(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体上もしくは溶液中に存在する試料からの蛍光を検出する蛍光読み取り装置であり、
平行光を照射する光源と、
前記平行光を整形するとともに、前記試料面上で２次ピンホール像を結像する回折光を生じる励起ピンホールと、
前記励起ピンホールにより整形された平行光を、対物レンズの瞳位置に１次ピンホール像として集光させる投光レンズと、
前記投光レンズによって集光された光を、一定の断面積を有した平行光束の励起光として前記試料へ照射する対物レンズと、
前記試料から発し前記対物レンズを通った蛍光を結像する結像レンズと、
前記結像レンズの結像位置に設けられた受光ピンホールと、
前記受光ピンホールを通った前記蛍光を検出する検出手段と、
を具備したことを特徴とする蛍光読み取り装置。
【請求項２】
前記励起ピンホールは、前記投光レンズの前側焦点位置に設けられたことを特徴とする請求項１に記載の蛍光読み取り装置。
【請求項３】
前記結像レンズの結像位置に作られる像と前記受光ピンホールの大きさがほぼ等しいことを特徴とする請求項１または２に記載の蛍光読み取り装置。
【請求項４】
前記励起ピンホールの形状と前記受光ピンホールの径を変更可能としたことを特徴とする請求項２または３に記載の蛍光読み取り装置。
【請求項５】
前記試料は、核酸または核酸と結合した試薬に結合した蛍光色素からなることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の蛍光読み取り装置。
【請求項６】
前記核酸の少なくとも一部が前記担体上に１つ以上固定化されており、前記核酸と特異的に結合する試薬に蛍光色素が結合していることを特徴とする請求項５に記載の蛍光読み取り装置。
【請求項７】
前記担体上に前記試料が一定間隔で配置されている標本が一定間隔毎に移動し、蛍光の測定と前記標本の移動とを繰り返して複数の前記試料を測定することを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の蛍光読み取り装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、担体上もしくは溶液中に存在する試料からの蛍光を検出する蛍光読み取り装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
この種の装置には、特に検出目的である核酸の特異的な配列の一部に、相補的な配列(以下、プローブ)をガラスやシリコン、プラスチックなどの担体上に固相した、いわゆるＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイの蛍光を測定する装置がある。この装置では、各プローブに蛍光を標識することにより測定が行われる。しかし、ここで検出すべき蛍光量は、他の細胞や組織を検出対象とした蛍光量に比較して非常に微量であることが知られている。
【０００３】
そこで、蛍光量の高感度な検出を行う必要がある。そのための蛍光読み取り装置の原理は、
（１）共焦点/光電子増倍管/スキャンニング方式
（２）冷却ＣＣＤ方式
に大きく分けられる。これらは、それぞれ以下のような特徴がある。
【０００４】
（１）この方式の蛍光読み取り装置は、共焦点レーザー方式によりスキャンニングを行い、主にガラス担体上の核酸の結合反応を検出する用途に用いられる。共焦点方式にて外乱光によるノイズの除去を行い、高測定性能を実現しているが、焦点深度が非常に浅い。一般的な共焦点レーザー方式の焦点深度は対物レンズのＮＡに依存しており、次式によって求められる。
【０００５】
焦点深度＝（０．６×波長）／（ＮＡ）2
例えば、波長６３２ｎｍのレーザーを用いてＮＡ０．３のレンズを使用した場合は、焦点深度は上式から約４μｍとなる。このように非常に狭い深度を有する光学系においては、焦点が合えばノイズのない明瞭な蛍光測光が得られる。しかし、焦点がずれると正確な蛍光量を測定できず、ガラス内部にピントが合うとガラスの自家蛍光をひろい、バックグラウンドが明るくなる。このため、チップ、アレイ側の歪みやたわみなどの影響を受けやすく、チップ、アレイ前面について均一な蛍光面像が得られにくいという懸念がある。
【０００６】
また、この種の最新型の装置では、スキャンニングに同調するオートフォーカシング機能を取り入れ、均一な蛍光面像を得る改良を行っているが、装置の大型化、高価格化という難点がある。
【０００７】
（２）この方式の蛍光読み取り装置は、光源にハロゲンランプを使用し、冷却ＣＣＤを用いており、マイクロアレイシステムを使用して作成したガラス担体のマイクロアレイ上の核酸の結合反応を検出する用途に用いられている。この方式は、（１）の方式に比べて広い範囲を一度に測定できるので、読み取り時間が短い。また、露光時間を変えることにより、蛍光の強いサンプルから弱いサンプルまで幅広く対応することができる、更に、励起光用フィルターを交換することにより、使用する蛍光物質に合わせた励起光が得られるなどの特徴を有している。
【０００８】
しかしながら、実際の測定においては、原理上感度が（１）の方式に劣り、高感度の解析が必要なＳＮＰダイピングや遺伝子発現頻度解析測定においては不十分であるという難点がある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
(1)．現在、分子生物学の分野を中心に用いられているチップやマイクロアレイは、その担体の材質が、ガラス板、シリコン板、ナイロンやニトロセルロース製の多孔質フィルターなど、さまざまである。これらの材料には、いずれも微妙な歪み、たわみ及び自家蛍光が存在する。従って、これらの材質表面上の微量蛍光を測定しようとすると、上記の従来技術では、歪み等により測定面全面について均一な蛍光測光が行えない。
【００１０】
(2)．上記（１）,（２）に示した先行技術は、それぞれ、（１）共焦点レーザー方式を用いているため、合焦時には正確な測定が可能であるが、非合焦点時には読み取り感度が低下する、（２）光電子増倍管とＣＣＤの感度差および測光範囲の差により、ＣＣＤ方式は読み取り感度が低い、という課題を有している。一般に、高感度な蛍光検出を行うためには励起光強度を高くする必要があるが、特に蛍光物質が有機材料の場合、励起光強度が高くなるに伴い、材料の劣化が著しくなる問題もある。
【００１１】
(3)．上記(2)に示した（１），（２）のような課題を克服するために、最新技術においては、オートフォーカス方式を取り入れたり、レーザー適用本数を増加させ、対照測定を行なうことにより補正をする試みがなされている。しかし、これらの方策は装置を大型化し、価格も高価になる傾向がある。また、担体の形状によっては隔壁などの突起があり、オートフォーカスなどの光学系を追加することができない場合もある。
【００１２】
(4)．従来の装置では、焦点を数μｍ移動させただけで蛍光読み取り量が大きく変化し、ノイズ量が大幅に増減するなど、測定条件の設定が容易ではない。
【００１３】
本発明の目的は、測定対象の状態に関わらず均一な蛍光測光が行え、微量蛍光を高感度に検出でき、測定条件の設定を容易にするとともに、装置の小型化を図る蛍光読み取り装置を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
課題を解決し目的を達成するために、本発明の蛍光読み取り装置は以下の如く構成されている。
【００１５】
（１）本発明の蛍光読み取り装置は、担体上もしくは溶液中に存在する試料からの蛍光を検出する蛍光読み取り装置であり、平行光を照射する光源と、前記平行光を整形するとともに、前記試料面上で２次ピンホール像を結像する回折光を生じる励起ピンホールと、前記励起ピンホールにより整形された平行光を、対物レンズの瞳位置に１次ピンホール像として集光させる投光レンズと、前記投光レンズによって集光された光を、一定の断面積を有した平行光束の励起光として前記試料へ照射する対物レンズと、前記試料から発し前記対物レンズを通った蛍光を結像する結像レンズと、前記結像レンズの結像位置に設けられた受光ピンホールと、前記受光ピンホールを通った前記蛍光を検出する検出手段と、を具備する。
【００１６】
（２）本発明の蛍光読み取り装置は上記（１）に記載の装置であり、かつ前記投光レンズの前側焦点位置に設けられ、前記光源から照射された平行光を整形する励起ピンホールを備えている。
【００１７】
（３）本発明の蛍光読み取り装置は上記（１）または（２）に記載の装置であり、かつ前記結像レンズの結像位置に作られる像と前記受光ピンホールの大きさがほぼ等しい。
【００１８】
（４）本発明の蛍光読み取り装置は上記（２）または（３）に記載の装置であり、かつ前記励起ピンホールの形状と前記受光ピンホールの径を変更可能とした。
【００１９】
（５）本発明の蛍光読み取り装置は上記（１）乃至（４）のいずれかに記載の装置であり、かつ前記試料は、核酸または核酸と結合した試薬に結合した蛍光色素からなる。
【００２０】
（６）本発明の蛍光読み取り装置は上記（５）に記載の装置であり、かつ前記核酸の少なくとも一部が前記担体上に１つ以上固定化されており、前記核酸と特異的に結合する試薬に蛍光色素が結合している。
【００２１】
（７）本発明の蛍光読み取り装置は上記（１）乃至（６）のいずれかに記載の装置であり、かつ前記担体上に前記試料が一定間隔で配置されている標本が一定間隔毎に移動し、蛍光の測定と前記標本の移動とを繰り返して複数の前記試料を測定する。
【００２２】
上記手段を講じた結果、それぞれ以下のような作用を奏する。
【００２３】
（１）本発明の蛍光読み取り装置によれば、測定対象のＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイの歪み、たわみ等の平面牲に影響されずに均一な蛍光測光が行える。さらに、核酸の結合反応のような微弱な蛍光しか得られない試料からの微量蛍光を高感度に検出することができ、且つ、試料へ照射する励起光を一定の断面積を有した平行光束とすることで、試料の損傷も防げる光学系をなす。
【００２４】
また、簡易な光学系を採用することにより、小型で安価な装置を構成できる。さらに、対物レンズに対して試料が担体のどちら側に形成されていても測光が可能であり、操作が容易で測定条件が設定しやすい装置を構成できる。
【００２５】
（２）本発明の蛍光読み取り装置によれば、テレセントリックな励起光学系により、試料に対する正確なピント調整が可能となる。
【００２６】
（３）本発明の蛍光読み取り装置によれば、励起光が当たってる試料の面以外から発せられた蛍光や外乱光が光検出手段に到達することを防止できる。
【００２７】
（４）本発明の蛍光読み取り装置によれば、試料の状態や測定目的に応じてピンホールの形状と径を変更できる。
【００２８】
（５）本発明の蛍光読み取り装置によれば、試料からの蛍光を検出することで、蛍光量を測定することができる。
【００２９】
（６）本発明の蛍光読み取り装置によれば、試料からの蛍光を検出することで、目的の核酸が存在するか否かを判定し、また存在した場合にはその蛍光量を測定することができる。
【００３０】
（７）本発明の蛍光読み取り装置によれば、複数の試料に対する走査を高速化することができる。
【００３１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。
【００３２】
図１は、本発明の実施の形態に係る微量蛍光読み取り装置の光学系を示す図であり、図２は図１の一部構成を示す図である。この微量蛍光読み取り装置は、担体上もしくは溶液中に存在する試料からの蛍光を測定、定量する。
【００３３】
図１に示すように、平行光束光源１の光路上には、励起ピンホール５、投光レンズ２、及び波長選択素子（ダイクロイックミラー）７が備えられている。なお、励起ピンホール５はピンホールが設けられた板部材からなり、投光レンズ２の前側焦点位置に設置されている。また、波長選択素子７の反射光路上には、対物レンズ３と担体１０に保持された試料（プローブ）１１とが備えられている。波長選択素子７の透過光路上には、結像レンズ４、受光ピンホール６、及び光検出装置８が備えられている。なお、受光ピンホール６はピンホールが設けられた板部材からなり、結像レンズ４の後側焦点位置に設置されている。
【００３４】
平行光束光源１から照射された平行光は、その一部が励起ピンホール５のピンホールを通り、投光レンズ２を介して波長選択素子７で反射され、対物レンズ３の後焦点位置９付近に集光された後、対物レンズ３を介して担体１０上（もしくは溶液中）の試料１１にテレセントリックに照射される。試料１１から発した蛍光は、対物レンズ３を介して波長選択素子７を透過し、結像レンズ４によって結像され、その結像位置に設置された受光ピンホール６のピンホールを通り、光検出装置８に入射され検出される。
【００３５】
このように本実施の形態の構成では、投光レンズ２の前側焦点位置に励起ピンホール５を設置し、投光レンズ２、対物レンズ３、及び結像レンズ４によって作られる像の大きさと受光ピンホール６の大きさとをほぼ等しくしている。
【００３６】
本実施の形態の構成は、小穴直良光学系と呼ばれる光学系と似ているが、励起光をテレセントリック照明とした点に特徴がある。具体的には、平行光束を励起ピンホール５で整形し、投光レンズ２により対物レンズ３の瞳位置９に１次ピンホール像として集光させることで、試料１１へ照射する励起光を一定の断面積を有した平行光束とする。このとき、図２に示すように、励起ピンホール５で生じた回折光１２が、試料１１面上で２次ピンホール像を作る。この２次ピンホール像により、試料１１のピント位置を知ることができるため、ピント調整を正確に行なえる。
【００３７】
励起光によって励起され試料１１から発した蛍光は、第２次の面光束となり、再び対物レンズ３を通り、結像レンズ４の後焦点位置で３次ピンホール像を作る。この３次ピンホール像とほぼ等しい大きさのピンホールを有する受光ピンホール６を設置することで、励起光が当たってる試料１１の面以外から発せられた蛍光や外乱光が、光検出装置８に到達しないという利点がある。
【００３８】
ただし、担体が自家蛍光を有すると、後述するように本実施の形態における光学系の深い焦点深度により、自家蛍光を拾う問題がある。これは、光検出装置８の前に設置する受光ピンホール６のピンホールが、一般の共焦点光学系で用いられるピンホールに比べて遥かに大きくなることに起因する。一般の共焦点光字系においても、ピンホールを大きくすることで焦点深度を大きくすることは可能であるが、その場合、共焦点光学系の利点が無くなる。
【００３９】
図３は、焦点位置に対する蛍光量の変化を示す図である。本実施の形態では、蛍光は面光源（試料１１）から発しているため、一般的な光学顕微鏡と同等の焦点深度となる。したがって、従来からの問題点であった、チップやマイクロアレイの歪みやたわみの影響により蛍光データが不均一となりやすい点、および焦点合わせなどの測定条件設定が困難な点を解決することができる。しかし、担体に自家蛍光があるとバックグランドノイズとなり、像が全体的に明るくなる。
【００４０】
ところが、バックグランドノイズの光量は、図３に示すようにピントの位置に関わらずほぼ一定の値となっている。このため、あらかじめ試料１１近傍の試料１１の無い部分でバックグランドノイズの光量を測定しておき、その光量を測定された試料の蛍光量から差し引くことで、試料の正確な蛍光量の測定が可能となる。あるいは、試料に関わらず担体１０の材質や形状がある程度一定である場合には、あらかじめバックグランドノイズ量を決めておいて、測定された試料の蛍光量から一律に差し引くようにしてもよい。
【００４１】
また本実施の形態では、励起ピンホール５で生じた回折光１２が、試料１１面上で２次ピンホール像を作っている。これにより、対物レンズ３の試料１１面への焦点合わせを容易に行う事ができる。通常、励起光が試料面に平行光束として照射される場合、焦点合わせが難しいという問題が考えられるが、本実施の形態ではこの問題も解決している。さらに本実施の形態においては、オートフォーカス機構などを追加することなく、焦点合わせの効果が得られるので、小型で低価格な装置を実現できる。
【００４２】
さらに、試料１１への励起光が一定の断面積を有した平行光束であるため、単位面積あたりの励起光強度が共焦点光学系に比べて格段に低く、色素材料の劣化を抑えることができる。これにより、許容できる同程度の劣化状態では共焦点光学系に比べて励起光強度を高くすることができ、蛍光量が増えるため高感度化も可能となる。
【００４３】
本実施の形態の光学系は、励起ピンホール５のピンホール形状、および投光レンズ２の焦点距離と対物レンズ３の焦点距離との組み合わせにより、試料１１面に結像する平行光束の断面積を自由に変更できる。そのため、試料面の平行光束径と光学系の倍率を考慮した励起ピンホール５を設置することで、前述した効果を維持したまま測定の分解能を自由に変更することが可能となる。
【００４４】
また、３次ピンホール像の大きさよりも受光ピンホール６のピンホールの大きさを大きくすると、試料１１からの全蛍光量を光検出装置８で検出することが容易になる。この場合、試料１１を走査しながら測定する時の測光間隔を短くすると、光検出装置８の測光領域と試料１１とが、（ａ）全く重ならない、（ｂ）一部重なる、（ｃ）完全に重なる、の関係になる３つの状態が繰り返し生じる。
【００４５】
ここで（ｃ）の完全に重なる状態では、測光領域内で試料１１がどこに位置していようと、光検出装置８で測光される試料１１からの蛍光量は一定である。よって、測光される蛍光量のプロファイルを解析することで、（ｃ）の状態を容易に把握することが可能となり、（ｃ）の状態で複数測光された蛍光量を平均化することで、ＳＮ比を向上させることが可能となる。
【００４６】
逆に、３次ピンホール像の大きさよりも受光ピンホール６のピンホールの大きさを小さく、またはピンホールの形状を矩形状にすると、試料１１の一部分のみからの蛍光を測光することができるので、順次走査しながら測光する事で試料１１の蛍光分布を画像化し、解析することができる。上記のように励起ピンホール５と受光ピンホール６のピンホールの大きさと形状を、試料１１の状態や測定目的によって変更し、使い分ける事ができる。
【００４７】
本実施の形態における主な測定対象は、担体１０上に試料１１（プローブ）として１つ以上固定化された核酸であり、該核酸と特異的に結合する試薬に蛍光色素が結合している。このため、試料１１からの蛍光を検出することで、目的の核酸が存在するか否かを判定し、また存在した場合にはその蛍光量を測定することができる。
【００４８】
しかし、担体１０上に固定化された核酸は一定の面積を有しており、通常は３μｍ2〜３ｍｍ2程度であり、この試料１１は必ずしも均一に固定化されておらず、不均一な固定がされた場合は、この同種類の試料から発する蛍光量も不均一となってしまう。よって、正確な蛍光量を測定するためには、この試料１１全体を細かく走査して、不均一な蛍光像を更に演算して正確な蛍光量を求める必要がある。しかし、走査を精細にすると、走査に多くの時間が必要となり、効率が悪くなる。
【００４９】
そこで本実施の形態では、３次ピンホール像の大きさよりも受光ピンホール６のピンホールの大きさをわずかに大きくし、全体の蛍光量を一度に測定することで、走査を簡略化している。また、複数に固定化された試料１１は、お互いを区別するために、一定間隔をおいて担体１０上に配置されて標本をなす場合がある。この場合は、励起光を試料１１の位置のみに照射して微量蛍光の測定をした後、担体１０とともに前記標本を前記一定間隔毎移動して次の試料１１を測定することを繰り返すことで、複数の試料１１に対してさらに走査を高速化することも可能である。
【００５０】
また、本実施の形態で使用できる平行光束光源１に制限はないが、よく用いられる光源としてレーザー光源がある。光検出装置８にも制限はないが、高感度な検出を行うためには、フォトマルチメーターやアバランシェフォトダイオードなどが良く用いられる。波長選択素子７も励起光と蛍光を分離することが可能であれば制限はないが、ダイクロイックミラーが良く用いられる。また、テレセントリック光学系は必ずしも完全に正確な構成でなくても、上述の特徴を得ることができるため、試料１１の近傍(±５μｍ程度)の範囲において平行光束が集光されないよう構成すればよい。この場合、平行光束の大きさ（幅）は、３μｍ〜２００μｍとすることが可能であるが、実際には５μｍ〜５０μｍが適切な大きさである。
【００５１】
また本実施の形態では、試料１１が担体１０の上下どちら側に付いても、対物レンズ３に担体１０の厚さを補正したものを用いれば、測光は可能である。この対応は、高い隔壁などを持った担体１０を用い、隔壁の形成されている側に試料が付いている場合などにも好適である。
【００５２】
（実施例）
以下、本発明の実施例を説明する。
【００５３】
本実施例では、図１に示した光学系を用い、微量蛍光読み取り装置を構成した。試料としては、市販のスライドガラス(マツナミガラス社製)上に、プローブとして１９塩基の一本鎖ＤＮＡを、１００ｎＭと１０ｎＭの２種類の濃度で滴下した。滴下、乾燥後のプローブの大きさは、約３５０μｍであった。
【００５４】
このプローブのＤＮＡに相補的な配列を含む１００塩基の一本鎖ＤＮＡの３'末端に、蛍光色素(アマシャムファルマシアバイオテク社製ＣＹ３)を標識した検体を、プローブを固定したスライドガラスと共に６０℃の温度で１時間反応させた。反応後、純水で洗浄、乾燥したスライドガラスを測定した。
【００５５】
図４は、本実施例の測定結果を示す図である。本実施例では、プローブが固定されているスライドガラスＳの中の幅２０ｍｍ、長さ６０ｍｍの部分を測定している。図４に示すように、測定範囲全面に渡り、均一で明瞭な蛍光像が観察される。すなわち、本発明の特徴である、チップやマイクロアレイの歪みやたわみの影響を受けず、均一な蛍光観察が可能であり、測定走査が容易で感度が高い微量蛍光読み取り装置が実現されている。また、本発明の微量蛍光読み取り装置は、構成が簡単で、安価に構成できることも特徴である。
【００５６】
また、本実施例の比較例として、市販の共焦点検出器（Packard  BioChip  Technologies製品  ＳｃａｎＡｒｒａｙ４０００ＸＬ）により試料の測定を行った。試料は上記実施例と同じものを用いた。
【００５７】
図５は、比較例の測定結果を示す図である。図５に示すように、平坦に見えるスライドガラスＳであっても、広い測定範囲内での僅かなゆがみにより、測定できない部分（右上部分等）が顕著に現われる。これでは正確な検査を行うことはできない。よって、この図５の比較例と比べて、図４に示した本発明による微量蛍光読み取り装置の効果は明白である。
【００５８】
なお、本発明は上記実施の形態のみに限定されず、要旨を変更しない範囲で適宜変形して実施できる。本発明による蛍光読み取りは、上記の試料だけを対象としたものではなく、測定対象を限定するものではない。
【００５９】
【発明の効果】
本発明の蛍光読み取り装置によれば、一定の断面積を有した平行光束の励起光を試料に対し照射するので、均一な蛍光測光が実施できる。また、焦点深度が深いため、取得できる蛍光量が多く、バックグラウンドノイズの影響も受け難いことから、微量蛍光を高感度に検出することができ、ＳＮ比が向上する。
【００６０】
さらに、光学系が簡易であるため、装置を小型で安価に設計製作することが可能である。また、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイをステージ等に設置するだけで、厳密な合焦点を必要としないため、合焦操作や測定の条件設定が簡易である。また、担体の形状を選ばずに測定を行える。また、励起光に平行光を用いることから、試料の大きな面や単位面積当たりに対する励起光の密度が少なくなるため、蛍光色素の劣化が少なくなる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施の形態に係る微量蛍光読み取り装置の光学系を示す図。
【図２】本発明の実施の形態に係る光学系の一部構成を示す図。
【図３】本発明の実施の形態に係る焦点位置に対する蛍光量の変化を示す図。
【図４】本発明の実施例に係る測定結果を示す図。
【図５】本発明の比較例に係る測定結果を示す図。
【符号の説明】
１…平行光束光源
２…投光レンズ
３…対物レンズ
４…結像レンズ
５…励起ピンホール
６…受光ピンホール
７…波長選択素子
８…光検出装置
９…焦点位置
１０…担体
１１…試料
１２…回折光
Ｓ…スライドガラス
【図１】
0004834242.tif 000002
【図２】
0004834242.tif 000003
【図３】
0004834242.tif 000004
【図４】
0004834242.tif 000005
【図５】
0004834242.tif 000006