(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分がフルボ酸またはその塩からなる医薬組成物であって、ヒト及び動物から選択される対象において、炎症、アクネ、湿疹、若しくはウイルス感染症、またはその組合わせの処置に用いる医薬組成物。
【請求項２】
組成物が、対象に経口または局所投与するためのものである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
組成物が、局所投与に適した液剤、パスタ剤、軟膏剤、散剤または他の剤形で提供される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
フルボ酸またはその塩が、オキシフルボ酸またはその塩である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
オキシフルボ酸またはその塩が、下記の官能基分析値をもつ、請求項４に記載の医薬組成物：
全酸基：            １１．５〜１５．５ｍｅｑ／ｇ
カルボキシル基：    ８．５〜１２．５ｍｅｑ／ｇ
フェノール性基：    ２．３〜３．７ｍｅｑ／ｇ。
【請求項６】
ヒト及び動物から選択される対象における、炎症、アクネ、湿疹、若しくはウイルス感染症、またはその組合わせの処置に用いるための医薬の製造における、フルボ酸またはその塩の使用。
【請求項７】
医薬が経口または局所投与用である、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
フルボ酸またはその塩が、オキシフルボ酸またはその塩である、請求項６または７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、フルボ酸（ｆｕｌｖｉｃ  ａｃｉｄ）、および種々の状態の処置におけるその使用に関する。
【０００２】
腐植物質は遍在性であり、環境中で植物および動物の残骸の腐植により生成する（ＭａｃＣａｒｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。これらの物質は、ｐＨの関数としての水中溶解度に基づいて、フミン酸、フルボ酸およびフミンに分けることができる。フルボ酸は、すべてのｐＨ条件下で水溶性であり、一般にフミン酸より分子サイズおよび分子量が小さくかつ色濃度が低い画分である。
【０００３】
腐植物質は一般に河川水中の溶存有機炭素濃度の５０％を占め、そのうち９０〜９５％はフルボ酸である。土中ではフミン酸がフルボ酸より３〜５倍多く（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，１９８２）、これに対し水中ではフルボ酸がフミン酸より９〜１０倍多い（Ｍａｌｃｏｌｍ，１９８５）。
【０００４】
フミン酸は下記の治療に有効に用いられている：
（ｉ）ヒトにおける胃酸過多症その他の胃障害（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ，１９６６；Ｇｒａｍｓｃｈ，１９６１）
（ｉｉ）炎症（Ｓａｌｚ，１９７４；Ｍｏｔｏｈｉｓａ  ｅｔ  ａｌ．，１９７４）
（ｉｉｉ）貧血症および高コレステロール血症（Ｓｏｌｏｖｅｙｖａ  ａｎｄ  Ｌｏｔｏｓｈ，１９８４）
（ｉｖ）フォン−ウィルブランド病（Ｌｏｐｅｚ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
【０００５】
フルボ酸をヒトおよび動物の疾病の処置に使用する可能性については、これまで調べられていなかった。
Ｗａｎｇ  ら（１９９６）は、フルボ酸と活性酸素フリーラジカルの相互作用を調べ、ピート由来のフルボ酸がスーパーオキシドおよびヒドロキシルラジカルを両方とも捕捉しうることを見出した。塩素処理水中にみられる高変異原性フラノンおよびインビトロ反転ラット腸嚢系を用いて、フルボ酸がラット小腸からの変異原物質の吸収を阻害することも示された（Ｃｌａｒｋ  ａｎｄ  Ｃｈｉｐｍａｎ，１９９５）。
【０００６】
中国のある地域で飲料水中にフルボ酸が含まれることがカシン−ベック病（Ｋａｓｈｉｎ−Ｂｅｃｋ  ｄｉｓｅａｓｅ）と関係するが、これはセレン欠乏食と関連して起きるにすぎない（Ｐｅｎｇ  ａｎｄ  Ｘｕ，１９８７）。
【０００７】
ＵＳＰ４，９９９，２０２および５，２０４，３６８には、フルボ酸、その塩または誘導体を有効成分として含む、殺菌性および静菌性をもつ組成物が開示されている。これらの組成物は消毒剤として有用であると記載されている。
【０００８】
発明の概要
本発明の１態様によれば、フルボ酸、その塩、エステルまたは誘導体を有効成分として含む医薬組成物が提供される。
【０００９】
本発明の医薬組成物は、対象に経口または局所投与するためのものとして提供できる。
局所投与の場合、組成物は局所投与に適した液剤、パスタ剤、軟膏剤、散剤または他の剤形で提供できる。
【００１０】
対象はヒトまたは動物であってよい。
さらに本発明によれば、対象の状態の処置における、フルボ酸、その塩、エステルまたは誘導体の使用が提供される。状態は、たとえば炎症、アクネ、湿疹、または細菌もしくは真菌もしくはウイルス感染症であってよい。
【００１１】
状態の処置は、経口または局所投与によるものであってよい。
対象は一般にヒトまたは動物である。
フルボ酸は、ＵＳＰ４，９１２，２５６に記載された種類の湿式石炭酸化法により誘導されるフルボ酸であることが好ましい。このようなフルボ酸を、以下において”オキシフルボ酸またはＯＦＡ”と呼ぶ。
【００１２】
Ｂｅｒｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）は、オキシフルボ酸中にほぼ５０種類の異なる化合物を同定した。それらの大部分がカルボン酸であった。それらの化合物は大部分が通常の生理的代謝産物であり、生成物混合物中に有毒化合物は証明されなかった。
【００１３】
オキシフルボ酸の典型的な官能基分析値を以下に示す：
全酸基：            １１．５〜１５．５ｍｅｑ／ｇ
カルボキシル基：    ８．５〜１２．５ｍｅｑ／ｇ
フェノール性基：    ２．３〜３．７ｍｅｑ／ｇ。
【００１４】
本発明の一例において、ヒトまたは動物に局所適用するための組成物は、水性クリーム剤中に４．５％または９．０％（質量）のオキシフルボ酸を含む。
好ましい態様の説明
本発明を実施するに際し、有効成分はフルボ酸、その塩、エステルまたは誘導体である。前記のような好ましい官能基分析値をもつオキシフルボ酸について、多数のインビトロおよびインビボ試験を行った。これらを以下に記載する。
【００１５】
オキシフルボ酸がインビトロで免疫機能に及ぼす作用
オキシフルボ酸がヒト好中球によるオキシダント産生に及ぼす作用
ヒト好中球（Ｆｉｃｏｌｌで分離）をオキシフルボ酸（１２．５および２５ｕｇ／ｍｌ）により、３７℃で１５分間処理した。これらの細胞をＰＭＡ（ミリスチン酸酢酸ホルボール）（２０ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、フェリシトクロムＣ（１ｍＭ）のスーパーオキシド阻害性還元を測定することにより、スーパーオキシド産生を判定した。試験した両濃度で、有意のスーパーオキシド産生阻害がみられた（表１）。
【００１６】
【表１】
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【００１７】
スーパーオキシドを発生するヒポキサンチン（１ｍＭ）／キサンチン−オキシダーゼ（１００ｍＵ／ｍｌ）酵素系を用いて、オキシフルボ酸（２５ｕｇ／ｍｌ）のスーパーオキシド捕捉活性を判定した。オキシフルボ酸はスーパーオキシド捕捉活性を示した（表２）。
【００１８】
【表２】
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【００１９】
オキシフルボ酸が混合リンパ球培養物の増殖応答に及ぼす作用
これらの実験は、異なる２ドナーのリンパ球を被験薬の系列希釈液の存在下および不存在下の両方で７日間同時培養することにより行われた。オキシフルボ酸は細胞増殖の用量関連阻害を生じた（図１）。
【００２０】
オキシフルボ酸がヒトリンパ球によるインターロイキン２（ＩＬ−２）産生に及ぼす作用
フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激したヒトリンパ球培養物を６０、８０および１００μｇ／ｍｌのオキシフルボ酸で２日間処理した後、細胞を遠心分離し、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｌｃ，英国バッキンガムシャー）からのＢｉｏｔｒａｋ  ＴＭヒトインターロイキン２  ＥＬＩＳＡ系を用いて上清のＩＬ−２レベルをアッセイした。
【００２１】
オキシフルボ酸は、試験した３種類すべての濃度で刺激リンパ球によるＩＬ−２産生を統計的に有意に低下させた（図２）。
インビボでの抗炎症性化合物としてのオキシフルボ酸の評価
１．ジニトロフルオロベンゼン感作マウスにおける評価
５０匹のＢＡＬＢ  Ｃ雌マウス（６〜７週令）を用い、Ｒｈｅｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）記載の方法に従って、２，４−ジニトロ−１−フルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）感作マウスにおけるオキシフルボ酸（４．５および９％クリーム剤、局所適用）の作用を評価した。マウスを剃毛腹部へのＤＮＦＢ適用により感作し、５群に分け、６日後に右耳を攻撃した。各群のマウスの炎症した耳を下記のいずれかのクリーム剤で２日間局所治療した：対照クリーム剤、オキシフルボ酸４．５％、オキシフルボ酸９％、ジクロフェナク（ｄｉｃｈｌｏｐｈｅｎａｃ）ナトリウム１％（Ｖｏｌｔａｒｅｎ  Ｅｍｕｌｇｅｌ、登録商標）およびベタメタゾン０．１％（Ｂｅｔｎｏｖａｔｅ、登録商標）。攻撃の前、ならびにその２４および４８時間後に、耳の厚みをクロックゲージで測定した。
【００２２】
４種類の処置すべてが、両日とも炎症を有意に軽減させた（図３）。これらの結果は、マウスを殺し、罹患した耳をパラフィンろうに包埋した後、顕微鏡により確認された。
【００２３】
２種類のオキシフルボ酸クリーム剤で２日間処置した間に、毒性の徴候はみられなかった。
異なる操作から採取したオキシフルボ酸バッチ（９８１０００５５および９８１１００６７）および同じ連続操作から連日採取した異なるバッチ（９９０３００８６〜９９０３００８９）から得たクリーム剤間の変動の可能性を調べるための実験も行った。この試験では、１群当たり５匹のマウス７群を用いた。第１群を対照クリーム剤で処置し、一方、他の６群を前記６種類の９％オキシフルボ酸クリーム剤で処置した。この実験の結果を図４に示す。
【００２４】
この場合も、６種類のオキシフルボ酸クリーム剤で２日間処置した間に、毒性の徴候はみられなかった。
前記実験と同様な結果が得られた。この場合も、オキシフルボ酸はこのモデルの炎症を統計的に有意に阻害した。異なるオキシフルボ酸クリーム剤を用いて得た結果について、分散分析（２元ＡＮＯＶＡ）を行った。Ｐ値は、１日目については０．１３１、２日目については０．７６１である。したがって、試験した各種試料間に有意差はなかった。
【００２５】
２（ａ）．ネコおよびイヌにおける化膿性外傷性皮膚炎の評価
この試験は、Ｄｒ．Ｏ．Ｊ．Ｂｏｔｈａ（Ｈａｔｆｉｅｌｄ  Ｂｉｒｄ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，プレトリア）により行われた。１０臨床例が試験に用いられた。この試験に適性であるためには、動物の皮膚に下記の事象がなければならなかった：膨疹、紅斑、心因性掻痒および化膿。処置前に、病変部を軽度、中等度、または重度に分類した。試験中には他の処置を行わなかった。所有者に９％オキシフルボ酸クリーム剤を供給し、そのクリーム剤を罹患部に１日２回適用するように指示した。この処置を７日間続けなければならなかった。所有者に処置開始のちょうど７日後に再来するように依頼し、各症例を再び臨床評価し、生検および写真撮影した。
【００２６】
後記の組織病理学的検査から分かるように、試験した１０症例すべてにおいて臨床的にも病理学的にも炎症軽減がみられた。いずれの症例にも副作用は認められなかった。大部分の場合、病変部の消炎は完全であり、再発しないことが認められた。慢性かつ持続的症例と記載した１例のみにおいて、所有者はそのイヌがまだひどく掻きむしるので、３日後に再来した。そこで即効性コルチゾンを投与たところ、イヌは好ましい反応を示した。この試験で得られた典型的な例が図５にみられる。これらの写真は、左上腕内側に病変部をもつダルマシアン犬の処置前および後に撮影された。処置前（図５Ａ）には重度の膨疹、紅斑および化膿が認められたのに対し、処置後（図５Ｂ）には紅斑および化膿がなく、ごくわずかに残る膨疹のみが認められた。さらに、１回目の生検の生検病変は完全に治癒していた。
【００２７】
２（ｂ）．組織病理学的検査：皮膚生検：臨床試験：局所軟膏剤−９％フルボ酸クリーム剤
方法：
アレルギー性皮膚炎および湿疹の病変をもつ臨床例を、表３に示す各種動物において確認した。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
約３ｍｍの対照病変（処置前）の生検試料を採集し、ホルマリンに固定し、処置後に先の生検部位にできるだけ近い部位で生検を続けた。
ホルマリン固定した皮膚生検試料を組織学的試験に用いられる標準的ルーティン法に従って処理し、パラフィンろうに包埋し、各６μｍの切片を調製した。すべての切片をヘマトキシリンおよびエオシン染色法で着色した。
【００３０】
組織病理学的所見：
組織病理学的所見を表４に示す。対照試料をまず個々の形態学的病変について調べ、これらを表４に示すように等級づけした。処置病変の生検試料を同様に評価した。
【００３１】
個々の病因および形態学的変化は症例毎に異なるので、各症例の各病変はその元の対照病変と比較できるにすぎないということを留意すべきである。
【００３２】
【表４】
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【００３３】
【表５】
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【００３４】
結論：
これらの結果は、組織病理学的所見にすぎないと解釈すべきである。これらの結果を、処置した病変の臨床所見に加えて提示する。
【００３５】
一般に、前記の制限を考慮した上で、処置病変では治癒が促進され、炎症が軽減したように思われる。
表面（浅い）滲出性皮膚炎（急性炎症）は、確実にすべての症例で治癒促進を示した。肥厚性表皮（表皮肥厚症）は慢性状態であり、したがって処置に際してほとんど変化を示さなかった。処置病変１例を除くすべてにおいて、元の未処置病変と比較して皮膚の炎症度も軽減した。
【００３６】
処置病変と同じ期間、未処置のまま放置した対照または病変は、無かった。したがって、これらの結果を解釈する際に、関与因子として自然治癒を排除することはできない。
【００３７】
実験動物における毒性試験
急性および慢性毒性試験を行って、これによりオキシフルボ酸の安全性およびきわめて低い毒性を証明した。
【００３８】
急性経口および経皮毒性試験、急性皮膚および眼刺激試験、皮膚感作試験、ならびに亜慢性経口および経皮毒性試験を行い、オキシフルボ酸液剤（２５．４％濃縮液剤）およびオキシフルボ酸クリーム剤（この場合、５．３３％のオキシフルボ酸を含有するように配合）を評価した。これらの試験の結果を表５および６にまとめる。
【００３９】
【表６】
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【００４０】
【表７】
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【００４１】
考察
これらのデータは、本発明製品がいずれも急性経皮または経口暴露試験に際して測定可能な毒性を生じなかったことを示す。
【００４２】
亜慢性経口および経皮毒性試験に際しては、両物質ともきわめて高い用量を用いた。オキシフルボ酸試験では、動物に１０００ｍｇ／ｋｇ／日の有効物質を投与した。５．３３％オキシフルボ酸クリーム剤を、ラットの皮膚に１０００ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で９０日間適用した。異常な臨床徴候は認められず、試験中に死亡した動物もなかった。被験物質を適用した動物の臨床病理状態および体重の変化は比較的小さかった。
【００４３】
オキシフルボ酸の抗微生物性
オキシフルボ酸液剤（フルボ酸２５．４質量％）および４．５質量％オキシフルボ酸クリーム剤の抗微生物性を、周知の多数の病原体についてインビトロで評価した。得られた結果を表７および８に示す。記号＋は増殖、記号−は非増殖を表す。
【００４４】
【表８】
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【００４５】
【表９】
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【００４６】
さらに、４．５％オキシフルボ酸クリーム剤および２５．４質量％オキシフルボ酸液剤が細菌および真菌の増殖を阻害する効力を、数種類の被験生物についてＳＡＢＳ法７３０（インビトロ）に従って調べた。得られた結果を表９に示す。
【００４７】
【表１０】
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【００４８】
以上の試験から、オキシフルボ酸はクリーム剤中に配合した場合ですら、ある被験生物に対してある程度の抗微生物活性または静菌もしくは静真菌効力を示すことが分かる。
【００４９】
４．５％オキシフルボ酸クリーム剤についてＳＡＢＳ微生物学部門で防腐効力試験を行い、このクリーム剤がＵＳＰ  ２３（１９９５）の要求を満たすことが認められた。
【００５０】
オキシフルボ酸の抗ウイルス活性
方法：
下記のウイルスについて試験した：
ヒト単純ヘルペスウイルス１型
ヒトアデノウイルス２型
サルロタウイルスＳＡ１１
ポリオウイルス１型Ｓａｂｉｎワクチン株
コクサッキーＢウイルス１型実験室株
コクサッキーＡウイルス９型実験室単離株
ウイルスをベルベットモンキー腎細胞または原発性肝癌細胞系（ＰＬＣ／ＰＲＦ／５）中で増殖させた。ウイルス懸濁原液をタイトレートしてそれらの力価を確認し、１００×５０％組織培養感染用量（１００ＴＣＩＤ50）／２００μｌを含有するウイルス懸濁液を調製した。
【００５１】
宿主細胞へのウイルス結合の阻害：９６ウェルミクロタイタートレー中の適切な単層細胞培養物を、無血清ＭＥＭ中で最低１時間洗浄して飢餓状態にした。飢餓処理後、無血清ＭＥＭ中のオキシフルボ酸２倍希釈液を１００ＴＣＩＤ50のウイルスと共に各ウェルに添加した。ミクロタイタートレーを３７℃でインキュベートし、毎日、７日間、ＣＰＥを調べた。１００ＴＣＩＤ50のウイルスを接種したオキシフルボ酸無添加ウェルを、陽性対照として用いた。ＣＰＥの発現は結合阻害が起きなかったことを示す。
【００５２】
宿主細胞におけるウイルス複製の阻害：９６ウェルミクロタイタートレー中の適切な単層細胞培養物を、無血清ＭＥＭ中で最低１時間洗浄して飢餓状態にした。飢餓処理後、１００ＴＣＩＤ50のウイルスをすべてのウェルに添加し、１〜２時間吸着させた。吸着後、吸着していないウイルスを無血清ＭＥＭを用いてウェルから洗い去った。次いで無血清ＭＥＭ中のオキシフルボ酸２倍希釈液を適切なウェルに添加した。ミクロタイタートレーを３７℃でインキュベートし、毎日、７日間、ＣＰＥを調べた。１００ＴＣＩＤ50のウイルスを接種したオキシフルボ酸無添加ウェルを、陽性対照として用いた。ＣＰＥの発現はウイルス複製阻害が起きなかったことを示す。
【００５３】
結果：
オキシフルボ酸が宿主細胞へのウイルス結合およびウイルスの複製に及ぼす作用は、表１０Ａおよび１０Ｂにみられる。
【００５４】
【表１１】
0004700808.tif 000012
【００５５】
【表１２】
0004700808.tif 000013
【００５６】
考察
オキシフルボ酸は１．８７〜３．７５ｍｇ／ｍｌで６種類の被験ウイルス培養物の結合を阻害したのに対し、ウイルスの複製は０．４６９〜３．７５ｍｇ／ｍｌの濃度で阻害された。サルロタウイルスＳＡ１１の場合、ウイルス複製の限定阻害は０．１０３ｍｇ／ｍｌという低い濃度で認められた。
【００５７】
したがってオキシフルボ酸は、
ｉ）好中球由来の前炎症反応性オキシダントであるスーパーオキシドを捕捉する；
ｉｉ）リンパ球由来の前炎症性サイトカインＩＬ−２の産生を低下させる；
ｉｉｉ）移植臓器拒絶反応に典型的な混合リンパ球反応を阻害する；
ｉｖ）グラム陽性、グラム陰性、ならびに真菌性およびウイルス性のヒト病原体に対してインビトロ活性をもつ；
ｖ）ジニトロフルオロベンゼン感作マウスにおいて誘発された接触過敏反応を、ジクロフェナクナトリウムおよびベタメタゾンなど一般に用いられる抗炎症薬と同程度に有効に阻害する（ただしこれら２薬剤は、著しい不都合な副作用を伴う）；
ｖｉ）ネコおよびイヌにおいて化膿性外傷性皮膚炎に対するインビボ抗炎症活性をもつ；
ｖｉｉ）実験動物における毒性がきわめて低い
化合物である。
【００５８】
参考文献
【００５９】
【表１３】
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【００６０】
【表１４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、オキシフルボ酸について実施した特定の試験の結果をグラフで示す。
【図２】  図２は、オキシフルボ酸について実施した特定の試験の結果をグラフで示す。
【図３】  図３は、オキシフルボ酸について実施した特定の試験の結果をグラフで示す。
【図４】  図４は、オキシフルボ酸について実施した特定の試験の結果をグラフで示す。
【図５】  図５ＡおよびＢは、本発明のオキシフルボ酸クリーム剤を用いて化膿性外傷性皮膚炎を治療した結果を写真で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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