(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
出芽酵母のSln1遺伝子欠損株、大腸菌のRcsC遺伝子欠損株又は分裂酵母のPhks遺伝子欠損株に、下記の群Aから選ばれるサイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドと下記の群Bから選ばれるサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとが導入されてなる形質転換細胞。
［群A；サイトカイニン受容体］
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｃ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１９６から１１７６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｉ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｅ）のサイトカイニン受容体が有するアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失及び／若しくは他のアミノ酸によって置換されたアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｊ）上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のサイトカイニン受容体が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
［群B；サイトカイニン生合成酵素］
（ａ）配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｂ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｃ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｄ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｅ）配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｆ）配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｇ）配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｈ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のサイトカイニン生合成酵素が有するアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失及び／若しくは他のアミノ酸によって置換されたアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｉ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のサイトカイニン生合成酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるサイトカイニン生合成酵素
【請求項２】
出芽酵母のSln1遺伝子欠損株に、下記の群Aから選ばれるサイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドと下記の群Bから選ばれるサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとが導入されてなる形質転換細胞。
［群A；サイトカイニン受容体］
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｃ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１９６から１１７６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｉ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｅ）のサイトカイニン受容体が有するアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失及び／若しくは他のアミノ酸によって置換されたアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｊ）上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のサイトカイニン受容体が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
［群B；サイトカイニン生合成酵素］
（ａ）配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｂ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｃ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｄ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｅ）配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｆ）配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｇ）配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｈ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のサイトカイニン生合成酵素が有するアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失及び／若しくは他のアミノ酸によって置換されたアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｉ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のサイトカイニン生合成酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるサイトカイニン生合成酵素
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトカイニン受容体及びサイトカイニン生合成酵素の共発現形質転換細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトカイニンは、高等植物の細胞分裂及び分化に関する植物ホルモンであり、高等植物細胞の分裂の誘起、カルスや髄から茎葉への分化、葉の黄化や落葉、落果等の防止、頂芽優先の打破等の作用を示すことが知られている重要な生理活性物質である（非特許文献１参照）。近年、植物のサイトカイニン生合成の鍵酵素がイソペンテニル基転移酵素であって、この酵素がジメチルアリル二リン酸のイソペンテニル基をアデノシン−５’−三リン酸及び／又はアデノシン−５’−二リン酸に転移させることが明らかになった（非特許文献２、非特許文献３、特許文献１参照）。
サイトカイニンの生合成を制御する活性を有する物質は、植物生長調節剤、例えば、果樹であるリンゴ、ミカン等の落果防止剤、植物の草丈を調節することによるイネ、ムギ等の倒伏防止剤、収穫後の果実の甘味増強剤、タバコやバラの腋芽抑制剤等として利用可能である。
このようなサイトカイニンの生合成を制御する活性を有する物質を見出す方法として、被験物質を植物個体に直接散布してその生理的な変化を観察、評価する方法を用いることができる。
【０００３】
【非特許文献１】Cytokinins: Chemistry, Activity, and Function, CRC Press (1994)
【非特許文献２】Identification of Plant Cytokinin Biosynthtic Enzymes as Dimethylallyl Diphosphate:ATP/ADP Isopentenyltransferases. Plant&Cell Physiol. (2001)42,677-685
【非特許文献３】Identification of Genes Encoding Adenylate Isopentenyltransferase, a Cytokinin Biosynthesis Enzyme, in Arabidopsis thaliana. J.Biol.Chem. (2001)276,26405-26410
【特許文献１】WO2002072818A1 Genes encoding proteins participating in cytokinin synthesis
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
当該方法は、植物個体に直接散布するに足る量の被験物質を準備することを必要とし、また前記植物個体の育成や被験物質散布後の植物個体の生理的変化の観察、評価に多大な時間を要する、といった問題があった。そこで、サイトカイニンの生合成を制御する活性を有する物質を少量の被験物質で迅速に見出すための種々な方法の開発が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、かかる状況のもと鋭意検討した結果、被験物質のサイトカイニンの生合成を制御する活性を分析し、またサイトカイニンの生合成を制御する活性を有する物質を少量のサンプルでかつ迅速に探索するための、サイトカイニン受容体及びサイトカイニン生合成酵素の共発現形質転換細胞を見出し、本発明に至った。
【０００６】
即ち、本発明は、
１．サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとが導入されてなる形質転換細胞（以下、本発明形質転換細胞と記すこともある。）；
２．サイトカイニン受容体が下記のいずれかのサイトカイニン受容体であることを特徴とする前項１記載の形質転換細胞
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｃ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｄ）膜貫通領域の一部が欠失しているものであって、かつ膜貫通領域を少なくとも１個以上有するサイトカイニン受容体
（ｅ）配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１９６から１１７６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｆ）配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号５０から１１７６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｇ）配列番号６で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号３２から１０３６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体
（ｈ）互いにホモな由来であるサイトカイニン受容体の細胞外領域、サイトカイニン受容体の膜貫通領域及びサイトカイニン受容体のヒスチジンキナーゼ領域と、前記３つの領域に対してヘテロな由来であるヒスチジンキナーゼのレシーバー領域とから構成されるキメラ型サイトカイニン受容体
（ｉ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のサイトカイニン受容体が有するアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失及び／若しくは他のアミノ酸によって置換されたアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体
（ｊ）上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のサイトカイニン受容体が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体；
３．サイトカイニン生合成酵素が、イソペンテニル基転移酵素であることを特徴とする前項１又は２記載の形質転換細胞；
４．サイトカイニン生合成酵素が、下記のいずれかのサイトカイニン生合成酵素であることを特徴とする前項１又は２記載の形質転換細胞
（ａ）配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｂ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｃ）配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｄ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｅ）配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｆ）配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｇ）配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｈ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のサイトカイニン生合成酵素が有するアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失及び／若しくは他のアミノ酸によって置換されたアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素
（ｉ）上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のサイトカイニン生合成酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるサイトカイニン生合成酵素；
５．形質転換細胞が酵母であることを特徴とする前項１乃至４記載の形質転換細胞；
６．形質転換細胞が出芽酵母であることを特徴とする前項１乃至４記載の形質転換細胞；
等を提供するものである。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、サイトカイニン受容体及びサイトカイニン生合成酵素の共発現形質転換細胞が提供可能となり、当該形質転換細胞を利用することでサイトカイニンの生合成を制御する活性の分析方法が提供可能となり、さらに当該分析方法を利用することでサイトカイニンの生合成を制御する活性を有する物質を少量のサンプルでかつ迅速に見出す方法等が提供可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、詳細に本発明を説明する。
サイトカイニンはイソペンテニル基又はヒドロキシル化されたイソペンテニル基を持っているため、植物では何らかのアデニン骨格のイソペンテニル化によりサイトカイニンが合成されると長年考えられてきた。そして、近年、ジメチルアリル二リン酸をイソペンテニル基供与体とするアデノシン−５’−三リン酸及び／又はアデノシン−５’−二リン酸のイソペンテニル化が植物のサイトカイニン生合成の律速段階であることが明らかになった。このようなイソペンテニル基転移酵素が、本発明で用いられるサイトカイニン生合成酵素の代表的な例である。
【０００９】
イソペンテニル基転移酵素の具体的な例としては、例えば、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０のいずれかで示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失及び／若しくは他のアミノ酸によって置換されたアミノ酸配列を有するサイトカイニン生合成酵素、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるサイトカイニン生合成酵素等を挙げることができる。ここで、「複数のアミノ酸」とは、より具体的には、２個〜約２０個程度のアミノ酸を意味し、例えば、２個〜約１０個のアミノ酸、２個〜５個のアミノ酸を一例としてあげることができる。また、「１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失及び／若しくは他のアミノ酸によって置換されたアミノ酸配列」としては、例えば、付加、欠失及び／若しくは他のアミノ酸によって置換される前のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を一例としてあげることもできる。
これらの「アミノ酸が付加、欠失及び／若しくは他のアミノ酸によって置換」や「８０％以上の配列同一性」には、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８又は２０のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が細胞内で受けるプロセシング、該タンパク質が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異等が含まれる。
【００１０】
サイトカイニン受容体は、例えば、カイネチン、ゼアチン等のプリン系サイトカイニン、Ｎ−フェニル−Ｎ’−（４−ピリジル）ウレア等のウレア系サイトカイニン等のサイトカイニンに特異的に結合し、Two-Component regulatory system(又はHis to Asp phosphorelay system)と呼ばれる細胞内信号伝達メカニズムによって高等植物細胞の増殖、分化を制御する機能を有するタンパク質である。本発明で用いられるサイトカイニン受容体として、例えば、ヒスチジンキナーゼファミリーに属しており、細胞外領域、膜貫通領域、ヒスチジンキナーゼ領域（細胞内でヒスチジンキナーゼ活性を有しかつ活性部位となるHis残基を保持する領域）及びレシーバー領域（リン酸基転移の受容部を有しかつ活性部位となるAsp残基を保持する領域）から構成されているタンパク質をあげることができる。
【００１１】
このようなサイトカイニン受容体の具体的な例としては、例えば、配列番号２、４又は６のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体、配列番号２、４又は６のいずれかで示されるアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失及び／若しくは他のアミノ酸によって置換されたアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体、配列番号２、４又は６のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と相補性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体、後述する膜貫通領域一部欠失型サイトカイニン受容体、後述するキメラ型サイトカイニン受容体等を挙げることができる。ここで、「複数のアミノ酸」とは、より具体的には、２個〜約２０個程度のアミノ酸を意味し、例えば、２個〜約１０個のアミノ酸、２個〜５個のアミノ酸を一例としてあげることができる。また、「１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失及び／若しくは他のアミノ酸によって置換されたアミノ酸配列」としては、例えば、欠失、置換若しくは付加される前のアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を一例としてあげることもできる。
これらの「アミノ酸が付加、欠失及び／若しくは他のアミノ酸によって置換」や「８０％以上の配列同一性」には、配列番号２、４又は６のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するタンパク質が細胞内で受けるプロセシング、該タンパク質が由来する生物の種差、個体差、組織間の差異等により天然に生じる変異等が含まれる。
本発明において「配列同一性」とは、２つのＤＮＡ又は２つのタンパク質間の配列の同一性及び相同性をいう。前記「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のＤＮＡ又はタンパク質は、２つの配列の最適なアラインメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していてもよい。このような配列同一性に関しては、例えば、Vector NTIを用いて、ClustalWアルゴリズム(Nucleic Acid Res.,22(22):4673-4680(1994)を利用してアラインメントを作成することにより算出することができる。尚、配列同一性は、配列解析ソフト、具体的にはVector NTI、GENETYX-MACや公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えば、ホームページアドレスhttp://www.ddbj.nig.ac.jpにおいて、一般的に利用可能である。
【００１２】
前記「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Sambrook J., Frisch E. F., Maniatis T.著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１５Ｍ  クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）溶液中で６５℃にてハイブリッドを形成させた後、1×ＳＳＣで室温にて洗浄するような条件等を挙げることができる。洗浄ステップにおける塩濃度は、例えば、１×ＳＳＣで室温の条件（低ストリンジェンシーな条件）から０．１×ＳＳＣで室温の条件（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。洗浄ステップにおける温度は、例えば、室温（低ストリンジェンシーな条件）から６８℃（高ストリンジェンシーな条件）から選択することができる。また、塩濃度と温度の両方を変えることもできる。
【００１３】
次いで、サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとが導入されてなる形質転換細胞の作製について説明する。
サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとが導入されてなる形質転換細胞は、サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを、例えば、以下のようにして宿主細胞に導入することにより得ることができる。
【００１４】
（１）ｃＤＮＡの調製
まず、例えば、J.,Sambrook, E.,F.,Frisch, T.,Maniatis著、モレキュラークローニング第２版（Molecular Cloning 2nd edition）記載の方法に準じて、高等植物等の植物等から全ＲＮＡを調製する。具体的には、例えば、イネ、トウモロコシ、ムギ等の単子葉植物、タバコ、ダイズ、アラビドプシス等の双子葉植物等である高等植物からその組織の一部を採取した後、当該組織を液体窒素中で凍結させた後、乳鉢等により物理的に磨砕し、(a)得られた磨砕物に、塩酸グアニジンとフェノールとを含む溶液又はSDSとフェノールとを含む溶液を添加して全ＲＮＡを得る方法、(b)前述の磨砕物にグアニジンチオシアネートを含む溶液を添加して、さらにＣｓＣｌを加え遠心分離分離することにより全ＲＮＡを得る方法等を用いればよい。当該操作には、例えば、ISOGEN（株式会社ニッポンジーン）、RNeasy Total RNA Purification Kit（株式会社キアゲン）等の市販のキットを用いることもできる。
【００１５】
次いで、全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する。例えば、セルロース又はラテックスに結合されたオリゴｄＴ鎖とｍＲＮＡのポリＡ鎖とのハイブリダイゼーションを利用した方法等を用いることができる。当該操作には、例えば、mRNA Purification Kit（アマシャムバイオサイエンス株式会社）、OligotexTM−dT30〈Super〉（タカラバイオ株式会社）等の市販のキットを用いることができる。
さらに、このようにして調製されたｍＲＮＡ（ポリＡ鎖を有するｍＲＮＡ）を用いてｃＤＮＡを作製する。例えば、オリゴｄＴ鎖又はランダムプライマーをｍＲＮＡにアニールさせた後に、逆転写酵素を作用させることによりｃＤＮＡを作製すればよい。またさらに、当該ｃＤＮＡに、例えば、RNaseH、DNA PolymeraseIを作用させることにより、２本鎖ｃＤＮＡを作製することができる。当該操作には、SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社クロンテックカンパニー）、cDNA Synthesis Kit（タカラバイオ株式会社）、cDNA Synthesis Kit（アマシャムバイオサイエンス株式会社）、ZAP-ｃDNA Synthesis Kit(Stratagene)等の市販のキットを用いることができる。
【００１６】
（２）クローニング
このように調製されたｃＤＮＡから、例えば、配列番号１、３又は５のいずれかで示される塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いるポリメラーゼチェイン反応（以下、ＰＣＲと記す。）や、配列番号１、３又は５のいずれかで示される塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを取得することができる。同様に、例えば、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかで示される塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いるＰＣＲや、配列番号７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかで示される塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法により、サイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを取得することができる。
【００１７】
ＰＣＲを用いる場合には、約２０ｂｐから約４０ｂｐ程度の塩基配列、例えば、配列番号１、３又は５で示される塩基配列の５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域からそれぞれ選択した塩基配列に基いて設計、合成したＤＮＡをプライマーセットとして用いることができる。当該プライマーセットとしては、例えば、配列番号２３で示される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号２４で示される塩基配列からなるＤＮＡとのセットをプライマーセットに挙げることができる。用いられるＰＣＲ反応液は、ｃＤＮＡ２５０ｎｇにキット指定の反応液を添加することにより調製すればよい。ＰＣＲ反応条件としては、使用するプライマーセットによって適宜変更することができるが、例えば、９４℃で２分間保温し、次に約８℃で３分間保温した後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４分間のサイクルを４０サイクル程度繰り返す条件や、９４℃で５秒間次いで７２℃で４分間の保温を１サイクルとしてこれを５から１０サイクル行い、さらに、９４℃で５秒間保温し、次いで７０℃で４分間保温するサイクルを１サイクルとしてこれを２０から４０サイクル程度繰り返す条件をあげることができる。当該操作には、例えば、Takara HeraculaseTM（タカラバイオ株式会社）、Advantage cDNA PCR Kit（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社クロンテックカンパニー）に含まれるＤＮＡポリメラーゼ、TAKARA Ex Taq（タカラバイオ株式会社）、Platinum PCR SuperMix（インビトロジェン株式会社）等の市販のキットを用いることができる。
【００１８】
ハイブリダイゼーション法を用いる場合には、例えば、クローニングとシークエンス：植物バイオテクノロジー実験マニュアル（渡辺、杉浦編集、農村文化社1989年）記載の方法に準じてクローニングを行うことができる。
用いられるプローブは、配列番号１、３又は５で示される塩基配列の部分塩基配列を有するＤＮＡ（約２００塩基〜約５００塩基程度の鎖長）を合成し、当該ＤＮＡを、例えば、Random Primed DNA Labeling Kit（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）、Random Primer DNA Labelling Kit Ver.2（タカラバイオ株式会社）、ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Ditection System（アマシャムバイオサイエンス株式会社）、Megaprime DNA-labelling system（アマシャムバイオサイエンス株式会社）等を用いた公知の方法に準じてラジオアイソトープ標識又は蛍光標識することにより得ることができる。
ハイブリダイゼーション条件としては、例えば、ストリンジェントな条件をあげることができ、具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９Ｍクエン酸三ナトリウム）、５×デンハルト溶液（０．１％(ｗ/ｖ) フィコール４００、０．１％(ｗ/ｖ) ポリビニルピロリドン、０．１％ＢＳＡ）、０．５％(ｗ/ｖ) ＳＤＳ及び１００μg/ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ存在下に、又は１００μｇ/ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）中で、６５℃で保温し、次いで１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウム）及び０．５％ＳＤＳ存在下に、室温で１５分間の保温を２回行い、さらに０．１×ＳＳＣ（０．０１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００１５Ｍクエン酸三ナトリウム）及び０．５％ＳＤＳ存在下に、６８℃で３０分間保温する条件をあげることができる。
シロイヌナズナ由来のサイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、まずシロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーファージ液 (約1000000pfu)を鋳型にして、TAKARA LA taqTM（タカラバイオ株式会社）を用いて、配列番号２５に示されるＤＮＡと配列番号２６に示されるＤＮＡとをプライマーセットとしてＰＣＲを行うことによりプローブとするＤＮＡを増幅し、これを取得すればよい。同様に、シロイヌナズナ由来のサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、まずシロイヌナズナｃＤＮＡライブラリーファージ液 (約1000000pfu)を鋳型にして、TAKARA LA taqTM（タカラバイオ株式会社）を用いてＰＣＲを行うことによりプローブとするＤＮＡを増幅し、これを取得すればよい。用いられるＰＣＲ反応液は、ＤＮＡライブラリー２５０ｎｇにキット指定の反応液を添加することにより調製すればよい。
ＰＣＲ反応条件としては、例えば、９４℃で２分間保温し、次に８℃で３分間保温した後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で５分間のサイクルを４０サイクル繰り返すことにより増幅を行う条件をあげることができる。
次に、増幅・取得されたＤＮＡを鋳型にして、Megaprime DNA-labelling system（アマシャムバイオサイエンス株式会社）を用いて、当該キット指定の反応液を用いることにより32Pでラベルされたプローブを作製することができる。このようにして作製されたプローブを用いて通常の方法に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行い、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９Ｍクエン酸三ナトリウム）、５×デンハルト溶液（０．１％(ｗ/ｖ) フィコール４００、０．１％(ｗ/ｖ) ポリビニルピロリドン、０．１％ＢＳＡ）、０．５％(ｗ/ｖ) ＳＤＳ及び１００μg/ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ存在下に、又は１００μg/ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）中で、６５℃で保温し、次いで１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウム）及び０．５％ＳＤＳ存在下に、室温で１５分間の保温を２回行い、さらに０．１×ＳＳＣ（０．０１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム）及び０．５％ＳＤＳ存在下に、６８℃で３０分間保温することにより当該プローブにハイブリダイズするクローンを得ることができる。
【００１９】
また、サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとは、例えば、それぞれ配列番号１、３又は５のいずれかで示される塩基配列と配列番号７、９、１１、１３、１５、１７又は１９のいずれかで示される塩基配列とに基づいて、例えば、ホスファイト・トリエステル法（Hunkapiller,M.et al., Nature, 310, 105, 1984）等の通常の方法に準じて、核酸の化学合成を行うことにより調製することもできる。
【００２０】
上記のようにして得られたサイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとは、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd edition」(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press、「Current Protocols In Molecular Biology」(1987), John Wiley & Sons,Inc.ISBN0-471-50338-X等に記載される通常の方法に準じてベクターにクローニングすればよい。用いられるベクターとしては、例えば、pBlueScriptIIベクター（Stratagene）、pUC18/19ベクター（タカラバイオ株式会社）、ＴＡクローニングベクター（インビトロジェン株式会社）等をあげることができる。
尚、クローニングされたＤＮＡの塩基配列は、Maxam Gilbert法 (例えば、Maxam,A.M & W.Gilbert, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 560, 1977 等に記載される)やSanger法（例えばSanger,F. & A.R.Coulson, J.Mol.Biol., 94, 441, 1975、Sanger,F, & Nicklen and A.R.Coulson., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 74, 5463, 1977等に記載される）等により確認すればよい。当該操作には、例えば、Termo Seqenase II dye terminator cycle sequencing kit（アマシャムバイオサイエンス株式会社）、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社）等の市販キットを用いることができる。
【００２１】
（３）発現ベクターの構築
サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを発現するベクター及びサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを発現するベクターの構築は、通常の方法（例えば、J.,Sambrook, E.,F.,Frisch, T.,Maniatis著、モレキュラークローニング第2版（Molecular Cloning 2nd edition）、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press）等に記載されている方法）に準じて行えばよい。
例えば、形質転換する宿主細胞において利用可能なベクター、例えば、宿主細胞中で複製可能な遺伝情報を含み、自立的に増殖できるベクターであって、さらに、宿主細胞からの単離・精製が可能であり、検出可能なマーカーを持っていてもよいベクター（具体的には、大腸菌等の細菌を宿主細胞とする場合には、例えば、プラスミドpUC119(タカラバイオ株式会社)やファージミドpBluescriptII(Stratagene）等を使用すればよい。酵母を宿主細胞とする場合には、例えば、プラスミドpACT2(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社クロンテックカンパニー)等を使用すればよい。植物細胞を宿主細胞とする場合には、例えば、プラスミドpBI221 （日本ベクトン・ディッキンソン株式会社クロンテックカンパニー）等を使用すればよい。）に、サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又はサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを組み込むことにより構築すればよい。
【００２２】
サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの上流に、宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合する形で前記ベクターに組み込むことにより、サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させることが可能となる発現ベクターを構築することができる。同様に、サイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの上流に、宿主細胞で機能可能なプロモーターを機能可能な形で結合する形で前記ベクターに組み込むことにより、サイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させることが可能となる発現ベクターを構築することができる。ここで、「機能可能な形で結合させる」とは、宿主細胞においてプロモーターの制御下にサイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド及びサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが発現するように、当該プロモーターとサイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド、及び当該プロモーターとサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとを結合させることを意味する。宿主細胞で機能可能なプロモーターとしては、例えば、宿主細胞が大腸菌である場合には、大腸菌のラクトースオペロンのプロモーター（lacP）、トリプトファンオペロンのプロモーター(trpP)、アルギニンオペロンのプロモーター(argP)、ガラクトースオペロンのプロモーター(galP)、tacプロモーター、T7プロモーター、T3プロモーター、λファージのプロモーター(λ-pL、λ-pR)等をあげることができる。また、宿主細胞が酵母である場合には、ADH1プロモーター（尚、ADH1プロモーターは、例えばADH1プロモーター及び同ターミネーターを保持する酵母発現ベクターpAAH5 〔Washington Research Fundation から入手可能、Ammerer ら、Method in Enzymology、101 part（p.192-201）〕から通常の遺伝子工学的方法により調製することができる。ADH1プロモーターは、Washington Research Fundation の米国特許出願第299,733 に含まれており、米国において、工業的、商業目的で使用する場合は、権利者からの権利許諾を必要とする。）等をあげることができる。宿主細胞が植物細胞である場合には、例えば、ノパリン合成酵素遺伝子（ＮＯＳ）プロモーター、オクトピン合成酵素遺伝子（ＯＣＴ）プロモーター、カリフラワーモザイクウィルス(ＣａＭＶ)由来１９Ｓプロモーター、ＣａＭＶ由来３５Ｓプロモーター等をあげることができる。
【００２３】
また、サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド及びサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを、宿主細胞において機能可能なプロモーターをあらかじめ保有するベクターに組み込む場合には、当該ベクターが保有するプロモーターとサイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとが機能可能な形で結合するように、当該ベクターが保有するプロモーターとサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとが機能可能な形で結合するように、それぞれ当該プロモーターの下流にサイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又はサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを挿入すればよい。例えば、前述の酵母用プラスミドpACT2はADH1プロモーターを有しており、当該プラスミドのADH1プロモーターの下流にサイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又はサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを挿入すれば、それぞれサイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド又はサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを、例えば、CG1945(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社クロンテックカンパニー)等の酵母内で発現させることが可能となる発現ベクターを構築することができる。
【００２４】
（４）形質転換細胞の作製
構築された発現ベクターを宿主細胞に通常の方法に準じて導入することにより、本発明において用いられる形質転換細胞を作製することができる。形質転換細胞を作製するために用いられる宿主細胞としては、例えば、細菌、酵母、植物細胞等を挙げることができる。細菌としては、例えば、大腸菌、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属等に属する細菌を挙げることができる。酵母としては、出芽酵母、分裂酵母を挙げることができ、さらに具体的には、例えば、サッカロマイセス属、スキゾサッカロマイセス属等に属する酵母を挙げることができる。植物細胞としては、例えば、タバコの培養細胞であるＢＹ−２ 株、トウモロコシ（Black Mexican Sweet）の培養細胞であるＢＭＳ 株等を挙げることができる。
発現ベクターを上記の宿主細胞に導入する方法としては、形質転換される宿主細胞に応じた通常の導入方法を適用することができる。例えば、宿主細胞として細菌を用いる場合には、「モレキュラー・クローニング」（J.Sambrookら、コールド・スプリング・ハーバー、１９８９年）等に記載される塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法等の通常の導入方法を用いることにより前記発現ベクターを宿主細胞に導入することができる。宿主細胞として酵母を用いる場合には、例えば、リチウム法を基にしたYeast transformation kit(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社クロンテックカンパニー)等を用いることにより前記発現ベクターを宿主細胞に導入することができる。また、宿主細胞として植物細胞を用いる場合には、例えば、アグロバクテリウム感染方法（特公平2-58917及び特開昭60-70080）、プロトプラストへのエレクトロポレーション方法（特開昭60-251887及び特開平5-68575）、パーティクルガン方法（特表平5-508316及び特開昭63-258525）等の通常の導入方法を用いることにより前記発現ベクターを宿主細胞に導入することができる。
【００２５】
次に、膜貫通領域一部欠失型サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを導入してなる形質転換細胞及びその作製について説明する。
本発明において用いられるサイトカイニン受容体としては、天然型サイトカイニン受容体が有する複数（通常２個〜４個程度）の膜貫通領域のうち、その一部の膜貫通領域が欠失しているものであって、膜貫通領域を少なくとも１個以上有するサイトカイニン受容体（尚、本願中では、膜貫通領域一部欠失型サイトカイニン受容体と記すこともある。）を挙げることもできる。ここで、「天然型サイトカイニン受容体」とは、同種の生物間において最も高い頻度で存在しているアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体を意味しており、一般的に野生型サイトカイニン受容体とも呼ばれているものである。
このような膜貫通領域一部欠失型サイトカイニン受容体としては、より具体的には、天然型サイトカイニン受容体から膜貫通領域の一部分、例えば、膜貫通領域１個〜２個程度、が欠失しており、天然型サイトカイニン受容体が有する膜貫通領域の個数よりも少ない個数の膜貫通領域を保持するようなサイトカイニン受容体等をあげることができる。サイトカイニン受容体の膜貫通領域の構造は、例えば、配列番号２、４又は６に示されるアミノ酸配列について、http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html から利用可能である構造予測ソフトウエア等を用いて推定することができる。
【００２６】
具体的には、配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１９６〜１１７６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体（膜貫通領域２個）、配列番号４で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号５０〜１１７６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体（膜貫通領域３個）、配列番号６で示されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号３２〜１０３６で示されるアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体（膜貫通領域２個）、これらのサイトカイニン受容体が有するアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が付加、欠失及び／若しくは他のアミノ酸によって置換されたアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体、例えばこれらのアミノ酸配列のアミノ末端に１つのメチオニンが付加されたアミノ酸配列からなるサイトカイニン受容体等を挙げることができる。
【００２７】
上記のサイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドは、例えば、天然型サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを、当該受容体の膜貫通領域の一部のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドが欠失し、かつ天然型サイトカイニン受容体が有する膜貫通領域の個数よりも少ない個数の膜貫通領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドが保持されるように、通常の遺伝子工学的手法を用いて切断・結合することにより構築することができる。
当該サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとが導入されてなる形質転換細胞の作製は、前述の、サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとが導入されてなる形質転換細胞の作製の説明において記載される方法に準ずればよい。
【００２８】
次に、キメラ型サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを導入してなる形質転換細胞及びその作製について説明する。
本発明において用いられるサイトカイニン受容体としては、互いにホモな由来であるサイトカイニン受容体の細胞外領域、サイトカイニン受容体の膜貫通領域及びサイトカイニン受容体のヒスチジンキナーゼ領域と、前記３つの領域に対してヘテロな由来であるヒスチジンキナーゼのレシーバー領域とから構成されるキメラ型サイトカイニン受容体（尚、本願中では、キメラ型サイトカイニン受容体と記すこともある。）を挙げることもできる。具体的には例えば、CRE1、AHK2、AHK3のいずれかのサイトカイニン受容体に由来する細胞外領域、膜貫通領域及びヒスチジンキナーゼ領域と、出芽酵母のSln1遺伝子にコードされるヒスチジンキナーゼに由来するレシーバー領域とから構成されるキメラ型サイトカイニン受容体を挙げることができる。
【００２９】
サイトカイニン受容体をはじめとするヒスチジンキナーゼファミリーのタンパク質は、高等植物等の植物、微生物に共通して次のようなアミノ酸配列を有している。即ち、細胞外領域、膜貫通領域（通常２個〜４個程度）、細胞内でヒスチジンキナーゼ活性を有しかつ活性部位となるHis残基を保持するヒスチジンキナーゼ領域及びリン酸基転移の受容部を有しかつ活性部位となるAsp残基を保持するレシーバー領域からなる。上記のキメラ型サイトカイニン受容体では、細胞外領域、膜貫通領域及びヒスチジンキナーゼ領域がいずれも同一のサイトカイニン受容体由来であるが、これに対してレシーバー領域が前者のサイトカイニン受容体とは異なるヒスチジンキナーゼファミリータンパク質に由来することが重要である。
当該キメラ型サイトカイニン受容体のレシーバー領域は、ヒスチジンキナーゼ領域からの信号伝達を受け取り、これを次のステップに伝えるような機能を有していればよく、サイトカイニン受容体の細胞外領域、膜貫通領域及びヒスチジンキナーゼ領域からなる領域に対してホモな由来であるレシーバー領域が本来有する機能を相補又は改良できるものであればよい。
このようなレシーバー領域としては、例えば、微生物由来のヒスチジンキナーゼが有するレシーバー領域（例えば、酵母、大腸菌等の微生物由来のヒスチジンキナーゼが有するレシーバー領域、さらに具体的には、出芽酵母由来のSln1遺伝子にコードされるヒスチジンキナーゼが有するレシーバー領域（例えば、配列番号２１に示すアミノ酸配列を参照）、サルモネラ由来のChey遺伝子にコードされるヒスチジンキナーゼが有するレシーバー領域、大腸菌のハイブリッドセンサーであるRcsC遺伝子にコードされるヒスチジンキナーゼが有するレシーバー領域（Maeda T et al. Nature:369 242-245(1994)、例えば、配列番号２２に示すアミノ酸配列参照）、分裂酵母の細胞周期制御にかかわるPhks遺伝子にコードされるヒスチジンキナーゼが有するレシーバー領域（Shieh,JC et al, Gene Dev. 11, 1008-1022 (1997)）等を用いることができる。
【００３０】
ここで、サイトカイニン受容体のヒスチジンキナーゼ領域とは、例えば、複数の膜貫通領域の中で最もＣ末端側に存在する膜貫通領域のＣ末端側下流に存在する領域であって、Annual Review of Genetics 23:311-336(1989)、Microbiological Reviews 53(4): 450-490(1989)、Science 262:539-544(1993)及びScience 274:982-985(1996)に記載のように一般的なヒスチジンキナーゼに共通の５つの保存モチーフを有することを特徴とする領域であり、例えば、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体（AHK2）では配列番号４の５８７番目のアミノ酸から８４４番目のアミノ酸までを含む領域であり、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体（AHK3）では配列番号６の４５０番目のアミノ酸から７００番目のアミノ酸までを含む領域であり、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するサイトカイニン受容体（CRE1）では配列番号２の４４９番目のアミノ酸から７１４番目のアミノ酸までを含む領域である。
サイトカイニン受容体のレシーバー領域とは、例えば、ヒスチジンキナーゼ領域とサイトカイニン受容体のＣ末端との間に存在する領域であって、Annual Review of Genetics 23:311-336 (1989)、Science 262:539-544 (1993)及びScience 274:982-985 (1996)に記載のように一般的なヒスチジンキナーゼに共通の３つの保存モチーフを有することを特徴とする領域であり、例えば、AHK2では配列番号４の８９１番目のアミノ酸から１１６３番目のアミノ酸までを含む領域であり、AHK3では配列番号６の７４６番目のアミノ酸から１０１８番目のアミノ酸までを含む領域であり、CRE1では配列番号２の７６３番目のアミノ酸から１０３８番目のアミノ酸までを含む領域である。
細胞外領域の少なくともひとつは、最もＣ末端側に存在する膜貫通領域と該膜貫通領域よりもひとつＮ末端側に存在する膜貫通領域との間に存在する領域（サイトカイニン認識に関与する領域）であって、Plant and Cell Physiology 42(2):231-235(2001)に記載のようにAHK2、AHK3、CRE1の３者間で５０％以上保存されている領域であり、AHK2では配列番号４の２５９番目のアミノ酸から５３６番目のアミノ酸までを含む領域であり、AHK3では配列番号６の１２０番目のアミノ酸から３９９番目のアミノ酸までを含む領域であり、CRE1では配列番号２の１３２番目のアミノ酸から３９８番目のアミノ酸までを含む領域である。
【００３１】
キメラ型サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドは、サイトカイニン受容体の細胞外領域、サイトカイニン受容体の膜貫通領域、サイトカイニン受容体のヒスチジンキナーゼ領域及びヒスチジンキナーゼのレシーバー領域の各領域のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ調製し、これらを途中に終止コドンが現れないように、かつフレームがずれないように、必要に応じて適当なリンカーを挿入して、通常の遺伝子工学的手法を用いて連結することによって構築することができる。尚、サイトカイニン受容体の細胞外領域及びサイトカイニン受容体の膜貫通領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドや、サイトカイニン受容体の細胞外領域、サイトカイニン受容体の膜貫通領域及びサイトカイニン受容体のヒスチジンキナーゼ領域のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、一分子のポリヌクレオチドとして調製して、キメラ型サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの構築に用いてもよい。
【００３２】
尚、前記各領域のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、公知の方法を用いてそれぞれ作製することができる。例えば、ＰＣＲによって作製する場合には、まず、増幅しようとする各領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの５'端領域の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（５'側プライマー）及び３'端領域の塩基配列と相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチド（３'側プライマー）をそれぞれ設計し、合成する。当該プライマーは、通常１４塩基程度以上３５塩基程度以下のオリゴヌクレオチドであればよく、さらにこのプライマーの５'端側には、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡどうしの連結又はこれらＤＮＡとベクターとの連結の際に利用しうる制限酵素認識配列を設けておいてもよい。次いで、当該プライマーを用いてかつｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲに使用する通常の反応条件下で増幅反応を行えばよい。サイトカイニン受容体の細胞外領域、サイトカイニン受容体の膜貫通領域若しくはサイトカイニン受容体のヒスチジンキナーゼ領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを調製する場合に使用される鋳型としては、例えば、高等植物等の植物由来のｃＤＮＡのライブラリーをあげることができる。また、ヒスチジンキナーゼのレシーバー領域のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの調製の場合に使用される鋳型としては、例えば、通常の方法で調製された微生物由来のｃＤＮＡライブラリー又は全ＤＮＡがあげられる。
【００３３】
当該キメラ型サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとが導入されてなる形質転換細胞の作製は、前述のサイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとが導入されてなる形質転換細胞の作製の説明において記載される方法に準ずればよい。
【００３４】
次に、サイトカイニンに関わる細胞内信号伝達系について説明する。
本発明において、前述のようにして作製された形質転換細胞内で発現されたサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達の有無又はその量を測定するには、形質転換細胞を作製するために使用される宿主細胞が本来有している細胞内信号伝達系を利用すればよい。また、当該宿主細胞に、Two-Component regulatory systemと呼ばれる細胞内信号伝達機能を担うレギュレーター及び／又はメディエーターをコードするＤＮＡを導入・発現させ、これを細胞内信号伝達系として利用してもよい。利用可能なTwo-Component regulatory systemとしては、例えば、シロイヌナズナが有する5種類の受容体  ETR1、ETR2、ERS1、ERS2及びEIN4（Chang et al. Science 262:539-544(1993)、Hua  et al. Science 269:1712-1714(1995)、Sakai et al. Plant Cell Physiol 39:1232-1239（1998））や浸透圧のセンサー機能を有するAtHK1（Urao  Plant Cell 11:1743-1754（1999））に対応したTwo-Component regulatory system等を挙げることができる。
【００３５】
また、このような形質転換細胞を作製するために使用される宿主細胞として、宿主細胞固有のヒスチジンキナーゼ活性よりも低いヒスチジンキナーゼ活性を有するように改良された宿主細胞を使用することもできる。例えば、天然の宿主細胞から一つ以上のヒスチジンキナーゼを欠失させることにより細胞固有のヒスチジンキナーゼ活性よりも低いヒスチジンキナーゼ活性を有するように改良された宿主細胞があげられる。ヒスチジンキナーゼ活性が低いとは、ヒスチジンキナーゼ領域の活性部位となるHis残基からレシーバー領域の活性部位となるAsp残基へのリン酸基の転移量が少ないことであり、その結果、細胞内信号伝達の量が減少する。宿主細胞固有のヒスチジンキナーゼ活性よりも低いヒスチジンキナーゼ活性を有するように改良された宿主細胞では、例えば、生育量の変化、形態の変化、形状の変化、細胞内での特定物質の生合成量の変化、特定物質の代謝量の変化等が起こることがある。具体的には、Saccharomyces cerevisiae等の出芽酵母由来の浸透圧センサー機能を有するタンパク質をコードするSln1遺伝子を欠損させた株（Maeda T et al. Nature:369 242-245(1994)）等を挙げることができる。この株は、Saccharomyces cerevisiae に存在するヒスチジンキナーゼを欠失しているため、生育量が減少し、本サイトカイニン受容体を導入すると、該受容体からの細胞内信号伝達の有無又はその量を宿主細胞の生育量を指標としてより明確に検出できる。また、大腸菌由来のハイブリッドセンサーであるRcsC遺伝子の欠損株や分裂酵母の細胞周期制御にかかわるPhks遺伝子の欠損株等も好ましい態様の一例としてあげることができる。
【００３６】
次に、サイトカイニンの生合成を制御する活性の分析方法について説明する。
サイトカイニンの生合成を制御する活性の分析方法において、サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとサイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドとが導入されてなる形質転換細胞に被験物質を接触させる具体的な工程の例としては、例えば、当該形質転換細胞を、被験物質を含む培地で培養する方法をあげることができる。当該形質転換細胞の培養は、液体培地中にて培養する液体培養や、前記液体培地に寒天等を加えた固体培地上にて培養する固体培養等いずれの形態であってもよい。前記培地中の被験物質の濃度としては、例えば、約１ｎＭ〜約１ｍＭをあげることができ、好ましくは、約１０ｎＭ〜約１００μＭがあげられる。培養時間としては、例えば、１時間以上３日間程度までをあげることができ、好ましくは、２５時間から２日間程度までがあげられる。
前記工程後に、前記形質転換細胞内で発現されたサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達の有無又はその量を測定し、得られた測定値を指標として、サイトカイニンの生合成を制御する活性を分析する。
【００３７】
具体的には、例えば、PTP2 Tyrosine  phosphatase遺伝子（Ota et al, Proc.N.A.sci.USA, 89, 2355-2359 (1992)）を導入したSln1遺伝子欠損株であるTM182（sln1Δ）株（Maeda T et al. Nature:369 242-245(1994)）を宿主細胞として作製された形質転換細胞（即ち、サイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達によって細胞生育が直接的に制御される機能を有する形質転換細胞）を使用する場合には、炭素源としてグルコースを用いた培地（寒天培地又は液体培地）、例えば、DOHLU+Glu培地での当該形質転換細胞の生育量を指標としてサイトカイニンの生合成を制御する活性を測定すればよい。被験物質を加えないDOHLU+Glu培地（サイトカイニンの生合成を制御する活性を有する物質を含まない培地）を用いた場合の当該形質転換細胞の生育を基準にして、被験物質を加えたDOHLU+Glu培地を用いた場合に当該形質転換細胞の生育を変化させうる被験物質はサイトカイニンの生合成を制御する活性を有すると評価することができる。さらに、PTP2 Tyrosine  phosphatase遺伝子を導入したSln1遺伝子欠損株であるTM182（sln1Δ）株を宿主細胞として、サイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドを導入せず、サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドのみを導入してなる形質転換細胞の生育が、DOLU+Glu培地及びサイトカイニンを加えたDOLU+Glu培地で当該被験物質の有無に関わらず一定である場合には、当該被験物質はサイトカイニン生合成を制御する活性を有し、かつサイトカイニン生合成を制御する活性の他には、サイトカイニン生合成を制御するのとは別の方法でサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達量を増減させる活性あるいはその他の方法で酵母の生育を制御する活性を有さない可能性が高いと評価することができる。尚、被験物質がサイトカイニンの生合成や受容とは何ら関係の無い別の方法で酵母の生育を制御する活性を有するかを検証するための対照として、炭素源としてグルコースの代わりにガラクトースを用いた培地（例えば、DOLU+Gal培地）でのPTP2 Tyrosine  phosphatase遺伝子を導入したSln1遺伝子欠損株であるTM182（sln1Δ）株の生育が、被験物質の有無に関わらず一定であることを調べてもよい。
【００３８】
また、Phks遺伝子欠損株である分裂酵母を宿主細胞として作製された形質転換細胞（即ち、サイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達によって細胞生育が直接的に制御される機能を有する形質転換細胞）を使用する場合には、当該分裂酵母の分裂様式を顕微鏡下に観察すればよい。被験物質を加えない培地を用いた場合の当該形質転換細胞の分裂増殖を基準にして、被験物質を加えた培地を用いた場合に当該形質転換細胞の分裂増殖を変化させうる被験物質はサイトカイニンの生合成を制御する活性を有すると評価することができる。
cps-LacZを導入したRcsC遺伝子欠損大腸菌を宿主細胞として作製された形質転換細胞を使用する場合には、X-Galの発色を寒天培地又は液体培地で観察すればよい（Suzuki et al. Plant Cell Physiol 42:107-113(2001)）。被験物質を加えない培地を用いた場合の当該形質転換細胞の色を基準にして、被験物質を加えた培地を用いた場合に当該形質転換細胞の色を変化させうる被験物質はサイトカイニンの生合成を制御する活性を有すると評価することができる。
【００３９】
さらに、かかるサイトカイニンの生合成を制御する活性の分析方法により、異なる２種以上の物質（例えば、異なる２種以上の物質のうち、少なくとも一つの物質がサイトカイニンの生合成を制御する活性を有さない物質であることが好ましい。）のサイトカイニンの生合成を制御する活性を各々分析し、各被験物質に接触した形質転換細胞について測定されたサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達の有無又はその量を比較することにより得られる差異に基づき、前記物質のサイトカイニンの生合成を制御する活性を評価・検定することもできる。
【００４０】
そして、上記の検定方法により評価されたサイトカイニンの生合成を制御する活性に基づきサイトカイニンの生合成を制御する活性を有する物質を選抜することにより、サイトカイニンの生合成を制御する活性を有する物質を探索することもできる。
【００４１】
上記の探索方法により選抜されたサイトカイニンの生合成を制御する活性を有する物質は、植物生育調節剤の有効成分として利用してもよい。
上記の植物生長調節剤の処理の対象となる植物としては、例えば、花卉・観葉植物等の鑑賞用植物、穀類・野菜・果樹等の作物、繊維植物、樹木、芝等が挙げられる。
当該植物生長調節剤は、通常、固体担体、液体担体等と混合し、必要により界面活性剤、その他の製剤用補助剤等を添加して、乳剤、水和剤、懸濁剤、水溶剤等に製剤化して用いられる。これらの製剤中にサイトカイニンの生合成を制御する活性を有する物質が一般に０．５〜９０重量％、好ましくは１〜８０重量％含有される。
【００４２】
製剤化するに際し用いられる固体担体としては、例えば、粘土類（カオリナイト、珪藻土、合成含水酸化珪素、フバサミクレー、ベントナイト、酸性白土等）、タルク、その他の無機鉱物（セリサイト、石英粉末、硫黄粉末、活性炭、炭酸カルシウム等）化学肥料（硫安、燐安、硝安、塩安、尿素等）等の微粉末や粒状物が挙げられ、液体担体としては、例えば、水、アルコール類（メタノール、エタノール等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン等）
、芳香族炭化水素類（トルエン、キシレン、エチルベンゼン、メチルナフタレン等）、非芳香族炭化水素類（ヘキサン、シクロヘキサン、ケロシン等）、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、ニトリル類（アセトニトリル、イソブチロニトリル等）、エーテル類（ジオキサン、ジイソプロピルエーテル等）、酸アミド類（ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等）、ハロゲン化炭化水素類（ジクロロエタン、トリクロロエチレン等）等が挙げられる。
界面活性剤としては、例えば、アルキル硫酸エステル類、アルキルスルホン酸塩、アルキルアリ−ルスルホン酸塩、アルキルアリールエーテル類及びそのポリオキシエチレン化物、ポリエチレングリコールエーテル類、多価アルコールエステル類、糖アルコール誘導体等が挙げられる。
その他の製剤用補助剤としては、例えば、カゼイン、ゼラチン、多糖類（澱粉、アラビアガム、セルロース誘導体、アルギン酸等）、リグニン誘導体、ベントナイト、合成水溶性高分子（ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸等）等の固着剤や分散剤、ＰＡＰ（酸性リン酸イソプロピル）、ＢＨＴ（２，６−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール）、ＢＨＡ（２−／３−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノール）、植物油、鉱物油、脂肪酸、脂肪酸エステル等の安定剤が挙げられる。
【００４３】
このようにして製剤化されたサイトカイニンの生合成を制御する活性を有する物質は、そのままで、又は、水等で希釈して、植物の茎葉部・枝葉部・花実部への散布処理、果実への浸漬処理、果実への塗布処理に用いる。また、当該植物生長調節剤は、対象植物に対して、１回若しくは複数回処理する。
上記の植物生長調節剤を果実の落下抑制を目的として用いる場合には、例えば、当該植物生長調節剤を水に希釈し、これを収穫前に果樹の果実部及び枝葉部に散布する。
上記の植物生長調節剤を綿のボール落下抑制を目的に使用する場合には、例えば、当該植物生長調節剤を水に希釈し、これを収穫前に綿のボール及び茎葉部に散布する。
上記の植物生長調節剤は、生育中の植物に対して処理してもよいし、収穫後の植物に対して処理してもよい。
【００４４】
上記の植物生長調節剤におけるサイトカイニンの生合成を制御する活性を有する物質の施用量は、製剤形態、施用時期、施用方法、施用場所、対象植物により変わり得るが、１ヘクタール当り通常１〜８０００ｇである。また、当該植物生長調節剤を水に希釈して用いる場合の使用濃度は、製剤形態、施用時期、施用方法、施用場所、対象植物により変わり得るが、一般には上記物質の使用濃度として０．０００１〜１０００ｍＭで、望ましくは０．００１〜１０ｍＭである。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００４６】
まず、サイトカイニンの生合成を制御する活性を有する物質を製剤化して、上記の植物生長調節剤とした例を、以下に製剤例として示す。以下の例において部は重量部を表す。
【００４７】
製剤例１
サイトカイニンの生合成を制御する活性を有する物質５０部、リグニンスルホン酸カルシウム３部、ラウリル硫酸ナトリウム２部及び合成含水酸化珪素４５部をよく粉砕混合して水和剤を得る。
【００４８】
製剤例２
サイトカイニンの生合成を制御する活性を有する物質７０部、リグニンスルホン酸カルシウム３部、ラウリル硫酸ナトリウム２部及び合成含水酸化珪素２５部をよく粉砕混合して水和剤を得る。
【００４９】
製剤例３
サイトカイニンの生合成を制御する活性を有する物質４０部、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート３部、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）３部及び水５２部を混合し、粒度が５ミクロン以下になるまで湿式粉砕して懸濁剤を得る。
【００５０】
実施例１  （サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの調製及び当該ポリヌクレオチドを発現するベクターの調製（その１）：CRE1クローニング用シロイヌナズナｃＤＮＡファージライブラリーの作成）
シロイヌナズナのWassilewskija系統の種子を７０％のエチルアルコールで１分殺菌し、さらに１．５％の次亜塩素酸ナトリウムで１０分間殺菌した。これを滅菌水でよく洗った後、ＧＭ培地（４．３ｇ Murashige and Skoog's basal salt mixture, １％ sucrose, １０ｍｌ of ５％ ＭＥＳ−ＫＯＨ (ｐＨ５．７), ０．３％PhytagelTM (SIGMA)）で２週間培養後、５ｇの植物を得た。これを液体窒素中で凍結させた後、乳鉢により物理的に磨砕した。得られた磨砕物に１０ｍｌの抽出バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、１４ｍＭ βメルカプトエタノール）と１０ｇのフェノールとの混合液を加えた。Ｖｏｌｔｅｘ  ミキサーで攪拌した後、さらに１０ｍｌのクロロホルムを加えて激しく攪拌し、１００００回転で２０分間遠心分離した。回収された水層にＬｉＣｌを最終濃度２Ｍとなるように加え、−８０℃で３時間放置した後、解凍し、１００００回転で２０分間遠心分離し、沈殿を回収した。回収された沈殿を２ｍｌのＴＥ (１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ ８．０) １ｍＭ ＥＤＴＡ)に溶かした後、０．２ｍｌの３Ｍ 酢酸ナトリウム(ｐＨ５．２)と５ｍｌのエタノールとを加えて遠心分離し、ＲＮＡを沈殿として回収した。さらに回収された沈殿（ＲＮＡ）から、OligotexTM dT30super(ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社)を用いてｐｏｌｙＡが結合したＲＮＡを抽出した。
抽出されたｐｏｌｙＡが結合したＲＮＡからのファージｃＤＮＡライブラリーの作製は、ZAP-cDNARSynthesis Kit（Stratagene）を用い、説明書に従って作製した。作製されたファージｃＤＮＡライブラリーの力価は500000PFUであった。
【００５１】
実施例２  （サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの調製及び当該ポリヌクレオチドを発現するベクターの調製（その１）： CRE１のＤＮＡプローブの作製）
実施例１で作製されたファージｃＤＮＡライブラリーのファージ液（約1000000PFU）を鋳型として、TAKARA LA TaqTMキット（タカラバイオ株式会社）を用い、配列番号２５で示されたＤＮＡ及び配列番号２６で示されたＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、ＤＮＡを増幅した。詳細を以下に述べる。
ファージ1000000pfu及びプライマーＤＮＡ各々０．２μＭにキット説明書に従ってｄＮＴＰ等の反応組成物を添加することによりＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲの条件として、９４℃で２分間保温し、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６８℃で５分間のサイクルを４０サイクル繰り返す増幅条件下でＰＣＲを行うことにより、目的のＤＮＡ断片の増幅を行った。次に増幅されたＤＮＡ断片を鋳型にしてMegaprime DNA-labelling system  キット（アマシャムバイオサイエンス株式会社）を用いて32Ｐでラベルしたプローブを調製した。尚、反応液（２５μｌ）は、増幅されたＤＮＡ断片２５ｎｇに32ＰｄＣＴＰ ２．０ ＭＢｑを添加し、キットに指定される反応組成物を添加することにより調製された。ラベル化反応は、３７℃１０分間で行われた。
【００５２】
実施例３  （サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの調製及び当該ポリヌクレオチドを発現するベクターの調製（その１）：CRE1遺伝子を保持するファージｃＤＮＡクローンの取得）
実施例２で調製されたプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションにより目的とするCRE1遺伝子をクローニングした。詳細を以下に述べる。
実施例１で作製されたファージｃＤＮＡライブラリーを用いて、ZAP-cDNARSynthesis Kitの説明書に従い 、プラークを形成させた。形成されたプラークからニトロセルロースフィルター上にＤＮＡを吸着させた後、紫外線処理をすることにより、フィルター上にＤＮＡを固定した。このようにして調製されたフィルターを用いて、６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ、０．０９Ｍクエン酸ナトリウム）、５×デンハルト溶液（０．１％(ｗ/ｖ) フィコール４００、０．１％(ｗ/ｖ) ポリビニルピロリドン、０．１％ＢＳＡ）、０．５％(ｗ/ｖ) ＳＤＳ及び１００μｇ/ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ存在下に、又は１００μｇ/ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）中に６５℃で保温した後、１×ＳＳＣ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）及び０．５％ＳＤＳ存在下に室温で１５分間の保温を２回行い、さらに０．１×ＳＳＣ（０．０１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム）及び０．５％ＳＤＳ存在下に、６８℃で３０分間保温することによりハイブリダイズするファージｃＤＮＡクローンを得た。
【００５３】
実施例４  （サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの調製及び当該ポリヌクレオチドを発現するベクターの調製（その１）：CRE1ｃＤＮＡのクローニング）
実施例３で得られたファージｃＤＮＡクローンのｃＤＮＡを鋳型として、配列番号２３で示されるＤＮＡ及び配列番号２４で示されるＤＮＡをプライマーとしてＰＣＲ反応を行うことにより、配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡを増幅した。詳細を以下に述べる。
ＰＣＲ反応は、Herculase Enhanced DNA Polymerase (東洋紡績株式会社)を用いて、９４℃で１分間保温し、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４分間のサイクルを２５サイクル繰り返す増幅条件下で行われた。尚、ＰＣＲ反応液（５０μｌ）は、ファージｃＤＮＡクローンのｃＤＮＡ５００ｎｇ及びプライマーＤＮＡ各々１００ｎｇにキット説明書に従ってｄＮＴＰ等の反応組成物を添加することにより調製された。
このようにして目的のＤＮＡ断片の増幅を行った。
【００５４】
実施例５  （サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの調製及び当該ポリヌクレオチドを発現するベクターの調製（その１）：CRE1発現ベクターの構築）
酵母発現ベクターであるp415CYC１（Munberg et al. Gene:156 119-122(1995)、ＡＴＣＣライブラリー （Ｎｏ.８７３８２）から入手可能）を制限酵素ＳｍａＩで切断した後、T4 DNA Ligaseを用いて、実施例４で得られた配列番号１で示される塩基配列を有するＤＮＡを発現ベクターp415CYC1のCYC1プロモータ配列に結合することにより、酵母において目的タンパク質が発現されるように組み込んだ。挿入されたＤＮＡの配列が正しい向きであり、ＤＮＡ配列が配列番号１に示された塩基配列であることを自動塩基配列決定装置を用いて確認し、発現プラスミドp415CYC-CRE１を得た。
【００５５】
実施例６  （サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの調製及び当該ポリヌクレオチドを発現するベクターの調製（その２）：AHK3(AAF99730) ｃＤＮＡのクローニング）
シロイヌナズナのWassilewskija系統の種子を７０％のエチルアルコールで１分殺菌し、さらに１．５％の次亜塩素酸ナトリウムで１０分間殺菌した。これを滅菌水でよく洗った後、ＧＭ培地（４．３ｇ Murashige and Skoog's basal salt mixture, １％ sucrose, １０ｍｌ of ５％ ＭＥＳ−ＫＯＨ (ｐＨ５．７), ０．３％PhytagelTM (SIGMA)）で２週間培養することにより、５ｇの植物を得た。これを液体窒素中で凍結させた後、乳鉢により物理的に磨砕した。得られた磨砕物に１０ｍｌの抽出バッファー（２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＳＤＳ、１４ｍＭ βメルカプトエタノール）と１０ｇのフェノールとの混合液を加えた。Ｖｏｌｔｅｘミキサーで攪拌した後、さらに１０ｍｌのクロロホルムを加えて激しく攪拌し、１００００回転で２０分間遠心分離した。回収された水層にＬｉＣｌを最終濃度２Ｍとなるように加え、−８０℃で３時間放置した後、解凍し、１００００回転で２０分間遠心分離し、沈殿を回収した。回収された沈殿を２ｍｌのＴＥ (１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０) １ｍＭ ＥＤＴＡ)に溶かした後、０．２ｍｌの３Ｍ 酢酸ナトリウム(ｐＨ５．２)と５ｍｌのエタノールとを加えて遠心分離し、ＲＮＡを沈殿として回収した。さらに回収された沈殿（ＲＮＡ） ４０ μｇから、３０unitのFPLCpureTM  DnaseI(アマシャムバイオサイエンス株式会社)と６０unitのSuperace(Ambion)を加えることにより、混在するゲノムＤＮＡを除去した後、これをフェノール／クロロホルム処理、及びエタノール処理により精製した。次に、精製されたＲＮＡを鋳型として、かつoligo(dT)12-18 (アマシャムバイオサイエンス株式会社)をプライマーとして用いたＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。ＲＴ−ＰＣＲ反応は、SuperScript II Rnase H- Reverse Transcriptase（インビトロジェン株式会社）を用いて、４２℃で４０分間行われた。尚、ＲＴ−ＰＣＲ反応液は、SuperScript II Rnase H- Reverse Transcriptase の説明書に指定される方法に従い調製された。
このようにして目的とするｃＤＮＡを増幅した。
増幅されたｃＤＮＡを鋳型として、配列番号２７に示されるＤＮＡ及び配列番号２８に示されるＤＮＡをプライマーとして用いたＰＣＲ反応を行い、配列番号５で示される塩基配列を有するＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応は、Herculase Enhanced DNA Polymerase (東洋紡績株式会社)を用いて、９４℃で１分間保温し、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４分間のサイクルを４１サイクル繰り返す増幅条件下で行われた。尚、ＰＣＲ反応液（５０μl）は、鋳型ＤＮＡ５００ｎｇ、プライマーＤＮＡ各々１００ｎｇにキット説明書に従ってｄＮＴＰ等の反応組成物を添加することにより調製された。
このようにして目的のＤＮＡ断片の増幅を行った。
【００５６】
実施例７  （サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの調製及び当該ポリヌクレオチドを発現するベクターの調製（その２）：pHM-1の構築）
p415CYC1（Munberg et al. Gene:156 119-122(1995) 、ＡＴＣＣライブラリー （Ｎｏ．８７３８２）から入手可能）を制限酵素ＳｐｅＩ及びＢａｍＨＩで消化した後、T4 DNA Ligaseを用いて、配列番号２９及び３０で示される合成ＤＮＡ断片（リンカー）を挿入し、さらにp415CYC1に新たに制限酵素サイトＳａｃＩＩ、ＡｐａＩ、ＮｈｅＩを付加することにより、ｐHM-1を構築した。
【００５７】
実施例８  （サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの調製及び当該ポリヌクレオチドを発現するベクターの調製（その２）：AHK3発現ベクターの構築）
実施例７で構築されたpHM-1を、制限酵素ＳａｌＩ及びＳａｃＩＩを用いて切断した後、T4 DNA Ligaseを用いて、配列番号５で示される塩基配列を有するＤＮＡを発現ベクターpHM-1のCYC1プロモーター配列に結合することにより、酵母において目的タンパク質が発現されるように組み込んだ。挿入されたＤＮＡの塩基配列の配列及び向きが正しいことを自動塩基配列決定装置を用いて確認し、発現プラスミドp415CYC-AHK3を得た。
【００５８】
実施例９  （サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの調製及び当該ポリヌクレオチドを発現するベクターの調製（その２）：AHK2(BAB09274)ｃＤＮＡのクローニング）
実施例６で調製されたＤＮＡ断片（全ＲＮＡより逆転写によって調整したｃＤＮＡ）を鋳型として、配列番号３１で示されるＤＮＡ及び配列番号３２で示されるＤＮＡをプライマーとして用いたＰＣＲ反応を行い、配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応は、TAKARA  Pfu Turbo denature（タカラバイオ株式会社）を用いて、９４℃で１分間保温し、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４分間のサイクルを３０サイクル繰り返す増幅条件下で行われた。尚、ＰＣＲ反応液（５０μｌ）は、鋳型ＤＮＡ５００ｎｇ及びプライマーＤＮＡ各々５０ｎｇに、説明書に従ってｄＮＴＰ等の反応組成物を添加することにより調製された。
このようにして目的のＤＮＡ断片の増幅を行った。
【００５９】
実施例１０  （サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの調製及び当該ポリヌクレオチドを発現するベクターの調製（その２）：AHK2(BAB09274)Δ  ｃＤＮＡのクローニング）
実施例６で調製されたＤＮＡ断片（全ＲＮＡより逆転写によって調整したｃＤＮＡ）を鋳型として、配列番号３３で示されるＤＮＡ及び配列番号３４で示されるＤＮＡをプライマーとして用いたＰＣＲ反応を行い、配列番号３で示される塩基配列のうち、塩基番号５８６〜３５３１で示される塩基配列の５’末端にＡＴＧを付加した塩基配列を有するＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応は、TAKARA  Pfu Turbo denature（タカラバイオ株式会社）を用いて、９４℃で１分間保温し、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４分間のサイクルを３０サイクル繰り返す増幅条件下で行われた。尚、ＰＣＲ反応液（５０μｌ）は、鋳型ＤＮＡ５００ｎｇ及びプライマーＤＮＡ各々５０ｎｇに、説明書に従ってｄＮＴＰ等の反応組成物を添加することにより調製された。
このようにして目的のＤＮＡ断片の増幅を行った。
【００６０】
実施例１１  （サイトカイニン受容体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの調製及び当該ポリヌクレオチドを発現するベクターの調製（その２）：AHK2及びAHK2Δ発現ベクターの構築）
実施例７で構築されたpHM-1を制限酵素ＳａｃＩＩ及びＮｈｅＩを用いて切断した後、実施例９及び実施例１０で得られたＤＮＡ断片をT4 DNA Ligaseを用いてpHM-1のCYC1プロモータ配列に結合することにより、酵母において目的タンパク質が発現されるように組み込んだ。挿入されたＤＮＡの塩基配列の配列及び向きが正しいことを自動塩基配列決定装置を用いて確認し、発現プラスミドp415CYC-AHK2及びp415CYC-AHK2Δを得た。
【００６１】
参考例１  （形質転換細胞TM182-CRE1、TM182-AHK2、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK3の作製）
得られた発現プラスミドp415CYC-CRE1（実施例５）、p415CYC-AHK2（実施例１１）、p415CYC-AHK2Δ（実施例１１）及びp415CYC-AHK3（実施例８）をそれぞれ用いて、Sln1遺伝子欠損株であるTM182（sln1Δ）（Maeda T et al. Nature:369 242-245(1994)）を形質転換した。形質転換は、Polyethylene glycol/lithium acetate (PEG/LiAc)-mediated transformation 法を用い、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社クロンテックカンパニーのMatchmaker Two-Hybrid System 3 User Manual 22ページに記載される VII.Library Transformation & Screening Protocolsに従って行った。得られる形質転換細胞では、ロイシンの栄養要求性が消失することを利用し、DOLU+Gal培地で生育する形質転換酵母を選択し、形質転換細胞TM182-CRE1、TM182-AHK2、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK3を作製した。
【００６２】
参考例２  （形質転換細胞TM182-CRE1、TM182-AHK2、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK3のサイトカイニン応答（その１））
参考例１で作製された形質転換細胞TM182-CRE１、TM182-AHK2、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK3の培養液１０μｌ（酵母約８００個体）を、濃度１０μＭのtrans-zeatinを添加したDOLU+Glu寒天培地上にスポットして、３０℃で３０時間培養を行った。培養終了後、当該形質転換細胞の生育状態を観察し、デジタルカメラにて写真を撮影した。
その結果、TM182-CRE1、TM182-AHK2、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK3のいずれの形質転換細胞も、trans-zeatinを添加したDOLU+Glu寒天培地の場合には、trans-zeatinを添加しないDOLU+Glu寒天培地の場合に比べて高い増殖度を示した。このことから、形質転換細胞がサイトカイニンに対して応答し、DOLU+Glu寒天培地での生育が可能であることを示している。また、形質転換細胞が、trans-zeatin存在の有無に関わらずDOLU+Gal培地で生育可能であることも確認した。
【００６３】
参考例３  （形質転換細胞TM182-CRE1、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK2のサイトカイニン応答（その２））
参考例１で得られた形質転換細胞TM182-CRE1、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK2形質転換細胞の培養液を種々の濃度（１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ）のサイトカイニンを含むDOLU+Glu寒天培地上にスポットして、３０℃で３０時間培養を行った。培養終了後、生育状態を観察し、デジタルカメラにて写真を撮影した。表１に、各形質転換細胞が生育可能であったtrans-zeatin及びcis-zeatin  の最低濃度を示した。
【００６４】
【表１】
0004797359.tif 000002
【００６５】
参考例４  （サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を有する物質の探索方法（その１））
参考例１で得られた形質転換細胞TM182-AHK2、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK3をDOLU+Gal培地２００ｍｌに植菌し、３０℃で３６時間前培養を行い、この培養液をDOLU＋Glu培地でOD600＝0.100に希釈し、さらにそれをDOLU＋Glu培地で２００分の１に希釈したものを、希釈前培養液とした。
９６穴プレートの各ウエルに、濃度１０ｍＭに調製した被験物質（Abscisic acidまたは6-Benzyl aminopurine）のジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯと記す。）溶液をDOLU+Glu培地にて１００倍に希釈した溶液（１００μＭ）を２０μｌ添加したアッセイプレートを準備した。同時に、ＤＭＳＯ  ２０μｌをDOLU+Glu培地にて１００倍に希釈した溶液が２０μｌ入れられたアッセイプレートを対照区として準備した。
上記の希釈前培養液を２００μｌずつ両アッセイプレートの各ウエルに添加し、３０℃で２４時間培養した後、プレートリーダーを用いて各ウエルの濁度を測定した。当該濁度と対照区における濁度とを比較することにより、被験物質のサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性を検定した。表２に、各被験物質を添加した各形質転換細胞培養液のOD620の吸光度を示した。6-Benzyl aminopurineを添加した試験区における濁度が対照区における濁度に比べて高い値を示したことから、6-Benzyl aminopurineを、サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性物質として選抜した。
【００６６】
【表２】
0004797359.tif 000003
【００６７】
参考例５  （サイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性物質の探索方法（その２））
参考例１で得られた形質転換細胞TM182-AHK2、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK3 をDOLU+Gal培地２００ｍｌに植菌し、３０℃で３０時間前培養を行う。実施例１０で選抜されたサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性物質の供試濃度が１０ｎＭから１００μＭとなるように種々変化させて添加したDOLU+Glu寒天培地に、前培養した形質転換細胞（TM182-AHK2、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK3）１０μｌをスポットして３０℃で３０時間培養する。培養終了後、形質転換細胞（TM182-AHK2、TM182-AHK2Δ及びTM182-AHK3）の増殖状態が観察される最低供試濃度から当該供試物質のサイトカイニン受容体に対するアゴニスト活性の強度を検定・確認する。
【００６８】
実施例１２  （サイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの調製及び当該ポリヌクレオチドを発現するベクターの調製：AtIPT4 ｃＤＮＡのクローニング）
シロイヌナズナのWassilewskija系統の種子を７０％のエチルアルコールで１分殺菌し、さらに１．５％の次亜塩素酸ナトリウムで１０分間殺菌した。これを滅菌水でよく洗った後、GM培地（４．３ｇ Murashige and Skoog's basal salt mixture, １％ sucrose, １０ｍｌ of ５％ ＭＥＳ−ＫＯＨ (ｐＨ５．７), ０．３％PhytagelTM (SIGMA)）で２０日間培養することにより、５ｇの植物を得た。これを液体窒素中で凍結させた後、１．５ｍｌ容チューブ内で物理的に磨砕した。得られた磨砕物に１００μｌの２×ＣＴＡＢ (２％ (ｗ/ｖ) Cetyl trimethyl ammonium bromide( 以下、ＣＴＡＢと記す。)、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、１．４Ｍ ＮａＣｌ、１％ (ｗ/ｖ) ＰＶＰ)を加えた。６０℃で３０分間放置した後、１００μｌのクロロホルム／イソアミルアルコール溶液（クロロホルム:イソアミルアルコール＝２４:１）を加え、Ｖｏｌｔｅｘミキサーで攪拌した。その後、２０℃、１５０００回転で２０分間遠心分離した。遠心分離後の上層７５μｌを、あらかじめイソアミルアルコール７５μｌが入れられた０．６ｍｌ容チューブに移し、２５℃で２０分間放置した。その後２０℃、１５０００回転で２０分間遠心分離することにより、沈殿を回収した。回収された沈殿に３００μｌの７０％エタノールを加え、Ｖｏｌｔｅｘミキサーで攪拌した。その後、４℃、１５０００回転で１５分間遠心分離することにより、沈殿を回収した。回収された沈殿を３７℃で５分間放置した後、Ｔ１０Ｅ０．２（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ８．０)）３０μｌを加えて沈殿を溶解させてゲノムＤＮＡ溶液を得た。
次に、得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３５で示されるＤＮＡ及び配列番号３６で示されるＤＮＡをプライマーとして用いたＰＣＲ反応を行うことにより、配列番号１１で示される塩基配列を有するＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応は、Herculase Enhanced DNA Polymerase (東洋紡績株式会社)を用いて、９４℃で１分間保温し、９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で６０秒間のサイクルを４０サイクル繰り返し、最後に７２℃で１分間保温する増幅条件下で行われた。尚、ＰＣＲ反応液（５０μｌ）は、鋳型ＤＮＡ１００ｎｇ、プライマーＤＮＡ各々１００ｎｇに、キット説明書に従ってｄＮＴＰ等の反応組成物を添加することにより調製された。
このようにして目的のＤＮＡ断片の増幅を行った。
【００６９】
実施例１３  （サイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの調製及び当該ポリヌクレオチドを発現するベクターの調製：AtIPT4発現ベクターの構築）
酵母発現ベクターであるp423ADH（Munberg et al. Gene:156 119-122(1995)、ＡＴＣＣライブラリー （Ｎｏ．８７３７１）から入手可能）を制限酵素ＳｍａＩで切断した後、T4 DNA Ligaseを用いて、実施例１２で得られた配列番号１１で示される塩基配列を有するＤＮＡを発現ベクターp423ADHのADHプロモータ配列に結合することにより、酵母において目的タンパク質が発現されるように組み込んだ。挿入されたＤＮＡの配列が正しい向きであり、ＤＮＡ配列が配列番号１１に示された塩基配列であることを自動塩基配列決定装置を用いて確認し、発現プラスミドp423ADH-IPT4を得た。
同様に、酵母発現ベクターであるp423CYC1（Munberg et al. Gene:156 119-122(1995)、ＡＴＣＣライブラリー （Ｎｏ．８７３７９）から入手可能）を制限酵素ＳｍａＩで切断した後、T4 DNA Ligaseを用いて、実施例１２で得られた配列番号１１で示される塩基配列を有するＤＮＡを発現ベクターp423CYC1のCYC1プロモータ配列に結合することにより、酵母において目的タンパク質が発現されるように組み込んだ。挿入されたＤＮＡの配列が正しい向きであり、ＤＮＡ配列が配列番号１１に示された塩基配列であることを自動塩基配列決定装置を用いて確認し、発現プラスミドp423CYC1-IPT4を得た。
【００７０】
実施例１４  （サイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの調製及び当該ポリヌクレオチドを発現するベクターの調製：AtIPT5 ｃＤＮＡのクローニング）
実施例１２と同様にシロイヌナズナのWassilewskija系統の植物体から得られたゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３７で示されるＤＮＡ及び配列番号３８で示されるＤＮＡをプライマーとして用いたＰＣＲ反応を行うことにより、配列番号１３で示される塩基配列を有するＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応は、Herculase Enhanced DNA Polymerase (東洋紡績株式会社)を用いて、９４℃で１分間保温し、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で９０秒間のサイクルを３５サイクル繰り返し、最後に７２℃で１分間保温する増幅条件下で行われた。尚、ＰＣＲ反応液（５０μｌ）は、鋳型ＤＮＡ１００ｎｇ及びプライマーＤＮＡ各々１００ｎｇに、キット説明書に従ってｄＮＴＰ等の反応組成物を添加することにより調製された。
このようにして目的のＤＮＡ断片の増幅を行った。
【００７１】
実施例１５  （サイトカイニン生合成酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドの調製及び当該ポリヌクレオチドを発現するベクターの調製：AtIPT5発現ベクターの構築）
酵母発現ベクターであるp423ADH（Munberg et al. Gene:156 119-122(1995)、ＡＴＣＣライブラリー （Ｎｏ．８７３７１）から入手可能）を制限酵素ＳｍａＩで切断した後、T4 DNA Ligaseを用いて、実施例１４で得られた配列番号１３で示される塩基配列を有するＤＮＡを発現ベクターp423ADHのADHプロモータ配列に結合することにより、酵母において目的タンパク質が発現されるように組み込んだ。挿入されたＤＮＡの配列が正しい向きであり、ＤＮＡ配列が配列番号１３に示された塩基配列であることを自動塩基配列決定装置を用いて確認し、発現プラスミドp423ADH-IPT5を得た。
同様に、酵母発現ベクターであるp423CYC1（Munberg et al. Gene:156 119-122(1995)、ＡＴＣＣライブラリー （Ｎｏ．８７３７９）から入手可能）を制限酵素ＳｍａＩで切断した後、T4 DNA Ligaseを用いて、実施例１４で得られた配列番号１３で示される塩基配列を有するＤＮＡを発現ベクターp423CYC1のCYC1プロモータ配列に結合することにより、酵母において目的タンパク質が発現されるように組み込んだ。挿入されたＤＮＡの配列が正しい向きであり、ＤＮＡ配列が配列番号１３に示された塩基配列であることを自動塩基配列決定装置を用いて確認し、発現プラスミドp423CYC1-IPT5を得た。
【００７２】
実施例１６  （本発明形質転換細胞の作製：形質転換細胞TM182-CYC1-CYC1IPT4、TM182- CYC1-ADHIPT4、TM182- CYC1-CYC1IPT5、TM182- CYC1-ADHIPT5、TM182-CRE1-CYC1IPT4、TM182-CRE1-ADHIPT4、TM182-CRE1-CYC1IPT5、TM182-CRE1-ADHIPT5、TM182-AHK2-CYC1IPT4、TM182-AHK2-ADHIPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT5及びTM182-AHK2-ADHIPT5の作製）
市販のp415CYC1、実施例５で得られたp415CYC-CRE1、実施例１１で得られたp415CYC-AHK2の３種類の発現プラスミドのいずれか１つと、実施例１３で得られたp423ADH-IPT4、p423CYC1-IPT4、実施例１５で得られたp423ADH-IPT5、p423CYC1-IPT5の４種類の発現プラスミドのいずれか１つとの計２つの発現プラスミドを同時に用いて、Sln1遺伝子欠損株であるTM182（sln1Δ）（Maeda T et al. Nature:369 242-245(1994)）を形質転換した。形質転換は、Polyethylene glycol/lithium acetate (PEG/LiAc)-mediated transformation 法を用い、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社クロンテックカンパニーのMatchmaker Two-Hybrid System 3 User Manual 22ページに記載される VII.Library Transformation & Screening Protocolsに従って行った。得られる形質転換細胞では、ロイシンの栄養要求性とヒスチジンの栄養要求性が消失することを利用し、DOHLU+Gal培地で生育する形質転換酵母を選択し、形質転換細胞TM182-CYC1-CYC1IPT4、TM182- CYC1-ADHIPT4、TM182- CYC1-CYC1IPT5、TM182- CYC1-ADHIPT5、TM182-CRE1-CYC1IPT4、TM182-CRE1-ADHIPT4、TM182-CRE1-CYC1IPT5、TM182-CRE1-ADHIPT5、TM182-AHK2-CYC1IPT4、TM182-AHK2-ADHIPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT5及びTM182-AHK2-ADHIPT5を作製した。
【００７３】
実施例１７  （本発明形質転換細胞の作製：形質転換細胞TM182-AHK2Δ-CYC1IPT4、TM182- AHK2Δ-ADHIPT4、TM182- AHK2Δ-CYC1IPT5、TM182- AHK2Δ-ADHIPT5、TM182-AHK3-CYC1IPT4、TM182-AHK3-ADHIPT4、TM182-AHK3-CYC1IPT5及びTM182-AHK3-ADHIPT5の作製）
実施例１１で得られたp415CYC-AHK2Δ及び実施例８で得られたp415CYC-AHK3の２種類の発現プラスミドのいずれか１つと、実施例１３で得られたp423ADH-IPT4、p423CYC1-IPT4、実施例１５で得られたp423ADH-IPT5及びp423CYC1-IPT5の４種類の発現プラスミドのいずれか１つとの計２つの発現プラスミドを同時に用いて、Sln1遺伝子欠損株であるTM182（sln1Δ）（Maeda T et al. Nature:369 242-245(1994)）を形質転換する。形質転換は、Polyethylene glycol/lithium acetate (PEG/LiAc)-mediated transformation 法を用い、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社クロンテックカンパニーのMatchmaker Two-Hybrid System 3 User Manual 22ページに記載される VII.Library Transformation & Screening Protocolsに従って行う。得られる形質転換細胞では、ロイシンの栄養要求性及びヒスチジンの栄養要求性が消失することを利用し、DOHLU+Gal培地で生育する形質転換酵母を選択することにより、形質転換細胞TM182-AHK2Δ-CYC1IPT4、TM182- AHK2Δ-ADHIPT4、TM182- AHK2Δ-CYC1IPT5、TM182- AHK2Δ-ADHIPT5、TM182-AHK3-CYC1IPT4、TM182-AHK3-ADHIPT4、TM182-AHK3-CYC1IPT5及びTM182-AHK3-ADHIPT5を作製する。
【００７４】
実施例１８  （本発明形質転換細胞の利用：形質転換細胞TM182-CYC1-CYC1IPT4、TM182- CYC1-ADHIPT4、TM182- CYC1-CYC1IPT5、TM182- CYC1-ADHIPT5、TM182-CRE1-CYC1IPT4、TM182-CRE1-ADHIPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT4、TM182-AHK2-ADHIPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT5及びTM182-AHK2-ADHIPT5の培養）
実施例１６で作製された形質転換細胞TM182-CYC1-CYC1IPT4、TM182-CYC1-ADHIPT4、TM182-CYC1-CYC1IPT5、TM182-CYC1-ADHIPT5、TM182-CRE1-CYC1IPT4、TM182-CRE1-ADHIPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT4、TM182-AHK2-ADHIPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT5及びTM182-AHK2-ADHIPT5の培養液１０μｌ（酵母約８００個体）を、DOHLU+Glu寒天培地上にスポットして、３０℃で３０時間培養を行った。培養終了後、当該形質転換細胞の生育状態を観察し、デジタルカメラにて写真を撮影した。
その結果、TM182-CYC1-CYC1IPT4、TM182-CYC1-ADHIPT4、TM182-CYC1-CYC1IPT5及びTM182-CYC1-ADHIPT5は生育しなかったものの、TM182-CRE1-CYC1IPT4、TM182-CRE1-ADHIPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT4、TM182-AHK2-ADHIPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT5及びTM182-AHK2-ADHIPT5は生育した。また、濃度１０μＭのtrans-zeatinを添加したDOHLU+Glu寒天培地の場合には、TM182-CYC1-CYC1IPT4、TM182-CYC1-ADHIPT4、TM182-CYC1-CYC1IPT5及びTM182-CYC1-ADHIPT5は生育しなかったものの、TM182-CRE1-CYC1IPT4、TM182-CRE1-ADHIPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT4、TM182-AHK2-ADHIPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT5及びTM182-AHK2-ADHIPT5は生育した。このことは、形質転換細胞TM182-CRE1-CYC1IPT4、TM182-CRE1-ADHIPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT4、TM182-AHK2-ADHIPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT5及びTM182-AHK2-ADHIPT5が自ら合成するサイトカイニンに対して応答し、DOHLU+Glu寒天培地での生育が可能であることを示している。尚、これら１０種類全ての形質転換細胞が、trans-zeatin存在の有無に関わらずDOHLU+Gal培地で生育可能であることも確認した。
【００７５】
実施例１９  （本発明形質転換細胞の利用：形質転換細胞TM182-CYC1-CYC1IPT4、TM182-CYC1-ADHIPT4、TM182-CYC1-CYC1IPT5、TM182-CYC1-ADHIPT5、TM182-CRE1-CYC1IPT4、TM182-CRE1-ADHIPT5の培養）
実施例１６で得られた形質転換細胞TM182-CYC1-CYC1IPT4、TM182-CYC1-ADHIPT4、TM182-CYC1-CYC1IPT5、TM182-CYC1-ADHIPT5、TM182-CRE1-CYC1IPT4及びTM182-CRE1-ADHIPT5をDOHLU+Gal培地２００ｍｌに植菌し、３０℃で３６時間前培養を行い、この培養液をDOHLU＋Glu培地でOD600＝0.200に希釈し、さらにそれをDOHLU＋Glu培地で２００分の１に希釈したものを、希釈前培養液とした。
９６穴プレートの各ウエルに、濃度２００ｐｐｍに調製した被験物質（Abscisic acidまたは6-Benzyl aminopurine）のＤＭＳＯ溶液を１μｌ添加したアッセイプレートを準備した。同時に、ＤＭＳＯを１μｌ入れたアッセイプレートを対照区として準備した。
上記の希釈前培養液を１００μｌずつ両アッセイプレートの各ウエルに添加し、３０℃で２４時間培養した後、プレートリーダーを用いて各ウエルの濁度を測定した。表３に、各被験物質を添加した各形質転換細胞培養液のOD600の吸光度を示した。TM182-CYC1-CYC1IPT4、TM182-CYC1-ADHIPT4、TM182-CYC1-CYC1IPT5及びTM182-CYC1-ADHIPT5はいずれの被験物質においても生育しなかったものの、TM182-CRE1-CYC1IPT4及びTM182-CRE1-ADHIPT5はいずれの被験物質においても生育した。また、TM182-CRE1-CYC1IPT4及びTM182-CRE1-ADHIPT5は、ＤＭＳＯのみを添加した培地よりも6-Benzyl aminopurineを添加した培地での生育が早かった。これらのことは、形質転換細胞TM182-CRE1-CYC1IPT4及びTM182-CRE1-ADHIPT5が自ら合成するサイトカイニンに対して応答しDOHLU+Glu培地での生育が可能であること及び形質転換細胞TM182-CRE1-CYC1IPT4及びTM182-CRE1-ADHIPT5の生育速度がサイトカイニンの量によって増減することを示している。
【００７６】
【表３】
0004797359.tif 000004
【００７７】
実施例２０  （本発明形質転換細胞の利用：形質転換細胞TM182-CYC1-CYC1IPT4、TM182-CYC1-ADHIPT4、TM182-CYC1-CYC1IPT5、TM182-CYC1-ADHIPT5、TM182-CRE1-ADHIPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT5、TM182-AHK2-ADHIPT5の培養）
実施例１６で得られた形質転換細胞TM182-CYC1-CYC1IPT4、TM182-CYC1-ADHIPT4、TM182-CYC1-CYC1IPT5、TM182-CYC1-ADHIPT5、TM182-CRE1-ADHIPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT5及びTM182-AHK2-ADHIPT5をDOHLU+Gal培地２００ｍｌに植菌し、３０℃で３６時間前培養を行い、この培養液をDOHLU＋Glu培地でOD600＝0.200に希釈し、さらにそれをDOHLU＋Glu培地で２００分の１に希釈したものを、希釈前培養液とした。
９６穴プレートの各ウエルに、濃度２００ｐｐｍに調製した被験物質（Abscisic acidまたは6-Benzyl aminopurine）のＤＭＳＯ溶液を１μｌ添加したアッセイプレートを準備した。同時に、ＤＭＳＯを１μｌ入れたアッセイプレートを対照区として準備した。
上記の希釈前培養液を１００μｌずつ両アッセイプレートの各ウエルに添加し、３０℃で２４時間培養した後、プレートリーダーを用いて各ウエルの濁度を測定した。表４に、各被験物質を添加した各形質転換細胞培養液のOD600の吸光度を示した。TM182-CYC1-CYC1IPT4、TM182-CYC1-ADHIPT4、TM182-CYC1-CYC1IPT5及びTM182-CYC1-ADHIPT5はいずれの被験物質においても生育しなかったものの、TM182-CRE1-ADHIPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT5及びTM182-AHK2-ADHIPT5はいずれの被験物質においても生育した。また、TM182-CRE1-ADHIPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT5及びTM182-AHK2-ADHIPT5は、ＤＭＳＯのみを添加した培地よりも6-Benzyl aminopurineを添加した培地での生育が早かった。これらのことは、形質転換細胞TM182-CRE1-ADHIPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT5及びTM182-AHK2-ADHIPT5が自ら合成するサイトカイニンに対して応答しDOHLU+Glu培地での生育が可能であること及び形質転換細胞TM182-CRE1-ADHIPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT4、TM182-AHK2-CYC1IPT5及びTM182-AHK2-ADHIPT5の生育速度がサイトカイニンの量によって増減することを示している。
【００７８】
【表４】
0004797359.tif 000005
【００７９】
実施例２１  （本発明形質転換細胞の利用：サイトカイニン生合成を制御する活性を有する物質の探索方法）
実施例１６で得られた形質転換細胞TM182-CRE1-ADHIPT5をDOHLU+Gal培地２００ｍｌに植菌し、３０℃で３６時間前培養を行い、この培養液をDOHLU＋Glu培地でOD600＝0.200に希釈し、さらにそれをDOHLU＋Glu培地で２００分の１に希釈したものを、希釈前培養液とする。また、PTP2 Tyrosine  phosphatase遺伝子を導入したSln1遺伝子欠損株であるTM182（sln1Δ）をDOLU+Gal培地２００ｍｌに植菌し、３０℃で３６時間前培養を行い、この培養液をDOLU＋Gal培地でOD600＝0.100に希釈し、さらにそれをDOLU＋Gal培地で２００分の１に希釈したもの、及び、参考例１で得られた形質転換細胞TM182-CRE1をDOLU+Gal培地２００ｍｌに植菌し、３０℃で３６時間前培養を行い、この培養液をDOLU＋Glu培地でOD600＝0.100に希釈し、さらにそれをDOLU＋Glu培地で２００分の１に希釈したものを、希釈前培養液とする。形質転換細胞TM182-CRE1の希釈前培養液は、最終濃度２ｐｐｍの６−ベンジルアミノプリン（サイトカイニン）を加えた希釈前培養液も同時に調製する。
９６穴プレートの各ウエルに、濃度２００ｐｐｍに調製した被験物質のＤＭＳＯ溶液を１μｌ添加したアッセイプレートを準備する。同時に、ＤＭＳＯを１μｌ入れたアッセイプレートを対照区として準備する。
上記の希釈前培養液を１００μｌずつ両アッセイプレートの各ウエルに添加し、３０℃で２４時間培養した後、プレートリーダーを用いて各ウエルの濁度を測定する。形質転換細胞TM182-CRE1-ADHIPT5の生育速度がＤＭＳＯのみを添加した対照区と比較して増加又は減少したウェルに添加されていた被験物質を、サイトカイニン生合成を制御する活性を有する物質として選抜することが出来る。このとき、形質転換細胞TM182-CRE1-ADHIPT5の生育速度がＤＭＳＯのみを添加した対照区と比較して増加又は減少したウェルに添加されていた被験物質が添加されたウェルにおけるTM182（sln1Δ）の生育速度がＤＭＳＯのみを添加した対照区と比較して増減の無い場合には、当該被験物質をサイトカイニン生合成を制御する活性及び／又はサイトカイニン生合成を制御するのとは別の方法でサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達量を増減させる活性を有し、かつサイトカイニン生合成を制御する活性及び／又はサイトカイニン生合成を制御するのとは別の方法でサイトカイニン受容体からの細胞内信号伝達量を増減させる活性の他には酵母の生育を制御する活性を有さない可能性が高い物質として選抜することが出来る。さらに、形質転換細胞TM182-CRE1-ADHIPT5の生育速度がＤＭＳＯのみを添加した対照区と比較して増加又は減少したウェルに添加されていた被験物質が添加されたウェルにおける形質転換細胞TM182-CRE1の生育速度がＤＭＳＯのみを添加した対照区と比較して増減の無い場合には、当該被験物質をサイトカイニン生合成を制御する活性を有し、かつサイトカイニン生合成を制御する活性の他には酵母の生育を制御する活性を有さない可能性が高い物質として選抜することが出来る。
【００８０】
以下に、本発明において使用される培地の組成を記す。
（ａ）DOLU+Glu培地
【００８１】
【表５】
0004797359.tif 000006
【００８２】
（ｂ）DOLU+Gal培地
【００８３】
【表６】
0004797359.tif 000007
【００８４】
（ｘ）Drop-out mix:
【００８５】
【表７】
0004797359.tif 000008
【００８６】
（ｃ）DOLU+Glu寒天培地
培地（ａ）に２％（Ｗ／Ｖ）の寒天が添加された固体培地。
【００８７】
（ｄ）DOLU+Gal寒天培地
培地（ｂ）に２％（Ｗ／Ｖ）の寒天が添加された固体培地。
【００８８】
（ｅ）DOHLU+Glu培地
【００８９】
【表８】
0004797359.tif 000009
【００９０】
（ｆ）DOHLU+Gal培地
【００９１】
【表９】
0004797359.tif 000010
【００９２】
（ｙ）Drop-out mix:
【００９３】
【表１０】
0004797359.tif 000011
（ｇ）DOHLU+Glu寒天培地
培地（ｅ）に２％（Ｗ／Ｖ）の寒天が添加された固体培地。
（ｈ）DOHLU+Gal寒天培地
培地（ｆ）に２％（Ｗ／Ｖ）の寒天が添加された固体培地。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明により、サイトカイニン受容体及びサイトカイニン生合成酵素の共発現形質転換細胞が提供可能となり、当該形質転換細胞を利用することでサイトカイニンの生合成を制御する活性の分析方法が提供可能となり、さらに当該分析方法を利用することでサイトカイニンの生合成を制御する活性を有する物質を少量のサンプルでかつ迅速に見出す方法等が提供可能となる。
【配列表フリーテキスト】
【００９５】
配列番号２３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２９
リンカーとして設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号３０
リンカーとして設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号３１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３３
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３４
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３５
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３６
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３７
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号３８
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
【配列表】
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