(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源装置と、
前記光源装置から発せられたパルス状のレーザ光を対物レンズにて集光して標本に照射し、前記標本において発せられた蛍光を観察する観察装置本体と、
前記対物レンズと前記標本との間の距離を調節するＺ軸駆動機構と、
制御装置と、を備え、
前記光源装置は、前記パルス状のレーザ光を射出するパルスレーザ光源と、
前記パルスレーザ光源から射出される前記パルス状のレーザ光の光束径を調節する入射調節装置とを備え、
前記制御装置は、前記Ｚ軸駆動機構により前記対物レンズと前記標本との間の距離を調節して観察面の深さを深くするにしたがって、前記対物レンズの瞳位置での光束径が絞られるように、前記入射調節装置を制御する多光子励起型観察装置。
【請求項２】
前記制御装置は、前記標本における観察面の深さと、前記入射調節装置の操作量とを対応付けて記憶するメモリ装置を備え、観察面の深さに対応する操作量を前記メモリ装置から取得し、取得した操作量で前記入射調節装置を制御する請求項１に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項３】
前記制御装置は、前記標本における観察面の深さに応じて、前記標本に照射する前記パルス状のレーザ光の光量を調節する請求項１に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項４】
前記制御装置は、前記標本における観察面の深さと、前記パルス状のレーザ光の光強度とを対応付けて記憶するメモリ装置を備え、観察面の深さに対応する前記光強度を前記メモリ装置から取得し、取得した前記光強度となるように前記光源装置を制御する請求項３に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項５】
前記制御装置は、前記標本における観察面の深さと、前記パルス状のレーザ光の照射パルス数とを対応付けて記憶するメモリ装置を備え、観察面の深さに対応する前記照射パルス数を前記メモリ装置から取得し、取得した前記照射パルス数となるように前記光源装置を制御する請求項３に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項６】
前記メモリ装置に記憶させる内容を入力するための入力部を備える請求項２、請求項４、又は請求項５のいずれかに記載の多光子励起型観察装置。
【請求項７】
前記光源装置から射出される前記パルス状のレーザ光を走査するレーザ走査部と、
前記レーザ走査部により走査された前記パルス状のレーザ光を前記対物レンズを通して前記標本に集光させる対物光学系と、
前記標本における前記パルス状のレーザ光の集光位置から発せられた蛍光を検出する光検出装置とを備え、
前記光検出装置は、
前記蛍光の入射に応じて検出信号を出力する検出部と、
前記検出部における前記蛍光の検出感度を、前記標本の観察面の深さに応じて調整する検出制御部と、
を具備する請求項１に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項８】
前記検出制御部は、前記検出部における光電変換の感度および出力された信号の積分時間の少なくとも一方を調整する請求項７に記載の多光子励起型観察装置。
【請求項９】
前記光検出装置はピンホールを備え、
前記検出制御部は、前記ピンホールの開口径を調整する請求項７に記載の多光子励起型観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、多光子励起型観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体等の標本にその表面から超短パルスレーザ光を照射して、標本の表面または内部から発せられる多光子蛍光を検出することにより、細胞等の機能を観察する装置として、多光子励起型の観察装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
また、従来、試料のＸＹ方向の２次元平面に対してスポット光を走査しつつ該試料からの反射光又は透過光を検出することによってＸＹ方向の２次元平面の画像データを取得し、該スポット光の焦点位置をＺ方向に変化させることによって、試料の表層部から深層部まで異なる深さにおける画像データを取得する走査型レーザ顕微鏡が知られている。
【０００４】
ところで、上述のようにＺ方向に焦点位置を変えた場合、得られる各画像はＺ軸が深くなるに従い輝度が低くなってしまうという現象が生ずる。そこで、従来、観察により得られた画像データの光量を後処理することにより見かけの明るさを補正し、輝度が均一で見やすい画像を得る技術が提案されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００５】
【特許文献１】特許第２８４８９５２号公報
【特許文献２】特開２０００−２７５５４１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年、生物研究の進展等に伴って、生体標本のより深い部分を観察したいという要請が高まっている。通常のレーザ走査型顕微鏡は、共焦点効果によって観察標本の光学的な内部断層像を取得することができるが、生体標本において観察可能な深さは表面から５０μｍ程度であった。
上記特許文献１に記載された多光子励起法は、生体透過性のよい近赤外線で蛍光を励起するため、深部観察に好適である。しかしながら、多光子励起法であっても、例えば、深さ１００μｍを超えるような深部を観察しようとすると、標本による励起光や蛍光の散乱、屈折、吸収の影響が強くなり、解像度やＳ／Ｎ比が悪化し、鮮明な画像を取得することができないという問題があった。
【０００７】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、非常に深い領域(例えば、表面から約１００μｍ以上)まで観察する場合であっても、表層部から深層部まで鮮明な画像を得ることのできる多光子励起型観察装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の参考例は、パルスレーザ光を出射する光源装置と、前記光源装置から発せられたパルスレーザ光を標本に照射し、標本において発せられた蛍光を観察する観察装置本体と、前記標本における観察面の深さに応じて、前記標本に照射する前記パルスレーザ光の光量を調節する制御装置とを具備する多光子励起型観察装置を提供する。
【０００９】
上記構成によれば、光源装置から発せられたパルスレーザ光が観察装置本体に供給され、観察装置本体によって、標本に照射されると、標本における多光子励起効果によって、パルスレーザ光が集光させられた位置において多光子蛍光が発生する。発生した多光子蛍光は観察装置本体によって検出され、観察される。この場合において、観察面の深さが変更されると、制御装置の作動により、標本に照射されるパルスレーザ光（励起光）が、観察面の深さに応じた光量に調節される。例えば、観察面の深度が深くなるほど、標本に照射されるパルスレーザ光の光量が大きくなるように調節される。これにより、観察面の深さに応じて適切な光量のパルスレーザ光が照射されるので、どの深さでも多光子励起を効果的に発生させることが可能となり、表層部から深層部まで鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。制御装置は、パルスレーザ光の光強度、或いは発振周波数を制御することにより、標本に照射するレーザ光の光量を調節する。
更に、本発明によれば、事後的に画像処理を行う必要もないので、処理を簡素化することが可能となる。
【００１０】
上記の多光子励起型観察装置において、前記制御装置は、前記標本における観察面の深さと、前記レーザ光の光強度とを対応付けて記憶するメモリ装置を備え、前記観察面の深さに対応するレーザ光の光強度を前記メモリ装置から取得し、取得したレーザ光の強度となるように前記光源装置を制御するようにしても良い。
【００１１】
このように構成することで、観察面の深さが変化した場合には、メモリ装置から観察面の深さに応じた適切なパルスレーザ光の光強度の情報を取得することで、容易に且つ迅速にパルスレーザ光の強度を最適に調節することができる。この結果、観察面の深さに応じて速やかに標本に照射するレーザ光の光量を変化させることが可能となる。
上記メモリ装置に記憶する情報は、例えば、以下のようにして求められたものである。
例えば、前記標本の深さ方向に関する観察範囲内で少なくとも２つの基準深度を選定し、前記観察面を前記基準深度に設定した状態で、前記レーザ光の光強度を所定範囲で変化させ、そのときの観察画像を観察することにより、各基準深度における最適な光強度を特定する。そして、前記基準深度と光強度との関係を用いて、観察面の各深度に対応する最適な光強度を求め、前記メモリ装置に記憶する。
【００１２】
上記の多光子励起型観察装置において、前記制御装置は、前記標本における観察面の深さと、前記レーザ光の照射パルス数とを対応付けて記憶するメモリ装置を備え、前記観察面の深さに対応するレーザ光の照射パルス数を前記メモリ装置から取得し、取得した照射パルス数となるように前記光源装置を制御するようにしても良い。
【００１３】
このように構成することで、観察面の深さが変化した場合には、メモリ装置から観察面の深さに応じたレーザ光の光強度を得ることで、容易に且つ迅速にレーザ光の強度を調節することができる。この結果、観察面の深さに応じて速やかに標本に照射するレーザ光の光量を変化させることが可能となる。
上記メモリ装置に記憶する情報は、例えば、以下のようにして求められたものである。
例えば、前記標本の深さ方向に関する観察範囲内で少なくとも２つの基準深度を選定し、前記観察面を前記基準深度に設定した状態で、前記レーザ光の照射パルス数を所定範囲で変化させ、そのときの観察画像から各基準深度における最適な照射パルス数を特定する。そして、前記基準深度と光強度との関係に基づいて、観察面の各深度に対応する最適な照射パルス数を求め、前記メモリ装置に記憶する。
【００１４】
本発明は、光源と、前記光源装置から発せられたパルス状のレーザ光を対物レンズにて集光して標本に照射し、前記標本において発せられた蛍光を観察する観察装置本体と、前記対物レンズと前記標本との間の距離を調節するＺ軸駆動機構と、制御装置とを備え、前記光源装置は、前記パルス状のレーザ光を射出するパルスレーザ光源と、前記パルスレーザ光源から射出される前記パルス状のレーザ光の光束径を調節する入射調節装置とを備え、前記制御装置は、前記Ｚ軸駆動機構により前記対物レンズと前記標本との間の距離を調節して観察面の深さを深くするにしたがって、前記対物レンズの瞳位置での光束径が絞られるように、前記入射調節装置を制御する制御装置とを具備する多光子励起型観察装置を提供する。
【００１５】
このように構成することで、制御装置によって観察面の深さに応じて適切に調整された光束径のパルスレーザ光が照射される。本願発明者は、実験において、観察深さが深くなるほど、照射するパルスレーザ光のビーム径を対物レンズ本来の性能を実現する光束径よりも絞ることによって、深層部の観察画像の鮮明さが向上することを確認した。このように、観察深さに応じて照射ビーム径を変化させることで、どの深さでも良好な解像度の観察画像を取得することが可能となり、表層部から深層部まで鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。
【００１６】
上記の多光子励起型観察装置において、前記制御装置は、前記標本における観察面の深さと、前記入射調節装置の操作量とを対応付けて記憶するメモリ装置を備え、前記観察面の深さに対応する前記操作量を前記メモリ装置から取得し、取得した操作量で前記入射調節装置を制御するようにしても良い。
【００１７】
このように、観察面の深さと最適な操作量とを対応付けて記憶するメモリ装置を備えることにより、観察面の深さに応じた操作量で入射調節装置を迅速に制御することができる。これにより、レーザ光の光束径を、観察面の深さに応じた最適な径に調節することができる。
上記メモリ装置に記憶する情報は、例えば、以下のようにして求められたものである。
例えば、前記標本の深さ方向に関する観察範囲内で少なくとも２つの基準深度を選定し、前記観察面を前記基準深度に設定した状態で、前記入射調節装置を所定の操作範囲で調節することにより、レーザ光の光束径を変化させ、そのときの観察画像から各基準深度における最適な入射調節装置の操作量を特定する。そして、前記基準深度と入力調節装置の操作量との関係に基づいて、観察面の各深度に対応する最適な操作量を求め、前記メモリ装置に記憶する。
【００１８】
上記の多光子励起型観察装置において、前記メモリ装置に記憶させる内容を外部から入力するための入力手段を備えていても良い。
【００１９】
このような構成によれば、メモリ装置に記憶している対応付け情報を状況に応じて容易に変更、設定することが可能となる。
【００２０】
本発明の参考例は、レーザ光を出射する光源装置と、前記光源装置からのパルスレーザ光を走査するレーザ走査部と、前記レーザ走査部により走査されたパルスレーザ光を標本に集光させる対物光学系と、前記標本におけるパルスレーザ光の集光位置から発せられた多光子蛍光を検出する光検出装置とを備え、前記光検出装置は、前記多光子蛍光の入射に応じて検出信号を出力する検出部と、前記検出部における前記多光子蛍光の検出感度を、前記標本の観察面の深さに応じて調整する検出制御部とを具備する多光子励起型観察装置を提供する。
【００２１】
上記構成によれば、光源装置から発せられたレーザ光は、レーザ走査部によって走査され対物光学系によって標本に集光される。これにより、標本における集光位置においては、多光子励起効果により多光子蛍光が発生する。この多光子蛍光は、光検出装置へ導かれ、多光子蛍光が検出されることにより、標本の深さ方向の所定の位置における内部状態を多光子蛍光画像として観察する。この場合において、観察面の深さが変更されると、検出制御部の作動により、検出部の検出感度が調整されるので、観察面にて発生した多光子蛍光を効果的に取得することが可能となり、表層部から深層部まで鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。
【００２２】
上記の多光子励起型観察装置において、前記検出制御部は、前記検出部における光電変換の感度および出力された信号の積分時間の少なくとも一方を調整することとしても良い。
【００２３】
このような構成によれば、観察面の深さが変更されると、検出制御部は、検出部における光電変換の感度および出力された信号の積分時間の少なくとも一方を調整する。例えば、観察面の深さが深くなるほど、上記光電変換の感度、および、積算時間の少なくともいずれか一方が大きくなるように調節される。これにより、観察面にて発生した多光子蛍光を効果的に取得することが可能となり、表層部から深層部まで鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。更に、本発明によれば、メモリに画像データが格納される以前の光量を観察面の深さに応じて変更することができるので、例えば、上記特許文献２等に開示されているように、事後的に画像処理を行う場合に比べて、調整の自由度が高く、最適な状態の画像データを保存することができる。
【００２４】
上記の多光子励起型観察装置において、前記光検出装置はピンホールを備え、前記検出制御部は、前記ピンホールの開口径を調整することとしても良い。
【００２５】
このような構成によれば、観察面の深さが変更されると、検出制御部は、光検出装置が備えるピンホールの開口径を調整する。例えば、観察面の深さが深くなるほど、上記ピンホールの開口径が大きくなるように調節する。これにより、観察面にて発生した多光子蛍光を効果的に取得することが可能となり、表層部から深層部まで鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。更に、本発明によれば、メモリに画像データが格納される以前の光量を観察面の深さに応じて変更することができるので、例えば、上記特許文献２等に開示されているように、事後的に画像処理を行う場合に比べて、調整の自由度が高く、最適な状態の画像データを保存することができる。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、非常に深い領域(例えば、表面から約１００μｍ以上)まで観察する場合であっても、表層部から深層部まで鮮明な画像を得ることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の第１の実施形態に係る多光子励起型観察装置について図１〜図４を参照して説明する。
本実施形態に係る多光子励起型観察装置１は、例えば、多光子励起型顕微鏡であって、図１に示されるように、光源装置２と、該光源装置２の後段に配置される蛍光顕微鏡本体（観察装置本体）３とを備えている。
【００２８】
前記光源装置２は、極短パルスレーザ光を出射するパルスレーザ光源４と、該パルスレーザ光源４から発せられる極短パルスレーザ光Ｌの群速度分散を補償する分散補償光学系５と、分散補償された極短パルスレーザ光Ｌのオンオフあるいは強度変調する音響光学装置６と、該音響光学装置６とパルスレーザ光源４との間に配置され、音響光学装置６に入射させる極短パルスレーザ光Ｌを調節する入射補正装置７と、音響光学装置６から出射され、前記蛍光顕微鏡本体３に入射される極短パルスレーザ光Ｌを調節する顕微鏡入射補正装置８とを備えている。
【００２９】
前記分散補償光学系５は、例えば、一対のプリズム９，１０とミラー１１とから構成されている。あるいはグレーティング対により構成されていてもよい。プリズム９，１０どうしの間隔あるいはグレーティングどうしの間隔を調節することで、波長ごとの光路長を調節して、パルスレーザ光源４から蛍光顕微鏡本体３の対物レンズ３ａに至る全光学系における群速度分散を補償するようになっている。
【００３０】
前記入射補正装置７は、アライメント調節装置１２とビーム整形光学系１３とを備えている。
前記アライメント調節装置１２は、例えば、位置および角度を調節可能な２枚のミラーを備え、極短パルスレーザ光Ｌの光軸の位置と偏向を調節し、音響光学装置６に対して適正な位置と角度で精度よく入射させるように構成されている。図中、符号１４は、パルスレーザ光源４から発せられた極短パルスレーザ光Ｌを反射して分散補償光学系５に指向させる一方、分散補償光学系５から出力された極短パルスレーザ光Ｌの光軸から紙面に垂直方向に外れた位置に配置されているミラーである。
【００３１】
また、ビーム整形光学系１３は、分散補償光学系５を通過し、アライメント調節装置１２によって位置合わせされた極短パルスレーザ光Ｌの光束径を絞り、音響光学装置６の結晶１５（図２参照）の有効範囲Ｘ内に漏れなく入射させるように構成されている。
本実施形態においては、ビーム整形光学系１３は、例えば、両凸レンズ１６と平凹レンズ１７とを組み合わせたガリレイ型のビームエキスパンダにより構成されている。また、ビーム整形光学系１３は、パルスレーザ光源４と音響光学装置６との間に、その中央よりも音響光学装置６側に配置されていることが好ましい。また、ビーム整形光学系１３は、音響光学装置６の前方１００〜１０００ｍｍの位置に配置されていることがさらに好ましい。
【００３２】
前記音響光学装置６は、図２に示されるように、例えば、ＡＯＭであって、２酸化テルルからなる結晶１５と、該結晶１５を固定するケース１８と、結晶１５に接着された圧電素子からなるトランスデューサ（図示略）と、該トランスデューサに入力する電気信号を伝達する音響波発生用電気回路（図示略）と、前記結晶１５に接着されたヒートシンク（放熱部材）２１とを備えている。結晶１５とケース１８との間、結晶１５とヒートシンク２１との間には、例えば、シリコーングリースのようなサーマルコンパウンドあるいはインジウム箔からなる界面材２２が設けられている。
【００３３】
結晶１５を挟んで対向するケース１８の一対の側壁にはそれぞれ開口部２４が設けられており、一の開口部２４から極短パルスレーザ光Ｌを入射させ、結晶１５を通過した極短パルスレーザ光Ｌを他の開口部２４から出射させるようになっている。
前記ヒートシンク２１は、例えば、アルミニウムあるいはアルミニウム合金のような熱伝導率の高い材質からなり、平行間隔をあけて配置される複数の平板状のフィン２１ａを備えている。
【００３４】
前記顕微鏡入射補正装置８は、アライメント調節装置２５と、視準光学系２６とを備えている。
アライメント調節装置２５は、アライメント調節装置１２と同様の構造を有し、蛍光顕微鏡本体３に入射させる極短パルスレーザ光Ｌの光軸の位置と偏向を精度よく調節することができるようになっている。
【００３５】
また、視準光学系２６は、例えば、両凸レンズ２７と平凹レンズ２８とからなり、ビーム整形光学系１３と同様のガリレイ型のビームエキスパンダにより構成されている。視準光学系２６は、ビーム整形光学系１３により音響光学装置６の有効範囲Ｘを漏れなく通過するようにその光束径およびビームダイバージェンスを補正され、かつ、アライメント調節装置２５により光軸の位置および偏向を調節された極短パルスレーザ光Ｌが、蛍光顕微鏡本体３の対物レンズ３ａの前方の所定の位置（試料Ａの所定の位置）にビームウエストを形成するように、出射される極短パルスレーザ光Ｌの光束径およびビームダイバージェンスを補正するようになっている。さらに具体的には、視準光学系２６は、対物レンズ３ａの瞳位置において、極短パルスレーザ光Ｌが、その瞳径と略同等の光束径を有するように、その光束径およびビームダイバージェンスを補正するようになっている。
【００３６】
前記蛍光顕微鏡本体３は、極短パルスレーザ光Ｌを２次元的に走査する２次元走査機構２９、２次元走査された極短パルスレーザ光Ｌを集光して中間像を結像させる瞳投影レンズ３０、中間像を結像した極短パルスレーザ光Ｌを集光して略平行光にする結像レンズ３１、略平行光にされた極短パルスレーザ光Ｌを集光して試料Ａに結像させる対物レンズ３ａ、試料Ａにおいて発せられ対物レンズ３ａにより集光された多光子蛍光Ｆを極短パルスレーザ光Ｌから分岐するダイクロイックミラー３２、分岐された多光子蛍光Ｆを検出する光検出装置４０を備えている。符号３５、３６はミラーである。前記２次元走査機構２９は、例えば、互いに直交する２本の軸線回りに揺動させられる２枚のガルバノミラー（図示略）を近接配置してなる、いわゆる近接ガルバノミラーにより構成されている。
【００３７】
図３は、図１に示した多光子励起型観察装置１の各部を制御する制御系の概略構成を示す図である。図３において、上述の図１と同一の構成要素には同一の符号を付し、その説明を省略する。
図３に示すように、多光子励起型観察装置１が備える制御装置５０は、コンピュータ５１、レーザ制御装置５２、レーザパワーコントローラ５３、及び走査制御装置５４を備えている。
【００３８】
コンピュータ５１は、内部にＧＵＩなどのユーザインターフェースを有しており、ユーザにより設定された観察スケジュールに基づいて、レーザ制御装置５２、走査制御装置５４に対して制御指令を出力することにより、標本の所定の観察面に対してレーザ光（励起光）を照射させる。更に、コンピュータ５１は、図１に示した光検出装置３４からのディジタルデータを取得し、このデータを画像化してモニタ５５に出力することにより、標本Ａの所定の観察面における観察画像をユーザに提供する。
【００３９】
レーザ制御装置５２は、内部にＳＲＡＭ（メモリ装置）５２１を備えている。このＳＲＡＭ５２１には、標本Ａの観察面の深さと好適なレーザ強度とが対応付けられたルックアップテーブルが記憶されている。レーザ制御装置５２は、後述する走査制御装置５４からの同期信号に基づいてＳＲＡＭ５２１のルックアップテーブルを参照することにより、観察面の深さに適したレーザ強度を取得し、このレーザ強度に応じた強度指令をレーザパワーコントローラ５３に出力する。レーザパワーコントローラ５３は、レーザ制御装置５２からの強度指令に基づいて光源装置２が備える音響光学装置６或いはレーザ光源４自体を制御することにより、蛍光顕微鏡本体３に入射させるレーザ光の光強度を調節する。
これにより、光源装置２からは、標本Ａにおける観察面の深さに対して好適な強度のパルスレーザ光が出射されることとなる。
【００４０】
一方、走査制御装置５４は、コンピュータ５１からの制御指令に基づいて、２次元走査機構２９を走査することにより、光源装置２から出射されたパルスレーザ光を標本Ａの観察面においてＸＹ方向に走査させるとともに、Ｚ軸駆動機構６０を駆動することにより、対物レンズ３ａと標本Ａとの距離を調節することで、レーザ光を標本Ａの所定の観察面に集光させることにより、その位置において多光子励起効果を発生させる。
走査制御装置５４は、Ｚ駆動機構６０の駆動するタイミングで同期信号をレーザ制御装置５２に出力する。これにより、レーザ制御装置５２は、標本Ａにおける観察面の深さ変化を把握することができる。
【００４１】
このような構成を備える多光子励起型観察装置１おいて標本観察を行う際には、まず、事前の準備として、プリスキャンを行う。
プリスキャンにおいては、ユーザにより入力された標本観察のＺ方向（深さ）における上限（以下、「表層部」という。）及び下限（以下、「深層部」という。）にそれぞれ観察面を設定したときの画像をそれぞれ取得する。具体的には、Ｚ駆動機構６０を駆動することにより、標本Ａの観察面を深層部にセットし、この状態でレーザ光を照射する。このとき、レーザパワーコントローラ５３は、レーザ制御装置５２からの指令に基づいて、レーザ光の強度を最低値から徐々に上昇させる。ユーザは、モニタ５５に映された観察画像を確認し、最も画像が鮮明に取れたときのレーザ光の光強度をコンピュータ５１に記録させる。
【００４２】
続いて、Ｚ駆動機構６０を駆動することにより、標本Ａの観察面を表層部にセットし、この状態でレーザ光を照射する。このとき、レーザパワーコントローラ５３は、先ほどと同様に、レーザ制御装置５２からの指令に基づいて、レーザ強度を最低値から徐々に上昇させる。ユーザは、モニタ５５に映された観察画像を確認し、先ほど確認した深層部と同じ明るさの画像が得られたときの光強度をコンピュータ５１に記録させる。
【００４３】
続いて、深層部における光強度と、表層部における光強度とを用いて、中間部（深層部と表層部の間の層）における光強度を求める（図４参照）。
ここで、一般的に、観察面の深度が深くなるにつれて標本内媒体での散乱により光強度が減衰するので、以下の（１）式に示す媒質内の光散乱の関係式から中間部における光強度を求めることができる。
【００４４】
【数１】
0004759425.tif 000002
【００４５】
Φ，Ｄ＝１／３μS，μS，μa，ｑは、それぞれ位置ｒにおける光の積分強度、光拡散係数、等価散乱係数、吸収係数、媒体内部光源強度（＝０）とする。
【００４６】
また、上記（１）に示した関係式以外にも、一般的に用いられている補間方法、例えば、直線補間や多項式近似を用いて中間部における好適な光強度を求めても良い。
【００４７】
更に、演算により求めるほか、観察を行う観察面の全ての深さについて、上述したように光強度を特定するプレスキャンを行い、各観察面に対応する最適な光強度を求めるようにしても良い。
このような手法により、各観察面に対応する光強度が決定すると、コンピュータ５１は、これらの情報を対応付けたルックアップテーブルを作成してレーザ制御装置５２のＳＲＡＭ５２１に書き込みを行う。これにより、後述する本観察において、レーザ光の光強度が、このルックアップテーブルに登録された光強度に調節されることとなる。
【００４８】
本観察においては、まず、走査制御装置５４によりＺ駆動機構６０が駆動されて、観察面が標本Ａの表層部になるように調節され、走査制御装置５４から同期信号がレーザ制御装置５２に出力される。レーザ制御装置５２は、この同期信号を受け取ると、ＳＲＡＭ５２１に記録されたルックアップテーブルから、表層部に対応するレーザ強度を取得し、このレーザ強度に応じた強度指令をレーザパワーコントローラ５３に出力する。これにより、レーザパワーコントローラ５３が当該強度指令に基づいて光源装置２を制御することにより、光源装置２から観察面に対応する好適な強度のパルスレーザ光が出射される。光源装置２から出射された超短パルスレーザ光Ｌは、図１に示す顕微鏡本体３に向けて出射される。
【００４９】
顕微鏡本体３に入射された超短パルスレーザ光Ｌは、走査制御装置５４により走査される２次元走査機構２９により２次元的に走査されつつ、図１に示す瞳投影レンズ３０、結像レンズ３１、ダイクロイックミラー３２および対物レンズ３ａを介して標本Ａの表層面に集光され、この表層面においてＸＹ方向に２次元走査され、多光子励起効果を発生させる。この多光子励起効果により生じた多光子蛍光Ｆは、ダイクロイックミラー３２により分岐され、光検出装置４０に導かれる。光検出装置４０は、この光量を検出し、検出量に応じたディジタルデータを図２に示すコンピュータ５１に出力する。これにより、コンピュータ５１により表層面における観察画面が作成されて、モニタ５５に表示される。
【００５０】
続いて、走査制御装置５４は、レーザ光をＸＹ方向に走査し終わると、Ｚ駆動機構６０を調節することにより、標本Ａの観察面を次の深度、例えば、中間部において深度が最も浅い位置に合わせるとともに（図４参照）、レーザ制御装置５２に対して同期信号を出力する。レーザ制御装置５２は、同期信号を受信すると、ＳＲＡＭ５２１に記録されているルックアップテーブルから観察面の深さに対応するレーザ強度を取得し、これをレーザパワーコントローラ５３に出力する。これにより、次の観察面の深さに好適な光強度での観察が行われることとなる。
そして、このような観察面の深さが変更されるたびに、その深さに対応する光強度のパルスレーザ光が標本Ａの観察面に集光され、図４に示すように、各深さにおける観察画像がそれぞれ取得される。
【００５１】
以上説明してきたように、本実施形態に係る多光子励起型観察装置１によれば、観察面の深さが変更されると、制御装置５の作動により、パルスレーザ光が観察面の深さに応じた好適な光強度に調節され、標本Ａの観察面に集光されるので、観察面において多光子励起を効果的に発生させることが可能となり、表層部から深層部まで鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。
また、観察面の深さが変化した場合に、ＳＲＡＭ５２１に記録されているルックアップテーブルを参照することにより、観察面の深さに応じた好適なレーザ光の光強度を容易に得ることができるので、迅速にレーザ光の強度を調節することができ、この結果、観察面の深さに応じて速やかに標本に照射するパルスレーザ光の光量を変化させることが可能となる。
【００５２】
更に、超短パルスレーザ光Ｌは、アライメント調整光学系５によりその光軸位置および角度を調節され、かつ、ビーム整形光学系７によりその光束径およびビームダイバージェンスを調節されているので、標本Ａの各観察面に高い精度で集光される。したがって、空間分解能の高い多光子蛍光画像を取得することができる。
【００５３】
なお、本実施形態に係る多光子励起型観察装置１では、観察面の深度に応じてレーザ光の光強度（ピークパワー）を変化させることとしたが、これに代えて、標本を照射するパルスレーザ光のパルス数を変化させるようにしても良い。標本に照射されるパルス数を変化させるには、パルスレーザ光源におけるパルス発振周波数を変化させたり、音響光学装置６のような高速シャッタ手段によってレーザパルスの一部を時間的に遮断する（パルスを間引く）ことによって実現できる。このようにしても、標本Ａの観察面に照射するレーザ光の光量を変化させることができるので、上述したレーザ光の光強度を変化させるときと同様の効果を奏することが可能となる。
【００５４】
次に、本発明の第２の実施形態に係る多光子励起型観察装置１００について、図５を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る多光子励起型観察装置１００は、標本の観察面の深さに応じてレーザ光の光束径を変化させるものである。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る多光子励起型観察装置１と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。
【００５５】
図５は、本実施形態に係る多光子励起型観察装置１００の要部構成を示す概略図である。
図５において、本実施形態に係る多光子励起型観察装置１００は、パルスレーザ光源４と蛍光顕微鏡本体３との間にパルスレーザ光源４から出射されたパルスレーザ光の光束径を変化させるための入射調節装置を備えている。この入射調節装置としては、例えば、パルスレーザ光源４から出射された光をコリメートするコリメートレンズ光学系６１を採用することが可能である。入射調節装置としてコリメートレンズ光学系６１を採用した場合には、パルスレーザ光の光軸方向に対して、コリメートレンズ光学系６１の位置を変更することにより、コリメート関係を変化させて、対物レンズ３ａの瞳位置での光束径を変化させることが可能となる。これにより、標本Ａの観察面に集光されるレーザ光の光束径を変化させることが可能となる。
【００５６】
また、多光子励起型観察装置１００の制御装置７０は、図３に示したレーザパワーコントローラ５３に代わって上記コリメートレンズ光学系６１を光軸方向に移動することのできる電動駆動部７３を備え、また、レーザ制御装置５２に代わって、レーザ制御装置７２を備えている。
【００５７】
前記電動駆動部７３は、コリメートレンズ光学系６１を光軸方向に移動することのできる直動レール７３１と、ラックピニオンギヤを持つステッピングモータ７３２、及びステッピングモータ７３２を駆動するモータドライバ７３３を備えている。
前記レーザ制御装置７２は、内部にＳＲＡＭ（メモリ装置）７２１を備えている。このＳＲＡＭ７２１には、標本Ａの観察面の深さと好適なコリメートレンズ光学系６１の位置とが対応付けられたルックアップテーブルが記憶されている。
【００５８】
レーザ制御装置７２は、走査制御装置５４からの同期信号に基づいてＳＲＡＭ７２１のルックアップテーブルを参照することにより、観察面の深さに適したコリメートレンズ系６１の位置を取得し、この位置にコリメートレンズ系６１を移動させる制御指令を電動駆動部７３に出力する。電動駆動部５３は、レーザ制御装置７２からの制御指令に基づいて、ステッピングモータ７３２を制御する。これにより、ステッピングモータ７３２の制御量に応じた移動量で、コリメートレンズ光学系６１が直動レール上を移動し、観察面の深さに応じたレンズ位置で停止する。
これにより、光源装置２からは、標本Ａにおける観察面の深さに対して好適な光束系のパルスレーザ光が出射されることとなる。
【００５９】
上記ルックアップテーブルの作成については、上述の第１の実施形態と同様、次のような手順で行われる。
まず、プリスキャン時に、標本の観察面を深層部にセットし、この状態でレーザ光を照射する。このとき、コリメートレンズ系６１の位置を徐々に移動させることにより、パルスレーザ光の光束径を徐々に絞る。ユーザは、モニタ５５に映された観察画像を確認し、最も画像が鮮明に取れたときのコリメートレンズ系６１の位置をコンピュータ５１に記録させる。
【００６０】
続いて、Ｚ駆動機構６０を駆動することにより、標本Ａの観察面を表層部にセットし、この状態でレーザ光を照射する。そして同様に、コリメートレンズ系６１の位置を移動させることにより、パルスレーザ光の光束径を徐々に絞る。ユーザは、モニタ５５に映された観察画像を確認し、最も画像が鮮明に取れたときのコリメートレンズ系６１の位置をコンピュータ５１に記録させる。なお、表層部が標本の表面に設定された場合には、本来の対物レンズ３ａの性能が出せる光束系が自動的に設定されるので、上述のようなプリスキャンにおける位置記録は不要となる。
【００６１】
このようにして、深層部における光強度と、表層部における光強度とが特定されると、これらの値を用いて、中間部（深層部と表層部の間の層）におけるコリメートレンズ系６１の位置を求める。この中間部における位置決定については、上述の第１の実施形態と同様、（１）式に示した媒質内の光散乱の関係式、一般的に用いられている補間方法を用いるほか、観察を行う観察面の全ての深さについてもプレスキャンを行うことにより、各観察面の深さに対応する最適なレンズ位置を求めることが可能である。
【００６２】
このような手法により、各観察面に対応するレンズ位置が決定すると、コンピュータ７１は、これらの情報を対応付けたルックアップテーブルを作成してレーザ制御装置７２のＳＲＡＭ７２１に書き込みを行う。これにより、本観察においては、観察面の深さに対応してコリメートレンズ光学系６１の位置が調節されることにより、最適な光束径のレーザ光が観察面に集光されることとなる。
なお、本観察における制御装置７０の制御内容等については、上述した第１の実施形態と同様であるので、説明を省略する。
【００６３】
以上説明してきたように、本実施形態に係る多光子励起型観察装置１００によれば、標本の観察面の深さに応じてレーザ光の光束径を変化させるので、標本の観察面の深さに依存する屈折率の不一致に関する問題を解消でき、どの深さにおいても良好な解像度の観察が像をえることが可能となる。これにより、表層部から深層部まで鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。
【００６４】
なお、本実施形態では、パルスレーザ光源４から発せられるパルスレーザ光の光束径を調節する入射調節装置として、コリメートレンズ光学系６１を採用したが、入射調節装置はこの例に限れることなく、他の光学系を採用しても良い。
【００６５】
また、コリメートレンズ光学系６１の全体の位置をずらすのではなく、電動式のズーム光学系（例えば、フォーカルズームレンズ等）を構成し、コリメートの条件に影響を与えることなく光束径を変化させるシステムをしても良い。また、電動駆動部７３は、上述の構成に限られることなく、例えば、ピエゾアクチュエータなど、高精度の位置決めが可能なアクチュエータを採用することが可能である。
【００６６】
また、本実施形態では、ルックアップテーブルに、観察面の深さに対応するレンズの位置を設定していたが、この例に限られることなく、例えば、ステッピングモータの差分パルス数等を登録するようにしても良い。つまり、レンズの位置を決定づけることのできる情報であれば、上記レンズ位置に代わって採用することが可能である。
【００６７】
次に、本発明の第３の実施形態に係る多光子励起型観察装置について、図６を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る多光子励起型観察装置は、光検出装置４０が備える各部の制御を標本Ａの観察面の深さに応じて変化させることにより、良好な光検出を行い鮮明な観察画像を得るものである。
本実施形態の説明において、上述した第１の実施形態に係る多光子励起型観察装置１と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。
【００６８】
図６に示すように、本実施形態に係る光検出装置４０は、図１に示したダイクロイックミラー３４により分岐された多光子蛍光Ｆを集光する集光レンズ４１、ピンホール４２、レンズ４３、ＰＭＴ等の光電子増倍管（光増幅部）４４と、光電子増倍管４４からの信号を積算する積算器（積算部）４５を備えている。
ピンホール４２は、多光子励起型観察装置には無くても良いものであるが、このピンホール４２をあえて設けることにより、光検出精度を向上させることができる。光電子増倍管４４は、ピンホール４２を通過した多光子蛍光Ｆを検出する。積算器４５は、光電子増倍管４４から出力される検出信号を所定期間積算し、積算後の信号をコンピュータ９１に出力する。また、コンピュータ９１は、受け取った信号をもとに観察画像を生成する。
【００６９】
本実施形態に係る制御装置９０は、第１の実施形態に示したレーザパワーコントローラ５３に代えてハイボルトコンバータ９３を備え、また、レーザ制御装置５２に代えて受光回路制御装置９２を備えている。コンピュータ９１は、上述した第１の実施形態に係るコンピュータ５１と略同様の機能を備えているが、レーザ制御装置５２に代わって受光回路制御装置９２に対して制御信号を出力する点で異なる。
【００７０】
前記ハイボルトコンバータ９３は、受光回路制御装置９２からの制御指令に基づいて、光電子増倍管４３の増倍率を変化させる。
受光回路制御装置９２は、内部にＳＲＡＭ（メモリ装置）９２１を備えている。このＳＲＡＭ９２１には、標本Ａの観察面の深さと、ピンホールの径、光電子増倍管４４の増倍率、及び積算器４５の積算時間とがそれぞれ応付けられたルックアップテーブルが記憶されている。このような光検出装置４０において、増倍率、積算時間を変化させることで、光検出の検出感度を調整でき、また、ピンホール径を変化させることで、検出する光量を調整することができる。
【００７１】
受光回路制御装置９２は、走査制御装置５４からの同期信号に基づいてＳＲＡＭ９２１のルックアップテーブルを参照することにより、観察面の深さに適した制御量、つまり、ピンホール４２の径、光電子増倍管４４の増倍率、積算器４５の積算時間を取得し、これらの制御量に基づいて各部を制御する。具体的には、ピンホール４２の径をルックアップテーブルから取得した値に調節するとともに、ハイボルトコンバータ９３に対してルックアップテーブルから取得した増倍率に光電子増倍管４４を設定する旨の制御信号を出力し、積算器４５に対して積算時間を出力する。これにより、ピンホール４２に入射した多光子蛍光Ｆのうち、適切な蛍光量がレンズ４２を介して光電子増倍管４４に導かれ、深さに応じた増倍率で検出されることとなる。そして、検出された信号が積算器により深さに応じた最適な積算時間で積算されて、コンピュータ９１に出力されることとなる。
【００７２】
なお、ルックアップテーブルの作成については、上述の第１の実施形態と同様、プリスキャン時に標本の観察面を深層部や表層部に順次セットした状態で、上記ピンホール、光電子増倍管、積算器の制御量をそれぞれ変化させることにより、最適な観察画像が取得できる制御量をそれぞれ取得する。そして、深層部における制御量、表層部における制御量から中間部における制御量を求め、これらの制御量に基づいてルックアップテーブルがコンピュータ９１により作成されて、受光回路制御装置９２のＳＲＡＭ９２１に書き込まれる。
【００７３】
なお、本観察における制御装置９０の制御内容等については、上述した第１の実施形態と同様であるので、説明を省略する。
【００７４】
以上説明してきたように、本実施形態に係る多光子励起型観察装置によれば、標本Ａの観察面の深さが変更されると、受光回路制御装置９２の作動により、光検出装置４０内のピンポール４２の径、光電子増殖管４４の増倍率、及び積算器４５の積算時間が、観察面の深さに応じて調節される。例えば、観察面の深さが深くなるほど、ピンホールの径、光電子増倍管の増倍率、及び積算部の積算時間が大きくなるように調節される。これにより、観察面にて発生した多光子励起効果を効果的に取得することが可能となり、表層部から深層部まで鮮明な多光子蛍光画像を得ることができる。
【００７５】
更に、本実施形態に係る多光子励起型観察装置によれば、メモリ（図示略）に画像データが格納される以前の光量を観察面の深さに応じて変更することができるので、例えば、従来のように、事後的に画像処理を行う場合に比べて、調整の自由度が高く、最適な状態の画像データを保存することができる。
なお、本実施形態では、ピンポール４２の径、光電子増殖管４４の増倍率、及び積算器４５の積算時間の全てを観察面の深さに応じて調節する例について述べたが、この例に限定されず、これらの制御量のいずれか一つを調節することにしても良い。
【００７６】
次に、本発明の第４の実施形態に係る多光子励起型観察装置３００について、図７を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る多光子励起型観察装置３００は、上述した第１の実施形態に係る制御装置５０（図３参照）と第２の実施形態に係る制御装置７０（図５参照）とが備える機能を併せ持つものである。
本実施形態の説明において、上述した第１及び第２の実施形態に係る多光子励起型観察装置１、１００と構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を省略する。
【００７７】
本実施形態に係る制御装置８０は、標本Ａの観察面の深さに応じてパルスレーザ光の光強度を変化させる機能と、標本Ａの観察面の深さに応じてコリメートレンズ光学系６１の位置を調節することにより、レーザ光の光束径を変化させる機能とを備えている。
このため、レーザ制御装置８２が備えるＳＲＡＭ８２１には、標本Ａの観察面の深さと光強度とが対応付けられたルックアップテーブルと、観察面の深さと光束径とが対応付けられたルックアップテーブルとが記憶されている。そして、これらのルックアップテーブルを参照することにより、観察面の深さに応じてレーザ光の光強度及び光束径を調節する。これにより、観察面の深さが変化しても、鮮明な観察画像を常に得ることが可能となる。
なお、この多光子励起型観察装置３００に、更に、上述した第３の実施形態に係る多光子励起型観察装置の制御装置９０により実現される機能を追加しても良い。
【００７８】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】本発明の第１の実施形態に係る多光子励起型観察装置の概略構成を示すブロック図である。
【図２】図１の多光子励起型観察装置に用いられる音響光学装置の一例を示す斜視図である。
【図３】図１に示した多光子励起型観察装置の制御系の一例を示す図である。
【図４】観察面の表層部、中間部、深層部について説明する図である。
【図５】本発明の第２の実施形態に係る多光子励起型観察装置の制御系の一例を示す図である。
【図６】本発明の第３の実施形態に係る多光子励起型観察装置の制御系の一例を示す図である。
【図７】本発明の第４の実施形態に係る多光子励起型観察装置の制御系の一例を示す図である。
【符号の説明】
【００８０】
１、１００、３００  多光子励起型観察装置
２  光源装置
３  蛍光顕微鏡本体
４  パルスレーザ光源
３ａ  対物レンズ
４０  光検出装置
４１  集光レンズ
４２  ピンホール
４３  バリアフィルタ
４４  光電子増倍管
４５  積算器
５０、７０、９０  制御装置
５１、７１、９１  コンピュータ
５２、７２、８２  レーザ制御装置
５３  レーザパワーコントローラ
５４  操作制御装置
５５  モニタ
６０  Ｚ方向駆動部
６１  コリメータレンズ光学系
７３  電動駆動部
９２  受光回路制御装置
９３  ハイボルトコンバータ
５２１、７２１、８２１、９２１  ＳＲＡＭ
７３１  直動レール
７３２  ステッピングモータ
７３３  モータドライバ
【図１】
0004759425.tif 000003
【図２】
0004759425.tif 000004
【図３】
0004759425.tif 000005
【図４】
0004759425.tif 000006
【図５】
0004759425.tif 000007
【図６】
0004759425.tif 000008
【図７】
0004759425.tif 000009