(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アスコピロンＰを抗腫瘍成分として含有することを特徴とする腫瘍の抗腫瘍剤。
【請求項２】
１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを腫瘍の転移抑制成分として含有することを特徴とする腫瘍の転移抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースおよび／またはアスコピロンを有効成分とする抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース(以下、１，５−ＡＦと略すことがある)は、ある種の子嚢菌や紅藻が有する酵素α−１，４−グルカンリアーゼを利用して澱粉あるいは澱粉分解物を基質として生産することができる。１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースは、グルコースから水分子が１つ取れた特異的な構造を有する糖である。既に、これまで抗酸化活性（特許文献１参照）や抗菌活性を有することが報告されている（特許文献２参照）。さらに、最近の研究では高血糖抑制作用（特許文献３参照）があることも報告されており、生理活性を持つ新規の糖としても注目されている。
【０００３】
アスコピロンは１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースから酵素反応によって調製できることが報告されている（特許文献４、特許文献５および特許文献６参照）。元来アスコピロンはある種の子嚢菌が生合成することが知られており（非特許文献１参照）、Ｐｅｚｉｚａｌｅｓ目例えば、Ｐｉｃａｒｉａ  ｌｅｉｏｃａｒｐａおよびＡｎｔｈｒａｃｏｂｉａ  ｍｅｌａｌｏｍａならびにＴｕｂｅｒａｌｅｓ目例えば、Ｔｕｂｅｒ  ｍｅｌａｎｏｓｐｏｒｕｍの菌体抽出液を１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースに作用させ調製できることも報告されている。
【０００４】
アスコピロンＰ（２−Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−５−ｈｙｄｒｏｘｙ−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−４Ｈ−ｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅ）は、１９７８年および１９８１年に、米国の科学者のグループによって、アスコピロンＰを有機合成の出発物質として使用する目的で、アミロペクチン、アミロース、及びセルロースを熱分解することによって調製された（非特許文献２参照）。
アスコピロンＰ(以下、ＡＰＰと略すことがある)は１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースと同様に抗酸化活性、抗菌活性を有することが報告されている（特許文献７、特許文献８および特許文献９参照）。
【０００５】
現在、臨床の場で使用されている抗腫瘍剤の多くは、化学的性質上、酸化促進作用を有しており、副作用例えば肝障害、腎障害、骨髄抑制、肺障害等を併発する危険性が高い。これに対し、１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースおよびアスコピロンは抗酸化活性を有し、炎症細胞の活性化（活性酸素産生）をも抑制することにより、ブレオマイシン、シスプラチンなどの抗腫瘍剤にみられるような炎症性の組織障害を減弱させると考えられる。従って、他の抗腫瘍剤との併用において、抗腫瘍効果の増強が期待できるだけでなく副作用の軽減をもたらす化学療法補助薬への応用も期待できる。
【特許文献１】特表平９−５０５９８８号公報
【特許文献２】特開２００１−８９３７７号公報
【特許文献３】特表２００３−５１９６６０号公報
【特許文献４】国際公開第ＷＯ０３／３８０８４号パンフレット
【特許文献５】国際公開第ＷＯ０３／３８０８５号パンフレット
【特許文献６】国際公開第ＷＯ０３／３８１０７号パンフレット
【特許文献７】国際公開第ＷＯ０２／２６０６０号パンフレット
【特許文献８】国際公開第ＷＯ０２／２６０６１号パンフレット
【特許文献９】国際公開第ＷＯ００／５６８３８号パンフレット
【非特許文献１】Ｍ．Ａ．Ｂａｕｔｅ．，ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３，（１９９１）４１−４５
【非特許文献２】Ｓｈａｆｉｚａｄｅｈ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，６７，（１９７８）４３３−４４７およびＳｔｅｖｅｎｓｏｎ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．，９０，（１９８１）３１９−３２５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの腫瘍の転移抑制剤およびアスコピロンＰを活性成分とし、炎症を抑制することが期待される、予後に優れた抗腫瘍剤を提供することにある。
本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、アスコピロンＰを含有することを特徴とする抗腫瘍剤によって達成される。
また、本発明によれば、本発明の上記目的及び利点は、１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを含有する腫瘍の転移抑制剤によって達成される。
【発明の効果】
【０００８】
１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースおよび／またはアスコピロンを用いることで、副作用を殆ど伴わずに腫瘍の増殖ないし転移を抑制できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明において「抗腫瘍」とは、腫瘍の増殖ないし転移を抑制する作用を含む概念である。
すなわち、生体内に腫瘍細胞を保有する個体に本発明の剤を適当量しかるべき方法で投与することにより、有意に腫瘍の増殖ないし転移を抑制することが可能である。
【００１０】
アスコピロンとしては、例えば子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）由来の１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース脱水酵素による１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの脱水産物、あるいは１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースをアルカリ条件下で処理するか、或は、加熱処理を施すことによって生成されるような、化学的あるいは物理的操作による１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの脱水生成物を挙げることができる。アスコピロンの例として、幾つかの構造式を図１に示す。図１中、左に記載の構造式がアスコピロンＰである。
【００１１】
本発明の剤は、それ自体公知の種々の方法で投与することが可能であり、投与量、投与部位、投与する間隔、期間等は、患者の年齢や体重、病状あるいは他の薬剤や治療法と併用した場合などを考慮して決定することができる。
投与方法としては、例えば、注射や点滴などにより静脈内や皮下、腹腔内、あるいは経口投与などによることができ、特別に制限されない。
また、本発明の剤を食品に添加し、その食品を摂取して体内に取り込む形態をとることも可能である。
【００１２】
投与量は、投与方法、投与する間隔、腫瘍の種類および患者の重篤度により異なるが、例えば、一回あたりの投与量はアスコピロンでは０．０００００１μｇ／ｋｇ〜１,０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．００１μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇとすることができ、また１,５−アンヒドロフルクトースでは、０．００１μｇ／ｋｇ〜１０,０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１,０００ｍｇ／ｋｇとすることができる。
また、この一回の投与量を数回に分けて投与することもできる。
【００１３】
本発明の剤の形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、坐剤、注射剤、経皮吸収剤等が挙げられるが、特に制限されない。また、本発明の剤は、製剤を調製するうえで必要な成分例えば、製剤担体や賦形剤、安定剤等を含有することもできる。さらに、本発明の効果を奏する限り、他の抗腫瘍剤あるいはその他の薬理成分あるいはブドウ糖などの栄養成分を含むことも可能である。
以下に本発明について検討した結果を詳述する。なお、以下の試験においては１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースおよびアスコピロンは、公知の方法に基づいて調製したものを使用した。
【００１４】
試験例
細胞株および培養方法
接着系癌細胞株のＣ５７  ＢＬ／６  マウスメラノーマ細胞株（Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ）、ヒト肺腺癌細胞株（Ａ５４９）、ヒトケラチノサイト由来腫瘍様細胞株（ＨａＣａＴ）、ヒト子宮頚部癌細胞株（ＨｅＬａ）は１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）と２％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地中で、３７℃、ＣＯ2濃度５％の条件下で培養した。浮遊系腫瘍細胞のＴＨＰ−１（前骨髄性白血病細胞株）は１０％ＦＣＳと２％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ  １６４０培地中で、３７℃、ＣＯ２濃度５％の条件下で培養した。
生細胞数の測定方法
６ウェルのプレート上に増殖したＢ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ細胞を２％グルタルアルデヒドで固定した後、４％クリスタルバイオレットで染色し、その染色性のある細胞を生細胞と判定した。
【００１５】
細胞死の割合および各細胞周期にある細胞の割合の測定方法
細胞培養液を種々の濃度のアスコピロンＰ溶液（アスコピロンＰをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解したもの）で刺激し、所定の時間培養後、トリプシンを用い細胞を浮遊した状態で回収した。その後、４℃で３０分間７０％エタノールで固定した後、５０μｇ／ｍｌプロピジウムヨード（ＰＩ）溶液で染色した。３０分後、ＦＡＣＳを用いて、ＤＮＡヒストグラムを作成し、細胞死の割合および細胞周期について調べた。
【００１６】
接着細胞数の測定方法
ＴＨＰ−１細胞培養液に１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース溶液（１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースをＤＭＳＯに溶解したもの）を添加し、次いでホルボールエステル（ＰＭＡ；ｐｈｏｒｂｏｌ  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  ａｃｅｔａｔｅ）で刺激した。３７℃、５％ＣＯ２条件下で一時間培養後、Ｇｉｅｍｓａ染色法で接着した細胞を染色した。
【００１７】
結果および考察
１）アスコピロンＰによる細胞増殖抑制効果
５×１０3個／ｍｌのＢ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ細胞（Ｃ５７  ＢＬ／６  マウスメラノーマ細胞）を６ウェルのプレートに播種し、細胞が底面に接着後（２４ｈｒ）、培養液中の最終濃度が０〜０．７０ｍＭ になるようアスコピロンＰ溶液（溶媒としてＤＭＳＯを使用）を等量ずつ添加した。３７℃、５％ＣＯ2条件下で一週間培養後、生細胞数を測定した。
結果を図２に示す。コントロール（ＤＭＳＯのみを添加）での生存細胞を１００％としたとき、アスコピロンＰを添加することで、生細胞の数は濃度依存的に顕著に減少し、最終濃度（０．７０ｍＭ）ではその割合は５０％以下まで低下した。これらの結果から、アスコピロンＰは腫瘍細胞の増殖抑制能を有すると考えられた。
【００１８】
２）アスコピロンＰによる腫瘍細胞アポトーシス誘導効果
Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ細胞に対するアスコピロンＰの腫瘍細胞増殖抑制効果の機序が、他の抗腫瘍剤においてみられるような殺細胞効果によるものであるかを検討した。本検討項目において、Ｂ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ細胞以外に４種類のヒト癌細胞株（ＴＨＰ−１：前骨髄性白血病、ＨｅＬａ：子宮頚癌、Ａ５４９：肺胞上皮癌、ＨａＣａＴ：皮膚癌モデル細胞）を加えて、アスコピロンＰの刺激により誘導される死細胞の割合を調べた。なお、ここでは各癌細胞培養液に対し、アスコピロンＰを１．４ｍＭになるように添加し、４８時間後の死細胞の割合を測定した。結果を表１に示す。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
表１より、アスコピロンＰはそれぞれの癌細胞に由来する癌の種類を問わず、幅広いスペクトラムをもった殺細胞効果を示すことがわかる。さらに、ＨａＣａＴ細胞を用いた実験系において、アスコピロンＰを添加後（１．４ｍＭ）、４８時間でアポトーシス特異的なＤＮＡの断片化が認められた（図３）。このことから、アスコピロンＰによる細胞死はアポトーシスであることが確認され、同じ結果がＡ５４９細胞を用いた系においても得られた。さらに、ＴＨＰ−１細胞を用いた系において、アスコピロンＰは０．３５ｍＭで、４８時間以内に細胞死を誘導することが認められた（図４）。
【００２１】
３）アスコピロンＰの特異的細胞死誘導作用
ＨａＣａＴ細胞は、１０％ＦＣＳの存在下では腫瘍細胞としての特徴を有しているが、低濃度のＦＣＳ存在下（１％以下）では、正常細胞に近い性格をもつことが知られている。この性質を利用して、アスコピロンＰが正常細胞に及ぼす影響を検討した。結果を図５に示す。腫瘍様に増殖しているＦＣＳ１０％条件下ではアスコピロンＰ添加後（１．４ｍＭ）、４８時間以内で約３０％もの細胞死を誘導したのに対し（図５（ｃ））、正常細胞様の特徴をもつＦＣＳ１％では１．４ｍＭのアスコピロンＰ存在下においても、ほとんど死細胞は認められなかった（図５（ｂ））。これより、アスコピロンＰは増殖性の高い細胞（腫瘍細胞）に特異的に作用し、増殖の遅い細胞（正常細胞）にはほとんど影響を及ぼさないことが示唆された。
一方、ＦＣＳ１０％で腫瘍様に増殖しているＨｅＬａ細胞において、アスコピロンＰ添加後（１．４ｍＭ）２４時間では、顕著なＳ期細胞集団の増加およびＧ２／Ｍ期の細胞集団の減少が観察され（図６）、その後、４８時間では先に示したように約１０％の細胞死を誘導した。このことから、アスコピロンＰの細胞周期上の作用点はＤＮＡ合成期間であるＳ期であり、Ｇ２／Ｍ期への移行を阻害し、結果として細胞死を誘導することが示唆される。したがって、アスコピロンＰが抗腫瘍剤として生体に投与された場合、大半が細胞周期上のＧ０／１期にあると考えられる正常細胞に障害を与えることなく、腫瘍細胞にのみ特異的に殺細胞効果を発揮することが期待される。
【００２２】
４）１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースによるインテグリンの機能抑制作用
白血病細胞株をホルボールエステル（ＰＭＡ）で刺激すると、接着分子インテグリンの活性化がみられ、その結果，細胞現象として活性酸素生成、細胞接着亢進、細胞浸潤が誘導されることが知られている。そこで、１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース存在下で、ＴＨＰ−１細胞株を培養し、ホルボールエステルで刺激後の接着細胞数を指標としてインテグリン機能を評価した。
結果を図７に示す。１２．３ｍＭの１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースはホルボールエステルによる細胞接着性を約２５％程度に抑制した。従って、腫瘍細胞の転移において重要な役割を果たすと考えられるインテグリン分子の機能を１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースは抑制しうることが推察された。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明をさらに詳述する。本発明はかかる実施例により何ら制限されるものではない。
【００２４】
実施例１
Ｃ５７  ＢＬ／６  マウスにＢ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ細胞（５×１０６個）を腹腔内に播種した後，１５日目から毎日ＰＢＳ（燐酸緩衝液）ならびにアスコピロンＰ溶液を腹腔内投与し（投与量は２００ｍｇ／ｋｇ）、生存率を調べた（癌性腹膜炎モデル）。この実験系において、予めＢ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ細胞をマウスの腹腔内に播種すると、無投与ならびにＰＢＳ投与の場合、１４日目以降から個体（マウス）は死亡することが確認された。本実験系を用いて、アスコピロンＰの末期癌モデルに対する延命効果について検討した結果を図８に示す。平均生存日数はアスコピロンＰ投与群では８日、ＰＢＳ群は４日であり、生体内においても抗腫瘍効果を有することが証明された。さらに、アスコピロンＰ投与群の４０％（ｎ＝２）において、コントロール（ＰＢＳ群）と比較して３倍以上ものアスコピロンＰ投与後の生存期間の延長がみられた。このことは，アスコピロンＰのｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗腫瘍効果を意味するものである。
【００２５】
実施例２
実施例１と同様にＣ５７  ＢＬ／６マウスにＢ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ細胞（５×１０6個）を腹腔内に播種した後、２日目から毎日ＰＢＳならびに１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを腹腔内投与した（投与量は２００ｍｇ／ｋｇ）。生存率を図９に示す。腫瘍細胞播種後の平均生存日数は１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース群が１９日、コントロールのＰＢＳ群が１４日であった。この結果から、１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの担癌マウスに対する延命効果が認められた。
【００２６】
実施例３
次に、Ｃ５７  ＢＬ／６ マウスにＢ１６  ｍｅｌａｎｏｍａ細胞（１×１０５個）を背中に皮下播種し、３日目から１３日目までＰＢＳならびにアスコピロンＰを１日おきに腫瘍局所に皮下注射し（ＰＢＳに溶かした溶液を用い投与量は２５ｍｇ／ｋｇとした），腫瘍の容積（長径×短径2×０．５２）で抗腫瘍効果を評価した（図１０）． 腫瘍細胞播種後、７日目まではいずれも差は認められなかったが、７日目以降アスコピロンＰ投与群はＰＢＳ投与群と比べて顕著に腫瘍の容積が少ないことがわかった。一般に，臨床の場では腫瘍の増大速度が遅いものほど予後が良好といわれる。すなわち，アスコピロンＰのin vivoにおける抗腫瘍効果を示すものである。また、アスコピロンＰ投与群の屠殺後の解剖所見では腫瘍の転移はほとんど観察されなかった。
【００２７】
実施例４
前骨髄性白血病細胞（ＴＨＰ−１細胞）の細胞培養液を種々の濃度のアスコピロンＰ溶液（アスコピロンＰをＤＭＳＯに溶解したもの）、シスプラチン溶液（同様にＤＭＳＯで溶解）、さらにアスコピロンＰとシスプラチンの混合溶液で刺激し、４８時間培養後、十分にピペッティングして均一な単一細胞からなる浮遊液の状態で回収した。ここで一部は血球計算板を用い顕微鏡下で細胞数を測定した。残りの細胞浮遊液は４℃で３０分間７０％エタノール固定した後、最終５０μｇ／ｍｌプロピジウムヨード（ＰＩ）溶液で染色した。３０分後、ＦＡＣＳを用いてＤＮＡヒストグラムを作成し、細胞死の割合を調べ各々の生細胞数を算出した（図１１）。コントロール（ＤＭＳＯのみを添加）での生細胞を１００％としたとき、アスコピロンＰを添加することでその割合は３０％前後から約５０％まで減少し、細胞の増殖抑制効果が確認された。一方、シスプラチンとアスコピロンＰを併用した群の生細胞の割合は、１０％前後であり、アスコピロンＰとシスプラチンとの相乗効果が確認された。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】アスコピロンの構造式例
【図２】クリスタルバイオレット染色法による、アスコピロンＰの細胞増殖抑制能評価
【図３】アガロースゲル電気泳動法によるＤＮＡ断片化解析
【図４】フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による死細胞の定量的評価
【図５】フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による死細胞の定量的評価
【図６】フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による細胞周期
【図７】白血病細胞株におけるインテグリンの機能評価
【図８】（実施例１）アスコピロンＰ投与後のマウスの生存率
【図９】（実施例２）１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース投与後のマウスの生存率
【図１０】（実施例３）アスコピロンＰ投与後マウスの腫瘍容積の評価
【図１１】（実施例４）アスコピロンＰとシスプラチンの細胞増殖抑制能評価
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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