(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的に活性な製品の個体への無菌的投与のために適した最終殺菌方法において，
製品とその製品を熱安定性にするのに十分な量のα-Ｄ-グルコピラノシル-α-Ｄ-グルコピラノシド（トレハロース）を含む乾燥サンプルを、パルボウイルスを不活性化するために少なくとも80℃の加熱温度および少なくとも72時間の加熱の持続時間で加熱する工程を含む方法。
【請求項２】
生物学的に活性な製品は，全血，血漿，血清，胎盤，乳汁，尿，細胞培養物および細胞培養液上清からなる群より選択される生物学的起源から得られる「請求項１」記載の方法。
【請求項３】
製品は、アルブミン製品，免疫グロブリン，凝固製品、フィブリノーゲンおよびプロテアーゼ阻害剤からなる群より選択される「請求項１」または「請求項２」記載の方法。
【請求項４】
アルブミン製品はＨＳＡおよび寒冷可溶性グロブリンからなる群より選択される「請求項２」または「請求項３」記載の方法。
【請求項５】
免疫グロブリンは破傷風，百日咳，肝炎，ヘルペス，水痘帯状疱疹，レンチウイルスおよび狂犬病に対する抗体からなる群より選択される「請求項２」記載の方法。
【請求項６】
凝固製品は抗血友病ＶＩＩＩ因子，およびＩＸ因子複合体からなる群より選択される「請求項２」または「請求項３」記載の方法。
【請求項７】
プロテアーゼ阻害剤はα-１プロテアーゼ阻害剤および抗トロンビンＩＩＩからなる群より選択される「請求項２」または「請求項３」記載の方法。
【請求項８】
生物学的に活性な製品は鎮痛剤である「請求項１」記載の方法。
【請求項９】
生物学的に活性な製品は麻酔剤である「請求項１」記載の方法。
【請求項１０】
生物学的に活性な製品は化学療法剤である「請求項１」記載の方法。
【請求項１１】
生物学的に活性な製品はホルモンである「請求項１」記載の方法。
【請求項１２】
生物学的に活性な製品はワクチンである「請求項１」記載の方法。
【請求項１３】
熱安定性は製品の活性の30％未満の喪失を生じる「請求項１〜12いずれか一項」に記載の方法。
【請求項１４】
乾燥したサンプルの残留水分含量は４％未満である「請求項１〜13いずれか一項」記載の方法。
【請求項１５】
パルボウイルスの感染性の少なくとも104倍の低下を生じるのに十分な温度および加熱時間である「請求項１〜14いずれか一項」記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は，血液ならびに他の生物起源に由来する製品の滅菌の分野に関する．本発明は，生物学的に活性な生成物を，トレハロースの存在下，ウイルスとくにパルボウイルスを死滅させるのに十分な条件において，ある時間加熱することを包含する．
背景技術
生物学的に活性な製品からウイルスおよび他の夾雑物を完全に除去することは広範囲の様々な治療用および予防用製品の製造および使用に必須である．多数の方法が現在，使用されている．これらは主として，乾燥熱処理，クロマトグラフィー，溶媒-洗浄剤（ＳＤ）処置および低温殺菌である．これらの方法はすべて欠点があり，すべての既知のウイルスを効果的に排除するものはない．これらの方法によっては不活性化されない，まだ特徴が明らかにされていないウイルスも存在する（総説としてはCuthbertsonら（1991）Blood Separation and Plasma Fractionation.Wiley-Liss,Inc.pp.348-435;Mozen（1993）J.Clin.Apheresis 8:126-130;Ingerslev（1994）,Haemastasis 24:311-323;Dornerら（1993）,Virological Safety Aspects of Plasma Derivatives,Ed.Brown,Dev.Biol.Stand.,Basel,Karger,Vol.81,pp.137-143;Mannucci（1993）Vox Sang.64:197-203;およびHammanら（1994）Vox Sang.67:72-77参照）．
治療的有用性を有する広範な様々の製品が生物学的起源たとえば血漿および細胞系から誘導される．アメリカ合衆国で分画化に使用される血漿の大部分は全国に分布する集血センターにおいて血漿泳動によって得られる．センターは血漿をアメリカ合衆国およびヨーロッパの分画業者に提供する．１年間に約1,300万人の献血によって約900万リットルの血漿が収集されている．この数字に赤十字社からの約80万リットルが加わる．
ヒト血漿からの製品は数グループに分類される．すなわち，アルブミン製品，免疫グロブリン，寒冷不溶性グロブリン，凝固製品，およびプロテアーゼ阻害剤である．アルブミン製品はまた，分画Ｖ製品とも呼ばれ，主として火傷のようなショック状態または水分の喪失が主要な問題である出血ショックの膠質浸透圧の回復に使用される．
免疫グロブリン，または「γグロブリン」は分画IIから単離され，血漿プール起源の代表的抗体の混合物を含有する．受動免疫に使用される高免疫グロブリンの多くは，高レベルの保護抗体を含むドナー血漿から単離される．寒冷不溶性グロブリンはフィブリノーゲンおよびフォンビルブラント因子を包含する．
凝固製品は，血友病ＡおよびＢにおける置換療法にそれぞれ使用される抗血友病VIII因子およびIX因子複合体を包含する．抗-阻害凝固複合体とも呼ばれるIX因子複合体の活性型が調製され，VIII因子阻害剤とともに患者の処置に使用される．プロテアーゼ阻害剤にはα１抗-トリプシンとしても知られるα１プロテイナーゼ阻害剤が包含され，これは先天性の欠損症の処置に用いられる．抗トロンビンIIIは血栓症の併発を招く先天性欠損の阻害剤である．
他の体液も治療用製品の起源となる．たとえば，エリトロポエチンは以前，再生不良性貧血患者の血液もしくは尿から精製されていた（米国特許第4,677,195号）．高度に精製されたアルブミンもヒト胎盤から得られていた
0004841018.tif 000002
トランスジェニック動物の乳汁中における組換えタンパク質の製造が現在では商業ベースで実現している．
現在では，組換えタンパク質を発現する培養細胞から多くの治療用製品が得られている．培養細胞は動物またはヒト血清の存在下に定常的に増殖されている．生成物は細胞からまたは細胞培養液上清から取得され，したがって，培地または細胞自体からのウイルスを含有する可能性がある．得られるこれらの生成物にはそれらに限定されるものではないが，コロニー刺激因子，モノクローナル抗体およびそれらの誘導体，増殖因子たとえばエリトロポエチン，インターロイキンが包含される．増殖因子だけで何万ドルもの産業を形成している（総説には，たとえばErickson（1991）Sci.Am.,Feb.1991,pp.126-127参照）．
細胞培養物から誘導されるタンパク質のウイルス夾雑の危険は，血漿製品に伴う危険よりもはるかに低いとはいえ，細胞を取り扱う場合にはウイルス夾雑の危険は避けられない．この理由から，モノクローナル抗体のような製品はウイルスを不活化するために熱処理に付される．さらに，組換えタンパク質の組成物を安定化するため，ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の添加が一般に行われている．
臨床的に問題になる主要な血液運搬ウイルスにはＢ型およびＣ型肝炎ウイルスならびにＨＩＶおよびＨＴＬＶレトロウイルスが包含される．血液誘導体に関してはＨＴＬＶＩおよびIIならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＢ）は細胞結合性であるため，細胞を含まない製品には危険をもたらさないように思われる．
新しいウイルスが発見されるたびに，不活性化のプロトコールはそれらが包含されるように改訂される．たとえば，ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）がVIII因子の標準処理によっては生存することの発見は，新たな，さらに厳しい条件下において生成物を安定化するために，ＨＳＡの添加を要求するプロトコールへの改変を必要とした（Mozon,1993）．
血漿分画中のＨＩＶおよび肝炎ウイルスを不活性化するための方法は知られている．上述のように，ＨＳＡの存在下60℃に10時間加熱することにより，ＨＩＶは不活性化される．非Ａ非Ｂ肝炎（ＮＡＮＢＨ）ウイルスはVIII因子およびIX因子プレパレーション中，凍結乾燥状態で80℃に72時間加熱することにより不活性化されることが見出された（UK Haemophilia Centre,Directors on Surveillance of Virus Transmission by Concentratesの研究グループ（1988）Lancet,Oct.8,pp.814-816）．
近年，公衆衛生の観点からは珍しいが，実際の輸血ならびに血漿，血漿誘導体および細胞生成物の使用による潜在的輸血の両者に影響される新しい輸血感染疾患が数種同定された．これらにはパルボウイルス（Ｂ19）の感染が包含される．この病原体は，ウイルスの不活性化に現在用いられている方法に抵抗を示すものと思われる（Sherwood（1993）Ed.Brown,Virology Safety Aspects of Plasma Derivatives,Dev.Biol.Stand.,Basel,Karger,Vol.81,pp.25-33）．
現在使用されているウイルス不活性化方法はまた，得られた生物学的製品の生物活性に変化を生じる可能性がある．製品の免疫原性は滅菌処理がタンパク質のアンフォールディングおよび／または凝集を誘導する場合，とくに重要である．たとえば，VIII因子濃縮物は２段階強度よりも高い１段階強度，より迅速なＦＸａの発生，および低分子量ポリペプチドの増加によってＦVIII活性化の証拠を示すことが見出されている．ウイルスの不活性化操作はまた，非ＦVIII成分の変化も誘発し，これらは，これらの濃縮物の一部の免疫抑制活性の一部の原因となる可能性がある（Barrowcliff（1993）Virology Safety Aspects of Plasma Derivatives,Ed.Brown,Dev.Biol.Stand.,Basel,Krager,Vol.81,pp.123-135）．
インビトロおよびエキソビボ両者における免疫系機能の著しい変化は，生物学的に誘導された製品に高頻度に暴露された患者に認められた．ＨＩＶ-陰性患者での変化には，刺激に対する応答および細胞ターンオーバーのマーカーによって評価される免疫担当細胞の数および機能の低下を包含する．これらの変化は慢性的なウイルス疾患が存在する場合に起こるように思われる．さらに，因子濃縮物の変性した同種異系タンパク質不純物および他の夾雑物も免疫抑制の原因になっている可能性がある（総説としてIngerslev（1994）参照）．
ヒトパルボウイルスはコード番号：Ｂ19を与えられた最近発見された病原体である（Cossartら（1975）Lancet 1:72-73）．それはきわめて小さい（24nm）一本鎖ＤＮＡウイルスであり，きわめて単純なタンパク質コートを有するが脂質外部エンベロープはもたない．それは１〜２週間の一過性ウイルス血症しか生じないが，少なくとも1012ウイルス粒子／mlの著しく高い循環ウイルス力価を生じる．パルボウイルスは通常臨床的には明瞭ではないことが多い比較的軽微な疾患しか起こさず，第五病または伝染性紅斑として知られる軽い風疹様の発疹を生じるのみであるが，さらに重篤な反応を起こすこともある．パルボウイルスは骨髄幹細胞に感染し，これは基底に既存の貧血がある患者では重篤な生命に危険がある状態を起こすことがある．先天性の溶血性貧血および免疫不全状態を有する患者では急性の造血中断の結果としての無形成クリーゼを起こすことがある．また，パルボウイルスは妊婦に胎児水腫を生じる．すなわち，パルボウイルスには血漿由来の治療剤を投与されている患者，とくに止血障害のある患者で感染の危険がある．このウイルスは，パルボウイルスの感染のみならず同様の特徴を有する他の病原ウイルスの危険のために，煩雑な殺ウイルス法およびクロマトグラフィー除去法を使用してもある濃度まで感染する懸念がある．
溶血性障害を有する小児の研究では，熱処理しなかった血漿誘導体中のパルボウイルスは迅速な感染性を示すことが見出された．加熱処理したVIII因子濃縮物で処置された小群の（Ｎ＝９）小児の研究では，パルボウイルスは感染しなかった（Williamsら（1990）Vox Sang.58:177-181）．しかしながら，他の研究では熱処理製品でもパルボウイルスは感染した（Corsiら（1988）J.Med.Virol.25:151-153）．肝炎ウイルスやＨＩＶの場合とは異なり，パルボウイルスは個々の献血血漿について試験されていないので，プール血漿中に存在する．
上述のように，生物学的に誘導される治療用製品中のウイルスの不活性化には様々な処置が提案され，使用されている（総説としてはSoumela（1993）Trans.Med.Rev.VII:42-57参照）．最終製品は分離工程および不活性化工程の組合せによって得られ，これは両者ともウイルス負荷の低下に有効である．
数種の加熱処理が現在使用されている．アルブミン製品には溶液中での加熱が一般的に使用される．これは，低温殺菌としても知られている．ウイルスは液体サンプルを，少量の安定剤たとえばカプリル酸またはトリプトファンの存在下に少なくとも10時間60℃に加熱することによって不活性化される．しかしながら，この方法は，大部分のタンパク質がこれらの条件下には変性するので，他の製品には不適当である．低温殺菌は広いスペクトルのウイルス，たとえば，ＨＩＶ，ＨＢＶ，ＨＣＶ，ＨＡＶ，ＨＳＶ，ポリオウイルスＣＭＶ，ムンプスウイルス，麻疹ウイルスおよび風疹ウイルスを不活性化することが示されている（Nowakら（1993）Virological Safety Aspects of Plasma Derivatives,Ed.Brown,Dev.Biol.Stand.Basel,Vol.81,pp.169-176およびSoumela,1993）．これらの研究ではパルボウイルスは試験されなかった．さらに，低温殺菌した凝固因子の使用はネオ抗原の形成を伴っていた（Ingerslev,1994）．
凍結乾燥した場合の乾燥製品の加熱の実施では，不安定なタンパク質は68℃までの温度に耐えられる．60℃での加熱を包含する以前の方法は肝炎ウイルスの不活性化に使用されていた（たとえば米国特許第4,456,590号参照）．しかしながら，これらの条件は，精製凝固因子によるウイルスの感染から明らかなように，ＨＩＶの不活性化には不十分であった．68℃で72時間処理した製品も安全ではないことが分かった（Soumela,1993）．さらに最近になって肝炎ウイルスおよびＨＩＶの不活性化を確実にするためもっと高い温度および長い加熱時間たとえば80℃で72時間が使用されてきた（たとえば，Knevelmanら（1994）Vox Sang.66:89-95）．しかしながら，最も不安定な生物学的活性物質とくにバイオ医薬品はこのような極端な温度／時間条件への暴露には耐えられない．この方法の他の欠点はパルボウイルスの不活性化に関し，しばしば予測できない結果を生じることである（Santagostinoら（1994）Lancet 343:798;Yeeら（1995）Lancet 345:794）．
ウイルスの溶媒／洗浄剤（ＳＤ）による不活性化は脂質エンベロープを有するウイルスの膜の分裂によるものである．ウイルスは細胞受容体の認識部位の構造的分裂または破壊によって非感染性になる．大部分のヒト病原性ウイルスは脂質エンベロープを有するが，パルボウイルスおよびＨＡＶは脂質エンベロープをもたず，この方法では不活性化されない（総説はWiedingら（1993）Ann.Hematol.67:259-266参照）．ＳＤ法は多くの国で使用されている（Horowitzら（1993）Virological Safety Aspects of Plasma Derivatives,Ed.Brown,Dev.Biol.Stand.Basel,Karger,Vol.81,pp.147-161）．関連方法では，脂質が脂質エンベロープを有するウイルスの不活性化に使用されている（Isaacsら（1994）Ann.NY Acad.Sci.724:457-464）．
多くの他の方法が開発され，また開発中である．たとえば，血漿の低温殺菌は血漿を9-プロピオールアセトンおよびＵＶ光の組合せに暴露することによって実施されている．しかしながら，この方法は不安定なタンパク質の活性を低下させる．様々な化学処理たとえばプソラレンとＵＶＡ，ＢＰＤ-ＭＡと光線の使用を含む方法が提案されているが，これらは脂質-エンベロープウイルスの不活性化に限定される．カプリル酸および食塩に殺ウイルス性があることも見出されている．様々な物理的分離方法，たとえば親和性クロマトグラフィー，冷エタノール分画化，微孔膜およびペルフルオロカーボン乳化も試験されている（Lawrence（1993）Virological Safety Aspects of Plasma Derivatives,Ed.Brown,Dev.Biol.Stand.,Basel,Karger,Vol.81,pp.191-197;Burnouf（1993）同誌，pp.199-209;Teh（1993）Vox Sang.65:251-257;Lebingら（1994）Vox Sang.67:117-124;DiScipio（1994）Prot.Exp.Purif.5:178-186;Morgenthaler & Omar（1993）Virological Safety Aspects of Plasma Derivatives,Ed.Brown,Vol.81,pp.185-190;Erickson（1992）Sci.Am.,September,pp.163-164;およびMcCreathら（1993）J.Chromatog.629:201-213）．
血漿タンパク質の製造時におけるウイルスの不活性化の成功を決定するためには３つの前提条件を満たすことが要求される．第一に，製造操作が可能な限り正確にスケールダウンされなければならない．第二に，添加実験のために関連試験ウイルスが選択されなければならない．第三に，得られたサンプルを，感染ウイルスについて適切にアッセイしなければならない．このような試験の方法の詳細はたとえば，Hilfenhausら（1993）Ed.Brown,Virological Safety Aspects of Plasma Derivatives,Dev.Biol.Stand.Basel,Karger,Vol.81,pp.117-123）によって記載されている．ここではこれらの指針に従った．
トレハロース，（α-Ｄ-グルコピラノシル-α-Ｄ-グルコピラノシド）は天然に存在する非還元性二糖であり，最初，ある種の植物および動物における乾燥障害の予防に関連して発見され，それらは障害を生じることなく乾燥することが可能で，再び水和されると再生する．トレハロースは二水和型として市販されている．トレハロースはタンパク質，ウイルスおよび食品の乾燥時変性を防止するのに有用であることが示されている（米国特許第4,891,319号；第5,149,653号；第5,026,566号；Blakeleyら（1990）Lancet,336:854-855;Roser（1991,July）Trends in Food.Sci.& Tech 166-169;Colacoら（1992）Biotechnol.Internat.345-350;Roser（1991）BioPharm.4:47-53;Colacoら（1992）Bio/Tech.10:1007-1011;およびRoserら（1993,May）New Scientists,pp.25-28参照）．トレハロース二水和物は適正製造規準（Good Manufacturing Process,ＧＭＰ）グレードの結晶製品として入手できる．トレハロースの乾燥無水型を作成する方法は欧州特許公開第600,730号に記載されている．この方法はトレハロースシロップを種結晶の存在下に加熱し，無水トレハロースを回収するものである．
トレハロースは，細菌，酵母，かび，昆虫および無脊椎動物のような様々の動物および植物種に広く見出される．多くの昆虫では，これは主要な血糖である．ヒトにおける唯一の供給源は食餌たとえばきのこおよび酵母製品のような食品である（Hadsarovova-Nohejlova（1973）Gastroenterol.65:130-133）．
トレハロースには腹膜透析システムにおける使用が米国特許第4,879,280号に記載されている．この場合，グルコースを用いる従来システムの置換物として数種の二糖の一つに挙げられている．トレハロースは，容易にはグルコースに分解されないので，したがって血中グルコースレベルの上昇を回避できる二糖として透析システムにおける使用が言及されている．トレハロースはまた，主として，慣用の非経口投与用製剤に伴う褐変を生じることなくオートクレーブで滅菌できることから，非経口投与用組成物における使用に適しているとも記載されている（日本特許公開平6-70718号）．
トレハロースはヒトの食餌の一般的成分であり，その代謝についての情報がある．単糖のみが腸管上皮を通過できることから，経口的摂取後，トレハロースはそののままでは胃腸管から吸収されない（Ravich & Bayless（1983）Clin.Gast.12:335-356）．トレハロースは酵素トレハラーゼによって２分子のグルコースに代謝される（Sacktor（1968）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 60:1007-1014）．トレハロースはヒトを含め大部分の哺乳動物生体の正常な成分であり，ヒト血清，リンパ球および肝臓に同定されているが，主として腸管ならびに腎臓近位尿細管の刷子縁に局在する（Belfioreら（1973）Clin.Chem.19:447-452;Eze（1989）Biochem.Genet.27:487-495;Yoshidaら（1993）Clin.Chim.Acta 215:123-124;およびKramers & Catovsky（1978）Brit.J.Haematol.38:4453-461）．トレハラーゼは，ヒトや動物の腸管における膜結合タンパク質ある（Bergozら（1981）Digestion 22:108-112;Riby & Galand（1985）Comp.Biochem.Physiol.82B:821-827;およびChenら（1987）Biochem.J.247:715-724）．
本明細書に引用された参考文献はすべて引用により本明細書に導入される．
発明の開示
本発明は，生物学的起源から誘導される製品とくに治療用製品の殺菌方法およびそれによって得られる組成物に関する．本発明の方法は，製品を熱安定性にするのに十分な量のトレハロースの存在下に乾燥し，乾燥したサンプルをウイルスを実質的に不活性化するのに十分な温度および時間の加熱条件に暴露することを包含する．加熱条件は脂質エンベロープをもたないウイルスを不活性化するのに十分であることが好ましい．乾燥方法は，スプレー乾燥および真空乾燥のような常温乾燥条件ならびに凍結乾燥の両者を包含する本技術分野で既知の任意の方法である．加熱条件は広範囲の温度および加熱時間の組合せをカバーする．
本発明はさらに，本発明の方法によって得られた組成物を包含する．これらの組成物は安定な生物学的製品を含有し，検出可能な感染性ウイルス，とくにパルボウイルスを含有しない．
発明を実施するための最良の形態
本明細書に詳述したように，血液由来の生物学的製品には多くの最終殺菌法がある．これらの方法は本明細書に参考文献によって例示したように本技術分野において周知であり，さらに詳細に説明する必要はないものと考える．抗体親和性クロマトグラフィーのような厳密な精製方法ではウイルスを全く含まない生物学的製品が得られるが，製品から一様に，感染性ウイルスとくに脂質エンベロープをもたないウイルスを排除する工業的に実施可能な方法はこれまで見出されていない．さらに，製品から感染性ウイルスを除去するために殺菌条件を厳密にする程，製品の活性の低下および／または製品の免疫原性の増大を生じる．
血液誘導製品に加えて，本明細書に示した殺菌方法の利点を利用できる多くの生物学的に活性な製品がある．これらには，それらに限定されるものではないが組換えによって製造されるタンパク質，単離されたネイティブなタンパク質，抗生物質，酵素，サイトカインおよび増殖因子ならびに医薬的に活性な分子たとえば鎮痛剤，麻酔剤，制吐剤，抗生物質，化学療法剤，ホルモン，ビタミンおよびステロイドが包含される．
個体に無菌的に導入される物質も，本発明の方法を使用するのに適している．これらには，それらに限定されるものではないが薬物，抗生物質，造影剤および診断試薬が包含される．投与される製品が不安定な場合，たとえばセファロスポリン，治療用抗生物質およびエリトロポエチンには，使用直前に再水和できる安定な乾燥した滅菌組成物を提供する本発明は重要である．トレハロースは血流中でトレハラーゼに暴露されると２分子のグルコースに分解するので，注射，輸液等の薬剤にきわめて適している．グルコースは軽度の一過性の血糖レベルの上昇を起こすが，臨床的にはほとんど問題にならない．
本発明は個体に無菌的に投与する必要がある製品の最終殺菌方法を包含する．この方法の工程には，製品および製品を実質的に熱安定性とするのに十分な量のα-Ｄ-グルコピラノシル-α-Ｄ-グルコピラノシド（トレハロース）を含有する乾燥サンプルを得る工程，ならびに乾燥サンプルをウイルスが実質的に不活性化するのに十分な温度および時間好ましくは脂質エンベロープをもたないウイルスが不活性化される加熱条件下に加熱する工程を包含する．乾燥サンプルにはさらに適当な緩衝剤，補助剤等が含まれていてもよい．再水和により適当な濃度になる量が好ましい．
製品は様々な起源から誘導できる．好ましくは，製品は既知の生物学的起源，それらに限定されるものではないが，例えば全血，血漿，血清，胎盤，乳汁，尿，細胞培養物および細胞培養液の上清から誘導される．さらに，製品は化学合成もしくは酵素合成により合成的に，または組換えＤＮＡ技術の使用によって誘導することもできる．これらの起源の調製方法および製品の単離方法は本技術分野において周知である．
全血，血漿および血清から単離または誘導される製品には通常，それらに限定されるものではないが，アルブミン製品，免疫グロブリン，凝固製品およびプロテアーゼ阻害剤が包含される．アルブミン製品には，それらに限定されるものではないがＨＳＡ，寒冷不溶性グロブリンおよびフィブリノーゲンが包含される．免疫グロブリンには，それらに限定されるものではないが，破傷風，百日咳，Ｂ型肝炎，Ｒho（Ｄ），水痘帯状疱疹，および狂犬病に対する抗体が包含される．凝固製品にはそれらに限定されるものではないが，抗血友病VIII因子，IX因子複合体，および活性化IX因子複合体が包含される．プロテアーゼ阻害剤にはそれらに限定されるものではないが，α１プロテアーゼ阻害剤，α１抗トリプシンおよび抗トロンビンIIIが包含される．これらの製品には他の起源も利用できる．たとえば，アルブミンは胎盤原料から得ることができる．
生物学的起源が細胞培養物または細胞培養液の上清である場合，製品にはそれらに限定されるものではないが，コロニー刺激因子，モノクローナル抗体およびそれらの誘導体，ならびに増殖因子が包含される．典型的な増殖因子にはそれらに限定されるものではないが，天然由来または組換えエリトロポエチン，サイトカインおよびインターロイキンが包含される．
製品が無菌的に投与する必要がある薬剤である場合，製品にはそれらに限定されるものではないが鎮痛剤，麻酔剤，化学療法剤，ホルモンおよびワクチンが包含される．鎮痛剤にはそれらに限定されるものではないが，モルヒネ，ベンゾカイン，ペチジンおよびデルメロールが，麻酔剤にはそれらに限定されるものではないがブピビカイン，アトラキュリウムおよびベキュロニウムが包含される．
化学療法剤は，それらに限定されるものではないが，放射性同位元素，ビンカアルカロイドたとえばビンブラスチン，ビンクリスチンおよび硫酸ビンデシン，アドリアマイシン，硫酸ブレオマイシン，カルボプラチン，シスプラチン，シクロホスファミド，シタラビン，ダカルバジン，ダクチノマイシン，塩酸ドゥアノルビシン，塩酸ドキソルビシン，エトポシド，フルオロウラシル，塩酸メクロロレタミン，メルファラン，メルカプトプリン，メトトレキセート，マイトマイシン，マイトタン，ペントスタチン，ピポブロマン，塩酸プロカルベーズ，ストレプトゾトシン，タキソール，チオグアニン，ならびにウラシルマスタードが包含される．
適当なホルモンには，それらに限定されるものではないが，エストロジェン，テストステロン，プロゲステロンおよびそれらの合成同族体が包含される．典型的なワクチンには，単一および多重抗原サブユニットワクチンの両者，ならびに死滅細菌およびウイルスプレパレーションならびに癌抗原が包含される．典型的な抗生物質には，それらに限定されるものではないが，セファロスポリンおよびアミノグリコシドが包含される．
方法は乾燥サンプルを取得するための第１工程を包含する．サンプルを乾燥するためには様々な方法が利用できる．これらには，それらに限定されるものではないが，空気乾燥，真空乾燥，スプレー乾燥および凍結乾燥が包含される．これらの方法は本明細書に示す実施例において詳細に例示するが，本技術分野においては周知である（たとえば，米国特許第4,891,319号，第5,026,566号，および第5,149,653号参照）．
サンプルは通常，溶液または懸濁液に調製され，製品，製品に熱安定性を付与するのに十分な量のトレハロース，および任意の他の通常の添加物たとえば適当な緩衝剤，補助剤等を包含する．通常，トレハロースは溶液の1〜50重量％の量を存在させる．しかしながら，トレハロースはもっと希釈されていても，また濃縮されていてもよい．もっと薄いと不適当に長い乾燥時間が必要になり，もっと濃いと溶液が粘稠になる．製品，トレハロースおよび添加物の正確な初期濃度は経験的に決定される必要があるが，これは，本明細書に示す実施例を与えられた当業者にとっては十分その技術の範囲内にある．製品およびトレハロースの濃度は，乾燥後に生じる製品の活性の喪失が約30％未満であるようにすることが好ましい．さらに好ましくは，活性の喪失は15％未満，最も好ましくは活性の喪失は10％未満である．
乾燥サンプルが得られたならば，それはウイルスを不活性化するのに十分な温度および持続時間からなる加熱条件に付される．通常，乾燥サンプルは，脂質エンベロープを有するウイルスを不活性化するためには80℃で72時間，および脂質エンベロープをもたないウイルスをさらに不活性化するために90℃で72時間の加熱に付される．加熱温度と加熱時間の至適な組合せは経験的に決定されることになる．このような決定は，本明細書に示す実施例を与えられた当業者にとっては十分その技術の範囲内にある．至適条件は通常，試験サンプルに不活性化すべきウイルスまたは類似の物理的性質を有するウイルスを加えることにより決定される．ウイルスの不活性化および／または除去操作のため規制当局が要求する力価の喪失は４log10の低下であることから，通常，添加したウイルスの４log10力価の喪失が「不活性化」とみなされる．
この方法は製品の実質的な熱安定性を生じる．この方法では好ましくは，製品の活性約30％未満の喪失を生じる．この方法ではさらに好ましくは，製品の活性約15％未満の喪失を生じる．この方法では最も好ましくは，製品の活性約10％未満の喪失を生じる．
この方法は，安定性が高く長期間にわたって保存できる乾燥サンプルを提供する．保存安定性は殺菌製品の残留水分に関係する．この方法では好ましくは残留水分含量約４％未満の乾燥サンプルが製造される．さらに好ましくは，残留水分含量は約２％未満である．最も好ましくは残留水分含量は約0.8〜1.0％である．残留水分は，それらに限定されるものではないが，示差熱分析，熱重量測定またはカール・フィッシャー電量分析を包含する様々な方法により測定できる．
加熱温度および加熱時間の範囲は広範囲に変動するが，特定のサンプルについての至適時間は，本分野の知識ならびに本明細書に提供された実施例を与えられれば，経験的に決定することができる．本明細書に示す結果は，約80℃で72時間の加熱は約90℃で20時間の加熱と同様に有効であることを指示している．さらに長い時間および／または高い温度も利用できるが，製品の活性の喪失を伴う可能性はある．
好ましくは，この方法では夾雑するウイルスの感染性に４log10倍の低下が生じる．この測定を行うには多くの方法が知られている．これらの多くは上に引用したが，他の多くの方法も本技術分野では知られている．脂質のエンベロープを有するウイルスは，脂質のエンベロープをもたないウイルスよりも熱処理に対する抵抗性が低いので，脂質のエンベロープをもたないウイルスの感染性の喪失を測定すれば，脂質のエンベロープを有するウイルスもすべて不活性化されたことを指示する．脂質のエンベロープをもたないウイルスには，それらに限定されるものではないが，Ａ型肝炎ウイルスおよびパルボウイルスが包含される．脂質のエンベロープをもたないウイルスは好ましくはパルボウイルスである．
本発明はまた，請求された発明の方法により得られる組成物を包含する．この組成物は検出可能な感染性ウイルスを含まず，貯蔵安定性が著しく優れている．さらに，処理時における治療用製品の変性または化学的分解の低下により，製品のレシピエントに対する免疫反応の発生率も低下する．
組成物はとくに鎮痛剤および化学療法剤のような薬物の場合，単一の剤形とすることが好ましい．単一剤形は初期の溶液または懸濁液を適当な容器に分取し，容器を別個に処理することによって製造できる．このような分取および処理は好ましくは自動化される．別法として，１用量以上のバッチで材料を処理し，乾燥製品を単一用量に分割することもできる．本発明はしたがって，請求された組成物の単一用量剤形を包含する．
ＨＳＡのような製品では，バッチ毎に処理することが好ましい．大量のバッチを処理して工業的にバルク品を提供することができる．本発明は，したがって，さらに請求された組成物のバルク型製品を包含する．
以下の実施例は，本発明を例示するものであるが，請求された発明を限定するものではない．
実施例１
パルボウイルスの感染性およびアルカリホスファターゼの活性に対する様々な糖の作用の比較
50％トレハロース溶液中１mg/mlのアルカリホスファターゼの保存溶液を50ｍＭ重炭酸アンモニウムおよび２％ＨＳＡ含有25ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中に作成し，106.5ＴＣＩＤ50/mlのイヌパルボウイルスを加えた．汚染した組成物のアリコート250μlを3mlのWheaton医薬用ガラスバイアル中で，ＦＴＳ乾燥器またはLabconco凍結乾燥器を用いて真空乾燥または凍結乾燥した．
真空乾燥には棚温度を最初30℃にセットし，この間真空を段階的に30mTorrに低下させ，ついで棚温度を60℃に上昇させて乾燥をさらに12〜16時間行った．凍結乾燥には，棚温度を１分間に５℃の速度で−40℃まで低下させてサンプルを凍結し，バイアルを１時間完全に凍結させたのち，真空を10mTorrに低下させてサンプルを−40℃で40時間乾燥させた．棚温度をついで１分間に0.05℃の速度で＋20℃まで上昇させてサンプルを＋20℃で３時間乾燥させ，最後に，棚温度を１分間に0.05℃の速度で＋40℃まで上昇させてサンプルを＋40℃でさらに２時間乾燥させた．真空下バイアルに栓をし，サンプルを４℃に保持して乾燥対照とした．最終殺菌には，バイアルをHeraeus乾燥オーブン中，80℃で72時間，または90℃で20時間処理した．パルボウイルス活性のlog10低下およびアルカリホスファターゼ活性の％低下を評価した．
パルボウイルスは培養細胞上の力価によりアッセイし，終点はブタ赤血球の凝集によって決定した．略述すれば，滅菌蒸留水を用いて乾燥サンプルをそれらの元の容量に再構築し，10倍希釈系列をイーグルの最少必須維持培地（ＥＭＥＭ）中に調製した．５％ウシ胎児血清含有ＥＭＥＭ中Ａ72細胞の懸濁液を細胞のコンフルーエントなフラスコのトリプシン処理によって調製し，2〜5×103細胞／mlを含有する細胞懸濁液1mlを24ウエル細胞培養プレートのウエルに分配した．ウイルスサンプルの各希釈液100μlを細胞培養プレートのウエルに四重に接種し，プレートを５％ＣＯ2の雰囲気下，37℃で14日間インキュベートした．
14日後，各ウエルからの細胞培養培地について１％ブタ赤血球を用いてヘマグルチニン活性を試験した．ウイルス感染度アッセイにおける終点の定量のためのKarberの式，すなわち−log希釈間隔−（陽性試験の総数）−0.5を用いてウイルス力価をlog10ＴＣＩＤ50/mlとして計算した．
アルカリホスファターゼは，市販の試薬Sigma fast（登録商標）アルカリホスファターゼ基質アッセイを用いて比色法によってアッセイした．略述すれば，サンプルおよび標準アルカリホスファターゼプレパレーション（1mg/ml）について２倍希釈系列を調製し，ＥＩＡプレート中100Ｔlのサンプルに100Ｔlの基質を加え，暗所で30分間インキュベートした．発色は，デルタソフトプレートリーダーパッケージと接続したTitertek multiscanを用い405nmで読取り，サンプルの活性を標準曲線の直線部分に相当する吸収値から計算した．乾燥対照を100％活性とし，これらの値から処置サンプルの活性の％低下を計算した．
すべてのウイルスアッセイについて，処置サンプルの力価のlog10低下を乾燥対照のlog10ＴＣＩＤ50/ml値から回収されたlog10ＴＣＩＤ50/mlウイルスを差し引いて計算した．結果は表１に示す．
表中，≧はウイルスがアッセイの検出レベル以下であったことを意味する．
ＲＩＴは「力価の低下」を意味する．
ＨＳＡはヒト血清アルブミンである．
*は乾燥対照におけるlog10ＴＣＩＤ50/mlパルボウイルス＝6.5である．
**は乾燥対照におけるアルカリホスファターゼ活性＝100％である．
ＧＰＳはグリコピラノシルソルビトールである．
n.d.はアッセイを行わなかったことを意味する．
略号は，実施例の項および以下の表を通じて同一である．
0004841018.tif 000003
実施例２
真空乾燥による生物活性の喪失を伴うことなくトレハロース中におけるパルボウイルスの感染性を消失させるための最終殺菌：温度および時間の影響
50％トレハロース溶液中，1mg/mlのアルカリホスファターゼの保存溶液を，50ｍＭ重炭酸アンモニウムおよび２％ＨＳＡ含有25ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液中に作成し，106.5ＴＣＩＤ50/mlのイヌパルボウイルスを加え，ＦＴＳ乾燥器内で真空下に乾燥した．組成物250μlを3mlのバイアル中で，30mTorr真空，棚温度を60℃の最終操作パラメーターを達成する手動プログラム用いてＦＴＳ乾燥器で乾燥した．真空下バイアルに栓をし，サンプルを４℃に保持して乾燥対照とした．
最終殺菌には，バイアルをHeraeus乾燥オーブン中80℃で72時間または90℃で144時間まで処理した．パルボウイルス活性のlog10低下およびアルカリホスファターゼ活性の％低下を評価した．パルボウイルスは，実施例１に記載のようにブタ赤血球の凝集により追跡した培養細胞中の力価によってアッセイした．実施例１に記載したように，Karberの式を用いてウイルス力価をlog10ＴＣＩＤ50/mlとして計算した．アルカリホスファターゼは実施例１に記載のように，市販の試薬Sigma fast（登録商標）アルカリホスファターゼ基質アッセイを用いて比色法によりアッセイした．
得られた結果の要約は80℃で72時間または90℃で144時間の最終殺菌後のパルボウイルス力価のlog10低下およびアルカリホスファターゼ活性の％低下をまとめた表２に示す．表２中，*は乾燥対照におけるlog10ＴＣＩＤ50/mlパルボウイルス＝6.5であり，**は乾燥対照におけるアルカリホスファターゼ活性＝100％であり，≧はアッセイの検出限界以下であることを意味する．
0004841018.tif 000004
実施例３
生物学的活性を喪失することなくエンベロープを有するまたは有しないウイルスの感染性を排除するためのトレハロース中真空乾燥による最終殺菌
この実験では，実施例１の場合と同じ組成物を，３種の異なるウイルスプレパレーション：ポリオウイルス；パルボウイルス（それぞれ，エンベロープをもたないＲＮＡおよびＤＮＡ含有ウイルス）；および麻疹ウイルス（エンベロープを有するＲＮＡウイルス）によって汚染した．ウイルス力価のlog10低下およびアルカリホスファターゼ活性の％低下を上述のようにまたは以下に記載するように評価した．ポリオウイルスは細胞変性アッセイを用いてアッセイした．略述すれば，滅菌蒸留水を用いて乾燥サンプルをそれらの元の容量に再構築し，10倍希釈系列をＥＭＥＭ中に調製し，100μlの希釈液をベロ細胞のコンフルーエントな単層を含有する96ウエル細胞培養プレートのウエルに五重に接種した．プレートを７日間インキュベートし，細胞変性効果を誘発したウイルスを光学顕微鏡を用いウエルを検査することにより計数した．ウイルス力価をlog10ＴＣＩＤ50/mlとして回収し，この場合も，ウイルスの感染性アッセイにおける終点の定量のためにKarberの式を用いて計算した．すべてのウイルスアッセイについて，処置サンプルの力価のlog10低下を乾燥対照のlog10ＴＣＩＤ50/ml値から回収されたlog10ＴＣＩＤ50/mlウイルスを差し引いて計算した．
麻疹ウイルスの感染性は，プラークアッセイを用いて測定した．略述すれば，滅菌蒸留水を用いて乾燥サンプルをそれらの元の容量に再構築し，10倍希釈系列をＥＭＥＭ中に調製した．200μlの各希釈液をベロ細胞のコンフルーエントな単層を含有する6ウエルプレートのウエルに二重に接種した．細胞に37℃で１時間ウイルスを吸着させたのち，各ウエルに2mlのオーバーレイ培地（１％カルボキシメチルセルロースおよび５％ウシ胎児血清含有ＥＭＥＭ）を加えた．ついでプレートを５％ＣＯ2の雰囲気下，37℃で７日間インキュベートした．細胞の単層中にウイルスによって誘発されたプラーク形成をクリスタルバイオレット染色により可視化した．
プラークを数えて，回収されたウイルスを1mlあたりのプラーク形成単位，すなわちＰＦＵ/ml＝プラーク数×希釈ファクター×５の計算により定量した．すべてのウイルスアッセイについて，処置サンプルの力価のlog10低下を乾燥対照のlog10ＰＦＵ/ml値から回収されたlog10ＰＦＵ/mlウイルスを差し引くことにより計算した．結果は，80℃で72時間または90℃で20時間最終殺菌後のポリオウイルス，麻疹ウイルスおよびパルボウイルスの力価のlog10低下，ならびにアルカリホスファターゼ活性の％低下を示す表３に掲げる．表３中，*は乾燥対照におけるlog10ＴＣＩＤ50/mlポリオウイルス＝4.5；**は乾燥対照におけるlog10ＰＦＵ/ml麻疹ウイルス＝5.10；***は乾燥対照のlog10ＴＣＩＤ50/mlパルボウイルス＝6.5；****は乾燥対照におけるアルカリホスファターゼ活性＝100％である．≧はアッセイの検出限界以下であることを意味する．
0004841018.tif 000005
実施例４
生物活性の喪失を伴うことなく血液産物からパルボウイルスの感染性を排除するためのトレハロース中における乾燥による最終殺菌
10％クエン酸ナトリウムおよび15％食塩を含有する，10％および25％のトレハロースまたはスクロース溶液中に，フィブリノーゲン（分画１，１-Ｓ型，Sigma Chemical Company）を溶解し，この溶液を遠心分離して不溶性の物質を除去し，タンパク質濃度を5mg/mlの最終フィブリノーゲン濃度に調製した．保存フィブリノーゲン溶液を106.5ＴＣＩＤ50/mlのイヌパルボウイルスで汚染させた．このフィブリノーゲン溶液のアリコート12mlを5mlのWheaton医薬用ガラスバイアルに分配し，サンプルをＦＴＳ乾燥器で真空乾燥またはLabconco凍結乾燥器で凍結乾燥した．真空乾燥では，乾燥器の棚温度を予め10℃に冷却し，真空を30,000mTorrに低下させた。次いで棚温度を40℃に上昇させ、真空を30,000mTorrに２分間，20,000mTorrに２分間，10,000mTorrに20分間低下させた．ついで真空を30,000mTorrに５分間上昇させ，ついで30mTorrに低下させてサンプルを棚温度を60℃で一夜乾燥した．凍結乾燥では，サンプルを５℃/分で−40℃で凍結させ，−40℃に16時間保持し，ついで棚温度を−35℃に上昇させて10mTorrの真空で80時間乾燥させた．棚温度25℃に上昇させてサンプルを10mTorrの真空でさらに５時間乾燥させた．真空下にすべてのバイアルに栓をし，サンプルをHeraeus乾燥オーブン中，90℃で20時間または48時間加熱して最終殺菌を行った．
バイアルを再構築して，総可溶性タンパク質ならびに凝固性タンパク質を定量した．フィブリノーゲンの凝固アッセイはNational Institute of Biological Standardトロンビン凝固アッセイの改良法によった．略述すればフィブリノーゲンサンプルおよび標準を，フィブリノーゲン溶液へのトロンビンの添加により凝固させ，血餅中のタンパク質濃度を７Ｍ尿素中での血餅の溶解および280nmにおける吸収の定量によって測定した．
3mlの水を加えると，90℃に20時間暴露したフィブリノーゲン／スクロースプレパレーションを除くすべてのプレパレーションが容易に再構築された．90℃に20時間暴露した凍結乾燥フィブリノーゲン／スクロースプレパレーションは明らかに異なる褐色の着色を示した．タンパク質アッセイでは大部分のタンパク質（約90％）が再構築時に溶解したが，フィブリノーゲン／スクロース90℃/20時間の場合は，きわめてわずかな可溶性タンパク質しか認められなかった．凝固アッセイでは，可溶性タンパク質中約95％がトロンビンの添加により凝固することが示された．得られた結果の要約を，凝固性フィブリノーゲンおよびパルボウイルスの力価のlog10低下を掲げた表４に示す．
0004841018.tif 000006
以上，本発明を明確化と理解の目的で例示および実施例により細部にわたって説明したが，本技術分野の熟練者にはある種の改変および修飾を実施できることは自明であろう．したがって，以上の説明および実施例は，以下の請求の範囲によってその輪郭を示した本発明の範囲の限定するものと解すべきではない．