(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼとしてプロレザー（商品名、登録商標）、プロテアーゼＡ「アマノ」（商品名）またはプロテアーゼＰ「アマノ」６（商品名）を用い、一般式（Ｉ）：
【化１】
0004834208.tif 000005
（式中、Ｒ1はメチル基またはｎ−ブチル基を示す）で表わされるｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物を加水分解反応により光学分割することを特徴とする（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの製造法。
【請求項２】
ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物およびプロテアーゼを水または緩衝液中で撹拌し、該ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物を加水分解反応させる請求項１記載の（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの製造法に関する。詳しくは、たとえば生理活性物質をはじめとする種々の有機化学製品の中間体としてきわめて有用な（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの前駆体である（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸を製造する方法または製造可能な方法としては、たとえば
（１）化学的に合成されたｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸を光学活性アミンにより光学分割する方法（特開昭６０−１３７７５号公報）、
（２）光学活性なβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸であるアロトレオニンに、ハロゲン化ニトロシルまたは亜硝酸ナトリウムを反応させ、苛性アルカリでエポキシ化する方法（特公昭４０−２１７６６号公報）、
（３）シャープレス酸化により得た光学活性ヒドロキシメチルエチレンオキシドをルテニウム酸化させる方法［テトラヘドロン  レターズ(Tetrahedron Lett.)、３１（３５）、５０２３（１９９０）］、
（４）ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルをリパーゼやエステラーゼにより加水分解し、反応後の水層中より（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸を回収する方法（特開平４−２１２８８１号公報）
などが知られている。
【０００３】
しかしながら、（１）〜（３）の方法は、光学活性な原料または光学分割剤を必要とし、また（４）の方法は、（２Ｒ，３Ｓ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの製造方法としては有用であるが、水層より回収した（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸は光学純度が低いといった欠点を有し、これら（１）〜（４）の方法は、さらに反応条件や光学分割条件を選択しなければならず、簡便な方法ではなく、経済的な方法でもなかった。
【０００４】
さらに、クロトン酸エステルの微生物による酸化が報告されているものの、前記のごとき光学活性体の有効な製造方法に関しては開示されていない（特開昭６１−２５４９２号公報）。
【０００５】
このように、現在のところ（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸の有効な製造方法が提案されておらず、よってそのエステルである（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの製造方法に関しても充分に研究がなされていないのが実情である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は前記従来技術に鑑みてなされたものであり、生理活性物質をはじめとする種々の有機化学製品の中間体としてきわめて有用な（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルを、簡便かつ経済的に製造する方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、プロテアーゼとしてプロレザー（商品名）、プロテアーゼＳ（商品名）、プロテアーゼＡ（商品名）またはプロテアーゼＰ（商品名）を用い、一般式（Ｉ）：
【０００８】
【化２】
0004834208.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｒ1はメチル基またはｎ−ブチル基を示す）で表わされるｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物を加水分解反応により光学分割することを特徴とする（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの製造法に関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明の製造法によれば、プロテアーゼを用い、一般式（Ｉ）：
【００１１】
【化３】
0004834208.tif 000003
【００１２】
（式中、Ｒ1はハロゲン原子もしくは芳香族置換基で置換されていてもよい直鎖状または分岐鎖状の炭素数１〜１８のアルキル基、またはハロゲン原子もしくは芳香族置換基で置換されていてもよい直鎖状または分岐鎖状の炭素数１〜１８のアルケニル基を示す）で表わされるｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物を加水分解反応にて光学分割させて、（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルを容易に効率よく得ることができる。すなわち、一般式（Ｉ）で表わされるｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物を原料とし、これにプロテアーゼを作用させることにより立体選択的にエステルの加水分解を行なわせ、ついで分離、精製して（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルを得るものである。
【００１３】
本発明に用いられるｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルは、一般式（Ｉ）で表わされるものであり、たとえばクロトン酸エステルの酸化により容易に得ることができる（特開平３−１９６５１９号公報）。
【００１４】
前記一般式（Ｉ）において、Ｒ1で示されるアルキル基としては、たとえばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基などの好ましくは炭素数１〜８のアルキル基や、たとえば２−クロロエチル基、２−ブロモエチル基、２−クロロプロピル基、２−ブロモプロピル基などの、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などのハロゲン原子で置換されたアルキル基、たとえばベンジル基、１−フェニルエチル基、２−フェニルエチル基、３−フェニルプロピル基などの芳香族置換基で置換されたアルキル基などがあげられ、またＲ1で示されるアルケニル基としては、たとえばイソプロペニル基、アリル基、３−ブテニル基や、たとえば２−クロロアリル基、２−ブロモアリル基、３−クロロ−３−ブテニル基、３−ブロモ−３−ブテニル基などの、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子などのハロゲン原子で置換されたアルケニル基、たとえば３−フェニル−２−プロペニル基、４−フェニル−２−ブテニル基などの芳香族置換基で置換されたアルケニル基などがあげられる。
【００１５】
前記ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルは、エナンチオマー混合物であり、その混合比率が１：１のもの、すなわちラセミ体が実用的価値の面で好ましいが、本発明にはとくに限定がなく、いかなる混合比率のエナンチオマー混合物をも用いることができる。
【００１６】
本発明に用いることができるプロテアーゼとしては、たとえばバチルス（Bacillus）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、スタフィロコッカス（Staphylococcus）属、リゾプス（Rhizopus）属、クロストリジウム（Clostridium）属、ストレプトミセス（Streptomyces）属、ペニシリウム（Penicillium）属に属する微生物などが生産するプロテアーゼ；パパイン、ブロメライン、フィシンなどの植物より産生されるプロテアーゼ；トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パンクレアチンなどの動物より産生されるプロテアーゼなどが例示されるが、ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物のエステル基を立体選択的に加水分解し、目的とする（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルを回収することができるものであればプロテアーゼの種類にとくに限定がない。前記例示のなかでは、たとえばバチルス・エスピー（Bacillus sp.）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、アスペルギルス・メレウス（Aspergillus melleus)などに由来のものが立体選択性によりすぐれる点でとくに好ましい。
【００１７】
前記プロテアーゼの市販品としては、たとえばバチルス・エスピー由来のプロレザー（登録商標）およびプロテアーゼＳ「アマノ」（天野製薬（株）製、商品名）、アスペルギルス・オリザエ由来のプロテアーゼＡ「アマノ」（天野製薬（株）製、商品名）、アスペルギルス・メレウス由来のプロテアーゼＰ「アマノ」６（天野製薬（株）製、商品名）などがあげられる。
【００１８】
前記プロテアーゼの使用量は、プロテアーゼの種類に応じ、その単位重量あたりの酵素活性によって異なるので一概に決定されるものではないが、反応速度や得られる（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの光学純度が低下しないようにするためには、ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのラセミ体１００重量部（以下、部という）に対して０．１部以上、好ましくは１部以上となるように調整することが望ましく、また経済性や（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの収率が低下しないようにするためには、ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのラセミ体１００部に対して１００部以下、好ましくは５０部以下となるように調整することが望ましい。
【００１９】
なお、反応に用いるｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物が、混合比率が１：１でないラセミ体以外の混合物である場合、前記プロテアーゼの使用量は、該エナンチオマー混合物の混合比率に応じて適宜前記範囲外の量に変更してもよい。
【００２０】
前記プロテアーゼはそれぞれ単独で用いてもよく、また必要に応じて２種以上を混合して用いることもできる。これらプロテアーゼのうち、微生物が生産するものは、微生物を培養することによって得られるが、その使用形態は、菌体培養液をそのまま、粗酵素、精製酵素として、または常法によりこれを固定化して用いるなど、いかなる形態であってもよく、とくに限定されるものではない。また動植物より産生されるプロテアーゼにおいても、動植物組織細胞もしくは動植物培養細胞をそのまま、粗酵素、精製酵素として、または常法によりこれを固定化して用いるなど、いかなる形態であってもよく、とくに限定されるものではない。
【００２１】
ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物より、プロテアーゼを用いて立体選択的に目的とする（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルを回収する加水分解反応は、基質となるｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物およびプロテアーゼを、通常水または緩衝液中で撹拌することによって行なうことができるが、緩衝液を用いた場合には、プロテアーゼの至適ｐＨ内で、プロテアーゼの酵素活性が保持されたまま加水分解反応が進行するので、プロテアーゼの使用量を減らすことができるといった利点がある。
【００２２】
前記緩衝液としては、たとえばリン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどの無機酸塩の緩衝液、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどの有機酸塩の緩衝液などの通常用いられるものが例示される。これらの緩衝液を用い、反応液のｐＨを用いるプロテアーゼの最適ｐＨに合わせて加水分解反応させることが好ましい。
【００２３】
緩衝液の使用量は、用いる緩衝液の種類および濃度により異なるので一概に決定されるものではないが、反応速度や得られる（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの光学純度が低下しないようにするためには、ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのラセミ体１００部に対して２００部以上、好ましくは５００部以上となるように調整することが望ましく、また経済性や（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの収率が低下しないようにするためには、ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのラセミ体１００部に対して２００００部以下、好ましくは５０００部以下となるように調整することが望ましい。
【００２４】
なお、反応に用いるｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物が、混合比率が１：１でないラセミ体以外の混合物である場合、前記緩衝液の使用量は、該エナンチオマー混合物の混合比率に応じて適宜前記範囲外の量に変更してもよい。
【００２５】
さらに、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどの水溶液を用い、ｐＨスタットにて反応液のｐＨをコントロールすると、前記緩衝液を用いた場合と同様の効果を得ることができる。
【００２６】
なお、前記加水分解反応時には、水または緩衝液とともに有機溶媒を用いてもよく、かかる有機溶媒には、基質となるｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルのエナンチオマー混合物を溶解し、プロテアーゼの酵素活性を阻害しないかぎりとくに限定がない。
【００２７】
加水分解反応の反応温度は通常０〜５０℃程度であることが好ましく、また反応時間は１〜４０時間程度であることが一般的であるが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
加水分解反応の経時および終点は、高速液体クロマトグラフィ（以下、ＨＰＬＣという）などにより確認することができる。反応終了後、反応液に適切な有機溶媒、たとえばｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、トルエン、ジイソプロピルエーテル、酢酸エチル、ジクロロエタンなどを加えて抽出を行ない、必要に応じて抽出により混入する不純物を水にて洗浄し、除去することもできる。抽出物は、減圧濃縮後、蒸留やカラムクロマトグラフィなどの通常の精製方法を適用することにより、目的とする（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルを得ることができる。
【００２９】
なお、分液後も水層中のプロテアーゼはｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸エステルを加水分解させる活性を有しているので、そのまま連続反応が可能である。
【００３０】
【実施例】
つぎに、本発明の（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルの製造法を実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。
【００３１】
実施例１〜４
精製水４６６．４ｇ、リン酸二水素カリウム６８．２ｇおよび水酸化ナトリウム１５．４ｇより調製したリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）に、ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルのラセミ体２５．０ｇおよび表１に示すプロテアーゼ２．５ｇを添加し、２５℃で８時間撹拌して反応させ、ＨＰＬＣにて反応の経時および終点を確認した。
【００３２】
反応終了後、反応液を２００ｍｌのｎ−ヘキサンにて２回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させたのち、ｎ−ヘキサンを減圧留去させ、得られた油状物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ（展開液：ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝４／１（体積比））で精製し、（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルを得た。
【００３３】
得られた（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルについて、光学分割カラムを用いたＨＰＬＣ（カラム：ダイセル化学工業（株）製、キラルセルＯＤ、溶媒：ｎ−ヘキサン／２−プロパノール＝２０／１（体積比））により光学純度を求めた。また、（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルの収量をｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルの仕込み量で除して収率を求めた。これら収量、収率および光学純度を表１に示す。
【００３４】
【表１】
0004834208.tif 000004
【００３５】
表１に示された結果から、実施例１〜４のごとき本発明の製造法によれば、高光学純度の（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルを、容易かつ経済的に得ることができることがわかる。
【００３６】
実施例５
精製水１８６６ｇ、リン酸二水素カリウム２７２．７ｇおよび水酸化ナトリウム６３．３ｇより調製したリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）に、ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルのラセミ体１００．０ｇおよびプロレザー（天野製薬（株）製、登録商標）３０．０ｇを添加し、２５℃で１４．５時間撹拌して反応させ、ＨＰＬＣにて反応の経時および終点を確認した。
【００３７】
反応終了後、反応液を６００ｍｌのｎ−ヘキサンにて２回抽出した。抽出液からｎ−ヘキサンを減圧留去させ、得られた油状物を蒸留して精製し、（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルを得た。
【００３８】
得られた（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルについて、実施例１〜４と同様にして光学純度および収率を求めた。これらの結果を収量とあわせて以下に示す。また、以下の条件で沸点および比旋光度を測定した。その結果もあわせて以下に示す。
【００３９】
収量：３３．３ｇ
収率：３３．３％
光学純度：９７．７％ｅ.ｅ.
沸点（６Torr）：７７℃
比旋光度（Ｃ＝２、クロロホルム中、２５℃）：＋１７．３°
【００４０】
さらに、得られた（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよびＩＲスペクトルのデータを以下に示す。
【００４１】
1Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3中、δ値（ｐｐｍ）、日本電子（株）製ＧＸ−５００にて測定）：０．９３（ｔ，３Ｈ）、１．３９（ｍ，２Ｈ）、１．６２（ｍ，２Ｈ）、３．１７（ｄ，１Ｈ）、３．２１（ｑｄ，２Ｈ）、４．１６（ｔｄ，２Ｈ）ＩＲ（ｎｅａｔ、ｃｍ-1、（株）島津製作所製ＦＴＩＲ−４２００にて測定）：１７４４
【００４２】
実施例６
精製水１８６６ｇ、リン酸二水素カリウム２７２．７ｇおよび水酸化ナトリウム６３．３ｇより調製したリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）に、ｔｒａｎｓ−２，３−エポキシ酪酸メチルのラセミ体１００．０ｇおよびプロレザー（天野製薬（株）製、登録商標）３０．０ｇを添加し、２５℃で１２時間撹拌して反応させ、ＨＰＬＣにて反応の経時および終点を確認した。
【００４３】
反応終了後、反応液を６００ｍｌのｎ−ヘキサンにて２回抽出した。抽出液からｎ−ヘキサンを減圧留去させ、得られた油状物を蒸留して精製し、（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸メチルを得た。
【００４４】
得られた（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸メチルについて、実施例１〜４と同様にして光学純度および収率を求めた。これらの結果を収量とあわせて以下に示す。また、以下の条件で沸点および比旋光度を測定した。その結果もあわせて以下に示す。
【００４５】
収量：２９．１ｇ
収率：２９．１％
光学純度：９５．４％ｅ.ｅ.
沸点（２６Torr）：７２℃
比旋光度（Ｃ＝２、クロロホルム中、２４℃）：＋２１．９°
【００４６】
さらに、得られた（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸メチルの1Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよびＩＲスペクトルのデータを以下に示す。
【００４７】
1Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3中、δ値（ｐｐｍ）、日本電子（株）製ＧＸ−５００にて測定）：１．４１（ｄ，３Ｈ）、３．２１（ｄ，１Ｈ）、３．２４（ｑｄ，１Ｈ）、３．７８（ｓ，３Ｈ）
ＩＲ（ｎｅａｔ、ｃｍ-1、（株）島津製作所製ＦＴＩＲ−４２００にて測定）：１７５０
【００４８】
以上のごとき実施例５および６の結果から、本発明の製造法によれば、高光学純度の（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸ｎ−ブチルおよび（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸メチルを、容易かつ経済的に得ることができることがわかる。
【００４９】
【発明の効果】
本発明の製造法によれば、生理活性物質をはじめとする種々の有機化学製品の中間体としてきわめて有用な（２Ｓ，３Ｒ）−２，３−エポキシ酪酸エステルを、簡便かつ経済的に製造することができる。