(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列表における、塩基番号３８から塩基番号１４０７までの塩基配列を有する、または、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、放線菌由来のタンパク質生産のためのタンパク質用塩基配列の上流側に結合されて、上記タンパク質生産能の向上活性を有していることを特徴とするプロモーター。
【請求項２】
請求項１記載のプロモーターと、上記プロモーターの下流側に上記タンパク質生産のためのタンパク質用塩基配列とを有していることを特徴とするベクター。
【請求項３】
上記タンパク質用塩基配列は、ホスフォリパーゼＤの生成用であることを特徴とする請求項２記載のベクター。
【請求項４】
上記タンパク質用塩基配列は、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウムのＤＮＡ由来のものであることを特徴とする請求項２記載のベクター。
【請求項５】
上記タンパク質用塩基配列は、配列番号１の配列表における、塩基番号１５１２から塩基番号３０３０までの塩基配列、または上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された、タンパク質生産能を備えた塩基配列であることを特徴とする請求項２記載のベクター。
【請求項６】
上記タンパク質用塩基配列の下流側に、タンパク質の翻訳を停止するためのパリンドローム配列を有していることを特徴とする請求項２ないし５の何れかに記載のベクター。
【請求項７】
上記パリンドローム配列は、配列番号１の配列表における、塩基番号３０３１から塩基番号３２１３までの塩基配列、または上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された、タンパク質の翻訳を停止する機能を備えた塩基配列であることを特徴とする請求項６記載のベクター。
【請求項８】
請求項２ないし７の何れかのベクターが宿主としてのストレプトマイセス・リヴィダンス内に組み込まれていることを特徴とする組換え微生物。
【請求項９】
請求項８記載の組換え微生物を培養液中にて培養して、上記タンパク質用塩基配列に基づくタンパク質を生産することを特徴とするタンパク質の製造方法。
【請求項１０】
上記培養液に、グルコースを添加することを特徴とする請求項９記載のタンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ホスフォリパーゼＤ（phospholipase D 、以下、ＰＬＤという）などの酵素のタンパク質を効率良く生産できる、プロモーター、それを用いたベクター、および上記ベクターを組み込んだ組換え微生物、並びに上記組換え微生物によるタンパク質の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＬＤは、高いエステル交換反応活性を有するため、有用な各種のリン脂質合成反応への応用が可能なものであり、その応用範囲を広げるために、ＰＬＤの工業化つまり大量生産による低廉化が期待されている。
【０００３】
このようなＰＬＤの有用性から、ＰＬＤを大量分泌生産する微生物のスクリーニングが広範に行われてきた。そのスクリーニングの結果、現時点では、放線菌群のみが大量のＰＬＤを分泌生産することが知られている。
【０００４】
それら放線菌群の中でも、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウム( ＩＦＯ12852)（Streptoverticillium cinnamoneum 、以下、Stv. cinnamoneum (ＩＦＯ12852)と略記する）は、現時点において、分泌ＰＬＤ活性の最も高い菌株であることが判っている(Nakajima et al., Biotechnol. Bioeng., Vol.44, 1193-1198 (1994))。
【０００５】
上記のＩＦＯ番号は、微生物の国内寄託機関である、財団法人醗酵研究所（所在、大阪市）にて入手できる微生物のカタログ番号である。なお、ストレプトバーティシリウムについては、分類上、ストレプトマイセス（Streptomyces）に分類されることがある。
【０００６】
また、従来、野性株のStv. cinnamoneumについて、肉エキスをベースとする培地を用い、培地組成や培養条件を種々変更して、ＰＬＤの発現活性量を最大化することが試みられたが、その発現活性は最大でも2000単位／リットル（以下、U/L と略記する）程度であった。本明細書では、単位中のL は、特に断らないかぎり、1000 cm3を示すものとする。
【０００７】
また、得られたＰＬＤの精製が容易な、より夾雑タンパク質の少ない TSB培地を用いた場合では、野性株のStv. cinnamoneumにおける、ＰＬＤの発現活性量はさらに低く、1500 U/L程度にとどまっていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、上記従来では、培地中に分泌されるＰＬＤの含量割合が、まだ低いことから、得られたＰＬＤは、培地からＰＬＤを精製するのに手間取り、ＰＬＤの生産コストが高くなることによって高価なものとなり、ＰＬＤの適用可能範囲が制限されるという問題を生じている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明のプロモーター(promoter)は、以上の課題を解決するために、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウムのＤＮＡ由来の塩基配列であり、ＰＬＤ等のタンパク質生産のためのタンパク質用塩基配列(mat peptide) の上流側に結合されて、上記タンパク質生産能の向上活性を有していることを特徴としている。
【００１０】
上記プロモーターとしては、配列番号１の配列表における、塩基番号３８から塩基番号１４０７までの塩基配列を有する、または、上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、タンパク質生産のためのタンパク質用塩基配列の上流側に結合されて、上記タンパク質生産能の向上活性を有しているものであってもよい。
【００１１】
上記の構成によれば、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウムのＤＮＡ由来の上記塩基配列を有することにより、ＰＬＤなどのタンパク質の生産能を向上させることができる。
【００１２】
本発明のベクターは、以上の課題を解決するために、上記プロモーターと、上記プロモーターの下流側にタンパク質生産のためのタンパク質用塩基配列とを有していることを特徴としている。
【００１３】
上記ベクターでは、タンパク質用塩基配列は、ＰＬＤの生産用であってもよく、また、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウムのＤＮＡ由来のものであってもよい。
【００１４】
さらに、上記タンパク質用塩基配列は、配列番号１の配列表における、塩基番号１５１２から塩基番号３０３０までの塩基配列、または上記塩基配列において１もしくは数個の塩基配列が欠失、置換もしくは付加された、タンパク質生産能を備えた塩基配列であってもよい。
【００１５】
上記の構成によれば、上記プロモーターを有することにより、例えば、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウムのＤＮＡ由来の、ホスフォリパーゼＤの生成用等のタンパク質用塩基配列によるタンパク質生産能を向上させることが可能となる。
【００１６】
上記ベクターにおいては、タンパク質用塩基配列の下流側に、タンパク質の翻訳を停止するためのパリンドローム配列(terminator)を有していることが好ましい。上記構成によれば、ＰＬＤなどのタンパク質の生産能を向上させることができる。
【００１７】
本発明の組換え微生物は、前記の課題を解決するために、上記の何れかのベクターが宿主内に組み込まれていることを特徴としている。上記組換え微生物では、宿主は、放線菌であってもよく、また、ストレプトマイセス・リヴィダンスであってもよい。
【００１８】
上記組換え微生物では、ベクターに組み込まれたタンパク質用塩基配列に沿ったタンパク質の生産能が、組み込まれたプロモーターによって、向上しており、上記タンパク質を効率よく、かつ、培地中にて高純度にて生産できる。
【００１９】
本発明のタンパク質の製造方法は、前記の課題を解決するために、上記の何れかに記載の組換え微生物を培養液中にて培養して、タンパク質用塩基配列に基づくタンパク質を生産することを特徴としている。上記製造方法では、培養液に、グルコースを添加することが好ましい。
【００２０】
上記方法によれば、ベクター中に、上記プロモーターが組み込まれていることによって、ＰＬＤなどのタンパク質を効率よく、培地中に高純度にて分泌して生産することができる。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態について図１ないし図１０に基づいて説明すれば、以下の通りである。
【００２２】
（１）放線菌からＤＮＡ（ゲノム）の抽出
放線菌からのＤＮＡ（ＰＬＤ生成用）抽出は、放線菌に関する遺伝子操作技術を扱った、「Genetic Manupulation of Streptomyces」(Hopwood,D.A., Bibb,M.J., Chater,K.F., Kieser,T., Bruton,C.J., Kieser,H.M., Lydiate,D.J., Smith,C.P., Ward,J.M., and Schremph,H. (1985) "Genetic Manupulation of Streptomyces: a Laboratory Manual", the John Innes Foundation, Norwich)に記載の方法に従って行った。
【００２３】
放線菌（Stv. cinnamoneum (ＩＦＯ12852)）を、滅菌した 100 mL のトリプティクソイブロス培地（Tryptic Soy Broth 、以下、 TSB培地という）にて振とう培養を、温度30℃にて48時間行った。この振とう培養の際、培地中に、直径が２−３cm程の大きさのステンレスコイルを加えた。これにより、振とう培養中における、フロック状菌体の形成を抑制した。
【００２４】
上記TSB 培地としては、pancreatic digest of casein 17.0 g/L, papaic digest of soybean meal 3.0 g/L, dextrose 2.5 g/L, sodium chloride 5.0 g/L, dipotassium phosphate 2.5 g/L を含むDifco 社製のものを用いた。本明細書において、滅菌とは、飽和水蒸気下、121 ℃で20分間曝すことにより、培地等の溶液中に含まれる微生物を死滅させることである。
【００２５】
培養終了後、得られた菌体を集菌し、ＴＥbuffer（10mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM EDTA をオートクレーブにて滅菌したもの）にて洗浄を３回行った。洗浄後、5 mLのＴＥbufferに菌体を懸濁し、溶菌を促進させるために、リゾチーム、アクロモペプチダーゼを、それぞれ、2 mg/mL 、4 mg/mL となるように加え、30℃にて液体の粘性が高くなるまで保温した（約30分間）。
【００２６】
その後、溶菌溶液に対し、プロナーゼ、 EDTA 、SDS をさらに加え、37℃にて２時間保温した。保温終了後、溶菌溶液から、フェノール・クロロホルム抽出法、ポリエチレングリセロール沈殿法にて、用いた放線菌の染色体ＤＮＡをガラス棒にて取り出した。最後に、取り出した染色体ＤＮＡにＲＮase 処理を施し、染色体ＤＮＡ（ゲノム）の抽出操作を終了した。本明細書では、ＰＬＤの生成に関する遺伝子については、 pld遺伝子という。
【００２７】
次に、 pld遺伝子プロモーター領域およびバリンドローム領域のＤＮＡ配列の決定について説明する。
【００２８】
上述の取り出した染色体ＤＮＡ（ゲノム）を制限酵素Ｓau 3Ａ1 で切断した後、断片化させた断片ＤＮＡをそれぞれクローニングベクターｐＵＣ8 にライゲーションし、大腸菌Nova Blue (Novagen社製）に形質転換することにより、ゲノムライブラリーを構築した。
【００２９】
ＰＬＤのアミノ酸配列解析の結果から、アミノ酸末端側の約25アミノ酸配列が確認されていたため、そのアミノ酸配列に相当するＤＮＡプローブを作成し、コロニーハイブリダイゼーションにより、 pld遺伝子の同定を行った。その結果、 pld遺伝子を部分的に含む断片ＤＮＡを２種類取得した。
【００３０】
一つは、ＰＬＤアミノ酸末端側の塩基配列と、その上流約１５００ベース（塩基）を含む断片ＤＮＡであり、他方は、ＰＬＤカルボキシル基末端側の塩基配列とその下流約１０００ベース（塩基）を含む断片ＤＮＡであった。それぞれの断片ＤＮＡの塩基配列をサンガー法により解析し、重複する塩基配列を元に、 pld遺伝子の地図（塩基配列）を構築した。
【００３１】
解析した全塩基配列より、配列表に示すように、 pld遺伝子の下流側には、タンパク質翻訳を物理的に終了させる機能を有するパリンドローム配列が存在することが確認された。
【００３２】
また、後述するように、上記 pld遺伝子を組み込んだ放線菌におけるＰＬＤの高い分泌発現活性量から、 pld遺伝子の上流側においては、強力な発現プロモーター配列が存在すると想定されたため、解析の終了した上流側約１０００ベース（塩基）の塩基配列の領域をプロモーター領域と設定した。上記プロモーター領域は、配列番号１の配列表における、塩基番号３８から塩基番号１４０７までである。
【００３３】
（２）ｐＵＣ702-promoter−pld プラスミドの構築
pld発現カセットを有する放線菌用の pld分泌発現ベクター（ｐＵＣ702-promoter-pld）の調製を以下の手順にて行った〔図１ないし図３、並びに配列表を参照〕。 pld発現カセットとは、 pld遺伝子の上流側のプロモーター領域（プロモーターおよびリボソーム結合サイト）、 pld遺伝子（シグナル配列(sig peptide) とmature pld遺伝子(mat peptide) からなる）、および pld遺伝子の下流側のパリンドローム配列とを有するものである。
【００３４】
上記リボソーム結合サイトは、配列番号１の配列表における、塩基番号１３９６から塩基番号１４０３までである。上記シグナル配列は、配列番号１の配列表における、塩基番号１４０８から塩基番号１５０９までである。上記mature pld遺伝子は、シグナル配列を含まない分泌後のＰＬＤ配列に対応する部分であり、配列番号１の配列表における、塩基番号１５１０から塩基番号３０３０までである。上記パリンドローム配列は、配列番号１の配列表における、塩基番号３０３１から塩基番号３２１３までである。
【００３５】
また、配列番号２の配列表における、アミノ酸番号−３４からアミノ酸番号−１は、シグナル配列を示す。配列番号２の配列表における、アミノ酸番号１からアミノ酸番号５０５は、ＰＬＤのアミノ酸配列を示す。
【００３６】
プラスミドの構築において、遺伝子操作は、基本的にMolecular cloning 法に従って行った。また、制限酵素は、New England Biolabs 社製のものを、ライゲーションには、ＤＮＡライゲーションキットver2（宝酒造製）を用いた。
【００３７】
図１ないし図３には、プラスミド構築の手順を示す。まず、図１に示す、放線菌Stv. cinnamoneum (ＩＦＯ12852)由来の pld遺伝子プロモーター領域、 pld遺伝子、および pld遺伝子下流側のパリンドローム配列からなる pld発現カセットをＰＣＲ(Polymerase Chain (amplification) Reaction) 法により増幅した。一般に、放線菌はＧＣ含量が高いために、プロモーター領域と pld遺伝子−パリンドローム配列とに二分割して、ＰＣＲ増幅を行った。
【００３８】
その時に、シグナル配列部分にある開始コドンであるTTG(ロイシン）を、ATG(メチオニン）になるようにプライマーを設計した。ＰＣＲ増幅条件として、熱変性、アニーリング、伸長反応の温度および時間をそれぞれ、例えば94℃、60℃、68℃で15秒、30秒、７分として、この増幅を30サイクル行った。
【００３９】
テンプレートとしては、Stv. cinnamoneumの染色体を用いた。増幅には、ＫＯＤ-plus-ＤＮＡ-Polymerase （東洋紡製）を使用し、ＰＣＲ増幅の増幅効率を上げるために、反応系には終濃度10％となるように、ＧＣ-Melt （Clonetech 社製）を加えた。
【００４０】
プライマーとしては、プロモーター領域の増幅には、5'-GGGTACCACGTCATGGCGGGTCTCTCTCGTCCG-3' （Ｓ−ＰＬＤ-38-Ｋpn I）および5'-TCTGCATGCTGCATCCTTAAACGAAGTAACGATTCCGCG-3' （ＡＳ−Ｐro−Ｓph I）を使用し、 pld遺伝子−パリンドローム配列の増幅には、5'-ACAGCATGCTCCGCCACCGGCTCCGCCGTTTACACCGCT-3' （Ｓ−Ｓig−Ｓph I）および5'-GGTAAGCTTGGTACCATTTCCTCGCTGGTCGGTTCGGGGCCAGCGCAT-3'（ＡＳ−Ｈin dIII ・Ｋpn I-3213 ）を使用した。
【００４１】
ＰＣＲ法で増幅したプロモーター領域のフラグメントは、制限酵素Ｋpn Iおよび制限酵素Ｓph Iで切断し、同一酵素で切断したｐＵＣ18とライゲーションした後に、大腸菌 Nova Blueに形質転換し、プラスミドｐＵＣ18-promoter を得た。
【００４２】
一方、 pld遺伝子−パリンドローム配列のフラグメントは、制限酵素Ｓph Iおよび、Ｈin dIII サイトで切断し、同一酵素で切断したｐＵＣ19とライゲーションした後に、大腸菌 Nova Blueに形質転換し、プラスミドｐＵＣ19-pldを得た。
【００４３】
プラスミドｐＵＣ18-promoter およびプラスミドｐＵＣ19-pldの遺伝子配列は、ＤＮＡシーケンサー（ＰＥ-biosystem gene analyzer 310）により確認した。
【００４４】
次に、図２に示すように、ｐＵＣ19-pldプラスミドから制限酵素Ｓph IおよびＨin dIII により、 pld遺伝子−パリンドローム配列のフラグメントを切り出し、同じく制限酵素Ｓph IおよびＨin dIII で切断したｐＵＣ18-promoter とライゲーションした後に、大腸菌 Nova Blueに対し形質転換し、プロモーター領域-pld遺伝子−パリンドローム配列からなる pld発現カセットを有するプラスミドｐＵＣ18-promoter-pld を得た。
【００４５】
一方、図３に示すように、シャトルベクターｐＵＣ702 を調製した。ｐＵＣ702 は、大腸菌用ベクターｐＵＣ19、および放線菌用ベクターｐＩＪ702 をＳac IおよびＫpn Iサイトで結合したもので、以下の報文に記載の方法に従って調製した（報文名：Molnar et al., J. Ferment. Bioeng., 72, 368-372 (1991)）。
【００４６】
続いて、ｐＵＣ18-promoter-pld プラスミドから pld発現カセットを含むフラグメントを制限酵素Ｋpn Iにより切り出し、同じく制限酵素Ｋpn Iにより切断した上記シャトルベクターｐＵＣ702 とライゲーションした後に、大腸菌 Nova Blueに形質転換し、プラスミドｐＵＣ702-promoter−pld を得た。このプラスミドｐＵＣ702-promoter−pld の発現カセットが正しい向きに挿入されたか否かについては、ＤＮＡシーケンサーにより確認した。
【００４７】
（３）ｐＵＣ702-mature pldプラスミドの構築
上記のプロモーター領域を持たない放線菌（Stv. cinnamoneum (ＩＦＯ12852)）由来の pld遺伝子発現ベクターを、比較例として、シャトルベクターｐＵＣ702 を用い、図３ないし図５に示すように構築した。
【００４８】
まず、図４に示すように、二段階のＰＣＲ法により、 pld遺伝子を増幅させた。First ＰＣＲの条件として、熱変性、アニーリング、伸長反応の温度および時間を、それぞれ、例えば98℃、52℃、72℃で、45秒、45秒、４分とし、この増幅を25サイクル行った。テンプレートとしては、Stv. cinnamoneumの染色体を使用した。増幅には、Pyrobest−ＤＮＡ-polymerase(宝酒造製）を用い、終濃度10％となるように、ＧＣ-Melt(Clonetech 社製）を反応系に加えた。
【００４９】
増幅用のプライマーとしては、5'-CCCGGGAGCTGATAGCTTCTCCGCGTTGATCTTCC-3' （Genome-S）および5'-CCATGATTACGAATTCCCGGGGATCTTGGT-3'（Genome2-AS）を使用した。 Second ＰＣＲの条件は、テンプレートとしてFirst ＰＣＲ後の生成物を使用し、増幅用のプライマーとして、5'-TCGGAATTCGAGGTACCATGCTCCGCCACCGGCTCCGC-3'（Ｅco−Ｋpn−Ｓig−ＦＷ−ＰＬＤ）および5'-GCAGGTACCCCCCCTTGGCCGCGATTCCCG-3'（Ｋpn-Palind-ＲＶ−ＰＬＤ）を使用した。それ以外の増幅条件はFirst ＰＣＲと同様である。
【００５０】
続いて、ＰＣＲ後、図５に示すように、増幅されたフラグメント（シグナル配列−mature pld遺伝子−パリンドローム配列を含む）を制限酵素Ｋpn Iで切断し、同一酵素で切断したｐＵＣ19とライゲーションした後に、大腸菌 Nova Blueに形質転換し、プラスミドｐＵＣ19-pldを得た。このプラスミドの pld遺伝子の配列をＤＮＡシーケンサーにて確認した。
【００５１】
ｐＵＣ19−pld プラスミドをＫpn Iで切断して、シグナル配列−mature pld遺伝子−パリンドローム配列を含むフラグメント（断片ＤＮＡ）を回収した。同一酵素で切断した、図３に示すシャトルベクターｐＵＣ702 とライゲーションした後に、大腸菌 Nova Blueに形質転換することで、プラスミドｐＵＣ702-pld を得た。このｐＵＣ702-pld プラスミドの pld遺伝子部分が正しい向きに挿入されたか否かについては、ＤＮＡシーケンサーにより確認した。
【００５２】
（４）放線菌のプロトプラスト調製
放線菌プロトプラストの調製および後述する形質転換は、前述した「Genetic Manupulation of Streptomyces」の記載に従って行った。放線菌としては、ストレプトマイセス・リヴィダンス（Streptomyces lividans 1326株）、以下、S.lividansと略記する）を使用した。S.lividansを滅菌した5 mLの TSB培地に植菌し、30℃にて２〜３日間種培養を行った。
【００５３】
続いて、坂口フラスコに 150 mL のYEME培地と、前述のステンレスコイルとを入れ、種培養液１mLを植菌し、36時間〜40時間、30℃にて本培養を行った。上記YEME培地は、Difco yeast extract 3 g/L 、Difco bacto-peptone 5 g/L 、Difco malt extract 3 g/L、glucose 10 g/L、sucrose 340 g/L を含み、オートクレーブにて滅菌した後、 MgCl2・6H2O(2.5M) 2 mL/L 添加、glycine(20％) 25 mL/L を含むものである。
【００５４】
培養終了後（S.lividansの色素が赤くなる前）、培養された菌体を含む培地を取り出し、上記培地に対し3000 rpm、10分間の遠心操作を行った。遠心された培地から上清を除き、残った菌体を50 mL の10.3％ sucrose溶液で２回洗浄した。
【００５５】
洗浄後の菌体に、15 mL になるまでリゾチーム(lysozyme)溶液（ 2 mg/mL in Ｌbuffer、フィルター滅菌）を加えた菌体懸濁液を調製し、上記菌体懸濁液を30℃にて30分間保温した。上記菌体懸濁液は、沈殿が生じる度によく攪拌した。
【００５６】
その後、上記菌体懸濁液に対し、15 mL のＰbufferを加え、よく攪拌し、続いて、上記菌体懸濁液を滅菌したコットンウールによりろ過した。ろ過後のろ液を、3000 rpm、７分間の遠心操作を行った。
【００５７】
遠心されたろ液から上清を除くことにより得られた菌体に対しＰbufferを加えた。Ｐbufferを加える量は、血球計による測定において、４〜５×１０9/mLとなるよう調節した。そのように調製された菌体プロトプラスト懸濁溶液を、滅菌チューブに分注し、−70℃で保存した。
【００５８】
Ｌ(Lysis) bufferは、sucrose(10.3％) 100 mL、TES buffer(5.73 ％, pH7.2) 10 mL、K2SO4(2.5 ％) 1 mL、trace element solution 0.2 mL 、KH2PO4(0.5％) 1 mL、 MgCl2・6H2O(2.5M) 0.1 mL 、CaCl2(2.5M) 1 mLに蒸留水を加えて１ Lとしオートクレーブ滅菌した溶液に対し、使用直前にリゾチーム（ナカライ製）を、2 mg/mL となるように加えたものである。
【００５９】
Ｐ(protoplast)bufferは、sucrose 10.3 g、K2SO4 0.025 g 、 MgCl2・6H2O 0.202 g、trace element solution 0.2 mL を蒸留水で溶かし80 mL としてオートクレーブ滅菌したものに対し、これとは別に、それぞれオートクレーブ滅菌済の、KH2PO4(0.5％) 1 mL、 CaCl2・2H2O(3.68 ％) 10 mL 、TES buffer( ナカライ製、TES 粉末を5.73％となるように溶解し、pHを7.2 に調整したもの）10 mL をそれぞれ添加したものである。
【００６０】
trace element solutionは、ZnCl2 40 mg/L 、 FeCl3・6H2O 200 mg/L 、 CuCl2・2H2O 10 mg/L、 MnCl2・4H2O 10 mg/L、 Na2B4O7・10H2O 10 mg/L 、(NH4)6Mo7O24・4H2O 10 mg/Lとなるように、それぞれを蒸留水に溶解したものである。
【００６１】
（５）放線菌の形質転換
宿主として、上述したようにプロトプロスト化した放線菌であるS.lividansを用いた。上述したように調製したS.lividansのプロトプラストの懸濁溶液の冷凍物を素早く解凍し、室温で3000 rpm、７分間の遠心操作を行った。続いて、前述した（２）に記載のプラスミド溶液を 20 μL 加え、次に、0.5 mLのＴbufferを加えて素早くピペッティングを行った。
【００６２】
Ｔbufferを加えて３分以内に、5 mLのＰbufferを加え、軽く遠心操作( 3000 rpm、30秒間）を行った。上清を除き、沈殿した残渣に対し、0.5 mLのＰbufferを加え、0.1 mLずつ、各R2YEプレートの表面にほぼ均一に塗布して30℃にて保温した。
【００６３】
１日〜２日後、塗布された各R2YEプレートに対し、Tiostreptone( 和光純薬製、Stock solutionとして50 mg/mL in ＤＭＳＯ) を終濃度 500μg/mLとなるように加えた 0.7％ soft agar（ナカライ製）を 3 mL ずつ、それぞれ、ほぼ均一に塗布して、同じく30℃にて保温した。これにより、宿主である放線菌S.lividansの形質転換（組換え微生物）を完了した。
【００６４】
この組換え微生物は、（財）発酵研究所（大阪）に対し、名称:Streptomyces lividans /pUC702-PLD（ＩＦＯ 16465）として寄託されているものです。また、前述の（３）に記載のプラスミド溶液についても同様に操作して形質転換した放線菌S.lividans（組換え微生物）を得た。
【００６５】
Ｔ(Transformation)bufferは、75 mL の蒸留水に、35.8 g PEG1000を溶解したＳＥPEG1000 溶液と、sucrose(10.3％) 25 mL 、前述のtrace element solution 0.2 mL 、および、K2SO4(2.5 ％) 1 mLとを混合して、オートクレーブ滅菌したものを、9.3 mLとり、別々にオートクレープ滅菌済の、CaCl2(5M) 0.2 mL、Tris-maleic acid buffer 0.5 mLを加えたものである。上記のTris-maleic acid buffer は、 1 MのTris buffer 溶液のpHをリンゴ酸(maleic acid) にて8.0 に調整したものである。
【００６６】
R2YEプレートは、R2YE培地 100 mL に対して、2.2 g のDifco Bacto agarを加えオートクレーブ滅菌し、そのagarが固化する前に、別々にオートクレーブ滅菌済の、KH2PO4(0.5％) 1 mL、 CaCl2・2H2O(5M) 0.4 mL 、L-proline(20％) 1.5mL 、NaOH(1 N) 0.7 mLを加え、滅菌済のシャーレに所定量注入して、R2YEプレートとしたものである。R2YE培地は、sucrose 103 g 、K2SO4 0.25 g、 MgCl2・6H2O 10.12 g、glucose 10 g、Difco casaminoacids 0.1 g 、trace element solution 2 mL 、Difco yeast extract 5 g 、および、TES buffer 5.73 g を蒸留水 1 Lに溶解して調製したものである。
【００６７】
（６）組換えS.lividans（組換え微生物）の培養
上述した方法により得られた組換えS.lividansを、通気攪拌型培養装置を用いて培養を行った。まず、前述のTiostreptone（終濃度 5μg/mL）を加えた TSB培地 5 mL を入れた試験管に、R2YEプレートから植菌し、30℃で培養を２日〜３日間行った。さらに、坂口フラスコに TSB培地 100 mL と、Tiostreptone（終濃度 5μg/mL）を加え、上記試験管の種培養液 1 mL を植菌し、さらに、30℃で培養を２日〜３日間行った。
【００６８】
本培養として、通気攪拌型培養装置（エイブル社製、2 L のジャーファーメンター(BMJ-02PI)）に、 TSB培地 1 LとTiostreptone（終濃度 5μg/mL）とを加え、坂口フラスコの種培養液 50 mLを植菌した。培養は、培養温度28℃、pH=7.0、DO（溶存酸素濃度）＝ 2 ppm、通気量 2 vvmに設定して制御することで行った。
【００６９】
（７）ＰＬＤの活性測定
ＰＣ（ホスファチジルコリン、レシチン(Lecithin)ともいう）をＰＬＤによって加水分解させたときに生成するコリンを、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼとフェノールに反応させると、赤色キノン色素を生成する。この色素をコリンエステラーゼＢ−テストワコー（和光純薬製）を用いて、分光光度計で測定することにより、上記ＰＬＤの活性を測定した。１単位（Ｕ）の酵素活性の定義を、１分間に１μモル（mol)のコリンを遊離することとする。
【００７０】
まず、反応基質混合溶液を調製する。上記反応基質混合溶液におけるチューブ１本当たりの混合組成を、H2O 40μL 、200 mMのTris-HCl(pH=7.4) 20 μL 、10 mM のCaCl2 10μL 、１％Triton X-100 10 μL 、50 mg/mLのLecithin Emulsion 10μL とした。上記Lecithin Emulsion は、卵から得られたLecithin 500 mg を 1 mL のジエチルエーテルに溶解し、水で 10 mLにメスアップしたものを超音波懸濁させたものである。
【００７１】
ＰＬＤの活性測定では、ＰＬＤ酵素溶液 10 μL に対し、上述の反応基質混合溶液 90 μL を混合し、よく攪拌し、37℃で10分間反応させた。反応後、0.5 mMのEDTAを加え、反応を停止させた。次に、基質酵素剤（コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノール）500 μL を加え、37℃で５分間保温し、反応停止液500 μL を加え、反応を停止させた。
【００７２】
次に、検量線を作成する。水と、コリンエステラーゼＢ−テストワコーの基準液とを、それぞれ、150 μL と0 μL 、140 μL と10μL 、130 μL と20μL 、120 μL と30μL で混合し、それらの吸光度（波長 505 nm ）を分光光度計にてそれぞれ測定した。それぞれの吸光度の値が、0 U/L 、500 U/L 、1000 U/L、1500 U/LとなるＰＬＤ活性に相当するとして検量線を作成した。この検量線を用いて、試料中のＰＬＤ活性を決定した。
【００７３】
（８）電気泳動法（SDS-PAGE）
ＰＬＤの分泌発現を確認するため、12.5％の分離ゲルを用いて、SDS-PAGE電気泳動を行った。電気泳動においては、培地サンプル 20 μL を用いた。ゲルの染色は色素(Coomassie Brilliant Blue)を用いて行った。上記電気泳動は、文献（Garfin et al., Methods Enzymol. 182, 425-441 (1990) ）に記載の方法に基づいて行った。
【００７４】
（９）ＰＬＤの精製
培地中に分泌生産されたＰＬＤの精製は、pH6 における、陽イオン交換樹脂（Macroprep high S (バイオラッド社製など））によって行った。溶出は、塩化ナトリウムの段階溶出（0.5 M)あるいは直線的濃度勾配法（0-0.5 M)にて行った。また、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーも同等の効果を示した。
【００７５】
発明者らは、Stv. cinnamoneum（ＩＦＯ 12852) 由来の pld遺伝子のクローニングを行い、各種遺伝子発現系を利用した組換え微生物による、ＰＬＤの高効率生産プロセスを見出した。
【００７６】
まず、本発明者らは、以前において、組換えベクターを用いたＰＬＤの発現系として、大腸菌や酵母（Pichia pastoris)を用いた発現系の構築を試みたが、最も発現活性能が高い野性株のStv. cinnamoneumに対し、大腸菌の場合は１／２０、酵母の場合は１／４の発現活性量しか確認することができなかった。ただし、上記の各場合でも、タンパク質としてのＰＬＤの生産量自体は、大量確認できたことから、これらの発現系では、放線菌由来のＰＬＤが天然型の正しい立体構造を形成することが阻害されているため、発現活性量が低くなったものと思料された。
【００７７】
山根らも、放線菌（Streptomyces antibioticus)由来のＰＬＤを用いた、大腸菌における分泌生産系の開発を行っているが、最大でも、その発現活性量は約3500 U/L程度であった（Iwasaki et al., J. Ferment. Bioeng., 79, 417-421 (1995) ）。したがって、放線菌ＰＬＤの高分泌生産系の開発には、放線菌の宿主−ベクター系の開発が極めて重要であると考えられた。
【００７８】
そこで、本発明者らは、放線菌の一種であるS.lividansを宿主とし、Stv. cinnamoneum由来の pld遺伝子を組み込んだ発現系（ｐＵＣ702-pld 、図３ないし図５に示す）、さらに pld遺伝子に対し、さらにプロモーター領域を組み込んだ発現系（ｐＵＣ702-promoter-pld、図１ないし図３に示す）の構築を行った。構築した各組換えプラスミドを、それぞれ、放線菌であるS.lividansに形質転換し、形質変換した各S.lividansを試験管により培養した。
【００７９】
その結果、S.lividans／ｐＵＣ702-pld の発現系においては、野性株のStv. cinnamoneumと同等の発現量しか確認することができなかったが、S.lividans／ｐＵＣ702-promoter-pldの発現系（試験管培養では、20000 U/L ）では、野性株のStv. cinnamoneum（試験管培養では、1300 U/L）に対し、著しく大きな発現量（約１５倍量）を確認することができた。
【００８０】
したがって、本発明に係るプロモーターは、所望するＰＬＤ等のタンパク質の菌体外生産において極めて強力であり、ＰＬＤを始めとする種々な組換えタンパク質の発現において極めて有効であると考えられた。
【００８１】
そこで、通気攪拌型培養槽を用いて、この発現系S.lividans／ｐＵＣ702-promoter-pldの培養条件の最適化に関する検討を行った。条件としては、前述のTSB 培地に初発添加グルコース濃度をそれぞれ、0 g/l 、5 g/l 、15 g/l、30 g/lとし、培養温度28℃、pH=7.0、およびDO（溶存酸素濃度）＝ 2 ppmにコントロールすることで、それぞれ培養を行った。
【００８２】
図６に示すように、グルコースを添加しないときは、培地中の分泌ＰＬＤの活性が約 20000 U/Lであったが、図７ないし図９に示すように、グルコースの添加量の増加に従ってＰＬＤ生産量は増加し、グルコースを 30 g/l 添加することにより、培地中に約 30000 U/LのＰＬＤ活性を分泌生産することができることが判る。このＰＬＤ活性は、野性株のStv. cinnamoneumのＰＬＤ活性（同じ TSB培地では 1500 U/L ）と比べると、約２０倍の発現量であり、野性株のStv. cinnamoneumのＰＬＤ活性（培地は異なるが最適化し場合では 2000 U/L ）と比べると、約１５倍の発現量である。
【００８３】
ただし、初発グルコース濃度を、 30 g/l を超えて大きくしても、菌体量は増加するものの、ＰＬＤの生産量は増加しなかった。これは、過剰なグルコースの存在に起因するカタボライトリプレッションの影響によるものと考えられた。上記カタボライトリプレッションは、異化産物抑制、つまり、グルコースなどの代謝産物によって多数の酵素の合成が阻害されることを意味する。
【００８４】
さらに、初発のグルコース濃度 15 g/l の場合について、培地中に分泌生産されたＰＬＤの純度を電気泳動（SDS-PAGE）により、図１０に示すように、確認した。ＣＢＢ色素染色では、夾雑タンパク質がほとんど見られず、ほぼＰＬＤがシングルバンドとして確認することができた。
【００８５】
この培地中に分泌生産されたＰＬＤタンパク質を、SDS-PAGEのバンドより定量したところ、約 75 mg/Lであった。この定量値からＰＬＤの活性を計算すると、約 400 U/Lとなった。以前、本発明者らは、Stv. cinnamoneumから精製を行った天然型ＰＬＤの活性は、 468 U/Lであった(Ogino et wl., J. Biochem., 125, 263-269 (1999))。このことから、本発明において得られたＰＬＤは、天然型のＰＬＤに極めて近い値を有していた。
【００８６】
よって、本発明に係るＰＬＤ（タンパク質）の製造方法では、培地中のＰＬＤは、高濃度で、かつ高純度であり、その上、得られたＰＬＤの活性も、天然型のＰＬＤに極めて近いことから、大腸菌を始めとする、従来の各種の発現系での問題点を全て解決できたことが判る。
【００８７】
また、本発明に係るＰＬＤの製造方法は、培地中に分泌されるＰＬＤ純度が高いことから、ＰＬＤの分離回収が、菌体除去後に、一段のイオン交換カラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーで可能であるので、極めて、迅速かつ安価に、上記ＰＬＤを精製できて、上記ＰＬＤの生産コストを軽減できるものとなっている。
【００８８】
以上のように、本発明者らが見出した放線菌由来のプロモーターをベクターに組み込んだ放線菌（組換え微生物）由来のＰＬＤ発現系は、天然型に極めて近い高活性なＰＬＤを培地（つまり菌体外）中に、高純度、かつ高濃度な形態で大量生産できることから、極めて有効なＰＬＤ発現系であることが判る。
【００８９】
このように、培地中に、組換えタンパク質を高純度に分泌生産できる発現系は、従来少なく、上記ＰＬＤ以外の、有用な各種のタンパク質生産への応用が想定される。つまり、本発明に係るベクター（プラスミド）の発現カセット（プロモーター−シグナル配列−パリンドローム配列）は、例えば、コレステロールオキシダーゼ等の、各種放線菌由来の有用タンパク質の分泌生産を始めとして、各種有用タンパク質の分泌生産において極めて有効なものと想定された。
【００９０】
また、本発明の組換え微生物であるS.lividans／ｐＵＣ702-promoter-pldは、Stv. cinnamoneumと同様に（Fukuda et al., Biotechnol. Lett., 18, 951-956 (1996)）、微生物保持粒子（ＢＳＰs)への効率的な固定化を行うことができるため、固定化菌体を利用した、ＰＬＤを始めとする有用タンパク質の連続生産も可能であり、有用タンパク質の生産能を飛躍的に向上させて、上記有用タンパク質の低廉化を図ることができるものである。
【００９１】
【発明の効果】
本発明のプロモーターは、以上のように、ストレプトバーティシリウム・シンナモニウムのＤＮＡ由来の塩基配列であり、タンパク質生産のためのタンパク質用塩基配列の上流側に結合されて、上記タンパク質生産能の向上活性を有している構成である。
【００９２】
本発明のベクターは、以上のように、上記プロモーターと、上記プロモーターの下流側に、ＰＬＤ等のタンパク質生産のためのタンパク質用塩基配列とを有している構成である。
【００９３】
本発明の組換え微生物は、以上のように、上記ベクターが、放線菌等の宿主内に組み込まれている構成である。
【００９４】
本発明のタンパク質の製造方法は、以上のように、上記組換え微生物を培養液中にて培養して、タンパク質用塩基配列に基づくタンパク質を生産する方法である。
【００９５】
それゆえ、上記構成および方法は、上記プロモーターを用いたことにより、ＰＬＤ等のタンパク質の生産能を向上させることができ、上記タンパク質を工業化により低廉化できて、適用範囲を広げることができるという効果を奏する。
【００９６】
【配列表】
0004834900.tif 000002
0004834900.tif 000003
0004834900.tif 000004
0004834900.tif 000005
0004834900.tif 000006
0004834900.tif 000007
0004834900.tif 000008
0004834900.tif 000009
0004834900.tif 000010
0004834900.tif 000011
0004834900.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のプロモータを含む、ＰＬＤ生産用のＤＮＡの説明図である。
【図２】上記プロモータを含むベクターの説明図である。
【図３】上記ベクターを作成するための他の前駆体の説明図である。
【図４】比較のための、上記プロモーターを省いた、ＰＬＤ生産用のＤＮＡの説明図である。
【図５】上記ＰＬＤ生産用のＤＮＡを含むベクターの説明図である。
【図６】図２に示すベクターを組み込んだ、本発明の組換え微生物による、グルコース無添加における、ＰＬＤの生産能を示すグラフである。
【図７】図２に示すベクターを組み込んだ、本発明の組換え微生物による、グルコース濃度 5 g/Lにおける、ＰＬＤの生産能を示すグラフである。
【図８】図２に示すベクターを組み込んだ、本発明の組換え微生物による、グルコース濃度 15 g/L における、ＰＬＤの生産能を示すグラフである。
【図９】図２に示すベクターを組み込んだ、本発明の組換え微生物による、グルコース濃度 30 g/L における、ＰＬＤの生産能を示すグラフである。
【図１０】図２に示すベクターを組み込んだ、本発明の組換え微生物による、グルコース濃度 15 g/L における培養において、安定期での培養液中のＰＬＤを示すSDS-PAGEの図面代用写真である。
【図１】
0004834900.tif 000013
【図２】
0004834900.tif 000014
【図３】
0004834900.tif 000015
【図４】
0004834900.tif 000016
【図５】
0004834900.tif 000017
【図６】
0004834900.tif 000018
【図７】
0004834900.tif 000019
【図８】
0004834900.tif 000020
【図９】
0004834900.tif 000021
【図１０】
0004834900.tif 000022