(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＰＡＲＣに対する抗体、及びＧＰＣ３に対する抗体を含む、悪性黒色腫（メラノーマ）の診断キット。
【請求項２】
悪性黒色腫（メラノーマ）の診断のために、サンプル中のＳＰＡＲＣ及びＧＰＣ３を測定する方法。
【請求項３】
サンプルとＳＰＡＲＣに対する抗体を接触させる工程、及びサンプルとＧＰＣ３に対する抗体を接触させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サンプル中のＳＰＡＲＣ及びＧＰＣ３を定量することを含む、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
サンプルが血清あるいは血漿である、請求項２から４の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性黒色腫（メラノーマ）の新規な診断キット、及び診断方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
メラノーマは、悪性黒色腫と呼ばれる皮膚癌の一種である。皮膚癌にもいろいろ種類があるが、メラノーマは、悪性度が最も高い皮膚癌で、非常に恐れられている。皮膚を構成している細胞のなかに、メラニン色素を産生する細胞があり、これを色素細胞（メラノサイト）と呼ぶが、この細胞が癌化したものがメラノーマである。【０００３】
日本におけるメラノーマの発生数は人口10万人あたり1.5〜2人くらいと言われ、年間1500人〜2000人くらい発生していると推測されている。欧米では人口10万人あたり10数人以上の発生と言われ、オーストラリアでは人口10万人あたり20数人以上の発生で世界一発生数が高いと言われている。それだけに欧米やオーストラリアの人々はメラノーマに関心を持ち、メラノーマの発生に注意をしている。また、驚くことに外国でも日本でもメラノーマの発生は年々増加傾向が認められている。最近の調査では、日本におけるこの病気による年間死亡者数は450人前後もいる。メラノーマは何歳の人でも発生しているが、特に40歳以上になると発生が多くなり、60歳〜70歳台が最も多くなっている。小児の発生は非常に少ないが、発生しないということはなく、最近20〜30歳台の若年者の発生が多くなっている傾向がある。性別では特にどちらかに多いという傾向はなく、男女どちらにも発生する。日本人のメラノーマが発生しやすい部位は、足底（足のうら）が最も多く、約3割ぐらいを占めている。足や指の爪の部分にも多くできることが、日本人の特徴である。そのほか、欧米人と同様に体、手、足、顔、頭など、どこの皮膚にも発生する。【０００４】
一方、血清腫瘍マーカーの測定は、メラノーマの診断のみならず、術後症例における再発の早期発見と、進行期例の治療効果の判定に重要である。メラノーマの腫瘍マーカーとしては、これまでに血清のＬＤＨや5-S-cysteinyldopa (5-S-CD)の有用性が知られていたが、さらに近年、S-100β蛋白およびmelanoma inhibitory activity (MIA)がより鋭敏なマーカーとして報告されている。本邦では、5-S-CDが広く用いられている。しかし、いずれの腫瘍マーカーも、Stage IVといったかなり進行したものでないと陽性にならず、メラノーマの診断や、術後再発の早期発見という面では、有用性は限られているといわざるを得ない。【０００５】
本発明者等は先に、グリピカン３（glypican-3；ＧＰＣ３）が、分泌蛋白であり、ELISA法を用いて40％の肝細胞癌患者および40％のメラノーマ患者の血清中にグリピカン３（glypican-3；ＧＰＣ３）を検出することができ、これが、肝細胞癌の新しい腫瘍マーカーとして有用であることを報告した（Nakatsura, T.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 306, 16-25 ,2003；及びNakatsura, T.ら,Clin. Cancer Res. 10,6612-6621,2004）。【０００６】
SPARC （Secreted protein,acidic rich in cysteine）（別名osteonectinまたはBM-40）は骨の構成蛋白として、1981にTermineらによって報告され、また基底膜の腫瘍の間質の構成成分として1987年にMannらによって報告された（Termine  JDら,Cell,26:99-105,1981；及びMann Kら,FASEB J 218:167-172,1987)。【０００７】
SPARCは様々な機能をもつ細胞間質糖蛋白である。その主な機能としては、細胞の癒着阻止、細胞の増殖阻止、細胞間質の調節などがある。（Bradshaw and Sage, J. Clin. Invest,107:1049-1054,2001；及びBrekken and Sage, Matrix Biol.,2001;19:816-827）コラーゲンなどの間質の構造蛋白を結合することで細胞間質と細胞との相互作用を調節している。【０００８】
成人におけるSPARCは、骨、血小板、創傷部位あるいは腫瘍などの組織が改築をくり返している部位で高発現している。SPARCと腫瘍の関係については様々な癌腫で、多くの報告が行われており、腫瘍細胞あるいは腫瘍組織におけるホストの間質細胞、炎症細胞がSPARCを発現する。【０００９】
Leddaらは、免疫組織学的検査にて、ヒトメラノーマにおけるSPARCの発現が、腫瘍の進行に相関することを報告した。（Leddaら,J.Invest.Delmatol.,108,210-214,1997）。またLeddaらは、SPARCのアンチセンス発現ベクターを用いてヒトのメラノーマ細胞のSPARCの発現を抑えると、in vitro で接着性や浸潤性が失われ、in vivo での発癌性がなくなったことを報告した（Leddaら,Nature Med.,3,171-176,1997）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
メラノーマの腫瘍マーカーとしては、血清のＬＤＨや本邦で広く用いられている5-S-cysteinyldopa (5-S-CD)、さらに近年、より鋭敏なマーカーとして報告されている、S-100β蛋白およびmelanoma inhibitory activity (MIA)があるが、いずれの腫瘍マーカーも、Stage IVといったかなり進行したものでないと陽性にならず、メラノーマの早期診断や、術後再発の早期発見という面では、有用性は限られているといわざるを得ない。本発明は、メラノーマの早期診断に有用な他の腫瘍マーカーを見出し、これを利用した悪性黒色腫（メラノーマ）の診断キット、及び診断方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者等は、先に、肝細胞癌およびメラノーマの患者血清中に可溶性ＧＰＣ３タンパク質を検出し、肝細胞癌およびメラノーマの新たな腫瘍マーカーとなり得ることを明らかにした。本発明者等は今回、ＧＰＣ３と同様にメラノーマ患者血清および血漿中に可溶性SPARCタンパク質を検出し、メラノーマに対する新規腫瘍マーカーになりうることを発見した。SPARCタンパク質はＧＰＣ３と同様に早期のメラノーマも検出でき、GPC3の測定を併用することでメラノーマの診断率を60％にまであげることができた。【００１２】
すなわち、本発明によれば以下の発明が提供される。
（１）ＳＰＡＲＣに対する抗体、及びＧＰＣ３に対する抗体を含む、悪性黒色腫（メラノーマ）の診断キット。
（２）サンプル中のＳＰＡＲＣ及びＧＰＣ３を測定することを特徴とする、悪性黒色腫（メラノーマ）の診断方法。【００１３】
（３）  サンプルとＳＰＡＲＣに対する抗体を接触させる工程、及びサンプルとＧＰＣ３に対する抗体を接触させることを含む、（２）に記載の診断方法。
（４）  サンプル中のＳＰＡＲＣ及びＧＰＣ３を定量することを含む、（２）又は（３）に記載の診断方法。
（５）  サンプルが血清あるいは血漿である、（２）から（４）の何れかに記載の診断方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明者等は、Nakatsura, T.ら,Clin. Cancer Res. 10,6612-6621,2004に記載の方法を用い、ＳＰＡＲＣ及びＧＰＣ３の組み合わせがメラノーマの早期診断に有用な血清腫瘍マーカーであることを見いだした。【００１５】
ヒトＳＰＡＲＣタンパク質のアミノ酸配列は公知であり、例えばGenBankのタンパク質データベースにAccession No. NM 003118として登録されており、当業者であれば容易に入手することができる。【００１６】
ヒトＧＰＣ３タンパク質のアミノ酸配列は公知であり、当業者であれば容易に入手することができる。【００１７】
本発明は、ＳＰＡＲＣに対する抗体、及びＧＰＣ３に対する抗体を含む、悪性黒色腫（メラノーマ）の診断キットを提供する。本発明で用いるＳＰＡＲＣに対する抗体及びＧＰＣ３に対する抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよく、それらは当業者に公知の方法（例えば、「新生化学実験講座１,タンパク質Ｉ,389-406,東京化学同人」参照）により調製することが可能である。ＳＰＡＲＣタンパク質及びＧＰＣ３タンパク質はアミノ酸配列が前記のように公知であり、該アミノ酸配列に基づいて通常のタンパク質発現技術を用いて製造することができ、また市販のもの（Zymed Laboratories,CA）を利用することも可能である。市販のＳＰＡＲＣまたはＧＰＣ３を用いる場合は、必要に応じてSDS-OutTM（Sodium Dodecyl Sulfate Precipitation Reagent; PIERCE, Rockford, ILより購入）を用いてＳＤＳを除いて使用することが好ましい。またＳＰＡＲＣまたはＧＰＣ３の部分ペプチドは、ＳＰＡＲＣまたはＧＰＣ３のアミノ酸配列から適当な部分配列を選択し、通常のペプチド合成技術を用いて製造できる。【００１８】
ＳＰＡＲＣまたはＧＰＣ３に対するポリクローナル抗体の調製は、例えば、ウサギ、モルモット、マウス、ニワトリなどの動物に適量のＳＰＡＲＣタンパク質またはＧＰＣ３タンパク質またはその部分ペプチドを投与する。投与は、抗体産生を促進するアジュバント（FIAやFCA）と共に行ってもよい。投与は、通常、数週間ごとに行う。免疫を複数回行うことにより、抗体価を上昇させることができる。最終免疫後、免疫動物から採血を行うことにより抗血清が得られる。この抗血清に対し、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインAや固定化抗原を用いたアフィニティー精製を行うことにより、ポリクローナル抗体を調製することができる。【００１９】
一方、ＳＰＡＲＣまたはＧＰＣ３に対するモノクローナル抗体の調製は、例えば、ＳＰＡＲＣタンパク質またはＧＰＣ３タンパク質もしくはその部分ペプチドを、上記と同様に動物に免疫し、最終免疫後、この免疫動物から脾臓またはリンパ節を採取する。この脾臓またはリンパ節に含まれる抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、ハイブリドーマを調製する。目的のハイブリドーマをスクリーニングし、これを培養し、その培養上清からモノクローナル抗体を調製することができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインAや固定化抗原を用いたアフィニティー精製により行うことができる。尚、本発明の目的のためには、抗体はＳＰＡＲＣまたはＧＰＣ３のいかなるエピトープを認識するものであってもよい。【００２０】
また、本発明では、上記した抗体の断片を使用してもよい。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等が挙げられる。【００２１】
診断剤としての正確性のためには、ＳＰＡＲＣに対する抗体またはＧＰＣ３に対する抗体はヒト型抗体もしくはヒト抗体であることが好ましい。ヒト型抗体は、例えば、マウス-ヒトキメラ抗体であれば、ＳＰＡＲＣタンパク質またはＧＰＣ３タンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、そのH鎖定常部をヒトIgE H鎖定常部遺伝子に組換え、マウス骨髄腫細胞に導入することにより調製できる。また、ヒト抗体は、免疫系をヒトと入れ換えたマウスにＳＰＡＲＣタンパク質またはＧＰＣ３タンパク質を免疫することにより調製することが可能である。【００２２】
本発明の診断キットにおいて、限定するものではないが、ＳＰＡＲＣに対する抗体、及びＧＰＣ３に対する抗体は、それぞれ例えば0.5μg/mlの濃度で用いることができる。本発明の診断キットには、上記したＳＰＡＲＣに対する抗体およびＧＰＣ３に対する抗体の他に、必要に応じて薬学的に許容される担体等を適宜含有させることができる。【００２３】
本発明はさらに、サンプル中のＳＰＡＲＣ及びＧＰＣ３を測定することを特徴とする、悪性黒色腫（メラノーマ）の診断方法を提供する。具体的には、サンプルとＳＰＡＲＣに対する抗体を接触させる工程、及びサンプルとＧＰＣ３に対する抗体を接触させる工程によって、サンプル中のＳＰＡＲＣ及びＧＰＣ３を測定することができる。本発明において、サンプルは、メラノーマに罹患しているおそれのある被験者から得られる血清、唾液、尿等が挙げられるが、特に好ましくは血清である。サンプルと上記抗体との接触は、当分野において通常行われている方法に基づいて行えばよく、特に限定するものではない。診断は、例えばサンプルと上記抗体との接触の後、サンプル中に存在し得るＳＰＡＲＣと抗体との特異的結合、及びサンプル中に存在し得るＧＰＣ３と抗体との特異的結合を、蛍光物質や発光物質、酵素等で標識した二次抗体等を使用して定量的に検出することにより行うことができる。また、診断のための反応をウェル等の液相中で行ってもよく、あるいはＳＰＡＲＣに対する抗体、又はＧＰＣ３に対する抗体を固定した固相支持体上で行ってもよい。この場合、メラノーマに罹患していない正常なサンプル、あるいはメラノーマであることが判明しているサンプルを用いて予め作製した標準値と比較することによって、測定された値がメラノーマ陽性であるか否かを判定することができる。また、診断の際には、多数のメラノーマ患者と健常人の血清中ＳＰＡＲＣ量及びＧＰＣ３量を測定して、カットオフ値を設定することが好ましい。【００２４】
ＳＰＡＲＣに対する抗体及びＧＰＣ３に対する抗体を用いて、サンプル中のＳＰＡＲＣ及びＧＰＣ３を免疫学的に検出する方法の具体例としては、サンドイッチＥＬＩＳＡ等の酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、又は放射性免疫測定法（ＲＩＡ）などがあり、これらの技術は当業者に周知である。例えば、サンドイッチＥＬＩＳＡでは、抗原認識部位の異なる２種類の抗体を用意し、一方の抗体はプレートに吸着させておく。サンプルをプレートに接触させて反応を行い、さらに抗原認識部位の異なる他方の抗体を反応させ、さらにペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素で標識した抗イムノグロブリン抗体を反応させる。酵素により発色する基質を添加して発色反応させた後、分光光度計により発色強度を測定することにより、サンプル中のＳＰＡＲＣおよびＧＰＣ３の検出または測定を行うことができる。また、放射性免疫測定法では、酵素でなく125Ｉ等の放射性物質で標識した抗体を用いて、酵素免疫測定法と同様の操作を行い、シンチレーションカウンターで放射線を測定する。【００２５】
本発明の診断方法は、メラノーマに罹患しているか否かの診断に用いることができる他、メラノーマに対する治療の効果を確認するために経時的に行うこともできる。【００２６】
本発明のキットには、上記したＳＰＡＲＣに対する抗体およびＧＰＣ３に対する抗体が少なくとも含まれ、その他に、サンプル中のＳＰＡＲＣ及びＧＰＣ３を検出するのに必要な試薬（例えば、二次抗体、発色試薬、緩衝液など）を適宜含めることができる。
以下、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
［実施例１］マウス細胞株におけるＳＰＡＲＣ  ｍＲＮＡの発現
逆転写-ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）を用いたＳＰＡＲＣ  ｍＲＮＡ発現を検討した。マウス細胞系であるB16, B16F1, B16F10, EL4 MCA,及びLLCは東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターから入手した。【００２８】
ＲＴ-ＰＣＲは公知の方法（例えばNakatsura, T.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 936-944 , 2001)）に従って行った。533bpの断片を増幅するマウスＳＰＡＲＣ遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを設計し、これを用いて９４℃、５分の初期変性、及び５８℃のアニーリング温度での３０増幅サイクルからなるＲＴ-ＰＣＲ反応を行った。用いたＳＰＡＲＣ ＰＣＲプライマー配列は、
センス：5'-GTCCCACACTGAGCTGGC-3'（配列番号１）
アンチセンス：5'-AAGCACAGAGTCTGGGTGAGTG-3'（配列番号２）である。【００２９】
マウス細胞系におけるＳＰＡＲＣ ｍＲＮＡの発現を比較した。結果を図１Ａに示す。図１Ａにおいて、レーン 1: B16, レーン2:B16-F1,レーン 3:B16-F10, レーン4:MCA, レーン5:NIH-3T3,レーン6:LLC, 及びレーン7: EL4を示す。【００３０】
図１Ａの結果から分かるように、B16 ,B16F1 及びB16F10 メラノーマ細胞系においてＳＰＡＲＣ ｍＲＮＡの強い発現が示された。MCA, LLC,NIH/3T3においても発現を認めたが、EL4においてはそのような発現は見られなかった（図１Ａ）。【００３１】
［実施例２］ヒトメラノーマ細胞株におけるＳＰＡＲＣ ｍＲＮＡの発現
逆転写-ＰＣＲ（ＲＴ-ＰＣＲ）を用いて、ＳＰＡＲＣ ｍＲＮＡ発現を検討した。メラノーマ細胞系であるG361, CRL1579, SK-MEL-28及びHMV-Iは東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターから入手した。526mel, 888melは慶応大学のY. Kawakami博士よりご供与頂いた。また164、SK-MEL-19、HM3KO、MEWO, colo38は熊本大学のT. Kageshita博士よりご供与頂いた。さらに、正常ヒト表皮メラニン細胞NHEMは、クラボウ（倉敷紡績株式会社）より購入した。【００３２】
ＲＴ-ＰＣＲは公知の方法（例えばNakatsura, T.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 936-944 (2001)）に従って行った。343bpの断片を増幅するヒトＳＰＡＲＣ遺伝子特異的ＰＣＲプライマーを設計し、これを用いて９４℃、５分の初期変性、及び５８℃のアニーリング温度での26増幅サイクルからなるＲＴ-ＰＣＲ反応を行った。用いたＳＰＡＲＣ ＰＣＲプライマー配列は、
センス：5'-CGAAGAGGAGGTGGTGGCGGAAAA-3'（配列番号３）
アンチセンス：5'-GGTTGTTGTCCTCATCCCTCTCATAC-3'（配列番号４）であり、
対照実験のためのβ-アクチン ＰＣＲプライマー配列は、
センス：5'-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3'（配列番号５）
アンチセンス：5'-GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3'（配列番号６）である。【００３３】
対照であるβ-アクチンｍＲＮＡによる標準化の後、メラノーマ細胞系におけるＳＰＡＲＣ ｍＲＮＡの発現を比較した。結果を図１Ｂに示す。図１Ｂにおいて、レーン1:164, レーン2:888, レーン3:HM3KO, レーン4:CRL1579, レーン5: 526mel, レーン6:G361, レーン7:MEWO, レーン8:SK-MEL-28, レーン9: SK-MEL-19, レーン10:Colo38, レーン11:HMV-I,及びレーン12: NHEM (melanocyte)を示す。【００３４】
図１Ｂの結果から分かるように、164, 888mel , HM3KO, CRL1579, 526mel,  G361, MEWO, SK-MEL-28, SK-MEL-19, colo38, NHEMは発現の上昇を認めたが、HMV-Iではそのような発現は見られなかった。尚、正常メラノサイトにも発現がみられた。【００３５】
［実施例３］ヒトメラノーマ組織におけるＳＰＡＲＣ蛋白の発現
Western blotting法を用いて、ヒト正常皮膚、ヒト色素性母斑、ヒトメラノーマ組織におけるＳＰＡＲＣ蛋白の発現を調べた。検体は、熊本大学医学部皮膚科学講座において治療されたインフォームドコンセントの得られたものを、T.Kageshita博士より御供与頂いた。【００３６】
Western blottingは公知の方法で行った。サンプルを7％アクリルアミドゲルにて電気泳動ののち、ニトロセルロースメンブレン(Bio Rad)へtransferし、5％スキムミルク、1％BSAを加えた0.2％Tween20-TBS溶液にてブロッキング (4℃, 一晩)した。HSP105 マウスモノクローナル抗体(Haematologic Technologies, USA)および、対照としてマウスモノクローナルβ-アクチン抗体(Sigma)を1次抗体として1時間室温でインキュベーションし、洗浄の後HRP 標識抗マウス抗体、HRP標識抗マウス抗体(Amersham Bioscience)にて30分インキュベーションし,洗浄の後、ECL Western Blottiong detection Reagents (Amersham Bioscience)にて検出した。【００３７】
結果を図２に示す。図２において、レーン1:母斑, レーン2:患者１（末端黒子型）正常皮膚, レーン3:患者１斑, レーン4:患者１メラノーマ, レーン5:患者２（末端黒子型）正常皮膚, レーン6:患者２斑, レーン7:患者２メラノーマ, レーン8:患者３（表在拡大型）メラノーマ, レーン9:患者４（表在拡大型）正常皮膚, レーン10: 患者４（表在拡大型）班, レーン11: 患者４（表在拡大型）メラノーマ, レーン12:患者５（表在拡大型）メラノーマ転移を示す。【００３８】
図２の結果から分かるように、母班、正常皮膚、斑ではＳＰＡＲＣ蛋白の発現はわずかであったが、すべてのメラノーマ組織でＳＰＡＲＣ蛋白は高発現していた。【００３９】
［実施例４］メラノーマ細胞系の培養上清及びメラノーマ患者血清中の可溶性ＳＰＡＲＣ蛋白質の存在
９６ウェルのＥＬＩＳＡプレート（Nunc, Denmark）を室温で一晩、ＰＢＳ、ｐＨ7.4中0.05μg／ウェルの抗-ヒトＳＰＡＲＣモノクロ-ナル抗体（Zymed laboratories,San Francisco）でコートした。次いで、１００％ブロックエース（大日本製薬株式会社）を用い、室温で１時間、プレートをブロッキングした。陽性対照の標準サンプル及び培養上清、１０％ブロックエースで２００倍希釈した患者血清をビオチン化抗-ヒトＳＰＡＲＣポリクローナル抗体(R&D system,minneapolis)と共に添加し、室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳで３回洗浄した後、各ウェルにＨＲＰ-コンジュゲートストレプトアビジン（ENDOGEN, Woburn）を添加した。３０分のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢ基質溶液（ENDOGEN）を添加した。解析のためにＥＬＩＳＡリーダー（モデル550、Bio-Rad）を４５０ｎｍで用いた。【００４０】
インフォームドコンセントを得た後、熊本大学医学部皮膚科学講座において治療を受けたメラノーマ患者から血清サンプルを得た。ＳＰＡＲＣはその名の通り、分泌蛋白であり、メラノーマにおいてＳＰＡＲＣタンパク質が分泌されるかどうかの検出を試みた。【００４１】
抗-ヒトＳＰＡＲＣ抗体及びビオチン化抗-ヒトＳＰＡＲＣポリクローナル抗体を用いて酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）による検出を行った。市販のＳＰＡＲＣタンパク質(Haematologic Technologies, USA)を用い、ＥＬＩＳＡ系におけるＳＰＡＲＣの定量の精度を確認した。ＳＰＡＲＣタンパク質の連続希釈を用い、ＯＤデータに基づいてＳＰＡＲＣタンパク質を定量する標準曲線を評価した。１１種類のメラノーマ細胞株のうち、１０種類の培養上清中にＳＰＡＲＣタンパクが検出された（図３）。【００４２】
次に、メラノーマ患者血清中の可溶性ＳＰＡＲＣタンパク質の検出を行った。８７名の術前メラノーマ患者から血液サンプルを採取し、医療記録から患者のプロファイルを集めてTNM分類に基づいて臨床段階を決定した。８７名のメラノーマ患者及び６０名の健康なドナー（ＨＤ）の血清中のＳＰＡＲＣタンパク質の量をＥＬＩＳＡによって評価した（図４、図５）。ＨＤ血清中にも血小板由来と思われるＳＰＡＲＣタンパク質が検出されたが、メラノーマ患者の一部では、より高値のＳＰＡＲＣタンパク質が検出された。ＨＤの平均値＋2SD（2337ng/ml）をカットオフ値とした場合、メラノーマ患者87人中29人（33.3%）が陽性となるが、健常人は60人中3人が陽性となり、特異度は95％であった。さらに、メラノーマ患者で術前陽性値を示し、術後の経過をおうことができた１０例中７例において、摘出手術後には血清中にＳＰＡＲＣタンパクが検出されなくなった。健常人の血清中にも、血小板由来と思われるＳＰＡＲＣタンパク質が検出されたため、血小板由来のＳＰＡＲＣタンパク質の影響を排除する為に、１１名のメラノーマ患者及び２１名の健康なドナー（ＨＤ）の血漿中のＳＰＡＲＣタンパク質の量をＥＬＩＳＡによって評価した（図６）。ＳＰＡＲＣタンパク質５００ng/mlをカットオフ値とした場合、メラノーマ患者の平均値は606ng/ml で、11人中4人（36.4%）が陽性となるが、健常人の平均値は140ng/ml となり、21人中1人が陽性となり、特異度は95％であった。【００４３】
さらに、メラノーマ患者血清中の可溶性ＭＩＡ,５-Ｓ-ＣＤ,ＧＰＣ３,ＳＰＡＲＣ,およびＳＰＡＲＣもしくはＧＰＣ３を検出した。結果を表１に示す。ＳＰＡＲＣはＧＰＣ３と同様にStage I, IIの早期でもメラノーマの診断に有効であった。また、ＳＰＡＲＣおよびＧＰＣ３を用いることによって、6割以上のメラノーマ患者をスクリーニングできた。また、上記と同一の血清におけるＳＰＡＲＣ陽性及びＧＰＣ３陽性の内訳を以下の表２に示す。【００４４】
【表１】
0004834839.tif 000002
【００４５】
【表２】
0004834839.tif 000003
【００４６】
表１及び表２、図５の結果から明らかなように、従来のメラノーマの腫瘍マーカー、5-S-CD、最近注目されているMIAはいずれもStage III, IVの進行したメラノーマでしか有用でないが、ＳＰＡＲＣはＧＰＣ３と同様にStage I, IIの早期でもメラノーマの診断に有効であった。しかしながら、ＳＰＡＲＣはＧＰＣ３の重陽性の例は少なく、別個の機序で、血清中に分泌されていると考えられ、ＳＰＡＲＣとＧＰＣ３を併用することにより、診断率を上昇させることができる。即ち、ＳＰＡＲＣおよびＧＰＣ３を用いることによって、6割以上のメラノーマ患者をスクリーニングでき、メラノーマの新規な腫瘍マーカーとして有用であることが明らかとなった。なおMIAの測定には、ドイツ  Roche社のMIA ELISAキットを用いた。【００４７】
また、メラノーマ肉眼分類別のメラノーマ患者血清中の可溶性ＳＰＡＲＣ蛋白を検出した。結果を表３に示す。ＳＰＡＲＣはメラノーマの組織型の違いによらず、様々な組織型で蛋白の増加を認めた。【００４８】
【表３】
0004834839.tif 000004
【００４９】
表３の結果は、日本人に多い足の裏にできる末端黒子型や、欧米人に多くみられる表在拡大型や悪性黒子型などの組織型の違いによらず、様々な組織型の診断に寄与すると考えられた。【００５０】
さらに１６名のメラノーマ患者の術前及び術後における血清ＳＰＡＲＣ値（単位はｎｇ／ｍｌ）の変化を以下の表４に示す。１６例中のうち１３例において、術後に、血清ＳＰＡＲＣ値はカットオフ値（２３４０ｎｍ／ｍｌ）以下に低下した。【００５１】
【表４】
0004834839.tif 000005
【産業上の利用可能性】
【００５２】
本発明による診断キット、及び診断方法は、メラノーマに罹患しているか否かを診断するのに非常に有用である。ＳＰＡＲＣ及びＧＰＣ３の組み合わせは、世界中の多くのメラノーマ患者に対する癌診断における用途に対して非常に有用であることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１はＳＰＡＲＣ ｍＲＮＡの発現を示す。
【図２】図２は、Western blotting法によるヒトメラノーマ組織におけるＳＰＡＲＣ蛋白の発現を示す。
【図３】図３は、メラノーマ細胞系の培養上清中に分泌されるＧＰＣ３タンパク質のＥＬＩＳＡによる定量の結果を示す。
【図４】図４は、メラノーマ患者血清中の可溶性ＳＰＡＲＣ蛋白質の存在を示す。
【図５】図５は、Stage別メラノーマ患者血清中の可溶性ＳＰＡＲＣ蛋白質の存在を示す。
【図６】図５は、メラノーマ患者血漿中の可溶性ＳＰＡＲＣ蛋白質の存在を示す。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【図２】
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【配列表】
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