(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
既知の定常領域を各々の末端に有する複数の核酸分子を調製する方法であって、以下：
a) 核酸分子を含むサンプルを取得する工程；
b) プライマーの集団に対して該核酸分子を供して核酸分子／プライマー混合物を形成する工程であって、ここで該プライマーの集団が、自己非相補的でありかつ該集団内の他のプライマーに対して非相補的であり、そして５’から３’方向に定常領域および可変領域を含み、ここで該定常領域の配列が、集団の複数のプライマー間で同一である既知の配列を有し、そして該可変領域においてシトシンおよびチミジン、グアニンおよびアデニン、アデニンおよびシトシン、ならびにグアニンおよびチミジンからなる群から選択される２種類の非相補的ヌクレオチドがランダムに配列しており、さらに該定常領域および可変領域の配列が、工程c)で用いられる条件下で該プライマーの集団がクロスハイブリダイゼーションまたは自己ハイブリダイゼーションしないように、アデニンおよびグアニン、アデニンおよびシトシン、グアニンおよびチミジン、ならびにシトシンおよびチミジンからなる群より選択される2種類の非相補的ヌクレオチドを含む、工程；ならびに
c) 該核酸分子／プライマー混合物をポリメラーゼに供する工程であって、該供する工程が各々の末端に既知の定常領域を含む複数の分子を生成する条件下である、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記核酸分子が一本鎖核酸分子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一本鎖核酸分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡキメラを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸分子が二本鎖核酸分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記二本鎖核酸分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡキメラである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記核酸分子が一本鎖核酸分子および二本鎖核酸分子の混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記一本鎖核酸分子がＲＮＡでありそして前記二本鎖核酸分子がＤＮＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法が、d) 複数の分子を増幅して、増幅された分子を生成する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記増幅する工程がポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記定常領域および可変領域が、グアニンおよびアデニンからなる、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記定常領域および可変領域が、シトシンおよびチミジンからなる、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
前記定常領域および可変領域が、アデニンおよびシトシンからなる、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記定常領域および可変領域が、グアニンおよびチミジンからなる、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記定常領域が６〜１００ヌクレオチド長である、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
前記可変領域が４ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド長である、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
前記プライマーの集団がさらに、その３’末端に０〜３個のランダムな塩基を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
前記定常領域および可変領域がそれぞれ、グアニンおよびチミジンからなり、そして前記プライマーの集団が３’末端に０個、１個、２個または３個のランダムな塩基を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリメラーゼが鎖交換性ポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
請求項18に記載の方法であって、ここで、前記鎖交換性ポリメラーゼが、φ２９ポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、９°Ｎｍポリメ ラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ヒトＨＩＶ逆転写酵素、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損した変異型Ｔ７ファージＤＮＡポリメラーゼ、またはこれらの混合物である、方法。
【請求項２０】
前記鎖交換性ポリメラーゼがクレノウ Ｅｘｏ−である、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記鎖交換性ポリメラーゼが３’−−>５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損した変異型Ｔ７ファージＤＮＡポリメラーゼである、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
前記鎖交換性ポリメラーゼがＭＭＬＶ逆転写酵素である、請求項19に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、前記核酸分子／プライマー混合物を、ポリメラーゼの連続移動性を増強する化合物に供する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物が一本鎖化ＤＮＡ結合性タンパク質またはヘリカーゼである、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記混合物をポリメラーゼに供する工程が、ＧＣ−リッチなＤＮＡおよび／またはＲＮＡを介した重合反応を促進する１つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記薬剤がジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、７−デアザ−ｄＧＴＰ、またはそれらの混合物を含む、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記増幅する工程が、ＧＣ−リッチなＤＮＡを介した重合反応を促進する１つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項8に記載の方法。
【請求項２８】
前記薬剤がＤＭＳＯ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、ベタイン、またはそれらの混合物を含む、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記集団のプライマーの各々が同一の定常領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
２つ以上の定常領域がプライマーの集団中に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
請求項8に記載の方法であって、ここで前記方法が以下の工程：
増幅された分子を修飾して修飾ヌクレオチド塩基を組み込み、これによって標識化分子を生成する工程であって、該増幅された分子がさらに一本鎖ＤＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、またはそれらの混合物として規定される、工程；
該標識化分子から一本鎖分子を生成する工程であって、該一本鎖分子が基材上の既知の位置に整列された相補的配列にハイブリダイズし得る、工程；および
少なくとも１つのハイブリダイゼーション信号を分析する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項３２】
前記修飾する工程が修飾ヌクレオチド塩基の化学的組み込み、酵素的組み込みまたは物理的組み込みを包含する、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記修飾塩基が放射性または蛍光性である、請求項31に記載の方法。
【請求項３４】
前記生成する工程が、前記二本鎖分子の変性を含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３５】
前記基材がマイクロアレイ基材を含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３６】
前記分析する工程が、少なくとも１つのハイブリダイゼーション信号のバックグラウンドを差し引いた強度を測定する工程を包含する、請求項31に記載の方法。
【請求項３７】
前記分析する工程が、増幅されたライブラリーのコピー数の測定を含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３８】
ポリシトシン（ポリＣ）またはポリグアニン（ポリＧ）を含む８〜３０塩基長のホモポリマー性配列が、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの使用を介して前記増幅された分子の末端に取り込まれる、請求項8に記載の方法。
【請求項３９】
ホモポリマー性のポリＣまたはポリＧを含む増幅された分子が、核酸分子中の所望の配列に対して相補的な第1のプライマーおよびポリＣまたはポリＧに対して相補的な第2のプライマーを使用してさらに増幅される、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
少なくともいくつかの増幅されたＤＮＡが、配列決定、ハイブリダイゼーションまたはその両方にさらに供される、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
ホモポリマー性配列ポリＣまたはポリＧを含む増幅された分子が、核酸分子中の異なる所望の配列に対して相補的であるプライマーおよびポリＣプライマーまたはポリＧプライマーの混合物を用いてさらに増幅される、請求項38に記載の方法。
【請求項４２】
いくつかの増幅された所望のＤＮＡ分子の混合物が、配列決定、ハイブリダイゼーションまたはその両方にさらに供される、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
前記段階c)が、単一等温工程を含む等温条件下で行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項４４】
前記等温工程が、12℃〜42℃の間の温度で行われる、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
前記等温工程が、12℃〜37℃の間の温度で行われる、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
前記段階c)が、12℃〜42℃の間の温度の連続等温工程を含む等温条件下で行われる、請求項1記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年３月７日に出願された米国仮特許出願第６０／４５３，０６０号への優先権を主張し、この出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、遺伝学、分子生物学、遺伝子型決定、および発現プロフィール形成の分野に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、当初のゲノムまたは転写された配列の偏りのない表現である産物を生じるＤＮＡまたはｃＤＮＡの増幅のための方法に関し、ここで、これらの方法は、プライマーダイマーを実質的に形成し得ないプライマーを利用する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
遺伝学研究のために、ＤＮＡサンプルの質および量は重要である。高スループット遺伝子分析は、試験のために大量のテンプレートを必要とする。しかし、例えば、個々の患者サンプルから抽出されるＤＮＡの量は限られている。ＤＮＡサンプルサイズはまた、法医学および古生物学の作業を制限する。従って、完全ゲノムを増幅するための-方法を開発することで一致した努力が存在している。全ゲノム増幅（ＷＧＡ）の目的は、種々の手順、ならびに将来の作業および患者サンプルの記録保管のための長期間貯蔵に十分な量のゲノム配列を提供することである。自動化可能で、頑丈な、表示様式で、完全ゲノムを増幅することの明らかな必要性が存在している。全ゲノム増幅は、歴史的には、３の技法：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換、または細胞不死化の１つを用いて達成されている。
【０００４】
（ＰＣＲＴＭ）
ＰＣＲＴＭは、ＤＮＡを増幅するための強力な技法である（Ｓａｉｋｉ、１９８５）。このインビトロ技法は、熱変性、プライマーアニーリングおよびポリメラーゼ伸長を繰り返すことによってＤＮＡを増幅し、それによって、単一の標的ＤＮＡ分子を検出可能な量に増幅する。ＰＣＲＴＭは、ヒトでは長さが約１０８塩基である完全染色体のような長いＤＮＡ分子の増幅には受け入れられない。ＰＣＲ反応で一般に用いられるポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼであり、これは、約５０００塩基より大きなＤＮＡの領域を増幅することはできない。さらに、増幅標的に隣接する正確なヌクレオチド配列の知識が、このＰＣＲ反応に用いられるプライマーを設計するために必要である。
【０００５】
（全ゲノムＰＣＲＴＭ）
全ゲノムＰＣＲＴＭは、ＤＮＡの完全プールまたは特異的プライマー結合部位間の未知の介在配列のいずれかの増幅を生じる。公知の増幅（Ｌｕｅｄｅｃｋｅら、１９８９）または一般の増幅（Ｔｅｌｅｎｉｕｓら、１９９２）と称される、ＤＮＡの完全プールの増幅は、異なる手段よって達成され得る。すべてのアプローチに共通するのは、ＰＣＲＴＭシステムが、特定のＤＮＡ配列に対する優先度なしに、反応混合物中のＤＮＡフラグメントを一致して増幅する能力である。全ゲノムＰＣＲＴＭのために用いられるプライマーの構造は、全体として縮重（すなわち、すべてのヌクレオチドがＮ、Ｎ＝Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃと称されている）、部分的に縮重（すなわち、いくつかのヌクレオチドがＮと称されている）または非縮重（すなわち、すべての位置が規定されたヌクレオチドを示す）と記載されている。
【０００６】
全ゲノムＰＣＲＴＭは、総ゲノムＤＮＡを、ＰＣＲによって増幅され得る形態への変換を含む（ＫｉｎｚｌｅｒおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、１９８９）。この技法では、総ゲノムＤＮＡは、せん断、または、例えば、ＭｏｂＩのような制限酵素を用いる酵素的消化を経由して平均サイズ２００〜３００塩基対にフラグメント化される。これらのＤＮＡの末端は、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントとのインキュベーションにより平滑とされる。これらＤＮＡフラグメントは、インビトロで合成された２０塩基対ＤＮＡフラグメントからなる捕獲リンカーに連結される。これらの捕獲リンカーは、２つのリン酸化オリゴマー：５’−ＧＡＧＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＡＴＡＴＣＴＡ−３’（配列番号１）および５’−ＧＡＧＡＴＡＴＴＡＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴＣ−３’（配列番号２）からなる。自己連結された「捕獲」リンカーに対して選択するために、この連結産物はＸｈｏＩで切断される。各捕獲リンカーは、その末端にＸｈｏＩ部位の半分を有し；従って、ＸｈｏＩは、それら自身に連結した捕獲リンカーを切断するが、大部分のゲノムＤＮＡフラグメントに連結した捕獲リンカーを切断しない。この連結されたＤＮＡは、プライマーとして捕獲オリゴマーを用いてＰＣＲＴＭによって増幅され得る形態にある。目的のＤＮＡは、次に、特異的タンパク質または核酸への結合を介して選択され、および回収され得る。特異的に結合された小量のＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲＴＭを用いて増幅され得る。選択および増幅のステップは、所望の純度を達成するために必要な頻度で繰り返され得る。０．５ｎｇの出発ＤＮＡは５０００倍に増幅されたが、ＫｉｎｚｌｅｒおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ（１９８９）は、より小さなフラグメントの増幅に向かう偏りを報告した。
【０００７】
（非縮重プライマーを用いる全ゲノムＰＣＲＴＭ）
（孤立リンカーＰＣＲＴＭ）
２つの相補的プライマーの自己ハイブリダイゼーションに起因する従来の捕獲リンカーの非効率性のため、プライマーの非対称リンカーが設計された（Ｋｏら、１９９０）。捕獲リンカーオリゴヌクレオチドの配列（ＫｉｎｚｌｅｒおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、１９８９）の配列が、１つの鎖の３’−末端から欠失した３塩基の配列を除いて用いられた。この「孤立リンカー（ｌｏｎｅ  ｌｉｎｋｅｒ）」は、非パリンドローム突出末端および平滑末端の両方を有し、それ故、リンカーのマルチマー化を防ぐ。さらに、リンカーの配向が規定されたとき、単一のプライマーが増幅ために十分であった。４塩基切断酵素を用いた消化後、これら孤立リンカーが連結された。孤立リンカーＰＣＲＴＭ（ＬＬ−ＰＣＲＴＭ）は、同様の効率で増幅されることが報告された１００塩基から約２ｋｂの範囲のフラグメントを生成する。
【０００８】
（散在反復配列ＰＣＲ）
ＤＮＡの一般増幅のために用いられるとき、散在反復配列ＰＣＲＴＭ（ＩＲＳ−ＰＣＲＴＭ）は、ゲノム内の繰り返し配列に基づく非縮重プライマーを用いる。これは、適切に配置された繰り返し間のセグメントの増幅を可能にし、そしてヒトの染色体特異的ライブラリーおよび領域特異的ライブラリーを生成するために用いられている（Ｎｅｌｓｏｎら、１９８９）。ＩＲＳ−ＰＣＲＴＭはまた、Ａｌｕ要素媒介−ＰＣＲＴＭ（ＡＬＵ−ＰＣＲＴＭ）と呼ばれ、これは、Ａｌｕ繰り返しファミリーの最も保存された領域に基づくプライマーを用い、そしてこれら配列によって隣接されるフラグメントの増幅を可能にする（Ｎｅｌｓｏｎら、１９８９）。ＩＲＳ−ＰＣＲＴＭの主要な欠点は、Ａｌｕファミリーのような豊富な繰り返し配列が、ヒトゲノムの全体に均一に分布されておらず、特定領域（例えば、ヒト染色体の軽鎖）に優勢に見出されていることである（ＫｏｒｅｎｂｅｒｇおよびＲｙｋｏｗｓｋｉ、１９８８）。従って、ＩＲＳ−ＰＣＲＴＭは、これらの領域に向かう偏り、およびその他のより少なく現れる領域の増幅の欠如を生じる。さらに、この技法は、目的のゲノム中の豊富な繰り返しファミリーの存在の知識に依存している。
【０００９】
（リンカーアダプターＰＣＲＴＭ）
ＩＲＳ−ＰＣＲＴＭの制限は、リンカーアダプター技法（ＬＡ−ＰＣＲＴＭ）を用いてある程度和らげられる（Ｌｕｅｄｅｃｋｅら、１９８９；Ｓａｕｎｄｅｒｓら、１９８９；ＫａｏおよびＹｕ、１９９１）。この技法は、未知の制限酵素ＤＮＡフラグメントを、連結された二重鎖オリゴヌクレオチド（リンカーアダプター）の支援により増幅する。ＤＮＡは、ＲｓａＩのような頻繁に切断する制限酵素で一般に消化され、長さ平均５００ｂｐであるフラグメントを生じる。連結後、ＰＣＲＴＭが、アダプターの配列に相補的なプライマーを用いて実施され得る。温度条件は、相補的ＤＮＡ配列のアニーリングを特異的に高めるように選択され、これは、これらアダプター間に位置する未知配列の増幅に至る。増幅後、これらフラグメントはクローン化される。ＬＡ−ＰＣＲＴＭでは、制限酵素部位間の距離の偏りに基づく以外の配列選択の偏りはほとんどない。ＬＡ−ＰＣＲＴＭの方法は、ＩＲＳ−ＰＣＲＴＭに共通の領域偏りおよび種依存性のハードルを克服する。しかし、ＬＡ−ＰＣＲＴＭは、その他の全ゲノム増幅（ＷＧＡ）法より技術的にはより困難である。
【００１０】
ヒト、マウス、および植物の染色体の多数のバンド特異的顕微解剖ライブラリーが、ＬＡ−ＰＣＲＴＭを用いて確立されている（Ｃｈａｎｇら、１９９２；Ｗｅｓｌｅｙら、１９９０；Ｓａｕｎｄｅｒｓら、１９８９；Ｖｏｏｉｊｓら、１９９３；Ｈａｄａｎｏら、１９９１；Ｍｉｙａｓｈｉｔａら、１９９４）。染色体の顕微解剖領域のＰＣＲＴＭ増幅は、制限酵素（例えば、Ｓａｕ３Ａ、ＭｂｏＩ）を用いる消化により実施され、多くの短いフラグメントを生成し、これらは、ＰＣＲＴＭ増幅のためのプライミング部位を提供するリンカー−アダプターオリゴヌクレオチドに連結される（Ｓａｕｎｄｅｒｓら、１９８９）。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化され、そして制限酵素によって生成された末端に相補的である５’−オーバーハングを生成した２つのオリゴヌクレオチドである２０マーおよび２４マーは、等モル量で混合され、そしてアニールされた。この増幅の後、１μｇ程度のＤＮＡが、多糸染色体から解剖された１つのバンド程度の小量から増幅され得る（Ｓａｕｎｄｅｒｓら、１９８９；Ｊｏｈｎｓｏｎ、１９９０）。リンカー−アダプターの染色体制限酵素フラグメントの各末端への連結は、インビトロ半保存的ＤＮＡ複製のために必要なプライマー結合部位を提供する。この技術のその他の適用は、１つのフローソートされたマウス染色体１１の増幅および得られるＤＮＡライブラリーの染色体ペインティングにおけるプローブとしての使用（Ｍｉｙａｓｈｉｔａら、１９９４）、および単一のフローソートされた染色体のＤＮＡの増幅（ＶａｎＤｅａｎｔｅｒら、１９９４）を含む。
【００１１】
ＰＣＲＴＭで用いられる異なるアダプターは、Ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅである（Ｒｉｌｅｙら、１９９０）。この技法は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）からの末端配列の単離に主として用いられている（Ｋｌｅｙｎら、１９９３；Ｎａｙｌｏｒら、１９９３；Ｖａｌｄｅｓら、１９９４）。Ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅは、制限酵素によって生成されたオーバーハングに相補的なオーバーハングを含む合成オリゴヌクレオチド二重鎖である。この二重鎖は、プライマー結合部位として非相補性の領域を含む。消化されたＹＡＣとＶｅｃｔｏｒｅｔｔｅ単位との連結の後、Ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅと同一であるプライマーと、酵母ベクターから由来するプライマーとの間で増幅が実施される。産物は、最初のＰＣＲＴＭサイクルにおいて、合成が上記酵母ベクタープライマーから起こり、それ故、ＹＡＣ挿入物の末端からの産物を合成する場合にのみ生成される。
【００１２】
（プライミング許可ランダムミスマッチ（Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ａｕｔｈｏｒｉｚｉｎｇ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）ＰＣＲＴＭ）
非縮重プライマーを用いる別の全ゲノムＰＣＲＴＭは、プライミング許可ランダムミスマッチＰＣＲＴＭ（ＰＡＲＭ−ＰＣＲＴＭ）であり、これは、特異的プライマーおよび非特異的アニーニング条件を用い、プライマーのランダムハイブリダイゼーションを生じ、ユニバーサル増幅に至る（Ｍｉｌａｎら、１９９３）。アニーリング温度は、最初の２サイクルについて３０℃まで減少され、そして引き続くサイクルで６０℃に高められ、生成されたＤＮＡフラグメントを特異的に増幅する。この方法は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）による同定のためにフローソートされたブタ染色体を汎用増幅するために用いられている（Ｍｉｌａｎら、１９９３）。類似の技法は、顕微解剖されたＤＮＡから染色体ＤＮＡクローンを生成するために用いられた（Ｈａｄａｎｏら、１９９１）。この方法では、任意の標的ＤＮＡをランダムにプライムし、かつ増幅する配列中に特有の２２マーが利用される。プライマーは、３つの制限酵素に対する認識部位を含んでいた。熱サイクリングは、３つのステージで行われ：ステージ１は、１２０分間、２２℃のアニーリング温度を有し、そしてステージ２および３は、ストリンジェントなアニーリング条件下で実施された。
【００１３】
（単一細胞比較ゲノムハイブリダイゼーション）
単一細胞レベルで、完全ゲノムの総合的な分析を可能にする方法が開発され、単一細胞総合的ゲノムハイブリダイゼーション（ＳＣＯＭＰ）と称されている（Ｋｌｅｉｎら、１９９９；ＷＯ００／１７３９０）。単一細胞からのゲノムＤＮＡは、ＭｓｅＩのような４塩基カッターでフラグメント化され、この４塩基が均一に分布されているという前提に基づき、２５６ｂｐ（４４）の期待される平均を与える。連結仲介ＰＣＲＴＭを利用して、この消化された制限酵素フラグメントを増幅した。要約すれば、２つのプライマー（（５’−ＡＧＴＧＧＧＡＴＴＣＣＧＣＡＴＧＣＴＡＧＴ−３’；配列番号３）；および（５’−ＴＡＡＣＴＡＧＣＡＴＧＣ−３’；配列番号４））；を互いにアニールし、２つの５’オーバーハングをもつアダプターを生成する。より短いオリゴから生じる５’オーバーハングは、ＭｓｅＩ切断によって生成されるＤＮＡフラグメントの末端に相補的である。このアダプターを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて上記消化されたフラグメントに連結した。より長いプライマーのみがこのＤＮＡフラグメントに連結された。なぜなら、より短いプライマーは、連結に必要な５’リン酸を有さなかったからである。連結後、第２のプライマーは変性により除去され、そして第１のプライマーは、上記消化されたＤＮＡフラグメントに連結されたままであった。得られる５’オーバーハングは、ＤＮＡポリメラーゼの添加によりフィルインされた。得られる混合物を、次いで、上記より長いプライマーを用いてＰＣＲＴＭによって増幅した。
【００１４】
この方法は、制限酵素消化に依存してゲノムＤＮＡをフラグメント化するので、ＤＮＡ中の制限酵素部位の分布に依存している。非常に小さい制限酵素フラグメントおよび非常に長い制限フラグメントは、効率的に増幅されず、偏った増幅を生じる。ＭｓｅＩ切断によって生成された２５６の平均フラグメント長さは、増幅するには短か過ぎる多数のフラグメントを生じる。
【００１５】
（縮重プライマーを用いる全ゲノムＰＣＲＴＭ）
ユニバーサル増幅のために非縮重プライマーを用いる多くの技法にともなう困難性を克服するために、部分的または全体的縮重プライマーを用いる技法が、微小量のＤＮＡのユニバーサル増幅のために開発された。
【００１６】
（縮重オリゴヌクレオチドプライムＰＣＲＴＭ）
縮重オリゴヌクレオチドプライムＰＣＲＴＭ（ＤＯＰ−ＰＣＲＴＭ）が、部分的縮重プライマーを用いて開発され、それ故、ＩＲＳ−ＰＣＲより一般的な増幅技法を提供する（Ｗｅｓｌｅｙら、１９９０；Ｔｅｌｅｎｉｕｓ、１９９２）。システムは、非特異的プライマー（５’−ＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＴＮＮＮＮＴＴＣ−３’（配列番号５）；３’末端から位置４、５、６および７で完全縮重を示す）を用いて記載された（Ｗｅｓｌｅｙら、１９９０）。３’末端における３つの特異的塩基は、６４（４３）塩基毎にハイブリダイズすることが統計学的に予期され、従って、最後の７つの塩基が、上記プライマーの部分的縮重に起因して一致する。増幅の最初のサイクルは、低アニーリング温度（３０℃）で行われ、テンプレートに沿って頻繁な間隔でＤＮＡ合成を開始するために十分なプライミングを可能にする。このプライマーの３’末端にある規定された配列は、開始部位を分離する傾向にあり、それ故、産物のサイズを増加する。このＰＣＲ産物分子はすべて、共通の特異的５’配列を含むので、最初の８サイクルの後、アニーリング温度は５６℃に高められる。このシステムは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａから顕微解剖された染色体ＤＮＡを非特異的に増幅するために開発され、上記のＬｕｅｄｅｃｋｅら（１９８９）のマイクロクローニングシステムを置換した。
【００１７】
用語ＤＯＰ−ＰＣＲＴＭは、フローソートされた染色体を用いるゲノムマッピング研究のための方法を開発したＴｅｌｅｎｉｕｓらによって導入された（１９９２）。単一のプライマーが、ＤＯＰ−ＰＣＲＴＭが、Ｗｅｓｌｅｙ（１９９０）らによって用いられたように用いられる。このプライマー（５’−ＣＣＧＡＣＴＣＧＡＣＮＮＮＮＮＮＡＴＧＴＧＧ−３’（配列番号６）；は、３’−末端上の６つの特異的塩基、中央にある６塩基の縮重部分および５’−末端にある稀な制限酵素部位をもつ特異的領域を示す。増幅は、２つのステージで起こる。ステージ１は、低温サイクルを包含する。最初のサイクルにおいて、プライマーの３’−末端は、低アニーリング温度によって開始された標的ＤＮＡの複数部位にハイブリダイズする。第２のサイクルでは、相補的配列が、上記プライマーの配列に従って生成される。ステージ２では、プライマーアニーリングは、すべての非特異的ハイブリダイゼーションを制限する温度で実施される。１０までの低温度サイクルが実施されて十分なプライマー結合部位を生成する。４０までの高温サイクルが付加されて優勢な標的フラグメントを特異的に増幅する。
【００１８】
ＤＯＰ−ＰＣＲＴＭは、ＰＣＲＴＭプロトコールの開始の低アニーリング温度の間に用いられた部分的縮重オリゴヌクレオチドの３’−末端によって特定される短い配列からプライミングする原理に基づく。これらの短い配列は頻繁に存在するので、標的ＤＮＡの増幅は、複数の遺伝子座で同時に進行する。ＤＯＰ−ＰＣＲＴＭは、高レベルの単一コピー配列を含むライブラリーの生成に適用可能であり、相当量の提供された非汚染ＤＮＡが得られ得る（例えば、フローソートされた染色体）。この方法は、１ナノグラムより少ない出発ゲノムＤＮＡに適用された（ＣｈｅｕｎｇおよびＮｅｌｓｏｎ、１９９６）。
【００１９】
全体が縮重するプライマーのシステムと比較したＤＯＰ−ＰＣＲＴＭの利点は、より高い効率の増幅、非特異的プライマー−プライマー結合の減少した機会、および、さらなる分子操作のための５’末端における制限酵素部位の利用可能性である。しかし、ＤＯＰ−ＰＣＲＴＭは、標的ＤＮＡをその全体で複製することを必要としない（ＣｈｅｕｎｇおよびＮｅｌｓｏｎ、１９９６）。さらに、比較的短い産物が生成されるので、長さが約５００ｂｐまでのフラグメントの特異的増幅が生成される（Ｔｅｌｅｎｉｕｓら、１９９２；ＣｈｅｕｎｇおよびＮｅｌｓｏｎ、１９９６；Ｗｅｌｌｓら、１９９９；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃｅｓｐｅｄｅｓら、１９９８；Ｃｈｅｕｎｇら、１９９８）。
【００２０】
これらの制限を考慮して、サイズが０．５〜７ｋｂの範囲の長いＤＯＰ−ＰＣＲＴＭ産物を生成する方法が記載され、引き続くＰＣＲで長い配列標的の増幅を可能にしている（Ｂｕｃｈａｎａｎら、２０００）。しかし、長いＤＯＰ−ＰＣＲは、２００ｎｇのゲノムＤＮＡを利用し、これは、大部分の適用が入手可能であるより多いＤＮＡである。引き続き、低ＤＮＡ量ＤＯＰ−ＰＣＲＴＭ（ＬＬ−ＤＯＰ−ＰＣＲＴＭ）と称される、ピコグラム量のゲノムＤＮＡから長い増幅産物を生成する方法が記載された（Ｋｉｔｔｌｅｒら、２００２）。この方法は、これを、より長い産物を生成するために必要なステップである、ＤＮＡポリメラーゼＰｗｏの３’−５’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性、およびＤＯＰ−ＰＣＲＴＭの間の増加したアニーリングおよび伸長時間によって達成する。成功率における改良が、その他のＤＯＰ−ＰＣＲＴＭ法と比較して示されたが、この方法は、失敗の大部分が完全遺伝子座のドロップアウト、そして残りの遺伝子型失敗が散発性遺伝子座ドロップアウトおよび対立遺伝子座ドロップアウトであることに起因して１５．３％の失敗率を有していた。遺伝子座を横切る失敗の発生に対するランダムな期待値からの有意な偏差が存在し、それ故、全ゲノム適用範囲に対する遺伝子座依存性の効果を示した。
【００２１】
（配列独立ＰＣＲＴＭ）
縮重プライマーを用いる別のアプローチが、Ｂｏｈｌａｎｄｅｒら（１９９２）によって記載され、配列独立ＤＮＡ増幅（ＳＩＡ）と呼ばれている。ＤＯＰ−ＰＣＲＴＭと対照的に、ＳＩＡは、ネストされたＤＯＰ−プライマーシステムを取り込む。第１のプライマー（５’−ＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＡＮＮＮＮＮ−３’（配列番号７）；は、５塩基のランダム３’−セグメント、および制限酵素部位を含む５’末端の特異的１６塩基セグメントから構成された。ＰＣＲＴＭのステージ１は、変性のための９７℃で開始し、４℃への冷却が続き、プライマーを複数のランダム部位にアニールさせ、そして次に３７℃に加熱する。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。第２の低温度サイクルでは、プライマーは、この第１ラウンドの産物にアニールする。ＰＣＲＴＭの第２のステージでは、プライマー（５’−ＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣ−３’（配列番号８）；が用いられ、これは、３’末端に、プライマーＡの１５の５’塩基を含む。５サイクルが、このプライマーを用い、４２℃の中間のアニーリング温度で実施される。さらなる３３サイクルが、５６℃の特異的アニーリング温度で実施される。ＳＩＡの産物は、２００ｂｐ〜８００ｂｐの範囲である。
【００２２】
（プライマー伸長予備増幅）
プライマー伸長予備増幅（ＰＥＰ）は、ゲノムのユニバーサル増幅を達成するために全体縮重プライマーを用いる方法である（Ｚｈａｎｇら、１９９２）。ＰＥＰは、プライマーとして、１５塩基の完全に縮重したオリゴヌクレオチドのランダム混合物を用い、従って、各位置で４つの可能な塩基のいずれか１つが存在し得る。理論的には、このプライマーは、４×１０９の異なるオリゴヌクレオチド配列の混合物から構成される。これは、ランダムに分布した部位からのＤＮＡ配列の増幅に至る。５０サイクルの各々において、テンプレートは、最初、９２℃で変性される。引き続き、プライマーが、低温度（３７℃）でアニールされ、これは、次に、５５℃に連続的に増加され、そしてポリメラーゼ伸長のためにさらに４分間保持される。
【００２３】
改良されたＰＥＰ（Ｉ−ＰＥＰ）の方法が、主に慣用的な病理学で用いられる組織切片からの腫瘍の調査のために、ＰＥＰの効率を増加するよう開発され、複数マイクロサテライト調査および単一または数個の細胞での配列決定調査を信頼性良く実施した（Ｄｉｅｔｍａｉｅｒら、１９９９）。Ｉ−ＰＥＰは、ＰＥＰ（Ｚｈａｎｇら、１９９２）とは、細胞溶解アプローチ、改良された熱サイクル条件、およびより高い忠実度のポリメラーゼの添加において異なっている。詳細には、細胞溶解は、ＥＬ緩衝液中で実施され、Ｔａｑポリメラーゼが、プルーフリーディングＰｗｏポリメラーゼと混合され、そして９４℃での変性ステップの前に、６８℃で３０秒間のさらなる伸長工程が付加される。この方法は、１細胞〜５細胞からのＤＮＡの増幅でＰＥＰおよびＤＯＰ−ＰＣＲＴＭより効率的であった。
【００２４】
ＤＯＰ−ＰＣＲＴＭおよびＰＥＰの両方は、種々の遺伝子試験およびアッセイへの前駆体として首尾良く用いられている。これらの技法は、ＤＮＡ量が限られる法医学および遺伝子病診断の分野に統合されている。しかし、いずれの技法も、ＤＮＡをその全体で複製することをしない（ＣｈｅｕｎｇおよびＮｅｌｓｏｎ、１９９６）か、または特定遺伝子座の完全な適用範囲を提供することをしない（Ｐａｕｎｉｏら、１９９６）。これらの技法は、遺伝子型決定またはマーカー識別のための増幅された供給源を生成する。これら方法により生産される産物は一致して短く（＜３ｋｂ）、そしてそれ故、多くの適用で用いることはできない（Ｔｅｌｅｎｉｕｓら、１９９２）。さらに、多くの試験は、２〜３のマーカーまたは遺伝子座を調査することを必要とする。
【００２５】
（タグ化ＰＣＲＴＭ）
タグ化ＰＣＲＴＭ（Ｔ−ＰＣＲＴＭ）は、４００ｂｐ〜１．６ｋｂの範囲のサイズの小量のＤＮＡサンプルから効率的に増幅するため、ＰＥＰの増幅効率を増加するよう開発された（Ｇｒｏｔｈｕｅｓら、１９９３）。Ｔ−ＰＣＲＴＭは、２ステージ戦略であり、これは、最初の２〜３の低ストリンジェントサイクルのために、５’末端に一定１７塩基対をもつプライマー、および３’末端に９〜１５のランダム塩基を含むタグ化ランダムプライマーを用いる。最初のＰＣＲＴＭステップでは、このタグ化されたランダムプライマーを用いて、両末端にタグ化プライマー配列をもつ産物を生成し、これは、低アニーリング温度を用いることにより達成される。取り込まれなかったプライマーは、次いで除去され、そして増幅が、第１のプライマーの一定５’配列のみを含む第２のプライマーを用いて高ストリンジェンシー条件下で実施され、指数的増幅を可能にする。この方法は、取り込まれなかった縮重プライマーの除去を必要とすることに起因して、その他の方法より労働集約的であり、これはまた、サンプル材料の損失を引き起こし得る。これは、ナノグラム以下の量のＤＮＡテンプレートを用いるとき、重要である。この精製ステップの間のテンプレートの避けられない損失は、Ｔ−ＰＣＲＴＭの適用範囲に影響し得る。さらに、１２以上のランダム塩基をもつタグ化プライマーは、プライマー−プライマー伸長または濾過ステップの間にこれらより長いプライマーを除去する効率がより低いことから生じる非特異的産物を生成し得る。
【００２６】
（タグ化ランダムヘキサマー増幅）
Ｔ−ＰＣＲＴＭに関連する問題を基に、タグ化ランダムヘキサマー増幅（ＴＲＨＡ）が、より短いランダム塩基をもつタグ化ランダムプライマーを用いることが有利であろうことを前提に開発された（Ｗｏｎｇら、１９９６）。ＴＲＨＡでは、最初のステップは、ｐＮＬ１プラスミドからサイズが分布したＤＮＡ分子の集団を生成することである。これは、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、および５’−末端にＴ７プライマーでタグ化されたランダムヘキサマー（Ｔ７−ｄＮ６、５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＮＮＮＮＮＮ−３’（配列番号９）；を用いるランダム合成反応を経由して実施された。Ｋｌｅｎｏｗで合成された分子（サイズ範囲２８ｂｐ〜＜２３ｋｂ）は、次いで、Ｔ７プライマー（５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ−３’（配列番号１０）で増幅された。偏りの調査は、当初のＤＮＡテンプレートの７６％のみが優勢に増幅され、そしてＴＲＨＡ産物で代表されたことを示した。
【００２７】
（鎖置換）
ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）は、プラスミドおよび細菌ファージＤＮＡのような大きな環状ＤＮＡテンプレートを増幅するために開発された（Ｄｅａｎら、２００１）。長さ７０ｋｂのＤＮＡ鎖を合成するφ２９ＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムエキソヌクレアーゼ耐性ヘキサマープライマーを用い、ＤＮＡを３０℃の等温反応中で増幅した。第２のプライミング事象は、置換された産物ＤＮＡ鎖上で生じ、鎖置換を経由する増幅を生じる。
【００２８】
この技法では、２つのセットのプライマーが用いられる。右のセットのプライマーの各々は、標的ヌクレオチド配列の１つの側面に隣接するヌクレオチド配列に相補的な部分を有し、そして左のセットのプライマー中のプライマーの各々は、標的ヌクレオチド配列の他方の側面に隣接するヌクレオチド配列に相補的な部分を有する。この右のセット中のプライマーは、標的ヌクレオチド配列を含む核酸分子の１つの鎖に相補的であり、そして左セット中のプライマーは、反対の鎖に相補的である。両方のセット中のプライマーの５’末端は、これらプライマーが上記核酸分子中の隣接配列にハイブリダイズするとき、目的の核酸配列の遠位方向にある。理想的には、各セットの各メンバーは、上記標的ヌクレオチド配列に隣接する別個かつ非重複ヌクレオチド配列に相補的な部分を有する。増幅は、各プライマーで開始され、そして標的核酸配列を通って継続することによって進行する。この方法の鍵となる特徴は、複製の間に介在するプライマーの置換である。一旦、右のセットのプライマーから伸長された核酸鎖が、左のセットのプライマーがハイブリダイズする核酸分子の領域に到達すると、そして逆の場合も同様であるが、別のラウンドのプライミングおよび複製が始まる。これは、合成されるべき標的核酸配列のネストされたセットの複数コピーを可能にする。
【００２９】
（複数置換増幅）
ＲＣＡの原理は、複数置換増幅（ＭＤＡ）と呼ばれる技法のおいて、ＷＧＡに拡張された（Ｄｅａｎら、２００２；ＵＳ  ６，２８０，９４９Ｂ１）。この技法では、プライマーのランダムセットを用いてゲノムＤＮＡのサンプルをプライムする。ランダムまたは部分的にランダムな配列のプライマーの十分に大きなセットを選択することにより、このセット中のプライマーは、集合的に、そしてランダムに、サンプル中の核酸の全体に分布して核酸配列に相補的である。増幅は、高度に所有欲の強いポリメラーゼφ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いる複製によって進行し、各プライマーで開始し、そして自然終結まで継続する。このポリメラーゼによる複製の間の介在プライマーの置換は、全体ゲノムの複数の重複コピーが合成されることを可能にする。
【００３０】
ゲノムＤＮＡを汎用的に増幅するためのランダムプライマーの使用は、ランダムプライマーが全体ゲノムの上を等しくプライムするという仮定に基づき、それ故、代表的増幅を可能にする。これらプライマーそれら自身はランダムであるけれども、ゲノム中のプラマイーハイブリダイゼーションの位置はランダムではない。なぜなら、異なるプライマーは特有の配列、そしてそれ故、（異なる融解温度のような）異なる特徴を有しているからである。ランダムプライマーは、全体ゲノム上のすべての場所を等しくプライムしないので、増幅は、出発物質の完全な代表ではない。このようなプロトコールは、特定の遺伝子座を調査することでは有用であるが、ランダム−プライム増幅産物の結果は、出発物質（例えば、全体ゲノム）の代表ではない。
【００３１】
（細胞不死化）
通常のヒト体細胞は、限られた寿命を有し、そして限られた数の細胞分裂後に老年期に入る（ＨａｙｆｌｉｃｋおよびＭｏｏｒｈｅａｄ，１９６１；Ｈａｙｆｌｉｃｋ  １９６５；Ｍａｒｔｉｎら、１９７０）。老年期では、細胞は生存するが、もはや分裂しない。細胞増殖に関するこの制限は、通常のヒト細胞の調査に対する障害を表し、細胞が複数の実験室間で共有されているか、または、生化学的分析のため、遺伝子操作のため、または遺伝子スクリーニングのために必要な大量の細胞を生産されることのように、特に、細胞分裂の多くのラウンドが用いられているからである。この制限は、稀な遺伝ヒト疾患の調査について特に重要である。なぜなら、収集された生物学的サンプル（生体組織または血液）の容量は通常少なく、そして限られた数の細胞を含むからである。
【００３２】
永久的細胞株の確立が、重要材料のこの欠如を回避するための１つの方法である。いくつかの腫瘍細胞は、制限のない成長能力をもつ培養を生じ、そして発癌遺伝子または発癌物質でのインビトロ形質転換は、永久的線維芽細胞およびリンパ芽球細胞株を確立するための首尾良い手段であることが証明されている。このような細胞株は、哺乳動物生化学の分析および疾患関連遺伝子の同定において価値がある。しかし、このような形質転換細胞は、代表的には、生理学的および生物学的性質で有意な改変を示す。最も注目すべきことには、これら細胞は、異数性、自然過剰変異能力、接触阻害の損失および細胞周期チェックポイントに関連する生化学的機能における改変をともなう。それらの通常の相当物とは異なるこれらの細胞性質は、多くの細胞機能、特に、ゲノム一体性に関連する特定の機能の分析、およびヒト染色体不安定性症候群の研究に顕著な制限を課している。
【００３３】
最近の進展は、複製の老齢期の開始が、通常のヒト細胞が分裂する各回に起こるテロメアの短縮化によって制御されることが示された（Ａｌｌｓｏｐｐら、１９９２；Ａｌｌｓｏｐｐら；１９９５；Ｂｏｄｎａｒら、１９９８；ＶａｚｉｒｉおよびＢｅｎｃｈｉｍｏｌ，１９９８）。テロメアＤＮＡのこの損失は、線状ＤＮＡ分子の末端を完全に複製できないＤＮＡポリメラーゼαの能力の結果である（Ｗａｔｓｏｎ、１９７２；Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖ、１９７３）。老齢期が、最も短い１つ以上のテロメアがテロメア結合性タンパク質によってもはや保護され得ず、そしてそれ故、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ破壊として認識されるとき誘導されることが提案された。機能的なチェックポイントをもつ細胞では、ｄｓＤＮＡの導入は、ｐ５３およびｐ１６／ｐＲＢチェックポイントの活性化、ならびに老齢期を模倣する成長静止状態に至る（ＶａｚｉｒｉおよびＢｅｎｃｈｉｍｏｌ、１９９６；Ｄｉ  Ｌｅｏｎａｒｄｏら、１９９４；ＲｏｂｌｅｓおよびＡｄａｍｉ、１９９８）。老齢期細胞における細胞周期進行はまた、同じ２つの機構によってブロックされる（Ｂｏｎｄら、１９９６；Ｈａｒａら、１９９６；Ｓｈａｙら、１９９１）。このブロックは、ｐ５３およびｐＲＢを不活性化し得るＳＶ４０ラージＴ抗原のようなウイルス発癌遺伝子によって克服され得る。ＳＶ４０ラージＴ抗原を発現する細胞は、老齢期を逃れるが、それらの延長された寿命の間テロメア反復を失い続ける。これらの細胞はなお不死であり、そして末端テロメア短縮化は、最終的に、細胞を、「危機」と称される第２の非増殖ステージに到達させる（Ｃｏｕｎｔｅｒら、１９９２；ＷｒｉｇｈｔおよびＳｈａｙ；１９９２）。危機から逃れることは、通常テロメラーゼの再活性化がともない、非常に稀な事象（１０７に１つ）である（Ｓｈａｙら、１９９３）。
【００３４】
テロメラーゼは、新たなテロメアＤＮＡを合成することによりテロメアの侵食を補償し得る特有の細胞逆転写酵素である。テロメラーゼの活性は、特定の生殖系列細胞中に存在するが、皮膚、腸および血液中の幹細胞のような幹細胞の増殖性子孫を除き、大部分の体細胞組織における発生の間に抑制される（ＵｌａｎｅｒおよびＧｉｕｄｉｃｅ、１９９７；Ｗｒｉｇｈｔら、１９９６；Ｙｕｉら、１９９８；Ｒａｍｉｒｅｚら、１９９７；Ｈｉｙａｍａら、１９９６）。この酵素テロメラーゼは、少なくとも２つのサブユニット；テロメア反復（ｈＴＲ）の合成のテンプレートとして供される一体のＲＮＡ、および逆転写酵素活性を有するタンパク質（ｈＴＥＲＴ）から構成されるリボ核タンパク質である。このＲＮＡ成分（ｈＴＲ）は、ヒト細胞中に遍在するが、ｈＴＥＲＴをコードするｍＲＮＡの存在は、テロメラーゼ活性をもつ細胞に限定されている。通常ヒト細胞における外来性ｈＴＥＲＴの強制発現は、これら細胞でテロメラーゼ活性を生成するに十分であり、そしてテロメアの侵食を防ぎ、かつ老齢期および危機の両方の誘導を回避する（Ｂｏｄｎａｒら、１９９８；ＶａｚｉｒｉおよびＢｅｎｃｈｉｍｏｌ、１９９８）。最近の研究は、テロメラーゼが種々の細胞型を不死化し得ることを示した。ｈＴＥＲＴで不死化された細胞は、通常細胞周期制御、機能的ｐ５３およびｐＲＢチェックポイントを有し、接触阻害され、足場依存性であり、増殖に成長因子を必要とし、そして通常の核型を所有する（Ｍｏｒａｌｅｓら、１９９９；Ｊｉａｎｇら、１９９９）。
【００３５】
従って、関連技術は、全ゲノム増幅のための種々の技法を提供する。しかし、偏りのない高スループットライブラリー生成および／またはＤＮＡ分子の調製に従順な方法および組成物に対する当該技術分野における必要性が残っている。例えば、日本国特許第ＪＰ８１７３１６４Ａ２号は、クローニング不在下のソーティングアウトＰＣＲＴＭ増幅、２本鎖ＤＮＡのフラグメント化、切断末端への既知配列オリゴマーの連結、および得られるＤＮＡフラグメントをこのオリゴマーに相補的なソーティングアウト配列を有するプライマーを用いて増幅することによるＤＮＡを調製する方法を記載している。このソーティングアウト配列は、蛍光標識および５’および３’末端における１〜４塩基からなり、ＤＮＡフラグメントの多数のコピーを増幅する。
【００３６】
米国特許第６，１０７，０２３号は、２つのフラグメント混合物の１つに特有である二重鎖ＤＮＡフラグメント、すなわち、陽性供給源由来の二重鎖ＤＮＡフラグメントの混合物中に存在するが、陰性供給源由来のフラグメント混合物からは存在しないフラグメントを単離する方法を記載している。この方法を実施する際、２本鎖リンカーがこれらフラグメント混合物の各々に付着され、そして各混合物中の多くのフラグメントは、以下のステップ（ｉ）単一フラグメントの鎖を生成するためにこれらフラグメントを変性すること；（ｉｉ）この単一の鎖を、その配列が各鎖の１つの末端でこのリンカー領域に相補的であるプライマーとイブリダイズし、鎖／プライマー複合体を形成すること；および（ｉｉｉ）この鎖／プライマー複合体をポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドの存在下で２本鎖フラグメントに変換することを連続的に繰り返すことにより増幅される。所望のフラグメント増幅が達成された後、この２つのフラグメント混合物は変性され、次いで、この２つの混合物と関連するリンカー領域がハイブリダイズしない条件下でハイブリダイズされる。陽性供給源混合物に特有のＤＮＡ種、すなわち、陰性供給源混合物からのＤＮＡフラグメント鎖とハイブリダイズしない種が、次いで、選択的に単離される。
【００３７】
特許ＷＯ／０１６５４５Ａ１は、フィンガープリント法としての使用のために、単一プライマーを用いてＤＮＡまたはＲＮＡを増幅するための方法を詳述する。このプロトコールは、動物および植物のような、なおより複雑なゲノムを含む生物から得られるサンプル内に存在する微生物、細菌およびその他の複雑なゲノムの分析のために設計された。標的とする領域を増幅するためのこの手順の利点は、プライマーの構造および配列である。詳細には、このプライマーは、高い融解温度を生じる非常に高いシトシンおよび非常に低いグアニン含量を有するよう設計されている。さらに、このプライマーは、無視し得る二次構造形成能力を有するような様式で設計されている。これは、プライマー−ダイマーのアーチファクトの制限された生成をもたらし、そしてこれら領域の先験的知識なくして目的の領域の増幅を改良する。本発明とは対照的に、この方法は、単一のプライミング配列の利用に起因して、ゲノム内の領域のサブセットをプライムし得るのみである。さらに、このプライマーの構造は、本発明における一定増幅領域および可変プライミング領域に対して、一定プライミング領域のみを含む。従って、非縮重配列からなる単一プライマーは、ゲノム内の限られた数の領域のプライミングを生じ、全ゲノムの増幅を妨げる。
【００３８】
米国特許第６，１１４，１４９号は、ＲＮＡ転写から形成され得るか、またはゲノムの一本鎖または２本鎖ＤＮＡフラグメントに由来する、異なる配列のＤＮＡフラグメントの混合物を増幅する方法に関する。これらフラグメントは、末端デオキシヌクレオチド転移酵素および選択されたデオキシヌクレオチドとともに処理され、アンチセンス鎖の３’末端にホモポリマーテイルを形成し、そしてセンス鎖は、共通の３’末端を有して提供される。これらフラグメントは、上記アンチセンス鎖のホモポリマーテイルに相同であるホモポリマープライマー、および上記センス鎖共通３’末端配列に相同である規定された配列のプライマーと混合され、フラグメント変性、アニーリング、および重合の繰り返しサイクルで、これらフラグメントを増幅する。１つの実施形態では、上記規定された配列およびホモポリマープライマーは同じであり、すなわち、１つのプライマーのみが用いられる。これらプライマーは、選択された制限酵素部位配列を含み得、増幅されたフラグメントの末端で方向性の制限酵素部位を提供する。
【００３９】
米国特許第６，１２４，１２０号および同第６，２８０，９４９号は、複数の鎖置換増幅（ＭＳＤＡ）に基づく核酸配列の増幅のための組成物および方法を記載する。増幅は、サイクル中ではなく、連続的な等温複製において起こる。２セットのプライマー（すなわち、標的ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列に相補的な右側のセットおよび左側のセット）が使用される。各プライマーにおいて開始される複製、および複製の間にプライマーに介入する置換を介してその標的核酸配列を通して連続することにより、増幅が進行する。このことは、その標的核酸配列のネスト化されたセットの複数のコピーが短期間に合成されることを可能にする。この方法の別の形態（全ゲノム鎖置換増幅（ＷＧＳＤＡ）といわれる）において、ランダムなセットのプライマーが、ゲノム核酸のサンプルをランダムにプライムするために使用される。コンカテマー化（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅｄ）ＤＮＡ（ＭＳＤＡ−ＣＤ）の多重鎖置換増幅といわれる、代替的な実施形態において、ＤＮＡのフラグメントは、まず、リンカーと一緒に連結される。コンカテマー化ＤＮＡは、次いで、適切なプライマーを用いる鎖置換合成によって増幅される。ランダムなセットのプライマーは、全ゲノム増幅に類似の様式でＤＮＡコンカテマーの合成をランダムにプライムするために使用され得る。リンカー配列に相補的なプライマーは、そのコンカテマーを増幅するために使用され得る。合成は、そのリンカーからそのコンカテマー化ＤＮＡのセクションを通じて次のリンカーへと進み、さらに続く。そのリンカー領域が複製されると、ＤＮＡ合成についての新たなプライミング部位が作り出される。このようにして、コンカテマー化ＤＮＡサンプル全体の複数の重複コピーが、短時間に合成され得る。
【００４０】
米国特許第６，３６５，３７５号は、予備増幅反応においては相補的なランダムプライマー、２つの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（そのうちの１つが３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する）を使用する第２の増幅反応においては遺伝子座特異的プライマーでの、ＤＮＡのプライマー伸長予備増幅のための方法を記載する。予備増幅は、２０〜６０回のサーマルサイクルによって行われる。この方法は、アニーリング段階と伸長段階との間で、ゆっくりしたトランジションを利用する。２つの伸長工程が行われる：１つは、低温で、２つめのものは、高温で。このアプローチを使用すると、特に長いアンプリコンの集団が請求される。第２の増幅反応において使用される特異的プライマーは、標的核酸の配列またはその相補配列と同一である。潜在的な第３の増幅反応においてネスト化ＰＣＲを行うために使用される特異的プライマーは、第２の増幅反応において使用されるプライマーと同じ基準に従って選択される。その方法の請求される利点は、わずか１種の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、Ｔａｑポリメラーゼ）を使用する方法と比較して、数個の細胞のレベルに対するその改善された感度およびその増幅の増大した信頼性（これは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性のプルーフリーディングの存在に起因する）である。
【００４１】
Ｂｏｈｌａｎｄｅｒら（１９９２）は、小さく分解した（ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｅｄ）材料が、３’末端にランダムな５塩基の配列および５’末端に規定された配列を有するプライマーを使用して、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼで最初の２回のＤＮＡ合成において増幅され得る方法を開発した。予備増幅された材料は、次いで、その第１のプライマーの不変の５’配列に等価な第２のプライマーを使用するＰＣＲによってさらに増幅される。
【００４２】
Ｂｏｈｌａｎｄｅｒの手順の改変およびＤＯＰ−ＰＣＲ（Ｇｕａｎら（１９９３））を使用すると、シークエナーゼバージョン２（各変性工程の後に、新鮮な酵素が補給される）を用いた予備増幅反応、続いて、ＴａｑポリメラーゼでのＰＣＲ増幅のサイクリングにおいて、ＤＯＰ−ＰＣＲプライマーを使用して、小さく分割した染色体の増幅の感度を増大させることができた。
【００４３】
本来のＢｏｈｌａｎｄｅｒの方法の別の改変は、ワールドワイドウェブ上で、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）のＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓによって、マイクロアレイ分析におけるＤＮＡ調製のためのプロトコル集において発表されている。このプロトコルは、１ｎｇ未満のＤＮＡのゲノム代表を増幅するために使用されていた。このプロトコルは、３セットの酵素反応からなる。ラウンドＡにおいて、シークエナーゼは、３’末端に完全にランダムな配列および５’末端に規定された配列を含むプライマーを伸長して、その後のＰＣＲのためのテンプレートを生成するために使用される。ラウンドＢの間、その特異的プライマーＢは、既に生成されたテンプレートを増幅するために使用される。最後に、ラウンドＣは、アミノアリルｄＵＴＰまたはシアニン改変ヌクレオチドのいずれかを組み込むさらなるＰＣＲサイクルからなる。
【００４４】
Ｚｈｅｌｅｚｎａｙａ（１９９９）は、ランダムＤＮＡフラグメントを調製する方法を開発した。この方法において、２回のサイクルが、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、ならびにランダム３’−配列と５’−不変部分（制限部位を含む）を有するプライマーを用いて行われる。１回目のサイクルの後、そのＤＮＡは変性され、新たなクレノウフラグメントが添加される。次いで、慣用的なＰＣＲ増幅が、不変プライマーを利用して行われる。
【００４５】
当該分野における他の方法とは対照的に、本発明は、ＤＮＡテンプレートを、特に全ゲノム増幅のための、優先的に、ネイティブゲノムに代表的な様式で調製する、種々の新しい方法を提供する。
【００４６】
（ＲＮＡ発現分析）
ＤＮＡ内でコードされる遺伝子および調節転写物の発現は、細胞内代謝を調節する主な機構である。ＲＮＡの転写およびその転写後プロセシングは、細胞機能の全ての相についてのフレームワークを設定する。本質的な細胞機能（例えば、複製および分化）を制御するタンパク質について、ＲＮＡ発現およびタンパク質合成のレベルは、緊密に相関されている。細胞または組織の環境内での変化は、しばしば、細胞機能における必然的な改変を生じる。例えば、細胞は、環境的要因（例えば、リガンドおよび代謝産物により刺激されるシグナル伝達）に応じて、遺伝子発現のパターンを変化させ得る。さらに、ＲＮＡおよびタンパク質の細胞性発現は、いくつかの治療薬剤の使用と同様に、故意に変化され得る。遺伝子発現におけるこれらの変化は、これらの薬物の有益な効果および毒性効果の両方に起因し得る。正常状態または病的状態の両方での遺伝子発現における変化は、潜在性のある処置の作用の有効性および機構を決定するために利用され得る。発癌性形質転換の場合、細胞は、癌の進行の間に、発現においてわずかな変化を示し得る。細胞形質転換に関与する重要なタンパク質の遺伝子発現における変化は、腫瘍形成の推定マーカーとして使用される潜在性を有する。ヒトゲノムの配列決定およびマッピングは、潜在的に発現される遺伝子のデータベースにおいて生じた。高密度マイクロアレイを含むいくつかのツールは、潜在的なスプライス改変対を含むこれらの遺伝子の各々の発現を測定するために開発された。
【００４７】
細胞または組織の寿命の中の特定の時機に転写された遺伝子は、細胞機能に関与する調節性応答およびタンパク質コード応答を示す。いくつかの実施形態において、本発明は、ＲＮＡプロフィールに代表的な配列の不偏性に関連する。位置決めされた組織、細胞の小さな群または１個の細胞から発現された遺伝子の高信頼性の増幅は、遺伝子発現におけるわずかな変化の分析を可能にする。限定されたサンプル材料から潜在的に発現される広い範囲のＲＮＡ分子プロファイリングの必要性は、その開始材料を代表し続ける増幅方法を要する。本明細書中に記載される発明は、直接的処理には不十分な、臨床的適用および診断的適用において代表的に回収される一定量のＲＮＡから大量のｃＤＮＡを生成する方法を提供する。全トランスクリプトーム増幅は、ある程度線形的な増幅および指数関数的増幅に主に基づいた方法とともに、比較的歴史が短い。
【００４８】
ＲＮＡ配列の増幅のための転写ベースの方法およびＰＣＲベースの方法は、ともに、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ウイルス起源の種々の逆転写酵素）の活性に依存する。プライミングおよび増幅のストラテジーに拘わらず、逆転写についての配列特異的偏りは、避けられないことであることが論じられ得る。同様に増幅されたコントロールサンプルと試験サンプルとの間の比較を示すことによって、遺伝子プロファイリング実験において、この偏りの源が扱われる。
【００４９】
線形的な転写ベースの方法および単一プライマー増幅（ＳＰＡ）ベースの方法は、ランダムプライミングまたはポリ−Ｔプライミングのいずれかを使用する最初の逆転写工程を要する。得られたｃＤＮＡの増幅を容易にするために、逆転写のために利用されるプライマーは、特定の遍在的配列を導入する非相補的テールを含み得る。インビトロ転写（ＩＶＴ）ベースの増幅方法の場合、特定の結合部位および開始部位は、ファージＲＮＡポリメラーゼのプライミング部位および認識部位のうちの１つに対応する５’オリゴ伸長として導入される（ＰｈｉｌｌｉｐｓおよびＥｂｅｒｗｉｎｅ，１９９６；ＵＳ００５５１４５４５Ａ）。逆転写または第１鎖ｃＤＮＡ合成から生じるＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ鎖の分解の後に、第２鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして働く。第２鎖ｃＤＮＡ生成物は、テールをつけられた（ｔａｉｌｅｄ）プライマーにＲＮＡポリメラーゼ認識部位をランダムにまたは最終的に組み込むようにプライムされ得、それによって、線形的な増幅のための基質が生成され得る。プロトコルに対する種々の改変は、第１鎖ｃＤＮＡ生成物を伸長して、グアニンの短いストレッチを導入するための末端転位酵素（ＷａｎｇおよびＣｈｕｎｇ；ＵＳ００５９３２４５１Ａ）を利用し、そしてモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（これは、３〜５個のシトシンリボヌクレオチドを伸長産物の３’末端に付加する傾向を有する）のネイティブの末端転位酵素活性を利用する、第２鎖プライミングを包含する。この活性は、ＧｉｎｓｂｅｒｇおよびＣｈｅ（ＵＳ２００３０１８６２３７Ａ１）による第２鎖プライミングについて、および「ＳＭＡＲＴ」ａｄａｐｔａｔｉｏｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）において使用されてきた。ここで伸長されたポリ−Ｃテールをプライムし得る、３’末端において一連のグアニン残基を有する鎖スイッチアダプターが使用される（Ｓｃｈｍｉｄｔら，１９９９）。
【００５０】
ＲＮＡポリメラーゼによる線形的増幅の代わりは、「単一プライマー増幅」（ＳＰＡ）である。これによって、その最初の逆転写酵素を組み込んだプライマー配列は、Ｔａｑポリメラーゼでのプライマー伸長の一連のラウンドにおけるプライマーアニーリングのための結合部位を表す（Ｓｍｉｔｈら，２００３）。ＳＰＡの特異化された変形例において、その反応は、等温条件下で行われ、それによってそのプライマーは、部分的にＤＮＡおよび部分的にＲＮＡからなる。鎖置換ポリメラーゼ活性およびＲＮａｓｅＨ活性の存在下で、各プライマー伸長生成物は、そのプライマーの５’ＲＮＡ成分内のＲＮａｓｅ  Ｈについての基質を生成する。伸長生成物の切断は、連続プライミング部位を生成し、その反応は、線形的鎖置換等温様式でサイクルする（ＮｕＧＥＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．；ＷＯ０２／７２７７２；ＵＳ２００３／００１７５９１  Ａ１；ＵＳ２００３／００１７５９１Ａ１）。転写および逆転写の一連のラウンドは、百万倍程度の増幅を生じ得る。
【００５１】
ＲＮＡのＰＣＲベースの増幅は、逆転写および第２鎖合成の同じ最初の工程を包含する。当業者は、指数関数的増殖に際して偏りが導入される可能性があることを認識しているが、いくつかの方法は、その増幅産物が、最小のゆがみを有し、本来のＲＮＡ転写物を非常によく代表することを実証した。その標準的な方法は、典型的な第１鎖合成および第２鎖合成によって生成される二本鎖ｃＤＮＡを使用する。簡潔には、逆転写酵素は、オリゴｄＴおよびランダムプライマーから開始して、第１鎖合成を促進し、続いてＤＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮａｓｅ  ＨおよびＤＮＡリガーゼのカクテルは第２鎖合成および修復を促進する。既知の配列を含むユニバーサルアダプターは、次いで、その後の増幅のために、第２鎖ｃＤＮＡ分子に連結され得る。このプロセスは、逆転写酵素非テンプレート指向性のシトシン残基の付加の使用を介して、連結媒介性アダプター連結の用件を回避することによって、実質的に改善され得る。ユニバーサル配列は、次に、鎖スイッチング媒介性第２鎖ｃＤＮＡ合成のためのプライマーとして導入される（Ｓｃｈｍｉｄｔら，１９９９）。
【００５２】
サンプル間に導入される偏りの中和を補助するさらなる改善は、ユニバーサルプライミング部位および独特のプライミング部位の両方を含む、改変されたプライマーを使用して、実証された。Ｍａｋｒｉｇｉｏｒｇｏｓら（２００２）は、共通の遠位プライマー配列を共有する複数のサンプルを同時に増幅するために、２つに分かれたプライマー構築物を使用する「平衡化ＰＣＲ（ｂａｌａｎｃｅｄ  ＰＣＲ）」の有用性を実証した。サンプルの混合物は、同時に増幅され得、増幅に影響を及ぼすいかなる不純物も他の要因も最小にされる。そのプールされたサンプルは、続いて、個々の配列タグに基づいて、二次的な低サイクル増幅またはプライマー伸長標識反応のいずれかにおいて、それらそれぞれの近位プライマー配列から分けられる。
【００５３】
指数関数的な増幅は、転写物間の比較的豊富な関係性を低下させるという評判があるが、その偏りのほとんどは、増幅因子（ａｍｐｌｉｍｅｒ）を生成するにあたって必要とされる種々の工程に原因があり得るとされる。任意の所定の転写物の特異的配列は、逆転写の効率に影響を及ぼし得、これらの効果は、転写物の長さが増えるにつれて、悪化し得る。ＩＶＴベースの増幅およびＰＣＲベースの増幅を組み合わせて使用する方法は、感度の高いアプローチおよび特定のアプローチの両方を提供するが、それらは、第１鎖および第２鎖の中間的な段階的ｃＤＮＡ合成を維持する。（Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．ＵＳ００６２７１００２Ｂ１；Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏ．  ＵＳ２００３０１１３７５４Ａ１）。
【００５４】
本発明は、一工程で、均一なサイズ分布を有する増幅因子の形態で転写物を捕捉することによって、偏りの導入を最小にする。ＷＴＡ生成物は、ＲＮＡ分子の完全性、ＲＮＡ分子全体の逆転写を完了する能力、第２鎖合成の間のテンプレートスイッチのための要件、およびアダプターの連結とは無関係に合成される。ユニバーサル非自己相補性プライマーを使用する生成物のその後の増幅は、全ての適用（例えば、下流の発現研究）に適した、偏りのない代表を生じる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００５５】
（発明の要旨）
本発明は、全ゲノムまたは全トランスクリプトームの増幅に関し、本発明は、その目的を達成するための種々の方法および組成物を包含する。特定の実施形態において、全ゲノムは、単一の細胞から増幅されるが、他方、別の実施形態において、その全ゲノムは、複数の細胞から増幅される。特定の実施形態において、その全トランスクリプトソームは、ポリＡ＋ＲＮＡから増幅され、または、別の実施形態において、全トランスクリプトソームは、総ＲＮＡから増幅される。
【００５６】
本発明の特定の局面において、本発明は、特定の部位の表示の損失を伴うことなく、実質的に全てのゲノムまたは実質的に全てのトランスクリプトームの増幅を行うための方法（本明細書中で、「全ゲノム増幅」および「全トランスクリプトーム増幅」として、それぞれ、定義される）に関する。特定の実施形態において、全ゲノム増幅は、ゲノムライブラリーの実質的に全てのフラグメントの同時増幅を包含する。さらに特定の実施形態において、「実質的に全体の」または「実質的に全ての」とは、ゲノムにおける全ての配列における。約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、または約９９％について言及する。当業者は、全ゲノムの増幅は、いくつかの実施形態において、このような増幅における相対的な差異は考慮されていないが、他のものと比べて特定の配列の非均等配列増幅を包含することを認識する。
【００５７】
特定の実施形態において、本発明は、テンプレートＤＮＡの代表的な増幅可能コピーを含むライブラリーの生成した後にＤＮＡを恒久化すること（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）に関する。このライブラリー生成工程は、特別な自己不活性縮合プライマー（ｓｅｌｆ−ｉｎｅｒｔ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｐｒｉｍｅｒ）を利用し、それらのプライマーは、それらがプライマー−ダイマーおよび鎖置換活性を備えるポリメラーゼを形成する能力を取り除くように設計されている。
【００５８】
本発明の１つの特定の局面において、本質的には自己非相補的ヌクレオチドを含む自己不活性縮重プライマーを使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡを一様に増幅するための方法が存在する。特定の実施形態において、その縮合オリゴヌクレオチドは、互いに、ワトソン−クリック塩基対を形成しない。このプライマー相補的がないことによって、ランダムプライマーによるＤＮＡ増幅に関与する技術分野において既知の殆どの問題（例えば、過剰なプライマーダイマー形成、完全なもしくは散在性の対立遺伝子ドロップアウト、非常に短い増幅産物の生成、および、いくつかの場合において、一本鎖であるか、短いか、または断片化している、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の増幅が不能であること）が克服される。
【００５９】
特定の実施形態において、本発明は、例えば、ハイスループット様式で、単一の試験管またはマイクロタイタープレート中で実施され得る２工程手順を提供する。第１の工程（これは、「ライブラリー合成工程」と呼称される）は、高い縮合性のプライマーおよび、鎖置換活性を保持する少なくとも１つの酵素を使用して、アンプリコンの両端で既知配列の取り込み処理を包含する。得られた分枝プロセスによって、自己相補的末端を有する分子が作製される。これらの得られた分子ライブラリーは、例えば、Ｔａｑポリメラーゼおよび既知配列に対応するプライマーを使用するＰＣＲＴＭによって、第２工程として増幅される。それによって、顕著な偏りを生じずに、その全ゲノムまたはトランスクプトームを数千倍に増幅する。この増幅の生成物は、さらなる時間で、再増幅され得る。その結果、例えば、数百万倍を超える増幅が得られる。
【００６０】
したがって、本発明の１つの特定の局面において、核酸分子を調製する方法が存在する。この方法は、少なくとも１つの１本鎖核酸分子を得る工程；その一本鎖核酸分子を複数のプライマーに供して、１本鎖核酸分子／プライマー混合物を形成する工程であって、ここで、そのプライマーは、実質的に自己非相補的であり、かつ、その複数のもののうちの他のプライマーに対して非相補的である核酸配列を含み、ここで、その配列は、５’→３’の方向に、定常領域および可変領域を含む、工程；およびこの一本鎖核酸分子／プライマー混合物を一本鎖置換ポリメラーゼにある条件下で供する工程であって、この条件は、この供する工程によって、各々末端に、既知核酸配列の全部または一部分を含む複数の分子を生成する条件である、工程を包含する。
【００６１】
本方法は、プライマーを設計する工程であって、それらのプライマーが、目的にどおりに実質的に自己非相補的であり、かつ複数のもののうちの他のプイラマーに対して実質的に非相補的であるように設計される、工程をさらに包含する。この方法はまた、既知核酸配列を含む複数の分子を増幅して、分子の増幅を生じる工程をさらに包含する。このような増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応を含み得、その連鎖反応は、例えば、その既知核酸配列に相補的であるプライマーを利用する連鎖反応である。
【００６２】
それらのプライマーは、定常領域および可変領域を含み得て、それらの両方は、実質的に自己非相補的であるか、そして、その複数のもののうちの他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含む。特定の実施形態において、特定のプライマーに対する、定常領域および可変領域は、同じ２つのヌクレオチドから構成されるが、その２つの領域の配列は、通常は、異なっている。この定常領域は、好ましくは、既知であり、増幅方法におけるプライマーのための標的化配列であり得る。この可変領域は、既知であっても、既知でなくとも良いが、好ましい実施形態においては、既知である。上述の可変領域は、無作為に選択されてよく、または、供給源ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）において現れる頻度に比例して意図的に選択されてもよい。特定の実施形態において、その可変領域のヌクレオチドは、ＤＮＡ供給源（例えば、対応するワトソン−クリック塩基対形成パートナーを含む、ゲノムＤＮＡ）における標的部位でプライムする。特定の実施形態において、この可変領域は、縮合していると考えられる。
【００６３】
一本鎖核酸分子は、いくつかの実施形態において、ＤＮＡであってもよく、そして、代替的な実施形態において、その一本鎖核酸分子は、ＲＮＡであるか、またはＤＮＡ−ＲＮＡキメラである。
【００６４】
本発明の他の局面において、タグは、増幅された分子の末端に取り込まれ、好ましくは、ここで、その既知配列が、その増幅された分子の各末端のタグに隣接する。このタグは、ホモポリマー性配列であり得、特定の実施形態においては、プリンである。ホモポリマー性配列は、一本鎖（例えば、一本鎖のポリＧまたはポリＣ）であり得る。また、このホモポリマー性配列は、二本鎖ＤＮＡの領域（ここで、ホモポリマー性配列のうちの１本鎖は、例えば、ポリＣのような全て同じヌクレオチドであり、そして、それに対して相補的な領域の二本鎖領域の反対の鎖は、適切なポリＧを含む）についても言及する。
【００６５】
そのホモダイマー配列の取り込みは、当該分野において既知の種々の様式で存在し得る。例えば、その取り込みは、末端のデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を含み得る。ここでは、ホモポリマー性テイルが、末端のデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を介して加えられる。類似の活性を有するほかの酵素もまた、使用され得る。そのホモポリマー性配列の取り込みは、増幅される分子の末端に、そのホモポリマー性配列を含むアダプターを連結することを包含し得る。そのホモポリマー性配列の取り込みのさらなる例では、５’→３’方向に、そのホモポリマー性配列および既知配列を含むプライマーを利用することによって、ＤＮＡポリメラーゼを用いてその増幅される分子を複製する。
【００６６】
本発明のさらなる実施形態において、そのホモポリマー性配列を含む増幅される分子は、既知配列に相補的なプライマーおよびそのホモポリマー性配列に相補的なプライマーを使用して、さらに増幅される。本発明者らは、それらの分子がグアニンホモポリマー性配列を含むと、例えば、驚くべきことに、単にホモシトシンプライマーを用いて分子増幅することが、抑制され、特定の配列（例えば、その既知配列）に相補的なプライマーおよびそのホモシトシンプライマーを用いる分子の増幅が好まれる傾向にあることを実証した。これらの実施形態は、例えば、少量のＤＮＡがプロセッシングに利用可能であり、それらが、ライブラリーに変換され、ユニバーサルプライマーを使用して増幅され、次いで、それと同じユニバーサル配列を３’末端に有し、さらに、ホモポリマー性（例えば、ポリＣ）を５’末端に有する新たなユニバーサルプライマーを用いて、再増幅または複製がなされるという筋書きで利用され得る。次いで、これは、例えば、特定の実施形態において、標的化増幅／配列決定のための非限定的な資源として使用され得る。
【００６７】
本発明の特定の実施形態において、上述の取得工程は、少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡ分子を得る工程、およびその二本鎖ＤＮＡ分子を加熱して、少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡ分子を産生する工程を包含するとしてさらに規定され得る。
【００６８】
本明細書において記載される方法によって処理される核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラであり得、そして、これらは、任意の有用な供給源（例えば、ヒトサンプル）から取得され得る。特定の実施形態において、二本鎖ＤＮＡ分子は、ゲノム（例えば、ヒトのサンプルから得られたゲノム）を包含するとしてさらに規定される。このサンプルは、ヒト（例えば、血液、血清、血漿、脳髄液、頬擦過標本、乳頭吸引物、生検材料、精液（これらは、射精液としても記載され得る）、尿、糞、毛包、唾液、汗、免疫沈降されたかまたは物理的に単離されたクロマチン、などから得られる任意のサンプルであり得る。特定の実施形態において、上述のサンプルは、単一の細胞を包含する。
【００６９】
本発明の特定の実施形態において、それらのサンプルから調製された核酸分子は、診断情報または予防情報を提供する。例えば、そのサンプルから調製された核酸分子は、ゲノムコピー数情報および／またはゲノム配列情報、対立遺伝子バリエーション情報、癌診断、出生前診断、父性情報、疾患診断、検出、モニタリングおよび／または処置情報、配列情報などを提供し得る。
【００７０】
本発明の特定の局面において、それらのプライマーは、さらに、定常性の第１領域および可変性の第２領域を有するとして規定される。これらの領域の各々は、２つの非相補的ヌクレオチドから構成される。この第１領域および第２の領域は、各々が、グアニン、アデニンまたはそれらの両方から構成されてもよく；シトシン、チミジンまたはそれらの両方から構成されてもよく；アデニン、シトシン、またはそれらの両方から構成されておもよく；あるいは、グアニン、チミジンまたはそれらの両方から構成されてもよい。その第１の領域は、約６〜約１００ヌクレオチドを含み得る。この第２の領域は、約４〜約２０のヌクレオチドを含み得る。このポリヌクレオチド（プライマー）は、さらに、その遠位の３’末端の０〜約３のランダムな塩基から構成され得る。特定の実施形態において、そのヌクレオチドは、塩基または骨格アナログである。
【００７１】
特定の実施形態において、第１の領域および第２の領域は、各々、グアニンおよびチミジンから構成され、そして、そのポリヌクレオチド（プライマー）は、約１、約２または約３つのランダムな塩基を、その３’末端に含むが、それは、その３’末端に、ランダムな塩基を０個含み得る。
【００７２】
その既知の核酸配列は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いるようなその後の増幅に、使用され得る。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は、鎖置換ポリメラーゼ（例えば、Φ２９ポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、９°Ｎｍポリメラーゼ、ＤＮＡ  ポリメラーゼＩのクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴ７ファージＤＮＡポリメラーゼの変異形態、またはそれらの混合物）を利用する。特定の実施形態において、上述の鎖置換ポリメラーゼは、クレノウであるか、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴ７ファージＤＮＡポリメラーゼの変異形態である。
【００７４】
本明細書において利用される方法は、一本鎖の核酸分子／プライマー混合物をポリメラーゼ連続移動性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）増強化合物（例えば、１本鎖ＤＮＡ結合タンパク質またはヘリカーゼ）に供する工程をさらに包含し得る。
【００７５】
本発明のいくつかの実施形態において、少なくとも１つのＲＮＡ分子を増幅する方法が存在し、この方法は、ＲＮＡ分子を得る工程；そのＲＮＡ分子を複数のプライマーに供して、ＲＮＡ分子／プライマー混合物を形成する工程であって、ここで、そのプライマーが実質的に自己非相補的でありかつ、その複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで、その配列が５’→３’方向に定常領域および可変領域を含む、工程；そのＲＮＡ分子／プライマー混合物をポリメラーゼに供する工程であって、その供する工程が各々の末端に定常領域を含む複数のＤＮＡ分子を生成する条件下である、工程；ならびに、ポリメラーゼ連鎖反応を介してその複数のＤＮＡ分子を増幅する工程であって、その反応が該定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程を包含する。
【００７６】
そのＲＮＡ分子は、サンプル（例えば、細胞総ＲＮＡ、トランスクリプトーム、または両方を含むサンプル）から取得され得る。そのサンプルは、１以上のウイルスから取得され得、１以上の細菌からも取得され得；また、例えば、動物細胞、細菌、および／またはウイルスの混合物から取得され得る。そのサンプルは、ｍＲＮＡ（例えば、親和性捕捉法によって取得されるｍＲＮＡ）を含み得る。
【００７７】
本発明の別の局面において、ゲノム、トランスクリプトーム、またはその両方を増幅する方法が存在し、この方法は、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、または両方を得る工程；このゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたは両方を改変して少なくとも１つの一本鎖の核酸分子を生成する工程；その一本鎖の核酸分子を複数のプライマーに供して、核酸／プライマー混合物を形成する工程であって、ここで、そのプライマーが実質的に自己非相補的でありかつ、その複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで、その配列が５’→３’方向に定常領域および可変領域を含む、工程；その核酸／プライマー混合物を鎖置換ポリメラーゼに供する工程であって、その供する工程が各々の末端に定常領域を含む複数のＤＮＡ分子を生成する条件下である、工程；ならびに、ポリメラーゼ連鎖反応を介してその複数のＤＮＡ分子を増幅する工程であって、その反応がその定常核酸配列に対して相補的なプライマーを利用する、工程を包含する。
【００７８】
本方法は、以下の工程をさらに包含する：二本鎖ＤＮＡ分子を改変して、一本鎖分子を生成する工程であって、この一本鎖分子は、既知核酸配列を、その５’末端および３’末端の両方に含む、工程；その一本鎖のＤＮＡ分子のうちの少なくとも１つのある領域を支持体に固定されたオリゴヌクレオチドの３’末端の相補的領域にハイブリダイズさせて、一本鎖ＤＮＡ／オリゴヌクレオチドハイブリッドを生成する工程；および上述のオリゴヌクレオチドの３’末端を伸長して、伸長ポリヌクレオチドを生成する工程。特定の実施形態において、その方法は、上述の一本鎖ＤＮＡ／オリゴヌクレオチドハイブリッドからその一本鎖ＤＮＡ分子を取り出す工程をさらに包含する。
【００７９】
本発明の１つの局面において、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含むサンプルから総核酸を得る方法が存在し、その方法は、以下の工程を包含する：ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を提供する工程；その混合物を、二本鎖核酸を変性させる温度まで必要に応じて加熱する工程；および、その混合物を、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を複製するポリメラーゼに供する工程。いくつかの実施形態において、上述の方法は、本質的に、上述の提供する工程、必要に応じた加熱工程、および供する工程からなる。この供する工程は、その混合物を複数のプライマーに供して、核酸／プライマー混合物を形成する工程であって、ここで、そのプライマーが実質的に自己非相補的でありかつ、その複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで、その配列が５’→３’方向に定常領域および可変領域を含む、工程；その核酸／プライマー混合物を、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を効率的に複製するポリメラーゼに供する工程であって、その供する工程が各々の末端に定常核酸配列を含む複数のＤＮＡ分子を生成する条件下である、工程；ならびに、ポリメラーゼ連鎖反応を介してその各々の末端に定常領域を含む複数のＤＮＡ分子を増幅する工程であって、その反応がその既知核酸配列に対して相補的なプライマーを利用する、工程として、さらに規定され得る。
【００８０】
本発明の別の局面において、総トランスクリプトームを増幅する方法が存在する。この方法は、以下の工程を包含する：総ＲＮＡを得る工程；そのＲＮＡ分子を複数のプライマーに供して、ＲＮＡ分子／プライマー混合物を形成する工程であって、ここで、それらのプライマーが実質的に自己非相補的でありかつ、その複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで、その配列が５’→３’方向に定常領域および可変領域を含む、工程；そのＲＮＡ分子／プライマー混合物を、逆転写酵素に供する工程であって、その供する工程が各々の末端に定常領域を含む複数のＤＮＡ分子を生成する条件下である、工程；ならびに、ポリメラーゼ連鎖反応を介してその複数のＤＮＡ分子を増幅する工程であって、その反応がその定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程。
【００８１】
本発明の別の局面において、タンパク質をコードするトランスクリプトームを増幅する方法が存在する。この方法は、以下の工程を包含する：ｍＲＮＡを得る工程；そのｍＲＮＡ分子を複数のプライマーに供して、ｍＲＮＡ／プライマー混合物を形成する工程であって、ここで、それらのプライマーが実質的に自己非相補的でありかつ、その複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで、その配列が５’→３’方向に定常領域および可変領域を含む、工程；そのｍＲＮＡ／プライマー混合物を、逆転写酵素に供する工程であって、その供する工程が各々の末端に定常領域を含む複数のＤＮＡ分子を生成する条件下である、工程；ならびに、ポリメラーゼ連鎖反応を介してその複数のＤＮＡ分子を増幅する工程であって、その反応がその定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程。
【００８２】
本発明の他の局面において、少なくとも１つのｍＲＮＡ分子から生成されたＤＮＡ分子を増幅する方法が存在し、その方法は、以下の工程を包含する：そのｍＲＮＡ分子からｃＤＮＡ分子を得る工程；ｃＤＮＡ分子を改変して、少なくとも１つのｓｓＤＮＡ分子を生成する工程；そのｓｓＤＮＡ分子を複数のプライマーに供してｓｓＤＮＡ分子／プライマー混合物を形成する工程であって、ここでそのプライマーが実質的に自己非相補的でありそしてその複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここでその配列が５’→３’方向に定常領域および可変領域を含む、工程；そのｓｓＤＮＡ分子／プライマー混合物を鎖置換ポリメラーゼに供する工程であって、その供する工程が各々の末端にその定常領域を含む複数のＤＮＡ分子を生成する条件下である、工程；ならびにポリメラーゼ連鎖反応を介して各々の末端にその定常領域を含む複数のＤＮＡ分子を増幅する工程であって、その反応がその定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程。
【００８３】
上述の取得工程は、逆転写酵素（例えば、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＨＩＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素またはそれらの混合物）を用いてそのｍＲＮＡ分子を逆転写することによってそのｃＤＮＡ分子を生成する工程をさらに包含しるとして規定され得る。
【００８４】
本発明の別の局面において、複数のポリヌクレオチドを備えるキットが存在し、ここで、そのポリヌクレオチドは、実質的に自己非相補的でありかつ、その複数の中の他のポリヌクレオチドに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで、その複数のものが、適切な容器中に分散されている。そのキットは、さらに、鎖置換ポリメラーゼのようなポリメラーゼを備え得、このポリメラーゼとしては、例えば、Φ２９ポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、９°Ｎｍポリメラーゼ、ＤＮＡ  ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、ＭＭＬＶ逆転写酵素、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴ７ファージＤＮＡポリメラーゼの変異形態、またはそれらの混合物が挙げられる。
【００８５】
本発明のさらなる局面において、ＤＮＡ分子の複数の集団に含まれるＤＮＡ分子の集団を増幅する方法が存在し、この方法は、以下の工程を包含する：ＤＮＡ分子の複数の集団を得る工程であって、ここで、上述の複数あるうちの少なくとも１つの集団は、５’→３’方向に、その集団に特異的な既知の同定配列、および既知のプライマー増幅配列を有するＤＮＡ分子を含む、工程；および、ポリメラーゼ連鎖反応によって上述のＤＮＡ分子の集団を増幅する工程であって、その反応では、その同定配列のためにプライマーを利用する、工程。
【００８６】
上述の取得工程は、既知プライマー増幅配列を含むＤＮＡ分子の集団を得る工程；５’→３’方向に、既知の同定配列および既知のプライマー増幅配列を有するプライマーを用いて上述のＤＮＡ分子を増幅する工程；およびＤＮＡ分子の他の集団のうち少なくとも１つと上述の集団を混合する工程として、さらに、規定され得る。特定の実施形態において、ＤＮＡ分子のその集団は、ゲノムＤＮＡを含むか、ゲノムであるか、または、トランスクリプトームである。
【００８７】
本発明の別の局面において、ＤＮＡ分子の複数の集団に含まれるＤＮＡ分子の集団を増幅する方法が存在し、ここで、この方法は、以下の工程による：ＤＮＡ分子の複数の集団を得る工程であって、複数のうちの少なくとも１つの集団が、ＤＮＡ分子を含み、ここで、そのＤＮＡ分子の５’末端は、５’→３’方向に、その集団に特異的な既知の同定配列を有する一本鎖領域、および既知のプライマー増幅配列を含む工程；複数のＤＮＡ分子の一本鎖既知同定配列の少なくとも一部分の、表面に対する結合を介して、その集団を単離する工程：および、プライマー増幅配列に相補的なプライマーを利用するポリメラーゼ連鎖反応によってその単離されたＤＮＡ分子を増幅する工程。
【００８８】
上述の取得工程は、以下のようにさらに規定され得る：既知プライマー増幅配列を含むＤＮＡ分子の集団を得る工程；５’→３’方向で、既知同定配列、非複製リンカー；およびその既知プライマー増幅配列を含むプライマーを用いて上述のＤＮＡ分子を増幅する工程；ならびに、ＤＮＡ分子の他の集団の少なくとも１つと上述の集団を混合する工程。さらに、その単離工程は、上述の既知同定配列に相補的である領域を含む固定されたオリゴヌクレオチドに対して上述の一本鎖既知同定配列の少なくとも一部分を結合させる工程として、さらに規定され得る。
【００８９】
本発明の他の局面において、複数のポリヌクレオチドが存在し、ここで、その複数であるポリヌクレオチドは、実質的に自己非相補的でありかつ、その複数の中の他のポリヌクレオチドに対して実質的に非相補的である核酸配列を含む。その核酸は、以下のうちの少なくとも１つが実質的に不能であるポリヌクレオチドを与えるものとしてさらに規定され得る：自己ハイブリダイゼーション：自己プライミング；その複数のものうちの別のポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーション；および複数の重合反応の開始。この複数のポリヌクレオチドは、５’→３’方向に、第２可変領域の５’側に第１の定常領域を含むことでさらに規定され得る。特定の実施形態において、その定常領域は、その後の増幅ためであり、そして／または、その可変領域は、ランダムアニーリング、ランダムプライミング、またはその両方のためである。
【００９０】
上述のポリヌクレオチドの第１領域および第２領域はそれぞれ、２つの非相補的ヌクレオチド（例えば、グアニン、アデニンまたはそれらの両方；アデニン、シトシンまたはそれらの両方；シトシン、チミジンまたはそれらの両方；あるいは、グアニン、チミジンまたはそれらの両方）から構成され得る。その第１の領域は、約６〜約１００ヌクレオチドを含み得、そして／または、その第２の領域は、約４〜約２０のヌクレオチドを含み得る。さらに、上述のポリヌクレオチドは、さらに、その遠位の３’末端の約０〜約３のランダムな塩基から構成され得る。その核酸配列は、いくつかの実施形態において、塩基、または骨格アナログ、またはその両方から構成され得る。
【００９１】
特定の実施形態において、第１の領域および第２の領域は、各々、グアニンおよびチミジンから構成され、そのポリヌクレオチドは、その３’末端に、０、１、２、または３のランダムな塩基を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、ｄｓＤＮＡおよびＲＮＡを含むサンプルからＲＮＡを区別して得る方法であって、この方法は、以下の工程を包含する：そのｄｓＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を提供する工程；ｄｓＤＮＡの変性を防ぐように、その混合物を、約７５℃を超えない温度まで必要に応じて加熱する工程；およびその混合物を、一本鎖ＲＮＡテンプレートのみを複製するポリメラーゼに供する工程。特定の実施形態において、その方法は、本質的に、上述の提供工程および供する工程からなるか、または、提供工程、必要に応じた加熱工程、および供する工程からなる。この供する工程は、以下でさらに規定される：ｓｓＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ／プライマー混合物を形成するための複数のプライマーに、上述の混合物を供する工程であって、ここで、それらのプライマーは、実質的に自己非相補的であり、かつ、その複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで、その配列は、５’→３’方向に、定常領域および可変領域を含む、工程；およびｓｓＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ／プライマー混合物を、一本鎖ＲＮＡのみをプライミングし、複製するポリメラーゼに供する工程であって、この供する工程が、各々の末端に、定常核酸配列を含む複数のＤＮＡ分子を生成する条件である、工程；およびポリメラーゼ連鎖反応を介してその定常領域を末端に含む複数のＤＮＡ分子を増幅する工程であって、その反応が、その定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程。
【００９３】
本発明の別の局面において、増幅したゲノム、トランスクリプトーム、またはその両方を固定する方法が存在し、これは、増幅したゲノム、トランスクリプトームまたはその両方を得る工程であって、ここで、そのゲノム、トランスクリプトームまたはその両方に由来する複数の分子が、既知プライマー増幅配列を、その分子の５’末端および３’末端の両方に含む、工程；および複数のその分子を支持体に結合させる工程による。この結合工程は、複数の分子を、上述の既知プライマー増幅配列を介して、支持体に共有結合する工程を包含するとして規定され得る。
【００９４】
特定の実施形態において、その共有結合させる工程は、以下のようにさらに規定される：少なくとも１つの一本鎖分子の領域を上述の支持体に固定したオリゴヌクレオチドの３’末端にある相補的領域にハイブリダイズさせる工程；そのオリゴヌクレオチドの３’末端を伸長させて、一本鎖分子／伸長ポリヌクレオチドハイブリッドを生成する工程。この方法はまた、上述の一本鎖分子／伸長ポリヌクレオチドハイブリッドから上述の一本鎖分子を取り除いて、伸長ポリヌクレオチドを生成する工程を包含する。この方法はまた、上述の伸長ポリヌクレオチドを複製する工程をさらに包含する。この複製工程は、以下のようにさらに規定され得る：上述の伸長ポリヌクレオチドに、ポリメラーゼおよび上述の既知プライマー増幅配列に相補的なプライマーを提供する工程；そのプライマーの３’末端を伸長して、伸長プライマー分子を形成する工程：ならびにその伸長プライマー分子を放出する工程。
【００９５】
本発明の別の特定の局面において、増幅したゲノムを固定する方法が存在して、この方法は、増幅したゲノムを得る工程であって、ここで、そのゲノムに由来する複数のＤＮＡ分子は、その分子の５’末端および３’末端の両方に増幅配列を含む、工程；および複数のそのＤＮＡ分子を支持体に結合させる工程。特定の実施形態において、この結合工程は、上述のタグを通して、上述の支持体に上記複数のＤＮＡ分子を結合させる工程としてさらに規定され得る。このタグは、ビオチンであり得、そして、その支持体は、ストレプトアビジンを含み得る。特定の実施形態において、このタグは、アミノ基またはカルボキシル基を含むが、例えば、当該分野で有用な他のタグが、企図される。
【００９６】
しかし、本発明の特定の局面において、上述のタグは、一本鎖領域を含み、そして、その支持体は、そのタグの領域に相補的である配列を含むオリゴヌクレオチドを含む。このタグは、同定配列としてさらに規定される一本鎖を含み得る。さらに、このＤＮＡ分子は、上述の同定配列の３’側にあり、かつ、既知のプライマー増幅配列の５’側にある非複製可能リンカーを含むとしてさらに規定され得る。特定の実施形態において、この方法は、上述の固定したゲノムから夾雑物を取り除く工程をさらに包含する。
【００９７】
増幅した分子を有する方法は、以下の工程をさらに包含する：二本鎖分子としてさらに規定される、増幅した分子を改変して、改変したヌクレオチド塩基を取り込み、それによって、標識分子を生成する工程；その標識した分子から一本鎖分子を生成する工程であって、この一本鎖分子は、基質上の既知位置に、配置される相補的配列にハイブリダイズすることができる、工程；ならびに少なくとも１つのハイブリダイゼーションシグナルを分析する工程。この改変する工程は、例えば、放射性であるかまたは蛍光発光性ある改変ヌクレオチド塩基の、化学的、酵素的、または物理的な取り込みを包含し得る。特定の実施形態において、その生成工程は、その二本鎖分子の変性を包含する。この基質は、マイクロアレイ基材を含み得る。さらに、この分析工程は、少なくとも１つのハイブリダイゼーションシグナルのバックグラウンドを差し引いた強度を測定し、そして／またはその増幅した分子の、コピー数、代表物、またはその両方を測定する工程を包含し得る。
【００９８】
本発明のさらなる実施形態において、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含むサンプルからＤＮＡまたはＲＮＡをそれぞれ区別して得る方法が存在し、この方法は、以下の工程を包含する：そのＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を提供する工程；ＤＮＡまたはＲＮＡに選択的に影響する温度に、その混合物を加熱する工程；ならびに、それぞれＤＮＡまたはＲＮＡを選択的に複製するポリメラーゼにその混合物を供する工程。上記提供する工程が、以下にようにさらに規定され得る：上記混合物を複数のプライマーに供してｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ／プライマー混合物を形成する工程であって、ここでそのプライマーが実質的に自己非相補的でありそしてその複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここでその配列が５’から３’方向に定常領域および可変領域を含む、工程；そのｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ／プライマー混合物を、それぞれＤＮＡまたはＲＮＡを選択的に複製するポリメラーゼに供する工程であって、その供する工程が各々の末端にその定常領域を含む複数のＤＮＡ分子を生成する条件下である、工程；ならびにポリメラーゼ連鎖反応を介して各々の末端にその定常領域を含む複数のＤＮＡ分子を増幅する工程であって、その反応がその定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程。
【００９９】
特定の局面において、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むサンプルからＤＮＡを区別して得る方法が存在し、この方法は、以下の工程を包含する：ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を提供する工程；少なくとも約９４℃〜約１００℃の温度に該混合物を加熱して、一本鎖核酸を生成する工程；ならびにＤＮＡテンプレート（鋳型）のみを複製するポリメラーゼに該混合物を供する工程。この方法は、以下の工程をさらに包含し得る：上述の混合物を複数のプライマーに供してｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ／プライマー混合物を形成する工程であって、ここで、それらのプライマーが実質的に自己非相補的でありそしてその複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここでその配列が５’→３’方向に定常領域および可変領域を含む、工程；ならびに上述のｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ／プライマー混合物をＤＮＡを選択的に複製するポリメラーゼに供する工程であって、その供する工程が各々の末端に既知の核酸配列を含む複数のＤＮＡ分子を生成する条件下である、工程。この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応を介して複数のＤＮＡ分子を増幅する工程であって、その反応が定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程をさらに包含し得る。これらのポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり得、特定の実施形態において、例えば、φ２９ポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、９°Ｎｍポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウＥｘｏ−フラグメント、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠損した変異型Ｔ７ファージＤＮＡポリメラーゼ、またはこれらの混合物であり得る。このＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウＥｘｏ−フラグメントである。
【０１００】
本発明の別の局面において、ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を含むサンプルからＲＮＡを区別して得る方法が存在する。この方法は、以下の工程を包含する：ＤＮＡおよびＲＮＡの混合物を提供する工程；ｄｓＤＮＡの変性を防ぐように、上述の混合物を、約７５℃を超えない温度まで加熱する工程；およびその混合物を、一本鎖ＲＮＡテンプレートのみを複製するポリメラーゼに供する工程を包含する、方法。この方法は、以下の工程をさらに包含する：上記の混合物を複数のプライマーに供して、ｓｓＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ／プライマー混合物を形成する工程であって、ここで、それらのプライマーは、実質的に自己非相補的であり、かつ、その複数のもののうちの他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、かつ、ここで、それらのプライマーは、既知核酸配列を含む、工程；ならびに上述のｓｓＲＮＡ／ｄｓＤＮＡ／プライマー混合物を一本鎖ＲＮＡのみをプライムしそして複製するポリメラーゼ（例えば、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素）にある条件下で供する工程であって、この条件は、その供する工程が、各末端に既知核酸配列を含む複数のＤＮＡ分子を生成する条件である、工程。
【０１０１】
特定の実施形態において、本方法は、複数のＤＮＡ分子を、ポリメラーゼ連鎖反応を介して増幅する工程をさらに包含し、この反応は、上述の既知核酸配列に相補的であるプライマーを利用する。
【０１０２】
本発明のいくつかの実施形態において、ゲノムＤＮＡを含む複数のｄｓＤＮＡ分子が存在する。ここで、それらの分子が、変性して第１の鎖分子および第２の鎖分子を生じる場合、これらの各々は、第１の鎖分子および第２の鎖分子のそれぞれの末端における第１の末端領域および第２の末端領域を含み、その第１の分子の第１の末端領域および第２の末端領域のそれぞれは、第１の分子の第１の末端領域および第２の末端領域における配列に対して実質的に自己非相補的である核酸配列を含み、かつ、その第２の分子の第１の末端領域および第２の末端領域の各々は、第２の分子の第１の末端領域および第２の末端領域における配列に対して実質的に非自己相補的である核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、上述の第１の鎖分子の第１の末端領域および第２の末端領域の各々は、複数のもののうちの第１の鎖の他の分子の第１の領域および第２の領域における配列に対して非相補的である核酸配列を含み、かつ、その第２の分子の第１の領域および第２の領域は、複数のもののうちの他の分子の第２の鎖の第１の領域および第２の領域における配列に対して非相補的である核酸配列を含む。これらのＤＮＡ分子はその第１の末端領域および第２の末端領域で、ホモポリマータグをさらに含み得、ここで、その末端領域は、その分子上のそのホモポリマー性タグの前にある。特定の実施形態において、その増幅した分子は、ゲノムライブラリーとしてさらに規定され得る。
【０１０３】
本発明のさらなる実施形態において、物質の限定された供給源からゲノムの配列決定を行う方法が存在し、その方法は、以下の工程を包含する：物質の限定された供給源から少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡ分子または一本鎖ＤＮＡ分子を得る工程；その二本鎖ＤＮＡ分子を熱に供して、少なくとも１つの一本鎖ＤＮＡ分子を生成する工程；その一本鎖ＤＮＡ分子を複数のプライマーに供して、ＤＮＡ分子／プライマー混合物を形成する工程であって、ここで、そのプライマーは、実質的に自己非相補的であり、かつ、その複数あるうちの他のプライマーに対して、実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで、その配列は、５’→３’方向で、定常領域および可変領域を含む、工程；その供する工程によって、その定常領域を各々末端に含む複数のＤＮＡ分子を生成する条件の下、そのＤＮＡ分子／プライマー混合物を、ポリメラーゼに供する工程；ならびにポリメラーゼ連鎖反応を介して、各末端の定常領域を含むその複数のＤＮＡ分子を増幅する工程であって、その反応は、その定常領域に相補的なプライマーを利用する、工程；その複数の増幅した分子から、増幅したＤＮＡ分子の第１のサンプルおよび第２のサンプルを提供する工程；その第１のサンプルからのその増幅したＤＮＡ分子の少なくともいくつかの配列決定を行い、少なくとも１つの特異的ＤＮＡ配列を得る工程；ホモポリマー性のポリＣ／ポリＧ配列を、その第２のサンプルからの増幅したＤＮＡ分子の末端に取り込み、ホモポリマー性増幅分子を生成する工程；ホモポリマー性増幅分子のうち少なくともいくつかを、ポリＣプライマーおよびその特異的ＤＮＡ配列に相補的なプライマー用いて第２のサンプルから増幅する工程；およびさらなる特異的配列に関連して、その配列決定工程および増幅工程を反復して、それによって、そのゲノムの実質的に完全なコンティグを生じる工程。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、ホモポリマー性配列を取り込む工程は、以下の工程のうちの１つを包含する：ｄＧＴＰの存在下で、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによって、上述の増幅したＤＮＡフラグメントの３’末端を伸長する工程；上述のホモポリマー性ポリＣ／ポリＧ配列を含むアダプターを、上記の増幅したＤＮＡフラグメントの末端に連結させる工程；または、その５’末端にホモポリマー性ポリＣ配列およびその３’末端に定常領域を含むプライマーを用いてその増幅したＤＮＡフラグメントを複製する工程を包含する。上記の配列決定工程は、ベクターに、上記第１のサンプルからの増幅されたＤＮＡフラグメントをクローニングする工程；およびそのクローニングされたフラグメントのうちの少なくともいくつかを配列決定する工程として、さらに規定され得る。
【０１０５】
上述の増幅分子の特異的配列は、第１のサンプルを配列決定する工程によって得られ、そして、ここで、１以上のさらなる特異的配列は、第２のサンプルから増幅した分子を配列決定する工程によって得られる。物質の限定された供給源は、例えば、培養工程に対して実質的に耐性である微生物、または絶滅種であり得る。特定の実施形態において、ゲノムを配列決定する工程は、最小の冗長性をもって達成される。
【０１０６】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明確である。しかし、この詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しつつも、例示するのみのためのものであることが理解される。なぜならば、本発明の精神および範囲のうちにある種々の変更および改変が、上述の詳細な説明から、当業者にとっては明らかであるからである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０７】
（発明の詳細な説明）
長期間にわたる特許法上の慣習と一致して、用語「ａ」および「ａｎ」は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と合わせて本明細書（特許請求の範囲を含む）において使用される場合、「１つ以上」を示す。
【０１０８】
本発明の実施は、他のように示さない限り、当業者の範囲内にある分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡなどの従来技術を使用する。そのような技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版（１９８９），ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）、ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）,シリーズＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬＳ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７），ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．ＳｍｉｔｈおよびＫ．Ｓｔｕｈｌ編、１９８７）、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＯＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．ＳｈｅｖａｃｈおよびＷ．Ｓｔｒｏｂｅｒ編、１９９１）；ＡＮＮＵＡＬ  ＲＥＶＩＥＷ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ；ならびに雑誌（例えば、ＡＤＶＡＮＣＥＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）中の研究論文を参照のこと。本明細書中で言及される（上記および下記の両方）すべての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書中で参考として援用される。
【０１０９】
２００３年３月７日出願の米国特許仮出願番号６０／４５３，０７１は、その全体が参考として本明細書中で援用される。本明細書と同時に出願された米国特許非仮出願（番号は未知であるが、米国特許仮出願番号６０／４５３，０７１に対する優先権を主張している）もまた、その全体が本明細書中に参考として援用される。米国特許出願２００３０１４３５９９もまた、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１１０】
（Ｉ．定義）
用語「塩基アナログ」とは、本明細書中で使用される場合、４種のＤＮＡ塩基（アデニン、シトシン、グアニン、およびチミン）のうちの１種と類似するが異なる組成を有し、その結果、異なる対形成特性を有する、化合物を指す。例えば、５−ブロモウラシルは、チミンのアナログであるが、時には、グアニンと対形成し、２−アミノプリンは、アデニンのアナログであるが、時には、シトシンと対形成する。
【０１１１】
用語「骨格アナログ」とは、本明細書中で使用される場合、ＤＮＡのデオキシリボースリン酸骨格が改変されている化合物を指す。その改変は、その改変型ＤＮＡのヌクレアーゼ安定性または細胞膜透過性を変化させるように多数の方法でなされ得る。例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、デオキシリボースリン酸骨格の代わりにアミド骨格を有する、新規なＤＮＡ誘導体である。当該分野における他の例としては、メチルホスホネートが挙げられる。
【０１１２】
用語「ブロックされた３’末端」とは、本明細書中で使用される場合、ヒドロキシル基を欠くＤＮＡの３’末端として定義される。
【０１１３】
用語「平滑末端」とは、本明細書中で使用される場合、５’末端と３’末端とを有する二本鎖ＤＮＡ分子の末端であって、その５’末端および３’末端が同じ位置で終端している末端を指す。従って、その平滑末端は、５’突出も３’突出も含まない。
【０１１４】
用語「相補性」とは、本明細書中で使用される場合、特異的水素結合を介してワトソン−クリック塩基対を形成する能力を指す。
【０１１５】
用語「コンティグ（ｃｏｎｔｉｇ）」とは、本明細書中で使用される場合、重複する配列から構築されている、連続的な（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）（連続する（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ））ＤＮＡ配列を指す。
【０１１６】
用語「縮重」とは、本明細書中で使用される場合、ヌクレオチドまたは一連のヌクレオチドであって、規定された配列とは対照的に、その同一性が、種々のヌクレオチド選択肢から選択され得るヌクレオチドまたは一連のヌクレオチドを指す。具体的実施形態において、２つ以上の異なるヌクレオチドからの選択肢が存在し得る。さらなる具体的実施形態において、１つの特定の位置におけるあるヌクレオチドの選択は、プリンのみからの選択、ピリミジンのみからの選択、または対形成しないプリンおよびピリミジンからの選択を含む。
【０１１７】
用語「自己不活性（ｓｅｌｆ−ｉｎｅｒｔ）」とは、本明細書中で使用される場合、ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰとの存在下であるが他のＤＮＡテンプレートの非存在下において、プライマーまたはプライマー混合物が自己プライミングしてＤＮＡ合成を開始することができないことを指す。この用語はまた、細胞内におけるｍＲＮＡの集合的まとまりを指し得る。
【０１１８】
用語「ＤＮＡ恒久化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）」とは、本明細書中で使用される場合、ＤＮＡ分子の混合物が、発現量（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を損失することも、かつ／またはサイズを減少することもなく、反復的な無制限増幅を可能にする形態へと変換することを指す。具体的な実施形態において、ＤＮＡ分子の混合物は、１コピーより多くの特定のＤＮＡ配列を含む。別の具体的実施形態において、ＤＮＡ分子の混合物は、ゲノムを含む。
【０１１９】
用語「ゲノム」とは、本明細書中で使用される場合、個体により、細胞により、または細胞小器官によって保有される、集合的遺伝子の組として定義される。
【０１２０】
用語「ゲノムＤＮＡ」とは、本明細書中で使用される場合、個体により、細胞により、または細胞小器官によって保有される部分的または完全な集合的遺伝子の組を含む、ＤＮＡ物質として定義される。
【０１２１】
用語「トランスクリプトーム」とは、本明細書中で使用される場合、細胞中で発現される集合的ＲＮＡの組として定義される。
【０１２２】
用語「ハイブリダイゼーション」とは、本明細書中で使用される場合、１つ、２つ、または多くの相補的一本鎖ＤＮＡ分子間で二本鎖ＤＮＡ領域を形成するプロセスを指す。しかし、いくつかの実施形態においては、三本鎖ＤＮＡ領域が、ハイブリダイゼーションを介して生成される。
【０１２３】
用語「最小重複性」とは、本明細書中で使用される場合、コンティグを生成する、最少数の配列決定されたＤＮＡフラグメントを指す。当業者は、これが、全てのギャップを埋めるために高い重複性を必要とする「ショットガン」配列決定とは対照的であることを認識する。代表的には、「ショットガン」配列決定の重複性は、約１０〜１５（重複性＝（配列決定されたＤＮＡの総量）／（そのゲノムのサイズ））であり、一方、最小重複性を有する場合、その重複性は、１と約２との間であり得る。
【０１２４】
用語「非正準（ｎｏｎ−ｃａｎｏｎｉｃａｌ）塩基対または非ワトソン−クリック塩基対」とは、本明細書中で使用される場合、標準的な（ワトソン−クリック）Ａ−Ｔ対形成およびＧ−Ｃ対形成を含まない、塩基間で可能な全ての相互作用を指す。具体的な実施形態において、その非正準塩基対は、アデニン核酸塩基とグアニン核酸塩基、アデニン核酸塩基とシトシン核酸塩基、シトシン核酸塩基とチミジン核酸塩基、グアニン核酸塩基とチミジン核酸塩基、アデニン核酸塩基とアデニン核酸塩基、グアニン核酸塩基とグアニン核酸塩基、シトシン核酸塩基とシトシン核酸塩基、またはチミジン核酸塩基とチミジン核酸塩基を包含する。
【０１２５】
用語「非相補的」とは、特異的水素結合を介して少なくとも１つのワトソン−クリック塩基対を分子間に形成する能力を欠く、核酸配列を指す。
【０１２６】
用語「非自己相補的」とは、特異的水素結合を介して少なくとも１つのワトソン−クリック塩基対を分子内に形成する能力を欠く、核酸配列を指す。
【０１２７】
用語「非鎖置換ポリメラーゼ」とは、本明細書中で使用される場合、例えば、下流プライマーの存在によって停止されるまで伸長するポリメラーゼとして定義される。具体的実施形態において、そのポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。
【０１２８】
用語「ランダムにフラグメント化する」とは、本明細書中で使用される場合、順序立っていない様式で（例えば、配列同一性とも、中断を含むヌクレオチドおよび／または中断を取り囲むヌクレオチドの位置とも無関係に）、ＤＮＡ分子をフラグメント化することを指す。具体的な実施形態において、そのランダムなフラグメント化は、当該分野における周知の方法により、機械的、化学的、または酵素的である。
【０１２９】
用語「ＲＮＡ恒久化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）」とは、本明細書中で使用される場合、ＲＮＡ分子の混合物（例えば、トランスクリプトーム）が、発現量（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を損失することも、かつ／またはサイズを減少することもなく、反復的な無制限増幅を可能にする形態へと変換することを指す。具体的な実施形態において、トランスクリプトームは、細胞由来、個体由来、または細胞小器官由来の、転写されたｍＲＮＡ分子の集合として定義される。
【０１３０】
用語「一本鎖核酸分子／プライマー混合物」とは、本明細書中で使用される場合、少なくとも１つの一本鎖核酸分子を含む混合物であって、本明細書中で記載されるような少なくとも１つのプライマーが、その一本鎖核酸分子中の一領域にハイブリダイズされる、混合物を指す。具体的実施形態において、複数の縮重プライマーが、その一本鎖核酸分子の少なくともいくらかの部分に対して相補的な配列を含む。さらなる具体的な実施形態において、その混合物は、複数の一本鎖核酸分子を含み、それらの分子は、それらにハイブリダイズしている複数の縮重プライマーを有する。さらなる具体的な実施形態において、その一本鎖核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【０１３１】
用語「鎖置換ポリメラーゼ」とは、本明細書中で使用される場合、伸長する場合に下流フラグメントを置換するポリメラーゼとして定義される。具体的な実施形態において、そのポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を含む。
【０１３２】
用語「実質的に不可能である」とは、本明細書中で使用される場合、当該分野で公知である標準的条件に供した場合に大多数のポリヌクレオチドが活性を有すことができないことを指す。具体的な実施形態において、その活性は、自己ハイブリダイゼーション、自己プライミング、複数における別のポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーション、その複数における重合の開始、またはそれらの組み合わせを包含する。具体的な実施形態において、この用語は、プライマー分子のうちの少なくとも約７０％が、２つの非相補的かつ非自己相補的なヌクレオチドから構成されており、より好ましくは、プライマー分子の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％が、２つの非相補的かつ非自己相補的なヌクレオチドから構成されていることを指す。
【０１３３】
用語「実質的に非自己相補的かつ実質的に非相補的」とは、本明細書中で使用される場合、特異的水素結合を介してワトソン−クリック塩基対を分子間および分子内に形成する能力を欠く、複数のプライマーを指す。具体的な実施形態において、プライマー分子の少なくとも約７０％がその複数において、２つの非相補的かつ非自己相補的なヌクレオチドから構成されており、より好ましくは、プライマー分子の少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９９％、最も好ましくは１００％が、その複数において、２つの非相補的かつ非自己相補的なヌクレオチドから構成されている。
【０１３４】
用語「好熱性ＤＮＡポリメラーゼ」とは、本明細書中で使用される場合、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを指す。
【０１３５】
当業者は、特定のヌクレオチド部位についてのヌクレオチドの選択を示すために、当該分野において慣用的な一文字コードが存在することを認識する。例えば、Ｒは、ＡまたはＧを指し；Ｙは、ＣまたはＴを指し；Ｍは、ＡまたはＣを指し；Ｋは、ＧまたはＴを指し；Ｓは、ＣまたはＧを指し；Ｗは、ＡまたはＴを指し；Ｈは、ＡまたはＣまたはＴを指し；Ｂは、ＣまたはＧまたはＴを指し；Ｖは、ＡまたはＣまたはＧを指し；Ｄは、ＡまたはＧまたはＴを指し；そしてＮは、ＡまたはＣまたはＧまたはＴを指す。従って、ＹＮプライマーは、少なくとも１つ（好ましくはそれ以上）の一連のジヌクレオチドの組を含み、その各々は、１番目の位置にＣまたはＴを含み、二番目の位置にＡ、Ｃ、ＧまたはＴを含む。これらのジヌクレオチドの組は、プライマー（および／またはアダプター）中で反復され得る。
【０１３６】
（ＩＩ．自己不活性縮重プライマーを使用して既知のユニバーサル配列を組み込むことによる、全ゲノムおよび全トランスクリプトームを増幅するためのＤＮＡライブラリーの調製）
本発明の実施形態において、ゲノム全体またはトランスクリプトーム全体の増幅が存在し、この増幅は、既知のユニバーサル配列を組み込むこと、その後に、その既知のユニバーサル配列の少なくとも一部に対して相補的な既知のユニバーサルプライマーを使用してＰＣＲ増幅工程を行うことを包含する。具体的な実施形態において、その既知のユニバーサル配列を組み込むためのプライマーは、縮重領域を含み、さらなる具体的な実施形態においては、その既知のユニバーサル配列およびその縮重領域は、非自己相補的核酸配列を含む。従って、非自己相補的配列を欠くプライマーと比較して、自己ハイブリダイゼーションおよび分子間プライマーハイブリダイゼーションが有意に減少する。
【０１３７】
プライマーダイマーの形成は、ランダムプライマーを使用するＤＮＡ増幅またはＲＮＡ増幅のための既存の方法において共通する問題である。個々の配列各々についての効率的なプライミングを達成するために、ランダムプライマーは、非常に高濃度で適用されなければならない。特定の標的ＤＮＡテンプレートもしくは標的ＲＮＡテンプレートまたはテンプレート分子の集団全体に対するアニーリングの効率は、効率的なプライミングのために必要な高プライマー濃度から生じるプライマーダイマーの形成によって、大いに減少される。
【０１３８】
ＤＮＡを増幅するためにランダムプライマーを使用する場合の当該分野で公知の他の問題としては、座の脱落（喪失）に起因してそのゲノム全体を増幅できないこと、短い増幅生成物の生成、およびいくつかの場合には、分解したＤＮＡまたは人工的にフラグメント化したＤＮＡを増幅することができないことが、挙げられる。
【０１３９】
本発明は、新規な型のオリゴヌクレオチドプライマーを利用し、そのプライマーは、その配列のうちの少なくとも大部分として、互いとの安定なワトソン−クリック対形成には関与せず、従って自己プライミングしない、２種類だけのヌクレオチド塩基を含む。そのプライマーは、その５’末端に定常既知配列を含み、その定常既知配列に対して３’側に位置する可変縮重ヌクレオチド配列を含む。ワトソン−クリック塩基対形成に関与しないことが公知である、４つの可能な２塩基組み合わせが存在し、Ｃ−Ｔ、Ｇ−Ａ、Ａ−Ｃ、およびＧ−Ｔである。これらは、１つのワトソン−クリック塩基対を形成しないはずであり、ＤＮＡポリメラーゼとｄＮＴＰとの存在下でプライマー−ダイマーの生成をもたらし得る、４つの異なる型の縮重プライマーを示唆する。これらのプライマーが、図２Ａに示されており、縮重ヌクレオチドについての一般的命名法（Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｒ＝ＧまたはＡ、Ｍ＝ＡまたはＣ、およびＫ＝ＧまたはＴ）に従って、それぞれ、プライマーＹ、プライマーＲ、プライマーＭおよびプライマーＫと呼ばれる。
【０１４０】
例えば、Ｙプライマーは、Ｃ塩基とＴ塩基とから構成される５’既知配列ＹＵを有し、３’末端に、例えば１０個のランダムに選択されたピリミジン塩基ＣおよびＴを含む縮重領域（Ｙ）１０を有する。Ｒプライマーは、Ｇ塩基とＡ塩基とから構成される５’既知配列ＲＵを有し、３’末端に、例えば１０個のランダムに選択されたプリン塩基ＧおよびＡを含む縮重領域（Ｒ）１０を有する。Ｍプライマーは、Ａ塩基とＣ塩基とから構成される５’既知配列ＭＵを有し、３’末端に、例えば１０個のランダムに選択された塩基ＡおよびＣを含む縮重領域（Ｍ）１０を有する。最後に、Ｋプライマーは、Ｇ塩基とＴ塩基とから構成される５’既知配列ＫＵを有し、３’末端に、例えば１０個のランダムに選択された塩基ＧおよびＴを含む縮重領域（Ｋ）１０を有する。記載された設計のプライマーは、自己プライミングせず、従って、プライマーダイマーを形成しない。この理由のために、用語「自己不活性プライマー」が、本明細書中で使用される。しかし、これらは、完全にランダムなプライマーと比較して減少した全体的頻度ではあるが、対応するワトソン−クリック塩基パートナーを含む標的部位でプライミングする。具体的実施形態において、これらのプライマーは、特定の条件下でプライマーダイマーを形成可能ではあるが、そのような構造を欠くプライマーと比較して大いに減少したレベルで形成する。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、これらのプライマーは、その３’末端に、完全にランダムな（すなわち、４種の塩基のいずれかを含む）短いヌクレオチド配列を補充される。そのようなプライマーは、図２に示されており、ＹＮ、ＲＮ、ＭＮ、およびＫＮと標識されている。限定数の完全にランダムな塩基が、このＹプライマー、Ｒプライマー、Ｍプライマー、またはＫプライマーの３’末端に存在する場合、それは、そのプライミング頻度を増加し、限定された自己プライミング能力をなお維持する。この縮重Ｙプライマー、縮重Ｒプライマー、縮重Ｍプライマー、または縮重Ｋプライマーの３’末端に異なる数の完全にランダムな塩基を使用することにより、そしてその反応条件を注意深く最適化することによって、最小限のプライマーダイマー形成しか伴わない望ましいＤＮＡ生成物を選ぶように、この重合反応の結果を正確に制御し得る。
【０１４２】
従って、ライブラリー合成の第一工程において、記載された設計の合成プライマーは、少なくとも限定された鎖置換活性を保有するＤＮＡポリメラーゼを用いる伸長／重合反応にランダムに組み込まれる。生じた分枝プロセスによって、その末端に既知の（ユニバーサルな）自己相補的配列を有するＤＮＡ分子が生成される。「増幅」工程と呼ばれる第二工程において、これらの分子は、Ｔａｑポリメラーゼ（または他の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ）と、上記のランダムプライマーの既知の５’テールの少なくとも一部に対応する１つのプライマーとを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、指数関数的に増幅される。図１は、本発明の模式的概要を示す。本発明は、以前に記載されたランダムプライマーによるＤＮＡ増幅およびＲＮＡ増幅について当該分野で公知である主要な問題を克服する。
【０１４３】
（１．核酸供給源）
任意の供給源もしくは複雑度の一本鎖核酸もしくは二本鎖核酸、またはそれらのフラグメントが、供給材料として使用され得、本発明において記載される方法によって増幅され得る。すなわち、いくつかの実施形態において、一本鎖ＤＮＡが、本明細書中に記載される方法に従って得られて処理され、他の実施形態においては、二本鎖ＤＮＡが得られ、ｓｓＤＮＡを生じるように操作され、このｓｓＤＮＡは、本明細書中に記載される方法に供される。具体的実施形態において、ｄｓＤＮＡが、熱、化学処理（例えば、アルカリ性ｐＨ）、機械的操作、放射線、またはこれらの組み合わせで変性される。別の具体的実施形態において、実質的に一本鎖のＲＮＡが、本明細書中に記載される方法に従って得られて処理される。具体的実施形態において、全核酸は、二本鎖ＤＮＡ分子と一本鎖ＲＮＡ分子との混合物として得られ、その後、ＤＮＡ画分のみもしくはＲＮＡ画分のみまたはそれら両方を別個に、またはそれら両方を混合して、選択的に増幅するように処理される。
【０１４４】
（２．縮重プライマーの設計）
図２は、本発明のこの局面において利用される縮重プライマーの設計を示す。原理上、本発明は、オリゴヌクレオチドプライマーの適用を使用する。このプライマーは、その５’末端に定常既知配列（これは、ユニバーサル配列と呼ばれ得る）を含み、その３’末端に可変縮重ヌクレオチド配列を含み、このプライマーは、各々、ワトソン−クリック塩基対形成に関与しないことが公知である少なくとも４つの可能な塩基組み合わせのうちのいずれかから構成される。その可能なプライマー組成としては、ピリミジンのみ（ＣおよびＴ）、プリンのみ（ＡおよびＧ）、または対形成しないプリンとピリミジン（ＡとＣ、またはＧとＴ）が挙げられる。この最後の組み合わせ（ＧとＴ）は、非正準ワトソン−クリック塩基対形成を許容することが当該分野で公知である。好ましい実施形態において、このＧとＴとの対が、本発明において利用される。具体的な実施形態において、上記プライマーは、その５’末端に、Ｃ塩基とＴ塩基、Ｇ塩基とＡ塩基、Ａ塩基とＣ塩基、またはＧ塩基とＴ塩基とから構成される約１８塩基配列の定常部分を含み、その後に、約１０塩基のランダムなＹ塩基、Ｒ塩基、Ｍ塩基、またはＫ塩基をそれぞれ含み、そしてその３’末端に、０塩基と約６塩基との間の個数の完全にランダムな塩基Ｎを含む（図２、表ＩＩＩ、プライマー１〜７）。実施例１および２は、ＹプライマーおよびＹＮプライマーが、限定量のプライマーダイマーだけしか形成しないことを示し、これは、その３’末端にある完全にランダムな塩基Ｎの数に比例する。対照的に、類似する設計であるがワトソン−クリック塩基対形成に関与し得る塩基から構成されるプライマーは、過剰量のプライマーダイマーを生じ、これにより、ＤＮＡ増幅またはＲＮＡ増幅の効率が大いに減少される（実施例２参照）。
【０１４５】
プライマーの選択は、塩基組成、複雑度、ならびに標的ＤＮＡまたは標的ＲＮＡ中の反復エレメントの存在および量に依存する。個々の増幅反応産物を、異なる非ワトソン−クリック対を含むがその末端に同じ既知配列を有する縮重プライマーと組み合わせることによって、可能な最高レベルの発現的（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ）かつ均一なＤＮＡ増幅を達成し得る。当業者は、望ましい結果を達成するための最適なプライマーと反応条件とを選択する方法を認識している。
【０１４６】
実施例２は、ピリミジンのみの種々のプライマーを、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いるヒト全ゲノム増幅反応においてプライマーダイマーを形成する能力、増幅効率、および均一性（ランダムに選択されたゲノムマーカーの発現量（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ））において比較したことを記載する。試験したピリミジンのみのプライマーすべてのうち、２つのランダム３’塩基（Ｙ（Ｎ）２）を含むプライマーが、最も均一な全ゲノム増幅をもたらし、同時に、検出不能な量のプライマーダイマーしか生じなかった。従って、好ましい実施形態において、約１塩基と約３塩基との間の個数の完全にランダムな塩基を３’末端に含む縮重プライマーが、利用される。
【０１４７】
（３．ＤＮＡポリメラーゼの選択）
好ましい実施形態において、鎖置換活性を保有するＤＮＡポリメラーゼが、利用される。好ましい鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔ７ファミリーのエキソＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、宿主チオレドキシンサブユニットを補因子として必要とするポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、ｆＩ、ｆＩＩ、Ｗ３１、Ｈ、Ｙ、ｇｈ−１、ＳＰ６、またはＡｌｌ２２（Ｓｔｕｄｉｅｒ（１９７９）））、エキソＢｓｔラージフラグメント、Ｂｃａ  ＤＮＡポリメラーゼ、９ｏＮｍポリメラーゼ、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、ファージｆ２９ポリメラーゼ、ファージＭ２ポリメラーゼ、ファージｆＰＲＤ１ポリメラーゼ、エキソＶＥＮＴポリメラーゼ、およびファージＴ５エキソＤＮＡポリメラーゼである。
【０１４８】
ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウエキソフラグメント、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が減少または除去されているファージＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＭＭＬＶ逆転写酵素は、本発明において最も好ましい。従って、好ましい実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウエキソフラグメント、またはＳｅｑｕｅｎａｓｅバージョン２が、全ゲノム増幅のためのポリメラーゼとして使用される（実施例２）。ＭＭＬＶ逆転写酵素が、全トランスクリプトーム増幅のためのポリメラーゼとして使用される（実施例１４）。
【０１４９】
（４．反応条件）
一般に、プライミング効率を増加する要因（例えば、温度低下または塩濃度増加および／もしくはＭｇ２＋イオン濃度増加）は、ＤＮＡポリメラーゼの鎖置換活性および速度を阻害し、温度上昇および低Ｍｇ２＋イオン濃度または低塩濃度は、重合／鎖置換の効率を増加するが、プライミング効率を減少する。一方、効率的なプライミングを促進する要因はまた、プライマーダイマー形成の機会も増加する。鎖置換活性は、いくつかのタンパク質因子によって促進され得る。そのような鎖置換増強因子または連続移動性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）増強因子の存在下または非存在下で鎖置換複製を実施し得るどのポリメラーゼも、そのポリメラーゼがそのような因子の非存在下で鎖置換複製を実施しない場合でさえ、開示される発明における使用のために適切である。鎖置換複製において有用な因子は、（ｉ）細菌起源、ウイルス起源、または真核生物起源の多数の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢタンパク質）（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＳＳＢタンパク質、ファージＴ４遺伝子３２産物、ファージＴ７遺伝子２．５タンパク質、ファージＰｆ３  ＳＳＢ、複製タンパク質Ａ  ＲＰＡ３２サブユニットおよびＲＰＡ１４サブユニット（Ｗｏｌｄ，１９９７））のいずれか；（ｉｉ）他のＤＮＡ結合タンパク質（例えば、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、単純ヘルペスタンパク質ＩＣＰ８、ＢＭＲＦ１ポリメラーゼ補助サブユニット、ヘルペスウイルスＵＬ２９  ＳＳＢ様タンパク質；（ｉｉｉ）ＤＮＡ複製に関与することが公知である多数の複製複合体タンパク質（例えば、ファージＴ７ヘリカーゼ／プライマーゼ、ファージＴ４遺伝子４１へリカーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｅｐヘリカーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｒｅｃＢＣＤヘリカーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉトポイソメラーゼおよび真核生物トポイソメラーゼ（Ｃｈａｍｐｏｕｘ，２００１））のいずれかである。
【０１５０】
上記重合反応の正確なパラメーターは、ポリメラーゼおよび縮重プライマーの選択に依存する。当業者は、そのようなパラメーターを改変する方法を、本明細書中に提供される教示に基づいて認識する。上記縮重プライマーの３’末端にあるランダムな塩基の数を変化させることにより、そしてその反応条件を注意深く最適化することにより、プライマーダイマーの形成は、最小限に維持され得、同時に、その増幅効率および発現量（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）は、最大にされ得る。
【０１５１】
ＤＮＡのランダムなフラグメント化および必要な場合にはＲＮＡのランダムなフラグメント化は、記載されるような機械的処理、化学的処理、または酵素処理によって、実施され得る。好ましい実施形態において、ＤＮＡは、低塩緩衝液（例えば、ＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５〜８．５）またはＴＥ−Ｌ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５〜８．５））中で約９５℃にて、約１分間〜約１０分間加熱することによって、フラグメント化される（例えば、その全体が参考として援用される、２００２年１１月１３日出願の米国特許出願番号１０／２９３，０４８参照）。
【０１５２】
本発明の例示的なライブラリー合成反応は、約１０μｌ〜約２５μｌの範囲の容量を有する混合物中で実施される。その反応混合物は、好ましくは、熱的または機械的にフラグメント化された約０．５ｎｇ〜約１００ｎｇのＤＮＡ（あるいは好ましい実施形態においては、約０．５ｎｇ未満のＤＮＡ）、約０．５μＭ〜約３０μＭの自己不活性縮重プライマー、約０ｎＭ〜約２００ｎＭの既知配列プライマー（すなわち、個々の縮重プライマーの既知の５’末端に対応するプライマー）、約２単位〜約１０単位のＫｌｅｎｏｗ  Ｅｘｏ−（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）またはＳｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ２（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、０ｎｇ〜約３６０ｎｇのＳＳＢタンパク質、約５ｍＭ〜約１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０ｍＭ〜約１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む。この反応緩衝液は、好ましくは、約６．５と約９との生理的ｐＨで作動する緩衝能を有する。好ましくは、その反応のインキュベーション時間は、約１０分間と約１８０分間との間であり、そのインキュベーション温度は、約１２℃と約３７℃との間である。インキュベーションは、約１２℃と約３７℃との間を、１サイクル当たり合計３〜５分間サイクリングすることによって、または好ましくは、約１２℃と約３０℃との間での単一等温工程もしくは約１２℃と約３７℃との間の連続等温工程によって、実施される。その反応は、Ｍｇ２＋をキレート化するために充分な量のＥＤＴＡを添加することによって、または好ましくは、上記ポリメラーゼの熱不活化によって、あるいはその両方によって、終結される。
【０１５３】
本発明の好ましい実施形態において、上記ライブラリー合成反応は、容量約１５μｌにて実施される。その反応混合物は、熱的または機械的にフラグメント化された約５ｎｇ以下のＤＮＡ、例えば、既知領域と縮重領域とにＧ塩基およびＴ塩基を含み２つの完全にランダムな３’塩基を含む約２μＭの自己不活性縮重プライマーＫ（Ｎ）２（表ＩＩＩ、プライマー番号１４）、約２単位と約４単位と間のＳｅｑｕｅｎｃｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２  ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、約５ｍＭと約１０ｍＭとの間のＭｇＣｌ２、約１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ約７．５を有する約１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、および約７．５ｍＭジチオスレイトールを含む。好ましくは、その反応のインキュベーション時間は、約６０分間と約１２０分間との間であり、そのインキュベーション温度は、等温モードにて約２４℃、または別の好ましい実施形態において、約１６℃と約３７℃との間での連続的等温工程による。
【０１５４】
本発明の別の好ましい実施形態において、そのライブラリー合成反応は、容量約２０μｌにて実施される。その反応混合物は、熱的にフラグメント化されているかまたはフラグメント化されていない約２５ｎｇ以下のＲＮＡ、例えば、既知領域と縮重領域とにＧ塩基およびＴ塩基を含み２つの完全にランダムな３’塩基を含む約１μＭの自己不活性縮重プライマーＫ（Ｎ）２（表ＩＩＩ、プライマー番号１４）、５’に既知のＧ塩基およびＴ塩基を含み、３’末端にポリＴ塩基を含む約２００ｎＭのプライマーＫ（Ｔ）２０（表ＩＩＩ，プライマー番号１９）、約５０単位〜約２００単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、約３ｍＭ〜約１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、約７５ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ約８．３の約５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、および約１０ｍＭジチオスレイトールを含む。好ましくは、その反応のインキュベーション時間は、約３０分間〜約１２０分間であり、そのインキュベーション温度は、等温モードで約４２℃であり、または別の好ましい実施形態においては、約２４℃と約４２℃との間での連続的等温工程による。
【０１５５】
既知配列プライマーを用いる代表的な増幅工程は、約１ｎｇ〜約１０ｎｇのライブラリー合成産物および約０．３μＭ〜約２μＭの既知配列プライマーを、当該分野で周知の標準的ＰＣＲ反応において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、またはそれらの誘導体および混合物）にとって最適な条件下で含む。増幅するのが困難であることが公知である配列（例えば、他の方法ではＰＣＲ最適化の努力（例えば、変性工程および重合工程の温度および時間）から利益を受けないことが公知であるＧ／Ｃ含量が高い配列）について、反応添加物（例えば、ＤＭＳＯおよび／または７−デアザｄＧＴＰ）はまた、本発明の方法によって構築されるライブラリーにおける発現量（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を改善し得る。
【０１５６】
（ＩＩＩ．核酸）
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、少なくとも１つの核酸塩基（例えば、ＤＮＡ中に見出される天然に存在するプリン塩基もしくはピリミジン塩基（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」およびシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ中に見出される天然に存在するプリン塩基もしくはピリミジン塩基（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」、およびＣ））を含む、少なくとも１分子または一本のＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラ、またはそれらの誘導体もしくはアナログを一般的には指す。用語「核酸」は、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を包含する。用語「オリゴヌクレオチド」とは、長さが約３核酸塩基と約１００核酸塩基との間である、少なくとも１つの分子を指す。用語「ポリヌクレオチド」とは、長さが約１００核酸塩基よりも長い少なくとも１つの分子を指す。これらの定義は、一般的には、少なくとも１つの一本鎖分子を指すが、具体的実施形態においては、少なくとも１つの一本鎖分子に対して部分的、実質的、または完全に相補的である、少なくとも１つのさらなる鎖もまた包含する。従って、核酸は、少なくとも１つの二本鎖分子または少なくとも１つの三本鎖分子であって、その分子の鎖を含む特定の配列の１つ以上の相補鎖もしくは「相補体」を含む、分子を包含し得る。本明細書中で使用される場合、一本鎖核酸は、接頭語「ｓｓ」により示され得、二本鎖核酸は、接頭語「ｄｓ」により示され得、三本鎖核酸は、接頭語「ｔｓ」により示され得る。
【０１５７】
「相補的」である核酸、または「相補体」とは、標準的なワトソン−クリック結合相補性法則、フーグスティーン結合相補性法則、または逆フーグスティーン結合相補性法則に従って、塩基対形成することが可能である核酸である。しかし、具体的な実施形態において、本発明のプライマーは、標準的なワトソン−クリック塩基対を、特に同じプライマー内の他のヌクレオチドと形成することが不可能な大多数のヌクレオチドを含む。
【０１５８】
本明細書中で使用される場合、用語「相補性」または「相補体」とは、上記に示された同じヌクレオチド比較によって評価され得る場合に、実質的に相補的である核酸を指し得る。用語「実質的に相補的」とは、連続的な核酸塩基または１つ以上の核酸塩基部分がその分子中に存在しない場合には半連続的な核酸塩基の、少なくとも１つの配列を含む核酸を指し得、たとえすべてには満たない核酸塩基が対応する核酸塩基と塩基対形成しない場合でさえ、少なくとも１つの核酸鎖または二重鎖に対してハイブリダイズ可能である。特定の実施形態において、「実質的に相補的な」核酸は、その核酸塩基配列のうちの約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、から約１００％まで、およびこれらの内の任意の範囲が、ハイブリダイゼーションの間に少なくとも１つの一本鎖核酸分子または二本鎖核酸分子と塩基対形成することが可能である、少なくとも１つの配列を含む。特定の実施形態において、用語「実質的に相補的」とは、ストリンジェントな条件下で少なくとも１つの核酸鎖または二重鎖にハイブリダイズし得る少なくとも１つの核酸を指す。特定の実施形態において、「部分的に相補的」な核酸は、低ストリンジェンシー条件下で少なくとも１つの一本鎖核酸もしくは二本鎖核酸にハイブリダイズし得る少なくとも１つの配列を含むか、またはその核酸塩基配列のうちの約７０％未満が、ハイブリダイゼーションの間に少なくとも１つの一本鎖核酸分子または二本鎖核酸分子と塩基対形成することが可能である少なくとも１つの配列を含む。
【０１５９】
本明細書中で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズ可能である」とは、二本鎖分子または三本鎖分子、あるいは部分的に二本鎖または三本鎖の性質を有する分子を形成することを意味することが理解される。用語「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズ可能である」とは、用語「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」、および用語「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェント条件」を包含する。
【０１６０】
本明細書中で使用される場合、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」とは、相補的配列を含む１つ以上の核酸鎖の間またはその核酸鎖の内でのハイブリダイゼーションを可能にするが、ランダムな配列のハイブリダイゼーションを排除するものである。ストリンジェントな条件は、核酸と標的鎖との間のミスマッチを、（もし許容するにしても）ほとんど許容しない。そのような条件は、当業者にとって周知であり、高い選択性を必要とする適用のために好ましい。非限定的適用としては、少なくとも１つの核酸（例えば、遺伝子またはその核酸セグメント）の単離、または少なくとも１つの特定のｍＲＮＡ転写物またはその核酸セグメントの検出などが、挙げられる。
【０１６１】
ストリンジェントな条件は、低塩条件および／または高温度条件（例えば、約５０℃〜約７０℃の温度における約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍ  ＮａＣｌにより提供される）を含み得る。望ましいストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、特定の核酸の長さ、標的配列の長さおよび核酸塩基含量、その核酸の電荷組成、ハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたは他の溶媒の存在によって、部分的に決定されることが理解される。条件は、よりストリンジェントにされ得る（例えば、漸増量のホルムアミドの添加）ことが一般的に認識される。
【０１６２】
これらの範囲、ハイブリダイゼーションの組成および条件は、非限定的な例として言及されたに過ぎないこと、そして特定のハイブリダイゼーション反応にとって望ましいストリンジェンシーは、しばしば、１つ以上のポジティブコントロールもしくはネガティブコントロールに対する比較によって経験的に決定されることもまた理解される。想定される適用に依存して、標的配列に対する核酸の種々の程度の選択性を達成するために、種々のハイブリダイゼーション条件を使用することが好ましい。非限定的例において、ストリンジェントな条件下で核酸にハイブリダイズしない関連標的核酸の同定または単離は、低温度および／または高イオン強度でのハイブリダイゼーションによって達成され得る。そのような条件は、「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」と呼ばれ、低ストリンジェンシーの非限定的例としては、約２０℃〜約５０℃の範囲で、約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍ  ＮａＣｌにて実施されるハイブリダイゼーションが挙げられる。当然、特定の適用に適合するようにその低ストリンジェンシー条件または高ストリンジェンシー条件をさらに改変することは、当業者の範囲内にある。
【０１６３】
本明細書中で使用される場合、「核酸塩基」とは、少なくとも１つの天然に存在する核酸（すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡ）において見出される天然に存在する複素環式塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、またはＵ（「天然に存在する核酸塩基」）、ならびにそれらの天然または非天然のキメラ、誘導体、およびアナログを指す。核酸塩基の非限定的例としては、プリンおよびピリミジン、ならびにそれらの誘導体およびアナログが挙げられ、それらは、天然に存在する核酸塩基対形成を置換し得る様式で、少なくとも１つの天然に存在する核酸塩基と１つ以上の水素結合（例えば、ＡとＴ、ＧとＣ、およびＡとＵとの間での水素結合形成）を一般的に形成（「アニール」または「ハイブリダイズ」）し得る。
【０１６４】
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオチド」とは、１つ以上のヌクレオチドを別の分子にかまたは互いに対して共有結合させて１つ以上の核酸を形成するために一般的に使用される「骨格部分」をさらに含む、ヌクレオシドを指す。天然に存在するヌクレオチド中の「骨格部分」は、代表的には、リン部分を含み、このリン部分は、五炭糖に共有結合されている。その骨格部分の結合は、代表的には、その五炭糖の３’位置または５’位置のいずれかで生じる。しかし、他の結合型が、特に、天然に存在する五炭糖またはリン部分の誘導体もしくは模倣物をそのヌクレオチドが含む場合には、当該分野で公知であり、非限定的例が、本明細書中に記載される。
【０１６５】
（ＩＶ．核酸の増幅）
増幅のためのテンプレートとして有用である核酸は、本明細書中に記載される方法により作製される。特定の実施形態において、この方法が作製する、増幅のための核酸の由来となるＤＮＡ分子は、細胞、組織または他のサンプルから標準的な方法に従って単離され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。
【０１６６】
用語「プライマー」は、本明細書中で使用される場合、テンプレート依存性プロセスにおいて新生核酸の合成を開始し得る任意の核酸を含むことを意味する。代表的に、プライマーは、１０〜２０および／または３０塩基対長のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列も用いられ得る。プライマーは、二本鎖および／または一本鎖の形態で提供され得るが、一本鎖形態が好ましい。
【０１６７】
核酸に選択的にハイブリダイズするように設計されたプライマーの対は、選択的ハイブリダイゼーションを可能とする条件下で、テンプレート核酸と接触する。所望の用途に依存して、プライマーに完全に相補的である配列にのみハイブリダイゼーションを可能にする高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が選択され得る。他の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、プライマー配列との一つ以上のミスマッチを含む核酸の増幅を可能にする低いストリンジェンシー下で生じ得る。一旦ハイブリダイズすると、テンプレート−プライマー複合体は、テンプレート依存性核酸合成を促進する一種以上の酵素と接触する。複数ラウンドの増幅は、「サイクル」とも言われ、十分な量の増幅産物が産生されるまで行なわれる。
【０１６８】
増幅産物は、検出され得るか、または定量され得る。特定の適用において、検出は、視覚的手段により行なわれ得る。あるいは、検出は、化学発光、組み込まれた放射標識もしくは蛍光標識の放射活性のシンチグラフィー、またはさらに電子的インパルスシグナルおよび／もしくは熱的インパルスシグナルを用いる系（Ａｆｆｙｍａｘ技術）による産物の間接的同定を包含し得る。
【０１６９】
所定のテンプレートサンプル中に存在するオリゴヌクレオチド配列を増幅するために、多数のテンプレート依存性プロセスが利用可能である。最もよく知られている増幅方法の一つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭと称される）であって、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号および同第４，８００，１５９号、ならびにＩｎｎｉｓら、１９９０（これらのそれぞれは、本明細書中にその全体が参考として援用される）に詳細に記載される。手短に述べると、二つの合成オリゴヌクレオチドプライマー（これらは、増幅されるテンプレートＤＮＡの二つの領域（各鎖に対して一箇所）に相補的である）が、過剰なデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）、熱安定性のポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ）の存在下でテンプレートＤＮＡ（純粋である必要はない）に添加される。一連の温度サイクル（代表的には、３０〜３５ラウンド）の中で、標的ＤＮＡが繰り返し縮重され（約９５℃）、プライマーにアニーリングされ（代表的には、５０〜６０℃）、そして、娘鎖がプライマーから伸長する（７２℃）。娘鎖が作製されると、それらは、後のサイクルでテンプレートの役割を果たす。従って、二つのプライマーの間のテンプレート領域が、線形的というよりは、むしろ指数関数的に増加する。
【０１７０】
逆転写酵素ＰＣＲＴＭ増幅手順は、増幅したｍＲＮＡの量を定量するために行なわれ得る。ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写の方法は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に記載される。逆転写の代替的な方法は、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを使用する。これらの方法は、ＷＯ  ９０／０７６４１に記載される。ポリメラーゼ鎖反応方法は、当該分野で周知である。ＲＴ−ＰＣＲＴＭの代表的な方法は、米国特許第５，８８２，８６４号に記載される。
【０１７１】
（Ａ．ＬＣＲ）
増幅のための別の方法は、欧州特許出願第３２０，３０８号（これは、本明細書中に参考として援用される）に開示されるリガーゼ連鎖反応（「ＬＣＲ」）である。ＬＣＲでは、二つの相補的なプローブ対が調製され、そして、標的配列の存在下で、各対は、これらの対が隣接する標的の反対側の相補鎖に結合する。リガーゼの存在下で、二つのプローブ対は、連結して単一の単位を形成する。ＰＣＲＴＭにおけるのと同様の温度サイクルによって、結合してライゲーションした単位は、標的から解離し、次いで、過剰なプローブ対のライゲーションのための「標的配列」としての役目を果たす。米国特許第４，８８３，７５０号（これは、本明細書中に参考として援用される）は、プローブ対を標的配列に結合するためのＬＣＲに類似する方法を記載する。
【０１７２】
（Ｂ．Ｑβレプリカーゼ）
Ｑβレプリカーゼ（ＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載される）はまた、本発明におけるなお別の増幅方法として使用され得る。この方法では、標的の領域に対して相補的である領域を有するＲＮＡの複製配列が、ＲＮＡポリメラーゼの存在下でサンプルに添加される。そのポリメラーゼは、複製配列を複製し、次いで、それらは、検出され得、そして定量され得る。
【０１７３】
（Ｃ．等温増幅）
制限部位の一本鎖にヌクレオチド三リン酸を含む標的分子の増幅を達成するために、制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼが使用される等温増幅方法は、本発明における核酸の増幅に有用であり得る。このような増幅方法は、Ｗａｌｋｅｒら、１９９２によって記載され、これは、本明細書中に参考として援用される。
【０１７４】
（Ｄ．鎖置換増幅）
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、鎖置換および合成の複数のラウンド（すなわち、ニック翻訳）を含む核酸の定温増幅を行なう別の方法である。修復連鎖反応（ＲＣＲ）と称される類似する方法は、増幅のための標的化領域にわたるいくつかのプローブをアニーリングし、その後、４つの塩基の内２つのみが存在する修復反応を行なう工程を包含する。他の二つの塩基は、容易に検出するためのビオチン化誘導体として添加され得る。類似のアプローチが、ＳＤＡに用いられる。
【０１７５】
（Ｅ．環状プローブ反応）
標的特異的配列はまた、環状プローブ反応（ＣＰＲ）を用いて検出され得る。ＣＰＲでは、非特異的ＤＮＡの３’配列および５’配列ならびに特異的ＲＮＡの中央の配列を有するプローブを、サンプル中に存在するＤＮＡにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの際に、その反応をＲＮａｓｅ  Ｈで処理し、そのプローブの産物を、消化の後に放出される特有の産物として同定する。もとのテンプレートを別の環状プローブにアニーリングさせ、その反応を繰り返す。
【０１７６】
（Ｆ．転写に基づいた増幅）
他の核酸増幅手順としては、核酸配列に基づいた増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲ（Ｋｗｏｈら、１９８９；ＰＣＴ特許出願ＷＯ８８／１０３１５（それぞれ、本明細書中で参考として援用される））を含む転写ベースの増幅システム（ＴＡＳ）が挙げられる。
【０１７７】
ＮＡＳＢＡにおいて、増幅のための核酸は、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、臨床サンプルの熱変性、溶解緩衝液による処理ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの単離のためのミニスピンカラム、またはＲＮＡの塩化グアニジニウム抽出によって調製され得る。これらの増幅技術は、標的特異的配列を有するプライマーをアニーリングさせる工程を包含する。重合の後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを、ＲＮａｓｅ  Ｈで消化する一方で、二本鎖ＤＮＡ分子を再度熱変性する。いずれにしても、二番目の標的特異的プライマーを添加し、重合させることにより、一本鎖ＤＮＡを完全に二本鎖にする。次いで、二本鎖ＤＮＡ分子をＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）により、転写増幅する。定温環状反応では、ＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに逆転写し、そして、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）により再度転写する。生じた産物は、短縮型であれ、完全なものであれ、標的特異的配列を示す。
【０１７８】
（Ｇ．ローリングサークル増幅）
ローリングサークル増幅（米国特許第５，６４８，２４５号）は、環状テンプレートを使用することにより、鎖置換反応の有効性を増加させる方法である。５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないポリメラーゼは、テンプレートの周囲で複数の連続的なサイクルを行なう間に、環状テンプレートの情報の複数のコピーを作製する。産物の長さは、非常に長く、代表的には、直接配列決定できないほど長い。テンプレートとして第一の鎖置換産物を使用する反応に、第二の鎖置換プライマーが添加される場合、さらなる増幅が達成される。
【０１７９】
（Ｈ．他の増幅方法）
他の増幅方法（英国特許出願ＧＢ２，２０２，３２８号およびＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５（これらは、それぞれ本明細書中に参考として援用される）に記載される）は、本発明に従って用いられ得る。前者の出願において、「改変」プライマーは、ＰＣＲＴＭ様のテンプレートおよび酵素依存性合成に使用される。プライマーは、捕獲部分（例えば、ビオチン）および／または検出部分（例えば、酵素）で標識することにより改変され得る。後者の出願では、過剰の標識プローブがサンプルに添加される。標的配列の存在下で、そのプローブは結合し、そして、触媒的に切断される。切断後、標的配列はインタクトなまま遊離され、過剰のプローブに結合される。標識プローブの切断は、標識配列の存在を示す。
【０１８０】
ＭｉｌｌｅｒらのＰＣＴ特許出願ＷＯ８９／０６７００（本明細書中に参考として援用される）は、一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）を標的化するためのプロモーター／プライマー配列のハイブリダイゼーション、その後のその配列の多数のＲＮＡコピーの転写に基づく核酸配列増幅スキームを開示する。このスキームは、周期的ではない（すなわち、新しいテンプレートは、生じたＲＮＡ転写物から産生されない）。
【０１８１】
他の適した増幅方法としては、「ＲＡＣＥ」および「ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ  ＰＣＲＴＭ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０；Ｏｈａｒａら、１９８９、それぞれは、本明細書中に参考として援用される）が挙げられる。生じる「ジオリゴヌクレオチド」の配列（それにより増幅する）ジオリゴヌクレオチドの配列を有する核酸の存在下での二つ（またはそれより多く）のオリゴヌクレオチドのライゲーションに基づいた方法（Ｗｕら、１９８９、これは、本明細書中に参考として援用される）はまた、本発明の増幅工程において用いられ得る。
【０１８２】
（Ｖ．酵素）
本発明と関連して使用され得る酵素としては、以下の表に列挙される核酸修飾酵素が挙げられる。
【０１８３】
（表Ｉ：ポリメラーゼおよび逆転写酵素）
（熱安定ＤＮＡポリメラーゼ：）
ＯｍｎｉＢａｓｅＴＭシークエナーゼ
Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ
Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、配列決定等級
ＴａｑＢｅａｄＴＭホットスタートポリメラーゼ
ＡｍｐｌｉＴａｑゴールド
Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ
Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ
Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ
（ＤＮＡポリメラーゼ：）
ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウフラグメント、エキソヌクレアーゼマイナス
ＤＮＡポリメラーゼＩ
ＤＮＡポリメラーゼＩラージ（クレノウ）フラグメント
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ
（逆転写酵素：）
ＡＭＶ逆転写酵素
ＭＭＬＶ逆転写酵素
ＨＩＶ逆転写酵素
（表ＩＩ：ＤＮＡ／ＲＮＡ改変酵素）
（リガーゼ：）
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ
（キナーゼ）
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
（ＶＩ．ＤＮＡポリメラーゼ）
好ましい実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、本発明の方法に使用される。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、一つ以上の酵素を用いて実施され得、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を保持する単一のＤＮＡポリメラーゼ分子の機能を達成するために複数の酵素が併用されることが想定される。５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を保持する効果的なポリメラーゼとしては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  ＤＮＡ  ポリメラーゼＩ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、単純ヘルペスＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、熱シークエナーゼ（ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ）および野生型Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼまたは改変Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。好ましい実施形態において、効果的なポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウもしくはＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、またはＭＭＬＶ逆転写酵素である。
【０１８４】
実質的に二本鎖核酸テンプレートにおける切断が、３’ヒドロキシル基を含むか、または３’ヒドロキシル基を含むように反応する少なくとも一塩基長または一ヌクレオチド長の間隙である場合、使用され得る効果的なポリメラーゼの範囲は、さらに広くなる。このような局面において、効果的なポリメラーゼは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ  ＤＮＡ  ポリメラーゼＩ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、単純ヘルペスＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメント、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、熱シークエナーゼまたは改変Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼであり得る。好ましい局面において、効果的なポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼまたはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼである。
【０１８５】
（ＶＩＩ．ハイブリダイゼーション）
想定される適用に依存して、標的配列（例えば、アダプター内における）に対するプローブまたはプライマーの選択性の程度の変動を達成するために、変動するハイブリダイゼーション条件を用いることが所望される。高選択性を必要とする適用については、代表的に、ハイブリッドを形成するために、比較的高ストリンジェンシー条件を用いることが所望される。例えば、比較的低い塩条件および／または比較的高温条件は、約５０℃〜約７０℃の温度での約０．０２Ｍ〜約０．１０ＭのＮａＣｌにより提供される。このような高ストリンジェンシー条件は、プローブまたはプライマー間のミスマッチとテンプレートまたは標的鎖との間のミスマッチを、もしあったとしてもほとんど許容せず、特定の遺伝子の単離または特定のｍＲＮＡ転写物の検出に特に適している。ホルムアミドの添加量の増加によって条件がより高ストリンジェンシーになり得ることが一般に理解される。
【０１８６】
塩濃度を増加し、そして／または温度を下げることにより、条件は、より低ストリンジェンシーになり得る。例えば、中程度のストリンジェンシー条件は、約３７℃〜約５５℃の温度で、約０．１〜０．２５ＭのＮａＣｌにより提供され得るのに対して、低ストリンジェンシー条件は、約２０℃〜約５５℃の範囲の温度で、約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩により提供され得る。ハイブリダイゼーション条件は、所望の結果に依存して容易に操作され得る。
【０１８７】
他の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、例えば、以下、約２０℃〜約３７℃の間の温度で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭ  ジチオスレイトールの条件下で達成され得る。用いられる他のハイブリダイゼーション条件としては、約４０℃〜約７２℃の範囲の温度で、約１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が挙げられる。
【実施例】
【０１８８】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。代表的な技術に続く実施例に開示される技術が、本発明者らによって、本発明の実施において良好に機能することが発見され、従ってその実施のための好ましい様式を構成すると考えられ得ることを当業者は理解すべきである。しかし、当業者は、多くの変化が開示される特定の実施形態においてなされ得、なお本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同様なまたは類似した結果を得ることができることを本発明の開示の観点から理解するべきである。
【０１８９】
（実施例１：縮重ピリミジンプライマーの設計ならびに自己プライミングおよび伸長の分析）
一定の１８塩基配列、続く１０のランダムなピリミジンおよび３’末端の０〜６個の完全にランダムな塩基を含むピリミジンプライマー（表ＩＩＩ、プライマー１〜７）を、自己プライミング能力およびモデルテンプレートオリゴヌクレオチドを伸長する能力について比較する。
【０１９０】
【表３−１】
0004773338.tif 000002
【０１９１】
【表３−２】
0004773338.tif 000003
【０１９２】
モデルテンプレートオリゴヌクレオチド（表ＩＩＩ、オリゴヌクレオチド９）は、Ｔ７プロモーター配列、３’末端の続く１０のランダムプリン塩基からなっていた。反応混合物は、２５μｌの最終体積中に、１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反応緩衝液（ＮＥＢ）、４ユニットのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（ＮＥＢ）、２００μＭ  ｄＮＴＰ、３５０ｎＭ  テンプレートオリゴ９、３．５μＭまたは３５μＭの縮重ピリミジンプライマーＹおよびＹＮ（表ＩＩＩ、プライマー１〜７）を含有した。ｄＮＴＰを含有しないコントロールはまた、それぞれＹプライマーまたはＹＮプライマーに関して含まれる。サンプルを４５℃で、５分間または１５分間インキュベートし、２μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを添加することにより停止させた。その反応物のアリコートを、ＳｙｂｒＧｏｌｄ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した後、１０％ＴＢ−尿素変性ポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分析した。図３は、比較実験の結果を示す。４５℃で、ＢｓｔポリメラーゼおよびｄＮＴＰとの５分間のインキュベーションの後に、３５μＭの濃度で適用した場合、３個までのランダムな塩基をその３’末端に有するプライマーには、自己プライミングの証拠は検出されなかった（図３Ａ）。対照的に、テンプレートオリゴヌクレオチドを含むサンプルでは、伸長産物に対応する新規バンドが、３５μＭおよび３．５μＭの両方のプライマー濃度で観察された（図３Ｂ）。別の実験において、その３’末端に６個までのランダムな塩基を有する縮重ピリミジンプライマーを、自己プライミング能力について分析した（図３Ｃ）。Ｂｓｔポリメラーゼとの１５分間のインキュベーションの後、３個以下のランダムな塩基を有するプライマーを含むサンプルでは、伸長産物は観察されなかった（図３Ｃ、レーン１〜３）のに対して、より高い複雑性を有するプライマー（Ｎ３および上記）は、伸長産物の量が徐々に増加することを示した（図３Ｃ、レーン４〜６）。ｄＮＴＰなしで、Ｂｓｔポリメラーゼとインキュベートしたコントロールサンプルは、伸長産物を示さなかった（図３Ｃ、レーン７〜１２）。
【０１９３】
（実施例２：ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウエキソフラグメントを含むライブラリー合成に使用される種々の縮重ピリミジンプライマーの比較およびその後の全ゲノム増幅）
標準的な手順により単離したヒトリンパ球ゲノムＤＮＡを、ＴＥ緩衝液中でＨｙｄｒｏＳｈｅａｒＴＭデバイス（Ｇｅｎｅ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いて平均１．５Ｋｂの大きさにランダムに断片化した。反応混合物は、２５μｌの最終体積中に、１×ＥｃｏＰｏｌ緩衝液（ＮＥＢ）中の５０ｎｇの断片化ＤＮＡ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、３６０ｎｇの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＵＳＢ）、５００ｎＭの既知のＹＵプライマー（表ＩＩＩ、プライマー８）、および１μＭの、３’末端に０〜６個のランダムな塩基を有する縮重ピリミジンプライマー（表ＩＩＩ、プライマー１〜７）または１μＭの、３’末端に６個のランダムＮ塩基を有するＴ７プライマー（表ＩＩＩ、Ｔ７（Ｎ）６プライマー１６）を含有していた。９５℃で、２分間の縮重工程の後、そのサンプルを１６℃まで冷却し、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠如するクレノウ酵素（ＮＥＢ）を５ユニット添加することによりその反応を開始した。ＷＧＡライブラリー合成を、１６℃で１０分間、２４℃で１０分間、そして３７℃で１５分間の３工程プロトコルで実施した。反応を、１μｌの２５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で停止させ、サンプルを９５℃で３分間加熱した。アリコートをＥｔＢｒで染色後、１％アガロースゲル上で分析した（図４）。図４は、アッセイに用いられた条件下で、３個以上の完全にランダムな３’塩基を有するＹＮプライマーを使用する場合のみプライマーダイマーが形成したことを示す。ダイマーの量は、ランダムな塩基の数の増加につれて徐々に増加した（図４、レーン４〜７）。対照的に、２個までの完全にランダムな３’塩基を有するプライマーを使用する場合には、プライマーダイマーは形成しなかった（図４、レーン１〜３）。一定のＴ７プロモーター配列（プリンおよびピリミジンの両方を含む）ならびにその３’末端に完全にランダムなヘキサマーを含むプライマー（表ＩＩＩ、プライマー１６）を使用した場合、過剰量のダイマーが生じた（図４、レーン８）。
【０１９４】
５ｎｇの投入ＤＮＡ（ｉｎｐｕｔ  ＤＮＡ）に対応するライブラリー反応のアリコートを、リアルタイムＰＣＲによりさらに増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、以下を含有した：５０μｌの最終体積中に、１×チタンＴａｑ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、フルオレセインおよびＳｙｂｒＧｏｌｄ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１００，０００希釈物、１μＭの既知のＹＵプライマー（または縮重Ｔ７（Ｎ）６プライマーの場合には、既知のプライマーＴ７（表ＩＩＩ、プライマー１７））、５ユニットのチタンＴａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、およびクレノウライブラリー合成反応物の３μｌのアリコート（約５ｎｇの入力ゲノムＤＮＡ）。反応を、Ｉ−ＣｙｃｌｅｒＴＭリアルタイムＰＣＲ機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、９４℃１５秒間、６５℃２分間で１８サイクル反応を行なった。図５は、リアルタイムＰＣＲのクロマトグラムを示す。全ての縮重ピリミジンプライマーは、約９サイクルで集中した最大の５０％に対応するシグナルを有する同様の増幅効率を示したのに対して、３’末端にランダムヘキサマーを含むＴ７配列（表ＩＩＩ、プライマー１６）は、過剰なプライマーダイマーの形成に起因して一桁以上効率が低かった（４サイクル右にシフトしていた）（図５、レーン８を参照のこと）。
【０１９５】
０〜６個のランダムな３’塩基を有するピリミジンプライマーにより調製したサンプルの代表分析を、３０個のヒトゲノムＳＴＳマーカーの一群（表ＩＶ、ＳＴＳマーカー１〜６、８〜１０、１２、１４、１６、１９、２０、２３、２６、２９〜３１、３５、３６、３８、４０、４１、４３、４４、４６、４７および４９）を使用して行った。
【０１９６】
【表４−１】
0004773338.tif 000004
【０１９７】
【表４−２】
0004773338.tif 000005
【０１９８】
【表４−３】
0004773338.tif 000006
【０１９９】
＊省略した配列番号は、定量的ＲＴ−ＰＣＲにおいて良好に増幅しなかった脱落したＳＴＳ配列を示す。
【０２００】
＊＊ＳＴＳマーカー配列の固有の名称は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＵｎｉＳＴＳデータベースに由来する。ＳＴＳ領域の配列ならびに定量的リアルタイムＰＣＲに使用されるフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトのＵｎｉＳＴＳデータベースに見出され得る。
【０２０１】
既知のＹＵプライマーを用いるＰＣＲによって増幅された物質を、Ｑｉａｑｕｉｃｋフィルター（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、その後１０ｎｇのアリコートをリアルタイムＰＣＲで分析した。反応を、Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、上記のように２５μｌの体積で、９４℃１５秒間、６８℃１分間で４５サイクル行なった。１０ｎｇの断片化ＤＮＡ、１ｎｇの断片化ＤＮＡおよび０．２ｎｇの断片化ＤＮＡに相当する標準を各ＳＴＳに使用し、各ＳＴＳに対して標準曲線を適合することにより量を計算し（Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒソフトウェア、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、そして、頻度ヒストグラムとしてプロッティングした（図６）。試験した全てのピリミジンプライマーの内で、Ｙ（Ｎ）２は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでのほぼ均一な全ゲノム増幅を補助した（図６Ａ）が、なお、限られた量のプライマーダイマーしか産生しなかった（図３および図４）。Ｙ（Ｎ）２プライマーを用いた全ゲノム増幅の後に分析したＳＴＳマーカーの内８３％は、平均の２倍の範囲内であり、９０％は、平均の３倍の範囲内であるのに対して、これらの数の平均は、分析した全ての他のＹＮプライマーに対してそれぞれ６３〜７０％の範囲および７３〜８０％の範囲であった。
【０２０２】
（実施例３：ＤＮＡポリメラーゼＩまたはシークエナーゼバージョン２のクレノウエキソフラグメントおよび縮重プライマーＹ（Ｎ）２を用いて増幅可能ＤＮＡライブラリーへ変換される、熱的に断片化したゲノムＤＮＡの全ゲノム増幅）
標準的な手順により単離したヒトリンパ球ゲノムＤＮＡを、ＴＥ−Ｌ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中で、９５℃で５分間加熱することにより、ランダムに断片化した。この反応混合物は、２５μｌの最終体積中に、１×ＥｃｏＰｏｌ緩衝液（ＮＥＢ）または１×シークエナーゼ緩衝液（ＵＳＢ）中の１００ｎｇの熱的に断片化したＤＮＡ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、３６０ｎｇの一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＵＳＢ）、２００ｎＭの既知のＹＵプライマー（表ＩＩＩ、プライマー８）、および５００ｎＭの縮重Ｙ（Ｎ）２プライマー（表ＩＩＩ、プライマー３）を含有していた。９５℃で、２分間の縮重工程の後、そのサンプルを１６℃まで冷却し、２．５ユニットのクレノウエキソポリメラーゼ（ＮＥＢ）または６．５ユニットのシークエナーゼバージョン２（ＵＳＢ）をそれぞれ添加することにより、その反応を開始した。ＷＧＡライブラリー合成を、１６℃で１０分間、２４℃で１０分間、そして３７℃で１２分間の３工程プロトコルで実施した。反応を、１μｌの５００ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で停止させ、サンプルを７５℃で３分間加熱した。５ｎｇの入力ＤＮＡに相当するライブラリー合成反応のアリコートを、リアルタイムＰＣＲによりさらに増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、以下を含有していた：５０μｌの最終体積中に、１×チタンＴａｑ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、フルオレセインおよびＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１００，０００×希釈物、１μＭの既知のＹＵプライマー（またはランダムＴ７（Ｎ）６プライマーの場合には、既知のＴ７（プライマー１８））、５ユニットのチタンＴａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、および５ｎｇ入力ゲノムＤＮＡに相当する体積のライブラリー合成反応物）。反応を、Ｉ−ＣｙｃｌｅｒＴＭリアルタイムＰＣＲ機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、９４℃１５秒間、６５℃２分間で１７サイクル行なった。図７は、リアルタイムＰＣＲのクロマトグラムを示す。シークエナーゼバージョン２は、試験した両方の濃度でのクレノウエキソポリメラーゼと比較して、一桁高い効率を示した。ＰＣＲ増幅反応のアリコートを、ＥｔＢｒを用いて染色した後、１％アガロースゲル上で分析した。シークエナーゼ合成は、クレノウエキソポリメラーゼと比較してより大きい平均サイズのアンプリコンを産生した（図８）。シークエナーゼまたはクレノウエキソポリメラーゼを用いて作製したＰＣＲ増幅ライブラリーの代表分析を、一群の３３個のヒトゲノムＳＴＳマーカー（表ＩＶ、ＳＴＳマーカー１、５、６、１４、１９、２２、２６、３８、４３、４６、４７、５２、５３、５４、５８、６０、６２、６３、６９、７２、７４、８０、８１、８２、８５、８９、９１、９４、９６、９９、１０４、１０７、１０８）を用いて行なった。
【０２０３】
既知のＹＵプライマーをもちいたＰＣＲにより増幅した物質を、Ｑｉａｑｕｉｃｋフィルター（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、１０ｎｇのアリコートをリアルタイムＰＣＲで分析した。反応を、Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、上記のように２５μｌの体積で、９４℃１５秒間、６８℃１分間で４５サイクル行なった。１０ｎｇの断片化ゲノムＤＮＡ、１ｎｇの断片化ゲノムＤＮＡおよび０．２ｎｇの断片化ゲノムＤＮＡに相当する標準を各ＳＴＳに使用した。各ＳＴＳに対して標準曲線を適合することにより量を計算し（Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒソフトウェア、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、そして、頻度ヒストグラムとしてプロッティングした（図９）。シークエナーゼライブラリー調製物は、より小さい異常値を有するクレノウエキソ−と比較してより代表的な増幅を生じた。シークエナーゼで調製したライブラリーの増幅の後、分析したＳＴＳマーカーのうち８０％〜８５％は、平均値の２倍の範囲内であるのに対して、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで調製したライブラリーの増幅後に分析したＳＴＳマーカーは、平均６７％であった。
【０２０４】
（実施例４．非相補的な塩基を二つのみ含む縮重プライマーＹ（Ｎ）２、Ｒ（Ｎ）２、Ｍ（Ｎ）２およびＫ（Ｎ）２と３’末端に真にランダムな塩基を二つ含むプライマーの、ヒト全ゲノムライブラリー調製および増幅の効率の比較）
標準的な手順により単離したヒトリンパ球ゲノムＤＮＡを、ＴＥ−Ｌ緩衝液中で、９５℃で４分間加熱することにより、ランダムに断片化した。この反応混合物（各縮重プライマーに対して一つ）は、２４μｌの最終体積中に、１×ＥｃｏＰｏｌ緩衝液（ＮＥＢ）中の１００ｎｇの熱的に断片化したＤＮＡ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、および１μＭの縮重Ｙ（Ｎ）２プライマー、縮重Ｒ（Ｎ）２プライマー、縮重Ｍ（Ｎ）２プライマーまたは縮重Ｋ（Ｎ）２プライマー（表ＩＩＩ、プライマー３、１０、１２および１４）を含有していた。９５℃で、２分間の縮重工程の後、そのサンプルを１６℃まで冷却し、１μｌ（３ユニット）のシークエナーゼバージョン２（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を添加することにより、そのライブラリー合成反応を開始した。その反応を、１６℃で１５分間、２４℃で１５分間、そして３７℃で１５分間の３工程プロトコルで実施した。反応を、１μｌの２５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を添加することにより停止させ、サンプルを７５℃で５分間加熱した。５ｎｇの入力ＤＮＡに相当するライブラリー反応物のアリコートを、定量的リアルタイムＰＣＲによりさらに増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、５０μｌの最終体積中に、以下を含有していた：１×チタンＴａｑ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、フルオレセインおよびＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１００，０００×希釈物、１μＭの既知のＹＵプライマー、ＲＵプライマー、ＭＵプライマー、またはＫＵプライマーであって、その配列が、それぞれの縮重プライマーの５’の既知の部分と同一であるプライマー（表ＩＩＩ、プライマー８、１１、１３および１６）、５ユニットのチタンＴａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、およびライブラリー合成反応の５ｎｇの入力ゲノムＤＮＡ等価物。増幅を、Ｉ−ＣｙｃｌｅｒＴＭリアルタイムＰＣＲ機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、９４℃１５秒間、６５℃２分間で１６サイクル行なった。図１０は、グアニンおよびチミジンを含む縮重プライマー（Ｋ（Ｎ）２プライマー）が、試験した全てのプライマーの内で最も効率よくプライミングすることを示している。また、ともにグアニンを含む縮重プライマー（Ｒ（Ｎ）２およびＫ（Ｎ）２）は、シトシン含有プライマー（Ｍ（Ｎ）２およびＹ（Ｎ）２）と比較してより有効である。これらの知見は、グアニンおよびチミジンが、他の二つの塩基と比較してより迅速に非標準的な塩基対合に関与し得るという事実により説明され得る。概してＫ（Ｎ）２プライマーは、Ｙ（Ｎ）２プライマーと比較して約１桁大きく効果的であった（図１０）。シークエナーゼを用いて作製されたＰＣＲ増幅ライブラリーの代表分析を、一群の３５個のヒトゲノムＳＴＳマーカー（表ＩＶ、ＳＴＳマーカー４０〜４４、４６、４７、４９、５２、５４、５５、５８、６０、６２、６３、６６〜７０、７２、７４、７６、７７、７９、８０、８１〜８６、８８および８９）を用いて行なった。既知のプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した物質をＱｉａｑｕｉｃｋフィルター（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、１０ｎｇのアリコートをリアルタイムＰＣＲにて分析した。さらに、各個々の増幅反応物を２．５ｎｇ含む合わせたサンプルを、並行に行なった。反応は、２５μｌの体積で、Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、９４℃１５秒間、６８℃１分間の４５サイクルで行なった。１０ｎｇ、１ｎｇおよび０．２ｎｇの断片化ゲノムＤＮＡに相当する標準を各ＳＴＳに対して使用した。量は、各ＳＴＳ（Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒソフトウェア、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に対して標準曲線を適合させることにより得て、頻度ヒストグラムとしてプロッティングした。図１１に示されるように、Ｋ（Ｎ）２プライマーの使用により、最も均一かつ代表的なＤＮＡ増幅を生じた。この研究において、Ｋ（Ｎ）２プライマーを用いて増幅した後に分析したＳＴＳマーカーの９１％は、平均値の２倍以内であったが、Ｙ（Ｎ）２プライマー、Ｍ（Ｎ）２プライマーおよびＲ（Ｎ）２プライマーについては、それぞれ６３％、７４％および８３％であった。
【０２０５】
（実施例５．シークエナーゼバージョン２およびＹ（Ｎ）２縮重プライマーを含む全ゲノムライブラリーの調製の間の異なる様式のインキュベーション、ならびにその後のヒトＤＮＡの代表的な増幅の比較）
標準的な手順により単離したヒトリンパ球ゲノムＤＮＡを、ＴＥ−Ｌ緩衝液中で、９５℃で４分間加熱することにより、ランダムに断片化した。この反応混合物は、２５μｌの最終体積中に、１×ＥｃｏＰｏｌ緩衝液（ＮＥＢ）中の１００ｎｇの熱的に断片化したＤＮＡ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、および１μＭの縮重Ｙ（Ｎ）２プライマー（表ＩＩＩ、プライマー３）を含有していた。９５℃で、２分間の縮重工程の後、そのサンプルを１６℃または２４℃まで冷却し、３ユニットのシークエナーゼバージョン２（ＵＳＢ）を添加することにより、ＷＧＡライブラリー合成反応を開始した。その反応を、以下の３つの異なるプロトコルで実施した：（ｉ）等温２４℃で１時間、（ｉｉ）各１分間で、１６℃、２４℃および３７℃の間のサイクルで、計１９サイクル（合計所要時間は、１時間）、ならびに（ｉｉｉ）１６℃で２０分間、２４℃で２０分間、３７℃で２０分間の３工程インキュベーションプロトコル。反応を、１μｌの２５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）により停止させ、サンプルを７５℃で５分間加熱した。５ｎｇの入力ＤＮＡに相当するライブラリー合成反応物のアリコートを、リアルタイムＰＣＲによりさらに増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、５０μｌの最終体積中に、以下を含有していた：１×チタンＴａｑ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、フルオレセインおよびＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１００，０００×希釈物、１μＭの既知のＹＵプライマー（または表ＩＩＩ、プライマー８）、５ユニットのチタンＴａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、および合成反応の５ｎｇの入力ゲノムＤＮＡ。反応を、Ｉ−ＣｙｃｌｅｒＴＭリアルタイムＰＣＲ機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、９４℃１５秒間、６５℃２分間で１７サイクル行なった。図１２は、リアルタイムＰＣＲのクロマトグラムを示す。２４℃で１時間の等温インキュベーションは、最も高い増幅効率を生じ、その後３工程インキュベーションプロトコルを行なった。周期的インキュベーションは、等温インキュベーションと比較して、２周期の反応速度の遅れを生じた（図１２）。シークエナーゼを用いたライブラリー調製後のＰＣＲにより増幅したサンプルの代表分析を、一群の３１個のヒトゲノムＳＴＳマーカー（表ＩＶ、ＳＴＳマーカー４０、４２〜４４、４６、４７、４９、５２、５４、５８、６０、６２、６６、６７、６８、７１、７２、７４、７７、７９、８０〜８６、８８および８９）を用いて行なった。既知のＹＵプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した物質を、Ｑｉａｑｕｉｃｋフィルター（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、１０ｎｇのアリコートをリアルタイムＰＣＲにて分析した。反応は、上記のように２５μｌの体積で、Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、９４℃１５秒間、６８℃１分間の４５サイクルで行なった。１０ｎｇ、１ｎｇおよび０．２ｎｇの断片化ゲノムＤＮＡに相当する標準を、各ＳＴＳに対して使用した。量は、各ＳＴＳ（Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒソフトウェア、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に対して標準曲線を適合させることによって得て、頻度ヒストグラムとしてプロッティングした（図１３）。示されるように、等温増幅は、他の二つのインキュ��ーションプロトコルと比較して、わずかに良好な発現量（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を生じた。
【０２０６】
（実施例６．ヒト全ゲノム増幅プロトコールにおける、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅを用いた自己不活性型変性プライマーＫ（Ｎ）２濃度の滴定）
標準的手順によって単離されたヒトリンパ球ゲノムＤＮＡを、ＴＥ−Ｌ緩衝液中で９５℃で４分間加熱することによって、ランダムにフラグメント化した。この反応混合物（２５μｌ）は、１×ＥｃｏＰｏｌ緩衝液（ＮＥＢ）中の１００ｎｇの熱でフラグメント化したＤＮＡ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、および５００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、１０μＭ、もしくは３３μＭの、その３’末端に塩基Ｇおよび塩基Ｔならびに２つの完全にランダムな塩基を含有する自己不活性型変性プライマーＫ（Ｎ）２（表ＩＩＩ、プライマー１４）を含んだ。９５℃、２分の変性工程の後、サンプルを、２４℃に冷却し、そして３単位のＳｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２  ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ）を添加することによって、ライブラリ合成反応を開始した。ＷＧＡライブラリ合成を、２４℃で４５分間、等温で行った。１μｌの２５０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）によって反応を停止し、そしてサンプルを、７５℃で５分間加熱した。５ｎｇの投入ＤＮＡに対応するライブラリ合成反応のアリコートを、リアルタイムＰＣＲによってさらに増幅した。このＰＣＲ反応混合物は、５０μｌの最終容量中に、以下を含有した：１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、フルオレセインおよびＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１００，０００×希釈液、１μＭの既知のＫＵプライマー（表ＩＩＩ、プライマー１６）、５単位のＴｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ならびに５ｎｇの投入ゲノムＤＮＡに対応する容量のライブラリ合成反応液。Ｉ−ＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、９４℃で１５秒間および６５℃で２分間の１５サイクルの間、反応を実行した。図１４は、リアルタイムＰＣＲのクロマトグラムを示す。増幅の効率は、０．５μＭと２μＭとの間の自己不活性型変性プライマーＫ（Ｎ）２の濃度において、同様であった。１０μＭおよび３３μＭにおいて、増幅は阻害された（図１４）。ＰＣＲによって増幅されたサンプルの発現量分析は、１７のヒトＳＴＳマーカーのパネル（表ＩＶ、ＳＴＳマーカー：４０〜４４、４６、４７、４９、５２、５４、５５、５８、６０、６２、６３、６６、および６７）を用いて行った。既知のＫＵプライマーを用いてＰＣＲによって増幅された物質を、Ｑｉａｑｕｉｃｋフィルター（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、１０ｎｇのアリコートをリアルタイムＰＣＲで分析した。Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、２５μｌの容量で、９４℃で１５秒間および６８℃で１分間の４５サイクルの間、反応を実行した。１０ｎｇ、１ｎｇおよび０．２ｎｇのフラグメント化ゲノムＤＮＡに対応する標準を、各ＳＴＳについて使用した。量を、各ＳＴＳについての標準カーブフィッティングによって計算し（Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒソフトウェア、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、そして分布図としてプロットした（図１５）。示されるように、ＳＴＳマーカーの発現量は、プライマーＫ（Ｎ）２濃度が０．５μＭから２μＭへと上昇することによって、有意に向上した。１０μＭまたは３３μＭのプライマーＫ（Ｎ）２を適用した場合、ゲノムマーカーの発現量の障害が生じた（図１５；��３μＭについてはデータを示さず）。０．５μＭと２μＭとの間のプライマー濃度により、平均９１％のＳＴＳマーカーが、平均値の２倍の係数の範囲内であった。一方、１０μＭプライマーでは、パーセンテージは８２であった。
【０２０７】
（実施例７．変性プライマーＫ（Ｎ）２およびＳｅｑｕｅｎａｓｅを用いたヒト全ゲノム増幅におけるＤＮＡ投入量の滴定）
標準的手順によって単離されたヒトリンパ球ゲノムＤＮＡを、ＴＥ−Ｌ緩衝液中で９５℃で４分間加熱することによって、ランダムにフラグメント化した。この反応混合物は、全容量１５μｌ中に、１×ＥｃｏＰｏｌ緩衝液（ＮＥＢ）中の１００ｎｇ、２５ｎｇ、１０ｎｇもしくは５ｎｇの熱でフラグメント化したＤＮＡ（または陰性コントロールとしてＴＥ−Ｌ緩衝液のみ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、および１μＭの変性プライマーＫ（Ｎ）２（表ＩＩＩ、プライマー１４）を含んだ。９５℃、２分の変性工程の後、サンプルを、１６℃に冷却し、そして１．８５単位のＳｅｑｕｅｎａｓｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ）を添加することによって、反応を開始した。ライブラリ合成を、１６℃で２０分間、２４℃で２０分間、および３７℃で２０分間行った。１μＬの８３ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）によって反応を停止し、そしてサンプルを、７５℃で５分間加熱した。５ｎｇの投入ＤＮＡに対応する合成反応のアリコート（または５ｎｇ  ＤＮＡの場合、反応混合液全体）を、リアルタイムＰＣＲによってさらに増幅した。このＰＣＲ反応混合物は、７５μｌの最終容量中に、以下を含有した：１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、フルオレセインおよびＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１００，０００×希釈液、１μＭの既知のＫＵプライマー（表ＩＩＩ、プライマー１６）、５単位のＴｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ならびに５ｎｇの投入ゲノムＤＮＡのライブラリ合成反応液。Ｉ−ＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、９４℃で１５秒間および６５℃で２分間の１４サイクルの間、反応を実行した。図１６は、リアルタイムＰＣＲのクロマトグラムを示す。ＰＣＲによって増幅されたサンプルの発現量分析は、２０個のヒトＳＴＳマーカーのパネル（表ＩＶ、ＳＴＳマーカー：４０、４２〜４４、４６、４７、４９、５２、５４、５５、５８、６０、６２、６３、６６〜６９、および７４）を用いて行った。既知のＫＵプライマーを用いてＰＣＲによって増幅された物質を、Ｑｉａｑｕｉｃｋフィルター（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、１０ｎｇのアリコートをリアルタイムＰＣＲで分析した。Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、２５μｌの容量で、９４℃で１５秒間および６８℃で１分間の４５サイクルの間、反応を実行した。１０ｎｇ、１ｎｇおよび０．２ｎｇのフラグメント化ゲノムＤＮＡに対応する標準を、各ＳＴＳについて使用した。定量化を、各ＳＴＳについての標準カーブフィッティングによって行い（Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒソフトウェア、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、そして量を分布図としてプロットした（図１７）。示されるように、ＳＴＳマーカーの発現量は、１００ｎｇ未満のＤＮＡを用いて合成する場合、より良好であった（図１７）。２５ｎｇまたは５ｎｇのゲノムＤＮＡから増幅したサンプルの１００％が、平均値の２倍の係数の範囲内であった。一方、１００ｎｇまたは１０ｎｇから増幅されたサンプルは、平均で９５％であった。本実施例において、評価されたＳＴＳマーカーについての最大のメジアン値は、５ｎｇの投入テンプレートを用いて達成された（図１７）。
【０２０８】
本明細書において記載されるゲノムライブラリは、高度に発現される全ゲノム増幅のための非常に有効な資源を提供する。大きさ（２００〜２，０００ｂｐ）および既知のプライミング（既知の配列）部位はまた、ＤＮＡ保管、保存、回収および最増幅のような適用に関して、それらを非常に魅力的なものとしている。複数のライブラリが、マイクロアレイとして固定化および保存され得る。チューブの底、マイクロプレートまたは磁気ビーズに一端を共有結合されたライブラリは、固定されたアンプリコンを複製し、すぐ使用するために複製された分子を分離し、そして保存を継続するために本来固定されていたＷＧＡライブラリに戻すことによって、何回も使用され得る。
【０２０９】
ＷＧＡアンプリコンの構造はまた、ＤＮＡの不正な増幅および使用を防止するために、すべてのゲノムサンプルに対する個人識別（ＩＤ）ＤＮＡタグを導入するため、容易に改変され得る。このＩＤタグの配列を知る者のみが、遺伝物質を増幅および分析し得る。このタグは、多くの臨床ＤＮＡサンプルを扱う場合、遺伝的交差汚染を防止するために有用であり得る。
【０２１０】
大きな細菌クローン（ＢＡＣ、ＰＡＣ、コスミドなど）から作製されたＷＧＡライブラリは、ゲノムマイクロアレイを作製するために増幅および使用され得る。
【０２１１】
以下に示される実施例は、ＷＧＡライブラリの概説された用途を増強し得るプロセスを記載する。
【０２１２】
（実施例８．全ゲノム増幅による個体識別ＤＮＡタグの組み込み；いくつかのＷＧＡライブラリの混合物からの個々のＷＧＡライブラリの回収）
この実施例は、後に続く他のＷＧＡライブラリを含む混合物からのこのライブラリの回収の目的のため、ＤＮＡ識別配列（ＩＤ）を用いて個々のＷＧＡライブラリをタグ化する２つのプロセスを記載する。このような状況は、意図的または不可避的に生じ得る（例えば、非常に多数のＷＧＡ  ＤＮＡサンプルを操作もしくは保存する場合）、または意図的に生じ得る（例えば、保存されたライブラリ中の遺伝情報への不正なアクセスを防止する必要がある場合）。
【０２１３】
どちらのプロセスも、３’末端に既知の配列Ｕおよび５’末端に個人ＩＤ配列タグを有する既知のプライマーに関する（図１８）。第一の場合では、この既知のプライマーは、定型的な塩基（Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）からなり、そして複製され得る（図１８Ａ）。第二の場合では、この既知のプライマーは、非ヌクレオチドリンカーＬ（例えば、ヘキサエチレングリコール、ＨＥＧ）を有し、複製され得ない（図１８Ｂおよび１８Ｃ）。
【０２１４】
複製可能な既知のプライマーを用いた３つの異なるＷＧＡライブラリのタグ化、混合、および回収のプロセスは、図１９に示される。これは、４つの工程を包含する：１）３つのゲノムＤＮＡサンプルは、本特許出願において上述される方法を用いて、３つのＷＧＡライブラリに転換される；２）３つのＷＧＡライブラリは、その５’末端に対応するＩＤ  ＤＮＡタグＴ１、Ｔ２およびＴ３を有する３つの個別の複製可能な既知のプライマー、Ｔ１Ｕ、Ｔ２ＵおよびＴ３Ｕを用いて増幅される（図１８Ａ）；３）３つのライブラリ全ては、一緒に混合される。混合物を増幅および遺伝子型決定するためのあらゆる試みは、混合されたパターンをもたらす；そして、４）このＷＧＡライブラリは、個別のＩＤプライマータグＴ１、Ｔ２およびＴ３を用いたＰＣＲによって分離される。
【０２１５】
複製不可能な既知のプライマーを用いた３つの異なるＷＧＡライブラリのタグ化、混合、および回収のプロセスは、図２０に示される。これは、５つの工程を包含する：１．）３つのゲノムＤＮＡサンプルは、本特許出願において上述される方法を用いて、３つのＷＧＡライブラリに転換される；２．）３つのＷＧＡライブラリは、その５’末端に対応するＩＤ  ＤＮＡタグＴ１、Ｔ２およびＴ３を有する３つの個別の複製不可能な既知のプライマー、Ｔ１Ｕ、Ｔ２ＵおよびＴ３Ｕを用いて増幅される（図１８Ｂおよび１８Ｃ）。得られた生成物は、プライマーのＩＤ領域によって形成される５つの一本鎖テイルを有する；３．）３つのライブラリ全ては、一緒に混合される。混合物を増幅および遺伝子型決定するためのあらゆる試みは、混合されたパターンをもたらす；４．）このＷＧＡライブラリは、固体支持体に固定されたそれらの５’テイルの相補オリゴヌクレオチドＴ１＊、Ｔ２＊およびＴ３＊へのハイブリダイゼーションによって、分離される；そして、５．）この分離されたライブラリは、既知のプライマーＵを用いたＰＣＲによって増幅される。
【０２１６】
ゲノムライブラリに関する上記のタグ化および回収のプロセスは、個別の全トランスクリプトームライブラリに同様に適用され得る。
【０２１７】
（実施例９．標的化ＤＮＡ／ＲＮＡ増幅のためのＷＧＡ／ＷＴＡライブラリへのポリ−Ｃ機能性タグの組み込み）
本発明において記載されたライブラリ合成法によって調製されたＷＧＡ（またはＷＴＡ）ライブラリは、改変またはタグ化されて、特定の配列を組み込み得る。このタグ化反応は、機能性タグを組み込み得る。例えば、ポリシトシンからなる機能性５’タグは、プライマーとして末端のＣ１０配列を用いて、ライブラリ増幅を抑制するために働き得る。末端の相補性同種重合体のＧ配列は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによって（図２１Ａ）か、ポリ−Ｃ配列を含有するアダプターのライゲーションによって（図２１Ｂ）か、または５’非相補性ポリ−Ｃテイルを有するユニバーサル近位配列Ｕに相補的なプライマーを用いたＤＮＡ重合によって（図２１Ｃ）、増幅されたＷＧＡライブラリの３’末端に付加され得る。Ｃ−テイルは、８〜３０塩基長であり得る。好ましい実施形態において、Ｃ−テイルの長さは、１０〜１２塩基である。
【０２１８】
米国特許出願２００３０１４３５９９（本明細書においてその全体が参考として援用される）に記載されるように、Ｇ／Ｃ塩基対二本鎖ＤＮＡまたはポリ−Ｇ一本鎖３−伸長部分からなる同種重合体テイルに隣接されるゲノムＤＮＡライブラリは、ポリ−Ｃプライマーによるその増幅能が抑制される。この抑制は、この配列における代替的な四つ組Ｇ様の二次構造の形成による、ポリＧ領域におけるプライミング効率の減少によって引き起こされ、そして周知の「抑制ＰＣＲ」と対照的に、ＤＮＡアンプリコンの大きさに依存しない。「抑制ＰＣＲ」は、自己相補的アダプターによって形成される「皿状の（ｐａｎ−ｌｉｋｅ）」二本鎖構造から生じ、結果としてＤＮＡフラグメントの大きさに強く依存し、短いアンプリコンでより顕著であった（Ｓｉｅｂｅｒｔら、１９９５；ＵＳ００５７５９８２２Ａ）。この抑制効果は、標的化部位を第二の部位特異的プライマーで均衡させる場合、その標的化部位に対して減少する。これによって、固有のプライミング部位およびユニバーサルな末端配列を含む複数のフラグメントの増幅は、特異的プライマーおよびポリ−Ｃプライマー（例えば、プライマーＣ１０）を用いて選択的に増幅される。当業者は、ゲノムの複雑性が、単一種のＤＮＡを増幅して複雑なＷＧＡライブラリから精製するための連続的または正味の（ｎｅｓｔｅｄ）増幅に対する必要条件を決定付け得ることを認識する。
【０２１９】
（実施例１０．マイクロアレイ形式におけるＷＧＡライブラリ）
目的を達成するため、例えば、個々のＷＧＡライブラリは、例えばマイクロアレイ上などにおいて、固定化され得る。マイクロアレイ形式は、数万の不死化ＤＮＡサンプルまたは数十万の不死化ＤＮＡサンプルでさえ、小さなマイクロチップ上に保存することを可能にし、そしてそれらに対する高速自動化アクセス手段を有する。ＷＧＡライブラリがマイクロアレイ表面に固定化され得る２つの基本的な方法（共有結合および非共有結合）が存在する。図２２は、共有結合固定化のプロセスを示す。これは、３つの工程を包含する：工程１．固体支持体に共有結合された既知のプライマー−オリゴヌクレオチドＵへの一本鎖（変性）ＷＧＡアンプリコンのハイブリダイゼーション。工程２．ＤＮＡポリメラーゼによるプライマーＵの伸長およびハイブリダイズしたアンプリコンの複製。工程３．１００ｍＭの水酸化ナトリウム溶液およびＴＥ緩衝液による洗浄。非共有結合固定化は、親和性タグ（ビオチンのようなタグ）またはアンプリコンの５’末端におけるＤＮＡ配列タグを有するＷＧＡライブラリを用いて達成され得る。ビオチンは、既知のプライマーＵの５’末端に配置され得る。一本鎖５’親和性タグおよび／またはＩＤタグは、複製不可能なプライマーを用いることによって導入され得る（図１８および図２０）。ビオチン化ライブラリは、マイクロアレイの表面に共有結合されたストレプトアビジンを通じて固定化され得る。５’オーバーハングの形態のＤＮＡ配列タグを有するＷＧＡライブラリは、マイクロアレイの表面に共有結合された相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ得る。共有結合性に整列化されたライブラリおよび非共有結合性に整列化されたライブラリの両方の例は、図２３に示される。
【０２２０】
（実施例１１．固定化されたＷＡＧライブラリの繰り返しの使用）
共有結合性に固定化されたＷＧＡライブラリ（またはビオチン−ストレプトアビジン相互作用を通じて固定化されたライブラリ）は、全ゲノム増幅のためのレプリカライブラリを作製するために繰り返し使用され得る（図２４）。その模範的な場合において、そのプロセスは４つの工程を包含する：１）長期保存からの固定化されたライブラリの回収；２）ＤＮＡポリメラーゼおよび既知のプライマーＵを用いた固定化されたライブラリの複製；３）水酸化ナトリウムによるレプリカ分子の分離、中和、および増幅；そして、４）中和および長期保存のための固相ライブラリの回復。
【０２２１】
（実施例１２．複製不可能なプライマー親和性タグを用いたＷＧＡ生成物の精製およびハイブリダイゼーションによるＤＮＡ固定化）
多くの用途に関して、増幅されたＤＮＡの精製は重要である。５’オーバーハングを有するＷＧＡライブラリは、磁気ビーズ、チューブまたはマイクロプレートの表面に共有結合された相補的オリゴヌクレオチドに対してハイブリダイズされ得、ＴＥ緩衝液または水で洗浄されて過剰のｄＮＴＰ、緩衝液およびＤＮＡポリメラーゼを除去され得、次いで、少量のＴＥ緩衝液中で加熱することによって遊離され得る。この目的のため、一本鎖５’−親和性タグは、複製不可能なプライマーを用いることによって導入され得る（図２５）。
【０２２２】
（実施例１３．自己不活性型プライマーを有するＤＮＡポリメラーゼ  Ｉのクレノウエキソフラグメントによって調製されたライブラリの全ゲノム増幅とＤＯＰ−ＰＣＲ増幅との比較）
本実施例は、本発明において記載される全ゲノム増幅とＤＯＰ−ＰＣＲ増幅のための市販のキットとの間の並行比較を記載する。
【０２２３】
ヒトリンパ球ゲノムＤＮＡを、フェノール−クロロホルム抽出を用いた標準的手順によって単離した。
【０２２４】
ＤＮＡポリメラーゼ  Ｉのクレノウフラグメントによる全ゲノム増幅のため、１０μｌのＴＥ−Ｌ緩衝液中に５ｎｇまたは２０ｐｇを含むサンプルを、９５℃で４分間加熱することによってランダムにフラグメント化した。サンプルに、１４μｌの全容量中に、最終濃度で、１×ＥｃｏＰｏｌ緩衝液（ＮＥＢ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１μＭの変性したＫ（Ｎ）２プライマー（表ＩＩＩ、プライマー１４）、および１５ｎｇ／μｌのＳＳＢタンパク質（ＵＳＢ）を含有する反応緩衝液を補充した。９５℃、２分の変性工程の後、サンプルを、２４℃に冷却し、そして５単位（１μｌ）のクレノウエキソ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を添加することによって、ライブラリ合成反応を開始した。
【０２２５】
２４℃で６０分間のインキュベーションの後、７５℃で５分間加熱することによって、反応を停止した。この合成反応物を、リアルタイムＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲ反応混合物は、７５μｌの最終容量中に、以下を含有した：１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、フルオレセインおよびＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１００，０００×希釈液、１μＭのユニバーサルＫＵプライマー（表ＩＩＩ、プライマー１６）、５単位のＴｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、全部で１５μｌのライブラリ合成反応液。Ｉ−ＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、９４℃で１５秒間および６５℃で２分間、反応を実行した。
【０２２６】
ＤＯＰ−ＰＣＲによる増幅は、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ（カタログ番号；１６４４９６３）から購入したＤＯＰ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＴＭ  Ｋｉｔを用いて行った。増幅反応は、製造者の説明書のプロトコール２に従って実行した。簡単に言うと、フルオレセインおよびＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１００，０００×希釈液を補充された、５０μｌの標準的なＤＯＰ  ＰＣＲ反応混合液中に５ｎｇまたは２０ｐｇのＤＮＡを含むサンプル（またはＤＮＡを含まないコントロールサンプル）を、Ｉ−ＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、９５℃で５分間の変性工程後、９４℃で３０秒間、３０℃で３０秒間（３０℃から７２℃まで３０秒間で上昇（１．４℃／秒））および７２℃で１．５分間で５回サイクルさせ、続いて９４℃で３０秒間、６２℃で３０秒間および７２℃で１．５分間で４５回サイクルさせ、そして７２℃で７分間最終伸長させることによって、増幅した。
【０２２７】
図２６Ａは、クレノウエキソＰＣＲおよびＤＯＰ−ＰＣＲによる全ゲノム増幅のリアルタイムＰＣＲ曲線を示す。示されるように、いずれの投入ＤＮＡ量（すなわち５ｎｇおよび２０ｐｇ）においても、ＤＮＡポリメラーゼ−Ｉのクレノウラグメントおよび変性Ｋ（Ｎ）２プライマーによって調製されたライブラリの全ゲノム増幅は、約２５ＰＣＲサイクルで、ＤＯＰ−ＰＣＲでの増幅よりも有効となった。この結果は、本発明の方法が、ＤＯＰ−ＰＣＲ技術よりも数桁感受性が高いことを示す。
【０２２８】
発現量分析を、１６個のランダムなヒトゲノムＳＴＳマーカーのパネル（表ＩＶ、ＳＴＳマーカー：４０、４〜４４、４６、４７、４９、５２、５４、５５、５８、６０、６２、６３、および６６）を用いて行った。ユニバーサルＫＵプライマーを用いてＰＣＲによって増幅された物質を、Ｑｉａｑｕｉｃｋフィルター（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、そして１０ｎｇのアリコートをリアルタイムＰＣＲで分析した。Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、２５μｌの容量で、９４℃で１５秒間および６８℃で１分間の４５サイクルの間、反応を実行した。１０ｎｇ、１ｎｇおよび０．２ｎｇのフラグメント化ゲノムＤＮＡに対応する標準を、各ＳＴＳについて使用した。定量化を、各ＳＴＳについての標準カーブフィッティングによって行った。
【０２２９】
図２６Ｂは、リアルタイムＰＣＲ標準カーブフィッティングに由来する、分析されたＳＴＳマーカーの対数分布プロットを示す。全１６個のゲノムマーカーの分布は、ＤＯＰ−ＰＣＲ生成物と比較して、ＤＮＡポリメラーゼ  Ｉのクレノウフラグメントおよび変性Ｋ（Ｎ）２プライマーにより調製されたＰＣＲ増幅全ゲノムライブラリにおいて、より密接しておりかつ発現量のバイアスが有意に減少していた。また、２０ｐｇのゲノムＤＮＡ（ほぼ３個の二倍体ゲノムに相当する）から増幅されたライブラリにおける提唱される方法によるＳＴＳマーカーの平均量は、５ｎｇのＤＮＡ（ほぼ１０００個の二倍体ゲノムに相当する）からＤＯＰ−ＰＣＲにより調製されたＤＮＡ生成物と比較して、およそ一桁多い。
【０２３０】
まとめると、これらの結果は、ゲノム配列の発現量の感度および正確性の両方に関して、ＤＯＰ−ＰＣＲ技術（Ｔｅｌｅｎｉｕｓら、１９９２）に対する本発明の方法の優位性を示す。
【０２３１】
（実施例１４：血清から単離されたＤＮＡのライブラリ作製および全ゲノム増幅）
この実施例は、血清分離管（ＳＳＴ）から回収された血清から単離されたゲノムＤＮＡの増幅を記載する。血液を、８ｍｌのバキュテイナーＳＳＴ管へ集めた。この血清管を、室温で３０分間静置させた。この管を、加速およびブレーキを最小にして、１，０００×Ｇで１０分間遠心した。その後、この血清を清潔な管に移した。単離された血清サンプルは、直ちにＤＮＡ抽出使用することもでき、また使用前に−２０℃で保存することもできる。
【０２３２】
１ｍｌの血清からのＤＮＡを、ＤＲＩ  ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いて、製造者のプロトコールに従って精製した。得られたＤＮＡを、ｐｅｌｌｅｔ  ｐａｉｎｔ  ＤＮＡ  ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、製造者の使用説明書に従って沈殿させ、そしてこのサンプルをＴＥ−Ｌｏ中に再懸濁し、血清で最終容量を３０ｍｌとした。サンプル中に存在するＤＮＡの量および濃度を、Ｙｂ８  Ａｌｕプライマー対；Ｙｂ８Ｆ  ５’−ＣＧＡＧＧＣＧＧＧＴＧＧＡＴＣＡＴＧＡＧＧＴ−３’（配列番号１２０）、およびＹｂ８Ｒ  ５’−ＴＣＴＧＴＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＧＧＡＣＴ−３’（配列番号１２１）を用いて、リアルタイムＰＣＲによって定量化した。簡単に言うと、２５ｍｌの反応液を、９４℃で１５秒間および７４℃で１分間で、４０サイクルの間増幅した。１０ｎｇ、１ｎｇ、０．１ｎｇ、０．０１ｎｇ、および０．００１ｎｇのゲノムＤＮＡに対応する標準を使用し、そして血清ＤＮＡの量および濃度を、標準カーブフィッティング（Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒソフトウェア、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって計算した。
【０２３３】
血清から単離されたＤＮＡを、ＴＥ−Ｌ緩衝液中で９５℃で４分間加熱することによって、ランダムにフラグメント化した。この反応混合物は、１５μｌの最終容量中に、１×ＥｃｏＰｏｌ緩衝液（ＮＥＢ）中の１０ｎｇの熱でフラグメント化したＤＮＡ、２００μＭの各ｄＮＴＰ、および１μＭの変性Ｋ（Ｎ）２プライマー（表ＩＩＩ、プライマー１４）を含有した。９５℃、２分の変性工程の後、このサンプルを、４℃に冷却し、そして５単位のクレノウエキソ（ＮＥＢ）を添加することによって、反応を開始した。１６℃で２０分間、２４℃で２０分間、および３７℃で２０分間の３工程インキュベーションプロトコールによって、ＷＧＡライブラリ合成を実行した。７５℃で１５分間加熱することによって、反応を停止し、そしてその後４℃で冷却した。ライブラリ反応物全体を、リアルタイムＰＣＲによってさらに増幅した。このＰＣＲ反応混合物は、７５μｌの最終容量中に、以下を含有した：１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、フルオレセインおよびＳｙｂｒＧｏｌｄ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１０，０００×希釈液、１μＭの既知のＫＵプライマー（表ＩＩＩ、プライマー１５）、０．５×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、およびライブラリ反応の投入ゲノムＤＮＡ  １０ｎｇ。Ｉ−ＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、９４℃で１５秒間および６５℃で２分間で１７サイクルの間、反応を実行した。この増幅曲線は、図２７に図示される。
【０２３４】
増幅された物質を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  ＰＣＲプレートによって精製し、そして光学濃度によって定量した。増幅生成物のゲル分析は、最初の血清ＤＮＡと同様のサイズ分布（２００ｂｐ〜１．６ｋｂ）を示した（図２８Ａ）。さらに、増幅されたＤＮＡは、ヒトゲノムＳＴＳマーカーのパネルを用いて、リアルタイム定量ＰＣＲを用いて分析された。このパネルを形成するマーカーは、表ＩＶに列挙される。定量リアルタイムＰＣＲは、製造者の指示に従って、Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行われた。簡単に言うと、２５μｌの反応液を、９４℃で１５秒間および６５℃で１分間で４０サイクルの間増幅した。１０ｎｇ、１ｎｇおよび０．２ｎｇのフラグメント化ゲノムＤＮＡに対応する標準を、各ＳＴＳについて使用し、量を、各ＳＴＳについての標準カーブフィッティングによって計算して（Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒソフトウェア、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、分布としてプロットした。血清からのＷＧＡ生成物の定量リアルタイムＰＣＲは、示した。試験した全８マーカーが、平均増幅の５の係数の範囲内であった。これらの結果は、最初の血清ＤＮＡの発現量が、その後のＷＧＡに維持されていることを示す。図２８Ｂは、増幅されたＤＮＡにおけるヒトゲノムＳＴＳマーカーの発現量の散布図である。
【０２３５】
（実施例１５．自己不活性型変性プライマーＫおよびＤＮＡポリメラーゼ  Ｉのクレノウエキソフラグメントを用いて調製されたライブラリからの単一ヒト細胞および個々の毛包の全ゲノム増幅）
本実施例は、単一ヒト血液細胞、単一精子細胞、および個々の毛包からの全ＤＮＡの全ゲノム増幅を記載する。
【０２３６】
健康な女性の提供者からの３マイクロリットルの新鮮な吸引血液を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．５ｍＭ  ＥＤＴＡからなる希釈緩衝液２７μｌを含むＰＣＲチューブ中で、１細胞／μｌ、０．５細胞／μｌ、または０．２細胞／μｌのレベルへと、指数関数的に希釈した。平均血液数を、５×１０３有核細胞／血液１ｍｌと仮定した。同様に、健康な提供者からの射精物３μｌを同じレベルで希釈し、平均精子数を、２０，０００／射精物１μｌと仮定した。健康な女性の提供者からの単一の毛包を、以下に記載されるように溶解し、次いで、溶解緩衝液で指数関数的に希釈した。
【０２３７】
それぞれの細胞希釈液１マイクロリットルを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００７％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および０．１２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（ＵＳＢ）を含む、９μｌの新たに調製した溶解緩衝液と混合した。毛包の場合、この毛包を、１０μｌの溶解緩衝液に懸濁した。このサンプルを、１時間、５０℃でインキュベートし、細胞を溶解した。この毛包サンプルをさらに、溶解緩衝液で１０２〜１０６倍に連続的に希釈し、そして各希釈液を、ＷＧＡライブラリ調製に供した。
【０２３８】
サンプルを９９℃で４分間加熱して、プロテイナーゼＫを不活化し、核タンパク質を分解し、そしてＤＮＡを熱でフラグメント化した。ライブラリ合成工程を、１４μｌの全容量中に、１×ＥｃｏＰｏｌ緩衝液（ＮＥＢ）、２００ｍＭの各ｄＮＴＰ、１μＭの変性プライマーＫ（表ＩＩＩ、配列番号１５）、および１５ｎｇ／μｌのＳＳＢ（ＵＳＢ）を含む反応混合物中で行った。９５℃、２分の変性工程の後、サンプルを、２４℃に冷却し、そして５単位（１μｌ）のクレノウエキソＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を添加することによって、反応を開始した。２４℃で６０分間のインキュベーションの後、７５℃で５分間加熱することによって、反応を停止した。この合成されたライブラリを、リアルタイムＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲ反応混合物は、７５μｌの最終容量中に、以下を含有した：１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、フルオレセインおよびＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１００，０００×希釈液、１μＭのユニバーサルＫＵプライマー（表ＩＩＩ、プライマー１６）、５単位のＴｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、全部で１５μｌのライブラリ合成反応液。毛包希釈液の場合、ＤＮＡを有さないブランクコントロールを含んだ。異なる希釈での余分な単一細胞サンプルを増幅した。これは、自己コントロールとして働く（すなわち、最高希釈において、１細胞が増幅されたか、または細胞が増幅されなかった）。Ｉ−ＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、９４℃で１５秒間および６５℃で２分間、反応を実行した。
【０２３９】
図２９は、単一有核血球の増幅を示す。およそ８サイクルが、単一細胞と細胞なしとの間で、得られた増幅プロフィールを分離する。これは、単一血球の存在下と非存在下との間の明らかな区別を可能にする。
【０２４０】
ＰＣＲで増幅された５つの単一細胞サンプルの発現量分析を、１６個のヒトＳＴＳマーカーのパネル（表ＩＶ、ＳＴＳ  マーカー：４０、４〜４４、４６、４７、４９、５２、５４、５５、５８、６０、６２、６３、および６６）を用いて行った。ユニバーサルＫＵプライマーを用いてＰＣＲによって増幅された物質を、Ｑｉａｑｕｉｃｋフィルター（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、そして１０ｎｇのアリコートをリアルタイムＰＣＲで分析した。Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、２５μｌの容量で、９４℃で１５秒間および６８℃で１分間の４５サイクルの間、反応を実行した。１０ｎｇ、１ｎｇおよび０．２ｎｇのフラグメント化ゲノムＤＮＡに対応する標準を、各ＳＴＳについて使用した。定量化を、各ＳＴＳについての標準カーブフィッティングによって行った。増幅バイアスに対するコピー数の影響を評価するため、各単一細胞増幅反応液の容量の１／６を合わせて、プールサンプルとした。このプールサンプルを、上記のように、ＳＴＳマーカー発現量について分析した。０．２ｎｇ未満の標準テンプレートのレベルで増幅されたマーカーを、脱落とみなした。表Ｖは、プールサンプルと比較した、３つの個別の単一細胞増幅についての脱落マーカーの数を示す。
【０２４１】
（表Ｖ．全ゲノム増幅した単一血球および６つの個別の増幅した単一細胞のプールからのＳＴＳマーカー増幅）
【０２４２】
【表５】
0004773338.tif 000007
【０２４３】
ゲノムマーカー脱落物の大部分は、個別の単一細胞増幅反応物において、ランダムであった。個別の増幅した単一細胞のプールの後、脱落数は、およそ半分に減少した（表Ｖ）。
【０２４４】
図３０は、単一精子細胞の増幅を示す。この場合では、単一細胞を有するサンプルと細胞を有さないサンプルとの間の距離は、わずか約２サイクルであった（血液有核細胞と比較して一倍体ゲノムについて予想されたおよそ６サイクルではない）。特定の実施形態において、この違いは、不十分な溶解または精子細胞中の増幅のインヒビターの存在に帰せられる。それにもかかわらず、２サイクルの違いによってでさえも、単一細胞と細胞なしとの間の区別が可能である。
【０２４５】
図３１に示されるように、溶解した毛包の指数関数的希釈は、予期されたように、約３．５〜４サイクルの連続的な移行を示した。１：１，０００，０００の最高希釈は、ブランクコントロールより約２サイクル早く増幅した。これは、精製されたゲノムＤＮＡと比較した場合、およそ２ｐｇのＤＮＡに相当する。これは、法医学適用途についてのこの方法の可能性を示す。
【０２４６】
（実施例１６．変性Ｋ（Ｎ）０プライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ−Ｉのクレノウエキソフラグメントによる単一ヒト染色体の増幅）
本実施例は、単一コピーのヒト染色体からの全ＤＮＡの増幅を記載する。
【０２４７】
９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて５μｌの水中に分けられた、転座（１１；１２）（ｑ２１；ｐｌ３．３３）を有するリンパ芽球細胞株由来の単一コピーの誘導染色体を、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した。各転座誘導染色体の１４個の個別サンプルを、１０μｌの最終容量中に１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００７％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および０．１２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（ＵＳＢ）を含む、新たに調製した溶解緩衝液中において、５０℃で１時間溶解した。
【０２４８】
サンプルを９９℃で４分間加熱して、プロテイナーゼＫを不活化し、核タンパク質を分解し、そしてＤＮＡを熱でフラグメント化した。ライブラリ合成工程を、１４μｌの全容量中に、１×ＥｃｏＰｏｌ緩衝液（ＮＥＢ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１ｍＭの変性Ｋ（Ｎ）０プライマー（表ＩＩＩ、配列番号１５）、および１５ｎｇ／μｌのＳＳＢ（ＵＳＢ）を含む反応混合物中で行った。９５℃、２分の変性工程の後、サンプルを、２４℃に冷却し、そして５単位（１μｌ）のクレノウエキソＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を添加することによって、反応を開始した。２４℃で６０分間のインキュベーションの後、７５℃で５分間加熱することによって、反応を停止した。このライブラリ合成反応を、以下を含む混合物中で、リアルタイムＰＣＲによって増幅した：７５μｌの最終容量中、１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、フルオレセインおよびＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１００，０００×希釈液、１μＭのユニバーサルＫＵプライマー（表ＩＩＩ、プライマー１６）、５単位のＴｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、全部で１５μｌのライブラリ合成反応液。ＤＮＡを有さないブランクコントロールもまた含んだ。Ｉ−ＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で、９４℃で１５秒間および６５℃で２分間、反応を実行した。
【０２４９】
図３２は、単一コピーヒト染色体の増幅を示す。単一染色体とＤＮＡのないブランクコントロールとの間のおよそ４サイクルの距離が、観察された。
【０２５０】
（実施例１７．異常細胞の検出および分析のための単一細胞ＷＧＡの増幅）
ＷＧＡ増幅した単一細胞ＤＮＡは、ゲノムレベルで組織細胞の異種性を分析するために使用され得る。癌診断の場合、これは、血液および／または生検中に存在する癌細胞の異種性の検出および統計学的分析を促進する。出生前診断の場合、これは、血液および／または子宮頸管スミアから単離された胎仔細胞の同定および遺伝的分析に基づいた、非侵襲性アプローチの開発を可能にする。個々の細胞内のＤＮＡの分析はまた、細胞集団の複雑性および異種性によって通常隠されている新しい細胞マーカー、特徴または性質の発見を促進し得る。
【０２５１】
増幅された単一細胞ＤＮＡの分析は、２つの方法で行われ得る。図３３に示された伝統的アプローチにおいては、増幅されたＤＮＡサンプルは、ゲノムマイクロアレイへのハイブリダイゼーション、または他の任意の分析手段（例えば、ＰＣＲ、シークエンシング、ＳＮＰゲノタイピング、マイクロサテライトゲノタイピング等）を用いて一つ一つ分析される。この方法は、以下を包含する：１．）組織の個々の細胞への分離；２．）個別の（単一細胞）ＷＧＡライブラリの調製および増幅；３．）従来の方法による、個々の単一細胞ゲノムＤＮＡの分析。このアプローチは、個々の細胞のゲノム全体に渡る評価が必要である場合の状況において、有用である。
【０２５２】
図３４に示された第二のアプローチにおいては、増幅されたＤＮＡサンプルは、膜、ガラス、または任意の他の固体支持体上にスポットされ、次いで核酸プローブによってハイブリダイズされて、特定のゲノム領域のコピー数が検出される。この方法は、以下を包含する：１．）目的の組織の個々の細胞への分離；２．）個別の（単一細胞）ＷＧＡライブラリの調製および増幅；３．）個別の（単一細胞）ＷＧＡ  ＤＮＡのマイクロアレイの調製；４．）単一細胞ＤＮＡマイクロアレイの、遺伝子座特異的プローブとのハイブリダイゼーション；５．）そして、細胞異種性の定量分析。このアプローチは、大きな細胞集団において、ゲノム領域の限られた数のみが分析されるべきである場合の状況において、特に役立ち得る。
【０２５３】
（実施例１８．遺伝子コピー数の検出および分析のための全ゲノム増幅の適用）
ＷＧＡ増幅されたＤＮＡは、ライブラリー合成および増幅の間、配列およびコピー数の完全性の両方を保持する。ライブラリーのこの特徴は、発癌性形質転換において観察されるような遺伝子増幅事象を受けていると疑われる細胞または組織の潜在的な評価を容易にする。遺伝子増幅事象の早期の検出は、少しの疑わしい細胞または生検材料における事象を調べる能力を必要とする。この適用は、この実施例に記載されるように、Ｘ染色体における公知の染色体異数体の患者由来のモデルサンプルのセットを用いて最も良く示される。
【０２５４】
ＸＯ、ＸＸ、およびＸＸＸを有する患者由来のＤＮＡは、ＷＧＡラブラリー合成のためのテンプレートとして役立った（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＭｉｃｈｉｇａｎのＤｒ．Ａｒｕｌ  Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎによって好意により提供された）。標準的手順によって単離されたＤＮＡを、４分間、９５℃で加熱することによってＴＥ−Ｌ緩衝液中でランダムにフラグメント化した。反応混合物は、１×ＥｃｏＰｏｌ緩衝液（ＮＥＢ）中の２５ｎｇの熱フラグメント化ＤＮＡ（またはネガティブコントロールとしてただのＴＥ−Ｌ緩衝液）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、および１μＭの変性Ｋ（Ｎ）２プライマー（表ＩＩＩ、プライマー１４）、１５ｎｇ／μｌ  ＳＳＢ（ＵＳＢ）を１４μｌの合計容量で含んだ。２分間、９５℃の変性工程の後、サンプルを１６℃に冷却し、そして反応を、５単位（１μｌ）のＫｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ）を添加することによって開始した。ＷＧＡライブラリー合成を、１６℃で２０分間、２４℃で２０分間、そして３７℃で２０分間行った。反応を１μｌの８３ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で停止させ、そしてサンプルを７５℃で５分間加熱した。５ｎｇの投入ＤＮＡに対応する反応物のアリコートを、リアルタイムＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、以下を含む：１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、各２００μＭのｄＮＴＰ、フルオレセインおよびＳｙｂｒＧｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１００，０００×希釈液、１μＭ既知ＫＵプライマー（表ＩＩＩ、プライマー１６）、５単位のＴｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、およびライブラリー合成反応物の５ｎｇ投入ゲノムＤＮＡ（７５μｌの最終容量）。反応を、Ｉ−ＣｙｃｌｅｒリアルタイムＰＣＲ機器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において、９４℃で１５秒間、および６５℃で２分間で、１４サイクルで実行した。
【０２５５】
分析のために、ライブラリーの個々の５ｎｇのアリコートを、Ｘ染色体ＳＴＳプライマー対（１５２および１５４、表ＩＶ）を使用して、全体で２５ｎｇの投入テンプレートを再構成する組み合わせ混合物と比較した。ユニバーサルＫＵプライマーを用いるＰＣＲによって増幅される材料を、Ｑｉａｑｕｉｃｋフィルター（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、そして１０ｎｇのアリコートをリアルタイムＰＣＲで分析した。反応を、９４℃で１５秒、および６８℃で１分間、の４０サイクルを、Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において、２５μｌ容量で行った。
【０２５６】
図３５は、各セットのプライマーについての正規化ＳＴＳリアルタイムＰＣＲ曲線を示す。パネルＡおよびＣは、１×染色体コピー、２×染色体コピー、および３×染色体コピーを有するサンプルについて、単一の２５ｎｇ  ＷＧＡライブラリーから増幅した個々の５ｎｇアリコートのクラスタリングを示す。各場合において、変動は、およそ＋／−０．５サイクルである。図３５のパネルＢおよびＤは、個々の増幅の再構成において変動がどのように平均化されるかを示す。各場合において、再構成された混合物を３連で試験し、１×と２×との間のテンプレートの倍加における全サイクルシフト、および第３コピー（３×）がＸ染色体についてトリソミーの場合に加えられる場合の予測される約半サイクルを示す。
【０２５７】
ＷＧＡ増幅ライブリーについて本明細書中に示される正確なコピー数測定は、遺伝子増幅事象における臨床的適用についての可能性を例示する。少ない量のテンプレートからのライブラリーを作製する能力と組み合わせて、本発明は、ＤＮＡサンプルがしばしば非常に制限される、癌および胎児期の診断に使用され得る。
【０２５８】
（実施例１９．ＭＭＬＶ逆転写酵素および自己不活性変性プライマーによって、ポリＡ＋ＲＮＡから調製されたライブラリーを使用する、全トランスクリプトーム増幅）
この実施例は、本明細書中において、「全トランスクリプトーム増幅」（ＷＴＡ）と呼ばれる細胞または細胞集団内での転写されたＲＮＡの発現パターンを忠実に表す増幅可能なライブラリーの作製のための本発明の応用を記載する。
【０２５９】
ＥＢＶ形質転換ヒトＢリンパ細胞、Ｒａｊｉ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来の精製ポリＡ＋ＲＮＡは、ＷＴＡライブラリー調製のための投入テンプレートとして役立った。ＷＧＡプロトコールの場合のように、ＷＴＡを２工程（ライブラリー合成およびライブラリー増幅）で行う。ライブラリー合成は、類似の自己不活性変性プライマー（プライマーＫ）、異なるＤＮＡポリメラーゼ（特に、ＭＭＬＶ逆転写酵素）を含む。これは、ＷＧＡに類似する伸長／鎖置換反応を介して進行するが、ＲＮＡテンプレートのフラグメント化を必要としない（しかし、フラグメント化は、所望の場合、平均アンプリコンサイズを減少するために適用され得る）。ｍＲＮＡ分子の３’末端の提示を改善するために、ポリＡテールに相補的なプライマーＫ（Ｔ）２０（表ＩＩＩプライマー１９）もまた添加された。ライブラリー合成反応物を構築するために、プライマーを、ポリＡ＋ＲＮＡテンプレートにアニールした。アニーリングは、１００ｎｇまたは１０ｎｇのポリＡ＋ＲＮＡ、プライマーＫ（Ｎ）２［１μＭ］（表ＩＩＩプライマー１４）およびＫ（Ｔ）２０［２００ｎＭ］（表ＩＩＩプライマー１９）（組み合わせてまたはＫ（Ｎ）２［１μＭ］単独で）、ｄＮＴＰミックス［１μＭ  ｅａ．］および１７μｌまでのＲＮａｓｅを含まない水の混合物を、７０℃で５分間、簡単に加熱し、続いて、氷へとすぐに移すことによって促進した。２μｌの１０×ＭＭＬＶ緩衝液を、最終濃度の７５ｍＭ  ＫＣＬ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオトレイトール（ｐＨ８．３）および１μｌ（２００単位）ＭＭＬＶ逆転写酵素（ＮＥＢ）に添加することによって、ポリメラーゼ反応を開始した。反応物を混合し、そして１時間４２℃でインキュベートした。酵素活性を、９５℃で５分間の熱不活性化によって保持した。
【０２６０】
１０ｎｇの投入ＲＮＡ（または１０ｎｇサンプルの場合、全反応混合物）に対応するＷＴＡライブラリー合成反応物のアリコートを、リアルタイムＰＣＲによってさらに増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、以下を含んだ：１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、各２００ｎＭ  ｄＮＴＰ、フルオレセインおよびＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１００，０００×希釈物、１μＭ  ＫＵプライマー（表ＩＩＩプライマー１６）、５単位のＴｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびライブリー合成反応物からの投入ポリＡ＋ＲＮＡの１０ｎｇ当量を表す容量（７５μｌの最終容量）。反応を、リアルタイムＰＣＲ  Ｉ−ＣｙｃｌｅｒＴＭ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において、１７サイクル（９４℃、２０秒および６５℃、２分）を実行した。投入テンプレートの効果およびＰＣＲ増幅に移される引き続く反応容量を、図３６に示す。全１０ｎｇのライブラリー合成産物は、１００ｎｇライブラリー合成反応から取られた１０ｎｇと比較して、遅延したリアルタイムＰＣＲ反応速度を示す。増幅プロフィール（単回サイクルシフトのみ）のライブラリー調製工程においてＲＮＡの量の適度の効果は、これらのＲＮＡ量について入手可能なテンプレートの小さな差異のみを示唆する。
【０２６１】
全トランスクリプトーム増殖の１つの特定の適用は、少量のＲＮＡ由来のマイクロアレイ発現分析を可能にすることである。伝統的なＲＮＡ増幅法は、転写物のｍＲＮＡプール内に存在するポリＡテールのプライミングを使用する。結果として、今日まで、マイクロアレイ研究は、ｍＲＮＡの３’末端に偏っていた。本発明と既存のマイクロアレイ標的バイアスとの適合性を増大するために、Ｋ（Ｔ）２０プライマーを使用した。この追加されるプライミングの効果を示すために、各プライマーの存在下および非存在下において増幅を試験した。図３７は、１０ｎｇ  ポリＡ＋ＲＮＡがライブラリー合成工程のテンプレートとして働く場合のＫ（Ｔ）２０の非存在下での２サイクルシフト、およびＫ（Ｎ２）の非存在下での６サイクルシフトを示す。これらのプライマーの合わせた効果は、ｍＲＮＡ分子にわたる均一なプライミングを容易にし、全メッセージにわたる投入ＲＮＡのより均一な提示を示す。
【０２６２】
得られる増幅ライブラリー産物のアガロースゲル電気泳動分析は、より高い投入テンプレートおよびポリＡテール特異的プライミングでの観察されるリアルタイム改善を支持する。図３８は、種々のプライマー条件でのこれらのライブラリーの各々から増幅された産物の分子量範囲を示す。ポリＡテールおよびランダム内部部位の両方のプライミングの組み合わせは、より大きな産物サイズ範囲にわたるよりしっかりした増幅を生じる。Ｋ（Ｔ）２０プライミングの非存在は、Ｋ（Ｎ）２プライマーの非存在下よりも、性能に対する効果がかなり少なく、これは、各アンプリコンについての第２のユニバーサルプライミング部位を作製しないことによって、増幅に適切な産物を本質的に排除する。１００ｎｇ投入テンプレートライブラリーは、あまり頻繁でないプライミングまたは単純により多い開始量のより大きなＲＮＡ分子を示唆するアンプリマーのより幅広いサイズの分布を示す。
【０２６３】
特定のｍＲＮＡ分子の提示は、種々のレベルの発現におけるＲＮＡサンプルに提示される公知の遺伝子に存在する１１個の特異的ヒトＳＴＳマーカー（表ＩＶ、ＳＴＳマーカー：２０、３１，４７、５１、８６、１０３、１０６、１１０、１１９、１３４、１４０）についてのリアルタイムＰＣＲ分析によって評価された。ユニバーサルＫＵプライマーでのＰＣＲによって増幅される材料を、Ｑｉａｑｕｉｃｋフィルター（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、そして１０ｎｇアリコートをリアルタイムＰＣＲで分析した。反応を、２５μｌ容量でＩ−Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で９４℃で１５秒間および６８℃で１分間４５サイクルで行った。１０ｎｇ、１ｎｇおよび０．２ｎｇのフラグメント化ゲノムＤＮＡに対応する標準を、各ＳＴＳについて使用した。定量化を、各ＳＴＳについて標準曲線当てはめによった。図３９は、これらのＳＴＳ部位の提示を示す。選択されるＳＴＳ部位の各々は、Ｋ（Ｎ）２プライマーおよびＫ（Ｔ）２０プライマーが組み合わされ、１００ｎｇ投入ライブラリーについての平均性能を幾分改善する場合に観察される認識可能な改善で各条件について表された。
【０２６４】
本発明の別の独特の特徴は、特定のｍＲＮＡ遺伝子座にわたるＷＴＡライブラリー提示に関する。組み合わされた末端および半ランダム内部プライミングが、３’末端に向かう偏り無しで、全ＲＮＡ分子集団にわたるアンプリコンを生成することを期待し得る。この陳述を立証するために、３つの大きな転写物を、３’末端から種々の距離のＳＴＳプライマー対（表ＩＶ  ＳＴＳ  ４２、４２ａ、４２ｂ、８５、８５ａ、８５ｂ、１１９、１１９ａ、１１９ｂ）を使用して試験した。図４０は、これらの遺伝子座についてのＷＴＡ増幅のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。結果は、Ｋ（Ｔ２０）プライマーの含有に起因する３’提示が改善した全ての部位の提示を示す。特定部位増幅における相対的な差異は、特定の配列の増幅の種々のプライミングおよび効率に起因する。これらの結果は、３つのランダムに選択された大きな転写物についての３’末端からの異なる距離での相対的に均一なライブラリー提示を示す。提示は、幅広い範囲のＲＮＡ投入テンプレート（１００ｎｇ〜１０ｎｇ）から作製されたライブラリー間で一致する。ＳＴＳ  ４２ａの３’末端から１７９５ｂｐで観察された増幅の、その隣接するより近位の配列およびより遠位の配列（４２および４２ｂ、表ＩＶ）と比較して低いレベルは、特定の領域のＷＴＡ増幅が、目的の特定の部位の周りのヌクレオチド配列に大いに依存し得ることを示唆する。ライブラリー間の特定のマーカーの増幅の再現性は、２つのサンプル（すなわち、癌組織対正常組織）間の特定の部位の発現レベルを直接比較する能力を示唆する。
【０２６５】
（実施例２０．全トランスクリプトーム増幅：投入テンプレートおよびＭｇＣｌ２濃度の滴定）
組織（例えば、生検組織）の体系的なサンプリングおよびレーザー顕微解剖由来のＲＮＡのＷＴＡ増幅、またはサンプルが独特のコホート由来のまれな収集物の場合として制限される増幅は、少ない投入テンプレート量由来のしっかりした増幅の必要性を示す。投入テンプレートの許容範囲および最適ＭｇＣｌ２濃度を評価するために、正常にプールされた前立腺（ＣＰＰ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からの全ＲＮＡを、３ｍＭおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ２において、０．２５ｎｇ〜１０ｎｇで調べた。アニーリングは、１０ｎｇ、１ｎｇ、０．５ｎｇまたは０．２５ｎｇのＣＰＰ全ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、プライマーＫ（Ｎ）２［１μＭ］（表ＩＩＩプライマー１４）およびＫ（Ｔ２０）［２００ｎＭ］（表ＩＩＩ；プラマー１９）、ｄＮＴＰミックス［１μＭ  ｅａ．］およびＲＮａｓｅを含まない水（１７μｌまで）の混合物を７０℃で５分間簡単に加熱し、続いて、氷にすぐに移すことによって促進した。ライブラリー合成反応は、最終濃度の７５ｍＭ  ＫＣＬ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３ｍＭまたは１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール（ｐＨ８．３）および１μｌ（２００単位）ＭＭＬＶ逆転写酵素（ＮＥＢ）または１μｌ（５０単位）ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）への２μｌの１０×ＭＭＬＶ緩衝液の添加によって開始した。反応物を混合し、そして１時間４２℃でインキュベートした。酵素活性を、５分間、９５℃での熱不活化によって保持した。
【０２６６】
ライブラリー合成反応物を、以下を含む反応混合物におけるリアルタイムＰＣＲによって増幅した：１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、各２００ｎＭのｄＮＴＰ、フルオレセインおよびＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１００，０００×希釈物、１μＭ  ＫＵプライマー（表ＩＩＩプライマー１６）、５単位のＴｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）および５ｎｇ、０．５ｎｇ、０．２５ｎｇおよび０．１２５ｎｇの開始テンプレートを表す５０％のライブラリー合成反応物（１２．５μｌ）（７５μｌの最終容量）。反応を、リアルタイムＰＣＲ  Ｉ−ＣｙｃｌｅｒＴＭ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で、１７〜３３サイクル（９４℃で２０秒、および６５℃で２分）で行った。図４１は、予期されるテンプレート依存性滴定でのリアルタイム増幅プロフィールを示す。テンプレートの倍加は、１サイクルシフトとして見られる予期される２倍の増加を生じる一方、０．５ｎｇ〜５ｎｇの１０倍の増加は、予期される１０倍（３．４サイクル）シフトよりもすこし多くを与えた。性能における目立つ差異は、２つの緩衝液酵素の組み合わせで観察される。
【０２６７】
投入テンプレート濃度および緩衝液条件にわたる提示の変動を評価するために、１０ｎｇおよび０．２５ｎｇの投入テンプレート量からのサンプルをＳＴＳ分析によって評価した。特定のｍＲＮＡ分子の提示は、種々のレベルの発現におけるＲＮＡサンプルに提示される公知の遺伝子に存在する１１個の特異的ヒトＳＴＳマーカー（表ＩＶ、ＳＴＳマーカー：２０、３１，４７、５１、８６、１０３、１０６、１１０、１１９、１３４、１４０）についてのリアルタイムＰＣＲ分析によって評価された。ユニバーサルＫＵプライマーでのＰＣＲによって増幅される材料を、Ｑｉａｑｕｉｃｋフィルター（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、そして１０ｎｇアリコートをリアルタイムＰＣＲで分析した。反応を、２５μｌ容量でＩ−Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で９４℃で１５秒間および６８℃で１分間４５サイクルで行った。１０ｎｇ、１ｎｇおよび０．２ｎｇのフラグメント化ゲノムＤＮＡに対応する標準を、各ＳＴＳについて使用した。定量化を、各ＳＴＳについて標準曲線当てはめによった。図４２は、アッセイされた遺伝子それぞれの相対量を示す。低い（３ｍＭ、ＮＥＢ）ＭｇＣｌ２条件下で０．２５ｎｇへ投入物を減らすことは、信頼レベル以下のまれなメッセージの提示を減少する。提示は、リアルタイム増幅反応速度によって予測されるように、増加した（１０ｍＭ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）ＭｇＣｌ２条件で、顕著に増加する。
【０２６８】
緩衝系間の差異をさらに調べるために、ＭｇＣｌ２濃度の滴定を調べた。正常なプールされた前立腺（ＣＰＰ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）１０ｎｇから全ＲＮＡを、３〜１２ｍＭの範囲のＭｇＣｌ２にわたって増幅した。アニーリングは、１０ｎｇのＣＰＰ全ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、プライマーＫ（Ｎ）２［１μＭ］（表ＩＩＩプライマー１４）およびＫ（Ｔ）２０［２００ｎＭ］（表ＩＩＩ；プラマー１９）、ｄＮＴＰミックス［１μＭ  ｅａ．］およびＲＮａｓｅを含まない水（１７μｌまで）の混合物を７０℃で５分間簡単に加熱し、続いて、氷にすぐに移すことによって促進した。ライブラリー合成反応は、最終濃度の７５ｍＭ  ＫＣＬ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３ｍＭまたは１ｍＭ増分への補充〜１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール（ｐＨ８．３）および１μｌ（５０単位）ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）への２μｌの１０×ＭＭＬＶ緩衝液の添加によって開始した。反応物を混合し、そして１時間４２℃でインキュベートした。酵素活性を、５分間、９５℃での熱不活化によって保持した。ライブラリー合成反応物を、以下を含む反応混合物におけるリアルタイムＰＣＲによってさらに増幅した：１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、各２００ｎＭのｄＮＴＰ、フルオレセインおよびＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１００，０００×希釈物、１μＭ  ＫＵプライマー（表ＩＩＩ、プライマー１６）、５単位のＴｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、および５ｎｇの開始テンプレートを提示する５０％の各ライブラリー合成反応物（１０μｌ）（７５μｌの最終容量）。反応を、リアルタイムＰＣＲ  Ｉ−ＣｙｃｌｅｒＴＭ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において、１９サイクル（９４℃で２０秒間、および６５℃で２分間で）で実行した。図４３は、ＷＴＡライブラリー作製に対するＭｇＣｌ２の効果を詳細に示すリアルタイムＰＣＲ曲線を示す。ライブラリー調製工程の間、６ｍＭ〜約１２ｍＭのＭｇＣｌ２以上の条件は、最適な反応速度を生じる。ＭｇＣｌ２は、本発明のＷＴＡ適用におけるプライマー結合および鎖置換のレベルをそれ自身で現れ得る塩基対形成に影響することが公知である。当業者は、本発明の特定の適用のための最適な濃度（例えば、テンプレートサイズおよび複雑性のようなパラメーターを含む）を決定し得る。
【０２６９】
（実施例２１．ＷＴＡ方法を使用する単鎖核酸テンプレートの優先的増幅）
残留ＤＮＡが臨床サンプル中に存在し得る適用において、または全核酸が単離される適用において、同じサンプルからＤＮＡまたはＲＮＡを選択的に増幅する能力は、有利にし得る。この実施例において、ＷＴＡプロトコールは、フラグメント化および変性を伴うおよび伴わない、全ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡのサンプルに適用する。
【０２７０】
ＤＮＡ投入テンプレートおよびＲＮＡ投入テンプレートからのＷＴＡライブラリー形成を評価するために、ゲノムＤＮＡ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  ＣＥＰＨゲノムＤＮＡ（＃７０５７）または全ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＰＰ）の１０ｎｇサンプルを、水中６．５μｌの最終容量に希釈した。フラグメント化および変性は、９５℃で４分間加熱し、氷（４℃）に急に（ｓｎａｐ）冷却し、１．５μｌの１０×ＭＭＬＶ緩衝液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を、最終濃度の７５ｍＭ  ＫＣＬ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール（ｐＨ８．３）、プライマーＫ（Ｎ）２［１μＭ］（表ＩＩＩプライマー１４）およびＫ（Ｔ）２０［２００ｎＭ］（表ＩＩＩ、プライマー１９）、ｄＮＴＰミックス［１μＭ  ｅａ．］およびＲＮａｓｅを含まない水（１４μｌまで）に添加し、続いて、９５℃まで簡単に２分間加熱し、氷で冷却してプライマーをアニールすることによって行った。フラグメント化も変性もされていないサンプルを、５分間、標準的な７０℃処理を受けさせ、続いて、氷（４℃）に急に冷却し、１．５μｌの１０×ＭＭＬＶ緩衝液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を、最終濃度の７５ｍＭ  ＫＣＬ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール（ｐＨ８．３）、プライマーＫ（Ｎ）２［１μＭ］（表ＩＩＩプライマー１４）およびＫ（Ｔ）２０［２００ｎＭ］（表ＩＩＩ、プライマー１９）、ｄＮＴＰミックス［１μＭ  ｅａ．］およびＲＮａｓｅを含まない水（１４μｌまで）に添加した。ポリメラーゼ反応は、１μｌ（５０単位）ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）の添加によって開始した。反応物を混合し、そして２３℃で１５分間インキュベートし、１時間４２℃でインキュベートした。酵素活性を、９５℃で５分間の熱不活化によって保持した。
【０２７１】
ライブラリー反応物を、以下を含む反応混合物におけるリアルタイムＰＣＲによって増幅した：１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑ反応緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、各２００ｎＭ  ｄＮＴＰ、フルオレセインおよびＳｙｂｅｒＧｒｅｅｎ  Ｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）の１００，０００×希釈物、１μＭ  ＫＵプライマー（表ＩＩＩプライマー１６）、５単位のＴｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）および７５μｌの最終容量中の全１０ｎｇの開始テンプレートを提示する１００％のライブラリー反応物（１５μｌ）。反応を、リアルタイムＰＣＲ  Ｉ−ＣｙｃｌｅｒＴＭ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）において、１３〜１７サイクル（９４℃、２０秒および６５℃２分）を実行した。図４４Ａは、各テンプレートからのリアルタイム増幅プロフィールを示す。フラグメント化および変性後にＤＮＡから増幅したライブラリーは、本発明のＷＧＡ実施形態に類似のプロフィールを示す。特許請求されるように、ＭＭＬＶポリメラーゼ活性は、ＷＧＡライブリー合成における他のポリメラーゼを効率的に置換し得る。フラグメント化および変性の非存在下において、ＤＮＡは、かなり阻害され、増幅において約６サイクルの遅延、または反応に関与するおよそ１％のテンプレートを示す。ＲＮＡテンプレートのみが、直接的なアニーリングおよび伸長と比較して、フラグメント化および変性条件の最小の効果のみを示す。これらの反応およびテンプレートの無いコントロール反応のそれぞれにおいて増幅された産物の分子量の差を図４４Ｂに示す。各反応をプラトーに進行させ、そしてアガロースゲル電気泳動によって評価した。ＤＮＡテンプレートからのライブラリーフラグメントの分布は、ＷＧＡ産物について観察された分布と一致する。ＲＮＡの熱処理は、ライブラリーフラグメントのサイズ分布を、５０〜１００塩基対短く移動し、アンプリコンサイズを仕立てる能力を示す。２８サイクルの増幅後、２００ｂｐを超えるアンプリコンを作製しないテンプレートはなかった。
【０２７２】
フラグメント化および変性に基づいてＤＮＡテンプレートとＲＮＡテンプレートとの間を区別する能力は、テンプレートの制御された差示的アクセスを示す。ＲＮＡ調製物中のＤＮＡの残留微量物を、非変性条件下で、ＲＮＡテンプレートに関して約１％効率で増幅する。本明細書中で詳細には示さないが、当該分野で公知なように、Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−は、テンプレートとしてＲＮＡを利用せず、それによって、複雑な混合物から各核酸集団を選択的に増幅するための方法を提供する。
【０２７３】
（実施例２２．制限アーカイブされたサンプルまたは臨床サンプルからのＤＮＡライブラリーおよびＲＮＡライブラリーの合成のための全核酸差示的増幅プラットフォーム）
いくつかの遺伝子プロファイリング研究において、ゲノム（ＤＮＡ）情報および発現（ＲＮＡ）情報の両方が、評価される組織または細胞の完全な分析を提供するために必要とされる。遺伝子配列、コピー数、および転写配列の効率的な発現における変化が一緒にされる場合のみ、サンプルの完全な分析が達成され得る。多くの場合において、臨床単離物またはアーカイブサンプルは、制限され、そして１つの単離スキームにだけ十分であり得る。ゲノムライブラリーおよび発現ライブラリーの増幅は、本発明を使用する全増幅プラットフォームを介して合理化され得る。
【０２７４】
図４５は、ＤＮＡポメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ  Ｅｘｏ−フラグメントおよび熱変性核酸（ＷＧＡ）またはＭＭＬＶ逆転写酵素および非変性核酸（ＷＴＡ）と組み合わせて、自己不活性変性プライマーを使用して、全核酸単離物からのＤＮＡおよびＲＮＡの選択的増幅を示す。デバイスを、全核酸調製物からの選択的増幅によって、ＤＮＡおよびＲＮＡの分離について図で示す。例えば、この様式で適用されるかまたはミクロ流体プラットフォームにおいて適用される本発明は、ＤＮＡおよびＲＮＡの選択的分解または選択的単離よりも選択的増幅を使用し、制限サンプルから核酸の調製と関連するサンプルの損失のような問題を排除する。
【０２７５】
（実施例２３．標的化されたＤＮＡ増幅のためのホモポリマーＧ／Ｃタグ化ＷＧＡライブラリーの適用）
標的化された増幅は、制限配列情報が利用可能であるか、または既知の領域に隣接する再配列または配列が問題であるゲノムに適用され得る。例えば、トランスジェニック構築物は、ランダム一体化事象によって慣用的に作製される。一体化部位を決定するために、挿入物に存在することが公知の配列からの有向の配列決定またはプライマーウォーキングを適用し得る。本明細書中に記載される発明は、公知領域およびユニバーサルプライマーに特異的なプライマーを使用して、有向の増幅様式で使用され得る。ユニバーサルプライマーは、全体的ライブラーを増幅するその能力において増強され、それによって、特定のプライマーとユニバーサルプライマーとの間で産物の増幅を実質的に支持し、そして全ゲノムライブラリーの増幅を実質的に阻害する。
【０２７６】
標的増幅についてのＷＧＡライブラリーの変換は、ホモポリマー末端タグの組み込みを含む。Ｃテールユニバーサルプライマーでのライブラリーの増幅は、プライマーの５’ポリＣ伸長成分の長さの依存性を示す。本発明に記載される方法によって調製されるＷＧＡライブラリーは、ポリＣ伸長プライマーを使用してＰＣＲ再増幅による標的増幅のために変換され得る。図４６Ａは、リアルタイムＰＣＲのポリＣの増加する長さで増強される増幅を示す。Ｃ１５ＵおよびＣ２０Ｕについての曲線の減少した傾きは、遅延した反応速度を示し、プライミング効率の減少したテンプレート利用可能性または抑制を示唆する。
【０２７７】
ポリＣタグ化によって課せられるライブラリーの増幅の抑制を示すために、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してライブラリーを精製し、そしてそれぞれのタグの長さに対応するポリＣプライマーを用いてＰＣＲ増幅に供した。図４６Ｂは、全ゲノム増幅の抑制を反映するリアルタイムＰＣＲ結果を示す。短いＣ１０タグ化ライブラリーのみが、適度な増幅能力を保持する一方、Ｃ１５タグおよびＣ２０タグは、ＰＣＲの４０サイクル後に完全に抑制されたままである。
【０２７８】
（実施例２４．多重標的化ＤＮＡ増幅のためのホモポリマーＧ／Ｃタグ化ＷＧＡライブラリーの増幅）
タグ化増幅のためのＧ／Ｃタグ化ライブラリーの適用は、複数のライブラリーアンプリマーを増幅するために、単一の特定のプライマーを使用する。標的ライブラリーの複雑性は、各特定のプライマーについての富化の相対的レベルを示す。低い複雑性の細菌ゲノムにおいて、単回の選択は、配列決定またはクローニングの目的で本質的に純粋な産物を増幅するために十分であるが、高い複雑性のゲノムにおいて、二次の内部に「ネスト化」標的事象は、最も高いレベルの純度を達成するのに必要であり得る。
【０２７９】
ＣテールユニバーサルＵプライマーでの再増幅によって組み込まれるＣ１０タグ化末端でのヒトＷＧＡライブリーを使用して、特定の部位をタグ化し、そして相対的な富化をリアルタイムＰＣＲで評価した。図４７Ａは、ユニバーサルタグ特異的プライマーＣ１０と組み合わせてまたはＣ１０単独で、連続した一次１°標的化プライマーおよび二次２°標的化プライマーについてリアルタイムＰＣＲ増幅からのクロマトグラムを示す。一次増幅において達成されるこの特定の標的化アンプリコンについての富化は、約１０，０００倍である。ネスト化プライマーでの二次増幅は、開始テンプレートの１，０００，０００倍の全富化のさらなる２桁の純度近くで富化する。富化レベルがプライマー特異性とともに変動し得る一方、連続的標的化増幅反応に適用される高い特異性のプライマーは、一般的に近い純度に産物を富化するために組み合わせることが当業者に理解される。
【０２８０】
多重様式における標的化増幅を適用するために、特定のプライマー濃度を、個々の部位の富化の有意な減少無しに、５分の１（２００ｎＭから４０ｎＭ）に減少した（図４７Ｂ）。このプライマー濃度の減少によって、４５種のプライマーおよびユニバーサルＣ１０プライマーの組合せが、反応許容範囲内の合計プライマー濃度［２μＭ］を維持し得る。
【０２８１】
多重標的化増幅の有用性を評価するために、Ｏｌｉｇｏ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．５３プライマー分析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．：Ｃａｓｃａｄｅ  ＣＯ）を使用して、ＳＴＳ部位（表ＩＶ）に隣接する一組のプライマーを設計した。プライマーは、１８〜２５塩基長であり、高い内部安定性、低い３’末端安定性、および５７〜６２℃の融点（５０ｍＭ塩および２ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を有する。全ての標準基準（例えば、低いプライマー−ダイマーおよびヘアピン形成）を満たすプライマーを設計し、ヒトゲノムデータベース６−マー頻度表に対してフィルターした。Ｇ／Ｃタグ化ＷＧＡライブラリーの一次多重化標的化増幅を、１０〜５０ｎｇのタグ化ＷＧＡライブラリー、それぞれ１０〜４０ｎＭの４５種の特定のプライマー（表ＶＩＩ）、２００ｎＭ  Ｃ１０プライマー、ｄＮＴＰミックス、１×ＰＣＲ緩衝液および１×Ｔｉｔａｎｉｕｍ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して実行し、ＦＣＤ（１：１００，０００）およびＳＧＩ（１：１００，０００）色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を、Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、リアルタイムＰＣＲ検出のために添加した。増幅を、サンプルを９５℃で３分３０秒間、続いて、９４℃で２０秒、６８℃で２分の１８〜２４サイクルに加熱することによって実行した。反応プラトーへのサイクル数は、絶対的なテンプレート濃度およびプライマー濃度に依存する。増幅される材料を、Ｑｉａｑｕｉｃｋスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、そして分光光度計によって定量した。
【０２８２】
各部位の富化を、リアルタイムＰＣＲを使用して評価した。定量的リアルタイムＰＣＲを、製造業者の指示に従って、Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して評価した。簡単に述べると、２５μｌの反応物を９４℃で１５秒間、および６８℃で１分間の４０サイクルで増幅した。１０ｎｇ、１ｎｇおよび０．２ｎｇのフラグメント化ＤＮＡに対応する標準を各ＳＴＳに使用し、各ＳＴＳについて標準曲線当てはめ（Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒソフトウェア、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって量を計算し、そして分布としてプロットした。図４８Ａは、各標的化部位についての相対倍数増幅を示す。部位１および２９の一次増幅は、多重反応において増幅せず、一重反応における遅延反応速度を示した（図示せず）。同じデータの分布プロットは、３０００倍の平均富化を示す（図４８Ｂ）。高度に過剰増幅される部位のような富化レベルの差異は、テンプレート上のどこかの偽プライミングから生じるようである。このような変動は、富化されたテンプレートのネスト化増幅の使用で補償される。
【０２８３】
二次標的化増幅を、ユニバーサルＣ１０プライマーと組み合わせて、テンプレートとしての一次標的化産物および二次ネスト化プライマー（表ＶＩＩ）を使用して実行した。反応剤濃度および増幅パラメーターは、上記一次増幅と同一であった。多重化二次増幅を、Ｑｉａｑｕｉｃｋスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）によって精製し、分光光度計によって定量化した。特定の部位の富化を、製造業者の指示に従って、Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、リアルタイムＰＣＲで評価した。簡単に述べると、２５μｌの反応物を９４℃で１５秒間、および６８℃で１分間の４０サイクルで増幅した。１０ｎｇ、１ｎｇおよび０．２ｎｇのフラグメント化ＤＮＡに対応する標準を各ＳＴＳに使用し、各ＳＴＳについて標準曲線当てはめ（Ｉ−Ｃｙｃｌｅｒソフトウェア、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によって量を計算し、そして分布としてプロットした。図４９Ａは、ネスト化増幅後の各標的化部位についての相対存在度を示し、そして図４９Ｂは、頻度に対するデータをプロットする。
【０２８４】
この様式で適用される標的化増幅は、多重化ＰＣＲに必要とされるプライマーの複雑性減少する。得られるアンプリマーのプールを、配列決定プラットフォームまたは遺伝子型決定プラットフォームで評価し得る。
【０２８５】
（実施例２５．全ゲノムおよび標的化増幅によって促進される培養不可能または制限種の非冗長ゲノム配列決定）
全ゲノムおよび標的化増幅は、増殖が困難である微生物または既に絶滅した種のゲノムの配列決定のために唯一の機会を提供する。このような仮定ＤＮＡ配列決定プロジェクトを示す図を、図５０に示す。最初に、目的の生物についてのＤＮＡの制限量（図５０Ａ）を、上記の任意の方法を使用するかまたは２００３年３月７日に出願された米国特許出願６０／４５３，０７１および同じものに対して優先権を主張しこれと同時に出願された米国非仮特許出願に記載されるように、ＷＧＡライブラリーに変換し、そして増幅する（図５０Ｂ）。第２に、増幅されたＷＧＡ  ＤＮＡの画分を、細菌ベクター（図５０Ｃ）にクローニングする一方で、増幅されたＷＧＡ  ＤＮＡの別の画分を、Ｃタグ化ＷＧＡライブラリーに変換した（図５０Ｄ）。第３に、クローン化したＤＮＡを、最小の冗長性で配列決定し（図５０Ｅ）、標的化配列決定および「ウォーキング」を開始するための十分な配列情報を作製し（図５０Ｆ）、これは、非冗長配列決定および配列決定プロジェクトの仕上げ後に残る全てのギャップの配列決定を最終的に生じる（図５０Ｇ）。この概説された戦略は、制限された種の配列決定だけでなく、費用がかかり冗漫で高度に冗長な「ショットガン」法を置換することにより任意の大きなＤＮＡ配列決定プロジェクトにおいても使用され得る。
【０２８６】
【表６−１】
0004773338.tif 000008
【０２８７】
【表６−２】
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【０２８８】
【表６−３】
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【０２８９】
（実施例２６．新規核酸増幅方法の汎用性ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの異なる供給源とのその適合性、ならびに増幅される材料の分析の異なる方法）
図５１に提示される図は、核酸増幅の提案される方法と適合性であるＤＮＡおよびＲＮＡサンプルの多様性、この増幅技術の汎用性、ならびに可能な適用の多様性を示す。
【０２９０】
核酸供給源としては、全ての動物（ヒトを含む）、植物、真菌、培養可能および培養不可能な細菌およびウイルス、ならびに琥珀および石内に見出される絶滅種が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、任意の新鮮、凍結、またはパラフィン包埋されホルマリン固定された、組織、体液、法医学サンプル、細胞培養物、単一細胞、単一染色体などから単離され得る。
【０２９１】
ライブラリー調製工程は、テンプレートとして全核酸を使用し得（図の中心部分に示されるプロトコル、矢印Ａ）、そしてＤＮＡおよびＲＮＡの両方の増幅を生じ得るか、または精製されたＤＮＡを使用し、そして全ゲノムの増幅を生じ得るか（図の左部分に示されるプロトコル、矢印Ｂ）、または精製されたＲＮＡを使用し、そして全トランスクリプトームの増幅を生じ得るか（図の右部分に示されるプロトコル、矢印Ｃ）、または全核酸および対応する選択方法を使用し、そして全ゲノムの増幅を生じ得るか（図の左部分に示されるプロトコル、矢印Ｄ）、または全トランスクリプトームの増幅を生じ得る（図の右部分に示されるプロトコル、矢印Ｅ）。
【０２９２】
全核酸、ＤＮＡ、またはＲＮＡから調製および増幅されるライブラリーは、ユニバーサル定常配列の５’末端でポリＣ領域を組み込むように改変され得る（矢印ＦおよびＧ）。Ｃテールライブラリーは、標的化増幅および特定のゲノム領域またはＲＮＡ転写物の分析のために使用され得る。
【０２９３】
全核酸、ＤＮＡ、またはＲＮＡから調製および増幅されるライブラリーは、他のタグを組み込むために改変され得（図１９〜２５を参照のこと）、そしてＩＤ同定、固体支持体またはマイクロアレイ上への固定、あるいは多重使用のために使用され得る（図５１に示されない）。
【０２９４】
提案される核酸増幅技術の適用としては、小さなＤＮＡ／ＲＮＡサンプルの遺伝子型決定、遺伝子発現分析、培養不可能または絶滅生物の配列決定、種々の疾患の分子診断、出生前診断、ウイルス／細菌診断、法医学などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９５】
（参考文献）
本明細書中に言及される全ての特許および刊行物は、本発明が関係する当業者の水準を示す。全ての特許および刊行物は、各々の個々の刊行物が具体的に個々に参考として援用されて示されるかのように、同じ程度までその全体が本明細書中で参考として援用される。
【０２９６】
（特許）
【０２９７】
【表７−１】
0004773338.tif 000011
【０２９８】
【表７−２】
0004773338.tif 000012
【０２９９】
（刊行物）
【０３００】
【表８−１】
0004773338.tif 000013
【０３０１】
【表８−２】
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【０３０２】
【表８−３】
0004773338.tif 000015
【０３０３】
【表８−４】
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【０３０４】
【表８−５】
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【０３０５】
【表８−６】
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【０３０６】
【表８−７】
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【０３０７】
本発明およびその利点が詳細に記載されているが、種々の変更、置換および変化が、添付の特許請求の範囲によって規定される発明の精神および範囲から逸脱することなく、ここでなされ得ることが理解されるべきである。さらに、本出願の範囲が、本明細書中に記載されるプロセス、製造、組成物、手段、方法および工程の特定の実施形態に制限されることは意図されない。当業者は、本発明の開示から、本明細書中に記載される対応する実施形態と実質的に同じ機能を実施するかまたは実質的に同じ結果を達成する、現在存在するかまたは後に開発されるプロセス、製造、組成物、手段、方法および工程が、本発明に従って利用され得ることを理解する。従って、添付の特許請求の範囲は、このようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法または工程を、これらの範囲内で含むことを意図する。
【図面の簡単な説明】
【０３０８】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の局面をさらに示すために含められる。本発明は、本明細書中に示される特定の実施形態の詳細な記載とともに、これらの１以上の図面を参照することによって、よりよく理解され得る。
【図１】図１は、自己不活性縮重プライマーを有する既知の配列を組み込み、続いてＰＣＲ増幅を行うことによる、全ゲノムおよび全トランスクリプトーム増幅の模式図を示す。破線は、新たに合成される鎖を示す。実線は、既知の配列を示す。
【図２】図２は、プライマー−ダイマーを形成するそれらの能力を排除するように設計された例示的自己不活性縮重プライマーの設計の模式図である。
【図３】図３Ａ〜３Ｃは、縮重ＹＮ−プライマー（０〜約６個の完全にランダムな塩基（Ｎ）を３’末端に、ならびに１０個の縮重ピリミジン塩基Ｙおよび既知のピリミジン配列ＹＵを５’末端に含むプライマー（図２））の自己プライミングおよび伸長の分析を提供する。図３Ａにおいて、０個、１個、２個または３個のランダムＮ塩基を含むＹＮプライマーを、ｄＮＴＰありまたはなしで使用した。図３Ｂにおいて、０、１、２または３個のランダムＮ塩基を含むＹＮプライマーおよびモデルテンプレートオリゴヌクレオチド（表ＩＩＩ、プライマー９）を使用した。図３Ｃにおいて、ＹＮ−プライマーの自己プライミングを試験した。注：ピリミジン塩基は、Ｓｙｂｒ  Ｇｏｌｄで有効に染色されない。ＹＮ−プライマーの完全にランダムな部分（Ｎ）内のプリン塩基の存在は、これらのオリゴヌクレオチドの染色の有効性を大きく増大させる。
【図４】図４は、０〜６個の完全にランダムな塩基をその３’末端に有する縮重ＹＮプライマーまたはＴ７プロモーター配列をその５’領域におよび６個の完全にランダムな塩基をその３’末端に含むプライマー（表ＩＩＩ、プライマー１７）による、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウエキソ−フラグメントを用いたヒト全ゲノム増幅におけるプライマー−ダイマー形成についてのアッセイを示す。完全にランダムな塩基（Ｎ）の数は、各プライマーの略語の最後に示される。
【図５】図５は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウエキソ−フラグメントおよび図４に記載される自己不活性縮重プライマーで合成した全ゲノムライブラリーの５ｎｇのアリコートのリアルタイムＰＣＲ増幅を示す。
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、図４の記載において特定された例示的縮重ピリミジンＹＮプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウエキソ−フラグメントでの全ゲノム増幅後の、３０個の例示的なヒトＳＴＳマーカーの代表分析を示す。１０ｎｇの増幅ＤＮＡを含むアリコートを、ＳＴＳマーカーのＰＣＲ分析のために使用した。図６Ａにおいて、０〜３個のランダム３’塩基を有するピリミジンプライマーを、ライブラリー合成工程のために使用し、図６Ｂにおいて、４〜６個のランダム３’塩基を有するピリミジンプライマーを使用した。完全にランダムな塩基（Ｎ）の数は、各プライマーの略語の最後に示される。
【図６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、図４の記載において特定された例示的縮重ピリミジンＹＮプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウエキソ−フラグメントでの全ゲノム増幅後の、３０個の例示的なヒトＳＴＳマーカーの代表分析を示す。１０ｎｇの増幅ＤＮＡを含むアリコートを、ＳＴＳマーカーのＰＣＲ分析のために使用した。図６Ａにおいて、０〜３個のランダム３’塩基を有するピリミジンプライマーを、ライブラリー合成工程のために使用し、図６Ｂにおいて、４〜６個のランダム３’塩基を有するピリミジンプライマーを使用した。完全にランダムな塩基（Ｎ）の数は、各プライマーの略語の最後に示される。
【図７】図７は、３’末端にて２つのランダム塩基を有する自己不活性縮重ピリミジンプライマーＹ（Ｎ）２を使用する、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウエキソ（Ｋｌｅｎｏｗ  Ｅｘｏ）−フラグメントまたはシークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）バージョン２で熱によりフラグメント化したヒトゲノムＤＮＡの全ゲノム予備増幅サンプル（５ｎｇアリコート）のリアルタイムＰＣＲ増幅を示す。
【図８】図８は、図７に関する説明において特定されるような自己不活性縮重ピリミジンプライマーＹ（Ｎ）２を使用する、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウエキソ−フラグメントまたはシークエナーゼバージョン２で熱によりフラグメント化したヒトゲノムＤＮＡの増幅産物のゲル分析を示す。
【図９】図９は、例示的な自己不活性縮重ピリミジンプライマーＹ（Ｎ）２およびＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウエキソ−フラグメントまたはシークエナーゼバージョン２を用いた、全ゲノム増幅後の３３個の例示的ヒトＳＴＳマーカーの代表分析を示す。１０ｎｇの増幅ＤＮＡに対応するアリコートを、ＳＴＳマーカーのＰＣＲ分析に使用した。
【図１０】図１０は、ワトソン−クリック塩基対合に関与しないことが既知の、４つのあり得る塩基対組み合わせを含み、シークエナーゼバージョン２  ＤＮＡポリメラーゼを用いたライブラリー合成反応においてそれらの３’末端に２つの完全にランダムな塩基を含む４種の自己不活性縮重プライマーの間の比較を示す。そのライブラリー合成反応の５ｎｇの投入ＤＮＡに対応するアリコートの定量リアルタイムＰＣＲ増幅が示される。略語は、その自己不活性縮重プライマーの塩基組成を示す。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｅは、図１０に対する説明において特定された自己不活性縮重プライマーおよびシークエナーゼバージョン２  ＤＮＡポリメラーゼまたは組み合わせサンプル（このサンプル中、別個の縮重プライマーを用いた各等量の４つの個々の反応物を、そのＳＴＳマーカーのＰＣＲ増幅前に合わせた）を用いた全ゲノム増幅後の、３５個の例示的ヒトＳＴＳマーカーの代表分析を示す。増幅ＤＮＡの１０ｎｇに対応するアリコートを、ＳＴＳマーカーのＰＣＲ分析に使用した。略語は、その自己不活性縮重プライマーの塩基組成を示す。
【図１２】図１２は、シークエナーゼバージョン２  ＤＮＡポリメラーゼおよび自己不活性縮重プライマーＹ（Ｎ）２を用いたヒトＤＮＡの全ゲノム増幅における、２４℃で６０分間の等温インキュベーション、１６℃、２４℃、および３７℃で各２０分間の３工程インキュベーション、ならびに１６℃、２４℃、および３７℃で各１分間を１９サイクルのサイクリングインキュベーションの間の比較を示す。ＷＧＡライブラリー合成反応の投入ＤＮＡの５ｎｇに対応するアリコートを、定量リアルタイムＰＣＲにより増幅した。
【図１３】図１３は、図１２に対する記載において詳述されるように、自己不活性縮重プライマーＹ（Ｎ）２およびシークエナーゼバージョン２  ＤＮＡポリメラーゼを用いた全ゲノム増幅後の１７個のヒトＳＴＳマーカーの代表分析を示す。増幅ＤＮＡの１０ｎｇに対応するアリコートを、ＳＴＳマーカーのＰＣＲ分析に使用した。
【図１４】図１４は、シークエナーゼバージョン２  ＤＮＡポリメラーゼを用いた、ヒトＷＧＡにおける０．５μＭ〜３３μＭの自己不活性縮重プライマーＫ（Ｎ）２の滴定を示す。ＷＧＡライブラリー合成反応の５ｎｇの投入ＤＮＡに対応するアリコートを、定量リアルタイムＰＣＲによって増幅した。
【図１５】図１５は、図１４に対する説明において特定されるように、０．５〜１０μＭの濃度で適用される例示的な自己不活性縮重プラマーＫ（Ｎ）２およびシークエナーゼバージョン２  ＤＮＡポリメラーゼを用いる全ゲノム増幅後の、１７個の例示的ヒトＳＴＳマーカーの代表分析を示す。１０ｎｇの増幅ＤＮＡに対応するアリコートを、ＳＴＳマーカーのＰＣＲ分析に使用した。定量リアルタイムＰＣＲから得られるＤＮＡ量の分布プロットが示される。水平バーは、メジアン値を表す。
【図１６】図１６は、自己不活性縮重プライマーＫ（Ｎ）２およびシークエナーゼバージョン２  ＤＮＡポリメラーゼを用いたＷＧＡ反応における５ｎｇ〜１００ｎｇの熱によりフラグメント化したゲノムＤＮＡからの滴定を示す。ＷＧＡライブラリー合成反応の５ｎｇの投入ＤＮＡに対応するアリコートを、定量リアルタイムＰＣＲによって合成した。
【図１７】図１７は、図１６に対する説明において特定されるように、自己不活性縮重プライマーＫ（Ｎ）２およびシークエナーゼバージョン２  ＤＮＡポリメラーゼを用いた５ｎｇ〜１００ｎｇの間の熱によりフラグメント化したＤＮＡの全ゲノム増幅の後の２０個の例示的なヒトＳＴＳマーカーの代表分析を示す。１０ｎｇの増幅ＤＮＡに対応するアリコートを、ＳＴＳマーカーのＰＣＲ分析に使用した。定量リアルタイムＰＣＲから得られたＤＮＡ量の分布プロットが示される。水平バーは、メジアン値を示す。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｃは、ＩＤタグを有する既知のプライマーの構造を示す。図１８Ａは、３’末端にその既知のプライマー配列Ｕおよび５’末端に個々のＩＤ配列タグＴを有する複製可能な既知のプライマーを示す。図１８Ｂは、３’末端に既知のプライマー配列Ｕ、５’末端に個々のＩＤ配列タグＴ、およびそれらの末端の間に複製不能な有機リンカーＬを有する複製不能な既知のプライマーを示す。図１８Ｃは、複製不能な既知のプライマーで増幅した後のＷＧＡライブラリーにおけるＤＮＡフラグメントの末端の５’突出構造を示す。
【図１９】図１９は、いくつかのライブラリーを混合し、ＩＤ特異的ＰＣＲによる個々のライブラリーを回収することによる、複製可能な同定（ＩＤ）タグを有するＷＧＡライブラリーの合成のプロセスおよびそれらの使用（例えば、安全性および／または秘密保持目的のため）を示す。
【図２０】図２０は、いくつかのライブラリーを混合し、ＩＤ特異的ハイブリダイゼーション捕捉による個々のライブラリーを回収することによる、複製不能ＩＤタグを有するＷＧＡライブラリーの合成のプロセスおよびそれらの使用（例えば、安全性および／または秘密保持目的のため）を示す。
【図２１】図２１は、ユニバーサルプライマーＣ１０および独特のプライマーＰを使用して、１または複数の特定のゲノム部位の標的化した増幅のためのこれらの改変ＷＧＡライブラリーのその後の使用に伴う、そのユニバーサルな既知のプライマー配列Ｕのそれぞれ、３’末端または５’末端に位置する増幅したＷＧＡライブラリーをさらなるＧｎもしくはＣ１０配列タグを有するライブラリーに変換するプロセスを示す。図２１Ａ−ＴｄＴ酵素を使用する（ｄＧ）ｎテールの組み込みによるライブラリータグ化；図２１Ｂ−長いオリゴヌクレオチドの５’末端にＣ１０配列を有するアダプターの連結によるライブラリータグ化；図２１Ｃ−その５’末端にＣ１０配列を有する既知のプライマーを使用する、ＷＧＡライブラリーの二次的複製によるライブラリータグ化。
【図２２】図２２は、固体支持体上のＷＧＡライブラリーの共有結合による固定化のためのプロセスを示す。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｂは、マイクロ−アレイフォーマットにおけるＷＧＡライブラリーを示す。図２２Ａは、固体支持体上にそのライブラリーを共有結合することを利用した実施形態を示す。図２２Ｂは、固体支持体にライブラリーを非共有結合することを利用した実施形態を示す。
【図２４】図２４は、その固定化ＷＧＡライブラリーが繰り返し使用され得る実施形態を示す。
【図２５】図２５は、複製不能な既知のプライマーおよび磁性ビーズアフィニティー捕捉を利用する、ＷＧＡ生成物精製の方法を記載する。
【図２６】図２６Ａおよび２６Ｂは、本発明において記載される全ゲノム増幅と、ＤＯＰ−ＰＣＲ増幅のための市販のキットとの間の比較を示す。ゲノムＤＮＡの５ｎｇおよび２０ｐｇのアリコートを、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウエキソ−フラグメントおよび１Ｍの自己不活性縮重プライマーＫ（Ｎ）２、またはＤＯＰ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒＴＭキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）で増幅した。（Ａ）５ｎｇ  ｇＤＮＡ、２０ｐｇ  ｇＤＮＡ、またはブランクコントロールからのライブラリーについてのリアルタイムＰＣＲ増幅曲線。（Ｂ）図２５Ａにおいて増幅された全ゲノムライブラリーから増幅した１６個のゲノムＳＴＳマーカーの対数分布プロット。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウエキソ−フラグメントおよび自己不活性縮重プライマーＫ（Ｎ）２での増幅は、ＤＯＰ  ＰＣＲと比較して、感度およびゲノムマーカーの表示（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の両方において優れていた。
【図２７】図２７は、血清分離チューブに収集された血清から単離されたＤＮＡから生成されたライブラリーの増幅曲線を示す。その増幅を、１７サイクルにわたって行った。
【図２８】図２８Ａおよび２８Ｂは、血清ＤＮＡからの増幅生成物の分析を示す。図２８Ａは、血清ＤＮＡ（右）および増幅生成物（左）両方のゲル分析である。出発血清ＤＮＡおよび増幅材料の両方は、２００ｂｐ〜１．６ｋｂのサイズ範囲を示し、これは、その増幅材料が、血清から単離されたＤＮＡと同じサイズ分布を維持していることを示す。図２８Ｂは、血清ＤＮＡからの増幅生成物における８個のＳＴＳ部位のリアルタイムＳＴＳ分析である。そのグラフ全体を横切る実線は、光学密度に基づくＳＴＳアッセイに付加されるＤＮＡ量、および８個のＳＴＳ部位の平均値の両方を示す。短い線は、リアルタイムＰＣＲ分析により得られた８個のＳＴＳ部位のメジアン値を示す。全ての８個の部位は、その平均増幅の５倍以内で示された。
【図２９】図２９は、本発明の方法による単一の血液有核細胞の増幅を示す。
【図３０】図３０は、本発明の方法による単一の精子細胞の増幅を示す。
【図３１】図３１は、本明細書に記載される方法の例示的な法医学的適用のための毛包サンプルの希釈物を示す。
【図３２】図３２は、単一のコピー染色体の増幅を示す。
【図３３】図３３は、全ゲノム増幅によって生成された、単一細胞ＤＮＡに由来するその増幅されたＤＮＡのマイクロアレイハイブリダイゼーション分析を示す。
【図３４】図３４は、細胞（例えば、癌細胞）を検出および分析するための単一細胞ＤＮＡアレイを例示する。
【図３５】図３５は、ＸＯ、ＸＸ、およびＸＸＸの既知の異数体の患者ＤＮＡから合成されたＷＧＡライブラリーにおける遺伝子座コピー数値を評価するために、２つのＸ染色体特異的プライマー対を使用するリアルタイムＰＣＲ増幅を示す。パネルＡおよびＣは、５個の個々の増幅の各々からの曲線を示す。パネルＢおよびＤは、三連で試験した５つのライブラリーの混合物を示し、これは、ＷＧＡライブラリーにおけるコピー数情報の維持を示す。
【図３６】図３６は、自己不活性縮重プライマーＫ（Ｎ）２およびＭＭＬＶ逆転写酵素を使用する、ヒトＢリンパ球ＲＮＡからの１０ｎｇおよび１００ｎｇから調製されたＷＴＡライブラリーのリアルタイムＰＣＲ増幅を示す。増幅プロフィールは、１００ｎｇの投入テンプレートと１０ｎｇの投入テンプレートとの間の１サイクル差について示す。
【図３７】図３７は、２つの異なる自己不活性プライマーＫ（Ｎ）２およびＫ（Ｔ２０）ならびにこれらの組み合わせで調製したＷＴＡライブラリーのリアルタイムＰＣＲ増幅を示す。有意な改善は、Ｋ（Ｎ）２およびＫ（Ｔ２０）の組み合わせが使用される場合に観察された。
【図３８】図３８は、増幅ＷＴＡライブラリーのゲル電気泳動分析を示す。蛍光トランスイルミネーション（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｉｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）（Ｆｌｕｏｒ−Ｓ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により可視化されたエチジウムブロミド染色の観察されたパターンは、ライブラリー合成において投入ＲＮＡの量を変化させることから、および利用されるプライマーの組み合わせを変化させることから生じるフラグメントサイズおよび強度の範囲を示す。１００ｎｇの投入ＲＮＡは、プライマーＫ（Ｔ２０）の有意な影響なく、より大きな生成物を生じる。１０ｎｇの投入ＲＮＡからのライブラリーは、一般に、より小さな増幅生成物を生じ、Ｋ（Ｔ２０）プライマーの添加による有意な改善を示す。
【図３９】図３９は、増幅ＷＴＡライブラリーの定量リアルタイムＰＣＲ分析を提供する。そのプロットは、ヒトＳＴＳマーカーに対応する１１個の部位の分析を示す。各カラムにおける長い棒は、平均値を示す一方で、短い棒は、メジアン値を示す。１０ｎｇにおける線は、各アッセイにおいて添加された、分光光度分析による増幅ＤＮＡの量を示す。１１個の部位全てが、各サンプル中で検出され、このことは、全ての部位が、全てのサンプル中で効率的に増幅されたことを示す。これら１１個のマーカーの代表は、Ｋ（Ｎ２）の１００ｎｇライブラリーとＫ（Ｎ２）＋Ｋ（Ｔ２０）の１００ｎｇライブラリーとの間で類似である。その分布は、１００ｎｇライブラリーよりも１０ｎｇライブラリーでより広く、１０ｎｇのＫ（Ｎ２）ライブラリーの分布は、１０ｎｇのＫ（Ｎ２）＋Ｋ（Ｔ２０）のライブラリーよりもわずかに広い。
【図４０】図４０は、ヒトＳＴＳマーカーを使用して、３’末端から３つの異なる距離における３つの例示的に発現されたｍＲＮＡ遺伝子座のリアルタイムＰＣＲ分析の結果を例示する。各ＳＴＳについてのｍＲＮＡに長さは、ＳＴＳ４２については６，６４２ｂｐであり、ＳＴＳ８５については３，１００ｂｐであり、ＳＴＳ１１９については９，３０１ｂｐである。ＳＴＳ４２遺伝子座の３’末端からの距離は、１，０８７ｂｐ、１，７９５ｂｐ、および５，８３５ｂｐである。ＳＴＳ８５遺伝子座についての３’末端からの距離は、７７ｂｐ、１，３３１ｂｐ、および１，８２７ｂｐである。ＳＴＳ１１９遺伝子座についての３’末端からの距離は、１，８３４ｂｐ、３，７４６ｂｐ、および５，８０５ｂｐである。結果は、Ｋ（Ｎ）２ライブラリー合成プライマーまたはＫ（Ｎ）２＋Ｋ（Ｔ２０）ライブラリー合成プライマーのいずれかを有する、１００ｎｇおよび１０ｎｇの投入ライブラリーについて示される。特定の転写物に沿った異なる長さでのＷＴＡライブラリーについてのマーカー配列の代表は、異なる量のＲＮＡから作製されたライブラリーの間で一致した結果を示し、Ｋ（Ｔ２０）の付加とともに、３’提示におけるわずかな改善のみを示す。
【図４１】図４１は、投入テンプレートのリアルタイムＰＣＲ分析の結果、ならびにＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素とともに代表的に使用される２種の主要なＭｇＣｌ２濃度を例示する。
【図４２】図４２は、図４１において記載されるサンプルのサブセット内のそれらの相対量についてのリアルタイムＰＣＲによって分析される特定の部位の得られる代表を示す（１０ｎｇおよび０．２５ｎｇの投入テンプレート；３ｍＭおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ２濃度）。このような実験の代表であるように、より強く増幅するサンプルはまた、特定の部位のより良好な代表を示す。
【図４３】図４３は、総ＲＮＡのＷＴＡ増幅に対するＭｇＣｌ２濃度の効果を示す。一定の１０ｎｇテンプレートＲＮＡを使用すると、そのＭｇＣｌ２濃度は、３ｍＭ〜１２ｍＭの範囲にわたって変化した。これらの反応条件下でのＷＴＡ実行において、明らかな依存性が認められ、最適な増幅性能は、６ｍＭ〜１０ｍＭの間で起こる。
【図４４】図４４は、変性ありまたは変性なしのＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを使用する、ＷＴＡライブラリー合成における一本鎖テンプレートの選択的増幅を示す。パネルＡは、これらのライブラリーの増幅のリアルタイムＰＣＲ曲線を示す。パネルＢは、エチジウムブロミド染色した、０．８％アガロースゲルで泳動させた得られた生成物を示す。わずか約１％のＤＮＡサンプルが、変性なしのライブラリー増幅因子（ａｍｐｌｉｍｅｒ）に変換され得るが、変性は、ＲＮＡテンプレートに対して影響をほとんど及ぼさない。
【図４５】図４５は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウエキソ−フラグメントと熱変性核酸（ＷＧＡ）またはＭＭＬＶ逆転写酵素と非変性核酸（ＷＴＡ）、ならびに総核酸調製物からの選択的増幅によるＤＮＡおよびＲＮＡの単離のための推測デバイス（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅ）を組み合わせて、自己不活性縮重プライマーを使用する総核酸単離物からのＤＮＡおよびＲＮＡの選択的増幅の原理を例示する。
【図４６】図４６Ａおよび４６Ｂは、合成されたＷＧＡライブラリーの増幅に対するポリＣタグの阻害効果を示す。図４６Ａは、重合により組み込まれる異なる長さのポリＣタグのリアルタイムＰＣＲ増幅クロマトグラムを示す。図４６Ｂは、対応するポリＣプライマーで増幅されたＣタグ化ライブラリーの増幅の遅延した反応速度論または抑制を示す。
【図４７】図４７Ａおよび４７Ｂは、特定のプライマーおよびユニバーサルＣ１０タグプライマーを使用する標的化増幅のリアルタイムＰＣＲを示す。パネルＡは、上記の投入テンプレート濃度の組み合わせ富化による一次的な特定のプライマーおよび二次的な特定のプライマーでの逐次的なシフトを示す。図４７Ｂは、選択的増幅に対する特異的プライマー濃度の効果を示す。リアルタイムＰＣＲ曲線は、プライマー濃度に対する特定の富化の勾配を示す。
【図４８】図４８Ａおよび４８Ｂは、多重化した標的化増幅における各独特の一次オリゴヌクレオチドについての個々の特異的部位富化を詳細に示す。図４８Ａは、等量の出発テンプレートに対する各部位についての富化の値を示す一方で、図４８Ｂは、増幅の頻度のヒストグラムと同じデータを示す。
【図４９】図４９Ａは、４５個の複数の特異的プライマーについての二次的な「ネスト化」リアルタイムＰＣＲの結果の分析を示す。富化は、出発テンプレートに対する、倍数増幅として表され、１００，０００倍〜１，０００，０００倍を超える範囲である。図４９Ｂは、４５個全ての多重部位に対する分布頻度を示す。
【図５０】図５０は、限定された出発物質から合成されたタグ化ライブラリーを用いた全ゲノム配列決定プロジェクトの模式図を示す。ライブラリーは、クローニングアプローチのための基質として、かつギャップ充填およびプライマーウォーキング（ｐｒｉｍｅｒ  ｗａｌｋｉｎｇ）のための指向性配列決定テンプレートのＣタグ化フォーマットへの変換を介して機能し得る増幅可能なフォーマットにおいて貴重なまたは稀なサンプルを回収する手段を提供する。
【図５１】図５１は、本発明の核酸増幅方法の普遍性ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの異なる供給源および増幅材料のためのあり得る適用の多様性との適合性を例示するダイアグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４７】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１６】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図３３】
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【図３９】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【配列表】
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