(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
空気中に配置されて絶縁物を介して高電圧を発生させる複数の電極を有し、シングルパルスの高電圧を上記電極に印加する電圧印加手段を備え、
上記シングルパルスの高電圧を電極に印加することによって上記複数の電極の間に配置された生体組織又は細胞と該生体組織又は細胞に導入させる分子とに交響運動を生起させ、分子間の結合エネルギーよりも大きな運動エネルギーを分子に付与し、上記生体組織又は細胞に穿孔を形成することなく分子を生体組織又は細胞に導入させる
ことを特徴とする分子導入装置。
【請求項２】
請求項１において、
電圧発生手段は、電力を供給する電力供給手段と、該電力供給手段から電力供給されて高電圧を電極に供給する昇圧手段と、上記電力供給手段から昇圧手段への電力の供給及び断接を行いシングルパルスの高電圧を発生させる開閉手段と、該開閉手段の断接を制御する開閉制御手段とを備え、
上記シングルパルスの高電圧の印加周期は、１０Ｈｚ〜１０００Ｈｚであり、
上記電極間の電圧は、±１万ボルト〜±１００万ボルトである
ことを特徴とする分子導入装置。
【請求項３】
空気中に配置されて絶縁物を介して高電圧を発生させる複数の電極にシングルパルスの高電圧を印加し、
上記シングルパルスの高電圧を電極に印加することによって上記複数の電極の間に配置され且つ容器に収納された生体組織又は細胞（ただし、生体組織および細胞として人体そのものを除く）と該生体組織又は細胞に導入させる分子とに交響運動を生起させ、分子間の結合エネルギーよりも大きな運動エネルギーを分子に付与し、上記生体組織又は細胞に穿孔を形成することなく分子を生体組織又は細胞に導入させる
ことを特徴とする分子導入方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、医学及び生物学等の分野において、遺伝子等の分子を細胞内に導入する分子導入装置及び分子導入方法に関するものである。
背景技術
近年、遺伝子治療が脚光を浴びてきている。ところが、未だ遺伝子を確実に生体内へ導入する方法は確立していない。現在、遺伝子導入方法には、リポゾーム法、ウイルス法、リン酸カルシウム法、ジーンガンなどの直接注入法及び電気穿孔法であるエレクトロポレーション法（electroporation）がある。電気的方法においては、矩形直流パルス又は指数関数減衰パルスを用いている。
【０００１】
上記電気穿孔法を適用している分子導入装置には、日本特許第２７３９９７８号公報に開示されているものがある。この分子導入装置は、複数の生体粒子を溶液中の電極の間に配置し、パルス高周波の振動電界を上記電極の間に印加し、上記生体粒子のポレーション又は透過を行うものである。
解決課題
上述した従来の遺伝子導入方法としてのリポゾーム法、ウイルス法、リン酸カルシウム法、ジーンガン及びエレクトロポレーション法は、何れにおいても生体に無害で且つ安定した遺伝子導入をもたらすものとはいえないという問題があった。
【０００２】
電気的方法においては、矩形直流パルス又は指数関数減衰パルスを用いるため、遺伝子の導入時に組織細胞の障害が避けられない。また、この電気的方法では、目的とした細胞又は組織全体に確実に遺伝子を導入させることが困難である。
【０００３】
また、上記日本特許第２７３９９７８号公報に開示された分子導入装置は、ＲＦ高周波電流パルスを溶液中に通電する方法である。この場合、溶液中に流入する電流（電子の数）が大きくなるため、細胞傷害が生ずる。この細胞傷害を防止するためには、通電電力を低下させる必要がある。しかし、この通電電力を低下させると、細胞等の分子の振動能力が低下する。この結果、分子を細胞内へ確実に導入させることができないという問題があった。
【０００４】
本発明は、斯かる点に鑑みてなされたものであり、動植物やその他の生物において、生体、培養組織接着細胞及び浮遊細胞の何れにおいても、傷害がなく且つ確実に遺伝子等の分子を細胞内に導入し、蛋白又は活性の発現をもたらすことを目的とするものである。
発明の開示
本発明は、分子間の結合エネルギーよりも大きい運動エネルギーを、細胞へ導入させる分子に付与するようにしたものである。この結果、細胞に穿孔等を形成することなく、分子を安全に細胞内に導入させることができる。
【０００５】
本願発明者らは、大きい運動エネルギーを如何にして分子に付与するかに関し、永年鋭意研究をした結果、下記の手段を見出したものである。本発明は、体内組織又は細胞を標的に、電気的フィールド、磁気的フィールド又は音波的フィールドを形成する。そして、分子の共鳴運動と、細胞膜の可逆的な極性反転の反復脱分極とを励起させ、細胞内外における分子の膜通過を可能とする。すなわち、電気的には負の荷電をもつ細胞膜が正に極性反転すれば、同じく負に帯電した分子との相互反発が消失して互いに吸引し合う。この結果、遺伝子等の分子の細胞内への移行が惹起される。
【０００６】
更に詳述すると、本発明において、放電されるのは、例えば、シングルスパイクのみでよく、スパイクの上行脚と下行脚が最初の１振動をもたらすのみでよい。その後の全ての振動は、生体系を含んだ共振回路の交響反応現象である。したがって、全ての振動反応は、単回の励起に伴う二次現象であり、振動波（高周波）の出力は、必ずしも必要としない。
【０００７】
導入する分子が細胞内に移行する仕組みは、次の通りである。どの様な高電圧の瞬発励起であっても、全ての分子種は、分子量、帯電性と帯電部位又は立体構造などによって規定される固有振動特性がそれぞれ異なる。このために、分子の共鳴振動の位相偏差と、分子の相対運動におけるモーメントの減衰偏移とが生じる。時には、分子対分子が離反し合ったり、衝突しあう現象が出現する。したがって、導入する分子と細胞膜の構成分子とは、衝突と離反を繰り返す。そして、細胞膜の立体構造が歪んだ瞬間などに、分子が細胞内へ進入する機会を得る。
【０００８】
この瞬発刺激に引き続く電気的減衰振動は、導入装置と生体内回路に包含される電子や分子の共鳴運動の総和として観察されるものであり、分子が細胞内へ進入する事象を反映するものである。
【０００９】
また、本発明は、静水面に小石を落として液面の振動を得るのに対し、高周波法は、オールで液体を捌いて水面を振動させることに相当する。石を落とす場合は、オイルであれ、水であれ、何れの液体もその容量と液体自身の物性に適切な振動様式を来す。これに対し、液体を捌く場合には、捌くこと自体が液面に不適切な動揺を与えるため、大きな振動が得られない。同振幅の振動を得るためには、明らかに、小石を落とす方がオールによる手段よりもエネルギー損失が少ない。例えば、音の場合は、本発明の方法では、音叉をたたいて共鳴音を得るのに対し、高周波刺激では、音叉を細かく揺すっていることに相当する。明らかに、音叉をたたいた方がきれいな共鳴が得られる。
【００１０】
詳述すると、第１の発明は、空気中に配置されて絶縁物を介して高電圧を発生させる複数の電極と、該電極に接続され、シングルパルスの高電圧を上記電極に印加する電圧印加手段とを備え、上記シングルパルスの高電圧を電極に印加することによって上記複数の電極の間に配置された生体組織又は細胞と該生体組織又は細胞に導入させる分子とに交響運動を生起させ、分子間の結合エネルギーよりも大きな運動エネルギーを分子に付与し、上記生体組織又は細胞に穿孔を形成することなく分子を生体組織又は細胞に導入させる。
【００１１】
また、第２の発明は、上記第１の発明において、電圧発生手段が、電力を供給する電力供給手段と、該電力供給手段から電力供給されて高電圧を電極に供給する昇圧手段と、上記電力供給手段から昇圧手段への電力の供給及び断接を行いシングルパルスの高電圧を発生させる開閉手段と、該開閉手段の断接を制御する開閉制御手段とを備え、上記シングルパルスの高電圧の印加周期は、１０Ｈｚ〜１０００Ｈｚであり、上記電極間の電圧は、±１万ボルト〜±１００万ボルトである。
【００１２】
一方、第３の発明は、分子導入方法に関する発明であって、空気中に配置されて絶縁物を介して高電圧を発生させる複数の電極と、該電極に接続され、シングルパルスの高電圧を上記電極に印加する電圧印加手段とを備え、上記シングルパルスの高電圧を電極に印加することによって上記複数の電極の間に配置され且つ容器に収納された生体組織又は細胞（ただし、生体組織および細胞として人体そのものを除く）と該生体組織又は細胞に導入させる分子とに交響運動を生起させ、分子間の結合エネルギーよりも大きな運動エネルギーを分子に付与し、上記生体組織又は細胞に穿孔を形成することなく分子を生体組織又は細胞に導入させる。
【００１３】
つまり、一般に、分子導入装置、特に、電気的導入法の遺伝子導入装置においては、対象組織や細胞を傷害しないことが求められる。遺伝子導入装置が、細胞組織の破壊を招けば、装置自体の適格性が損なわれる。細胞破壊を招く原因は、対象細胞に対する供給電力量が過剰であることが多い。したがって、遺伝子導入装置は、細胞破壊の前に速やかに飽和蓄積電力を中和することによって、細胞破壊を回避することが肝要である。
【００１４】
この回避方法としては、次の方法がある。先ず、体内の所定部位には、予め注射等により所望の遺伝子を導入しておく。そして、ハイインピーダンスの高圧電源より、充分に昇圧された電圧を上記所定部位に間欠的に繰り返し印加する。
【００１５】
つまり、シングルパルスである瞬発的な高電圧を間欠的に発生させる。この瞬発の高電圧の印加によって、装置自身と生体によって形成される電気的自由共振回路が励起される。そして、この共振回路の構成成分で且つ電子や電荷を帯びた分子は、減衰振動を起こす。
【００１６】
特に、本発明では、電極が高絶縁物を介して生体組織又は細胞と外側の遺伝子等の分子とに非接触状態で配置されている。換言すれば、高絶縁部で被覆された電極を生体組織又は細胞内に挿入しても電流が流れず、安全である。そして、上記電極の間で分子等に電圧を印加する。
【００１７】
その際、周辺の細胞組織及び導入された遺伝子も周辺細胞の自由共振回路内に組み込まれ、各分子の固有の共振特性を発揮して自由減衰振動する。細胞膜の近傍に分布する遺伝子は、自らが帯電している電荷と同一の瞬発電界が与えられたときには、逆電界方向に、また、次の瞬時に逆電界が与えられたときには、順電界側に向けてファラデーの法則に基づく力学的モーメントを受ける。そして、自由減衰振動による遺伝子の連続運動と、細胞膜の可逆的な極性反転の反復との結果、遺伝子と細胞膜の分子との間には、加速度的な相対運動が生起し、遺伝子の膜通過がもたらされる。
【００１８】
この結果、従来の電極の間の溶液に直流のみを印加する方法に比べて遺伝子の細胞内への導入確率は飛躍的に向上すると共に、対象部位と周辺の細胞の破壊を確実に防止することができる。
【００１９】
細胞膜及び細胞壁の構造によって、その厚さを考慮したとき、その膜及び壁に印加される電圧から、薄膜間電子障壁を電子がすり抜けるトンネル効果も発揮される。
【００２０】
また、高電界環境下における電子共鳴相互作用が周辺分子を加速度的に励起するポッピング現象によって、導入する分子が雪崩的に細胞膜又は細胞壁を通過することもできる。
【００２１】
特に、後者は、従来、直流パルスを溶液中で供給し、電流を流しながら遺伝子を導入していた。本発明は、高電界は発生させるものの、ハイインピーダンスの高圧電源及び高絶縁電極を用いるため、導入する生体組織又は細胞に殆ど電流が流れす、安全性を確保することができる。
【００２２】
また、磁場を形成することにより電流を偏移させ、電子スピンを生起させたり、遺伝子等の分子の共振を制御するようにしてもよい。
【００２３】
また、単に自由共振に限られず、フーリエ波形合成などの多様な周期性の振動を付与するようにしてもよい。この場合、様々な組織細胞の共振を生じさせることができる。
【００２４】
また、抵抗値や電極の形状及びサイズを変更することにより、適切な共振条件を観察しつつ分子の導入を進めるようにしてもよい。
発明の効果
本発明によれば、従来の直流のみを印加する方法に比べて遺伝子の細胞内への導入確率は飛躍的に向上すると共に、対象部位と周辺の細胞の破壊を確実に防止することができる。
【００２５】
特に、電極と分子等とが非接触の状態であるので、広範囲の適用を可能とすることができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。
【００２６】
−実施形態１−
図１に示すように、本実施形態の分子導入装置１は、体内の細胞に分子である遺伝子を導入する遺伝子導入装置であって、電圧発生手段１１と電圧印加手段１２とを備えている。この分子導入装置１は、図２に示すように、導入する遺伝子２を予め注射等の手段により生体内に存在させていることを前提としている。
【００２７】
通常、遺伝子２を単に体内に注入するのみでは、細胞３の細胞膜３ａによって遺伝子２の細胞３内への侵入が拒まれる。従って、注入した遺伝子２は、細胞３内及び細胞核４内に移行することができない。この結果、遺伝子２の注入によって期待すべき変化は発現しない。
【００２８】
上記電圧発生手段１１は、電力供給手段である電力供給回路２０と、昇圧手段であって変圧器である昇圧トランス３０と、開閉手段であるスイッチングトランジスタ２２と、開閉制御手段である信号制御回路４０とを備えている。
【００２９】
上記電力供給回路２０は、直流の電源２１を備え、該電源２１の両端が昇圧トランス３０の一次側巻線３１の両端に接続されている。上記電力供給回路２０は、電源２１から一定の直流電力を昇圧トランス３０に供給するように構成されている。
【００３０】
上記スイッチングトランジスタ２２は、電力供給回路２０から昇圧トランス３０の一次側巻線３１への電力の供給及び遮断を行うように構成されている。つまり、上記スイッチングトランジスタ２２は、昇圧トランス３０への電力供給を断接する。上記スイッチングトランジスタ２２は、電源２１の負側と昇圧トランス３０の一次側巻線３１との間に接続され、コレクタが昇圧トランス３０の一次側巻線３１に接続され、エミッタが接地されている。
【００３１】
上記信号制御回路４０は、周波数発信回路４１と波形成形回路４２とを備えている。該周波数発信回路４１は、予め設定された所定周波数の制御信号を出力するように構成されている。上記波形成形回路４２は、周波数発信回路４１の制御信号を所定波形に成形して制御信号を出力するように構成されている。そして、該波形成形回路４２は、スイッチングトランジスタ２２のベースに接続され、該スイッチングトランジスタ２２を所定タイミングでオン及びオフさせるように構成されている。
【００３２】
上記昇圧トランス３０は、低圧部の一次側巻線３１と高圧部の二次側巻線３２とを備えている。そして、該昇圧トランス３０は、一次側巻線３１と二次側巻線３２との巻線比で定まる昇圧比に基づいて二次側巻線３２に所定の高電圧を発生させるように構成されている。
【００３３】
上記昇圧トランス３０は、図３に示すように、スイッチングトランジスタ２２のオン状態において、一次側巻線３１が励磁され、該一次側巻線３１に所定の電気エネルギーＡを蓄える。一方、上記スイッチングトランジスタ２２がオフすると、蓄えられた電気エネルギーを放出する。そして、図４に示すように、昇圧トランス３０の二次側巻線３２には、電界変動を介して電子の揺れ動きが誘起され、瞬発電圧と生振幅の残留減衰振動波の交番電圧Ｂが誘起される。
【００３４】
つまり、シングルパルスである瞬発的な高電圧の発生によって、正弦減衰波の交番電圧Ｂが誘起される。
【００３５】
上記電圧印加手段１２は、一対の電極プローブ５０，５０を備え、該両電極プローブ５０，５０が配線６０，６０によって昇圧トランス３０の二次側巻線３２の各端に接続されて構成されている。上記各配線６０には、過電流制限を行う限流抵抗６１とコンデンサ６２が直列に接続されている。
【００３６】
上記電極プローブ５０は、筒状の電極筒５１と、該電極筒５１の内部に収納され、上記配線６０が接続された電極である先端電極５２とを備えている。上記電極筒５１の内部には、シリコンなどの絶縁材料の充填材５３が充填されている。更に、上記電極プローブ５０は、高絶縁被覆物６３を備えている。つまり、上記電極筒５１は、高絶縁性を有する高絶縁被覆物６３で被覆されている。該電極プローブ５０は、高絶縁被覆物６３で被覆されているので、誘電率に従って構成される等価コンデンサとして機能する。
【００３７】
上記一対の電極プローブ５０，５０は、生体の所定部位に設置され、つまり、所定の細胞３と非接触状態で配置される。上記一対の電極プローブ５０，５０は、所定の細胞３の付近に高圧の瞬発電圧を印加するように構成されている。そして、上記電圧印加手段１２は、生体を含めた外部共振回路を構成し、一対の電極プローブ５０，５０が生体組織に接触通電した際、生体を含めた外部共振回路に対して微分器として働き、外部共振回路に大きなトリガー電圧を供給する。
【００３８】
−遺伝子２の導入方法−
次に、上述した分子導入装置による遺伝子２の導入方法について説明する。
【００３９】
先ず、導入する遺伝子２を予め注射等の手段により生体内に注入する。その後、上記遺伝子２を導入する細胞３を目標に一対の電極プローブ５０，５０を生体に対して固定する。続いて、昇圧トランス３０の一次側巻線３１に電源２１から直流電力を供給する一方、周波数発信回路４１から所定の制御信号を出力させる。この制御信号は、波形成形回路４２によって波形が成形され、スイッチングトランジスタ２２のベースに所定の制御信号を出力する。
【００４０】
上記スイッチングトランジスタ２２が制御信号によってオン状態になると、昇圧トランス３０の一次側巻線３１に所定の電気エネルギーが蓄えられる（図３参照）。その後、上記スイッチングトランジスタ２２が制御信号によってオフすると、一次側巻線３１に蓄えられた電気エネルギーを放出する。その際、図４に示すように、昇圧トランス３０の二次側巻線３２には、急峻な高電圧と共に、減衰振動波を伴う励起電圧Ｂが誘起される。
【００４１】
この急峻な高電圧は、一対の電極プローブ５０，５０の間に作用し、電圧印加手段１２は、生体を含めた外部共振回路を形成する。この生体を含めた外部共振回路は、瞬発電圧をトリガー電圧として励起され、共振を起こす。そして、細胞３の共振時において、図５に示すように、トリガー電圧に引き続く電子と荷電分子の共振動態の総和である振幅変調波形の電圧変動Ｃが観察される。
【００４２】
この出力電圧によって生体に刺激を与えることにより、電圧の印加点を中心とした生体回路は、電気的自由共振回路を形成し、正弦波の減衰振動が誘起される。周辺の細胞３及び遺伝子２も自由共振回路内に組み込まれ、固有共振特性に同期して振動する。
【００４３】
この結果、図２に示すように、細胞膜３ａの近傍にある遺伝子２は、自らが帯電している電界と同一電界が与えられたときには逆電界側に移動し、また、逆電界が与えられたときには中和できる電界側に移動する。そして、固有共振特性に基づく連続運動と細胞膜３ａの可逆的な極性反転の反復の結果、遺伝子２は加速度的な振る舞いを起こす。この結果、上記遺伝子２は、細胞膜３ａを通過し、細胞３内の分子との衝突と拡散により、細胞核４の核内遺伝子５の構成の一部となり所望の効果を示す。
【００４４】
つまり、一般に、分子導入装置１、特に、電気的導入法の遺伝子導入装置においては、対象の体内組織や細胞３を傷害しないことが求められる。遺伝子導入装置は、細胞３や体内組織の破壊を招けば、装置自体の適格性が損なわれる。細胞３や体内組織の破壊を招く原因は、対象とする細胞３に対する供給電力量が過剰であることが多い。したがって、遺伝子導入装置は、細胞３等の破壊の前に速やかに飽和蓄積電力を中和することによって、細胞３等の破壊を回避することが肝要である。
【００４５】
この回避方法としては、上述したように、先ず、体内の所定部位には、予め注射等により所望の遺伝子２を導入しておく。そして、ハイインピーダンスの高圧電源である昇圧トランス３０より、昇圧された電圧を上記所定部位に間欠的に繰り返し印加する（図４参照）。この電圧の印加によって、印加点を中心とした生体回路は、電気的自由共振回路を形成し、分子減衰振動が誘起される。
【００４６】
周辺の細胞３及び導入された遺伝子２も自由共振回路内に組み込まれ、遺伝子２の固有の共振特性に同期して振動する。すなわち、細胞膜３ａの近傍に存在する遺伝子２は、自らが帯電している電荷と同一の瞬発電界が与えられたときには、逆電界方向に、また、次の瞬時に逆電界が与えられたときには、順電界側に向けてファラデーの法則に基づく力学的モーメントを受ける。
【００４７】
この瞬時に極大を形成する分子振動は、遺伝子２の固有振動特性に基づいて収斂することになる。しかし、遺伝子２が完全静止する前に、次の瞬時の電界刺激が印加されるときには、新たな極大の分子振動を開始する。細胞膜３ａを構成する分子群も同様の期序による振動を励起される。これにくわえて、細胞膜３ａにおいては、電位に依存する電流チャンネルが開閉するため、膜電位が変換されることにもなる。固有共振特性に従った遺伝子２の連続振動と細胞膜３ａの脱分極の反復の結果、遺伝子２は、加速度的運動を伴なった振る舞いを生起し、細胞膜３ａを通過する。
【００４８】
この結果、従来の直流のみを印加する方法やＲＦ法に比べて遺伝子２の細胞３内への導入確率は飛躍的に向上すると共に、対象部位と周辺の細胞３の破壊を確実に防止することができる。
【００４９】
また、磁場を形成することにより電流を偏移させ、電子スピンを生起させたり、遺伝子２等の分子の共振を制御するようにしてもよい。
【００５０】
また、一層、強力な磁場を形成した場合、ＤＮＡの二重螺旋構造を緩めて遺伝子２等の分子を細胞３内に導入させることができる。また、遺伝子２等の分子をゲノム内に組み込むことも可能となる。
【００５１】
また、単に自由共振に限られず、フーリエ波形合成などの多様な振動を付与するようにしてもよい。この場合、様々な体内組織や細胞３の共振を生じさせることができる。
【００５２】
また、共振条件やや電極５２又は電極プローブ５０の形状及びサイズを変更することにより、適切な共振条件を観察しつつ分子の導入を進めるようにしてもよい。
【００５３】
また、上記信号制御回路４０が周波数可変の制御信号を出力するので、導入する遺伝子２に合致した電圧印加の周期に調整することができる。
【００５４】
一方、上記高電圧の印加の周波数は、１０Hz〜１０００Hzが好ましく、交番電圧を印加する継続時間は、１０秒〜１０分が好ましい。そして、この１０秒〜１０分の印加を繰り返し行う。
【００５５】
また、上記一対の電極プローブ５０，５０の間の電圧は、±１万ボルト〜±１００万ボルトに設定され、電圧印加手段１２のインピーダンスは、ｎ×１０１０オーム以上であり、一対の電極プローブ５０，５０の間に流れる電流、つまり、細胞３等に流れる電流は、１マイクロアンペア以下である。したがって、細胞３の周辺は、電流が殆ど流れない微電流の環境で、且つ高電圧の環境が形成される。
【００５６】
尚、上記スイッチングトランジスタ２２がオフした後、次にオフするまでの１サイクルの時間Ｔに対するオフ時間ｔの比であるデューティ比（ｔ／Ｔ）は、０．０３〜０．４が好ましい。
【００５７】
−実施例１−
孵化した後２日目の鶏とビフィズス菌を用いてＧＦＰ遺伝子の導入発現を試みた。一対の電極プローブ５０の間には、±１５万ボルトの高電圧を繰り返して印加することとした。
【００５８】
ＧＦＰ遺伝子を鶏の大腿筋に注射した後、３０秒〜２分の間、上記高電圧を印加した。また、ビフィズス菌の場合は、プラスチック皿内で３０秒〜６０秒の間、上記高電圧を印加した。このとき、鶏の大腿筋には、単収縮現象（twitch現象）が観察され、筋細胞の脱分極が明らかであった。
【００５９】
導入処置後の鶏及びビフィズス菌の増殖能力に異常は認められなかった。また、ＧＦＰ遺伝子の導入後の５日目において、鶏では、正常な大腿筋の発育と均一且つ高レベルのＧＦＰ発現が認められた。
【００６０】
また、ＧＦＰ遺伝子の導入後、３日目において、本分子導入装置１を適用した使用群（ＧＣＳ）と本分子導入装置１を適用しない未使用群（ＣＴＬ）とを比較した。ＧＣＳでは、緑色蛍光を発生するヨーグルト上清がみられたのに対し、ＣＴＬでは、上清の蛍光が認められなかった。更に、吸光スペクトル解析によって、ＧＣＳ群には、図１９に示すように、特異的な３４０nm〜４００nmに分布するエネルギー吸収域を確認した。
【００６１】
この図１９及び図２０は、ＧＣＳとＣＴＬのビフィズス菌を市販の牛乳中で３７℃において、７２時間振とう培養後、３０００gにて２０分間、遠心分離して両者の培養上清を得た結果を示している。石英キュペット内に上清を注入して分光光度計にてスペクトロスコピーを行ったところ、ＧＣＳ群にのみ、図１９に示すように、３４０nm〜４００nmの吸光が明らかであった。
【００６２】
一方、図２０に示すように、ＣＴＬ群には、ＧＣＳ群の如く特異的なエネルギー吸収域は確認できなかった。
【００６３】
−実施例２−
細胞を遠心チューブ内で沈殿させ、少量の高濃度ＧＦＰプラスミド液（２０μｇ）を添加して懸濁させ、上述した分子導入装置１によって高電界を作用させた。電圧印加手段１２における高電圧（±１５万ボルト）の印加の周波数は、８０Hz〜８００Hzとし、２分の間電圧を印加させた。
【００６４】
この場合、ＧＦＰの発現が確認された。このＧＦＰの発現は、Hela細胞とPC12細胞を用い、２回の実験を行い、それぞれ再現性が確認された。また、この場合、上記高電圧印加の周波数は、１６０Hzが最も高効率であった。
【００６５】
−実施例３−
１００μｇ（１μｇ／μｌ）のβ-Gal発現プラスミドをマウス大腿筋に数カ所に渡り筋注した。その後、右足には、下記の条件で瞬発の高電圧を印加し、左足には、高電圧を印加しなかった。
【００６６】
条件（１）  ±１５万vの瞬発高電圧を１６０Hzの周波数で５分間印加し、続けて、１００vの瞬発高電圧を８０Hzの周波数で５分間印加した。
【００６７】
条件（２）  ±１５万vの瞬発高電圧を２００Hzの周波数で５分間印加し、続けて、１００vの瞬発高電圧を３００Hzの周波数で５分間印加した。
【００６８】
４日後、マウス大腿筋より組織切片を採取し、Ｘ-Galによる染色を行った。
【００６９】
結果は、β-Gal陽性細胞、すなわち緑色染色細胞が検出され、筋肉組織への遺伝子の導入が確認された。遺伝子の導入効率は、条件（２）が高効率であった。
【００７０】
−実施例４−
孵化後１日の鶏の大腿筋に、抗サイクリンB1マウスモノクローナル抗体を注入し、蛋白分子の細胞内への導入を試みた。一対の電極プローブ５０，５０の間には、試験体の固定具の接地点電位を中心として±２５万vの高電圧を６０Hzにて１分間印加して共振回路を励起した。
【００７１】
このとき、電極プローブ５０では、生体組織の空間分布様式により、空間窒素プラズマの生成、空間唸り音や電界観察用オシロスコープ上の減衰波の形状と周期に多様な変動がみられた。この事実から、本発明によれば、装置外部において、電界内に分布する電子やイオン化元素、また、組織や種々の分子自体の振動が瞬発電圧以後の電圧波形を構成することが明らかであった。すなわち、図４及び図５に示す減衰波は、装置内外を包含して形成される自由共振回路において、電荷を有する分子群の減衰振動を観察した。
【００７２】
遺伝子を導入した後、２６時間後に、大腿筋をホルマリン固定して、パラフィン切片を作成した。その後、抗マウスIgG二次抗体とストレプトアビジンービオチン結合を介して、ペルオキシダーゼ発色反応により抗サイクリンB1抗体の核内への導入分布を確認した。これにより、抗体蛋白が共振励起により細胞内へ移行した後、標的分子であるサイクリンB1の局在部位である細胞核へ集積したことが証明された。
【００７３】
更に、孵化後２日の鶏大腿筋には、FITCでラベルされたIgGを注入し、電極プローブ５０，５０の間に、試験体の固定具の接地点電位を中心として±２５万vの高電圧を１５０Hzにて１分間印加して共振回路を励起した。５分後に、大腿筋を急速冷凍し、凍結切片を作成したところ、図１８に示すように、蛍光顕微鏡下にて骨格筋細胞内に広範なFITC蛍光の分布を認めた。
【００７４】
この図１８は、FITCラベルされた抗体蛋白を導入された骨格筋を示している。ノマルスキー法による細胞輪郭とFITC蛍光の重ね合わせ画像によれば、背景である細胞外には蛍光を認めず、殆ど全ての筋肉細胞内細胞質に緑色蛍光が明瞭である。
【００７５】
−実施形態２−
図６は、電極プローブ５０の他の実施形態を示している。
【００７６】
この図６の電極プローブ５０は、可変容量型であり、筒状の電極筒５１の内部内に先端電極５２とリアクタンス部５４とコンデンサ部５５とを備えて構成されている。
【００７７】
上記先端電極５２は、電極筒５１の先端部に収納固定されている。上記リアクタンス部５４の一端は先端電極５２に接続されている。上記コンデンサ部５５は、実施形態１のコンデンサ６２に相当し、固定電極５５ａと可動電極５５ｂとより構成されている。そして、上記固定電極５５ａはリアクタンス部５４に接続されている。一方、上記可動電極５５ｂは、ネジ部５６を介して配線６０が接続されている。該ネジ部５６は、電極筒５１の基端部にねじ嵌合されている。
【００７８】
したがって、上記電極筒５１を配線６０に対して回転させると、固定電極５５ａと可動電極５５ｂとギャップが変化し、コンデンサ部５５の容量が変化する。この結果、装置内部の共振特性が変化する。尚、上記電極筒５１は高絶縁被覆物６３で被覆されている。
【００７９】
この結果、導入する遺伝子２等の分子振動に有効な過渡的電圧と生振幅の残留減衰振動波の高電圧Ｂを生成することができる。
【００８０】
−実施形態３−
図７は、更に電極プローブ５０の他の実施形態を示している。
【００８１】
この図７の電極プローブ５０は、可変リアクタンス型であり、筒状の電極筒５１の内部内に先端電極５２とコンデンサ部５５とリアクタンス部５４とを備えて構成されている。
【００８２】
上記先端電極５２は、電極筒５１の先端部に収納固定されている。上記コンデンサ部５５は、２つの固定電極５５ｃ，５５ｃより構成されている。１つの固定電極５５ｃは、先端電極５２に接続され、他の固定電極５５ｃは、リアクタンス部５４が接続されている。
【００８３】
上記リアクタンス部５４は、コイル５４ａと該コイルに接する集導片５４ｂとより構成されている。上記コイル５４ａは、コンデンサ部５５の固定電極５５ｃに接続されている。上記集導片５４ｂは、ネジ部５６を介して配線６０が接続されている。該ネジ部５６は、電極筒５１の基端部にねじ嵌合されている。
【００８４】
したがって、上記電極筒５１を配線６０に対して回転させると、コイル５４ａと集導片５４ｂとの接触位置が変化し、リアクタンス部５４のインダクタンスが変化する。この結果、装置内部の共振特性が変化する。尚、上記電極筒５１は高絶縁被覆物６３で被覆されている。
【００８５】
この結果、導入する遺伝子２等の分子振動に有効な高電圧Ｂを調整することができる。
【００８６】
−実施形態４−
図８は、電力供給回路２０の他の実施形態を示している。
【００８７】
この図８の電力供給回路２０は、電力調整回路７０を備えたものである。つまり、上記電力調整回路７０は、電源２１より供給される電力を所定の制御電力に調整するように構成されている。そして、該電力調整回路７０は、制御電力を昇圧トランス３０の一次側巻線３１と、信号制御回路４０の周波数発信回路４１に出力するように該昇圧トランス３０と信号制御回路４０に接続されている。
【００８８】
したがって、本実施形態では、上記電力調整回路７０が導入する遺伝子２又は細胞３等に対応した制御電力を生成する。つまり、上記電力調整回路７０が電源２１の電流又は電圧を調整することになる。
【００８９】
したがって、上記電力調整回路７０を設けているので、導入する遺伝子２などに合致した瞬発高電圧Ｂを生成することができる。この結果、遺伝子２の膜通過を確実に行わせることができる。特に、上記電力調整回路７０が電流及び電圧を制御するので、導入する遺伝子２などの分子振動に有効な高電圧Ｂをより精度よく生成することができる。
【００９０】
−実施形態５−
図９及び図１０は、分子導入装置１の他の実施形態を示している。
【００９１】
この分子導入装置１は、複数対の電極プローブ５０ａ，５０ｂ，５０ｃ，…を備えている。具体的に、上記分子導入装置１は、３対の電極プローブ５０ａ，５０ｂ，５０ｃを備えている。そして、電圧発生手段１１は、３つの昇圧トランス３０ａ，３０ｂ，３０ｃを備えている。
【００９２】
上記電圧発生手段１１の電力供給回路２０は、第１電源２１ａと第２電源２１ｂとを備え、該第２電源２１ｂの正側が各昇圧トランス３０ａ，３０ｂ，３０ｃの一端に接続されている。
【００９３】
また、上記電圧発生手段１１は、３つのスイッチ２４を備え、該各スイッチ２４は、２つのスイッチングトランジスタ２２ａ，２２ｂより構成されている。該各スイッチ２４の２つのスイッチングトランジスタ２２ａ，２２ｂは、コレクタとエミッタとが接続されると共に、ベースに信号制御回路４０が接続されている。
【００９４】
上記各スイッチ２４の第１スイッチングトランジスタ２２ａのコレクタは、第１電源２１ａの正側に接続され、第２スイッチングトラジスタ２２ｂのエミッタは、第２電源２１ｂの負側に接続されている。そして、上記各スイッチ２４の２つのスイッチングトランジスタ２２ａ，２２ｂにおけるコレクタとエミッタとの間には、各昇圧トランス３０ａ，３０ｂ，３０ｃの一端が接続されている。
【００９５】
上記信号制御回路４０は、単相交流様、三相交流様、多相交流様、複数周波又は合成波形を各スイッチングトランジスタ２２ａ，２２ｂ，…に出力可能に構成されている。
【００９６】
したがって、上記各スイッチ２４の第１スイッチングトランジスタ２２ａがオンすると、第１電源２１ａによって各昇圧トランス３０ａ，３０ｂ，３０ｃの一次側巻線３１に正の電流が流れ、該第１スイッチングトランジスタ２２ａがオフすると、各昇圧トランス３０ａ，３０ｂ，３０ｃの二次側巻線３２に正電圧バーストが生じる。
【００９７】
また、上記各スイッチ２４の第２スイッチングトランジスタ２２ｂがオンすると、第２電源２１ｂによって各昇圧トランス３０ａ，３０ｂ，３０ｃの一次側巻線３１に負の電流が流れ、該第２スイッチングトランジスタ２２ｂがオフすると、各昇圧トランス３０ａ，３０ｂ，３０ｃの二次側巻線３２に負電圧バーストが生じる。
【００９８】
一方、上記６つの電極プローブ５０ａ，５０ｂ，５０ｃ，…は、図１０に示すように、遺伝子を導入する細胞３に対して放射状に配置されている。そして、対となる電極プローブ５０ａ，５０ｂ，５０ｃの間に所定の電位差が生じる。
【００９９】
したがって、上記各昇圧トランス３０ａ，３０ｂ，３０ｃの昇圧によって３対の電極プローブ５０ａ，５０ｂ，５０ｃの間の電圧を異なるようにしてもよい。また、上記各スイッチングトランジスタ２２ａ，２２ｂ，…のスイッチング動作によって遺伝子２などに異なる方向から電圧が印加されることになる。
【０１００】
この結果、３つの瞬発高電圧ベクトルが合成された瞬発高電圧を形成して、遺伝子などに有効な共振を励起させることができる。その他の構成、作用及び効果は、実施形態１と同様である。
【０１０１】
尚、本実施形態においては、３対の電極プローブ５０ａ，５０ｂ，５０ｃと３つのスイッチ２４を備えたが、実施形態１に対応して、１対の電極プローブ５０ａと１つのスイッチ２４を設けるようにしてもよい。これによって正電圧バースト又は負電圧バーストを生じさせることができる。
【０１０２】
−実施形態６−
図１１は、分子導入装置１を用いて遺伝子を細胞に導入するための補助具である容器７０を示している。
【０１０３】
上記容器７０は、細胞溶液を収納するものであって、所定の誘電特性を有する材料で形成され、碗状の本体７１と、該本体７１の上部開口を閉鎖する蓋体７２とより構成されている。そして、該蓋体７２には、抜気用の開口である空気孔７３が形成されている。
【０１０４】
上記容器７０の材料としては、ガラス、セラミックス、高分子材料（ポリエチレン、ポリカボネート、テフロン等）が挙げられる。
【０１０５】
上記本体７１の内部には、凹部７４が形成され、該凹部７４に強い電界が生じるように構成されている。更に、上記本体７１は、凹部７４に強い電界が生じるように絶縁部と導電部とが形成されている。
【０１０６】
つまり、上記本体７１に細胞溶液と共に、該細胞に導入する遺伝子を注入し、蓋体７２によって本体７１を閉鎖する。その際、本体７１の内部空気は空気孔７３から排出される。そして、上記本体７１の細胞溶液中の細胞は、凹部７４に集中することになる。
【０１０７】
その後、例えば、実施形態１の電極プローブ５０，５０によって容器７０の内部に高電圧を印加する。その際、本体７１において、細胞密度の高い凹部７４に電界が集中して該電界が強くなるので、より多くの細胞周辺における遺伝子等の共振が大きくなり、スムーズに遺伝子２が細胞３に導入される。
【０１０８】
尚、上記容器７０は、本体７１と蓋体７２とが一体物であってもよい。また、上記凹部７４は、本体７１又は蓋体７２の内面又は外面の少なくとも一部に形成されておいればよい。
【０１０９】
−変形例−
上記容器７０の本体７１の凹部７４は、図１２から図１４に示すように、各種の形状に形成してもよい。
【０１１０】
つまり、図１２に示すように、上記凹部７４は、中央部から外側に向かって渦巻状に旋回する螺旋状に形成してもよい。また、上記凹部７４は、複数の同心円であってもよい。
【０１１１】
また、図１３に示すように、上記凹部７４は、格子状に形成してもよい。
【０１１２】
また、図１４に示すように、上記凹部７４は、波線状に形成し、凹部７４の全長さをより延長したり、複数の波線凹部としてもよい。
【０１１３】
−実施形態７−
図１５は、分子導入装置１を用いて遺伝子を細胞に導入するための補助具８０を示している。
【０１１４】
上記補助具８０は、体内の所定部位に強い電界を生じさせるようにしたものである。該補助具８０は、所定の誘電特性を有する軟性の接着プレートに形成されている。そして、上記補助具８０は、例えば、線状の導電体が網状に形成され、絶縁面と人体９０の表面に接着されるように構成されている。
【０１１５】
したがって、遺伝子２を体内に注入した後、上記補助具８０を人体９０の表面に接着する。その後、例えば、実施形態１の電極プローブ５０，５０によって体内の所定部位に高電圧を印加する。その際、補助具８０によって所定部分に電界が集中して該電界が強くなるので、遺伝子２などの共振振幅が大きくなり、遺伝子２が細胞３にスムーズに導入する。
【０１１６】
−実施形態８−
図１６は、分子導入装置１を用いて遺伝子を細胞に導入するための補助具８０の他の実施形態を示している。
【０１１７】
上記補助具８０は、図１７に示すように、線状の導電体８１を網状に形成して鞘状に形成されている。該補助具８０は、例えば、血管９１の内部に絶縁鞘を介して導入配置される。
【０１１８】
上記補助具８０の材料としては、ガラス、セラミックス、高分子材料（ポリエチレン、ポリカボネート、テフロン等）が挙げられる。
【０１１９】
したがって、上記補助具８０を血管９１内に挿入すると共に、遺伝子２を体内に注入する。または、補助具８０とゲルなどの基質に展開した遺伝子２を一体化してもよい。その後、例えば、実施形態１の電極プローブ５０，５０によって体内の所定部位に高電圧を印加する。その際、補助具８０の導電体８１によって所定部分に電界が集中して該電界が強くなるので、遺伝子２などの共振振幅が大きくなり、遺伝子２が細胞３にスムーズに導入する。
【０１２０】
−その他の実施形態−
上記各実施形態において、昇圧手段は、変圧器である昇圧トランス３０を用いたが、圧電効果を利用した圧電素子を用いてもよい。その際、上記圧電素子は、歪みを加えて所定の瞬発高電圧を発生させるように構成する。
【０１２１】
また、本各実施形態は、電圧印加手段１２が瞬発の高電圧を印加するようにしたが、交番電圧を印加するようにしてもよく、また、瞬発の高電圧と交番電圧とを重畳した電圧を印加するようにしてもよい。
【０１２２】
また、上記電圧印加手段１２は、昇圧手段と直列又は並列にスパークギャップ又は放電管を備えていてもよい。
【０１２３】
また、上記電圧印加手段１２の高絶縁部は、電極５２に近接して配置される高絶縁遮蔽物であってもよい。
【０１２４】
また、上記電極プローブ５０は、金属、セラミックス又は有機物質を含む電導物質によって構成されていてもよい。
【０１２５】
また、分子の膜通過は、投入する印加電圧、共振定数又は電極位置の変動により、共振特性を変化させて調整するようにしてもよい。
【０１２６】
また、上記各実施形態において、電極プローブ５０，５０の間に形成される電界を可視化するために、ファントム（模擬生体組織）を適用するようにしてもよい。
【０１２７】
また、上記各実施形態において、電極プローブ５０，５０の間に形成される電界の強度を測定するために、放電センサを用いるようにしてもよい。
【０１２８】
また、補助具８０は、実施形態に限定されず、絶縁部と導電部とが形成されておればよく、要するに、所定部位に強い電界が形成されるように構成されておればよい。
【０１２９】
一方、導入する分子は、ポリヌクレオチド、蛋白質、ウィルス、各種薬剤を含む低分子化合物又は異種若しくは同種の細胞分子であってもよい。
【０１３０】
上記ポリヌクレオチドとしては、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリヌクレオチド誘導体などが挙げられる。
【０１３１】
これらの具体例としては、ＣＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、遺伝子発現ベクター、デコイ核酸などが挙げられる。
【０１３２】
上記蛋白質としては、例えば、アナログ蛋白質、生理的活性蛋白質、生理的活性物質のレセプター、抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体様合成分子、ケージド分子などが挙げられる。
【０１３３】
上記各種薬剤を含む低分子化合物としては、例えば、抗がん剤、抗生物質、免疫抑制剤、色素物質、発光蛍光物質などが挙げられる。
【０１３４】
また、上記導入する分子の導入を促進する物質としては、電子、電子スピンプローブ分子、膜電位プローブ分子、光学プローブ分子、麻酔薬、クロルプロマジン類、ポリミキシンＢなどの抗生物質、フィブロネクチンなどの細胞接着分子、蛋白、リボ蛋白、ペプチド、アミノ酸などが挙げられる。
【０１３５】
また、生体組織は、動物又は植物の組織であってもよく、細胞３は、動物、植物若しくは微生物の細胞又は動物、植物若しくは微生物からクローンした細胞であってもよい。
【０１３６】
上記動物としては、例えば、原虫、昆虫、無脊椎動物、脊椎動物、ヒト、生殖器を有する生体の雌雄同体生物などが挙げられる。
【０１３７】
上記微生物としては、例えば、ウィルス、細菌、カビなどが挙げられる。
【０１３８】
上記生物由来の細胞としては、例えば、受精卵、精子、卵子、始原生殖細胞、ブラストシスト、細胞種系統、ＥＳ細胞を含む各種幹細胞及びプロジェニター細胞、植物の種子、カルスなどが挙げられる。
【０１３９】
上記クローン化された細胞としては、例えば、初代培養細胞、経代培養細胞などが挙げられる。
【０１４０】
また、分子は、サポニン、ジギトニン、ジメチルスルフォキサイドなどの界面活性剤、イオノフォア、リピッド、セラミド、アルブミン、グリセリン、ゼラチン若しくは血清の少なくとも一つ、又は細胞内外の浸透圧若しくはイオンバランスを制御する分子を含有した液で調製されていてもよい。
【０１４１】
また、分子は、軟膏、クリーム、ゲル状の基材又は注射用水に展開し、体表面への塗布、体表面への貼付又は体内への注入が行われるようにしてもよい。
【０１４２】
また、本発明は、細胞融合に適用してもよいことは勿論である。つまり、通常、細胞融合は、ポリエチレングリコールを用いて細胞間の融合を行う。また、細胞壁を有する細胞では、プロトプラスト化処理した後に行う。しかし、ポリエチレングリコールには、細胞毒性があり融合効率の向上に支障をきたす。そこで、本発明の分子導入装置を適用し、細胞膜を振動させる。この結果、ポリエチレングリコールを使用することなく細胞融合が行われる。
【０１４３】
また、本発明は、品種改良及び遺伝子組換え植物に適用してもよいことは勿論である。遺伝子組換え植物の作成は、以下の過程で行われる。
【０１４４】
先ず、培養植物細胞に対しアデノウイルスやパーティクルガンを用いて遺伝子を導入する。次に、遺伝子が導入された細胞を選別し、その細胞を組織培養して個体の植物をへと分化をさせる。
【０１４５】
しかし、植物の遺伝子組換えは、先に述べた培養細胞の確立と、細胞から個体への組織培養法の確立が必須であるために、全ての植物に遺伝子組換えが可能なわけではない。タバコやイネといった比較的遺伝子操作が容易に行える植物以外は、遺伝子組換えが現段階では困難である。
【０１４６】
そこで、本発明の分子導入装置を適用し、ジーンシンフォナイザーを用いて種子全体に遺伝子を導入する。この結果、組織培養の過程を省略することができ、また、植物種を選ばない新しい遺伝子組換え植物作成法が可能である。
【０１４７】
通常植物への遺伝子導入は、アグロバクテリウム ベクター、パーティクルガン又はエレクトロポレイション法を用いる。しかし、動物細胞とは異なり、細胞壁を持つことから植物細胞内への遺伝子導入効率が低く、この細胞壁を分解するプロトプラスト化又はカルスを誘導させることが不可欠とされてきた。本発明は、細胞壁、細胞膜ともに振動させるので、プロトプラスト化やカルス誘導を行なうことなく遺伝子の導入が可能になる。また、本発明は、細胞に対する障害性が低いことから、遺伝子導入効率の高い植物細胞へ遺伝子導入方法になる。
【０１４８】
【産業上の利用可能性】
以上のように、本発明による分子導入装置及び分子導入方法は、分子を細胞に導入する場合に有用であり、遺伝子治療、再生治療、標的組織又は標的細胞への薬物導入、動植物の品種改良、トランスジェニック、遺伝子組換え生物の作成、細胞融合及び人為的物質合成などに適している。
【図面の簡単な説明】
図１は、分子導入装置を示す電気回路図である。
図２は、遺伝子の細胞膜通過を概略的に示す状態図である。
図３は、昇圧トランスの励磁波形を示す波形図である。
図４は、昇圧トランスの二次側巻線に生ずる瞬発電圧及び減衰電圧の波形図である。
図５は、細胞の共振時を示す電圧波形図である。
図６は、実施形態２の電極プローブを示す断面図である。
図７は、実施形態３の電極プローブを示す断面図である。
図８は、実施形態４の分子導入装置を示す電気回路図である。
図９は、実施形態５の分子導入装置を示す電気回路図である。
図１０は、実施形態５の電極プローブの配置を示す配置図である。
図１１は、実施形態６の分子導入装置に用いる容器を示す斜視図である。
図１２は、実施形態６の容器における凹部の変形例を示す図１１Ｘ−Ｘ線における断面図である。
図１３は、実施形態６の容器における凹部の他の変形例を示す図１１Ｘ−Ｘ線における断面図である。
図１４は、実施形態６の容器における凹部の他の変形例を示す図１１Ｘ−Ｘ線における断面図である。
図１５は、実施形態７の分子導入装置に用いる補助具を示す図である。
図１６は、実施形態８の分子導入装置に用いる補助具を示す断面図である。
図１７は、実施形態８の補助具を示す斜視図である。
図１８は、実施形態１における実施例４を示す鶏大腿筋の顕微鏡写真である。
図１９は、実施形態１における実施例１の試験結果を示し、本分子導入装置を適用した使用群（ＧＣＳ）の吸光図である。
図２０は、実施形態１における実施例１の試験結果を示し、本分子導入装置を適用しない未使用群（ＣＴＬ）の吸光図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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