(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)−ラミナリア オクロロイカ（Laminaria ochroleuca）を収穫する工程；
b)−洗浄する工程；
c)−破砕及び微小破砕する工程；
d)−遠心により細胞破砕片を除去する工程；
e)−酸を用いる沈殿及び活性炭上への吸着により分画する工程；及び
f)−ＨＰＬＣを用いるグリシン−ベタインの定量分析によりコントロールされる濾過工程であり、該濾過が１０００Ｄのカット−オフ閾値（cut-off threshold）を有するタンジェンシャル濾過（tangential filtration）である濾過工程
を含む方法を用いて得られることを特徴とする藻類のベタインに富む抽出物。
【請求項２】
該方法のe)工程において、酸が塩酸である請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
グリシン−ベタインを少なくとも１０重量％含むことを特徴とする請求項１に記載の抽出物。
【請求項４】
化粧品又は医薬用途の組成物における有効成分としての、請求項１〜３のいずれかに記載の藻類抽出物の使用。
【請求項５】
浸透性ストレスから細胞内環境を保護する有効成分としての、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
抗−ラジカル有効成分としての、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
皮膚の抗−老化有効成分としての、請求項４に記載の使用。
【請求項８】
有効成分として請求項１〜３のいずれかに記載の抽出物を１〜４０重量％含む、クリーム、ジェル、エマルジョン又は乳剤(milk)タイプの化粧品又は医薬組成物。
【請求項９】
a)−ラミナリア オクロロイカ（Laminaria ochroleuca）を収穫する工程；
b)−洗浄する工程；
c)−破砕及び微小破砕する工程；
d)−遠心により細胞破砕片を除去する工程；
e)−酸を用いる沈殿及び活性炭上への吸着により分画する工程；及び
f)−ＨＰＬＣを用いるグリシン−ベタインの定量分析によりコントロールされる濾過工程であり、該濾過が１０００Ｄのカット−オフ閾値（cut-off threshold）を有するタンジェンシャル濾過（tangential filtration）である濾過工程
を含むことを特徴とする、藻類のベタインに富む抽出物の調製方法。
【請求項１０】
該方法のe)工程において、酸が塩酸である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該方法のe)工程がｐＨ１．０で行われる、請求項９又は１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ベタインに富む藻類抽出物、その抽出方法並びに化粧品及び医薬組成物における有効成分としてのその使用に関する。
【０００２】
【従来の技術及びその課題】
特に汚染、温度変化、湿度変化のために、及びより特別な環境下で、海水に長い間接触したり太陽に晒されたことによる、主として外部環境の活動的な影響から皮膚の保護を確実にする組成物を提供することが、化粧品の製造業者の不変の目的である。
【０００３】
種々の有効成分は、好ましくは天然の、野菜又は動物起源において探し求められている。実際、ストレスの各種の条件に対して細胞保護に寄与するいくつかの分子が、天然に見い出されている。これらの中で、ベタインは、ホメオスタシスを維持し、特に浸透性ストレスから細胞内環境を保護する役割を果たすことが知られている（特に、Petroniniら Biochem. J. 282, 1992, 69-73 及び Sutherlandら, J. Bacteriol., 168, 1986, 805-814 参照）。
【０００４】
これらの分子は、動物及び植物界の双方において、又はバクテリア及びプランクトンにおいて、見い出されている。
【０００５】
それらは、浸透圧の変化を受ける藻類、特に波との接触および出現を交互に受ける藻類の場合に豊富にある。
【０００６】
これが、本出願人が、特に化粧品工業にとって潜在的に興味のある分子を探索するために、ブリタニーの海岸において多量の褐藻(Pheophyceae)ファミリーの褐藻類を利用した理由である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本出願人は、特にラミナリア  オクロロイカ（Laminaria ochroleuca）として知られる藻類の抽出物を調製すること及び工業的スケールで実行するのに容易な方法を用いて該抽出物をベタインファミリーの物質で豊富にすることに努力した。
【０００８】
本発明の方法は、
a)−新鮮な藻類を収穫する工程；
b)−該藻類を洗浄する工程；
c)−破砕及び微小破砕する工程；
d)−遠心により細胞破砕片を除去する工程；
e)−酸、好ましくはＨＣｌを用いる沈殿及び活性炭上への吸着により分画する工程；
f)−ＨＰＬＣを用いるグリシン−ベタインの定量分析よりモニターされ、濾液のグリシン−ベタイン濃度が１２．５％に到達したときに停止する濾過工程（この濾過は、好ましくは１０００Ｄのカットオフ閾値でのタンジェンシャル濾過(tangential filtration)である
を包含する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
かくして得られる抽出物は、少なくとも１０％を示すグリシン−ベタイン濃度に関して標準化されており、原料物質源がコンブ属(Laminaria)であることから、ラミナイン（Laminaine）と呼ばれるだろう。
【００１０】
浸透保護剤としてのベタインの公知の性質に加えて、本出願人は、細胞膜及び細胞外マトリクス（プロテオグリカン類及びグリコサミノグリカン類）の構成要素の新合成（neosynthesis）についての、抗−ラジカル効果及び刺激効果を明らかにした。本出願人は、本発明の藻類抽出物を特に化粧品用途の組成物の有効成分としての使用を企図してこれらの予測できない性質を利用した。
【００１１】
藻類抽出物の異なった性質は、本出願人により明らかにされ、これは以下に示す実施例から明らかになるが、実際には皮膚のコンディションを改善するためおよびフリーラジカル放出の原因となる及び／又は皮膚再生を減速して老化を促進するストレスの様々なコンディションに対する抵抗性を改善するために、特に本発明の抽出物を使用することを予期できる。
【００１２】
このように、本発明は、化粧品組成物又は医薬組成物において、上記藻類抽出物を、特に浸透保護、抗−ラジカル及び抗皮膚老化の有効成分として使用することに関する。
【００１３】
該有効成分は、クリーム、ジェル、エマルジョン又は乳剤(milk)タイプのいかなる化粧品組成物及び医薬組成物に混合するために使用できる。
【００１４】
本発明は、また、上記藻類抽出物を１〜４０％含有する化粧品組成物又は医薬組成物に関する。
【００１５】
同一の有効成分は、下記に示す方法と類似の抽出方法を用い、他の植物からも抽出され得る。
【００１６】
本発明の目的はまた、それを含む任意の植物から抽出された上記有効成分を、フリーラジカルに対して保護する有効成分として及び／又は皮膚の抗老化トリートメントとしての使用に拡がる。
【００１７】
以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく、本発明を説明する。
【００１８】
実施例１：抽出プロセス
ラミナリア・オクロロイカ・アルガ(Laminaria ochroleuca alga)は、ブリタニー（Brittany）の北部海岸で、５月から９月の間に収穫された。
【００１９】
収穫された藻類は、容器中の海水中で移される。それらは、製造サイトに着くと直ぐに、処理される。
【００２０】
それらは、ウルシェル（Urschell,  登録商標）型のブレードクラッシャー中で、破砕され、１００〜２００μｍの範囲のサイズの粒子にされる。
【００２１】
破砕された材料は、グリコール含有（５０％）脱イオン水中に、溶液１リットル当たり破砕物４３０ｇの割合で、懸濁される。
【００２２】
より微細な破砕は、細胞の内容物を放出させるために、ウルトラチュラックス（Ultra Turax,  登録商標）型のブレードホモジナイザーを用いて、常温で３時間行われる。
【００２３】
破砕された材料は、細胞破砕片を除去するために、１６０００ｇで４５分間遠心分離された。上清を回収し、当初の容量の３分の１にまで真空濃縮する。
【００２４】
次いで、蒸留水中で１／２０に希釈し、それにｐＨを１．０とするための３５％ＨＣｌ、及び４％の活性炭を加え、そして３０分間マグネティックスターラーによる攪拌に供した。
【００２５】
酸の添加により多数の望ましくない物質（特にタンパク質）を沈殿させることができ、又活性炭は種々の有機物質（フェノール型物質等）を吸着する。
【００２６】
次いで、その上清は、１０００Ｄのカット−オフ閾値（cut-off threshold）でタンジェンシャル濾過（tagential filtration）することにより、ベタイン類を濃縮する。清澄な濾液を集めて、Zamarrenoの方法（J. Agricultural and Food Chemistry, 45,3:774-776）に従って、ＵＶ検出器を備えたＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて分析した。
【００２７】
標準として、精製したグリシン−ベタイン（シグマ社）の０．２、０．４、０．８及び２重量％の蒸留水溶液を用いて、２０倍希釈して、検量線を作成する。
【００２８】
藻類抽出物試料は、そのクロマトグラフイーピークの表面を標準曲線と比較して、測定される。
【００２９】
濃縮工程は、グリシン−ベタイン濃度が１２．５±２．５％に達したときに停止した。かくして得られた抽出物を、以下の例において、「ラミナイン（Laminaine）」と称する。
【００３０】
実施例２：抗ラジカル効果の証明
ラミナインが抗ラジカル効果を有しているという事実は、皮膚生検から培養されたヒト真皮の繊維芽細胞におけるマロンジアルデヒドを定量的に分析することにより、証明された。試験は、第二代から第四代の培養の間の培養物について行われる。
【００３１】
マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）定量分析：脂質過酸化指数（Lipoperoxidation index）。
【００３２】
繊維芽細胞は、多数のマルチウエルディッシュ（各２４ウエル）に、１０％牛胎児血清、１０ｍＭのＬ−グルタミン及び８０μｌのゲンタマイシンが補足されたＲＰＭＩ  １６４０培養培地１ｍｌ中に、ウエル当たり１０5個の細胞の割合で、分配された。それらは、次いで、ＣＯ2インキュベータ中で２４時間維持された。
【００３３】
ラミナインは、１用量につき３ウエルの割合で、マルチウエルディッシュに異なる濃度（純品、１／２、１／５及び１／０）で分配された。種々の試験が、並行して行われた：
−３ウエルは、溶媒のみを受けた；
−３ウエルは、ＳＯＤ（スーパオキシドディスムターゼ）及びカタラーゼを受けた（ネガティブコントロール）；
−３ウエルは、キサンチン−ヒポキサンチンコンプレックスを受けた（防御酵素の効率の試験（ＳＯＤ＋カタラーゼ））；
−１２ウエルは、キサンチン−ヒポキサンチンに加えて、ラミナインの４種の希釈物を受けた；
−１２ウエルは、ラミナインの４種の希釈物を受けた。
【００３４】
マロンジアルデヒドの抽出
細胞のトリプシン処理（trypsinisation）及び遠心分離後、細胞ペレットを下記中に懸濁した：
−２５０μｌの５０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８、０．１ＭのＮａＣｌ含有；
−２０ｍＭ  ＥＤＴＡ
−２５μｌの７％ＳＤＳ
−３００μｌのＨＣｌ（０．１Ｎ）
−３８μｌの１％リンタングステン酸水溶液
−３００μｌの０．６７％チオバルビツール酸水溶液
５０℃の暗所で１時間インキュベーション後氷水中で冷却し、各チューブに３００μｌのｎ−ブタノールを加えた。これらを、０℃、１００，０００ｇで１０分間遠心分離した。上相をＭＤＡ定量分析のために回収した。
【００３５】
マロンジアルデヒド定量分析
ＭＤＡは、下記ＨＰＬＣを用いてＭＤＡ−ＴＢＡコンプレックスを分離後、蛍光を測定することにより、定量的に分析された。
【００３６】
−モデル２．２００ビショフ（Bischoff）ポンプ
−モデルアルコット（Alcott）オートサンプラー自動インジェクター
−Ｃ１８ウルトラセップ（Ultrasep）カラム（３０ｃｍ×０．１８ｃｍ）、多孔度(porosity)６μｍ
−蛍光検出器、ジャスコ（Jasco）８２１−Ｆ１。
【００３７】
蛍光検出は、励起５１５ｎｍ及び発光５５３ｎｍで行われた。使用した溶出液は、メタノール：水、４０：６０（ｖ／ｖ）からなり、そのｐＨは１ＭのＫＯＨで８．３に調整された。
【００３８】
定量は、ＩＣＳソフトウエアパッケージ（ピック(Pic)３）（インストルメンテーション、コンソンマブルサービス（Instrumentation, Consommable Service））を用いて、同様に処理した標準試料（０．１２５；０．２５；０．５；１μＭ）と関連させて、行われた。
【００３９】
タンパク定量分析
タンパクの定量分析は、ブラッドフォード（BRADFORD）法を用いて行われた。５９５ｎｍの吸光度の増加は、ユニカム（UNICAM）８６２５分光光度計を用いて測定されたタンパクの濃度に比例する。
【００４０】
結果−細胞ホモジネート中のマロンジアルデヒドの定量分析
１−生理的な脂質過酸化
【００４１】
【表１】
0004632494.tif 000002
【００４２】
ラミナインの存在下、特に１／５〜１／１０希釈において、生理的な脂質過酸化に対する顕著な防御が認められた。
【００４３】
２−誘導された脂質過酸化
この分析の目的のためには、ラミナイン純品又は１／２希釈の生理的なＭＤＱの有意でない減少の観点から、１／５及び１／１０希釈のみが使用された。
【００４４】
【表２】
0004632494.tif 000003
【００４５】
ラミナインが、キサンチン／ヒポキサンチンのフリーラジカルを生じる系により起こる脂質過酸化に対して、１／５及び１／１０希釈において、相当な防御を与えること、それは公知の防御酵素のＳＯＤ−カタラーゼにより与えられる防御と少なくとも同程度であることが、認められた。
【００４６】
用いられた実験条件下で、ラミナインは、このように、培地中で２４時間の接触後、ヒト繊維芽細胞上で、有意な抗ラジカル活性を有している。
【００４７】
実施例３−培養物中の線維芽細胞によるプロテオグリカン及びグリコサミノグリカン合成刺激の実証
ヒト皮膚の生検から得た線維芽細胞を、培地中にまき、２〜４継代によって増倍させ、10%ウシ胎児血清、10mM L-グルタミン及び80μg/ml ゲンタマイシンを添加した10mlのRPMI 1640培養培地を含む多数の25cm2のディッシュに105個/mlの割合で分配させた。その後、CO2インキュベータ中２４時間維持した。
【００４８】
ラミナインを種々の濃度（1/2、1/5及び1/10希釈）で、１用量当たり３ディッシュに基づき、各ディッシュに分配した。同時に、３つのディッシュには水のみを加え、コントロールの目的で使用した。
【００４９】
ラミナインで前処理した細胞の放射性前駆体を取り込み能力(capacity))を調べるために、パルス技術を採用した。放射性前駆体である（[3H]）-グルコサミンを、細胞の回収前１８時間に培養物中に加えた。細胞-生成物接触時間は３７℃で２４時間であった。
【００５０】
培地を吸引によって除去した後、細胞を無血清培地で２度洗浄し、取り込まれなかった放射能を除去し、その後、支持体から培養物の表面をこすることによって、剥離させた。細胞をもう一度、培地で洗浄し、その後、600gで5分間遠心した。以下の操作をこの細胞ペレットについて行った。
【００５１】
−FPLC（ファースト蛋白液体クロマトグラフィー(Fast Protein Liquid Chromatography)）を用いたプロテオグリカンの定量分析
−総グルコサミノグリカン（GAGs）の新合成（neosynthesis）
−総蛋白の定量分析
−選択的消化によるグリコサミノグリカンの特徴付け。
【００５２】
−  抽出
膜プロテオグリカン
ペレットの第１画分をデオキシリボヌクレアーゼ(50 U/ml)及びプロテアーゼインヒビターを含む1M NaCl中に懸濁液に置き換えた。その後、ホモジネートを４℃で２時間インキュベートした。12000gで30分間遠心して、膜周囲の（peri-membrane）プロテオグリカンを含む第１のホモジネートを得た。該ペレットを用いて他の２種のコンポーネントからプロテオグリカンを抽出した（Ｃ１）。
【００５３】
膜貫通(Trans-membrane)プロテオグリカン
第１抽出工程から得られたＣ１ペレットを、4% デオキシコール酸ナトリウムを含む0.1% アジ化ナトリウム溶液に再懸濁させ、75mVで20秒間超音波処理し、その後、4℃で２時間インキュベートした。膜貫通プロテオグリカンを含む第二の上清を、12000gで30分間遠心することによって得た。該ペレットを用いてマトリクス・コンパートメントからプロテオグリカンを抽出した（Ｃ２）。
【００５４】
マトリクス・プロテオグリカン
ペレットＣ２を0.1% アジ化ナトリウム溶液で３回洗浄し、その後、攪拌しながら4M HCl グアニジン、0.1% トリトンX-100及びプロテアーゼインヒビターを含む50mM 酢酸ナトリウムバッファー中の懸濁液に置き換えた。
【００５５】
マトリクスプロテオグリカンを含む第三の上清を、12000gで30分間遠心することによって得た。
【００５６】
２−ＦＰＬＣを用いた精製
ＦＰＬＣを用いて精製する前に、３種の上清の各々を３倍の容量の100%純エタノール中4℃で終夜沈殿させ、その後、12000gで30分間遠心した。得られたペレットを、50mM Tris-HClバッファー、pH7.4に再懸濁させた。
【００５７】
同様な分析プロトコルを３試料について行った。
【００５８】
陰イオン交換クロマトグラフィーを用いた。これは、実際に、それらのグリコサミノグリカン鎖によりプロテオグリカンに供給された高密度の負の荷電によって促進された。
【００５９】
各ペレットを、250mlの50mM Tris-HClバッファー、pH7.4に再懸濁させた。DEAE-Sepharose gel CL-6B（ファルマシア）を、K 10/40カラム（ファルマシア）にそそぎ入れた。この陰イオン交換ゲルは高い分離能及び高収率を与える。各試料100μlを注入した；溶出の後、波長280nmの分光蛍光計で検出した。
【００６０】
プロテオグリカンを含むピークを1M NaClで溶出した。
【００６１】
３−定量分析
放射能測定を  パッカード(Packard)（Flo-one）カウンターを用いてHPLCからの出口で行った。
【００６２】
４−選択的分解を用いた同定
画分中に存在するGAGsの性質を決定するために、異なる分解反応を行った。
【００６３】
ACコンドロイチナーゼによる消化
ACコンドロイチナーゼは、グルクロン酸を解重合させ、その結果、コンドロイチン硫酸を分解する。
【００６４】
GAGsの凍結乾燥した材料のアリコートを、ACコンドロイチナーゼ（0.2U/ml）を含むTris-HClバッファー、pH8中37℃で１時間インキュベートした。反応を-20℃で凍結することによって停止させた。
【００６５】
ABCコンドロイチナーゼによる消化
ABCコンドロイチナーゼは、グルクロン酸及びイズロン酸を解重合させ、その結果、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸を分解する。
【００６６】
GAGsの凍結乾燥材料の第二のアリコートを、ABCコンドロイチナーゼ（0.5U/ml）を含む同じTris-HClバッファー、pH8中37℃で１時間インキュベートした。反応は-20℃で停止させた。
【００６７】
亜硝酸による消化
亜硝酸溶液を、硝酸ナトリウム（0.148M）及び酢酸（3.6M）を混合することによって調製した。
【００６８】
亜硝酸は、アミノスルホネート基を有するグルコサミン結合から、２位でグルコシド結合を切断する；その結果、これはヘパリン及びヘパラン硫酸に特異的である。
【００６９】
反応は、周囲温度で８０分間行った；それは、1M 硫酸アンモニウムを添加することによって停止させた。加水分解物は、乾燥蒸発させ、その後、分析のために50mM Tris-HCl溶液に再置換させた。
【００７０】
CL.6Bゲル（ファルマシア）上でのGAGsの分離
このゲルは、低分子量の分子を研究するのに適している。50mM Tris-HClバッファー、pH7.4によって平衡化させ、 K 10/40カラム（ファルマシア）にそそぎ入れた。溶出は、0.35M NaClを含む同じバッファーを用いて行った。1ml画分を集め、5mlのシンチレ−ティング液を添加後、カウントした。
【００７１】
【表３】
0004632494.tif 000004
【００７２】
このように、我々は、ラミナイン存在下でのプロテオグリカンの新合成の有意な刺激を観察する。
【００７３】
【表４】
0004632494.tif 000005
【００７４】
結論として、1/5及び1/10に希釈したラミナインは、培養物中のヒト線維芽細胞のマトリクス構成成分の新合成に、有意な作用を示す。
【００７５】
得られた結果は、実際に、各々膜（67%）、膜周囲（約34%）及びマトリクス（1/5に希釈の場合で25%）におけるプロテオグリカンの新合成の有意な刺激を示している。
【００７６】
同時に、DS/HS及びDS/CS対及びHSの定量分析によって、細胞膜の領域中に特に存在するヘパラン硫酸の産生を刺激（1/10に希釈した場合30%）することが判明した。細胞レベルでのPGsの存在は、細胞及び細胞外マトリクスの代謝において主要な効果を有する。これらPGsは、それらの局在によって、種々のタイプの細胞−リガンド、細胞−細胞及び細胞−マトリクスの相互作用を引き起こし得る。
【００７７】
実施例４−培養物中の繊維芽細胞によるコラーゲン合成刺激の証明
繊維芽細胞を実施例３と同様の条件下に培養物中にまく。
【００７８】
細胞のプレインキュベーション
プレインキュベーションの目的は、血清因子の減少を通して細胞の活性を低下させることによって、細胞を細胞周期のＧ１期又はＧ０期に同期させることである。コンフルエンス段階に達した後、培地を除去し、0.5％のFCSが添加されたRPMI培地に置き換える。プレインキュベーション時間は24時間続ける。
【００７９】
細胞インキュベーション
細胞インキュベーションが終わると、培地を除去し、全ての痕跡量の血清成分を除去するために、FCSを含まないRPMI培地で細胞層をリンスする。インキュベーション操作は、0.28 mmole/lの濃度のビタミンＣ又は、種々の希釈度のラミナインを添加した培養培地で行う。
【００８０】
使用されたビタミンＣの濃度は、コラーゲンの分泌だけでなくヒドロキシル化酵素を活性化するのに最適である。0.2mmole/lの濃度のβ−アミノプロピオニトリルもまた、リシル−オキシダ−ゼ酵素を阻害することによって、培養培地中にフィブリルの形で新合成コラーゲンが析出するのを防ぐために添加される。
【００８１】
インキュベーション時間（24時間）の終わりに、培養培地を回収し、細胞層をリンスする。
【００８２】
HPLCを使用したヒドロキシプロリンの定量分析
−方法の原理
アミノ酸類は、オフトアルデヒドアシッド（ophtaldehyde acid; OPA）で誘導され、その干渉を除く。ヒドロキシプロリン及びプロリンは、アミノ基をNBD-Clに結合させることによって、NBD-Clで誘導される。NBD-Hpを逆相HPLCを用いて分離し同定する。アミノ酸誘導体の分離を調製するために、ヒドロキシプロリンを含有するスタンダードを最初にNBD-Clに結合させた。
−材料
ヒドロキシプロリンは、逆相HPLCを用いて分離した後、蛍光を測定することにより定量化する。
−モデル2.00ビショフ(Bischoff)ポンプ
−アルコットモデル(Alcott Model)788オートサンプラータイプ自動インジェクター
−ウルトラセプ(Ultrasep)Ｃ18カラム（30cm×0.18cm)、多孔度(porosity)6μm−蛍光検出器、ジャスコ（Jasco）821-FI
−クロマトグラフィー条件：
移動相は、アセトニトリル／リン酸ナトリウムバッファー混合物、01 mol/l, pH7.2(9:91v/v)によって構成される；流速を1ml/分にセットする；溶離は定常モード(stationary mode)で行われ、サイクルは10分続く。移動相は予め濾過され、使用前に脱気される。
−試薬の調製
NBD-Cl＝25mmoleをメタノールに溶解する。
【００８３】
OPQ＝メタノール中に150mmole
バッファー＝0.4mmole/l；pHを7.2に調整する
ヒドロキシプロリンの水溶液（50mg/l）、及び0.5から40mg/lの範囲の濃度を得るために希釈される。
−標準範囲
10μlの種々濃度の標準溶液を10μlのバッファー（pH9）と混和する。5μlのOPAを添加して撹拌した後、チューブを周囲温度で5分間維持する；次に、10μlのNBD-Cl溶液を添加する。反応は、遮光下で60℃で3分間行う。そしてチューブを氷中に置く。得られた着色はオレンジ色で、遮光下では少なくとも3時間は安定である。この混合物50μlを注入する。サンプリングカーブは直線である。
【００８４】
培養培地のサンプルを同様に処理し、試験を3回繰り返す。
−結果
ヒドロキシプロリンの分離及び同定は、逆相HPLCを使用して行われた。蛍光ピークは、積分後、培養培地中のヒドロキシプロリン濃度を計算するために使用された。
【００８５】
【表５】
0004632494.tif 000006
【００８６】
1/5及び1/10に希釈されたラミナインは、コンフルエントなヒト繊維芽細胞において、コラーゲン合成及びヒドロキシル化酵素の活性化に最適の濃度で使用されたビタミンＣ（43％）によって誘導されるよりもコラーゲン新合成の増加が大きいことが認められた。