(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）塩基性抗菌ペプチドの遺伝子及び前記塩基性抗菌ペプチドの正電荷を実質的に中和させることができる酸性ペプチドの遺伝子を、一つのプロモーターの下で別個のペプチドに翻訳同伴されて発現させる２個のシストロンからなる２−シストロンＤＮＡ構造物を製造する段階と、
（ｉｉ）前記２−シストロンＤＮＡ構造物を発現ベクターに挿入し、これを微生物に導入させ、前記塩基性抗菌ペプチドと前記酸性ペプチドとの封入体を発現させる段階と、
（ｉｉｉ）前記微生物細胞から封入体を収得した後、電荷の差を用いて塩基性抗菌ペプチドを分離して収得する段階と、からなることを特徴とする抗菌ペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記ＤＮＡ構造物で２個のシストロンは、最初のシストロンの終結コドンであるＵＡＡまたはＵＧＡと二番目のシストロンの開始コドンであるＡＵＧとが重なっているＵＡＡＵＧまたはＵＧＡＵＧ配列で連結されることを特徴とする請求項１に記載の抗菌ペプチドの製造方法。
【請求項３】
前記段階（ｉ）には、二番目のシストロンの翻訳を増進させるために、最初のシストロンの終結コドン前にシャイン・ダルガノ配列（ＡＧＧＡＧＧＴ）を含む塩基配列を導入する段階が含まれることを特徴とする請求項１に記載の抗菌ペプチドの製造方法。
【請求項４】
前記塩基配列は、アミノ酸配列ＥＥＶＥを暗号化するＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡ(配列番号９)であることを特徴とする請求項３に記載の抗菌ペプチドの製造方法。
【請求項５】
前記塩基性抗菌ペプチドは、ヒストニンＩＩ、パラシン及びペキシガナンのうち何れか一つであることを特徴とする請求項１に記載の抗菌ペプチドの製造方法。
【請求項６】
前記酸性ペプチドは、１つ以上の二硫化結合を有することを特徴とする請求項１に記載の抗菌ペプチドの製造方法。
【請求項７】
前記酸性ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するｍＩＦ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するｍＩＦ２または配列番号５のアミノ酸配列を有するｍＩＦ３のうち何れか一つであることを特徴とする請求項１ないし請求項６のうち何れか一項に記載の抗菌ペプチドの製造方法。
【請求項８】
配列番号１のアミノ酸配列を有することを特徴とするｍＩＦ１ペプチド。
【請求項９】
配列番号３のアミノ酸配列を有することを特徴とするｍＩＦ２ペプチド。
【請求項１０】
配列番号５のアミノ酸配列を有することを特徴とするｍＩＦ３ペプチド。
【請求項１１】
塩基性抗菌ペプチドの遺伝子及び前記塩基性抗菌ペプチドの正電荷を実質的に中和させることができる酸性ペプチドの遺伝子を一つのプロモーターの下で別個のペプチドに翻訳同伴されて発現させる２個のシストロンからなることを特徴とする２−シストロンＤＮＡ構造物。
【請求項１２】
前記抗菌ペプチドは、ヒストニンＩＩ、パラシン及びペキシガナンのうち一つであり、
前記酸性ペプチドは、請求項７ないし請求項８のうち何れか一項に記載のペプチドであり、
前記２個のシストロンは、最初のシストロンの終結コドンであるＵＡＡまたはＵＧＡと二番目のシストロンの開始コドンであるＡＵＧとが重なっているＵＡＡＵＧまたはＵＧＡ
ＵＧ配列で連結されることを特徴とする請求項１１に記載の２−シストロンＤＮＡ構造物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本発明は、微生物から抗菌ペプチド（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）を効果的に生産することができる遺伝子構造物と、それを用いて抗菌ペプチドを効果的に量産及び分離する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗菌ペプチドは、微生物に対する耐性が問題視されている既存の抗生剤とは異なる活性によって抗菌活性を表わすので、耐性の誘発可能性が少ないという長所を有している。したがって、抗菌ペプチドは、次世代抗生物質として利用可能であるので、製薬・食品分野などでの産業的応用可能性が非常に高い。
【０００３】
しかし、前述した抗菌ペプチドの産業的利用に最大の障害要因は、既存のペプチド生産方法としては、これらを安価で大量に提供できないということである。例えば、化学合成で抗菌ペプチドを生産する場合には、経済性が劣り、微生物を利用した遺伝工学的技法で抗菌ペプチドを生産する場合には、経済性はあるが、大部分の抗菌ペプチドが１０〜４０個のアミノ酸からなる短いペプチドであるので、微生物宿主の多様なタンパク質分解酵素によって破壊されやすく、発現された抗菌ペプチドの抗菌活性によって宿主微生物の成長を阻害して、ペプチドの生産収率が非常に低いという問題点がある。
【０００４】
抗菌ペプチドを微生物で大量発現させて生産するための必須要件は、第一に、抗菌ペプチドが宿主微生物のタンパク質分解酵素によって容易に破壊されないようにし、第二に、抗菌ペプチドが有する微生物に対する毒性を効果的に中和させることである。従来には、融合タンパク質を用いて宿主細胞を殺さずに、宿主である微生物から所望のペプチドを生産する方法が一般的に使われた。しかし、このような方法は、因子Ｘａ（Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ）やエンテロキナーゼ（ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ）のようなタンパク質分解酵素またはシアン化ブロモ（ＣＮＢｒ）やヒドロキシルアミンのような化学物質を用いて融合タンパク質から所望する抗菌ペプチドを分離しなければならないが、このような過程は、時間とエネルギーとが多く消耗され、この過程中にペプチド発現収率が大幅に落ちるだけではなく、分離後にも融合タンパク質と抗菌ペプチドとの間に不溶の残基が残っている致命的な短所がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、前記問題点を解決するために案出されたものであって、本発明の目的は、微生物で抗菌ペプチドを融合発現させた場合、融合パートナーと抗菌ペプチドの分離に利用される手続きの複雑さと生産量の損失なしに、容易に効果的に抗菌ペプチドを量産することができる方法を提供することであり、また、このような抗菌ペプチドを量産のための遺伝子構造物及び抗菌ペプチドの融合パートナーを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するために、本発明者は、抗菌ペプチドと抗菌ペプチドの電荷を中和させることができる反対電荷の酸性ペプチドとを翻訳同伴された２−シストロン（ｔｗｏ−ｃｉｓｔｒｏｎ）システムを用いて同伴発現させて封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）を形成させることによって、宿主微生物に対する毒性効果を中和させて抗菌ペプチドを量産する方法を開発するのに至った。
【０００７】
本発明は、（ｉ）塩基性抗菌ペプチドの遺伝子及び前記塩基性抗菌ペプチドの正電荷を
実質的に中和させることができる酸性ペプチドの遺伝子を一つのプロモーターの下で別個のペプチドに翻訳同伴されて発現させる２−シストロンシステムのＤＮＡ構造物を製造する段階と、（ｉｉ）前記２−シストロンのＤＮＡ構造物を発現ベクターに挿入し、これを微生物に導入させ、前記塩基性抗菌ペプチドと前記酸性ペプチドとの封入体を発現させる段階と、（ｉｉｉ）前記微生物細胞から封入体を収得した後、電荷の差を用いて塩基性抗菌ペプチドを分離して収得する段階と、からなる抗菌ペプチドの製造方法を提供する。
【０００８】
本発明は、前記製造方法において、前記ＤＮＡ構造物は、二つのシストロンが最初のシストロンの終結コドンであるＵＡＡまたはＵＧＡと二番目のシストロンの開始コドンであるＡＵＧとが重なっているＵＡＡＵＧまたはＵＧＡＵＧ配列（ＤＮＡ構造物では、ＴＡＡＴＧまたはＴＧＡＴＧ配列である）で連結されることである方法を提供する。
【０００９】
本発明は、前記製造方法において、前記ＤＮＡ構造物を製造する段階には、二番目のシストロンの翻訳を増進させるために、最初のシストロンの終結コドン前にシャイン・ダルガノ配列（ＡＧＧＡＧＧＴ）を含む塩基配列を導入することが含まれることである方法を提供する。
【００１０】
本発明は、前記製造方法において、前記塩基性抗菌ペプチドは、ヒストニンＩＩ、パラシン及びペキシガナンのうち何れか一つであることである方法を提供する。
本発明は、前記製造方法において、前記酸性ペプチドは、一つ以上の二硫化結合を有することである方法を提供する。
【００１１】
本発明は、前記製造方法において、前記酸性ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するｍＩＦ１、配列番号３のアミノ酸配列を有するｍＩＦ２または配列番号５のアミノ酸配列を有するｍＩＦ３のうち何れか一つであることである方法を提供する。
【００１２】
本発明は、また、塩基性抗菌ペプチドの遺伝子及び前記塩基性抗菌ペプチドの正電荷を実質的に中和させることができる酸性ペプチドの遺伝子を一つのプロモーターの下で別個のペプチドに翻訳同伴されて発現させる２−シストロンのＤＮＡ構造物を提供する。
【００１３】
本発明は、また、塩基性抗菌ペプチドの正電荷を実質的に中和させることができる酸性ペプチドとして配列番号１のアミノ酸配列を有するｍＩＦ１ペプチド、配列番号３のアミノ酸配列を有するｍＩＦ２ペプチド及び配列番号５のアミノ酸配列を有するｍＩＦ３ペプチドを提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によって融合タンパク質の形態を構成しなくても、抗菌ペプチドと酸性タンパク質とを翻訳同伴させて抗菌ペプチドの発現が宿主に及ぼす成長阻害効果を極小化して、ペプチドの生産を可能にする。これにより、抗菌ペプチドの種類に関係なく、組替え微生物から抗菌ペプチドを大量に容易に生産可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明をより具体的に説明する。
【００１６】
本発明で使われる２−シストロン発現システムは、一つのプロモーターの下で二つの遺伝子がともに発現されることができるシステムであって、原核生物の場合、自然界でも多重−シストロン（ｍｕｌｔｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）に遺伝子が発現される多様な事例が存在する。原核生物のこのようなシステムを応用して本発明では、単独に発現させにくい抗菌ペプチドを効果的に大量発現させるように翻訳同伴（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ）されて発現される２−シストロン発現システムを開発したものである。
さらに具体的に、本発明では、抗菌ペプチドの強い塩基性によって宿主のＤＮＡまたはＲＮＡを攻撃して招来される細胞毒性を減らすか無くすことによって、すなわち、抗菌ペプチドの強い塩基性を一時的に中和させて抗菌ペプチドを大量発現できるシステムを開発したものである。
【００１７】
そのために、同伴発現パートナー（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒ）を導入して、一つのプロモーターの下で抗菌ペプチドと翻訳同伴されて発現させる。
【００１８】
本発明の２−シストロン発現システムで使われる抗菌ペプチドとしては、塩基性を有した如何なる抗菌ペプチドでも良い。塩基性の抗菌ペプチドとして望ましくは、ヒストニンＩＩ、パラシン、ペキシガナンなどが使われる。さらに望ましくは、ヒストニンＩＩが使われる。
【００１９】
本発明の２−シストロン発現システムでの同伴発現パートナーは、抗菌ペプチドの塩基性を中和させて細胞毒性を一時的に弱化させることができる酸性の電荷を帯びなければならない。それだけではなく、生産物が宿主に及ぼす細胞毒性を阻んで生産量を効果的に増大させるためには、抗菌ペプチドが不溶性（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）の形態に発現及び生産されなければならない。したがって、酸性（陰性）電荷を有すると同時に封入体を効果的に多く形成させることができる同伴発現パートナーを利用する。
【００２０】
同伴発現ペプチドは、一つのプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の下で抗菌ペプチドとともに発現され、融合ではない翻訳同伴の形態に発現される。すなわち、同伴発現ペプチドと抗菌ペプチドは、それぞれの翻訳開始部位（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｏｎ；ＴＩＲ）を有し、前で先に発現される同伴発現タンパク質の翻訳が、後で発現される抗菌ペプチドの翻訳に密接に影響を及ぼしながら発現される（絵３参照）。
【００２１】
一つのプロモーターの下で発現される二つのシストロンが利用されるが、発現しようと目的するターゲットである塩基性の電荷（ｃｈａｒｇｅ）が強い抗菌ペプチドを二番目のシストロンに置いて、これを中和させるために、最初のシストロンに酸性ペプチドを置く。そして、最初のシストロンと二番目のシストロンは、最初のシストロンの終結コドンと二番目のシストロンの開始コドンとがオーバーラップされて連結される（翻訳同伴される）。望ましくは、最初のシストロンの終結コドンであるＵＡＡまたはＵＧＡと二番目のシストロンの開始コドンであるＡＵＧとが重なっているＵＡＡＵＧまたはＵＧＡＵＧ配列で連結されている。さらに望ましくは、ＵＡＡＵＧ配列（ＤＮＡ構造物では、ＴＡＡＴＧである）で連結される。このような塩基配列を有することによって、最初のシストロンの翻訳に使われたリボソームが終結放出因子（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆａｃｔｏｒ；ＴＲＦ）によってｍＲＮＡから離れて翻訳が終結される以前に二番目のシストロンの新たな開始コドンを用いて連続的に発現されることができ、最も近い距離で発現された二つのペプチドが接合することが可能である。
【００２２】
二番目のシストロンの発現比率をさらに高めるために、最初のシストロンの終結コドンの３〜７塩基配列前、すなわち、二番目のシストロンの開始コドンの５〜９塩基配列前にシャイン‐ダルガノ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＡＧＧＡＧＧＴ）を有するように構成して、リボソームのｍＲＮＡ結合をさらに効率的に起きるようにできる。例えば、前記シャイン‐ダルガノ配列を含む配列は、ＮＡＧＧＡＧＧＴＮＮＮＮ（Ｎ：Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ、いずれも可能）であり得る。望ましくは、前記配列がＥＥＶＥを暗号化するＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡ配列は、完璧なシャイン‐ダルガノ配列であるＡＧＧＡＧＧＴを含んでおり、これはアミノ酸残基Ｅ（グルタミン酸）が三つ含まれて、−３の負電荷を帯びて塩基性の抗菌ペプチドの中性化に寄与する最適の配列になる。
【００２３】
本発明に使われる酸性ペプチドは、人為的にデザインするかまたは自然界に存在する酸性タンパク質のうちから選択することができ、それを暗号化する遺伝子を合成するか、自然界から分離して使用できる。一つの具体的な例で、望ましい酸性ペプチドは、人間ガンマインターフェロン（ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ；ｈＩＦＮ−γ）の類似体またはその断片である。
【００２４】
抗菌ペプチドがＤＮＡまたはＲＮＡに結合することを防止できるように、塩基性抗菌ペプチドの正電荷を中和させる酸性ペプチドを考案する。酸性ペプチドは、抗菌ペプチドの正電荷を実質的に中和させることができることが望ましい。酸性ペプチドの長さは限定されないが、抗菌ペプチドの生産効率のために、可能な限り短いものが良い。また、発現しようとする抗菌ペプチドの正電荷の数及び分布を考慮して、電荷の効果的な中和に適した負電荷の数と分布を有していることが望ましい。
【００２５】
また、酸性ペプチドは、最小２個以上のシステイン残基を有することがさらに望ましい。このようなシステイン残基は、発現後に二硫化結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ）による２次構造を形成することによって、酸性ペプチドの負電荷と抗菌ペプチドの正電荷との間の相互作用を促進すると推定される。また、酸性ペプチドは、抗菌ペプチドの塩基性を中和させることができる酸性を有すると同時に封入体をよく形成することができる特性を有することが望ましい。封入体を作ることで宿主のタンパク質分解酵素による分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を阻むことができるためである。
【００２６】
本発明の具体的な実施状態において、酸性ペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のシステイン残基を有しも良い。システイン残基の個数が増えるほど封入体の形成傾向が高くなる。
【００２７】
要約すれば、抗菌ペプチドによって適した酸性ペプチドは、次のような基準を使って考案及び選択することができる。すなわち、（１）目的する抗菌ペプチドの正電荷の数及び分布と類似している負電荷の数と分布を有すること、（２）アミノ末端部位にシステイン残基を有して最小２個以上のシステイン残基を有すること、（３）微生物内のタンパク質分解酵素の攻撃から安定的になるように、不溶性の封入体形態に発現されることができること、（４）効率的な抗菌ペプチド生産のために、可能な限り長さが短いこと、である。
【００２８】
本発明に使われる宿主微生物としては、遺伝子操作が容易で組替えタンパク質を低費用で多く生産することができる多様な微生物が使われる。例えば、大腸菌、枯草菌を含めたバクテリアと酵母などを使用できる。望ましくは、大腸菌を使う。
【００２９】
本発明の２−シストロンシステムのＤＮＡ構造物を微生物への導入に適したベクターは、宿主微生物、ペプチドの大きさなどによって当該技術分野の熟練者ならば、容易に選択することができ、また、本発明のＤＮＡ構造物を適した発現ベクターに挿入して、宿主微生物に導入する方法は、当該技術分野の熟練者ならば、容易に理解することができる。
【００３０】
封入体形態に発現された酸性タンパク質と抗菌ペプチドは、融合タンパク質の形態に発現されたものではなく、独立した形態に発現されて接合しているものであるために、ベクターＸａやエンテロキナーゼのようなタンパク質分解酵素またはシアン化ブロモ（ＣＮＢｒ）やヒドロキシルアミンのような化学物質を用いて分離する必要がない。封入体を溶解した後に電荷の差を用いて容易に分離することができ、一つの具体的な例として、イオン交換カラム（ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｌｕｍｎ）を使えば、容易に分離が可能である。
【００３１】
以下、本発明を次の実施例によってより具体的に説明する。これら実施例は、ただ本発明を具体的に説明するための例示に過ぎず、本発明の範囲が、下記の実施例によって制限されないということは、当業者に自明である。特に、本発明の実施例で例示された特定の抗菌ペプチド、酸性ペプチド、ＤＮＡ構造物、プライマー、宿主微生物、ベクター、分離及び精製方法などは、単に望ましい具体的な例に過ぎないものであって、各種の塩基性抗菌ペプチドの量産のために、酸性ペプチドを同伴発現させるための翻訳同伴システムを用いる発明は、本発明の範疇に属すると思わなければならない。
【００３２】
＜実施例１＞酸性タンパク質のアミノ酸配列決定及びその遺伝子の製造
韓国特許第２００１−０３１４７２１号（生物学的活性がある新規のペプチド）によって公開された配列番号１５番のペプチドと同一のアミノ酸配列の強力な抗菌ペプチドであるヒストニンＩＩ（アミノ酸配列：ＲＡＧＬＱＦＰＶＧＲＬＬＲＲＬＬＲＲＬＬＲ）（配列番号１０）とを発現するため、ヒストニンＩＩの電荷分布を考慮して、次のような特徴の酸性ペプチドを探索した。
１．ヒストニンＩＩの正電荷の数及び分布と類似している負電荷の数及び分布を有すること。
２．アミノ末端部位にシステイン残基を有すること。
３．微生物内のタンパク質分解酵素の攻撃から安定的になるように、不溶性の封入体の形態に発現されること。
４．効率的な抗菌ペプチドの生産のために、可能な限り長さが短いこと。
【００３３】
探索したそれぞれの酸性タンパク質を抗菌ペプチドと翻訳同伴させるために、同伴発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）タンパク質のアミノ末端には、クローニングのための制限酵素ＮｄｅＩの認識部位（ＣＡＴＡＴＧ）を導入した。そして、カルボキシ末端には、同伴発現する酸性タンパク質の酸性（陰性）をさらに増加させ、二番目のシストロンの翻訳がさらによく起きるように、終結コドン前にシャイン‐ダルガノ配列（ＡＧＧＡＧＧＴ）を含む塩基配列ＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡ（アミノ酸ＥＥＶＥを暗号化）を導入した（図１Ａ、配列番号１，２参照）。
【００３４】
（段階１）
人間ガンマインターフェロン（ｈＩＦＮ−γ）は、１４６個のアミノ酸で構成されたタンパク質であって、大腸菌から過発現させる場合、総タンパク質の９０％以上が不溶性の封入体を形成する特徴を有したタンパク質である。酸性を帯びており、アミノ末端近くにシステイン基を有しているので、同伴発現酸性タンパク質として適する。ｈＩＦＮ−γのカルボキシ末端には、インターシストロン（ｉｎｔｅｒｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）部位を有するように変形構成して、−５の酸性電荷を帯びるように製作した。これを暗号化するように、複数の単一鎖のオリゴヌクレオチド種類を合成し（表１の１〜９番（配列番号１１〜１９））、組替え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ＰＣＲ方法（Ｓｍｉｔｈ  Ｈ．Ｏ．ｅｔ．ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００３，１００（２６）１５４４０−１５４４５）を通じて１５０個のアミノ酸で構成された同伴発現タンパク質ｍＩＦ１の二重鎖のＤＮＡ切片を完成した（図１Ａ、配列番号１，２）。
【００３５】
（段階２）
前記段階１で提示したｈＩＦＮ−γは、発現しようとする抗菌ペプチドに比べて約７倍ほど分子量が大きいので、抗菌ペプチドの効果的な量産のためにさらに小さい同伴発現タンパク質が必要である。ｈＩＦＮ−γアミノ末端の８８個のアミノ酸からなるタンパク質にインターシストロン部位（アミノ酸ＥＥＶＥを暗号化）を添加して９２個のアミノ酸からなり、−６の酸性電荷を有したｍＩＦ２を製作した。表１で提示した単一鎖のオリゴヌクレオチド（表１の１〜５番（配列番号１１〜１５））を用いて組替えＰＣＲ方法を通じて９２個のアミノ酸で構成された同伴発現タンパク質ｍＩＦ２の二重鎖のＤＮＡ切片を完成した（図１Ｂ、配列番号３，４）。
【００３６】
（段階３）
前記段階２よりｈＩＦＮ−γの長さをさらに減らして、アミノ末端に位置する５９個アミノ酸からなるタンパク質にインターシストロン部位（ＥＥＶＥ暗号化）を添加して６３個のアミノ酸からなり、−６の酸性の電荷値を有したｍＩＦ３を製作した。表１で提示した単一鎖のオリゴヌクレオチド（表１の１〜３番（配列番号１１〜１３））を用いて組替えＰＣＲ方法を通じて６３個のアミノ酸で構成された同伴発現タンパク質ｍＩＦ３の二重鎖のＤＮＡ切片を完成した（図１Ｃ、配列番号５，６）。
【００３７】
【表１】
0004804525.tif 000002
【００３８】
＜実施例２＞抗菌ペプチドと酸性ペプチドとの同伴発現のためのＤＮＡ切片の製造
抗菌ペプチドヒストニンＩＩ遺伝子を暗号化するＤＮＡ切片を作るため、表１のプライマー１２、１３番のような単一鎖のオリゴマーを合成した。そして、ＤＮＡ重合化を通じて二重鎖のヒストニンＩＩを暗号化する遺伝子切片を製造した（図２Ａ（配列番号７））。この際、ヒストニンＩＩのカルボキシ末端には、ｐＥＴ２１ｃのクローニング時に使うため、制限酵素ＢａｍＨＩ認識部位（ＧＧＡＴＣＣ）を挿入した。
【００３９】
図２Ｂで示すように、酸性ペプチドと抗菌ペプチドヒストニンＩＩとが翻訳同伴されるためのＤＮＡ切片を組替えＰＣＲ方法を用いて製作した。ｍＩＦ１  ＤＮＡ断片とヒストニンＩＩ  ＤＮＡ断片とが同伴発現されるように連結されたｍＩＦ１−ヒストニンＩＩ（ｍＩＦ１Ｈ）ＤＮＡ構造物を作るため、前記ヒストニンＩＩの二重鎖ＤＮＡ切片と実施例１のｍＩＦ１  ＤＮＡ切片とを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として表１のプライマー（１、９、１３番）を用いて組替えＰＣＲをした。そして、ｍＩＦ２−ヒストニンＩＩ（ｍＩＦ２Ｈ）を得るために、前記ヒストニンＩＩの二重鎖ＤＮＡ切片と実施例１のｍＩＦ２  ＤＮＡ切片とを鋳型として表１のプライマー（１、１０、１３番（配列番号１１，２０，２３））を用いて組替えＰＣＲをした。同様に、ｍＩＦ３−ヒストニンＩＩ（ｍＩＦ３Ｈ）を得るために、前記ヒストニンＩＩの二重鎖ＤＮＡ切片と実施例１のｍＩＦ３ＤＮＡ切片とを鋳型として表１のプライマー（１、１１、１３番）を用いて組替えＰＣＲをした。
【００４０】
＜実施例３＞酸性ペプチド遺伝子−抗菌ペプチド遺伝子の翻訳同伴ベクターの製造
実施例１と実施例２とから製造された酸性ペプチド遺伝子と抗菌ペプチド遺伝子とが２−シストロン発現ベクターで構成されるために、図２Ａ〜図２Ｃのように二つのシストロンが翻訳同伴しているが、独立的に存在するか重なっている状態に発現されるように製作した。最初のシストロンには、塩基性の抗菌ペプチドを中性化させることができ、封入体を形成させることができる酸性ペプチドを同伴発現パートナーに置いて、二番目のシストロンには、抗菌ペプチドが発現されるように前記実施例２から製作したｍＩＦ１Ｈ、ｍＩＦ２Ｈ、ｍＩＦ３Ｈ  ＤＮＡ切片を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩとを用いて切断した後、ゲル抽出キット（Ｇｅｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いて所望の大きさのＤＮＡ切片を分離した。そして、これらをＮｄｅＩとＢａｍＨＩとに切断したｐＥＴ２１ベクターに連結させ、酸性ペプチドと抗菌ペプチドとの翻訳同伴ベクターｐｍＩＦ１Ｈ、ｐｍＩＦ２Ｈ、ｐｍＩＦ３Ｈを製造した（図３）。
【００４１】
＜実施例４＞いろいろな酸性の同伴発現ペプチドと抗菌ペプチドとの発現程度比較
前記実施例３から製造した酸性ペプチドと抗菌ペプチドとの翻訳同伴ベクターｐｍＩＦ１Ｈ、ｐｍＩＦ２Ｈ、ｐｍＩＦ３ＨをＣａＣｌ２を利用した形質転換方法でＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）にそれぞれ導入した。ＬＢ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｏｔａｎｉ、トリプトン１％、酵母抽出物０．５％、ＮａＣｌ０．５％）培地を使い、培養液がＯＤ６００＝０．５〜０．６の間である時、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加してペプチド発現を誘導した。
【００４２】
図４で、Ｍ１とＭ２は、分子量標準マーカーを表わし、レーン（ｌａｎｅ）１は、それぞれのプラスミドｐｍＩＦ１Ｈ、ｐｍＩＦ２Ｈ、ｐｍＩＦ３Ｈに形質転換されてＩＰＴＧで発現誘導をしていない大腸菌であり、レーン２は、ｐｍＩＦ１−Ｈに形質転換されてＩＰＴＧで発現誘導した大腸菌であり、レーン３は、ＩＰＴＧ発現誘導後の細胞破砕と遠心分離後の上澄み液であり、レーン４は、細胞破砕と遠心分離後に得られた沈殿物（封入体）を３Ｍウレア（ｕｒｅａ）溶液で溶解したものであり、レーン５は、対照群として合成した抗菌ペプチドである。矢印ａはｍＩＦ１（１５．１ｋＤａ）、矢印ｂはｍＩＦ２（１０ｋＤａ）、矢印ｃはｍＩＦ３（７ｋＤａ）、矢印ｄは抗菌ペプチド（２．５ｋＤａ）を表す。
【００４３】
いろいろな酸性ペプチドと抗菌ペプチドとの同伴発現を比べた結果、そのうち最小サイズである６３個のアミノ酸で構成されたｍＩＦ３を導入して、効果的に抗菌ペプチドを発現させることができるということを確認した。
【００４４】
＜実施例５＞最適化された酸性同伴発現ペプチドを導入した翻訳同伴２−シストロンシステムを通じる抗菌ペプチドヒストニンＩＩの生産
最適化された酸性同伴発現ペプチドｍＩＦ３を用いて抗菌ペプチドを大量発現して分離及び精製した。ｐｍＩＦ３Ｈに形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を１００ｍｌのＬＢ培地で育てて、培養液の懸濁程度がＯＤ６００＝０．５〜０．６である時、１ｍＭのＩＰＴＧを添加してペプチドの発現を誘導した後、４時間後に培養液を除去してＴｒｉｓ緩衝溶液で細胞を破砕した後、遠心分離して沈殿物を収穫した。この沈殿物を３Ｍウレア溶液で２時間常温放置してから溶かした後、１５Ｓリソース（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）陽イオン交換カラムにローディングした後、０．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出して抗菌ペプチドヒストニンＩＩを分離した、分離されたヒストニンＩＩをＣ−１８カラム（３．９ｘ３００ｍｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を利用した逆相ＨＰＬＣでもう一度精製して純粋に分離した。
【００４５】
図５では、Ｍ１とＭ２は、分子量標準マーカーを表わし、レーン１は、ｐｍＩＦ３−Ｈに形質転換されてＩＰＴＧで発現誘導をしていない大腸菌であり、レーン２は、ｐｍＩＦ３−Ｈに形質転換されてＩＰＴＧで発現誘導した大腸菌であり、レーン３は、ＩＰＴＧ発現誘導後の音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）後の上澄み液であり、レーン４は、音波処理後の沈殿物、すなわち、不溶性の封入体であり、レーン５は、レーン４の沈殿物をｐＨ１０の３Ｍウレアに溶解（ｒｅｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）させてリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）した後の封入体である。レーン６とレーン７は、１５Ｓリソース陽イオンクロマトグラフィー方法を通過させて分離したサンプルであって、それぞれカラムに吸着されないか吸着されたサンプルである。レーン８は、レーン７での正電荷だけ有する抗菌ペプチドのみを逆相ＨＰＬＣでもう一度精製して得た純粋な組替え抗菌ペプチドである。レーン９は、対照群として合成した抗菌ペプチドである。
【００４６】
得られた組替え抗菌ペプチドの抗菌活性を確認した結果、組替え抗菌ペプチドは、自然型の抗菌ペプチドと同一の抗菌活性を有すると確認された。
【００４７】
＜実施例６＞最適化された酸性同伴発現ペプチドを導入した翻訳同伴２−シストロンシステムを通じる他の抗菌ペプチドパラシン（ｐａｒａｓｉｎ）、ペキシガナン（ｐｅｘｉｇａｎａｎ）の生産
最適化された酸性同伴発現ペプチドｍＩＦ３を用いてヒストニンＩＩ以外の他の塩基性の抗菌ペプチドパラシンとペキシガナンとを発現して、多様な抗菌ペプチドの発現に本発明で提示した方法が包括的に利用されるということを確認した。ｐｍＩＦ３−パラシンとｍＩＦ３−ペキシガナンとに形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を１００ｍｌのＬＢ培地で育てて、培養液の懸濁程度がＯＤ６００＝０．５〜０．６である時、１ｍＭのＩＰＴＧを添加してペプチドの発現を誘導した後、４時間後に培養液を除去してＴｒｉｓ緩衝溶液で細胞を破砕した後、遠心分離して沈殿物を収穫した。この沈殿物を３Ｍウレア溶液で２時間常温放置してから溶かした後、抗菌ペプチドパラシンとペキシガナンとの発現程度を確認した。
【００４８】
図６では、Ｍ１とＭ２は、分子量標準マーカーを表わし、レーン１は、それぞれｐｍＩＦ３−パラシンとｐｍＩＦ３−ペキシガナンとに形質転換されてＩＰＴＧで発現誘導をしていない大腸菌であり、レーン２は、それぞれｐｍＩＦ３−パラシンとｐｍＩＦ３−ペキシガナンとに形質転換されてＩＰＴＧで発現誘導した大腸菌であり、レーン３は、ＩＰＴＧ発現誘導後の音波処理後の上澄み液であり、レーン４は、音波処理後の沈澱される不溶性の封入体をｐＨ１０の３Ｍウレアに溶解させてリフォールディングした後の封入体である。レーン５は、対照群として合成した抗菌ペプチドパラシンとペキシガナンとである。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明は、翻訳同伴システムを利用した抗菌ペプチドの大量発現方法に関連する分野に適用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ】本発明の酸性の同伴発現パートナータンパク質のアミノ酸配列であり、本発明の実施例で使用したｍＩＦ１のアミノ酸配列である。
【図１Ｂ】本発明の酸性の同伴発現パートナータンパク質のアミノ酸配列であり、本発明の実施例で使用したｍＩＦ２のアミノ酸配列である。
【図１Ｃ】本発明の酸性の同伴発現パートナータンパク質のアミノ酸配列であり、本発明の実施例で使用したｍＩＦ３のアミノ酸配列である。
【図２Ａ】本発明の抗菌ペプチドのアミノ酸配列と酸性タンパク質が抗菌ペプチドと翻訳同伴される２−シストロン発現のためのＤＮＡ切片の模式図であり、本発明の実施例で使用したヒストニンＩＩのアミノ酸配列である。
【図２Ｂ】本発明の抗菌ペプチドのアミノ酸配列と酸性タンパク質が抗菌ペプチドと翻訳同伴される２−シストロン発現のためのＤＮＡ切片の模式図であり、本発明の実施例で使用した酸性タンパク質−抗菌ペプチド翻訳同伴発現のためのＤＮＡ切片の模式図である。
【図３】本発明の実施例で使った酸性タンパク質遺伝子−抗菌ペプチド遺伝子の翻訳同伴される２−シストロン発現ベクターの製造図面及び分離精製に対する模式図である。
【図４】本発明の一実施例で使ったいろいろな酸性同伴発現タンパク質と抗菌ペプチドとの発現程度の比較図面である。
【図５】本発明の一実施例で使った抗菌ペプチドヒストニンＩＩを大腸菌でＩＰＴＧ誘導を通じて発現させた後、ヒストニンＩＩを純粋に分離する過程で得られたペプチド溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真である。
【図６】本発明の一実施例で使った抗菌ペプチドパラシンとペキシガナンとを大腸菌でＩＰＴＧ誘導を通じて発現させたＳＤＳ−ＰＡＧＥ写真である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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