(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素、並びに逆転写活性およびＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の少なくとも２種類の酵素を含有することを特徴とする、ＲＴ−ＰＣＲ用試薬。
【請求項２】
ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素、逆転写活性を有する酵素、およびＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の少なくとも３種類の酵素を含有することを特徴とする、ＲＴ−ＰＣＲ用試薬。
【請求項３】
少なくとも２種類の酵素を用いて１工程でＲＴ−ＰＣＲを行うことを特徴とするＲＴ−ＰＣＲ用試薬であって、
（ａ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素により試料に含まれるＤＮＡを分解し、
（ｂ）逆転写活性を有する酵素により試料に含まれるＲＮＡと相補的なＤＮＡ鎖を合成し、
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により標的ＲＮＡと相補的なＤＮＡを増幅するための成分を含有する試薬。
【請求項４】
ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素がＤＮアーゼＩであることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＲＴ−ＰＣＲ用試薬。
【請求項５】
マンガンイオン含有量が１ｍＭ以下であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＲＴ−ＰＣＲ用試薬。
【請求項６】
反応容器中にＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素、並びに逆転写活性およびＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の少なくとも２種類の酵素を一緒に存在させ、１工程でＲＴ−ＰＣＲを行うことを特徴とするＲＴ−ＰＣＲ方法。
【請求項７】
反応容器中にＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素、逆転写活性を有する酵素、およびＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素の少なくとも３種類の酵素を一緒に存在させ、１工程でＲＴ−ＰＣＲを行うことを特徴とするＲＴ−ＰＣＲ方法。
【請求項８】
少なくとも２種類の酵素を用いて１工程でＲＴ−ＰＣＲを行うことを特徴とするＲＴ−ＰＣＲ方法であって、下記工程
（ｄ）ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素により試料に含まれるＤＮＡを分解し、
（ｅ）逆転写活性を有する酵素により試料に含まれるＲＮＡと相補的なＤＮＡ鎖を合成し、
（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により標的ＲＮＡと相補的なＤＮＡを増幅すること、からなる方法。
【請求項９】
ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を有する酵素がＤＮアーゼＩであることを特徴とする、請求項５〜８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、偽陽性を低減可能なリボ核酸増幅試薬組成、および該組成を用いたリボ核酸の増幅方法ならびに該方法を使用するための試薬またはキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法に代表される核酸増幅法は、特定の配列を有する核酸を短時間で特異的に検出する目的において優れた方法である。しかし、ＰＣＲ法による増幅の鋳型となる核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の形で提供される必要があるため、リボ核酸（ＲＮＡ）を対象とする場合は、直接、ＰＣＲ法によって増幅することはできない。ＲＮＡをＰＣＲ法により検出するためには、ＲＮＡが有する遺伝情報を逆転写活性を有する酵素などを用いてＤＮＡに変換する必要がある。このような逆転写とＰＣＲを組み合わせた方法においては、特にＲＮＡのみが検出対象である場合、特定の予防処理をしない限り、ＲＮＡ試料に混入したＤＮＡによって肯定的な結果が導かれることによる偽陽性が大きな問題となる。
【０００３】
上記問題を解決するための１つの可能性は接合プライマーの使用である。接合プライマーは、ゲノムＤＮＡがＲＮＡに転写されるエキソン配列と、プロセシングによりＲＮＡに転写されないイントロン配列を含むことを利用し、その５'末端がエキソンの５'末端の配列に相補的で、その３'末端が隣接したエキソンの３'末端のヌクレオチドに相補的だが、ゲノム上の該２つのエキソンの間に位置するイントロンの３'末端のヌクレオチドに相補的でないヌクレオチドを含むように配列が選択されたオリゴヌクレオチドである。この場合、試料へのＤＮＡの混入による偽陽性は少なくとも部分的に回避できる。しかしながら、該方法では、イントロンを含まない遺伝子に対しては無効である。
【０００４】
さらに、ゲノム上に存在する偽遺伝子は長さにおいて転写されたＲＮＡと同一であるため、ＰＣＲにおいて両者を区別することができないという同じ問題を提示する。このような場合、転写反応の前に試料をＤＮアーゼで処理することが有効である（例えば、非特許文献１および２、参照）。偽陽性を低減させるためのＤＮアーゼの使用に関しては、例えば反応試薬に添加する２価イオンとしてマグネシウムの代わりにマンガンイオンを存在させることでＤＮアーゼを効率的に作用させる、などの改良が行われている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
しかし、従来公知のいずれの技術においても、試料をＤＮＡ分解活性を有する酵素と反応させた後、煩雑な抽出操作などにより該酵素を除去したＲＮＡ試料を逆転写反応に供している。すなわち、試料を入手してからリボ核酸の増幅を行うまでに煩雑な偽陽性予防処理を行う必要があり、これは研究や診断の現場において人的または時間的な効率を低下させる要因の一つとなり得る。
【０００６】
【特許文献１】特表平１１−５０３３２５号公報
【非特許文献１】ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第９巻、第２６２−２６８頁、１９９０年
【非特許文献２】ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１３巻、第７２６−７２９頁、１９９２年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであって、その目的とするところは、簡便に偽陽性を低減可能なリボ核酸増幅試薬組成、および該組成を用いたリボ核酸の増幅方法ならびに該方法を使用するための試薬またはキットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々鋭意検討したところ、試料に含まれるＤＮＡの分解（偽陽性予防処理）とリボ核酸の増幅を１工程で行うことが可能な試薬組成を見出した。
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【０００９】
（１）少なくとも一種類の酵素を含有することによりＤＮＡ分解活性および逆転写活性およびＤＮＡポリメラーゼ活性を有することを特徴とする、リボ核酸増幅用試薬組成。
【００１０】
（２）ＤＮＡ分解活性を有する酵素、および逆転写活性および／またはＤＮＡポリメラーゼ活性を有する少なくとも一種類の酵素を含有することを特徴とする、リボ核酸増幅用試薬組成。
【００１１】
（３）少なくとも一種類の酵素を用いて１工程でリボ核酸を増幅することを特徴とするリボ核酸増幅用試薬組成であって、
（ａ）ＤＮＡ分解活性を有する酵素により試料に含まれるデオキシリボ核酸を分解し、
（ｂ）逆転写活性を有する酵素により試料に含まれるリボ核酸をデオキシリボ核酸に変換し、
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により標的ＲＮＡに相補的なデオキシリボ核酸を増幅するための成分を含有する試薬組成。
【００１２】
（４）ＤＮＡ分解活性を有する酵素がＤＮアーゼIであることを特徴とする、（１）から（３）のいずれかに記載のリボ核酸増幅用試薬組成。
【００１３】
（５）マンガンイオンを含まないことを特徴とする、（１）から（４）のいずれかに記載のリボ核酸増幅用試薬組成。
【００１４】
（６）反応容器中にＤＮＡ分解活性を有する酵素、逆転写活性および／またはＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素を一緒に存在させ、１工程でリボ核酸を増幅することを特徴とするリボ核酸の増幅方法。
【００１５】
（７）少なくとも一種類の酵素を用いて１工程でリボ核酸を増幅することを特徴とするリボ核酸増幅方法であって、下記工程
（ａ）ＤＮＡ分解活性を有する酵素により試料に含まれるデオキシリボ核酸を分解し、
（ｂ）逆転写活性を有する酵素により試料に含まれるリボ核酸をデオキシリボ核酸に変換し、
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素により標的ＲＮＡに相補的なデオキシリボ核酸を増幅することから成る方法。
【００１６】
（８）ＤＮＡ分解活性を有する酵素がＤＮアーゼIであることを特徴とする、（６）または（７）に記載のリボ核酸増幅方法。
【００１７】
（９）マンガンイオンを含まないことを特徴とする、（６）から（８）のいずれかに記載のリボ核酸増幅用試薬組成。
【００１８】
（１０）（６）から（９）のいずれかに記載の方法を用いてリボ核酸を増幅するための試薬またはキット。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、試料に含まれるデオキシリボ核酸の分解（偽陽性予防処理）とリボ核酸の増幅を１工程で行うことができ、特に研究や診断の現場において人的または時間的な効率を大きく向上させることが可能となる。また、本発明の波及効果として、該現場において大きな問題となっている、増幅反応の途中で容器の蓋を開閉することによるコンタミネーションの予防策を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明においてリボ核酸の増幅とは、試料中のリボ核酸から増幅したい核酸（標的核酸）をその固有の配列の相補性を利用して増幅することを指し、具体的には、該リボ核酸を自身に相補的なデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）に変換した後、該ｃＤＮＡを増幅する一連の流れを指す。本発明におけるリボ核酸増幅試薬組成およびそれを用いたリボ核酸の増幅方法が適用可能な該ｃＤＮＡ増幅の方法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＤＡ法など特に限定されるものではないが、一般的に熱安定性の高い酵素を用いるＰＣＲ法の使用がより好ましい。
【００２１】
RNAを含む試料に混在するDNAによる擬陽性を防止するためには、まずRNAを含む試料に混在するDNAをDNアーゼで分解するが、次のRNAからｃDNAに変換した際にこのDNアーゼが残存している場合にはｃDNAが分解すると考えられていた。しかしながら発明者らの検討によると、逆転写酵素によりｃDNAに変換した際のRNA-ｃDNAハイブリッド状態では、DNアーゼが存在していても分解されることなくｃDNAが維持されることを見出し、さらに、引き続くPCR反応の高温下によってDNアーゼ、逆転写酵素の活性を失活させることができることにをヒントに、各酵素の組み合わせ、各酵素量の最適化、各酵素のいずれもが有効に働く試薬液組成の最適化を検討することにより、本発明を完成させた。
【００２２】
本発明の偽陽性を低減可能なリボ核酸増幅試薬組成の好ましい一例としては、まず、（ａ）ＤＮＡ分解活性を有する酵素、（ｂ）逆転写活性を有する酵素、（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素、を含むことが好ましい。
さらに、（ｄ）ＲＮアーゼ阻害剤、（ｅ）核酸増幅用プライマー、（ｆ）ｄＮＴＰ、（ｇ）反応バッファー、（ｈ）リボ核酸含有試料などを含むことができる。
【００２３】
（ａ）ＤＮＡ分解活性を有する酵素としては、各種のＤＮＡ依存的エキソヌクレアーゼまたはＤＮＡ依存的エンドヌクレアーゼを使用し得るが、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド２本鎖を分解する活性を有しない酵素の使用が望ましい。具体的にはＤＮアーゼの使用が好ましく、ＤＮアーゼIの使用がより好ましい。該酵素の使用量としては、おおよそ０〜２５℃程度の温度範囲にて６０分以内に偽陽性の原因となる試料中のデオキシリボ核酸を分解し、かつ後工程の酵素反応を阻害しない量であることが必要である。また、RNA-ｃDNAハイブリッドを実質上分解しない量であること、加熱のみで失活させうる量であることが大切である。具体的には、ＤＮアーゼIの場合は５〜５０００単位／ｍｌ程度の使用が好ましく、１００〜１０００単位／ｍｌ程度の使用がより好ましい。
【００２４】
（ｂ）逆転写活性を有する酵素としては、従来公知のレトロウイルス、特にモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）、ヒト後天性免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、トリ骨髄芽症ウイルス（ＡＭＶ）などに由来する各種の逆転写酵素を特に限定されることなく使用できる。また、レトロウイルス由来の逆転写酵素の多くでＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド２本鎖のＲＮＡを分解する活性、すなわちＲＮａｓｅＨ活性を有することが知られており、この活性の存在はＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成する際に鋳型−プライマー複合体の鋳型を分解し、その分解位置がプライマーの３'端に近い場合は鋳型−プライマー複合体が解離されるため伸長性が低下するという結果を招く。このような問題を排除するため、本発明の逆転写活性を有する酵素としては、実質的にＲＮａｓｅＨ活性を有していない逆転写酵素を使用することが好ましい。具体的には、Ｍ−ＭＬＶ由来のＲＮａｓｅＨ活性除去変異体の場合は５〜５０００単位／ｍｌ程度の使用が好ましく、１００〜１０００単位／ｍｌ程度の使用がより好ましい。
【００２５】
（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としては、Ｔ４またはＴ７ファージ、大腸菌、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）属、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属など種々の起源のＤＮＡポリメラーゼおよびその改良変異体を特に限定されることなく使用できるが、核酸の増幅方法としてＰＣＲ法を使用する場合はＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼなど熱安定性の酵素を使用することが好ましい。中でもＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼまたは該酵素を改良したＤＮＡポリメラーゼは増幅量および反応速度の観点から最も好ましい。具体的には、ＫＯＤ  Ｄａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼの場合は１〜２００単位／ｍｌ程度の使用が好ましく、１０〜１００単位／ｍｌ程度の使用がより好ましい。
なお、（ｂ）逆転写活性を有する酵素および（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素については逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼによる代替も可能であり、このような性質の酵素としてはＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼが最も代表的である。
【００２６】
本発明において、１工程で反応を行うためには、上述の各酵素の組み合わせの相性も考慮することが重要である。具体的な個々の酵素を選択するときには、各酵素が有効に作用するバッファー組成（ｐH、塩濃度等）が共通するもの、近いものを組み合わせることが好ましい。
【００２７】
（ｄ）ＲＮアーゼ阻害剤としては、ヒト胎盤やブタ肝臓などに由来する各種のＲＮアーゼ阻害剤を特に限定されることなく使用でき、５〜５０００単位／ｍｌ程度の使用が好ましく、１００〜１０００単位／ｍｌ程度の使用がより好ましい。
【００２８】
（ｅ）核酸増幅用プライマーは１〜１０００ｎＭ程度を含む。中でも特異性を高めるために、１００〜５００ｎＭ程度がより好ましく、２００ｎＭ程度がさらに好ましい。
【００２９】
（ｆ）ｄＮＴＰは５０〜１０００μＭ程度を含む。１００〜７００μＭ程度がより好ましく、２００〜４００μＭ程度がさらに好ましい。
（ｇ）反応バッファーについては、本発明のリボ核酸増幅試薬に含まれる酵素の能力を最大限に発揮する目的で、緩衝液や金属塩の濃度、溶液のｐＨなどが適宜選択され得る。
これらは、組み合わせる酵素により、最適な範囲は異なるが、例えば実施例で示したＤＮａｓｅI（ロシュ製）、Ｍ−ＭＬＶ由来逆転写酵素ＲＮａｓｅＨ活性除去変異体（東洋紡績製）、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡績製）の組み合わせの場合では、ｐＨは室温下で測定した場合に６．５〜９．５、さらには室温下で測定した場合に８．０〜９．０が好ましく、Ｍｇ濃度は１．０ｍＭ〜５．０ｍＭ、さらには１．５〜４．０ｍＭが好ましい。
【００３０】
特に、１工程で反応を行うためには、試薬に含まれる酵素のいずれもがその能力を発揮できる試薬組成に調整する必要がある。特にMgは各酵素の依存性が高いため、各酵素の適正濃度範囲にすることが好ましい。なお、やむを得ない場合には反応中に塩などを追加しても良いが、操作性等の面で、反応開始時にはすべての添加物が反応溶液中に含まれる様にすることが好ましい。
また、酵素の安定性を高める目的で、該試薬にウシ血清アルブミンなどの添加剤を適宜混合しても良い。
【００３１】
さらに、試薬組成物中のマンガンイオンの含有量は１ｍＭ以下であることが好ましい。マンガンイオンは通常、例えばＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼに代表される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性を増強するために添加することがあるが、マンガンイオンの存在は非特異的な増幅やスメア状の増幅を引き起こしやすくなる、または核酸を増幅する効率が低下するなどの理由で好ましくない。
マンガンイオンの含有量はさらに好ましくは０．５ｍＭ以下であり、特に好ましくは０．１ｍＭ以下であり、  最も好ましくは実質的に含有されないことである。実質的に含有されないとは、非特異的な増幅やスメア状の増幅を引き起こしやすくなる、または核酸を増幅する効率が低下するなどの不具合を生じない量以下である。
【００３２】
（ｈ）リボ核酸は本発明において、例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどの、いずれのリボ核酸であってもよい。また本発明は、イントロンを含まないｍＲＮＡ試料、および偽遺伝子が存在するまたは偽遺伝子が存在するかどうかわからないｍＲＮＡ試料において、特に効果的に作用する。本発明によれば、偽陽性の原因となるデオキシリボ核酸が高度に混入した場合でさえ、リボ核酸を選択的に増幅し得る（実施例１を参照）。したがって、本発明のリボ核酸増幅方法において、完全には精製されていないＲＮＡを含有する試料を用いることが可能である。特にデオキシリボ核酸の含有量は、標的となるリボ核酸に対応するかどうかに関わらず、リボ核酸を増幅するための従来技術にしたがって用いられた試料中の含有量を越えることができる。試料は、例えば、バクテリア、動物または植物組織、個体細胞由来の溶解物などのあらゆる材料から調製することができる。また、リボ核酸は試料中に溶解させてもよいし、固相に固定させてもよい。
【００３３】
増幅反応は、ＤＮＡ分解反応、逆転写反応、ＰＣＲ反応を含む。これらの反応は１ステップで行われることが好ましい。ここで言う１工程とは、これらの反応を途中に抽出・分離工程を入れることなく行うことであり、さらには途中で添加物等を加えることなく行われる行われることが好ましい。特には、測定サンプルを含めた反応溶液を調整した後は、温度コントロールおよび必要に応じて攪拌のみで各反応が順次進められることが好ましい。
【実施例】
【００３４】
以下に、ＤＮＡ分解活性を有する酵素としてＤＮアーゼIを、逆転写活性を有する酵素としてＭ−ＭＬＶ由来のＲＮａｓｅＨ活性除去変異体（東洋紡績製）を、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する酵素としてＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡績製）をそれぞれ用いることを例に挙げて、本発明について具体的に説明する。なお、該発明の最大の新規性は、増幅反応系からＤＮＡ分解活性を有する酵素を除去する工程および途中で酵素を含有する溶液などを添加する工程を省略し、１工程で、偽陰性の原因となり得るＤＮＡの分解から標的ＲＮＡに相補的なＤＮＡ増幅の反応までを行うことにある。したがって、以下に開示する例において構成成分の一部、すなわち酵素の変更または該変更に合わせた試薬組成の改良などは、前述の指針に従えば当業者にとって容易である。したがって、以下の事例は、本発明の内容を何ら限定するものではない。
【００３５】
実施例１
本発明のリボ核酸増幅試薬組成における偽陽性低減効果の確認
（１）試料の調製
ＨｅＬａ細胞よりＲＮＡおよびＤＮＡをそれぞれ抽出した。該核酸を１％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線照射下での蛍光を検出した。このとき核酸抽出に用いた細胞数および電気泳動に用いた核酸の量を表１に示し、該電気泳動によって得られた写真を図１に示す。なお、図１のレーン番号は表１のサンプル番号に対応する。電気泳動の条件は、定電圧１００Ｖ、３０分間にて行った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、検出されたＤＮＡ断片の鎖長を比較する際の参考とした。操作方法ならびに他の条件は、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らのモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）（１９８２年）に記載の技法に従った。
【００３６】
【表１】
0004639629.tif 000002
【００３７】
（２）試料に含まれるリボ核酸の増幅
表１におけるサンプル番号１〜４の核酸について、それぞれ電気泳動に用いた量を試料としてＧ３ＰＤＨ遺伝子を標的リボ核酸とする増幅反応を行った。反応液組成は、ＤＮａｓｅI（ロシュ製）５００単位／ｍｌ、Ｍ−ＭＬＶ由来逆転写酵素ＲＮａｓｅＨ活性除去変異体（東洋紡績製）５００単位／ｍｌ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡績製）２５単位／ｍｌ、ＲＮアーゼ阻害剤（東洋紡績製）５００単位／ｍｌ、Ｇ３ＰＤＨプライマーセット（東洋紡績製）各２００ｎＭ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰおよびｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを各０．４ｍＭ、および１倍濃度の増幅用緩衝液（東洋紡績製、室温下で測定した場合のｐＨが８．６のトリス緩衝液および３．７ｍＭのＭｇを含む）である。  また、Mnイオンの添加は行われていない。ただし、本検討におけるＤＮａｓｅIおよびＭ−ＭＬＶ由来逆転写酵素ＲＮａｓｅＨ活性除去変異体の有効性を確認する目的で、表２に示すように一部の酵素を添加しない反応液も用意した。実際の使用にあたっては、反応液に試料溶液を添加し、反応液量を５０μｌとして、以下の反応に供した。反応条件は以下の通りである：
【００３８】
ＤＮＡ分解反応              ４℃、１５分
逆転写反応                ４２℃、２０分
ＰＣＲ反応       熱変性      ：９８℃、１０秒
アニーリング：６０℃、２秒
伸長反応    ：７４℃、３０秒
【００３９】
上記ＤＮＡ分解反応および逆転写反応は１回のみ、ＰＣＲ反応（熱変性、アニーリング、伸長反応）は３５回繰り返した。これらの操作はパーキンエルマー社のＤＮＡサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００）を用いて行った。増幅反応後の反応液５μｌを２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線照射下での蛍光を検出した。アガロース電気泳動で得られた写真を図２に示す。なお、図２のレーン番号は表２のサンプル番号に対応する。電気泳動の条件は、定電圧１００Ｖ、３０分間にて行った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、検出されたＤＮＡ断片の鎖長を比較する際の参考とした。
【００４０】
【表２】
0004639629.tif 000003
【００４１】
（３）結果
図１（および表１）のサンプル番号１〜３より明らかなように、細胞試料によっては、抽出したリボ核酸（ＲＮＡ）に大量のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が混入することがある。図１のサンプル番号４に対照として電気泳動した抽出ＤＮＡと比較すると、例えば図１のサンプル番号２の抽出ＲＮＡに混入しているＤＮＡは試料とした細胞の１０％前後に相当する量に及ぶ。ＤＮＡとＲＮＡは化学的に極めて類似した物質であるため、このように特に両核酸を含有する生体細胞などを試料とする場合では、抽出ＲＮＡからＤＮＡを完全に排除することは極めて困難である。同様に図１のサンプル番号４に電気泳動した抽出ＤＮＡにも、電気泳動で検出できない量のＲＮＡが混入していることが予想される。
【００４２】
図２（および表２）より明らかなように、本発明の試薬組成（サンプル番号１〜４）では約４５０ｂｐの部分に明瞭な増幅を確認できるが、ＲＮＡ増幅試薬組成に逆転写酵素が含まれない、すなわち本発明のリボ核酸増幅試薬組成から逆転写活性を有する酵素を除去した場合（サンプル番号５〜８）には増幅を確認できない。したがって、図２のサンプル番号１〜４で確認された増幅は各試料に含まれるＲＮＡに起因する。一方、ＲＮＡ増幅試薬組成にＤＮＡ分解酵素が含まれない、すなわち本発明のリボ核酸増幅試薬組成からＤＮＡ分解活性を有する酵素を除去した場合では、該組成に逆転写酵素が含まれる場合（サンプル番号９〜１２）および逆転写酵素が含まれない場合（サンプル番号１３〜１６）ともに約４５０ｂｐの部分に明瞭な増幅を確認できる。すなわち、図２のサンプル番号１３〜１６で確認された増幅は各試料に含まれるＤＮＡに起因する偽陽性である。このように本発明のリボ核酸増幅試薬組成ではＤＮＡ分解活性を有する酵素を含んでいることにより、試料に含まれるＲＮＡのみに起因する増幅を確認することが可能である。
【００４３】
実施例２
既存のリボ核酸増幅試薬組成との増幅効率の比較
（１）試料の調製
実施例１においてＨｅＬａ細胞より抽出したＲＮＡ溶液（図１におけるサンプル番号１）を１０倍ずつ希釈した段階希釈液を調製し、試料とした。
【００４４】
（２）試料に含まれるリボ核酸の増幅
I．本発明のリボ核酸増幅試薬組成による増幅
実施例１と同様の方法により、表３に示す試料についてそれぞれＧ３ＰＤＨ遺伝子を標的リボ核酸とする増幅反応を行った。
【００４５】
II．従来のリボ核酸増幅試薬組成による増幅
表３に示す試料にそれぞれＤＮａｓｅI（ロシュ製）５００単位／ｍｌを添加し、４℃で１５分間反応させ、試料に含まれるＤＮＡを分解した。反応後の溶液を９９℃で１０分間加熱してＤＮａｓｅIを失活させた後、該溶液にＭ−ＭＬＶ由来逆転写酵素ＲＮａｓｅＨ活性除去変異体（東洋紡績製）５００単位／ｍｌ、ＲＮアーゼ阻害剤（東洋紡績製）５００単位／ｍｌ、Ｇ３ＰＤＨプライマーセット（東洋紡績製）各２００ｎＭ、ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰおよびｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを各０．４ｍＭ、および１倍濃度の増幅用緩衝液（東洋紡績製）を添加し、４２℃で２０分間反応させ、逆転写反応を行った。反応後の溶液を９９℃で１０分間加熱して逆転写酵素を失活させた後、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ  Ｄａｓｈ（東洋紡績製）２５単位／ｍｌを添加し、増幅反応を行った。増幅反応の条件は以下の通りである：
【００４６】
熱変性：      ９８℃、１０秒
アニーリング：６０℃、２秒
伸長反応：    ７４℃、３０秒
【００４７】
上記熱変性、アニーリング、伸長反応は３５回繰り返した。これらの操作はパーキンエルマー社のＤＮＡサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００）を用いて行った。
【００４８】
I．本発明のリボ核酸増幅試薬組成による増幅、II．従来のリボ核酸増幅試薬組成による増幅ともに、増幅反応後の反応液５μｌを２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線照射下での蛍光を検出した。アガロース電気泳動で得られた写真を図３に示す。なお、図３のレーン番号は表３のサンプル番号に対応する。電気泳動の条件は、定電圧１００Ｖ、３０分間にて行った。反応液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、検出されたＤＮＡ断片の鎖長を比較する際の参考とした。
【００４９】
【表３】
0004639629.tif 000004
【００５０】
（３）結果
図３（および表３）のサンプル番号１〜３より明らかなように、本発明のリボ核酸増幅試薬組成によって１工程でリボ核酸を増幅させた場合（サンプル番号１〜７）および従来のリボ核酸増幅試薬組成によって３工程でリボ核酸を増幅させた場合（サンプル番号８〜１４）について、増幅効率は同様であった。すなわち、本発明のリボ核酸増幅試薬組成では従来の方法と同様の増幅効率を実現しながら、増幅に必要な作業工程数を大幅に短縮することが可能である。また、該工程数の短縮は単に手間が軽減されるだけでなく、研究や診断の現場において大きな問題となっている、増幅反応の途中で容器の蓋を開閉することによるコンタミネーションの予防策としても重要な効果である。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明により、試料に含まれるデオキシリボ核酸の分解（偽陽性予防処理）とリボ核酸の増幅を１工程で行うことができ、特に研究や診断の現場において人的または時間的な効率を大きく向上させることが可能となる。また、本発明の波及効果として、該現場において大きな問題となっている、増幅反応の途中で容器の蓋を開閉することによるコンタミネーションの予防策を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ＨｅＬａ細胞より抽出したＲＮＡおよびＤＮＡを示す図面に代わる電気泳動写真である。
【図２】ＨｅＬａ細胞より抽出したＲＮＡおよびＤＮＡについて、本発明のリボ核酸増幅試薬組成を用いて増幅したＤＮＡ断片を示す図面に代わる電気泳動写真である。
【図３】ＨｅＬａ細胞より抽出したＲＮＡについて、本発明のリボ核酸増幅試薬組成および従来のリボ核酸増幅試薬組成を用いて増幅したＤＮＡ断片を示す図面に代わる電気泳動写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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