(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の持続性培養物を取得する方法であって、
（ａ）始原生殖細胞を含有するトリ生殖腺細胞を原条形成後のトリ胚から集め；
（ｂ）そのトリ生殖腺細胞を予め調整しておいたフィーダーマトリックスと接触させて付着させ、ここで前記フィーダーマトリックスは繊維芽細胞を含んでなり；そして
（ｃ）本質的には、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞よりなるトリ細胞培養物を取得するのに十分な時間、そのトリ生殖腺細胞を培地の存在下に予め調整しておいたフィーダーマトリックスで増殖させる；
ことを含んでなる方法。
【請求項２】
トリ生殖腺細胞を１４期〜４５期、１５期〜３１期または２７期〜３０期の胚から集める、請求項１に記載の方法であって、前記期はHanburgerおよびHamilton（Ｈ＆Ｈ）ステージングシステムによる、方法。
【請求項３】
トリ生殖腺細胞を約１０,０００〜約２０,０００細胞の範囲数で予め調整しておいたフィーダーマトリックスと接触させて付着させる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
約２０,０００のトリ生殖腺細胞を予め調整しておいたフィーダーマトリックスと接触させて付着させる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
繊維芽細胞が約４０,０００〜約６０,０００細胞、約５０,０００〜約６０,０００細胞、約５５,０００〜約６０,０００細胞または約６０,０００細胞の範囲数で予め調整しておいたフィーダーマトリックスに存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
繊維芽細胞がマウス繊維芽細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
マウス繊維芽細胞がマウス繊維芽細胞フィーダー層を形成する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
マウス繊維芽細胞がマウスＳＴＯ繊維芽細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
未分化のトリ細胞を培地の存在下に予め調整しておいた繊維芽細胞フィーダーマトリックスで少なくとも３日間増殖させる場合に幹細胞表現型を保持することができる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
トリ胚が、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジの胚よりなる群から選択される胚である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
トリ胚がニワトリ胚である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
培地が調整培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
調整培地がＢＲＬ調製培地である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
予め調整しておいたフィーダーマトリックスが予め調整しておいたＳＴＯ繊維芽細胞フィーダーマトリックスである、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、一般に胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞に関し、そして特にトリ始原生殖細胞および胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞に関する。
【０００２】
略語表
【表１】
0004841777.tif 000002
【０００３】
背景技術
哺乳動物において、生殖隆起から培養した始原生殖細胞は、多能性胚幹細胞を発生させる能力を有する。例えば、Ｈoganの１９９７年１１月２５日に発行された米国特許第５,６９０,９２６号；Ｈoganの１９９７年９月２３日に発行された米国特許第５,６７０,３７２号；およびＨoganの１９９５年９月２６日に発行された米国特許第５,５３７,３５７号は各々、哺乳動物の多能性胚幹細胞およびそれらを製造する方法を開示している。これらの特許の開示は、哺乳動物の胚幹細胞、そして特にＳＣＦ、ＦＧＦおよびＬＩＦよりなる増殖因子の組み合わせを使用して、マウスおよび他の哺乳動物の胚幹細胞を培養することに限定されている。
【０００４】
トリ始原生殖細胞（ＰＧＣ）の培養物に関する現在の先行技術報告は、ＰＧＣ表現型を保持する努力および増殖を刺激する努力に集中している。例えば、Ｃhang，Ｉ. Ｋ.ら，Ｃell. Ｂiol. Ｉnt. １９９７年８月；２１（８）４９５−９；Ｃhang，Ｉ. Ｋ.ら，Ｃell. Ｂiol. Ｉnt. １９９５年２月；１９（２）１４３−９；Ａllioli，Ｎ.ら，Ｄev. Ｂiol. １９９４年９月；１６５（１）３０−７；および１９９９年２月１１日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ ９９／０６５３３（出願人−Ｕniversity of Ｍassachusetts；発明者−Ｐonce de Ｌeonら）を参照されたい。
【０００５】
胚幹細胞（ＥＳＣ）表現型を発現する未分化のトリ細胞およびそれらを取得する方法は、Ｐetitteらの１９９４年８月２３日に発行された米国特許第５,３４０,７４０号；Ｐetitteらの１９９７年８月１２日に発行された米国特許第５,６５６,４７９号；およびＰetitteらの１９９８年１１月３日に発行された米国特許第５,８３０,５１０号に開示されている。ＥＳＣ表現型を発現する未分化のトリ細胞は、とりわけ、発生学上の開発試験（すなわち、その細胞をマーカー遺伝子で標識して、インビボに注入した後、それらの分布を観察することによる）およびトランスジェニック家禽の産生のためのツールとして有用である。それらは、トランスジェニック家禽の産生に対して相同的組換えの適用を可能とするのに有用である。そのような用途から考えて、ＥＳＣ表現型を発現する未分化のトリ細胞を得るためのさらなる方法の開発は、当業界での継続的な必要性を表す。
【０００６】
発明の要約
胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の持続性培養物を取得する方法を開示する。その方法の好ましい態様は、（ａ）始原生殖細胞を含有するトリ細胞を原条形成後のトリ胚から集め；（ｂ）そのトリ細胞を予め調整しておいたフィーダーマトリックスと接触させて付着させ；そして（ｃ）本質的には、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞よりなるトリ細胞培養物を取得するのに十分な時間、そのトリ細胞を培地の存在下にフィーダーマトリックスで増殖させる；ことを含んでなる。
【０００７】
そのトリ細胞は、１４期以降の胚（Ｈ ＆ Ｈ）、好ましくは１４期〜４５期の胚、より好ましくは１５期〜３１期の胚、そしてさらにより好ましくは２７期〜３０期の胚から集める。より好ましくは、そのトリ細胞を約１０,０００〜約２０,０００細胞の範囲数でフィーダーマトリックスと接触させて付着させる。さらにより好ましくは、約２０,０００のトリ細胞をフィーダーマトリックスと接触させて付着させる。
【０００８】
そのフィーダーマトリックスは、繊維芽細胞を含んでなるのがよい。その繊維芽細胞は、約４０,０００〜約６０,０００細胞、好ましくは約５０,０００〜約６０,０００細胞、さらにより好ましくは約５５,０００〜約６０,０００細胞の範囲数でフィーダーマトリックスに存在し得る。最も好ましくは、約６０,０００の繊維芽細胞がフィーダーマトリックスに存在する。
【０００９】
好ましくは、その繊維芽細胞は、マウス繊維芽細胞、より好ましくはマウスＳＴＯ繊維芽細胞を含んでなる。好ましい態様において、そのマウス繊維芽細胞は、マウス繊維芽細胞フィーダー層を形成する。
【００１０】
そのトリ胚は、限定されるものではないが、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジの胚が含まれる群から任意に選択される胚である。好ましい態様において、そのトリ胚は、ニワトリの胚である。
【００１１】
従って、本発明の目的は、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞を培養するための新規方法を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞を、始原生殖細胞を含有するトリ細胞から培養する方法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、トリ始原生殖細胞を使用して、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の培養物を作成する際に使用するためのフィーダーマトリックスを提供することである。
【００１４】
本発明のまたさらなる目的は、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の培養物を確立する際に使用するための、始原生殖細胞を含有するトリ細胞の最適数を特性決定することである。
【００１５】
本明細書中、本発明の目的の幾つかを上述しているが、本明細書中、以下に最もよく記載する付随の実験例および図面と関連させると、他の目的も記載が進むにつれて明らかとなるであろう。
【００１６】
図面の簡単な説明
図１は、培養における様々な数のＳＴＯフィーダー細胞での生殖腺ＰＧＣの生存率を図示する棒グラフである。１ウェルあたり１０,０００の生殖腺細胞を様々な数のＳＴＯ細胞（１ウェルあたり５０,０００、５５,０００および６０,０００細胞）に播種した。発生段階特異的マウス胚抗原−１（ＳＳＥＡ−１−ＰＧＣおよびＥＳＣのためのマーカー）に陽性の細胞を、培養後、０、１および３日目に、ＰＧＣ数として数えた。１ウェルあたり６０,０００細胞のグループでは、他のグループより高いＰＧＣ数を３日目に示す（Ｐ＜０.０５）。この結果は、フィーダー細胞の実質的に完全な単層、例えば、約６０,０００細胞を含有する単層が、ＰＧＣ培養物に好ましいことを示す。
【００１７】
図２は、予め調整しておいたＳＴＯフィーダー細胞を使用しての生殖腺ＰＧＣ培養の生存率を図示する棒グラフである。１または２日間予め調整しておいた後、１ウェルあたり２０,０００の生殖腺細胞を１ウェルあたり６０,０００のＳＴＯ細胞に播種した。２日間予め調整しておいたＰＧＣが高い生存率を示す。
【００１８】
図３は、１培養ウェルあたり様々な数の生殖腺細胞を播種する効果を図示する一組の棒グラフである。
【００１９】
図３Ａは、１ウェルあたり１０,０００または２０,０００の生殖腺細胞（図３Ａに提示する凡例では、「１０」および「２０」として示す）を播種した後の、様々な数のＳＴＯ細胞（１ウェルあたり４０,０００、５０,０００または６０,０００−図３Ａに提示する凡例では、「４０」、「５０」および「６０」として示す）での２０以上のＳＳＥＡ−１陽性細胞のコロニー数を図示する棒グラフである。このように、図３Ａに提示する凡例では、「４０／１０」、「５０／１０」および「６０／１０」という表示は各々、ＳＴＯ細胞数が１ウェルあたり４０,０００、５０,０００または６０,０００であること、および１ウェルあたり１０,０００の生殖腺細胞を播種することを示し、そして「４０／２０」、「５０／２０」および「６０／２０」という表示は各々、ＳＴＯ細胞数が１ウェルあたり４０,０００、５０,０００または６０,０００であること、および１ウェルあたり２０,０００の生殖腺細胞を播種することを示す。
【００２０】
図３Ｂは、１ウェルあたり１０,０００または２０,０００の生殖腺細胞（図３Ｂに提示する凡例では、「１０」および「２０」として示す）を播種した後の、様々な数のＳＴＯ細胞（１ウェルあたり４０,０００、５０,０００または６０,０００−図３Ｂに提示する凡例では、「４０」、「５０」および「６０」として示す）での生殖腺ＰＧＣの増殖を図示する棒グラフである。このように、図３Ｂに提示する凡例では、「４０／１０」、「５０／１０」および「６０／１０」という表示は各々、ＳＴＯ細胞数が１ウェルあたり４０,０００、５０,０００または６０,０００であること、および１ウェルあたり１０,０００の生殖腺細胞を播種することを示し、そして「４０／２０」、「５０／２０」および「６０／２０」という表示は各々、ＳＴＯ細胞数が１ウェルあたり４０,０００、５０,０００または６０,０００であること、および１ウェルあたり２０,０００の生殖腺細胞を播種することを示す。２０,０００の生殖腺細胞 対 １０,０００の生殖腺細胞を使用すると、個々のＰＧＣの増殖はより高かった（Ｐ＜０.０５）。同様に、５日後に形成されたＳＳＥＡ−１陽性コロニーの数は、播種した生殖腺細胞の数に依存した。
【００２１】
図４は、図３に関して上記したような、ＳＴＯ細胞で５日間培養したニワトリ生殖腺細胞のＳＳＥＡ−１染色を示す一連の写真である。
【００２２】
図４Ａは、個々のＳＳＥＡ−１陽性ＰＧＣを示す、新たに播種した培養物（０日）を図示する。培養を開始した時点では、ＰＧＣのみがＳＳＥＡ−１エピトープに対して陽性であった。
【００２３】
図４Ｂは、３日間培養した後の、ＳＳＥＡ−１陽性ＥＳ細胞のコロニーを図示する。
【００２４】
図４Ｃは、３日間培養した後の、ＰＧＣ由来のＥＳ細胞の大きなコロニーを図示する。
【００２５】
図４Ｄは、ＳＳＥＡ−１で染色した３日間の培養物の低倍率像を図示する。個々に染色したＰＧＣおよびＳＳＥＡ−１陽性ＥＳ細胞のコロニーに注目されたい。
【００２６】
図４Ｅは、５日間培養した後の、ＥＳ細胞コロニーのＳＳＥＡ−１染色を図示する。
【００２７】
図４Ｆは、５日間培養した後の、ＰＧＣ由来のＥＳ細胞コロニーの高倍率像を図示する。
【００２８】
発明の詳細な説明
哺乳動物において、生殖隆起から培養した始原生殖細胞は、多能性胚幹細胞を発生させる能力を有する。しかしながら、トリ（ＰＧＣ）の培養物に関する報告は、ＰＧＣ表現型を保持する努力および増殖を刺激する努力に集中している。そこで、本発明の目的は、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の発生をトリＰＧＣから可能とする方法を開発して提供することであった。
【００２９】
例えば、Ｈoganの１９９７年１１月２５日に発行された米国特許第５,６９０,９２６号、Ｈoganの１９９７年９月２３日に発行された米国特許第５,６７０,３７２号、およびＨoganの１９９５年９月２６日に発行された米国特許第５,５３７,３５７号に開示されているように、ＰＧＣを哺乳動物の胚から単離するのとは違って、本発明に従って単離した始原生殖細胞を含有するトリ生殖腺細胞は、相当な数のストローマ細胞も含んでなる。ストローマ細胞の存在は、哺乳動物のシステムでは観察されない本発明の方法の開発に複雑さを加える。
【００３０】
次の用語は、当業者により十分理解されると思われるが、本発明の説明を容易にするために、次の定義を詳述する。
【００３１】
本明細書中で使用する「トリ」という用語は、限定されるものではないが、Ｇallinacea sp.、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジを含め、全てのトリ種をいう。ニワトリが一般に好ましい。
【００３２】
ＥＳ細胞およびＥＳ細胞培養物に関して本明細書中で使用する「持続性」という用語は、たとえ細胞が最終的に老化を被るとしても、さらなる細胞分裂をすることができる細胞または細胞培養物をいう。
【００３３】
「胚幹細胞表現型」という語句は、大きな核、突出した核小体、および小さな細胞質を有する、未分化のトリ細胞をいう。
【００３４】
ＬＩＦおよびbＦＧＦの存在下にＳＴＯフィーダー細胞単層で保持されるマウスＰＧＣは、胚幹細胞に似ている細胞を結果的にもたらすことが報告されている。Ｒesnickら，Ｎature ３５９：５５０−５５１（１９９２）；Ｍatsuiら，Ｃell ７０：８４１−８４３（１９９２）を参照されたい。Ｒesnickら，Ｎature ３５９：５５０−５５１（１９９２）は、そのような細胞を、便宜上、「胚細胞」（ＥＧ）と名付けて、それらがインビボでＰＧＣから派生したという意味を含めることを提唱した。しかしながら、当業者の間では、胚生殖細胞および胚幹細胞は、それらが（幾つかの遺伝子のメチル化での相違が報告されているにもかかわらず）顕微鏡検査で同一であるように見え、同一の免疫学的マーカーを示すという点で表現型的に同一であり、そして両方とも培養で広く分化して、胚盤胞へと注入した場合にはキメラに与えられることから、それらの多能性および全能性を実証することを示しているという点で機能的に同一であることが認識されている。従って、「胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞」という語句は、トリ始原生殖細胞から誘導された細胞を包含し、それゆえに、本発明の方法に従って培養した細胞を記載するために使用する。
【００３５】
長年にわたる特許法条約に従い、「a」および「an」という用語は、特許請求の範囲を含め、本出願で使用する場合には「１以上」を意味する。
【００３６】
本発明を実施するために細胞を得るトリ胚は、原条形成後の時期のものであるのが好ましく、そして性分化より前の時期のものであるのが好ましい。本発明を実施するために細胞を得るトリ胚は、１７、１８、１９、２０および２１期を含め、好ましくは１４期以降のもの、より好ましくは１４期〜４５期のもの、さらにより好ましくは１５期〜３１期のものであって、最も好ましくはＨanburgerおよびＨamilton（Ｈ ＆ Ｈ）ステージングシステムでの発生の２７〜３０期のものである。
【００３７】
そのような胚は、便利には、約５５〜約１６８時間（すなわち、約２〜約７日間）、より好ましくは約７２〜約１６８時間（すなわち、約３〜７日間）、さらにより好ましくは約９６〜約１６８時間（すなわち、約４〜７日間）、そしてさらにより好ましくは約９６〜約１２０時間（すなわち、約４〜５日間）インキュベートした受精卵から得るのがよい。好ましい態様において、胚生殖腺ＰＧＣおよびストローマ細胞は、ＥＤＴＡおよび／または緩衝溶液といったような適当な溶液を使用して、胚生殖腺から集めるのがよい。好ましくは、単細胞懸濁液を得るよう注意する。
【００３８】
このように、本発明の態様は、トリ胚から集めた始原生殖細胞を含有するトリ生殖腺細胞からの、胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞の取得に関係する。本発明の開示より前は、当業者の間では、例えば、胚が生殖腺発生と関連のある時期に達したら、トリ胚生殖隆起または生殖腺から集めるのがよいといったような、始原生殖細胞を含有するトリ胚生殖腺細胞は、最後には生殖細胞のみに分化するというのが一般的見解であった。本発明は、例えば、トリ胚の生殖隆起または生殖腺から集めた始原生殖細胞を含有するトリ生殖腺細胞の一部が、胚幹細胞表現型を発現する未分化の細胞になることを示す。これゆえに、本発明の方法は、始原生殖細胞を、例えば、生殖隆起または生殖腺から、より多くの数で単離するのがよい、胚幹細胞表現型を発現する未分化の細胞を培養する間、便宜性を提供し、そして典型的には、より進歩したトリ胚の開発から考えて、単離するのがより容易である。
【００３９】
典型的には、本発明の培養物には、本明細書中に定義するフィーダーマトリックスが含まれる。フィーダーマトリックスは、ＥＳＣを得る目的で培養した細胞またはセルラインのいずれかであり得る。あるいはまた、フィーダーマトリックスは、始原生殖細胞が局在する器官もしくは組織、例えば、生殖腺から誘導することができるか、またはそれらの器官もしくは組織により提供され得る。あるいはまた、フィーダーマトリックスを含んでなるフィーダー細胞は、結合した増殖因子を加えた細胞間マトリックスで置換することができる。
【００４０】
当業界で知られている手順に従って、本明細書中で使用するフィーダーマトリックスを構築する。上述したように、フィーダーマトリックスを予め調整しておくのが好ましい。「予め調整しておく」という用語は、始原生殖細胞を含有する生殖腺細胞をフィーダーマトリックスと接触させて付着させるより前の時間、例えば、フィーダーマトリックスによる増殖因子または他の因子の産生を開始させて確立するのに十分な時間、フィーダーマトリックスを培地の存在下に培養することを意味する。実験例に開示するように、始原生殖細胞を含有する生殖腺細胞をフィーダーマトリックスと接触させて付着させるより前に、フィーダーマトリックス自体を１〜２日間培養することにより、フィーダーマトリックスを予め調整しておく。
【００４１】
そのフィーダーマトリックスは、マウス繊維芽細胞を含んでなるのが好ましい。ＳＴＯ繊維芽細胞が好ましいが、一次繊維芽細胞も適当である。そしてまた、本発明は、マウス細胞フィーダーマトリックスの用途に関して記載しているが、他のマウス種（例えば、ラット）；他の哺乳動物の種（例えば、有蹄動物、ウシおよびブタ種）；またはトリ種（例えば、Ｇallinacea、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラおよびキジ）からの細胞を含んでなるフィーダーマトリックスを使用してもよいことを意図する。
【００４２】
本発明の培養方法は、場合により、フィーダー細胞の単層を確立することを含んでなるのがよい。標準的な技術を使用して、フィーダー細胞を有糸分裂により不活性化するのがよい。例えば、フィーダー細胞を、γ放射線（例えば、４００ラドのγ放射線）にさらすのがよいか、またはマイトマイシンＣ（例えば、１０μg／ml、２−３時間）で処理するのがよい。細胞を有糸分裂により不活性化する手順は、典型的には、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕniversity Ｂoulevard，Ｍanassas，ＶＡ ２０１１０−２２０９から細胞（例えば、ＳＴＯフィーダー細胞は、ＡＴＣＣ受託番号 １５０３の下に入手可能である）と共に送られる情報にも詳述されている。単層は、場合により、約８０％の集密度まで、好ましくは約９０％の集密度まで、そしてより好ましくは約１００％の集密度まで培養するのがよい。フィーダー細胞の単層としての構造は、培養物に好ましい構造であるが、全ての適当な構造が本発明の範囲内のものであることを意図する。このように、例えば、フィーダー細胞の層、単層、集合体、凝集体または他の会合体もしくは群集体は、本発明の範囲内に入ることを意図し、そして特に「マトリックス」という用語の意味に入ることを意図する。
【００４３】
このように、トリＰＧＣは、細胞凝集体が形成されるよう、縦に、横に、斜めに、またはそれら全ての組み合わせで、不均一に拡張することができる。本発明に従って、このように、ＰＧＣを適当なフィーダー細胞と混合して、その細胞をマルチウェルプレートのような適当な培養容器へと挿入することにより、培養物を形成することができることを意図する。
【００４４】
本発明を実施する際に使用する培地は、全ての適当な培地であるのがよい。その培地は、調整培地または合成培地であるのがよく、これらは両方とも当業界で知られている。調整培地、そして特にＢＲＬ調整培地が一般に好ましい。例として、Ｓmith，Ａ. Ｇ.およびＨooper，Ｍ. Ｌ.，Ｄev. Ｂiol. １９８７年５月；１２１（１）：１−９により記載されているような、当業界で認識されている技術に従って、ＢＲＬ調整培地を作成する。ＢＲＬ細胞は、ＡＴＣＣから受託番号 ＣＲＬ−１４４２の下に入手可能である。場合により、その培地には、限定されるものではないが、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（bＦＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ−スチール因子またはＳＦとも呼ばれる）、トランスフォーミング増殖因子−β１（ＴＧＦ−β１）および抗レチノイン酸を含め、増殖因子を補うのがよい。
【００４５】
好ましい態様において、４〜５日間インキュベートしたトリ胚からの始原生殖細胞を含有するトリ胚生殖腺細胞を、調整培地と共に、予め調整しておいたフィーダーマトリックスへと播種すると、そのトリ細胞は、胚幹細胞表現型を示す細胞のネストまたはコロニーを発生させる。哺乳動物の幹細胞での場合とは違って、予め調整しておいたフィーダーマトリックスを有して、ＥＳＣ表現型を発現する未分化のトリ細胞へのトリＰＧＣの生存および発生を容易にするのが一般に好ましい。本発明のトリ胚細胞は、一次細胞培養物に典型的であるように、少なくとも１または２ヶ月間培養することができ、これは、インキュベートしていないトリ胚からの細胞の一次培養物の通常２週間の寿命より相当長い。
【００４６】
本発明の細胞培養物は、動物に投与するために、細胞を（例えば、機械的分離により）分離して、その細胞を薬学的に許容され得る担体（例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液）と完全に混合することにより製剤化するのがよい。そのような製剤でのトリ細胞を作成して、非相同ＤＮＡ配列を以下により多く詳細に記載する方法でトリ被験対象へと運ぶのがよい。
【００４７】
本発明の方法により取得される未分化のトリ細胞は、とりわけ、発生学上の開発試験（すなわち、その細胞をマーカー遺伝子で標識して、インビボに注入した後、それらの分布を観察することによる）およびトランスジェニック家禽の産生のためのツールとして有用である。それらは、トランスジェニック家禽の産生に対して相同的組換えの適用を可能とするのに有用である。
【００４８】
胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞は、トランスジェニックのキメラのトリを含め、キメラのトリの産生にも有用であるべきである。トランスジェニックのキメラのトリは、異種タンパク質の回収に有用であろうことを意図し、これは、そのようなキメラのトランスジェニックのトリの卵から直接回収することができるのが好ましい。例えば、そのようなトリは、治療用タンパク質および他のポリペプチドの産生および回収に使用することができる。
【００４９】
トリ種において、レシピエントの胚へと注入した場合に生存能力を保有する、あるドナーの細胞型を単離している。Ｅtchesら，Ｐoultry Ｓcience ７２：８８２−８８７（１９９３）；Ｅtchesら，Ａvian Ｉncubationにおいて，第２２章、Ｂutterworth Ｐublishers（１９９０）；Ｖerrinder Ｇibbinsら，Ｆourth Ｗorld Ｃongress on Ｇenetics Ａpplied to Ｌivestock Ｐroduction，Ｅdinburgh（１９９０）；Ｐetitteら，Ｄevelopment １０８，１８５−１８９（１９９０）を参照されたい。これらの試験は、Ｘ期の胚（産卵時の胚）から誘導された胞胚葉細胞が、比較可能なレシピエントのＸ期の胚に移された場合でも生存能力を持ったままであることを示した。このように、本発明は、トリの表現型を変える新たな方法、および本明細書中に開示するトリ胚幹細胞でそのように産生されたトリを提供する。その方法は、本明細書中に開示するトリ胚幹細胞にインビトロでＤＮＡ配列を（例えば、レトロウイルスベクターでの電気穿孔またはトランスフォーメーションにより）トランスフェクトした後、そのトランスフェクトした胚幹細胞を、孵化後のトリにおいて表現型の変化（例えば、タンパク質発現の変化、増殖率、試料効率、疾患抵抗性、またはこれらの因子全ての組み合わせの変化）をもたらすのに有効であるＤＮＡ配列と共に、トリ胚を含有する卵へと（例えば、卵黄嚢へと、または漿尿膜へと、好ましくは胚下腔へと、そして好ましくは初期の胚発生の間に（例えば、インキュベーションの２または３日前に、そして最も好ましくはインキュベーションの１日前に））注入することを含んでなる。
【００５０】
好ましくは、ＤＮＡを導入する卵を孵化するまでインキュベートして、そのように産生されたトリを少なくとも表現型の変化が現れる年齢まで育てる。全ての適当な方法で測定する測定可能な表現型の変化を誘起するのに十分な孵化後の動物において、生理反応が得られる限り、トランスフォームした胚およびトリがキメラであるならば、それは有害な結果のものではない。さらなる例として、キメラ、またはＤＮＡ配列の生殖系列伝達により産生されるそのトランスジェニック子孫におけるタンパク質発現は、プロモーターを誘発する薬剤での、キメラまたはそのトランスジェニック子孫の処置で結合した、導入されたＤＮＡ配列への誘発可能なプロモーターの取り込みによって確立され得る。
【００５１】
インオボ(in ovo)注入の機構は重要ではないが、その方法は、その処置が孵化率を減少させないよう、胚の組織および器官並びにその周囲の胚外膜を過度に損傷しないのが好ましい。例えば、出願人は、卵に窓を形成させた後、直径５０μmのマイクロピペットまたは直径５０μmの針といったような注入用マイクロピペットまたは針を使用することにより、インオボ注入を実施している。所望ならば、その卵をワックス等のような実質的に細菌不透過性のシーリング物質でシールして、その後の望ましくない細菌の侵入を防ぐことができる。適当なシーリング物質は、場合により、生物学的に許容され得る抗菌組成物を含んでなるのがよい。
【００５２】
トリ胚のための高速自動注入システムは、特に本発明を実施するのに適当であろうことが予想される。本発明を実施するのに適したそのような装置は全て、本明細書中に記載する胚幹細胞表現型を発現する未分化のトリ細胞を含む注入器を含んでなり、その注入器は、その装置により卵にＤＮＡを注入するよう位置する。加えて、その注入後の卵における穴をシールするために、操作上、注入と関連のあるシーリング装置を与えるのがよい。
【００５３】
本発明の胚幹細胞と共にインオボで導入したＤＮＡ配列は、一般に、トリ細胞で機能的なプロモーター、およびそのプロモーターに操作可能なように結合させたペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を含んでなる構築物である。好ましくは、そのタンパク質またはペプチドは、生理学的に活性であって、トリにおける表現型の変化を引き起こすことができる。一般に、ＤＮＡ構築物は、リポソーム、リン酸カルシウム、電気穿孔またはＤＭＳＯといったような、当業界で知られている様々な技術を使用して、本発明の胚幹細胞をトランスフォームするための、（電気穿孔により本発明の胚幹細胞へと導入された）線状ＤＮＡ配列、またはベクターもしくは他の適当な担体により運ばれる配列であるのがよい。以下に論ずるベクターは、天然型またはその誘導体のどちらかでの、プラスミド、ウイルス（レトロウイルスを含む）およびファージであるのがよい。
【００５４】
タンパク質またはペプチドをコードする遺伝子の実例は、成長ホルモン、甲状腺放出ホルモン（ＴＲＨ）、ＭarekのＭＤＸ、およびコクシジウム症のための抗原のような免疫原性組換え抗原よりなる群から選択されるタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子である。
【００５５】
遺伝子光学による、クローン遺伝子、組換えＤＮＡ、ベクター、トランスフォームした宿主細胞、タンパク質およびタンパク質フラグメントの産生は十分知られている。例えば、Ｂellらの米国特許第４,７６１,３７１号，第６コラム第３行〜第９コラム第６５行；Ｃlarkらの米国特許第４,８７７,７２９号，第４コラム第３８行〜第７コラム第６行；Ｓchillingの米国特許第４,９１２,０３８号，第３コラム第２６行〜第１４コラム第１２行を参照されたい。制限エンドヌクレアーゼ消化、ベクターの作成、ＤＮＡ精製および他のそのような手順のためのプロトコルは、本質的には、標準的なクローニングマニュアルに記載されている通りである。Ｓambrookら，Ｍolecular Ｃloning，a Ｌaboratory Ｍanual（第２版，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress，Ｎ.Ｙ.（１９８９）を参照されたい。
【００５６】
ベクターは、目的の遺伝子をコードするＤＮＡを増幅および／または発現させるために本明細書中で使用する製可能なＤＮＡ構築物である。適当な発現ベクターは、そのベクターを正しい宿主へと導入した場合にクローンcＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを正しい方向で発現させることができる調節要素を有するであろう。そのような要素には、典型的には、限定されるものではないが、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用するプロモーター領域、または誘発剤の投与により誘発可能であり得るプロモーター領域、結合した非相同プロモーター、スプライスアクセプターおよび／またはドナー配列からの転写を何倍も刺激することができるエンハンサー要素、並びに終止およびポリアデニル化シグナルが含まれる。翻訳を可能とすることができるリボソーム結合部位のための配列も必要であって、これを発現させるべき遺伝子に操作可能なように結合させる。最近、骨格筋構造遺伝子および必須近位プロモーター配列の両方の上流に位置して、操作可能なように互いに関連する、筋肉に特異的なプロモーターが単離された（ＭarおよびＯrdahl，Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８５，６４０４−６４０８（１９８８））。ベクターは、プラスミド、ウイルス（例えば、アデノウイルス、サイトメガロウイルス）、ファージ、および組換えにより宿主ゲノムへと組み込み可能なＤＮＡフラグメントを含んでなる。そのベクターは、場合により、独立して宿主ゲノムを複製して機能するのがよく、または幾つかの場合には、ゲノム自体へと組み込むのがよい。
【００５７】
実験例
本発明の好ましい方法を説明するために、次の実験例が含まれている。本発明の発明者達により見出された、または彼らにより意図された技術および手順の面から、次の実験例のある態様を記載して、本発明の実施において十分行う。これらの実施例を発明者達の標準的な実験実施の使用によって例示する。本発明の開示および当業者の一般的レベルから考えて、当業者は、次の実験例が例示的なものであることのみを意図するものであって、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、多数の変更、修飾および交替を使用することができることが分かるであろう。
【００５８】
実施例１
生殖腺細胞の収集
ＥＤＴＡを使用して、生殖腺ＰＧＣおよびストローマ細胞の混合物を２７−３０期（Ｈ ＆ Ｈ）の胚生殖腺から集めた。単一細胞懸濁液を得るよう注意する。特に、２７−３０期（Ｈ ＆ Ｈ）のニワトリ胚からの生殖腺を適当な(blunt)切開により集めて、Ｃa２＋およびＭg２＋を含んでいないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ(−)）１滴にプールした。胚から集めた後、１.５mlのＥppendorfチューブ中、その生殖腺を０.０２％ ＥＤＴＡ １mlへと入れた後、３７℃のインキュベーターに１０分間入れた。次いで、そのチューブを２００Ｇで３分間遠心分離にかけて、上澄みを除去した。次いで、集めた生殖腺を、１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭと共に、細胞濾過器（ＦＡＬＣＯＮ（登録商標）２３６０、細孔径１００μＭ）から新たなチューブへと通した。これは、単一細胞懸濁液を与えた。
【００５９】
１０％ ＦＢＳを含むＤＭＥＭを使用して、照射したＳＴＯフィーダー層を９６ウェルのプレートに作成した。次いで、ＦＢＳ起源、フィーダー細胞数、ＳＴＯ細胞のバッチ（旧 対 新）、フィーダー層の予調整、および播種した生殖腺細胞数を含め、幾つかの培養パラメーターを試験した。
【００６０】
実施例２
生殖腺細胞の培養
生殖腺細胞をＳＴＯフィーダー層で３−５日間培養して、抗ＳＳＥＡ−１で染色した。単一のＳＳＥＡ−１陽性ＰＧＣ数およびＳＳＥＡ−１陽性コロニー数を、培養の０、１、３および５日目に試験した。最も多くの場合、多数のＰＧＣの死が最初の２４時間の培養物で起こり、続いて、単一のＰＧＣ数の増大が３−５日目に起こった。生殖腺ＰＧＣの生存および増殖は、ＳＴＯフィーダー層の質、播種したＳＴＯ細胞数、ＳＴＯフィーダー層の予調整、および初期に播種した生殖腺細胞数により影響を受ける。実験の間に、多数の変動がＦＢＳの１つのバッチ内で観察され、ＦＢＳ起源が培養物に影響を及ぼし得ることが提唱された。
【００６１】
図１は、培養における様々な数のＳＴＯフィーダー細胞での生殖腺ＰＧＣの生存率を示す。１ウェルあたり１０,０００細胞の生殖腺細胞を様々な数のＳＴＯ細胞に播種した：１ウェルあたり５０,０００、５５,０００および６０,０００細胞。ＳＳＥＡ−１陽性細胞を、培養後、０、１および３日目に、ＰＧＣ数として数えた。１ウェルあたり６０,０００細胞のグループでは、ＰＧＣ数が他のグループより３日目で高い（Ｐ＜０.０５）。この結果は、フィーダー細胞の完全な単層がＰＧＣ培養物に好ましいことを示す。
【００６２】
実施例３
ＳＴＯフィーダー層の予調整
ＳＴＯフィーダー層の予調整は、最初の２４時間以内に見られる初期の細胞死を改善した。３日間の培養により、ＳＳＥＡ−１陽性細胞のコロニーを単一のＰＧＣと共に見出すことができた。５日間の培養後、これらのコロニーは、数および大きさを増大させた。コロニー内の細胞は、ＰＧＣより小さくて、十分に定義されたコロニーボーターで密に充填されていることから、胚幹細胞表現型を発現させた。幾つかのコロニーは、２,０００細胞以上含むと推定された。ＰＧＣおよびＥＳＣ様コロニーの混合物は、生殖腺ＰＧＣの画分のみがＥＳＣ表現型を発生させることができるであろうことを提唱する。
【００６３】
図２は、予め調整しておいたＳＴＯフィーダー細胞を使用しての生殖腺ＰＧＣ培養の生存率を示す。１または２日間予め調整しておいた後、１ウェルあたり２０,０００の生殖腺細胞を１ウェルあたり６０,０００のＳＴＯ細胞に播種した。２日間予め調整しておいたＰＧＣが高い生存率を示す。
【００６４】
実施例４
生殖腺細胞の量
図３Ａは、１ウェルあたり１０,０００または２０,０００の生殖腺細胞を播種した後の、様々な数のＳＴＯ細胞（１ウェルあたり４０,０００、５０,０００または６０,０００）での２０以上のＳＳＥＡ−１陽性細胞のコロニー数を示す。２０以上のＳＳＥＡ−１陽性細胞を有するコロニー数を測定して、ＥＳＣ表現型を発現する未分化の細胞を含有するコロニーを、個々のＰＧＣおよびＰＧＣの任意の群集体から、保守的な方法で区別する。
【００６５】
図３Ｂは、１ウェルあたり１０,０００または２０,０００の生殖腺細胞を播種した後の、様々な数のＳＴＯ細胞（１ウェルあたり４０,０００、５０,０００または６０,０００）での生殖腺ＰＧＣの増殖を示す。２０,０００の生殖腺細胞 対 １０,０００の生殖腺細胞を使用すると、個々のＰＧＣの増殖はより高かった（Ｐ＜０.０５）。同様に、５日後に形成されたＳＳＥＡ−１陽性コロニーの数は、播種した生殖腺細胞の数に依存した。
【００６６】
参考文献
以下に挙げる参考文献、さらにはまた、明細書中に引用する参考文献は全て、それらが、本明細書中で使用する方法、技術および／または組成物に関する背景を補い、説明し、提供し、またはそれらを教示する程度まで参照することにより、本明細書中に組み込まれる。
【００６７】
Ａllioli，Ｎ.ら，Ｄev. Ｂiol. １９９４年９月；１６５（１）３０−７;
Ｃhang，Ｉ. Ｋ.ら，Ｃell. Ｂiol. Ｉnt. １９９５年２月；１９（２）１４３−９；
Ｃhang，Ｉ. Ｋ.ら，Ｃell. Ｂiol. Ｉnt. １９９７年８月；２１（８）４９５−９；
Ｅtchesら，Ａvian Ｉncubationにおいて，第２２章、Ｂutterworth Ｐublishers（１９９０）；
Ｅtchesら，Ｐoultry Ｓcience ７２：８８２−８８７（１９９３）；
ＭarおよびＯrdahl，Ｐroc. Ｎatl. Ａcad. Ｓci. ＵＳＡ ８５，６４０４−６４０８（１９８８）；
１９９６年５月２日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ ９６／１２７９３；
１９９９年２月１１日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ ９９／０６５３３；
１９９９年２月１１日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ ９９／０６５３４；
【００６８】
Ｐetitteら，Ｄevelopment １０８，１８５−１８９（１９９０）；
Ｓmith，Ａ. Ｇ.およびＨooper，Ｍ. Ｌ.，Ｄev. Ｂiol. １９８７年５月；１２１（１）：１−９；
米国特許第４,０４０,３８８号；
米国特許第４,４６９,０４７号；
米国特許第４,５９３,６４６号；
米国特許第４,６８１,０６３号；
米国特許第４,７６１,３７１号；
米国特許第４,８７７,７２９号；
米国特許第４,９０３,６２５号；
【００６９】
米国特許第４,９１２,０３８号；
米国特許第５,３４０,７４０号；
米国特許第５,５３７,３５７号；
米国特許第５,６５６,４７９号；
米国特許第５,６７０,３７２号；
米国特許第５,６９０,９２６号；
米国特許第５,８３０,５１０号；
Ｓambrookら，Ｍolecular Ｃloning，a Ｌaboratory Ｍanual（第２版，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｐress，Ｎ.Ｙ.（１９８９））；
Ｖerrinder Ｇibbinsら，Ｆourth Ｗorld Ｃongress on Ｇenetics Ａpplied to Ｌivestock Ｐroduction，Ｅdinburgh（１９９０）。
【００７０】
本発明の様々な詳細は、本発明の範囲を逸脱することなく変更してもよいことが理解されるであろう。さらにまた、先の記載は、説明のみを目的とするものであって、限定を目的とするものではなく、本発明は、特許請求の範囲により定義される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、培養における様々な数のＳＴＯフィーダー細胞での生殖腺ＰＧＣの生存率を図示する棒グラフである。
【図２】  図２は、予め調整しておいたＳＴＯフィーダー細胞を使用しての生殖腺ＰＧＣ培養の生存率を図示する棒グラフである。
【図３】  図３は、１培養ウェルあたり様々な数の生殖腺細胞を播種する効果を図示する一組の棒グラフである。
【図４】  図４は、図３に関して上記したような、ＳＴＯ細胞で５日間培養したニワトリ生殖腺細胞のＳＳＥＡ−１染色を示す一連の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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