(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２１の配列を含むヌクレオチドプローブおよび配列番号２３および配列番号２２の配列からなるフォワードおよびリバースプライマーを含むＢＣＲ−ＡＢＬ  ＲＱ−ＰＣＲ核酸セット。
【請求項２】
白血病患者における微小残存病変検出のためのＲＱ−ＰＣＲ法における請求項１記載のセットの使用であって、該セットは、Ｍ−ｂｅｒ融合遺伝子転写産物を増幅させるために用いられ、前記ＲＱ−ＰＣＲ法は、
（ｉ）増幅可能な適正化された患者サンプルを続く分析のために選択する工程と、
（ｉｉ）逆転写（ＲＴ）反応を実施するための最適条件を規定する工程と、
（ｉｉｉ）ＲＱ−ＰＣＲプロトコルのための最適条件を規定する工程と、
（ｉｖ）データ分析のための標準化された手技を確立する工程と
を包含し、
適切な制御遺伝子転写産物は、融合遺伝子産物と並行して増幅させられる、使用。
【請求項３】
共通の閾値は、指数関数期にあるようにするために０．１に設定され、共通のベースラインは３〜１５サイクルに設定される、請求項２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合遺伝子転写産物の増幅による白血病患者における微小残存病変検出のための実時間定量的ＰＣＲ（ＲＱ−ＰＣＲ）法に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）のための現行の治療プロトコルは、予後因子（prognostic factor）に基づいており、この予後因子は、治療の層別化に寄与する（非特許文献１〜３）。複数年にわたって白血病において識別されるキーとなる予後因子は、予備治療の特徴、例えば、年齢、ＷＢＣ（白血球）数、免疫表現型プロファイル、特定の染色体異常、異常融合遺伝子および突然変異（例えば、ＡＭＬにおけるＦＬＴ３遺伝子交換）を含む。初期の治療に応じてさらなる周知の予後マーカーが、特に、ＡＬＬおよびＡＭＬにおける吸入治療後の骨髄中の芽球の存在下または不存在下、または、ＣＭＬ患者における細胞遺伝学的応答において提供される。
【０００３】
しかしながら、重要なことは、このような古典的なパラメータを基準としたのでは患者での成果が信頼できる程には予測され得ず、したがって、微小残存病変（minimal residual disease：ＭＲＤ）を試験することの潜在的な重要性が根底にあることを強調することである。最近の１０年にわたる技術開発によって、細胞形態学または核型化（karyotyping）の閾値を超える白血病細胞の検出が可能になった（非特許文献４）。
【０００４】
バックグラウンドである１０３の正常細胞における少なくとも１つの白血病細胞の感度を有する下記３の異なる技術が現在用いられている。：１．免疫表現型化（immunophenotyping）、２．ＡＬＬにおける免疫グロブリン（Ｉｇ）およびＴ細胞レセプタ（ＴＣＲ）遺伝子のクローン再配列（clonal rearrangement）を検出するための、ゲノムＤＮＡを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および３．遺伝子再配列、主として、染色体転座の結果として生じるＦＧ転写産物を検出するための逆転写酵素−ＰＣＲ（reverse-transcriptase−ＰＣＲ：ＲＴ−ＰＣＲ）である。最初の２つは腫瘍負荷（tumor load）を直接的に測定するが、最後の方法は、遺伝子発現を測定する。
【０００５】
白血病患者におけるＭＲＤ情報は、下記３つの病理学的状況において独立の予後因子として明確に確立されている。：１）幼時ＡＬＬ、特に吸入治療後；２）ドナーの白血球注入の指導を可能にする、同種幹細胞移植後のＣＭＬ患者におけるＢＣＲ−ＡＢＬ検出および３）明らかな再発に比較して分子レベルの再発時点での早期治療に対して利点を与える、硬着（consolidation）治療後の急性前骨髄球性白血病（acute promyelocytic leukemia：ＡＰＬ）患者におけるＰＭＬ−ＲＡＲＡ検出。これらのデータは、いくつかの現行の多中心治療試験（multicenter therapeutic trial）での層別化戦略において分子モニタリングの導入につながった。
【０００６】
しかしながら、他のタイプの白血病におけるＭＲＤ検出の臨床への応用は、多くの系列の患者において立証されるべきままに残っている。
【０００７】
標準化された予後方法論の欠点の問題を解決するために、８年前に欧州の研究所は、BIOMED-1 Concerted Actionを通じて共同計画を実施した。
【０００８】
このConcerted Actionは、ＭＲＤの検出および診断スクリーニングに適した少なくとも１０−４（ＲＮＡに希釈されたＲＮＡ）の感度を達成する、標準化されたネステッドＲＴ−ＰＣＲアッセイの開発に導いた（非特許文献５）。
【０００９】
しかしながら、「終了点（end-point）」ＰＣＲ分析によっては、ＭＲＤレベルを精密に定量することができない。この限界は、長期の臨床的な緩解患者における低レベルのＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１１またはＰＭＬ−ＲＡＲＡ（非特許文献１）転写産物の発見および健康な個体における極低レベルのＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍＲＮＡの検出によって明示された。定量的なＰＣＲ分析は、競合ＰＣＲ（competitive PCR）によって達成された。専門の研究所は、この技術が再発の正確な予測を可能にすることを示し、このような分析がＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１またはＡＭＬ１−ＥＴＯ転写産物を伴うＢＣＲ−ＡＢＬ−陽性ＣＭＬまたはＡＭＬの患者の治療に適合されるように用いられ得ることを示唆した。
【００１０】
しかしながら、この競合ＰＣＲは労力が大きく時間を消費するので、標準化も大規模な多中心分析（multicenter analysis）もできない。
【００１１】
より最近になって、実時間定量的ＰＣＲ（real-time quantitative  ＰＣＲ：ＲＱ−ＰＣＴ）が導入された（非特許文献６）。ＣＭＬまたはＡＬＬ患者におけるＢＣＲ−ＡＢＬ、ＡＭＬ患者におけるＰＭＬ−ＲＡＲＡ、ＡＭＬ１−ＥＴＯおよびＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１、およびＡＬＬ患者におけるＴＥＬ−ＡＭＬ１等のＰＣＲターゲットとしてＦＧ転写産物を用いるＭＲＤ研究に対するこの技術の信頼性およびその潜在的な臨床価値を立証する個々の研究所からの多数の原稿が存在する。
【００１２】
しかしながら、多中心試験内の大規模なＭＲＤ研究のためにこの革新的な技術を適用するために、標準化されたＲＱ−ＰＣＲ手技が依然として保証されていた。
【００１３】
本発明者らは、上記が最初のこのよう利用可能な技術であったので、ＡＢＩ  ７７００大綱（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ−ＵＳＡ）に基づき、ＰＱ−ＰＣＲの標準化および定量コントロール分析を開発するために「Ｅｕｒｏｐｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ」（ＥＡＣ）プログラムにより欧州委員会（European Commission）（ＳＡＮＣＯ）の健康および消費者保護の共同計画を立案した。主要な目的は、適切な分子マーカーを有している白血病に対する各治療戦略の相対的な効果を評価するためにＭＲＤデータを比較することができる標準化されたプロトコルを確立することにあった。幼時および成人ＡＬＬおよびＡＭＬの３０〜４０％まで、およびＣＭＬ患者の９５％超をカバーする、白血病において最も頻繁に発生する融合遺伝子転写産物が選択された。
【００１４】
上記のように、標準ＲＴ−ＰＣＲと比較して、ＲＱ−ＰＣＲは、遺伝子発現を精密に定量化することができる。この技術の魅力的な特徴は、ＲＮＡの質および量等の重大なパラメータが評価され得ることにある。これは、ターゲット遺伝子およびハウスキーピングまたは内因性基準遺伝子（endogenous reference genes）とも呼ばれる１以上の対照遺伝子（control genes：ＣＧ）の並行増幅によって達成される。
【００１５】
ＲＱ−ＰＣＲ分析のあらゆる適用における適切なＣＧが、あらゆる実験処理によって影響されない、異なる分析されたサンプルの中で全ての有核細胞において安定に発現する遺伝子として定義され得る。ＣＧ（複数）の十分に機能を果たさない増幅は、ＲＮＡの質、量およびｃＤＮＡ合成効率の変動を反映したターゲット遺伝子転写産物量の対応する低減によって達成されるべきである。このため、ＣＧ発現の定量化は、大多数の新鮮なサンプルにおいて観察された基準値に基づいて、劣悪な質のサンプルを検出するために用いられ得る。さらに、ＲＱ−ＰＣＲは、サンプル単位で実験感度を評価することを可能にするだろう。これは、ＰＣＲ陰性の追跡調査サンプルにとって特に重要である。
【００１６】
ＲＱ−ＰＣＲアッセイに関する文献が激増しているが、適切なＣＧの選択に関する大きな成果はこれまで全く発表されていない。
【００１７】
ＣＧの選択は、重大な論点として残されており、コンセンサスが依然として見出される必要がある。現在までのところ、ＲＱ−ＰＣＲによるＭＲＤ検出のための多くのＣＧ（ＡＢＬ、ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、ＰＢＧＤ、ＴＢＰおよび１８ｓ  ｒＲＮＡ）が依然として用いられている。ＣＧ分析の包括が白血病患者におけるＭＲＤ検出の信頼性をかなり増大させるだろう。 
しかしながら、これは、ＣＧおよびＦＧアッセイの最適化および標準化にかなり依存する。
【非特許文献１】ローベンベルグ・ビー（Lowenberg B）、ダウニング・ジェイ・アール（Downing JR）およびバーネット  エイ（Burnett A）著，「アキュート・ミエロイド・ロイケミア  エヌ・イングル・ジェイ・メド（Acute myeloid leukemia.N Engl J Med）」，１９９９年，３４１号，ｐ１０５１−１０６２
【非特許文献２】ベルマ・エイ（Verma A）およびストック・ダブリュー（Stock W）著，「マネージメント・オフ・アダルト・アキュート・リンフォブラスティック・ロイケミア：ムービング・トゥワード・ア・リスク−アダプテッド・アプローチ．キュア・オピン・オンコール（Management of adult acute lymphoblastic leukemia:moving toward a risk-adapted approach.Curr Opin Oncol)」，２００１年，１３号，ｐ１４−２０
【非特許文献３】アペルバウム・エフ・アール（Appelbaum FR），「パースペクティブ・オン・ザ・フューチャー・オフ・クロニック・ミエロイド・ロイケミア・トリートメント．セミン・ヘマトル（Perspectives on the future of chronic myeloid leukemia treatment.Semin Hematol）」，２００１年，３８号，ｐ３５−４２
【非特許文献４】カンパナ・ディー（Campana D）およびピュイ・シー−エイチ（Pui C-H），「ディテクション・オフ・ミニマル・ディズィーズ・イン・アキュート・ロイケミア：メソドロジック・アドバンス・アンド・クリニカル・シグニフィカンス．ブラッド（Detection of minimal disease in acute leukemia:methodologic advances and clinical significance.Blood）」，１９９５年，８５号，ｐ１４１６−１４３４
【非特許文献５】ヴァン・ドンジン・ジェイ・ジェイ（Van Dongen JJ）、マキンティレ・イー・エイ（Macintyre EA）、ガベルト・ジェイ・エイ（Gabert JA）、デラベッセ・イー（Delabesse E）、ロッシ・ブイ（Rossi V）、サグリオ・ジー（Saglio G）、ゴッタルジ・イー（Gottardi E）、ランバルディ・エイ（Rambaldi A）、ドッティ・ジー（Dotti G）、グリーシンガー・エフ（Griesinger F）、パレリラ・エイ（Parrerira A）、ガメイオ・ピー（Gameio P）、ディアス・エム・ジー（Diaz MG）、マレック・エム（Malec M）、ランゲラク・エイ・ダブリュー（Langerak AW）、サン・ミゲル・ジェイ・エフ（San Miguel JF）、ビオンディ・エイ（Biondi A）著，「スタンダダイズド・ＲＴ−ＰＣＲ  アナリシス・オフ・フュージョン・ジーン・トランスクリプツ・フロム・クロモソーム・アベレーション・イン・アキュート・ロイケミア・フォー・ディテクション・オフ・ミニマル・レジドュアル・ディジーズ（Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberration in acute leukemia for detection of minimal residual disease）」，レポート・オフ・ザ・ＢＩＯＭＥＤ−１  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  Ａｃｔｉｏｎ（Report of the BIOMED-1 Concerted Action）：インベスティゲーション・オフ・ミニマル・レジドゥアル・ディジーズ・イン・アキュート・ロイケミア．ロイケミア（investigation of minimal residual disease in acute leukemia.Leukemia），１９９９年，第１３号，ｐ１９０１−１９２８
【非特許文献６】ファン・デル・ベルデン・ブイ（van der Velden V）、ホシュハウス・エイ（Hochhaus A）、カザニジア・ジー（Cazzanigia G）、セゼパンスキ・ティー（Szczepanski T）、ガベルト・ジェイ（Gabert J）およびファン・ドンジン・ジェイ（van Dongen J）著，「ディテクション・オフ・ミニマル・レジドゥアル・ディジーズ・イン・ヘマトポイエティック・マリグナンシーズ・バイ・リアル−タイム・クウァンティタティブ・ＰＣＲ（Detection of minimal residual disease in hematopoietic malignancies by real-time quantitative PCR）：プリンシプルズ，アプローチズ、アンド・ラボラトリ・アスペクト．ロイケミア（Principles,approaches,and laboratory aspect.Leukemia）」，２００３年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
これらの理由のために、本出願の発明者らは、ＦＧ  ＲＱ−ＰＣＲ分析の設計、最適化および標準化に焦点を当て、より特定的には、正常サンプルおよび白血病サンプルの大きなパネルでのＲＱ−ＰＣＲアッセイに適切なＣＧの選択および確認に特に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
したがって、本発明の目的は、融合遺伝子転写産物（fusion gene transcript）の増幅による白血病患者における微小残存病変検出のための定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＱ−ＰＣＲ）法における相当の改良を提供することにあり、上記改良は、
（ｉ）増幅可能な適正化された患者サンプルを次の分析のために選択する工程と、
（ｉｉ）ＲＴ反応を実施するための最適条件を規定する工程と、
（ｉｉｉ）ＲＱ−ＰＣＲプロトコルのための最適条件を規定する工程と、
（ｉｖ）データ分析のための標準化された手技を確立する工程と
を包含する。
【００２０】
本発明は、有利には、ＦＧ転写産物のＲＱ−ＰＣＲ分析を用いるＭＲＤ研究の国際的な基準についての基礎を提供することができる。
【００２１】
本発明の方法では、適切な対照遺伝子転写産物が融合遺伝子転写産物に並行して増幅されるべきである。
【００２２】
サンプル変動を正すための対照遺伝子の包含は、本発明の方法を遺伝子転写産物検出に適用可能にし、このため、将来の研究のための大綱を創り出す。ここで、ＲＱ−ＰＣＲアッセイは、治療効果を評価するため、特に、チロシンキナーゼ、ホスファチジル−イノシトール−３−キナーゼまたはファルネシル−トランスフェラーゼタンパク質の阻害剤等の革新的な薬物のために重大であるべきである。
【００２３】
治療戦略は、このような標準化されたＭＲＤ評価にしたがって適合されることになる。血縁でない同種移植、ドナーのリンパ球の注入等の治療決定を行う際または基本的には最も効果的な治療戦略を選択する際にこのような生物学的データ援助によって援助されることが大きな改良になるであろう。
【００２４】
さらに、本発明にしたがって急性および慢性白血病におけるマーカーに対して規定された標準化された方法は、腫瘍血液学、より広い意味では腫瘍学分野における他の生物学的マーカーのためのモデルであり得る。
【００２５】
今日の半自動化ＭＲＤ検出等の新規技術、あるいは将来の大量迅速処理チップＤＮＡ技術のための標準化および定量コントロールプログラムは、革新的な遺伝子方法論を通じて達成される進歩が白血病患者の成果を改善する際に最大の利点を生み出すことを確認することが必須である。
【００２６】
好ましい実施形態によると、本発明の方法において用いられるべき対照遺伝子は、ＡＢＬ、Ｂ２ＭおよびＧＵＳからなる群から選択される。
【００２７】
好ましくは、ＡＢＬ、Ｂ２ＭおよびＧＵＳのためのフォワードプライマー、プローブよびリバースプライマーの配列は、それぞれ下記の通りである。
【００２８】
配列番号１（ＥＮＦ１００３）、配列番号２（ＥＮＰｒ１０４３）および配列番号３（ＥＮＲ１０６３）および
配列番号７（ＥＮＦ１１０２）、配列番号８（ＥＮＰｒ１１４２）および配列番号９（ＥＮＲ１１６２）
これらの３つの好ましい対照遺伝子のセットの配列および局在性は表３７に与えられる。
【００２９】
最も好ましくは、本発明の方法において用いられるべき選択される対照遺伝子はＡＢＬである。
【００３０】
この実施形態の好ましい状況において、基準範囲のＡＢＬ値がそれぞれ１．３×１０３〜１．３×１０５コピー、またはＣｔが２１．９〜２９．３である全サンプルは、増幅可能なサンプルと考えられ、続く分析のために適正化（qualify）される。
【００３１】
本発明の別の目的は、本発明の方法において用いられるべき各融合遺伝子転写産物に特異的なプライマーおよびプローブのセットを提供することにある。
【００３２】
したがって、本発明の方法では、
−  融合遺伝子がＥ２Ａ−ＰＢＸ１である場合には、その対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ、下記の通りであり：
配列番号１０（ＥＮＦ１０１）、配列番号１１（ＥＮＰ１４１）および配列番号１２（ＥＮＲ１６１）、
−  融合遺伝子がＭＬＬ−ＡＦ４である場合には、その対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ下記の通りであり：
配列番号１３（ＥＮＦ２０７）、配列番号１４（ＥＮＦ２０８）、配列番号１５（ＥＮＰ２４２）および配列番号１６（ＥＮＲ２６２）、
−  融合遺伝子がＴＥＬ−ＡＭＬ１である場合には、その対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ下記の通りであり：
配列番号１７（ＥＮＦ３０１）、配列番号１８（ＥＮＰｒ３４１）および配列番号１９（ＥＮＲ３６１）、
−  融合遺伝子がＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍ−ｂｃｒである場合には、その対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ下記の通りであり：
配列番号２０（ＥＮＦ４０２）、配列番号２１（ＥＮＰ５４１）および配列番号２２（ＥＮＲ５６１）、
−  融合遺伝子がＢＣＲ−ＡＢＬ  Ｍ−ｂｃｒである場合には、その対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ下記の通りであり：
配列番号２３（ＥＮＦ５０１）、配列番号２４（ＥＮＰ５４１）および配列番号２５（ＥＮＲ５６１）、
−  融合遺伝子がＳＩＬ−ＴＡＬ１である場合には、その対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ下記の通りであり：
配列番号２６（ＥＮＦ６０１）、配列番号２７（ＥＮＰ６４１）および配列番号２８（ＥＮＲ６６４）、
−  融合遺伝子がＰＭＬ−ＲＡＲＡである場合には、その対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列はそれぞれ下記の通りであり：
配列番号２９（ＥＮＦ９０３）、配列番号３０（ＥＮＦ９０６）、配列番号３１（ＥＮＦ９０５）、配列番号３２（ＥＮＰ９４２）および配列番号３３（ＥＮＲ９６２）、
−  融合遺伝子がＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１である場合には、その対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ下記の通りであり：
配列番号３４（ＥＮＦ８０３）、配列番号３５（ＥＮＰｒ８４３）、配列番号３６（ＥＮＲ８６２）、配列番号３７（ＥＮＲ８６３）および配列番号３８（ＥＮＲ８６５）、
−  融合遺伝子がＡＭＬ−ＥＴＯである場合には、その対応するフォワードプライマー、プローブおよびリバースプライマーの配列は、それぞれ下記の通りである：
配列番号３９（ＥＮＦ７０１）、配列番号４０（ＥＮＰ７４７）および配列番号４１（ＥＮＲ７６１）。
【００３３】
これらのプライマーおよびプローブの配列および位置は、表５、８、１１、１４、１７、２１、２４、２７および３０に与えられる。
【００３４】
本発明の方法の最も好ましい実施形態においては、上記方法の工程（ｉｉ）は、下記の通りである：
全ＲＮＡ  １μｇをＨ２Ｏ  １０μｌ中に加え；
７０℃で１０分間にわたってインキュベートし；
氷冷し、下記試薬を最終容量が２０μｌになるまで加え：
逆転写酵素（ＭＭＬＶまたはＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩまたはＩＩのいずれか）：１００Ｕ
ＲＴバッファー（用いられるＲＴアーゼによる）
ＤＮＴＰ：１Ｍｍ
ＤＴＴ：１０Ｍｍ
ランダム・ヘキサマー（Random Hexamers）：２５μＭ
ＲＮアーゼインヒビター：２０Ｕ
続いて下記条件でインキュベートし：
室温で１０分間；
４２℃で４５分間；そして、
９９℃で３分間
ＲＴ工程後に４℃でサンプルを置き；そして、
最終的なｃＤＮＡを３０μｌのＨ２Ｏで希釈する。
【００３５】
より好ましくは、本発明方法の工程（ｉｉｉ）は下記の通りである：
最終容量：  ２５μｌ；
最終ｃＤＮＡ  ５μｌ（１００ｎｇのＲＮＡに等価）；
プライマー：  各３００ｎｍ；
プローブ：２００ｎＭ（ＡＭＬ１−ＥＴＯプローブの場合には１００ｎＭ）；
マスターミックス（Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）：１２．５μｌ（１Ｘ）
からなるサンプルを下記条件でインキュベートし；
５０℃で２分間；そして、
９５℃で１０分間；
次に５０サイクル下記を行う：
９５℃で１５秒間；そして、
６０℃で１分間。
【００３６】
有利には、本発明の方法の工程（ｉｖ）は、下記のようにして進行される；
共通の閾値を０．１（ただし、ＰＭＬ−ＲＡＲＡについては０．０５）に設定し；
共通のベースラインを３〜１５（ただし、Ｂ２Ｍについては３〜１０）サイクルに設定する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
以下、下記表および添付された図面を参照しながら本発明がより詳細に記載される。
【００３８】
（構成）
フェーズＩおよびＩＩの目的は、プライマーおよびプローブの最初の選択、さらには、メンバーの訓練であった。
【００３９】
フェーズＩＩＩａの間、異なる標準曲線が比較され（すなわち、ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはＤＮＡプラスミドを用いて生成された）、特定のネットワーク内の選択されたプライマー／プローブのセットの最終的な確認がなされた。並行して、発明者らは、最初の品質コントロールラウンド（ＱＣ１）を実施した。
【００４０】
フェーズＩＩＩｂの間、選択されたＦＧプライマー／プローブセットの試験が、本部で調製されたコード化された品質コントロールサンプルに対して、含まれる全研究所によって着手された（ＱＣ２）。ＦＧ転写産物ターゲットのこの試験は、元々のＦＧ転写産物ネットワークの外部の無作為に選択された研究所によって実施された。
【００４１】
フェーズＩＶａ中、未希釈細胞系ＲＮＡサンプルを含む第三の品質コントロールラウンド（ＱＣ３）が実施された。
【００４２】
フェーズＩＶｂの間、白血病細胞系および患者サンプルにおける規格化されたＦＧ転写産物レベルの基準値が、ＥＡＣ標準化プロトコルによるＥＡＣプライマー／プローブセットを用いて決定された。
【００４３】
さらに、新鮮なサンプル中の正常な末梢血（peripheral blood：ＰＢ）、骨髄（bone marrow：ＢＭ）およびＰＢ幹細胞における対照遺伝子のための基準範囲が確立された。
【００４４】
（材料および方法）
（原理）
現在利用可能なＲＱ−ＰＣＲ技術により、１（タックマン（登録商標））または２（Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ）の内部オリゴヌクレオチドプローブからのＰＣＲ反応中の蛍光放出または蛍光色素を検出することができ、検出された蛍光は、サンプル７に存在するターゲットの量に比例する。
【００４５】
タックマン（登録商標）プローブを利用するＡＢＩ  ７７００大綱を用いてＥＡＣプロトコルを行うことが決定された。単回の実行で大多数のサンプル（９６ウェルのプレートフォーマット）を分析することができる利用可能な最初のロバスト（robust）ＲＱ−ＰＣＲ技術であったからである。５’ヌクレアーゼアッセイ（タックマン（登録商標）技術）は、５’リポーター（reporter）蛍光体（例えばＦＡＭ）および３’クエンチャ（quencher）蛍光体（例えばＴＡＭＲＡ）を有する単一の内部オリゴヌクレオチドプローブを用いる。延長期の間、タックマン（登録商標）プローブは、Ｔａｑポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって加水分解され、それによりリポーターおよびクエンチャ蛍光体を分離し、結果として、蛍光を増大させる（図１）。タックマン（登録商標）技術では、閾値を超えるシグナルを検出するために必要なＰＣＲサイクル数は、サイクル閾値（Ｃｔ）と呼ばれ、反応の開始時に存在するターゲットの量に直接的に比例する（図２ａ）。ΔＲｎは、安定期（plateau phase）に達した時の蛍光強度の増加に対応する。既知数の分子を有する標準物質または較正物質（calibrator）を用いて、標準曲線を確立し、試験サンプルに存在するターゲットの精密な量を決定することができる（図２ｂ）。標準曲線の理論的な傾きは、最大効率を有するＰＣＲ反応に対して−３．３２である。標準曲線のために既知量のＤＮＡ分子を用いると、Ｙ軸上の切片点は、１分子を検出するために理論的に必要なサイクル数を規定する。
【００４６】
（分子ターゲット）
アッセイは、１５のＲＮＡターゲット（Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１、ＭＩＬ−ＡＦ４（変異体エクソン９−エクソン５、エクソン１０−エクソン４およびエクソン１１−エクソン５）、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、ＢＣＲ−ＡＢＬ（Ｍ−ｂｃｒおよびｍ−ｂｃｒ）、ＳＩＬ−ＴＡＬ１、ＰＭＬ−ＲＡＲＡ（ｂｃｒ１、ｂｃｒ２およびｂｃｒ３）、ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１（タイプＡ、ＤおよびＥ）およびＡＭＬ１−ＥＴＯ）を生じさせるより共通の切断点変異体を含む９の白血病関連融合遺伝子を検出するように設計された。
【００４７】
さらに、サンプル毎の質の変動および遺伝子発現定量化のための対照遺伝子として機能させるための適性について１４のハウスキーピング遺伝子が評価された。３の対照遺伝子（ＡＢＬ、Ｂ２ＭおよびＧＵＳ）が最終的に選択され、発明者らは、フェーズＩＩ−ＩＩＩの間にはＡＢＬ遺伝子の発現を分析し、フェーズＩＶの間には３の選択された対照遺伝子（ＡＢＬ、Ｂ２ＭおよびＧＵＳ）の全てを分析した。
【００４８】
（プライマーおよびプローブの設計）
プライマーおよびプローブは、プライマーエクスプレス（登録商標）ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、２の分離されたエクソン上のそれらの位置およびＢＩＯＭＥＤ−１プログラム（５）に記載されたプライマーセットによって発生されたアンプリコン（amplicon）の配列に基づいて設計された。それらは、対応するＦＧのエクソン／イントロン構造の概略図に表される（実施例１〜９を参照のこと）。最初の２回のミーティングの間、プライマーおよびプローブの最初の選択がなされ、各分子ターゲットに対して新たに設計されたセットおよび経験を積んだ研究所からのすでに利用可能な「組織内（in house）」セットが評価された。セットの選択は、下記に基づく；１）非特異的な増幅人為産物がないこと；２）−３．３２（１００％の理論効率）前後の傾きを有する良好な効率；３）良好な感度（プラスミド希釈物に対して少なくとも１０−４のＲＮＡ希釈物または１００コピー）；４）最も高い希釈物に対する安定期においてΔＲｎ値＞１．０を有する反応のロバストネス（robustness）（表４）。このような結果は、特定のプライマー／プローブセットが選択される参加研究所の少なくとも８０％に到達される必要があった。潜在的なプライマー／プローブセットが並行して細胞系およびプラスミドの一連の希釈物に関して試験され、最良の性能プロファイルを、特に感度の点で有するセットが選択された。選択基準を満たすプライマー／プローブのセットがない場合には、新たなセットが設計および評価された。全体として、第１のフェーズ中に試験された４７のプライマーセットおよび４４のプローブから開始して、１２のプライマーのセットおよび９のプローブが１５のターゲットのために最終的に選択された（各実施例中の図を参照のこと）。各場合において、タックマン（登録商標）ベースのＲＱ−ＰＣＲ分析の感度は、以前に標準化されたネステッド（nested）ＲＴ−ＰＣＲ分析（５）に匹敵するようである。ＢＣＲ遺伝子については、Ｙ（シチジンまたはチミジン）は、最近記載された多形性（polymorphism）にしたがってＢＣＲプライマー上の位置３１８８に現れる。
【００４９】
最初のＣＧスクリーニングでは、１１のＣＧのためのプライマーおよびプローブのセットを含む予め発生分化されたヒト内因性対照プレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの好意により提供された）が用いられたが、これは、製造業者によって推奨されたからである（表３６）。ＥＡＣの研究所によって設計された６のさらなるＣＧプライマーおよびプローブのセット（アベルソン（ＡＢＬ）に対する１のＥＡＣおよび１の組織内セット、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）に対する１の組織内セット、ポルホビリノーゲン・デアミナーゼ（ＰＢＧＤおよびＰＢＧＤ２）に対する２のＥＡＣセットおよび転写因子ＩＩＤ（ＴＢＰ）に対する１の組織内セット）が分析された。（表３６）。選択の後、ＣＧの数は、最終的には、３に減らされ、これらは、さらなる分析に付された（図３４および表３７）。オリゴヌクレオチド・プライマーおよびプローブが、プライマーエクスプレス（登録商標）１．０プログラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびＯｌｉｇｏ  ６プログラム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ，米国）を用いて設計された。プライマーおよびプローブのセットはまた、アッセイがｃＤＮＡ特異的であることを確認するためにＰＣＲ当たり１００ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて試験された。
【００５０】
（細胞系（cell line）および診断時における白血病サンプルからのＲＮＡおよびｃＤＮＡ）
ＲＮＡおよび／またはｃＤＮＡサンプルは、本部においてＦＧネットワークリーダーによって調製され（表１）、フェーズＩ〜ＩＶａ中にドライアイスを用いてそれらの各ネットワークのメンバーに分配された。患者のＲＮＡがネットワークリーダーによって提供される希少なＦＧ転写産物（ＰＭＬ−ＲＡＲＡ  ｂｃｒ２およびｂｃｒ３およびＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１  タイプＤおよびＥ）以外は、ＦＧ転写産物−陽性細胞系ＲＮＡは共通に用いられた（特定の細胞系については表１を参照のこと）。これらのＲＮＡサンプルは、ＰＢリンパ球（ＰＢＬ）ＲＮＡまたはＦＧ転写産物陰性細胞系ＲＮＡ中に希釈された。細胞系は、ＤＳＭＺ（Ｂｒａｕｓｃｈｗｅｉｇ，ドイツ）、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，米国）から購入されたか、または、大学の研究所によって直接的に提供され（ＴＯＭ−１、ＭＥ−１およびＰＦ３８２）て、供給者に指示にしたがって培養された。フェーズＩＩＩの間、ネットワークリーダーの研究所は、ｃＤＮＡの当量希釈物系列を調製した。フェーズＩＶｂの間、関連のＦＧ転写産物に対して陽性であり１８月未満の保存された患者サンプルＲＮＡが、未希釈であるかおよび／または大腸菌  １６Ｓ＆２３Ｓ  ｒＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍｅｙｌａｎ，フランス）の１μｇ／μｌの溶液に希釈されて局所で２回分析された。
【００５１】
（プラスミド較正物質（calibrators））
プラスミドを調製するためのＡＢＬ、Ｂ２ＭおよびＧＵＳ遺伝子転写産物のＰＣＲ生成物は、それぞれ、ＡＢＬ−Ｆ（５’−ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＡＧＴ  ＡＧＣ−３’）およびＡＢＬ−Ｒ（５’−ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＡＧＧ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＡ  Ｃ−３’）、Ｂ２Ｍ−Ｆ（５’−ＣＣＴ  ＴＧＡ  ＧＧＣ  ＴＡＴ  ＣＣＡ  ＧＣＧ  Ｔ−３’）およびＢ２Ｍ−Ｒ（５’−ＣＣＴ  ＧＣＴ  ＣＡＧ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＣＡＡ  ＡＣＡ  ＴＧ−３’）およびＧＵＳ−Ｆ（５’−ＣＣＴ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＧＴＧ  ＡＧＣ  ＡＡ−３’）およびＧＵＳ−Ｒ（５’−ＧＴＣ  ＴＧＣ  ＣＧＴ  ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＴＣＣ  Ａ−３’）により増幅された。ＢＩＯＭＥＤ−１  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ＡｃｔｉｏｎのＰＣＲ条件が用いられた（５）。プラスミド希釈物のクローニングおよび調製のためのプロトコルは既に開示されている。ＡＢＬおよびＧＵＳプラスミドについては、３の希釈物（１０５、１０４および１０３コピーを５μｌ）が標準曲線を計算するために用いられた。Ｂ２Ｍプラスミドについては、３の異なる希釈物（１０７、１０６および１０５コピーを１μｌ）が用いられた。Ｃｔ値のための対応する変動係数は、全ての希釈物に対して４％（ＡＢＬ）、５％（Ｂ２Ｍ）または３％（ＧＵＳ）未満であった（全フェーズからのデータ）。
【００５２】
（生物学的材料およびＲＮＡの調製）
ヘパリン添加された末梢血（ＰＢ）、骨髄（ＢＭ）およびＰＢ幹細胞（ＰＢＳＣ）から単核細胞（ＭＮＣ）がフィコール−ハイバック密度勾配遠心分離によって得られた。全ての患者サンプリングは、所与の施設および／または地理的地帯の地域倫理委員会によって認可されたプロトコルにしたがって実施された。ＲＳ４；１１の細胞系は、１０％のウシ胎仔血清を有する培地ＲＰＭＩ１６４０において生育され、指数関数的生育期に採取された。ＲＮＡは、製造業者の推奨に従い、ＴＲＩゾル試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｅｒｇｙ，フランス）、ＲＮＡゾル試薬（Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｔａｌｉａ，ローマ，イタリア）またはカラムベースシステム（column based system）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，ドイツ）のいずれかを採用する参加研究所において型通りの方法によって抽出された。抽出および単離の後、ＲＮＡ濃度は、２６０ｎｍにおける光学密度の測定によって決定され、ＲＮＡは使用するまで−８０℃で保存された。
【００５３】
（ターゲット遺伝子配列を含むプラスミドＤＮＡ較正物質）
１５の異なるＦＧ転写産物のＰＣＲ生成物は、以前に記載されたように、ＢＩＯＭＥＤ−１  ＡおよびＢプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって細胞系または患者のＲＮＡから発生された（５）。ＰＣＲ生成物は、ＰＣＲ  ＩＩ  ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，オランダ）にクローニングされた。選択されたプラスミドクローンは、それらの挿入を確認するために配列決定された（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｇｒｅｎｏｂｌｅ，フランス）。続く大量生成の後、プラスミドは、ＱＩＡＦＩＬＴＥＲ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭＩＤＩキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ，フランス）を用いて抽出され、分光光度計により定量された。１μｇに対するコピー数は、ベクターおよび挿入物の分子量に従って判断された。次いで、２０μｇのプラスミドが、ＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素により３７℃で１時間にわたって攪拌下に線状にされた。分解されたプラスミドは、２０ｎｇ／μｌの大腸菌１６Ｓ＆２３Ｓ  ｒＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ）を含むＴｒｉｓ  １０ｍＭ、ＥＤＴＡ  １ｍＭ  ｐＨ８の溶液に連続的に希釈された。５の一連の希釈物（２００，０００、２０，０００、２００、２０、および２コピー／ｍｌ）が調製された。対応する標準曲線が、−３．４５の平均傾きおよび３９．８±１Ｃｔの切片を生じさせた。２２．５±１の平均Ｃｔ値は、２０，０００コピー／μｌの希釈物に対して得られた。
【００５４】
（標準化されたＲＴ−ＰＣＲプロトコル）
共通のＥＡＣプロトコルは、フェーズＩおよびＩＩ中に全ての分子ターゲット（ＦＧおよびＣＧ転写産物）に対して確立され、その後、フェーズＩＩＩおよびＩＶの全体にわたって各研究所によって用いられた（表４）。
【００５５】
（ＲＴ工程）
この反応は、ＢＩＯＭＥＤ−１プロトコル２４から適合させられた。全ＲＮＡ  １μｇから開始して、主要な修飾は、ランダム・ヘキサマー（２５μＭ）およびＭＭＬＶまたはＳｕｐｒｅｓｃｒｉｐｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｒｏｃｈｅ）のいずれかの逆転写酵素（１００Ｕ）の濃度変更を含んでおり、これは、アッセイの感度をかなり増大させた。
【００５６】
（ＲＱ−ＰＣＲ工程）
全てのＲＱ−ＰＣＲ反応は、７７００ＡＢＩ大綱（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，米国）によって、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入されたＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘと共に同一の製造業者の好意により提供されたプライマーおよびタックマン（登録商標）プローブを用いて実施された。増幅サイクル数は５０であった（詳細なプロトコルは表３に記載されている）。
【００５７】
（ＲＱ−ＰＣＲアッセイの最適化（フェーズＩＩ））
結果を最適化し、費用を節約するために、フェーズＩＩは、プライマーおよびプローブの濃度（プライマーに対して９００および３００ｎＭおよびプローブに対して２００および１００ｎＭ）および反応容積（５０μｌ対２５μｌ）のアッセイの感度への影響の評価を含んでいた。
【００５８】
ＦＧ陰性ＲＮＡ中のＦＧ陽性細胞系ＲＮＡの一連の希釈物（１０−１〜１０−５）およびプラスミド（１０６〜１０コピー）を用いてＦＧネットワーク内で大規模に試験した後、プライマー  ３００ｎＭおよびプローブ  ２００ｎｍの濃度を有する（ただし、ＡＭＬ１−ＥＴＯについては、プローブ  １００ｎＭが選択された）２５μｌの容積を用いて最適な結果が得られた（実施例９を参照のこと）。
【００５９】
比較データ分析に関して、指数関数期にあるようにするために０．１の共通の閾値設定が選択された。このような閾値は、典型的には、いくつかの陰性対照においてまれに観察されていたいわゆる「クリープ曲線（creeping curve）」より上の部分にある。「クリープ曲線」は、ＰＣＲ反応の間に緩やかに上昇する陰性サンプルからの増幅曲線として定義される。最近の現象の根底にある機構は、完全に明らかであるというわけではないが、「多成分」観点の考察は、それが特別の増幅を暗示していないことを示している（下記参照のこと）。しかしながら、ＰＭＬ−ＲＡＲＡについては、閾値は０．０５に固定された。ＰＣＲ増幅の指数関数期が比較的短期であるからである（低ΔＲｎ）。ベースラインは、３〜１０が用いられた高い発現遺伝子（Ｂ２Ｍ）を除き３〜１５サイクルから（ＡＢＬおよびＧＵＳ）計算された。さらに、発明者らは、フェーズＩ〜ＩＩＩａの間は、陽性ＲＮＡ（患者または細胞系）の正常ＰＢＬまたは陰性細胞系ＲＮＡへの希釈物（１０−１〜１０−６）を用い、フェーズＩＩＩａの間はｃＤＮＡを用いる同一の希釈物系列を用いた。
【００６０】
（標準曲線の比較（フェーズＩＩＩａ））
ＲＮＡ、ｃＤＮＡおよびプラスミドの標準曲線間の比較は、結果（標準曲線の傾き、感度および再現性）へのＲＴ工程の影響を決定するために各研究所に対して実施された。ＦＧネットワークリーダーは、ターゲットネットーク内の異なる研究所（４〜１２のメンバー、表１を参照のこと）に本部で調製されたＦＧ転写産物−陽性細胞系ＲＮＡの一連の希釈物および対応するｃＤＮＡ、さらには、対応するＦＧ対照プラスミドの一連の希釈物（２０００００、２００００、２００、２０および２コピー／μＬ）を送った。
【００６１】
（コード化されたサンプルについての品質コントロール（quality control：ＱＣ）ラウンド）
（一般的な構成）
ＱＣ１（フェーズＩＩＩａ）およびＱＣ３（フェーズＩＶａ）は、特定の研究所によって実施され（表１）、Ｑ２（フェーズＩＩＩｂ）は、含まれる無作為に選択された研究所で行われた（均衡無作為アッセイの項を参照のこと）。
【００６２】
（対照サンプルおよび（偽（false）−）陽性および（偽−）陰性の定義）
全ての実験およびＱＣラウンドにおける陽性対照は、明確に定義された細胞系および患者サンプルに関係する（表１および２）。次の２つのタイプの陰性対照が用いられた：１）コード化されたＦＧ陰性ＲＮＡサンプルおよび２）ＰＣＲ生成物の汚染をチェックするための既知の陰性対照。これらの後者の汚染対照は、非増幅対照（ＮＡＣ）および非テンプレート対照（ＮＴＣ）に関係し、非増幅対照（ＮＡＣ）はヒトのｃＤＮＡの代わりに大腸菌ＲＮＡを含み、非テンプレート対照（ＮＴＣ）はヒトのｃＤＮＡの代わりに水を含んでいた。特にＮＡＣおよびＮＴＣ陰性対照は、この問題が過小評価されがちであるため、ＰＣＲ生成物の交差汚染（cross-contamination）の同定のために最大限に重要であると見なされた。
【００６３】
陽性ウェルは、（プラスミド標準曲線のＹ−切片Ｃｔ値＋１）のＣｔより下のＣｔ値を有するＳ字状増幅（ログスケール）として定義された。ＦＧのＲＮＡサンプルでの増幅は、ＣＧ発現について２回および３回実施された。偽陰性サンプルは、陽性ウェルの５０％未満を有する陽性ＲＮＡサンプルとして定義された（０／２、０／３または１／３）。偽陽性の結果は、陽性ウェルの少なくとも５０％を有する陰性サンプルとして定義された（１／２、２／３または３／３）。
【００６４】
（実験の感度および再現性）
感度および再現性の基準は、各ＦＧ転写産物に対してコード化されたサンプルによってＱＣ実験中に規定された（表４）。実験は、研究所の８０％超が、１．５Ｃｔ未満のＣｔ差を有する少なくとも２の陽性ウェルを検出すれば特定の希釈物に対して再現可能であると仮定された。実験の感度は、どんなＣｔ値であったとしても研究所の８０％超において陽性ウェルの少なくとも５０％を示す最後の希釈物として規定された。
【００６５】
（均衡（balanced）無作為アッセイ（フェーズＩＩＩｂ））
このアッセイは、医療情報局（Department of Medical Information）（マルセイユ，フランス）によって設計された。目的は、どの程度のＲＱ−ＰＣＲ結果が、ＥＡＣプロトコルにしたがう臨床設定においてＦＧ転写産物のＭＲＤ定量化に対して研究所間で類似したかについて評価することにある。研究は次の２つの主要点に焦点を当てた：１）多中心（multicenter）研究のとって重要である特定のＦＧ転写産物に対する研究所間の結果の比較および２）治療中の潜在的な腫瘍負荷（load）を評価するために重要である希釈物実験でのＲＱ−ＰＣＲ方法論の線形性。均衡無作為アッセイは、各参加研究所（ｎ＝２５）における全てのＲＱ−ＰＣＲ分析（ｎ＝１５）を行うことなくこれらの２点を評価するための適切な統計的研究であるようである。
【００６６】
統計専門家が２５の参加研究所を９のネットワークに無作為に割り当てた。９の主要なＦＧ転写産物のそれぞれは、全部で１００のＲＱ−ＰＣＲ実験を行うＦＧ転写産物ネットワークのリーダーを含む１１の研究所において試験された（ただし、ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１ネットワークについては、ｎ＝１２）。各研究所は、５のコード化されたサンプルを４の異なるターゲットに対して試験し、このＱＣ２研究において全部で５００のコード化されたサンプルが分析された（表２）。ＦＧ転写産物−陽性対照ＲＮＡは、陰性ＲＮＡサンプル（ＨＬ６０またはＰＢＬ）中に希釈された（１０−１、１０−３および１０−４希釈物）。
【００６７】
共通のプレート設計が用いられた；対照遺伝子（ＡＢＬ）、ＦＧ転写産物およびプラスミド希釈物（ＡＢＬ  ｎ＝３、ＦＧ  ｎ＝５）は３回増幅され、これに対して、４の陰性対照（ＡＢＬおよびＦＧターゲットのためのＮＡＣおよびＮＴＣ）については２回行われた。未処理データが各ＦＧネットワークリーダーによって収集および分析された。各ＦＧネットワーク内の結果を集めるために共通のエクセルワークシートが設計され、次いで、続く統計学的分析のためにマルセイユに転送された（下記参照）。コード化されたＲＮＡサンプルに対する唯一の例外基準は、フェーズＩＩＩａ中にＣＧネットワーク内で行われたアッセイによって規定された正常範囲［２２−２９．３］から外れたＡＢＬ  Ｃｔ値であった。
【００６８】
（データ収集）
１４の候補ＣＧ（１７のプライマーおよびプローブのセット）を試験するために、データが、ｉ）ＡＢＩ内因性対照プレート、ｉｉ）組織内およびｉｉｉ）新たに設計されたＥＡＣのプライマーおよびプローブのセットから得られた。ＡＢＩ内因性対照プレートについては、５の研究所が、全部で６５の異なる保管されたサンプル：診断時に得られた２２の正常なＰＢＭＮＣ、１５のＡＬＬ（４のＰＢ／１１のＢＭ）、１５のＣＭＬ（１０のＰＢ／５のＢＭ）および１３のＡＭＬ（５のＰＢ／８のＢＭ）サンプルを試験した。この数は、ＴＦＲＣに対して５３（１の研究所に関して部分的に失敗したデータ）に、１８Ｓ  ｒＲＮＡに対して２１（１つの研究所のみから利用可能なデータ）に低減された。最小の４の正常ＰＢおよび４の白血病サンプルは、研究所毎に要求された。組織内のＡＢＬ、Ｂ２ＭおよびＴＢＰのプライマーおよびプローブのセットについては、２０のサンプル：４の正常ＰＢＭＮＣ、３のＡＬＬ、７のＡＭＬおよび６のＣＭＬが１の研究所において試験された。ＥＡＣ  ＡＢＬ、ＰＢＧＤおよびＰＢＧＤ２のセットについては、３６のサンプル：４のＰＢＭＮＣ、１１のＡＬＬ、７のＡＭＬおよび１４のＣＭＬが２の研究所において試験された。同じＣＧに対して２の異なるセットのプライマーを伴って得られた対をなす結果（１研究所のみ）が、３のＣＧ：ＡＢＬ（ｎ＝２０）、Ｂ２Ｍ（ｎ＝１２）およびＴＢＰ（ｎ＝１２）に対して利用可能であった。全てのこれらの実験は、ＲＴ工程を最適化する前およびデータ分析のための共通の閾値を確立する前に実施された。
【００６９】
見込みのある研究では、新鮮な正常（ＰＢ、ＢＭまたはＰＢＳＣ）、ＡＬＬ、ＡＭＬまたはＣＭＬ（ＰＢまたはＢＭのいずれか）サンプルが、個々の研究所において３のＥＡＣ選択ＣＧに対して試験された（表３７）。サンプルが得られたのと同一の日にＭＮＣは単離され、細胞は溶解された（ＲＮＡ抽出手技の最初の工程）。最初に、３１６のサンプルが集められた（表３８）。６の白血病サンプルが除外された。Ｂ２Ｍプラスミド増幅が乏しかったためＣＧ分析が不可能であったからである。結果として、サンプルの同一セットについての基準値を規定するために３１０サンプルのみが分析された。推定ＦＧ転写産物の存在に関する情報は利用可能でなかった。
【００７０】
遡及研究（フェーズＩＶｂ）については、同定されたＦＧ転写産物を有する３１１の保管ＡＬＬ、ＡＭＬまたはＣＭＬサンプル（ＰＢまたはＢＭのいずれか）が個々の研究所において３のＥＡＣ選択ＣＧに対して、これらの研究所が対応するＦＧネットワークに含まれていなかったとしても、試験された。結果は、ＦＧネットワークリーダーによって収集され、表にまとめられた。下記に規定された基準範囲内のＣＧ  Ｃｔ値を有するサンプルのみが分析のために選択された。ＴＥＬ−ＡＭＬ１ネットワークでは、５７サンプルのうちの３０のみがＧＵＳ転写発現のために試験された。Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１ネットワークでは、Ｂ２Ｍ発現についてのデータは、１のサンプルに対して利用可能でなかった。
【００７１】
（統計分析）
（一般方法論）
ＣＧおよびＦＧ  ＲＱ−ＰＣＲデータが、各ＦＧネットワークリーダーによって収集および分析された。各遺伝子のための平均Ｃｔまたは平均ΔＣｔ（平均Ｃｔ［ＦＧ］−平均Ｃｔ［ＣＧ］）値およびコピー数（ＣＮ）のｌｏｇ１０の平均値が用いられた。規格化されたコピー数（ＮＣＮ）は、ＣＧ転写産物の１コピー当たりのＦＧのＣＮ（ｌｏｇ１０［ＦＧ  ＣＮ］の平均値−ｌｏｇ１０［ＣＧ  ＣＮの平均値）として規定された（ただし、Ｂ２Ｍ遺伝子転写産物レベルについての規格化については、結果は、１００コピー当たりで表現された）。ＣＮは、正規分布を示さないので、統計分析のためにＣＮの対数値が用いられた。より容易に理解するために、対数方式で得られた結果は、続いて、十進数値に変換された。
【００７２】
有意性のレベルは、ｐ＜０．０５に設定された。表および図において、ｐ値が０．０５〜０．１であったときには、統計的に有意でなかったとしても、数は記された。ｐ値が＞０．１であったときには、結果は、有意でない（ＮＳ）として表されている。異なる遺伝子の発現レベル間の相関は、ピアソン相関係数（ｒ）によって測定された。データを表示するために用いられたボックスのプロットは、サンプルの５０％を含むボックス（２５％〜７５％）内の中間値（暗線）を示す。統計分析は、マルセイユ（フランス）において、ＳＰＳＳ  １０．１ソフトウェア（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，シカゴ，米国）を用いて実施された。
【００７３】
（均衡無作為アッセイ（フェーズＩＩＩｂ））
−  研究所間の転写産物定量化における有意差の検出
サンプル毎の４のパラメータ（Ｃｔ、ΔＣｔ、ＣＮおよびＮＣＮ）が、全体的な線形モデルを用いて試験された。研究所数は、無作為効果として設定され、データが分析された。結果が研究所間で選択されたパラメータおよび転写産物に対して類似しなかった場合（ｐ＜０．０５）には、サブグループを規定するその他（ｐ≧０．０５）により再現可能な研究所の数を評価するためにポストホック（post-hoc）分析（ターキー（Tukey）法）が用いられた。このために、結果の再現性を見積もるために２の基準：ターキー法にしたがって平均間の有意差がない相違（ｐ≧０．０５）によって規定されるような少なくとも２の他の研究所により再現可能なサブグループの数（Ｓｎ）および研究所の数（Ｌｎ）が選択された。特定の研究所が２または３のサブグループに存在する場合には、１回だけカウントされた。研究所間の結果を比較するために最良のパラメータは、最も高いＬｎ値および最も低いＳｎ値を有するものである。理想的には、全ての研究所（Ｌｎ＝１１または１２／ネットワークまたは全体的なアッセイに対してＬｎ＝２５）を含む１サブグループ（Ｓｎ＝１）のみが期待された。
【００７４】
−  線形性の評価
３のコード化された陽性サンプルを用いてＦＧ転写産物の定量化の線形性を測定するために、ピアソン相関係数が選択された。各ＦＧ転写産物に関しては、結果を評価するための最良のパラメータ（ΔΔＣｔまたはＮＣＮ）は、最も高い相関係数を有するものであった。
【００７５】
（診断時の基準値（フェーズＩＶｂ））
ＣＧ増幅がＡＢＬ  Ｃｔ［２１．８−２９．４］、Ｂ２Ｍ  Ｃｔ［１５．６−２４．９］およびＧＵＳ  Ｃｔ［２０．８−２８．０］のように規定された新鮮なサンプルの正常範囲内にない場合には白血病サンプルは分析から除外された。ＰＢおよびＢＭ間の比較は、非パラメトリック試験（少なくとも５の対になったサンプルに対するウィルコクスン検定（Wilcoxon paired test）または対になっていないサンプルに対するマン・ホイットニー検定（Mann-Whitney U test））により実施された。少なくとも５の対になったサンプルは、ＦＧ転写産物毎に予想された。ＮＣＮの発現の９５％範囲は、選択された遺伝子に対する３〜９７％の範囲にあてはまる。ＦＧ  ＣＮおよび各ＣＧ  ＣＮ間の相関係数は、ＣＧによる規格化の前に与えられる。細胞系（単数または複数）に関しては、８の異なる研究所における同一のサンプルについて得られた中間値が示されている。
【００７６】
（結果）
（対照遺伝子の選択）
（選択基準）
対照遺伝子群は、ｉ）１１の共通に用いられるＣＧに対するプライマー／プローブセットを含む予め発生分化されたヒト内因性対照プレート（ＡＢＩ）、ｉｉ）６のプライマー／プローブのセット（表３６）を用いて、正常ＰＢおよび診断上の白血病サンプルについての候補ＣＧのスクリーニングを開始した。１４のＣＧをカバーする１７のプライマー／プローブのセットのうちで、ネットワークは、高位の中間発現（１６．４〜２３．０のＣｔ）を有する少なくとも１つおよび中位の中間発現（２３．０〜２９．６のＣｔ）を有する少なくとも１つを同定することを目的とした。任意に規定されるこれらの制限は、２ｌｏｇ（６．６  Ｃｔ）の範囲をカバーした。より低い制限は、ベースライン計算のために適切な数の記録を得るように選択され、より高い制限は、サンプル評価のための十分な感度を達成するように選択された。
【００７７】
選択されたＣＧは、次の第一の基準を満たすべきである；ｉ）偽遺伝子（既知または試験中に出くわす）がないこと、ｉｉ）非常に高いまたは低い発現を除く高位または中位の発現、ｉｉｉ）正常ＰＢサンプルと白血病サンプルとの間のＣＧ発現に有意な差がないおよびｉｖ）ＰＢおよびＢＭ間のＣＧ発現に有意な差がない。除外のための第二の基準も識別される：ｉ）任意の潜在的な性による用量効果（dosage gender effect）を避けるためにＸ染色体があること、ｉｉ）診断時の１の白血病タイプ（ＡＭＬ、ＡＬＬまたはＣＭＬ）または正常ＰＢ内の変動性およびｉｉｉ）細胞周期依存発現。
【００７８】
２のＣＧ：ＡＢＩプライマーおよびプローブのセット（表３６）を用いて試験された１８Ｓ  ｒＲＮＡ  およびＴＢＰがそれらの発現レベルにしたがって除外された。４の高度に発現されたＣＧ（ＰＯ、ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤおよびＢ２Ｍ）の中で、Ｂ２Ｍのみが偽遺伝子を持つとは知られていない。しかしながら、ＡＢＩセットによって分析されたＢ２Ｍ発現は、正常および白血病サンプル間およびＰＢおよびＢＭ間で有意に異なっていた（両方の場合においてｐ＜０．００１、ｎ＝６５、マン・ホイットニー検定）。したがって、ＡＢＩ  Ｂ２Ｍセットは放棄された。ＡＢＩプレート上で中位の発現を有する５の残るＣＧの中で、第二の理由：ＨＰＲＴおよびＰＧＫ（Ｘ染色体があること）およびＴＦＲＣ（造血細胞における変動性のある発現）のために３つが放棄された。
【００７９】
４のＣＧをカバーする６のさらなるプライマーおよびプローブのセットの中で、ＰＢおよびＢＭ間に統計的に有意な差が観察されなかったので、組織内のＢ２Ｍ  ＲＱ−ＰＣＲセットが適しているようであった。４の正常サンプルのみが試験されたので、正常および白血病サンプル間の比較は可能でなかった（材料および方法を参照のこと）。中位の発現を有するＣＧの中で、ＥＡＣセットにより増幅されたＴＢＰ転写産物が適正な中間発現レベルを有していた（Ｃｔ＝２５．７）。ＰＢＧＤおよびＰＢＧＤ２のセットは、類似の中間Ｃｔ値を示した（Ｃｔ＝２７）。しかしながら、選択的な転写開始点の存在のため、これらのＰＢＧＤセットは、最終的には放棄された。２のＡＢＬセットの中間Ｃｔ値は、Ｃｔ値が相関する（ｒ＝０．８７、ｎ＝２０）ものの、同一ではなかった（表３６）。中間Ｃｔ値がより低いので、ＡＢＬ  ＥＡＣセットが実施された。
【００８０】
したがって、最初の選択過程の後、遺伝子の数は、５：ＡＢＬ、Ｂ２Ｍ、ＣＹＣ、ＧＵＳおよびＴＢＰに低減した（表３６）。
【００８１】
（正常ＰＢＭＮＣにおける発現の変動性）
これらの５の最初に選択されたＣＧは、正常なドナーから５の局所的に調製されたＰＢサンプルを用いて６のＣＧ研究所のそれぞれにおいてさらなる分析に付された。ＲＱ−ＰＣＲ分析は、最適化されたＥＡＣ  ＲＴおよびＰＣＲ手技を用いて実施された。ＡＢＬ、Ｂ２Ｍ、ＣＹＣおよびＧＵＳのＣｔ値における変動は類似しており、全てが３のＣｔ値内であった（図３７）。これらの４のＣＧの線を結ぶとほぼ平行であった。このため、Ｃｔ値における変動は、ｃＤＮＡ合成の効率の差および／またはＲＮＡの最初の量（下記参照）の変動のせいであるとされてもよい。対照的に、ＴＢＰ遺伝子転写産物は、５のＣｔ値の変動（３２倍に等しい）および非平行のサンプル線を示し、これは、ＴＢＰ遺伝子発現のより大きい変動を示す（図３７）。したがって、ＴＢＰ遺伝子は、さらなる分析から除外された。
【００８２】
（プライマー／プローブのセットのｃＤＮＡ特異性）
ヒト内因性対照プレートのために用いられたプライマーおよびプローブの配列は利用可能でなかったので、ＣＹＣおよびＧＵＳ遺伝子に対する新しいプライマーおよびプローブのセット（ＥＡＣセット）が設計および試験された。３の異なるＣＹＣプライマー／プローブのセットが、２の研究所において評価され、各セットが偽遺伝子の存在に起因してゲノムＤＮＡを増幅させることが見出された。このため、ＣＹＣは、さらなる分析から除外された。
【００８３】
偽遺伝子または偶然のゲノム相同性に起因する偽陽性結果の危険性を評価するために、ＡＢＬ、Ｂ２ＭおよびＧＵＳ  ＥＡＣプライマー／プローブのセットが５の研究所において、正常なドナーおよび白血病患者から得られた１５０のゲノムＤＮＡサンプル（研究所当たり３０）について試験された。Ｂ２ＭおよびＧＵＳに対する全てのＲＱ−ＰＣＲ分析は陰性であり、これに対して、ＡＢＬ  ＲＱ−ＰＣＲでは、５の試験研究所のうちの３においてサンプルの７％（１０／１５０）が陽性であった（それぞれ、ｎ＝２、３および５の陽性結果）。しかしながら、Ｃｔ値の範囲は３５〜４５（データは図示せず）であり、したがって、良好な質のＲＮＡサンプルを用いて得られたＣｔ値からは大きくかけ離れていた。結果として、ある程度の残存するＤＮＡがＲＮＡサンプル中に存在していたとしても、これは、ＣＧデータに大きくは影響しないだろう。したがって、発明者らは、ＤＮＡの低レベル増幅に基づきＡＢＬプライマーセットを除外しないことを決めた。結論として、表３７に示されるＡＢＬ、Ｂ２ＭおよびＧＵＳのプライマー／プローブのセットがさらなる試験のために潜在的な候補ＣＧとして選択された。
【００８４】
（正常および白血病サンプルにおけるＣＧ発現）
最初の研究でｃＤＮＡ合成およびＲＱ−ＰＣＲプロトコルのための最適条件を確立し、最適のＣＧを規定した後、ＥＡＣネットワークは、正常および白血病サンプルにおける選択されたＣＧの発現での生物学的な変動を確立することを進めた。
【００８５】
（新鮮なサンプルにおける選択されたＣＧの発現）
この見込みのある研究は、正常なドナー（ｎ＝１２６）並びに診断時の白血病患者（ｎ＝１８４）について実施された。この特定の採取ではＭＲＤも研究され得るので、正常なＰＢＳＣ（ｎ＝２６）が試験された。寄与研究所並びにサンプルタイプおよび数は、表３８に示されている。
【００８６】
正常なサンプルでは、ＡＢＬ遺伝子発現は、ＰＢ、ＢＭおよびＰＢＳＣ間で有意な差はない（図３８ａ）。逆に、全体的に線形のモデル（ｐ＜０．００１、ｎ＝１２６）を用いて分析された場合にはＢ２Ｍ遺伝子発現は３の異なるサンプルのタイプ（ＰＢ、ＰＢＳＣおよびＢＭ）間で有意に異なる。しかしながら、ポストホック分析は、ＰＢまたはＰＢＳＣサンプルにおけるＢ２Ｍ発現レベルは類似していることを示した（図３８ｂ）。ＧＵＳ遺伝子発現は、全体的に線形のモデル（ｐ＜０．００１，ｎ＝１２６）を用いる３のサンプルのタイプ間で有意に異なっていた。ポストホック分析は、ＧＵＳ発現はＰＢにおいて有意により低いが、ＢＭおよびＰＢＳＣ間で有意には異ならないことを示した（図３８ｃ）。白血病サンプルでは、ＣＧ発現は、ＢＭおよびＰＢ間またはＡＬＬ、ＡＭＬおよびＣＭＬ間で有意には異ならないが、ＧＵＳ発現は例外であった（ｐ＝０．０３，ｎ＝１８４）（図３８ａ、ｂ、ｃ）。
【００８７】
正常および白血病サンプル間の比較は、ＡＢＬ発現のみが有意には異ならないこと（ｐ＝０．２１，ｎ＝３１０）を示した（図３８ａ）。対照的に、全体的に線形のモデルを用いるＢ２ＭおよびＧＵＳ発現に対しては有意な相違（ｐ＜０．００１，ｎ＝３１０）が見出された（図３８ｂおよびｃ）。同一のサンプル（ｎ＝３１０）についてＣＮではなくＣｔ値が分析された場合、類似の結果が得られた。
【００８８】
（新鮮な正常および白血病サンプルにおけるＣＧ発現に対する基準値）
発明者らは、ＣＧ発現の範囲を評価し、続いて、低品質サンプルを識別するために、新鮮なサンプルについての基準値を確立することを決めた（材料および方法の項を参照のこと）。基準値は、目標（中間離）および２の制限（３％および９７％）によって規定された。この範囲外のサンプル（新鮮なサンプルの６％）は、予期しない結果として考えられた。高すぎるＣｔ値を有し、結果として低すぎるＣＮを有するサンプルは、抑制因子（inhibitor）を含む劣化されたと思われるサンプル（単数または複数）であり、これに対して、低すぎるＣｔ値を有し、このため高すぎるＣＮ値を有するサンプルは、過大評価されたＲＮＡ定量化に関連付けられ得る。１２６の正常サンプルおよび１８４の診断時の白血病サンプルに基づく基準値が表３９に示されている。
【００８９】
正常なサンプル（ｎ＝１２６）では、ＡＢＬおよびＧＵＳ発現では約５０倍の相違、Ｂ２Ｍ発現では７０倍に至る相違が見出された（表３９）。白血病サンプル（ｎ＝１８４）では、ＡＢＬおよびＧＵＳ遺伝子発現では約１００倍の相違、Ｂ２Ｍ発現では５００倍に至る相違が観察された（表３９）。平均値（中間値ではない）および２の標準偏差を用いるパラメトリックなアプローチは、同様の結果を、百分率に基づく方法論（データは図示せず）に与えた。
【００９０】
（保管されたサンプルにおけるＣＧ発現）
識別されたＦＧ転写産物を有する、保管された診断時白血病サンプル（ｎ＝３１１）についてのデータは、ＦＧグループから得られた。品質劣化していないサンプルが、上記に規定された基準値にしたがって選択され、これにより、品質劣化または抑制因子の存在に起因してＣＧの増幅が粗悪なまたはない場合を除外した。ＡＢＬは、ＧＵＳまたはＢ２Ｍに比較してサンプルを含むことについてより限定的なＣＧであり（除外されたサンプルの比率は、それぞれ、１１％、９％および６％）、結果として、このＣＧのために分析されたサンプルの数はより少なくなった。ＴＥＬ−ＡＭＬ１ネットワークでは５７サンプルのうちの３０のみがＧＵＳ転写産物発現について試験されたので、２５７サンプルの結果のみが最終的にこのＣＧに対して利用可能であった。
【００９１】
新鮮な白血病サンプルについて実施された前述の分析（上記を参照のこと）に類似する分析が実施された。ＡＢＬ遺伝子転写産物のＣＮのみが組織および白血病タイプ間で（ｐ＝０．５０，ｎ＝２７７）またはＢＭおよびＰＢサンプルが合流された場合にはＦＧ転写産物グループ間で（ｐ＝０．１０，ｎ＝２７７，図６ａ）有意には相違していなかった。対照的に、Ｂ２Ｍ遺伝子転写産物のＣＮは、組織および白血病タイプ間（ｐ＝０．０３，ｎ＝２９０）およびＦＧ転写産物グループ間（ｐ＝０．０４，ｎ＝２９０，図３９ｂ）で有意に相違していた。また、ＧＵＳ遺伝子発現は、組織および白血病タイプ間（ｐ＜０．００１，ｎ＝２５７）およびＦＧ転写産物グループ間（ｐ＜０．００１，ｎ＝２５７，図３９ｃ）で有意に異なっていた。
【００９２】
（対照遺伝子および融合遺伝子間の相関）
どんなＣｔまたはＣＮ値が用いられた場合でも３のＣＧの発現レベルは常時相関されていた（ｐ＜０．０１）。最も高い相関は、新鮮な正常サンプルでのＡＢＬおよびＢ２Ｍ（ｒ＝０．７３）またはＧＵＳ（ｒ＝０．７２）のＣｔ値間（図４０ａ）および新鮮な白血病サンプルにおけるＡＢＬおよびＧＵＳ（ｒ＝０．８０）のＣｔ値間（図４０ｂ）で見出された。
【００９３】
保管された白血病サンプルでは、最も高い相関がＢ２ＭおよびＧＵＳ遺伝子のＣｔ値間で見出され（ｒ＝０．６７）、これに対して、最も低い相関が同一のサンプルにおけるＡＢＬおよびＧＵＳ遺伝子のＣｔ値間で観察され（ｒ＝０．５４）、これは、これら２の遺伝子の異なる品質低下の速動性を示唆している。最終的には、ＦＧ転写産物発現およびＡＢＬ遺伝子転写産物発現間の相関は、２の他のＥＡＣ選択ＣＧより高いか同一である。
【００９４】
（対照遺伝子の選択）
ＡＢＬ遺伝子発現は正常および診断時の白血病サンプル間で有意には異ならないことが上記に示された。さらに、３の広く試験されたＣＧのうちで、ＡＢＬ遺伝子発現は、診断時サンプルにおいてＦＧ転写産物との最も高い相関を有していた。本発明者らの研究では、ＭＲＤ検出のモデル（フェーズＩＩＩｂ）において、ＦＧ発現のＣＧとしてのＡＢＬの発現への規格化（normalization）が、未処理（規格化していない）ＣｔまたはＣＮ値と比較して、得られたＦＧ転写産物結果の再現性を改善した。したがって、発明者らは、診断および追跡調査サンプルにおける規格化のための第一選択のＣＧとしてＡＢＬを用いることを提案する。第二選択として、発明者らは、Ｂ２ＭまたはＧＵＳのいずれかを、それらの診断時の制限的なＦＧ転写産物発現およびＮＣＮの変動性との相対的な相関に応じて用いることを推奨する。実際に、ＣＧの低発現レベルでの単離されたサンプルの識別は、ＲＮＡの劣化またはこのようなサンプルにおける抑制因子の存在を示唆する。他方、試験された全サンプルに対する低減されたまたは消失したＣＧ増幅の観察は、ＲＴまたはＰＣＲ反応中の試薬の問題を示す。最後に、各患者ＲＮＡサンプルに対するＣＧ転写産物のＣＮは、予備ＰＣＲ工程の効率の規格化を許容する。
【００９５】
（標準曲線の比較（フェーズＩＩＩａ））
最低のＲＮＡ、ｃＤＮＡ（１０−３および１０−４）およびプラスミド（１０６、１０５および１０３コピー）希釈物に対するＣｔ値において、本部でおよび局所で調製されたｃＤＮＡサンプル間でさえも有意な差異が観察されなかった。最も高い希釈物に関しては、Ｃｔ値は、本部から分配されたｃＤＮＡ（１０−３および１０−４希釈物）およびプラスミド（１０および１００コピー）に対するほうがＲＮＡ希釈物に対するよりも研究所間でより再現性が高かった。制限的なＣＶは、ｃＤＮＡおよびプラスミドに対して５％未満で、最も高い希釈物でのＲＮＡに対して１１％であった。２のターゲットネットワーク（ＡＭＬ１−ＥＴＯおよびＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１  タイプＡ）において、この観察は、より一層の結果として、本部で調製されたｃＤＮＡサンプルと比較して、ＲＴが局所的に実施されたサンプルに対して有意なより少ない陽性の結果を生じた。ｃＤＮＡまたはプラスミド希釈物により確立された傾きが、参加研究所の大部分に対して理論的な傾き−３．３２（１００％効率）に近かった。対照的に、ＲＮＡ希釈物からの傾きは、転写中のＲＮＡ劣化におそらく起因するより低い反応効率を示していた。最後に、全ターゲットに対するＲＮＡ希釈物の感度レベルは、ＢＩＯＭＥＤ−１プログラム２４で設計された標準化されたネステッドＰＣＲに類似しており、ＰＭＬ−ＲＡＲＡのｂｃｒ２およびｂｃｒ３変異体に対してより一層良好であった。１０のプラスミドコピーは、一般的に、全ての研究所によって検出され得た（フェーズＩＩＩａおよびｂを参照のこと）。
【００９６】
（均衡無作為アッセイ（フェーズＩＩＩｂ））
このアッセイは、研究所間の転写産物定量化における相違を検出するために企画された。研究所は、４の異なるＦＧ転写産物を増幅させるために無作為に、一般的には、それらの元々のＦＧネットワーク外部から選ばれた（材料および方法の項を参照のこと）。この方法論はまた、偽陰性および陽性が、特定のＦＧに焦点を当てる研究所のみが実験を実施した他のフェーズに対して釣り合いがとれるように同一かどうかを検出するためにＱＣラウンドとして重要である。
【００９７】
（ＡＢＬ増幅）
−  プラスミド希釈物について
発明者らは、２５研究所の中で３のＡＢＬプラスミド希釈物に対して非常に類似した結果を観察した。発明者らは、ＡＢＬの１０５コピーのプラスミド希釈物に対して、２２．３０±０．３８（Ｃｔ±Ｓｄ，ｎ＝２９６）および１．７％の対応するＣＶを見出した。発明者らは、３のＡＢＬプラスミド希釈物に対するＡＢＬ  Ｃｔ測定に関して有意の研究所効果（無作為効果としてのセット）を見出した（ｐ＜０．００１，ｎ＝２９６）。しかし、反対の研究所間の相違は、１．２Ｃｔ以下であった。このような相違は、臨床の観点ではあまり関連しないようであった。材料および方法の項において規定された基準にしたがって、全ての研究所は、各ＡＢＬプラスミド希釈物のＣｔ値に対して再現性のある結果を有していた。
【００９８】
−  コード化されたＲＮＡサンプルについて
ＣｔまたはＣＮ値（図３０ａに例として与えられたＰＭＬ−ＲＡＲＡネットワークの結果）を用いてＡＢＬ発現が比較された場合、高度に希釈されたサンプル（１０−３および１０−４）および陰性サンプル間に有意な相違はネットワーク内で見出されなかったが、ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１ネットワークは例外である（ｐ＝０．０３）。逆に、発明者らは、同一のサンプル（例として図３０ｂに与えられたＰＭＬ−ＲＡＲＡネットワークの結果）について各ネットワーク内の研究所間に非常に有意な相違（ｐ＜０．００１）を見出した。このため、ＣｔおよびＣＮ値は、試験研究所に依存するが、サンプルに依存していなかった。これらのデータは、予備ＰＣＲ工程中に変動（転写およびＲＴ効率）が起こることを強く示唆する。
【００９９】
（融合遺伝子転写産物の増幅）
発明者らは、連続的な希釈物モデルにおいてＲＱ−ＰＣＲの結果を出すために最良のパラメータ（Ｃｔ、ＣＮ、ΔＣｔまたはＮＣＮ）に焦点を当てた。発明者らは、１１の異なる研究所（図３１に例としてのＰＭＬ−ＲＡＲＡネットワーク）において測定された３の希釈されたサンプルについての対応する相関係数を計算した。相関係数は、５のＦＧにおいてＮＣＮ法に対してより高く、２のＦＧにおいてΔＣｔ法を用いてわずかにより高く、これに対して、両方法は、残る２のＦＧに対して等価であった（表３３）。Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１転写産物の定量化に対してのみ、ＡＢＬは、ＲＱ−ＰＣＲ結果を規格化するためのＣＧとして有用でないようであった。全体として、規格化のためのＡＢＬ遺伝子転写産物の使用は、結果の線形性を大きく改善することが見出され（図３２に例としてのＰＭＬ−ＲＡＲＡネットワーク）、異なる希釈物間に観察されるＦＧ  ＣｔおよびＣＮ値の重複が回避された。
【０１００】
最後に、発明者らは、ＭＲＤ定量化に対するこのモデルの結果をチェックした。コード化されたＦＧ陽性サンプル（ｎ＝８２４、全９のＦＧターゲットをカバーする）に関連されたウェルに対するＣｔ値（Ｙ軸）およびＣＮ値（ｌｏｇ１０，Ｘ軸）間の相関曲線は、それぞれ、−３．３５の平均の傾きおよび３９．７の切片を示した。これらの良好な結果は、９の異なるプラスミドセット（転写産物当たり１）によってさえも、プラスミドセットがどんなものであったとしてもコード化されたＲＮＡサンプルにおけるＦＧ転写産物の定量化が類似することを示した。
【０１０１】
（診断時白血病サンプルにおける融合遺伝子発現レベル）
発明者らは、診断時に得られた５５の対になったＢＭおよびＰＢサンプルを比較した。ＭＬＬ−ＡＦ４ネットワークにおける２のさらなる対は、数が不十分であったため分析されなかった。統計分析は、サンプル源がＮＣＮとして表される関連ＦＧの診断時の発現レベルに有意な影響を有さないことを示したが、ＣＧとしてＢ２ＭまたはＧＵＳを用いるＰＭＬ−ＲＡＲＡは例外であった。これらの分析は、いずれかの診断材料源がＭＲＤ研究のための適切な基準として作用し得たことを示唆するだろう。全体として、各ＦＧ転写産物の中間のＮＣＮがＡＢＬ遺伝子転写産物のコピー当たり８．５コピー（Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１）から下の０．１コピー（ＳＩＬ−ＴＡＬ１）までの範囲で変動可能であった（図３３ａ）。このような結果は、Ｂ２ＭおよびＧＵＳ  ＣＧによっても観察された。異なるＦＧの相対的な発現レベルは、一般的に、規格化のために用いられたＣＧに関わりなく一致していた（図３３ｂ、ｃ）が、ある程度の不均一性が少数の場合において観察された（実施例の項におけるＰＭＬ−ＲＡＲＡ、ＡＭＬ１−ＥＴＯおよびＳＩＬ−ＴＡＬ１を参照のこと）。大抵の場合には、患者サンプルにおけるＦＧ転写産物のＮＣＮは、対応する細胞系対照において観察されたものに類似する（各実施例を参照のこと）。これらの結果は、情報が利用可能であった場合には、サンプルにおける芽球細胞の割合にしたがって修正された。
【０１０２】
（大腸菌ＲＮＡ中のＲＮＡ希釈物系列）
ＦＧ陽性細胞系または患者ＲＮＡは、１０倍の希釈工程を用いて、大腸菌ＲＮＡ中に希釈された（１０−１〜１０−６、材料および方法の項を参照のこと）。細胞系または患者ＲＮＡの最後の陽性希釈物と、対応する未希釈ＲＮＡにおけるＦＧおよびＣＧレベルを基礎にして予想された感度との間に、制限希釈物実験において一致が観察された。これらのデータは、純粋なサンプル中でのＣＮによるＣＧおよびＦＧの定量化が正しいことを示した。同一の希釈物についての線形性の回帰分析は、ＦＧ／ＣＧ比が純粋なサンプル中のＦＧ発現レベルに依存する３〜５対数希釈物にわたって有意には変化しない（２倍未満）ことを示した。これらの結果は、大きな希釈範囲についてのＦＧおよびＣＧに対する等しいＲＱ−ＰＣＲ増幅効率を示した。
【０１０３】
（ＲＱ−ＰＣＲデータの表現）
ＲＱ−ＰＣＲ分析によるＭＲＤモニタリングは、多点治療試行（multi-center therapeutic trial）での決定を行うための道具になっている。この理由のために、一定の方法で表現されることがＲＱ−ＰＣＲの結果にとって最も重要である。大部分の出版物は、標準曲線によるＦＧおよびＣＧ間のコピー数比を用いており、この比は、十進法値または百分率として表現される。標準曲線を得るために、研究所は、細胞系ＣｄｎａまたはプラスミドＤＮＡいずれかを用いた。これまでは、ΔΔＣｔ法を用いた著者は少数であり、発明者らの知識では、診断のｃＤＮＡの標準曲線はこれまで用いられていない。
【０１０４】
４の可能性が議論される：１）細胞系ＲＮＡ希釈物、２）診断サンプルに対する陽性細胞数の百分率、３）コピー数比および４）ΔΔＣｔ法。
【０１０５】
１）細胞系ＲＮＡ希釈物は、発明者らの研究に示されるように転写中の劣化に対して非常に高感度であるようである。１の細胞系に対する発現の変動性は、大きな変動を受け得る。このような潜在的な変動は、細胞系の供給源、ＲＮＡ抽出がなされた場合には細胞培養のタイミング、および最終的にはＲＴ効率に依存する。多点研究のために、このような困難を克服するための選択は、本部でｃＤＮＡを調製し、これを分配することであり得た。
【０１０６】
２）陽性細胞の頻度として表される結果は、他のＭＲＤ技術との直接的な比較を可能にするという大きな利点を有するだろう。さらに、この研究において観察されたように患者間のＦＧ転写発現レベルにおける変動性が与えられれば、それは個々の患者内のＦＧ転写低減の速動性のより信頼性の高い決定を可能にするだろう。しかしながら、このようなアプローチは、ＭＲＤの相対レベルが判断され得る診断材料の利用可能性次第である。単一細胞レベルでの治療中のＦＧ発現の精密なレベルおよびその変動が完全に明らかというわけではないので、発明者らは、最終的には、発明者らの実験でのターゲット（ＦＧ転写産物）と基準（ＣＧ転写産物）との比で結果を表現することを決定した。
【０１０７】
３）比（ＮＣＮ）は、ＡＢＬまたはＧＵＳ遺伝子転写産物のコピー当たりおよび高い発現レベルに起因してＢ２Ｍ遺伝子転写産物の１００コピー当たりのＦＧコピーとして表現された。この比は、開始ＲＮＡ量とは無関係であるべきである。この目的のために、発明者らは、プラスミド標準曲線を用いた。これは、転写産物のコピー数を直接的に定量する可能性を提示する。発明者のデータは、プラスミドがＲＱ−ＰＣＲ分析の研究所間または研究所内の規格化のために適した較正物質であることを示す。プラスミドＤＮＡは、おそらく、潜在的ＱＣ材料としてのｃＤＮＡの大規模な生成法を用いた場合には達成される見込みがないような安定性およびロバストネスを提供する良好な選択である
この方法の潜在的な欠点は次の通りである。第一に、発明者らは患者サンプルと同一の範囲内のＦＧコピーを含むプラスミド希釈物を用いたが、汚染の危険性がある。ＰＣＲ分析に対する通常の厳格な用心がこのリスクを制限するために常時要求される。第二に、プラスミド較正物質の使用が、患者サンプルのために利用可能なウェル数を低減させ、費用をわずかに増加させる。第三に、較正物質は、変動性を潜在的に増大させるさらなる工程／計算を導入する。最後に、ＤＮＡプラスミドは、ＲＴ効率を直接的には評価しない。しかし、患者サンプルにおけるＣＧ発現レベルは予備ＰＣＲ工程の対照を明らかに示す。
【０１０８】
４）ΔΔＣｔ法（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｕｓｅｒ’ｓ  ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２）は、これらの不利な点を有していないが、それ自体に制限がある。本方法は、各プレート毎に類似および一致するＦＧおよびＣＧアッセイの相対的な効率頼みであり、したがって、１７の対になったサンプルを含む７０のＣＭＬサンプルの分析のための発明者らの研究において１度出くわすようなＣｔ値の上昇によってアッセイ性能における劣化が検出され得るように、陽性ＲＮＡまたはｃＤＮＡの標準が型にはまったように含まれることが重要である。この方法は、専門家研究所において非常に効率的であり得、かつ、診断時のサンプルと比較したＭＲＤの相対レベルを決定するために用いられ得る。このアプローチは研究所内または外設定における実験間の変動の評価に向いていないかもしれないという懸念がある。これは、異なるグループ間のＲＱ−ＰＣＲデータを比較する場合、特に異なる機器が用いられる場合（今日少なくとも８の提供業者がある）に困難性を創り出すかもしれない。
【０１０９】
（ＥＡＣデータに基づくＲＱ−ＰＣＲ実験の感度レベルを評価するための提案）
（背景）
追跡調査中に患者サンプルにおいてＦＧ転写産物増幅の欠失に出くわした場合、得られた結果の信頼性および臨床上の関連を決定するために特定のアッセイに対する検出限界を評価することが必要である。この問題に取り組むために、発明者らは、所与の実験の感度レベルを計算するための２の式を提案する。コピー数の値の使用が以降に記録されることになる。
【０１１０】
（計算）
式は、大腸菌希釈物実験の結果および診断時サンプルにおいて１前後の傾きを有するＦＧ  ＣＮとＣＧ  ＣＮとの間の相関に基づく（各特定の実施例を参照のこと）。この式では、感度は、診断時のＦＧのＮＣＮおよびサンプルのＣＧ  ＣＮに直接的に関連付けられる。理想的には、計算は、芽球百分率に対する修正後の患者の診断時のＮＣＮに基づくべきである。利用可能でなければ、ＥＡＣデータが用いられ得る。このモデルでは、ＦＧプラスミドの１０コピーが任意の特定の融合転写産物に対して増幅されるべきである。１００コピーのみが増幅され得るならば、感度は１ｌｏｇ１０まで低減されるだろう。
【０１１１】
ＳＥＮＳ＝−ｌｏｇ１０（ＮＣＮ）−ｌｏｇ１０（ＣＧ  ＣＮ）
この式では、ＳＥＮＳは、診断時サンプルに対する実験の感度（ｌｏｇ１０）であり、１０ＳＥＮＳとして表現されるべきである。ＮＣＮは、診断時の患者サンプルの比、または、利用可能でないならばＥＡＣデータからの対応する中間ＮＣＮのいずれかである。
【０１１２】
式は、診断時の全てのＣＧに対して有効であるが、高いレベルの白血病細胞を含むサンプルについてのＢＣＲ−ＡＢＬ／ＡＢＬ比に対する過小評価への偏向に気づくべきである。しかしながら、ＡＢＬ遺伝子のみが、ＢＭとＰＢとの間および正常サンプルと診断時の白血病サンプルとの間に有意な差を全く示さない。このため、この式は、追跡調査中の実験の感度レベルを評価することに対してあらゆる相関がないＣＧとしてＡＢＬを有する場合にのみ用いられ得る。
【０１１３】
（現実の事例による３の例示）
（診断時）
患者Ａが診断時に小児科Ｔ−ＡＬＬを示す。ＰＢサンプル中のＳＩＬ−ＴＡＬ１  ＦＧ転写産物の調査が陰性のままである。発明者らのＥＡＣプロトコルを有するＲＱ−ＰＣＲを用いたＡＢＬ遺伝子転写産物の定量化は４６０００コピーである。このため、診断時のＰＢ（０．０９、表２２）における中間ＳＩＬ−ＴＡＬ１  ＦＧ転写産物発現に対するＥＡＣデータに基づく実験の推定された感度は、次の通りである：
ＳＥＮＳ
＝−ｌｏｇ１０（０．０９）−ｌｏｇ１０（４６０００）
＝−３．６（すなわち１０−３．６）
（再発時）
患者ＢがＴＥＬ−ＡＭＬ１陽性前駆体Ｂ−ＡＬＬの遅発性再発を示す。ＴＥＬ−ＡＭＬ１  ＦＧ転写産物のそのＰＢサンプルにおける定量化は、４１９０００コピーである。ＡＢＬ遺伝子転写産物の同じサンプルにおける定量化は１７０００コピーである。この患者に対するＴＥＬ−ＡＭＬ１／ＡＢＬ比は２５（４１９０００／１７０００）である。したがって、この患者におけるＴＥＬ−ＡＭＬ１  ＦＧ発現に基づく推定される感度は次の通りである。
【０１１４】
ＳＥＮＳ
＝−ｌｏｇ１０（２５）−ｌｏｇ１０（１７０００）
＝−５．６（すなわち１０−５．６）
（追跡調査の間）
同じ患者Ｂが３月後に、ＰＢおよびＢＭサンプルにおけるＴＥＬ−ＡＭＬ１  ＦＧ転写産物の検出のためにＲＱ−ＰＣＲを行った。ＴＥＬ−ＡＭＬ１  ＦＧ転写産物は、両サンプルにおいてＲＱ−ＰＣＲによって検出されない。ＰＢおよびＢＭサンプルについてのＡＢＬ遺伝子転写産物定量化の結果はそれぞれ７７００および１３７００コピーである。ＴＥＬ−ＡＭＬ１  ＮＣＮがＰＢおよびＢＭ間で有意には異ならないという観察（図１１）に基づいて、再発時（４１９０００／１７０００）でのこの患者における比が、この実験の感度を計算するために用いられる。
【０１１５】
ＳＥＮＳ（ＢＭ）
＝−ｌｏｇ１０（４１９／１７）−ｌｏｇ１０（１３７００）
＝−５．５（すなわち１０−５．５）
ＳＥＮＳ（ＰＢ）
＝−ｌｏｇ１０（４１９／１７）−ｌｏｇ１０（７７００）
＝−５．３（すなわち１０−５．３）
古典的ＲＴ−ＰＣＲ  ＦＧ転写産物追跡調査と比較して、この事例における感度は、患者に依存し、細胞系サンプルに依存しない。この方法論により計算された感度の閾値は、細胞系希釈物についての古典的なＲＴ−ＰＣＲ（５）に基づくものより明らかに精密である。
【０１１６】
本発明は、以下の非制限的な実施例によってさらに説明される。
【実施例】
【０１１７】
（実施例１：Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１融合遺伝子転写産物を有するｔ（１；１９）（ｑ２３；ｐ１３））
（１．１  背景）
白血病ＦＧ転写産物Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１は、Ｅ２ＡおよびＰＢＸ１（ｆｏｒｍｅｒｌｙ  ｐｒｌ）遺伝子のｔ（１；１９）（ｑ２３；ｐ１３）による融合に由来する。ｔ（１；１９）（ｑ２３；ｐ１３）は、幼児の３〜５％および成人の３％の前駆体−Ｂ−ＡＬＬにおいて見出される。９５％の事例において、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１転写産物が発現される。この発現は、細胞質Ｉｇのμ鎖の検出に緊密に関連付けられる。残存するｔ（１；１９）前駆体−Ｂ−ＡＬＬは、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１陰性であり、Ｅ２Ａ遺伝子の再配列を示さない。
【０１１８】
染色体１９上に位置するＥ２Ａ遺伝子は、へリックス−ループ−へリックスＩｇエンハンサー結合因子Ｅ１２およびＥ４７をコード化し、染色体１上のＰＢＸ１遺伝子は、ＤＮＡ結合ホメオボックスタンパク質をコード化する。Ｅ２Ａのゲノム構成は、明確に規定されており、切断点は、ほとんど排他的に、エクソン１３および１４間の３．５ｋｂイントロンにおいて発生する。ＰＢＸ１のゲノム構成は、未だ十分には知られておらず、切断点は、エクソン１および２間の約５０ｋｂのイントロン領域にわたって散在する。Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１  ＦＧ転写産物についての大部分の事例は、一定のＥ２Ａエクソン１３のＰＢＸ１エクソン２との接合部を示す（図３）。変異体ＦＧ転写産物は、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１陽性患者約５〜１０％において説明される。それは引き延ばし状の２７ヌクレオチドのＥ２Ａ−ＰＢＸ１接合点への挿入によって特徴付けられる。この挿入された配列は、おそらくＰＢＸ１の選択的スプライシングされたエクソンから生じる。
【０１１９】
ＦＧは、ＰＢＸ１のＣ末端ＤＮＡ結合ホメオボックスドメインに接合されたＥ２ＡのN末端転写活性化因子ドメインを含むキメラの転写活性化因子をエンコードする。Ｅ２Ａ−ＰＢＸ１タンパク質の転写活性は、インビトロおよびインビボの両方で立証される。
【０１２０】
ＭＲＤを評価するためにＥ２Ａ−ＰＢＸ１  ＦＧ転写産物のＲＴ−ＰＣＲ増幅を用いるいくつかの研究が報告された。それらの全ては、１０−４／−５までの検出閾値を示す定量化アッセイにより実施された。これらの報告のもので、追跡調査中にＥ２Ａ−ＰＢＸ１転写産物の存在または不存在下に治療成果を予測したものはない。偶発性のない生存（event-free survival）においてＰＣＲ−陽性およびＰＣＲ−陰性患者間に全く相違が見出されない７１の患者を含む最も大きい系列が、硬着（consolidation）治療の終了時に分析された。全てのこれらの研究は、ｔ（１；１９）陽性ＡＬＬ患者をモニタリングする際のＭＲＤの定量評価の制限に目標を定めており、ＲＱ−ＰＣＲ法等の定量的アプローチの重要性を強調する。
【０１２１】
（１．２  ＥＡＣデータ）
（１．２．１  プライマー設計および最適化（フェーズＩおよびＩＩ））
試験された２のプライマーおよびプローブのセットの中から、一方：ＥＮＦ１０１，ＥＮＲ１６１およびＥＮＰ１４１が選択された。位置およびヌクレオチド配列が図３および表５にそれぞれ示される。このセットは、ＨＬ６０  ＲＮＡ中のＥ２Ａ−ＰＢＸ１陽性細胞系６９７（ＡＣＣ４２としても知られる）ＲＮＡの高希釈物での安定期においてより高いΔＲｎ値を基礎として選択された。フェーズＩＩおよびフェーズＩＩＩ実験の間、プライマーおよびプローブのこのセットにより、７研究所のうち７で、６９７のＨＬ６０  ＲＮＡ中ＲＮＡの１０−４希釈物を検出することができた。典型的な増幅プロットの例（１０−１、１０−３、１０−４細胞系ＲＮＡ希釈物）が図４に示される。結論としては、ＥＮＦ１０１、ＥＮＲ１６１およびＥＮＰ１４１が変異体形態を含めた全てのＥ２Ａ−ＰＢＸ１融合転写産物の定量化のために適しているということだった。
【０１２２】
（１．２．２  ６９７の細胞系および診断時患者サンプルにおけるＥ２Ａ−ＰＢＸ１発現（フェーズＩＶ））
１の細胞系６９７および２７の診断時サンプル（１４のＢＭおよび１３のＰＢ）が分析された。芽球百分率（形態学的に規定される）が２のサンプル（１のＰＢおよび１のＢＭ）を除く全てにおいて利用可能であり、７４〜１００％の範囲（中間＝９６％）であった。対照遺伝子に対する中間値および９５％範囲およびＥ２Ａ−ＰＢＸ１のＣｔ値、並びに規格化されたＥ２Ａ−ＰＢＸ１のコピー数（芽球百分率にしたがって修正された）が、表６に記録されている。６９７の細胞系および患者サンプルにおけるＥ２Ａ−ＰＢＸ１およびＣＧに対して検出されたＣｔ値は類似しており、これは、それらが類似のレベルで発現されたことを示している。最も高い相関係数がＥ２Ａ−ＰＢＸ１およびＡＢＬ転写産物間に観察された。ＰＢおよびＢＭサンプルの中で、１０が対になったサンプルであり、疾患の提示時に同じ患者において採取された。統計的に有意な差異は、対になったサンプルにおけるＣｔまたはＮＣＮに関してＢＭおよびＰＢ間に観察され得なかった（図５）。
【０１２３】
（１．２．３  ＱＣラウンド（フェーズＩＩＩａ〜ＩＶａ））
種々のＱＣラウンド中に、１１の陰性サンプル（５の陰性ＲＮＡ、３のＮＡＣおよび３のＮＴＣ）および５の陽性サンプル（ＨＬ６０  ＲＮＡ中の６９７の細胞系ＲＮＡの１０−３（２サンプル）および１０−４（３サンプル）希釈物）が８〜１０の研究所において試験された（表７）。陰性サンプルのＥ２Ａ−ＰＢＸ１増幅は、１５６のウェルを計上した。３のウェル（３の異なるサンプルに対応する）は、陽性であることが見出された（２％）が、これらサンプルのどれも、材料および方法の項において規定された基準にしたがって陽性とは見なされなかった。陽性サンプルのＥ２Ａ−ＰＢＸ１増幅は、７８のウェルを計上した。１のみが陰性であるとみなされた（１％）。材料および方法の項において規定された基準にしたがって、以前のフェーズにおいて規定された感度閾値から期待されたように、全部で５の陽性サンプルは陽性であることが見出された。
【０１２４】
（実施例２：ＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子転写産物を有するｔ（４；１１）（ｑ２１；ｑ２３））
（２．１  背景）
ｔ（４；１１）（ｑ２１；ｑ２３）は、前駆体−Ｂ−ＡＬＬにおける最もよくみられる１１ｑ２３転座であり、ＭＬＬ（ＨＲＸ、Ｈｔｒｘ、ＡＬＬ１）およびＡＦ４（ＦＥＬ）遺伝子を含む。ＭＬＬ−ＡＦ４陽性は、小児および成人ＡＬＬの事例の５％で観察され、このサブグループは、幼児および治療誘導型ＡＬＬの４０〜６０％を計上する。哺乳動物ＭＬＬの機能は依然として未知の部分が大きいが、発生分化期の分節において中心的な役割を果たしているようである。最近のマウスＡＦ４ノックアウトは、この遺伝子がリンパ系統（lymphoid lineage）の個体発生に含まれる推定の転写因子をエンコードしていることを示唆した。インビボで示されたストレス誘導型細胞死に対するＭＬＬ−ＡＦ４陽性白血病の増大された抵抗性がそれらの乏しい予後に寄与するために示唆された。
【０１２５】
分子レベルで、ＭＬＬおよびＡＦ４遺伝子における切断点は、エクソン８および１２間（ＭＬＬ）およびエクソン３および７間（ＡＦ４）のイントロン内に広げられており、いくつかの転写産物が成人または幼児ＡＬＬのいずれかにおいてより頻度が高い（５）。１０−４感度によるネステッドＲＴ−ＰＣＲ技術を用いると、ＭＬＬ−ＡＦ４転写産物の低発現レベルは診断時の幼児ＡＬＬの１３％に達し、それらのうちのいくつかはサザン分析によるＭＬＬ−ＡＦ４の再配列に対して陰性であり、新鮮な正常ＢＭまたは胎児肝臓サンプルの約２５％であることが記録された。これらのデータに基づいて、著者らは、ＭＬＬ−ＡＦ４  ＦＧ転写産物に対するＲＴ−ＰＣＲアッセイがＭＲＤモニタリングのために適していないことを示唆した。しかしながら、これらの顕著な発見は、他のグループまたは他の技術によってこれまで確認されていない。
【０１２６】
それにも関わらず、同じ期間において、ネステッドＲＴ−ＰＣＲを用いる、２５のＭＬＬ−ＡＦ４陽性患者についての最初の見込みのあるＭＲＤ研究は、ＰＣＲの陽性（positivity）、再発および生存の間に有意な相関を示した。ＭＬＬ−ＡＦ４  ＦＧ転写産物の異種性、幼児および成人ＡＬＬにおけるそれらの相対的に低い発病率および古典的な治療によるそれらの乏しい予後は、このＲＴ−ＰＣＲターゲットに対して記録されたＭＲＤ研究の数の乏しさを説明する。
【０１２７】
（２．２  ＥＡＣデータ）
（２．２．１  プライマー設計および最適化（フェーズＩおよびＩＩ））
試験された３のプローブおよび６のプライマーのセットから、共通のプローブＥＮＰ２４２および共通のリバースプライマーＥＮＲ２６２（両方ともＳＦ４エクソン５上に位置される）が採用された（図６および表８）。ＭＬＬ−ＡＦ４  ＦＧ転写産物が非常に多岐にわたるために、全てのＭＬＬ−ＡＦ４変異体に対する共通のプライマー／プローブのセットは設計され得なかった。ＭＬＬ遺伝子上の２のフォワードプライマー：ＥＮＦ２０７（エクソン９）およびＥＮＦ２０８（エクソン１０）（５）が非幼児の少なくとも９０％および幼児ＭＬＬ−ＡＦ４  ＦＧ転写産物の６０％を増幅させるために用いられた。発明者らの知識では、ＲＱ−ＰＣＲのためのプライマー／プローブのセットは、今日まで、ＭＬＬ−ＡＦ４または任意の他のＭＬＬ  ＦＧ転写産物について出版されていない。
【０１２８】
３の細胞系：ＲＳ４；１１（ＭＬＬエクソン１０−ＡＦ４エクソン４）、ＭＶ４−１１（ＭＬＬエクソン９−ＡＦ４エクソン５）および２の選択的転写産物（ＭＬＬエクソン１０および１１−ＡＦ４エクソン５）を発現するＡＬＬ−ＰＯが試験のために利用可能であった。３のプラスミド：ＭＬＬ−ＡＦ４エクソン９−エクソン５、エクソン１０−エクソン４およびエクソン１１−エクソン５が構成された。典型的な増幅プロットの例（１０−１、１０−３、１０−４の細胞系ＲＮＡ希釈物）が図７に示されている。細胞系材料に関する発明者らの感度データは、ネステッドＰＣＲアッセイを用いるＭＬＬ−ＡＦ４  ＦＧ転写産物の検出に対して以前に観察されたもの（５）に類似していた。「クリーピング（creeping）曲線」現象は、陰性サンプルおよび大部分の関連研究所内で希少な事象であった（材料および方法の項および実施例９を参照のこと）。
【０１２９】
（２．２．２  細胞系および診断時患者サンプルにおけるＭＬＬ−ＡＦ４発現（フェーズＩＶ））
含まれる２２のサンプル（２の対になったサンプルを含む１４のＢＭおよび８のＰＢ）の中で、それらのうちの大部分（ｎ＝１９）は、ＡＬＬのためのフランス治療プロトコルＬＡＬＡ−ＦＲＡＬＬＥから採用され、マルセイユにて試験された。サンプル中の芽球細胞の百分率は、全サンプルについて知られておらず、したがって、結果は、この提案にしたがって修正されなかった。規格化されたＭＬＬ−ＡＦ４  ＦＧ転写産物発現（ＮＣＮ）は、細胞系（ｎ＝３）および患者間で類似するようである（表９）。ＭＬＬ−ＡＦ４  ＮＣＮ中の相違は、ＰＢおよびＢＭサンプル間で観察されなかった（図８）。発現の９５％範囲は、Ｂ２Ｍを用いるかＣＧを全く用いないで得られた結果に比較してＣＧとしてＡＢＬまたはＧＵＳのいずれかを用いた場合に低減した（表９）。さらに、ＭＬＬ−ＡＦ４およびＡＢＬ転写産物レベル間の相関が、診断時サンプルにおいて試験された３の対照遺伝子で観察された中では最も高かった（表９）。
【０１３０】
（２．２．３  ＱＣラウンド（フェーズＩＩＩａ〜ＩＶａ））
偽陰性サンプルは１０−３および１０−４希釈物に対してほとんど観察されなかった（６％，７／１１０）。偽陽性とも呼ばれる陰性サンプル（ＦＧ陰性サンプル、ＮＡＣおよびＮＴＣ）内のＭＬＬ−ＺＦ４  ｃＤＮＡの増幅は、３％（５／１７６）に制限され、個々の研究所に制限された（表１０）。偽陽性ウェルにおけるＣｔ値は常時３０より大きく、時間の大部分は３７より高かった。
【０１３１】
（実施例３：ＴＥＬ−ＡＭＬ１融合遺伝子転写産物を有するｔ（１２；２１）（ｐ１３；ｑ２２））
（３．１  背景）
ＴＥＬ（ＥＴＶ６）−ＡＭＬ１（ＣＢＦＡ２，ＲＵＮＸ１）  ＦＧ転写産物は、潜在の（cryptic）ｔ（１２；２１）（ｐ１３；ｑ２２）に由来し、幼時前駆体−Ｂ−ＡＬＬの約２５％に見出される。ＴＥＬおよびＡＭＬ１の両方が核転写因子をエンコードし、この核転写因子は、正常な造血にとって重要である。それらの融合が白血病誘発につながるのは、ＴＥＬの正常な機能を妨害すること、および／または、ＡＭＬ１ターゲット遺伝子発現をそこなう転写抑制因子を形成することによる。２の繰り返される転座切断点が記載される。第一のものは、ＴＥＬイントロン５およびＡＭＬ１イントロン１内で切断して、ＴＥＬエクソン５−ＡＭＬ１エクソン２  ＦＧ転写産物を発生させる。第二のものは、ＴＥＬ−ＡＭＬ１陽性ＡＬＬの約１０％において見出され、ＡＭＬ１イントロン２内で切断して、３９ｂｐより短いＴＥＬエクソン−ＡＭＬ１エクソン３  ＦＧ転写産物を発生させる（図９）。この後者のＦＧ転写産物も、ＡＭＬ１エクソン３を欠く転写産物と共に、選択的スプライシングの結果として、ＡＭＬ１エクソン２融合を有する場合に検出される。ＴＥＬイントロン４中に切断点を有する事例が記載されてはいるが、例外的であるのは変わりがない。
【０１３２】
ＴＥＬ−ＡＭＬ１陽性ＡＬＬの予後は依然として問題が多い。ＴＥＬ−ＡＭＬ１  ＦＧ転写産物の存在が高い４年後生存率（probability of 4 years-even free survival）と関わりがあることが同意されている。しかしながら、再発率が一般のＡＬＬの再発率に類似しており、大部分の再発が治療後に起こることを報告した著者も中にはいる。ある研究から他の研究へのこれらの変動が方法論の偏向または化学療法摂生の効力における相違に起因するかどうかは、依然として不明である。
【０１３３】
ＴＥＬ−ＡＭＬ１陽性ＡＬＬを有する患者に対するＭＲＤ結果を報告した研究はこれまでほとんどない。これらの研究の大部分は、転写レベルの定量的または半定量的評価に依存していた。前駆体−Ｂ−ＡＬＬにおける高頻度のＴＥＬ−ＡＭＬ１転写産物陽性は、ＭＲＤを追跡するためのこの転写産物にターゲットを向けた定量ＲＴ−ＰＣＲ戦略を開発するためにいくつかのグループによって促進された。予備データは、ＭＲＤが導入治療後でも患者の４０〜５０％で検出可能であり、何人かの患者で高ＭＲＤレベルが見出されたことを示す。しかしながら、ＴＥＬ−ＡＭＬ１融合の頻度が比較的高いにもかかわらず、患者の少数の系列のみがこれまでに分析され（常時患者数は３０人未満）、再発の希少性、さらには、それらが遅発性に発生する可能性によって、これまでのところ、あらゆる臨床的相関をなすことが困難であった。
【０１３４】
（３．２  ＥＡＣデータ）
（３．２．１  プライマー設計および最適化（フェーズＩおよびＩＩ））
試験のために用いられた細胞系は、ＴＥＬエクソン５−ＡＭＬ１エクソン２融合を示すＲＥＨ，９３であった。２のプラスミド構成物も用いられ、一方が、「長い転写産物」（ＴＥＬエクソン５−ＡＭＬ１エクソン２）を含み、他方が、「短い転写産物」（ＴＥＬエクソン５−ＡＭＬ１エクソン３）を含んでいた（材料および方法の項を参照のこと）。
【０１３５】
最適化フェーズの終了時に、１のプライマー／プローブのセット（ＴＥＬエクソン５上のＥＮＦ３０１、ＡＭＬ１エクソン３上のＥＮＲ３６１およびＴＥＬエクソン５上のＥＮＰｒ３４１）が最初に試験された５のセットから選択された（図９および表１１）。典型的な増幅プロットの例（１０−１、１０−３、１０−４細胞系ＲＮＡ希釈物）が図１０に示され；最適化されたＲＴおよびＰＣＲ条件は、ＰＢＬ  ＲＮＡ中のＲＥＨ細胞系の１０−４希釈物およびプラスミドの１０コピーを事例の１００％において検出することを可能にし、これは、ＢＩＯＭＥＤ−１  Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  Ａｃｔｉｏｎ（５）において以前に得られた結果と一致する。このプライマーのセットを用いるＴＥＬ−エクソン４融合を有する転写産物等の分子レベルの変動が未検出のままであることに留意される必要がある。
【０１３６】
（３．２．２  ＲＥＨ細胞系および診断時患者サンプルにおけるＴＥＬ−ＡＭＬ１発現（フェーズＩＶ））
ＴＥＬ−ＡＭＬ１発現は、ＲＥＨ細胞系および５７のＴＥＬ−ＡＭＬ１陽性前駆体−Ｂ−ＡＬＬ（２３の対になったサンプルを含む、３０のＢＭおよび２７のＰＢサンプル）において研究された（表１２）。サンプルは、１８〜１００％の白血病芽球を含んでいた。これらのサンプルの大部分は、セントルイス病院（パリ、フランス）の患者から得られた。ＮＣＮは、各サンプルに存在する芽球の百分率に対して計算および調節された。
【０１３７】
ＲＥＨ細胞系におけるＴＥＬ−ＡＭＬ１発現は、第一の白血病サンプルにおいて検出された範囲内であった。
【０１３８】
ＡＢＬ  ＮＣＮに対する有意な差は、同じ患者において診断時に収集されたＰＢおよびＢＭサンプルと比較した場合に、ＴＥＬ−ＡＭＬ１発現において観察されなかった（図１１）。
【０１３９】
（３．２．３  ＱＣラウンド（フェーズＩＩＩａ〜ＩＶａ））
前のフェーズにおいて規定された感度閾値から期待されたように、ＲＥＨ細胞系の１０−３および１０−４ＲＮＡ希釈物は、常時、材料および方法の項において規定された基準にしたがって陽性であることが見出された（表１３）。５×１０−５希釈物は、７／７の研究所において陽性であることが見出された。種々のＱＣランドの間、１１の陰性サンプル（６の陰性ＲＮＡおよび５のＮＡＣまたはＮＴＣサンプル）が７〜１１の研究所において試験され、全部で２７９の増幅ウェルに対応した（表１３）。これらのウェルの９（３％）が偽陽性であることが見出され、これは、上記の基準にしたがって、９３のうちの３（３％）の偽陽性サンプルに対応する。これらの偽陽性ウェルは、６の異なる研究所において観察された。３の陽性ウェルを有する偽陽性が観察された事例はなく、Ｃｔ値は、常時、３９より高かった。全ての偽陽性ウェルは、陰性ＲＮＡに対応する一方で、ＮＡＣおよびＮＴＣは、常時、陰性であった。この観察は、これらの偽陽性結果がＲＴ工程等の増幅に先立つ汚染に起因し得たことを示唆している。
【０１４０】
（実施例４：ＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍ−ｂｃｒ融合遺伝子転写産物を有するｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１））
（４．１  背景）
ＢＣＲ−ＡＢＬ  ＦＧは、フィラデルフィア染色体（Ｐｈ）の形成に関連付けられ、白血病において検出される最も一般的な遺伝子異常の１つである。ＡＬＬでは、Ｐｈは、成人の２５〜３０％および幼児の２〜５％の事例において検出される。頻度は低いが、それは、急性骨髄性白血病に関連付けられる。ＡＬＬサブセットでは、この遺伝子損傷は、非常に乏しい予後を付与することが知られており、結論として、異系骨髄移植を含めて、果敢な治療を計画する際にその検出が重要である。さらに、Ｐｈ染色体は、ＣＭＬの事例の９５％超において見出され、この疾患のホールマークになっている。分子レベルで、Ｐｈ染色体すなわちｔ（９；２２）は、ＢＣＲ遺伝子（染色体２２）の５’部のＡＢＬ遺伝子（染色体９）の３’部への近位に帰着する。大多数の患者において、ＢＣＲ遺伝子における切断点は、３の明白に規定された領域；ｉ）第一のイントロンの５５Ｋｂ配列（第二切断点クラスター領域（minor breakpoint cluster region：ｍ−ｂｃｒ）と呼ばれる）、ｉｉ）エクソン１２〜１６に及ぶ５．８Ｋｂ領域（第一切断点クラスター領域（major breakpoint cluster region：Ｍ−ｂｃｒ）と呼ばれる）およびｉｉｉ）最終のイントロン１９（μ−ｂｃｒと呼ばれる）内に密集される。μ−ｂｃｒ切断点の分析は、それらの極度の希少性に起因して議論されることはまずない。ｍ−ｂｃｒ切断点の場合には、ＢＣＲ遺伝子の第一のエクソン（ｅ１）がＡＢＬ遺伝子の第二エクソン（ａ２）に並置される。結果として生じる融合転写産物（ｅ１−ａ２）は、１９０Ｋｄａのキメラタンパク質（ｐ１９０）をエンコードする。このタイプのＢＣＲ−ＡＢＬ  ＦＧは、Ｐｈ陽性ＡＬＬの成人の６５％および幼児の８０％において見出される。ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子をエンコードするｐ１９０がＣＭＬにおいて見出されるのは散発性の事例のみである。
【０１４１】
多大な努力にも関わらず、ハイブリッドＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質が形質転換能力を得る分子機構は、依然として十分に理解されているわけではない。しかしながら、ＢＣＲ−ＡＢＬタンパク質は、増加され、かつ、脱調節されたチロシンキナーゼ活性を示し、それは、アポトーシスおよび成長因子非依存性成長の阻害につながる正常なサイトカイン依存シグナル形質導入経路を脱調節するようである。
【０１４２】
Ｐｈ＋  ＡＬＬ患者におけるＭＲＤの臨床値についての全ての研究は、ＢＣＲ−ＡＢＬ陽性細胞が強い化学療法によっても根絶され得ないことを示す。ＳＣＴによって試験された３６のＰｈ＋  ＡＬＬ患者の系統において、多変量分析によって、ＭＲＤのＲＴ−ＰＣＲ評価が継続的な完全な寛解に対する最良の予後指標であることが報告された。最近になって、１３のｍ−ｂｃｒ陽性ＡＬＬ患者のＲＱ−ＰＣＲ分析による追跡調査が報告された。全てのこれらのデータが示唆しているのは、Ｐｈ＋  ＡＬＬ患者において、臨床上の決定をなす際に助けとなるために、残余の白血病細胞の定量モニタリングがそれらの定量検出より価値が高いことを証明し得ることである。
【０１４３】
（４．２  ＥＡＣデータ）
（４．２．１  プライマー設計および最適化（フェーズＩおよびＩＩ））
「プライマーエクスプレス（登録商標）」ソフトウェアを用いて設計された４の異なるプライマー／プローブのセットの効率が、ＴＯＭ−１細胞系（ｅ１−ａ２接合またはｍ−ｂｃｒ）由来ＲＮＡのＨＬ６０細胞由来ＲＮＡへの１：１０系列希釈物実験において試験された。全てのプライマー／プローブのセットは非特異的増幅人為産物を含んでいないが、２のセットが安定期の感度およびΔＲｎ値の点で優れていた。両方のセットは、類似の増幅効率を有しており、１０−５の感度および１０−１細胞系希釈物においてΔＲｎ＞３．０に達した。広範囲な試験の後、ＥＮＦ４０２（ＢＣＲエクソン１に位置される）、ＥＮＲ５６１およびプローブＥＮＰ５４１（両方とも、ＡＢＬエクソン２に位置される）を含んでいたセットが選択された。リバースプライマーおよびプローブの両方がＢＣＲ−ＡＢＬ（Ｍ−ｂｃｒ）  ＦＧ転写産物のＲＱ−ＰＣＲ検出のために用いられたセットに対して共通する（図１２、表１４）。典型的な増幅プロットの例（１０−１、１０−３、１０−４細胞系ＲＮＡ希釈物）が図１３に示される。
【０１４４】
（４．２．２  ＴＯＭ−１細胞系および診断時患者サンプルにおけるＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍ−ｂｃｒ  ＦＧ発現（フェーズＩＶ））
ｍ−ｂｃｒ転写産物の基準インターバルを確立するために、発明者らは、診断時の一連のＡＬＬ患者からの１７のＢＭサンプルおよび７のＰＢサンプル並びにＴＯＭ−１細胞系由来の本部で調製され分配されたＲＮＡにおいてＦＧ発現を決定した（表１５）。アッセイされたＦＧおよび３のＣＧ転写産物に対して、別々の系列のプラスミド希釈物が、転写産物のコピー数を計算するために各実験において増幅された。増幅のために適切でないためにＡＢＬ  Ｃｔ＞２９３を有するサンプルが分析から除外されたが、全ての転写産物のＣｔ値は、一般的に、患者材料よりも細胞系においてより低かった（ＢＭおよびＰＢの両方）。これは、おそらく患者ＲＮＡのいくつかの量が少ないことに起因する。しかしながら、対照遺伝子による規格化の後には、ｍ−ｂｃｒ転写産物レベルは、患者およびＴＯＭ−１細胞系に類似しており、４の対になったＢＭおよびＰＢサンプルにおいてかなり類似していた（図１４）。
【０１４５】
ＡＢＬ  ｍＲＮＡを増幅させるために用いられたプライマーおよびプローブは、ＢＣＲ−ＡＢＬ  ＦＧ  ｍＲＮＡを増幅させることもでき、したがって、データを規格化するために用いられたＡＢＬ遺伝子発現のアッセイは、サンプル中のｍ−ｂｃｒ転写産物のレベルによって影響を及ぼされるかもしれない。
【０１４６】
（４．２．３  品質コントロールラウンド（フェーズＩＩＩａ〜ＩＶａ））
３回のＱＣラウンドにおいて３／１２９ウェルのみが偽陰性結果を与え（詳細は材料および方法を参照のこと）、全ての場合において１０−４ＴＯＭ−１希釈物に対して偽陰性が得られた。さらに、偽陽性結果は、ＰＣＲ試験の５．３％において検出された（１３／２４６、表１６）。
【０１４７】
（実施例５  ＢＣＲ−ＡＢＬ  Ｍ−ｂｃｒ融合遺伝子転写産物を有するｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１））
（５．１  背景）
大部分の事例のＣＭＬは、フィラデルフィア染色体として知られる小さい派生染色体２２に帰結するｔ（９；２２）の存在と関連付けられる。結果として染色体９上のＡＢＬプロトオンコジーンが染色体２２上のＢＣＲ遺伝子に融合される。ＣＭＬ患者およびフィラデルフィア陽性成人ＡＬＬ患者の約３５％では、染色体２２上の切断点が、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１２〜１６間のいわゆる第一切断点クラスター領域（major breakpoint cluster region：Ｍ−ｂｃｒ）に位置される。染色体９上の切断点は、大抵の場合、ＡＢＬ遺伝子においてエクソン１および２間に位置される。このＢＣＲ−ＡＢＬ  ＦＧの転写産物生成物は、８．５ｋｂの異常融合ＲＮＡであり、これは脱調節された活性を有するチロシンキナーゼであるＢＣＲ−ＡＢＬキメラタンパク質（ｐ２１０）を生じさせる２の接合変異体ｂ２ａ２および／またはｂ３ａ２を有する。ｂ２ａ３およびｂ３ａ３  ＢＣＲ−ＡＢＬ転写産物を有する希少な事例が観察され得る。
【０１４８】
その高い感度のために、定量ＲＴ−ＰＣＲはＣＭＬにおける残留性の疾患をモニタリングするために広く用いられるが、部分的に矛盾した結果を生じた。異系ＢＭ移植（BM transplantation：ＢＭＴ）を受けた患者の一連の分析が示したのは、繰り返されたＰＣＲポ陽性が再発の危険性が増加することと相関したということである。逆に、他の研究は、ＰＣＲ陽性および続く再発間の相関を全く見出さず、異系ＢＭＴの長期生存者は、移植から複数年経過しても決して再発もなくＰＣＲ陽性であり得た。
【０１４９】
ＢＣＲ−ＡＢＬ  ＦＧ転写産物のレベルを定量化するための競合ＲＴ−ＰＣＲ法が、ＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍＲＮＡ検出の予測値を改善する努力する中でいくつかのグループによって開発された。ＢＭＴを受けた患者の一連の分析が示したのは、患者が依然として血液学的および細胞遺伝学的に緩解した状態にありながら、ＢＣＲ−ＡＢＬ  ＦＧ転写産物レベルのモニタリングが切迫した再発を予測するのに有用であり得るということである。定量ＲＴ−ＰＣＲ研究に基づいて、２のグループが「分子レベルの再発（molecular relapse）」パラメータを規定することを提案した。さらに、ＢＣＲ−ＡＢＬ  ＦＧ転写産物の定量化がまた、インターフェロンαに対する応答およびイマチニブ（Imatinib）治療患者をモニタリングするのに有用であることが分かった。
【０１５０】
遭遇する報告が多いにも関わらず、競合ＲＴ−ＰＣＲを用いたＢＣＲ−ＡＢＬ  ＦＧ転写産物のモニタリングは、臨床上の影響を制限した。これは、部分的には、このアプローチが標準化するのが困難であるという事実に起因する。実時間ＰＣＲの出現以来、いくつかのグループがこの技術によりＣＭＬ患者をモニタリングすることの実行可能性を記載する報告を発表した。しかしながら、大部分のＲＱ−ＰＣＲ研究は、含まれる患者が余りにも少なすぎるかまたは異なる治療プロトコルからの患者であり、これは、方法論の困難性と相まって、臨床上の影響を評価することおよびＲＱ−ＰＣＲによりＣＭＬ患者をモニタリングするための一般的なガイドラインを規定することが困難なものとしていた。ＲＱ−ＰＣＲために標準化されたプロトコルの利用可能性は、異なるセンター間のデータ比較を容易にし、患者が再発する可能性がある閾値を規定することおよび究極的には、ＢＣＲ−ＡＢＬ  ＦＧ転写産物の速動性に基づいて早期治療介在の影響を評価することを可能にするだろう。
【０１５１】
（５．２  ＥＡＣデータ）
（５．２．１  プライマー設計および最適化（フェーズＩおよびＩＩ））
２の選択的なフォワードＢＣＲプライマー（一方は、ＢＣＲエクソン１３（エクソンｂ２）上に位置され、他方は、ＢＣＲエクソン１４（エクソンｂ３）上に位置される）およびリバースＡＢＬプライマーおよびプローブ（両者とも、ＡＢＬ遺伝子の第二のエクソン上に位置される）が設計された（図１２）。このセットは、ネットワーク内で既に利用可能な５の類似セットと共に、ＰＣＲ反応の感度並びにロバストネスについて評価された（材料および方法の項を参照のこと）。これらのパラメータに基づいて、ＥＡＣグループによって設計されたセットが選択された。Ｋ−５６２細胞系の希釈物系列が２のフォワードプライマーのいずれかを用いて等価の効率で増幅されてから、ＢＣＲエクソン１３（エクソンｂ２）上に位置される１の共通のフォワードプライマーＥＮＦ５０１が、融合変異体ＢＣＲ−ＡＢＬ  ｂ３−ａ２およびｂ２−ａ２の両方を増幅させるために選択された（図１２、表１７）。典型的な増幅プロットの例（１０−１、１０−３、１０−４細胞系ＲＮＡ希釈物）が図１５に示されている。
【０１５２】
（５．２．２  Ｋ−５６２細胞系および診断時患者サンプルにおけるＢＣＲ−ＡＢＬ  Ｎ−ｂｃｒ発現（フェーズＩＶ））
−  ＣＭＬに関し、Ｋ−５６２および診断時の患者において
ＢＣＲ−ＡＢＬ  Ｍ−ｂｃｒ転写産物の発現は、診断時のサンプルにおけるＦＧ発現レベルの範囲を確立するために、２９のＣＭＬ患者において定量化された（表１８、図１６ａ）。これらのサンプルは、１５のＢＭおよび１４のＰＢを含んでいた。ＣＧ対するＢＣＲ−ＡＢＬ  ＦＧの発現は、ＢＭおよびＰＢ間で非常に類似していた。ＢＣＲ−ＡＢＬ  Ｍ−ｂｃｒ発現レベルにおける大きな変動は、個々の患者間に見出されなかった。Ｋ−５６２細胞系におけるＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍＲＮＡの発現は、Ｂ２Ｍに対して２ｌｏｇおよびＧＵＳ遺伝子に対して１ｌｏｇだけＣＭＬ診断時サンプルより高いことが見出された（表１８を参照のこと）。
【０１５３】
−  ＢＣＲ−ＡＢＬ  Ｍ−ｂｃｒ陽性ＡＬＬにおいて
慢性期のＣＭＬ患者からの診断時サンプルに加えて、ＢＣＲ−ＡＢＬ  Ｍ−ｂｃｒ発現が診断時のＢＣＲ−ＡＢＬ  Ｍ−ｂｃｒ陽性ＡＬＬサンプルにおいて定量化された（表１９、図１６ｂ）。Ｂ２ＭおよびＧＵＳに対するＢＣＲ−ＡＢＬの発現は、ＣＭＬサンプルと比較してＡＬＬサンプルにおいてより高いことが見出された（表１８および１９）。発明者らは、ＣＧとしてＢ２ＭまたはＧＵＳのいずれかを用いてＭ−ｂｃｒ  ＡＬＬおよびＣＭＬ患者間の発現のＦＧレベルにおける統計上の差異を観察した（ｐ＝０．００１）が、ＡＬＬにおいてｍ−ｂｃｒおよびＭ−ｂｃｒ間に差は観察されなかった（図１７）。
【０１５４】
ＡＢＬ対照遺伝子を増幅させるために設計されたプライマーセットはエクソン２上に位置され、ＢＣＲ−ＡＢＬ  ＦＧも増幅させた。この理由のために、対照遺伝子としてのＡＢＬの使用は、高比率の細胞がＢＣＲ−ＡＢＬを発現する場合にＣＭＬおよびＰｈ＋  ＡＬＬサンプルにおけるＢＣＲ−ＡＢＬを定量化するためのバイアスを導入し得た。比（ＢＣＲ−ＡＢＬ／ＡＢＬ）を用いることは、最大比が１であるので、理論的にはこれらのサンプルにおける腫瘍負荷の過小評価につながるだろう。しかしながら、このバイアスは、診断時のＦＧ転写産物の相対的な定量化に小さい影響を有していた（下記を参照のこと）。発明者らは、診断時のＣＭＬ患者のＢＭにおいて３．０までの値およびＰＢサンプルにおいて４．４までの値を見出したが（表１８）、全ての中間ＢＣＲ−ＡＢＬ／ＡＢＬ比は１より小さかった。ただし、診断時のＰＢ  ＣＭＬ患者については例外である（表１５および１８）。プラスミド較正物質により得られたこれらの予期しない結果は、較正物質なし（ΔＣｔ法）で確認され、ＲＱ−ＰＣＲによる遺伝子転写産物定量化の精度の限界を明らかに示した。同様の結果がオリゴ中心の関連において観察された。
【０１５５】
（５．２．３  品質コントロールラウンド（フェーズＩＩＩａ〜ＩＶａ））
偽陰性の百分率は、第一および第二の品質コントロールラウンドに対して４．９％（１４／２８５）であった（表２０）。偽陰性を示した研究所は、特定フェーズにおける全てのターゲットに対する感度において一致した低下を有しており、これは、より低い感度に対する原因は、ＰＣＲ関連の問題よりも低いＲＴ効率にあることを示していた。
【０１５６】
第三の品質コントロールラウンド（フェーズＩＶａ）では、ＦＧ陰性サンプル内の偽陽性結果の特定の高い頻度（１８％、４／２２）にも関わらず以前のフェーズに類似する偽陽性の割合（５．５％、６／１１０）が観察された（表２０）。この観察は、おそらく、１０−１希釈物ではなくコード化されたサンプルの中に未希釈Ｋ−５６２  ＲＮＡを含み、その結果、ｃＤＮＡをＰＣＲプレート上にピペット注入する場合に隣接ウェルを偶発的に汚染する危険性が増加することによって説明される。大部分の偽陽性サンプル（ＮＡＣ／ＮＴＣ）が個々の研究所において蓄積される一方で、その他の研究所（ＱＣラウンド当たり１の研究所）が偶然に単一の偽陽性ウェルを示したかまたは全く偽陽性ウェルを示さなかったことが留意されるべきである。
【０１５７】
（実施例６：  ＳＩＬ−ＴＡＬ１融合遺伝子転写産物を有する１ｐ３２上の染色体内微欠失（intra-chromosomal microdeletion））
（６．１  背景）
１ｐ３２上の微欠失（microdeletion）は、幼時Ｔ−ＡＬＬにおいて見出される最も頻度の高い染色体異常である。微欠失は、ＴＡＬ１遺伝子（Ｔ細胞急性白血病１遺伝子（T cell acute leukemia 1 gene）、幹細胞白血病（stem cell leukemia：ＳＣＬ）としても知られている）またはＴ細胞白血病遺伝子５（ＴＣＬ５）および約９０ｋｂ上流に位置されるＳＩＬ遺伝子（ＳＣＬ中断遺伝子座：SCL interrupting locus）を含んでいる。結果として、ＴＡＬ１コード化配列は、Ｔ細胞において発現されるＳＩＬプロモーターの制御下に置かれており、結論として、ＴＡＬ１遺伝子は、含まれるＴ−ＡＬＬにおいて異常に発現される。
【０１５８】
ＴＡＬ１遺伝子、特に、エクソン４、５および６は、４２ｋＤａのタンパク質をエンコードし、これは、基本的ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写因子である。ＴＡＬ１タンパク質は、Ｅ２Ａファミリーの構成要員を含む他のｂＨＬＨ転写因子によりヘテロダイマー化することができ、造血系統の発生分化のための必須因子である。ＳＩＬ遺伝子は、即時型（immediate-early）遺伝子ファミリーの構成要員であるが、造血細胞におけるその機能は、未だ明確に定義されていない。
【０１５９】
ＳＩＬおよびＴＡＬ１遺伝子の両方がいくつかの保存された欠失切断点を含むが、大抵の場合（≧９５％）は、ｔａｌｄｂ１またはｔａｌｄｂ２切断点と組み合わせてｓｉｌｄｂ１切断点を含む。選択的スプライシングによって、３の異なるＳＩＬ−ＴＡＬ１転写産物が形成され得、このうち、タイプＩＩ転写産物が最も支配的なものである。ＳＩＬ−ＴＡＬ１転写産物の発生と予後または成果との間に明らかな関係はない。
【０１６０】
ＳＩＬ−ＴＡＬ１転写産物は、Ｔ−ＡＬＬにおいて広く見出されており、Ｔ−ＡＬＬにおいてそれらは患者の５〜２５％で存在する。頻度は、Ｔ−ＡＬＬの免疫表現型（ＳＩＬ−ＴＡＬ１  ＦＧの存在がＣＤ３−およびＴＣＲαβ＋  Ｔ−ＡＬＬに制限される）およびＴＣＲＤ遺伝子欠失の発生に関連付けられる。ＳＩＬ−ＴＡＬ１  ＦＧ転写産物は、成人と比較して幼児においてより頻繁であるようである。
【０１６１】
ＤＮＡレベルでのＴＡＬ１欠失の検出は、すでに記載されている。最近の報告は、Ｔ−ＡＬＬ患者におけるＤＮＡレベルでのＴＡＬ１欠失を検出するためのタックマン（登録商標）ベースのＲＱ−ＰＣＲ法を記載した。その報告では、フォワードプライマーおよびプローブがＳＩＬエクソン１ｂ（および続くフォワードイントロンの一部）に配置され、リバースプライマーがＴＡＬ１エクソン１ｂ中に位置された。ＣＥＭ細胞系を用いれば、１０−５の感度が得られ得、これは、単一の白血病ゲノムと等価である。発明者らの知識では、ＳＩＬ−ＴＡＬ１  ＦＧ転写産物に対するＲＱ−ＰＣＲプライマー／プローブのセットは、これまでのところ出版されていない。
【０１６２】
（６．２  ＥＡＣデータ）
（６．２．１  プライマー設計および最適化（フェーズＩおよびＩＩ））
最初に、３のタックマン（登録商標）プローブ（ＳＩＬエクソン１ａ、ＴＡＬ１エクソン４およびＴＡＬ１エクソン５中に位置される）、２のフォワードプライマー（両方ともＳＩＬエクソン１ａ中に位置される）および５のリバースプライマー（２がＴＡＬ１エクソン３中に、２がＴＡＬ１エクソン４中に、１がＴＡＬ１エクソン６中に位置される）が特異性および効率のために試験された。
【０１６３】
単一のフォワードプライマー（ＥＮＦ６０１；ＳＩＬエクソン１ａ中に位置される）、リバースプライマー（ＥＮＲ６６４；ＴＡＬ１エクソン３中に位置される）およびプローブ（ＥＮＰ６４１；ＳＩＬエクソン１ａ中に位置される）が選択された（図１８および表２１）。典型的な増幅プロットの例（１０−１、１０−３、１０−４細胞系ＲＮＡ希釈物）が図１９に示される。
【０１６４】
選択されたプライマー／プローブのセットは、事実上、全てのＳＩＬ−ＴＡＬ１転写産物（最も一般的なタイプＩＩ並びにタイプＩＩＩ）を検出することになるが、明らかな再配列なしでＴＡＬ１転座すなわちＴＡＬ１遺伝子の「異常」発現を検出することはない。
【０１６５】
（６．２．２  細胞系および診断時患者サンプルにおけるＳＩＬ−ＴＡＬ１発現（フェーズＩＶ））
６の異なるＳＩＬ−ＴＡＬ１陽性細胞系の未希釈ＲＮＡがＣＧ発現（ＡＢＬ、Ｂ２ＭおよびＧＵＳ）に対して２回、ＳＩＬ−ＴＡＬ１  ＦＧ発現に対して３回試験された（表２２）。３の研究所において、全部で１６の診断時ＳＩＬ−ＴＡＬ１陽性患者（５の対を含む１０のＢＭおよび１０のＰＢサンプル）も含まれていた。
【０１６６】
ＣＧ転写産物に対するＣｔ値は、患者サンプルと比較して細胞系において有意により低く（表２２）、これは、保存された患者サンプルが用いられたかまたはそれらの発現が主要な患者サンプルよりも細胞系においてより高い事実に起因するかもしれない。ＳＩＬ−ＴＡＬ１転写産物発現（Ｃｔ、ＣＮおよびＮＣＮ）は、試験された６の細胞系間で類似していたが、患者では、ＳＩＬ−ＴＡＬ１  ＦＧ転写産物発現においてわずかに大きい変動が見出された（表２２）。それにもかかわらず、規格化されたＳＩＬ−ＴＡＬ１  ＦＧ転写産物発現は、細胞系と患者との間で異ならなかった。さらに、ＢＭおよびＰＢサンプル（５の対を含む）間の比較が示したことは、ＳＩＬ−ＴＡＬ１転写産物発現が両方の区画において類似することであった（図２０）。
【０１６７】
（６．２．３  ブラインドサンプルによる品質コントロールラウンド（フェーズＩＩＩａ〜ＩＶａ））
偽陽性は、４６のＦＧ陰性サンプルのうちの２において観察され（４．３％）、１６２のＮＡＣ／ＮＴＣウェルのうちでは観察されず（０％）、結果として、全体の偽陽性は１．０％（２／２０８）であった。偽陰性は第一のＱＣラウンド（フェーズＩＩＩａ）において観察されたのみであり、次の２回のＱＣラウンドでは観察されなかった（表２３）。したがって、偽陰性は、問題ではないようであるが、これは、白血病細胞サンプルにおけるＳＩＬ−ＴＡＬ１  ＦＧ転写産物のレベルに依存するかもしれない。
【０１６８】
（実施例７：ＰＭＬ−ＲＡＲＡ融合遺伝子転写産物を有するｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１））
（７．１  背景）
ＰＭＬ−ＲＡＲＡ  ＦＧ転写産物（ｔ（１５；１７）（ｑ２２；ｑ２１）転座の分子の結果物）は、ＡＰＬの事例の大部分に関連し、Ｍ３細胞形態を有する明瞭なＡＭＬサブセットである。
【０１６９】
ＡＰＬは、南ヨーロッパのより若い成人における新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）ＡＭＬの１０〜１５％を計上する。小児科患者の中で、ＡＰＬの発病率は、通常、より低く、３〜９％を計上すると考えられるが、イタリアの協同研究から出版されたデータが示しているのは、成人に観察されるのと同じ発病率でイタリアの子供にＡＰＬが発生するということである。さらに、中央および南アメリカにおける異なる国からのいくつかの小さい系列が小児ＡＰＬの予想より高い頻度を示した。
【０１７０】
ｔ（１５；１７）に融合された２の遺伝子はＰＭＬおよびレチノール酸レセプターα（retinoic acid receptor α：ＲＡＲＡ）遺伝子であり、ＰＭＬは染色体１５上に位置され、レチノール酸レセプターα遺伝子は、染色体１７上に位置される。他の遺伝子は、ｔ（１５；１７）に対して陰性の細胞形態学ＡＰＬの場合の希少な例、例えば、染色体１１ｑ２３上のＰＬＺＦ、５ｑ３５上のＮＰＭ、１１ｑ１３上のＮＵＭＡおよび１７ｑ２１上のＳＴＡＴ５Ｂ等においてＲＡＲＡに融合されることが示される。
【０１７１】
キメラＰＭＬ−ＲＡＲＡタンパク質は、転写抑制因子である。リガンド（レチノール酸、ＲＡ）を欠く場合には、それは、ＳＭＲＴ（ＲＡＲおよびＴＲに対するサイレンシング・メディエーター：silencing mediator for RAR and TR）およびＮ−ＣｏＲ（核内受容体補抑制物質：nuclear receptor co-repressor）等の補抑制物質と共にＤＮＡに結合し、クロマチンを転写活性化因子または基本転写機構部分（basal transcription machinery）に近づけないようにする。
【０１７２】
ＲＡＲＡの切断点は、常時、長さが１７Ｋｂであるイントロン２において発生する（図２１）。対照的に、ＰＭＬ遺伝子座の３の領域：イントロン６（ｂｃｒｌ；事例の５５％）、エクソン６（ｂｃｒ２、５％）およびイントロン３（ｂｃｒ３；４０％）がｔ（１５；１７）転座切断点に含まれる（図２１）。結果として、３の可能なＰＭＬ−ＲＡＲＡ異性体があり、これらは、ロング（Ｌすなわちｂｃｒ１）、バリアント（Ｖ、すなわちｂｃｒ２）およびショート（Ｓ、すなわちｂｃｒ３）として表される。ＰＭＬ遺伝子のエクソン６における変動可能な切断点位置およびＦＧ転写産物における変動可能な数のＲＡＲＡイントロン２誘導型ヌクレオチドの包含のために、ＰＣＲ生成物のサイズがｂｃｒ２陽性の場合に変動することが留意されるべきである。キメラＰＭＬ−ＲＡＲＡおよびＲＡＲＡ−ＰＭＬ転写産物は、ＰＭＬおよびＲＡＲＡ遺伝子座（loci）間の相互の転座の結果として形成される。しかしながら、ＲＡＲＡ−ＰＭＬ  ＦＧ転写産物が全てではないが大抵のＡＰＬ事例において存在するという観察は、ＰＭＬ−ＲＡＲＡ  ＦＧ転写産物を診断時およびモニタリング中のＡＰＬ細胞の検出のためのＰＣＲターゲットとして使用するのに有利である。ＰＭＬ−ＲＡＲＡ  ＦＧ転写産物のＲＴ−ＰＣＲ分析に対して標準化された条件がＢＩＯＭＥＤ−１  Ｃｏｍｃｅｒｔｅｄ  Ａｃｔｉｏｎによって開発された（５）。異なるＰＭＬ切断点領域の存在並びにＰＭＬの中央のエクソン間の選択的スプライシングの存在によって発生された種々のＰＭＬ−ＲＡＲＡ  ＦＧ転写産物の検出を可能にするプライマーセットが設計された。
【０１７３】
最近の１０年において、オール・トランスのレチノール酸（all-trans retinoic acid：ＡＴＲＡ）による分化治療（differentiation therapy）の利用可能性は、ＡＰＬを有する患者の成果において著しい進歩を引き起こした。挑戦は、予備治療特徴を基礎にすると高い信頼性で区別され得ず、かつ、最初の緩解での集中的な治療から潜在的に利益を得ることができる、特に再発の危険がある患者の比較的小さいサブグループをいかに識別するかにある。全体として、一般的に同意されていることは、硬着（consolidation）後の陽性ＰＭＬ−ＲＡＲＡ試験が続く血液学的な再発の強い予測変数であり、これに対し、繰り返して陰性の結果は、大部分の患者において長期生存に関連付けられることである。１のグループは、治療完了後に行われた３月のＢＭ監視骨髄によって検出されるＰＣＲ陽性の再出現が再発の高い予測性を有することを報告した。このような戦略を用いると、再発の約７０％が首尾良く予測された。再発の危険が高いＡＰＬ患者を識別するためのＭＲＤの用途における異なる予測がＭＲＣ  ＡＴＲＡ試験に用いられ、ここでは、分子レベルの緩解を達成する速動性が評価された。最後に、分子レベルの再発時に早期治療を達成する利点は依然として証明される必要があるが、予備的な証拠は、このような戦略を支持する。
【０１７４】
異なる方法（特定の抗体で染色する従来の核型であるＦＩＳＨおよびＰＭＬ）の中で、ＰＭＬ−ＲＡＲＡ  ＦＧ転写産物のＲＴ−ＰＣＲ検出（５）がＭＲＤ検出に適した唯一のアプローチであるようである。さらに、定量ＰＣＲは、治療の早期における疾患の異なるレベルと臨床上の成果と間の相関についての情報を提供し得た。しかしながら、ＡＰＬ患者にＲＱ−ＰＣＲの使用を報告する研究は比較的ほとんどない。
【０１７５】
（７．２  ＥＡＣデータ）
（７．２．１  プライマー設計および最適化（フェーズＩおよびＩＩ））
ＲＡＲＡ遺伝子エクソン３上の１のプローブおよび２のリバースプライマーが、ＰＭＬ遺伝子上の７のフォワードプライマーと組み合わせて評価された。５のフォワードプライマーは、ＰＭＬエクソン６中に設計され、２および３の特定のプライマーは、それぞれ、ｂｃｒ１およびｂｃｒ２の切断点に対するものであり、他方、ｂｃｒ３に対する２のプライマーは、ＰＭＬエクソン３中に設計された。ｂｃｒ２  ＰＭＬ切断点の局在性についての出版されたデータに基づいて、ＰＭＬエクソン６上の各フォワードプライマーは、ｂｃｒ２の場合の少なくとも８０％をカバーするために設計された。試験のために利用可能な唯一の細胞系は、ＮＢ−４，１６５であり、これは、ｂｃｒ１  ＰＭＬ切断点を有する。ｂｃｒ２およびｂｃｒ３プライマー／プローブのセットの評価のために、診断時の患者ＢＭ  ＲＮＡが用いられた。全ての３のＰＭＬ−ＲＡＲＡ切断点変異体に対するプラスミド構成物が作製された（材料および方法の項を参照のこと）。
【０１７６】
細胞系および患者ＲＮＡおよびプラスミド希釈物について広く試験した後、３の特定のプライマー／プローブのセット：プローブ（ＲＡＲＡ  ＥＮＰ９４２）、共通のリバースプライマー（ＲＡＲＡ  ＥＮＲ９６２）および３のＰＭＬフォワードプライマー（ＥＮＦ９０３（ｂｃｒ１に対する）、ＥＮＦ９０６（ｂｃｒ２に対する）およびＥＮＦ９０５（ｂｃｒ３に対する））が、最大の感度に基づいてそれぞれ選択された（図２１）。配列は表２４に列挙される。ＥＮＦ９０６はｂｃｒ１並びにｂｃｒ２の事例を増幅させるために潜在的に用いられ得るが、ＮＢ−４細胞系の一連の希釈物におけるＰＭＬ−ＲＡＲＡの増幅に対するＥＮＦ９０６およびＥＮＦ９０３の直接的な比較は、後者のプライマーがｂｃｒ１の場合の増幅に対してより感度の高いアッセイを提供することを示した。典型的な増幅プロットの例（ＰＢＬ  ＲＮＡ中の１０−１、１０−３、１０−４ＮＢ−４  ＲＮＡ（ｂｃｒ１））が図２２に示される。
【０１７７】
（７．２．２  細胞系および診断時患者サンプルにおけるＰＭＬ−ＲＡＲＡの発現（フェーズＩＶ））
ＰＭＬ−ＲＡＲＡの発現は、ＮＢ−４細胞系および１６の陽性ＡＭＬ−Ｍ３  ｂｃｒ１患者において研究された（表２５、図２３）。６の対になったＢＭ／ＰＢサンプルを含む１４のＢＭおよび９のＰＢサンプルからなる患者サンプルが診断時に得られた。サンプルは、白血病芽球の１０〜１００％を含んでいた。規格化されたコピー数が、各サンプルに存在する芽球の百分率に対して計算および調節された。ＮＢ−４細胞系におけるＰＭＬ−ＲＡＲＡの発現は、主要な白血病サンプルにおいて検出されたＦＧ発現の範囲内であった。
【０１７８】
ＰＭＬ−ＲＡＲＡの発現が、６のＢＭおよび４のＰＢサンプルからなる（４の対になったＢＭ／ＰＢサンプルを含む）診断時の６のｂｃｒ３陽性患者において研究された。数はかなり制限されているが、対になったサンプルについてのＰＢおよびＢＭを比較したときにＰＭＬ−ＲＡＲＡ  ｂｃｒ３の発現において有意な差は観察されなかったが、Ｂ２Ｍの規格化された結果は例外であった（図２３を参照のこと）。
【０１７９】
（７．２．３  ＱＣラウンド（フェーズＩＩＩａ〜ＩＶａ））
種々のＱＣラウンドの間、１４５の陰性サンプルが３のフェーズの間に７〜１１の研究所において試験された（表２６）。１００のＮＡＣ／ＮＴＣサンプルのうちの５（５％）および４５のＦＧ陰性サンプルのうちの５（１１％）がｂｃｒ１増幅に対して偽陽性であった（表２６）。全体として、偽陽性の頻度は、６．９％（１０／１４５）であった。いわゆる偽陽性は、個々の研究所に制限され、偽陽性ウェルにおけるＣｔ値は、常時、３０を超え、時間の大部分は３５より長かった。
【０１８０】
対照的に、上記の基準にしたがって、１０−３および１０−４希釈物に対する偽陰性サンプル（ｎ＝９６）は、ｂｃｒ１、ｂｃｒ２またはｂｃｒ３のいずれに対しても観察されなかった。１０−４希釈物でｂｃｒ２およびｂｃｒ３に対して独立して試験された４２のウェルのうちどれも、偽陰性としての結果が得られなかった。１０−４希釈物でｂｃｒ１に対して試験された１８０ウェルのうちの８（４．４％）のみ偽陰性としての結果になった。
【０１８１】
（実施例８：ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１融合遺伝子転写産物を有するＩｎｖ（１６）（ｐ１３ｑ２２））
（８．１  背景）
染色体１６の狭動原体逆位（pericentric inversion）（ｉｎｖ（１６）（ｐ１３ｑ２２））は、新しく診断されたＡＭＬ事例の約８〜９％において見出される。ｉｎｖ（１６）陽性ＡＭＬは、ｔ（８，２１）転座を有するものと共に、一般に「コア結合因子（Core Binding Factor：ＣＢＦ）」白血病として参照されるグループに含まれる。両方共、造血において必須の役割を担う異種植皮の転写因子ＣＢＦの構成要素をコード化する遺伝子の再配列を特徴とするからである。Ｉｎｖ（１６）または希少ｔ（１６；１６）（ｐ１３；ｑ２２）は、ＣＢＦＢ鎖遺伝子の平滑筋ミオシンの重鎖遺伝子ＭＹＨ１１との融合につながる。結果として生じるＦＧ  ｍＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲによって検出され得、診断およびモニタリング研究の両方に対する適切な分子マーカーを示す。これまでに、１０の異なるＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１  ＦＧ転写産物が報告された。陽性患者の８５％超がタイプＡ転写産物を有し、タイプＤおよびＥ転写産物はそれぞれほぼ５％示し、全ての他のタイプは、散発的な場合において発生する。ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１陽性ＡＭＬは、通常、好ましい予後を有すると考えられ、患者の５０％超が長期ＣＲを得ている。従来の化学療法によるこのような好ましい結果によって何人かの著者が考えるようになったのは、適切なドナーが利用可能なときでも同種ＢＭＴ（allo-BMT）がこれらの患者において第一のＣＲを強化する必要性を示さないということである。それにも関わらず、再発率は依然として高く、血液学的ＣＲの間にＭＲＤを検出するための信頼できる方法が緩解治療後の強度を特定の患者コホート（cohort）により良好に適合させるために必要とされていることを示している。これまでに、ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１  ＦＧ転写産物を検出するために採用された定量ＲＴ−ＰＣＲベースの方法の使用は、ＣＲにおける患者の予後サブグループの矛盾がない識別を可能にしなかった。実際に、標準ネステッドＲＴ−ＰＣＲの使用は、相容れないＭＲＤ結果を引き起こした。すなわち、最も多い報告では、延期されたＣＲにおける大多数の患者がＰＣＲ陰性であることが見出された一方で、少数の長期生存者は、ＲＴ−ＰＣＲ陰性とは決して考えられなかった。さらに、ＰＣＲ陰性患者の１０〜２０％は、結局は再発し、これは、ＰＣＲ陰性の
達成が治療と同じ意味合いでないことを示唆している。上記結果を解釈する際の困難性のいくつかが、含まれる方法論の標準化を欠くことに由来するかもしれない。競合ＰＣＲまたはＲＱ−ＰＣＲを用いる定量ＲＴ−ＰＣＲ研究は、導入および硬着治療の早期の間のＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１  ＦＧ転写産物における減少をモニタリングすることを可能にした。しかしながら、これまでに調査された患者数が少ないことに起因して、速動性または再発を予測するための遮断レベルを規定することは可能ではない。
【０１８２】
（８．２  ＥＡＣデータ）
（８．２．１  プライマー設計および最適化（フェーズＩおよびＩＩ））
フェーズＩの間、発明者らは、６のプライマー／プローブのセットを試験した。３はＡ形態に対するものであり、２はＤ形態に対するものであり、１はＥ形態に対するものである。ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１転写産物のタイプＡ、ＤおよびＥは全事例の約９５％を示すので、これらの転写産物を増幅させるために発明者らは、ＣＢＦＢエクソン５上に位置される共通のフォワードプライマー（ＥＮＦ８０３）およびＣＢＦＢエクソン５上に位置される共通のプローブ（ＥＮＰｒ８４３）を用いることを決定した。タイプＡに対してはＭＹＨ１１エクソン１２上（ＥＮＲ８６２）、タイプＤに対してはＭＹＨ１１エクソン８上（ＥＮＲ８６３）およびタイプＥに対してはＭＹＨ１１エクソン７上（ＥＮＲ８６５）にそれぞれ位置される３の異なるリバースプライマー（図２４および表２７）が選択された。典型的な増幅プロットの例（１０−１、１０−３、１０−４ＲＮＡ希釈物）がＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１転写産物の全てのタイプに対して図２５に示される。
【０１８３】
（８．２．２  ＭＥ−１細胞系および診断時患者サンプルにおけるＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１の発現（フェーズＩＶ））
ＭＥ−１細胞系の純粋なＲＮＡ（タイプＡ）が８の異なる研究所において試験された（表２８）。さらに、２４のタイプＡ患者、３のタイプＤ患者および４のタイプＥ患者の診断時のＢＭまたはＰＢサンプルが分析された（図２６）。診断時のＦＧ転写産物の値は、患者の全ての３のカテゴリーにおいて類似していたが、患者毎の変異の範囲が１ｌｏｇであることを示している。
【０１８４】
（８．２．３  ＱＣラウンド（フェーズＩＩＩａ〜ＩＶａ））
１０−３希釈物に対する偽陰性結果は観察されず、これに対して、１０−４希釈物で、最大１２％の偽陰性結果が観察された（表２９）。偽陽性はＮＡＣおよびＮＴＣウェルにおける全てのフェーズの間には見られなかった（０％、ｎ＝１０４）が、フェーズＩＶａの間に偽陽性の単一の事例（１６のうちの２ウェル）がコード化されたＦＧ陰性サンプルにおいて観察されたが、原因は汚染であった（表２９）。
【０１８５】
（実施例９：ＡＭＬ１−ＥＴＯ融合遺伝子転写産物を有するｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２））
（９．１  背景）
ＡＭＬ１（ＣＢＦＡ２，ＲＵＮＸ１）−ＥＴＯ（ＭＴＧ８）遺伝子融合は、ＡＭＬに関連付けられる最も一般的な染色体再配列であるｔ（８，２１）（ｑ２２；ｑ２２）に由来し、幼児および若い成人のＡＭＬの事例の約８％において検出される。ＡＭＬ１遺伝子は、異種植皮転写因子ＣＢＦ（コア結合因子：core binding factor）のα２サブユニットをエンコードする。異種植皮転写因子ＣＢＦは造血発生分化のために重要であり、そのβサブユニットが、ＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１  ＦＧにつながる（実施例８を参照のこと）ｉｎｖ（１６）／ｔ（１６；１６）によって妨害される。
【０１８６】
図２７に示されるように、ＡＭＬ１の切断点は、イントロン５内に位置され、これに対してＥＴＯの切断点は、エクソン２の上流に発生する。これは、ＡＭＬ１エクソン５がＥＴＯエクソン２（５）に融合される単一タイプのＡＭＬ１−ＥＴＯ  ＦＧ転写産物を生じさせ、これにより、多数の切断点領域を有するＦＧ（ＭＬＬ−ＡＦ４を有するｔ（４；１１）、ＰＭＬ−ＲＡＲＡを有するｔ（１５；１７）およびＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１を有するｉｎｖ（１６）等）と比較して分子スクリーニング戦略およびＭＲＤモニタリングが単純になる。
【０１８７】
ＡＭＬ１−ＥＴＯは、第一のＣＲにおけるＢＭＴの型にはまった使用をしても全体的にも生存利益を付与しないようなｔ（８；２１）を有する患者の一般的に好ましい成果の点で、ＭＲＤ検出のための重要なＰＣＲターゲットである。したがって、最も重要であるのは、さらなる治療によって得をし得る再発の危険性が高い患者の比較的小さいサブグループを識別することである。しかしながら、ＡＭＬ１−ＥＴＯ陽性ＡＭＬにおけるＭＲＤ検出の役割は、化学療法後の長期緩解中の患者のＦＧ転写産物である自家移植したＢＭＴ／ＰＢＳＣＴおよび同等のａｌｌｏＢＭＴの検出の点で少しばかり問題がある。病気が治った患者における残余の転写産物の検出は、ＡＭＬ１−ＥＴＯのみではＡＭＩの仲介をするには不十分である証拠を提供するとみなされ、最近では、緩解骨髄に存在する幹細胞、単球およびＢ細胞の一部に関係することが示された。したがって、ｔ（８；２１）陽性ＡＭＬが治ったと考えられた患者におけるＰＣＲ陽性の比較的頻繁な報告は、他のＡＭＬ  ＦＧターゲットに対する感度（典型的には１０４〜１０５中の１）と比較して、ＡＭＬ１−ＥＴＯ  ＲＴ−ＰＣＲアッセイに対して共通して達成されるより高いレベルの感度（典型的には１０５中の１〜１０６中の１）を反映した可能性がある。最近の研究が従来の定量ＲＴ−ＰＣＲがＡＭＬ１−ＥＴＯ陽性ＡＭＬにおいて独立した予後因子を提供する可能性を有することを示したという事実に関わらず、この患者サブグループにおける治療アプローチを決定する手段としてのＭＲＤ検出に対する感度の高い「終了点」アッセイの適性に関して何らかの懸念がある。
【０１８８】
最近数年にわたって、定量ＲＴ−ＰＣＲ法は、それらが再発が運命づけられる患者の比較的小さいサブグループをより高い信頼性で識別得るかどうか決定するために調査された。競合ＲＴ−ＰＣＲアッセイは、診断時の事例間でＡＢＬに対してＡＭＬ１−ＥＴＯ発現において変動を示し（ＢＭにおいて１０倍、ＰＢにおいて３２倍）、ＡＭＬ１−ＥＴＯおよびＡＢＬ  ｍＲＮＡが比較的安定であることを示唆している。さらに、これらの研究は、化学療法後のＦＧ転写減少の変動する速動性を示した。低いか検出できないレベルのＡＭＬ１−ＥＴＯ転写産物を有する患者はＣＣＲの持続に関連付けられ、再発を予測する転写産物数は高いかまたは上昇する。これらの将来有望な予備的データは、ＲＱ−ＰＣＲがこのＡＭＬサブセットでのＭＲＤモニタリングに対して変動可能である可能性があるが、後者の技術が、労力負担がより少なく、より再現性が高くかつ大規模な臨床試験に使用することに向いている標準化に対して影響を受けやすいという付加された利点を有することを示唆する。ＲＱ−ＰＣＲの予備的な研究は競合ＲＴ−ＰＣＲにより得られた結果を必然的に確認し、診断時ＢＭにおけるＡＭＬ１−ＥＴＯ発現レベルにおいて３．５〜２０倍の変動を示したが、これは、芽球百分率に関係せず、かつ、治療に対する応答を評価する場合を考慮に入れる必要があった。さらに、化学療法に対する応答の速動性における変動可能性が留意され、興味深いことに、ＡＭＬ１−ＥＴＯ転写産物もＡＭＬから長期緩解にある患者において検出された。しかしながら、ＲＱ−ＰＣＲの予測値は、大多数の患者被験者において首尾一貫した治療アプローチに対して確立されるべきままである。
【０１８９】
（９．２  ＥＡＣデータ）
（９．２．１  プライマー設計および最適化（フェーズＩおよびＩＩ））
最初に、Ｍａｒｃｕｃｃｉら（７）によって出版されたプライマーおよびプローブの配列が、２の「組織内」セットと共に試験された。前者のプライマー／プローブのセットが感度の点で優れていたが、発明者らは、陰性対照サンプルにおいて大きな繰り返されるバックグラウンドシグナルを観察した。したがって、発明者らは、このプライマーセットに類似する２の新しいプローブを設計することを決定し、切断点上に位置されるＥＮＰ７４７を、ＡＭＬ１エクソン５上に位置されるフォワードプライマーＥＮＦ７０１およびＥＴＯエクソン２上のリバースプライマーＥＮＲ７６１と共に選択するに至った（図２７および表３０）（５）。試験のために利用可能な細胞系はＫＡＳＵＭＩ−１であった。ＡＭＬ１−ＥＴＯ  ＲＱ−ＰＣＲアッセイは、比較的高いΔＲｎと関連して、特にロバストであることが見出された（図２８ａを参照のこと）。したがって、２００ｎＭから１００ｎＭへのプローブ濃度の低減が評価された。プローブ濃度の低下は、アッセイの感度に影響を及ぼさず、「ベースライン・クリーピング（baseline creeping）」の人為現象は、非常に希少にのみ観察された（図２８ｂ）。
【０１９０】
（９．２．２  ＫＡＳＵＭＩ細胞系および診断時患者サンプルにおけるＡＭＬ１−ＥＴＯ発現（フェーズＩＶ））
ＫＡＳＵＭＩ−１細胞系の未希釈ＲＮＡが５の異なる研究所において試験された（表３１）。２２の患者サンプルからの保管された診断ＲＮＡに対する分析が４の異なる研究所によって請け負われた。対照遺伝子当たりのＢＭおよびＰＢ間の全て差異は、対になったサンプルについて有意でなかった（ｎ＝１０、ウィルコクスン検定）。除外基準を適用した後、１２のＰＢおよび１０のＢＭサンプルが評価された（表３１）。
【０１９１】
ＡＭＬ１−ＥＴＯ転写産物発現（ＣｔおよびＣＮ）は、患者サンプルおいてよりもＫＡＳＵＭＩ−１細胞系においてより高かった（約２Ｃｔ値の中位の差）。患者サンプルの中で、ＡＭＬ１−ＥＴＯ  ＦＧ転写産物の発現において差異は見られなかった。対照遺伝子に関して、ＡＢＬの発現は、細胞系および患者サンプル間で類似した。Ｂ２Ｍの発現において、患者サンプルと細胞系との間およびＢＭサンプルとＰＢサンプルとの間の両方に大きな変動が見られた。ＧＵＳに対して、中間結果が観察された（表３１および図２９）。
【０１９２】
（９．２．３  ＱＣラウンド（フェーズＩＩＩａ〜ＩＶａ））
１０−３および１０−４希釈物に対する偽陰性結果は観察されなかった（全部で１１２の分析されたサンプルのうち０）。これは、ＲＱ−ＰＣＲアッセイの良好な感度に沿っている（表３２）。全体として、偽陽性の頻度は、９．７％（１５／１５４）であった。１０８のＮＡＣ／ＮＴＣサンプルのうちの６（５．６％）および４６のＦＧ陰性サンプルのうちの９（２０％）がＡＭＬ１−ＥＴＯ増幅に対して偽陽性であった（表３２）。コード化されたＦＧ陰性サンプルでは、偽陽性は、大部分の事例において、個々の研究所に制限された。
【０１９３】
（略語の一覧）
ＡＢＬ：  Abelson gene（アベルソン遺伝子）
ＡＬＬ：  acute lymphoblastic leukemia（急性リンパ芽球白血病）
ＡＰＬ：  acute promyelocytic leukemia（急性前骨髄球性白血病）
Ｂ２Ｍ：  beta-2-microglobulin（ベータ−２−ミクログロブリン）
ＢＭ：  bone marrow（骨髄）
ＢＭＴ：  bone marrow transplanation（骨髄移植）
ＣＢＦ：  core binding factor（コア結合因子）
ＣＧ：  control gene（対照遺伝子）
ＣＭＬ：  chronic myeloid leukemia（慢性骨髄性白血病）
ＣＮ：  copy number（コピー数）
ＣＯＲ．ＣＯＥＦ：  correlation coefficient（相関係数）
ＣＶ：  coefficient of variation（変動係数）
ＥＡＣ：  Europe Against Cancer
ＥＮＦ：  European network foward primer
ＥＮＰ：  European network TaqMan probe
ＥＮＰｒ：  European network reverse TaqMan probe
ＥＮＲ：  European network reverse primer
ＦＡＭ：  6-carboxy-fluorescein（６−カルボキシ−フルオレセイン）
ＦＧ：  fusion gene（融合遺伝子）
ＦＩＳＨ：  Fluorescent in-situ hybridization（蛍光in-situハイブリッド形成）
ＧＵＳ：  beta-glucuronidase（ベータ−グルクロニダーゼ）
ＭＧＢ：  minor groove binding
ＭＭＬＶ：  murine moloney leukemia virus（マウスモロニー白血病ウイルス）
ＭＮＣ：  mononuclear cells（単核細胞）
ＭＲＤ：  minimal residual disease（微小残存病変）
ＭＲＤｖ：  minimal residual disease value（微小残存病変値）
ＮＡＣ：  no amplification control
ＮＣＮ：  normalized copy number（規格化コピー数）
ＮＤ：  not done
ＮＴＣ：  no template control
ＰＮ：  peripheral blood（末梢血）
ＰＢＬ：  peripheral blood lymphocyte（末梢血リンパ球）
ＰＢＭＮ：  peripheral blood mononuclear cells（末梢血単核細胞）
ＰＢＳＣＴ：  peripheral blood stem cell transplanation（末梢血幹細胞移植）
ＰＣＲ：  polymerase chain reaction（ポリメラーゼ連鎖反応）
ＱＣ：  quality control（品質コントロール）
ＲＱ−ＰＣＲ：  real time quantitative  polymerase chain reaction（実時間定量ポリメラーゼ連鎖反応）
ＲＴ：  reverse transcription（逆転写）
ＳＥＮＳｖ：  sensitivity value（感度値）
ＴＡＭＲＡ：  6-carboxy-tetramethyl-rhodamine（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）
（参照の一覧）
【化１】
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【０１９４】
【表１】
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【０１９５】
【表２】
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【０１９６】
【表３】
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【０１９７】
【表４】
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【０１９８】
【表５】
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【０１９９】
【表６】
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【０２００】
【表７】
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【０２０１】
【表８】
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【０２０２】
【表９】
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【０２０３】
【表１０】
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【０２０４】
【表１１】
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【０２０５】
【表１２】
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【０２０６】
【表１３】
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【０２０７】
【表１４】
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【０２０８】
【表１５】
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【０２０９】
【表１６】
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【０２１０】
【表１７】
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【０２１１】
【表１８】
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【０２１２】
【表１９】
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【０２１３】
【表２０】
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【０２１４】
【表２１】
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【０２１５】
【表２２】
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【０２１６】
【表２３】
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【０２１７】
【表２４】
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【０２１８】
【表２５】
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【０２１９】
【表２６】
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【０２２０】
【表２７】
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【０２２１】
【表２８】
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【０２２２】
【表２９】
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【０２２３】
【表３０】
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【０２２４】
【表３１】
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【０２２５】
【表３２】
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【０２２６】
【表３３】
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【０２２７】
【表３４】
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【０２２８】
【表３５】
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【０２２９】
【表３６】
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【０２３０】
【表３７】
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【０２３１】
【表３８】
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【０２３２】
【表３９】
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【０２３３】
【表４０】
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【０２３４】
【図面の簡単な説明】
【０２３５】
【図１】図１は、加水分解プローブ（タックマン（登録商標））を用いるＲＱ−ＰＣＲ検出の原理を示す。ａ）二蛍光性（bi-fluorescent）プローブ（Ｒ：レポーター、Ｑ：クウェンチャが、ＰＣＲ反応中にテンプレートの相補的核酸配列上に対合する。ｂ）延長期（extension phase）中にプローブがＤＮＡポリメラーゼ酵素によって解離（degrade）され、これにより、ＰＣＲチューブにおける機器により検出される蛍光が増大される。
【図２】図２は、ＥＡＣプライマーおよびプローブセットを用いるＭＬＬ（ｅｘ  １０）−ＡＦ４（ｅｘ  ４）プラスミドの増幅を示す。ａ）５のＤＮＡプラスミド希釈溶物（１０６〜１０分子）の増幅プロット（Ｌｏｇ１０スケール）、ｂ）５のプラスミド希釈物を用いて得られる標準曲線
【図３】図３は、ＲＱ−ＰＣＲのプライマーおよびプローブセット（ＥＮＦ１０１−ＥＮＰ１４１−ＥＮＲ１６１）によってカバーされたＥ２Ａ−ＰＢＸ１融合遺伝子転写産物の概略図である。プライマーおよびプローブの下の数は、正常な遺伝子転写産物におけるそれらの５’ヌクレオチドの位置を表す（表５を参照のこと）。
【図４】図４は、陰性ＲＮＡサンプル中のＥ２Ａ−ＰＢＸ１陽性ＲＮＡサンプルの１０−１、１０−３および１０−４希釈物の増幅プロットを示す。
【図５】図５は、対照遺伝子としてＡＢＬ、Ｂ２ＭまたはＧＵＳのいずれかを用いる診断時のＢＭとＰＢとの間のＥ２Ａ−ＰＢＸ１融合遺伝子転写産物発現の比較を示す。比（ＮＣＮ）は、ＡＢＬまたはＧＵＳ遺伝子の１コピーおよびＢ２Ｍ遺伝子の１００コピー当たりのＥ２Ａ−ＰＢＸ１のコピー数の比として定義される。中間値が黒色太線に対応している。ボックスは、２５％と７５％によって規定される範囲を表す。対照遺伝子当たりのＢＭとＰＢとの間の全ての差が対にされたサンプル（ｎ＝１０，ウィルコクスン検定）に関して有意というわけではない。ｎ：患者サンプルの数
【図６】図６は、ＲＱ−ＰＣＲのプライマーおよびプローブセットによってカバーされたＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子転写産物の概略図である。２のＲＱ−ＰＣＲセットは、ＡＦ４エクソン５（ＥＮＲ２６２−ＥＮＰ２４２）上の共通のプローブおよび共通のリバースプライマーにより利用可能である。第１のセットは、ＭＬＬエクソン９（ＥＮＦ２０７）上のフォワードプライマーを用いており、第２のセットは、ＭＬＬエクソン１０（ＥＮＦ２０８）上のフォワードプライマーを用いている。ＡＦ４エクソン５を欠くＭＬＬ−ＡＦ４  ＦＧ転写産物はＥＡＣセットによって増幅され得ない。合わせて、セットは、幼児または非幼児患者のいずれかにおいてＭＬＬ−ＡＦ４変異体の約７５％を占める（図の右側上の相対的な頻度を参照のこと）。プライマーおよびプローブの下の数は正常遺伝子転写産物におけるそれらの５’ヌクレオチドの位置を表す（表８を参照のこと）。
【図７】図７は、陰性ＰＢ  ＭＮＣ  ＲＮＡサンプル中のＲＳ４；１１の細胞系ＲＮＡの１０−１、１０−３および１０−４希釈物の増幅プロットを示す。
【図８】図８は、対照遺伝子としてＡＢＬ、Ｂ２ＭまたはＧＵＳのいずれかを用いる診断時のＢＭとＰＢとの間のＭＬＬ−ＡＦ４融合遺伝子転写産物発現の比較を示す。比（ＮＣＮ）は、ＡＢＬまたはＧＵＳ遺伝子の１コピーおよびＢ２Ｍ遺伝子の１００コピー当たりのＭＬＬ−ＡＦ４のコピー数の比として定義される。中間値は、黒色太線に対応する。ボックスは、２５％と７５％によって規定される範囲を表す。ｎ：患者数。
【図９】図９は、ＲＱ−ＰＣＲのプライマーおよびプローブのセット（ＥＮＦ３０１−ＥＮＰｒ３４１−ＥＮＲ３６１）によってカバーされたＴＥＬ−ＡＭＬ１融合遺伝子転写産物の概略図である。プライマーおよびプローブの下の数は、正常遺伝子転写産物におけるそれらの５’ヌクレオチドの位置を表す（表１１を参照のこと）。
【図１０】図１０は、陰性ＲＮＡサンプル中のＴＥＬ−ＡＭＬ１陽性ＲＮＡサンプルの１０−１、１０−３および１０−４希釈物の増幅プロットを示す。
【図１１】図１１は、対照遺伝子としてＡＢＬ、Ｂ２ＭまたはＧＵＳのいずれかを用いる診断時におけるＢＭとＰＢとの間のＴＥＬ−ＡＭＬ１融合遺伝子転写産物発現の比較を示す。比（ＮＣＮ）は、ＡＢＬまたはＧＵＳ遺伝子の１コピーおよびＢ２Ｍ遺伝子の１００コピー当たりのＴＥＬ−ＡＭＬ１のコピー数の比として定義される。中間値は、黒色太線に対応する。ボックスは、２５％および７５％によって規定される範囲を表す。対照遺伝子当たりのＢＭとＰＢとの間の全ての差が対にされたサンプルに関して有意というわけではない（ｎ＝２３，ウィルコクスン検定）。ｎ：患者サンプルの数。
【図１２】図１２は、ＲＱ−ＰＣＲのプライマーおよびプローブのセットによってカバーされたＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子転写産物の概略図である。ｍ−ｂｃｒに関して、セット：ＥＮＦ４０２−ＥＮＰ５４１−ＥＮＲ５６１およびＭ−ｂｃｒに関しては、セット：ＥＮＦ５０１−ＥＮＰ５４１−ＥＮＲ５６１である。プライマーおよびプローブの下の数は、正常遺伝子転写産物におけるそれらの５’ヌクレオチドの位置を表す（表１４および１７を参照のこと）。相対頻度は、ｍ−ｂｃｒ変異体内のｅ１−ａ２転写産物の割合およびＭ−ｂｃｒ変異体内のｂ３−ａ２およびｂ２−ａ２転写産物の割合を表す。
【図１３】図１３は、陰性ＲＮＡサンプル中のＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍ−ｂｃｒ陽性ＲＮＡサンプルの１０−１、１０−３および１０−４希釈物の増幅プロットを示す。
【図１４】図１４は、対照遺伝子としてＡＢＬ、Ｂ２ＭまたはＧＵＳいずれかを用いる診断時におけるＢＭとＰＢとの間のＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍ−ｂｃｒ融合遺伝子転写産物発現の比較を示す。比（ＮＣＮ）は、ＡＢＬまたはＧＵＳ遺伝子の１コピーおよびＢ２Ｍ遺伝子の１００コピー当たりのＢＣＲ−ＡＢＬ  ｍ−ｂｃｒのコピー数の比として定義される。中間値は、黒色太線に対応する。ボックスは、２５％および７５％によって規定される範囲を表す。ｎ：患者サンプルの数。
【図１５】図１５は、陰性ＲＮＡサンプル中のＢＣＲ−ＡＢＬ  Ｍ−ｂｃｒ陽性ＲＮＡサンプルの１０−１、１０−３および１０−４希釈物の増幅プロットを示す。
【図１６】図１６は、対照遺伝子としてＡＢＬ、Ｂ２ＭまたはＧＵＳのいずれかを用いるＢＭとＰＢとのＢＣＲ−ＡＢＬ  Ｍ−ｂｃｒ融合遺伝子転写産物発現の比較を例示する。ａ）ＣＭＬサンプル、ｂ）ＡＬＬサンプル。比（ＮＣＮ）は、ＡＢＬまたはＧＵＳ遺伝子の１コピーおよびＢ２Ｍ遺伝子の１００コピー当たりのＢＣＲ−ＡＢＬ  Ｍ−ｂｃｒのコピー数の比として定義される。中間値は、黒色太線に対応する。ボックスは、２５％および７５％によって規定される範囲を表す。ｎ：患者サンプルの数。
【図１７】図１７は、対照遺伝子としてＡＢＬ、Ｂ２ＭまたはＧＵＳのいずれかを用いる診断時におけるｍ−ｂｃｒ  ＡＬＬ、Ｍ−ｂｃｒ  ＡＬＬおよびＭ−ｂｃｒ  ＣＭＬ間のＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子転写産物発現の比較を示す。ｍ−ｂｃｒ  ＡＬＬ、Ｍ−ｂｃｒ  ＡＬＬおよびＭ−ｂｃｒ  ＣＭＬ間のＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子発現を比較するためにＰＢおよびＢＭが各群にしたがってプールされた。Ｂ２ＭまたはＧＵＳ対照遺伝子のいずれかを有するｍ−ｂｃｒおよびＭ−ｂｃｒ  ＡＬＬ間に有意な差異は観察されなかった（マン・ホイトニー検定）。Ｂ２ＭまたはＧＵＳ対照遺伝子のいずれかを有するＢＣＲ−ＡＢＬ陽性ＡＬＬ（ｎ＝４１）およびＣＭＬ（ｎ＝２９）サンプルの間に非常に有意な差が見られた（マン・ホイトニー検定）。ｎ：患者サンプルの数。
【図１８】図１８は、ＲＱ−ＰＣＲプライマーおよびプローブのセット（ＥＮＦ６０１−ＥＮＰ６４１−ＥＮＲ６６４）によってカバーされたＳＩＬ−ＴＡＬ１融合遺伝子転写産物の概略図である。プライマーおよびプローブの下の数は、正常な遺伝子転写産物におけるそれらの５’ヌクレオチドの位置を表す（表２１を参照のこと）。
【図１９】図１９は、陰性ＲＮＡサンプル中のＳＩＬ−ＴＡＬ１陽性ＲＮＡサンプルの１０−１、１０−３および１０−４希釈物の増幅プロットを示す。
【図２０】図２０は、対照遺伝子としてＡＢＬ、Ｂ２ＭまたはＧＵＳのいずれかを用いる診断時におけるＢＭおよびＰＢ間のＳＩＬ−ＴＡＬ１融合遺伝子転写産物発現の比較を示す。比（ＮＣＮ）は、ＡＢＬまたはＧＵＳ遺伝子の１コピーおよびＢ２Ｍ遺伝子の１００コピー当たりのＳＩＬ−ＴＡＬ１のコピー数の比として定義される。中間値は黒色太線に対応する。ボックスは、２５％および７５％によって規定される範囲を表す。対照遺伝子当たりのＢＭおよびＰＢ間の全ての差異は対になったサンプルに関して有意でない（ｎ＝５、ウィルコクスン検定）。ｎ：患者サンプルの数。
【図２１】図２１は、ＲＱ−ＰＣＲプライマーおよびプローブのセットによってカバーされたＰＭＬ−ＲＡＲＡ融合遺伝子転写産物の概略図である。３セットが全てのＰＭＬ−ＲＡＲＡ転写産物変異体をカバーするために利用可能である。ＲＡＲＡ遺伝子エクソン３上の共通のプローブ（ＥＮＰ９４２）および共通のリバースプライマー（ＥＮＲ９６２）が用いられる。ＢＣＲ１、ＢＣＲ２およびＢＣＲ３変異体が、ＥＮＦ９０３、ＥＮＰ９０６およびＥＮＦ９０５フォワードプライマーによりそれぞれ増幅される。各特定の転写産物の相対頻度が図の右側に表されている。プライマーおよびプローブの下の数は、正常な遺伝子転写産物におけるそれらの５’ヌクレオチドの位置を表す（表２４を参照のこと）。
【図２２】図２２は、陰性ＲＮＡサンプル中のＰＭＬ−ＲＡＲＡ  ＢＣＲ１陽性ＲＮＡサンプルの１０−１、１０−３および１０−４希釈物の増幅プロットを示す。
【図２３】図２３は、対照遺伝子としてＡＢＬ、Ｂ２ＭまたはＧＵＳのいずれかを用いる診断時におけるＢＭおよびＰＢ間のＰＭＬ−ＲＡＲＡ融合遺伝子転写産物発現の比較を示す。比（ＮＣＮ）は、ＡＢＬまたはＧＵＳの１コピーおよびＢ２Ｍ遺伝子の１００コピー当たりのＰＭＬ−ＲＡＲＡのコピー数の比として定義される。中間値は、黒色太線に対応する。ボックスは、２５％および７５％によって規定される範囲を表す。対照遺伝子当たりのＢＭおよびＰＢ間の全ての差異は、Ｂ２Ｍ  ＮＣＮ（ｐ＝０．０３）を除いて対になったサンプルに関して有意でない（ｎ＝ウィルコクスン検定）。ｎ：患者サンプルの数。
【図２４】図２４は、ＲＱ−ＰＣＲのプライマーおよびプローブのセットによってカバーされたＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１融合遺伝子転写産物の概略図である。ａ）タイプＡ：ＥＮＦ８０３−ＥＮＰｒ８４３−ＥＮＲ８６２のセット、ｂ）タイプＤ：ＥＮＦ８０３−ＥＮＰｒ８４３−ＥＮＲ８６３のセット、ｃ）タイプＥ：ＥＮＦ８０３−ＥＮＰｒ８４３−ＥＮＲ８６５のセット。各特定の転写産物の相対頻度は、図の右側に表されている。プライマーおよびプローブの下の数は、正常な遺伝子転写産物におけるそれらの５’ヌクレオチドの位置を表す（表２７を参照のこと）。
【図２５】図２５は、陰性ＲＮＡサンプル中のＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１陽性ＲＮＡサンプルの１０−１、１０−３および１０−４希釈物の増幅プロットを示す。ａ）ＭＥ−１細胞系に関するセットタイプＡ、ｂ）患者サンプルに関するセットタイプＤ、ｃ）患者サンプルに関するセットタイプＥ。
【図２６】図２６は、対照遺伝子としてＡＢＬ、Ｂ２ＭまたはＧＵＳいずれかを用いる診断時におけるＢＭおよびＰＢ間のＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１融合遺伝子転写産物発現の比較を示す。サンプルは、転写産物タイプに関係なく、それらの起源（ＢＭまたはＰＢ）にしたがってプールされた。比（ＮＣＮ）は、ＡＢＬまたはＧＵＳ遺伝子の１コピーおよびＢ２Ｍ遺伝子の１００コピー当たりのＣＢＦＢ−ＭＹＨ１１のコピー数の比として定義される。中間値は、黒色太線に対応する。ボックスは、２５％および７５％によって規定される範囲を表す。ｎ：患者サンプルの数
【図２７】図２７は、ＲＱ−ＰＣＲのプライマーおよびプローブのセットによってカバーされたＡＭＬ１−ＥＴＯ融合遺伝子転写産物の概略図である。ＥＡＣコード（ＥＮＦ７０１、ＥＮＰ７４７、ＥＮＲ７６１）。プライマーおよびプローブの下の数は、正常な遺伝子転写産物におけるそれらの５’ヌクレオチドの位置を表す（表３０を参照のこと）。プローブは、切断点上に位置される。
【図２８】図２８は、陰性ＲＮＡサンプル中のＡＭＬ１−ＥＴＯ陽性ＲＮＡサンプルの１０−１、１０−３および１０−４希釈物の増幅プロットを示す。ａ）古典的な増幅プロット。ｂ）ＮＡＣサンプルに観察されるクリーピング曲線現象。
【図２９】図２９は、対照遺伝子としてＡＢＬ、Ｂ２ＭまたはＧＵＳのいずれかを用いる診断時におけるＢＭおよびＰＢ間のＡＭＬ１−ＥＴＯ融合遺伝子転写産物発現の比較を示す。比（ＮＣＮ）は、ＡＢＬまたはＧＵＳ遺伝子の１コピーおよびＢ２Ｍ遺伝子の１００コピー当たりのＡＭＬ１−ＥＴＯのコピー数の比として定義される。中間値は、黒色太線に対応する。ボックスは、２５％および７５％によって規定される範囲を表す。対照遺伝子当たりのＢＭおよびＰＢ間の全ての差異は、対になったサンプルについて有意でない（ｎ＝１０、ウィルコクソン検定）。しかしながら、ＧＵＳ遺伝子の使用は、ＡＭＬ１−ＥＴＯ／ＧＵＳの比に対して観察される値の範囲が大きいため推奨されない。ｎ：患者サンプルの数。
【図３０】図３０は、均衡無作為アッセイ（balanced randomized assay）（フェーズＩＩＩｂ、ＰＭＬ−ＲＡＲＡネットワーク）間の１１の無作為に割り当てられた研究所にて試験された４のコード化されたサンプルのＡＢＬ遺伝子転写産物定量化についての予備（pre）ＰＣＲ工程の影響を示す。ａ）全体的に線形のモデルを用いてコード化されたサンプル間に有意な差異はない。ｂ）同一サンプルに対して研究所間に非常に有意な差異がある。コード化されたサンプルを他の研究所に送ったのはネットワークリーダーである。１０−１希釈物が分析から除外されたのは、４つの他のものと同じであるとは考えられないからである。１０−３および１０−４希釈されたサンプルが図３１および３２にも表されている。
【図３１】図３１は、均衡無作為アッセイ（フェーズＩＩＩｂ）の間の３のコード化されたサンプルにおけるＰＭＬ−ＲＡＲＡ融合遺伝子転写産物の増幅の研究所毎の結果を示す。ａ）ＦＧ転写産物のＣｔ値。ｂ）３のコード化されたサンプルのＦＧ転写産物のＡＢＬ  ＮＣＮ。希釈物は、ＮＢ−４  ＲＮＡの陰性ＲＮＡサンプルへの１０−１（■）、１０−３（▲）および１０−４（●）希釈物であった。ＣＧは、結果の線形性を大きく改善した（図３２も参照のこと）。１０−３および１０−４希釈されたサンプルは図３０にも表される。
【図３２】図３２は、ＰＭＬ−ＲＡＲＡネットワーク内の均衡無作為アッセイ（フェーズＩＩＩｂ）中に得られた結果の概略図である。３のコード化されたＰＭＬ−ＲＡＲＡ陽性サンプル：１０−１（Ｙ軸＝４）、１０−３（Ｙ軸＝２）および１０−４（Ｙ軸＝１）が１１の異なる研究所において分析された。結果は、Ｘ軸上：希釈液にしたがう各コードされたサンプルのａ）Ｃｔ値またはｂ）ＰＭＬ−ＲＡＲＡ／ＡＢＬの比に示す。これらのサンプルは、図３０および３１に表されたものと同一である。これらのサンプルから計算された相関係数ｒおよび回帰曲線が図に表される。両方の図を比較するために、Ｘ軸に同一尺度が用いられた。Ｃｔ値およびデルタＣｔ値およびＣＮおよびＮＣＮのためにフェーズＩＩＩｂの間に各ＦＧネットワークに対して同一の分析が実施された。結果は表３３に表される。
【図３３】図３３は、診断時の白血病サンプルにおけるＦＧ転写産物発現の比較を示す。ａ）対照遺伝子としてＡＢＬを使用した場合、ｂ）対照遺伝子としてＢ２Ｍを使用した場合、ｃ）対照遺伝子としてＧＵＳを使用した場合。比（ＮＣＮ）は、ＡＢＬまたはＧＵＳ遺伝子転写産物の１コピーまたはＢ２Ｍ遺伝子転写産物の１００コピー当たりのＦＧ転写産物のコピー数の比として定義される。中間値は、黒色太線に対応する。ボックスは、２５％および７５％によって規定される範囲を表す。ＢＭおよびＰＢサンプルは、転写産物毎にプールされる。ｎ：各特定の転写産物に対する患者サンプルの数。
【図３４】図３４は、ＥＡＣ  ＲＱ−ＰＣＲセットによってカバーされた３の選択されたＣＧ転写産物の概略図を示す。ＡＢＬ  ＥＡＣセット：（ＥＮＦ１００３、ＥＮＰｒ１０４３、ＥＮＲ１０６３）、Ｂ２Ｍ  ＥＡＣのセット：（ＥＮＦ１３０２、ＥＮＰｒ１３４２、ＥＮＲ１３６２）およびＧＵＳ  ＥＡＣセット：（ＥＮＦ１１０２、ＥＮＰｒ１１４２、ＥＮＲ１１６２）。プライマーおよびプローブの下の数は、遺伝子転写産物におけるそれらの５’ヌクレオチドの位置を表す（表３７を参照のこと）。ＥＮＲ＝フォワードプライマー、ＥＮＰｒ＝タックマン（登録商標）リバースプローブ、ＥＮＲ＝リバースプライマー。
【図３５】図３５は、ＲＱ−ＰＣＲのためのｃＤＮＡ反応の最適化を示す。ａ）ＲＴ−ＲＱ−ＰＣＲに関する逆転写酵素（ＲＴ）濃度の効果。Ｋ５６２細胞系ＲＮＡの７の分割量が、２５ｍＭのランダムプライマーおよびｃＤＮＡ反応のマイクロリットル当たりＭＭＬＶ  ＲＴの０．５〜３２Ｕからの２倍希釈物を用いてｃＤＮＡに逆転写される。タックマン（登録商標）ＰＣＲは、各ｃＤＮＡについてＢ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ、ＡＢＬおよびＢＣＲ−ＡＢＬのためのプライマーセットを用いて実施され、各ｃＤＮＡにおける４のターゲット遺伝子の平均Ｃｔ値がＲＴ濃度に対してプロットされた。ｂ）Ｋ５６２  ＲＮＡにおける異なるｃＤＮＡプライマータイプの比較：プライマーに特異的なターゲット遺伝子の混合物（各１ｍＭ）、ランダムヘキサマープライマー（random hexa-mer primers）（２５ｍＭ）、オリゴ（ｄＴ）プライマー（５ｍＭ）およびプライマーなし。ｃ）ｃＤＮＡ収率に関するプライマー濃度の効果。細胞系Ｋ５６２およびＲＥＨからのＲＮＡ分割量が、ｃＤＮＡ反応のマイクロリットル当たり５ＵのＭＭＬＶ  ＲＴおよび１〜１２５ｍＭのランダムヘキサマープライマーを用いて逆転写された。ｃＤＮＡの収率は、Ｂ２Ｍ、ＧＡＤＰＨおよびＡＢＬを用いるタックマン（登録商標）ＰＣＲによってモニタリングされた。各ｃＤＮＡにおける３のターゲット遺伝子の平均Ｃｔがプライマー濃度に対してプロットされた。
【図３６】図３６は、Ｂ２Ｍ遺伝子転写産物増幅によって評価されたｃＤＮＡ合成の研究所間の再現性を示す。ＲＳ４；１１  細胞系ＲＮＡの大腸菌（E.coli）ＲＮＡへの１０倍希釈物が、本部（研究所＃１）で調製され、一定分量が、ドライアイスを用いて、ＣＧグループメンバー研究所に分配された。各研究所は、ｃＤＮＡ合成およびタックマン（登録商標）分析を実施した。ＡＢＬおよびＧＵＳ遺伝子転写産物に対して同様の結果が観察された。
【図３７】図３７は、正常なＰＢサンプルにおけるＣＧ発現における変動を示す。３０の正常なドナーからのＰＢＭＮＣがＣＹＣ、ＧＵＳ、ＴＢＰ、ＡＢＬおよびＢ２Ｍ遺伝子特異的ＲＱ−ＰＣＲセットを用いて分析された。各線は、１サンプルからのデータを示す。
【図３８】図３８は、３１０の新鮮な正常および白血病サンプルにおける３のＣＧ転写産物発現の比較を示す。ａ）ＡＢＬ、ｂ）Ｂ２Ｍおよびｃ）ＧＵＳ。正常なサンプルに対しては、分析は、組織（ＢＭ、ＰＢまたはＰＢＳＣ）により実施された；相対的な発現レベルが、ポストホック分析後にＢ２Ｍ遺伝子転写産物に対してＰＢおよびＰＢＳＣ間に、ＧＵＳ遺伝子転写産物に対してＢＭおよびＰＢＳＣ間に見出された。右上隅には、サンプルタイプ（正常、ＡＬＬ、ＡＭＬまたはＣＭＬ）および組織にしたがって実施された全体的な線形モデルの結果を示す。黒色太線は、中間値に対応する。ボックスは、２５％および７５％によって規定された範囲を表す。同様の分析が保管された白血病サンプルについて実施された（結果参照）。
【図３９】図３９は、ＦＧによる診断時における保管された白血病サンプルにおける３のＣＧ転写産物発現の比較を示す。ａ）ＡＢＬ、ｂ）Ｂ２Ｍ、ｃ）ＧＵＳ。ＢＭおよびＰＢサンプルからのデータは、ＦＧ転写産物毎に合流された。右上隅には、ＦＧ転写産物にしたがって実施された全体的な線形モデルの結果を示す。黒色太線は、中間値に対応する。ボックスは、２５％および７５％によって規定された範囲を表す。ＴＥＬ−ＡＭＬ１ネットワークでは、５７のサンプルのうち３０のみがＧＵＳ転写産物発現のために試験された。
【図４０】図４０は、３のＥＡＣ選択ＣＧ間の相関を示す。ａ）新鮮な正常なサンプル、ｂ）白血病サンプル。結果は、正常サンプルと比較して白血病サンプルにおいて全体的により広がっていることが表している。この観察は、含まれるサンプル数（１８４対１２６）および研究所数（１４対６）の増加、ＣＧ発現の効果的な異型遺伝子性に関連付けられ得る。
【図４１】図４１は、ＥＡＣ  ＭＬＬ−ＡＦ４およびＡＢＬ−ＰＣＲセットを用いるＭＬＬ−ＡＦ４陽性患者の縦軸の（longitudinal）ＭＲＤモニタリングを示す。時間０は診断時、時間１２は細胞学的再発時である。診断時の値は１（１００％）であり続くＦＧ陽性結果は、診断時サンプルに対する相対として表される。診断から４月後に、ＰＢサンプルは、明らかに劣化した（ＡＢＬ  Ｃｔ値：３２．３、ＡＢＬ  ＣＮ：２５７）。結果は図に示すが、注意するべきは、この陰性結果の解釈である。計算は、表４０に見出されるΔΔＣｔおよびＮＣＮ法にしたがって実施された。両計算方法によって、ＭＲＤ値および感度の両方に対して同様の結果が得られ、結果として、一つのみのグラフが示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【図２５ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８ａ】
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【図２８ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３ａ】
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【図３３ｂ】
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【図３３ｃ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８ａ】
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【図３８ｂ】
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【図３８ｃ】
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【図３９ａ】
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【図３９ｂ】
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【図３９ｃ】
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【図４０ａ】
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【図４０ｂ】
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【図４１】
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【配列表】
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