(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−２２８２でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体４４で認識される特徴を有するネコカリチウイルス（ＦＣＶ）またはこのＦＣＶのカプシドタンパクと、獣医学的に許容されるビヒクルまたは賦形剤とを含む、ネコカリチウイルス病に対する免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項２】
登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−２２８２でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体４４で認識される特徴を有するネコカリチウイルス（ＦＣＶ）を含む請求項１に記載のネコカリチウイルス病に対する免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項３】
不活化されたＦＣＶである請求項１または２に記載の免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項４】
登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−２１６６でＣＮＣＭに寄託されたＦＣＶの４３１株を含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項５】
登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−２２８２でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマによって分泌されるモノクローナル抗体４４で認識される特徴を有するＦＣＶのカプシドタンパクを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のネコカリチウイルス病に対する免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項６】
登録番号ＣＮＣＭＩ−２１６６でＣＮＣＭに寄託されたＦＣＶの４３１株に由来するカプシドタンパクを含む請求項５に記載の免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項７】
ＦＣＶの他の株から得られた抗体をさらに含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項８】
上記のＦＣＶの他の株がＣＮＣＭに登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−２１６７で寄託されたＧ１株である請求項７に記載の免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項９】
上記のＦＣＶの他の株が不活化されたものである請求項７または８に記載の免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項１０】
上記のＦＣＶの他の株のサブユニットを含む請求項７〜９のいずれか一項に記載の免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項１１】
上記のＦＣＶの他の株のカプシドタンパクを含む請求項７〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項１２】
少なくとも１種のネコの他の病原体に対して免疫応答する少なくとも１つのネコワクチンをさらに含む請求項１〜１１のいずれか一項に記載の免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項１３】
上記のネコの他の病原体がネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ白血球減少症（panleucopenie feline）ウイルス（ＦＰＶ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、狂犬病ウイルスおよびクラミジアから成る群の中から選択される請求項１２に記載の免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項１４】
上記のネコワクチンを弱毒化生ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、組換えワクチンまたはポリヌクレオチドワクチンの形で含む請求項１２または１３に記載の免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項１５】
免疫賦活剤をさらに含む請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項１６】
水酸化アルミニウムを含む請求項１５に記載の免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項１７】
アクリル酸ポリマーまたはメタクリル酸ポリマー、無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのポリマーを含む請求項１５に記載の免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項１８】
カーボマーを含む請求項１７に記載の免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項１９】
水中油形乳剤の形をしている請求項１〜１４のいずれか一項に記載の免疫原性製剤およびワクチン。
【請求項２０】
登録番号ＣＮＣＭ  Ｉ−２２８２でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマ。
【請求項２１】
請求項２０に記載のハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、ネコカリチウイルス菌株を用いた免疫原性製剤およびワクチン、特にネコカリチウイルス病に対する不活性化ワクチンまたはサブユニットワクチンの製造方法に関するものである。
本発明の免疫原性製剤およびワクチンはネコの他の病原体をベースに作られた免疫原性製剤またはワクチンと組み合わせて多価免疫原性製剤およびワクチンにすることができる。
【０００２】
【従来の技術】
ネコカリチウイルス（ＦＣＶ）が初めて記載されたのは１９５７年である（Fastier L. B. Am. J. Vet. Res. 1957. 18, 382-389）。ネコカリチウイルスはネコヘルペスウイルスと共に猫の上気道のウイルス性疾患の２大原因である。ＦＣＶウイルスは多くの動物に影響を与えており、ＦＣＶ保有率は１５％〜２５％、抗ＦＣＶ血清有病率は７０〜１００％である（Coutts et al. Vet. Rec. 1994. 135. 555-556; Ellis T. M. Australian Vet. J. 1981. 57. 115-118; Harbour et al. Vet. Rec. 1991. 128. 77-80; Reubel et al. Feline Dendistry 1992. 22. 1347-1360）。一般に、上気道の疾病は初期相の高熱症の後に頬側潰瘍（口蓋、舌、唇、鼻）、鼻炎、結膜炎、場合によっては摂食障害および無力症を伴う。ＦＣＶウイルスは肺炎、腸炎、および関節痛（跛行症候群：lameness syndrome）を引き起こすこともある。
【０００３】
ＦＣＶウイルスは水平方向にのみ感染し、妊娠中の母猫からその子猫への垂直感染は無い（Johnson R. P. Res. Vet. Sci. 1984. 31. 114-119）。ＦＣＶは感染した動物と健康な動物との間の接触またはくしゃみ時に気道から感染する（Wardley RC. Virol. 1976. 52. 243-249）。
ネコカリチウイルスはカリチウイルス科の裸のウイルスであり、寸法が約７．７キロベース対（ｋｂｐ）の１本鎖の正のＲＮＡを有する（Radfor et al. Proc. 1st Int. Symp. Caliciviruses ESVV 1997. 93-99）。
【０００４】
多くのＲＮＡウイルスと同様に、ＦＣＶのウイルスの母集団はかなり不均質である。１９７０年代初期から交差血清中和実験（cross-serum neutralization experiment）によって抗原変化が証明されている。ＦＣＶは複数のウイルス株または準種に分類できる（Radfor et al. Proc. 1st Int. Symp. Caliciviruses ESVV 1997. 93-99）。
複数のＦＣＶ株、特にＦ９株（登録番号ＶＲ−７８２でアメリカ式培養収集またはＡＴＣＣに寄託）、２２８０菌株（ＡＴＣＣ  ＶＲ−２０５７）、ＫＣＤ株（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５１）およびＣＦＩ株（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５４）が同定され、単離されている。
【０００５】
ＦＣＶに対する予防ワクチンは７０年代末期から弱毒化ＦＣＶ株、１９５８年にBittleによってアメリカ合衆国で単離されたＦ９株またはインビトロまたはインビボ継代によるＦ９に由来する株（「Ｆ９類似物」）から主として導入された。
不活性ワクチンも入手可能である。主にアメリカ合衆国で、それぞれ１９７０年に肺炎の猫（Kahn and Gillepsite. Cornell Vet. 1970. 60. 669-683; Powvey et al. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1980. 177. 347-350）から、１９８３年に跛行症候群の猫（Pedersen et al. Fel. Prac. 1983. 13. 26-35; Pedersen N. C. and Hawkins K. F. Vet Microbiol. 1995. 47. 141-156）から単離された２５５株および２２８０株が用いられる。
【０００６】
経時的な抗原性変異のため、６０〜７０年代に単離されたワクチン株、例えばＦ９株、２５５株および２２８０株に対して作られた抗血清は９０年代の単離体をほとんど中和しない。例えば、抗Ｆ９血清は、１９８０年〜８９年では５６％、１９５８〜７９年では８６％のアメリカ製単離体を中和するのに対して１９９０年〜１９９６年のアメリカ製単離体の４３％を中和し、１９９０〜９６年のイギリス製単離体のたったの１０％しか中和しない（Lauritzen et al. Vet. Microbiol. 1997. 56. 55-63）。従って、古いＦＣＶ株から得られた弱毒化ワクチンおよび不活性化ワクチンは現在のＦＣＶ株を保護するには不充分である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、広い交差中和血清スペクトルを有する抗体をネコで生じる新規なＦＣＶ菌株を見出すことにある。
本発明の他の目的は、ＦＣＶ菌株からネコカリチウイルス病に対する免疫原性製剤およびワクチンを作ることにある。
本発明のさらに他の目的は、ネコカリチウイルス病と少なくとも１種のネコの他の病原体とに対する多価免疫原性製剤および多価ワクチンを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、フランス、イギリス、アメリカ合衆国でネコカリチウイルスに感染した徴候を示す猫から採取した咽頭のスワブから得た４種のＦＣＶ菌株を選択した。これらの菌株はそれぞれＧ１菌株（フランスのパリにあるパスツール研究所のCollection Nationale de Cultures de Microorganismes(またはＣＮＣＭ)に登録番号Ｉ−２１６７で寄託）および４３１菌株（登録番号Ｉ−２１６６でＣＮＣＭに寄託）で、これらは１９９９年３月１２日に寄託された。後２つの菌株はアメリカから得られたもので、ＲＭＩ６とＲＭＩ９と名付けられた。なお、フランスで単離されたＦＣＶのＧ１菌株は、１９７８年にイギリスでTohya Y.によって単離された同じくＧ１とよばれるＦＣＶ菌株（Tohya Y. et al. Jpn. J. Sci., 1990, 52, 955-961）とは対応していない。
【０００９】
本発明では、基準パネルのＦＣＶ単離体に対する交差血清中和試験によって、ＦＣＶ４３１、Ｇ１、ＲＭＩ６およびＲＭＩ９菌株を選択した。この基準パネルは、ネコカリチウイルスに感染した徴候を示し、３ヶ所の地理的に異なる場所から来た猫から採取した１８種の現在のＦＣＶ単離体から成る。７つの単離体はアメリカから来たもので、ＲＭＩ１、ＲＭＩ２、ＲＭＩ３、ＲＭＩ５、ＲＭＩ６、ＲＭＩ７およびＲＭＩ９として同定された。７つの単離体はフランスのもので、Ａ２、Ｆ１、Ｇ１、Ｇ３、Ｆ３０３１、Ｈ３−２およびＨ１−４と名付けられた。最後の４つの単離体はイギリスのもので、４３１、３８８ｂ、３３７およびＪ５と名付けられた。
【００１０】
パネル菌株およびＲＭＩ６、ＲＭＩ９菌株は請求によって本出願人から入手することができる。これらの菌株は雑誌「Archives of Virology」(Poulet et al. Arch. Virol. February 2000. 145(2). 243-261)でも公開されており、これはインターネット上で入手可能である。
【００１１】
驚くことに、基準パネルの１８種のＦＣＶ単離体との間の交差血清中和試験で、単離体４３１の抗血清は基準パネルの１７種の異種単離体の中の１４種を中和するということが分かった（同種血清中和滴定量は考慮しない）。これに対して「従来の」ワクチン菌株２５５およびＦ９はそれぞれ１８種のパネル単離体の中の２種しか中和しない。
全く予期しないことであったが、ＦＣＶ４３１菌株はネコ科の動物、特に猫を大部分のＦＣＶ菌株から保護するのに使用可能な優れた菌株であるということを本発明者は発見した。当業者は本明細書で開示されたＦＣＶ菌株のパネルによって他の優勢ＦＣＶ菌株を選択することができる。均等性から、本発明には広い交差中和スペクトルを有する抗体を有するＦＣＶ４３１菌株と均等なＦＣＶ菌株が含まれる。
【００１２】
ＦＣＶ菌株の抗血清の場合には、基準パネルの１８種の異種単離体（ＦＣＶ４３１を含む）の中の少なくとも１３種を血清中和し、好ましくは抗血清が基準パネルの１８種の異種単離体の中の少なくとも１４種を血清中和し、さらに好ましくは抗血清が基準パネルの１８種の異種単離体の中の少なくとも１５種を血清中和するような均等性が存在する。
一般には、異種血清中和滴定量が１．２log10 VN50以上の場合にそのＦＣＶ菌株は他のＦＣＶ菌株を血清中和するといえる（Povey C. and Ingersoll J., Infection and Immunity, 1975, 11, 877-885）。本発明者はこの値を陽性閾値（positivity threshold）としたが、２log10 VN50以下の同種血清中和滴定量のＦＣＶ単離体を用いて得られる交差血清中和の結果を解釈することはできない。
【００１３】
ＦＣＶ４３１株に対するＦＣＶ株の均等性を確立する第２の方法は、ＦＣＶ４３１株に特有なモノクローナル抗体を用い、非直接蛍光抗体法（ＩＩＦ）によって候補のＦＣＶ株を試験する方法である。本発明者はこの方法で４３１株に特有であると証明された複数のモノクローナル抗体の生産に成功した。その１つを４４と名付けた。４３１に特有なモノクローナル抗体、例えばモノクローナル抗体４４の免疫蛍光に反応性がある場合には均等物がある。このモノクローナル抗体および対応ハイブリドーマは請求によって本出願人から入手でき、Poulet達の文献の「Arch. Virol. 2000. 145. 1-19」にも記載されている。また、対応ハイブリドーマは１９９９年８月１１日に登録番号Ｉ−２２８２でＣＮＣＭに寄託されている。当業者は従来方法を用いてモノクローナル抗体を完全に製造することができ、パネルから４３１株に特有なモノクローナル抗体を選択することができるということは言うまでもない。
【００１４】
本発明の第１の対象は、ネコカリチウイルス株４３１（上記定義の均等物を含む）から作られ、獣医学的に許容される溶媒または賦形剤中に（好ましくは免疫賦活剤の存在下に）添加された、好ましくは弱毒化またはサブユニットの形をした、免疫原性製剤およびワクチンの製造方法にある。
本明細書で免疫原性製剤とは、猫に投与した時にネコの所定病原体に対して免疫応答を生じさせることができる任意の製剤を意味する。ワクチンとは有効な保護を与えることができる製剤を意味する。
【００１５】
他のＦＣＶのＧ１、ＲＭＩ６およびＲＭＩ９株はＦＣＶ４３１株に対して相補性であるため選択された。すなわち４３１とこれら３つのＦＣＶの中の１つの抗血清を組み合わせることによって、基準パネル単離体を１００％血清中和することができる。すなわち、４３１抗血清が中和しないか、中和が弱い（１．２ｌｏｇ10ＶＮ50以下）の基準パネルのＦＣＶ単離体に対して、これら３つのＦＣＶ株は２ｌｏｇ10ＶＮ50以上の同種血清中和滴定値および１．２ｌｏｇ10ＶＮ50以上の異種血清中和滴定値を示す。
本発明は、ＦＣＶ４３１株に対して同じ相補性を有する均等なＦＣＶ株も含むものである。これらの株、特にＧ１に特異なモノクローナル抗体を作り、選択することによって、この他の基準を基にして均等物を決めることができる。
【００１６】
本発明の第２の対象は、本発明のＦＣＶ４３１株またはその均等物の１つに加えて、少なくとも１種の他のＦＣＶ株、特にＧ１、ＲＭＩ６、ＲＭＩ９からなる群とこれらの均等物の中から選択される相補性株の抗体を加え、さらに必要に応じて免疫賦活剤を加えた、獣医学的に許容される溶媒または賦形剤の中に作られる免疫原性製剤およびワクチンにある。上記の単数または複数の他のＦＣＶ株から得られる抗体は不活化ウイルスまたはサブユニットであるのが好ましい。
【００１７】
本発明が特に対象とするものは、２種のＦＣＶ株、４３１株およびＧ１株を組み合わせた免疫原性製剤、不活化ワクチンまたはサブユニットワクチンにある。
驚くべきことに、２つの株ＦＣＶＧ１と４３１とを組み合わせると、有利な相乗効果が生じる。ＦＣＶＧ１と４３１の２つの株の相補性の研究で、Ｇ１単独、４３１単独および両方を組み合せた場合（Ｇ１＋４３１）に起こる免疫反応を比較した。２種のＦＣＶ株Ｇ１と４３１との混合物で免疫化した動物のグループの方が臨床的に優れた保護が得られるという利点が確認された。
ＦＣＶウイルスの培養および増殖はネコの細胞、特にCrandell-Reese Feline KidneyまたはCRFK細胞（American Type Culture Collection からＣＣＬ−９４の番号で入手可能）で、１細胞当たり２〜０．０１の５０％細胞感染量（CCID50）の感染効率（moi）、好ましくは０．５CCID50／細胞で実施するのが好ましい。
【００１８】
回収および精製後に、不活性化免疫原性製剤または不活性化ワクチンにするＦＣＶウイルスを化学処理（例えばホルマリンまたはホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エチレンイミン、二成分エチレンイミン（ＢＥＩ））および／または加熱処理で不活化する。直前にブロモエチルアミン（ＢＥＡ）から作ったエチレンアミンの作用で本発明のウイルスを不活化するのが好ましい。ウイルス粒子は従来の濃縮方法、特に限外濾過法で濃縮し、必要あ場合には従来の精製手段、特にゲル濾過法または特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下の選択沈殿法で精製する。精製は予め濃縮しないで行うこともできる。
【００１９】
免疫原性製剤、不活化ワクチンまたはサブユニットワクチンは、ウイルス粒子を獣医学上許容される溶媒または賦形剤に溶解し、必要な場合には免疫賦活剤を加えて作る。抗原の１回の投与量は約１０5〜約１０10CCID50、好ましくは不活化前滴定量を１回の投与量当たり約１０8〜約１０9CCID50に等しする。
本発明の免疫原性製剤およびワクチンに免疫賦活剤に追加される免疫賦活剤としては（１）水酸化アルミニウム、（２）アクリル酸ポリマーまたはメタクリル酸ポリマー、無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのポリマーを用いるか、（３）免疫原性製剤またはワクチンを水中油乳剤、特にPlenum Press 1995のM. Powell, M. Newman偏、「Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach」の１４７頁に記載の乳剤ＳＰＴに配合するか、この同じ本に記載の乳剤ＭＦ５９に配合する。
【００２０】
水中油乳剤は液体パラフィン軽油（欧州薬局方タイプ）；スクアラン等のイソプレノイドオイル；アルケン、特にイソブテンまたはデセンのオリゴマー化で得られるオイル；直鎖アルキル基を含む酸またはアルコールのエステル、特に植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ(カプリレート／カプレート)、グリセリルトリ(カプリレート／カプレート)、プロピレングリコールジオレアート；分岐鎖脂肪アルコールまたは脂肪酸のエステル、特にイソステアリン酸をベースにすることができる。オイルを乳化剤と組み合わせて乳剤にする。乳化剤は非イオン系界面剤、特にソルビタン、マニド（mannide）、グリセロール、ポリグリセロール、プロピレングリコールおよびオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸またはヒドロキシステアリン酸のエステルであるのが好ましく、必要に応じてエトキシ化されたポリオキシプロピレン−ポリオキシレンブロックコポリマー、特にプロニック（Pluronic、登録商標）コポリマー、特にそのL121である。
【００２１】
アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーは糖またはポリアルコールのポリアルケニルエーテルで架橋する。これらの化合物はカルボマーとよばれている（Pharmeuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者は米国特許第２，９０９，４６２号（その内容は本明細書の一部を成す）を参照することができる。この特許には少なくとも３つ、好ましくは８つ以下のヒドロキシル基を有するポリヒドロキシル化合物で架橋されたアクリルポリマーで、少なくとも３つのヒドロキシルが少なくとも２つの炭素原子を有する不飽和脂肪族基で置換されたものが記載されている。好ましい基は２〜４個の炭素原子を含むもの、例えばビニル、アリールおよびその他のエチレン性不飽和基である。不飽和基自体がメチル等の他の成分を含んでいてもよい。カルボポル（Carbopol、登録商標）（BF Goodrich社、オハイオ、アメリカ合衆国）の名称で市販の製品が特に適している。この製品をアリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールで架橋する。種々の製品の内でカルボポル（Carbopol）974P、934Pおよび971P(登録商標)が挙げられる。
【００２２】
無水マレイン酸とアルケニル誘導体とのコポリマーの中では、無水マレイン酸とエチレンとの直鎖または分岐鎖のコポリマー、例えばジビニルエーテルで架橋されたEMA(登録商標)コポリマー（Monsanto社）が好ましい。「J. Fields 他, Nature, 186:778-780, １９６０年６月４日」（その内容は本明細書の一部を成す）も参照できる。このアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよびEMAコポリマーはその構造中に下記式の基本単位を有しているのが好ましい：
【００２３】
【式１】
0004841775.tif 000002
（ここで、
Ｒ1およびＲ2はＨまたはＣＨ3を表し、互いに同一でも異なっていてもよく、
ｘ＝０または１、好ましくはｘ＝１であり、
ｙ＝１または２で、ｘ＋ｙ＝２である）
【００２４】
EMAコポリマー(登録商標)ではｘ＝０、ｙ＝２であり、カーボマーではｘ＝ｙ＝１である。
最終ワクチン組成物でのポリマー濃度は０．０１％〜１．５％Ｗ／Ｖ、特に０．０５％〜１％Ｗ／Ｖ、好ましくは０．１％〜０．４％Ｗ／Ｖである。
不活化ウイルスと、本発明の同じＦＣＶ株および／または本発明の異なるＦＣＶ株のサブユニットとを組み合わせることもできる。
【００２５】
本発明の他の対象は多価ワクチンにある。この多価ワクチンは獣医学上許容される溶媒または賦形剤の中に、少なくともＦＣＶ４３１株（その均等物を含み、場合によっては少なくとも一種の他のＦＣＶ株、特に本発明の相補的な株、特にＧ１、ＲＭＩ６およびＲＭＩ９から選択される株）の不活性ネコカリチウイルスワクチンと、ネコの他の病原体に対する少なくとも一つのワクチンとを含み、好ましくは免疫賦活剤をさらに含む。サブユニットベースの多価ワクチンも同様にして作ることができる。
【００２６】
ネコ病原体はネコ鼻気管炎ウイルスまたはネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ白血球減少症ウイルスまたはネコパルヴォウイルス（ＦＰＶ）、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、狂犬病ウイルス、クラミジアから成る群の中から選択される。
本発明のＦＣＶワクチンは使用直前にネコの他のワクチン価(単数または複数)と混合することもできる。これらのワクチン価は弱毒化生ワクチン、不活化ワクチン、サブユニットワクチン、組換えワクチンまたはポリヌクレオチドワクチンの形にすることができる。
【００２７】
本発明のさらに他の対象は多価免疫ワクチン接種キットにある。このキットは獣医学上許容される溶媒または賦形剤（免疫賦活剤をさらに含むのが好ましい）中に添加した本発明のＦＣＶワクチン価と、ネコの他の病原体の少なくとも一価とを別々に包装したものである。ＦＣＶワクチン価はネコの他のワクチン価、特に凍結乾燥状態で提供される弱毒化ワクチン価、組換えワクチン価またはポリヌクレオチドワクチン価の溶剤の役目をする。
【００２８】
本発明では、ウイルスからカプシドを抽出し、必要に応じて抽出前または後に不活化して免疫原性製剤またはサブユニットワクチンを作ることができる。従って、本発明の製剤またはワクチンは、単一または複数の主成分として、本発明株、特に４３１株（均等物を含む）、必要に応じてさらに他のＦＣＶ株、特にＧ１またはその均等物から作られ、必要に応じて不活性化されたカプシドプロテインと副断片とからなる抽出物を含む。これらのサブユニットワクチンおよび製剤には上記の免疫賦活剤を加えるのが好ましい。不活性ワクチンまたは製剤全体とサブユニットワクチンまたは製剤とを混合することもできる。
【００２９】
本発明のさらに他の対象はＧ１株をベースにした（特に不活化または抽出サブユニットの）免疫原性製剤またはワクチンにある。
本発明のさらに他の対象は、ネコカリチウイルス病に対して猫を免疫化する方法にある。この免疫化方法では本発明の組み合わせ多価サブユニットまたは不活化ＦＣＶワクチンを猫に投与する。ワクチンの投与は特に非経口経路、好ましくは皮下または筋肉経路で行うのが好ましい。注射回数および各ワクチンの接種プロトコルで用いる各ワクチンの投与量は当業者が正確に規定することができるものである。投与量は０．２〜２ｍｌ、好ましくは約１ｍｌである。
以下、実施例と交差血清中和滴定の結果を示す図を参照して本発明をより詳細に説明するが、本発明がそれらに限定されるものではない。
【００３０】
【実施例】
実施例１
ウイルス単離体とハイブリドーマ
ネコカリチウイルスに感染した徴候を示す猫から採取された咽頭スワブからネコカリチウイルス（ＦＣＶ）を得た。各ＦＣＶは地理的起源が異なり、ＦＣＶ４３１、３３７、Ｊ５、３８８ｂ、２２０および３９３株はイギリスで単離され、イギリス、グラスゴー大学のO. Jarrett教授によって提供された。ＦＣＶＡ２、Ｇ１、Ｇ３、Ｆ３０３１、Ｆ１、Ｈ３−２およびＨ１−４株は本発明者がフランスで単離した。ＦＣＶＲＭＩ１、ＲＭＩ２、ＲＭＩ３、ＲＭＩ５、ＲＭＩ６、ＲＭＩ７およびＲＭＩ９株は本発明者がアメリカ合衆国で単離した。
【００３１】
抗生剤、特に５０ｍｌ／ｇのゲンタマイシンを含む５％ウシ胎児血清（Bayer Diagnastic社製）を加えた２ｍｌのダルベッコの修正イーグル最小培地（Dulbecco's modified Eagle's minimum medium:DMEM, Gibco BRL）に咽頭試料を回収した。単離体は試験まで−７０℃に凍結する。モノクローナル抗体４４は431 2 0 17 E9 Tで同定されるハイブリドーマから得られ、これはＦＣＶ４３１株に特異なものである。
【００３２】
実施例２
ウイルス単離体の増殖
１ｍｌ当たり１００，０００個の細胞を含む、５％ウシ胎児血清を加えたDMEM培地を用いて９６穴プレートまたは２５ｃｍ2ファルコン（ファルコン社）中で猫の肝臓細胞(Crandell-Reese Feline Kidney またはCRFK No. ATCC CCL-94, Crandell 他、In Vitro 1973. 9. 176-185)を培養する。５％ＣＯ2を含む雰囲気中で３７℃で細胞を培養する。３日後、細胞層は集密する。培地を５０ｍｇ／ｌのゲンタマイシンを加えた血清無しDMEM培地に代え、解凍した一定分量のＦＣＶウイルスの単離体（実施例１）をＦＣＶウイルスの限界稀釈クローニングでは１穴につき１００μｌの４倍連続稀釈、或いは１つのファルコンにつき１ｍｌの容積比率で加える。
細胞変性効果（ＥＣＰ）の完了後（培養開始後２４〜４８時間）、ウイルスの懸濁液を回収し、−７０℃で凍結する。ウイルスバッチには一般に３〜４回の連続した継代が必要である。ウイルスバッチは−７０℃で貯蔵する。
【００３３】
実施例３
血清の製造
１０6.0CCID50の適切なＦＣＶウイルスを口鼻経路で子猫に接種し、各ＦＣＶウイルスに対して抗血清を作った。特定病原体除去（ＳＰＦ）した子猫の年齢は１０〜１４週であった。各動物の血清を感染１ヶ月後に回収した。血清を熱失活（５６℃で３０分）し、一定分量に分配し、−２０℃で貯蔵した。
実施例４
インビトロ交差血清中和
ネコカリチウイルス病の徴候を示す猫から採取した咽頭スワブから得た１８種のフィールド単離体の間で交差血清中和試験を実施する。この内の７種の地理的起源はフランスで、Ａ２、Ｆ３０３１、Ｇ１、Ｇ３、Ｆ１、Ｈ３−２およびＨ１−４の名称で同定され、その４種の地理的起源はイギリスで、Ｊ５、３３７、３８８ｂおよび４３１の名称で同定され、最後の７種の地理的起源はアメリカ合衆国で、ＲＭＩ１、ＲＭＩ２、ＲＭＩ３、ＲＭＩ５、ＲＭＩ６、ＲＭＩ７およびＲＭＩ９の名称で同定される。
【００３４】
各単離体に対して得られた血清(実施例３)の１８種の単離体を中和する能力を試験した。血清を９６穴細胞培養プレート内のDMEM培地で３回連続稀釈した。約１００CCID50のウイルス株を含む０．０５ｍｌの培地を実施例２で作った０．０５ｍｌの稀釈血清に添加した。この混合物を５％のＣＯ2を含む雰囲気下の培養器内で３７℃で２時間培養した。
１ｍｌ当たり約１００，０００個の細胞を含む０．１５ｍｌのＣＲＦＫ細胞の懸濁液を各混合物に添加し、細胞変性効果を観察した。各血清の中和滴定量をKarber法で計算した。滴定量は穴の５０％に対する細胞変性効果を抑制する最大稀釈率で与えられ、ｌｏｇ10単位で表される。得られた最小の滴定量は０．７ｌｏｇ10ＶＮ50であった。各血清を少なくとも２回、好ましくは３回滴定した。
［図１］は１８種のＦＣＶ株と１８種の血清との間で実施した交差血清中和試験で得られた全ての中和滴定量を示している。
【００３５】
実施例５
間接免疫蛍光(ＩＩＦ)試験
テストされるＦＣＶウイルスに感染した単層で培養されたＣＲＦＫ細胞を収容した９６穴プレートでＩＩＦ試験を実施する。
５％ウシ胎児血清を含むＦ１５培地（Gibco BRL, Cat # 045-1075）に１ｍｌ当たり９０，０００個の細胞を含む１穴当たり２００μｌのＣＲＦＫ細胞の懸濁液を９６穴プレート内で培養する。集密になった時に３２０CCID50のＦＣＶを１００μｌのＦ１５培地中で培養する。最初のＣＰＥ病巣が現れた時に細胞をカルシウムまたはマグネシウムを全く含まない冷たいＰＢＳ（ＰＢＳ、Sigma）で洗浄し、５％ｖ／ｖの水を含む冷たいアセトンで３０分間、−２０℃で定着させる。乾燥後、感染、定着した細胞を３７℃で３０分間、１穴当たり１００μｌの抗４３１モノクローナル抗体４４（ハイブリドーマー431 2 0 17 E9 T、５０ｍＭのTRIS-HCLバッファで１／５０００に稀釈、ｐＨ７．６）に対応する腹水と接触させる。
【００３６】
ＰＢＳで２回洗浄した後、同じ条件下でフルオレッセインイソチオシアネート（Biosys, 2mg/mlで共役されたFITC）と共役し、５０ｍＭのTRIS-HCLバッファで１／１５０に稀釈したｐＨ７．６のヤギの抗マウスＩｇＧ抗体を培養して、抗体の吸着を可視化する。紫外線下で光学顕微鏡を用いて読取る。
このモノクローナル抗体をパネルの単離体それぞれに対して試験した。モノクローナル抗体はＦＣＶ４３１に感染したＣＲＦＫ細胞にのみ吸着する。
この試験を用いてＦＣＶ４３１株の均等物を決定することもできる。均等物はモノクローナル抗体４４が吸着するものである。
【００３７】
実施例６
相乗効果
３２匹のワクチン接種されていない約９週齢のＳＰＦの子ネコをランダムにそれぞれ８匹の子ネコから成る４群（Ａ〜Ｄで識別する）に分け、各群を隔離した箱に入れる。
ウイルス懸濁液(実施例２)を解凍し、ＰＢＳで稀釈して所望の滴定量にした後、Ｂ群には１０3.3CCID50/mlのＦＣＶ  Ｇ１接種剤を１ｍｌ、Ｃ群には１０3.5CCID50/mlのＦＣＶ  ４３１接種剤を１ｍｌ、Ｄ群には１０3.3CCID50/mlのＦＣＶ  Ｇ１接種剤を０．５ｍｌおよび１０3.5CCID50/mlのＦＣＶ  ４３１接種剤を０．５ｍｌ、皮下注射でネコに接種する。Ａ群は対照群である。
【００３８】
Ａ〜Ｄ群それぞれの半分をランダムに１群と２群の２つに分け、隔離された箱に入れる。各動物をワクチン接種後３１日目（ｄ３１）にテストする。
１群の動物に１０7.2CCID50/mlの滴定量を有する攻撃ウイルス株ＦＣＶ２２０を口鼻経路で１ｍｌ（経口で０．５ｍｌ、各鼻孔に０．２５ｍｌ）抗原投与する。
１群の動物に１０6.8CCID50/mlの滴定量を有する攻撃ウイルス株ＦＣＶ３９３を口鼻経路で１ｍｌ（経口で０．５ｍｌ、各鼻孔に０．２５ｍｌ）抗原投与する。
【００３９】
ウイルス株ＦＣＶＧ１と４３１とは交差血清中和で遠いので、毒性菌株ＦＣＶ２２０と３９３とを選択した。
２つの箱同士の相互汚染は注意深く避けた。動物の直腸温度を計り、臨床検査（一般的状態、舌および口蓋の潰瘍の有無、歯肉炎の有無、鼻炎の有無、結膜炎の有無、跛行症の有無、動物の死）を行い、両群の動物を臨床的に観察した。
【００４０】
得られた臨床的兆候のスコアを下記尺度に従って各群について合計して各動物の合計臨床スコアを計算した：
直腸の温度：
０  ：３９℃未満
１  ：３９℃以上、３９．５℃未満
２  ：３９．５℃以上、４０℃未満
３  ：４０℃以上
一般的状態：
０  ：通常の行動
１  ：消耗
【００４１】
舌および口蓋の潰瘍（複数有る場合、全ての潰瘍の直径の合計）：
０  ：潰瘍無し
１  ：直径１〜５ｍｍ
２  ：直径６〜１０ｍｍ
３  ：直径１０ｍｍ以上
歯肉炎：
０  ：歯肉炎無し
１  ：歯肉炎
【００４２】
鼻炎：
０  ：鼻炎無し
１  ：漿液性の鼻汁を伴う鼻炎
２  ：粘液性から粘液膿性の鼻汁を伴う鼻炎
結膜炎：
０  ：結膜炎無し
１  ：漿液分泌を伴う結膜炎
２  ：粘液膿分泌を伴う結膜炎
【００４３】
跛行症：
０  ：跛行症無し
１  ：跛行症
死：
０  ：生存
５  ：死。
得られた平均臨床スコアは下記の通りである：
【００４４】
【表１】
0004841775.tif 000003
【００４５】
得られた結果から、最良の株で得られた平均値と２つの株の混合で得られた平均値とが大きく異なることから、ＦＣＶＧ１株とＦＣＶ４３１株との間に相乗作用があることが証明された（Kruskal-Wallis test）。
【００４６】
実施例７
不活化ワクチンの製造
ＣＲＦＫ細胞を２リットル回転フラスコ（８５０ｃｍ2）内で、３７℃で、２．５％ラクトアルブミン水解物（Gibco BRL）と５％ウシ胎児血清（Gibco BRL）とを加えた修正イーグル最小培地（MEM, Gibco BRL）中で培養する。１ｍｌにつき約１００，０００個の細胞を含むＭＥＭ培地中の細胞懸濁液を１つの回転フラスコにつき３００ｍｌ加える。３日後、細胞層は集密になる。細胞培地を無血清のＭＥＭ培地および１つの細胞につき０．５CCID50の感染効率（ｍｏｉ）で加えられたＦＣＶウイルスに代える。ウイルスの培養を３７℃で２４〜４８時間続けて、細胞の芝生全体に細胞変性効果が得られるようにする。ウイルス懸濁液を回収し、１．５μmの孔を有するバグフィルターで精製する。回収時のＦＣＶウイルスの滴定量は１ｍｌにつき８．５±０．３ｌｏｇ１０CCID50である。
【００４７】
２２℃で１８時間、約８ｍＭ濃度のエチレンイミンでウイルスを不活化する。  ２８ｇの水酸化ナトリウムのペレットを２００ｍｌの蒸留水に溶解し、使用直前に約１．２Ｍの溶液に相当する６８．１ｇのブロモエチルアミン（ＢＥＡ）を加えてエチレンイミンを作る（H. Bahnemann, Arch. Virol., 1975, 47, 47-56）。不活性ウイルス懸濁液を１００ｋＤａ（Filtron）のcut-offの超硬化型限外濾過カートリッジ上で１００倍に濃縮し、−７０℃で凍結する。
【００４８】
解凍後に不活性ウイルス懸濁液をＰＢＳバッファ（ＮａＣｌ  ８ｇ／ｌ；ＫＣｌ２ｇ／ｌ；ＫＨ2ＰＯ4  ０．２ｇ／ｌ；Ｎａ2ＨＰＯ4  ２  Ｈ2Ｏ  １．４４ｇ／ｌ）で１／３３に稀釈する。ワクチンを下記方法で作る：３２℃で２分間、Silversonタービン乳化機を用いて、不活性ウイルスの稀釈溶液から成る１６７ｍｌの水性相を、７％ｗ／ｖのアンヒドロマンニトールオレアート、平均１１個の酸化エチレン（ＥＯ）分子を含む８％ｗ／ｖのエトキシル化オレイン酸および８５％ｗ／ｖの液体パラフィン軽油（欧州薬局方タイプ）から成る８３ｍｌの油性相に乳化する。ワクチンは５℃で貯蔵する。
【００４９】
ワクチンを作る他の方法では、６００バールの圧力、３０〜４０℃の温度で、５％ｗ／ｖのスクワラン、２．５％ｗ／ｖのPluronic L121(登録商標)、０．２％ｗ／ｖのトゥイン（Tween） 80、解凍後にＰＢＳバッファで１／４６に稀釈された９２．３％ｗ／ｖのウイルス懸濁液の混合物をY110モデルの高圧ホモジナイザー（Microfluidics Corp.）で３回乳剤にする。
さらに他の方法では、０．４％ｗ／ｖのカルボポル974P（Carbopol、登録商標）を含む生理食塩水（ＮａＣｌ  ９ｇ／ｌ）溶液を作り、水酸化ナトリウムでｐＨを７．３〜７．４に調整する。このカルボポル（Carbopol）溶液を、解凍後に１／２５に稀釈された不活性ＦＣＶウイルスの懸濁液と同重量部混合する。ワクチンを５℃で貯蔵する。
乳剤の水性相またはカルボポル（Carbopol、登録商標)と混合した水性相は、ＦＣＶ４３１株またはＦＣＶＧ１株またはＦＣＶ４３１とＧ１株の同重量部の混合物のいずれかに対応する、ＰＢＳで稀釈した濃縮不活性ウイルス懸濁液から成る。
【００５０】
実施例８
不活化ＦＣＶ４３１の免疫抗原性の制御
１９匹のワクチンを接種されていない約９週齢のＳＰＦの子ネコをランダムに１群目は１２匹、２群目は７匹の子ネコから成る２群（ＡとＢで識別する）に分け、各群を隔離された箱に入れる。
実施例７で記載のように、アンヒドロマンニトールオレアート、エトキシル化オレイン酸および液体パラフィン軽油から成る免疫賦活剤でワクチンを作る。
Ａ群のネコに１０7CCID50/mlのＦＣＶ  ４３１接種剤を１ｍｌ、皮下注射で２回（Ｄ０およびＤ２８）接種する。Ｂ群は対照群である。
【００５１】
最初のワクチン接種から４２日後（Ｄ４２）に、１０6CCID50/mlの滴定量を有する攻撃ウイルス株ＦＣＶ４３１を口鼻経路で１ｍｌ（経口で０．５ｍｌ、各鼻孔に０．２５ｍｌずつ）投与して、動物を攻撃する。
抗ＦＣＶ４３１中和抗体の水準と臨床スコアを観察した。実施例６に記載の尺度に従って各群について得られた臨床兆候のスコアを合計して、各動物の合計臨床スコアを計算した。
得られた結果は下記の通りである：
【００５２】
ｌｏｇ10ＶＮ50／ｍｌで表した抗ＦＣＶ４３１中和抗体の滴定量：
【表２】
0004841775.tif 000004
【００５３】
Ｄ４２〜Ｄ５６の間の平均臨床スコア：
【表３】
0004841775.tif 000005
【００５４】
これらの結果は同種攻撃に対する臨床的保護に優れ、血清変換が良好であることが示している。
本発明は上記の特定の実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲または精神を逸脱しない限り、種々の変形例を含むものである。本発明は特許請求の範囲のみで定義される。