(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫仲介不全症治療用医薬組成物生産のための免疫レギュレータの使用であって、ゲル透過クロマトグラフィーにおいて求められる、１キロダールトンより少ない見かけの分子量をもって溶離され、Ｔ細胞に影響を与えてＴｈ１細胞レベルをダウンレギュレートするおよび／またはＴｈ２細胞レベルをアップレギュレートすることによってＴｈ１／Ｔｈ２バランスを調節することができる、妊娠している哺乳動物の尿から得られる免疫レギュレータの使用。
【請求項２】
前記妊娠している哺乳動物の尿が妊娠初期の尿であることを特徴とする請求項１に記載の免疫レギュレータの使用。
【請求項３】
前記哺乳動物はヒトであることを特徴とする請求項２に記載の免疫レギュレータの使用。
【請求項４】
免疫仲介不全症治療用医薬組成物生産のための免疫レギュレータの使用であって、ゲル透過クロマトグラフィーにおいて求められる、１キロダールトンより少ない見かけの分子量をもって溶離される、妊娠している哺乳動物の尿から得られる免疫レギュレータであって、免疫調節効果を有する哺乳動物の絨毛性ゴナドトロピン製剤から得られる活性成分を含み、前記活性成分は非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスから得られる脾臓細胞を刺激することができ、前記活性成分が非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスから得られる脾臓細胞のγ‐インターフェロン産生を阻害することができることを特徴とする免疫レギュレータの使用。
【請求項５】
免疫仲介不全症治療用医薬組成物生産のための免疫レギュレータの使用であって、ゲル透過クロマトグラフィーにおいて求められる、１キロダールトンより少ない見かけの分子量をもって溶離される、妊娠している哺乳動物の尿から得られる免疫レギュレータであって、免疫調節効果を有する哺乳動物の絨毛性ゴナドトロピン製剤から得られる活性成分を含み、前記活性成分は非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスから得られる脾臓細胞を刺激することができ、前記成分が非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスから得られる脾臓細胞のインターロイキン−４産生を刺激することができることを特徴とする免疫レギュレータの使用。
【請求項６】
前記成分が非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスから得られる脾臓細胞のインターロイキン−４産生を刺激することができることを特徴とする請求項４に記載の免疫レギュレータの使用。
【請求項７】
免疫仲介不全症治療用医薬組成物生産のための免疫レギュレータの使用であって、ゲル透過クロマトグラフィーにおいて求められる、１キロダールトンより少ない見かけの分子量をもって溶離される、妊娠している哺乳動物の尿から得られる免疫レギュレータであって、免疫調節効果を有する哺乳動物の絨毛性ゴナドトロピン製剤から得られる活性成分を含み、前記活性成分は非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスから得られる脾臓細胞を刺激することができ、前記活性成分は臓器不全の後または臓器不全の間にＡＳＡＴ血漿値を減少することができることを特徴とする免疫レギュレータの使用。
【請求項８】
前記活性成分は臓器不全の後または臓器不全の間にＡＳＡＴ血漿値を減少することができることを特徴とする請求項４〜６のいずれか１項に記載の免疫レギュレータの使用。
【請求項９】
免疫仲介不全症治療用医薬組成物生産のための免疫レギュレータの使用であって、ゲル透過クロマトグラフィーにおいて求められる、１キロダールトンより少ない見かけの分子量をもって溶離される、妊娠している哺乳動物の尿から得られる免疫レギュレータであって、免疫調節効果を有する哺乳動物の絨毛性ゴナドトロピン製剤から得られる活性成分を含み、前記活性成分はリポ多糖誘導敗血症ショックに対してマウスを保護することができ、前記活性成分が非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスから得られる脾臓細胞のγ‐インターフェロン産生を阻害することができることを特徴とする免疫レギュレータの使用。
【請求項１０】
免疫仲介不全症治療用医薬組成物生産のための免疫レギュレータの使用であって、ゲル透過クロマトグラフィーにおいて求められる、１キロダールトンより少ない見かけの分子量をもって溶離される、妊娠している哺乳動物の尿から得られる免疫レギュレータであって、免疫調節効果を有する哺乳動物の絨毛性ゴナドトロピン製剤から得られる活性成分を含み、前記活性成分はリポ多糖誘導敗血症ショックに対してマウスを保護することができ、前記成分が非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスから得られる脾臓細胞のインターロイキン−４産生を刺激することができることを特徴とする免疫レギュレータの使用。
【請求項１１】
前記成分が非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスから得られる脾臓細胞のインターロイキン−４産生を刺激することができることを特徴とする請求項９に記載の免疫レギュレータの使用。
【請求項１２】
免疫仲介不全症治療用医薬組成物生産のための免疫レギュレータの使用であって、ゲル透過クロマトグラフィーにおいて求められる、１キロダールトンより少ない見かけの分子量をもって溶離される、妊娠している哺乳動物の尿から得られる免疫レギュレータであって、免疫調節効果を有する哺乳動物の絨毛性ゴナドトロピン製剤から得られる活性成分を含み、前記活性成分はリポ多糖誘導敗血症ショックに対してマウスを保護することができ、前記活性成分は臓器不全の後または臓器不全の間にＡＳＡＴ血漿値を減少することができることを特徴とする免疫レギュレータの使用。
【請求項１３】
前記活性成分は臓器不全の後または臓器不全の間にＡＳＡＴ血漿値を減少することができることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載の免疫レギュレータの使用。
【請求項１４】
前記哺乳動物の絨毛性ゴナドトロピン製剤が妊娠している哺乳動物の尿から誘導されることを特徴とする請求項４〜１３のいずれか１項に記載の免疫レギュレータの使用。
【請求項１５】
Ｔ細胞に影響を与えてＴｈ１細胞レベルをダウンレギュレートするおよび／またはＴｈ２細胞レベルをアップレギュレートすることによって、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを調節することができる請求項４〜１４のいずれか１項に記載の免疫レギュレータの使用。
【請求項１６】
リンパ性前駆体に対する脊髄性前駆体からの選択的分化によって樹状細胞分化を調節することができる請求項４〜１５のいずれか１項に記載の免疫レギュレータの使用。
【請求項１７】
前記刺激脾臓細胞が、前記脾臓細胞によって再構成されているＮＯＤ‐重篤合併免疫欠損マウスにおける糖尿病の発症を遅延させることができることを特徴とする請求項４〜１６のいずれか１項に記載の免疫レギュレータの使用。
【請求項１８】
前記免疫仲介不全症が、糖尿病、多発性硬化症、または慢性移植拒絶反応の慢性炎症を含むことを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１９】
前記免疫仲介不全症が、敗血症、アナフィラキシーショックまたは急性または超急性拒絶反応の急性炎症を含むことを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記免疫仲介不全症が、全身性エリテマトーデス、または慢性関節リウマチの自己免疫疾患を含むことを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記免疫仲介不全症が、喘息または寄生生物疾患のアレルギーを含むことを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
前記免疫仲介不全症が、ウイルスまたは細菌の感染病原体に対して向けられる過敏な免疫応答を含むことを特徴とする請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
前記治療が、治療される個人におけるリンパ球サブセット集団の、細胞レベルのダウンレギュレートおよび／またはアップレギュレートによる相対的割合の調節および／または、相対的割合に関連した、サイトカインの産生特性によるサイトカイン活性の調節を含むことを特徴とする請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
前記集団がＴｈ１またはＴｈ２細胞を含むことを特徴とする請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記免疫レギュレータがｈＣＧ製剤またはｈＣＧ製剤から誘導された分画を含むことを特徴とする請求項１〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、免疫学の分野に関し、さらにとりわけ、アレルギー、自己免疫疾患、移植関連疾患および炎症疾患などの免疫仲介障害の分野に関する。
【０００２】
免疫系は、炎症性物質、微生物侵襲、または傷害に脅かされたときにサイトカインや他の液性因子を産生して宿主を防御する。ほとんどの場合、この複雑な防御ネットワークは正常な恒常性をうまく復帰させるが、しかしある場合には液性因子が実際に宿主に害毒を及ぼしうる。アナフィラキシーショック、自己免疫疾患、および免疫複合体障害を含む、免疫疾患および免疫系由来の傷害の例のいくつかについて、広く調査されている。
【０００３】
液性および細胞性免疫学、分子生物学および病理学における最近の進歩は、自己免疫は免疫仲介疾患の一部であるとする現在の考え方に影響を与えている。これらの進歩は、抗体、Ｂ細胞とＴ細胞の多様性、先天性の（単球、マクロファージ、顆粒球、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、γδ  Ｔ細胞、補体、急性期蛋白、など）および後天性の（ＴおよびＢ細胞と抗体）または細胞性および液性免疫応答の形成ならびにそれらの相互依存性、（自己）寛容誘導および免疫学的応答が自己抗原的成分に対して起こる理由についての基本的な点における本願発明者らの理解を深めた。
【０００４】
１９００年から、免疫学のセントラルドグマは、免疫系は通常は自己に応答しないというものだった。しかしながら、最近ではかつて考えられていたほど自己免疫応答は珍しくなく、また全ての自己免疫応答が有害ではないこといくつかの応答には通常の免疫応答を調節するために、明確な役割を果たしているものもあることが明らかとなった。たとえば、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）によってコードされる細胞表面抗原や自己イディオタイプに対する抗イディオタイプ応答の認識のようなある形の自己免疫応答は、多様性および健全な免疫系の正常な機能に重要で、事実、必須である。
【０００５】
見かけ上は、チェックと均衡との複雑な系が種々の免疫系細胞のサブセット（すなわちＴ細胞）の間で維持されていて、それによって個体に外来の侵入物に対抗できる免疫系を提供している。この意味において、自己免疫は免疫系において調節する役割を果たしている。
【０００６】
しかしながら、現在ではまた、異常な自己免疫応答は多くのヒトや動物の疾患の、ときに最初の原因となり、別の場合では二次的な寄与をするものとなると認識されている。自己免疫疾患のタイプは頻繁に重複し、複数の自己免疫障害が同一の個体、自己免疫内分泌異常を持つ個体でおこる傾向がある。自己免疫症候群は、リンパ性過形成、悪性リンパ球または血漿細胞増殖およびγ−グロブリン不全症、選択的Ｉｇ不全と補体系不全のような免疫不全障害によって仲介されうる。
【０００７】
全身性エリテマトーシス、糖尿病、リウマチ性関節炎、産後甲状腺機能減退、自己免疫性血小板減少症、（判読不明）のような自己免疫疾患は、たとえば広く分布する自己抗原的決定因子に対する、あるいは器官または組織特異的抗原に対して起こる自己免疫応答で特徴づけられる。これらの疾患は、ただ一つの抗原性標的に対して、または多くの自己抗原に対して、異常な免疫応答を引き起こしうる。多くの例において、自己免疫応答が修飾されていない自己抗原またはウイルス、微生物抗原とハプテン類のような多種の何らかの物質に修飾（または類似）された自己抗原に対して起こるかは明らかでない。
【０００８】
さまざまな自己免疫不全についての根源と病原を説明する統一された見解はいまだ成立していない。実験動物における研究から、自己免疫疾患は、個体同士で異なる遺伝子的および免疫学的な幅広い異常が原因となりえ、また多くの付加的な外因性（ウィルス、細菌）または内因性（ホルモン、サイトカイン、異常遺伝子）促進因子の存在または非存在に依存して、生涯の早期または後期に発現しうるとする概念を支持している。
【０００９】
主な自己免疫疾患を寄せ付けない同様なチェックと均衡とには、アレルギー（喘息）、セプシスや敗血性ショックのような急性炎症疾患、慢性炎症疾患（すなわちリウマチ性疾患、シューグレン症候群、多発性硬化症）、移植関連免疫応答（移植片対宿主疾患、輸血後血小板減少症）、そして反応性抗原が（少なくとも最初は）自己抗原ではないであろうが、しかしそこで前記抗原に対する免疫応答が原則的に個体にとって望ましくなく、有害であるような他の多くの疾患などの免疫仲介障害が含まれる。セプシスは免疫伝達物質における症候群であり、たとえば微生物感染、傷害または他の因子により誘発され、恒常性の異常、器官損傷や結局は致死的なショックを引き起こす急性炎症状態を誘発する。セプシスは重篤な感染への全身的反応に関係している。セプシス症患者は通常、発熱、心拍増加、頻呼吸、白血球増加および感染の局在部位を示す。血液や感染部位からの微生物培養は頻繁に、しかし例外なく陽性である。この症候群が低血圧または多臓器機能不全（ＭＯＳＦ）に至ったとき、この状態をセプシスまたは敗血性ショックと呼ぶ。最初は、微生物が感染病巣で増殖する。微生物は血流に侵入することが出来、結果血液培養陽性となったり、局所的に増殖し、さまざまな物質を血流に放出しうる。このような物質は、病理学的に２つの基本的なカテゴリーに分類される。内毒素と外毒素である。内毒素は典型的にはブドウ球菌のタイコ酸抗原のような微生物の構成要素からなり、またはグラム陰性菌のＬＰＳのような内毒素である。外毒素（たとえば毒性ショック症候群毒素−１、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ，Ｂ，またはＣ）は微生物により合成され直接放出される。
【００１０】
その名前から示唆されるように、これらのタイプの細菌毒素は共に病原性を持ち、血漿タンパク質前駆体または細胞（単球／マクロファージ、内皮細胞、中性球、Ｔ細胞、および他のもの）からの大量の内因性の宿主由来免疫伝達物質の放出を刺激する。
【００１１】
実際、一般的に組織と器官の損傷を引き起こすこれらの免疫伝達物質はセプシスや敗血性ショックに関係する。これらの作用のいくつかは、伝達物質に直接誘導される器官損傷をくい止めるものもある。しかしながら、ショック関連性器官機能不全の一部はおそらく伝達物質仲介の脈管異常に起因し、全身性と局所性の血流異常という結果となり、抵抗性の低血圧またはＭＯＳＦを引き起こす(Bennett et al.)。
【００１２】
非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスは自己免疫疾患、この場合血中グルコース濃度上昇（高血糖）が主要な医学的特徴であるインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）のモデルである。前記血中グルコース濃度の上昇は膵臓ランゲルハンス島のインスリン産生β細胞の自己免疫的破壊が原因であるとされている(Bach et al.1991, Atkinson et al. 1994)。これは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージと樹状細胞のヘテロ集団の混合によって構成されるこの小島(インスリン炎)を取り囲み、透過する巨大な細胞の浸潤を伴う(O'Reilly et al.1991)。
【００１３】
ＮＯＤマウスはβ細胞に対する自己免疫がＩＤＤＭ発達の最初の段階であるモデルを表している。糖尿形成はヒトの疾患としては特定のＭＨＣクラスＩＩ遺伝子と複数の関係のない遺伝子座の間の階乗的な相互作用によって成立する。さらに、ＮＯＤマウスは遺伝と環境、また初期と二次的な自己免疫間の重大な相互作用をきれいに示し、その臨床的兆候はたとえばさまざまな外的要因に依存し、最も重要なのはＮＯＤマウスが飼われる環境の微生物量である。
【００１４】
ＮＯＤマウスにおける自己免疫に関しては、ほとんどの抗原特異的抗体およびＴ細胞応答はこれらの抗原が糖尿患者で自己抗原として検出された後に測定された。ＮＯＤ糖尿病におけるこれらの自己抗原の役割の理解は、さらに病原性自己抗原と付帯現象としての自己免疫とを区別することにつながるだろう。
【００１５】
一般的に、Ｔリンパ球は免疫仲介疾患工程の開始に中心的役割を果たす。(Sempe et al. 1991, Miyazaki et al. 1985, Harada et al. 1986, Makino et al. 1986)。ＣＤ４＋Ｔ細胞は少なくともＴｈ１とＴｈ２の２つの主要なサブセットに分けられる。活性化したＴｈ１細胞はＩＦＮ−γとＴＮＦ−αを分泌し、一方Ｔｈ２細胞はＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０を産生する。Ｔｈ１細胞は有効な細胞性免疫の形成に大きく関与しているのに対し、Ｔｈ２細胞は酸性球と肥満細胞の活性化およびＩｇＥ産生を含んだ液性と粘液性の免疫とアレルギーの形成に役立っている(Abbas et al. 1996)。多くの研究がマウスとヒトの糖尿病とＴｈ１表現型分化とを関係づけている(Liblau et al.1995,Katz et al.1995)。一方、Ｔｈ２Ｔ細胞は比較的無害であると示されている。Ｔｈ２Ｔ細胞は実際は防御的であることを疑う人もいる。katz et alは、ＣＤ４＋Ｔ細胞がナイーブなレシピエントを糖尿に変化させる能力はＴＣＲそれ自体によって認識される抗原特異性ではなく、Ｔ細胞応答の表現型の性質に存在することを示した。強く分極したＴｈ１細胞が新生ＮＯＤマウスに疾患を起こすが、一方Ｔｈ２Ｔ細胞は、活性化され糖尿形成性のＴｈ１Ｔ細胞集団と同じＴＣＲを持つにも関わらずそれを起こさない。さらに、Ｔｈ２Ｔ細胞を１０倍以上同時に移入しても、Ｔｈ２Ｔ細胞はＴｈ１誘導性糖尿病を好転させることができない。
【００１６】
セプシスまたは敗血性ショックの発生率は１９３０年代から増加しており、最近の全ての証拠は、この増加は続くであろうことを示唆している。この発生の増加の理由は数多い。すなわち血管内カテーテルのような侵入性器具の利用の増加、癌と移植に対する細胞傷害性、免疫抑制性薬物療法の広範な利用、セプシスを起こしやすい癌や糖尿病患者の寿命の延長、および抗生物質耐性菌の感染の増加である。セプシスまたは敗血性ショックは集中強化治療室における最も多い死因であり、合衆国の死因の第１３位である。この疾患の正確な発生数は、報告されないため知られていないが、しかしながら、合衆国での年間の概算では４００，０００人がセプシスを発症し、２００，０００人の敗血性ショックの患者がおり、この疾患で１００，０００人が死亡している。
【００１７】
グラム陰性およびグラム陽性菌のようなさまざまな微生物は、真菌類を含め、セプシスや敗血性ショックの原因となりうる。ある種のウイルスやリケッチアは同様の症候群を形成させうる。グラム陽性菌と比べ、グラム陰性菌はセプシスや敗血性ショックをある程度形成させやすいようである。どの部位に感染してもセプシスや敗血性ショックの原因となりうる。セプシスの頻度の高い原因は、腎炎、肺炎、腹膜炎、胆管炎、小胞炎、または髄膜炎である。これらの感染の多くは「院内（Nosocomial）」であり、他の医学的問題で入院している患者に起こる。正常な宿主防御を持つ患者では、ほとんどの患者で感染部位を同定できる。しかしながら、好中球減少症の患者では、おそらく小さく、医学的に現れない皮膚や腸の感染が適当な好中球の循環のない血流への侵入を引き起こすために、背端酢患者の半数以下で臨床的な感染部位を発見できない。明らかに、このような危険を持つ患者においてセプシスまたは敗血性ショックから守る必要がある。
【００１８】
最近、セプシスの患者を最も治療が効果的な臨床的病態の初期に特定することにかなりの努力が向けられている。定義は器官機能不全（循環器、呼吸器、腎臓、肝臓、中枢神経系、血液、または代謝の異常）の証拠を伴った感染への全身性反応（発熱、心拍増加、頻呼吸、白血球増加）の兆候を含む。もっとも最新の定義では全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）という語句を用い、セプシスは感染によってだけでなく、外傷や膵炎のような非感染性の不全によっても引き金となりうる生体の免疫学的に仲介される炎症反応であることを強調している（全身性炎症反応（ＳＩＲＳ）、セプシスおよび敗血性ショックについての関係はCrit. Care Med. 20:864, 199２を参照のこと；セプシスと敗血性ショックの病原的事象の順序についての総説はN. Engl. J. Med. 328:1471, 1993を参照のこと）。
【００１９】
毒性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）とは、臨床的に関連のある内毒素を指し、毒性ショック症候群の患者の９０％以上で原因物質として特定されている（毒性ショックはスーパー抗原性外毒素が原因のセプシスまたは敗血性ショックと定義されている）。スーパー抗原は「通常」の抗原とはＭＨＣ分子に提示される前に細胞内でのプロセッシングが必要でない点で異なっている。代わりにそれらはＴＣＲの外部の半保存領域に結合し、ＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示された自己抗原の誤った「認識」の原因となる(Perkins et al, Huber et al. 1993)。これはＴ細胞とＡＰＣ両方の「誤った」活性化を起こし、増殖、エフェクター機能とサイトカイン分泌の活性化を引き起こす。スーパー抗原のＴ細胞のポリクローナルな活性化のために、大量の炎症性サイトカイン放出のための全身性の広範なショックが引き起こされる(Huber et al. 1993, Miethke et al. 1992)。
【００２０】
セプシスに関与する炎症性サイトカインは類似している。これらの免疫伝達分子は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、窒素酸化物（ＮＯｘ）とインターロイキン１（ＩＬ−１）であり、微生物毒素への応答として単球、マクロファージや他のリ白血球によって大量に放出される(Bennett et al. Gutierrez-Ramos et al. 1997)。ＴＮＦや他の内因性伝達分子の放出は、さまざまな器官へのリンパ球浸潤と炎症のみならず発熱、白血球減少、血小板減少、血流力学変化、散発性の血管内凝固といった、全てが最終的に致死的となるセプシスの病理生理学的反応を引き起こしうる。ＴＮＦはまた内皮細胞に接着受容体（セレクチン類）を発現させる原因となり、白血球を活性化して炎症部位への接着、伸展そして移動のために内皮細胞表面に接着することを助けるこれらの受容体へのリガンドを発現させる（Bennett et al.)。セプシスや敗血性ショックの特定の動物モデルでは、モノクローナル抗体により接着段階を阻害すると組織傷害を防ぎ生存率を改善した。
【００２１】
自己免疫疾患と急性および慢性炎症疾患両方でのこれらの発見は、活性化したＴｈ−サブ集団間のバランスを調節している細胞の存在の仮定に同意する。そのような調節Ｔ細胞集団の反応性の変化によって誘導されるこのバランスでの可能性のある不釣り合いは、結果としてあるきわめて重要なサイトカインの欠損または過剰産生となる免疫仲介を引き起こしうる（O'Garra et al.1997）。これらのＴｈ−サブ集団は免疫応答の薬理学的調節に関する可能性のある標的である。
【００２２】
一般的に、免疫仲介障害は処置するのが難しい。よく、コルチコステロイドでの処置などの幅広く活性のある薬剤が適用され、または多くの局面で処置された個体に対して有害であろう他の広く活性のある坑炎症剤が適用される。
【００２３】
一般的に免疫系の抑制と均衡を調節し、免疫仲介障害を処置するためのよりよく、より特異的な可能性についての必要性が存在する。
【００２４】
本発明は特に免疫レギュレータ（ＩＲ）、免疫仲介障害の処置のための医薬組成物、免疫仲介障害を処置するための医薬組成物および方法を準備する場合のＩＲの使用を提供する。本明細書で記述したような免疫仲介障害には、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病、リウマチ病、シェーグレン症候群、多発性硬化症などの慢性炎症疾病、移植片対宿主疾病、輸血後血小板減少、慢性移植拒絶、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、喘息、アレルギーおよび慢性自己免疫疾患などの移植関連免疫応答、（超）急性移植拒絶、敗血性ショックおよび急性自己免疫疾患などの急性炎症疾病が含まれる。自己免疫疾患は一般的に未知の原因の疾患の集合である。これらの疾病のほとんどにおいて、自己反応性抗体および／または自己反応性Ｔリンパ球の産生が発見できる。自己免疫応答はまた、ウイルスまたは細菌感染の発現として起こる可能性もあり、またたとえばＢ型肝炎ウイルス感染による破壊性肝炎のような重篤な組織障害となりうる。
【００２５】
自己免疫疾患は、応答が最初に特定の器官に局在する抗原に対するのか、あるいは広い範囲の抗原に対するのかどちらかに依存して、器官特異的または非器官特異的として区分され得る。自己免疫疾患の処置の現在の主流は免疫抑制および／または（組織障害のために）ホルモン置換のような生命組成物の置換である。しかしながらステロイドまたは細胞増殖抑制性薬のような免疫抑制性薬剤は明らかな副作用を持っており、その適用を制限している。ここで、より特異的な免疫調節薬の使用が自己免疫疾患および他の炎症の処置において本発明によって提供される。たとえばＴｈ１／Ｔｈ２比を調節すること、樹状細胞の分化を調整することによる以下に記述するような免疫調節特性、低副作用プロフィール、初期臨床観察などを基準にすると、これらの製剤が自己免疫疾患などの免疫仲介炎症の患者の処置にとても有用であることが示される。
【００２６】
免疫疾患の非限定的なリストには、橋本甲状腺炎、原発性  (mysxoedema)  浮腫甲状腺中毒、悪性貧血、自己免疫萎縮性胃炎、アジソン病、早期閉経、インスリン依存性糖尿病、スティッフマン症候群、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、男性不妊症、天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体起因ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫溶解性貧血、突発性血小板減少性紫斑病、突発性血小板減少、原発性胆汁性肝硬変、活性慢性肝炎、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ様関節炎、皮膚真菌症、多発性筋炎、強皮症、混合結合組織病、円板状エリテマトーデス、および全身性エリテマトーデスが含まれる。
【００２７】
１つの実施形態において、本発明はＴｈ１細胞レベルをダウンレギュレートするおよび／またはＴｈ２細胞レベルをアップレギュレートすること、または動物内でのその相対比に影響を与えることが可能な免疫レギュレータであって、尿、または血清、乳清、胎盤抽出物、細胞または組織などの体性産生物の他の供給源から入手可能な前記免疫レギュレータを提供する。本明細書で入手可能なものは、直接的にまたは間接的に前記供給源から前記ＩＲを入手することに言及しており、ＩＲはたとえば化学合成を介してまたは天然の動物または植物供給源から入手される。
【００２８】
好ましい実施形態において、本発明は疾患動物（たとえばヒト）でのリンパ球サブセット集団の相対比および／またはサイトカイン活性を調節し、好ましくはこれらのリンパ球サブセット集団はＴｈ１またはＴｈ２集団からなる。一般的に、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子上に提示された関連抗原性ペプチドの刺激によって天然ＣＤ４+ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）は機能的に成熟エフェクター細胞に分化する。産生されるサイトカインの特徴的な組を基準にすると、Ｔｈ細胞は一般に少なくとも２つの異なるサブ集団、もっぱらインターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）およびリンホトキシンを産生するＴｈ１細胞と、一方ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３を産生するＴｈ２細胞に分けられる。これらのＴｈ１およびＴｈ２サブセットはサイトカイン産生特性においてこれらの分極化したサブセット中、両極をなすものであることがはっきりしており、個々のＴｈ細胞は同等のサイトカイン遺伝子発現よりも差異を示す。これらのサブセットは関連ペプチドによるＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＦＮ−γを含むサイトカインの列を産生しているＴｈ０細胞への誘引の後、共通のＴｈ前駆体細胞（Ｔｈｐ）から分化する。これらの活性化Ｔｈ０細胞は、それらの微小環境の細胞性およびサイトカイン組成物に基づいてＴｈ１またはＴｈ２へその後分極化する。マクロファージのサブセットに加え、樹状細胞の様々なサブセットのような抗原提示細胞はＴｈ１またはＴｈ２サブセット分化へのこの分極を広く決定する。Ｔｈ１−ＴＨ２サブセットは、主にＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０を介してそれぞれのサイトカイン産生特性を交差調節することが明らかであり、この概念から、これらの２つのサブセット間のバランスの障害は結果として異なる臨床的発現になるであろうことが合理的に解釈される［５］。ＩＬ−１２は、Ｔｈ１サブセット分極化を促進している優性因子であり、樹状細胞およびマクロファージがＩＬ−１２を産生する。さらに、ＩＬ−１２はＴ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によるＩＦＮ−γ産生を誘導する。最近、ＩＬ−１８がＴｈ１分化を誘導するためにＩＬ−１２と相乗的に作用することが報告された。Ｔｈ２細胞の分極化はＴ細胞または好塩基球および肥満細胞によって産生されるＩＬ−４の存在に非常に依存する。ＡＰＣ−由来ＩＬ−６はまた分化しているＴｈ細胞で少量のＩＬ−４を誘導することも示された。ＩＬ−１０およびＡＰＣ−由来プロスタグランジンＥ2（ＰＧＥ2）はＩＬ−１２の産生およびＴｈ１起爆を阻害する。
【００２９】
Ｔｈ１−Ｔｈ２変化はＴｈ１細胞の機能と細胞仲介免疫（炎症応答、遅延型過敏症、および細胞傷害性）との相互関係およびＴｈ２細胞と体液性免疫との相互作用を明らかにするのに有用であった。一般的に、感染性疾患の間で、細胞内細菌、真菌および原生動物への抵抗性は、好結果のＴｈ１応答を行うことに関連する。Ｔｈ１応答はまた、関節炎、大腸炎、および他の炎症状態のような病理にも関連しうる。蠕虫などの細胞外病原体に対する効果的な保護は主としてＴｈ２応答を必要とし、増強された体液性免疫は結果として、特異的な抗体の産生による病原体の好結果の中和となる可能性がある。
【００３０】
さらに他の好ましい実施形態において、本発明は樹状細胞の分化を調整することのできる免疫レギュレータを提供する。Ｔｈ１対Ｔｈ２型細胞の選択的副産物は、前駆体Ｔｈ細胞と、そのＭＨＣクラスＩＩ分子との結合での関連ペプチドを運んでいる抗原提示細胞（ＡＰＣ）との相互作用に依存する。ＡＰＣによって放出され、樹状細胞と適切なＴ細胞レセプターを持つＴ細胞との間の最初の相互作用の間に存在するサイトカインはＴｈ１対Ｔｈ２サブセットへの分化を駆動する。最近、ＤＣ（脊髄性対リンパ性）に対する２つの異なる前駆体がヒトで記述された。骨髄性前駆体からのＤＣ１の選択的分化がＣＤ４０リガンドまたは内毒素での刺激後に起こり、結果としてＩＬ−１２の高産生となった。リンパ性前駆体はＣＤ４０リガンド刺激後のＤＣ２細胞への成長を促し、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−１０を産生した。これらのサイトカインは活性化Ｔｈ細胞の分化を駆動する第１の重要物である。ＩＬ−４はＩＬ−１０の存在によって強く増強されるＴｈ２型細胞の成長に必要であり、一方Ｔｈ１型細胞への選択的分化はＩＬ−１２の存在にもっぱら影響される。ＤＣ１はＩＬ−１２の産生で特徴づけられるので、これらは、最初にＴｈ１型細胞の成長を誘導し、一方ＤＣ２はＩＬ−１０を産生し選択的に外因性ＩＬ−４の存在下でのＴｈ２分化を促進する。本明細書で、本発明によって提供されたようなＩＲはＤＣ活性および分化を調節しまたは調整でき、したがってＴｈ１および／またはＴｈ２細胞の選択的分化と活性化とを可能にすることが示されている。
【００３１】
１つの実施形態において、本発明は哺乳動物絨毛性ゴナドトロピン製剤から入手可能な活性成分であり、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスから入手した脾臓細胞を刺激できる前記活性成分を含むか、またはたとえばＤＣ活性かおよび分化を調整し調節を可能にする、または、たとえば前記刺激された脾臓細胞が、前記脾臓細胞で再構成させたＮＯＤ−重篤−複合−免疫不全マウスでの糖尿病の始まりを遅延させることのできる、あるいは前記活性成分が非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスから入手した脾臓細胞のガンマ−インターフェロン産生を阻害できる、または前記活性成分が非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスから入手した脾臓細胞のインターロイキン−４産生を刺激できるような本明細書での詳細な記述で示したような糖尿病または慢性移植拒絶などの慢性炎症の場合、Ｔｈ１および／またはＴｈ２細胞の選択的分化と活性化とを可能にするような前記活性化合物に機能的に関連した活性成分を含む免疫レギュレータを提供する。
【００３２】
他の実施形態において、本発明は哺乳動物絨毛性ゴナドトロピン製剤から入手可能な活性成分であり、たとえば前記活性成分がショックと共に一般的にみられるような組織不全の後または間にＡＳＡＴまたは他の関連する血漿酵素レベルを減少させることが可能であるような本明細書での詳細な記述で示したように、ショックまたは（超）急性移植拒絶と共にみられるような、急性炎症の場合、たとえばＤＣの活性化および分化を調節し調整することを可能にする、またはＴｈ１および／またはＴｈ２細胞の選択的分化と活性化とを可能にするような、敗血性ショックを誘導するリポポリサッカライドに対してマウスを保護することが可能な前記活性成分を含む免疫レギュレータを提供する。
【００３３】
１つの実施形態において、本発明による前記免疫レギュレータは、詳述した記述でさらに詳しく述べるように、ゲル浸透クロマトグラフィー内で決定されたような５８〜１５キロダルトンの明白な分子量で溶出した分画に存在している活性成分を含み、そこでは関連する、阻害するまたは相乗作用する成分もまた見つかった。他の実施形態では、本発明は詳述した記述でさらに詳しく述べるように、前記活性成分がゲル浸透クロマトグラフィーで決定したように１５キロダルトンよりも小さい明白な分子量で溶出する分画に存在する免疫レギュレータを提供し、たとえば前記活性成分はゲル浸透クロマトグラフィーで決定したように＜１キロダルトンの明白な分子量で溶出された分画に存在する。本発明による前記免疫レギュレータは尿より簡単に入手できるけれども、たとえば前記哺乳動物絨毛性ゴナドトロピン製剤が尿、またはゴナドトロピンを含む血清、細胞または組織のような他の供給源から得られるような場合も適切である。前記供給源からはまた、たとえばＴｈ１および／またはＴｈ２細胞活性を調節でき、および／または樹状細胞分化を調整できる本発明による免疫レギュレータも提供される。
【００３４】
好ましくは、本発明で提供されたような免疫レギュレータは、妊娠哺乳類、好ましくはヒトから入手可能であり、たとえば妊娠メス馬の血清中で発見された妊娠メス血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）（ＩＲ−Ｓ）、または妊娠しているマウスの子宮より抽出された妊娠マウス子宮抽出物（ＰＭＵＥ）（ＩＲ−ＵＥ）、または妊娠女性の血液または尿で発見されたヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧまたはＨＣＧ）のような（胎盤）ゴナドトロピンを含むように調製した薬理学的製剤から入手可能である。本発明によって提供されたようなＩＲは、たとえば妊娠の第１トリメスターの尿（ＩＲ−Ｕ）および商業的ｈＣＧ製剤（ＩＲ−Ｐ）が免疫調節効果を有しているので、ゴナドトロピンに関連できるかあるいは関連できないかであろう。とりわけ、ＩＲは自己免疫および急性、慢性炎症疾患を阻害または調節できる。ＴＮＦおよびＩＦＮ−ガンマはセプシスまたは敗血性ショックなどの急性炎症疾患に、また自己免疫および慢性炎症疾患に薬理学的に関連する。ＩＲはＴ細胞サブセットを調節する能力を有しており、ＴＮＦおよびＩＦＮ−ガンマを阻害するので、ＩＲはセプシスまたは敗血性ショック（急性炎症疾患）のような免疫仲介障害、および全身性エリテマトーデス、糖尿病、リウマチ様関節炎、分娩後甲状腺機能不全、自己免疫貧血およびアレルギーや慢性炎症疾患（すなわちリウマチ病、シェーグレン症候群、多発性硬化症）および移植関連免疫応答のような他の疾病などの自己免疫疾患または慢性炎症疾患を、処置し、抑制し、防止するのに使用できる。本願発明者らの結果はたとえばＩＲが内毒素によってまたは外毒素によって引き起こされたセプシスまたは敗血性ショックを阻害することを示す。本発明によって提供されたようなＩＲは、急性炎症疾患と同様に免疫仲介自己免疫疾患、慢性炎症疾患を抑制するかまたは阻止する。
【００３５】
本発明はアレルギー、自己免疫疾患、移植関連疾患、急性または慢性炎症疾患などの免疫仲介障害を処置するための医薬組成物を提供し、および／またはたとえば活性成分を含むリンパ球作用を刺激し、または調節するための免疫レギュレータ（ＩＲ）を提供し、前記活性成分は２０週齢メス非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスより入手した脾臓細胞を刺激でき、前記刺激された脾臓細胞は前記脾臓細胞で８週齢時に再構築されたＮＯＤ−重篤−複合−免疫欠失（ＮＯＤ．ｓｃｉｄ）マウスでの糖尿病の始まりを遅延し、またはそれに機能的に関連した活性成分を含む。
【００３６】
１つの実施形態において、本発明は前記活性成分が２０週齢メス非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスから入手した脾臓細胞のガンマ−インターフェロン産生を阻害し、またはインターロイキン−４を刺激することができるような医薬組成物または免疫レギュレータを提供する。ｈＣＧおよびＰＭＳＧのようなゴナドトロピンの臨床的品質の製剤が長い間、小胞増殖または排卵刺激が望ましい状態での再産生不全の処置を助けるために使用されてきた。前記製剤は一般的に血清または尿から入手し、また精製および相対的活性の度合いが、血清または尿中の最初の濃度に依存し、そして使用した調製の様々な方法に依存してしばしば変化する。
【００３７】
特定の実施形態において、本発明は哺乳動物ＣＧ製剤より入手可能な活性成分であって、非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスから入手した脾臓細胞を刺激できるような前記活性成分を含むか、またはたとえば前記刺激された脾臓細胞が前期脾臓細胞で再構築したＮＯＤ−重篤−複合−免疫欠失マウスでの糖尿病の始まりを遅延できるような前記活性成分と機能的に関連する活性成分を含む免疫レギュレータを提供する。
【００３８】
本発明はまた、前記活性成分が非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスから入手したガンマ−インターフェロン産生物を阻害できるような免疫レギュレータも提供する。本発明はまた前記活性成分が非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスから入手した脾臓細胞のインターロイキン−４産生を刺激することができるような免疫調整剤も提供する。
【００３９】
たとえば妊娠の第１トリメスターの尿中（ＩＲ−Ｕ）および商業的なｈＣＧ製剤中（ＩＲ−Ｐ）で存在するようなｈＣＧ存在または非存在で本発明によって提供されたような免疫レギュレータ（ＩＲ）は免疫調節効果を持つ。とりわけＩＲは自己免疫および急性、慢性炎症疾患を阻害または調節できる。ＴＮＦおよびＩＦＮ−ガンマは病理学的に、セプシスまたは敗血性ショックのような急性炎症疾患に関連し、また自己免疫および慢性炎症疾患にも関連する。ＩＲはＴ−細胞サブセットを調節する能力およびＴＮＦおよびＩＦＮ−ガンマを抑制する能力があるので、ＩＲはセプシスまたは敗血性ショック（急性炎症疾患）のような免疫仲介障害、および全身性エリテマトーデス、糖尿病、リウマチ様関節炎、分娩後甲状腺機能不全、自己免疫貧血およびアレルギーや慢性炎症疾患（すなわちリウマチ病、シェーグレン症候群、多発性硬化症）および移植関連免疫応答のような他の疾病などの自己免疫疾患または慢性炎症疾患を、処置し、抑制し、防止するのに使用できる。本願発明者らの結果はたとえばＩＲが内毒素によってまたは外毒素によって引き起こされたセプシスまたは敗血性ショックを阻害することを示す。本発明によって提供されたようなＩＲは、急性炎症疾患と同様に免疫仲介自己免疫疾患、慢性炎症疾患を抑制するかまたは阻止する。
【００４０】
不確かな観察および実験室での研究は、ｈＣＧが坑カポージ肉腫および坑ヒト免疫不全ウイルス効果を有するであろうことをすでに示唆している（Treatment Issues, July/August 1995,ページ15）。ｈＣＧ製剤はｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫不全患者およびマウスにてカポージ肉腫（ＫＳ）上で直接のアポトーシス（細胞傷害性）効果を有し、免疫不全患者での前造血効果を有することが観察され（Lunardi-Iskandar et al.,Nature 375,64-68; Gill et al., New.Eng.J.Med.335, 1261-1269, 1996；米国特許第５６７７２７５号）、ヒトおよび類人猿免疫不全ウイルス（ＨＩＶおよびＳＩＶ）における直接の抑制性抗ウイルス効果を有することが観察された（Lunardi-Iskandar e t al., Nature Med.4,428-434,1998，米国特許第５７００７８１号）。前記細胞傷害性および抗ウイルス効果はまた、臨床的品質のｈＣＧ製剤中に存在する未知のｈＣＧ仲介因子（ＨＡＦ）に起因してきた。しかしながら、商業的なｈＣＧ製剤（CG-10、Steris Profasi、Pregnyl、Choragen、Serono Profasi、APLなど）は様々な効果を有している。これらのいくつかの解析（AIDS，11:1333-1340，1997）はたとえばただいくつか（CG-10、Steri s Profasiなど）がＫＳ−殺傷性であり、一方他（Pregnyl、Choragen、Serono Profasi）はそうではないことを示している。第二に、（αまたはβ）ｈＣＧの組換え体サブユニットは殺傷するが、もとの状態の組換え体ｈＣＨはそうではない。殺傷効果はまたリンパ球でもみられたことも見いだされた。ＫＳの治療は最近その抗腫瘍効果のためにベータ−ｈＣＧを使用することに向けられ（Eur.J.Med Res,21:155-158,1997）、尿から単離されたベータ−コア断片がＫＳ細胞において最も高いアポトーシス活性を有していることが報告された（AIDS,11:713-721,1997）。最近、Gallo et al.はヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の臨床品質未精製製剤の坑カポージ肉腫、坑ＨＩＶ、坑ＳＩＶおよび明確な造血効果を報告した（Lunardi-Iskandar et al.,1995, Gill et al. 1996, Lunardi-Iskandar et al.,1998）。これらの先行研究と対照的に、ｈＣＧ製剤の抗腫瘍および抗ウイルス活性は、その精製されたサブユニットまたはその主要な分解産生物、β−コアを含む野生型ｈＣＧヘテロダイマーによらず、代わりにまだ同定されていないｈＣＧ仲介因子（ＨＡＦ）としてその中の活性部位残基によることが主張されている。本当の因子が何であろうと、さまざまなｈＣＧ製剤内のこれらの未同定の因子は、腫瘍細胞における直接の細胞傷害性効果に加えて、選択的なアポトーシスの誘導を通して抗腫瘍活性を有する。さらに、単核細胞での腫瘍の浸潤がないことから、抗腫瘍効果が免疫仲介応答のためであり得ないと仮定している。
【００４１】
さらに、報告された臨床品質のｈＣＧの前造血効果はＨＩＶに感染したヒトでの臨床研究で注目され（Lunardi-Iskandar et al.1998）、造血効果は間接的であり、ＣＤ４+細胞の救出によって引き起こり、さもなくばｈＣＧの坑ＨＩＶ活性を介してＨＩＶによって殺される。
【００４２】
本発明はｈＣＧ製剤またはその誘導された断片より入手可能な、免疫仲介障害の処置のための免疫レギュレータまたは医薬組成物を提供する。前記免疫レギュレータの効果には、細胞傷害性または抗ウイルス効果の代わりに（末梢リンパ球、胸腺細胞または脾臓細胞で発見されるような）リンパ球集団における刺激効果が含まれる。本発明は、妊娠哺乳動物から入手可能な少なくとも１つの免疫レギュレータでの処理を動物に行うことを含む免疫仲介障害を処置する方法を提供する。前記処置は直接的であり、たとえば処置は前記個体に、本発明で提供したような免疫レギュレータを含むｈＣＧまたはＰＭＳＧ製剤のような医薬組成物を与えることを含んでよい。またたとえば尿または血清または（母親起源または胎児起源の）胎盤または他の組織または細胞からサンプリングすることで、そして（たとえばゲル浸透クロマトグラフィーなどの）本技術分野で公知の分別技術によって前記尿または血清または組織または細胞から前記活性成分を含む前記免疫レギュレータを調製することで、そして記述したようにＮＯＤマウスまたはその脾臓細胞を刺激することによってその活性成分を試験することで、妊娠動物から由来する分画または分画群で前記医薬組成物を提供することもできる。とりわけ、胎児は潜在的に、敵対する免疫攻撃を引き起こすことなく本質的に子宮内の外来の組織として発達する、その母親との胎児免疫学的葛藤から生き延びなければならないので、前記製剤または成分が好ましく妊娠動物より由来する。したがって、この「同種移植片（allog raft）」拒絶を防ぐために、母親および胎児間の免疫学的相互作用が、母親のリンパ球への胎児抗原の浸透の欠如を介してか、母親リンパ球の機能的「抑制（suppression）」を介してかのいずれかですぐに抑制されなければならない。胎児抗原が提示された場合、母親の免疫応答はほとんど有害でない、抗体仲介Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）型へ偏るであろう。このことは、妊娠女性が症例ではない極度の感染に感受性になることを示唆する。妊娠中のメス個体はその感染への抵抗性を保持しまたは増加させさえする。さらに、前記個体は通常オス個体と比べて免疫疾患、特に自己免疫疾患に、より感受性になる一方で、妊娠中これらの疾患に、より抵抗がある。
【００４３】
本発明はまた、リンパ球のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激および前記刺激されたリンパ球を医薬組成物として免疫仲介障害についての動物の処置のために前記動物に移入させるための方法を提供する。本発明の特定の実施形態において、医薬組成物が本発明によって提供された免疫レギュレータでｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激したリンパ球を含んで提供される。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態において、前記障害には糖尿病、さらに急性、慢性炎症などの他の免疫仲介障害が含まれ、処置され得る。他の好ましい実施形態においては、前記障害にはセプシスまたは敗血性ショックが含まれる。本発明は動物に対する処置の方法を提供し、好ましくは前記動物はヒトである。
【００４５】
特定の実施形態において、本発明によって提供された方法はさらに、Ｔｈ１またはＴｈ２細胞、またはＴｈ３またはＴｈ８細胞、または他のエフェクターまたは調節Ｔ細胞集団を含むサブセット集団のような前記動物でのリンパ球サブセット集団の相対比および／またはサイトカイン活性化またはサイトカイン発現またはマーカー発現を調節することを含む。
【００４６】
本発明はまた本発明による方法での使用のための免疫レギュレータおよび好ましくはアレルギー、（全身性エリテマトーデスまたはリウマチ様関節炎などの）自己免疫疾患、移植関連疾患、（敗血性またはアナフィラキシーショック、または急性または超急性移植拒絶などの）急性および（アテローム性動脈硬化症、糖尿病、多発性硬化症または慢性移植拒絶などの）慢性炎症疾患を含む群より選択した免疫仲介障害の処置のための医薬組成物を作るための、好ましくは妊娠哺乳動物より入手可能な前記免疫レギュレータの使用を提供する。さらに、本発明は、前記免疫仲介障害が喘息または寄生虫性疾患などのアレルギーを含むような本発明による使用、または前記免疫仲介障害が、ウイルスまたは細菌などの感染物に対して示された過度の強力な免疫応答を含むような本発明による使用を提供する。しばしばこれらの疾患のほとんどで、自己反応性抗体および／または自己反応性Ｔリンパ球の産生が、あまりに強い免疫応答の一部分を展開し、または担っているとみることができる。このことは、たとえば、ＩｇＥ産生が過度に強くまたは疾患がＴｈ２依存である寄生虫性疾患でみられ、器官に有害であり、またＴＢＣまたはハンセン病のような（微）細菌感染でもみられる。自己免疫応答はまた、たとえばＢ型肝炎ウイルス感染による破壊的肝炎のようにウイルスまたは細菌感染の顕在化としてあらわれ得、結果として深刻な組織損害となり得、またはリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）感染でもみられる。前記過度に強い免疫応答は本発明によって提供されたような免疫レギュレータで溝において続く。本発明によって提供されるようなまた他の使用は血管疾患の処置に関連し、そこでは細胞および組織に対するラジカル障害（ラジカルに起因する障害）が本発明によるＩＲで処置することで防止されまたは回復し、またＩＲは直接的または間接的に坑オキシダントとして働く。たとえば、Ｉ型糖尿病の病因の決定事象はインスリン産生膵臓ベータ細胞の破壊である。ベータ細胞量の進行性減少が慢性自己免疫応答の結果であるという強い証拠が存在する。この過程中、島浸潤免疫細胞、島微小内皮細胞およびベータ細胞それ自身が細胞傷害性伝達物質を放出できる。サイトカインおよび特に一酸化窒素（ＮＯ）は強力なベータ細胞毒性エフェクター分子である。反応性ラジカルＮＯは、主に広がったＤＮＡ鎖の破壊の誘導を介してその有害な効果を仲介し、酸素などの他のラジカルはＴｈ１およびＴｈ２細胞のようなリンパ球のサブ集団へのその効果を介して仲介する。この最初の損傷はベータ細胞の死で終了する連鎖事象を引き起こし、免疫応答の混乱を引き起こす。
【００４７】
さらに、本発明による免疫レギュレータは細胞−細胞間相互作用、または細胞応答、とりわけ、たとえば先天性または後天性免疫系の相互作用の調節に関連した免疫学的特質の細胞の相互作用または応答を誘導または支配するラジカルを調節することができる。理論によって結びつけようとするわけではないが、免疫系には２つの部分、すなわち先天性（非特異的）および後天性（特異的）系があり、両方とも細胞性および体液性成分を有する。先天性免疫系の細胞性成分の例は単球、マクロファージ、顆粒球、ＮＫ細胞、肥満細胞、ｇｄ  Ｔ細胞などであり、一方体液性成分の例はリソザイム、補体、急性期タンパク質およびマンノース結合レクチン（ＭＢＬ）である。後天性免疫系の主要な細胞性成分はＴおよびＢ細胞であり、一方体液性成分は抗体である。後天性系は感染およびより多い多細胞器官での過剰な存在の除去におけるその特異性、有効性ゆえに最も研究されてきた。先天性系はしばしば原始的なものであると見なされ、「単純である（unsophisticated）」と考えられる。しかしながら、先天性系は存続しているだけではなく、もっとも基礎的な免疫攻撃のひとつ、すなわち胎生にて重大な役割を果たし得る。先天性系はリンパ球に対する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩおよびＩＩ分子と関連した抗原の処理および提示によって免疫応答をはじめさせる。全応答はしばしば、先天性免疫系との相互作用を介して表面分子またはサイトカインを共刺激的に産生する（内毒素のような）アジュバントを必要とする。このことは抗原の生物学的重要性を決定し、この情報を後天性系に伝達する。よってこれは後天性系に応答するかどうかを指示する。よってこれらの２つの大きな免疫系の部分は、互いに影響するだけでなく、少なくともたとえばサイトカインおよび共刺激分子などを介して細胞レベルでは互いに調節する。
【００４８】
これらの２つの系が別々にまたは組み合わせで関与するような多くの生理学状態および免疫病理学がある。たとえば妊娠において母親の先天性免疫系がさらに刺激されるということが明らかにされ、あるいはＩＩ型糖尿病が慢性過活動先天性免疫系の疾患であるということが提案されてきた。他の例としてはリステリア症での先天性免疫系の関与がある。後天性免疫系での調節不全が全身性のまたは器官特異的な自己免疫、アレルギー、喘息などのような免役疾患を引き起こす可能性もあるが、しかし妊娠の維持および「同種移植片」拒絶の防止で重要な役割も果たすことができる。
【００４９】
上述したように、後天性系は感染を除去する時点の特異性、有用性のため、およびより多い多細胞器官での過剰な存在のためによく研究されてきている。その調節もまたよく研究されてきた。たとえば、サイトカイン微小環境が免疫応答の間のＴｈ１またはＴｈ２細胞型へのＴヘルパー細胞分化で鍵となる役割を果たしていることがよく知られている。ＩＬ−１２はＴｈ１分化を誘導し、一方ＩＬ−４はＴｈ２分化を誘導する。最近樹状細胞のサブセット（ＤＣ１、ＤＣ２）がＴｈ１細胞かＴｈ２細胞のどちらかの分化を決定する異なるサイトカイン微小環境を提供することも示されてきた。さらに、成熟Ｔ細胞応答からの負のフィードバックループがまた、好ましい樹状細胞サブセットの生存を調節し、したがって選択的に延長されたＴｈ１またはＴｈ２応答を阻害する。さらに、Ｔｈ１応答の発達が、ＩＬ−４によって直接的に、そして先天性免疫応答によって刺激されたマクロファージによるＩＬ−１２およびインターフェロン−ｇ−誘導因子（ＩＧＩＦ）の産生を阻害するＩＬ−１０によって間接的に拮抗されうる。増殖および分化するのにＩＬ−４に依存しているＴｈ２細胞は、アレルギー性およびアトピー性顕示に関わり、さらにＩＬ−４およびＩＬ−１０のそれらの産生を介して寛容での役割を果たすことが示唆されている。とりわけ、Ｔｈ１からＴｈ２への変換が器官特異的自己免疫病状の発達を防止でき、妊娠の維持に必要であったことが示唆されてきた。最近異なるサブセットの調節Ｔ細胞がＴｈ１およびＴｈ２応答両方の原因となり、また免疫病状の発達を防止するということが明らかになってきた。これらの調節Ｔ細胞の多くの共通の特徴の１つは、その機能が少なくとも部分的にＴＧＦ−ベータの作用によることであり、このことはＩＬ−１０が優先的にＴｈ１のみを抑制する一方で、Ｔｈ１およびＴｈ２分化両方を阻害するＴＧＦ−ベータの能力によって続くであろう。
【００５０】
Ｔｈ１対Ｔｈ２型細胞の選択的成長は前駆体Ｔｈ細胞のそのＭＨＣクラスＩＩ分子と結合する関連ペプチドを運んでいる抗原提示細胞（ＡＰＣ）との相互作用に依存する。ＡＰＣによって放出され、樹状細胞と適切なＴ細胞レセプターを持つＴ細胞間の最初の相互作用の間存在するサイトカインは、Ｔｈ１対Ｔｈ２サブセットへの分化を駆動する。最近、ＤＣ（脊髄性対リンパ性）に対する２つの異なる前駆体がヒトで記述された。骨髄性前駆体からのＤＣ１の選択的分化がＣＤ４０リガンドまたは内毒素での刺激後におこり、結果としてＩＬ−１２の高産生となった。リンパ性前駆体はＣＤ４０リガンド刺激後のＤＣ２細胞への成長を促し、ＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−１０を産生した。これらのサイトカインは活性化Ｔｈ細胞の分化を駆動する第１の重要物である。ＩＬ−４はＩＬ−１０の存在によって強く増強されるＴｈ２型細胞の成長に必要であり、一方Ｔｈ１型細胞への選択的分化はＩＬ−１２の存在にかなり影響される。ＤＣ１はＩＬ−１２の産生で特徴づけられるので、これらは、最初にＴｈ１型細胞の成長を誘導し、一方ＤＣ２はＩＬ−１０を産生し選択的に内因性ＩＬ−４の存在下でのＴＨ２分化を促進する。
【００５１】
特定の実施様態において、前記免疫レギュレータには臨床的品質のｈＣＧまたはＰＭＳＧ調製品またはその誘導された断片が含まれる。たとえば、本発明は糖尿病の処置のための医薬組成物を準備するための、ｈＣＧ調製品またはそれと機能的に同等の調製品の使用を提供する。また他の例では、本発明はセプシスまたは敗血性ショックの処置と防止のための医薬組成物の準備のための、ｈＣＧ調製品またはそれと機能的に同等の調製品の使用を提供する。たとえば、本発明は前記処置にたとえば処置した個体におけるＴｈ１および／またはＴｈ２のようなリンパ球のサブセット集団の相対比および／またはサイトカイン活性化を調節することが含まれるような本発明による使用を提供する。
【００５２】
本発明はさらに、候補免疫レギュレータ分画の治療的効果を決定することを含む免疫レギュレータの選択のための方法を提供する。例示のため実験モデルとして有用なＮＯＤマウスのような糖尿病の兆候を示す傾向にある動物に尿分画またはそれより誘導された分画を与えることで、そして本質的に前記動物での糖尿病の発達を決定することで、そこでそのような免疫調節分画または活性成分が選択されまたは同定されるような方法が得られる。また他の実施様態において、本発明はＬＰＳまたは他の毒素の影響を受けたことがあるマウスのような敗血性ショックの兆候を示す傾向にある動物に尿分画またはそれより誘導された分画を与え、前記動物での敗血性ショックの発達を測定することで免疫レギュレータの治療的効果を決定することを含む免疫レギュレータを選択するための方法を提供する。好ましくは本発明による方法は、前記治療効果がさらに前記動物でのリンパ球サブセット集団の相対比および／またはサイトカイン活性を決定することで測定されるか、または前記治療的効果がさらに前記動物での酵素レベルを決定することまたはたとえば本明細書で詳細に記述して示したような本技術分野で公知の他の臨床的パラメータを測定することで測定されるのが好ましい。
【００５３】
理論によって結びつけるつもりはないが、本発明者らの結果は、本発明によって提供されたようなＩＲはｉｎ  ｖｉｖｏ（ＢＡＬＢ／ｃ、ＮＯＤ）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴｈ１／Ｔｈ２バランスを調節できることを示している。ＮＯＤのような優性Ｔｈ１発現系モデルにおいて、他のものの中で（ＴＲ−Ｐおよびその分画のような）ＩＲはＩＦＮ−ガンマ産生をダウンレギュレートし（ｉｎ  ｖｉｖｏ／ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）、ＩＬ−４産生とは対照的にＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータ産生を促進し、このことはＩＲによるＴｈ３およびＴｈ１のような調節細胞の誘導を示している。これらの調節細胞は免疫および炎症疾病および免疫寛容でのＩＲの臨床的効果において役割を果たしている可能性がある。本発明者らはまた、ＩＲおよびその分画が、別々にＩＦＮ−ガンマ産生の阻害を和らげるようには見えない分画ＩＲ−Ｐ３およびｒｈＣＧを除いて、ｉｎ  ｖｉｒｔｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＩＦＮ−ガンマの産生を阻害できることを示した。ＩＲ−Ｐ３とｒｈＣＧの組合せはより強いＩＦＮ−ガンマの阻害を与える。このことはこれらのモデルでの少なくともそのＩＦＮ−ガンマ阻害について、ｒｈＣＧに対するＩＲ−Ｐ３の必要性を暗示している。これはまたｉｎ  ｖｉｖｏでの処置ＮＯＤマウスから入手した坑ＣＤ３刺激脾臓細胞に対して、またはＴｈ２表現系へのＴヘルパー細胞の分極に対して暗示している。
【００５４】
さらに、ＩＲ−Ｐ、その分画（ＩＲ−Ｐ１、ＩＲ−Ｐ２、ＩＲ−Ｐ３）およびｒｈＣＧとの組合せでのＩＲ−Ｐ３はすべてＢ細胞のＩｇＧ２ａへのクラススイッチを阻害でき、一方ＩＲ−Ｐ２およびｒｈＣＧはなんの阻害の緩和も与えなかった。ＩＦＮ−ガンマ産生および分化における本発明者らの結果は、ＩｇＧ２ａ阻害に対してＩＲ−Ｐ３が最大の結果を与えるためにはｒｈＣＧは必要ないことを本発明者らはみたのであるが、ＩＲ−Ｐと比較したときＲ−Ｐ３のみでは最大の効果を持たなかったことを示した。しかしながらＩＲ−Ｐ３の影響下でのＩＬ−１０の産生の増加はＩＲ−Ｐ１のそれより少なかった。このことは、ＩＬ−１０、ｈＣＧの最大産生に対して、それらの分解産生物またはＩＲ−Ｐ３との組合せでのＩＲ−Ｐ１でのまだ未知のサブ分画が必要であることを示唆している。ＩＲ−Ｐ３のみはすでにＩＬ−１０産生を促進できることから、ＩｇＧ２ａの産生を阻害するために他の分画または成分は必要ない。
【００５５】
本発明者らはまた本発明によって提供されたようなＩＲがＢＡＬＢ／ｃ動物モデルにおいて（ｉｎ  ｖｉｔｒｏでおよびｅｘ  ｖｉｖｏで）ＩＦＮ−ガンマ産生とＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−４およびＩＬ−６の促進を阻害できることを示した。したがって、少なくともこれらのサイトカインがＩＲによる免疫応答の調節で、および調節細胞の誘導に関与することが明らかである。著しく、ＩＲはＮＯＤとは対照的にＢＡＬＢ／ｃマウスで（ｅｘ  ｖｉｖｏで）坑ＣＤ３刺激脾臓細胞の増殖を促進する。このことは自己免疫疾患モデルであるＮＯＤと明確な免疫病状のない動物モデルであるＢＡＬＢ／ｃの違いを反映している可能性がある。両方（ＮＯＤ／ＢＡＬＢ／ｃ）の動物モデルにおいて、ＩＲは脾臓のＬＰＳ刺激増殖を促進する（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ）。
【００５６】
ＮＯＤおよびＢＡＬＢ／ｃマウスでの本発明者らのＤＣ実験は、ＩＲがただＴ細胞応答を調節するだけでなく、ＤＣの成熟化および機能を調節できることを示している。専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能するＤＣは、免疫寛容において重要な役割を果たす。アロ−ＭＬＲ中のＩＲでのＣ５７Ｂ／６  ＤＣの処理はＴ細胞増殖をダウンレギュレートすることができる。このことはＩＲがまた寛容の状態の誘導を促進することができることを示す。これらのデータを基に、本発明者らは、ＩＲで処置したレシピエント（ＢＡＬＢ／ｃ）へのＭＨＣと非ＭＨＣの非両立性皮膚（Ｃ５７ＢＬ／６）移植を行った。本発明者らのデータは、対照群において同種移植片（皮膚）は１５日以内に完全に拒絶され、一方３回ＩＲで処置したレシピエントマウスの皮膚移植片は２１日後に拒絶された。したがってＩＲは移植片拒絶を遅延することができる。本発明にて提供されたようなＩＲは免疫疾患に対する多くの動物モデルにおける免疫病状を阻害することができる。ＩＲは（糖尿病に対する）ＮＯＤモデル、および（ＭＳに対する）ＥＡＥモデルでの免疫病状および臨床的症状を阻害し、同種移植片拒絶を阻害し、ＳＺＴ−誘導糖尿病を遅延させる。本発明者らのデータはまたＩＲは異なる細胞集団において効果を持つことを示している。ＩＲはＴ細胞に影響を与え、したがってＴｈ１／Ｔｈ２バランスを調節し、言い換えるとただＴ細胞を調節するだけでなくＡＰＣ区画における影響を持つような調節細胞を誘導する。さらに、ＩＲはＡＰＣ区画を直接的に調節でき、先天性および後天性免疫応答に影響を与えることができる。そのように行うことにより、ＩＲはただ後天的免疫系の不均衡にも起因する疾患に影響を及ぼすことができるだけでなく、先天性免疫系または両方の系の不均衡に起因する疾患に影響を及ぼすことができる。たとえば、ＩＩ型糖尿病の原因におけるサイトカインと先天性免疫系の役割が重要でありそうである。最近遺伝的に、さもなければ先に処理した対象での加齢および栄養過多のような未知の因子がマクロファージのような細胞からのサイトカインの分泌の増加、さらにはアテローム性動脈硬化症プラークからのサイトカイン分泌を引き起こすことが示唆された。サイトカインによって誘導される急性期応答には（ＶＬＤＬトリグリセリドを上昇させ、ＨＤＬコレステロールを低下させる）異常脂血症およびフィブリノーゲンのようなアテローム性動脈硬化症への他のリスク因子が含まれる。サイトカインはまた、膵臓ベータ細胞（インスリン分泌の改善に貢献）、脂肪組織（レプチン放出の刺激）および脳、刺激コルチコトロピン放出ホルモン、ＡＣＴＨおよびしたがってコルチゾール分泌においても働く。後者は中枢神経肥満、高血圧およびインスリン抵抗性に寄与する可能性がある。インスリン抵抗性のさらなる原因は、サイトカインＴＮＦ−アルファであり、これはインスリンレセプターのチロシンキナーゼ活性を阻害する。微小血管または巨大血管合併症のないＩＩ型糖尿病患者は高い急性期応答を持ち、しかし組織合併症はＩＩ型糖尿病でさらにストレス反応物を増加させる。アテローム性動脈硬化症であり糖尿病ではない対象において、「血液病学的ストレス症候群（haematological stress syndrom）」が多年間認められ、フィブリノーゲン、血液粘性増加および血小板数と活性の増加のような高急性期反応物をふくむ。内皮細胞、平滑筋細胞およびアテローム性動脈硬化症プラークのマクロファージによって産生されたサイトカインがアテローム性動脈硬化症でみられる急性期応答に寄与しうる。樹立した急性期タンパク質またはフィブリノーゲン、血清アミロイドＡ、ＰＡＩ−１、Ｌｐ（ａ）リポタンパク質およびＶＬＤＬトリグリセリドなどの心臓血管疾患に対する推定リスク因子に加えて、前炎症サイトカインが糖尿病合併症部位で、または内皮、平滑筋細胞およびマクロファージ上で働くことによってアテローム性動脈硬化症を悪化させうる糖尿病工程それ自身によって産生された。したがって、おそらくサイトカインおよびアテローム性動脈硬化症を含む正のフィードバックがあり、おそらく糖尿病での動脈性疾患の加速を止める。プラークはサイトカインを産生し、これはさらにアテローム性動脈硬化症の工程を局部的に悪化させ、しかしまた急性期タンパク質の循環の増加を引き起こし、これらの多くがそれ自身アテローム性動脈硬化症のリスク因子である。
【００５７】
手短に記すと、サイトカインおよび先天性免疫系はＩＩ型糖尿病およびアテローム性動脈硬化症の機能上の変化で中心的な役割を担う。ＩＲはそのような応答を調製する能力を持つので、これはＩＩ型糖尿病およびアテローム性動脈硬化症およびその合併症に有用でもある。さらにＩＲは、活性酸素種（ＲＯＳ）が重要な役割を果たしているＨＤ−ＳＴＺモデルにおける糖尿病のような疾患の誘導を遅延させることができ、したがってＩＲはまた直接的または間接的に坑オキシダントとして作用でき、またこのことが糖尿病および関連疾病の処置と防止に有用である理由である。さらに、本発明は本発明による方法によって選択された免疫レギュレータ、そのような選択された免疫レギュレータを含む医薬組成物を提供し、免疫仲介障害の処置のための医薬組成物の調製のための前記方法を提供する。生体活性ＩＲを含む分画を液体クロマトグラフィーによって均質に精製した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス補助レーザー質量脱着／イオン化−飛行時間）を用いてデータベーススクリーニングと組み合わせた質量分析計での直接の解析により、ＩＲまたは多重分子複合体でのその断片の特性化ができる。核磁気共鳴分光学がＩＲ中の水素原子への結合の型およびＩＲの分子構造の情報を提供する。赤外および近紫外分光はＩＲの構造的決定を補助する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＮＭＲ解析は分離、そして必要であれば生体活性ＩＲの二次的配列決定および合成を補足する。化学的変異挿入をＩＲの化学的組成物を変異させるように行い、バイオセンサーシステムのような好ましい検出系での定量的および定性的結合解析を行うことで、レセプター／アクセプターでの相互作用部位の正確なマッピングが可能である。
【００５８】
化学的、遺伝的修飾によるＩＲの誘導体を、ＩＲまたはＩＲ含有混合物の活性を実証する上記方法またはアッセイで、生物活性について再び試験した。さらに、本発明はＩＲのレセプターの存在の立証を提供する。（妊娠）尿の様々な分画、商業的ｈＣＧ調製品またはその断片、組換え体ｈＣＧまたはその断片に公知の量のＩＲを打ち込んだ。混合物をゲル浸透クロマトグラフィーにて解析し、加えたたＩＲとフリーのＩＲのない言及した試料と比較した。ＩＲピークのより大きい分子量分画へのシフトは、レセプター／アクセプターの存在を示唆している。（ＩＲをレセプター／アクセプターより置換した後の）ＩＲ活性についての分画を解析することはシフトしたＩＲピークを含むこの溶出プロフィールを検証した。シフトしたＩＲ活性を含む分画から、レセプター／アクセプターを液体クロマトグラフィーで精製し、置換によってＩＲの機能を検証した。さらにＩＲをヨウ素で処理し、第１トリメスター妊娠尿の分画、商業的ｈＣＧ調製品またはその断片および混合物へ打ち込み、還元および非還元下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）のような好ましい検出系で評価した。このようなゲルのブロットをＳＴＯＲＭ技術を用いて定量的蛍光体イメージング解析のような系で解析した。ＩＲをアフィニティークロマトグラフィーの方法によって結合している部分を単離することができる化学的架橋または担体タンパク質の使用によって、たとえばアフィジェル（Affigel）に固定化した。引き続く溶出で精製されたレセプター／アクセプター分子が得られる。このレセプター／アクセプターを可溶性または膜結合形態での細胞外および細胞内供給源より単離し、活性化したバイオセンサー表面に固定化した。ついで様々な濃度のＩＲをこのセンサー表面でプローブし、結果の結合プロフィールより結合速度定数および解離速度定数を決定し、親和定数を計算した。ＩＲおよびレセプター／アクセプターの異なる混合物のプローブ化によって、結合エピトープの特性の情報を得るためにエピトープマッピングを評価した。非疾病状態下およびＩＲの活性に関連ある様々な免疫および関連障害の間での細胞発現および組織分布を査定するために、膜結合形態でのＩＲレセプターの検出を可能にするために（たとえば蛍光および放射活性）標識化した。標識化ＩＲを用い、利用可能な精製したレセプターを得ることで、モノクローナル抗体および他の特異的試薬を可溶性ＩＲレセプターの測定のための定量的免疫アッセイの目的に添って生成した。組換え体ＤＮＡ技術をＩＲ産生原核生物および真核生物発現系をつくるのに使用した。レセプター／アクセプターでの相互作用部位の正確な同定を可能にしている結合プロフィールの変化を持つＩＲ変異体の作製のために部位特異的変異導入を使用した。遺伝子のクローニングに際し、ＩＲの構成性のおよび誘導可能な発現を持つトランスジェニックマウスおよびＩＲ遺伝子欠損マウスをバイオテクノロジーおよび遺伝子治療の領域へ踏み込むことを可能にするよう作成した。
【００５９】
精製したＩＲをモノクローナル抗体および／または他の特異的薬剤を産生するために使用し、したがってＩＲ特異的定量性免疫アッセイの設計が可能である。また単鎖Ｆv断片を、多量の異なる特異性からなるレパートリーを含むファージライブラリーを使用したファージディスプレイ技術を用いることで単離した。
本発明はさらに、それによって本発明を限定することなしに詳細な記述によって説明される。
【００６０】
詳細な記述
免疫レギュレータ（ＩＲ）
第１トリメスターの妊娠尿からのＩＲ−Ｕの精製（方法１）
第１トリメスターの妊娠尿（２リットル）を健常志願者から瓶に集め、２日以内に実験室に配送されるまで冷蔵した。配送された日に、１リットル当り１ｇのアジ化ナトリウムを加え、水酸化ナトリウムによってｐＨを７．２〜７．４に調整し、室温（ＲＴ）にて１時間沈殿させた。上清の７５％を静かに他に移し、沈殿物に近い残りの部分を遠心（４０℃、２５０００ｒｐｍにて１０分）して沈殿物を除き、残りの上清に加えた。０．４５（ｍ、ミニタンで）（ミリポア）の横断濾過によって上清を濾過した。続いて、１０ｋＤａで切り捨てるＹＭディオポア・メンブレンを備えたアミコン限外濾過装置で濾過物（２リットル）を濃縮した。最終容量（２５０ｍｌ）を１０リットルのミリＱ水で２回透析した。つぎに１０ｋＤａ切り捨てのアミコン限外濾過にて試料をさらに最終容量３ｍｌまで濃縮した。
【００６１】
ゲル透過
スーパーデックス７５ゲル透過カラムを備えたファルマシアＦＰＬＣシステムを用いて、処理した尿試料（ＩＲ−Ｕ）および市販のｈＣＧ製剤（ＩＲ−Ｐ）（プレグニル、オルガノン、オッス、ＮＬ）を分析した。操作条件はこの文書の他のところに示す。
【００６２】
第１トリメスターの妊娠尿からのＩＲ−Ｕの精製（方法２）
第１トリメスターの妊娠尿から低分子量分画を精製するために、５０ｍＭの重炭酸アンモニウムの中でＦＤＣ（登録商標）Ｇ２５を備えたＦＰＬＣシステムにて、５０ｍｌの尿を直接脱塩した。用いた操作条件を以下に示す。
【００６３】
【表１】
0004804626.tif 000002
【００６４】
第１トリメスターの妊娠尿からのＩＲ−Ｕの精製（方法３）
方法１および２から得たＩＲ−Ｕ（第１トリメスターの尿）を分析するために、本願発明者らは、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム中で、アルテックのミクロスフェアサイズ排除（ＧＰＣ）カラム６０Ａまたは３００Ａ（２５０ｘ４．６ｍｍ）を備えたシマズのＨＰＬＣシステムも用いた。両カラムの分離範囲はそれぞれ、２，８００〜２５０および１，２００，０００〜７，５００ダルトンであった。分離できる試料容量は１０〜５０ｍｌであった。流速は２５分間で０．３ｍｌ／分であった。外部分子量標準を用いて、カラムの溶出部位を補正した。用いたマーカーは、アプロチニン（６，５００Ｄａ）、チトクロームＣ（１２、４００）、炭酸脱水酵素（２９，０００）、アルブミン(６６，０００）およびブルーデキストラン（２，０００，０００）であった。
【００６５】
ＩＲのさらに異なった２つのｈＣＧ製剤を分析するために、ＩＲ−Ｐ（プレグニル、オルガノン、オッス、オランダ）およびＩＲ−Ａ（ＡＰＬ、ウエイス  エールスト、米国フィラデルフィア）を用いた。２つの方法によってＩＲ−Ｐをさらに分離した。スーパーデックス７５ゲル透過カラム（ＨＲ５／３０）（ファルマシア、スウェーデン）を備えたファルマシアＦＰＬＣシステムを用いて、ＩＲ−Ｐを分析した。カラム操作緩衝液には、５０ｍＭの重炭酸アンモニウムを用いた。このカラムの分離範囲は、球状タンパク質については１００，０００〜３，０００Ｄａの範囲である。処理試料容量は１ｍｌであり、流速は４５分間で０．５ｍｌ／分である。さらにミクロスフェアＧＰＣ６０Ａ（２５０ｘ４．６ｍｍ）も用いた。このカラムは、サイズによって除くクロマトグラフィによってタンパク質、ペプチドおよびその他の水溶性巨大分子を分離する。このカラムの分離範囲は、２８，０００〜２５０ダルトンだった。３つの選択された領域に分画され、分子量が見かけ上＞１０ｋＤａで溶出したＩＲ−Ｐ１、見かけの分子量１０ｋＤａ〜１ｋＤａで溶出したＩＲ−Ｐ２、および見かけの分子量が＜１ｋＤａで溶出したものである。
【００６６】
第１トリメスターの妊娠尿における低分子量分画（ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ）および市販のｈＣＧ製剤（プレグニル、ＡＰＬ）由来のＩＲの精製：方法４
手順  方法３によって第１トリメスターの妊娠尿および市販のｈＣＧ製剤から得た低分子量分画（＜２ｋＤａ）を凍結乾燥して、さらにバイオ−ゲルＰ−２カラム（９６ｘ１．５ｃｍ）上でゲル濾過クロマトグラフィによって分析した。分画（１３〜１７ｍｇ）を二重蒸留した水（８〜１２ｍｌ）に懸濁した。物質は完全には溶解しなかった。遠心分離（シグマ２０１、３０００ｒｐｍにて１０分）によって沈殿物（８〜１１ｍｇ）を上清から分離した。バイオ−ゲルＰ−２カラム上でのゲル濾過クロマトグラフィによって上清（６〜８ｍｌ）を分画した。流速１５ｍｌ／分にて水でカラムから溶出させた。ＬＫＢ２１４２差動屈折計およびＬＫＢユービコードＳＩＩ（２０６ｎｍ）にて溶出を監視した。ファルマシアＦｒａｃ１００フラクション・コレクタによって分画（２０分）を回収した。確かな分画をプールして凍結乾燥した。さらに抗ショック活性についてこのような分画を調べた。
【００６７】
ゲル透過：  スーパーデックス７５ゲル透過カラムを備えたファルマシアＦＰＬＣシステムを用いて、処理した尿試料（ＩＲ−Ｕ）および市販のｈＣＧ製剤（ＩＲ−Ｐ）（プレグニル；オルガノン；オッス、ＮＬ）を分析した。用いた操作条件を以下に示す。
【００６８】
【表２】
0004804626.tif 000003
【００６９】
陰イオン交換クロマトグラフィ：  重なり合った分画をさらに分離するために、１ｍｌのモノＱＨＲ５／５ＦＰＬＣ陰イオン交換クロマトグラフィを用いた。操作条件を以下に示し、緩衝液の組合せは、緩衝液Ａとして１０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．３および緩衝液Ｂとして１ＭのＮａＣｌを含有するＰＢＳから成っていた。
【００７０】
【表３】
0004804626.tif 000004
【００７１】
ＩＲ−ＵおよびＩＲ−Ｐのさらなる処理：  尿試料中に存在するタンパク質種の間の共有結合を減らすために、本願発明者らは、尿（ＩＲ−Ｕ）およびｈＣＧ製剤（ＩＲ−Ｐ）試料を１００℃にて６０ｍＭの２−メルカプトエタノールで３分間処理した。それに続いて、処理したＩＲ−ＵおよびＩＲ−Ｐ試料を同一条件でスーパーデックス７５カラムにかけた。
【００７２】
ＩＲ−ＵのＦＰＬＣ分画の活性測定：  １．４に分割してＯＤ２８０ｎｍにて尿分画のタンパク質濃度を測定した。１００(ｇに相当する５０００ＩＵ／ｍｌのプレグニルｈＣＧ製剤を用いて、この値からｈＣＧ単位の量を算出した。
【００７３】
ＩＲを精製するおよび／または単離するための別の方法には、たとえば、ＰＢＳを用いたＦＰＬＣシステムにおけるスーパーデックス７５カラムによるゲル濾過で、解像度を高め、それは疎水性相互作用を乱すためのエタノールと共に、またはそれを用いずに行い、必要に応じて後で陽イオン交換を行うことが含まれている。試料は還元型でも非還元型でも分析することができる。もう１つの方法には、その他の成分から炭水化物成分を上手く分離するためのレクチン・アフィニティカラムが含まれ、そのために溶出物をさらにゲル濾過にかける。もちろん、当該技術で既知の方法によって合成または組換え（ポリ)ペプチド配列を得る、および（合成）抗体、すなわち、ファージに由来した抗体を選択してさらにＩＲを選択することも可能である。
【００７４】
自己免疫疾患の実験：  非肥満型糖尿病（ＮＯＤ）マウスは自己免疫疾患のモデルであり、この場合はインスリン依存性の糖尿病（ＩＤＤＭ）となり、その主な臨床症状は血中グルコース濃度の上昇（高血糖）である。膵臓のランゲルハンス島においてインスリンを産生するβ細胞が免疫反応の仲介によって壊されることによって血中グルコース濃度の上昇が起きる（Bach et al. 1991, Atkinson et al. 1994)。この破壊には、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージおよび樹状細胞から構成される不均一な集団による膵島周囲および膵島の中への（膵島炎）大量の細胞浸潤が伴っている（O'Reilly et al. 199 1)。このようなマウスで糖尿病の発症を検知する最も早い信頼できる方法は、血液中のグルコース濃度を調べることである。
【００７５】
ＮＯＤマウスは、β細胞に対する自己免疫がＩＤＤＭ発生の最初の出来事であるというモデルである。一般に、疾患過程を惹起するにはＴリンパ球が中心的な役割を演じている(Sempe et al. 1991, Miyazaki et al. 1985, Harada et al. 1986, Makino et al. 1986)。糖尿病形成には、ヒトの疾患と同様に、独特なＭＨＣクラスＩＩ遺伝子と複数の連関していない遺伝子座との複合因子の相互作用が仲介している。さらに、ＮＯＤマウスでは遺伝と環境の重大な相互関係が見事に立証されている。住環境の清潔度の差異によって、環境因子が糖尿病を仲介する遺伝子の作用にいかに影響し得るのかが説明されている（Elias et al. 1994)。
【００７６】
ＮＯＤマウスで記録されている自己免疫に関しては、抗原特異的抗体およびＴ細胞反応のほとんどは、糖尿病個体の自己抗体としてこのような抗原が検出された後に研究されている。ＮＯＤマウスにおいてこのような自己抗原が演じている役割を理解することは、一義的な病原自己抗原と随伴現象である自己免疫とを区別できる可能性がある。さらに、ＩＤＤＭ患者は遺伝的にも、病原的にも不均一であることを念頭に置くべきである。
【００７７】
長期にわたる典型的なＮＯＤの膵臓の組織検査によれば、３〜４週齢で血管周囲に浸潤細胞が認められるが、６〜７週齢では膵島は典型的には依然としてきれいである。浸潤細胞は膵島を取り囲む、または一方の極に集積して膵島に達する。１０週齢から１２週齢の間に浸潤細胞は膵島に浸透し、膵島はリンパ球によって腫脹する。上述したように、住環境および微生物的および環境因子における差異が糖尿病感受性遺伝子の浸透度に影響を与え得る。
【００７８】
本願発明者らの掌中では典型的には１４〜１７週齢でＮＯＤマウスは糖尿病になる。しかしながら、これは研究室毎に異なっている（平均１４〜１９週齢）(Elias et al. 1994)。
【００７９】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は少なくとも２つの主なサブセットＴｈ１およびＴｈ２に分離することができる。活性化されたＴｈ１はＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを分泌し、一方Ｔｈ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１０を産生する。Ｔｈ１細胞は効果的な細胞性免疫の誘導に決定的に関与しているが、Ｔｈ２は、好酸球および肥満細胞の活性化およびＩｇＥの産生を含む液性および粘膜免疫およびアレルギーの誘導に役立っている(Abbas et al. 1996)。数多くの研究によって今やマウスおよびヒトの糖尿病とＴｈ１表現型の発生とが関連付けられている(Liblau et al. 1995, Katz et al. 1995)。
【００８０】
Ｔｈ２Ｔ細胞は相対的に無害であることが判っている。実際Ｔｈ２Ｔ細胞は防御的であると推測する者もいる。しかし、Ｋａｔｚらは、ＴＣＲ自体によって認識される抗原特異性を有さないが、Ｔ細胞応答の表現型的性質を有する、ナイーブなレシピエントに、ＣＤ４＋Ｔ細胞が糖尿病を移入させる能力を有することを明らかにした。ＮＯＤ新生児マウスに疾患を移入させたのはＴｈ１Ｔ細胞に強く偏っていて、Ｔｈ２Ｔ細胞は、糖尿病を起こすＴｈ１Ｔ細胞集団と同一のＴＣＲを有し、活性化されているにもかかわらず、疾患を移入させることはなかった。さらに、Ｔｈ１とＴｈ２とを共に移入した場合、Ｔｈ２細胞を１０倍多く移入してもＴｈ１が誘導した糖尿病をＴｈ２Ｔ細胞が改善することはなかった(Pakala et al. 1997)。
【００８１】
Ｔｈ１に分極したＴ細胞は、新生児ＮＯＤマウスに疾患を移入することができるが、Ｔｈ２に分極したＴ細胞はそれができず、Ｔｈ１に分極したＴ細胞およびＴｈ２分極したＴ細胞の両方では、ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスおよび免疫を抑制した受入者に疾患を移入することができる。ＮＯＤ．ｓｃｉｄ受入マウスにおけるＴｈ２が仲介する糖尿病は、長い糖尿病前期間があり、全体的な発症率は低かった。その上、Ｔｈ２による糖尿病病変は独特であり、新生児であれ、ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスであれ、自然発症の糖尿病またはＴｈ１誘導の糖尿病で見られる病変とは、全く異なっている(Pakala et al. 1997)。
【００８２】
さらに、ＩＦＮ−γは糖尿病に関わっており（ヒトと同様にＮＯＤにおいても）抗ＩＦＮ−γは糖尿病を妨害する；病気の状態で膵島にはＩＦＮ−γ＋細胞が存在し、抗原特異的Ｔｈ１クローンが糖尿病の発症を加速する(Pakala et al. 1997, O'Garra et al. 1997)。しかも、Ｔｈ２だけで新生児ＮＯＤに膵島炎を起こすが、免疫抑制されたＮＯＤ．ｓｃｉｄでは糖尿病を誘導する能力を有し、また抗ＩＬ−１０によって疾患は阻害されるが、抗ＩＬ−４では阻害されない(Pakala et al. 1997)。このことは非Ｔｈ２調節性Ｔ細胞が正常マウスには存在するが、免疫不全マウスではそのようなものは存在しないことを示唆している。このような結果は、活性化されたＴｈ亜集団の間の均衡を調節する細胞の存在を強調している。そのような調節性Ｔ細胞集団の改変された反応性によってこの均衡が乱されることによって免疫仲介性の疾患が起き、特定の極めて重要なサイトカインの欠如や過剰産生を招く可能性がある(O'Garra et al. 1997)。
【００８３】
自己免疫疾患の中には、特に慢性関節リウマチ（ＲＡ）のようなＴｈ１が仲介する疾患では（Grossman et al. 1997, Russel et al. 1997, Buyon et al. 1998, Hintzen et al. 1997)、妊娠期間中緩解する可能性のあるものがある。その上、妊娠が上手く行くことはＴｈ２型の現象である(Raghupath et al. 1997)。本願発明者らは、ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発生および管内モデルにおいてｈＣＧ製剤とそのプレグニル分画（オルガノン、Ｏｓｓ）について調べた。
【００８４】
驚くべきことに本願発明者らは、１５週齢のＮＯＤマウスにｈＣＧ製剤を週３回１ヵ月間腹腔内投与することによって、糖尿病の発症を遅らせる、または阻止することができるのを見い出した。さらに、このような処理をしたＮＯＤマウスの脾細胞を分画せずにＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスに移入することによってＮＯＤ．ｓｃｉｄにおける糖尿病の進行を遅らせる、または防ぐことができるが、処理していないマウスの脾細胞ではそのようなことはできない。この抗糖尿病効果はｈＣＧではなくて妊娠女性から得ることが可能な分画に存在する。
【００８５】
マウス  ＮＯＤマウスは本願発明者らの施設で、特定病原体未感染条件にて飼育された。本願発明者らのコロニーでは、糖尿病の自然発症は、１５週齢のメスで８５％である。ＮＯＤ．ｓｃｉｄも本願発明者らの施設で、特定病原体未感染条件にて飼育された。ＮＯＤから糖尿病誘発細胞を８週齢のＮＯＤ．ｓｃｉｄに移入すると２２日後に糖尿病を発症する。
【００８６】
糖尿病  アボット・メディセンス・プレジションＱ．Ｉ．Ｄ．糖質計を用いて静脈血の測定を行うことによって糖尿病を評価し、また糖尿を監視した（Gluketur試験；ベーリンガーマンハイム、マンハイム、ドイツ）。２回連続してグルコース測定値が１３．７５ｍｍｏｌ／ｌ（２５０ｍｇ／ｄｌ）より高い場合に動物は糖尿病であると見なされた。糖尿病の発症は、最初に連続して高い数値だった日付とした。＞３３ｍｍｏｌ／ｌの高血糖が持続する場合は、長期化した不快感を避けるために動物を屠殺した。
【００８７】
免疫組織化学  ＣＯ2によってマウスを窒息死させた。膵臓全体を切除し、凍結切片を作るためにＯＣＴコンパウンド（ティッシュ−テック）中で急速凍結した。５−(ｍの凍結切片を作成し、風乾して使用するまで−２０℃にて保管した。ホルマリン固定した切片についてキシレンとアルコールとにて脱パラフィンを行い、一般形態観察のためにヘマトキシリンとエオシンとで染色した。次いで、２工程プロトコールを用いてインスリンに関する免疫組織化学的検索を行った。内因性ペルオキシターゼ活性をブロックし、インスリンに対するウサギ抗血清と共にスライドをインキュベートした（カリフォルニア州、カーペンテリア、ダコ社、５％のマウス正常血清中で１：５００にて３０分）。洗浄工程の後、  西洋ワサビのペルオキシダーゼを結合した抗ウサギＩｇ（ダコ社、５％のＮＭＳにて１：５００で３０分）と反応させ、アミノ−エチル−カルバゾール（ＡＥＣ、ピアース）にて１０分間で発色し、クリスタルマウントに包埋した。
【００８８】
生体内の抗糖尿病効果：ＰＢＳ（ｎ＝４）、３００ＩＵのプレグニル（ｎ＝４）、または６００ＩＵのプレグニル（ｎ＝４）を週３回４週間にわたって１５週齢のＮＯＤマウスに腹腔内投与し、上述のように糖尿病を評価した。４週間後処置を止め、ＰＢＳ群および６００ＩＵのプレグニル群を１週間後に屠殺した。３００ＩＵのプレグニル群は、２８週齢になるまで生存させた。脾細胞の移入。６００ＩＵのプレグニル投与ＮＯＤおよびＰＢＳ投与対照ＮＯＤから脾臓を切除し、未分画脾細胞を回収した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２０ｘ１０6個の細胞を８週齢のＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスに腹腔内投与で移入した。
【００８９】
移入実験：
９週齢のＮＯＤマウスから未分画脾細胞を回収し、１０％のＦＢＳを添加したＲＰＭＩの中で管内にて３００ＩＵ／ｍｌのＩＲ−Ｐ、１００ｍｇ／ｍｌのＩＲ−Ｕ３−５またはＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦと共に、被覆した抗ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１；２５ｍｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２で刺激した。次いで５％ＣＯ2、３７℃にて４８時間プレートをインキュベートした。４８時間後、細胞をＰＢＳにて２回洗浄し、２０ｘ１０6個の細胞を８週齢のＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスに腹腔内投与によって移入した。
【００９０】
管内の再刺激：平底９６穴プレートにて、２０週齢のＮＯＤマウスから得た未分画脾細胞（１ｘ１０6個）を１０％のＦＢＳを加えたＲＰＭＩ中で、ＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ、１０(ｇ／ｍｌ）または被覆した抗ＣＤ３（１４５−２ｃ１１、２５ｇ／ｍｌ）と共に、様々な用量のｈＣＧ−プレグニル（５０、１００、３００、６００、８００ＩＵ／ｍｌ）、分画１〜２（２００ｇ／ｍｌ）、分画３〜５（２００ｇ／ｍｌ）、ヒト組換えｈＣＧ、α−ｈＣＧ、およびβ−ｈＣＧ（それぞれ２００ｇ／ｍｌ）を加えて刺激した。抗ＣＤ３を被覆したウエルにはＩＬ−２（４０ＩＵ／ｍｌ）を加えた。５％ＣＯ2、３７℃にて４８時間プレートをインキュベートした。４８時間のインキュベートの後、サイトカインの分析のために培養上清を回収した。
【００９１】
ＣＤ４＋Ｔ細胞を２０週齢のＮＯＤマウスの未分画脾細胞から単離し、様々な条件で上述のように抗ＣＤ３で刺激した。このような細胞にはＩＬ−２（４０ＩＵ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８（１０(ｇ／ｍｌ）を加えた。４８時間のインキュベートの後、サイトカインを分析するために培養上清を回収した。
【００９２】
ＣＤ４＋細胞がＴｈ１またはＴｈ２サイトカインエフェクター細胞に分化する可能性におけるＩＲの影響を調べるために、ＩＲの存在下または非存在下におけるＴｈの分極アッセイを行った。ＣＤ４＋細胞を精製するための原料として、８週齢のメスＮＯＤから得た未分画非細胞を用いた。Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球／マクロファージおよび顆粒球に特異的な抗体と共に補体を用いた除去による負の選抜によって、脾臓から精製ＣＤ４＋Ｔ細胞を得た。ＣＤ１１ｂ、Ｂ２２０、ＣＤ８およびＣＤ４０に対するビオチン化モノクローナル抗体のカクテルおよび、その後にストレプトアビジン結合微小ビーズ（ミルテニー・バイオテック、Bergisch Gladbachドイツ）とインキュベートし、磁気活性化細胞分画装置を用いて細胞をさらに精製した。実験に用いたＣＤ４＋細胞はフローサイトメトリーで確定したように常に９０〜９５％精製されていた。最初の刺激については、精製したＣＤ４＋Ｔ細胞を平底９６穴プレートにて（米国、イリノイ州、ネーパービル、ナルジ  ヌンク社）１ｘ１０5個／ウエルにて培養し、プレートに結合した抗ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１、２５ｍｇ／ｍｌ）、抗ＣＤ２８、およびＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）と共に刺激した。Ｔｈ１細胞の分化については、抗ＩＬ−４モノクローナル抗体（１１Ｂ１１、１０ｍｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）を培養に加えた。Ｔｈ２の感作は、ＩＬ−４（３５ｎｇ／ｍｌ）および抗ＩＦＮ−γモノクローナル抗体（ＸＭＧ  １．２、５ｍｇ／ｍｌ）で行った。さらに、Ｔｈ１およびＴｈ２を感作する条件では、阻止抗体、抗ＩＬ−１０（１０ｍｇ／ｍｌ）、抗ＴＧＦｂ（１０ｍｇ／ｍｌ）、およびＶｉｔＤ３（１０ｍｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下における３００ＩＵのＩＲ−Ｐおよび１００ｍｇ／ｍｌのＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦで行った。未感作の培養には抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８およびＩＬ２だけが含有された。用量はすべて予備実験で最適化したものであった。４日間の培養の後、細胞を３回洗浄し、新しく抗ＣＤ３を被覆した９６穴プレートに移し、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）と抗ＣＤ２８（１０ｍｇ／ｍｌ）との存在下で再刺激した。４８時間後、培養上清を回収し、Ｔｈ１対Ｔｈ２の分極を読み取るものとして、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−４、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０の産生を測定した。
【００９３】
生体外でのＮＯＤにおけるサイトカイン実験
げっ歯類では、抗体産生におけるＩｇＭからＩｇＧなどのクラスへのスイッチは主としてサイトカインが仲介するＴ細胞の制御下にあると思われる。優勢なＴｈ１への分極は、大量のＩＦＮ−ガンマ産生の影響下、ＩｇＭ産生からＩｇＧ２ａへのＢ細胞のクラススイッチを仲介するが、Ｔｈ２への分極はＢ細胞においてＩｇＧ１産生へのアイソタイプスイッチを誘導する。本願発明者らは、８〜１０週齢のＮＯＤマウスに、ＰＢＳ（ｎ＝５）、またはＩＲ−Ｐおよびその分画ＩＲ−Ｐ１、ＩＲ−Ｐ２、ＩＲ−Ｐ３、または組換えｈＣＧ（ｒｈＣＧ）およびＩＲ−Ｐ３との併用でのｒｈＣＧをそれぞれ２００ｍｇ３日間腹腔内投与した。未分画非細胞を全群から分離し、ＬＰＳまたは被覆した抗ＣＤ３で上述のように刺激した。様々な時点でサイトカインおよび増殖を以下のように測定した。すなわち抗ＣＤ３刺激の増殖（ｔ＝１２、２４、４８時間）、抗ＣＤ３刺激のＩＦＮ−ガンマ（ｔ＝２４、３０、４８時間）、ＬＰＳ刺激のＩｇＧ２ａ産生（ｔ＝７日）である。Ｔｈ１への分極におけるＩＲ処理の効果を調べるために、本願発明者らは、ＣＤ４＋細胞を単離し、上述のようにＴｈ１分極アッセイを行った。
【００９４】
ＢＡＬＢ／ｃにおける実験
その有益な臨床効果からＩＲの免疫調節活性を分離するために、本願発明者らは健康なＢＡＬＢ／ｃマウスに３００ＩＵのＩＲ−Ｐまたは１００ｍｇ／ｍｌのＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ（ｎ＝５）を腹腔内投与した。この系統は一般に、Ｔｈ２に由来する免疫応答による刺激に反応すると考えられている。ＩＲによる４日間の刺激の後、上述したようなＴｈの分極について対照およびＩＲ−Ｐ処理マウスから得た精製ＣＤ４＋脾細胞を分析した。脾臓ＡＰＣによって産生されるサイトカインのレベルにおけるＩＲ−Ｐの影響を調べるために、対照とＩＲ−Ｐ処理ＢＡＬＢ／ｃマウスから得た脾細胞を管内にてＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ０２６：Ｂ６；１０ｍｇ／ｍｌ、米国ミシガン州デトロイト、ディフコ・ラボラトリーズ）で刺激した。４８時間のインキュベートの後、サイトカイン分析（ＩＬ−１２ｐ７０、  ＩＬ−６）のために培養上清を回収した。
【００９５】
ＩＬ−１０ノックアウトマウス実験
ＩＬ−１０遺伝子を遺伝子ターゲットされたマウス（ＩＬ−１０ノックアウト）におけるＩＲ−Ｐの影響を生体内で調べるために、本願発明者らはそのようなマウス（ｎ＝２）に連続４日間、１日当り３００ＩＵのＩＲ−Ｐを腹腔内投与した。  処理の４日後、脾細胞とリンパ節の細胞を回収し、ＬＰＳおよび抗ＣＤ３に応答して増殖する能力を調べた。さらに、対照およびＩＲ−Ｐ処理マウスからＣＤ４＋細胞を精製し、上述のようなＴｈ分極の能力を分析した。
【００９６】
ＮＯＤの骨髄細胞浮遊液
骨髄（ＢＭ）に由来する樹状細胞（ＤＣ）におけるＩＲ−Ｐが誘導する効果を調べるために、９週齢のメスＮＯＤマウス（ｎ＝２）の骨髄を分離し、２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ（２．０ｘ１０5個／ｍｌ）と共に６日間インキュベートし、７日目に３００ＩＵ／ｍｌのＩＲ−Ｐまたは１００ｍｇ／ｍｌのＩＲ−Ｕ（ＩＲ−Ｕ、ＩＲ−Ｕ−Ｆ３−５（スーパーデックス７５に由来する）、またはＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ（ＦＤＣ−由来））と共にさらに２４時間インキュベートした。手短に言えば、大腿骨および脛骨から筋肉と腱を外し、ＤＢＳＳ−ＦＣＳを用いて乳鉢で砕いた。２２ゲージの針を介して２ｍｌの注射筒に吸引することによって単一細胞の浮遊液を得、その後ナイロンフィルター（網目サイズはそれぞれ１００および３０ｍｍ、オランダ、アムステルダム、ポリモンＰＥＳ、カーベル）にて細胞浮遊液を２回こした。さらに、ＤＣの成熟にＩＲが影響を与えるのかどうかを知るために、ＮＯＤマウスのＢＭも直接ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＲと共に７日間培養した。８日目に以下のマーカーの発現についてフローサイトメーターにて細胞を分析した。すなわちＣＤ１ｄ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＥＲ−ＭＰ２０、ＥＲ−ＭＰ５８、Ｆ４／８０、Ｅ−ｃａｄ、ＭＨＣ  ＩＩ、ＭＨＣ  Ｉ、ＲＢ６  ８Ｃ５である。９週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３）からのＢＭ細胞でも同様の実験を行った。
【００９７】
同種混合リンパ球反応（ＭＬＲ）：
移植の拒絶におけるＩＲの免疫抑制活性を調べるために、本願発明者らは同種ＭＬＲを行った。９週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３）のＢＭ細胞を上述のように分離し、（組換えマウス）ｒｍＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＲ（ＩＲ−Ｐ  ３００ＩＵ／ｍｌ、ＩＲ−Ｕ  ３００ｍｇ／ｍ、ＩＲ−Ｕ３−５  ３００ｍｇ／ｍｌ、ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ  ３００ｍｇ／ｍｌ）で７日間処理した。７日後生じたＤＣを放射線処理（２，０００ラド）、９週齢のメスＣ５７ＢＬ／Ｌｙから分離したＣＤ３＋脾細胞と共に培養した。このようなＣＤ３+細胞とＤＣ細胞とを様々な比で培養し、［3Ｈ］ＴｄＲの取り込み（培養の最後の１６時間に０．５ｍＣｉ／ウエル）によってＴ細胞の増殖を測定した。
【００９８】
サイトカインのＥＬＩＳＡ：ＩＬ−４は捕捉抗体としてモノクローナル抗ＩＬ−４抗体（１１Ｂ１１）を用いて検出し、ビオチン結合ラット抗マウスＩＬ−４モノクローナル抗体（ＢＶＤ６  ２４Ｇ２．３）で明らかにした。ＩＦＮ−γは捕捉抗体としてモノクローナル抗ＩＦＮ−γ抗体（ＸＭＧ１．２）を用いて検出し、またビオチン結合ラット抗マウスＩＦＮγモノクローナル抗体（Ｒ４６Ａ２）で明らかにした。両者ともに検出にはＡＢＴＳ基質を用いた。
【００９９】
ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−４およびＩＦＮ−ｇについてサイトカイン特異的捕捉抗体をＰＢＳで希釈して（それぞれ、２０Ｆ３およびＳＸＣ−１は１ｍｇ／ｍｌ、１１Ｂ１１およびＸＮＧ１．２は５ｍｇ／ｍｌ）、平底マイクロプレート（米国、オックスナード、ベクトン・ディッキンソン、９６穴、ファルコン３９１２、マイクロテストＩＩフレキシブル・アッセイプレート）を４℃にて１８時間被覆した。被覆後、プレートを洗浄（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン２０）し、１％ＢＳＡを添加したＰＢＳで室温にて１時間ブロックした。洗浄した後、試料および標準液を加え、室温にて少なくとも４時間インキュベートを継続した。その後、ビオチン化した検出抗体（３２Ｃ１１（ＩＬ−６）およびＲ４６Ａ２（ＩＦＮγ）は１ｍｇ／ｍｌ、２Ａ５．１（ＩＬ−１０）およびＢＶＤ６．２４Ｇ２（ＩＬ−４）は０．１ｍｇ／ｍｌ）を加え、４℃にて一晩インキュベートした。洗浄後、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（１／１５００希釈、米国、ペンシルベニア州、ウエストグローブ、ジャクソン・イムノリサーチ）を加えた。１時間後、プレートを洗浄し、２，２’−アジノ−ビス−３−エチルベンソ−チアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ，１ｍｇ／ｍｌ、米国、ミズーリ州、セントルイス）を用いて反応を視覚化した。タイターテック・マルチスキャン（米国、レッドウッドシティ、フローラボ）を用いて４１４ｎｍにて光学密度を測定した。ＩＬ−１２ｐ７０、ＴＮＦ−ａおよびＴＧＦ−ｂについては、市販のＥＬＩＳＡキットによって製造者が提供しているプロトコールに従って測定した。
【０１００】
敗血症または敗血症性ショックに関する実験：
敗血症または敗血症性ショックを調べるには３つの一般的なマウスモデルがある。すなわち高用量のＬＰＳ、Ｄ−ガラクトサミンの感作と併用した低用量ＬＰＳおよびＤ−ガラクトサミンと併用した低用量のスーパー抗原である。
【０１０１】
敗血症または敗血症性ショックを調べるために用いられる最初のモデルの１つには、腹膜腔間にかなり大量のＬＰＳ（３００〜１２００(ｇの間）を投与することが含まれていた。マウスは細菌毒素には完全に抵抗性でもこの高用量には屈する。マウスにおける高用量のＬＰＳはヒトでの低用量に相関することが示唆されている(Mietheke at al.)。ヒトにおける敗血症または敗血症性ショックの７０％は、グラム陰性細菌の内毒素によって引き起こされ、３０％はグラム陽性細菌から放出される外毒素によって起きる。グラム陰性細菌の細胞膜に結びついた従来の内毒素、独特のリポ多糖類は、敗血症または敗血症性ショックの病因カスケードの最も共通したイニシエータを意味している。内毒素分子は、抗原性や構造上多様な一連のオリゴ糖類でできた外核、グラム陰性細菌の間で共通の類似性を持つオリゴ糖類の内核、および細菌種に高度に保存されている核脂質Ａから成っている。脂質Ａが内毒素の毒性を示す多くの特性に関与している。ＬＰＳのような内毒素の全身性の影響は、内毒素感受性のマクロファージを養子移入すると内毒素抵抗性であったマウスが毒素に感受性になるので、主としてマクロファージが仲介すると思われる(Freudenberg et al. 1986)。
【０１０２】
内毒素による敗血症または敗血症性ショックのさらによく用いられるモデルは、ガラクトサミンで同時に処理（Ｄ−Ｇａｌ感作）した後、低用量のＬＰＳにＢＡＬＢ／ｃマウスが感受性になることを上手く利用している。このＤ−Ｇａｌ処理によって動物はＬＰＳの毒性効果に劇的に感受性となり、ナノグラム量で野生型動物が６〜７時間で致死となるような毒性を肝臓に誘発することができる。この内毒素の全身性の効果には主としてマクロファージが介在していると思われる(Gutierrez-Ramos et al. 1997)。敗血症を生じるのは特定の伝達物質がさらに重要であることは疑いもないが、おそらく相互作用し、促進し、互いに阻害しあう多数の生物および宿主に由来する伝達物質が敗血症または敗血症性ショックの病因に関与している。
．ＬＰＳ、ＴＮＦおよびその他の伝達物質に対する反応において、内皮細胞およびマクロファージは、強力な血管拡張物質、内皮由来血管弛緩因子（ＥＤＲＦ）を放出することができ、それは最近、酸化窒素であることが同定された。この分子は、平滑筋の弛緩および強力な血管拡張を起こす。酸化窒素シンターゼの競合阻害剤によって酸化窒素の産生を阻害すると、内毒素ショックに陥った動物の血圧が上昇するという結果を招く。このことは、酸化窒素が敗血症による低血圧に部分的に関与することを示唆している。酸化窒素の阻害によって血圧が回復することはないが、そのような阻害によって組織の血流が低下する可能性がある(Bennett et al.)。
【０１０３】
内毒素はまた、通常、補体活性化第2経路を介して補体カスケードを活性化することができる。これはアナフィラトキシンＣ３ａおよびＣ５ａの放出を招き、それらは血管を拡張し、血管透過性を高め、血小板を凝集し、好中球を活性化し、凝集することができる。このような補体に由来する伝達物質は、敗血症または敗血症性ショックに関連する微細血管の異常に部分的に関与している。さらに内毒素は、第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）、カリクレインおよびキニノゲンの活性化を介したブラジキニンの放出を招く。ブラジキニンも血管拡張剤であり、血圧降下物質である。ＬＰＳによる第ＸＩＩ因子の活性化によって、内因（マクロファージおよび内皮細胞が放出する組織因子を介して）および外因の凝固経路の活性化が導かれる。これは凝固因子の消費およびＤＩＣを招く。ＴＮＦも外因経路を活性化し、このような凝固の異常に寄与している可能性がある。
【０１０４】
アラキドン酸カスケードの様々な代謝によって血管拡張（プロスタサイクリン）、血管収縮（トロンボキサン）、血小板の凝集、または好中球の活性化が起きることも知られている。実験動物では、シクロオキシゲナーゼまたはトロンボキサン・シンターゼを阻害することによって内毒素ショックを防御してきた。敗血症の患者では、高レベルのトロンボキサンＢ２（ＴＢＸ２）および６−ケトプロスタグランジンＦ１（プロスタサイクリン代謝の最終産物）が存在する。数多くのサイトカインは内皮細胞または白血球からこのようなアラキドン酸代謝物の放出を起こすことができる。
【０１０５】
同様のやり方で、内毒素ショックモデルＤ−Ｇａｌ感作ＢＡＬＢ／ｃマウスを低用量のＴＳＳＴ−１またはＳＥＢで処理する。このようなスーパー抗原は、Ｔ細胞の大きな集団の増殖および活性化を刺激する。実際、このようなスーパー抗原で誘導されたＴ細胞の活性化は、ほとんどポリクローン性Ｔ細胞の活性化と見なされ、特異的なＶベータファミリーを発現しているＴ細胞はすべて、ＴＣＲ／ＭＨＣＩＩ／およびスーパー抗原による抗原非特異的結合を介して活性化される（図１４）。
【０１０６】
Ｄ−ガラクトサミンは、肝臓を標的とする転写阻害剤であることが判っており、急性期タンパク質の合成を妨害する。実際このような急性期タンパク質は肝臓がＴＮＦαを解毒する／失活させるのに役立っていると考えられている。実際、低用量内毒素モデルまたは外毒素モデルにおけるＤ−ガラクトサミン処理には、ＴＮＦα仲介肝臓アポトーシスが伴っている。Ｄ−ガラクトサミン単独による処理では肝臓のアポトーシスは起きず、このような臓器を損傷する作用は、低用量の両モデルでは抗ＴＮＦα抗体によって中和することができる(Gutierrez-Ramos et al. 1997)。
【０１０７】
敗血症および敗血症性ショックの実験に用いたマウス：８〜１２週齢のメスＢＡＬＢ／ｃおよびＳＪＬマウスを全実験に用いた。欧州実験動物科学協会（ＦＥＬＡＳＡ）、動物の健康に関するワーキンググループの報告（Laboratory Animals 28:1-24, 1994)に記載されたプロトコールに従って、特定病原体未感染条件下、本願発明者らの施設で動物を飼育した。
【０１０８】
注射用プロトコール：毒性ショック（ＴＳＳＴ−１およびＤ−ガラクトサミン）(ｎ＝６）。
【０１０９】
外毒素モデル用には、１００μｌの滅菌食塩水（９％）に溶解した２０ｍｇのＤ−ガラクトサミンを、Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に注射した。次いでそれらに、１００μｌの滅菌食塩水に溶解した４μｇのＴＳＳＴ−１を、各肩甲骨の下約０．５ｃｍの２ヵ所に皮下注射した。対照群には、 Ｄ−ガラクトサミンを用いずに４μｇのＴＳＳＴ−１を皮下注射するか、またはＤ−ガラクトサミンのみを用いて処理した。また、Ｄ−ガラクトサミンで感作されたＢａｌｂ／ｃマウスの一群は、ＴＳＳＴ−１処理前の３日間にわたり、７００ＩＵのＩＲ−Ｐを用いて腹腔内に前処理した。
【０１１０】
ＬＰＳモデル（ｎ＝６）
内毒素モデル用には、Ｂａｌｂ／ｃおよびＳＪＬマウスを、６００μｇのＬＰＳを用いて腹腔内に処理した。対照群はＰＢＳのみを用いて腹腔内に処理した。ＩＲ−Ｐの効果を検査するため、本願発明者らはＢａｌｂ／ｃおよびＳＪＬマウスに、７００ＩＵを用いて３日間前処理し、次いで６００μｇのＬＰＳを用いて注射した。さらにまた、Ｂａｌｂ／ｃマウスの一群に、ＩＲ−Ｕ分画（ＩＲ−Ｕ１、ＩＲ−Ｕ２、ＩＲ−Ｕ３〜５）を各々２００μｇの同一用量を用いて３日間にわたり腹腔内に前処理し、次いで６００μｇのＬＰＳを注射した。低分子量分画を検査するため、本願発明者らはＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ（ＩＲ−Ｕ５（＜１０Ｋｄａｌ＞分画も含む）、ＩＲ−Ｐ３（方法３によって入手された）、ＩＲ−ＡならびにＩＲ−Ａ３（方法３によって入手された）、および方法４によって入手されるたそれらの分画について、抗ショック活性を検査した。加えて、本願発明者らはペプチドカラムからの３つの分画（Ｆ１〜３）の抗ショック活性についても調べた（方法は本文書の他の箇所に示されている）。また、本願発明者らはＢａｌｂ／ｃマウスを、ＬＰＳの注射の１および２時間後に、各々７００ＩＵのＩＲ−Ｐを用いて２回腹腔内に処理した。
【０１１１】
疾病の半定量的測定：以下の測定基準を用いてマウスの疾病レベルを採点した。
１  毛皮からの浸出あり、正常なマウスとの行動の差異は検出されず。
２  毛皮からの浸出あり、寄せ合い反射あり、刺激（ケージの軽打等）に対し反応、取扱い時は健康なマウスと同様に活動的。
３  ケージの軽打に対して遅い反応、取扱い時は無抵抗または従順だが、新しい環境に単独で置かれた場合の好奇心は残存。
４  好奇心の欠如、刺激に対しごくわずかに反応するかまたは無反応、全く不動。
５  呼吸困難、仰臥位にされた後の自動復元は不能または遅鈍（瀕死、犠牲にされた）。
【０１１２】
ＷＢＣおよび血小板のカウント： ＴＳＳＴ−１モデルからは、２４時間の時点において、一群当り無作為に選ばれた２匹のマウスから、１００μｌの血液を尾部出血法を用いて入手した。ＥＤＴＡチューブに全血を集め、自動化された血液学分析器にて分析した。
【０１１３】
ショックについてのデータ
動物および処理：ハーラン（Harlan）から入手した８〜１０週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを本研究に使用した。動物を殺し、肝臓および脾臓を以下に示したように切除し、さらなる研究用とした。マウスの取扱いならびに実験方法は、動物の保護および使用に関する米国実験動物保護認定協会ガイドライン（American Association of Accreditaion of Laboratory Animal Care guidlines for animal care and use）に従って行なった。
【０１１４】
注射のプロトコール： 大腸菌からのＬＰＳ（シグマケミカル社（Sigma Chemica Co））を、１５０ｍｇ／ｋｇにて腹腔内に投与し、高用量ＬＰＳショックモデル用とした。ＩＲの効果を検査するべく、マウスにＩＲ−Ｐ（プレグニル（Pregnyl)；オルガノン（Organon)；オランダ、オス（Oss) ）およびその分画であるＩＲ−Ｐ１、ＩＲ−Ｐ２、ＩＲ−Ｐ３、およびＩＲ−Ａ３（APL；ワイイス・アイヤスト（Wyeth Ayerst）、米国ペンシルベニア州、フィラデルフィア）の各々２００ｍｇの同一用量を用い、３日間にわたり（ｔ＝−３、ｔ＝−２、ｔ＝−１）腹腔内に前処理し、次いでＬＰＳをｔ＝０において注射した。またマウスの一群には、ＬＰＳ注射の１および２時間後の２回にわたり、各々ＩＲ−Ｐまたはデキサメタゾンを用いて腹腔内に処理した。
【０１１５】
血液検査：各群の血液を、各時点（ｔ＝−７２時間、−１時間、および４８時間）において、３匹のマウスの尾部出血により回収し、白血球、血小板、血漿酵素ＬＤＨ、ＡＬＡＴ、およびＡＳＡＴの慣例的な測定用としてプールした。次にマウスを犠牲にし、肝臓および脾臓を切除し、以下に示したように研究した。
【０１１６】
移植モデル：
動物および処理：ＩＲ−Ｐが同種移植片を保護することが可能かどうかを決定するべく、本願発明者らはＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）に、腹腔内に１日当り６００Ｉ．Ｕ．のＩＲ−Ｐか、あるいはＰＢＳを用いて、２日間にわたり処理した。３日目に、Ｃ５７ＢＬ／６ドナーの尾部の皮膚を、ＩＲ−ＰまたはＰＢＳで処理したＢＡＬＢ／ｃレシピエントの背側胸部に、ビリンガムおよびメダワー（Billingham and Medawar)の方法の変法を用いて移植した。移植片は、ドナーの生存可能な皮膚／毛髪が検出されない場合に拒絶されたとみなした。移植の後、ＩＲ−Ｐで前処理されたＢＡＬＢ／ｃレシピエントには、さらなる２日間の処理を行なった。
【０１１７】
ＥＡＥモデル（ＭＳ）
ＥＡＥの誘導。８〜１２週齢のメスのＳＪＬマウス（ｎ＝５）を、５０ｍｌ（０．５ｍｇ／ｍｌ）のＰＬＰ−ペプチドを用いて４ヵ所の異なる場所に免疫化した（ｔ＝０）。２４時間後、１０10個の百日咳菌を尾部に、ｉ．ｖ．（静脈内）に注射した。続いて、７２時間後に（ｔ＝３）、百日咳菌によりマウスを再度免疫化した。７日目よりマウスを秤量し、毎日ＥＡＥの臨床徴候を以下のように０〜５の段階に等級づけた。
【０１１８】
ＥＡＥの等級        症状
０                  徴候なし
０．５              不全麻痺または部分的な尾部の麻痺
１                  完全な尾部の麻痺
２                  不全対麻痺；四肢の弱まりおよび尾部の麻痺
２．５              部分的な四肢の麻痺
３                  完全な後肢または前肢の麻痺
３．５              対麻痺
４                  四肢の麻痺
５                  死亡
【０１１９】
ＩＲ処理：一群のマウスにはまた８日目から１日当り６００Ｉ．Ｕ．のＩＲ−Ｐを週３回、腹腔内に２週間にわたって処理し、対照群には同じ体積のＰＢＳを用いて処理した。
【０１２０】
ストレプトゾトシンモデル：
ストレプトゾトシンの注射。多様な用量のストレプトゾトシン（ＭＤ−ＳＴＺ）モデル用には、２５ｍｇ／ｋｇのＳＴＺ（シグマ）をクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、可溶化後５分以内に、先に記述したように腹腔内に注射した。６〜９週齢のオスのマウスに、連続して５日間（実験の１日目から５日目まで）注射した。連続５日間のＳＴＺの後、ＩＲ−Ｐ（６００Ｉ．Ｕ．を腹腔内に）（ｎ＝５）またはクエン酸緩衝液（ｎ＝５）を用い、週４回、３週間にわたってマウスを処理した。高用量のストレプトゾトシン（ＨＤ−ＳＴＺ）モデル用には、ストレプトゾトシン（１６０ｍｇ／ｋｇ）の単回の腹腔内投与により、マウスに高血糖症を誘導した。対照群のマウスは、相応する体積のクエン酸緩衝液のみを受けた。
【０１２１】
結果
ｈＣＧ分画の製剤および特徴づけ。１または２バイアルの工業用等級のｈＣＧ−プレグニル（５，０００ＩＵ／バイアル）溶液のゲル濾過を、セファデックス（Sephdex）７５カラム（ＨＲ５／３０）（ファルマシア（Pharmacia）、スウェーデン）を装備したファルマシアＦＰＬＣシステムにおいて行なった。処理試料容量は１ｍｌであった。流速は、以後の４５分間は０．５ｍｌ／分であった。高い乳糖含有量を有する工業用等級のｈＣＧ溶液の粘性のため、０．２ｍｌ／分の流速を１分間実行した。ｈＣＧの比較的精製されたプレグニル製剤には、ｈＣＧおよびごく少量のｈＣＧコアフラグメントが存在しており、それらの位置を内部のサイズマーカーとして使用した。ｈＣＧはゲル濾過において７８ｋＤａの分子として溶出され、ｈＣＧのβ−コアは１９ｋＤａの分子として溶出された。１〜５の分画が集められ、分画１〜２はｈＣＧを含んでおり、分画５はｈＣＧ（コアフラグメントなし）を含んでいた。分画１〜２および分画３〜５の抗糖尿病効果について、２０週齢のＮＯＤの全脾臓細胞を管内で処理し、かつそれらをＮＯＤ．ｓｃｉｄに移植することによって検査した。この方法により、ヒトの組換えｈＣＧ、α−ｈＣＧ、およびβ−ｈＣＧ（シグマ（Sigma)、米国ミズーリ州、セントルイス）についても検査した。
【０１２２】
ＩＲ−ＵおよびＩＲ−Ｐのゲル浸透：図１５は、未希釈のＩＲ−Ｕ試料の５０μｌのＦＰＬＣクロマトグラムを表している。流出緩衝液はＰＢＳであった。クロマトグラムは、７０、３７、１５、および１０ｋＤａに４つの主要なピークを示した。これらのピークを同定するべく、ＩＲ−Ｐ（プレグニル)の５００μｌの試料（５０００ＩＵを含んでいる）を、同様の流出条件下に同一のカラムに適用した。得られたプロフィール（図１６）もまたこれらの４つのピークを示したが、その比率は異なっていた。ピーク分画２は（α／β）ヘテロダイマーｈＣＧ（３７ｋＤａ）を表わし、一方分画３は個々の鎖か、これらの鎖かまたはβ−コアの残存鎖のホモダイマー、および他の分子（１５〜３０ｋＤａ）を表す。これらの結果から本願発明者らは、最初の３半期の尿が同一の４つの主要なタンパク質を含んでおり、それらは予期されたように工業用のｈＣＧ製剤にも存在していると結論した。本願発明者らはこれらを（ＩＲ−Ｐ１、ＩＲ−Ｐ２、ＩＲ−Ｐ３〜５（プールされた））、（ＩＲ−Ｕ１、ＩＲ−Ｕ２、ＩＲ−Ｕ３〜５（プールされた））と名付けた。分画５はタンパク質を含まないか、または１０ｋＤａより小さい分子量のタンパク質を含む。さらに、重複している分画２および３は、ＩＲ−Ｕと同様にＩＲ−Ｐにも見られ、これによりこれらの分画中に共有結合によって結合しているタンパク質種が存在することが示唆された。
【０１２３】
陰イオン交換クロマトグラフィーならびにＩＲ−ＵおよびＩＲ−Ｐのさらなる処理：
重複している分画２および３のさらなる分離を、１ｍｌのＭＯＮＯ  Ｑ  ＨＲ５／５陰イオン交換カラムにおいて行なった。図１７は、ＰＢＳにて１：２０に希釈された５０μｌのＩＲ−Ｕのクロマトグラムを表す。二つの主要なタンパク質ピークが４３％および５５％の緩衝液Ｂにおいて溶出されたが、分離はされず、これらのタンパク質間の共有結合が示唆される。５０％緩衝液Ｂを用いて保持する不連続溶出勾配を用いても、これらのピークが分離する結果にはならなかった（データは示さず）。したがって本願発明者らは、尿試料中に存在するタンパク質種の共有結合のため、さらなる精製にはイオン交換クロマトグラフィーが使用できないことを結論づけた。
【０１２４】
ＩＲ−Ｕ試料中に存在する主要なタンパク質種の間に推定される共有結合を減じるべく、本願発明者らは６０ｍＭの２−メルカプトエタノールを用いて１００℃にて３分間試料を処理し、次いで試料を同等の条件下にセファデックス７５カラムに適用した。図１８は、ピーク１（７０ｋＤａ）が残存しており（図１５〜１７も参照のこと）、分画２（ｈＣＧを表す、３７ｋＤａ）はほとんど消失し、低分子（＜１０ｋＤａ）の二つの新たなピークを生じる結果となったことを示している。ピーク３は残存し、したがって単離されたベータ−コアおよび単量体タンパク質を過剰に含むようである。ピーク４（１０ｋＤａ）はもまた還元処理により消失した。
【０１２５】
同様の還元処理をＩＲ−Ｐの試料（プレグニル）に適用した。同様に処理されたＩＲ−Ｕ試料のプロフィールと同じように、ｈＣＧ（図１９）はピーク２の減少、ピーク３の増加を示し、一方新たなタンパク質ピークがピーク１と２の間に現われた。さらに、破壊産物のピーク（＜１０ｋＤａ）の増加も明らかであった。
【０１２６】
移入実験：
全脾臓細胞を９週齢のＮＯＤから回収し、１０％ＦＢＳを追加したＲＰＭＩ＋中の管内において、３００ＩＵ／ｍｌのＩＲ−Ｐ、１００ｍｇ／ｍｌのＩＲ−Ｕ３〜５またはＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦと共に、被覆された抗ＣＤ３（１４５−２ｃｌｌ；２５ｍｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）を用いて刺激した。次いでプレートを、空気中５％ＣＯ2下に、３７℃にて４８時間インキュベートした。４８時間後、細胞をＰＢＳにて２回洗浄し、２０x１０6細胞を８週齢のＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスに腹腔内に移入した。
【０１２７】
生体内におけるＩＲの抗糖尿病効果：４匹の１５週齢のメスのＮＯＤマウス（ｎ＝４）を、ＰＢＳ，３００ＩＵのプレグニル、または６００ＩＵのプレグニルを用い、週３回、４週間にわたって腹腔内に処理した。処理の後、ＰＢＳの群の全てのマウスは糖尿病であり（血糖＞３３ｍｍｏｌ／ｌ）、体重が減少し、不具合の様子であったが、一方３００ＩＵのプレグニル、および６００ＩＵのプレグニルの群では疾病のないままであった。それらの血糖値は６ｍｍｏｌ／ｌを超えることはなく、非常に健康そうに見えた（図１および３）。膵臓における浸潤の可能性およびインタクトなインスリン産生細胞を評価するべく、ＰＢＳおよび６００ＩＵのプレグニル群のマウスを処理後に殺し、全膵臓を除去してインスリンの免疫組織化学用とした。ＰＢＳ群からの膵臓の切片は、多くの浸潤中の細胞を示し、これらの細胞は島へ侵入した。またＰＢＳ群の膵臓には、多数のＢリンパ球およびＴリンパ球が存在していた。この発見は、本願発明者らによる他の、ＣＤ４＋細胞数の選択的な減少に起因する脾臓のＣＤ８／ＣＤ４細胞の比の上昇、およびこれらのマウスの脾臓におけるＢリンパ球数の減少という所見（データは示さず）と一致する。６００ＩＵのプレグニル群のマウスでは、膵臓に浸潤はなく、さらに驚いたことに、多数のインスリンを産生している新しい島が見られた。また、膵臓におけるＢリンパ球およびＴリンパ球の数も減少しており、それは正常なレベルのＣＤ８／ＣＤ４比およびこれらのマウスの脾臓におけるＢリンパ球数と一致した。３００ＩＵのプレグニル群からのマウスは、２８週齢まで生存し続けた。それらは健康的に見え、体重の減少はなく、血糖値は８ｍｍｏｌ／ｌを超えなかった（図１および３）。インスリンの存在についての免疫組織化学も行なった。膵臓には浸潤している細胞はまだ存在しており、インスリンを産生しているいくつかの島もあった。これらのマウスは、６００ＩＵのプレグニル群と共に、４週間にわたってプレグニルで処理し、２０週から２８週までは処理しないままであった。
【０１２８】
処理済みおよび未処理のＮＤＯマウスの脾臓細胞が、ＮＤＯ．ｓｃｉｄに糖尿病を誘導する能力を保持しているかどうかを決定するため、本願発明者らはＰＢＳおよび６００ＩＵプレグニル群からの脾臓細胞をＮＤＯ．ｓｃｉｄ マウスに移入した。移入の２２日後では、ＰＢＳのＮＤＯ．ｓｃｉｄ群は糖尿病に関して陽性であり、１週間以内に３３ｍｍｏｌ／ｌを超える血糖値に達したが、一方６００ＩＵプレグニル群からの脾臓細胞を受けたＮＤＯ．ｓｃｉｄ マウスは正常のままであった（血糖＜７ｍｍｏｌ／ｌ ）。移入の７週間後では、 ＰＢＳ群は非常に不具合のようであった（図２）が、６００ＩＵプレグニルのＮＤＯ．ｓｃｉｄ群はなお９ｍｍｏｌ／ｌ より低い血糖値を有しており、健康のままであった。この時点で両群からのマウスを殺した。
【０１２９】
管内での再刺激。ＮＯＤにおいては疾病の経過をとおして、高レベルのＩＮＦ−γ、ＩＬ−１、およびＴＮＦ−aが報告されており、このサイトカインのプロフィールがＴｈ１のサブセットの選択的活性化に一致するという理由から、本願発明者らは管内において、２０週齢のメスのＮＯＤマウスからの全脾臓細胞および精製されたＣＤ４＋によるサイトカイン産生に及ぼす、プレグニルの影響を調べた。抗糖尿病効果がｈＣＧまたはそのサブユニットの一つか、あるいは用いた製剤に含まれていた他の因子にあるのかを判断するべく、本願発明者らはプレグニルからゲル浸透クロマトグラフィー（図１２）によって入手された異なる分画、およびヒトの組換えｈＣＧとそのサブユニットの、サイトカイン産生に対する効果についても検査した。またこれらの分画の効果を、再構成されたＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスにおける血糖値について生体内でも調べた。
【０１３０】
本願発明者らは、５０〜６００ＩＵ／ｍｌのプレグニル、Ｆ３〜５（５８〜１５ｋＤａ）を用いて処理したマウスから入手された脾臓細胞による、ＩＦＮ−γ産生の強力な、またヒトの組換えβＣＧを用いた弱い阻害を観察した。８００ＩＵ／ｍｌのプレグニルを用いて処理されたマウスからの脾臓細胞では、ＩＦＮ−γの産生には中程度の増加があったにすぎない。同様なパターンが、ＩＬ−４産生の分析時にも観察された（図５）。さらに、３００〜６００ＩＵ／ｍｌのプレグニルを用いて処理されたマウスからの刺激された脾臓細胞においては、ＩＬ−１およびＴＮＦ−aの著しい阻害が、付随しておこるＩＬ−６およびＩＬ−１０産生の刺激と共に観察された（データは示さず）。
【０１３１】
さらに、移入実験は、Ｆ３〜５または６００ＩＵのプレグニルを用いて処理された２０週齢のＮＯＤマウスの全脾臓細胞が、ＰＢＳで処理されたＮＯＤ細胞の再構成に比較して、ＮＯＤ．ｓｃｉｄにおける糖尿病の発症を遅延または予防することさえ可能であることを示した（図７）。しかしながら、Ｆ１〜２（８０〜７０ｋＤａ）を用いても、ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスにおける糖尿病の発症に対して何ら有意の効果は観察されなかった。プレグニルがＴｈ２型マウスに対して効果を有するかどうかを調べるべく、本願発明者らはＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）に３００ＩＵのプレグニルを腹腔内に用いて４日間にわたり、またＰＢＳ（ｎ＝５）を用いて処理した。脾臓よりＣＤ４＋細胞を単離した後、本願発明者らはそれらを抗ＣＤ３／ＩＬ−２を用いて４８時間にわたり刺激し、さらに上清を集めてＩＦＮ−γおよびＩＬ−４サイトカインの測定用とした。また本願発明者らは、異なる用量のプレグニルを用いてＣＤ４＋細胞を処理した。続いて上清を集め、サイトカイン分析用とした。著しいＩＦＮ−γの阻害と、付随したＩＬ−４の刺激とが、抗ＣＤ３／ＩＬ−２だけを用いて刺激されたＣＤ４＋細胞に見出され（Ｔｈ１−＞Ｔｈ２）、一方その逆が、異なる用量のプレグニルを用いて管内で処理されたＣＤ４＋細胞に見られた（Ｔｈ２−＞Ｔｈ１）。
【０１３２】
ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦの抗糖尿病活性
ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ（＜５ｋＤａ）の抗糖尿病活性を検査するべく、本願発明者らは、この分画を用い、またＰＢＳを用いて（対照）、糖尿病誘発性細胞を管内において処理した。これらの細胞をＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスに移入すると、ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ処理された細胞を用いて再構成されたＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスでは、対照群（ｎ＝３）に比較して糖尿病の発症が遅延されたことを示した。
【０１３３】
ＣＤ４＋細胞が、Ｔｈ１サイトカイン産生エフェクター細胞に分化するための潜在能力を測定するべく、ＩＲの存在または非存在下にＴｈの分極分析を行なった。本願発明者らはまた、組換えｈＣＧ（ｒｈＣＧ）およびベータ−ｈＣＧも、このＴｈの分極分析で調べた。Ｔｈ１表現型に向けて分極しているＣＤ４＋に対するＩＦＮ−ガンマの強力な阻害が、ＩＲ−ＰおよびＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦを用いて見出された（図２８）。組換えベータ−ｈＣＧについて観察された産生には、ＩＦＮ−ガンマの中程度の阻害だけがあり、組換えｈＣＧでは何ら影響が見られなかった（図２８）。
【０１３４】
ＩＲ−Ｐ３がその完全な活性を働かせるために、ｈＣＧ等の付加的な因子を必要とするかどうかを決定するべく、本願発明者らはまたＩＲ−Ｐ、その分画であるＩＲ−Ｐ３、ｒｈＣＧ、およびｒｈＣＧと組合されたＩＲ−３を用いてＮＯＤマウスを処理し、次いでＴｈ１の分極を行なった。図６４は、ＩＲ−ＰがＴｈ１分極分析におけるＩＦＮ−ガンマ産生を阻害し、それによりＴｈ１細胞の増殖をＴｈ１分極の条件下に阻害したことを示している。ＩＲ−Ｐ３およびｒｈＣＧを単独に用いるとＴｈ１分極の中程度の阻害が見られ、一方ＩＲ−Ｐ３とｒｈＣＧとの組合せによりＴｈ１細胞の増殖は完全に阻止された（図６４）。
【０１３５】
また本願発明者らは、これらのＩＲ処理されたマウスからの脾臓細胞を、抗ＣＤ３を用いて刺激し、異なる時点においてＩＦＮ−ガンマおよびＩＬ−１０の産生を測定した。図６５は、ＩＲ−Ｐおよび、その分画であるＩＲ−Ｐ１およびＩＲ−Ｐ２を用いた生体内での処理が、管内における抗ＣＤ３に刺激されたＩＦＮ−ガンマ産生を阻害し、一方、中程度のＩＦＮ−ガンマ産生の増加がｒｈＣＧおよびＩＲ−Ｐ３を用いて検出されたことを示している。さらに、 ｒｈＣＧと組合わされたＩＲ−Ｐ３分画は、ＩＦＮ−ガンマ産生を阻害することが可能であった（図６５）。また本願発明者らは、抗ＣＤ３によって刺激されたＩＬ−１０産生（ｔ＝４８）を、これらの生体内で処理されたマウスの脾細胞において測定した。図（図６７）は、全ての分画（ＩＲ−Ｐ、ＩＲ−Ｐ１、ＩＲ−Ｐ２、ＩＲ−Ｐ３）がＩＬ−１０の産生を増加することが可能であったことを示す。
【０１３６】
ＩＲおよびその分画が抗ＣＤ３による脾細胞の増殖を管内において促進するので、ＩＲを用いた生体内の処理が、抗ＣＤ３に刺激された管内の増殖に及ぼす影響を知るべく、本願発明者らはまた、これらのＩＲ処理されたマウスから異なる時点（ｔ＝１２、２４、４８時間）において入手された脾細胞の、ＣＤ３に刺激される増殖を測定した。図（６６）は、抗ＣＤ３が、ＩＲ−Ｐ処理されたＮＯＤマウスからの脾細胞を刺激したこと、またＩＲ−Ｐ１が管内における低い増殖能を有することをを示している。さらに、ＩＲ−Ｐ３およびｒｈＣＧで処理されたマウスからの脾細胞は、ＰＢＳ処理された対照マウス（ＣＴＬ）に比較して、高い増殖能を示したが、一方ｒｈＣＧと組合わさたＩＲ−Ｐ３は、ＩＲ−Ｐと同様の増殖の減少を引起こした。ＩＲ−Ｐ２で処理されたＮＯＤマウスからの脾細胞の、抗ＣＤ３に刺激された増殖には、中程度の効果が見られた。
【０１３７】
上述のように、優位のＴｈ１分極は、ＩＦＮ−ガンマの大量産生の影響下に、Ｂ細胞のＩｇＭからＩｇＧ２産生への切替えを引起こす。したがって、本願発明者らは、ＩＲ処理されたＮＯＤマウスから入手された、ＬＰＳに刺激された脾細胞におけるＩｇＧ２の産生も測定した。図６８はＩＲ−Ｐ、ＩＲ−Ｐ１、およびＩＲ−Ｐ３処理された、ＬＰＳ刺激された脾細胞が、管内において、より少ないＩｇＧ２ａを産生したのに対し、ＩＲ−Ｐ２ではＩｇＧ２ａの中程度の阻害が見られたことを示す。さらに、重ねてｒｈＣＧ処理はＩｇＧ２ａの産生を減じることはできず、一方ＩＲ−Ｐ３との組合わせではそれが可能であった（図６８）。
【０１３８】
ＧＭ−ＣＳＦ刺激ＮＯＤの骨髄細胞：
骨髄からの樹状細胞（ＤＣ）の成熟に及ぼすＩＲの影響を測定するべく、本願発明者らは８週齢のＮＯＤマウスからの骨髄細胞を、ＧＭ−ＣＳＦの存在下に７日間培養した。このような条件下では、骨髄からのＤＣの増殖は９０％よりも多い。 本願発明者らが、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＲ−Ｐの存在下にＤＣを７日間同時培養した場合には、本願発明者らは、ＩＲで処理された全てのＤＣが、ＧＭ−ＣＳＦだけで処理された対照のＤＣよりも未成熟であることを観察した。このことは、細胞表面マーカーＣＤｌｄ、ＥＲ−ＭＰ５８、Ｆ４／８０、ＣＤ１４の減少と、ＣＤ４３、ＣＤ９５、ＣＤ３１、およびＥ−ｃａｄの増加から結論された（図２９）。さらに、表面マーカーＥＲ−ＭＰ２０／ＬＹ６Ｃ、ＭＨＣＩおよびＩＩには何ら変化が観察されなかった（図２９）。
【０１３９】
これに対し、ＧＭ−ＣＳＦを用いてＤＣを６日間培養し、７日目に３００ＩＵ／ｍｌのＩＲ−Ｐ（図３０）または１００ｍｇ／ｍｌのＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ（図３１）と共にさらに２４時間同時培養すると、ＤＣはより成熟し、ＡＰＣのように、よりよく機能することができた。このことは、 ＣＤｌｄ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、Ｆ４／８０、ＣＤ１１ｃ、およびＭＨＣＩＩ細胞表面マーカーの増加から結論された（図３０および図３１）。
【０１４０】
ＢＡＬＢ／ｃの分極分析
ＩＲがＴｈ２表現型マウスに対しても効果をもつかどうかを調べるため、本願発明者らはＩＲ−ＰおよびＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦをＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて調べた。ＩＲ処理の後、本願発明者らは分極分析法においてＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。分極分析により、ＩＲ−ＰおよびＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦで処理されたマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、より低いＩＦＮ−ガンマ産生能を有するが（図３２および図３３）、一方これらの細胞は、ＰＢＳ処理マウスからの細胞に比較して、より多くのＩＬ−４を産生した（図３４および図３５）。このことは、生体内でのＩＲ処理により、Ｔ細胞がＴｈ２表現型に向けてさらにシフトされたことを示唆している。ＰＢＳ処理および異なる用量のＩＲ−Ｐで処理されたＩＲ−ＰマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−ガンマの増加（図３６）およびＩＬ−４産生の減少（図３７）を示しており、このことはＴｈ１表現型へ向けたシフトを示唆している。Ｔｈ２表現型に向けたＣＤ４＋Ｔ細胞のシフトが、ＩＬ−１０またはＴＧＦ−ベータ依存性であるかどうかを決定するべく、本願発明者らはまたＩＲ−Ｐ処理マウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞の分極分析に、抗ＩＬ−１０および抗ＴＧＦ−ベータを添加した。このことは、ＩＲ−Ｐ処理マウス細胞のＴｈ１の分極条件下ではＩＦＮ−ガンマ産生の、またＴｈ２の分極条件下では、抗ＩＬ−１０の添加に支持されるＩＬ−４産生の増加を引起こしており（図３８および図３９）、このことはＩＲ−ＰによるＴｈ１／Ｔｈ２分極におけるＩＬ−１０の関与を示唆している。さらに、抗ＴＧＦ−ベータの管内の処理では、Ｔｈ１およびＴｈ２の分極条件におけるＩＬ−４およびＩＦＮ−ガンマの産生には、対照とＩＲ−Ｐ処理群との間に大きい差異が見られなかった（図４０および図４１）。このことは、ＩＲ処理に起因してＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータが関与することを証明している。さらに、ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦからの精製されたＣＤ４＋細胞は、対照のマウスからの細胞よりも多くのＴＧＦ−ベータを産生する（図４３）。抗ＩＬ−１０または抗ＩＬ−６が両培養物に添加されると、対照群のマウスからのＣＤ４＋細胞は、ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ処理された群よりも多くのＴＧＦ−ベータを産生する。このことは、ＴＧＦ−ベータ産生におけるＩＬ−６およびＩＬ−１０の関与を示唆している。このことは、ＩＲ処理マウスからの、ＬＰＳ刺激された脾臓細胞が、対照マウスと比較して高いレベルのＩＬ−６を産生することを示す本願発明者らのデータ（図４５）と一致する。
【０１４１】
ＵＶＢを照射されたマウスの脾臓細胞もまた、より多くのＩＬ−１０を産生し、Ｔｈ１サイトカイニンの抑制を誘導する。これらのマウスからの脾臓細胞のＬＰＳおよび抗ＣＤ３による刺激は、それらの増殖能が低いことを示した。また本願発明者らは、ＵＶＢおよびＩＲで処理されたＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾臓細胞の、ＬＰＳと抗ＣＤ３とに刺激される増殖を比較した。 ＬＰＳおよび抗ＣＤ３に誘導される増殖の減少が、ＵＶＢ処理されたＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾細胞の培養後に観察され（図４６および図４７）、ＩＲまたは、ＩＲもしくはＵＶＢ照射処理により組合わされた処理では、ＬＰＳおよび抗ＣＤ３に刺激される増殖が増加した（図４６および図４７）。
【０１４２】
ＩＬ−１０ノックアウトマウスの結果：
ＬＰＳおよび抗ＣＤ３に刺激された増殖におけるこのような変化が、ＩＬ−１０依存性であるかどうかを決定するべく、本願発明者らはＩＬ−１０ノックアウトマウスにＩＲ−ＰまたはＵＶＢ処理を行なった。ＵＶＢ照射およびＩＲ−Ｐ処理されたＢＡＬＢ／ｃマウスを比較した場合、抗ＣＤ３で刺激された脾臓細胞においては何ら増殖パターンの変化は見られず（図４７）、一方抗ＣＤ３で刺激されたリンパ節細胞においては、両群のＵＶＢ照射されたＢＡＬＢ／ｃに比較して逆の増殖パターンが観察された（図４９）。このことは、ＵＶＢ処理後の抗ＣＤ３刺激による増殖の減少または、脾臓細胞のＩＲ−Ｐ処理後の増殖の増加が完全にＩＬ−１０依存性ではないが、一方抗ＣＤ３刺激されたリンパ節細胞についてはこのことが正しいことを示している。ＬＰＳ刺激された脾臓細胞の増殖を４８時間後に評価した場合、本願発明者らは、対照群に比較してＵＶＢおよびＩＲ−Ｐ処理された群における増殖の増加を観察したが（図５１）、一方７２時間増殖の時点では、両群に増殖の減少が観察された（図５０）。
【０１４３】
生体内におけるＵＶＢまたはＩＲ−Ｐ処理の、細胞マーカーＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、Ｍ５／１１４について陽性の細胞のパーセントに及ぼす影響を測定するべく、本願発明者らはリンパ節細胞および脾臓細胞についてフローサイトメトリー分析を行なった。ＩＲ−Ｐ処理されたＩＬ−１０ノックアウトマウスのリンパ節では、Ｂ２２０およびＭ５／１１４陽性細胞の減少と、ＣＤ４およびＣＤ８陽性細胞の増殖とが観察され（図５２）、一方脾臓においては、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０、およびＭ５／１１４陽性細胞の増加が観察された（図５３）。ＵＶＢ処理群では、ＣＤ８陽性細胞の増加と、ＣＤ４、 Ｂ２２０、およびＭ５／１１４陽性細胞の減少がリンパ節に見られたが（図５２）、ＣＤ８陽性細胞の中程度の増加を除き、脾臓細胞では何ら細胞マーカーの変化は観察されなかった（図５３）。
【０１４４】
ＧＭ−ＣＳＦ刺激骨髄細胞の結果：
骨髄の樹状細胞（ＤＣ）の成熟度に対するＩＲの影響を測定するべく、本願発明者らはＢＡＬＢ／ｃマウスからの骨髄細胞を、ＧＭ−ＣＳＦの存在下に７日間培養した。この方法では、骨髄からのＤＣの増殖は９０％よりも多い。本願発明者らがこれらのＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＲ（ＩＲ−Ｐ、ＩＲ−Ｕ、ＩＲ−Ｕ３〜５、ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ）の存在下に７日間にわたって同時培養したところ、ＩＲで処理されたＤＣは全て、ＧＭ−ＣＳＦだけで処理された対照ＤＣよりも未成熟であることを観察した。このことは、細胞表面マーカーＣＤｌｄ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＥＲ−ＭＰ５８、Ｆ４／８０、Ｅ−ｃａｄ、およびＭＨＣＩＩの減少から結論された（図５４）。さらに、ＣＤ９５には中程度の増加が観察された（図５４）。対照的に、ＤＣをＧＭ−ＣＳＦと共に６日間培養し、７日目に３００ＩＵ／ｍｌのＩＲ−Ｐ、または１００ｍｇ／ｍｌのＩＲ−Ｕ（ＩＲ−Ｕ、ＩＲ−Ｕ３〜５、またはＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ）をさらなる２４時間にわたり補足した場合には、それらはさらに成熟し、ＡＰＣのように、よりよく機能することができた。このことは、ＣＤｌｄ、ＣＤ１４、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＥＲ−ＭＰ５８、Ｆ４／８０、ＲＢ６  ８Ｃ５、Ｅ−ｃａｄ、およびＭＨＣＩＩ細胞表面マーカーの増加から結論された（図５５）。
【０１４５】
アロ−ＭＬＲの結果
ＩＲの免疫抑制活性を、たとえば移植目的のために検査するべく、本願発明者らはまた、９週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃからのＢＭ細胞を用いて、前述のようにアロ−ＭＬＫ（混合リンパ球反応）を行ない、ＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＲ（ＩＲ−Ｐ、３００ＩＵ／ｍｌ；ＩＲ−Ｕ、３００ｍｇ／ｍｌ；ＩＲ−Ｕ３〜５、３００ｍｇ／ｍｌ；ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ、３００ｍｇ／ｍｌ）と共に７日間培養した。７日後、これらのＤＣ細胞を照射し（２，０００ラド）、９週齢のメスのＣ５７ＢＬ／Ｌｙから単離された脾臓のＣＤ３+細胞と、種々の割合にて同時培養した。培養の最後の１６時間の［3Ｈ］ＴｄＲの取込みにより、Ｔ細胞の増殖を測定した。増殖のデータは、ＩＲ処理されたＤＣが、調べた全てのＤＣ対Ｔ細胞比において、増殖を阻害することが可能であることを示している（図５６）。
【０１４６】
ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ、ＩＲ−Ｐ３、ＩＲ−Ａ３のアンチショック活性：
精製法２によって得られたＩＲの低分子分画（ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ）はまたアンチショック活性を有しており（図５７）、この分画で処理されたマウスは生き残った。また本願発明者らは、superdex@peputideから入手された３つの全ての分画、ＩＲ−Ｐ３、およびＩＲ−Ａ３の、アンチショック活性について調べた。この活性のスクリーニング法は、本文書の他の場所に述べらている。本願発明者らの結果は、superdex@peputideから入手された３つの全ての分画およびＩＲ−Ｐ３がアンチショック活性を有しており、一方ＩＲ−Ａ３は低ないし中程度の活性を有していたことを示した（データは示さず）。
【０１４７】
方法３による精製
図１００は、ＩＲ−Ｐ試料のマクロスフェア（macrosphere)ＧＰＣ ６０Åのクロマトグラムを示す。
【０１４８】
３つの選ばれた領域すなわち、見かけ上１０ｋＤａより大きい分子量で溶出するＩＲ−Ｐ１、見かけ上１０ｋＤａ〜１ｋＤａの間の分子量で溶出するＩＲ−Ｐ２、および見かけ上１ｋＤａより小さい分子量で溶出するＩＲ−Ｐ３が分画された。これらの全ての活性は、少なくともアンチショック活性について検査され、それらは全てアンチショック活性を有していた（本文書の他の場所に示されておいる）。
【０１４９】
図１０１は、ＩＲ−ＰおよびＩＲ−Ａ試料のマクロスフェア（macrosphere)ＧＰＣ ６０Åのクロマトグラムを示す（５００ＩＵの各試料を同一の注入体積にて注射した）。この結果は、ＩＲ−Ｐ試料中のＩＲ−Ｐ３分画に比較して、ＩＲ−Ａ分画が多量のＩＲ−Ａ３分画を含むことを示した。本願発明者らは、同量のＩＲ−ＡおよびＩＲ−Ｐ分画について、それらのアンチショック活性を調べた。その結果は、ＩＲ−Ｐに比較して、ＩＲ−Ａが低ないし中程度のアンチショック活性を有していたことを示した（データは示さず）。
【０１５０】
方法４による精製：
妊産婦から、その妊娠の第１トリメスターを通じてプールされた尿を入手した。ＦＰＬＣシステムにおけるＦＤＣカラム上で脱塩し、５０ｍＭの重炭酸アンモニウムを溶出緩衝液として用いた後、プールされた低分子分画（ＬＭＦＤ；＜５ｋＤａ）を凍結乾燥した。当該ＬＭＤＦ試料（１３〜１７ｍｇ）を懸濁し、溶出に水を用いてバイオゲル（Bio-Gel）Ｐ−２にかけた。溶出プロフィールは８つの異なるピークに分離され、プールされた分画について、ＬＰＳに誘導される敗血症性ショックにおける生物活性を検査した（方法は本文書の他の場所に述べられている）。ＬＰＳショックの阻害を基盤とすれば、この活性は分画Ｉｃ（“？”）、ＩＩ、ＩＩＩ、ＶＩ、およびＶＩＩに局在していた。これらのピークは、４０〜４５ｍｌ（ピークＩｃ「？」）、４５〜５０ｍｌ（ピークＩＩＩ）、６０〜６５ｍｌ（ピークＶＩ）、および６５〜７０ｍｌ（ピークＶＩＩ）の間の溶出体積を含む（図９７）。
【０１５１】
ＩＲ−Ｐ（プレグニル）試料をマクロスフェア（Macrosphere)ＧＰＣ ６０Åカラムにかけ、重炭酸アンモニウムを用いて溶出した。３番目のピーク分画（図１００）（ＩＲ−Ｐ３）をプールし、バイオゲルＰ−２カラムにかけ、水を用いていくつかのピークに溶出した。ＬＰＳショックモデルにおける活性の検査により、当該活性が７〜９時間の溶出の間に位置する分画に局在することが示された（図９８）。
【０１５２】
ＩＲ−Ａ（ＡＰＬ）試料をマクロスフェア（Macrosphere)ＧＰＣ ６０Åカラムにかけ、重炭酸アンモニウムを用いて溶出した。３番目のピーク分画（ＩＲ−Ａ３）をプールし、バイオゲルＰ−２カラムにかけ、水を用いていくつかに溶出した。ＬＰＳショックモデルにおける活性を検査することにより、当該活性がピーク２、３、および７に局在することが示された。これらのピークは１０５〜１１５ｍｌ（ピーク２）、１１５〜１２０ｍｌ（ピーク３）、および１６０〜１８０ｍｌ（ピーク７）の間の溶出体積を含んでいた（図９９）。
【０１５３】
生体内におけるＩＲの抗敗血症または敗血症性ショック効果
生存曲線：本実験からの最も著しい結果は、ＴＳＳＴ−１およびＤ−Ｇａｌ処理に先立ってＩＲ−Ｐを処理された動物のもの、対、そうでなかったもの、の間のはっきり分かれた差である（図２０．）。このことは、本生存実験から得られた生存曲線において明らかである。Ｄ−ガラクトサミン感作と組合わされた４μｇ用量のＴＳＳＴ−１は、３２時間までに１００％致死であり、ＴＳＳＴ−１への露出に先立ってＩＲを用いて前処理された動物は、致死量の毒性ショックの影響のために死ぬことはなかった。
【０１５４】
ＬＰＳ処理されたＢａｌｂ／ｃマウスおよびＳＪＬマウスは、ＬＰＳに対して異なる感受性を示した。６００μｇのＬＰＳは、ＢａｌｂｃおよびＳＪＬにおいて各々４８時間および３６時間までに１００％致死であるが、一方ＩＲで前処理されたＢａｌｂ／ｃおよびＳＪＬマウスは生き残った。また本願発明者らは、ＩＲ−Ｕ分画、すなわちＩＲ−Ｕ１、ＩＲ−Ｕ２、ＩＲ−Ｕ３、およびＩＲ−Ｕ３〜５（プールされた）を用いてＢａｌｂ／ｃマウスを前処理し、次いでＬＰＳで処理した。これらの実験は、ＩＲ−Ｕ１およびＩＲ−Ｕ２で前処理されたマウスは４８時間までに重い病気になったことを示し、それらはＬＰＳ群と共に殺された。しかしながらＩＲ−Ｕ３〜５で処理されたマウスは生き残った。
【０１５５】
Ｂａｌｂ／ｃマウスの一群に、ＬＰＳの注射の後、７００ＩＵのＩＲ−Ｐを用いて２回処理した。対照群のマウス（ＬＰＳのみ）は、その厳しい病気のため４８時間の時点で殺された。ＩＲ−Ｐ処理された生き残りのマウスは、２匹（２／６）を除き、６０時間の時点で殺された。
【０１５６】
疾病の動態：目に見える病気の兆候は、全ての実験動物において明らかであるが、この病気の動態と、明らかな厳しさとは、有意に異なっていた。すなわちＩＲ−Ｐで前処理されたＢａｌｂ／ｃマウス群は、ＩＲ−Ｕ３〜５で前処理されたマウスに加えて、ＴＳＳＴ−１外毒素モデルにおいても（図２１）、またＬＰＳ内毒素モデルにおいても、疾病レベル２を超えなかった、というように。ＬＰＳモデルにおける、ＩＲ−Ｐで前処理されたＳＪＬマウスおよびＩＲ−Ｐで後処理されたＢａｌｂ／ｃマウスは、疾病レベル３を超えなかった。両モデルにおける全てのマウスは、疾病レベル５を超えた時点で殺された。
【０１５７】
ＴＳＳＴ−１におけるショックに誘導される体重の減少：  ＩＲの前処理はまた、毒性ショックの生存体の体重減少を有意に誘導する結果となった。本実験からの体重減少のデータは、同等の疾病動態が続いた別の実験からのもの（データは示さず）と結びつけられたが、ＩＲによる前処理のない４μｇのＴＳＳＴ−１＆Ｄ−Ｇａｌ群の２匹が生存するという結果に終わった（図１２．）。
【０１５８】
この体重減少のデータを、２標本Ｔ検定（ミニタブ（Minitab)統計学ソフトウェア、バージョン１１．２１を使用）を用いて統計学的に分析すると、低いn数にもかかわらず、３２および４８時間において、体重減少における有意差（Ｐ（ＨＯ：μ１＝μ２）＜０．０５）が観察され、nが増加すると、有意性がより高くなりそうであることが示される。
【０１５９】
２標本Ｔ検定および信頼区間
３２時間における体重減少に関する２標本Ｔ
（群１＝ＴＳＳＴ−１＆Ｄ−Ｇａｌ；群２＝ＩＲ前処理を伴うＴ＆Ｄ）
群        平均        標準偏差      標準誤差  平均
１          ４        ４．７５      １．７９      ０．８９
２          ６        １．２８      ２．２２      ０．９１
【０１６０】
μ１〜μ２の９５％ＣＩ（信頼区間）：（０．４５，  ６．４８）
Ｔ検定  μ１＝μ２（ｖｓ  ｎｏｔ＝）： Ｔ＝２．７２  Ｐ＝０．０３０  ＤＦ＝７
【０１６１】
４８時間における体重減少に関する２標本Ｔ
（群１＝ＴＳＳＴ−１＆Ｄ−Ｇａｌ；群２＝ＩＲ前処理を伴うＴ＆Ｄ）
群        数      平均        標準偏差      標準誤差  平均
１        ３        １０．０５            ２．２５      １．３
２        ６          ３．４９            ４．４１      １．８
【０１６２】
μ１〜μ２の９５％ＣＩ：（１．１，  １２．０）
Ｔ検定  μ１＝μ２（ｖｓ  ｎｏｔ＝）：Ｔ＝２．９５  Ｐ＝０．０２６  ＤＦ＝６
【０１６３】
ＷＢＣ（白血球）および血小板の計数：血中の白血球レベル（図２３）は、標準マウス（バー＃１）およびＩＲ−Ｐで前処理されたマウス（バー＃３）において数えられたＷＢＣカウントに対し、ＴＳＳＴ−１およびＤ−Ｇａｌ単独の処理では（バー＃２）有意に高かった。このことは、予想されたように、致死の毒性ショックを罹患しているマウスにおける、より高いレベルの免疫活性化を示している。ＩＲ−Ｐ群においてはまだ正常なレベルのＷＢＣが存在しており、このような発見はまた、この群が目に見える厳しい疾病の兆候を示さないため、本願発明者らの他の結果と一致する。
【０１６４】
血小板のカウント（図２４）は、ＴＳＳＴ−１  Ｄ−Ｇａｌ処理されたマウスにおいても減じられた。上昇した血小板のカウントは、ＩＲ−Ｐ処理されたマウスにおいて見られた。
【０１６５】
移植結果：
移植研究の主要な目的は、同種移植の拒絶反応を抑制するための、そしてさらにより良く、アロ特定の寛容を引き起こすための方法の開発である。この目的のために、動物モデルが広く使用され、そして、皮膚の同種移植の拒絶反応が、妨げるのに最も難しいものの一つであるかも知れないことが明らかになってきた。
【０１６６】
もしアロ反応性が免疫反応抑制剤により抑制されないならば、ＭＨＣ―異移植片損失は避けられない。現在、免疫反応抑制のプロトコルは多数の免疫反応抑制剤の組み合わせの使用に基づき、それは、潜在的に拒絶過程の異なった段階を妨げるもので、抗原認識、Ｔ細胞サイトカイン産生、サイトカイン活性およびＴ細胞増殖、マクロファージ、ＮＫ細胞および細胞障害性Ｔ細胞を含む。試験的設定で、多くの薬剤およびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、その免疫反応抑制潜在能力を評価されてきている。これらの中でミゾリビン、ＲＳ―６１４４３、１５―デオキシスペルグアリン、ブレキナーナトリウムおよびＬＦＡ―１，ＩＣＡＭ―１，ＣＤ３，ＣＤ４およびＩＬ−２Ｒに対するｍＡｂがある。Ｔ細胞、マクロファージおよびＮＫ細胞のような多くの細胞型により産生されるサイトカインは、拒絶過程に影響するかも知れない。移植片拒絶でのそれらの主要な役割の故に、それらが生産するＣＤ４＋Ｔ細胞およびサイトカインは、同種移植片の拒絶および許容において広く研究されてきた。ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、そのサイトカイン産生パターンに基づいて、少なくともＴｈ１およびＴｈ２細胞の２つのサブセットに細分できる。Ｔｈ１細胞はＩＬ―２、ＩＦＮ―ガンマおよびＴＮＦ―ベータを生成するが、遅延型過敏性（ＤＴＨ）反応および細胞の細胞障害性において役割を果たし、一方Ｔｈ２細胞はＩＬ―４、ＩＬ５，ＩＬ―６およびＩＬ―１０を産生し、Ｂ細胞分化および抗体生成の有効に刺激する。これらの２つのＴｈサブセットはお互いに増殖および機能を調節できる。ＩＦＮ―ガンマはＴｈ２細胞増殖を阻害し、そしてＩＬ―４効果に拮抗し、ＩＬ―１０はＴｈ１サイトカイン産生を阻害する。これらの２つのサブセットをまた調節できる調節Ｔ細胞の存在に対する徴候がある。移植片拒絶はＴｈ１細胞によって仲介されると思われており、そのことが、ＤＴＨおよびＣＴＬ活性を刺激するかも知れない。一方では、アロ反応性のＴｈ１細胞の抑制は、移植片許容につながるかも知れない。
【０１６７】
免疫反応抑制は炎症誘発性のサイトカインを、抗サイトカインｍＡｂまたは溶解性サイトカイン受容体の供給により中和することで達成される。あるいは、Ｔ細胞の一つのＴｈサブセットへの分化の「ゆがみ」はサイトカイン環境を変化させることにより達成される。たとえば、ＩＦＮ―ガンマ（Ｔｈ１，ＮＫ細胞）およびＩＬ―１２（マクロファージ、Ｂ細胞）がＴｈ１細胞分化を促進し、ＩＬ―４（Ｔｈ２）がＴｈ２細胞の発達を向上する。抗サイトカインｍＡｂまたはサイトカインによって生体内サイトカイン環境を変えることが同様な効果を持つかも知れない。さらにＴｈ３およびＴｒ１のような、かつＤＣ１およびＤＣ２のような調節細胞の誘発は、また移植の拒絶を減じ、かつ移植片の寛容を引き起こす。
【０１６８】
結果：  ＢＡＬＢ／ｃレシピエントのＩＲ―Ｐによる治療は、未治療の対照群に比べてＣ５７ＢＬ／６皮膚移植生存を延長した。ＩＲ―Ｐ治療のレシピエントが移植後２２日間まで移植片を延長することができたのに対し（図９６）、対照レシピエントは１２日間の間に皮膚移植片を拒絶した（図９５）。図９５および９６は、１つのＩＲ―Ｐ治療によるそのような延長された移植片（１９日に撮られた写真）および対照マウスからの拒絶された移植片を示す。
【０１６９】
ＥＡＥ結果：
ＰＢＳで治療されたマウスは、最初の３週間の間ただ体重が減っただけであった（図７７）。全実験中に、疾病に耐性を存続した一匹のマウスを除いて、これらのマウスは、全て少なくとも２匹のＥＡＥ臨床治療の徴候があり、そして、より長い疾病の持続期間を示した（図７８）。ＩＲ治療のマウス群中、実験中観察された体重減少はより少なく（図７９）、かつ２匹のマウスが実験中疾病にかからなかった。この群の病気のマウスは最大の臨床得点が２であり、そして疾病の持続期間は短く、ＰＢＳ治療群よりもＥＡＥの症状からより早く回復した（図８０）。
【０１７０】
ショックの結果
ＩＲ治療のマウスはＬＰＳ誘起のショックに耐性がある。すなわちＩＲ治療のマウスに対する高用量のＬＰＳ治療の効果を測定するために、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝３０）がＬＰＳで腹腔内注射され、生存は５日間評価された。ＰＢＳ治療のＢＡＬＢ／ｃマウスは、高用量のＬＰＳ注射後１日〜２日の間ショックに屈し、５日目にはただ１０％のマウスのみ生存した。対照的に、ＩＲ―ＰもしくはそのＩＲ―Ｐ１またはＩＲ―Ｐ３分画で治療されたマウスは５日目に１００％生存した（Ｐ＜０．００１）（図５８）、一方、ＩＲ―Ｐ２、ＩＲ―Ａおよびデキサメサゾン治療のマウスは約７０％の生存を実証した（図５８）。
血液検査：ショックでのＬＰＳに対する全身の反応の主な症状は、器官における重症の炎症であり、器官不全または器官系機能不全につながり、最初は肝臓で起こる。したがって、本願発明者らはＷＢＣおよび血小板と同様に、ＡＬＡＴ、ＡＳＡＴ、ＬＤＨ１のような酵素を測定した。図５９はＩＲ―Ａ、ＩＲ―ＰおよびそのＩＲ―Ｐ１、ＩＲ―Ｐ３分画で、全血小板数が正常範囲（１００〜３００×１０9／ｍｌ）で、一方対照ではＩＲ―Ｐ２およびデキサメサゾン治療のマウスで、全血小板数が正常範囲より低いことを示す。図６０〜図６２は、ＩＲ―Ａ、ＩＲ―ＰまたはそのＩＲ―Ｐ１、ＩＲ―Ｐ２またはＩＲ―Ｐ３分画で治療されたマウスが、対照およびデキサメサゾン治療のマウスと比べて、血漿中で比較的低いレベルのＡＬＡＴ、ＬＤＨ１およびＡＳＡＴ酵素を有することを示す。これらの酵素は、器官の損傷によって、ショックの間血液中により高い濃度で存在した。これらの結果は本願発明者らの生存結果と一致する（図５８）。加えて、ショックの間、その炎症の場所の転移により、血液中に低い数のＷＢＣが見いだされた。図６３の本願発明者らの結果は、ＩＲ―Ａ、ＩＲ―Ｐおよびその分画で治療されたマウスは、対照およびデキサメサゾン治療のマウスよりもｔ＝４８時間でＷＢＣの適度の正常レベルを持ち、ＩＲ治療マウスにおいてより弱い炎症の反応を示唆する。
【０１７１】
生体外ＮＯＤ／ＬＴＪ結果：
図６４は、ｒｈＣＧとの組合せでＩＲ―ＰまたはＩＲ―Ｐ３で治療された、ＮＯＤマウスから分離されたＣＤ４＋細胞でのＴｈ１分極アッセイにおけるＩＦＮ−ガンマ産生の阻害を示し、一方、ｒｈＣＧおよびＩＲ―Ｐ３単独によるＴｈ１分極で適度な阻害が見いだされた。これは、ｒｈＣＧがＴｈ１サブセットを最大に阻害するので、ＩＲ―Ｐ３分画がｒｈＣＧを必要とすることを示唆する。
【０１７２】
図６５はＰＢＳ治療のマウスと比べて、ｒｈＣＧと組合せてＩＲ―Ｐ、ＩＲ―Ｐ１、ＩＲ―Ｐ２またはＩＲ―Ｐ３で治療されたＮＯＤマウスから得られた、抗ＣＤ３刺激脾臓細胞におけるＩＦＮ−ガンマ産生の阻害を示す。ｒｈＣＧおよびＩＲ―Ｐ３は、単独では組合せた場合と同じ効果を持たない。これは、ＩＲ―Ｐ３分画が、ｒｈＣＧのＩＦＮ−ガンマ阻害の理由でｒｈＣＧを必要とすることを再び示唆する。
【０１７３】
図６６は、ｒｈＣＧと組合せてＩＲ―Ｐ、その分画、ｒｈＣＧまたはＩＲ―Ｐ３で治療されたＮＯＤマウスから得られた脾臓細胞の異なる時点（ｔ＝１２，２４，４８時）での抗ＣＤ３刺激増殖を示す。再び結果は、前のＩＦＮ−ガンマ阻害（図６５）と一致する。ここで、ＩＲ―Ｐ３分画はまた、生体内治療されたＮＯＤマウスからの脾臓細胞の抗ＣＤ３誘起増殖に対する阻害効果の理由で、ｒｈＣＧを必要とする。
【０１７４】
図６７は、ＩＲ―Ｐおよびその分画が、ＰＢＳ治療のマウスと比べて、治療ＮＯＤマウスからの抗ＣＤ３刺激脾臓細胞のＩＬ―１０産生を促進することを示す。
【０１７５】
図６８は、ＩｇＧ２ａ産生が、ＮＯＤマウスのＩＲ―Ｐ２またはｒｈＣＧによる生体内治療により阻害されないことを示し、一方、ＩＲ―Ｐ、ＩＲ―Ｐ１、ＩＲ―Ｐ３およびｒｈＣＧと組合せたＩＲ―Ｐ３がＩｇＧ２ａ産生を阻害することを示す。ｒｈＣＧと組合せたＩＲ―Ｐ３はＩＲ―Ｐと同じ特性を有するので、この組合せが、また妊娠の誘発、ＩＶＦ、流産の予防または関連した問題のために使用されると考えられる。
【０１７６】
ＳＴＺモデル
糖尿病Ｉの病因の決定的なことは、インスリン産生膵臓ベータ細胞の破壊である。ベータ細胞塊の進行する減少は、慢性の自己免疫反応の結果であるという強い証拠がある。この過程の間、ランゲルハンス島内侵入免疫細胞、ランゲルハンス島内毛細血管内皮の細胞およびベータ細胞そのものが、細胞障害性の伝達物質を放出することができる。サイトカイン、および特に窒素酸化物（ＮＯ）は、ベータ細胞に影響を及ぼす有毒なエフェクター分子である。反応性のＮＯラジカルは、主に、広範囲のＤＮＡストランド切断誘発を介して、その有害な効果を仲介する。この初期の損傷はおそらく一連の出来事を引き起こし、それはベータ細胞の死で終わる。
【０１７７】
げっ歯動物に引き起こされる、ベータ細胞毒ストレプトゾトシン（ＳＺ）による糖尿病は、膵臓のベータ細胞の破壊に関係する機構を研究するために、動物モデルとして広範囲に渡って用いられる。ＳＺはグルコース輸送体ＧＬＵＴ―２を介して膵臓ベータ細胞により利用される。この薬剤は細胞内で分解し、そしてアルキル化またはＮＯの生成のいずれかによってＤＮＡに損傷を起こす。ＤＮＡストランド破壊の出現は、大量の細胞核の酵素ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の活性化につながり、それはＮＡＤ＋を基質として大量の（ＡＤＰ−リボース）ポリマーを合成する。ＰＡＲＰ活性化の結果として、ＮＡＤ＋の細胞性の濃度はそこで非常に低いレベルまで減じ、それで、細胞に十分なエネルギーを起こす能力がなくなると考えられ、そして最後には細胞を死に導く。
【０１７８】
反応性のラジカルはまた、腎障害、閉塞性腎障害、急性および慢性の腎性同種移植片の拒絶反応、（ＳＬＥ、関節リウマチ、糖尿病、ＭＳのような）自己免疫性疾患、ＡＩＤＳ、血管形成に関する疾患、アテローム性動脈硬化症、血栓症およびＩＩ型真性糖尿病のような多くの疾患の病因において重要な役割を果たす。たとえば、最近増加したＤＮＡ塩基への酸化損傷が、ＩＩ型真性糖尿病の患者に見られ、それが病因および糖尿病の合併症に寄与する。本願発明者らは、ＩＲがまたＳＴＺ誘発糖尿病の誘発を遅らせる能力を有するかどうか、そしてまた細胞反応性ラジカル形成および防御への効果を有するかどうかを試験した。
【０１７９】
ＨＤ―ＳＴＺモデルにおいて、糖尿病の誘発は、ＰＡＲＰの誘発活性化による膵臓の細胞組織の、ベータ細胞への直接の効果による。結果として、ＮＡＤ＋の減少および細胞に十分なエネルギーを起こす能力がなくなることが、最後には細胞を死に導く。このことは、どの免疫の成分もこの過程に含まれないことを示唆する。比較すると、ＭＤ―ＳＴＺモデルには、強い免疫成分が存在する。図６９および図７０は、ＩＲ―Ｐ治療が両方のモデルにおいて、糖尿病の誘発を遅らせられることを示す。この遅れの背後の機構はおそらく異なる性質のものである。
【０１８０】
ヒトの研究
免疫系は、多種多様の多数の微生物に応答するにもかかわらず、そしてその自己抗原への不断の暴露にもかかわらず、平衡状態を保つ顕著な能力を持つ。外から侵入した抗原に生産的な応答をした後に、免疫系は休息の状態に戻り、それでリンパ球の数と機能状態は、おおよそ予備免疫のレベルにリセットされる。この過程は恒常性と呼ばれ、そしてそれは免疫系を新しい抗原性の挑戦に効果的に応答させる。生成的なリンパ系器官から新しく移出するものが、常在の細胞とともに「スペース」と競合するように、予備免疫のリンパ球分集団のサイズおよびレパートリーは、また綿密に制御される。
【０１８１】
自己抗原を認識する能力のある受容体を伴うリンパ球は、常に生成され、しかし正常な個々は、その自己の抗原に応答しない状態を維持し、これは自己寛容と呼ばれる。
【０１８２】
自己免疫疾患において、免疫系が不適切に「自己」を認識し、それが、病理の体液および／または細胞の免疫反応につながる。正常な、非自己免疫状態において、自己反応性リンパ球が、削除されるかまたは末梢の自己リガンドに非応答とされる。潜在的に自己反応性の細胞の集団は実証できるが、それらがリガンドへ自己免疫反応を起こすようにはみえない。もし、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）相互作用が退化され、Ｔ細胞はリガンド（１、２）の相違により活性化できるならば、自己免疫疾患の状況は、これらの自己反応性の細胞が分子模倣を介して活性化されることで明らかになる。適当な条件下で自己反応Ｔ細胞の活性化が、サイトカインの誘発および特定の同時刺激分子（たとえば、ＣＤ８０／ＣＤ８６およびＣＤ４０）の上方制御により促進され、自己免疫につながるという証拠がある。
【０１８３】
免疫系が、自己組織を非自己と間違え、そして不適当な攻撃を組み込む
とき、結果は自己免疫疾患となる。多くの自己免疫疾患がある。いくつかの例は、ウェゲナー肉芽腫症、多発性硬化症、１型真性糖尿病、および関節リウマチである。更に、感染症もまた免疫疾患の誘発につながる免疫応答を誘発でき、一方、感染症そのものは宿主には危険ではない。たとえば、結核での結核菌の役割であり、そこで免疫系が結核菌に積極的に反応し、炎症性の病気となり自己の免疫反応による組織破壊となる。同様なことが、また、たとえばらい菌に対しても事実である。
【０１８４】
自己免疫疾患は異なる方法で体にそれぞれ影響することができる。たとえば、自己免疫反応は、多発性硬化症では脳に、そしてクローン病では内臓に向けられる。他のシェーグレン病および全身性ループスエリテマトーデス（ループス；ＳＬＥ）のような自己免疫疾患では、影響された組織や器官は同じ病気で個々の間で変化するかも知れない。多くの自己免疫疾患はまれである。集団的に、しかしながら、それらは西洋社会で多くの人々をひどく苦しめる。
【０１８５】
多くの自己免疫疾患が男性よりも女性において、より一般的である。性的二型性は自己免疫疾患の広範囲をカバーし、器官特異（グレーブス病のような）から一般化されたＳＬＥまでを範囲とする。ＭＳでは、メス―オス優勢近似で２：１〜３：１である。ＭＳおよび他の自己免疫疾患での性の偏りの理由は、明らかでないが、多くは感染症への免疫応答での性関連相違としての要素、性ステロイド効果および性連鎖の遺伝要素を含む。ＭＳ、シェーングレン、ＳＬＥ、およびＲＡは異なる疾患で、病因論においておそらく異なることが認められる。
【０１８６】
しかしながら、共通に関連することは、女性におけるこれらの疾患の圧倒的な罹患率である。これらの疾患のそれぞれが自己免疫であり、性ホルモンおよび性別の効果が同様かも知れないことの考慮は、これらの疾患の比較を有用にする。自己免疫疾患は女性を特に労働年齢および出産可能な年齢に襲う。しかしながら、これらの臨床経過は、妊娠中は驚くほど厳しさが減るか、またはまさに寛解がみられる。
【０１８７】
妊娠中、女性は、細胞仲介の免疫の弱化（Ｔｈ１応答）および体液免疫の或る成分の強化（Ｔｈ２応答）と一致する免疫的な変化を受ける。妊娠中の母体系による、このＴｈ２が偏った類似の応答は、一時的な免疫抑制または免疫調節の状態を導入し、これが胎児への母の拒絶応答の抑制となり、しかし母の感染への耐性を維持またはまさに増加する。加えて、いくつかの自己免疫疾患への減少した罹患率、特にＴｈ１細胞仲介の免疫疾患がまた観測されてきた。たとえば、関節リウマチ（顕著にＴｈ１細胞が仲介する自己免疫疾患）の女性のおよそ７７％が、妊娠中症状の一時的な寛解を経験し、それは大多数の場合第１トリメスターから現れる。したがって、Ｔｈ１細胞仲介の自己免疫疾患における妊娠中の臨床の改善は、おそらく初期妊娠中の生理的な免疫変化に関係するはずである。
【０１８８】
本願発明者らのＩＲはＮＯＤおよびＥＡＥのような動物モデルにおける自己免疫疾患の発生を阻害できるので、本願発明者らは免疫疾患の数人の患者を治療した。全患者は、手に負えない疾患のために、インフォームドコンセントの後に治療された。
【０１８９】
患者１：ウェゲナー肉芽腫症
ウェゲナー肉芽腫症は、男性および女性の両方に影響を与える自己免疫血管性の疾患であり、中年の人により一般的であるが、どの年齢の人にも影響を与える。初期の症状は、慢性で進行性の炎症を伴う上部および下部の気道に関係する。炎症は組織または皮膚における塊または肉芽腫を形成するかも知れない。それは血管の一般的な炎症（血管炎）および腎臓の炎症（糸状腎炎）に進行するかも知れない。腎臓に関係しない、限られた形の疾患が起こるかも知れない。
【０１９０】
血管炎は小さいおよび中くらいのサイズの血管壁における自己免疫反応の結果である。慢性の血管炎は、血管の中で狭小化を起こし、そして組織への血液の流れの障害という結果となる。この状態は組織に損傷を起こすかも知れない（壊死）。
【０１９１】
自己免疫疾患は、これらの反応が、自己反応抗原の産生によって体自身の細胞および組織に対して不可解に生じるとき起こる。ウェゲナー肉芽腫症で、抗原は或る白血球の細胞質中の成分に進む。ウェゲナー肉芽腫症の原因は知られていない。疾患は感染症の過程に類似しているが、原因となる物質は単離されていない。患者の大多数に抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）が見いだされ、そのレベルは疾患の活性度に関連するように見える。ウェゲナー肉芽腫症は、特にヨーロッパや有色人種（アフリカ人、南アメリカ人、アジア人）には、極めてまれな疾患である。患者の実際の数は知られていないが、おおよその見積もりで、年間１００万人のアメリカ人当たり新しく２例、またはアメリカ合衆国で毎年約５００の診断された実例である。疾患はどの年齢でも起きるが、人生の４番目または５番目の十年間にそのピークがある。
【０１９２】
男性および女性に同様に影響する。
患者の８５％が１９才より上である。
【０１９３】
患者の平均年齢は４１才である（最新の年齢範囲は５〜９１才である）。
全患者の９７％が白人系、２％が黒人および１％が他の人種である。
【０１９４】
ウェゲナー肉芽腫症の症状、およびこれらの症状の厳しさは一人の患者と別の患者で異なるが、ほとんどの患者が最初に上部気道に症状を認める。疾患の共通の症状は、しつこい鼻漏（鼻水の出る鼻）、または他の、標準の治療では効き目を示さずそして進行して悪化する、風邪の様な症状である。
【０１９５】
鼻漏は、副鼻腔洞ドレナージの結果であり、そして呼吸器の障害や痛みを引き起こせる。病訴は、鼻からの漏出、副鼻腔炎、鼻膜潰瘍および外皮形成、聴力の問題を伴う耳の炎症、咳、喀血および胸膜炎（肺の内面の炎症）を含む。他の初期の症状は、熱、疲労、倦怠感（不快感）、食欲減退、体重減少、関節痛、寝汗、尿の色の変化、脱力感を含む。ほとんどのウェゲナー肉芽腫症の患者は、上記の全ての症状を経験するわけではなく、疾患の厳しさはそれぞれの患者で異なる。ときどき副鼻腔中の微生物感染からの結果として、熱はしばしば出る。患者の三分の一は、疾患の発症において症状がないかも知れない。
【０１９６】
臨床検査はウェゲナー肉芽腫症に対して明確なものではなく、ただ患者が炎症疾患を持つことを示唆する。血液検査はしばしば貧血（低い赤血球数）および他の血液中の変化を示す。胸部Ｘ線および腎臓生検は、ウェゲナー肉芽腫症診断に使用される手段として重要である。効果のある治療にとって早期診断は重要である。無症候の患者は、ＡＮＣＡ血液検査ならびに副鼻腔および肺のＣＴスキャンにより診断される。ウェゲナー肉芽腫症の診断をするのに、平均で５〜１５ヶ月かかる。全診断の４０％が３ヶ月以内に行われ、１０％が５〜１５年以内に行われる。
【０１９７】
他の診断手段は次の通りである。
赤血球沈降速度は一般的に上昇する。
【０１９８】
完全な血液数はしばしば貧血、上昇した白血球数、上昇した血小板数を示す。
尿検査はしばしば腎臓関与のスクリーニング検査として考慮される。
【０１９９】
２４時間の尿の堆積が、或る患者に腎臓機能の評価するために用いられる。
ｃ―ＡＮＣＡは特徴的であり、プロテイナーゼー３抗体を測定する。
【０２００】
ＩＲ−Ｐによる患者１の初期治療結果
患者は、手に負えない疾患のために、インフォームドコンセントの後に治療された。
【０２０１】
診断：副鼻腔に関する組織病理学に基づくウェゲナー肉芽腫症およびｃＡＮＣＡ試験。
実例：５年間再発性のウェゲナー肉芽腫症と知られた３４才の男性患者。この患者は高用量のステロイド、シクロスポリン（５ｍｇ／ｋｇ）およびシクロフォスファミド（１−２ｍｇ／ｋｇ）の治療を受けた。１９９８年７月に進行性の疾患のために、ＩＲ（プレグニル）の治療を毎日５０００Ｉ．Ｕ，ｓ．ｃ．受けた。
【０２０２】
図８１はＩＲ治療の前、患者は高い投与量のステロイドの故に免疫不全であったことを示す。ＩＲ治療の後Ｔリンパ球（ＣＤ４，ＣＤ８）のレベルは増加し、Ｂ細胞を除き正常範囲であった。本願発明者らはまたＩＲ治療中かから得られた、ＬＰＳおよびＰＭＡ／Ｃａ刺激ＰＢＭＣ中のサイトカインを測定した。本願発明者らは、ＬＰＳ刺激ＰＢＭＣが治療中ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ―１０およびＩＬ―１２をより多く産生し（図８２ａ）、一方、ＰＭＡ／Ｃａ刺激ＰＢＭＣはより少なくＩＦＮ−ガンマを産生すること（図８２ｂ）を観測した。それでここで、本願発明者らは、ＩＲ治療は抗炎症サイトカイン（ＩＬ―１０、ＴＮＦ）の産生を増し、一方炎症サイトカイン（ＩＦＮ−ガンマ）の産生を減じることを示す。これは本願発明者らの治療の３ヶ月間、副鼻腔に関する炎症活性により測定された通り、更なる進行は観測されず、臨床観察と一致する。これらの結果はＩＲ−Ｐの有益な効果を示唆する。
【０２０３】
患者２：多発性筋炎
定義：全身性結合的組織疾患で、Ｔ細胞仲介の筋線維の破壊を起こす炎症を通して起こる。これらの症候群の、他の可能性のある原因は、補体活性、感染、薬剤、ストレス、ワクチンを含む。それは人々にどの年齢にも影響するが、ほとんど一般に５０〜７０才の間の人々、または５〜１５才の間の子供に起こる。それは男性よりも女性に２倍影響する。筋衰弱が突然に、または週または月に渡ってゆっくりと起こる。頭の上に腕を上げること、座る位置からの起立、または階段を上ることが難しくなるだろう。声が、喉頭の衰弱により影響されるだろう。関節痛、心臓の炎症、そして肺の（肺）疾患が起こる。皮膚筋炎と呼ばれる同様な状態が、暗く赤い発疹が、顔、首、肩、胸上部、および背に現れるとき明らかである。悪性腫瘍がこの疾患と関係する。多発性筋炎の出現率は、１０，０００人の人々について５人である。
【０２０４】
患者２：診断：全身性硬化症／多発性筋炎  重複（組織病理学に基づいた）。  実例：５０才の女性で２年間、活性多発性筋炎構成要素を伴う全身性硬化症にかかっている。彼女はダプソン、ステロイド、メトトレキセートおよびシクロスポリンで治療された。クレアチン燐酸により測定された、手に負えない筋炎の故に、３ヶ月間プレドンゾン、ジルテックおよびプレグニル５０００Ｉ．Ｕ．，ｓ．ｃ．の組合せで治療された。治療中、ＣＰＫレベルは１１００から７５０に下がった。これは疾患活性における減少を反映する。
【０２０５】
図８３はＩＲ−Ｐ治療のために、リンパ球、Ｔ細胞（ＣＤ４、ＣＤ８）およびＢ細胞の数が減少することを示し、これは、治療による機能亢進免疫系の下方制御を示す。これは本願発明者らのサイトカインのデータ（図８６）と一致し、このデータはＬＰＳ刺激ＩＬ―１２およびＴＮＦアルファのＰＢＭＣによる阻害を示す。更に、治療中ＩＬ―１０産生での増加があり、これは抗炎症サイトカインである（図８６）。加えて、上昇したＣＰＫおよび肝臓酵素（ＡＳＡＴ、ＡＬＡＴ）が、また減少した（図８４および８５）。これは全ては疾患の活性での減少を反映する。
【０２０６】
患者３：真性糖尿病（Ｉ型）
真性糖尿病は、グルコースおよび他のエネルギー産生燃料の減じられた代謝に特徴のある慢性疾患であり、加えて血管性および神経障害性の合併症が遅れて発現する。真性糖尿病は、高血糖症を伴う顕著な病原性の機構を共通の特徴として含む疾患の群からなる。原因にかかわらず、疾患はインスリン欠乏に関係し、それは、共存インスリン耐性の含有量の点でみたときに、全部、部分的、または相対的であろう。インスリンの欠乏は、糖尿病、そして高血糖症につながる代謝の混乱において、主な役割を果たし、その結果疾患の合併症において鍵となる役割を果たす。アメリカ合衆国で真性糖尿病は、医者と接する患者に対して最も一般的な理由の四番目であり、早発の障害および死亡率の主な原因である。それは労働年齢の人々の間で、失明、最後の段階での腎臓疾患、そして非外傷性の肢切断の主な原因である。それは、心臓、脳、および末梢神経の疾病率および死亡率の危険を増す。明るい面では、最近のデータは、疾病のほとんどの衰弱させる合併症が、高血糖症および心血管の危険要素の前向きな治療により妨げられるかまたは遅らせられることを示す。
【０２０７】
インスリン依存真性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、臨床的に規定された糖尿病の型の一つであり、顕著に子供および若年成人に発現するが、全ての年齢群に現れるだろう。主なＩＤＤＭへの遺伝的感受性は、ＨＬＡ複合体に染色体６上でつながる。これらの遺伝的背景は、ベータ細胞破壊につながる免疫仲介過程を開始するために、環境因子（おそらく或るウイルス、食物および気候）と相互に作用する。一方、非インスリン依存糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は、臨床的に規定された別の糖尿病の型であるが、糖尿病の最も一般的な形である。ＮＩＤＤＭの罹患率は、母集団によって非常に変化する。最も大きな割合はピマインディアンに見いだされる。この形の糖尿病に寄与すると認められる主な環境因子は、肥満症および身体活動である。ＮＩＤＤＭは、全ての母集団で強い家族性集合体を示し、明らかに遺伝的感受性および環境因子間の相互作用の結果である。ＮＩＤＤＭが発現する前に、インスリン濃度は、糖血症および肥満症の程度に対して高く、インスリン耐性の存在を反映する。インスリン耐性が悪くなると、グルコースレベルは増加し、グルコース不耐性の出現を伴い、最後に、インスリン応答がインスリン耐性を補えないとき、ＮＩＤＤＭの出現を伴う。
【０２０８】
本願発明者らの予備のマウスデータは、ＩＲがＴｈ１表現型サイトカインをＴｈ２表現型にシフトする能力を持ち、そしてＩＲはまたＮＯＤマウスで糖尿病を阻害でき、本願発明者らは、それがまた糖尿病のような人免疫疾患に積極的な臨床効果を持つべきであるとみなした。
【０２０９】
患者３：診断：真性糖尿病Ｉ型
実例：患者は２１才の男性で３ヶ月前から真性糖尿病にかかっている。彼はインスリン（アクトラピッドおよびインスラタード）で治療された。抗―島細胞抗体の高いレベルが彼の血液にあった。彼はプレグニル５０００Ｉ．Ｕ．ｓ．ｃ．で３ヶ月治療された。彼の治療の間インスリンは図８７に示すように、減少した正常血糖を維持する必要がある。プレグニルの中止後、彼のインスリンは再び上昇する必要がある（図８７）。この新しく真性糖尿病を発症した患者において、インスリンはＩＲ―Ｐの治療中、有意に下がる必要があり、そしてまたグルコース調節の改善が見いだされ、これは、ＩＲ―Ｐ治療中グリコシル化ＨｂＡｌｃレベル（図８７）での減少およびＬＰＳ刺激ＰＢＭＣにより産生された（図８８）炎症サイトカイン（ＩＬ１２、ＴＮＦアルファ、ＩＦＮ−ガンマ）での減少により支持される。更に、ＩＬ―１０の増加（抗炎症サイトカイン）が、また治療中観測された（図８８）。これらすべては、島細胞機能の改善および、最終的には、またより良いグルコース制御を示唆する。
【０２１０】
多発性硬化症と関連状態（管内データ）
多発性硬化症（ＭＳ）は未知の原因の疾患であり、臨床的には特徴的な症状、兆候および進行によって、病理学的には散乱した炎症領域および脳、視神経および脊髄の髄鞘脱落によって定義される。ＭＳの最初の症状は、もっとも一般的には１５歳から５０歳の間で現れる。
【０２１１】
ＭＳの原因は未知であるが、しかし病因には免疫仲介炎症髄鞘脱落が含まれることが広く信じられている。ＭＳの脳の病理学的試験では、リンパ球および単球による免疫病理学的過程脈管周囲浸潤、病巣での細胞によるクラスＩＩＭＨＣ抗原発現、活性化した免疫細胞によって分泌されたリンホカインおよびモノカインの顕著な特徴および感染の明白な証拠の欠失を示す。
【０２１２】
自己免疫病原についてのさらなる証拠には、（１）ＭＳ患者の血液および脳脊髄液（ＣＳＦ）での免疫学的異常、著しい選択的鞘内液免疫活性化、リンパ球サブセット異常、および血中およびＣＦＳ中の高頻度の活性化リンパ球、（２）ＭＳと特定のＭＨＣクラスＩＩアロタイプ間の結合、（３）ＭＳ患者の、免疫抑制剤で改善される傾向にあり、免疫応答を刺激するインターフェロン−ガンマ処置で悪化する免疫調節に対する臨床的応答、（４）ＭＳおよび実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）、すなわち炎症髄鞘脱落の再発性症状発現が、ミエリン基礎タンパク質またはプロテオリピドタンパク質を感受性動物に接種することで誘導できるような動物モデルの間の著しい相同性が含まれる。
【０２１３】
疫学的研究は、ＭＳの病理学での環境および遺伝的因子を提案している。疾患の一定ではない地理的分布および様々な時点−原因の流行は、環境因子を提示してきたが、しかしながら、過去３０年間にわたる真剣な研究では、感染原因を確立し得なかった。移動研究は、青年期より前での定義されていない環境因子の暴露がＭＳの引き続く発達に必要であることを示した。遺伝的影響は、二卵性双生児と比較した一卵性での過剰な一致、家族でのＭＳの集積化、リスクの人種変動およびクラスＩＩＭＨＣアロタイプとの関連によってよく確立されている。カフカス人では、ＨＬＡクラスＩＩハプロタイプＤＲ１５、ＤＱ６、Ｄｗ２がＭＳのリスクの増加に関連して強くそして一定に現れる。
【０２１４】
免疫学的、疫学的、および遺伝的な証拠は、遺伝的に感受性の個体の幼児期の間の環境因子への暴露（おそらく任意の多くの共通ウイルス）が結局免疫仲介炎症髄鞘脱落を引き起こす可能性があるという考えを支持する。遺伝的な、環境のそして免疫学的な因子と、環境の引き金の特性の間の正確な相互作用は解決すべきままである。本願発明者らはＭＳ患者よりＰＢＭＣを単離し、これらをＬＰＳまたはＰＭＡ／Ｃａで刺激した。２４時間培養後、サイトカイン分析のために上清を回収した（ＴＧＦ−ベータ、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−ガンマ）。
【０２１５】
ＭＳ患者１（管内）：ＩＲ−Ｐで処理したＬＰＳ刺激ＰＢＭＣでＴＧＦ−ベータおよびＩＬ−１０の産生の増加があった（図ＨおよびＩ）。ＰＭＡ／Ｃａによって刺激し、ＩＲ−Ｐによって処理した培養でのＴＧＦ−ベータおよびＩＬ−１０産生に違いは観察されず（図８９および９０）、一方ＩＲ−ＰはＰＭＡ／Ｃａ刺激ＰＢＭＣでのＩＦＮ−ガンマの産生を阻害した（図９１）。
【０２１６】
ＭＳ患者２（管内）：患者２より入手したＰＢＭＣは、ＴＰＡ／Ｃａ刺激のみと比較してＩＲ−Ｐで処理した培養においてＴＧＦ−ベータおよびＩＦＮ−ガンマの産生の減少を示し、一方ＩＲ−Ｐ処理はＬＰＳ刺激ＴＧＦ−ベータ産生を増加させた（図９２および９３）。ＩＬ−１０産生はＬＰＳおよびＴＰＡ／Ｃａ刺激培養両方でＩＲ−Ｐによって阻害された（図９４）。
【０２１７】
管内でのＭＳ患者からのＰＢＭＣによる抗炎症サイトカインの産生におけるＩＲ−Ｐの刺激効果と、炎症サイトカインの産生における阻害効果は、ＥＡＥが誘導されるＳＪＬマウスのＩＲ−Ｐ処理の有益な臨床効果と関連がある（本文章の他の部分を参照のこと）。
【０２１８】
ヒト気管支上皮細胞株ＢＥＡＳ  ２Ｂ（喘息管内データ）
気管炎症によって特徴づけられる疾患は集団の実質的な割合に影響を及ぼす。これらの疾病には喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）が含まれる。欧州連合においては、ＣＯＰＤと喘息とは、肺炎とともに死因の第３位である。刺激物、感染薬剤および炎症伝達物質への応答でのサイトカインと成長因子との産生は、急性および慢性気管炎症の開始、永続および阻害に重要な役割を演じる。
【０２１９】
気管炎症は気管の炎症細胞および内在細胞より放出される様々な伝達物質およびサイトカインの過剰な産生と活性化に関連する。ここで上皮は炎症の伝達物質の主要な標的であるだけでなく、それ自身炎症過程への活性のある関連物であることが明らかである。気管支上皮細胞は化学誘引物質の放出を介して気管へ炎症細胞を補充することができ、細胞接着分子の発現を介して上皮を横切る炎症細胞移動を管理でき、そしてサイトカイン、ケモカイン、アラキドン酸代謝産物ならびに弛緩因子および収縮因子などの伝達物質の放出を介して他の細胞の炎症活性を調節できる。
【０２２０】
気管支上皮細胞は受動的バリアを形成するだけでなく、免疫応答に活発な役割を担ってもいる。これらは炎症促進または抗炎症のいずれかで働くであろう様々な伝達物質を産生できる。さらに、気管支上皮細胞は多くの異なる細胞型に対する接着分子を発現してよく、したがってそれらの漸増に貢献する。
【０２２１】
気管に存在する炎症細胞から産生されるＴＮＦ−アルファはＲＡＮＴＥＳおよびＩＬ−６のような他の炎症サイトカインおよびケモカインを誘発させることができる。また抗炎症サイトカインの産生をダウンレギュレートでき、したがって上皮細胞の保護機能に損害を与えうる。グルココルチコイドは、ＩＬ−６、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−４を含む、喘息に関連するほとんどのサイトカインおよびケモカインの転写を阻害する。この阻害は少なくとも特にグルココルチコイドの治療的効果に対して反応性である。
【０２２２】
本願発明者らの結果（図７１〜図７３）は、これらの発見と一致し、デキサメタゾンがＢＥＡＳ  ２Ｂ細胞株でのＩＬ−６およびＲＡＮＴＥＳ産生を誘導するＴＮＦ−アルファを阻害できることを示している。さらに、デキサメタゾンは抗炎症ＴＧＦ−ベータサイトカインのダウンレギュレーションを誘導するＴＮＦ−アルファを回復させることができ、一方ＩＲ−ＰはＴＧＦ−ベータ産生を回復させるだけでなく、この抗炎症サイトカインをさらに増進させる（図７３）。さらに、デキサメタゾンおよびＩＲ−Ｐは両方ともＲＡＮＴＥＳの産生を誘導するＩＦＮ−ガンマを抑制できる（図７４）。
【０２２３】
ＴＮＦ−アルファはまた、そこで炎症細胞を補充する上皮細胞の表面上にＨＬＡ−ＤＲおよびＩＣＡＭ−１などの細胞接着マーカーを誘導できる。この場合、上皮細胞はまた抗原提示細胞（ＡＰＣ）としても機能できる。本願発明者らの結果は、デキサメタゾンとＩＲ−Ｐ両方がＨＬＡ−ＤＲおよびＩＣＡＭ−１の発現を誘導するＴＮＦ−アルファをダウンレギュレートできたことを示している（図７５および７６）。これらの結果はＩＲ−Ｐがまたアレルギー、喘息および特定の寄生虫性疾患のようなＴｈ２−型サイトカイン表現型によって特徴づけられる疾患の臨床的進行に影響を与える能力を有することを示している。
【０２２４】
考察
ノノース糖尿病（ＮＯＤ）マウスはもともとヒトＩＤＤＭ患者に対する免疫病理学および臨床症状との明らかな類似性を持つインスリン依存糖尿病を進展させる。結果として、ＮＯＤマウスは、ＩＤＤＭの潜在する免疫生物学およびそれを制御する複雑な遺伝学を研究するための貴重なツールとなってきた。これらの研究を通して、本願発明者らは現在、糖尿病がＴｈ１／Ｔｈ２サブセットの比の不釣り合いおよびその結果インスリン産生β細胞の破壊に起因することを知っている。この破壊はＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α／βおよびＩＬ−１のような前炎症サイトカインを産生するβ−細胞抗原特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞によっておこる。研究数の増加が現在糖尿病を（マウスおよびヒトの）Ｔｈ１類似細胞の選択的分化と関連させている。
【０２２５】
対照的に、妊娠は選択的Ｔｈ２現象であると考えられており、驚くべきことに妊娠中、多くの免疫仲介疾患の厳しさが減少してみられた。対照的にＧａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．は、第一トリミスター妊娠で存在するｈＣＧ仲介因子（ＨＡＦ）が抗腫瘍（および抗ウイルス）効果をもち、これはおそらく腫瘍細胞上での直接的な細胞傷害性効果によって、しかしこれらの著者によると免疫仲介応答によってではなく行われる。
【０２２６】
ここで本願発明者らは、たとえば（第一トリメスター）妊娠の尿から入手可能な免疫レギュレータは、妊娠中の上述した免疫異常に影響を与えるだけでなく、ＮＯＤマウスでの糖尿病の発展にも影響を及ぼす。
【０２２７】
本願発明者らの結果はたとえば第一トリメスター妊娠の尿からの部分的に精製したｈＣＧ調製品であるＰｒｅｇｎｙｌは、たとえば４週間の間１週間に３回のみ処置した場合に１５週齢ＮＯＤで、糖尿病の開始を遅延できることを示めす。さらに、これらの転送にて処置したマウスから単離した脾臓細胞はまた、免疫無防備状態ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスでの糖尿病の開始を遅延させる可能性がある。本願発明者らはこの坑糖尿病活性がｈＣＧそれ自身、そのサブユニット、β−コア（β−ｈＣＧの天然に壊れた産生物）に、または同定されていない因子（ＨＡＦ）に存在しているかどうかを査定するためにＰｒｅｇｎｙｌ調製品を分別した。Ｐｒｅｇｎｙｌは入手可能な最も精製されたｈＣＧ調製品の１つであり、少量のβ−コア断片のみを含むということが充分わかっている。本願発明者らはほとんどの坑糖尿病活性がｈＣＧのない分画に存在することを発見した。さらに本願発明者らはヒト組換え体α−ｈＣＧおよびβ−ｈＣＧも何の効果を持たないことを示した。しかしながら、本願発明者らはｈＣＧが糖尿病および他の免疫仲介疾患での他の因子と相乗作用を示すことができる可能性を無視していない。
【０２２８】
ＮＯＤマウスの膵臓でのインスリンおよび浸潤の存在の免疫組織学的解析は、６００  ＩＵ  Ｐｒｅｇｎｙｌで処置したＮＯＤマウスが明らかな浸潤を示してはいなかったことを明らかにした。さらに、新規インスリン小島が膵臓でみられ、これはこの処置によって誘導された可能性のある再生工程を示している。以前に言及したように、通常９週齢時に浸潤している細胞が小島に浸透し、この小島がリンパ球で膨張する。本願発明者らの実験において、ＮＯＤマウスは１５週齢であって、ＰＢＳ処置対照マウスはその時その膵臓で多くの浸潤細胞をもち、ほとんどがインスリン産生細胞ではない。さらに、ＰＢＳ処置マウスではまたその脾臓においてＣＤ８／ＣＤ４の比が上昇し、その膵臓で多くのＴ細胞を持つ。本願発明者らの処置したマウスはその脾臓で正常のＣＤ８／ＣＤ４比を持ち、その膵臓で浸潤は見つからないので、ＣＤ８／ＣＤ４比の上昇は、膵臓内へのＣＤ４＋の選択的増加によるものであった。ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αはＴリンパ球の増加に関与する（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９９８）。
【０２２９】
本願発明者らの結果は、ＮＯＤマウスの６００  ＩＵ  Ｐｒｅｇｎｙｌによる４週間の処置が、その他の炎症のおこった膵臓の形態および機能に劇的な効果を持つことを示す。さらに本研究者らの３００  ＩＵ  Ｐｒｅｇｎｙｌ  ＮＯＤマウスは処置なしで２８週齢まで生存し、糖尿病のないままであった。６００  ＩＵ  Ｐｒｅｇｎｙｌ  ＮＯＤマウスをまたシェーグレン病のような一般化された自己免疫疾患の症状について試験したが、みられなかった。
【０２３０】
ＮＯＤの全脾臓細胞および精製したＣＤ４＋細胞を用いた本願発明者らのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験はｉｎ  ｖｉｖｏデータと一致した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰｒｅｇｎｙｌ、Ｆ３−５によって処置し、より小さな範囲ヒト組換え体β−ｈＣＧで処置したＮＯＤマウスからの脾臓細胞によって放出されたＩＦＮ−γ、ＩＬ−１およびＴＮＦ−α放出の明らかな阻害があった（データは示していない）。ＩＬ−４産生の増加も観察され、この処置でのＴｈ１のＴｈ２型応答への変動を示している。８００  ＩＵ  Ｐｒｅｇｎｙｌ以上の投与量は反対の結果を引き起こし、多量のｈＣＧそれ自身の存在によるのであろう。
【０２３１】
免疫系は明らかに糖尿病の開始に関与する。Ｐｒｅｇｎｙｌでの処置は免疫系に影響を及ぼし、したがってＮＯＤマウスでの疾患活性を減少させうる。Ｐｒｅｇｎｙｌの有用な臨床効果からその免疫調節活性を分離するために、本願発明者らは健康なＢＡＬＢ／ｃマウスを処置した。この種は一般的にＴｈ２駆動免疫応答での刺激に応答すると考えられている。本願発明者らの結果は、Ｐｒｅｇｎｙｌ処置ＢＡＬＢ／ｃマウスから得た精製したＣＤ４＋  Ｔ細胞がさらにＴｈ２傾斜を表すことを示唆している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰｒｅｇｎｙｌで刺激したとき、同じ細胞はＩＦＮ−γ産生の増加とＩＬ−４産生の減少を示した。このことはＰｒｅｇｎｙｌがｉｎ  ｖｉｖｏ対ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの処置において異なる調節Ｔ細胞サブセットに影響を与えることを意味する。本願発明者らはｉｎ  ｖｉｖｏでの処理が、ＴＧＦ−βの選択的産生およびＩＬ−１０のより低いか全くない産生によって特徴づけられるおそらくＣＤ４＋  Ｔｒ１細胞の集団の成長を刺激する。これらのＣＤ４＋  Ｔｒ１細胞が、Ｔｈ１細胞の活性を選択的に阻害するために、Ｔｈ１駆動疾患含有糖尿病およびＭＳの異なるモデルでみられ（Ｏ’Ｇａｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）、したがって疾患のひどさをも減少させる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰｒｅｇｎｙｌで刺激したＰｒｅｇｎｙｌ処置ＢＡＬＢ／ｃマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞による同じことがＴｈ２細胞の減少にともなったＴｈ１細胞の増加を示した。これはＩＬ−１０の高産生およびＴＧＦ−βの低産生によって特徴づけられるＣＤ４＋  Ｔｈ３細胞の好ましい刺激と一致する。これらの調節細胞はＴｈ１細胞によるＩＦＮ−γ産生の抑制およびＴｈ２型細胞の成長のインヒビターである。ＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスにおいてＴｈ２細胞の安定した増加が、少ない深刻な高血糖および膵臓小島での浸潤の異なる特性の原因であることも示されてきた。
【０２３２】
３００  ＩＵ  Ｐｒｅｇｎｙｌ処置ＮＯＤの本願発明者らの結果と本願発明者らの再形成されたＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスは、ＰＢＳ−処置ＮＯＤと比較したときにとりわけＮＯＤ．ｓｃｉｄにおいて、血中グルコースの同様のゆっくりした増加を示し、異なる浸潤特性を示した。ＮＯＤマウスにおいてＰｒｅｇｎｙｌの活性はＴｈ１およびＴｈ２細胞両方を阻害しているＴｈ３細胞の誘導でよく仲介されうる。これらのＴｈ３細胞は本当に少なくとも引き延ばされた期間疾病活性を抑制してよい。機能的Ｔ細胞を持たないＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスにおいて、Ｐｒｅｇｎｙｌ処置脾臓細胞での再形成はＴｒ１細胞の選択的誘導で調節され、したがってＴｈ１サブセットのみを阻害する。引き延ばされた期間の後、糖尿病誘発性Ｔｈ２細胞の安定した成長が、糖尿病のあまり深刻ではない形態の遅い開始の原因である。同様に、本願発明者らのＦ１−２ではなくＦ３−５が上で論議した現象を示し、ｈＣＧが観察された影響の原因にはなり得ないことを示している。このＦ３−５は主として自己免疫糖尿病の開始での免疫応答における決定的な効果の方へ向かっており、この疾病および他の免疫仲介障害の免疫治療に対する活性成分である。
【０２３３】
さらに、Ｐｒｅｇｎｙｌおよび機能的にそれと同等の免疫レギュレータはインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）で効果的である。ＮＩＤＤＭ患者での本質的な問題はインスリン抵抗性および肥満であり、ＴＨＦ−（アルファ）が肥満およびＮＩＤＤＭのインスリン抵抗性の原因であることが示された（Ｍｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，  Ｓｏｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，  Ｐｆｅｉｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，  Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９４，  Ａｒｇｉｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９４）。ＴＮＦ−アルファによって誘導されたこのインスリン抵抗性は、おそらくその有用な作用を血液の遊離脂肪酸（ＦＦＡ）濃縮を誘導するＴＮＦ−アルファの低下によって、および／または筋肉内のインスリンレセプター自己リン酸化へ遠位の細胞内部分でのグルコース取り込みの刺激によって行うような、ＰｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅおよびＭｅｔｆｏｒｍｉｎなどの最近発展した薬で、および遺伝子工学的に作製したヒト坑−ＴＮＦ−アルファ抗体（ＣＤＰ５７１）（Ｓｏｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７，  Ｏｆｅｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９６）で逆転されうる。さらに、網膜障害の存在（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）（糖尿病の遅延合併症のひとつ）が特に血漿ＴＮＦ−アルファの上昇を仲介し、性依存性である（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。ＴＮＦ−アルファの増加は男性ＮＩＤＤＭでおこるがしかし女性のＮＩＤＤＭではおこらず、網膜障害および神経障害、腎障害または微小血管障害のような他の合併症の発達に参加しうる（Ｐｆｅｉｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。Ｐｒｅｇｎｙｌおよび分画３−５が免疫調整潜在力を持ち、特にＴＮＦ−アルファを直接的または間接的に阻害する。Ｐｒｅｇｎｙｌおよびその断片３−５はまたＮＩＤＤＭ患者で有用な効果を持つ。さらに、女性での糖尿病合併症の発生が低いことは、女性ホルモンの関連を示す。セプシスまたは敗血性ショックで示される鍵となる病因サイトカインは、セプシスまたは敗血性ショックおよび悪疫質を含む種々の炎症状態および他の深刻な疾患に関連する病態生理で鍵となる役割を占める免疫学的な伝達物質ＴＮＦαである。ＴＮＦがＴ細胞によって（たとえばスーパー抗原［内毒素］を介したＴ細胞活性化によって）、または内毒素を介したマクロファージによって産生されたとき、それは攻撃有機体を疎隔し拒絶するであろう炎症反応を仲介する。感染が広がった場合、循環系への多量のＴＮＦの引き続く放出は破壊的であり、器官系に損害を与え、致死ショックの状態を引き起こす。これらの毒性効果は宿主細胞におけるＴＮＦの直接的な作用によっておよびＩＬ−１、ＩＦＮ−ガンマを含む他の内因性免疫学的伝達物質のカスケードとの相互作用によっておこる。
【０２３４】
このことはＤ−ガラクトサミンで感作し、ＴＮＦαで処置したマウスでの症状のようなショックの誘導およびＴＳＳＴ−１およびＤ−ガラクトサミン処置に続く坑ＴＮＦα  ｍＡｂｓの同時注入後の疾病の致死および視覚的兆候両方の阻害によって示された。低投与量の内毒素モデルにおいて、および外毒素モデルにおいて、Ｄ−ガラクトサミン処置は、肝臓にショック誘導に続いて存在する高レベルのＴＮＦαを緩和させる急性期タンパク質の転写を阻害するために必要である。これらの急性期タンパク質の欠損はネズミ肝細胞のＴＮＦα仲介アポトーシス誘導への感受性の増加を導く。このアポトーシスおよびＴＮＦαの炎症効果を中和する能力がないことは死を導く。
【０２３５】
本願発明者らはたとえば妊娠の第１トリメスターの尿（ＩＲ−Ｕ）で、および商業的なｈＣＧ調製品（ＩＲ−Ｐ）で存在しているｈＣＧを持つまたはもたない因子（ＩＲ）が免疫調整効果を持つことを示してきた。とりわけこれらは自己免疫および炎症疾患を阻害する潜在力を持つ。ＴＮＦおよびＩＦＮ−ガンマが病理学的にセプシスまたは敗血性ショックに、およびまた自己免疫および炎症疾患に関与することから、ＩＲはまたショックのような急性炎症状態でＴＮＦおよびＩＦＮ−ガンマを阻害する能力を持つ。本願発明者らの結果はＩＲが、ＬＰＳで（内毒素モデル）またはＴＳＳＴ−１で（外毒素モデル）処置したＢＡＬＢ／ｃまたはＳＪＬでのセプシスまたは敗血性ショックを阻害することを示す。ＩＲは慢性炎症疾患を阻害する効力を持つだけでなく、ショックのような急性炎症疾患も抑制できる。さらに本願発明者らはまた、ＩＲでの処置後でさえもショックを阻害することを示す。さらに、本願発明者らのＩＲ断片データはほとんどの坑ショック活性が、主にｈＣＧの個々の鎖、それらの鎖のホモダイマーまたはベータ−コア残余鎖、これらの鎖の分解産生物および他の分子（＞３０  ｋＤａ）を含むＩＲ−（Ｕ／Ｐ）３−５［ｐｏｏｌｅｄ］で残っていることを示している。本願発明者らはまた同一の断片ＩＲ−Ｕ／Ｐ３−５がＮＯＤマウスモデルで坑糖尿病効果を持つことを示した。したがって内毒素および外毒素モデルはＮＯＤマウスおよびＮＯＤ．ｓｃｉｄマウスでの坑糖尿病活性の決定のための高速読み出しモデルとして役に立つ。内毒素および外毒素モデルの助けによって、本願発明者らは４８時間以内のＩＲ断片での坑糖尿病活性について調査できる。
【０２３６】
したがって、Ｐｒｅｇｎｙｌおよびその分画３−５のようなＩＲは調節Ｔ細胞サブセットに影響を与えることで免疫系を調節することによって自己免疫糖尿病を抑制する高い潜在力を持つ。本願発明者らのＮＯＤおよびＢＡＬＢ／ｃデータは、これらがＴ細胞サブセットバランス（Ｔｈ１−＞Ｔｈ２／Ｔｈ２−＞Ｔｈ１）を元に戻す潜在力を持つことを示す。したがって、Ｐｒｅｇｎｙｌおよびその断片３−５は、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、ＮＩＤＤＭ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などのＴｈ１サイトカインが優位な疾患、Ｔｈ２サイトカイン応答が優位なアレルギーおよび喘息のような移植モデルおよび疾患の様な免疫仲介疾患のひどさを調節するのにも効果的である。（ＭＳに対するＥＡＥ−モデル、ＮＩＤＤＭに対するＢＢ−ラット、ＲＡに対するフィッシュ−ラットおよびＭＬＲ−モデル、アレルギーに対するＯＶＡ−モデル、ＳＬＥに対するＭＬＲ／ｌｐｒおよびＢＸＳＢモデルのような）これらの疾患の動物モデル、ＫＫ−Ａｙ−マウス、ＧＫラット、ウィスター脂肪ラット、ｆａ／ｆａラットは他のものの中で他の免疫調節疾患のモデルを提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ４週間ＰＢＳで処置された１５週齢ＮＯＤ（非肥満性糖尿病）マウスが１７週齢で糖尿病になり（＞１３．７５  ｍｍｏｌ／ｌ）、また１週間内にそれらマウスは血糖値が３０  ｍｍｏｌ／ｌより上になったが、一方、３００  ＩＵプレグニールで治療されたＮＯＤマウスは、１９週齢で治療が停止されても、殺傷される（２８週齢で）まで非糖尿病のままであったことを示している。その場合血糖値は、８  ｍｍｏｌ／ｌよりも低いままであった。
【図２】  ＰＢＳ処置ＮＯＤマウス（図３）から脾臓細胞を受け入れて再構成されたＮＯＤ  ＳＣＩＤ（重篤複合免疫不全）マウスが転移の２２日後に糖尿病になり、一方、６００  ＩＵプレグニール治療ＮＯＤにより再構成されたＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスは、それらマウスが殺傷される（転移後８週）まで非糖尿病状態のままであったことを示している。
【図３】  ４週間ＰＢＳで処置された１５週齢ＮＯＤマウスが１７週で糖尿病（＞１３．７５  ｍｍｏｌ／ｌ）になり、また１週間内でそれらマウスは３０  ｍｍｏｌ／ｌより上になったが、６００  ＩＵプレグニールによって治療されたＮＯＤマウスは、それらマウスがＰＢＳ群と一緒に殺傷される（２１週齢で）まで非糖尿病のままであったことが示されている。３００  ＩＵプレグニールで治療された１５週齢ＮＯＤマウスはそれらマウスが殺傷される（２８週齢で）まで、その治療が１９週齢で停止されても、非糖尿病状態のままであった。その場合血糖値は、８  ｍｍｏｌ／l以下のままであった。
【図４】  ２０週齢雌ＮＯＤから脾臓細胞が分離され、また、抗ＣＤ３とＩＬ−２の存在下で４８時間異なる条件で培養された（「−」培地のみ、「＋」には抗ＣＤ３，５０，１００，３００，６００，８００  ＩＵ／ｍｌプレグニール、Ｆ１−２、Ｆ３−５、ｒｈ−ｈＣＧ、ｒｈ−α−ｈＣＧ、ｒｈ−β−ｈＣＧ [各２００μｇ／ｍｌ]）。４８時間後ＩＮＦ−（サイトカインＥＬＩＳＡ法が実施された。その結果から、ＩＮＦ−（プレグニール（５０〜６００  ＩＵ／ｍｌ）とｈＣＧを含んでいない分画３〜５（Ｆ３〜５）の用量依存性阻害があることが示されている。ｈＣＧ自体の効果を示唆する８００  ＩＵ／ｍｌプレグニールを加えたＩＮＦ−ｇにおいて増加がある。ＩＬ−４に対する効果は、ｈＣＧ、ヒト組換え（ｒｈ）ｈＣＧ、ｒｈ−α−ｈＣＧを含有する分画１〜２（Ｆ１〜２）に関してはみられなかった。ｒｈ−β−ｈＣＧに関しては、ＩＮＦ−ｇ値で多少減少がみられる。
【図５】  ２０週齢雌ＮＯＤから脾臓細胞が分離され、また、抗ＣＤ３とＩＬ−２の存在下で４８時間異なる条件で培養された（「−」培地のみ、「＋」には抗ＣＤ３，５０，１００，３００，６００，８００  ＩＵ／ｍｌプレグニール、Ｆ１−２、Ｆ３−５、ｒｈ−ｈＣＧ、ｒｈ−α−ｈＣＧ、ｒｈ−β−ｈＣＧ[各２００μｇ／ｍｌ]）。４８時間後ＩＬ−４サイトカインＥＬＩＳＡ法が実施された。その結果から、ＩＬ−４（プレグニール（５０〜６００  ＩＵ／ｍｌ））とｈＣＧを含んでいない分画３〜５（Ｆ３〜５）の用量依存性増加があることが示されている。ｈＣＧ自体の効果を示唆する８００  ＩＵ／ｍｌプレグニールを加えたＩＬ−４では減少している。ＩＮＦ−ｇに対する効果は、ｈＣＧ、ヒト組換え（ｒｈ）ｈＣＧ、ｒｈ−α−ｈＣＧ  ｒｈ−β−ｈＣＧを含有する分画１〜２（Ｆ１〜２）に関してはみられなかった。
【図６】  ２０週齢雌ＮＯＤからＣＤ４  Ｔ細胞が分離され、また、抗ＣＤ３とＩＬ−２、抗ＣＤ２８の存在下で48時間異なる条件で培養された（「−」培地のみ、「＋」には抗ＣＤ３，５０，１００，３００，６００，８００  ＩＵ／ｍｌプレグニール、Ｆ１−２、Ｆ３−５、ｒｈ−ｈＣＧ、ｒｈ−α−ｈＣＧ、ｒｈ−β−ｈＣＧ[各２００μｇ／ｍｌ]）。４８時間後ＩＮＦ−γサイトカインＥＬＩＳＡ法が実施された。その結果から、プレグニール（５０〜３００  ＩＵ／ｍｌ）を加えたＩＮＦ−γとｈＣＧを含んでいない分画３〜５（Ｆ３〜５）の用量依存性阻害があることが示されている。ｈＣＧ自体の効果を示唆する６００〜８００  ＩＵ／ｍｌプレグニールを加えたＩＮＦ−γでは増加している。ＩＮＦ−ｇに対する効果は、ｈＣＧ、ヒト組換え（ｒｈ）ｈＣＧ、ｒｈ−α−ｈＣＧを含有する分画１〜２（Ｆ１〜２）に関してはみられなかった。ｒｈ−β−ｈＣＧに関しては、ＩＮＦ−γ値で多少減少がみられる。
【図７】  ４８時間ＰＢＳ、６００  ＩＵプレグニール、分画１〜２（Ｆ１〜２）、分画３〜５（Ｆ３〜５）あるいはヒト組換えβ−ｈＣＧ(ｂ−ｈＣＧ)で処置された２０週齢の雌の脾臓細胞の転移実験、またその後に８週齢ＮＯＤ  ＳＣＩＤマウス（ｎ＝３）が示されている。転移の２２日後に、ＰＢＳ処置されたＮＯＤの脾臓を受け入れたＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスが糖尿病になった。Ｆ１〜２とｂ−ｈＣＧを受け入れたＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスがそれぞれ４と５週間後に糖尿病になり、一方、６００  ＩＵプレグニールとＦ３〜５を受け入れたＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスは約６週間非糖尿病のままであったが、その後にすべてのマウスが殺傷された。それはプレグニールとＦ３〜５には最大抗糖尿病効果があることを示している。たいていのｈＣＧを含有しているＦ１〜２はこれらのマウスにおける糖尿病の発生に対する効果を有していないため、抗糖尿病効果はｈＣＧそれ自体には効果がないことは明白である。組換えヒトβ−ｈＣＧには多少抗糖尿病の効果がある。
【図８】〜【図１１】  プレグニールがＴｈ２タイプマウスに対しても効果を有しているかどうかを試験するために、われわれは、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）を４日間３００  ＩＵプレグニール腹腔内投与により治療し、またＰＢＳ（ｎ＝５）により処置した。脾臓からＣＤ４+細胞を分離した後、われわれはそれらを、４８時間抗ＣＤ３／ＩＬ−２により刺激し、その上澄みをＩＦＮ−γ（図８）とＩＬ−４（図９）サイトカインの測定のために回収した。われわれはまた、ＣＤ４+細胞を、プレグニールの異なる投与量で処置した。その後に、その上澄みはＩＮＦ‐ｇ  ＥＬＩＳＡ(図１０)法による分析のために回収された。図８は、３００  ＩＵプレグニールによるｉｎ  ｖｉｖｏ処置がＩＮＦ‐ｇを抑制し、また、もう一方では、ＩＬ‐４の産生を増加させていることを示している。これは、Ｔｈ‐２表現型に向かってさらにシフトされることを暗に示している。異なるプレグニールの投与量によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで再び処置された同じ細胞が、ＩＮＦ‐ｇにおいては増加（図１０）を、またＴｈ‐１表現型に向かってのシフトを示唆するＩＬ‐４においては減少（図１１）を示している。これはすべて、プレグニールとＦ３〜５が調節Ｔ細胞サブセット（Ｔｈ３，Ｔｒ１）に対して効果を有していることを暗に示している。
【図１２】カラム
Superdex ７５時間 １０/３０；ＦＰＬＣシステム（Pharmacia）
合計容量Ｖt＝２５ｍｌ；ボイドボリュームＶ0＝８．７ｍｌ；フロー率１ｍｌ／分；緩衝液；緩衝液 １０ｍＭ
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７.３；室温カラム効率＝３８，０００Ｎ／ｍ
選択率ＫAV＝１．７３７〜０．２７８２ｌｏｇ（ｒ2＝０．９８２）、ＭＷ＝分子質量
分離｛類｝範囲：球状タンパク質に関して３，０００〜１００，０００ダールトン
0004804626.tif 000005
サンプル
プレグニール（オレガノン、ロット番号：１６８５５８、有効期限：２８．１１．９９）
サンプル容量＝０．５ ｍｌ＝２，０００単位；感度０．１ＡＵＦＳ
クロマトグラム
ピーク１＝分画１〜２：Ｖｅ＝１４．７〜１５．１ｍｌ；ＫAV＝０．３７〜０．３９
ピーク２＝分画３〜５：Ｖｅ＝１５．３８〜１７．９９ｍｌ；
ＫAV＝０．４１〜０．５７
ＫAV＝（Ｖe−Ｖ0）／（Ｖt−Ｖ0）
ピーク１は、分離開始後、１４．７〜１５．１ｍｌの間の容量で溶離する。これは７０，０００〜８０，０００ダールトン分子質量に対応する。これは分画には部分的にｈＣＧの二量体形態が含まれている（J.E. Griffin, S.R. Ojeda編「内分泌生理学テキスト」第2版、199頁、オックスフォード大学出版部、オックスフォード、1992年刊（“Textbook of Endocrine Physiology, Second edition, J.E. Griffin, S.R. Ojeda（Ed.）Oxford University Press, Oxford, 1992, pp.199”））。ピーク２は、１５．３８〜１７．９９ｍｌの間の容量で溶離し、これは１５００〜５８，０００ダールトンの間の容量に対応する。この分画には部分的にβ-サブユニット（ＭＷ=２２，００ダールトン）、ｈＣＧとそのほかの分解産物、不明の分子がまだ含まれている。これらの計算はこのカラムの上述の選択を基礎とした。
【図１３】  敗血症あるいは敗血症ショックの３つ異なるモデルにおいて作動している提案メカニズム。Ａ）は高用量エンドドキシンモデル。Ｂ）は低用量エンドトキシンである。Ｃ）はＴＳＳＴ‐１／ＳＥＢである。高および低用量エンドトキシン（ａ，ｂ）においては、エンドトキシン（ＬＰＳ）の全身的な効果はマクロファージにより大部分は仲介されているが、一方、エキソトキシンモデル（Ｃ）においては、超抗原（ＴＳＳＴ−１／ＳＥＢ）はＴ細胞により仲介される。ＴＮＦ、ＩＦＮならびにＩＣＥ（ＩＬ−１αおよびβ）の両方の場合で、敗血症ショックの病因で重要な役割を果している。
【図１４】  超抗原により誘導されるＴ細胞活性は、特異的Ｖ−βファミリーを表現しているＴ細胞はすべて、ＴＣＲ／ＭＨＣＩＩ／と超抗原の非抗原特異的結合により活性化されるという点で、ポリクローナルＴ細胞活性化とみなすことができる。
【図１５】  非希釈ＩＲ−Ｕサンプルの５０μｌのＦＰＬＣクロマトグラム。
【図１６】  非希釈ＩＲ−Ｐサンプルの５０μｌのＦＰＬＣクロマトグラム。
【図１７】  図１５から分画２と３をさらに分離。
【図１８】  ２−メルカプトエタノール処理された５０μｌ ＩＲ−ＵサンプルのＦＰＬＣクロマトグラム。
【図１９】  ２−メルカプトエタノール処理された５０μｌ ＩＲ−ＰサンプルのＦＰＬＣクロマトグラム。
【図２０】  ＴＳＳＴ−１とＤ−Ｇａｌ処置の前にＩＲ−Ｐにより処置された動物と、処置されていなかった動物との間の生存率において、はっきりとした差はみつかっていない。
【図２１】  ＩＲ−Ｐ前処置Ｂａｌｂ／ｃマウスは、ＴＳＳＴ−１エキソトキシンモデルにおける疾患レベル２を超えないが、一方、Ｄ−Ｇａｌ−ＴＳＳＴ−１群は疾患レベル５を越え、殺傷された。
【図２２】  ＩＲ前処置はまた、中毒性ショックの生存動物の体重減少の低下という結果になった。
【図２３】  この数字は、致死中毒性ショック（棒グラフ２）に罹っているマウスにおける免疫活性が高い値であることを示している。正常Ｂａｌｂ／ｃマウス（棒グラフ１）に比較すると、ＩＲ−Ｐ群（棒グラフ３）ではＷＢＣに関してはまだ正常値である。
【図２４】  この数字は、正常Ｂａｌｂ／ｃマウス（棒グラフ１）に比較すると、ＴＳＳＴ−１群（棒グラフ２）において血小板数での多少の減少を示している。血小板数はＩＲ−Ｐ処置群Ｂａｌｂ／ｃマウス（棒グラフ３）において非常に高値がみられた。
【図２５】  この数字は、第1トリメスター妊娠尿サンプル（ＩＲ−Ｕ）のＦＤＣ  Ｇ２５クロマトグラムを示している。分画ＩＲ−Ｕ／ＨＭＤＦ（高分子量脱塩カラム分画）は５ｋＤａよりも明らかに大きい分子量を有し、一方、ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ（低分量脱塩カラム分画）は５ｋＤａよりも小さい分子量を明らかに有する。
【図２６】  この数字は、ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦサンプルのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ＧＰＣクロマトグラムを示す。得られたプロフィールは、その割合は異なっていたが、少なくとも５ピークを示した。
【図２７】  Ｓｕｐｅｒｄｅｘペプチド、ＰＣ３．２／３０を装備されているＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＳＭＡＲＴシステムにおいては低分子量分画（ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ）を示している。運転用緩衝液に関しては、４０ｍＭトリス、５  ｍＭ  ＭｇＣｌ2＋１５０  ｍＭ  ＮａＣｌは使用され、またフロー率は７５分間５０  ｍｌ／分であり、また単一のものは２１４と２５４  ｎｍ波長で分析された。回収された１〜３分画があった（ＬＭＤＦ１〜３）。シトクロームＣとＧｌｙ１６は内部サイズマーカーとして使用された。ピーク１、２、３はそれぞれ約１．３ｋＤａ、１．１５ｋＤａ、４００Ｄａで溶離された。
【図２８】  この図は、ＣＤ４＋細胞のＴｈ１表現型に分極するＣＤ４＋細胞に対し、ＩＲ−ＰおよびＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦではＩＦＮ−ガンマ産生に強い阻害があることを示す（in vivo）。組換えベータ−ｈＣＧではＩＦＮ−ガンマ産生の弱い阻害だけが観察され、組換えｈＣＧでは、対照（ＭＥＤ）と比べて、効果は見られなかった。
【図２９】〜【図３１】  ＩＲはまたＤＣの成熟に関して効果を有しており、ＮＯＤマウス由来のＢＭもまた７日間ＧＭ−ＣＳＦとＩＲとともに直接共同培養された。８日目に、すべての細胞が以下のマーカーの発現についてフローサイトメーターにより分析された。すなわち、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＥＲ−ＭＰ２０、ＥＲ−ＭＰ５８、Ｆ４／８０、Ｅ−ｃａｄ、ＭＨＣ  ＩＩ、ＭＨＣ  Ｉ、ＲＢ６、８Ｃ５である。
われわれは、ＩＲにより処置されたすべてのＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦのみにより処置された対照ＤＣよりも成熟してはいなかった。細胞表面マーカーＣＤ１ｄ、ＥＲ−ＭＰ５８、Ｆ４／８０、ＣＤ１４における減少、ＣＤ４３、ＣＤ９５、ＣＤ３１、Ｅ−ｃａｄにおける増加から結論付けられた。さらに、細胞表面マーカーＥＲ−ＭＰ２０／ＬＹ６Ｃ、ＭＨＣ  ＩとＩＩでは何の変化も観察されなかった（図２９）。図３０と３１は、ＤＣが、６日間ＧＭ−ＣＳＦとともに培養され、また７日目に追加して２４時間３００ＩＵ／ｍｌ  ＩＲ−Ｐ(図３０)あるいはＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦの１００ｍｇ／ｍｌ（図３１）とともに共同培養されたとき、ＤＣはさらに成熟され、またＡＰＣとしてよりよく機能することができた。これは、ＣＤ１ｄ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９５、Ｆ４／８０、ＣＤ１１ｃ、ＭＨＣ  ＩＩ細胞表面マーカーにおける増加から結論付けられた（図３０と３１）。
【図３２】  Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＩＲ−Ｐ処置により、ＣＤ４＋細胞がＴｈ２表現型にシフトすることを示す。これは、対照（ＣＴＬ）グループと比べて、ＩＦＮ−ガンマ産生の阻害によって示される。
【図３３】  Ｔｈ１サブセットのダウンレギュレーションを示唆するＰＢＳ処置マウスに比較して、ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦで処置されたＢＡＬＢ／ｃマウスの精製ＣＤ４＋細胞はＴｈ１分極測定においてはＩＦＮ−γをより少なく産生することを示している。
【図３４】  Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＩＲ−Ｐ処置により、ＣＤ４＋細胞は、Ｔｈ２表現型にシフトすることを示す。このことは、対照（ＣＴＬ）マウスと比べて、ＩＬ−４産生の増加によって示される。
【図３５】  ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦにより処置されたＢＡＬＢ／ｃマウスの精製ＣＤ４＋細胞は、Ｔｈ２サブセットのアップレギュレーションを示唆するＰＢＳ処置されたマウスに比較すると、Ｔｈ２分極測定においてより多くＩＬ−４を産生することを示す。
【図３６】  異なる量のＩＲ−Ｐ（in vitro）によって処置されたＰＢＳおよびＩＲ−Ｐマウス（in vivo）からのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＦＮ−ガンマ産生の増加を示すことを示しており、このことは、Ｔｈ１表現型へのシフトを示唆する（図３７も参照）。
【図３７】  異なる量のＩＲ−Ｐ（in vitro）によって処置されたＰＢＳおよびＩＲ−Ｐマウス（in vivo）からのＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＩＬ−４産生の減少を示すことを示しており、このことは、Ｔｈ１表現型へのシフトを示唆する（図３６も参照）。
【図３８】〜【図４１】  Ｔｈ２表現型に向かうＣＤ４＋Ｔ細胞のシフトがＩＬ−１０あるいはＴＧＦ−β依存性であるかどうかを判定するために、われわれはまた、ＩＲ−Ｐ処置マウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞の分極測定において、抗ＩＬ１０と抗ＴＧＦ−βを付け加えた。図３８は、Ｔｈ１分極条件におけるＩＲ−ＰグループのＩＦＮ−ガンマ産生の増加を示す。これは、Ｔｈ２サブセットへのＩＲ−Ｐの効果の促進が、少なくともＩＬ−１０依存性であることを示す（詳細は本文を参照）。図３９は、Ｔｈ２分極条件における、ＩＬ−４産生の増加が、対照（ＣＴＬ）グループおよびＩＲ−Ｐグループにおける抗−ＩＬ１０in vi tro処置において見られることを示している。このことは、Ｔｈ１／Ｔｈ２分極におけるＩＬ−１０の関与を示唆している（詳細は本文を参照）。一方、大きな差異は、対照とＩＲ−Ｐ処置群の間の抗ＴＧＦ−β  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ処置を伴うＴｈ２とＴｈ１分極条件（図４０と４１）におけるＩＬ−４とＩＦＮ−γ産生においてはみられなかった。
【図４３】〜【図４５】  図４３、４４ａ、ｂと４５は、ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ由来の精製ＣＤ４+細胞は対照マウス由来の細胞よりもＴＦＧ−βをより多く産生することを示している。抗ＩＬ−１０あるいは抗ＩＬ−６が両方の培養培地に加えられたとき、対照群マウス由来のＣＤ４＋細胞ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ処置群よりもＴＧＦ−βをより多く産生することを示している。これは、ＴＧＦ−β産生におけるＩＬ−６とＩＬ−１０の関与を示唆している。これは、対照マウス群に比較すると、ＩＲ処置マウス由来のＬＰＳ刺激脾臓細胞はＩＬ−６の高い値（図４５）を産み出すことを示しているわれわれのデータと一致している。
【図４６】，【図４７】  ＵＶＢ処置ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞の培養後、ＬＰＳと抗ＣＤ３誘導増殖の減少が観察され、一方、ＩＲあるいは組み合わせたＩＲまたはＵＶＢ照射処置がＬＰＳと抗ＣＤ３刺激増殖を増加させた（図４６と４７）。
【０２４９】
【図４８】、【図４９】  ＬＰＳと抗ＣＤ３刺激増殖におけるこの変化がＩＬ−１０依存性であるかどうかを判定するため、われわれはＩＲ−ＰあるいはＵＶＢにより、ＩＬ−１０ノックアウトマウスを処置した。増殖パターンにおける変化は、ＵＶＢ照射とＩＲ−Ｐ処置ＢＡＬＢ／ｃマウスが比較されたときには（図４７）、抗ＣＤ３刺激脾臓細胞においてはみられらなかったが、一方、両群のＵＶＢ照射ＢＡＬＢ／ｃと比較すると、増殖における逆のパターンが抗ＣＤ３刺激リンパ節細胞においては観察された（図４９）。これは、ＵＶＢ処置後の抗ＣＤ３刺激増殖の減少、あるいは脾臓細胞のＩＲ−Ｐ処置後の増殖の増加は、完全にＩＬ−１０依存性ではなく、一方、これは抗ＣＤ３刺激リンパ節細胞に関しては真実であることを示している。
【図５０】，【図５１】  ４８時間で脾臓細胞のＬＰＳ刺激増殖を示しており、われわれは、対照群に比較すると、ＵＶＢとＩＲ‐Ｐ処置群における増殖の増加を観察し（図５１）、一方、増殖における増加が増殖に関して７２時間で両方の群で観察された（図５０）。
【図５２】，【図５３】  Ｂ２２０とＭ／１１４陽性細胞の減少、ならびにＣＤ４とＣＤ８陽性細胞の増加がＩＲ‐Ｐ‐処置ＩＬ‐１０ノックアウトマウス（図５２）のリンパ節において観察され、一方、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２２０とＭ５／１１４陽性細胞の増加が脾臓において観察された（図５３）。ＵＶＢ処置群において、ＣＤ８陽性細胞の増加とＣＤ４、Ｂ２２０、Ｍ５／１１４陽性細胞の増加が脾臓において観察された（図５３）。ＵＶＢ処置群においては、ＣＤ８陽性細胞の増加とＣＤ４、Ｂ２２０、Ｍ５／１１４陽性細胞がリンパ節においてみられ（図５２）、一方、ＣＤ８陽性細胞の軽度増加以外に細胞マーカーの変化が脾臓細胞の間で観察された（図５３）。
【図５４】，【図５５】  ＢＡＬＢ／ｃマウス由来のＤＣは、７日間、ＧＭ−ＣＳＦとＩＲ（ＩＲ−Ｐ、ＩＲ−Ｕ、ＩＲ−Ｕ３-５、ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ）の存在下で共同培養される場合は、われわれはＩＲにより処置されたすべてのＤＣが、ＧＭ−ＣＳＦのみにより処置された対照ＤＣよりも成熟していなかったことを観察している。これは細胞表面マーカーＣＤ１d、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＥＲ−ＭＰ５８、Ｆ４／８０、Ｅ−ｃａｄ、ＭＨＣ  ＩＩの増加から結論付けられた(図５４)。さらに、ＣＤ９５の軽度増加が観察された（図５４）。対照的に、６日間ＤＣがＧＭ−ＣＳＦとともに培養され、また７日目にその培養培地が追加の２４時間の間、３００  ＩＵ／ｍｌ  ＩＲ−Ｐあるいは１００ｍｇ／ｍｌ  ＩＲ−Ｕ(ＩＲ−Ｕ、ＩＲ−Ｕ３−５、ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ)を補給された場合には、それらＤＣはより成熟し、またＡＰＣとしてよりよく機能することができた。これは細胞表面マーカーＣＤ１ｄ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＥＲ−ＭＰ５８、Ｆ４／８０、Ｅ−ｃａｄ、ＭＨＣ  ＩＩの増加から結論付けられた(図５４)。
【図５６】  図５６はアロＭＬＲを示す。増殖データは、全ＤＣのなかのＩＲ処置ＤＣ対Ｔ細胞の割合により増殖を抑制することができることを示している（図５６）。
【図５７】  ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ分画の抗ショック活性を示す。試験活性の方法はこの出願のなかの他所で説明されている。
【図５８】  ＩＲ処置マウスにおけるＬＰＳ高投与処置の効果を測定。ＬＰＳ（１５０ｍｇ／ｋｇ）をＢａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３０）に腹膜内注射し、生存率を５日間にわたり毎日評価。ＰＢＳ処置Ｂａｌｂ／ｃマウスは、高投与量のＬＰＳの注射の後、１〜２日の間にショック死し、５日目に生存していたのはわずか１０％だけであった。対照的に、ＩＲ−Ｐ，ＩＲ−Ｐ１およびＩＲ−Ｐ３で処置されたマウスは１００％、５日目でも生存していた（Ｐ＜０．００１）が、ＩＲ−Ｐ２、ＩＲ−Ａおよびデキサメタゾン処置のマウスは約７０％の生存率を示した。
【図５９】  ＩＲ−Ａ，ＩＲ−ＰおよびそのフラクションＩＲ−Ｐ１，ＩＲ−Ｐ３は全て正常範囲内（１００−３００×１０9）の血小板数を有するが、対照、ＩＲ−Ｐ２処置およびデキサメタゾン処置のマウスは正常範囲以下の血小板数を有する。
【図６０】〜【図６２】  ＩＲ−Ａ，ＩＲ−ＰならびにそのフラクションＩＲ−Ｐ１，ＩＲ−Ｐ２およびＩＲ−Ｐ３で処置されたマウスは、対照およびデキサメタゾン処置マウスと比べて、血漿中に存在するＡＬＴ，ＬＤＨ１およびＡＳＡＴ酵素のレベルが比較的低い。これらの酵素は、臓器損傷のために、ショック時に血液中に高濃度で存在し、したがって、この結果は我々の生存率の結果と一致する（図５８）。
【図６３】  ＩＲ−Ａ，ＩＲ−Ｐおよびそのフラクションで処置されたマウスは、４８時間後の時点で、対照およびデキサメタゾン処置マウスよりも、中程度〜正常のＷＢＣレベルであり、ＩＲ処置マウスにおいては炎症反応がより低いことを示唆している。
【図６４】  ＩＲ−Ｐ処置およびＩＲ−Ｐ３と組合せたｒｈＣＧ処置のＮＯＤマウスから単離されたＣＤ４＋細胞のＴｈ１分極アセイにおけるＩＦＮガンマ産生の阻害を示し、中低度の阻害がｒｈＣＧとＩＲ−Ｐ３によるＴｈ１分極においてのみ見られる。このことは、ＩＲ−Ｐ３と組合せたｒｈＣＧ処置のＮＯＤマウスが、Ｔｈ１産生の強い阻害を示すことを示している。これは、ＩＲ−Ｐ３フラクションは、Ｔｈ１サブセットを最大限抑制するためにｒｈＣＧを必要とすることを示唆している。
【図６５】  ＰＢＳ処置マウスに比較すると、ＩＲ−Ｐ、ＩＲ−Ｐ１、ＩＲ−Ｐ２、あるいはｒｈＣＧとＩＲ−Ｐ３と組み合わせてそれらにより治療されたＮＯＤマウスから得られる抗ＣＤ３刺激脾臓細胞においてＩＦＮ−γの阻害を示している。ｒｈＣＧとＩＲ−Ｐ３単独では、組み合わせたものと同じ効果を有していなかった。これは、ＩＲ−Ｐ３分画が、そのＩＦＮ−γ阻害のためにはｒｈＣＧを必要とすることを再び示唆している。
【図６６】  ｒｈＣＧと組み合わせたＩＲ−Ｐ、その分画、ｒｈＣＧあるいはＩＲ−Ｐ３により処置されたＮＯＤマウスから得られる脾臓細胞の異なる時点（ｔ＝１２、２４、４８時間）で抗ＣＤ３刺激増殖を示している。再び、その結果は前出のＩＦＮ−γ阻害と一致している（図６５）。ここで、ＩＲ−Ｐ３分画はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏ処置されたＮＯＤマウスから脾臓細胞の抗ＣＤ３誘導増殖についてその阻害効果にはｒｈＣＧを必要とした。
【図６７】  ＩＲ−Ｐおよびそのフラクションが、ＰＢＳ処置マウスとに比べて、処置されたＮＯＤマウスからの抗ＣＤ３刺激脾臓細胞のＩＬ−１０産生を促進することを示している。
【図６８】  ＩｇＧ２ａ産生は、ＩＲ−Ｐ２およびｒｈＣＧINVIVO処置によって阻害されないが、ＩＲ−Ｐ，ＩＲ−Ｐ１，ＩＲ−Ｐ３およびＩＲ−Ｐ３と組合せたｒｈＣＧはＩｇＧ２ａ産生を抑制する。
【図６９】，【図７０】  IR−P処置は、ＨＤ−ＳＴＺモデルならびにＭＤ−ＳＴＺモデルの双方において糖尿病の誘発を遅延し得ることを示す。この遅延の背後にあるメカニズムはおそらく異なった性質のものである。
【図７１】〜【図７４】  ＢＥＡＳ  ２Ｂ細胞系統の結果：デキサメタゾンはＢＥＡＳ  ２Ｂ細胞系統におけるＴＮＦ−α誘導ＩＬ−６とＲＡＮＴＥＳ産生を阻害することができることを示している。ＩＲ−Ｐはまた、ＴＮＦ−α誘導炎症サイトカインの産生を阻害することができる。さらに、デキサメタゾンは、抗炎症ＴＧＦ−βサイトカインのＴＧＦ−α誘導ダウンレギュレーションを回復させることができ、一方、ＩＲ−ＰはＴＧＦ−β産生を回復させるだけではなく、またさらにこの抗炎症サイトカインを促進する（図７５）。さらに、デキサメタゾンとＩＲ−Ｐは両方ともＲＡＮＴＥＳのＩＦＮ−γ誘導産生を阻害することができた（図７４）。
【図７５】，【図７６】  ＢＥＡＳ  ２Ｂ細胞系統のフローサイトメトリー分析：結果は、デキサメタゾンとＩＲ−Ｐ両方とも、ＨＬＡ−ＤＲとＩＣＡＭ−１のＴＮＦ−α誘導発現をダウンレギュレートすることができた。
【図７７】〜【図８０】  ＥＡＥモデルの結果；ＰＢＳ処置マウスは最初の３週間で体重を減らしただけであった（図７７）。実験全期間疾患に対する抵抗が残っていた１匹のマウスを除いて、これらのマウスは、少なくとも２およびより長い疾患期間ＥＡＥの臨床徴候をすべて有していた（図７８）。ＩＲ処置マウス群においては、実験期間中に観察された体重減少はより少ないものであって（図７９）、また２匹のマウスは実験期間中は疾患には罹らなかった。この群の中で疾患に罹ったマウスは、最大臨床スコア２を有し、また、短い疾患期間を有していたが、ＰＢＳ処置群よりもＥＡＥ症候群から早く回復した（図８０）。
【図８１】〜【図８２】  図８１は、ＩＲ処置前は、患者はステロイド剤の高投与量のために免疫無防備状態になっていた。ＩＲ処置後、Ｔリンパ球（ＣＤ４、ＣＤ８）の値が増加し、またＢ細胞以外は正常範囲内にあった。われわれはまた、ＩＲ処置期間に患者から得られたＬＰＳとＰＭＡ／Ｃａ刺激ＰＢＭＣのサイトカインを測定した。われわれは、治療期間中にＬＰＳ刺激ＰＢＭＣによりＴＮＦ−α、ＩＬ−１０とＩＬ−１２がより多く産生され（図８２ａ）、一方、ＰＭＡ／Ｃａ刺激ＰＢＭＣはより少ないＩＦＮ−γを産生した（図８２ｂ）。
【図８３】〜【図８６】  図８３は、ＩＲ−Ｐ治療のため、リンパ球、Ｔ細胞（ＣＤ４、ＣＤ８）、Ｂ細胞の数が減少し、それがその治療による過剰活性化免疫システムのダウンレギュレーションの表示であることを示している。これはまた、ＰＢＭＣによりＬＰＳ刺激ＩＬ−１２とＴＮＦ−αの阻害を示すわれわれのサイトカインのデータと一致している。さらに、その治療期間中にＩＬ−１０産生の増加があったが、それは抗炎症サイトカインである（図８６）。さらに、上昇ＣＰＫと肝酵素（ＡＳＡＴ、ＡＬＡＴ）はまた減少した（図８４と８６）。これはすべて、疾患活性の減少を反映している。
【図８７】，【図８８】  図８７と８８は、糖尿病患者のＩＲ−Ｐ治療の期間中に、正常血糖を維持するために必要なインスリンが図８７に示されているように、減少したことを示している。プレグニールの停止後、その男性患者のインスリン必要量は再び上昇した（図８７）。糖尿病の新たな発症を伴ったこの患者では、インスリンの必要量がＩＲ−Ｐによる治療期間中に有意に下降し、また、ブドウ糖コントロールの改善もまた見出され、ＩＲ−Ｐ治療（図８７）期間中にグリコシル化ＨｂＡ１ｃ値の減少、またＬＰＳ刺激ＰＢＭＣにより産生された炎症性サイトカイン（ＩＬ１２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ）の減少により支持された。さらに、ＩＬ−１０（抗炎症性サイトカイン）の増加もまた治療期間中に観察された（図８３）。これはすべて、膵島細胞機能と最終的により良いブドウ糖調節の改善を示唆している。
【図８９】〜【図９１】  ＭＳ（多発性硬化症）患者１（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）:ＩＲ−Ｐにより処置されたＬＰＳ刺激ＰＢＭＣにおけるＴＧＦ−βとＩＬ−１０の産生における増加があった（図ＨとＩ）。ＴＧＦ−βとＩＬ−１０産生においては、ＰＭＡ／Ｃａにより刺激された培養培地と、ＩＲ−Ｐにより処置された培養培地では差異はなく（図８９と９０）、一方、ＩＲ−ＰはＰＭＡ／Ｃａ刺激ＰＢＭＣにおけるＩＦＮ−γの産生を阻害した（図９１）。
【図９２】〜【図９４】  ＭＳ（多発性硬化症）患者２（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）:患者２から得られたＰＢＭＣは、ＴＰＡ／Ｃａ刺激のみと比較すると、ＩＲ−Ｐにより処置された培養培地におけるＴＧＦ−βとＩＦＮ−γの産生減少を示し、一方、ＩＲ−Ｐ処置は、ＬＰＳ刺激ＴＧＦ−β産生を増加させる（図９２と９３）。ＩＬ−１０産生は、ＬＰＳとＴＰＡ／Ｃａ刺激培養培地の両方でＩＲ−Ｐにより阻害された（図９４）。
【図９５】，【図９６】  非治療対照群と比較すると、ＢＡＬＢ／ｃ受容者のＩＲ−Ｐによる治療は、C５７ＢＬ／６皮膚移植生存を延長した。対照受容者は、１２日間内に皮膚移植を拒絶し（図９５）、一方、ＩＲ−Ｐ治療受容者は、移植後２２日までその皮膚移植を延長することができた（図９６）。図９５と９６は、ＩＲ−Ｐ治療とその対照マウスからの移植の拒絶のため、こうした１つの延期された移植を示している（写真は１９日目に撮られた）。
【図９７】  ＩＲ−Ｕ／ＬＭＤＦ  Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２クロマトグラムを示している。
【図９８】  ＩＲ−Ｐ３  Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２クロマトグラムを示している。
【図９９】  ＩＲ−Ａ３  Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２クロマトグラムを示している。
【図１００】  ＩＲ−Ｐサンプルの巨球ＧＰＣ６０Åクロマトグラムを示している。３つの選択領域が分画化された。＞１０ｋＤａの分子量で明らかに溶離されたＩＲ−Ｐ１、１０ｋＤａ〜１ｋＤａの間の分子量で明らかに溶離されるＩＲ−Ｐ２、＜１ｋＤａの分子量で溶離されるＩＲ−Ｐ３である。これらすべての活性は少なくとも抗ショック活性に関して試験された（詳細はテキストを参照）。
【図１０１】  ＩＲ−ＰとＩＲ−Ａサンプルの巨球ＧＰＣ６０Åクロマトグラムを示している（各サンプルの５００  ＩＵは同じ注射量で注射された）。その結果は、ＩＲ−ＰサンプルにおけるＩＲ−Ｐ３分画に比較すると、大量のＩＲ−Ａ３分画がＩＲ−Ａには含まれている。我々は、それらの抗ショック活性に関してＩＲ−ＡとＩＲ−Ｐの同量を試験した。その結果は、ＩＲ−Ｐに比較して低から軽度の抗ショック活性をＩＲ−Ａが有することを明らかにした（結果は示さず）。
【図１０２】  精製方法１、２、３、４（詳細についてはテキストを参照）のフロー図を示している。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６４】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９６】
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【図９５】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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