(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−メトキシ−４−メチルフェノール、２−メトキシ−４−エチルフェノール、及び２−エトキシ−４−メチルフェノールからなる群より選択された少なくとも１種、あるいはその塩を含有してなることを特徴とする破骨細胞分化抑制剤。
【請求項２】
１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．１〜１０ｍｇを経口投与あるいは直腸内投与するか、または、１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．０５〜５ｍｇを注射剤として投与するものであり、
錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、トローチ剤、チュアブル剤、内服液剤、注射剤、あるいは坐剤の形態に調製されたことを特徴とする請求項１に記載の軟骨細胞破壊抑制剤。
【請求項３】
２−メトキシ−４−メチルフェノール、２−メトキシ−４−エチルフェノール、及び２−エトキシ−４−メチルフェノールからなる群より選択された少なくとも１種、あるいはその塩を含有してなることを特徴とする骨粗鬆症用薬剤。
【請求項４】
１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．１〜１０ｍｇを経口投与あるいは直腸内投与するか、または、１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．０５〜５ｍｇを注射剤として投与するものであり、
錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、トローチ剤、チュアブル剤、内服液剤、注射剤、あるいは坐剤の形態に調製されたことを特徴とする請求項３に記載の軟骨細胞破壊抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、破骨細胞分化抑制剤、及びこれを含んでなる骨粗鬆症用薬剤に関し、詳しくは骨粗鬆症、ベーチェット病、薬物性骨代謝異常症、糖尿病性骨減少症などの骨代謝性疾患（骨代謝異常症）の予防または治療に用いる破骨細胞分化抑制剤、及びこれを含んでなる骨粗鬆症用薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨代謝性疾患の１つである骨粗鬆症は、現在日本では約５００万〜８００万人もの骨粗鬆症患者がいるといわれ、年々増え続けている。この疾患は、周知のとおりカルシウム不足が進んで骨密度が減少し、骨がスカスカになって折れやすくなる病気である。すなわち、骨には、古くなった骨を破壊すべく骨のカルシウムを溶解する破骨細胞と、破壊された骨を修復して再生する骨芽細胞の２種類がある。両者のバランスが崩れ、破骨細胞による骨の溶解（骨吸収）が骨芽細胞による骨の再生を上回ることにより、骨のカルシウム不足が進行して骨密度が減少し、そして骨粗鬆症などの骨代謝性疾患が引き起こされる。
【０００３】
これに対し、腸管からカルシウム吸収を増加させ、骨形成を促進する活性型ビタミンＤ３やカルシトリオール、骨吸収を抑制し骨形成を促進するカルシトニンやエルカトニン、あるいは骨吸収を抑制しエストロゲンのカルシトニン分泌を促進するイプリフラボンなどの治療用薬剤が用いられ、ある程度の成果が得られている（例えば特許文献１）。しかしながら、骨粗鬆症の国内罹患者数が５００万〜８００万人という非常に高い数字や、この疾患が患者を、特に老人を寝たきり、延いては痴呆にしてしまう原因になることから事態は深刻であり、より一層効果的な予防手段あるいは治療手段が望まれていた。
【特許文献１】特開平７−１７８５４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
骨代謝において崩れたバランスを立て直す（あるいはバランスが崩れないように予防する）ことに鑑み、本発明者は破骨細胞への分化に着目した。すなわち、破骨細胞は造血幹細胞に由来し、それから分化した破骨細胞前駆細胞が破骨細胞分化誘導因子（ Receptor Activator for NF-κB Ligand, ＲＡＮＫＬ ）の作用を受けて（破骨細胞前駆細胞におけるＲＡＮＫＬ受容体にＲＡＮＫＬが作用して）多核化し、そして成熟破骨細胞へと分化する。そのＲＡＮＫＬの発現に変化もたらすことで破骨細胞への分化を抑制し、骨吸収を最小限に食い止め、これによって骨形成優勢をもたらすことで骨代謝性疾患を予防あるいは治療することが効果的であろうと考え、そのような作用を持つ（破骨細胞への分化を抑制し得るような）化合物を種々試みた。いくつかの試行錯誤を重ねた結果、本発明者はついにある種の化合物が破骨細胞への分化を抑制することを突き止め、そして本発明に至った。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の破骨細胞分化抑制剤は、下記の一般式（Ｉ）で示される化合物あるいはその塩を含有してなることを特徴とする。
【化３】
0004773102.tif 000002
【０００６】
［但し、上記一般式（Ｉ）におけるＲ１はメチル基またはエチル基、Ｒ２は水素原子または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基であって、Ｒ１とＲ２は同一であっても異なっていてもよい。］
また、本発明の骨粗鬆症用薬剤は、上記の一般式（Ｉ）で示される化合物あるいはその塩を有効成分として含有してなることを特徴とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、破骨細胞への分化に対して抑制的に働いて骨吸収を最小限に食い止め、全体的に骨形成優勢として結果的に骨代謝性疾患を予防あるいは治療することができる。別のメカニズムを持つ他の薬剤（例えば、骨芽細胞の死滅を抑制する薬剤、骨芽細胞の分化を促す薬剤など）と併用することにより、より一層骨形成優勢となり、効果的に骨代謝性疾患を予防あるいは治療することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
破骨細胞分化抑制剤
前述したように、本発明の破骨細胞分化抑制剤は、下記の一般式（Ｉ）で示される化合物あるいはその塩を含有してなるものである。
【化４】
0004773102.tif 000003
【０００９】
上記一般式（Ｉ）におけるＲ１はメチル基またはエチル基、Ｒ２は水素原子または炭素数１〜５の直鎖または側鎖のアルキル基であって、Ｒ１とＲ２は同一であっても異なっていてもよい。以下に具体例を挙げるが、この例示でいう「ブチル」は、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチルを総称したものであり、また「プロピル」は、ｎ−プロピル、イソプロピルを総称したものである。すなわち、２−メトキシフェノール（グアヤコール）、２−メトキシ−３−メチルフェノール、２−メトキシ−３−エチルフェノール、２−メトキシ−３−プロピルフェノール、２−メトキシ−３−ブチルフェノール、２−メトキシ−４−メチルフェノール、２−メトキシ−４−エチルフェノール、２−メトキシ−４−プロピルフェノール、２−メトキシ−４−ブチルフェノール、２−メトキシ−５−メチルフェノール、２−メトキシ−５−エチルフェノール、２−メトキシ−５−プロピルフェノール、２−メトキシ−５−ブチルフェノール、２−エトキシフェノール、２−エトキシ−３−メチルフェノール、２−エトキシ−３−エチルフェノール、２−エトキシ−３−プロピルフェノール、２−エトキシ−３−ブチルフェノール、２−エトキシ−４−メチルフェノール、２−エトキシ−４−エチルフェノール、２−エトキシ−４−プロピルフェノール、２−エトキシ−４−ブチルフェノール、２−エトキシ−５−メチルフェノール、２−エトキシ−５−エチルフェノール、２−エトキシ−５−プロピルフェノール、２−エトキシ−５−ブチルフェノールなどが挙げられる。
【００１０】
中でも、Ｒ２が炭素数１〜３であることが、破骨細胞への分化を抑制する能力に優れているという点で好ましく、メチル基あるいはエチル基であることがさらに好ましい。また、Ｒ２は３または４の位置に結合していることが、破骨細胞への分化を抑制する能力に優れているという点で好ましく、４の位置に結合していることがさらに好ましく、中でも、破骨細胞への分化を抑制する能力にさらに優れているという点で、グアヤコール（以下、単に「２ＭＰ」ともいう）、２−メトキシ−４−メチルフェノール（以下、単に「２Ｍ４ＭＰ」ともいう）、２−メトキシ−４−エチルフェノール（以下、単に「２Ｍ４ＥＰ」ともいう）、２−エトキシ−４−メチルフェノール（以下、単に「２Ｅ４ＭＰ」ともいう）、２−エトキシ−４−エチルフェノール（以下、単に「２Ｅ４ＥＰ」ともいう）が好ましく、その中でもグアヤコール、２Ｍ４ＭＰ、及び２Ｍ４ＥＰが最も好ましい。なお、上記一般式（Ｉ）で示される化合物は１種類を単独で使用しても良いし、２種以上を併用することもできる。
【００１１】
これらグアヤコール、２Ｍ４ＭＰ、２Ｍ４ＥＰはいずれも、木クレオソートの構成成分である（ Ogata N., Baba T. Analysis of beechwood creosote by gas chromatography-mass spectrometry and high-performance liquid chromatography. Res Commun Chem Pathol Pharmacol ６６，４１１−４２３（１９８９）,ブナ木クレオソートのガスクロマトグラフィー・質量分析法および高速液体クロマトグラフィー法による分析）。緒方規男（N. Ogata）他著ファーマコロジー（Pharmacology）、４６巻、（１９９３）、第１７３頁には、クレオソートが腸管運動抑制に基づく止瀉作用を有する旨記載されている。また、医薬品製造指針（日本公定書協会編）１９８８年版第２４０頁の胃腸薬製造承認基準において、Ｖ欄の止瀉薬の区分中１項の殺菌剤として収載されている。また、伊藤宏著「薬理学」（（株）蛍光堂、１９８３年１月５日改訂第６版発行）第４１６頁にも、木クレオソートは腸内防腐に用いるほか、吸入適応により去痰作用を示す旨記載され、日本薬局方でも、去痰、腸内異常醗酵、食中毒などに用いる旨記載されている。ザ・ユナイテッド・ステーツ・ディスペンサトリー（The United States Dispensatory）、２７th ed.（１９７３）、第３５５頁にも、木クレオソートは、外用として殺菌剤、内用として去痰剤として使用される旨記載されている。
【００１２】
塩の形態 
また、本発明の破骨細胞分化抑制剤は、塩基を用いた塩の形態とすることも可能である。用いる塩としては、薬学的に（薬剤学的に）許容し得る塩であれば特に限定するものではなく、例えば、ナトリウム、カルシウム、カリウム、マグネシウム、リチウムなどの金属塩、アミン類（モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン）との塩あるいはアンモニウム塩などが挙げられる。
【００１３】
骨代謝性疾患
本発明の破骨細胞分化抑制剤を用いる対象疾患名としては、例えば骨粗鬆症、高カルシウム血症、ベーチェット病、薬物性骨代謝異常症、糖尿病性骨減少症などの骨代謝性疾患が挙げられる。
【００１４】
使用量
本発明の破骨細胞分化抑制剤の投与量（使用量）については、対象となる動物の種類あるいは性別、年齢、症状の程度によって変わるので一概にはいえないが、ヒトにおける経口投与あるいは直腸内投与（坐剤）の場合は、およそのところ１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．１〜１０ｍｇであり、０．５〜５ｍｇであることが好ましく、また注射剤としての投与の場合には、１日当たり成人体重１ｋｇに対して０．０５〜５ｍｇであり、０．２５〜２．５ｍｇであることが好ましい。これらの１日量を１回でまたは分２〜分４、あるいはそれ以上の回数に分けて投与することができる。
【００１５】
剤型
本発明の破骨細胞分化抑制剤は、医療用薬剤における一般的な形態で以て使用される。一般的な形態としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、カプセル剤（軟カプセル剤、硬カプセル剤）、顆粒剤、トローチ剤、チュアブル剤、内服液剤や、注射剤（血管内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与など）、あるいは坐剤などが挙げられる。錠剤、顆粒剤、散剤の形態に調製する際には、従来公知の担体を広く使用でき、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、澱粉、結晶セルロース等の賦形剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、ゼラチン、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等の結合剤、例えば、澱粉、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等の崩壊剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸などの滑沢剤が使用できる。錠剤には、必要に応じて、通常の剤皮を施すこともでき、例えば、糖衣錠、フィルムコーティング錠等とすることができ、さらに二層錠、多層錠としてもよい。また、顆粒剤や散剤も通常の剤皮を施すことができる。
【実施例】
【００１７】
本発明の一実施例を以下に説明するが、本発明はこれによって限定されない。
【００１８】
破骨細胞への分化誘導（図１参照）
破骨細胞への分化誘導を従来公知の方法によって行った。すなわち、６週齢マウスから大腿骨と脛骨を摘出し、骨髄細胞を回収後、マクロファージ・コロニー刺激因子（macrophage colony stimulating factor、Ｍ−ＣＳＦ）１０ng/ml存在下で１０％牛胎子血清（ＦＢＳ）を含むα−ＭＥＭ中で培養した。２４時間後に上清を回収したのち、遠心分離処理を行い、破骨前駆細胞を含む単球画分を採取した。これをα−ＭＥＭに投入し懸濁させたのちFicoll試薬の上に積層し、そして密度勾配遠心分離法（５００×ｇ・１５分間）により調製した単球画分をＭ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で５日間培養した。培養５日目においては、細胞に酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（tartrate-resistant alkaline phosphatase，ＴＲＡＰ）染色を行って破骨細胞を確認した。
【００１９】
適切な細胞密度の検討（図２）
以降の実験において、破骨細胞をＴＲＡＰ染色して観察する際、どの程度の密度の時に破骨細胞の成熟が適切かを判断するため、３種の細胞密度（ １×１０４cells／cm２，１×１０５cells／cm２，１×１０６cells／cm２）に調整した破骨前駆細胞を５日間培養した後、ＴＲＡＰ染色して観察した。その結果、１×１０５cells／cm２の場合に成熟した破骨細胞数が最も多いことが分かり、以降の実験における破骨細胞の観察もこの密度（１×１０５cells／cm２）で行うこととした。
【００２０】
Ｍ−ＣＳＦとＲＡＮＫＬの濃度と培養期間（図３と図４）
密度勾配遠心分離法（５００×ｇ・１５分間）により調製した単球画分を５日間培養、Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下で培養するに際し、Ｍ−ＣＳＦとＲＡＮＫＬの各々の濃度をどの程度にするのが最も効果的かを調べるべく、Ｍ−ＣＳＦとＲＡＮＫＬの濃度(ng/ml)を種々設定（Ｍ−ＣＳＦ／ＲＡＮＫＬ＝０／２０，２０／０，１０／１０，２０／２０，２０／５０及び２０／１００）して培養を行った。その結果、Ｍ−ＣＳＦ／ＲＡＮＫＬ＝２０(ng/ml)／５０(ng/ml)あるいは２０(ng/ml)／１００(ng/ml)とした場合に破骨細胞への分化が顕著であることが分かったので、以下の実験において、Ｍ−ＣＳＦ／ＲＡＮＫＬ＝２０(ng/ml)／５０(ng/ml)の濃度で行うこととした。
【００２１】
また、Ｍ−ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬの存在下での単球画分の培養期間を５日間としたのは、培養１日目〜５日目の細胞をＴＲＡＰ染色して各々の分化状況を観測した結果、培養５日目の系が最も顕著であったので、以下の実験においてＭ−ＣＳＦとＲＡＮＫＬの存在下での単球画分の培養期間を５日間とした（図４参照）。
【００２２】
破骨細胞の確認（図５〜図８）
培養された（単球画分から誘導した）細胞が破骨細胞であるかどうかの確認試験を行った。すなわち、Ｍ−ＣＳＦ存在下（１０ng/ml）、１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ中で２４時間培養した細胞（０日目）、及びそれよりＭ−ＣＳＦとＲＡＮＫＬ共存下で１日培養後〜６日培養後の細胞におけるｍＲＮＡをそれぞれ抽出し（図５参照）、ＲＴ−ＰＣＲ法により半定量を行った（このときに用いたプライマーを図６に示す）。図７に示すとおり、全ての破骨細胞遺伝子マーカーの培養後期における著明な発現が確認できた。
【００２３】
また、上記と同様、０日目の細胞およびそれより１日培養後〜６日培養後の各々の細胞における破骨細胞遺伝子マーカーの定量を、ＲＴ−ＰＣＲ法により行った。結果を図８に示す（６日目の発現量を１００％とした相対値で表している）。これらの結果から、骨髄から採取した単球画分を破骨細胞に誘導できたことが確認できた。
【００２４】
単球画分から破骨細胞への分化抑制試験［１］（図９および図１０）
単球画分から破骨細胞へ分化させる培養において、グアヤコール（２ＭＰ）、２−メトキシ−４−メチルフェノール（２Ｍ４ＭＰ）、及び２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）の存在がどのような影響をもたらすかについて実験を行った。
【００２５】
すなわち、Ｍ−ＣＳＦ（１０ng/ml）存在下、１０％ＦＢＳを含むα−ＭＥＭ中で２４時間培養したのち（図１および図９参照）、２ＭＰ（１ｍＭ）、２Ｍ４ＭＰ（１ｍＭ）、及び２Ｍ４ＥＰ（１ｍＭ）を加えた培養液（Ｍ−ＣＳＦ／ＲＡＮＫＬ＝２０(ng/ml)／５０(ng/ml)含有）中で培養した。
【００２６】
培養５日後における破骨細胞の状況をＴＲＡＰ染色を行って観察した。結果を図１０に示す。この図から、単球画分から破骨細胞への分化を、２ＭＰ、２Ｍ４ＭＰ、及び２Ｍ４ＥＰが抑制したことが分かる。
【００２７】
単球画分から破骨細胞への分化抑制試験［２］（図１１〜図１３）
２ＭＰ、２Ｍ４ＭＰ、及び２Ｍ４ＥＰの濃度を変更したという以外は上記分化抑制試験［１］と同様にして培養を行った。具体的には、２ＭＰ、２Ｍ４ＭＰ、及び２Ｍ４ＥＰの濃度をそれぞれ、１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍ、１０−３Ｍとして培養を行い、分化した破骨細胞数をＴＲＡＰ染色して数えた（図１１〜図１３参照）。なお、図では、２ＭＰ、２Ｍ４ＭＰ、及び２Ｍ４ＥＰの濃度を０とした場合の染色陽性破骨細胞数を１００とした相対数値（％）で表した。
【００２８】
骨粗鬆症への適用（in vivo動物実験）
冒頭でも述べたように、生体には骨を溶かしてカルシウムを血液中に放出する破骨細胞と、血中カルシウムから骨を形成する骨芽細胞のバランスによって、血中カルシウム濃度と骨密度を維持している。女性ホルモンはこの働きに大きな影響を与えており、更年期に女性ホルモンが減少すると、破骨細胞が増加して骨からのカルシウムの溶出、尿中へのカルシウム排出が増加する。これにより、急激に骨密度が減少し、骨粗鬆症を引き起こして頻繁な骨折や日常的な痛みが起こる。
【００２９】
以下の実験では、卵巣摘出手術を行った雌性マウス（女性ホルモンの分泌を強制的に減らして更年期を想定したマウス）における骨粗鬆症予防効果を本発明の破骨細胞分化抑制剤を用いて確認した。
【００３０】
すなわち、８週齢雌性マウスに、図１４の如く従来公知の方法で卵巣摘出手術を施した。このモデルマウスに、図１５のプロトコールで示すように術後１日目から週３回、２Ｍ４ＭＰ、及び２Ｍ４ＥＰを０．１７mg／kg経口投与し、術後４週目（２８日後）に体重と骨密度を測定した。なお、骨密度は、摘出骨（脛骨、大腿骨）を７０％エタノールで４日間固定し、この摘出骨に軟Ｘ線を照射するＳＥＸＡ法（Single Energy X-ray Absorptiometry、単一エネルギーＸ線吸収法）で測定した（測定機器：アロカ社製、ＤＣＤ−６００Ｒ）。比較対照のため、コントロール群（開腹後、そのまま（卵巣摘出せずに）縫合し、縫合後も薬剤投与をしなかった群。以下、「Ｓｈａｍ」という）と、卵巣を摘出し、２Ｍ４ＭＰ及び２Ｍ４ＥＰを投与しなかった群（以下、「ＯＶＸ」という。なお、ＯＶＸは、ovariectomizedの略）を作成した。
【００３１】
結果を図１６（体重）、図１７（骨密度＜脛骨＞）、及び図１８（骨密度＜大腿骨＞）に示す。図１６から、Ｓｈａｍはもちろんのこと、各モデルマウスは４週後（２８日後）も健康体であったことがわかる。そして、図１７および図１８から、卵巣を摘出して女性ホルモンの分泌を強制的に抑えたマウスにおいて、ＯＶＸでは骨密度が減少する反面、２Ｍ４ＭＰおよび２Ｍ４ＥＰを投与したグループでは、大腿骨、脛骨ともに骨密度の有意な（Ｓｈａｍと同レベルの）維持（回復）が認められた。したがって、本発明の有効成分である破骨細胞分化抑制剤は、骨粗鬆症などの骨代謝性疾患の予防薬あるいは治療薬として有効であり、これらを日常的に摂取すれば、前記骨代謝性疾患の予防あるいは治療として十分にその効果が期待される。
【００３２】
以下に本発明の破骨細胞分化抑制剤を含んだ製剤例の一例を示すが、これによって限定するものではない。
【００３３】
製剤例１（丸剤）
（処方１）
２ＭＰ、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ  ５ｍｇ
カンゾウ  ２５ｍｇ
グリセリン  １０ｍｇ
常水  ５０ｍｇ
下記処方の各成分を練合し、その丸剤塊を切丸機で分割し、製丸機で成丸し、１丸中に本発明の破骨細胞分化抑制剤５ｍｇを含有する丸剤を調製した。
【００３４】
製剤例２（硬カプセル剤）
（処方２）
２ＭＰ、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ  １０ｍｇ
デンプン  ２５０ｍｇ
２ＭＰ、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰとデンプンを混合して混合末とし、硬カプセルに充填して１カプセル中に本発明の破骨細胞分化抑制剤１０ｍｇを含有する硬カプセル剤を調製した。
【００３５】
製剤例３（軟カプセル剤）
（処方３）
２ＭＰ、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ  １０ｍｇ
オリーブ油  ２００ｍｇ
２ＭＰ、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰとオリーブ油に溶解して溶液を得、ソフトカプセルに充填して、１カプセル中に本発明の破骨細胞分化抑制剤１０ｍｇを含有する軟カプセル剤を調製した。
【００３６】
製剤例４（錠剤）
（処方４）
２ＭＰ、２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰ  ２０ｍｇ
乳糖  ２５０ｍｇ
メチルセルロース  ３ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム  ２ｍｇ
カルボキシメチルセルロース  １０ｍｇ
上記処方のステアリン酸マグネシウム以外の各成分を混合し、これを水と混練して顆粒とし、この顆粒を乾燥後、ステアリン酸マグネシウムと混合して圧縮成型するか、あるいは上記処方の各成分を混合して直接圧縮成型し、１錠２８５ｍｇの錠剤を調製した。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明によれば、単球画分から破骨細胞への分化を最小限に食い止めることができるので（破骨細胞数の減少をもたらすことができるので）、全体的には骨形成優勢となり、結果的に骨代謝性疾患を予防あるいは治療することができる。単独での使用でも構わないし、別のメカニズムを持つ他の薬剤（例えば、骨芽細胞を活性化する薬剤）と併用することにより、より一層骨形成優勢となり、効果的に骨代謝性疾患を予防あるいは治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】破骨細胞の培養方法を示した略示説明図である。
【図２】観察のために最も適した細胞密度を１×１０５cells/cm２とした根拠を示す図であり、上３つはＴＲＡＰ染色前（左から、１×１０４cells／cm２，１×１０５cells／cm２，１×１０６cells／cm２）、下３つはＴＲＡＰ染色後（左から、１×１０４cells／cm２，１×１０５cells／cm２，１×１０６cells／cm２）の図である。
【図３】Ｍ−ＣＳＦ(ng/ml)／ＲＡＮＫＬ(ng/ml)の濃度を変えて培養（分化誘導）を行い、誘導した細胞をＴＲＡＰ染色した図であり、その濃度(ng/ml)は上段左から、０／２０，２０／０，下段左から、２０／２０，２０／５０，２０／１００である。
【図４】Ｍ−ＣＳＦ／ＲＡＮＫＬの濃度を２０(ng/ml)／５０(ng/ml)として培養（分化誘導）を行い、誘導した細胞の１日目（上段左）、２日目（上段中）、３日目（上段右）、４日目（下段左）、５日目（下段中）の図であり、下段右は、培養５日目の細胞をＴＲＡＰ染色した図である。
【図５】単球画分から誘導した細胞が破骨細胞であることを確認すべく、所定のタイミングで細胞を取り出す（延いては、mＲＮＡを抽出する）プロトコールを示した説明図である。
【図６】ＲＴ−ＰＣＲ法で遺伝子マーカーの半定量を行う際に用いたプライマーを示す図である。
【図７】破骨細胞遺伝子マーカーの存在をＲＴ−ＰＣＲ法で半定量した結果の図である。
【図８】破骨細胞遺伝子マーカーの存在を、その発現量で以て定量的に表したグラフ図である。
【図９】単球画分から破骨細胞へ分化させる培養において、グアヤコール（２ＭＰ）、２−メトキシ−４−メチルフェノール（２Ｍ４ＭＰ）、及び２−メトキシ−４−エチルフェノール（２Ｍ４ＥＰ）の存在がどのような影響をもたらすかについての実験を行うプロトコールの図である。
【図１０】前図のプロトコールで培養を進めた５日後の細胞をＴＲＡＰ染色し、コントロール（２ＭＰ，２Ｍ４ＭＰまたは２Ｍ４ＥＰの濃度ゼロ）の場合と比較した図である。
【図１１】５日間、２ＭＰを持続曝露させて破骨細胞への分化（誘導）を行ったときの結果を示すグラフ図である。
【図１２】５日間、２Ｍ４ＭＰを持続曝露させて破骨細胞への分化（誘導）を行ったときの結果を示すグラフ図である。
【図１３】５日間、２Ｍ４ＥＰを持続曝露させて破骨細胞への分化（誘導）を行ったときの結果を示すグラフ図である。
【図１４】卵巣摘出手術の概要とその後の測定に関する略示説明図を示す。
【図１５】２Ｍ４ＭＰ、及び２Ｍ４ＥＰの存在がどのような影響をもたらすかについての実験を行うプロトコールの図である。
【図１６】卵巣摘出からの経時的な体重の変化を示したグラフ図である。
【図１７】脛骨の骨密度の測定値を示したグラフ図である。
【図１８】大腿骨の骨密度の測定値を示したグラフ図である。
【図１】
0004773102.tif 000004
【図２】
0004773102.tif 000005
【図３】
0004773102.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0004773102.tif 000011
【図９】
0004773102.tif 000012
【図１０】
0004773102.tif 000013
【図１１】
0004773102.tif 000014
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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