(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有し、蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステムの転写アクティベーター遺伝子が高発現され、さらに蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステムの形成抑制遺伝子が不活性化されていることにより、蟻酸から水素を生成させる機能が向上し、かつ乳酸脱水素酵素遺伝子が不活性化され、さらに、フマル酸還元酵素遺伝子の一部が不活性化されていることを特徴とするエシェリキア・コリ。
【請求項２】
エシェリキア・コリ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）株を用いて作製されたものである請求項１に記載のエシェリキア・コリ。
【請求項３】
エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＳＲ１３  ΔｌｄｈＡ  ΔｆｒｄＢＣ株（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７７４）。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のエシェリキア・コリを、好気条件下にて培養した後、さらに、嫌気条件で培養して水素生成能力を誘導発現することを特徴とする水素生成能力の誘導発現方法。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれかに記載のエシェリキア・コリを、好気条件下にて培養した後、さらに、嫌気条件で培養して水素生成能力を誘導発現し、次いで蟻酸化合物の供給下、前記の培養したエシェリキア・コリを水素発生用溶液中で培養することを特徴とする水素の生成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有し、蟻酸類から水素を生成させることの機能が向上し、かつ乳酸生成経路、例えば乳酸脱水素酵素遺伝子（ｌｄｈＡ）が不活性化、さらにはコハク酸生成経路、例えばフマル酸還元酵素遺伝子（ｆｒｄＡＢＣＤ）の一部が不活性化されている微生物に関する。また本発明は、前記微生物を用いた培養方法、前記微生物に水素生成能力を付与（誘導発現）する方法、及び水素生成能力が付与された微生物を用いた水素生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
水素は化石燃料と異なり、燃焼しても炭酸ガスや硫黄酸化物等の環境問題が懸念される物質を発生しない究極のクリーンエネルギー源として注目され、単位質量当たりの熱量は石油の３倍以上あり、燃料電池に供給すれば電気エネルギーおよび熱エネルギーに高い効率で変換できる。
【０００３】
水素生成のために、従来化学的製法として、例えば天然ガスやナフサの熱分解水蒸気改質法等の技術が提案されている。これらの方法は高温高圧の反応条件を必要とし、そしてこの方法により製造される合成ガスにはＣＯ（一酸化炭素）が含まれるため燃料電池用燃料として使用する場合には燃料電池電極触媒劣化の問題があり、このためＣＯを除去する必要がある。しかしながら、ＣＯ除去は、技術的に困難性が伴い、容易ではない。
【０００４】
一方、微生物による生物的水素生成方法は常温常圧の反応条件であること、そして発生するガスにはＣＯが含まれないためその除去も不要である。このような観点から、微生物による生物的水素生成は燃料電池用燃料供給のより好ましい方法として、注目されている。
【０００５】
生物的水素生成方法には大別して光合成微生物を使用する方法と非光合成微生物（主に嫌気性微生物）を使用する方法に分けられる。前者の方法は水素生成に光エネルギーが用いられるが、低い光エネルギー利用効率のため、広大な集光面積を要し、水素生成装置の価格問題や維持管理の難しさ等、解決しなければならない課題が多く未だ実用的なレベルには至っていない。
【０００６】
後者の方法では、嫌気性微生物における水素生成に関する代謝経路が種々知られている。該代謝経路としては、例えば、グルコースのピルビン酸への分解経路において水素が発生する経路；ピルビン酸からアセチルＣｏＡを経て酢酸が生成する過程において水素が発生する経路；又はピルビン酸由来の蟻酸より直接水素が発生する経路等が挙げられる。ピルビン酸由来の蟻酸より直接水素を発生する経路は、蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステム〔ＦＨＬ（Ｆｏｒｍａｔｅ  Ｈｙｄｒｏｇｅｎ  Ｌｙａｓｅ）システム〕として、多くの微生物が有している。このＦＨＬシステムに関してはエシェリキア・コリについて数多くの報告がある。
【０００７】
嫌気発酵による単位時間単位体積当たりの水素生成速度は遅いことが実用化の障壁となっていたが、特許文献１において、高効率の水素生成方法が開示されている。該特許文献には、水素生成能力の備わっていない好気培養菌体に、嫌気条件下で培養することにより水素生成能力を誘導発現することが記載されているが、遺伝子の改変による水素生成能力向上、および遺伝子の改変により水素生成能力を誘導する時間を短くする方法に関しては何ら言及されていない。
非特許文献１には、乳酸経路を破壊したことによる水素生成速度の向上、および水素収率の向上に関する記載がなされている。該文献には、グルコースからの水素生成に関する記述はなされているものの、水素生成能力の誘導発現、遺伝子の改変による水素生成速度及び収率の向上に関する記述は一切ない。
【０００８】
非特許文献２では、酸化還元レベルの異なる様々な有機性基質による有機酸等の生成バランスについての報告がなされている。該文献においては、乳酸脱水素酵素遺伝子ｌｄｈＡおよびフマル酸還元酵素遺伝子ｆｒｄを不活性化し、乳酸・コハク酸の生成が抑えられた微生物が報告されている。ここでは生成物の酸化還元バランスについての記載がされているものの、水素生成に関する記載は勿論のこと、水素生成能力の誘導発現に関する言及は全くない。
【０００９】
フマル酸還元酵素は４つの遺伝子ｆｒｄＡＢＣＤによりコードされ、４種のタンパクがそれぞれサブユニットとなり複合酵素として活性を有するとされているが、非特許文献２ではどのような方法によりフマル酸還元酵素遺伝子（ｆｒｄ）が不活性化されているのか、またいずれのサブユニットが不活性化されているのか不明である。
【００１０】
非特許文献３においては、蟻酸からの水素生成速度が向上した微生物が得られている。該文献に記載の微生物は、蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステムの転写アクティベーター遺伝子ｆｈｌＡが高発現され、さらに蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステムの形成抑制遺伝子ｈｙｃＡが不活性化されている。しかしながら、該文献では水素生成能力の誘導発現の強化方法やこれに基因すると思われる水素生成能力の向上に関する記述は全くなされていない。
【特許文献１】国際公開第２００４／０７４４９５Ａ１号
【非特許文献１】早出広司ら、バイオハイドロゲンII（Ｂｉｏｈｙｄｒｏｇｅｎ  II）、２００１年、ｐ．１９５−２０４
【非特許文献２】Ｋ．Ｙ．ＡＬＡＭら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、１９８９年、第１７１巻、ｐ．６２１３−６２１７
【非特許文献３】吉田章人ら、アプライド・エンバイロメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｅｎｖｉｒｏｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、２００５年、第７１巻，ｐ．６７６２−６７６８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
好気培養条件下では、一般に微生物を増殖させて高濃度にすることは容易である。その微生物に嫌気培養条件下で水素生成能力を付与する（即ち誘導発現する）ことも可能である。しかしながら、微生物に水素生成能力を誘導発現するために嫌気培養する際、微生物が高濃度であれば、微生物に充分な水素生成能力を付与することが困難であるという問題点があった。このように嫌気条件下水素生成能力をより効率的に誘導発現しうる微生物の創製が切望されている。
本発明の目的は、従来の技術では解決できなかった、水素生成能力の誘導発現培養時に優れた水素生成能力を獲得しうる新規な遺伝子組み換え技術による創製微生物、該微生物に水素生成能力を誘導する方法、及び水素生成能力を獲得した該微生物と有機性基質として蟻酸化合物を用いる生物的水素生成方法を提供するものである。そのようにして得られる水素生成能力を有する微生物を使用して生成された水素は燃料電池用の燃料源として使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、上記の課題を解決することを目的として、鋭意検討を行った結果、蟻酸化合物から水素を生成する能力が向上した微生物が得られることを見出した。さらにこの微生物が高い濃度においても優れた水素生成能力を獲得し、そして高い濃度でも水素生成能力を発揮することができ、しかも水素生成速度が一段と向上した技術となることを見出した。このような知見に基づき、本発明者等はさらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は、
（１）蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有し、蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステムの転写アクティベーター遺伝子が高発現され、さらに蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステムの形成抑制遺伝子が不活性化されていることにより、蟻酸から水素を生成させる機能が向上し、かつ乳酸生成経路が不活性化されていることを特徴とする微生物、
（２）さらに、コハク酸生成経路が不活性化されていることを特徴とする（１）に記載の微生物、
（３）乳酸生成経路の不活性化が、乳酸脱水素酵素遺伝子の不活性化により行われていることを特徴とする（１）に記載の微生物、
（４）コハク酸生成経路の不活性化が、フマル酸還元酵素遺伝子の一部を不活性化することにより行われていることを特徴とする（２）記載の微生物、
（５）（１）〜（４）に記載の微生物が、通性嫌気性細菌であることを特徴とする微生物、
（６）（５）に記載の通性嫌気性細菌が、エシェリキア・コリの形質転換体であることを特徴とする微生物、
（７）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）  ＳＲ１３  ΔｌｄｈＡ  ΔｆｒｄＢＣ株（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７７４）、
（８）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）  ＳＲ１３  ΔｌｄｈＡ株（独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター  受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７７３）、
（９）（１）〜（８）のいずれかに記載の微生物を、好気条件下にて培養した後、さらに、嫌気条件で培養することを特徴とする水素生成能力を有する微生物の培養方法、及び
（１０）（１）〜（８）のいずれかに記載の微生物を、好気条件下にて培養した後、さらに、嫌気条件で培養し、次いで蟻酸化合物を供給下、前記の培養した微生物を水素発生用溶液中で培養することを特徴とする水素の生成方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の微生物は優れた水素生成能力を容易に獲得し、この水素生成能力を獲得した微生物は、蟻酸化合物から単位微生物当たりの水素生成速度が向上し、しかも、水素生成能力を獲得した微生物を用いる水素生成方法では、反応器の容量を小さくすることができ、コンパクトで低コストの水素生成装置を構築することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の微生物は、蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有し、蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステムの転写アクティベーター遺伝子が高発現され、さらに蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステムの形成抑制遺伝子が不活性化されていることにより、蟻酸から水素を生成させる機能が向上し、しかも乳酸生成経路が不活性化され、さらにコハク酸生成回路が不活性化されている。乳酸生成経路が不活性化されている微生物とは、好ましくは乳酸脱水素酵素遺伝子が不活性化されている微生物であり、さらにコハク酸生成回路が不活性化されている微生物とは、好ましくはフマル酸還元酵素遺伝子の一部が不活性化されている微生物である。このような微生物は、好気条件下での培養増殖後、嫌気条件下で培養することにより水素生成機能を獲得し、ついで蟻酸化合物の供給下に水素生成用溶液中で培養することにより、工業的に有利に水素を製造することができる。以下、本発明につき詳細に説明する。
【００１６】
なお上記「高発現」とは、目的遺伝子の発現量が増加されていることを意味し、目的遺伝子を２ケ以上有する場合や目的遺伝子が一つであってもプロモーターの改変等により発現量が増加されている場合等も含む。
「蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステムの形成抑制」とは、ピルビン酸由来の蟻酸から水素を生成する経路である蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステム（ＦＨＬシステム）の形成が阻害または抑制されることをいう。なお阻害または抑制には、一部阻害または抑制をも含む。
「不活性化」とは、目的遺伝子の発現が阻害または抑制されることをいう。該不活性化には、例えば、目的遺伝子が破壊等により欠失または欠損し、目的遺伝子の発現が認められない場合も含む。なお阻害または抑制には、一部阻害または抑制をも含む。
【００１７】
本発明の微生物の創製に用いられる微生物は、蟻酸脱水素酵素遺伝子（Ｆ．Ｚｉｏｎｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８６年、８３巻、ｐ．４６３０−４６５４）およびヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｒ．Ｂｏｅｈｍら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９０年、４巻、ｐ．２３１−２４３）を有する微生物である。これら宿主として使用される微生物は、嫌気性微生物が好ましい。嫌気性微生物としては、偏性嫌気性微生物よりも通性嫌気性微生物が好ましい。通性嫌気性微生物としては、例えばエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物―例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ９６３７、ＡＴＣＣ１１７７５、ＡＴＣＣ４１５７、ＡＴＣＣ２７３２５等）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属微生物―例えばクレブシェラ ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＡＴＣＣ１３８８３、ＡＴＣＣ８０４４等）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属微生物―例えばエンテロバクター アエロギネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ１３０４８、ＡＴＣＣ２９００７等）、エンテロバクター  クロアセ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）、偏性嫌気性微生物としては、例えばクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属微生物―例えばクロストリジウム ベイエリンキイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ  ＡＴＣＣ２５７５２、ＡＴＣＣ１７７９５等）、クロストリジウム  ブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム  アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）等が挙げられる。
【００１８】
これらの嫌気性微生物の嫌気条件による分裂増殖は好気条件によるそれと比較して極めて遅いことより、実用的な量を確保するために、嫌気性微生物は、好ましくは好気条件により培養される。この意味では嫌気性微生物の内、偏性嫌気性微生物より通性嫌気性微生物が好適に使用される。そのため、上記微生物の内ではエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エンテロバクター アエロギネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）等が好適に使用される。
【００１９】
本発明による蟻酸化合物から水素を生成させる機能は、蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステムの転写アクティベーター遺伝子（たとえば、ｆｈｌＡ遺伝子）を高発現すること、および、蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステムの形成を抑制する遺伝子（たとえば、ｈｙｃＡ遺伝子）を不活性化することにより向上する。
ｆｈｌＡ遺伝子を宿主である嫌気性微生物に導入する方法としては、例えばｆｈｌＡ遺伝子（ＤＮＡ）もしくは該ＤＮＡの上流にネイティブプロモータあるいはＴ７、ｌａｃ、ｔａｃ又はｔｒｃ等の外来プロモータ等を有したＤＮＡを、プラスミド又はコスミド等のベクターに挿入し、このベクターを宿主である微生物へ導入する方法等が挙げられる。前記ベクターは、必要によりリボソーム結合部位、開始コドン、終始コドン又はターミネーター等を含んでいてもよい。また、その他の方法としては、トランスポゾンにｆｈｌＡ遺伝子を挿入し、前記トランスポゾンを宿主の染色体上へ挿入する方法等が挙げられる。上記ＤＮＡとしては、該ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＦＨＬシステムの転写アクティベーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが含まれる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば前記ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍの塩化ナトリウム存在下、約６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍の濃度のＳＳＣ溶液を用い、約６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
【００２０】
上記ベクターとしては、好ましくはプラスミドが用いられる。プラスミドを用いることにより、上記嫌気性微生物において、より容易にｆｈｌＡ遺伝子を高発現し得る。用いるプラスミドの種類には特に制限はなく、例えばエシェリキア・コリ内で自律複製可能なプラスミドであればいずれも好ましく用いることができる。該プラスミドの好ましい具体的例としては、例えばｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ３９８、ｐＨＳＧ３９９（以上、タカラバイオ社製）、低コピープラスミドｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８（以上、ニッポンジーン社製）、ｔｒｃプロモータを有するｐＴｒｃ９９Ａ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）等が挙げられる。
【００２１】
前記ＤＮＡのベクター（プラスミド）への挿入は、自体公知の方法で行うことができるが、市販のライゲーションキット等を用いるのが簡便で好ましい。ライゲーションキットとしては、例えばＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ  １、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ  ２．１（タカラバイオ社製）、Ｆａｓｔ−Ｌｉｎｋ（登録商標）；  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＡＲ  ＢＲＯＷＮ  ＣＯ．，ＬＴＤ製）、Ｌｉｇａｔｉｏｎ−Ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｃｅ  Ｋｉｔ（ニッポンジーン社製）又はラピッドＤＮＡライゲーションキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）等が挙げられる。
【００２２】
上記のようにして得られるベクターを宿主である微生物に導入する方法は、自体公知の方法を用いることができる。該方法の好ましい具体例としては、例えば、コンピテント細胞を塩化カルシウムで処理する方法（Ｍａｎｄｅｌ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｉｇａ，Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５９（１９７０））や、細胞をプロトプラスト又はスフェロプラストの状態にして導入する方法（Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｏｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８，１１１（１９７９）；Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．  ａｎｄ  Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｏ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ，２７４，３９８（１９７８）；Ｈｉｎｎｅｎ，Ａ．，Ｈｉｃｋｓ，Ｊ．Ｂ．  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，Ｇ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８））、エレクトロポレーション法（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４３，１９７（１９９７））等が挙げられる。
【００２３】
ｆｈｌＡ遺伝子が導入された微生物は、例えば、Ｘ−ｇａｌによる青白コロニーや薬剤耐性マーカー（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の抗生物質耐性付与遺伝子等）等に従って、公知の選択方法により容易に選択することができる。
【００２４】
ＦＨＬシステムの形成を抑制する遺伝子、乳酸生成経路、およびコハク酸生成経路に関与する遺伝子が不活性化のターゲットとなる。これらの遺伝子としては、それぞれ例えばｈｙｃＡ遺伝子、乳酸脱水素酵素遺伝子ｌｄｈＡ、フマル酸還元酵素遺伝子ｆｒｄＡＢＣＤ等が挙げられる。ｈｙｃＡ遺伝子、乳酸脱水素酵素遺伝子ｌｄｈＡ、またはフマル酸還元酵素遺伝子ｆｒｄＡＢＣＤを不活性化する方法としては、例えば、変異原を用いた突然変異による非遺伝子工学的手法や、制限酵素・リガーゼなどを用い、任意に遺伝子配列の操作を行う遺伝子工学的手法が挙げられる。該遺伝子を確実に不活性化するためには、遺伝子工学的手法により不活性化することが好ましい。遺伝子工学的手法により該遺伝子を不活性化する方法としては、該遺伝子をあらかじめクローニングしておき、該遺伝子の特定部位に非遺伝子工学的手法もしくは遺伝子工学的手法により突然変異を起こす、あるいは遺伝子工学的手法により特定の長さの欠損部位を設ける、さらには薬剤耐性マーカーなどの外来性遺伝子を導入することにより、不活性化のためのＤＮＡを準備し、この変異遺伝子を含むＤＮＡを細胞へ戻し、相同組み換えを起こさせることにより該遺伝子を不活性化する方法が好ましく用いられる。
【００２５】
薬剤耐性マーカーを遺伝子内に導入し不活性化する場合、薬剤を含む培地にて目的とする株をスクリーニングすることにより薬剤耐性マーカーを導入した株を得ることができる。場合により薬剤耐性マーカーなどの外来遺伝子が周辺の遺伝子に影響を及ぼすことがあるが、その場合には、特定の長さの欠損部位を設けた遺伝子を導入することが望ましい。この場合は、スクリーニングを行う材料がないため、不活性化を行う遺伝子と同時に致死遺伝子を細胞内に導入し、相同組み換えを行う方法が用いられる。致死遺伝子としては、例えば、エシェリキア・コリ内ではバチルス・サブチリス由来のｓａｃＢ遺伝子が挙げられる。具体的には、不活性化を行う遺伝子には、特定長の欠損領域のあるＤＮＡとｓａｃＢを含むベクターを準備する。このベクターを宿主である微生物に導入し、相同組み換えを行う。相同組み換えを効率よく行うためには、温度感受性のベクターを用いることがより好ましい。温度感受性ベクターとしては、温度感受性レプリコンｐＳＣ１０１ｔｓをもつ、ｐＭＡ２、ｐＬＯＩ２２２６、ｐＴＨ１８ｋｓ１、ｐＴＨ１８ｋｓ５などが挙げられる。一度相同組み換えを行った宿主内には、不活性化された遺伝子と元来より存在する不活性化されていない遺伝子が存在する。次にこの相同組み換えを行った宿主を致死遺伝子が誘発される条件下で培養することにより、致死遺伝子領域と不活性化されていない遺伝子領域との二度目の相同組み換えがおこり、ＦＨＬシステムの形成を抑制する遺伝子であるｈｙｃＡ遺伝子または乳酸脱水素酵素遺伝子ｌｄｈＡまたはフマル酸還元酵素遺伝子ｆｒｄＡＢＣＤは不活性化され、目的とする組み換え株を得ることが可能となる。
【００２６】
また、遺伝子組み換えにより高発現もしくは不活性化する遺伝子は、ｆｈｌＡ遺伝子、ｈｙｃＡ遺伝子、ｌｄｈＡ遺伝子、ｆｒｄＡＢＣＤ遺伝子などを文献調査、もしくは公知の分子生物学的実験もしくはそれから派生する相同性検索等により特定した後、その配列を用いて遺伝子を選択して、上述の操作により高発現もしくは不活性化する。より詳しくは、例えばエシェリキア・コリ  Ｋ−１２  Ｗ３１１０株は既に全ゲノムＤＮＡ配列が解読されており、Ｗ３１１０株内に存在するｆｈｌＡ遺伝子、ｈｙｃＡ遺伝子、ｌｄｈＡ遺伝子、ｆｒｄＡＢＣＤ遺伝子の配列は、以下ＵＲＬに記載のデータベース
より検索を行うことにより、見出すことができる。ここで得られるＤＮＡ配列より、ｆｈｌＡ遺伝子、ｈｙｃＡ遺伝子、ｌｄｈＡ遺伝子、ｆｒｄＡＢＣＤ遺伝子を有した配列を増幅することが可能である。あるいは、ｆｈｌＡ、ｈｙｃＡ、ｌｄｈＡ、ｆｒｄＡＢＣＤと相同性の高い配列を、以下ＵＲＬに記載のデータベース
より検索し、この配列を用いて該当遺伝子を探索することができる。
このようにして、蟻酸化合物から水素を生成する機能が向上し、乳酸生成経路が不活性化、さらにはコハク酸生成経路に関与する遺伝子が不活性化されている微生物の創製が可能となる。
【００２７】
以下、上記の方法により得られた本発明の微生物に水素生成能力を獲得させる培養方法、およびその水素生成能力を有する微生物を用いた水素生成方法について示す。
本発明による水素生成方法は、微生物の嫌気培養増殖とともに水素生成を行う方法と微生物培養段階と嫌気条件下の水素生成段階とを分ける方法が挙げられるが、水素の生産性の観点から微生物培養段階と水素生成段階とを分ける方法が好ましい。
【００２８】
以下に微生物培養段階と水素生成段階とを分ける具体的な方法について記す。まず本発明の微生物は、好気条件下で培養される。この微生物培養段階においては、水素生成能力を有していない本発明の微生物が増殖する。
好気条件下で微生物を培養する段階においては、微生物は高濃度まで短時間で培養することができる。培養するための手段としては公知の方法が用いられる。培養は好気条件で、例えば、振盪培養、ジャーファーメンター（Ｊａｒ  Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）培養もしくはタンク培養等の液体培養、又は固体培養等が挙げられる。培養温度は、微生物が生育可能な範囲で適宜変更できるが、通常約１５〜４０℃、好ましくは約３０〜４０℃である。培地のｐＨ値は約６〜８の範囲が好ましい。培養時間は、培養条件によって異なるが通常約０．５〜５日が好ましい。
【００２９】
次に、上記の方法で得られる水素生成能力を有していない微生物に水素生成能力を誘導発現する（即ち、水素生成能力を付与する）方法について示す。
水素生成能力を有していない微生物の水素生成能力を有する微生物への変換（水素生成能力の誘導発現）は、好ましくは嫌気条件下で培養することにより行われる。嫌気条件下での培養は、培地中の各種構成成分の拡散を促進するために撹拌培養が好ましい。嫌気条件下での攪拌培養開始時の微生物濃度は、約０．０１〜８０質量％（湿潤状態菌体質量基準）が好ましい。この際、微生物が水素生成能力を獲得するために、嫌気条件下での攪拌培養中に微生物が分裂増殖することが好ましいが、分裂増殖することは必ずしも必要ではなく、分裂増殖しない場合においても、ＦＨＬシステムの機能の発現が誘導されれば良い。上記方法によって微生物に、例えば、４００ｍｌ以上／ｈ／ｇ ｗｅｔ ｃｅｌｌ、好ましくは４２０ｍｌ以上／ｈ／ｇ ｗｅｔ ｃｅｌｌの水素生成機能が付与される。
【００３０】
嫌気条件下において、培養液中の酸化還元電位は、−１００〜−５００ｍＶ程度、さらに好ましくは−２００〜−５００ｍＶ程度である。培地の嫌気状態を調整する方法としては、培地中の溶存酸素を除去する方法であれば、いずれも好ましく用いることができ、例えば培地の加熱処理や減圧処理あるいは培地中への窒素ガス等のバブリング等により溶存ガスを除去する方法があげられる。培養液中の溶存ガス、特に溶存酸素の除去を行う具体的な方法として、好ましくは約１３．３３×１０２Ｐａ以下、より好ましくは約６．６７×１０２Ｐａ以下、さらに好ましくは約４．００×１０２Ｐａ以下の減圧下で、好ましくは約１〜６０分間、より好ましくは約５〜６０分間、脱気処理する方法が挙げられ、該方法により、嫌気条件の培養液を得ることができる。また、必要に応じて還元剤を水溶液に添加して嫌気条件で用いる水溶液を調整することができる。用いる還元剤としては、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオン、または硫化ソーダ等が挙げられる。これらの還元剤は一種、あるいは数種類を組み合わせて用いることも可能である。
【００３１】
本発明の微生物に嫌気条件下で水素生成能力を付与するための培養は、炭素源、窒素源、ミネラル源等を含む通常の栄養培地を用いて行うことができる。炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ラクトース、スクロース、セルロース、リボース、リビトール、アラビトール、ラムノース、フコース、廃糖蜜、グリセロール等が挙げられる。窒素源としては、無機態窒素源では、例えばアンモニア、アンモニウム塩、硝酸塩等、または有機態窒素源では、例えば尿素、アミノ酸類、タンパク質等が挙げられる。これらはそれぞれ単独もしくは混合して用いることができる。無機態、有機態ともに同様に利用することが可能である。またミネラル源として、おもにＫ、Ｐ、Ｍｇ、Ｓなどを含む化合物、例えばリン酸一水素カリウム、硫酸マグネシウム等を好適に用いることができる。この他にも必要に応じて、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸、ビオチン、チアミン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することもできる。また、培地は蟻酸脱水素酵素およびヒドロゲナーゼからなるＦＨＬシステムにおける水素生成のために、微量金属成分を含むことが好ましい。必要な微量金属成分は培養する微生物種により異なるが、鉄、モリブデン、セレン又はニッケル等が挙げられる。なお、これらの微量金属成分は酵母エキス等の天然栄養源には相当程度含まれている。そのため、天然栄養源を含む培地においては、必ずしも微量金属成分の添加を必要とはしない。
【００３２】
嫌気条件下で水素生成能力を誘導発現するための培養には、上記の炭素源が必要であるが、微生物の体内へ取り込む速度の遅い炭素源を用いることが好ましい。これらの炭素源としては、ラクトース、ガラクトース、アラビノース、キシロース、リボース、リビトール、アラビトール、ラムノース、フコースなどが挙げられる。
誘導発現培養の微生物濃度に関しては、高濃度の微生物を嫌気条件下にて培養することが、より効果的に水素生成能力を付与することができるために好ましい。微生物の濃度としては、好ましくは約１〜５０％（Ｗ/Ｖ）が用いられる。特に微生物あたりの水素生成能力を高めるためには、約１〜３０％（Ｗ/Ｖ）の範囲で、嫌気条件下で培養を行うことがさらに好ましい。
【００３３】
嫌気条件下での攪拌培養の条件として、温度域は、好ましくは約２０〜４５℃、より好ましくは約２５〜４０℃である。ｐＨ域は、好ましくは約４．０〜１０．０の範囲、より好ましくは約５．０〜８．０の範囲である。同時にｐＨ値を制御することが好ましく、酸、アルカリを用いてｐＨ値の調整を行うことも可能である。温度域、ｐＨ域ともに、上記の範囲内が微生物にとって最適な温度域、ｐＨ域である。通常、培養開始時の炭素源濃度は好ましくは約０．１〜２０％（Ｗ/Ｖ）、さらに好ましくは１〜５％（Ｗ／Ｖ）である。
【００３４】
本発明の蟻酸脱水素酵素遺伝子およびヒドロゲナーゼ遺伝子を有し、蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステムの転写アクティベーター遺伝子が高発現され、さらに蟻酸ヒドロゲンリアーゼシステムの形成抑制遺伝子が不活性化され、かつ乳酸生成経路が不活性化された微生物は、乳酸生成経路が不活性化されていない微生物よりもより高い水素生成能力のある微生物に形質転換されているので、効率的に水素生成のための触媒となりうる。さらにコハク酸生成経路を不活性化することにより、さらに高い水素生成能力のある微生物が得られるので、これを用いれば、一層水素を生成することができる。
【００３５】
本発明の微生物に付与される水素生成能力の向上は、組換え技術により創製された本発明の微生物への水素生成能力の誘導発現が効率的に行われるためと考えられる。
上記誘導発現する時に使用される上記炭素源に基づく炭素の流れが、本発明の微生物では乳酸およびコハク酸に関する代謝経路の組換えにより、ピルビン酸から蟻酸への経路に集約されることになり、乳酸およびコハク酸に関する代謝経路が改変されていない微生物に比べて、本発明の微生物は、誘導発現培養時に蟻酸からの水素生成に関するＦＨＬシステムの機能がより高度に発揮できる状態を獲得できると考えられる。
【００３６】
さらに本発明の水素生成の基質である蟻酸化合物の代わりに、グルコース等の有機性基質を使用し誘導発現培養を行った場合には、殆ど水素生成能力は向上しない現象が認められる。この現象は、誘導発現培養を行えば、本発明のＦＨＬシステム機能の向上は等しく獲得されてはいるが、グルコース等の有機性基質の水素生成に至る代謝経路反応の律速段階が蟻酸から水素生成工程ではなく、グルコースから蟻酸に至る何れかの代謝経路にあるとすれば理解できることである。（図４参照）またＦＨＬシステムの誘導発現を含むタンパク質の合成には、培地中に存在する乳酸が阻害的に働くことが認められていることから、誘導発現培養時に蓄積する乳酸の生成を抑えることによりＦＨＬシステムの誘導発現が効果的に起こると理解される。  
【００３７】
次にこのようにして得られる水素生成能力を獲得した微生物を用いた水素生成方法について示す。
上述の水素生成能力を誘導発現するための培養終了後、培地中にある水素生成能力が誘導発現された微生物をそのまま用いることもできるし、一度微生物を分離した後に、還元状態（嫌気条件下）にある水素発生溶液に分離した微生物を加えて使用することもできる。いずれの場合であっても、培地又は水素生成溶液に蟻酸化合物を供給することにより、微生物に水素を生成させることができる。水素生成反応は一定のｐＨ値で行うことにより安定して実施できるので、反応液には緩衝作用をもつ成分を添加することが好ましい。用いる緩衝剤としては、好ましくはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、炭酸緩衝液などの酸緩衝液や、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳ、ＣＡＰＳなどのＧｏｏｄの緩衝試薬などが挙げられる。反応のｐＨ値により緩衝試薬の濃度、緩衝試薬の種類は適宜調整することが可能である。
【００３８】
水素を生成させる方法としては、微生物を添加した水素生成溶液に連続的にあるいは間欠的に蟻酸化合物を供給することで実施される。
蟻酸化合物は、ホルミルオキシ碁（化学構造式ＨＣＯＯ−）を有する物質である。具体的には、例えば、蟻酸、蟻酸ナトリウム、蟻酸カリウム、蟻酸カルシウム、蟻酸マンガン、蟻酸ニッケル、蟻酸セシウム、蟻酸バリウム、蟻酸アンモニウム等が挙げられる。それらの中でも、水に対する溶解度の面から蟻酸、蟻酸ナトリウム、蟻酸カリウム、蟻酸カルシウム、および蟻酸アンモニウムが好ましく、さらに、コストの面から蟻酸、蟻酸ナトリウムおよび蟻酸アンモニウムが好ましい。
【００３９】
水素生成溶液へ添加する蟻酸化合物として蟻酸を用いた場合に、その濃度は、好ましくは約３０〜１００％（Ｗ／Ｗ）、さらに好ましくは５０〜１００％（ｗ/ｗ）である。蟻酸化合物の濃度が低い場合、蟻酸化合物の供給に伴い、水素生成溶液の体積が増加するために、反応液中の微生物濃度も変化し、反応制御が容易でなくなることから好ましくない。蟻酸化合物の供給速度としては、水素生成溶液のｐＨ値が約４．０〜９．０の範囲で制御される範囲であれば、特に制限はない。
水素の生成反応の反応温度は、一般的な常温微生物が宿主である場合、好ましくは約２０〜４５℃、さらに好ましくは約３０〜４０℃の範囲である。
【００４０】
水素生成溶液としては、還元状態下（嫌気条件下）の水素生成溶液を用いる必要がある。水素生成溶液の酸化還元電位は、好ましくは約−１００〜−５００ｍＶ、さらに好ましくは約−２００〜−５００ｍＶである。
【００４１】
水素生成溶液の微生物濃度は、好ましくは約０．１〜８０％（Ｗ/Ｗ）（湿潤状態菌体質量基準）である。水素生成溶液の粘性が高くなるという観点から、微生物濃度は、好ましくは約０．１〜７０％（Ｗ／Ｗ）（湿潤状態菌体質量基準）が用いられる。
【００４２】
水素生成溶液には、気体の発生が激しいため、消泡剤を加えることが好ましい。消泡剤については、公知なものが用いられ、具体的には例えばシリコーン系［例えば、ＳＩ（Ｓｉｌｉｃｏｎｅ）（和光純薬工業社製）等］、又はポリエーテル系［例えばＰＥ−Ｈ（Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ−Ｈｉｇｈ）、ＰＥ−Ｍ（Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ−Ｍｅｄｉｕｍ）、ＰＥ−Ｌ（Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ−Ｌｏｗ）（いずれも和光純薬工業社製）等］の消泡剤が好ましく用いられる。
微生物、蟻酸化合物及び消泡剤は、自体公知の方法に従って、水素生成溶液に供給することができる。
【００４３】
このようにして得られる微生物を使用して製造される水素は燃料電池用の燃料源として使用することができる。以下、本発明の水素生成方法を用いた燃料電池システムについて示す。
本発明の水素生成方法においては、主に水素と二酸化炭素からなるガスが生成され、基本的には一酸化炭素は生成されない。一般的に固体高分子型燃料電池の燃料として用いる場合には、一酸化炭素を除去するシステム（ＣＯ変成器、ＣＯ除去器等）を用いて、ＣＯは１０ｐｐｍ以下に維持する必要がある。本発明の創製微生物を用いた水素生成方法ではＣＯを除去する改質器の設置が不要となり、装置を簡易化できる。また燃料電池の寿命の面からも、本発明に係る水素生成方法により製造されるガスを用いることが好ましい。
【００４４】
また、従来の都市ガスを用いた水素生成装置の改質方法では、６００℃以上の改質温度が必要となり、メタノールを用いた改質方法でも数百℃の改質温度が必要となるのに対して、本発明の反応容器の温度はほぼ常温で用いることが可能である。さらに、改質器の立ち上げおよび終了過程には昇温や冷却の時間を要するが、本発明の方法では、常温で水素の生成ができるので、そのような時間が不要となり、簡便な燃料電池システムが構築できる。
本発明の水素生成方法を用いた燃料電池システムは、ＣＯが発生しないため、燃料電池の劣化に対しても問題が少ないこと、水素の供給方法としても、高温の必要な改質器のシステムを必要としないこと、蟻酸化合物の供給と同時に水素生成可能であることなど、多くの点で優れている。
【実施例】
【００４５】
以下参考例、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
［参考例１］  エシェリキア・コリＷ３１１０株のＦＨＬシステム転写アクティベーター遺伝子ｆｈｌＡ高発現かつＦＨＬシステム生成に関する抑制遺伝子ｈｙｃＡ破壊（不活性化）株の作成
１）ゲノムＤＮＡの抽出
エシェリキア・コリＷ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７３２５）を、表１記載のＬＢ培地１０  ｍｌで３７℃一晩振盪培養行い、ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にてゲノムＤＮＡの抽出を行った。
【００４６】
【表１】
0004827547.tif 000002
【００４７】
２）ｈｙｃＡ破壊株作製用ベクターの作成
上記１）にて取得したゲノムDNAから、プライマー
CTCTGGATCCATTTCATCTTCGGGCGTGC   （配列番号１）
CTCTGAGCTCAAAGGTCACATTTGACGGCG  （配列番号２）  
を用い、サーマルサイクラー  ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ＡＢＩ社製）を使用してｈｙｃＡ領域を増幅した。増幅したＤＮＡおよびプラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造（株）製）をＢａｍＨＩ、及びＳａｃＩで制限酵素処理後、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ  ｖｅｒ  ２．１（宝酒造（株）製）によりライゲーションを行い、ベクター ｈｙｃＡ−ｐＨＳＧ３９８を得た。さらに、得られたベクターをＡｖａＩＩ、及びＸｍｎＩで制限酵素処理後、ＤＮＡ  Ｂｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（宝酒造（株）製）により平滑末端処理を行い、その後、８ｂｐのＥｃｏＲＩリンカーGGAATTCCと共にライゲーションし、△ｈｙｃＡ−ｐＨＳＧ３９８を得た。
【００４８】
またｐＭＶ５  （Ｖｅｒｔｅｓ, Ａ. Ａ. ｅｔ ａｌ. Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＳ３１８３１, ａ ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｆｒｏｍ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ. Ｍｏｌ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. １１, ７３９−７４６  （１９９４））からＰＣＲを用いて、プライマー
CTCTGCATGCAACCCATCACATATACCTGC  （配列番号３）
CTCTGCATGCATCGATCCTCTAGAGTATCG  （配列番号４）  
を用いて、ｓａｃＢ領域を増幅したものおよびプラスミドｐＴＨ１８ｋｓ１（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ, Ｔ. ｅｔ ａｌ. Ａ ｓｅｔ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ−ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ／−ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ ａｎｄ ｉｎ ａｎ ｉｓｏｇｅｎｉｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ （ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ, ｋａｎａｍｙｃｉｎ, ｌａｃＺ, ｒｅｐＡ, ｐａｒ, ｐｏｌＡ）. Ｇｅｎｅ ２４１, １８５−１９１  （２０００））をＢａｍＨＩ、及びＳｐｈＩで制限酵素処理後、ライゲーションにより、ベクターｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１を得た。
得られたベクターｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１のＢａｍＨＩサイトとＳａｃＩサイトの間に△ｈｙｃＡ−ｐＨＳＧ３９８の△ｈｙｃＡ領域を挿入し、△ｈｙｃＡ−ｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１を得た。  
【００４９】
３）ベクターの導入およびｈｙｃＡ破壊株の作製
上記の方法により得られたベクター△ｈｙｃＡ−ｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１をＷ３１１０株にエレクトロポレーション法により導入した。下表２記載の培地にて４３℃培養することで、相同組み換えが起こり、ベクターが染色体上に挿入された組み換え株を得た。
【００５０】
【表２】
0004827547.tif 000003
【００５１】
さらに、上記の培地で得られた株から表３で示す培地にて３０℃で培養することにより、Ｗ３１１０株のＦＨＬシステムの生成に関する抑制遺伝子ｈｙｃＡの破壊株を得た。
【００５２】
【表３】
0004827547.tif 000004
【００５３】
４）ｈｙｃＡ破壊株の分子生物学的確認
上記の方法により得られたＷ３１１０株のＦＨＬシステム生成に関する抑制遺伝子ｈｙｃＡの破壊株はシーケンサーＰｒｉｓｍ ３１００ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢI社製）により、ｈｙｃＡ領域の削除された株であることを確認した。
【００５４】
５）ｆｈｌＡ高発現用ベクターの作製
上記１）にて取得したゲノムDNAから、プライマー
GGGGTACCTAAAATTCTAAATCTCCTATATGTTAG  （配列番号５）
CGGGATCCTGCGTCATCTCATCGATGACAA       （配列番号６）
を用い、サーマルサイクラー ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（ＡＢＩ社製）を使用してｆｈｌＡおよびその上流のプロモータ領域を増幅した。増幅したＤＮＡおよびプラスミドｐＭＷ１１８（ニッポンジーン社製）をＫｐｎＩ、及びＢａｍＨＩにて制限酵素処理後、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖｅｒ ２．１（宝酒造（株）製）によりライゲーションを行い、ベクター ｆｈｌＡ−ｐＭＷ１１８を得た。
【００５５】
６）ベクターの導入およびｈｙｃＡ破壊かつｆｈｌＡ高発現株の作製
上記２）で得られたベクター ｆｈｌＡ−ｐＭＷ１１８をｈｙｃＡ破壊株にエレクトロポレーション法により導入し、表１の培地にて目的とするｈｙｃＡ破壊かつｆｈｌＡ高発現株のコロニーを取得した。
【００５６】
７）ｆｈｌＡ高発現の分子生物学的確認
上記の方法により得られたＦＨＬシステム生成に関する抑制酵素遺伝子ｈｙｃＡ破壊かつＦＨＬシステムの転写アクティベーターｆｈｌＡ高発現株のｆｈｌＡの高発現の評価はリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により行った。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法は以下に記す方法に従った。まず、ｆｈｌＡの高発現株および野生株を表１記載の培地にグルコース２０  ｍＭ（さらにｆｈｌＡ高発現株についてはアンピシリン５０  ｍｇ／Ｌ）を添加し、１０時間嫌気培養した菌体から、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にてトータルＲＮＡを抽出した。トータルＲＮＡ、下記ｆｈｌＡのプライマー、
Fwd  ：  AGATCGTTTCTGTCGTCACCG  （配列番号７）
Rev  ：  CCGGCATAACAACTCATAGTCG （配列番号８）
およびＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＴ−ＰＣＲ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、表４の混合液を作成し、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７０００ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ社製）によって、５０℃  ３０分で逆転写、９５℃  １５分で熱変性を行った後、９５℃  １５秒、５７℃  ２０秒、６０℃  １分の条件で４０サイクルの熱サイクルでＤＮＡを合成し、各サイクルでの蛍光強度を検出することにより、ＤＮＡの増幅曲線から算出されるＣＴ値の差よりｆｈｌＡの発現差を調べた。その結果、ｈｙｃＡ破壊かつｆｈｌＡ高発現の株は、野生株に比べｆｈｌＡについて５倍以上の発現量があることが確かめられた。
【００５７】
【表４】
0004827547.tif 000005
【００５８】
上記の如くして、本参考例により形質転換されたＷ３１１０株はＷ３１１０ △ｈｙｃＡ／ｆｈｌＡ−ｐＭＷ１１８と命名し（以下、ＳＲ１３株と示す。）、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０２９１  受託日  平成１６年１１月９日）。
【００５９】
［実施例１］エシェリキア・コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３２５）のｆｈｌＡ遺伝子高発現かつｈｙｃＡ遺伝子破壊株における、さらに乳酸脱水素酵素遺伝子ｌｄｈＡを不活性化した株の作成
１）ゲノムＤＮＡの抽出
エシェリキア・コリＷ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７３２５）を、表１で示される組成のＬＢ培地１０ｍＬにて、好気条件下、３７℃で一晩振盪培養を行い、ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にてゲノムＤＮＡの抽出を行った。
【００６０】
２）乳酸脱水素酵素遺伝子ｌｄｈＡ破壊株作製用ベクターの作成
上記１）にて取得したゲノムＤＮＡから、下記プライマー：
CCTGTTTCGCTTCACCGGTCAG  （配列番号９）
TCTTTGGTTCTGTCCAGTACCG  （配列番号１０）  
を用い、サーマルサイクラー  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ＡＢＩ社製）を使用してｌｄｈＡ領域を増幅した。増幅したＤＮＡ及びプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）をＢａｍＨＩ、及びＰｓｔＩで制限酵素処理後、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ  ２．１（宝酒造（株）社製）によりライゲーションを行い、ベクター  ｌｄｈＡ−ｐＴｒｃ９９Ａを得た。このベクターを鋳型とし、下記プライマー：
GGACTAGTCTGGCGTTCGATCCGTATCC    （配列番号１１）  
GCTCTAGACCAAAACCTTTCAGAATGCGCA  （配列番号１２）  
を用い、ｌｄｈＡの一部欠落した箇所を増幅した。
これとは別に、プラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造（株）社製）を鋳型とし、下記プライマー：
GCTCTAGAACGGAAGATCACTTCGCAGAAT  （配列番号１３）
GGACTAGTTTAAGGGCACCAATAACTGCCT  （配列番号１４）  
を用い、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）領域を増幅した。
増幅した２つのＤＮＡ断片（ｌｄｈＡの一部欠落したＤＮＡ、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子領域）をそれぞれ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩで制限酵素処理後、両ＤＮＡ断片をＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ  ２．１（宝酒造（株）社製）によりライゲーションを行い、ｌｄｈＡの欠落した箇所にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入されたベクター  ΔｌｄｈＡ（ＣｍＲ）−ｐＴｒｃ９９Ａを得た。
【００６１】
さらに、このようにして得られたベクターをＢａｍＨＩ、及びＰｓｔＩで切断することにより、ΔｌｄｈＡ（ＣｍＲ）領域のＤＮＡを得た。
ベクターｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１のＢａｍＨＩサイトとＰｓｔＩサイトの間にΔｌｄｈＡ（ＣｍＲ）領域のＤＮＡを挿入し、ΔｌｄｈＡ（ＣｍＲ）−ｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１を得た。
このベクターの構造図を図１に示す。
【００６２】
３）ベクターの導入及び乳酸脱水素酵素遺伝子ｌｄｈＡ不活性化株の作成
上記の方法により得られたベクターΔｌｄｈＡ（ＣｍＲ）−ｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１をエシェリキア・コリ  ＳＲ１３株にエレクトロポレーション法により導入した。下表５記載の培地にて４３℃にて培養することで、相同組み換えが起こり、ベクターがエシェリキア・コリ  ＳＲ１３株の染色体上に挿入された組み換え株を得た。
【００６３】
【表５】
0004827547.tif 000006
【００６４】
上記表５記載の培地で培養後、さらに、得られた株を表６で示す培地にて３０℃でプレート培養することにより、エシェリキア・コリ  ＳＲ１３株のｌｄｈＡ遺伝子の破壊株を得た。
上記の如くして、本実施例により形質転換された株はエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＳＲ１３  ΔｌｄｈＡと命名し、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７７３  受託日  平成１８年１月２７日）。
【００６５】
【表６】
0004827547.tif 000007
【００６６】
４）乳酸脱水素酵素遺伝子ｌｄｈＡを不活性化した株の分子生物学的確認
上記の方法により得られたエシェリキア・コリ  ＳＲ１３株のｌｄｈＡを不活性化した株はシーケンサー  Ｐｒｉｓｍ  ３１００  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ社製）により、ｌｄｈＡ領域にクロラムフェニコール耐性遺伝子が挿入され、ｌｄｈＡが不活性化された状態であることを確認した。
【００６７】
［実施例２］エシェリキア・コリＷ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３２５）のｆｈｌＡ遺伝子高発現かつｈｙｃＡ遺伝子破壊株かつ乳酸脱水素酵素遺伝子ｌｄｈＡを不活性化、さらにフマル酸還元酵素遺伝子ｆｒｄＡＢＣＤを不活性化した株の作成
１）フマル酸還元酵素遺伝子ｆｒｄＡＢＣＤ破壊株作製用ベクターの作成
Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡから、下記プライマー：
GCGAGCTCGTGCAAACCTTTCAAGCCGA  （配列番号１５）
CGGGATCCGACACCAATCAGCGTGACAA  （配列番号１６）
を用い、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（ＡＢＩ社製）を使用してｆｒｄＡＢＣＤ領域を増幅した。増幅したＤＮＡおよびプラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造（株）製）をＢａｍＨＩ、及びＳａｃＩで制限酵素処理後、ＤＮＡ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ  ２．１（宝酒造（株）製）によりライゲーションを行い、ベクター ｆｒｄＡＢＣＤ-ｐＨＳＧ３９８を得た。さらに、得られたベクターを鋳型に、プライマー
CCGCTCGAGCTGAACCCAGAGTTCATCGG  （配列番号１７）
CCGCTCGAGAACGTACGCTTTCGCCAGTT  （配列番号１８）
を用いてインバースＰＣＲ後、ＸｈｏＩで処理し、ｐＵＣ４Ｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を鋳型にプライマー
CCGCTCGAGGAAGATGCGTGATCTGATCCT  （配列番号１９）
CCGCTCGAGGCCACGTTGTGTCTCAAAATC  （配列番号２０）
を用いて増幅したカナマイシンカセットを挿入し、ΔｆｒｄＢＣ−ｐＨＳＧ３９８を得た。
【００６８】
ベクターｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１のＢａｍＨＩサイトとＳａｃＩサイトの間にΔｆｒｄＢＣ−ｐＨＳＧ３９８のΔｆｒｄＢＣ領域を挿入し、ΔｆｒｄＢＣ−ｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１を得た。ベクター構築図を図２に示す。
【００６９】
２）ベクターの導入およびｆｒｄＢＣ破壊株の作製
上記１）の方法により得られたベクターΔｆｒｄＢＣ−ｓａｃＢ−ｐＴＨ１８ｋｓ１を実施例１で得られたｆｈｌＡ高発現・ｈｙｃＡ破壊・ｌｄｈＡ破壊株にエレクトロポレーション法により導入した。表５記載の培地にて４３℃培養することで、相同組み換えが起こり、ベクターが染色体上に挿入された組み換え株を得た。
さらに、上記で得られた株から表７で示す培地にて３０℃で培養することにより、ＳＲ１３株の乳酸脱水素酵素遺伝子ｌｄｈＡおよびフマル酸還元酵素遺伝子ｆｒｄＢＣの破壊株を得た。
【００７０】
【表７】
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【００７１】
３）フマル酸還元酵素遺伝子ｆｒｄＢＣ破壊株の分子生物学的確認
上記の方法により得られたフマル酸還元酵素遺伝子ｆｒｄＢＣの破壊株はシーケンサーＰｒｉｓｍ  ３１００  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＡＢＩ社製）により、ｆｒｄＢＣの不活性化された株であることを確認した。
上記の如くして、本実施例により形質転換された株はエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＳＲ１３  ΔｌｄｈＡ  ΔｆｒｄＢＣと命名し、独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに寄託されている（受託番号：ＦＥＲＭ  Ｐ−２０７７４  受託日  平成１８年１月２７日）。
【００７２】
［実施例３］実施例１により得られたエシェリキア・コリ株(ｆｈｌA遺伝子高発現かつｈｙｃＡ遺伝子破壊かつ乳酸脱水素酵素遺伝子ｌｄｈＡ破壊株)を用いた水素生成方法
１）好気条件下での培養
実施例１により得られたエシェリキア・コリ株(ｆｈｌA遺伝子高発現かつｈｙｃＡ遺伝子破壊かつ乳酸脱水素酵素遺伝子破壊株)を下表８で示される組成の培養液  １０ｍＬに加え、好気条件下、３７℃で一晩振盪培養を行った。
一晩振盪培養した培養液５ｍＬを、表８記載の培地５００ｍＬへ植菌し、１Ｌ容ジャーファーメンター（ＡＢＬＥ−ＢＩＯＴ社製）にて好気培養を行った。この際、ｐＨ＝６．５（５Ｎ  ＮａＯＨにて調整）、３７℃、通気速度＝１Ｌ／ｍｉｎ．で１２時間培養を行った。これにより約２５ｇ（湿重量）の菌体が得られた。
【００７３】
【表８】
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【００７４】
２）嫌気条件下での培養
好気条件下で培養を行った培養液を遠心分離機にかけ（６５００回転、２０分）、上澄み液を除去し、水素生成能力を有する微生物を得るために、表８で示される組成の培養液２００ｍＬにて嫌気条件下３７℃で８時間の培養を行った。
このとき、微生物濃度を１０％（湿潤状態微生物質量基準）に設定して懸濁し、嫌気条件下での培養を開始した。嫌気条件下での培養は窒素９５％、水素５％雰囲気の嫌気チャンバーシステム（Ｃｏｙ社製）内で行った。なお、ｐＨは６．０を保つように適時５Ｍ水酸化ナトリウムの添加を行った。
嫌気培養を１２時間行った後、培養液の遠心分離を行い、菌体を回収した。
得られた菌体を、下記表９に記載の組成で示される水素生成用溶液５０ｍＬに菌体密度が０．２％（湿潤状態菌体質量基準）になるように懸濁した。
【００７５】
【表９】
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【００７６】
このように作成した菌体を懸濁した水素生成溶液に、溶液の蟻酸ナトリウム濃度が１００ｍＭとなるように蟻酸ナトリウムを添加し、微生物の水素生成能力を測定した。
水素生成能力の測定方法としては、蟻酸ナトリウムを滴下した直後に、生成するガスを水上置換法により集める方法により測定を行った。
今回、蟻酸ナトリウムの添加から５分間に発生するガス量より、水素生成初速度を求めた。なお、生成ガスをガスクロマトグラフィー（島津製作所社製）により分析したところ、生成ガス中には５０容積％の水素と残余のガス（炭酸ガス）を含んでいた。
【００７７】
［実施例４］実施例２により得られたエシェリキア・コリ株(ｆｈｌA遺伝子高発現かつｈｙｃＡ遺伝子破壊かつ乳酸脱水素酵素遺伝子ｌｄｈＡ破壊およびフマル酸還元酵素遺伝子ｆｒｄＡＢＣＤ破壊株)を用いた水素生成方法
実施例２で得られた株  エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）  ＳＲ１３  ΔｌｄｈＡ  ΔｆｒｄＢＣを用いる以外は、実施例３と同様の方法で、好気条件下での培養、嫌気条件下での培養を行い、水素生成初速度の測定を行った。
【００７８】
［比較例１］乳酸脱水素酵素を不活性化していない株として、エシェリキア・コリ  Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７３２５）を用いた水素生成菌体の培養方法および水素生成反応
野生株のエシェリキア・コリ  Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ  ２７３２５）を用いる以外は、実施例３と同様の方法で、好気条件下での培養、嫌気条件下での培養を行い、水素生成初速度の測定を行った。
【００７９】
［比較例２］乳酸脱水素酵素を不活性化していない株として、エシェリキア・コリ  ＳＲ１３株を用いた水素生成菌体の培養方法および水素生成反応
エシェリキア・コリ  ＳＲ１３株を用いる以外は、実施例３と同様の方法で、好気条件下での培養、嫌気条件下での培養を行い、水素生成初速度の測定を行った。
【００８０】
図３に、実施例３、４と比較例１、２において、水素生成初速度を測定した結果を示す。図３より、本発明による乳酸脱水素酵素遺伝子を不活性化した株（実施例３）および、さらにフマル酸還元酵素遺伝子を不活性化した株（実施例４）は、対照株（比較例１、２）と比較して、水素生成能力が向上していることが明確である。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明の微生物は、微生物燃料電池等に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】実施例１のベクターの構造を示す図である。
【図２】実施例２のベクターの構造を示す図である。
【図３】実施例１および比較例１、２で得られた水素生成能力を示す図である。
【図４】グルコースから水素までの代謝経路を示す図である。
【図３】
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【図４】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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