(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩酸ロメフロキサシン（ＬＦＬＸ）、スパルフロキサシン（ＳＰＦＸ）、塩酸シプロフロキサシン（ＣＰＦＸ）、及びガチフロキサシン水和物（ＧＦＬＸ）からなる群から選ばれるニューキノロン剤を含有することを特徴とする超音波治療用薬剤。
【請求項２】
前記ニューキノロン剤が、ＬＦＬＸ、ＳＰＦＸ、及びＧＦＬＸからなる群から選ばれる請求項１記載の薬剤。
【請求項３】
前記ニューキノロン剤がＳＰＦＸである請求項２記載の薬剤。
【請求項４】
前記超音波治療用薬剤が活性酸素発生剤である請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項５】
前記超音波治療用薬剤が抗腫瘍剤である請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はニューキノロン剤を含有する超音波治療用薬剤、特に超音波治療用活性酸素発生剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ニューキノロン剤（ニューキノロン系抗生物質）は、従来のキノロン系抗生物質であるナリジクス酸に類似した母核である４−キノロン骨格の６位にフッ素を有する構造を持った抗生物質である。従来のキノロン系抗生物質が主としてグラム陰性桿菌に対してのみ抗菌活性を有し、尿路感染症に適用されていたのに対して、ニューキノロン剤は呼吸器感染症などにも適応を拡大した広い抗菌スペクトルを有している。ニューキノロン剤は非常に強力で広範囲の抗菌スペクトルと、より少ない副作用を有するため、感染症の治療に臨床的に幅広く使用されてきた（非特許文献１）
【０００３】
また、音響動力学療法(sonodynamic therapy：ＳＤＴ)は薬物と超音波との相乗効果を利用した、癌治療のための有望な新しい方法である（非特許文献２及び７）。ホトダイナミック化合物であるヘマトポルフィリン（Ｈｐ）やその誘導体は、薬剤単体では細胞損傷を引き起こさないような濃度であっても、超音波照射を使うと細胞損傷効果を増強させることが見出された。Ｈｐと超音波とを組合せることによって、治療の有効性が増大し、必要な超音波照射の強度は低下した（非特許文献３）。しかし、Ｈｐは、重度の光線皮膚炎などいくつかの臨床的な副作用を有し、患者から太陽光から４週間以上遮断しなければならないとの臨床報告もある。したがって、Ｈｐは、現在までのところ臨床的にあまり幅広く使用されていない。
【０００４】
【非特許文献１】Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３６（１１）（１９９２）２５４４−２５４７
【非特許文献２】Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９３（２００２）２１６−２２２
【非特許文献３】Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８１（１９９０）３０４−３０８
【非特許文献４】Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９０（１９９９）１１４６−１１５１
【非特許文献５】Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８９（１９９８）４５２−４５６
【非特許文献６】Ｄｒｕｇｓ  Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．２０（５）（１９９４）１７７−１８３
【非特許文献７】Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ，３８（６）（１９９４）１２０９−１２１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
最近、ピロキシカムのような一部の非ステロイド性抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤ）が、抗腫瘍効果について上記のＨｐと超音波照射との組み合わせと同様の協奏効果が生じることが見出された（非特許文献２、４、５及び７）。ピロキシカムはＨｐよりは副作用が少ないものの、それでも音響動力学化合物として臨床的に使用するためには高濃度で使用しなければならず、臨床的に使用するには依然として理想から程遠いものであった。
【０００６】
従って、抗腫瘍効果について、新しい音響動力学化合物の登場が求められていた。
一方、ニューキノロン剤は非常に強力で広範囲の抗菌スペクトルを有する抗生物質であり、より少ない副作用を有するため、感染症の治療に臨床的に幅広く使用されてきた（非特許文献１）が、音響動力学化合物としての使用の可能性は現在まで記載も示唆もされていない。また、ニューキノロン剤が、感染症の治療のほかに、癌治療にも適応できることについては従来記載も示唆もされていない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、ニューキノロン剤の存在下での超音波に対する腫瘍細胞の感受性の変化、及び超音波とニューキノロン剤との組合せの腫瘍治療への適応可能性について鋭意検討し、得られた知見に基づき本発明をなすに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ニューキノロン剤を含有することを特徴とする超音波治療用薬剤。
（２）前記ニューキノロン剤が、塩酸ロメフロキサシン（ＬＦＬＸ）、スパルフロキサシン（ＳＰＦＸ）、塩酸シプロフロキサシン（ＣＰＦＸ）、及びガチフロキサシン水和物（ＧＦＬＸ）からなる群から選ばれる上記（１）記載の薬剤。
（３）前記ニューキノロン剤が、ＬＦＬＸ、ＳＰＦＸ及びＧＦＬＸからなる群から選ばれる上記（２）記載の薬剤。
（４）前記ニューキノロン剤がＳＰＦＸである上記（３）記載の薬剤。
（５）前記ニューキノロン剤の４−キノロン骨格の８位にフッ素基又はメトキシ基を有する上記（１）記載の薬剤。
（６）前記超音波治療用薬剤が活性酸素発生剤である上記（１）〜（５）のいずれかに記載の薬剤。
（７）前記超音波治療用薬剤が抗腫瘍剤である上記（１）〜（５）のいずれかに記載の薬剤。
（８）腫瘍に罹患した被験体に上記（１）〜（７）のいずれかに記載の薬剤を、必要に応じて賦形剤又は担体と共に投与し、次いで被験体又はその腫瘍部に超音波を照射することからなる腫瘍の治療方法。
（９）超音波強度が２．０Ｗ以上である上記（８）記載の方法。
【発明の効果】
【０００９】
超音波照射とニューキノロン剤とを組合せることにより、ニューキノロン剤を腫瘍の治療に相乗効果的に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明においてニューキノロン剤とは、当該業界で通常ニューキノロン系抗生物質と称される薬剤のことを言い、特に塩酸ロメフロキサシン（ＬＦＬＸ）、スパルフロキサシン（ＳＰＦＸ）、塩酸シプロフロキサシン（ＣＰＦＸ）、及びガチフロキサシン水和物（ＧＦＬＸ）等が挙げられる。本発明においては、好ましくはＬＦＬＸ、ＳＰＦＸ、ＣＰＦＸ及びＧＦＬＸが用いられ、より好ましくはＬＦＬＸ、ＳＰＦＸ及びＧＦＬＸが用いられ、更に好ましくはＳＰＦＸが用いられる。
【００１１】
また、特に、４−キノロン骨格の８位（Ｃ８）にフッ素基又はメトキシ基を有するニューキノロン剤が好ましく用いられ、ＬＦＬＸ、ＳＰＦＸ及びＧＦＬＸがこれに該当する。
【００１２】
ＬＦＬＸ、ＳＰＦＸ、ＣＰＦＸ又はＧＦＬＸの存在下で超音波を照射し、肉腫１８０（ｓａｒｃｏｍａ  １８０）の細胞に対する音響動力学的な抗腫瘍効果をイン・ビトロで検査したところ、ニューキノロン剤を加えた群における腫瘍細胞の生存率は、同薬剤を加えなかった群に比べて有意に低かった。腫瘍細胞の生存率は、特にＣＰＦＸ群よりＳＰＦＸ群で有意に低く、またＳＰＦＸの効果は用量依存性である。
【００１３】
この発見は、従来感染症治療薬として使用されてきたニューキノロン剤が超音波照射下で抗腫瘍性活性薬剤として使用できることを示している。従って、本発明の超音波治療用薬剤は抗腫瘍剤として用いることができる。
【００１４】
また、ヒドロキシルラジカルの捕捉剤であるＤ−マンニトールを、上記ニューキノロン剤の代表としてのＳＰＦＸと共に使用した場合、超音波照射後の腫瘍細胞生存率はＳＰＦＸのみを使用した場合と同程度であった。しかし、一重項酸素とヒドロキシルラジカルの捕捉剤であるＬ−ヒスチジンをＳＰＦＸと共に使用した場合は、超音波照射後の腫瘍細胞生存率はＳＰＦＸのみを使用した場合に比べて有意に高かった。
このことは、ニューキノロン剤が超音波照射下で活性酸素発生剤として一重項酸素を発生させ、これが抗腫瘍効果に寄与していることを示していると考えられる。従って、本発明の超音波治療用薬剤は活性酸素発生剤として用いることができる。
【００１５】
ニューキノロン剤は、非常に有効性の高いクラスの抗生物質に属し、一般的な細菌感染症に打ち勝つための第１選択肢として臨床的に使用されている。
理論に束縛されることは本発明者らの意図するところではないが、フッ素基やメトキシ基など官能基をＣ８位に有するニューキノロン剤は、超音波を照射するとＣ８位でラジカルを形成し、その後、図６に示すように酸素と反応して一重項酸素の発生をもたらす不安定なペルヒドロキシル化合物を提供すると考えられる。
【００１６】
本発明において、ニューキノロン剤の溶液の濃度は、０．０１ｍＭより高いことが好ましく、０．０５ｍＭ以上がより好ましく、０．１ｍＭ以上が更に好ましく、０．２ｍＭ以上が最も好ましい。以下に記載する実施例で使用したＳＰＦＸの最低有効濃度は０．０５ｍＭであった。
ニューキノロン剤は人に投与される時は、従来薬学的によく知られた形態及び経路が適用される。例えば散剤、錠剤、カプセル剤、軟膏、注射剤、シロップ剤、水剤等により経口的に又は非経口的に使用され、必要に応じて、賦形剤（例えば、乳糖、Ｄ−マンニトール、トウモロコシデンプン、結晶セルロース等）、崩壊剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等）、結合剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク等）、コーティング剤（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、酸化チタン等）、可塑剤（例えば、ポリエチレングリコール等）、基剤（例えば、ポリエチレングリコール、ハードファット等）、溶解剤ないし溶解補助剤（例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等）、ｐＨ調節剤（例えば、無機又は有機の酸又は塩基）、等張化剤（例えば、食塩、ブドウ等、グリセリン等）、安定化剤等が使用される。
また、ニューキノロン剤は、製剤中に、例えば、０．１〜９９．５重量％、好ましくは、０．５〜９５重量％の量で使用されるのが適当である。症状や、年齢、体重等によって異なるが、通常成人１日当たり、体重１ｋｇにつき、０．０５〜１００ｍｇ、好ましくは、０．１〜５０ｍｇの量で投与することができる。
【００１７】
ＳＰＦＸは、経口使用のために新しく開発された、広範囲の強力な抗菌活性を有するキノロンである。この化合物は、以下の薬理学的な利点を有する。（ｉ）高密度の、大部分が脂質である外莢膜及び細胞壁への透過率が高いこと、（ｉｉ）組織透過率が優れており、血漿で得られるレベルより２〜１１倍高いレベルがもたらされること、（ｉｉｉ）マクロファージ内での蓄積が優れていること、（ｉｖ）マウスの血漿、及びヒトの血漿でも、長い半減期が得られること。
この優れた薬物動態によって、ＳＰＦＸ等のニューキノロン剤は、有用な抗生物質であるだけでなく、音響動力学化合物としても有用であることがわかる。
【００１８】
本発明において超音波は、例えば非特許文献２、４又は７で用いられたような超音波発生装置等、公知のものを用いることができる。これらの装置を用いて、例えば周波数２ＭＨｚで、２．０Ｗ以上の強度の超音波を３０秒以上、好ましくは６０秒以上、皮膚等の体表面を通して患部に又は直接患部に照射する。照射は例えば磁気共鳴画像化装置（ＭＲＩ）の画像を基に、コンピュータで正確に患部の位置を特定しながら行うこともできる。超音波の照射の時期は、ニューキノロン剤の投与後、薬剤の生体内における薬物動態を考慮して適宜決定することができる。
【００１９】
本発明の薬剤は、腫瘍に罹患した被験体に、必要に応じて賦形剤又は担体と共に投与し、次いで被験体又はその腫瘍部に、超音波を、好ましくは２．０Ｗ以上の強度で照射することにより、腫瘍の治療方法に用いることができる。
【実施例】
【００２０】
材料及び方法
（１）腫瘍細胞の調製
腹水肉腫１８０（ａｓｃｉｔｉｃ  ｓａｒｃｏｍａ  １８０）を実験腫瘍として使用した。肉腫１８０の懸濁液（約１ｍｌ）を７週齢のＩＣＲ雄マウス（日本エスエルシー株式会社（Ｓｈｉｚｕｏｋａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏ．））に腹腔内注射し、約７〜１０日後に採取した１．０〜２．０ｍｌの腹水液を、細胞数が７．５２×１０５個／ｍｌ（５．２５×１０５個／０．７ｍｌ）に設定されるようにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈した（以降、ストック溶液と呼ぶ）。対照溶液は、ストック溶液を１００ｍｌのＰＢＳで２倍に希釈することによって調製した。腫瘍細胞生存率は、トリパンブルー色素排除法によって、光学顕微鏡（オリンパス株式会社  ＢＨ−２１０  ×４００）下で血球計数器（萱垣医理科工業）を使用して評価した。腹水液中の腫瘍細胞の変性の影響を排除するために、２．５％未満の死亡率を有するストック溶液を以下の実験で使用した。
【００２１】
（２）薬剤
以下の５つの薬剤の、肉腫１８０に対する音響動力学化合物としての抗腫瘍性活性を検討した（図１）。
１）ピロキシカム（日本ロシュ株式会社、東京から供給）Ｃ１５Ｈ１３Ｎ３Ｏ４Ｓ、分子量３３１．３５
２）ＬＦＬＸ（塩野義製薬株式会社、大阪から供給）Ｃ１７Ｈ１９Ｆ２Ｎ３Ｏ３・ＨＣｌ、分子量３８７．８１
３）ＳＰＦＸ（大日本製薬株式会社、大阪から供給）Ｃ１９Ｈ２２Ｆ２Ｎ４Ｏ３・ＨＣｌ、分子量３９２．４１
４）ＣＰＦＸ（バイエル薬品株式会社、大阪から供給）Ｃ１７Ｈ１８ＦＮ３Ｏ３・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ、分子量３８５．８２
５）ＧＦＬＸ（杏林製薬株式会社、東京から供給）Ｃ１９Ｈ２２Ｆ２Ｎ３Ｏ４・１１／２Ｈ２Ｏ、分子量４０２．４２。
【００２２】
各薬物の０．２ｍＭ溶液を調製するために、６．６３ｍｇのピロキシカム、７．７６ｍｇのＬＦＬＸ、７．８５ｍｇのＳＰＦＸ、７．７２ｍｇのＣＰＦＸ、又は８．０４ｍｇのＧＦＬＸを、０．３ｍｌのＤＭＦに個別に溶解し、１００ｍｌのＰＢＳで別々に希釈した。０．２ｍＭの濃度は、実験系に影響を与えないと予想される０．３ｍｌのＤＭＦに溶解することができる薬物量に基づいている（非特許文献２及び４）。
【００２３】
（３）超音波発生装置
本実施例で使用した超音波発生装置は、非特許文献２、４又は７で用いたものと同じである。
（４）超音波照射実験
１．４ｍｌの対照溶液、及び各薬物の０．２ｍＭ溶液の０．７ｍｌと混合した０．７ｍｌのストック溶液（６群）を、径１０ｍｍ、高さ４０ｍｍ、底厚１ｍｍのガラスセル（秋田大学医学部の機器センターで作成）に個別に投入した。既に言及したように、各ガラスセルに含まれる腫瘍細胞の数は約５．２６×１０５個に設定した。まず、薬剤自体を加えることによってストック溶液中の腫瘍細胞生存率が変化するかどうかを経時的に検討した（ｎ＝１０）。次に、対照溶液及び薬剤添加溶液に、周波数２ＭＨｚで１．５Ｗ、２．０Ｗ、３．０Ｗの超音波をそれぞれ３０秒間及び６０秒間照射した（ｎ＝１０）。確実に圧電素子をガラスセルに密着させるために、超音波伝達ゲル（Ｐａｒｋｅｒ、Ａｑｕｓｏｎｉｃ  １００、ニュージャージー州フェアフィールド）を使用した。ガラスセル内の溶液の温度を室温（２２〜２６℃）に設定した。超音波照射によって破壊された細胞は死亡細胞として計数したので、この実験における細胞生存率は、（照射後の生存細胞数／照射前の生存細胞数）×１００（％）として計算した。細胞の変性及び壊死の程度を見るために、超音波照射前及び後に、細胞懸濁液からメイギムザスメアを調製した。
【００２４】
（５）活性酸素の同定
一重項酸素とヒドロキシルラジカルの捕捉剤であるＬ−ヒスチジン塩酸塩一水和物（和光純薬工業株式会社）、及びヒドロキシルラジカルの捕捉剤であるＤ−マンニトール（半井化学薬品株式会社）を使用して、既に言及した超音波照射実験と同じ条件下で腫瘍細胞生存率を算出した（ｎ＝１０）。この結果を、０．２ｍＭのニューキノロン剤を加えたそれぞれの群の結果と比較した。Ｌ−ヒスチジン及びＤ−マンニトールの濃度は、それぞれ０．２Ｍに設定した。
【００２５】
（６）統計分析
腫瘍細胞生存率の平均及び標準偏差を各群について計算した。群の間の差は、ウィルコクソン検定による比較のＰ値が０．０５以下の場合に有意であると見なした。
【００２６】
結果
（１）腫瘍細胞生存率に対する薬剤の経時的な影響
対照群の腫瘍細胞生存率は、３時間以内では０．２ｍＭの薬剤を加えた群と有意な差がなかった。３時間以内では、薬剤添加群の間の生存率で有意な差は観察されなかった。
【００２７】
（２）腫瘍細胞生存率に対する超音波照射の影響
３０秒及び６０秒の照射時間において、対照群と薬剤添加群のいずれも、超音波の強度を上げると腫瘍細胞生存率が下がった（図２Ａ及び図２Ｂ）。
超音波強度が１．５Ｗの場合は、３０秒及び６０秒の照射時間で対照群と薬剤添加群との間に有意な差は見出されなかった（図２Ａ及び図２Ｂ）。それに対して、超音波強度を２Ｗに上げた場合は、３０秒（対照は７８．７２±１２．２５％；ＬＦＬＸは４９．４６±１４．６２％、Ｐ＝０．００１１；ＳＰＦＸは３０．８５±１５．４１％、Ｐ＝０．０００２；ＣＰＦＸは６６．４７±１１．２７％、Ｐ＝０．０２３３；ＧＦＬＸは３８．８４±８．３５％、Ｐ＝０．０００１；ピロキシカムは４０．４３±１２．３３％、Ｐ＝０．０００１）、及び６０秒（対照は５２．１４±２２．４１％；ＬＦＬＸは２７．１４±９．５２％、Ｐ＝０．０２８；ＳＰＦＸは２３．４１±８．７４％、Ｐ＝０．００３９；ＣＰＦＸは３８．３１±８．９９％、Ｐ＝０．００１６；ＧＦＬＸは２６．０８±９．５２％、Ｐ＝０．００４８；ピロキシカムは２８．１９±９．４０％、Ｐ＝０．０２８９）で、薬剤添加群の腫瘍細胞生存率は対照群に比べて有意に低かった（図２Ａ及び図２Ｂ）。腫瘍細胞生存率は、３０秒及び６０秒で、Ｃ８位に官能基を有さないＣＰＦＸ群に比べて、Ｃ８位にフッ素基及びメトキシ基を有するＬＦＬＸ、ＳＰＦＸ及びＧＦＬＸ、並びにピロキシカム群で有意に低かった（図２Ａ及び図２Ｂ）。
【００２８】
３Ｗ、３０秒間又は６０秒間では、対照群と薬剤添加群のいずれも腫瘍細胞生存率が低く、有意な差は見られなかった。この実験の後、最も効果的な結果をもたらしたＳＰＦＸの様々な濃度（０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０５ｍＭ及び０．０１ｍＭ）を、既に言及した条件と同じ条件下で更なる実験用に選択した。
【００２９】
２Ｗで３０秒間超音波照射を行うと、腫瘍細胞の生存率はＳＰＦＸ０．２ｍＭの群（３０．８５±１５．４１％）、０．１ｍＭの群（３４．５８±１５．９０％）それに０．０５ｍＭの群とも（４４．１５±８．３５％）、対照群に比べ有意に低く（ｐ＜０．０００１）、６０秒間の照射でも同様であった（ｐ＜０．０００１）（０．１ｍＭの群では２８．７２±５．７０％、０．０５ｍＭの群では３４．０５±８．７７％）。３０秒又は６０秒のいずれでも対照群と０．０１ｍＭ群との間には差がなかった。また３０秒間照射したとき０．２ｍＭの群の生存率は０．０５ｍＭの群より有意に低値であった（Ｐ＝０．０２８１）（図３）。
【００３０】
（３）メイギムザスメア（Ｍａｙ−Ｇｉｅｍｓａ  Ｓｍｅａｒ）
照射後、青紫色に染まった肉腫１８０細胞が拡散して見られ、対照群では核及び細胞質のほとんどがよく維持されていた（図４Ａ）。しかし、０．２ｍＭのＳＰＦＸ群では、腫瘍細胞は濃縮した核と明るい細胞質を示し、全細胞数は減少しており、ほとんどの細胞が損失又は小片に断片化されていた（図４Ｂ）。
【００３１】
（４）活性酸素捕捉剤の効果
腫瘍細胞生存率は、３０秒（ｐ＜０．０００１）及び６０秒（ｐ＜０．０００１）で、ＳＰＦＸのみが存在する場合に比べて、０．２ｍＭのＳＰＦＸと共に０．２ＭのＬ−ヒスチジンが存在する場合で有意に高かった。しかし、Ｄ−マンニトールを加えた群では、腫瘍細胞死の抑制は見られなかった（図５）。
【００３２】
考察
以上の実験では、２Ｗの超音波照射における腫瘍細胞生存率は、３０秒の照射では、対照７８．７２％に対して、ＬＦＬＸ４９．４６％、ＳＰＦＸ３０．８５％、ＣＰＦＸ６６．４７％、及びＧＦＬＸ３８．８４％、並びにピロキシカム４０．３０％であり、また６０秒の照射では、対照５２．１４％に対して、ＬＦＬＸ２７．１４％、ＳＰＦＸ２３．４１％、ＣＰＦＸ３８．３１％、及びＧＦＬＸ２６．０８％、並びにピロキシカム２８．１９％であった。薬剤添加群では腫瘍細胞生存率は対照より有意に低かった。
【００３３】
１．５Ｗの超音波照射では、群の間で有意な腫瘍細胞生存率の差は見出されなかったが、３Ｗの超音波照射では、対照群と薬剤添加群のいずれも腫瘍細胞生存率は０％に近かった。この結果から、高出力の超音波照射では、超音波照射のみでも肉腫１８０細胞を破壊することができるようではあるが、ニューキノロン剤が存在すると、より短い時間、より弱い出力で相当の抗腫瘍効果が得られる。４つのニューキノロン剤のすべてが音響動力学化合物として効果的である。
【００３４】
更に、２Ｗの超音波照射では、３０秒及び６０秒の照射後の腫瘍細胞生存率は、対照群に比べて、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、及び０．０５ｍＭのＳＰＦＸ群で有意に低かった。０．０１ｍＭのＳＰＦＸ群と対照群の間で有意な差は見出されなかった。０．２ｍＭ群の腫瘍細胞生存率も、０．０５ｍＭ群に比べて３０秒又は６０秒で有意に低かった。これらの結果は、ＳＰＦＸの存在下での超音波照射の効果は用量依存性であることを示している。ガラスセル内の肉腫１８０細胞を根絶させるには、０．０５ｍＭより高い用量のＳＰＦＸの存在下で、２Ｗを超える超音波が必要であった。
【００３５】
上記実験例では、薬剤のＰＢＳへの溶解を補助するために、可溶化剤であるＤＭＦをニューキノロン剤やピロキシカムと同時に使用した（非特許文献２及び４）が、ＤＭＦの抗腫瘍効果は報告されていない。また、ニューキノロン剤の中には、ある種の癌細胞系でアポトーシスを誘発させるかもしれない（非特許文献６）。
【００３６】
従って、本発明者らは超音波処理を施さずに、対照群と薬剤添加群との腫瘍細胞生存率を比較した。しかし、３時間経った後でも、０．３％のＤＭＦの存在下でも、或いは薬剤を加えた場合でも、腫瘍細胞の生存率に変化は見出されなかった。このことは、増強された抗腫瘍効果が、超音波と薬剤とを組み合わせた音響動力学効果に起因していることを示している。
【００３７】
Ｈｐの音響動力学反応では、いくつかの側面から見た証拠によって、音響化学的（ｓｏｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ）に活性化されたＨｐによって生じた一重項酸素が最も重要な細胞損傷媒体である可能性が高いことが示唆される（非特許文献２、４及び７）。
【００３８】
Ｌ−ヒスチジンは一重項酸素とヒドロキシルラジカルの捕捉剤として作用することで知られているが、超音波で誘導したヒドロキシルラジカルを捕捉するためであれば、０．２Ｍの濃度のＤ−マンニトールだけで十分である。従って、Ｌ−ヒスチジンによる、ＳＰＦＸの存在下における超音波処理で誘発させた細胞損傷の有意な減少、及び０．２ＭのＤ−マンニトールに有意な効果が見られなかったことは、一重項酸素が細胞損傷における重要な媒体であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ピロキシカム、ＬＰＬＸ、ＳＰＦＸ、ＣＰＦＸ及びＧＦＬＸの構造式を示す。
【図２Ａ】２Ｗ、３０秒での超音波照射後の腫瘍細胞生存率を示す。対照群と薬剤添加群、及びＣＰＦＸ群と他の薬剤添加群の間で有意な差が見られた。
【図２Ｂ】２Ｗ、６０秒での超音波照射後の腫瘍細胞生存率を示す。対照群と薬剤添加群、及びＣＰＦＸ群と他の薬剤添加群の間で有意な差が見られた。
【図３】様々な濃度のＳＰＦＸの存在下における、超音波照射後の腫瘍細胞生存率を示す。２Ｗ、３０秒及び６０秒で、対照群と０．０５ｍＭ以上の濃度のＳＰＦＸを加えた群との間、０．２ｍＭ群と０．０５ｍＭや０．１ｍＭの群の間、及び０．１ｍＭ群と０．０１ｍＭ群の間に有意な差が見られた。
【図４Ａ】対照群でのメイギムザスメアを示す。腫瘍細胞は青紫に染まり、核と細胞質のいずれも損なわれずに維持されている（×４００）。
【図４Ｂ】０．２ｍＭのＳＰＦＸ群でのメイギムザスメアを示す。２Ｗ、３０秒で、腫瘍細胞はほとんど損失又は小片に断片化された（×４００）。
【図５】Ｌ−ヒスチジン及びＤ−マンニトールの、腫瘍細胞死を抑制する効果を示す。２Ｗ、３０秒及び６０秒で、腫瘍細胞生存率はＳＰＦＸ群よりＳＰＦＸ＋Ｌ−ヒスチジン群で有意に高かったが、ＳＰＦＸ＋Ｄ−マンニトール群とＳＰＦＸ群では有意な差は見出されなかった。
【図６】ニューキノロン剤から一重項酸素を生じさせる妥当と思われる機構を示す。
【図１】
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【図６】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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