(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（a）〜（c）を含むバイオリアクター：
（a）  ハウジングと一体型の気体導入手段；およびハウジングと一体型の気体排出手段を含む内面を有するハウジング；
（b）  各モジュールが
（i）  最内中空ファイバおよび最外中空ファイバを含む、それぞれの中空ファイバが内面と外面を有する、少なくとも３つの同軸に整えられた中空ファイバと、
（ii）  最内中空ファイバの内面によって境界が定められる第１のコンパートメントを含む少なくとも３つのコンパートメントと、該少なくとも３つの同軸の中空ファイバの隣接するファイバ間のそれぞれの環状空間によって境界が定められる少なくとも２つのコンパートメントと
を含む、ハウジング内に存在する中空ファイバの複数のモジュール；ならびに
（c）  複数のモジュールによって占有されていないハウジングの内面内の空間によって境界が定められる最外コンパートメント。
【請求項２】
中空ファイバが半透過性である、請求項１記載のバイオリアクター。
【請求項３】
中空ファイバがポリスルホン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、ポリテトラフルオロエチレン、酢酸セルロース、およびセルロース混合エステルからなる群より選択される物質を含む、請求項２記載のバイオリアクター。
【請求項４】
第１のコンパートメント、少なくとも１つのさらなるコンパートメント、および最外コンパートメントがそれぞれ、少なくとも１つの入口と少なくとも１つの出口をさらに含む、請求項１記載のバイオリアクター。
【請求項５】
バイオリアクターが少なくとも109個の細胞をさらに含む、請求項１記載のバイオリアクター。
【請求項６】
細胞が肝細胞である、請求項５記載のバイオリアクター。
【請求項７】
肝細胞がブタ肝細胞およびヒト肝細胞からなる群より選択される、請求項６記載のバイオリアクター。
【請求項８】
ハウジングが、第１のコンパートメントに関して少なくとも１つの入口マニホールドおよび少なくとも１つの出口マニホールドをさらに含む、請求項４記載のバイオリアクター。
【請求項９】
少なくとも１つのマニホールドが流れの分配器をさらに含む、請求項８記載のバイオリアクター。
【請求項１０】
少なくとも１つのコンパートメントが細胞外マトリクスをさらに含む、請求項９記載のバイオリアクター。
【請求項１１】
少なくとも１つの環状空間が0.2ミリメートル〜0.8 ミリメートルである、請求項１記載のバイオリアクター。
【請求項１２】
バイオリアクターが、オートクレーヴ、エチレンオキサイド、およびガンマ線照射からなる群より選択される手段によって滅菌される、請求項１記載のバイオリアクター。
【請求項１３】
最内中空ファイバの長さが、２センチメートル〜50センチメートルである、請求項１記載のバイオリアクター。
【請求項１４】
ハウジングが第１の末端と第２の末端を有し、各入口と各出口がハウジングの第１の末端に存在する、請求項８記載のバイオリアクター。
【請求項１５】
中空ファイバのモジュールと実質的に平行な微小ファイバをさらに含む、請求項８記載のバイオリアクター。
【請求項１６】
微小ファイバが少なくとも１つのエアレーション入口と少なくとも１つのエアレーション出口とをさらに含む、請求項15記載のバイオリアクター。
【請求項１７】
少なくとも１つの同軸中空ファイバがペルフルオロカーボンによって飽和される、請求項１記載のバイオリアクター。
【請求項１８】
少なくとも１つの同軸中空ファイバの孔の大きさが１×10-6 m未満である、請求項１記載のバイオリアクター。
【請求項１９】
少なくとも１つの同軸中空ファイバの孔の大きさが0.1×10-6 m未満である、請求項１記載のバイオリアクター。
【請求項２０】
少なくとも１つの同軸中空ファイバの孔の大きさが0.05×10-6 m未満である、請求項１記載のバイオリアクター。
【請求項２１】
少なくとも１つの成分が、細胞外マトリクスと混合した細胞を含む、請求項１記載のバイオリアクター。
【請求項２２】
各バイオリアクターサブユニットが以下の（a）〜（d）を含む、複数のバイオリアクターサブユニットを含む直列に連結したバイオリアクター：
（a）  ハウジングと一体型の気体導入手段；およびハウジングと一体型の気体排出手段を含む内面を有するハウジング；
（b）  各モジュールが
（i）  最内中空ファイバおよび最外中空ファイバを含む、それぞれが内面と外面を有する、複数の同軸中空ファイバと、
（ii）  最内中空ファイバの内面によって境界が定められる第１のコンパートメント、および複数の同軸中空ファイバの隣接するファイバ間のそれぞれの環状空間によって境界が定められる少なくとも１つのさらなるコンパートメントを含む複数のコンパートメントと
を含む、ハウジング内に存在する中空ファイバの複数のモジュールの列；
（c）  複数のモジュールによって占有されていないハウジングの内面内の空間によって境界が定められる最外コンパートメント；ならびに
（d）  少なくとも１つの他のバイオリアクターサブユニットの少なくとも１つのコンパートメントに直列に連結した１つのバイオリアクターサブユニットの少なくとも１つのコンパートメント。
【請求項２３】
各バイオリアクターサブユニットが少なくとも109個の細胞をさらに含む、請求項２２記載のバイオリアクター。
【請求項２４】
細胞が肝細胞である、請求項２３記載のバイオリアクター。
【請求項２５】
細胞がヒト肝細胞とブタ肝細胞からなる群より選択される、請求項２４記載のバイオリアクター。
【請求項２６】
各バイオリアクターサブユニットの少なくとも１つのコンパートメントが細胞外マトリクスをさらに含む、請求項２３記載のバイオリアクター。
【請求項２７】
以下の段階を含む、請求項２２記載のバイオリアクターの使用方法：
（a）  請求項２２記載の直列に連結したバイオリアクターのバイオリアクターサブユニットに患者から得られた血漿を導入する段階；
（b）  血漿の少なくとも一部を、バイオリアクターサブユニットの細胞コンパートメントの中に放射状に流れさせて、生体内変換排水を形成する段階；
（c）  請求項２２記載のバイオリアクターの第２のバイオリアクターサブユニットに、生体内変換した排水を導入する段階；および
（d）  生体内変換した排水の少なくとも一部を、第２のバイオリアクターサブユニットの細胞コンパートメントの中に放射状に流れさせ、補足血漿を形成する段階。
【請求項２８】
以下の（a）〜（c）を含む、多同軸中空ファイババイオリアクター：
（a）  内面を含むハウジング；
（b）  内面が少なくとも１つの最内入口と少なくとも１つの最内出口とを含む第１のコンパートメントの境界を定める、内面を有する最内ファイバを含む、少なくとも３つの同軸半透過性中空ファイバと、各コンパートメントが、少なくとも１つの外側入口と少なくとも１つの外側出口とを含む、少なくとも３つの中空ファイバの隣接するファイバのあいだの各環状空間によって境界が定められる、複数のコンパートメントとを含む
中空ファイバモジュールであって、
各成分がそれぞれの環状空間、それぞれの外側入口とそれぞれの外側出口のあいだの流れの連絡手段を含み、環状空間の１つが真核細胞を含む、中空ファイバモジュール；ならびに
（c）  該少なくとも３つの中空ファイバの最外ファイバの外面と、ハウジングの内面のあいだの空間によって境界が定められ、少なくとも１つの最外入口と少なくとも１つの最外出口とを含む、最外コンパートメントであって、
少なくとも１つのコンパートメントが真核細胞を含む場合に、ハウジングが、コンパートメントのそれぞれに関して少なくとも１つの入口マニホールドと少なくとも１つの出口マニホールドとを含むコンパートメント。
【請求項２９】
以下の段階を含む、細胞培養方法：
請求項２８記載のバイオリアクターのコンパートメントに生存細胞を導入して、同軸で隣接する中空ファイバの中に栄養培地を通過させる段階。
【請求項３０】
（a）（i）  環状空間と真核細胞の全数とを有する環状コンパートメントと、
（ii）  それぞれの隣接するコンパートメントが液体を含む、該環状空間に対して隣接して同軸である少なくとも二つのコンパートメントと、
（iii）  環状空間に対する完全なエアレーション供給と
を含む装置に患者から得られた血漿を循環させ、
（b）  血漿の一部が環状コンパートメントを通過するようにした、請求項１記載のバイオリアクター。
【請求項３１】
通過が圧力によって促進される、請求項３０記載のバイオリアクター。
【請求項３２】
血漿の一部が患者の循環系に戻される、請求項３０記載のバイオリアクター。
【請求項３３】
装置が、その中に第２の環状空間と真核細胞の全数とを有する第２の環状コンパートメントをさらに含む、請求項３０記載のバイオリアクター。
【請求項３４】
装置が、その中に第２の環状空間と真核細胞の全数とを有する第２の環状コンパートメントをさらに含む、請求項３１記載のバイオリアクター。
【請求項３５】
装置が、その中に第２の環状空間と真核細胞の全数とを有する第２の環状コンパートメントをさらに含む、請求項３２記載のバイオリアクター。
【請求項３６】
血漿の一部が患者の循環系に戻される、請求項３４記載のバイオリアクター。
【請求項３７】
以下の（a）〜（b）を含む、バイオリアクターにおいて細胞生存率を増強するために放射状流速を選択する方法であって、
第１の中空ファイバに関連した第１の水圧と第２の中空ファイバに関連した第２の水圧とを測定して、水圧の差を得る段階、放射状の流れを測定する段階、および第１の水圧、第２の水圧、またはその組み合わせを調節して、細胞生存率を改善するために一つまたはそれ以上の放射状流速を選択する段階を含む方法：
（a）  各モジュールが
（i）  最内中空ファイバおよび最外中空ファイバを含む、それぞれが内面と外面を有する、複数の同軸中空ファイバと、
（ii）  最内中空ファイバの内面によって境界が定められる第１のコンパートメントを含む、複数のコンパートメントと、
（iii）  複数の同軸中空ファイバの隣接するファイバ間のそれぞれの環状空間によって境界が定められる少なくとも１つのさらなるコンパートメントと
を含む、ハウジング内に存在する中空ファイバの複数のモジュールの列；
（b）  複数のモジュールによって占有されていないハウジングの内面内の空間によって境界が定められる最外コンパートメント。
【請求項３８】
第１のファイバと第２のファイバが同軸である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
放射状流速が以下の式に基づいて選択される、請求項３８記載の方法：
【数１】
0004656789.tif 000004
式中、ΔPは、圧力の差であり、Qは、放射状流速、Lは、第１と第２のファイバの長さの短いほうの長さ、raは、バイオリアクターの中心線から第１のファイバの内表面までの半径距離、rbは、バイオリアクターの中心線から第１のファイバの外表面までの半径距離、rcは、バイオリアクターの中心線から第２のファイバの内表面までの半径距離、rdは、バイオリアクターの中心線から第２のファイバの外表面までの半径距離、K1は、第１のファイバの透水率、およびK2は、第２のファイバの透水率である。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、その完全な開示が参照として本明細書に組み入れられる、1999年６月３日に提出された米国特許出願第60/137,594号の優先権を主張するものである。
【０００２】
政府の利権：  本発明は、第1F32 DK09713-01号として国立糖尿病消化腎疾患研究所によって与えられた助成金によって行われた。政府は本発明において特定の権利を保有する。
【０００３】
１．発明の分野
本発明は、全般的に、細胞培養のための装置およびこの装置を作成および用いるプロセスに関する。特に、本発明は、真核細胞を増殖または維持するための装置ならびに装置を作成および使用するプロセスに関する。本発明の一つの態様は、ヒト肝臓の機能を実施する。
【０００４】
２．本発明の背景および問題の認識
肝不全は、急性肝不全、慢性肝疾患、および多臓器不全を含むいくつかの主要なタイプに分類される。肝不全の主な病因は、ウイルス性肝炎ならびに薬剤および毒素によって誘発された肝毒性である。進行肝不全によって脳症および昏睡が起こり、致命的となる可能性がある。治療は、肝機能が自然に回復するまで、または肝臓移植を受けるまでの患者の安定化に重点を置く。総計すると、肝不全に帰因する年間死亡率は、米国において年間27,000人を越える。
【０００５】
非生物学的材料のみで構成される装置である人工臓器は、ヘルスケアを大きく前進させた。腎透析装置、機械的換気装置、心ペースメーカー、および機械的心臓ポンプを含む人工臓器と組織代用体は、見込みがない生命を脅かす疾患を有する多くの人々の生命を維持する。そのような人工臓器の有用性は、それらが広く用いられていることに表れている。例えば、ペースメーカーは、その生物学的類似体の代用物として実に見事な働きをする。
【０００６】
時に腎透析装置とも呼ばれる人工腎臓は、純粋に人工的な臓器の利益と短所の双方を表す。人工透析装置は、尿素、クレアチニン、水および過剰量の塩分を血液から除去するために有効であり、このように、本来の腎臓の主な役割を部分的に満たしている。明らかに、人工腎臓は、腎不全患者の死を延期した。しかし、腎透析装置は選択性が不十分で、ステロイドホルモンのような生体成分の除去が不適切であるが、本来の機能する腎臓はそうではない。その結果、長期間にわたる透析によって、骨の喪失、凝固異常、免疫不全、および不妊症が起こる可能性がある。
【０００７】
腎不全患者とは異なり、肝不全患者は特異的に治療することができない。腎透析は腎不全の治療に革命をもたらしたが、現在のところ、肝不全ではこれに匹敵するものはない。現在、難治性腎不全に対して利用できる唯一の治療は、肝臓移植である。肝不全患者の多くは、併発感染症または他の臓器不全のために移植に適しない。臓器不足と待機時間の長いリストのために、肝臓移植に適した患者でさえも、しばしば同種異系移植を待つ間に死亡する。UCLAは、移植候補者の４分の１が肝臓が得られる前に死亡すると報告した。小児年齢群での移植に適した臓器は、なおさらにまれである（ブスチル（Busuttil, R. W.）ら、Ann. Surg. 1987、206、387）。
【０００８】
本来の肝臓は、４つの主なクラスの生化学機能を有する。第１に、肝臓は、血清アルブミン、α-アンチトリプシン、α-マクログロブリン、酵素、凝固因子、微量元素の担体分子、およびアポリポ蛋白質のような血液の主要な無細胞成分を含む、広範囲の蛋白質を生合成する。次に、肝臓は、これらの成分を血液循環に放出する。肝臓はまた、アミノ酸と脂肪酸の適当な血漿濃度を維持する。第２に、肝臓は解毒反応において主な役割を有する。肝臓は、多くの有害な外毒素を酸化またはこれと抱合するが、これは通常、しかし必ずしも常ではないが、毒素の有害な特徴を減少させるプロセスである。肝臓はまた、過剰量のヘモグロビンを破壊し、ヘモグロビンのポルフィリン分子を代謝して、鉄成分をリサイクルする。第３に、ビリルビンのような老廃物は、抱合されて胆管を通じて排泄される。第４に、肝臓は、胆汁酸塩を合成して分泌するが、これは脂肪の乳化および消化を促進する洗浄剤として作用する。肝機能の多様性および生化学特徴は、体外肝支持体の複雑度を大きく増加させる。
【０００９】
生体人工臓器は、生きた生物学的成分を含み、且つこれを維持するようにデザインされた人工臓器である。多くの生物機能は、最も単純なペースメーカーの場合のように、一定の間隔で電位を単に生成するよりはるかに複雑である。例には、血液成分の生合成および有害物質の異化的処理が含まれる。肝臓、内分泌腺、骨髄、および腎臓は、そのような特殊な生化学機能において顕著である。生物学的成分を含まない人工臓器は、これらの臓器によって行われる複雑な生化学機能を再現することができない。
【００１０】
これまで、非生物学的人工肝臓代用物は血液透析と血液潅流に依存していたが、これは非常に短期間であり、得られた利益は非常に限定されていた（アベ（Abe, T.）ら、Therapeutic Apheresis、2000、4：26）。純粋に人工的な臓器とは対照的に、有効な肝代用物は、生体成分を含まなければならない。肝臓は、皮膚、腸、造血系、および血管のような広く分布する臓器を除くと、ヒトの体内において最も大きい臓器である。インビトロにおいて機能する肝臓の大きい塊を維持するには多様な障壁がある。機能的な生体人工肝臓を開発する際の問題少なくとも８個を記述することができる；1）適当な生存細胞を増殖または得ること；2）重要な最小限の細胞塊を提供すること；3）細胞に酸素を供給すること；4）細胞に栄養を供給すること、および細胞老廃物を効率的に除去すること；5）剪断力と水圧を制限すること；6）毒素の生合成と生体内変換能を有する分化細胞表現型を誘導または維持すること；7）無菌性を維持すること；および8）補体による肝組織拒絶または溶解を防止すること。
【００１１】
1）  適当な生存細胞を増殖または得ること。生体人工肝臓において用いられる可能性がある肝細胞は、確立された細胞株、ヒトもしくは動物の肝臓、または原始肝細胞からの初代単離体となりうるが、腫瘍発生因子を分泌することから、細胞株を組み入れたBALデザインのFDA承認に負の影響を及ぼしている（ウ（Xu, A. S. L.）ら、2000、「系統生物学と肝臓（Linearge Biology and Liver）」、ランザ、ランガー、およびバカンティ（Lanza, R.P., Langer R., and Vacanti, J.）（編）、アカデミックプレス、サンジエゴ、559〜597ページ）。分化した肝臓の機能の多くを発現する肝臓の細胞株、例えばHepG2およびC3Aが利用できる。細胞株は、細胞株の増殖が細胞の老化によって制限されるのではなく、栄養の利用によって制限されることから、体外塊細胞培養系またはバイオリアクターにおいて十分な細胞数の増殖能を提供し、患者の生命を維持する可能性がである。初代ヒトまたは動物肝細胞も同様に、機能的な生体人工的肝臓にとって必要な数で得ることができる。しかし、細胞調製にヒト肝臓を用いることは、入手できないために制限され、そして細胞調製に動物肝臓を用いる場合には、ある程度の細胞不適合性が起こる。急性の細胞不適合性は、外来細胞を認識する抗体の結合と、その後の補体系の蛋白質の結合および外来細胞の溶解が原因である。長期間の細胞不適合性メカニズムも同様に存在するが、暫定的または「ブリッジ」医薬品としてバイオリアクターを用いることに関していかなる問題も示さないはずである。分化した細胞の大きい塊の初回接種に対して考えられる代用は、成熟肝細胞の前駆物質である肝臓の肝細胞の増殖である。最近の報告から、成熟と分化に向けての経路において、肝臓の前駆細胞が多数回の細胞分裂を経ることが示唆されている（ブリル（Brill, S.）ら、Differentiation 1995、59、95；シガール（Sigal, S. H.）ら、Differentiation 1995、59、35）。適当なサイトカインを段階毎に適用することによって、増殖と分化のプロセスを適切に制御すれば、臨床的に有用な細胞量を調製することが可能となりうる。
【００１２】
2）重要な最小限の細胞塊を提供すること。ヒト成人肝臓の重量は約1400〜1600 グラムであり、かなりの貯蔵容量、または余剰容量を特徴とする。ヒトの生存は、総肝臓重量の約15〜20％で維持されうると推定される。肝臓塊の数値の20％は、細胞約５×1010個に対応する（カサイ（Kasai）ら、Artif Organs 1994、18、348）。従来の生体人工肝デザインは、全てではないが、そのほとんどの容量がかなり不適当である。すなわち、そのような装置が維持できるのは、細胞５×1010個より少ない数、またはこれより少ない次数の細胞である。血漿成分の生合成および解毒反応にとって重要な細胞塊が存在しなければ、これらの他のデザインは臨床での有用性がほとんどない。
【００１３】
3）細胞に酸素を供給すること。ネフロン、腺房、気泡、微小絨毛、皮膚等のようなほとんどの臓器の機能的ユニットは、それに対して物理化学的勾配がある毛細管床からなる。これらの勾配は物質輸送作用によって制御される。酸素は細胞培養を制限する主な栄養分である（マクドナルド（Macdonald, J. M.）ら、NMR Biomed. 1998、11、1；グラッケン（Gracken, M. W.） ら、Ann NY Acad. Sci 1983、413、355）。当該生物学的または化学的材料を含むバイオリアクター内での「完全」な酸素付加またはエアレーションは、酸素と炭酸の物質輸送を大きく増強する。後者の形成はpHを制御するために用いることができる。
【００１４】
酸素は一般的に、中空ファイバ生体人工肝臓における制限栄養素である（カタパノ（Catapano,,G.）ら、Int. J. Art Organs 1996、19、61）が、その理由は主に、肝細胞が非常に好気性細胞であるために酸素物質輸送の問題を引き起こすためである。酸素は、比較的高い拡散係数を有し、その肝臓の洞様毛細血管の血液から肝細胞への物質移動は、対流よりむしろ拡散によって支配される（すなわち、対流と潅流は圧勾配によって引き起こされる）。これらの作用は、酸素分子が糖分子のような他の栄養分より、または蛋白質のような生合成産物よりはるかに小さいこと、そして肝細胞が生体人工肝臓において急な濃度勾配を形成することが原因である。酸素拡散と酸素消費の速度が既知で、そして細胞密度推定値が妥当であるとすれば、酸素の利用が増殖の律速因子となる拡散距離は約200 μmである（マクドナルド（Macdonald, J. M.）ら、1999、「細胞封入技術と治療（Cell Encapsulation Technology and Therapeutics）」、クートライバー、ランザ＆チック（Kuhtreiber, W., Lanza, R.P., and Chick, W. L.）（編）、バークハウザーボストン、ケンブリッジ、252〜286ページ）。空気によって連続的に酸素付加した生体人工肝臓では、潅流培地における酸素の軸方向制限は25 mmとなる（マクドナルド（Macdonald）ら、1999、上記）。
【００１５】
肝細胞は高い代謝速度を有し、持続的な酸素供給を必要とする。酸素消費速度はHepG2細胞の場合0.59〜0.7 nmols/s/細胞106個の範囲であり（スミス（Smith, M.D.）ら、Int. J. Artif. Organs、1996、19、36）、単離肝細胞の場合0.42 nmols/s/細胞106個である（ロテム（Rotem, A.）ら、Biotech Bioeng. 1992、40、1286）。完全な酸素付加、すなわち、細胞への培地供給路に沿った持続的な酸素供給は、肝細胞に酸素を供給するために必須である。連続的な酸素付加は、培地供給の液体ラインにおける１つまたはそれ以上の場所での酸素付加であり、有効な生体人工肝にとって必要な肝細胞の塊を維持することができない。連続的な酸素付加の問題点は、酸素担体を添加していない水性培地における酸素の溶解度が低いために、存在するいかなる酸素も細胞の代謝によって急速に枯渇する点である。実際に、従来のバイオリアクター半透過性膜に沿った縦方向の流れにおいて、肝細胞は経路に沿って2.5 cm以内で酸素を枯渇し、したがって、増加するスターリング流による対流性の酸素物質移動が改善する。従来のバイオリアクターによる流速の増加は、ファイバの二股化（breeches）を引き起こし、肝細胞の機能に有害な影響を及ぼしうる（カリエス（Callies, R.）ら、Bio/Technology 1994、12：75）。このように、適当な酸素供給を提供しない生体人工肝デザインが維持することができるのは、ごく限られた数の細胞に過ぎない。さらに、拡散が制限された系に酸素を流入させると、細胞の増殖は酸素供給に非常に近いところ（約0.2 mm未満）に限定される。例えば、ゴッフェ（Goffe）の米国特許第5,622,857号は、いくつかの同軸およびいくつかの平行な半透過性の中空ファイバを有するバイオリアクターを開示している。ゴッフェのデザインは、完全な酸素付加を可能にするが、細胞コンパートメントの厚みを制限していない。そのデザインにおけるファイバ間の空間は3〜5 mmであり、酸素拡散距離を厳密に制御していない。同様に、ダーネル（Darnell）らの米国特許第5,183,566号は、平行な中空ファイバの束を有するバイオリアクターを開示している。ダーネルらのデザインは、多数の個々の多同軸ファイバの束を正確に再現可能な拡散距離で構築することができず、このデザインは容易に規模拡大することができない。ダーネルらのデザインは、平行なファイバの束を用いているが、この場合も酸素拡散の問題に有効に対処していない。このように、細胞塊の拡散が制限される厚みについて有効に対処し、重大な細胞塊を提供し、且つ有害な剪断力が作用することなくバイオリアクターの長さ全体にわたって酸素を供給するバイオリアクターがなおも必要である。
【００１６】
4）細胞に栄養を供給すること、および細胞老廃物を効率的に除去すること。
炭水化物、脂質、無機質およびビタミンのような栄養分を供給する問題は、中空ファイバ技術を変更したいくつかの方法によって首尾よく解決されているが、これらの特徴は、いかなる生存生体人工肝臓または生体人工臓器デザインにも首尾よく組み入れられなければならない。同様に、代謝老廃物を除去する問題は、通常、栄養を供給する同じ系によって扱われる。グルタメート、ピルベート、およびグルコースの消費速度は典型的に、細胞密度と増殖速度を妥当に仮定すれば、0.03〜0.3 nmols/s/細胞106個の範囲である（クレマー（Cremmer, T.）ら、J. Cell Physiol. 1981、106、99；イマムラ（Imamura, T.）ら、Anal. Biochem. 1982、124、353；グラッケン（Glachen, M.）、Dissertation 1987）。組織における酸素の拡散速度は、水中のピルベートと類似であり、グルコースの速度より高い。これらの消費速度は、酸素消費速度より小さいために、酸素は、ほとんどの状態において律速栄養である。
【００１７】
5）剪断力と水圧を制限すること。所定のバイオリアクターでは、重度の酸素勾配を形成することなく、適当な酸素物質移動のために、対流と拡散の最適なバランスが存在する。例えば、非毒性酸素範囲、すなわち＜0.4 mM（溶解定数は、1.06 mM/原子、空気溶解度は37℃で0.2 mM）を用いて、酸素物質移動の対流成分は、細胞が酸素供給から0.2 mm以上離れると増加するはずである（マクドナルド（Macdonald）ら、1999、上記）。酸素洞様毛細血管における部分的酸素圧は、門脈三分岐付近で約70 mm Hgであり、中心静脈付近で20 mm Hgに低下し、これは、有離の酸素の0.096〜0.027 mMという範囲に等しく、ヘモグロビン結合酸素は、6.26〜2.91 mMの範囲である。肝臓の洞様毛細管における血流の速度は、約0.02 cm/sであるが、酸素拡散係数は約４次数低く、または２×10-6 cm2/sである。しかし、肝機能は、剪断力の増加によって負の影響を受け、インビボの肝細胞はディッセの空間における内皮と細胞外マトリクスの層によって保護されている。十分な剪断力は肝細胞を殺すであろう。他の研究者は、剪断力が特定のチトクロームP450を誘導することを発見した（ムフチ＆シュラー（Mufti, N. A. and Shuler, M. L.）、Biotechnol. Prog. 1995、11、659）。最近の研究から、70％の肝切除より90％の肝切除では肝臓は早く再生すること、そしてこれはより大きい剪断力に帰因することが示されている（サトウ（Sato, Y.）ら、Surg. Today、1997、27、518）。しかし、このより早い再生はまた、増強された酸素、栄養およびアゴニストの物質移動による可能性もある。したがって、なお最適な機能を示しながら肝細胞を維持することができる剪断力の何らかの最大レベルが存在する。最大レベルは、内皮層が肝細胞を保護すれば増加しうる。
【００１８】
対流を増加させるために、水圧勾配を増加させる。水圧の上昇は肝細胞を内破させうる。したがって、これらの圧以下にすることが重要である。シリンジを用いた同軸バイオリアクターへのこれらの細胞の接種のあいだに、７ psi以上（＞300 mm Hg）の水圧を２分間以上生成すると、単離したラット肝細胞の100％死亡を引き起こすことが可能である。
【００１９】
6）毒素の生合成と生体内変換能を有する分化細胞表現型を誘導または維持すること。血液成分の生合成と毒素の解毒を含む肝臓の特殊な機能が分化表現型に関連することから、肝細胞の分化表現型を用いることは有用な生体人工肝臓を生成するために必要である。これらの特殊な機能は、細胞が分化すると全体として、または部分的に失われ、これはしばしば単離された初代細胞培養の場合に起こる。対照的に、急速に増殖することができる肝細胞の型は、未分化の表現型であり、２つの相対する必要性のバランスをとることが実験者に任せられる（エナト（Enat, R.）ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1984、81、1411）。いくつかの報告は、肝細胞の表現型がサイトカインおよび細胞外マトリクス成分の存在によって調節される可能性があることを示唆している。特に、コラーゲンIVとラミニンに富む細胞外マトリクス成分は、エンゲルブレック-ホルム肉腫（Engelbrech-Holm Sarcoma：EHS）によって産生され、マトリゲル（登録商標）として市販されているが、これをホルモンを添加した培地と共に用いると、分化表現型を誘導する（エナト（Enat, R.）ら、上記；ビッセル（Bissell, D. M.）、Scan. J. Gasterenterol. Suppl 1988、151、1；ブリル（Brill, S.）ら、Proc. Soc. Exp. Biol. Med.、1993、204、261）。
【００２０】
7）無菌性を維持すること。バイオリアクターおよび関連成分の容易な滅菌技法の実施は、体外生体人工臓器を臨床的に用いるために必須である。幸いなことに、体外装置の滅菌と標準的なインラインフィルターによる無菌状態の維持の双方に関する標準的な方法を含む滅菌技法が十分に確立されている。
【００２１】
8）補体による肝組織拒絶または溶解を防止すること。外来組織の拒絶は、外来細胞表面に対する循環中の抗体の結合、補体系の蛋白質の接着、および障害細胞の溶解を含む、補体媒介溶解として知られる急速なプロセスによって起こる可能性がある。細胞媒介免疫系は、遅延型拒絶反応の原因である。しかし、細胞媒介免疫系は、宿主とドナー細胞とを直接接触させないバイオリアクター系では、主な役割を有しないはずである。例えば、バイオリアクターの構造的成分に対する異物反応も同様に、細胞媒介であり、したがって、実質的な障壁とならないはずである。
【００２２】
必要とされる改善
上記の観点から、肝不全患者の生命を維持するために生体人工肝臓に対する明らかな必要性が存在する。特に、非常に薄い細胞層における高い生物学的細胞容量を有し、酸素および栄養分に対して容易に近づくことができる生体人工肝臓の改善版が必要である。細胞培養において細胞の大きい塊に対して効率的な酸素輸送を提供し、そして有用な生合成細胞産物の患者への輸送を可能にする装置またはバイオリアクターが必要である。同様に、そのような装置を用いる有効な方法も必要である。
【００２３】
既存のバイオリアクターデザインに関する問題は、不適当な酸素付加、生物学的細胞成分の容量が最小であること、毒素除去能の制限、過剰な剪断および水圧力、ならびに生合成細胞産物を患者が用いるために輸送することが難しい点が含まれる。さらに、既存のバイオリアクターデザインは、細胞塊の拡散が制限される厚み、重要な細胞塊を提供すること、およびバイオリアクターの長さ全体に対して酸素を供給すること、に対して有効に対処することができない。
【００２４】
３．発明の概要
したがって、バイオリアクター細胞培養において、大きい細胞塊への有効な酸素輸送、および有用な生合成細胞産物の患者への輸送を提供する装置の様々な態様、ならびにそれを用いる方法を提供することが本発明の目的である。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、必須の酸素と栄養分を提供して、且つ代謝産物を運び去る、持続的に酸素付加して流動する栄養培地に隣接する薄い環状空間に細胞が含まれるようにする装置を提供することである。
【００２６】
本発明のなおさらなる目的は、バイオリアクターにおける大きい細胞塊の生合成産物を回収する装置を提供することである。
【００２７】
本発明のなおさらなる目的は、これらの毒素を除去または不活化することができない患者から血液または血漿を解毒する装置を提供することである。
【００２８】
本発明のなおさらなる目的は、代用肝臓として役立つ装置を提供することである。
【００２９】
本発明は、以下を有する、大規模の多同軸中空ファイババイオリアクターを提供する：内面を有するハウジング；および各モジュールが少なくとも３個の同軸の半透過性中空ファイバを有する、中空ファイバの約20〜約400モジュールの列。中空ファイバのモジュールは、第２のファイバ内に収まる第１のファイバ；第３のファイバ内に収まる第２のファイバ；等を有する。各ファイバは内面と外面とを有する。第１のコンパートメントは、第１のファイバの内面によって境界が定められ、少なくとも１つの第１の入口と少なくとも一つの第１の出口とを有する。第２のコンパートメントは、第１のファイバの外面と第２のファイバの内面の間に第１の環状空間によって境界が定められ、少なくとも一つの第２の入口と少なくとも一つの第２の出口を有する。第３のコンパートメントは、第２のファイバの外面と第３のファイバの内面の間の第２の環状空間によって境界が定められ、少なくとも一つの第３の出口と少なくとも一つの第３の出口とを有し、その後のコンパートメントは隣接するファイバによって境界が定められる。完全なエアレーションを可能にするための最外コンパートメントは、最外ファイバの外面とハウジングの内面とのあいだの環状空間によって境界が定められ、少なくとも１つの最外入口と少なくとも１つの最外出口とを有する。ハウジングは、各コンパートメントについて、少なくとも１つの入口マニホールドと少なくとも１つの出口マニホールドとを有する。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、二つまたはそれ以上のコンパートメントが持続的に直列して接続している多数の大規模多同軸中空ファイバを有する直列に連結したバイオリアクターを特徴とする。この装置は、患者の血漿における毒素の生体内変換と、患者の血液を補給するための血漿成分の生合成の双方にとって特に有用である。
【００３１】
本発明のさらなる態様には、NMR試験に特に適合している多同軸ファイババイオリアクターであって、および一面または片側の末端から全ての口へのアクセスが必要である場合に用いられる一面多同軸中空ファイババイオリアクターが含まれる。
【００３２】
本発明のなおさらなる態様には、小規模試験に特に適合している両側多同軸中空ファイババイオリアクターが含まれる。
【００３３】
本発明のなおさらなる態様には、密に充填された中空ファイババイオリアクターが含まれる。この装置は、緻密に配置された細胞の高密度培養にとって特に有用であり、患者の血漿における毒素の生体内変換と、患者の血液を補給するための血漿成分の生合成の双方に適している。
【００３４】
本発明のバイオリアクターは、生体人工肝臓として用いると、患者が小児、子供、青年期または成人、男女にかかわらず、患者の体重に応じて、そして患者において残っている肝機能の程度に応じて、肝臓の機能的容量を容易に調節できるようにするモジュラーデザインを有する。本発明のバイオリアクターはさらに、患者の血漿における毒素の生体内変換を可能にする、および生体人工肝臓からの生合成産物の患者への有効な移動を増強する、血漿および栄養培地コンパートメントを有する。肝臓または他の細胞と共に用いると、本発明は、患者のために生合成産物を調製するために、実験に用いるために、そして血液の解毒のための補助生体内変換装置として用いるために有用である。血液中の毒素には、代謝老廃物、細胞または赤血球破壊産物、アセトアミノフェンのような認定基準に従った薬剤の過剰投与、および不法な薬剤の過剰投与が含まれるが、これらに限定しない。本発明の製造が容易であることから、費用効果が高く商業的に開発することが可能となる。
【００３５】
このように、以下のより詳細な説明がよりよく理解されるように、そして本発明の当技術分野への貢献がよりよく認識されるように、大まかに本発明のより重要な局面を説明した。当然のこととして、下記に述べるような、添付の特許請求の範囲の主題となるであろう本発明のさらなる局面が存在する。
【００３６】
この局面において、本発明の少なくとも一つの態様を詳細に説明する前に、本発明は、これまでの説明に記載したような、または図面に記載したような構築の詳細および成分の配置への適用に限定されないと理解すべきである。本発明は、他の態様が可能であり、様々な方面において実践され、実施されることが可能である。同様に、本明細書において用いられるその表現および用語は、説明するためであって、制限的に解釈すべきではない。
【００３７】
そのため、当業者は、本開示に基づく考え方を、本発明のいくつかの目的を実行するために他の構造、方法およびシステムをデザインするための基礎として容易に利用してもよいと認識するであろう。したがって重要な点は、請求の範囲は、本発明の精神および範囲から逸脱しない限り、そのような同等の構築物も含むと解釈される点である。
【００３８】
さらに、上記の要旨の目的は、米国特許および特許事務所および一般大衆、特に、特許または法律用語または表現を熟知していない当技術分野の科学者、エンジニア、および医師が、本出願の技術的開示の性質および本質にざっと目を通しただけで直ちに決定できるようにすることである。要旨は、出願した本発明を定義しようとするものではなく、特許請求の範囲によって測られ、本発明の範囲をいずれにせよ制限すると解釈されない。
【００３９】
これらは、本発明の他の目的と併せて、本発明を特徴づける新規性に関する様々な特徴と共に、添付されて本開示の一部となる特許請求の範囲において詳しく指摘される。本発明、その操作上の利点およびその使用によって得られる特定の目的をよりよく理解するために、添付の図面および本発明の好ましい態様を説明した記述を参考にしなければならない。
【００４０】
５．好ましい態様の説明
5.1  定義
環状空間。二つの隣接する中空ファイバの距離離れた中心から外側に向かう距離。
【００４１】
BAL。生体人工肝臓。本発明の特定の態様でもある：大規模多同軸中空ファイババイオリアクター、緻密に充填された中空ファイババイオリアクター、または肝細胞の必要量、栄養培地および気体を加えた直列に連結したバイオリアクター。
【００４２】
バイオリアクターモジュール。同軸に配置された半透過性の中空ファイバ。一つのモジュールは多同軸中空バイオリアクターの中心部を形成し、大規模多同軸中空ファイババイオリアクターは、多数のモジュールを含む。
【００４３】
生体内変換。組織または細胞による血液または血漿の代謝的解毒。
【００４４】
第４のコンパートメント。存在すれば、第３の中空ファイバの外側と、中空ファイバに隣接する第４の中空ファイバの内側によって境界を定められ、二つの口、すなわち第４のコンパートメントの入口と第４のコンパートメントの出口に接続している、バイオリアクター態様におけるコンパートメント。
【００４５】
第１のコンパートメント。第１の、最内同軸中空ファイバの内側によって一部その境界が決定され、二つの口、すなわち、第１のコンパートメントの入口と第１のコンパートメントの出口に接続しているバイオリアクターの態様おけるコンパートメント。
【００４６】
完全なエアレーション。気体、典型的に、流路に沿ってほぼ全ての点における空気または二酸化炭素を含む酸素に対する暴露。完全なエアレーションは、気泡発生装置または気体交換装置が流体回路の一つの点で挿入される連続的なエアレーションとは区別される。
【００４７】
マニホールド。ファイバの末端部位に存在し、コンパートメントを物理的に区切り、液体の流れを分流させることを意図するバイオリアクターの一部。
【００４８】
微小ファイバまたは微小口径の中空ファイバ。口径が200〜500 マイクロメートルの半透過性中空ファイバ。
【００４９】
多同軸中空ファイババイオリアクター。中空のハウジングに囲まれた三つまたはそれ以上の同軸に配置された半透過性の中空ファイバを含むバイオリアクター。
【００５０】
栄養培地。糖、微量元素、ビタミン、および増殖促進物質に富む電解質溶液。それぞれの特定の処方は、処方者によって、または処方者の名前が付けられ、時に奇抜な、または明確でない名前がつけられている。栄養培地には、RPMI 1640（ロスウェルパークメモリアルインスチチュート、処方番号1640）、ハムF-12（ハム博士のFシリーズ培地の12番目の処方）、DMEM（ダルベッコ改変イーグル培地）およびCMRL-1415（コノートメディカルリサーチラボラトリー処方番号1415）が含まれるがこれらに限定しない。栄養培地は、ルーチンとして、ホルモン、無機質およびインスリン、セレン、トランスフェリン、血清および血漿を含むがこれらに限定されない当業者に既知の因子を加えることによって強化される。
【００５１】
一面多同軸中空ファイババイオリアクター。入口と出口が共に同じ末端平面に存在する多同軸中空ファイババイオリアクターの型。この型は、NMR試験、および一面からの全ての口にアクセスすることが必要な試験に特に適合する。
【００５２】
最外コンパートメント。最外中空ファイバの外側とハウジングの内側によって境界が定められ、二つの口、すなわち最外コンパートメントの入口と最外コンパートメントの出口に接続しているバイオリアクターにおけるコンパートメント。
【００５３】
ポッティング。接着による、または他の適した手段による成分の結合を意味する当技術分野の用語。
【００５４】
大規模多同軸中空ファイババイオリアクター。モジュールの組の全体が中空のハウジングによって囲まれている、同軸に配置された半透過性の中空ファイバの約20モジュールから約400モジュールの列を含むバイオリアクター。
【００５５】
第２のコンパートメント。第１の最内同軸中空ファイバの外側と同軸中空ファイバに隣接する第２の内側によって境界が定められ、二つの口、すなわち第２のコンパートメントの入口と第２のコンパートメントの出口に接続しているバイオリアクター態様におけるコンパートメント。一面の多同軸中空ファイババイオリアクターおよびいくつかの閉端ファイバデザインでは、１つのコンパートメントのみがコンパートメント２へのアクセスを提供する。
【００５６】
直列に連結したバイオリアクター
二つまたはそれ以上のコンパートメントが持続的に直列して接続している、多数の大規模同軸中空ファイババイオリアクターまたは多数の緻密に充填された中空ファイババイオリアクター、またはその組み合わせを含むシステム。この意味において、それぞれの大規模バイオリアクターを、バイオリアクターサブユニットと呼ぶ。
【００５７】
第３のコンパートメント。第２の中空ファイバの外側と同軸中空ファイバに隣接する第３の中空ファイバの内側によって境界が定められ、二つの口、すなわち第３のコンパートメントの入口と第３のコンパートメントの出口に接続しているバイオリアクター態様におけるコンパートメント。
【００５８】
緻密に充填された中空ファイババイオリアクター。同軸に配置された半透過性の中空ファイバの約20モジュールから約400モジュールの列を含む大規模バイオリアクター。エアレーションのための微小ファイバを平行に、モジュールに隣接して配置され、全体が中空のハウジングによって囲まれる。
【００５９】
5.2  装置の要素
本発明には、理論的に、同軸ファイバの数に制限がないモジュールによる多同軸バイオリアクターが含まれる。好ましい態様において、大規模多同軸バイオリアクターは、少なくとも２組のマニホールド、少なくとも３つのサイズの中空ファイバ、少なくとも２組の末端キャップ、およびハウジングを含む。バイオリアクターのこの態様は、少なくとも４つの異なるコンパートメントを含む。モジュールデザインは、２組のマニホールドで構成され、各マニホールドの組はファイバのそれぞれの末端に接続している。マニホールドの組と同軸に配置され、且つファイバに対して同軸に配置された約20〜約400個の一連の穴が存在する。マニホールドは選択的に、ファイバの中を通過する流体と気体相の流速がほぼ均一になるように流れの分布器を含む。ファイバマニホールドの組立体は、最も大きい直径から最も小さい直径まで放射状に結合しており、最も小さい直径のファイバから最も大きい直径のファイバまで同軸に結合している。より小さい直径のファイバをより大きい直径のファイバに挿入してそれぞれのマニホールドを共に密封する。ファイバを配置するために、２つもしくはそれ以上のドエルを、３つのマニホールドにおいて正確に穴をあけた穴の中に、または隣接するマニホールド上の舌状構造および溝を接続することによって挿入する。
【００６０】
本発明のバイオリアクターは、「完全な」酸素付加を既定の拡散距離と都合よく組み合わせ、可能性がある胆管形成に適合するように口を有し、および／または容易に規模を拡大することができる。完全な酸素付加は、溶存気体の効率的な物質移動およびpHの制御を可能にする。既定の拡散距離によって、剪断力、栄養の利用、およびpHのような予測可能な軸方向および中心から外側方向の物理化学的生物学的パラメータが可能となる。患者に用いる場合、少なくとも４つのコンパートメントの１つまたはそれ以上を患者の血漿のために用いることができ、もう一つを完全に酸素付加した培地によって細胞を潅流するために用いることができる。選択的に、毒素が１つのユニットにおいて細胞塊の中を放射状に血漿から潅流して、次のユニットにおいて合成因子を注入することができるように、２つまたはそれ以上のバイオリアクターユニットを直列して接続することができる。胆管の出口のような口を用いて胆管系が開発される可能性がある。
【００６１】
図1Aは、複数のコンパートメントを含む本発明の多同軸ファイバユニットを示す。最内ファイバ102が、標準培地または血漿を受領するための毛細管内空間または第１のコンパートメント104を提供する。中央ファイバ106は、肝細胞のような細胞を含めるための環状空間または第１の中央コンパートメント108を提供する。外側ファイバ110は、培地を受領するための毛細管外空間または第２の中央コンパートメント112を提供する。ハウジング114は、多同軸ファイバユニットの最外境界部を定める。ハウジング114と外側ファイバ110とのあいだの空間または最外コンパートメント116は、気体の受領を可能にする。拡散距離118は、第１の中央コンパートメント108の半分の幅である。放射状潅流120は、例えば、ファイバユニットの中の溶存酸素の放射状の流れであり、軸性潅流122は、例えばファイバユニットの中の溶存酸素の軸方向の流れである。
【００６２】
図1Bは、生存細胞と完全な酸素付加を有する同軸バイオリアクターの第１の中央コンパートメント108を横切る放射状の酸素勾配を示し、酸素濃度は、第１のコンパートメント104と第２の中央コンパートメント112、そして0.4 mm離れた102と106の環状空間126において等しい。示すように、距離126が拡散距離118において0.2 mmに近づくと、酸素の百分率124はゼロに近づく。距離が0.4 mmに近づくと、酸素百分率124は100％に近づき、この場合も第２の中央コンパートメント112からの酸素拡散による。
【００６３】
図1Cは、「一連」または「平行」な酸素付加のいずれかを有する生体人工肝臓バイオリアクターを用いることによって得られる軸方向の酸素勾配を示す。示すように、酸素百分率128は、「連続」酸素付加132を用いる場合、距離130では減少するが、「平行」134酸素付加を用いる場合ほぼ一定のままであり、それによって、完全な酸素付加による軸方向の酸素勾配の減少を示す。
【００６４】
本発明は、完全な酸素付加と結合した所望の拡散距離の正確な制御を可能にし、およびポッティング材料と組み合わせたモジュラーデザインによって、いかなる組成物のファイバも所望の同軸となるように配置される。ポッティング材料は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、ボドナー（Bodnar）らの米国特許第4,227,295号に開示されるように当業者に既知である。ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスルホン等のような熱可塑性のファイバを用いる場合、バイオリアクターは、ロビンソン（Robinson）らの米国特許第5,015,585号に記載されたような熱結合方法を用いて構築することができる。
【００６５】
図2Aは、多同軸ファイバユニットを含む大規模多同軸バイオリアクターを示す。好ましい態様において、バイオリアクターは、ハウジング202に含まれる約20〜約400個の多同軸ファイバモジュールを含む。しかし、理論的に、同軸ファイバの数に制限はない。示すように、ハウジング202は、長さ204が17センチメートルであり、直径206が８センチメートルであるが、別の寸法も予想される。例えば、ファイバの長さは、約２センチメートルから約50センチメートルとなりえて、直径は約１センチメートルから約100センチメートルとなりうる。ハウジング202は、例えば、バイオリアクターのそれぞれの末端に関して、3組のマニホールド208、および1組の末端キャップ210を含む。それぞれの大きさの中空ファイバについて１組のマニホールドが必要である。ハウジングは、ガラス、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、デルリン、テフロン、スチール、真鍮、セラミック、または他の適した材料で構築される。マニホールド208と末端キャップ210は、アクリル酸、熱可塑剤、セラミックまたは他の適した材料から機械加工、または形成することができる。各多同軸ファイバモジュールを含む中空ファイバは、好ましくは半透過性であり、それぞれ、例えば３サイズである；外径約５ミリメートルのポリスルホン；外径約３ミリメートルのポリスルホン；および外径約１ミリメートルの酢酸セルロース。このように、同軸ファイバユニットあたりファイバ３個、ファイバのモジュールあたりマニホールド３個が存在し、マニホールドはファイバのそれぞれの末端に接続している。所望のΔPは、口212からの流出流速を、例えば針の弁を用いて制限することによって形成することができる。本発明はまた、対応するマニホールドおよび口を有する各ファイバモジュールにおける３つ以上の同軸ファイバを有する態様を想定する。
【００６６】
上記の、または類似の寸法の各バイオリアクターは、組織約160グラムまでを保持することができる。さらに、もう一つの態様において、細胞コンパートメントに対してより大きい環状コンパートメントを用いることによって、および／またはより長いファイバを用いることによって、より大きい細胞塊容量が支持される。細胞コンパートメントの環状デザインは、より大きいバイオマスの程度を得ることができることから、単一のチューブを用いる場合よりさらなる長所を有する。例えば、フ（Hu）らの米国特許第5,605,835号に記載される生体人工肝臓では、肝細胞が最内毛細管内コンパートメントにおいてコラーゲンに封入され、体外肝として必要とされる約120 gの組織を得るために、直径200μmの酢酸セルロースの中空ファイバ44,860個を必要とするであろう。対照的に、図２に示す本発明の態様は150分の１であるファイバ数を用いる。
【００６７】
口に至る開口部は、材料の移動を可能にする。最内口212は、バイオリアクターの中への培地または血漿の流れを可能にする。第１の中央口214は、バイオリアクターへの細胞の接種またはバイオリアクターへの細胞の流れを可能にする。第２の中央口216は、バイオリアクターの中への培地の流れを可能にする。最後に、最外口218はバイオリアクターへの気体の流れを可能にする。もう一つの口を用いることも想定される。例えば、培地は、口218の中を流れ、細胞は口216にまたはその中を流れ、培地または血漿は214の中を流れ、そして酸素または他の気体は212の中を流れうる。
【００６８】
図2Bは、多同軸バイオリアクター内に存在する多数のコンパートメントを含む多同軸ファイバユニットの拡大図である。示すように、第１のコンパートメント104内に存在する培地または血漿は、最内口212から流れるまたは受領することができる。同様に、（1）第１の中央コンパートメント108内に存在する細胞は、第１の中央口214に流れる、または中央口から受領することができ；（2）第２の中央コンパートメント112内に存在する培地は第２の中央口216に流れる、または中央口から受領することができ；および（3）最外コンパートメント116に存在する気体は最外口218に流れる、または最外口から受領することができる。同様に、最内ファイバ220、中央ファイバ222、および最外ファイバ224を含む中空ファイバのモジュールも示す。１つ以上の中央ファイバを有するモジュールを含む態様も想定される。
【００６９】
図3Aは、第1のマニホールド302、第2のマニホールド304、および第3のマニホールド306を含む1組のマニホールド208をさらに示している。マニホールドはそれぞれ、直径が約15センチメートルであり、約20個から400個の穴を有する円形領域から成る。ただし、任意の数の穴を有することが可能である。これらの穴は、それぞれのファイバの外径に対応する３つの異なる直径を有している。このため、各穴の間に2mmの空間を存在する１列当たり20本のファイバを有することができる。ただし、最適な穴パターンは所望のファイバ・モジュールの数に基づいて決定される。これらのファイバは、任意の所望の中空のファイバまたはチューブで構成することができ、それぞれのファイバ直径に適合するようにそれぞれの部品の設計仕様を適切に変更することができる。
【００７０】
２つの例示的なポッティング手順、すなわち、心合わせされた同軸ファイバが得られる手順とそうでない手順について説明する。どちらの手順でも、ファイバはそれぞれのマニホールド208に挿入される。外側ファイバ110は、シリコン、セラミック、ガラスなどの空気透過性材料で構成することができる。一例として、ポリプロピレンの外側中空ファイバを熱可塑性溶接と共に使用することができる。
【００７１】
ファイバを心合わせするために使用されるポッティング手順は、図3A、図3B、および図3Cに示されている追加的な３組の部品、すなわち、（１）第１のマニホールド用の第１の中空ファイバ・ガイド314、第２のマニホールド用の第２の中空ファイバ・ガイド316、および第３のマニホールド用の第３の中空ファイバ・ガイド318、（２）スペーサ320、ならびに（３）それぞれの中空ファイバ・サイズ（外側110、中央106、および内側102）ごとの中空ファイバ・クリップ（外側322、中央324、および内側326）を必要とする。中空ファイバ・ガイドは、厚さ3mmで剛性を維持することのできる任意の材料で構成することができる。マニホールドと中空ファイバ・ガイドは互いに重ね合わせられ、順次マニホールド穴がドエルと位置合わせされ、外側ファイバ110がマニホールドの穴に挿入され、次いでファイバの端部が中空ファイバ・ガイドを少なくとも1cmだけ越えて延びるように中空ファイバ・ガイドに挿入される。ファイバがハウジング202に挿入され、外側ファイバの他方の端部が、次の第１のマニホールド302および第１の中空ファイバ・ガイドに挿入される。中空ファイバ・ガイドが、一対のスペーサ320をマニホールドと中空ファイバ・ガイドとの間でスライドできるようにする距離だけマニホールドから離れる方向に延ばされる。スペーサ320は、隣接するマニホールド延長部310にそれぞれの側で接着される。マニホールド208、スペーサ320、および中空ファイバ・ガイドがしっかりと固定された後、中空ファイバがテープまたはクリップでしっかりと固定される。各ファイバ・サイズに適合する外側ファイバ・クリップ322、中央ファイバ・クリップ324、および内側ファイバ・クリップ326が各ファイバ列を横切って挿入され、それにより、ファイバがぴんと張られて同軸性が維持されると共に、内側ルーメンが密に挟み込まれ、したがって、ポッティング中に中央ファイバが詰まることはなくなる。したがって、ファイバ・クリップは列の長さに応じて長さを変化させる。マニホールド208にねじ込まれるかあるいは密封され、ポッティング・プロセス中にエポキシを保持する働きをする鋳造ポット312に、しっかりと固定されたファイバ、スペーサ、および中空ファイバ・ガイドが挿入される。この組立体は、鋳造ポット312が底部に配置された状態で、10度ないし45度下向きに口305の方へ傾斜するように直立に配置される。 ポッティング材料、たとえばエポキシが側部口305に注入され、マニホールド208の側部に沿って穴332を通って流れ、鋳造ポット312に含まれる空隙334を充填する。気泡を除去するために鋳造ポット312の底部にはタップ穴が設けられている。適切な量のエポキシが空隙334を充填するように、かつマニホールド308の両側を覆うレベルまで追加される。エポキシがほぼ硬化された後、中空ファイバ・ガイド・スペーサ320、鋳造ポット312、およびエポキシが切断され、マニホールドの上に非常に小さなエポキシ308層が残る。したがって、スペーサ320、中空ファイバ・ガイド314、316、318、およびファイバ・クリップ322、324、および326は、（１）ポッティング中にファイバをぴんと張り、心合わせし、（２）マニホールド208の上にエポキシ308層を残すように切断することのできる中空ファイバの隙間間でエポキシを硬化させる領域を形成するという���つの目的を果たす。
【００７２】
他の方法を使用して内側ファイバを心合わせすることができる。第１の例では、剛性のロッドが内側ファイバのルーメンに挿入されて内側ファイバが心合わせされる。次いで、コラーゲンなど温度に依存するゲル状マトリクスと細胞が混合され、マトリクスがゲルになる。次いで、ロッドが取り外される。第２の例では、必要な内側ファイバ間隔に等しい直径を有するモノフィラメント・ファイバがスペーサとして働く。ポリプロピレン、ポリエチレン、または他の適切な材料で作られたモノフィラメントが内側ファイバの周りに１センチメートル当たり１巻き程度にらせん状に巻かれている。次に、モノフィラメントを有する内側ファイバの巻き線は、中央ファイバに挿入される。これによって、内側ファイバおよび中央ファイバを軸対称にすることができる。したがって、植え付けられている細胞がコルクねじ型経路に従う。要素306を使用してモノフィラメントに内側ファイバがポッティングされる。
【００７３】
図3Dは、多同軸バイオリアクター内に位置しており、心合わせされた同軸ファイバ・プロセスによって形成された複数のコンパートメントを備える多同軸ファイバの切欠拡大図である。したがって、第１のマニホールド302は、エポキシ308によって頂部および底部で固定されており、その一部が最外コンパートメント116および第２の中央口216を形成している。第２のマニホールド304は、エポキシ308によって頂部および底部で固定されており、その一部が第２の中央口216および第１の中央口214を形成している。第３のマニホールド306は、エポキシ308によって頂部および底部で固定されており、その一部が最内口212を形成している。
【００７４】
心合わせされていないファイバを形成するポッティング・プロセスは、中空ファイバ・ガイド、モノフィラメント、またはスペーサを必要としないが、遠心分離機を必要とする。図3Eは、第１のマニホールド302、第２のマニホールド304、第３のマニホールド306、および鋳造ポット312を示す、３組のマニホールド208の図である。第２のマニホールド304および第３のマニホールド306が穴を有さず、ファイバを同軸に位置合わせすることに留意されたい。エポキシ・ポッティング・プロセスは、参照としてその全体が本明細書に組み入れられたBodnarら（米国特許第4,227,295号）に記載されている。このプロセスでは、ファイバ端部が２つのそれぞれのマニホールドに挿入される。ファイバ端部がまとめられ、次いでテープ、ひも、または他の何らかの材料でしっかりと固定され密封される。次いで、鋳造ポット312が両端に取り付けられる。この組立体がその軸中心で遠心分離機ロータに取り付けられる。組立体の上方に小さく平坦な容器が配置され、この容器は、組立体の各端部で口305に取り付けられた穴を各端部に有している。遠心分離機が回転するにつれて、エポキシが容器の中央に配置され、容器の端部の方へ押し出され、容器の穴に沿って口305を通して鋳造ポット312内に押し込まれ、ファイバ束の隙間を充填する。適切な量のエポキシが鋳造ポット312まで流れた後、組立体は、エポキシが部分的に硬化するまで回転し続ける。次いで、余分のエポキシおよび鋳造ポット312が切断され、開放された中空ファイバ穴が組立体の両端部に残り、次のエポキシ・ポッティング・ステップが実行される。各マニホールド間で漏れが起こらないように、マニホールド208はその境界に沿って溶接されるか、あるいはエポキシ樹脂で接着される。
【００７５】
図４は、３組のファイバで構成された本発明の１つのモジュールの組立体用の２つの手順の４つの主要なステップを説明する図である。この手順では、第１のステップ401で、外側ファイバ110の端部が第１のマニホールド302の穴に挿入され、次いで第１のマニホールド302がハウジング202に取り付けられ、ファイバ端部がポッティングされる。次のステップ402では、第２組のファイバ、すなわち中央ファイバ106が外側ファイバ110に挿入され、ファイバ端部が第２のマニホールド304の穴に挿入され、ファイバ端部がポッティングされる。次のステップ403では、内側ファイバ102が中央ファイバ106に挿入され、ファイバ端部が第３のマニホールド306の穴に挿入され、ファイバ端部がポッティングされる。最後のステップ404では末端キャップが取り付けられる。第２のステップ402および第３のステップ403の間に、ドエル穴310を介して少なくとも２つのドエルが、互いに隣接するマニホールドに挿入され、互いに隣接するマニホールドの穴が位置合わせされる。第２のマニホールド304は４つのドエル穴310を有している。これは、ポッティング・プロセスが完了した後にドエル穴を空隙310に維持し、それによって、ドエルを挿入し第２のマニホールド304を第３のマニホールド306に適切に位置合わせできるようにする中空ファイバで、少なくとも２つの穴が充填されるからである。互いに同様な材料に対して熱可塑性溶接を実行することができ、したがって、本発明において、第１のマニホールド302は、ポリプロピレン・ファイバを溶接するためにポリプロピレンで作られている。
【００７６】
図５は、一般的な溶接プロセスを示している。中空ファイバ502の内径内にテフロン・コーク501が挿入され、ファイバ壁がマニホールド208の穴503の壁に押し付けられる。ヒート・ガンまたは熱可塑性溶接機504を使用してファイバ壁502と穴503の壁が溶融させられる。組立体が冷却された後、テフロン・プラグが取り外される。第１のマニホールド302の穴に整合するテフロン・プラグのジブを使用して外側ファイバ端部がそれぞれの第１のマニホールド302に溶接される。ハウジング313の両端は、第１のマニホールド302がはめ込まれるスロットを有している。ファイバがマニホールドと同じ材料で構成されており、心合わせされていない同軸ファイバが形成される可能性が高いので、第２のマニホールド304および第３のマニホールド306を取り付けるテフロン・プラグの同様なジブを使用して、すべての３組のファイバを熱可塑性溶接することができる。第１のステップ401では、第1のマニホールド302がハウジング313に溶接される。第２のステップ402では、第２のマニホールド304がマニホールド302に溶接される。第３のステップ403では、第３のマニホールド306が第２のマニホールド304に溶接される。第４のステップ404では、末端キャップ210が第３のマニホールド306に溶接される。
【００７７】
図6Aは、両側多同軸中空ファイババイオリアクターを示している。バイオリアクターは、ポリプロピレンまたは他の任意の機械加工または成形された材料から機械加工または形成された部品を使用し、バイオリアクターのそれぞれの端部ごとに１つの、２つの各部品と、３本の半透過性中空ファイバと、直径が約８ミリメートルから10ミリメートルの核磁気共鳴（NMR）チューブ（たとえば、ニュージャージー州BuenaのWilmad Inc.から市販されている）とを使用して組み立てられる。バイオリアクターを構成するために使用される中空ファイバは、外径が約８ミリメートルで壁厚が0.5ミリメートルのファイバと、外径が2.6ミリメートルで壁厚が0.4ミリメートルのファイバと、外径が0.8ミリメートルで壁厚が0.2ミリメートルのファイバであり、ポリプロピレンで作られ、孔径が0.2マイクロメートルである（たとえば、ドイツのAkzo-Nodel社から市販されている）。それぞれのファイバは、外径が８ミリメートルのシリコーン・チューブ（たとえば、ミシガン州ミッドランドのDow Corning社から市販されている）と、それぞれ壁厚が0.4ミリメートルおよび0.2ミリメートルであり孔径が0.1マイクロメートルおよび0.65マイクロメートルである、外径が３ミリメートルおよび1.3ミリメートルのポリスルフォン中空ファイバ（たとえば、ウィルミントンのAG/Technologies, Inc.から市販されている）とで構成することができる。あるいは、より小さな外径および壁厚を有するシリコーン・チューブを外側ファイバ110に使用し、穿孔された剛性のチューブの上にかぶせて構造的な剛性を与えることができる。酸素の拡散は壁厚に反比例し、したがって、シリコーンチューブの壁が薄ければ薄いほど、酸素の優れた物質移動が可能になる。外径が2.6ミリメートルのポリプロピレン・ファイバを、壁厚が0.5ミリメートルであり孔径が0.65マイクロメートルである外径３ミリメートルのポリスルホン・ファイバで置き換え構成することができる。このようなファイバは、それぞれのファイバに適合するようにそれぞれの部品の所望の仕様を適切に変更することによって任意の所望の中空ファイバまたはチューブで構成することができる。ファイバは、組立て時の最終長よりも少なくとも２ミリメートル長くなりように切断される。
【００７８】
外側ファイバ110に過フッ素化ポリマーを被覆し、Compact Membrane Systems社（デラウェア州ウィルミントン）から提供されているプロセスまたは他の同様な孔充填プロセスを使用して各孔に橋架けするかあるいは各孔を詰まらせ、「濡れ」または水による飽和を回避し、培地からの水の蒸発を効果的になくすことができる。図３で説明した拡大された多同軸バイオリアクターに被覆を施すこともできる。物質移動のために、被覆はファイバの培地側に施される。被覆を行わない場合、孔が濡れるのを避けるために、空気コンパートメントは、隣接する培地コンパートメントよりも高い圧力を有さなければならず、蒸発および凝縮を低減させるために、気体流は培地流よりも高温であるべきである。
【００７９】
本発明では、両面多同軸バイオリアクターは最大の外側ファイバ110（たとえば、内径５ミリメートル、外径8.1ミリメートル）および第１のマニホールド302で組み立てられる。ポリウレタン・エポキシなどの固定手段または熱可塑性溶接、あるいはそれらの組合せを使用してファイバをそれぞれの部品に固定することができる。ハウジング、すなわちNMRチューブ604は、カラー606およびＯリング602によって第１のマニホールド302にしっかりと固定される。
【００８０】
図6B、図6C、および図6Dはさらに第１のマニホールドを示している。図6Bに示すように、前側は第１の円形凹部領域610を備えており、それに対して図6Cに示すように、後側は第１の円形凸部領域612を備えている。第１の円形凹部領域610と第１の円形凸部領域612は共に第１の空隙614を部分的に形成している。図6Dに示すように、Ｏリング602が第１の円形凹部領域610内に配置される。カラー606がそれに取り付けられる。最外口218も図示されている。
【００８１】
図6E、図6F、図6G、および図6Hはさらに第２のマニホールドを示している。図6Fに示すように、前側は第２の円形凹部領域620を備えており、それに対して図6Gに示すように、後側は第２の円形凸部領域622を備えている。第２の円形凹部領域620と第２の円形凸部領域622は共に第２の空隙624を部分的に形成している。細胞が第２のマニホールド302と第３のマニホールド304との間の空間に収集されないように、カラー326を中央ファイバ106の上を滑らせ、第２の空隙624にぴったりとはめこみ、かつ第３のマニホールド304の前部空隙636にぴったりとはめこむことができる。第２の中央口216も図示されている。図6Cは、第１のマニホールド302がどのように第２のマニホールド304と連通しているかも示している。
【００８２】
図6Iは、第２の空隙624、第２の中央口216、および第１の中央口214を示す、第２のマニホールドの斜視図である。
【００８３】
図6J、図6K、および図6Lは第３のマニホールドを示している。図6Jおよび図6Kに示すように、前側は、第３の空隙634を部分的に形成する第３の円形凹部領域630を備えている。図6Lには第１の中央口214も示されている。図6Mはまた、完全な組立体の断面を示し、第２のマニホールド304が第３のマニホールド306とどのように連通しているかを示している。
【００８４】
図6Nは、マニホールドの一方の側にすべての４つの入口および出口を有する両面バイオリアクターの完全な組立体の平面図であり、第１のマニホールド302、第２のマニホールド304、第３のマニホールド306、培地口212、細胞口214、培地口216、気体口218、およびカラー606を示している。
【００８５】
バイオリアクターは、図７に示すスタンドまたはホルダ702を使用して大量生産することができる。このスタンドは、ファイバ703の軸が、ファイバ穴開口部705を含むマニホールド704の平面に垂直になるように、マニホールド208およびファイバ軸703を溝701内に保持する。次いで、マニホールド／ファイバ空間706にエポキシを充填するか、あるいは図５に示す熱可塑性溶接プロセスによってファイバが固定される。エポキシを使用する場合、エポキシは炉内で急速に硬化され、次いで他方の側がポッティングされ、図７に示す手順全体が繰り返される。この製造法は、図４に示すバイオリアクター組立プロセスがロボットによって実行される大量生産向けに自動化することができる。大量生産された両面バイオリアクターでは、10mmガラスNMRチューブ604を密閉するために使用される第１のマニホールド302上のＯリング602およびカラー610ならびにねじ山が、ポリプロピレンまたはガラス製10mm NMRチューブ604に置き換わるのに適切な材料で構成されたチューブを使用して置き換えられ、熱可塑性溶接されるかあるいはエポキシ樹脂で接着され、シールが形成される。好ましい態様では、外側ファイバ110は溶接され、２つの内側ファイバ102および106はエポキシ樹脂で接着される。同軸ファイバに関しては、放射状に直径が最大のファイバから最小のファイバへ、かつ軸方向に直径が最小のファイバから最大のファイバへと、ファイバマニホールド208組立体（図６）に取り付けられる。外側ファイバ110が２つのＯリング602、２つのカラー606、10mm NMRチューブ604に挿入され、次いで第１のマニホールド302に挿入される。２つのカラーが締め付けられ、次いで、バイオリアクター組立体の両端にある第１のマニホールド302がスタンド702の溝701に挿入される。たとえば、図５で説明したプロセスを使用して、外側ファイバ110が所定の位置に熱可塑性溶接される。現在ダンベル形状を呈しているバイオリアクターに第２のマニホールド304を取り付けることができる。
【００８６】
外径が約2.6ミリメートルのポリプロピレンまたは外径が３ミリメートルのポリスルホンの第２のファイバが、外径寸法が5mmの外側ファイバに挿入され、図７に示すエポキシ・プロセスによって第２のマニホールド304に取り付けられる。第１のマニホールド302と第２のマニホールド304はその境界に沿って溶接される。外径が約0.8ミリメートルの第３のファイバが、内径が1.8ミリメートルのポリプロピレンまたは内径が２ミリメートルのポリスルホンの中空ファイバから成る第２のファイバに挿入され、上述のように第３のマニホールド306に取り付けられる。バイオリアクターの第２の端部でのみマニホールドにファイバを取り付ける間、ファイバはそれぞれのマニホールドまたは部品番号と同一平面をなすように切断される。末端キャップ210、すなわちねじ付きホース・バードが第３のマニホールド306の各端部に接着されるか、あるいはねじ込まれる。
【００８７】
図８は、一方の側に入口802および出口804を有する同軸バイオリアクターを示している。好ましい態様では、バイオリアクターは軸方向の長さが40ミリメートル未満であり、ファイバは、１インチの±５ミル内でファイバ直径に適合する同軸さら穴を有するマニホールドまたは末端キャップでしっかりと固定される。任意選択で、肝細胞によって内側ファイバが心合わせされ、それによって構成がより容易になり、軸方向の拡大が可能になる。バイオリアクターは、植付け手順に応じて部分的に充填することができる。バイオリアクターは、入口および出口が１つずつしかない点を除いて、両面多同軸中空ファイババイオリアクターと同様に、内側ファイバ102、中央ファイバ106、外側ファイバ110、およびマニホールド208を用いて組み立てられる。図８の一面多軸中空ファイババイオリアクターは、上記で両面多同軸中空ファイババイオリアクターに関して説明したのと同じファイバおよびNMRチューブを使用する。本態様において、ハウジング114は、NMRチューブである。従来型の垂直ボア磁石と共に使用される10ミリメートルNMRプローブにこの特定の構造を挿入することができる。入口802と出口804を交換することによって流れ方向806を切り換えることができる。外側環体内の流量は、３つのマニホールドの周りの円として位置合わせされた穴808の直径および数によって部分的に調節される。マニホールドおよびファイバは、上記で両面多同軸中空ファイババイオリアクターに関して説明したように組み立てられる。植付け口810および空気流812も図示されている。
【００８８】
内側ファイバ102をなくし底部マニホールド812の穴808を省略することによって、追加的な一面多軸中空ファイババイオリアクターデザインを構成することができる。これにより、流れが内側コンパートメント104から、細胞が存在する第１の中央コンパートメント108を通り、第２の中央コンパートメント112から出るようにし、あるいはその逆の方向に進むようにすることによって、流れ構成が変更される。本発明の外側コンパートメントでは酸素付加が起こるので、培地が細胞塊に入る前に適切に酸素付加されるように、第２の中央コンパートメント112から内側コンパートメント104の方へ流れることが好ましい。
【００８９】
NMR感度を高めるために、一面バイオリアクターを8mmから15mmなどのより小さな直径のNMRチューブ内にはまるようにすることができる。より小さな直径をを実現するために、本発明の一態様では、外径が200μmから500μmのマイクロボア・エアレーション・ファイバが、内側ファイバ102、外径が１ミリメートルから1.3ミリメートルの中央ファイバ106、および外径が３ミリメートルから４ミリメートルの外側フィルタ110として働く。内側コンパートメント104を介して酸素付加を行う場合、好ましい流れは、第１の中央コンパートメント108から第２の中央コンパートメント112の細胞塊を通り、外側コンパートメント116を介して出る。内側コンパートメント104の気体チャンバーは一端が閉鎖されており、気体は、各コンパートメントから拡散により、バイオリアクターの頂部にあるコネクタを介して気体チャンバーに連結された空気流に流出する。バイオリアクター内で空気を循環させるには、空気流設計が必要である。図９の内側ファイバ102はバイオリアクターの底部でマニホールドに取り付けられており、200μmないし500μmの少なくとも１本の戻りマイクロボア・エアレーション・ファイバ902が、外側コンパートメント116に接触しているマニホールドの穴808にエポキシ樹脂で接着され、培地の戻りに使用される。あるいは、0.8mmポリプロピレン・ファイバで構成された内側ファイバ小形酸素付加装置で構成された２ファイバ同軸バイオリアクターが一面バイオリアクターに直列に配置され、水ジャケットによって気体が加熱され、温度の変化および／または酸素付加装置とバイオリアクターとの違いによる気体放出が回避される。
【００９０】
図10Aは、直列に連結された人工肝臓を示している。この人工肝臓は、サブユニット当たり最大約160gの組織を有する少なくとも２つの人工肝臓サブユニットを含む。口1006および／または1014ならびに1024および／または1032を介してそれぞれの環状コンパートメントに細胞懸濁液が導入され、環状コンパートメントに固定される。放射状流動性を使用して培地が血漿から細胞に灌流し、生体内変換機能が実現される。この流れは第２のサブユニットにおいて切り換えられ、したがって、合成要素が細胞から血漿に流入することができる。放射状の流れは、下記に詳細に記載されている。
【００９１】
図10Aに示すように、患者由来の血漿1001が第１の血漿入口1004を通って第１の人工肝臓サブユニット1002に流入し、培地が第１の培地入口1008を通って第１の人工肝臓サブユニット1002に流入し、気体が第１の気体入口1010を通って第１の人工肝臓サブユニット1002に流入する。放射状の流れは、ファイバの透水率が比較的高くなるような孔径および孔数の特性を有する中空ファイバを選択し、後述の流体力学モデルで決定される実質的な圧力勾配をファイバを横切って有することによって生成される。図10Bは、血漿コンパートメント1042が細胞コンパートメント1044および培地コンパートメント1046よりも高い圧力を有する条件の下での血漿流を示している。このような条件の下では、いくらかの血漿が入口1004から放射状に血漿コンパートメント1042へ流れ、細胞コンパートメント1044に含まれる細胞塊を通り、培地コンパートメント1046に流入し、培地出口1016から流出する。次いで、残りの培地が第１の血漿出口1012を通って第１の人工肝臓サブユニット1002から流出し、Ｔ継手1048によって分割される。培地は第１の培地出口1016を通って第１の人工肝臓サブユニット1002から流出し、気体は第１の気体出口1018を通って第１の人工肝臓サブユニット1002から流出する。放射状の流れを駆動するためにΔPを形成するのに必要な血漿コンパートメント1042内のより高い圧力は、血漿流をＴ継手1048の所で分割し、血漿入口1004を血漿出口1012に連結する再循環ポンプ1013を介して血漿を血漿コンパートメント1042内で急速に再循環させることによって生成される。流量または流速によって、血漿入口1004で十分な上部圧力が生成され、ポンプ流量は、口1004および1008にある圧力計1048によって測定されるΔPに関して調整される。血漿出口1012とＴ継手1048との間の配管にニードル弁1054を挿入することによって所望のΔPを生成することもできる。このように、血漿の流量は第１の人工肝臓サブユニット1002内で一定であり、所望のΔPはニードル弁における流量を変化させることによって得られる。同じ原則を使用して第２の人工肝臓サブユニット1020内の放射状流を制御することができる。代替態様では、血漿出口1012をなくすことによって血漿コンパートメント1042の一端が閉鎖されている。
【００９２】
次いで、この流れは、出口1016からの流体が第２の培地入口1022を通って第２の人工肝臓サブユニット1020に流入し、血漿が第２の血漿入口1026を通って第２の人工肝臓サブユニット1020に流入し、気体が第２の気体入口1028を通って第２の人工肝臓サブユニット1020に流入するように第２のサブユニットにおいて切り換えられる。培地の一部は、入口1022から放射状に環状細胞層を通って血漿コンパートメントに流入する。次いで、残りの培地が第２の培地出口1030を通って第２の人工肝臓サブユニット1020から流出し、流体流がＴ継手1050で分割され、一部が患者1052に戻される。細胞は任意選択で、第２の細胞出口1032を通って第２の人工肝臓サブユニット1020から流出し、血漿は第２の血漿出口1034を通って第２の人工肝臓サブユニット1020から流出し、気体は第２の気体出口1036を通って第２の人工肝臓サブユニット1020から流出する。図10Cは血漿を含む培地流を示しており、この場合、血漿コンパートメント1042が培地コンパートメント1046に切り換えられている。上述のように、血漿を含む培地をポンプ1031によって急速に再循環させ、十分な上部圧力を生成することによって、培地コンパートメント1046内にΔPが確立される。ΔPは、口1022および1026にある圧力計1049によって測定される。代替態様では、（ニードル弁または他の同様な装置を使用して）第２の培地出口1030を通る流れをなくすか、あるいは制限することによって十分な上部圧力が生成される。
【００９３】
放射状の流れを生成するには、いくつかの流れ構成が可能である。２つのコンパートメント内の流量の差によって圧力差（ΔP）が得られ、それによって環状空間を横切る放射状の流れが生成される。この放射状の流れにはダルシーの法則が適用される。
ｖｒ＝κΔP/ηL  (I)
式中、ｖｒは放射状の流速であり、κは透水率、すなわち、中空ファイバの物理的性質（孔径および孔数を含む）、溶媒および溶質の物理的性質に依存する定数であり、ηは溶液の粘度であり、Ｌは２つのコンパートメント間の接点の長さであり、ここでは主としてファイバ長である。10-6m、0.1 x 10-6m、および0.05 x 10-6mを含むがこれらに限定されない任意の様々な孔径を選択することができる。したがって、高い透水率を有するファイバを適切に選択し、流量を変化させることによって、放射状の流れを改善することができる。
【００９４】
ダルシーの法則に基づくモデルにより、内側ファイバ102および中央ファイバ106の透水率が与えられた場合に圧力差と放射状の流れとの相関関係を推定することができる。このモデルでは、圧縮不能なニュートン流体が仮定されると共に、軸方向圧力勾配が無視できるものであり、ファイバを横切る流量が一定であるものと仮定されている。２つの同心中空ファイバに関してこの数式を導くと、以下の関係が得られる。
【数２】
0004656789.tif 000002
【００９５】
図11Aは、上の数式で使用される変数を定義した図である。Ｑは、水圧P1を特徴とするコンパートメント1102から、透水率K1を特徴とするファイバ1104の孔を通り、中間コンパートメント1106を通り、透水率K2を特徴とする第２のファイバ1108の孔を通り、水圧P2を特徴とするコンパートメント1110に至る放射状流量である。中心線からファイバ1104の内側までの半径距離はraであり、外側ファイバ1104までの半径距離はrbであり、内側ファイバ1108までの半径距離はrcであり、ファイバ1108の外側までの半径距離はrdである。酸素、培地、血漿、および生合成生成物を含むがこれらに限らない任意の特定の化学成分の放射状の流れの方向が圧力差の方向に依存することを理解されたい。流れの方向および対応する放射状流量の方向は、正でも負でもよく、流量およびＱの符合で表される。本発明では、内側コンパートメントから外側コンパートメントへの流れに対応するＱの値が企図され、同様に、外側コンパートメントから内側コンパートメントへの流れに対応するＱの値が企図される。図11Bは、圧力差の関数としての、第２の中央コンパートメント112から内側コンパートメント104への放射状の流れの実験データを、K1およびK2の実験によって求められた値を使用したモデル化データと比較した図である。図11Cは、図11Bに示した実験に対応する細胞コンパートメント1106内の圧力を示している。図11Bと図11Cの比較により、膜透過圧力差の大部分が中央ファイバ106を横切って起こり、中央ファイバ106の透水率が比較的高くかつ壁厚が比較的大きいためにそれが起こることがわかる。したがって、細胞は、第２の中央コンパートメント112で生成される高い圧力の悪影響から保護され、中央ファイバ106の透水率が高くなるにつれて、圧力がより容易に第１の中央コンパートメント108に伝達されるようになり、細胞は第２の中央コンパートメント112内の圧力から保護されにくくなる。したがって、このモデルは一般に、バイオリアクターの動作時に、内側ファイバ102および中央ファイバ106の所与の透水率に対する適切な圧力差を予想するために用いることができる。好ましい態様では、この装置は、細胞コンパートメント内の放射状流速および静水圧に関する培養条件を選択する際に助けになる、この予想モデルに基づくソフトウェア・プログラムを含む。
【００９６】
細胞の生存可能性を改善するために半透過性ファイバを備えるバイオリアクターにおける放射状流速を選択する方法は、第１の半透過性ファイバに関連する第１の水圧および第２の半透過性ファイバに関連する第２の水圧を測定し圧力差を得て、細胞の生存可能性が改善されるように１つまたは複数の放射状流量を選択するために第１の水圧、第２の水圧、またはそれらの組合せを調整することを含む。
【００９７】
したがって、一態様では、本発明は、細胞の生存可能性を改善するために半透過性ファイバを備えるバイオリアクター内の放射状流量を選択する方法であって、第１の半透過性ファイバに関連する第１の水圧および第２の半透過性ファイバに関連する第２の水圧を測定し圧力差を得て、細胞の生存可能性が改善されるように１つまたは複数の放射状流量を選択するために第１の水圧、第２の水圧、またはそれらの組合せを調整することを含む方法を含む。第１のファイバと第２のファイバは同軸でよい。特定の態様では、放射状流量を選択する方法は、以下の数式に基づいて放射状流量を選択することを含む。
【数３】
0004656789.tif 000003
式中、ΔPは圧力差であり、Ｑは放射状流量であり、Ｌは第１および第２のファイバ長のうちの短い方の長さであり、ｒａは、バイオリアクターの中心線から第１のファイバの内面までの半径距離であり、ｒｂは、バイオリアクターの中心線から第１のファイバの外面までの半径距離であり、ｒｃは、バイオリアクターの中心線から第２のファイバの内面までの半径距離であり、ｒｄは、バイオリアクターの中心線から第２のファイバの外面までの半径距離であり、K1は第１のファイバの透水率であり、K2は第２のファイバの透水率である。
【００９８】
ソフトウェアは、図12に示すアルゴリズムの形でよく、特定の細胞タイプの物質移動条件を選択するために使用することができる。初期ΔP値は、拡散距離118およびファイバ長や、当該の組織内の既知の生理学的条件を含め、バイオリアクターの特性の知識から得られる。
【００９９】
放射状流アルゴリズムの詳細な説明を図12で与える。論理ブロックS20に示す第１のステップではまず、バイオリアクターの形状および寸法を含むバイオリアクターのパラメータと、静水圧および剪断応力に対する抵抗を含む細胞のパラメータが入力される。次いで、論理ブロックS22で圧力差がサンプリングされる。次のステップでは、論理ブロックS24に示すように、圧力差が、システムで使用される細胞の生存可能性に整合する静水圧の限界内であるかどうかを判定する必要がある。 圧力差が許容限界外である場合、論理ブロックS26に示すように圧力差が調整される。次いで、静水圧が再び測定され、論理ブロックS28に示すように、許容限界内であるかどうかが判定される。
【０１００】
論理ブロックS24または論理ブロックS28の判定において静水圧が細胞の生存可能性に相当する値である場合、論理ブロックS30に示すように放射状流量が測定される。
【０１０１】
次のステップでは、論理ブロックS32に示すように、放射状の流れに関連する剪断力が当該の細胞タイプの生存可能性限界内であるかどうかが判定される。剪断力が許容限界外である場合、論理ブロックS34に示すように、ΔPおよび放射状流量Ｑに関係する上記の公式IIが適用される。論理ブロックS34の計算の結果として、必要に応じて、より適切な透水率K1および／または透水率K2が求める（S36）。
【０１０２】
論理ブロックS34と同様に１つまたは複数の透水率が変化すると、システムは論理ブロックS24に戻り、さらに第１の静水圧を評価し、次いで剪断力を評価する。
【０１０３】
論理ブロックS24または論理ブロックS28と同様に静水圧力が細胞の生存可能性に整合する限界内であるとき、論理ブロックS30と同様に放射状流量Ｑが測定される。放射状の流れに関連する剪断力が細胞の生存可能性に整合する場合、論理ブロックS38に示すように、細胞が生存するための条件が確立される。許容静水圧および剪断力に適度に狭い限界を設定することによって、細胞を長期間生存させるための最適な条件が得られる。
【０１０４】
他の態様では、本発明は、半透過性ファイバを備えるバイオリアクターにおける放射状流量を算出するための命令を含むコンピュータ読み取り可能な媒体であって、命令が、（ａ）少なくとも２本の半透過性ファイバのそれぞれの透水率の測定値を受信する段階と、（ｂ）少なくとも２本の同軸半透過性ファイバの圧力差に関連する静水圧測定値を受信する段階と、（ｃ）同軸半透過性ファイバ間の放射状流量を推定する段階とを含む媒体を備えることができる。
【０１０５】
図13Aは、互いに入れ子にされた３本の同軸中空ファイバを備える多同軸バイオリアクターの断面を示している。図13Aは、最内ファイバ102、中央ファイバ106、外側ファイバ110、およびハウジング114を示している。
【０１０６】
図13Bは、多同軸バイオリアクターの代替態様の断面を示している。図13Bは、最内ファイバ102、中央ファイバ106、より小さなエアレーション・ファイバ1302、およびハウジング114を示している。より小さなエアレーション・ファイバ1302は、最内ファイバ102および中央ファイバ106を含む同軸ファイバを積み重ねることによって形成された空間内に配置される。したがって、最内ファイバ102の内壁によって第１のコンパートメントが形成される。最内ファイバ102の外壁および中央ファイバ106の内壁によって第２のコンパートメントが形成される。中央ファイバ106の外壁およびハウジング114によって第３のコンパートメントが形成される。より小さなエアレーション・ファイバ1302の内壁によって第４のコンパートメントが形成される。代替態様では、最内ファイバ102の内側に第４のより小さなエアレーション・ファイバを挿入することによってエアレーション用の第５のコンパートメントを形成することができる。
【０１０７】
図14はバイオリアクターの態様を示している。第１のマニホールド302、第２のマニホールド304、末端キャップ210、内側コンパートメント入口1408、内側コンパートメント出口1410、細胞コンパートメント1412、気体入口1414、気体出口1416、最外コンパートメント入口1418、最外コンパートメント出口1420、およびハウジング202の各構成要素が示されている。
【０１０８】
図15は、バイオリアクターを構成する際に使用される装置を示している。図示されている構成要素には、複数のファイバ1502、第２のマニホールド304、第１のマニホールド302、ハウジング202、Ｏリング416、真空ヘッド1504、およびメッシュ1506が含まれる。真空によって、より小さなファイバをより大きなファイバに高速に挿入することができる。メッシュ1506はファイバを所定の位置に保持する。
【０１０９】
多同軸バイオリアクターの拡大態様では、マニホールドが様々なファイバ用の複数の同軸穴から成り、マニホールド上に厳密に配置された穴にドエルが配置され、それによってすべての多ファイバユニットが同軸になる。多ファイバ・ユニットは同軸設計のために正確に再現されるので、単一の多ファイバ・ユニットから得た実験パラメータが直接、拡大バイオリアクターに適用される。
【０１１０】
バイオリアクターの構成は、医師に明白な多数の変形形態を有することができる。一例として、中空ファイバの孔径、長さ、壁厚、および組成を変えることができ、上記および図11に示した流体力学モデルを使用して最適な中空ファイバ特性を決定することができる。中空ファイバは、ポリスルホン、酢酸セルロース、セルロースの混合エステル、再生セルロース、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリビニリジン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、およびポリアミドを含むがこれらに限らない任意のある数の材料で作ることができる。酢酸セルロースは栄養基をより透過しやすく、ポリプロピレンは気体をより透過しやすく、当業者は、これらおよびその他の特性に基づいて適切なファイバを選択する。孔を形成し孔径を調節する手段は、当業者には自明であり、中性子衝突、制御された多重化、浸出剤の取込みを含むがこれらに限らない。ポリウレタン・エポキシを含むいくつかの接着剤のうちのどれかを使用してファイバをポッティングすることができ、当業者には適切な接着剤が認識されよう。
【０１１１】
６．実施例
本発明の実施における多様な局面に関し理解を助けるために、以下に具体例を示す。但し、以下の例は単に具体例であって、本発明は以下の記載に限定されるものではない。当然のことであるが、かかる限定は、特許請求の範囲の各項によってのみ成されるものである。
【０１１２】
6.1  一面多同軸中空ファイバ・バイオリアクター中での肝細胞機能のNMRによる解析
スプラーク・ドーリー（Sprague-Dawley）ラットをペントバルビトール（腹腔内に50 mg/kg）で麻酔する。腹側を正中に切開して、肝臓を露出させる。門脈にカニューレを挿入し、細胞解離溶液を注入する。エチレンジアミン四酢酸（50 mM）とコラゲナーゼ（1〜20 mg/ml）を含むクレブス・ヘンセレイト（Krebs-Henseleit）緩衝液（pH7.4）を連続的に注入することによって、肝細胞を遊離させる。肝臓の灌流が適切に行われているか否かは、肝臓が均一に白色化することで判別できる。遊離した細胞を回収して、一面多同軸中空ファイバ・バイオリアクターの細胞コンパートメント（コンパートメント２）に入れる。
【０１１３】
柔軟な銅被覆コンポジット上に光エッチングした２個のヘルムホルツコイルからなるNMRプローブを用いて核磁気共鳴（NMR）を行った。適切に絶縁を施したこれらのコイルを、バイオリアクターに巻き付けて、二つのコイルが互いに対角に配向するようにする。31Ｐのスペクトル変化の測定によってエネルギー代謝を調べるときは、内部コイルを81MHzにする。スペクトルの最適な比較を行うために、磁石の等角点における中心クレードル上にこのプローブとバイオリアクターの組立体を設置する。エアレーションした栄養培地をバイオリアクターの第１のコンパートメントの入口から供給する。全体のエアレーションは、バイオリアクターの最外もしくは第４のコンパートメントにつながる入口４を通して、５％のCO2を含む９５％の空気流によって行う。ハムF-12栄養培地はペリスタポンプでコンパートメント３を通じて供給する。培地のリザーバーの温度を、温度コントロール水浴で４２℃に保ち、これによって、バイオリアクターの温度を３７℃に維持する。γ[３１Ｐ]ヌクレオチド三リン酸、β[３１Ｐ]ヌクレオチド二リン酸からのNMRシグナル、エネルギー代謝に関するその他の細胞成分、および生合成を分析する。NMRシグナルは、気体流速および酸素分率、栄養培地の流速、および添加細胞密度によって決まる物質移動の関数である。
【０１１４】
6.2  細胞非存在下における酸素流
酸素微小電極を変換器とWorkbenchTMソフトウエアーとにつなぎ、既知の標準物質で検定を行う。多同軸中空ファイバ・バイオリアクターのコンパートメント２に、この検定済み酸素微小電極を、ファイバ長に沿って等間隔に設置する。血漿のリザーバーは、多同軸中空ファイバ・バイオリアクターの最内コンパートメントであるコンパートメント１の入口につながっている。RPMI1640栄養培地のリザーバーはコンパートメント３の入口につながっている。ペリスタポンプは、血漿と栄養培地を循環させるように直列に配置する。コンパートメント２も栄養培地で満たす。各微小電極からのシグナルを１０秒間隔で取得し、ソフトウエアーで処理して酸素分圧に変換する。ある特定の間隔で、気相を５％のCO2を含む９５％の空気と５％のCO2を含む９５％の窒素ガスと交互に入れ替える。酸素分圧低下と回復の速度を、異なる流速で測定し、細胞の存在下および非存在下で酸素流を求める。
【０１１５】
6.3  ビリルビン値の測定に用いる体外肝補助装置としての利用
背景：  ガンラットモデルはヒトにおけるクリグラーナジャー症候群の動物モデルであり、本バイオリアクターの体外肝補助装置としての効果を示すための理想的なモデルである。ガンラットは、常染色体劣性に遺伝する欠損を有するウィスター（Wister）ラットである。劣性ホモ接合の動物個体中の欠損は、ビリルビン（老化した赤血球中のヘモグロビンの分解物）の抱合と胆汁中排泄に必要な酵素であるUDP-グルクロノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子中にある。つまり、ガンラットはビリルビンの抱合と排泄ができず、高ビリルビン血症になり、血漿ビリルビン濃度が１mg/ｄＬである正常ラットに比して、その血漿ビリルビン濃度は約５〜２０mg/ｄＬに達する。
【０１１６】
実験プロトコール：  さらに大規模の多同軸中空ファイバ・バイオリアクターを用いて、ガンラットの体外肝補助装置とする。ヘテロ接合（表現形は正常）のガンラットの肝臓を灌流し、肝細胞を単離する。この細胞をダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）に懸濁し、１０９の細胞をバイオリアクターの第２のコンパートメントに入れる。中空ファイバの壁で仕切られた環状間隙中の肝細胞とは隔たっている第３のコンパートメントに、ガンラットの大腿動脈から得た血液（平均総血液容量は約１０〜１２mL）を通し、ペリスタポンプにより流速約0.6〜0.8 mL/min でバイオリアクターを灌流させる。同時に、バイオリアクターの第１のコンパートメントに約0.5mL/minの流速でDMEMを流す。バイオリアクターから流れ出た血液は再びガンラットに戻る。
【０１１７】
バイオリアクターから流出する血液の非包合および抱合型ビリルビン濃度を、シグマ総量直接的ビリルビン（Sigma Total and Direct Bilirubin）測定システムを用い、シグマ化学社の説明書（Sigma Procedure #522/533）に従って６時間に渡り調べた。
【０１１８】
6.4  大規模の多同軸中空ファイバ・バイオリアクター/BALおける肝細胞の生合成機能
実施例１おいて単離された肝細胞をさらに、ショ糖密度勾配を用いたゾーン遠心法で分離する。実質細胞に対応する密度分画を回収し、大規模の多同軸バイオリアクターの無菌的細胞コンパートメント（コンパートメント２）に入れる。
【０１１９】
暖めたハムF-12栄養培地をコンパートメント１と３に循環させ、且つ５％のCO2を含む９５％の空気をコンパートメント４にエアレーションして実質細胞を維持する。コンパートメント１からの流出液を回収し、分画を分析して、肝細胞の生合成機能に関するパラメータを求める。アルブミン合成をELISA 法（Enzyme-linked immunosorbent assay）で測定する。
【０１２０】
6.5  大規模の多同軸中空ファイバ・バイオリアクター/BALにおける生体内変換の機能
実施例１おいて単離された肝細胞をさらに、ショ糖密度勾配を用いたゾーン遠心法で分離する。クッパー細胞に対応する密度分画を回収し、大規模の多同軸中空ファイバ・バイオリアクターの無菌的細胞コンパートメント（コンパートメント２）に入れる。
【０１２１】
DMEM（フェノールレッド不含）をコンパートメント１と３の入口と出口を通して循環させ、５％のCO2を含む９５％の空気をコンパートメント４の入口と出口を通してエアレーションしてバイオリアクター中の細胞を維持する。この細胞をコンパートメント中で付着させ、次に遊離のヘモグロビン（1〜10mg/mL）をコンパートメント１に導入する。コンパートメント３におけるヘモグロビンおよびヘモグロビンの代謝産物のレベルは、直列につないだ分光光度計で調べる。
【０１２２】
6.6  個体治療のためにヒト細胞を含む直列に連結したバイオリアクター
記載の方法（Mickelson, J. K.ら, Hepatology 1995,22,866）で、ヒト肝癌株C3A 細胞を培養し、直列に連結したバイオリアクターの全ての第２のコンパートメントに導入する。栄養培地と５％のCO2を含む９５％の空気をそれぞれ、第３および最外コンパートメントにポンプで注入する。細胞の増殖は、グルコース利用度で追跡する。細胞の増殖がプラトーもしくは定常相に達したら、アルブミンの合成量を調べる。
【０１２３】
肝不全個体の血液を血漿交換で血漿と細胞とに分離し、血漿を第１のバイオ人工肝サブユニットの第１のコンパートメントにポンプで注入する。血漿流の一部は、第１のコンパートメントから放射状に、細胞コンパートメントを通じて第３のコンパートメントに流れ、生体内変換した流出液を生ずる。第１のバイオ人工肝サブユニットの第１のコンパートメントを出た血漿は、第２のバイオ人工肝サブユニットの第３のコンパートメントに流れ込む。第１のバイオ人工肝サブユニットの第３のコンパートメントからの生体内変換した流出液は、第２のバイオ人工サブユニットの第１のコンパートメントに流入する。第１のバイオ人工肝サブユニットにおける放射流は、血漿の一部を解毒し、第２のバイオ人工サブユニットにおける放射流は、血漿に生合成産物を付与することによって補足血漿を生成する。生存徴候、黄疸、および毒素の血中濃度を定期的に調べる。血漿と培地の流速を調整して、循環している毒素の生体内変換効率を最大にする。個体の生存についての評価を下す。
【０１２４】
6.7  大規模の多同軸中空ファイバ・バイオリアクターにおける肝細胞分化にもたらす細胞外マトリクスの効果
上記の実施例４に示したゾーン遠心法により実質細胞を単離し、イングルブレス・ホルム・スワム（Englebreth-Holm-Swarm）マウスサルコーマから得た再構成基底マトリクスに懸濁する。これを大規模の多同軸バイオリアクターのコンパートメント２（細胞コンパートメント）に導入する。基底マトリクスに付着させて、肝細胞の細胞周期をＧ０期で止め、正常な肝の形質を維持する（Ranaら, 1994）。高度分化状態は、アルブミンおよびC/EBP等の肝転写因子等の合成により特徴付けられる。暖めたハムF-12栄養培地をコンパートメント１と３に循環させ、５％のCO2を含む９５％の空気をコンパートメント４にエアレーションして実質細胞を維持する。コンパートメント１からの流出液を回収し、分画を分析して、肝細胞の生合成機能に関するパラメータを分析する。アルブミン合成をELISA 法（Enzyme-linked immunosorbent assay）で測定する。
【０１２５】
6.8  大規模の多同軸中空ファイバ・バイオリアクターにおけるヒト肝細胞の増殖と分化
ヒト肝実質細胞をBlock等の方法（Block G. D.ら, J Cell Biol. 1996, 132,1133）で単離し、大規模の多同軸中空ファイバ・バイオリアクターのコンパートメント２に入れる。コンパートメント４には空気とCO2を19:1で混合したものを、コンパートメント３には栄養培地HGMを入れ、この中に肝細胞増殖因子（HGF/SF）、上皮成長因子およびトランスフォーミング成長因子αを入れることで、これらを実質細胞に接触させ、細胞を増殖させる。転写因子C/EBPのC/EBPに対する比は、この処理で低下し、また細胞のアルブミン合成も減少する。Sanchez （Sanchez A.ら, Exp Cell Res 1998, 242, 27）の記載の処方に従って、コンパートメント３を流れる栄養培地に、細胞分化とアルブミン合成を誘起する上皮成長因子およびトランスフォーミング成長因子を添加する。
【０１２６】
6.9  大規模の多同軸中空ファイバ・バイオリアクターにおけるホルモンと因子の生合成
副甲状腺を無菌的に得てすり潰し、Hornicek等が記載の方法（Hornicek F. L.ら, Bone Miner 1988, 4, 157）でコラゲナーゼ処理を行う。ウシ胎児血清を含むCMRL-1415栄養培地に分散させた細胞を懸濁し、大規模の多同軸バイオリアクターのコンパートメント２に導入する。５％のCO2を含む９５％の空気をポンプでポート４を通してエアレーションする。暖めた栄養培地をポート１と３にポンプで注入し、チャンバーからの流出液を限界濾過で濃縮して、副甲状腺ホルモン、副甲状腺血圧上昇因子、その他の細胞生産物を回収する。ホルモンおよび因子は、免疫沈降およびクロマトグラフィーによって精製する。
【０１２７】
6.10  個体の治療目的でヒトの細胞を含み５つのコンパートメントからなる直列に連結したバイオリアクター
上記実施例６のようにして、ヒト肝癌株C3A 細胞を培養する。但し、５つのコンパートメントからなる直列に連結したバイオリアクターの第３のコンパートメントにおいて、これが成されるところが上記と異なっている。最内コンパートメント（コンパートメント１）および最外コンパートメント（コンパートメント５）を５％のCO2を含む９５％の空気で満たす。栄養培地を第２、第４のコンパートメントそれぞれにポンプで注入する。細胞の増殖は、グルコース利用度で追跡する。細胞の増殖がプラトーもしくは定常相に達したら、アルブミンの合成量を調べる。
【０１２８】
肝不全個体の血液を血漿交換で血漿と細胞とに分離し、直列に連結したバイオリアクターの第２のコンパートメントに血漿をポンプで注入する。生存徴候、黄疸、毒素の血中濃度を定期的に調べる。血漿と培地の流速を調整して、循環している毒素の生体内変換効率を最大にする。個体の生存についての評価を下す。
【０１２９】
6.11  緻密に充填されたファイバを含む５つのコンパートメントからなる直列に連結したバイオリアクターの構築、および個体の治療目的でのヒト細胞の使用
バイオリアクターサブユニットを、環状細胞コンパートメントの外側境界の一部をなす３００本からなる同軸ファイバ（外径３mm）で構成する。外径３mmのファイバの一本一本に外径1.3 mmの中空ファイバを挿入し、環状細胞コンパートメントの内側境界の一部および第２のコンパートメントの外側境界の一部を形成させる。各同軸ファイバモジュールの最内コンパートメントとして、1.3 mmの中空ファイバの一本一本に一本の微小口径中空ファイバ（外径300 μm）を挿入する。さらに３００本の微小ファイバからなる別の一組を同軸モジュールに隣接して平行に設置する。それぞれ両セットの微小ファイバにはエアレーション供給を行い、血漿と培地に酸素を添加する。最外コンパートメントはコンパートメント４であり、これは最外（外径３mmの）同軸ファイバの外側、同軸モジュールに隣接した微小ファイバの外側、およびこれらに囲まれる囲いの内部で形成される。
【０１３０】
直列に連結したバイオリアクターおよび付帯する管類、接合部品は滅菌を行う。
【０１３１】
ヒト肝細胞を実施例８のように単離し、２つのバイオリアクターサブユニットそれぞれの環状細胞コンパートメント、コンパートメント３に導入する。実施例８に記載の栄養培地および増殖因子と接触させて、肝細胞の密度が肝不全個体の治療に充分となるまで細胞を増殖させる。生肝細胞を含むバイオリアクターサブユニットを今後BALサブユニットと呼ぶ。
【０１３２】
個体の治療に用いる場合、個体の血漿は第１のBALサブユニットのコンパートメント２に入り、第１の血漿入口を通る。また培地は、第１のBALサブユニットのコンパートメント４に入り、第１の培地入口を通る。気体は、第１のBALサブユニットの気体入口を通る。第１のサブユニットにおける放射流は、ファイバと交叉する圧勾配によって生じる。このような圧勾配は、血漿コンパートメントの水圧が細胞または培地コンパートメントの水圧より高い等の事柄にによって形成される。その結果、血漿の一部は、コンパートメント２から環状細胞コンパートメントを通り、コンパートメント４に流入する。この過程において、細胞コンパートメント中の肝細胞は細胞コンパートメントを通過する血漿を生物学的に解毒することができる。解毒を受けた血漿がコンパートメント４に流入すると、培地は解毒を受けた血漿成分を含むようになる。残りの血漿は、次に第１のBALサブユニットを出て、第１の血漿出口を通る。培地は第１のBALサブユニットを出て、コンパートメント４の第１の出口を通る。気体は、第１のBALサブユニットを出て、第１の気体出口を通る。流れのスキームは、次に第２のサブユニットに移る。コンパートメント４の第１の出口を出た液体（解毒済み血漿を含む）は第２のBALサブユニットに入り、コンパートメント２の第２の入口を通る。同様に、コンパートメント２の第１の出口を出た血漿は第２のBALサブユニットに入り、コンパートメント４の第２の入口を通る。気体は第２のBALサブユニットに入り、第２の気体入口を通る。培地の一部はコンパートメント２の入口から放射状に流れ、環状細胞層を通り、第２のコンパートメント４に入る。肝細胞は、サブユニット２の細胞コンパートメントを流れる培地に、蛋白質およびその他の生合成産物を付与する。このような付与を受けた培地が、残りの血漿に流れ込むと、その結果得られる修飾血漿は部分的に解毒を受けたものであり、且つ部分的に生合成された蛋白質が付与されたものである。この残りの培地は、次に第２のBALを出て、コンパートメント２の第２の出口を通る。修飾血漿は第２のBALを出て、コンパートメント４の第２の出口を通る。気体は第２のBALサブユニットを出て、第２の気体出口を通る。修飾血漿、第４のコンパートメント４からの流出液は、個体を延命させるためにこの個体に戻る。
【０１３３】
6.12  大規模の多同軸中空ファイバ・バイオリアクターの製造
器具を用いて、バイオリアクターを組み立てる。このバイオリアクターは、陰圧が必要なときに真空ヘッドを取り付け、より細いファイバを迅速に挿入するためのメッシュに対し中空ファイバの束をこの真空ヘッドによって保持する。中空ファイバのもう一方の端をマニホールドに挿入し、容器中に設置する。ポリウレタン・エポキシを用いて、中空ファイバをマニホールドに接着し、マニホールド、エポキシおよび中空ファイバに遠心力を負荷してファイバ内部からエポキシを除去する。硬化したら、中空ファイバの自由端を鋸で切りそろえる。この過程を繰り返し、真空にし、次に細い中空ファイバのセットの挿入を行う。端をマニホールドに接着し、遠心し、切りそろえを行う。
【０１３４】
上の説明と実施例の目的は、本発明の態様を例示することであって、これらのみに限定されるものではない。これらの説明によって、本発明の範囲を逸脱することなしに、本発明の組成物および方法に様々な改変、変更を加えてさらに別の態様を作り出すことが可能であることは、当業者であれば理解できる。バイオリアクターシステムの多様な要素からなる特定の組成物は、例えば、限定的要因と見なされるものではない。従って、本開示における図面および説明は、本発明の理解を助けるために提供するものであって、この範囲を制限するために成されるものではない。
【０１３５】
本明細書に引用のすべての特許、文献は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。
【０１３６】
本発明の多くの特徴および利点は、本明細書の詳細な説明から明らかであり、従って、本発明の真の精神と範囲に合致する本発明の特徴および利点は、添付の特許請求の範囲によって網羅されるものである。さらに、数多くの改変、変更が当業者によって容易に成されうるので、例示および記載された特定の構成および操作によって本発明の限定を行うものではない。従って、適当な改変物や同等物いずれも本発明の範囲に属するものと見なされうる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  多数のコンパートメントを含む多同軸ファイバユニットの部分的な図を示す。
【図１Ｂ】  中心から外側に向かう酸素濃度のグラフによる表示を示す。
【図１Ｃ】  軸方向の酸素濃度のグラフによる表示を示す。
【図２Ａ】  多同軸ファイババイオリアクターの立面図を示す。
【図２Ｂ】  多同軸ファイバユニットの細部の拡大図を示す。
【図３Ａ】  ファイバを中心に集める一組の成分を示す。
【図３Ｂ】  スペーサーの詳細を示す。
【図３Ｃ】  ファイバクリップを示す。
【図３Ｄ】  バイオリアクターのマニホールドの配置の詳細を示す。
【図３Ｅ】  マニホールドのもう一つの説明を提供する。
【図４】  多同軸バイオリアクターを構築するために用いられる二つの技法に関する４つの主な段階を示す。
【図５】  熱可塑性の溶接中空ファイバの一般的プロセスを示す。
【図６Ａ】  バイオリアクターの両側態様の透視図を示す。
【図６Ｂ】  第１のマニホールドの前面の詳細を示す。
【図６Ｃ】  第１のマニホールドの背面の詳細を示す。
【図６Ｄ】  第１のマニホールドと関連する成分の拡大図を示す。
【図６Ｅ】  第２のマニホールドの前面の詳細を示す。
【図６Ｆ】  第２のマニホールドの前面の詳細を示す。
【図６Ｇ】  第２のマニホールドの背面の詳細を示す。
【図６Ｈ】  マニホールドの環状体と詳細を示す。
【図６Ｉ】  第２のマニホールドの断面図を示す。
【図６Ｊ】  第３のマニホールドの前面の詳細を示す。
【図６Ｋ】  第３のマニホールドの前面の透視図を示す。
【図６Ｌ】  第３のマニホールドの背面を示す。
【図６Ｍ】  第２および第３のマニホールドの断面図を示す。
【図６Ｎ】  両側バイオリアクターの完全な組立体の平面図を提供する。
【図７】  大量生産バイオリアクターのためのスタンドを示す。
【図８】  一面バイオリアクターの透視図を示す。
【図９】  完全な酸素付加を有する小さい一面バイオリアクターを示す。
【図１０Ａ】  直列に連結したバイオリアクターをさらに立面図で示す。
【図１０Ｂ】  直列に連結した生体人工肝臓の中心から外側に向かう流れを詳細図で示す。
【図１０Ｃ】  直列に連結した生体人工肝臓の中心から外側に向かう流れを詳細図で示す。
【図１１Ａ】  ダーシーの法則の実行において用いられる変数を示す。
【図１１Ｂ】  中心から外側方向への流速と圧の差の関係を示す。
【図１１Ｃ】  一つの細胞コンパートメントにおける中心から外側方向への流速と圧との関係を示す。
【図１２】  優れた生理的機能と細胞生存率を得るための中空ファイバ特徴を選択するためのアルゴリズムを示す。
【図１３Ａ】  多同軸バイオリアクターの断面図を示す。
【図１３Ｂ】  多同軸バイオリアクターのもう一つの態様の断面図を示す。
【図１４】  バイオリアクターの一つの態様の透視図を示す。
【図１５】  バイオリアクターの構築において用いられる装置の透視図を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【図６Ｈ】
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【図６Ｉ】
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【図６Ｊ】
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【図６Ｋ】
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【図６Ｌ】
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【図６Ｍ】
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【図６Ｎ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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