(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビオチンおよびアビジンから選ばれる少なくとも一つを構成成分として含むモノマーを共重合成分として含む下限臨界溶液温度を有するポリマーが固定化された磁性微粒子。
【請求項２】
少なくとも１つのモノマー構成成分がビオチンである請求項１記載の磁性微粒子。
【請求項３】
ビオチンがアビジンと結合したビオチン（ 以下「アビジン結合ビオチン」と云う。） である請求項２記載の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子。
【請求項４】
目的物質と相互に特異的作用を有し、且つアビジンが固定化された物質を、ビオチンに結合させた請求項１〜３の何れか１項記載の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子。
【請求項５】
目的物質と相互に特異的作用を有し、且つビオチンが固定化された物質を、アビジンに結合させた請求項１〜３の何れか１項記載の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子。
【請求項６】
目的物質と相互に特異的作用を有する物質が酵素、蛋白質、核酸、ペプチド、分子シャペロン、ヒートショックプロテイン、および抗体から選ばれた１種以上である請求項４または５記載の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項記載の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子を用いることを特徴とする物質の変換方法。
【請求項８】
請求項１〜６の何れか１項記載の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子を用いることを特徴とする微生物の分離方法または濃縮方法。
【請求項９】
請求項１〜６の何れか１項記載の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子を用いることを特徴とする変性蛋白質の改質方法。
【請求項１０】
請求項１〜６の何れか１項記載の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子を用いることを特徴とする核酸の精製、検出、または濃縮方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の核酸の精製、または濃縮方法により得られた核酸を増幅することを特徴とする核酸の検出方法。
【請求項１２】
増幅方法がＰＣＲ法またはＲＴ−ＰＣＲ法である請求項１１記載の核酸の検出方法。
【請求項１３】
請求項１〜６の何れか１項記載の磁性微粒子を含有する分離剤。
【請求項１４】
請求項１３記載の分離剤を用いることを特徴とする生体物質の分離方法。
【発明の詳細な説明】
＜技術分野＞
本発明は、下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子、およびそれを用いた物質の変換方法、微生物の分離方法または濃縮方法、変性蛋白質の改質方法、核酸の検出方法、分離剤、および生体物質の分離方法に関する。
＜背景技術＞
クリニカルマイクロバイオロジーレビュー（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．）１９９４年、４３〜５４頁に記載されるように、磁性微粒子に抗体や対塩基を固定化し、種々の生体分子や微生物などの分離を行う試みが数多く行われている。これらの方法に用いられる磁性微粒子は、磁石での回収時間を考慮して、通常１μｍ以上の粒径を有するものが用いられる。しかしながら、粒径が大きくなるに従い、その表面積は小さくなるため、蛋白質や核酸等の小さな分子を分離しようとする場合、その効率が大きな問題となる。
この粒径の問題を解決する方法としてアプライドマイクロバイオロジーアンドバイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）１９９４年、４１巻、９９〜１０５頁、および、ジャーナルオブファーメンテーションアンドバイオテクノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）１９９７年、８４巻、３３７〜３４１頁では、磁性微粒子の存在下、下限臨界溶液温度（以下「ＬＣＳＴ」と記載する。）を有するポリイソプロピルアクリルアミドを重合することにより、ＬＣＳＴを有し且つ粒径が１００〜２００ｎｍ程度の磁性微粒子が得られること、さらに該磁性微粒子は粒径が従来のものよりも小さいにも係わらず、溶液の温度をＬＣＳＴ以上に上げることで、これらを凝集させ簡単に回収することが可能であることが報告されている。
この報告では、ポリイソプロピルアクリルアミドの重合の際にメタクリル酸を共重合させておき、重合終了後、該カルボン酸にカルボジイミドを使用して牛血清アルブミンを固定化し、血清中の牛血清アルブミン抗体の精製を試みている。
しかしながら、この方法では使用目的ごとに酵素や抗体等を磁性微粒子上のポリマーに固定化する工夫をし、さらに未反応物を取り除く必要があるため、精製を行うという操作をしなければならず、汎用的ではなかった。また、この方法では、核酸を直接蛋白質等に結合させなくてはならず、核酸の固定化は非常に困難であった。
上記の通り、従来技術では、分離剤等の分野において、ＬＣＳＴを有する磁性微粒子の有用性が認められているものの、汎用性に乏しいという問題を抱えていた。
＜発明の開示＞
本発明者らは、前述の従来技術の課題に鑑み鋭意研究を重ねた。その結果、ビオチンおよびアビジンから選ばれた１種以上が固定化された下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子であれば、使用目的ごとに酵素や抗体等を磁性微粒子上のポリマーに固定化する必要がなく、さらに、核酸を直接蛋白質等に結合させる必要もなくなることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
以上の記述から明らかなように、本発明の目的は、分離剤等の用途において汎用性の高い下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子と、それを用いた物質の変換方法、微生物の分離方法または濃縮方法、変性蛋白質の改質方法、核酸の検出方法、および生体物質の分離方法を提供することにある。
本発明は以下の構成を有する。
（１）ビオチンおよびアビジンから選ばれた１種以上が固定化された下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子。
（２）ビオチンおよびアビジンから選ばれた１種以上が、下限臨界溶液温度を有するポリマーを介して磁性微粒子に固定化された前記第１項記載の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子。
（３）ビオチンが固定化された下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子。
（４）ビオチンが下限臨界溶液温度を有するポリマーを介して磁性微粒子に固定化された前記第３項記載の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子。
（５）ビオチンがアビジンと結合したビオチン（以下「アビジン結合ビオチン」と記載する。）である前記第３項または第４項記載の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子。
（６）目的物質と相互に特異的作用を有し、且つアビジンが固定化された物質を、ビオチンに結合させた前記第１項〜第４項の何れか１項記載の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子。
（７）目的物質と相互に特異的作用を有し、且つビオチンが固定化された物質を、アビジンに結合させた前記第１項、第２項および第５項の何れか１項記載の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子。
（８）目的物質と相互に特異的作用を有する物質が酵素、蛋白質、核酸、ペプチド、分子シャペロン、ヒートショックプロテイン、および抗体から選ばれた１種以上である前記第６項または第７項記載の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子。
（９）前記第１項〜第８項の何れか１項記載の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子を用いることを特徴とする物質の変換方法。
（１０）前記第１項〜第８項の何れか１項記載の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子を用いることを特徴とする微生物の分離方法または濃縮方法。
（１１）前記第１項〜第８項の何れか１項記載の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子を用いることを特徴とする変性蛋白質の改質方法。
（１２）前記第１項〜第８項の何れか１項記載の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子を用いることを特徴とする核酸の精製、検出、または濃縮方法。
（１３）前記第１２項記載の核酸の精製、または濃縮方法により得られた核酸を増幅することを特徴とする核酸の検出方法。
（１４）増幅方法がＰＣＲ法またはＲＴ−ＰＣＲ法である前記第１３項記載の核酸の検出方法。
（１５）前記第１項〜第８項の何れか１項記載の磁性微粒子を含有する分離剤。
（１６）前記第１５項記載の分離剤を用いることを特徴とする生体物質の分離方法。
＜発明を実施するための最良の形態＞
本明細書においてビオチンとは、ビオチンまたはイミノビオチンを意味し、アビジンとは、アビジンまたはストレプトアビジンを意味する。
本発明に使用するＬＣＳＴを有する磁性微粒子（以下「ＬＣＳＴ微粒子」と記述する。）とは、磁性微粒子を含有する溶媒において、該磁性微粒子含有溶媒の温度が特定温度を下回った場合には、該磁性微粒子が溶媒に溶解した状態となり、該特定温度以上となった場合には、該磁性微粒子が溶媒中に析出、凝集する性質を有する磁性微粒子のことである。ＬＣＳＴとは該特定温度のことである。また、ＬＣＳＴを境に磁性微粒子の溶解、析出が起こる現象をＬＣＳＴ特性と言う。
前述の溶媒は特に限定されるものではないが、具体的には水、および水を５０重量％以上含有する液体を挙げることができる。さらに水を５０重量％以上含有する液として具体的には、生理食塩水、緩衝液などを挙げることができる。また、ポリマーを含有した状態でＬＣＳＴ特性を示すのであれば、該溶媒は、アセトンなどの有機溶媒と水との混合液であっても良い。
本発明に使用するＬＣＳＴ磁性微粒子の組成や構造は特に限定されるものではないが、ＬＣＳＴを有するポリマーが磁性微粒子の表面に固定化されたものであることが好ましい。
ＬＣＳＴを有するポリマーとしては、例えば、ポリＮ置換アクリルアミド誘導体及びその共重合体、ポリＮ置換メタクリルアミド誘導体及びその共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリプロピレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド、ポリＮビニルアルキルアミド、およびポリＮ−イソプロピルアクリルアミドなどが挙げられる。
ＬＣＳＴを有するポリマーが固定化される磁性微粒子は特に限定されるものではないが、その素材は、常温で磁性を示す物質であれば有機物質であっても無機物質であっても良い。具体的には、酸化ニッケル粒子、フェライト粒子、マグネタイト粒子、コバルト鉄酸化物、バリウムフェライト、炭素鋼、タングステン鋼、ＫＳ鋼、希土類コバルト磁石の微粒子、およびヘマタイト粒子などを挙げることができる。
該磁性微粒子の粒子径は、該磁性微粒子を分散させた溶媒に磁力をかけた場合であっても、その磁力によって該磁性微粒子が吸着されないサイズであればよく、本発明においては特に限定されるものではないが、１ｎｍ〜１μｍの範囲であることが好ましく、より好ましくは１ｎｍ〜１００ｎｍの範囲である。
本発明に使用する磁性微粒子の調製方法について、マグネタイトを用いた場合を例にとって説明する。オレイン酸ナトリウムとドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムとを用いてマグネタイトを二重のミセルとし、このミセルを水溶液中に分散させることにより、粒径が数十ｎｍである磁性マグネタイト微粒子を得ることができる。この方法はバイオカタライシス（Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ）１９９１年、第５巻、６１〜６９頁に記載の方法である。
磁性微粒子表面へのＬＣＳＴポリマーの固定化は、何れの作用によるものであっても構わない。物理的な吸着であっても、水素結合や共有結合などの化学結合によるものであっても良い。固定化方法として具体的には、磁性微粒子の存在下にＬＣＳＴポリマーを重合する方法、溶媒中においてＬＣＳＴポリマーと磁性微粒子とを接触させる方法、磁性微粒子にＳＨ基などの官能基を有するカップリング剤を結合させ、該官能基を基点としてＬＣＳＴポリマーをグラフト重合させる方法などを挙げることができる。
その中でも、磁性微粒子の存在下にＬＣＳＴポリマーを重合する方法で得られた本発明の磁性微粒子は、その含有液中において溶解と析出・凝集との繰返しを行った場合であっても、固定化されたＬＣＳＴポリマーが該磁性微粒子から脱離しにくいことから好ましい。
ビオチンおよびアビジンから選ばれた１種以上を、磁性微粒子に固定化されたＬＣＳＴポリマーに固定化する方法は特に限定されるものではなく、既に合成されたＬＣＳＴポリマーに、ビオチンおよびアビジンから選ばれた１種以上を固定化する方法（以下「固定化法」と記載する。）や、ビオチンまたはアビジンを構造の一部とするモノマーと、重合によりＬＣＳＴポリマーを形成するモノマーとを重合させることにより、ＬＣＳＴポリマーに該一対の物質の一方を導入する方法（以下「重合法」と記載する。）などを挙げることができる。
前述の固定化法としては共有結合であることが好ましいが、イオンコンプレックスや電荷移動錯体を利用した結合、生化学的親和性等を利用した結合であってもよい。
一方、重合法は、ポリマー中への重合比を比較的制御しやすいことから本発明に好ましく用いることが出来る。ビオチンを磁性微粒子に固定化されたＵＣＳＴポリマーに固定化する方法について、ビオチンをその構造の一部とするモノマーを用いた該重合法を例にとって詳細に説明する。
重合によりＬＣＳＴポリマーを形成するモノマーとしては、例えば、Ｎ置換アクリルアミド誘導体、Ｎ置換メタクリルアミド誘導体、ビニルメチルエーテル、プロピレンオキサイド、エチレンオキサイド、Ｎビニルアルキルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（下記一般式（１））等が挙げられる。
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ビオチンをその構造の一部とするモノマーとしては、ビオチンの末端カルボキシル基を用いた（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリレート誘導体などを挙げることが出来るが、本発明においてこれらに限定されるものではない。
該重合法において好ましく使用することができるＬＣＳＴポリマーを形成するモノマーとしては、前述のＮ−イソプロピルアクリルアミドを挙げることができ、ビオチンをその構造の一部とするモノマーとしては、下記一般式（２）で表される重合性ビオチン誘導体を挙げることができる。
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一般式（２）中、Ｒ２は水素原子又はアルキル基を示す。Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立に水素原子、アルキル基又はアリール基を示す。Ｔは酸素原子又は＝ＮＨ基を示す。Ｗは単結合又はカルボニル基、チオカルボニル基もしくは炭素数１〜５のアルキレン基を示す。Ｕは単結合又は−ＮＨ−基を示す。Ｘは単結合又は炭素数１〜８の炭化水素結合、酸素原子もしくは−ＮＨ−基を示す。Ｙは単結合又はカルボニル基、チオカルボニル基、−ＮＨ基−、１，２−ジオキシエチレン基もしくは１，２−ジアミノエチレン基を示す。Ｚは単結合又はカルボニル基、チオカルボニル基、炭素数１〜５のアルキレン基、酸素原子もしくは−ＮＨ−基を示す。Ｖは単結合又は炭素数１〜５のアルキレン基を示す。
一般式（２）で表されるモノマーの中でも、下記一般式（３）〜（５）で表される重合性ビオチン誘導体は、該重合法に好ましく使用することができる。
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一般式（３）〜（５）中、Ｒ１は単結合又は炭素数１〜４のアルキレン基を示し、Ｒ５は炭素数２又は３のアルキレン基を示す。Ｘ１は酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｘ２〜Ｘ５はそれぞれ独立に、酸素原子又は−ＮＨ−基を示す。Ｔ、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ上記一般式（２）における定義と同じである。
上記一般式（３）で示される重合性ビオチン誘導体は、一般に下記一般式（６）で示されるビオチン又はビオチン誘導体の側鎖カルボキシル水酸基を適当な脱離基に変換後、下記一般式（７）で示されるアクリル誘導体と縮合反応させることにより得ることができる。
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上記一般式（４）で示される重合性ビオチン誘導体は、一般に下記一般式（８）で示されるビオチン誘導体を、適当なアクリル化剤（メタクリル化剤等も含む。例えばアクリル酸、アクリル酸クロリド、無水アクリル酸、アクリロキシスクシンイミド等のアクリル化剤、メタクリル酸、メタクリル酸クロリド、無水メタクリル酸、メタクリロキシスクシンイミド等のメタクリル化剤などが挙げられる。）と反応させることにより得ることができる。
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ここで、一般式（８）で表されるビオチン誘導体は、一般式（６）で表されるビオチン又はビオチン誘導体を適当な還元剤で還元して得られるアルコール体（Ｘ４＝酸素原子）の水酸基を、脱離基機能を有する官能基に変換し、変換後の該アルコール体とアミン誘導体（Ｘ４＝−ＮＨ−）とを置換反応させることにより得ることができる。
上記一般式（５）で示される重合性ビオチン誘導体は、一般に下記一般式（９）で示されるビオチン誘導体を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エーテル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン、クロロホルム、酢酸エチル、アセトン、脂肪族炭化水素、ベンゼン、トルエン等の非プロトン性溶媒中で、一般式（１０）で示されるイソシアネート物質と反応させることにより得ることができる。
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さらに、下記一般式（１１）で表される重合性ビオチン誘導体は、該重合法に特に好ましく使用することができる。
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さらに、該重合法に好ましく使用することができるモノマーとして、一般式（１２）で表されるビオチンメタクリアミド誘導体、および一般式（１３）で表されるビオチン誘導体が挙げられる。
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重合法についてより具体的に説明する。ＬＣＳＴポリマーを形成するモノマーを０．０１〜１０重量％含有する溶液中に、上記ビオチンモノマーを、モル比（ＬＣＳＴポリマーを形成するモノマー：イミノビオチンモノマー）で好ましくは１００００：１〜５：１、より好ましくは１０００：１〜１０：１となるように添加し、更に磁性微粒子を０．０１〜５重量％となるように添加する。
次いで該溶液に重合開始剤（例えば過硫酸カリウム）０．０１〜１重量％や重合促進剤（例えばテトラメチレンジアミン）０．００１〜０．１重合％を添加して重合を開始させる。重合は窒素雰囲気で行っても良い。また、重合時の溶液温度は特に限定されるものではないが、２０〜６０℃程度が好ましい。また、得られるポリマーの分子量は特に限定されるものではないが、数万〜１００万程度がであることが好ましい。
本発明のＬＣＳＴ磁性微粒子を、磁性微粒子の存在下ＬＣＳＴポリマーを重合する方法によって製造した場合には、未反応のモノマーや塩などの夾雑物が反応液に共存している。該夾雑物の除去は、透析によって行ってもよく、または溶液の温度をＬＣＳＴ以上とし、凝集させ凝集物を磁石で回収後上清を取り除くことによって行っても良い。
本発明において、ＬＣＳＴ磁性微粒子に固定化するのは、ビオチンおよびアビジンから選ばれた１種以上であればよいが、ＬＣＳＴポリマーにアビジンを直接固定化することは困難であることから、ビオチンであることが好ましい。
アビジンをＬＣＳＴ磁性微粒子に容易に固定化する方法としては、ビオチンを介してＵＣＳＴポリマーに固定化する方法が好ましい。つまり、アビジンはアビジン結合ビオチンのかたちでＬＣＳＴポリマーに固定化されていることが好ましい。
本発明において、ＬＣＳＴを有する磁性微粒子にビオチンが固定化された場合であれば、アビジンを固定化した目的物質のみを選択的に分離、回収することが可能となり、ＬＣＳＴを有する磁性微粒子にアビジンが固定化された場合であれば、ビオチンを固定化した目的物質のみを選択的に分離、回収することが可能となる。
なお、本発明のＬＣＳＴ磁性微粒子に、アビジンが固定化された場合には、アビジンのビオチン結合４サイトのうち最大３サイトを開いた状態に保つことが可能であることから、ビオチン化された目的物質をさらに効率よく分離、回収することが可能となる。
さらに、目的物質と相互に特異的作用を有し且つアビジンが固定化された物質を、ビオチン・アビジン結合により、ビオチンが固定化された本発明のＬＣＳＴ磁性微粒子に固定化して得られる磁性微粒子、およびアビジンが固定化された本発明のＬＣＳＴ磁性微粒子に、目的物質と相互に特異的作用を有し且つビオチンが固定化された物質を、ビオチン・アビジン結合により、アビジンが固定化された本発明のＬＣＳＴ磁性微粒子に固定化して得られる磁性微粒子であれば、高い効率での基質の変換、分離、濃縮、回収が可能となる。
特に、アビジンが固定化された本発明のＬＣＳＴ磁性微粒子に、目的物質と相互に特異的作用を有し且つビオチンが固定化された物質を、ビオチン・アビジン結合により、アビジンが固定化された本発明のＬＣＳＴ磁性微粒子に固定化して得られる磁性微粒子であれば、アビジンのビオチン結合４サイトのうち最大３サイトを開いた状態に保つことが可能であることから、ビオチン化された目的物質をより高い効率での基質の変換、分離、濃縮、回収が可能となる。
本発明において、目的物質と相互に特異的作用を有する物質は特に限定されるものではないが、具体的には、酵素、蛋白質、核酸、ペプチド、分子シャペロン、ヒートショックプロテイン、および抗体などを挙げることができる。
例えば、目的物質と相互に特異的作用を有する物質として酵素を用いた場合には、従来の固定化酵素を用いた酵素反応に比べ、より速い速度で基質を変換することが可能である。その際使用される酵素は特に限定されるものではないが、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、分解酵素、異性化酵素、および合成酵素などを挙げることができる。
基質の変換により生成した物質は、本発明の磁性微粒子と該生成物質とを含有する溶液の温度を上げることにより、該磁性微粒子のみを析出させ、析出した該磁性微粒子のみを磁力を用いて取り除くことにより、酵素と該生成物質とを容易に分離することができる。
目的物質と相互に特異的作用を有する物質として抗体を用いた場合には、溶液中の微生物の分離、濃縮を効率よく行うことができる。その際に使用する抗体はモノクローナル抗体であってもよく、ポリクローナル抗体であっても良い。
溶液中の微生物の分離方法、濃縮方法は特に限定されるものではないが、具体的には、微生物を含有する溶液に該磁性微粒子を添加し、微生物と該磁性微粒子とを充分に接触させた後、該溶液の温度を上げることにより、微生物を吸着した磁性微粒子のみを析出させ、析出した磁性微粒子のみを磁力を用いて取り除く方法を挙げることができる。この方法であれば、溶液中の微生物を容易に分離、濃縮することが可能である。
例えば、使用する抗体がサルモネラ抗体であれば、食品懸濁液中のサルモネラ菌だけを容易に分離、濃縮することが可能であることから、任意の抗体が固定化された本発明の磁性微粒子と適当な検出試薬とを組み合わせることによって、感度の高い微生物検査キットもしくは診断薬を作ることも可能である。
目的物質と相互に特異的作用を有する物質として分子シャペロンやヒートショックプロテインを用いた本発明のＬＣＳＴ磁性微粒子であれば、溶液中における、酵素や抗体の安定性を高めることから、その繰り返し離床が可能となり、工業レベルでの蛋白質生産、物質生産を補助することが出来る。通常、分子シャペロンのような蛋白質は高価なため、工業レベルでの使用は困難である。
目的物質と相互に特異的作用を有する物質として核酸を用いた本発明のＬＣＳＴ磁性微粒子を、核酸を含有する溶液に添加し、該磁性微粒子と核酸とを充分に接触させた後、該溶液の温度を上げることにより、核酸を吸着した磁性微粒子のみを析出させ、析出した磁性微粒子のみを磁力を用いて取り除く方法を挙げることができる。この方法であれば、溶液中の核酸を容易に分離、濃縮することが可能である。また、該核酸の分離、濃縮方法は、特定遺伝子の精製、濃縮、検出等に応用することも可能である。
また、複数種類の核酸と該磁性微粒子とを含有する混合液中で、ハイブリダイゼーションを充分に行った後、該混合液の温度を上げることにより核酸ごと凝集、回収を行った後、再度温度を下げることで容易に任意の核酸の精製、検出、濃縮を行うことが出来る。
例えば目的とするＤＮＡと相補的な配列を有するビオチン化ＤＮＡやビオチン化ポリチミンを用いることで、目的ＤＮＡやｍＲＮＡを濃縮、精製することが出来る。得られた核酸を各種遺伝子増幅法により増幅させることで、感度良く核酸を検出することが出来る。核酸の増幅方法は特に限定されないが、ＰＣＲ法やＲＴ−ＰＣＲ法が本発明に好ましく用いることができる。
本発明の分離剤は、本発明のＬＣＳＴ磁性微粒子を含有するものであれば特に限定されるものではないが、該磁性微粒子の分離剤に対する含有割合が１〜１００重量％の範囲であることが好ましく、特に好ましくは２〜３０重量％の範囲である。
その他の成分としてはフェライト粒子、マグネタイト粒子、およびヘマタイト粒子などを挙げることができる。
本発明の分離剤を用いれば、微生物、核酸、タンパク、ペプチド、抗原、環境ホルモンなどの分離を容易に行うことが出来る。
＜実施例＞
以下、実施例を示してこの発明をさらに詳細にかつ具体的に説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。
実施例１［磁性微粒子の調製］
磁性微粒子を以下の方法により調製した。
１Ｌ容のフラスコ内で硫酸第一鉄（７水和物）８３．４ｇおよび亜硝酸ナトリウム１０．４ｇを蒸留水５００ｍｌとよく混合し、４０℃で２０分間撹拌した。その後、濃アンモニウム１２５ｍｌを添加し、不溶物を集め、蒸留水で２回洗浄し、マグネタイトを得た。得られたマグネタイトを１Ｌ容のフラスコ内で蒸留水５００ｍｌに添加し、溶液の温度を８０℃とした後、オレイン酸ナトリウム７．５ｇを添加し、同温度で２０分間撹拌した。その後、１Ｎの塩酸でｐＨを５．５に調整し、得られた不溶物をろ過により集め、蒸留水で２回洗浄し、オレイン酸の層を有するマグネタイトを得た。これを再度１Ｌ容のフラスコに添加し、蒸留水を５００ｍｌ添加し、溶液の温度を７０℃とした後、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム７．５ｇを添加し一晩撹拌し、磁性微粒子を得た。
実施例２［ＬＣＳＴ磁性微粒子の調製］
上記磁性微粒子を使用して、ＬＣＳＴ磁性微粒子を以下の方法により調製した。
３００ｍｌ容のフラスコ内に実施例１で調製した磁性微粒子４ｍｌ、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド０．４８８ｇ、Ｎ−ビオチニル−Ｎ′−メタクロイルトリメチレンアミド１２．７ｍｇおよび蒸留水９４ｍｌを添加し室温でよく撹拌した。そこに０．１ｇの過硫酸カリウムを添加し、室温で６時間撹拌した。得られた溶液を一昼夜透析し、ビオチンが固定化されたＬＣＳＴ磁性微粒子溶液を得た。
得られた溶液の下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を測定したところ、３１℃であった。このＬＣＳＴは生理食塩水中や１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中でもほとんど変化しなかった。尚、ＬＣＳＴは可視光の透過率を用いて求めた。
実施例３［水溶液中からのアビジンの分離］
実施例２で得られたＬＣＳＴ磁性微粒子溶液５０μｌ、１．０％アビジン溶液５０μｌ、１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ、蒸留水８００μｌを試験管中で良く混合した後、溶液の温度を３１℃以上にした。凝集物をネオジ磁石（４３００Ｇ）により回収し、上清部分１００μｌを取り出し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）による変性処理後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、上清からアビジンに対応するバンドが無くなっていることを確認した。
実施例４［卵白中からのアビジンの特異的分離］
実施例２で得られたＬＣＳＴ磁性微粒子溶液５０μｌ、１．０％アビジン溶液５０μｌ、１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ、蒸留水４５０μｌ、２．５％の卵白溶液４００μｌを試験管中で良く混合した後、溶液の温度を３１℃以上にした。凝集物をネオジ磁石により回収し、上清部分１００μｌを取り出し、ＳＤＳによる変性処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、上清からアビジンに対応するバンドのみが無くなっていることを確認した。
実施例５［ＬＣＳＴ磁性微粒子へのアビジン固定化酵素の固定化］
実施例２で得られたＬＣＳＴ磁性微粒子溶液１００μｌ、市販のアビジン固定化ペルオキシダーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１０００μｌ、１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ及び蒸留水７００μｌを添加し、良く混合した。得られた溶液を加熱し、磁石により凝集物を回収し、上清１９００μｌを取り除いた後、新たに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１９００μｌを添加し、アビジン固定化ペルオキシダーゼを固定化したＬＣＳＴ磁性微粒子溶液を調製した。この溶液はＬＣＳＴ以下では溶解し、ＬＣＳＴ以上では凝集した。溶液の温度を恒温槽により変化させ、溶解、凝集および磁石による回収の操作を行い、それぞれの上清のペルオキシダーゼの活性を下記に示すペルオキシダーゼの活性測定法により測定した。なお、磁石による磁性微粒子の回収後は毎回上清１９００μｌを取り除き、新たに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１９００μｌを添加した。
（ペルオキシダーゼ活性測定法）
１００ｍＭ過酸化水素１００μｌ、５０ｍＭフェノール１００μｌ、５０ｍＭ  ４−アミノアンチピリン１００μｌ、１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ、蒸留水５８０μｌを吸光度計のセル内で予め混合し、そこへサンプル２０μｌを添加し、再び良く混合した後、生成物を５００ｎｍの吸収の増加により測定した。なお、以上の操作は３０℃で行った。
上記の方法により繰り返し凝集、溶解を行った場合の上清の酵素活性を測定した結果を下記表−１に示す。なお、酵素活性は最初の溶解時の活性を１００とした場合の比活性で示した。
0004797144.tif 000010
この結果より磁性微粒子に固定化されたアビジン固定化ペルオキシダーゼは磁性微粒子と共に溶解、凝集を繰り返しかつ同作業の繰り返しによっても活性は低下し難いことが明らかとなった。
実施例６［アビジン固定化ＬＣＳＴ磁性微粒子へのビオチン固定化酵素の固定］
まず、アビジンのビオチン結合サイト３カ所が空いている状態のアビジン固定化ＬＣＳＴ磁性微粒子を得るため、実施例２で得られたＬＣＳＴ磁性微粒子溶液５０μｌに１．０％アビジン溶液５００μｌ、１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ、蒸留水３５０μｌを試験管中で良く混合した後、４０℃の恒温槽中に置き溶液の温度を３１℃以上にした。凝集物をネオジ磁石（４３００Ｇ）により回収し、ポリマーとの結合部位以外のビオチン結合サイトが空いているアビジン固定化ＬＣＳＴ磁性微粒子を得た。
このアビジン固定化磁性微粒子溶液１００μｌ、市販のアビジン固定化ペルオキシダーゼ溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１０００μｌ、１．０Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１００μｌ及び蒸留水７００μｌを添加し、良く混合した。得られた溶液を加熱し、磁石により凝集物を回収し、上清１９００μｌを取り除いた後、新たに０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）１９００μｌを添加し、ビオチン固定化ペルオキシダーゼを固定化したアビジン固定化ＬＣＳＴ磁性微粒子を調製した。
このＬＣＳＴ磁性微粒子を使って、実施例５と同様に溶解、凝集回収を繰り返し、上清の酵素活性を測定した結果を下記表−２に示す。なお、酵素活性についても同様に最初の溶解時の活性を１００とした場合の比活性で示した。
0004797144.tif 000011
この結果よりアビジンの固定化されたＬＣＳＴ磁性微粒子に結合したビオチン固定化ペルオキシダーゼは磁性微粒子と共に溶解、凝集を繰り返しかつ同作業の繰り返しによっても活性は低下しにくいことが明らかとなった。
実施例７［ＬＣＳＴ磁性微粒子への分子シャペロンの固定化］
市販のビオチンが固定化されたヒートショックプロテインＨＳＰ７０を１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）によく混合させた後、５μｌを取り出し、変性処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＨＳＰ７０のバンドを確認した。続いて実施例６で調製した、ポリマーとの結合部位以外のビオチン結合サイトが空いているアビジン固定化ＬＣＳＴ磁性微粒子５０μｌを加え、良く混合したのち、実施例３と同様に溶液を加熱し磁性微粒子を凝集後、磁石により回収し、上清のＨＳＰ７０を同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認したところ上清にはＨＳＰ７０は無く、磁性微粒子に固定化されたアビジンと結合していることが確認された。
実施例８［微生物の分離濃縮方法］
市販のビオチン固定化サルモネラ抗体を実施例６と同様にＬＣＳＴ磁性微粒子に固定化した。固定化したことはＳＤＳ−ＰＡＧＥを用い確認を行った。続いてこのサルモネラ菌が１個／ｍｌになるように調整した菌けん濁液２０ｍｌにこの磁性微粒子溶液１ｍｌを添加してよく撹拌後、実施例３と同様に溶液を加熱し、磁性微粒子を凝集後、磁石により回収し、上清を取り除き１ｍｌの溶液とした。この溶液を予め滅菌し、５０℃にインキュベートしていたブレインハートインフュージョン寒天培地２０ｍｌに添加し、すばやく混合後、シャーレに広げ、寒天が固まるまで放冷し、３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間後のコロニー数を計測した結果を下記表−３に示した。また、これら総ての操作はクリーンベンチ内にて行った。また、対照として、磁性微粒子を添加せず、最初に調整した菌けん濁液１ｍｌ中の菌数を同様に測定した。
0004797144.tif 000012
この結果より、サルモネラ菌はこの磁性微粒子により濃縮されていることが明らかである。
実施例９［ＬＣＳＴを示す磁性微粒子への核酸の固定化］
市販のビオチン化ラベルされたＤＮＡ断片５００μｌ（５０〜１０００ｂｐ）に蒸留水４５０μｌ、実施例６で調製したポリマーとの結合部位以外のビオチン結合サイトが空いているアビジン固定化ＬＣＳＴ磁性微粒子５０μｌを加え、良く混合したのち、実施例３と同様に溶液を加熱し、磁性微粒子を凝集後、磁石により回収し、上清のＤＮＡ断片をアがロースゲル電気泳動により確認したところ、いずれのＤＮＡ断片も磁性微粒子に結合していることが示唆された。
ＲＮＡについても同様の実験を行い、磁性微粒子への結合を確認した。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２０００年８月２１日出願の日本特許出願Ｎｏ．２０００−２４９７７４に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
＜産業上の利用可能性＞
ビオチンおよびアビジンから選ばれた１種以上が固定化された本発明の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子は、使用目的ごとに酵素や抗体等を磁性微粒子上のポリマーに固定化する必要がなく、さらに、核酸を直接蛋白質等に結合させる必要もないことから、分離剤等の用途において汎用性が高い。
また、本発明の下限臨界溶液温度を有する磁性微粒子を用いた物質の変換方法、微生物の分離方法または濃縮方法、変性蛋白質の改質方法、核酸の検出方法、および生体物質の分離方法は、効率良くその目的を達成することが可能である。