(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルファン症候群の分析のためのプローブの使用であって、プローブは
（１）以下の（ａ）または（ｂ）からなる核酸：
（ａ）配列番号１の塩基番号１−１８００００で表される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基番号１−１８００００の塩基配列の一部に、欠失、置換または付加があり、かつ前記塩基配列と少なくとも９０％または９５％の相同性を有する核酸、または
（２）以下の（ａ）または（ｂ）からなる核酸：
（ａ）配列番号２の塩基番号１−２０９０で表される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基番号１−２０９０の塩基配列の一部に、欠失、置換または付加があり、かつ前記塩基配列と少なくとも９０％または９５％の相同性を有する核酸
である、プローブの使用。
【請求項２】
請求項１に記載のプローブを用いてマルファン症候群であるか否かを定めるための方法であって、前記プローブによって認識される核酸を分析し、３番染色体上のｐ２４．１からｐ１４．２までの領域における欠失や断裂の有無を定めるか、または配列番号２の塩基番号１−２０９０で表される塩基配列からなる核酸において、欠失や点変異の有無を定めることを含み、プローブによって認識される核酸を分析して検出する変異が、ＴＧＦＢＲ２遺伝子において１５２４Ｇ＞Ａ、９２３Ｔ＞Ｃ、１３４６Ｃ＞Ｔおよび１６０９Ｃ＞Ｔの位置であることを特徴とする、方法。
【請求項３】
マルファン症候群をスクリーニングする方法であって、次のプローブ
（１）以下の（ａ）または（ｂ）からなる核酸：
（ａ）配列番号１の塩基番号１−１８００００で表される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基番号１−１８００００の塩基配列の一部に、欠失、置換または付加があり、かつ前記塩基配列と少なくとも９０％または９５％の相同性を有する核酸、または
（２）以下の（ａ）または（ｂ）からなる核酸：
（ａ）配列番号２の塩基番号１−２０９０で表される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基番号１−２０９０の塩基配列の一部に、欠失、置換または付加があり、かつ前記塩基配列と少なくとも９０％または９５％の相同性を有する核酸
によって認識される核酸を分析し、ＴＧＦＢＲ２遺伝子において１５２４Ｇ＞Ａ、９２３Ｔ＞Ｃ、１３４６Ｃ＞Ｔおよび１６０９Ｃ＞Ｔの位置での変異を検出する、方法。
【請求項４】
核酸ハイブリダイゼーション法または全塩基配列決定法を用いて行う、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸ハイブリダイゼーション法はインシトゥーハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記インシトゥーハイブリダイゼーション法は蛍光インシトゥーハイブリダイゼーション法である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法に用いるためのキットであって、次のプローブ
（１）以下の（ａ）または（ｂ）からなる核酸：
（ａ）配列番号１の塩基番号１−１８００００で表される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基番号１−１８００００の塩基配列の一部に、欠失、置換または付加があり、かつ前記塩基配列と少なくとも９０％または９５％の相同性を有する核酸、または
（２）以下の（ａ）または（ｂ）からなる核酸：
（ａ）配列番号２の塩基番号１−２０９０で表される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基番号１−２０９０の塩基配列の一部に、欠失、置換または付加があり、かつ前記塩基配列と少なくとも９０％または９５％の相同性を有する核酸
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プローブ及びスクリーニング方法に関し、特に、マルファン症候群診断用プローブ及びスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マルファン症候群は、身体の結合組織に影響する遺伝性疾患のことで,骨格、肺、目、心臓や大動脈といった多くの器官に症状が現れる遺伝性疾患であり、症状の度合いはそれぞれの患者によって異なる。
【０００３】
マルファン症候群患者の責任遺伝子の1つにFibrillin1（FBN1）がしられているが、FBN1の異常で説明できない患者群が数多く存在する。臨床的に、特に注意すべき点はマルファン症候群患者の大動脈は 正常より太くもろいことがあり、血管にかかる圧力により、大動脈の拡大（瘤）、解離、破裂や、大動脈弁および僧坊弁の閉鎖不全などが引き起こされてしまう危険があることである。
【０００４】
しかしながら、早期に診断を行い、薬物治療と運動制限を組み合わせ、定期検診をし症状によっては外科的手術を施すことにより、平均に近い寿命を全うすることが可能である。
【０００５】
このようなマルファン症候群の処置法として、例えば、細胞外/上皮増殖因子ポリペプチドを利用した方法が知られている(特表2000-508894)。
【０００６】
【特許文献１】特表2000-508894号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、上述のように処置法があっても、マルファン症候群であることを判断するのは非常に困難であるという問題がある。マルファン症候群は、結合組織の多様な疾患で、 骨格や肺、目、心臓、血管に症状があらわれる。しかしながら全ての症状や特徴が必ず現れるわけではなく、症状が現れたとしても、その度合いはそれぞれの患者によって異なる。 そのため、マルファン症候群であると気付くのが遅れたり、自分はマルファンでは無いと考えてしまう場合が少なくない。マルファン症候群にとって最も重要で効果的な対処法は「まず自分がマルファンだと知る事、そして正しい知識を身に付ける事」であると考えられている。すなわち、心臓血管系に現れる症状など見えない所で進行してしまうので自分がマルファン症候群と知らなければ進行に気がつかず重大な結果になることがあり得る。すなわち、マルファン症候群であるか否かを早期に把握することが可能であれば、病気の進行を防ぐことができる。したがって、このようなことからマルファン症候群であることを早期に確定できる判断方法は責任遺伝子の１つであるFBN１の遺伝子診断が唯一であったが、総ての患者で異常が同定されるわけではない。すなわち、FBN1以外の原因によることが疑われている患者群が知られていた。
【０００８】
そこで、本発明は、FBN1異常によらないマルファン症候群であるか否か早期に判断可能なマルファン症候群診断用プローブ、前記プローブを用いたスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明者らは、マルファン症候群とその原因遺伝との関係について鋭意研究した結果、本発明のプローブ、及び当該プローブを用いたスクリーニング方法を見出した。
【００１０】
本発明のマルファン症候群診断用プローブは、以下の（ａ）又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基配列番号１−１８００００で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−１８００００の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と少なくとも９０％または９５％の相同性を有する核酸
からなる核酸を用いることに関する。
【００１１】
また、本発明のマルファン症候群診断用プローブは、以下の（ａ）又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−２０９０で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−２０９０の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と少なくとも９０％または９５％の相同性を有する核酸
からなる核酸を用いることに関する。
【００１２】
本発明では、マルファン症候群診断用プローブは、以下の（ａ）又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号３に示す、アミノ酸配列番号１−５６７で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号３に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有するペプチド断片
からなるペプチド断片を用いることに関する。
【００１３】
また、本発明のスクリーニング方法は、前述又は後述のプローブを用いることができる。
【００１４】
また、本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様において、スクリーニングを、核酸ハイブリダイゼーション法を利用した方法、又は全塩基配列決定を用いて行なうことを特徴とする。
【００１５】
また、本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様において、前記核酸ハイブリダイゼーション法を利用した方法が、in situ ハイブリダイゼーション法、又はサザンハイブリダイゼーション法であることを特徴とする。
【００１６】
また、本発明のスクリーニング方法の好ましい実施態様において、前記in situハイブリダイゼーション法が、蛍光in situハイブリダイゼーション法であることを特徴とする。
【００１７】
また、本発明のマルファン症候群であるか否かを判断する方法は、前述又は後述のスクリーニング方法を用いて、正常な３番染色体のｐ２４．１〜ｐ１４．２領域における断裂の有無、又は前述又は後述の核酸において、欠失や点変異の有無によって判断することに関する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、早期にFBN１異常によらないマルファン症候群であるか否かを判断することができるという有利な効果を奏する。例えば、遺伝子変異を保有し、未発症である患者を発症前に診断し早期の医療介入により生命予後を向上させることが可能である。さらに、細胞外マトリックスを構成するFBN1の異常と、TGFBシグナル伝達系の異常が同様のヒト疾患で確認されたことから、TGFBシグナル伝達系を標的とした本疾患群の治療法の開発にもつながることが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明に従い、マルファン症候群診断用プローブは、以下の（ａ）又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号１に示す、塩基配列番号１−１８００００で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−１８００００の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ、前記塩基配列と８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有する核酸
からなる核酸を用いることができる。当該核酸は、ヒト３番染色体のＴＧＦＢＲ２由来のものであり、当該ＴＧＦＢＲ２に相補的な核酸である。具体的には、ＴＧＦＢＲ２のエキソン１〜７、及びイントロンを含むゲノムＤＮＡに相補的な核酸である。本発明に従い、プローブに用いることができる核酸は、前記配列番号１−１８００００の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するものを包含することができる。これは、一部が欠失、置換若しくは付加されているものであっても、後述するように、例えば、プローブとして利用することができるからである。例えば、後述するように、マルファン症候群であるか否かを判断する際に、３番染色体のｐ２４．１〜ｐ１４．２領域における断裂の有無が重要であるので、係る領域を有するもので、上記配列と一定以上の相同性を有する配列は、プローブとして使用することができる。
【００２０】
また、本発明に従い、マルファン症候群診断用プローブは、以下の（ａ）又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号２に示す、塩基配列番号１−２０９０で示される塩基配列からなる核酸、
（ｂ）前記塩基配列番号１−２０９０の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記塩基配列と８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するもの
からなることができる。このような相同性を有するものであっても、後述するようにプローブとして使用することができる。
【００２１】
また、本発明に従い、マルファン症候群診断用プローブは、以下の（ａ）又は（ｂ）、すなわち、
（ａ）配列表の配列番号３に示す、アミノ酸配列番号１−５６７で示されるアミノ酸配列からなるペプチド断片、
（ｂ）当該配列番号３に示す、アミノ酸配列の一部が欠失、置換若しくは付加されていて、かつ前記アミノ酸配列と８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するペプチド断片
からなることができる。このような断片を用いても、プローブとして、下記のスクリーニング方法に使用することができる。
【００２２】
ここで、上述の核酸についての精製、単離方法について説明する。当該精製、単離方法は、特に限定されるものではないが、以下の手順で精製、単離することができる。
【００２３】
ゲノムDNAは、標準的なプロトコールを使用して抹消血管リンパ球から抽出することができる。TGFBR２コード領域をカバーするエクソン(GenBank  accession number, NT 022517)は、PCRによって直接シークエンス用に増幅可能である。そして、PCRを、例えば、２５〜４５回、約95℃で１０〜３００秒間、約50℃で１０〜３００秒間、及び約72℃で１０〜３００秒間、適当な緩衝液、例えば、1.5ｍMMgCl２、０．２mM各ｄNTP、1μMU  TaqDNAポリメラーゼを含む１ｘPCR緩衝液(Applied Biosystems, Foster city, CA)を含む50μL混合物中で、繰り返スことにより、PCR産物を得ることができる。得られたPCR産物を精製し、常法、例えば、サンガー法などにより塩基配列を決定することができる。
【００２４】
また、全ｍRNAをヒトの繊維芽細胞から抽出することが可能である。抽出されたｍRNAを逆転写酵素により逆転写すれば、cDNAを得ることができる。
【００２５】
このようにして得られたプローブを用いて、以下のように本発明のスクリーニングを行なうことができる。好ましい実施態様において、スクリーニングを、核酸ハイブリダイゼーション法を利用した方法、又は全塩基配列決定を用いて行なうことができる。前記核酸ハイブリダイゼーション法を利用した方法として、in situ ハイブリダイゼーション法、又はサザンハイブリダイゼーション法を挙げることができる。
【００２６】
すなわち、本発明のプローブの使用方法としては、上述の核酸を、直接又はPCR法で増幅しプローブとして用いる。患者ゲノムDNAを適当な制限酵素で消化後高分子膜にブロットして固定する。本発明のプローブをハイブリダイズさせればよい。ハイブリダイズの方法は、常法により特に限定されるものではないが、例えば、サザンブロッティング法、in situ ハイブリダイゼーション法、塩基配列決定法などを挙げることができる。in situ ハイブリダイゼーション法は、迅速かつ、的確にスクリーニングすることができるという観点から望ましい。in situ ハイブリダイゼーション法には、蛍光in situ ハイブリダイゼーション法(以下、FISH法という)、ラジオアイソトープin situ ハイブリダイゼーション法等がある。FISH法の概略は、例えば、スライドグラス上に染色体標本を調製し、これに標識プローブをハイブリダイズし、直接検鏡するのが一般的である。
【００２７】
また、本発明のプローブのハイブリダイズに使用される支持体としては、薄膜、粉末、粒状物、ゲル、ビーズ、繊維等の他、分散液、エマルジョン等を挙げることができる。これらは適当なカラムに充填して使用してもよい。こららのうち薄膜が好ましく、例えばニトロセルロース膜、ナイロン膜が好ましい。
【００２８】
ここで、本発明のプローブに使用される標識の例を説明する。標識の例として当業者に周知のものを使用することができ、特に限定されないが、例えば、３２P、３５Sなどの放射性原子、ビオチン基、アジピン基、または酵素類、蛍光標識等などのほか、抗原抗体系を利用する場合には、抗原を含んでいても良い。これらも本発明の範囲に包含される。
【００２９】
また、当該プローブについては、核酸と正常な３番染色体の一部とは、相補的に結合するが、３番染色体に異常、すなわち、欠失異常等が有ると、本発明の核酸と異常な３番染色体とは、結合しない性質を利用してプローブを用いることができる。
【００３０】
マルファン症候群であるか否かを判断するに当たり、まず、第一に塩基配列決定により判明した塩基配列同士の比較が重要である。それ以外に、サザン法、FISH法での大きな欠失、断裂を見ることが重要である。
【００３１】
上述の性質を利用すれば、マルファン症候群であるか否かを判断することが可能である。すなわち、上述のスクリーニング方法を用いて、正常な3番染色体のp24.1〜p14.2領域における欠失、断裂の有無、又は前記請求項２に記載の核酸において、欠失や点変異の有無によって判断するが可能である。
【実施例】
【００３２】
ここで、本発明の一実施例を説明するが、本発明は、下記の実施例に限定して解釈されることを意図するものではない。以下の実施例は、本発明の一実施態様を説明するための用いたものであり、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨及び範囲を逸脱しない限り、いかなる変更等を排除するものではない。
【００３３】
実施例１
マルファン症候群は、目、骨格、心臓血管におけるカージナル発現を有する細胞外マトリックス疾患であり、フィブリン遺伝子（FBN1）における15q21.1での欠陥に関連する。当方は、大規模なフランス人ファミリーにおいて3p24.2 −p25 でMFSタイプ２（MFS2OMIM154705）としても知られる座を以前にマップした（MS1家系）。日本のマルファン症候群患者におけるTGFβ受容体２遺伝子（TGFBR２）を分裂させる3p24.1の染色体ブレークポイントの同定は、当方にTGFBR2は、MＦＳ２遺伝子と考えさせた。当方は、異常スプライシングで生じ、MS1において日本人患者で断裂していたTGFBR2のｐ.Q508Q突然変異体を見出した。3つの他のミスセンス突然変態体は、４例の血縁関係のない患者に見出され、ルシフェラーゼ測定によってTGF-βシグナル活性の機能損失を確定した。
【００３４】
当方は、複合染色体再配列、46,XY,ｔ（１；５；４）（p３５；ｑ３３．２；ｑ３５）、ins(3)(q11.2;p24,1p14.2)de novo をもつ日本人マルファン症候群患者に遭遇した。これらの染色体ブレークポイントの1つとして、3p24.1は、MＦＳ２遺伝子座と一致し、染色体挿入により3p24.1でのＴＧＦＢＲ２遺伝子の断裂が疾患を引き起こしたと仮定された。FISHマッピングは、BACクローン、RP11-479I10、RP11-７７５G14及びRP11-1056A20は、ブレークポイントを補った(図１)。TGFBR22遺伝子は、3つのBACによってオーバーラップする共通の領域における唯一の遺伝子であり、ブレークポイントで破壊されている(図1)。
【００３５】
TGFBR2は、3p24.2-p25でMＦＳ２のマッピングを提供した大規模なフランス人ファミリー（MS1）分析された。分析されたMS1からの74メンバーの総ての中で、c.1524g>A置換は、MＦＳ２で影響を受けた25メンバーで見出されたが、32の健康な兄弟、16人の血縁でない配偶者、一つの罹患が疑われたIV53及び60の実関係フランス人対照例(図２a)では置換はなかった。このトランジションは、アミノ酸置換は引き起さないが(p。Q508Q)，エクソン６の最後のヌクレオチドに位置し、スプライシングプロセスが影響を受けることを示唆している。スプライシング上のコンセンサス値は、95.6から82.3へc。1524G＞Aによって修正されるが別の良好なコンセンサス配列(Aggtｘｘｇ、値90.5)は、イントロンの配列において23bpはなれて位置した(図2b)。本疾患から2例の罹患者の繊維芽細胞のｃDNAとエクソン５及び7（MUT1  F及びMUT1B）にセットされたプライマーとを使用したRT-PCR分析は、予想される通常のバンド(データに示さず)とともにより大きい生産物を明らかにした。配列決定は、イントロン６の２３bpの核酸がアミノ酸位置５２５で未成熟のストップコドンを作るエクソン５を加えられた異常なスプライシングを確認した(図２b)。この異常な断片は、III-４１(健康体)又は未関連正常対照例からの繊維芽細胞において見出されなかった。分子データは、臨床データと一致した。
【００３６】
当方は、次に、9の未関連フランス人ファミリーからMFSプロバンドを、FBN１突然変異体、又はFBN１の関連が認められない10の日本人MFS患者とともに、研究した。TGFBR2の７エクソンの2方向配列後、当方は、3つのミスセンス突然変異体、すなわち、ｃ.９２３T>C(p.l308P)、c.1346C>T(p.S449F)及びc.1609C>T(p.r537C)を、同定した。C.923T>Cをフランス人ファミリーMS57のプロバンドにおいてのみ見出したが、彼女の罹患していない親（父と確定）又は2人の兄弟において見出されず、それゆえ、新たに突然変異を証明した。
c.1346C>Tは、フランス人ファミリーにおいて(MS382)、及び他のファミリーに及び一人の日本人患者においてc.1609C>Tが同定された。MS587において、2つの影響を及ぼすメンバーは(IV-1及びIII-4)は、c.1609C>Tを運搬するために示された。総てのミスセンス突然変異体は、TGF-β受容体２タンパク質のセリン/スレオニンキナーゼ領域内に位置し、それぞれが、相同なマウス及びラットTgfbr2遺伝子、マウス及びハエAcvr2、及び線虫類daf遺伝子(図3)において保存されたり、化学的に類似であるアミノ酸へ影響を与える。267の未関係の日本人健康体対照例(534の染色体)及び92の白人の健康体対照例(184の染色体)の中で、突然変異体は、見出されなかった。当方は、胸の大動脈の動脈留及び分析（TAAD）で存在する１０のフランス人プロバンドも調査した。推定遺伝子座が3p24-25とされる。この疾患に対してマップ化したが、突然変異体は、同定されなかった。
【００３７】
当方は、試験管内ルシフェラーゼ測定をTGF-βシグナリング上の突然変異体の影響を評価するために使用した。pTARE-Luc  シス-受容体プラスミド及びpRL−TKベクターをHEK293の中へ感染させ、相対的ルシフェラーゼ活性(RLA)を決定した。外因性のTGF-β１を添加後、3倍に増加した基礎活性を観察した(図４)。野生型（WT）TGFBR2ｃDNAの感染は、以前に報告されたように、外因性TGF−βの不存在下でさえ約１２のRLAを示した。対照的に、キナーゼ領域を欠く先端突然変異体、δcyt、は、WTと比較して外因性TGF-βでさえRLAの明らかな減少を示した。他のミスセンス型タイプ突然変異体、l308P、S449F、及びR537Cとの感染において、RLAの重大な減少も認識され、TGF-βシグナリングへの減弱が示唆された。
【００３８】
TGF-βは、細胞質領域においてセリン/スレオニンキナーゼ活性を有するタイプI及びタイプII受容体のヘテロマー複合体を通じて、増殖、細胞サイクル停止、アポトーシス、分化、及び細胞外マトリックス形成を含め細胞プロセスの大きいスペクトルを制御するサイトカインである。欠陥TGF-βシグナル形質導入は、腫瘍形成に重要な役割を演じ、TGFBR2、SMAD4、及びSMAD2は、種々の腫瘍において腫瘍抑制遺伝子として作用することがよく確立されている。腫瘍細胞において見出されたTGFBR2遺伝子突然変異体の大部分は、エクソン３のポリA反復において存在する(図3)。多くのミスセンス突然変異体は、種々の癌において遺伝子に報告されており、機能損失の結果を示唆している。１つの生殖細胞系列突然変異体（受容体のキナーゼサブ領域に位置するc.944C＞T（ｐ.T３１５M））を、遺伝性の無孔結腸直腸腫瘍を有する同類において報告した。機能的研究は、TGF-βへ返答する成長阻害における欠陥、及びc.944C>Tが細胞外タンパク質を誘発するための能力の維持を示し、2つの相違するTGF-βシグナリング経路が存在するかもしれないことを示唆した。このことが、なぜ悪性腫瘍が体制TGFBR２突然変異体を有するMLCTDにおいて通常観察されないのかを部分的に説明することができるかもしれない。さらに、当方は、TGFBR2突然変異体の3つの異なるクラスを同定したので、TGFBR2の機能の損失が、疾患の優性遺伝形式を説明することができるかもしれない。Fbn1ノックアウトマウスの研究によって、Neptune等は、肺気腫を発症させる傾向を含め、MFSにおける種々の問題にあるようであるTGF-βの過剰発現を証明した。当方は、TGFB1の領域特異的生殖細胞系列突然変異体は、マルファン症候群様の症状、すなわち、細長い手足及び脊柱の変形を有する患者がもつカムラチ・エンゲルマン症候群（OMIM  ♯131300）を引き起こすことを以前に報告した。TGF-βは、細胞外フィブリンマトリックスをおそらく制御する。当方の結果は、TGF-βシグナリングの混乱が、細胞外マトリックスの異常をきたす疾患の病因に寄与する新たな証明を提供する。
【００３９】
調査された10のフランス人MＦＳプロバンドの内、TGFBR2突然変異体は、共通の臨床像、すなわち、突出した大動脈、やせ細り、皮膚症状、軽度の眼症状特性(水晶体転位症を有する対象MS1-IV-83の以外)をもつ4人の患者にのみ見出されたが、硬膜拡張、又は肺疾患特性はなかった。今後、更なるデータを、この遺伝子において突然変異体と関係する完全な臨床スペクトルを評価するために収集しなければならない。他のオーバーラップする病変が、MASS症候群など(mitral valve Prolapse, Aortic dilatation, and Skin and Skeletal manifestations syndrome, OMIM ♯604308)、家族性僧帽弁逸脱（MIM♯157700）、及び常染色体性TAAD（OMIM♯132900）などで調査されるべきである。当方がテストした10のTAAD患者において突然変異体は見出されなかったが、疾患は、異質であり、TGFBR2及びTAAD2が遺伝子であることを問題外とする前に、更なる調査が正当化される。
【００４０】
対象及び臨床的評価
新たに４６、XY,ｔ（１；４；５）（p35；ｑ33.2；ｑ35）、インス(3)(Q11.2;p24.1p14.2)を有する日本人患者、すなわち、患者は13歳の男性である。いくつかの漏斗胸が12歳の時に作用した。彼は、彼の口蓋高位、マルファン症候群(ポジティブリスト、親指しゃぶり)、環軸関節の不全脱臼、脊柱側弯症、ひじでの減少した伸縮、バルサルバ洞動脈を含め上昇する大動脈の拡張、僧帽弁逸脱、不完全な右脚ブロック、鼠径部ヘルニアのために臨床的にマルマン症候群と診断された。下垂体短成長のために成長ホルモンで治療された。12歳のとき、彼の高さは、135.2cm[-2.0SD]で体重24.8kg[-2.0SD]であった。
【００４１】
MS1ファミリー
大規模なフランス人ファミリーを、大動脈解剖から39歳の男性対象の死後、確かめられた。ファミリー研究の初めの部分に対して完全な個人臨床特性を以前に述べた。ファミリー調査の第二ステップをAmbroise  Pare病院のマルファン臨床において行なわれた。リスクを持つ対象は、慎重な物理学的試験、心エコー検査、スリップランプ試験、を経た。20の新しいファミリーメンバ-が調査され、サンプル化され(IV-40、IV-43、IV-48、V-6,V-7,V-8,V-9,V-10,V-11,V-12,V-13及びV-14)DNAが劣化した4人の患者は、再びサンプル化された（III-13、III-41、IV-32及びIV-53）。これら１２ファミリーメンバーのうち、骨格、又は心臓欠陥系又はこれらの器官/組織において唯一単離されたマイナーな知見のいずれにおいても異常がない８つを影響を受けないものとして考慮した。
【００４２】
MS57ファミリー：MS57−MA319は、長頭、漏斗胸、マルファン症候群、脊柱側弯症、脊椎辷り症、突出寛骨臼、奇形顔面、狭口蓋、デンタルクロウディング、脈理膨張、平坦な角膜、穏やかな逆流を有する大動脈膨張（+８SD）、僧帽弁逸脱、及び粘液様弁、動脈留心房中隔、及び小さな心房中隔欠陥を有する。彼女は、18歳で突然死した。彼女の兄弟と親は影響がない。彼女の姉妹MS-MA328は、僅かな骨格特徴、マルファン症候群を有したが、漏斗胸は影響ないと考えられた。彼女の6歳の娘は正常である。
【００４３】
MS382ファミリー：MS382-MA1515は、幼年時代に診断された10歳の少女である。彼女の父は突然39歳で死んだ。MＦＳの明確な骨格兆候即ち、非対称性鳩胸、プラスの手首徴候、長頭症、重度の脊柱側湾症、ひざ及びひじ関節の関節過伸展性や、明確な筋肉低血圧症、及び臍ヘルニアを認めた。放射性試験は、外反股及び硬膜拡張症を明らかにした。彼女は、12歳で外科手術を必要とする動脈管開存症、卵円孔、心室間中隔欠陥及び大動脈起始部膨張(10年で50mm)を示した。非常に穏やかな虹彩膨張を除き、眼の兆候は注目されなかった。彼女の母及び姉妹は、生存しているが、MLCTDの特徴を有していない。
【００４４】
MS587ファミリー
MS587―MA1771(III-7)は、26歳での彼女の突然の死後、検査された31歳の女性である(II-4)。大動脈解離、僧帽弁逆流が5歳の年で現われ、身長は、31歳で＋６SDであった。彼女は、肺疾患、胸膜炎、歯が凝集した狭い口蓋、脊柱側弯症、線状萎縮、乱視を持つ弱い近眼を示した。家族歴として、2人の突然の死、すなわち、26歳での彼女の父の兄弟(II−3)、32歳での彼女の父の姉妹の死(II−２)を認めた。III-1(34歳)は、大動脈膨張、減少した上部及び下部断片割合、マルファン症候群、漏斗胸、狭い口蓋弓、脊柱側弯症、を示した。III-4(28歳)は、穏やかな知恵遅れ、穏やかな脊柱側弯症、漏斗胸、関節の過伸展性、歯が凝集した狭い口蓋、扁平足、線状萎縮、及び大動脈弁逆流を持つ大動脈膨張(+６SD)を持っていた。IV-1（４．５歳）は、逆流のない大動脈膨張(+６SD)、増加した身長、長頭症、弓状口蓋、脊柱側弯症を示した。
【００４５】
日本の患者
FBN1突然変異体の運搬を示さない日本人MFS患者をTGFBR2突然変異体用に調べた。それらのうちの７つは、以前に報告された。IRB是認プロトコールによって詳細な臨床情報を提供できないが、総ての10の患者は、MFSに対して改訂された基準に適合した。
【００４６】
突然変異体分析
ゲノムDNAは、標準的なプロトコールを使用して抹消血管リンパ球から抽出した。TGFBR２コード領域をカバーするエクソン(GenBank  accession number, NT 022517)は、PCRによって直接シークエンス用に増幅した。PCR増幅及びシークエンシングプライマーは、要求により提供される。PCRを35回、95℃で30秒間、50℃で30秒間、及び72℃で30秒間、1.5ｍMMgCl２、０．２mM各ｄNTP、1μMU  TaqGoldポリメラーゼを含む１ｘPCR緩衝液(Applied Biosystems, Foster city, CA)を含む50μL混合物中で、繰り返した。PCR産物をExoSAP-IT(Amercham-Pharmacia,Cleveland,OH)で精製し、標準プロトコールによるBigDye  Terminator  chemistry  バージョン３で両方のストランドを配列決定した。シークエンシング反応を96℃で１０秒間、50℃で5秒間、及び60℃で4分間(25サイクル)、Gene  Amp  PCR  System２７００、又は９７００のいずれかで行なった(Applied  Biosystems)。反応混合物を精製し、提供者のプロトコールに従い、配列分析ソフトウエア(Applied  Biosystems)及びAuto  Assembler  Ver.  ２．１．１ソフトウエア(Applied  Biosystems)を備えるABI  Genetic  Analyzer  ３１００（Applied  Biosystems）で分析した。
【００４７】
全ｍRNAを、製造者の指示に従い、RNA  B登録商標（Bioprobe  Systems,Montreuil-sur-bois,France）を使用して、ファミリーMS1の２つ影響されているもの（III-37及びIV-10 ）及び１つ未影響のメンバー（III-41）、及び通常の対照例のヒトの繊維芽細胞から抽出した。
【００４８】
サンプルをRQ1  RNアーゼーフリーDNアーゼ（Promega,Madison、WI,USA）で処理した。全ｍRNAは、Superscript（登録商標）II  RNアーゼ逆転写酵素（GibcoBRL/Invitrogen, Cergy^Pontoise, France）を使用して逆転写した。PCRをエクソン５及び７にセットしたプライマーを用いて行い、次いで、上述したように配列決定した（MUT1  F:５‘―TGC  AAG  ATA  CAT  GGC  TCC  AG  −３’；MUT1  B:５‘−AGC  TCA  CTG  AAG  CGT  TCT  GC−３’）。シークエンシングをフランス人家族の総ての対象において、MS1用のプライマーMUT2F、及びMUT2  B（MUT2  f:５‘TGT  GTC  GAA  AGC  ATG  AAG  GA−３’、MUT2B:5’−TCC  AGA  ATT  CTC  TGC  CAC  CT−３‘）及びMS57用のMUT3F及びMUT3B（MUT3F:５’−TGC  CTC  TTG  GAA  GAC  AGC  GAA  CT−３‘）；MUT３  B：５’−ACT  CCT  GTA  GGT  TGC  CCT  TG−３‘）を用いてPCRによって行い、その後配列決定した。
【００４９】
ファミリーMS1の遺伝子型
ミクロサテライト及びテトラヌクレオチド  マーカーを公の遺伝子データベース、すなわち、Genethon:http://wwwgenethon.fr/,及びCHLC:http://www.chlc.o
rg/.から選択した。ゲノムDNAは、以前に述べた遺伝子型であった。20マーカ―座の局所的なハプロタイプは、tel-D3S1293からD3S1619−cen へ構築した（図２（D#S1293、D2S3038、D3S1599、D3S3659、D3S3598、D3S3700、D3S1567、D３S1583、D3S2336、D3S2466、D3S2335、D3S2337、D3S3037、D3S1759、D3S1283、D3S1266、D3S1609、D3S3727、D2S3567及びD3S1619））。D3S3567は、遺伝子内のTGFBR2マーカーである。ハプロタイプと組み合わせた物理地図は、当方にマーカーオーダーを決定することを可能とさせた。
【００５０】
DNA構築
野生型TGFBR２ｃDNA（WT）（GenBank  accession  number, NM 003242; amino acids 1-567）及び不完全型ｃDNA (δcyt)(全キナーゼ領域を欠くアミノ酸1-222)を、RT-PCRによって鋳型としてヒト胎児脳BD Marathon-Ready cDNA(BD Bioscience, Palo Alto, CA)を使用して生成し、 pcDNA３．１(-)発現ベクターの中へサブクローン化した(Invitorogen,Carlsbad,CA)。部位直接的突然変異生成を、当方が研究したMLCTDファミリーにおいて見出されたpcDNA3.1(-)、l308P、S449F、及びR537CにおけるTGFBR２の3つの変異体を生成するために添付のプロトコ-ルにより急速部位直接的突然変異生成キットを(Stratagene,  LaJolla, CA)を使用して行なった。総ての変異体ｃDNAは、シークエンシングによって確認された。使用した総てのプライマーの配列は、要求により提供される。
【００５１】
細胞培養、トランスフェクション及びルシフェラーゼ測定
HEK293細胞を、10％胎児牛血清を含むダルベッコEagle培地（DMEM、Sigma、St.Louis,MO）において３７℃で５％CO2インキュベーターにおいて成長させた。HEK２９３細胞をTGFBR2構築物(WT,δcyt、L308P、S449F、又はR537C)レポータープラスミド(pTARE-Luc cis-レポーター又はｐCIS-CKネガティブ対照例)、及びpRL-TKベクター(標準化用の内部スタンダード)で、トランスファースト  トランスフェクション(Promega)を使用するデュアル-ルシフェラーゼレポーター測定システム(Promega)において同時に感染させた。PTARE―Luc  シスレポータープラスミドは、基本的なプロモーター因子(TATAボックス)及びTGF-β/アクティビン応答因子(TARE)を含む。このレポータープラスミドは、これらの因子の制御下ホタルルシフェラーゼを発現する一方、pCIS-CKネガティブコントロールプラスミドは、効果がTGF-βシグナル特異的であるかを評価するための誘導可能なシスエンハンサー因子を含んでいない。トランスフェクション後、HEK293細胞をDMEMにおいて36時間インキュベートし、培地を10ng/mlTGF-β１を含むDMEMへ置換した。8時間後、細胞を培養し、4倍にしてルシフェラーゼ活性用に評価した。ルシフェラーゼ活性をTD-20/20照度計  DLReady(Turmer Designs Instrument, Sunnyvale, CA)を使用して、測定した。統計分析は、StatViewをPost-hoc  試験によって行い、P＜０．０５が統計的相違と考えられた。
【産業上の利用分野】
【００５２】
例えば、遺伝子変異を保有し、未発症である患者を発症前に診断し早期の医療介入により生命予後を向上させることが可能である。さらに、細胞外マトリックスを構成するFBN1の異常と、TGFBシグナル伝達系の異常が同様のヒト疾患で確認されたことから、TGFBシグナル伝達系を標的とした本疾患群の治療法の開発にもつながることが期待される。
【００５３】
したがって、広く、医学、生物化学、生物学、分子生物学等の分野において貢献し得ることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、複合染色体異常を有する日本人患者の3ｐ24.1から単離されたＴＧＦＢＲ２の周辺を示す。  3ｐ24.1ブレークポイントは、ＭＬＣＴＤ座も3ｐ24.2-ｐ25でマップしたので分析された。この患者において、染色体断片3ｐ24.1-ｐ14.2を3ｑ11.2の中へ挿入した。ＦＩＳＨ分析をＲＰ１１-775ｇ14は3ｐ24.1ブレークポイントを補う。3ｐ24.1ブレークポイントを含む要約フィジカルマップが示された。水平の線は、ＢＡＣクローンを示し、ブレークポイントを補うクローンを示し、矢印は遺伝子を示す。ＴＧＦＢＲ２は、ブレークポイントにマップした遺伝子だけである。
【図２】図２は、大規模なフランス人ファミリー（ＭＳ１）及び異常なスプライシングを引き起こす突然変異体のハプロタイプ分析を示す。a: メンバーのファミリーＭＳ１の家系及び３ｐ２４．１マーカーの分離は、ＭＬＣＴＤ(塗りつぶした印)と影響するか、又はしなかった（開口印）。緑の印は、突然変異体、ｃ.1524ｇ＞Ａのメンバーを示し、オレンジは、突然変異体なしのものを示す。疾患と共に分離したハプロタイプを赤で示す。ｂ：通常(緑)及び異常スプライシング（オレンジ）は、ｃ１５２４Ｇ＞Ａ(ｐ.ｑ508Ｑ)によって引き起こされた。突然変異した対立遺伝子において、イントロン６の23ｂｐヌクレオチドは、エクソン６の後新しく加えられて、レギュラーエキソン７へ結合され、アミノ酸５２５において未成熟ストップコドンを生じた。
【図３】図３は、ＭＬＣＴＤにおいて見出されたＴＧＦＢＲ２と突然変異体のゲノム構造を示す。ＴＧＦＢＲ２は、７つのエキソンからなる。四角はエキソンを示す。膜貫通領域、キナーゼ領域、ＵＴＲは、それぞれ、ライトブルー、ピンク、灰色で示す。(Ａ)10及び(ＧＴ)３はゲノムの不安定部位である。３つの他のミスセンス突然変異体、ｃ.923Ｔ>ｃ(ｐ.ｌ308ｐ)、ｃ.1346ｃ>Ｔ(ｐ.Ｓ449)、及びｃ.1690ｃ>Ｔ(ｐ.ｒ537ｃ)を、それぞれ、ファミリーＭＳ５７、ＭＳ３８２及びＭＳ587で見出した。各突然変異体は、マウス及びラットＴｇｆｂｒ２、マウス及びハエＡｃｖｒ２、及び線中類daf遺伝子の中で、進化の過程で保存されているか、キナーゼ領域において化学的に類似のアミノ酸で生じた。複数配列決定は、web ベース、ソフトウエア、ＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して行なった。
【図４】図４は、ＭＬＣＴＤを有する患者において見出されたＴＧＦＢＲ２ミスセンス突然変異体によるＴＧＦ-βシグナル活性の欠陥を示す。  種々のＴＧＦＢＲ構築物で一時感染させた後、ＨＥＲ293細胞においてｐＴＡＲＥ-Ｌｕｃシス受容体の相対的ルシフェラーゼ活性を、識別可能なＲ.reinformisルシフェラーゼを含む共に感染させた対照例ベクター、pRL-TKの活性を使用しtて正規化することによって計算した。データは、平均+SDを示す。細胞を44時間外因性TGF-β1(10ng.ml)(r＆D,Minneapolis,MN)を有するか、有しないで44時間インキュベートした。PpTARELucシス受容体による唯一の基礎活性は、おそらくHEK293における外因性TGF-β１のためである。野生型（WT）TGFBR2  ｃDNAでの感染は、RLAの重要な価値(約１６)を示す。一方、キナーゼ領域を欠く、不完全突然変異体、σcytは、RLAの重要性が低いことを示した。他のミスセンスが型突然変異体、l308P,S449F、及びR537Cでの感染も低いRLAの重要性を示し、σcytのものと同様であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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