(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）アミノ酸及びα型（configuration）N-アセチル化ヘキソサミンを含み、該N-アセチル化ヘキソサミンが2-アセタミド-2-デオキシ-α-D-グルコピラノシドであり、（b）核磁気共鳴分析法によって検出可能なO-アセチル基を含まず、かつ（c）比色分析法により検出可能なヘキソースまたはリンを含まず、(d)表皮ブドウ球菌（S.epidermis）、S.ヘモリチカス（S.hemolyticus）及びS.ホミニス（S.hominis）からなる群より選択されるブドウ球菌種に見られ、かつ(e)ATCC 202176のもとで寄託されたブドウ球菌株に対する抗体と特異的に結合する、以下に記載の工程によって入手可能な単離されたブドウ球菌抗原。
(1)抗原をもつ表皮ブドウ球菌株ATCC 202176を４％NaClを添加したコロンビアブロス中で37℃において24時間発酵させ、最終濃度２％のフェノール：エタノール（１：１）で細胞を死滅させ、次いで遠心分離して得られた細胞ペーストの懸濁物をプロナーゼ、リソスタフィン、DNase及びRNaseを用いて処理する。
(2)懸濁液を、トリクロロ酢酸(TCA)中で10％の溶液とし、60℃でインキュベートする。
(3)遠心分離を行ってからその上澄みを1MのNaOHを用いてpH7.0に中和し、続いて25％〜75％の冷エタノール/CaCl2を用いて連続的に沈殿させることによって核酸及び高分子量のタンパク質を除去し、その後抗原含有物質を沈殿させる。
(4)粗沈殿物を水に溶解させ、残ったエタノールを透析により除去する。
(5)残留タイコ酸（teichoic acid）を、陰イオン交換クロマトグラフィーによって除去する。
(6)画分を抗原に対して特異的な抗体を用いたキャピラリー沈降法によって調べて抗原含有画分を決定し、それをプールし、透析、凍結乾燥を行い、残存するペプチドグリカンを切断するためにリゾチームで処理を行う。
(7)酵素処理された粗抗原含有画分を再懸濁し、Tris-HCl緩衝液、PH7.0で0.1M〜0.25M NaClの直線濃度勾配により陰イオン交換カラムによる再クロマトグラフィーを行う。
(8)単一特異性抗血清を用いて比色分析法及びキャピラリー沈降法により決定されたリン陰性で抗原陽性の画分をプールし、水に対して透析し、凍結乾燥する。抗原のほとんどは、0.2MのNaClで溶出される。
(9)粗抗原をさらにカラムクロマトグラフィーによって精製してから抗原含有画分をプールし、実質的に純粋な抗原を作製する。
【請求項２】
上記のアミノ酸がセリン、アラニン、アスパラギン酸/アスパラギン、バリン、およびトレオニンを含む、請求項1記載の抗原。
【請求項３】
上記のセリン、アラニン、アスパラギン酸/アスパラギン、バリン、およびトレオニンが、39：25：16：10：7のモル比で存在する、請求項2記載の抗原。
【請求項４】
免疫担体に結合された請求項1記載の抗原を含む、抗原担体接合物。
【請求項５】
上記の免疫担体が、組換え的に産生された緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）外毒素Aの非毒性変異体株である、請求項4記載の抗原担体接合物。
【請求項６】
請求項1記載の抗原および滅菌された、その薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項７】
請求項4記載の抗原免疫担体接合物および滅菌された、その薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項８】
上記の免疫担体が、組換え的に産生された、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）の非毒性外毒素Aタンパク質である、請求項7記載の組成物。
【請求項９】
ブドウ球菌感染症の治療または予防のための免疫治療剤の調製における、請求項8記載の組成物の使用。
【請求項１０】
ブドウ球菌感染症に対する免疫治療剤を調製する方法であり、請求項8記載の組成物によって免疫化された被験者から回収した血漿から、ブドウ球菌に対する抗体を含む過免疫（hyperimmune）グロブリンを回収する段階を含む方法。
【請求項１１】
請求項1記載の抗原に対する抗体を含む、過免疫グロブリン。
【請求項１２】
請求項1記載の抗原に対するモノクローナル抗体。
【請求項１３】
ブドウ球菌感染症の治療または予防のための免疫治療剤の調製における、請求項11記載の過免疫グロブリンの使用。
【請求項１４】
試料中の抗ブドウ球菌抗体の存在を検出するためのアッセイ法であり、以下の段階を含む方法：
請求項1記載のブドウ球菌抗原を、ブドウ球菌特異的抗体を含むことが疑われる試料と混合する段階；ならびに
該抗原及び、該試料中のブドウ球菌特異的抗体との結合に関して、上記の混合物をモニターする段階。
【請求項１５】
上記の抗原が固体マトリクス上に固定される、請求項14記載のアッセイ法。
【請求項１６】
以下を含む、試料中の抗ブドウ球菌抗体の存在を検出するためのキット：
請求項1記載のブドウ球菌抗原；ならびに
該抗原を、ブドウ球菌特異的抗体を含むことが疑われる試料と混合するため、及び該試料中のブドウ球菌特異的抗体との間の結合に関して上記の混合物をモニターするための説明書。
【請求項１７】
上記の抗原が固体マトリクスに固定される、請求項16記載のキット。
【請求項１８】
試料中の抗ブドウ球菌抗原の有無を検出するためのアッセイ法であり、以下の段階を含む方法：
請求項1記載のブドウ球菌抗原に対するモノクローナル抗体を、ブドウ球菌抗原を含むことが疑われる試料と混合する段階；および
該抗原と該モノクローナルブドウ球菌抗体との間の結合に関して上記の混合物をモニターする段階。
【請求項１９】
上記の抗体が固体マトリクス上に固定される、請求項18記載のアッセイ法。
【請求項２０】
以下を含む、試料中のブドウ球菌に特異的な抗原の存在を検出するためのキット：
請求項1記載のブドウ球菌抗原に対するモノクローナル抗体；ならびに
該モノクローナル抗体を、ブドウ球菌特異的抗原を含むことが疑われる試料と混合するため、及び該モノクローナル抗体と該試料中のブドウ球菌特異的抗原との結合に関して上記の混合物をモニターするための説明書。
【請求項２１】
上記のモノクローナル抗体が固体マトリクス上に固定される、請求項20記載のキット。
【請求項２２】
カテーテルへのブドウ球菌細菌の付着を防止するための方法であり、請求項1記載の抗原によって該カテーテルを処理する段階を含む方法。
【請求項２３】
請求項1記載の抗原が塗布されたカテーテル。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、新規ブドウ球菌（Staphylococcus）抗原ならびに抗原を得る方法および用いる方法に関する。
【０００２】
ブドウ球菌（Staphylococcus）は様々な病原性メカニズムによっていくつかの疾患を引き起こす。これらの疾患の最も発生率の高い、そして重篤なものは、入院患者での菌血症およびその合併症である。特に、黄色ブドウ球菌は、創傷感染症ならびにカテーテルおよび人工器官装置に関連した感染症を引き起こしうる。ブドウ球菌菌血症に関連した重篤な感染症には、骨髄炎、浸潤性心内膜炎、および敗血症が含まれる。問題は、病院株に多数の抗生物質耐性が存在し、それによって療法の選択が重度に制限されるためにいっそうひどくなる。ほとんどの場合、原因となる微生物は、黄色ブドウ球菌（S.aureus）、表皮ブドウ球菌（S.epidermis）、S.ヘモリチカス（S.hemolyticus）もしくはS.ホミニス（S.hominis）の株、またはこれらの組合せである。ブドウ球菌に関する問題は、治療の選択を深刻に制限する院内菌における抗生物質多剤耐性（multiple antibiotic resistance）によってさらに複雑になる。
【０００３】
黄色ブドウ球菌ワクチンは、抗生物質耐性の問題に対する解決を提供すると考えられる。多数のブドウ球菌種に共通な抗原によって、多様なブドウ球菌感染症に対して有効である単一の抗原を含むワクチンの産生が可能となると考えられる。
【０００４】
発明の概要
したがって、本発明の目的は、ブドウ球菌の多数の種由来の臨床的に重要な株の大多数に共通な抗原を提供することである。
【０００５】
さらなる目的は、ブドウ球菌の多数の種由来の臨床的に重要な株の大多数に共通な抗原を含むワクチンを提供することである。
【０００６】
もう一つの目的は、ブドウ球菌の多数の種由来の臨床的に重要な株の大多数に共通な抗原に対する抗体を含む、過免疫グロブリン組成物を提供することである。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、多数のブドウ球菌種由来の臨床的に重要な株の大多数に共通な抗原、特に表皮ブドウ球菌（S.epidermis）、S.ヘモリチカス（S.hemolyticus）、もしくはS.ホミニス（S.hominis）株のコアグラーゼ陰性種に共通な抗原を有する細胞の全細胞（whole cell）ワクチンを提供することである。
【０００８】
さらにもう一つの目的は、ブドウ球菌感染症を診断するためのキットおよびアッセイ法を提供することである。
【０００９】
本発明のこれらおよび他の目的に従って、（a）アミノ酸及びα型N-アセチル化ヘキソサミンとを含み、（b）核磁気共鳴分析法によって検出可能なO-アセチル基を含まず、かつ（c）ATCC 202176のもとで寄託されたブドウ球菌株に対する抗体に特異的に結合する、単離されたブドウ球菌抗原を提供する。
【００１０】
また、ブドウ球菌抗原及び、その滅菌され薬学的に許容される担体とを含む組成物も提供される。免疫療法は、そのような組成物の免疫刺激量を被験者に投与する段階を含む。
【００１１】
また、抗原を有するブドウ球菌株由来の細胞を含む全細胞ワクチンも提供される。
【００１２】
また、全細胞ワクチン及びその滅菌され薬学的に許容される担体とを含む組成物も提供される。ワクチンは、ブドウ球菌感染症に対する防御を提供するために被験者に投与されうる。
【００１３】
ブドウ球菌感染症に対する免疫治療剤を、本発明の組成物によって被験者を免疫化する段階、免疫化された被験者から血漿を採取する段階、および回収した血漿からブドウ球菌に対する抗体を含む過免疫グロブリンを回収する段階によって調製することができる。過免疫グロブリンは、抗原に対する抗体を含む。免疫療法は、被験者にこの過免疫グロブリンを投与する段階を含む。
【００１４】
本発明はまた、本発明の抗原が塗布されたカテーテル、および本発明の抗原によってカテーテルを処理する段階を含む、ブドウ球菌細菌のカテーテルへの付着を防止する方法を提供する。好ましい態様において、カテーテルは静脈内カテーテルである。
【００１５】
本発明のその他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な記述から明らかとなるであろう。しかし、本発明の意図および範囲内で様々な変更および修飾を行ってもよいことは、この詳細な説明から当業者には明らかであるため、本発明の好ましい態様を示す詳細な説明および特殊な実施例は説明するために限って提示されていると理解すべきである。
【００１６】
好ましい態様の説明
表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）、S.ヘモリチカス（S.haemolyticus）、及びS.ホミニス（hominis）からなる臨床的に重要な（clinically-significant）多くの単離物が、本明細書において「本抗原（the antigen）」と記載された、共通の抗原を有することが見出された。本抗原は、非常に多くの臨床的に重要なブドウ球菌単離物による感染に対する防護作用をもたらすワクチンの主成分である。これに関して、「臨床的に重要な」単離物とは、病原性である単離物である。
【００１７】
特に本発明者らは、ブドウ球菌の大多数の臨床上の単離物が、抗原/接合体抗体血清と非常に強く反応し、そのため本抗原を含む菌株として分類されうることを発見した。さらにとりわけ、種々の起源から得られた臨床上の単離物の分類により、スライド凝集（slide agglutination）によって検出した場合、約60％の表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）、50％のS.ヘモリチカス（S.haemolyticus）及び40％のS.ホミニス（hominis）の単離物が本抗原を発現することが示された。S.ヘモリチカス（S.haemolyticus）及びS.ホミニス（hominis）の単離物の酵素的切断物を免疫拡散アッセイ法に供したところ、試験された全ての単離物が本抗原の存在について陽性を示した。
【００１８】
本抗原に対する抗体は、S.アウレウス（aureus）のタイプ5、タイプ8、タイプ4、またはK73（タイプ5の変異型菌株）のうちのどれかから単離された多糖類と交差反応しない。したがって本抗原は特異的であり、即ち相同的な菌株由来の抗血清とのみ単結合を形成する。
【００１９】
本抗原を、本明細書に記載されたプロトコールにしたがって培養されたある種のブドウ球菌単離物から、実質的に純粋な形態で、回収可能な量得ることができる。特に、精製された抗原は、1％未満の核酸を含む。この点に関する「回収可能な」量とは、本抗原の単離された量が、イムノアッセイのような放射線標識法よりも感度の低い方法によっても検出されうり、かつ本抗原自体の溶液への移動を含む更なる操作に供することを意味する。
【００２０】
本抗原を得るためには本発明による単離物をまず、4％のNaClを添加した改変コロンビアブロス（Columbia Broth）で発酵させる。発酵させた後で細胞を死滅させ、続いて細胞を上澄みから分離するために遠心分離する。
【００２１】
抗原を細胞ペーストから抽出する。本抗原のある程度は上澄みに存在しているが、その量は細胞ペーストに含まれる量と比較すると重要でない。収量が小さく、また培地からヘキソースが混入するおそれがあるため、上澄みから抽出することは好ましくない。
【００２２】
細胞ペーストの懸濁物をプロナーゼ、リソスタフィン、DNase及びRNaseを用いて処理する。懸濁液を、トリクロロ酢酸(TCA)中で10％の溶液とし、60℃でインキュベートする。遠心分離を行ってからその上澄みを1MのNaOHを用いてpH7.0に中和し、続いて25％〜75％の冷エタノール/CaCl2を用いて連続的に沈殿させることによって核酸及び高分子量のタンパク質を除去し、その後抗原含有物質を沈殿させる。
【００２３】
粗沈殿物を水に溶解させ、残ったエタノールを透析により除去する。残留タイコ酸（teichoic acid）を、陰イオン交換クロマトグラフィーによって除去する。画分を本抗原に対して特異的な抗体を用いたキャピラリー沈降法によって調べて抗原含有画分を決定し、それをプールし、透析、凍結乾燥を行い、残存するペプチドグリカンを切断するためにリゾチームで処理を行う。酵素処理された粗抗原含有画分を再懸濁し、Tris-HCl緩衝液、PH7.0で0.1M〜0.25M NaClの直線濃度勾配により陰イオン交換カラムによる再クロマトグラフィーを行う。単一特異性抗血清を用いて比色分析法及びキャピラリー沈降法のぞれぞれにより決定されたリン陰性で抗原陽性の画分をプールし、水に対して透析し、凍結乾燥する。本抗原のほとんどは、0.2MのNaClで溶出される。粗抗原をさらにカラムクロマトグラフィーによって精製してから抗原含有画分をプールし、実質的に純粋な抗原を作製する。
【００２４】
精製された抗原は、二重免疫拡散法において全細胞抗血清と反応させた場合、単一の沈降素バンドを生じる。精製された抗原の免疫電気泳動法及び、精製段階の際のイオン交換カラムの溶出パターンは、負に荷電された分子を示している。
【００２５】
実質的に純粋な抗原及びC18カラムにおいて逆相クロマトグラフィーによって再精製された抗原の両方が、スーパーローズ（superose）6HRカラムで多分散型（polydisperse）プロフィールを示す（図１）。どちらも1％未満の核酸を含む。比色分析法によってヘキソース、リンまたはO-アセチル基は検出されなかった。精製された抗原はクマージーブルーSDS-PAGEで染色されない。
【００２６】
ガス液体クロマトグラフィー-質量スペクトル分析(GLC-MS)によって、精製された抗原を分析すると、主要なグリコシル成分としてGlcNAcの存在が認められる。これは弱酸に対して感受性であり、GlcNAc残基がグリコシド結合によって結合していないことを示している。本抗原はタンパク質分解酵素の作用に耐性がある。
【００２７】
GlcNAcが存在することは、本抗原を1H-NMR及び13C-NMRスペクトル分析することで確認され、これはδ4.88ppm及びδ100.48ppmにそれぞれ一つのアノマーのシグナルを示している（図2A及び2B参照）。NMRスペクトル分析ではまた、O-アセチル基が存在しないことも確認できる。O-アセチル化がないことは、20％〜80％のO-アセチル化を含むタイプ5及びタイプ8などの他のブドウ球菌抗原と対照的な差異がある。
【００２８】
JH1、H2の値が小さいこと（1.0Hz未満)は、グルコサミンがα型であることを示しており、それはJC、Hカップリング定数に対してc=173Hzが測定されることより確認できる。13C-NMRスペクトル中のδ24.860ppm(NAac-CH3)及びδ176.814ppm(NAc-CO)におけるシグナルは、グルコサミンがN-アセチル化されていることを示唆しており、そのため本抗原の炭水化物部分が2-アセタミド-2-デオキシ-α-D-グルコピラノシドであると仮定される。
【００２９】
この抗原のアミノ酸分析は、セリン、アラニン、アスパラギン酸/アスパラギン、バリン、及びスレオニンが、約39:25:16:10:7というモル比で存在することを示している。アミノ酸は、この抗原分子の約32重量％を構成している。
【００３０】
タイプ5およびタイプ8黄色ブドウ球菌抗原それぞれのNMRスペクトルならびに米国特許第5,770,208号に開示された336抗原のNMRスペクトルと、抗原のNMRスペクトルとの比較により、これらの抗原とは化学的に異なることが示される。タイプ5およびタイプ8多糖類抗原の構造は、モリューら（Moreau）、Carbohydr. Res. 201：285（1990）；およびフォーニエールら（Fournier）、Infect. Imm. 45：87（1984）によって解明された。いずれも、スルフヒドリル基を導入するために用いることができるManNAcAと共に反復単位の中にFucNAcpを有する。構造は以下の通りである：
タイプ5：
【化１】
0004656728.tif 000002
タイプ8：
【化２】
0004656728.tif 000003
対照的に、本発明による抗原はその主要な糖質成分としてグルコサミンを有する。
【００３１】
哺乳類に菌血症を発症させるためには、極めて多数の菌体、または宿主抵抗性を低下させるような何らかの既知の手技を必要とする。しかし、インビトロ貪食は、インビボでの保護免疫に相関するものとして調べることができる。このモデルでは、336抗原特異的モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が、インビトロで黄色ブドウ球菌にオプソニンを作用させるか否かは、コジマら（Kojima）、Infect. Dis. Immun. 58：2367〜2374（1990）が記述した方法に従って貪食によって測定する。インビトロでのオプソニン食作用（opsonophagocytosis）分析により、ワクチンとしての効力が予測されると当技術分野では認識されている。例えばフィッシャー（Fischer）らにより、インビトロでのオプソニン分析で検出された機能的な抗体とインビボでの活性との間の相関関係を明らかにしている。J.Inf.Dis.169;324〜9 (1994)。
【００３２】
抗原を含むワクチンによって誘導された抗体は、種類特異的な食作用を促進する。インビトロでの食作用分析はしたがって、この抗原に対する抗体が本抗原をもつブドウ球菌菌株による感染に対対して防護的であることを示す。この抗原に基づくワクチンを、臨床的なブドウ球菌菌株の大多数から起きる感染に対して防護するために用いることが可能である。マウスの致死モデル及びマウスの菌血モデルを用いて得られたインビボでの結果はインビトロのオプソニン食作用分析の結果と一致しており、そして抗原に対する抗体は、本抗原をもつブドウ球菌の菌株で試されたマウスにおいて、死亡率と菌血症の低下に結びつくことを示している。
【００３３】
好ましくは、本発明による本抗原の組成物または本抗原を含む全細胞の組成物は、本抗原または本抗原を含む細胞で「本質的に構成される」。この文脈で、「本質的に構成される」という用語は、組成物がワクチンとして被験者に投与される場合に抗原に対する（及びもし存在するのであれば他の抗原に対する）免疫応答の誘発を阻害する、または、本抗原が診断に用いられる場合に診断アッセイ法の特徴である抗原-抗体結合特性を阻害する任意の材料を、組成物が含まないことを意味する。
【００３４】
本発明による抗原は、試料中にブドウ球菌抗原及び/または抗ブドウ球菌抗体が存在することを検出するための診断アッセイ法を作成する際に役立つ。この抗原または本抗原に特異的な抗体を、単独でまたは他のブドウ球菌抗原もしくは抗体と組み合わせて、ブドウ球菌抗原または抗体を含むと疑われる試料と混合し、抗原-抗体結合性についてモニターする。抗原または抗体を、放射活性標識または酵素標識を用いて標識する。抗原または抗体がマトリックスの表面に接触する相補的な抗体または抗原と結合できるように、好ましい態様では、抗原または抗体は固体マトリックス上に固定化される。その後試料をマトリックス表面に接触させ、表面を抗原-抗体結合性についてモニターする。
【００３５】
例えば、抗原または抗体は、抗原または抗体が固相に結合して、酵素-抗体または酵素-抗原結合物を用いて試料中に存在する抗体または抗原を検出および／または定量する、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）において用いることができる。または、可溶化して分離された抗原がニトロセルロース濾紙と結合するウェスタンブロットアッセイを用いることができる。次に、抗体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ-Ig結合物のような酵素または標識結合抗免疫グロブリン（Ig）を、沈殿可能または検出可能な基質の存在下で濾紙とインキュベートすることによって検出する。ウェスタンブロットアッセイは、所望の抗原の純度が50％以上である必要はないという利点を有する。ELISAおよびウェスタンブロット技術に関する記述は、その全体が本明細書において参照として組み入れられる、アウスベルら（Ausubel）編、「分子生物学の最新プロトコル（CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY）」、John Willy and Sons（1988）の第10章および第11章に見られる。
【００３６】
ワクチンに用いる際には、抗原に対する免疫応答を誘導するためのT細胞とB細胞との相互作用を改善するために、336抗原を、通常ポリペプチドまたは蛋白質のような免疫担体に結合することが好ましい。これは抵抗性が低下した患者での使用を意図したワクチンの場合には特に重要である。免疫担体は、能動免疫の場合にも、および受動免疫の場合のボランティアにおける高力価の抗血清を調製する際にも免疫原性を増強する。本発明の適した免疫担体には、例えば、ファトムら（Fattom）、Inf. and Imm. 61：1023〜1032（1993）が記述しているように、免疫担体として一般的に用いられる他の蛋白質と共に、破傷風毒素、ジフテリア毒素、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）外毒素Aまたはその誘導体、外毒素Aの組換え型非毒性変異株が含まれる。
【００３７】
本抗原を担体タンパク質に接合させるためにまず抗原を誘導体化する（derivatized）。さまざまな方法を用いることによって、抗原を誘導体化して免疫担体に共有結合させることができる。本抗原の活性化されたカルボキシル基を、ADH、シスタミンまたはPDPHを用いて誘導体化でき、続いて本抗原を担体タンパク質のカルボキシ基と、部分的にアミド化された抗原とのカルボジイミド仲介反応、またはチオール化した抗原のSPDP誘導体化担体タンパク質とのジスルフィド相互変換のいずれかによって、担体タンパク質に結合させることができる。
【００３８】
KohnらのFEBS Lett.154: 109〜210 (1993)の方法にしたがって、この技術分野で既知の手法により、この抗原上の水酸基を、シアノゲンブロマイドまたは1-シアノ-4-ジメチルアミノ-ピリジニウムテトラフルオロボレートを用いて活性化でき、その後抗原を、6炭素二官能基スペーサーであるアジピン酸ジヒドラジド(ADH)を用いて誘導体化できる。続いてこの材料を、ジフテリア毒素(Dtd)、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来の組換え外タンパク質（exoprotein）A(rEPA)、破傷風毒素(TTd)、または他の適当な担体タンパク質に、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(EDAC)によって連結させる。得られた接合体を、ゲル濾過クロマトグラフィーによって未反応の抗原から分離することができる。抗原を担体タンパク質に接合させるために用いた方法にかかわらず、本抗原の担体タンパク質への共有結合は、抗原の免疫原性を有意に増大させ、マウスへの最初の、及び二度目の抗原刺激の両方の後の、抗原に対する抗体のレベルを増加させることになる。
【００３９】
好ましくは、抗原または抗原結合物は、アジュバント誘発毒性を避けるために、アジュバントを用いないで投与する。アジュバントを用いる場合には、保護的なIgGサブタイプ2抗体を促進するアジュバントを用いることが好ましい。典型的なアジュバントには、水酸化アルミニウム、フロイントの完全アジュバント（CFA）およびフロイントの不完全アジュバント（IFA）が含まれる。硫酸デキストランは、ブドウ球菌細胞表面抗原に対するIgG2抗体の強力な刺激剤であることが示されており、同様にアジュバントとして適している。
【００４０】
本発明はまた、抗原を有するブドウ球菌株に結合または中和するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（マウスまたはヒト）の産生に336抗原を用いることにも関する。これらの抗体を産生するプロトコルは、アウスベルら（Ausubel）編、「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、NY、第11章；バーテル＆ヒルシャウト（Bartel and Hirshaut）編、「ハイブリドーマ作成法（METHODS OF HYBRIDOMA FORMATION）」、257〜271、Humana Press、Clifton、NJ（1988）；ビテッタら（Vitetta）、Immunol. Rev. 62：159〜83（1982）；およびラソ（Raso）、Immunol. Rev. 62：93〜117（1982）に記述されている。
【００４１】
ポリクローナル抗体産生のために接種物は、典型的に抗原-免疫担体を、生理食塩液のような生理学的に許容される希釈剤に分散させて、水性組成物を形成することによって調製する。アジュバントの有無によらず、接種物の免疫刺激量を哺乳類に投与し、次に、抗原が保護的な抗336抗原抗体を誘導するために十分な期間、接種した哺乳動物を維持する。抗原に対する反応にプライミングされていない個体には抗原-免疫担体の追加免疫量を用いてもよい。
【００４２】
抗体には、一般的に用いられる多様な動物、例えば、ヤギ、霊長類、ロバ、ブタ、ウサギ、ウマ、雌鶏、モルモット、ラット、およびマウスの抗体調製物を含んでもよく、適当な選択、分画および精製を行った後のヒト抗体であってもよい。動物の抗血清はまた、ホルマリンで死滅させた、抗原を持つブドウ球菌株を動物に接種することによって、従来の方法によって、動物を飼育し、さらに加工するために血清または血漿を回収することによって、作製してもよい。
【００４３】
このようにして誘導された抗体は、アルコール分画およびカラムクロマトグラフィーまたは免疫アフィニティクロマトグラフィーのような周知の技法によって望ましい程度に回収および単離することができる；すなわちセファデックス登録商標のような材料を充填したクロマトグラフィーカラムに抗原を結合させ、抗血清をカラムに通過させ、それによって特異的抗体を保持して、その他の免疫グロブリン（IgGs）および混入物質を分離し、その後カオトロピック剤によって溶出して精製抗体を回収するが、選択的にその後例えば、血液型抗原またはその他の非病原性種を結合させたカラムを通過させることによってさらに精製する。この技法は、問題の病原菌に対する抗体力価を生じたヒトの血清または血漿から望ましい抗体を単離し、このように抗原に結合することができる抗体を確実に保持させる場合には好ましい可能性がある。次に、抗原を持つブドウ球菌株に対する受動免疫用製剤にそれらを用いることができる。
【００４４】
モノクローナル抗体組成物は、検出限界の範囲内で、336抗原と有効に結合することができる1種類のみの抗体結合部位を含む。モノクローナル抗体型の適した抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて調製することができる。
【００４５】
本発明のモノクローナル抗体組成物を産生するハイブリドーマを作製するためには、骨髄腫またはその他の自己不死化細胞株を、抗原で高度免疫化した哺乳類の末梢血、リンパ節、または脾臓から得たリンパ球と融合させる。骨髄腫細胞株はリンパ球と同じ種に由来することが好ましい。脾細胞は典型的に、ポリエチレングリコール1500を用いて骨髄腫細胞と融合する。融合したハイブリッドをHATに対する感受性によって選択する。本発明の抗体分子を分泌するハイブリドーマはELISAを用いて同定することができる。
【００４６】
Balb/cマウスの脾臓、ヒト末梢血、リンパ節または脾細胞は、マウスまたはヒトハイブリドーマの調製に用いられる好ましい材料である。本発明において用いられる適したマウス骨髄腫は、ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン-感受性(HAT)細胞株が含まれ、好ましい骨髄腫はP3X63-Ag8.653である。ヒトモノクローナル抗体産生のための好ましい融合パートナーはSHM-D33で、これはメリーランド州、ロックビルのATCCから、CRL 1668の名称で入手可能なヘテロ骨髄腫である。
【００４７】
本発明のモノクローナル抗体組成物は、適当な特異性の抗体分子を分泌するハイブリドーマ1個を含む栄養培地からなるモノクローナルハイブリドーマ培養を開始することによって産生することができる。培養はハイブリドーマが培地中に抗体分子を分泌するために十分な条件および期間維持する。次に、抗体含有培地を回収する。次に抗体分子を周知の技法によってさらに単離することができる。
【００４８】
これらの組成物の調製に有用な媒体は、当技術分野で周知でしかも市販されており、その中には、合成培養培地、近交系動物等が含まれる。一例としての合成培地は、20％仔ウシ胎児血清を加えたダルベッコの最少基本培地である。一例としての近交系マウス株はBalb/cである。
【００４９】
本発明におけるそれらの有用性に影響を及ぼすのは、主に抗体の抗原特異性であるため、種間融合のようなその他のモノクローナル抗体組成物の調製法もまた含まれる。感染した人から得たヒトリンパ球をヒト骨髄腫細胞株と融合して、抗原を認識する抗体産生をスクリーニングすることができるハイブリドーマを産生することができる。しかし、この点においてより好ましいのは、感染したヒト被験者からの生物試料の使用を伴わないプロセスである。例えば、本明細書に記述のワクチンで免疫化した被験者は、本発明内の抗体組成物に用いることが適している抗体源となることができる。
【００５０】
特に好ましい態様において、黄色ブドウ球菌タイプ5およびタイプ8に対するタイプ特異的抗体に関する記述と同様の方法を用いて、336抗原に対するモノクローナル抗体を産生する。精製したモノクローナル抗体は、臨床単離菌を収集することによって細菌凝集アッセイによって特徴付けを行う。
【００５１】
本説明によって産生されたモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体組成物を受動免疫によって用いて、抗原を有するブドウ球菌株による感染症の予防または治療を目的とした免疫応答を誘導することができる。この点において、抗体の調製物はポリクローナル組成物であってもよい。そのようなポリクローナル組成物は、抗原に結合する抗体を含み、さらにブドウ球菌の他の株を特徴付ける抗原に結合する抗体を含んでもよい。ポリクローナル抗体成分はポリクローナル抗血清であってもよく、好ましくは、抗原で、およびまた可能ならば他のブドウ球菌抗原でも試された動物からのアフィニティ精製抗体である。または、抗原に対するモノクローナル抗体と他のブドウ球菌抗原に対するモノクローナル抗体との混合物である、「遺伝子操作したオリゴクローナル」混合物を用いてもよい。
【００５２】
双方のタイプの混合物において、抗体を化学結合させて、抗原及びブドウ球菌のその他の株の特徴となる抗原の一方または双方に結合することができる単一の多特異的分子を形成すると有利となりうる。そのような結合を行う1つの方法は、例えば、二つの異なる抗体のペプシン消化によって得られた2つの異なるF(ab')2断片を混合することによって、二価F(ab')2 ハイブリッド断片を作製し、還元的に開裂してFab'断片の混合物を形成し、その後ジスルフィド結合の酸化的再形成によって、最初の抗原のそれぞれに特異的なFab'部分を含むハイブリッド断片を含むF(ab')2断片の混合物を生成することである。そのようなハイブリッド抗体断片の調製法は、フェテアヌ（Feteanu）「生物学と医学における標識抗体（LABELED ANTIBODIES IN BIOLOGY AND MEDICINE）」、321〜23、McGraw-Hill Int'l Book Co.（1978）；ニソノフら（Nisonoff）、Arch Biochem. Biolphys. 93：470（1961）；およびハンマーリングら（Hammerling）、J. Exp. Med. 128：1461（1968）；ならびに米国特許第4,331,647号に開示されている。
【００５３】
全くヘテロ特異的な二価断片を作製するその他の方法、例えば、開裂した断片を結合させるための二機能リンカーを用いることも当技術分野で既知である。例えば、ボスら（Boss）の米国特許第4,816,397号の方法に従って、抗体の軽鎖および重鎖を組み込んだ組換え型分子が知られている。抗体の特徴を有する組換えまたは合成結合分子を産生する類似の方法も本発明に含まれる。2つ以上の異なる単特異的抗体または抗体断片は、当技術分野で既知の様々なリンカーを用いて結合することができる。
【００５４】
本発明に従って産生された抗体成分は、抗体全体、抗体断片、または小断片を含むことができる。抗体は例えば、IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、キメラ抗体または二価もしくは多種抗原もしくはエピトープ特異性を有するハイブリッド抗体のような如何なるタイプの免疫グロブリン全体であってもよく、または断片、例えばハイブリッド断片を含むF(ab')2、Fab'、Fab等の断片であってもよく、さらに特異的な抗原と結合して複合体を形成することによって抗体のような挙動を示す、如何なる免疫グロブリンまたは如何なる天然、合成、もしくは遺伝子操作した蛋白であってもよい。特に、Fab断片は、大腸菌（E. Coli）のような遺伝的に形質転換した宿主において発現または集合させることができる。このように、ラムダベクター系は、祖先の抗体を産生する被験者の潜在的多様性と同等の、またはそれ以上の潜在的多様性を有するFab'の集団を発現するために利用することができる。ヒューズ（Huse, W.D.）ら、Science 246：1275〜81（1989）を参照のこと。
【００５５】
本発明の抗原は、組成物中の活性成分であることができ、さらに細胞免疫応答および／またはブドウ球菌感染症と闘う抗体のインビボ産生を誘導するワクチンとして用いることができる、活性成分のための薬学的に許容される担体をさらに含む。この点において、薬学的に許容される担体は、材料が不活性である、またはそうでなければワクチン投与という意味において、活性剤と両立しうると共に医学的に認容されるという理由から、薬剤を投与するための溶媒として用いることができる材料である。適した賦形剤の他に、薬学的に許容される担体は、希釈剤、アジュバント、抗酸化剤、保存剤および可溶化剤のような従来のワクチン添加剤を含んでもよい。
【００５６】
別の態様では、抗原をもつ細胞は全細胞のワクチンにおいて用いられる。本抗原をもつ細胞を、全細胞ワクチンにおける使用のために、抗原をもつことがわかっている菌株に対する抗体を用いて、またより好ましくは本明細書に記載されているような単離された抗原に対するモノクローナル抗体を用いて同定し、選択できる。これに関して、本抗原に対する抗体を細胞とともに混合するような、単純なスライド凝集実験を利用することができる。
【００５７】
寄託された菌株ATCC 202176は、本抗原をもつブドウ球菌の代表的な菌株であり、本抗原をもつ他の菌株を同定する際に有用な抗体を産生するために利用できる。しかしながら、本抗原、全細胞ワクチンまたは、本抗原をもつ他の細胞の同定に有用な抗体のいずれかを産生するために、寄託された菌株を用いる必要はない。ATCC 202176が、そのような細胞を同定する一つの免疫学的な手段を提供することは滅多にない。
【００５８】
精製された抗原ワクチンについて上記に記載したように、全細胞ワクチンも薬学的に許容される担体を含んでいる。また全細胞ワクチンは任意で、希釈剤、アジュバント、抗酸化剤、保存剤、及び溶解剤といった従来のワクチン添加物を含んでいてもよい。好ましい態様では全細胞ワクチンは本抗原をもつ細胞のみを含んでいて、本抗原を運搬しないブドウ球菌の菌株由来の細胞は含んでいない。
【００５９】
本発明によるワクチンを、ブドウ球菌にまだ感染していない被験者に投与することができ、それによって、その被験者にブドウ球菌保護免疫応答（液性または細胞性）を誘導することができる。または、本発明のワクチンを、ブドウ球菌感染症を既に発症しているが、ワクチンに対して生じた免疫応答が感染症のさらなる広がりを抑制できるほど十分に初期段階である被験者に投与することができる。
【００６０】
もう一つのアプローチによって、本発明のワクチンは、ブドウ球菌に対して作製された抗体を含む、特異的なワクチンによるチャレンジに対して生成されたグロブリン源となる被験者に投与することができる。このように処置した被験者は、従来の血漿分画法によって高度免疫グロブリンが得られるような血漿を提供し、ブドウ球菌感染症に対する耐性を付与するために、またはこれを治療するためにこのグロブリンが別の被験者に投与されるであろう。本発明の高度免疫グロブリンは、免疫無防備状態の人、侵襲性技法を受ける人、またはワクチン接種に反応して自身の抗体を産生する時間がない人にとって特に有用である。
【００６１】
同様に、本発明によって産生されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗ブドウ球菌抗体は、免疫毒素と結合して、ブドウ球菌感染症を既に発症しているが広範囲には広がっていない被験者に投与することができる。この目的のため、本発明の説明に従って産生された抗体材料は、本明細書において定義したような薬学的に許容される担体と共に投与する。
【００６２】
本発明はさらに、以下の説明的な実施例を参考にすることによって説明される。
【００６３】
実施例1：ブドウ球菌（Staphylococcus）の発酵
抗原をもつ表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）株、ATCC 202176を50Lの発酵槽において、4％ NaClを添加したコロンビアブロス中で発酵させた。発酵は、16時間齢の1Lの種培養から開始した。細胞は、37℃において低エアレーションで（1 v.v.m.）、軽く撹拌しながら(200 rpm)24時間発酵させた。発酵後、最終濃度2％のフェノール：エタノール（1:1）で細胞を死滅させ、次いで遠心分離して細胞を上清から分離した。
【００６４】
全細胞抗血清を調製するためにワクチンとして使用する細胞を、室温において一晩3％ホルマリン固定した。抗原を精製するための細胞は、発酵槽にフェノール-エタノール（1:1, vol/vol）を最終濃度2％まで添加し、15℃〜20℃において2時間ゆっくり混合することによって死滅させた。この処理の後、目に見える細胞は検出されなかった。次いで、14,500×gで遠心分離することによって細胞を採取し、使用時まで-70℃において保存した。
【００６５】
実施例2：全細胞抗血清の調製
実施例1のホルマリン固定された細胞をOD540nm=1に調整し、ウサギに静脈内注射した。アジュバントは使用しなかった。ウサギは毎週採血し、陽性の全細胞血清を回収し、プールした。プロテインGアフィニティーカラムによって全細胞血清からIgGを精製した。
【００６６】
実施例3：抗原の精製
細胞ペーストから抗原を抽出した。細胞ペーストの懸濁物（0.5g/ml）をプロナーゼ（1 mg/細胞1g)で37℃において4時間処理し、次いでリソスタフィン（175 U/細胞1g）、DNaseおよびRNase(0.1 mg/各1g)で処理し、4℃において一晩保存した。懸濁物をトリクロロ酢酸（TCA）で10％とし、60℃において4時間インキュベートした。遠心分離後、上清を1 M NaOHでpH 7.0に中和し、その後、10 mM CaCl2の存在下において25％〜75％冷エタノールで連続沈殿させた。25％エタノールに調整し、4℃において4時間インキュベーションすることによって、中和した上清から核酸および高分子量タンパク質を沈殿させた。遠心分離後、上清を75％エタノールに調整し、4℃において4時間〜12時間インキュベーションして、抗原を含有する物質を沈殿させた。
【００６７】
粗抗原を含有する沈殿物を水に溶解し、残存エタノールを透析によって除去した。透析後の物質を0.01 M Tris-HCl pH7.0、0.3 M NaClに調整し、残存するタイコ酸をQ-セファロースカラムの陰イオン交換クロマトグラフィーによって0.01 Tris-HCl pH 7.0、0.3 M NaClでフロースルーモードで除去した。抗原に特異的な抗体によるキャピラリー沈降法によって画分を試験し、抗原を含有する画分を判定した。抗原を含有する画分を水で透析し（3×5L）、凍結乾燥し、リゾチーム（0.5 mg/細胞ペースト1g）で37℃において3時間処理して、残存するペプチドグリカンを消化した。酵素処理し、粗の抗原を含有する画分を0.01 Mの濃度でTris-HCl pH 7.0に再度懸濁し、0.1M〜0.25 M NaClの直線濃度勾配でQ-セファロースカラムで再度クロマトグラフィーした。実施例2の単一特異性抗血清を比色分析法およびキャピラリー沈降法によってそれぞれ測定したとき、リン-陰性で、抗原陽性の画分をプールし、水で透析し、凍結乾燥した。抗原のほとんどは0.2 M NaClで溶出した。粗の抗原はセファロースCL6Bカラムでさらに精製して、実質的に純粋な抗原を得た。抗原を含有する画分をプールし、水で透析し、凍結乾燥した。
【００６８】
実施例4：抗原の特徴づけ
精製した抗原のGLC-MSによる分析は、主要なグリコシル成分としてGlcNAcの存在を示した。これは、δ4.88ppmおよびδ100.48ppmにそれぞれ1つのアノマーシグナルを示す、抗原の1H-NMRおよび13C-NMR分光法によって確認した。単一のアノマーシグナルの存在は、主要成分として単糖の存在を意味する。O-アセチル基に相当するシグナルは見られない。
【００６９】
JH1、H2の小さい値（1.0 Hz未満）は炭水化物のα型を示し、これは、JC、Hカップリング定数のc=173 Hzの測定値によって確認した。13C NMRのδ24.860 ppm(NAc-CH3)およびδ176.814 ppm(NAc-CO)のシグナルは、グルコサミンがN-アセチル化され、抗原2-アセタミド-2-デオキシ-α-D-グルコピラノシドの炭水化物部分を形成していることを示した。他のC13-NMRスペクトルシグナルはδ75,122、δ73,953、δ73.865、δ73.807、δ72.939、δ69.847、δ69.638、δ69.585、δ63.515およびδ56.321にそれぞれ出現する。
【００７０】
抗原のアミノ酸分析は、セリン、アラニン、アスパラギン酸/アスパラギン、バリンおよびスレオニンが約39:25:16:10:7のモル比で存在することを示した。アミノ酸は、抗原分子の約32重量％を構成した。
【００７１】
精製した抗原の免疫電気泳動（IEF）の移動度は負に荷電した基の存在を示した。精製した抗原は、フェノール硫酸アッセイによって検出される中性の糖を含有しない。
【００７２】
実施例5：抗原-免疫担体接合体の調製
精製した抗原は、50 mM酢酸中100℃において30分間または80℃において90分間加水分解することによって部分的に脱重合した。反応混合物を凍結乾燥し、酢酸を凍結乾燥によって除去した。部分的に加水分解した抗原を0.5 M ADHに溶解し、最終濃度5 mg/mLとし、0.1 M HClでpHを5.6に調整した。EDAC(粉末として）を添加することによって抗原溶液を100 mM EDACとし、0.1 M HClでpHを5.6に維持し1時間放置した。次いで、反応混合物を0.2 M NaClで透析し（1回）、次いでセファデックスG25カラム（2.6×30 cm）で脱塩し、凍結乾燥した。抗原に取り込まれたADHの量は、標準としてADHを使用したトリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）によって比色測定した。
【００７３】
ADH誘導体化抗原（10 mg）を1795μLの0.1M MES緩衝液pH 5.6に溶解し、10 mgのrEPAに相当する205μLのrEPA溶液（48 mg/mL）を添加した。EDAC(粉末として)を添加することによって、反応混合物を100 mM EDACとし、混合物を室温において60分間撹拌した。1 M MES-ナトリウム塩（pH 9.21）でpHを7.0にすることによって反応を停止した。PBSで溶出するセファクリルS-300カラムのサイズ排除クロマトグラフィーによって純粋な接合体を得た。接合体中の抗原およびタンパク質の量は、標準として対応する抗原またはBSAを使用する競合的ELISAおよびクーマジーブルーアッセイ（Pierce）によって測定した。同様の手法を使用して、抗原-Dtd接合体を調製した。
【００７４】
実施例6：抗原-免疫担体接合体に対する抗血清の調製
実施例5により調製した抗原-免疫担体接合体50μgを0、14および28日めに皮下注射することによって、雌のニュージーランド白ウサギを免疫化した。1回目の注射は等容量の完全フロインドアジュバント（CFA）と共に投与し、その後の注射は不完全フロインドアジュバント（IFA）と共に投与した。ウサギから採血した試験用血液試料は、ウサギを免疫化した抗原に特異的なウサギ沈降抗体の存在についてモニターした。力価を高める必要があるときは、さらなる注射を投与した。
【００７５】
ウサギを免疫化した抗原に特異的な抗体を含有する高力価ウサギ抗血清を得るためにウサギから採血した。抗体は、補体の存在下においてHL 60による抗原をもつ細胞の死滅を仲介することができた。抗原-rEPAまたは抗原Dtd接合体で免疫化したウサギも抗原特異的抗体を誘導することができた。これらの抗体は、キャピラリー中で抗原との沈降物を形成した。
【００７６】
精製した複合血清IgGは、ELISAによる16.0 mg/mlの総IgGおよびELISAによる1.54mg/mlの抗原特異的IgGを含有することを示した。複合IgGは、インビトロアッセイにおいてHL-60細胞による対応するブドウ球菌（Staphylococcus）細菌のオプソニン食作用を仲介する特異的抗体の能力を評価するため、および動物モデルにおいてインビボにおける有効性を評価するためにオプソニン食作用アッセイに使用した。
【００７７】
実施例7：インビトロにおけるオプソニン食作用アッセイ
抗原をもつブドウ球菌（Staphylococcus）株、ATCC 202176の細菌をストックビーズから新しいトリプチック（Tryptic）ソイ寒天プレートに移した。プレートを5％CO2雰囲気下において37℃で18時間〜20時間インキュベートした。細菌をプレートからかき取り、4％ NaClを添加した200 mLのコロンビアブロスを接種するために使用した。細菌を37℃において18時間〜20時間インキュベーションし、次いで25℃〜35℃において10分間2000 romで遠心分離し、上清を除去した。ペレット化した細菌を2mLの滅菌生理食塩液に再度懸濁し、650 nmにおける吸光度が0.1の細菌の懸濁物を調製するために使用した。
【００７８】
0.1％ゼラチンを添加したMEM培地中の上記の細菌懸濁物から調製した200倍希釈試料を細菌溶液の通常在庫として使用した。この細菌調製液を、スライド凝集反応に対応する抗血清について試験した。細菌の通常在庫を、適当な希釈のMEM培地を入れたマイクロタイタープレートウェルに添加した。
【００７９】
0.1％ゼラチンを添加したMEM培地1mlあたり1.0×106細胞の濃度に調整したHL-60細胞からPMNを得た。PMN細胞は30℃〜35℃、1000 rpmにおいて10分間遠心分離した。ペレット化した細胞を、0.1％ゼラチンを添加した5mLのMEM培地に再度懸濁し、1000 rpmで10分間遠心分離した。ペレット化した細胞を、0.1％ゼラチンを添加した1mLのMEM培地に再度懸濁し、1×106/mlの作業濃度を得た。
【００８０】
ヒト血清から調製したヒト補体を、0.1％ゼラチンを添加したMEM培地で80倍希釈した。マイクロタイタープレートウェルの反応混合物は50 μlの細菌[106細胞/ml]、50 μlの希釈した血清、50 μlのPMN[1×106細胞/ml]および50 μlの補体[1:80]を含有し、総容量は200 μlであった。0時において、反応プレートの試料10 μlを連続的に5倍、10倍および50倍希釈した。各希釈液の試料10 μlをトリプチック（Tryptic）ソイ寒天（TSA)プレートで培養した。TSAプレートを5％CO2雰囲気下において37℃において一晩インキュベートした。0時希釈後、反応プレートを37℃において90分間インキュベートした。試料を再度混合した。反応プレートの試料10 μlを連続的に5倍、10倍および50倍希釈した。各希釈液の試料10 μlをTSAプレートで培養し、次いで5％CO2雰囲気下において37℃において一晩インキュベートした。
【００８１】
各希釈液/試料/プレートの細菌コロニーを計数し、細菌の死滅の割合を以下の式によって算出した：
【式１】
0004656728.tif 000004
【００８２】
ATCC 202176で免疫化したウサギの全細胞抗血清および抗原-Dtd接合体に対して形成されたウサギ抗体は、ヒト補体の存在下においてHL-60によるブドウ球菌（Staphylococcus）のオプソニン食作用を仲介する。全細胞抗血清および抗抗原-rEPA接合体ウサギ抗体のオプソニン活性は抗原によって完全に吸収された。
【００８３】
実施例8：抗原-rEPA接合体を用いたワクチン化による、致死的なブドウ球菌（Staphylococcus）抗原投与からのマウスのインビボにおける防御
合計24匹のマウスを、各群8匹のマウスからなる3つの群に分割した。第1の群のマウスは実施例5によって調製した2.5 μgの精製抗原-rEPA接合体およびIFAを腹腔内注射した。第2の群のマウスはPBSプラスIFAを注射し、第3のマウスはPBSを注射した。マウスは2週間間隔で、同じワクチンまたは対照投与で2回追加抗原投与した。
【００８４】
3回めの注射（2回目の追加免疫投与）の1週間後、抗原をもつ表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）の粘液産生株、#V01048株の1.15×108 cfuを5％ブタムチンに加えたものをマウスに投与した。投与されたマウスを罹病率および致死率についてモニターした。結果は、第1群のマウスの75％(2/8)は致死的な投与から生存し、投与後216日めでも生存していたが、第2および第3群のマウスは全て投与後41日めまでに死滅したことを示した。
【００８５】
実施例9：抗原-特異的なモノクローナル抗体による、致死的なブドウ球菌（Staphylococcus）投与からマウスのインビボにおける防御
抗原-特異的モノクローナル抗体の予防作用を、抗原投与用の抗原をもつ表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）の粘液産生株#977を使用した同じマウスマデルにおいて評価した。マウス群は0.5 mgもしくは1.0 mgの表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）抗原特異的モノクローナル抗体、1 mgの大腸菌(E.coli)特異的モノクローナル抗体または1 mgの表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）粘液特異的モノクローナル抗体をそれぞれ皮下注射して免疫化した。免疫の24時間後に、マウスに1×108 CFUの細菌を6％ブタムチンに加えたものを腹腔内投与し、マウスを罹病率および死亡率についてモニターした。結果は、本発明による抗原に特異的なモノクローナル抗体による用量-依存的な防御を示した。粘液に特異的な抗体も大腸菌(E.coli)に特異的な抗体も投与に対して防御しなかった。
【００８６】
実施例10：抗原-Dtd接合体を用いたワクチン化による菌血症からのマウスのインビボにおける防御
合計80匹のマウスを、各群40匹からなる2つの群に分割した。第1の群のマウスには、実施例5により調製した2.5 μgの精製抗原-Dtd接合体およびIFAを皮下注射して免疫化した。第2群のマウスには、MEP接合体（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa)の粘液性エキソポリサッカライドとDtdの接合体）プラスIFAを注射した。マウスには、同じワクチンまたは対照投与を用いて2週間間隔で2回追加免疫投与をした。
【００８７】
3回めの注射の1週間後に、抗原をもつ表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）の粘液産生株、#V01048株の致死量下用量（5.0×107 cfu）を5％ブタムチンに加えたものをマウスに腹腔内投与した。投与したマウスを6、24、30および48時間経過時に脱血し、陽性の細菌培養について試験した（各経過時点において10匹のマウス）。結果は、抗原-rEPA接合体による免疫化は、投与したマウスにおいて血中からの細菌の除去を促進することによって菌血症を有意に低下したことを示した。MEP接合体で免疫化した対照群は菌血症から防御されなかった。
【００８８】
実施例11：インビトロにおいて抗原がブドウ球菌（Staphylococcus）細菌の静脈カテーテルへの粘着を妨害する能力
抗原をもつ表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）の粘液産生株#977および抗原をもつS.ヘモリティカス（S.haemolyticus）株4162(細菌の粗抽出物の二重免疫拡散によって測定した)の静脈カテーテルへの粘着を仲介する抗原の能力をインビトロ粘着アッセイにおいて評価した。細菌は、4％塩化ナトリウムを添加したコロンビア寒天プレートで37℃において一晩増殖させた。翌日、このプレートから単離したコロニーを、4％塩化ナトリウムを添加した5mlのコロンビアブロスに接種した。次いで、この培養物を37℃において振とうさせながら4時間増殖させ、次いで650 nMのOD 0.12に調整した。
【００８９】
シングル1 1/4" IV Insyteカテーテル[放射線不透過性登録商標Vialon材料、Becton Dickinson Vascular Access, ユタ州サンディ]を、0.5 mg/ml抗原のPBS溶液1 ml容量中で37℃において30分間インキュベートした。次いで、カテーテルを冷却したPBSで丁寧に洗浄し、細菌懸濁物1mlに浸漬し、振とうしないで37℃において30分間インキュベートした。次いで、カテーテルを冷却したPBS溶液で再度洗浄し、3片の均一な小片にスライスした。スライスしたカテーテルを500 μLのPBSに浸漬し、氷上で1分間超音波処理し、カテーテルに付着した細菌細胞を除去した。この懸濁物をPBSで10倍、100倍および1000倍希釈して、TSAプレート上に接種し、37℃において18時間〜20時間インキュベートした。細菌コロニーを計数し、異なる抗原をコーティングしたカテーテルからの細菌回収の差を測定した。
【００９０】
結果は、静脈カテーテルを表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）202176から単離した抗原と共に事前インキュベーションすることにより、抗原をもつ表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）の粘液産生株#977の粘着を97.5％低下し、S.ヘモリティカス（S.haemolyticus）の粘着を92％低下したことを示した。表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）202176から精製した抗原と同一の抗原は、S.ヘモリティカス（S.haemolyticus）およびS.ホミニス（S.hominis）の細菌壁の粗抽出物中で検出された。これは、表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）の抗原が凝固酵素陰性ブドウ球菌（Staphylococci）の静脈カテーテルへの粘着の原因となっていることを示唆している。
【００９１】
実施例12：インビトロにおいて抗原特異的抗体のFab断片がブドウ球菌（Staphylococcus）細菌の静脈カテーテルへの粘着を妨害する能力
抗原特異的抗体のFab断片が、抗原をもつ株、表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）の粘液産生株RP62Aの、ヒト血漿中で事前にインキュベートした静脈カテーテルへの粘着を妨害する能力をインビトロ粘着アッセイにおいて評価した。細菌は、4％塩化ナトリウムを添加したコロンビア寒天プレートで37℃において一晩増殖させた。翌日、このプレートから単離したコロニーを、4％塩化ナトリウムを添加した5 mlのコロンビアブロスに接種した。この培養物を37℃において振とうさせながら4時間増殖させ、次いで650 nmのODを0.12に調整した。細菌懸濁物（1 mL）を3000 rpmで遠心分離し、ペレットを1 mLのFab溶液（1 mg/mL）に再懸濁させ、37℃において30分間インキュベートした。
【００９２】
シングル1 1/4" IV Insyteカテーテル[放射線不透過性登録商標Vialon材料、Becton Dickinson Vascular Access, ユタ州サンディ]を、0.5 mg/ml抗原のPBS溶液1 ml容量中で37℃において30分間インキュベートした。次いで、カテーテルを冷却したPBSで丁寧に洗浄し、細菌懸濁物1mlに浸漬し、振とうしないで37℃において30分間インキュベートした。次いで、カテーテルを冷却したPBS溶液で再度洗浄し、3片の均一な小片にスライスした。スライスしたカテーテルを500 μLのPBSに浸漬し、氷上で1分間超音波処理し、カテーテルに付着した細菌細胞を除去した。この懸濁物をPBSで10倍、100倍および1000倍希釈して、TSAプレート上に接種し、37℃において18時間〜20時間インキュベートした。細菌コロニーを計数し、異なる抗原をコーティングしたカテーテルからの細菌回収の差を測定した。
【００９３】
結果は、抗原をもつ表皮ブドウ球菌（S.epidermidis）の粘液産生株RP62Aの粘着は、通常のウサギ抗体から調製したFab断片でカテーテルを前処理することによって影響されなかったことを示した。抗原特異的ウサギ抗体から調製したFab断片による同じ細菌の前処理は、細菌の静脈カテーテルへの粘着を効果的に阻害した。これらのデータおよび実施例11のデータは、抗原は、凝固酵素陰性ブドウ球菌（Staphylococci）の生体材料への粘着に重要な役割を果たしていることを示唆している。抗原および抗原特異的抗体による粘着の阻害は、凝固酵素陰性ブドウ球菌（Staphylococci）によって生じる異物性感染症を防止する際に重要な役割を果たす可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明のブドウ球菌抗原に対する、スペロース6HRにおけるクロマトグラフィープロフィールである。
【図２Ａおよび図２Ｂ】  本発明のブドウ球菌抗原に関するNMRスペクトルである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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