(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレンシートで成型されており、細胞懸濁液の流入ポート及び流出ポートを有するバッグ状の容器の内表面において、
ポリエチレンを構成する炭素原子に結合する水素原子の一部がフッ素原子に置換され、
酸素透過係数が、１００〜５０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍであり、
二酸化炭素透過係数が、１０００〜２００００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍである細胞培養容器。
【請求項２】
上記ポリエチレンシートの厚みが、５０〜３００μｍである請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項３】
ポリエチレンシートで成型されており、細胞懸濁液の流入ポート及び流出ポートを有するバッグ状の容器の内表面と、フッ素ガスとを不活性ガス存在下で反応させることを特徴とするポリエチレンを構成する炭素原子に結合する水素原子の一部がフッ素原子に置換されたポリエチレンシートで成型された細胞培養容器の製造方法。
【請求項４】
上記容器の流入ポート及び流出ポートを通じて、容器の内部にフッ素ガスを含有する不活性ガスを流通させることにより、ポリエチレンを構成する炭素原子に結合する水素原子の一部をフッ素原子に置換させる請求項３に記載の細胞培養容器の製造方法。
【請求項５】
フッ素ガスの含有量が不活性ガスに対して０．１〜２０．０容量％である請求項３又は４に記載の細胞培養容器の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマーを構成する炭素原子に結合する水素原子の一部がフッ素原子に置換されてなるプラスチック製細胞培養容器に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、機能障害や機能不全に陥った生体組織および臓器に対して、細胞を積極的に利用して、その機能の再生をはかることを目的とした再生医療の分野が発展してきた。哺乳動物から健常な細胞取り出し、該細胞を生体外で培養した後、再び生体に戻す技術もこの一環である。
【０００３】
従来、哺乳動物の付着細胞や懸濁細胞を生体外で行う培養は、ポリスチレン製のシャーレの中で行われてきた。しかし、このような容器はガス透過性が低いため、細胞増殖に必要な酸素や二酸化炭素の交換を十分行うために、培養液の液厚を３ｍｍ程度とし、容器中に空気層を設けなくては、十分な細胞増殖が得られなかった。従って、細胞を大量に培養するときには、無駄な空間があるため、多くのスペースを必要としていた。
【０００４】
かかる問題を解決すべく、アイオノマーで形成された細胞培養容器（特許文献１）、ポリエチレンシートで形成された細胞培養容器（特許文献２〜４）、ポリ−４−メチルペンテン−１樹脂とポリ−４−メチルペンテン−１樹脂以外のポリオレフィン樹脂で形成された細胞培養容器（特許文献５）、含フッ素溶融樹脂からなる培養器（特許文献６，７）等が報告されている。これらの細胞培養容器は、ガス透過性が高く、容器一杯に培養液を充填し、培養することが可能である。従ってポリスチレン製のシャーレで培養するよりも培養スペースを小さくできるため、大量培養に適している。
【０００５】
しかしながら、さらに培養スペースを効率化するために、優れた細胞増殖効果を有し、大量培養に適した細胞培養容器が必要とされている。
【０００６】
【特許文献１】特開昭６０−１６０８８１号公報
【特許文献２】実開平１−９９２００号公報
【特許文献３】特開平２−２５５０７７号公報
【特許文献４】特開平３−１７２１６９号公報
【特許文献５】特開２００１−１９０２６７号公報
【特許文献６】特開昭６３−１９８９７２号公報
【特許文献７】実開昭６２−６８５９９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来の細胞培養容器よりも培地への異物の混入を抑制し、細胞増殖能に優れ、大量培養に適した細胞培養容器の開発が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、
（１）ポリエチレンシートで成型されており、細胞懸濁液の流入ポート及び流出ポートを有するバッグ状の容器の内表面において、ポリエチレンを構成する炭素原子に結合する水素原子の一部がフッ素原子に置換され、酸素透過係数が、１００〜５０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍであり、二酸化炭素透過係数が、１０００〜２００００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍである細胞培養容器、
（２）上記ポリエチレンシートの厚みが、５０〜３００μｍである上記（１）項に記載の細胞培養容器、
（３）ポリエチレンシートで成型されており、細胞懸濁液の流入ポート及び流出ポートを有するバッグ状の容器の内表面と、フッ素ガスとを不活性ガス存在下で反応させることを特徴とするポリエチレンを構成する炭素原子に結合する水素原子の一部がフッ素原子に置換されたポリエチレンシートで成型された細胞培養容器の製造方法、
（４）上記容器の流入ポート及び流出ポートを通じて、容器の内部にフッ素ガスを含有する不活性ガスを流通させることにより、ポリエチレンを構成する炭素原子に結合する水素原子の一部をフッ素原子に置換させる上記（３）項に記載の細胞培養容器の製造方法、及び
（５）フッ素ガスの含有量が不活性ガスに対して０．１〜２０．０容量％である上記（３）又は（４）項に記載の細胞培養容器の製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の細胞培養容器は、従来の細胞培養容器よりも培地への異物の混入を抑制し、細胞増殖能に優れ、しかも大量培養に適している。本発明の細胞培養容器では、従来の容器に比べて、細胞をより高密度に培養でき、より多数の細胞を得ることができる。さらに一定数の細胞を得るためには、より小容量の培地での培養、増殖が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の細胞培養容器は、細胞を培養するためのプラスチック容器であり、ポリマーを構成する炭素原子に結合する水素原子の一部がフッ素原子に置換（以下、フッ素置換ともいう）されることを特徴としている。フッ素置換とは、ポリマーを構成する炭素原子に結合する水素原子の一部がフッ素原子に置き換わることを意味し、一部とはフッ素原子の置換前のポリマーを構成する炭素原子に結合する水素原子の数の割合を１００％とした場合、フッ素原子に置換した数が約０．１〜９９．９％、好ましくは約０．５〜５０％、さらに好ましくは約１〜１０％である。最も好ましくは約２〜５％である。
【００１１】
本発明のポリマー容器の形状は特に限定されるものではなく、例えばバッグ、ボトルなどが挙げられる。とりわけ大量生産が容易であり、軽量である可撓性のシートで形成されたバッグ形状が好ましい。さらに、細胞懸濁液を導入・導出するポートをそれぞれ設けることが、取り扱いの上で好ましい。
【００１２】
また、ポリマーは、構成する炭素原子に結合する水素原子の一部がフッ素ガスによりフッ素原子に置換されうるものであれば特に限定されるものではない。具体的には、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリエステル、シリカ系ポリマーまたはポリオレフィンなどの熱可塑性樹脂が挙げられ、中でもポリオレフィンが好ましい。ポリオレフィンの具体例としては、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンおよびポリ４−メチルペンテンなどが挙げられるが、中でもポリエチレンが好ましい。
【００１３】
また、本発明の細胞培養容器において、フッ素置換は、ポリマー容器の内表面、外表面または両面のいずれであってもよい。ポリマー容器の内表面がフッ素置換されていることが好ましい。
【００１４】
本発明の細胞培養容器は、細胞を培養するにあたり十分な通気性を有していることが好ましい。具体的には、酸素透過係数が約１００〜５０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ、好ましくは約１１００〜３０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ、さらに好ましくは約１２５０〜２７５０ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍであり、二酸化炭素透過係数が約１０００〜２００００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍ、好ましくは約３０００〜１１５００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍであり、さらに好ましくは約５０００〜９０００ｃｍ３／ｍ２・２４ｈｒ・ａｔｍである。
【００１５】
本発明におけるフッ素置換は、ポリマーシートで成型された容器の内表面または／及び外表面と、フッ素含有ガスとを不活性ガス存在下で反応させることで達成されるが、同様の効果が得られる方法であれば、これに限定されるものではない。不活性ガスは、窒素、アルゴンなどフッ素置換反応を阻害しないものであればよい。不活性ガスに対するフッ素ガスの含有量は約０．１〜２０．０容量％、好ましくは約０．１〜１０容量％である。温度条件は約−２０〜１５０℃、好ましくは約０〜４０℃である。反応温度は高いほどフッ素置換の反応速度が増すが、火災などの災害に注意する必要がある。また、圧力条件は、約０．０１〜１０．０ａｔｍ、好ましくは約０．０１〜２．０ａｔｍ、さらに好ましくは常圧付近である。反応時間は、反応温度、圧力条件により異なるが、例えば約２５℃で圧力条件が常圧（大気圧）付近であれば約３０秒〜２００分、好ましくは約１分〜２００分、より好ましくは約１分〜２０分である。
【００１６】
本発明の細胞培養容器は、成型したポリマー容器に直接フッ素置換を施す方法、またはあらかじめフッ素置換したポリマーを容器に成型する方法で製造することができる。ここで、ポリマー容器の製造はプラスチックシートを用いて常法により実施できる。プラスチックシートの厚みは、通常約５０〜３００μmが好適に用いられる。例えば、ポリマー容器がバッグ状である場合、インフレーション法、Ｔダイ法などで可撓性シートを作成し、ヒートシール法によって成型することができる。
【００１７】
成型したポリマー容器に直接フッ素置換を施す方法は、例えばポリマーをインフレーション法やＴダイ法により作成したシートを、細胞懸濁液の流入ポートおよび流出ポートを設けてバッグ状に成型し、該流入ポートおよび流出ポートからバッグ内部に、フッ素を含有した不活性ガスを流すことにより行われる。インフレーション法の条件は、ポリマーの種類によって異なり、例えば、ポリエチレンを使用する場合、溶融温度は約１６０〜１８０℃、引取速度は約１０〜３０ｍ／ｍｉｎでポリエチレンシートを作成することができる。フッ素置換反応は、フッ素ガスを約０．１〜２０．０容量％、好ましくは約０．１〜１０容量％含有した不活性ガスを使用する。
【００１８】
あらかじめフッ素置換したポリマーを容器に成型する方法しては、片面のみがフッ素置換されたポリマーを作成し、該ポリマーのシートにポートを設けた状態でバッグに成型する方法が挙げられる。例えば、特開昭６２−１４０８２１号公報に記載された方法またはこれに準じた方法により片面のみがフッ素置換されたポリマーのシートからバッグを作成することができる。具体的にはポリマーをインフレーション法によりシート状に成型する際に、内部にフッ素ガスを約０．１〜２０．０容量％、好ましくは約０．１〜１０容量％含有した不活性ガスを流すことでフッ素置換反応を行う。インフレーション法における条件は、ポリマーの種類によって異なり、例えば、ポリエチレンを使用する場合、溶融温度は約１６０〜１８０℃、引取速度は約１０〜３０ｍ／ｍｉｎで作成することができる。このようにして得たシートを、温度約１７０〜１９０℃におけるヒートシール法によりバッグ状に成型することにより本発明の細胞培養容器を製造することができる。
【００１９】
さらに、上記フッ素置換反応は、プラズマ処理、コロナ放電処理などの処理と併用することにより、一層効果的に行うことができる。例えば、コロナ放電の場合、電圧約１０〜３０ｋＶ、好ましくは約１５〜２５ｋＶであり、周波数は約１０〜３０ｋＨｚ、約１５〜２５ｋＨｚである。加えて、材料の融点より約２０〜１３０℃低い温度で加熱するとさらに好ましい。加熱方法は、赤外線照射、熱風吹きつけなどが挙げられるが、特に限定されるものではない。
【００２０】
上記製造方法によって得られた細胞培養容器を用いた細胞培養は、常法に従って実施できる。例えば、培養する細胞は、臍帯血細胞、造血幹細胞、リンパ球細胞、ハイブリドーマなどの浮遊細胞、肝細胞などの臓器を形成する実質細胞等が挙げられる。また、用いる培地は市販されている基礎培地でよく、イーグルＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０、ＨａｍＦ１０培地、ＨａｍＦ１２培地などが挙げられる。播種する細胞の濃度は、好ましくは約１．０×１０４〜５．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、さらに好ましくは、約１．０×１０５〜２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌであり、より高密度で培養することができ、細胞の大量培養が可能となる。
【実施例】
【００２１】
以下に本発明を、実施例、実験例により具体的に説明する。
【００２２】
実施例１
直鎖状低密度ポリエチレン（三井化学社製）をＴダイ法によりシート（厚み：１００μm）を作成した。Ｔダイ法における条件は、溶融温度１７０℃、引っ張り速度２５ｍ／ｍｉｎとした。このシートを６×１０センチ四方にカットし、２枚のポリエチレンシートの間に細胞懸濁液の流入ポートおよび流出ポートを設けた状態で重ね、縁部をヒートシール法によりバッグ状に成型することでポリエチレンバッグの細胞培養容器を作成した。この細胞培養容器の流入ポートおよび流出ポートからバッグ内部に、大気圧下、３０℃でフッ素ガス１０容量％を含有した窒素ガスを１分間流すことにより、細胞培養容器を製造した。
【００２３】
実施例２
直鎖状低密度ポリエチレン（三井化学社製）をＴダイ法によりシート（厚み：１００μm）を作成した。Ｔダイ法における条件は、溶融温度１７０℃、引っ張り速度２５ｍ／ｍｉｎとした。このシートを６×１０センチ四方にカットし、２枚のポリエチレンシートの間に細胞懸濁液の流入ポートおよび流出ポートを設けた状態で重ね、縁部をヒートシール法によりバッグ状に成型することでポリエチレンバッグの細胞培養容器を作成した。この細胞培養容器の流入ポートおよび流出ポートからバッグ内部に、大気圧下、３０℃でフッ素ガス１０容量％を含有した窒素ガスを１分または１８０分間流すことにより、細胞培養容器（２種類）を製造した。
【００２４】
実施例３
直鎖状低密度ポリエチレン（三井化学社製）をインフレーション法によりシート（厚み：１００μm）を作成した。インフレーション法における条件は、溶融温度１７０℃、引っ張り速度２５ｍ／ｍｉｎとした。このシートを１０センチ四方にカットし、２枚のポリエチレンシートの間に細胞懸濁液の流入ポートおよび流出ポートを設けた状態で重ね、縁部をヒートシール法によりバッグ状に成型することでポリエチレンバッグの細胞培養容器を作成した。この細胞培養容器の流入ポートおよび流出ポートからバッグ内部に、大気圧下、２５℃でフッ素ガス１５容量％を含有した窒素ガスを１分間流すことにより、細胞培養容器を製造した。
【００２５】
実施例４
直鎖状低密度ポリエチレン（三井化学社製）をインフレーション法によりシート（厚み：１００μm）を作成した。インフレーション法における条件は、溶融温度１７０℃、引っ張り速度２５ｍ／ｍｉｎとした。このシートを１０センチ四方にカットし、２枚のポリエチレンシートの間に細胞懸濁液の流入ポートおよび流出ポートを設けた状態で重ね、縁部をヒートシール法によりバッグ状に成型することでポリエチレンバッグの細胞培養容器を作成した。この細胞培養容器の流入ポートおよび流出ポートからバッグ内部に、大気圧下、２５℃でフッ素ガス５容量％を含有した窒素ガスを５分間流すことにより、細胞培養容器を製造した。
【００２６】
実施例５
直鎖状低密度ポリエチレン（三井化学社製）をインフレーション法によりシート（厚み：１００μm）を作成した。インフレーション法における条件は、溶融温度１７０℃、引っ張り速度２５ｍ／ｍｉｎとした。このシートを１０センチ四方にカットし、２枚のポリエチレンシートの間に細胞懸濁液の流入ポートおよび流出ポートを設けた状態で重ね、縁部をヒートシール法によりバッグ状に成型することでポリエチレンバッグの細胞培養容器を作成した。この細胞培養容器の流入ポートおよび流出ポートからバッグ内部に、大気圧下、２５℃でフッ素ガス１０容量％を含有した窒素ガスを１０分間流すことにより、細胞培養容器を製造した。
【００２７】
実験例１  フッ素ガス処理容器の内表面ポリマーの元素分析値及びガス透過性
実施例１で得られた細胞培養容器、比較対照として、(1)実施例１に記載のフッ素ガスで処理する前のポリエチレン容器（ＰＥ）、(2)フッ素ガスで処理されていないポリテトラフルオロエチレン（厚み：１００μm）容器（ＰＴＦＥ）及び(3)フッ素ガスで処理されていないテトラフルオロエチレン・ヘキサフルオロプロピレン共重合体（厚み：１００μm）容器（ＦＥＰ）の内表面の元素分析値並びに容器の酸素ガス及び二酸化炭素（炭酸ガス）の透過性を測定した。
元素分析値は、蛍光Ｘ線分析（島津蛍光Ｘ線分析装置ＸＲＦ―１７００）を用いて測定した。酸素及び二酸化炭素のガス透過性はJIS K  ７１２６法（ISO 2556に記載の方法）に準拠し、ガス透過性測定装置（ＭＴ−Ｃ３、東洋精機製作所）を用いて測定した。
結果を表１に示す。
表１  内表面ポリマーの元素分析値及びガス透過性
0004632791.tif 000002
供試サンプル（実施例１）は比較対照(1)とほぼ同等のガス透過性を示した。比較対照(3)の酸素透過性は、供試サンプル（実施例１）の約８０％であるが、培養液のｐＨ値維持に必要な二酸化炭素透過性は、供試サンプル（実施例１）の約４０％と低い値であった。
供試サンプル（実施例１）のバッグ状容器の外表面では、フッ素原子が検出限界以下であり、バッグ状容器のフッ素ガス処理によりフッ素原子で置換されている部分は、バッグ状容器の内表面のごく浅い部分であることが示された。
【００２８】
実験例２  細胞増殖試験
実施例１で得られた細胞培養容器、及び比較対照として実施例１に記載のフッ素ガス処理前の直鎖状低密度ポリエチレン容器に、ヒト白血病細胞株のＭＯＬＴ−４細胞を懸濁した１０％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ１６４０培地（ＭＯＬＴ−４細胞株の播種濃度：１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）５ｍｌをそれぞれ加え、３７℃／５％二酸化炭素／９９％ＲＨ（相対湿度）で１０日間培養を行った。培養５日目より、バッグ状容器から培養液の一部をサンプリングし、ヘモサイトメーターによりバッグ状容器内の細胞濃度を算出した。
結果を表２に示す。
表２  ＭＯＬＴ−４細胞濃度（×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）
0004632791.tif 000003
本発明の実施例１の細胞培養容器は、比較対照のフッ素置換されていないポリエチレン容器より優れた細胞増殖能を示すことは明らかである。  
【００２９】
実験例３  細胞増殖試験
実施例２で得られた２種類の細胞培養容器〔フッ素ガス処理時間が１分間で製造された容器（本発明(1)）及びフッ素ガス処理時間が１８０分間で製造された容器（本発明(2)）〕、及び比較対照として市販のポリスチレン製の培養フラスコ（２５ｃｍ２フラスコ、カタログ番号４３０６３９、コーニング社製、米国）に、ヒト白血病細胞株のＭＯＬＴ−４細胞を懸濁した１０％牛胎児血清を含んだＲＰＭＩ１６４０培地（ＭＯＬＴ−４細胞株の播種濃度；１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）５ｍｌを加え、３７℃／５％二酸化炭素／９９％ＲＨ（相対湿度）で、６日間培養を行った。バッグ状容器から培養液の一部をサンプリングし、実験例２に記載の方法と同様な方法によりバッグ状容器内の細胞濃度を算出した。
結果を表３に示す。
表３  ＭＯＬＴ−４細胞濃度
0004632791.tif 000004
本発明の細胞培養容器（フッ素ガス処理時間が１分間）は、明らかに比較対照の容器より優れた細胞増殖倍率を示す。
【００３０】
実験例４  フッ素ガス処理容器の内表面ポリマーの元素分析値及び水接触角
実施例２で得られた２種類の細胞培養容器〔フッ素ガス処理時間が１分間で製造された容器（本発明(1)）及びフッ素ガス処理時間が１８０分間で製造された容器（本発明(2)）〕、及び比較対照として市販のポリスチレン製の培養フラスコ（２５ｃｍ２フラスコ、カタログ番号４３０６３９、コーニング社製、米国）の内表面ポリマーの元素分析値（炭素原子及びフッ素原子）及び水接触角を表４に示す。
元素分析は、実験例１に記載の方法と同様に行い、水接触角はJIS K 6768 （ISO 8296）に記載の方法で測定した。
表４  元素分析値及び水接触角
0004632791.tif 000005
水接触角度から、本発明の細胞培養容器（フッ素ガス処理時間が１分間）の内表面は、やや親水性を示すことが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明の細胞培養容器は、優れた細胞増殖能を有し、培地への異物の混入を抑制し、より効率的な大量細胞培養ができる。