(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）、
（Ｉ）Ｎ−（Ｓ）m−（Ｔh）n
（ＩＩ）（Ｔh）n−（Ｓ）m−Ｃ
に表されるキメラペプチド、あるいは式（Ｉ）のペプチドの混合物、式（ＩＩ）のペプチドの混合物、または式（Ｉ）および式（ＩＩ）のペプチドの混合物であるキメラペプチドであって：
Ｎが、βアミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）に由来する天然に存在する内部アミロイドβペプチド切断産物の遊離Ｎ末端の最初の４アミノ酸残基であり；
Ｃが、βアミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）に由来する前記天然に存在する内部アミロイドβペプチド切断産物の遊離Ｃ末端の最後の４アミノ酸残基であり；
ＴhがＴヘルパー細胞エピトープであり；
Ｓがスペーサーアミノ酸残基であり；
ｍが０、１、２、３、４、または５であり；そして
ｎが１、２、３、または４である前記キメラペプチド。
【請求項２】
ｍが１、２、３、４、または５である、請求項１に記載のキメラペプチド。
【請求項３】
前記内部アミロイドβペプチド切断産物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、３、４、５、６、および７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１または２記載のキメラペプチド。
【請求項４】
Ｔhが、雑多なＴヘルパー細胞エピトープである、請求項１から３のいずれか一項に記載のキメラペプチド。
【請求項５】
前記の雑多なＴヘルパー細胞エピトープが、破傷風毒素、百日咳毒素、ジフテリア毒素、麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）Ｆタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）表面抗原、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍｉｔｉｓ）主要外膜タンパク質、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）スポロゾイト周囲タンパク質（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）トリオースリン酸イソメラーゼ、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＴｒａＴ由来である、請求項４記載のキメラペプチド。
【請求項６】
前記の雑多なＴヘルパー細胞エピトープが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８から２７からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４または５記載のキメラペプチド。
【請求項７】
Ｓがグリシンである、請求項１から６のいずれか一項に記載のキメラペプチド。
【請求項８】
免疫有効量の請求項１から７のいずれか一項に記載のキメラペプチド、および薬学的に許容しうるキャリアー、賦形剤、希釈剤、または補助剤を含む、免疫組成物。
【請求項９】
前記の薬学的に許容しうる補助剤がアジュバントである、請求項８記載の免疫組成物。
【請求項１０】
前記アジュバントがミョウバンである、請求項９記載の免疫組成物。
【請求項１１】
βアミロイド前駆体タンパク質の切断に由来するアミロイドβペプチドの遊離Ｎ末端または遊離Ｃ末端に対して哺乳動物を免疫化するための免疫組成物を調製するための、請求項１から７のいずれか一項に記載のキメラペプチドの使用。
【請求項１２】
哺乳動物がヒトである、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
請求項１から７のいずれか一項に記載のキメラペプチドに特異的な抗体の抗原結合部分を含む分子。
【請求項１４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３記載の分子。
【請求項１５】
哺乳動物の受動免疫のための免疫組成物を調製するための、請求項１３または１４に記載の分子の使用。
【請求項１６】
哺乳動物がヒトである、請求項１５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願に対するクロス・リファレンス
本出願は、その全内容が本明細書に援用される、米国仮出願第６０／１６９，６８７号、１９９９年１２月８日出願から優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、異なる供給源由来のＴ細胞エピトープに連結したＢ細胞エピトープを含むキメラペプチド免疫原、該キメラペプチドを含む免疫組成物、および該キメラペプチドを用いた免疫法に関する。
【０００３】
背景技術の説明
アルツハイマー病（ＡＤ）の主な組織病理学的特徴は、小脳扁桃の実質、海馬および新皮質の神経突起斑および散在斑内のアミロイド沈着の存在である（ＧｌｅｎｎｅｒおよびＷｏｎｇ、１９８４；  Ｍａｓｔｅｒｓら、１９８５；  ＳｉｓｏｄｉａおよびＰｒｉｃｅ、１９９５）。アミロイドは、共通のβひだ構造を有する原線維凝集体を記述する、一般的な用語である。これらの凝集体は、コンゴーレッドおよび偏光の存在下で、複屈折特性を示す（ＧｌｅｎｎｅｒおよびＷｏｎｇ、１９８４）。散在斑は、反応性および変性過程と強く相関するようである神経突起斑と対照的に、比較的良性であると考えられる（Ｄｉｃｋｓｏｎら、１９８８；  Ｔａｇｌｉａｖｉｎｉら、１９８８；  Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、１９８９；  Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、１９９２）。神経突起斑の主な構成要素は４２アミノ酸残基のアミロイド−β（Ａβ）ペプチド（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９３；  Ｒｏｈｅｒら、１９９３）であり、これは、はるかに大きなβ−アミロイド前駆体タンパク質、βＡＰＰ（またはＡＰＰ）に由来する（Ｋａｎｇら、１９８７）。βＡＰＰからタンパク質分解的に切断される、アミロイド−βペプチドの２つの主なＣ末端変異体、Ｖａｌ４０で終わるＡβ１−４０、およびＡｌａ４２またはＴｈｒ４３で終わるＡβ１−４２（４３）が、アミロイド沈着に見られた（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９３；  Ｒｏｈｅｒら、１９９３）。Ａβ１−４２は、１−４０Ａβペプチドより産生量が豊富でない（Ｈａａｓｓら、１９９２；  Ｓｅｕｂｅｒｔら、１９９２）が、Ａβ１−４２の優先沈着は、このＣＯＯＨ伸長型が、１−４０  Ａβより不溶性であり、そしてより凝集する傾向にあり、そして逆平行βひだシートを形成するという事実から生じる（Ｊｏａｃｈｉｍら、１９８９；  Ｈａｌｖｅｒｓｏｎら、１９９０；  Ｂａｒｒｏｗら、１９９２；  Ｂｕｒｄｉｃｋら、１９９２；  Ｆａｂｉａｎら、１９９４）。Ａβ１−４２は、Ａβ１−４０の凝集の種を蒔くことが可能である（ＪａｒｒｅｔｔおよびＬａｎｓｂｕｒｙ、１９９３）。Ｉｗａｔｓｕｂｏら（１９９６）およびＳａｉｄｏら（１９９６）は、さらに、他の変異体アミロイド−βペプチド、Ａβ  ３（ピログルタミン酸）−４２、Ａβ  １１（ピログルタミン酸）−４２、Ａβ  １７−４２、Ａβ  １（Ｄ−Ａｓｐ）−４２、およびＡβ  １（Ｌ−イソＡｓｐ）−４２もまた、脳中のアミロイド沈着に存在することが見出されたと報告した。
【０００４】
ＡＰＰ遺伝子が配列決定され、そして染色体２１上にコードされることが見出された（Ｋａｎｇら、１９８７）。ＡＰＰ遺伝子の発現によって、６９５、７５１および７７０アミノ酸の、いくつかのＡβ含有アイソフォームが生成され（図１）、後者の２つのβＡＰＰは、Ｋｕｎｉｔｚセリンプロテアーゼ阻害剤と構造的および機能的相同性を共有するドメインを含む（Ｋａｎｇら、１９８７；  Ｋｉｔａｇｕｃｈｉら、１９８８；  Ｐｏｎｔｅら、１９８８；  Ｔａｎｚｉら、１９８８；  Ｋｏｎｉｇら、１９９２）。神経系におけるβＡＰＰの機能は、定義されないままであるが、βＡＰＰが、ニューロンの接着および増殖を仲介する際に（Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、１９８９；  Ｓａｉｔｏｈら、１９９４；  ＳａｉｔｏｈおよびＲｏｃｈ、１９９５）、そしてことによるとＧタンパク質連結シグナル伝達経路において（Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏら、１９９３）、役割を果たすという証拠が増えてきている。培養細胞において、βＡＰＰは、構成性分泌経路を通じて成熟し（Ｗｅｉｄｅｍａｎｎら、１９８９；  Ｈａａｓｓら、１９９２；  Ｓｉｓｏｄｉａ  １９９２）、そしていくつかの細胞表面結合βＡＰＰは、α−セクレターゼと称される酵素によってＡβドメイン内で切断され（Ｅｓｃｈら、１９９０）、この事象は、Ａβアミロイド形成を妨げる（図１）。いくつかの研究によって、どちらもアミロイド形成性である、２つのさらなるβＡＰＰプロセシング経路が示されてきている：第一に、エンドソーム／リソソーム経路が、いくつかが全Ａβ配列を含む、βＡＰＰ関連膜結合断片の複合体組を生成し（Ｈａａｓｓら、１９９２；  Ｇｏｌｄｅら、１９９２）；そして第二に、完全には理解されていない機構によって、Ａβ１−４０が馴化培地に分泌され、そしてｉｎ  ｖｉｖｏで脳脊髄液中に存在する（Ｈａａｓｓら、１９９２；  Ｓｅｕｂｅｒｔら、１９９２；  Ｓｈｏｊｉら、１９９２；  Ｂｕｓｃｉｇｌｉｏら、１９９３）。リソソーム分解がＡβの産生に有意に貢献するとは、もはや考えられていない（ＳｉｓｏｄｉａおよびＰｒｉｃｅ、１９９５）。ＡβのＮＨ2およびＣＯＯＨ末端での切断に関与するタンパク質分解酵素は、それぞれ、βおよびγと称される（図１）が、まだ同定されていない。最近まで、Ａβは、前駆体の異常な代謝によって生成されると一般的に考えられていた。しかし、培養中の非常に多様な細胞の馴化培地およびヒト脳脊髄液にＡβが存在することは、Ａβが細胞の正常機能として産生されることを示す。
【０００５】
アミロイド沈着が、ＡＤを生じる律速要因であるならば、この疾患に関連する全ての因子は、アミロイド沈着を促進するかまたはアミロイドによって誘発される病理を増進するか、いずれかであろう。アミロイド沈着の可能性は、ＡＰＰの過剰なコピーが存在するトリソミー２１（ダウン症候群）によって（Ｎｅｖｅら、１９８８；  Ｒｕｍｂｌｅら、１９８９）、ＡＰＰの増加した発現によって、そして家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）関連突然変異によって（Ｖａｎ  Ｂｒｏｅｃｋｈｏｖｅｎら、１９８７；  Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎら、１９９１；  Ｇｏａｔｅら、１９８９；  Ｇｏａｔｅら、１９９１；  Ｍｕｒｒｅｌｌら、１９９１；  Ｐｅｒｉｃａｋ−Ｖａｎｃｅら、１９９１；  Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇら、１９９２；  Ｔａｎｚｉら、１９９２；  Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓら、１９９２；  Ｍｕｌｌａｎら、１９９２）、増進される。これらの突然変異のいくつかは、Ａβの増加した総産生（Ｃａｉら、１９９３；  Ｃｉｔｒｏｎら、１９９２）、またはより原線維形成性であるペプチドの特異的過剰産生（Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら、１９９１；  Ｃｌｅｍｅｎｔｓら、１９９３；  Ｓｕｚｕｋｉら、１９９４）、または原線維形成を誘導する因子の増加した発現（Ｍａら、１９９４；  Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋｉら、１９９４）と相関する。総合すると、これらの知見は、アミロイド沈着が、ＡＤの発展の重要な要素であるという仮説（Ｈａｒｄｙ  １９９２）を強く支持するが、もちろん、対らせんフィラメントなどの、疾患に関連する他の年齢関連変化が、アミロイド沈着の結果としてよりむしろ、平行に発展し、そして独立に痴呆に貢献する可能性があることを排除しない。
【０００６】
研究者の主な焦点およびＡＤの薬剤開発に関連するものの主な目的は、中枢神経系（ＣＮＳ）のＡβ沈着量を減少させることである。これらの活性は、２つの一般的な領域に属する：Ａβの産生に影響を与える因子、および不溶性Ａβ原線維の形成に影響を与える因子である。第三の療法目的は、Ａβ神経毒性に引き起こされる炎症反応を減少させることである。
【０００７】
第一のものに関し、新たに合成されるβＡＰＰが、形質膜に挿入されるためにどのようにプロセシングされるかの詳細な理解を得て、そして成熟タンパク質切断部位に基づいて指定されている、推定上のアミロイド形成セクレターゼを同定するために、主な努力が進行中である。薬理学的展望から、Ａβの産生を減少させる最も直接的な方法は、βまたはγセクレターゼいずれかの直接的な阻害を通じる。非特異的阻害剤は、現在、入手可能であるが、いくつかの化合物は、間接的に活性を阻害することが示されている。例えば、バフィロマイシンは、約５０ｎＭのＥＣ50でＡβ産生を阻害し（Ｋｎｏｐｓら、１９９５；  Ｈａａｓｓら、１９９５）、これはＡβセクレターゼと共に小胞中に局在する血管Ｈ+ＡＴＰアーゼの阻害剤としての作用を通じてである可能性が最も高い。高濃度で用いられる、別の化合物、ＭＤＬ２８１７０は、γセクレターゼの活性を遮断するようである（Ｈｉｇａｋｉら、１９９５）。βまたはγセクレターゼの同定が、アミロイド形成ペプチドの形成を遮断するための特異的プロテアーゼ阻害剤の合成を導くことが一般的に望ましい。しかし、これらの酵素がβＡＰＰに特異的であるかどうか、またはこれらがことによると他の重要な分泌機能を持つのかどうかは未知である。
【０００８】
同様に、βＡＰＰのプロセシングが、アミロイド形成性または非アミロイド形成性経路を通じて指示されるか決定することが可能な、シグナル伝達経路に干渉するいかなる試みを通じても、標的および標的化特異性の問題が生じるであろう。さらに、これらのシグナル伝達機構は、なお同定される必要がある。結論として、Ａβの過剰生産を導く、根底にある、複雑でそして多様な分子機構の現在の理解では、薬理学的剤による選択的標的化にほとんど希望はない。
【０００９】
神経毒性がＡβのβひだ凝集体と関連しているようであることを考慮すると、１つの療法アプローチは、Ａβ凝集を阻害するかまたは遅らせることである。このアプローチの利点は、Ａβの過剰発現を誘発する細胞内機構、またはＡβによって細胞内で誘導される影響を、よく理解する必要がないことである。Ａβに結合する多様な剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、Ａβ神経毒性を阻害することが可能であり、例えばＡβ結合色素であるコンゴーレッドは、培養ニューロンにおいて、Ａβ誘導毒性を完全に阻害する（Ｙａｎｋｎｅｒら、１９９５）。同様に、抗生物質リファムパシン（ｒｉｆａｍｐａｃｉｎ）もまた、Ａβ凝集、そして続いて神経毒性を妨げる（Ｔｏｍｉｙａｍａら、１９９４）。例えばヘキサデシル−Ｎ−メチルピペリジニウム（ＨＭＰ）ブロミド（Ｗｏｏｄら、１９９６）のように、Ａβに直接結合することによる、またはＡβ沈着の形成に貢献する他の分子とＡβの相互作用を妨げることによる、この過程の阻害剤として、他の化合物が開発中である。こうした分子の例は、すべてのアミロイドに同定され、そしてアミロイド誘導に関連する炎症の最も初期の段階に結び付けられる、ヘパラン硫酸またはヘパラン硫酸プロテオグリカン、パールカンである。
【００１０】
ヘパラン硫酸はＡβペプチドと相互作用し、そして二次および三次アミロイド構造的特徴を与える。最近、小分子陰イオン性硫酸は、この反応に干渉し、アミロイド形成を妨げるかまたは阻止することが示されてきている（Ｋｉｓｉｌｅｖｓｋｙ、１９９５）が、これらの化合物が、ＣＮＳに進入するかどうかは明らかでない。パールカン結合ドメインの配列に基づくペプチドは、Ａβおよびパールカンの間の相互作用を阻害するようであり、そしてＡβ由来ペプチドが自己重合するのを阻害する能力は、ＡＤの療法的措置の発展への潜在的な糸口として探求されている。しかし、これらの化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの有効性は、いくつかの理由のため、大きくないようであり、最も顕著には、血液脳関門を長期間に渡って貫通する必要性のためである。
【００１１】
Ａβ凝集を阻害するかまたは遅延させる別の手段として、ＷＯ  ９６／２５４３５は、Ａβ  １−４２ペプチドの未結合Ｃ末端に末端特異的であるが、Ａβ  １−４３ペプチドに特異的でないモノクローナル抗体を、Ａβ  １−４２の凝集を妨げるのに使用する可能性を開示する。こうしたＡβ末端特異的モノクローナル抗体の投与は、Ａβ  １−４２の未結合Ｃ末端残基と相互作用し、それによりＡＤにおいて病原性である可能性がある凝集に干渉しそして該凝集を破壊することがさらに開示されているが、これらのＡβ  Ｃ末端特異的モノクローナル抗体を、どのように療法的に用いるかに関する特定の開示はない。Ａβペプチド凝集の直接的または間接的操作は、魅力的な療法戦略であるようであるが、この一般的なアプローチのありうる不都合な点は、この種類の薬理学的化合物は、長期間に渡って投与する必要があり、そして脳組織中で集積して、そして非常に毒性のものとなる可能性があることである。
【００１２】
ＷＯ  ９８／４４９５５は、薬理学的剤の反復投与と関連する問題を避けるため、新規のアプローチを取り、そしてアルツハイマー病の開始を妨げる方法、またはアミロイド−βペプチドに末端特異的な組換え抗体の脳内での安定異所性発現を通じて、アルツハイマー病の進行を阻害する方法を開示する。
【００１３】
最近、Ｓｃｈｅｎｋら（１９９９）は、アミロイド−βでの免疫は、アミロイド−β沈着およびアルツハイマー病様神経病理の動物モデルとして役立つ、ＰＤＡＰＰトランスジェニックマウスにおいて、アルツハイマー病様病理を減弱させることを立証した。彼らは、アルツハイマー病型神経病理の開始前に、若い動物を免疫すると、β−アミロイド斑形成、神経突起ジストロフィーおよびアストログリオーシス（ａｓｔｒａｇｌｉｏｓｉｓ）の発展が本質的に予防され、一方、アルツハイマー型神経病理の開始後の、より年老いた動物の治療は、これらの神経病理の度合いおよび進行を減少させると観察されることを報告した。
【００１４】
Ｓｃｈｅｎｋらに報告される結果は、アルツハイマー病を治療する一般的なアプローチとして免疫調節を用いることに対する保証を提供するが、Ｓｃｈｅｎｋらによる、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）アミロイド−βでの免疫は、ヒトにおいてアルツハイマー病の治療のための免疫プログラムを開発する際に、注意を向ける必要がある、いくつかの問題を有する。１つの問題は、ヒトアミロイド−βでヒトを免疫することによって、どのくらい容易に抗自己抗体反応を生じさせることが可能か、明らかでないことである。さらに、ヒトアミロイド−βに対して、抗自己抗体反応を生じさせたとしても、患者にとって有害であるであろう、自己免疫が発展するかどうかは不明である。他の問題には、内因性アミロイド−βの形の抗原が、患者免疫系に常に利用可能であり、そして神経毒性であると考えられるアミロイド−βを投与してもしなくても、患者に対して重大なそして不都合な薬理学的影響を有するであろうため、どのように免疫を逆転させるかまたは停止させるかが含まれる。
【００１５】
ペプチドに基づくアプローチの代替法は、Ａβ神経毒性の細胞機構を解明し、そしてこれらの細胞標的にねらいを定めた療法を開発することである。フリーラジカル仲介ニューロン損傷のカルシウム機能障害を調節することに焦点が当てられてきている。Ａβが細胞表面上でＲＡＧＥ（進行したグリケーション最終産物の受容体）に結合し、それにより、細胞傷害性酸化刺激を生成する可能性がある反応を誘発することが仮定されている（Ｙａｎら、１９９６）。Ａβの細胞表面結合部位への接近の遮断は、ＡＤにおいてニューロン損傷の進行を遅延させる可能性がある。現在まで、Ａβ誘導神経毒性の遮断に特異的な薬理学的剤はない。
【００１６】
本明細書において、いかなる文献の引用も、こうした文献が適切な先行技術であるか、または本出願のいずれかの請求項の特許可能性に対する、よく考え抜かれた資料であることの容認として意図されない。いかなる文献の内容または日付に関するいかなる言及も、出願時点で出願者が入手可能である情報に基づき、そしてこうした言及の正確さに関する容認を構成しない。
発明の概要
本発明は、スペーサーアミノ酸残基（類）を伴いまたは伴わず、内部ペプチド切断産物のものと異なる供給源由来のＴヘルパー細胞エピトープに融合した、未結合Ｎ末端またはＣ末端としての、前駆体または成熟タンパク質の天然に存在する内部ペプチド切断産物由来の末端特異的Ｂ細胞エピトープを持つ、キメラペプチドまたはキメラペプチド混合物を提供する。
【００１７】
本発明はまた、免疫有効量のキメラペプチドまたはキメラペプチド混合物を含む、免疫組成物も提供する。この免疫組成物は、キメラペプチドのＢ細胞エピトープが末端特異的である内部ペプチド切断産物が、自己分子である、被験者哺乳動物において、抗体を作成するのに用いられる。
【００１８】
本発明にさらに提供されるのは、自己前駆体または成熟タンパク質由来の内部自己ペプチド切断産物の未結合Ｎ末端または未結合Ｃ末端に対して、哺乳動物を免疫する方法である。より具体的には、免疫法は、アミロイドβ沈着および斑と関連するアミロイドβペプチドに対して、抗体を作成し、そして個体を免疫することに向けられる。
【００１９】
本発明のさらに別の側面は、本発明記載のキメラペプチドに特異的な抗体の抗原結合部分を含む分子、およびこの分子を用いた受動免疫法に向けられる。
好ましい態様の詳細な説明
本発明の１つの側面は、一般的に、未結合ＮまたはＣ末端としての、前駆体または成熟タンパク質の天然に存在する内部ペプチド切断産物由来のＮまたはＣ末端特異的Ｂ細胞エピトープが、スペーサーアミノ酸残基を伴いまたは伴わず、異なる供給源由来のＴヘルパー細胞エピトープに融合されている、キメラペプチドまたはキメラペプチド混合物に向けられる。キメラペプチドまたはペプチド類は、免疫する哺乳動物の自己分子（それに天然の分子）である内部ペプチド切断産物の未結合Ｎ末端または未結合Ｃ末端に対して、哺乳動物を免疫するための免疫組成物において用いられる。より具体的には、本発明の好ましい態様として、キメラペプチド（類）は、Ｔヘルパー細胞エピトープに融合した、アミロイドβペプチドのＮ末端の最初の２から５のアミノ酸残基、またはＣ末端の最後の２から５のアミノ酸残基であるＮ末端またはＣ末端末端特異的Ｂ細胞エピトープを有する。こうしたキメラペプチド（類）を、免疫組成物の一部としてヒト個体に投与する際、その個体は、末端特異的Ｂ細胞エピトープが由来する、アミロイドβペプチドまたはペプチド類に対して免疫されるであろう。
【００２０】
本発明の例としてのアミロイドβペプチド特異的Ｂ細胞エピトープを含むキメラペプチドおよびアミロイドβペプチドに対して免疫する方法の好ましい態様として、キメラペプチド（類）、免疫組成物、および免疫法を拡大し、そしてそれに対して本発明の方法によって作成された末端特異的抗体が前駆体または成熟自己タンパク質と交差反応しないであろう、他の内部ペプチド切断産物に向けることが可能であることを、当業者は容易に認識するであろう。同様に、好ましい態様として、ヒトにおいてアミロイドβペプチドに対する末端特異的抗体を作成する、本発明にしたがった免疫法に関して、以下に記載される利点の大部分は、本発明のキメラペプチドまたはペプチド類を用いた免疫に、一般的に適用可能である。
【００２１】
Ｂ細胞によって生じる、タンパク質またはペプチドの明示された領域に対する抗体反応は、免疫系のＴヘルパー細胞が、同時にその抗原の別の部分を認識することを必要とすることが周知である。これは、一般的に、Ｂ／Ｔ細胞協働（ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ）と称される。本発明にしたがい、この現象は、連続する直線配列中にＢおよびＴ細胞エピトープを両方含む、合成キメラペプチドを作成することによって、模倣することが可能である。こうしたキメラペプチドは、マウス、ヒト／マウスキメラおよび霊長類で、抗体産生を駆動するのに用いられ、非常に成功してきている（Ｓｈａｒｍａら、１９９３；  Ｉｆｖｅｒｓｅｎら、１９９５；  Ｏ’Ｈｅｒｎら、１９９７）。
【００２２】
本発明において、アミロイドβペプチドの未結合Ｎ末端の最初の２から５アミノ酸残基、または未結合Ｃ末端の最後の２から５アミノ酸残基を含むＢ細胞エピトープを、スペーサーアミノ酸残基を伴いまたは伴わず、既知の強いＴヘルパー細胞エピトープに融合させ、キメラペプチドを形成する。こうした既知の強いＴ細胞エピトープの限定されない例は、よく研究されている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の破傷風毒素の雑多な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）エピトープ（Ｈｏら、１９９０；  Ｐａｎｉｎａ−Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎら、１９８９）である。これは、このエピトープが、いくつかの多様なヒト遺伝的背景で働くことが知られているためである（Ｖａｌｍｏｒｉら、１９９２および１９９４）。
【００２３】
好ましい態様のような、アミロイドβ末端特異的Ｂ細胞エピトープおよび破傷風毒素の雑多なＴヘルパー細胞エピトープを含むキメラペプチド（類）での免疫は、以下の特異性を持つ抗体を生じるはずである：
（１）大部分の個体は、すでに破傷風毒素に血清陽性である（すなわち以前の破傷風免疫から）ため、ヒトにおいて不適切であろう、抗破傷風抗体；
（２）アミロイドβペプチドの末端特異的Ｂ細胞エピトープおよび破傷風毒素のＴヘルパー細胞エピトープを連結する接合部によって生成される新規エピトープを認識するが、免疫原自体以外はまったく認識せず、そしてしたがって、免疫個体において、ｉｎ  ｖｉｖｏで不適切であろう、抗接合部抗体；および
（３）アミロイドβ沈着／斑形成を阻害し、減少させ、またはことによると逆転さえさせるため、本発明にしたがった方法によって作成されることが求められる、望ましい抗体である、抗Ｎ末端または抗Ｃ末端特異的アミロイドβ抗体。
【００２４】
本発明にしたがった免疫法によって作成される、望ましい抗Ｎ末端または抗Ｃ末端特異的アミロイドβ抗体は、アミロイドβペプチド、および該ペプチドがタンパク質分解的に得られるβアミロイドタンパク質前駆体（βＡＰＰ）の間を区別することが可能である。これらの末端特異的アミロイドβ抗体は、アミロイドβペプチドの末端に特異的に結合し、脳の細胞外空間、間質液および脳脊髄液におけるアミロイドβペプチドの集積、および老年性アミロイド沈着または斑への凝集を遅らせ、減少させまたは予防し、そしてアミロイドβペプチドと、アミロイドβの神経毒性に貢献する他の分子の相互作用を遮断する。
【００２５】
可溶性アミロイドβペプチドが存在する、血液、並びに脳の細胞外空間、間質液および脳脊髄液における、抗Ｎ末端または抗Ｃ末端特異的アミロイドβ抗体の存在は、可溶性抗体−アミロイドβ複合体の形成を促進する。これらの可溶性抗体−アミロイドβ複合体は、上矢状静脈洞のクモ膜絨毛を通じた、全身血液循環への、細胞外空間、間質液および脳脊髄液のドレナージによって、中枢神経系から一掃される。この方式で、可溶性アミロイドβペプチドが、細胞外空間、間質液および脳脊髄液で集積して、アミロイド沈着を形成し、そして／または神経毒性を誘導することが妨げられる（図１）。さらに、本発明の方法にしたがった、可溶性アミロイド−βペプチドのクリアランスは、例えばアミロイド−β誘導補体活性化およびサイトカイン放出を阻害することによって、そしてまた、ＲＡＧＥ受容体などの細胞表面受容体とＡβの相互作用を遮断することによって、アルツハイマー病に観察される炎症過程を減少させることが期待される。
【００２６】
図１に示されるように（Ｓｃｈｅｈｒ、１９９４を参照されたい）、そして背景技術項に論じられるように、β−アミロイドタンパク質前駆体（βＡＰＰ）はまた、増殖促進および神経保護機能を有すると考えられる、タンパク質分解産物の前駆体、可溶性β−アミロイドタンパク質前駆体（ｓβＡＰＰ）としても働くと考えられる。抗Ｎ末端または抗Ｃ末端特異的アミロイドβ抗体が、アミロイドβペプチドの形成に関連しないβＡＰＰの正常な生物学的機能に干渉しないであろうことは、当業者に容易に理解されるであろう。
【００２７】
本発明の好ましい態様にしたがった免疫法の利点には以下が含まれる：
（１）即座かつ容易に産生され、そして品質保証に関して容易に調節される安価なペプチド抗原が能動免疫に用いられ；
（２）内部ペプチド切断産物（アミロイドβペプチド）のＮまたはＣ末端の２から３のみ、そしてことによると４または５までのアミノ酸残基の包含は、内部ペプチド切断産物が、タンパク質分解的に得られる前駆体または成熟タンパク質（βＡＰＰ）と反応し、そしてしたがって、この前駆体または成熟タンパク質の機能と干渉する可能性がある抗体が産生される量を最小にするはずであり；
（３）独立非自己Ｔ細胞エピトープの使用は、自己寛容を破壊し、そして自己抗原に対する抗体の産生を可能にするはずであり（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄら、１９９１）；
（４）抗自己Ｔ細胞免疫が、すべての既知の自己免疫疾患の進行の根底にあるため、内部ペプチド切断産物（アミロイドβ）由来のＴ細胞エピトープのキメラペプチド（類）の非存在は、自己免疫のいかなる重大な問題も避けるはずであり；そして
（５）患者の免疫系は、免疫原として、破傷風毒素とアミロイドβの組み合わせと、天然に遭遇することは決してないため、免疫が自己限定であり、そして可逆性であるはずであり、抗体力価は時間と共に次第に低下する。この自己限定および可逆性免疫は、合成避妊ワクチンでの臨床試験で立証されてきている（Ｔａｌｗａｒら、１９９７）。
【００２８】
本発明のキメラペプチドは、式（Ｉ）または式（ＩＩ）、
（Ｉ）Ｎ−（Ｓ）m−（Ｔh）n
（ＩＩ）（Ｔh）n−（Ｓ）m−Ｃ
に表され、式中：
Ｎは、哺乳動物において、天然に存在する際、前駆体タンパク質または成熟タンパク質由来である、アミロイドβペプチドなどの天然に存在する内部ペプチド切断産物の未結合Ｎ末端の最初の２、３、４、または５アミノ酸残基であり；
Ｃは、該天然に存在する内部ペプチド切断産物の未結合Ｃ末端の最後の２、３、４、または５アミノ酸残基であり；
Ｔhは、該天然に存在する内部ペプチド切断産物のものと異なる天然供給源（すなわち生存生物種）由来のＴヘルパー細胞エピトープであり；
Ｓはスペーサーアミノ酸残基であり；
ｍは０、１、２、３、４、または５であり；そして
ｎは１、２、３、または４である。
【００２９】
やはり意図されるのは、各キメラペプチドの内部ペプチド切断産物が、同一であっても異なっても、すなわち異なるアミロイドβペプチドであってもよい、式（Ｉ）および式（ＩＩ）のキメラペプチドの混合物である。しかし、これらのキメラペプチド混合物は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）のキメラペプチドの混合物に限定されず、そしてＮが異なる内部ペプチド切断産物（すなわち異なるアミロイドβペプチド）由来である、式（Ｉ）のペプチドの混合物、またはＣが異なる内部ペプチド切断産物（すなわち異なるアミロイドβペプチド）由来である、式（ＩＩ）のペプチドの混合物を含む可能性がある。
【００３０】
本発明のキメラペプチドは、約２０から９０アミノ酸残基の間の長さ、好ましくは、約２０から７５アミノ酸残基の間、より好ましくは、約２０から５０アミノ酸残基の間、そして最も好ましくは、約２０から４０アミノ酸残基の間の長さを有する。
【００３１】
天然に存在する内部ペプチド切断産物の未結合Ｎ末端（Ｎ）または未結合Ｃ末端（Ｃ）由来のＢ細胞エピトープは、好ましくは、２または３アミノ酸残基であり、これはペプチド切断産物の前駆体タンパク質または成熟タンパク質と交差反応する抗体を作成するのに十分でない。天然に存在する内部ペプチド切断産物の未結合Ｎ末端または未結合Ｃ末端の４または５アミノ酸残基のＢ細胞エピトープもまた、適切である可能性があるが、前駆体タンパク質または成熟タンパク質と交差反応性であるいくつかの抗体が作成される、わずかに増加した可能性がある。
【００３２】
本発明の好ましいキメラペプチド態様は、ヒトに天然に存在する場合、βＡＰＰから由来するアミロイドβペプチドに由来する、それぞれ、式（Ｉ）または（ＩＩ）中のＮまたはＣを有する。本明細書において、用語「由来する」は、天然供給源から得られる場合、ペプチドまたはタンパク質が、単一タンパク質分解的切断事象によるか、または１より多い切断および／または変換事象によるか、いずれにしても、前駆体タンパク質または成熟タンパク質からの切断または変換の結果であることを意味する。好ましい態様の場合、アミロイド沈着、原線維、および斑中に、天然に存在することが見出されるいかなるアミロイドβペプチドも、内部ペプチド切断産物として、用語「アミロイドβペプチド」に含まれる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（Ａβ１−４０）、３（Ａβ１−４２）、４（Ａβ１−４３）、５（Ａβ３−４２）、６（Ａβ１１−４２）、および７（Ａβ１７−４２）のペプチドは、こうした「アミロイドβペプチド」の限定されない例である。
【００３３】
Ｔhは、天然に存在する内部ペプチド切断産物の供給源と異なる天然供給源に由来する、Ｔヘルパー細胞エピトープである。言い換えると、該Ｔヘルパー細胞エピトープは、本発明の方法にしたがって免疫された哺乳動物被験者において、自己分子の一部として認識されない。該Ｔヘルパー細胞エピトープは、前駆体または成熟タンパク質の内部である（末端に位置しない）、ペプチド切断産物のＮ末端またはＣ末端に特異的なＢ細胞エピトープと組み合わされ、有効な抗体反応を引き起こす。
【００３４】
効率的な抗体反応を引き起こすためには、免疫原は、主要組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩＩ抗原と関連して、提示されなければならないことが知られている。抗原提示細胞（ＡＰＣ）に産生される、ＭＨＣクラスＩＩ抗原は、配列特異的方式で、免疫原に存在するＴ細胞エピトープに結合する。このＭＨＣクラスＩＩ−免疫原複合体は、ＣＤ４+リンパ球（Ｔh細胞）によって認識され、これが、提示された免疫原由来のＢ細胞エピトープを認識することが可能な特異的Ｂ細胞の増殖、およびこうしたＢ細胞による、Ｂ細胞エピトープ特異的抗体の産生を引き起こす。アミロイドβペプチドは自己分子であるため、これらはいかなる認識可能なＴhエピトープも持たず、そして２から５アミノ酸残基のＢ細胞エピトープは、いかなるＴ細胞エピトープもまったく欠くであろう。こうしたエピトープは、破傷風毒素、百日咳毒素、麻疹ウイルスＦタンパク質およびＢ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を含む、強力な免疫原に由来する、特定の配列によって提供することが可能である。選択されるＴhエピトープは、好ましくは、異なるＭＨＣハプロタイプを発現する多数の個体において、Ｔヘルパー細胞反応を引き出すことが可能である。これらのエピトープは、雑多な集団の多くの異なる個体において機能し、そして雑多なＴhエピトープとみなされる。雑多なＴhエピトープは、遺伝的に多様な集団群のほとんどのメンバーで、強力な抗体反応を引き出す利点を提供する。
【００３５】
さらに、本発明のキメラペプチド中のＴヘルパー細胞エピトープはまた、既定の集団のほとんどのメンバーで免疫反応を引き起こす能力に関してだけでなく、記憶／リコール反応を引き起こす能力に関しても、好適に選択される。哺乳動物がヒトである場合、本発明のキメラペプチドを用いた免疫療法を受けている大部分のヒト被験者／患者は、すでに小児科ワクチン（すなわち麻疹＋おたふく風邪＋風疹およびジフテリア＋百日咳＋破傷風ワクチン）、およびおそらくＢ型肝炎ウイルスワクチンで免疫されているであろう。これらの患者は、したがって、キメラ小児科ワクチンに存在するＴhエピトープの少なくとも１つに、以前、曝露されている。標準的ワクチンでの免疫を通じて、Ｔhエピトープに以前曝露されていることによって、キメラペプチドの投与（すなわちリコール反応）の際、直ちに増殖し、それにより、キメラペプチドに対する迅速なＢ細胞反応を刺激することが可能なＴh細胞クローンが確立されているはずである。さらに、Ｔhエピトープは、毒素分子を用いてＴヘルパー細胞反応を引き出す際に遭遇する問題である、キャリアー誘導免疫反応につながる可能性がある、いかなる病原体特異的Ｂ細胞および／またはサプレッサーＴ細胞エピトープも回避する。
【００３６】
本発明のキメラペプチド中のＴhエピトープは、雑多であるが普遍的でない。この特性は、Ｔhエピトープが、異なるＭＨＣ抗原を発現する、異系交配集団の大部分で反応性である（集団の５０から９０％で反応性である）が、その集団のすべてのメンバーで反応性ではないことを意味する。内部ペプチド切断産物に対する、包括的で、普遍的に近い免疫反応性を提供するため、異なるＴhエピトープとのキメラペプチドの組み合わせを調製することが可能である。例えば、破傷風および百日咳毒素、麻疹ウイルスＦタンパク質およびＨＢｓＡｇ由来の雑多なＴhエピトープを持つ４つのキメラペプチドの組み合わせは、より有効である可能性がある。
【００３７】
雑多なＴhエピトープはしばしば、共通の構造的特徴を共有する。例えば、雑多なＴhエピトープは、約１５から約３０残基の大きさの範囲にある。両親媒性らせんは、Ｔhエピトープの共通の特徴である。両親媒性らせんは、周囲表面を占める、疎水性アミノ酸残基を持つ、α−らせん構造によって定義される。Ｔhエピトープは、頻繁に、Ｇｌｙまたは荷電残基後の２つから３つの疎水性残基の次に荷電または極性残基が続くなどの、さらなる一次アミノ酸パターンを含む。このパターンは、Ｒｏｔｈｂａｒｄ配列を定義する。Ｔhエピトープはしばしば、陽性荷電残基に、荷電残基後の４番目、５番目、および８番目の位で、疎水性残基が続く、１、４、５、８ルールにしたがう。これらの構造のすべては、共通の疎水性、荷電および極性アミノ酸で構成され、各構造は、単一のＴhエピトープ内に同時に存在することが可能である。
【００３８】
したがって、Ｔhは、Ｔhエピトープを含むアミノ酸（天然または非天然）の配列である。Ｔhエピトープは、連続エピトープでもまたは非連続エピトープでもよい。したがって、Ｔhのすべてのアミノ酸が、必ずしもエピトープの一部でなくてもよい。したがって、Ｔhエピトープは、Ｔhエピトープの類似体（ａｎａｌｏｇ）および部分も含め、内部ペプチド切断産物に対する免疫反応を増進するかまたは刺激することが可能である。免疫優性Ｔhエピトープは、広く異なるＭＨＣタイプを持つ動物およびヒト集団において、広く反応性である（Ｃｅｌｉｓら、１９８８；  Ｄｅｍｏｔｚら、１９８９；およびＣｈｏｎｇら、１９９２）。本発明のキメラペプチドのＴhドメインは、約１０から約５０のアミノ酸残基、そして好ましくは、約１０から約３０のアミノ酸残基を有する。多数のＴhエピトープが存在する（ｎが２以上）場合、各Ｔhエピトープは独立に、同一であるかまたは異なる。
【００３９】
Ｔhエピトープ類似体は、Ｔhエピトープ中の１から約５つのアミノ酸残基の置換、欠失および挿入を含む。Ｔh部分は、内部ペプチド切断産物に対する免疫反応を増進するかまたは刺激するのに十分である、Ｔhエピトープの連続部分である。Ｔh部分の例は、単一の、より長いペプチド由来の、一連の重複ペプチドである。
【００４０】
本発明のＴhエピトープには、Ｂ型肝炎表面抗原Ｔヘルパー細胞エピトープ（ＨＢs  Ｔh）、百日咳毒素Ｔヘルパー細胞エピトープ（ＰＴ  Ｔh）、破傷風毒素Ｔヘルパー細胞エピトープ（ＴＴ  Ｔh）、麻疹ウイルスＦタンパク質Ｔヘルパー細胞エピトープ（ＭＶF1  Ｔh）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍｉｔｉｓ）主要外膜タンパク質Ｔヘルパー細胞エピトープ（ＣＴ  Ｔh）、ジフテリア毒素Ｔヘルパー細胞エピトープ（ＤＴ  Ｔh）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）スポロゾイト周囲タンパク質（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）Ｔヘルパー細胞エピトープ（ＰＦ  Ｔh）、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）トリオースリン酸イソメラーゼＴヘルパー細胞エピトープ（ＳＭ  Ｔh）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＴｒａＴ  Ｔヘルパー細胞エピトープ（ＴｒａＴ  Ｔh）および免疫増進類似体が含まれ、そしてエピトープ配列が以下の表１に提供される。
【００４１】
表１
【００４２】
【表１】
0004804690.tif 000002
免疫原性は、本発明にしたがったキメラペプチドの雑多なＴhエピトープおよびＢ細胞エピトープの間に、スペーサー残基Ｓ（すなわちＧｌｙ−Ｇｌｙ）を付加することを通じて、改善することが可能である。Ｂ細胞エピトープからＴhエピトープを物理的に分離することに加え、グリシン残基は、Ｂ細胞エピトープとＴhエピトープを連結することによって生成されるいかなる人工的な二次構造も破壊し、そしてそれにより、Ｔおよび／またはＢ細胞反応間の干渉を除去することが可能である。ヘルパーエピトープおよび抗体誘発ドメイン間のコンホメーション的な分離は、こうして、提示される免疫原および適切なＴhおよびＢ細胞間のより効率的な相互作用を可能にする。Ｓのアミノ酸残基（類）は、天然存在アミノ酸であってもまたは非天然存在アミノ酸であってもよく、限定されるわけではないが、β−アラニン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、チロキシン、ガンマ−アミノ酪酸、ホモセリン、シトルリンおよびそれらに匹敵するものが含まれる。
【００４３】
本発明のキメラペプチドは、一般の当業者に公知の合成化学法によって作成することが可能である。したがって、キメラペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓペプチド合成装置などのペプチド合成装置上で、ｔ−ＢｏｃまたはＦ−ｍｏｃ化学反応いずれかと共に、固相合成の自動化メリフィールド技術を用いて、合成することが可能である。
【００４４】
望ましいキメラペプチドを完全に組み立てた後、標準法にしたがって、樹脂を処理し、樹脂からペプチドを切断し、そしてアミノ酸側鎖上の保護基を脱ブロッキングする。遊離ペプチドをＨＰＬＣによって精製し、そして例えばアミノ酸解析によって、または配列決定によって、生化学的に性質決定する。ペプチドの精製および性質決定法は、一般の当業者に公知である。
【００４５】
あるいは、公知の組換えＤＮＡ技術によって、より長い直線キメラペプチドを合成することが可能である。ＤＮＡ技術に関するいかなる標準的なマニュアルも、本発明のキメラペプチドを産生するのに、詳細なプロトコルを提供する。本発明のキメラペプチドをコードする遺伝子を構築するため、アミノ酸配列を核酸配列に逆転写し、そして好ましくは、遺伝子が発現されるであろう生物の最適化コドン使用を用いる。次に、典型的には、ペプチドおよび必要であれば制御要素いずれかをコードする重複オリゴヌクレオチドを合成することによって、合成遺伝子を作成する。合成遺伝子を適切なクローニングベクターに挿入し、そして組換えクローンを得て、そして性質決定する。その後、選択された発現系および宿主に適した条件下で、キメラペプチドを発現させ、そして標準法によってキメラペプチドを精製し、そして性質決定する。
【００４６】
キメラペプチドに対し、所望による部分として、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種のインベイシン・タンパク質の免疫刺激エピトープを、Ｂ細胞エピトープと反対側で、キメラペプチドのＴヘルパー細胞エピトープに連結することが可能である。病原性細菌エルシニア属種のインベイシンは、該細菌の哺乳動物細胞への進入を仲介する外膜タンパク質である（Ｉｓｂｅｒｇら、１９９０）。該細菌による培養哺乳動物細胞への侵入は、エルシニア・インベイシン分子および培養細胞上に存在するいくつかの種類のインテグリン類β１ファミリー間の相互作用を必要とすることが立証された（Ｔｒａｎ  Ｖａｎ  Ｎｈｉｅｕら、１９９１）。Ｔリンパ球（特に活性化免疫または記憶Ｔ細胞）にはβ１インテグリン類が豊富であるため、ヒトＴ細胞に対するインベイシンの影響が調べられてきている（Ｂｒｅｔｔら、１９９３）。インテグリン類は、フィブロネクチン、ラミニンおよびコラーゲンを含む、細胞外マトリックスタンパク質との相互作用を通じて、血管外への、そして結合組織を通じた、抗原曝露部位への、免疫Ｔ細胞の移動を促進する。インベイシン分子のカルボキシ末端は、非特異的マイトジェンである抗ＣＤ３抗体の存在下で、未処置（ｎａｉｖｅ）ヒトＣＤ４+  Ｔに関して共刺激性であり、顕著な増殖およびサイトカインの発現を引き起こすことが見出された。β１インテグリン類と相互作用し、この刺激を引き起こす特異的なインベイシン・ドメインもまた、同定された（Ｂｒｅｔｔら、１９９３）。このドメインと関連する立証されたＴ細胞共刺激特性のため、これを、Ｂ細胞エピトープと反対側で、本発明のキメラペプチド中の雑多なＴhエピトープに連結してもよい。
【００４７】
グラム陰性細菌の外膜タンパク質の多くは、脂質修飾され、そしてかつ非常に免疫原性である。共有脂質連結および免疫原性の間に明らかに相関があるため、細菌膜タンパク質に一般的な脂質である、トリパルミトイル−Ｓ−グリセロールシステイン（Ｐａｍ3Ｃｙｓ）を、Ｂ細胞または細胞傷害性Ｔ細胞エピトープいずれかを提示する合成ペプチドにカップリングしてもよい。この脂質連結によって、かなりのアジュバント反応が引き出されるため、キメラペプチドの雑多なＴhエピトープは、Ｂ細胞エピトープへの連結と反対側で、脂質修飾してもよい。こうした脂質修飾キメラペプチドは、同一ペプチドの非修飾型より免疫原性である可能性がある。
【００４８】
Ｔhエピトープ、並びにインベイシン・エピトープおよび脂質部分の免疫刺激特性の開示を含む、米国特許５，８４３，４４６が、本明細書に完全に援用される。
【００４９】
抗原をアジュバントと同時投与すると、免疫原性を、さらに、かなり改善することが可能である。アジュバントは抗原の免疫原性を増進するが、必ずしもそれ自体、免疫原性でなくてもよい。アジュバントは、投与部位の近くに、局所的に抗原を保持することによって作用し、免疫系の細胞への、抗原の緩慢な持続放出を促進する貯蔵所（ｄｅｐｏｔ）効果を生じることが可能である。アジュバントはまた、免疫系の細胞を、抗原貯蔵所に引き付け、そしてこうした細胞が免疫反応を引き出すよう、刺激することも可能である。
【００５０】
免疫刺激剤またはアジュバントは、例えばワクチンに対する、宿主免疫反応を改善するため、何年も用いられてきている。リポ多糖などの内因性（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ）アジュバントは、ワクチンとして用いられる死細菌または弱毒化細菌の構成要素である。外因性（ｅｘｔｒｉｎｓｉｃ）アジュバントは、典型的には、抗原に非共有結合している免疫調節剤であり、そして宿主免疫反応を増進するため、処方される。したがって、アジュバントは、非経口的に搬送された抗原に対する免疫反応を増進することが同定されている。しかし、これらのアジュバントのいくつかは毒性であり、そして望ましくない副作用を引き起こす可能性があり、これらをヒトおよび多くの動物で使用するのに不適切なものにしている。実際、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（一般的には、集合的にミョウバンと称される）のみが、ヒトおよび獣医学ワクチンにおいて、アジュバントとして日常的に用いられる。ジフテリアおよび破傷風トキソイドに対する抗体反応を増加させる際のミョウバンの有効性は、よく確立されており、そしてＨＢｓＡｇワクチンもまた、ミョウバンでアジュバント化されてきている。
【００５１】
広範囲の外因性アジュバントが、抗原に対する強力な免疫反応を誘発することが可能である。これらには、膜タンパク質抗原に複合体化したサポニン類（免疫刺激複合体）、ミネラルオイルと一緒のプルロニックポリマー類、ミネラルオイル中の死んだ放線菌（ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フロイントの完全アジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖（ＬＰＳ）と共にリピドＡなどの細菌産物、およびリポソームが含まれる。体液性免疫反応（ＨＩＲ）および細胞仲介免疫（ＣＭＩ）を効率的に誘導するため、免疫原をアジュバント中で乳化する。多くのアジュバントは毒性であり、肉芽腫、急性および慢性炎症（フロイントの完全アジュバント、ＦＣＡ）、細胞溶解（サポニン類およびプルロニックポリマー類）および発熱原性、関節炎および前部ブドウ膜炎（ＬＰＳおよびＭＤＰ）を誘導する。ＦＣＡは優れたアジュバントであり、そして研究に広く用いられているが、その毒性のため、ヒトまたは獣医学ワクチンでの使用には、認可されていない。
【００５２】
米国特許第４，８５５，２８３号は、免疫調節因子またはアジュバントとして、各々、糖残基中で、アミノ酸によって置換されている、Ｎ−グリコシルアミド類、Ｎ−グリコシル尿素類およびＮ−グリコシルカルバメート類を含む糖脂質を解説する。米国特許第４，２５８，０２９号は、オクタデシルチロシンヒドロクロリド（ＯＴＨ）が、破傷風トキソイドおよびホルマリン不活性化Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型ポリオウイルス（ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）ワクチンと複合体化した際、アジュバントとして機能することを解説する。また、Ｎｉｘｏｎ−Ｇｅｏｒｇｅら、１９９０は、組換えＢ型肝炎表面抗原と複合体化した芳香族アミノ酸のオクタデシルエステルが、Ｂ型肝炎ウイルスに対する宿主免疫反応を増進することを報告した。
【００５３】
内部ペプチド切断産物に対する免疫反応を最大にする、外因性アジュバント／エマルジョン処方の添加が好ましい。適切なアジュバントおよびキャリアーは：（１）第Ｉ相ヒト試験で使用に成功しているもの；（２）前臨床安全性研究における反応原性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）の欠如に基づき、ヒトでの使用の認可に可能性を有するもの；または（３）食品およびコンパニオン動物での使用が認可されているものである。
【００５４】
最小用量数、理想的にはただ１回の用量の投与後に最大免疫反応を生じる免疫療法措置が、非常に望ましい。この結果には、微小粒子中に免疫原を捕捉することを通じて、近づくことが可能である。例えば、吸収可能縫合素材であるポリ（ラクチド−コ−グリコリド）コポリマーは、免疫原を含む微小粒子に形成することが可能である。経口または非経口投与後、ｉｎ  ｖｉｖｏでの微小粒子加水分解は、非毒性副産物である乳酸およびグリコール酸を生じ、そして捕捉過程によって、大部分未改変である免疫原を放出する。微小粒子分解および捕捉免疫原放出の速度は、いくつかのパラメーターによって制御することが可能であり、こうしたパラメーターには（１）粒子形成に用いられるポリマー類の比（より高いコ−グリコリド濃度を持つ粒子は、より迅速に分解する）；（２）粒子の大きさ（より小さい粒子は、より大きいものより迅速に分解する）；および（３）捕捉効率（より高い濃度の捕捉抗原を持つ粒子は、より低い装填の粒子より迅速に分解する）が含まれる。微小粒子処方はまた、異なる遊離速度の免疫原捕捉微小粒子を混合することによって、単一投与において、一次免疫および続く追加免疫も提供することが可能である。１週間未満から６ヶ月を越える範囲で、抗原を遊離させることが可能な単一用量処方を、容易に達成することが可能である。さらに、微小粒子に捕捉されている、本発明にしたがったキメラペプチドの搬送はまた、微小粒子免疫原が外因性アジュバント／エマルジョン処方と混合されている場合、改善された有効性も提供することが可能である。
【００５５】
キメラペプチドの有効性は、動物、例えばマウスまたはラットに、ミョウバン中に処方されたキメラペプチドを注射し、そしてその後、内部ペプチド切断産物に対する免疫反応を追跡することによって、確立し、そして解析することが可能である。
【００５６】
本発明の別の側面は、１以上の本発明のキメラペプチドの免疫有効量、および薬学的に許容しうるキャリアー、賦形剤、希釈剤、またはアジュバントを含む補助剤を含む、免疫組成物を提供する。したがって、キメラペプチドは、アジュバント、薬学的に許容しうるキャリアー、賦形剤、希釈剤、補助剤、または免疫組成物中に日常的に提供される他の成分を用いた免疫組成物として、処方することが可能である。こうした処方は、一般の当業者によって、容易に決定することが可能であり、そして即時放出および持続放出のための処方、例えば微小被包が含まれる。本免疫組成物は、皮下、経口、筋内、あるいは他の非経口または内部経路を含む、いかなる好適な経路によって、投与することも可能である。同様に、ワクチンは、単一用量として投与しても、または投与のため多数の用量に分割してもよい。免疫スケジュールは、一般の当業者によって、容易に決定される。例えば、本発明で用いることが可能なアジュバントまたは乳化剤には、ミョウバン、不完全フロイント・アジュバント、リポシン（ｌｉｐｏｓｙｎ）、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、エマルシゲン（ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ）およびＩＳＡ７２０が含まれる。好ましい態様において、アジュバント／乳化剤は、ミョウバン、不完全フロイント・アジュバント、リポシンおよびサポニンの組み合わせ、スクアレンおよびＬ１２１の組み合わせ、またはエマルシグネド（ｅｍｕｌｓｉｇｎｅｄ）およびサポニンの組み合わせである。
【００５７】
本発明の免疫組成物は、１以上のキメラペプチドの免疫有効量および薬学的に許容しうるキャリアーを含む。投薬単位型中のこうした組成物は、体重ｋｇあたり、各ペプチド約０．５μｇから約１ｍｇを含むことが可能である。多用量で搬送される場合、投薬単位型は、好適に、投薬あたり、適切な量に分割される。
【００５８】
本発明の２以上のキメラペプチドのカクテルを含む免疫組成物は、より広い集団において、免疫有効性を増進し、そしてしたがって、アミロイドβなどの内部ペプチド切断産物に対するより優れた免疫反応を提供する。他の免疫刺激合成キメラペプチド免疫原は、強力なワクチン用に、内蔵のアジュバント原性（ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ）を提供するように、リポペプチド中への修飾を通じて生じる。本発明の合成キメラペプチド免疫原に対する免疫反応は、Ｏ’Ｈａｇｅｎら（１９９１）に記載される種類の生物分解性微小粒子内へのまたは該粒子上での包括を通じた搬送によって、改善することが可能である。免疫原は、Ｐａｍ3Ｃｙｓなどの共有結合脂質部分を含むアジュバントを伴いまたは伴わず、被包することが可能であり、そしてこうした微小粒子は、フロイントの不完全アジュバントまたはミョウバンなどの免疫刺激アジュバントと共に投与することが可能である。該微小粒子は、経口投与のため、および局所投与のため、免疫原に対する免疫反応を強化し、そして持続または定期的反応のための時間調節放出を提供するように作用する（Ｏ’Ｈａｇａｎら、１９９１）。
【００５９】
本発明のさらなる側面は、哺乳動物において、天然に存在する（ｎａｔｕｒａｌｌｙ−ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）場合、前駆体タンパク質または成熟タンパク質に由来する、天然に存在する内部ペプチド切断産物の未結合Ｎ末端および／または未結合Ｃ末端に対する免疫法である。この方法は、本発明にしたがって、内部ペプチド切断産物が自己分子である哺乳動物に、本発明のキメラペプチドを含む免疫組成物を投与することを伴う。この方法の好ましい態様は、方法が、βアミロイド前駆体タンパク質と交差反応しない抗Ｎ末端または抗Ｃ末端特異的アミロイドβ抗体を作成するため、アミロイドβペプチドに対して免疫することに向けられる場合のものである。この好ましい態様において、本方法に用いられるキメラペプチド（類）の式（Ｉ）および（ＩＩ）のＮおよび／またはＣは、アミロイドβペプチドのＮ末端および／またはＣ末端由来である。
【００６０】
本発明のさらなる側面は、本発明にしたがったキメラペプチドに特異的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体の抗原結合部分を含む分子である。この分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでキメラペプチドに対して作成された抗体であってもよいし、または抗原結合部分を含む抗体の断片、いずれかのアイソタイプのキメラまたはヒト化免疫グロブリン分子と共に、一本鎖抗体を含むよう意図される、組換え抗体であってもよい。
【００６１】
キメラ抗体は、その異なる部分が、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するヒト化抗体などの、異なる動物種に由来する分子であると理解される。キメラ抗体およびその産生法は、当該技術分野に公知である。例えば、キメラ抗体を産生するため、抗体の可変領域をコードするＤＮＡを、他の抗体をコードするＤＮＡ中に挿入しても、または該ＤＮＡに連結してもよい（米国特許４，８１６，５６７；  Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９）。
【００６２】
一本鎖抗体は、末端特異的ペプチド結合能を有し、そして免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変領域に相同な、または類似のアミノ酸配列対を含む（連結されたＶH−ＶLまたは一本鎖Ｆｖ）、一本鎖混成ポリペプチドであってもよい。ＶHおよびＶLはどちらも、天然モノクローナル抗体配列をコピーしてもよいし、あるいは鎖の１つまたは両方が、米国特許５，０９１，５１３に記載される種類のＣＤＲ−ＦＲ構築物を含んでもよい。軽鎖および重鎖の可変領域に類似の別個のポリペプチドは、ペプチドリンカーによって共に保持される。こうした一本鎖抗体、例えば一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）の産生法は、特に、ＶHおよびＶL鎖のポリペプチド構造をコードするＤＮＡが性質決定されているか、または配列解析によって容易に確認することが可能である場合、例えば米国特許４，９４６，７７８、米国特許５，０９１，５１３、米国特許５，０９６，８１５、Ｂｉｏｃｃａら（１９９３）、Ｄｕａｎら（１９９４）、Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒら（１９９５）、Ｍａｒａｓｃｏら（１９９３）、およびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎら（１９９５）に記載される方法にしたがって、達成することが可能である。
【００６３】
ｉｎ  ｖｉｖｏで抗体を作成する慣用法に加え、抗体は、ファージディスプレー技術を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生することが可能である。組換え抗体の産生は、慣用的な抗体産生に比較して、はるかに迅速であり、そして桁外れの数の抗原に対して生成することが可能である。対照的に、慣用法において、多くの抗原が非免疫原性であるかまたは非常に毒性であることが証明されており、そしてしたがって、動物において抗体を生成するのに用いることが不可能である。さらに、組換え抗体の親和性成熟（すなわち親和性および特異性の増加）は、非常に単純であり、そして比較的迅速である。最後に、特定の抗原に対する多数の異なる抗体を、１つの選択法で生成することが可能である。組換えモノクローナル抗体を生成するため、すべてファージディスプレーライブラリーに基づく多様な方法を用いて、異なる抗原認識部位を持つ抗体の大きなプールを生成することが可能である。こうしたライブラリーは、いくつかの方法で作成することが可能である：重鎖生殖系列遺伝子のプールにおける合成ＣＤＲ３領域をクローニングし、そしてしたがって、多様な特異性を持つ組換え抗体断片を選択することが可能な大きな抗体レパトアを生成することによって、合成レパトアを生成することが可能である。抗体ライブラリーの構築のための出発材料としてヒトのリンパ球プールを使用してもよい。ヒトＩｇＭ抗体の未処置レパトアを構築し、そしてこうして、非常に多様なヒトライブラリーを生成することが可能である。この方法は、異なる抗原に対する多数の抗体を選択するのに広く用いられ、成功してきている。
【００６４】
本発明のさらに別の側面は、内部ペプチド切断産物が自己分子である哺乳動物、好ましくはヒトに、本発明にしたがったキメラペプチドに特異的な抗体の抗原結合部分を含む分子を投与することを伴う、受動免疫法である。この方法の好ましい態様は、方法が、その抗原結合部分がアミロイドβペプチドに末端特異的である分子で受動免疫することに向けられるものである。
【００６５】
これで、本発明は完全に説明され、本発明は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、そして過度の実験を伴わずに、広い範囲の同等のパラメーター、濃度および条件内で、行うことが可能であることが、当業者によって、認識されるであろう。
【００６６】
本発明は、その特定の態様と関連して記載されているが、さらなる修飾が可能であることが理解されるであろう。本出願は、一般的に、本発明の原理にしたがい、本発明のいかなる変動、使用、または適応も含むよう意図され、そして本発明が関与する技術内の既知のまたは習慣的な実施内にあるような、そして付随する請求項の範囲内に示される、先の本質的な特徴に適用可能であるような、本発明からの逸脱を含む。
【００６７】
本明細書に引用されるすべての参考文献は、学術誌論文または抄録、公開または対応する米国または外国特許出願、発行米国または外国特許、あるいは他のいかなる参考文献も含めて、完全に本明細書に援用され、これは引用される参考文献に示される、すべてのデータ、表、図、および本文を含む。さらに、本明細書に引用される参考文献中に引用される参考文献の全内容もまた、本明細書に完全に援用される。
【００６８】
既知の方法工程、慣用法工程、既知の方法または慣用法への言及は、いかなる点でも、本発明の側面、説明または態様のいずれかが、相当する技術に開示され、解説されるかまたは示唆されていることの承認ではない。
【００６９】
特定の態様の前述の説明は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするため、当該技術分野の技術内の知識（本明細書に引用される参考文献の内容を含む）を適用することによって、多様な適用のため、過度の実験なしに、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、こうした特定の態様を容易に修飾し、そして／または適応させることが可能である。したがって、こうした適応および修飾は、本明細書に提示される解説および手引きに基づき、開示される態様の意味および同等物の範囲内であるよう意図される。本明細書の言葉遣いまたは用語は、説明の目的のためのものであり、そして限定のためのものではなく、本明細書の用語または言葉遣いは、本明細書に提示される解説および手引きを、一般の当業者の知識と組み合わせて考慮して、当業者が解釈するためのものであることを理解すべきである。
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、β−アミロイド前駆体タンパク質（βＡＰＰ）およびα、β、γ−セクレターゼ切断産物の図式的描写を示す。多様なドメインの一般的な位置が、α、β、およびγ−セクレターゼの切断部位に沿って示される。
【図２】  図２は、アミロイド−βペプチド（Ａβ）が由来するβＡＰＰの領域の部分的アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を示す。矢印は、α−、β−、およびγ−セクレターゼ切断部位を示す。
【配列表】
0004804690.tif 000003
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【図１】
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【図２】
0004804690.tif 000011