(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
絶縁性基板と、
前記絶縁性基板上に形成された、作用極および対極を含む電極系と、
前記電極系の上部または近傍に形成された、リポプロテインリパーゼ、補酵素依存型グリセロールデヒドロゲナーゼおよび電子受容体を含む反応層と、
を備える、前記電極系に流れる電流値に基づいて中性脂肪の濃度を測定するためのバイオセンサであって、
前記補酵素がピロロキノリンキノンまたはフラビンアデニンジヌクレオチドである、バイオセンサ。
【請求項２】
前記電極系が、参照極をさらに含む、請求項１に記載のバイオセンサ。
【請求項３】
前記電子受容体が、フェリシアンイオン、ｐ−ベンゾキノン、ｐ−ベンゾキノン誘導体、フェナジンメトサルフェート、フェナジンメトサルフェート誘導体、メチレンブルー、チオニン、インジゴカーミン、ガロシアニン、サフラニン、フェロセンおよびその誘導体、α−ナフトキノンおよびα−ナフトキノン誘導体からなる群から選択される１種または２種以上である、請求項１または２のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項４】
前記反応層が、界面活性剤およびｐＨ緩衝剤をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項５】
前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、請求項４に記載のバイオセンサ。
【請求項６】
前記ｐＨ緩衝剤のｐＨが６〜９である、請求項４または５に記載のバイオセンサ。
【請求項７】
前記反応層が、親水性高分子をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項８】
前記親水性高分子が、タンニン酸、ペクチン、カゼイン、カラギナン、ファーセレラン、プルラン、コラーゲン、キチン、キトサン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、リグニンスルホン酸、およびこれらの誘導体からなる群から選択される１種または２種以上である、請求項７に記載のバイオセンサ。
【請求項９】
前記反応層が、
前記電子受容体および前記親水性高分子を含み、前記グリセロールデヒドロゲナーゼを実質的に含まない、第１反応層と、
前記第１反応層の上層に形成された、前記グリセロールデヒドロゲナーゼおよび前記親水性高分子を含み、前記電子受容体を実質的に含まない、第２反応層と、からなる、請求項７または８に記載のバイオセンサ。
【請求項１０】
前記第１反応層と前記第２反応層との間に、実質的に前記親水性高分子からなる第３反応層が形成された、請求項９に記載のバイオセンサ。
【請求項１１】
前記電極系の上層に、略矩形の開口部を有する絶縁層が形成され、前記対極の前記開口部からの露出面積が、前記作用極の前記開口部からの露出面積の１．２〜３．０倍であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項１２】
前記電極系をバイオセンサ外部へと電気的に導通させるためのリード部およびコネクタ部をさらに備え、
前記電極系を構成する材料が、１０μｍの厚さにおいて１００Ω／□以下の表面抵抗値を有するカーボンを主成分とする材料であり、前記リード部および前記コネクタ部を構成する材料が、１０μｍの厚さにおいて５０ｍΩ／□以下の表面抵抗値を有する金属を主成分とする材料である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項１３】
前記金属が、銀、金、白金、およびパラジウムからなる群から選択される１種または２種以上の金属である、請求項１２に記載のバイオセンサ。
【請求項１４】
前記グリセロールデヒドロゲナーゼが、界面活性剤の存在下、２価性架橋試薬で化学修飾されてなる修飾グリセロールデヒドロゲナーゼである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
【請求項１５】
前記グリセロールデヒドロゲナーゼが、グルコノバクター属に属する細菌由来である、請求項１４に記載のバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体試料などに含まれる中性脂肪を、迅速かつ高精度に定量することができるバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、中性脂肪の測定方法として（１）クロモトローブ酸を用いる方法、（２）アセチルアセトン法、（３）酵素法、（４）ネフェロメーターを用いる方法等があるが、これらの方法はいずれも煩雑な分析操作と長い分析時間を必要とするものである。このため、試料に含まれる特定成分の測定を行う際に、試料液の希釈や攪拌などを行うことなく簡易かつ迅速に目的物を定量するものとして、バイオセンサが開発されている。【０００３】
このような中性脂肪測定用バイオセンサとして、ｐＨ感応性イオン選択的電界効果トランジスタのゲート絶縁膜上に被覆された多孔質高分子膜または親水性の均質高分子膜にグリセロールエステル加水分解酵素を固定化したことを特徴とするトリグリセライドセンサがある（特開昭５９−２１０３５６号公報）。【０００４】
また、リポプロテインリパーゼとグリセロールオキシダーゼを用いた中性脂肪センサも知られている（特開昭５９−２２８１５８号公報）。当該センサは、第一の電極と第二の電極とを有し、一方の電極近傍に固定化酵素を配置し、膜電極間に流れる電流に基づいて、被測定溶液中に含まれる中性脂肪を測定するようにしたセンサであって、固定化酵素としてリポプロテインリパーゼとグリセロールオキシダーゼとを用いるものである。しかしながら、該装置は、ガラス製の内管とガラス製の外管とからなり、前記内管の底部に第一電極が設けられ、前記内管と前記外管との間に内部液を入れ、この内部液に第二電極が配置されるものであり、この電極を３０℃に維持された水槽に入れ、測定試料をこの水槽に注入するというものであり、装置が複雑である。【０００５】
より簡便な装置として、絶縁性基板上に少なくとも測定極と対極とを有する電極系を形成し、酵素、電子受容体および試料液の反応時の物質濃度変化を電気化学的に電極系で検知し、試料液の基質濃度を測定するセンサが提案されている（特開２００１−３４３３４９号公報）。当該センサは、測定極上に、リポプロテインリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼおよび界面活性剤を保持し、かつ試料液が通過可能な保持体を載置して第一層を形成させ、対極上に、界面活性剤を保持し、試料液が通過可能な保持体を載置して第二層を形成させた中性脂肪測定用センサである。
【発明の開示】
【０００６】
しかしながら、上記特開昭５９−２１０３５６号公報に記載のトリグリセライドセンサでは、グリセロールエステル加水分解酵素により遊離した脂肪酸をｐＨ感応性イオン選択的電界効果トランジスタを用いて測定するものであり、応答値が試料濃度の対数に比例するため測定精度が充分ではない。また、装置が複雑となる問題点もある。
【０００７】
また、上記特開昭５９−２２８１５８号公報記載の中性脂肪センサでは、正確に測定するために温度を一定にする加温装置が必要であり、測定試料もセンサ外から供給する必要があるため、試料量も多く必要となり、少量の試料からの測定は困難である。
【０００８】
加えて、特開２００１−３４３３４９号公報記載のセンサでは、酵素と電子受容体とが異なる層を構成するため、装置が極めて複雑であり、リポプロテインリパーゼに加えて、グリセロールキナーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼという高価な酵素を二種も使用する必要がある。
【０００９】
近年、生活習慣病である高脂血症の患者の数が増加の一途を辿っており、血液等の試料中の中性脂肪の濃度を迅速かつ高精度で測定可能なセンサの開発が強く望まれているのが現状である。
【００１０】
そこで本発明は、試料の前処理を行うことなく、生体試料などの試料から迅速かつ高精度で中性脂肪の濃度を測定可能なセンサを提供することを目的とする。
【００１１】
本発明者らは、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成された、作用極および対極を含む電極系と、前記電極系の上部または近傍に形成された反応層と、を備える、前記電極系に流れる電流値に基づいて中性脂肪の濃度を測定するためのバイオセンサにおいて、前記反応層にリポプロテインリパーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼおよび電子受容体を含ませることで、試料中のグリセロール濃度が迅速かつ高精度に測定されうることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１２】
すなわち、本発明の一形態は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成された、作用極および対極を含む電極系と、前記電極系の上部または近傍に形成された、リポプロテインリパーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼおよび電子受容体を含む反応層と、を備える、前記電極系に流れる電流値に基づいて中性脂肪の濃度を測定するためのバイオセンサに関する。
【００１３】
本発明のさらに他の目的、特徴および特質は、以後の説明および添付図面に例示される好ましい実施の形態を参酌することによって、明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明のバイオセンサの各構成要素の形成パターンを示す平面図である。（ａ）は、絶縁性基板上でのリード部およびコネクタ部の形成パターンを示す平面図である。（ｂ）は、電極系を構成する参照極の形成パターンを示す平面図である。（ｃ）は、電極系を構成する作用極および対極の形成パターンを示す平面図である。（ｄ）は、絶縁層の形成パターンを示す平面図である。（ｅ）は、スペーサおよび反応層の形成パターンを示す平面図である。
【図２】図１の各図に示す各構成要素の積層順序を示す分解斜視図である。
【図３】図１および図２の各図に示す各構成要素が形成されてなるバイオセンサを示す平面図である。
【図４】実施例１−１の結果を示すグラフである。
【図５】実施例１−２の結果を示すグラフである。
【図６】実施例２−１〜２−３の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための好ましい一実施形態について説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみには制限されない。【００１６】
本発明の一形態は、絶縁性基板と、前記絶縁性基板上に形成された、作用極および対極を含む電極系と、前記電極系の上部または近傍に形成された、リポプロテインリパーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼおよび電子受容体を含む反応層と、を備える、前記電極系に流れる電流値に基づいて中性脂肪の濃度を測定するためのバイオセンサに関する。【００１７】
図１は、本発明のバイオセンサ１０の各構成要素の形成パターンを示す平面図である。なお、図１の各図においては、各図により説明するための構成要素に加えて、絶縁性基板２０の外形を示す仮想線が図示されている。図１（ａ）は、絶縁性基板２０上でのリード部３０およびコネクタ部３２の形成パターンを示す平面図である。図１（ｂ）は、電極系４０を構成する参照極４２の形成パターンを示す平面図である。図１（ｃ）は、電極系４０を構成する作用極４４および対極４６の形成パターンを示す平面図である。図１（ｄ）は、絶縁層５０の形成パターンを示す平面図である。図１（ｅ）は、スペーサ６０および反応層７０の形成パターンを示す平面図である。なお、図１の各図においては、各図により説明するための構成要素と、絶縁性基板２０とが図示されている。図２は、図１の各図に示す各構成要素が形成されてなるバイオセンサ１０を示す平面図である。図２に示すバイオセンサ１０においては、絶縁性基板２０上に、一体化されたリード部３０およびコネクタ部３２、電極系４０、絶縁層５０、スペーサ６０および反応層７０が、絶縁層基板２０の側からこの順に積層されている。なお、バイオセンサ１０は、カバーによりさらに覆われた状態で使用および貯蔵される場合があるが、図１および図２においてはかようなカバーの図示は省略されている。また、説明の都合上、図面の寸法比率は誇張されており、図示する形態が実際とは異なる場合がある。【００１８】
バイオセンサ１０は、体液などの試料中の中性脂肪の濃度を測定するための装置である。以下、バイオセンサ１０を構成する各部材について詳細に説明する。【００１９】
バイオセンサ１０は、その基体として絶縁性基板２０を備える。絶縁性基板２０は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）やポリエチレン等の樹脂、ガラス、セラミックス、紙などの従来公知の絶縁性材料により構成されうる。絶縁性基板２０の形状やサイズについては、特に制限されない。【００２０】
絶縁性基板２０上には、図１および図２に示すように、リード部（３０ａ、３０ｂ、３０ｃ）およびコネクタ部（３２ａ、３２ｂ、３２ｃ）が形成されている。コネクタ部（３２ａ、３２ｂ、３２ｃ）は、後述する電極系４０とバイオセンサ１０外部とを電気的に接続するための手段として機能し、リード部（３０ａ、３０ｂ、３０ｃ）を介して電極系４０と電気的に接続されている。リード部（３０ａ、３０ｂ、３０ｃ）は、図２に示すように、コネクタ部（３２ａ、３２ｂ、３２ｃ）から、電極系４０の位置まで延長されており、電極系４０の各電極（４２、４４、４６）の下地層を構成する。リード部（３０ａ、３０ｂ、３０ｃ）およびコネクタ部（３２ａ、３２ｂ、３２ｃ）を構成する材料は特に制限されず、バイオセンサのリード部およびコネクタ部の形成に従来用いられている材料が適宜用いられうる。ただし、バイオセンサ１０の応答感度をより一層向上させるという観点からは、リード部（３０ａ、３０ｂ、３０ｃ）およびコネクタ部（３２ａ、３２ｂ、３２ｃ）は、表面抵抗値のより小さい材料から構成されることが好ましい。具体的には、１０μｍの厚さにおいて５０ｍΩ／□以下、より好ましくは４０ｍΩ／□以下の表面抵抗値を有する材料から構成されることが好ましい。表面抵抗値が上記の範囲よりも大きい材料を用いてリード部およびコネクタ部を構成すると、基質濃度と応答値との間の線形性が低下し、本発明による測定感度の向上効果が充分に得られない虞がある。一方、当該材料の表面抵抗値の下限については特に制限はないが、リード部３０およびコネクタ部３２と基板との接着性を確保するためにバインダを添加することを考慮すると、リード部３０およびコネクタ部３２の表面抵抗値は、１０μｍの厚さにおいて０．１ｍΩ／□以上程度となることが予想される。ただし、リード部３０およびコネクタ部３２が、これらの範囲を外れる表面抵抗値を有する材料から構成されても、勿論よい。上述した好ましい表面抵抗値を有する材料としては、例えば、銀、金、白金、およびパラジウムなどの金属を主成分とするものが挙げられる。各リード部（３０ａ、３０ｂ、３０ｃ）および各コネクタ部（３２ａ、３２ｂ、３２ｃ）を構成する材料は、それぞれ同一であってもよいし、異なっていてもよい。ただし、低コストという観点から、リード部およびコネクタ部は、いずれも銀により構成されることが好ましい。リード部およびコネクタ部の形成方法は特に制限されず、スクリーン印刷法やスパッタリング法などの従来公知の手法により形成されうる。この際、リード部およびコネクタ部を構成する材料は、ポリエステル等の樹脂バインダを含むペーストの形態で提供されうる。上記の手法により塗膜を形成した後には、塗膜を硬化させる目的で、５０〜２００℃程度の温度で加熱処理を施すとよい。【００２１】
図１および図２に示すように、リード部（３０ａ、３０ｂ、３０ｃ）が延長されてなる下地層の上層には、電極系４０が形成されている。この電極系４０は、バイオセンサ１０の使用時において、後述する反応層７０中の試料に電圧を印加するための電圧印加手段、および、試料中に流れる電流を検出するための電流検出手段として機能する。【００２２】
図示する形態において、電極系４０は、参照極４２、作用極４４、および対極４６の３極からなる。すなわち、図示する形態のバイオセンサ１０は、３電極式センサである。ただし、本発明のバイオセンサは３電極式のみに制限されず、参照極を含まない電極系を備えた２電極式センサであってもよい。なお、電極系４０における電圧の制御がより高感度で行われるという観点からは、２電極式よりも３電極式が好ましく用いられうる。【００２３】
作用極４４および対極４６は、バイオセンサ１０の使用時に一対となって、後述する反応層７０中の試料に電圧を印加した際に流れる酸化電流（応答電流）を測定するための電流測定手段として機能する。バイオセンサ１０の使用時には、参照極４２と作用極４６との間に所定の電圧が印加される。各電極を構成する材料は特に制限されず、バイオセンサの電極系の形成に従来用いられている材料が適宜用いられうる。ただし、バイオセンサ１０の応答感度をより一層向上させるという観点から、電極系４０は、１０μｍの厚さにおいて１００Ω／□以下、より好ましくは８０Ω／□以下の表面抵抗値を有する材料から構成されることが好ましい。表面抵抗値が上記の範囲よりも大きい材料を用いて電極系４０を構成すると、基質濃度と応答値との間の線形性が低下し、本発明による測定感度の向上効果が充分に得られない虞がある。一方、当該材料の表面抵抗値の下限については特に制限はない。各電極（４２、４４、４６）を構成する材料は、それぞれ同一であってもよいし、異なっていてもよい。ただし、耐腐食性およびコストの観点から、各電極（４２、４４、４６）は、いずれもカーボンを主成分として構成されることが好ましい。ただし、場合によっては、種々の金属等のカーボン以外の材料により、電極系４０が構成されてもよい。電極系の形成方法は特に制限されず、スクリーン印刷法やスパッタリング法などの従来公知の手法により形成されうる。この際、電極系を構成する材料は、ポリエステル等の樹脂バインダを含むペーストの形態で提供されうる。上記の手法により塗膜を形成した後には、塗膜を硬化させる目的で、加熱処理を施すとよい。【００２４】
本形態のバイオセンサ１０において、電極系４０を構成する各電極（４２、４４、４６）は、図３に示すように、電極系４０の上層に形成された絶縁層５０の有する略矩形の開口部から、露出している。ここで、前記開口部からの作用極４４および対極４６の露出面積の比の値は、所定の範囲内に制御されていることが好ましい。具体的には、対極４６の前記開口部からの露出面積は、作用極４４の前記開口部からの露出面積の１．２〜３．０倍である。対極４６の露出面積が作用極４４の露出面積の１．２倍未満であると、酸化電流値の測定時における対極４６での酸化還元反応の飽和が充分に抑制されず、バイオセンサ１０の測定感度を向上させるという本発明の効果が充分に得られない虞がある。一方、対極４６の露出面積が作用極４４の露出面積の３．０倍を超えると、バイオセンサ１０の小型化が困難となる虞がある。【００２５】
絶縁性基板２０上に形成されたリード部（３０ａ、３０ｂ、３０ｃ）およびコネクタ部（３２ａ、３２ｂ、３２ｃ）、並びに電極系４０の上層には、図１および図２に示すように、電極系４０が露出するように、絶縁層５０が形成されている。絶縁層５０は、電極系４０を構成する各電極間の短絡を防止するための絶縁手段として機能する。絶縁層５０を構成する材料は特に制限されないが、例えば、レジストインク、ＰＥＴやポリエチレン等の樹脂、ガラス、セラミックス、紙などにより構成されうる。絶縁層５０の形成方法についても特に制限はなく、スクリーン印刷法や接着法などの従来公知の手法により形成されうる。【００２６】
電極系４０および絶縁層５０の上層には、図１および図２に示すように、スペーサ６０および反応層７０が形成されている。バイオセンサ１０の使用時には、反応層７０において、後述する酵素反応が進行する。また、スペーサ６０を設けることで、バイオセンサ１０の使用時における反応層７０および試料溶液の漏出が防止される。図示する形態において、スペーサ６０は、電極系４０に対応する部位に矩形の開口部を有しており、この開口部に反応層７０が設けられている。ただし、スペーサ６０の有する開口部の形状は矩形のみに制限されず、任意の形状が用いられうる。スペーサ６０を構成する材料は特に制限されないが、例えば、ＰＥＴやポリエチレン等の樹脂、ガラス、セラミックス、紙などにより構成されうる。スペーサ６０および反応層７０の形成方法は特に制限されず、例えば、所定の部位に開口部を有するスペーサ６０を載置し、この開口部に反応層７０を形成するための溶液を滴下して、乾燥させるという手法が用いられうる。【００２７】
本形態のバイオセンサにおいて、反応層７０は、リポプロテインリパーゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼおよび電子受容体を含む。【００２８】
従来、絶縁性基板上に作用極と対極とを有する電極系が形成され、前記電極系上または電極系の近傍に反応層が形成されるバイオセンサがあり、反応層にリポプロテインリパーゼと他の酵素とを組み合わせるセンサも存在した。しかしながら本発明では、リポプロテインリパーゼとともにグリセロールデヒドロゲナーゼを配合することで、簡便かつ安価に中性脂肪の測定を行うことができる。しかも、反応層は電子受容体をさらに含むため、酵素を含む反応層と電子受容体を含む層とを別個に設ける必要がなく、構造を簡便にすることができる。本形態のバイオセンサにリポタンパク質を含む試料を添加すると、反応層に含まれるリポプロテインリパーゼが、リポタンパク質中の中性脂肪を分解することにより、グリセロールおよび脂肪酸が遊離する。そして、反応層にグリセロールデヒドロゲナーゼおよび電子受容体が存在すると、グリセロールが酸化されるとともに電子受容体が還元される。そのため、得られる電子受容体の酸化電流値から基質の濃度を正確に定量することができる。以下、本発明の特徴的な構成について詳細に説明する。【００２９】
本形態のバイオセンサにおいて用いられるリポプロテインリパーゼとしては、リポタンパク質を分解してグリセロールを遊離できるものであれば特に制限はなく、従来公知のリポプロテインリパーゼであっても、さらにこれを改質して安定性や反応性を向上させたものなど、いずれも好適に使用されうる。反応層におけるこのようなリポプロテインリパーゼの含有量も、用いられる生体試料の種類やその添加量などによって適宜選択することができる。一般には、反応層に含まれるリポプロテインリパーゼ量は、０．００１〜１０００活性単位、より好ましくは０．１〜５００活性単位、特に好ましくは０．１〜３００活性単位である。なお、リポプロテインリパーゼの活性単位の定義および測定方法は以下の通りである。【００３０】
［リポプロテインリパーゼ活性の測定方法］
２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）１ｍＬに大豆油エマルジョン２ｍＬを添加し、十分に撹拌した後、リポプロテインリパーゼ含有溶液を１ｍＬ添加し、３７℃にて２０分間振盪させる。振盪後、反応停止液を１０ｍＬ添加し、さらにｎ−ヘプタン６ｍＬおよびイオン交換水４ｍＬを添加し、十分に撹拌する。なお、「大豆油エマルジョン」とは、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）で調製した１０％ウシ血清アルブミン溶液１６ｍＬに大豆油２４ｍＬを添加し、十分に撹拌したものである。また、「反応停止液」とは、ｎ−ヘプタン／２−プロパノール／２Ｎ硫酸（１０／４０／１、ｗ／ｗ／ｗ）混合液である。【００３１】
次いで、上層（ｎ−ヘプタン層）を６ｍＬ取り、これにクレゾールレッド指示薬を２滴滴下し、エタノールで調製した０．０１Ｍ水酸化カリウム溶液で滴定を行い、液が紫色に変化した時点を滴定の終点として、遊離した脂肪酸量を求める。ブランクとしては、リポプロテインリパーゼ含有溶液に代えて２０ｍＭリン酸緩衝液１ｍＬを用いて同様の操作を行い、遊離した脂肪酸量を求める。【００３２】
上記条件において、１分間に１μｍｏｌの脂肪酸を遊離させるリポプロテインリパーゼ量を１活性単位と定義する。【００３３】
また、グリセロールデヒドロゲナーゼとしても同様に、グリセロールを酸化して電子受容体を還元できるものであれば特に制限はなく、従来公知のグリセロールデヒドロゲナーゼであっても、さらにこれを改質して安定性や反応性を向上させたものなど、いずれも好適に使用することができる。特には、グリセロールデヒドロゲナーゼが補酵素依存型であることが好ましい。【００３４】
このような補酵素としては、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）、ＣｏＱなどのキノン補酵素、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ＦＭＮ、ＮＡＤ、ＮＡＤＰ、ビオチンなどのビタミン補酵素などを好適に使用することができる。これらの中でも、補酵素はＰＱＱまたはＦＡＤであることが好ましく、ＰＱＱであることがより好ましい。ここで、例えば、グリセロールオキシダーゼを酵素として反応層に含ませると、溶液中の溶存酸素を使用して反応が進行するため、正確な中性脂肪の測定を行うことが困難である。これに対し、上述した形態のバイオセンサによれば、補酵素依存型のグリセロールデヒドロゲナーゼは溶液中の電子受容体のみを反応に使用するため溶存酸素の影響を受けない。従って、還元された電子受容体を酸化して得られる酸化電流を測定すれば、グリセロールの濃度が正確に測定されうる。反応層におけるグリセロールデヒドロゲナーゼの含有量も、用いられる生体試料の種類やその添加量などによって適宜選択することができる。一般には、反応層に含まれるグリセロールデヒドロゲナーゼ量は、０．０１〜２００活性単位、より好ましくは０．０５〜１００活性単位、特に好ましくは０．１〜８０活性単位である。なお、グリセロールデヒドロゲナーゼの活性単位の定義および測定方法については、後述する実施例の記載が参照されうる。【００３５】
本形態において用いられるグリセロールデヒドロゲナーゼは、市販の商品を購入して用いてもよいし、自ら調製したものを用いてもよい。当該酵素を自ら調製する手法としては、例えば、当該酵素を産生する細菌を利用する手法がある。当該酵素を産生する細菌としては、例えば、グルコノバクター属、シュードモナス属など様々な属に属する細菌が挙げられる。本実施形態では、特にグルコノバクター属に属する細菌の膜画分に存在するＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼが好ましく用いられうる。さらに、入手の容易さから、グルコノバクター属、特には、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ  ３１７１、３２５３、３２５８、３２８５、３２８９、３２９０、３２９１、グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）ＮＢＲＣ  ３２５１、３２６０、３２６４、３２６５、３２６８、３２８６、グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  Ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ  ３２６２等が用いられうる。このような微生物の代表菌株としては、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ  ３２９１が挙げられる。【００３６】
これらの細菌からＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを得る手法については特に制限されず、従来公知の知見が適宜参照されうる。【００３７】
本形態のバイオセンサにおいて、グリセロールデヒドロゲナーゼがＰＱＱ依存性である場合、当該グリセロールデヒドロゲナーゼは、界面活性剤の存在下、２価性架橋試薬で化学修飾されて得られる修飾グリセロールデヒドロゲナーゼであることが好ましい。かような修飾グリセロールデヒドロゲナーゼにおいては、疎水性の酵素が凝集せずに架橋構造が導入されて構造が強固となっており、熱安定性が向上しうる。従って、上述した実施形態のバイオセンサによれば、試料中の中性脂肪濃度をより高精度で測定することが可能となる。【００３８】
２価性架橋試薬は、ＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼに含まれるアミノ基などと反応して架橋構造を導入できるものであれば特に制限はなく、固定化酵素の分野で酵素の架橋剤として使用できるジアルデヒド化合物、ジカルボン酸化合物、ジイソシアネート系化合物、イミデート化合物などを好適に使用することができる。ジアルデヒド化合物としては、グルタルアルデヒド、スクシンジアルデヒド、アジピンアルデヒド等があり、ジカルボン酸化合物としては、アジピン酸、ジメチルアジピン酸等があり、ジイソシアネート系化合物としてはヘキサメチレンジイソシアネート、トルエンジイソシアネートなどがあり、イミデート化合物としては、ジメチルスベルイミデート、ジメチルピメルイミデートなどがある。本発明では、上記２価性架橋試薬の中でも、グルタルアルデヒドが特に好ましい。【００３９】
一方、界面活性剤としては、一般的に膜タンパク質の可溶化に用いられているものであれば特に制限されず、従来公知の知見が適宜参照されうる。例えば、トリトンＸ−１００、オクチルグルコシド、コール酸ナトリウムなどが挙げられる。【００４０】
架橋反応時の反応温度は、用いる２価性架橋試薬によって適宜選択することができるが、一般には０〜４０℃程度で行うことが好ましく、反応時間は１分〜４時間、好ましくは５分〜２時間程度、特に好ましくは５分〜１時間である。１分を下回ると架橋が十分でなく未架橋酵素量が多くなり、一方、４時間を越えると架橋率が上がりすぎ酵素の活性が失われる場合がある。【００４１】
架橋反応は、グリシン溶液またはトリス塩酸緩衝液のような停止剤を加えて反応させることで停止させることができる。上記架橋処理後、未反応のグリシン、２価性架橋試薬、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、および停止剤と２価性架橋試薬との反応物は、透析法、クロマトグラフィー法、限外濾過法等を行うことで除去することができる。本発明では、特に透析法を行うことが好ましい。その理由は、操作が簡便であり、コストがかからないためである。【００４２】
電子受容体は、バイオセンサ１０の使用時において、酸化還元酵素の作用によって生成した電子を受け取る、すなわち還元される。そして、還元された電子受容体は、酵素反応終了後に電極系４０に流される電流によって電気化学的に酸化される。この際に流れる電流（酸化電流と称する）の大きさから、試料溶液中の所望の成分の濃度が算出されうる。【００４３】
本形態のバイオセンサにおいて用いられる電子受容体についても特に制限はなく、グリセロールデヒドロゲナーゼによるグリセロールの酸化に伴って還元され、電極系への電圧の印加により酸化されるものであればよい。具体的には、例えば、フェリシアンイオン、ｐ−ベンゾキノン、ｐ−ベンゾキノン誘導体、フェナジンメトサルフェート、フェナジンメトサルフェート誘導体、メチレンブルー、チオニン、インジゴカーミン、ガロシアニン、サフラニン、フェロセンおよびその誘導体、α−ナフトキノンおよびα−ナフトキノン誘導体などが例示される。ここで、ｐ−ベンゾキノン誘導体、フェナジンメトサルフェート誘導体、α−ナフトキノン誘導体としては、ｐ−ベンゾキノン、フェナジンメトサルフェート、α−ナフトキノンに炭素数１または２のアルキル基が結合したもの、炭素数１または２のアルコキシ基が結合したもの、フッ素原子、塩素原子、臭素原子などのハロゲン原子が結合したものなどが挙げられる。なお、グリセロールデヒドロゲナーゼとして上述したＰＱＱ依存型グリセロールデヒドロゲナーゼが反応層に含まれる場合には、電子受容体として、フェナジンメトサルフェート、フェナジンメトサルフェート誘導体である１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート、ｐ−ベンゾキノン、ｐ−ベンゾキノン誘導体である２−メチル−１，４−ベンゾキノン、α−ナフトキノンを採用することが好ましい。【００４４】
また、これらの電子受容体は１種のみが単独で用いられてもよいし、例えば１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェートとフェリシアンイオンとを組み合わせるなど、２種以上が併用されてもよい。【００４５】
反応層における電子受容体の反応層中の濃度は、使用する酸化還元酵素や対象とする試料の種類や添加量などによって適宜選択することができるが、一般には、０．５〜１０μＬの試料を添加する場合には、１センサあたり、好ましくは０．０１〜１０００μｇであり、より好ましくは０．１〜１００μｇであり、特に好ましくは１〜５０μｇである。【００４６】
反応層は、界面活性剤およびｐＨ緩衝剤をさらに含むことが好ましい。これは以下の理由による。すなわち、本形態のバイオセンサは試料中の中性脂肪濃度を測定する目的で用いられる。従って、センサに滴下される試料は脂溶性物質である中性脂肪を含む。ここで、反応層が界面活性剤およびｐＨ緩衝剤をさらに含む本実施形態によれば、試料中の中性脂肪の脂溶性に起因する測定感度の低下が抑制されうる。以下、上述した実施形態について詳細に説明する。【００４７】
本実施形態のバイオセンサにおいて、反応層７０は、界面活性剤を含む。反応層７０に界面活性剤が含まれることにより、試料中に含まれる中性脂肪の反応層７０への溶解が促進されうる。その結果、測定感度に優れるバイオセンサが提供されうる。【００４８】
反応層７０に含まれる界面活性剤の種類は特に制限されず、従来公知の界面活性剤が用いられうる。ここで、界面活性剤は、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、および非イオン性界面活性剤に大きく分類されるが、これらのいずれが用いられてもよい。ここで、陽イオン性界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩などが挙げられる。陰イオン性界面活性剤としては、アルキル硫酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸塩、コール酸塩などが挙げられる。両性界面活性剤としては、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチンなどが挙げられる。非イオン性界面活性剤としては、アシルソルビタン、アルキルグルコシド、トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）系界面活性剤、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）系界面活性剤、Ｂｒｉｊ系界面活性剤などが挙げられる。ただし、これら以外の界面活性剤が用いられてもよいことは勿論である。なかでも、好ましくは非イオン性界面活性剤が、より好ましくはトゥイーン系やトリトン系の界面活性剤が用いられる。【００４９】
反応層７０における界面活性剤の含有量については特に制限はなく、試料溶液中の脂溶性物質の量などに応じて適宜調節されうる。一例を挙げると、０．５〜１０μＬの試料溶液を添加して用いるバイオセンサ１０の反応層７０には、通常は０．１〜５００μｇ、好ましくは１〜１００μｇ、より好ましくは１〜５０μｇの界面活性剤が含まれる。【００５０】
また、本実施形態のバイオセンサ１０において、反応層７０は、ｐＨ緩衝剤を含む。反応層７０がｐＨ緩衝剤を含むと、バイオセンサ１０の感度がより一層向上しうる。この理由は以下の通りであると推測される。すなわち、試料溶液の添加により反応層７０が溶解する際、試料溶液の組成によっては、反応層７０のｐＨが変動する場合がある。ｐＨ変動の一例としては、反応層７０において試料中の中性脂肪が分解することによる脂肪酸の遊離に伴うｐＨの低下が挙げられる。ここで、バイオセンサ１０のメカニズムは、酸化還元酵素により酸化される基質の量を間接的に定量するというものであるから、反応層７０のｐＨが変動すると、当該酵素の種類によっては、反応層７０のｐＨと酵素の最適ｐＨとがずれてしまい、センサの測定感度の低下につながる場合がある。これに対し、反応層７０がｐＨ緩衝剤を含むと、かようなｐＨ変動が抑制され、ｐＨ変動に伴うセンサの測定感度の低下が防止されるのである。【００５１】
反応層７０に含まれるｐＨ緩衝剤の種類は特に制限されず、用いる酵素の最適ｐＨに応じて適宜選択されうるが、一例としては、グリシン−ＨＣｌ、グリシン−ＮａＯＨ、クエン酸−クエン酸ナトリウム、ＭＥＳ−ＮａＯＨ、ＭＯＰＳ−ＮａＯＨ、リン酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸などが挙げられる。なお、ｐＨ緩衝剤のｐＨは、６〜９であることが好ましい。また、これらのｐＨ緩衝剤は、１種のみが単独で反応層７０に含まれてもよいし、２種以上が併せて反応層７０に含まれてもよい。また、上記以外のｐＨ緩衝剤が反応層７０に含まれてもよいことは勿論である。【００５２】
さらに反応層は、他の成分を含みうる。他の成分としては、例えば、親水性高分子や酵素安定化剤などが挙げられる。【００５３】
反応層が親水性高分子を含むことにより、電極系表面からの反応層の剥離が防止されうる。また、親水性高分子は、反応層表面の割れを防ぐ効果も有しており、バイオセンサの信頼性を高めるのに効果的である。さらに、タンパク質などの吸着性成分の電極系４０への吸着もまた、抑制されうる。このような親水性高分子としては、特に制限されないが、例えば、セルロース、グアーガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチン、アクリル酸およびその塩、メタクリル酸およびその塩、スターチ、無水マレイン酸およびその塩、アガロースゲル、タンニン酸、ペクチン、カゼイン、カラギナン、ファーセレラン、プルラン、コラーゲン、キチン、キトサン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、リグニンスルホン酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、およびこれらの誘導体が挙げられる。これらの中でも、タンニン酸、ペクチン、カゼイン、カラギナン、ファーセレラン、プルラン、コラーゲン、キチン、キトサン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、リグニンスルホン酸、およびこれらの誘導体が反応層７０に含まれると、吸着性成分の電極への吸着がより一層抑制され、タンニン酸、ペクチン、カゼイン、およびこれらの誘導体が特に好ましく用いられうる。なお、上記の親水性高分子は、１種のみが単独で反応層７０に含まれてもよいし、２種以上が併せて反応層７０に含まれてもよい。なお、このような親水性高分子の配合量は、一般には１センサあたり、好ましくは０．１〜１０００μｇであり、より好ましくは１〜５００μｇであり、特に好ましくは５〜１００μｇである。【００５４】
反応層７０は１層のみからなる層であってもよいし、２層以上からなる層であってもよい。反応層７０が２層からなる形態としては、例えば、電子受容体および親水性高分子を含み、グリセロールデヒドロゲナーゼを実質的に含まない第１反応層と、前記第１反応層の上層に形成された、グリセロールデヒドロゲナーゼおよび親水性高分子を含み、電子受容体を実質的に含まない第２反応層とから、反応層７０が構成される形態が挙げられる。また、反応層７０が３層からなる形態としては、例えば、電子受容体および親水性高分子を含み、グリセロールデヒドロゲナーゼを実質的に含まない第１反応層と、前記第１反応層の上層に形成された、親水性高分子を含み、グリセロールデヒドロゲナーゼおよび電子受容体を実質的に含まない第２反応層と、前記第２反応層の上層に形成された、グリセロールデヒドロゲナーゼおよび親水性高分子を含み、電子受容体を実質的に含まない第３反応層とから、反応層７０が構成される形態が挙げられる。【００５５】
また、図示する形態において、反応層７０は電極系４０の上層に形成されているが、場合によっては、図示する形態とは異なり、電極系４０の近傍に反応層７０を形成し、電極系４０と反応層７０とが直接接触しない形態としてもよい。なお、反応層７０が電極系４０の「近傍」に形成される形態としては、電極系４０と反応層７０との間に空間やフィルタが介在する形態や、試料供給口と電極系４０との間に反応層７０が形成される形態などが例示される。【００５６】
以上、本発明のバイオセンサ１０の構成について詳細に説明したが、上記の形態のみに制限されることはなく、従来公知の知見を適宜参照して、種々の改良を施すことも可能である。従来公知の知見としては、例えば、特開平２−０６２９５２号公報、特開平５−８７７６８号公報、特開平１１−２０１９３２号公報などが挙げられる。【００５７】
続いて、本発明のバイオセンサ１０の動作について説明する。【００５８】
まず、濃度の測定を希望する成分を含む試料の所定量を、バイオセンサ１０の反応層７０に供給する。試料の具体的な形態は特に制限されず、バイオセンサ１０に用いられるグリセロールデヒドロゲナーゼの基質である中性脂肪を含む溶液が適宜用いられうる。試料としては、例えば、血液、尿、唾液などの生体試料、果物、野菜、加工食品原料などの食品等が用いられうる。ただし、その他の溶液が試料として用いられてもよい。また、特に中性脂肪の含有量がより高い試料溶液を用いると、本発明の効果がより一層顕在化しうる。なお、試料は原液がそのまま用いられてもよいし、粘度などを調節する目的で適当な溶媒で希釈された溶液が用いられてもよい。試料を反応層７０へ供給する形態は特に制限されず、所定量の試料を反応層７０に対して垂直に直接滴下することにより供給してもよいし、別途設けた試料供給手段により、反応層７０に対して水平方向から試料を供給してもよい。【００５９】
反応層７０へと試料が供給されると、試料中の基質である中性脂肪は、反応層７０に含まれるリポプロテインリパーゼの作用によってグリセロールおよび脂肪酸に分解される。次いで、遊離したグリセロールはグリセロールデヒドロゲナーゼの作用によって酸化され、自身の酸化と同時に電子を放出する。基質から放出された電子は、電子受容体に捕捉され、これに伴って電子受容体は酸化型から還元型へと変化する。試料の添加後、バイオセンサ１０を所定時間放置することにより、リポプロテインリパーゼおよびグリセロールデヒドロゲナーゼの作用によって試料中の中性脂肪が完全に酸化され、一定量の電子受容体が酸化型から還元型へと変換される。試料中の中性脂肪と酵素との反応を完結させるための放置時間については特に制限はないが、試料添加後、通常は０〜５分間、好ましくは０〜３分間、バイオセンサ１０を放置すればよい。【００６０】
その後、還元型の電子受容体を酸化する目的で、電極系４０を介して、作用極４４と対極４６との間に、所定の電圧を印加する。これにより、反応層７０中に電流（以下、「酸化電流」とも称する）が流れ、この電流によって還元型の電子受容体が電気化学的に酸化され、酸化型へと変換される。この際に測定される酸化電流の値から、電圧印加前の還元型の電子受容体の量が算出され、さらに、グリセロールデヒドロゲナーゼと反応したグリセロールの量が定量されうる。そして、最終的には、試料中の中性脂肪濃度が算出されうる。酸化電流を流す際に印加される電圧の値は特に制限されず、従来公知の知見を参照して適宜調節されうる。一例を挙げると、−２００〜７００ｍＶ程度、好ましくは０〜６００ｍＶの電圧を、参照極４２と作用極４４との間に印加すればよい。電圧を印加するための電圧印加手段についても特に制限はなく、従来公知の電圧印加手段が適宜用いられうる。【００６１】
本発明の他の形態によれば、上述したバイオセンサ１０を用いた、試料中の中性脂肪濃度の測定方法が提供される。【００６２】
酸化電流値の測定、および当該電流値から基質濃度への換算の手法としては、所定の電圧を印加してから一定時間後の電流値を測定するクロノアンペロメトリー法が用いられてもよいし、クロノアンペロメトリー法による電流応答を時間で積分して得られる電荷量を測定するクロノクーロメトリー法が用いられてもよい。簡単な装置系により測定されるという点で、クロノアンペロメトリー法が好ましく用いられうる。【００６３】
以上、還元型の電子受容体を酸化する際の電流（酸化電流）を測定することにより中性脂肪濃度を算出する形態を例に挙げて説明したが、場合によっては、還元されずに残存している酸化型の電子受容体を還元する際の電流（還元電流）を測定することにより中性脂肪濃度を算出する形態が採用されてもよい。
【実施例】
【００６４】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。【００６５】
（酵素活性）
５０μＭ  ＤＣＩＰ、０．２ｍＭ  ＰＭＳ、４００ｍＭ  グリセロールを含んだ０．２％トリトンＸ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．０）中に、ＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを溶解してＰＱＱ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼ溶液を調製した。該溶液に含まれる酵素と基質との反応をＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化によって追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１単位（Ｕ）とした。なお、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数は１６．３ｍＭ−１とした。【００６６】
（参考例１）
ソルビトール（２質量％）、酵母エキス（０．３質量％）、肉エキス（０．３質量％）、コーン・スティープ・リカー（０．３質量％）、ポリペプトン（１質量％）、尿素（０．１質量％）、ＫＨ２ＰＯ４（０．１質量％）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．０２質量％）、ＣａＣｌ２（０．１質量％）、ｐＨ７．０よりなる培地４００ｍＬを５００ｍＬ容坂口フラスコに一本あたり１００ｍＬずつ移し、１２１℃、２０分間でオートクレーブを行った。【００６７】
種菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ３２９１株を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間培養し、種培養液とした。【００６８】
次に上記と同じ組成で調製した培地６．６Ｌを１０Ｌ容ジャーファーメンターに移し、１２１℃で２０分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液４００ｍＬを移した。これを、７５０ｒｐｍ、通気量７Ｌ／分、３０℃で２４時間培養した。【００６９】
培養液を遠心分離して集菌し、蒸留水で懸濁後、フレンチプレスにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離し、得られた上清を超遠心分離して、膜画分を沈殿物として得た。この膜画分を１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁後、最終濃度が１％となるようにトリトンＸ−１００を加え、４℃で２時間撹拌した。超遠心分離し、上清を０．２質量％トリトンＸ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析し、これを可溶化膜画分とした。この可溶化膜画分をＦＰＬＣにてＲｅｓｏｕｒｃｅＱ（６ｍＬ）で分画し、得られた活性画分を０．２質量％トリトンＸ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析後、凍結乾燥することにより、比活性３Ｕ／ｍｇタンパク質の酵素標品を得た。このグルコノバクター・オキシダンス由来グリセロールデヒドロゲナーゼを、以下、単に「ＧｌｙＤＨ」とも称する。【００７０】
（実施例１−１）
電極系が形成されたセンサ基板として、市販のセンサ電極（ＢＶＴ社製；ＡＣ１．Ｗ５．Ｒ１）を準備した。このセンサ基板において、電極系は直径約６ｍｍの略円形状である。さらに、上記で準備した電極系の上部に、直径６ｍｍの孔を開けた厚さ０．２ｍｍのＰＥＴシートを貼り合わせ、スペーサを形成した。電極系上のスペーサの孔の内部に、上記の参考例１で得たＧｌｙＤＨ（２０Ｕ／ｍＬ）と、リポプロテインリパーゼ（天野エンザイム製、１０，０００Ｕ／ｍＬ）と、電子受容体として１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート（同人化学研究所製：１０ｍｍｏｌ／Ｌ；以下、「ｍ−ＰＭＳ」とも称する）とを混合したリン酸緩衝生理食塩水を１０μＬ滴下し、室温で乾燥させて反応層を形成した。【００７１】
この反応層上に、トリオレインを５０ｍｇ／ｄＬ含有する試料液１０μＬを滴下した。試料に含まれるトリオレインがリポプロテインリパーゼによって脂肪酸およびグリセロールに加水分解され、このグリセロールがＧｌｙＤＨにより酸化され、同時に反応層中の電子受容体が還元された。【００７２】
試料を滴下してから５分後に、参照極に対して＋１５０ｍＶの電位を作用極に印加して、電子受容体の酸化電流値を測定した。測定には電気化学測定システムＨＺ−５０００北斗電工製、ＨＡＧ１５１２ｍ／ＢＰ）を使用した。この電流値（応答電流）は電子受容体の還元体の濃度、すなわち試料中のトリオレイン濃度に比例する。この電流値を測定することで試料中のトリオレインの濃度を評価した。【００７３】
なお、試料は、１０質量％のトリトンＸ−１００を含むリン酸緩衝生理食塩水にトリオレイン（東京化成工業製）を溶解させたものである。【００７４】
次いで、試料に含まれるトリオレイン量を０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ、１５０ｍｇ／ｄＬおよび２００ｍｇ／ｄＬに代えたこと以外は、上記と同様にして応答電流を測定した。各濃度のトリオレインを含む試料について電位印加後１秒後の電流量をプロットした結果を図４に示す。【００７５】
図４に示すように、応答電流値とトリオレイン濃度の間に良好な線形性が認められた。【００７６】
（実施例１−２）
実施例１−１で使用した電極系上に、０．５％（ｗ／ｖ）のカルボキシメチルセルロースナトリウム（和光純薬製；以下、「ＣＭＣ」とも称する）水溶液を滴下乾燥後、実施例１と同様にして得られたＧｌｙＤＨ（２０Ｕ／ｍＬ）、リポプロテインリパーゼ（１０，０００ｕ／ｍＬ）およびｍ−ＰＭＳ（１０ｍｍｍｏｌ／Ｌ）を含む０．５％ＣＭＣ溶液を滴下し、乾燥させて反応層を形成した。【００７７】
このバイオセンサを使用して、実施例１−１と同様に応答電流値とトリオレイン濃度の相関性を調べた。その結果を図５に示す。【００７８】
図５に示すように、得られた応答電流値はＣＭＣの影響により若干低下しているが、応答電流値と中性脂肪濃度には実施例１よりもさらに高い相関性が認められた。【００７９】
（実施例２−１）
電極系が形成されたセンサ基板として、市販のセンサ電極（ＢＶＴ社製；ＡＣ１．Ｗ５．Ｒ１）を準備した。このセンサ基板において、電極系は直径約６ｍｍの略円形状である。さらに、上記で準備した電極の上部に、直径６ｍｍの孔を開けた厚さ０．２ｍｍのＰＥＴシートを貼り合わせ、スペーサを形成した。【００８０】
一方、ｐＨ７．０のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に、上記の参考例で得た酸化還元酵素であるＧｌｙＤＨ（３０Ｕ／ｍＬ）、リポプロテインリパーゼ（天野エンザイム株式会社製、１０，０００Ｕ／ｍＬ）、電子受容体である１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート（以下、「ｍ−ＰＭＳ」とも称する）（株式会社同仁化学研究所製、１０ｍＭ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（０．５質量％）、および界面活性剤であるトリトンＸ−１００（２質量％）を添加して、反応層形成用組成物を調製した。【００８１】
上記で調製した反応層形成用組成物の１０μＬを、スペーサの有する孔の内部に滴下し、室温で乾燥させて、反応層を形成した。【００８２】
さらに、トリトンＸ−１００を１０質量％含有するｐＨ７．０のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に、トリオレイン（東京化成工業株式会社製）を１００ｍｇ／ｄＬの濃度となるように溶解させて、試料溶液を調製した。【００８３】
調製した試料溶液を、上記の反応層に１０μＬ滴下した。試料溶液中のトリオレインがリポプロテインリパーゼによって脂肪酸（オレイン酸）とグリセロールとに加水分解され、このグリセロールがＧｌｙＤＨにより酸化される。この際、グリセロールの酸化と同時に、反応層中の電子受容体（ｍ−ＰＭＳ）が還元される。【００８４】
試料を滴下してから３０秒後に、参照極に対して＋１５０ｍＶの電位を作用極に印加して、電子受容体の酸化電流値を測定した。測定には電気化学測定システムＨＺ−５０００北斗電工製、ＨＡＧ１５１２ｍ／ＢＰ）を使用した。この酸化電流（応答電流）の値は還元型電子受容体の濃度、すなわち試料中のトリオレイン濃度に比例する。【００８５】
さらに、試料溶液中のトリオレイン濃度を３００ｍｇ／ｄＬおよび５００ｍｇ／ｄＬとしたこと以外は、上記と同様の手法により、酸化電流値を測定した。また、コントロール試料として、トリオレインを含まない試料溶液を調製し、同様に酸化電流値を測定した。測定した酸化電流値をグラフにプロットした。このグラフを図６に示す。図６に示すグラ
フは、その傾きが大きいほどセンサの測定感度が高いことを意味する。本実施例においては、図６に示すような傾きの比較的大きいグラフが得られる。従って、本実施例によれば、測定感度に優れるセンサが提供されることがわかる。【００８６】
（実施例２−２）
反応層形成用組成物を調製する際に、界面活性剤であるトリトンＸ−１００を添加しなかったこと以外は、上記の実施例２−１と同様の手法により、センサ基板上にスペーサおよび反応層を形成し、試料溶液の添加後の酸化電流（応答電流）値の測定を行った。得られた結果をプロットしたグラフを図６に示す。本実施例においては、図６に示すように、得られるグラフの傾きが小さいが、ある程度の線形性は認められる。【００８７】
（実施例２−３）
反応層形成用組成物を調製する際に、リン酸緩衝生理食塩水に代えて蒸留水を用いたこと以外は、上記の実施例２−１と同様の手法により、センサ基板上にスペーサおよび反応層を形成し、試料溶液の添加後の酸化電流（応答電流）値の測定を行った。得られた結果をプロットしたグラフを図６に示す。本実施例においては、図６に示すように、得られるグラフの傾きは小さいが、ある程度の線形性は認められる。【００８８】
なお、本出願は、２００５年３月２９日に出願された日本国特許出願第２００５−０９５１６９号および日本国特許出願第２００５−０９６４２７号に基づいており、その開示内容は、参照により全体として引用されている。
【図１】
0004700687.tif 000002
【図２】
0004700687.tif 000003
【図３】
0004700687.tif 000004
【図４】
0004700687.tif 000005
【図５】
0004700687.tif 000006
【図６】
0004700687.tif 000007