(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
未成熟コムギにおいて、配列番号１、８、３４、４８及び４５のそれぞれの塩基配列で特定される５種の遺伝子の発現量を測定することを含む、コムギの完熟種子における二次加工性状を推定する方法。
【請求項２】
さらに、配列番号２〜７、９〜３３、３５〜４４、４６、４７、４９〜１２１のそれぞれの塩基配列で特定される遺伝子から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の発現量を測定することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
逆転写定量ＰＣＲ法により遺伝子の発現量を測定する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
未成熟コムギを用いてコムギの完熟種子における二次加工性状を推定するためのキットであって、
配列番号１、８、３４、４８及び４５のそれぞれの塩基配列で特定される５種の遺伝子を特異的に増幅するための、配列番号１、８、３４、４８及び４５の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列において少なくとも連続した１５塩基をそれぞれ含むプライマーセット、及び／又は配列番号１、８、３４、４８及び４５のそれぞれの塩基配列で特定される５種の遺伝子に特異的にハイブリダイズする、配列番号１、８、３４、４８及び４５の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列において少なくとも連続した１５塩基をそれぞれ含むプローブセットを含む、該キット。
【請求項５】
さらに、配列番号２〜７、９〜３３、３５〜４４、４６、４７、４９〜１２１のそれぞれの塩基配列で特定される遺伝子から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を特異的に増幅するための、該配列番号２〜７、９〜３３、３５〜４４、４６、４７、４９〜１２１のそれぞれの塩基配列で特定される遺伝子から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列において、少なくとも連続した１５塩基をそれぞれ含むプライマーセット、及び／又は配列番号２〜７、９〜３３、３５〜４４、４６、４７、４９〜１２１のそれぞれの塩基配列で特定される遺伝子から選ばれる少なくとも１種の遺伝子に特異的にハイブリダイズする、該配列番号２〜７、９〜３３、３５〜４４、４６、４７、４９〜１２１のそれぞれの塩基配列で特定される遺伝子から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列において、少なくとも連続した１５塩基をそれぞれ含むプローブセットを含む、請求項４記載のキット。
【請求項６】
未成熟コムギを用いてコムギの完熟種子における二次加工性状を推定するためのキットであって、配列番号１〜１２１のそれぞれの塩基配列で特定される遺伝子の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列において、少なくとも連続した１５塩基をそれぞれ含むプライマーセット、及び／又は配列番号１〜１２１のそれぞれの塩基配列で特定される遺伝子の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列において、少なくとも連続した１５塩基をそれぞれ含むプローブセットを含み、該セットの少なくとも１つのプライマー又はプローブを用いて、未成熟コムギを用いてコムギの完熟種子における二次加工性状を推定する、上記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、成長段階にあるコムギにおいて遺伝子マーカーを検出し、早期にコムギの二次加工性状を推定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コムギ、特に日本国内で生産されるコムギは、生産年度による品質のぶれが問題となる。この原因は、特に日本国内では、比較的栽培面積が小さいところに多品種を生産していること、年度ごとの気象条件が種子の品質に影響していることなどが挙げられる。ところが、種子が完熟するまで二次加工性状を推定することが困難であることから、低品質のコムギを購買してしまうというリスクがあり、種子が成熟する以前の早期段階で将来の完熟種子の二次加工性状を推定する技術の開発が望まれていた。【０００３】
このような状況下、コムギの二次加工性状を支配する遺伝子が、いくつか報告されている。その中でも、高分子量グルテニンサブユニット、プロインドリン及びワキシータンパク質について研究が行われている。【０００４】
コムギの高分子量グルテニンは、製パン適性を決定付けるタンパク質として古くから研究がなされている。Ｐａｙｎｅらは、高分子量グルテニンをコードする遺伝子が第一染色体の長腕に存在することを明らかにした（非特許文献１）。これらは異なる分子量のサブユニットをコードしており、Ｄ１染色体には、優れた製パン適性と関連の深いサブユニットペア（１Ｄｘ５＋１Ｄｙ１０）が存在する（非特許文献２）。これを、劣った製パン適性と関連するサブユニット（１Ｄｘ２＋１Ｄｙ１２）と、アミノ酸配列について比較したところ、グルテンの構造や物理的特徴と関連することが示された（非特許文献３）。実際に、１Ｄｘ５を元来持っていないコムギにこれを遺伝子導入した場合、導入された遺伝子のコピー数に応じて製パン適性が向上したという報告がある（非特許文献４）。さらに、フロリダ大学は、製パン適性を改良する目的で、高分子量グルテニンサブユニットを形質転換によって導入する方法を開示している（特許文献１）。【０００５】
プロインドリンは、薄力粉に特徴的な澱粉結合性タンパク質「Ｇｒａｉｎ  Ｓｏｆｔｎｅｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ」として同定された（非特許文献５及び６）。このタンパク質は当初フライアビリンと名づけられた。該タンパク質は、２つの主要なコンポーネントを有し、これらはプロインドリンａ及びｂとして知られる脂質結合性タンパク質と相同であることが明らかになった。このタンパク質が含まれていない強力小麦粉にこのタンパク質を加えていくとその添加量とパンの硬さが逆相関を示した。このことからプロインドリンは、パンの品質に影響を与える因子であることが示された（非特許文献７）。【０００６】
ワキシータンパク質も澱粉結合性タンパク質として研究されてきた。穀物の澱粉には、直鎖状のアミロースと分岐構造を持つアミロペクチンの２種類がある。イネ及び大麦などの多くの穀物には、アミロースとアミロペクチンの両方の分子を含む「ウルチ性品種」と、アミロースを含まない「モチ性品種」のものがある。コムギについては、「モチ性」のものが天然には知られていなかったが、最近、東北農業研究センターが世界で初のモチ性コムギを開発することに成功した。ウルチ性コムギにはＷｘタンパク質が存在しているのに対して、モチ性コムギではＷｘタンパク質の存在が見られない。普通系コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．）は３種のＷｘ遺伝子を有する６倍体であり、Ｗｘ−Ａ１、Ｗｘ−Ｂ１、Ｗｘ−Ｄ１を染色体腕７ＡＳ、４ＡＬ、及び７ＤＳ上にもつ。特許文献２には、コムギにおける３種のＷｘ遺伝子（Ｗｘ−Ａ１、Ｗｘ−Ｂ１、Ｗｘ−Ｄ１）の発現の有無を二次元電気泳動法を用いて確認する方法が記載されている。また、同特許公報には、Ｗｘ遺伝子２種の発現を欠いたコムギ変異体を交配に用いてモチ性コムギを作出する方法が記載されている。さらに特許文献３には、モチ性コムギから製造した小麦粉を０．５〜３０重量％含有する穀粉を用いて製造したパン類であって、冷蔵保存後又は冷凍保存後解凍して喫食しても食感が劣化しないパン類が記載されている。ワキシータンパク質をコードしている遺伝子はワキシー座遺伝子として知られている。この３種類の変異型のワキシー座遺伝子を検出する方法が特許文献４に記載されている。【０００７】
このように、コムギにおけるタンパク質の性状及び澱粉の性状を支配する遺伝子がいくつか知られており、従来の育種法や遺伝子組み換えにより作出されたコムギの粉を用い、製パン試験を含む二次加工試験や生地物性を調査することにより、その機能が実証されている。【０００８】
しかし、上記の知見は特定の遺伝子とコムギの二次加工性状との関係を示したに過ぎず、また、コムギの二次加工性状には、上記以外にも多くの因子が関係するものと考えられる。従って、成長段階の未成熟コムギの段階で、将来結実した種子のもつ二次加工性状を推定することは困難であった。
【非特許文献１】Payne, P.I., Holt, L.M., Law, C.N. (1981) Theor Appl Genet 60:229-236
【非特許文献２】Payne, P.I., Corfield, K. G., Holt, L. M., Blackman, J. A. (1981) J Sci Food Agric 32:51-60
【非特許文献３】Flavell, R. B., Goldsbrough, A.P., Robert, L.S., Schnick, D., Thompson, R.D. (1989)
【非特許文献４】Barro, F., Rooke, B., Bekes, F., Gras, P., Tatham, A.S., Fido, R., Lazzeri, P.S., Shewry, P.R. and Barcelo, P. (1997) Nature Biotec 15:1295-1299
【非特許文献５】Greenwell, P. and Schofield, J. (1986) Cereal Chem. 63:379-380
【非特許文献６】Jolly, C.J., Rahman, S., Kortt, A.A. and Higgins, T.J.V. (1993) Theor Appl Genet 86:589-597
【非特許文献７】Dubreil, L., Meliande, S., Chiron, H., Compoint, J.P., Quillien, L. Branlard, G. and Marion, D. (1998) Cereal Chem. 75:222-229
【特許文献１】特表２０００−５１６０９７号公報
【特許文献２】特許第３１７０５９５号公報
【特許文献３】特開平９−１９１８１９号公報
【特許文献４】特開２００３−２８４５９８号公報
【発明の開示】
【０００９】
本発明の課題は、収穫したコムギから得られるコムギ粉の二次加工性状を、コムギ種子が成熟する以前の早期段階で推定する手段を提供することである。
【００１０】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、成熟前の早期段階において発現量が変化し、その発現量の変化が将来の完熟種子の二次加工性状と関連する遺伝子マーカーを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
【００１２】
（１）未成熟コムギにおいて、配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の発現量を測定することを含む、コムギの完熟種子における二次加工性状を推定する方法。
【００１３】
（２）少なくとも、配列番号１、８、３４、４８及び４５のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子から選ばれる少なくとも１種の遺伝子の発現量を測定することを含む、（１）記載の方法。
【００１４】
（３）逆転写定量ＰＣＲ法により遺伝子の発現量を測定する、（１）又は（２）記載の方法。
【００１５】
（４）未成熟コムギを用いてコムギの完熟種子における二次加工性状を推定するためのキットであって、
配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するための、１０〜４０塩基長の連続したプライマーから選ばれる少なくとも１のプライマー、及び／又は配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子に特異的にハイブリダイズする、１０〜４０塩基長の連続したプローブから選ばれる少なくとも１のプローブを含む、該キット。
【００１６】
（５）配列番号１、８、３４、４８及び４５のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するための、１０〜４０塩基長の連続したプライマーから選ばれる少なくとも１のプライマー、及び／又は配列番号１、８、３４、４８及び４５のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子に特異的にハイブリダイズする、１０〜４０塩基長の連続したプローブから選ばれる少なくとも１のプローブを含む、（４）記載のキット。
【００１７】
（６）配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子から選ばれる遺伝子の少なくとも１種に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１０塩基の連続したプローブを含む、未成熟コムギを用いてコムギの完熟種子における二次加工性状を推定するためのアレイ。
【００１８】
（７）配列番号１、８、３４、４８及び４５のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子から選ばれる遺伝子の少なくとも１種に特異的にハイブリダイズする、少なくとも１０塩基の連続したプローブを含む、未成熟コムギを用いてコムギの完熟種子における二次加工性状を推定するためのアレイ。
【００１９】
本発明により、コムギ種子が成熟する以前の早期段階で、将来のコムギ完熟種子の二次加工性状を推定することが可能になる。それにより、低品質のコムギを購買するリスクを低減することができる。
【００２０】
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願第２００４−２７１３９１号の明細書、請求の範囲および／または図面に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明者らは、登熟期に高温又は低温にさらされたときに、その発現量が変化する遺伝子を見いだし、未成熟コムギにおいて該遺伝子をマーカーとしてその発現量を測定することにより、将来の完熟種子の二次加工性状を推定できることを見いだした。【００２２】
本発明において、コムギとは、イネ科コムギ属に属する植物を意味し、例えば、パンコムギ、タルホコムギ、マカロニコムギ等を挙げることができるが、コムギに分類されるものであれば、これらに限定されるものではない。本発明は、パンコムギ、特にＴｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍにおいて好適に用いられる。【００２３】
本発明の方法においてマーカーとして用いられる遺伝子は、配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子であり、これらから選ばれる少なくとも１種の遺伝子の発現量を測定する。本発明においては、好ましくは配列番号１、８、３４、４８及び４５のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子から選ばれる少なくとも１種の遺伝子、好ましくは５種の遺伝子の発現量を測定する。【００２４】
本発明において、配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子には、配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列からなる遺伝子、及び該遺伝子と機能的に同等な遺伝子が包含される。ここで「機能的に同等」とは、対象となる遺伝子によってコードされるポリペプチドが、配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列からなる遺伝子によってコードされるポリペプチドと同等の生物学的機能、生化学的機能を有することを指す。【００２５】
あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドをコードするＤＮＡを調製する当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989）を利用する方法が挙げられる。【００２６】
機能的に同等な遺伝子は、通常、アミノ酸配列レベルにおいて高い相同性を有する。高い相同性とは、アミノ酸レベルにおいて、通常、少なくとも５０％以上の同一性、好ましくは７５％以上の同一性、さらに好ましくは８５％以上の同一性、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993）によって決定することができる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。なお、本明細書中において、「遺伝子」という用語には、ＤＮＡのみならずそのｍＲＮＡやｃＤＮＡも含むものとする。また、全長遺伝子のみならずＥＳＴも含むものとする。【００２７】
従って、配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子には、配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列からなる遺伝子が包含される。配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列からなる遺伝子の塩基長は、機能的に同等の遺伝子をコードする限り特に制限されない。塩基配列の一部とは、各塩基配列の一部分の塩基配列であって、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせるのに十分な塩基配列の長さを有するものであり、例えば、少なくとも５０塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。好ましくは各塩基配列において連続する少なくとも５０塩基、好ましくは少なくとも１００塩基、より好ましくは少なくとも２００塩基の配列である。ここで「連続する」とは、基準とする塩基配列のうち連続した塩基配列を含むことを意味する。【００２８】
本明細書において、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、すなわち、各遺伝子に対し高い相同性（相同性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上）を有するオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする条件をいう。より具体的には、このような条件は、０．５〜１ＭのＮａＣｌ存在下４２〜６８℃で、又は５０％ホルムアミド存在下４２℃で、又は水溶液中６５〜６８℃で、ハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液を用いて室温〜６８℃でフィルターを洗浄することにより達成できる。【００２９】
上記遺伝子の発現量の測定は、当技術分野で通常用いられる方法で実施することができ、好ましくは、未成熟コムギに由来する試料において、配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子から選ばれる少なくとも１種の遺伝子をコードするＲＮＡを検出する方法が挙げられる。ここで、ＲＮＡの検出には、ｍＲＮＡの検出だけでなく、ＲＮＡから変換されたｃＤＮＡやｃＲＮＡの検出も包含される。【００３０】
試料中の配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子をコードするＲＮＡを検出する方法としては、配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するための、１０〜４０塩基長の連続したプライマー、及び／又は配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子を特異的にハイブリダイズする、１０〜４０塩基長の連続したプローブから選ばれる少なくとも１のプローブを用いる方法が挙げられる。【００３１】
配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するためのプライマーは、配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列において、その一部を増幅するものであってもよい。例えば、配列番号１の２７〜１７６位の塩基配列、配列番号８の１５０〜２５０位の塩基配列、配列番号３４の１２〜８０位の塩基配列、配列番号４８の４０〜１４９位の塩基配列、配列番号４５の６９〜２１６位の塩基配列を増幅するものでもよい。【００３２】
特定の遺伝子を特異的に増幅するためのプライマー及び特定の遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブの設計は、当技術分野において通常用いられる方法によって実施できる。プライマーの長さは、通常１０塩基以上、好ましくは１０〜４０塩基、より好ましくは１５〜３０塩基である。プローブの長さは、通常１０塩基以上、好ましくは１０〜４０塩基であり、さらに好ましくは１５〜３０塩基である。【００３３】
また設計の際には、プライマー又はプローブの融解温度（Ｔｍ）を確認することが好ましい。Ｔｍとは、任意の核酸鎖の５０％がその相補鎖とハイブリッドを形成する温度を意味し、テンプレートＤＮＡ又はＲＮＡとプライマー又はプローブとが二本鎖を形成してアニーリング又はハイブリダイズするためには、アニーリング又はハイブリダイゼーションの温度を最適化する必要がある。一方、この温度を下げすぎると非特異的な反応が起こるため、温度は可能な限り高いことが望ましい。従って、設計しようとするプライマー又はプローブのＴｍは、増幅反応又はハイブリダイゼーションを行う上で重要な因子である。Ｔｍの確認には、公知のプライマー又はプローブ設計用ソフトウエアを利用することができ、本発明で利用可能なソフトウエアとしては、例えばＡｍｐｌｉｆｙなどが挙げられる。またＴｍの確認は、ソフトウエアを使わず、自ら計算することによっても行うことができる。その場合には、最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｍｅｔｈｏｄ）、Ｗａｌｌａｎｃｅ法、ＧＣ％法等に基づく計算式を利用することができる。本発明では、平均Ｔｍが約５０〜７０℃のプライマー及び５５〜７５℃のプローブを用いることが好ましい。プライマー又はプローブとして特異的なアニーリング又はハイブリダイズが可能な条件としては、その他にもＧＣ含量などがあり、そのような条件は当業者に周知である。【００３４】
プライマーは、設計時にテンプレートとして使用する配列に対し相同的な場合と相補的な場合があり、一般にフォワードプライマーの場合はテンプレート配列に対し相同配列となり、リバースプライマーの場合はテンプレート配列に対し相補配列となることに留意してプライマーを設計する必要がある。このようなプライマーの設計は当業者には周知である。【００３５】
プライマーの具体例としては、例えば、以下のプライマーセットが挙げられる：
（ａ）配列番号１の塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットとして、配列番号１３０で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１３１で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセットが挙げられ、
（ｂ）配列番号８の塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットとして、配列番号１３３で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１３４で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセットが挙げられ、
（ｃ）配列番号３４の塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットとして、配列番号１３６で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１３７で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセットが挙げられ、
（ｄ）配列番号４８の塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットとして、配列番号１３９で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４０で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセットが挙げられ、
（ｅ）配列番号４５の塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するプライマーセットとして、配列番号１４２で表される塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号１４３で表される塩基配列からなるリバースプライマーとのセットが挙げられる。【００３６】
配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブは、配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列において、その一部に特異的にハイブリダイズするものであってもよい。例えば、配列番号１の１１３〜１２８位の塩基配列、配列番号８の２１３〜２２８位の塩基配列、配列番号３４の３３〜４７位の塩基配列、配列番号４８の９１〜１０６位の塩基配列、配列番号４５の１７８〜１９４位の塩基配列にハイブリダイズするものでもよい。【００３７】
さらに、当業者には周知のように、上記のようなプライマー又はプローブには、アニーリング又はハイブリダイズする部分以外の配列、例えばタグ配列などの付加配列が含まれていてもよく、そのような付加配列が付加されたものも本発明の範囲内に含まれるものとする。【００３８】
次に、未成熟コムギにおいて、配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子の発現量を測定する手段の一実施形態として、未成熟コムギに由来する試料中の各遺伝子をコードするＲＮＡ量に基づき、該遺伝子の発現量を測定する方法について以下に述べる。【００３９】
まず未成熟コムギに由来する試料から全ＲＮＡを抽出する。本発明において未成熟コムギとは、受粉して花が咲いてから収穫されるまでのコムギであれば特に制限されないが、開花後、通常１〜４０日、好ましくは５〜３５日のコムギである。本発明において未成熟コムギに由来する試料としては、種子を使用する。【００４０】
ＲＮＡを抽出する方法としては、例えば、チオシアン酸グアニジン・塩化セシウム超遠心法、チオシアン酸グアニジン・ホットフェノール法、グアニジン塩酸法、酸性チオシアン酸グアニジン・フェノール・クロロホルム法(Chomczynski, P. and Sacchi, N., (1987) Anal. Biochem., 162, 156-159）などを利用することができる。【００４１】
抽出されたＲＮＡはさらに精製してｍＲＮＡとして使用することが好ましい。精製方法は特に限定されないが、真核細胞の細胞質に存在するｍＲＮＡの多くは、その３’末端にポリ（Ａ）配列を持つため、この特徴を利用して、例えば、以下のように実施することができる。まず抽出した全ＲＮＡにビオチン化オリゴ（ｄＴ）プローブを加えてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを吸着させる。次に、ストレプトアビジンを固定化した常磁性粒子担体を加え、ビオチン／ストレプトアビジン間の結合を利用して、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを捕捉させる。洗浄操作の後、最後にオリゴ（ｄＴ）プローブからポリ（Ａ）＋ＲＮＡを溶出する。また、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムを用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡを吸着させ、これを溶出して精製する方法も採用してもよい。溶出されたポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、さらに、ショ糖密度勾配遠心法等により分画してもよい。このようにして得られたＲＮＡ、該ＲＮＡから得られるｃＤＮＡやｃＲＮＡ、及びその増幅産物を以下において被検核酸と称し、本発明における遺伝子発現量の測定方法は、これら被検核酸のいずれを測定する場合も包含する。【００４２】
遺伝子の発現量を測定する方法は、特に制限されず、当技術分野で通常用いられる方法によって実施できる。例えば、ノーザンハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーション法及び逆転写ＰＣＲ法などが挙げられ、本発明においては逆転写ＰＣＲ法を用いるのが好ましい。さらに、本発明においては、好ましくはリアルタイムＰＣＲ法及び競合ＰＣＲ法などの定量ＰＣＲ法を組み合わせることにより、各遺伝子の発現量を定量的に測定する。【００４３】
本発明は、特に、組織や成長段階によって発現量の変化のない遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）の発現量に対する特定の遺伝子の発現量の比を測定することにより、未成熟コムギにおける特定の遺伝子の発現量の増減を測定する。組織や成長段階によって発現量の変化のない遺伝子としては、ユビキチン遺伝子、アクチン遺伝子、チューブリン遺伝子、及びリボソーマルＲＮＡ遺伝子等が挙げられ、本発明においてはユビキチン遺伝子を標準遺伝子として使用するのが好ましい。【００４４】
逆転写ＰＣＲ法は、まず、試料から得られたＲＮＡをテンプレートとして、逆転写酵素反応によりｃＤＮＡを作製し、その後、作製したｃＤＮＡをテンプレートとして一対のプライマーを用いてＰＣＲ法を行うものである。【００４５】
競合ＰＣＲ法では、同じプライマーを用いて、定量の内部標準となる競合的テンプレートから得られる増幅産物と被検核酸から得られる増幅産物との量を比較することにより、被検核酸に含まれる検出対象を定量することができる。【００４６】
リアルタイムＰＣＲ法では、例えば、５’端は蛍光色素（レポーター）で、３’端は消光色素（クエンチャー）で標識した、目的遺伝子の特定領域にハイブリダイズするプローブが使用される。プローブは、通常の状態ではクエンチャーによってレポーターの蛍光が抑制されている。この蛍光プローブを目的遺伝子に完全にハイブリダイズさせた状態で、その外側からＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行う。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が進むと、そのエキソヌクレアーゼ活性により蛍光プローブが５’端から加水分解され、レポーター色素が遊離し、蛍光を発する。リアルタイムＰＣＲ法は、この蛍光強度をリアルタイムでモニタリングすることにより、テンプレートＤＮＡの初期量を定量する。【００４７】
リアルタイムＰＣＲ法には、例えばＳＹＢＲＴＭＧｒｅｅｎ法やＴａｑＭａｎＴＭ法を使用することができる。リアルタイムＰＣＲ法の反応サイクルとしては、例えば、５０℃２分、９５℃１０分、（９５℃１５秒、６０℃分）４０サイクルを使用できる。得られた結果は、例えば、１８ｓリボソームＲＮＡを用いて標準化することができる。【００４８】
上記増幅反応後に特異的な増幅反応が起こったか否かを検出するには、増幅反応により得られる増幅産物を特異的に認識することができる公知の手段を用いることができる。例えば、増幅反応の過程で取り込まれるｄＮＴＰに、放射性同位体、蛍光物質、発光物質などの標識体を作用させ、この標識体を検出することにより実施できる。放射性同位体としては、３２Ｐ、１２５Ｉ、３５Ｓなどを用いることができる。また蛍光物質としては、例えば、フルオレセン（ＦＩＴＣ）、スルホローダミン（ＴＲ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）などを用いることができる。また発光物質としてはルシフェリンなどを用いることができる。【００４９】
これら標識体の種類や標識体の導入方法等に関しては、特に制限されることはなく、従来公知の各種手段を用いることができる。例えば標識体の導入方法としては、放射性同位体を用いるランダムプライム法が挙げられる。【００５０】
標識したｄＮＴＰを取り込んだ増幅産物を観察する方法としては、上述した標識体を検出するための当技術分野で公知の方法であればいずれの方法でもよい。例えば、標識体として放射性同位体を用いた場合には、放射活性を、例えば液体シンチレーションカウンター、γ−カウンターなどにより計測することができる。また標識体として蛍光を用いた場合には、その蛍光を蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダーなどを用いて検出することができる。【００５１】
本発明の方法においては、上記プローブを用いてハイブリダイゼーション反応を行い、その特異的結合を検出することにより、各遺伝子の発現量を測定することもできる。ハイブリダイゼーション反応は、プローブが特定の遺伝子に由来する塩基配列のみと特異的に結合するような条件、すなわちストリンジェントな条件下で行う必要がある。そのようなストリンジェントな条件は当技術分野で周知であり、特に限定されない。ハイブリダイゼーションを行う場合には、プローブに蛍光標識（ＦＡＭなど）、放射性標識、酵素標識、ビオチン標識等の適当な標識を付加することができる。【００５２】
本発明において遺伝子発現量の測定は、標識化プローブと未成熟コムギから得られた被検核酸とをハイブリダイズ可能なように接触させることによっても実施できる。「ハイブリダイズ可能なように」とは、上述したストリンジェントな条件下にて特異的な結合が起こる環境（温度、塩濃度）において、ということである。具体的には、試料又は被検核酸をスライドグラス、メンブラン、マイクロタイタープレート等の適当な担体に担持し、標識を付加したプローブを添加することにより、プローブと被検核酸とを接触させてハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイズしなかったプローブを除去した後、被検核酸とハイブリダイズしているプローブの標識を検出する。標識の濃度を指標とすることにより、定量的な検出が可能となる。標識化プローブを用いた検出方法の例としては、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）法等を挙げることができる。【００５３】
本発明において、被検核酸の少なくとも１つを検出する方法としてマイクロアレイ、マクロアレイ等のアレイ法を挙げることができる。この場合は、次のような方法によって検出を行うことができる。すなわち、被検核酸に特異的にハイブリダイズするプローブをスライドグラス、メンブラン、マイクロタイタープレート等の適当な担体に担持し、被検核酸を標識化した後でプローブとのハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリダイズしなかった被検核酸を除去した後、プローブとハイブリダイズしている被検核酸の標識を検出する。標識の濃度を指標とすることにより、定量的な検出も可能となる。【００５４】
プローブ及び被検核酸のいずれも標識化せず、プローブと試料又は被検核酸とのハイブリダイゼーションによって形成された二本鎖核酸（ハイブリッド）を検出することもできる。二本鎖核酸の検出は、例えば、核酸の二本鎖部分に特異的に結合する蛍光色素等を用いて行うことができる。そのような色素としては、例えば、特開２００２−１８１８１６号公報に記載された蛍光インターカレータ等を挙げることができる。【００５５】
遺伝子発現量の測定においてハイブリダイゼーションを行う場合、被検核酸はＤＮＡ及びＲＮＡのいずれでもよいが、高感度の検出を必要とする場合には、ＲＮＡを被検核酸とする方が望ましい。【００５６】
高感度の測定を行うためには、増幅反応とハイブリダイゼーション反応とを組合せ、プライマーを用いた増幅反応を行って得られる増幅産物に対し、別のプローブを用いてハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。そのような組合せを利用する場合のプライマー及びプローブは、当業者であれば設計することができ、その具体例は上述のとおりである。【００５７】
本発明のアレイは、公知の技術、例えば、村松正明、那波宏之（監修）、「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」、秀潤社（２００３年３月発行）に記載される方法に従って調製することができ、これを用いたアレイ法も当該文献を参照して実施することができる。【００５８】
本発明の方法では、未成熟コムギにおいて、配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される少なくとも１種の遺伝子の発現量を測定することにより、コムギ完熟種子の二次加工性状を推定する。【００５９】
松木らは、コムギが登熟期に高温にさらされるとアミロペクチンの側鎖長が長くなることを報告している（Matsuki, J., Yasui, T., Kohyama, K., and Sasaki, T. (2003) Cereal Chem. 80(4):476-480）。Ｓｈｉ及びＳｅｉｂは、低温で育成されたコムギ中のアミロペクチンは、側鎖長が短いものが多いことを報告しているが、その一方で、澱粉糊化温度はアミロペクチン側鎖長と相関関係にあることを報告している（Shi, Y.C., and Seib, P.A. (1995) Carbohydr.Polym. 26:141-147））。また、Ｓｈｉｂａｎｕｍａらは、澱粉のアミロペクチン側鎖長は、うどん適性に影響を与えることを報告している（Shibanuma, K., Takeda, Y., Hizukuri, S., and Shibata, S. (1994) Carbphydr. Polym. 25:111-116）。また、登熟期に高温にさらされるとアミロース含量が増加することが報告されている（Tester, R.F., Debon, S. J.J., Davies, H.V., and Gidley, M.J. (1995) J. Sci. Food Agric）。また、ＳｔｏｎｅとＮｉｃｈｏｌａｓは、グリアジンに対するグルテニンの割合は高温ストレスでも変化がない品種も有れば、劇的に減るものもあるとしている（Stone, P.E., and Nicholas, M.E. (1994) Aust. J. Plant Physiol. 21:887-900）。これに対してＢｌｕｍｅｎｔｈａｌらは、登熟期に３５℃以上の高温にさらされることにより、遺伝的改変により生地特性が低下することを示している（Blumenthal, C.S., Barlow, E.W.R., and Wrigley. C.W. (1993) J. Cereal Sci. 18:3-21）。さらにＢｌｕｍｅｎｔｈａｌらは、登熟期に高温ストレスにさらされることによるドウのもろさは、グリアジンに対するグルテニン比の減少とラージグルテニンポリマー割合の減少が原因であるとしている（Blumenthal, C., Bekes, F., Gras, P.W., Barlow, W.R., and Wrigley, C.W. (1995) Cereal Chem. 72(6):539-544）。ＤｕＰｏｎｔらは、開花後肥料を追加しないという条件下では、高温によりタンパク質含量とω−グリアジン量が増加することを報告している（DuPont, F.M., Altenbach, S., Chan, R., Cronin, K., and Lieu, D. (2000) In: Shewry, P.R., and Tatham, A.S. (Eds.), Gluten Royal Society of Chemstry, Cambridge, pp. 488-491）。以上の知見を表１にまとめた。
【表１】
0004764343.tif 000002
【００６０】
本発明者らは、未成熟コムギにおいて、上記配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子の発現量を上記方法によって測定し、得られた各遺伝子の発現量を、ユビキチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子の発現量に対する比として算出し、得られた結果を、登熟期において高温にさらされた場合又は低温にさらされたコムギにおいて得られる結果と比較することによって、将来得られる完熟種子の二次加工性状を推測できることを見いだした。【００６１】
各遺伝子の発現量に基づき、コムギ完熟種子の二次加工性状を推測する方法について以下に述べる。【００６２】
まず、未成熟コムギにおける配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子の発現量を、ハウスキーピング遺伝子の発現量に対する比として算出する。続いて、得られた発現量比を、登熟期に高温又は低温にさらされた場合の各遺伝子の発現量比と比較する。その結果、未成熟コムギにおける各遺伝子の発現量比が、登熟期に高温にさらされた場合の各遺伝子の発現量比に類似する場合は、該未成熟コムギから将来得られる完熟種子の二次加工性状は、登熟期において高温にさらされたコムギから得られる完熟種子の二次加工性状と類似する、すなわち、うどん適性が低下し、生地特性が低下し、ドウがもろくなると推定できる。逆に、未成熟コムギにおける各遺伝子の発現量比が、登熟期に低温にさらされた場合の各遺伝子の発現量比に類似する場合は、該未成熟コムギから将来得られる完熟種子の二次加工性状は、登熟期において低温にさらされたコムギから得られる完熟種子の二次加工性状と類似する、すなわち、製パン適性及びうどん適性が低下すると推定できる。【００６３】
より具体的には、未成熟コムギにおいて、ユビキチン遺伝子発現量に対する、配列番号１の塩基配列で特定される遺伝子発現量の比が０．０６〜０．２４倍、配列番号８の塩基配列で特定される遺伝子発現量の比が０．８〜３．２倍、配列番号３４の塩基配列で特定される遺伝子発現量の比が０．４５〜１．８倍、配列番号４８の塩基配列で特定される遺伝子発現量の比が０．２４倍以上、配列番号４５の塩基配列で特定される遺伝子発現量の比が０．００１５〜０．００６倍であれば、将来得られる完熟種子の性状は、登熟期に高温にさらされたコムギから得られる完熟種子の性状を有すると推測できる。すなわち、アミロース含量が高く、アミロペクチンの側鎖長が長く、澱粉糊化温度が高く、タンパク質含量が高く、グルテニン／グリアジン比が低く、ラージグルテニンポリマーが少ないという特徴を有することが推定できる。【００６４】
一方、未成熟コムギにおいて、ユビキチン遺伝子発現量に対する、配列番号１の塩基配列で特定される遺伝子発現量の比が０．２４倍以上、配列番号８の塩基配列で特定される遺伝子発現量の比が３．２倍以上、配列番号３４の塩基配列で特定される遺伝子発現量の比が０．４５倍以下、配列番号４８の塩基配列で特定される遺伝子発現量の比が０．０６倍以下、配列番号４５の塩基配列で特定される遺伝子発現量の比が０．００１５倍以下であれば、将来得られる完熟種子の性状は、登熟期に低温にさらされたコムギから得られる完熟種子の二次加工性状を有すると測定できる。すなわち、アミロース含量が低く、アミロペクチンの側鎖長が短く、澱粉糊化温度が低く、タンパク質含量が低く、アミロース及びアミロペクチンが低分子化しているという特徴を有することが推定できる。【００６５】
そしてそのような性状と、表１にまとめたような従来の知見とを組み合わせることにより、完熟種子から得られる小麦粉の二次加工性状を推定することができる。【００６６】
本発明はまた、未成熟コムギを用いて、コムギ完熟種子における二次加工性状を推定するためのキットに関する。該キットは、上記の配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子を特異的に増幅するための１０〜４０塩基長のプライマーから選ばれる少なくとも１のプライマー、及び／又は上記の配列番号１〜１２１のいずれかの塩基配列で特定される遺伝子に特異的にハイブリダイズする１０〜４０塩基長のプローブから選ばれる少なくとも１のプローブを含む。【００６７】
本発明のキットは、プライマーを含む場合には、さらに、反応液を構成するバッファー、ｄＮＴＰ混合物、酵素類（逆転写酵素、ＲＮａｓｅＨなど）、校正用の標準試料などを含んでいてもよい。本発明のキットは、プローブを含む場合には、さらに、ハイブリダイゼーションバッファー、洗浄バッファー、マイクロプレート、ナイロンメンブレンなどを含んでいてもよい。さらに、ユビキチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子を特異的に増幅するためのプライマー及び／又はハウスキーピング遺伝子に特異的にハイブリダイズするプローブを含んでいてもよい。
【実施例】
【００６８】
（実施例１）
開花直前まで外で成育させたコムギを１５℃の人工気象室で生育させた。開花後１０日目に一部を２０℃又は１０℃の環境下に移し、開花後１５日目まで同一環境下で生育させた。開花後１５日目に一部の未成熟種子を回収し、発現遺伝子解析用の試料とした。残りの一部を１５℃の環境に移動し開花後５０日目を完熟とみなし、成分分析に供した。【００６９】
一方、開花期に人工気象室に移動し１５℃で生育させた後、開花後３０日目に一部を２０℃又は１０℃の環境下に移し、開花後３５日目まで同一環境下で生育させた。開花後３５日目に一部の未成熟種子を回収し、発現遺伝子解析用の試料とした。残りの一部を１５℃の環境に移動し、開花後５０日目を完熟とみなし、成分分析に供した。【００７０】
発現解析は、Ｈｉ−ＣＥＰ（Ｈｉｇｈ  Ｃｏｖｅｒａｇｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）法で行った。Ｈｉ−ＣＥＰ法は、放射線医学総合研究所の安倍ら（Fukumura R, Takahashi H, Saito T, Tsutsumi Y, Fujimori A, Sato S, Tatsumi K, Araki R, Abe M., Nucleic Acids Res. 2003, 15;31(16): e94）が開発した方法であり、以下の要素で構成される。【００７１】
（１）ｍＲＮＡ抽出
三温度帯にて育成したコムギ未成熟種子からＳＤＳ−フェノール法にて全ＲＮＡを抽出した。すなわち、種子を粉砕し抽出バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＬｉＣｌ、１％  ＳＤＳ）に懸濁後、フェノール／クロロホルム処理を行った。さらにフェノール／クロロホルム処理を行った後、ＬｉＣｌ沈殿を行った。沈殿物を４００μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解し、フェノール／クロロホルム処理、クロロホルム処理、ＥｔＯＨ沈殿処理を行った。乾燥後２００μｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に溶解し、２０μｌのＥｔＯＨを加え、多糖類を沈殿させて除いた。上清をＥｔＯＨ沈殿し、乾燥後、ＤＥＰＣ処理水に溶解した。この溶液からＭｉｃｒｏ−ＦａｓｔＴｒａｃｋＴＭ  ２．０  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｍＲＮＡを精製した。精製法は、キットに付属のマニュアルに従った。【００７２】
（２）選択的ＰＣＲ用テンプレート作製
５’末端にビオチンを付加させたオリゴｄＴ（５’−ビオチン−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ−３’）をプライマーとして、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ  Ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて２本鎖ｃＤＮＡを合成した。この２本鎖ｃＤＮＡを制限酵素ＭｓｐＩで消化した後、ＭｓｐＩアダプター（５’−ＡＡＴＧＧＣＴＡＣＡＣＧＡＡＣＴＣＧＧＴＴＣＡＴＧＡＣＡ−３’及び５’−ＣＧＴＧＴＣＡＴＧＡＡＣＣＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＡＧＣＣＡＴＴ−３’）を付加し、アビジン磁性粒子（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ；Ｄｙｎａｌ社製）を用いてポリＡ側断片のみを集めた。続いて制限酵素ＭｓｅＩで消化してからＭｓｅＩアダプター（５’−ＡＡＧＴＡＴＣＧＴＣＡＣＧＡＧＧＣＧＴＣＣＴＡＣＴＧＣＧ−３’及び５’−ＴＡＣＧＣＡＧＴＡＧＧＡＣＧＣＣＴＣＧＴＧＡＣＧＡＴＡＣＴＴ−３’）を付加し、アビジン磁性粒子を用いてポリＡ側断片を捨てた。残った断片を以下の選択的ＰＣＲ用のテンプレートに用いた。【００７３】
（３）２５６種類のプライマーを用いた選択的ＰＣＲ
上記アダプターと結合するようにプライマーを設計し、ＰＣＲを行った。その際にプライマーの端をｃＤＮＡ断片側に２塩基はみだすように設計し、１６通り全てのパターンを行った。またＭｓｐＩ側のプライマーにＦＡＭを用いた蛍光標識を行った。プライマーには蛍光プライマーとしてＭｓｐＩ−プライマー（５’−ＦＡＭ−ＡＣＴＣＧＧＴＴＣＡＴＧＡＣＡＣＧＧＮＮ−３’）とＭｓｅＩ−プライマー（５’−ＡＧＧＣＧＴＣＣＴＡＣＴＧＣＧＴＡＡＮＮ−３’）を用い、ＰＣＲサイクルは９５℃−１分：１サイクル，（９５℃−２０秒，７１．５℃−３０秒，７２℃−１分）：２８サイクル，６０℃−３０分：１サイクルで行った。【００７４】
（４）サンプル間のプロファイルの比較及び発現量の変化している断片の選抜
ＰＣＲ産物を適当な濃度に薄めて３μｌとり、ホルムアミド１０μｌ、ＲＯＸマーカー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）０．３μｌを加えてＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３１００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて泳動を行った。得られた結果をＧｅｎｅＳｃａｎ３．７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて解析し、発現量の変化している断片を選抜した。【００７５】
（５）選抜断片の塩基配列決定
２０ｘ４０ｃｍのガラス板にアクリルアミドゲルを作製した。（４）にて選抜した断片が含まれるＰＣＲ混合物を泳動し、目的断片を切り出した。切り出した断片を１ｘＴＥバッファーに懸濁し、その懸濁液をテンプレートにＰＣＲを行い、切り出した断片と目的断片が同じであるか否かを確認した。プライマーはＭｓｐＩ−ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔ７  プライマー（５’−ＴＡＧＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＧＧＧＴＡＣＴＣＧＧＴＴＣＡＴＧＡＣＡＣＧＧ−３’）とＭｓｅＩ−ｕｎｉｖｅｒｓａｌプライマー（５’−ＡＧＧＣＧＴＣＣＴＡＣＴＧＣＧＴＡＡ−３’）であった。同じ分子量のＰＣＲ産物が得られたら、ダイレクトシークエンスにてその配列を読んだ。その際にはＴ７プライマー（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）を用いた。【００７６】
発現解析の結果得られたデータを表２に示した。表中の配列番号は、配列表における配列番号に対応している。特徴及び倍率と記載した列に、登熟期に温度変化を与えたときの挙動（対照区と比較した場合の発現量の増加又は減少）とその変化の倍率を示した。また、国立遺伝学研究所の主催するＤＤＢＪで相同性検索を行った結果、相同性が高かった遺伝子、ＥＳＴの例とそのアクセション番号を示した。
【表２】
0004764343.tif 000003
【００７７】
0004764343.tif 000004
【００７８】
0004764343.tif 000005
【００７９】
0004764343.tif 000006
【００８０】
（実施例２）
表２に挙げた遺伝子のリストから、相同検索において既知の遺伝子と高い相同性が確認された遺伝子から、５種の遺伝子を選択した。すなわち、α−アミラーゼをコードする遺伝子（配列番号１）、カタラーゼをコードする遺伝子（配列番号８）、α−、β−グリアジンをコードする遺伝子（配列番号３４）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａをコードする遺伝子（配列番号４８）、γ−グリアジンをコードする遺伝子（配列番号４５）である。そして、これらのターゲット遺伝子について、開花後１５日目のコムギ（Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．）種子中における発現量の定量を試みた。遺伝子解析ソフトＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｖｅｒ．２を用い、それぞれターゲット遺伝子内に、定量リアルタイムＰＣＲ用のプライマー及びプローブを設計した。その配列を表３に示す。
【表３】
0004764343.tif 000007
【００８１】
開花直前まで外で育てたコムギを人工気象室に移し、環境温度を１５℃に保った。この内の一部を開花後１０日目に１０℃又は２０℃の室温の部屋に移し、開花後１５日目に未成熟種子を一部収穫した。残りの鉢は１５℃に移し、開花後４０日目に収穫した。この未成熟種子から全ＲＮＡを抽出した。方法は、以下の手順に拠った。【００８２】
約５００ｍｇのコムギ種子を微粉砕し、１２ｍｌの抽出バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  ＬｉＣｌ、１％  ＳＤＳ）、８ｍｌのＴＥ（ｐＨ  ８．０）飽和フェノール／クロロホルムで混合し、遠心分離（８，０００Ｘｇ、３０分）を行った。上層に等量のＴＥ（ｐＨ  ８．０）飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、遠心分離（８，０００Ｘｇ、３０分）を行った。上層に１／３量の１０Ｍ  ＬｉＣｌを加え、遠心分離（８，０００Ｘｇ、３０分）を行った。−２０℃で１時間静置後、遠心分離（８，０００Ｘｇ、３０分）を行い沈殿物を５ｍｌの２Ｍ  ＬｉＣｌに懸濁した。さらに遠心分離（８，０００Ｘｇ、１５分）を行い沈殿物を４００μｌのＤＥＰＣ処理水に懸濁した。等量のＴＥ（ｐＨ  ８．０）飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、遠心分離（８，０００Ｘｇ、１０分）を行った。上層に等量のＴＥ（ｐＨ  ８．０）飽和クロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を加え、遠心分離（８，０００Ｘｇ、１０分）を行った。上層に１／１０倍量の３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）、２．５倍量のＥｔＯＨを加え、遠心分離（８，０００Ｘｇ、１０分）を行った。沈殿を２００μｌの０．１Ｍ  酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）に溶解させた。２０μｌのＥｔＯＨをゆっくり滴下し遠心分離（８，０００Ｘｇ、１０分）を行った。上清に２．５倍量のＥｔＯＨを加え遠心分離（８，０００Ｘｇ、１０分）を行った。沈殿を１ｍｌの７０％  ＥｔＯＨ（３０％  ＤＥＰＣ処理水）で洗い、遠心分離（８，０００Ｘｇ、１０分）を行った。【００８３】
沈殿をデシケーターで乾燥し、１００μｌのＤＥＰＣ処理水に溶解した。抽出したＲＮＡは、変性ゲルを用いて電気泳動し、リボソームＲＮＡの存在により健全度を評価した。また、逆転写リアルタイムＰＣＲに備えて分光光度計で濃度を測定した。【００８４】
次に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭＤｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔにより全ＲＮＡをテンプレートとしてｃＤＮＡを合成した。合成は添付マニュアルに従ったが、プライマーとして、ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いた。【００８５】
組織又は成長ステージによって発現量が変動しない内部標準遺伝子としてユビキチン遺伝子を使用した。いくつかの濃度幅で内部標準にて定量ＰＣＲ法を行い、検量線を得て、適当な濃度幅を決めた。最も適当な濃度溶液をターゲット用定量ＰＣＲ法のテンプレートとして使用した。定量ＰＣＲ法は、９６穴プレートで行い、各サンプルつき４ウェルずつ使用した。各ウェル中の反応液組成を表４に示す。
【表４】
0004764343.tif 000008
【００８６】
定量ＰＣＲ法はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｓｅ  ｄｅｔｅｃｔｏｒにて行った。サイクルは５０℃２分、９５℃１０分、（９５℃１５秒、６０℃１分）ｘ４０サイクルで行った。得られた結果は１８ｓリボソームＲＮＡを用いて標準化した。【００８７】
最終的に収穫したコムギ完熟種子の澱粉、タンパク質の特徴を解析した。解析項目は、アミロース含量、アミロペクチン側鎖長、タンパク質含量、グリアジンに対するグルテニンの量比である。それぞれの測定法を以下に示す。【００８８】
アミロース含量
粉砕したコムギ完熟種子に少量の水を加え生地を作り、水中で揉み出しグルテンのみを取り出した。残りの澱粉懸濁液を遠心分離にかけ、沈殿物を乾燥し澱粉試料とした。アミロース含量測定は、Ｗｉｌｌｉａｍｓらの方法（Williams, P.C., Kuzina, F.D., and Hlynak, I. (1970) Cereal Chem. 47:411-420）に従った。この試料の水分を測定後、約１００ｍｇを精秤し、１ｍｌの９５％  ＥｔＯＨと９ｍｌの１Ｎ  ＮａＯＨを加え熱湯中で１０分間熱処理した。室温まで冷やした後、澱粉液を水で洗いながら別容器に回収した。１００ｍｌにフィルアップし、１ｍｌの１Ｍ  ＡｃＯＨと２ｍｌのヨード液を加えた。良く混ぜた後、２０分間静置し、分光光度計で６２０ｎｍの吸光度を測った。ポテトアミロース、アミロペクチンで検量線を引き、各試料のアミロース含量を決定した。【００８９】
アミロペクチン側鎖長分布の解析
小泉らの方法（Koizumi, K., Fukuda, M., and Hizukuri, S. (1991) J. Chromatogr. 585:233-238）に従い、アミロペクチンの側鎖長分布を解析した。澱粉試料を熱メタノールで処理しアミラーゼを失活させた。水に懸濁し、１００℃で１時間処理しゲル化した。酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）中でイソアミラーゼ処理を行った（４０℃、８時間）。さらに酵素を追加し１６時間処理した。その後、沸騰水中で失活させ、側鎖分布をＨＰＡＥＣで決定した。イソアミラーゼ処理した澱粉試料を０．４Ｍ  ＮａＯＨに溶解し、フィルターで夾雑物を除き、パルス電流滴定装置付きの陰イオン交換クロマトグラフ（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）に供した。コントロールとしてグルコース、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオースなどを同様にＨＰＡＥ−ＰＡＤにかけ、各試料のアミロペクチン鎖長を比較した。【００９０】
澱粉糊化温度の測定
早川らの手法（Hayakawa, K., Tanaka, K., Nakamura, T., Endo, S., and Hoshino, T. (1997) Cereal Chem. 74(5):576-580）に従った。すなわち、ＤＳＣ（示差走査熱分析計）により澱粉の糊化ピーク温度を測定した。ＤＳＣ専用の銀製パンに澱粉１０ｍｇを採り蒸留水４０μｌを加え蓋をシールした。２５℃から１５０℃に一定速度（毎分５℃）で昇温し澱粉糊化に伴う吸熱を測定した。糊化のピーク温度（Ｔｐ）を糊化温度として測定した。【００９１】
粗タンパク質含量
一般に良く知られているケルダール分解法により測定した。粉砕した完熟コムギ種子を加水分解後、遊離窒素を測定した。タンパク質換算係数５．７をかけ粗タンパク質含量とした。【００９２】
グルテニン／グリアジン比の測定
Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌらの方法（Blumenthal, C., Bekes, F., Gras, P.W., Barlow, W.R., and Wrigley, C.W. (1995) Cereal Chem. 72(6):539-544）に従った。すなわち、タンパク質を還元剤なしで完熟コムギ種子の粉砕物から抽出した。ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含むリン酸緩衝液中に懸濁し、超音波処理を施し十分に溶解した。フィルターろ過した後、サイズ排除型ＨＰＬＣにかけた。最初に出現するピークを凝集したグルテニンとして２番目に出現するピークを単体のグリアジンとして定義し、面積比をグルテニン／グリアジン比として算出した。【００９３】
上記試験の結果を表５及び表６に示す。
【表５】
0004764343.tif 000009
【表６】
0004764343.tif 000010
【００９４】
（実施例３）
開花後１５日目〜２０日目の麺用国内産コムギの未成熟種子を一部収穫した。一方、収穫後の完熟種子も収穫した。この未成熟種子から全ＲＮＡを抽出した。方法は、上記実施例２に示した手順に従った。分光光度計で濃度を測定後、同様の方法で、ｃＤＮＡを合成し定量リアルタイムＰＣＲに供した。【００９５】
定量リアルタイムＰＣＲを行い、５種の遺伝子について、ユビキチン遺伝子の発現量に対する相対発現量を測定した。結果を表７に示す。
【表７】
0004764343.tif 000011
【００９６】
表７に示される遺伝子発現パターンは、登熟期に低温にさらされたコムギにおける発現パターンと類似していることから、このコムギから得られる成熟種子は、表１に示された特徴、すなわち、アミロペクチンの側鎖長が短く、澱粉糊化温度が低く、アミロース及びアミロペクチンが低分子化しているという特徴を有することが予想された。【００９７】
そこで、実施例２に示した方法に従い、完熟後に収穫した種子の成分分析を実施したところ、収穫した完熟種子が予想される特徴を有することが証明された（表８）。以上から、上記の５遺伝子の発現量を登熟段階の種子において評価することにより、将来収穫する完熟種子から得られる小麦粉の二次加工性状を推定できることが明らかになった。
【表８】
0004764343.tif 000012
【００９８】
（実施例４）
開花後２０日目から３０日目と思われる国内産コムギの未成熟種子を一部収穫した。一方、収穫後の完熟種子もサンプリングした。この未成熟種子から全ＲＮＡを抽出した。方法は、対照実験に示した手順に拠った。分光光度計で濃度を測定後、同様の方法で、ｃＤＮＡを合成し定量リアルタイムＰＣＲに供した。定量リアルタイムＰＣＲの結果、ユビキチン遺伝子の発現量に対する相対発現量は、表９に示すとおりだった。
【表９】
0004764343.tif 000013
【００９９】
表９に示される遺伝子発現パターンは、登熟期に高温にさらされたコムギにおける発現パターンと類似していることから、このコムギから得られる成熟種子は、表１に示された特徴、すなわち、アミロース含量が高く、アミロペクチンの側鎖長が長く、澱粉糊化温度が高く、タンパク質含量が高く、グルテニン／グリアジン比が低く、ラージグルテニンポリマーが少ない、という特徴を有することが予想された。【０１００】
そこで、実施例２に示した方法に従い、完熟後に収穫した種子の成分分析を実施したところ、収穫した完熟種子が予想される特徴を有することが証明された（表１０）。以上から、上記の５遺伝子の発現量を登熟段階の種子において評価することにより、将来収穫する完熟種子から得られる小麦粉の二次加工性状を推定できることが明らかになった。
【表１０】
0004764343.tif 000014
【産業上の利用の可能性】
【０１０１】
本発明により、コムギ種子が成熟する以前の早期段階で、将来のコムギ完熟種子の二次加工性状を推定することが可能になる。それにより、低品質のコムギを購買するリスクを低減することができる。
【０１０２】
本明細書で引用したすべての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書中に取り入れるものとする。
【配列表】
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