(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジェミニウィルスRepタンパク質によって認識されうる第1のRepタンパク質認識配列、3'末端のイントロン、ターミネーターに機能的に結合した対象遺伝子の3'末端部分、該対象遺伝子の5'末端部分に機能的に結合したプロモーター、5'末端のイントロン、およびジェミニウイルスRepタンパク質によって認識されうる第2のRepタンパク質認識配列を、5'から3'の直鎖状形状で含む、直鎖状遺伝子構築物であって；該Rep認識配列が、互いに環状化を促進するように適合され、該3'末端および5'末端のイントロン配列が、スプライシング能力を有し；該対象遺伝子の3'および5'末端部分が、一緒に該対象遺伝子のコード領域を構成し；環状化された場合に、3'末端のイントロンと5'末端のイントロンが、イントロン配列を形成し、および該対象遺伝子の5'末端部分が、該イントロン配列によって該対象遺伝子の該3'末端部分から分離されており；イントロン配列を切除した場合に、該対象遺伝子の5'末端部分が、該対象遺伝子の3'末端部分に機能的に結合し；および該対象遺伝子を発現した場合に、該対象遺伝子が、該構築物の環状化の前およびイントロン配列の切除の前に、該対象遺伝子の離れた部分には存在しない活性もしくは特性を示すか、活性もしくは特性を示すための能力を示す、直鎖状遺伝子構築物。
【請求項２】
前記対象遺伝子が、mRNA、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする、請求項1記載の遺伝子構築物。
【請求項３】
前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、細胞死を引き起こすかまたはそうでなければ細胞死を促進する、請求項2記載の遺伝子構築物。
【請求項４】
前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、酵素活性を有する、請求項2記載の遺伝子構築物。
【請求項５】
前記構築物が、真核細胞に導入されている、請求項1記載の遺伝子構築物。
【請求項６】
前記真核細胞が、植物細胞である、請求項5記載の遺伝子構築物。
【請求項７】
前記プロモーターが、アルコール誘導可能プロモーターである、請求項4記載の遺伝子構築物。
【請求項８】
ssDNAウイルスに抵抗性のトランスジェニック植物またはその子孫を作成する方法であって、該植物のゲノム中に、ジェミニウィルスRepタンパク質によって認識されうる第1のRepタンパク質認識配列、イントロンの3'末端、ターミネーターに機能的に結合した対象遺伝子の3'末端部分、該対象遺伝子の5'末端部分に機能的に結合したプロモーター、イントロンの5'末端、およびジェミニウイルスRepタンパク質によって認識されうる第2のRepタンパク質認識配列を、5'から3'の直鎖状形状で含む、直鎖状遺伝子構築物を導入する段階を含み；該Rep認識配列が、互いに環状化を促進するように適合され、該3'末端および5'末端のイントロン配列が、スプライシング能力を有し；該対象遺伝子の3'および5'末端部分が、一緒に該対象遺伝子のコード領域を構成し；環状化された場合に、3'末端のイントロンと5'末端のイントロンが、イントロン配列を形成し；ジェミニウイルスRepタンパク質を有するssDNAによって植物またはその子孫の植物細胞が感染した場合に、該遺伝子構築物が、切除および環状化されて、該イントロン配列によって該対象遺伝子の該3'末端部分から分離されている該対象遺伝子の5'末端部分を含む遺伝要素を形成し；イントロン配列を切除した場合に、該対象遺伝子の5'末端部分が、該対象遺伝子の3'末端部分に機能的に結合し、および該対象遺伝子が、植物細胞を死滅させるかそうでなければ植物細胞を休止させるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中で発現され；および該構築物の環状化の前および切除の前に、該対象遺伝子の離れた部分が、植物細胞を死滅させるかそうでなければ植物細胞を休止させるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードしてはいない、方法。
【請求項９】
前記ssDNAウイルスがジェミニウィルス科の群のメンバーである、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記ジェミニウイルス科のウイルスが、ベゴモウィルスまたはマストレウィルスである、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
直鎖状遺伝子構築物を含む遺伝的に修飾された植物またはその部分であって、該直鎖状遺伝子構築物が、ジェミニウィルスRepタンパク質によって認識されうる第1のRepタンパク質認識配列、3'末端のイントロン、ターミネーターに機能的に結合した対象遺伝子の3'末端部分、該対象遺伝子の5'末端部分に機能的に結合したプロモーター、5'末端のイントロン、およびジェミニウイルスRepタンパク質によって認識されうる第2のRepタンパク質認識配列を、5'から3'の直鎖状形状で含むものであり；該Rep認識配列が、互いに環状化を促進するように適合され、該3'末端および5'末端のイントロン配列が、スプライシング能力を有し；該対象遺伝子の3'および5'末端部分が、一緒に該対象遺伝子のコード領域を構成し、環状化された場合に、3'末端のイントロンと5'末端のイントロンが、イントロン配列を形成し、および該対象遺伝子の5'末端部分が、該イントロン配列によって該対象遺伝子の該3'末端部分から分離されており；イントロン配列を切除した場合に、該対象遺伝子の5'末端部分が、該対象遺伝子の3'末端部分に機能的に結合し；および該対象遺伝子を発現した場合に、該対象遺伝子が、該構築物の環状化の前およびイントロン配列の切除の前に、該対象遺伝子の離れた部分には存在しない活性もしくは特性を示すか、活性もしくは特性を示すための能力を示す、遺伝的に修飾された植物またはその部分。
【請求項１２】
ナノウイルスRepタンパク質によって認識されうる第1のRepタンパク質認識配列、3'末端のイントロン、ターミネーターに機能的に結合した対象遺伝子の3'末端部分、該対象遺伝子の5'末端部分に機能的に結合したプロモーター、5'末端のイントロン、およびナノウイルスRepタンパク質によって認識されうる第2のRepタンパク質認識配列を、5'から3'の直鎖状形状で含む、直鎖状遺伝子構築物であって；該Rep認識配列が、互いに環状化を促進するように適合され、該3'末端および5'末端のイントロン配列が、スプライシング能力を有し；該対象遺伝子の3'および5'末端部分が、一緒に該対象遺伝子のコード領域を構成し；環状化された場合に、3'末端のイントロンと5'末端のイントロンが、イントロン配列を形成し、および該対象遺伝子の5'末端部分が、該イントロン配列によって該対象遺伝子の該3'末端部分から分離されており；イントロン配列を切除した場合に、該対象遺伝子の5'末端部分が、該対象遺伝子の3'末端部分に機能的に結合し；および該対象遺伝子を発現した場合に、該対象遺伝子が、該構築物の環状化の前およびイントロン配列の切除の前に、該対象遺伝子の離れた部分には存在しない活性もしくは特性を示すか、活性もしくは特性を示すための能力を示す、直鎖状遺伝子構築物。
【請求項１３】
前記対象遺伝子が、mRNA、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする、請求項12記載の遺伝子構築物。
【請求項１４】
前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、細胞死を引き起こすかまたはそうでなければ細胞死を促進する、請求項13記載の遺伝子構築物。
【請求項１５】
前記ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、酵素活性を有する、請求項13記載の遺伝子構築物。
【請求項１６】
前記構築物が、真核細胞に導入されている、請求項12記載の遺伝子構築物。
【請求項１７】
前記真核細胞が、植物細胞である、請求項16記載の遺伝子構築物。
【請求項１８】
前記プロモーターが、アルコール誘導可能プロモーターである、請求項15記載の遺伝子構築物。
【請求項１９】
ssDNAウイルスに抵抗性のトランスジェニック植物またはその子孫を作成する方法であって、該植物のゲノム中に、ナノウイルスRepタンパク質によって認識されうる第1のRepタンパク質認識配列、イントロンの3'末端、ターミネーターに機能的に結合した対象遺伝子の3'末端部分、該対象遺伝子の5'末端部分に機能的に結合したプロモーター、イントロンの5'末端、およびナノウイルスRepタンパク質によって認識されうる第2のRepタンパク質認識配列を、5'から3'の直鎖状形状で含む、直鎖状遺伝子構築物を導入する段階を含み；該Rep認識配列が、互いに環状化を促進するように適合され、該3'末端および5'末端のイントロン配列が、スプライシング能力を有し；該対象遺伝子の3'および5'末端部分が、一緒に該対象遺伝子のコード領域を構成し；環状化された場合に、3'末端のイントロンと5'末端のイントロンが、イントロン配列を形成し；ナノウイルスRepタンパク質を有するssDNAによって植物またはその子孫の植物細胞が感染した場合に、該遺伝子構築物が、切除および環状化されて、該イントロン配列によって該対象遺伝子の該3'末端部分から分離されている該対象遺伝子の5'末端部分を含む遺伝要素を形成し；イントロン配列を切除した場合に、該対象遺伝子の5'末端部分が、該対象遺伝子の3'末端部分に機能的に結合し、および該対象遺伝子が、植物細胞を死滅させるかそうでなければ植物細胞を休止させるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質中で発現され；および該構築物の環状化の前および切除の前に、該対象遺伝子の離れた部分が、植物細胞を死滅させるかそうでなければ植物細胞を休止させるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードしてはいない、方法。
【請求項２０】
前記ssDNAウイルスがナノウィルス群のメンバーである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
直鎖状遺伝子構築物を含む遺伝的に修飾された植物またはその部分であって、該遺伝子構築物が、ナノウイルスRepタンパク質によって認識されうる第1のRepタンパク質認識配列、3'末端のイントロン、ターミネーターに機能的に結合した対象遺伝子の3'末端部分、該対象遺伝子の5'末端部分に機能的に結合したプロモーター、5'末端のイントロン、およびナノウイルスRepタンパク質によって認識されうる第2のRepタンパク質認識配列を、5'から3'の直鎖状形状で含むものであり；該Rep認識配列が、互いに環状化を促進するように適合され、該3'末端および5'末端のイントロン配列が、スプライシング能力を有し；該対象遺伝子の3'および5'末端部分が、一緒に該対象遺伝子のコード領域を構成し、環状化された場合に、3'末端のイントロンと5'末端のイントロンが、イントロン配列を形成し、および該対象遺伝子の5'末端部分が、該イントロン配列によって該対象遺伝子の該3'末端部分から分離されており；イントロン配列を切除した場合に、該対象遺伝子の5'末端部分が、該対象遺伝子の3'末端部分に機能的に結合し；および該対象遺伝子を発現した場合に、該対象遺伝子が、構築物の環状化の前およびイントロン配列の切除の前に、該対象遺伝子の離れた部分には存在しない活性もしくは特性を示すか、活性もしくは特性を示すための能力を示す、遺伝的に修飾された植物またはその部分。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に、構築物に関し、詳細には、これに限定されないが真核細胞のゲノムなどのより大きいヌクレオチド配列から共有結合により閉じた環状で放出されうるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物に関する。好ましくは、ポリヌクレオチド配列は、一旦放出されると、ポリヌクレオチド配列の発現を可能にする形態で再構成される。一態様において、再構成されたポリヌクレオチド配列は、これに限定されないがイントロン配列または他のスプライスシグナルなどの外来性ヌクレオチドの全てまたは一部が挿入されているコード配列を含む。コード配列の発現、特に転写は外来性配列をスプライシングすることに関係する。この態様によると、コード配列は、ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質、アンチセンスもしくはセンス核酸分子またはリボザイムをコードすることができる。別の態様において、再構成されたポリヌクレオチド配列は、プロモーター要素とコード配列との間に配置された外来ポリヌクレオチド配列を含む。この態様において、コード配列の発現は、外来配列の存在によって実質的に有害に影響されない。さらに別の態様において、再構成された配列は、プロモーターの機能に影響を与えない外来配列を含むRNAプロモーターまたは他の調節遺伝子配列を作製する。放出および環状化は、一般に、タンパク質媒介性刺激などの刺激に応答する。さらに詳細には、タンパク質はウィルスまたは原核細胞もしくは真核細胞由来のタンパク質または発生上および／または組織特異的に調節されるタンパク質である。本発明の構築物は、特に、病原菌に対する遺伝的抵抗性を与える際に有用であり、また例えば、癌を治療する際または植物の雄性もしくは雌性不稔性を誘導する際に有用なアポトーシスもしくは他の細胞死機序を誘導する際に有用である。従って、構築物は、選択された遺伝子配列の部位特異的発現および／または発生上調節される発現を可能にする。
【０００２】
背景技術
本明細書においてどのような従来技術についての言及も、この従来技術がオーストラリアや任意の他の国の共通の一般知識の一部を形成すると認めるものとしてまたは何らかの形でそれと示すものとしては考えず、また考えるべきではない。
【０００３】
組換えDNA技術の知識が深まるにつれ、医学、園芸および農業などの技術分野の調査および開発が大いに促進されている。植物細胞などの細胞内に有用な表現型の変化を誘導する、例えば、病原菌において自然に発生している遺伝子機序を利用することが特に重要である。このことは、種々の植物病原菌に対する抵抗性を植物に誘導する機序に関連する園芸分野において特に明らかである。
【０００４】
作物におけるウィルス抵抗性の形成は、例えば、標的ウィルス由来の導入遺伝子で形質転換することによりかなり進歩している。導入遺伝子を使用する上で最も成果を挙げているのはRNA植物ウィルスを用いたものである。しかし、遺伝子組換えによる抵抗性により1本鎖DNA(ssDNA)植物ウィルスを制御する試みは数多くあるにもかかわらず、RNA植物ウィルスで成果を挙げている方法は、ssDNA植物ウィルスには有効ではない。DNA植物、特に1本鎖DNA(ssDNA)植物ウィルスは、熱帯および亜熱帯地方において広範囲な果実、野菜、穀類および繊維作物の重大な商業上の損失の原因となる。
【０００５】
植物に感染するssDNAウィルスには2つの群があると報告されている。これらはジェミニウィルスと最近記載されているナノウィルス群である。ジェミニウィルスは双生(geminate)ビリオンと一連(monopartite)または二連(bipartite)のいずれかの環状ssDNAゲノムを有する。各分子は鎖長が約2.7 kbである。ジェミニウィルス属のうち、ベゴモウィルスおよびマストレウィルスが最も重要である。ベゴモウィルスはコナジラミ媒介性で、一連(monopartite)または二連(bipartite)のゲノムを有する。この属のメンバーは、トマト（黄化）葉巻病ウィルス（熱帯および亜熱帯地域のほとんどに伝播する種々のウィルスからなる）、アフリカキャッサバモザイクウィルス（アフリカ）、ビーンゴールデンモザイクウィルス（南米および中央アメリカ）、リョクトウ黄化モザイクウィルス（インド）および綿葉巻病ウィルス（南および東南アジア）などの近代農業の経済的破綻を最も生じやすいとされるウィルスをいくつか含む。多数のベゴモウィルスは、コナジラミベクター、Bemesia tabaciの侵略的な「B生物型（biotype）」が広範に導入された結果として近年その影響が劇的に増加している。マストレウィルスは農業に対してはあまり影響を与えていないが、大きな損害の原因となっている作物もある。これらのウィルスはヨコバイが媒介し、一連(monopartite)のゲノムを有する。この属のメンバーには、トウモロコシ縞葉枯病(maize streak)ウィルス(アフリカ)、コムギ萎縮病（wheat drawf)ウィルス（ヨーロッパ）およびタバコ黄萎病(tobacco yellow dwarf)ウィルスが含まれる。
【０００６】
ナノウィルスは等大(isometric)ビリオンおよび環状ssDNAゲノムを有するが、これらのゲノムは、その各々が約1 kbである少なくとも6つの異なる不可欠なゲノム構成成分を有する複数構成体である。ツノゼミが媒介し、バヌアツで唯一報告されている暫定的なナノウィルスであるココナッツ葉腐敗(coconut folia decay)ウィルスを除いて、これらのウィルスはアブラムシが媒介する。経済的に見て最も重要なナノウィルスはバナナバンチートップウィルス(BBTV)であり、これは1920年代にオーストラリアのバナナ産業をほぼ壊滅させ、南太平洋、アジアおよびアフリカにおいて大きな損害が生じた。サブタレニアンクローバ萎縮病ウィルス（オーストラリア）、ソラマメ壊死黄化ウィルス（地中海）およびココナッツ腐敗(coconut folia decay)ウィルス（バヌアツ）は全て収穫に大きな損害をもたらす。
【０００７】
ベゴモウィルス、マストレウィルスおよびナノウィルスのゲノム組織化には、ゲノム構成成分の数およびサイズ並びに遺伝子の数およびサイズ、転写物の処理方法、遺伝子の方向性等を含む大きな差がある。しかし、これらのウィルスは複製および感染方法が非常に類似していることを示唆する顕著な類似性もある。ジェミニウィルスおよびナノウィルスは全て、(i)ニッキングおよび接合活性を有し、ウィルスゲノムのローリングサークル複製を支持するRepタンパク質、(ii)ビリオンコートタンパク質、(iii)宿主細胞の網膜芽細胞腫様タンパク質に結合して細胞をS期に移行させることに関与するタンパク質、(iv)細胞間移動タンパク質および(v)核シャトルタンパク質をコードする。さらに、これらのウィルスは機能的に類似した遺伝子間部位(IR)を有する。例えば、ベゴモウィルスのIR、マストレウィルスのLIRおよびバナナバンチートップナノウィルスのCR-SLは全て(i)全てのジェミニウィルスとナノウィルス間で保存性が高く、Repタンパク質によるニッキングおよび連結部位であるノナヌクレオチドループ配列であるステム／ループ構造および(ii)Repタンパク質を認識するこの部位内のドメインを含む。マストレウィルスのSIRおよびバナナバンチートップナノウィルスのCR-Mは、ビリオンssDNAが転写的に活性なdsDNAに変換するのをプライミングする内因性プライマーの結合部位である。
【０００８】
作物において遺伝子組換えによるRNAウィルスへの抵抗性の形成が成功し、ssDNAウィルスに対するこのような抵抗性の必要性が増加していることにより、コートタンパク質遺伝子、移動タンパク質遺伝子およびRepタンパク質遺伝子を含む種々のウィルス遺伝子を標的とするssDNAウィルスの種々の方法が検討されている。また、欠損干渉DNAおよび自殺遺伝子を使用した方法が検討されている。この分野におけるほとんどの研究は、マストレウィルスまたはナノウィルスではなくベゴモウィルスに関係している。
【０００９】
本発明に至る研究において、本発明者らは、植物において遺伝的抵抗性を誘導するために、ssDNAウィルスの複製機序を利用した。しかし、本発明は、刺激に応答して特定の表現型を生ずるポリヌクレオチド配列の発現などの遺伝的活性を調節する際に多種多様の用途がある。
【００１０】
発明の概要
本明細書全体において、その内容がそうでないことを特に要求しない限り、「含む（comprise）」という用語または「1つのものを含む（comprises）」もしくは「含んでいる（comprising）」などの変化形は、記載されている構成要素もしくは完全体または構成要素もしくは完全体の集合を含むことを意味するが、任意の他の構成要素もしくは完全体または構成要素もしくは完全体の集合を除外するのではないことが理解される。
【００１１】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、配列識別子番号(配列番号：)によって言及される。配列番号：は、配列識別子<400>1、<400>2等に数字が対応する。配列リストは請求の範囲の後に示されている。
【００１２】
本発明の一局面は、ウィルス由来の複製促進タンパク質もしくはその誘導体または真核細胞もしくは原核細胞相同物が遺伝子構成要素および隣接するヌクレオチド配列の全てまたは一部の切り出しおよび環状化を促進する真核細胞のゲノムに組み込まれた場合に、ウィルス由来の複製促進タンパク質もしくはその誘導体または真核細胞および原核細胞相同物によって認識されうるヌクレオチド配列が機能的に隣接した遺伝子構成要素を含む構築物であって、該ウィルス由来の複製促進タンパク質もしくはその誘導体または真核細胞もしくは原核細胞相同物によって認識されうる該ヌクレオチド配列がイントロン配列もしくはそれらの一部または他のスプライスシグナルを含む1つ以上の外来配列に隣接するかまたはそれに挿入され、非環状形態の遺伝子構成要素および他のヌクレオチド配列は、環状化された上で、環状化の前または環状化して発現する前には2つのモジュールヌクレオチド配列にはなかった特性を示す遺伝子配列またはその特性を示す能力を形成する2つのモジュールヌクレオチド配列を含む、構築物を提供する。
【００１３】
本発明の別の局面は、Repタンパク質またはその機能的誘導体もしくは相同物の存在下において遺伝子構成要素を含む環状ヌクレオチド配列の作製を促進するRepタンパク質認識配列、または他のウィルスまたは真核細胞もしくは原核細胞由来の機能的相同物が隣接する遺伝子構成要素を含む構築物であって、該Repタンパク質認識配列が1つ以上の認識配列に隣接するかまたはそれに挿入され、該遺伝子構成要素は、該遺伝子構成要素が環状化した分子内に含有される場合に、該ポリヌクレオチド配列の発現を可能にするのに必要な調節配列に機能的に結合したポリヌクレオチド配列を含み、環状化された上で、遺伝子構成要素が、Repタンパク質認識配列の全てまたは一部によってポリヌクレオチド配列から分離された調節配列を含み、該ポリヌクレオチド配列が発現された上で、発現産物をコードするように、直鎖状の遺伝子構成要素が、5'側から3'側方向に向かって、
ポリヌクレオチド配列と、
環状のときに該ポリヌクレオチド配列の発現を可能にする調節配列と
を含む、構築物を提供する。
【００１４】
本発明のさらなる局面は、5'側から3'側方向に向かって、第1、第2、第3、第4、第5および第6のヌクレオチド配列を含む構築物であって、
第1および第6のヌクレオチド配列は同じであっても、異なっていてもよく、該第1および第6の配列の全てまたは一部を含む該第1および第6の配列が隣接する遺伝物質は、該構築物がゲノム配列などのより大きいヌクレオチドに組み込まれた場合に、切り出しおよび環状化されうるように、第1および第6のヌクレオチド配列は各々1つ以上のRepタンパク質またはそれらの誘導体もしくは相同物によって認識されうるRepタンパク質認識配列を含み、該Repタンパク質認識配列は、イントロン配列もしくはそれらの一部または他のスプライスシグナルを含む1つ以上の外来配列に隣接するかまたはそれに挿入され、
第2のヌクレオチド配列はポリヌクレオチド配列の3'側部分を含み、
第3のヌクレオチド配列は該第2の配列に機能的に結合する転写ターミネーターまたはその機能的な誘導体もしくは相同物であり、
第4のヌクレオチド配列は第5のヌクレオチド配列に機能的に結合するプロモーター配列であり、
第5のヌクレオチド配列はポリヌクレオチド配列の5'側部分であり、該ポリヌクレオチド配列の5'側および3'側部分が該ヌクレオチド配列の全長のコード配列であり、
1つ以上のRepタンパク質の存在下において、構築物がゲノム配列などのより大きいヌクレオチド配列に組み込まれた場合に、環状化された遺伝子配列は、該第1および／または第6のヌクレオチド配列の全てまたは一部を含む外来配列または他のスプライスシグナルの全てまたは一部を含むポリヌクレオチド配列に機能的に結合した該プロモーター配列と転写ターミネーター配列とを順に含むより大きい該ヌクレオチド配列から分離して作製される、構築物を提供する。
【００１５】
本発明のよりさらに別の局面は、構築物を作製する際に使用する遺伝子構成要素であって、この遺伝子構成要素が、5'側から3'側方向に向かって、転写ターミネーターに機能的に結合したポリヌクレオチド配列の3'側部分と、ポリヌクレオチド配列の5'側部分に機能的に結合したプロモーターとを含み、環状化された上で、ポリヌクレオチド配列の5'側部分が、外来配列またはイントロン配列または他のスプライスシグナルの全てまたは一部によって分離されたポリヌクレオチド配列の該3'側部分に機能的に結合される、遺伝子構成要素に関する。
【００１６】
本発明のよりさらに別の局面は、配列番号：31〜配列番号：36に実質的に記載のヌクレオチド配列、または配列番号：31〜配列番号：36の各々と60%の類似性を有するヌクレオチド配列、または配列番号：31〜配列番号：36の1つ以上にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、またはその相補的な形態を42℃の低ストリンジェンシー条件下において含む構築物を提供する。
【００１７】
本発明のよりさらに別の局面は、ssDNAウィルスに抵抗性のトランスジェニック植物またはその子孫を作出する方法であって、5'側から3'側方向に向かって、イントロン配列または他のスプライスシグナルに隣接するかまたはそれに挿入されるRepタンパク質認識配列と、ポリヌクレオチド配列の3'側末端部分と、転写ターミネーターまたはその機能的等価物と、ポリヌクレオチド配列の5'側および3'側部分が、細胞死または休止状態を誘導することができるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のコード領域であるポリヌクレオチド配列の5'側末端部分に機能的に結合したプロモーター配列と、同じかまたは異なるRepタンパク質認識配列とを含む構築物を該植物のゲノムに組み込む段階を含み、隣接するRepタンパク質認識配列を認識することができるRepタンパク質を有するssDNAウィルスが該植物細胞に感染した上で、構築物が切り出され、環状化して、植物細胞を死滅させるかまたはそうでなければ植物細胞を休止させるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する形態に該ポリヌクレオチド配列を再構成する方法を含む。
【００１８】
本発明のよりさらに別の局面は、Repタンパク質認識タンパク質またはその機能的誘導体もしくは相同物の存在下において遺伝子構成要素を含む環状ヌクレオチド配列の作製を促進するRepタンパク質認識配列が隣接する遺伝子構成要素を含む構築物であって、該Repタンパク質認識配列が、イントロン配列もしくはそれらの一部または他のスプライスシグナルを含む1つ以上の外来配列に隣接するかまたはそれに挿入され、該遺伝子構成要素が、該プロモーターの機能を実質的に妨害する鎖長のヌクレオチド配列によって分離されるプロモーターの3'側部分および5'側部分を含み、環状化された上で、遺伝子構成要素は、Repタンパク質認識配列および／またはイントロン配列または他のスプライスシグナルの全てまたは一部によって分離されるプロモーター配列の5'側および3'側部分を含むが、プロモーターの活性を不活性化せず、該環状分子は、必要に応じて、ポリヌクレオチド配列に機能的に結合したプロモーターをさらに含むように、直鎖状の該遺伝子構成要素は、5'側から3'側方向に向かって、
該プロモーターの3'側部分と、
必要に応じて、該プロモーターの該3'側部分に機能的に結合するポリヌクレオチド配列と、
該プロモーターの5'側部分と
を含む構築物を提供する。
【００１９】
プロモーターはDNAプロモーターであっても、RNAプロモーターであってもよい。
【００２０】
配列識別名の要約を示す。
配列識別名の要約
0004797141.tif 000002
【００２１】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、一部には、真核細胞のゲノムから特異的な標的配列を切り出し、環状化するためにウィルス由来の複製促進タンパク質を使用することができるという認識を根拠としている。「切り出す」という用語は、この場合には、標的配列の放出、より詳細には複製可能な放出を含む。ウィルス由来の複製促進タンパク質は、ウィルス由来の複製促進タンパク質に特異的で、それによって認識される特定の配列が隣接した遺伝子構成要素のニッキング、切り出しおよび環状化を開始する。本発明は、ウィルス由来の促進タンパク質の誘導体並びにそれらの真核細胞および原核細胞の相同物に及ぶ。従って、本発明は、ポリヌクレオチド配列の切断および連結を促進することができる任意の配列に及び、本明細書において「認識配列」と呼び、「外来配列」と本明細書において考えることもできる。認識配列は、イントロン配列または他のスプライスシグナルを含む外来配列に隣接するかまたは挿入される。
【００２２】
一態様において、環状化過程により、発現されたとき、スプライス可能な外来配列によって分離される2つのモジュール成分から特定の遺伝子配列を形成することができる。環状化前に、モジュール成分は遺伝子的に分離されており、従って機能的に結合されていない。機能的な結合は、便利なことに、例えば、一態様において、モジュール成分を含む遺伝子配列が発現されるかどうかによって示される。この例において「発現される」という用語は、mRNAへの転写、必要に応じてmRNA配列の翻訳産物への翻訳を含む。しかし、発現は、モジュール成分から遺伝子配列を構成するための唯一の基準ではない。別の態様において、環状化により産生される遺伝子配列は、発現を必要としない他の有用な機能を有することもある。例えば、得られた遺伝子配列はタンパク質結合認識部位を含んでいてもよく、それによって特定の細胞質または核タンパク質を標的とすることができる。または、再構成されたポリヌクレオチド配列はプロモーター構成要素とコード配列との間に外来配列を含む。前者の場合には、プロモーターは、好ましくは、TMV、AMVまたはTEVウィルス由来などのRNAプロモーターである。
【００２３】
または、プロモーターは、認識配列の挿入がその活性に実質的に有害な影響を与えないDNAプロモーターである。
【００２４】
従って、本発明の一局面は、ウィルス由来の複製促進タンパク質もしくはその誘導体または真核細胞もしくは原核細胞相同物が遺伝子構成要素および隣接するヌクレオチド配列の全てまたは一部の切り出しおよび環状化を促進する真核細胞のゲノムに組み込まれた場合に、ウィルス由来の複製促進タンパク質もしくはその誘導体または真核細胞および原核細胞相同物によって認識されうるヌクレオチド配列が機能的に隣接した遺伝子構成要素を含む構築物であって、該ウィルス由来の複製促進タンパク質もしくはその誘導体または真核細胞もしくは原核細胞相同物によって認識されうる該ヌクレオチド配列がイントロン配列もしくはそれらの一部または他のスプライスシグナルを含む1つ以上の外来配列に隣接するかまたはそれに挿入され、非環状形態の遺伝子構成要素および他のヌクレオチド配列が、環状化された上で、環状化の前または環状化して発現する前には2つのモジュールヌクレオチド配列にはなかった特性を示す遺伝子配列またはそれを示す能力を形成する2つのモジュールヌクレオチド配列を含む、構築物を提供する。
【００２５】
「構築物」という用語は、広義に使用され、少なくとも2つの異種配列を含む遺伝子構築物、核酸分子、ベクター、プラスミドまたは任意の他のヌクレオチド配列を含む。従って、構築物は、異なる遺伝子起源由来の2つ以上のヌクレオチド配列を含むように操作された組換え分子である。一態様において、構築物は単離された形態である。「単離された」という用語は、生物学的に純粋な状態、実質的に純粋な状態または少なくとも1回の精製段階が構築物を含む試料に実施されている別の状態を含む。「精製段階」は、例えば、沈殿、遠心分離および／またはクロマトグラフィーまたは電気泳動による分離を含む。別の態様において、遺伝子構築物は宿主細胞のゲノムに組み込まれる。構築物は、組み込み後に、損失、除去または再配列されるヌクレオチド配列を含んでもよい。さらに別の態様において、構築物は、環状でインビトロにおいて作製されるか、または宿主細胞のゲノムから切り出されることにより環状になる。
【００２６】
「遺伝子構成要素」という用語は広義に使用され、遺伝子構成要素の5'側から3'側方向または3'側から5'方向に向かって特定の順に操作された2つ以上のヌクレオチド配列系列を含む。本質的に、遺伝子構成要素はモジュール形態の2つのヌクレオチド配列を含む。「モジュール」という用語は、ヌクレオチド配列の構成または構造にどのような限定も与えるべきではなく、1つの遺伝子配列が2つの成分、すなわち、モジュール成分に分割されることを強調している。環状化された上で、2つのモジュール成分は一体として方向付けされ、イントロンおよびスプライス配列または他の認識配列を含む任意の外来配列が除去された後、遺伝子配列が別個のモジュール形態にあるときには存在しなかった特定の活性または特性を示す1つの遺伝子配列を構成する。ある状況下において、2つのモジュール成分の間に存在する外来配列は、環状であるとき、環状化されて互いが適切な配向で構成される場合、外来配列の存在がモジュール成分の機能に実質的に有害な影響を与えないならば、除去する必要がない場合もある。一般に、モジュール成分はポリヌクレオチド配列の5'側部分および3'側部分と呼ばれる。部分は、数ヌクレオチド（すなわち、約2〜約500）から多数のヌクレオチド（すなわち、約501〜約10,000）を含む。5'側および3'側部分は中央部分を含んでもよい。
【００２７】
好ましい態様において、遺伝子構成要素は、環状のとき、2つのモジュール配列を含む遺伝子配列に機能的に結合したプロモーターを含む。2つのモジュール配列は、イントロン配列、スプライスシグナルまたは他の認識配列によって分離されていてもよい。従って、遺伝子構成要素は、5'側から3'側方向に直鎖状に、ポリヌクレオチド配列の3'側部分を含む第1のモジュールヌクレオチド配列と、上記ポリヌクレオチド配列の5'側部分に機能的に結合したプロモーター配列とを含む。環状化されると、ポリヌクレオチド配列の3'側部分は新たに方向づけされ、ポリヌクレオチド配列の5'側部分に塩基結合によって融合され、それによってプロモーターに機能的に結合した機能的ポリヌクレオチド配列を再構成する。構築物に応じて、イントロン配列、スプライスシグナルまたは他の認識配列は再構成されたポリヌクレオチド配列の5'側および3'側部分を分離することができる。発現中に処理すると、イントロン配列、スプライスシグナルまたは他の認識配列を切り出すことができる。特に好ましい態様において、遺伝子構成要素は、ポリヌクレオチド配列の3'側部分に機能的に結合し、ポリヌクレオチド配列の3'側部分の下流に転写ターミネーター配列を含む。「プロモーター」および「ターミネーター」などの用語は広義に使用され、以下により詳細に記載されている。
【００２８】
別の態様において、再構成されたポリヌクレオチド配列はプロモーター要素とコード配列との間に配置されたイントロン、スプライスシグナルまたは他の認識配列をコードする。この態様によると、認識配列は転写中に除去されないと思われる。
【００２９】
よりさらに別の態様において、遺伝子構成要素は、プロモーターまたは他の調節配列の2つのモジュール成分を含む。好ましくは、モジュール成分は、環状化によりプロモーター配列を形成する。イントロン配列、スプライスシグナルまたは他の認識配列がプロモーター配列のモジュール成分を分離する場合には、このような配列はプロモーター配列の活性を破壊しないかまたは破壊しても一部である。または、プロモーターは、TMV、AMVまたはTEV由来のプロモーターなどのRNAプロモーターである。
【００３０】
ポリヌクレオチド配列は、再構成されたとき、環状化により融合される前の別個モジュールヌクレオチド配列には存在しなかった活性もしくは特性または活性もしくは特性を示す能力を示す。このような活性または特性には、特定の機能を有するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする能力、mRNA配列をコードし、その後ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳される、または宿主遺伝子もしくは他の遺伝子配列をダウンレギュレーションするアンチセンスもしくはセンス分子として作用する、またはプロモーターもしくは他の調節配列として作用する能力が含まれる。遺伝子配列に含まれる別の特性には、タンパク質に結合して核調節配列と相互作用する、あるいはリボザイムおよび／もしくはデオキシリボザイム分子に作用するまたはそれをコードする能力が含まれる。
【００３１】
特に重要なことには、遺伝子配列は、酵素活性、調節活性または構造活性を有するタンパク質をコードすることができ、またはヒトまたは家畜などの哺乳類に投与される場合には治療作用を示すことができる。後者の種類の分子の例にはサイトカイン、インターフェロンおよび増殖因子が含まれる。酵素活性を有するタンパク質は特に好ましく、このようなタンパク質は生化学経路を活性化する際、代謝物の特定の経路への流れを促進する際、殺虫剤、殺真菌剤もしくは除草剤に対する抵抗性などの特性を与える際、またはウィルスおよび細胞内微生物を含む細胞内病原菌などの病原菌に対する抵抗性を与える際に有用である。本発明の遺伝子構築物の標的として考慮される細胞には動物細胞、植物細胞、単細胞生物および微生物が含まれる。動物細胞は、霊長類、ヒト、家畜、鳥類、魚類、爬虫類、両生類および昆虫およびクモ類由来であってもよい。植物細胞は単子葉類または双子葉類植物由来であってもよい。
【００３２】
特に有用な一態様において、ポリヌクレオチド配列によってコードされるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質はアポトーシスまたは他の形態の細胞死を誘導する。これは、例えば、ウィルスに対する遺伝的抵抗性を促進する手段として有用であり、または特定の種類の細胞の細胞死を媒介するのに有用である。
【００３３】
一態様において、例えば、構築物は1本鎖DNA（ssDNA）ウィルスに対する抵抗性を促進するために使用される。このようなウィルスは、重要な作物および観賞用植物に感染することによって、農業および園芸産業に大きな損害をもたらす。植物に感染するssDNAの2つの群はジェミニウィルスおよびナノウィルスである。
【００３４】
一態様において、ウィルス由来の複製促進タンパク質もしくはその誘導体または真核細胞もしくは原核細胞相同物によって認識されうる隣接配列はステム／ループヌクレオチド構造である。好ましくは、ステム／ループ構造は、約5〜約20、好ましくは約6〜約15、最も好ましくは約9ヌクレオチド（すなわち、ノナヌクレオチド）で、ウィルス由来の複製促進タンパク質もしくはその誘導体または真核細胞もしくは原核細胞相同物によるニッキングおよび連結部位である短いヌクレオチド配列ループである。別の態様において、隣接配列は、切断および連結活性を有する任意のタンパク質によって認識される。このようなタンパク質の例はトポイソメラーゼである。これらの配列は全て本明細書において「認識配列」と呼ばれる。最も好ましくは、認識配列は「Rep」タンパク質によって認識される。このタンパク質は、ジェミニウィルスおよびナノウィルスのメンバー由来であり、認識配列を含むステム／ループ構造の5'側ドメインに結合する。しかし、本発明はステムループ構造に限定されないが、このような用途は本明細書において考慮されている。本発明は、ジェミニウィルスまたはナノウィルス由来の任意のRepタンパク質並びにその誘導体または、他のウィルス由来  または真核細胞もしくは原核細胞由来の相同物に及ぶ。真核細胞の例には哺乳類、昆虫、爬虫類、両生類および酵母細胞が含まれる。
【００３５】
他の認識配列またはそれらの等価物の例にはBBTV DNA1〜6の遺伝子間領域、TLCVまたはTYDVの短反復および長反復を含む。「イントロン配列」は、転写により、スプライシングされる能力を有するヌクレオチドの配列である。イントロン配列が存在しても、そのイントロン配列が挿入されている配列の機能に有害な影響を与えないなどの、ある種の状況において、イントロン配列はスプライシングされない。
【００３６】
本発明のこの局面の構築物は、隣接配列と同じまたは実質的に同じ認識配列、すなわち、1つのRepタンパク質またはその誘導体もしくは相同物によって認識されうる配列を含んでもよく、または異なるRepタンパク質またはその誘導体、またはその真核細胞もしくは原核細胞相同物によって認識されうる異なる認識配列を含んでもよい。さらに、認識配列は全長の配列または半分のイントロン配列2本などの一部の配列であってもよい。
【００３７】
Repタンパク質は、ウィルス感染などによって細胞に導入されていてもよく、または発生上遺伝子配列によってコードされていても、もしくは構築物を保有する動物または植物または生物において組織特異的に発現されてもよい。
【００３８】
別の好ましい態様において、Repタンパク質またはその機能的誘導体もしくは相同物の存在下において遺伝子構成要素を含む環状ヌクレオチド配列の作製を促進するRepタンパク質認識配列、または他のウィルスまたは真核細胞もしくは原核細胞由来の機能的相同物が隣接した遺伝子構成要素を含む構築物であって、該Repタンパク質認識配列が1つ以上の認識配列に隣接するかまたはそれに挿入され、該遺伝子構成要素は、該遺伝子構成要素が環状化した分子内に含有されるとき、該ポリヌクレオチド配列の発現を可能にするのに必要な調節配列に機能的に結合したポリヌクレオチド配列を含み、環状化された上で、遺伝子構成要素が、Repタンパク質認識配列の全てまたは一部によってポリヌクレオチド配列から分離された調節配列を含み、該ポリヌクレオチド配列が発現された上で、発現産物をコードするように、直鎖状の遺伝子構成要素が、5'側から3'側方向に向かって、ポリヌクレオチド配列と、
環状のときに該ポリヌクレオチド配列の発現を可能にする調節配列と
を含む、構築物が提供される。
【００３９】
好ましくは、調節配列はプロモーター配列および必要に応じて転写ターミネーターを備える(include)または含む(comprise)。上記のように、認識配列は、イントロン配列または他のスプライスシグナルなどの外来配列を備える。
【００４０】
別の態様において、Repタンパク質認識タンパク質またはその機能的誘導体もしくは相同物の存在下において遺伝子構成要素を含む環状ヌクレオチド配列の作製を促進するRepタンパク質認識配列が隣接した遺伝子構成要素を含む構築物であって、該Repタンパク質認識配列が、イントロン配列もしくはそれらの一部または他のスプライスシグナルを含む1つ以上の外来配列に隣接するかまたはそれに挿入され、該遺伝子構成要素は、該プロモーターの機能を実質的に妨害する鎖長のヌクレオチド配列によって分離されるプロモーターの3'側部分および5'側部分を含み、環状化されたとき、遺伝子構成要素は、Repタンパク質認識配列の全てまたは一部によって分離されるプロモーター配列の5'側および3'側部分を含むが、プロモーターの活性を不活性化せず、該環状分子は、必要に応じて、ポリヌクレオチド配列に機能的に結合したプロモーターをさらに含むように、直鎖状の該遺伝子構成要素は、5'側から3'側方向に向かって、
該プロモーターの3'側部分と、
必要に応じて、該プロモーターの該3'側部分に機能的に結合するポリヌクレオチド配列と、
該プロモーターの5'側部分と
を含む構築物が提供される。
【００４１】
または、プロモーターは、TMV、TEVまたはAMVなどのRNAプロモーターである。
【００４２】
このようなシステムの利点は、構築物が直鎖状で、例えば、ゲノムなどのより大きいヌクレオチド配列に組み込まれるとき、プロモーター配列は不活性であるということである。しかし、環状化されると、プロモーター配列は再構成され、それによってプロモーター活性を可能にする。次いで、必要に応じて本発明の機能的に結合したポリヌクレオチド配列が発現される。
【００４３】
好適なプロモーターの例には、カリフラワーモザイクウィルス35Sプロモーターが含まれる。別の有用なプロモーターはユビキチンプロモーターである。一般に、ユビキチンプロモーターなどの単子葉植物プロモーターはプロモーターと発現されるエクソンの開始コドンとの間にイントロン配列を必要とする。このイントロン配列がないと、プロモーターの発現は非常に低いか、または完全に欠損する。本発明の遺伝子構築物は、環状化されたとき、ステムループ構造を含むイントロン配列がユビキチンプロモーターの下流にイントロン配列を形成し、それによって機能を可能にするように設計することができる。
【００４４】
他の好適なプロモーターを以下に記載する。
【００４５】
別の好ましい態様において、本発明は、5'側から3'側方向に向かって、第1、第2、第3、第4、第5および第6のヌクレオチド配列を含む構築物であって、
第1および第6のヌクレオチド配列は同じであっても、異なってもよく、該第1および第6の配列の全てまたは一部を含む該第1および第6の配列が隣接する遺伝物質は、該構築物がゲノム配列などのより大きいヌクレオチドに組み込まれたとき、切り出しおよび環状化されうるように、第1および第6のヌクレオチド配列は各々1つ以上のRepタンパク質またはそれらの誘導体もしくは相同物によって認識されうるRepタンパク質認識配列を含み、該Repタンパク質認識配列は、イントロン配列もしくはそれらの一部または他のスプライスシグナルを含む1つ以上の外来配列に隣接するかまたはそれに挿入され、
第2のヌクレオチド配列はポリヌクレオチド配列の3'側部分を含み、
第3のヌクレオチド配列は該第2の配列に機能的に結合する転写ターミネーターまたはその機能的な誘導体または相同物であり、
第4のヌクレオチド配列は第5のヌクレオチド配列に機能的に結合するプロモーター配列であり、
第5のヌクレオチド配列はポリヌクレオチド配列の5'側部分であり、該ポリヌクレオチド配列の5'側および3'側部分が該ヌクレオチド配列の全長のコード配列であり、
1つ以上のRepタンパク質の存在下において、構築物がゲノム配列などのより大きいヌクレオチド配列に組み込まれた場合に、環状化された遺伝子配列は、該第1および／または第6のヌクレオチド配列の全てまたは一部を含む外来配列または他のスプライスシグナルの全てまたは一部を含むポリヌクレオチド配列に機能的に結合した該プロモーター配列と転写ターミネーター配列とを順に含むより大きい該ヌクレオチド配列から分離して作製される、構築物を提供する。
【００４６】
本発明の上記の局面によると、第1および第6ヌクレオチド配列は、イントロン配列または他のスプライスシグナルに隣接する、またはそれに挿入されるRepもしくはその誘導体または真核細胞もしくは原核細胞誘導体などのウィルス由来複製促進タンパク質の認識配列を示す。第2〜第5ヌクレオチド配列は以前に規定した遺伝子構成要素を示す。
【００４７】
本発明のよりさらに別の局面は、構築物を作製する際に使用する遺伝子構成要素であって、該遺伝子構成要素が、5'側から3'側方向に向かって、転写ターミネーターに機能的に結合したポリヌクレオチド配列の3'側部分と、ポリヌクレオチド配列の5'側部分に機能的に結合したプロモーターとを含み、環状化されたときに、ポリヌクレオチド配列の5'側部分が、外来配列またはイントロン配列または他のスプライスシグナルの全てまたは一部によって分離されたポリヌクレオチド配列の該3'側部分に機能的に結合される、遺伝子構成要素に関する。
【００４８】
本発明の構築物には種々の用途がある。一態様において、構築物は、ssDNAウィルスに対する遺伝的抵抗性を植物細胞において形成するために使用される。防御が求められている特定のウィルスには、ジェミニウィルスまたはナノウィルスが含まれるが、これらに限定されない。この態様において、構築物は「自殺遺伝子」、すなわち、細胞アポトーシス、溶解、死または生化学的もしくは生理学的休止状態を誘導する産物をコードする遺伝子を含む。構築物は、植物細胞ゲノムに組み込まれうる条件下において植物細胞に組み込まれる。構築物の遺伝子構成要素に隣接するRepタンパク質認識配列を認識するRepタンパク質を有する特定のssDNAウィルスが植物に感染すると、植物は植物細胞から再生され、増殖され、構築物は切り出され、再環状化され、それによって「自殺遺伝子」を再構成し、その発現を促進する。次いで、細胞は死滅するか、または休止状態になり、ssDNAウィルスの複製および放出を防止する。
【００４９】
特に好ましい態様において、本発明は、配列番号：31〜配列番号：36に実質的に記載のヌクレオチド配列、または配列番号：31〜配列番号：36の各々と60%の類似性を有するヌクレオチド配列、または配列番号：31〜配列番号：36の1つ以上にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列、またはその相補的な形態を42℃の低ストリンジェンシー条件下において含む構築物を提供する。
【００５０】
従って、本発明の別の局面は、ssDNAウィルスに抵抗性の遺伝子組換え植物またはその子孫を作出する方法であって、5'側から3'側方向に向かって、イントロン配列または他のスプライスシグナルに隣接するかまたはそれに挿入されるRepタンパク質認識配列と、ポリヌクレオチド配列の3'側末端部分と、転写ターミネーターまたはその機能的等価物と、ポリヌクレオチド配列の5'側および3'側部分が、細胞死または休止状態を誘導することができるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質のコード領域であるポリヌクレオチド配列の5'側末端部分に機能的に結合したプロモーター配列と、同じかまたは異なるRepタンパク質認識配列とを含む構築物を該植物のゲノムに組み込む段階を含み、隣接するRepタンパク質認識配列を認識することができるRepタンパク質を有するssDNAウィルスが該植物細胞に感染すると、構築物が切り出され、環状化して、植物細胞を死滅させるかまたはそうでなければ植物細胞を休止させるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する形態の該ポリヌクレオチド配列を再構成する方法を含む。
【００５１】
本発明の構築物の別の用途は雄性不稔性植物を作出することである。この態様では、Repタンパク質をコードする遺伝ウィルスを花粉特異的プロモーターの制御下におく。上記の「自殺遺伝子」を含む構築物も、花粉特異的プロモーターの制御下においてRep遺伝子によって認識されるRepタンパク質認識配列を使用して作製される。花粉が形成されるとき、花粉特異的プロモーターが活性化され、自殺遺伝子を活性化する。花粉細胞は選択的に破壊されるか、または休止状態にされる。
【００５２】
本明細書に記載する構築物の他の用途は、植物または特定の組織または種実または植物の他の生殖材料に、色の変化を促進する遺伝物質を導入することを含む。色の変化を促進する遺伝子配列の例は、フラボナル3'-ヒドロキシラーゼ、フラボナル3',5'-ヒドロキシラーゼまたはフラボン3'-シンターゼなどのアントシアニン経路の酵素をコードする遺伝子である。
【００５３】
別の態様において、構築物は2つの異なるRepタンパク質認識配列に隣接し、すなわち、2つの異なるRepタンパク質によって認識されうる。一方のRepタンパク質は植物ゲノムに挿入される遺伝子によってコードされ、他方のRepタンパク質は、感染性のssDNAウィルスによって導入されうる。または、Repタンパク質は、発現される異なるプロモーターおよびある種の発生段階によってコードされうる。
【００５４】
本発明は植物およびssDNAウィルスに関連して特に記載されているが、本発明は、非ssDNAウィルスおよび昆虫、哺乳類または爬虫類細胞などの真核細胞などの他の起源由来の、相同な切り出し構造物並びに部位特異的切り出しおよび接続活性を有する他のタンパク質に及ぶ。本発明が植物に関する限りでは、植物は単子葉植物であっても、双子葉植物であってもよい。
【００５５】
本明細書において使用する「植物細胞」という用語は、植物由来の原形質体または他の細胞、配偶子形成細胞および植物全体を再生する細胞を含む。植物細胞は植物中の細胞と培養中の原形質体または他の細胞を含む。
【００５６】
本明細書において使用する「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、mRNA、RNA、cRNA、cDNAまたはDNAを示す。
【００５７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書においてアミノ酸残基のポリマーおよびそれらの変異体を言及し、交換可能である。
【００５８】
2つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列の関係を記載するために使用される用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「配列の同一性」、「配列の同一性の割合」および「「実質的な同一性」が含まれる。「参照配列」は、鎖長が少なくとも12であるが、多くは15〜18、しばしば少なくとも25モノマー単位であり、ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含む。2つのポリヌクレオチドは各々、2つのポリヌクレオチドの配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部分だけでも）を含むので（1）、2つ（または2つ以上の）ポリヌクレオチド間の配列の比較は、典型的には、局所領域の配列の類似性を同定し、比較する「比較ウィンドウ」において2つのポリヌクレオチドの配列を比較することによって実施される。「比較ウィンドウ」は、少なくとも6つの隣接位置、通常約50〜約100、さらに通常では約100〜約150の概念的なセグメントをいい、2つの配列を最適な状態で整列化してから、隣接した位置の同じ番号の参照配列と配列とを比較する。比較ウィンドウは、2つの配列を最適に整列化するために、参照配列（追加および欠損を含まない）と比較するとき、約20%以下の追加または欠損（すなわち、キャップ）を含んでいてもよい。比較ウィンドウを整列化するための配列の最適なアラインメントは、アルゴリズムのコンピュータによる実行（the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI,USAのGAP, BESTFIT, FASTAおよびTFASTA)によって実施してもよく、または選択される種々の方法のいずれかによって作製されるインスペクション（inspection）と最も良好なアラインメント（すなわち、比較ウィンドウの最も高い相同性率を生ずる）によって実施されてもよい。例えば、Altschulら、1997によって開示されているBLASTファミリーのプラグラムに言及されることもある。配列分析の詳細な考察は、Altschulら、1994〜1998のユニット19.3に見ることができる。
【００５９】
本明細書において使用する「配列の同一性」という用語は、配列が、比較ウィンドウのヌクレオチド間またはアミノ酸間に基づいて同一である程度をいう。従って、「配列の同一性の割合」は、従って、「配列の同一性の割合」は、比較ウィンドウにおいて最適な状態で整列させた2つの配列を比較し、同じ核酸塩基（例えば、A、T、C、G、I）または同じアミノ酸残基（例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、CysおよびMet)が両配列に生じる位置の数を求めて、一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウィンドウの総位置数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、結果に100をかけて、配列の同一性の割合を得ることによって算出される。本発明の目的のためには、「配列の同一性」は、ソフトウェアに添付の参照マニュアルに使用されている標準デフォルトを使用したDNASISコンピュータプログラム(Version 2.5 for Windows; avairable from Hitachi Software engineering Co., Ltd., South San Fransisco, California,USA)によって算出した「一致の割合」を意味することが理解される。
【００６０】
本明細書において低ストリンジェンシー条件という言及は、少なくとも約0〜少なくとも約15%v/vホルムアミドおよびハイブリダイゼーション用の少なくとも約1M〜少なくとも約2Mの塩および洗浄条件のための少なくとも約1M〜少なくとも約2Mの塩を備え（includes）、かつ含む(encompasses)。一般に、低ストリンジェンシー条件は約25〜30℃から約42℃である。温度は変更してもよく、ホルムアミドを置換するため、および／または別の緊縮条件を得るためにさらに高い温度を使用してもよい。少なくとも約16%〜少なくとも約30%v/vホルムアミドおよびハイブリダイゼーション用の少なくとも約0.5M〜少なくとも約0.9Mの塩および洗浄条件のための少なくとも約0.5M〜少なくとも約0.9Mの塩を備え（includes）、含む(encompasses)中程度の緊縮条件または少なくとも約31〜少なくとも約50%v/vホルムアミドおよびハイブリダイゼーション用の少なくとも約0.01M〜少なくとも約0.15Mの塩および洗浄条件のための少なくとも約0.01M〜少なくとも約0.15M塩を備え（includes）、かつ含む(encompasses)高ストリンジェンシー条件などの別のストリンジェンシー条件を適宜適応してもよい。一般に、洗浄はTm=69.3 + 0.41(G + C)%(MarmurおよびDoty, 1962)において実施される。しかし、2本鎖DNAのTmは、ミスマッチ塩基対の数が1%増加するごとに1℃低下する（BonnerおよびLaskey, 1974）。ホルムアミドはこれらのハイブリダイゼーション条件では必要に応じて使用される。従って、特に好ましいレベルのストリンジェンシー条件は以下のように規定される：低ストリンジェンシー条件は6×SSC緩衝液、0.1%w/vSDS、25〜42℃の温度；中程度のストリンジェンシー条件は2×SSC緩衝液、0.1%w/vSDS、20〜65℃の温度；高ストリンジェンシー条件は0.1×SSC緩衝液、0.1%w/vSDS、低くても65℃の温度である。
【００６１】
「形質転換」という用語は、外来または異種核酸を導入することによって、生物、例えば、真核細胞の遺伝子型を変更することを意味する。
【００６２】
「ベクター」とは核酸分子、好ましくは、核酸配列が挿入またはクローニングされていてもよい、例えば、プラスミド、バクテリオファージまたは植物ウィルス由来のDNA分子を意味する。ベクターは、好ましくは、1つ以上の独自の制限部位を含有し、標的細胞もしくは組織またはその始原細胞もしくは組織を含む規定された宿主細胞において自発的に複製することができるか、またはクローニングされた配列が再生可能であるように、規定された宿主のゲノムに組み込み可能である。従って、ベクターは、自発的に複製するベクター、すなわち、その複製が染色体の複製から独立している染色体外実体として存在するベクター、例えば、直鎖状または閉環状プラスミド、染色体外構成要素、ミニ染色体または人工染色体であってもよい。ベクターは、自己複製を保証する任意の手段を含有していてもよい。または、ベクターは、細胞に導入されたとき、レシピエント細胞のゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。ベクターシステムは、宿主細胞のゲノムに組み込まれる総DNAを含有する、1つのベクターもしくはプラスミド、2つ以上のベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを含んでもよい。ベクターの選択は、典型的には、ベクターと、ベクターが導入される予定の細胞との適合性に依存する。ベクターはまた、好適な形質転換体を選択するために使用することができる抗生物質抵抗性遺伝子などの選択マーカーも含んでもよい。このような抵抗性遺伝子の例は当業者に周知である。
【００６３】
「遺伝子」という用語は広義に使用され、遺伝子のエクソンに対応するcDNAを含む。従って、本明細書において「遺伝子」を言及することは、以下を含むと考えられるべきである：
(i)転写および／もしくは翻訳調節配列ならびに／またはコード領域および／もしくは非翻訳配列（すなわち、イントロン、5'側および3'側非翻訳配列）からなる典型的なゲノム遺伝子、または
(ii)遺伝子のコード領域（すなわち、エクソン）ならびに5'側および3'側非翻訳配列に対応するmRNAまたはcDNA、並びに／或いは
(iii)必要に応じて、構造領域に発現特徴を与えることができる転写および／もしくは翻訳調節領域からなる非翻訳配列および／または異種プロモーター配列をさらに含むコード領域（すなわち、エクソン）に対応する構造領域。
【００６４】
「遺伝子」という用語は、機能的産物、詳細にはセンスもしくはアンチセンスmRNA産物またはペプチド、オリゴペプチドもしくはポリペプチドまたは生物学的に活性なタンパク質の全てまたは一部をコードする合成または融合分子を記載するためにも使用される。「遺伝子」への言及はまた「合成遺伝子」への言及も含む。
【００６５】
「合成遺伝子」という用語は、好ましくは、構造遺伝子配列に機能的に結合した少なくとも1つ以上の転写および／または翻訳調節配列を含む、先に規定した非天然型遺伝子をいう。
【００６６】
「構造遺伝子」という用語は、伝達して、mRNAを作製することができ、必要に応じて、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたは生物学的に活性なタンパク質分子をコードするヌクレオチド配列を意味すると考えられる。例えば、mRNAが機能的翻訳開始シグナルを欠損するか、またはmRNAがアンチセンスmRNAである場合には、mRNAは全てがペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されないことを当業者は承知している。本発明は、明らかに、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたは生物学的に活性なタンパク質分子をコードすることができないヌクレオチド配列を含む合成遺伝子を含む。詳細には、このような合成遺伝子は、真核生物の細胞、組織または器官において標的遺伝子発現を改変する際に有利であることを本発明は見出した。
【００６７】
「構造遺伝子領域」という用語は、機能的に結合したプロモーター配列の制御下において細胞、組織または器官において発現される合成遺伝子の一部をいう。構造遺伝子領域は、1つのプロモーター配列または複数のプロモーター配列の制御下において機能的であってもよい。従って、合成遺伝子の構造遺伝子領域は、アミノ酸配列をコードすることができるか、またはそれに相補的であるヌクレオチド配列を含んでもよい。これに関しては、本発明を実施する際に使用される構造遺伝子領域はまた、アミノ酸配列をコードするが、機能的翻訳開始コドンおよび／または機能的翻訳停止コドンを欠損するので、結果として、完全なオープンリーディングフレームを含まないヌクレオチド配列も含む。本発明に関しては、「構造遺伝子領域」という用語はまた、該遺伝子を発現する真核細胞において通常は翻訳されない遺伝子の5'側上流または3'側下流配列などの非コードヌクレオチド配列にも及ぶ。
【００６８】
従って、本発明に関しては、構造遺伝子領域は、同じかまたは異なる遺伝子の2つ以上のオープンリーディングフレーム間に融合物を含んでもよい。このような態様において、本発明は、異なる非隣接領域を標的とすることによって、1つの遺伝子の発現を調節する、またはマルチジーンファミリーの異なる遺伝子を含む、いくつかの異なる遺伝子の発現を同時に調節するために使用することができる。真核細胞に内因的ではなく、詳細には、ウィルス病原菌由来の2つ以上のヌクレオチド配列を含む融合核酸分子の場合には、融合は、いくつかの病原菌における遺伝子の発現を標的とすることによって、いくつかの病原菌に対して免疫または防御を同時に与えるという付加的な長所を提供することができる。または、あるいはさらに、融合は、その病原菌の2つ以上の遺伝子の発現を標的とすることによって、任意の病原菌に対するより効果的な免疫を提供することができる。
【００６９】
本発明のこの態様により特に好ましい構造遺伝子領域は、少なくとも1つの翻訳可能なオープンリーディングフレームを含み、さらに好ましくは、必ずしも該構造遺伝子領域の5'側末端ではないが、該オープンリーディングフレームの5'側末端に配置される翻訳開始コドンをさらに含むものである。これに関しては、構造遺伝子領域は少なくとも1つの翻訳可能なオープンリーディングフレームおよび／またはAUGもしくはATG翻訳開始コドンを含むことができるにもかかわらず、このような配列が含まれることは、標的遺伝子の発現を調節するために、本発明では導入した核酸分子の翻訳が生じる必要があることを必ずしも示唆していない。いかなる理論または作用様式に結びつけるわけではないが、少なくとも1つの翻訳可能なオープンリーディングフレームおよび／または翻訳開始コドンが本発明の核酸分子に含まれることによって、mRNA転写産物の安定性が増加する働きをし、それによって本発明の有効性を改善することができる。
【００７０】
本発明の合成遺伝子に含まれうる構造遺伝子配列の最適な数は、該構造遺伝子配列の各々の鎖長、それらの方向性および互いの同一性の程度に応じてかなり異なる。例えば、当業者は、インビボにおける反復性ヌクレオチド配列の本質的な不安定性および逆反復ヌクレオチド配列を含む長い合成遺伝子がインビボにおいて組換えを生じる傾向があることによる、このような配列を構築することに関連する困難さを承知である。このような困難さにもかかわらず、本発明の合成遺伝子に含まれる構造遺伝子配列の最適な数は、いかなる不要な実験を行わず、リコンビナーゼ欠損細胞系統を使用して本発明の合成遺伝子を構築するなどの標準的な手法に従い、反復配列の数を、組換え事象を排除または最小にするレベルに減少させ、多重構造遺伝子配列の総鎖長を許容されうる限界、好ましくは5〜10 kb未満、さらに好ましくは2〜5 kb未満、よりさらに好ましくは0.5〜2.0 kb長に維持することにより、当業者によって実験的に決定することができる。
【００７１】
真核細胞における発現では、構築物は、一般に、ポリヌクレオチド配列以外に、プロモーターおよび必要に応じてポリヌクレオチド配列の発現を促進するように設計された他の調節配列を含む。
【００７２】
本明細書において「プロモーター」への言及は広義に考えられるべきであり、CCAATボックスが存在する場合でも、存在しない場合でも、正確な転写開始に必要なTATAボックスを含む、典型的なゲノム遺伝子の転写調節配列と、発生および／または外部刺激に応答してまたは組織特異的に遺伝子発現を変更する追加の調節配列（すなわち、上流の活性化配列、エンハンサーおよびサイレンサー）とを含む。プロモーターは、通常、必ずではないが、それが発現を調節する構造遺伝子領域の上流または5'側に位置づけされる。さらに、プロモーターを含む調節要素は、通常、遺伝子の転写の開始部位の2 kb以内に位置づけられる。
【００７３】
本発明に関連して、「プロモーター」という用語は、細胞内における核酸分子の発現を活性化または増強する、合成もしくは融合分子または誘導体を記載するためにも使用される。
【００７４】
好ましいプロモーターは、センス分子の発現をさらに増強する、および／または該センス分子の空間的発現および／または時間的発現を変更するために、1つ以上の特定の調節要素の追加のコピーを含有してもよい。例えば、銅誘導性(copper inducibility)を与える調節要素を、センス分子の発現を駆動する異種プロモーター配列に隣接して配置し、それによって該分子の発現に銅誘導性(copper inducibility)を与えることができる。
【００７５】
核酸分子をプロモーター配列の調節的制御下に置くことは、発現がプロモーター配列によって制御されるように該分子を位置づけることを意味する。プロモーターは、一般に、プロモーターが制御する遺伝子の5'側（上流）に位置づけられる。異種プロモーター／構造遺伝子の組み合わせを構築する際には、そのプロモーターとプロモーターが制御する遺伝子、すなわち、プロモーターが誘導される遺伝子との自然の状況下における距離とほぼ同じ距離である、プロモーターを遺伝子転写開始部位から離れた所に位置づけることが一般に好ましい。当技術上周知であるように、プロモーターの機能を損失しなければこの距離は幾分変更可能である。同様に、制御下に置かれている異種遺伝子に対する調節配列要素の好ましい位置づけは、自然の状況下の遺伝子構成要素、すなわち、それが誘導される遺伝子の位置づけによって規定される。また、当技術上周知であるように、この距離も幾分変更することができる。
【００７６】
本発明の合成遺伝子に使用するのに好適なプロモーターの例には、植物、動物、昆虫、真菌、酵母または細菌細胞中で機能することができるウィルス、真菌、細菌、動物および植物由来プロモーターが含まれる。プロモーターは、構成的に、または発現が生ずる細胞、組織もしくは器官とは異なって、または発現が生ずる発生段階とは異なって、またはとりわけ生理的ストレスもしくは病原菌もしくは金属イオンなどの外部刺激に応答して、構造遺伝子成分の発現を調節することができる。
【００７７】
好ましくは、プロモーターは、少なくとも標的遺伝子が発現している間、さらに好ましくは、該細胞、組織または器官において標的遺伝子の検出可能な発現が開始される直前にも、真核細胞、組織または器官において核酸分子の発現を調節することができる。
【００７８】
従って、強力な構成的プロモーターが本発明の目的またはウィルス感染もしくは標的遺伝子発現の開始によって誘導されうるプロモーターに特に有用である。
【００７９】
植物機能性および動物機能性プロモーターが本発明の構築物に使用するのに特に好ましい。好ましいプロモーターの例には、バクテリオファージT7プロモーター、バクテリオファージT3プロモーター、SP6プロモーターなどのウィルスプロモーター、lacオペレーター-プロモーター、tacプロモーターなどの細菌プロモーター、SV40後期プロモーター、SV40早期プロモーター、RSV-LTRプロモーター、CMV IEプロモーターなどのウィルスプロモーターまたはCaMV 35Sプロモーター、SCSVプロモーター、SCBVプロモーターなどの植物ウィルスプロモーターなどが含まれる。
【００８０】
標的遺伝子の発現と同時、または標的遺伝子の発現の前に高レベルの発現を生じさせる好ましい要件を考慮する際、プロモーター配列は関心のある宿主において、とりわけ、哺乳類細胞のCMV-IEプロモーターまたはSV40早期プロモーター配列、SV40後期プロモーター配列、およびある種の植物細胞のCaMv 35SプロモーターまたはSCBVプロモーターなどの強力な構成プロであることがかなり望ましい。当業者は、具体的に記載されているもの以外に追加のプロモーター配列を容易に認識すると思われる。
【００８１】
本発明に関連して、「に機能的に結合している」または「機能的に制御下にある」等は、構造遺伝子領域または多重構造遺伝子領域の発現が、細胞、組織、器官または生物全体内で、それが空間的に結合しているプロモーター配列の制御下にあることを示すと考えられる。
【００８２】
構築物は、好ましくは、効率的な転写のための追加の調節要素、例えば、転写停止配列を含有する。
【００８３】
「ターミネーター」という用語は、転写の停止信号を出す転写単位の末端のDNA配列をいう。ターミネーターは、一般にポリアデニル化シグナルを含有する3'側非翻訳DNA配列であり、一次転写物の3'側末端へのポリアデニレート配列の追加を促進する。植物細胞において活性なターミネーターは周知であり、文献に記載されている。それらは細菌、真菌、ウィルス、動物および／または植物から単離することができ、またはde novo合成することができる。
【００８４】
プロモーター配列の場合と同様に、ターミネーターは、使用することが意図されている細胞、組織または器官において機能的である、いかなるターミネーター配列であってもよい。
【００８５】
本発明の合成遺伝子に使用するのに特に好適なターミネーターの例には、とりわけ、SV40ポリアデニル化シグナル、HSV TKポリアデニル化シグナル、CYC1ターミネーター、ADHターミネーター、SPAターミネーター、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のノパリンシンターゼ(NOS)遺伝子ターミネーター、カリフラワーモザイクウィルス(CaMV)35S遺伝子のターミネーター、トウモロコシ（Zea mays）のzein遺伝子ターミネーター、ルビスコ（Rubisco）スモールサブユニット遺伝子(SSU)遺伝子ターミネーター配列、サブクローバ萎縮ウィルス(SCSV)遺伝子配列ターミネーター、任意のrho-非依存性大腸菌ターミネーターまたはlacZαターミネーターが含まれる。
【００８６】
特に好ましい態様において、ターミネーターは、動物細胞、組織および器官内で機能的であるSV40ポリアデニル化シグナルもしくはHSV TKポリアデニル化シグナル、植物細胞、組織または器官において活性なオクトピンシンターゼ(OCS)もしくはノパリンシンターゼ(NOS)ターミネーター、または原核細胞において活性なlacZαターミネーターである。
【００８７】
当業者は、本発明を実施する際に使用するのに好適となりうる追加のターミネーター配列を承知である。このような配列は、いかなる不要な実験を行わなくても容易に使用することができる。
【００８８】
構築物を細胞に導入（すなわち、トランスフェクトまたは形質転換）する手段は当業者に周知である。
【００８９】
上記の構築物は、それが発現される細胞、組織または器官における合成遺伝子の検出を容易にするために、例えば、検出可能なマーカー酵素またはその機能的な類似物もしくは誘導体をコードするマーカーヌクレオチド配列を加えることによってさらに改変することができる。この態様によると、マーカーヌクレオチド配列は翻訳可能な形式で存在し、例えば、構造遺伝子のいずれか1つ以上の翻訳産物との融合ポリペプチドとして、または非融合ポリペプチドとして発現される。
【００９０】
当業者は、本明細書に記載されている合成遺伝子を作製する方法および望ましい条件下での特定の細胞または細胞種において、望ましい場合に発現させうる要件について承知していると思われる。詳細には、本発明を実施するのに必要な遺伝子操作には、大腸菌体などの原核細胞または植物細胞または動物細胞において本明細書に記載されている遺伝子構築物またはその誘導体を増殖することが必要であることは当業者に周知である。
【００９１】
本発明の構築物は、直鎖状DNAとして改変を加えないが、必要に応じて、特に細胞、ウィルス粒子またはリポソームに含有させて、好適な細胞、組織または器官に導入することができる。遺伝子構築物を作製するには、本発明の合成遺伝子を、後に導入する宿主細胞、組織または器官において維持および／または複製および／または発現することができる、バクテリオファージベクター、ウィルスベクターまたはプラスミド、コスミドもしくは人工染色体ベクターなどの好適なベクターまたはオピソーム（opisome）分子に挿入する。
【００９２】
従って、本発明のさらに別の局面は、少なくとも、本明細書に記載されている遺伝子構成要素と複製開始点および／または選択マーカー遺伝子配列の1つ以上を含む遺伝子構築物を提供する。
【００９３】
遺伝子構築物は、ウィルス病原菌に対する耐性特性を提供する以外に、新規な遺伝的特徴を導入するために真核細胞を形質転換するのに特に好適である。このような追加の新規特徴は、別個の遺伝子構築物または本明細書に記載されている合成遺伝子を含む同じ遺伝子構築物で導入されてもよい。特に、このような追加の特徴と本明細書に記載されている合成遺伝子を1つの遺伝子構築物内でコードする遺伝子配列を含むことに関して、遺伝子操作数および組織培養要件数が減り、かつ費用効率が増加する点で、当業者は大きな利点を認識すると思われる。
【００９４】
通常、細菌に使用するのに好適な複製開始点および選択マーカー遺伝子は、発現されること、または真核細胞に導入されること、または真核細胞のゲノムに組み込まれることが意図されている遺伝子構築物内に含有される遺伝子配列からは物理的に分離されている。
【００９５】
本明細書において使用する「選択マーカー遺伝子」という用語は、本発明の遺伝子構築物またはその誘導体がトランスフェクトした細胞またはそれで形質転換した細胞の同定および／または選択を容易にするために発現する表現型を細胞に付与する任意の遺伝子を含む。
【００９６】
本明細書において考慮される好適な選択マーカー遺伝子には、特に、アンピシリン耐性遺伝子(Ampr)、テトラサイクリン耐性遺伝子(Tcr)、細菌カナマイシン耐性遺伝子(Kanr)、ゼオシン耐性遺伝子（ゼオシンは、ブレオマイシンファミリーの薬剤で、InVitrogen Corporationの商標である）、抗生物質エウロバシジン(aureobasidin)Aに対して耐性を与えるAURI-C遺伝子、フォスフィノスリシン耐性遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(nptII)、ハイグロマイシン耐性遺伝子、β-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子、蛍光タンパク質コード遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子が含まれる。
【００９７】
好ましくは、選択マーカー遺伝子はnptII遺伝子またはKanr遺伝子または緑色蛍光タンパク質(GFP)コード遺伝子である。
【００９８】
当業者は、本発明を実施する際に有用な他の選択マーカー遺伝子を承知であり、本発明は選択マーカー遺伝子の性質によって限定されない。
【００９９】
本発明は、本質的に本明細書に記載されており、原核細胞もしくは真核細胞において該遺伝子構築物を維持および／もしくは複製することならびに／または真核細胞もしくは生物のゲノムに該遺伝子構築物またはその一部を組み込むことを意図している遺伝子配列をさらに含む遺伝子構築物全てに及ぶ。
【０１００】
例えば、リポソーム媒介性トランスフェクションまたは形質転換、弱毒化ウィルス粒子または細菌細胞による細胞の形質転換、細胞交配、当業者に周知の形質転換またはトランスフェクション手法のような上記の標準的な方法を、細胞、組織または器官に構築物を導入するために使用することができる。
【０１０１】
植物組織または細胞に組換えDNAを導入する別の手段には、CaCl2を使用した形質転換およびその改良法、原形質体へのDNAの直接取り込み、原形質体へのPEG媒介性取り込み、微粒子銃、エレクトロポレーション、DNAのマイクロインジェクション、組織外植片または細胞への微粒子銃、核酸の組織への真空浸潤（vaccum-infiltration)、植物の場合のT-DNA媒介性のアグロバクテリウム（Agrobacterium）から植物組織への導入が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０２】
細胞への微粒子銃では、微粒子が細胞内に推進されて形質転換細胞を作製する。任意の好適な弾道細胞(ballistic cell)形質転換方法および装置を、本発明を実施する際に使用することができる。例示的な装置および手法は、Stompら(米国特許第5,122,466号)ならびにSanfordおよびWolf(米国特許第4,945,050号)によって開示されている。弾道(ballistic)形質転換手法を使用する場合には、遺伝子構築物は、形質転換される細胞内で複製することができるプラスミドを組み込むことができる。
【０１０３】
このようなシステムに使用するのに好適な微粒子の例には、1〜5μmの金球体が含まれる。DNA構築物は、沈降などの任意の好適な技法によって微粒子に沈着することができる。
【０１０４】
本発明のさらに別の態様において、本明細書に記載されている遺伝子構築物は、発現される細胞のゲノムに組み込まれるように適合される。宿主細胞のゲノムへの遺伝子配列または遺伝子構築物の組み込みを実施するために、ある種の追加の遺伝子配列が必要とされる場合があることを当業者は承知である。植物の場合には、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）TiプラスミドのT-DNAの左および右境界配列が一般に必要とされる。
【０１０５】
本発明は、構築物またはそれらの一部を含む単離された細胞、組織または器官にまでさらに及ぶ。本発明は、該細胞、組織および器官由来の再生された組織、器官および生物全体、かつそれらの珠芽および子孫並びに種実および他の繁殖材料にまでさらに及ぶ。
【０１０６】
例えば、植物は、ホルモン含有培地において形質転換された植物細胞または組織または器官から再生することができ、再生された植物は、形質転換細胞と未形質転換細胞のキメラ、クローン形質転換体（例えば、発現カセットを含有するように形質転換された全ての細胞）、形質転換された組織および形質転換されていない組織の移植片（例えば、柑橘類において形質転換されてない接ぎ芽に移植した形質転換される根茎ストック）などの種々の形態をとることができる。形質転換された植物は、クローン増殖または典型的な育種技法などの種々の手段によって増殖することができる。例えば、第1世代（すなわちT1）の形質転換された植物を自家受粉して(selfed)、同型接合体の第2世代（すなわちT2）の形質転換された植物を得、T2植物をさらに典型的な育種技法により増殖させることができる。
【０１０７】
別の態様において、標的遺伝子配列の発現の調節を誘導するために構築物を使用する。例えば、構築物は、直鎖状のとき、5'側から3'側に向かって、アンチセンス配列、プロモーターおよびセンス配列を含む。次いで、これらの構成要素に、ウィルス由来の複製促進タンパク質認識配列（例えば、ステムループ）または哺乳類もしくは微生物の相同物を隣接させる。ターミネーター配列は、認識配列が隣接する領域の外側に配置される。複製放出の結果、アンチセンスおよびセンス形態の標的遺伝子配列を含むポリヌクレオチド配列が作製される。
【０１０８】
次いで、得られたポリヌクレオチド配列はヘアピンループを形成することができる。構築物は、タンデム、複数反復、逆むきまたはそれらの組み合わせを生ずるように変更することができる。このような構築物は、植物および動物細胞における遺伝子サイレンシングに有用である。直鎖状の構成要素の順序は重大ではない。例えば、センスおよびアンチセンス配列の位置は交換可能である。好適な構築物の一例を図27に示す。
【０１０９】
本発明は、以下の限定するものではない実施例によってさらに説明される。
【０１１０】
実施例1
BBTVに基づく発現ベクター
ポテト光誘導性組織特異的ST-LS1遺伝子由来のイントロンがその中に挿入された、バルナーゼをコードする遺伝子の発現を駆動するカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（35S）が含まれた一連の発現ベクターを構築した（NT-INTRON-CT）。ターミネーターはノパリン合成酵素（nos）またはBBTV DNA-6（BT6）の主要なオープンリーディングフレーム（ORF）のいずれかに由来した。
【０１１１】
構築物は重複プライマーを用いたPCRを用いて組み立て（表1）、および当技術分野において既知の標準技術を用いてpGEM-Tベクターにクローン化した。発現ベクターpTBNを構築し、図1に示す。pTBN（配列番号：66）は、その上に他の発現ベクターが構築される骨格を示している。プライマー名および結合部位は各配列の大きさ通りに示されている。pTBN（他の構築物と同様に）を段階的方法で増幅した。最初に、3つの断片全てを別々に増幅した（すなわち35S、NT-INTRON-CTおよびnos）。全配列はその後各断片をプライマー＋1および‐4を用いたPCRにおいて混合することにより増幅した。
【０１１２】
図2に示したpTBN6（配列番号：67）は、イントロンに挿入されたBBTV DNA-6（6I）のCR-SLおよびCR-Mを含む624bpの領域を含む。
【０１１３】
図3に示したpTBN1（配列番号：68）は、pTBN6と同一に、イントロンに挿入されたBBTV DNA-1（1I）のCR-SLおよびCR-Mを含む163bpの領域を含む。nosターミネーターをBBTV DNA-6の大オープンリーディングフレーム由来の126bpのターミネーターにより置換した。
【０１１４】
再環状化ベクターはpTBN6およびpTBN1に基づいている。それらにはRep認識配列が隣接し、そしてBBTV Rep存在下でのみ、再環状化および、引き続く転写活性化が生じるように設計されている。3つの異なるベクター、pRTBN6、pRTBN1およびpRTBN1/6を作製した。
【０１１５】
図4に示したpRTBN6はpTBN6から構築した。2つの断片は＋5および-4、ならびに＋1および-6を用いて各々増幅した。これらはpGEM-Tにクローン化し、そしてpRTBN6を作製するためにサブクローン化した。
【０１１６】
図5に示したpRTBN1はpTBN1から、pRTBN6と類似の様式で構築した。
【０１１７】
図6に示したpRTBN1/6はpRTBN1およびpRTBN6の混成体であった。
【０１１８】
翻訳不能ベクターをまた上述の構築物の各々に対して構築した（pTBNを除く）。これらのベクターにおいては、バルナーゼ遺伝子の開始コドンを＋11プライマーを用いて削除した（表1を参照）。構築物はpUBN6、pUBN1、pRUBN6およびpUBN1と名づけた。
【０１１９】
【表１】
オリゴヌクレオチドプライマー配列
0004797141.tif 000003
【０１２０】
実施例2
TYDVに基づく発現ベクター
（a）イントロン含有GUSレポーター遺伝子発現カセットの構築
pCAMBIA2301ベクターはCAMBIA（キャンベラ、オーストラリア）から取得した。このベクターはuidAコード領域の5'側部分内に189bpのカタラーゼイントロンを含む。CaMV 35Sプロモーター領域（800bp）、uidAコード領域およびnosターミネーターをHindIII/SphI断片としてpCAMBIA2301から切り出し、および同様に消化したpGEM-Tベクター（プロメガ）に挿入した。その後の構築物はpGEM-2301と呼称した。800bpのCaMV 35SプロモーターをNotI/BglII消化およびライゲーションにより、より強い530bpのCaMV 35Sプロモーターで置換した。その後のベクターをp35S-2301（図7）と呼称し、全ての引き続くクローン化段階の鋳型として利用した。
【０１２１】
（b）タバコ黄色萎縮マストレウイルス（TYDV）大きい遺伝子間領域の単離およびp35S-2301のカタラーゼイントロンへの挿入
TYDV（ゲンバンクアクセッション番号：M81103）の大きい遺伝子間領域（LIR）（ヌクレオチド＋1からヌクレオチド＋272）を含む272bpの断片を、LIR-FおよびLIR-R（図1を参照）を用いたPCRによりTYDV感染タバコ葉組織から増幅した。
【０１２２】
プライマー：
0004797141.tif 000004
【０１２３】
CaMV 35Sプロモーター（530bp）、uidA第1エクソン（19bp）およびカタラーゼイントロンの5'側半分（83bp）を含むセグメントは、35S-IEおよびCAT-Aプライマーを用いたPCRにより、p35S-2301プラスミドDNAから増幅した。この断片はCAT-Aと呼称した。
【０１２４】
プライマー：
0004797141.tif 000005
【０１２５】
カタラーゼイントロンの3'側半分（106bp）およびuidA第2エクソン（1809bp）を含むセグメントは、CAT-BおよびGUS-BstEIIプライマーを用いたPCRによりp35S-2301プラスミドDNAから増幅した。この断片はCAT-Bと呼称した。
【０１２６】
プライマー：
0004797141.tif 000006
【０１２７】
得られたPCR産物はpGEM-Tにクローン化し、およびヌクレオチド配列を確認した。最終的には、各断片をpGEM-Tから切り出し（EcoRI/PstIを用いてCAT-A、PstI/SalIを用いてLIR、およびSalI/BstEIIを用いてCAT-B）、およびpTEST1（図8）プラスミドを作製するためにEcoRI/BstEII消化したp35S-2301へ共にライゲーションした。
【０１２８】
（c）TYDV LIRをカタラーゼイントロンに挿入することによりGUS発現が影響されるか否かの決定に向けて
GUS発現、そして従うイントロンスプライシングが、TYDV LIRをp35S-2301のカタラーゼイントロンに挿入することにより影響されるかを決定するために、構築物を胚性バナナ細胞に衝撃した、そしてGUS活性を一過的にアッセイした。試験プラスミドpTEST1および陽性対照プラスミドp35S-2301を1μmの金粒子上にコーティングし、そしてバイオリスティカリー（Biolistically）に5日齢のバナナ胚性細胞に、ベッカー（Becker）ら（2000）にしたがって、導入した（Musa spp. 栽培品種「レディフィンガー（Ladyfinger）」  AAA）。衝撃後2日後の細胞を回収し、GUS活性を組織化学的にアッセイした（Jeffersonら、1987）。非衝撃細胞においては内在性のGUS活性は観察されなかった。明青色染色細胞塊により明らかな強いGUS活性が陽性対照プラスミドp35S-2301を衝撃した細胞から観察された。対照的にpTEST1を衝撃した細胞からのGUS発現は、青色染色細胞塊の数および強度により決定されるようにそれより低かった（約1/5）。この結果は、TYDV LIRをp35S-2301のカタラーゼイントロンに挿入することにより、GUS発現は消失しないが、しかしある程度イントロンプロセシングに影響を与える可能性ことを示唆している。
【０１２９】
（d）TYDV LIR内の潜在性イントロンスプライシング部位の同定
TYDV LIRが、プレmRNAプロセシングに影響しうる、可能性のある潜在性イントロンスプライシング部位を含んでいるかを決定するために、p35S-2301およびpTEST1を衝撃した細胞に由来するRNA抽出物からcDNAを合成した。Changら（1993）の方法を用いて、p35S-2301およびpTEST1を衝撃後2日後のバナナ細胞から総RNAを単離した。uidA2プライマーを用いて総RNAから相補的DNAを合成した。このcDNAは引き続くuidA1およびuidA3プライマーを用いたネスティドPCRのための鋳型として使用した。得られたPCR産物はpGEM-Tにクローン化し、そして配列決定した。配列決定により、uidAコード領域プレmRNAからのカタラーゼイントロンの異常スプライシングに寄与しうる、TYDV LIR内の2つの可能性のある部位が同定された。TYDV LIRを単離するために使用したプライマーLIR-F内に位置する、最初の配列
0004797141.tif 000007
は共通3'側スプライス部位
0004797141.tif 000008
に強い類似性を有している。2番目の配列
0004797141.tif 000009
（ヌクレオチド＋43からヌクレオチド＋50）は共通5'スプライス部位
0004797141.tif 000010
にいくらかの類似性を有している。
【０１３０】
プライマー：
0004797141.tif 000011
【０１３１】
（e）TYDV LIRからの3'側潜在性イントロンスプライシング部位の除去
同定された2つの潜在性イントロンスプライシング部位のなかで、最初のもの（CTGCAGGC）が、5'側カタラーゼイントロンスプライシング部位との位置関係のために最も意義があると考えられた。TYDV LIRからこの配列を除去するために、新規プライマーLIR-Xhoは、元々のPstIおよびNotI制限部位の代わりにXhoI部位を含むように設計した。
【０１３２】
TYDV LIRを、LIR-XhoおよびLIR-Rプライマーを用いてPCRによりpTEST1プラスミドDNAから再増幅した。この断片はLIR-Xと呼称した。同様に、CaMV 35Sプロモーター（530bp）、uidA第1エクソン（19bp）およびカタラーゼイントロンの5'側半分（83bp）を含む断片は、FUPおよびCAT-Xhoプライマーを用いたPCRによりpTEST1プラスミドDNAから再増幅した。この断片をCAT-Xと呼称した。両方のPCR産物をpGEM-Tにクローン化し、そしてそれらの配列を確認した。最終的には、元々のインサートを置換するために、PCR断片をpGEM-Tから切り出し（XhoI/SalIを用いてLIR-X、およびPstI/XhoIを用いてCAT-X）、そしてPstI/SalI消化したpTEST1にライゲーションした。この構築物はpTEST2と呼称した（図9）。pTEST2における潜在性イントロンスプライシング部位の除去により、異常スプライシングが減少し、mRNAプロセシングが改善したために、pTEST1よりも高いレベルのGUS発現が生じた。
【０１３３】
プライマー：
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【０１３４】
（f）Rep活性化可能GUS発現ベクターの構築
TYDVの小さい遺伝子間領域（SIR）（ヌクレオチド＋1275からヌクレオチド＋1504）を含む229bpの断片を、SIR-FおよびSIR-Rプライマー（図2を参照）を用いたPCRによりTYDV感染タバコ葉組織から増幅した。得られたPCR産物はpGEM-Tにクローン化し、そしてヌクレオチド配列を確認した。このプラスミドはpGEM-SIRと呼称した。TYDV SIRはpGEM-SIRからSphI断片として切り出し、そして、pTEST1内のnosターミネーター下流の固有のSphI部位に挿入した。この構築物はpTEST1-SIRと呼称された。
【０１３５】
プライマー：
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【０１３６】
CaMV 35Sプロモーター、uidA第1エクソン、カタラーゼイントロン5'側半分およびTYDV LIRをNotI/SalI断片としてpTEST2から切り出し、および同様に消化したpGEM-Tベクターに挿入した。その後のクローンはpGEM-CATXと呼称した。TYDV LIR、カタラーゼイントロン3'側半分、uidA第2エクソン、nosターミネーター、およびTYDV SIRをNotI断片としてpTEST1-SIRから切り出し、かつpGEM-CATX内の固有のNotI部位に挿入した。この構築物はpTEST3と呼称した（図10）。活性化可能GUS発現カセットを引き続いてpTEST3からSacI/ApaI消化により切り出し、そしてバイナリープラスミドpART27（Gleave 1992）内のnos pro-NPTII-nos terカセットの上流に位置するSacI/ApaI制限部位に挿入した。この構築物はpTEST4と呼称した（図11）。このベクターpTEST4をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（LBA4404）にSinghら（1993）の方法を用いてエレクトロポレーションにより導入した。
【０１３７】
（g）感染性TYDV1.1merの構築
TYDVゲノムの2つの重複する断片を、LIR-F/SIR-R（配列番号：19／配列番号：32）およびLIR-R/TYD-3F（配列番号：20／配列番号：33）のプライマー組を用いたPCRによりTYDV感染タバコ葉組織から増幅した。得られたPCR産物（それぞれTYD-RおよびTYD-L）をpGEM-Tにクローン化し、それらの配列を確認した。これらのプラスミドは各々pGEM-TYD-RおよびpGEM-TYD-Lと呼称した。TYDVゲノムの1659bp断片はpGEM-TYD-LからEcoRI消化により切り出し、そしてpGEM-TYD-Rの固有のEcoRI部位に挿入した。この構築物はpGEM-TYDV1.1merと呼称した。TYDV1.1merをpGEM-TYDV1.1merからSalI/EcoRI部分消化により切り出し、そして、uidA遺伝子およびnosターミネーターを置換するために、同様に消化したpBI101.3ベクター（クロンテック）に挿入した。この構築物はpBI-TYDV1.1merと呼称した（図12）。pBI-TYDV1.1merベクターはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（LBA4404）にSinghら（1993）の方法を用いてエレクトロポレーションにより導入した。
【０１３８】
プライマー：
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【０１３９】
（h）CaMV 35S-TYDV Rep融合物の構築
TYDVの完全なRep遺伝子（RepAを含む）（ヌクレオチド＋2580から＋1481）を、TYDVRepFおよびTYDVRepRプライマーを用いたPCRによりTYDV感染タバコ葉組織から増幅した。得られたPCR産物を、pDH51（Pietrzakら、1986）のCaMV 35Sプロモーター（530bp）およびCaMV 35Sターミネーター（200bp）の間に位置するSmaI部位に直接クローン化した。この構築物はp35S-Repと呼称した（図13）。
【０１４０】
プライマー：
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【０１４１】
実施例3
TYDVベクターを用いたGUS発現アッセイ法
（a）双子葉植物および単子葉植物細胞における一過性のRep活性化GUS発現
タバコ（NT-1）細胞は本質的にはAn（1985）に記載されるように維持し、そしてドグダール（Dugdale）ら（1998）に詳述されるように微粒子銃のために調製する。バナナ（Musa spp．栽培品種「レディフィンガー」 AAA）胚性細胞浮遊物を以前に記載されているように調製した。金粒子のコーティングおよびバイオリスティックパラメータは本質的にはドグダール（Dugdale）ら（1998）またはベッカー（Becker）ら（2000）に記載されている通りであった。
【０１４２】
この研究に使用されたプラスミドは
（i）  陽性対照としてのp35S-2301（図7）
（ii） pTEST3（図10）
（iii）p35S-Rep（図13）、ならびに
（iv） pTEST3およびp35S-Rep
を含んでいた。
【０１４３】
両方の細胞株の5枚のプレートを、4種のプラスミドの組み合わせの各々用に衝撃した。細胞は衝撃3日後に回収し、GUS活性を組織化学的および／または蛍光分析的にアッセイした（Jeffersonら、1987）。
【０１４４】
非衝撃細胞においては内在性のGUS活性は観察されなかった。明青色染色細胞塊により明らかな強いGUS活性が陽性対照プラスミドp35S-2301を衝撃した細胞から観察された。p35S-RepまたはpTEST3のいずれかを衝撃した細胞においてはGUS発現は観察されなかった。対照的にp35S-RepおよびpTEST3の両方を衝撃した細胞は、陽性対照プラスミドp35S-2301を用いて得られた細胞よりも強く青色に染まる。この結果は、トランスにTYDV Repを添加するだけで、pTEST3内のGUS発現カセットが実際に活性化することを示唆している。
【０１４５】
（b）GUS多コピー植物エピソーム（MPE）のRep媒介によるニッキング、連結および複製
TYDVを基礎とするGUS  MPEの検出はPCR法を用いて達成される。uidA1（配列番号：25）およびuidA3（配列番号：27）プライマーはカタラーゼイントロンにまたがるuidA遺伝子の断片を増幅する。pTEST3プラスミドからのTYDVを基礎とするMPEのRep媒介による放出が生じるときのみ、このプライマー組み合わせはPCRにおいて600bpの産物を生じる（uidA遺伝子の140bp、カタラーゼイントロンの190bpおよびTYDV LIRの270bpを含む）。
【０１４６】
タバコNT-1およびバナナ細胞は上記の4種のプラスミドの組み合わせの各々を用いて衝撃する。衝撃3日後、細胞は回収し、そしてスチュワート（Stewart）およびヴィア（Via）の方法（1993）を用いて総gDNAを抽出する。総gDNA（1μg）をuidA1（配列番号：25）およびuidA3（配列番号：27）プライマーを用いたPCR鋳型として使用する。PCR産物は1.5％w／vアガロースゲルにより電気泳動する。330bpの産物を対照プラスミドp35S-2301を衝撃した細胞のgDNAから得る（図7）。この産物は導入プラスミドDNAのuidAおよびカタラーゼイントロン配列に相当する。非衝撃細胞またはpTEST3もしくはp35S-Rep単独を衝撃した細胞のgDNAからはPCR産物は得られない。600bpの産物をpTEST3およびp35S-Repの両者を衝撃した細胞のgDNAから得る。この結果は以前のGUS組織化学アッセイ法を支持し、そしてTYDVを基礎とするMPEはpTEST3およびp35S-Repの両者を衝撃した細胞においてのみ生成されることを示唆する。
【０１４７】
TYDVを基礎とするMPEの複製はサザンハイブリダイゼーションにより評価される。この方法を用いて、ローリングサークル複製を意味する多量体型のMPEをハイブリダイゼーションにより検出する。4種のプラスミドの組み合わせの各々を用いて衝撃した細胞由来の総gDNA（20μg）は1.5％w／vアガロースゲルにより電気泳動する。DNAはサザン（Southern）の方法（1975）によりナイロン膜（ロッシュ）に転移する。uidAおよびカタラーゼイントロンに特異的な600bpのDIG標識プローブはuidA1（配列番号：25）およびuidA3（配列番号：27）プライマーを用いたPCRにより増幅する。uidA特異的プローブをDIG Easy-Hyb溶液（ロッシュ）中で42℃にてナイロン膜とハイブリダイズし、そしてメーカーの指示書に従いCDP-Star基質（ロッシュ）を用いてシグナルを検出する。TYVDを基礎とするMPEの特徴的なスーパーコイル状、直鎖状および開環状型および高分子量多量体型は、pTEST3およびp35S-2301の両方を導入した植物細胞由来のgDNAにおいてのみ検出される。併せて、これらの結果は、トランスに提供された時、TYVD Repが単子葉植物および双子葉植物の両細胞型においてTYVDを基礎とするMPEのニッキング、連結および複製する能力を有することを確認する。さらに、pTEST3プラスミドからのuidAの発現はTYDV Rep添加時においてのみ活性化し、そしてその添加は非複製型GUS発現カセット（p35S-2301）よりも有意に高い発現を生じることが、これらの結果により示唆される。
【０１４８】
実施例4
Rep活性化可能カセットを用いた単子葉植物および双子葉植物安定性形質転換
バナナ（Musa spp．栽培品種「レディフィンガー」 AAA）胚性細胞浮遊物を微粒子を基礎とする安定性形質転換のために標的化する。プラスミドを1μgのpDHKAN（Pietrzakら、1986）を用いて共形質転換する以外は、以前に記載されているように、細胞はpTEST3を用いて衝撃する。このプラスミドは、NPTII遺伝子の発現が抗生物質カナマイシンまたはジェネティシンに対する耐性を与えるCaMV35S pro-NPTII-CaMV 35S terカセットを含む。トランスジェニックバナナ植物の選択、培養および再生は本質的にはベッカー（Becker）ら（2000）に記載されているように実施する。独立したトランスジェニック植物がNPTIIおよびuidA遺伝子の両方を含んでいることを各々NPT-F/NPT-RおよびuidA4/uidA5のプライマー組を用いてPCRにより確認する。10個の独立した形質転換体を更なる研究のために選択する。
【０１４９】
プライマー：
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【０１５０】
タバコ（Nicotiana tabacum 栽培品種「サムスン（Samsun）」）は、Horschら（1998）の方法にしたがって、葉盤へのアグロバクテリウム媒介性感染により形質転換される。プラスミドpTEST4に由来するT-DNAを用いて10個の独立したトランスジェニック植物を形質転換する。各系統は、上記のように、NPTIIおよびuidAコード領域を含んでいることがPCRにより示されている。
【０１５１】
Rep活性化可能GUS発現カセット（すなわち、各々pTEST3（図10）およびpTEST4（図11））を用いて形質転換した10種のトランスジェニックバナナおよびタバコ系統の各々に由来する葉片を、プラスミドp35S-Repを用いて形質転換する。衝撃3日後、葉片をGUS組織化学アッセイ法に供する。10種のバナナおよびタバコ系統の各々に由来する葉片の未射撃のものにおいてはGUS発現は明らかではない。プラスミドp35S-Repを用いて衝撃された葉片は複数の青色のGUS染色塊を示している。以前に記載されているように、これらの葉片においては、TYDVを基礎とするMPEのRep指示性ニッキング、連結および複製が確認される。これらの結果はTYDV Repがいずれかのプラスミドの安定的に組み込まれたコピーからGUS発現を活性化する能力を有すること、およびインビボにおいてTYDVを基礎とするMPEのニッキング、連結および複製をすることが可能であることを示している。
【０１５２】
実施例5
トランスジェニックタバコにおいてTYDV感染活性化された発現
ボルトン（Boulton）の方法（1995）を用いて、pBI-TYDV1.1mer（実施例2（f）、図12を参照）により形質転換したアグロバクテリウム培養を用い、10個のトランスジェニックタバコ系統の各々を浸潤する。2ヶ月の期間の後、試料を感染点および植物全体から回収し、GUS発現を組織化学アッセイ法を用いて評価する。GUS活性（すなわち青色染色組織）は、模擬接種対照と比較して、TYVD感染植物においてのみ認められた。時間が経過するにつれて、脈管構造を介してGUS発現が感染の最初の点から植物の様々な部位に広がる。GUS発現カセットのRep指示性ニッキング、連結および複製は以前に記載されているように確立されている。この結果は、TYDV感染が、組み込まれている染色体コピーからGUS発現カセットを複製的に放出するのに十分であることを示唆している。
【０１５３】
実施例6
BBTVを基礎とする発現ベクターを用いた一過性の細胞死アッセイ法
バルナーゼが細胞死を引き起こすことができる能力を有することを証明するために、発現ベクター（pTBN、pTBN6、pTBN1、図1、2および3）を用いてアッセイ法を実施した。陰性対照はpUBN6およびpUBN1（上記実施例1を参照）であった。これらの構築物の各々は、本質的にはドグダール（Dugdale）ら（1998）に記載されるようにバナナ（Musa spp 栽培品種 ブルゴエ（Bluggoe））胚性細胞浮遊物にGUSベクターとともに共衝撃した。GUSベクターは強力なプロモーター（レポーター遺伝子βグルクロニダーゼの発現を駆動するトウモロコシUbi1、CaMV 35SまたはバナナAct1）を含んでいた（Jefferson、1987）。GUS活性の引き続くMUGアッセイ法はpTBN、pTBN6またはpTBN1のいずれかを用いて形質転換した細胞が陰性対照（pUBN1またはpUBN6）よりも低いGUS活性を有することを示した（図14）。これはイントロンスプライシングが依然として生じており、そして少なくともpTBN1の場合においては元々のpTBNベクターと有意には異ならないことを示唆する。したがって、イントロン内へのBBTV複製要素を含めることで、pTBNと比較してスプライシング効率または引き続くバルナーゼの活性は有意には減少しなかった。
【０１５４】
BBTVを基礎とする「1.1mer」の再環状化および複製がRep（BBTV  DNA-1由来の遺伝子産物）存在下で生じることを示した実験を実施した。BBTV DNA-5遺伝子産物（推定上のレチノブラストーマ結合様タンパク質）を含有することにより複製が増強されることもまた見出された。その結果、再環状化ベクターの各々（pRTBN6（図4）、pRTBN1（図5）、pRUBN6、pRUBN1）をBBTV DNA-1および5「1.1mer」およびGUS発現ベクターとともに衝撃した。
【０１５５】
【表２】
バナナ細胞の微粒子衝撃に使用されるプラスミドの組み合わせ
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【０１５６】
図15に示されている結果は以前の発現ベクター細胞死アッセイ法を支持した（図14）。改めて、翻訳不能バルナーゼを含む構築物（pRUBN6およびpRUBN1）は翻訳可能な構築物よりも高いGUS活性を有していた。
【０１５７】
Repタンパク質存在下でのみバルナーゼ活性が誘導されることを示すために実験を実施した。その結果、それが存在する時のみ発現が生じるであろうことを証明するためにアッセイ法はRep（BBTV DNA-1「1.1mer」）＋/−にて実施した（表3）。「スタッファー」DNAは一定のDNA濃度を保つために使用した。
【０１５８】
【表３】
バナナ細胞の微粒子衝撃に使用されるプラスミド濃度
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【０１５９】
BBTV DNA-1および5「1.1mer」存在下で再環状化構築物が複製可能であるかを観察するために、翻訳不能構築物を一過性のバナナ細胞複製アッセイ法に含めた。細胞は衝撃後0、4および8日後に回収し、総細胞DNAを抽出し、そしてサザンハイブリダイゼーションを用いて解析した。
【０１６０】
最初に、膜をDIG標識CaMV 35Sプローブを用いてプロービングした。4日または8日目の細胞では複製型は見られなかった。しかしながら、0日目においては可能性のある複製型がpRUBN6およびpRUBN1の両方において非常に低い濃度で存在した。35Sプローブをストリッピングし、膜をDIG標識BBTV DNA-1プローブで再びプロービングした。高レベルの複製が4日および8日目に回収した細胞の両方で観察され、そして0日目に回収した細胞ではほとんど見られなかった。
【０１６１】
実施例7
TYDVに基づく発現ベクターを用いた細胞死アッセイ法
（a）TYDVに対する抵抗性を与えるための、Rep活性化可能自殺遺伝子ベクター
プラスミドpRTBN（DNA Plant Technologies, Oakland, California）は、ジャガイモST LS1イントロン（188 bp）が内部に取り込まれたバルナーゼコード領域（339 bp）を含む。プライマーBARN.EXP1およびBARN.EXP2を用いたPCRにより、pRTBNから全長バルナーゼ遺伝子およびイントロンを増幅した。プライマーBARN.UTRおよびBARN.EXP2を用いて、翻訳不可能な対照遺伝子を同様に増幅した。
【０１６２】
プライマー：
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【０１６３】
PCR産物をpGEM-Tベクターにクローン化した。これらのクローンを各々、pGEM-BTRおよびpGEM-BUTRと呼称した。TYDV LIR（LIR-X）をpGEM-T からEcoRI断片として切り出し、pGEM-BTRおよびpGEM-BUTRのジャガイモLTSイントロン内に位置するMfeI部位に挿入した。これらのプラスミドを各々、pBTR-LIRおよびpBUTR-LIRと呼称した。pBTR-LIRおよびpBUTR-LIR における、LIRを含むバルナーゼ遺伝子を、BamHI/PstI断片として切り出し、同様に切断したpGUS2ベクターに挿入し、元のuidAコード領域に置き換えた。プラスミドpGUS2はCaMV35S pro（530 bp）-uidA遺伝子-CaMV 35S ter（200 bp）を含む。これらの構築物を各々、p35S-BTR-LIRおよびp35S-BUTR-LIRと呼称した（図17）。BamHI/PstIを用いた、pGEM-BTRおよびpGEM-BUTRからのバルナーゼ遺伝子の切り出し、および同様に切断したpGUS2への挿入により、2つの対照プラスミドを構築した。これらの対照プラスミドを各々、p35S-BTRおよびp35S-BUTRと呼称した（図18）。
【０１６４】
（b）単子葉植物細胞および双子葉植物細胞における、TYDV Rep活性化バルナーゼ活性の一過的な評価
インビボにおけるバルナーゼ活性を決定するために、自殺構築物は、緑色蛍光タンパク質（gfp）発現カセットと共衝撃した。バルナーゼの発現および作用（即ち細胞死）は、翻訳不可能なバルナーゼ対照と比較して、緑色蛍光塊における有意な減少が認められる場合に生じていると考えられる。
【０１６５】
バナナ（Musa spp. 栽培品種「レディフィンガー（Ladyfinger）」）およびタバコ（Nicotiana tabacum NT-1）細胞は、上記の実施例3において説明されたように、プラスミド(i)p35S-BTR、(ii) p35S-BUTR、(iii) p35S-BTR-LIR、および(iv) p35S-BUTR-LIR（図17および図18）を用いて衝撃する。各プラスミドは、1μgのpWORMとの共衝撃を行う。構築物pWORMは、CaMV 35S pro(530 bp)-gfp(750 bp)-CaMV 35S ter(200 bp)カセットを含み、両細胞種を用いた一過性アッセイ法において強い緑色蛍光を与えることが以前に示されている（Dugdaleら, 1998）。
【０１６６】
衝撃3日後、緑色蛍光を、GFP-Plus 蛍光モジュール（励起＝490、発光＝510）を用いたLeica MZ12解剖顕微鏡を使用して可視化する。p35S-BTRおよびp35S-BTR-LIRの双方は、p35S-BUTRおよびp35S-BUTR-LIRと比較して、pWORMからのgfp発現を著しく減少する（緑色蛍光塊の数値および強度によって決定される）。この結果は、TYDV LIRのp35S-BTR内のST LS1イントロンへの挿入が、イントロンのプロセシングを妨げず、バルナーゼ発現も阻害しないことを示唆する。
【０１６７】
（c）TYDV Rep活性化可能バルナーゼベクターの構築
プライマー35S-IE（配列番号：21）およびLIR-R（配列番号：20）を用いたPCRによって、CaMV 35Sプロモーター、バルナーゼ5'側の遺伝子半分、ST LS1 5'側イントロン半分およびTYDV LIRを、p35S-BTR-LIR（図17A）から再増幅する。PCR産物をpGEM-Tベクターにクローン化し、配列を確認する。このプラスミドをpGEMB5'と呼称する。TYDV LIR、ST LS1 3'側イントロン半分、バルナーゼ3'側遺伝子半分およびnosターミネーターを、p35S-BTR-LIRからXhoI/SacI断片として切り出し、TYDV SIRをpGEM-SIRからSacI/NcoI断片として切り出し、CaMV 35Sプロモーター、バルナーゼ5' 側遺伝子半分、ST LS1 5'側イントロン半分およびTYDV LIRをpGEMB5'からNcoI/SacII部分断片として切り出す。インサートをXhoI/SacIIで切断したpBluescript II（Stratagene）と共に連結する。その結果生じる構築物をpBTR.test1と呼称する（図19A）。翻訳不可能な対照ベクターを同様に調製し、その結果生じる構築物をpBUTR.test1と呼称する（図19B）。
【０１６８】
（d）単子葉植物細胞および双子葉植物細胞における、一過性のTYDV Rep活性化バルナーゼ発現
上記に説明されるように、以下の表4にて挙げられるプラスミドの組み合わせを用いて、バナナ（Musa spp. 栽培品種「レディフィンガー（Ladyfinger）」）およびタバコ（Nicotiana tabacum NT-1）の細胞に衝撃する：
【０１６９】
【表４】
バナナおよびタバコの細胞における一過性形質転換アッセイ法のためのプラスミドの組み合わせ、およびその結果生じるgfp発現（＋または−として評価された）
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【０１７０】
表4の結果は、バルナーゼの発現（およびそれによる細胞死）は、TYDV Repがトランスに与えられた場合にpBTR-test1からのみ活性化することを示唆する。翻訳不可能なバルナーゼ遺伝子カセット（pBUTR-test1）のRep活性化発現では、pWORMからのgfp発現における有意な減少は全く生じない。プライマーBARN.UTR（配列番号：40）およびBARN.EXP2（配列番号：41）がPCRに使用され、上述したプライマーを用いて、DIG標識したバルナーゼ特異的プローブが合成されることを除いては、pBUTR-test1、pWORM、およびp35S-Repを用いて衝撃された細胞由来のMPEのRep媒介によるニッキング、連結、および複製は、以前に説明されたように確証される。
【０１７１】
（e）Rep活性化可能バルナーゼ遺伝子カセットを含むバイナリープラスミドの構築
Rep活性化可能バルナーゼカセットを、pBTR-test1およびpBUTR-test1からPvuII断片として切り出し、バイナリープラスミドpTAB5（CSIRO, Canberra, Australia）における、CaMV 35S pro-NTPII-CaMV 35S ter カセットの下流に位置する唯一のEcoRI部位（DNAポリメラーゼIの大クレノウ断片を使用して平滑末端とした）に挿入する。その結果生じる構築物を各々、pTAB-BTR1およびpTAB-BUTR1と呼称する。シン（Singh）ら（1993）の方法を用いたエレクトロポレーションにより、双方のベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（LBA4404）に導入する。
【０１７２】
（f）Rep活性化可能バルナーゼカセットを用いた、単子葉植物および双子葉植物の安定性形質転換
バナナの安定性形質転換のために、プラスミドpBTR-test1およびpBUTR-test1が、pDHKANを用いて独立して共形質転換されること、および、プラスミドpTAB-BTR1およびpTAB-BUTR1を有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）培養が、タバコリーフディスクのアグロバクテリウム（Agrobacterium）仲介の形質転換に使用されることを除いて、上記の実施例4において説明されたように、バナナ（Musa spp. 栽培品種「レディフィンガー（Ladyfinger）」）およびタバコ（Nicotiana tabacum 栽培品種「サムスン（Samsun）」）の安定性形質転換を行う。
【０１７３】
プライマー組LIR-F/LIR-R（配列番号：19／配列番号：20）およびNPT-F/NPT-R（配列番号：36／配列番号：37）を各々用いたPCRにより、形質転換植物体はバルナーゼ遺伝子カセットおよびNPTII遺伝子を含むことが確証される。単子葉植物種および双子葉植物種の両方の、10個の独立したトランスジェニック系統が、さらなる研究のために選択される。
【０１７４】
（g）トランスジェニックタバコにおける、TYDVに対するRep活性化過敏感抵抗性
pTAB-BTR1およびpTAB-BUTR1を用いて形質転換した、10個の独立したタバコ植物体におけるバルナーゼ発現のRep活性化を、説明されたように、p35S-Rep構築物の葉片への微粒子衝撃により、最初に調べた。衝撃2日後、導入部分の壊死は、翻訳不可能な対照（pTAB-BUTR1）と比較して、Rep活性化可能翻訳可能性バルナーゼ遺伝子カセット（pTAB-BTR1）を用いて形質転換されたタバコ植物体の葉上においてのみ明らかである。この結果から、TYDV Repがトランスに導入された場合、染色体に組み込まれた遺伝子コピーからバルナーゼ発現カセットを複製放出するのに十分であることが示唆される。Rep媒介によるニッキング、連結、および複製は、NT-1細胞における一過性アッセイ法について説明されたように、pTAB-BUTR1を用いて形質転換されたタバコ植物体の葉片において確証される。
【０１７５】
トランスジェニックタバコにおけるTYDVに対する過敏感抵抗性を示すため、保毒ヨコバイ（Orosius argentatus）に植物を2日間まで摂食させた。その次週に渡って、最初にヒル（Hill, 1937）によって説明されたように、特徴的なTYDV病徴について植物体を調べた。Rep活性化可能な、翻訳不可能バルナーゼ発現カセット（pTAB-BUTR1）を用いて形質転換された植物体は、萎縮、黄化、葉縁および若葉先端の屈曲、および節間の短縮を含む、典型的なTYDV病徴を生じる。対照的に、Rep活性化可能な、翻訳可能バルナーゼ発現カセット（pTAB-BTR1）を用いて形質転換されたタバコ植物体は、アブラムシの摂食部位において異常な壊疽病斑を示す（バルナーゼに誘導された細胞死の結果の可能性が非常に高い）。これらの植物体は、感染していないタバコ植物体と比較して、確実に3ヶ月間に渡り、正常に生長し、いずれの時点においてもTYDV感染に特徴的な病徴を発達させない。
【０１７６】
感染2週間後、スチュワート（Stewart）およびヴィア（Via）（1993）の方法を用いて、20個のトランスジェニックタバコ植物体および非感染対照の各々の葉から全gDNAを単離する。TYDVコートタンパク質遺伝子（CP-FおよびCP-R）に対して設計されたプライマーを用いたPCRのための鋳型として、総gDNA（1μg）を使用する。765 bp コートタンパク質遺伝子、およびそのためのウイルスゲノムは、pTAB-BUTR1を用いて形質転換されたタバコにおいてのみ検出される。この結果により、pTAB-BTR1を用いて形質転換されたタバコ植物体はTYDV感染に対して抵抗性があり、長期間に渡って、TYDV誘導性の病徴が現われないことが示唆される。
【０１７７】
プライマー：
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【０１７８】
実施例8   BBTVに基づくgfpベクターの構築
Rep活性化可能バルナーゼカセットに基づく、同様な一連のベクターを、緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするレポーター遺伝子およびBBTV遺伝子間領域を用いて構築した。一連のpRTBNベクターと同様の方法で、オーバーラッピングPCRにより、発現ベクターおよび再環状化ベクターの両方を構築し、pUC19ベクターにクローン化した。これらのベクターの構築において使用したプライマーは、表5にて示される。ある場合においては、プラスミドpBN、pTBN6およびpTBN1をPCRの鋳型として使用した。
【０１７９】
【表５】
オリゴヌクレオチド配列
0004797141.tif 000022
【０１８０】
最初に、プラスミドpGI（配列番号：69）、pGI6（配列番号：70）、pGI1（配列番号：71）を構築した。それらは図20、図21および図22にて各々示される。最終的に、プラスミドpRGI6、pRGI1、pRGI1/6を構築した。それらは図23、図24および図25にて各々示される。図20から図25においては、イントロンはジャガイモST-LS1イントロンを指し、遺伝子間領域はBBTV DNA-1またはDNA-6のいずれかに由来し、CTおよびNTはGFPレポーター遺伝子のC末端部分およびN末端部分を指す。
【０１８１】
これらの様々な構築物の有効性は、バナナ懸濁細胞の微粒子銃による一過性アッセイ法において評価される。最初の一過性アッセイ法では、様々なモノマーが複製放出され再環状化されるかどうかを、およびGFP遺伝子が正しく転写、プロセシング、発現されるかどうかを決定するため、GFP発現を評価する。BBTV DNA-1 1.1 merを、pGI1またはpGI6のいずれかの当モル量と混合し、バナナの胚誘導性懸濁細胞に衝撃する。衝撃の8日後、GFP特異的なプローブを用いて、サザンハイブリダイゼーションにより、複製放出および環状化を調べる。GFP顕微鏡を用いてGFP発現をモニタリングし、ウエスタンブロット法およびGFP特異的な抗血清を用いて定量する。
【０１８２】
サザンハイブリダイゼーションは、BBTV DNA-1 1.1merがトランスに送達される場合にのみ、pGI1またはpGI6Pのいずれかからの単量体環状分子の存在を示す。同様に、GFP発現は、ウイルス由来の1.1merが存在する場合にのみ検出される。
【０１８３】
実施例9
バルナーゼ誘導性のBBTVに対する抵抗性についてのバナナの安定性形質転換
BluggoeおよびCavendishの双方の、バナナの胚誘導性懸濁細胞を、微粒子銃（Beckerら, 2000）を用いて、pRTBN6および選択可能なマーカー遺伝子を有するプラスミドで共形質転換する。Rep活性化可能バルナ−ゼカセットの完全なコピーがバナナゲノムに取り込まれたかどうかを決定するため、再分化した幼植物体をPCRによって調べる。陽性の形質転換体を増殖させ、最初に、各形質転換から得られる5つの植物体を、20個のBBTV保毒アブラムシにより感染させる。形質転換した植物体と形質転換していない植物体の間のウイルスDNAの蓄積レベルを比較するため、サザンハイブリダイゼーション法を使用する。有望なトランスジェニック系統をさらに増殖し、再度感染させ、アッセイ法を行う。
【０１８４】
ほとんど全ての場合において、トランスジェニックバナナ植物体は、対照と比較して、バナナの房先端の病気の証拠を全く示さない。むしろ、アブラムシの摂食部位における異常な壊死が認められ、バルナーゼに誘導された細胞死を反映している可能性が非常に高い。PCRおよびサザンハイブリダイゼーションを用い、調べた植物体のいかなる部分においても、BBTVのコートタンパク質遺伝子は検出できず、これらの系統はBBTVの感染、複製および蔓延に対して抵抗性があることが示唆される。
【０１８５】
実施例10
TYDVに基づく組織特異的および誘導可能なRep活性化発現
Rep発現部位を調節するため、およびそのための植物体内におけるトランスジーン活性化／複製を調節するため、組織特異的なプロモーターを使用した。
【０１８６】
（a）構成的な発現
ベクターpTAB16は、pBIN16における右および左のT-DNA境界の間に位置するCaMV 35S pro-bar 選択遺伝子-ocs terおよびCaMV 35S pro-uidA-CaMV 35S ter カセットを含む。EcoRI/BamHIによる切断によって、CaMV 35S-TYDV Rep遺伝子カセットをp35S-Repから切り出し、同様に切断したpTAB16ベクターに挿入し、元のCaMV 35S-uidA カセットに置き換える。この構築物は、pTAB-TYDV-Repと呼称する。
【０１８７】
（b）種子特異的な発現
1 kbのイネグルテリンプロモーター（ゲンバンクアクセッション番号：X52153）は、タバコにおいて種子特異的なレポーター遺伝子の発現を司ることが示されている（Leisyら, 1989）。NcoIによる切断によって、プラスミドpGT3-JEFLK（Miller, 2001）からイネグルテリンプロモーターを切り出し、同様に切断したpTAB-TYDV-Repベクターに連結し、元のCaMV 35Sプロモーターに置き換える。この構築物はpGL-TYDV-Repと呼称する。
【０１８８】
（c）根特異的な発現
880 bpのシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の根に特異的なキナーゼホモログ（ARSK1）プロモーター（ゲンバンクアクセッション番号：L22302）は、シロイヌナズナ（A.thaliana）の根の表皮、内皮、および皮層領域において、組織特異的なuidAレポーター遺伝子発現を司ることが示された（HwangおよびGoodman, 1995）。プライマーARSK-FおよびARSK-Rを用いたPCRにより、シロイヌナズナ（A.thaliana）のgDNAから、ARSK1プロモーターを増幅する。その結果得られるPCR産物をpGEM-Tにクローン化し、配列を確認する。NcoIによる切断によって、pGEM-TからARSK1プロモーターを切り出し、同様に切断したpTAB-TYDV-Repに連結し、元のCaMV 35Sプロモーターに置き換える。この構築物をpAR-TYDV-Repと呼称する。
【０１８９】
プライマー：
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【０１９０】
（d）傷害により誘導可能な発現
2032 bpのアスパラガス（Asparagus officinalis） PR遺伝子（AoPR1）プロモーター（ゲンバンクアクセッション番号：A26573）は、例えばカルスのような、傷害を受けた細胞種および活発に分裂する細胞種において、強いレポーター遺伝子発現を司ることが示された（Firekら, 1993）。プライマーAoPR-FおよびAoPR-Rを用いたPCRにより、AoPR1プロモーターをアスパラガス（A.officinalis）のgDNAから増幅する。その結果生じたPCR産物をpGEM-Tにクローン化し、配列を確認する。NcoIによる切断によって、AoPR1プロモーターをpGEM-Tから切り出し、同様に切断したpTAB-TYDV-Repに連結し、元のCaMV 35Sプロモーターに置き換える。この構築物をpAo-TYDV-Repと呼称する。
【０１９１】
プライマー：
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【０１９２】
（e）アルコールにより誘導可能な発現
アスペルギルス・ニドゥランス（Aspergillus nidulans）に由来するALCスイッチ（switch）は、AlcAプロモーターおよびAlcRレセプターに基づく、アルコールにより誘導可能なプロモーター系である。ALCスイッチは、uidAレポーター遺伝子モデル（Caddickら, 1998）を用い、植物の系において機能することが示された。プラスミドpSRNAGS（BTI, コーネル大学(Cornell University), Ithaca, New York）は、pBIN16において、CaMV 35S pro-AlcR遺伝子-nos terおよびAlcA pro-uidAレポーター遺伝子-CaMV 35S ter カセットを含む。プライマー35S-IE（配列番号：21）およびAlc-R（配列番号：61）を用いたPCRにより、CaMV 35S pro-AlcR遺伝子-nos ter-AlcA pro カセットをpSRNAGSから増幅する。PCR産物をpGEM-Tにクローン化し、配列を確認する。その後、NcoIによる切断によってインサートを切り出し、同様に切断したpTAB-TYDV-Repに連結し、元のCaMV 35Sプロモーターに置き換える。この構築物をpAlc-TYDV-Repと呼称する。
【０１９３】
プライマー：
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【０１９４】
シン（Singh）ら（1993）の方法を用いたエレクトロポレーションにより、バイナリーTYDV Repを含むプラスミドの各々をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）（LBA4404）に導入する。
【０１９５】
（f）組織特異的および誘導可能なRep発現は、正確な組織種においてレポーター遺伝子の活性化を司る
プラスミドpTEST4を用いて形質転換したタバコ植物体からの葉は、ホーシュ（Horsch）ら（1988）の方法を用いて、プラスミドpTAB-TYDV-Rep、pGL-TYDV-Rep、pAR-TYDV-Rep、pAo-TYDV-Rep、およびpAlc-TYDV-Repを有するアグロバクテリウム（Agrobacterium）に重感染させる。この場合、形質転換したタバコ植物体の選択は、除草剤ホスホイノスリシンアンモニウム（PPT）を用いて達成される。プライマーTYDV.RepFおよびTYDV.RepRを用いたPCRにより、トランスジェニック植物体はTYDV Rep遺伝子を含むことが確証される。各プラスミドについての10個の独立した形質転換体を、さらなる研究のために選択する。植物体を成熟するまで生長させ、開花させて種子を採集する。独立した形質転換体から、葉、茎、根、花および種子を含む、異なる植物体器官を採集し、組織化学的解析を用いてGUS活性を検出する。
【０１９６】
プラスミドpTAB-TYDV-Repを用いて重形質転換したタバコ植物体は、調べた植物体の全ての部分を通して強いGUS発現を示す。これらの植物体におけるGUS発現レベルは、非複製対照であるpTAB16を用いて形質転換された植物体よりもかなり高い。
【０１９７】
対照的に、プラスミドpGL-TYDV-Repを用いて重形質転換された植物体は、種子においてのみ強いGUS発現を示し、プラスミドpAR-TYDV-Repを用いて重形質転換された植物体は、根においてのみ強いGUS発現を示し、プラスミドpAo-TYDV-Repを用いて重形質転換された植物体は、傷害を受けた細胞および分裂細胞において強いGUS発現を示し、プラスミドpAlc-TYDV-Repを用いて重形質転換された植物体は、1％ v/vエタノール溶液に浸した場合にのみ、強い構成的なGUS発現を示す。
【０１９８】
GUS発現カセットのRep媒介によるニッキング、連結、および複製は、プラスミドpTAB-TYDV-Repを用いて重形質転換されたタバコ植物体の全ての組織種において、（以前に説明されたように）確証される。対照的に、この活性はプラスミドpGL-TYDV-Repを用いて重形質転換された植物体の種子、プラスミドpAR-TYDV-Repを用いて重形質転換された植物体の根、プラスミドpAo-TYDV-Repを用いて重形質転換された植物体の傷害部位、および構成的に、プラスミドpAlc-TYDV-Repを用いて重形質転換された、エタノール誘導された植物体においてのみ検出される。この結果により、TYDV Rep遺伝子の組織特異的な発現または誘導性発現は、これらの組織種においてのみ、Rep活性化可能GUSカセットからの高レベルの発現を与えることが示唆される。
【０１９９】
実施例11
TMV p50およびhrmA遺伝子仲介の抵抗性−TYDVに基づく
（a） タバコにおいて、TMV p50ヘリカーゼ断片のTYDV Rep活性化発現は、全身獲得抵抗性（SAR）を誘導する
過去の研究（Ericksonら, 1990）により、50 kDaのタバコモザイクウイルス（TMV）ヘリカーゼ断片（p50）の非ウイルス発現は、適したタバコ品種（例えば、タバコ（Nicotiana tabacum）栽培品種「プチハバナ（Petite Havana）」N遺伝子に関してホモ接合であるSR1）においてN-仲介の過敏感反応（HR）を誘導するのに十分であることが示された。防御反応は、結果としてウイルスの複製および移行の阻害が生じるような、ウイルス感染部位における細胞死、および全身獲得抵抗性（SAR）経路の誘導によって特徴付けられる。
【０２００】
クローン化したゲノムTMV DNA（カリフォルニア大学植物遺伝子発現センター(Plant Gene Expression Centre, University of California, USA)）に由来するプライマーp50-Fおよびp50-Rを用いたPCRによって、p50遺伝子断片を増幅する。PCR産物をpGEM-Tにクローン化し、配列を確認する。pTEST3由来のTYDV LIRを含むカタラーゼイントロン（図10）を、p50コード領域における唯一のEcoRI部位にインフレームに組み込む。このプラスミドをpGEM50-LIRと呼称する。上記の実施例2においてpTEST3について説明されたように、pUCに基づくRep活性化可能p50遺伝子プラスミドを引き続き構築する。pTEST4について説明されたように、カセットをpART27に挿入する。その結果得られるp50 Rep活性化可能バイナリープラスミドをpSAR1と呼称する。以前に説明されたように、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を形質転換するために、プラスミドpSAR1を用いる。
【０２０１】
プライマー：
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【０２０２】
（b）タバコにおけるTYDVに対する全身獲得抵抗性
プラスミドpSAR1由来のT-DNAを用いて形質転換した、10個のタバコ植物体（Nicotiana tabacum栽培品種「プチハバナ（Petite Havana）」N遺伝子に関してホモ接合であるSR1）をアグロバクテリウム（Agrobacterium）仲介の形質転換によって得、上記に説明されたように、PCRによってRep活性化可能カセットおよびNTPII遺伝子を含むことを確証する。以前に説明されたように、植物をTYDVに感染させ、病徴を観察する。Rep活性化可能p50遺伝子によって形質転換したタバコ植物体は、感染2日後、アブラムシの摂食部位において異常な過敏感壊死を示す。典型的なTYDV誘導性の病徴を示す感染した非トランスジェニックタバコ植物体と比較して、これらの植物体は、確実に3ヶ月間に渡り、正常に生長する。
【０２０３】
以前に説明されたように、TYDVゲノムDNAは、接種された非トランスジェニックタバコにおいて検出されるが、トランスジェニック対照系統や非感染対照系統においては検出されない。この結果から、TMV p50遺伝子のTYDV Rep-誘導性発現は、適したタバコ栽培品種においてN遺伝子の過敏感反応を刺激し、TYDV感染に対する抵抗性を与えるのに十分であることが示唆される。
【０２０４】
（c） 傷害誘導可能TYDV Rep発現は、TMV p50遺伝子発現を活性化し、様々な病原体に対するSARを誘発する
以前に説明されたように、pSAR1で形質転換したタバコ植物体の葉を、プラスミドpAo-TYDV-Rep（実施例10）を含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）を用いて重感染させる。さらなる研究のために、傷害誘導可能Rep遺伝子を確実に含む、10個の重形質転換系統を選択する。トランスジェニック植物体および適した対照を、例えば、(i)タバコ葉脈モザイクウイルスのアブラムシによる伝搬、(ii)線虫ベクターパラトリコドルス・パチデルムス（Paratrichodorus pachydermus）に媒介されるタバコ茎壊疽ウイルス、および(iii)感染性BeYDV 1.1merのバイオリスティック導入のように、様々なウイルス病原体に感染させる。時間経過後、特徴的なウイルス誘導性の病徴について植物体を観察する。全てのトランスジェニック植物体は、対照と比較して、ウイルス接種部位において異常な過敏感壊死を示す。
【０２０５】
（d）タバコにおいて、TYDV Repの傷害誘導可能性の発現は、hrmA仲介の広範な病原体への抵抗性を活性化する
シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae pv. syringae）由来のhrmA遺伝子産物は、多くのタバコ栽培品種において病原体関連の遺伝子を活性化し、ウイルス、菌類および細菌を含む様々な病原体に対する抵抗性を与えることが示された（Shenら, 2000）。
【０２０６】
プライマーhrm-Fおよびhrm-Rを用いたPCRにより、コード配列を含むプラスミドから、hrmA遺伝子を増幅する。続いて、pTEST3について上記の実施例2において説明されたように、pUCに基づくRep活性化可能hrmAプラスミドを構築する。pTEST4について説明されたように、カセットをpART27に挿入する。その結果生じるhrmA-活性化可能バイナリープラスミドをpSAR2と呼称する。説明されたように、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を形質転換するために、プラスミドpSAR2を使用する。
0004797141.tif 000027
【０２０７】
以前に説明されたように、アグロバクテリウム（Agrobacterium）仲介の形質転換により、プラスミドpSAR2由来のT-DNAを用いて形質転換した10個のタバコ植物体（Nicotiana tabacum）を得、PCRによってRep活性化可能カセットおよびNTPII遺伝子を含むことを確証する。以前に説明されたように、プラスミドpAo-TYDV-Repを含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）を用いて、pSAR2で形質転換したタバコ植物体の葉を重感染させる。さらなる研究のために、傷害誘導可能Rep遺伝子を確実に含む、10個の重形質転換系統を選択する。例えばタバコ葉脈モザイクウイルス、タバコ疫病菌フィトフソラ・パラシチカ（Phytophthora parasitica）、およびタバコ野火病細菌シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae pv. tabaci.）のような、様々な病原体を用いて、トランスジェニック植物体および適した対照を感染させる。時間の経過後、特徴的な病原体誘導性の病徴について植物体を観察する。全てのトランスジェニック植物体は、対照と比較して、接種部位における異常な過敏感壊死を示す。
【０２０８】
実施例12
TYDVに基づくヒト血清アルブミンの過剰発現
（a）商業的に重要なタンパク質、ヒト血清アルブミンのRep活性化過剰発現
アルブミンは、血液の血清タンパク質の約半分を構成する、可溶性の単量体タンパク質である。アルブミンは、主にステロイド、脂肪酸、および甲状腺ホルモンのための担体タンパク質としての機能を果たし、細胞外液量を安定化させる役割を担う。
【０２０９】
プライマーAlb-FおよびAlb-Rを用いたPCRによって、遺伝子を含むプラスミドから、1831 bpのヒト血清アルブミン（HSA）コード領域（Lawnら, 1981）を増幅する。pTEST3について上記の実施例2にて説明されたように、pUCに基づくRep活性化可能HSAプラスミドを続いて構築する。pTEST4について説明されたように、pART27にカセットを挿入する。その結果生じるHSA活性化可能バイナリープラスミドをpHSA1と呼称する。説明されたように、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を形質転換するため、プラスミドpHSA1を使用する。
【０２１０】
説明されたように、アグロバクテリウム（Agrobacterium）仲介の形質転換により、プラスミドpHSA1由来のT-DNAを用いて形質転換した10個のタバコ植物体（Nicotiana tabacum）を得、PCRにより、Rep活性化可能カセットおよびNTPII遺伝子を含むことを確証する。説明されたように、プラスミドpTAB-TYDV-Rep、pGL-TYDV-Rep、pAo-TYDV-Rep、pAlc-TYDV-Repを含むアグロバクテリウム（Agrobacterium）を用いて、pHSA1で形質転換したタバコ植物体の葉を重感染させる。各形質転換から得られる10個の重形質転換系統は、Rep遺伝子を含むことを確認し、さらなる研究のために選択する。植物を成熟するまで生長させ、ELISA法およびHSA遺伝子産物に対して作製した抗体を用いてHSA含量を評価する。HSAタンパク質は高レベルで、しかし異なる植物体の部分または特定的な条件下において検出される；即ち、構成的に（pTAB-TYDV-Rep）、種子のみにおいて（pGL-TYDV-Rep）、傷害を受けた組織において（pAo-TYDV-Rep）、およびアルコール処理した植物体において構成的に（pAlc-TYDV-Rep）検出される。プラスミドpHSA1由来のヒト血清アルブミン遺伝子のRep活性化発現について提案されるモデルは、図26において示される。
【０２１１】
プライマー：
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【０２１２】
本明細書において説明される本発明は、特定的に説明されたもの以外に多様化および改変が可能であることが当業者には理解される。本発明はそのような全ての多様化および改変を含むことを理解されるべきである。本発明はまた、個々にまたは集合的に本明細書において言及されるかまたは示され、全ての段階、特徴、構成物および化合物をも含み、任意の2つまたはそれ以上の該段階または特徴のいかなるまたはあらゆる組み合わせをも含む。
【０２１３】
参考文献
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0004797141.tif 000030
0004797141.tif 000031
【図面の簡単な説明】
【図１】  pTBNの模式図を示す。
【図２】  pTBN6の模式図を示す。
【図３】  pTBN1の模式図を示す。
【図４】  pRTBN6の模式図を示す。
【図５】  pRTBN1のダイグラムを示す。
【図６】  pRTBN1/6の模式図を示す。
【図７】  プラスミドp35S-2301の略図を示す。
【図８】  プラスミドpTEST1の略図を示す。
【図９】  プラスミドpTEST2の略図を示す。
【図１０】  プラスミドpTEST3の略図を示す。
【図１１】  プラスミドpTEST4の略図を示す。
【図１２】  プラスミドpBI-TYDV1.1merの略図を示す。
【図１３】  プラスミドp35S-Repの略図を示す。
【図１４】  発現ベクターを使用した細胞死アッセイ法の結果をグラフで示す。エラーバーは95%信頼区間を示す。
【図１５】  発現ベクターを使用した再環状化細胞死アッセイ法の結果をグラフで示す。エラーバーは95%信頼区間を示す。
【図１６】  発現ベクターを使用した誘導性再環状化細胞死アッセイ法の結果をグラフで示す。エラーバーは95%信頼区間を示す。
【図１７】  プラスミド(A)p35S-BTR-LIRおよび(B)p35S-BUTR-LIRの略図を示す。
【図１８】  プラスミド(A)p35S-BTRおよび(B)p35S-BUTRの略図を示す。
【図１９】  プラスミド(A)pBTR.test1および(B)pBUTRtest1の略図を示す。
【図２０】  pGIの模式図を示す。
【図２１】  pGI6の模式図を示す。
【図２２】  pGI1の模式図を示す。
【図２３】  pRGI6の模式図を示す。
【図２４】  pRGI1の模式図を示す。
【図２５】  pRGI1/6の模式図を示す。
【図２６】  プラスミドpHSA1からヒト血清アルブミンをRep活性化発現させるために提案されているモデルの略図を示す。
【図２７】  遺伝子発現のセンス／アンチセンス調節に使用する構築物の模式図を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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