(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−アセチルヘパロザン及びウシ腎臓由来のヘパラン硫酸に対して反応し、マウスのエンジェルブレス-ホーム-スワーン腫瘍組織由来のヘパラン硫酸に対する反応性がＮ−アセチルヘパロザンに対する反応性の５％以下であり、ヘパリン及び脱硫酸化ヘパリン類に対して反応しない抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
タンパク質とＮ−アセチルヘパロザンとを結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、請求項１又は２に記載の抗体。
【請求項４】
リンパ球及びミエローマ細胞が、マウス由来である請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
受託番号が、FERM BP-10534、FERM BP-10535又はFERM BP-10536であるハイブリドーマ
により産生されるモノクローナル抗体。
【請求項６】
受託番号が、FERM BP-10534、FERM BP-10535又はFERM BP-10536であるハイブリドーマ
。
【請求項７】
試料中に存在するヘパラン硫酸又はＮ−アセチルヘパロザンの検出方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体を用いることを特徴とする検出方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体を少なくとも含む、試料中に存在するヘパラン硫酸又はＮ−アセチルヘパロザンの検出キット。
【請求項９】
試料が、体液、細胞、組織及び細胞もしくは微生物の培養物からなる群から選択されるものに由来することを特徴とする、請求項７に記載の検出方法。
【請求項１０】
試料が、体液、細胞、組織及び細胞もしくは微生物の培養物からなる群から選択される
ものに由来することを特徴とする、請求項８に記載の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−アセチルヘパロザン及びウシ腎臓由来のヘパラン硫酸に対して反応し、マウスのエンジェルブレス-ホーム-スワーン腫瘍組織由来のヘパラン硫酸に対して実質的に反応しない新規な抗ヘパラン硫酸抗体、及びそれを用いたヘパラン硫酸の検出方法、並びにヘパラン硫酸検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願書類中で使用する略号は以下の通りである。
２ＤＳＨ：２−Ｏ−脱硫酸化ＨＥＰ
２ＳＨ：（６−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ
６ＤＳＨ：６−Ｏ−脱硫酸化ＨＥＰ
６ＳＨ：（２−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ
Ａｃ−２ＤＳＨ：Ｎ−アセチル化２ＤＳＨ
Ａｃ−６ＤＳＨ：Ｎ−アセチル化６ＤＳＨ
Ａｃ−ＮＡＨ：Ｎ−アセチル化ＮＡＨ
Ac−NSH：Ｎ−アセチル化ＮＳＨ
ＣＤＳＨ：完全脱硫酸化・Ｎ−アセチル化ＨＥＰ
Ｃｈ：コンドロイチン
ＣＳ−Ａ（Ｓ）：サメ由来コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳ−Ａ（Ｗ）：クジラ由来コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳ−Ａ：コンドロイチン硫酸Ａ
ＣＳ−Ｂ：コンドロイチン硫酸Ｂ
ＣＳ−Ｃ：コンドロイチン硫酸Ｃ
ＣＳ−Ｄ：コンドロイチン硫酸Ｄ
ＣＳ−Ｅ：コンドロイチン硫酸Ｅ
ＥＨＳ−ＨＳ：エンジェルブレス-ホーム-スワーン腫瘍組織由来のヘパラン硫酸
ＧＡＧ：グリコサミノグリカン
ＨＡ：ヒアルロン酸
ＨＥＰ：ヘパリン
ＨＳ：ヘパラン硫酸
ＨＳＰＧ：プロテオグリカン・ヘパラン硫酸
ＩｄｏＡ：Ｌ−イズロン酸
ＫＳ：ケラタン硫酸
ＮＡｃ−ＨＥＰ：Ｎ−アセチル化ＨＥＰ
NAH：N−アセチルヘパロザン
ＮＤＳＴ：グルコサミニルＮ−デアセチラーゼ／Ｎ−スルフォトランスフェラーゼ
ＮＨ2−２ＳＨ：（６−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＨ2−６ＳＨ：（２−Ｏ・Ｎ）−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＨ2−ＣＤＳＨ：完全脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＨ2−ＨＥＰ：Ｎ−脱硫酸化ＨＥＰ
ＮＳＨ：（２−Ｏ・６−Ｏ）−脱硫酸化ＨＥＰ
また、本明細書において、Ｄ−グルコサミン残基はＧｌｃＮＨ2、ヘキスロン酸残基はＨｅｘＡ、Ｎ−硫酸化−Ｄ−グルコサミン残基はＧｌｃＮＳ、Ｄ−グルクロン酸残基はＧｌｃＡ、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン残基はＧｌｃＮＡｃと表記されることがある。さらに、部分的に脱アセチル化したＮＡＨは、PDNAc-NAHと表記されることがある。【０００３】
ＧＡＧの一種であるＨＳ及びＨＥＰはＤ−グルコサミン残基とヘキスロン酸（ＧｌｃＡ又はＩｄｏＡ）残基からなる二糖の繰り返し構造を基本糖鎖構造として有する酸性多糖である。また、それらは様々な程度にＯ−硫酸化、Ｎ−硫酸化、Ｎ−アセチル化によって修飾されている。ＨＳはほとんど全ての動物種の細胞表面にＨＳＰＧとして存在しており（非特許文献１）、細胞外マトリックスの主要構成成分である。
一方、ＨＥＰは粘膜及び肥満細胞の顆粒に局在している。ＨＥＰは多くの生理活性タンパク質（以下、「ＨＥＰ結合性タンパク質」又は「ＨＢＰ」という）と結合することがin vitroで明らかにされているが、それらＨＢＰの機能はＨＥＰが結合することによって制御されることがin vitroで明らかにされている。例えば、繊維芽細胞増殖因子や肝細胞増殖因子などのＨＢＰの安定化、コファクター又はコレセプターとして作用し、細胞の増殖を制御していると言われている。また、同様の結果がＨＳを用いた実験においても確認されている。さらに、個々の生理活性ＨＢＰに結合するＨＥＰの構造は一様ではなく、その硫酸化度や部位特異的な硫酸化が重要であることが明らかになりつつある。【０００４】
ＨＢＰの生体内における主要リガンドはＨＥＰではなく、寧ろ、ＨＳであると考えられている。つまり、ＨＳが上述した様々な生物学的な反応を制御していると考えられている。したがって、動物体内に幅広く存在し、多様な機能を備えたＨＳは、動物及びヒトにとって重要な成分であり、その定性的ないし定量的な、特異性の高い検出は、生物学及び医学上非常に重要な意義を有する。このような意味でＨＳのモノクローナル抗体は、またとない検出試薬となりうるものである。【０００５】
上述した理由から、近年、ＨＳ又はＨＥＰを抗原とする抗体作製に関する報告が多数なされるようになった。ＨＳのＮ−硫酸化グルコサミンユニット（-[ＨｅｘＡ−ＧｌｃＮＳ] -）を認識するモノクローナル抗体であるmAb HepSS-1とmAb F58-10E4は、市販され広く利用されている。【０００６】
ＨＳの構造解析を非特許文献２に記載の「2・8グリコサミノグリカン分解酵素とＨＰＬＣを組み合わせた構造解析」などを用いて行うと、ＨＳの主要構成二糖が非硫酸化二糖のＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃであることが容易にわかる。その存在比はＨＳが分離された臓器にも依存するが、５０−６０％に及ぶ。つまり、ＨＳの主要構造はＮ−アセチルグルコサミンユニット（-[ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＡｃ] -）である。【０００７】
また、糖尿病などある種の疾患では、ＨＳ及びＨＥＰの硫酸化反応の第一ステップを触媒するＮＤＳＴ活性が低下するので、その結果として、Ｎ−アセチルグルコサミンユニットの割合は増加する（非特許文献３）。さらに、腎由来のＨＳにはグルコサミンユニット（-[ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＨ2]-）も存在することが知られている（非特許文献４）。したがって他の臓器由来のＨＳと腎臓由来のＨＳを見分けるためには腎臓由来のＨＳに特異的に存在する構造、すなわち、グルコサミンユニットを認識する抗体を用いることがより望ましい。このように、ＨＳの非硫酸化ドメインを形成するＮ−アセチルグルコサミンユニットやグルコサミンユニットを検出・定量することは硫酸化ドメイン検出・定量することと同様に重要である。【０００８】
しかしながら、ＨＳの非硫酸化ドメインを形成するグルコサミンユニットやＮ−アセチルグルコサミンユニットを認識するモノクローナル抗体はそれぞれ、mAb JM403とmAb 865の一種類ずつに過ぎない（非特許文献４〜７）。
HSのグルコサミンユニットを認識するmAb JM-403はvan den Born, J.らがラットの糸球体から精製したＨＳＰＧで免疫したマウスから調製したものである。van den Born, J.らはＨＳにはグルコサミンユニットが平均2から3箇所存在し、当該抗体はＨＳをアセチル化すると反応性が消失することを報告している。また、当該抗体はＮＡＨと反応しないが、脱Ｎ−アセチル化されたＮＡＨに対してＨＳよりも強い反応性を示すことも報告している。さらに、ＨＳ中に存在するＮ−硫酸化グルコサミンユニットは当該抗体の反応性に影響しないが、Ｏ−硫酸化構造やＩｄｏＡ構造が当該抗体の反応性を阻害することを報告している（非特許文献８）。
一方、ＨＳのＮ−アセチルグルコサミンユニットを認識するmAb 865は元々、Peters, H.らによって抗腸内細菌抗原（anti-ECA）に対する抗体として獲得されたものであるが、大腸菌Ｋ５株のキョウ膜多糖（以下、「ＮＡＨ」という）とも交差反応する抗体である。当該抗体はＮＡＨの硫酸化したものやＮ−脱アセチル化したものとは反応せず、エピトープが１８糖以上のＮ−アセチルグルコサミンユニットであることがvan den Born, J.らによって報告されている。また、ＨＳに対する当該抗体の反応性はＮＡＨに対するそれの１／３０００以下であるが（非特許文献７）、正常ＨＳに比べて硫酸化度が高い、マウスのＥＨＳ−ＨＳとも反応することも報告されている。
マウスのEHS-HSは硫酸化度が高いHSである。したがって、マウスのEHS-HSに反応する抗体は、硫酸化度が高いHSに反応し得る点で、抗原に対する特異性が比較的低い抗体であるといえる。以上に述べたように、ＨＳのＮ−アセチルグルコサミンユニット又はグルコサミンユニット等からなる非硫酸化部位を認識するが、マウスのＥＨＳ−ＨＳに対して反応しない抗体は知られていなかったため、このような抗体が望まれていた。
【非特許文献１】Biochemistry,10, 20 1445（1971 ）
【非特許文献２】新生化学実験講座3、糖質II（東京化学同人刊、1991年）ｐ49-62
【非特許文献３】Diabetes, 40, 1449 (1991)
【非特許文献４】Kidney Int., 41, 115(1992)
【非特許文献５】J. Biol. Chem., 270, 31303 (1995)
【非特許文献６】Infect. Immun., 50, 459 (1985)
【非特許文献７】J. Biol. Chem., 271, 22802(1996)
【非特許文献８】J. Biol. Chem., 270, 31303 (1995)
【発明の開示】
【０００９】
本発明は試料中のHS又はNAHの検出に好適に用いることができる抗体を提供することを課題とする。特に、Ｎ−アセチルグルコサミンユニット又はグルコサミンユニットからなる非硫酸化部位を特異的に認識する抗体を提供することを課題とする。
【００１０】
本発明者らは上記課題の解決を目指し、タンパク質とＮＡＨとを結合させてなる物質を抗原として新規な抗ＧＡＧ抗体の作製を試みた。
本発明者らが抗原作製のために用いたＮＡＨは、主にＮ−アセチルグルコサミンユニットからなる酸性多糖である（Eur. J. Biochem.,116, 359-364 (1981)）。特開2004-018840に記載の「Ｎ−アセチルヘパロサン画分及びその製造法」にしたがって調製したＮＡＨの構造を、先に示した「グリコサミノグリカン分解酵素とＨＰＬＣを組み合わせた構造解析」で解析したところ、99.5％以上がＮ−アセチルグルコサミンユニットからなっているが、一部にグルコサミンユニット（（[ＧｌｃＡ−ＧｌｃＮＨ2]））も含まれていた。故に、本発明者らは、調製されたＮＡＨは、ＮＡＨに対する抗体並びに、ＨＳ中のＮ−アセチルグルコサミンユニット又はグルコサミンユニットに対する抗体を得る抗原物質として優れた特性を有すると考えた。本発明者らは鋭意検討の結果、ＮＡＨに反応する抗体、さらにＨＳのＮ−アセチルグルコサミンユニット又はグルコサミンユニットを認識する抗体を作製することに成功した。さらに、この抗体がマウスのＥＨＳ−ＨＳに対して実質的に反応しないことを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）NAH及びウシ腎臓由来のＨＳに対して反応し、マウスのEHS-HSに対して実質的に反応しない抗体。
（２）NAH及びウシ腎臓由来のＨＳの非硫酸化部位を認識する（１）の抗体。
（３）非硫酸化部位が、Ｎ−アセチルグルコサミンユニット又はグルコサミンユニットからなる、（２）の抗体。
（４）NAHに対する反応性と、ウシ腎臓由来のＨＳに対する反応性との比が、１０：２〜１０：２０である（１）〜（３）のいずれかの抗体。
（５）ＨＡに対して実質的に反応しない、（１）〜（４）のいずれかの抗体。
（６）ＨＥＰ又は脱硫酸化ＨＥＰ類に対して実質的に反応しない、（１）〜（５）のいずれかの抗体。
（７）Ｃｈ、ＣＳ−Ａ、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ又はＫＳに対して実質的に反応しない、（１）〜（６）のいずれかの抗体。
（８）モノクローナル抗体である、（１）〜（７）のいずれかの抗体。
（９）タンパク質とNAHとを結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、（１）〜（７）のいずれかの抗体。
（１０）リンパ球及びミエローマ細胞が、マウス由来である（９）の抗体。
（１１）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM BP-10534、FERM BP-10535又はFERM BP-10536であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
（１２）タンパク質とNAHとを化学的に結合させてなる物質であって、NAHに反応する抗体を産生させ得る抗原性を有する物質。
（１３）タンパク質とNAHとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物由来のリンパ球と哺乳動物由来のミエローマ細胞との細胞融合により形成されたハイブリドーマ。
（１４）哺乳動物がマウスである（１３）のハイブリドーマ。
（１５）独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにおける受託番号が、FERM BP-10534、FERM BP-10535又はFERM BP-10536であるハイブリドーマ。
（１６）試料中に存在するＨＳ又はNAHの検出方法であって、（１）〜（１１）のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とする検出方法。
（１７）（１）〜（１１）のいずれかの抗体を少なくとも含む、試料中に存在するＨＳ又はNAHの検出キット。
（１８）試料が、体液、細胞、組織及び細胞もしくは微生物の培養物からなる群から選択されるものに由来することを特徴とする、（１６）の検出方法。
（１９）試料が、体液、細胞、組織及び細胞もしくは微生物の培養物からなる群から選択されるものに由来することを特徴とする、（１７）の検出キット。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】各種修飾HEPの製造方法を示す図。
【図２】NAH33抗体、NAH43抗体、NAH46抗体の各種ＧＡＧに対する反応性を示す図その１。
【図３】NAH33抗体、NAH43抗体、NAH46抗体の各種ＧＡＧに対する反応性を示す図その２。
【図４】NAH33抗体、NAH43抗体、NAH46抗体の各種ＧＡＧに対する反応性を示す図その３。
【図５】NAH33抗体（A）、NAH43抗体（B）、NAH46抗体（C）の特異的な反応性を示す図。
【図６】各種Ｂｉ−ＧＡＧの濃度を変化させた場合の、NAH33抗体、NAH43抗体、NAH46の反応性を示す図その１。(a) 及び(b)はＮＡＨ３３抗体、(c)及び(d)はＮＡＨ４３抗体、(e) 及び(f)はＮＡＨ４６抗体の反応性を示す。
【図７】各種Ｂｉ−ＧＡＧの濃度を変化させた場合の、NAH33抗体、NAH43抗体、NAH46の反応性を示す図その２。(a)はＮＡＨ３３抗体、(b)はＮＡＨ４３抗体、(c)はＮＡＨ４６抗体の反応性を示す。
【図８】NAH33抗体（A）、NAH43抗体（B）、NAH46抗体（C）を用いたラット腎臓凍結切片に対する免疫組織染色の結果を示す図（写真）。矢印は陽性の部位を示す。
【図９】ヘパチリナーゼ消化処理（B,D,F）、非処理（A,C,E）時の免疫組織染色の結果を示す図（写真）。A,BはNAH33抗体、C,DはNAH43抗体、E,FはNAH46抗体を用いた染色結果である。実線矢印は陽性の部位を示す。破線矢印は陽性反応が消失した部位を示す。
【図１０】抗体固相化プレートを用いたウシ腎臓由来のＨＳの検出−その１（図中、(i)、(ii)、(iii)は、表４における固相化抗体及びＨＲＰ標識抗体の組み合わせを示す。）
【図１１】抗体固相化プレートを用いたウシ腎臓由来のＨＳの検出−その２（図中、(i)、(iv)、(v)は、表４における固相化抗体及びＨＲＰ標識抗体の組み合わせを示す。）
【図１２】フローサイトメトリー法を用いた細胞表面のＨＳの検出結果を示す図。図中（＋）はＨＳ陰性細胞（ヘパリチナーゼＩ消化有り）を使用した旨、（−）はＨＳ陽性細胞（ヘパリチナーゼＩ消化なし）を使用した旨を表す。（A）はＨＳ陽性細胞に対する陰性対照抗体の反応性、（B）はＨＳ陽性細胞に対するＮＡＨ４６抗体の反応性、（C）はＨＳ陰性細胞に対するＮＡＨ４６抗体の反応性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を更に詳細に説明する。【００１４】
本発明は、ＮＡＨ及びウシ腎臓由来のHSに対して反応し、EHS-HSに対して実質的に反応しない抗体（以下「本発明抗体」ともいう。）を提供する。【００１５】
ＮＡＨは大腸菌Ｋ５株のキョウ膜多糖であって、Ｎ−アセチルグルコサミンユニットを基本糖鎖構造として有する酸性多糖である（Eur. J. Biochem.,116, 359-364 (1981)）。ＮＡＨは、例えば、後述する参考例１に記載の方法により調製することができる。
前記ウシ腎臓由来のＨＳは、後述する参考例３に記載の二糖組成の解析結果に示すように、D-グルコサミン残基のＮ位が約３５％硫酸化したＨＳである。このようなウシ腎臓由来のＨＳは、例えばアセトン脱脂ウシ腎臓をアルカリ抽出、プロテアーゼ消化、除核酸、アルコール分画、コンドロイチナーゼABC処理した後、Schiller, S.らの方法にしたがったクロマトグラフィ法を行うことにより精製することができる（Lanber, A. et al., Biochim. Biophys. Acta., 29, 443 (1958)，Schiller, S. et al., J. Biol. Chem., 236, 983 (1961)，Iverius, P. H., Biochem. J. 124, 677(1971)）。具体的なウシ腎臓由来のＨＳとしては、例えば、生化学工業株式会社の研究用試薬コード番号４００７００のＨＳが挙げられる。【００１６】
マウスのＥＨＳ−ＨＳ（エンジェルブレス-ホーム-スワーン腫瘍組織由来のヘパラン硫酸）とは、マウスのＥＨＳ（エンジェルブレス-ホーム-スワーン）腫瘍組織から単離されるＨＳを意味する。マウスのＥＨＳ腫瘍組織からのＨＳの調製は、例えば、特公平7−53756号公報に記載の方法に従って行うことができる。このようなＥＨＳ−ＨＳは、後述する参考例３に記載の二糖組成の解析結果に示すように、D-グルコサミン残基のＮ位が約６５％硫酸化したＨＳである。
本発明において、特に断らない限り「反応」とは免疫学的反応又は抗原抗体反応を意味し、抗体と抗原との反応性は例えば、ELISA法、RIA法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロッティング法などによって調べることができる。例えば、抗体を用いてELISA法を行ったときに、抗原の濃度の増加に比例して反応シグナルが増強される場合に、該抗体は該抗原に反応するということができる。
また、本発明明細書において、「実質的に反応しない」とは、抗体と抗原との反応性が、上記の反応性を調べる方法で反応シグナルを与えないか、極めて弱い反応シグナルしか与えない程度であることを意味するが、特に本発明抗体のＥＨＳ−ＨＳとの反応性については、例えば上記に例示した反応性を調べる各方法における反応時間、検出方法、測定に用いる抗原溶液中の抗原濃度及び抗体溶液中の抗体濃度等の条件を、例えば検出結果として約２．０の吸光度差（吸光度差は、本発明抗体を含有する溶液を試験溶液として上記本発明抗体と抗原との反応性を測定した場合に得られる吸光度から、本発明抗体を含有しないブランク溶液を試験溶液として用いた場合に得られる吸光度を減算して得ることができる。具体例としては後述する実施例４を参照されたい）が得られる程度に本発明抗体のＮＡＨに対する反応性を十分に検出することができる条件と同様に設定し、ＥＨＳ−ＨＳに対する反応性を調べた場合において、本発明抗体のＥＨＳ−ＨＳに対する反応性が、ＮＡＨに対する反応性の、例えば１０％以下、より好ましくは５％以下であれば、実質的に反応しないと解することができる。また、上記の検出において設定する条件のより具体的な例としては、例えば後述する実施例４におけるＮＡＨ３３抗体、ＮＡＨ４３抗体、及びＮＡＨ４６抗体の反応性の測定における条件のいずれかを採用することもできるので、参照されたい。
また後述する、本発明抗体の、ＮＡＨに対する反応性とウシ腎臓由来のＨＳに対する反応性との比、及びＮＡＨに対する反応性と約４０％脱Ｎ−アセチル化したＮＡＨに対する反応性との比に例示される、本発明抗体のＮＡＨに対する反応性とその他ＧＡＧ等に対する反応性との比に関する記載は、例えば上記に例示した反応性を調べる各方法における反応時間、検出方法、測定に用いる抗原溶液中の抗原濃度及び抗体溶液中の抗体濃度等の条件を、例えば検出結果として約２．０の吸光度差が得られる程度に本発明抗体のＮＡＨに対する反応性を十分に検出することができる条件と同様に設定し、ＮＡＨ及びその他ＧＡＧ等の反応性を調べた場合における、両者の反応性の強度の比を表すものである。また、上記の検出において設定する条件のより具体的な例としては、例えば後述する実施例４におけるＮＡＨ３３抗体、ＮＡＨ４３抗体、及びＮＡＨ４６抗体の反応性の測定における条件のいずれかを採用することもできるので、参照されたい。
なお本発明抗体が、後述するＮＡＨ３３抗体、ＮＡＨ４３抗体、又はＮＡＨ４６抗体である場合における、上述した本発明抗体のＥＨＳ−ＨＳとの反応性、及び本発明抗体のＮＡＨに対する反応性とその他ＧＡＧ等に対する反応性との比を調べる方法については、後述する実施例４に記載の方法を採用することができるので参照されたい。【００１７】
本発明抗体は上記の様に、ＮＡＨ及びウシ腎臓由来のHSに対して反応し、EHS-HSに対して実質的に反応しない限りにおいて特に限定されない。従って、本発明抗体は、ＮＡＨ及びウシ腎臓以外の由来のHSにも反応し得るものである。このような本発明抗体が反応するHSは、後述する実施例に記載の方法により得られる非硫酸化二糖の存在比が、約４０％以上であることが好ましく、約５０％以上であることがより好ましい。【００１８】
本発明抗体は、ＮＡＨに対する反応性と、ウシ腎臓由来のＨＳに対する反応性との比が、１０：２〜１０：２０であるものが好ましく、１００：２０〜１００：９０であることがより好ましい。
上記のような抗体としては、下記（イ）又は（ロ）に記載の抗体が例示される。
（イ）ＮＡＨに対する反応性と、ウシ腎臓由来のＨＳに対する反応性との比が、１００：３０〜１００：５０抗体。さらに上記の比が、１００：３５〜１００：４５である抗体。このような抗体としては、具体的には、受託番号がFERM BP-10534又はFERM BP-10536であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（それぞれ「ＮＡＨ３３抗体」および「ＮＡＨ４６抗体」ともいう。）が例示される。
（ロ）ＮＡＨに対する反応性と、ウシ腎臓由来のＨＳに対する反応性との比が、１００：６０〜１００：９０である抗体。さらに上記の比が、１００：７０〜１００：８０である抗体。このような抗体としては、具体的には、受託番号がFERM BP-10535であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（「ＮＡＨ４３抗体」ともいう。）が例示される。【００１９】
また、本発明の抗体は、ＨＡに対して実質的に反応しない抗体であることが好ましい。
上記のＨＡとしては、後述する実施例に記載のＨＡが例示される。また、本発明の抗体は、ＨＥＰ又は脱硫酸化修飾ＨＥＰ類に対して実質的に反応しない抗体であることが好ましく、ＨＥＰ及び脱硫酸化修飾ＨＥＰ類に対して実質的に反応しない抗体であることがより好ましい。上記のＨＥＰとしては、後述する実施例に記載のＨＥＰが例示される。
また、上記の脱硫酸化修飾ＨＥＰ類とは、後述する実施例に記載の、６ＤＳＨ、ＮＳＨ、ＮＨ2−ＨＥＰ、ＮＨ2−２ＳＨ、ＮＨ2−６ＳＨ、ＮＨ2−ＣＤＳＨ、ＮＡｃ−HEP、２ＳＨ、６ＳＨ、ＣＤＳＨ、Ａｃ−６ＤＳＨ及びAc−NSHからなる群より選択されるもを意味する。さらに上記の抗体は、２ＤＳＨ及び/又はＡｃ−２ＤＳＨに対して実質的に反応しない抗体であることがより好ましい。
さらに、本発明の抗体は、Ｃｈ、ＣＳ−Ａ、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ及びＫＳからなる群から選択されるＧＡＧに対して実質的に反応しない抗体であることが好ましく、Ｃｈ、ＣＳ−Ａ、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ及びＫＳに対して実質的に反応しない抗体であることがより好ましい。上記のＧＡＧとしては、それぞれ後述する実施例に記載のＧＡＧが例示される。【００２０】
また、本発明の抗体は、脱Ｎ−アセチル化したＮＡＨに対して、特定の反応性を有することが好ましい。このような抗体としては、下記（ハ）〜（ホ）に記載の抗体が例示される。
（ハ）約４０％脱Ｎ−アセチル化したＮＡＨに対して実質的に反応しない抗体。さらに、上記の抗体は、上記反応性に加え、約２０％脱Ｎ−アセチル化したＮＡＨに対して実質的に反応しないことが好ましく、約１０％脱Ｎ−アセチル化したＮＡＨに対して実質的に反応しないことがより好ましい。このような抗体としては、具体的には、受託番号がFERM BP-10534であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＮＡＨ３３抗体）が例示される。
（ニ）ＮＡＨに対する反応性と、約４０％脱Ｎ−アセチル化したＮＡＨに対する反応性との比が、１００：６０〜１００：１５０である抗体。さらに、上記の比は、１００：８０〜１００：１３０であることがより好ましく、約１００：１１０であることが最も好ましい。さらに、上記の抗体は、ＮＡＨに対する反応性と、約２０％脱Ｎ−アセチル化ＮＡＨに対する反応性との比が、１００：６０〜１００：１５０であることが好ましく、ＮＡＨに対する反応性と、約１０％脱Ｎ−アセチル化ＮＡＨに対する反応性との比が、１００：６０〜１００：１００であることが好ましい。このような抗体としては、具体的には、受託番号がFERM BP-10535であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＮＡＨ４３抗体）が例示される。
（ホ）約４０％脱Ｎ−アセチル化したＮＡＨに対して、実質的に反応しない抗体。さらに、ＮＡＨに対する反応性と、約２０％脱Ｎ−アセチル化したＮＡＨに対する反応性との比は、１００：１０〜１００：５０であることが好ましい。さらに上記の抗体は、ＮＡＨに対する反応性と、約１０％脱Ｎ−アセチル化ＮＡＨに対する反応性との比が、１００：６０〜１００：１００であることがより好ましい。このような抗体としては、具体的には、受託番号がFERM BP-10536であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（ＮＡＨ４６抗体）が例示される。
脱Ｎ−アセチル化したＮＡＨは、例えば、後述する「[参考例１]２．PDNAc-NAHの調製」に記載の方法に従って調製することができる。本発明明細書において、脱Ｎ−アセチル化したＮＡＨにおける脱Ｎ−アセチル化の割合（％）は、後述する「[参考例１]２．PDNAc-NAHの調製」に記載の方法により得られる脱Ｎ−アセチル化の割合（％）を意味する。
本発明の抗体は、NAH及びウシ腎臓由来のHSの非硫酸化部位を認識し得るものである。
上記の非硫酸化部位には、具体的にはＮ−アセチルグルコサミンユニット又はグルコサミンユニットからなる部位が挙げられる。このような非硫酸化部位は、Ｎ−アセチルグルコサミンユニットとグルコサミンユニットのどちらか一方からなってもよく、両方からなってもよい。【００２１】
本発明の抗体の種類は特に制限されず、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体がより好ましい。モノクローナル抗体はそのフラグメントであってもよい。モノクローナル抗体のフラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ’）2化抗体、Ｆａｂ化抗体、短鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ（Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）及びミニボディ（Ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）などが挙げられる。
モノクローナル抗体の免疫グロブリンクラスは特に制限されないが、IgMであることが好ましく、IgM, κ-chainであることがより好ましい。【００２２】
上記モノクローナル抗体は、例えば、タンパク質とＮＡＨとを化学的に結合させてなる物質を抗原として免疫した哺乳動物（好ましくはマウス）の抗体産生細胞（好ましくはリンパ球）と哺乳動物（好ましくはマウス）のミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを作製し、得られたハイブリドーマから上記性質を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマの培養上清からモノクローナル抗体を回収することにより得ることができる。【００２３】
この抗体を産生させるために用いる抗原物質は、タンパク質とＮＡＨとを化学的に結合させて得られる物質であって、ＮＡＨに反応する抗体を産生させ得る抗原性を有する物質である。この物質は例えば、特開2004-018840に記載の方法により調製したＮＡＨをタンパク質に共有結合させることによって得ることができる。【００２４】
以下に、本発明の抗体を得るための方法を詳細に示す。ただし、本発明の抗体を得る方法は、以下のものには限定されない。
本発明の抗体を得るための第一段階としては、抗体を産生する新規な単クローンハイブリドーマを確立することが挙げられる。このハイブリドーマを確立する方法の具体的詳細は実施例で示すが、簡単には次の３工程から成る。
1.免疫
2.細胞融合
3. ハイブリドーマの選択と単クローン化【００２５】
１．免疫
本発明において、免疫の工程で用いる抗原は、ＮＡＨを用いることが好ましい。また、上記ＮＡＨは、タンパク質と化学的に結合させて用いることが好ましい。上記タンパク質は、ウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」という。）又はヘモシアニン（以下、「ＫＬＨ」という。）であることが好ましい。
本発明において、免疫に用いる抗原としてはGAG又はプロテオグリカンを用いることが好ましく、なかでもNAHを用いることがより好ましい。さらにこれらは、タンパク質と結合させて用いることがより好ましい。例えばGAG又はプロテオグリカンと、タンパク質との化学的な結合の様式は特に限定されないが、共有結合が好ましく、ジスルフィド結合（以下、「−ＳＳ−」という）がより好ましい。具体的には、例えば、GAGを還元アミノ化し、これと５ｍＭ Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（以下、「ＳＰＤＰ」という）を反応させて、２−ピリジルジチオプロピニル化GAGを得る。これをジチオスレイトール等の還元剤で還元し、チオール化GAGを得る。同様に、タンパク質とＳＰＤＰを反応させ、２−ピリジルジチオプロピニル化タンパク質を得る。次に、チオール化GAG溶液と２−ピリジルジチオプロピニル化タンパク質溶液を混合することによって、GAGとタンパク質間にＳＳ結合を生成させ、GAG−ＳＳ−タンパク質を得る（以下、「GAG抗原」という）。
本発明で免疫される動物は豚、牛、マウス、ラット等の哺乳動物であることが好ましく、抗体産生細胞の相手となるミエローマ細胞がマウス由来のものであることが好ましいため、特にマウスが好ましい。例えば上記方法により調製したＮＡＨ抗原を哺乳動物に皮下注射することにより免疫を行うことができる。注射方法はこれに限らず、腹腔内注射、静脈注射でも良い。通常、免疫は数回に分けて行うが、免疫はアジュバントと共に投与することが好ましい。アジュバンとしては、ミョウバン、結核死菌、核酸、完全フロインドアジュバント、不完全フロイントアジュバント等、アジュバント効果が期待できるもので有ればよいが、特に、ＴｉｔｅｒＭＡＸ  Ｇｏｌｄ（シグマ社製）良い。【００２６】
２．細胞融合
最終免疫後にリンパ節或は脾臓を摘出し、得られるリンパ球を細胞融合に供する。一方、細胞融合に使用される腫瘍細胞株としてはミエローマ細胞が好ましく、通常、マウスのBALB/c 由来のP3 -NS-1/1-Ag4-1、P3 -X63-Ag8-U1(P3 U1)、P3 -X63-Ag8-653、SP2/0-Ag14 等を用いることができる。【００２７】
３．ハイブリドーマの選択と単クローン化
ハイブリドーマの選択と単クローン化は下記に例示される方法により、行うことができる。すなわち、ハイブリドーマの増殖の盛んな細胞培養上清を種々の分析法（例えばRIA法 、プラーク法、凝集反応法、ELISA法、フローサイトメトリー法、組織染色法、ウェスタンブロッティング法 等）でNAHに反応する目的の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、次に、得られたハイブリドーマについてクローニングを行う。クローニングの方法としてはFACS（Fluorescent Activated Cell Sorter ）もしくは、一般によく用いられる限界希釈法等が挙げられる。例えば、限界希釈法では９６ウェルプレートの１ウェルあたり細胞が１個以下になるように行うことが好ましい。どの方法を用いてもクローニングは２回繰返し行うことが好ましく、単一クローンとすることが好ましい。【００２８】
本発明の抗体を得るための第二段階としては、抗ＮＡＨモノクローナル抗体を産生することが挙げられる。
抗ＮＡＨモノクローナル抗体を産生する方法としては、得られた単一クローンを、大量にin vitro で培養する方法、in vivo で培養（腹水化）する方法が挙げられ、目的に応じて選択することができる。単一のハイブリドーマが作るモノクローナル抗体は、細胞培養液又は、ハイブリドーマを移植したマウスの腹水から分離精製することができる。これら粗抗体液からの抗体精製は、塩析、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等、生化学的一般的手法を適宜組み合わせることによって達成することができる。【００２９】
上記のようにして得られるモノクローナル抗体としては、NAH33と名づけられたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（以下、NAH33抗体という。）を挙げることができる。上記のハイブリドーマは、2005年３月１１日に、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託され、受託番号FERM P-20457が付与された。その後、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-10534が付与された。
NAH33抗体は、下記の反応性を示す。すなわち、ＮＡＨ及びウシ腎臓由来のHSに対して反応し、マウスのＥＨＳ−ＨＳ、ＨＡ、ＨＥＰ、Ｃｈ、ＣＳ−Ａ、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ、ＫＳ、PDNAc-NAH（約４０％脱Ｎ−アセチル化したNAH、約２０％脱Ｎ−アセチル化したNAH及び約１０％脱Ｎ−アセチル化したNAH）に対して実質的に反応しない。また、ウシ腎臓由来のＨＳに対する反応性は、NAHに対する反応性の約４０％である。さらに、ＮＡＨに対する反応性と、Ac-NAHに対する反応性との比は、約１：１である。【００３０】
上記のようにして得られる、別のモノクローナル抗体としては、NAH43と名づけられたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（以下、NAH43抗体という。）を挙げることができる。上記のハイブリドーマは、2005年３月１１日に、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託され、受託番号FERM P-20458が付与された。その後、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-10535が付与された。
NAH43抗体は、下記の反応性を示す。すなわち、NAH及びウシ腎臓由来のHSに対して反応し、マウスのＥＨＳ−ＨＳ、ＨＡ、ＨＥＰ、Ｃｈ、ＣＳ−Ａ、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ及びＫＳに対して実質的に反応しない。また、ウシ腎臓由来のＨＳに対する反応性は、ＮＡＨに対する反応性の約７５％である。またこの抗体は、NAHに対する反応性と、約２０％脱Ｎ−アセチル化したNAHに対する反応性に実質的に差がない。すなわち、NAHに対する反応性と、約４０％脱Ｎ−アセチル化したNAHに対する反応性との比、並びにNAHに対する反応性と、約２０％脱Ｎ−アセチル化したNAHに対する反応性との比が、共に約１００：１１０である。NAHに対する反応性と、約１０％脱Ｎ−アセチル化したNAHに対する反応性との比は、約１００：８０である。さらに、Ａｃ−ＮＡＨに対する反応性は、ＮＡＨに対する反応性の約７０％である。【００３１】
上記のようにして得られる、さらに別のモノクローナル抗体としては、NAH46と名づけられたハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体（以下、NAH46抗体という。
）を挙げることができる。ハイブリドーマNAH46は、2005年３月１１日に、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託され、受託番号FERM P-20459が付与された。その後、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-10536が付与された。
NAH46抗体は、下記の反応性を示す。すなわち、ＮＡＨ及びウシ腎臓由来のHSに対して反応し、マウスのＥＨＳ−ＨＳ、ＨＡ、ＨＥＰ、Ｃｈ、ＣＳ−Ａ、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ及びＫＳに対して実質的に反応しない。また、ウシ腎臓由来のＨＳに対する反応性は、NAHに対する反応性の約４０％である。またこの抗体は、約４０％脱Ｎ−アセチル化したNAHに対して実質的に反応しない。また、約２０％脱Ｎ−アセチル化したNAHに対する反応性は、NAHに対する反応性の約４０％であり、約１０％脱Ｎ−アセチル化したNAHに対する反応性は、NAHに対する反応性の約８０％である。さらに、NAHに対する反応性と、Ａｃ−ＮＡＨに対する反応性との比は、約１：１である。【００３２】
本発明抗体は、試料中に存在するＨＳ又はNAHの検出に用いることができる。したがって本発明は、試料中に存在するＨＳ又はNAHの検出方法であって、本発明の抗体を用いることを特徴とする検出方法を提供する。
上記の試料とは、ＨＳ又はNAHを含むか、それを含む可能性を有する試料であれば特に限定されない。ここで、「ＨＳ又はNAHを含む」とは、ＨＳとNAHのどちらか一方を含んでいてもよく、ＨＳとNAHを両方含んでいてもよいことを意味する。このような試料としては、ＨＳ又はNAHを含みうるものである限りにおいて特に限定されないが、試料の由来となるものとして、尿、血液、血漿、血清、関節液、髄等の体液、分泌物、細胞、組織、臓器、動・植物細胞又は微生物の培養上清、細胞自体、菌体自体等の培養物等が例示される。上記「由来」とは、上記に例示したものに由来する精製物、抽出物、標本等であってもよく、そのもの自体であってもよいことを意味する。
本発明の検出方法において、組織標本を試料に用いる場合は通常の免疫組織染色法などを用いることができ、体液を試料に用いる場合はELISA法、RIA法、サンドイッチ法、競合法、プラーク法、凝集反応法、フローサイトメトリー法、ウェスタンブロッティング法などを用いることができる。
上記のサンドイッチ法においては、後述する実施例７に示す様に、本発明抗体をプレート等に例示される固相に固着させて第一抗体として用いても良く、また、本発明抗体を標識して第二抗体として用いても良い。ここで本発明抗体としては、例えばＮＡＨ３３抗体、ＮＡＨ４３抗体、ＮＡＨ４６抗体等が例示される。また、本発明抗体を第一抗体として用いる場合の第二抗体、及び本発明抗体を第二抗体として用いる場合の第一抗体は、検出の対象であるＨＳ又はＮＡＨに結合し得る物質である限りにおいて特に限定されないが、例えばmAb JM403（以下、「ＪＭ４０３」と記載する）、mAb F58-10E4（以下、「１０Ｅ４」と記載する）等の抗体が例示される。また、第一抗体と第二抗体の両者に本発明抗体を用いても良い。この場合、第一抗体及び第二抗体には、本発明抗体を適宜組み合わせて使用することができるが、例えば、第一抗体としてＮＡＨ３３抗体を用い、第二抗体としてＮＡＨ３３抗体、ＮＡＨ４３抗体又はＮＡＨ４６抗体のいずれかを用いる組み合わせ、第一抗体としてＮＡＨ４３抗体を用い、第二抗体としてＮＡＨ３３抗体、ＮＡＨ４３抗体又はＮＡＨ４６抗体のいずれかを用いる組み合わせ、第一抗体としてＮＡＨ４６抗体を用い、第二抗体としてＮＡＨ３３抗体、ＮＡＨ４３抗体又はＮＡＨ４６抗体のいずれかを用いる組み合わせ等が例示される。
本発明の検出方法によれば、本発明の抗体の反応の特異性を利用することにより、本発明の抗体により認識し得る試料中に存在するＨＳ又はＮＡＨを特異的に検出することができる。また、本発明の検出方法は、前述した本発明の抗体の反応性を利用することにより、例えば細胞、組織の癌化、炎症の有無又はその程度の判定、培養上清中に含まれるＮＡＨ又はHSの測定、各種疾患の有無又はその程度の判定等といった目的にも応用することが可能である。【００３３】
また本発明は、本発明の抗体を少なくとも含む、試料中に存在するＨＳ又はNAHの検出キットを提供する。本発明の検出キットによれば、本発明検出方法をより簡便に行うことができる。上記において、「本発明の抗体を少なくとも含む」キットとしては、例えば本発明抗体そのもの（溶液に溶解した本発明抗体等も含む）を構成成分として含むキット、本発明抗体を固着させた固相を構成成分として含むキット、酵素等により標識した本発明抗体を構成成分として含むキット等が例示される。また、上記の「試料」なる用語の意味は、上述した本発明の検出方法における説明をそのままあてはめることができる。また、上記検出キットは、上記抗体に加えて、2次抗体、反応バッファー、洗浄液、反応基質、ＨＳ標準液などを含むものであってもよい。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明する。なお、本発明は本実施例に限定されるものではない。【００３５】
［参考例１］  ＮＡＨ及びPDNAc-NAHの調製
１．ＮＡＨの調製
ＮＡＨは大腸菌 K5を用いた発酵法によって調製した（特開2004-018840号公報参照）。得られたＮＡＨの特徴を以下に示した。Shodex STANDARD P-82 kit ( P-800; 788 kDa, P-400; 404 kDa, P-200; 210 kDa, P-100; 112 kDa, P-50; 47.3 kDa, P-20; 22.8 kDa, P-10; 11.8 kDa, P-5; 5.9 kDa、昭和電工)を分子量標準マーカーとしたゲルろ過クロマトグラフィ法によって測定した重量平均分子量（Mw）と数平均分子量（Mn）はそれぞれ、128,646と106,144で、分子量分散度(Mw/Mn)は1.212であった。EtBr（エチジウムブロミド）比色定量法によって測定した核酸含量は0.09％であった。Lowry法（Lowry J.ら, J. Biol. Chem. 193, 265-275, (1951) ）によって測定したタンパク含量は2.38％であった。2,4,6-TNBS法(Biochemica et Biophysica Acta. (1967)141, 358-365 )によって測定した遊離アミンのモル数は0.026μM/mgであった。【００３６】
２．PDNAc-NAHの調製
上記方法で調製したＮＡＨを原料として、Shaklee, P. N.らの方法に従ってPDNAc-NAHを調製した（Biochem. J., 217, 187 (1984)）。脱アセチル化度（％）はアミノ酸定量用試薬のFluoraldehyde(TM) Reagent Solution（PIERCE社）を用いて測定した。具体的には，50ug/mlの試料溶液を80ulずつ試験管に分注し、800ulの上記試薬を添加し、当該混液の蛍光（λex=340nm、λem=455nm）を測定した。スタンダードとしてグルコサミン塩酸塩を用い，蛍光強度から試料溶液中のグルコサミン濃度（ug/ml）を算出した。NAHはグルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンからなる多糖なので、50ug/mlのNAH中のＮ−アセチルグルコサミン濃度は概算すると25ug/mlとなる。そこで、算出したグルコサミン濃度をＮ−アセチルグルコサミン濃度の概算値で除し、百分率であらわすことで脱アセチル化度とした。脱アセチル化反応の反応時間別の脱アセチル化度は以下表のとおりであった。【００３７】
【表１】
0004841546.tif 000002
【００３８】
［参考例２］  ビオチン標識ＧＡＧ（以下、「Ｂｉ−ＧＡＧ」という）の調製
１．天然型GAGのビオチン標識化
天然型ＧＡＧ（ＮＡＨ、ＨＳ、ＨＡ、ＨＥＰ、Ｃｈ、ＣＳ−Ａ（Ｓ）、ＣＳ−Ａ（Ｗ）、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ、ＫＳ）を０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（pH5.5）に溶解して、１０ｍｇ／ｍｌ のＧＡＧ溶液を調製した。１ｍｌの各ＧＡＧ溶液に、ジメチルスルホキシド（和光純薬工業社製）で２０ｍＭに調製したビオチン-LC-ヒドラジド（PIERCE社製）を２５μｌ 添加した。続いて、０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で１００ｍｇ／ｍｌに調製したEDC（PIERCE社製）溶液を１２．５μｌ添加した。よく撹拌した後、常温（１５℃〜２５℃）で１６−２４時間撹拌反応を行った。反応終了後、この反応物を透析膜（cutoff分子量１０，０００以下）において、透析液としてリン酸緩衝生理食塩水（pH7.2〜7.5、カルシウムイオン等の2価イオン不含：以下、「ＰＢＳ（−）」という）等を用い、十分に遊離のビオチンを除去した。透析終了後、Ｂｉ−ＧＡＧ濃度を５ｍｇ／ｍｌ に調製し、凍結保存した。
上記の方法により、ビオチン標識した天然型ＧＡＧ（Ｂｉ−ＮＡＨ、Ｂｉ−ＨＳ、Ｂｉ−ＨＡ、Ｂｉ−ＨＥＰ、Ｂｉ−Ｃｈ、Ｂｉ−ＣＳ−Ａ（Ｓ）、Ｂｉ−ＣＳ−Ａ（Ｗ）、Ｂｉ−ＣＳ−Ｂ、Ｂｉ−ＣＳ−Ｃ、Ｂｉ−ＣＳ−Ｄ、Ｂｉ−ＣＳ−Ｅ、Ｂｉ−ＫＳ）を得た。
尚、ＮＡＨは参考例１の調製品、ＨＥＰはSPL社製（ブタ腸由来）、その他のＧＡＧは生化学工業株式会社製の下記のものを用いた。ＨＡ（ブタ皮由来）、Ｃｈ（下記のＣＳ−Ｃを原料として、酸性メタノール処理することにより得た）、ＣＳ−Ａ（Ｓ）（チョウザメ脊索由来）、ＣＳ−Ａ（Ｗ）（クジラ軟骨由来）、ＣＳ−Ｂ（ブタ皮由来）、ＣＳ−Ｃ（サメ軟骨由来）、ＣＳ−Ｄ（サメ軟骨由来）、ＣＳ−Ｅ（イカ軟骨由来）、ＫＳ（ウシ角膜由来）。ＨＳは生化学工業株式会社製のウシ腎臓由来のＨＳを用いた。以下、本実施例ではこれを単にウシ腎臓由来のＨＳと呼ぶ。
２．ＰＤＮＡｃ−ＮＡＨ及び化学修飾GAGのビオチン標識化
参考例１に記載のPDNAc-NAH30 、PDNAc-NAH60、 PDNAc-NAH120を出発物質として、上記と同様の方法によりビオチン標識化した。
また、化学修飾GAGとして、ＨＥＰを出発物質とした部位特異的な脱硫酸化体12種とNAHのN-アセチル化体を調製し、上記と同様の方法でビオチン標識化した。化学修飾GAGの調製法を以下に述べる。
６DSH、２DSH及びNSHはKariya, Y.らの方法にしたがって調製した（Kariya, Y. et al., J. Biochem., 123, 240(1998)）。
ＮＨ2-HEP、ＮＨ2-2SH、ＮＨ2-6SH及びＮＨ2-CDSHはそれぞれの出発物質であるHEP、６DSH、２DSH及びNSHのピリジニウム塩を調製し、それをAyotte, L.らの方法（Ayotte, L. et al., Carbohydr. Res., 145, 267(1986)）にしたがって脱N-硫酸化することによって調製した。
NAc-HEP、2SH、6SH、CDSH、Ac-6DSH、Ac-NSH及びAc-NAHはそれぞれの出発物質であるＮＨ2-HEP、ＮＨ2-2SH、ＮＨ2-6SH、ＮＨ2-CDSH、6DSH、NSHおよびNAHをDanishefsky, I.らの方法（Danishefsky, I. et al., Methods Carbohydr. Res., 5, 407(1965)）にしたがってN-アセチル化することによって調製した。上記の各種修飾HEPの製造方法の流れを、図１に示す。【００３９】
［参考例３］  マウスのEHS-HS及びウシ腎臓由来のＨＳの二糖組成の解析
マウスのEHS-HS及びウシ腎臓由来のHSの二糖組成の解析を行った。二糖組成は下記試験法１の酵素消化による二糖組成分析により得られる特定が可能な構造を持つ不飽和二糖の量（ΔDiHS-0S, ΔDiHS-NS, ΔDiHS-6S, ΔDiHS-US, ΔDiHS-di(6,N)S, ΔDiHS-di(U,N)S, ΔDiHS-di(U,6)S, ΔdiHS-tri(U,6,N)Sのモル％の合計）を100%として、上記特定の構造を持つ二糖の割合を示したものであり、当該数値は酵素消化前の硫酸化多糖の硫酸化を反映するものである。
なお、本願明細書中において、二糖組成の表記は、下記を意味する。【００４０】
【化１】
0004841546.tif 000003
【００４１】
【表２】
0004841546.tif 000004
【００４２】
また、上記略号の示す構造は以下のとおり表記されることもある。
ΔdiHS-0S:ΔhexA1→4HexNAc, ΔdiHS-NS:ΔhexA1→4HexNS, ΔdiHS-6S:ΔhexA1→4HexNAc(6S), ΔdiHS-US:ΔhexA(2S)1→4HexNAc, ΔdiHS-di(6,N)S:ΔhexA1→4HexNS(6S), ΔdiHS-di(U,N)S:ΔhexA(2S)1→4HexNS, ΔdiHS-di(U,6)S:ΔhexA(2S)1→4HexNAc(6S), ΔdiHS-tri(U,N,6)S:ΔhexA(2S)1→4HexNS(6S)。
上記中、ΔhexAは不飽和ウロン酸、HexNAcはN-アセチルヘキソサミン、HexNSはN-硫酸化ヘキソサミン、カッコ内は硫酸基の結合位置を示す。【００４３】
試験法1
[酵素消化による二糖分析]
硫酸化多糖における硫酸基の置換位置を分析する方法は、次のようにして行った。すなわち、それぞれの硫酸化多糖を酵素消化し、生成した不飽和二糖（前記構造式：化1）を高速液体クロマトグラフィ（HPLC）で分析した（非特許文献２に記載の「2・8グリコサミノグリカン分解酵素とHPLCを組み合わせた構造解析」参照）。各不飽和二糖のピーク面積を計算して、全面積に対するピーク面積をパーセントとして表した。
（1）酸化多糖及び低分子化硫酸化多糖の分解酵素による消化
新生化学実験講座3、糖質II（東京化学同人刊、1991年）ｐ４９−６２に記載の方法により、2 mM酢酸カルシウムを含む20 mM酢酸ナトリウム（pH7.0）220 μlに硫酸化多糖又は低分子化硫酸化多糖1.0 mgを溶解して、20mUのヘパリナーゼ、20 mUのヘパリチナーゼI及びIIを加えて、37℃、2時間反応させた。
(2)HPLCによる分析
硫酸化多糖及び低分子化硫酸化多糖の分解酵素による消化を行った後の溶液50 μlを、HPLC（医理化、モデル852型）を用いて分析した。イオン交換カラム（ダイオネックス社、CarboPac PA-1カラム4.0mm × 250mm）を使用し、232 nmでの吸光度を測定した。4〜12糖スタンダードを基準とし（Yamada, et al., J.Biol.Chem., 270,8696-8706,(1995)）、流速1 ml/分で、塩化リチウムを用いたグラジエント系（50 mM→2.5 M）を用いる方法に準拠した（Kariya, et al., Comp.Biochem.Physiol., 103B,473,(1992)）。
今回、試験に使用したウシ腎臓由来のHSとマウスのEHS-HSの二糖組成分析の結果を表３に示す。【００４４】
【表３】
0004841546.tif 000005
NS(total)は、ΔDiHS-NS, ΔDiHS-di(6,N)S, ΔDiHS-di(U,N)S,ΔDiHS-tri(U,6,N)Sの合計を表す。
上記表中において、N.Dは検出限界以下であったことを示す。【００４５】
［参考例４］  固相化ストレプトアビジンプレートの作製
ストレプトアビジン（Vector社製）をＰＢＳ（−）で２０μｇ／ｍｌに希釈し、マキシソープ（登録商標） ９６ウェルマイクロプレート（ヌンク社製）の各ウェルに５０μｌずつストレプトアビジン溶液を加え、４℃で１４〜１８時間保存することにより、均一にコーティングした。このプレートをＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ウェルのストレプトアビジンでコーティングされていない部分をブロッキングするためのブロッキング物質として，ApplieDuo（最終希釈率5倍、生化学工業株式会社製）及び防腐剤として０．０５％プロクリン（登録商標）３００（SUPELCO社製）を含むリン酸緩衝液（上記ＰＢＳ（−）のうち、塩化ナトリウム、塩化カリウム不含、pH7.2〜7.5：以下、「ＰＢ」という）を加え、常温で2時間静置した。静置後、ブロッキング溶液を十分に除去し、３７℃で２時間乾燥させることにより、所望する固相化ストレプトアビジンプレートを得た。プレートは乾燥剤とともにアルミラミネート袋に封入し、冷蔵保存した。【００４６】
［参考例５］  Ｂｉ−ＧＡＧ固相化プレートの作製
参考例２で調製したＢｉ−ＧＡＧを添加剤としてApplieDuo（登録商標）（最終希釈率２０倍、生化学工業株式会社製）と、防腐剤として０．０５％プロクリン３００とを含むＰＢＳ（−）（以下、「反応液Ａ」という）に溶解し、1μg/mｌ溶液を調製した。参考例４で作製した固相化ストレプトアビジンプレートを０．０５％ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート（ICI社  商標  Tween２０相当品、和光純薬工業社製）及び防腐剤として０．０５％プロクリン（登録商標）３００を含むＰＢＳ（−）（以下、「洗浄液」という）３００μｌで４回洗浄し、各ウェルにＢｉ−ＧＡＧ溶液を100μLずつ加え、常温で30分静置して、固相化ストレプトアビジンにＢｉ−ＧＡＧを固定化した（以下、「Ｂｉ−ＧＡＧ固相化プレート」という）。【００４７】
［実施例１］
１．  ＮＡＨ抗原の調製その１
（１）還元アミノ化ＮＡＨ（以下、「ＲＡ−ＮＡＨ」という）の調製
参考例１で調製したＮＡＨを５０ｍｇ秤量し、２ｍｌの２Ｍ塩化アンモニウム水溶液に溶解した。溶液に２５ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加し、７０℃で２日間、還元アミノ化反応を行った。反応液に１３ｍｇのシアノ水素ホウ素ナトリウムを添加し、さらに２日間同一条件で反応を行った。氷浴中で冷却後、４００μｌの酢酸を添加し反応を完全に停止させた。ＲＡ−ＮＡＨは２倍量のエタノールを用いた溶媒沈殿法で回収し、エタノール洗浄後、凍結乾燥した。３９．５ｍｇのＲＡ−ＮＡＨ凍結乾燥物を得た。【００４８】
（２）２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化ＮＡＨ（以下、「ＰＤＰ−ＮＡＨ」という）の調製
上記（１）で調製したＲＡ−ＮＡＨを１０．４ｍｇ秤量し、２ｍｌの０．１Ｍ食塩−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。溶液に８０μｌの５ｍＭＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（以下、「ＳＰＤＰ」という、シグマ社）エタノール溶液を添加した後、室温で３０分間、ＰＤＰ化反応を行った。過剰のＳＰＤＰを除くために蒸留水を用いて透析を行った後、凍結乾燥した。９．５ｍｇのＰＤＰ−ＮＡＨ凍結乾燥品を得た。【００４９】
（３）チオプロピオニルＮＡＨ（ＳＨ−ＮＡＨ）の調製
上記（２）で調製したＰＤＰ−ＮＡＨを９．５ｍｇ秤量し、１ｍｌの０．１Ｍ食塩−０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した。溶液に終濃度が２５ｍＭに成るようにジチオスレイトールを添加し、室温で６０分間、還元反応を行った。ＳＨ−ＮＡＨは２倍量のエタノールを用いた溶媒沈殿法で回収した。得られた沈殿はエタノール洗浄後、凍結乾燥した。８．３ｍｇのＳＨ−ＮＡＨ凍結乾燥物を得た。【００５０】
（４）２−ピリジルジスルフィドプロピオニル化タンパク質（ＰＤＰ−タンパク質）の調製
ＢＳＡ（シグマ社製）１００ｍｇ又はＫＬＨ（シグマ社製）６０ｍｇを終濃度２．５ｍｇ／ｍｌに成るように０．１Ｍ食塩−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）へ溶解した。溶液に終濃度が２３８μＭになるように５ｍＭ ＳＰＤＰエタノール溶液を添加した後、室温で３０分間、ＰＤＰ化反応を行った。過剰のＳＰＤＰを除くために反応液を蒸留水に対して一晩、透析した後、凍結乾燥した。凍結乾燥品としてＰＤＰ−ＢＳＡ及びＰＤＰ−ＫＬＨをそれぞれ、１０４．２ｍｇと５９．４ｍｇずつ得た。【００５１】
（５）ジスルフィド結合を介したＮＡＨ−タンパク質コンジュゲート（ＮＡＨ−ＳＳ−ＫＬＨ）の調製
上記（３）で調製したＳＨ−ＮＡＨと上記（４）で調製したＰＤＰ−ＢＳＡを用いて、ＧＡＧ／タンパク質混合比の条件検討を行い、ＧＡＧ／タンパク質混合比を２と決定した。そこで、ＳＨ−ＮＡＨ（１．５ｍｇ）とＰＤＰ−ＫＬＨ（０．７５ｍｇ）を１ｍｌの０．１Ｍ食塩−０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）へ溶解し、室温で２時間、コンジュゲーション反応を行った。反応中に生成されるピリジル−２−チオンを除くために反応液を蒸留水に対して一晩、透析した後、凍結乾燥した。凍結乾燥品としてＮＡＨ−ＳＳ−ＫＬＨを１．９ｍｇ得た。得られたＮＡＨ−ＳＳ−ＫＬＨをＮＡＨ抗原として用いた。【００５２】
２．  ＮＡＨ抗原の調製その２−ＮＡＨのカルボキシル基を介したタンパク質コンジュゲートの調製
参考例１で調製したＮＡＨ及びＢＳＡ（バイエルセロロジカル社製）の１０ｍｇ／ｍｌ溶液を０．１Ｍ 2-モルホリンエタンスルホン酸（以下、「ＭＥＳ」という）緩衝液（ｐＨ５．５）でそれぞれ調製した。Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（以下、「ＥＤＣ」という、ＰＩＥＲＣＥ社製）の１００ｍｇ／ｍｌ溶液を０．１Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ５．５）で調製した。ＮＡＨ溶液（３００μｌ）とＢＳＡ溶液（１５０μｌ）を混合した。混合液に４μｌのＥＤＣ溶液を添加した後、室温で２０時間、コンジュゲーション反応を行った。反応液を蒸留水に対して一晩、透析した後、凍結乾燥した。ＮＡＨ−ＢＳＡ凍結乾燥物を３．５ｍｇ得た。【００５３】
［実施例２］  抗ＮＡＨモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマの取得
（１）免疫
実施例１の「ＮＡＨ抗原の調製その１」で調製したＮＡＨ抗原の終濃度が０．５ｍｇ／ｍｌに成るように、アジュバントとして用いたTiterMAX  Gold（２ｍｌ、シグマ社製）に少量の精製水に溶解したＮＡＨ抗原を添加した（抗原液）。４匹のＢＡＬＢ／Ｃマウス（６週齢メス、日本チャルズリバー）の皮下等に抗原液を１００μｌ／ｈｅａｄずつ、2週間おきに２から３回投与した。さらに、抗原のみを投与する最終免疫を行った。最終免疫の3日後にリンパ節或は脾臓を摘出し免疫感作されたリンパ球を得た。【００５４】
（２）ハイブリドーマの作製
上記（１）で得たリンパ球を、前もって培養中のマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｕ１、シマ研究所）と４.４：１から５：１の割合で混合し、５０％ポリエチレングリコール１５００（ロシュ社製）にて融合させた。融合細胞の培養にはRPMI1640（コージンバイオ社製）に１５％のウシ胎仔血清、HATを添加したものを用い、コロニーが増殖するまでおよそ８日間培養した。クローニング法として、一般によく用いられる限界希釈法を採用した。９６ウェルマイクロプレートに１ウェルあたり細胞が１個以下になるように細胞を上記培地で希釈し、培養を行った。マウス１匹あたり１〜２枚のマイクロプレートを用い、単一クローンとした。尚、クローニングは１〜２回繰返し行った。【００５５】
（３）ＥＬＩＳＡ法による抗体の１次スクリーニング
細胞融合後８日目より、ＥＬＩＳＡ法による抗体の１次スクリーニングを実施した。実施例１の「２．  ＮＡＨ抗原の調製その２」で調製したＮＡＨ−ＢＳＡ又は、実施例１の「１．  ＮＡＨ抗原の調製その１」で調製したＮＡＨ−ＳＳ−ＫＬＨを９６ウェルマイクロプレートに１μg/ｍｌを５０μｌずつ入れ固相化した。抗原液を捨て４倍に希釈したブロックエース（大日本製薬）で室温１時間又は４℃、一晩ブロッキングした。ブロッキング液を捨てた後、培養上清を５０μｌ／ウェルずつ加え、３７℃で１時間インキュベーションした。続いて１０希釈のブロックエースで1０００倍に希釈したアルカリ・ホスファターゼ−抗マウス IgG+M+A（ザイメット社製）を５０μｌ／ウェルずつ加え、３７℃で1時間インキュベーションした。精製水で４回洗浄した後、基質液（ALPローゼ、  シノテスト社製）を５０μｌずつ加え、さらに室温で２０分間インキュベーションした。同じく呈色液を用いて発色させ、４９５ｎｍの吸光度を対照６６０ｎｍで、プレートリーダーを用いて測定した。反応の強い８クローンを選択し、２４ウェルプレートの培養段階で活性を維持していた６クローンを２次スクリーニングで評価した。【００５６】
（４）ＥＬＩＳＡ法による抗体の２次スクリーニング
上記（３）で選択した６クローンについて、２次スクリーニングとして、ビオチン標識NAH（以下、「Ｂｉ−ＮＡＨ」という）を用いたＥＬＩＳＡ法を用いて評価した。
参考例５で作製したＢｉ−ＮＡＨ固相化プレートを洗浄液で4回洗浄した後、各ウェルに培養上清液を１００μｌずつ加え、これを常温（１５〜２５℃）で６０分間静置して抗原抗体反応させた。ブランクは反応液のみのウェルとした。反応終了後、洗浄液で４回洗浄し、各ウェルにホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を反応液で２０００倍希釈した二次抗体溶液を１００μｌずつ加え、これを常温で６０分間静置して抗原抗体反応させた。反応終了後、このプレートを洗浄液で４回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてテトラメチルベンジジン溶液（以下、「ＴＭＢ溶液」という、BIOFX社製）を１００μｌずつ 加え、常温で３０分間反応させ、発色させた。プレートに反応停止液（BIOFX社製）を１００μｌずつ 加えて反応を停止させた後、ＴＭＢ分解（実施例４参照）によって増加する波長４５０nmの吸光度（対照波長６３０nm）をウェルリーダーＳＫ−６０３（登録商標）（生化学工業株式会社販売）で測定した。抗体の反応性は、Ｂｉ−ＮＡＨに対する各クローン培養上清液の吸光度からブランクの吸光度を減算した吸光度差（以下、吸光度差と記載する）で評価した。
このように、当該NAH抗原を免疫し、ハイブリドーマ選択及びモノクローナル化を経て、NAHに対する抗体を産生する３クローン（クローン名：ＮＡＨ３３、ＮＡＨ４３、ＮＡＨ４６）を樹立した。【００５７】
［実施例３］  モノクローナル抗体の精製
（１）腹水採取
各クローンの腹水化はプリスタン処理を行った３匹のBALB/Cマウス（１５週齢メス  日本チャルズリバー社製）を用いた。各マウスの腹腔へ５×１０6個の細胞を移植し、１０日目から２数回にわたり２０日目まで腹水を採取した。各３クローン（ＮＡＨ３３、ＮＡＨ４３、ＮＡＨ４６）の服水採取量はそれぞれ、２０ｍｌ、２６ｍｌと４０ｍｌであった。セルロース・アセテート膜電気泳動分析（ニトロセルロース膜（SERECA-V），60ｍMバルビタールBuffer(ｐH8.6)，１ｍV/ｃｍ(幅)，ニグロシン染色）を用いて採取した腹水の抗体含量を評価した。【００５８】
（２）抗体精製
抗体のアイソタイプを常法に従い試験した結果、３種類の抗体のアイソタイプは何れもＩｇＭ κ-chainであったことから、HiTrap IgY Purification HPカラム（５ｍｌ，アマシャム・バイオサイエンス社製）を用いたクロマトグラフィで抗体を精製した。具体的には、マウス腹水を結合緩衝液（20mMリン酸緩衝液、0.5MK２SO4,ｐH7.5）にて透析し、０．４５μｍフィルターにてろ過した。ろ液を結合緩衝液で十分に置換した上記カラムに通液した。ODをモニタリングしながら値が０になるまで結合緩衝液でカラムを洗浄した後、溶出緩衝液（20mMリン酸緩衝液,pH7.5）を通液し、カラムに結合したタンパク質を溶出させた。溶出タンパク質部分を集め、５０％飽和になるように硫酸アンモニウムを粉末で加え、タンパク質を沈殿させた。遠心処理にて沈殿を集めPBSにて十分に透析した。タンパク質濃度を測り純度検定を行った（A280,1%=13.0にて濃度換算、セルロース・アセテート膜電気泳動による純度検定）。その結果、精製抗体ＮＡＨ３３抗体、ＮＡＨ４３抗体及びＮＡＨ４６抗体をそれぞれ、３．４ｍｇ、０．４ｍｇと３．１ｍｇずつ得た。【００５９】
[実施例４]  精製モノクローナル抗体の特徴
方法
以後、ＮＡＨ３３抗体、ＮＡＨ４３抗体及びＮＡＨ４６抗体について、各種抗原に対する反応性を、Ｂｉ−ＧＡＧ固相化プレートを用いたＥＬＩＳＡ法で検討した。
参考例５で作製したＢｉ−ＧＡＧ固相化プレートを洗浄液で4回洗浄した後、各ウェルに、反応液Ａで濃度を調製した試験抗体を含む溶液（以下、「試験抗体溶液」と記載する。）を１００μｌずつ加え、これを常温で６０分間静置して抗原抗体反応させた。ブランクは反応液Ａのみのウェルとした。反応終了後、洗浄液で４回洗浄し、各ウェルにホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグロブリン抗体（ダコ社製）を反応液Ａで２０００倍希釈した二次抗体溶液を１００μｌずつ加え、これを常温で６０分間静置して抗原抗体反応させた。反応終了後、このプレートを洗浄液で４回洗浄し、ペルオキシダーゼの基質としてテトラメチルベンジジン溶液（以下、「ＴＭＢ溶液」という、BIOFX社製）を１００μｌずつ 加え、常温で３０分間反応させ、発色させた。プレートに反応停止液（BIOFX社製）を１００μｌずつ 加えて反応を停止させた後、ＴＭＢ分解によって増加する波長４５０nmの吸光度（対照波長６３０nm）をウェルリーダーＳＫ−６０３（登録商標）（生化学工業株式会社販売）で測定した。抗体の反応性は、Ｂｉ−ＧＡＧに対して試験抗体溶液を反応させた場合の吸光度から、試験抗体溶液の代わりにブランク（反応液Ａ）を用いた場合の吸光度を減算した吸光度差（以下、吸光度差と記載する）を算出することにより評価した。なお、当該３種類の抗体の試験抗体溶液中の濃度については、各抗体のＢｉ−NAHに対する反応性による至適濃度をあらかじめ検討し、特に断りのない場合、ＮＡＨ３３抗体は０．３μg/mｌ、ＮＡＨ４３抗体は０．８μg/mｌ、ＮＡＨ４６抗体は０．０４μg/mｌとした。ただし、図4中に記載の修飾ＧＡＧの試験においてはＮＡＨ３３抗体は０．２μg/mｌ、ＮＡＨ４３抗体は０．５μg/mｌ、ＮＡＨ４６抗体は０．０２μg/mｌの濃度のものを使用した。【００６０】
結果
１．各種ビオチン標識ＧＡＧ（Ｂｉ−ＧＡＧ）に対する反応性
上記の方法により、３種類の抗体の各種ＧＡＧ（ＮＡＨ、ウシ腎臓由来のＨＳ、ＨＡ、ＨＥＰ、Ｃｈ、ＣＳ−Ａ（Ｓ）、ＣＳ−Ａ（Ｗ）、ＣＳ−Ｂ、ＣＳ−Ｃ、ＣＳ−Ｄ、ＣＳ−Ｅ、ＫＳ）に対する反応性を測定し、特異性を検討した。各種ＧＡＧに対する各抗体の反応性の結果を図２に示した。各抗体の反応性は、吸光度差により評価した（図２）。
ＮＡＨ３３抗体、ＮＡＨ４３抗体、ＮＡＨ４６抗体はいずれも、Ｂｉ−NAH及びＢｉ−ＨＳに反応性を示し、Ｂｉ−ＨＡ、Ｂｉ−ＨＥＰ、Ｂｉ−Ｃｈ、Ｂｉ−ＣＳ−Ａ（Ｓ）、Ｂｉ−ＣＳ−Ａ（Ｗ）、Ｂｉ−ＣＳ−Ｂ、Ｂｉ−ＣＳ−Ｃ、Ｂｉ−ＣＳ−Ｄ、Ｂｉ−ＣＳ−Ｅ及びＢｉ−ＫＳとは全く反応性を示さなかった。【００６１】
２．NAHの類縁体及び修飾体との反応性
上記３種類の抗体の認識部位をより詳細に検討するために、ＮＡＨの類縁体及び修飾体を用いて、その反応性を検討した（図３）。ＮＡＨ類縁体として、特公平7−53756に記載された方法で調製したマウスのＥＨＳ−ＨＳを用いた。マウスのＥＨＳ−ＨＳはＨＳと同様の基本骨格を持ち、D-グルコサミン残基のＮ位が約６５%が硫酸化された分子である。
また、ＮＡＨ修飾体として、前記のＰＤＮＡｃ−ＮＡＨ６０を用いた。各抗体の反応性は、Ｂｉ−ＮＡＨに対する反応性（吸光度差）を100％として、参考例２に記載した方法に準じて調製したビオチン標識ＥＨＳ−ＨＳ（Ｂｉ−ＥＨＳ−ＨＳ）、Ｂｉ−PDNAc-NAH60 に対する反応性を相対値として評価した。測定は、上記「１．各種ビオチン標識ＧＡＧ（Ｂｉ−ＧＡＧ）に対する反応性」に記載の方法と同様の方法により行った。さらに同様の方法により、参考例２の「２．化学修飾GAGのビオチン標識化」に記載のHEPを出発物質とした部位特異的な脱硫酸化体とNAHのN-アセチル化体（Ac-NAH）に対する反応性の試験を行った（図４）。ただし、図４にはＮＡＨの反応性から算出した相対値ではなく、吸光度差を示す。
ＮＡＨ３３抗体はＮＡＨ及びウシ腎臓由来のＨＳと反応したが、ＥＨＳ−ＨＳ及びPDNAc-NAH60とは反応しなかった。この結果は、ＮＡＨ３３抗体のＮＡＨ又はＨＳに対する反応においては、グルコサミン残基のアミノ基がアセチル化されていることが重要で、グルコサミン又はＮ−硫酸化されたグルコサミンは逆に前記反応を妨害する方向に働く可能性を示唆している。以上のことから、ＮＡＨ３３抗体の、ＮＡＨ又はＨＳに対する反応における抗原決定基には、ＧｌｃＮＡｃが含まれており、この構造が反応に重要であることが示唆された。
ＮＡＨ４３抗体はＮＡＨ、ウシ腎臓由来のＨＳ及びＰＤＮＡｃ−ＮＡＨ60と反応したが、反応性の強度はＰＤＮＡｃ−ＮＡＨ60≧ＮＡＨ＞ウシ腎臓由来のＨＳだった。一方、マウスのＥＨＳ−ＨＳとの反応性はＮＡＨとのそれの2％未満だった。この結果は、ＮＡＨ４３抗体のＮＡＨ又はＨＳに対する反応においては、グルコサミン残基のアミノ基がアセチル化されていることは必ずしも重要ではないが、Ｎ−硫酸化されたグルコサミンは逆に前記反応を妨害する方向に働く可能性を示唆している。以上のことから、ＮＡＨ４３抗体の、ＮＡＨ又はＨＳに対する反応における抗原決定基には、ＧｌｃＮＡｃ及びＧｌｃＮＨ２が含まれていることが示唆された。
ＮＡＨ４６抗体はＮＡＨ、ウシ腎臓由来のＨＳ及びＰＤＮＡｃ−ＮＡＨ60と反応したが、反応性の強度はＮＡＨ＞ウシ腎臓由来のＨＳ＝ＰＤＮＡｃ−ＮＡＨ60だった。一方、マウスのＥＨＳ−ＨＳとの反応性はＮＡＨのそれの5％程度にすぎなかった。この結果は、ＮＡＨ４６抗体のＮＡＨ又はＨＳに対する反応においては、グルコサミン残基のアミノ基がアセチル化されていることが重要で、グルコサミン又はＮ−硫酸化されたグルコサミンは逆に前記反応を妨害する方向に働く可能性を示唆している。以上のことから、ＮＡＨ４６抗体の、ＮＡＨ又はＨＳに対する反応における抗原決定基には、ＧｌｃＮＡｃが含まれており、この構造が反応に重要であることが示唆された。【００６２】
３．各抗体の特異性の確認
上記３種類の抗体の反応特異性を確認するために、Ｂｉ−ＮＡＨ、Ｂｉ−ＨＳ、Ｂｉ−PDNAc-NAH60をヘパリチナーゼ（生化学工業株式会社製）を用いて分解し、各抗体の反応性が低下又は消失するか否か検討した。ヘパリチナーゼはApplieDuo（登録商標）（最終希釈率２０倍、生化学工業株式会社製）、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム（ナカライテスク社製）、５ｍＭ  塩化カルシウム（和光純薬社製）、防腐剤として０．０５％プロクリン３００を含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ社製）塩酸緩衝液（ｐＨ７．３−７．７）（以下、「ヘパリチナーゼ希釈液」という）で50mU／ｍL調製した。上記実施例のように作製したＢｉ−ＧＡＧ固相化プレート及びＢｉ−PDNAc-NAH60固相化プレートを洗浄液で４回洗浄し、希釈したヘパリチナーゼ溶液を１００μL／ｗｅｌｌで添加後、３７℃、２時間静置することにより、固相Ｂｉ−ＧＡＧ又は固相Ｂｉ−PDNAc-NAH60を消化した。消化後、プレートを同様に洗浄し、３種類の抗体を上記実施例に記載の方法に準じて添加、その後の操作を行い、反応性を測定した。反応性の評価は吸光度差とした。結果を図５（A）〜（C）に示す。
上記３種類の抗体の反応性は、ヘパリチナーゼ消化により、いずれのＢｉ−ＧＡＧ及びＢｉ−PDNAc-NAH60対してもほとんど消失した。このことから、３種類の抗体が各ＧＡＧ及びＧＡＧ修飾体に特異的に反応することが確認できた。【００６３】
[実施例５]  Ｂｉ−ＧＡＧ濃度を変化させた場合の反応性
各種Ｂｉ−ＧＡＧの濃度を０．０〜１．０μｇ/ｍＬの範囲内で変化させたことの他、実施例４と同様の方法により、それぞれの抗体の反応性の分析を行った。ここでは上記Ｂｉ−PDNAc-NAHとして、参考例１に記載したPDNAc-NAH30、PDNAc-NAH60、PDNAc-NAH120を用いた。結果を図６(a)〜(f)に示す。さらに、「２．化学修飾GAGのビオチン標識化」に記載の各種ＧＡＧに対する結果を、図７(a)〜(c)に示す。【００６４】
[実施例６]
（１）ラット腎臓凍結切片を用いて免疫組織染色で染色性を検討した。
ＳＤラット（日本チャールスリバー社、８週齢、雄）をジエチルエーテル（和光純薬工業社製）で麻酔し、腹部大動脈より放血、屠殺後、腎臓を摘出した。摘出した腎臓はＯＣＴコンパウンド（三共マイルス社製）に包埋し、アセトン・ドライアイスで凍結させ、クリオスタット（ライカ社販売）にて厚さ6μmの切片を作製した。
作製した切片は２時間常温にて風乾後、冷アセトン（４℃）で固定を行い、さらに常温で１時間風乾した。その後、ＰＢＳ（−）で洗浄し、０．１％アジ化ナトリウム（和光純薬工業社製）−０．３％過酸化水素水（和光純薬工業社製）を含む蒸留水中に常温で１０分間浸漬し、内因性のペルオキシダーゼ活性を除去した後ＰＢＳ（−）で洗浄し、０．１％カゼイン（和光純薬工業社製）を含むＰＢＳ（−）（以下「ＰＢＳ」という）でブロッキングを常温で６０分間行った。
ＰＢＳ（−）で洗浄後、アビジン−ビオチンブロッキングキット（ＶＥＣＴＯＲ社製）にて内因性のビオチンのブロッキングを行った。
その後ＰＢＳ（−）で洗浄し、ＮＡＨ３３抗体、ＮＡＨ４３抗体、ＮＡＨ４６抗体をＰＢＳでそれぞれ０．５μg/mL、２μg/mL、０．５μg/mLに希釈し、４℃で一晩反応させた。ＰＢＳ（−）で洗浄後、１０％ラット血清を含むビオチン標識抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（ＪＡＣＫＳＯＮ社製）をＰＢＳで５００倍に希釈し、常温で３０分間反応させた。ＰＢＳ（−）で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ニチレイ社製）を常温にて３０分間反応させた。ＰＢＳ（−）で洗浄後ＤＡＢ発色キット（Ｚｙｍｅｄ社製）にて茶色の発色反応を行った。
発色後、ＰＢＳ（−）に浸漬し反応を停止させ、常水にて５分間洗浄した。その後対比染色を行うためヘマトキシリン（ＤＡＫＯ社製）にて核染色（青色）を行った。常水にて５分間洗浄後、常法に従い脱水、透徹操作を行い封入した。【００６５】
染色像を図８に示した。
ＮＡＨ３３抗体及びＮＡＨ４６抗体は腎糸球体基底膜、血管内皮及びボーマン嚢に茶色の強い陽性反応（矢印）が見られたのに対してＮＡＨ４３は腎糸球体基底膜と血管内皮に陽性反応（矢頭）が観察された。【００６６】
（２）ヘパリチナーゼ消化による特異性の確認
上記方法にて切片を作製し、同様に冷アセトン固定（４℃）を行い風乾した。ＰＢＳ（−）で洗浄後、ヘパリチナーゼＩ（生化学工業株式会社製）を１μＭ酢酸カルシウム（和光純薬工業社製）を含む２０ｍＭ酢酸（和光純薬工業社製）緩衝液（ｐＨ７．０）（以下「緩衝液」という）に２５０ｍＵ／ｍｌとなるように希釈し、３７℃で２時間反応させた。対照として緩衝液のみを同様に反応させた。ＰＢＳ（−）で洗浄後上記方法と同様に抗体を反応させ、ＤＡＢ発色キット（Ｚｙｍｅｄ社製）を用い茶色の発色反応を行った。
発色後、ＰＢＳ（−）に浸漬し反応を停止させ、常水にて５分間洗浄した。その後対比染色を行うためヘマトキシリン（ＤＡＫＯ社製）にて核染色（青色）を行った。常水にて５分間洗浄後、常法に従い脱水、透徹操作を行い封入した。【００６７】
染色像を図９に示した。
対照と比較してヘパリチナーゼ消化したものは、陽性反応（茶色）の消失又は減衰が認められ、ＨＳを特異的に認識していることが確認された。【００６８】
[実施例７]  抗体固相化プレートを用いたウシ腎臓由来のＨＳの検出
本発明抗体のＮＡＨ４６抗体を用い、抗体固相化プレートを用いたウシ腎臓由来のＨＳの検出を行った。
１．方法
（１）抗体固相化プレートの作製
ＮＡＨ４６抗体をＰＢＳ（−）で２０μｇ／ｍｌに希釈し、この抗体溶液をマキシソープ（登録商標） ９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに５０μｌずつ加え、４℃で１４〜１８時間保存することにより、均一にコーティングした。このプレートをＰＢＳ（−）で２回洗浄し、ブロッキング物質としてＡｐｐｌｉｅＤｕｏ（最終希釈率５倍）を、また防腐剤として０．０５％プロクリン（登録商標）３００を含むリン酸緩衝液（上記ＰＢＳ（−）のうち、塩化ナトリウム、塩化カリウム不含、pH7.2〜7.5）を加え、常温で2時間静置した。静置後、ブロッキング溶液を十分に除去し、３７℃で２時間乾燥させることにより、所望するＮＡＨ４６抗体固相化プレートを得た。ＮＡＨ４６抗体固相化プレートは乾燥剤とともにアルミラミネート袋に封入し、冷蔵保存した。
上記におけるＮＡＨ４６抗体を、ＪＭ４０３及び１０Ｅ４（ともに生化学工業株式会社製）に代えることの他、同様にしてＪＭ４０３固相化プレート及び１０Ｅ４固相化プレートを作製した。【００６９】
（２）ＨＲＰ標識抗体溶液の調製
ＮＡＨ４６抗体溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を、市販のＨＲＰ標識キット（同仁化学社製）により、所定の方法に従ってＨＲＰ標識した。得られたＨＲＰ標識抗体はそれぞれ、ＡｐｐｌｉｅＤｕｏ（最終希釈率２０倍）、ｐＨ７．３〜７．７ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ）、ＮａＣｌ（８ｇ／リットル）、Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）、防腐剤としてプロクリン３００（０．０５％）を含む溶液（以下、「測定用反応液」という）を用いて８００倍に希釈し、ＨＲＰ標識抗体溶液を得た。
上記におけるＮＡＨ４６抗体を、ＪＭ４０３及び１０Ｅ４に代えることの他、同様にしてＪＭ４０３及び１０Ｅ４のＨＲＰ標識抗体溶液を調製した。【００７０】
（３）ウシ腎臓由来のＨＳの検出
上記（１）記載の抗体固相化プレートの各ウェルに、測定用反応液を１００μｌずつ添加した。続いて、このウェルに、測定用反応液で約１０．０、５．０、２．５、１．２５、０．６３、０．３１、０．１６μｇ／ｍｌに調製したウシ腎臓由来のＨＳ溶液を２０μｌずつ添加し、４℃で１８時間静置し、「固相化抗体―ウシ腎臓由来のＨＳ」の複合体を形成させた（第一反応）。なお、測定用反応液のみ（ウシ腎臓由来のＨＳ；０μｇ／ｍｌ）を添加したウェルをブランクとした。上記の第一反応の後、各ウェルを３００μｌの洗浄液（ｐＨ７．３〜７．７ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０mM）、ＮａＣｌ（８ｇ／リットル）、Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）、プロクリン３００（０．０５％）を含む溶液）で４回洗浄した。洗浄後、上記（２）で調製したＨＲＰ標識抗体溶液を、下記の表４に示す組み合わせとなる様、各ウェルにそれぞれ１００μｌずつ添加し、４℃で３時間静置し、「固相化抗体−ウシ腎臓由来のＨＳ−ＨＲＰ標識抗体」の複合体を形成させた（第二反応）。【００７１】
【表４】
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【００７２】
各ウェルを上記と同様の方法により洗浄し、上記複合体中のＨＲＰを検出するため、ペルオキシダーゼの基質としてＴＭＢ溶液を１００μｌずつ加え、常温（１５〜２５℃）で３０分間静置して発色させた。続いて反応停止液（ＢＩＯＦＸ社製）を１００μｌずつ加えて反応を停止させた後、ＴＭＢ分解によって生じる分解産物の吸光波長である４５０ｎｍの吸光度（対照波長６３０ｎｍ）をウェルリーダーＳＫ−６０３で測定した。ウシ腎臓由来のＨＳの検出は、ブランクの吸光度を減算した吸光度差で評価した。【００７３】
２．結果
図１０及び１１に示した通り、固相化抗体としてＮＡＨ４６抗体を用い、ＨＲＰ標識抗体としてＮＡＨ４６抗体、ＪＭ４０３、１０Ｅ４のいずれかを用いた場合、及び、ＨＲＰ標識抗体としてＮＡＨ４６抗体を用い、固相化抗体としてＪＭ４０３又は１０Ｅ４を用いた場合のいずれによっても、ウシ腎臓由来のＨＳを検出可能であり、濃度依存的な反応性を示すことが明らかとなった。【００７４】
[実施例８]  フローサイトメトリー法を用いた細胞表面のＨＳの検出
本発明抗体のＮＡＨ４６抗体を用い、フローサイトメトリー法（以下、ＦＣＭという）により細胞表面のＨＳの検出を行った。
１．方法
（１）細胞の調製
ｃｏｌｏ２０１細胞(ヒト大腸ガン由来、大日本製薬社販売)を培地に懸濁し、ＣＯ２インキュベーター(池本理化社製、５％ＣＯ２存在下、３７℃)で3日間培養した。上記において培地としては、RPMI 1640 with L-glutamine(ＳＩＧＭＡ社製)に、非働化ウシ胎児血清(ＩＣＮ社製)を10%の濃度となるように、またペニシリン−ストレプトマイシン(大日本製薬社製)をペニシリンGナトリウム、硫酸ストレプトマイシンとしてそれぞれ６０ＩＵ／ｍＬ、６０μｇ／ｍＬの濃度となるように加えたものを用いた。得られた培養細胞は１０6個/ｍＬとなるようにＰＢＳ（−）に懸濁した。この懸濁液の一部を分取し、５０ｍＵ／ｍｌのヘパリチナーゼＩ（生化学工業株式会社製）を含むＰＢＳ（−）に懸濁し、３７℃で２０分間、遮光下で反応させ、細胞表面のＨＳを消化した細胞を、ＨＳ陰性細胞とした。ヘパリチナーゼＩを含まないＰＢＳ（−）で同様に処理した培養細胞を、ＨＳ陽性細胞とした。【００７５】
（２）ＦＣＭ
（１）で得られたＨＳ陽性細胞及びＨＳ陰性細胞を、それぞれＰＢＳ（−）を用いて遠心(１５００ｒｐｍ、５分、４℃、以下同様。)洗浄を２回行い、１０μｇ/ｍＬのＮＡＨ４６抗体溶液に懸濁し、４℃で３０分間、遮光下で反応させた。これらについて遠心洗浄を２回行い、ＰＢＳ（−）で５０倍に希釈したＦＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（ＪＡＣＫＳＯＮ社製）と、４℃で３０分間、遮光下で反応させた。これらについて、さらに遠心洗浄を２回行った後、１ｍＬのＰＢＳ（−）に懸濁し、フィルター付チューブ(ベクトンディッキンソン社製)でろ過した。得られた細胞懸濁液を、フローサイトメーター  ＥＰＩＣＳ  ＸＬ−ＭＣＬ(ベックマンコールター社製)を用いて解析した。
なお、上記のＮＡＨ４６抗体をマウスＩｇＭ（ＳＩＧＭＡ社製）に変え、同様の処理・解析を行った結果を陰性の対照とした。以下、マウスＩｇＭを陰性対照抗体という。【００７６】
２．結果
ＨＳ陽性細胞に対して、陰性対照抗体は反応しなかった一方（図１２（Ａ））、ＮＡＨ４６抗体は反応し（図１２（Ｂ））、ｃｏｌｏ２０１細胞表面に存在するＨＳを検出した。
ＨＳ陰性細胞に対して、陰性対照抗体、ＮＡＨ４６抗体は反応しなかった（図１２（Ｃ））。このことからＮＡＨ４６抗体は、ｃｏｌｏ２０１細胞表面に存在するＨＳを、特異的に認識していることが確認された。
以上のことから、本発明抗体によって、細胞表面に存在するＨＳを特異的に検出することができることが明らかになった。
【産業上の利用の可能性】
【００７７】
本発明の抗体は、ＮＡＨ及びウシ腎臓由来のＨＳに対して反応するため、試料中のＨＳ又はＮＡＨの検出に好適に用いることができる。また、マウスのＥＳＨ−ＨＳと実質的に反応しないため、硫酸化度が低いＨＳ等を特異的に検出することができる。また本発明の抗体は、ＨＳのＮ−アセチルグルコサミンユニット又はグルコサミンユニットからなる非硫酸化部位を特異的に認識し得ることから、上記構造の特異的な検出に応用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図８】
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【図９】
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