(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）トリプトファン残基の酸化度が未知であるタンパク質試料Ａと、トリプトファン残基の酸化度が未知であるタンパク質試料Ｂとを用意し、
（ｉｉ）修飾試薬として、互いに同じ分子構造を有し、且つ互いに質量数の異なる同位体を含むことによって異なる分子量を有する２種の化合物を用意し、
前記タンパク質試料Ａに対し、前記２種の化合物のうちいずれか一方の化合物を用いてトリプトファン残基の修飾を行い、修飾タンパク質試料Ａ’を得て、
別途、前記タンパク質試料Ｂに対し、前記２種の化合物のうちいずれか他方の化合物を用いてトリプトファン残基の修飾を行い、修飾タンパク質試料Ｂ’を得て、
（ｉｉｉ）前記修飾タンパク質試料Ａ’と前記修飾タンパク質試料Ｂ’とを混合し、質量分析用混合試料を得て、
（ｉｖ）前記質量分析用混合試料を質量分析に供し、タンパク質試料Ａ及びタンパク質試料Ｂの各々におけるトリプトファン残基の酸化度を定量することを含む、タンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の定量を行う方法。
【請求項２】
前記修飾試薬が、スルフェニル化合物である、請求の範囲第１項に記載のタンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の定量を行う方法。
【請求項３】
前記スルフェニル化合物が、アリールスルフェニルハライドである、請求の範囲第２項に記載のタンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の定量を行う方法。
【請求項４】
前記アリールスルフェニルハライドが、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロライドである、請求の範囲第３項に記載のタンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の定量を行う方法。
【請求項５】
請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の方法を行い、その後、アミノ酸配列決定を行うことにより、タンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の位置を決定する方法。
【請求項６】
（ｉ）トリプトファン残基の酸化度を定量すべきタンパク質試料Ｃと、トリプトファン残基の酸化度が既知であるタンパク質試料Ｄとを用意し、
（ｉｉ）修飾試薬として、互いに同じ分子構造を有し、且つ互いに質量数の異なる同位体を含むことによって異なる分子量を有する２種の化合物を用意し、
前記タンパク質試料Ｃに対し、前記２種の化合物のうちいずれか一方の化合物を用いてトリプトファン残基の修飾を行い、修飾タンパク質試料Ｃ’を得て、
別途、前記タンパク質試料Ｄに対し、前記２種の化合物のうちいずれか他方の化合物を用いてトリプトファン残基の修飾を行い、修飾タンパク質試料Ｄ’を得て、
（ｉｉｉ）前記修飾タンパク質試料Ｃ’と前記修飾タンパク質試料Ｄ’とを混合し、質量分析用混合試料を得て、
（ｉｖ）前記質量分析用混合試料を質量分析に供することによって、前記タンパク質試料Ｃにおけるトリプトファン残基の酸化度を定量することを含む、タンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の定量を行う方法。
【請求項７】
前記修飾試薬が、スルフェニル化合物である、請求の範囲第６項に記載のタンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の定量を行う方法。
【請求項８】
前記スルフェニル化合物が、アリールスルフェニルハライドである、請求の範囲第７項に記載のタンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の定量を行う方法。
【請求項９】
前記アリールスルフェニルハライドが、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロライドである、請求の範囲第８項に記載のタンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の定量を行う方法。
【請求項１０】
請求の範囲第６〜９項のいずれか１項に記載の方法を行い、その後、アミノ酸配列決定を行うことにより、タンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の位置を決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質・ペプチド化学分野、及び質量分析学分野に関する。より詳しくは、本発明は、タンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の定量及び位置決定を行う方法（Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｏｘｉｄｉｚｅｄ  Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、酸化トリプトファン残基の定量は、紫外可視スペクトルを測定し、酸化による吸光度の変化を解析することにより行われてきた（例えば、Ｗ．Ｅ．Ｓａｖｉｇｅ  ａｎｄ  Ａ．Ｆｏｎｔａｎａ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５，２８５（１９８０）参照）。
一方、タンパク質・ペプチド中のトリプトファン残基を選択的に修飾することができる物質として、スルフェニルハライド（例えば、Ｓｃｏｆｆｏｎｅ  Ｅ，Ｆｏｎｔａｎａ  Ａ，Ｒｏｃｃｈｉ  Ｒ，Ｓｕｌｆｅｎｙｌ  Ｈａｌｉｄｅｓ  ａｓ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｉ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７（１９６８）９７１−９７９参照）や、ベンジルハライド（例えば、Ｈｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ  Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ，Ｊｒ．（１９７２），Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｔｉｖｅ  ｂｅｎｚｙｌ  ｈａｌｉｄｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，２５，４６８−４８２参照）などが知られている。
そして、タンパク質・ペプチド中のトリプトファン残基に着目した定量プロテオーム解析が、スルフェニルハライドの安定同位体標識化合物を用いて行われている（例えば、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，１７，１６４２−１６５０（２００３）、国際公報第２００４／００２９５０号パンフレット参照）。
【非特許文献１】Ｗ．Ｅ．サヴィージ（Ｗ．Ｅ．Ｓａｖｉｇｅ）及びＡ．フォンタナ（Ａ．Ｆｏｎｔａｎａ）、「インターナショナル・ジャーナル・オブ・ペプチド・アンド・プロテイン・リサーチ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９８０年、第１５巻、ｐ．２８５
【非特許文献２】スコフォン・Ｅ（Ｓｃｏｆｆｏｎｅ  Ｅ）、フォンタナ・Ａ（Ｆｏｎｔａｎａ  Ａ）、及びロッチ・Ｒ（Ｒｏｃｃｈｉ  Ｒ）、「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９６８年、第７巻、ｐ．９７１−９７９
【非特許文献３】ホートン・Ｈ・Ｒ（Ｈｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｒ．）及びコシュランド・ＤＥ・ジュニア（Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ，Ｊｒ．）、「メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）」、１９７２年、第２５巻、ｐ．４６８−４８２
【非特許文献４】「ラピッド・コミュニケーションズ・イン・マス・スペクトロメトリー（Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）」２００３年、第１７巻、ｐ．１６４２−１６５０
【特許文献１】国際公報第２００４／００２９５０号パンフレット
【発明の開示】
【０００３】
発明の目的
生体内で起こるタンパク質の酸化は、タンパク質の活性の低下、毒性発現などを引き起こすものであり、白内障、肺気腫、リウマチ、喘息などと関わっていることが報告されている。さらに、タンパク質の酸化はどの位置においても一様に進行するのではなく、酸化を受けやすい位置とそうでない位置がある。様々なｉｎ  ｖｉｖｏ或いはｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件における酸化の位置とその程度とを知ることは、生命現象、構造活性相関などの解明に大きな意味を持つと考えられる。
本発明では、トリプトファン残基の酸化度に着目した。トリプトファン残基はメチオニン残基と並んで酸化されやすいアミノ酸残基であるため、酸化ストレス、加齢変化などの研究において注目されている。
上に挙げた従来技術のうち、紫外可視スペクトルを用いた酸化トリプトファン残基の定量方法では、精度の良い定量を行うことはできない。また、タンパク質中のどのトリプトファン残基が酸化されているのかもわからない。
なお、上に挙げた従来技術のうち、スルフェニルハライドの安定同位体標識化合物を用いた定量プロテオーム解析においては、酸化トリプトファン残基の定量については示唆されていない。
本発明の目的は、タンパク質・ペプチド中のトリプトファン残基の酸化の程度を決定することができる方法、及び、酸化を受けたトリプトファン残基の位置を決定することができる方法を提供することにある。
発明の概要
本発明には、以下の発明が含まれる。
下記（１）〜（４）の発明は、タンパク質の酸化度の相対量を定量する方法である。
（１）    （ｉ）トリプトファン残基の酸化度が未知であるタンパク質試料Ａと、トリプトファン残基の酸化度が未知であるタンパク質試料Ｂとを用意し、
（ｉｉ）修飾試薬として、互いに同じ分子構造を有し、且つ互いに質量数の異なる同位体を含むことによって異なる分子量を有する２種の化合物を用意し、
前記タンパク質試料Ａに対し、前記２種の化合物のうちいずれか一方の化合物を用いてトリプトファン残基の修飾を行い、修飾タンパク質試料Ａ’を得て、
別途、前記タンパク質試料Ｂに対し、前記２種の化合物のうちいずれか他方の化合物を用いてトリプトファン残基の修飾を行い、修飾タンパク質試料Ｂ’を得て、
（ｉｉｉ）前記修飾タンパク質試料Ａ’と前記修飾タンパク質試料Ｂ’とを混合し、質量分析用混合試料を得て、
（ｉｖ）前記質量分析用混合試料を質量分析に供し、タンパク質試料Ａ及びタンパク質試料Ｂの各々におけるトリプトファン残基の酸化度を定量することを含む、タンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の定量を行う方法。
上記（１）において、タンパク質とは、比較的分子量の小さいペプチドをも含む意味で用いる。
上記（１）においては、工程（ｉ）で２種類のタンパク質試料を用意し、工程（ｉｉ）で同位体組成のみが異なる２種類の修飾試薬を用いて当該２種のタンパク質試料を別々に修飾し（すなわち同位体標識法によりいずれか一方のタンパク質試料を同位体標識し）、工程（ｉｉｉ）で２種類の修飾タンパク質試料を混合し、工程（ｉｖ）で質量分析を行う。
また、上記（１）において、工程（ｉｉｉ）で得られる質量分析用混合試料は、本発明の方法に供する試料の種類によって必要に応じた処理が適宜行われたものであって良い。すなわち、工程（ｉｉｉ）において、混合処理とともに、脱塩処理、乾燥処理、再可溶化処理、還元アルキル化処理、断片化処理、濃縮分離処理及び分画処理などから選ばれる処理が当業者によって適宜行われて良い。
（２）  前記修飾試薬が、スルフェニル化合物である、（１）に記載のタンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の定量を行う方法。
（３）  前記スルフェニル化合物が、アリールスルフェニルハライドである、（２）に記載のタンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の定量を行う方法。
（４）前記アリールスルフェニルハライドが、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロライドである、（３）に記載のタンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の定量を行う方法。
下記（５）の発明は、タンパク質のトリプトファン残基の酸化位置を決定する方法である。
（５）    （１）〜（４）のいずれかに記載の方法を行い、その後、アミノ酸配列決定を行うことにより、酸化されたトリプトファン残基の位置を決定する方法。
下記（６）〜（９）の発明は、タンパク質の酸化度の絶対量を定量する方法である。
（６）    （ｉ）トリプトファン残基の酸化度を定量すべきタンパク質試料Ｃと、トリプトファン残基の酸化度が既知であるタンパク質試料Ｄとを用意し、
（ｉｉ）修飾試薬として、互いに同じ分子構造を有し、且つ互いに質量数の異なる同位体を含むことによって異なる分子量を有する２種の化合物を用意し、
前記タンパク質試料Ｃに対し、前記２種の化合物のうちいずれか一方の化合物を用いてトリプトファン残基の修飾を行い、修飾タンパク質試料Ｃ’を得て、
別途、前記タンパク質試料Ｄに対し、前記２種の化合物のうちいずれか他方の化合物を用いてトリプトファン残基の修飾を行い、修飾タンパク質試料Ｄ’を得て、
（ｉｉｉ）前記修飾タンパク質試料Ｃ’と前記修飾タンパク質試料Ｄ’とを混合し、質量分析用混合試料を得て、
（ｉｖ）前記質量分析用混合試料を質量分析に供することによって、前記タンパク質試料Ｃにおけるトリプトファン残基の酸化度を定量することを含む、タンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の定量を行う方法。
上記（６）において、タンパク質とは、比較的分子量の小さいペプチドをも含む意味で用いる。
上記（６）においては、工程（ｉ）で２種類のタンパク質試料を用意し、工程（ｉｉ）で同位体組成のみが異なる２種類の修飾試薬を用いて当該２種のタンパク質試料を別々に修飾し（すなわち同位体標識法によりいずれか一方のタンパク質試料を同位体標識し）、工程（ｉｉｉ）で２種類の修飾タンパク質試料を混合し、工程（ｉｖ）で質量分析を行う。
また、上記（６）において、工程（ｉｉｉ）で得られる質量分析用混合試料は、本発明の方法に供する試料の種類によって必要に応じた処理が適宜行われたものであって良い。すなわち、工程（ｉｉｉ）において、混合処理とともに、脱塩処理、乾燥処理、再可溶化処理、還元アルキル化処理、断片化処理、濃縮分離処理及び分画処理などから選ばれる処理が当業者によって適宜行われて良い。
（７）  前記修飾試薬が、スルフェニル化合物である、（６）に記載のタンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の定量を行う方法。
（８）  前記スルフェニル化合物が、アリールスルフェニルハライドである、（７）に記載のタンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の定量を行う方法。
（９）前記アリールスルフェニルハライドが、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロライドである、（８）に記載のタンパク質中の酸化されたトリプトファン残基の定量を行う方法。
下記（１０）の発明は、タンパク質のトリプトファン残基の酸化位置を決定する方法である。
（１０）    （６）〜（９）のいずれかに記載の方法を行い、その後、アミノ酸配列決定を行うことにより、酸化されたトリプトファン残基の位置を決定する方法。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、本発明において、トリプトファン残基の酸化度が共に未知である、タンパク質試料Ａとタンパク質試料Ｂとを解析対象とした場合の一例を概説する図である。
図２は、本発明において、トリプトファン残基の酸化度が未知であるタンパク質試料Ｃと、トリプトファン残基が酸化されていないこと（すなわち酸化度が０％であること）が分かっている非酸化タンパク質試料Ｄとを解析対象とした場合の一例を概説する図である。
図３は、トリプトファン残基非酸化ＤＳＩＰ試料を用い、５０％のトリプトファン残基が酸化されているＤＳＩＰ試料について、本発明のトリプトファン残基酸化度の定量を行った結果を示すＭＳスペクトルである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
（ｉ：タンパク質試料の準備）
まず、トリプトファン残基の酸化状態を調べるための２種類のタンパク質試料を用意する。２種のタンパク質試料としては、以下の関係にあるものを挙げることができる。
例えば、一方のタンパク質がある検体に由来するタンパク質試料であり、他方のタンパク質が別の検体に由来するタンパク質試料である場合；一方のタンパク質が解析すべきタンパク質試料であり、他方のタンパク質試料が前記一方のタンパク質に対する対照タンパク質である場合；一方のタンパク質試料が病態サンプルから抽出したタンパク質試料であり、他方のタンパク質試料が正常サンプルから抽出したタンパク質試料である場合、などが挙げられる。
本発明に供する２種のタンパク質は、後の質量分析において解析を行いやすいように、互いに同じ量を用意することが好ましい。２種のタンパク質は、少なくとも一方の酸化度が未知であり、両者の酸化度が異なれば、両タンパク質試料におけるタンパク質のそれぞれの平均分子量は厳密には異なってくる。しかしながら、本発明においてターゲットとするトリプトファン残基はタンパク質中での出現頻度が最も少ない部類に属するアミノ酸であるため、当該平均分子量の差は本質的に無視できるものと考えることができる。
２種のタンパク質試料の両方においてトリプトファン残基の酸化度が未知である場合（この場合、２種のタンパク質試料をタンパク質試料Ａ及びＢと記載する場合がある）は、本発明によって、それぞれのタンパク質試料の相対的な酸化度を知ることができる。２種のタンパク質試料のうちいずれか一方の酸化度が未知であり、いずれか他方の酸化度が既知である場合（この場合、一方のタンパク質試料をタンパク質試料Ｃ、他方のタンパク質試料をタンパク質試料Ｄと記載する場合がある）、前記一方のタンパク質試料について絶対的な酸化度を知ることができる。
タンパク質試料は、可溶化処理が行われたものであっても良い。可溶化の方法としては、特に限定されない。例えば、変性剤として、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤、尿素、グアニジン塩酸塩などを用いてタンパク質を可溶化することができる。変性剤の濃度は特に限定されず、タンパク質試料の可溶化及び変性が起こるように、タンパク質試料の種類やその他の条件等を考慮して当業者が適宜決定すればよい。反応条件についても、常温変性及び熱変性を問わず、使用する変性剤を考慮して当業者が適宜決定すればよい。
（ｉｉ）タンパク質試料の修飾
本工程では、いわゆる同位体標識法により、２種類のタンパク質のいずれか一方を同位体標識する。この際、同位体標識法を行うための修飾試薬によって、２種類のタンパク質両方において、酸化されていないトリプトファン残基が修飾される。
修飾試薬としては、トリプトファン残基への選択的修飾能を有し、且つ酸化されたトリプトファン残基に対しては反応しない化合物を特に限定することなく用いることができる。
トリプトファン残基は、側鎖インドール環の２位が最も反応性が高く、通常はこの位置で酸化が起こる。そこで、本発明で用いるトリプトファン残基に対する修飾試薬としては、トリプトファン残基が酸化されていない場合は側鎖インドール環の２位への反応性を有し、トリプトファン残基が酸化されている場合はそのような反応性を有しない特性を有する化合物が用いられる。
なおかつ、本発明における修飾試薬は、互いに分子構造は同じであるが、互いに質量数の異なる同位体を含むことによって分子量が異なる２種の化合物を組み合わせて用いる。このうち、分子量が大きい化合物を重い試薬とし、分子量が小さい試薬を軽い試薬とする。より具体的にいうと、修飾試薬分子を構成する少なくとも１種類の元素が安定同位体で標識された化合物と、それとは同一構造であるが、前述の元素が前記安定同位体とは別の安定同位体で標識された化合物とを組み合わせて用いる。そして、質量数の大きい安定同位体で標識された化合物の方を重い試薬として、他方の化合物を軽い試薬として用いる。
なお、安定同位体で標識される元素は複数であっても良い。
具体的には、タンパク質試料Ａ及びＢを用意した場合は、タンパク質試料Ａを重い試薬及び軽い試薬のうちいずれか一方で修飾し、修飾タンパク質試料Ａ’を得て、タンパク質試料Ｂを重い試薬及び軽い試薬のうちいずれか他方で修飾し、修飾タンパク質試料Ｂ’を得る。同様に、タンパク質試料Ｃ及びＤを用意した場合、タンパク質試料Ｃを重い試薬及び軽い試薬のうちいずれか一方で修飾し、修飾タンパク質試料Ｃ’を得て、タンパク質試料Ｄを重い試薬及び軽い試薬のうちいずれか他方で修飾し、修飾タンパク質試料Ｄ’を得る。
本発明において用いることができる修飾試薬としては、一般式１：Ｒ１−Ｓ−Ｘ１（Ｒ１は有機基を表し、Ｘ１は脱離基を表す）で表される構造を有する化合物や、一般式２：Ｒ２−Ｘ２（Ｒ２は置換されてよいアラルキル基を表し、Ｘ２は脱離基を表す）で表される構造を有する化合物などが挙げられる。
上記一般式１で表される化合物、すなわちスルフェニル化合物としては、上記一般式１におけるＲ１が置換されてよいアリール基である、アリールスルフェニルハライドが好ましい。さらに、アリールスルフェニルハライドとしては、２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリド（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｅｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＮＢＳＣｌ）が好ましい。
２−ニトロベンゼンスルフェニルクロリドを用いる場合、下記式に示すように、重い試薬としての２−ニトロ［１３Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド（ＮＢＳＣｌ  ｈｅａｖｙ）と、軽い試薬としての２−ニトロ［１２Ｃ６］ベンゼンスルフェニルクロリド（ＮＢＳＣｌ  ｌｉｇｈｔ）とを組み合わせて用いることが好ましい。
ＮＢＳＣｌ  ｈｅａｖｙ試薬及びＮＢＳＣｌ  ｌｉｇｈｔ試薬は、ともに島津製作所製１３Ｃ  ＮＢＳ（Ｒ）Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−Ｎに収容されて販売されている。
0004656236.tif 000002
なお、タンパク質・ペプチド中のトリプトファン残基に対する修飾試薬としてのスルフェニル化合物については、国際公報第２００４／００２９５０パンフレットなどに詳述されている。
上記一般式２で表される化合物としては、ベンジルハライドが好ましい。さらに、ベンジルハライドとしては、２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミド（２−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ  ｂｒｏｍｉｄｅ）などが挙げられる。
２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロミドを用いる場合、下記式に示すように、重い試薬としての２−ヒドロキシ−５−ニトロ［１３Ｃ６］ベンジルブロミドと、軽い試薬としての２−ヒドロキシ−５−ニトロ［１２Ｃ６］ベンジルブロミドとを組み合わせて用いることが好ましい。
0004656236.tif 000003
なお、タンパク質・ペプチド中のトリプトファン残基に対する修飾試薬としてのベンジルハライド化合物については、Ｈｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ  Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ，Ｊｒ．（１９７２），Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｔｉｖｅ  ｂｅｎｚｙｌ  ｈａｌｉｄｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，２５，４６８−４８２などに詳述されている。
修飾試薬としては、上に挙げた化合物に限らず、トリプトファン残基に対する修飾能を有し、且つ酸化トリプトファン残基に対する反応性を有さない化合物が、重い試薬と軽い試薬と組み合わされていれば特に限定されない。
（ｉｉｉ：質量分析用混合試料の調製）
上記の修飾工程によって得られた２種の修飾タンパク質試料Ａ’とＢ’、或いは２種の修飾タンパク質試料Ｃ’とＤ’とを互いに混合する。
質量分析用混合試料においては、混合された修飾タンパク質試料は、脱塩処理、乾燥処理、再可溶化処理、還元アルキル化処理、断片化処理、及び／又は、トリプトファン残基を有する分子について濃縮分離処理されたものであっても良い。
これらの処理を行う段階は、修飾タンパク質試料同士の混合段階の前後を問わず、当業者が適宜決定することができる。
これら処理を行うための方法は、いずれも限定されない。例えば脱塩工程は、セファデックスカラムなど、通常用いられる脱塩カラムを用いることによって行うことができる。再可溶化処理は、上述の可溶化処理と同様に行うことができる。還元アルキル化処理も、通常の方法によって行うことができる。断片化処理も特に限定されず、通常行われるトリプシンなどの酵素による消化や化学的断片化を行うことができる。
濃縮分離処理も特に限定されない。例えば、セファデックスカラムや、フェニル基を有する担体を充填したカラムを用いることができる。フェニル基を有する担体を充填したカラムは、上記（ｉｉ）工程における修飾試薬として、π電子性化合物（ＮＢＳＣｌ試薬を含む）が用いられる場合などに有用に用いられる。このようなカラムとしては、Ｈｉ−Ｔｒａｐ  ｐｈｅｎｙｌ  ＦＦ、Ｈｉ−Ｔｒａｐ  ｐｈｅｎｙｌ  ＨＰ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、（以上、アマシャムバイオサイエンス社製）、ＹＭＣ＊ＧＥＬ  Ｐｈ（ワイエムシィ社製）などが挙げられる。
さらに、質量分析用混合試料は、分画処理が行われたものであっても良い。分画処理を行うための方法としては、逆相カラムとＨＰＬＣとを用いたシステムを用いる方法などが挙げられる。分画処理を行われた場合の質量分析用混合試料は、それぞれ、複数の画分を含むことになる。
（ｉｖ：質量分析）
上記質量分析用混合試料について、質量分析を行う。本発明における測定にはＭＡＬＤＩ型質量分析装置を用いることができる。この場合、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析装置（例えば島津製作所／クレイトス製ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ  ｐｌｕｓ）等や、ＭＡＩＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦ型質量分析装置（例えば島津製作所／クレイトス製ＡＸＩＭＡ−ＱＩＴ）等が用いられる。
ＭＡＬＤＩ質量分析装置を用いる場合、マトリックスとしては特に限定されない。例えば、ＤＨＢ（２，５−ジヒドロキシ安息香酸；２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）、４−ＣＨＣＡ（α−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸；α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、３−ＣＨＣＡ（α−シアノ−３−ヒドロキシ桂皮酸；α−ｃｙａｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、３Ｈ４ＮＢＡ（３−ヒドロキシ−４−ニトロ安息香酸；３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）などをマトリックスとして用いることができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型質量分析装置を用いる場合は、４−ＣＨＣＡをマトリックスとして用いると良い。一方、ＭＡＩＤＩ−ＩＴ−ＴＯＦ型質量分析装置を用いる場合は、３−ＣＨＣＡ、３Ｈ４ＮＢＡ、３Ｈ４ＮＢＡと４−ＣＨＣＡとの混合物をマトリックスとして用いると良い。
このような条件のもと、上記質量分析用混合試料について、質量分析装置による測定を行い、ＭＳスペクトルを得る。ＭＳスペクトル解析は、以下のようにして行う。
たとえば、上記工程（ｉ）で同量の２種のタンパク質試料を用意し、１３Ｃ  ＮＢＳＣｌ及び１２Ｃ  ＮＢＳＣｌを用いた上記工程（ｉｉ）と、断片化を含む上記工程（ｉｉｉ）とを行って質量分析用混合試料を得た場合を仮定する。上記工程（ｉ）で用意した２種のタンパク質試料のうち、少なくともいずれか一方のタンパク質試料において、トリプトファン残基が部分的に酸化されていた場合、すなわち、２種のタンパク質試料のうち、少なくともいずれか一方の試料中に、酸化トリプトファン残基を有するタンパク質（以下、ｏｘｉ−Ｔｒｙ含有タンパク質と記載する場合がある）が、非酸化トリプトファン残基を有するタンパク質（以下、ｎｏｎ−ｏｘｉ−Ｔｒｙ含有タンパク質と記載する場合がある）とともに含まれていた場合、得られる質量分析用混合試料には、ＮＢＳ修飾トリプトファン残基を有するペプチド（以下、ＮＢＳ−Ｔｒｙ含有ペプチドと記載することがある）と、酸化トリプトファン残基を有するペプチド（以下、ｏｘｉ−Ｔｒｙ含有ペプチドと記載することがある）とが少なくとも含まれる。ＮＢＳ−Ｔｒｙ含有ペプチドとしては、重い試薬で修飾された１３ＣＮＢＳ−Ｔｒｙ含有ペプチドと軽い試薬で修飾された１２ＣＮＢＳ−Ｔｒｙ含有ペプチドとが含まれる。
ＭＳスペクトルの解析においては、上記工程（ｉｉ）で用いた重い試薬と軽い試薬との分子量差に相当する質量電荷比を有するペアピーク（すなわちＮＢＳ−Ｔｒｙ含有ペプチドのピーク）に着目する。
ＮＢＳ試薬による修飾は、酸化されていないトリプトファン残基に対して起こることから、ペアピークを構成する２本のピークそれぞれの強度比は、上記（ｉ）で用意した２種のタンパク質試料中にそれぞれに含まれていたｎｏｎ−ｏｘｉ−Ｔｒｙ含有タンパク質の量の比に相当する。従って、ペアピークの強度の逆数比が、ｏｘｉ−Ｔｒｙ含有タンパク質の量の比に相当することになる。
このように、工程（ｉｖ）のＭＳ解析では、ペアピークを構成する２本のピークそれぞれの強度比から、タンパク質試料中の酸化度を求める。
また、工程（ｉ）で用意したタンパク質試料の量比と、工程（ｉｖ）で得られたＭＳスペクトルにおけるペアピークの強度比とが同じになる場合も考えられる。タンパク質試料の双方の酸化数が未知の場合にこのようなスペクトルが得られる場合、工程（ｉ）における２種のタンパク質試料のいずれにもｏｘｉ−Ｔｒｙ含有タンパク質が含まれていなかった可能性と、２種のタンパク質試料が同じ割合でｏｘｉ−Ｔｒｙ含有タンパク質を含んでいた可能性との両方が考えられる。そのため、工程（ｉｖ）のＭＳ解析では、ＮＢＳ−Ｔｒｙ含有ペプチドに相当する当該ペアピークとともに、ＮＢＳ−Ｔｒｙ含有ペプチドに対応する構造を有するｏｘｉ−Ｔｒｙ含有ペプチドに相当するシングルピークが検出されていることを確認することが好ましい（ここで、「ＮＢＳ−Ｔｒｙ含有ペプチドに対応する構造を有するｏｘｉ−Ｔｒｙ含有ペプチド」とは、トリプトファン残基がＮＢＳ化されているか酸化されているかの違いを除いてはＮＢＳ−Ｔｒｙ含有ペプチドと同じ構造を有するペプチドをいう）。このようなシングルピークが検出されていれば、２種のタンパク質試料が同じ割合でｏｘｉ−Ｔｒｙ含有タンパク質を含んでいたと判断することができる。
以下に、参考例をモデルに、本発明をより具体的に説明する。
［参考例１］
参考例１では、トリプトファン残基の酸化度が共に未知である、タンパク質試料Ａとタンパク質試料Ｂとを解析対象とした場合の一例を示す（図１参照）。
まず、タンパク質試料Ａ及びタンパク質試料Ｂを、同じ量だけ用意する（ｉ）。タンパク質試料Ａを、ＮＢＳＣｌ  ｈｅａｖｙ試薬で１３Ｃ  ＮＢＳ修飾し、１３Ｃ  ＮＢＳ修飾タンパク質試料Ａ’を得る。一方で、タンパク質試料Ｂを、ＮＢＳＣｌ  ｌｉｇｈｔ試薬で１２Ｃ  ＮＢＳ修飾し、１２Ｃ  ＮＢＳ修飾タンパク質試料Ｂ’を得る（ｉｉ）。１３Ｃ  ＮＢＳ修飾タンパク質試料Ａ’と１２Ｃ  ＮＢＳ修飾タンパク質試料Ｂ’とを混合／脱塩し、還元／アルキル化、トリプシン消化、及び濃縮を行い、質量分析用混合試料を調製する（ｉｉｉ）。得られた質量分析用混合試料を、質量分析装置を用いて測定する（ｉｖ）。得られるＭＳスペクトルにおいて、ＮＢＳＣｌ  ｈｅａｖｙ試薬とＮＢＳＣｌ  ｌｉｇｈｔ試薬との分子量差に相当する６Ｄａの質量差を有するペアピーク、すなわちＮＢＳ−Ｔｒｙ含有ペプチドのピークに着目する。図１の（ｉｖ）に、ＭＳスペクトル（横軸：質量電荷比（Ｍａｓｓ／Ｃｈａｒｇｅ）、縦軸：相対強度（％  Ｉｎｔ．））のモデルを示す。図１のように、当該ペアピークのうち、タンパク質試料Ａに由来する１３Ｃ  ＮＢＳ−Ｔｒｙ含有ペプチドのピーク強度と、タンパク質試料Ｂに由来する１２Ｃ  ＮＢＳ−Ｔｒｙ含有ペプチドのピーク強度との比が、３：７であったとする。タンパク質試料Ａとタンパク質試料Ｂとが同量用いられたことから、タンパク質試料Ａとタンパク質試料Ｂとにおける、ｏｘｉ−Ｔｒｙ含有タンパク質の量比は、７：３であったことが分かる。すなわち、参考例１においては、タンパク質試料Ａとタンパク質試料Ｂとのトリプトファン残基酸化度の相対比は、７：３であったことが分かる。
［参考例２］
参考例２では、トリプトファン残基の酸化度が未知であるタンパク質試料Ｃと、トリプトファン残基が酸化されていないこと（すなわち酸化度が０％であること）が分かっている非酸化タンパク質試料Ｄとを解析対象とした場合の一例を示す（図２参照）。
まず、タンパク質試料Ｃ及び非酸化タンパク質試料Ｄを、同じ量だけ用意する（ｉ）。タンパク質試料Ｃを、ＮＢＳＣｌ  ｈｅａｖｙ試薬で１３Ｃ  ＮＢＳ修飾し、１３Ｃ  ＮＢＳ修飾タンパク質試料Ａ’を得る。一方で、非酸化タンパク質試料Ｄを、ＮＢＳＣｌ  ｌｉｇｈｔ試薬で１２Ｃ  ＮＢＳ修飾し、１２Ｃ  ＮＢＳ修飾タンパク質試料Ｂ’を得る（ｉｉ）。その後は、上記参考例１と同様の工程（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）を行う。得られたＭＳスペクトルにおいて、ペアピークに着目し、非酸化タンパク質試料Ｄに由来する１２Ｃ  ＮＢＳ−Ｔｒｙ含有ペプチドのピーク強度に対する、タンパク質試料Ｃに由来する１３Ｃ  ＮＢＳ−Ｔｒｙ含有ペプチドのピーク強度を調べる。図２のように、非酸化タンパク質試料Ｄに由来するピークの強度を１とした場合に、タンパク質試料Ｃに由来するピークの強度が０．２であったとする。タンパク質試料Ｃと非酸化タンパク質試料Ｄとが同量用いられたことから、参考例２においては、タンパク質試料Ｃのトリプトファン残基酸化度は８０％であったことが分かる。
本発明においてターゲットとしているトリプトファン残基は、タンパク質中での出現頻度が最も少ない部類に属するアミノ酸である。その頻度は、たとえば上記の工程（ｉｉｉ）で断片化処理を行った場合に得られるトリプトファン残基含有ペプチドフラグメントなどの、比較的鎖長の短いペプチド１分子につき、トリプトファン残基１個であることが多い。
この場合、本発明では、ＭＳ解析により酸化度が明らかになったタンパク質試料に関し、酸化されたトリプトファン残基の位置の決定を行うこともできる。具体的には、ＭＳ測定で得られたペアピークの少なくともいずれか一方をプレカーサイオンとしてＭＳ／ＭＳ測定、或いはそれ以上の多段階ＭＳ測定を行い、アミノ酸配列を決定する。アミノ酸配列を決定することは、トリプトファン残基の位置を特定することでもある。
ＭＳで得られたペアピーク自体は、タンパク質試料中のｎｏｎ−ｏｘｉ−Ｔｒｙ含有タンパク質に由来するものであるが、ｎｏｎ−ｏｘｉ−Ｔｒｙ含有タンパク質中のトリプトファン残基の位置を知ることによって、当該ｎｏｎ−ｏｘｉ−Ｔｒｙ含有タンパク質に対応する構造を有するｏｘｉ−Ｔｒｙ含有タンパク質（すなわち、トリプトファン残基が酸化されているか否かの違いを除いてはｎｏｎ−ｏｘｉ−Ｔｒｙ含有タンパク質と同じ構造を有するタンパク質）における酸化位置を間接的に知ることができる。
【実施例】
【０００６】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれにより限定されるものではない。
［実施例１］
解析すべきペプチドとして、デルタ睡眠誘発ペプチド（ＤＳＩＰ：ＷＡＧＧＤＡＳＧＥ（配列番号１）、ｍ／ｚ  ８４８．１）を用いた。５０％のトリプトファン残基が酸化されたＤＳＩＰモデル試料（すなわち、酸化ＤＳＩＰと非酸化ＤＳＩＰとを等量含む試料）を調製し、１００％非酸化ＤＳＩＰをコントロールとして、モデル試料の酸化度の定量を行った。
１．ＤＳＩＰ酸化体の調製
１）過蟻酸の調製
蟻酸９００μＬと過酸化水素水（３０ｗ／ｗ％）１００μＬとを混合して氷上で２時間反応させた。
２）ＤＳＩＰの酸化
ＤＳＩＰ（ペプチド研究所製）１００μｇを０．１ｖ／ｖ％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液２００μＬに溶解した。得られたＤＳＩＰの溶液に、上記１）で調製した過蟻酸１００μＬを加えて、室温で２．５時間反応させた。液体クロマトグラフィー（ＬＣ）によって原料の消失を確認し、その後、凍結乾燥した。
２．５０％のトリプトファン残基が酸化されたＤＳＩＰモデル試料の調製
上記１．で調製したＤＳＩＰ酸化体の全量を、５０μＬの酢酸に溶解し、ＤＳＩＰ酸化体溶液とした。別途、酸化されていないＤＳＩＰ１００μｇを、５０μＬの０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ水溶液に溶解し、非酸化ＤＳＩＰ溶液とした。ＤＳＩＰ酸化体溶液に非酸化ＤＳＩＰ溶液を加えて混合した。得られた混合物は、５０％のトリプトファン残基が酸化されたＤＳＩＰ２００μｇを、酢酸−０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ水溶液（体積比１：１）混合溶液中に含む試料に相当する。
３．ＮＢＳ試薬（１３Ｃ  ＮＢＳ（Ｒ）Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ−Ｎ、島津製作所製）による、モデル試料中のトリプトファン残基の酸化度の定量
非酸化のＤＳＩＰ２００μｇを、酢酸−０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ水溶液（体積比１１）混合溶液中に溶解し、非酸化ＤＳＩＰ試料とした。非酸化ＤＳＩＰ試料に、１２Ｃ  ＮＢＳ試薬（１ｍｇ）の酢酸（１００μＬ）溶液を加えた。一方、上記２．で調製したＤＳＩＰモデル試料に、１３Ｃ  ＮＢＳ試薬（１ｍｇ）の酢酸（１００μＬ）溶液を加えた。双方の試料を、室温で３時間反応させた。反応終了後、双方の試料からそれぞれアリコート２μＬを取って互いに混合し、さらに、０．１ｖ／ｖ％ＴＦＡ水溶液２００μＬで希釈した。ＺｉｐＴｉｐ処理を行った後、マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて、質量分析装置（ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ、島津製作所製）にてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを測定した。
４．ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳの結果
ＭＳスペクトル上では、ＮＢＳ試薬による修飾を受けたＤＳＩＰのペアピークが、ｍ／ｚ  １００２．５８、１００８．６４に観測された。それぞれのピークの面積比は、Ａｒｅａ（１００２．５８）：Ａｒｅａ（１００８．６４）＝１．９９：１であった。
これは、より大きい質量電荷比を有するピークが、１３Ｃ  ＮＢＳ試薬の修飾を受けた試料、すなわち酸化トリプトファン残基を有するＤＳＩＰモデル試料であり、当該モデル試料におけるトリプトファン残基酸化度が５０％であることを示している。この結果は、ＤＳＩＰモデル試料中に、トリプトファン残基を酸化したＤＳＩＰを５０％、トリプトファン残基が酸化されていないＤＳＩＰを５０％含ませたことと良い一致を示した。このことから、試料中のトリプトファン残基酸化度が、ＭＳスペクトルにおけるペアピークの強度から求められることが示された。従って、２種類の試料のうち少なくとも一方のトリプトファン残基酸化度が未知であっても、ペアピークの強度から、相対的或いは絶対的酸化度を求めることが示された。
上記実施例においては、トリプトファン残基酸化度が５０％であるタンパク質試料を人為的に調製し、この試料について解析を行うことによって、本発明の効果が奏されていることを確認した。従って、本発明は、天然のトリプトファン残基酸化度を有するタンパク質試料に対しても、当然実施することができる。また、上記実施例においては、ＤＳＩＰ試料を解析対象のタンパク質試料とし、同位体標識法を行うための修飾試薬としてＮＢＳ試薬を用い、解析を行った。しかしながら、本発明は、ＤＳＩＰ試料以外のタンパク質試料、及び、ＮＢＳ試薬以外の同位体標識用修飾試薬にも適用される。そのため、上記実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。さらに、特許請求の範囲の均等範囲に属する変更は、すべて本発明の範囲内のものである。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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