(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目における塩基Ｃ及びＡの挿入又は欠失を検出することを含む、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクの判定方法。
【請求項２】
３９４番目及び３９５番目における塩基の欠失を有する場合に、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクが低いと判定される、請求項１記載の判定方法。
【請求項３】
配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の１３５番目、１４８番目、３９４番目及び３９５番目、８１７番目、８３７番目、並びに９７６番目の塩基からなるハプロタイプを検出することを含む、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクの判定方法。
【請求項４】
１３５番目の塩基がＧ、１４８番目の塩基がＡ、３９４番目及び３９５番目の塩基が欠失、８１７番目の塩基がＧ、８３７番目の塩基がＣ、並びに９７６番目の塩基がＴのハプロタイプを有する場合に、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクが低いと判定される、請求項３記載の判定方法。
【請求項５】
配列番号２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて上記塩基の欠失若しくは挿入を検出する、請求項１又は２に記載の判定方法。
【請求項６】
配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーセットを用いて上記塩基の欠失若しくは挿入又は上記ハプロタイプを検出する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項７】
以下のオリゴヌクレオチドの１種以上を含む、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクを診断するためのキット。
（ａ）配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目に存在する遺伝子多型を含む配列からなるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、かつ配列番号１に示される塩基配列のうち該遺伝子多型を含む連続する少なくとも１９塩基からなる配列に対し相補的な配列からなるプローブ用オリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目に存在する遺伝子多型を含む配列を増幅することができ、かつ配列番号１に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１９塩基からなる配列、又は該配列に対し相補的な配列を含むプライマー用オリゴヌクレオチド
【請求項８】
配列番号２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、請求項７記載のキット。
【請求項９】
配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、請求項７記載のキット。
【請求項１０】
遺伝子多型を有するＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、候補物質の存在下で該細胞を培養し、リポーター活性を測定することを含み、該遺伝子多型が、配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目における塩基Ｃ及びＡの挿入である、ＭＵＣ５Ｂ転写活性阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
遺伝子多型が、配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の１３５番目の塩基がＧ、１４８番目の塩基がＧ、３９４番目及び３９５番目の塩基Ｃ及びＡの挿入、８１７番目の塩基がＡ、８３７番目の塩基がＧ、並びに９７６番目の塩基がＣであるハプロタイプである、請求項１０記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ムチン遺伝子ＭＵＣ５Ｂのプロモーター領域に存在する遺伝子多型（ＳＮＰｓ、挿入／欠失型多型、及びハプロタイプ）を検出することを含む気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクの判定方法、該方法に使用されるオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドを含む気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクを診断するためのキットなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
びまん性汎細気管支炎（diffuse panbronchiolitis；以下ＤＰＢと略す）は、慢性副鼻腔炎を伴う慢性気道炎症性疾患である。それまで分類されていた慢性閉塞性肺疾患とは別の新しい疾患として、１９６０年代半ばにその概念が確立されたが、その病因はまだ明らかでない。ＤＰＢの報告は主として日本・韓国・中国など東アジアが中心であり、少数の欧米からの報告も多くはアジア系の移民であり、その発症に人種差が見られることから遺伝的な背景が示唆されてきた。
【０００３】
ＤＰＢの疾患感受性に関与する遺伝子の一つは、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座とＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の間に存在すると考えられ、この領域では新規遺伝子のクローニングが試みられている。それ以外に、ＤＰＢの病態に関連すると考えられる遺伝子として、これまでにTransporter associated with antigen processing（ＴＡＰ）（非特許文献１）、Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator（ＣＦＴＲ）（非特許文献２）、ＩＬ−８（非特許文献３）及びＴＮＦα（非特許文献４）などの解析が試みられてきたが、ＤＰＢと一義的な関連を示すものは認められていない。
【０００４】
従って、ＤＰＢとの関連性を示す遺伝的因子を特定し、ＤＰＢの発症研究や治療に利用することが望まれていた。
【０００５】
【非特許文献１】Keicho, N.ら，Tissue antigens，第53巻，p.366-373，1999年
【非特許文献２】Wang, W.ら，Nippon Rinsho，第54巻，p.525-532，1996年
【非特許文献３】Emi, M.ら，Journal of Human Genetics，第44巻，p.169-172，1999年
【非特許文献４】Keicho, N.ら，Respiratory medicine，第93巻，p.752-753，1999年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、びまん性汎細気管支炎（ＤＰＢ）と関連性のある遺伝子多型（ＳＮＰｓ、挿入／欠失型多型、及びハプロタイプ）を同定し、これらの遺伝子多型を利用して気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクを判定する方法、該方法に用いることのできるオリゴヌクレオチド、気道粘膜炎症性疾患の診断用キットなどを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは上記の課題を解決すべくムチン遺伝子ＭＵＣ５Ｂのプロモーター領域の遺伝子多型を解析したところ、複数の変異が同定され、特に新規に同定された２塩基の欠失部位を含むハプロタイプでＤＰＢと強い負の関連を示すことを見出した。さらに、ルシフェラーゼアッセイ法を用いた実験により、上記のハプロタイプが転写活性に影響を与え、その結果遺伝子産物量が変化し、この変化がＤＰＢを引き起こす可能性を見出した。本発明はかかる知見により完成されたものである。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（８）を包含する。
（１）ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域に存在する遺伝子多型を検出することを含む、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクの判定方法。
上記方法において、検出される遺伝子多型としては、配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目における塩基Ｃ及びＡの挿入又は欠失が含まれる。ここで、該遺伝子多型が、３９４番目及び３９５番目における塩基Ｃ及びＡの欠失を有する場合には、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクは低いと判定される。
【０００９】
また上記方法において、検出される遺伝子多型としては、配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の１３５番目、１４８番目、３９４番目及び３９５番目、８１７番目、８３７番目、並びに９７６番目の塩基からなるハプロタイプが含まれる。ここで、該遺伝子多型が、１３５番目の塩基がＧ、１４８番目の塩基がＡ、３９４番目及び３９５番目の塩基が欠失、８１７番目の塩基がＧ、８３７番目の塩基がＣ、並びに９７６番目の塩基がＴのハプロタイプを有する場合に、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクが低いと判定される。
【００１０】
（２）ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域に存在する遺伝子多型を含む配列からなるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクの判定においてプローブとして用いるオリゴヌクレオチド。
（３）ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域に存在する遺伝子多型を含む配列を増幅することができ、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクの判定においてプライマーとして用いるオリゴヌクレオチド。
上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列のうち、連続する少なくとも１０塩基からなる配列、又は該配列に対し相補的な配列を有するものとすることができる。ここで、かかるオリゴヌクレオチドとしては、限定するものではないが、配列番号２〜５のいずれかに示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００１１】
（４）配列番号２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクの判定に用いるプライマーセット。
（５）配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクの判定に用いるプライマーセット。
【００１２】
（６）前記オリゴヌクレオチドの１種以上を含む、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクを診断するためのキット。
上記診断キットにおいて、１種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとすることができる。また、１種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとすることもできる。
【００１３】
（７）遺伝子多型を有するＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、候補物質の存在下で該細胞を培養し、リポーター活性を測定することを含む、ＭＵＣ５Ｂ転写活性阻害物質のスクリーニング方法。
上記スクリーニング方法において、ＭＵＣ５Ｂプロモーター領域に含まれる遺伝子多型は、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーターの転写活性を増強し、ＭＵＣ５Ｂの転写を促進するものであることが好ましく、例えば、配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目における塩基Ｃ及びＡの挿入、あるいは、配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の１３５番目の塩基がＧ、１４８番目の塩基がＧ、３９４番目及び３９５番目の塩基Ｃ及びＡの挿入、８１７番目の塩基がＡ、８３７番目の塩基がＧ、並びに９７６番目の塩基がＣのハプロタイプとすることができる。
【００１４】
（８）遺伝子多型を有するＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子断片と被験試料を接触させ、該遺伝子断片と該被験試料に含まれる該遺伝子多型に特異的な転写因子との結合を検出することを含む、ＭＵＣ５Ｂの転写因子のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、気道粘膜炎症性疾患（特にびまん性汎細気管支炎）の罹患リスクを判定することが可能となる。また、本発明のオリゴヌクレオチド及び診断キットにより、かかる判定を簡便かつ迅速に行うことができる。
【００１６】
また本発明により、ＭＵＣ５Ｂの転写活性阻害物質及び転写因子をスクリーニングすることができ、ＭＵＣ５Ｂが関連する可能性のある気道粘膜炎症性疾患の発症機構の解明、その予防又は治療薬の開発などに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
１．気道粘膜の炎症性疾患の判定方法
（１）ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における遺伝子多型
本発明の方法は、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域に存在する遺伝子多型（ＳＮＰｓ、挿入／欠失型多型、及びハプロタイプ）を検出することによって、気道粘膜の炎症性疾患の罹患リスクを判定する方法である。
【００１８】
本明細書において、「遺伝子多型」には、ＳＮＰｓ、挿入／欠失型多型、及びハプロタイプが含まれる。
【００１９】
ここでＳＮＰ（Single nucleotide polymorphism：一塩基多型）とは、ある特定の遺伝子又は遺伝子群における一塩基の核酸の変異をいい、複数箇所に存在する上記一塩基の核酸の変異（ＳＮＰ）をＳＮＰｓとして表す。このようなＳＮＰｓは、個体間における形質や形態の多様性を引き起こすことがあることが知られている。
【００２０】
また挿入／欠失型多型とは、１以上の塩基（例えば１〜数十塩基）が欠失又は挿入していることによる多型をいう。
【００２１】
またハプロタイプとは、連続した遺伝子領域又は遺伝子群中の複数箇所の変異部位における対立遺伝子の種類と数とによって表される上記変異（ＳＮＰｓ）のタイプ（近接する対立遺伝子（アレル）でのアレルの組み合わせ）を示す。その具体例は、例えば後記実施例に示される。ハプロタイプにおける組換え頻度は通常の組換え頻度よりも低く、遺伝的に保存される傾向がある。従って、多型と疾患との関連性を調べる場合には、個々の変異との関連性だけではなく、特定のハプロタイプとの関連性を調べることも重要である。
【００２２】
以下に、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における遺伝子多型について説明する。本明細書において、遺伝子（例えばＭＵＣ５Ｂ遺伝子）におけるＸ番目の塩基をその位置を示す数字Ｘと、塩基を表す記号との組み合わせで示す場合がある。例えば、「１３５Ｇ／Ａ」とは、１３５番目の位置にあるＧ又はＡを示す。また、プロモーター領域のＹ番目の塩基とは、配列番号１に示す塩基配列のＹ番目の位置にある塩基を示す。ここで、配列番号１に示すＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の最後の塩基（１１５３番目の塩基）は、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子の転写開始点から１００番目の塩基に相当する。すなわち、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子の転写開始点は、配列番号１に示される塩基配列の１０５４番目の塩基に相当し、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域は、配列番号１に示される塩基配列の１０５３番目の塩基（−１）から上流の１番目の塩基（−１０５３）の領域である。
【００２３】
（ａ）Ｌ１多型（１３５Ｇ／Ａ）：ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の１３５番目の塩基におけるＧ／ＡのＳＮＰ
（ｂ）Ｌ２多型（１４８Ａ／Ｇ）：ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の１４８番目の塩基におけるＡ／ＧのＳＮＰ
（ｃ）Ｌ３多型：ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目の塩基におけるＣＡの挿入／欠失型多型
（ｄ）Ｌ４多型（８１７Ｇ／Ａ）：ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の８１７番目の塩基におけるＧ／ＡのＳＮＰ
（ｅ）Ｌ５多型（８３７Ｃ／Ｇ）：ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の８３７番目の塩基におけるＣ／ＧのＳＮＰ
（ｆ）Ｌ６多型（９７６Ｃ／Ｔ）：ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の９７６番目の塩基におけるＣ／ＴのＳＮＰ
また、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域におけるハプロタイプは、下記表１に示す多型を含むものである。
【００２４】
【表１】
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表１中、Ｌ３多型の列に示す「Ｉ」は、塩基Ｃ及びＡの挿入を表し、また「Ｄ」は、塩基Ｃ及びＡの欠失を表す。
【００２５】
本発明においては、上記の遺伝子多型を検出することによって、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクを判定する。
【００２６】
ここで、「気道粘膜炎症性疾患」とは、気道粘膜における炎症性疾患を意味し、特に限定はされないが、例えば、びまん性汎細気管支炎（ＤＰＢ）、慢性気管支炎、嚢胞性線維症、気管支拡張炎及び慢性副鼻腔炎などが挙げられる。ムチンは、上皮（例えば粘膜）において細胞防御機能等を有する粘液性のタンパク質であり、また別のムチン遺伝子が炎症性疾患と関係していることも報告されていることから、本発明において検出する遺伝子多型は、上記の気道粘膜炎症性疾患と関連していると考えられる。
【００２７】
また本明細書において、「罹患リスク」とは、疾患への罹りやすさ（感受性）又は罹りにくさ（抵抗性）を意味し、「罹患リスクが高い」とは、他の被験者と比較して、特定の多型を有する被験者が疾患に罹る確率が高いことを意味し、一方「罹患リスクが低い」とは、他の被験者と比較して、特定の多型を有する被験者が疾患に罹る確率が低いことを意味する。また、疾患の罹患リスクの「判定」とは、疾患発症の可能性の判断（罹患危険性の予想）、疾患の遺伝性素因の有無の判断、疾患の遺伝的要因の解明などをいう。
【００２８】
例えば、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における１３５番目の塩基がＧ、１４８番目の塩基がＡ、３９４番目及び３９５番目の塩基が欠失、８１７番目の塩基がＧ、８３７番目の塩基がＣ、並びに９７６番目の塩基がＴのハプロタイプを有する場合には、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクが低いと判定できる。
【００２９】
これに対し、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における１３５番目の塩基がＧ、１４８番目の塩基がＧ、３９４番目及び３９５番目の塩基（Ｃ及びＡ）が挿入、８１７番目の塩基がＡ、８３７番目の塩基がＧ、並びに９７６番目の塩基がＣのハプロタイプを有する場合には、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクが相対的に高いと判定できる。
【００３０】
また例えば、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目における塩基Ｃ及びＡが欠失している多型を有する場合には、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクが低いと判定できる。
【００３１】
一方、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目における塩基Ｃ及びＡが挿入されている多型を有する場合には、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクが相対的に高いと判定できる。
【００３２】
（２）遺伝子多型の検出
本発明において、遺伝子多型の検出の対象は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡのいずれでもよい。また、上記対象を採取する試料としては、任意の生物学的試料、例えば血液、唾液、リンパ液、気道粘液、骨髄液、尿、精液、腹腔液、等の体液；気道粘膜、鼻腔粘膜等の組織細胞等が挙げられる。ゲノムＤＮＡ等は、これらの試料より常法に従い抽出、精製し、調製することができる。
【００３３】
また本発明においては、気道粘膜の炎症性疾患の罹患リスクを判定する対象としては、ヒトを含む哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウスなど）であれば特に限定されない。判定対象は、特にヒトであることが好ましく、さらにはアジア人種であることが好ましい。
【００３４】
上記試料から調製されたＤＮＡ等を用いて、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における遺伝子多型を検出する。ここで、遺伝子多型の「検出」とは、ある特定の遺伝子多型の種類を決定したり、遺伝子多型の有無を判定することをいい、「タイピング」とも呼ばれるものである。
【００３５】
遺伝子多型を検出するにあたっては、まず遺伝子多型を含む部分を増幅する。増幅は、例えばＰＣＲ法によって行われるが、他の公知の増幅方法、例えばＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法等で行ってもよい。
【００３６】
プライマーの選択は、例えば、前記の遺伝子多型部位を含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基、より好ましくは１０〜５０塩基の配列を増幅するように行う。
【００３７】
プライマーは、前記の遺伝子多型部位を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。
【００３８】
増幅のために用いるプライマーは、試料が一の遺伝子多型を有する場合にのみ増幅されるようにセンスプライマー又はアンチセンスプライマーの一方がその遺伝子多型部位にハイブリダイズするように選択してもよい。そのように選択することによって、増幅反応が起こったか否かを調べるだけで遺伝子多型を検出することが可能となる。プライマーは必要に応じて蛍光物質や放射性物質等により標識することができる。
【００３９】
あるいは、遺伝子多型の種類にかかわらず全ての場合にその遺伝子多型を含む領域を増幅できるように、遺伝子多型部位を挟むように２つのプライマーを設計することも可能である。そのようにして得られる増幅産物（断片）のサイズ、塩基配列、高次構造などの差異に基づいて、遺伝子多型を検出することができる。
【００４０】
例えば、サイズの差異に基づいて遺伝子多型を検出する場合には、例えばアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などにより、サイズの差異による移動度の違いを利用して、特定の遺伝子多型を検出することができる。また、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism；ＲＦＬＰ）を利用して検出することもできる。この場合には、遺伝子多型を含む領域を増幅した後、得られた増幅産物を、所定の遺伝子多型に独特な長さの断片を生じることが知られている制限酵素で切断する。制限酵素により消化された増幅産物は、遺伝子多型の種類に応じてサイズが異なるため、上述と同様に電気泳動法などを利用して検出することができる。
【００４１】
また、塩基配列の差異に基づいて遺伝子多型を検出する場合には、得られる増幅産物を直接配列決定することによって、遺伝子多型を検出することができる（ダイレクトシークエンシング法）。配列決定は、例えばジデオキシ法、マキサム−ギルバート法等の公知の方法により行うことができる。
【００４２】
また立体構造の差異に基づいて遺伝子多型を検出する場合には、ＰＣＲ−単鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析を利用することができる。ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法は、増幅して得られた増幅産物を熱変性によって一本鎖ＤＮＡとした後、これをゲル中での電気泳動によって分離し、配列変化による移動度の変化を解析する方法であり、遺伝子多型の差異によって、一本鎖ＤＮＡの高次構造が異なることにより移動度が異なることを利用するものである。
【００４３】
本発明の判定方法においてプライマーとして使用することのできるオリゴヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる：
（ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット
このプライマーセットを用いると、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における３９４番目及び３９５番目における塩基の多型部位を増幅することができる。得られる増幅断片は、上述した直接塩基配列決定法又はＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を用いて分析することにより、３９４番目及び３９５番目における塩基の挿入／欠失型多型を検出することができる。
【００４４】
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット
このプライマーセットを用いると、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の１３５番目、１４８番目、３９４番目及び３９５番目、８１７番目、８３７番目、並びに９７６番目の塩基からなるハプロタイプを含む領域を増幅することができる。
【００４５】
また、遺伝子多型の検出は、一の遺伝子多型に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより行うことができる。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な手段により標識してもよい。プローブは、前記の遺伝子多型部位を含み、試料から調製したＤＮＡ等とハイブリダイズし、採用する検出条件下に検出可能な程度の特異性を与えるものである限りいかなるものでもよい。プローブとしては、例えば前記の遺伝子多型部位を含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基の配列、より好ましくは１０〜５０塩基の配列にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを用いることができる。また、遺伝子多型部位がプローブのほぼ中心部に存在するようにオリゴヌクレオチドを選択するのが好ましい。該オリゴヌクレオチドは、プローブとして機能し得る限り、即ち、目的の遺伝子多型の配列とハイブリダイズするが、他の遺伝子多型の配列とはハイブリダイズしない条件下でハイブリダイズする限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。
【００４６】
本発明に用いるハイブリダイゼーション条件は、遺伝子多型を区別するのに十分な条件である。例えば、試料から調製したＤＮＡ等が一の遺伝子多型の場合にはハイブリダイズするが、他の遺伝子多型の場合にはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件である。
【００４７】
プローブは、一端を基板に固定してＤＮＡチップとして用いることもできる。この場合、ＤＮＡチップには、一の遺伝子多型に対応するプローブのみが固定されていても、両方の遺伝子多型に対応するプローブが固定されていてもよい。
【００４８】
また、遺伝子多型は、上述した以外にも、当業者に公知のあらゆる方法によって検出することができる。そのような方法としては、変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ：denaturing gradient gel electrophoresis）、ミスマッチ部位の化学的切断を利用した方法（ＣＣＭ：chemical cleavage of mismatches）、プライマー伸長法（ＰＥＸ）、インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）法、定量的リアルタイムＰＣＲ検出法（ＴａｑＭａｎ法）等を用いることができる。
【００４９】
（３）気道粘膜炎症性疾患の罹患リスク診断キット
上述したプライマー又はプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクを診断するためのキットとして提供される。
【００５０】
本発明の診断キットは、少なくとも１つオリゴヌクレオチドを含むものである。また、さらに遺伝子多型の検出を実施するために必要な１種以上の成分を含んでもよい。そのような成分としては、限定されるものではないが、制限酵素、ポリメラーゼ、バッファー（例えばＴｒｉｓ緩衝液）、ｄＮＴＰ、標識用及び検出用試薬（蛍光色素など）、説明書などが挙げられる。
【００５１】
本発明の気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクを診断するためのキットにより、被験者の罹患リスクを簡便かつ迅速に診断することが可能となり、その診断結果に応じて適切な処置を施すことができる。
【００５２】
２．Ｍｕｃ５Ｂの発現状態の分析方法
ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域に存在する遺伝子多型は、そのプロモーターの転写活性に影響することから、本発明によればまた、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域に存在する遺伝子多型を検出することによって、Ｍｕｃ５Ｂの発現状態を分析することができる。
【００５３】
例えば、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における１３５番目の塩基がＧ、１４８番目の塩基がＧ、３９４番目及び３９５番目の塩基が挿入（Ｃ及びＡ）、８１７番目の塩基がＡ、８３７番目の塩基がＧ、並びに９７６番目の塩基がＣのハプロタイプの場合には、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーターの転写活性が高く、その結果、Ｍｕｃ５Ｂの発現量が多いと判断できる。
【００５４】
これに対し、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における１３５番目の塩基がＧ、１４８番目の塩基がＡ、３９４番目及び３９５番目の塩基が欠失、８１７番目の塩基がＧ、８３７番目の塩基がＣ、並びに９７６番目の塩基がＴのハプロタイプの場合には、ＭＵＣ５Ｂのプロモーターの転写活性が低く、その結果、Ｍｕｃ５Ｂの発現量が少ないと判断できる。
【００５５】
また、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目における塩基Ｃ及びＡが挿入されている多型の場合には、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の転写活性が高く、その結果、Ｍｕｃ５Ｂの発現量が多いと判断できる。
【００５６】
一方、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーターの３９４番目及び３９５番目における塩基Ｃ及びＡが欠失している多型の場合には、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーターの転写活性が低く、その結果、Ｍｕｃ５Ｂの発現量が低いと判断できる。
【００５７】
３．ＭＵＣ５Ｂの転写活性阻害物質のスクリーニング方法
本発明においては、前記の遺伝子多型を有するＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、候補物質の存在下で該細胞を培養し、リポーター活性を測定し、その活性を指標としてＭＵＣ５Ｂの転写活性阻害物質をスクリーニングすることができる。
【００５８】
このスクリーニング方法において使用する遺伝子多型は、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーターの転写活性を増強し、ＭＵＣ５Ｂの転写を促進してその発現量を有意に高くするものであることが好ましく、例えば、配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目における塩基Ｃ及びＡの挿入、あるいは、配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の１３５番目の塩基がＧ、１４８番目の塩基がＧ、３９４番目及び３９５番目の塩基Ｃ及びＡの挿入、８１７番目の塩基がＡ、８３７番目の塩基がＧ、並びに９７６番目の塩基がＣのハプロタイプであることが好ましい。
【００５９】
スクリーニングは、例えば、上記の遺伝子多型を有するＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の遺伝子断片の下流にレポーター遺伝子を挿入した転写ユニットを構築し、該転写ユニットを導入した細胞を候補物質の存在下又は非存在下の両方の場合について培養し、候補物質の存在下で培養を行った場合にレポーター活性が下がれば、その候補物質はＭＵＣ５Ｂ転写活性阻害物質として選択することができる。
【００６０】
ここでリポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼなどの遺伝子が用いられる。
【００６１】
候補物質としては任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリーでもよい。候補物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
【００６２】
上記のスクリーニング法により得られるＭＵＣ５Ｂの転写活性阻害物質もまた本発明の範囲内である。このようなＭＵＣ５Ｂの転写活性阻害物質は、喀痰量の減少につながり、気道粘膜炎症性疾患の治療剤の候補物質として有用である。
【００６３】
４．ＭＵＣ５Ｂ転写因子のスクリーニング方法
本発明においてはまた、前記の遺伝子多型を有するＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子断片と被験試料を接触させ、上記断片と該被験試料に含まれる該遺伝子多型に特異的な転写因子との結合を検出することによって、ＭＵＣ５Ｂの転写因子をスクリーニングすることができる。
【００６４】
スクリーニングにおいて、前記の遺伝子多型を有するＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子断片と転写因子との結合の検出は、ゲルシフト法（電気泳動移動度シフト解析：electrophoretic mobility shift assay，ＥＭＳＡ）、ＤＮａｓｅＩフットプリント法等によって行うことがきるが、ゲルシフト法が好ましい。ゲルシフト法では、タンパク質（転写因子）が結合すると、ＤＮＡ−タンパク質複合体となるため分子サイズが大きくなり、電気泳動におけるＤＮＡの移動度が遊離ＤＮＡの場合よりも低下するので、電気泳動におけるバンドの「シフト」が起こる。従って、放射性同位体（３２Ｐなど）で標識した遺伝子断片と被験試料とを、例えば混合により接触させ、ゲル電気泳動を行い、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成により生じた移動度の違いをオートラジオグラフィーで検出することができる。すなわち、被験試料中に転写因子が含まれる場合には、転写因子の結合した遺伝子断片はゆっくり移動するため、通常のバンドよりも遅れて移動するバンドとして検出される。
【００６５】
スクリーニングにおいて用いる被験試料は、ＭＵＣ５Ｂの転写因子（タンパク質）の存在が予想される試料であれば特に限定されるものではなく、天然由来の試料、あるいはペプチドライブラリーなどでもよい。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００６７】
〔実施例１〕ムチンＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における欠失・挿入多型の同定
ヒト末梢血白血球よりゲノムＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを鋳型として表２に示すプライマーセット（配列番号２及び３）を用いてＰＣＲを行った。酵素にはＴａｑポリメラーゼ（AmpliTaq Gold DNA polymerase,Applied Biosystems,Foster City,California,USA）を用いた。
【００６８】
【表２】
0004825956.tif 000003
【００６９】
得られたＰＣＲ産物を用いて、ABI BigDye terminator cycle-sequencing kit とABI3100 automated sequencer（Applied Biosystems, Foster City,California,USA）を用いて塩基配列を決定した。その結果、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域に塩基Ｃ及びＡの欠失又は挿入の多型を見出すことができた。この欠失・挿入多型（Ｌ３とする）を含む周辺の塩基配列と、この多型の周囲に認められた別の５つの多型（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６）を図１に示す。Ｌ３以外は既知のものであり、ＮＣＢＩのデータベースであるｄｂＳＮＰの登録番号はそれぞれ、ｒｓ８８５４５５（Ｌ１），ｒｓ８８５４５４（Ｌ２）、ｒｓ７１１５４５７（Ｌ４）、ｒｓ７１１８５６８（Ｌ５）及びｒｓ２７３５７３８（Ｌ６）である。
【００７０】
この多型Ｌ３は、表２に示したプライマーセット（配列番号２及び３）で増幅したＰＣＲ産物を、１０％アクリルアミドゲル上で泳動するＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を用いても同様に確認することができた。
【００７１】
〔実施例２〕ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における多型とＤＰＢとの関連性
（１）ハプロタイプ解析
ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域には、ハプロタイプ解析の結果、多型Ｌ１からＬ６よりなる３つの代表的なハプロタイプが認められ（表３）、Ｌ３が欠失となっているＨ２の頻度は、ＤＰＢ患者で有意に低下していた（ｐ＝０．０００２）。
【００７２】
【表３】
0004825956.tif 000004
表３中、多型Ｌ３の列に示す「Ｉ」は、塩基Ｃ及びＡの挿入を表し、また「Ｄ」は、塩基Ｃ及びＡの欠失を表す。
【００７３】
ハプロタイプ関連解析の結果より、Ｌ３におけるＣＡの欠失をともなうハプロタイプがＤＰＢにおいては疾患抵抗性に関与している可能性が考えられた。このＬ３多型を含むプロモーターの転写活性を検討するためルシフェラーゼアッセイを行った。
【００７４】
上記６つの多型を含む１０９０塩基の領域を、制限酵素ＢｇｌＩＩサイト及びＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加したプライマーセットで増幅し（表４；配列番号４及び５）、これらの制限酵素で処理した後、pGL3-Basic Vector（Promega,Madison,WI,USA）にクローニングした。このプラスミドを大腸菌に導入・増幅し、抽出後に肺粘液性類表皮癌由来のヒト気管支上皮細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１８４８）にトランスフェクトし、２４時間培養後にDual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）にて活性を測定した（図２）。Ｌ３を含むハプロタイプが最も低い転写活性を有しており、健常者においてＭｕｃ５Ｂの分泌を低下させることにより、ＤＰＢの疾患抵抗性に関与している可能性が考えられた。
【００７５】
【表４】
0004825956.tif 000005
【００７６】
（２）個々の多型とアリル頻度との解析
ＭＵＣ５Ｂのプロモーター領域に同定された６つの多型に関して、ＤＰＢ患者９２例と健常対照１２８例のＤＮＡを用いて遺伝子多型を検出し、その関連を解析した。アリル頻度の検討では、Ｌ２（ｐ＝０．００８）、Ｌ４（ｐ＝０．０４９）、Ｌ６（ｐ＝０．０４）で疾患と関連が示されたが、Ｌ３の欠失・挿入多型の検討の結果、表５に示すように、Ｌ３における塩基ＣＡの欠失はＤＰＢ患者で有意に低下していた（ｐ＜０．０００１）。従って、このＬ３多型は、ＤＰＢの疾患抵抗性に関係しているといえる。
【００７７】
【表５】
0004825956.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明により、気道粘膜炎症性疾患（特にびまん性汎細気管支炎）の罹患リスクを判定することが可能となる。また、本発明のオリゴヌクレオチド及び診断キットにより、かかる判定を簡便かつ迅速に行うことができる。
【００７９】
また本発明により、ＭＵＣ５Ｂの転写活性阻害物質及び転写因子をスクリーニングすることができ、ＭＵＣ５Ｂが関連する可能性のある気道粘膜炎症性疾患の発症機構の解明、その予防又は治療薬の開発などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域におけるＬ１〜Ｌ６の遺伝子多型を示す図である。
【図２】ハプロタイプＨ１、Ｈ２又はＨ３を有するＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の転写活性を示す図である。
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号１：Ｙ＝Ｃ又はＴ、Ｒ＝Ａ又はＧ、Ｓ＝Ｇ又はＣ、ＮＮ＝ＣＡの挿入／欠失
配列番号２〜５：合成オリゴヌクレオチド
【図１】
0004825956.tif 000007
【図２】
0004825956.tif 000008
【配列表】
0004825956000001.app