(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0004759193.tif 000023
［式中、Ｒ１およびＲ３は水素であり、Ｒ２およびＲ４は同一であっても異なっていてもよく、直線状または分枝して、一般式（ＩＩ）：
【化２】
0004759193.tif 000024
（式中、ｐ１は０ないし５であり、ｐ２は１ないし５であり；ｐ３およびｐ４の値は同一であっても異なっていてもよく、０から５であり；
Ａ１、Ａ３およびＡ４は同一であっても異なっていてもよく、セリン、リジン、オルニチン、スレオニン、ヒスチジン、システイン、アルギニンおよびチロシンから選択されるアミノ酸であり；および
Ａ２は、リジン、オルニチンおよびヒスチジンから選択されるアミノ酸である）
で示されるアミド（ＣＯＮＨ）結合によって互いに連結した１以上のアミノ酸から形成されるペプチド基であり、該ペプチド基はアミド結合によって式（Ｉ）に示されるスペルミン骨格に連結しており；
Ｒ５およびＲ６は、２４個までの炭素原子を有する飽和直鎖ヒドロカルビル基であり、該ヒドロカルビル基は、アミドまたはアミン（ＮＣＨ２）結合によって式（Ｉ）に示されるスペルミン骨格に連結している］
で示される一般構造を有する化合物またはその塩。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ３が同一であり、Ｒ２およびＲ４が同一であり、Ｒ５およびＲ６が同一である対称性の請求項１記載の化合物。
【請求項３】
式（ＩＩ）のペプチド基においてｐ１が１であり、ｐ２、ｐ３およびｐ４が全て０である請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
式（ＩＩ）のペプチド基においてｐ１およびｐ２がどちらも１であり、ｐ３およびｐ４がどちらも０である請求項１または２記載の化合物。
【請求項５】
式（ＩＩ）のペプチド基においてｐ１が０であり、ｐ２、ｐ３およびｐ４が全て１である請求項１または２記載の化合物。
【請求項６】
式（ＩＩ）のペプチド基においてｐ１およびｐ３が０であり、ｐ２が１であり、ｐ４が２である請求項１または２記載の化合物。
【請求項７】
Ａ１がセリンである請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物。
【請求項８】
Ａ２がリジンである請求項１〜６のいずれか１項記載の化合物。
【請求項９】
ヒドロカルビル基が：
−（ＣＨ２）１１ＣＨ３
−（ＣＨ２）１３ＣＨ３
−（ＣＨ２）１５ＣＨ３
−（ＣＨ２）１７ＣＨ３
−（ＣＨ２）１９ＣＨ３
−（ＣＨ２）２３ＣＨ３
から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項１０】
ヒドロカルビル基が：
−ＣＯ（ＣＨ２）１０ＣＨ３
−ＣＯ（ＣＨ２）１２ＣＨ３
−ＣＯ（ＣＨ２）１４ＣＨ３
−ＣＯ（ＣＨ２）１６ＣＨ３
−ＣＯ（ＣＨ２）１８ＣＨ３
−ＣＯ（ＣＨ２）２２ＣＨ３
から選択される請求項１記載の化合物。
【請求項１１】
化合物：
【化５】
0004759193.tif 000025
。
【請求項１２】
化合物：
【化６】
0004759193.tif 000026
。
【請求項１３】
式：
【化７】
0004759193.tif 000027
で示される化合物ＧＳＣ１。
【請求項１４】
式：
【化８】
0004759193.tif 000028
で示される化合物ＧＳＣ４。
【請求項１５】
式：
【化９】
0004759193.tif 000029
で示される化合物ＧＳＣ４０。
【請求項１６】
式：
【化１０】
0004759193.tif 000030
で示される化合物ＧＳＣ４２。
【請求項１７】
式：
【化１１】
0004759193.tif 000031
で示される化合物ＧＳＣ２。
【請求項１８】
式：
【化１２】
0004759193.tif 000032
で示される化合物ＧＳＣ１２。
【請求項１９】
イン・ビトロでの真核生物または原核生物細胞中へのＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドまたはその類似体のトランスフェクションを容易にすることにおける請求項１〜１５のいずれか１項記載の化合物の使用。
【請求項２０】
化合物が
（ｉ）中性担体；または
（ｉｉ）錯化試薬
よりなる群から選択される１以上の補足物と組み合わせて使用される請求項１９記載の化合物の使用。
【請求項２１】
中性担体がジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
錯化試薬がＰＬＵＳ試薬である請求項２０記載の使用。
【請求項２３】
錯化試薬が主に塩基性アミノ酸を含んでなるペプチドである請求項２０記載の使用。
【請求項２４】
ペプチドが塩基性アミノ酸よりなる請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
塩基性アミノ酸がリジンおよびアルギニンから選択される請求項２３または２４記載の使用。
【請求項２６】
ペプチドがポリリジンまたはポリオルニチンである請求項２４記載の使用。
【請求項２７】
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを細胞中へ移入してアンチセンスノックアウト効果を成し遂げる請求項１９〜２６のいずれか１項記載の使用。
【請求項２８】
遺伝子療法のためにオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを細胞中へ移入する請求項１９記載の使用。
【請求項２９】
生物全体において遺伝的免疫化（抗体の産生）のためにオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを細胞中へ移入する請求項１９記載の使用。
【請求項３０】
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを培養中の細胞中へ移入する請求項１９〜２６のいずれか１項記載の使用。
【請求項３１】
請求項１〜１８のいずれか１項記載の化合物および医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３２】
イン・ビトロにおける、互いのあるいは固体または半固体表面に対する培養中の細胞の接着を容易にするための請求項１〜１８のいずれか１項記載の化合物の使用。
【請求項３３】
アミノ酸またはペプチドをヒドロカルビル化スペルミン骨格に付加することを特徴とする請求項１記載の化合物の製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、新規に同定されたスペルミン：ペプチドをベースとする界面活性剤の化合物、かかる化合物の使用およびそれらの製法に関する。本発明は、また、ドラッグデリバリーのために細胞中への化合物の輸送を容易にするためのスペルミン：ペプチドをベースとする界面活性剤の化合物の使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
界面活性剤は、低濃度であっても、液体の表面特性に顕著に影響を及ぼす物質である。例えば、界面活性剤は、水または水溶液中に溶解し場合に表面張力を有意に減少し、２液体間または液体と固体間の界面張力を減少する。界面活性剤分子の該特性は、産業界、特に洗剤およびオイル業界において幅広く開発されてきた。１９７０年代において、界面活性剤分子の新規なクラスが報告され、疎水性架橋によって連結される極性末端を有する２つの疎水性鎖によって特徴付けられた（Deinega, Yら、Kolloidn. Zh. 36, 649, 1974）。「ジェミニ（gemini）」と呼ばれるこれらの分子は（Menger, FMおよびLittau, CA, J. Am. Chem. Soc. 113, 1451, 1991）、それらの単量体等価物を越える非常に望ましい特性を有する。例えば、それらは、油および水をベースとする液体間の界面張力の減少において非常に効果的であり、非常に低い臨界ミセル濃度を有する。
【０００３】
陽イオン界面活性剤は、とりわけ、培養中の細胞中へのポリヌクレオチドのトランスフェクションに用いられ、かかる薬剤の例は遺伝子テクノロジーに関わる科学者に市販されている（例えば、Promega Corp. WI, USAから入手可能な真核生物細胞のトランスフェクション用の試薬TfxTM-50）。
遺伝子療法またはアンチセンス療法のいずれかの場合、イン・ビボでの細胞へのＤＮＡの効率のよいデリバリーが何年間かの主要な目的であった。デリバリービヒクルとしてのウイルスの使用、例えば、嚢胞性繊維症（ＣＦ）の矯正的遺伝子療法のために呼吸系における上皮細胞に対するアデノウイルスの使用に多くの注目が集まった。しかしながら、ＣＦ患者における成功した遺伝子移入のいくつかの証拠にもかかわらず、炎症副作用および移入遺伝子の限られた一過性発現のため、アデノウイルス経路には疑問が残る。陽イオン界面活性剤を使用する研究を包含するイン・ビボ遺伝子デリバリーのための数個の別法が研究された。Gao, Xら、(1995) Gene Ther. 2, 710-722は、陽イオン脂質を有するアミンを用いて、ＣＦ膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）の正常なヒト遺伝子を用いるＣＦマウスの呼吸器上皮中への該アプローチの可能性を明らかにした。該グループは、引き続いてリポソームＣＦ遺伝子療法試験を行い、それは、単に部分的な成功にすぎないが、ヒトにおける該アプローチの可能性を明らかにした（Caplen, NJ.ら、Nature Medicine, 1, 39-46, 1995）。より近年には、他のグループが、遺伝子デリバリーに対する他の陽イオン脂質、例えば、コレステロール誘導体の可能性を研究した（Oudrhiri, N.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 1651-1656, 1997）。この限られた研究は、これらのコレステロールをベースとする化合物のイン・ビトロおよびイン・ビボの両方での上皮細胞中への遺伝子の移入を容易にする能力を明らかにし、それにより、この一般的なアプローチの妥当性の支持を導いた。
【０００４】
これらの研究および他の研究は、この新たな研究分野において、細胞に基づく実験におけるトランスフェクションの場合インビトロならびに遺伝子療法およびアンチセンス治療の場合イン・ビボの両方で、細胞中へのポリヌクレオチドの効果的な移入を容易にするため新規な低毒性界面活性剤分子を開発することに対する継続した要望があることを示す。本発明は、既存の化合物によって示される困難を克服しようとするものである。
【０００５】
（発明の開示）
本発明は、スペルミン骨格を有し、式（Ｉ）：
【化１３】
0004759193.tif 000002
［式中、Ｒ１およびＲ３は水素であり、Ｒ２およびＲ４は同一であっても異なっていてもよく、直線状または分枝して、アミド（ＣＯＮＨ）結合によって互いに連結し、さらに一般式（ＩＩ）：
【化１４】
0004759193.tif 000003
（式中、ｐ１は０ないし５であり、ｐ２は１ないし５、好ましくは１であり；ｐ３およびｐ４の値は同一であっても異なっていてもよく、０から５、好ましくは０であり；
Ａ１、Ａ３およびＡ４は同一であっても異なっていてもよく、セリン、リジン、オルニチン、スレオニン、ヒスチジン、システイン、アルギニンおよびチロシンから選択されるアミノ酸であり；および
Ａ２は、リジン、オルニチンおよびヒスチジンから選択されるアミノ酸である）
で示されるアミド結合によってスペルミン骨格に連結した１以上のアミノ酸から形成されるペプチド基であり；
Ｒ５およびＲ６は、２４個までの炭素原子を有し、アミドまたはアミン（ＮＣＨ２）結合によってスペルミン骨格に連結した飽和または不飽和ヒドロカルビル基であるか；または
式中、Ｒ１およびＲ３は水素であり、Ｒ２およびＲ４は同一であっても異なっていてもよく、２４個までの炭素原子を有し、アミドまたはアミン結合によってスペルミン骨格に連結した飽和または不飽和ヒドロカルビル基であり、Ｒ５およびＲ６は同一であっても異なっていてもよく、アミド結合によってスペルミン骨格に連結した式（ＩＩ）のペプチド基である］
で示される一般構造を有するスペルミン：ペプチドをベースとする界面活性剤の化合物またはその塩、好ましくは医薬上許容される塩に関する。
【０００６】
本明細書に使用される場合、「ヒドロカルビル」なる語は、直鎖または分枝鎖であってもよい１ないし２４個の炭素原子を有する基を示し、３ないし６個の炭素原子を有する飽和炭素環式環を包含し、その鎖は不飽和（二重および／または三重炭素−炭素結合）を含んでいてもよい。
式（ＩＩ）のペプチド基におけるアミノ酸Ａ１、Ａ２およびＡ３間のアミド結合は、アミノ酸がジアミン、例えば、リジンまたはオルニチンである場合を除いて（この場合、該結合は２つのアミン基のどちらを含んでいてもよい）、標準的なペプチド結合（α結合）である。例えば、Ａ１がリジンである場合、アミノ酸Ａ２に対する結合は、標準的なアルファアミド結合であってもよく、またはリジン側鎖のアミンが関与するイプシロン（ε）アミド結合であってもよい。同様に、Ａ１がオルニチンである場合、Ａ１がＡ２に結合しているアミド結合はアルファ結合であってもよく、またはオルニチンアミノ酸残基の側鎖上のアミンを用いて形成されるデルタ（δ）結合であってもよい。
【０００７】
好ましくは、化合物は対称性であり、すなわち、Ｒ１およびＲ３は同一であり、Ｒ２およびＲ４は同一であり、Ｒ５およびＲ６は同一である。本発明の対称性スペルミン：ペプチドをベースとする界面活性剤の化合物は、「ジェミニ」界面活性剤である。
好ましい具体例において、式（ＩＩ）の基におけるＡ１はセリンまたはスレオニン、好ましくはセリンである。好ましくは、式（ＩＩ）の基におけるＡ３およびＡ４はリジン、オルニチン、ヒスチジンまたはアルギニンである。
【０００８】
さらに好ましい具体例において、ヒドロカルビル基は：
【化１５】
0004759193.tif 000004
から選択される。
【０００９】
もう一つ別の好ましい具体例において、ヒドロカルビル基は：
【化１６】
0004759193.tif 000005
から選択される。
【００１０】
本発明の化合物は、当業者によく知られた合成ペプチド化学を用いて容易に入手可能な出発材料から調製されうる。図１ａおよび１ｂに示されるスキームは、ヒドロカルビル基がアミン結合によってスペルミン部分に連結している本発明の化合物の一般的な合成法を示し、図２ａおよび２ｂに示されるスキームは、カルボニル基がアミド結合によってスペルミン部分に連結している本発明の化合物の一般的な合成法を示す。
【００１１】
図１および２に示される方法は、対称性の、すなわち、「ジェミニ」のスペルミン：ペプチドをベースとする界面活性剤の合成についてである。本発明の非対称性スペルミン：ペプチドをベースとする界面活性剤は、異なる保護基を用いることによって、例えば、スペルミンの第一アミンに不斉を導入することによって調製できる。適当な窒素保護基は、当該分野でよく知られており、例えば、"Protective Groups in Organic Chemistry"（T.W.Greene, Wiley-Interscience, New York, 2nd Edition, 1991）に記載されている。
【００１２】
本発明のもう一つ別の態様は、スペルミン：ペプチドをベースとする界面活性剤の化合物を用いる方法に関する。かかる使用は、イン・ビボまたはイン・ビトロにおけるＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド、またはその類似体の真核生物または原核生物細胞中への移入を容易にすることを包含する。これらの使用は、生物全体における遺伝子療法および遺伝的免疫化（抗体の産生の場合）の場合、アンチセンスノックアウト効果を達成するためのポリヌクレオチドのトランスフェクションを容易にすることを包含する。他の使用は、培養細胞中へのポリヌクレオチドの移入が必要な場合、例えば、特に遺伝子発現研究およびアンチセンス調節実験において、培養中の細胞中へのポリヌクレオチドのトランスフェクションを容易にするために、本発明の化合物を使用することを包含する。ポリヌクレオチドは、化合物と混合でき、細胞に添加し、ポリヌクレオチドの取り込みが可能になるようにインキュベートできる。さらなるインキュベーション後、トランスフェクトされたＤＮＡによって提供された表現型特性について細胞をアッセイでき、または該ＤＮＡから発現されたｍＲＮＡのレベルをノーザンブロッティングまたはＰＣＲに基づく定量法、例えば、TaqmanR（登録商標）法（Perkin Elmer, Connecticut, USA）の使用によって決定できる。本発明の化合物は、培養基中の細胞におけるＤＮＡの細胞性取り込み効率において、先行技術における化合物と比べて、有意な改善、典型的には３〜６倍の改善を与える。トランスフェクションプロトコールにおいて、ジェミニ化合物は、トランスフェクション効率を上げるために、１以上の補足物と組み合わせて使用してもよい。かかる補足物は、例えば：
（ｉ）中性担体、例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）（Farhood, H.ら、(1985) Biochim. Biophys. Acta 1235 289）；
（ｉｉ）錯化試薬、例えば、市販のＰＬＵＳ試薬（Life Technologies Inc. Maryland, USA）またはペプチド、例えば、ポリリジンまたはポリオルニチンペプチドまたは主として、排他的ではないが、リジン、オルニチンおよび／またはアルギニンのような塩基性アミノ酸を含むペプチド
から選択されうる。上記のリストは、網羅されているわけではなく、トランスフェクションの効率を上げる他の補足物が本発明の範囲内に入る。
【００１３】
また別の態様において、本発明は、本発明の化合物を用いる遺伝子療法における遺伝子材料の移入に関する。
本発明のさらに別の態様は、本発明の化合物を用いてイン・ビトロおよびイン・ビボでのヌクレオチドをベースとしない薬剤化合物の細胞中へのデリバリーをもたらす方法に関する。
さらなる態様において、本発明は、抗感染療法において使用する場合、ポリヌクレオチドまたは抗感染性化合物の原核生物または真核生物中への移入を容易にする方法に関する。
下記の定義は、本明細書においてしばしば使用されるある特定の用語の理解を容易にするために提供される。
【００１４】
「アミノ酸」なる語は、＋Ｈ３ＮＣＨ（Ｒ）ＣＯ２−の形態の二極性イオン（双極性イオン）をいう。それらは、Ｒ基の性質によって区別され、Ｒが水素以外である場合、不斉であることができ、ＤおよびＬファミリーを形成する。アミノ酸は、天然または非天然アミノ酸であってもよい。Ｒ基が例えば、非極性（例えば、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン）または極性（例えば、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニンおよびリジン）であることができる２０個の天然に生じるアミノ酸が存在する。非天然アミノ酸の場合、Ｒは、天然に見出されるアミノ酸において見出されないいずれか他の基であることができる。
【００１５】
「ポリヌクレオチド」なる語は一般に、非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよいいずれかのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。「ポリヌクレオチド」なる語は、限定するものではないが、１本鎖および２本鎖ＤＮＡ、１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、１本鎖および２本鎖ＲＮＡ、および１本鎖および２本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、１本鎖あるいはより典型的には、２本鎖または１本鎖および２本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含んでなるハイブリッド分子を包含する。さらに、「ポリヌクレオチド」なる語は、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む３本鎖領域をいう。ポリヌクレオチドなる語はまた、１以上の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定性もしくは他の理由で修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。「修飾された」塩基は、例えば、トリチル化塩基およびイノシンのような普通でない塩基を包含する。種々の修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに施され；したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的には天然に見出されるようなポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態、ならびにウイルスおよび細胞に特有のＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短いポリヌクレオチドを包含する。
【００１６】
「トランスフェクション」なる語は、化学的または物理的手段のいずれかによる細胞膜の修飾を含む方法を用いる培養中の細胞中へのポリヌクレオチドの導入をいう。かかる方法は、例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。ポリヌクレオチドは、直線状または環状の１本鎖または２本鎖であってもよく、ポリヌクレオチドの複製またはポリヌクレオチドの一部を含みうる同種もしくは異種遺伝子の発現を調節するエレメントを包含する。
本発明は、ここに、下記の実施例によって記載される。
【００１７】
実施例
実施例１  ＧＳＣ１の合成
工程１：
【化１７】
0004759193.tif 000006
【００１８】
Ｎ−カルボエトキシフタルイミド（４ミリモル、４３９ｍｇ）のクロロホルム（５ｍｌ）中溶液を室温で、スペルミン（２ミリモル、４０６．７ｍｇ）のクロロホルム（５ｍｌ）中攪拌溶液に一度に加えた。混合物を１時間攪拌し、溶媒を除去し、粗生成物を適当な真空下で乾燥させて、さらに精製することなく標題化合物を得た（Sosnovsky, G. (1986) Zeitschrift fuer Naturforschung 41b: 122-129）。
【００１９】
工程２：
【化１８】
0004759193.tif 000007
【００２０】
保護されたスペルミン３５０ｍｇ（０．７６ミリモル）を１０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中に溶解し、塩化ラウロイル３当量（２．２８ミリモル）および２ｍｌの乾燥ピリジンを加えた。３０分還流後、混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒を除去し、粗生成物をＡｃＯＥｔ（２５ｍｌ）中に溶解し、飽和重炭酸塩（２ｘ２０ｍｌ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発させた。得られた油をＡｃＯＥｔ／ヘキサン（１：１〜４：１）ｒｆ＝０．２０（ＡｃＯＥｔ／ヘキサン１：１）を用いるシリカゲル上のクロマトグラフィーに付して、油としてビス−ドデシルを得（４９０ｍｇ、８４％）、それを白色の半固体結晶として結晶化させた。
1H-NMR (CDCl3): 7.9-7.6 m (8H (-C6H4-)2); 3.7-3.6 m (4H); 3.4-3.2 m (8H); 2.3-2.1 m (4H); 2.0-1.8  m (4H);1.6-1.4 m (8H); 1.3-1.1 m (32H); 0.9-0.8 m (6H). 13C-NMR (CDCl3): 173.1, 173.0, 172.9, 172.8, 168.3, 168.2, 134.2, 134.1, 133.9, 133.8, 132.2, 132.1, 132.0, 131.9, 123.4, 123.2, 47.6, 45.7, 45.5, 45.4, 43.5, 43.4, 35.9, 33.9, 33.2, 33.1, 30.9, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 29.1, 28.3, 28.2 ,27.1, 26.7, 26.4, 25.5, 25.4, 25.2, 25.1, 24.9, 22.7, 14.1
【００２１】
工程３：
【化１９】
0004759193.tif 000008
【００２２】
ビス−フタルイミド（４００ｍｇ、０．４８ミリモル）を２０ｍｌのＭｅＯＨ中に溶解し、ヒドラジン一水化物０．４ｍｌを加え、混合物を６時間還流した。溶媒を除去し、粗生成物をＭｅＯＨ（２０ｍｌ）中に再溶解し、２ｍｌの濃ＨＣｌを加えた。混合物を３０分間還流し、溶媒を除去した。残渣を水性ＮａＯＨ１０％中に溶解し、沈殿物をろ過し、３量の冷水で洗浄した。残渣を乾燥させて白色粉末を得た（１１２ｍｇ、４１％）。
1H-NMR (MeOH): 3.21 t (3J = 6.8Hz, 4H); 2.6-2.5 m (8H); 2.76 t (3J = 7.5Hz, 4H); 1.7-1.5 m (12H); 1.4-1.2 m (32H); 0.89 t (3J = 6.9Hz, 6H (-CH3)2)
【００２３】
工程４：
【化２０】
0004759193.tif 000009
【００２４】
ジアミン１００ｍｇ（０．１７６ミリモル）、ＨＯＢｔ２当量（０．３５３ミリモル、５４ｍｇ）、ＢＯＣ２Ｌｙｓ２．４当量（０．４２３ミリモル、１３５ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ２当量（０．３５３ミリモル、６２ｍｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍｌ）中に溶解した。混合物を−１０℃で冷却し、ＤＣＣ２．４当量（０．４２３ミリモル、８７ｍｇ）を加えた。混合物を−１０℃で攪拌し、非常にゆっくりと室温に戻し、一晩放置した。ろ過によってＤＣＵを除去し、溶媒を蒸発させた。粗生成物をＡｃＯＥｔ（３０ｍｌ）中に再溶解し、４％ＮａＨＣＯ３（２ｘ１５ｍｌ）、４％クエン酸（２ｘ１５ｍｌ）、水（２０ｍｌ）および最後にブライン（２０ｍｌ）で連続洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固した。残渣をシリカゲル上のクロマトグラフィーに付し、ヘキサン／ＡｃＯＥｔ１／１（ｒｆ＝０．０１）〜ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ９／１（ｒｆ＝０．６）で溶出して、油を得た（１５２ｍｇ、７１％）。
1H-NMR (CDCl3): 7.05 sbroad(1H); 6.69 sbroad (1H); 5.6-4.7 m (6H); 4.9-4.1 m (4H); 3.7-3.0 m (16H); 2.2-2.0 m (6H); 2.0-1.0 m (88H); 0.88 t (3J = 6.8Hz, 6H (-CH3)2)
【００２５】
工程５：
【化２１】
0004759193.tif 000010
【００２６】
テトラ保護ジェミニ１５０ｍｇ（０．１２ミリモル）をＣＨ２Ｃｌ２／ＴＦＡ１／１（２５ｍｌ）中に溶解し、室温で０．５時間攪拌した。溶媒を除去して脱保護した化合物をＴＦＡ塩として得、それを陰イオンＤｏｗｅｘ １Ｘ８上で交換して、テトラヒドロクロリド塩を粘着性の油として得た。化合物を少量のＭｅＯＨ中に再溶解し、エーテルで沈殿させ、デカンテーションによって溶媒を除去し、これを３回繰り返してＧＳＣ１を得た。
1H-NMR (MeOH): 3.8-3.1 m (8H); 3.0-2.8 m (4H); 2.2-2.1 m (4H); 2.0-1.4 m (26H); 1.4-1.2 m (36H); 0.90 t (3J = 6.8Hz, 6H (-CH3)2). M/z(H+): 823.75; (2H+): 412.38
【００２７】
実施例２  ＧＳＣ４の合成
工程１：
【化２２】
0004759193.tif 000011
【００２８】
ジアミン１５０ｍｇ（０．２６５ミリモル）を５％水性アセトニトリル（１０ｍｌ）中に溶解し、トリエチルアミン２．２当量（０．６ミリモル、８０μｌ）を加えた。アセトニトル（８ｍｌ）中におけるＮα，Ｎε−ビス−ｔｅｒ−ブチル−カルバメート−Ｌ−リジン−Ｌ−セリン−Ｏ−スクシンイミデート（通常のペプチド合成によって形成された）２当量（０．５２８ミリモル、２８０ｍｇ）をゆっくりと加えた。混合物を室温で４８時間攪拌し、溶媒を除去した。粗生成物をＡｃＯＥｔ（３０ｍｌ）中に再溶解し、水（２ｘ２０ｍｌ）、３％ＨＣｌ（２ｘ２０ｍｌ）、水（２０ｍｌ）および最後にブライン（２０ｍｌ）で連続洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固して２５２ｍｇを得た（６５％）。
1H-NMR (CDCl3): 4.9-4.1 m (4H); 3.6-3.0 m (20H); 2.2-2.0 m (8H); 2.0-1.0 m (80H); 0.88 t (3J = 6.8Hz, 6H (-CH3)2)
【００２９】
工程２：
【化２３】
0004759193.tif 000012
【００３０】
テトラ保護ジェミニ２４８ｍｇ（０．１７７ミリモル）をＴＨＦ／濃ＨＣｌ １／１（２５ｍｌ）中に溶解し、室温で１時間攪拌した。溶媒を除去して脱保護した化合物を粘着性の暗色油として得、それを少量のＭｅＯＨ中に再溶解し、エーテルで沈殿させ、デカンテーションによって溶媒を除去し、これを数回繰り返して、ＧＳＣ４をピンク色の粉末として得た（１２０ｍｇ、６０％）。
1H-NMR (MeOH): 4.0-3.9 m (2H); 3.5-3.2 m ; 3.1-2.9 m (4H); 2.5-2.3 m (4H); 2.3-2.1 m (1H); 2.0-1.5 m (20H); 1.4-1.2 m (32H); 0.90 t (3J = 6.8Hz, 6H (-CH3)2)
【００３１】
実施例３  ＧＳＣ４０の合成
工程１：
【化２４】
0004759193.tif 000013
【００３２】
ジアミン１２０ｍｇ（０．２１２ミリモル）、ＨＯＢｔ２．５当量（０．５３ミリモル、７２ｍｇ）、（ＢＯＣ２Ｌｙｓ）Ｌｙｓ２．５当量（０．５３ミリモル、４２６ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ２．５当量（０．５３ミリモル、９２μｌ）をＣＨ２Ｃｌ２／ＴＨＦ１／１（２０ｍｌ）中に溶解した。混合物を−１０℃で冷却し、ＤＣＣ２．４当量（０．５０８ミリモル、１０５ｍｇ）を加えた。混合物を−１０℃で攪拌し、非常にゆっくりと室温に戻し、一晩放置した。ろ過によってＤＣＵを除去し、溶媒を蒸発させた。粗生成物をＥｔＯＡｃ（３０ｍｌ）中に再溶解し、４％ＮａＨＣＯ３（２Ｘ１５ｍｌ）、４％クエン酸（２Ｘ１５ｍｌ）、水（２０ｍｌ）および最後にブライン（２０ｍｌ）で連続洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固した。残渣をシリカゲル上のクロマトグラフィーに付し、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ１／１（ｒｆ＝０．０１）〜ＥｔＯＡｃ／ＭｅＯＨ９／１（ｒｆ＝０．５５）で溶出して油を得た（２１０ｍｇ、４６％）。
1H-NMR (CDCl3): 4.9-4.6 m (2H); 4.1-3.9 m (4H); 3.5-2.9 m (16H); 2.3-2.1 m (2H); 1.9-1.0 m (164H); 0.88 t (3J = 6.8Hz, 6H (-CH3)2)
【００３３】
工程２：
【化２５】
0004759193.tif 000014
【００３４】
オクタ保護ジェミニ２００ｍｇ（０．０９４ミリモル）をＴＨＦ／濃ＨＣｌ １／１（２０ｍｌ）中に溶解し、室温で１時間攪拌した。溶媒を除去して脱保護した化合物を黄色油として得、それを少量のＭｅＯＨ中に再溶解し、エーテルで沈殿させ、デカンテーションによって溶媒を除去し、これを数回繰り返して、ＧＳＣ４０を黄色粉末として得た（１３０ｍｇ、８５％）。
【００３５】
実施例４  ＧＳＣ４１の合成
工程１：
【化２６】
0004759193.tif 000015
【００３６】
ジアミン２００ｍｇ（０．３５ミリモル）を５％水性アセトニトリル（２０ｍｌ）中に溶解し、トリエチルアミン２当量（０．７ミリモル、０．１ｍｌ）を加えた。アセトニトリル（１０ｍｌ）中におけるビス−（Ｎα，Ｎε−ビス−ｔｅｒ−ブチル−カルバメート−Ｌ−リジン）−Ｌ−リジン−Ｌ−セリン−Ｏ−スクシンイミデート２当量（０．７１ミリモル、７００ｍｇ）をゆっくりと加えた。混合物を室温で４８時間攪拌し、溶媒を除去した。粗生成物をＡｃＯＥｔ（３０ｍｌ）中に再溶解し、水（２ｘ２０ｍｌ）、３％ＨＣｌ（２ｘ２０ｍｌ）、水（２０ｍｌ）および最後にブライン（２０ｍｌ）で連続洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固して５０９ｍｇを得た（６３％）。
1H-NMR (CDCl3): 4.9-4.6 m ; 4.1-3.9 m (4H); 3.6-2.9 m (22H); 2.3-2.1 m (4H); 2.0-1.0 m ; 0.88 t (3J = 6.8Hz, 6H (-CH3)2)
【００３７】
工程２：
【化２７】
0004759193.tif 000016
【００３８】
テトラ保護ジェミニ４９９ｍｇ（０．２１６ミリモル）をＴＨＦ／濃ＨＣｌ １／１（３０ｍｌ）中に溶解し、室温で１時間攪拌した。溶媒を除去して脱保護した化合物を粘着性の茶色の油として得、それを少量のＭｅＯＨ中に再溶解し、エーテルで沈殿させ、デカンテーションによって溶媒を除去し、これを数回繰り返してＧＳＣ４１を茶色粉末として得た（３５０ｍｇ、９０％）。
【００３９】
実施例５  ＧＳＣ４２の合成
工程１：
【化２８】
0004759193.tif 000017
【００４０】
ジアミン２００ｍｇ（０．３５ミリモル）を５％水性アセトニトリル（２０ｍｌ）中に溶解し、トリエチルアミン２当量（０．７ミリモル、０．１ｍｌ）を加えた。アセトニトリル（１０ｍｌ）中におけるビス−（Ｎα，Ｎε−ビス−ｔｅｒ−ブチル−カルバメート−Ｌ−リジン）−Ｌ−リジン−Ｌ−セリン−Ｏ−スクシンイミデート２当量（０．７１ミリモル、７００ｍｇ）をゆっくりと加えた。混合物を室温で４８時間攪拌し、溶媒を除去した。粗生成物をＡｃＯＥｔ（３０ｍｌ）中に再溶解し、水（２ｘ２０ｍｌ）、３％ＨＣｌ（２ｘ２０ｍｌ）、水（２０ｍｌ）および最後にブライン（２０ｍｌ）で連続洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、蒸発乾固して５２２ｍｇを得た（７０％）。
1H-NMR (CDCl3): 6.7-6.6 m (2H); 5.5-5.3 m (2H); 4.9-4.6 m (4H); 4.5-4.3 m (4H); 4.1-3.9 m (4H); 3.5-2.9 m (20H); 2.3-2.1 m (4H); 1.9-1.0 m ; 0.88 t (3J = 6.8Hz, 6H (-CH3)2)
【００４１】
工程２：
【化２９】
0004759193.tif 000018
【００４２】
テトラ保護ジェミニ５１７ｍｇ（０．２４２ミリモル）をＴＨＦ／濃ＨＣｌ １／１（３０ｍｌ）中に溶解し、室温で１時間攪拌した。溶媒を除去して脱保護した化合物を粘着性の暗色の油として得、それを少量のＭｅＯＨ中に再溶解し、エーテルで沈殿させ、デカンテーションによって溶媒を除去し、これを数回繰り返して、ＧＳＣ４２を茶色粉末として得た（３４６ｍｇ、８８％）。
【００４３】
実施例６  ＧＳＣ２の合成
工程１：
【化３０】
0004759193.tif 000019
【００４４】
保護されたスペルミン１．２３ｇ（２．６５ミリモル）を１，２−ジクロロエタン（２５ｍｌ）中に溶解し、ドデシルアルデヒド２．５当量（６．６ミリモル、１．５ｍｌ）を加えた。１０分後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム６当量（１５．９ミリモル、１ｇ）を加え、混合物を室温で一晩攪拌した。次いで、シアノ水素化ホウ素ナトリウム４．５当量（７５０ｍｇ）をさらに加え、混合物を室温で一晩攪拌した。該溶液をジクロロメタン（１５０ｍｌ）と水（１５０ｍｌ）の間に分配し、ｐＨ９に調整した。得られたエマルジョンを分液漏斗中に１２時間放置した。次いで、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。粗生成物をシリカゲル上のクロマトグラフィーに付し、０．１％ＮＥｔ３を含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン１／４〜１／２（ｒｆ：０．３）で溶出して、半固体黄色化合物を得た（５４０ｍｇ、２６％）。
【００４５】
工程２：
【化３１】
0004759193.tif 000020
【００４６】
保護されたスペルミン２００ｍｇ（０．２５ミリモル）をメタノール（１０ｍｌ）中に溶解し、ヒドラジン一水化物１０当量（２．５ミリモル、０．１３ｍｌ）を加えた。混合物を８時間還流し、溶媒を除去した。粗生成物を１０ｍｌのメタノール中に再溶解し、濃ＨＣｌ（２ｍｌ）を加え、混合物を３０分間還流し、氷中で冷却し、ろ過した。溶媒を除去し、粗生成物をジクロロメタン（３０ｍｌ）中に再溶解し、室温で３０分攪拌し、ろ過によって沈殿を除去した。溶液を蒸発させ、減圧下で乾燥させてＧＳＣ２を黄色半固体化合物として得た（１５０ｍｇ、８８％）。
【００４７】
実施例７  ＧＳＣ１２の合成
工程１：
【化３２】
0004759193.tif 000021
【００４８】
ジアミン１４３ｍｇ（０．２６５ミリモル）を５％水性ＴＨＦ（１０ｍｌ）およびＮＥｔ３０．６ミリモル（８０ｍｌ）中に溶解し、ＴＨＦ（５ｍｌ）中における活性化ペプチド２当量（０．５２８ミリモル、２８２ｍｇ）を加えた。混合物を一晩攪拌し、濃縮した。次いで、粗生成物をＥｔＯＡｃ（６０ｍｌ）中に溶解し、水（２ｘ２０ｍｌ）、３％ＨＣｌ（２ｘ２０ｍｌ）、水（２０ｍｌ）、ブライン（２０ｍｌ）で連続洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を蒸発させて粘着性の白色化合物を得た（２１０ｍｇ、５８％）。
【００４９】
工程２：
【化３３】
0004759193.tif 000022
【００５０】
テトラ−Ｂｏｃ２００ｍｇ（０．１４６ミリモル）をＴＨＦ／濃ＨＣｌ １／１（２０ｍｌ）中に溶解し、室温で１時間攪拌した。溶媒を除去し、粗生成物を少量のＭｅＯＨ中に再溶解し、エーテルで沈殿させ、−２０℃に冷却し、デカンテーションによって溶媒を除去し、これを数回繰り返してＧＳＣ１２を黄色粉末として得た（１５０ｍｇ、８７％）。
【００５１】
実施例８  スペルミン：ペプチドをベースとする界面活性剤の化合物を用いるルシフェラーゼを発現する組換えプラスミドの細胞中へのトランスフェクション
トランスフェクション研究は、接着細胞系統ＣＨＯ−Ｋ１を用いて行われた（Puckら、1958）。完全培地は、１０％ｖ／ｖ胎仔ウシ血清および１ｘＬ−グルタミンを補足したＭＥＭアルファ培地より構成された。全培地および補足物は、Life Technologiesより入手した。
【００５２】
β−ガラクトシダーゼを発現する安定なトランスフェクト細胞系統は、１０：１比率におけるプラスミドｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼ・コントロール・ベクター（pSV-β-Galactosidase Control Vector）（Promega）とプラスミド セレクタ・ベクタ−ネオ（Selecta Vecta-Neo）（R&D Systems）の同時トランスフェクションによって生じた。Ｇ４１８（Life Technologies）選択（０．８ｍｇ ｍｌ−１）後、候補細胞系統をβ−ガラクトシダーゼ活性（β−Galレポーター遺伝子アッセイ, 化学ルミネセンス; Roche Diagnostics）について試験した。
【００５３】
イン・ビトロ遺伝子トランスフェクション
１ウェルあたり１ｘ１０４細胞の適当な密度でのトランスフェクションの１６〜１８時間前に、細胞を９６ウェルＭＴＰプレート（Beckton Dickinson）中に播種した。トランスフェクションのために、１ウェルあたり６４ｎｇのルシフェラーゼリポーター遺伝子プラスミド、ｐＧＬ３−コントロール・ベクター（Promega）を種々の濃度のスペルミン：ペプチドをベースとする界面活性剤の化合物および錯化剤と一緒にインキュベートした。室温で３０分インキュベーション後、OPTI-MEMR（登録商標）培地（Life Technologies）をトランスフェクション混合物に加え、該溶液を細胞上に置いた（１ウェルあたりの最終容量：１００μｌ）。３７℃で３時間または一晩インキュベーション後、トランスフェクション溶液を完全培地と交換し、細胞をさらに３７℃でインキュベートした。製造者のガイドライン（Roche Diagnostics）にしたがって、トランスフェクションの約４８時間後にレポーター遺伝子アッセイを行った。Packard TopCount NXT ミクロプレートシンチレーションおよびルミネセンスカウンターにおいてルミネセンスを測定した。標準化目的で、β−ガラクトシダーゼ活性（β−Galレポーター遺伝子アッセイ; 化学ルミネセンス; Roche Diagnostics）を測定し、β−ガラクトシダーゼ活性あたりのルシフェラーゼ活性を計算した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１ａおよび図１ｂ。ヒドロカルビル基（この場合、ドデシル）がアミン結合によってスペルミン部分に連結しているスペルミン：ペプチドをベースとする界面活性剤の化合物の合成のための一般的なスキーム。図１ａの最終化合物は、図１ｂの最初の化合物である。
【図２】  図２ａおよび図２ｂ。カルボニル基（この場合、ドデカノイル）がアミド結合によってスペルミン部分に連結しているスペルミン：ペプチドをベースとする界面活性剤の化合物の合成のための一般的なスキーム。図２ａの最終化合物は、図２ｂの最初の化合物である。
【図３】  スペルミン：ペプチドをベースとするジェミニ界面活性剤ＧＳ−Ｃ−１、ＧＳ−Ｃ−２、ＧＳ−Ｃ−３、ＧＳ−Ｃ−４およびＧＳ−Ｃ−１２でのＣＨＯ−Ｋ１細胞（ベータ−ガラクトシダーゼで安定にトランスフェクトした）のトランスフェクション。棒は、８実験の平均ｃｐｓ（１秒あたりのカウント）±平均の標準誤差を示す。
【図１ａ】
0004759193.tif 000033
【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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