(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物細胞から分離した核のホルマリン固定化物の破砕物を抗原とし、ハイブリドーマ法により得られた、ハイブリドーマ、ＦＥＲＭＰ−１９３６９株が産生する抗ヒストンモノクローナル抗体であって、ヒストンH3およびH4の内部構造L2リンカー領域を特異的に認識する抗ヒストンモノクローナル抗体。
【請求項２】
動物細胞から分離した核のホルマリン固定化物がHeLa細胞から分離した核のホルマリン固定化物である請求項１に記載の抗ヒストンモノクローナル抗体。
【請求項３】
動物細胞から分離した核のホルマリン固定化物の破砕物を抗原として、免疫感作して得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合して得られたものであって、請求項１に記載の抗ヒストンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、ＦＥＲＭＰ−１９３６９株。
【請求項４】
動物細胞から分離した核のホルマリン固定化物がHeLa細胞から分離した核のホルマリン固定化物である請求項３に記載のハイブリドーマ。
【請求項５】
抗体産生細胞が、脾細胞である請求項３に記載のハイブリドーマ。
【請求項６】
脾細胞及びミエローマ細胞がマウスの由来の細胞である請求項５に記載のハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒストンH3およびH4の内部構造L2リンカー領域を認識する抗ヒストンモノクローナル抗体及びその産生ハイブリドーマに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒストンは種を越えて相同性が高く、生体内において異物として認識されにくいため抗原性が低く、動物に免役する通常の方法によりヒストンに対する抗体を作成することは、従来困難であった。しかしながら自己免疫疾患である全身性紅斑性狼瘡(SLE; Systemic Lupus Erythematosus)の患者血清中には多くの抗ヒストン抗体が存在していることが知られている。またその多くの自己免疫疾患患者血清中においてはヒストン以外にも、HMGタンパク、リボヌクレオプロテイン、RNAポリメレース、tRNA合成酵素、トポイソメレース等に対する抗体や一本鎖DNA、二本鎖DNA、Z-DNA、二本鎖RNA、rRNA、ポリADPリボース等を認識する抗体が含まれていることが既に報告されている。
【０００３】
これら自己免疫疾患患者において見られる自己抗体がどのようにして作製されるのかは未だ充分解明されていないが、死細胞の核分解物が抗原刺激となっていると予想されている。また、核分解産物の一つであるヌクレオソームは、これら抗体の作製を助けるT細胞を刺激することも報告されている。
【０００４】
そこでこれまで多くの場合、抗ヒストン抗体はSLE患者より供与された血清を用いて精製により得ることが多かった。この場合、抗体価、抗原の特徴ならびに抗原に対する親和性、抗原抗体反応速度等の抗体の特徴が患者血清のロットの差が顕著であり、同一規格の抗体の安定供給を行うことが非常に困難であった。また日本においてはSLE患者の血清を入手することは困難であり、これら生体試料を全て輸入に頼ることは倫理面においても問題があった。
【０００５】
また近年自己免疫疾患モデルマウス(MRL/lprマウスやNZB/NZWマウス)より脾細胞を調製し、これを用いて抗ヒストンモノクローナル抗体の作製も行われている。しかしながら本方法で得られる抗ヒストンモノクローナル抗体のクローン数は限られており、得られるモノクローナル抗体の種類も限定されている。多くの場合にはH1等のリンカーヒストンに対する抗体やヌクレオソーム構造のうちDNAに覆われていないアミノ末端領域を認識する抗体がほとんどである。さらに、従来の抗ヒストンモノクローナル抗体についての技術は、主にヒストンのアミノ末端領域のアミノ酸修飾の違いを認識する抗体の開発に向けられていたため、該抗体はヌクレオソームの内部構造を検討することができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
一方、ヒストンのアミノ末端の変化を認識しなくとも、ヒストンの内部領域を認識する抗体、特にヌクレオソーム構造においてDNAとコアヒストンが結合するようなヒストンの領域を認識する抗体は、ヌクレオソームの構造変化を直接検出するするために有用な手段であり、さらに後記する多様な用途に使用できるものである。そこで本発明の課題は、ヌクレオソーム構造においてDNAとコアヒストンが結合するようなヒストンの領域を認識する抗体を、上記従来技術等における血清等からの分離手段によらず、モノクローナル抗体として提供することにあり、また、このため、該抗体を容易にかつ多量に生産しうるハイブリドーマを提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで、本発明者等は、鋭意研究の結果、動物細胞の核ホルマリン固定化物の破砕物を抗原として、免疫感作して得られた抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合して得られたハイブリドーマをスクリーニングすることにより、ヌクレオソーム構造においてDNAとコアヒストンが結合するようなヒストンの領域を認識する抗体を高率に産生するとともに、かつ増殖性に優れたクローンを見いだし本発明を完成させるに至ったものである。
すなわち、本発明は以下（１）及び（２）に係るものである。
【０００８】
（１）動物細胞から分離した核のホルマリン固定化物の破砕物を抗原とし、ハイブリドーマ法により得られた、ハイブリドーマ、ＦＥＲＭＰ−１９３６９株が産生する抗ヒストンモノクローナル抗体であって、ヒストンH3およびH4の内部構造L2リンカー領域を特異的に認識する抗ヒストンモノクローナル抗体。
（２）動物細胞から分離した核のホルマリン固定化物がHeLa細胞から分離した核のホルマリン固定化物である上記（１）に記載の抗ヒストンモノクローナル抗体。
（３）動物細胞から分離した核のホルマリン固定化物の破砕物を抗原として、免疫感作して得られた抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合して得られたものであって、請求項１に記載の抗ヒストンモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、ＦＥＲＭＰ−１９３６９株。
（４）動物細胞から分離した核のホルマリン固定化物がHeLa細胞から分離した核のホルマリン固定化物である上記（３）に記載のハイブリドーマ。
（５）抗体産生細胞が、脾細胞である上記（３）に記載のハイブリドーマ。
（６）脾細胞及びミエローマ細胞がマウスの由来の細胞である上記（５）に記載のハイブリドーマ。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の抗ヒストンモノクローナル抗体は、ヒトを始めとする多種のヒストンH3およびH4のL2リンカー領域を認識するものであり、各種ヒストンやヌクレオソームの分離精製、定量等、極めて広い範囲の用途に適用可能なものである。また、本発明のハイブリドーマは、上記モノクローナル抗体を効率よく生産可能なものであり、本発明は、細胞、遺伝子操作技術等において極めて有用なものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の抗ヒストンモノクローナル抗体は 動物細胞の核ホルマリン固定化物の破砕物を抗原とし、ハイブリドーマ法によって得られる。
本発明を、より具体的に説明すると、本発明は、HeLa細胞の核ホルマリン固定化物の破砕物を抗原とし、ハイブリドーマ法により得られたことに基づく、この製法についてさらに具体的に説明する。
使用する抗原は、HeLa細胞から核を分離精製し、ホルムアルデヒドにより核内構造を固定化した後、超音波により破砕し断片化したものである。
該抗原による免疫感作は、マウスより取り出した脾細胞を用い、Bossの方法(Boss, B. D. (1984) Brain Res., 291, 193-196)に従って、in vitroで行った。
【００１１】
Bossの方法とは抗体を作製するにあたり、通常のマウスやウサギに抗原を免役する方法に代わり、in vitroにおいて免疫感作する方法である。本方法の長所としては、（１）少ない抗原量においても免役することが可能、（２）免疫期間が短い、（３）通常の動物に感作した場合に観察される免疫寛容や免疫抑制を避けることができ、抗原性に依存することなく抗体を作製することが可能、（４）毒性の強い抗原においても免疫が可能、（５）免役した動物に対して為害性を示す抗体についても作成可能といったことがあげられる。
【００１２】
B細胞の抗体産生を誘導するためにはマクロファージ、T細胞による抗原提示やシグナルクロストークが必要とされるが、脾細胞中にはB細胞を始めとしてこれらの細胞が含まれている。そこでマウスより脾細胞を調製し、無血清培地中でアジュバントであるN-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamineと共に抗原刺激を行い、培地中で免疫感作する。
【００１３】
次いで上記免疫感作され脾細胞とミエローマ細胞をポリエチレングリコールにより細胞融合させ、常法により、HAT培地でハイブリドーマを選別し、  さらに希釈法により得たハイブリドーマの各クローンの培養上澄みを、上記抗原の核ホルマリン固定化物を使用した酵素免疫測定法（ELISA）により測定し陽性のハイブリドーマクローンを得る。さらに得られたクローンについて、HeLa細胞核を細分化した、DNA画分、ヌクレオソーム画分、ヒストン画分、核マトリックス画分を用いたELISAにより認識抗原の決定を行い、ヒストン画分に特異的に陽性反応を示すハイブリドーマクローンを得る。この後、抗体産生能力及び増殖性が良好なクローンをさらにスクリーニングし、本発明の抗ヒストンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを得る。
【００１４】
本発明の上記抗ヒストンモノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、独立行政法人  産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３６９として寄託されている。
【００１５】
上記ハイブリドーマから得られた本発明の抗ヒストンモノクローナル抗体は、ヒストンH3ならびにH4のリンカー領域L2に特異的に反応し、これらヒストンのアミノ末端やL1やaヘリックス領域には反応しない。またその他のヒストンH1、H2AおよびH2Bとは反応しない。
【００１６】
本発明の抗ヒストンモノクローナル抗体は、ヒトのみならずニワトリや多くのヒストンH3およびH4の内部構造L2リンカー領域を特異的に認識するものであるから、例えば本発明の抗ヒストンモノクローナル抗体を使用したアフィニティクロマトを行うことにより、アミノ末端領域のアミノ酸修飾の相違によらず、各種細胞核破砕物等からコアヒストン及びヒストンH3/H4テトラマーさらにはヒストンH3、H4各々を容易に分離精製できる。極めて汎用性に富む。また、真核生物細胞内において、遺伝子の転写、複製、修復等が行われている領域においてはクロマチン構造が変化することが知られており、該抗ヒストン抗体を用いて細胞核内を染色することにより、クロマチン構造が変化しヌクレオソーム構造崩壊しつつある領域を直接観察同定することができる。さらにはクロマチン構造をホルマリンで固定化した後、該抗ヒストン抗体を用いてアフィニティクロマトを行うことにより、このクロマチン構造が変化しヌクレオソーム構造崩壊しつつある領域を特異的に回収することができる。
以上は、マウスの脾細胞とマウスのミエローマ細胞とのハイブリドーマを使用する場合を主に説明したが、本発明は、これに限らず、マウス由来の抗体産生細胞とヒト由来のミエローマ細胞を使用するハイブリドーマ法、あるいはマウス由来の抗体産生細胞とラット由来のミエローマ細胞を使用するハイブリドーマ法等、従来既知のハイブリドーマ法を適用して、抗ヒストンモノクローナル抗体を得ることができる。
【００１７】
また、本発明の抗ヒストンモノクローナル抗体は上記用途のほかにも様々な用途に使用できる。これらについて以下に例示する。
（ａ）自己免疫疾患研究用モデル動物の作製
ヒト自己免疫疾患、特にSLE患者血清中には、抗ヒストン抗体が存在していることが知られている。またこれら疾患のモデルマウス(NZB x NZW)F1、MRL、BXSBなどにおいても同様に、血清中に抗ヒストン抗体が存在している。この血清中の抗ヒストン抗体量と臨床症状には相関関係があり、抗ヒストン抗体が自己免疫疾患の何らかの原因になっていると考えられている(Suwa, A. and Mimori, T., Nippon Rinsho. (1999), 57, 403-405)。またSLEにおいて見られる抗ヒストン抗体が、細胞表面特にBリンパ球前駆細胞の細胞表面タンパクと反応することにより、情報伝達系に作用することも示唆されている（Raz, E. et al., Eur. J. Immunol. (1993), 23, 383-390, Mecheri, S. et al., Mol. Immunol. (1993), 30, 549-557）。よって今回樹立された抗ヒストンモノクローナル抗体を例えばマウスに接種することにより、自己免疫疾患研究用モデルマウスが作成可能となる。
【００１８】
（ｂ）細胞毒性物質の評価
培養細胞を、種々の細胞毒性物質で処理すると、細胞が死滅していく。この時死細胞核内から培地中に放出されるヒストンを含む核内分解産物を、本抗ヒストンモノクローナル抗体を用い、上記の手法で定量することにより、生細胞率（死滅率）を測定することができ、これにより、細胞毒性物質の評価を行うことができる。
【００１９】
（ｃ）細胞内における転写反応の調節
核内において遺伝子DNAはクロマチン構造を取ることにより、転写を抑制している。本抗ヒストン抗体を細胞内において発現させることにより、ヒストンH3ならびにH4が本抗体と結合し、ヌクレオソーム構造の形成を抑制することが可能となる。これにより遺伝子DNAは常に転写可能状態を維持できることより、転写を活性化することが可能であると考えられる。
【００２０】
（ｄ）エストロゲンの細胞増殖作用の抑制
エストロゲンの細胞に及ぼす作用は、高結合のエストロゲンレセプターを介した経路(Type I)と低結合の他のタンパク質との結合を介する経路(Type II)があり、特に細胞増殖に関してはType IIの経路が非常に重要であることが報告されている(Markaverich, B. M., et al., Endocrinol. (1981), 109, 62-69)。さらにType IIがヒストンH4の結合を介した経路であるという報告がなされた(Shoulars, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (2002), 296, 1083-1090)。そこで抗ヒストン抗体を細胞内で発現させることにより、エストロゲンのType II経路を介した活性化を阻害し、細胞増殖を抑制することが可能となる。
【００２１】
（ｅ）本発明の抗ヒストンモノクローナル抗体の改変による各種ヒストン抗体の作成
現在、抗体の遺伝子改変による各々特異性が異なる抗体を作成する手段が研究されており、これには、例えば、抗体産生細胞からモノクローナル抗体mRNAを抽出し、抗原認識部位（Variable region）に変異を人工的に導入することにより、抗原の認識性を調節するものがある。本発明のハイブリドーマから抗ヒストンモノクローナル抗体mRNAを抽出し、変異を加えることにより、その他のヒストンH2A、H2BならびにH1等の種々のヒストン様タンパクの特異的認識抗体を作成できる可能性があり、この種の抗体改変技術の研究において、極めて有用な被験試料を提供できる。
【実施例１】
【００２２】
(1)抗原の調製
HeLa細胞1 x 108個を10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl溶液に懸濁し、NP-40存在下においてホモジナイズし後1000 x g５分間の遠心にて核を沈殿として分離精製する。１％ホルムアルデヒド溶液5 ml中に精製した核を懸濁し室温にて２０分間反応させることによりDNAを含めた核内構造を固定した。この固定化核画分を２分間超音波破砕によりDNAが平均3kbpなるくらいまで断片化し、これを抗原として用いた。
【００２３】
(2)細胞融合及びクローニング
８週齡雌マウスより脾細胞5 x 108個を調製し、Bossの方法(Boss, B. D. (1984) Brain Res., 291, 193-196)に従いN-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine存在下にて、先に調製した抗原を用いてin vitroにて免疫感作を行った。３日間感作培養の後、6 x 107個の脾細胞と6 x 106個の8-アザグアニン耐性マウスミエローマ細胞であるP3U1 (P3-X63-Ag8-U1)とを混合し、遠心後の沈査に50%ポリエチレングリコール（平均分子量4000）を添加し、２分間穏やかに反応させることにより細胞融合を行った。得られたハイブリドーマ含有液を96ウェルマイクロカルチャープレートに植え込み、HAT培地を用いて２週間培養を行った。増殖の認められたウェルの培養上清を採取して酵素免疫測定法(ELISA)によりスクリーニングを行い、抗原として用いたHeLa細胞固定化核全画分に陽性を示したウェルの細胞についてクローニングを行った。ELISA陽性ウェル中の細胞を96ウェルマイクロカルチャープレートに平均１ウェル当り0.1-1個を植え込んだ。培養開始後２週間でコロニーの形成が認められ、こうして得られたコロニーについて上記と同様にスクリーニング及びクローニングを行い、所期の反応性を示す抗体を産生しているハイブリドーマ（クローン）を得た。
【００２４】
(3)スクリーニング
上記（２）で得たハイブリドーマのうち、抗ヒストン抗体を産生する所期のクローンを得るためのスクリーニングは、ELISA法を利用して行った。即ち、抗原に用いた核画分を更にDNA画分、ヌクレオソーム画分、核マトリックス画分、主にヒストンを含む硫酸抽出画分に分画し、それぞれ（10mg/mlの濃度で100ml/ウェル）を96ウェルマイクロプレートに固相化（4℃、一昼夜）させた後に、BSAでブロッキングしたウェルで培養上清を反応させ（室温、90分間）、洗浄後にさらにパーオキシダーゼ標識抗マウスIgG+IgM抗体を添加して室温で60分間反応させ、次いでo-フェニレンジアミンを基質とした発色系で検出した。
【００２５】
(4)抗ヒストン抗体産生ハイブリドーマの作製及び当該抗DNA抗体の取得
上記（２）により、固定化核抗原認識抗体の産生能を有するハイブリドーマを２０クローン樹立することができたが、さらに、上記（３）のスクリーニングを行うことにより、上記ヒストン画分に対して陽性の抗ヒストン抗体産生ハイブリドーマは8クローン樹立された、このうちハイブリドーマ増殖性及び抗体産生能におけるバランスの面から最も優れていると考えられるクローンに係るハイブリドーマ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９３６９）を血清無添加培地中もしくはプリスタン投与マウスの腹腔内において増殖させその培養上清もしくは腹水を回収した。これらを硫安塩析後、HPLCハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーにより精製回収し、本発明の抗ヒストンモノクローナル抗体を得た。
【００２６】
（５）抗ヒストンモノクローナル抗体の特性
（ａ）抗ヒストンモノクローナル抗体の基質特異性
種々の濃度のHeLa細胞遺伝子DNA、ヒストン画分、マトリックス画分、ヌクレオソームを96ウェルマイクロプレートに固相化（4。C、一昼夜）させた後に、BSAでブロッキングし、抗ヒストンモノクローナル抗体(1mg/ml)を100ml各ウェルに加えて反応させた（室温、90分間）。洗浄後にさらにパーオキシダーゼ標識抗マウスIgG+IgM抗体を添加して室温で60分間反応させ、次いでo-フェニレンジアミンを基質とした発色系を用い、492 nmの吸光度を測定した。結果を第１図に示す。図示されるように、本抗ヒストンモノクローナル抗体はヒストン画分のみを認識することが判明した。
【００２７】
（ｂ）各々のヒストンに対する反応性
ヒストン画分のタンパクをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、ニトロセルロース膜にウェスタンブロットした。2%BSAでブロッキングした後,本抗ヒストンモノクローナル抗体(1mg/ml)10 mlを加え、室温で１時間反応させ、洗浄後にさらにパーオキシダーゼ標識抗マウスIgG+IgM抗体を添加して室温で60分間反応させ、次いでECLを基質とした発光系を用い反応するヒストンタンパクを検出した。結果を第２図に示す。
図に示されるように、本抗ヒストンモノクローナル抗体はヒトならびにニワトリのヒストンH3ならびにH4ともに同様に認識する。 
【００２８】
（ｃ）ヒストンタンパクにおける認識領域
ヒストンタンパクのアミノ酸配列を基に、ヒストンH3とH4に相同性が高く、H2AならびにH2Bには相同性の低い領域をコンピュータを用いて検索したところ、ヒストンH4におけるa1ヘリックス(Ile-Arg-Arg-Leu-Ala-Arg-Arg-Gly)とL2リンカー(Thr-Glu-His-Ala-Lys-Arg-Lys-Thr-Val-Thr)を見出した。これらのペプチドをデヒドロ葉酸還元酵素との融合タンパクとして大腸菌に発現させ、精製した後、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、ニトロセルロース膜にウェスタンブロットした。2%BSAでブロッキングした後,本抗ヒストンモノクローナル抗体(1mg/ml)10 mlを加え、室温で１時間反応させ、洗浄後にさらにパーオキシダーゼ標識抗マウスIgG+IgM抗体を添加して室温で60分間反応させ、次いでECLを基質とした発光系を用い反応するタンパクを検出した。結果を第３図に示す。本結果よりL2リンカー特異的に本抗体と結合していた。以上の結果より本抗ヒストンモノクローナル抗体はヒストンH3およびH4のL2リンカー領域を認識している事が判明した。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の抗ヒストンモノクローナル抗体のヒストン認識性を、各核内成分、遺伝子DNA、ヒストン画分、マトリックス画分、ヌクレオソームについて試験した結果を示すグラフである。
【図２】各々のヒストンタンパクに対する本発明の抗ヒストンモノクローナル抗体の結合性を試験した結果を示す図である。
【図３】結合の予測されたペプチド断片を含む組み合えタンパクに対する本発明の抗ヒストンモノクローナル抗体の反応性をウェスタンブロット解析により試験した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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