(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド又は該ポリペプチドの医薬的に許容される塩の一種以上を有効成分として含有する、成人病の予防及び治療に有効なポリペプチド組成物であって、前記ポリペプチド及びその塩は、合成したものであるか又は天然物中から単離したものであることを特徴とする成人病の予防及び治療に有効なポリペプチド組成物。
【請求項２】
上記成人病が、痛風、及び高尿酸血症である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
請求項１又は２記載の組成物を含有することを特徴とする食品、飲料又は医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品、飲料及び医薬の分野で有用な、高尿酸血症を含む成人病の予防及び治療に利用可能な組成物と、該組成物を含有する食品、飲料及び医薬品に関するものである。尚、本発明でいう成人病とは、一連のガンと生活習慣病のことであり、具体的には例えば、固形ガン、転移性ガン、痛風、高尿酸血症、動脈硬化性疾患、冠動脈疾患、脳血管障害、末梢循環障害、糖尿病、高血圧などである。
【背景技術】
【０００２】
生活習慣の中でも食習慣が健康に及ぼす影響は大きく、食習慣の乱れはガン、痛風、高尿酸血症、高脂血症、動脈硬化性疾患、冠動脈疾患、脳血管障害、及び高血圧といった一連の成人病や生活習慣病を招く要因となる。これらは互いに影響を及ぼしあうものも多いため、1 つの症状が単独で発症するだけではなく、複数が同時に発症するケースも多い。例えば、動脈硬化性疾患は高血圧や糖尿病が主要冠危険因子として挙げられており（日本動脈硬化学会  動脈硬化性疾患診療ガイドライン2002年版より）、高脂血症でも高血圧や糖尿病が危険因子として挙げられている（非特許文献１参照）。また、痛風の患者で高血圧や肥満、動脈硬化性疾患などを合併するケースなども知られている。現在、日本では死因の三分の二近くが成人病、生活習慣病に関連したものであり、これに対して厚生労働省も平成12年より「健康日本21」という健康づくり運動を実施している（厚生労働省ホームページより）。【０００３】
しかし、バランスのとれた食事の摂取は理想ではあるものの、現代人の食生活は乱れがちであり、崩れたバランスを栄養補助食品などの利用で補う者も多い。サメやウシなどの動物由来軟骨は医薬品原体や栄養補助食品の素材として長年利用されてきたものの１つであり、それらの抽出物で精製度が高いものの１部は医薬用として、比較的精製度の低い糖質やペプチドなどの混合物については、主に食品や飲料用として利用されてきた。軟骨より得られるコンドロイチン硫酸などの多糖、及びそれに結合する蛋白質で構成されるプロテオグリカンを中心に分解・抽出・精製したものがヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、あるいはコンドロイチン硫酸蛋白複合体などとして、又、コラーゲンに由来する蛋白質成分を中心に分解・抽出・精製したものがコラーゲンやコラーゲンペプチドとして現在も流通している。このような製品の一例としては医薬用コンドロイチン硫酸、食用コンドロイチン硫酸ＳＣＰ、及びフィッシュコラーゲンＷＰ（全てマルハ株式会社製）などを挙げることができる。これらを継続して服用することでガンのような成人病、動脈硬化性疾患、高尿酸血症などの生活習慣病や関節痛の軽減、皮膚の質の向上、及び老化の抑制などに対して有益な効果が得られるといわれている。例えば、食用コンドロイチン硫酸ＳＣＰ（マルハ株式会社製）は継続的に摂取することで高尿酸血症、痛風や骨粗鬆症の予防に有益な作用が得られることが報告されている（特許文献１及び２参照）。【０００４】
【非特許文献１】山田信博担当編集  循環器NOW12   動脈硬化・高脂血症  P153
【特許文献１】特開２００３−３３５６９８号公報
【特許文献２】特許第３２４８１７０号明細書
【発明の開示】
【０００５】
しかしながら、コンドロイチン硫酸やコラーゲンそのものの生理作用については知見があるものの、動物由来軟骨抽出物を精製することで得られる組成物中に含まれる有効成分については未解明な部分も多い。
従って、本発明は、動物由来軟骨抽出物中に存在する有効成分を解明し、該有効成分を含有する高尿酸血症などの成人病の予防及び治療に有効な組成物及びその利用法を提供することにある。
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成すべく種々検討した結果、軟骨抽出物中の塩基性を示す画分の酵素消化物が高尿酸血症などの成人病に対し有益な作用を有することを知見した。また、上記塩基性を示す画分を逆相系カラムを用いてさらに分画したところ、カラム吸着画分の１つが上記作用を示した。本画分は、ＧＰＣ分析の結果、分子量５万Ｄａ以下であり、アミノ酸分析の結果、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、ロイシン、チロシン、リシン及びアルギニンを含むことを見出した。本画分を酵素消化したものをＨＰＬＣによるパターン分析にかけたところ、２０以上の主要なポリペプチドとそれらの酵素消化物などで構成されることを見出した。
【０００８】
本発明は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド又は該ポリペプチドの医薬的に許容される塩の一種以上を有効成分として含有する、成人病の予防及び治療に有効なポリペプチド組成物であって、前記ポリペプチド及びその塩は、合成したものであるか又は天然物中から単離したものであることを特徴とする成人病の予防及び治療に有効なポリペプチド組成物を提供するものである。
【０００９】
さらに、本発明は、上記の組成物を含有することを特徴とする食品、飲料及び医薬品を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例で使用した等電点電気泳動装置の概略を示す図である。
【図２】サメ軟骨抽出物を等電点電気泳動法で分画した際の各セルの総アミノ酸濃度、コンドロイチン硫酸濃度、及びｐＨを示す図である。
【図３】食用コンドロイチン硫酸ＳＣＰ（マルハ株式会社製）を等電点電気泳動法で分画した際の各セルの総アミノ酸濃度、コンドロイチン硫酸濃度、及びｐＨを示す図である。
【図４】サメ軟骨抽出物の塩基性画分を逆相カラムで分画した際のクロマトグラムを示す。
【図５】サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物ｆｒ４及びそのアルカラーゼ消化物の溶出パターンを確認した際のクロマトグラムを示す。
【図６】サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物ｆｒ４のＧＰＣ分析時のクロマトグラムを示す。
【図７】サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物ｆｒ４のＧＰＣ分析時のクロマトグラムを示す。
【図８】サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物ｆｒ４のアルカラーゼ消化物のＧＰＣ分析時のクロマトグラムを示す。
【図９】サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物ｆｒ４のアルカラーゼ消化物のＧＰＣ分析時のクロマトグラムを示す。
【図１０】サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物ｆｒ４のアルカラーゼ消化物中に含まれるポリペプチド分取時のクロマトグラムを示す。
【図１１】配列番号１に示すアミノ酸配列からなる合成ポリペプチド(YLDNY) のＨＰＬＣパターンを示す図である。
【図１２】配列番号１に示すアミノ酸配列からなる合成ポリペプチド(YLDNY) のＨＰＬＣマスクロマトグラフを示す図である。
【図１３】正常ラットを用いた食用コンドロイチン硫酸ＳＣＰ分画物の血清尿酸値低下活性を評価した図である。
【図１４】オキソン酸カリウム混餌誘発による高尿酸血症モデルラットを用いたサメ軟骨水抽出物の分画物のアルカラーゼ消化物の血清尿酸値低下活性を評価した図である。
【図１５】オキソン酸カリウム腹腔内投与による高尿酸血症モデルラットを用いたサメ軟骨水抽出物の分画物のアルカラーゼ消化物の血清尿酸値低下活性を評価した図である。
【図１６】サメ軟骨抽出物の塩基性画分を逆相カラムで分画し、アルカラーゼで消化した物の血清尿酸値評価結果を示す図である。
【図１７】サメ軟骨抽出物の塩基性画分を逆相カラムで分画し、アルカラーゼで消化した物の中に含まれるポリペプチドの血清尿酸値低下活性を示す図である。
【図１８】配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド(YLDNY) 投与血清の尿酸合成酵素の阻害活性を示す図である。
【図１９】ラット尿酸塩足浮腫法によるサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物による痛風に対する活性の評価を示す図である。
【図２０】ラット尿酸針状結晶空気嚢法によるサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物による痛風に対する活性の評価を示す図である。
【図２１】サメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物による固形ガンに対する活性の評価を示す図である。
【図２２】サメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物による転移性ガンに対する活性の評価を示す図である。
【図２３】高脂血症モデルマウスにサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物を２８日間投与した際の血清中性脂肪値と血清総コレステロール値を示す図である。
【図２４】脳血管障害モデルラットにサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物を２８日間投与した際の脳梗塞領域率を示す図である。
【図２５】オキソン酸カリウム腹腔内投与による高尿酸血症モデルラットを用いた配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＹＬＤＮＹ）の血清尿酸値低下活性を評価した図である。
【図２６】配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＹＬＤＮＹ）の配列の一部からなるペプチド（アミノ酸数；２）の尿酸合成酵素の阻害活性を示す図である。
【図２７】配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＹＬＤＮＹ）の配列の一部からなるペプチド（アミノ酸数；３）の尿酸合成酵素の阻害活性を示す図である。
【図２８】配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＹＬＤＮＹ）の配列の一部からなるペプチド（アミノ酸数；４）の尿酸合成酵素の阻害活性を示す図である。
【図２９】配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（ＹＩＮＹ）の尿酸合成酵素の阻害活性を示す図である。
【図３０】サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物中に含まれるポリペプチド（ＹＮＬ、ＧＹＬ、ＩＮＦ）の尿酸合成酵素の阻害活性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明の成人病の予防及び治療に有効な組成物の好ましい実施形態について詳述する。
本発明の組成物は、動物由来軟骨抽出物の塩基性画分を酵素消化することで得ることができる。
本発明の組成物の原料となる動物由来軟骨としては、例えば、軟骨魚類、硬骨魚類、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、甲殻類又は軟体動物由来の軟骨が挙げられるが、好ましくは軟骨魚類、硬骨魚類、哺乳類、鳥類又は軟体動物由来の軟骨であり、より好ましくは軟骨魚類、硬骨魚類又は哺乳類由来の軟骨であり、更により好ましくは軟骨魚類又は硬骨魚類由来の軟骨であり、特に好ましくは軟骨魚類由来の軟骨である。【００１２】
本発明で用いられる動物由来軟骨抽出物は、上記動物由来軟骨から水やアルコールなどの適当な溶媒を用いて抽出したものである。上記動物由来軟骨は、由来の異なる２種類以上を併用することもできる。また、上記動物由来軟骨が軟骨魚類、硬骨魚類及び哺乳類由来の軟骨の場合には、該軟骨を酵素処理した後、抽出するのが好ましい。
また、上記動物由来軟骨抽出物としては、食用コンドロイチン硫酸ＳＣＰ（マルハ株式会社製）、コンドロイチン硫酸（食品用）（新日本薬業株式会社製）、ＳＮＣ−２０、ＳＮＣ−４０（ともに株式会社ニチロ製）、コンドロイチンＱ（キユーピー株式会社製）、フィッシュコラーゲンＷＰ（マルハ株式会社製）、コラーゲンペプチド（酵素消化品）（和光純薬株式会社製）、マリンマトリックス（焼津水産化学工業株式会社製）、ニワトリゼラチン（日本ハム株式会社製）、Ｐ−ＬＡＰ（日本ハム株式会社製）などの市販品を用いることもできる。【００１３】
上記動物由来軟骨抽出物の塩基性画分は、上記動物由来軟骨抽出物を例えば等電点電気泳動法により分画することにより得られる。
上記塩基性画分は、等電点９以上の画分であることが好ましく、より好ましくは等電点１１〜１３の画分である。更に好ましくは、等電点が上記範囲内で、アスパラギン酸、グルタミン酸、プロリン、グリシン、アラニン、ロイシン、チロシン、 リシン及びアルギ
ニンを含む画分であり、更により好ましくは、これらの画分のうち分子量が５万Ｄａ以下の画分である。【００１４】
本発明の組成物の有効成分である酵素消化物は、上記塩基性画分を酵素消化したものである。該酵素消化に用いられる酵素としては、アルカラーゼやプロテアーゼなどが挙げられ、該酵素処理は、通常、ｐＨ６〜８に調製した５〜１５％基質溶液を４０〜６０℃で４〜１２時間反応させることにより行うとよいが、この条件に限定されるものではない。【００１５】
上記酵素消化物は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０の何れかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、アミノ酸配列Leu-Tyr からなるポリペプチド、アミノ酸配列Tyr-Tyr からなるポリペプチド、アミノ酸配列Ser-Leu からなるポリペプチド、アミノ酸配列Tyr-Leu からなるポリペプチド、アミノ酸配列Leu-Phe からなるポリペプチド、アミノ酸配列Arg-Tyr-Phe からなるポリペプチド、アミノ酸配列Val-Tyr-Gln からなるポリペプチド、アミノ酸配列Tyr-Asn-Leu からなるポリペプチド、アミノ酸配列Gly-Tyr-Leu からなるポリペプチド、アミノ酸配列Gly-Phe-Leu からなるポリペプチド、アミノ酸配列Ile-Asn-Phe からなるポリペプチド、アミノ酸配列Val-Glu-Tyr からなるポリペプチド、アミノ酸配列Ile-Asn-Tyr からなるポリペプチド、アミノ酸配列Ile-Tyr-Leu からなるポリペプチド、又はこれらのポリペプチドの一部分、あるいはこれらのアミノ酸配列を一部に有するポリペプチド若しくはこれらのポリペプチドの医薬的に許容される塩を一種以上含むことが好ましく、特に、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９及び１０の何れかに示すアミノ酸配列からなるポリペプチド、アミノ酸配列Arg-Tyr-Phe からなるポリペプチド、アミノ酸配列Val-Tyr-Gln からなるポリペプチド、アミノ酸配列Tyr-Asn-Leu からなるポリペプチド、アミノ酸配列Gly-Tyr-Leu からなるポリペプチド、アミノ酸配列Ile-Asn-Tyr からなるポリペプチド、アミノ酸配列Ile-Tyr-Leu からなるポリペプチド、アミノ酸配列Tyr-Leu-Asp からなるポリペプチド、アミノ酸配列Leu-Asp-Asn からなるポリペプチド、アミノ酸配列Asp-Asn-Tyr からなるポリペプチド、又はこれらのポリペプチドの医薬的に許容される塩を一種以上含むことが好ましい。
【００１６】
また、本発明の組成物は、上記のポリペプチド又はその塩の一種以上を有効成分として含有するポリペプチド組成物であってもよい。該ポリペプチド組成物において、有効成分として含有する上記のポリペプチド又はその塩は、有機合成的手法や微生物を用いた発酵法などにより人工的に合成したものでもよく、また上記動物由来軟骨などの天然物中に存在する上記のポリペプチドやその塩を単離したものでもよい。
上記のポリペプチド又はその塩の合成法の好ましい一例を以下に挙げる。上記動物由来軟骨を粉体化したものを十分量の水で抽出し、得られた抽出物を等電点電気泳動、逆相カラムクロマト、ゲルろ過カラムクロマト、限外ろ過などの方法を用いて分画することにより、上記のポリペプチド又はその塩を得る方法が挙げられる。また、上記有機合成的手法としては、一般に用いられるFmoc法等の化学合成法が挙げられる。
本発明の組成物の有効成分であるポリペプチドは、従来より食されている天然物中に存在しているものであり、その安全性には問題がない。【００１７】
上記のポリペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、酒石酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩が用いられるが、これらに限定されるものではない。【００１８】
本発明の組成物は、例えば、ラクトース、白土、シュークロース、デキストリン、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウムなどの適当な固体担体を用いて、錠剤、散剤、顆粒剤、トローチ剤又はカプセル剤としたり、シロップ、植物油、水などの液体担体を適宜用いて、シロップやソフトゼラチンカプセル剤として、経口投与によって摂取させることができる。また、他の飲食品に添加した形態で摂取させることもできる。
本発明の組成物には、必要であれば、糖類又は塩などの等張剤、生体内のｐＨに適応するｐＨを与える緩衝剤、界面活性剤、酸化防止剤、吸収遅延剤などを配合することもできる。
【実施例】
【００１９】
以下に本発明の効果を示す実施例を挙げるが、本発明はこれらの実施例に何等制限されるものではない。【００２０】
実施例１（動物由来軟骨抽出物の製造）
粉末サメヒレ軟骨２５０ｇに１２００ｍｌの蒸留水を加えて撹拌後、遠心分離（１０分, ３０００ｒｐｍ）し、上清を得た。残渣は２００ｍｌの蒸留水を加えて撹拌後、同様に遠心分離し上清を回収する操作を２回繰り返した。回収した上清は１つにまとめて凍結乾燥(FD-81、EYELA)した。その結果、５０ｇのサメ軟骨抽出物を得た。【００２１】
実施例２（動物由来軟骨抽出物の製造）
ウシ肩胛骨部軟骨２５０ｇに１０００ｍｌの蒸留水を加えた後、１２０℃で１２０分加熱して溶解させた。溶解後、５０℃まで冷却し、市販のアルカラーゼを４００μｌ添加後、３時間反応させた。反応後、２０００ｍｌの変性エタノールを加えて撹拌し、上清を回収した。上清は真空乾燥で変性アルコールを除去後、凍結乾燥した。その結果、６２ｇのウシ軟骨抽出物を得た。【００２２】
実施例３（サメ軟骨抽出物の塩基性画分の分画）
実施例１で得られた５０ｇのサメ軟骨抽出物を１０％水溶液とし、５リットル容量の等電点電気泳動装置で、含有する成分の等電点の違いを利用して１０画分に分画した。等電点電気泳動は、電圧を５００Ｖとし、装置を流れる電流が一定となったことを確認した後、終了した。分画後、各セル溶液のｐＨが９以上であったものを塩基性画分として回収し、１つにまとめた後、凍結乾燥 (FD-81 、EYELA)した。使用した等電点電気泳動装置の概略図を図１に、サメ軟骨抽出物の塩基性画分の等電点を表１に、その歩留まりを表２に、サメ軟骨抽出物を等電点電気泳動法で分画した際の各セルの総アミノ酸濃度、コンドロイチン硫酸濃度及びｐＨを図２に、それぞれ示した。また、製品として流通しているサメ軟骨抽出物の１つである、食用コンドロイチン硫酸ＳＣＰ（マルハ株式会社製）５０ｇを上記と同様の条件で分画した際の各セルの総アミノ酸濃度、コンドロイチン硫酸濃度及びｐＨを図３に示した。尚、図１に示す等電点電気泳動装置において、セル１〜４及びセル７〜１０は蒸留水で満たされ、各セル間は半透膜で仕切られている。【００２３】
【表１】
0004834671.tif 000002
【００２４】
【表２】
0004834671.tif 000003
【００２５】
実施例４（逆相カラムを用いたサメ軟骨抽出物の塩基性画分の分画）
Bakerbond C18 を充填した２ｃｍ×２０ｃｍカラムで２ｇのサメ軟骨抽出物の塩基性画分を分画した。溶出速度は１０ｍｌ／ｍｉｎ．とし（溶離液；水（０．１％ＴＦＡ））、モニターは２８０ｎｍで行った。２ｇの塩基性画分を１００ｍｌの溶離液に溶かしてカラムにLoad後、充分量（２５０ｍｌ）の溶離液で洗浄し、非吸着画分を回収した。その後、０→６０％（２０ｍｉｎ）アセトニトリルでグラジエント溶出した。回収した溶離液（洗浄に用いた溶離液を含む）が２９５ｍｌ〜３５０ｍｌの画分をｆｒ．２、３５０ｍｌ〜４００ｍｌの画分をｆｒ．３、４００ｍｌ〜５００ｍｌの画分をｆｒ．４とした。
溶離液に不溶の成分については別途回収した。回収した各画分は全て凍結乾燥(FD-81、EYELA)した。分画した際のクロマト図を図４に、分画結果を表３に、ｆｒ．４のアミノ酸含量を表４に、それぞれ示した。【００２６】
【表３】
0004834671.tif 000004
【００２７】
【表４】
0004834671.tif 000005
【００２８】
実施例５（サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物ｆｒ．４及びそのアルカラーゼ消化物の溶出パターンの確認）
サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の１つであるｆｒ．４及びそのアルカラーゼ消化物の溶出パターンの確認を以下の条件で行った。その際のクロマト図を図５に示した。
カラム；Cosmosil 5C18-MS-II, Nacalai Tesque (4.6 x 250 mm)
カラム温度；４０℃
検出波長；２３０ｎｍ
分析時間；４０分
移動相；0.1% TFA存在下で10→80％アセトニトリル／30分。30〜35分は80％アセトニトリル-0.1% TFA 。
溶出速度；０．７ｍｌ／ｍｉｎ．【００２９】
実施例６（サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物ｆｒ４及びそのアルカラーゼ消化物のＧＰＣ分析、並びに主要ペプチドのアミノ酸配列の確認）
ｆｒ４又はそのアルカラーゼ消化物５ｍｇに５００μｌの蒸留水を加えて撹拌後、遠心分離（２分, １２０００ｒｐｍ）し、上清を得た。残渣は２００μｌの３０％アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）を加えて撹拌後、同様に遠心分離し上清を回収した。回収した上清は１つにまとめて凍結乾燥(FD-81、EYELA)した。得られたサンプルを以下の条件でゲルろ過カラムにかけ、１分間隔で分取した。各分取物を乾固した後に１００μｌの蒸留水を加えたものを、以下の条件でＨＰＬＣを用いて分析した。その結果、ｆｒ４では分子量５００００以下の成分で構成されると考えられた。その際のクロマト図を、ｆｒ４については図６及び図７に、ｆｒ４のアルカラーゼ消化物については図８及び図９に、それぞれ示した。また、ｆｒ４のアルカラーゼ消化物については、さらにアミノ酸シークエンサー（PPSQ-21,島津）で分析を行い、含まれるピークのアミノ酸配列の確認を行った。その結果を図１０及び表５に示した。
ゲルろ過時の条件
充填材；Superdex Peptide
検出波長；２３０ｎｍ
分析時間；４０分
移動相；３０％アセトニトリル（0.1% TFA含有）
溶出速度；０．５ｍｌ／ｍｉｎ．
分取物のＨＰＬＣによる分析時の条件
カラム；Cosmosil 5C18-MS-II, Nacalai Tesque (4.6 x 250 mm)
カラム温度；４０℃
検出波長；２３０ｎｍ
分析時間；４０分
移動相；0.1% TFA存在下で10→80％アセトニトリル／30分。30〜35分は80％アセトニトリル-0.1% TFA 。
溶出速度；１．０ｍｌ／ｍｉｎ．【００３０】
【表５】
0004834671.tif 000006
【００３１】
実施例７（配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの合成）
ｆｒ４のアルカラーゼ消化物中に含まれるポリペプチドの１つである配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド(YLDNY) を、Fmoc法で合成を行った。アミノ酸保護基はFmoc基を用い、縮合剤やあらかじめ活性化させておいた該当するα−アミノ酸誘導体を用いて順次結合させていった。保護基として用いたFmoc基の除去はピペリジン処理で行った。合成したポリペプチドの確認はＨＰＬＣとＨＰＬＣマスクロマトグラフを用いて行った。その結果を図１１及び図１２に示した。
ＨＰＬＣは以下の条件で行った。
機器；Waters 2690
カラム；Discovery,C18 (4.6 x 250 mm)
検出波長；２１５ｎｍ
分析時間；２０分
移動相；0.1% TFA 0→30％アセトニトリル(0.1%TFA)/20分
溶出速度；１．５ｍｌ／ｍｉｎ．
また、ＨＰＬＣマスクロマトグラフは以下の条件で行った。
機器；HPLC: Agilent 1100 series,マスクロマトグラフ：Thermo Finnigan LCQ
Advantage
カラム；Discovery,C18 (4.6 x 250 mm)
分析時間；０．９５分
移動相；0.1% TFA、アセトニトリル(0.1%TFA)
溶出速度；１．０ｍｌ／ｍｉｎ．【００３２】
実施例８（正常ラットを用いた食用コンドロイチン硫酸ＳＣＰ（マルハ株式会社製）分画物の血清尿酸値低下活性の評価）
サメ軟骨抽出物として食用コンドロイチン硫酸ＳＣＰ（マルハ株式会社製）を実施例３と同様の方法で等電点電気泳動を行い、酸性画分、弱酸性画分、及び塩基性画分に分画（組成比はそれぞれ３８％、２５% 、及び３７% ）したものを被験物質として１ｇ／ｋｇ体重相当量（酸性画分；１×０．３８＝３８０ｍｇ，弱酸性画分；１×０．２５＝２５０ｍｇ，塩基性画分；１×０．３７＝３７０ｍｇ）を、馴化飼育後の７週齢ＳＤ系雌性ラットにゾンデ針を用いて２２日間反復強制経口投与した。飼料はＣＲＦ−１（オリエンタル酵母社製）を、飲料水はつくば市営水道水をともに自由摂取させた。飼育期間終了後、ネンブタール麻酔下で腹大動脈全採血により血液を採取し、市販の尿酸値測定キット（尿酸Ｂテストワコー）を用いて血清尿酸値の評価を行った。その結果、食用コンドロイチン硫酸ＳＣＰの塩基性画分に血清尿酸値低下活性が観察された。評価結果(n=6, 平均±SD, ＊;p＜0.05 vs Vehicle [ANOVA後、Scheff法で検定])を図１３に示す。【００３３】
実施例９（オキソン酸カリウム混餌誘発による高尿酸血症モデルラットを用いたサメ軟骨水抽出物の分画物の酵素消化物の血清尿酸値低下活性の評価）
実施例１と同様の方法で作製したサメ軟骨の水抽出物を等電点電気泳動法により酸性、弱酸性、及び塩基性画分に分画（組成比はそれぞれ６６％、２４% 、及び１０% ）し、それらをアルカラーゼ消化したものを被験物質として１ｇ／ｋｇ体重相当量（酸性画分；１×０．６６＝６６０ｍｇ，弱酸性画分；１×０．２４＝２４０ｍｇ，塩基性画分；１×０．１０＝１００ｍｇ）を、馴化飼育後の７週齢ＳＤ系雌性ラットにゾンデ針を用いて２８日間反復強制経口投与した。飼料は一般の飼育飼料に２．５％オキソン酸カリウムを混合させたものを高尿酸血症誘発飼料とし、自由摂取させた。高尿酸血症誘発飼料組成を表６に示す。飲料水はつくば市営水道水を自由摂取させた。飼育期間終了後、ネンブタール麻酔下で腹大動脈全採血により血液を採取し、市販の尿酸値測定キット（ウリックアシッドテストワコー）を用いて血清尿酸値の評価を行った。その結果、サメ軟骨水抽出物中の塩基性画分に血清尿酸値低下活性が観察された。評価結果(n=6, 平均±SD, ＊＊;p＜0.01, ＊;p＜0.05 vs Vehicle [ANOVA後、Dunnett 法で検定])を図１４に示す。【００３４】
【表６】
0004834671.tif 000007
【００３５】
実施例１０（オキソン酸カリウム腹腔内投与による高尿酸血症モデルラットを用いたサメ軟骨水抽出物の分画物の酵素消化物の血清尿酸値低下活性の評価）
実施例１と同様の方法で作製したサメ軟骨の水抽出物を等電点電気泳動法により酸性、弱酸性、及び塩基性画分に分画（組成比はそれぞれ６６％、２４% 、及び１０% ）し、それらをアルカラーゼ消化したものを被験物質として１ｇ／ｋｇ体重相当量（酸性画分；１×０．６６＝６６０ｍｇ，弱酸性画分；１×０．２４＝２４０ｍｇ，塩基性画分；１×０．１０＝１００ｍｇ）を、馴化飼育後のWistar系雄性ラット（１５０〜２２０ｇ）にゾンデ針を用いて強制経口投与した。その１時間後に高尿酸血症誘発剤としてオキソン酸カリウム／３％アラビアゴム生理食塩水溶液を２５０ｍｇ／ｋｇ体重量を腹腔内に単回投与し、誘発剤投与１時間後にネンブタール麻酔下で腹大動脈より血液を採取した。血液は常法により血清化し、市販の尿酸値測定キット（ウリックアシッドテストワコー）を用いて血清尿酸値の評価を行った。その結果、サメ軟骨水抽出物中の塩基性画分に血清尿酸値低下活性が観察された。評価結果(n=6, 平均±SD, ＊;p＜0.05 vs Vehicle [T-TEST]) を図１５に示す。【００３６】
実施例１１（サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物の血清尿酸値低下活性の評価）
実施例４と同様の方法で作製したサメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物をアルカラーゼ消化後、最も組成比の低いｆｒ４の投与量が５０ｍｇ／ｋｇ体重となるように設定して組成比を基に投与量（表７）を決め、馴化飼育後のWistar系雄性ラット（１５０〜２２０ｇ）にゾンデ針を用いて強制経口投与した。その１時間後に高尿酸血症誘発剤としてオキソン酸カリウム／３％アラビアゴム生理食塩水溶液を２５０ｍｇ／ｋｇ体重量を腹腔内に単回投与し、誘発剤投与１時間後にネンブタール麻酔下で腹大動脈より血液を採取した。血液は常法により血清化し、市販の尿酸値測定キット（ウリックアシッドテストワコー）を用いて血清尿酸値の評価を行った。その結果、逆相カラム吸着画分の１つであるｆｒ４のアルカラーゼ消化物に血清尿酸値低下活性が観察された。評価結果(n=6, 平均±SD, a,b [異符号間で有意] ;p＜0.05 vs Vehicle [ANOVA後、Scheff法で検定])を図１６に示す。尚、比活性は、非誘発群の血清尿酸平均値を０、Vehicle 群の血清尿酸平均値を１００とした時の投与物１ｍｇあたりの％抑制値である。【００３７】
【表７】
0004834671.tif 000008
【００３８】
実施例１２（サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物中に含まれるポリペプチドの血清尿酸値低下活性の評価）
塩基性画分の逆相カラム分画物のアルカラーゼ消化物中に含まれる配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド(YLDNY) 及び配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド(SPPYWPY) を実施例７に示される方法などを用いて合成し、ラットに５ｍｇ／ｋｇ体重量、尾静脈投与した。その直後に高尿酸血症誘発剤としてオキソン酸カリウム／３％アラビアゴム生理食塩水溶液を２５０ｍｇ／ｋｇ体重量を腹腔内に単回投与し、誘発剤投与１時間後にネンブタール麻酔下で腹大動脈より血液を採取した。血液は常法により血清化し、市販の尿酸値測定キット（ウリックアシッドテストワコー）を用いて血清尿酸値の評価を行った。その結果、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド(YLDNY) 及び配列番号３に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド(SPPYWPY) のいずれにも血清尿酸値低下活性が観察された。評価結果(n=8, 平均±SD, ＊;p＜0.05, ＊＊;p＜0.01, ＊＊＊;p＜0.001 vs Vehicle [T-TEST])を図１７に示す。【００３９】
実施例１３（配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド投与血清の尿酸合成酵素の阻害活性の評価）
塩基性画分の逆相カラム分画物のアルカラーゼ消化物中に含まれる配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド(YLDNY) をラットに５ｍｇ／ｋｇ体重量、尾静脈投与し、その１時間後に採取した血液から調製した血清１００μｌを、酵素基質として１５μＭキサンチンを含む５０ｍＭ Tris-HCl Buffer(pH7.4) ２ｍｌに添加したものを反応液とした。それに０．１unit（25units/25mlの酵素溶液を100 μl 添加）の牛乳由来キサンチンオキシダーゼ (XO；wako) を添加して１１分間反応（３７℃下) させた。キサンチンオキシダーゼの作用でキサンチンから生成する尿酸量をＯＤ値（２９２ｎｍ）の変化で評価し、さらにそこから下記の式で酵素活性を算出した。その結果、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド(YLDNY) を投与した血清を添加した場合では、キサンチンオキシダーゼ活性が阻害を受けた。その結果(n=6, 平均±SD, ＊＊;p＜0.01, ＊;p＜0.05 vs Vehicle [T-TEST]) を図１８に示す。尚、アロプリノールは反応液に溶解した。【００４０】
【数１】
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【００４１】
実施例１４（ラット尿酸塩足浮腫法によるサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物の痛風に対する活性の評価）
馴化飼育後のWistar系雄性ラット（２００〜２５０ｇ）に１００ｍｇ／ｋｇ体重量の実施例３と同様の方法で作製したサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物(Vehicle群は大塚注射用水) を強制経口投与した後、エーテル麻酔下で左後肢蹠皮下には０．１ｍｌの１０％尿酸針状結晶生理食塩水溶液を、右後肢蹠皮下には同量の生理食塩水を投与した。その後、左右後肢に生じる浮腫容積の差を両群間で評価したところ、Vehicle 群に対しサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物投与群は有意に低値を示した。その結果(n=6, 平均±SD, ＊;p＜0.05 vs Vehicle [T-TEST]) を図１９に示す。尚、Vehicle 群における左右後肢に生じる浮腫容積の差の平均を１００とした。【００４２】
実施例１５（ラット尿酸針状結晶空気嚢法によるサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物の痛風に対する活性の評価）
馴化飼育後のSD系雄性ラット（１５０〜２００ｇ）に１００ｍｇ／ｋｇ体重量の実施例３と同様の方法で作製したサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物(Vehicle群は大塚注射用水) を６日間強制経口投与した後、エーテル麻酔下で背部皮下に８ｍｌの空気を注入して空気袋を作成した。その２４時間後に再度１００ｍｇ／ｋｇ体重量のサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物(Vehicle群は大塚注射用水) を強制経口投与し、さらに５％尿酸針状結晶／０．５％カルボキシメチルセルロース（０．５％カゼイン含）溶液４ｍｌを上記空気袋内に注入した。尿酸針状結晶投与４日後に空気袋内の滲出液を回収して液量を測定し、Vehicle 群との比較を行った。その結果、Vehicle 群に対しサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物投与群は有意に低値を示した。その結果(n=6, 平均±SD, ＊;p＜0.05 vs Vehicle [T-TEST]) を図２０に示す。尚、Vehicle 群における滲出液量の平均を１００とした。【００４３】
実施例１６（サメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物の固形ガンに対する活性の評価）
マウス由来のガン細胞B16F10メラノーマをBDF1マウスの背部に移植後、３００ｍｇ／ｋｇ体重量の実施例３と同様の方法で作製したサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物(Vehicle群は大塚注射用水) を１４日間反復して腹腔内投与を行った。移植した腫瘍を投与開始から１５日目に摘出してその重量を測定し、投与物の増殖に対する影響を評価した。その結果、Vehicle 群（蒸留水投与）と比較してサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物投与群では腫瘍重量が有意に低値を示した。その結果(n=9, 平均±SD, ＊;p＜0.05 vs Vehicle [T-TEST]) を図２１に示した。尚、Vehicle 群における腫瘍の重量の平均を１００とした。【００４４】
実施例１７（サメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物の転移性ガンに対する活性の評価）
実施例３と同様の方法で作製したサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物を２８日間、３００ｍｇ／ｋｇ体重／日量を強制経口投与し、投与開始１４日目にマウス由来B16F10皮膚ガン細胞をC57BL/6 マウスの尻尾の静脈に移植した。被験物質投与開始から２８日後の肺へのガン転移の程度について検査を行った。その結果、肺に転移したガン（黒い斑点）数はVehicle 群（蒸留水投与）と比較して、サメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物投与群では有意に低値を示した。その結果(n=12,平均±SD, ＊;p＜0.05vs Vehicle [T-TEST]) を図２２に示した。尚、Vehicle 群における転移したガンの数の平均を１００とした。【００４５】
実施例１８（サメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物の動脈硬化症に対する活性の評価）
４週齡のICR 系雄性マウスに４０％牛脂混合高脂肪食を自由摂食させることで誘発した高脂血症モデルマウスに、実施例３と同様の方法で作製したサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物を２８日間、１００ｍｇ／ｋｇ体重／日量を強制経口投与した。投与期間終了後、ネンブタール麻酔下で腹大動脈より全採血し、血液は常法により速やかに血清化した。中性脂肪と総コレステロールの測定を行ったところ、サメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物投与群は、Vehicle 群（蒸留水投与）と比較して有意に低値を示した。高脂血症誘発に用いた高脂肪食の組成を表８に、血清中性脂肪値と血清総コレステロール値の測定結果(n=6, 平均±SD, ＊;p＜0.05 vs Vehicle [T-TEST]) を図２３に示した。【００４６】
【表８】
0004834671.tif 000010
【００４７】
実施例１９（サメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物の脳血管障害抑制活性の評価）
４週齡の、中大脳動脈結紮による脳血管障害モデルラットに、実施例３と同様の方法で作製したサメ軟骨抽出物の塩基性画分のアルカラーゼ消化物を２８日間、１００ｍｇ／ｋｇ体重／日量を強制経口投与させた結果、Vehicle 群（蒸留水投与）と比較して脳梗塞領域率が有意に低値を示した。投与開始２８日後の脳梗塞領域率を比較した結果(n=8, 平均±SD, ＊;p＜0.05 vs Vehicle [T-TEST]) を図２４に示す。尚、Vehicle 群における脳梗塞領域率の平均を１００とした。【００４８】
実施例２０（サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物中に含まれるポリペプチドの特性値）
塩基性画分の逆相カラム分画物のアルカラーゼ消化物中に含まれるポリペプチド２４種類を実施例７に準じた方法により１０〜３００ｍｇ合成し、その特性値を測定した。得られたポリペプチドの分子量、溶解性、及び外観の評価結果を表９に示す。【００４９】
【表９】
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【００５０】
実施例２１（配列番号1に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの血清尿酸値低下活性の評価）
サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物中に含まれる配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（YLDNY）を実施例７に準じた方法により合成し、ラットに５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重量、経口投与した。その１時間後に高尿酸血症誘発剤としてオキソン酸カリウム／３％アラビアゴム生理食塩水溶液を２５０ｍｇ／ｋｇ体重量を腹腔内に単回投与し、誘発剤投与１時間後にネンブタール麻酔下で腹大動脈より血液を採取した。血液は常法により血清化し、日本臨床化学会の勧告法（臨床化学,22,300-307,1993）で血清尿酸値の測定を行った。その結果、血清尿酸値低下活性が観察され、その５０％抑制量（ＩＤ50）は３９．３ｍｇ／ｋｇと算出された。評価結果(n=6, 平均±SD, *;p<0.05 vs 0mg/kg [Dunnett])を図２５に示す。【００５１】
実施例２２（配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの配列の一部からなるペプチドの尿酸合成酵素の阻害活性の評価）
サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物中に含まれる配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（YLDNY）の配列の一部からなるペプチド（YL、LD、DN、NY、YLD、LDN、DNY、YLDN、LDNY）を実施例７に準じた方法により合成し、酵素基質として１５μＭキサンチンを含む50mM Tris-HCl Buffer (pH7.4)１ｍｌに添加したものを反応液とした。それに0.1 unit（25units/25mlの酵素溶液を100μl添加）の牛乳由来キサンチンオキシダーゼ（XO；wako）を添加して１０分間反応（３７℃）させた。キサンチンオキシダーゼの作用でキサンチンから生成する尿酸量をＯＤ値（２９２ｎｍ）の変化で評価し、さらにそこから上記〔数１〕に示す式で酵素活性を算出した。その結果、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（YLDNY）の配列の一部からなるペプチドであるLD、DN、LDN、DNY、YLDN、及びLDNYを添加した場合では、キサンチンオキシダーゼ活性が阻害を受け、その５０％阻害量は、それぞれLD（IC50=1.7×10-3M）、DN（IC50=5.0×10-4M）、LDN（IC50=7.6×10-4M）、DNY（IC50=8.8×10-4M）、YLDN（IC50=1.2×10-3M）、及びLDNY（IC50=7.5×10-4M）と算出された。その結果（n=6, 平均±SD, *;p<0.05 vs control [Dunnett]）を図２６、図２７、及び図２８に示す。【００５２】
実施例２３（配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドの尿酸合成酵素の阻害活性の評価）
サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物中に含まれる配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド（YINY）を実施例７に準じた方法により合成し、酵素基質として１５μＭキサンチンを含む50mM Tris-HCl Buffer (pH7.4) 200μlに添加したものを反応液とした。それに0.1 unit（10 units/100μlの酵素溶液を1μl添加）のバターミルク由来キサンチンオキシダーゼ（XO；wako）を添加して１０分間反応（３７℃）させた。キサンチンオキシダーゼの作用でキサンチンから生成する尿酸量をOD値（292nm）の変化で評価し、さらにそこから上記〔数１〕に示す式で酵素活性を算出した。その結果、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドであるYINYを添加した場合では、キサンチンオキシダーゼ活性が阻害を受け、その５０％阻害量は、IC50=3.7×10-3Mと算出された。その結果（n=6, 平均±SD, *;p<0.05 vs コントロール[Dunnett]）を図２９に示す。【００５３】
実施例２４（サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物中に含まれるポリペプチドの尿酸合成酵素の阻害活性の評価）
サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物中に含まれるポリペプチド（YNL、GYL、INF）を実施例７に準じた方法により合成し、酵素基質として１５μＭキサンチンを含む50mM Tris-HCl Buffer (pH7.4) 200μlに添加したものを反応液とした。それに0.1 unit（10 units/100μlの酵素溶液を1μl添加）のバターミルク由来キサンチンオキシダーゼ（XO；wako）を添加して１０分間反応（37℃）させた。キサンチンオキシダーゼの作用でキサンチンから生成する尿酸量をOD値（292nm）の変化で評価し、さらにそこから上記〔数１〕に示す式で酵素活性を算出した。その結果、サメ軟骨抽出物の塩基性画分の逆相カラム分画物の酵素消化物中に含まれるポリペプチド（YNL、GYL、INF）を添加した場合では、キサンチンオキシダーゼ活性が阻害を受けた。その結果（n=6, 平均±SD, *;p<0.05 vs コントロール[Dunnett]）を図３０に示す。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明によれば、食品、飲料及び医薬の分野で有用な、高尿酸血症を含む成人病の予防及び治療に利用可能な組成物と、該組成物を含有する食品、飲料及び医薬品を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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