(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体補綴物とポリエポキシアミン化合物を接触させることによって架橋された蛋白質を含む移植可能な生体補綴物。
【請求項２】
生体補綴物をpH約6〜10の水性液体中でポリエポキシアミン化合物と接触させる、請求項１記載の移植可能な生体補綴物。
【請求項３】
蛋白質が、pH約7〜10の水性液体中で生体補綴物とポリエポキシアミン化合物を接触させることによって架橋される、請求項１記載の移植可能な生体補綴物。
【請求項４】
蛋白質が、pH約7.0〜7.4の水性液体中で生体補綴物とポリエポキシアミン化合物を接触させることによって架橋される、請求項１記載の移植可能な生体補綴物。
【請求項５】
ポリエポキシアミン化合物がトリグリシジルアミンである、請求項１記載の移植可能な生体補綴物。
【請求項６】
蛋白質が、ポリエポキシアミン化合物と、メチルチオ部分、一級アミン部分、フェノール性ヒドロキシル部分、リン酸部分、およびカルボキシル部分からなる群から独立して選択される蛋白質の部分を接触させることによって架橋される、請求項１記載の移植可能な生体補綴物。
【請求項７】
移植可能な生体補綴物を第2の安定化試薬で処理する、請求項１記載の移植可能な生体補綴物。
【請求項８】
第2の安定化試薬が架橋試薬である、請求項７記載の移植可能な生体補綴物。
【請求項９】
第2の安定化試薬が石灰化阻害剤である、請求項７記載の移植可能な生体補綴物。
【請求項１０】
石灰化阻害剤が塩化アルミニウムである、請求項９記載の移植可能な生体補綴物。
【請求項１１】
第2の安定化試薬がグリコサミノグリカン安定化試薬である、請求項７記載の移植可能な生体補綴物。
【請求項１２】
グリコサミノグリカン安定化試薬がカルボジイミドである、請求項１１記載の移植可能な生体補綴物。
【請求項１３】
移植可能な生体補綴物を安定化する方法であって、生体補綴物とポリエポキシアミン化合物を接触させることを含み、これにより生体補綴物が安定化される方法。
【請求項１４】
移植可能な生体補綴物の安定化のための組成物であって、ポリエポキシアミン化合物、ならびに石灰化阻害剤、グリコサミノグリカン安定化試薬、および第2の架橋試薬のうち少なくとも1つを含む組成物。
【請求項１５】
移植可能な生体補綴物が、人工心臓、人工心臓弁、弁形成リング、皮膚移植片、血管移植片、血管ステント、構造ステント、血管シャント、心血管シャント、硬膜移植片、軟骨移植片、軟骨インプラント、心膜移植片、人工靱帯、人工腱、人工膀胱、綿撒糸、縫合糸、永久留置型経皮装具、外科パッチ、血管ステント、心血管ステント、構造ステント、コーティングステント、血管シャント、心血管シャント、およびコーティングカテーテルからなる群から選択される、請求項1記載の移植可能な生体補綴物。
【請求項１６】
移植可能な生体補綴物が人工心臓弁である、請求項１５記載の移植可能な生体補綴物。
【請求項１７】
移植可能な生体補綴物が生物組織を含む、請求項1記載の移植可能な生体補綴物。
【請求項１８】
組織が、心臓、心臓弁、大動脈起始部、大動脈壁、大動脈弁尖、心膜組織、結合組織、硬膜、バイパス移植片、腱、靱帯、皮膚組織、血管、臍帯組織、骨組織、筋膜、および粘膜下組織からなる群から選択される、請求項１７記載の移植可能な生体補綴物。
【請求項１９】
組織を動物から採取する、請求項１７記載の移植可能な生体補綴物。
【請求項２０】
動物がヒト、ウシ、ブタ、イヌ、アザラシ、およびカンガルーからなる群から選択される、請求項１９記載の移植可能な生体補綴物。
【請求項２１】
移植可能な生体補綴物が生体補綴組織の合成類似体を含む、請求項1記載の移植可能な生体補綴物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明の分野は、移植可能な生体補綴（bioprosthetic）装具および組織の安定化である。
【０００２】
本明細書で生体補綴装具（bioprosthetic devices）または生体補綴物と総称する、生物供給源に由来する補綴物（prosthesis）および組織の外科的移植は、医学の多くの分野で確立された診療行為となっている。一般的な生体補綴装具には、心臓弁、心膜移植片、軟骨移植片およびインプラント、靱帯および腱補綴物、血管移植片、皮膚移植片、硬膜移植片、ならびに膀胱補綴物が含まれる。人工弁の場合には、生体補綴物は、抗凝固療法を必要としないことから、非生物的補綴物よりも血液適合性が高いと思われる。
【０００３】
生体補綴装具には、完全に動物組織から構成される補綴物、および動物組織と合成材料との組み合わせが含まれる。さらに、生体補綴装具に用いる生物組織は、レシピエント（自家性）、レシピエントと同じ種の動物（同種性）、異なる種の動物（異種性）、または、人工培養した組織もしくは細胞から入手すること、またはそれらに由来することが可能である。組織の源にかかわらず、生体補綴装具を設計する際の主な目的には、装具の機能的持久性を高めることを目的とする耐久性の強化および生体力学的劣化の減少が含まれる。
【０００４】
生体補綴装具の材料安定性は、例えば組織の免疫拒絶、機械的ストレス、および石灰化を含む、レシピエントにおけるいくつかの過程のうち任意のものによって損なわれる可能性がある。前処理を行わずに（すなわち、移植前に安定化せずに）、またはレシピエントの免疫系をあらかじめ抑制せずに生体組織の移植を行うと、レシピエントで組織に対する免疫応答が誘発される恐れがある。生体補綴組織が免疫系によって「非自己」として識別されると、移植片の破壊および劣化が起こる恐れがある。免疫応答が仮にない場合でも、移植組織に対する機械的ストレスは、生体補綴物の構造の変化およびその力学的機能に重要な特徴の喪失を誘発する可能性がある。これらの崩壊過程に加えて、生体補綴組織の石灰化（すなわち、補綴物の内部、表面および周辺へのカルシウムおよび他の無機塩の沈着）も組織の弾性および柔軟性を実質的に低下させ、生体力学的な機能不全および劣化を招く恐れがある。機械的特性を改善し、抗原性を緩和することによって生体補綴装具の耐用寿命を延長する目的で、装具を移植前にさまざまな薬剤を用いて処理することが可能である。これらの前処理法は当技術分野で固定、架橋、および安定化として総称される。
【０００５】
グルタルアルデヒドは、弁および他のコラーゲンに富む生体補綴装具の処理に用いられる最も一般的な安定化試薬である。グルタルアルデヒドは、単独で、ならびにジイソシアネート、ポリエポキシドエーテル、およびカルボジイミドを含む他のさまざまな試薬との併用で、組織の移植前安定化に用いられてきた架橋剤である。グルタルアルデヒドおよび選択的には他の試薬を用いた前処理は、組織の表面および内部の蛋白質および他の構造を共有結合することにより、移植可能な組織を免疫反応性および機械的ストレスの両方の点で安定化する。生体補綴組織の架橋とともに、組織の移植後石灰化を遅延させるために別の試薬（例えば、エタノール）による処理を行うこともできる。グルタルアルデヒドを安定化試薬として用いると補綴物石灰化が早まる恐れがあり、石灰化阻害剤を用いることが必要となる。既知の石灰化阻害剤には、エタノール、塩化アルミニウム、コンドロイチン硫酸およびアミノプロパンヒドロキシホスホネート（APD）が含まれる。
【０００６】
生体補綴装具を安定化し、移植後石灰化を軽減することができる組成物および方法に対しては大きな需要が存在する。本発明はこのような組成物および方法を提供する。
【０００７】
発明の概要
本発明は、ポリ-(2-ヒドロキシオルガノ)アミノ部分によって架橋された蛋白質を含む移植可能な生体補綴物に関する。生体補綴物は、生体補綴物の2つまたはそれ以上のエポキシ反応性部分、例えば、メチルチオ基、一級アミン基、フェノール性ヒドロキシル基、リン酸基、またはカルボキシル基などを、ポリ-(2-ヒドロキシオルガノ)アミノ部分に置換する（すなわち、ポリエポキシアミン化合物と反応させてこれを得る）ことが可能である。例えば、生体補綴物の表面にある実質的にすべてのエポキシ反応性基をポリ-(2-ヒドロキシオルガノ)アミノ部分に置換する（すなわち、これらがポリ-(2-ヒドロキシオルガノ)アミノ部分によって結合させるように反応させる）ことができる。生体補綴物は例えば、人工心臓、人工心臓弁、弁形成リング、皮膚移植片、血管移植片、血管ステント、構造ステント、血管シャント、心血管シャント、硬膜移植片、軟骨移植片、軟骨インプラント、心膜移植片、人工靱帯、人工腱、人工膀胱、綿撒糸、縫合糸、永久留置型経皮装具、外科パッチ、コーティングステントおよびコーティングカテーテルのうち任意のものでありうる。ポリ-(2-ヒドロキシオルガノ)アミノ部分としては、例えば、トリグリシジルアミンを生体補綴物のエポキシ反応性基と反応させることによって形成されるポリ-(2-ヒドロキシプロピル)アミノ部分が可能である。
【０００８】
移植可能な生体補綴物は、生物組織（例えば、心臓、心臓弁、大動脈起始部、大動脈壁、大動脈弁尖、心膜組織、結合組織、硬膜、バイパス移植片、腱、靱帯、皮膚組織、血管、臍帯組織、骨組織、筋膜、または粘膜下組織）を含むものでありうる。このような組織は、動物（例えば、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、アザラシ、またはカンガルー）から採取することができる。または、移植可能な生体補綴物は、生体補綴組織の合成類似体を含むものでもよい。
【０００９】
生体補綴物の蛋白質は、例えばpHが約6〜10、約7〜10、または約7.0〜7.4の水性液体中で、生体補綴物をポリエポキシアミン化合物と接触させることによって架橋させることができる。ポリエポキシアミン化合物の一例はトリグリシジルアミンである。
【００１０】
移植可能な生体補綴物を、ポリエポキシアミン化合物に加えて第2の安定化試薬で処理することもできる。例えば、第2の安定化試薬はグリコサミノグリカン安定化試薬（例えば、カルボジイミド）、架橋試薬または石灰化阻害剤（例えば、塩化アルミニウム）でありうる。
【００１１】
本発明はまた、移植可能な生体補綴物とポリエポキシアミン化合物を接触させることによって製造される移植可能な生体補綴物も含む。生体補綴物はそれによって安定化される。
【００１２】
さらに、本発明は、移植可能な生体補綴物の安定化の方法を含む。本方法は、生体補綴物を安定化するために生体補綴物とポリエポキシアミン化合物を接触させることを含む。
【００１３】
もう1つの面において、本発明は、移植可能な生体補綴物を安定化するための組成物に関する。本組成物は、ポリエポキシアミン化合物、ならびに石灰化阻害剤、グリコサミノグリカン安定化試薬、および第2の架橋試薬のうち少なくとも1つを含む。
【００１４】
詳細な説明
本発明は、安定化された移植可能な生体補綴物、および、過去にこの目的に用いられていない一群の化合物のうち1つまたは複数を用いる移植可能な生体補綴物（例えば、移植可能な生物組織または合成組織含有もしくは組織様のインプラント）の安定化の方法に関する。この安定化の方法は、生体補綴物とポリエポキシアミン化合物を接触させることを含む。本明細書に記載する通り、生体補綴物をさらに安定化する目的で、それを1つまたは複数の追加的な試薬で処理することもできる。
【００１５】
定義
本明細書で用いる場合、以下の用語のそれぞれは、このセクションでこれに対応づけられた意味を有する。
【００１６】
「1つの（a）」および「1つの（an）」という冠詞は、本明細書では、冠詞の文法的対象の1つまたは複数（すなわち少なくとも1つ）のことを指して用いられる。例えば、「1つの要素（an element）」は、1つの要素または複数の要素を意味する。
【００１７】
「生体補綴物」とは、移植可能な蛋白質を含む物であり、その全体または部分は、生物組織（例えば、ヒトまたは培養ヒト組織から入手した組織などの、動物または培養動物組織から入手した組織）、このような組織の構成要素（例えば、組織の細胞または細胞外マトリックス）またはこれらの何らかの組み合わせから構成される。生体補綴物は、その意図したインプラント形態において生物的な構造および機能を特別に保持および実現する。生体補綴物または構成品の例には、人工心臓、人工心臓弁、弁形成リング、皮膚移植片、血管移植片、血管ステント、心血管ステントまたは構造ステント、血管シャントまたは心血管シャント、硬膜移植年、軟骨移植片、軟骨インプラント、心膜移植片、人工靱帯、人工腱、人工膀胱、綿撒糸、縫合糸、永久留置型経皮装具、人工関節、人工肢、生体工学的構築物（すなわち、マイクロプロセッサーまたは他の電子部品を含むこれらの生体補綴物の1つ）および外科パッチが非制限的に含まれる。
【００１８】
「移植」およびその文法的諸形態は、補綴物の実質的な劣化を伴わずに数時間、数日、数週間、数カ月、または数年という期間にわたって接触を継続することを意図して、補綴物（例えば、生体補綴物）と動物の組織をインビボで接触させるプロセスを指す。このような接触は、例えば、補綴物を動物の組織にまたは内部に移植または付着させること、および装具を動物の身体の開口部、腔、切開部、または他の天然もしくは人工的に作成した空隙の内部に置くことを含む。
【００１９】
生体補綴物の「安定化」およびその文法的諸形態は、生体補綴物の機械的強度を高めること、生体補綴物を動物の内部または表面に移植した後の劣化の速度または発生率を低下させること、またはこれらの何らかの組み合わせを意味する。劣化の原因には、機械的摩耗、補綴物と動物の免疫系との間の反応、および補綴物に伴う石灰化が含まれる。安定化は、生体補綴物の耐久性、貯蔵寿命、および疲労寿命の1つまたは複数を増加させることができる。生体補綴物を安定化する手段の例には、補綴物の構成要素（例えば、蛋白質）の共有結合（「架橋」）、補綴物に伴う石灰化の阻害、有益な重合体または他の物質を生体補綴物に組み込むこと、および補綴物または補綴物に付随した組織の表面のグリコサミノグリカン（GAG）を安定化することが含まれる。GAGは例えば、GAG分子に関連して少なくとも2つの共有結合を形成させる試薬と組織を反応させると組織上で「安定化される」。これらの結合は実際には分子内のものでも分子間のものでもよい。このような結合を形成させる試薬を本明細書では「GAG安定化試薬」と称する。「安定化」「固定」および「架橋」という用語は本明細書で互換的に用いられる。
【００２０】
GAGまたは蛋白質は、GAGまたは蛋白質が組織を通常含む健康個体における組織の表面または内部に通常存在するもの（例えば、GAGまたは蛋白質を組織とともに単離するか、それを単離した後に組織に添加するかの別を問わず、組織の表面または内部に通常存在するGAGまたは蛋白質）であれば、組織に関して「内因性」である。その他の場合は、GAGまたはタンパク質は組織に関して「外因性」である。
【００２１】
「ポリエポキシアミン化合物」とは、アミン部分（例えば、一級、二級、三級または四級アミン部分、例えばトリグリシジルアミンのオリゴマーなど）および複数のエポキシド部分をいずれも含む化学種のことである。この群のポリエポキシアミンには、例えば、ジエポキシアミンおよびトリエポキシアミンが含まれる。
【００２２】
「ポリ-(2-ヒドロキシオルガノ)アミノ部分」とは、ポリエポキシアミン化合物と1つまたは複数の基質分子（例えば、蛋白質または生体補綴物）の複数のエポキシ反応性部分との反応によって形成される部分のことである。
【００２３】
ポリ-(2-ヒドロキシオルガノ)アミノ化合物の文脈における「-オルガノ-」は、化合物のエポキシアミン部分とアミン部分との間に介在する炭素含有部分（例えば、C1〜C6直鎖アルキル基などのアルキル基）を指す。
【００２４】
「エポキシ反応性部分」は、エポキシド環と反応して、エポキシド環を開裂させ、その部分とエポキシド環の原子との間に共有結合を形成させうる部分のことである。
【００２５】
説明
本発明は、移植可能な生物組織または蛋白質含有マトリックスを含むインプラントなどの生体補綴物の安定化に関する。この安定化は、生体補綴物とポリエポキシアミン化合物を、好ましくは水性液体の存在下で接触させて、1つまたは複数のポリ-(2-ヒドロキシオルガノ)アミノ部分によって架橋された蛋白質を含む移植可能な生体補綴物を得ることによって行われる。ポリエポキシアミンは、アミン基（例えば、一級、二級、および三級アミン基）、チオ基（例えば、チオールおよびメチルチオ基）、ヒドロキシル基（例えば、蛋白質内のチロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸側鎖のフェノール性およびカルボキシル性ヒドロキシル基）およびリン酸基を含む、生体補綴物の表面または内部の化学基の間に共有結合を形成させることができる。生体補綴物とポリエポキシアミン化合物を接触させる結果として、ポリエポキシアミン化合物と生体補綴物との間、例えば、ポリエポキシアミン化合物と1つもしくは複数のアミノ酸残基側鎖（例えば、生体補綴物の組織にとって内因性の蛋白質および外因性蛋白質の両方を含む、1つまたは複数の蛋白質の側鎖）との間、ポリエポキシアミン化合物の1つの分子と同じポリエポキシアミン化合物のもう1つの分子との間、またはポリエポキシアミン化合物のアミノ酸残基側鎖ともう1つの分子との間などに、共有化学結合が形成される。ポリエポキシアミン化合物を用いた結果として、生体補綴物のエポキシ反応性部分の間に共有結合が生じる。このため、生体補綴物の互いに結合した化学基（例えば、互いに結合したアミノ酸残基側鎖）が生じ、それによって生体補綴物が安定化される。生体補綴物を別の化合物（例えば、生体補綴物に通常存在しない蛋白質）の存在下でポリエポキシアミン化合物と接触させると、他の化合物を生体補綴物と結合させることができる。
【００２６】
エポキシアミン化合物と生体補綴物の化学部分との反応によって形成される化学部分の例が図6〜12に示されている。当然ながら、複数のこのような部分をポリエポキシアミン化合物と生体補綴物の部分との反応によって形成させ、複数の部分を図6および図8〜12中の「オルガノアミノ」と表記した部分によって結合させる（すなわち、ポリ-(2-ヒドロキシオルガノ)アミノ部分によって結合させる。「オルガノアミノ」という表記は、図6および図8〜12のそれぞれの式に表記したヒドロキシエチル部分以外のポリ-(2-ヒドロキシオルガノ)アミノ部分の部分のことを指す）こともできる。
【００２７】
図6では、エポキシアミンまたはポリエポキシアミン化合物と生体補綴物のエポキシ反応性部分（「Z」）との反応により、エポキシド環が開裂して、エポキシド環の炭素原子の1つとZ部分との間に共有結合が形成され、それによって2-ヒドロキシオルガノアミン部分が結合したZ部分が生じている。例えば、エポキシアミン化合物がトリグリシジルアミン（TGA、トリエポキシアミン）である場合には、図7に示す通り、TGAと生体補綴物のZ部分との反応によって、Z部分と2-ヒドロキシ-3-(ジグリシジルアミノ)プロピル部分との間に共有結合が形成される。2-ヒドロキシ-3-(ジグリシジルアミノ)プロピル部分の反応していないエポキシド部分は、Z部分を有する分子の他の1つもしくは2つのエポキシ反応性部分、または他の分子の1つもしくは2つのエポキシ反応性部分と反応して、その1つまたは複数の分子の部分と共有結合することができる。同様に、ポリエポキシドアミン化合物は、化合物中のエポキシド環の数と同じ数のエポキシ反応性部分と反応することができる。ポリエポキシアミン化合物（TGAなどのポリエポキシアミン化合物を含む）と反応した複数のエポキシ反応性部分を有する分子または物（例えば、蛋白質、生体補綴物、または組織）は、「ポリ-(2-ヒドロキシオルガノ)アミノ部分によって置換された」と言われる。2-ヒドロキシ基はさらにエポキシド部分と反応して架橋ネットワークを形成することができる。2-ヒドロキシ基から形成されるエーテル結合は、以下の特許請求の範囲では2-ヒドロキシ部分と見なされる。
【００２８】
エポキシアミン化合物と反応する反応性部分としては、例えば、図8に示すメチルチオ部分（例えば、蛋白質内のメチオニン残基のメチルチオ部分）、図9に示す一級アミン部分（例えば、蛋白質内のリジン残基の一級アミン部分）、図10に示すフェノール性ヒドロキシル部分（例えば、蛋白質内のチロシン残基のヒドロキシル部分）、図11に示すリン酸部分（例えば、蛋白質内のホスファチジルセリン残基のリン酸部分）、または図12に示すカルボキシル部分（例えば、蛋白質内のグルタミン酸残基のカルボキシル残基）が可能である。図8および9における「X」は、塩素イオンまたは酢酸イオンなどの、非反応性で生体適合性のある陰イオンであることが好ましい。
【００２９】
本発明は、ポリエポキシアミン化合物と反応した複数のエポキシ反応性部分を有する、安定化された移植可能な生体補綴物（すなわち、1つまたは複数のポリ-(2-ヒドロキシオルガノ)アミノ部分によって架橋されたエポキシ反応性部分を有する移植可能な生体補綴物）を含む。例えば、生体補綴物の表面エポキシ反応性部分のすべて、実質的にすべて、または一定割合（例えば、90％、80％、70％、50％、25％、10％、5％、または1％またはそれ未満）を、1つまたは複数のポリ-(2-ヒドロキシオルガノ)アミノ部分によって架橋させることができる。
【００３０】
ポリエポキシアミン化合物は少なくとも2つのエポキシド部分を有し、3つまたはそれ以上を有することもできる。好ましくは、ポリエポキシアミン化合物は、エポキシド環が最も近いアミノ部分から1〜5個の他の原子（例えば、TGAでエポキシド環と三級アミン部分を隔てているメチレン基などの、C1〜C5の分枝状または直鎖状のアルキレン鎖）によって隔てられている、TGAなどのものである。エポキシド環と最も近いアミノ部分との間に介在しうる他の化学基には、例えば、分枝状または直鎖状のアルケニル鎖が含まれる。
【００３１】
もう1つの態様において、ポリエポキシアミン化合物は、それに（例えば重合体の一端もしくは両端に、または内部もしくは全体にわたる側鎖として）結合した複数のエポキシド基を有する重合体である。一部のポリエポキシアミン化合物はエポキシ反応性部分（例えば、四級以外のアミン部分）を有し、自己重合を起こして直鎖状または分枝状の重合体を生じうることが認識されている。分枝の長さまたは程度は、例えば、ポリエポキシアミン標本に自己重合を行わせる時間を調整することによって調節可能である。例えば、TGAは図13に示すように自己重合を行える三級アミンである。このような重合体を用いる場合、重合体は、ポリエポキシアミン化合物分子を生体補綴物の1つもしくは複数の部分とすでに結合したポリエポキシアミン化合物分子と重合させることにより、ポリエポキシアミン化合物を生体補綴物と接触させる前に重合させることにより、またはその両方によって形成可能である。ポリエポキシアミン重合体を用いる場合、重合体は直鎖状重合体でも分枝状重合体でもよく、好ましくは分子量は約185〜10,000である。例えば、重合体が少なくとも約15個のTGA分子の重合によって形成され、分子量が3000を上回るTGA重合体が得られるような、TGAの重合体を用いることができる。図13に示す通り、ポリエポキシアミン化合物の重合は、複数の第四アンモニウム部分を有する重合体の形成をもたらしうる。先行技術のポリエポキシド化合物（例えば、Denacol（商標）製品）はアミノ基を含まないため、自己重合によって四級アンモニウム基を有するポリエポキシアミン化合物重合体を形成しない。任意の特定の動作理論に拘束されるものではないが、本明細書に記載のポリエポキシアミン化合物重合体中の四級アンモニウム部分は、少なくとも一部には、このような重合体で処理した生体補綴物の安定性が改善される一因と考えられている。
【００３２】
ポリエポキシアミン化合物は当技術分野で知られた合成法（例えば、本明細書に記載のロス（Ross）ら、1963 J. Org. Chem. 29：824〜826の変法、またはマーチャノバ（Martyanova）ら、1990、Sb. Nauch. Tr. Lenengr. In-t Kinoinzh. 2：139〜141 {Chem. Abst.番号116：43416および116：31137}またはチェスロフ（Chezlov）ら、1990、Zh. Prikl. Khim.（Leningrad）63：1877〜1878 {Chem. Abst.番号114：121880}による）を用いて調製することができる。これらの化合物の先行技術の応用は、工業用樹脂および感光乳剤に限定されている。本開示は、生物医学的用途にポリエポキシアミン化合物を用いる初の記載であると考えられる。
【００３３】
ポリエポキシアミン化合物は実質的に任意の濃度で使用可能である。しかし、ポリエポキシアミン化合物の濃度は、かなりの速度の反応が起こる程度には高いものの、顕著な（例えば、50％を上回る）細胞毒性が生じるほどには高くないことが好ましい。例えば、反応速度は、グルタルアルデヒドを用いて得られる約50％以上の程度の架橋（すなわち、例えば、示差走査熱量測定法などを用いて熱収縮温度を決定した場合）が約30日以内の反応で、好ましくは10日以内の反応で得られるようなものであってよい。例えば、ポリエポキシアミン化合物がトリグリシジルアミンである場合には、好ましい濃度の範囲は約0.01〜1Mであり、本明細書に記載する反応条件に関しては約100mMであることが好ましい。
【００３４】
安定化の方法に用いる水性液体は、特に組織含有生体補綴物の場合には、安定化反応混合物のpHを約6〜10、約7〜10、または好ましくは約7.0〜7.4に維持する必要がある。しかし、本明細書に記載の安定化方法をさらに低いpH値で用いることも可能である。生体補綴物が合成材料を含む（またはそれから完全に構成される）場合には、pH約2〜12などのさらに幅広い範囲のpHで安定化反応を行える。液体は例えば、pH約6.9〜7.9の10〜500mMのナトリウムもしくはカリウムHEPES緩衝液、またはpH約8.5〜9.5の10〜500mMのホウ酸ナトリウムもしくはホウ酸カリウム緩衝液などの緩衝液でありうる。緩衝液は、存在するポリエポキシアミン化合物の量に対して、さらにはポリエポキシアミン化合物の量×#に対しても過剰に用いることが好ましく、ここで#はポリエポキシアミン化合物の1分子当たりのエポキシ部分の平均数である。混合物が経時的に新鮮な（すなわち、反応していない）反応混合物と交換される場合には、緩衝液を過剰に用いる代わりに少量の緩衝液を有する反応混合物を用いることもできる。この代替法では、反応混合物のpHをモニターし、有意なpH変化が検出された時点で反応混合物に追加の緩衝液を置換または補充することができる。緩衝液は、ポリエポキシアミン化合物の生体補綴物との反応を阻害する様式でポリエポキシアミン化合物または生体補綴物と化学的に反応しないように選択する必要がある。最も一般的な緩衝液（例えば、ホウ酸緩衝液、HEPES、炭酸緩衝液、カコジル酸緩衝液、クエン酸緩衝液、TRISおよびMOPS）が使用に適している。
【００３５】
安定化反応混合物のpHは、ポリエポキシアミン化合物と生体補綴物との間の反応が進行するとともに上昇する可能性がある。反応混合物のpHは一定の最大値またはそれ以下（例えば、pH 10またはそれ以下、好ましくはpH 7.4またはそれ以下）に維持することが好ましい。pHの維持は、混合物の酸性化、緩衝液の添加、および反応混合物と望ましいpH（例えば、pH 7〜7.4）を有する新鮮な反応混合物との置換を含む、任意の既知の方法によって行うことができる。例えば、反応混合物が100mM HEPESおよび100mM TGAを含み、pHが約7.0であって、これを毎日交換することが可能である。
【００３６】
生体補綴物およびポリエポキシアミン化合物を接触した状態に維持する期間の長さは、約3時間から数カ月またはさらに長い期間にわたりうる。接触期間は好ましくは少なくとも約3日間であり、より好ましくは少なくとも約7日間である。水性液体中で生体補綴物およびポリエポキシアミン化合物を8〜10日間接触させることで十分と判断される。
【００３７】
安定化混合物の温度は、反応が適切な速度で進行し、生体補綴物が障害されない実質的に任意の温度であってよい。反応速度が温度が高くなるに伴って上昇することは認識されている。生体補綴物が蛋白質を含む場合には（例えば、動物から入手した組織を含む場合には）、反応混合物の温度を例えば20〜37℃に維持してもよい。
【００３８】
ポリエポキシアミン化合物による移植前処理を、人工心臓、人工心臓弁、血管移植片、弁形成リング、皮膚移植片、硬膜移植片、心膜移植片、軟骨移植片またはインプラント、心膜移植片、人工靱帯、人工腱、人工膀胱、綿撒糸、縫合糸、永久留置型経皮装具、外科パッチ、血管ステント、心血管ステントまたは構造ステント、コーティングステントおよびコーティングカテーテル、血管シャントまたは心血管シャントなどの、生体補綴物の安定化のために用いることができる。好ましくは、生体補綴装具は人工心臓弁である。移植前にポリエポキシアミン化合物で処理する生物組織は、レシピエントから、レシピエントと同じ種の動物から、またはレシピエントとは異なる種の動物から入手可能である。ドナー動物の例には、ヒト、ウシ、ブタ、イヌ、アザラシ、およびカンガルーなどの哺乳動物が含まれる。組織の例には、心臓、心臓弁、大動脈起始部、大動脈壁、大動脈弁尖、心膜組織（例えば、心膜パッチ）、結合組織、硬膜、バイパス移植片、腱、靱帯、皮膚組織（例えば、皮膚）、血管、臍帯組織、骨組織、筋膜、および粘膜下組織が含まれる。または、組織が、培養組織、動物から入手した細胞外マトリックスを含む補綴物、再構成組織（例えば、人工骨様媒体中にある骨細胞）などであってもよい。本明細書に記載の安定化方法を、生物組織のものと類似した表面化学基を有する材料である、非生物由来の1つまたは複数の材料を含む生体補綴物の安定化のために用いることもできる（例えば、蛋白質を含む合成マトリックスなど）。
【００３９】
生体補綴組織の合成類似体は、天然の組織マトリックス中に一般に認められるものを含め、合成重合体、生物重合体、またはその両方から形成することができる。適した合成重合体には、例えば、ポリアミドおよびポリスルホンが含まれる。生物重合体は天然のものでもよく、発酵などによってインビトロで産生されるものでもよい。精製された生物重合体は、製織、編成、注入成形、成形、押出、細胞配列、および磁気的配列などの方法によって基質中に適切に形成させることができる。適した生物重合体には、コラーゲン、エラスチン、絹、ケラチン、ゼラチン、ポリアミノ酸、多糖類（例えば、セルロースおよびデンプン）、およびこれらの任意のものの共重合体が非制限的に含まれる。例えば、コラーゲン重合体およびエラスチン重合体を、製織および成形などのさまざまな方法のうち任意のものによって合成生体補綴組織類似体として形成させることができる。合成組織類似体は天然の組織マトリックスを模倣する。または、合成基質を単独でまたは天然基質とともに用いて組織類似体を生成することもできる。合成組織類似体は、その表面もしくは内部に細胞を播種した状態で、または細胞のない状態で移植可能である。このような組織類似体は選択的には吸収性であってよい。
【００４０】
本明細書に記載の生体補綴物、組成物、および方法は、ポリエポキシアミン化合物を単一の生体補綴物反応性物質として含むものには限定されない。追加的な架橋試薬、石灰化阻害剤、GAG安定化剤などの他の薬剤をポリエポキシアミン処理とともに（すなわちその前、最中、または後に）用いることができる。
【００４１】
当技術分野で知られた架橋試薬には、グルタルアルデヒド、他のジアルデヒド、カルボジイミド、ポリエポキシエーテルなどが含まれる。グルタルアルデヒドは広く用いられている有効な架橋剤であるが、上記に考察した通り、これを用いると生体補綴物における石灰化が許容レベルを上回る恐れがある。生体補綴物自体とは必ずしも反応しない他の架橋試薬には、例えば、連鎖延長剤およびジカルボン酸が含まれる。ポリエポキシアミン化合物は単独で用いても十分な架橋を得ることができる。しかし、またさらに架橋の程度がさらに高ければ、補綴物の機械的安定性をさらに高めることができる。このため、生体補綴物においてより高い程度の架橋を得るためには、他の架橋試薬をポリエポキシアミン化合物とともに用いることが有益と考えられる。したがって、本発明は、ポリエポキシアミン化合物を単独で、または1つもしくは複数の他の架橋試薬とともに用いることを含む。
【００４２】
ポリエポキシアミンでないエポキシド含有化合物の、生物組織の移植前処理のための使用は当技術分野で知られている。このような化合物の1つは、一般式Iを有し、混合物の最も豊富な成分がn＝2およびn＝3である、オリゴマーのポリグリセロールエーテルの混合物であるDenacol 521（商標）（Nagase Chemical Co.、Japan）である。
【化１】
0004841097.tif 000002
Denacol 521（商標）は架橋試薬として作用し、先行技術の他のエポキシド含有化合物と同様に、生物組織の十分な架橋を得るためにアルコールおよび触媒と併用する必要がある。これらの試薬とは対照的に、ポリエポキシアミン化合物はアルコールおよび追加的な触媒が存在しなくても生体補綴物の安定化に用いることができる。ポリエポキシアミン化合物の使用に伴う架橋と、先行技術のエポキシド化合物の使用に伴う架橋と比較して架橋の効率が高まることは、少なくとも一部には、ポリエポキシアミンの反応性が、アミン基を含まないエポキシド化合物の反応性と比べて高いことに起因すると考えられる。その結果、TGAなどのポリエポキシアミン化合物は、チオール基、ヒドロキシル基、アミン基、およびカルボニル基などの蛋白質によくみられる化学基と容易に反応し、アルコールおよび触媒の添加を必要としない。さらに、上記の通り、ポリエポキシアミン化合物はエポキシ反応性部分（すなわち、アミン部分）を含むため、これらの化合物は生体補綴物との間および相互の間に共有結合を形成することができる。
【００４３】
生体補綴物をポリエポキシアミン化合物で処理することにより、生体補綴物の化学部分と共有結合することに加えて、補綴物に伴う移植後石灰化も阻害される。先行技術の石灰化阻害剤の例には、エタノール、塩化アルミニウム、コンドロイチン硫酸、プロピレングリコール、αアミノオレイン酸、界面活性剤、洗浄剤などが含まれる。接触した生体補綴物の機械的耐久性を実質的に高めるために別の試薬を必要とするこれらの化合物とは対照的に、ポリエポキシアミン化合物は別の試薬がなくとも、化学部分と共有結合して生体補綴物の石灰化耐性を実質的に高めることができる。
【００４４】
生体補綴組織の安定化は、組織中に内因的に存在するGAGを安定化することによって増強することができる。GAG安定化試薬の例には、1-エチル-3-(3ジメチル-アミノプロピル）カルボジイミド（EDAC）などのカルボジイミド、ヘテロ官能性アジド、および炭水化物-蛋白質結合試薬が含まれる。GAG安定化試薬およびポリエポキシアミン化合物を併用して移植可能な生体補綴装具を処理することにより、ポリエポキシアミン化合物のみによる処理と比べて生体補綴物の安定化を増強しうる。このため、本発明は、生体補綴組織の安定化のために、ポリエポキシアミン化合物およびGAG安定化試薬を同時にまたは連続的にどちらかの順序で用いることを含む。生体補綴物の内部または表面で安定化されるGAGは内因性でも外因性でもよい。
【００４５】
本発明は、本明細書に記載の安定化方法に従ってポリエポキシアミン化合物を用いて安定化された生体補綴物を含む。例えば、本明細書に記載した通りに、生物組織を動物供給源から採取して（例えば、ブタから大動脈弁尖を摘出すること、またはウシから心臓弁を入手することによる）、ポリエポキシアミン化合物を用いてインビトロで処理することができる。この安定化処理の後に、安定化された組織をレシピエント（例えば、心臓弁置換を必要とするヒト）に移植可能である。組織の採取および移植の方法は当技術分野で周知であり、実質的に任意のこのような1つまたは複数の方法を、本明細書に記載の生体補綴安定化法とともに用いることができる。
【００４６】
採取した動物組織は、組織の安定化の前または後に、組織の移植前にインビトロで操作することができる（例えば、ポリマー性ステントまたは支持体などの非生物由来の材料と組み合わせることによる）。当然ながら、1つまたは複数の追加的な試薬（例えば、GAG安定化試薬または石灰化阻害剤）を用いて組織を移植前に処理することもできる。
【００４７】
生体成分、合成成分またはその両方の組み合わせから構成され、ポリエポキシアミン化合物を用いて安定化された、組織改変された構築物および人工細胞、組織、または臓器などの生体補綴組織の合成類似体も本発明に含まれる。安定化された合成補綴物の例には、マイクロカプセル化された細胞または組織、ならびに蛋白質がコーティングされたカテーテル、ステントおよび人工関節などの補綴物が含まれる。
【００４８】
本発明に含まれる生体補綴組織およびその合成類似体には、本明細書に開示する方法を用いた安定化の結果として、レシピエントへの移植後に、先行技術の方法を用いて安定化されたものと比べて、1つもしくは複数の機械的特性の改善またはより自然な機械的特性を示すものが含まれる。このような特性には、強度、柔軟性、（低下した、または無視しうる程度の）毒性、および動物の周囲組織による正常細胞の内部増殖との適合性が非制限的に含まれる。このため、本明細書の記載の通りに処理した生体補綴組織は、外観の点で天然組織により類似している。例えば、本明細書の記載の通りに処理した軟組織の手触りは硬くなく、自然な柔軟性を有する。柔軟性の向上は、移植後の組織の機械的性能を、グルタルアルデヒドで固定した組織と比べて改善している。ポリエポキシアミン化合物を用いた組織の安定化は、より優れた血行動態、機能改善、および生体適合性の改善ももたらす。
【００４９】
本発明はさらに、少なくとも1つのポリエポキシアミン化合物、ならびに選択的には、緩衝剤、生理的塩（例えば、NaCl、KCl）、グリコサミノグリカン、グリコサミノグリカン安定化試薬、第2の架橋剤、および石灰化阻害剤のうち1つまたは複数を含む組成物を含む。これらの組成物はさらに、水性および非水性の液体、血液または血液製剤、ならびに本明細書に記載のポリエポキシアミン化合物を用いた生体補綴物の処理を容易にする他の液体も含みうる。生体補綴物の安定化のために特別に調製され、パッケージ化された組成物、例えば組成物の粉末状の混合された成分および組成物の凍結または濃縮された成分も本発明に含まれる。
【００５０】
次に本発明を以下の実施例を参照しながら説明する。この実施例は例示のみを目的として提供するものであり、本発明はこの実施例には限定されず、本明細書の開示の結果として明らかになるすべての変形物を含む。
【００５１】
実施例
この実施例で提示する実験は、生体補綴組織を安定化し、石灰化に対するその耐性を改善することを目的とするトリグリシジルアミン（TGA）の使用を例示したものである。
【００５２】
この実施例に提示する実験に用いた材料および方法を以下に説明する。
【００５３】
TGAの合成
TGA（図1中の化合物III）は以下の通りに調製した。アンモニアの24％溶液（27mlのNH3水溶液、0.38モル）を、過剰量（120ml、1.53モル）のエピクロロヒドリン（図1中の化合物I）、810mg（4.85mM）のアンモニウムトリフレート、および150mlのイソプロパノール（I-PrOH）を含む溶液に添加した。この結果得られた混合物を、水浴で間欠的に冷却しながら20〜25℃に25時間保った。エピクロロヒドリンをさらに30ml（0.38モル）追加した後に、混合物を20〜25℃にさらに25時間保った。この結果得られた溶液を120mlのイソプロパノールを加えることによって希釈し、20〜30℃の減圧下で濃縮して粘性シロップを得た。このシロップを30℃にさらに2.5時間保った。この手順の後に残った残存物を150mlのトルエン中に溶解し、30〜40℃の減圧下で濃縮して、トリス-(3-クロロ-2-ヒドロキシプロピル)アミン（図1中の化合物II）を得た。化合物IIを210mlのトルエンおよび25mlのテトラヒドロフランの混合液中に溶解した。
【００５４】
136g（3.4モル）の水酸化ナトリウムを136mlの水に溶解した溶液を、18〜22℃で0.5時間かけて化合物IIの溶液に添加した。この反応混合物を水浴で間欠的に冷却しながら激しく振盪して18〜22℃にさらに2時間保った後、272mlの水で希釈した。希釈中に混合液の温度が30℃を超えないようにした。有機層を水層から分離し、無水炭酸カリウムの存在下で5℃にて一晩乾燥させた。濾過によって乾燥剤を除去した後に、溶液を減圧下で濃縮し、その後に1ミリメートル水銀柱の真空装置内で50cmのヴィグロウ（Vigreux）分留カラムを用いて残存物を蒸留して、42.0gのTGAを得た（アンモニアからみた理論収量の65％）。TGAは沸点98〜101℃の粘性液体として回収された。液体TGAは冷却すると凝固し、室温に戻しても固体に保たれた。
【００５５】
上記のようにして合成したTGAを１H NMR分光分析によって確認した。CDCl3中にあるTGAの１H NMRスペクトルを図2に示すが、これは本方法によって調製したTGAが、2つのジアステレオマーの混合物であり、それぞれが約3対1の比で存在することを示している。量の多い方のジアステレオマーはR,R,SおよびR,S,Sエナンチオマーのラセミ混合物であると考えられ、少ない方のジアステレオマーはR,R,RおよびS,S,Sエナンチオマーの混合物であると考えられる。図2中の１H NMRスペクトルの化学シフトを各ジアステレオマーに関して以下に別々に説明する。量の多い方の異性体に関しては以下のNMRデータが得られた：δ、ppm、2.54（m、6H、エポキシCH2）、2.78（m、3H、エポキシCH）、3.13（m、6H、NCH２）。少ない方の異性体に関しては以下のNMRデータが得られた：δ、ppm：2.26（dd、14Hzおよび7Hz、3H、エポキシCH２のHＡ）、2.72（dd、14Hzおよび6.5Hz、3H、エポキシCH２のHＢ）、2.78（m、3H、エポキシCH）、3.04（dd、14Hzおよび3Hz、3H、NCH２のHＡ）、3.29（dd、14Hzおよび2.5Hz、3H、NCH２のHＢ）。ジアステレオマー組成物は、文献中に報告されたTGAのNMRスペクトルにおいても認められる（Everettら、1976、Org. Mag. Res. 8：275〜276）。
【００５６】
人工心臓弁の架橋手順
生体補綴組織の架橋を行う第1の方法では、4つの別々の架橋溶液を調製した：
1）pH 7.4の0.05M HEPES緩衝液中0.1M TGA、
2）pH 9.0の0.05Mホウ酸-ホウ砂緩衝液中0.1M TGA、
3）pH 7.4の0.05M HEPES緩衝液中0.1M Denacol 521（商標）（Nagase Chemical Co.、Japan）、および
4）0.6％（v／v）グルタルアルデヒドを含む0.05M HEPES緩衝液（pH 7.4）。
【００５７】
20個の新鮮なブタ大動脈弁尖を、4種の各溶液の別々の100mlのアリコートに添加した（すなわち、合計80個の弁尖を用いた）。弁尖および溶液を室温で定常的に振盪しながら溶液を変えずに最大10日間保った。選択した時点で各々の架橋反応の各弁尖から小さな切片を採取し、示差走査熱量測定法によって分析して熱収縮温度（Ts）を決定した。時間が経過してもTs値が実質的に一定に保たれた時点で、架橋反応は完了したと判断した。このようにして処理した弁尖を、以降の実験に用いるまで20日以上にわたって架橋溶液中に維持した。
【００５８】
生体補綴組織の架橋を行う第2の方法では、pH 7.4の0.10M HEPES緩衝液中にある0.1M TGAの100mlのアリコートを別々に調製した。この溶液の個々のアリコートに以下のものを添加した。
i）20個の新鮮なブタ大動脈弁尖、
ii）弁尖組織の量と重量の点で同等な量のウシ心膜、および
iii）弁尖組織の量と重量の点で同等な量のブタ大動脈壁断片。
組織および溶液を室温で定常的に振盪しながら最大7日間保ち、その間、各々の架橋反応のpHをモニタリングした。選択した反応に関しては、反応混合液を新たに調製した0.1M TGA（pH 7.4中0.10M HEPES緩衝液）の100mlのアリコートと24時間毎に交換した。選択した時点で、各々の安定化反応混合物中の各組織から小さな切片を採取し、示差走査熱量測定法によって分析して熱収縮温度（Ts）を決定した。7日間の反応後に各組織の一群を、4％（v／v）ホルマリンを含む100mlの0.05Mリン酸緩衝液に移し、以降の実験に用いるまでこの溶液中に保存した。
【００５９】
皮下石灰化試験
上記の通りに処理および保存を行った組織を用いてラットにおける皮下石灰化試験を行った。上記の2つの方法のいずれかによる処理の後、移植直前に組織を過剰量の滅菌生理食塩水で十分にすすぎ洗いした。組織を皮下に移植した（ラット1匹当たり1つの組織、1つの処理方法当たり10匹のラット）。移植から21日後に組織を回収し、各組織から採取した試料におけるそのカルシウム含量を測定した。
【００６０】
この実施例に提示した実験の結果を以下に説明する。
【００６１】
架橋反応のpHモニタリング
図3に示す通り、本明細書に記載の第1の安定化方法を用いた安定化反応混合物のpHは、7日間の反応期間中に11.5近くまで上昇した。これに対して、本明細書に記載の第2の方法に関して述べたように、反応中に反応混合液を24時間毎に交換した場合には、pHが約8を上回って上昇することはなかった。pHが極端に高くなることは生体補綴材料の調製のために有益ではないため、安定化反応中にpHが生理的pHの付近（すなわち7.4）に維持されることは、第2の方法が第1の方法を上回る大きな利点である。
【００６２】
グルタルアルデヒド処理およびTGA処理を行ったコラーゲン表面の相対的生体適合性
変性（100℃、1時間）ウシI型コラーゲンをフィルム化して2つの培養表面を用意した。一方の表面は、0.2％（v／v）グルタルアルデヒドを含むpH 7.4の溶液と室温（すなわち約20℃）で24時間接触させることによって処理した。もう一方の表面は、0.1M TGAを含むpH 7.4の溶液と37℃で24時間接触させることによって処理した。反応しなかった化合物を除くために、この両方の表面をリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4）を用いて十分にすすぎ洗いした。A10細胞（American Type Culture Collection；Gaithersburg、MDから入手）を両方の表面に与え、細胞の生存を観察した。グルタルアルデヒドで処理したコラーゲン表面に与えた細胞の高い割合（細胞の30％またはそれ以上と推定）は、約24時間の培養の後には死滅しているように思われ、かなりの量の壊死細胞片が観察された。TGAで処理したコラーゲン表面に与えた細胞では、約24時間の培養後に死滅したように思われた割合ははるかに低かった（すなわち、実質的に検出不能な割合であった）。これらの結果は、蛋白質表面のTGA処理により、同じ表面をグルタルアルデヒドで処理した場合よりも、生体適合性が高く細胞毒性が低い表面が得られることを示している。
【００６３】
人工心臓弁の架橋
図4に示す通り、ブタ大動脈弁尖の架橋は、グルタルアルデヒドを用いた方がTGAを用いた場合よりも大幅に早く生じた。TGAを用いた場合の遅い架橋速度は、構造蛋白質の架橋がより段階的に起こるため、グルタルアルデヒドで固定した補綴物よりも耐久性があり、柔軟で、毒性が低く、細胞の内部増殖との適合性が高い補綴物が得られることから、生体補綴物の移植前処理のために有益である。図4に示した結果は、TGAを用いて処理した組織中の蛋白質架橋の最終的な程度が、少なくとも10日間のTGA処理後には、グルタルアルデヒドを用いて得られる程度よりも低い可能性を示している。この理由から、別の架橋剤も一緒に用いることが有益と考えられる。
【００６４】
図5に提示したデータは、溶液を24時間毎に補充しながら、0.1M TGAおよび0.1M HEPESを含む溶液を用いて処理した弁尖組織に関する蛋白質架橋の最終的な程度が、7日間の反応後の時点で、7日後にグルタルアルデヒド処理によって得られた架橋の程度よりも低かったことを示している。しかし、pHを調節した反応における架橋の程度は、反応中に溶液を補充しないで同じTGA溶液を用いた場合に得られた架橋の程度よりも大幅に大きかった。さらに、溶液を補充したTGA処理ではTsが約83℃の弁尖組織が得られ、これはグルタルアルデヒドで固定した組織と同等であった。このため、反応混合物のpHを調節することによってほかの架橋剤を用いる必要性を軽減することができる。
【００６５】
皮下石灰化試験
この実施例に記載した2つの方法を用いて処理した個々の組織試料のカルシウム含量（組織1mg当たりのカルシウムのmg量）を表1および表2に列挙した。
【００６６】
表1の値は、上記の第1の安定化方法を用いて処理した弁尖組織を用いて得た。列Aの値はグルタルアルデヒドを用いて架橋したブタ大動脈弁尖に対応する。列BおよびCの値はDenacol 521（商標）の2つの異なるバッチを用いて架橋したブタ大動脈弁尖に対応する。列DおよびEの値はそれぞれHEPES緩衝液およびホウ酸緩衝液中のTGAを用いて架橋したブタ大動脈弁尖に対応する。各列の一番下に挙げた値は、その列のデータに対応する平均値±標準誤差である。
【表１】
0004841097.tif 000003
【００６７】
表2の値は、上記の第2の方法を用いて処理した組織を用いて得た。群Iの値はグルタルアルデヒドを用いて架橋した組織に対応する。群IIの値は、上記の第2の方法を用いて架橋した組織に対応する。群IIIの値は、上記の第2の安定化方法を用いて架橋した組織であって、後にホルマリン含有液体で処理してその中で保存した組織に対応する。列挙した値はその行のデータに対応する平均値±標準誤差である。
【表２】
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【００６８】
これらの実験の結果は、第1および第2の安定化方法に関して記載したようにTGAを用いて組織を処理すると、組織の移植後石灰化がこれらの組織のグルタルアルデヒド処理の場合よりも抑制され、Denacol 521（商標）などのポリエポキシドと少なくともほぼ同じ程度に移植組織の石灰化の防止に有効である。これらの実験により、大動脈弁尖のTGA処理ではDenacol 521（商標）で観察されたばらつきが認められないことも示している。さらに、これらの実験は、TGAを介した安定化反応混合物のpHを調節することによって石灰化耐性および架橋の程度が改善されることを示している。
【００６９】
この実施例に提示した実験は、本明細書に記載の安定化方法を用いて、組織の生体力学的安定性および石灰化耐性を高める目的で、移植前に生体補綴組織を架橋させることが可能なことを示している。
【００７０】
本明細書に引用したすべての特許、特許出願、および刊行物は参照として本明細書に組み入れられる。
【００７１】
本発明を特定の態様を参照しながら説明してきたが、発明の真の精神および範囲を逸脱することなく、本発明の他の態様および変形物を他の当業者が考案しうることは明らかである。添付する特許請求の範囲にはこのようなすべての態様および等価な変形物が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  トリグリシジルアミン（TGA）の調製のための合成方法を示している。
【図２】  本明細書の記載の通りに合成したTGAの１H NMRスペクトルである。
【図３】  本明細書に記載の2つの異なる安定化方法を用いてブタ心臓弁尖を処理した架橋溶液のpHの時間的変化を示したグラフである。
【図４】  示差走査熱量測定法を用いて評価した、本明細書に記載の2つの安定化方法を用いて処理したブタ心臓弁尖の熱収縮温度の時間的変化を示したグラフである。
【図５】  示差走査熱量測定法を用いて評価した、本明細書に記載の3つの安定化方法を用いて処理したブタ心臓弁尖の熱収縮温度の時間的変化を示したグラフである。
【図６】  Z部分と結合した2-ヒドロキシオルガノアミン部分が生じる、一般化したエポキシアミン化合物と図中に「Z」と表示した反応性部分との反応を示した概略図である。
【図７】  トリグリシジルアミンと図中に「Z」と表示した反応性部分と結合した2-ヒドロキシ3-(ジグリシジルアミノ)プロピル部分が生じる、このZ部分との反応によって形成される初期反応生成物を示した概略図である。
【図８】  一般化したエポキシアミン化合物と大分子のメチルチオ部分（例えば、蛋白質内のメチオニン残基側鎖）との反応を示した概略図である。大分子は波線で表わされている。Xは非反応性で生体適合性のある陰イオンである。
【図９】  一般化したエポキシアミン化合物と大分子の一級アミン部分（例えば、蛋白質内のリジン残基側鎖）との反応を示した概略図である。大分子は波線で表されている。Xは非反応性の生体適合性のある陰イオンである。図に示す通り、アルキルアミノ部分とエポキシアミン化合物の反応は、1つ、2つ、または3つの2-ヒドロキシアルキルアミノ部分の付加をそれに対して引き起こす可能性がある。
【図１０】  一般化したエポキシアミン化合物と大分子のフェノール性ヒドロキシル部分（例えば、蛋白質内のチロシン残基側鎖）との反応を示した概略図である。大分子は波線で表されている。
【図１１】  一般化したエポキシアミン化合物と大分子のリン酸部分（例えば、蛋白質内のホスファチジルセリン残基側鎖などのモノアルキルリン酸）との反応を示した概略図である。大分子は波線で表されている。
【図１２】  一般化したエポキシアミン化合物と大分子のカルボキシル部分（例えば、蛋白質内のグルタミン酸残基側鎖）との反応を示した概略図である。大分子は波線で表されている。
【図１３】  溶液中でのトリグリシジルアミンの重合を示した概略図である。Xは非反応性の生体適合性のある陰イオンである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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