(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリンをベースとする柔軟性のある凍結乾燥した創傷被覆物であって、前記創傷被覆物が、フィブリノーゲン溶液を０.５重量％までの量の生理学的に適合性を有する無機塩を含む溶液の添加あるいは該溶液に対する透析を含めて一段階または多段階透析に付し、透析物に０.２から１.０体積％のグリセロールを添加し、その混合物を水溶性トロンビン溶液の作用に付して、柔軟性のあるフィブリンウェブを形成させ、さらに前記フィブリンウェブを凍結乾燥させることからなる製造方法によって調製され、且つ前記フィブリンウェブがフィブリン単位当たり１０から８０重量％のグリセロールを含むことを特徴とする柔軟性のある凍結乾燥した創傷被覆物。
【請求項２】
請求項１記載の柔軟性のある凍結乾燥した創傷被覆物であって、前記フィブリンウェブが生分解性支持物質と強く結合されたものであることを特徴とする柔軟性のある凍結乾燥した創傷被覆物。
【請求項３】
フィブリンをベースとする柔軟性のある凍結乾燥した創傷被覆物の製造方法であって、フィブリノーゲン溶液を０.５重量％までの量の生理学的に適合性を有する無機塩を含む溶液の添加あるいは該溶液に対する透析を含めて一段階または多段階透析に付し、透析物に０.２から１.０体積％のグリセロールを添加し、混合物を水溶性トロンビン溶液の作用に付して、柔軟性のあるフィブリンウェブを形成させ、さらに前記フィブリンウェブを凍結乾燥させることからなる製造方法。
【請求項４】
請求項３記載の製造方法であって、前記フィブリンウェブの形成が、フィブリンウェブがその上に強く接着した層として固着される生分解性支持物質の存在下で行われることを特徴とする製造方法。
【請求項５】
請求項３または４に記載の製造方法であって、前記フィブリノーゲン溶液がさらに第XIII因子を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか記載の製造方法であって、前記フィブリノーゲン溶液を、１段階で、錯形成剤と生理学的に適合性を有する無機塩とを含む溶液で透析することを特徴とする製造方法。
【請求項７】
請求項３〜５のいずれか記載の製造方法であって、前記フィブリノーゲン溶液を、１段階で、錯形成剤を含む溶液で透析し、続いて前記フィブリノーゲン溶液に生理学的に適合性を有する無機塩を添加することを特徴とする製造方法。
【請求項８】
請求項３〜５のいずれか記載の製造方法であって、前記透析が２段階で行われ、前記フィブリノーゲン溶液を最初に生理学的に適合性を有する無機塩を含む溶液で透析することを特徴とする製造方法。
【請求項９】
請求項３〜８のいずれか記載の製造方法であって、水溶性カルシウム塩が前記トロンビン溶液に添加されることを特徴とする製造方法。
【請求項１０】
請求項３〜９のいずれか記載の製造方法であって、前記フィブリノーゲンを１０から２５ｇ／ｌの量で使用し、前記トロンビンを１０００I.U.／mlより少ない量で使用することを特徴とする製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、創傷治癒用の柔軟性のある生分解性フィブリンウェブおよびその製造に関する。このタイプのウェブ材料は、内部および外部創傷の止血のため、また生物学的因子のキャリア物質として用いることができる。
【０００２】
内部器官の外科的処置には、強い血流と組織の軟らかさにより生じる創傷の閉鎖の問題を伴うことが知られている。内部創傷の閉鎖にしばしば使用される方法は血管の電気凝固であり、たいていの場合患者にとって苦痛な術後癒着を引き起こす。さらに、この方法は外傷性の器官裂傷の閉鎖には限られた適合性しかない。良好な代替法にはフィブリン接着があるが、ここでは創傷はいくつかの内因性のヒト凝固因子の先行する反応によって閉鎖される。この場合創傷上で形成される凝固は高い適合性と迅速な止血という点で優れている。あまり有利でない点としては、フィブリン接着の適用に先だつ長い調整時間であり、特に内視鏡のために特別のアプリケータが必要とされる低侵襲手術において適用する際に有利でない。それゆえ、特別な調整を必要とせずにすぐに創傷に使用できるフィブリンをベースにした生分解性創傷被覆物を開発する試みがすでになされてきている。このタイプのウェブ物質は欧州特許出願００６８１４９に開示されており、フィブリノーゲン含有乾燥調製物であって、凍結乾燥により得られたフォームまたはウェブ構造を有し、少なくとも触媒活性量のトロンビンに加えて本質的に約１０から９５重量％のフィブリンと約５から９０重量％のフィブリノーゲンからなるものである。ウェブ状創傷被覆物の製造においては、フィブリンはこの場合最初にフィブリノーゲンおよびトロンビン含有水溶液中で製造され、さらに得られた反応混合物は深冷され凍結乾燥される。この物質は特に創傷治療用物質、骨キャビティ用充填物および／またはさらに活性化合物のためのキャリアとしての使用が意図されている。この創傷被覆物の大きな不利な点は、しかしながら、ここで問題としている硬直なもろいウェブであり水または血液と接触した後においてすらその硬直性を維持するという事実にある。結果として、このタイプのフィブリンウェブの適用の可能性は極めて制限される。さらに、少なくとも１つのトロンビンを含まない層と、少なくとも１つのフィブリノーゲンを含まない層を有し、どちらの場合も糖タンパクマトリックスを有する吸収性の多層シート物質がドイツ特許３２１４３３７に開示されている。トロンビンとフィブリノーゲンが空間的に分離されている結果、この場合はフィブリンウェブの形成が妨げられる。
【０００３】
それゆえ他の生体物質によるより適当な創傷被覆物の開発の試みがとぎれることなくなされている。主にウシ、ウマ、ブタからの動物結合組織から得られるコラーゲンのような生体物質からなるウェブが市場に見られる。例えばＥＰ−Ａ０４８５２１０にはフィブリン含有コラーゲン膜が提案されている。
【０００４】
このタイプの物質は、しかしながら、ウイルスの不活性化、特にＢＳＥ感染物の伝達可能性を避けるための安全手段を必要とする。さらに、ウシのコラーゲンに対して極めて過敏な患者のケースも文献に報告されている。それゆえ例えば胎盤から得られたコラーゲンのようなヒト由来物質から利用可能なコラーゲンウェブを作成することがすでに考えられている。これは明らかによりよい生体適合性を有しうるが、ウイルスへの安全性という問題があることは同様である。それゆえ、組替えまたはトランスジェニックヒトコラーゲンを創傷被覆物の製造に使用するという着想もすでに表明されてはいるが、このタイプのコラーゲンはたとえ開発の現段階においてもコストの理由で競争できるものではない。最後に、米国特許２４９２４５８には、創傷に止血目的で永久に導入するフィブリンフォームが開示されている。
【０００５】
最後に、分解性創傷被覆物製造のために、ポリヒドロキシカルボン酸、またはポリアミノ酸のような生分解性物質を合成的に製造して使用することもすでに考えられている。
【０００６】
これらの物質は明らかに組替え物より経済的な代替物であるが、強い出血および柔らかい組織での止血にはそれほど適していないことから使用が制限される。さらに、使用中に体内で炎症反応を引き起こす物質を分解過程で形成することから適合性がより低い。
【０００７】
本発明の目的はそれゆえ、従来の創傷被覆物において知られていた短所のない生分解性創傷被覆物を開発することであった。この目的は、フィブリンをベースとする生分解性創傷被覆物による本発明により達成される。すなわち、製造において特定の工程を用いた結果、かかる被覆物は高い柔軟性を有しそれゆえ出血創傷を被覆し閉鎖するためのウェブとして非常に適したものである。
【０００８】
本発明によれば、フィブリンをベースとする生分解性の柔軟な創傷被覆物であって、ほとんどまたは完全に透析可能成分が除かれたフィブリンウェブまたはフィブリンウェブを含む物がこれらの要求を満たすものであることがいまや明らかとなった。この場合、フィブリンウェブは生分解性キャリア物質とは好ましくは強く結合している。特にフィブリンウェブがフィブリン単位あたり１０から８０重量％のグリセロールを含むことが好ましい。
【０００９】
フィブリンをベースとするこのタイプの創傷被覆物は、フィブリノーゲン溶液を一段階または多段階透析処理に付した後、柔軟性フィブリンウェブをトロンビン水溶液をフィブリノーゲン溶液に作用させて形成し、これをさらに凍結乾燥に対する本発明の製造工程により製造される。
【００１０】
フィブリノーゲン溶液の一段階または多段階透析の結果、その成分は決定的に変化し含まれていた塩およびアミノ酸濃度が著しく減少する。これが柔軟性フィブリンウェブ製造の決定的な必要条件であることが考えられる。フィブリノーゲン溶液の透析は種々の方法で実施できる。一段階透析では、フィブリノーゲン溶液は、有機錯形成剤と生理学的適合性無機塩を同時に含んだ透析浴中で処理される。しかし一段階透析では有機錯形成剤のみを含む透析浴を用いて処理することもできる。そして透析完了後、生理学的適合性無機塩（一般的にNaCl）をフィブリノーゲン溶液中に０.０５から０.５重量％加える。
【００１１】
この透析に添加する有機錯形成剤は特にエチレンジアミン四酢酸、シュウ酸、クエン酸のアルカリ金属塩である。透析浴中の有機錯形成剤の濃度は一般的には１から２０mMで好ましくは１から５mMである。
【００１２】
しかしながら、透析を２つの段階で実施することも可能である。この場合、最初の段階でフィブリノーゲン溶液を上記錯形成剤塩の一つの水溶液で透析し、続いてＮａＣｌ溶液または他の生理学的適合性無機塩の溶液の透析浴を用いて第二の透析を実施する。
【００１３】
このようにして透析可能な付随物を含まないが、なお通常のフィブリン接着調製物中におけるように追加的に第XIII因子を含むことも可能なフィブロノーゲンは、柔軟なフィブリンウェブの製造のための極めて適合した出発物質である。これは透析したフィブロノーゲン溶液とトロンビンおよび塩化カルシウムの溶液とを混合することにより製造される。この工程で、水溶性カルシウム塩が一般的に０.５から４０mMの量存在する。一般的に、フィブリノーゲンはフィブリンウェブの製造に１０から２５ｇ／ｌの量で、そしてトロンビンは１００I.U.／mlまでの量使用される。フィブリンウェブ製造は０から３７℃の温度で起こる。
【００１４】
フィブリンウェブ製造のために、トロンビン／塩化カルシウム溶液をフィブリノーゲン溶液中に混合するすることができるが、トロンビン／塩化カルシウム溶液を平皿に導入したフィブリノーゲン溶液上にスプレーすることがより有利である。数メートル幅のフィブリンウェブの製造には、適当な幅の溶液槽に入れられたフィブリノーゲン溶液上に、フィブリノーゲン溶液上を一様に移動する一列に構成されたスプレーヘッドからトロンビン／塩化カルシウム溶液をスプレーする。フィブリンウェブ形成のための十分な反応時間経過後、乾燥処理、好ましくは凍結乾燥処理に付される。
【００１５】
凍結乾燥は好ましくは次のようになされる。
フィブリンウェブを−２８℃で２時間凍結し、同じ温度で真空下で１２時間乾燥する。−１０℃と２０℃での２回乾燥工程をそれぞれ１６時間および８時間同じく真空下で行う。
【００１６】
フィブリンウェブを生分解性キャリア物質と結合させると本発明に基づいて特に優れた創傷被覆物が製造される。好ましいキャリア物質としては特に天然の、または合成修飾されたコラーゲン、ケラチン、ゼラチン、炭水化物、またはセルロース誘導体である。キャリア物質としてはまた、合成生分解ポリマーも可能である。このうち特に好ましいものは、殊にポリヒドロキシカルボン酸、ポリエステル、ポリシアノアクリレート、ポリアミノ酸、ポリアルコールおよびシリコーンである。これらのキャリア物質は特にウェブまたはファブリックとして使用可能である。特に好ましい例としては、市販のウェブであるEthisorb(R) Patch Type ６（Ethicon製）およびコラーゲンウェブであるSurgicoll（Medical Biomaterial Product製）がある。ウェブEthisorb(R) Patch Type ６（Ethicon製）は合成吸収性でありポリグラクチン９１０（Vicryl(R)）とポリ−ｐ−ジオキサノン（PDS）から作られている。ポリグラクチン９１０はグリコリドとラクチドとの共重合体である。これらのウェブまたは他の生分解性キャリア物質は最も好ましくはフィブリンウェブ上にその製造時にコートされる。この場合、フィブリンウェブの形成をキャリア物質の存在下で実施するという工程が使用される。この目的で、キャリア物質を平皿にあるフィブリノーゲン溶液に完全に溶液で覆われるように入れる。それからトロンビン／塩化カルシウム溶液がスプレーされ、結果としてキャリア物質上に析出して強く粘着するフィブリンが形成される。この工程で高い柔軟性を有する２層ウェブが形成され、これはコーティングを変形することなく屈曲可能である。フィブリンをベースとするこのタイプの多層創傷被覆物の製造は、重い出血創傷の場合の止血効果を改良する点で有利である。キャリア物質の柔軟性はこの場合フィブリン創傷被覆物に悪い影響を与えるものではない。というのは、本発明による方法に従い製造する場合、フィブリンウェブは非常に柔軟なものとなるからである。
【００１７】
本発明によるフィブリンウェブは、イムノグロブリンのような生物学的、植物または合成活性化合物、化学療法剤または創傷治療を促進する抗生物質を加えた場合その治療価値がさらに改良され得る。それらがトロンビン添加により形成されるフィブリンウェブに取り込まれるためにはこれらの物質をフォブリノーゲン溶液に事前に添加することが好ましい。これらの物質はまた、最終フィブリンウェブにスプレーすることにより適用することも可能である。
【００１８】
本発明によるフィブリンウェブの引き裂き抵抗および弾性に関して著しい改良が、フィブリノーゲン溶液にグリセロールを添加して達成できる。フィブリン形成前にグリセロールをフィブリノーゲン溶液に０.２から１.０体積％（v／v）量で添加した場合、フィブリン単位当たり１０から８０重量％、好ましくは２０から５０重量％のグリセロール含有のフィブリン創傷被覆物が得られる。グリセロール添加によりかかる修飾されたフィブリンウェブの引き裂き力と弾性はきわめて大きくフィブリンウェブがゴム様の堅固さを帯びるほどである。さらに、グリセロール添加は、凝固因子といかなる化学反応をも行わないという有利な点も有する。対照的に、コラーゲンに基づく創傷被覆物は、生力学的安定性は化学的クロスリンクにより達成され得るが、新抗原形成の可能性があり、それゆえ生物的適合性は小さいものとなる。
【００１９】
フィブリンをベースとする本発明による創傷被覆物は好ましいサイズに切断でき、巻き取りまた牧戻すことができるものである。このようにして、低侵襲手術に容易に適用可能となる。
本発明は次の実施例によりより詳細に説明される。
【００２０】
実施例１
フィブリノーゲン（Beriplast(R)）を水にとり、０.０２Ｍクエン酸ナトリウム中で透析した。さらに０.０５％ＮａＣｌ中で透析した。透析物を１５％グリセロールと混合し前もって用意した金属槽に流し込んだ。得られた混合物上にトロンビン溶液をスプレーし、室温で３０から６０分インキュベートした。得られたフィブリン凝固物を−２８℃で凍結し、次にように凍結乾燥した。フィブリン凝固物をはじめ−２８℃で１２時間凍結し、同じ温度で１２時間真空下乾燥した。さらに１.３５×１０-1mbarで−１０℃１６時間、２５℃８時間の２回の乾燥工程を行った。
【００２１】
実施例２
フィブリノーゲン（Beriplast(R)）を水にとり、２mMクエン酸ナトリウム中で透析した。さらに０.０５％ＮａＣｌ中で透析した。透析物をさらに実施例１と同様に処理しトロンビン溶液とインキュベートし、凍結乾燥して柔軟性のフィブリンウェブを得た。
【００２２】
実施例３
フィブリノーゲン（Beriplast(R)）を水にとり、２mMクエン酸ナトリウム中で透析した。さらに０.１％ＮａＣｌ中で透析した。この後、トロンビン溶液をスプレーし、６０分までの間インキュベートし、凍結乾燥して柔軟性のフィブリンウェブを得た。
【００２３】
実施例４
フィブリノーゲン（Beriplast(R)）を水にとり、２mMクエン酸ナトリウム中で透析した。この後、フブリノーゲン溶液が０.０５％塩化ナトリウムを含むまで十分な量の１０％濃度の塩化ナトリウム溶液を加えた。さらに上の例と同様にしてフィブリンウェブ製造を行った。
【００２４】
実施例５
フィブリノーゲン（Beriplast(R)）を水にとり、２mMクエン酸ナトリウムおよび０.０５から０.０７％の塩化ナトリウム中で透析処理した。本発明によるフィブリンウェブをこのフィブリノーゲン溶液からトロンビン添加し、上の例で示した凍結乾燥して製造した。
【００２５】
実施例６
フィブリンウェブの製造のため、フィブリン形成の前にフィブリノーゲン溶液へ異なる量のグリセロールを以下のパーセント（v／v）で添加し、ウェブの引張り強度および弾性を乾燥状態および湿潤状態で測定した。結果を以下の表に示す。
【００２６】
【表１】
0004700157.tif 000002
【００２７】
表の値は、グリセロール添加がウェブの機械的安定性と弾性を濃度依存的に増加させることを示す。これらのフィブリンウェブは内部器官の手術において使用するに適しており、内視鏡で使用する可能性を提供するものである。
【００２８】
実施例７
フィブリノーゲン（Beriplast(R)）を水にとり、２mMクエン酸ナトリウム中で透析した。さらに０.０７％ＮａＣｌ中で透析した。透析物を１５％グリセロールと混合した。５×５cm金属槽に、ウェブEthisorb(R) Patch Type ６（Ethicon GmbH製）をその槽の底に貼り付け、そこへ透析物を注ぎ込んだ。トロンビンをスプレーしてフィブリン形成を行った。凍結乾燥後、両層ともお互いに十分粘着した柔軟性のある２層ウェブが得られた。