの）は、ヘリックスＡの最後のターンにあり、側鎖が少なくとも部分的に蛋白の外側表面にある場合には良好な選択であると考えられる。
【００５９】
４７位のプロリン残基および４８位のイソロイシン残基（配列番号１のもの）は、ＡＢループの末端にあり、ヘリックスＢの始めからの唯一の２個の残基である。これらは蛋白の表面にあり、グリコシル化部位挿入に好適であると考えられる。
【００６０】
６９位のプロリン残基は蛋白の表面にあり、グリコシル化には良い位置である。
【００６１】
位置９２のフェニルアラニン残基は、Ｃヘリックスの末端にあり、それの側鎖は受容体結合面であっても良いものと対向している。それは、グリコシル化部分からの受容体結合の妨害が最小限であるという点で、最も良好な結果を与えるものと考えられる。
【００６２】
１０２位のセリンはＣＤループの中央の蛋白表面にあり、１０１位（アラニン）および１０３位（グリシン）とともに、構造の比較的可撓性の部分になければならない。
【００６３】
この様に、本発明は、グリコシル化部位として１以上の配列変化を有する配列番号１（ｒＨｕ−レプチン１〜１４６、下記）または配列番号２（ｒＨｕ−レプチン１〜１４５、下記）を有するグリコシル化レプチン蛋白に関するものである。前記配列変化は以下のものから選択される。
【００６４】
０１Ｖ→Ｎ  ０２Ｐ→Ａ  ０３Ｉ→ＴまたはＳ（すなわち、下記の配列番号１における１番目のアミノ酸（すなわちバリン）のアスパラギンへの変化、２番目のアミノ酸のプロリンから他の１９種類のいずれかのアミノ酸（アラニンなど）への変化、ならびに３番目のアミノ酸のイソロイシンからトレオニンまたはセリンへの変化）。
【００６５】
０２Ｐ→Ｎ  ０３Ｉ  ０４Ｑ→ＴまたはＳ（すなわち、下記の配列番号１における２番目のアミノ酸（すなわちプロリン）のアスパラギンへの変化、３番目のアミノ酸のイソロイシンとしての維持、および４番目のアミノ酸のグルタミンからトレオニンまたはセリンへの変化）。
【００６６】
２３Ｄ→Ｎ  ２４Ｉ  ２５Ｓ→ＴまたはＳとしての維持（すなわち、下記の配列番号１における２３番目のアミノ酸（すなわちアスパラギン酸）のアスパラギンへの変化、２４番目のアミノ酸のイソロイシンとしての維持、および２５番目のアミノ酸についてのセリンとしての維持またはトレオニンへの変化）。
【００６７】
４７Ｐ→Ｎ  ４８Ｉ  ４９Ｌ→ＴまたはＳ（すなわち、４７番目のアミノ酸のプロリンからアスパラギンへの変化、４８番目のアミノ酸のイソロイシンとしての維持、および４９番目のアミノ酸のロイシンからトレオニンまたはセリンへの変化）。
【００６８】
４８Ｉ→Ｎ  ４９Ｌ  ５０ＴまたはＴ→Ｓ（すなわち、４８番目のアミノ酸のイソロイシンからアスパラギンへの変化、４９番目のアミノ酸のロイシンとしての維持、および５０番目のアミノ酸のトレオニンとしての維持またはセリンへの変化）。
【００６９】
６９Ｐ→Ｎ  ７０Ｓ  ７１Ｒ→ＴまたはＳ（すなわち、下記の配列番号１における６９番目のアミノ酸のプロリンからアスパラギンへの変化、７０番目のアミノ酸のセリンとしての維持、および７１番目のアミノ酸のアルギニンからトレオニンへの変化）。
【００７０】
９２Ｆ→Ｎ  ９３Ｓ  ９４Ｋ→ＴまたはＳ（すなわち、下記の配列番号１における９２番目のアミノ酸のフェニルアラニンからアスパラギンへの変化、９３番目のアミノ酸のセリンとしての維持、および９４番目のアミノ酸のリジンからトレオニンまたはセリンへの変化）。
【００７１】
１０１Ａ→Ｎ  １０２Ｓ  １０３Ｇ→ＴまたはＳ（すなわち、下記の配列番号１における１０１番目のアミノ酸のアラニンからアスパラギンへの変化、１０２番目のアミノ酸のセリンとしての維持、および１０３番目のアミノ酸のグリシンからトレオニンまたはセリンへの変化）。
【００７２】
１０２Ｓ→Ｎ  １０３Ｇ  １０４Ｌ→ＴまたはＳ（すなわち、下記の配列番号１における１０２番目のアミノ酸のトリプトファンからアスパラギンへの変化、１０３番目のアミノ酸のグリシンとしての維持、および１０４番目のアミノ酸のロイシンからトレオニンまたはセリンへの変化）。
【００７３】
１０３Ｇ→Ｎ  １０４Ｌ  １０５Ｅ→ＴまたはＳ（すなわち、下記の配列番号１における１０３番目のアミノ酸のグリシンからアスパラギンへの変化、１０４番目のアミノ酸のロイシンとしての維持、および１０５番目のアミノ酸のグルタミン酸からトレオニンまたはセリンへの変化）。
【００７４】
上記の簡単な記述は、配列番号１に関するアミノ酸位置を示すものであり、１個のアミノ酸の→別のアミノ酸への変化である。以下に示すように、３番目のアミノ酸（蛋白のＣ−末端方向へのアミノ酸）におけるトレオニンへの変化は、特にグリコシル化効率における商業的製造での容易さの点で好ましい。ただし上記で示したように、その位置ではセリンを用いることもできる。従来の１文字アミノ酸略称を用いている（Stryer, Biochemistry, Third Edition (1988), W. H. Freeman and Company, New York, 裏表紙、引用によって本明細書に含まれる）。
【００７５】
上記を考慮すると本発明は、下記のもの（「Ｔ／Ｓ」はトレオニンまたはセリンを示す）
（ａ）０１Ｖ→Ｎ  ０２Ｐ→Ｘ（Ｘはプロリン以外のアミノ酸である）  ０３Ｉ→Ｔ／Ｓ
（ｂ）０２Ｐ→Ｎ  ０３Ｉ  ０４Ｑ→Ｔ／Ｓ
（ｃ）２３Ｄ→Ｎ  ２４Ｉ  ２５Ｓ→Ｔ／Ｓ
（ｄ）４７Ｐ→Ｎ  ４８Ｉ  ４９Ｌ→Ｔ／Ｓ
（ｅ）４８Ｉ→Ｎ  ４９Ｌ  ５０Ｔ／Ｓ
（ｆ）６９Ｐ→Ｎ  ７０Ｓ  ７１Ｒ→Ｔ／Ｓ
（ｇ）９２Ｆ→Ｎ  ９３Ｓ  ９４Ｋ→Ｔ／Ｓ
（ｈ）１０１Ａ→Ｎ  １０２Ｓ  １０３Ｇ→Ｔ／Ｓ
（ｉ）１０２Ｓ→Ｎ  １０３Ｇ  １０４Ｌ→Ｔ／Ｓ
（ｊ）１０３Ｇ→Ｎ  １０４Ｌ  １０５Ｅ→Ｔ／Ｓ
から選択されるグリコシル化部位として１以上の配列変化を有する配列番号１（ｒＨｕ−レプチン１〜１４６、下記）を有するグリコシル化レプチン蛋白に関するものでもある。
【００７６】
以下の実施例は、単一グリコシル化および二重グリコシル化部位レプチン蛋白について、少なくとも非グリコシル化ｒｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６（配列番号１）に近い生理活性を示す。さらには、特定の３、４および５グリコシル化部位レプチン蛋白は、高い生理活性を示している。この様に本発明は、下記の実施例に記載の特定のグリコシル化レプチン蛋白をも含むものである。
【００７７】
−（配列番号１の番号割り付けに関して）１、２、４、８、２３、４４、４７、４８、６９、７０、９３、９７、１００、１０１、１０２、１０３、１１８および１４１から選択される位置に１つのグリコシル化部位を有するグリコシル化レプチン蛋白。
【００７８】
−２つのグリコシル化部位を有し、その２つの部位が（配列番号１の番号割り付けに関して）
４７＋６９、
４８＋６９、
６９＋１０１、
６９＋１０２、
６９＋１０３、
６９＋１１８および
１００＋１０２
から選択されるものである配列番号１のアミノ酸１〜１４６を有するグリコシル化レプチン蛋白。
【００７９】
−３つのグリコシル化部位を有し、その３つの部位が（配列番号１の番号割り付けに関して）
２＋４７＋６９、
２３＋４７＋６９、
４７＋６９＋１００、
４７＋６９＋１０２、
４８＋６９＋１１８、
６９＋１０２＋１１８および
６９＋１０３＋１１８
から選択されるものである配列番号１のアミノ酸１〜１４６を有するグリコシル化レプチン蛋白。
【００８０】
−４つのグリコシル化部位を有し、その４つの部位が（配列番号１の番号割り付けに関して）
２＋４７＋６９＋９２、
２＋４７＋６９＋１０２、
２３＋４７＋６９＋９２、
２３＋４７＋６９＋１０２および
４７＋６９＋１００＋１０２
から選択されるものである配列番号１のアミノ酸１〜１４６を有するグリコシル化レプチン蛋白。
【００８１】
−５つのグリコシル化部位を有し、その５つの部位が（配列番号１の番号割り付けに関して）
２＋２３＋４７＋６９＋９２、
２＋４７＋６９＋９２＋１０２、
２３＋４７＋６９＋９２＋１０２
から選択されるものである配列番号１のアミノ酸１〜１４６を有するグリコシル化レプチン蛋白。
【００８２】
より詳細には本発明には、以下のグリコシル化レプチン蛋白アミノ酸配列、そのような配列をコードするＤＮＡおよび以下に記載の具体的なＤＮＡが含まれる。
【００８３】
グリコシル化レプチン２、４７、６９（配列番号２５、ＤＮＡ）
【００８４】
【化１４】
0004841037.tif 000003
【００８５】
グリコシル化レプチン２、４７、６９（配列番号２６、蛋白）
【００８６】
【化１５】
0004841037.tif 000004
【００８７】
グリコシル化レプチン２、４７、６９、９２（配列番号２７、ＤＮＡ）
【００８８】
【化１６】
0004841037.tif 000005
【００８９】
グリコシル化レプチン２、４７、６９、９２（配列番号２８、蛋白）
【００９０】
【化１７】
0004841037.tif 000006
【００９１】
グリコシル化レプチン２、４７、６９、１０２（配列番号２９、ＤＮＡ）
【００９２】
【化１８】
0004841037.tif 000007
【００９３】
グリコシル化レプチン２、４７、６９、１０２（配列番号３０、蛋白）
【００９４】
【化１９】
0004841037.tif 000008
【００９５】
グリコシル化レプチン４７、６９、１０２（配列番号３１、ＤＮＡ）
【００９６】
【化２０】
0004841037.tif 000009
【００９７】
グリコシル化レプチン４７、６９、１０２（配列番号３２、蛋白）
【００９８】
【化２１】
0004841037.tif 000010
【００９９】
グリコシル化レプチン２、４７、６９、９２、１０２（配列番号３３、ＤＮＡ）
【０１００】
【化２２】
0004841037.tif 000011
【０１０１】
グリコシル化レプチン２、４７、６９、９２、１０２（配列番号３４、蛋白）
【０１０２】
【化２３】
0004841037.tif 000012
【０１０３】
グリコシル化レプチン４７、６９、９２、１０２（配列番号３５、ＤＮＡ）
【０１０４】
【化２４】
0004841037.tif 000013
【０１０５】
グリコシル化レプチン４７、６９、９２、１０２（配列番号３６、蛋白）
【０１０６】
【化２５】
0004841037.tif 000014
【０１０７】
これらは、以下の実施例で使用される具体的なアミノ酸配列および相当するＤＮＡであった。
【０１０８】
シアル酸部分による特定決定
さらに本発明のグリコシル化蛋白は、シアル酸部分の数によって特性決定することができる。一般に、Ｎ−連結グリコシル化部位には０〜４個のシアル酸部分があり、Ｏ−連結グリコシル化部位には０〜２個のシアル酸部分がある。代表的なグリコシル化蛋白調製物は、完全に（すなわち、全ての使用可能な部位を占有するシアル酸部分を有する）および部分的に（すなわち、全利用可能部位より少ない数を占有するシアル酸部分を有する）シアル化グリコシル化蛋白分子の混合したものを有する。
【０１０９】
シアル酸部分の数は、当業者に利用可能な方法によって求めることができる。例えば、シアル酸を除去する酵素で処理する前後に蛋白またはそれの調製物の分子量を測定し、構成要素の分子量を計算することができる。別法として、等電点分画その他の方法を用いて、シアル酸含有量を測定することができる。
【０１１０】
例えばヒトレプチン１〜１４５（配列番号２、下記）は２個のＯ−連結グリコシル化部位を有することから、完全にシアル化されると、４個のシアル酸部分を有する。単一のＮ−連結グリコシル化部位を用いた本明細書の実施例は、完全にシアル化されると４個のシアル酸部分を有する。完全にグリコシル化された場合に以下の２部位グリコシル化レプチン蛋白は、８個のシアル酸部分を有し、３部位では１２個のシアル酸部分、４部位では１６個のシアル酸部分、５部位グリコシル化レプチンでは２０個のシアル酸部分がある。この様に、本発明は、製造物中の各グリコシル化レプチン蛋白分子が５個以上のシアル酸部分を有するグリコシル化レプチン蛋白製造物を包含するものである。より好ましくは、治療性蛋白の持続的放出効果促進に関して、本発明はまた、製造物中の各グリコシル化レプチン蛋白分子が８〜２０個のシアル酸残基を有するグリコシル化レプチン蛋白製造物をも包含するものである。さらに、別のグリコシル化部位を加えることを選択し、それに応じてシアル酸含有量を２０超とすることもできる。
【０１１１】
３．レプチン蛋白骨格
グリコシル化レプチン医薬組成物に使用されるレプチンの種類は、上記で引用したＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９６／０５３０９（引用によって全体が本明細書に含まれる）に記載のものから選択することができる。その刊行物の図３（当該明細書では配列番号として引用）には、ヒトレプチン（ヒト「ＯＢ」蛋白とも称される）について誘導された全体が推定されたアミノ酸配列が示してある。そのアミノ酸には１〜１６７の番号が割り付けてある。信号配列開裂部位は、アミノ酸２１（Ａｌａ）の後にあることから、成熟蛋白はアミノ酸２２（Ｖａｌ）からアミノ酸１６７（Ｃｙｓ）まで広がっている。本発明の開示に関しては、本明細書においては異なる番号割り付けを用いており、アミノ酸位置１はバリン残基であって、それが成熟蛋白の開始点である。
【０１１２】
成熟組換えヒトレプチンのアミノ酸配列は、本明細書においては配列番号１として提供され、そこでは成熟蛋白の１番目のアミノ酸はバリンである（位置１）（本明細書においては、ｒＨｕ−レプチン１〜１４６と称する、配列番号１）。
【０１１３】
【化２６】
0004841037.tif 000015
【０１１４】
別法として、以下に示す１４５アミノ酸を有し、ｒＨｕ−レプチン１〜１４６と比較して２８位にグルタミンを持たないヒトレプチンの天然変異体を用いることができる（本明細書においては、ｒＨｕ−レプチン１〜１４５とも称される。配列番号２；ここで、空欄（「＿」）はアミノ酸がないことを示している。）。
【０１１５】
【化２７】
0004841037.tif 000016
【０１１６】
例えば、本明細書で引用している具体的なグリコシル化レプチン蛋白に関して、「Ｑ−」版のヒトレプチン（１〜１４５、配列番号２）を用いることを選択し、１〜１４６アミノ酸ヒトレプチンについて数え上げられる相当する部位を変更させることで、グリコシル化部位を含めることができる。
【０１１７】
一般に本明細書で使用されるレプチン蛋白は、ヒトでの治療に使用することができる（下記の動物レプチンも参照）。そこで、経験的に活性を調べて、どのレプチン蛋白型を使用可能であるかを決定することができる。ＷＯ９６／０５３０９に記載のように、天然型でのレプチン蛋白または断片（酵素開裂産生物など）その他の切断型および類縁体はいずれも生理活性を保持している可能性がある。そのような型のいずれも、本発明のグリコシル化レプチン組成物を製造するのに用いることができる。ただし、そのような変更型については試験を行って、所望の特性を確認しなければならない（さらに、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９６／４０９１２、ＷＯ９７／０６８１６、ＷＯ９７／１８８３３、ＷＯ９７／３８０１４およびＷＯ９８／０８５１２参照；いずれも引用によって本明細書に含まれる）。
【０１１８】
マウス配列と異なるアミノ酸を代えるなど、組換えヒト配列においてアミノ酸残基を変えることで、組換えヒトレプチンの類縁体を製造することができる。マウスレプチンは、特に成熟蛋白として、さらには特にＮ−末端でヒトレプチンとかなり相同である。組換えヒト蛋白はマウスにおいて生理活性を有することから、そのような類縁体はヒトにおいて活性であると考えられる。例えば、配列番号１で表される天然ヒトレプチンのアミノ酸配列においては、３２、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７，８９、９７、１００、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５位の１以上のアミノ酸を別のアミノ酸と置き換えることができる。マウス蛋白（配列番号３）の相当する位置のアミノ酸または別のアミノ酸を選択することができる。
【０１１９】
さらに、ラットレプチン（ＯＢ蛋白と称される）配列に基づいて合成分子を製造することができる（Murakami et al., BIOchem. Biophys, Res. Comm. 209: 944-52 (1995)；引用によって本明細書に含まれる）。ラットＯＢ蛋白は、（配列番号１の番号割り付けを用いて）４、３２、３３、３５、５０、６８、７１、７４、７７，７８、８９、９７、１００，１０１、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８および１４５という位置でヒトＯＢ蛋白と異なる。これら異なる位置の１以上のアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることができる。太字（下線）の位置は、マウスＯＢ蛋白とラットＯＢ蛋白がヒトＯＢ蛋白と異なるものであることから、特に変更に適している。これらの位置の１以上で、相当するラットＯＢ蛋白からのアミノ酸または別のアミノ酸を置き換えることができる。
【０１２０】
成熟ヒトＯＢ蛋白とは異なるラットおよびマウスの両方のＯＢ蛋白からの位置は、４、３２、３３、３５、５０、６４、６８、７１、７４、７７，７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５である。上記の１以上のアミノ酸が、例えば相当するラットまたはマウスの配列で認められるアミノ酸などの別のアミノ酸で置き換わった配列番号１によるＯＢ蛋白も有効であると考えられる。
【０１２１】
さらに、成熟ヒトＯＢ蛋白と異なるアカゲザルＯＢ蛋白で認められるアミノ酸は、（名称は、括弧内に１文字アミノ酸略称で示してある）８（Ｓ）、３５（Ｒ）、４８（Ｖ）、５３（Ｑ）、６０（Ｉ）、６６（Ｉ）、６７（Ｎ）、６８（Ｌ）、８９（Ｌ）、１００（Ｌ）、１０８（Ｅ）、１１２（Ｄ）および１１８（Ｌ）である。組換えヒトＯＢ蛋白はカニクイザルにおいて活性であることから、アカゲザルの異なるアミノ酸の１以上が、括弧内のアミノ酸などの別のアミノ酸で置き換わった配列番号１によるヒトＯＢ蛋白は有効であると考えられる。留意すべき点として、ある種のアカゲザルの異なるアミノ酸は、上記のマウス種で認められるものでもある（３５、６８、８９、１００および１１２位）。この様に、４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５位置のアミノ酸のうちの１以上が別のアミノ酸で置き換わったマウス／アカゲザル／ヒトコンセンサス分子（配列番号１の番号割り付けを使用）を製造することができる。
【０１２２】
他の類縁体は、蛋白アミノ酸配列の一部を欠失させることで製造することができる。例えば、成熟蛋白は信号配列が欠落している（−２２〜−１）。成熟蛋白の一部を欠失させることができ、その欠失は製造に付随するものであることができる。例えば、成熟蛋白の最初のＮ−末端アミノ酸を超えた信号配列その他の前駆配列の開裂がある。さらに、Ｎ−末端は１以上の別のアミノ酸を有することができ、それは、例えば信号ペプチド開裂部位の中央での開裂などのそのような前駆配列の使用に付随するもので、開裂部位のアミノ酸の一部が結合しているようにすることができる。
【０１２３】
以下の切断型ヒトレプチン蛋白分子を製造することができる（配列番号１の番号割り付けを使用）
（ａ）アミノ酸９８〜１４６、
（ｂ）アミノ酸１〜９９および（結合した）１１２〜１４６、
（ｃ）アミノ酸１〜９９およびアミノ酸９９〜１１２の間に順番通りに配置されたアミノ酸１００〜１１１のうちの１以上を有する（結合した）１１２〜１４６。
【０１２４】
さらに切断型は、ヒトＯＢ蛋白とは異なる（マウス、ラットまたはアカゲザルＯＢ蛋白で）アミノ酸の１以上が変わっていても良い。さらに変化は、ペプチド様物またはＤ−アミノ酸などの変化したアミノ酸の形であっても良い。
【０１２５】
酸性度、電荷、疎水性、極性、大きさまたは当業者には公知の他の特性に従って「保存的」であるアミノ酸置換を有する上記の蛋白が含まれる。それは下記の表１に示してある（Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company, N. Y., (1984), p. 498と索引（各所）参照。Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991参照（引用によって本明細書に含まれる）。）。
【０１２６】
【表１】
0004841037.tif 000017
【０１２７】
従って本発明のグリコシル化ヒトレプチン蛋白は、最初に（本明細書の配列番号１に示したアミノ酸配列に従って）
（ａ）適宜に２８位のグルタミニル残基を持たない、配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５の位置の１以上で置換された異なるアミノ酸を有する小項目（ａ）のアミノ酸配列；
（ｃ）（上記小項目（ａ）の番号割り付けに従って）
（ｉ）アミノ酸９８〜１４６、
（ｉｉ）アミノ酸１〜９９および１１２〜１４６
（ｉｉｉ）アミノ酸１〜９９ならびにアミノ酸９９〜１１２の間に順序通りにあるアミノ酸１００〜１１１の１以上を有する１１２〜１４６
（ｉｖ）１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のアミノ酸の１以上が別のアミノ酸で置き換わっている小項目（ｉ）の切断レプチン類縁体
（ｖ）４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のアミノ酸の１以上が別のアミノ酸で置き換わっている小項目（ｉｉ）の切断レプチン類縁体
（ｖｉ）４、８、３２、３３、３５、４８、５０、５３、６０、６４、６６、６７、６８、７１、７４、７７、７８、８９、９７、１００、１０２、１０５、１０６、１０７、１０８、１１１、１１２、１１８、１３６、１３８、１４２および１４５のアミノ酸の１以上が別のアミノ酸で置き換わっている小項目（ｉｉｉ）の切断レプチン類縁体
から選択される切断レプチン蛋白類縁体
（ｄ）１以上の保存アミノ酸置換基を有する小項目（ａ）〜（ｃ）のいずれかのレプチン蛋白
から選択される配列から開始し、次に好ましくはα−ヘリックスの外表面上の部位を選択して、付加または置換によってグリコシル化部位を挿入することで製造することができる。特定のグリコシル化部位は上記で示してある。
【０１２８】
レプチン蛋白、類縁体および関連分子も以下の刊行物に報告されている。しかしながら、報告の組成物の活性に関しては何も記載されていない。
【０１２９】
米国特許５５２１２８３号、５５２５７０５号、５５３２３３６号、５５５２５２２号、５５５２５２３号、５５５２５２４号、５５５４７２７号、５５５９２０８号、５５６３２４３号、５５６３２４４号、５５６３２４５号、５５６７６７８号、５５６７８０３号、５５６９７４３号、５５６９７４４号、５５７４１３３号、５５８０９５４号、５５９４１０１号、５５９４１０４号、５６０５８８６号、５６１４３７９号、５６９１３０９号、５７１９２６６（これらはいずれもEli Lilly and Companyに譲渡されたもの）；
ＰＣＴ  ＷＯ９６／２３５１３、ＷＯ９６／２３５１４，ＷＯ９６／２３５１５，ＷＯ９６／２３５１６，ＷＯ９６／２３５１７、ＷＯ９６／２３５１８、ＷＯ９６／２３５１、ＷＯ９６／２３５２０、ＷＯ９６／２３８１５、ＷＯ９６／２４６７０、ＷＯ９６／２７３８５、ＥＰ７２５０７８、ＥＰ７２５０７９（いずれもEli Lilly and Companyに譲渡されたもの）；
ＰＣＴ  ＷＯ９６／２２３０８（Zymogeneticsに譲渡されたもの）；
ＰＣＴ  ＷＯ９６／２９４０５（Ligand Pharmaceuticals, Inc.に譲渡されたもの）；
ＰＣＴ  ＷＯ９６／３１５２６（Amylin Pharmaceuticals, Inc.に譲渡されたもの）；
ＰＣＴ  ＷＯ９６／３４８８５（Smithkline Beecham PLCに譲渡されたもの）；
ＰＣＴ  ＷＯ９６／３５７８７（Chironに譲渡されたもの）；
ＥＰ７３６５９９（Takedaに譲渡されたもの）；
ＥＰ７４１１８７（F. Hoffman LaRocheに譲渡したもの）。
【０１３０】
ある程度、これらの引例は、有用なレプチン蛋白または類縁体、あるいは関連する組成物または方法を提供するものである。そのような組成物および／または方法は、併用投与の場合（特定の投与計画で一緒にまたは別個に）のように、本発明のグリコシル化レプチン医薬組成物と併用することができる。上記但し書きにより、これらの刊行物は引用によって本明細書に含まれる。
【０１３１】
核酸、ベクター、宿主細胞および他の発現系
本発明によって、本発明のグリコシル化レプチン蛋白をコードする核酸も想到される。そのような核酸は、既存の核酸配列の部位指向的突然変異誘発または合成手段、あるいは当業者には利用可能な他の手段によって製造することができる。下記の参考例で開示の方法は例示的なものである。
【０１３２】
ベクターには、当業者には利用可能なプラスミドベクターおよびウィルスベクターなどがある。ベクターは、クローニングまたは発現用であることができ、プラスミド、コスミドならびに原核または真核細胞感染ウィルスなどがある。グリコシル化蛋白の発現に関して、ベクターは真核細胞での発現において有用である。その発現系は、誘導可能なマウス乳腺腫瘍ウィルスＬＴＲプロモーターなどの系のような、構成的または誘導性であることができる。当業者には公知のように、エンハンサー、転写ターミネーター、スプライスドナーおよび受容体部位ならびに他の要素が全体の系に含まれていても良い。
【０１３３】
下記の参考例で開示のベクターは例示的なものである。本明細書の実施例では、変更型のｐＤＳＲα２を用いて、グリコシル化レプチン蛋白を発現させた。
【０１３４】
宿主細胞は、例えば本発明の核酸のクローニングに使用される細菌のように原核性であることができる。他の宿主細胞は真核性であることができる。真核性宿主細胞は、哺乳類におけるものなどの脊索動物門から選択することができる。ヒト細胞（ナマルバ、ヒーラ、ＨｅｐＧ２細胞などのヒト肝細胞癌、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト肝臓細胞、ヒト肺細胞またはヒト入手源から培養した細胞など）ならびにＣＯＳ細胞、あるいはハムスター仔腎臓細胞（「ＢＨＫ」細胞）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（「ＣＨＯ」）細胞、マウスセルトリ細胞、イヌ腎臓細胞、バッファローラット（buffalo rat）肝細胞、マウス乳腺腫瘍細胞などの他の哺乳動物細胞のような霊長動物細胞を用いることができる。昆虫細胞も用いることができる。酵母や真菌などの下等な宿主細胞生物も含まれる（生物の分類に関しては、Margulis, Five Kingdoms, 2d Edition (1988) W. H. Freeman & Co., New York参照）。
【０１３５】
複数の所望の蛋白を同時発現させるよう試みることができる。例えば、本発明のグリコシル化レプチン蛋白は、１以上の他の所望の蛋白とともに真核宿主細胞において発現することができる。その蛋白は、蛋白の特性に応じて多くの利用可能な分離法を用いて分離することができる。例えば、ＣＨＯ細胞などの単一の宿主細胞では、グリコシル化レプチン蛋白だけでなく、治療用途に望ましい異なるグリコシル化蛋白などの異なる蛋白を発現させることができる。例えば分子量を利用して、精製のために蛋白を分離することができる。そのようにして、単一の細胞培養物から２種類の異なる蛋白を製造することで、製造を経済的に行うことができる。
【０１３６】
トランスジェニック動物を用いて、本発明のグリコシル化レプチン蛋白を発現させることもできる。例えば、トランスジェニック乳生産動物（例えば雌牛またはヤギ）を用い、生産されたミルク中に本発明のグリコシル化レプチン蛋白を得ることができる。植物を用いて、本発明のグリコシル化蛋白を製造することができる。しかしながら、植物で起こるグリコシル化は哺乳動物細胞で生じるものとは異なっており、ヒトの治療用途には適さないグリコシル化産生物を生じる場合がある。
【０１３７】
遺伝子治療
本発明で提供されるＤＮＡ（または相当するＲＮＡ）も遺伝子治療に用いることができる。遺伝子治療に関する総説が出されている（Verma, Scientific American, November 1990, pp. 68-84；引用によって本明細書に含まれる。）。
【０１３８】
この様に本発明は、本発明のグリコシル化レプチン蛋白を発現する細胞群を提供する。そのような細胞は、治療を目的とした個体への移植または埋込に好適である。そこで、そのような細胞を個体に埋め込むことができる。そのような細胞は例えば、肝細胞、骨髄細胞または臍帯由来の細胞であることができる。別の形態として、血液始原細胞、Ｔ細胞その他の血液細胞などの循環細胞を用いたい場合がある。ヒトの場合、ヒト細胞を用いることができる。細胞は組織の形とすることができる。そのような細胞を培養してから、移植または埋込を行うことができる。
【０１３９】
受容個体に転移される細胞は、適切であれば、そのような細胞の成長または増殖に影響する１以上の因子を用いて培養することができる。造血細胞の培養には、造血因子を用いることができる。そのような因子には、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＭＧＤＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、インターロイキン（例：ＩＬ１〜ＩＬ１３）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦならびに当業者が利用可能なそれらの類縁体および誘導体などがある。
【０１４０】
ニューロンまたは神経膠などの神経細胞も用いることができ、それらはＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ３その他などの向神経因子とともに培養することができる。
【０１４１】
生存細胞の封入法は当業者には周知のものであり、封入細胞の製造およびそれの患者における埋込は、無駄な実験を行うことなく実施することができる。例えばベーゲ（Baetge）らは国際特許公開ＷＯ９５／０５４５２、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ／０９２９９（この開示内容は引用によって本明細書に含まれる）で、生理活性分子の効果的搬送のための遺伝子操作細胞を含む膜カプセルについて記載している。そのカプセルは生体適合性であり、容易に回収することができる。カプセルは、哺乳動物宿主への埋込時にin vivoで低下しないプロモーターに手技によって連結した生理活性分子をコードしたＤＮＡ配列を有する組換えＤＮＡ分子でトランスフェクションされた細胞を封入する。その機器は、生存細胞から受容個体内の特定の部位に分子の搬送を行わせるものである（さらに、米国特許４８９２５３８号、５０１１４７２号および５１０６６２７号参照；それぞれ、引用によって具体的に本明細書に含まれる）。生存細胞を封入する系については、エビシャー（Aebischer）らのＰＣＴ出願ＷＯ９１／１０４２５（引用によって具体的に本明細書に含まれる）に記載されている（エビシャーらのＰＣＴ出願ＷＯ９１／１０４７０、Winn et al., Exper, Neurol. 113: 322-329 (1991), Aebischer et al., Exper. Neurol. 111: 269-275 (1991); Tresco et al., ASAIO 38: 17-23 (1992)参照；それぞれ引用によって具体的に本明細書に含まれる。）。
【０１４２】
本発明のグリコシル化レプチン蛋白のin vivoおよびin vitroでの遺伝子治療投与も想到される。in vivo遺伝子治療は、ポリヌクレオチド分子その他の適切な搬送ベクターの局所注射を介して、本発明のグリコシル化レプチン蛋白をコードする核酸を細胞に導入することで行うことができる（Hefti, J. Neurobiology., 25: 1418-1435, 1994）。例えば、グリコシル化レプチン蛋白をコードするポリヌクレオチド分子は、標的細胞への搬送のためのアデノ関連ウィルスベクターに含まれていても良い（例：Johnson、国際特許公開ＷＯ９５／３４６７０、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８（引用によって開示内容が本明細書に含まれる）。）組換えアデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）ゲノムには、機能性プロモーターおよびポリアデニル化シーケンスに手技にて連結した向神経因子をコードするＤＮＡ配列をフランキングするＡＡＶ反転末端繰り返しを有する。
【０１４３】
別のウィルスベクターには、レトロウィルス、アデノウィルス、単純疱疹ウィルスおよび乳頭腫ウイルスベクターなどがあるが、これらに限定されるものではない。米国特許５６７２３４４号（１９９７年９月３０日発行、Kelley et al., University of Michigan；その開示内容は、引用によって本明細書に含まれる）には、組換え向神経ＨＳＶ−１ベクターの関与するin vivoのウィルス介在遺伝子転移について記載されている。米国特許５３９９３４６号（１９９５年３月２１日発行、Anderson et al., Department of Health and human Services；その開示内容は引用によって本明細書に含まれる）には、in vitroで予め処理して治療蛋白をコードするＤＮＡ部分を挿入したヒト細胞の搬送によって、治療蛋白を患者に提供する方法の例が示してある。遺伝子治療法の実施のための別の方法および材料については、アデノウィルスベクターの関与する米国特許５６３１２３６号（１９９７年５月２０日発行、Woo et al., Baylor College of Medicine）、レトロウィルスベクターの関与する米国特許５６７２５１０号（１９９７年９月３０日発行、Eglitis et al., Genetic Therapy, Inc.）、ならびにサイトカイン類を発現するレトロウィルスベクターが関与する米国特許５６３５３９９号（１９９７年６月３日発行、Kriegler et al., Chiron Corporation）に記載されている（これらの開示内容は引用によって本明細書に含まれる）。
【０１４４】
非ウィルス系搬送法には、リポソーム介在転移、露出ＤＮＡ搬送（直接注射）、受容体介在転移（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿および微粒子衝撃（例：遺伝子銃）などがある。遺伝子治療の材料および方法には、誘導プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的統合（integration）用のＤＮＡ配列、親細胞に勝る選択的利点を提供することができるＤＮＡ配列、形質転換細胞を確認するための標識、陰性の選択系および発現制御系（安全手段）、細胞特異定結合剤（細胞標的用）、細胞特異的内在化因子、ベクターによる発現を促進する転写因子ならびにベクター製造方法などもあり得る。遺伝子治療法実施におけるそのような別の方法および材料については、エレクトロポレーション法に関する米国特許４９７０１５４号（１９９０年１１月１３日発行、D. C. Chang, Baylor College of Medicine）、核リガンドについてのＷＯ９６４０９５８（１９９６年１２月１９日公開、Smith et al., Baylor College of Medicine）、遺伝子搬送のためのリポ蛋白含有系に関する米国特許５６７９５５９号（１９９７年１０月２１日発行、Kim et al., University of Utah Research Foundation）、リポソーム担体が関与する米国特許５６７６９５４号（１９９７年１０月１４日発行、K. L. Brigham Vanderbilt University）、リン酸カルシウムトランスフェクション法に関する米国特許５５９３８７５号（１９９７年１月１４日発行、Wurm et al., Genentech, Inc.）、ならびに生理活性粒子を、その粒子が細胞表面を貫通し、細胞内部に組み込まれるようになるような速度で推進させる米国４９４５０５０号（１９９０年７月３１日発行、Sanford et al., Cornell Research Foundation）に記載されている（これらの開示内容は、引用によって本明細書に含まれる）。発現制御法には、化学誘発調節（例：ＷＯ９６４１８６５およびＷＯ９７３１８９９）、変更ステロイドホルモン受容体系におけるプロゲステロン拮抗薬の使用（例：米国特許５３６４７９１号）、エクジソン制御系（例：ＷＯ９６３７６０９）および陽性テトラサイクリン制御可能な転写促進剤（例：米国特許５５８９３６２号、米国特許５６５０２９８号、米国特許５６５４１６８号）などがある。
【０１４５】
本発明の遺伝子治療または細胞治療にはさらに、第２の治療組成物の搬送も含まれ得ることも想到される。例えば、宿主細胞を変性させて、グリコシル化レプチン蛋白と天然ヒトレプチンの両方を発現・放出させることができる。別法として、それを別個の細胞で発現させ、そこから放出させることができる。そのような細胞は別個に患者に組み込むことができるか、あるいは細胞を、上記の封入膜などの単一の移植機器に含有させることができる。
【０１４６】
選択的結合分子
本発明はさらに、本発明のグリコシル化ヒトレプチン蛋白の選択的結合部分に関するものでもある。「選択的結合部分」とは、グリコシル化型または非グリコシル化型での、本発明のグリコシル化ヒトレプチン蛋白に選択的に結合する物質を指す。選択性は、結合部分がバックグラウンド（非選択的）レベル以上で対象のレプチン蛋白に結合するか否かによって決定する。選択的結合部分の特定の例には、例えばハイブリドーマ法によって、あるいは組換え核酸手段を用いて製造されるモノクローナル、ポリクローナル、単一特異的ポリクローナルなどの抗体などがある（例えばHuse et al., Science 246: 1275 (1989)参照）。本発明においては、核酸、ベクター、宿主細胞ならびに組換え抗体などの選択的結合部分の組換え核酸発現で使用される他の材料および方法も想到される。そのような選択的結合部分に、当業者が利用可能な材料および方法を用いて、化学発光、蛍光、比色または放射性などの検出可能な標識を結合させることができる。本発明のレプチン蛋白の検出または測定用に、これらの選択的結合分子のうちの１以上を含むアッセイまたはキットを製造することができる。例としては、特定のグリコシル化レプチン蛋白に選択的なモノクローナル抗体を含むキット、ならびに前記モノクローナル抗体の前記グリコシル化レプチン蛋白への結合を検出する手段がある。そのようなキットにおける他の材料および方法は、当業者が利用可能である。
【０１４７】
製剤および誘導体
本発明のさらに別の態様では、本発明のグリコシル化レプチン組成物および誘導体の医薬組成物を用いる方法が提供される（下記参照）。そのような医薬組成物は、注射による投与用、あるいは経口、硬膜内、肺、経鼻、経皮その他の投与形態用であることができる。本発明では、医薬的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、補助剤および／または担体とともに、有効量の本発明の蛋白または誘導体生成物を含む医薬組成物が想到される。そのような組成物は、各種の緩衝剤含有量（例：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；洗剤および可溶化剤（例：Ｔｗｅｅｎ８０、ポリソルベート８０）、酸化防止剤（例：アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例：チメルゾル（Thimersol）、ベンジルアルコール）および増量物質（例：乳糖、マニトール）などの添加剤が含まれ、ポリ酢酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の粒子状製造物またはリポソームへの材料の組み込みが行われる（例えば、ＰＣＴ  ＷＯ９６／２９９８９、Collins et al., ”Stable protein: phospholipid compositions and methods”（１９９６年１０月３日発行）参照；引用によって本明細書に含まれる）。ヒアルロン酸も用いることができ、それは循環における持続期間延長の効果を有する場合がある。そのような組成物は、本発明の蛋白および誘導体の物理的状態、安定性、in vivoでの放出速度、in vivoでのクリアランス速度に影響し得る（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), pp. 1435-1712参照；引用によって本明細書に含まれる）。その組成物は液体の形で製造することができるか、あるいは凍結乾燥品などの乾燥粉末とすることができる。経皮製剤の場合のように、移植徐放製剤も想到される。
【０１４８】
具体的に想到されるものとしては、上記誘導体化蛋白の経口製剤がある。蛋白には化学修飾を施して、その誘導体の経口搬送が効果的になるようにすることができる。想到される化学修飾には、１以上の部分の蛋白（またはペプチド）分子自体への付加があり、その場合に当該部分によって、（ａ）蛋白分解の阻害、（ｂ）胃または小腸からの血流中への取り込みが可能となる。さらには、蛋白の全体的安定性向上ならびに身体での循環時間の延長が望ましい（ＰＣＴ  ＷＯ９５／２１６２９、Habberfield, ”Oral Delivery of Chemically Modified Proteins”（１９９５年８月１７日公開）（引用によって本明細書に含まれる）および１９９６年１１月１２日発行の米国特許５５７４０１８号、Habberfield et al.,”Conjugates of Vitamin B12 and Proteins”（引用によって本明細書に含まれる）参照）。これら刊行物に開示の材料および方法は、本発明のグリコシル化レプチン組成物および方法に適用可能である。
【０１４９】
本発明においては、本発明の蛋白またはそれの誘導体の肺投与も想到される。蛋白（誘導体）は、吸入しながら哺乳動物の肺に投与され、肺上皮層を通過して血流に入る（例えば、１９９４年９月１５日公開のＰＣＴ  ＷＯ９４／２００６９、Niven et al.,”Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor”（引用によって本明細書に含まれる）およびすでに引用によって本明細書に含まれているＰＣＴ  ＷＯ９６／０５３０９の８３頁以降参照）。本発明のグリコシル化レプチン蛋白は、噴霧乾燥することで、平均粒径１０ミクロン未満、あるいはより好ましくは０．５〜５ミクロンの粒子とすることができる。各粒子の密度に応じて、それより大きい粒子を用いることができる。
【０１５０】
蛋白（または類縁体もしくは誘導体）の経鼻投与も想到される。経鼻投与によって、肺で薬剤沈着をさせる必要なく、鼻への治療薬投与後に蛋白は通過して直接血流に入ることができる。経鼻投与用製剤には、デキストランまたはシクロデキストランなどの吸収促進剤を含むものなどがある。他の粘膜を通る輸送を介した投与も想到される。
【０１５１】
本発明のグリコシル化レプチン蛋白は、蛋白部分に１以上の化学部分を付加させることによって誘導体化することもできる。生理活性蛋白の化学修飾は、ある一定の環境下で、治療蛋白の安定性向上および循環時間延長ならびに免疫原性低下などのさらなる利点を与えることが認められている（１９７９年１２月１８日発行の米国特許４１７９３３７号、Davis et al参照。総覧については、アブコウスキーらの報告（Abuchowski et al., Enzymes as Drugs）参照（J. S. Holcerberg and J. Roberts, eds. pp. 367-383 (891)）。蛋白修飾および融合蛋白について記載した総説論文がある（Francis, Focus on Growth Factors 3: 4-10 (May 1992)（Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, UK刊行）。さらに、化学修飾によって水溶性ポリマーを加えるなど、本発明のグリコシル化レプチン組成物をさらに修飾することが望まれる場合がある。化学部分の付加を行うには、さらに別の製造段階が必要となると考えられるが、薬剤特性の改善（何らかの条件下で、化学誘導体化により、例えば腎臓液胞の形成誘発によって薬剤があまり好ましくないものとなり得ることに留意、上記参照）に関してさらなる効果が生じる場合がある。化学部分は、蛋白の機能性または抗原性領域に対する影響を考慮しながら蛋白に付加させなければならない。当業者には利用可能な多くの付加方法がある（例えば１９９６年４月２５日公開のＰＣＴ  ＷＯ９６／１１９５３「N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods」（引用によって全体が本明細書に含まれる）およびＥＰ０４０１３８４（引用によって本明細書に含まれる。ＰＥＧのＧ−ＣＳＦへのカップリング。）参照）。これら刊行物に開示の方法およびポリマーは、例えば治療組成物の特性をさらに改善する上で誘導体化が望ましい場合には、本発明のグリコシル化レプチン組成物に適用可能である。
【０１５２】
融合蛋白は、グリコシル化レプチン蛋白部分にポリアミノ酸を付加させることで製造することができる。例えばポリアミノ酸は、蛋白の循環半減期をさらに延長する上で有効なキャリア蛋白であることができる。本発明の治療薬または化粧品に関して、そのようなポリアミノ酸は、中和抗原応答その他の有害応答を生じないものでなければならない。そのようなポリアミノ酸は、血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）、抗体もしくはそれの一部（抗体恒常領域、「Ｆｃ」とも称される）その他のポリアミノ酸からなる群から選択することができる。ポリアミノ酸の付加位置は、グリコシル化レプチン蛋白部分のＮ−末端または他の場所であることができ、蛋白への化学的「連結基」部分によって結合されていても良い（１９９８年２月２日公開の発明の名称が「Ob Fusion Protein Compositions and Methods」であるＰＣＴ  ＷＯ９８／２８４２７（引用によって全体が本明細書に含まれる）参照）。例えば「ＦＬＡＧ」タグ、「ｈｉｓ」タグ、「ｍｙｃ」タグその他の当業者には公知のポリアミノ酸タグの使用のように、ポリアミノ酸を用いて、検出や精製を補助することができる。
【０１５３】
それに関連して、本発明のグリコシル化レプチン蛋白に検出可能な標識を付加することができる。放射性同位元素、発光化合物（例：蛍光化合物または化学発光化合物）、酵素的に開裂可能な化合物、検出可能な抗体（またはそれの変更物）あるいは他の物質を、そのような本発明の蛋白の標識に用いることができる。標識を用いた蛋白の検出は、本発明の蛋白の有無または量、あるいはそのような蛋白を含む化合物（抗体／蛋白複合体など）を確認する上で有用であると考えられる。
【０１５４】
用量
当業者であれば、投与および所望の治療効果を観察することで、有効な用量を確認することができよう。現在のところ、未変更ｒｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６は、蛋白０．３ｍｇ／ｋｇ／日の用量で有効であることが明らかになっており、蛋白０．１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で効果が低下することが認められている（グリーンベルグらの報告（Greenberg et al., Preliminary safety and efficacy of recombinant methionyl human Leptin administered by SC injection in lean and obese subjects）。イリノイ州シカゴでの１９９８年６月１６日の米国糖尿病学会年会（Annual Meeting of the American Diabetes Association）での発表ポスター。）。さらに、望ましい用量範囲は、同じ（または低い）蛋白負荷量を低頻度で投与するものであることができる。有効な用量は、経時的な診断手段を用いて求めることができる。例えば、血液中（または血漿もしくは血清中）のレプチンの量を測定するための診断薬を最初に用いて、レプチンの内因性レベルを測定することができる。そのような診断手段は、抗体サンドウィッチアッセイなどの抗体アッセイの形であることができる。内因性レプチンの量を最初に定量し、基底線を決定する。内因性および外因性レプチン（すなわち、自己産生もしくは投与された身体内で認められる蛋白、類縁体または誘導体）の定量を治療経過中にわたって継続しながら、治療用量を測定する。従って、用量は治療経過の期間にわたって変動し得るものであり、最初に治療効果または美容上の効果が認められるまで比較的高用量を用い、相対的に低い用量を用いて治療効果または美容効果を維持する。
【０１５５】
肥満者治療の初期段階において、体重減少と不随する脂肪組織減少の増加が得られる用量を投与することができる。十分な体重減少が得られると、体重再増加を防止するが、所望の体重または脂肪重量を維持するだけの用量を投与することができる。これらの用量は、レプチンの効果が可逆的であることから、経験的に決定することができる（例えば、Campfield et al., Science 269: 546-549 (1995), p. 547）。そこで、体重減少が望ましくない時に体重減少をもたらす用量が認められる場合、それより低い用量を投与するが、所望の体重を維持するようにすることになると考えられる。
【０１５６】
使用方法
治療
治療薬の使用には、体重調節、糖尿病の治療または予防、血中脂質低減（および関連する状態の治療）、除脂肪体重増加およびインシュリン感受性の向上などがある。さらに本発明の組成物を、上記状態の治療または緩解のための１以上の医薬品製造に用いることができる。
【０１５７】
美容
単に外観を良くすることを望む対象者の場合、本発明の組成物は、体重減少または有害な医学的状態に対する併発効果のない体重維持に用いることができる。さらに本発明の組成物は、美容目的の１以上の製剤の製造に用いることができる。
【０１５８】
体重調節
本発明の組成物および方法を用いて体重を減らすことができる。別形態においては、本発明の組成物を所望の体重または脂肪蓄積レベルに維持するのに用いることができる。マウスモデルで示されているように（上記参照）、本発明のグリコシル化レプチン蛋白を投与することで体重が減少する。体重減少は主として脂肪組織すなわち脂肪のものである。そのような体重減少または特定体重の維持は、下記の記載のものなどの併発状態の予防または治療に関連したものとすることができ、従って治療的応用を構成することができるものである。
【０１５９】
糖尿病の治療
本発明の組成物および方法を、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病の予防または治療に用いることができる。ＩＩ型糖尿病は肥満と関係がある場合があることから、体重の減少（あるいは所望体重の維持または脂肪蓄積の低下もしくは維持）への本発明の使用によって、糖尿病進行の改善または予防を行うこともできる。さらに、体重低下を起こすだけの用量に達していない場合であっても、本発明の組成物を用いて糖尿病を予防または改善することができる。
【０１６０】
本発明の組成物を投与することで、内因性または外因性インシュリンに対する感受性を高めることができ、ＩＩ型糖尿病治療に必要な外因性インシュリンの投与量を減らしたり、その投与を不要とすることができる。本発明の組成物をＩ型糖尿病の治療、予防または改善に用いることができることも想到される。
【０１６１】
血中脂質調節
本発明の組成物および方法を、血中脂質レベルの調節に用いることができる。理想的には、血中脂質レベルの低下のみが望まれる状況、あるいは血中脂質レベルの維持が望まれる状況では、用量は体重減少を生じるには不十分である。そこで、肥満患者の治療の初期段階において、体重減少と同時に血中脂質レベル低下が得られる用量を投与することができる。十分な体重減少が得られたら、体重の再増加を防止するが、所望の血中脂質レベルを維持するだけの用量、あるいは例えば本明細書に記載した他の状態を防止するだけの用量を投与することができる。従って、体重低下が望ましくない場合に体重低下を生じる用量が認められる場合は、それより低い用量を投与することで、所望の血中脂質レベルを維持しつつ、所望の体重を維持するようにすることになると考えられる（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９７／０６８１６参照；引用によって本明細書に含まれる）。
【０１６２】
除脂肪体重増加またはインシュリン感受性向上
理想的には、除脂肪体重増加のみが望まれる状況では、用量は体重低下を生じるには不十分である。そこで、肥満患者の治療の初期段階において、体重減少と同時に脂肪組織減少／除脂肪体重増加が得られる用量を投与することができる。十分な体重減少が得られたら、体重の再増加を防止するが、所望の除脂肪体重増加（または除脂肪体重低減の防止）を維持するだけの用量を投与することができる。個体のインシュリンへの感受性を高めるには、用量に関する同様の検討事項を考慮することができる。糖尿病治療のために対象者に投与されると考えられるインシュリン（あるいは可能性として、アミリン、アミリン拮抗薬もしくは作働薬、あるいはチアゾリジンジオン類その他の可能性のある糖尿病治療薬）量を低下させるだけの体重減少を伴わない除脂肪体重増加を得ることができる。全体の強度を高めるには、同様の用量に関する検討事項があると考えられる。全体的な強度の同時上昇を伴う除脂肪体重増加は、体重増加を生じるには不十分な用量で得ることができる。赤血球（および血液中の酸素化）増加および骨吸収もしくは骨粗鬆症の低下などの他の利点も、体重減少を起こさずに得ることができる（例えば、１９９７年５月２９日公開のＰＣＴ  ＷＯ９７／１８８３３；引用によって全体が本明細書に含まれる）。
【０１６３】
併用療法
本発明の組成物および方法は、食事および運動の切り替えなどの他の治療法と併用することができる。糖尿病治療に有用な薬剤（例：インシュリンおよび恐らくは、アミリン、それの拮抗薬もしくは作働薬、チアゾリジンイオン類または他の可能性のある糖尿病治療薬）、コレステロールおよび血圧低下薬（血中脂質レベルを低下させる薬剤その他の心血管薬など）、活動亢進薬（例：アンフェタミン類）、利尿薬（脂質排出用）ならびに食欲抑制剤（神経ペプチドγ受容体に作用する薬剤、セロトニン再取り込み阻害薬または胃脂肪取り込み阻害薬など）などの他の薬剤がある。そのような投与は同時に行うことができるか、あるいは順次で行うことができる。さらに本発明の方法を、身体の全体的外観を変えるための美容手術（例：体重を減らすための脂肪吸引またはレーザー手術あるいは見かけの体重を増やすための埋込手術）などの外科手術と併用することができる。バイパス手術その他の動脈プラークなどの脂肪沈着物によって血管が閉塞されることで生じる有害な状態を緩和するための手術のような心臓手術の効果を、本発明の組成物および方法を併用することで高めることができる。超音波法またはレーザー法などの胆石除去法を、本発明の治療法の前、途中または後に用いることもできる。さらに本発明の方法を、骨折、筋肉損傷のための手術または治療、あるいは除脂肪組織体重増加によって改善されると考えられる他の治療への補助手段として用いることができる。
【０１６４】
製造方法
上記で示したように、信号配列および成熟蛋白配列の特定の構成物によってグリコシル化効率を高めることができることも認められている。それに関して、「信号配列」という用語（場合によって当業界では「信号ペプチド」と称される）は、通常は約１５〜３０アミノ酸長で、小胞体中への成熟蛋白の分泌を促進する疎水性アミノ酸が豊富である、成熟蛋白のＮ−末端またはその付近に認められるペプチドを指すのに用いられる。蛋白の最初のグリコシル化が起こるのは、小胞体または細胞膜領域である。信号配列は、成熟蛋白分泌に先だって、成熟配列から開裂する（Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Ed., 1987, p.731 (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, California参照）。詳細には、天然レプチン蛋白に手技にて連結された天然には認められない各種信号配列が用いられており、複数グリコシル化レプチン蛋白のグリコシル化効率が改善されることが認められている。
【０１６５】
例えば、天然のヒトレプチン信号配列と比較して、本明細書に記載の各種複数グリコシル化レプチン蛋白の発現と併用した場合に、組織プラスミノーゲン活性化剤配列に結合して通常認められる信号配列によって、比較的高いグリコシル化レベルが得られることが認められている（例：成熟蛋白の発現分子の割合が相対的に高い全ての好適な部位でのグリコシル化部分）。
【０１６６】
従って本発明は、グリコシル化レプチン蛋白の製造方法において、
（ａ）発現に好適な条件下に、５’から３’の方向で（ｉ）信号配列および（ｉｉ）グリコシル化レプチン蛋白をコードするＤＮＡをコードするＤＮＡ配列を有する宿主細胞を培養する段階、ならびに
（ｂ）前記グリコシル化レプチン蛋白を取得する段階
を有することを特徴とする方法に関するものでもある。
【０１６７】
さらに上記で説明したように、本発明は、前記信号が、
【０１６８】
【化２８】
0004841037.tif 000018
から選択されるグリコシル化レプチン蛋白の製造方法に関するものである。
【０１６９】
それに関係して、そのような信号ペプチドをコードする核酸配列を用いることができる。使用しなかった変更ヒトレプチン信号ペプチド信号配列（ｄ、配列番号６）を除き、以下のＤＮＡ配列を、以下の実施例に記載の方法に従って用いて、上記のような相当する信号ペプチドをコードした。
【０１７０】
【化２９】
0004841037.tif 000019
【０１７１】
高グリコシル化蛋白に関連していることが知られている信号配列を選択することができる。使用可能な信号配列は、エリトロポイエチン、因子ＶＩＩＩ、β−インターフェロン、血清アルブミン、インシュリン、フォンウィルブラント因子、ＣＤ１１α、ＩｇＧ、フォリスタチン（follistatin）、固有因子、Ｇ−ＣＳＦ、セルロプラスミン、ＬＡＭＰ−１、分泌されるホルモン類、成長因子および真核細胞で分泌されるヒトもしくは非ヒト（他の霊長動物、マウス、ラットその他の哺乳動物）の他の蛋白に由来のものである。酵母細胞の場合、酵母α−因子および他のものを用いることができる。他の各種遺伝子も、ヒトインフルエンザウィルスＡ、ヒトプレプロインシュリンおよびウシ成長ホルモンなど、哺乳動物細胞経での蛋白分泌を促進することができるリーダー配列を有する。
【０１７２】
さらに、試行錯誤によって信号配列のアミノ酸組成を至適化して、グリコシル化効率を向上させたり、非天然信号配列を得ることができる。例えば、疎水性アミノ酸残基の数を増やしたり、あるいは信号ペプチダーゼ開裂部位を変えることで膜で蛋白が費やす時間量を増やして、グリコシル化を行う細胞「機関」に蛋白が曝露される時間を延長することができる（「機関」とは、細胞の膜領域内でグリコシル化を行う酵素および他の部分についての簡略用語である）。
【０１７３】
既存の開裂部位（信号ペプチドが酵素開裂を受けて成熟蛋白を生じる信号ペプチドの炭素末端の部位）を異なる開裂部位に代えることで、特に哺乳動物細胞経での製造が有利となり、グリコシル化効率を高くすることができることも認められている。以前には当業者は、信号ペプチドに関係する前駆配列（下記参照）の酵素開裂部位を変えていた。
【０１７４】
下記の実施例で示すように、組織プラスミノーゲン活性化剤信号ペプチドの使用による３部位グリコシル化レプチン蛋白の発現によって、天然ヒトレプチン信号ペプチドの使用の場合より高いグリコシル化効率が得られた。さらに、天然ヒトレプチン信号ペプチドに代えた場合に、ｔＰＡ（セリン−プロリン−セリン）信号ペプチドの開裂部位によって、未変更ヒトレプチン信号ペプチドの使用に比べて改善されたグリコシル化効率が得られることがさらに認められた。
【０１７５】
特定の蛋白に関して、部位セリン−アスパラギン−セリン（「ＳＮＳ」）がグリコシル化効率を改善する機能を果たす場合がある。例えば、本明細書に記載のように、天然ヒトｔＰＡ信号ペプチド開裂部位の「ＳＮＳ」部位による置き換えによって、正しく開裂したグリコシル化レプチン蛋白（２位、４７位、６９位および９２位にグリコシル化部位を有する）の収量が高くなった。他の開裂部位には、セリン−プロリン−セリン（「ＳＰＳ」）、セリン−アスパラギン−セリン（「ＳＮＳ」）、セリン−プロリン（「ＳＰ」）およびセリン−プロリン−アラニン（「ＳＰＡ」）などがある。ＤＮＡコードの部位指向性突然変異誘発、ＤＮＡ合成ならびに細胞内でのゲノムＤＮＡの変化などの公知の方法による信号ペプチドに、新たな開裂部位を置き換えることができる。信号ペプチド、特に天然信号ペプチドなどの公知の分泌蛋白に関連して認められない信号ペプチドを製造し、上記のような開裂部位を含めることで、グリコシル化効率を至適化または最大化するよう選択することができる。
【０１７６】
天然ヒト組織プラスミノーゲン活性化剤（「ｔＰＡ」）のセリン−プロリン−セリン開裂部位などの一部の開裂部位は、成熟蛋白のＮ−末端領域から不完全に開裂する。そこで、ここで−１位と称する成熟蛋白のＮ−末端のセリン残基が残る。本発明はさらに、対象とする開裂部位を用いることを選択した場合に、成熟蛋白配列のＮ−末端の１以上のアミノ酸残基を有するかあるいは適宜に有する本発明のレプチングリコシル化蛋白をも含むものである。
【０１７７】
本発明はさらに、より具体的には、
−１位にセリン、アルギニン、プロリンまたはアラニン残基、
−１位にセリンおよび−２位にプロリン、
−１、−２および−３位にセリン−プロリン−セリン配列、
−１位にセリンおよび−２位にアルギニン、
−１位にセリン、−２位にアルギニンおよび−３位にセリン、
−１位にアルギニンおよび−２位にセリン、ならびに
−１位にアラニンおよび−２位にプロリン
を有するグリコシル化レプチン蛋白をも含む。
【０１７８】
さらに、成熟蛋白の一部を開裂させる信号ペプチド開裂部位があっても良い。従って、上記で示したように本発明には、対象とするグリコシル化部位を有する配列番号１または２のレプチン蛋白などの成熟蛋白のＮ−末端から欠失した５以下のアミノ酸残基を有するものなど、切断型のグリコシル化レプチン蛋白が含まれる。
【０１７９】
従って本発明は、グリコシル化蛋白の改良された製造方法であって、
（ａ）発現およびグリコシル化に好適な条件下に、５’から３’の方向で（ｉ）信号ペプチドおよび（ｉｉ）グリコシル化蛋白をコードするＤＮＡをコードするＤＮＡ配列を有する宿主細胞を培養する段階、ならびに
（ｂ）前記グリコシル化蛋白を取得する段階を有し、
前記改良が、グリコシル化効率について至適化されたペプチダーゼ開裂部位を有する信号ペプチドの使用を含む方法に関するものでもある。
【０１８０】
非天然開裂部位は、ＳＰＳ、ＳＰ、ＳＮＳおよびＳＰＡから選択することができる。実施例を含む本明細書に記載の信号ペプチドおよびグリコシル化レプチン蛋白は例として挙げてあるものである。ただし、これらの方法および組成物は、真核細胞によって分泌および／またはグリコシル化させるべき非常に多様な蛋白に広く適用可能である。そのような蛋白には、組織プラスミノーゲン活性化剤、因子ＶＩＩＩおよび他の血液凝固因子、エリトロポイエチンおよびそれの類縁体、ならびに他のグリコシル化蛋白などがあるが、これらに限定されるものではない。
【０１８１】
さらに、天然レプチンリーダー配列との併用で、「前駆配列」を使用することによってもグリコシル化効率を高めることができることも認められている。「前駆配列」は、至適には単位Ｒ−Ｘ−Ｒ／Ｋ−Ｒ（「Ｘ」はいずれかのアミノ酸である（および１文字略称は従来使用されているものである。上記参照）を有するアミノ酸配列である。前駆配列は、ＣＨＯ細胞に通常存在するフリン（furin）様プロテアーゼ類によって開裂可能である（最後のＲ後）（Watanabe et al., FEBS letters, 320: 215-218 (1993)；引用によって本明細書に含まれる））。ＣＨＯ細胞がそのような前駆配列を開裂させる能力は、フリン発現プラスミドが細胞にトランスフェクションされると向上することが明らかになっている（Yanagita et al., Endocrinology 133: 639-644 (1993)；引用によって本明細書に含まれる））。例えば、成熟ヒトレプチン配列は、フリンによる前駆配列の除去を妨害すると考えられるバリンで始まる。前駆配列のより良好な除去は、そのバリンをセリンやアラニンなどのより好ましいアミノ酸に変えることで、あるいはバリンの前にそのようなアミノ酸を挿入することで（例えば、部位指向性突然変異誘発その他の当業者に利用可能な方法によって）行うことができると考えられる。従って本発明の方法は、天然レプチン信号ペプチドまたは他の信号ペプチドとの併用でそのような前駆配列を使用することを含んでいても良い。
【０１８２】
本発明はさらに、本発明の変化した信号ペプチドおよび／または前駆配列をコードする核酸を含む上記で挙げたものおよび引用によって本明細書に含まれたものなどの核酸、ベクターおよび宿主細胞のような組成物をも包含するものである。
【０１８３】
実施例
以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するためのものであるが、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【０１８４】
実施例１は、各種グリコシル化レプチンのストークス半径測定を示す。
【０１８５】
実施例２は、「Ｎ４８Ｔ５０」と称される１部位グリコシル化レプチンのin vivo生理活性を示す。この実施例は、そのグリコシル化レプチンが、グリコシル化のない天然組換えヒトレプチンと少なくとも同等の活性を有することを示すものである。
【０１８６】
実施例３は、別の１部位グリコシル化レプチン類のin vitro生理活性を示す。
【０１８７】
実施例４は、受容体結合アッセイに関して、２部位グリコシル化レプチン蛋白のin vitro生理活性を示す。
【０１８８】
実施例５は、グリコシル化コンセンサス配列において、セリン残基ではなくトレオニン残基を用いることがグリコシル化効率に与える影響を示すものである。
【０１８９】
実施例６は、コンセンサス配列に隣接するアミノ酸がグリコシル化効率に影響することを示す。
【０１９０】
実施例７は、３部位グリコシル化レプチン蛋白が、未グリコシル化レプチンよりかなり長い全身循環時間を有することを示す。
【０１９１】
実施例８は、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、３部位グリコシル化レプチン蛋白が未グリコシル化レプチンと比較して体重減少の生理活性を向上させたことを示している。
【０１９２】
実施例９は、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、３部位グリコシル化レプチン蛋白が未グリコシル化レプチンと比較して食欲抑制の生理活性を向上させたことを示している。
【０１９３】
実施例１０は、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、３部位グリコシル化レプチン蛋白の間歇投与が未グリコシル化レプチンと比較して体重減少の生理活性を向上させたことを示している。
【０１９４】
実施例１１は、野生型動物での３部位グリコシル化レプチンを用いた別の用量応答試験を提供するものであり、かなり低い用量の３部位グリコシル化レプチンによって、未グリコシル化レプチンと比較してかなりの体重減少が生じることを示している。
【０１９５】
実施例１２は、野生型マウスでの３部位グリコシル化レプチンを用いた投与回数試験を提供するものであり、３部位グリコシル化レプチンを未グリコシル化レプチンより少ない回数で投与して、動物において同じ体重低下応答が得られることを示している。
【０１９６】
実施例１３は、別の複数グリコシル化部位レプチン蛋白とin vitroでの生理活性データについて記載したものである。
【０１９７】
実施例１４は、各種信号ペプチドおよびグリコシル化または収量に影響する他の配列を用いた、３部位グリコシル化レプチン蛋白の発現およびグリコシル化効率について記載したものである。
【０１９８】
実施例１５は、各種信号ペプチドおよびグリコシル化または収量に影響する他の配列を用いた、多様な複数グリコシル化部位レプチン蛋白に関する別の発現データを記載したものである。
【０１９９】
本明細書で使用の方法の参考例がそれに続いて記載されている。
【０２００】
実施例１
各種レプチンのストークス半径
本実施例は、各種レプチンがゲル濾過測定で異なるストークス半径を有することを示すものである。本実施例はさらに、繰り返し測定値を得た時に測定値が２Å未満で変動したように、１個のレプチングリコシル化蛋白のストークス半径を求めるゲル濾過法の一貫性を示すものでもある。
【０２０１】
方法
ゲル濾過実験は、システム制御、データ取得および解析用のユニコーン（Unicorn）制御装置、ＵＶ−１検出器および２８０ｎｍフィルターを搭載したファルマシア（Pharmacia）ＦＰＬＣシステムで行った。分離は、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水で平衡としたスーパーデックス（SuperDex）２００（ＨＲ１０／３０）カラムで、４℃および流量０．２５ｍＬ／分にて行った。溶離緩衝液に溶かした蛋白サンプルを、８４３５型分光光度計（Hewlett Packard）で測定しながら、０．１Ａ２８０を含む０．２５ｍＬ容量でカラムに通した。
【０２０２】
ファルマシアゲル濾過較正キット（高分子量および低分子量の両方）で認められる標準蛋白を製造者の指示に従って用いてカラムの較正を行った（製造者の指示に従い、カタラーゼは標準として用いなかった）。ヒトトランスフェリン（３６Å）、大豆トリプシン阻害薬（２２Å）およびウマ筋肉ミオグロビン（１９Å）などの別の標準は購入した（Sigma Chemicals）。ブルーデキストラン（Blue Dextran；ファルマシアゲル濾過較正キット）を用いて、空隙容量を決定した。各種レプチン型のいずれかについてのストークス半径値（Ｒｓ）は、
【０２０３】
【数２】
0004841037.tif 000020
対Ｒｓ（式中、Ｋａｖ＝（Ｖｅ−Ｖｏ）／Ｖｔ−Ｖｏであり；Ｖｅは蛋白の溶出容量であり；Ｖｏは空隙容量であり；Ｖｔはカラムの総床容量である）のプロットから計算した。
【０２０４】
結果
上記の方法とゲル濾過材料としてのスーパーデックス２００（商標）を用いて、以下のグリコシル化部位を有するｒＨｕ−レプチン１〜１４６（配列番号１、下記）について以下のストークス半径を測定した。
【０２０５】
【表２】
0004841037.tif 000021
【０２０６】
表からわかる通り、ゲル濾過による測定で、３部位グリコシル化レプチン蛋白分子の群は３０Åを超えるストークス半径を有する。平均ストークス半径（（３１．９＋３２．３）／２））は３２．１Åである。このゲル濾過法はさらに、１Åまでの一貫性を示した。比較として、沈降速度（本明細書には詳細には説明していない標準的な方法を使用）によって測定した場合、同じグリコシル化レプチン蛋白は３１．２Åのストークス半径を有していた。
【０２０７】
未グリコシル化レプチン蛋白（ｒｍｅｔＨｕ−レプチン）ならびに２種類の単一部位グリコシル化レプチン蛋白は、３０Å未満のストークス半径を有していた。下記の実施例で示されるように、Ｎ４８Ｔ５０グリコシル化レプチン蛋白はｒｍｅｔＨｕ−レプチンに匹敵する生理活性を有していた。３部位グリコシル化蛋白（４７、６９、１０２）は、循環時間延長（従って、薬剤へのin vivo曝露増加）に関してかなり向上した生理活性を有していた。それは、有効径（ここではストークス半径として表現）を大きくすることで、腎臓での濾過性および最終的分解が低下することによって循環時間が延長することを示している。
【０２０８】
実施例２
１部位グリコシル化レプチンＮ４８Ｔ５０のin vivoでの生理活性および血清循環時間
本実施例は、１部位グリコシル化レプチンがｒｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６（配列番号１）とほぼ同等またはそれよりわずかに高い生理活性を有することを示す。グリコシル化は、活性を障害したり、受容体結合を防止しなかった。さらに、１部位グリコシル化レプチンの血清循環時間は、ｒｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６（配列番号１）と同等またはそれよりわずかに長いことが示される。
【０２０９】
動物には、１日１回７日間にわたって同一用量で１部位グリコシル化レプチンまたはｒｍｅｔＨｕ−レプチンを投与した。７日間終了後、動物を屠殺し、脂肪含有量を調べた。ｒｍｅｔＨｕ−レプチンと比較して、１部位グリコシル化レプチンの投与によって、約２５％多い脂肪減少が生じた。これは、非天然グリコシル化部位を有する本発明のグリコシル化レプチン組成物が生理活性を保持していることを示している。
【０２１０】
方法
１．使用したレプチン組成物
このグリコシル化レプチン「Ｎ４８Ｔ５０」は、４８位のイソロイシン（「Ｉ」）がアスパラギン（「Ｎ」）で置き換わり、次の２個のアミノ酸が置き換わらずに残っている（ロイシン（「Ｌ」）およびトレオニン（「Ｔ」））天然ヒトレプチン１〜１４６（配列番号１）のアミノ酸配列を有していた。１日１回投与群（いずれについての注射容量は１００μＬ）については、１ｍｇ／ｋｇ用量群で０．２ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｋｇ用量群で２．０ｍｇ／ｍＬである。第０日のみ投与群については、濃度５ｍｇ／ｍＬ、４００μＬ注射、１００ｍｇ／ｋｇ用量とした。
【０２１１】
２．動物
動物数と種類
チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Charles River Laboratories, Wilmington, MA）からの雌Ｃ５７ＢＬ６マウス５匹。
【０２１２】
動物齢および体重
動物は８〜１０週齢であり、体重はそれぞれ約２０ｇであった。
【０２１３】
３．投与
各試験開始時に、マウスを秤量し、サンプルを皮下ボラスで注射した。
【０２１４】
秤量：動物施設で試験に先だって１週間馴致させた動物において基底線体重を測定した。基底線体重は、初回投与を受ける直前に測定した。各試験を通じて、体重は１日１回モニタリングした。最終体重を記録した後、動物を屠殺し、腹部脂肪の量を０〜３で等級分けした。０は肉眼で観察される脂肪残留なし、３という評点は正常な動物で肉眼観察される脂肪量を反映したものとした。
【０２１５】
結果
大腸菌で発現したｒｍｅｔＨｕ−レプチン（１〜１４６）を１日１回投与したマウスでは、図１に示したように、緩衝液対照と比較して体重が減少した。驚くべきことに、グリコシル化レプチン（Ｎ４８Ｔ５０レプチン）投与マウスでも体重減少があった。両方の形のレプチンで、体重減少量は用量が上昇する（１ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ）と増加した。１００μｇ／ｋｇの単回注射を行った場合、グリコシル化レプチン投与マウスの方が、ｒｍｅｔＨｕ−レプチン（１〜１４６）投与マウスより体重減少が大きかった。さらに体重減少は、ｒｍｅｔＨｕ−レプチン投与マウスと比較して、グリコシル化レプチン投与マウスの方が長く持続した。ｒｍｅｔＨｕ−レプチン投与マウスおよびＮ４８Ｔ５０レプチン投与マウスについての肉眼検査では、いずれの形のレプチンを投与されたマウスも腹部脂肪量が低下し、腹部脂肪量は用量が上昇すると減少したことが示された。これは、グリコシル化レプチンが脂肪含有量を低下させる上で有効であり、未グリコシル化ｒｍｅｔＨｕ−レプチンより少ない回数で投与可能であることを示している。
【０２１６】
１部位グリコシル化レプチンの薬物動態試験
本試験は、静脈投与の場合に、単一部位グリコシル化レプチンが未グリコシル化レプチンより長い半減期を有することを示すものである。皮下投与の場合に循環時間は、グリコシル化および未グリコシル化レプチンの両方で同様であった。
【０２１７】
材料
１．レプチン
上記の１部位グリコシル化レプチン（部位Ｎ４８Ｔ５０）を用い、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水中１０ｍｇ／ｍＬで製剤した。大腸菌で発現した組換えメチオニルヒトレプチン１〜１４６（配列番号１で、−１位がメチオニル残基のもの）を対照として用い、緩衝液中２．０ｍｇ／ｍＬで製剤した。
【０２１８】
２．動物
使用動物数／種類
雄ＣＤ−１マウス（Charles River Laboratories, Hollister, CA）３２匹（グリコシル化レプチン蛋白用）および８１匹（ｒ−ｍｅｔＨｕ−レプチン用）。
【０２１９】
動物齢／体重
動物は６〜９週齢であり、体重は約３０ｇであった。
【０２２０】
飼育／取り扱い
動物は個別に飼育し、実験齧歯類用飼料を自由に摂取させた。いずれの動物も動物取り扱い規範に従って取り扱った。
【０２２１】
３．投与
動物には、静脈投与（ＩＶ）または皮下投与（ＳＣ）にて、１．０ｍｇ／ｋｇの用量でグリコシル化レプチンを注射した。
【０２２２】
４．サンプリング
動物に麻酔を施し、標準的な心臓穿刺法を用いて所定の時点で採血を行った。グリコシル化レプチンの血清濃度を、イムノアッセイ（以下に記載）を用いて測定した。
【０２２３】
５．比較
循環時間データを、同様の大きさの動物について同じ投与経路を用い、同一用量でのｒｍｅｔＨｕ−レプチンに関する以前に得られたデータと比較した。
【０２２４】
結果
表２．１には、マウスでのグリコシル化レプチンおよびｒｍｅｔＨｕ−レプチンの薬物動態パラメータを示してある。ＩＶデータを比較すると、グリコシル化レプチンの方が、低い全身クリアランス（５００ｍＬ／ｈ／ｋｇと６７６ｍＬ／ｈ／ｋｇ）および長い終末半減期（１．２４時間と０．７３３時間）を示した。定常状態での分布容量（Ｖｓｓ）は、グリコシル化レプチンとｒｍｅｔＨｕ−レプチンとの間で同様であった。これらのデータは、グリコシル化蛋白がｒｍｅｔＨｕ−レプチンより遅く、全身循環から排除されることから、半減期および曝露（ＡＵＣ推定値２０００ｎｇ・ｈ／ｍＬと１４８０ｎｇ・ｈ／ｍＬ）が長くなったことを示している。ＳＣ投与後では、グリコシル化レプチンとｒｍｅｔＨｕ−レプチンの間で同様のピーク血清濃度（Ｃｍａｘ）が得られた（１２３０ｎｇ／ｍＬと１３８０ｎｇ／ｍＬ）。ただし、グリコシル化レプチンについてはピーク時間（ｔｍａｘ）の遅延があった。いずれの分子についても、得られた曝露推定値（ＡＵＣに基づいたもの）は同様であった。皮下投与での生物学的利用能は、グリコシル化レプチンで約６０．５％でありｒｍｅｔＨｕ−レプチンで７９．６％であった。
【０２２５】
【表３】
0004841037.tif 000022
【０２２６】
実施例３
他の１部位グリコシル化レプチン類のin vitroでの生理活性
以下の表３．１では、グリコシル化部位を含める変化のためのアミノ酸位置は、ｒＨｕ−レプチンである上記の配列番号１の番号割り付けに基づいている。
【０２２７】
蛋白は、天然ヒトレプチン信号ペプチドおよびＣＯＳ細胞を用いて、下記の参考例に記載の方法に従って発現させた。発現産生物について４種類の分析を行った（用いた方法については下記の記載してある）。
【０２２８】
１．野生型と比較した発現
蛋白の収量を、ＣＯＳ細胞で発現させたｒＨｕ−レプチン１〜１４６と比較した。ｒＨｕ−レプチン１〜１４６の量には、下記で定義の条件下に「１．００」という数字を割り当てた。
【０２２９】
２．グリコシル化パーセント
完全にグリコシル化された蛋白の収量を、下記に記載のウェスタンブロットの肉眼検査による総レプチン蛋白のパーセントとして求めた。
【０２３０】
３．野生型と比較した結合、レプチン−Ｒ
レプチン受容体の製造物を用いたin vitroでの競合アッセイで、得られた放射能標識グリコシル化レプチン蛋白を、下記に記載の方法に従って、レプチン受容体への結合の強度において、放射能標識ｒＨｕ−レプチン１〜１４６と比較した。
【０２３１】
４．野生型と比較したin vitroでの生理活性
下記のキメラレプチン受容体を用いるin vitroアッセイで、得られたグリコシル化レプチン蛋白を、以下に記載の方法に従ってｒＨｕ−レプチン１〜１４６と比較した。「ＮＤ」とは、実験を行わなかったためにデータが得られていないことを意味する。
【０２３２】
【表４】
0004841037.tif 000023
＊ＥＳＰ７７は、７７位のグリコシル化部位および下記で詳細に説明するエリトロポイエチンの信号ペプチドを用いた発現を示すものである。
【０２３３】
１／「位置」は、ｒＨｕ−レプチン１〜１４６である配列番号１に従ったアミノ酸位置を示す。挙げられている特定の配列（例：「５３」、「５５」など）は、「Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ」のコンセンサスグリコシル化配列における「Ｎ」位を示している。
【０２３４】
結果
表から明らかなように、得られた単一部位グリコシル化レプチン蛋白の場合、未グリコシル化レプチンと比較して、活性量が高くなっているように見えた１１８位にグリコシル化部位を有する蛋白を除き、ほとんどの単一部位グリコシル化レプチン蛋白が、本明細書で使用のin vitroアッセイで測定した生理活性にほとんど上昇を示さなかった。これらの類縁体の一部は、正常または比較的高いレベルで分泌され、ほとんどが、同様にして発現・分析したｒＨｕ−レプチン１〜１４６に匹敵する受容体結合活性を有していた。驚くべきことに、グリコシル化レプチン蛋白の一部は、受容体結合活性を保持していたとしても、in vitroでの生理活性が低かった。そこで、グリコシル化レプチン蛋白は、それがin vitro生理活性を保持したか否かに従って２つの種類の分けることができた。in vitro生理活性が低かったグリコシル化レプチン蛋白は、レプチン拮抗薬であることができる。
【０２３５】
実施例４
２部位グリコシル化レプチン類のin vitro生理活性
表４．１に示したように、各種２部位グリコシル化レプチン蛋白も製造し、単一部位蛋白に関する上記の方法に従って試験を行った。表記および略称は、１部位蛋白に関する表３．１でのものと同様である。
【０２３６】
グリコシル化の表記は、下記に記載のウェスタンブロットの肉眼検査によって測定した１個または２個の鎖を有する材料の大体のパーセントを示している。例えば、グリコシル化レプチン蛋白２５＋２９の場合、材料の５０％が１個の鎖を有しており、材料の５％が２個の鎖を有していた。
【０２３７】
【表５】
0004841037.tif 000024
受容体結合を保持し、生理活性を示す２個のグリコシル化部位の組合せを有する多くのグリコシル化レプチン蛋白を製造することができる。
【０２３８】
実施例５
コンセンサス配列においてセリンではなくトレオニンを用いてのグリコシル化効率の向上
本実施例は、グリコシル化コンセンサス配列においてセリンではなくトレオニンを用いた場合にグリコシル化部位効率が向上することを示すものである。本実施例では、グリコシル化部位を含める変化についての全てのアミノ酸配列位置は、ｒＨｕ−レプチン１〜１４６である配列番号１の番号割り付けに基づいたものである。
【０２３９】
グリコシル化レプチン蛋白は、下記の参考例に記載の方法を用いて構築、発現および分析した。結果は図２に示してある。２置換Ｗ１００、Ｓ１０２からＮ１００、Ｔ１０２による単一グリコシル化部位の導入によって、Ｎ−連結炭水化物の付加が生じ、炭水化物を含む分子の割合（ウェスタンブロッティングによって測定されるＳＤＳ  ＰＡＧＥによって）は、Ｗ１００、Ｓ１０２からＮ１００、Ｔ１０２置換の場合よりかなり大きかった。これは、コンセンサス配列にトレオニンを有する蛋白分子の方が、コンセンサス配列にセリンを有するものより多くグリコシル化されたことを示している。そこで、この発現系におけるグリコシル化効率は、Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒを用いた場合より、コンセンサス配列Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｔｈｒを用いた方が高い。そのように、トレオニン残基を用いることが好ましい。
【０２４０】
実施例６
上流配列によるグリコシル化効率への影響
本実施例は、−１位（置換アスパラギン残基に対して）のアミノ酸ならびにコンセンサス配列におけるアスパラギン残基の直接「上流」の（すなわち、Ｎ−末端方向）置換の両方によって、グリコシル化効率が影響されることを示す。
【０２４１】
Ｓ９９、Ｎ１００、Ｓ１０２という変化のあるｒＨｕ−レプチン１〜１４６は、９９位にセリン置換のない同様の変化と比較してグリコシル化効率が高いことが認められた。それは、コンセンサスグリコシル化部位周囲の置換によって、グリコシル化部位占有がさらに向上し得ることを示している。
【０２４２】
さらに驚くべき点として、Ｗ１００からＴ１００への置換によって、恐らくは１００位でのレプチンのＯ−グリコシル化が生じた。これは、Ｏ−連結またはＮ−連結炭水化物を、行われる特定の置換に応じて同じ位置に付加させることが可能であることを示している。図２は、示したようなＯ−連結グリコシル化部位とＮ−連結グリコシル化部位を比較するウェスタンブロットである。図からわかる通り、示した配列「ＴＡＳ」（配列番号１に関して）を用いることで、Ｏ−連結グリコシル化が生じる。
【０２４３】
実施例７
３部位グリコシル化レプチンの全身循環時間の向上
本実施例は、１より多いグリコシル化部位を有するグリコシル化レプチンが、未グリコシル化組換えヒトレプチンよりかなり長い循環時間を有することを示すものである。ここでわかるように、グリコシル化レプチンは、ｒｍｅｔＨｕ−レプチンと比較して、４〜５倍の全身クリアランス低下および半減期延長を示した。皮下投与での生物学的利用能低下は小さかったが（未グリコシル化と比較して約１０％の低下）、グリコシル化レプチンではなおも、皮下投与後に薬剤曝露が相対的に高かった。
【０２４４】
材料
１．レプチン
下記で製造した３部位グリコシル化レプチン（部位４７、６９および１０２、配列番号３２）を用い、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（Gibco）中１．７６ｍｇ／ｍＬで製剤した。大腸菌で発現した組換えメチオニルヒトレプチン１〜１４６（配列番号１で、−１位がメチオニル残基のもの）を対照として用い、緩衝液中２．０ｍｇ／ｍＬで製剤した。
【０２４５】
２．動物
使用動物数／種類
雄ＣＤ−１マウス（Charles River Laboratories, Hollister, CA）２７匹（グリコシル化レプチン蛋白用）および８１匹（ｒ−ｍｅｔＨｕ−レプチン用）。
【０２４６】
動物齢／体重
動物は６〜９週齢であり、体重は約３０ｇであった。
【０２４７】
飼育／取り扱い
動物は個別に飼育し、実験齧歯類用飼料を自由に摂取させた。いずれの動物も動物取り扱い規範に従って取り扱った。
【０２４８】
３．投与
動物には、静脈投与（ＩＶ）または皮下投与（ＳＣ）にて、１．０ｍｇ／ｋｇの用量でグリコシル化レプチンを注射した。
【０２４９】
４．サンプリング
動物に麻酔を施し、標準的な心臓穿刺法を用いて所定の時点で採血を行った。グリコシル化レプチンの血清濃度を、イムノアッセイ（以下に記載）を用いて測定した。
【０２５０】
５．比較
循環時間データを、同様の大きさの動物について同じ投与経路を用い、同一用量でのｒｍｅｔＨｕ−レプチンに関する以前に得られたデータと比較した。
【０２５１】
結果
結果を図３および４に示してある。図３は皮下投与後の血清レプチン濃度を示すグラフであり、図４は静脈投与後の血清レプチン濃度を示すグラフである。
【０２５２】
約３０Åを超えるストークス半径を有するグリコシル化レプチンのＩＶおよびＳＣ投与のいずれの後でも、血清濃度はｒｍｅｔＨｕ−レプチンで認められるものならびに単一部位グリコシル化レプチン（Ｎ４８Ｔ５０）のものより高かった。ｒｍｅｔＨｕ−レプチンの場合、両方の投与経路から６時間以内に、血清濃度は１．０ｎｇ／ｍＬ以下に低下したが、グリコシル化レプチンの血清濃度は、ＩＶおよびＳＣ投与から２４時間にわたって１．０ｎｇ／ｍＬ超に留まった。
【０２５３】
表７．１には、マウスでのグリコシル化レプチンおよびｒｍｅｔＨｕ−レプチンの薬物動態パラメータを示してある。
【０２５４】
【表６】
0004841037.tif 000025
【０２５５】
ＩＶデータ（図４参照）を比較すると、グリコシル化レプチンの方が、低い全身クリアランス（１２０ｍＬ／ｈ／ｋｇと６７６ｍＬ／ｈ／ｋｇ）および長い終末半減期（２．７６時間と０．７３３時間）を示した。定常状態での分布容量（Ｖｓｓ）は、グリコシル化レプチンとｒｍｅｔＨｕ−レプチンとの間で同様であった。これらのデータは、グリコシル化蛋白がｒｍｅｔＨｕ−レプチンより遅く、全身循環から排除されることから、半減期および曝露（ＡＵＣ推定値８３５０ｎｇ・ｈ／ｍＬと１４８０ｎｇ・ｈ／ｍＬ）が長くなったことを示している。ＳＣ投与後（図３参照）では、グリコシル化レプチンとｒｍｅｔＨｕ−レプチンの間で同様のピーク血清濃度（Ｃｍａｘ）が得られた（１４３０ｎｇ／ｍＬと１３８０ｎｇ／ｍＬ）。ただし、グリコシル化レプチンについてはピーク時間（ｔｍａｘ）の遅延があった。ＩＶ投与から得られた結果同様、皮下投与グリコシル化レプチンは、終末半減期の延長（２．２１時間と０．５４１時間）および曲線下面積（「ＡＵＣ」）の増加（５８００ｎｇ・ｈ／ｍＬと１１８０ｎｇ・ｈ／ｍＬ）を示した。それは恐らく、グリコシル化レプチンに関して全身クリアランスが低下したためと考えられる。皮下投与での生物学的利用能は、グリコシル化レプチンで約６９．５％でありｒｍｅｔＨｕ−レプチンで７９．６％であった。
【０２５６】
実施例８
３部位グリコシル化レプチンの体重減少活性の向上
本実施例は、ストークス半径が３０Åを超えるグリコシル化ヒトレプチンでは、未グリコシル化組換えヒトレプチンと比較してin vivo生理活性が向上していることを示すものである。本実施例からわかるように、１日１回投与で７日後に、未グリコシル化レプチンの場合と比較して、本実施例で投与した３部位グリコシル化レプチンの方がｏｂ／ｏｂマウスでの体重減少が約６．８倍多かった。
【０２５７】
方法
１．レプチン
下記で製造した３部位グリコシル化レプチン（部位４７、６９および１０２、配列番号３２）を用い、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．８）中１．９ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤した。組換えメチオニルヒトレプチン１〜１４６（配列番号１で、−１位がメチオニルのもの）を比較の基準として用い、５％ソルビトールを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）中２０ｍｇ／ｍＬで製剤した。５％ソルビトールを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を媒体対照として用いた。
【０２５８】
２．動物
温度、明暗および湿度を管理した条件下、６：００時に照明をオンとし、１８：００時に照明をオフとして動物を飼育した。アムゲン社（Amgen, Inc.）動物研究施設はＵＳＤＡおよびＡＡＡＬＡＣ−公認である。投与群当たり雌のｏｂ／ｏｂマウス（Jackson Laboratories）６匹を用いた。マウスは試験開始時に２ヶ月齢であり、体重は平均４５．６ｇであった。マウスは、群の平均体重が投与開始前に同等となるように投与群に無作為に割り当てた。動物はケージ当たり２匹飼育し、標準的な実験齧歯類飼料ペレットを自由に摂取させた。
【０２５９】
３．投与
全ての投与手順はアムゲン（Amgen）によって承認されたものであった（Institutional Animal Care And Use Committee）。グリコシル化レプチン、ｒ−ｍｅｔＨｕ−レプチンまたはプラシーボを、容量０．１ｍＬで肩甲領域への皮下注射によって１日１回投与した。レプチンの用量は、グリコシル化レプチンとｒ−ｍｅｔＨｕ−レプチンのいずれも０．５ｍｇ／ｋｇ／日とした。注射は７連続日で行い、試験第０日の晩に開始した（コロニーにおける消灯の２時間以内）。動物は注射時に１日１回体重測定した。データはいずれも、平均±ＳＥとして報告している。
【０２６０】
結果
図５でわかるように、３部位グリコシル化レプチン（「ＧＥ−レプチン」）によって最も大きい量の体重減少が得られ、平均体重減少は１０．８±０．３ｇ（初期体重の−２３．８±０．５％）であった。同用量のｒ−ｍｅｔＨｕ−レプチン（「ｈレプチン」）を投与することで平均体重減少１．６±０．４ｇ（初期体重の−３．５±１．１％）が得られ、プラシーボ投与によって平均体重増加２．６±０．２ｇ（初期体重の５．７±０．３％）があった。本実施例は、未グリコシル化組換えヒトレプチンと比較して、グリコシル化レプチンのin vivoでの生理活性がかなり向上したことを示している。
【０２６１】
実施例９
３部位グリコシル化レプチンの食欲抑制活性の向上
本実施例は、ストークス半径が３０Åを超えるグリコシル化ヒトレプチンでは、未グリコシル化組換えヒトレプチンと比較してin vivo生理活性が向上していることを示すものである。本実施例からわかるように、１日１回投与で７日後に、未グリコシル化レプチンの場合と比較して、本実施例で投与した３部位グリコシル化レプチンの方がｏｂ／ｏｂマウスでの飼料摂取が約１１倍少なかった。
【０２６２】
方法
１．レプチン
下記で製造した３部位グリコシル化レプチン（部位４７、６９および１０２、配列番号３２）を用い、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．８）中１．９ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤した。組換えメチオニルヒトレプチン１〜１４６（配列番号１で、−１位がメチオニルのもの）を比較の基準として用い、５％ソルビトールを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）中２０ｍｇ／ｍＬで製剤した。５％ソルビトールを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を媒体対照として用いた。
【０２６３】
２．動物
温度、明暗および湿度を管理した条件下、６：００時に照明をオンとし、１８：００時に照明をオフとして動物を飼育した。アムゲン社（Amgen, Inc.）動物研究施設はＵＳＤＡおよびＡＡＡＬＡＣ−公認である。投与群当たり雌のｏｂ／ｏｂマウス（Jackson Laboratories）６匹を用いた。マウスは試験開始時に２ヶ月齢であり、体重は平均４５．６ｇであった。マウスは、群の平均体重が投与開始前に同等となるように投与群に無作為に割り当てた。動物はケージ当たり２匹飼育し、標準的な実験齧歯類飼料ペレットを自由に摂取させた。
【０２６４】
３．投与
全ての投与手順はアムゲン（Amgen）によって承認されたものであった（Institutional Animal Care And Use Committee）。グリコシル化レプチン、ｒ−ｍｅｔＨｕ−レプチンまたはプラシーボを、容量０．１ｍＬで肩甲領域への皮下注射によって１日１回投与した。レプチンの用量は、グリコシル化レプチンとｒ−ｍｅｔＨｕ−レプチンのいずれも０．５ｍｇ／ｋｇ／日とした。注射は７連続日で行い、試験第０日の晩に開始した（コロニーにおける消灯の２時間以内）。
【０２６５】
４．飼料測定
毎日、各動物のケージにおける飼料量を秤量することで、注射時に１日１回飼料摂取を測定した。飼料摂取は、１日当たりマウス当たり摂取されたグラム数として報告しており、（前日のケージ中の飼料重量−当日の飼料重量）／ケージ当たりマウス数（２匹）として計算した。データはいずれも平均±ＳＥとして報告している。
【０２６６】
結果
図６でわかるように、３部位グリコシル化レプチンの投与によって最も大きい飼料摂取低下が生じ、７回目投与後の最後の２４時間期間における平均飼料摂取は０．４±０．０４ｇ／マウス／日であった。同じ２４時間期間で、媒体投与対照での飼料摂取（７．０±０．３ｇ／マウス／日）と比較して、組換えメチオニルヒトレプチンによって飼料摂取は４．４±０．４ｇ／マウス／日まで低下した。本実施例は、未グリコシル化組換えヒトレプチンと比較して、グリコシル化レプチンのin vivoでの生理活性がかなり向上したことを示している。
【０２６７】
実施例１０
間欠投与した３部位グリコシル化レプチンの体重減少活性の向上
本実施例は、ストークス半径が３０Åを超える３部位グリコシル化ヒトレプチンの向上したin vivoでの生理活性が、それを間歇的に投与した場合に維持されることを示すものである。本実施例からわかるように、１０倍高い用量の未グリコシル化レプチンを投与した場合と比較して、１日１回または２日に１回グリコシル化レプチンを投与した方が、ｏｂ／ｏｂマウスにおいて有意な体重減少があった。
【０２６８】
方法
１．レプチン
下記で製造した３部位グリコシル化レプチン（部位４７、６９および１０２、配列番号３２）を用い、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．８）中１．９ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤した。組換えメチオニルヒトレプチン１〜１４６（配列番号１で、−１位がメチオニルのもの）を比較の基準として用い、５％ソルビトールを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）中２０ｍｇ／ｍＬで製剤した。５％ソルビトールを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を媒体対照として用いた。
【０２６９】
２．動物
温度、明暗および湿度を管理した条件下、６：００時に照明をオンとし、１８：００時に照明をオフとして動物を飼育した。アムゲン社（Amgen, Inc.）動物研究施設はＵＳＤＡおよびＡＡＡＬＡＣ−公認である。投与群当たり雌のｏｂ／ｏｂマウス（Jackson Laboratories）６匹を用いた。マウスは試験開始時に４．５ヶ月齢であり、体重は平均６６．６ｇであった。マウスは、群の平均体重が投与開始前に同等となるように投与群に無作為に割り当てた。動物はケージ当たり２匹飼育し、標準的な実験齧歯類飼料ペレットを自由に摂取させた。
【０２７０】
３．投与
全ての投与手順はアムゲン（Amgen）によって承認されたものであった（Institutional Animal Care And Use Committee）。グリコシル化レプチン、ｒ−ｍｅｔＨｕ−レプチンまたはプラシーボを、容量０．１ｍＬで肩甲領域への皮下注射によって１日１回または２日で１回投与した。レプチンの用量は、グリコシル化レプチンまたはｒ−ｍｅｔＨｕ−レプチンを１日１回注射したマウスで０．２５または２．５ｍｇ／ｋｇ／日とした。グリコシル化レプチンまたはｒ−ｍｅｔＨｕ−レプチンを２日で１回注射したマウスでのレプチンの用量は、１または１０ｍｇ／ｋｇ／日とした。注射は７連続日で行い、試験第０日の晩に開始した（コロニーにおける消灯の２時間以内）。レプチンを２日に１回注射したマウスでは、隔日で媒体の注射を行った。動物は注射時に１日１回秤量した。体重減少パーセントを、（（第７日体重−第０日体重）／第０日体重）×１００）として計算する。データはいずれも平均±ＳＥとして報告している。
【０２７１】
結果
表１０．１に示したように、０．２５ｍｇ／ｋｇ／日のグリコシル化レプチンを１日１回注射したマウスは、同用量または１０倍用量の組換えメチオニルヒトレプチンを投与したマウスより多い体重減少を示した。
【０２７２】
【表７】
0004841037.tif 000026
【０２７３】
表１０．２に示したように、１ｍｇ／ｋｇ／日のグリコシル化レプチンを２日に１回注射したマウスでは、同用量または１０倍用量の組換えメチオニルヒトレプチンを投与したマウスより体重減少が大きかった。
【０２７４】
【表８】
0004841037.tif 000027
【０２７５】
本実施例は、未グリコシル化組換えヒトレプチンと比較したグリコシル化レプチンの生理活性向上が、その蛋白を肥満マウスに間歇的に投与した場合に保存されることを示している。
【０２７６】
実施例１１
野生型マウスでの３部位グリコシル化レプチンの用量応答試験
本実施例は、ストークス半径が３０Åを超える３部位グリコシル化ヒトレプチンが非肥満マウスにおいて生理活性を有することを示すものである。さらに本実施例は、野生型マウスにおいて、かなり低い用量のグリコシル化レプチンによって、未グリコシル化レプチンと比較してかなり大きい体重低下が生じることを確認するものである。
【０２７７】
１．レプチン
下記で製造した３部位グリコシル化レプチン（部位４７、６９および１０２、配列番号３２）を用い、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．８）中５．１ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤した。組換えメチオニルヒトレプチン１〜１４６（配列番号１で、−１位がメチオニルのもの）を比較の基準として用い、５％ソルビトールを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）中２０ｍｇ／ｍＬで製剤した。５％ソルビトールを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を媒体対照として用いた。
【０２７８】
２．動物
温度、明暗および湿度を管理した条件下、６：００時に照明をオンとし、１８：００時に照明をオフとして動物を飼育した。アムゲン社（Amgen, Inc.）動物研究施設はＵＳＤＡおよびＡＡＡＬＡＣ−公認である。投与群当たり雌のＣ５７Ｂ１／６Ｊマウス（Jackson Laboratories）６匹を用いた。マウスは試験開始時に２．５ヶ月齢であり、体重は平均２０．０ｇであった。マウスは、群の平均体重が投与開始前に同等となるように投与群に無作為に割り当てた。動物はケージ当たり２匹飼育し、標準的な実験齧歯類飼料ペレットを自由に摂取させた。
【０２７９】
３．投与
全ての投与手順はアムゲン（Amgen）によって承認されたものであった（Institutional Animal Care And Use Committee）。グリコシル化レプチン、ｒ−ｍｅｔＨｕ−レプチンまたはプラシーボを、容量０．１ｍＬで肩甲領域への皮下注射によって１日１回投与した。レプチンの用量は１または１０ｍｇ／ｋｇ／日とした。注射は７連続日で行い、試験第０日の晩に開始した（コロニーにおける消灯の２時間以内）。動物は注射時に１日１回秤量した。体重減少パーセントを、（（第７日体重−第０日体重）／第０日体重）×１００）として計算する。データはいずれも平均±ＳＥとして報告している。
【０２８０】
結果
表１１．１に示したように、１ｍｇ／ｋｇ／日のグリコシル化レプチンを１日１回注射したマウスは、同用量または１０倍用量の組換えメチオニルヒトレプチンを投与したマウスより多い体重減少を示した。
【０２８１】
【表９】
0004841037.tif 000028
【０２８２】
本実施例は、未グリコシル化組換えヒトレプチンと比較したグリコシル化レプチンの生理活性向上が、非肥満マウスでもあることを示している。
【０２８３】
実施例１２
野生型マウスに間歇的に投与した３部位グリコシル化レプチンの体重減少活性向上
本実施例は、ストークス半径が３０Åを超える３部位グリコシル化ヒトレプチンがｒ−ｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６と比較して向上した生理活性を有することを示すものである。さらに本実施例は、野生型マウスにおいて、グリコシル化レプチンをｒ−ｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６より回数の少ない投与計画で投与した場合に、その向上した生理活性が維持されることを示すものでもある。
【０２８４】
１．レプチン
下記で製造した３部位グリコシル化レプチン（部位４７、６９および１０２、配列番号３２）を用い、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ６．８）中５．１ｍｇ／ｍＬの濃度で製剤した。組換えメチオニルヒトレプチン１〜１４６（配列番号１で、−１位がメチオニルのもの）を比較の基準として用い、５％ソルビトールを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）中２０ｍｇ／ｍＬで製剤した。５％ソルビトールを含む１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を媒体対照として用いた。
【０２８５】
２．動物
温度、明暗および湿度を管理した条件下、６：００時に照明をオンとし、１８：００時に照明をオフとして動物を飼育した。アムゲン社（Amgen, Inc.）動物研究施設はＵＳＤＡおよびＡＡＡＬＡＣ−公認である。投与群当たり雌のＣ５７Ｂ１／６Ｊマウス（Jackson Laboratories）６匹を用いた。マウスは試験開始時に２．５ヶ月齢であり、体重は平均２０．０ｇであった。マウスは、群の平均体重が投与開始前に同等となるように投与群に無作為に割り当てた。動物はケージ当たり２匹飼育し、標準的な実験齧歯類飼料ペレットを自由に摂取させた。
【０２８６】
３．投与
全ての投与手順はアムゲン（Amgen）によって承認されたものであった（Institutional Animal Care And Use Committee）。グリコシル化レプチン、ｒ−ｍｅｔＨｕ−レプチンまたはプラシーボを、容量０．１ｍＬで肩甲領域への皮下注射によって１日１回投与した。レプチンの用量は、２日に１回注射で１、５または１０ｍｇ／ｋｇ／日とした。注射は７連続日で２日に１回行い、試験第０日の晩に開始した（コロニーにおける消灯の２時間以内）。マウスには、隔日で媒体を注射した。動物は注射時に１日１回秤量した。体重減少パーセントを、（（第７日体重−第０日体重）／第０日体重）×１００）として計算する。データはいずれも平均±ＳＥとして報告している。
【０２８７】
結果
表１２．１に示したように、１、５または１０ｍｇ／ｋｇ／日のグリコシル化レプチンを２日に１回注射したマウスは、同用量の組換えメチオニルヒトレプチンを２日に１回投与したマウスより多い体重減少を示した。
【０２８８】
【表１０】
0004841037.tif 000029
【０２８９】
本実施例は、未グリコシル化組換えヒトレプチンと比較したグリコシル化レプチンの生理活性向上が、その蛋白を非肥満マウスに間歇的に投与した場合でも保存されることを示している。
【０２９０】
実施例１３
別の複数グリコシル化部位レプチン蛋白
以下の表１３．１には、やはり製造された別のグリコシル化ヒトレプチン蛋白を示してある。この表の欄は、（１）Ｎ−グリコシル化の位置（配列番号１、ｒＨｕ−レプチン１〜１４６の番号割り付けに関して）（別段の断りがない場合）；（２）「野生型」（「ＷＴ」、ここでは配列番号１のｒＨｕ−レプチン１〜１４６）と比較した発現収量；（３）検出されたグリコシル化種；（４）「ＷＴ」と比較した受容体結合；（５）「ＷＴ」と比較した生理活性を示している。使用した方法は以下に説明している。「ＮＤ」という用語は、測定しなかったことを意味している（ここで発現に用いた具体的な配列は、グリコシル化レプチン蛋白４７＋６９＋１０２の発現に関連して以下の実施例でさらに詳細に説明している）。
【０２９１】
【表１１】
0004841037.tif 000030
略称および表記は上記で使用したものと同様である（例えば表４．１参照）。
＊「ＲＲＲ」は、グリコシル化レプチン蛋白上での３個のＣ−末端アルギニン残基の使用を示している。
【０２９２】
さらに、下記の実施例１５にさらに記載されている方法に従って、以下の複数部位グリコシル化レプチン蛋白を製造し、試験を行った。
【０２９３】
２＋２３＋４７＋６９＋９２；
２＋４７＋６９＋９２＋１０２；
２３＋４７＋６９＋９２＋１０２；
２＋４７＋６９＋９２；
２＋４７＋６９＋１０２；
２３＋４７＋６９＋１０２；
２３＋４７＋６９＋９２；
Ｑ−４７＋６９＋９２＋１０２（「Ｑ−」は、グリコシル化部位を付加した蛋白骨格として配列番号２ｒＨｕ−レプチン１〜１４５を用いたことを示している）；
４７＋６９＋１００ｅ＋１０２。
【０２９４】
さらに本発明は、４７、６９、９２および１０２位にグリコシル化部位を有するグリコシル化レプチン蛋白をも包含する。
【０２９５】
実施例１４
各種信号配列およびグリコシル化に影響する他の配列を用いた３部位グリコシル化レプチン蛋白の発現
本実施例は、やはり前述しているｒＨｕ−レプチン１〜１４６の４７位、６９位および１０２位にあるグリコシル化に利用可能な部位を有する３部位グリコシル化レプチン蛋白（配列番号１で、本明細書に記載の方法に従って製造した式Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔを用いた上記のグリコシル化部位を有するもの）のグリコシル化における相違を示すものである。ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞という２種類の細胞型での発現は、下記の参考例に記載の方法に従ったものである。グリコシル化は、下記の参考例に記載の方法に従って測定した。グリコシル化程度は、５がグリコシル化部位が最大占有されているように見えるものとする１〜５のスケールで評点した。「ＮＤ」という用語は、「測定せず」を意味する。
【０２９６】
各種信号配列を用いた。これら信号配列のアミノ酸配列を以下の表１４．１に示してある。下記の用語を用いて、本発明のグリコシル化レプチンを発現するのにどの信号配列その他のアミノ酸配列を用いたかを示した。
【０２９７】
【表１２】
0004841037.tif 000031
0004841037.tif 000032
0004841037.tif 000033
【０２９８】
【表１３】
0004841037.tif 000034
0004841037.tif 000035
0004841037.tif 000036
【０２９９】
各種ＴＰＡ信号ペプチド、特に変更Ｃ−末端（前駆配列の付加など）のあるものは、ＣＨＯ細胞およびＣＯＳ細胞の両方で最も高いグリコシル化効率を有するように思われた。
【０３００】
それはウェスタンブロット（図７）によって確認された。図からわかるように、ｔＰＡの信号配列を用いることで最も高分子量となったことから、最も高度にグリコシル化されたサンプルが得られた。
【０３０１】
図８は、上記のように３部位グリコシル化レプチン蛋白４７＋６９＋１０２についての各種発現条件の比較結果を示すウェスタンブロットである。この図のウェスタンブロットの左側から始めて、以下のように列の付加を行う。
【０３０２】
列１：分子量標準。
【０３０３】
列２：天然ヒトレプチン信号ペプチドを用いてＣＯＳ細胞で発現される３個のアルギニンのＣ−末端アミノ酸配列を有する４７＋６９＋１０２。
【０３０４】
列３：ＣＨＯ細胞で発現される列２と同じもの。
【０３０５】
列４：天然ヒトエリトロポイエチン信号ペプチドを用いて発現される列２と同じもの。
【０３０６】
列５：「ＱＴＴ  ＣＯＳ  ＥＳＰ」、天然ヒトエリトロポイエチン信号ペプチドを用いてＣＯＳ細胞で発現されるアミノ酸変化２７Ｔ２８Ｓ＞２７Ｔ２９Ｔを有するｒＨｕ−レプチン１〜１４５（配列番号２）。
【０３０７】
列６：「ＱＴＴ  ＣＨＯ  ＥＳＰ」、天然ヒトエリトロポイエチン信号ペプチドを用いてＣＨＯ細胞で発現される列５と同じもの。
【０３０８】
列７：「ＥＡ２  ４７＋６９＋１０２ＣＯＳ」、本実施例で示した、ヒトエリトロポイエチン信号ペプチドおよび変更ヒトアルブミン前駆配列を用いて、ＣＯＳ細胞で発現される、Ｃ−末端アルギニンを持たない列２と同じもの。
【０３０９】
列８：「ＥＡ２  ４７＋６９＋１０２ＣＨＯ」、ＣＨＯ細胞で発現される列７と同じもの。
【０３１０】
列９：「ＣＨＯでのＥＡ２  ４７＋６９＋１０２＋フリン」、本実施例で示したフリン構築物を用いた、列８と同じもの。
【０３１１】
高分子量帯域（グリコシル化を示す）の密度を示すことでわかるように、３グリコシル化レプチン蛋白（列２、３、４、７、８および９）は、１個のＯ−連結部位を有する変更ｒＨｕ−レプチン１〜１４５（列５および６）と比較してグリコシル化が多い。ＣＨＯ細胞を使用することで、ＣＯＳ細胞の場合と比較してグリコシル化量が増加し（例えば、列２と列４）、エリトロポイエチン信号ペプチドはグリコシル化を向上させるようにも思われた（例えば、列３と列５）。
【０３１２】
図９は、レプチン信号ペプチドまたはｔＰＡ信号ペプチドの使用、あるいはいずれか一方と他方の置換酵素開裂部位との使用を比較したウェスタンブロットである。ｔＰＡ信号ペプチド使用の方が、レプチン信号ペプチドの使用よりグリコシル化が多かった（左２列）。ペプチダーゼ開裂部位を含むレプチン信号ペプチドのＣ−末端部分をｔＰＡ信号ペプチドのＮ−末端部分とともに用いたところ、グリコシル化効率は低下した（「Ｔｐａ／レクチン」の列）。しかしながら、開裂部位を含むｔＰＡ信号ペプチドのＣ−末端部分をレプチン信号ペプチドのＮ−末端部分と使用すると、グリコシル化効率は上昇した（「レプチン／Ｔｐａ」列）。良好なグリコシル化効率が認められたのは、ｔＰＡ開裂部位のみをレプチン信号ペプチドに導入した場合であった（「レプチン（ＳＰＳ）」）。それは、部分開裂部位配列の置換より高いグリコシル化効率を有していた（「レプチン（ＳＰ）」）。
【０３１３】
図１０は、Ｎ−グリカナーゼによる炭水化物部分の除去の結果観察によるグリコシル化効率を比較するウェスタンブロットである。図からわかる通り、炭水化物を除去した列では（「＋」で示したもの）、レプチン蛋白は、未グリコシル化レプチンと同じ分子量まで移動する。Ｎ−グリカナーゼを用いない列（「−」）での見かけの炭水化物量を比較すると、エリトロポイエチン信号ペプチド（「ＥＳＰ」または上記の使用のような別の表記と組み合わせた場合は「Ｅ」）の使用によって、被験３部位グリコシル化レプチン蛋白はより効率良くグリコシル化されるように思われる。
【０３１４】
実施例１５
各種信号ペプチドおよびグリコシル化に影響する他の配列を用いた複数部位グリコシル化レプチン蛋白の別の発現試験
本実施例は、各種信号ペプチドおよび他の配列を用いた、単一および複数グリコシル化部位レプチン蛋白の発現に関する追加データを提供するものである。別段の断りがない限り、以下のグリコシル化レプチン蛋白は、好ましい式のＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔを用いて配列番号１に付加したグリコシル化部位を指す。発現はＣＯＳ細胞でのものであった。
【０３１５】
パーセント（「％」）グリコシル化とは、炭水化物を含む分子のパーセントを意味する。それは、ウェスタンブロット（以下に参考例でさらに詳細に説明する）の肉眼検査および視覚化した総レプチン蛋白のうちのグリコシル化蛋白の割合を主観的に求めることで測定した。
【０３１６】
対照
以下の表１５．１には、各種レプチン蛋白についてのデータを示してある。ヒトレプチン１〜１４５（配列番号２、本明細書では「Ｑ−」と表す）を、グリコシル化蛋白として発現した。エリトロポイエチン（上記実施例の場合のように「ＥＳＰ」）からの信号ペプチドを用い、天然グリコシル化部位を用いてＣＯＳ細胞で発現した場合、２５％グリコシル化があった（グリコシル化に利用可能な部位の２５％が、発現蛋白分子群でグリコシル化されたことを示す）。それは、天然ヒトレプチン信号ペプチド（上記のもの）を用いた場合に認められた１０％グリコシル化より高かった。グリコシル化部位の一つを、セリンではなく２９位のトレオニンを有するように変えた場合（表に示したように）、結果は２倍となり、Ｏ−グリコシル化に関しては、「Ｓ」より「Ｔ」の方が良いことを示している。天然Ｏ−連結部位の「Ｔ」と「Ｓ」のいずれも、それぞれ１および２炭水化物鎖の混合物でグリコシル化することができる。その部位を２９位に「Ｔ」を有するように変えた場合、１個および／または２個の鎖を有するそれら２部位のパーセントは上昇する。
【０３１７】
【表１４】
0004841037.tif 000037
【０３１８】
「ＷＴ」はｒＨｕ−レプチン１〜１４６（配列番号１）を示す。
「ＥＳＰ」は、上記の実施例１４に記載の天然ヒトエリトロポイエチン信号ペプチドを示す。
「ＥＳＰ  Ｏｂ＋」は、天然ヒトエリトロポイエチン信号ペプチドとともに上記のものを用いることを示す。
「（−Ｑ）Ｏｂ＋」は、ｒＨｕ−レプチン１〜１４５（配列番号２）を示す。
「ＥＡ」は、上記実施例１４の場合のように、ヒトアルブミン前駆配列とともに天然ヒトエリトロポイエチン信号ペプチドを用いることを示す。
【０３１９】
信号部位グリコシル化レプチン蛋白の発現
部位２の比較
以下の表１５．２からわかる通り、３個の末端アルギニンを付加することで、グリコシル化効率が向上した。
【０３２０】
【表１５】
0004841037.tif 000038
２回アッセイを行った場合、両方の結果を示してある。略称は、上記の実施例１４の場合と同様である。全ての表で用いている「ＮＤ」は、測定せずを意味するものである。
【０３２１】
部位２３の比較
以下の表１５．３からわかる通り、最も高い発現レベルおよび最も高い生物学的利用能が得られたのは、天然レプチン信号ペプチドを用いた場合であった（第１列、２３ａ）。発現はＣＯＳ細胞でのものであった。
【０３２２】
【表１６】
0004841037.tif 000039
略称は、上記の実施例１４の場合と同様である。全ての表で用いている「ＮＤ」は、測定せずを意味するものである。
【０３２３】
部位４７の比較
以下の表１５．４からわかる通り、３個の末端アルギニン（「ＲＲＲ」）を付加することで、４７位にグリコシル化部位を有するグリコシル化レプチン蛋白について別のグリコシル化が生じた。
【０３２４】
【表１７】
0004841037.tif 000040
２回アッセイを行った場合、両方の結果を示してある。略称は、上記の実施例１４の場合と同様である。全ての表で用いている「ＮＤ」は、測定せずを意味するものである。
【０３２５】
部位４８の比較
以下の表１５．５からわかる通り、ＣＯＳ細胞を用いた４８位信号部位グリコシル化レプチン蛋白について最も高い発現レベルは、ヒト血清アルブミンからの前駆配列と組み合わせたエリトロポイエチンからの信号配列を用いた場合であった。表からわかるように、この単一部位蛋白は、未グリコシル化レプチンより高い生理活性を有していた。
【０３２６】
【表１８】
0004841037.tif 000041
略称は、上記の実施例１４の場合と同様である。グリコシル化パーセントは、上記の表１５．１と同じ用語で表してある。
【０３２７】
部位６９の比較
以下の表１５．６からわかる通り、ｔＰＡ信号ペプチドと３個の末端アルギニンを使用することで、最も高いグリコシル化効率が得られた。
【０３２８】
表１５．６
【０３２９】
【表１９】
0004841037.tif 000042
略称は、上記の実施例で使用のものと同様である。グリコシル化パーセントは、上記の表１５．１と同じ用語で表してある。
【０３３０】
部位９２の比較
以下の表１５．７からわかる通り、３個の末端アルギニンを付加することで、グリコシル化効率が向上した。
【０３３１】
【表２０】
0004841037.tif 000043
用いた略称は、上記の実施例で使用のものと同様である。グリコシル化パーセントは、上記の表１５．１と同じ用語で表してある。
【０３３２】
部位１０２の比較
以下の表１５．８からわかる通り、３個のＣ−末端アルギニン残基を付加することで、グリコシル化効率が向上した。
【０３３３】
【表２１】
0004841037.tif 000044
用いた略称は、上記の実施例で使用のものと同様である。グリコシル化パーセントは、上記の表１５．１と同じ用語で表してある。
【０３３４】
２部位グリコシル化レプチン蛋白の発現
部位４７＋６９の比較
表１５．９でわかるように、部位４７＋６９レプチングリコシル化蛋白（上記記載）に関して、天然レプチン信号ペプチドの使用によって最も高い発現レベルが得られた。ヒト血清アルブミン前駆配列を有するエリトロポイエチン信号ペプチドの使用、あるいはヒト血清アルブミン信号ペプチドと前駆配列の使用によって、比較的高い生理活性結果が得られた。
【０３３５】
【表２２】
0004841037.tif 000045
略称は、上記で用いたものと同様である。グリコシル化は、上記で使用のものと同じ用語で表している（例えば表４．１参照）。
【０３３６】
部位６９＋１０２の比較
表１５．１０でわかるように、ＣＯＳ細胞でのエリトロポイエチン信号ペプチドの使用によって見かけ上、６９＋１０２の２部位グリコシル化レプチンの発現に悪影響があった（上記記載）。
【０３３７】
【表２３】
0004841037.tif 000046
略称は、上記で用いたものと同様である（詳細については実施例１４参照）。グリコシル化は、上記で使用のものと同じ用語で表している（例えば表４．１参照）。
【０３３８】
３部位グリコシル化レプチン蛋白の発現
表１５．１１でわかるように、エリトロポイエチン信号ペプチドの使用によって、ＣＯＳ細胞で発現される各種グリコシル化レプチン蛋白に対して多様な効果があった。興味深いことに、最も高い生理活性を有するグリコシル化レプチン蛋白は、最も高い受容体結合を有していた（数が小さいほど、受容体への親和性が高い）。
【０３３９】
【表２４】
0004841037.tif 000047
略称は、上記で用いたものと同様である（詳細については実施例１４参照）。グリコシル化は、上記で使用のものと同じ用語で表している（例えば表４．１参照）。
【０３４０】
４部位グリコシル化レプチン蛋白の発現
表１５．１２でわかるように、ＣＯＳ細胞での４部位グリコシル化レプチン蛋白発現の場合、各種発現レベルが得られ、得られたグリコシル化蛋白は多様な程度の受容体結合および生理活性を有していた。この４部位レプチンの群では、２３＋４７＋６９＋９２および２３＋４７＋６９＋１０２部位レプチンが、野生型（すなわち、ｒｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６、配列番号１）と比較して最も高い生理活性を有していた。
【０３４１】
【表２５】
0004841037.tif 000048
略称は、上記で用いたものと同様である（詳細については実施例１４参照）。グリコシル化は、上記で使用のものと同じ用語で表している（例えば表４．１参照）。
【０３４２】
５部位グリコシル化レプチン蛋白の発現
表１５．１３に示したように、各種５部位グリコシル化蛋白の発現レベルは、示した信号ペプチドを用いるとかなり低かった。一部のデータは測定しなかった（「ＮＤ」）。
【０３４３】
【表２６】
0004841037.tif 000049
略称は、上記で用いたものと同様である（詳細については実施例１４参照）。グリコシル化は、上記で使用のものと同じ用語で表している（例えば表４．１参照）。
【０３４４】
さらに、本発明のグリコシル化レプチン蛋白のウェスタンブロットは、発現条件および組成物における相違がグリコシル化効率の差となることも示している。図１１から、少なくとも５部位までグリコシル化部位数を増やすことで、ＣＨＯ細胞で発現した場合にレプチン蛋白上で認められるグリコシル化量が増えることが明らかである。サンプルは以下の通りである。
【０３４５】
列０：「モック（ＭＯＣＫ）」はレプチンを含まない細胞培養上清である。
【０３４６】
列１：「ＥＳＰ（Ｗ．Ｔ．）」、エリトロポイエチン信号ペプチドを用いて発現されるｒＨｕ−レプチン１〜１４６（配列番号１）。
【０３４７】
列２：「ＥＳＰ（Ｎ４８）」、示した単一部位グリコシル化レプチン蛋白（上記で説明したもの）を用いた上記と同じもの。
【０３４８】
列３：「ＥＳＰ（Ｎ４７＋Ｎ６９）」、示した２部位グリコシル化レプチン蛋白（上記で説明したもの）を用いた上記と同じもの。
【０３４９】
列４：「ＥＳＰ（Ｎ４７＋Ｎ６９＋Ｎ１０２）」、示した３部位グリコシル化レプチン蛋白（上記で説明したもの）を用いた上記と同じもの。
【０３５０】
列５：「Ｔｐａ（ＳＮＳ）Ｎ２＋Ｎ４６＋Ｎ６９＋Ｎ９２」は、ＳＮＳの酵素開裂部位を有するヒトｔＰＡ信号ペプチドを用いて発現した、上記のような４部位グリコシル化レプチン蛋白を示す（配列データについては実施例１４参照）。
【０３５１】
列６：「ＴｐａＮ２＋Ｎ２３＋Ｎ４７＋Ｎ６９＋Ｎ９２」は、天然ヒトｔＰＡ信号ペプチドを用いて発現した、上記のような５部位グリコシル化レプチン蛋白を示す（配列データについては実施例１４参照）。
【０３５２】
これからわかるように、グリコシル化部位が多くなると分子量が大きくなる（列１〜列６を比較）。これは、それらの部位が炭化水素を付加しており、レプチンには同時に５個までの鎖を付加させることが可能であることを示している。
【０３５３】
Ｎ−末端アミノ酸／ペプチド
以下の表１５．１４には、各種信号ペプチドに関する各種置換酵素開裂部位の使用に付随する対象のグリコシル化レプチン蛋白の異なるＮ−末端アミノ酸の比較を示してある。
【０３５４】
【表２７】
0004841037.tif 000050
【０３５５】
表からわかるように、正確なＮ−末端アミノ酸の収率が最も高い最も高度にグリコシル化されたレプチンは、信号ペプチドｔＰＡ（ＳＮＳ）を用いて得られた。レプチン（ＳＮＳ）も高度にグリコシル化され、Ｎ−末端アミノ酸としてセリンを有するレプチンを与えた（例：配列番号１の変更アミノ酸配列を有するグリコシル化レプチンにおける配列番号１の−１位のセリン）。
【０３５６】
参考例
以下の参考例は、上記実施例で用いた方法を提供するものである。
【０３５７】
ＤＮＡ、ベクターおよび宿主細胞の製造
１．ヒトレプチン（１〜１４６）発現ベクターの構築
これらの方法によって、哺乳動物細胞でのｒＨｕ−レプチン１〜１４６（配列番号１）の発現ベクターが得られる。信号ペプチドを含むｒＨｕ−レプチン１〜１４６をコードするＤＮＡも、本発明のグリコシル化レプチン蛋白製造のための鋳型として用いた。
【０３５８】
ｒＨｕ−レプチンアミノ酸１〜１４６をコードするＤＮＡとツァンの報告（Zhang et al., Nature 372: 425-432 (1994), p.430）の図６（引用によって本明細書にその全体が含まれる）にあるような信号配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってヒト脂肪ｃＤＮＡからクローニングした。クローニングした信号配列は、以下のアミノ酸配列をコードしていた。
MHWGTLCGFL WLWPYLFYVQ A
【０３５９】
プライマー
５’（順）フランキングプライマーは、ｒＨｕ−レプチン信号ペプチドのアミノ末端、ＸｂａＩ制限酵素部位および至適化コザック配列（TCT ATC TAG ACC ACC ATG CAT TGG GGA ACC CTG T）をコードしたものであった。３’（逆）フランキングプライマー配列（GAG AGT CGA CTA TCA GCA CCC AGG GCT GA）は、ｒＨｕ−レプチン（１〜１４６）および終止コドンのＣ末端の相補体ならびにＳａｌＩ制限部位を有していた。
【０３６０】
ベクターの製造
ＰＣＲ増幅産生物をＸｂａＩおよびＳａｌＩ制限酵素で消化させ、アガロースゲルで電気泳動させ、プロメガ（Promega；登録商標）ウィザード（Wizard；登録商標）キット法（Promega（登録商標） Corporation, Madison, WI）を用いてゲルから単離した。精製した産生物をＷＯ  ９０／１４３６３  １９９０（例えば図１２；引用によってその全体が本明細書に含まれる）に記載のものからわずかに変更させたＸｂａＩおよびＳａｌＩ切断ｐＤＳＲα２発現ベクターに連結させた。ここで用いたｐＤＳＲα２は同じ機能要素を維持したが、ＷＯ９０／１４３６３に記載のものとはわずかに変わっていた。ＨｉｎｄＩＩＩ部位での配列をAAGCTTCTAGAに変更してＸｂａＩ部位を得て、ＮｃｏＩ部位の配列をGTCGACCTAGGに変更してＳａｌＩ部位を得たが、それら２つの部位間で十分なＤＮＡ配列（「スタッファー（stuffer）ＤＮＡ」）を持たせることで、ＸｂａＩとＳａｌＩの両方による有効な切断によって、本発明のレプチン蛋白発現構築物の指向性クローニングのための切断プラスミドを得ることができるようにした。得られたｐＤＳＲα２／レプチンプラスミドを下記の哺乳動物細胞発現に、さらにはin vitro部位指向的突然変異誘発のための鋳型として用いた。
【０３６１】
２．部位指向的突然変異誘発によるレプチンへのグリコシル化部位の構築
ホーらの報告（Ho et al., Gene Vol.77, pp. 51-59 (1989)に記載のものと同様の重複延長ＰＣＲ法を用いる部位指向的突然変異誘発によって、ｒＨｕ−レプチン１〜１４６（配列番号１、上記）にグリコシル化部位を導入した。上記の方法に従って製造したｐＤＳＲａ２レプチンプラスミドを、部位指向的突然変異誘発の初期段階におけるＰＣＲ鋳型として利用した。
【０３６２】
ＰＣＲ
ＰＣＲ法は下記の連続する２段階で行った。
【０３６３】
段階１：５’（順）フランキングｒＨｕ−レプチンプライマー、逆突然変異原性プライマー、順突然変異原性プライマー（少なくとも部分的に逆突然変異原性プライマーに対して補完的）および３’（逆）フランキングｒＨｕ−レプチンプライマーという計４種類のオリゴヌクレオチドを用いて、レプチン鋳型ＤＮＡで２種類の反応（ＰＣＲ１およびＰＣＲ２）を行った。突然変異原性プライマーには、所望のヌクレオチド変化とその変化の各側で鋳型と正確に一致する６〜２０ヌクレオチドを有していた。ＰＣＲ１では、５’（順）フランキングプライマーおよび逆突然変異原性プライマーを用いた。ＰＣＲ２では、３’（逆）フランキングプライマーおよび順突然変異原性プライマーを用いた。ＰＣＲ１およびＰＣＲ２のＤＮＡ産生物には、突然変異およびその突然変異の両側に重複配列があった。増幅ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって分離した。正確な大きさのＤＮＡ断片を含むアガロース小片をゲルから切り離した。
【０３６４】
段階２：ＰＣＲ１およびＰＣＲ２からのＤＮＡを合わせ、５’順および３’逆フランキングプライマーのみを用いて第３のＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ１およびＰＣＲ２産生物の適切な鎖の補完的３’−末端領域のアニーリングとそれに続く鎖延長によって、全長レプチンＤＮＡ断片が形成された。そこで、所望の突然変異を含む全長ＤＮＡ部分を増幅した。
【０３６５】
ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞での発現のためのＰＣＲ
ヒト胎児腎臓細胞系２９３（American Type Culture Collectionから市販のものなど）での発現に関しては、５’（順）プライマーに、レプチン信号ペプチドコード領域(5’-TCTGGTACCTAGACCACCATGCATTGGGGAACCCTGT-3’）の前に終止コドン、ＫｐｎＩ部位およびコザック配列（ACCACC）を導入した配列を有していた。３’（逆）プライマー（5’-GAAGCGGCCGCCTATCAGCACCCAGGGCTGA-3’）は、グリコシル化レプチン蛋白コード領域の末端に２個の終止コドン（TGA  TAG）およびＮｏｔＩ制限部位を導入した配列を有していた。ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞発現に関しては、３’（逆）プライマーは、終止コドンとそれに続くＳａｌＩ制限部位（GAGAGTCGACTATCAGCACCCAGGGCTGA）を導入した配列を有していた。５’順反応プライマー（TCTATCTAGACCACCATGCATTGGGGAACCCTGT）は、レプチン開始コドン（ATG）の上流にＸｂａＩ制限部位とそれに続くコザック配列を有していた。
【０３６６】
ＰＣＲ法
下記の２種類の手順のいずれを互換的に用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。
【０３６７】
２９３発現用の構築の一部で使用される一方の方法では、チェンら（Cheng et al., PNAS 91: 5695 (1994)（引用によって全体が本明細書に含まれる）から採用したプロトコール、すなわち順および逆プライマーそれぞれ（５ｐｍ／μＬ）４μＬ、鋳型１μＬ（５０ｎｇ）、５倍ＬＰ緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ、ｐＨ８．７／２５％グリセリン／４２５ｍＭＫＯＡｃ）１０μＬ、ｄＮＴＰ原液（それぞれ１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ）２μＬ、ｒｔＴｈポリメラーゼ（Perkin Elmer （登録商標）；２．５Ｕ／μＬ）０．８μＬおよびベント（Vent）ポリメラーゼ（NEB；１倍ＬＰ緩衝液中１：１００新鮮希釈した後に０．０１Ｕ／μＬ）を用いてＰＣＲを実施した。Ｈ２Ｏを加えて最終容量を５０μＬとした。全ての成分を示した順序で混合し、１０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ１μＬを加えることで最初のサイクル時の温度が６０℃を超えた時点でＰＣＲを開始した。反応条件は、９４℃１０秒間／４５℃１分間／６８℃５分間を２サイクルと、それに続いて９４℃で１０秒間／５５℃で１分間／６８℃で５分間を２５サイクルとした。増幅断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、引用によって本明細書に含まれる製造業者（Bio 101, Inc.）提供のジーンクリーン（Geneclean（商標））キットおよび手順を用いて精製した。精製ＤＮＡをＮｏｔＩとＫｐｎＩで消化させ、それをジーンクリーン（商標）キットを用いて再度精製した。消化条件は、「Ｍ」緩衝液中２０単位ＫｐｎＩ（最終容量２２μＬ）（Boehringer Mannheim）とそれに続く「Ｈ」緩衝液３μＬ、最終容量５２μＬ中２０単位のＮｏｔＩの添加とした。次に、断片をＫｐｎＩおよびＮｏｔＩで切断したプラスミドｐＢＣＢに連結した。プラスミドｐＢＣＢは、ｆ１起源、ＳＶ４０起源、ネオマイシン耐性遺伝子およびＳＶ４０ポリアデニル化部位を有するｐＲＣ／ＣＭＶの領域の欠失により、ｐＲＣ／ＣＭＶ（Invitrogen（登録商標）、Carlsbad, Callifornia）から誘導した。連結ＤＮＡは、キャリアｔＲＮＡ存在下に０．３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）中２倍容量のエタノールを用いて沈殿させ、大腸菌にトランスフォームした。グリコシル化レプチン蛋白ＤＮＡを最初にコロニーＰＣＲによってスクリーニングして、正確な大きさおよび種類のＤＮＡ挿入物を含むクローンを確認した。その手順を用いて、プラスミドを含む細胞を、レプチン順および逆プライマー存在下にＰＣＲ管に入れた。次に混合物について、上記の反応条件を用いたＰＣＲを行った。次に、陽性クローンからのプラスミドを製造し、グリコシル化レプチン蛋白挿入物を配列決定して、所望のグリコシル化部位の存在を確認し、それ以外のアミノ酸変化が導入されていないことを確認した。
【０３６８】
構築物の残りの部分では、わずかに異なるＰＣＲ戦略を用いた。ＰＣＲはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）を用いて、または好ましくは、Ｔａｑポリメラーゼとは異なり延長鎖の３’末端に追加の鋳型形成されていないヌクレオチドを加える傾向のない校正ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕポリメラーゼ（Stratagene）を用いて行った。ＴａｑポリメラーゼＰＣＲでは、ＤＮＡ鋳型を１０倍ＴａｑＰＣＲ緩衝液２．５μＬ、１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ２．５μＬ、各プライマー５ｐｍｏｌおよび水と最終容量２５μＬで合わせた。ＰＣＲ混合物が９４℃に達した後、Ｔａｑポリメラーゼ０．５単位を加えた。次に、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間で２５サイクルにわたってＰＣＲ反応を行った。ＰｆｕポリメラーゼＰＣＲでは、最終容量５０μＬで１０倍Ｐｆｕ緩衝液（Stratagene）５μＬ、１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ５μＬ、各プライマー１０ｐｍｏｌおよび水と混合し、Ｐｆｕポリメラーゼ１．２Ｕを加えた。アニーリング温度４８℃でのＰＣＲ４サイクルを行い、次にアニーリング温度６６℃で２０サイクルを行った。各サイクルにおいて、９４℃で３０秒間の変性を行い、３０秒間アニーリングを行い、７４℃で３０秒間延長を行った。前述の第１段階の２つのＰＣＲ反応後、正確な大きさの生成物帯域を、電気泳動後にアガロースゲルから取り、ＰＣＲ１およびＰＣＲ２の産生物を含むゲルスライスを、ＰＣＲの第２段階用のＰＣＲ管に直接加えるか、あるいは最初に水３００μＬの入った管で混合してから煮沸して、アガロースを融解させてからＰＣＲ管に加えた。順および逆フランキングプライマーを用いて、前述の方法に従ってＴａｑまたはＰｆｕポリメラーゼによるＰＣＲを実施した。ＰＣＲの最終サイクル後、管を延長温度でさらに５分間インキュベートさせた。各類縁体について得られたＰＣＲ産生物を、プロメガ（登録商標）ウィザード（登録商標）ＰＣＲクリーンアップキットを用いてクリーニングした。精製ＤＮＡを、３７℃で１時間にわたり、ＸｂａＩおよびＳａｌＩ制限酵素（Boehringer Mannheim）を用いて５０μＬ制限消化物で消化した。消化物をプロメガ（登録商標）ウィザード（登録商標）ＰＣＲクリーンアップキットによってクリーニングした。次に消化断片を、ＸｂａＩおよびＳａｌＩ消化ｐＤＳＲａ２ベクターに連結した。ｐＤＳＲａ２レプチン類縁体プラスミドを含む連結反応液のうちの１μＬを用いて、エレクトロポレーションによるＤＨ１０細胞のトランスフォーメーションを行った。各類縁体について１個のコロニーを液体培地で終夜成長させ、キアゲン（Qiagen（登録商標）マキシ（Maxi）ＤＮＡ（登録商標）プラスミド単離キットを用いて単離した。各ｐＤＳＲａ２ヒトレプチン類縁体についてのＤＮＡを水に再懸濁させ、配列決定して、正確な配列が存在するこを確認した。
【０３６９】
複数グリコシル化部位
同じＰＣＲ法を用い、すでに変化を有するＤＮＡに新たな置換を導入することによって２以上のグリコシル化部位突然変異を組み合わせた。２グリコシル化部位レプチン類縁体遺伝子を構築するため、単一部位グリコシル化レプチンプラスミド（上記の方法に従って製造）をＰＣＲ鋳型として用い、適切なプライマーを用いた部位指向的突然変異誘発によって別のグリコシル化部位を導入した。同様に、３個のグリコシル化部位を有するレプチン類縁体をコードするプラスミドを、鋳型として２Ｎ−グリコシル化部位レプチンＤＮＡを用いて構築し、その方法を反復して、さらなるグリコシル化部位を導入することができた。別法として、ＰＣＲ１およびＰＣＲ２で異なるグリコシル化部位を有する２種類の異なるＤＮＡ鋳型を用いることで、グリコシル化部位突然変異の新たな組合せを製造することができる。例えば、２位、４７位、６９位および１０２位にグリコシル化部位を有する類縁体をコードしたＤＮＡは、ＰＣＲ１で２位にグリコシル化部位を有するＤＮＡ鋳型とＰＣＲ２で６９位および１０２位にグリコシル化部位を有するＤＮＡを用いることで、４７位グリコシル化のための突然変異原性プライマー対によって製造することができる。
【０３７０】
これらの一般的手順を用いて、上記実施例で示したグリコシル化レプチン蛋白の発現のためのプラスミドを構築した。各形についてのＤＮＡ配列変化を示す。
【０３７１】
キメラ信号ペプチド
部位指向的突然変異誘発で用いたものと同様の遺伝子スプライシング（Horton et al., Gene 77: 61-68 (1989)）のための重複延長ＰＣＲ法によって、レプチンまたは非レプチン信号ペプチドを有するレプチン類縁体の発現のための構築物を製造した。予備段階で、外因性遺伝子（例えば、組織プラスミノーゲン活性化剤（ＴＲＡ））の信号ペプチドをコードするＤＮＡを、クローニング法あるいは化学的および酵素的遺伝子合成の組合せによって得た。このＤＮＡをＰＣＲでの鋳型として用いて、前にコンセンサスコザック配列を有し、直後に成熟ｒＨｕ−レプチン（またはレプチン類縁体）のコード領域の第１の部分を有する外因性信号ペプチドをコードするＤＮＡ断片を得た。このＰＣＲ反応で用いたプライマーは、外因性遺伝子の５’（順）フランキングプライマーおよび５’部分（１０〜２５ヌクレオチド）が成熟レプチン（またはレプチン類縁体）のアミノ末端部分をコードする配列に対して補完的な逆プライマーであった。レプチン３’（逆）フランキングプライマーならびに外因性信号ペプチドおよび成熟レプチン（またはレプチン類縁体）配列の接合部領域をコードする順プライマーを用い、レプチンまたはレプチン類縁体ＤＮＡを鋳型として、第２のＰＣＲ反応を行った。この反応の順プライマーは、通常は１５〜３５ヌクレオチドにわたり、第１のＰＣＲによって生じたＤＮＡに重複するよう設計されたものである。これら２種類のＰＣＲ反応の生成物を前述の方法に従ってゲル精製し、混合し、アニーリングし、外因性５’（順）フランキングプライマーおよび３’（逆）フランキングレプチンプライマーのみを用いたＰＣＲで増幅した。
【０３７２】
宿主細胞
１．２９３細胞でのグリコシル化レプチン蛋白の発現
リポフェクタミン（lipofectamine）法を用いて、ヒト胎児腎臓細胞系「２９３」（American Type Culture Collectionから市販されているものなど）にＤＮＡをトランスフェクションした。２９３細胞を、２９３培地（ＤＭＥＭ（Difco（登録商標））／２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１倍ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン／２０％ＦＢＳ）中、組織培養プレート（Ｐ１００）で４０〜７０集密度まで成長させた。ＤＭＥＭ  １ｍＬ中グリコシル化レプチン蛋白をコードするプラスミドＤＮＡ２０μｇを、０．４５μｍアクロディスク（Acrodisc（登録商標））膜（Gelman Sciences）でフィルター滅菌した。リポフェクタミン（Gibco（登録商標）／BRL（登録商標））１００μＬを加え、ＤＮＡ−リポフェクタミン混合物を室温で２０分間インキュベートした。２９３細胞を含むプレートから培地を除去し、ＤＭＥＭおよびＤＮＡ／リポフェクタミン溶液４ｍＬを加えた。３７℃で４〜６時間後、２０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ５ｍＬを加え、培養物を終夜インキュベートした。翌日、細胞を２９３培地で洗浄し、新鮮な２９３培地５ｍＬを加えた。コンディショニングした培地を３日後に回収し、小分けし、−７０℃で保存した。
【０３７３】
２．ＣＯＳ細胞でのグリコシル化レプチン蛋白の発現
グリコシル化レプチン蛋白のｃＤＮＡクローンを、エレクトロポレーションによってＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１６５０）にトランスフェクションした。半集密シャーレからＣＯＳ−１細胞を回収し、培地（１０％ウシ胎仔血清および１％Ｌ−グルタミン／ペニシリン／ストレプトマイシン（Irvine Scientific）を含むＤＭＥＭ）で洗浄し、細胞６×１０６個／ｍＬで再懸濁した。細胞１／２ｍＬを０．２ｃｍエレクトロポレーションキュベット（Bio-Rad（登録商標））に移し入れ、グリコシル化レプチン蛋白をコードするプラスミドＤＮＡ２５μｇで設定した低電圧で６５０μＦおよび１３０ボルトにて、ＢＴＸエレクトロポレーションシステム・エレクトロセル・マニピュレータ（Electrocell Manipulator）６００（登録商標）を用いてエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞を、培地７ｍＬ中１００ｍＭ組織培養シャーレで平板培養した。コンディショニングした培地をエレクトロポレーションから３日後に回収し、０．４５μｍアクロディスク（登録商標）膜（Gelman Sciences）を用いて濾過し、−８０℃で保存した。
【０３７４】
３．ＣＨＯ細胞でのグリコシル化レプチン蛋白の発現
上記の特定のグリコシル化レプチン蛋白ＤＮＡを有するｐＤＳＲα２でジヒドロ葉酸レダクターゼ欠乏（ＤＨＦＲ−）チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のトランスフォーメーションとそれに続く個々のクローンの単離および試験によって、ｒＨｕ−レプチン１〜１４６またはグリコシル化レプチン蛋白の安定な発現を行った。６０ｍｍ組織培養シャーレで、トランスフェクションの前日に、ＣＨＯ  Ｄ−培地（ＤＭＥＭ−高グルコース、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、１％可欠アミノ酸（Gibco（登録商標））および１％ＨＴ補助剤）中で成長させた１×１０６個のＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞を平板培養した。そうして、ＤＮＡ沈殿物１０μｇが形成され、それを哺乳動物トランスフェクションキット説明書（Specialty Media、引用によって本明細書に含まれる）に従って平板に滴下した。組織培養インキュベータで２４時間後、培地を新鮮なＣＨＯ  Ｄ−培地と交換した。２４時間後、ＣＨＯ選択培地（Ｄ−ＭＥＭ高グルコース、１０％透析ウシ胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン／グルタミン、１％可欠アミノ酸（Gibco（登録商標））を用いて６枚の１００ｍｍ培養シャーレに分けた。コロニーが認められるまで培地を週１回交換した。１０〜１４日後、１倍トリプシン−ＥＤＴＡ（Life Technologies（登録商標））に浸漬した５ｍｍクローニングディスク（Labcore（登録商標））を用いて取り、ＣＨＯ選択培地の入った２４ウェル組織培養プレートで培養した。１〜２週間後、下記のレプチンＥＩＡアッセイを用いて、グリコシル化レプチン蛋白発現を測定した。最も良好な発現クローン（すなわち、ＥＩＡを用いて最も強力な応答を示したもの）を拡大し（expand）、極低温保存装置で冷凍した。
【０３７５】
一部の環境では、より迅速なプロトコールを用いて、ＣＨＯ細胞での類縁体の発現を行った。その場合、エレクトロポレーションを用いて細胞のトランスフェクションを行い、個々のクローンは単離しなかった。エレクトロポレーション実験では、上記のグリコシル化レプチン蛋白挿入物を有するｐＤＳＲα２  ２００μｇならびにニシン精子キャリアＤＮＡ２００μｇを用いた。ＤＮＡはフェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈殿してから、ＣＨＯ  Ｄ−培地で成長させた２×１０７個のＤＨＦＲ−チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞とともに、１倍ＨＥＢＳ  ８００μＬに再懸濁させた。細胞とＤＮＡを室温で１０分間インキュベートした。０．４ｃｍエレクトロポレーションキュベットでＢＩＯ  ＲＡＤジーンパルサー（Gene Pulser；商標）を用いて、２９０ボルトおよび９６０μファラッドでエレクトロポレーションを実施した。次に、細胞を室温で１０分間インキュベートし、ＣＨＯ  Ｄ−培地で１０分間洗浄し、遠心装置（Damon（登録商標）/IEC Division IEC HN-SII Centrifuge）で１０００ｒｐｍにて１０分間遠心し、ＣＨＯ  Ｄ−培地２０ｍＬに再懸濁させ、２枚の１０ｃｍシャーレに加えた。細胞を３７℃で２日間成長させ、ＣＨＯ選択培地に１：４で分け、約７０％集密度まで成長させた。次に、細胞を選択培地と６ｎＭメトトレキセートに１：２に分け、クローンが肉眼観察されるまで（約２週間）３７℃で成長させた。４以上のコロニーを含むプレートから蓄積液を得て、集密となるまで（約１週間）６ｎＭメトトレキセートを含む選択培地中で成長させた。次に、蓄積液を極低温保存装置で冷凍させた。
【０３７６】
Ｎ４８Ｔ５０レプチン（単一グリコシル化部位レプチン蛋白）の発現および精製
上記のＮ４８Ｔ５０レプチンを発現するＤＮＡを用いてＣＨＯ細胞をトランスフェクションした。細胞を、成長培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１（１：１）、３６５ｍｇ／Ｌ  Ｌ−グルタミン、１倍ＭＥＭ可欠アミノ酸、５％ＦＢＳ中、撹拌培養で拡大した。呼吸可能なキャップを取り付けたローラー瓶に、成長培地４００ｍＬ中２ｅ７個の細胞／瓶を接種し、空気中１０％ＣＯ２を１０秒間吹き込んだ。５日後、血清を含まない製造培地（４００ｍＬ／瓶、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）、３６ｍｇ／Ｌ（１倍）Ｌ−グルタミン、１倍ＭＥＭ可欠アミノ酸、１０μＭＣｕＳＯ４、１．５ｇ／Ｌの追加のグルコース）に瓶を移した。３連続回収物からの血清を含まないコンディショニングした培地を回収し（１８０リットル）、０．４５μｍフィルターで濾過し、約３０倍濃縮し、１００００分子量カットオフ膜を用いるタンジェント流限外濾過システム（Amicon（登録商標））を用いて、１ｍＭ  ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）中にダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションした培地は−２０℃で保存した。
【０３７７】
以下の段階を２〜８℃で行った。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．９）で平衡としたＱ−セファロースファストフロー（Fast Flow）カラム（Pharmacia（登録商標）、８ｃｍ×１４ｃｍ）にＤＦＭを負荷し、約２倍カラム容量の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓで洗浄して、全ての非結合化学種を溶出した。カラムに結合した状態で残っているＮ４８Ｔ５０レプチンを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．９）から２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．９）への勾配で１２倍カラム容量によって溶離して、分画に回収した。ウェスタンブロット分析によって測定された完全にグリコシル化されたＮ４８Ｔ５０レプチンを含む分画を合わせ、１倍容量の水で希釈して塩化ナトリウム濃度を低下させた。次にサンプルを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．９）で平衡状態としたバイオゲル（Bio-Gel；登録商標）ＨＴカラム（Bio-Rad（登録商標）、１０ｃｍ×７ｃｍ）に負荷し、約４倍カラム容量の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．９）で洗浄した。非結合化学種の分画を回収し、ウェスタンブロット分析によって測定したＮ４８Ｔ５０レプチンを含む分画を合わせた。
【０３７８】
１／３容量の３Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．９）を、バイオゲル（登録商標）ＨＴカラムからのＮ４８Ｔ５０レプチン蓄積液に加えた。この段階で１Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４中の蓄積液を、１Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．９）で平衡状態としたソース（Source）１５ＰＨＥカラム（Pharmacia（登録商標）、１０ｃｍ×１．６ｃｍ）に負荷し、約２倍カラム容量の１Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．９）で洗浄した。カラムに結合して残っているＦ３を、１Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．９）から１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．９）への勾配で４０倍カラム容量によって溶離することで分画を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で測定したＦ３を含む分画を合わせた。
【０３７９】
固体硫酸アンモニウムを、ソース１５ＰＨＥカラムからのＮ４８Ｔ５０レプチン蓄積液に加えて、最終濃度を約２．５Ｍとし、終夜インキュベートした。終夜沈殿物を遠心によって回収した。
【０３８０】
回収した硫酸アンモニウム沈殿物を水に再度溶解させ、酢酸でｐＨ４．５まで滴定し、１０ｍＭ  ＮａＣＨ２ＣＯＯＨ（ｐＨ４．５）で平衡状態としたソース１５Ｓカラム（Pharmacia（登録商標）、５．５ｃｍ×１．６ｃｍ）に負荷し、約２倍カラム容量の１０ｍＭ  ＮａＣＨ２ＣＯＯＨ（ｐＨ４．５）で洗浄した。カラムに結合した状態で残っているＮ４８Ｔ５０レプチンを、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＣＨ２ＣＯＯＨ（ｐＨ４．５）から１５０ｍＭ  ＮａＣｌへの勾配での７２倍カラム容量による溶離を行って、分画を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって測定されたＮ４８Ｔ５０レプチンを合わせ、ｐＨ７．５まで滴定した。
【０３８１】
ソース１５ＳカラムからのＮ４８Ｔ５０レプチン蓄積液を濃縮して約１ｍｇ／ｍＬとし、ダルベッコのＰＢＳ（Gibco（登録商標））にダイアフィルトレーションし、１００００分子量カットオフ膜（Filtron（登録商標））を有する撹拌細胞限外濾過システム（Amicon（登録商標））を用いて約５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。遠心限外濾過（Centricon 10、Amicon（登録商標））を用いて、Ｎ４８Ｔ５０レプチンをさらに１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。濃縮Ｎ４８Ｔ５０レプチンを濾過し（０．２２μｍ）、２〜８℃で保存した。
【０３８２】
ＩＩ．分析方法
本願においては、以下の分析方法を用いて、本発明のグリコシル化レプチン蛋白の特性決定を行った。
【０３８３】
Ａ．in vitroアッセイ
１．受容体結合アッセイ
本アッセイでは、膜結合レプチン受容体を標的として用いて、放射能標識試験グリコシル化レプチン類による結合量を測定した。
【０３８４】
チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞を、ヒトレプチン受容体ＤＮＡ（短縮型；Tartaglia et al., Cell 83: 1271以降(1995)（引用によって全体が本明細書に含まれる）；その論文全体が引用によって本明細書に含まれる）を用いたトランスフェクションによって操作して、ヒトレプチン受容体を安定に発現させた。レプチン受容体発現細胞を成長させ、低速遠心によって回収した。ペレット化した細胞（約５０ｍｇ湿重量）を０．３２Ｍショ糖／２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳに再懸濁させ、グラスコル（Glas-col（登録商標））モーターを用いてガラス性ホモジナイズ管中で均質化した。細胞膜を遠心（４８０００×ｇ）、ポリトロンホモジナイザー（Tissue Tearor（登録商標））を用いた分散および冷結合緩衝液（ＭＥＭ、Gibco BRL（登録商標）／２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、Gibco BRL（登録商標）／０．１％ＢＳＡ／０．５ｍｇ／ｍＬバシトラシン（Bacitracin（登録商標））（Sigma（登録商標））／０．１ｍｇ／ｍＬ  ＳＴＩ、Boehringer Mannheim／０．１ｍｇ／ｍＬ  ＡＥＢＳＦ、Boehringer Mannheim）中での再懸濁によって２回洗浄した。２回目の洗浄後、膜取得物を、冷結合緩衝液中で最終濃度２〜３ｍｇ湿重量／ｍＬにて再懸濁させた。
【０３８５】
１２ｍｍ×７５ｍｍ試験管中、室温で２〜３時間にわたり、膜溶液４００μＬ、２ｎＭ１２５Ｉ−レプチン（Amersham）５０μＬおよびサンプルもしくはレプチン標準（１０−６Ｍ  ｒＨｕ−レプチン１〜１４６）をインキュベートすることで競合結合を実施した。ガラス繊維フィルターでの濾過とブランデル（Brandel）細胞回収装置を用いた冷ＰＢＳによる洗浄３回によって、結合１２５Ｉ−レプチンを未結合１２５Ｉ−レプチンから分離した。ガンマカウンターによって、結合放射能を測定した。レプチン受容体についての各類縁体のアフィニティを、各類縁体についての冷変位曲線（ＩＣ５０）の中点値計算によって求めた。
【０３８６】
２．in vitro生理活性
本アッセイでは、レプチン受容体の細胞外領域、エリトロポイエチン受容体の経膜および細胞内領域を有するキメラレプチン受容体を用いて、in vitroでの生理活性を測定した。細胞外レプチン領域への結合による細胞内エリトロポイエチン受容体領域の活性化を行うと細胞は、Ｈ３−チミジン取り込みによって測定される増殖の生理活性を示した。
【０３８７】
インターロイキン−３（ＩＬ−３）依存性３２Ｄ（クローン３）マウス骨髄始原細胞（Greenberer et al., PNAS-USA 80: 2931 (1983)；引用によって本明細書に含まれる）を、１０％ウシ胎仔血清および１０ｎｇ／ｍＬＩＬ−３（Biosource（登録商標））を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Gibco（登録商標））で成長させた。キメラレプチン受容体−ＥＰＯ受容体（ＯＢＲ−ＥＰＯＲ）を標準的な方法で構築し、モロニーマウス肉腫ウィルスの転写プロモーターを含む発現ベクターにサブクローニングして、ベクターＯＢＲ−ＥＰＯＲ／ｐＬＪを得た。キメラ受容体は、ヒトレプチン受容体の細胞外領域（アミノ酸１〜８３９；Tartaglia et al., Cell: 83: 1271 (1996)（引用によって全内容が本明細書に含まれる））およびマウスエリトロポイエチン受容体の経膜および細胞内領域（アミノ酸２５０〜５０７；D’Andrea et al., 57: 277 (1989)（引用によって全内容が本明細書に含まれる））のコード領域を有していた。キメラ受容体を、エレクトロポレーションによって３２Ｄ細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション細胞を最初にＧ４１８（７５０μｇ／ｍＬ）で選択した。次に、１０％ウシ胎仔血清および２５ｎｇ／ｍＬＨｕレプチンを補充したＲＰＭＩ１６４０（Gibco（登録商標））でレプチン応答細胞を選択して、３２Ｄ−ＯＢＥＣＡ細胞を得た。キメラ受容体でトランスフェクションされなかった３２Ｄ細胞は、レプチンに対して未反応のままであった。
【０３８８】
３２Ｄ−ＯＢＥＣＡ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Hyclone Laboratories（登録商標））および１．０ｎｇ／ｍＬの組換えマウスＩＬ−３（Biosource（登録商標））を含む１６４０ＲＰＭＩ培地（Ｌ−グルタミンを含有しない１倍液、Gibco（登録商標））で成長させて、約５．０Ｅ＋０５個／ｍＬの密度とした。遠心によって（約２７０×Ｇ）細胞を回収し、無菌１倍ＰＢＳ（Gibco（登録商標））で２回洗浄し、２０％ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）＋８０％アッセイ培地（ＲＰＭＩ＋２％ＦＢＳ）＋１０ｎｇ／ｍＬのパン（pan）特異低抗ＴＧＦβ中和抗体からなる媒体に、１．０Ｅ＋０５個／ｍＬまで再懸濁させた。約０．１〜２００ｎｇ／ｍＬの範囲のアッセイ培地を用いて、延長１２点ｒｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６標準曲線を得た。試験サンプルをアッセイ培地で希釈し、代表的には延長複数点曲線として、あるいは標準曲線の線形範囲内に入る領域で試験を行った。各サンプル１００μＬ容量を、９６ウェル微量定量組織培養プレートの適切なウェルに加えた。サンプルまたは標準とともに細胞を、５±１％ＣＯ２および３７±２℃高湿度インキュベーターで約４８時間にわたり、ウェル（１００μＬ中）当たり細胞１００００個で成長させた。次に、３Ｈ−チミジン（ウェル当たり０．５μＣｉ、Dupont（登録商標））を加え、平板をさらに１８時間にわたってインキュベートし、そのＤＮＡを細胞回収装置（Tomtek 96 Mach II（登録商標））を用いるプレプリントガラス繊維フィルターマット（Pharmacia（登録商標））で回収した。フィルターを電子レンジで乾燥し、シンチレーション液（LKB（登録商標））の入ったＬＢＫ（登録商標）サンプル袋に入れ、ベータプレート（Betaplate（登録商標））シンチレーションカウンター（LKB（登録商標））でカウンティングした。細胞応答（平均ＣＰＭｓ−バックグラウンドの形で）を、ｒＨｕ−レプチン１〜１４６標準の重量（ｎｇ／ウェル）に対してプロットした。ｒｍｅｔＨｕ−レプチンまたはグリコシル化レプチンのサンプルの生理活性を、標準曲線の回帰分析から求めた。定量した生理活性（ｎｇ／ｍＬ）をレプチンＥＬＩＳＡによって求めた濃度で割ることで、比活性を計算した。
【０３８９】
Ｂ．グリコシル化レプチン蛋白の特性決定
１．酵素イムノアッセイ（「ＥＩＡ」）
ポリクローナル抗体
抗ｒｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６（−１位にメチオニル残基を有する配列番号１）ポリクローナル抗体を、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合したｒｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６の繰り返し皮下注射によって、ニュージーランドホワイトラビット（New Zealand white rabbit）で増やし、アジュバントタイターマックス（Titermax（商標））またはフロイントの完全アジュバント（初回注射）およびフロイントの不完全アジュバント（その後の注射）と混合した。得られたウサギ血清についてｒｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６との反応性を調べ、最も高い力価を有するウサギからの血清を蓄積し、ｒｍｅｔＨｕ−レプチンに結合したアクチゲル−ＡＬＤスーパーフロー（Actigel-ALD Superflow（登録商標））（Sterogene #2701-s-01）でアフィニティ精製した。精製したポリクローナル抗体の少量を、サンドイッチ酵素イミドアッセイ（ＥＩＡ）またはウェスタンでの検出抗体として用いる西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、Sigma（登録商標）Ｐ−８４１５）に結合させた。
【０３９０】
モノクローナル抗体
ＫＬＨ接合ｒｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６を複数回注射したロー（Lou）ラットから抗ｒｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６モノクローナル抗体を形成し、フロイントの完全アジュバント（初回注射）またはフロイントの不完全アジュバント（以後の注射）と混合した。ラットの血清について、ｒｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６との反応性を調べ、最も力価の高いものからの脾臓細胞を、標準的なハイブリドーマ法によってラット骨髄腫系Ｙ３Ａｇ１．２．３に融合した。得られたハイブリッド細胞を９６ウェルプレートで平板培養し、コロニーを形成させ、抗ｒｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６活性についての定量を行い、単一細胞クローニングを行った。ラットハイブリドーマからのモノクローナル抗体を、レプチンサンドイッチＥＩＡの１成分として用いた。
【０３９１】
サンドイッチアッセイ
微量定量プレート（９６ウェル標準［Immulon（登録商標）］またはハーフウェル［Costar（登録商標）］）を、炭酸／重炭酸緩衝液（ＮａＨＣＯ３０．０２９Ｍ、Ｎａ２ＣＯ３０．０１５Ｍ、ｐＨ９．６）中のポリクローナル（１．５μｇ／ｍＬ）またはモノクローナル（２．０μｇｈｍＬ）抗体それぞれ７５μＬまたは３０μＬでコーティングした。プレートをブロックし（１％ウシ血清アルブミン［ＢＳＡ］、５％ショ糖）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２％ＢＳＡで適切に希釈したサンプルをウェルに２連で加えた。各微量定量プレートには、９０〜４５８０ｐｇ／ｍＬの範囲を網羅するように、３連で一組のｒ−ｍｅｔＨｕ−レプチン標準またはグリコシル化レプチン標準も加えた。プレートを４℃で１８時間インキュベートし、吸引し、洗浄緩衝液（Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ、ＮａＣｌ  ０．１５Ｍ、ＥＤＴＡ  １０ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０  ０．０５％、ｐＨ７．３５［ＴＥＮ］）で３回洗浄し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＰＢＳ中２％ＢＳＡで約７０ｎｇ／ｍＬでＨＲＰ−結合ポリクローナル抗ｒｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６を加えた。プレートを室温で３時間インキュベートし、ＴＥＮで５回洗浄し、製造業者の説明（Kirkegaard and Perry #50-76-00, Gaithersburg, MD 20879）に従って、ＴＭＢ基質（テトラメチルベンジジン）で発色させた。微量プレート読取装置で４５０ｎｍにて吸光度を測定した。バックグラウンド色を引いた後に、各プレートについて作成した標準曲線からレプチン濃度を計算した。アッセイ感度は約９０ｐｇ／ｍＬであり、各微量プレートについて含めた対照から計算したアッセイ間およびアッセイ内変動はそれぞれ７．５％および５．４％であった。
【０３９２】
２．ウェスタンブロッティングによる炭水化物分析
概して、本発明のグリコシル化レプチン蛋白の分子量が大きいほど、グリコシル化が進行していた。そこで、このウェスタンブロット型分析を用いて、発現グリコシル化レプチン蛋白上に存在する炭水化物量を求めた。
【０３９３】
上記の方法に従ってグリコシル化レプチン蛋白ｃＤＮＡでトランスフェクションしたＣＯＳまたはＣＨＯ細胞からのグリコシル化レプチン蛋白約４００〜６００ｐｇを含む上清の規定容量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ３倍サンプル緩衝液（０．１８７５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、６％ＳＤＳ、３０％グリセリン、１５％２−メルカプトエタノール）と混合した。サンプルを１４％アクリルアミドＴｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Novex（登録商標））によって分析し、０．４５μｍニトロセルロース膜（Novex（登録商標））に移した。ニトロセルロース膜を洗浄し、１０％ＦＢＳおよび２％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ（Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  １３７ｍＭ、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０  ０．０８％）でブロックし、上記で製造したＨＲＰ−結合ポリクローナル抗ｒｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６（５％ＦＢＳおよび１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ中１４０ｎｇ／ｍＬ）とともに３〜５時間インキュベートした。ＴＢＳＴで５回、各５分間洗浄した後、製造者の説明に従って、ＥＣＬ試薬（Amersham（登録商標））で膜を現像した。膜を、１０〜６０秒間にわたってＸ−Ｏｍａｔ（登録商標）ＡＲフィルム（Kodak（登録商標））に曝露し、標準Ｘ線フィルムの場合同様に現像した。特異的蛋白帯域を視覚化し、分子量マーカーに対する位置から大きさを推定した。大きさが大きいほど、蛋白に結合している炭水化物部分が多い。
【０３９４】
Ｎ−グリカナーゼによる処理
Ｎ−グリカナーゼ処理は、Ｎ−連結炭水化物を除去することで、未グリコシル化レプチンの場合と同等の移動性上昇をもたらすものである。グリコシル化レプチン蛋白をＮ−グリカナーゼで処理することで、未グリコシル化レプチンと同様の分子量が得られた。それは、グリコシル化レプチン蛋白の大きさ上昇がＮ−連結炭水化物によるものであることを確認するものである。
【０３９５】
方法
グリコシル化レプチン蛋白４００ｐｇを含むＣＯＳ細胞コンディショニング培地を、０．５ＳＤＳ  １０μＬと混合し、各サンプルを３分間煮沸した。次に、０．５Ｍ  ＮａＰＯ４ｐＨ８．６＋７．５％ノニデット（nonidet）Ｐ４０を２５０単位／ｍＬＮ−グリカナーゼ（Genzyme（登録商標））とともに加えた。各サンプルを３７℃で終夜インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を加えることで反応停止し、上記の方法に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタン分析を行った。得られた結果は、認められたＳＤＳ  ＰＡＧＥの移動性低下はＮ−連結炭水化物の付加によるものであることを示している。多くのグリコシル化レプチン蛋白が確認されたことは、Ｎ−連結炭水化物付加を支持し得る箇所がレプチンに複数あることを示している。類縁体を２９３細胞で発現した場合も同様の結果が得られた。同様に、複数グリコシル化部位レプチン蛋白をＮ−グリカナーゼで処理した場合に、それの移動性も変化して未グリコシル化レプチンの移動性となり、移動性の差がＮ−連結炭化水素の存在によるものであることを示している。
【０３９６】
以上、好ましい実施態様と考えられるものにおいて本発明を説明したが、本発明はここで開示の実施態様に限定されるものではなく、逆に添付の特許請求の精神および範囲に含まれる各種変更および均等物を含むものであって、その特許請求の範囲は、そのような変更および均等物を全て包含するような最も広い解釈と一致すべきものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  各種用量の１部位グリコシル化レプチン（「グリコシル化ＣＨＯレプチン」）および非グリコシル化ｒｍｅｔＨｕ−レプチン１〜１４６（「レプチン」）を投与した動物についての、緩衝液対照と比較した体重減少を示すグラフである。
【図２】  実施例５および６で詳細に説明されるウェスタンブロットを示す図である。
【図３】  実施例７で詳細に説明される、雄ＣＤ−１マウスにおいて１．０ｍｇ／ｋｇのｒｍｅｔＨｕ−レプチンまたは３部位グリコシル化レプチン蛋白を皮下投与した後の血清レプチン濃度のグラフである。
【図４】  実施例７で詳細に説明される、雄ＣＤ−１マウスにおいて１．０ｍｇ／ｋｇのｒｍｅｔＨｕ−レプチンまたは３部位グリコシル化レプチン蛋白を静脈投与した後の血清レプチン濃度のグラフである。
【図５】  実施例８で詳細に説明される、３部位グリコシル化レプチン蛋白（「ＧＥ−レプチン」）投与時の体重減少のグラフである。
【図６】  実施例９で詳細に説明される、３部位グリコシル化レプチン蛋白（「ＧＥ−レプチン」）投与時の飼料摂取のグラフである。
【図７】  実施例１４で詳細に説明される、３部位グリコシル化レプチン蛋白の発現およびグリコシル化に対する各種信号ペプチドの効果を示すウェスタンブロットである。
【図８】  実施例１４で詳細に説明される、３部位グリコシル化レプチン蛋白のグリコシル化に対する各種信号ペプチドならびに他のペプチドの効果を示すウェスタンブロットである。
【図９】  実施例１４で詳細に説明される、３部位グリコシル化レプチン蛋白のグリコシル化に対するペプチダーゼ開裂部位の効果を示すウェスタンブロットである。
【図１０】  実施例１４で詳細に説明される、３部位グリコシル化レプチン蛋白のグリコシル化に対する各種信号ペプチドおよび他のペプチドの効果を示すウェスタンブロットである。
【図１１】  実施例１５に記載のウェスタンブロットであって、少なくとも５部位までグリコシル化部位数を増加させることで、ＣＨＯ細胞で発現する際にレプチン蛋白上で認められるグリコシル化の量が上昇することを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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