(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中のコムギ内在性ＤＮＡを、ＰＣＲによって検出または定量する方法であって、
前記被検試料中の核酸または前記被検試料から抽出した核酸を鋳型とし、以下の（ｉ）〜（ｖｉｉ）からなる群より選択されるプライマーペアを用いて核酸を増幅する工程と、
（ｉ）配列番号８に記載の塩基配列からなる核酸と配列番号９に記載の塩基配列からなる核酸とからなるプライマーペア、
（ｉｉ）配列番号１０に記載の塩基配列からなる核酸と配列番号１１に記載の塩基配列からなる核酸とからなるプライマーペア、
（ｉｉｉ）配列番号１２に記載の塩基配列からなる核酸と配列番号１３に記載の塩基配列からなる核酸とからなるプライマーペア、
（ｉｖ）配列番号１４に記載の塩基配列からなる核酸と配列番号１５に記載の塩基配列からなる核酸とからなるプライマーペア、
（ｖ）配列番号１６に記載の塩基配列からなる核酸と配列番号１７に記載の塩基配列からなる核酸とからなるプライマーペア、
（ｖｉ）配列番号１８に記載の塩基配列からなる核酸と配列番号１９に記載の塩基配列からなる核酸とからなるプライマーペア、および
（ｖｉｉ）配列番号２０に記載の塩基配列からなる核酸と配列番号２１に記載の塩基配列からなる核酸とからなるプライマーペア、
前記増幅された核酸を検出または定量する工程と、を含む方法。
【請求項２】
被検試料中のコムギをＰＣＲによって検出または定量するためのプライマーペアである以下のいずれかのプライマーペア：
（ｉ）配列番号８に記載の塩基配列からなる核酸と配列番号９に記載の塩基配列からなる核酸とからなるプライマーペア；
（ｉｉ）配列番号１０に記載の塩基配列からなる核酸と配列番号１１に記載の塩基配列からなる核酸とからなるプライマーペア；
（ｉｉｉ）配列番号１２に記載の塩基配列からなる核酸と配列番号１３に記載の塩基配列からなる核酸とからなるプライマーペア；
（ｉｖ）配列番号１４に記載の塩基配列からなる核酸と配列番号１５に記載の塩基配列からなる核酸とからなるプライマーペア、
（ｖ）配列番号１６に記載の塩基配列からなる核酸と配列番号１７に記載の塩基配列からなる核酸とからなるプライマーペア、
（ｖｉ）配列番号１８に記載の塩基配列からなる核酸と配列番号１９に記載の塩基配列からなる核酸とからなるプライマーペア；および
（ｖｉｉ）配列番号２０に記載の塩基配列からなる核酸と配列番号２１に記載の塩基配列からなる核酸とからなるプライマーペア。
【請求項３】
請求項２に記載のプライマーペアを含む、被検試料からＰＣＲによってコムギ内在性ＤＮＡ配列を検出または定量するためのキット。
【請求項４】
さらに、配列番号１から７のいずれか１つに記載の塩基配列からなるＤＮＡおよび遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な配列からなる１以上のＤＮＡを含む環状ＤＮＡを含む、請求項３に記載のキット。
【請求項５】
被検試料における遺伝子組換えコムギの混入率を決定する方法であって、
配列番号１から７のいずれか１つに記載の塩基配列からなるＤＮＡおよび遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な配列からなる１以上のＤＮＡを含む環状ＤＮＡと、被検試料から抽出したＤＮＡとを鋳型とし、請求項２に記載のプライマーペアから選択される少なくとも１つのプライマーペアを用いて定量ＰＣＲを行い、
環状ＤＮＡについての前記定量ＰＣＲの結果を用いて、鋳型ＤＮＡの分子数を求めるための検量線を作成し、
被検試料についての前記定量ＰＣＲの結果と、前記検量線とを用いて、前記被検試料中に含まれる、コムギ内在性ＤＮＡ配列の部分領域の分子数と、少なくとも一種類の遺伝子組換えコムギに特異的なＤＮＡ配列の部分領域の分子数とを求め、
前記遺伝子組換えコムギに特異的なＤＮＡ配列の部分領域の分子数を、前記コムギ内在性ＤＮＡ配列の部分領域の分子数で除して得られる比Ａを求めることを含む、方法。
【請求項６】
前記比Ａと、
遺伝子組換えコムギの標準種子から抽出したＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲを行って求められる、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的なＤＮＡ配列の部分領域の分子数を、コムギ内在性ＤＮＡ配列の部分領域の分子数で除して得られる比Ｂとを用い、
式１００×Ａ／Ｂを計算して、被検試料中の遺伝子組換えコムギの混入率を決定する工程、をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検試料中のコムギの内在性ＤＮＡ配列を検出または定量する方法に関し、特に食品素材および加工食品に含まれる遺伝子組換えコムギの混入率を決定する際に用いるコムギ内在性ＤＮＡの検出または定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本では、現在までにトウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ等について５０種以上の遺伝子組換え農作物（以下「ＧＭＯ」という）が安全性審査を経て輸入や販売を認められている。これに伴って、ＧＭＯ含有食品は、「遺伝子組換えに関する表示に係る加工食品品質表示基準第７条第１項及び生鮮食品品質表示基準第７条第１項の規定に基づく農林水産大臣の定める基準」（平成１２年３月３１日農林水産省告示第５１７号）、及び「食品衛生法施行規則及び乳及び乳製品の成分規格等に関する省令の一部を改正する省令等の施行について」（平成１３年３月１５日厚生労働省食発第７９号）に基づき、その表示が義務化されている。【０００３】
しかし、海外では、一度安全性評価が終了するとＧＭＯと非ＧＭＯが混在する形で栽培されることもあり、収穫後の流通の過程でも混入の可能性が否定できない。また、食品メーカ等は、加工食品の製造を製造業者に委託することも多く、仮に非ＧＭＯを使用するように指定して委託しても、製造業者の工場でＧＭＯも使用している場合は、このＧＭＯが加工食品に微量混入してしまうことがある。従って、表示の義務を遵守するためには、食品メーカ等は、完成した加工食品中にもＧＭＯが混入していないかどうか検査分析して確認することが求められる。【０００４】
加工食品およびその原料等の被検試料中のＧＭＯの検出方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）によって組換えＤＮＡ
を検出する方法、ＥＬＩＳＡ法によって組換え蛋白質を検出する方法があるが、加工食品の場合、加熱や加圧によって蛋白質が変性していることが多く、ＥＬＩＳＡ法では正確な検出ができないことが多いので、ＰＣＲ法により検出が行われる。【０００５】
検査分析する方法として、ＪＡＳ分析試験ハンドブック 遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル改訂第２版（非特許文献１）に記載される方法や、『組換えＤＮＡ技術応用食品の検査方法について（一部改正）』（平成１５年６月１８日厚生労働省食発第０６１８００２号）に記載される方法がある。これらによれば、ＧＭＯの検査分析においては、被検試料から抽出したＤＮＡでＰＣＲ増幅ができることを確認する目的で、各農産物の内在性ＤＮＡを検知するプライマーペアを用いてＰＣＲ法を行い、予想される長さのＰＣＲ産物が得られることを確認する必要があることが記載されている。また、被検試料中に含まれるＧＭＯを定量する場合には、その農産物が必ず持っている内在性ＤＮＡに対する組換えＤＮＡの存在比率から、組換え体の混入率を相対的に測定する方法が用いられる。【０００６】
例えばトウモロコシでは、５系統の承認ＧＭＯ品種それぞれに対して特異的な検知プライマーペアのほか、トウモロコシの内在性ＤＮＡとしてＳＳＩＩＢ遺伝子の領域を検知するプライマーペアが開発されている（非特許文献１）。このプライマーペアは、組換えＤＮＡの検出および定量において、内在性ＤＮＡ量の基準となるものであるため、増幅される内在性ＤＮＡの領域はゲノムにおいてシングルコピーであるとされている。【０００７】
『組換えＤＮＡ技術応用食品の検査方法について（一部改正）』（平成１５年１１月１３日食安発第１１１３００１号）では、定量ＰＣＲ法を行う際、トウモロコシまたはダイズの内在性ＤＮＡ及び組換えＤＮＡを標的とした特異的プライマー対により増幅された増幅産物をプラスミド上に連結したものを標準物質として使用している。かかる標準物質を用いて定量ＰＣＲ法を行うことにより、被検試料について一定時間定量ＰＣＲを行った場合に組換えＤＮＡのコピー数と内在性ＤＮＡのコピー数との比を正確に求めることができる。【０００８】
トウモロコシのように複数の系統のＧＭＯ品種が存在する場合には、各系統に特異的なＤＮＡと内在性ＤＮＡとを一つの環状ＤＮＡに組み込んだ標準物質を用いれば、各系統の混入率の測定において共通の標準物質を用いることができ、特に有用である。【０００９】
また、一般に、各系統に特異的な遺伝子は入手が困難であるが、一度これらを組み込んで環状ＤＮＡを作製すれば、環状ＤＮＡ自体を複製することによって、系統特異的なＤＮＡを安定して供給することも可能となる。
【非特許文献１】ＪＡＳ分析試験ハンドブック 遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル改訂第２版  （独立行政法人  農林水産消費技術センター）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
一方、パンコムギ（以下「コムギ」ということがある）について、現在のところ安全性審査を経た遺伝子組換え品はないが、近い将来の上市が予想される。このため、コムギのＧＭＯが流通した場合に備えて、コムギの内在性ＤＮＡを検出および定量する方法およびこれに用いるＰＣＲ用プライマーペアの開発が求められている。しかし、コムギの場合には、同じ穀物の中にゲノム構造やコードされる遺伝子の塩基配列について相同性の高い麦類、例えばオオムギ、ライムギ、オーツムギなどがある。さらに、一般的なコムギ（パンコムギ）の他に、デュラムコムギが存在する。特にデュラムコムギは、パンコムギが有するゲノム（ＡＡ、ＢＢ、ＤＤ）のうちのゲノム（ＡＡ、ＢＢ）を有するため、パンコムギとの相同性が非常に高く、誤検出してしまう可能性が高い。このため、デュラムコムギや他のムギ類を始めとする他の作物由来のＤＮＡを誤検出せず、パンコムギの内在性ＤＮＡのみを特異的に検出できる、すなわち他の作物と交叉性が無い方法が求められている。【００１１】
また、ＰＣＲ法により増幅する内在性ＤＮＡ領域がマルチコピーであると、被検試料中のコムギを正確に定量できず、被検試料中のＧＭＯコムギの混入率を正確に定量するためには増幅される内在性ＤＮＡの領域はゲノムにおいてシングルコピーであることが望ましい。【００１２】
さらに、定量ＰＣＲ法によってＧＭＯ混入率を求める場合は、コムギについても、内在性遺伝子ＤＮＡ及び組換えＤＮＡを標的とした特異的プライマー対により増幅可能な領域を環状ＤＮＡ上に連結した標準物質も有用である。【００１３】
そこで、本発明は、シングルコピーで、かつＰＣＲにおいて他の植物との交叉性なくコムギを特異的に検出できるコムギＤＮＡ（ゲノム）の部分領域を特定し、この部分領域を増幅するためのプライマーと、これらを用いた内在性ＤＮＡの好適な検出・定量方法とを提供することを目的とする。【００１４】
さらに、本発明は、コムギ内在性ＤＮＡ及び組換えＤＮＡを標的とした特異的プライマー対により増幅可能な領域を環状ＤＮＡ上に連結した標準物質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、コムギのゲノムＤＮＡにおいて、ＷａｘｙＤ遺伝子の非転写領域、スクローストランスポーターをコードするＴａＳＵＴ１Ｄ遺伝子の領域、カルボキシペプチダーゼIIIをコードするＣｂｐIII遺伝子の領域、ＧＳＳ（Genome  Survey  Sequence）配列、およびＬｒ１遺伝子（Leaf rust resistance gene）領域は、シングルコピーであり、かつＰＣＲ反応において他の植物との交叉性が無く、それを増幅することによってコムギ内在性ＤＮＡ配列を特異的に検出または定量できる部分領域が存在することを見出し、本発明を完成させた。【００１６】
即ち、本発明は、
［１］被検試料中のコムギ内在性ＤＮＡを、ＰＣＲによって検出または定量する方法であって、前記被検試料中の核酸または前記被検試料から抽出した核酸を鋳型とし、配列番号１から７のいずれか１つに記載の塩基配列の少なくとも８０％以上の領域を増幅可能なプライマーペアを用いて前記領域の核酸を増幅する工程、および前記増幅された核酸を検出または定量する工程を含む方法；
［２］前記プライマーペアが、（i）配列番号８に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号９に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（ii）配列番号１０に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号１１に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（iii）配列番号１２に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号１３に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（iv）配列番号１４もしくは１６に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号１５もしくは１７に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（v）配列番号１８に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号１９に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（vi）配列番号２０に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号２１に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、および（vii）前記（i）〜（vi）のプライマーペアのそれぞれにおいて、各核酸が有する塩基配列の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸のペアからなるプライマーペア、からなる群から選択されるプライマーペアである上記［１］記載の方法；
［３］前記プライマーペアに含まれるプライマーが１５〜４０塩基長の核酸である上記［１］または［２］記載の方法；
［４］被検試料中のコムギをＰＣＲによって検出または定量するためのプライマーペアであって、配列番号１から７のいずれか１つに記載の塩基配列の少なくとも８０％を含む領域を増幅可能であることを特徴とするプライマーペア；
［５］（i）配列番号８に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号９に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（ii）配列番号１０に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号１１に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（iii）配列番号１２に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号１３に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（iv）配列番号１４もしくは１６に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号１５もしくは１７に記載の塩基配列を含む核酸とで構成されるプライマーペア、（v）配列番号１８に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号１９に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（vi）配列番号２０に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号２１に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、および（vii）前記（i）〜（vi）のプライマーペアのそれぞれにおいて、各核酸が有する塩基配列の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸のペアからなるプライマーペア、からなる群より選択される上記［４］記載のプライマーペア；
［６］上記［４］または［５］に記載のプライマーペアを含む、被検試料からＰＣＲによってコムギ内在性ＤＮＡ配列を検出または定量するためのキット；
［７］遺伝子組換えコムギおよび非遺伝子組換えコムギが共通して有する内在性ＤＮＡと、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な配列からなる１以上の遺伝子組換えコムギ特異的ＤＮＡとを含む環状ＤＮＡ；
［８］配列番号１から７のいずれか１つに記載の塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡを含む環状ＤＮＡ；
［９］上記［４］または［５］に記載のプライマーペアを用いてＰＣＲにより増幅可能な領域を含む環状ＤＮＡ；
［１０］さらに、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的な配列からなる１以上のＤＮＡを含む、上記［９］または［１０］に記載の環状ＤＮＡ；
［１１］被検試料における遺伝子組換えコムギの混入率を決定する方法であって、上記［７］から［１０］のいずれか１項に記載の環状ＤＮＡと、被検試料から抽出したＤＮＡとを鋳型として定量ＰＣＲを行い、環状ＤＮＡについての前記定量ＰＣＲの結果を用いて、鋳型ＤＮＡの分子数を求めるための検量線を作成し、被検試料についての前記定量ＰＣＲの結果と、前記検量線とを用いて、前記被検試料中に含まれる、コムギ内在性ＤＮＡ配列の部分領域の分子数と、少なくとも一種類の遺伝子組換えコムギに特異的なＤＮＡ配列の部分領域の分子数とを求め、前記遺伝子組換えコムギに特異的なＤＮＡ配列の部分領域の分子数を、前記コムギ内在性ＤＮＡ配列の部分領域の分子数で除して得られる比Ａを求めることを含む、方法；
［１２］前記比Ａと、遺伝子組換えコムギの標準種子から抽出したＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲを行って求められる、遺伝子組換えコムギの各系統に特異的なＤＮＡ配列の部分領域の分子数を、コムギ内在性ＤＮＡ配列の部分領域の分子数で除して得られる比Ｂとを用い、式１００×Ａ／Ｂを計算して、被検試料中の遺伝子組換えコムギの混入率を決定する工程、をさらに含む、上記［１１］に記載の方法；
［１３］前記定量ＰＣＲに、上記［４］または［５］に記載のプライマーペアから選択される少なくとも１つのプライマーペアを用いる、上記［１１］または［１２］に記載の方法、に関する。【００１７】
本発明の方法は、食品素材および加工食品等の被検試料中のコムギの存在およびその量の正確な情報を与えるものであり、従って、本発明の方法に用いるＰＣＲ用プライマーペアは、コムギを特異的に検出し、コムギ以外の作物、例えばコメ、オオムギ、ライムギ、オーツムギ、ミノリムギ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ、トマト、ナス、アワ、キビ、ソバ、ナタネ等は交叉反応しないことが必要である。また、本発明のプライマーペアにより増幅すべき内在性ＤＮＡの領域は、シングルコピーであることが望ましい。【００１８】
ここで、検査法において、ＰＣＲ用プライマーペアがコムギ以外の作物と交叉反応すると、コムギ検出の偽陽性の可能性が生じるばかりでなく、被検試料中のコムギ内在性ＤＮＡの正確な定量は困難である。また、該内在性ＤＮＡ領域がマルチコピーであると、同様にコムギ内在性ＤＮＡを正確に定量できない。故に、そのような方法およびプライマーペアは、正確なＧＭＯコムギの混入率を決定することができない。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、食品素材および加工食品等の被検試料から、他の作物と交叉することなくコムギ内在性ＤＮＡを特異的に検出または定量することができる方法および該方法に用いるＰＣＲ用プライマーペアが提供される。該方法は、コムギ以外の穀物と相同性が低く、かつゲノム上でシングルコピーであるコムギ内在性ＤＮＡ配列の特異的な部分領域を、ＰＣＲによって検出または定量する。【００２０】
また、本発明により提供されるＧＭＯコムギ検知のための標準物質を用いることにより、定量ＰＣＲ法で、被検試料中のＧＭＯコムギの混入率をＧＭＯ系統別に精度良く求めることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に、本明細書において用いる用語の意味等を示し、本発明を詳細に説明する。【００２２】
本明細書において、用語「コムギ」は特にことわりがない限りパンコムギを意味する。【００２３】
本発明の方法は、コムギの内在性ＤＮＡ配列として、コムギのゲノム上のＷａｘｙＤ遺伝子の非転写領域とその３’上流領域（配列番号１６）、ＴａＳＵＴ１Ｄ遺伝子（Accession NO.AF408845）、ＣｂｐIII遺伝子（Accession NO.J02817）、Ｌｒ１遺伝子（Accession NO.S79983）、ＧＳＳ配列（Accession NO. AJ440705）の領域の特定部分を検出するものである。【００２４】
Ｗａｘｙ遺伝子は、コムギの４Ａ、７Ａ、７Ｄ染色体それぞれに１セットずつ、計３セット存在することが知られている（特開２００３−２８４５９８、Ainsworth, C. et al.: Plant Mol. Biol. 1993 Apr; 22(1):67-82）。加工食品中のコムギゲノムからＷａｘｙＤ遺伝子の全長を検出するのは困難であり、無作為に短い部分配列を選択すると、その領域はマルチコピーである可能性がある。【００２５】
本発明者らは、ＷａｘｙＤ遺伝子の非転写領域の塩基配列（配列番号２２）を決定し、その領域中にゲノムＤにのみ存在する、シングルコピーである領域があることを見出し、そのうちの１０１ｂｐの部分をＷｘ０１１領域とした（配列番号２）。また、１０２ｂｐの部分をＷｘ０１２領域とした（配列番号１）とした。本発明に係る方法では、Ｗｘ０１１領域またはＷｘ０１２領域の少なくとも８０％を含む領域をＰＣＲで増幅することによってＷａｘｙＤ遺伝子を検出・定量する。【００２６】
ＴａＳＵＴ遺伝子は、スクローストランスポーター遺伝子として知られ、コムギＡ、Ｂ、Ｄ染色体のそれぞれに塩基配列の相同性が非常に高いＴａＳＵＴ遺伝子が１コピーずつ存在するとの報告がある（Aoki, N. et al.: Plant Moleculer Biology 50:453-462, 2002）。しかし、本発明において、ゲノムＤのＴａＳＵＴ１Ｄ遺伝子の領域のうち、ｓｕｔ０１領域（配列番号３）およびｓｕｔ０２領域（配列番号４）がＤ染色体のみに存在するシングルコピー領域である可能性が見出された。そこで、本発明はまた、ｓｕｔ０１領域（配列番号３）および／またはｓｕｔ０２領域（配列番号４）の少なくとも８０％を含む領域をＰＣＲで増幅することによってＴａＳＵＴ１Ｄ遺伝子を検出・定量する方法に関する。【００２７】
本発明において、ゲノムのＣｂｐIII遺伝子の領域のうち、１００ｂｐのＣｂｐIII０１４領域（配列番号５）がシングルコピーである可能性が高く、定性ＰＣＲにおいて他の植物品種とほとんど交叉性がないことが確認された。そこで、本発明は、ＣｂｐIII０１４領域（配列番号５）の少なくとも８０％を含む領域をＰＣＲで増幅することによってＣｂｐIII遺伝子を検出・定量する方法に関する。【００２８】
コムギのＧＳＳ領域とは、ゲノム解析のプロモーターの様な役割を果たすＤＮＡをいう。本発明において、ＧＳＳ領域中、１１１ｂｐのｇｓｓ０１領域（配列番号６）は、シングルコピーである可能性が高く、定性ＰＣＲにおいて他の植物品種とほとんど交叉性がないことが確認された。そこで、本発明は、ｇｓｓ０１（配列番号６）領域の少なくとも８０％を含む領域をＰＣＲで増幅することによってｇｓｓ０１領域を検出・定量する方法に関する。【００２９】
本発明において、コムギゲノムのＬｒ１遺伝子の領域のうち、１１１ｂｐのＬｒ１０１領域（配列番号７）は、シングルコピーである可能性が高く、定性ＰＣＲにおいて他の植物品種とほとんど交叉性がないことが確認された。そこで、本発明はＬｒ１０１（配列番号７）領域の少なくとも８０％を含む領域をＰＣＲで増幅することによって、Ｌｒ１遺伝子を検出・定量する方法に関する。【００３０】
このように、上記Ｗｘ０１１領域、Ｗｘ０１２領域、ｓｕｔ０１領域、ｓｕｔ０２領域、ＣｂｐIII０１４領域、ｇｓｓ０１領域、およびＬｒ１０１領域は、それぞれ約１００〜１３０ｂｐと短いため、ＤＮＡが断片化されている可能性のある加工食品等の試料からもコムギ内在性ＤＮＡの検出および定量が可能である。【００３１】
尚、本願明細書において、「配列番号１から７のいずれか１つに記載の塩基配列の少なくとも８０％を含む領域」とは、配列番号１から７のいずれか１つに記載の塩基配列の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含むより短い領域、または配列番号１から７のいずれか１つに記載の塩基配列とさらにゲノム上における５’側および／または３’側の塩基配列を含み、かつ全長の少なくとも８０％が配列番号１から７のいずれか１つに記載の塩基配列を占めるより長い領域を意味する。かかる領域はシングルコピー領域を少なくとも８０％包含するため、配列番号１から７に記載の塩基配列より短い領域あるいは長い領域であっても、適切なプライマーペアを選択することにより、予測された長さのＰＣＲ産物が得られ、これによりコムギ内在性ＤＮＡを検出および／または定量することができる。【００３２】
本発明においてＰＣＲ法に用いるプライマーペアは、Ｗｘ０１１領域、Ｗｘ０１２領域、ｓｕｔ０１、ｓｕｔ０２領域、ＣｂｐIII０１４領域、ｇｓｓ０１領域、Ｌｒ１０１領域のいずれかの領域の少なくとも８０％の領域を増幅できるプライマーペアであれば特に限定されず、増幅しようとする領域の塩基配列に基づいて、プライマー作成上の基本ルールを遵守して設計することができる。その際、各プライマーのＴｍ値の統一を図ることに留意する。また、各プライマーの長さは、通常は１５〜４０ｂｐ、好ましくは１５〜３０ｂｐとする。【００３３】
ＰＣＲ用プライマーペアがコムギ以外の作物と交叉反応すると、コムギ検出の偽陽性の可能性が生じるばかりでなく、被検試料中のコムギ内在性ＤＮＡ配列の正確な定量は困難である。また、該内在性ＤＮＡ配列がマルチコピーであると、同様にコムギ内在性ＤＮＡ配列を正確に定量できない。故に、そのような方法およびプライマーペアは、正確なＧＭＯコムギの混入率を決定することができない。【００３４】
本発明の方法は、食品素材および加工食品等の被検試料中のコムギの存在およびその量の正確な情報を与えるものであり、従って、本発明の方法に用いるＰＣＲ用プライマーペアは、コムギを特異的に検出し、コムギ以外の作物、例えばコメ、デュラムコムギ、オオムギ、ライムギ、オーツムギ、ミノリムギ、トウモロコシ、ダイズ、ジャガイモ、トマト、ナス、アワ、キビ、ソバ、ナタネ等は交叉反応しないことが必要である。【００３５】
このようなプライマーペアとしては、例えば（i）配列番号８に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号９に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（ii）配列番号１０に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号１１に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（iii）配列番号１２に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号１３に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（iv）配列番号１４もしくは１６に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号１５もしくは１７に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（v）配列番号１８に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号１９に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（vi）配列番号２０に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号２１に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、および（vii）前記（i）〜（vi）のプライマーペアのそれぞれにおいて、各核酸が有する塩基配列の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸のペアからなるプライマーペア等が挙げられる。これらのプライマーペアは、Ｗｘ０１１領域、Ｗｘ０１２領域、ｓｕｔ０１、ｓｕｔ０２領域、ＣｂｐIII０１４領域、ｇｓｓ０１領域、Ｌｒ１０１領域のいずれかの領域を、他の作物と交叉性なく、特異的に増幅することができる。【００３６】
なお、「各プライマーの塩基配列の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸からなるプライマー」は、配列番号８〜２１に示される塩基配列の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含み、場合によりゲノムの塩基配列において５’側および／または３’側にシフトした、全長が短い、長いあるいは全く同じであるプライマーを意味する。このため、上記（vii）のプライマーペアでは、配列番号８〜２１に記載の塩基配列からなる核酸プライマーのうち、前方プライマー、後方プライマーまたはその両方を前述の条件に従って改変することができる。ただし、これらのプライマーは配列番号８〜２１の塩基配列を少なくとも８０％包含するため、（i）〜（vi）のプライマーペアと同様に、Ｗｘ０１１領域、Ｗｘ０１２領域、ｓｕｔ０１、ｓｕｔ０２領域、ＣｂｐIII０１４領域、ｇｓｓ０１領域、Ｌｒ１０１領域のいずれかの領域を、他の作物と交叉性なく、特異的に増幅することができる。【００３７】
本発明で用いられる被検試料は、コムギを含むまたは含む可能性のある食品素材および加工食品であり、例えばコムギの生の種子、乾燥種子、小麦粉やミックス粉などの食品原料やその加工中間原料、パン類や麺類などの加工食品が含まれる。また、食品素材または食品はヒトの食品のみならず、ペットフードや飼料を含む。さらに、コムギ以外の作物は、食品素材、食品原料として用いられる全ての作物を意味し、例えば上述した作物である。【００３８】
このような試料は、例えばそのまま、または粉砕して核酸抽出に供してもよく、洗浄して乾燥させてから破砕して核酸抽出に供してもよい。被検試料から抽出して分析に用いる核酸は通常はＤＮＡである。ＤＮＡは公知の任意の方法によって抽出してもよいが、現在は多数のＤＮＡ抽出キットが市販されており、これらを用いて抽出することができる。例えばＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、ＪＡＳ分析試験ハンドブック  遺伝子組換え食品検査・分析マニュアル改訂第２版（独立行政法人  農林水産消費技術センター）に記載された方法に従って被検試料からＤＮＡを抽出する。抽出したＤＮＡは、吸光度の測定などにより濃度を求め、ＰＣＲに好適な濃度まで希釈して用いることが好ましい。【００３９】
本発明の方法において、ＰＣＲは、使用するプライマーやＤＮＡポリメラーゼを考慮して常法に従って行うことができる。その際に、ＰＣＲ緩衝液、ｄＮＴＰ，ＭｇＣｌ2等の試薬は調製してもよいし、市販のＰＣＲキットを用いてもよい。ＰＣＲには、上記プライマーペアを一組または二組を以上用いてもよい。また、ＰＣＲ条件は、例えば９５℃３０秒、６３℃３０秒、７２℃３０秒を１サイクルとして４０サイクル行い、最後に終了反応として７２℃７分間という条件が挙げられるが、用いるプライマーのＴｍや増幅すべき領域の長さ、鋳型ＤＮＡの濃度などを考慮して適宜変更することができる。【００４０】
増幅された核酸（ＰＣＲ産物）の検出は、特定のＤＮＡ断片を同定しうる任意の方法、具体的にはアガロースゲル電気泳動、アクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、ハイブリダイゼーション、免疫学的方法などを用いて実施することができる。一般的には、ＰＣＲ産物を電気泳動し、その泳動パターンにより確認するが、例えばエチジウムブロミドを含む０．８％のアガロースゲルによる電気泳動を行い、バンドを確認することによって検出することができる。【００４１】
本発明は、上述の検出または定量方法で用いるプライマーペア、およびそれらのプライマーペアを含むキットを含む。プライマーは常法に従って製造することができる。また、キットはプライマーペアのほか、他の試薬、例えばｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ2、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼ、緩衝液（例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ）、グリセロール、ＤＭＳＯ、ポジティブコントロール用ＤＮＡ、ネガティブコントロール用ＤＮＡ、蒸留水等を包含してもよい。これらの試薬はキットの中で、それぞれ独立に梱包されて提供されてもよいし、２種以上の試薬が混合された形で提供されてもよい。キット中のそれぞれの試薬の濃度に特に制限はなく、本発明のＰＣＲを実施するについて可能な範囲であればよい。また、キットには、好適なＰＣＲ条件等の情報がさらに添付されていてもよいし、プライマー試薬のみであってもよい。【００４２】
また、本発明は、ＧＭＯコムギの混入率を定量ＰＣＲ法によって測定する際に有用な、標準物質を提供する。この標準物質は、Ｎｏｎ-ＧＭＯコムギとＧＭＯコムギとが共通して有する内在性ＤＮＡと、１以上のＧＭＯコムギ特異的ＤＮＡとを、１つの環状ＤＮＡ上に連結したものである。【００４３】
本発明に係る標準物質は、例えば、内在性ＤＮＡとして、配列番号１から７のいずれか１つに記載の塩基配列と少なくとも８０％の相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡを含む環状ＤＮＡであってもよい。【００４４】
また、例えば、（i）配列番号８に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号９に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（ii）配列番号１０に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号１１に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（iii）配列番号１２に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号１３に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（iv）配列番号１４もしくは１６に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号１５もしくは１７に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（v）配列番号１８に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号１９に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、（vi）配列番号２０に記載の塩基配列を含む核酸と配列番号２１に記載の塩基配列を含む核酸とからなるプライマーペア、および、（vii）前記（i）〜（vi）のプライマーペアのそれぞれにおいて、各核酸が有する塩基配列の少なくとも８０％の連続した塩基配列を含む核酸のペアからなるプライマーペア、からなる群から選択されるプライマーペアによって増幅されうる領域を、内在性ＤＮＡとして含む環状ＤＮＡであってもよい。【００４５】
標準物質として用いられる環状ＤＮＡは、内在性ＤＮＡおよびＧＭＯコムギの系統特異的ＤＮＡを挿入できるものであれば特に限定されず、例えば、ｐＢＲ系ベクター（例；ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２８等）、ｐＵＣ系ベクター（ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８等）、λファージ系ベクター（λｇｔ１０、λｇｔ１１等）、これらに改変を加えた市販のベクター等を用いることができる。【００４６】
ＧＭＯコムギを検出する場合は、遺伝子組換えにより普通コムギゲノムに挿入された外来ＤＮＡ配列のみを増幅して検出するのではなく、外来ＤＮＡ配列の上流および下流の内在性配列を含む領域を増幅する必要がある。他の作物にも、同一の外来ＤＮＡ配列を挿入してＧＭＯ作物を作製する場合があるため、外来ＤＮＡ配列のみ検出すると、ＧＭＯコムギ由来なのか、他の作物の遺伝子組換え体なのかが判別できないからである。従って、ＧＭＯ系統特異的配列を検出するためのプライマーは、各系統のＧＭＯコムギに挿入された外来ＤＮＡ配列とその上流および下流の内在性配列を含む領域を増幅できるプライマーである必要がある。かかるプライマーは、例えばダイズについて報告された文献（Wurz, A. et al.; 2nd Status report. BgVV, BgVV-Heft, 1/199797,118、またはKopell, E. et al.; Mitt. Gebiete Levensm, Hyg., 88, 164等を参照）に記載の方法またはそれに準じた方法に従って、作製される。上記標準物質に挿入されるＧＭＯコムギの各系統に特異的な配列は、かかるプライマーで増幅できるＤＮＡ配列が選択される。【００４７】
標準物質に挿入するコムギ内在性ＤＮＡと、ＧＭＯコムギ特異的ＤＮＡとが決定されたら、普通コムギゲノムまたはＧＭＯコムギゲノムを鋳型としたＰＣＲを行って、内在性ＤＮＡおよびＧＭＯコムギ特異的ＤＮＡをクローニングし、クローニングしたＤＮＡ断片と上記環状ＤＮＡのクローニングサイトとを同一の制限酵素で切断することにより、該ＤＮＡ断片を該環状ＤＮＡの切断された部位に連結することができる。制限酵素は、公知のものを適宜選択して使用することができ、例えば、EcoRI、SpeI、EcoRV、SmaI、SacI、NotI、HindIII、XhoI等が用いられる。【００４８】
こうして作製された標準物質を含む溶液について、２種以上の希釈系列を作り、それぞれについて定量的ＰＣＲを行うと、コムギ内在性ＤＮＡ配列、ＧＭＯ特異的ＤＮＡ配列の部分領域のそれぞれについて、検量線を求めることができる。さらに、本発明に係る標準物質は、定性ＰＣＲにおけるコムギ内在性ＤＮＡ配列またはＧＭＯ特異的ＤＮＡ配列のポジティブコントロールとしても利用することができる。【００４９】
本発明は、上述の標準物質を用いたＰＣＲにより、被検試料中におけるＧＭＯコムギの混入率を決定する方法を包含する。【００５０】
該方法では、まず、上述の標準物質と、被検試料から抽出したＤＮＡとを鋳型として定量ＰＣＲを行い、標準物質についての定量的ＰＣＲの結果を用いて、鋳型ＤＮＡの分子数を求めるための検量線を作成する。【００５１】
定量的ＰＣＲでは、データとしてＣｔ値が得られる。Ｃｔ値とは、定量ＰＣＲの増幅産物量の変化を経時的にとった場合に、増幅が指数関数的に起こるところで一定の増幅産物量になるサイクル数（threshold Cycle）のことである。このＣｔ値を、被検試料中にＰＣＲを行う前に含まれていたＤＮＡの初期分子数（鋳型ＤＮＡの分子数）に変換するために、上記検量線を利用することができる。【００５２】
検量線は、例えばＣｔ値を縦軸に、希釈系列に含まれる標準物質の分子数の対数を横軸にとって、公知の方法またはそれに準ずる方法に従って作成することができる。例えば、上記標準物質を様々な濃度で含む希釈系列を作成し、一定時間定量的ＰＣＲを行った後のそれぞれのＣｔ値を求めて、作成することが可能である。【００５３】
一方、前記被検試料中に含まれた、コムギ内在性ＤＮＡ配列の部分領域の初期分子数および、遺伝子組換えコムギに特異的なＤＮＡ配列の部分領域の分子数は、被検試料について行った定量的ＰＣＲの結果、即ちＣｔ値から、上述の検量線を用いて求めることができる。【００５４】
こうして、得られた遺伝子組換えコムギに特異的なＤＮＡ配列の部分領域の分子数を、コムギ内在性ＤＮＡ配列の部分領域の分子数で除して得られる比Ａを求め、遺伝子組換えコムギの標準種子を用いた定量的ＰＣＲを行って求められる、ＧＭＯコムギの各系統に特異的なＤＮＡ配列の部分領域の分子数を、コムギ内在性ＤＮＡ配列の部分領域の分子数で除して得られる比Ｂを用い、式１００×Ａ／Ｂを計算して、被検試料中の遺伝子組換えコムギの混入率を決定することができる。上記比Ｂは、非特許文献１において「内標比」と呼ばれるものであり、純粋なＧＭ系統毎の種子から抽出したＤＮＡ中の（組換え遺伝子）／（内在性遺伝子）の比率である。内標比は、各組換え系統種子中で一定の比率を示す。【００５５】
本発明に係るＧＭＯコムギ混入率の決定方法において行われる各ＰＣＲ工程は同時に実施することもできるし、別々に実施してもよい。それぞれ別にＰＣＲ工程を行う場合は、検量線を求めるために行ったＰＣＲと、核酸の増幅効率が略同一となる条件で行うことが好ましい。かかる条件としては、例えば、検量線を作成するために行ったＰＣＲの温度およびサイクルを同一とする条件が挙げられる。
【実施例１】
【００５６】
ＷａｘｙＤ遺伝子の検出
ＷａｘｙＤ遺伝子の非転写領域である１０１ｂｐのＷｘ０１１領域（配列番号２）、１０２ｂｐのＷｘ０１２領域（配列番号１）を増幅することにより検出した。
［１］プライマーの設計
プライマーは、プライマー設計ソフトＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（アプライドバイオシステムズ社）によって設計した。プライマーのデザインに当たっては、プライマー作製上の基本ルールを遵守し、各プライマーのＴｍ値の統一を図る他、ＤＮＡが断片化している加工食品からの検知を鑑みＰＣＲによる増幅産物が１００〜１５０ｂｐ程度になるように、またプライマーの塩基数が１８〜２５ｂｐとなるようにした。その結果、５’プライマーＷｘ０１１−５’（配列番号８）と３’プライマーＷｘ０１１−３’（配列番号９）、および５’プライマーＷｘ０１２−５’（配列番号１０）と３’プライマーＷｘ０１２−３’（配列番号１１）を得た。
［２］ＤＮＡの抽出
ＰＣＲの鋳型ＤＮＡサンプルとしては、コムギサンプルとして、コムギ２銘柄（１ＣＷ、ＷＷ）４品種（Ｎ６１を含む）および市販の小麦粉（日清製粉社製『カメリヤ』）から抽出したＤＮＡを用い、比較例として、コメ、トウモロコシ、アワ、キビ、ソバ、オオムギ２品種、ライムギ、オーツムギ、ダイズ、ナタネ、トマト、ナス、デュラムコムギ４品種（以下「デュラム品種Ａ〜Ｄ」という。）、１銘柄（ＣＡＤ）から抽出したＤＮＡを用いた。
コムギ、その他の植物試料について、１％ＳＤＳ(和光純薬)により洗浄、蒸留水によるすすぎ後、それぞれよく乾燥させ、次にマルチビーズショッカー（安井機械）を用いて微粉砕した。粉砕サンプル１ｇをＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）に供し、上記非特許文献１に記載されたトウモロコシのＤＮＡ抽出のプロトコルに従ってＤＮＡを抽出した。なお、デュラムコムギは各品種４粒ずつを無作為に選び、穀粒1粒ずつから該キットを用いて、該キットのプロトコルに従ってＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは吸光度から濃度を測定した後、その一部を純水で１０ｎｇ／μＬに希釈し、これをＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡ試料液として用いた。
［３］ＰＣＲ反応と電気泳動
ＰＣＲ反応液は以下のように調製した。すなわちＰＣＲ緩衝液（ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒＩＩ、アプライドバイオシステムズ社），２００μｍｏｌ／Ｌ  ｄＮＴＰ，１.５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ2，０.５μｍｏｌ／Ｌ  ５’および３’プライマー，および０.６２５単位  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ  Ｔａｑ  Ｇｏｌｄ，アプライドバイオシステムズ社）を含む液に１０ｎｇ／μＬに調整したＤＮＡ試料液２.５μＬを加え、全量を２５μＬとした。
ＰＣＲ増幅装置としてＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ９６００（アプライドバイオシステムズ社）を用い、反応条件は次のように設定した。まず９５℃に１０分間保ち反応を開始させ、次に９５℃３０秒間、６３℃３０秒間、７２℃３０秒間を１サイクルとして、４０サイクルのＰＣＲの増幅を行った。最後に終了反応として７２℃７分間保った後４℃で保存し、得られた反応液をＰＣＲ増幅反応液とした。
ＰＣＲ増幅反応液はエチジウムブロミドを含む０.８％アガロースゲル電気泳動に供した。コムギと他の作物の検知試験について、Ｗｘ０１１−５’／Ｗｘ０１１−３’の結果を図１に示し、Ｗｘ０１２−５’／Ｗｘ０１２−３’の結果を図２に示す。【００５７】
プライマーペアＷｘ０１１−５’／Ｗｘ０１１−３’、Ｗｘ０１２−５’／Ｗｘ０１２−３’のいずれでも、コムギサンプル（レーン１〜４）には、予想されたサイズのシングルバンドを検出し、コムギ以外のレーンにはバンドが認められなかった。このことから、プライマーペアＷｘ０１１−５’／Ｗｘ０１１−３’またはＷｘ０１２−５’／Ｗｘ０１２−３’を用いれば、他の作物と交叉性なく、コムギ内在性ＤＮＡとしてＷｘ０１１領域またはＷｘ０１２領域を検出できることが確認された。【００５８】
また、プライマーペアＷｘ０１２−５’／Ｗｘ０１２−３’を用いた場合のコムギとデュラムコムギについての結果を下記の表１に示す。プライマーペアＷｘ０１２−５’／Ｗｘ０１２−３’を用いれば、コムギとデュラムコムギも交叉性なく検出できることが確認された。【００５９】
【表１】
0004717807.tif 000002
【実施例２】
【００６０】
Ｗｘ０１２領域のコピー数の確認
Ｗｘ０１２領域のコピー数を確認するため、サザンハイブリダイゼーションを以下の条件で行った。【００６１】
コムギ２品種から抽出したＤＮＡをサンプルとした。ＤＮＡ抽出は実施例１と同様に行った。【００６２】
ハイブリダイゼーション、及び検出には、Gene Images Alkphos Direct Labeling and Detection System（アマシャムバイオサイエンス社）を用いた。試薬、緩衝液等は全てキットのプロトコル通りのものを使用した。【００６３】
〔１〕プローブの設計
該キットを用いたサザンハイブリダイゼーションにおいて、良好な感度が得られるプローブの大きさは３００ｂｐ以上であるとされている。しかし、Ｗｘ０１２は１０２ｂｐでありサザンハイブリダイゼーションのプローブとしては小さい。また、コムギのゲノムサイズは１．７×１０10ｂｐと大きく、検出感度を十分に高める必要性があるため、Ｗｘ０１２領域を含む４４４ｂｐのプローブＷｘＳ０１を設計し、５’プライマーＷｘＳ０１−５’（配列番号２３）と３’プライマーＷｘ０１２−３’（配列番号１１）を用いてＰＣＲにより作成し、プローブとして用いた。ＷｘＳ０１を得るためのプライマーの設計はＧｅｎｅｔｙｘ  Ｗｉｎ．を用い、プライマー作製上の基本ルールを遵守し、また各プライマーのＴｍ値の統一を図った。プローブの設計の概略を図３に示す。【００６４】
〔２〕制限酵素の選択
制限酵素は、目的の領域を切断せず、メチル化の影響を受けない酵素で、ターゲットを含む切断サイトの位置が判っている事を条件として選択した。その結果、単一酵素反応で目的の領域の両側を切断できるＭｂｏI、ＭｖａI、ＥｃｏＴ１４Iを選択した。
それぞれの制限酵素切断部位および切断片サイズを図４に示す。尚、図３における制限酵素部位は、配列番号２２に記載の塩基配列における位置である。【００６５】
〔３〕コムギのサザンハイブリダイゼーション
ＤＮＡに上述の各制限酵素を３７℃で１５時間反応させた。反応後、フェノール・クロロホルム処理、エタノール沈殿処理を行い、次いでＴＥ溶液に溶解した。得られたＤＮＡ溶液を、１．６％アガロースゲル（ＬＯ３、ＴａＫａＲａバイオ社）を用い、泳動液としてＴＡＥ溶液を使用した電気泳動に供した。次いで、２０×ＳＳＣ溶液を用い、一晩かけてゲル中のＤＮＡをメンブレン（ＨｙｐｅｒＢｏｎｄＮ+，アマシャムファルマシア社）に転写させた。【００６６】
ハイブリダイゼーションは５５℃で、キットのハイブリダイゼーションバッファーを用いて行った。プローブＷｘＳ０１の濃度は２０ｎｇ／ｍｌとなるようにし、１晩反応させた。洗浄は１次洗浄液を用いて５５℃で２０分間、２次洗浄液を用いて常温で１０分間行った。洗浄後、検出酵素反応を開始させたメンブレンを３分間放置後、検出溶液をよく落としてサランラップに包んだ。暗室で感光フィルム（Ｈｙｐｅｒ  ｆｉｌｍ、アマシャムファルマシア社）に１時間感光させて現像し、バンドの有無を確認した。【００６７】
その結果、ＭｂｏＩで切断した場合は２本、ＭｖａＩで切断した場合は３本、ＥｃｏＴ１４Ｉで切断した場合は３本または６本のバンドが検出された（図５）。Ｗａｘｙ遺伝子はゲノムＡに２コピー、ゲノムＤに１コピーあると報告されていること（Ainsworth, C. et al.: Plant Mol. Biol. 1993 Apr; 22(1):67-82）から、プローブＷｘＳ０１がハイブリダイズする領域がゲノムＡに２コピー、ゲノムＤに１コピー存在することが確認された。
〔４〕デュラムコムギのサザンハイブリダイゼーション
ゲノムＤが存在しないデュラムコムギゲノムを鋳型として、上記［３］と同様にサザンハイブリダイゼーションを行いった。【００６８】
その結果、ＭｂｏIで切断した場合は１本、ＭｖａIでは２本、またＥｃｏＴ１４Ｉ
では３本のバンドが検出された。しかし、ＥｃｏＴ１４Iによる３本のバンドは、その
うちの1本が他の２本より太く、バンド２本が重合したものであり、本実験ではデュラムコムギから検出されるバンドは最大４本であると判断した（図６）。この結果は、ＷｘＳ０１がゲノムＡに２コピー存在するという上記〔３〕と一致する。また、実施例１で内在性ＤＮＡのＷｘ０１２領域がゲノムＤのみに存在することが確認されている。これらの結果から、Ｗｘ０１２領域はコムギゲノム中に１コピーのみ存在することが確認された。
【実施例３】
【００６９】
定量的ＰＣＲによるＷｘ０１２の適正確認
次に、定量的ＰＣＲによる検知においても、Ｗｘ０１２が検知用内在性配列としての必要事項を満たすことを確認した。【００７０】
〔１〕ＴａｑＭａｎプローブの設計
プライマー、プローブの設計ソフトウエアであるPrimer Express(Applied BiosystemsJapan社製)を用いて設計した。ソフトウエアのプロトコルに記載された、プローブ選定時の確認事項を確認し、適当なプローブを選択した。設計したプローブの塩基配列を配列番号４２に記載する。【００７１】
〔２〕供試サンプル
ＰＣＲの鋳型ＤＮＡサンプルとしては、コムギ以外の１２種類の植物（コメ、トウモロコシ、アワ、キビ、ソバ、オオムギ、ライムギ、オーツムギ、ダイズ、ナタネ、ガルバンゾー、インゲン豆）、デュラムコムギ代表的４品種、及び、強力、中力、薄力コムギの代表的１９品種から抽出したＤＮＡを用いた。【００７２】
〔３〕ＤＮＡの抽出
コムギ、その他の植物試料について、１％ＳＤＳ(和光純薬)により洗浄、蒸留水によるすすぎ後、それぞれよく乾燥させ、次にマルチヒ゛ース゛ショッカー（安井機械）を用いて微粉砕した。得られた穀類の粉砕サンプル１ｇをDNeasy Plant Maxi kit(Qiagen)に供し、公定法に記載されたトウモロコシのDNA抽出プロトコルに従ってＤＮＡを抽出した。なお、デュラムコムギは各品種４粒ずつを無作為に選び、穀粒1粒ずつをDNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)をキットのプロトコル通り用いてＤＮＡの抽出を行った。また、コムギ4品種については、公定法に記載されているプロトコルに従ってGenomic-tip 20/G（QIAGEN）、及びＣＴＡＢ法による抽出を行い、更に、Dneasy Plant Mini kit(QIAGEN)による抽出も、キットに付録されているプロトコルに従って行った。抽出されたＤＮＡは吸光度の測定により濃度を求めた後、その一部を純水によって２０ｎｇ／μＬに希釈し、これをＰＣＲ反応の鋳型ＤＮＡ試料液として用いた。【００７３】
〔４〕定量的ＰＣＲ反応
定量的ＰＣＲは、ABI7700（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。【００７４】
分析は、各資料について２点、または３点並行で行った。１つのウェル当たり２５μＬの系で反応を行った。【００７５】
ＰＣＲの反応液は次のように調整した。まずTaq Man probe、5'-プライマー、3'プライマーの溶液を、それぞれ２μＭ、５μＭ、５μＭに純水で希釈し、これらと純水を１：１：１：１の割合で混合した溶液をPrimer・Probe Mix溶液とした。【００７６】
マスターミックスは、TaqMan Universal Master Mix(アプライドバイオシステムズ社)と、Primer・Probe Mix溶液を１.２５：１の割合で混合して必要量調整した。マスターミックスをテンプレートDNAの数だけ、７２μＬずつ分注し、それぞれに２０ｎｇ／ｍＬに調整した鋳型ＤＮＡを８μＬずつ加え、よく混合した。この混合液を９６穴プレートの指定ウェルに２５μＬずつ、１サンプルあたり３ウェルに分注した。【００７７】
反応条件は次のように設定した。５０℃で２分間保った後９５℃で１０分間保ち反応を開始させ、９５℃３０秒間、５９℃１分間を1サイクルとして４０サイクルの増幅反応を行い、その後５０℃で４分間保った。【００７８】
〔５〕コムギ特異性の確認
１９品種のコムギ、及び他の１２種類の植物のＤＮＡ、４品種のデュラムコムギから抽出したＤＮＡ、及びコムギ以外の１２種類植物から抽出したＤＮＡを鋳型として１サンプルにつき３ウェルにアプライして定量ＰＣＲを行った。【００７９】
Wx012-5'/3'プライマー及びTaqManプローブWx012−Tによる定量ＰＣＲの結果、ＮＴＣに対しては増幅曲線が検出されず、１９品種のコムギＤＮＡに対して良好な増幅曲線が検出された。コムギ以外の１２種の植物ＤＮＡ及び４品種のデュラムコムギＤＮＡに対しては増幅が検出されなかった。【００８０】
〔６〕検量線の直線性の確認
コムギのＤＮＡを300ng/μL、150ng/μL、75μL、30μL、10ng/μL、４ng/μL、1ng/μL、0.1ng/μL、に調整しこれらを、スタンダードの鋳型として定量PCRを行った。得られた結果から、ＪＡＳ分析法ハンドブックに従って検量線を求め、相関係数を確認した。【００８１】
得られた検量線を図８に示す。１〜３００ｎｇ/μＬ、及び０．１〜７５ｎｇ/μＬに調整したコムギＤＮＡをスタンダードの鋳型ＤＮＡとしてアプライした結果、直線性の高い検量線をひくことができ、定量試験に使用可能であることが示された。
【実施例４】
【００８２】
ＴａＳＵＴ１Ｄ遺伝子の検出
ＴａＳＵＴ１Ｄ遺伝子中のｓｕｔ０１領域（配列番号３）およびに記載の塩基配列からなるｓｕｔ０２領域（配列番号４）をＰＣＲにより増幅した。【００８３】
プライマーペアは上記ＷａｘｙＤの場合と同様に設計し、５'プライマーであるｓｕｔ０１−５’（配列番号１２）と３'プライマーであるｓｕｔ０１−３'（配列番号１３）、および５'プライマーであるｓｕｔ０２−５’（配列番号１４）と３'プライマーｓｕｔ０２−３’（配列番号１５）をＰＣＲ実験に用いた。その結果を表２に示す。【００８４】
【表２】
0004717807.tif 000003
いずれのプライマーペアを用いた場合も、コムギに対しては予測されたサイズのシングルバンド（それぞれ１３１ｂｐ、１０１ｂｐ）が検出され、他の穀類およびデュラムコムギ（ゲノム構成ＡａＢｂ）に対してはバンドが検出されなかった。なお、コムギについては複数の品種について同様の試験の行ったところ、すべてにおいて予測されたサイズのシングルバンドが検出された。【００８５】
また、これらのプライマーペアを設計した領域（Accession NO.AF408845、3924-4397；474bp）が、ゲノムＡ、Ｂ、Ｄにそれぞれ１コピーあることが既に示されている。さらに、ｓｕｔ０１−５’／３’およびｓｕｔ０２−５’／３’の増幅領域ｓｕｔ０１およびｓｕｔ０２は、定性ＰＣＲの場合コムギ（ゲノム構成ＡａＢｂＤｄ）に特異的で、デュラムコムギ（ゲノム構成ＡａＢｂ）から検出されなかったため、ｓｕｔ０１領域およびｓｕｔ０２領域はゲノムＤのみに１コピー存在する可能性の高いことが確認された。このことから、プライマーペアｓｕｔ０１−５’／３’またはｓｕｔ０２−５’／３’を用いれば、他の作物と交叉せず、コムギ内在性ＤＮＡ（ＴａＳＵＴ１Ｄ遺伝子）を検出できることが確認された。
【実施例５】
【００８６】
ＣｂｐIII遺伝子の検出
ＣｂｐIII遺伝子中のＣｂｐIII０１４領域（配列番号５）をＰＣＲにより増幅した。【００８７】
プライマーペアは上記ＷａｘｙＤの場合と同様に設計し、５'プライマーｃｂｐ０１４−５’（配列番号１６）と３'プライマーｃｂｐ０１４−３’（配列番号１７）をＰＣＲ実験に用いた。結果を図７に示す。コムギサンプル（レーン１〜４）には、予測されたサイズのシングルバンド（１０１ｂｐ）が検出され、コムギ以外のレーンにはバンドが検出されなかった。このことから、プライマーペアｃｂｐ０１４−５’／ｃｂｐ０１４−３’を用いれば、他の作物と交叉せず、コムギ内在性ＤＮＡ（Ｃｂｐ遺伝子）を検出できることが確認された。
【実施例６】
【００８８】
ＧＳＳ配列の検出
ＧＳＳ配列中のｇｓｓ０１領域（配列番号６）、ｇｓｓ０２領域（配列番号３０）、ｇｓｓ０３領域（配列番号３１）をＰＣＲにより増幅した。【００８９】
プライマーペアは上記ＷａｘｙＤの場合と同様に設計し、ｇｓｓ０１領域用プライマーとしてｇｓｓ０１−５'（配列番号１８）及びｇｓｓ０１−０３'（配列番号１９）に記載のペアを、ｇｓｓ０２領域用プライマーとしてｇｓｓ０２−５'（配列番号３４）およびｇｓｓ０２−３'（配列番号３５）に記載のペアを、ｇｓｓ０３領域用としてｇｓｓ０３−５'（配列番号３６）およびｇｓｓ０３−３'（配列番号３７）に記載のペアを利用して、ＰＣＲを行った。結果を表３に示す。【００９０】
【表３】
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すべてのプライマーペアが、コムギに対して予想されたサイズのシングルバンドを検出した。ｇｓｓ０２用プライマーおよびｇｓｓ０３用プライマーは、デュラムコムギおよびトウモロコシと交叉性が認められたが、ｇｓｓ０１用プライマーはこれらとの交叉性が認められず、ｇｓｓ０１用プライマーは、コムギ内在性遺伝子の検出に用いることができることが確認された。
【実施例７】
【００９１】
Ｌｒ１配列中のＬｒ１０１領域（配列番号７）、Ｌｒ１０２領域（配列番号３２）、Ｌｒ１０３領域（配列番号３３）をＰＣＲにより増幅した。【００９２】
プライマーペアは上記ＷａｘｙＤの場合と同様に設計し、Ｌｒ１０１領域用プライマーとして配列番号２０よび２１に記載のペアを、Ｌｒ１０２領域用プライマーとして配列番号３８および３９に記載のペアを、Ｌｒ１０３領域用として配列番号４０および４１に記載のペアを利用して、ＰＣＲを行った。結果を表４に示す。【００９３】
【表４】
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すべてのプライマーペアが、コムギに対して予想されたサイズのシングルバンドを検出した。Ｌｒ１０２用プライマーペアおよびＬｒ１０３用プライマーペアは、デュラムコムギとの交叉性が認められたが、Ｌｒ１０１用プライマーはこれらとの交叉性が認められず、Ｌｒ１０１用プライマーは、コムギ内在性遺伝子の検出に用いることができることが確認された。
【比較例】
【００９４】
（１）ＣｂｐIII遺伝子の塩基配列に基づいて設計された、５'プライマーＣｂｐ０１３−５’（配列番号２４）／３'プライマーＣｂｐ０１３−３’（配列番号２５）のプライマーペア、（２）ＴｔｈＶ遺伝子（Castagnaro A. et al.: J. Mol. Biol. 1992 A
pr 20;224(4):1003-9）の塩基配列に基づいて設計された５'プライマーＴｔｈＶ０１１−５’（配列番号２６）／３'プライマーＴｔｈＶ０１１−３'（配列番号２７）のプライマーペア、または（３）同様にＴｔｈＶ遺伝子の塩基配列に基づいて設計された
５'プライマーＴｔｈＶ０１２−５’（配列番号２８）／３'プライマーＴｔｈＶ０１２−３'（配列番号２９）のプライマーペアを用いて、ＰＣＲをコムギ内在性ＤＮＡの検知実験を行った。
【００９５】
ＤＮＡの抽出、ＰＣＲおよび電気泳動等は上記実施例に従って行った。
【００９６】
上記（１）のプライマーペアを用いた結果、コムギに対しては予測されたサイズのシングルバンドを検出したが、コメ、オオムギ、トウモロコシ、ライムギ、オオムギ（ミノリムギ）、オーツムギ、アワにもバンドが検出され、複数の作物との交叉性が認められた。（２）の結果、コムギに対しては予測されたサイズのシングルバンドを検出したが、オオムギに交叉性が認められた。（３）の結果、コムギに対しては予想されたサイズのシングルバンドを検出したが、ライムギとオオムギの一種であるミノリムギとに交叉性が認められた。これらの結果を下記の表５に示す。
【００９７】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】プライマーペアＷｘ０１１−５’／３’のコムギ特異性の結果を示す。各レーンはそれぞれ、Ｍ：１００ｂｐラダーマーカー、１：コムギ銘柄（１ＣＷ）、２：コムギ銘柄（ＷＷ）、３：コムギ銘柄（Ｎ６１）、４：小麦粉、５：コメ、６：オオムギ、７：トウモロコシ、８：ダイズ、９：ジャガイモ、１０：トマト、１１：ナス、１２：ライムギ、１３：ミノリムギ、１４：オーツムギ、１５：アワ、１６：キビ、１７：ソバ、１８：ナタネ、１９：Ｎｏ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（水）を示す。
【図２】プライマーペアＷｘ０１２−５’／３’のコムギ特異性の結果を示す。各レーンはそれぞれ、Ｍ：１００ｂｐラダーマーカー、１：コムギ銘柄（１ＣＷ）、２：コムギ銘柄（ＷＷ）、３：コムギ銘柄（Ｎ６１）、４：小麦粉、５：コメ、６：オオムギ、７：トウモロコシ、８：ダイズ、９：ジャガイモ、１０：トマト、１１：ナス、１２：ライムギ、１３：ミノリムギ、１４：オーツムギ、１５：アワ、１６：キビ、１７：ソバ、１８：ナタネ、１９：Ｎｏ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（水）を示す。
【図３】Ｗｘ０１２のコピー数推定のためのサザンハイブリダイゼーションにおけるプローブＷｘＳ０１の設計を示す図である。Ａは非転写領域を、Ｂはプローブを示す。
【図４】プローブＷｘＳ０１の制限酵素の切断部位を示す。
【図５】コムギのＷｘＳ０１をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションの結果を示す。各レーンは、それぞれ、１：ＷＷの品種△△をＭｂｏＩで切断、２：ＷＷの品種△△をＭｖａＩで切断、３：ＷＷの品種△△をＥｃｏＴ１４Ｉで切断、４：ＨＲＳの品種□□をＭｂｏＩで切断、５：ＨＲＳの品種□□をＭｖａＩで切断、６：ＨＲＳの品種□□をＥｃｏＴ１４Ｉ、Ｐ：Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｒｏｌ（ＷｘＳ０１：３００ｇ）で切断した結果を示す。
【図６】デュラムコムギのサザンハイブリダイゼーションの結果を示す。各レーンは、それぞれ、１：デュラム品種▽▽をＭｂｏＩで切断、２：デュラム品種▽▽をＭｖａＩで切断、３：デュラム品種▽▽をＥｃｏＴ１４Ｉで切断した結果を示す。
【図７】プライマーペアＣｂｐ０１４−５’／３’のコムギ特異性の確認実験の結果を示す。各レーンはそれぞれ、Ｍ：１００ｂｐラダーマーカー、１：コムギ銘柄（１ＣＷ）、２：コムギ銘柄（ＷＷ）、３：コムギ銘柄（Ｎ６１）、４：小麦粉、５：コメ、６：オオムギ、７：トウモロコシ、８：ダイズ、９：ジャガイモ、１０：トマト、１１：ナス、１２：ライムギ、１３：ミノリムギ、１４：オーツムギ、１５：アワ、１６：キビ、１７：ソバ、１８：ナタネ、１９：Ｎｏ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（水）を示す。
【図８】各種濃度のコムギＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲを行った結果から作成した検量線である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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