(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２〜４量体のプロアントシアニジンを含有する松樹皮由来のプロアントシアニジンと、
アミノ酸を３個以上含むペプチドであって、平均分子量が４００の大豆分解物または平均分子量が１，０００〜７，０００のコラーゲンペプチドと
からなる水可溶性結合体であって、
該松樹皮由来のプロアントシアニジン１質量部に対して、該大豆分解物または該コラーゲンペプチドが５０質量部の割合で含有される、
水可溶性結合体。
【請求項２】
前記松樹皮由来のプロアントシアニジンが、５量体以上のプロアントシアニジン１質量部に対し、２〜４量体のプロアントシアニジンを１質量部以上の割合で含有するプロアントシアニジンである、請求項１に記載の水可溶性結合体。
【請求項３】
前記松樹皮由来のプロアントシアニジンが、２〜４量体のプロアントシアニジンからなるプロアントシアニジンである、請求項１に記載の水可溶性結合体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかの項に記載の水可溶性結合体を含有する、水可溶性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、プロアントシアニジンを安定化する水可溶性結合体およびそれを含有する組成物に関する。
【背景技術】  プロアントシアニジンは、フラバン−３−オールおよび／またはフラバン−３，４ジオールを構成単位とする重合度が２以上の縮重合体からなる縮合型タンニンであり、古くから肌の収斂性を高めるなどの整肌効果を目的として使用されている。近年、プロアントシアニジンは、抗酸化作用や美白効果などの種々の活性を有することから、食品、化粧品などへの応用が図られている（特開昭６１−１６９８２号公報および特開平２−１３４３０９号公報）。例えば、タンパク質を配合した化粧料にも応用されている（特開平１１−７５７０８号公報、特開平６−３３６４２３号公報および特開２００２−２３８４９７号公報）。
しかし、プロアントシアニジンは、高い抗酸化力を有するがゆえに酸化されやすく、自己酸化重合を引き起こす。そのため、着色し易いなどの問題が生じる。さらに、自己酸化重合により、プロアントシアニジンの重合度が高くなるため、水への溶解性が低下し、沈澱が生じ易くなる。このような、重合度が高いプロアントシアニジンは、体内への吸収効率が低下するという問題も生じる。
特開２００１−２７０８８１号公報には、プロアントシアニジンに、ヒドロキシル基を有するアミノ酸または該アミノ酸を含有するジペプチドを添加することによって、溶液中のプロアントシアニジンの酸化重合による変色を防止することが記載されている。しかし、これらの組み合わせでは、液体状態で長期間保存すると、沈澱を生じる。
さらに、プロアントシアニジンは、体内での消化過程などによる分解によっても、活性を維持した状態を保持できなくなり、吸収効率が悪くなるという問題がある。
【発明の開示】
本発明は、保護安定性が高く、かつ生理活性が保持または高められたプロアントシアニジン、すなわち長期保存においても沈澱を生じず、かつ該生理活性を維持したまま生体内に輸送し得るプロアントシアニジンを提供することを目的とする。
本発明者等は、上記課題について鋭意検討した結果、驚くべきことに、特定のペプチドをプロアントシアニジンに結合させることによって、長期保存においても沈澱を生じず、生理活性に優れ、かつ該生理活性を維持したまま生体内に輸送し得る、プロアントシアニジンの水可溶性結合体が得られることを見出して、本発明に至った。
本発明の水可溶性結合体は、プロアントシアニジンと、アミノ酸を３個以上含むペプチドとからなる。
好ましい実施態様においては、上記ペプチドの平均分子量が７，０００以下である。
好ましい実施態様においては、上記プロアントシアニジンは、植物抽出物由来である。
本発明の組成物は、上記水可溶性結合体を含有する。
本発明によれば、プロアントシアニジン、特に植物抽出物を用いた場合は、植物抽出物中のプロアントシアニジンと、アミノ酸を３個以上含むペプチドとの水可溶性結合体は、プロアントシアニジンの保護安定性に優れ、吸収性がよく、長期保存においても沈澱を生じず、かつプロアントシアニジン由来の生理活性を有する。さらに、消化、吸収過程においても水可溶性結合体中のプロアントシアニジンが分解しないため、体内においても該生理活性を保持する。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明のプロアントシアニジンと、アミノ酸を３個以上含むペプチドとの水可溶性結合体および該水可溶性結合体を含有する組成物について説明する。なお、以下に説明する構成は、本発明を限定するものでなく、本発明の趣旨の範囲内で種々改変することができることは当業者に明らかである。
（プロアントシアニジン）
本発明の水可溶性結合体に用いられるプロアントシアニジンとは、フラバン−３−オールおよび／またはフラバン−３，４−ジオールを構成単位とする重合度が２以上の縮重合体からなる化合物群をいう。プロアントシアニジンは、ポリフェノール類の一種で、植物が作り出す強力な抗酸化物質である。上記プロアントシアニジンは、松、樫、山桃などの樹皮、ブドウ、ブルーベリー、イチゴ、アボガド、ニセアカシア、コケモモの果実もしくは種子、大麦、小麦、大豆、黒大豆、カカオ、小豆、トチの実の殻、ピーナッツの薄皮、イチョウ葉などに含まれている。また、西アフリカのコーラナッツ、ペルーのラタニアの根、日本の緑茶にも含まれている。
本発明に用いられるプロアントシアニジンとしては、重合度の低い縮重合体が好ましい、重合度が２〜３０の縮重合体（２〜３０量体）が好ましく、重合度が２〜１０の縮重合体（２〜１０量体）がより好ましく、重合度が２〜４の縮重合体（２〜４量体）がさらに好ましい。この重合度が２〜４の縮重合体を、本明細書ではＯＰＣ（オリゴメリック・プロアントシアニジン；ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｐｒｏａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ）という。ＯＰＣは、ヒトの体内では、生成することのできない物質である。特にＯＰＣは、ペプチドに対する結合力が強いにもかかわらず、ＯＰＣとペプチドとからなる結合体は、溶液中の沈殿や懸濁が起こらず、粉末や溶液中で安定であり、各成分の単独の効果よりも高い生理活性を有するため好ましい。
上記プロアントシアニジンは、ＯＰＣを含有することが好ましい。５量体以上のプロアントシアニジンは、ペプチドと結合することによって、懸濁や沈殿を起こし易いが、ＯＰＣを含有すると、５量体以上のプロアントシアニジンの凝集による懸濁や沈殿が起きにくくなる。５量体以上のプロアントシアニジンとＯＰＣとの割合に特に制限はない。ペプチドとの凝集による懸濁や沈殿の観点から、好ましくは５量体以上のプロアントシアニジン１質量部に対してＯＰＣが１質量部以上である。
本発明においては、プロアントシアニジンとして、上記の植物抽出物由来のプロアントシアニジンを用いることが好ましい。特にＯＰＣを含有する植物抽出物、例えば、樹皮、果実もしくは種子の抽出物が特に好適に用いられる。特に、ＯＰＣに富む植物抽出物、例えば、ＯＰＣを２０質量％以上、好ましくは３０質量％以上、より好ましくは４０質量％以上含有する植物抽出物が好ましい。ＯＰＣを２０質量％以上含有する植物抽出物として、松樹皮の抽出物が挙げられる。
プロアントシアニジン、特にＯＰＣは、上述のように抗酸化物質であるため、ガン・心臓病・脳血栓などの成人病の危険率を低下する効果、関節炎・アトピー性皮膚炎・花粉症などのアレルギー体質の改善効果などを有することが知られている。
さらにＯＰＣは、抗酸化作用のほか、口腔内のバクテリア増殖を抑制してプラーク（歯こう）を減少させる効果、血管の弾力性を回復させる効果、肌質を改善させる効果、コラーゲンの増強効果、高脂血症改善効果、血液中でのリポたんぱくが活性酸素によりダメージを受けるのを防止して、損傷した脂肪が血管の内壁に凝集し、コレステロールが付着することを防止する効果、活性酸素によって分解されたビタミンＥを再生させる効果、ビタミンＥの増強剤としての効果などを有することが知られている。この中でも、血管の弾力性を回復させる効果により血流が改善され得る。さらにペプチドにコラーゲンを用いた場合は、増強効果との相乗作用によって、肌質も改善され得る。
プロアントシアニジンを含有する植物抽出物を用いる場合は、植物抽出物中にさらにカテキン類を含有することが好ましい。好ましくは植物抽出物中に５質量％以上含有する。プロアントシアニジンを豊富に含有する上記植物抽出物には、カテキン類が含有され得る。カテキン（ｃａｔｅｃｈｉｎ）類とは、ポリヒドロキシフラバン−３−オールの総称であり、カテキン類としては、（＋）−カテキン、（−）−エピカテキン、（＋）−ガロカテキン、（−）−エピガロカテキン、エピガロカテキンガレート、エピカテキンガレートなどが知られている。植物由来の抽出物からは、狭義のカテキンといわれている（＋）−カテキンの他、ガロカテキン、アフゼレキン、ならびに（＋）−カテキンまたはガロカテキンの３−ガロイル誘導体が単離されている。
カテキン類は、植物抽出物中に、プロアントシアニジン１質量部に対して、０．１質量部以上含有されることが好ましい。より好ましくは、ＯＰＣを２０質量％以上含有する原料植物抽出物に、カテキン類が５質量％以上含有する。例えば、松樹皮抽出物のカテキン類含量が５質量％未満の場合、５質量％以上となるようにカテキン類を添加してもよい。カテキン類を５質量％以上含有し、かつＯＰＣを２０質量％以上含有する松樹皮抽出物を用いることが最も好ましい。
カテキン類には、発癌抑制作用、動脈硬化予防作用、脂肪代謝異常の抑制作用、血圧上昇抑制作用、血小板凝集抑制作用、抗アレルギー作用、抗ウイルス作用、抗菌作用、虫歯予防作用、口臭防止作用、腸内細菌叢正常化作用、活性酸素やフリーラジカルの消去作用、抗酸化作用などがあることが知られている。カテキン類には、血糖の上昇を抑制する抗糖尿病効果があることが知られている。カテキン類は、プロアントシアニジンの凝集沈殿や懸濁をより生じにくくする効果を有する。さらにＯＰＣとペプチドとの結合を安定化させ、高い生理活性を発揮させ得る。さらに、カテキン類は、ＯＰＣの存在下で水溶性が増すと同時に、ＯＰＣを活性化する性質があり、ＯＰＣとともに摂取することによって、ＯＰＣの作用を増強させる。
以下、ＯＰＣを豊富に含む松樹皮の抽出物を例に挙げて、プロアントシアニジンを含有する植物抽出物の調製方法を説明する。
松樹皮抽出物としては、フランス海岸松（Ｐｉｎｕｓ  Ｍａｒｔｉｍａ）、カラマツ、クロマツ、アカマツ、ヒメコマツ、ゴヨウマツ、チョウセンマツ、ハイマツ、リュウキュウマツ、ウツクシマツ、ダイオウマツ、シロマツ、カナダのケベック地方のアネダなどのマツ目に属する植物の樹皮抽出物が好ましく用いられる。中でも、フランス海岸松（Ｐｉｎｕｓ  Ｍａｒｔｉｍａ）の樹皮抽出物が好ましい。
フランス海岸松は、南仏の大西洋沿岸の一部に生育している海洋性松をいう。このフランス海岸松の樹皮は、プロアントシアニジン、有機酸、ならびにその他の生理活性成分などを含有し、その主要成分であるプロアントシアニジンに、活性酸素を除去する強い抗酸化作用があることが知られている。
松樹皮抽出物は、上記の松樹皮を水または有機溶媒で抽出して得られる。水を用いる場合には、温水または熱水が用いることが好ましい。これらの水には、抽出効率を向上させる点から、塩化ナトリウムなどの塩を添加することが好ましい。抽出に用いる有機溶媒としては、食品あるいは薬剤の製造に許容される有機溶媒が用いられ、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール、アセトン、ヘキサン、シクロヘキサン、プロピレングリコール、含水エタノール、含水プロピレングリコール、メチルエチルケトン、グリセリン、酢酸メチル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、食用油脂、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、および１，１，２−トリクロロエテンが挙げられる。これらの水および有機溶媒は単独で用いてもよいし、組合わせて用いてもよい。特に、水、熱水、エタノール、含水エタノール、および含水プロピレングリコールが好ましく、食品、医薬品に用いるときの安全性の観点から、水、熱水、エタノール、および含水エタノールがより好ましい。
松樹皮からプロアントシアニジンを抽出する方法は、特に限定されないが、例えば、加温抽出法、超臨界流体抽出法などが用いられる。
超臨界流体抽出法は、物質の気液の臨界点（臨界温度、臨界圧力）を超えた状態の流体である超臨界流体を用いて抽出を行う方法である。超臨界流体としては、二酸化炭素、エチレン、プロパン、亜酸化窒素（笑気ガス）などが用いられ、二酸化炭素が好ましく用いられる。
超臨界流体抽出法では、目的成分を超臨界流体によって抽出する抽出工程と、目的成分と超臨界流体とを分離する分離工程からなる。分離工程では、圧力変化による抽出分離、温度変化による抽出分離、または吸着剤・吸収剤を用いた抽出分離のいずれを行ってもよい。
また、エントレーナー添加法による超臨界流体抽出を行ってもよい。この方法は、超臨界流体に、例えば、エタノール、プロパノール、ｎ−ヘキサン、アセトン、トルエン、その他の脂肪族低級アルコール類、脂肪族炭化水素類、芳香族炭化水素類、またはケトン類を２〜２０Ｗ／Ｖ％程度添加し、得られた抽出流体で超臨界流体抽出を行うことによって、ＯＰＣ、カテキン類などの目的とする被抽出物の抽出溶媒に対する溶解度を飛躍的に上昇させる、あるいは分離の選択性を増強させる方法であり、効率的に松樹皮抽出物を得る方法である。
松樹皮からの抽出は、複数の抽出方法を組み合わせてもよい。複数の抽出方法を組み合わせることにより、種々の組成の松樹皮抽出物を得ることが可能となる。
上記抽出により得られた松樹皮抽出物は、プロアントシアニジン含有量を増加させる目的で精製してもよい。精製には、通常、酢酸エチルなどの溶媒が用いられるが、食品、医薬品としての安全性の面から、水またはエタノールを用いて、例えば、限外濾過、あるいは合成吸着剤（ダイヤイオンＨＰ−２０、セファデックス−ＬＨ２０など）を用いたカラム法またはバッチ法により精製することが好ましい。
本発明の植物抽出物として用いられる松樹皮抽出物は、具体的には、以下のような方法により調製されるが、これは例示であり、この方法に限定されない。
フランス海岸松の樹皮１ｋｇを、塩化ナトリウムの飽和水溶液３Ｌに入れ、１００℃にて３０分間抽出し、抽出液を得る（抽出工程）。その後、抽出液を濾過し、得られる不溶物を塩化ナトリウムの飽和溶液５００ｍＬで洗浄し、洗浄液を得る（洗浄工程）。この抽出液と洗浄液を合わせて、松樹皮の粗抽出液を得る。
次いで、この粗抽出液に酢酸エチル２５０ｍＬを添加して分液し、酢酸エチル層を回収する工程を５回行う。回収した酢酸エチル溶液を合わせて、無水硫酸ナトリウム２００ｇに直接添加して脱水する。その後、この酢酸エチル溶液を濾過し、濾液を元の５分の１量になるまで減圧濃縮する。濃縮された酢酸エチル溶液を２Ｌのクロロホルムに注ぎ、攪拌して得られる沈殿物を濾過により回収する。その後、この沈殿物を酢酸エチル１００ｍＬに溶解した後、再度１Ｌのクロロホルムに添加して沈殿させる操作を２回繰り返す洗浄工程を行う。この方法により、例えば、ＯＰＣを２０質量％以上含み、かつカテキン類を５質量％以上含有する、約５ｇの松樹皮抽出物が得られる。
上記松樹皮のような原料植物に由来する抽出物は、ＯＰＣを乾燥質量換算で好ましくは２０質量％以上、より好ましくは３０質量％以上含有する。このようにＯＰＣを高い割合で含有する原料として、松樹皮抽出物が好ましく用いられる。
なお、上記のように水やエタノールを用いて植物体から抽出した抽出物中には、５量体以上のプロアントシアニジンも含有されるが、プロアントシアニジンの極性溶媒への溶解度から、そのほとんどは１０〜２０量体以下となる。
（アミノ酸を３個以上含むペプチド）
本発明に用いられるペプチドは、アミノ酸を３個以上含んでいればよく、アミノ酸の種類およびその組み合わせに特に制限されない。上記ペプチドは、動物または植物由来のタンパク質およびその分解物であっても、有機合成によって得られたペプチドであってもよい。
上記動物または植物由来のタンパク質およびその分解物としては、例えば、牛、豚、鶏などの畜肉類、魚類、獣乳、卵などに由来する動物性タンパク質；大豆、ニンジン、小麦、トウモロコシ、えんどう豆などに由来する植物性タンパク質；およびこれらの分解物が挙げられる。特に、大豆、コラーゲン、およびニンジンに由来するペプチドが好ましく、大豆分解物、コラーゲンペプチド、およびニンジン由来ペプチドが最も好ましい。タンパク質は、原料をそのまま物理的に粉砕して使用してもよいし、水や有機溶媒などの溶媒を用いた抽出物として用いてもよい。上記タンパク質の分解物は、上記動植物性タンパク質の粉砕物または抽出物を酸、アルカリ、または酵素を用いて分解することによって得られ得る。
コラーゲンは、動物の結合組織を構成する主要タンパク質であり、骨、腱、皮膚、血管壁などに多く含まれる。分子内に１または複数の３重らせん構造を有し、構成するポリペプチド鎖のアミノ酸配列が異なる種々のタイプが存在する。コラーゲンの変性物であるゼラチンは、コラーゲンを含む原料を温（熱）水抽出することにより得られる分子量３０万から数万程度の水溶性タンパク質であり、アルカリ処理ゼラチン（等電点４．８〜５．３）と酸処理ゼラチン（等電点７〜９）とがある。
コラーゲンペプチドは、上記コラーゲンまたはゼラチンを、例えば、以下のように分解することによって得られたものである。まず、牛、豚などの皮または骨を、アルカリ溶液に２〜３ヶ月浸漬するアルカリ処理または希塩酸などに短期間浸漬する酸処理を施して、原料に含まれる不純物を除去し、かつ抽出を容易にするための前処理を行う。例えば、原料が牛骨である場合は、骨の中にリン酸カルシウムなどの無機質が含まれているため、予め希塩酸に漬けて無機質を除去し、これを温（熱）水抽出することによりゼラチンを得る。温（熱）水抽出は、一般には、最初の抽出温度は５０〜６０℃で、２回目以降は抽出温度を徐々に上げ、最終的には煮沸させる。次いで、得られたゼラチンを、通常用いられる酸あるいは酵素で加水分解する。このようにして、コラーゲンペプチドが得られる。このようなコラーゲンペプチドは、市販されており、容易に入手可能である。例えば、ニッピペプタイドＰＢＦ、ニッピペプタイドＰＲＡ（いずれも（株）ニッピ製）、ＳＣＰ−５０００、ＳＣＰ−３１００（いずれも新田ゼラチン（株）製）、コラーゲンペプチドＤＳ（協和ハイフーズ株式会社製）、ファルコニックスＣＴＰ（一丸ファルコス株式会社製）などが挙げられる。
大豆分解物は、例えば、大豆を脱脂し、水抽出した豆乳を酸沈殿して得られる分離大豆蛋白質をアルカリによる加水分解処理、酸、酵素、酸化剤又は還元剤を用いた分解処理またはこれらの組合せにより分解し、必要に応じて一定分子量のペプチドを分画して得られたものであり、市販のものを容易に入手することができる。例えば、ハイニュートＳ、Ｒ、Ｄ１、Ｄ３、ＤＣ５、ＳＭＳ、ＳＭＰ（以上、不二製油株式会社）などが挙げられる。
ニンジン由来のペプチドは、動物性コラーゲンとアミノ酸組成が類似しているものが好適である。例えば、Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ  Ｌ．由来ペプチドは、コラーゲン類似ペプチドである。
このアミノ酸を３個以上含むペプチドの平均分子量は、特に制限されない。好ましくは、平均分子量が７，０００以下、より好ましくは平均分子量が４００〜７，０００、さらに好ましくは４００〜６，５００、特に好ましくは４００以上３，０００未満である。このようなアミノ酸を３個以上含むペプチドを用いることによって、さらに、プロアントシアニジンが有する生理活性を増強することも期待できる。平均分子量が７，０００より大きくなると、多くのプロアントシアニジンと結合し、大きな結合体が形成されるため、沈殿や懸濁を生じる場合があり、さらにプロアントシアニジンの生体内の吸収が妨げられる可能性がある。平均分子量が４００より小さいペプチドは、長期保存において、凝集沈澱を生じる場合がある。
（水可溶性結合体）
本発明の水可溶性結合体は、プロアントシアニジン、特に植物抽出物を用いた場合は、植物抽出物中のプロアントシアニジンと、アミノ酸を３個以上含むペプチドとからなる。プロアントシアニジンと、アミノ酸を３個以上含むペプチドとの割合は、特に制限されない。水可溶性結合体中のプロアントシアニジンの保護安定性の点から、プロアントシアニジン１質量部に対して、アミノ酸を３個以上含むペプチド、例えば、大豆またはコラーゲン由来のペプチドを１質量部以上、より好ましくは５質量部以上、さらに好ましくは５質量部〜３００質量部、最も好ましくは５質量部〜１５０質量部含むことが好ましい。１質量部より少ないと、プロアントシアニジンの保護安定性が十分でない場合があり得る。
本発明の水可溶性結合体は、具体的には、水、エタノールなどの極性溶媒中で、プロアントシアニジン、特に植物抽出物を用いた場合は、植物抽出物中のプロアントシアニジンと、アミノ酸を３個以上含むペプチドとを混合することによって製造されることが好ましい。極性溶媒としては、好ましくは水である。混合は、例えば、プロアントシアニジンの乾燥粉末を極性溶媒に溶解させたプロアントシアニジン含有溶液と、アミノ酸を３個以上含むペプチドを同じ極性溶媒に溶解させたペプチド含有溶液とを混合する；ペプチド含有溶液にプロアントシアニジンの乾燥粉末を添加する；プロアントシアニジン含有溶液にペプチドの乾燥粉末を添加する；またはプロアントシアニジンの乾燥粉末とペプチドの乾燥粉末とを混合した後に極性溶媒を添加するなどによって行われ得る。
プロアントシアニジン含有溶液とペプチド含有溶液とを混合する場合、その混合割合に特に制限はない。沈澱を生じさせずに水可溶性結合体を得る点から、好ましくはペプチド含有溶液１容量部に対して、プロアントシアニジン含有溶液が１／５０容量部以上、より好ましくは１／１０容量部以上である。
ペプチド含有溶液にプロアントシアニジンの乾燥粉末を添加する、あるいはプロアントシアニジン含有溶液にペプチドの乾燥粉末を添加することによって混合する場合、攪拌しながら乾燥粉末を添加する、あるいは乾燥粉末を添加した後に攪拌することが、沈澱を防止する点から好ましい。
プロアントシアニジンの乾燥粉末とペプチドの乾燥粉末とを混合した後に極性溶媒を添加する場合、混合した粉末を攪拌しながら、極性溶媒を噴霧することが、均一な水可溶性結合体を得る点から好ましい。
得られた水可溶性結合体を、その後、当業者が通常用いる加工方法によって、粉末化してもよい。粉末化は、例えば、流動層造粒機などを用いて、プロアントシアニジンとペプチドとの混合粉末を攪拌しながら、極性溶媒を噴霧することによって行われる。粉末にした場合であっても、液状の水可溶性結合体と同様の効果を有し、例えば、プロアントシアニジンは、変色などの劣化が少なく、生理活性が保持または増強されており、生体内でその活性を発揮し得る。さらに、粉末にしておき、使用時に水などの溶媒に再溶解させることが、プロアントシアニジンの変色などの劣化が少ない点から好ましい。
本発明の水可溶性結合体は、アミノ酸を３個以上含むペプチドを、プロアントシアニジン、特に植物抽出物を用いた場合は、植物抽出物中のプロアントシアニジンに結合させることによって、プロアントシアニジンの保護安定性が高められ、かつ生理活性が保持または高められる。そのため、液状で長期保存しても沈澱が生じず、該生理活性を維持したまま生体内に輸送し得る。本発明の水可溶性結合体は、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、トイレタリー用品などとして利用され、経口投与および経皮投与のいずれの目的で使用しても、その効果を発揮し得る。特に液状の製品などの酸化安定化剤などとして利用することが好適である。
（水可溶性結合体含有組成物）
本発明の組成物は、上記水可溶性結合体を含有し、必要に応じて、その他の成分を含有し得る。この組成物は、上記水可溶性結合体と同様に、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、トイレタリー用品などとして利用される。
本発明の組成物に含有される水可溶性結合体の量は、投与方法や剤形によって異なり、特に制限されない。好ましくは、組成物中に、プロアントシアニジンが乾燥質量換算で０．００００１質量％〜５０質量％、より好ましくは０．００１質量％〜４０質量％、さらに好ましくは０．０１質量％〜２０質量％となるように含有される。
本発明の組成物には、上記水可溶性結合体以外に、医薬品、食品、医薬部外品、化粧料などに通常使用される他の成分を、該組成物の効果を損なわない範囲で含有してもよい。このような成分としては、例えば、水、薬効成分、酸化防止剤、他の油剤、保湿剤、界面活性剤、紫外線吸収剤、吸収促進剤、香料、色素、保存剤、増粘剤、キレート剤、防腐防黴剤などを挙げられる。
薬効成分としては、活性酸素除去剤、抗酸化剤、消炎鎮痛剤、抗ヒスタミン剤、止痒剤、殺菌剤、ビタミン剤、ホルモン剤などが挙げられる。
酸化防止剤は、プロアントシアニジンの酸化に対する安定性をさらに高める目的で添加する。さらに、体内のタンパク質や脂質の酸化を防止し、肌質を改善および保護する効果も得ることができる。酸化防止剤としては、ビタミンＡなどのカロテノイド類、ビタミンＢ類、アスコルビン酸、ビタミンＥ、これらの誘導体またはこれらの塩、Ｌ−システインおよびこれらの誘導体やその塩、リボフラビン、ＳＯＤ、マンニトール、トリプトファン、ヒスチジン、ケルセチン、没食子酸およびその誘導体、茶抽出物、およびグルタチオン酵母抽出物などの抽出物が挙げられる。好ましくは、アスコルビン酸ならびにその誘導体およびその塩である。
アスコルビン酸もしくはその誘導体またはその塩（以下、アスコルビン酸等という）は、プロアントシアニジンの安定性を高めるだけでなく、肌や脂質代謝に相乗的に効果を発揮し、肌質の改善効果（例えば、ハリやツヤが良くなる効果）および血管保護効果をより高める。アスコルビン酸等は、プロアントシアニジン１質量部に対して、好ましくは０．１質量部〜５０質量部、より好ましくは０．２質量部〜２０質量部となるように含有され得る。
本発明の組成物を食品などの経口投与を目的として利用する場合は、さらに必要に応じて、賦形剤、増量剤、結合剤、増粘剤、乳化剤、着色料、香料、食品添加物、調味料などの添加剤と混合され得る。例えば、ローヤルゼリー、ビタミン、プロテイン、卵殻カルシウムなどのカルシウム、キトサン、レシチン、クロレラ末、アシタバ末、モロヘイヤ末などの栄養成分としての食品添加物；ステビア末、抹茶パウダー、レモンパウダー、はちみつ、還元麦芽糖、乳糖、糖液などの調味料が混合され得る。そして、この組成物は、ハードカプセル、ソフトカプセルなどのカプセル剤、錠剤、もしくは丸剤などに、あるいは粉末状、顆粒状、茶状、ティーバッグ状、飴状、液体、ペースト状などの形態に成形され得る。これらは、形状または好みに応じて、そのまま飲食してもよく、あるいは水、湯、牛乳などに溶いて飲んでも良い。
本発明の組成物は、経皮投与を目的として、医薬品、医薬部外品、化粧品、トイレタリー用品として使用できる。例えば、化粧水、化粧クリーム、乳液、クリーム、パック、ヘアトニック、ヘアクリーム、シャンプー、ヘアリンス、トリートメント、ボディシャンプー、洗顔剤、石鹸、ファンデーション、白粉、口紅、リップグロス、頬紅、アイシャドー、整髪料、育毛剤、水性軟膏、油性軟膏、目薬、アイウォッシュ、歯磨剤、マウスウォッシュ、シップ、ゲルなどが挙げられる。また、シップやゲルのような担体や架橋剤に保持・吸収させ、局部へ貼付するなどの方法により、局所的な長時間投与を行うこともできる。
本発明の組成物を経口投与により摂取する場合の一日の投与量は、特に限定されないが、好ましくはプロアントシアニジンとして０．０２ｇ〜１ｇの範囲内で、様々な生理活性を得ることができる。また、経皮投与の場合は、局所的な投与となるため、前記の一定濃度となるように調製したものであれば、生理活性を得ることが可能である。
本発明の組成物を適切な量で摂取した場合、プロアントシアニジンおよびアミノ酸を３個以上含むペプチドをそれぞれ単独で摂取する場合に比べて、優れた血中の抗酸化力、血流改善効果、肌質改善効果などが得られる。特に、ＯＰＣを乾燥質量換算で２０質量％以上含有する植物抽出物を用いた場合、特に優れた効果が得られる。
【実施例】  以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明がこの実施例により制限されないことはいうまでもない。
（実施例１：水可溶性結合体）
松樹皮抽出物（２〜４量体：４０質量％、５量体以上：２５．１質量％、カテキン：５．１質量％、商標名：フラバンジェノール、株式会社東洋新薬）を０．２質量％含有する水溶液０．５ｍＬと、大豆分解物（平均分子量約４００、ハイニュートＰＭ、不二製油株式会社）を４質量％含有する水溶液０．５ｍＬとを混合して透明な混合液を得た。この混合液中のカテキン類、２量体のＯＰＣ、および３量体のＯＰＣを、シリカゲルクロマトグラフィー（ＴＬＣ）により検出することによって、結合体の形成の有無を確認した。すなわち、混合液中において、松樹皮抽出物に通常含有される上記成分の各標品と同じ位置にスポットが出現しなければ、上記成分が結合体を形成していると判断し、出現すれば、結合体を形成していないと判断した。結果を表１に示す。なお、ＴＬＣは、以下の条件で行い、指標としてカテキン（Ｒｆ値：０．８）ならびに２量体および３量体のＯＰＣの各標品（２量体：プロアントシアニジンＢ−２（Ｒｆ値：０．６）、３量体：プロアントシアニジンＣ−１（Ｒｆ値：０．４））を用いた：
ＴＬＣ：シリカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．製）
展開溶媒：ベンゼン／ギ酸エチル／ギ酸（２／７／１）
検出試薬：硫酸およびアニスアルデヒド硫酸
サンプル量：各１０μＬ
（比較例１〜３）
混合液の代わりに、実施例１の松樹皮抽出物を０．１質量％含有する水溶液を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、ＴＬＣにより結合体の形成の有無を確認した（比較例１）。上記同様にして、実施例１の大豆分解物（平均分子量約４００）を２質量％含有する水溶液（比較例２）およびグリシン（分子量７５：和光純薬工業株式会社製）を２質量％含有する水溶液（比較例３）についても、ＴＬＣにより結合体の形成の有無を確認した。結果を表１に併せて示す。
【表１】
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表１の結果からわかるように、実施例１の松樹皮抽出物と大豆分解物との混合液から、カテキンは検出されたが、２量体および３量体のプロアントシアニジン（ＯＰＣ）は検出されなかった。これに対して、比較例１の松樹皮抽出物含有溶液からは、カテキン、ならびに２量体および３量体のプロアントシアニジン（ＯＰＣ）がいずれも検出され、比較例２の大豆分解物含有溶液からはいずれも検出されなかった。このように、松樹皮抽出物と大豆分解物とを混合すると、松樹皮抽出物に本来含有される２量体および３量体のプロアントシアニジン（ＯＰＣ）が検出されなくなることがわかる。これは、松樹皮抽出物中の２量体以上のプロアントシアニジンと大豆分解物とが水可溶性の結合体を形成するためと考えられる。
（実施例２：凝集沈殿評価）
（１）プロアントシアニジン含有溶液の調製
実施例１で用いた松樹皮抽出物（以下、松樹皮抽出物Ａという）２０ｇを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０（ファルマシアバイオテク株式会社製）に供して分離し、乾燥粉末質量で７．６ｇの２〜４量体および５．１ｇの５量体以上のプロアントシアニジンを回収した。なお、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０による分離は、以下の条件で２回行った。
まず、水で膨潤させたＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０をカラム体積で５００ｍＬとなるように５０×５００ｍｍのカラムに充填し、５００ｍＬのエタノールで洗浄した。上記松樹皮抽出物１０ｇを２００ｍＬのエタノールに溶解し、これをカラムに通液して吸着させた後、１００〜８０％（ｖ／ｖ）エタノール−水混合溶媒でグラジエント溶出し、１００ｍＬずつ分取した。各画分について、シリカゲルクロマトグラフィー（ＴＬＣ）により、２〜４量体のＯＰＣの各標品（２量体：プロアントシアニジンＢ−２（Ｒｆ値：０．６）、３量体：プロアントシアニジンＣ−１（Ｒｆ値：０．４）、４量体：シンナムタンニンＡ２（Ｒｆ値：０．２））を指標として、ＯＰＣの溶出を検出した。ＴＬＣの条件は、実施例１と同様である。
ＯＰＣが検出された画分を集め、凍結乾燥して粉末を得た。次いで、ＯＰＣが検出されなくなったカラムに、５０％（ｖ／ｖ）水−アセトン混合溶媒１０００ｍＬを通液し、５量体以上のプロアントシアニジンを溶出させ、回収した画分を凍結乾燥させて粉末を得た。
得られた５量体以上のプロアントシアニジン０．１ｇと、上記の松樹皮抽出物Ａの粉末１ｇとを混合し、２〜４量体（ＯＰＣ）を３６質量％および５量体以上のプロアントシアニジンを３１質量％含む松樹皮抽出物を調製した（以下、松樹皮抽出物Ｂという）。
上記で得られた松樹皮抽出物Ｂを、最終濃度が０．２質量％となるように水溶液に溶解した（これをプロアントシアニジン含有溶液１とする）。これとは別に、上記松樹皮抽出物ＡのＯＰＣ画分をプロアントシアニジン含有溶液２、および上記５量体以上のプロアントシアニジン画分をプロアントシアニジン含有溶液３とした。
（２）ペプチドおよびアミノ酸含有溶液の調製
コラーゲン（平均分子量３０万：株式会社高研製）、ニッピペプタイドＰＡ−１００（平均分子量１０，０００：株式会社ニッピ製）、コラーゲンペプチドＤＳ（平均分子量７，０００：協和ハイフーズ社製）、ＳＣＰ−５０００（平均分子量５，０００：新田ゼラチン株式会社製）、ファルコニックスＣＴＰ（平均分子量３，０００：一丸ファルコス株式会社製）、ニッピペプタイドＰＡ−１０（平均分子量１，０００：株式会社ニッピ製）、大豆分解物（平均分子量約４００、ハイニュートＰＭ、不二製油株式会社）、セリン−グルタミン酸のジペプチド（シグマアルドリッチジャパン）およびグリシン（分子量７５：和光純薬工業株式会社製）を用いて、これらのコラーゲン、コラーゲンペプチド、またはアミノ酸が１０．０質量％となるように水溶液を各２ｍＬずつ調製した。
（３）評価
上記のように調製したペプチドまたはアミノ酸溶液各１ｍＬに、上記プロアントシアニジン含有溶液１〜３を１ｍＬずつそれぞれ混合した。これらの溶液を、１週間室温で放置し、１週間後に沈殿および懸濁の有無を目視により観察した。また、４０℃で６ヶ月間放置した後にも、沈殿および懸濁の有無を目視により観察した。結果を表２に示す。なお、対照として、１ｍＬのプロアントシアニジン含有溶液１に１ｍＬの水を加えた溶液（対照１）、１ｍＬのプロアントシアニジン含有溶液１に１ｍＬのアスコルビン酸含有溶液（０．１質量％）を混合した溶液（対照２）を設け、上記同様に、沈澱および懸濁の有無を目視により観察した。
【表２】
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表２からわかるように、混合液を室温にて１週間保存した場合、２〜４量体のプロアントシアニジン（プロアントシアニジン含有溶液２）またはＯＰＣを含むプロアントシアニジン（プロアントシアニジン含有溶液１）と、アミノ酸（グリシン）および２個以上のアミノ酸が結合したペプチド（セリン−グルタミン酸ジペプチド、大豆分解物、ならびに平均分子量１，０００、３，０００、５，０００，および７，０００のコラーゲンペプチド）、水のみ（対照１）、またはアスコルビン酸（対照２）との混合液では、ほとんど懸濁が見られなかった。しかし、これらのうちで、４０℃にて６ヵ月間保存した場合は、上記プロアントシアニジン含有溶液と、アミノ酸（グリシン）、２個以下のアミノ酸を含むペプチド（セリン−グルタミン酸ジペプチド）、水のみ（対照１）、またはアスコルビン酸（対照２）との混合液に沈殿や懸濁が見られた。また、平均分子量３００，０００のコラーゲンを用いた場合は、ゲル化した固形分が析出した。本発明のプロアントシアニジンと、３個以上（平均分子量４００以上）のアミノ酸を含むペプチドとの結合体のうち、水可溶性の結合体は、優れた保存安定性を示し、沈殿や懸濁を生じにくいことが分かる。
（実施例３：プロアントシアニジン保護効果）
実施例１で用いた松樹皮抽出物Ａ、実施例２で用いたセリン−グルタミン酸のジペプチドおよび大豆分解物、ならびに大豆より抽出し分解処理を行っていない大豆蛋白質（平均分子量１０，０００以上、不二製油株式会社）のそれぞれの乾燥粉末を、流動層造粒機を用いて、水を噴霧しながら、食品（顆粒品）を製造した（食品１〜４）。配合量を以下に示す。
【表３】
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５週齢のラット（日本チャールズリバー株式会社）に、一般の固形飼料（ＭＦ；オリエンタル酵母株式会社）を与えて１週間馴化させた後、眼底より採血し、血液中のＳＯＤ活性を測定キット（ＳＯＤテストワコー：和光純薬株式会社）を用いて測定した。測定後、ＳＯＤ活性の平均値が均一になるように１群６匹ずつ計５群に割り振った。これとは別に、上記食品１〜４をそれぞれ、松樹皮抽出物の最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるように精製水に混合した（試験液１〜４）。この混合液を、含有される松樹皮抽出物が１００ｍｇ／ｋｇ体重となるように、各群のラットにゾンデを用いて経口投与した。対照として、精製水を投与した群を設けた。経口投与４５分後および９０分後に、再度眼底から採血を行い、ＳＯＤ活性を測定した。結果を表４に示す。
【表４】
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表４の結果から、試験液１（松樹皮抽出物と大豆分解物とを用いた食品１含有）は、試験液２（松樹皮抽出物と大豆蛋白質とを用いた食品２含有）、試験液３（松樹皮抽出物とセリン−グルタミン酸のジペプチドとを用いた食品３含有）、試験液４（松樹皮抽出物のみを用いた食品４含有）、または精製水（食品非含有）に比べて、血中のＳＯＤ活性が高まっていることがわかる。このことは、試験液１において、プロアントシアニジンの生理活性の一つである抗酸化活性を消化過程から少なくとも保護し、吸収されて、プロアントシアニジンによる生体内のＳＯＤ活性が増強されていることを示す。また、松樹皮抽出物と大豆蛋白質とを用いた食品２を含む試験液２では、摂取後４５分後のＳＯＤ活性が、特に低いことから、吸収の阻害が起こっていると考えられる。
（実施例４：食品組成物の製造）
下記の配合量で飲料（５００ｍＬ）を製造した：
大豆ペプチド（平均分子量７００）                ０．１質量％
松樹皮抽出物                                    ０．０２質量％
アスコルビン酸ナトリウム                        ０．０１６質量％
果糖                                            ０．３質量％
オレンジ果汁                                    １．０質量％
水                                              残量
（実施例５：外用剤の製造）
下記の配合量で外用剤（化粧水）を調製した。この化粧水は、塗布することにより、表皮の血流改善効果と保湿性に優れており、沈殿のない安定な外用剤であった：
コラーゲンペプチド（平均分子量１，０００）      ０．０５質量％
松樹皮抽出物                                    ０．０５質量％
エチルアルコール                              ２０質量％
１，３−ブチレングリコール                    １０質量％
アラントイン                                    ０．２質量％
水                                              残量
【産業上の利用可能性】  本発明の水可溶性結合体は、プロアントシアニジンとアミノ酸を３個以上含むペプチドとからなる。この水可溶性結合体は、プロアントシアニジンの保護安定性が高められ、かつ生理活性が保持または高められる。そのため、液状で長期保存しても沈澱が生じず、該生理活性を維持したまま生体内に輸送し得る。本発明の水可溶性結合体は、食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、トイレタリー用品などとして利用され、経口投与および経皮投与のいずれかの目的で使用される。特に液状の製品などの酸化安定化剤として利用することができる。