(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸−カプロラクトン共重合体から構成されるスポンジ、及び、ポリ乳酸繊維から構成される組紐状の強化材を含み、少なくとも内面がスポンジである神経再生チューブ。
【請求項２】
前記強化材が外層であり、前記スポンジが内層である請求項１に記載のチューブ。
【請求項３】
さらに細胞接着性因子を含む請求項１又は２に記載のチューブ。
【請求項４】
さらに成長因子を含む請求項１〜３のいずれかに記載のチューブ。
【請求項５】
シュワン細胞がチューブの内面に播種されたことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のチューブ。
【請求項６】
以下の工程（Ａ）〜工程（Ｃ）：
工程（Ａ）：筒状芯体の外側にポリ乳酸繊維から構成される組紐状強化材を固定する、
工程（Ｂ）：得られた強化材固定芯体を乳酸−カプロラクトン共重合体の溶液に浸漬後凍結乾燥して、組紐状強化材よりも分解吸収期間の短いスポンジを形成する、
工程（Ｃ）：凍結乾燥物を筒状芯体から外し、必要に応じて反転する
を包含することを特徴とする、スポンジ及び組紐状強化材を有し、少なくとも内面がスポンジである神経再生チューブの製造方法。
【請求項７】
工程（Ｂ）で得られたスポンジ及び強化材を有する筒状芯体を細胞接着性因子及び／又は成長因子の溶液に浸漬して凍結乾燥する工程（Ｂ１）をさらに含み、工程（Ｂ１）で得られた凍結乾燥物を前記工程（Ｃ）に供することを特徴とする、細胞接着性因子及び／又は成長因子でコーティングされたスポンジ内面を有する請求項６に記載の神経再生チューブの製造方法。
【請求項８】
請求項６又は７の工程（Ｃ）で得られたチューブ内面にシュワン細胞を播種して培養する工程（Ｄ）をさらに包含する、内面にシュワン細胞を有する神経再生チューブの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、神経再生チューブ及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術及びその課題】
末梢神経の再生に関し、１９８２年に報告されたLundbergらによるシリコーンチューブモデルの発表以来、シリコーンチューブを用いて再生可能な断端間距離を延長するための試みがなされてきた。しかしながら、シリコーンチューブを用いて損傷神経を修復した場合、時間が経つにつれてチューブ内に再生した神経をシリコーンチューブが全周性に圧迫する可能性がある。
【０００３】
一方、生体吸収性高分子からなる高分子を用いる神経欠損の再生に関する技術も公知である。例えば特開２００１−７０４３６号公報は、スポンジ、チューブ、コイル等のコラーゲン支持体を用いる技術を開示しているが、このような支持体では十分な強度が得られない。
【０００４】
また、ＷＯ９８／２２１５５は、生体分解吸収性材料のチューブと、その内腔に該チューブの軸線にほぼ平行に沿って該チューブを貫通する空隙を有するコラーゲン体からなり、該空隙がコラーゲン、ラミニン等を含むマトリックスゲルで充填されている人工神経管を開示している。しかしながら、該人工神経管は内部をコラーゲン体及びマトリックスゲルで充填されているため、シュワン細胞を内部に播種できない。
【０００５】
本発明は、長い神経欠損部においても速やかな神経再生が可能であり、再生神経に対して悪影響のない神経再生チューブ及びその製造法を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、以下の神経再生チューブ及びその製造法を提供するものである。
項１．  生体吸収性高分子から構成されるスポンジ、及び、該スポンジより分解吸収期間の長い生体吸収性高分子から構成される筒状の強化材を含み、少なくとも内面がスポンジである神経再生チューブ。
項２．  筒状の強化材が組紐、編物、織物、不織布、パンチングシートまたはスパイラルメッシュの形状を有する項１に記載のチューブ。
項３．  前記筒状強化材が外層であり、前記スポンジが内層である項２に記載のチューブ。
項４．  さらに細胞接着性因子を含む項１〜３のいずれかに記載のチューブ。
項５．  さらに成長因子を含む項１〜４のいずれかに記載のチューブ。
項６．  シュワン細胞がチューブの内面に播種されたことを特徴とする項１〜５のいずれかに記載のチューブ。
項７．  以下の工程（Ａ）〜工程（Ｃ）：
工程（Ａ）：筒状芯体の外側に生体吸収性繊維から構成される筒状強化材を固定する、
工程（Ｂ）：得られた強化材固定芯体を生体吸収性高分子溶液に浸漬後凍結乾燥して、筒状強化材よりも分解吸収期間の短いスポンジを形成する、
工程（Ｃ）：凍結乾燥物を筒状芯体から外し、必要に応じて反転する
を包含することを特徴とする、スポンジ及び筒状強化材を有する神経再生チューブの製造方法。
項８．  工程（Ｂ）で得られたスポンジ及び強化材を有する筒状芯体を細胞接着性因子及び／又は成長因子の溶液に浸漬して凍結乾燥する工程（Ｂ１）をさらに含み、工程（Ｂ１）で得られた凍結乾燥物を前記工程（Ｃ）に供することを特徴とする、細胞接着性因子及び／又は成長因子でコーティングされたスポンジ内面を有する項７に記載の神経再生チューブの製造方法。
項９．  項７又は８の工程（Ｃ）で得られたチューブ内面にシュワン細胞を播種して培養する工程（Ｄ）をさらに包含する、内面にシュワン細胞を有する神経再生チューブの製造方法。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明において、生体吸収性高分子としては、合成生体吸収性高分子と天然生体吸収性高分子のいずれも使用することができる。合成生体吸収性高分子としては、脂肪族ポリエステル（ポリグリコール酸、ポリ乳酸（Ｄ体、Ｌ体、ＤＬ体）、ポリカプロラクトン、ポリバレロラクトン及びそれらの共重合体、例えば乳酸−カプロラクトン共重合体、乳酸−グリコール酸共重合体、グリコール酸−トリメチレンカーボネート共重合体、グリコール酸−トリメチレンカーボネート−ジオキサノン共重合体、グリコール酸−トリメチレンカーボネート−εカプロラクトン共重合体など）、ポリエステルエーテル（ポリ−１，４−ジオキサノン−２−オン、ポリ−１，５−ジオキセパン−２−オン、エチレングリコール−前記脂肪族ポリエステル共重合体や、前記脂肪族ポリエステルとポリエステルエーテルとの共重合体）が挙げられる。天然生体吸収性高分子としては、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロン酸、アルギン酸等が例示される。
【０００８】
スポンジを構成する好ましい合成生体吸収性高分子としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトンおよびそれらの共重合体などが例示され、強化材を構成する好ましい合成生体吸収性高分子としては、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトンおよびそれらの共重合体などが例示される。
【０００９】
スポンジを構成する合成生体吸収性高分子と、強化材を構成する該スポンジより分解吸収期間の長い合成生体吸収性高分子は、同一でも異なっていてもよい。
【００１０】
「該スポンジより分解吸収期間の長い合成生体吸収性高分子から構成される強化材」とは、強化材を構成する合成生体吸収性高分子自体がスポンジの合成生体吸収性高分子よりも生体内で分解抵抗性の高い高分子である場合の他に、高分子自体は同一であるか、或いは強化材の高分子の方が分解されやすいが、筒状の強化材がスポンジよりも分解され難いため、全体として合成生体吸収性繊維が合成生体吸収性スポンジよりも分解吸収期間が長くなる場合の両方を意味する。
【００１１】
本発明の強化材の構成要素としては、モノフィラメント、マルチフィラメント、紐などの繊維、シート、不織布が例示される。該繊維の直径は１０〜２０００μｍ程度、好ましくは５０〜１０００μｍ程度である。筒状の強化材としては、組紐、織物、編物、不織布、パンチングシートまたはフィラメント糸で螺旋状に編んだスパイラルメッシュ等が例示され、好ましくは組紐が例示される。筒状強化材の厚みは１０〜２０００μｍ程度、好ましくは５０〜１０００μｍ程度である。
【００１２】
本発明のスポンジの厚みは０．１〜５ｍｍ程度、好ましくは０．５〜２ｍｍ程度であり、スポンジの孔径は１〜５００μｍ程度、好ましくは１０〜２００μｍ程度である。強化材はスポンジの内部にあって一体として神経再生チューブを構成してもよく、スポンジが内層であり、強化材が外層であってもよい。この場合、スポンジ内層と強化材外層は完全に分離してもよく、スポンジと強化材が混在する層があってもよい。
【００１３】
本発明の神経再生チューブの厚みは０．１〜５ｍｍ程度、好ましくは０．５〜２ｍｍ程度、内径は０．１〜５ｍｍ程度、好ましくは０．５〜３ｍｍ程度である。
【００１４】
細胞接着性因子としては、コラーゲン（Ｉ型、IV型など）、ラミニン、フィブロネクチンなどが挙げられる。
【００１５】
成長因子としては、神経成長因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子、神経突起進展因子などが挙げられる。
【００１６】
細胞接着性因子及び成長因子は、スポンジの内部に含まれていてもよく、スポンジの表面にコーティングされていてもよい。細胞接着性因子及び成長因子は、さらに強化材の内部に含まれていてもよく、強化材の表面にコーティングされていてもよい。
【００１７】
本発明の神経再生チューブは、以下の工程（Ａ）〜工程（Ｃ）を含む方法により製造できる：
工程（Ａ）：筒状芯体の外側に合成生体吸収性繊維から構成される筒状強化材を固定する、
工程（Ｂ）：得られた強化材固定芯体を合成生体吸収性高分子溶液に浸漬後凍結乾燥して、筒状強化材よりも分解吸収期間の短いスポンジ層を形成する、及び
工程（Ｃ）：凍結乾燥物を筒状芯体から外し、必要に応じて反転する。
【００１８】
工程（Ａ）において、筒状強化材は筒状芯体の外側に密着するように外嵌してもよく、この場合、筒状強化材を外層に含む神経再生チューブが得られる（強化材が開口を有する場合、該開口にスポンジが侵入する）。また、筒状芯体の所定の位置（例えば神経再生チューブの長さに対応する位置）に、筒状強化材を固定するための着脱可能な突出部（例えば放射状の突起、ドーナツ状の鍔など）を設けることにより筒状芯体から離れた位置に固定してもよい。この場合、強化材と筒状芯体の隙間に合成生体吸収性高分子溶液が侵入するように、強化材或いは前記突起部において開口を有する。このように、筒状強化材を筒状芯体から離れた位置に固定することで、強化材とスポンジが一体となった（強化材がスポンジで囲まれた）神経再生チューブが得られる。
【００１９】
なお、筒状芯体は、内部に合成生体吸収性高分子溶液が侵入しないものが使用できる。
【００２０】
工程（Ｂ）において、合成生体吸収性高分子溶液は、強化材を構成する高分子をできるだけ溶かさない溶液であるのが望ましい。該溶液の溶媒としては、ジオキサン、クロロホルム、アセトニトリル、塩化メチレンなどが挙げられる。該溶媒が強化材を構成する高分子を溶解し得る場合、該溶媒の濃度が飽和溶解度に近くなるように、濃度、温度を調節するか、或いは  合成生体吸収性高分子溶液に強化材固定芯体を浸漬する時間をできるだけ短くし、浸漬後速やかに凍結乾燥するのが望ましい。
【００２１】
合成生体吸収性高分子溶液の濃度としては、０．１〜２０重量％程度、好ましくは１〜１０重量％程度である。
【００２２】
工程（Ｃ）において、浸漬後の凍結乾燥物を筒状芯体から外した場合、スポンジは強化材の外側に存在するか（強化材を筒状芯体に密着固定）、外側と内側の両方（強化材を筒状芯体と離れた位置に固定）に存在する場合がある。スポンジが強化材の外層として存在する場合、これを反転してスポンジを内面に有する神経再生チューブを得る。強化材の両側にスポンジ層を有する場合、内面がスポンジであるので必ずしも反転する必要はないが、強化材の外側のスポンジ層が内側と比較してより厚い場合、反転させて、内側のスポンジ層をより厚くした神経再生チューブを得るのが望ましい。
【００２３】
反転は、チューブの一端をチューブ内径より細い保持具にてつかんだ状態で、チューブの端をチューブ内に押し込んでいくことにより行うことができる。
【００２４】
反転を行わない場合、強化材を中空の第１筒状芯材の内側に固定し、中心部にさらに筒状の第２筒状芯材を固定し、第１筒状芯材と第２筒状芯材の間に合成生体吸収性高分子溶液を流し込んで凍結乾燥すれば、反転を行わないで、内面にスポンジを有する神経再生チューブを得ることができる。
【００２５】
合成生体吸収性高分子溶液に、細胞接着性因子及び／又は成長因子を所定の濃度で配合しておけば、該因子がスポンジ内に含まれる神経再生チューブを得ることができる。
【００２６】
工程（Ｂ）で得られたスポンジ及び強化材を有する筒状芯体を細胞接着性因子及び／又は成長因子の溶液（好ましくは水溶液）に浸漬して凍結乾燥する工程を行うことによっても、細胞接着性因子及び／又は成長因子でコーティングされたスポンジ内面を有する神経再生チューブを得ることができる。また、成長因子を架橋ゼラチン微粒子に包含させてからスポンジと複合化させてもよい。
【００２７】
細胞接着性因子の濃度としては、０．０１〜１０％程度が例示される。
【００２８】
細胞接着性因子及び／又は成長因子の溶液は、通常水溶液が用いられるが、含水アルコール等の水性溶液を用いてもよい。
【００２９】
チューブ内面にシュワン細胞を播種して培養すると、チューブ内面にシュワン細胞が１層で好ましくは内腔全周に存在する神経再生チューブを得ることができる。シュワン細胞を内腔全周に接着させるためには、チューブを回転させながら（転がしながら）ピペッティングして内腔全体にシュワン細胞を播種するのが好ましい。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明する。
製造例１
ポリ乳酸繊維(40d)を組紐機を用いて製紐し、筒状芯材とした。これをステンレス製ロッドにはめ、乳酸／ε−カプロラクトン共重合体（モル比５０／５０）のジオキサン溶液（５重量％）に浸漬後、−４０℃にて凍結してから３０℃で２４時間凍結乾燥した。このようにして、内層に乳酸／ε−カプロラクトン共重合体スポンジ、外層にポリ乳酸組紐からなる強化材を有する複合体（実験例４の(A)）を得た。
【００３１】
コラーゲン（Type I、豚腱由来アテロコラーゲン）の０．１％溶液を上記スポンジ複合体に十分に浸透させ、−１００℃にて凍結後３０℃にて２４時間凍結乾燥した。内面を含む全体にType Iコラーゲンがコーティングされたコラーゲンチューブ（実験例４の（Ｃ））を得た。
【００３２】
得られた神経再生チューブは、図１（組紐強化材層表面の５０倍拡大写真）、図２（スポンジ内層の４００倍拡大写真）、図３（チューブの横断面の５０倍拡大写真）に示すように、内層がスポンジであり、外層は強化材であって、スポンジ層と強化材層は分離していた。
製造例２
ポリ乳酸繊維(40d)を組紐機を用いて製紐し、筒状芯材とした。これをステンレス製ロッドにはめ、乳酸／ε−カプロラクトン共重合体（モル比２５／７５）のジオキサン溶液（５重量％）に浸漬後、−４０℃にて凍結してから３０℃で２４時間凍結乾燥した。このようにして、内層に乳酸／ε−カプロラクトン共重合体スポンジ、外層にポリ乳酸組紐からなる強化材を有する複合体（実験例４の(B)）を得た。
製造例３
Type Iコラーゲンに代えてType IVコラーゲンを用いる他は製造例１と同様にして内面を含む全体にType IVコラーゲンがコーティングされたコラーゲンチューブ（実験例４の（Ｄ））を得た。
製造例４
Type Iコラーゲンに代えてType IコラーゲンとType IVコラーゲンの混合物（１：１重量比）を用いる他は製造例１と同様にして全体にType I ＋Type IVコラーゲンがコーティングされたコラーゲンチューブ（実験例４の（Ｅ））を得た。
実験例１
Fischer 344ラット雄１０匹の両坐骨神経を一時的に切離する。右側は、P(LA/CL)スポンジ内層、芯材PLLA組紐外層で作製されたチューブ（内径2mm、長さ４ｍｍ）にType I コラーゲンをコーティングしたものを用い、両端に2mmずつ神経を挿入し、これらの神経断端を密着させて神経接合を行った。神経接合は、８・０ナイロン糸により神経をチューブに縫合することにより行った。一方、左側には、一時的に切離した坐骨神経を8-0ナイロン糸にて縫合を行った。
【００３３】
術後８週にて両側坐骨神経を摘出し、移植部の中枢及び末梢の軸索数及び軸索密度を測定した。
【００３４】
これらの結果によると、P(LA/CL)スポンジをPLLA組紐からなる芯材で補強したチューブを用いると神経の再生は良好な結果を示し、切断された神経を縫合するよりも簡便な方法で同等もしくはそれを上回る結果が得られた。
実験例２
Fischer 344ラット雄１０匹の両坐骨神経を約１２ｍｍ切除した。右側は、P(LA/CL)スポンジ内層、PLLA組紐外層で作製されたチューブ（内径2mm、長さ１６ｍｍ）にType I コラーゲンをコーティングしたものを用い、両端に2mmずつ神経を挿入し、欠損間隔を１２ｍｍになるようにし、８・０ナイロン糸にてチューブの両末端と神経繊維を縫合することにより固定した。左側には、Type I コラーゲンに代えてType IV コラーゲンを用いてコーティングした他は同様にして神経繊維を固定した。
【００３５】
術後８週にて両側坐骨神経を摘出し、移植部の中枢及び末梢の軸索数及び軸索密度を測定した。
【００３６】
これらの結果によると、神経断端はType I コラーゲンとType IV コラーゲンは、いずれも同様に良好な結果を示した。
実験例３
日本白色家兎１０羽を用い、両側の総腓腹神経に約20mmの欠損を作成した。次に同側の腓腹神経を６０ｍｍ採取し、長さ20mm×３本のcable graftを作製して、総腓腹神経欠損部に手術用顕微鏡下に極性を反転させ移植した。うち５羽１０肢は縫合部はそのままとし、閉創しコントロールとした。残り５羽１０肢に対しては中枢及び末梢の神経接合部に長さ６ｍｍ、内腔2mmの生体吸収性チューブを縦割りしたもので全周を巻き込み再び管腔状となるように縫合した。それら２群について術後６ヶ月の時点で電気生理学的・機能的及び形態学的検索を行った。
実験例４
製造例１〜４で得られた以下の（Ａ）〜（Ｅ）の複合体を用いた。
（Ａ）：CL:PLLA(50:50)、コラーゲンコーティング（−）
（Ｂ）：CL:PLLA(75:25)、コラーゲンコーティング（−）
（Ｃ）：CL:PLLA(50:50)、Type Iコラーゲンコーティング（＋）
（Ｄ）：CL:PLLA(50:50)、Type IVコラーゲンコーティング（＋）
（Ｅ）：CL:PLLA(50:50)、Type I＋Type IVコラーゲンコーティング（＋）
上記複合体を軸方向に切り、平板状の複合体を得、これをディスク状に切断した。得られたディスク状の複合体をエタノール処理した後、ラットの後根神経節から採取し培養したシュワン細胞を前記複合体のスポンジ状のCL／PLLA共重合体上又はその表面を覆ったコラーゲンコーティング層上に播種し、その接着性を走査電子顕微鏡及び組織学的に検討した。なお、シュワン細胞の同定にはS-100抗体による免疫染色を行った。複合体（Ｃ）を用いたS-100抗体による免疫染色結果を図４に示す。
【００３７】
その結果、(A)〜(E)の全ての複合体において、CL／PLLA共重合体スポンジ上に一層性にシュワン細胞の接着が認められた。
【００３８】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、シリコーンチューブを使用した場合と同等以上の神経再生が行われ得、しかも生体吸収性材料のみからなっているので術後に取り出す必要がない。
【００３９】
死体の神経移植が近年実施されているが、免疫抑制約が必要であったり、ウイルス感染の危険があり、一般的な手法になり難いが、本発明にはそのような問題はない。
【図面の簡単な説明】
【図１】組紐強化材層表面を示す図面代用写真（５０倍拡大）である。
【図２】スポンジ内層を示す図面代用写真（４００倍拡大）である。
【図３】チューブの横断面を示す図面代用写真（５０倍拡大）である。
【図４】実験例４のS-100抗体による免疫染色結果を示す図面代用写真である。
【図１】
0004740482.tif 000002
【図２】
0004740482.tif 000003
【図３】
0004740482.tif 000004
【図４】
0004740482.tif 000005