(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１またはそれ以上の分析物を検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）１またはそれ以上の分析物サンプルおよび１またはそれ以上の分析物捕獲物質を接触させ、ここに分析物捕獲物質はそれぞれ、分析物と直接または間接的に相互作用し、少なくとも１つの分析物は、分析物サンプル中に存在するならば、少なくとも１つの分析物捕獲物質と相互作用し、
分析物捕獲物質および分析物の相互作用を促進する条件下で分析物サンプルおよび分析物捕獲物質をインキュベートし、
（ｂ）工程（ａ）の前に、工程（ａ）と同時に、または工程（ａ）の後に、少なくとも１つの分析物捕獲物質および１またはそれ以上のレポーター結合プライマーを接触させ、ここにレポーター結合プライマーはそれぞれ、特異的結合分子およびローリングサークル複製プライマーを含み、特異的結合分子はそれぞれ、分析物捕獲物質と直接または間接的に相互作用し、ならびに、
特異的結合分子および分析物捕獲物質の相互作用を促進する条件下で分析物捕獲物質およびレポーター結合プライマーをインキュベートし、
（ｃ）工程（ａ）または工程（ｂ）の前に、工程（ａ）または工程（ｂ）と同時に、あるいは工程（ａ）または工程（ｂ）の後に、レポーター結合プライマーおよび１またはそれ以上の増幅標的サークルを接触させ、ここに増幅標的サークルはそれぞれ、プライマー相補部分を含む一本鎖の環状ＤＮＡ分子を含み、このプライマー相補部分は少なくとも１つのローリングサークル複製プライマーと相補的であり、ならびに、
増幅標的サークルおよびローリングサークル複製プライマーのハイブリダイゼーションを促進する条件下でレポーター結合プライマーおよび増幅標的サークルをインキュベートし、
（ｄ）工程（ｃ）の後でかつ、工程（ａ）または（ｂ）の前に、工程（ａ）または（ｂ）と同時に、あるいは工程（ａ）または（ｂ）の後に、増幅標的サークルの複製を促進する条件下でレポーター結合プライマーおよび増幅標的サークルをインキュベートし、
ここに増幅標的サークルの複製は直列型配列ＤＮＡ形成を生じさせ、直列型配列ＤＮＡの検出は対応する分析物の存在を示す。
【請求項２】
複数の分析物捕獲物質を１またはそれ以上の分析物サンプルと接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
複数の分析物サンプルを１またはそれ以上の分析物捕獲物質と接触させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの分析物がタンパク質またはペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１つの分析物が脂質、糖脂質、またはプロテオグリカンである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの分析物がヒト起源である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの分析物が非ヒト起源である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
分析物がいずれも核酸ではない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）の後で、かつ工程（ｂ）、（ｃ）、もしくは（ｄ）の前に、同時に、もしくは後に、分析物が、分析物サンプルから分析物捕獲物質を分離し、これにより分析物サンプルから分析物を分離することにより、分析物サンプルから分離される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの分析物が固形支持体に結合され、ここに固形支持体に結合された分析物と相互作用する分析物捕獲物質が固形支持体に結合される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
各分析物が固形支持体のあらかじめ決められた異なる領域に位置する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
固形支持体のあらかじめ決められた異なる領域間の距離が固定されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
固形支持体が、薄いフィルム、膜、ボトル、ディッシュ、ファイバー、織り繊維、成型ポリマー、粒子、ビーズ、微粒子、または組み合わせを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
固形支持体の少なくとも２つのあらかじめ決められた異なる領域間の距離が可変である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
固形支持体が、少なくとも１つの薄いフィルム、膜、ボトル、ディッシュ、ファイバー、織り繊維、成型ポリマー、粒子、ビーズ、または微粒子を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
固形支持体が、少なくとも２つの薄いフィルム、膜、ボトル、ディッシュ、ファイバー、織り繊維、成型ポリマー、粒子、ビーズ、微粒子、または組み合わせを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
固形支持体上の直列型配列ＤＮＡの位置が、固形支持体のある位置において分析物が分析物サンプル中に存在することを示す、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
固形支持体が、固形支持体の、複数のあらかじめ決められた異なる領域に位置する複数の分析物を含み、ここに分析物が包括的に複数の分析物捕獲物質と対応する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
固形支持体が、薄いフィルム、膜、ボトル、ディッシュ、ファイバー、織り繊維、成型ポリマー、粒子、ビーズ、微粒子、または組み合わせを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
固形支持体が、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン、酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカルボナート、テフロン、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンラバー、ポリアンヒドライド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、またはポリアミノ酸を含む、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
固形支持体が多孔性である、請求項１０〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの分析物サンプルおよび少なくとも１つの分析物捕獲物質を少なくとも１つのアクセサリー分子と接触させ、ここにアクセサリー分子は、少なくとも１つの分析物および少なくとも１つの分析物捕獲物質の相互作用に影響するものであることをさらに含む、請求項９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ａ）の前に、工程（ａ）と同時に、あるいは工程（ａ）の後に、アクセサリー分子を、少なくとも１つの分析物サンプル、少なくとも１つの分析物捕獲物質、または両者と接触させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１つの分析物を固形支持体と結合させ、ここにアクセサリー分子が固形支持体と結合される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ａ）の前に、工程（ａ）と同時に、あるいは工程（ａ）の後に、固形支持体と接触させることによって、アクセサリー分子が固形支持体と結合される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アクセサリー分子がタンパク質キナーゼ、タンパク質ホスファターゼ、酵素、または化合物である、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
アクセサリー分子が目的の分子であり、１またはそれ以上の分析物が試験分子であり、ここに、試験分子の、目的の分子との相互作用が検出される、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つの分析物が目的の分子であり、アクセサリー分子が試験分子であり、ここに、試験分子の、目的の分子との相互作用が検出される、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの分析物捕獲物質が目的の分子であり、１またはそれ以上の分析物が試験分子であり、ここに、試験分子の、目的の分子との相互作用が検出される、請求項９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも１つの分析物が目的の分子であり、１またはそれ以上の分析物捕獲物質が試験分子であり、ここに、試験分子の、目的の分子との相互作用が検出される、請求項９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ａ）の前に、工程（ａ）と同時に、あるいは工程（ａ）の後に、以下の工程をさらに含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法：
１またはそれ以上の第二の分析物捕獲物質および１またはそれ以上の第二の分析物サンプルを接触させ、
ここに、各分析物捕獲物質は分析物相互作用部分および捕獲部分を含み、分析物捕獲物質それぞれに関し、適合する第二の分析物捕獲物質が存在し、各第二の分析物捕獲物質は分析物相互作用部分および捕獲部分を含み
この分析物捕獲物質の分析物相互作用部分は、適合する第二の分析物捕獲物質の分析物相互作用部分と同一の分析物と相互作用し、
前記分析物捕獲物質および第二の分析物捕獲物質の捕獲部分はそれぞれ、１またはそれ以上のレポーター結合プライマーの特異的結合分子と相互作用し、分析物捕獲物質の捕獲部分は、適合する第二の分析物捕獲物質の捕獲部分より、異なる特異的結合分子と相互作用し、
各異なる特異的結合分子は、異なる１つのレポーター結合プライマーの部分であり、各異なるレポーター結合プライマーのローリングサークル複製プライマーは異なっており、各異なるローリングサークル複製プライマーは異なる１つの増幅標的サークルの複製をプライムし、各異なる増幅標的サークルは異なる直列型配列ＤＮＡを生じ、
ここに異なる分析物サンプル中の同一の分析物の存在または不存在は、対応する直列型配列ＤＮＡの存在または不存在によって示される。
【請求項３２】
１またはそれ以上の分析物サンプルおよび１またはそれ以上の第二の分析物サンプルを混合することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
１またはそれ以上の分析物捕獲物質および１またはそれ以上の第二の分析物捕獲物質を混合することをさらに含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
同時に、あるいは連続的に、１またはそれ以上の分析物捕獲物質および第二の分析物捕獲物質を同一の固形支持体と結合させることによって、１またはそれ以上の分析物捕獲物質および１またはそれ以上の第二の分析物捕獲物質を混合する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
分析物の１つに対応し、分析物捕獲物質と関連して生産される直列型配列ＤＮＡが、同一の分析物に対応し、適合する第二の分析物捕獲物質と関連して生産される直列型配列ＤＮＡと同一の位置にあり、かつ同時に検出され、ここに異なる分析物サンプル中の同一の分析物の存在または不存在は、対応する直列型配列ＤＮＡの存在または不存在によって示される、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
各分析物捕獲物質の捕獲部分が同一であり、分析物捕獲物質に対応するレポーター結合プライマーが同一であり、分析物捕獲物質に対応する増幅標的サークルが同一であり、
各第二の分析物捕獲物質の捕獲部分が同一であり、第二の分析物捕獲物質に対応するレポーター結合プライマーが同一であり、第二の分析物捕獲物質に対応する増幅標的サークルが同一である、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの分析物捕獲物質が、少なくとも１つの分析物に対して特異的な抗体を含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも１つの分析物捕獲物質が、少なくとも１つの分析物と特異的に結合する分子を含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
少なくとも１つの分析物捕獲物質が、アクセサリー分子とともに、少なくとも１つの分析物と特異的に結合する分子を含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
分析物捕獲物質および分析物が互いに直接または間接的に結合することによって相互作用する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも１つのアクセサリー分子を少なくとも１つの分析物サンプルおよび少なくとも１つの分析物捕獲物質と接触させ、ここにアクセサリー分子は少なくとも１つの分析物および少なくとも１つの分析物捕獲物質の相互作用に影響するものである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
アクセサリー分子が少なくとも１つの分析物捕獲物質の相互作用と拮抗する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
アクセサリー分子が少なくとも１つの分析物のアナログである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
アクセサリー分子が少なくとも１つの分析物捕獲物質の相互作用を促進する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
工程（ａ）の前に、工程（ａ）と同時に、あるいは工程（ａ）の後に、アクセサリー分子を、少なくとも１つの分析物サンプル、少なくとも１つの分析物捕獲物質、または両者と接触させる、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
アクセサリー分子がタンパク質キナーゼ、タンパク質ホスファターゼ、酵素、または化合物である、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
アクセサリー分子が少なくとも２０％純粋である、請求項４１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
アクセサリー分子が少なくとも５０％純粋である、請求項４１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
アクセサリー分子が少なくとも８０％純粋である、請求項４１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
アクセサリー分子が少なくとも９０％純粋である、請求項４１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
少なくとも１つの分析物が固形支持体に結合されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
固形支持体と結合された各分析物が、固形支持体と、あらかじめ決められた異なる領域において結合されている、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
固形支持体と結合された少なくとも１つの分析物が、固形支持体と間接的に結合されている、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
少なくとも１つの分析物捕獲物質が少なくとも１つの分析物と間接的に相互作用する、請求項１〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
少なくとも１つの分析物が別の分析物の修飾型であり、ここに少なくとも１つ特異的結合分子が、直接または間接的にこの分析物と相互作用し、この分析物は他方の分析物の修飾型であり、別の特異的結合分子が、直接または間接的に、他方の分析物と相互作用する、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
分析物がタンパク質であり、他方の分析物の修飾型が翻訳後修飾によって修飾されている、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
修飾がリン酸化またはグリコシル化である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
一組の検出プローブを、直列型配列ＤＮＡおよびこの検出プローブのハイブリダイゼーションを促進する条件下で、この直列型配列ＤＮＡと混合することによって、直列型配列ＤＮＡの検出が行われる、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
複数の異なる直列型配列ＤＮＡｓが多重検出を介して別個かつ同時に検出される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
一組の検出プローブがコンビナトリアル多色コーディングによってラベルされている、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
工程（ｄ）と同時に、あるいは工程（ｄ）の後に
セカンダリーＤＮＡ鎖置換プライマーおよび直列型配列ＤＮＡを接触させ、（ｉ）直列型配列ＤＮＡおよびセカンダリーＤＮＡ鎖置換プライマー間のハイブリダイゼーション、および（ｉｉ）直列型配列ＤＮＡの複製（ここに直列型配列ＤＮＡの複製はセカンダリー直列型配列ＤＮＡの形成を生じさせる）を促進する条件下でインキュベートすることをさらに含む、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
レポーター結合プライマーが少なくとも２０％純粋である、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
レポーター結合プライマーが少なくとも５０％純粋である、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
レポーター結合プライマーが少なくとも８０％純粋である、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
レポーター結合プライマーが少なくとも９０％純粋である、請求項１〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
分析物捕獲物質が少なくとも２０％純粋である、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
分析物捕獲物質が少なくとも５０％純粋である、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
分析物捕獲物質が少なくとも８０％純粋である、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
分析物捕獲物質が少なくとも９０％純粋である、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
１またはそれ以上の分析物を検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）１またはそれ以上の分析物サンプルを処理して、１またはそれ以上の分析物を修飾し、
（ｂ）少なくとも１つの分析物サンプルおよび１またはそれ以上のレポーター結合プライマーを接触させ、ここにレポーター結合プライマーはそれぞれ、特異的結合分子およびローリングサークル複製プライマーを含み、特異的結合分子はそれぞれ、修飾された分析物と直接または間接的に相互作用し、ならびに、
特異的結合分子および修飾された分析物の相互作用を促進する条件下で分析物サンプルおよびレポーター結合プライマーをインキュベートし、
（ｃ）工程（ａ）または（ｂ）の前に、工程（ａ）または（ｂ）と同時に、あるいは工程（ａ）または（ｂ）の後に、レポーター結合プライマーおよび１またはそれ以上の増幅標的サークルを接触させ、ここに増幅標的サークルはそれぞれ、プライマー相補部分を含む一本鎖の、環状ＤＮＡ分子を含み、このプライマー相補部分は少なくとも１つのローリングサークル複製プライマーと相補的であり、ならびに、
増幅標的サークルおよびローリングサークル複製プライマーのハイブリダイゼーションを促進する条件下でレポーター結合プライマーおよび増幅標的サークルをインキュベートし、
（ｄ）工程（ｃ）の後でかつ、工程（ａ）または（ｂ）の前に、工程（ａ）または（ｂ）と同時に、あるいは工程（ａ）または（ｂ）の後に、増幅標的サークルの複製を促進する条件下でレポーター結合プライマーおよび増幅標的サークルをインキュベートし、
ここに増幅標的サークルの複製は直列型配列ＤＮＡの形成を生じさせ、直列型配列ＤＮＡの検出は対応する分析物の存在を示す。
【請求項７１】
修飾基を分析物と結合させることによってすべての分析物が修飾されており、ここに修飾基はすべての分析物に関して同一であり、すべての特異的結合分子はこの修飾基と相互作用する、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
１またはそれ以上の分析物を検出する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）１またはそれ以上の分析物サンプルおよび１またはそれ以上のアレイを接触させ、ここに各アレイは一組の分析物捕獲物質、一組のアクセサリー分子、または両者を含み、各分析物捕獲物質は分析物と直接または間接的に相互作用し、
（ｂ）工程（ａ）の前に、工程（ａ）と同時に、あるいは工程（ａ）の後に、少なくとも１つの分析物サンプルおよび１またはそれ以上のレポーター結合プライマーを接触させ、ここに各レポーター結合プライマーは特異的結合分子およびローリングサークル複製プライマーを含み、各特異的結合分子は分析物と直接または間接的に相互作用し、ここに各アクセサリー分子は少なくとも１つの分析物および少なくとも１つの特異的結合分子または少なくとも１つの分析物捕獲物質の相互作用に影響するものであり、
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）のいずれか、または両者と同時に、あるいは工程（ａ）および（ｂ）のいずれか、または両者の後に、特異的結合分子、分析物、分析物捕獲物質およびアクセサリー分子の相互作用を促進する条件下で分析物サンプル、アレイ、およびレポーター結合プライマーをインキュベートし、
（ｄ）工程（ｂ）の前に、工程（ｂ）と同時に、あるいは工程（ｂ）の後に、レポーター結合プライマーおよび１またはそれ以上の増幅標的サークルを接触させ、ここにこの増幅標的サークルはそれぞれ、プライマー相補部分を含む一本鎖環状ＤＮＡ分子を含み、このプライマー相補部分は少なくとも１つのローリングサークル複製プライマーと相補的であり、ならびに、
増幅標的サークルおよびローリングサークル複製プライマーのハイブリダイゼーションを促進する条件下でレポーター結合プライマーおよび増幅標的サークルをインキュベートし、
（ｅ）工程（ｄ）の後でかつ、工程（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の前に、工程（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）と同時に、あるいは工程（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の後に、増幅標的サークルの複製を促進する条件下でレポーター結合プライマーおよび増幅標的サークルをインキュベートし、
ここに増幅標的サークルの複製は直列型配列ＤＮＡの形成を生じさせ、この直列型配列ＤＮＡの検出は対応する分析物の存在を示す。
【請求項７３】
各アレイが一組の分析物捕獲物質を含み、ここに各分析物捕獲物質は、固形支持体のあらかじめ決められた異なる領域において、固形支持体に固定されている、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
固形支持体のあらかじめ決められた異なる領域間の距離が固定されている、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
固形支持体が、薄いフィルム、膜、ボトル、ディッシュ、ファイバー、織り繊維、成型ポリマー、粒子、ビーズ、微粒子、または組み合わせを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
固形支持体のあらかじめ決められた異なる領域の少なくとも２つの間の距離が可変である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
分析物捕獲物質が、１立方センチメートル当たりの、異なる分析物捕獲物質が４００を超える密度で固形支持体に固定されている、請求項７３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
分析物捕獲物質がペプチドである、請求項７３〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
各異なるペプチドが少なくとも４アミノ酸長である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
各異なるペプチドが４〜２０アミノ酸長である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
各異なるペプチドが少なくとも１０アミノ酸長である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
各異なるペプチドが少なくとも２０アミノ酸長である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
少なくとも１つのアレイが、固形支持体に固定された少なくとも１，０００の異なる分析物捕獲物質を含む、請求項７３〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
少なくとも１つのアレイが、固形支持体に固定された少なくとも１０，０００の異なる分析物捕獲物質を含む、請求項７３〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
少なくとも１つのアレイが、固形支持体に固定された少なくとも１００，０００の異なる分析物捕獲物質を含む、請求項７３〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
少なくとも１つのアレイが、固形支持体に固定された少なくとも１，０００，０００の異なる分析物捕獲物質を含む、請求項７３〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
各あらかじめ決められた異なる領域が異なる領域のお互いから物理的に分離されている、請求項７３〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
固形支持体が、薄いフィルム、膜、ボトル、ディッシュ、ファイバー、織り繊維、成型ポリマー、粒子、ビーズ、微粒子、または組み合わせを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項８９】
固形支持体が、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン、酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカルボナート、テフロン、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンラバー、ポリアンヒドライド、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフメレート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、またはポリアミノ酸を含む、請求項７３〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
固形支持体が多孔性である、請求項７３〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
あらかじめ決められた異なる領域内の分析物捕獲物質が少なくとも２０％純粋である、請求項７３〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
あらかじめ決められた異なる領域内の分析物捕獲物質が少なくとも５０％純粋である、請求項７３〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
あらかじめ決められた異なる領域内の分析物捕獲物質が少なくとも８０％純粋である、請求項７３〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
あらかじめ決められた異なる領域内の分析物捕獲物質が少なくとも９０％純粋である、請求項７３〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
以下を含むキット：
（ａ）複数のレポーター結合プライマー（各レポーター結合プライマーが特異的結合分子およびローリングサークル複製プライマーを含み、各特異的結合分子は分析物捕獲物質と直接または間接的に相互作用する）、
（ｂ）複数の分析物捕獲物質（各分析物捕獲物質は分析物と直接または間接的に相互作用する）、および
（ｃ）複数の増幅標的サークル（各増幅標的サークルはプライマー相補部分を含む一本鎖の環状ＤＮＡ分子を含み、このプライマー相補部分は少なくとも１つのローリングサークル複製プライマーと相補的である）。
【請求項９６】
分析物捕獲物質が固形支持体と結合されている、請求項９５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
開示されている発明は、概して、タンパク質およびペプチドの検出およびプロファイル化の領域であり、特に微小規模のタンパク質発現プロファイル化の領域に関する。
【０００２】
ゲノムの情報内容はデオキシリボ核酸として保持される。与えられたゲノム配列のサイズおよび組成は、生物の形態および機能を決定する。一般に、ゲノムの複雑さは、その生物の複雑さに比例する。比較的単純な生物、例えば細菌は約１００〜５００万メガベースのゲノムを有し、一方、哺乳類ゲノムは約３０００メガベースである。一般にゲノムは、染色体（クロモソーム）として知られる物理的に区別されたセグメントに分割されている。細菌 Escherichia coli (E. coli) は単一の環状染色体を含有し、一方、ヒトゲノムは２４染色体からなる。
【０００３】
ゲノムＤＮＡは、糖−リン酸骨格に連結された４ＤＮＡ塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴ）を含有する二重鎖ポリマーとして存在する。ＤＮＡ上の塩基の並びがＤＮＡの主要な配列である。生物のゲノムはタンパク質をコードする領域およびコードしない領域を含有し、これにはエキソンおよびイントロン、プロモーターおよび遺伝子調節領域および非機能性ＤＮＡが含まれる。ゲノム分析により、遺伝子コピー数および染色体数、ならびにＤＮＡの主たる配列内における単一塩基の相違が存在することについての定量的測定が提供可能である。遺伝によって受け継がれる単一塩基の変化は多型と称され、一方、生物の生存期間中に獲得されたものは突然変異として知られる。ＤＮＡレベルでのゲノム分析では、遺伝子発現（すなわち、コード配列のＲＮＡおよびタンパク質複写物が合成されるプロセスである）の測定は提供されない。
【０００４】
ある生物由来のすべての細胞は同一のゲノムを含有すると考えられ、また同一種の異なる個体由来のゲノムは典型的に約９９．９％同一である。個体間における０．１％の多型の割合（Wang et al., Science 280: 1077 (1998)）は、およそ３百万の多型が任意の２ヒトゲノムの完全配列において見出せることが予測される点において有意である。タンパク質コードセグメント中に単一塩基変化が存在する場合、多型はタンパク質配列を変化させ、それゆえこのタンパク質の生化学的活性を変化させ得る。
【０００５】
ＤＮＡゲノムは、遺伝子として知られる分離した機能的領域から構成される。単純な生物、例えば細菌のゲノムは約１０００遺伝子を含有し（Fleischmann et al., Science 269: 496 (1995)）、またヒトゲノムは約１００，０００遺伝子を含有すると見積もられる（Fields et al., Nature Genet. 7: 345 (1994)）。ｍＲＮＡレベルでの遺伝的分析を、遺伝子発現の測定として用いることができる。各遺伝子の発現レベルは遺伝的および環境的要因の組み合わせによって決定される。遺伝的要因には、遺伝子調節領域、例えばプロモーター、エンハンサー、およびスプライス部位の正確なＤＮＡ配列が含まれる。したがって、ＤＮＡ中の多型は、同一種個体間の遺伝子発現におけるいくらかの差異に寄与することが予想される。発現レベルはまた、温度、ストレス、光、およびシグナル（ホルモンおよび他のシグナル伝達物質のレベルを変化させる）を含む環境的要因に影響される。この理由のため、ＲＮＡ分析は、生物の遺伝的潜在性についてばかりでなく、機能的状態の変化についての情報をも提供する（M. Schena and R.W. Dadvis, DNA Microarrays: A Practical Approach. (Oxford University Press, New York, 1999）1-16）。
【０００６】
遺伝子発現の第二段階はｍＲＮＡからのタンパク質の合成である。各ｍＲＮＡによって特有のタンパク質がコードされ、ここにｍＲＮＡの３ヌクレオチドごとにポリペプチド鎖の１アミノ酸がコードされ、ヌクレオチドのリニアな順序はアミノ酸のリニアな配列を表す。タンパク質は、合成された後に、一次配列によって大部分が決定されるその特有の三次元コンフォメーションをとる。タンパク質は、遺伝子調節、代謝、細胞構造、およびＤＮＡ複製における役割を含む幅広い範囲の生化学的活性を遂行することによりゲノムの機能的な指示を呈する。
【０００７】
集団中の個体は、タンパク質の一次アミノ酸配列を変更するか、あるいは遺伝子発現を変更することによって安定状態のタンパク質レベルを乱す多型のせいで、タンパク質活性における差異を有し得る。ｍＲＮＡレベルと同様に、タンパク質レベルもまた、環境の変化に応じて変化し得る；さらに、タンパク質レベルはまた、ｍＲＮＡレベルに直接影響しない翻訳制御および翻訳後制御を受ける（Schena and David, 1999）。プロテオミクス分析は、予測される遺伝子産物が実際に翻訳される場合、あるいはされるかどうかに関するデータ、被るかもしれない翻訳後修飾のレベルおよびタイプおよび他のタンパク質と比較された相対濃度を提供する（Humphrey-Smith and Blackstock, J. Protein. Chem. 16: 537-544 (1997)）。ＤＮＡがｍＲＮＡに転写された後、タンパク質に翻訳される前にエキソンが様々にスプライスされ得る。リボソームによるｍＲＮＡの翻訳の後、タンパク質は通常、種々の化学基、例えば炭水化物、脂質およびリン酸基の付加によって、ならびに、特定のペプチド結合のタンパク質分解を介して翻訳後修飾される。これらの化学的修飾は、タンパク質の機能を調節するのに非常に重要であるが、遺伝子によって直接コードされているものではない。さらに、ｍＲＮＡおよびタンパク質の両者は継続的に合成および分解されるため、タンパク質の最終レベルはｍＲＮＡレベルを測定することによって容易に得ることができるものではない（Patton, J. Chromatogr. 722: 203-223, (1999); Patton et al., J. Biol. Chem. 270:21404-21410 (1995)）。したがって、発現タンパク質のレベルを示すためにｍＲＮＡレベルがしばしば外挿されるが、ｍＲＮＡ種およびそれらがコードするタンパク質の実際の量の豊富さの間に相関はほとんどないことは驚くべきことではない（Anderson and Seilhamer, Eletrophoresis 18: 533-537; Gygi et al., Mol. Cell. Biol. 19: 1720-1730 (1999)）。
【０００８】
増大する証拠により、遺伝子およびタンパク質発現における変化は、与えられたヒト疾患の開始と相関するであろうことが示唆される（Schena and Davis, 1999）。疾患組織のプロテオミクス分析により、与えられた疾患において発現が変更されるタンパク質の同定が可能になるはずである。多数の小さい分子はまた、包括的なレベルでのタンパク質発現を変更し得る。疾患状態において変更された発現についての情報を、小さい分子を用いる処置から生じる変化と組み合わせて、与えられた疾患との闘争に有効で有り得る分子のクラスについて価値ある情報を提供できるだろう。したがってプロテオミクスは、リード化合物スクリーニングおよび最適化、毒性、薬力学、および薬物効力のようなプロセスにおいて役割を担う。
【０００９】
プロテオミクスの枢要成分は、多数のタンパク質を正確に、かつ再現性良く定量する能力である。典型的にプロテオミクスは、生物学的サンプルからタンパクを同時に分離すること、および分離時に分割されるタンパク質の相対量を定量することを含む。プロテオミクスは現在、二次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動に大きく依存している。しかし、２−Ｄゲルを用いて包括的なタンパク質発現に関する情報を得ることは技術的に困難であり、このプロセスを実行する半自動化手法が開発され始めたばかりである（Patton, Biotechniques 28: 944-957 (2000)）。さらに、２−Ｄゲルにおいてタンパク質発現を評価するために一般に用いられる染色（例えばクーマシーブルー（Coomassie Blue）、コロイド状金および銀染色）はこの能力において有効であるために必要とされるダイナミックレンジを提供しない。これらの染色は１０〜４０倍の範囲にわたってのみ線形（リニア）であり、個々のタンパク質の量は四桁の振り幅ほど異なる（Brush, The Scientist 12:16-22, 1998; Wirth and Romano, J. Chromatogr 698: 123-143 (1995)）。さらに、細胞当たり１〜２０００コピー存在する少量のタンパク質、例えば転写因子およびキナーゼは、しばしば重要な調節機能を行う種を示す。このような少量のタンパク質の正確な検出は、プロテオミクスに対する重要なチャレンジである。質量分析によって２つの異なるサンプル中のタンパク質の相対量を直接定量する方法は最近導入された。しかし、これらの方法の線形ダイナミックレンジはわずか４〜１０倍の範囲にわたってしか示されていない（Gygi et al. 1999; Oda et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 96: 6591-6596 (1999)）。
【００１０】
マイクロアレー技術の発達が、少量のサンプル中の何百または何千でさえの物質の、同時の、超感受性の測定を可能にすることが最近注目されている（Ekins, Clin. Chem. 44: 2015-2030 (1998)）。しかし、このアプローチは実行にまで減少させるのが難しい。なぜならこれらのマイクロアレーにスポットを創出するために極端に少容量（約０．５〜５ｎＬ）のサンプルを用いるため、極度に感受性の分析物検出方法を利用することが必要になるからである。ＤＮＡポリメラーゼによって指揮されるローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、等温度条件下、線形または等比動力学を用いて環状オリゴヌクレオチドプローブを複製できる（Lizardi et al., Nature Genet. 19: 225-232 (1998)）。単一プライマーを用いる場合、ＲＣＡは、２、３分のうちに、標的に共有結合した、直鎖の、何百または何千の直列に連結された標的のＤＮＡコピーを生産する。リニア増幅産物の作成により、標的の空間的分割および正確な定量が可能になる。ＲＣＡによって生産されるＤＮＡは、直列型ＤＮＡ配列の複数の部位でハイブリダイズする蛍光オリゴヌクレオチドタグでラベルできる。ＲＣＡは、マルチパラメトリックカラーコーディング用に設計されたフルオロフォアコンビネーションとともに用いることができ（Speicher et al., Nature Genet. 12:368-375 (1996)）、これにより同時に分析できる標的の数は著しく増大する。ＲＣＡ技術は、溶液中、インサイチュおよびマイクロアレー中で用いることができる。固相形式では、検出および定量が単一分子のレベルで達成できる（Lizardi et al., 1998）。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、少量および低濃度の分析物を検出する方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、サンプル中の少量および低濃度の複数の分析物を検出する方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、検出すべき分析物のシグナルを増幅する方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、サンプル中の少量および低濃度の複数の分析物を検出する自動化された方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、サンプル中の複数の分析物の存在をプロファイル化する方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、異なるサンプル中の複数の分析物の存在プロファイルを比較する方法を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、化合物の、目的の化合物との相互作用を評価する方法を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、少量および低濃度のタンパク質およびペプチドを検出する方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、サンプル中の、少量および低濃度の複数のタンパク質およびペプチドを検出する方法を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、検出すべきタンパク質またはペプチドのシグナルを増幅する方法を提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、サンプル中の、少量および低濃度の複数のタンパク質およびペプチドを検出する自動化された方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、サンプル中の複数のタンパク質およびペプチドの存在をプロファイル化する方法を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、異なるサンプル中の複数のタンパク質およびペプチドの存在プロファイルを比較する方法を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、目的のタンパク質およびペプチドとの、化合物の相互作用を評価する方法を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、少量および低濃度の分析物の検出用組成物を提供することである。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、少量および低濃度のタンパク質およびペプチドの検出用組成物を提供することである。
【００２７】
発明の要旨
少量の分析物、例えばタンパク質およびペプチドを検出するための組成物および方法が開示されている。この方法には、核酸プライマーを分析物と結合させ、次いでこのプライマーを用いて、環状ＤＮＡ分子のローリングサークル複製を媒介することが関与する。ＤＮＡサークルの増幅は、このプライマーの存在に依存する。したがって、開示されている方法は、ローリングサークル増幅を介して、任意の目的分析物から増幅されたシグナルを生じさせるものである。この増幅は、等温性であり、各プライマーから大量の核酸の生産を導くことができる。増幅されたＤＮＡは、プライマーを介して分析物と結合したままであり、これにより分析物の空間的検出が可能である。
【００２８】
開示されている方法は、好ましくは、タンパク質およびペプチドを検出および分析するために用いられる。好ましい態様では、複数の種々のタンパク質または分析物が直接または間接的に結合されているマイクロアレイを用いて、（それらが試験されるサンプル中に存在する場合、）複数のタンパク質が検出可能である。次いで、プライマーおよび特異的結合分子、例えば検出されるタンパク質に特異的な抗体、のコンジュゲートを用いて、ローリングサークル複製プライマーを種々のタンパク質と結合させる。このプライマーによってプライムされるローリングサークル複製は、このタンパク質が固定されているアレイの部位において、大量のＤＮＡ生産を生じさせる。アレイ中の種々のタンパク質はいくつかの方法によって識別可能である。例えば、種々のタンパク質がアレイ中のあらかじめ決められた位置に固定されている場合、増幅ＤＮＡの位置は関与するタンパク質を指し示すことが可能である。また、種々のタンパク質はそれぞれ、後に異なるＤＮＡサークルのローリングサークル複製をプライムする異なるローリングサークル複製プライマーと結合可能である。この結果、種々のタンパク質それぞれに対して別個の増幅されたＤＮＡが生じる。この異なる増幅ＤＮＡｓは任意の適当な配列に基づく核酸検出技術を用いて区別できる。
【００２９】
開示されている方法の別の好ましい態様には、２またはそれ以上の異なるサンプル中に発現されるタンパク質の比較が関与する。こうして得られる情報は、核酸発現プロファイルに蓄積された情報のタイプと類似している。開示されている方法は、任意の細胞または組織内で発現されているタンパク質の鋭敏で正確な検出および定量を可能にする。この開示されている方法はまた、異なるサンプル由来の同一の分析物（群）が同一のアッセイにおいて同時に検出されることを可能にする。
【００３０】
発明の詳しい記述
ここに開示するのは、少量の分析物、例えばタンパク質およびペプチドを検出するための組成物および方法である。この方法は、核酸シグナル増幅の能力を核酸ではない分析物の検出に適用する。核酸増幅技術に匹敵する増幅技術が存在しない分析物の検出は、一般に、十分な量の分析物の検出または極度に感度のよいラベルの使用に依存する。このようなラベルの使用は厄介であり、制限されている。開示されている方法は、任意の所望の分析物に関する増幅されたシグナルを生じさせる単純で感度のよい方法を提供する。
【００３１】
開示されている方法は、１つの型のＲＣＡであり、ここではレポーター結合プライマーが増幅標的サークルの増幅用のローリングサークル複製プライマーを提供する。開示されている方法は、ＲＣＡが、レポーター結合プライマーと標的分子（これは分析物とも称される）の結合に基づいて、増幅されたシグナル（すなわち、直列型配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ））を生じることを可能にする。レポーター結合プライマーの一部である特異的プライマー配列は、分析物に対するレポーター結合プライマーの（レポーター結合プライマーのアフィニティー部分を介する）特異的相互作用およびＲＣＡの結び付けを提供する。レポーター結合プライマーが分析物と結合すると、増幅標的サークル（ＡＴＣ）がレポーター結合プライマーのローリングサークル複製プライマー配列とハイブリダイズし、次いでＡＴＣがＲＣＡによって増幅される。得られたＴＳ−ＤＮＡは一端にレポーター結合プライマーのローリングサークル複製プライマー配列を含み、これによりＴＳ−ＤＮＡが分析物のその部位にアンカーされる。開示されている方法は、任意の分析物を用いて行うことができる。好ましい分析物は、増幅された核酸、例えばＴＳ−ＤＮＡおよび増幅標的サークルを含む核酸、抗原およびリガンドである。開示されている方法に関する標的分子は、本明細書中では概して、分析物と称する。
【００３２】
開示されている方法を用いて、タンパク質およびペプチドを検出し、分析するのが好ましい。好ましい態様では、種々のタンパク質が固定されているマイクロアレイを用いて複数のタンパク質を分析できる（これらが試験されるサンプル中に存在する場合）。次いでローリングサークル複製プライマーは、プライマーおよび、検出されるべきタンパク質に対して特異的な特異的結合分子、例えば抗体のコンジュゲートを用いて、種々のタンパク質と結合させる。このプライマーによってプライムされたローリングサークル複製は、このタンパク質が固定されているアレイの部位において大量のＤＮＡ生産を生じさせる。増幅されたＤＮＡはこのタンパク質に関する容易に検出可能なシグナルとして働く。アレイ内の種々のタンパク質はいくつかの方法によって識別できる。例えば、種々のタンパク質がアレイ内のあらかじめ決められた位置に固定されている場合、増幅されたＤＮＡの位置は関与するタンパク質を指し示すことができる。別法では、異なるタンパク質はそれぞれ、異なるＤＮＡサークルのローリングサークル複製をプライムする異なるローリングサークル複製プライマーと結合させることができる。その結果、それぞれの異なるタンパク質に関して別個に増幅されたＤＮＡが得られる。種々の増幅されたＤＮＡｓは任意の適当な配列に基づく核酸検出技術を用いて識別できる。
【００３３】
開示されている方法の別の好ましい態様には、２またはそれ以上の異なるサンプル中で発現されているタンパク質を比較することが含まれる。作成される情報は、核酸発現プロファイルにおいて蓄積された情報のタイプと同様である。例えば、異なるサンプル由来の同一の分析物（群）は、異なるＤＮＡサークルの複製をプライムする異なるプライマーと結合でき、異なる増幅ＤＮＡｓを生産する。この方法では、あるサンプル由来の分析物は、異なるサンプル中の同一分析物から異なる増幅ＤＮＡを生産する。この例は実施例１１に示され、ここでは、２つの異なるサンプル由来の同一の分析物は２つの異なるＤＮＡサークルの増幅を生じる。
【００３４】
サンプルが混合されている場合でさえ、プライマーが分析物と結合することによって、このサンプル特異的な検出を達成できる（本方法の好ましい様式）。例えば、図１１では、分析物捕獲物質（ハプテン１およびハプテン２とカップリングされた抗体）はそれぞれサンプル１およびサンプル２と混合することができる。別の好ましい態様では、各サンプル中の分析物は異なるハプテンで直接ラベルされている。これは種々のハプテンを異なるサンプル中の同一型分析物と結合させる。好ましい態様では、サンプルをともに混合する。図１１に示されるように、分析物は基質上に捕獲可能で、レポーター結合プライマーは分析物捕獲物質と結合させることができ、ＤＮＡサークルはローリングサークル複製プライマーから増幅される。異なるサンプル由来の分析物が基質上の同一部位に捕獲される場合（本方法の好ましい様式）でさえ、異なる増幅ＤＮＡｓが生産されるせいで、その位置に存在する各分析物のソースおよび量が測定できる。
【００３５】
分析物のソース（すなわち分析物が由来するサンプル）は、例えば種々の増幅ＤＮＡｓ（すなわち種々のサンプルに調節されたプライマーから生じるもの）に関する種々のラベルを用いて測定できる。他のラベルと同時に検出された場合に識別可能なラベル（例えば区別される発光スペクトルを有する蛍光ラベル）を用いて、すべてのサンプルをいっしょに混合し、いっしょに分析できる。検出されたラベルは、連鎖の成分：ラベル−増幅ＤＮＡ−環状ＤＮＡ−プライマー−分析物を経て、間接的に分析物のソースを同定するものである。
【００３６】
免疫ＲＣＡと称される、開示されている方法の別の好ましい形態では、ローリングサークル複製プライマーの５’末端を抗体と結合させる。開示されている方法の好ましい一形態では、抗体はハプテンに対するものである。開示されている方法の別の好ましい形態では、抗体は分析物それ自体に対するものである。環状ＤＮＡ（増幅標的サークルと称される）、ＤＮＡポリメラーゼ、およびヌクレオチドの存在下、ローリングサークル反応により多重コピーの環状ＤＮＡ配列からなるＤＮＡ分子（直列型配列ＤＮＡと称される）が生じ、これは抗体と結合したままである（図１）。増幅されたＤＮＡは、ハプテンラベルまたは蛍光ラベルされたヌクレオチドの直接包含、または蛍光または酵素ラベルされた相補的オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによるものを含む種々の方法で検出可能である。ＲＣＡ反応は、線形または幾何学的な動力学を用いて行うことができる（Lizardi et al., 1998）が、開示されているシグナル発生方法では線形ＲＣＡを用いるのが好ましい。
【００３７】
別の側面では、開示されている方法には、複合生物学的サンプル中に存在する分析物の固定および、サンプル中のその存在の測定および定量が関与する。固定により分析物を同定し、定量する方法は、アレルゲンを含有するサンプルを用いて本明細書中に記載されている。例えば、生物学的抽出物および液状物中に存在するアレルゲンは、まずこれらをマイクロアレイ上に選択的に固定することによって同定できる（実施例８参照）。次いで検出および定量のために免疫ＲＣＡマイクロアレイアッセイを用いることができる。
【００３８】
別の側面では、開示されている方法には、サンプル中の１以上の分析物の多重検出および定量が関与する。これは実施例９に説明され、ここでは、それぞれ固定された捕獲抗体を含有するいくつかの試験部位を含有するマイクロアレイが、検出されるべきタンパク質分析物の混合物を含有するサンプルとインキュベートされた。次いでこのマイクロアレイは、各分析物に関して少なくとも１つのビオチニル化抗体を含有する混合物とインキュベートされた。次いで免疫ＲＣＡマイクロアレイアッセイを用いて、検出および定量が行われた。
【００３９】
別の側面では、各ウェルがテフロンマスクによって分離されている１６マイクロウェル−ガラススライド内で、免疫ＲＣＡマイクロアレイアッセイを行うことができる。これは実施例８に記載され、ここでは、１００〜４００スポットのマイクロアレイが各マイクロウェルにプリントされた。これらのウェルのそれぞれが、異なるサンプル、およびコントロールをアッセイするのに用いられた。またマルチウェルスライド（slide）が、１６ウェル中の６内の抗−ＩｇＥ捕獲抗体のアレイを用いてプリントされた。このマルチウェル形成でのアレルゲンマイクロアレイにおける半自動化免疫ＲＣＡアッセイは、例えば、安価な Beckman BioMek 液体取扱いロボットを用いて実行することができる。
【００４０】
マイクロアレイに基づく免疫ＲＣＡアッセイは他の多重抗体アッセイに適用可能である。例えば、特定の免疫学的反応は、ＩｇＥより特異的ＩｇＧ４によって誘発される（AAAI Board of Directors, J Allergy Clin Immunol. 95:652-654 (1995)）。（抗−ＩｇＥとコンジュゲートされたプライマーが相補的である）ＤＮＡサークル由来の配列と異なっているＤＮＡサークルと相補的なＤＮＡプライマーとコンジュゲートされた抗−ヒトＩｇＧ４を使用することにより、アレルゲン特異的ＩｇＧ４およびＩｇＥの同時測定が可能であろう。このようなアッセイは、アレルゲン脱感作治療時に、または抗−ＩｇＥ治療の応答をモニターする（Chang Nature Biotech. 18:157-162 (2000)）のに用いることができる。
【００４１】
マイクロアレイに対する免疫ＲＣＡの重大な多重化能、空間的（すなわちアレイに対し複数の分析物をスポットする能力）および比色的（各分析物に結合する複数の抗体タイプを検出および区別する能力）の両者は、複数の特異的抗体、例えば、全身性自己免疫障害、炎症性関節炎、器官特異的自己免疫障害であることが疑わしい症状、または実際の組織適合性試験における、自己抗体の検出が関与する他の臨床診断試験用に用いることができる。さらなる適用には、第一および第二の免疫不全疾患であることが疑われる患者における株および種特異的ＩｇＭおよびＩｇＧの測定を伴う感染性疾患診断、ならびに機能性抗体応答のインビトロ試験が含まれる。最後に、この形式の多重化、自動性および超感受性は、抗体の検出が関与するこれら以外の他の免疫アッセイに適用できる。マイクロアレイでのＲＣＡ能を有するサンドイッチ免疫アッセイは、分析物、例えば前立腺血清抗原に関する慣用のアッセイと比べて感受性の３〜４対数増加を提供できる。したがって、開示されている方法は、複数の分析物を疾患の分子的段階に関して同時に試験することによって可能になる診断および予後能の大きな増加を生じる。
【００４２】
核酸は、複数の分析物検出のための理想的分子ラベルである。なぜなら、異なる特異的配列は個々の各分析物と任意に結合させることができるからである。ＤＮＡを抗体に直接共有結合カップリングさせると、各ＤＮＡラベルが特有のものであれば、未制限の数の抗体−ＤＮＡ付加物が製造され、任意の組み合わせで使用するのを可能になる（Hendrickson et al., Nucleic Acids Res. 23: 522-529 (1995)）。共有結合によるカップリングはまた、必要とされる試薬混合および洗浄工程が少ないため、単純なアッセイ形式の実行に関して利点を有し；さらに会合成分の化学量論的変化を回避できる。好ましい態様では、開示されている方法は、免疫ＲＣＡと称されるシグナル増幅ストラテジーにおいて、共有結合によるカップリングストラテジーを用いる。合成および精製ストラテジーにおいて、いくつかの修飾および改善を用い、これらのコンジュゲートを高純度、高収量で生産できる。
【００４３】
材料
Ａ．分析物
開示されている方法には、分析物の検出が関与する。一般に、化合物または複合体の、任意の化合物、部分、または成分が分析物であり得る。好ましい分析物はペプチド、タンパク質、および他の高分子、例えば脂質、複合炭水化物、プロテオリピド、膜断片、および核酸である。分析物はまた、より小さい分子、例えば補因子、代謝産物、酵素基質、金属イオン、および金属キレート物であり得る。分析物は１００ダルトン〜１，０００，０００ダルトンの範囲のサイズであるのが好ましい。
【００４４】
分析物は、天然に存在するか、あるいはインビトロまたはインビボで誘導される修飾を含有することができる。実際の修飾には、付加物形成、例えばハプテン結合、多量体化、他の化学部分との相互作用による複合体形成、消化または分解（例えばプロテアーゼによる）、および金属イオン結合または除去が含まれる。開示されている方法は、分析物の修飾状態における差異、例えばタンパク質のリン酸化またはグリコシル化状態を検出するのに用いることができる。
【００４５】
分析物は、好ましくはアレイ中にて、基質と直接または間接に結び付けることができる。最も好ましいのはマイクロアレイである。分析物は、分析物捕獲物質を用いて、捕獲するか、ならびに／あるいは固定することができる。固定された分析物は、開示されている方法にて用いられる他の成分、例えば分析物捕獲物質およびレポーター結合プライマーを捕獲するのに用いることができる。
【００４６】
Ｂ．レポーター結合プライマー
レポーター結合プライマーはオリゴヌクレオチドにカップリングされるか、あるいはつながれる特異的結合分子である。特異的結合分子は、レポーター結合プライマーのアフィニティー部分と称され、オリゴヌクレオチドはレポーター結合プライマーのオリゴヌクレオチド部分と称される。開示されている方法では、オリゴヌクレオチド部分は、ローリングサークル複製プライマーとして働く（したがって、本明細書中にて、レポーター結合物質のオリゴヌクレオチド部分はローリングサークル複製プライマーと称される）。このことは、加えられたＡＴＣのローリングサークル複製を可能にし、ここに、得られたＴＳ−ＤＮＡはレポーター結合プライマーにカップリングされる。このため、ＴＳ−ＤＮＡは分析物の部位に効率的に固定される。
【００４７】
ローリングサークル複製プライマー配列の配列は任意に選択できる。複数のレポーター結合プライマーを用いる多重アッセイでは、各レポーター結合プライマーに関するローリングサークル複製プライマー配列は実質的に異なっていて、非特異的標的検出の可能性を制限することが好ましい。別法では、いくつかの多重アッセイにおいて、ローリングサークル複製プライマー配列を関連配列とともに使用することが望ましいこともある。このようなアッセイは１または２、３のＡＴＣｓを使用して、多数の分析物を検出することができる。オリゴヌクレオチド部分は、オリゴヌクレオチド部分と増幅標的サークルのプライマー相補部分との間の特異的および安定なハイブリダイゼーションをサポートする任意の長さであり得る。一般的に、これは１２〜１００ヌクレオチド長、好ましくは２０〜４５ヌクレオチド長である。
【００４８】
本明細書中で用いられる、特異的結合分子とは、特定の分子または部分と特異的に相互作用する分子である。特定の結合分子と特異的に相互作用する分子または部分は、分析物または、特定の結合分子および分析物間の相互作用における中間体として働く別の分子であり得る。このような中間体の好ましい例は分析物捕獲物質である。用語「分析物」は、特異的結合分子と特異的に相互作用する別個の分子および分子の部分、例えばタンパク質のエピトープをともに意味することが理解されるべきである。抗体、レセプター／リガンド対のいずれかのメンバー、および特異的結合アフィニティーを有する他の分子は、レポーター結合プライマーのアフィニティー部分として有用な特異的結合分子の例である。抗体であるアフィニティー部分を有するレポーター結合プライマーは、本明細書中にて、レポーター抗体と称されることもある。ローリングサークル複製プライマーと、このような特異的結合分子とのカップリングにより、特異的結合分子のその特異的標的へ結合は、ローリングサークル増幅を用いてＡＴＣを増幅することによって検出できる。この増幅は、非常に少数の結合分析物の鋭敏な検出を可能にする。
【００４９】
特定の分析物と特異的に相互作用するレポーター結合プライマーは、その分析物に特異的であると称される。例えば、特定の抗原と結合する抗体であるアフィニティー部分を有するレポーター結合プライマーはその抗原に特異的であると称される。この抗原は分析物である。
【００５０】
レポーター結合プライマーのアフィニティー部分として有用な抗体は、商業的に入手可能であるか、あるいは十分に確立されている方法を用いて製造できる。例えば、Johnstone and Thorpe はページ３０〜８５に、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を製造するのに有用な一般的方法を記載している。この書籍は、全体では、アッセイ系における抗体の使用に関する多くの一般的技術および原理を記載している。
【００５１】
使用においては、レポーター結合プライマーは完全に純粋である必要はない。レポーター結合プライマーは、好ましくは、少なくとも２０％純粋、より好ましくは少なくとも５０％純粋、より好ましくは少なくとも８０％純粋、さらにより好ましくは少なくとも９０％純粋である。
【００５２】
Ｃ．増幅標的サークル（ＡＴＣ）は環状一本鎖ＤＮＡ分子であり、一般に、４０〜１０００ヌクレオチド、好ましくは約５０〜１５０ヌクレオチド、最も好ましくは約５０〜１００ヌクレオチドを含有する。ＡＴＣｓの部分は、このＡＴＣをローリングサークル複製（ＲＣＡ）に対して有用にする特定の機能を有する。これらの部分はプライマー相補部分、検出タグ部分、第二標的配列部分、アドレスタグ部分、およびプロモーター部分と称される。プライマー相補部分は、増幅標的サークルの必要な成分である。検出タグ部分、第二標的配列部分、アドレスタグ部分、およびプロモーター部分は任意的である。一般に、増幅標的サークルは、プライマー相補部分を含む一本鎖の環状ＤＮＡ分子である。ＡＴＣの特異的部分に対応しないＡＴＣのセグメントは任意に選択された配列であり得る。ＡＴＣｓは自己相補的ないかなる配列をも有さないのが好ましい。ミスマッチまたはギャップを有さない６ヌクレオチド長より大きい相補領域が存在しない場合に、この条件が満たされることが考慮される。また、プロモーター部分を含有するＡＴＣｓは、転写ターミネーター、例えば一連の８またはそれ以上のチミジンヌクレオチドに類似するいかなる配列をも有さないのが好ましい。
【００５３】
増幅標的サークルは、複製時に、増幅標的サークルと相補的な複数の繰り返し配列を含有する長いＤＮＡ分子を生じさせる。この長いＤＮＡ分子は本明細書中では、直列型配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ）と称される。ＴＳ−ＤＮＡはプライマー相補部分と相補的な配列を含有し、増幅標的サークル上に存在するならば、検出タグ部分、第二標的配列部分、アドレスタグ部分、およびプロモーター部分ト相補的な部分を含有する。ＴＳ−ＤＮＡ内のこれらの配列はプライマー配列（これはローリングサークル複製プライマーの配列に適合する）、スペーサー配列（スペーサー領域と相補的である）、検出タグ、第二標的配列、アドレスタグ、およびプロモーター配列と称される。増幅標的サークルは特異的結合分子に対するタグとして有用である。
【００５４】
Ｄ．ローリングサークル複製プライマー
ローリングサークル複製プライマー（ＲＣＲＰ）は、ＡＴＣのプライマー相補部分との配列相補性を有するオリゴヌクレオチドである。この配列はＲＣＲＰの相補部分と称される。ＲＣＲＰの相補部分およびその同族プライマー相補部分は、それらが互いに相補的である限り、任意の所望の配列を有することができる。一般に、ＲＣＲＰの配列は、ＡＴＣの任意の他の部分に対して有意に相補的ではないように選択できる。ローリングサークル複製プライマーの相補部分は、プライマーおよびプライマー相補部分間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションをサポートする任意の長さであり得る。一般に、これは１２〜１００ヌクレオチド長であるが、好ましくは２０〜４５ヌクレオチド長である。
【００５５】
ローリングサークル複製プライマーはまた、ＲＣＲＰの５'末端にて、ＡＴＣのいかなる部分とも相補的でないさらなる配列を含有するのが好ましい。この配列は、ＲＣＲＰの非相補部分と称される。ＲＣＲＰの非相補部分は、存在するならば、ＤＮＡ複製時に鎖置換を促進するように働く。ＲＣＲＰのこの非相補部分は任意の長さであってよいが、一般に１〜１００ヌクレオチド長、好ましくは４〜８ヌクレオチド長である。ローリングサークル複製プライマーは、鎖置換カスケード増幅における第三のＤＮＡ鎖置換プライマーとして用いることができる。
【００５６】
好ましい態様では、ローリングサークル複製プライマー（および本方法で用いられる他のプライマー）はスペーサーを含有してもよい。このスペーサーは、固定されている場合に、表面由来の空間的配置に関する要因を克服するか、プライマー上にポリメラーゼをアンカーするのを補助するか、あるいは他の利点、例えばアレイ成分の疎水性の調節または変更を提供するのを補助することができる。開示されている方法に関して有用なスペーサーには、ヌクレオチドスペーサー、例えばポリｄＴまたはポリｄＡ；脂肪族リンカー、例えばＣ１８、Ｃ１２、またはそれらの多量体；芳香族スペーサー、またはＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡまたはそれらの組み合わせが含まれる。
【００５７】
Ｅ．分析物捕獲物質
分析物捕獲物質は、分析物と相互作用可能であり、分析物が固定され、他の化合物および分析物から分離されることを可能にする任意の化合物である。分析物捕獲物質には、分析物相互作用部分が含まれる。また分析物捕獲物質には捕獲部分が含まれ得る。捕獲部分を有さない分析物捕獲物質は固形支持体に固定されるのが好ましい。分析物捕獲物質の分析物相互作用部分は、特定物質または部分と特異的に相互作用する分子である。分析物相互作用部分と特異的に相互作用するこの分子または部分は、分析物相互作用部分および分析物間の相互作用における中間体として働く分析物または別の分子であってよい。用語「分析物」は別々の分子および分子の部分、例えば、分析物相互作用部分と特異的に相互作用するタンパク質のエピトープを表すことが理解されるべきである。抗体、レセプター／リガンド対のメンバー、および特異的結合アフィニティーを有する他の分子は、分析物捕獲物質の分析物相互作用部分として用いることができる分子の例である。また分析物捕獲物質の特異的結合部分は、分析物が相互作用可能な任意の化合物または組成物、例えばペプチドであり得る。特定の分析物に特異的に相互作用する分析物捕獲物質は、その分析物に対して特異的であると言及される。例えば、特定の抗原と結合する抗体である分析物相互作用部分を有する分析物捕獲物質は、その抗原に対して特異的であると言及される。この抗原は分析物である。
【００５８】
分析物捕獲物質の分析物相互作用部分として有用な分子の例は、抗体、例えば粗製（血清）抗体、精製された抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ断片）；タンパク質Ａ、炭水化物結合タンパク質、および他の相互作用物のような物質と相互作用する抗体；タンパク質相互作用物（例えばアビジンおよびその誘導体）；ペプチド；および小さい化学物質、例えば酵素基質、補因子、金属イオン／キレート物、およびハプテンである。抗体は修飾するか、あるいは化学的に処理して、表面および／または標的に対する結合を最適化することができる。
【００５９】
分析物捕獲物質の分析物相互作用部分として有用な抗体は市販されているか、あるいは十分に確立されている方法を用いて製造できる。例えば Johnstone and Thorpe はページ３０〜８５において、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両者の製造に有用な一般的方法を記載している。この書籍は、全体では、アッセイ系における抗体の使用に関する多くの一般的技術および原理を記載している。
【００６０】
分析物捕獲物質の捕獲部分は、別の化合物と結合可能な任意の化合物である。好ましくは、捕獲部分は、別の化合物、例えばリガンド結合分子または抗体と結合または相互作用する化合物、例えばリガンドまたはハプテンである。また、捕獲部分および捕獲成分間のこのような相互作用は特異的相互作用、例えばハプテンおよび抗体間、またはリガンドおよびリガンド結合分子間のような相互作用であることが好ましい。ハプテンの例には、ビオチン、ＦＩＴＣ、ジゴキシゲニン、およびジニトロフェノールが含まれる。捕獲部分は、分析物捕獲物質と結合した化合物または複合体をそれと結合しないものから分離するのに用いることができる。
【００６１】
ある基質に関する分析物または分析物捕獲物質の捕獲は、いくつかの方法で行うことができる。一態様では、捕獲ドックを付着させるか、あるいは基質とカップリングさせる。捕獲ドックは、（分析物が結合しているか、結合するであろう）分析物捕獲物質上の捕獲部分と結合するか、あるいは相互作用して、分析物の付着を媒介する化合物または部分である。基質上に固定された捕獲ドックは、基質上における分析物の捕獲を可能にする。このような捕獲は、以後の工程を妨害するかもしれない反応成分を洗い出す都合のよい方法を提供する。別法では、分析物捕獲物質は基質上に直接固定される。この場合、分析物捕獲物質は捕獲部分を有する必要がない。
【００６２】
一態様では、固定される分析物捕獲物質または捕獲ドックは抗ハイブリッド抗体である。抗体および他のタンパク質を基質に固定する方法は十分に確立されている。固定は、標準的固定化学を用いる例えばアミノ化表面、カルボキシル化表面またはヒドロキシル化表面に対する結合によって達成できる。固定物質の例は、臭化シアン、スクシンイミド、アルデヒド、トシルクロライド、アビジン−ビオチン、光学架橋物質、エポキシドおよびマレイミドである。好ましい結合物質は、ヘテロ二官能性架橋物質、例えばＮ−[γ−マレイミドブチリルオキシ]スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）である。これらおよび他の結合物質、ならびにその結合における使用方法は、Protein Immobilization: fundamentals and applications, Richard F. Taylor, ed. (M. Dekker, New York, 1991), Johnstone and Thorpe, Immunochemistry In Practice (Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, 1987) pages 209-216 and 241-242, and Immobilized Affinity Ligands, Craig T. Hermanson et al., eds. (Academic Press, New York, 1992) に記載されている。抗体は、抗体上の遊離のアミノ基を、基質内に存在する反応性側鎖と化学的に架橋することによって基質と結合させることができる。例えば、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、またはヘテロ二官能性物質、例えばＧＭＢＳを架橋剤として用いて、抗体を、遊離のアミノ、カルボキシル、または硫黄基を含有する基質と化学的に架橋することができる。この方法では、遊離の抗体を含有する水溶液を、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミドの存在下で、固形基質とインキュベートする。グルタルアルデヒドを用いる架橋では、反応物を、０．１Ｍ カコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．４）のようなバッファー溶液中、容量で２％のグルタルアルデヒドとインキュベートすることができる。他の標準的固定化学は当業者に既知である。
【００６３】
１つの有用な型の分析物捕獲物質はペプチドである。種々のペプチドをアレイに固定した場合、これらは分析物に対する「えさ」として使用可能である。例えば、種々のペプチドのアレイを用いて、サンプルがいずれかのペプチドと相互作用する分析物を有するかどうか測定可能である。例えば、種々のサンプル中の分析物が結合するペプチドにおける差異に着目することによって、種々のサンプルを比較できる。開示されている方法の別の型では、目的の分析物に特異的な分析物捕獲物質のアレイを用いて、サンプル中の全組の分析物を存在を測定可能である。
【００６４】
使用に関して、分析物捕獲物質は完全に純粋である必要はない。分析物捕獲物質は、好ましくは、少なくとも２０％純粋、より好ましくは少なくとも５０％純粋、より好ましくは少なくとも８０％純粋、そして最も好ましくは少なくとも９０％純粋である。
【００６５】
Ｆ．アクセサリー分子
アクセサリー分子は、分析物および特異的結合分子または分析物捕獲物質の相互作用に影響する分子である。例えば、アクセサリー分子は、分析物と分析物捕獲物質または特異的結合分子との結合と拮抗する分子であってよい。拮抗性アクセサリー分子の１形態は分析物のアナログである。アナログとは、構造が類似しているが、拮抗において異なっている分子である。このような関連では、分析物アナログは、その分析物に特異的な、分析物捕獲物質または特異的結合分子との相互作用が十分に同様であるべきである。アクセサリー分子はまた、分析物および特異的結合分子または分析物捕獲物質の相互作用を補助するか、あるいはそれに必要である分子であり得る。このようなアクセサリー分子は、本明細書中では、分析物結合補因子と称される。
【００６６】
一タイプの開示されている方法では、アクセサリー分子はその分析物結合に対する作用に関して試験される化合物であり得る。例えば、開示されている方法を用いて、特異的結合分子または分析物捕獲物質との分析物相互作用の拮抗物質（または結合補因子）に関してスクリーニングすることができる。アクセサリー分子が分析物の相互作用に影響する場合、レポーター結合プライマーの分析物との結合（または、分析物捕獲物質の分析物との結合）の喪失または獲得のせいで、ＲＣＡの結果は変化する。分析物および分析物捕獲物質の相互作用に関する拮抗の例は、図１４に示されている。
【００６７】
使用に関して、アクセサリー分子は完全に純粋である必要はない。アクセサリー分子は、好ましくは、少なくとも２０％純粋、より好ましくは少なくとも５０％純粋、より好ましくは少なくとも８０％純粋、さらにより好ましくは少なくとも９０％純粋である。
【００６８】
Ｇ．検出ラベル
開示されている方法を用いて増幅される核酸の検出および定量を補助するために、検出ラベルを増幅される核酸に直接包含させるか、あるいは検出分子とカップリングさせることができる。本明細書中で用いられる検出ラベルとは、増幅される核酸と、直接あるいは間接的に結合させることができ、測定可能な検出シグナルを直接または間接的に生じさせる任意の分子である。核酸に包含させるか、または核酸または抗体プローブとカップリングさせるための、多くのこのようなラベルが当業者に既知である。ＲＣＡにおける使用に関して適当な検出ラベルの例は、放射性同位体、蛍光分子、リン光性分子、酵素、抗体、およびリガンドである。
【００６９】
適当な蛍光ラベルの例には、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、ダンシルクロライド、ローダミン、４'−６−ジアミジノ−２−フェニリノドール（ＤＡＰＩ）、およびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７が含まれる。好ましい蛍光ラベルはフルオレセイン（５−カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）およびローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）である。コンビナトリアル多色コーディングに関する好ましい蛍光ラベルは、ＦＩＴＣおよびシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７である。吸収および発光最大値はそれぞれ、これらの蛍光に関して：ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ；６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）であり、したがって、それらの同時検出が可能である。蛍光ラベルは、Molecular Probes, Eugene, OR and Research Organics, Cleveland, Ohio を含む種々の商業的供給元から入手できる。
【００７０】
ラベルされたヌクレオチドは、合成時のＲＣＡの生成物に直接包含可能であるため、好ましい型の検出ラベルである。増幅ＤＮＡまたはＲＮＡに包含可能な検出ラベルの例には、ヌクレオチドアナログ、例えばＢｒｄＵｒｄ（Hoy and Schimke, Mutation Research 290: 217-230 (1993)）、ＢｒＵＴＰ（Wansick et al., J. Cell Biology 122: 283-293 (1993)）およびビオチンで修飾されたヌクレオチド（Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6633 (1981)）または適当なハプテン、例えばジゴキシゲニンで修飾されたヌクレオチド（Kerkhof, Anal. Biochem. 205:359-364 (1992)）が含まれる。適当な蛍光ラベルヌクレオチドはフルオレセイン−イソチオシアネート−ｄＵＴＰ、シアニン−３−ｄＵＴＰおよびシアニン−５−ｄＵＴＰ（Yu et al., Nucleic Acids Res., 22:3226-3232 (1994)）である。ＤＮＡに関する好ましいヌクレオチドアナログ検出ラベルはＢｒｄＵｒｄ（ＢＵＤＲトリホスフェート、Sigma）であり、ＲＮＡに関する好ましいヌクレオチドアナログ検出ラベルはビオチン−１６−ウリジン−５'−トリホスフェート（ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、Boehringher Mannheim）である。フルオレセイン、Ｃｙ３、およびＣｙ５は直接ラベリングすることによってｄＵＴＰに連結できる。Ｃｙ３．５およびＣｙ７は、ビオチン−またはジゴキシゲニン−ラベルされたプローブの二次検出用のアビジンまたは抗−ジゴキシゲニンコンジュゲートとして利用可能である。
【００７１】
増幅される核酸に包含される検出ラベル、例えばビオチンは、その後、当分野に周知の鋭敏な方法を用いて検出可能である。例えば、ビオチンは、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲート（Tropix, Inc.）（これはビオチンと結合し、次いで適当な基質（例えば化学発光基質ＣＳＰＤ：２ナトリウム、３−(４−メトキシスピロ−[１，２,−ジオキセタン−３−２'−(５'−クロロ)トリシクロ[３．３．１．１３，７]デカン]−４−イル)フェニルホスフェート；Tropix, Inc.）の化学発光によって検出される）を用いて検出可能である。
【００７２】
増幅ＲＮＡの検出にて使用するのに好ましい検出ラベルは、アクリジニウム−エステル−ラベルされたＤＮＡプローブ（GenProbe, Inc., Arnold et al., Clinical Chemistry 35:1588-1594 (1989)）である。ハイブリダイズしていないプローブはアルカリによって破壊されるため、アクリジニウム−エステル−ラベルされた検出プローブは、洗浄なしに増幅ＲＮＡを検出することを可能にする（Arnold et al. (1989)）。
【００７３】
２またはそれ以上のこれらの検出ラベルを組み合わせた分子もまた検出ラベルとして考える。既知の検出ラベルを開示されているプローブ、タグ、および方法とともに用いて、開示されている方法を用いて増幅される核酸を検出できる。検出ラベルによって生成されるシグナルを検出および測定する方法もまた、当業者に既知である。例えば、放射性同位体はシンチレーションカウントまたは直接の視覚化によって検出できる；蛍光分子は蛍光分光器によって検出できる；リン光性分子はスキャナーまたは分光器によるか、あるいはカメラを用いる直接の視覚化によって検出できる；酵素は、酵素によって触媒される反応の生成物を検出または視覚化することによって検出できる；抗体は、この抗体とカップリングされた二次検出ラベルを検出することによって検出できる。このような方法は、開示されている増幅および検出方法において直接用いることができる。本明細書中で用いられるように、検出分子は増幅核酸と相互作用する、１またはそれ以上の検出ラベルがカップリングされている分子である。
【００７４】
Ｈ．検出プローブ
検出プローブは、ＴＳ−ＤＮＡ上に検出タグと相補的な配列を有するラベルされているオリゴヌクレオチドである。検出プローブの相補部分は、検出プローブおよび検出タグ間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションをサポートする任意の長さであってよい。この目的のため、１０〜３５ヌクレオチドの長さは好ましく、検出プローブの相補部分は１６〜２０ヌクレオチド長であるのが最も好ましい。検出プローブは上に記載される任意の検出ラベルを含有できる。好ましいラベルはビオチンおよび蛍光分子である。特に好ましい検出プローブは、分子ビーコンである。分子ビーコンは、蛍光分子でラベルされた検出プローブであり、ここに蛍光部分は検出プローブがハイブリダイズしたときにのみ蛍光を発する（Tyagi and Kramer, Nature Biotechnology 14:303-308 (1996)）。このようなプローブの使用は、ラベル検出前にハイブリダイズしなかったプローブを除去する必要を排除する。これはハイブリダイズしなかった検出プローブはシグナルを生じないからである。このことは、複合アッセイにおいては特に有用である。ＴＳ−ＤＮＡは、崩壊検出プローブを用いてＷＯ ９７／１９１９３に記載のように崩壊させることができる。ＴＳ−ＤＮＡの崩壊は、以下に記載されるコンビナトリアル多色コーディングを用いる場合に特に有用である。
【００７５】
Ｉ．ＤＮＡ鎖置換プライマー
第二ＤＮＡ鎖（ストランド）置換に関して用いられるプライマーは、本明細書中では、ＤＮＡ鎖置換プライマーと称される。本明細書中で第二ＤＮＡ鎖置換プライマーと称される、ある型のＤＮＡ鎖置換プライマーは、ＡＴＣの配列の部分と適合する配列を有するオリゴヌクレオチドである。この配列は第二ＤＮＡ鎖の適合部分と称される。この第二ＤＮＡ鎖置換プライマーの適合部分は、ＴＳ−ＤＮＡ内の配列と相補的である。第二ＤＮＡ鎖置換配列の適合部分は、ＴＳ−ＤＮＡ内の任意の配列と相補的であってよい。第二ＤＮＡ鎖置換プライマーの適合部分は、プライマーおよびその相補部分の間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションをサポートする任意の長さであり得る。概してこれは１２〜３５ヌクレオチド長であるが、１８〜２５ヌクレオチド長であるのが好ましい。
【００７６】
本明細書中で第三ＤＮＡ鎖置換プライマーと称される、別の型のＤＮＡ鎖置換プライマーは、ＡＴＣの配列の部分と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。この配列は第三ＤＮＡ鎖置換プライマーの相補部分と称される。この第三ＤＮＡストランド置換プライマーの相補部分は、ＴＳ−ＤＮＡ内の配列と適合する。第三ＤＮＡ鎖置換プライマーの相補部分はＡＴＣ内の任意の配列と相補的であってよい。第三ＤＮＡ鎖置換プライマーの相補部分は、プライマーおよびその相補物の間の特異的かつ安定なハイブリダイゼーションをサポートする任意の長さであり得る。概してこれは１２〜３５ヌクレオチド長であるが、好ましくは１８〜２５ヌクレオチド長である。
【００７７】
ＤＮＡ鎖置換プライマーおよびその使用は、米国特許第５，８５４，０３３号およびＷＯ ９７／１９１９３に、より詳細に記載されている。
【００７８】
Ｊ．オリゴヌクレオチド合成
ローリングサークル複製プライマー、検出プローブ、アドレスプローブ、増幅標的サークル、ＤＮＡ鎖置換プライマー、および任意の他のオリゴヌクレオチドは、確立されているオリゴヌクレオチド合成方法を用いて合成できる。オリゴヌクレオチドの生産または合成方法は当分野に周知である。このような方法は、標準的酵素消化の後、ヌクレオチド断片を単離すること（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989) Chaptres 5, 6 を参照）から、純粋な合成方法、例えば Milligen または Beckman System 1Plus DNA 合成装置（例えば Milligen-Biosearch, Burlington, MA または Perceptive Expedite の Model 8700 自動合成装置）を用いるシアノエチルホスホルアミダイト法までの範囲であり得る。オリゴヌクレオチド作成に有用な合成方法は、Ikuta et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 (1984),（ホスホトリエステルおよびホスファイト−トリエステル法）、および Narang et al., Methods Enzymol., 65:610-620 (1980),（ホスホトリエステル法）に記載されている。タンパク質核酸分子は既知の方法、例えば Nielsen et al., Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994) に記載されている方法によって製造できる。
【００７９】
本明細書中に記載されている多数のオリゴヌクレオチドは、他のオリゴヌクレオチドまたは核酸の特定部分と相補的であるように設計され、したがってこれらの間に安定なハイブリッドが形成可能である。これらのハイブリッドの安定性は既知の方法、例えば Lesnick and Freier, Biochemistry 34:10807-10815 (1995), McGraw et al., Biotechniques 8:674-678 (1990), および Rychlik et al., Nucleic Acids Res. 18:6409-6412 (1990) に記載の方法を用いて計算できる。
【００８０】
Ｋ．固形支持体
固形支持体とは、分析物が結合可能な固形状態の物質または支持体である。分析物は直接または間接的に固形支持体と結合させることができる。例えば、分析物は固形支持体に直接固定できる。分析物捕獲物質およびアクセサリー分子もまた、固形支持体に固定できる。好ましい型の固形支持体はアレイである。別の型の固形支持体はアレイ検出装置である。アレイ検出装置は、複数の種々のアドレスプローブまたは検出分子がアレイ、グリッド、または他の組織されたパターンでカップリングされている固形支持体である。
【００８１】
固形支持体において使用するための固形状態の基体には、オリゴヌクレオチドがカップリング可能な任意の固形物質が含まれる。これには、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセテート、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカルボネート、テフロン、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンラバー、ポリアンヒドレート、ポリグリコール酸、ポリ酪酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフメレート（polypropylfumerate）、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸のような材料が含まれる。固形状態の基体は、フィルム、膜、ボトル、ディッシュ、ファイバー、織りファイバー、成型ポリマー、粒子、ビーズ、微粒子、または組み合わせの任意の有用な形態であってよい。固形状態の基体および固形支持体は多孔性または非多孔性であり得る。固形状態の基体に関する好ましい型はミクロタイターディッシュである。最も好ましい型のミクロタイターディッシュは標準的９６ウェル型である。好ましい態様では、通常、ウェル当たりに１アレイを含有するマルチウェルのガラススライドを用いることができる。この特徴は、アッセイの再現性のより巧みな調節、処理量およびサンプルの取り扱いの増加、および自動化の容易性を可能にする。
【００８２】
種々の分析物、分析物捕獲物質、またはアクセサリー分子は、いっしょに１セットとして用いることができる。このセットは、別々の反応において別々に用いられるか、あるいはアレイに固定されている分析物、分析物捕獲物質、およびアクセサリー分子のすべてまたはサブセットの混合物として用いることができる。別々に用いられるか、あるいは混合物として用いられる分析物、分析物捕獲物質、およびアクセサリー分子は、例えば固形支持体と結合するか、あるいは固形支持体に固定されることによって物理的に分離することができる。アレイには、アレイ中の同定位置か、あるいはあらかじめ規定された位置に固定されている多数の分析物、分析物捕獲物質および／またはアクセサリー分子が含まれる。それぞれのあらかじめ規定された位置は、概して、１つの型の成分を有する（すなわち、その位置にあるすべての成分は同じものである）。各位置は複数コピーの成分を有するだろう。アレイ内で異なる成分が空間的に分離されることにより、分析物の別個の検出および同定が可能になる。
【００８３】
与えられるアレイは単一のユニットまたは構造であるのが好ましいが、これが必要とされるわけではない。分析物、分析物捕獲物質、またはアクセサリー分子のセットは任意の数の固形支持体にわたって分配することができる。例えば、極端な場合では、各プローブが別々の反応チューブまたは容器、または別々のビーズまたは微粒子に固定されることがある。
【００８４】
開示されている方法は、固形支持体に固定された種々の成分（例えば分析物、分析物捕獲物質、およびアクセサリー分子）を用いて、種々の様式で行うことができる。例えば図１４は、３つの分子（分子１、２、および３）の間の相互作用が固形支持体を用いて評価される、ある型の開示されている方法を例示している。３つの分子のそれぞれは、例えば、分析物捕獲試薬、およびアクセサリー分子、または分析物であり得る。分子２が分析物である場合、分子１は分析物捕獲物質であり、分子３はアクセサリー分子であろう。この場合、分析物（分子２）は固定されている。分子２が分析物捕獲物質である場合、分子１は分析物であり、分子３はアクセサリー分子であろう。この場合、分析物捕獲物質（分子２）は固定されている。この方法の別の型では、アクセサリー分子が固定されていてもよい。
【００８５】
別の態様では、ＲＣＡは溶液中で行われ、増幅産物はアレイに捕獲される。例えばビオチニル化された捕獲抗体を分析物含有サンプルに加え、次いで、分析物の異なる位置に結合するレポーター結合プライマーを加える。これらの成分−捕獲抗体およびレポーター結合プライマーは任意の順に加えることができる。次いでＲＣＡが行われ、ＴＳ−ＤＮＡが生産され、ストレプトアビジンを含有する基質（例えばストレプトアビジンビーズ（Dynal））上で精製される。次いでＴＳ−ＤＮＡは、ＴＳ−ＤＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドプローブを含有するアレイへのハイブリダイゼーションによって検出または定量される。このようなプローブは本明細書中ではアドレスプローブと称される。固形支持体の異なる領域に対し、異なるアドレスプローブを結合させることによって、種々のＲＣＡ産物が、異なる、したがって診断可能な位置に捕獲できる。例えばミクロタイタープレート多重アッセイでは、（それぞれ異なるプライマーおよびＡＴＣｓを介して増幅された）９６までの異なるＴＳ−ＤＮＡに特異的なアドレスプローブを、ミクロタイタープレート上に、それぞれ異なるウェル中にて固定可能である。捕獲および検出は、対応の分析物がサンプル中に存在するＴＳ−ＤＮＡに対応するアレイのプローブ要素においてのみ生じる。
【００８６】
オリゴヌクレオチドを固形状態の基体に固定する方法は十分に確立されている。アドレスプローブおよび検出プローブを含むオリゴヌクレオチドは、確立されているカップリング方法を用いて基体とカップリングさせることができる。例えば、適当な結合方法は、Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(11):5022-5026 (1994), および Khrapko et al., Mol Biol (Mosk) (USSR) 25:718-730 (1991) に記載されている。３'−アミン オリゴヌクレオチドをカゼインコーティングされたスライドに固定する方法は、Stimpson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 6379-6383 (1995) に記載されている。オリゴヌクレオチドを固形状態の基体に結合する好ましい方法は、Guo et al., Nucleic Acids Res. 22:5456-5465 (1994) に記載されている。
【００８７】
ＲＣＡアッセイに有用ないくつかの固形支持体は固形状態の基体に結合した検出抗体を有する。このような抗体は目的の分子に関して特異的であってよい。捕獲された目的の分子は、その後、第二のレポーター抗体の結合、続くＲＣＡによって検出できる。このような固形支持体における抗体の使用は、ＲＣＡアッセイが、抗体を製造可能な任意の分子の検出用に開発されることを可能にする。抗体を固形状態の基体に固定する方法は十分に確立されている。固定は、例えば、標準的固定化学を用いる、アミノ化表面、カルボキシル化表面またはヒドロキシル化表面への結合によって達成できる。結合剤の例は、臭化シアン、スクシンイミド、アルデヒド、トシルクロライド、アビジン−ビオチン、光架橋剤、エポキシドおよびマレイミドである。好ましい結合剤はヘテロ二官能性架橋剤 Ｎ−[γ−マレイミドブチリルオキシ]スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）である。これらおよび他の結合剤、ならびに結合におけるその使用方法は、Protein immobilization: fundamentals and applications, Richard F. Taylor, ed. (M. Dekker, New York, 1991), Johnstone and Thorpe, Immunochemistry In Practice (Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, 1987) pages 209-216 and 241-242, および Immobilized Affinity Ligands, Craig T. Hermanson et al., eds. (Academic Press, New York, 1992) に記載されている。抗体は、抗体の遊離のアミノ基を、固形状態の基体内に存在する反応性側鎖基に化学的に架橋することによって基体と結合可能である。例えば、抗体は、グルタルアルデヒド、カルボジイミド、またはＧＭＢＳをそれぞれ架橋剤として用い、遊離のアミノ、カルボキシル、または硫黄基を含有する基体と化学的に架橋することができる。この方法では、遊離の抗体を含有する水溶液をグルタルアルデヒドまたはカルボジイミドの存在下で固形状態の基質とインキュベートする。
【００８８】
抗体または他のタンパク質を固形状態の基体に結合する好ましい方法は、基体をアミノ−またはチオール−シランで官能化し、次いで官能化された基体をホモ二官能性架橋剤、例えばビス−スルホ−スクシンイミジルスベレート（ＢＳ３）またはヘテロ二官能性架橋剤、例えばＧＭＢＳで活性化することである。ＧＭＢＳでの架橋に関して、ガラス基体は、メルカプトプロピルトリメトキシシランの溶液（９５％エタノール中１％ ｖｏｌ／ｖｏｌ、ｐＨ５．５）に１時間浸漬し、９５％エタノール中ですすぎ、１２０℃で４時間加熱することによって化学的に官能化される。チオールで誘導されたスライドは、１％ジメチルホルムアミド、９９％エタノール中のＧＭＢＳの０．５ｍｇ／ｍＬ溶液中、室温で１時間浸漬することによって活性化する。抗体またはタンパク質は、活性化された基体に直接添加され、次いで２％ウシ血清アルブミンのような物質を含有する溶液でブロックされ、空気乾燥される。他の標準的固定化学は当業者に既知である。
【００８９】
固形支持体に固定された各成分（分析物捕獲物質、アクセサリー分子、および／または分析物）は、好ましくは、固形支持体のあらかじめ規定された領域のうちの異なる領域に位置する。あらかじめ規定された領域のうちの異なる領域のそれぞれは、異なる領域のお互いから物理的に分離されていてよい。固形支持体のあらかじめ規定された領域のうちの異なる領域の距離は、固定されているか、あるいは可変でもよい。例えば、アレイでは、各成分は互いに固定された距離で配置されていてよいが、ビーズに結合した成分は固定された空間的関係にない。特に、複数の固形支持体ユニット（例えば多数のビーズ）を使用すると、種々の距離が生じることになる。
【００９０】
成分は任意の密度で固形支持体に結合されるか、あるいは固定されることが可能である。成分は、好ましくは、１立方センチメートル当たりの異なる成分が４００を超える密度で固形支持体に固定される。成分のアレイは、任意の数の成分を有し得る。例えば、アレイが、固形支持体に固定されている少なくとも１，０００の異なる成分、固形支持体に固定されている少なくとも１０，０００の異なる成分、固形支持体に固定されている少なくとも１００，０００の異なる成分、固形支持体に固定されている少なくとも１，０００，０００の異なる成分を有し得る。
【００９１】
Ｌ．ＤＮＡポリメラーゼ
ＲＣＡのローリングサークル複製工程に有用なＤＮＡポリメラーゼは、プライムされる一本鎖サークルのローリングサークル複製を行わなければならない。このようなポリメラーゼは、本明細書中では、ローリングサークルＤＮＡポリメラーゼと称される。ローリングサークル複製に関して、ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換と称される、鋳型鎖と相補的な鎖の置換能を有し、かつ５'から３'のエキソヌクレアーゼ活性を欠いているのが好ましい。鎖置換は、増幅標的サークルの複数の直列型コピーの合成を生じさせるのに必要である。５'から３'のエキソヌクレアーゼ活性が存在するならば、合成された鎖の崩壊を生じさせるかもしれない。また、開示されている方法において使用するためのＤＮＡポリメラーゼは高度に進行性（processive）であるのが好ましい。開示されている方法においての使用に関する、ＤＮＡポリメラーゼの妥当性は、ローリングサークル複製を実行するその能力を評価することによって容易に決定できる。好ましいローリングサークルＤＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージφ２９ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，１９８，５４３号および第５，００１，０５０号、Blanco et al.）、ファージＭ２ＤＮＡポリメラーゼ（Matsumoto et al., Gene 84:247 (1989)）、ファージφＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（Jung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8287 (1987)）、ＶＥＮＴ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Kong et al., J. Biol. Chem. 268:1965-1975 (1993)）、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（Jacobsen et al., Eur. J. Biochem. 45:623-627 (1974)）、Ｔ５ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Chatterjee et al., Gene 97:13-19 (1991)）、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（Zhu and Ito, Biochem. Biophys. Acta. 1219:267-276 (1994)）、修飾Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Tabor and Richardson, J. Biol. Chem. 262: 15330-15333 (1987); Tabor and Richardson, J. Biol. Chem. 264:6447-6458 (1989); Sequenase（登録商標）(U.S. Biochemicals)）、およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（Kaboord and Benkovic, Curr. Biol. 5:149-157 (1995)）である。φ２９ＤＮＡポリメラーゼは最も好ましい。
【００９２】
鎖置換は、鎖置換因子、例えばヘリカーゼの使用によって促進することができる。鎖置換因子の存在下でローリングサークル複製を実行可能な任意のＤＮＡポリメラーゼが、たとえこのような因子の不存在下ではローリングサークル複製を実行できなく場合でも、開示されている方法において使用されるのに適していることが考慮される。ＲＣＡにおいて有用なストランド置換因子には、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼアクセサリーサブユニット（Tsurumi et al., J. Virology 67(12):7648-7653 (1993)）、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（Zijderveld and van der Vliet, J. Virology 68(2): 1158-1164 (1994)）、ヘルペス単純ウイルスタンパク質ＩＣＰ８（Boehmer and Lehman, J. Virology 67(2): 711-715 (1993); Skaliter and Lehman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(22):10665-10669 (1994)）、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（SSB; Rigler and Romano, J. Biol. Chem. 270:8910-8919 (1995)）、およびウシ胸腺ヘリカーゼ（Siegel et al., J. Biol. Chem. 267:13629-13635 (1992)）が含まれる。
【００９３】
ポリメラーゼの、ローリングサークル複製を行う能力は、Fire and Xu, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 92:4641-4645 (1995) に記載されるようなローリングサークル複製アッセイにおいてポリメラーゼを使用することによって測定できる。
【００９４】
上記材料は、開示されている方法を実行するのに有用なキットとして、任意の適当な組み合わせでパッケージすることができる。例えばキットは、多数のレポーター結合プライマーおよび／または多数の分析物捕獲物質を含み得る。キット中の分析物捕獲物質は固形支持体と結合可能である。
【００９５】
方法
開示されている方法は、ある型のＲＣＡであり、ここではレポーター結合プライマーが増幅標的サークルの増幅用のローリングサークル複製プライマーを提供する。開示されている方法は、レポーター結合プライマーが分析物と結合することに基づいてＲＣＡにより増幅シグナル（すなわち直列型配列ＤＮＡ（ＴＳ−ＤＮＡ））が生じることを可能にする。レポーター結合プライマーの部分である特異的プライマー配列はレポーター結合プライマーの分析物との（レポーター結合プライマーのアフィニティー部分を介する）特異的相互作用をＲＣＡとリンクさせることを提供する。ＲＣＡに関して、増幅標的サークル（ＡＴＣ）は、レポーター結合プライマーのローリングサークル複製プライマー配列とハイブリダイズし、次いでＲＣＡによりＡＴＣが増幅される。得られたＴＳ−ＤＮＡは、一端にレポーター結合プライマーのローリングサークル複製プライマー配列を包含し、これによりＴＳ−ＤＮＡを分析物の部位にアンカーする。開示されている方法は任意の分析物を用いて行うことができる。好ましい分析物はタンパク質およびペプチドである。
【００９６】
開示されている方法は、与えられたサンプル中に存在する分析物のプロファイルを作成するのに特に有用である。例えば、細胞内に存在する種々のタンパク質の存在および量を評価可能であり、これにより直接タンパク質発現プロファイルを提供する。このような分析、ある型のプロテオミクスは、核酸の存在および発現のゲノミクス分析と類似している。複数の分析物分析、例えば開示されている発明のプロテオミクス様式は、好ましくは分析物捕獲物質のアレイを用いて行うことができる。評価される分析物のすべてに関して特異的な分析物捕獲物質をアレイに含ませることによって、一回の手順において全範囲の分析物をアッセイできる。この型の方法はまた、複数のサンプル中の同一の組の分析物を簡単に比較することを可能にする。
【００９７】
開示されている方法の好ましい型では、２（またはそれ以上）の異なるサンプル中の分析物は、異なる組のレポーター結合プライマーを各サンプルと混合することによって同一アレイにおいて評価できる。各組のレポーター結合プライマーは、同一組の特異的結合分子を有するが、異なる組のローリングサークル複製プライマーを有する。異なる増幅標的サークルに特異的な異なるローリングサークル複製プライマーの作成により、特定の増幅標的サークルの増幅が、どのサンプル中に対応する分析物が存在するかを示す。
【００９８】
複数の分析物の同定は、分析物捕獲物質を用いて、分析物をそのアイデンティティーに基づいて捕獲および／または分離することによって促すことができる。例えば固定された分析物捕獲物質のアレイを用いて、アレイのあらかじめ規定された領域に特定の分析物を結合させることができる。その領域において分析物を検出することにより、分析物が同定される。分析物捕獲物質の１つの有用な型はペプチドである。種々のペプチドをアレイに固定した場合、これらは分析物用の「えさ（bait）」として用いることができる。例えば、種々のペプチドのアレイは、サンプルが任意のペプチドと相互作用する分析物を有しているかどうかを測定するのに用いることができる。異なるサンプルの比較は、例えば、異なるサンプル中の分析物が結合するペプチドの差異を識別することによって行うことができる。開示されている方法の別の型では、目的の分析物に特異的な分析物捕獲物質のアレイを用いて、サンプル中の全組の分析物の存在を測定できる。
【００９９】
開示されている方法の別の型では、アクセサリー分子を用いて、分析物と特異的結合分子または分析物捕獲物質の相互作用に影響することができる。例えば、開示されている方法を用いて、分析物と、特異的結合分子または分析物捕獲物質との相互作用に関する競合物質（または結合補因子）をスクリーニングできる。アクセサリー分子が分析物の相互作用に影響する場合、レポーター結合プライマーの分析物への（または分析物捕獲物質の分析物への）結合が失われるか、あるいは獲得されるため、ＲＣＡの結果は変化する。分析物と分析物捕獲物質の相互作用に関する拮抗物質の例は図１４に例示されている。
【０１００】
また、開示されている方法を用いて、種々の修飾された型の分析物が検出可能である。例えばリン酸化およびグリコシル化型のタンパク質が検出可能である。これは、例えば、種々の型の分析物に特異的な特異的結合分子を有するレポーター結合プライマーを用いて行うことができる。
【０１０１】
別の側面では、開示されている方法には、複合生物学的サンプル中に存在する分析物の固定、およびサンプル中のその存在の検出および定量が関与する。固定により分析物を同定および定量するプロセスは、アレルゲンを含有するサンプルを用いて本明細書中に記載されている。例えば、生物学的抽出物および液状物中に存在するアレルゲンは、まず、実施例８に記載されるように、マイクロアレイ上にこれらを選択的に固定することによって同定できる。免疫ＲＣＡマイクロアレイアッセイをその後に用いて、検出および定量できる。
【０１０２】
別の側面では、開示されている方法には、サンプル中の１以上の分析物の、多重化された検出および定量が含まれる。これは実施例９に例示され、ここでは、いくつかの試験部位を有し、各試験部位が固定された捕獲抗体を含有するマイクロアレイが、検出されるべきタンパク質分析物の混合物を含有するサンプルとインキュベートされる。このマイクロアレイは、次いで、各分析物に関して少なくとも１つのビオチニル化された抗体を含有する混合物とインキュベートされる。次いで免疫ＲＣＡマクロアレイアッセイが、検出および定量のために用いられる。
【０１０３】
別の側面では、免疫ＲＣＡマイクロアレイアッセイを１６マイクロウェル−ガラススライド内で行うことができ、ここでは、各ウェルは Teflon マスクによって分離されている。これは実施例８に例示されており、ここでは、１００〜４００スポットが各マイクロウェル内にプリントされている。これらのウェルのそれぞれを用いて、種々のサンプル、およびコントロールがアッセイされる。マルチウェルのスライドはまた、１６ウェルのうち６において、抗−ＩｇＥ捕獲抗体のアレイを用いてプリントされた。このマルチウェル形式のアレルゲンマイクロアレイに対する半自動の免疫ＲＣＡアッセイは、例えば安価な Beckman BioMek 液体取り扱いロボットによって実行できる。
【０１０４】
マイクロアレイに基づく免疫ＲＣＡアッセイは他の多重抗体アッセイに適用できる。例えば、特定の免疫学的反応はＩｇＥよりも特異的ＩｇＧ４によって生じる（AAAI Board of Directors, J Allergy Clin Immunol. 95:652-654 (1995)）。抗−ＩｇＥとコンジュゲートされたプライマーが相補的であるＤＮＡサークルとは、その配列において異なっているＤＮＡサークルと相補的なＤＮＡプライマーとコンジュゲートされた抗−ヒトＩｇＧ４を使用すると、アレルゲン特異的ＩｇＧ４およびＩｇＥの同時測定が可能であろう。このようなアッセイは、アレルゲン脱感作治療時、または抗−ＩｇＥ治療の応答をモニターするのに用いることができる（Chang Nature Biotech. 18:157-162 (2000)）。
【０１０５】
開示されている方法には、概して、以下の工程が含まれる：
（ａ）１またはそれ以上の分析物サンプルおよび１またはそれ以上のレポーター結合プライマーを接触させ、特異的結合分子および分析物の相互作用を促進する条件下で、分析物サンプルおよびレポーター結合プライマーをインキュベートする。各レポーター結合プライマーは特異的結合分子およびローリングサークル複製プライマーを含み、各特異的結合分子は分析物と直接または間接的に相互作用する。
（ｂ）工程（ａ）の前に、工程（ａ）と同時に、あるいは工程（ａ）の後に、レポーター結合プライマーおよび１またはそれ以上の増幅標的サークルを接触させ、増幅標的サークルおよびローリングサークル複製プライマーのハイブリダイゼーションを促進する条件下でレポーター結合プライマーおよび増幅標的サークルをインキュベートする。増幅標的サークルはそれぞれ、プライマー相補部分を含む一本鎖環状ＤＮＡ分子を含む。このプライマー相補部分は、少なくとも１つのローリングサークル複製プライマーと相補的である。
（ｃ）工程（ｂ）の後でかつ、工程（ａ）の前に、工程（ａ）と同時に、あるいは工程（ａ）の後に、増幅標的サークルの複製を促進する条件下で、レポーター結合プライマーおよび増幅標的サークルをインキュベートする。増幅標的サークルの複製は、直列型配列ＤＮＡの形成を生じさせ、この直列型配列ＤＮＡの検出は対応する分析物の存在を示す。好ましくは、分析物は、工程（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の前に、工程（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）と同時に、あるいは工程（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の後に分析物サンプルから分離される。
【０１０６】
またこの方法は、少なくとも１つの分析物サンプルを１またはそれ以上の分析物捕獲物質と接触させ、分析物捕獲物質を分析物サンプルから分離し、これにより分析物サンプルから分析物を分離することを含む。各分析物捕獲物質は分析物と直接または間接的に相互作用し、少なくとも１つの分析物は、分析物サンプル中に存在するならば、少なくとも１つの分析物捕獲物質と相互作用する。この方法はまた、少なくとも１つの分析物サンプルおよび少なくとも１つのレポーター結合プライマーを少なくとも１つのアクセサリー分子と接触させることを含む。このアクセサリー分子は、少なくとも１つの分析物および少なくとも１つの特異的結合分子または少なくとも１つの分析物捕獲物質の相互作用に影響する。
【０１０７】
本方法はまた、工程（ａ）の後、分析物サンプルおよび固形支持体を接触させる前に、１またはそれ以上の第一の分析物サンプルおよび１またはそれ以上の第二の分析物サンプルを混合することを含む。この型の方法では、分析物サンプルは、１またはそれ以上の第一の分析物サンプルおよび１またはそれ以上の第二の分析物サンプルを含み、レポーター結合プライマーは１またはそれ以上の第一のレポーター結合プライマーおよび１またはそれ以上の第二のレポーター結合プライマーを含む。各第一のレポーター結合プライマーに関して、適合する第二のレポーター結合プライマーが存在し、第一のレポーター結合プライマーの特異的結合分子は、適合する第二のレポーター結合プライマーの特異的結合分子と同一の分析物と相互作用する。また、種々のレポーター結合プライマーのそれぞれについてのローリングサークル複製プライマーは異なっており、各異なるローリングサークル複製プライマーは異なる１つの増幅標的サークルの複製をプライムし、そして各異なる増幅標的サークルは、異なる直列型配列ＤＮＡを生じる。異なる分析物サンプル中の同一の分析物の存在または不存在は、対応する直列型配列ＤＮＡの存在または不存在によって示される。
【０１０８】
本方法の別の型には、工程（ａ）の前に、工程（ａ）と同時に、あるいは工程（ａ）の後に、１またはそれ以上の第一の分析物捕獲物質および１またはそれ以上の第一の分析物サンプルを接触させ、ならびに１またはそれ以上の第二の分析物捕獲物質および１またはそれ以上の第二の分析物サンプルを接触させることが含まれる。各分析物捕獲物質には分析物相互作用部分および捕獲部分が含まれる。第一の分析物捕獲物質それぞれに関し、適合する第二の分析物捕獲物質が存在する。この第一の分析物捕獲物質の分析物相互作用部分は、適合する第二の分析物捕獲物質の分析物相互作用部分と同一の分析物と相互作用する。第一および第二の分析物捕獲物質の捕獲部分はそれぞれ、１またはそれ以上のレポーター結合プライマーの特異的結合分子と相互作用し、ならびに第一の分析物捕獲物質の捕獲部分は、適合する第二の分析物捕獲物質の捕獲部分より、異なる特異的結合分子と相互作用する。各異なる特異的結合分子は、異なる１つのレポーター結合プライマーの部分である。各異なるレポーター結合プライマーのローリングサークル複製プライマーは異なっており、各異なるローリングサークル複製プライマーは異なる１つの増幅標的サークルの複製をプライムし、そして各異なる増幅標的サークルは異なる直列型配列ＤＮＡを生じる。異なる分析物サンプル中の同一の分析物の存在または不存在は、対応する直列型配列ＤＮＡの存在または不存在によって示される。
【０１０９】
また、少なくとも１つの分析物が別の分析物の修飾型であり、少なくとも１つのレポーター結合プライマーの特異的結合分子は、直接または間接的に分析物と相互作用し、ここにこの分析物は他方の分析物の修飾型であり、そして別のレポーター結合プライマーの特異的結合分子は、直接または間接的に他方の分析物と相互作用する方法を行うことができる。
【０１１０】
開示されている方法の別の型では、一般に、以下の工程が含まれる：
（ａ）１またはそれ以上の分析物サンプルおよび１またはそれ以上の分析物捕獲物質を接触させ、分析物捕獲物質および分析物の相互作用を促進する条件下で分析物サンプルおよび分析物捕獲物質をインキュベートする。分析物捕獲物質はそれぞれ、分析物と直接または間接的に相互作用し、少なくとも１つの分析物は、分析物サンプル中に存在するならば、少なくとも１つの分析物捕獲物質と相互作用する。
（ｂ）工程（ａ）の前に、工程（ａ）と同時に、または工程（ａ）の後に、少なくとも１つの分析物サンプルおよび１またはそれ以上のレポーター結合プライマーを接触させ、特異的結合分子および分析物捕獲物質の相互作用を促進する条件下で分析物サンプルおよびレポーター結合プライマーをインキュベートする。レポーター結合プライマーはそれぞれ、特異的結合分子およびローリングサークル複製プライマーを含み、特異的結合分子はそれぞれ、分析物捕獲物質と直接または間接的に相互作用する。
（ｃ）工程（ａ）または工程（ｂ）の前に、工程（ａ）または工程（ｂ）と同時に、あるいは工程（ａ）または工程（ｂ）の後に、レポーター結合プライマーおよび１またはそれ以上の増幅標的サークルを接触させ、増幅標的サークルおよびローリングサークル複製プライマーのハイブリダイゼーションを促進する条件下でレポーター結合プライマーおよび増幅標的サークルをインキュベートする。増幅標的サークルはそれぞれ、一本鎖の環状ＤＮＡ分子を含み、これはプライマー相補部分を含み、このプライマー相補部分は少なくとも１つのローリングサークル複製プライマーと相補的である。
（ｄ）工程（ｃ）の後および、工程（ａ）または（ｂ）の前に、工程（ａ）または（ｂ）と同時に、あるいは工程（ａ）または（ｂ）の後に、増幅標的サークルの複製を促進する条件下でレポーター結合プライマーおよび増幅標的サークルをインキュベートする。増幅標的サークルの複製は直列型配列ＤＮＡ形成を生じさせ、直列型配列ＤＮＡの検出は対応する分析物の存在を示す。
【０１１１】
開示されている方法の別の型では、概して、以下の工程を含む：
（ａ）１またはそれ以上の分析物サンプルを処理し、１またはそれ以上の分析物を修飾する。
（ｂ）少なくとも１つの分析物サンプルおよび１またはそれ以上のレポーター結合プライマーを接触させ、特異的結合分子および修飾分析物の相互作用を促進する条件下で分析物サンプルおよびレポーター結合プライマーをインキュベートする。レポーター結合プライマーはそれぞれ、特異的結合分子およびローリングサークル複製プライマーを含み、特異的結合分子はそれぞれ、修飾分析物と直接または間接的に相互作用する。
（ｃ）工程（ａ）または（ｂ）の前に、工程（ａ）または（ｂ）と同時に、あるいは工程（ａ）または（ｂ）の後に、レポーター結合プライマーおよび１またはそれ以上の増幅標的サークルを接触させ、増幅標的サークルおよびローリングサークル複製プライマーのハイブリダイゼーションを促進する条件下でレポーター結合プライマーおよび増幅標的サークルをインキュベートする。増幅標的サークルはそれぞれ、プライマー相補部分を含む一本鎖の、環状ＤＮＡ分子を含み、このプライマー相補部分は少なくとも１つのローリングサークル複製プライマーと相補的である。
（ｄ）工程（ｃ）の後および、工程（ａ）または（ｂ）の前に、工程（ａ）または（ｂ）と同時に、あるいは工程（ａ）または（ｂ）の後に、増幅標的サークルの複製を促進する条件下でレポーター結合プライマーおよび増幅標的サークルをインキュベートする。増幅標的サークルの複製は直列型配列ＤＮＡの形成を生じさせ、直列型配列ＤＮＡの検出は対応する分析物の存在を示す。
【０１１２】
開示されている方法の別の型は、概して、以下の工程を含む：
（ａ）１またはそれ以上の分析物サンプルおよび１またはそれ以上のアレイを接触させる。各アレイは一組の分析物捕獲物質、一組のアクセサリー分子、または両者を含み、各分析物捕獲物質は分析物と直接または間接的に相互作用する。
（ｂ）工程（ａ）の前に、工程（ａ）と同時に、あるいは工程（ａ）の後に、少なくとも１つの分析物サンプルおよび１またはそれ以上のレポーター結合プライマーを接触させる。各レポーター結合プライマーは特異的結合分子およびローリングサークル複製プライマーを含み、各特異的結合分子は分析物と直接または間接的に相互作用し、各アクセサリー分子は少なくとも１つの分析物および少なくとも１つの特異的結合分子または少なくとも１つの分析物捕獲物質の相互作用に影響する。
（ｃ）工程（ａ）および（ｂ）のいずれか、または両者と同時に、あるいは工程（ａ）および（ｂ）のいずれか、または両者の後に、特異的結合分子、分析物、分析物捕獲物質およびアクセサリー分子の相互作用を促進する条件下で分析物サンプル、アレイ、およびレポーター結合プライマーをインキュベートする。
（ｄ）工程（ｂ）の前に、工程（ｂ）と同時に、あるいは工程（ｂ）の後に、レポーター結合プライマーおよび１またはそれ以上の増幅標的サークルを接触させ、増幅標的サークルおよびローリングサークル複製プライマーのハイブリダイゼーションを促進する条件下でレポーター結合プライマーおよび増幅標的サークルをインキュベートする。この増幅標的サークルはそれぞれ、プライマー相補部分を含む一本鎖環状ＤＮＡ分子を含み、このプライマー相補部分は少なくとも１つのローリングサークル複製プライマーと相補的である。
（ｅ）工程（ｄ）の後および、工程（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の前に、工程（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）と同時に、あるいは工程（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の後に、増幅標的サークルの複製を促進する条件下でレポーター結合プライマーおよび増幅標的サークルをインキュベートする。増幅標的サークルの複製は直列型配列ＤＮＡの形成を生じさせ、この直列型配列ＤＮＡの検出は対応する分析物の存在を示す。
【０１１３】
増幅標的サークルはローリングサークル複製の基質として働く。この反応は、以下の２試薬の添加を必要とする：
（ａ）ＡＴＣのプライマー相補部分に相補的なローリングサークル複製プライマー、および（ｂ）ローリングサークルＤＮＡポリメラーゼ。ＤＮＡポリメラーゼは、所望の限り進行させる進行性ローリングサークルポリメライゼーション反応において、プライマー伸張および鎖置換を触媒し、１００，０００ヌクレオチドまたはそれ以上の分子が生じ、これは増幅標的サークルと相補的な配列の約１０００までの直列型コピーを含有する。好ましいローリングサークルＤＮＡポリメラーゼは、バクテリオファージφ２９のＤＮＡポリメラーゼである。
【０１１４】
開示されている方法では、多くの種々の型のＲＣＡを用いることができ、そのほとんどは、米国特許第５，８５４，０３３号およびＷＯ９７／１９１９３に記載されている。例えば、リニアーローリングサークル複製（ＬＲＣＡ）には、増幅標的サークルの基本ローリングサークル複製が関与し、ＴＳ−ＤＮＡストランドが形成される。指数関数的ローリングサークル複製（ＥＲＣＡ）には、ＴＳ−ＤＮＡ中の多数の繰り返し配列の部位で開始される鎖置換複製によるＴＳ−ＤＮＡの複製が含まれる。ＴＳ−ＤＮＡの両鎖上の複数回のプライムにより、増幅標的サークルにおける配列の指数関数的な増幅が生じる。所望であれば、ＴＳ−ＤＮＡは、ＷＯ ９７／１９１９３に記載されるように検出用のコンパクトな構造に崩壊させることができる。
【０１１５】
ローリングサークル複製時には、反応において生じるＤＮＡをラベルするために、さらに放射能または修飾ヌクレオチド、例えばブロモデオキシウリジントリホスフェートを含んでもよい。別法では、ビオチニル化ヌクレオチドのような結合部分を提供する適当な前駆体を含んでもよい（Langer et al. (1981)）。
【０１１６】
開示されている方法を用いて分析および検出可能なタンパク質の例には、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＧＲＯアルファ、ＭＩＰ−１アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＣＰ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ酸性（FGF acidic）、ＦＧＦ塩基性（FGF basic）、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＬ−２Ｒａ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＰ−１０、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ＭＣＰ−２、およびＭＣＰ−３が含まれる。
【０１１７】
１．増幅産物の検出
現在の検出技術は、ＲＣＡの第二のサイクルを多くの場合において不必要にする。したがって、これはＲＣＡの第一のサイクルの産物を直接検出するように進めることができる。以下に記載のように、検出はプライマリーラベリングまたはセカンダリーラベリングによって達成することができる。
【０１１８】
（ａ）プライマリーラベリング
プライマリーラベリングは、ＲＣＡにおけるローリングサークル複製時に、蛍光ヌクレオチド、ビオチニル化ヌクレオチド、ジゴキシゲニン含有ヌクレオチド、またはブロモデオキシウリジンのようなラベルされている部分を包含させることからなる。例えば、シアニン色素ＵＴＰアナログ（Yu et al. (1994)）を１００ヌクレオチド毎に４アナログの割合で包含させることができる。インサイチュで増幅された核酸を検出する好ましい方法は、増幅時のＤＮＡをＢｒｄＵｒｄでラベルし、次いで包含されたＢＵＤＲをビオチニル化抗−ＢＵＤＲ抗体と結合させ（Zymed Labs, San Francisco, CA）、その後ビオチン部分をストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（Life Sciences, Inc.）と結合させ、最後に、フルオレセイン−チラミド（DuPont de Nemours & Co., Medical Products Dept.）を用いて蛍光を発生させることである。
【０１１９】
（ｂ）検出プローブを用いるセカンダリーラベリング
セカンダリーラベリングは、増幅ＤＮＡまたはＲＮＡを検出する検出プローブと称される適当な分子プローブを用いることからなる。例えば、増幅標的サークルは、検出タグと称される既知の任意の配列のいくつかの繰り返しを含有するように設計することができる。セカンダリーハイブリダイゼーション工程を用いて、検出プローブをこれらの検出タグに結合させることができる。この検出プローブは、上記のように、例えば酵素、蛍光分子、または放射性同位体を用いてラベルすることができる。増幅標的サークル当たり３つの検出タグ、ならびに、各検出プローブ当たり４つの蛍光部分を用いることにより、ＴＳ−ＤＮＡ中の各増幅標的サークル繰り返し部分に関して１２までの蛍光シグナル得ることができ、ＲＣＡによって増幅された各増幅標的サークルに関して１２，０００までの蛍光部分を生じさせることができる。
【０１２０】
（ｃ）アレイ検出の多重化およびハイブリダイゼーション
異なる増幅標的サークルの組を用いて、ＲＣＡは簡単に多重化される。ここに、各組は、特有の標的に結合するよう設計された異なる標的プローブ配列を有する。各標的に関して設計された標的プローブ配列は異なっているが、プライマー相補部分は変化しないままであってよく、したがってローリングサークル複製用のプライマーはすべての標的に関して同じままであり得ることに注意。ＲＣＡによって生じるＴＳ−ＤＮＡ分子は分子量が大きく、複雑さは小さい；この複雑さとは、増幅標的サークルの長さである。固形支持体中の固定された位置に与えられたＴＳ−ＤＮＡを捕獲するための２つの代替の方法がある。１つは増幅標的サークルのスペーサー領域内に、特有の増幅標的サークルそれぞれに関して特有のアドレスタグ配列を含ませることである。与えられた増幅標的サークルから生じたＴＳ−ＤＮＡは、それゆえ、特異的アドレスタグ配列に相当する配列を含有する。第二の好ましい代替方法は、ＴＳ−ＤＮＡ上に存在する標的配列をアドレスタグとして使用することである。
【０１２１】
（ｄ）コンビナトリアル（組み合わせの）多色コーディング
好ましい型の多重検出には、ラベルの組み合わせの使用が含まれ、ここにこのラベルは異なる波長の蛍光を発するか、あるいは異なる色を呈する。ハイブリダイゼーションプローブの検出に関する蛍光の利点の１つは、いくつかの標的が同一サンプル中で同時に視覚化できることである。組み合わせのストラテジーを用いて、スペクトルによって分割可能なフルオロフォアの数より多数の標的を識別できる。組み合わせのラベリングは、プローブ蛍光が完全に不存在（−）であるか、単位量で存在（＋）するため、多重形式でプローブをラベルする最も単純な方法を提供する；したがってイメージ分析はより自動化しやすく、多数の実験上の人為操作、例えば蛍光の示差光退色および励起源パワースペクトルの変化の作用が回避される。
【０１２２】
ラベルの組み合わせは、異なる検出プローブを同定し、ならびに拡張して、これらの検出プローブが結合する異なる分析物を同定するためのコードを確立する。このラベリング方法はコンビナトリアル多色コーディング（Combinatorial Multicolor Coding (CMC)）と称される。このようなコーディングは Speicher et al., Nature Genetics 12:368-375 (1996) に記載されている。コンビナトリアル多色コーディングには、組み合わされた場合に別々に検出可能な任意の数のラベルを用いることができる。２、３、４、５、または６ラベルを組み合わせて用いるのが好ましい。６ラベルを用いるのが最も好ましい。用いるラベルの数は、式：２Ｎ−１（式中、Ｎはラベルの数）にしたがって形成可能な特有のラベル組み合わせ数を確立する。この式にしたがって、２ラベルは３のラベル組み合わせを形成し、３ラベルは７のラベル組み合わせを形成し、４ラベルは１５のラベル組み合わせを形成し、５ラベルは３１のラベル組み合わせを形成し、ならびに６ラベルは６３のラベル組み合わせを形成する。
【０１２３】
Speicher et al. は、すべての可能な蛍光ペアの高度な識別を提供する、１セットの蛍光および、スペクトル間隔３５０〜７７０ｎｍを横切って区切られた対応する光学フィルターを記載している。コンビナトリアル多色コーディングに関して好ましいこの蛍光セットは、４'−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、およびシアニン色素、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７である。この好ましいセットに任意のサブセットを用いることもでき、この場合より少ない組み合わせが必要とされる。これらの蛍光に関する吸光および発光最大はそれぞれ：ＤＡＰＩ（３５０ｎｍ；４５６ｎｍ）、ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ；６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）およびＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）である。これらの蛍光の、励起および発光スペクトル、消光率および収量は、Ernst et al., Cytometry 10:3-10 (1989), Mujumdar et al., Cytometry 10:11-19 (1989), Yu, Nucleic Acids Res. 22:3226-3232 (1994),
および Waggoner, Meth. Enzymology 246:362-373 (1995) に記載されている。これらの蛍光はすべて、７５Ｗ Xenon arc. で励起可能である。
【０１２４】
２．さらなる増幅
セカンダリーＤＮＡ鎖置換は、ＴＳ−ＤＮＡを増幅する別の方法である。セカンダリーＤＮＡ鎖置換は、セカンダリーＤＮＡ鎖置換プライマーをＴＳ−ＤＮＡとハイブリダイズさせ、ＤＮＡポリメラーゼがこれらのプライムされた部位からＤＮＡを合成するのを可能にすることによって達成される。セカンダリーＤＮＡ鎖置換の産物は、セカンダリー直列型配列ＤＮＡまたはＴＳ−ＤＮＡ−２と称される。セカンダリーＤＮＡ鎖置換および鎖置換カスケード増幅は米国特許第５，８５４，０３３号およびＷＯ ９７／１９１９３に記載されている。
【０１２５】
実施例
実施例１
この実施例は、レポーター結合プライマーとして用いられる抗体−ＤＮＡコンジュゲートの構築および特徴付けを示す。
【０１２６】
オリゴヌクレオチド
用いるすべてのオリゴヌクレオチドは、Perseptive Biosystems Expedite DNA 合成装置で合成し、逆相ＨＰＬＣによって精製した。環状ＤＮＡｓは上記（４）のように構築した。コンジュゲートローリングサークル複製プライマー：５' チオール−ＧＴＡ ＣＣＡ ＴＣＡ ＴＡＴ ＡＴＧ ＴＣＣ ＧＴＧ ＣＴＡ ＧＡＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＡＧＴ ＴＡＣ Ａ−３'；増幅標的サークルＤＮＡ：５'−ＴＡＧ ＣＡＣ ＧＧＡ ＣＡＴ ＡＴＡ ＴＧＡ ＴＧＧ ＴＡＣ ＣＧＣ ＡＧＴ ＡＴＧ ＡＧＴ ＡＴＣ ＴＣＣ ＴＡＴ ＣＡＣ ＴＡＣ ＴＡＡ ＧＴＧ ＧＡＡ ＧＡＡ ＡＴＧ ＴＡＡ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＴ ＴＣ−３'；検出プローブ−５' Ｃｙ３ ＴＡＴ ＡＴＧ ＡＴＧ ＧＴＡ ＣＣＧ ＣＡＧ Ｃｙ３ ３'，５' Ｃｙ３ ＴＧＡ ＧＴＡ ＴＣＴ ＣＣＴ ＡＴＧ ＡＣＴ Ｃｙ３ ３'，５' Ｃｙ３ ＴＡＡ ＧＴＧ ＧＡＡ ＧＡＡ ＡＴＧ ＴＡＡ Ｃｙ３ ３。
【０１２７】
抗体−ＤＮＡコンジュゲート作成
抗体を、ＰＤ−１０カラム（Amersham-Pharmacia Biotech）でのクロマトグラフィーにより、５０ｍＭ リン酸ナトリウムｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡにバッファー交換した。脱塩した抗体（４１nmoles）を、暗中、窒素下、３７℃で３０分間、次いで室温で３０分間、１０倍モル過剰のスルホ−ＧＭＢＳ（Pierce）で処理した。未反応のスルホ−ＧＭＢＳは、リン酸ナトリウムｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＰＤ−１０カラムでのクロマトグラフィーで除去した。次いで抗体を４℃にて Centricon ＹＭ−３０で濃縮した。抗体当たりのマレイミドの数は、Ellman 試薬（Pierce）を用い、活性化抗体によるベータ−メルカプトエタノールの滴定にしたがってスルフヒドリルを測定することによって測定した。２８．１nmoles のスルホ−ＧＭＢＳ活性化抗体および１４２nmoles の５' チオールオリゴヌクレオチドを、８２５マイクロリットル容量中、室温で２時間、次いで４℃で一晩、コンジュゲートした。オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされた抗体は Q-Sepharose（Amersham Pharmacia Biotech）でのアニオン交換クロマトグラフィーにより、塩濃度勾配を用いて精製した（図２）。コンジュゲートを含有するフラクションをプールし、４℃で Superdex-200（Pharmacia）でのサイズ排除クロマトグラフィーに付し、遊離のオリゴヌクレオチドを除去した（図３）。
【０１２８】
拮抗ＥＬＩＳＡアッセイを行い、コンジュゲートが同族抗原に結合する能力を評価した。これらのアッセイでは、適合する非コンジュゲートおよびＤＮＡ−コンジュゲート抗体を、抗原の結合に対するレポーター抗体と拮抗するその能力に関し、並行して評価した。簡単には：マルチウェルプレート（Nunc Maxisorp）を、３７℃で一晩、０．１Ｍ ＮａＣＯ３中、２マイクロｇ／ｍＬの捕獲抗体（BiosPacific ヤギポリクローナル抗−ＩｇＥ）でコーティングした。この抗体溶液をバックグラウンドブロッキング溶液（ＴＢＳ中、５％ 粉末脱脂乳／０．０５％ ＮａＮ３）で置換し、３７℃で１時間インキュベートした。ＴＢＳ／０．０５％ Tween20 で４回洗浄してブロッカーを除去し、精製されたヒトＩｇＥ（Fitzgerald 多発性骨髄腫細胞由来）をＴＢＳ中５００ｎｇ／ｍＬで加え、３７℃で３０分間インキュベートした。ＴＢＳ／０．０５％ Tween 20 で４回洗浄して、ＩｇＥを除去し、次いであらかじめ作成しておいた、拮抗物質（非コンジュゲート抗−ＩｇＥまたはＤＮＡ〜抗−ＩｇＥコンジュゲート）およびレポーター（ビオチニル化抗−ＩｇＥ、PharMingen）からなる抗−ＩｇＥ混合物を添加した。ビオチニル化抗−ＩｇＥは固定レベルで保持したが、拮抗物質抗−ＩｇＥは種々のレベルで存在した。抗−ＩｇＥ混合物をウェル中、３７℃で３０分インキュベートした。ＴＢＳ／０．０５％ Tween 20 で３回洗浄した後、NeutrAvidin −アルカリホスファターゼ（Pierce Chemical Co.）と３７℃で３０分インキュベートすることによって、残りのビオチニル化抗−ＩｇＥを検出した。次いでウェルをＴＢＳ／０．０５％ Tween 20 で３回洗浄し、アルカリホスファターゼ基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェイトキット、Pierce Chemical Co.）とインキュベートした。呈色反応は１５分間進め、４０５ｎｍの吸光度を BioMek ＦＬ６００プレートリーダーで読み取った。それぞれ、タンパク質１モル当たり約３オリゴヌクレオチドとカップリングされたコンジュゲート抗体は、抗原に関して、非コンジュゲート型とほぼ等価な親和力を示した（図４）。
【０１２９】
ＲＣＡ反応を行い、コンジュゲートがプライマーとして働く能力を評価した。ＲＣＡ反応は、２０ｍＭ トリス−酢酸、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、５０ｍＭ 酢酸カリウム、および１ｍＭ ＤＴＴを含有する２５μＬバッファー（ｐＨ７．９）中、５ｎＭ プライマーまたはプライマー−コンジュゲート抗体、１０ｎＭ サークル、大腸菌ＳＳＢ（Promega）２００ｎｇ、Ｔ７ポリメラーゼ（USB）０．１２５ユニット、０．４ｍＭ 各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、および０．４ｍＭ [α−３２Ｐ]ＴＴＰ（３００−６００ cpm/pmol）を含有していた。添加は、氷上で行い、次いで３７℃に移した。ＲＣＡ産物は、指定された時間で、ＤＥ８１フィルター上にスポットすることにより定量した。抗体−プライマーコンジュゲートは、相補的サークルＤＮＡの存在下、等モル量の非コンジュゲートプライマーより多くのＲＣＡ反応産物を生じ（図５）、各抗体が１以上のプライマーとコンジュゲートされている観察と一致した。いずれの型のプライマーも、相補的サークルの不存在下、または非相補的サークルの存在下では、検出可能な産物を生じなかった。
【０１３０】
実施例２
この実施例は、ＥＬＩＳＡ形式における分析物の検出のための、レポーター抗体プライマー／抗体−ＤＮＡコンジュゲートの使用を示す。免疫ＲＣＡによる検出は、慣用の抗体−酵素コンジュゲートを用いる検出と比較した場合、より優れた感受性およびダイナミックレンジを有することが示されている。
【０１３１】
ＥＬＩＳＡアッセイ。９６ウェルプレート（Nunc Maxisorb）を、ウェル当たり２μｇ／ｍＬ ヤギポリクローナル抗−ヒトＩｇＥ １００μＬと、３７℃で２時間、次いで４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳ／０．０５％ Tween 20 １００μＬでプレートを３回洗浄し、次いで３７℃で２時間、５％ 乾燥脱脂乳でブロックした。プレートをＴＢＳ／０．０５％ Tween 20 で再洗浄した後、ＩｇＥ分析物を１００μＬ容量中種々の濃度で添加した。３７℃で３０分インキュベートした後、プレートをＴＢＳ／０．０５％ Tween 20 で３回洗浄した。慣用的ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、抗−ヒトＩｇＥ−アルカリホスファターゼコンジュゲートを各ウェルに加え、３７℃で３０分インキュベートする。プレートをＴＢＳ／０．０５％ Tween 20 で洗浄し、アルカリホスファターゼ基質ＭＵＰを加え、BioMek ＦＬ６００プレートリーダーにおいて、励起波長３６０ｎｍおよび発光波長４６０ｎｍで、２０分後の蛍光レベルを読み取った。免疫ＲＣＡ手順において、抗−ヒトＩｇＥ−ＤＮＡコンジュゲート（５ｎｇ／μＬ）を６０μＬ容量で各ウェルに加え、３７℃で３０分インキュベートした。プレートをＴＢＳ／０．０５％ Tween 20 １００μＬで３回洗浄し、φ２９バッファー（２５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、１ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、０．７５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．２５ｍＭ ＦＩＴＣ−１２−ｄＵＴＰ）６０μＬ中のサークル２ＤＮＡ（１７０ｎＭ）を各ウェルに加え、３７℃で３０分インキュベートした。１．５μＬのφ２９ＤＮＡポリメラーゼ（０．４Ｕ／μＬ）を加えてＲＣＡ反応を開始させ、３７℃で３０分継続した。ＲＣＡ産物は、抗−ＦＩＴＣ−アルカリホスファターゼコンジュゲートを加えることによって検出した。３７℃で３０分インキュベートした後、プレートをＴＢＳ／０．０５％ Tween 20 １００μＬで３回洗浄し、ＭＵＰ基質を加え、２０分後に蛍光レベルを読んだ。図６に示されるように、免疫ＲＣＡアッセイは慣用のアッセイより広い範囲のＩｇＥ濃度にわたって容量応答を示した。さらに、免疫ＲＣＡアッセイは、より増幅量が少ないリニア様式においてさえ、慣用のＥＬＩＳＡアッセイによって検出される約２桁低い振り幅のＩｇＥレベルを検出可能であった。
【０１３２】
実施例３
この実施例は、微粒子形式における、分析物の検出のための、レセプター抗体プライマー／抗体−ＤＮＡコンジュゲートの使用を示す。ヒトＩｇＥがまた、試験分析物として選択されるが、このサンドイッチアッセイは、アビジンコーティングされた磁性微粒子およびビオチニル化ポリクローナル抗−ヒトＩｇＥ捕獲抗体を用いて行った。簡単には、ストレプトアビジンコーティングされた磁性ビーズ（Bangs Laboratories）をＴＢＳ中の１６μｇ／ｍＬビオチニル化ポリクローナル抗−ヒトＩｇＥ（Pharmingen）の溶液でコーティングし、ＴＢＳ／０．０５％ Tween 20 中で３回洗浄し、２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡで一晩ブロックした。ビーズをＴＢＳ中のヒトＩｇＥ（２５ｎｇ／ｍＬ）と、室温で２０分間インキュベートし、ＴＢＳ／０．０５％ Tween 20 中で３回洗浄した。慣用の抗−ＩｇＥ−アルカリホスファターゼコンジュゲートまたは免疫ＲＣＡコンジュゲートを用いるＩｇＥの検出はＥＬＩＳＡアッセイに関して上に記載されるように行った。図７により、抗−ＩｇＥ−ＤＮＡコンジュゲートを用いる免疫ＲＣＡが、微粒子に結合した適度な濃度のＩｇＥを用いて強いシグナルを与えることを示すことができる。抗−ＩｇＥ−アルカリホスファターゼコンジュゲートの検出では、同量のインプットＩｇＥ（２５ｎｇ ＩｇＥ／ｍＬ）を用いる免疫ＲＣＡアッセイにより、約７５分の１のシグナルしか提供されなかった。
【０１３３】
実施例４
この実施例は、モデル系としての、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の検出に用いられるマイクロスポット上の固相検出に関する免疫ＲＣＡの妥当性を示す。この適用では、免疫ＲＣＡは間接的サンドイッチアッセイ形式で構成された。マウスモノクローナル抗−ＰＳＡ抗体は第二の部分の免疫−サンドイッチ複合体を形成するのに用いられる。この複合体は、ＲＣＡ反応をプライムする配列を含有するオリゴヌクレオチドとコンジュゲートされたポリクローナルウサギ抗−マウスＩｇＧ抗体を用いて検出された。
【０１３４】
マイクロスポットの調製。クリーンなガラススライドを、９５％ エタノールｐＨ５．５中のメルカプトプロピルトリメトキシシラン（１％ vol/vol）の溶液に１時間浸漬することによって化学的に官能化した。スライドを９５％エタノールで２分間すすぎ、窒素下で乾燥し、１２０℃で４時間加熱して硬化した。チオール−誘導化スライドは、１％ ジメチルホルムアミド、９９％ エタノール中、室温で１時間、ヘテロ二官能性架橋剤（クロスリンカー）、スルホ−ＧＭＢＳ（Pierce）の０．５ｍｇ／ｍＬ溶液に浸漬することによって活性化した。スライドをエタノールですすぎ、窒素下で乾燥し、使用するまで減圧乾燥器内に保存した。０．５ｍｇ／ｍＬ溶液０．２μＬをグリッドパターン内にピペッティングすることによって、ヤギ抗−ＰＳＡポリクローナル抗体（BioSpacifics）をスライドへスポットした。ハンドスポットアレイを２％ ＢＳＡ（プロテアーゼを含まない）でブロックし、空気乾燥し、使用するまで、窒素下４℃で保存した。使用直前に、ＰＢＳ ５０ｍＬ中、室温で２分間、アレイを再水和した。
【０１３５】
抗体捕獲。精製されたヒトＰＳＡ（BioSpacifics）をＰＢＳ中で所望の濃度に希釈した。ＰＳＡ希釈物１０μＬをカバーガラス（Hybrislip, Grace）にスポットし、次いでこれを、スライド上のアレイの領域にかぶせて裏返した。このスライドを、加湿チャンバー中、３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／０．０５％ Tween 20 中で２分間２回洗浄し、タップ乾燥した。ＰＢＳ中のモノクローナル抗−ＰＳＡ抗体中の１：５，０００希釈物１０μＬをアレイに加えた。このスライドを加湿チャンバー中、３７℃で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ／０．０５％ Tween 20 中で２分間２回洗浄し、タップ乾燥した。最後にウサギ抗−マウスＩｇＧ−ＤＮＡコンジュゲート（ＰＢＳ中１０ｎｇ／μＬ）をアレイに加え、加湿チャンバー中、３７℃で３０分間インキュベートした。スライドをＰＢＳ／０．０５％ Tween 20 中で２分間２回洗浄し、タップ乾燥した。
【０１３６】
ＲＣＡ反応。１０μＬφ２９バッファー（２５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ）中のサークル１ＤＮＡ（２００ｎＭ）をアレイに加え、４５℃で３０分間インキュベートした。ＲＣＡ反応混合物（２ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、１．５ｍＭ ｄＴＴＰ、０．５ｍＭ ビオチン−１６−ｄＵＴＰ ｄＮＴＰｓ、φ２９バッファー、０．４Ｕ／μＬφ２９ポリメラーゼ）１０μＬをアレイに加え、３７℃で３０分インキュベートした。このスライドを、２Ｘ ＳＳＣ／０．０５％ Tween 20 中、３７℃で２分間２回洗浄し、２Ｘ ＳＳＣ／０．０５％ Tween 20 中、室温で２分間２回洗浄し、タップ乾燥した（tapped dry）。２Ｘ ＳＳＣ、０．０５％ Tween 20 中の検出物質オリゴ混合物１０マイクロリットルをアレイに加え、３７℃で３０分間インキュベートした。スライドを２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ Tween 20 中で１分間４回洗浄した。ＣＡＣＨＥＴ溶液（１ｍｇ／ｍＬ Neutravidin、２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ Tween 20、０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．５ｍｇ／ｍＬ 超音波処理されたニシン精子ＤＮＡ）１０μＬをアレイに加え、３７℃で１５分インキュベートした。このスライドを室温で攪拌しながら２Ｘ ＳＳＣ、０．０５％ Tween 20 で５分洗浄した後、２Ｘ ＳＳＣで洗浄した。スライドを窒素下で乾燥し、スライドのアレイ部分を Prolong Antifade（Molecular Probes）でカバーした。蛍光イメージングは、ＣＣＤイメージング系および１００Ｘ対物レンズを備えた Zeiss エピフルオレセンス顕微鏡にて行った。蛍光定量はＩＰＬａｂソフトウェアを用いて行った。顕微鏡に備えられたＣＣＤカメラでの蛍光の定量は、シグナルが少なくとも２対数のＰＳＡ濃度にわたってリニアであること（図８）、および０．１ｐｇ／ｍＬ ＰＳＡ（３００zeptomoles）でも検出可能であることを示した。この検出レベルは、ＰＳＡに関する標準的免疫アッセイより約３桁の振り幅で大きな感受性である。この実施例においてコンジュゲートとして使用される抗体は、ウサギ抗−マウスＩｇＧポリクローナル抗体であり；この試薬は「共通の」コンジュゲートとして機能し、任意のマウスモノクローナル抗体を好感度で検出できる。
【０１３７】
実施例５
この実施例では、ピン−ツール型マイクロアレイ作成ロボットを用い、ガラススライドにスポットされたポリクローナルヤギ抗−ヒトＩｇＥ抗体のマイクロアレイでの、サンドイッチ形式の免疫ＲＣＡの使用を示す。これらのマイクロアレイでは、約０．５ｎＬの抗体溶液を各スポットに配置し、ここにスポットは約２００μｍの直径を有し、スポットからスポットの間隔は２５０μｍであった。抗−ＩｇＥマイクロアレイは、ヒトＩｇＥとインキュベートされ、結合した抗原は、ビオチニル化された抗−ヒトＩｇＥ抗体および、ＲＣＡプライム配列を含有するオリゴヌクレオチドとコンジュゲートされた抗−ビオチンモノクローナル抗体を用いて検出された。
【０１３８】
マイクロアレイの調製。チオール−シランを用いて官能化されたガラススライドは上記のように調製した。チオールで誘導されたスライドは、０．５ｍｇ／ｍＬ スルホ−ＧＭＢＳ（Pierce）、１％ ジメチルホルムアミド、９９％ エタノールの溶液に室温で１時間浸漬することによって活性化した。スライドをエタノールですすぎ、窒素下で乾燥し、使用するまで減圧乾燥器中に保存した。ピン−ツール型マイクロアレイ作成装置（GeneMachines）を用いて、ポリクローナルヤギ抗−ヒトＩｇＥ（BioSpacifics ０．５ｍｇ／ｍＬ）の溶液をスライドにスポットした。アレイを２％ ＢＳＡ（プロテアーゼを含まない）でブロックし、空気乾燥し、使用するまで窒素下４℃で保存した。
【０１３９】
抗原捕獲。５０ｍＭ グリシン中の２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ溶液（ｐＨ９．０）５０μＬ容量を加え、加湿チャンバー中３７℃で１時間インキュベートし、各マイクロアレイをブロックした。ブロック後、１ｘ ＰＢＳ／０．０５％ Tween 20 を含有するコプリンジャー（coplin jar）中にスライドを浸漬し、このスライドを２分間洗浄し、次いで１ｘ ＰＢＳで１分間洗浄することにより２回洗浄した。１０μＬ容量のヒト血清を各マイクロアレイに直ちに加え、加湿チャンバー中、３７℃で３０分インキュベートした後、ＰＢＳ／Tween 20 およびＰＢＳで上記のように洗浄した。
【０１４０】
免疫ＲＣＡ。BiotinTag Micro Biotinylation キット（Sigma）を用い、ヤギ抗−ヒトＩｇＥ（BiosPacigic, Inc.）をビオチンでラベルした。ＰＢＳ、０．０５％ Tween 20、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、２．５ｎｇ／μＬの抗体１０μＬを各アレイに適用し、加湿チャンバー中３７℃で３０分間インキュベートした。スライドをＰＢＳ、０．０５％ Tween 20 中で２分間２回洗浄した。プライマー１にコンジュゲートされたマウスモノクローナル抗−ビオチン抗体をＰＢＳ、０．０５％ Tween 20、１ｍＭ ＥＤＴＡ中の５０ｎＭ サークル１と３７℃で３０分アニーリングした。１０μＬを各アレイにアプライし、加湿チャンバー中３７℃で３０分インキュベートし、その後、スライドを２回洗浄した。次いでＴ７天然ＤＮＡポリメラーゼ（０．０１ユニット／μＬ）、１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．０４ｍｇ／ｍＬ ＳＳＢ、２０ｍＭ トリス ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２および２５ｍＭ ＮａＣｌを含有する反応溶液２０μＬ容量を各マイクロアレイに加えた。このスライドを３７℃で４５分インキュベートし、スライドを２Ｘ ＳＳＣ／０．０５％ Tween 20 溶液中、室温で洗浄し、反応をストップした。０．５μＭ ＤＮＡ修飾物の２０μＬ溶液を各アレイに加え、ＲＣＡ産物と３７℃で３０分ハイブリダイズさせた。スライドを室温の２Ｘ ＳＳＣ中で洗浄し、スピン乾燥した。General Scanning Luminomics 5000 マイクロアレイスキャナーにてスライドをスキャンし、QuantArray ソフトウェアを用いて蛍光を定量した。
【０１４１】
結果（図９）は、免疫ＲＣＡが高い感受性（１ｐｇ／ｍＬまで）、広いダイナミックレンジ（５対数）、および優秀なスポットからスポットへの再現性を有することを示す。最近、マイクロアレイに基づく免疫アッセイにおいて、アルカリホスファターゼコンジュゲートおよび検出用の蛍光基質ＥＬＦを用いることが報告された（Mendoza, et al., Biotechniques 27:778-788 (1999)）。ＥＬＦに基づくアッセイは、シグナルを読み取るのに、特別に構築されたＣＣＤに基づくカメラが必要であり、約１０ｎｇ／ｍＬの感受性が達成された。別の報告では、近赤外線色素でラベルされた抗体を用いて、マイクロアレイ上のＩｇＧサブクラスが検出された（Silzel, et al., Clin. Chem. 44: 2036-2043 (1998)）；この系はまた、特別に設計されたイメージング系を必要とし、約１５ｎｇ／ｍＬの検出限界を達成した。対照的に、免疫ＲＣＡによるシグナル増幅はｐｇ／ｍＬレンジの感受性を与え、このアッセイ結果を一般に入手可能なマイクロアレイスキャナーで読み取ることを可能にする。免疫ＲＣＡはまた、優秀な臨床感受性および特異性を有して、マイクロアレイ上のアレルゲン特異的ＩｇＥｓを検出するのに用いることができる。このためにコンジュゲートとして用いられた抗体はモノクローナル抗−ビオチン抗体であった。この試薬を用いて、任意のビオチニル化されたポリクローナルまたはモノクローナル抗体、ならびに、ビオチニル化可能である任意の他のタンパク質、核酸、または小分子を検出できる。
【０１４２】
実施例６
この実施例は、開示されている方法の単一分子カウント様式における、同時の２タンパク質の検出を示す。
【０１４３】
捕獲スライドの調製。スライドを、４−アミノブチル−ジメチルメトキシシランでコーティングし、１，４−フェニレン−ジイソチオシアネートで誘導した。アビジン捕獲試薬、オリゴヌクレオチド ５'−ＮＨ２−ＧＧ１８Ｇ−ビオチン−３'、および抗−ジゴキシゲニンＩｇＧ捕獲試薬、ジゴキシゲニン−スクシニル−ε−アミノカプロン酸水素化物（各５μＭ濃度）の混合物を、アレイ形式において、活性化されたスライド表面にスポットした（８−１０スポット／アレイ）。化学カップリングは２時間進行させた。このスライドを、０．５ｍＭ グリシン、ｐＨ９．５中で２回洗浄し、次いで３７℃で３０分間グリシン溶液中に置き、未反応の官能基をブロックした。このスライドを５０ｍＭ グリシン（ｐｈ９．５）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３％ ウシ血清アルブミン、０．１％ 超音波処理されたニシン精子ＤＮＡ、０．２％ ＮａＮ３中、３７℃で１時間さらにインキュベートし、ＰＢＳ、０．１％ Tween 20 中、室温で３分間洗浄した。その後このスライドを乾燥し、使用するまで４℃で保存した。
【０１４４】
捕獲スライドへの抗原の結合。種々の濃度のアビジンおよびヒツジ抗ジゴキシゲニンＩｇＧを、単独で、あるいは規定のモル比で正常ヒト血清中に注入した。注入された血清（１．０μＬ）を捕獲アレイにアプライし、スライドを湿ったチャンバー中、３７℃で３０分インキュベートした。次いでこのスライドをＰＢＳ／Tween20 中で２回洗浄し、空気乾燥した。７．５ｎＭ ウサギ抗−アビジン−プライマー−１コンジュゲートおよび７．５ｎＭ ウサギ抗−ヒツジＩｇＧ抗体−プライマー−２コンジュゲートの混合物５μＬを各アレイスポットに適用し、３７℃で２．５時間までインキュベートした。このスライドを８回（各１分）洗浄し、空気乾燥した。２ｘＳＳＣ、０．１％ Tween 20、３％ ＢＳＡ、０．１％ 超音波処理ニシン精子ＤＮＡ中の２環状プローブ（サークル１およびサークル２）の０．２μＭ 溶液５μＬを各スポットにアプライした。３７℃２０分ハイブリダイズした後、このスライドを３７℃で５分間２ｘＳＳＣ、０．１％ Tween-20 で洗浄し、空気乾燥した。
【０１４５】
ＲＣＡ−ＣＡＣＨＥＴ反応。ＲＣＡ反応混合物（５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ の各ｄＮＴＰ、１ｍＭ ＤＴＴ、ＳＳＢおよび０．５ユニット／μＬ Sequenase）５μＬを各スポットにアプライし、このスライドを３７℃で１５分間インキュベートした。スライドを洗浄後、これを空気乾燥し、０．２μＭの二重ラベル（蛍光＋２，４ＤＮＰ）された検出プローブの溶液５μＬを各アレイにアプライした。スライドは加湿チャンバー中、３７℃で３０分インキュベートし、次いで５回洗浄し、空気乾燥した。ＲＣＡ産物を蛍光の点源中に分解し、単一抗原−抗体複合体を数えることを可能にするために、ＰＢＳ中の３３ｎＭ ヒツジ抗−ＤＮＰ ＩｇＭを各アレイスポットに加え、スライドを３７℃で４５分間インキュベートし、室温で３分間、２ｘＳＳＣ中で洗浄し、次いで空気乾燥した。延長アンチフェード（antifade）溶液（Molecular Probes）をスライドにアプライし、このスライドを２０ｘ２０ｍｍカバーガラスで覆った。６３Ｘ対物レンズを用いて別々のＦＩＴＣおよびＣｙ３フルオロフォア顕微鏡イメージを捕らえ、各フィールド内の個々のＲＣＡ産物を手動でカウントした。ＦＩＴＣおよびＣｙ３イメージは電子的にマージされ、ＲＮＡシグナルは緑および赤に擬似呈色（pseudo-colored）させた。別個の蛍光シグナルは純粋なフルオレセインまたは純粋なＣｙ３スペクトルを有し、混合されたスペクトル（黄色）を有するシグナルが存在しないことにより、各ドットが単一の抗体−抗原複合体によって生じたことが示された。アビジン（明灰色）およびヒツジ抗−ジゴキシゲニンＩｇＧ（暗灰色）シグナルの定量により、明／暗シグナルの比が、２タンパク質抗原の既知の入力比と密に関連することが示され（図１０）、抗体−抗原複合体およびシグナル間の１対１対応がさらに示唆された。
【０１４６】
この実施例は、免疫ＲＣＡがマイクロアレイ適用に理想的に適していることを示す。完全等温性ＲＣＡ反応時に、得られた増幅ＤＮＡ分子は抗体−抗原複合体に共有結合したままである。マイクロアレイにおいて、このプロセスは、非増幅シグナル検出アプローチに対し、検出可能な蛍光シグナルに関する約３対数の増加を生じる。ＲＣＡのはっきりした特徴は、単一ＤＮＡレポーター分子から生じるシグナルを正確にローカライズする能力であり、したがって固形表面上の個別の認識イベントの視覚化を可能にする。ＲＣＡの長い一本鎖ＤＮＡ産物を修飾し、レポーターフルオロフォアおよびハプテン、例えば２，４−ジニトロフェノールでラベルされた多数の相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた場合、すべてのフルオロフォアは光の点源中に分解することが可能である。分子シグナルの数が極端に多い場合、マイクロアレイのスポット由来のシグナルは、凝集した蛍光を用いて読み取ることができる。しかしながら、表面結合抗原の数がより少ない場合、シグナルは別々の単一分子カウントとしてスコアでき、アトモル以下の分析物が視覚化できる。免疫ＲＣＡをマイクロアレイにて行うと、非常に広いダイナミックレンジを有するアッセイが提供され；単一分子カウントおよびトータル蛍光出力を組み合わせることにより６〜７対数のダイナミックレンジが示される。
【０１４７】
実施例７
この実施例は、２サンプル中のモデルタンパク質（ＩｇＥ）の相対濃度の測定を示す。
【０１４８】
リニアＲＣＡを介する２色発現レベルのプロファイル化では、チオールシラン化プラスＧＭＢＳでの処置によって活性化されたガラススライド上のポリクローナルヤギ抗−ヒトＩｇＥ（０．５ｍｇ／ｍＬ、BiosPacific）捕獲抗体でマイクロアレイをプリントした。２コンジュゲートのＭＡｂ抗−ＩｇＥ（BiosPacific、クローン番号Ａ３７０２００４７Ｐ）を構築した。第一のコンジュゲートに関して、抗体をスルホ−ＧＭＢＳで活性化し、次いで５'チオールＰｒ２（ＧＴＡ ＣＣＡ ＴＣＡ ＴＡＴ ＡＴＧ ＴＣＣ ＧＴＧ ＣＴＡ ＧＡＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＡＧＴ ＴＡＣ Ａ）と反応させた。第二のコンジュゲートに関して、抗体をＥＺ−リンク スルホＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Pierce Chemical Co.）を用いてビオチニル化した。また、抗体をスルホ−ＧＭＢＳで活性化し、次いで５'チオールＰｒ１（ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＡＡＡ ＣＡＣ ＡＧＣ ＴＧＡ ＧＧＡ ＴＡＧ ＧＡＣ ＡＴ）と反応させることによって、ＭＡｂ抗−ビオチンのコンジュゲート（Jackson Immunochemicals）を構築した。抗体−抗原複合体は、別個の反応において、ビオチン〜ＭＡｂ 抗−ＩｇＥを５０ｎｇ／ｍＬのＩｇＥと１チューブ内で、ならびにＰｒ２〜ＭＡｂ 抗−ＩｇＥを５００、５０、５および０ｎｇ／ｍＬ ＩｇＥと第二のチューブ内で、室温で１時間インキュベートすることによってプレ形成させた。適当な抗体−抗原複合体を次いで混合し、２０μＬ混合物をアレイ毎にアプライした。プレ形成された複合体の捕獲は、３７℃で３０分行った。次いで、２００ｎＭ サークル１、２００ｎＭ サークル２、および２．５ｎｇ／μＬ Ｐｒ１〜抗−ビオチンコンジュゲートを含有する混合物１０μＬを各アレイにアプライし、３７℃で３０分インキュベートした。次いでこのスライドを、１ｘＰＢＳ／０．０５％ Tween 20 中で２ｘ２'洗浄した。次いで、リニアＲＣＡ反応混合物（２０ｍＭ トリス−Ｃｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ 各ｄＮＴＰ、０．５μＭの、Ｃｙ５−ラベルされた検出プローブ（サークル１用）およびＣｙ３−ラベルされた検出プローブ（サークル２用）、２９．１ｎｇ／μＬ 大腸菌ＳＳＢ（Promega）、０．０１Ｕ／μＬ Ｔ７天然ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ）、および８％ＤＭＳＯ）１０μＬを各アレイにアプライし、３７℃で４５分間インキュベートした。次いでこのスライドを１ｘＰＢＳ／０．０５％ Tween 20 中および１ｘＰＢＳ中で洗浄し、空気乾燥し、スキャンした。図１２に示されるように、Ｃｙ５蛍光強度のＣｙ３蛍光強度に対する比は２サンプル中のＩｇＥの比を反映する。
【０１４９】
２サンプル中のタンパク質相対濃度の測定は、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）をモデルとして用いてさらに例証される。種々の濃度のＰＳＡ（Biospacifics）を、ＰＢＳ／０．０５％ Tween20 中の５ｎｇ／ｕＬのビオチンまたはＦＩＴＣラベルされたモノクローナル抗−ＰＳＡと、３７℃で３０分インキュベートした。ＰＳＡ／ＦＩＴＣ−抗−ＰＳＡおよびＰＳＡ／ビオチニル化抗−ＰＳＡ複合体を次いで互いに混合し、２０ｕＬの混合物をマイクロアレイ上、３７℃で３０分インキュベートした。スライドをＰＢＳ／０．０５％ Tween20 中で２分間２回洗浄した。このスライドを２．５ｎｇ／μＬの抗−ビオチン〜プライマー１コンジュゲート、抗−ＦＩＴＣ〜プライマー２コンジュゲート、またはこの２試薬の混合物とインキュベートした。ヤギポリクローナル抗−ＰＳＡ抗体（Biospacifics、０．３ｍｇ／ｍＬ）をＧＭＢＳ活性化チオシランガラススライド上に固定することによってマイクロアレイを調製し、記載されるようにブロックした。抗体ラベリングキット（Sigma Chemical Co., St. Louis, MI）を用いてモノクローナル抗−ＰＳＡ抗体（Biospacifics）をＦＩＴＣまたはビオチンでラベルした。
【０１５０】
マイクロアレイにおいて、Ｔ７天然ＤＮＡポリメラーゼを用い、５０ｎＭの各Ｃｙ５−ラベルされたサークル１およびＣｙ３ラベルされたサークル２修飾物の存在下、リニアＲＣＡを３７℃で４５分行った。スライドを、２ＸＳＳＣ／０．０５％ Tween 20 中で２分間２回洗浄し、１ＸＳＳＣで１分間すすぎ、乾燥し、GSI Lumonics GSA5000 スキャナーにて、Ｃｙ３およびＣｙ５フルオロフォアそれぞれに関する適当なセッティングでスキャンした。図１７に示されるように、Ｃｙ５蛍光強度のＣｙ３蛍光強度に対する比は２サンプル中のＰＳＡの比を反映する。
【０１５１】
実施例８
この実施例は、複合生物学的サンプル由来の分析物を固定するための方法および組成物、およびサンプル中のその存在を測定および定量するための、開示されている方法の使用を記載する。このプロセスは本明細書中では、アレルゲンを含有するサンプルを用いて例証される。
【０１５２】
アレルゲンマイクロアレイ。クリーンなガラススライドを実施例４に記載されるようにチオールで誘導した。ネコ毛、イヌ毛、ハウスダストダニ（D. farinae および D. pteronyssinus）、およびラッカセイ（ALK-Abello）の抽出物をＰＤ−１０カラム（Pharmacia）に付して分画し、次いで Centricon ＹＭ−３フィルター（Millipore）での限外ろ過により濃縮した。活性化されたスライドへの抽出物のスポッティングはピン−ツール型マイクロアレイ作成装置（GeneMachines）を用いて行った。ヒトＩｇＥおよび５'−アミノ修飾ＲＣＡプライマーをポジティブコントロールとしてスポットした。２％ＢＳＡ（プロテアーゼを含まない）を用いてアレイをブロックし、空気乾燥し、使用するまで窒素下４℃で保存した。
【０１５３】
免疫ＲＣＡ。５０ｍＭ グリシン（ｐＨ９．０）中の２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ溶液５０μＬ容量を加え、加湿チャンバー中、３７℃で１時間インキュベートすることによって各マイクロアレイをブロックした。ブロック後、スライドをＰＢＳ、０．０５％ Tween 20 で２分間、次いでＰＢＳ中で１分間、洗浄した（２回）。各アレイにヒト血清１０μＬをすぐに加え、加湿チャンバー内、３７℃で３０分インキュベートし、ＰＢＳ、０．０５％ Tween 20 中で２回洗浄した。マウスモノクローナル抗−ＩｇＥ抗体ＤＮＡコンジュゲートを５０ｎＭ 環状ＤＮＡ（配列：５'−ＴＡＧ ＣＡＣ ＧＧＡ ＣＡＴ ＡＴＡ ＴＧＡ ＴＧＧ ＴＡＣ ＣＧＣ ＡＧＴ ＡＴＧ ＡＧＴ ＡＴＣ ＴＣＣ ＴＡＴ ＣＡＣ ＴＡＣ ＴＡＡ ＧＴＧ ＧＡＡ ＧＡＡ ＡＴＧ ＴＡＡ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＣＴ ＴＣ）と、ＰＢＳ、０．０５％ Tween 20、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、３７℃で３０分アニーリングした。１０μＬを各アレイにアプライし、加湿チャンバー内、３７℃で３０分インキュベートした。スライドをＰＢＳ、０．０５％ Tween 20 中で２分間２回洗浄した。ＲＣＡ反応および検出は、実施例５に記載されるように行った。
【０１５４】
各ウェルがテフロンマスクによって十分に分離されている１６マイクロウェル−ガラススライドにおいて免疫ＲＣＡマイクロアレイアッセイを行った。各ウェル中、１００〜４００μｍのスポットのマイクロアレイをプリントした；これらの各ウェルは、異なるサンプル、またはネガティブコントロールまたはポジティブコントロールをアッセイするのに用いられた。また、マルチウェルスライドは、１６ウェルのうち６中の抗−ＩｇＥ捕獲抗体のアレイを用いてプリントされた。このマルチウェル形式での、アレルゲンマイクロアレイに対する免疫ＲＣＡアッセイの半自動化は安価な Beckman BioMek 液体取り扱いロボットにて実行した。
【０１５５】
実施例９
この実施例は、サイトカイン検出の具体的場合に適用して、サンプル中の１以上の分析物を多重化分析するための、開示されている方法の使用を記載する。
【０１５６】
マイクロアレイは、実施例５に記載されているように、１０ウェル Erie スライド中、チオール−シラン／ＧＭＢＳ化学を用いて調製した。簡単には、５サイトカインを認識するポリクローナル抗体（抗−ｂＮＧＦ、抗−ＩＬ１ｂ、抗−ＴＮＦａ、抗−ＩＬ６および抗−ＩＬ１ａ）（R&D Systems, Minneapolis, MN）をＰＢＳ中に０．５ｍｇ／ｍＬで溶解し、マルチウェルスライドにおけるマイクロアレイ作成に使用した。このマイクロアレイをブロックし、ＰＢＳ／０．５％ Tween 中の２０ｎｇ／ｍＬを含有するサンプルと、３７℃で３０分インキュベートした。このマイクロアレイを洗浄し、２．５μｇ／ｍＬビオチニル化モノクローナル抗体（R&D Systems）を含有する溶液とインキュベートした。記載されるように、α−ビオチン／プライマー１コンジュゲートを用いるＲＣＡによってスポットを検出した。
【０１５７】
図１８に示されるように、両サイトカインに関する抗体が存在する場合、マイクロアレイにてＴＮＦおよびＩＬ１ａを同時に検出可能であった。唯一の抗体が添加された場合に同族シグナルが１つしか生じなかったことによってシグナルの特異性が示されている。
【０１５８】
記載されている特定の方法論、プロトコル、および試薬は変更することができ、開示されている発明はこれらに制限されないことが理解されよう。また、本明細書中で用いられる用語は特定の態様のみを記載するためのものであり、本発明の範囲を制限することを意図するものではなく、本発明の範囲は請求の範囲によってのみ制限されるものであることが理解されるべきである。
【０１５９】
特に明確に記載しない限り、本明細書中および請求の範囲で用いられる単数形「a」、「an」、および「the」は、複数形への言及を含むものであることが留意されなければならない。したがって、例えば、「a host cell」との言及は、このような宿主細胞の複数形を含み、「the antibody」は１またはそれ以上の抗体および当業者に既知のその等価物を表す、などである。
【０１６０】
特に規定しない限り、本明細書中で用いられるすべての技術用語および科学用語は、開示されている発明が属する分野の当業者に一般に理解されている同一の意味を有する。本明細書中に記載されているものと同様または等価な任意の方法および材料を用いて、本発明を実施または試験することができるが、好ましい方法、デバイス、および材料は記載されているものである。本明細書中に引用されている刊行物およびそれらが言及している材料は、引用により本明細書中に具体的に包含される。本明細書中のすべての記載は、本発明が、先行する発明のそのような開示内容に先立つものではないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【０１６１】
当業者であれば、本明細書中に記載されている本発明の具体的態様の多くの等価な態様を認識するか、あるいは通常の実験を用いて確認できよう。このような等価な態様は、請求の範囲に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は免疫ＲＣＡアッセイの例を示す図である。左上：オリゴヌクレオチドとコンジュゲートされた抗体からなるレポーター結合プライマーは、共有結合または分析物捕獲物質により固形表面に捕獲されている分析物と結合する。右上：増幅標的サークルは、このオリゴヌクレオチド内の相補配列とハイブリダイズする。左下：得られた複合体は洗浄され、過剰の試薬が取り除かれ、増幅標的サークルはＲＣＡによって増幅される。右下：増幅された生成物は、蛍光ラベルされたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによってインサイチュでラベルされる。
【図２】  図２はカラムフラクションに対するタンパク質（マイクログラム／ｍＬ）のグラフである。コンジュゲーション混合物は、アニオン交換カラムにロードされ、実施例１に記載の塩濃度勾配を用いて溶出された。フラクションは集められ、タンパク質含量に関してアッセイされた。タンパク質ピークはプールされ、抗体／ＤＮＡ含量に関してＵＶ分光法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアッセイされた。
【図３】  図３はカラムフラクションに対する吸光度（吸光度単位Ｘ１０−３（２６０ｎｍ））を示すグラフである。抗体−ＤＮＡコンジュゲートを含有するアニオン交換クロマトグラフィー由来のフラクションをプールし、濃縮し、サイズ排除カラムにロードした（実施例１参照）。リン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０１％ Tween 20 中でＤＮＡを溶出し、２６０ｎｍにした。グラフは複数回のロード／溶出実験を重ねたものを示す；フラクション１６−２０をプールし、純度に関してチェックした。
【図４】  図４は拮抗抗体濃度（ｎＭ）に対する吸光度（４０５ｎｍ）を示すグラフである。このグラフは、抗−ヒトＩｇＥモノクローナル抗体の結合活性に対するコンジュゲーションの作用を示す。拮抗ＥＬＩＳＡアッセイは、抗−ヒトＩｇＥ抗体がＤＮＡ−コンジュゲート型（中抜きの四角）または非コンジュゲート型（充填された丸）で用いられ、実施例１に記載のように行われた。
【図５】  図５は時間に対するＤＮＡ合成（ｐｍｏｌｅｓ）のグラフである。このグラフは、ＲＣＡ反応において遊離のプライマーおよび抗体コンジュゲートプライマーを比較するものである。等モル量の抗−ヒトＩｇＥ−プライマー２コンジュゲート（中抜きの丸）または非コンジュゲートプライマー２を用いるＲＣＡを実施例１に記載のように行った。
【図６】  図６はＩｇＥ濃度（ｎｇ／ｍＬ）に対する蛍光のグラフである。このグラフはＥＬＩＳＡ形式の免疫ＲＣＡおよび慣用の免疫アッセイを比較するものである（実施例２を参照）。充填された丸は、抗−ヒトＩｇＥ−ＤＮＡコンジュゲートを用いる免疫ＲＣＡでのヒトＩｇＥのＥＬＩＳＡアッセイである。中抜きの丸は、抗−ヒトＩｇＥ―アルカリホスファターゼコンジュゲートを用いるヒトＩｇＥのＥＬＩＳＡアッセイである。
【図７】  図７は磁性微粒子形式の免疫ＲＣＡおよび慣用の免疫アッセイにおいて見られる蛍光の棒グラフである。これらのアッセイは、実施例３に記載の固相として磁性微粒子が用いられたことを除いて、図６のアッセイと同様に、同一の抗−ヒトＩｇＥコンジュゲートを用いて行われた。
【図８】  図８はＰＳＡ濃度（ｎｇ／ｍＬ）に対する蛍光のグラフである。このグラフは、マイクロスポットアッセイにおける免疫ＲＣＡによるＰＳＡの検出を示す。顕微鏡像内の蛍光は実施例４に記載のように定量され、マイクロスポット上でインキュベートされたＰＳＡ濃度に対してプロットされた。
【図９】  図９はＩｇＥ濃度（ｎｇ／ｍＬ）に対する蛍光のグラフである。このグラフは、マイクロアレイアッセイにおける免疫ＲＣＡによるＩｇＥの検出を示す（実施例５参照）。精製されたＩｇＥに関する、免疫ＲＣＡ抗−ＩｇＥマイクロアレイ用量応答。６マイクロアレイスポットから得られたシグナルが各スポットに関して平均され、バックグラウンドシグナル（ＩｇＥなし）が減算された。
【図１０】  図１０はアビジン：抗−ジゴキシゲニン比に対するドットカウントの棒グラフである。このグラフは、免疫ＲＣＡ−ＣＡＣＨＥＴを用いる二重の抗原検出を示す（実施例６を参照）。抗−アビジンおよび抗−ヒツジ抗体コンジュゲート由来のＲＣＡ産物はそれぞれ、フルオレセイン−およびＣｙ３−ラベルされた検出オリゴヌクレオチドで修飾された。蛍光シグナルはフルオレセインおよびＣｙ３検出に最適化されたフィルターセットを用いて別々に獲得された。
【図１１】  図１１は開示されている方法を例示する図であり、ここでは、２つの異なるサンプル（サンプル１およびサンプル２）中の同一分析物の存在を同一アッセイにおいて検出可能である。これは、それぞれ異なる捕獲部分（ハプテン１およびハプテン２）を有する２つの異なる分析物捕獲物質を用いて行うことができ、異なるレポーター結合プライマー（レポーター結合プライマー１および２）が異なる分析物捕獲物質と結合する。異なるレポーター結合プライマーはそれぞれ、異なるローリングサークル複製プライマーを有し、したがって、各プライマーは異なる増幅標的サークル（増幅標的サークル１および２）のローリングサークル増幅を媒介する。
【図１２】  図１２は、２つの異なるサンプル中のＩｇＥの割合に対し、Ｃｙ３蛍光強度に対するＣｙ５蛍光強度の割合を示す棒グラフである。このグラフは、２つの異なるサンプル中の同一分析物の発現プロファイル化を示す（実施例７を参照）。固定された濃度のＩｇＥは抗−ＩｇＥ抗体の一調製物とインキュベートされ、ならびに種々の濃度のＩｇＥは抗−ＩｇＥ抗体の第二の調製物とインキュベートされた。この２つの混合物は、同時に、抗−ＩｇＥ捕獲抗体からなるマイクロアレイにアプライされた。各ＩｇＥ−抗−ＩｇＥ複合体の量は、２つの異なるローリングサークル複製プライマーを含有する複合体それぞれに対する抗体−ＤＮＡコンジュゲートを用いる免疫ＲＣＡを利用して測定され、これにより同時にＣｙ５−ラベルおよびＣｙ３−ラベルされた検出プローブを有する２つのＴＳ−ＤＮＡｓが検出される。
【図１３】  図１３は開示されている方法の例示の図であり、ここでは、２つの異なる型の同一分析物の存在が検出される。これは、それぞれ、異なる型の分析物（この場合は、リン酸化型および非リン酸化型の分析物）に結合する異なる特異的結合分子を有する、２つの異なるレポーター結合プライマー（レポーター結合プライマー１および２）を用いることによって達成される。異なるレポーター結合プライマーはそれぞれ、異なるローリングサークル複製プライマーを有し、したがって各プライマーは異なる増幅標的サークル（増幅標的サークル１および２）のローリングサークル増幅を媒介する。
【図１４】  図１４は開示されている方法の例示の図であり、ここでは、拮抗分子の存在、または一方が固定されている２つの他の分子（分子１および分子３）の相互作用に関する分子の拮抗能が評価される。有効な拮抗分子（分子３）の存在下では、２つの他の分子の相互作用は減少するか、あるいは排除される。固定されていない分子１と相互作用するレポーター結合プライマーが用いられる。２つの分子が相互作用する場合、増幅されたＤＮＡはこれらの分子と結合する。そうでない（すなわち、拮抗分子が相互作用を阻害する）場合、増幅されたＤＮＡは固定された分子と結合しない。分子１、２、および３は、任意の順に、分析物、分析物捕獲物質、およびアクセサリー分子である。
【図１５】  図１５は開示されている方法の例示の図であり、ここではタンパク質のｍＲＮＡとの相互作用が検出される。プライマーおよび、ｍＲＮＡと相互作用するタンパク質からなるレポーター結合プライマー（リガンド−プライマー）はｍＲＮＡと結合し、ｍＲＮＡ／レポーター結合プライマーコンジュゲート（ｍＲＮＡ−ペプチド）は、ガラススライドに固定された分析物捕獲物質（オリゴ）とハイブリダイズする。次いでこのプライマーはローリングサークル複製を媒介することができる。
【図１６】  図１６は、１セットの２２患者サンプルに関するマイクロアレイ上のアレルゲンに対する蛍光強度の棒グラフである。このグラフは患者血清内のアレルゲン特異的なＩｇＥの免疫ＲＣＡマイクロアレイ検出を示す。患者由来の血清サンプルが、ネコ毛、イヌ毛、ハウスダストダニ（D. farinae および D. pteronyssinus）、およびラッカセイの抽出物でスポットされたマイクロアレイとインキュベートされた（実施例８参照）。アレイはスキャンされ、蛍光シグナルは記載のように定量された。
【図１７】  図１７は、単一マイクロアレイ上の、２つの異なるサンプル由来ＰＳＡの二色検出から得られたシグナルの割合に対する抗原の割合を示す棒グラフである。このグラフは、一方はビオチンラベルされた抗−ＰＳＡを伴い、他方はＦＩＴＣラベルされた抗−ＰＳＡを伴う、２つの異なるサンプル中の免疫ＲＣＡによるＰＳＡ抗原の定量を示す。このビオチンおよびＦＩＴＣサンプルは同一のアレイに添加され、抗−ビオチン（プライマー１）および抗−ＦＩＴＣ（プライマー２）コンジュゲートを用いる免疫ＲＣＡによって検出される。Ｃｙ３（プライマー２）およびＣｙ５（プライマー２）シグナル強度の割合は、２サンプル中のＰＳＡ抗原の割合の関数としてプロットされる（実施例７参照）。
【図１８】  図１８Ａおよび１８Ｂは、マイクロアレイ上の２つの異なるサイトカインに関する、同時の、多重化された検出におけるサイトカイン量の棒グラフである。このグラフは、２つのサイトカインの混合物を含有するサンプル由来のＩＬ１ａならびにＴＮＦサイトカインの定量を示す（図１８Ａ）。マイクロアレイは、アレイ中の異なる位置に固定された２つのサイトカインに関する捕獲抗体を含有していた。プライマー１とコンジュゲートされた抗−ビオチンを用いる免疫ＲＣＡによって検出を行った。ＩＬ１ａのみを含有するコントロールサンプルは、すなわちＩＬ１ａに関する単一のシグナルを生じ、このことは相互作用の特異性を示す（図１８Ｂ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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