(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のRNA及び第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含んでなる抗原を特異的に認識する抗ENA抗体の測定方法であって、
前記第１のRNAと実質的に同一である第２のRNAと、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一である第１のタンパク分子との複合体からなる抗原を再構築し、再構築された該抗原と検体とを反応させるステップを含む、ことを特徴とする抗ENA抗体の測定方法。
【請求項２】
第１のRNA、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、及び第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含んでなる抗原を特異的に認識し、かつその認識部位が前記第１のRNA、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、又はこれらの複合体のいずれかである抗ENA抗体の測定方法であって、
前記第１のRNAと実質的に同一である第２のRNAと、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一である第１のタンパク分子との複合体からなる抗原を再構築し、再構築された該抗原と検体とを反応させるステップを含む、ことを特徴とする抗ENA抗体の測定方法。
【請求項３】
下記a)〜c)のステップを含む、第１のRNA及び第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含んでなる抗原を特異的に認識する抗ENA抗体の測定方法。
a)前記第１のRNAと実質的に同一である第２のRNAと、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一である第１のタンパク分子との複合体からなる抗原を再構築するステップ、
b)再構築された前記抗原に検体を反応させるステップ、及び
c)ステップb)により生じた反応生成物を検出するステップ。
【請求項４】
下記a)〜c)のステップを含む、第１のRNA、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、及び第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含んでなる抗原を特異的に認識し、かつその認識部位が前記第１のRNA、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、又はこれらの複合体のいずれかである抗ENA抗体を測定する方法。
a)前記第１のRNAと実質的に同一である第２のRNAと、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一である第１のタンパク分子との複合体からなる抗原を再構築するステップ、
b)再構築された前記抗原に検体を反応させるステップ、及び
c)ステップb)により生じた反応生成物を検出するステップ。
【請求項５】
前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクは、U1RNP、Sm、SS-A、SS-B、Jo-1ならびにPM-Scl群より選ばれる細胞内非ヒストン可溶性タンパクである、ことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載される抗ENA抗体の測定方法。
【請求項６】
前記第２のRNAは遺伝子工学的手法又は化学合成により調製されたものである、ことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載される抗ENA抗体の測定方法。
【請求項７】
前記第１のタンパク分子は、リコンビナントタンパクである、ことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載される抗ENA抗体の測定方法。
【請求項８】
第１のRNA及び第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含んでなる抗原を特異的に認識する抗ENA抗体の測定に用いられる再構築された抗原であって、
前記第１のRNAと実質的に同一である第２のRNAと、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一である第１のタンパク分子との複合体からなる再構築された抗原。
【請求項９】
第１のRNA、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、及び第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含んでなる抗原を特異的に認識し、かつその認識部位が前記RNA、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、又はこれらの複合体のいずれかにある抗ENA抗体の測定に用いられる再構築された抗原であって、
前記第１のRNAと実質的に同一である第２のRNAと、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一である第１のタンパク分子との複合体からなる再構築された抗原。
【請求項１０】
前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクは、U1RNP、Sm、SS-A、SS-B、Jo-1ならびにPM-Scl群より選ばれる細胞内非ヒストン可溶性タンパクである、ことを特徴とする請求項８又は９に記載される再構築された抗原。
【請求項１１】
前記第２のRNAは遺伝子工学的手法又は化学合成により調製されたものである、ことを特徴とする請求項８〜１０のいずれかに記載される再構築された抗原。
【請求項１２】
前記第１のタンパク分子は、リコンビナントタンパクである、ことを特徴とする請求項８〜１１のいずれかに記載される再構築された抗原。
【請求項１３】
請求項８〜１２のいずれかに記載される再構築された抗原を不溶性支持体に結合してなる抗ENA抗体測定用固相化抗原。
【請求項１４】
第１のRNA及び第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含んでなる抗原を特異的に認識する抗ENA抗体測定用キットであって、
前記第１のRNAと実質的に同一である第２のRNAと、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一である第１のタンパク分子との複合体からなる再構築された抗原を不溶性支持体に固相化した固相化抗原と、抗ヒト免疫グロブリン抗体と、及び抗ENA抗体を含む標準検体と、を含んでなる抗ENA抗体測定用キット。
【請求項１５】
第１のRNA、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、及び第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含んでなる抗原を特異的に認識し、かつその認識部位が前記RNA、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、又はこれらの複合体のいずれかにある抗ENA抗体測定用キットであって、
前記第１のRNAと実質的に同一である第２のRNAと、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一である第１のタンパク分子との複合体からなる再構築された抗原を不溶性支持体に固相化した固相化抗原と、抗ヒト免疫グロブリン抗体と、及び抗ENA抗体を含む標準検体と、を含んでなる抗ENA抗体測定用キット。
【請求項１６】
前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクは、U1RNP、Sm、SS-A、SS-B、Jo-1ならびにPM-Scl群より選ばれる細胞内非ヒストン可溶性タンパクである、ことを特徴とする請求項１４又は１５に記載される抗ENA抗体測定用キット。
【請求項１７】
前記第２のRNAは遺伝子工学的手法又は化学合成により調製されたものである、ことを特徴とする請求項１４〜１６のいずれかに記載される抗ENA抗体測定用キット。
【請求項１８】
前記第１のタンパク分子は、リコンビナントタンパクである、ことを特徴とする請求項１４〜１７のいずれかに記載される抗ENA抗体測定用キット。
【請求項１９】
U1snRNA及びRNPとからなるU1RNPを特異的に認識する抗U1RNP抗体の測定方法であって、
前記U1snRNAと実質的に同一のRNAと、前記RNPと実質的に同一のタンパク分子との複合体からなる抗原を再構築し、再構築された該抗原と検体とを反応させるステップを含む、ことを特徴とする抗U1RNP抗体の測定方法。
【請求項２０】
下記A)〜C)のステップを含む、U1snRNA及びRNPとからなるU1RNPを特異的に認識する抗U1RNP抗体の測定方法。
A)前記U1snRNAと実質的に同一であるRNAと、前記RNPと実質的に同一であるタンパク分子との複合体からなる抗原を再構築するステップ、
B)再構築された前記抗原に検体を反応させるステップ、及び
C)ステップB)により生じた反応生成物を検出するステップ。
【請求項２１】
前記RNAは遺伝子工学的手法又は化学合成により調製されたものである、ことを特徴とする請求項１９又は２０に記載される抗U1RNP抗体の測定方法。
【請求項２２】
前記タンパク分子は、リコンビナントタンパクである、ことを特徴とする請求項１９〜２１のいずれかに記載される抗U1RNP抗体の測定方法。
【請求項２３】
下記a)〜c)のステップを含む、U1snRNA及びRNPを含んでなる抗原を特異的に認識する抗U1RNP抗体の測定方法。
a)遺伝子工学的手法又は化学合成により調製したU1snRNAと、３種のRNP、即ち、リコンビナントRNP70K、リコンビナントRNPA及びリコンビナントRNPCとの複合体からなる抗原を再構築するステップ、
b)再構築された前記抗原に検体を反応させるステップ、及び
c)ステップb)により生じた反応生成物を検出するステップ。
【請求項２４】
U1snRNAと実質的に同一であるRNAと、RNPと実質的に同一であるタンパク分子からなる、再構築された抗原であって、前記RNAは遺伝子工学的手法又は化学合成により調製されたものであり、前記第１のタンパク分子は、リコンビナントタンパクである、再構築された抗原。
【請求項２５】
請求項２４に記載される再構築された抗原を不溶性支持体に結合してなる抗U1RNP抗体測定用固相化抗原。
【請求項２６】
抗U1RNP抗体測定用キットであって、
U1snRNAと実質的に同一であるRNAと、RNPと実質的同一であるタンパク分子との複合体からなる再構築された抗原を不溶性支持体に固相化した固相化抗原と、抗ヒト免疫グロブリン抗体と、及び
抗U1RNP抗体を含む標準検体と、を含んでなる抗U1RNP抗体測定用キット。
【請求項２７】
前記RNAは遺伝子工学的手法又は化学合成により調製されたものである、ことを特徴とする請求項２６に記載される抗U1RNP抗体測定用キット。
【請求項２８】
前記タンパク分子は、リコンビナントタンパクである、ことを特徴とする請求項２６又は２７に記載される抗U1RNP抗体測定用キット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、抗ＥＮＡ抗体の測定方法及び測定キットに関する。詳しくは、細胞内非ヒストン可溶性タンパクであるＥＮＡ及びそれが結合するＲＮＡの複合体を用いた抗ＥＮＡ抗体の測定方法及び測定キットに関する。
背景技術
膠原病は、Ｐ．Ｋｌｅｍｐｅｒｅｒによって１９４２年に提唱された疾患概念であって、全身の結合組織にフィブリノイド変性が共通に認められる疾患の総称である。当初、膠原病の概念には、全身性エリテマトーデス、強皮症等の６疾患が含まれるとされていたが、今日では膠原病の概念はさらに広がりをみせている。膠原病における共通の病因ないし臨床的特徴の一つとして免疫異常が挙げられる。中でも、自己抗体の産生は特徴的で、膠原病患者の血清中には、種々の自己抗体が出現することが知られている。これらの自己抗体については、各疾患や臨床像との関連性が多くの研究者らによって研究、解明されてきており、特定の自己抗体の検出ないし測定は、具体的な疾患の特定又は診断、病因の究明、治療効果の判定、及び予後の推測等において有用であると考えられている。
膠原病患者血清中に出現する自己抗体の中で、等張緩衝液により細胞核から抽出される可溶性核抗原（ＥＮＡ：Ｅｘｔｒａｃｔａｂｌｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ）に対する抗体群は抗ＥＮＡ抗体と呼ばれている。抗ＥＮＡ抗体としては、その対応抗原により、抗ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）抗体、抗Ｓｍ抗体、抗ＳＳ−Ａ抗体、抗ＳＳ−Ｂ抗体等と称される種々の抗体が知られている。従来、抗ＥＮＡ抗体の測定は二重免疫拡散法（ＤＩＤ法）により行われてきた。
ＤＩＤ法は、特異性が高い反面、多数検体を同時に測定することが困難であり、また、測定結果について客観的判断が困難である点が問題とされている。一方、ＤＩＤ法に代わる測定方法として、各抗ＥＮＡ抗体に対応する抗原を用いたＥＬＩＳＡ法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）が提案されている。ＥＬＩＳＡ法は、簡便な操作により多数の検体を同時に処理できることに加えて、客観的な判定が容易であるといった利点を有するが、ＤＩＤ法では陽性判定となる検体の中に、ＥＬＩＳＡ法では陰性判定となるものが存在し、その乖離現象が問題とされていた（酒井  寛ら医学と薬学２１（５）；１９８９：９５７−６０）。以下、抗ＥＮＡ抗体の一種である抗ＲＮＰ抗体を例に挙げて具体的な問題点について述べる。
抗Ｕ１ＲＮＰ抗体は、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）やＭＣＴＤ（混合性結合組織病）患者等の自己免疫疾患患者血清中に高頻度で出現が認められる自己抗体である。この抗Ｕ１ＲＮＰ抗体の対応抗原は、ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）７０ｋタンパク（７０ｋＤａ）、ＲＮＰＡタンパク（３３ｋＤａ）、ＲＮＰＣタンパク（２２ｋＤａ）（以下、これらを総称して「ＲＮＰタンパク」という）であるといわれている（Ｔａｎ，Ｅ，Ｍ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４；１９８９：９３−１５２）。これらのＲＮＰタンパクは、生体内では、Ｕ１ｓｎＲＮＡ（１６５ｂａｓｅ）と呼ばれる、小さなリボ核酸（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＲＮＡ）に結合した複合体として存在していることが知られている（Ｖｅｎｒｏｏｉｊ，Ｗ，Ｊ．，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１４；１９８７：７８−８２）。Ｕ１ｓｎＲＮＡには、ＲＮＰタンパクの他にＳｍＢ’、ＳｍＢ、ＳｍＤ、ＳｍＥ、ＳｍＦ、ＳｍＧと呼ばれるタンパクも結合しており、大きなリボ核酸−タンパク複合体を形成して生体内に存在していることが分っている。
抗Ｕ１ＲＮＰ抗体をＤＩＤ法による測定をする場合、哺乳動物組織を粉砕したものを抽出した、いわゆるｃｒｕｄｅな抗原（ＤＩＤ抗原）が用いられる。ＤＩＤ法では、まず、ＤＩＤ抗原と検体とを寒天等のゲル層に設けた別々のスポットに入れ、両者をゲル層内で拡散させる。検体中に抗ＥＮＡ抗体が含まれている場合には、ゲル層内でＤＩＤ抗原と沈降物を形成し、沈降線として観察される。この沈降線がコントロールとして用いる既知の抗ＲＮＰ抗体陽性検体が形成する沈降線と融合するか否かにより抗Ｕ１ＲＮＰ抗体陽性又は陰性の判定がなされる。
一方、抗Ｕ１ＲＮＰ抗体をＥＬＩＳＡ法で測定する場合においては、Ｕ１ＲＮＰの構成要素である上記３種のタンパク（ＲＮＰ７０ｋ、ＲＮＰＡ、ＲＮＰＣ）を調製し、これを固相化したものが一般に用いられる。抗Ｕ１ＲＮＰ抗体はこれらのタンパクを抗原としていると考えられていたためである。しかしながら、これらのタンパク部分ではなくＵ１ｓｎＲＮＡを認識する抗Ｕ１ＲＮＰ抗体が存在することが、ＷｉｌｕｓｚならびにＫｅｅｎｅらにより確認された（Ｗｉｌｕｓｚ，Ｊ．，Ｋｅｅｎｅ，Ｊ．Ｄ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１（１２）；１９８６：５４９７−７２）。したがって、このタンパク部分ではなく、核酸（Ｕ１ｓｎＲＮＡ）部分を認識する抗Ｕ１ＲＮＰ抗体を検出できていないことがＤＩＤ法とＥＬＩＳＡ法の判定結果における乖離現象の一因であると推測される、また、立体的にＲＮＡタンパク複合体を形成することにより、あらたな抗原認識部位をＲＮＡタンパク複合体が呈示することも予測される。
本発明が解決しようとする課題は、従来の抗ＥＮＡ抗体の測定法における上記欠点を克服した新規な抗ＥＮＡ抗体の測定方法を提供することにある。
発明の開示
上記の課題を解決すべく、本研究者らは、まず抗Ｕ１ＲＮＰ抗体を対象としてＤＩＤ法についての検討を以下のように行った。
ＤＩＤ法に用いられるｃｒｕｄｅな抗原（以下、「ＤＩＤ抗原」という）を用いて抗Ｕ１ＲＮＰ抗体陽性検体を測定した場合には、沈降線が１本得られ、この沈降線がコントロールとして用いる既知の抗ＲＮＰ抗体陽性検体が形成する沈降線と融合するか否かにより検体が陽性であるか陰性であるかの判定がされる（酒井  寛ら医学と薬学２１（５）；１９８９：９５７−６０）。このｃｒｕｄｅな抗原をリボヌクレアーゼ処理したものを用いて、同様に測定を行ったところ、陽性検体において沈降線が消失してしまう現象が観察された。このことより、ＤＩＤ抗原中のＲＮＰタンパクは、Ｕ１ｓｎＲＮＡとの複合体を形成した状態で存在するものと推察された。なぜなら、仮に、ＤＩＤ抗原において３種の分子量の異なるＲＮＰタンパクが個別に存在するならば、抗Ｕ１ＲＮＰ抗体陽性検体と反応して得られる沈降線は、検体にもよるが最大で３本観察できるはずであり、また、ＤＩＤ抗原をリボヌクレアーゼ処理しても沈降線の消失は理論上起き得ないはずだからである。
また、免疫沈降法及びＥＬＩＳＡ法により、検体中の抗Ｕ１ＲＮＰ抗体とＵ１ｓｎＲＮＡとの反応性について検討を行った（後述の［参考実験例１］の（３）を参照）。上記のように、ＲＮＰタンパク部分ではなくＵ１ｓｎＲＮＡを認識する抗Ｕ１ＲＮＰ抗体の存在が証明されていたため、ＤＩＤ法では陽性であるがＲＮＰタンパクを用いたＥＬＩＳＡ法では陰性と判定される乖離検体は、Ｕ１ｓｎＲＮＡに対して反応性を持つのではないかと考えた。そこで、Ｕ１ｓｎＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法にて作製し（後述の［実施例１］を参照）、このＵ１ｓｎＲＮＡを用いて免疫沈降法及びＥＬＩＳＡ法により乖離検体の測定を行った。その結果、両測定方法において、Ｕ１ｓｎＲＮＡに反応性を持つものは一部の検体であった。
続いて、Ｕ１ｓｎＲＮＡと３種のＲＮＰタンパクをそれぞれ調製し、これらをＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ中で混合し、固相化したＥＬＩＳＡ系では、用いた乖離検体の全てが陽性と判定される結果であった。このことは、Ｕ１ｓｎＲＮＡがＲＮＰタンパクとｂｕｆｆｅｒ中で複合体を形成し、この複合体が固相化されたことを強く示唆するものである。また、この結果は、乖離検体中には、Ｕ１ｓｎＲＮＡ及び３種のＲＮＰタンパクを個別に認識する抗Ｕ１ＲＮＰ抗体以外に、Ｕ１ｓｎＲＮＡ−ＲＮＰタンパク複合体を認識する抗Ｕ１ＲＮＰ抗体の存在を示唆するものである。
本発明は、以上の検討及びそれにより得られた知見に基づくものであり、本発明の第１の局面は以下の構成からなる。
第１のＲＮＡ及び第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含んでなる抗原を特異的に認識する抗ＥＮＡ抗体の測定方法であって、
前記第１のＲＮＡと実質的に同一である第２のＲＮＡと、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一である第１のタンパク分子との複合体を形成し、該複合体と検体とを反応させるステップを含む、ことを特徴とする抗ＥＮＡ抗体の測定方法。
上記構成の抗ＥＮＡ抗体の測定方法によれば、まず、抗ＥＮＡ抗体が認識する抗原に含有されるＲＮＡ及び細胞内非ヒストン可溶性タンパクと、それぞれ実質的に同一のＲＮＡ及びタンパク分子とを用いて複合体が形成される。即ち、生体内における状態に近い抗原（複合体）が再構築され、これと検体中の抗ＥＮＡ抗体との反応性（結合性）が測定される。したがって、生体内における状態の抗原を認識し得る抗ＥＮＡ抗体を感度良く検出できる。このことは、従来、生体材料から抽出したｃｒｕｄｅな抗原を用いて測定した場合と、細胞内非ヒストン可溶性タンパクのみを抗原として測定した場合に生じていた測定結果の相違を解消できることをも意味する。即ち、ＤＩＤ法（二重免疫拡散法）を例に採れば、そこで用いられる抗原は、哺乳動物組織を出発材料として得られた抽出液であって、かかる抽出液中では、ほとんどの抗原（ＥＮＡ）は単独で存在しておらず、固有のＲＮＡに結合した状態で存在していると考えられる。従って、従来のＤＩＤ法においては、ＲＮＡに結合した状態のＥＮＡを認識する抗ＥＮＡ抗体の量が測定されていた。一方、測定対象の抗ＥＮＡ抗体が認識する細胞内非ヒストン可溶性タンパクを調製し、これを抗原としたＥＬＩＳＡ法による抗ＥＮＡ抗体の測定も提案されているが、その場合には単独で存在する細胞内非ヒストン可溶性タンパクを認識する抗ＥＮＡ抗体が測定されることとなる。このように、ＤＩＤ法とＥＬＩＳＡ法では、異なる抗原を用いて測定が行われるため、測定結果の整合ないし相関が得られない場合が生じていた。本発明の第１の局面における構成では、上記のように、生体に近い状態での抗原を用いて抗ＥＮＡ抗体の測定を行うため、生体材料からの抽出液を用いたＤＩＤ法等の従来法と高い相関性をもった測定が行える。
また、本発明の第１の局面で用いる複合体（抗原）は、遺伝子工学的手法、生化学的手法等を用いて容易に調製することができることから、測定操作の簡略化が図られ、また、安定した品質の製品が供給可能となる。
さらに、本発明の第１の局面では、新たに再構築した複合体を抗原として用いるため、従来法のように生体組織からの抽出物をもって抗原溶液とした場合に比較して、抗原（溶液）中の夾雑物の影響を大幅に減少でき、測定感度の向上が期待できる。
加えて、ＤＩＤ法との比較の観点からいえば、多量かつ不純物の含量の少ない抗原を調製可能であり、本発明の構成は多数検体を同時に測定可能なＥＬＩＳＡ法等に適用し得ることから、多数検体を短時間で測定可能であるといった利点もある。
発明を実施するための最良の形態
本発明の第１の局面における「抗原」は、第１のＲＮＡ（リボ核酸）及び第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含んで構成される。即ち、本発明の第１の局面では、生体内においてＲＮＡと細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含んで構成される抗原を特異的に認識する抗ＥＮＡ抗体が測定される。また、抗原として、第１のＲＮＡ及び第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクに加えて第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含んで構成されるものも含まれる。
第１のＲＮＡは、後述の第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクが特異的に結合するものであり、当該細胞内非ヒストン可溶性タンパクに固有のものである。例えば、Ｕ１ｓｎＲＮＡ、Ｕ２ｓｎＲＮＡ、ｈＹ１−５ｓｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ等である。第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクには、公知のＥＮＡ（可溶性核抗原：Ｅｘｔｒａｃｔａｂｌｅ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ）が含まれ、例えば、Ｕ１ＲＮＰ、Ｓｍ、ＳＳ−Ａ、ＳＳ−Ｂ、Ｊｏ−１ならびにＰＭ−Ｓｃｌのいずれかである。また、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクは単独のタンパクからなる場合はもちろんのこと、複数のタンパクの集合から構成される場合もある。例えば、ＲＮＰの場合においては、ＲＮＰ−７０ｋタンパク（７０ｋＤａ）、ＲＮＰ−Ａタンパク（３３ｋＤａ）及びＲＮＰ−Ｃタンパク（２２ｋＤａ）をもって、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクとすることができる。もちろん、これら３種のタンパクから任意に選択される１又は２種のタンパクをもって、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクとすることもできる。
抗原に第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパクが含まれる場合における、当該第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパクは第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと異なるタンパク分子であって、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクが結合する部位と異なる部位において第１のＲＮＡと結合するタンパクである。第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパクとしては、例えば、Ｕ１ＲＮＰ、Ｓｍ、ＳＳ−Ａ、ＳＳ−Ｂ、Ｊｏ−１又はＰＭ−Ｓｃｌを挙げることができる。また、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと同様に、単独のタンパクからなる場合はもちろんのこと、複数のタンパクの集合から構成される場合もある。例えば、ＳｍＢ’、ＳｍＢ、ＳｍＥ、ＳｍＦ、及びＳｍＧの集合からなるＳｍタンパクをもって、第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパクとすることができる。
本明細書中において、「抗ＥＮＡ抗体」とは、第１のＲＮＡ及びそれに対応する第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含む抗原を特異的に認識する抗体である。従って、抗ＥＮＡ抗体には、細胞内非ヒストン可溶性タンパク部分を認識するもの、当該細胞内非ヒストン可溶性タンパクが結合するＲＮＡ部分を認識するもの、及び当該細胞内非ヒストン可溶性タンパク及び当該ＲＮＡとの複合体部分を認識するものが含まれる。また、複合体部分には、細胞内非ヒストン可溶性タンパクとＲＮＡとが複合体を形成し、特定のコンフォメーションをとることにより形成される部分をも含むこととする。例えば、第１のＲＮＡがＵ１ｓｎＲＮＡ、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクがＲＮＰの場合には抗Ｕ１ＲＮＰ抗体が該当する。また、第１のＲＮＡがＵ１ｓｎＲＮＡ、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクをＳｍとした場合には抗Ｓｍ抗体が該当する。ここで、抗原が第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含む場合には、抗ＥＮＡ抗体は、第１のＲＮＡ第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、又はこれらの複合体を認識する抗体の集合であって、第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパク部分を認識するものを含まない。
本発明の第１の局面の測定方法では、まず抗原に含まれる第１のＲＮＡと実質的に同一である第２のＲＮＡと、上記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一の第１のタンパク分子との複合体（以下、「ＲＮＡタンパク複合体」という）が形成される。抗原に第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパクが含まれる場合においても、第１のＲＮＡと実質的に同一である第２のＲＮＡと、上記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一の第１のタンパク分子との複合体が形成される。
ここで、「実質的に同一である」とは、抗ＥＮＡ抗体との結合性において機能的なコンフォメーションを形成できるもののことをいい、第２のＲＮＡには、例えば、第１のＲＮＡと塩基配列が同一のもの、第１のＲＮＡの塩基配列の一部が欠損、置換若しくは付加されてなるものが含まれる。好ましくは第１のＲＮＡと同一の塩基配列を有するものが用いられる。尚、第２のＲＮＡは第１のタンパク分子と少なくとも結合できる必要がある。第１のタンパク分子において実質的に同一とは、例えば、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクとアミノ酸配列が同一のもの、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクのアミノ酸配列の一部が欠損、置換若しくは付加されてなるものが含まれる。好ましくは第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと同いるのアミノ酸配列を有するものが用いられる。上述のように第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクが複数のタンパクの集合からなる場合には、当該複数のタンパクとそれぞれ実質的に同一のタンパク分子の集合を第１のタンパク分子とすることが好ましい。尚、第１のタンパク分子は、第２のＲＮＡと少なくとも結合できる必要がある。
このような第２のＲＮＡは、例えば、公知の第１のＲＮＡの塩基配列を基に化学合成により作製することができる。また、哺乳動物組織、或いは哺乳動物培養細胞から公知の生化学的手法、遺伝子工学的手法を用いて上記第１のＲＮＡを精製し、これを第２のＲＮＡとして用いることもできる。また、精製した第１のＲＮＡを基に公知の遺伝子工学的手法によりこれを増幅して第２のＲＮＡとすることができる。例えば、抗ＥＮＡ抗体陽性のヒト血清中の抗ＥＮＡ抗体をｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ等の担体に結合させ、これへ適当な細胞抽出液（例えば、ＨｅＬａ細胞抽出液）等を添加することにより、ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合している抗ＥＮＡ抗体に特異的に結合する抗原をトラップさせる。そして、かかる抗原を周知の方法により精製することにより、抗原中のＲＮＡを得ることができる。このＲＮＡを鋳型にｃＤＮＡを調製し、続いて周知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法を実施して得られる当該ｃＤＮＡの転写産物を第２のＲＮＡとすることができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法に用いられる転写ベクターの種類は特に限定されず、公知のものを任意に選択して用いることができる。尚、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法を実施する前に、予めｃＤＮＡをＰＣＲ法により増幅しておくことが好ましい。最終的に得られる第２のＲＮＡの収量を増加させるためである。
第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一である第１のタンパク分子は、哺乳動物細胞組織、或いは哺乳動物培養細胞から公知の生化学的手法等を用いて精製したものを用いることができる。また、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクのアミノ酸配列が公知の場合には、当該アミノ酸配列をコードする遺伝子を用いてリコンビナントタンパクを作製し、これを第１のタンパク分子とすることができる。多量に調製する場合には、後者の方法が特に好ましい。リコンビナントタンパクを用いる場合には、タグ部分を有するものとすることが好ましい。即ち、タグ分子との融合タンパクとして発現させたリコンビナントタンパクとすることが好ましい。タグ部分に特異的に結合する担体を用いたアフィニティーカラムを利用することにより精製が容易に行えるからである。タグとしては、例えば、数個のヒスチジンからなるＨｉｓ−Ｔａｇ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、チオレドキシン、マルトース結合タンパク、Ｍｙｃ、Ｘｐｒｅｓｓ、ＦＬＡＧ等を用いることができる。中でも、Ｈｉｓ−ｔａｇが好ましい。Ｈｉｓ−ｔａｇは小さな分子であるため、これを用いることにより、第１のタンパク分子に占めるタグ部分が小さくなり、当該第１のタンパク分子と第２のＲＮＡ又は抗ＥＮＡ抗体の結合性に及ぼす影響が小さいものと考えられるからである。また、第１のタンパク分子は水系ｂｕｆｆｅｒであるＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ、Ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ又はＴｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ等に溶解できるものが好ましいからである。上記結合性の観点からは、タグ部分を有しないリコンビナントタンパクを用いることも好ましい。このようなリコンビナントタンパクは、タグ分子との融合タンパクとして発現させたものを、後にタグ部分を除去することにより調製することもできる。
上記のように作製された第２のＲＮＡと第１のタンパク分子を用いてＲＮＡタンパク複合体が形成される。例えば、両者を水系ｂｕｆｆｅｒ中に添加し、混合することにより両者を結合させる。この場合のｂｕｆｆｅｒは特に限定されるものではない。例えば、公知の組成からなるＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）ｂｕｆｆｅｒ、ｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ又はｔｒｉｓ（ｔｒｉｓ  ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）ｂｕｆｆｅｒが用いられる。
このようにして再構築されたＲＮＡタンパク複合体と検体とを反応させる。この操作により、検体中に存在する成分の一部（抗ＥＮＡ抗体）がＲＮＡタンパク複合体に特異的に結合し、抗ＥＮＡ抗体を測定することができる。このように、第２のＲＮＡと第１のタンパク分子により再構築されたＲＮＡタンパク複合体（新たな抗原）と検体とを反応させるため、この第２のＲＮＡ、第１のタンパク分子、又はこれらの結合体に結合性の成分のみを特異的に測定することが可能となる。このことは、第２のＲＮＡと第１のタンパク分子が、本来の抗原に含まれる第１のＲＮＡと第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクとそれぞれ実質的に同一であることから、第１のＲＮＡ、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、又はこれらの結合体に結合する成分のみが特異的に測定されることを意味するものである。
抗原に第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパクが含まれている場合においても、当該第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパクに対応する成分を含めずにＲＮＡタンパク複合体（抗原）が再構築され、これと検体とを反応させるため、検体中における、当該第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパクに結合性の成分を検出しない。即ち、第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパクに結合性の成分の影響を受けることなく検出ができ、特異的かつ高感度の測定が可能となる。
尚、本発明の第１の局面では、第１のＲＮＡ及び第１の非ヒストンタンパクに対応する第２のＲＮＡ及び第１のタンパク分子をそれぞれ調製し、これらの複合体（ＲＮＡタンパク複合体）を測定に利用する。仮に、生体材料からｎａｔｉｖｅの抗原を精製し、これを用いて同様の測定を行った場合には、本発明の効果は得られない。即ち、Ｕ１ＲＮＰを例に採れば、ｎａｔｉｖｅの状態のＵ１ＲＮＰはＵ１ｓｎＲＮＡにＲＮＰ及びＳｍが結合した状態で存在しているため、ｎａｔｉｖｅのＵ１ＲＮＰを抗原として用いれば、Ｕ１ｓｎＲＮＡ又はＲＮＰ部分に特異的に結合する抗体に加えて、Ｓｍ部分に結合する抗体も同時に検出（測定）されてしまうこととなる。本発明の第１の局面の測定方法では、例えば、Ｓｍを含まないＲＮＡタンパク複合体（抗原）が再構築され、これを用いて測定されるため、Ｓｍ部分に結合する抗体の影響を受けずに、Ｕ１ｓｎＲＮＡ又はＲＮＰに特異的に結合する抗体のみを検出することが可能となる。
ＲＮＡタンパク複合体と検体とを反応させて生じた反応生成物は直接測定することができる。即ち、本発明の第１の局面は、下記ａ）〜ｃ）のステップを含む、第１のＲＮＡ及び第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含んでなる抗原を特異的に認識する抗ＥＮＡ抗体の測定方法を含有する。
ａ）前記第１のＲＮＡと実質的に同一である第２のＲＮＡと、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一である第１のタンパク分子との複合体を形成するステップ、ｂ）前記複合体に検体を反応させるステップ、及びｃ）ステップｂ）により生じた反応生成物を検出するステップである。
また、本発明の第１の局面は、下記ａ）〜ｃ）のステップを含む、第１のＲＮＡ、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、及び第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含んでなる抗原を特異的に認識し、かつその認識部位が前記第１のＲＮＡ、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、又はこれらの複合体のいずれかである抗ＥＮＡ抗体を測定する方法を含有する。
ａ）前記第１のＲＮＡと実質的に同一である第２のＲＮＡと、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一である第１のタンパク分子との複合体を形成するステップ、ｂ）前記複合体に検体を反応させるステップ、及びｃ）ステップｂ）により生じた反応生成物を検出するステップ、である。
ＲＮＡタンパク複合体と検体とを反応させて生じた反応生成物を標識化し、標識量を測定することにより検出することもできる。この場合の標識化は、例えば、標識物質により標識された抗体（２次抗体）をステップｂ）により生じた反応生成物に反応させ、当該２次抗体を反応生成物に含まれる抗ＥＮＡ抗体に結合させることにより行うことができる。この場合の２次抗体は、反応生成物に含まれる抗ＥＮＡ抗体に結合性のあるものが用いられる。換言すれば、測定対象である抗ＥＮＡ抗体の種類に応じて適宜選択される。例えば、検体としてヒト生体液（ヒト血清等）を用いた場合には、抗ＥＮＡ抗体はヒト型の抗体であるので、２次抗体としては、標識された抗ヒト免疫グロブリン抗体を用いることができる。
標識化に用いる標識物質としては、検出可能な感度を有すれば特に限定されることはなく、公知の蛍光色素、酵素、放射性物質、ビオチン等を用いることができる。また、フェリチン、コロイド金等の電子密度の高い物質を用いることもできる。蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンＢイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）等が挙げられる。酵素としては、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、シトクロムｃ等が挙げれる。放射性物質としては、１２５Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ等が挙げられる。
ＲＮＡタンパク複合体は、予め不溶性支持体に結合させ、固相化した状態で用いることができる。ＲＮＡタンパク複合体を固相化することにより、当該複合体の安定化、取扱い及び保存の容易化等が図られ、また、簡便な操作による測定が可能となる。不溶性支持体としては、例えばポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等の樹脂、ガラス、やミセル粒子等の水に不溶性の物質が用いられ、特にその材質は限定されない。また、不溶性支持体の形状も特に限定されず、トレイ状、球状、棒状、繊維状、セル状、試験管状等の形状のものを採用することができる。この不溶性支持体への複合体の担持は物理吸着又は化学吸着によって行われる。
検体としては、血清、血漿、尿、髄液、腹水、胸水等の生体液が用いられる。好ましくは、血清が用いられる。血清を用いれば、簡便な測定が可能である。
上記の測定方法によれば、例えば、固相化した当該複合体に検体を反応させた後、反応生成物を標識化し、標識量を測定することにより、当該複合体に特異的に結合する検体中の成分、即ち抗ＥＮＡ抗体を測定することができる。
また、ＲＮＡタンパク複合体に結合可能な標準物質としての抗ＥＮＡ抗体（以下、「標準抗ＥＮＡ抗体」という）を用意し、これと検体とを競合的にＲＮＡタンパク複合体に反応させ、その結果ＲＮＡタンパク複合体に結合した標準抗ＥＮＡ抗体の量を測定することにより、間接的に検体中の抗ＥＮＡ抗体を定量することもできる。例えば、標準抗ＥＮＡ抗体を標識物質により標識化しておけば、反応生成物の標識量を測定することにより、ＲＮＡタンパク複合体に結合した標準抗ＥＮＡ抗体の量が測定される。
標準抗ＥＮＡ抗体は、例えば、抗ＥＮＡ抗体陽性の血清から公知の生化学的手法等により調製することができる。
また、標識物質としては、検出可能な感度を有すれば特に限定されることはなく、公知の蛍光色素、酵素、放射性物質、ビオチン等を用いることができる。また、フェリチン、コロイド金等の電子密度の高い物質を用いることもできる。蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンＢイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）等が挙げられる。酵素としては、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、シトクロムｃ等が挙げれる。放射性物質としては、１２５Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ等が挙げられる。
尚、ＲＮＡタンパク複合体と検体とを反応させて生ずる反応生成物を直接測定する方法としては、例えば、ＲＮＡタンパク複合体と、検体とをそれぞれゲル内で拡散させ、両者の結合を沈降線として観察する方法を挙げることができる。
以上のように、本発明の測定方法はＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、免疫比濁法、ラテックス凝集法、免疫沈降法、二重免疫拡散法等の各種免疫学測定法に適用されるものであり、また、第２のＲＮＡ及び第１のタンパク分子との複合体と検体とを反応させるステップを含むこれらの方法は、本発明に含有されるものである。
本発明の第１の局面において、測定対象の抗ＥＮＡ抗体を含む、所謂陽性検体を標準検体として用いることにより、検体の陽性、陰性の判定又は検体中の抗ＥＮＡ抗体の定量を行うことができる。
本発明の第１の局面は、特に、次の測定方法を含有する。
Ｕ１ｓｎＲＮＡ及びＲＮＰとからなるＵ１ＲＮＰを特異的に認識する抗Ｕ１ＲＮＰ抗体の測定方法であって、前記Ｕ１ｓｎＲＮＡと実質的に同一のＲＮＡと、前記ＲＮＰと実質的に同一のタンパク分子との複合体を形成し、該複合体と検体とを反応させるステップを含む、ことを特徴とする抗Ｕ１ＲＮＰ抗体の測定方法。
また、次の測定方法も含有する。
下記Ａ）〜Ｃ）のステップを含む、Ｕ１ｓｎＲＮＡ及びＲＮＰとからなるＵ１ＲＮＰを特異的に認識する抗Ｕ１ＲＮＰ抗体の測定方法。
Ａ）前記Ｕ１ｓｎＲＮＡと実質的に同一であるＲＮＡと、前記ＲＮＰと実質的に同一であるタンパク分子との複合体を形成するステップ、
Ｂ）前記複合体に検体を反応させるステップ、及び
Ｃ）ステップＢ）により生じた反応生成物を検出するステップ。
ステップＣ）においては、ステップＢ）により生じた反応生成物を標識化した後、標識量を測定することにより反応生成物の検出を行ってもよい。
本発明の第２の局面は、以下の構成からなる複合体である。
即ち、第１のＲＮＡ及び第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含んでなる抗原を特異的に認識する抗ＥＮＡ抗体の測定に用いられる複合体であって、前記第１のＲＮＡと実質的に同一である第２のＲＮＡと、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一である第１のタンパク分子からなる複合体である。本発明の第２の局面には、以下の構成からなる複合体が含まれる。第１のＲＮＡ、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、及び第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含んでなる抗原を特異的に認識し、かつその認識部位が前記ＲＮＡ、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、又はこれらの複合体のいずれかにある抗ＥＮＡ抗体の測定に用いられる複合体であって、前記第１のＲＮＡと実質的に同一である第２のＲＮＡと、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一である第１のタンパク分子からなる複合体である。
本発明の第２の局面である複合体は、上記本発明の第１の局面である抗ＥＮＡ抗体の測定方法に用いることができる。換言すれば、当該複合体に検体を反応させることにより、検体中の当該複合体に結合する成分である抗ＥＮＡ抗体を測定することができる。
第２の局面における、第１のＲＮＡ、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、抗原、抗ＥＮＡ抗体、第１のＲＮＡと実質的に同一である第２のＲＮＡ、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一である第１のタンパク分子、及び複合体の各要素については、上記本発明の第１の局面で述べたので、その説明を省略する。
本発明の第２の局面には、特に、以下の構成からなる複合体が含有される。即ち、Ｕ１ｓｎＲＮＡと実質的に同一であるＲＮＡと、ＲＮＰと実質的に同一であるタンパク分子からなる複合体である。
本発明の第３の局面は、上記本発明の第２の局面における複合体を不溶性支持体に結合した固相化抗原である。即ち、第２のＲＮＡと第１のタンパク分子との複合体を不溶性支持体に結合してなる抗ＥＮＡ抗体測定用固相化抗原である。
本発明の第３の局面である固相化抗原は、上記第２の局面の場合と同様に、本発明の第１の局面である抗ＥＮＡ抗体の測定方法に用いることができる。換言すれば、当該固相化抗原に検体を反応させることにより、検体中の当該固相化抗原に結合する成分である抗ＥＮＡ抗体を測定することができる。第２のＲＮＡと第１のタンパク分子との複合体を固相化することにより、当該複合体の安定化、取扱い及び保存の容易化等が図られ、また、簡便な操作による測定が可能となる。
不溶性支持体の性状、複合体の不溶性支持体への結合方法については、上記本発明の第１の局面において詳述したので、その説明を省略する。
本発明の第３の局面には、特に、Ｕ１ｓｎＲＮＡと実質的に同一であるＲＮＡと、ＲＮＰと実質的に同一であるタンパク分子からなる複合体を不溶性支持体に結合してなる抗Ｕ１ＲＮＰ抗体測定用固相化抗原が含有される。
本発明の第４の局面は、以下の構成からなる抗ＥＮＡ抗体測定用キットである。即ち、第１のＲＮＡ及び第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含んでなる抗原を特異的に認識する抗ＥＮＡ抗体測定用キットであって、前記第１のＲＮＡと実質的に同一である第２のＲＮＡと、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一である第１のタンパク分子との複合体を不溶性支持体に固相化した固相化抗原と、抗ヒト免疫グロブリン抗体と、及び抗ＥＮＡ抗体を含む標準検体と、を含んでなる抗ＥＮＡ抗体測定用キットである。また、第１のＲＮＡ、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、及び第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパクを含んでなる抗原を特異的に認識し、かつその認識部位が前記ＲＮＡ、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、又はこれらの複合体のいずれかにある抗ＥＮＡ抗体測定用キットであって、前記第１のＲＮＡと実質的に同一である第２のＲＮＡと、前記第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパクと実質的に同一である第１のタンパク分子との複合体を不溶性支持体に固相化した固相化抗原と、抗ヒト免疫グロブリン抗体と、及び抗ＥＮＡ抗体を含む標準検体とを含んでなる抗ＥＮＡ抗体測定用キットである。
本発明の第４の局面である抗ＥＮＡ抗体測定用キットを用いれば、抗ＥＮＡ抗体を簡便に測定することが可能である。また、当該キットは、上述の本発明の第１の局面の測定方法に利用することができる。
本発明の第４の局面における、第１のＲＮＡ、第１の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、第２の細胞内非ヒストン可溶性タンパク、抗原、抗ＥＮＡ抗体、第２のＲＮＡ、第１のタンパク分子、複合体、不溶性支持体、及び固相化抗原の各要素については、上記本発明の第１の局面ないし第３の局面において詳述したので、その説明を省略する。
抗ヒト免疫グロブリン抗体の種類は特に限定されず、公知のものを用いることができる。また、抗ヒト免疫グロブリン抗体は標識化されたものを用いることができる。
標識化された抗ヒト免疫グロブリン抗体としては、例えば、市販のペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ（γ鎖）抗体コード番号２０８、抗ヒトＩｇＡ（α鎖）抗体コード番号２１０、抗ヒトＩｇＭ（μ鎖）抗体コード番号２１２（（株）医学生物学研究所  製）を用いることができる。また、標識化に用いられる標識物質は、検出可能な感度を有すれば特に限定されることはなく、公知の蛍光色素、酵素、放射性物質、ビオチン等を用いることができる。また、フェリチン、コロイド金等の電子密度の高い物質を用いることもできる。蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンＢイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）等が挙げられる。酵素としては、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、シトクロムｃ等が挙げれる。放射性物質としては、１２５Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ等が挙げられる。
抗ＥＮＡ抗体を含む標準検体としては、抗ＥＮＡ抗体陽性の血清、血漿、尿、髄液、腹水、胸水等の生体液が用いられる。好ましくは、血清が用いられる。
本発明の第４の局面には、特に、以下の構成のキットが含まれる。即ち、抗Ｕ１ＲＮＰ抗体測定用キットであって、Ｕ１ｓｎＲＮＡの実質的に同一であるＲＮＡと、ＲＮＰと実質的同一であるタンパク分子との複合体を不溶性支持体に固相化した固相化抗原と、抗ヒト免疫グロブリン抗体と、及び抗Ｕ１ＲＮＰ抗体を含む標準検体と、を含んでなる抗Ｕ１ＲＮＰ抗体測定用キットである。
この場合においても抗ヒト免疫グロブリン抗体として標識化されたものを用いることができる。
［実施例１］  Ｕ１ｓｎＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法による調製
Ｕ１ｓｎＲＮＡは、転写ベクターであるｐＧＥＭ−４Ｚ（プロメガ社  製）とＲｉｂｏＭＡＸ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ社  製）を組み合わせて用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法により調製した。
（１−１）Ｕ１ＤＮＡの調製
Ｕ１ｓｎＲＮＡを転写させる鋳型となるＵ１ＤＮＡをクローニングし、これをｐＧＥＭ−４Ｚベクターに組み込むことにより、Ｕ１ｓｎＲＮＡを転写できる転写ベクターを作製した。具体的な操作は以下のように行った。
まず、１．５ｍｌ微小遠心チューブにｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社  製）２ｍｇ、ＩＰＰ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％ＮＰ−４０）５００μｌ、及び抗Ｕ１ＲＮＰ陽性患者血清２０μｌを混合し、４℃で一晩、緩やかに振とうしながら反応させ、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに抗Ｕ１ＲＮＰ抗体を吸着させた。次に、遠心処理（１５，０００ｒｐｍ，１ｍｉｎ，４℃）し、上清を捨てた。ペレットにＩＰＰｂｕｆｆｅｒ  ５００μｌを添加し、ピペット操作でよく撹拌した後、再び遠心処理（１５，０００ｒｐｍ，１ｍｉｎ，４℃）した後、上清を捨てた。この操作を３回繰り返し、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに非特異的に吸着した余分な蛋白を取り除いた。上記操作により得られたペレットにＮＥＴ−２  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）４００μｌを添加し、更にＨｅＬａ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔ（ＨｅＬａ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔの調製方法は、例えば、ＨｅＬａ  ｃｅｌｌをＮＥＴ−２  ｂｕｆｆｅｒを添加してよく懸濁した後、超音波処理することで細胞を破砕し、遠心分離して不溶化物を除去する）２００μｌを添加したものを４℃、２時間、緩やかに振とうさせながら反応させることにより、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上に吸着した抗Ｕ１ＲＮＰ抗体にＨｅＬａ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔ中のＵ１ｓｎＲＮＡ−ＲＮＰ−Ｓｍ複合体をトラップ（結合）させた。
次に、余分な蛋白を取り除くために遠心処理（１５，０００ｒｐｍ，１ｍｉｎ，４℃）し、上清を捨てた。得られたペレットにＮＥＴ−２  ｂｕｆｆｅｒ  ５００μｌを添加し、ピペット操作でよく撹拌した。これを再び遠心処理（１５，０００ｒｐｍ，１ｍｉｎ，４℃）した後、上清を捨てた。この操作を５回繰り返すことにより洗浄効果を高めた。最後の遠心処理（洗浄）の後、上清を捨て、ペレットにＮＥＴ−２  ｂｕｆｆｅｒ  ３００μｌ、１０％ＳＤＳ  １５μｌ、及び３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）３０μｌを順次添加した。さらに、フェノール／クロロホルム混液３００μｌを加えた後、十分攪拌し、遠心処理（１５，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，４℃）を行った。その結果得られた上層を別のエッペンチューブに移し、これをＵ１ｓｎＲＮＡ溶液とした。
Ｕ１ｓｎＲＮＡ溶液に冷エタノール９００μｌを添加した後、−８０℃で１時間静置することにより冷却した。その後、遠心処理（１５，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）し、Ｕ１ｓｎＲＮＡを沈殿させた。
次に、ペレット状のＵ１ｓｎＲＮＡをリボヌクレアーゼフリーの滅菌水２０μｌに溶解し、Ｕ１ｓｎＲＮＡの３’側と対合できるＤＮＡプライマー（５’−ＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＣＧＣＧＡＡＣＧＣＡＧＴＣＣＣＣＣＡＣＴＡ−３’）（配列番号：１）を添加し、逆転写酵素を作用させることにより、ＲＮＡ−ＤＮＡのヘテロ二本鎖を作製した。その後、このヘテロ二本鎖を鋳型として、Ｕｐｐｅｒ  ＰＣＲプライマーとして（５’−ＡＴＡＣＴＴＡＣＣＴＧＧＣＡＧＧＧＧＡＧＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＣＡ−３’）（配列番号：２）とＬｏｗｅｒ  ＰＣＲプライマーとして上記逆転写酵素反応に用いたＤＮＡプライマーで公知の方法によりＰＣＲ反応を行い、Ｕ１ＤＮＡ断片（配列番号：３）を得た。
（１−２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法によるＵ１ｓｎＲＮＡの取得及び精製
上記（１−１）で得られたＵ１ＤＮＡ断片にＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩのリンカーを公知の方法（例えば、遺伝子工学実験ノート＜ＤＮＡ取扱いの基本とサブクローニング＞１１４貢、羊土社、１９９７を参照）により付加したものをｐＧＥＭ−４ＺのＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター（ＳＰ６プロモーター）支配下にあるマルチクローニングサイトのＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩの間に挿入させることにより、Ｕ１ｓｎＲＮＡを転写させることのできるベクターとした（以下、このベクターを「ｐＧＥＭ−Ｕ１ｓｎＲＮＡベクター」という）。つぎに、ｐＧＥＭ−Ｕ１ｓｎＲＮＡベクターを用いて以下の方法でｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法を行い、Ｕ１ｓｎＲＮＡを作製した。
まず、ｐＧＥＭ−Ｕ１ｓｎＲＮＡベクターを公知のセシウムクロライド法に従い、高純度で精製した。その後、リボヌクレアーゼの混入を防ぐために、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（１００μｇ／ｍＬ），ＳＤＳ（０．５％），５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５ｍＭ  ＣａＣｌ２で、３７℃、３０分間処理した。その後、フェノール／クロロホルム混液により除蛋白処理をし、続いて、エタノールを加えてｐＧＥＭ−Ｕ１ｓｎＲＮＡを沈殿させた。その結果得られた、高純度に精製されたｐＧＥＭ−Ｕ１ｓｎＲＮＡを、公知の手法に従い制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、線状とした。この線状ｐＧＥＭ−Ｕ１ｓｎＲＮＡを鋳型とし、ＲｉｂｏＭａｘ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ−ＳＰ６（プロメガ製  製）を用いて転写反応を行った。転写反応は、線状ｐＧＥＭ−Ｕ１ｓｎＲＮＡ（１μｇ／ｍＬ）５０μｌ，ＳＰ６  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ５倍濃縮ｂｕｆｆｅｒ１００μｌ，ｒＡＴＰ（１００ｍＭ）２５μｌ，ｒＧＴＰ（１００ｍＭ）２５μｌ，ｒＣＴＰ（１００ｍＭ）２５μｌ，ｒＵＴＰ（１００ｍＭ）２５μｌ，ヌクレアーゼフリー滅菌水２００μｌ，ＳＰ６  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ  ５０μｌを混合し、ｔｏｔａｌ  ｖｏｌｕｍｅ  ５００μｌとしたものを３７℃、４時間インキュベートすることにより行った。その他の操作手順等はＲｉｂｏＭａｘ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ−ＳＰ６に添付の操作説明書に従った。
続いて、反応終了液からＵ１ｓｎＲＮＡを以下の方法にて精製した。はじめに、線状ｐＧＥＭ−Ｕ１ｓｎＲＮＡ（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ）１μｇあたり１ｕｎｉｔのＤＮａｓｅ（プロメガ社  製）を添加し、３７℃で１５分反応させることによりＤＮａｓｅ処理を行った。反応終了後、ＴＥ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ４．５で飽和させたフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（各液の割合は順に２５：２４：１）混液５００μｌを添加してよく攪拌し、続いて遠心（１５，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，４℃）した後、上層を新しいエッペンチューブに移した。この操作により、ＤＮａｓｅ処理されたｐＧＥＭ−Ｕ１ｓｎＲＮＡ（ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＤＮＡ）及び未反応のｒＮＴＰｓを除去した。続いて、酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）５０μｌを添加し、さらにイソプロパノール５００μｌを添加して、氷上で５分間静置、冷却した後、遠心（１５，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）することにより、Ｕ１ｓｎＲＮＡを沈殿させた。沈殿したＵ１ｓｎＲＮＡは、冷７０％エタノールで洗浄し、真空乾燥させた後、ヌクレアーゼフリー滅菌水５００μｌに溶解した（精製Ｕ１ｓｎＲＮＡ）。
以上の結果得られた精製Ｕ１ｓｎＲＮＡは、３００倍に希釈した後、波長２６０ｎｍにおける吸光度の測定により濃度を算出し、収量を求めた。その結果、精製した段階において５００μｌあたり約２〜３ｍｇの精製Ｕ１ｓｎＲＮＡが得られた。尚、波長２６０ｎｍにおける吸光度（Ａ２６０）＝１．０をＲＮＡ  ４０μｇ／ｍｌとして計算した。
［実施例２］  ＲＮＰの調製
ヒスチジンタグを融合した３種のリコンビナントＲＮＰ（Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰ７０ｋ（６８ｋＤａ）とＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＡ（３５ｋＤａ）とＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＣ（２３ｋＤａ））を以下の方法により作製した。
（２−１）Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰ７０ｋ（６８ｋＤａ）の発現系の作製及びＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰ７０ｋの精製
Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰ７０ｋ（６８ｋＤａ）の発現には、昆虫細胞発現系を用いた。具体的にはｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製の発現システム（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ）を利用して行った。以下にその概要を示す。
まず、ＨｅＬａ  ｃｅｌｌから調整されたｃＤＮＡを鋳型にしてＵｐｐｅｒ  ＰＣＲプライマー（５’−ＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＣＧＣＣＣＡＡＣＣＴＴＣＴＧ−３’）（配列番号：４）とＬｏｗｅｒ  ＰＣＲプライマー（５’−ＣＴＣＣＧＧＣＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＡＡＡＴＡＣＣＣＡＴＴ−３’）（配列番号：５）を用いて公知のＰＣＲ法によりＲＮＰ７０ｋ遺伝子を増幅させ、これに６個のＨｉｓとなるＤＮＡ配列を３’側に付加したＤＮＡ断片（配列番号：６）を作製した。このＤＮＡ断片にＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩのリンカーを公知の方法（例えば、遺伝子工学実験ノート＜ＤＮＡ取扱いの基本とサブクローニング＞１１４貢、羊土社、１９９７を参照）により付加したものｐＶＬ１３９３ベクター（ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社  製）のマルチクローニングサイト中にあるＢａｍＨＩサイトとＥｃｏＲＩサイトの間に挿入し、ＲＮＰ７０ｋ発現ベクター（ｐＶＬ／ＲＮＰ７０ｋと呼ぶ）とした。このｐＶＬ／ＲＮＰ７０ｋをＢａｃｕｌｏ  Ｇｏｌｄ  Ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）と混合し、ホモロガスリコンビネーションさせてＳＦ９細胞にトランスフェクションさせた。トランスフェクションさせたＳＦ９細胞を用いたプラークアッセイを行い、透明のプラークを生じたものを選択し、これを増幅させてウイルス液を調製した。
一方、スピナーフラスコに８ＬのＴＭＮ−ＦＨ培地を入れ、この中でＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞を細胞数３〜７×１０５個／ｍｌになるまで２７℃、７０ｒｐｍで懸濁培養させる。所望の細胞数になったのを確認後、上述のウイルス液をｍ．ｏ．ｉ（感染多重度）＝５になるように添加してウイルス感染させ、さらに２７℃、７０ｒｐｍで３日間懸濁培養した。このようにして得られた培養液を遠心処理してＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞を集め、細胞３ｇにつき２０ｍｌのｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１０ｍＭ  ＮａＦ  ｉｎ  ＰＢＳ）を添加してよく懸濁し、氷上３０分静置した。その後、遠心処理を行い、破砕された細胞を沈殿として集めた。この沈殿物に８Ｍ尿素（ｉｎ  ＰＢＳ）を添加して沈殿を可溶化させた。このようにして得られた昆虫細胞液からＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰ７０Ｋを次のように精製した。まず、ニッケルイオンを担持させたＣｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（ファルマシア社  製）を予め平衡化しておき、これへ上記の昆虫細胞液を添加することにより、昆虫細胞液中のＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰ７０ｋを吸着させた。非特異的に結合した成分を洗浄、除去した後、イミダゾールを含むＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８）を用いてカラムに吸着したＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰ７０Ｋを溶出させた。その際、イミダゾール濃度を１０〜５００ｍＭに変化させながら溶出させ、Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰ７０ｋの含有されるフラクションを得た（精製Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰ７０ｋ）。
（２−２）Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＡ（３５ｋＤａ）の発現系の作製及びＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＡの精製
Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＡ蛋白の発現系は、発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）と大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の組み合わせから構築することができ、Ｎｏｖａｇｅｎ社製のｓｙｓｔｅｍ（ｐＥＴ  Ｓｙｓｔｅｍ）を利用した。以下、操作方法の概要を述べる。
まず、ＨｅＬａ  ｃｅｌｌから調整されたｃＤＮＡを鋳型にしてＵｐｐｅｒ  ＰＣＲプライマー（５’−ＡＴＧＧＣＡＧＴＴＣＣＣＧＡＧＡＣＣＣＧＣＣＣＴＡＡＣＣＡＣ−３’）（配列番号：７）とＬｏｗｅｒ  ＰＣＲプライマー（５’−ＣＴＴＣＴＴＧＧＣＡＡＡＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＴＧＧＣＧＴ−３’）（配列番号：８）を用いて公知のＰＣＲ法によりＲＮＰＡをコードする遺伝子を増幅させ、このＤＮＡ断片にＮｃｏＩ及びＸｈｏＩのリンカーを公知の方法（例えば、遺伝子工学実験ノート＜ＤＮＡ取扱いの基本とサブクローニング＞１１４貢、羊土社、１９９７を参照）により付加したもの（配列番号：９）を、ｐＥＴ２８ａ（＋）のマルチクローニングサイト中にあるＮｃｏＩサイトとＸｈｏＩサイトの間に挿入し、ＲＮＰＡ発現ベクター（ｐＥＴ／ＲＮＰＡと呼ぶ）とした。この発現ベクターの発現産物は、ＲＮＰＡのＣ末端に６個のＨｉｓ（ヒスチジン）が融合したものである。このｐＥＴ／ＲＮＰＡを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させ、Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＡの発現系を構築した。
次に、ｐＥＴ／ＲＮＰＡにより形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培養液１２０ｍｌ中で３７℃、２００ｒｐｍ、１６時間振とう培養した。この培養液を種母培養液とする。本培養は次のように行った。即ち、１０Ｌスケールのジャー培養装置に６Ｌの１％グルコースと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培養液を準備し、ここへ種母培養液１２０ｍｌを添加し、３７℃で撹拌しながらＯＤ６００が５〜８になるまで培養した。その後、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｔｈｉｏ＿β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を１ｍＭの濃度になるように添加し、さらに２時間培養した。次に、培養液を遠心して集菌し、２％Ｔｗｅｅｎ２０，０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ，１μｇ／ｍｌ  Ｌｅｕｐｅｐｓｉｎを含むＰＢＳ  ３００ｍｌを加えて懸濁し、大腸菌を破砕した。その後、遠心処理により破砕上清を採取した。以上の操作により得られた大腸菌抽出液を、予め平衡化しておいた、ニッケルイオンを担持させたＣｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（ファルマシア製）に添加し、大腸菌抽出液中のＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＡを吸着させた。非特異的にカラムに吸着した成分を洗浄、除去した後、イミダゾールを含むＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８）にてカラムに吸着したＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＡを溶出させた。その際、イミダゾール濃度を１０〜５００ｍＭに変化させながら溶出させ、Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＡの含有されるフラクションを得た（精製Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＡ）。
（２−３）Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＣ（２３ｋＤａ）の発現系の作製及びＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＣの精製
Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＣの発現系は、上記Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＡと同じ発現システムを用いた。発現ベクターｐＥＴ２８ａ（＋）のマルチクローニングサイトのＮｃｏＩとＸｈｏＩの間に挿入するＤＮＡ断片が、ＲＮＰＡをコードするＤＮＡ断片ではなく、ＲＮＰＣをコードする遺伝子の断片（配列番号：１０）である点のみ異なる。このＲＮＰＣ遺伝子をＰＣＲで増幅させるために用いたＰＣＲプライマーは、Ｕｐｐｅｒ  ＰＣＲプライマー（５’−ＡＴＧＣＣＣＡＡＧＴＴＴＴＡＴＴＧＴＧＡＣＴＡＣＴＧＣＧＡＴ−３’）（配列番号：１１）とＬｏｗｅｒ  ＰＣＲプライマー（５’−ＴＣＴＧＴＣＴＧＧＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＣＣＧＧＧＣＣＧＡＧＴ−３’）（配列番号：１２）である。また、Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＣの精製も上記Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＡと同じ精製法で行った。
［参考実験例１］  Ｕ１ｓｎＲＮＡと乖離検体との反応性の検討
（１）ＤＩＤ法による抗Ｕ１ＲＮＰ抗体の測定
ＤＩＤ法（二重免疫拡散法）は、別名オクテロニー法とも呼ばれ、その原理は寒天板上にいくつかの穴を開けた後、抗原と抗体を別々の穴から向かい合って拡散させると、両者の濃度が最適となったところで沈降線が形成されることを利用した測定方法である。
抗Ｕ１ＲＮＰ抗体のＤＩＤ法による測定は、ＥＮＡ−１テスト（（株）医学生物学研究所  製）を用いて測定した。測定はＥＮＡ−１テストに添付される操作説明書に従って行った。
まず、ウサギ胸腺より抽出した凍結乾燥粗抗原（粗Ｕ１ＲＮＰ抗原）を滅菌水１００μｌで溶解したもの２０μｌを寒天板の中心穴にのせ、その周りに開けた穴に対し、抗Ｕ１ＲＮＰ抗体陽性コントロール血清と検体血清を各２０μｌずつ交互にのせる。室温で一晩以上反応させると沈降線が観察できるようになる。検体中に抗Ｕ１ＲＮＰ抗体が存在する（陽性）、又は存在しない（陰性）かは、陽性コントロールに含まれる抗Ｕ１ＲＮＰ抗体及び抗Ｓｍ抗体と粗Ｕ１ＲＮＰ抗原中の成分とが結合することにより形成される沈降線と、検体と粗Ｕ１ＲＮＰ抗原中の成分とが結合することにより形成される沈降線とが融合するか否かにより判定される。通常、陽性コントロールによる沈降線は二本観察でき中心部に近い側に抗Ｕ１ＲＮＰ抗体による沈降線が見られ、その沈降線よりもより外側に抗Ｓｍ抗体による沈降線が見られる。
（２）ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）のみを用いたＥＬＩＳＡ法（従来型ＥＬＩＳＡ法）による抗Ｕ１ＲＮＰ抗体の測定
ＰＢＳに、実施例２で得られた３種のリコンビナントＲＮＰ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰ）を、ＲＮＰ７０ｋ  ０．５５μｇ／ｍｌ＋ＲＮＰＡ  ０．２７μｇ／ｍｌ＋ＲＮＰＣ  ０．１８μｇ／ｍｌ、ｔｏｔａｌ  １μｇ／ｍｌとなるように添加し、直ちに９６穴マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに１００μｌ／ウェルずつ分注した。これを４℃で一晩放置することにより、リコンビナントＲＮＰをプレート上に吸着させた。各ウェルから反応液を取り除き、続いてＰＢＳ  ２００μｌを各ウェルに添加し、１０秒程度放置した。その後、各ウェルのＰＢＳを取り除いた。この洗浄操作を２回繰り返し、プレートに吸着していないＲＮＰを除去した。更に、ブロッキングｂｕｆｆｅｒ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）２００μｌを各ウェルに添加し、４℃で一晩放置してブロッキングを行なった。その後、各ウェルよりブロッキングｂｕｆｆｅｒを除去し、十分乾燥させてＥＬＩＳＡ測定用プレートとした。
このようにして得られたＥＬＩＳＡ測定用プレートを用いて、実施例２の（２−１）におけるＤＩＤ法において陽性患者血清或いは陰性患者血清、及び健常人血清を用いて、各検体中の抗Ｕ１ＲＮＰ抗体を測定した。測定は、検体希釈用緩衝液で各血清を１００倍希釈したもの１００μｌをＥＬＩＳＡ測定用プレートの各ウェルに添加し、２５℃で１時間静置して１次反応させた。続いて、各ウェルより反応液を除去した後、１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを十分洗浄した。その後、ペルオキシダーゼ標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を含む標識抗体液１００μｌを各ウェルに添加し、２５℃で１時間静置して２次反応させた。反応液を除去した後、１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで各ウェルを十分洗浄し、続いて、テトラメチルベンチジンと過酸化水素を含む酵素基質液１００μｌを各ウェルに添加した。２５℃で３０分間酵素反応させた後、１Ｎ硫酸１００μｌを各ウェルに添加して発色させ、４５０ｎｍの吸光度を分光光度計にて測定した。
その結果、ＤＩＤ法陽性検体の中でＥＬＩＳＡ法では陰性と判定されたものが認められた。当該検体（乖離検体）を以下の（３）における検討に用いた。また、ＤＩＤ法陰性検体はＥＬＩＳＡ法でも全て陰性であった。健常人検体については、全て陰性と判定された。
（３）ＤＩＤ法陽性、ＥＬＩＳＡ法陰性となる検体（乖離検体）とＵ１ｓｎＲＮＡとの反応性の検討
上記（１）及び（２）の測定結果の比較により、ＤＩＤ法では陽性判定となり、リコンビナントＲＮＰを用いたＥＬＩＳＡ法では陰性判定と認められた検体（乖離検体）と、実施例１の（１−２）で得られるＵ１ｓｎＲＮＡとの反応性を免疫沈降法及びＥＬＩＳＡ法により検討した。
免疫沈降法は、Ｍａｒｋ  Ｓ．Ｆｏｒｍａｎらにより開発された手法（Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１２，１３５６−１３６１，１９８５）に基づき行った。Ｍａｒｋ  Ｓ．Ｆｏｒｍａｎらの手法におけるＨｅｌａ  ｃｅｌｌ  ｅｘｔｒａｃｔの代わりに実施例１の（１−２）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法で得られるＵ１ｓｎＲＮＡを用いた。具体的には、以下の操作を行った。
まず、１．５ｍｌ微小遠心チューブにｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社  製）２ｍｇ、ＩＰＰ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０，５００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％ＮＰ−４０）５００μｌ、及び乖離検体血清２０μｌを混合し、４℃で一晩、緩やかに振とうしながら反応させ、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに乖離検体血清中の抗Ｕ１ＲＮＰ抗体を吸着させた。次に、遠心処理（１５，０００ｒｐｍ，１ｍｉｎ，４℃）し、上清を捨てた。ペレットにＩＰＰ  ｂｕｆｆｅｒ  ５００μｌを添加し、ピペット操作でよく撹拌した後、再び遠心処理（１５，０００ｒｐｍ，１ｍｉｎ，４℃）した後、上清を捨てた。この操作を３回繰り返し、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに非特異的に吸着した余分な蛋白を取り除いた。上記操作により得られたペレットにＮＥＴ−２  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）４００μｌを添加し、更に実施例１の（１−２）においてｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法により作製したＵ１ｓｎＲＮＡ（５ｍｇ／ｍＬ）２５μｌを添加したものを４℃、２時間、緩やかに振とうさせながら反応させることにより、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上に吸着した乖離検体中の抗Ｕ１ＲＮＰ抗体にＵ１ｓｎＲＮＡを結合させた。
次に、余分なＵ１ｓｎＲＮＡを取り除くために遠心処理（１５，０００ｒｐｍ，１ｍｉｎ，４℃）し、上清を捨てた。得られたペレットにＮＥＴ−２  ｂｕｆｆｅｒ  ５００μｌを添加し、ピペット操作でよく撹拌した。これを再び遠心処理（１５，０００ｒｐｍ，１ｍｉｎ，４℃）した後、上清を捨てた。この操作を５回繰り返すことにより洗浄効果を高めた。最後の遠心処理（洗浄）の後、上清を捨て、ペレットにＮＥＴ−２  ｂｕｆｆｅｒ  ３００μｌ、１０％ＳＤＳ  １５μｌ、及び３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）３０μｌを順次添加した。さらに、フェノール／クロロホルム混液３００μｌを加えた後、十分攪拌し、遠心処理（１５，０００ｒｐｍ，５ｍｉｎ，４℃）を行った。その結果得られた上層を別のエッペンチューブに移し、この溶液に冷エタノール９００μｌを添加した後、−８０℃で１時間静置することにより冷却した。その後、遠心処理（１５，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）した。得られたペレットをバッファーに溶解し、７Ｍ尿素を含む１０％ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ内で泳動させた。泳動後のｇｅｌを銀染色（シルバーステインプラスキット  Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）に供することによりＵ１ｓｎＲＮＡを確認した。
乖離検体１４検体（血清１〜血清１４）についての結果を図１に示す。図１は、銀染色後のｇｅｌを示す図である。レーン３〜１６に血清１〜１４より調製したサンプルをそれぞれ流した。コントロールとして、レーン１には（１−２）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法により調製したＵ１ｓｎＲＮＡ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を、レーン２には健常人血清より調製したサンプル（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）をそれぞれ流した。矢印はＵ１ｓｎＲＮＡのバンド位置を示す。図１に示されるように、Ｕ１ｓｎＲＮＡのバンドが観察されるのは一部のレーン（レーン６、８）であることがわかる。即ち、乖離検体中でＵ１ｓｎＲＮＡと反応性を持つものは一部の検体であることが示された。
ＥＬＩＳＡ法における測定方法は、上記（２）の従来型ＥＬＩＳＡ法による抗Ｕ１ＲＮＰ抗体の測定法と同様であるので、その説明を省略し、ここでは固相化方法についてのみ説明する。
まず、メチル化ＢＳＡを５０μｇ／ｍｌの濃度になるように１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈した液を９６穴マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｎｕｎｃ社  製）の各ウェルに１００μｌずつ添加し、２５℃で２時間放置した後、各ウェルから反応液を除去した。その後、実施例１の（１−２）において得られたＵ１ｓｎＲＮＡを２０μｇ／ｍｌになるように１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０，１ｍＭ  ＥＤＴＡで希釈したものを、各ウェルに１００μｌずつ添加し、４℃で一晩放置することにより、プレート上にメチル化ＢＳＡを介してＵ１ｓｎＲＮＡを吸着させた。各ウェルから反応液を除去し、続いて各ウェルにブロッキングｂｕｆｆｅｒ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を２００μｌずつ添加し、４℃で一晩放置することによりブロッキングを行なった。各ウェルからブロッキングｂｕｆｆｅｒを除去した後、十分乾燥させることによりＥＬＩＳＡ測定用プレートとした。
このように作製したＥＬＩＳＡ測定用プレートを用いて、乖離検体（血清１〜１４）についてＵ１ｓｎＲＮＡとの反応性を調べた。その結果、一部の検体においてのみ反応性（陽性）が認められた。
以上の免疫沈降法及びＥＬＩＳＡ法の結果を図２の表にまとめた。尚、上記（１）におけるＤＩＤ法及び上記（２）における従来型ＥＬＩＳＡ法（ＲＮＰタンパクのみを固相化したプレートを用いたＥＬＩＳＡ法）による各乖離検体の測定結果も併せて示した。
図２に示されるように、乖離検体１４検体中Ｕ１ｓｎＲＮＡに対して反応性を持つものは２検体（血清４、血清６）である。この結果は、いくつかの乖離検体中にはＵ１ｓｎＲＮＡを認識する抗体が存在することを示すと同時に、乖離検体中には、単独のＵ１ｓｎＲＮＡ、又は単独のＲＮＰを認識するのではない抗Ｕ１ＲＮＰ抗体が存在していることを示唆するものである。即ち、Ｕ１ｓｎＲＮＡ及び３種のＲＮＰタンパクを個別に認識する抗Ｕ１ＲＮＰ抗体以外に、Ｕ１ｓｎＲＮＡ−ＲＮＰタンパク複合体を認識する抗Ｕ１ＲＮＰ抗体の存在が示唆された。［参考実験例２］  ＤＩＤ法におけるＵ１ＲＮＰ抗原の反応性の検討
参考実験例１の（１）のＤＩＤ法に用いた粗Ｕ１ＲＮＰ抗原をＲＮａｓｅＡとＲＮａｓｅＴ１で処理した抗原と、同実験例（１）のＤＩＤ法では陽性と判定され、同実験例（２）の従来型ＥＬＩＳＡ法では陰性と判定された乖離検体との反応性をＤＩＤ法により調べた。
粗Ｕ１ＲＮＰ抗原のＲＮａｓｅ処理は次のように行った。ＥＮＡ−１テスト（（株）医学生物学研究所  製）に含まれるウサギ胸腺より抽出した凍結乾燥粗抗原である粗Ｕ１ＲＮＰ抗原を滅菌水９０μｌで溶解し、ここへＲＮａｓｅＡ  ５μｌ（ニッポンジーン製Ｃｏｄｅ３１３−０１４６１）とＲＮａｓｅＴ１  ５μｌ（ベーリンガーマンハイム製  Ｃｏｄｅ１０９１９３）を添加し、３７℃で３０分反応させた。また、ＤＩＤ法による測定は、参考実験例１の（１）に記載の方法と同様に行った。その結果、すべての乖離検体において抗Ｕ１ＲＮＰ抗体の存在を示す沈降線を観察することができなかった。即ち、すべての乖離検体において、粗Ｕ１ＲＮＰ抗原をＲＮａｓｅ処理することにより、反応性の低下ないし消失が認められた。このことは、粗Ｕ１ＲＮＰ抗原中のＲＮＰはＵ１ｓｎＲＮＡとの複合体を形成した状態で存在することを示唆するものである。
［実施例３］  Ｕ１ｓｎＲＮＡとＲＮＰとの複合体固相化抗原（ＥＬＩＳＡ測定用プレート）の作製
（３−１）Ｕ１ｓｎＲＮＡとＲＮＰとの複合体の作製
実施例２で得られた３種のＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰ（Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰ７０ｋ、Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＡ、Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＣ）を  ｔｏｔａｌ  １μｇ／ｍｌ（Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰ７０ｋ  ０．５５μｇ／ｍｌ、Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＡ  ０．２７μｇ／ｍｌ、Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＣ  ０．１８μｇ／ｍｌ）となるようにＰＢＳ中に添加した。さらに、実施例１で得られたＵ１ｓｎＲＮＡを添加した後、３７℃で５分インキュベートすることにより、Ｕ１ｓｎＲＮＡと３種のＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰとの複合体を作製した。この際、Ｕ１ｓｎＲＮＡの添加濃度を０〜２５μｇ／ｍｌ（０、５、１０、１５、２０、２５μｇ／ｍｌの各濃度）の範囲で変化させ、Ｕ１ｓｎＲＮＡ添加濃度がそれぞれ０、５、１０、１５、２０、及び２５μｇ／ｍｌである抗原溶液を作製した。尚、インキュベート終了後の抗原溶液は直ちに以下の複合体固相化抗原の作製に使用した。
（３−２）複合体固相化抗原（ＥＬＩＳＡ測定用プレート）の作製
上記（３−１）で得られたＵ１ｓｎＲＮＡ添加濃度の異なる抗原溶液を、９６穴マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに１００μｌずつ分注し、４℃で一晩放置することにより、Ｕ１ｓｎＲＮＡ−ＲＮＰ蛋白複合体をプレート上に吸着させた。その後、各ウェルの抗原溶液を除去し、ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ２００μｌを各ウェルに添加した。１０秒程度放置した後、各ウェルのＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒを除去した。この洗浄操作を２回繰り返し、未吸着のＵ１ｓｎＲＮＡ及びＲＮＰ等を除去した。更に、ブロッキングｂｕｆｆｅｒ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）２００μｌを各ウェルに添加し、４℃で一晩放置してブロッキングした。その後、各ウェルのブロッキングｂｕｆｆｅｒを除去し、十分乾燥させてＥＬＩＳＡ測定用プレートとした。
［実施例４］  ＥＬＩＳＡ測定キットの構築
実施例３により作製した、Ｕ１ｓｎＲＮＡ及び３種のリコンビナントＲＮＰ（Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰ７０ｋ、Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＡ、Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＣ）を吸着させたＥＬＩＳＡ測定用プレート、ペルオキシダーゼ標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（（株）医学生物学研究所  製）、及び抗Ｕ１ＲＮＰ抗体陽性の血清とを組み合わせて抗Ｕ１ＲＮＰ抗体測定用のキットを構築した。
［実施例５］  ＥＬＩＳＡ法による検体中の抗Ｕ１ＲＮＰ抗体の測定
実施例３で得られたＥＬＩＳＡ測定用プレートを用いて、以下の検体中の抗Ｕ１ＲＮＰ抗体を測定した。尚、各検体について、ＥＬＩＳＡ測定プレートに抗原を吸着させる際の抗原溶液中のＵ１ｓｎＲＮＡ濃度の異なるウェル（即ち、Ｕ１ｓｎＲＮＡ又はＵ１ｓｎＲＮＡとＲＮＰの複合体の吸着量の異なるウェル）を用いて測定を行った。
測定対象とした検体は、参考実験例１の（１）におけるＤＩＤ法では陽性判定となり、同実験例１の（２）における従来型ＥＬＩＳＡ法（即ち、３種のリコンビナントＲＮＰのみをマイクロプレートに固定化したもの（固定化抗原）と検体中の抗Ｕ１ＲＮＰとの結合をみる方法）では陰性判定と認められた血清１２検体（乖離検体）、ＤＩＤ法及び従来型ＥＬＩＳＡ法ともに陽性判定であった血清８検体（陽性検体）、及び健常人の血清からなる２１検体（健常人検体）である。
まず、反応用緩衝液で各検体を１００倍希釈したもの１００μｌをＥＬＩＳＡ測定用プレートの各ウェルに添加し、２５℃で１時間、静置させることにより１次反応を行った。各ウェルから反応液を除去した後、１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで各ウェルを十分洗浄した。その後、ペルオキシダーゼ標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（（株）医学生物学研究所  製）を含む標識抗体液１００μｌを各ウェルに添加し、２５℃で１時間、静置させることにより２次反応を行った。各ウェルから反応液を除去した後、１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで各ウェルを十分洗浄した。その後、テトラメチルベンチジンと過酸化水素を含む酵素基質液１００μｌを各ウェルに添加して、２５℃で３０分間酵素反応させた。続いて、各ウェルに１Ｎ硫酸を１００μｌずつ添加して酵素反応を止めた後、４５０ｎｍの吸光度を分光光度計にて測定した。
以上の測定の結果を図３の表及び図４のグラフに示した。図３及び図４において、乖離検体を乖離１〜乖離１２と表してある。同様に、陽性検体を陽性１〜陽性８と、健常人検体を健常人１〜健常人２１とそれぞれ表してある。図３の表には、ＥＬＩＳＡ測定プレートに抗原を吸着させる際の抗原溶液中のＵ１ｓｎＲＮＡ濃度の異なるウェルを用いて測定した結果をまとめて示してある。
図４のグラフより、ＤＩＤ法では陽性判定、従来型ＥＬＩＳＡ法では陰性判定の乖離検体では、Ｕ１ｓｎＲＮＡの添加濃度を多くした抗原溶液を添加して作製したウェルにおいて、検体中の抗Ｕ１ＲＮＰ抗体がより多く検出されていることがわかる。即ち、リコンビナントＲＮＰに加えてＵ１ｓｎＲＮＡを添加した抗原溶液により作製した固相化抗原を用いることにより、従来型ＥＬＩＳＡ法（リコンビナントＲＮＰのみを固相化した抗原を用いたＥＬＩＳＡ法）に比較して、反応性（検出感度）が著しく向上した。これは、乖離検体中のＵ１ｓｎＲＮＡ−ＲＮＰ複合体を認識する抗Ｕ１ＲＮＰ抗体を、ＤＩＤ法における場合と同様に検出できているためと推測される。
また、ＤＩＤ法及び従来型ＥＬＩＳＡ法ともに陽性の検体（陽性検体）については、Ｕ１ｓｎＲＮＡを添加しても反応性の向上が無いものもあるが、これについては、当該検体には主にＲＮＰのみを認識するタイプの抗Ｕ１ＲＮＰ抗体が含まれているためであると考えられる。健常人検体においては、Ｕ１ｓｎＲＮＡの添加により反応性の変化は認められず、このことから、抗原溶液中にＵ１ｓｎＲＮＡを添加しても非特異的な反応が存在しないことが示される。従って、抗原溶液としてＵ１ｓｎＲＮＡを添加したものを用いたとしても、健常人検体が陽性と判断されることはない。
以上のように、Ｕ１ｓｎＲＮＡとリコンビナントＲＮＰとの複合体を抗原とすることにより、従来型のＥＬＩＳＡ法では陰性と判定される検体においても陽性と判定する測定系が構築される。かかる測定系を用いれば、従来のＤＩＤ法と高い相関性をもった測定が行えるものであり、また、高感度に検体中の抗Ｕ１ＲＮＰを検出ないし測定することができる。
［実施例６］  ＲＮＰのみを用いたＥＬＩＳＡ法と、ＲＮＰ及びＵ１ｓｎＲＮＡの複合体を用いたＥＬＩＳＡ法との比較
ＲＮＰのみ固相化抗原として用いたＥＬＩＳＡ法と、ＲＮＰ及びＵ１ｓｎＲＮＡの複合体を固相化抗原として用いたＥＬＩＳＡ法の比較を以下のように行った。
まず、実施例２で得られたＨｉｓ−ｔａｇｇｄ  ＲＮＰ７０ｋ（０．５５ｕｇ／ｍＬ）、Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＡ（０．２７ｕｇ／ｍＬ）、及びＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＣ（０．１８ｕｇ／ｍＬ）をＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ中で３７℃、５分インキュベーションさせた後、９６穴マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに１００μｌずつ分注し、４℃で一晩放置することにより、各ＲＮＰをプレート上に吸着させた。その後、各ウェルの抗原溶液を除去し、ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ２００μｌを各ウェルに添加した。１０秒程度放置した後、各ウェルのＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒを除去した。この洗浄操作を２回繰り返し、未吸着のＲＮＰを除去した。更に、ブロッキングｂｕｆｆｅｒ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）２００μｌを各ウェルに添加し、４℃で一晩放置してブロッキングした。その後、各ウェルのブロッキングｂｕｆｆｅｒを除去し、十分乾燥させてＥＬＩＳＡ測定用プレート（ＲＮＰ−ＥＬＩＳＡプレート）とした。
一方、同様に実施例２で得られたＨｉｓ−ｔａｇｇｄ  ＲＮＰ７０ｋ（０．５５ｕｇ／ｍＬ）、Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＡ（０．２７ｕｇ／ｍＬ）、及びＨｉｓ−ｔａｇｇｅｄ  ＲＮＰＣ（０．１８ｕｇ／ｍＬ）と実施例１で得られたＵ１ｓｎＲＮＡ（１０ｕｇ／ｍＬ）をＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ中で３７℃、５分インキュベーションさせた後、９６穴マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｎｕｎｃ社製）の各ウェルに１００μｌずつ分注し、４℃で一晩放置することにより、Ｕ１ｓｎＲＮＡ−ＲＮＰ蛋白複合体をプレート上に吸着させた。その後、各ウェルの抗原溶液を除去し、ＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒ２００μｌを各ウェルに添加した。１０秒程度放置した後、各ウェルのＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒを除去した。この洗浄操作を２回繰り返し、未吸着のＵ１ｓｎＲＮＡ及びＲＮＰ等を除去した。更に、ブロッキングｂｕｆｆｅｒ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）２００μｌを各ウェルに添加し、４℃で一晩放置してブロッキングした。その後、各ウェルのブロッキングｂｕｆｆｅｒを除去し、十分乾燥させてＥＬＩＳＡ測定用プレート（Ｕ１ｓｎＲＮＡ＋ＲＮＰ  ＥＬＩＳＡプレート）とした。
以上のように作製したＥＬＩＳＡ測定用プレート（ＲＮＰ−ＥＬＩＳＡプレート及びＵ１ｓｎＲＮＡ＋ＲＮＰ  ＥＬＩＳＡプレート）を用いて、上記参考実験例１のＤＩＤ法（ＥＮＡ−１テスト（（株）医学生物学研究所  製）を用いたＤＩＤ法）において陽性と判定された膠原病患者血清１９６検体、陰性と判定された健常人血清８２検体について測定を行った。
まず、反応用緩衝液で各検体を１００倍希釈したもの１００μｌを各ＥＬＩＳＡ測定用プレートの各ウェルに添加し、２５℃で１時間、静置させることにより１次反応を行った。各ウェルから反応液を除去した後、１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで各ウェルを十分洗浄した。その後、ペルオキシダーゼ標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（（株）医学生物学研究所  製）を含む標識抗体液１００μｌを各ウェルに添加し、２５℃で１時間、静置させることにより２次反応を行った。各ウェルから反応液を除去した後、１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ  ｂｕｆｆｅｒで各ウェルを十分洗浄した。その後、テトラメチルベンチジンと過酸化水素を含む酵素基質液１００μｌを各ウェルに添加して、２５℃で３０分間酵素反応させた。続いて、各ウェルに１Ｎ硫酸を１００μｌずつ添加して酵素反応を止めた後、４５０ｎｍの吸光度を分光光度計にて測定した。
測定結果をグラフに表したものを図５に示した。図５（ａ）はＲＮＰ−ＥＬＩＳＡプレートを用いた測定結果をプロットしたグラフであり、同図（ｂ）はＵ１ｓｎＲＮＡ＋ＲＮＰＥＬＩＳＡプレートを用いた測定結果をプロットしたグラフである。図５（ａ）に示されるように、ＲＮＰのみを固相化抗原として用いた場合には、ＤＩＤ法陽性の検体群（左側の集団）での発色分布が、ＤＩＤ法陰性の健常人検体群（右側の集団）の発色分布と重なり合う部分が生じており（即ち、ＤＩＤ法陽性と判断された検体中において、ＤＩＤ法陰性と判定された検体（健常人検体）と同程度の発色である検体）、ＤＩＤ法陽性と判定された検体の一部は、ＲＮＰのみを固相化抗原として用いたＥＬＩＳＡ法では陽性として判定することができないことがわかる。換言すれば、ＤＩＤ法に対してＲＮＰのみを固相化抗原として用いたＥＬＩＳＡ法では、測定感度が不足していることが示される。
一方、図５（ｂ）に示されるように、Ｕ１ｓｎＲＮＡ及びＲＮＰを固相化抗原として用いた測定系においては、ＤＩＤ法陽性の検体群（左側の集団）での発色分布が、ＤＩＤ法陰性の健常人検体群（右側の集団）の発色分布と重なり合わず（即ち、ＤＩＤ法陽性の検体での発色が、ＤＩＤ法陰性の健常人検体の発色に比べて十分に高い）、当該Ｕ１ｓｎＲＮＡ及びＲＮＰを固相化抗原として用いたＥＬＩＳＡ法は、従来のＤＩＤ法と少なくとも同程度の測定感度を有することが示される。
図６に、以上の２つ測定系による測定結果をまとめてプロットしたグラフを示した。当該グラフでは、ＤＩＤ法陽性と判定された膠原病患者血清１９６検体の測定結果のみをプロットしてある。横軸は、ＲＮＰのみを固相化抗原として用いたＥＬＩＳＡ法における発色（Ａ４５０）、縦軸は、Ｕ１ｓｎＲＮＡ及びＲＮＰを固相化抗原として用いたＥＬＩＳＡ法における発色（Ａ４５０）である。グラフより、両測定系の間に正の相関が認められる。
以上のように、ＲＮＰ及びＵ１ｓｎＲＮＡを固相化抗原としたＥＬＩＳＡ法は、ＲＮＰのみを固相化抗原としたＥＬＩＳＡ法との間に相関関係が認められるものであり、これに加えて、従来のＤＩＤ法では陽性と判定されるがＲＮＰのみを固相化抗原としたＥＬＩＳＡ法では陰性判定とされる検体（乖離検体）を陽性として判定（検出）できる、高い検出感度を有する測定方法である。
産業上の利用の可能性
以上のように、本発明の抗ＥＮＡ抗体の測定方法では、生体内における状態の抗原を認識し得る抗ＥＮＡ抗体を感度良く検出できる。これは、従来、標準法とされたＤＩＤ法と高い相関をもった測定法が提供されることを意味する。また、本発明の測定方法に用いられる抗原は容易に調製できるため、操作の簡略化が図られる。さらに精製度の高い抗原を用いて測定を行うため、より高感度の測定が可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、参考実験例１の（３）において、乖離検体１４検体（血清１〜血清１４）について免疫沈降法を行った結果得られたサンプルを電気泳動した後、染色したｇｅｌを示す図である。レーン３〜１６に乖離検体より調製したサンプルをそれぞれ流した。コントロールとして、レーン１には実施例１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法により調製したＵ１ｓｎＲＮＡ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を、レーン２には健常人血清より調製したサンプル（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）をそれぞれ流した。矢印はＵ１ｓｎＲＮＡのバンド位置を示す。
図２は、参考実験例１の（３）における免疫沈降法及びＥＬＩＳＡ法による結果をまとめた表である。尚、同実験例の（１）におけるＤＩＤ法及び同実験例の（２）における従来型ＥＬＩＳＡ法（ＲＮＰタンパクのみを固相化したプレートを用いたＥＬＩＳＡ法）による各乖離検体の測定結果も併せて示した。
Ｉｎｄｅｘ１は、ＲＮＰ蛋白のみを固相化したＥＬＩＳＡプレートにおいて、健常人検体１００例を測定したＡ４５０の値の平均値＋３×標準偏差が０．２１５であったことより、各血清のＡ４５０／０．２１５を算出したものである。判定１においては、Ｉｎｄｅｘ１の値が１以上の場合は陽性（＋）、１以下の場合は陰性（−）とした。
Ｉｎｄｅｘ２は、Ｕ１ｓｎＲＮＡのみを固相化したＥＬＩＳＡプレートにおいて、健常人検体１００例を測定したＡ４５０の値の平均値＋３×標準偏差が０．３５０であったことより、各血清のＡ４５０／０．３５０を算出したものである。判定２においては、Ｉｎｄｅｘ２の値が１以上の場合は陽性（＋）、１以下の場合は陰性（−）とした。
判定３においては、図１に示したｇｅｌでＵ１ｓｎＲＮＡのバンドが観察された場合に陽性（＋）、観察されなかった場合に陰性（−）とした。
血清１〜１４は、ＤＩＤ法による測定において陽性（＋）と判定され、ＲＮＰ蛋白のみを固相化したＥＬＩＳＡにおいて陰性（−）と判定された乖離検体群である。
図３は、実施例５におけるＥＬＩＳＡ法の測定結果をまとめた表である。乖離検体を乖離１〜乖離１２と表してある。同様に、陽性検体を陽性１〜陽性８と、健常人検体を健常人１〜健常人２１とそれぞれ表してある。
図４は、実施例５におけるＥＬＩＳＡ法の測定結果（乖離検体１〜１２）をプロットしたグラフである。
図５は、実施例６におけるＥＬＩＳＡ法の測定結果を示すグラフである。図５（ａ）はＲＮＰ−ＥＬＩＳＡプレートを用いた測定結果をプロットしたグラフであり、同図（ｂ）はＵ１ｓｎＲＮＡ＋ＲＮＰ  ＥＬＩＳＡプレートを用いた測定結果をプロットしたグラフである。両グラフにおいて左側がＤＩＤ法陽性の検体群、右側がＤＩＤ法陰性の検体群の測定結果である。
図６は、実施例６の測定結果を示したグラフである。従来のＥＬＩＳＡ法（ＲＮＰのみを固相化抗原として用いた系）と本発明におけるＥＬＩＳＡ法（Ｕ１ｓｎＲＮＡとＲＮＰの複合体を固相化抗原として用いた系）との相関が示される。ＤＩＤ法陽性と判定された膠原病患者血清１９６検体の測定結果のみをプロットしてある。横軸は、ＲＮＰのみを固相化抗原として用いたＥＬＩＳＡ法における発色（Ａ４５０）、縦軸は、Ｕ１ｓｎＲＮＡ及びＲＮＰを固相化抗原として用いたＥＬＩＳＡ法における発色（Ａ４５０）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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