(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
金属標識可能なペプチド及び医薬品添加物として許容されうる塩基性有機化合物を含有することを特徴する医療用組成物であって、
金属標識可能なペプチドは、化学式（１）
（化１）
Ｚ-Ｙ-Ｌｅｕ-Ｐｈｅ-(Ｘ)ｎ-Ｌｙｓ（ＮＨ２）ｍ-ε（-（Ｒ）ｏ-（Ｔ）ｌ-Ｕ）（１）
（式（１）中、
Ｚはアミノ基の保護基を表し；
ＹはＭｅｔまたはＮｌｅを表し；
（Ｘ）ｎにおいて、Ｘは１個もしくはそれ以上のアミノ酸又は有機合成可能な化合物よりなるスペーサー、ｎは１または０を表し；
（ＮＨ２）ｍにおいて、ＮＨ２はＬｙｓのα位のカルボキシル基の保護基としてのアミド基、ｍは１または０を表し；
ε（-（Ｒ）ｏ-（Ｔ）ｌ-Ｕ）において、Ｒは、Ｌｙｓのε-アミノ基にアミド結合したＳｅｒまたはＴｈｒ、ｏは１または０、Ｔは、１個もしくはそれ以上のアミノ酸又は有機合成可能な化合物よりなるスペーサー、ｌは１または０、Ｕは、金属標識可能なトリペプチド、ジペプチドメルカプトアシレート、炭素数８から２０の窒素含有環状化合物、炭素数８から２０の窒素含有環状カルボン酸化合物、炭素数８から２０の窒素含有環状カルボン酸化合物の誘導体及び炭素数４から１０のアルキレンアミンカルボン酸から選択される金属標識可能な基を表す；
但し、ＸとＴは同じでも異なっていてもよい）
で表される化合物であり、及び
塩基性有機化合物は、塩基性アミノ酸又はイミダゾール環を有する塩基性化合物である、
医療用組成物。
【請求項２】
塩基性アミノ酸が、アルギニン、ヒスチジン及びリジンから選択される１種以上である、請求項１記載の医療用組成物。
【請求項３】
イミダゾール環を有する塩基性化合物がイミダゾールである請求項１記載の医療用組成物。
【請求項４】
金属標識可能なペプチドが診断薬もしくは治療用医薬品の有効成分として利用可能なペプチドである請求項１〜３のいずれか一項に記載の医療用組成物。
【請求項５】
金属標識可能なペプチドがアミノ酸３０残基以下又は分子量４５００以下である請求項１〜４のいずれか一項に記載の医療用組成物。
【請求項６】
金属標識可能なペプチドが白血球結合性化合物である請求項１〜５のいずれか一項に記載の医療用組成物。
【請求項７】
化学式（１）中、Ｕが、-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ａｓｐ、-Ｃｙｓ-Ａｓｐ-Ａｓｐ、-Ｃｙｓ-Ａｓｐ-Ｇｌｙ、-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｇｌｕ、-Ｃｙｓ-Ｇｌｕ-Ｇｌｕ、-Ｃｙｓ-Ｇｌｕ-Ｇｌｙ、-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ａｓｎ、-Ｃｙｓ-Ａｓｎ-Ａｓｎ、-Ｃｙｓ-Ａｓｎ-Ｇｌｙ、-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｇｌｎ、-Ｃｙｓ-Ｇｌｎ-Ｇｌｎ、-Ｃｙｓ-Ｇｌｎ-Ｇｌｙ、-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ｌｙｓ、-Ｃｙｓ-Ｌｙｓ-Ｌｙｓ、-Ｃｙｓ-Ｌｙｓ-Ｇｌｙ、-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ａｒｇ、-Ｃｙｓ-Ａｒｇ-Ａｒｇ、-Ｃｙｓ-Ａｒｇ-Ｇｌｙ、-Ａｓｐ-Ａｓｐ-メルカプトアセチル、-Ｇｌｙ-Ａｓｐ-メルカプトアセチル、-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-メルカプトアセチル、１，４，７，１０-テトラアザシクロドデカン（Ｃｙｃｌｅｎ）、１，４，８，１１-テトラアザシクロテトラデカン（Ｃｙｃｌａｍ）、１，４，８，１２-テトラアザシクロペンタデカン、１，４，８，１１-テトラアザシクロテトラデカン-５，７-ジオン（Ｄｉｏｘｏｃｙｃａｍ）、１，４，８，１１-テトラアザシクロテトラデカン-１，４，８，１１-テトラ酢酸（ＴＥＴＡ）、１，４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-N,N’,N”,N”’-テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，８，１１-テトラアザシクロテトラデカン-５，７-ジオン-N,N’,N”,N”’-テトラ酢酸、１，４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-酪酸、１，４，８，１０-テトラアザシクロドデカン-酪酸、１，４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-１-アミノエチルカルバモイルメチル-４，７，１０-トリス〔Ｒ，Ｓ〕-メチル酢酸（ＤＯ３ＭＡ）、１，４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-１，４，７，１０−α, α’, α’’, α’’’-テトラメチル酢酸（ＤＯＴＭＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(ＤＴＰＡ)、トリエチレンテトラミンヘキサ酢酸及びエチレングリコール-（２-アミノエチル）-N, N, N’, N’-テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）から選択される金属標識可能な基である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医療用組成物。
【請求項８】
化学式（１）中、Ｚがホルミル基である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医療用組成物。
【請求項９】
金属標識可能なペプチドが、
Ｎ-ホルミル-Ｎｌｅ-Ｌｅｕ-Ｐｈｅ-Ｎｌｅ-Ｔｙｒ-Ｌｙｓ（ＮＨ２）-ε（-Ｓｅｒ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ａｓｎ）、
Ｎ-ホルミル-Ｎｌｅ-Ｌｅｕ-Ｐｈｅ-Ｎｌｅ-Ｔｙｒ-Ｌｙｓ（ＮＨ２）-ε（-Ｓｅｒ-Ｃｙｓ-Ｇｌｙ-Ａｓｐ）、
Ｎ-ホルミル-Ｎｌｅ-Ｌｅｕ-Ｐｈｅ-Ｎｌｅ-Ｔｙｒ-Ｌｙｓ-ε（-Ｓｅｒ-Ｃｙｓ-Ａｓｐ-Ａｓｐ）、
Ｎ-ホルミル-Ｎｌｅ-Ｌｅｕ-Ｐｈｅ-Ｎｌｅ-Ｔｙｒ-Ｌｙｓ（ＮＨ２）-ε（-Ｓｅｒ-Ｄ-Ａｒｇ-Ａｓｐ-Ｃｙｓ-Ａｓｐ-Ａｓｐ）、
Ｎ-ホルミル-Ｎｌｅ-Ｌｅｕ-Ｐｈｅ-Ｎｌｅ-Ｔｙｒ-Ｌｙｓ（ＮＨ2）-ε（-Ｓｅｒ-Ｄ-Ａｒｇ-ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ））、
Ｎ-ホルミル-Ｍｅｔ-Ｌｅｕ-Ｐｈｅ-Ｌｙｓ-ε（-Ａｓｐ-Ａｓｐ-メルカプトアセチル）、
Ｎ-ホルミル-Ｍｅｔ-Ｌｅｕ-Ｐｈｅ-Ｌｙｓ-ε（-Ｇｌｙ-Ａｓｐ-メルカプトアセチル）、及び
Ｎ-ホルミル-Ｍｅｔ-Ｌｅｕ-Ｐｈｅ-Ｌｙｓ-ε（-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-メルカプトアセチル）から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医療用組成物。
【請求項１０】
還元剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、親水性有機溶媒及び安定化剤から選ばれる１種以上の添加剤を含有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医療用組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医療用組成物を凍結乾燥することによって得られることを特徴とする凍結乾燥した医療用組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医療用組成物における金属標識可能なペプチドを金属で標識することにより得られることを特徴とする医療用製剤。
【請求項１３】
金属が放射性金属又は常磁性金属である請求項１２記載の医療用製剤。
【請求項１４】
放射性金属が、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｇａ−６７、Ｙ−９０、Ｓｎ−１１７ｍ、Ｓｍ−１５３、Ｒｅ−１８６及びＲｅ−１８８から選択される、請求項１３記載の医療用製剤。
【請求項１５】
常磁性金属が、Ｇｄ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｕ及びＤｙから選択される、請求項１３記載の医療用製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属標識可能なペプチドの水溶性及び金属標識効率が改善された、金属標識可能なペプチドを含有する医療用組成物、金属標識された該ペプチドを含有する医療用製剤、並びに該ペプチドの金属標識方法に関する。更に詳しくは、水系溶媒に不溶もしくは難溶な金属標識可能なペプチドと共に塩基性有機化合物を水系溶媒に溶解させて得られる医療用組成物であって室温下での該ペプチドの金属標識効率を向上させることが可能となる医療用組成物、該医療用組成物における該ペプチドを金属により標識することにより得られる医療用製剤、並びに該ペプチドの金属標識方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子内に金属標識可能な基を有するペプチドは、放射性金属や常磁性金属等で標識することにより、診断剤または治療剤の有効成分として用いることができる。
従来、金属標識可能なペプチドは、そのペプチド構造内にアルキル基などの疎水部分が多い分子ほど水系溶媒への溶解性が低く、そのようなペプチドを水系溶媒に溶解するには、ジメチルスルホオキシド（DMSO）やジメチルホルムアミド（DMF）などの有機溶媒に予め溶解させておき、必要とする量の水、あるいは緩衝液、またあるいは何らかの水溶液と混合する手法が用いられる。例えば、ペプチドの一つであるホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（FMLP）は中性の緩衝液に難溶であることが知られている。この化合物を金属標識可能とした化合物ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ヒドラジノニコチン酸（ｆＭＬＦＫ−ＨＹＮＩＣ）を水系溶媒に溶解するためには、ＤＭＳＯを用いて溶解した後、必要な緩衝液あるいは水系溶媒を加える必要がある（非特許文献１参照）。
しかしながら、上記方法で溶解させる場合、水系溶媒と混合したときに溶解可能な有機溶媒の溶液に占める割合が減少し、ある一定の有機溶媒濃度を下回ると、白濁や析出などペプチドの不溶化が起こる場合があった。【０００３】
前記した如く金属標識可能なペプチドは、放射性金属で標識を行うことにより、核医学製剤として使用することができるが、ＤＭＳＯ等の有機溶媒を用いて該ペプチドを溶解させる既往の応用例では、その標識に１００℃、１０分以上の加熱反応条件、あるいは室温３０分以上の反応条件が必要とされている。
例えば、ｆＭＬＦＫ−ＨＹＮＩＣは、室温３０分〜６０分の反応条件が必要とされている（非特許文献１参照）。
ＦＭＬＰの誘導体であるペプチド群は炎症などの白血球浸潤を伴う疾患の画像化に有用とされるが、完全な水系溶媒でかつ金属標識が室温で可能な条件については明らかではない（非特許文献２参照）。【０００４】
【非特許文献１】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａｋｅｎ、ＣＪ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．，３８，８，１３１０−１３１５（１９９７）
【非特許文献２】Ｖｅｒｂｅｋｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７巻，７６９−７７９（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであり、水に不溶もしくは難溶なペプチドを水系溶媒に溶解させやすくし、かつ非加熱で金属標識が可能な該ペプチドを含有する医療用組成物、金属標識された該ペプチドを含有する医療用製剤、並びに該ペプチドの金属標識法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、こうした課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、従来の知見からすれば驚くべきことに、塩基性有機化合物にペプチドを添加することにより、有機溶媒や界面活性剤を用いずに該ペプチドを室温で容易に水溶液とすることができ、かつ非加熱で金属標識が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
即ち、本発明は、金属標識可能なペプチド及び医薬品添加物として許容されうる塩基性有機化合物を含有することを特徴とする医療用組成物に関する。
更に本発明は、上記医療用組成物を凍結乾燥することによって得られることを特徴とする凍結乾燥した医療用組成物に関する。
更に本発明は、上記医療用組成物における金属標識可能なペプチドを金属で標識することにより得られることを特徴とする医療用製剤に関する。
更に本発明は、金属標識可能なペプチドに金属を標識する方法であって、該ペプチドを塩基性有機化合物の水系溶媒に溶解させた後、金属を標識することを特徴とする金属標識方法に関する。
更に本発明は、上記金属標識方法を用いることを特徴とする、金属標識されたペプチドを含有する医療用製剤の製造方法に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明に係る医療用組成物を用いることにより、水系溶媒に不溶もしくは難溶である金属標識可能なペプチドの溶解性が向上し、更に加温することなく該ペプチドを金属標識することが可能となった。本発明に係る金属標識方法を用いることにより、該ペプチドに非加熱条件下で金属を標識させることが可能となった。更に、本発明に係る医療用組成物における該ペプチドを金属で標識した製剤は、例えば、ペプチドとして炎症のイメージングに用いることのできるペプチドを用いた場合には、ペプチドの炎症への集積率が、従来法により調製した組成物と比較して向上するという効果も奏していた。本発明により、例えば、ペプチドとして白血球結合性化合物を用いた場合には、個体の免疫応答反応を伴う白血球浸潤の盛んな部位のイメージングを行うＰＥＴ画像診断、ＳＰＥＣＴ画像診断、ＭＲＩ画像診断あるいは放射線治療等に有用な医療用組成物及び医療用製剤、並びにその標識方法を提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ペプチド１、ペプチド２、及びペプチド３の溶出率を示す図。
【図２】ｐＨ９における各種添加剤添加によるペプチド１の溶出率の比較を示す図。
【図３】ジメチルホルムアミド（DMF）を用いて加熱標識したＴｃ９９ｍ標識ペプチド１のウサギ感染症モデルにおけるイメージを示す図。
【図４】アルギニンを用いて非加熱標識したＴｃ９９ｍ標識ペプチド１のウサギ感染症モデルにおけるイメージを示す図。
【図５】異なる標識法で標識したＴｃ９９ｍ標識ペプチド１のウサギ感染症モデルにおける炎症集積（％投与量／Ｋ  ｐｉｘｅｌ）を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態について説明する。本明細書で用いるアミノ酸は全て一文字記号もしくは三文字記号で記し、特に断りのない限り左側をＮ末端側、右側をＣ末端側として表記した。アミノ酸に続くかっこ内は、特に断りのない限り側鎖に結合したペプチドならびに有機化合物を表すものである。また、かっこ内のアミノ酸配列は全体構造を把握しやすくするために、右側をＮ末端側、左側をＣ末端側として表記した。さらに、本明細書において、Ｄ体のアミノ酸はＤ−アミノ酸と記載した。【００１１】
本発明に係る医療用組成物は、具体的には、水系溶媒に不溶あるいは難溶である金属標識可能なペプチドと、医薬品添加物として許容され得る塩基性有機化合物を必須成分として、これらを水系溶媒に溶解することにより調製される。
塩基性有機化合物としては、例えば、塩基性アミノ酸やイミダゾール環を有する塩基性化合物が挙げられる。塩基性アミノ酸としては特に限定されないが、例えばアルギニン、リジン、ヒスチジン、ヒドロキシリジンなどが挙げられ、好ましくはアルギニン、リジン、ヒスチジン、より好ましくはアルギニンを使用する。イミダゾール環を有する塩基性化合物としては特に限定されないが、イミダゾールを例示することができる。塩基性アミノ酸あるいはイミダゾール環を有する塩基性化合物は１種を単独で用いることもできるが、２種以上を組み合わせて使用してもよい。【００１２】
塩基性有機化合物を金属標識可能なペプチドと共に水系溶媒に溶解する場合、塩基性有機化合物の医療用組成物における濃度は、組成物中０．１ｍＭから１Ｍの範囲となるように配合するのが好ましい。０．１ｍＭよりも濃度が薄い場合、標識促進効果が得られないため好ましくなく、１Ｍよりも濃度が濃い場合、浸透圧毒性が問題となるため好ましくない。また、塩基性有機化合物の量は、使用するペプチドの種類などによって変動するが、通常、金属標識可能なペプチドに対して、モル濃度にして１０倍から１００万倍の範囲で用いるのが好ましく、１０００倍から１０万倍の範囲がより好ましい。金属標識可能なペプチドに対して１０倍以下のモル濃度では、塩基性有機化合物による十分な溶解促進効果および標識促進効果が得られないため好ましくなく、１００万倍以上のモル濃度では、該塩基性有機化合物が過剰量存在したことによる、標識への阻害作用があるため好ましくない。
上記濃度範囲において、組成物として好ましい溶液のｐＨは８〜１２であり、より好ましくはｐＨ８．５〜１２である。ｐＨが８より酸性の場合、塩基性有機化合物による溶解促進効果が損なわれるため好ましくなく、ｐＨ１２よりもアルカリ性の場合、生体へ悪影響を与える恐れがあるため好ましくない。【００１３】
本発明で用いる金属標識可能なペプチドは、具体的には、水系溶媒に不溶もしくは難溶なペプチドであり、診断薬もしくは治療用医薬品の有効成分として利用可能なペプチドであることが好ましく、アミノ酸３０残基以下又は分子量４５００以下であるポリアミノ酸化合物がより好ましい。その構造中にアミノ基及びカルボニル基を含んでいてもよい。該ペプチドは、金属標識が可能である限り特に限定はされないが、炎症等の診断に用いる場合には、例えば白血球結合性化合物を用いることができる。【００１４】
本発明に用いるペプチドとしては、下記式（１）
（化１）
Ｚ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）ｍ−ε（−（Ｒ）ｏ−（Ｔ）ｌ−Ｕ）（１）
で表される化合物が好適に用いられる。ここで、化学式（１）は、白血球のホルミルペプチド受容体との結合部位Ｚ−Ｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−、全白血球中の単球、リンパ球への結合率を向上させる結合部分−（Ｒ）ｏ−、放射性金属、常磁性金属を標識可能な構造−Ｕ−、およびこれらを結合するスペーサー−（Ｘ）ｎ−、−Ｌｙｓ（ＮＨ２）ｍ−および−（Ｔ）ｌ−よりなっている。
化学式（１）中、Ｚはアミノ基の保護基を表し、ＹはＭｅｔまたはＮｌｅを表し、（Ｘ）ｎにおいて、Ｘは１個もしくはそれ以上のアミノ酸又は有機合成可能な化合物よりなるスペーサー、ｎは１または０を表し、（ＮＨ２）ｍにおいて、ＮＨ２はＬｙｓのα位のカルボキシル基の保護基としてのアミド基、ｍは１または０を表し、ε（−（Ｒ）ｏ−（Ｔ）ｌ−Ｕ）において、ＲはＬｙｓのε−アミノ基にアミド結合したＳｅｒまたはＴｈｒ、ｏは１または０、Ｔは１個もしくはそれ以上のアミノ酸又は有機合成可能な化合物よりなるスペーサー、ｌは１または０、Ｕは金属標識可能な基を表す。但し、ＸとＴは同じでも異なっていてもよい。【００１５】
化学式（１）中、Ｕについては、金属標識が可能である限り特に限定されないが、好ましくは、複数のアミノ酸より成る配位子、より具体的には、金属標識可能なトリペプチド、ジペプチドメルカプトアシレート、炭素数８から２０の窒素含有環状化合物、炭素数８から２０の窒素含有環状カルボン酸化合物、炭素数８から２０の窒素含有環状カルボン酸化合物の誘導体、炭素数４から１０のアルキレンアミンカルボン酸などが挙げられる。より具体的には、例えば、−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ、−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ、−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ、−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｎ、−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ、−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ、−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ、−Ｃｙｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ、−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ、−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ、−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙなどの金属標識可能なトリペプチド；−Ａｓｐ−Ａｓｐ−メルカプトアセチル、−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−メルカプトアセチル、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−メルカプトアセチルなどのジペプチドメルカプトアシレート；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（Cyclen）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（Cyclam）、１，４，８，１２−テトラアザシクロペンタデカン、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−５，７−ジオン（Dioxocycam）などの炭素数８から２０の窒素含有環状化合物；１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−１，４，８，１１−テトラ酢酸（TETA）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸（DOTA）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−５，７−ジオン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−テトラ酢酸、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−酪酸、１，４，８，１０−テトラアザシクロドデカン−酪酸などの炭素数８から２０の窒素含有環状カルボン酸化合物；１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１−アミノエチルカルバモイルメチル−４，７，１０−トリス〔Ｒ，Ｓ〕−メチル酢酸（DO3MA）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−α，α’，α’’，α’’’−テトラメチル酢酸（DOTMA）などの炭素数８から２０の窒素含有環状カルボン酸化合物の誘導体；エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（DTPA）、トリエチレンテトラミンヘキサ酢酸、エチレングリコール−（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）などの炭素数４から１０のアルキレンアミンカルボン酸などから選択される金属標識可能な基を用いることができる。【００１６】
化学式（１）で表される具体的な化合物としては、化学式（１）中、Ｚがホルミル基であるものが好ましく、例えば、
Ｎ−ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ）、
Ｎ−ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）、
Ｎ−ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ε（−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）、
Ｎ−ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）、
Ｎ−ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−e（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ））、
Ｎ−ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ））、
Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ε（−Ａｓｐ−Ａｓｐ−メルカプトアセチル）、
Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ε（−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−メルカプトアセチル）、
Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ε（−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−メルカプトアセチル）、
Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ε（−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−メルカプトアセチル）、
Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ε（−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ））、
Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ヒドラジノニコチン酸
などが挙げられる。【００１７】
更に好ましくは、
Ｎ−ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ）、
Ｎ−ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）、
Ｎ−ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ε（−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）、
Ｎ−ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−ε（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）、
Ｎ−ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−e（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ））、
Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ε（−Ａｓｐ−Ａｓｐ−メルカプトアセチル）、
Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ε（−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−メルカプトアセチル）、
Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ε（−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−メルカプトアセチル）
などが挙げられる。
化学式（１）に記載の化合物を本発明に用いる場合には、金属標識可能な基を、適当な保護基で保護したものを用いることもできる。【００１８】
上記した白血球結合性化合物などの金属標識可能なペプチドは、以下に説明する方法により合成することができる。
（１）全てアミノ酸から構成される場合は、アプライドバイオシステムズ社製ペプチド自動合成機等の汎用的に使用されているペプチド自動合成装置によりＢｏｃ法、あるいはＦｍｏｃ法等により合成することができる。合成された複合体は、固相用樹脂担体に結合した状態から脱保護基と樹脂担体切り放しを同時に行い、その後、逆相系カラム等を用いた高速液体クロマトグラフ法（以下、ＨＰＬＣ法という）にて精製することができる。その他、ペプチド液相合成法により調製してもよく、また、動物等から採取してもよい。【００１９】
（２）非アミノ酸化合物を含んでいる場合は、その多くの場合、上記した同様の方法によって合成できる。例えば、固相用樹脂担体にＬｙｓ残基またはその保護誘導体を結合させ、そのＮ末端にＸのアミノ酸残基またはその保護誘導体、あるいはスペーサーとしての機能を有する化合物またはその保護誘導体、Ｐｈｅまたはその保護誘導体、Ｌｅｕまたはその保護誘導体、Ｙのアミノ酸またはその保護誘導体を順次結合させ、続いて固相用樹脂担体に結合したＬｙｓの側鎖であるεアミノ基を活性化させて、ＲのＳｅｒあるいはＴｈｒまたはその保護誘導体を結合させ、それにスペーサーＴのアミノ酸またはその保護誘導体、あるいはスペーサーとしての機能を有する化合物またはその保護誘導体、次いで、Ｕの金属標識可能な基となり得る化合物またはその保護誘導体を結合させ、その後に樹脂担体から合成された目的とする上記式（１）の合成物を切り放すことによって合成できる。
他の金属標識可能なペプチドも上記方法を採用することによリ容易に合成することができる。【００２０】
本発明の医療用組成物における金属標識可能なペプチドの使用量は、通常、目的とする診断および治療に好ましいとされる範囲で使用することができる。この範囲は安全性において許容されうる範囲の量であることが望ましく、加えて受容体に作用するペプチドを用いる場合は、目的とする受容体と同等か、少ない量で用いることが望ましい。より具体的なペプチドの使用量は、好ましくは０．１ｎＭから１０μＭの濃度の範囲である。【００２１】
本発明の医療用組成物は、上記した金属標識可能なペプチドを、塩基性有機化合物と共に、水系溶媒、具体的には、滅菌水に必要に応じて、他の有機溶媒などを添加した溶媒に、溶解することにより調製される。必要に応じて所望とする添加剤をさらに加えることができる。添加剤としては、例えば、界面活性剤、親水性有機溶媒、還元剤、ｐＨ調整剤、安定化剤などを挙げることができる。【００２２】
界面活性剤としては特に限定はされないが、例えば、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール６００、ポリエチレングリコール１０００およびポリエチレングリコール１５４０などの非イオン性界面活性剤を挙げることができ、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを使用するのが好ましい。界面活性剤の添加量は、好ましくは医療用組成物中０．０１〜１重量％であり、より好ましくは０．０５〜０．５重量％である。
親水性有機溶媒としては特に限定されないが、例えば、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトニトリル、アセトン、メチルエチルケトンなどの極性有機溶媒を挙げることができる。親水性有機溶媒の添加量は、好ましくは医療用組成物中０．１〜１０重量％であり、より好ましくは０．２〜１重量％である。
還元剤は、標識される金属が酸化されるのを防ぐために添加される。還元剤としては特に限定されないが、例えば、塩化第一スズ、アスコルビン酸、水素化ホウ素ナトリウムなどを挙げることができる。還元剤を添加する際の濃度は、医療用組成物中０．０１ｍＭ〜１０ｍＭとなるように添加することが好ましく、さらに好ましくは、０．０５ｍＭ〜１ｍＭの範囲で添加する。
ｐＨ調整剤としては特に限定されないが、例えば、塩酸、酢酸、トリフルオロ酢酸（以下、「ＴＦＡ」とする）、クエン酸、リン酸、アスコルビン酸、水酸化ナトリウム、アンモニアなどを挙げることができる。
安定化剤としては特に限定されないが、例えば、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、ｐ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸ナトリウム、ゲンチシン酸、ゲンチシン酸ナトリウムなどを挙げることができる。安定化剤を添加する際の濃度は、組成物中０．１ｍＭ〜１Ｍとなるように添加することが好ましく、さらに好ましくは、５ｍＭ〜５００ｍＭの範囲で添加する。【００２３】
本発明に係る医療用組成物は、水系溶媒に金属標識可能なペプチドと塩基性有機化合物が溶解した水系溶液の形態で用いることもでき、また、水系溶液の形態にある医療用組成物を凍結乾燥して、凍結乾燥の形態とすることもできる。凍結乾燥することにより、キットやその他の形態の診断薬や治療用医薬品として用いることが容易に可能となり、注射剤の最終原料としても容易に用いることができる。凍結乾燥する場合には、水系溶媒に金属標識可能なペプチドと塩基性有機化合物が溶解した水系溶液の形態で用いる医療用組組成物を、通常の方法により凍結乾燥することができる。
水系溶液の形態あるいは凍結乾燥した形態にある本発明の医療用組成物は、金属などを含む標識用試薬などと共に、診断薬あるいは治療用医薬品として、供することができる。【００２４】
本発明の医療用組成物における金属標識可能なペプチドは、効率良く金属で標識することができ、金属で標識することにより調製された医療用製剤は、例えば、金属標識可能なペプチドとして、白血球結合性化合物などの炎症部位へのイメージングに利用できるペプチドを用いた場合には、ペプチドの作用により免疫反応を伴う炎症部位に集積し、標識された金属によって当該部位を画像化することができる。より具体的には、本発明に係る医療用製剤を放射性診断剤並びにＭＲＩ造影剤として用いることにより、かかる炎症部位を画像化することが可能である。また、本発明は画像化のみならず、適切な放射性金属を選択することにより、放射性治療剤として用いることができる。【００２５】
放射性診断剤として用いる場合には、本発明の医療組成物中の金属標識ペプチドをＴｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１１１、Ｇａ−６７、Ｓｎ−１１７ｍ、Ｓｍ−１５３、Ｒｅ−１８６などのＳＰＥＣＴ用放射性金属または、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６８などのＰＥＴ用放射性金属で標識した放射性金属標識ペプチドとするのが好ましい。ＭＲＩ造影剤として用いる場合には、該ペプチドにＣｕ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｇｄ、Ｄｙなどの常磁性金属を配位させた常磁性金属標識化ペプチドとするのが好ましい。放射性治療剤として用いる場合には、該ペプチドをＹ−９０、Ｒｅ−１８６またはＲｅ−１８８などの放射性金属で標識した放射性金属標識ペプチドとするのが好ましい。【００２６】
該ペプチドを金属、例えば放射性金属又は常磁性金属で標識する方法としては、種々の方法を用いることができる。例えば、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｅ−１８６およびＲｅ−１８８で標識する場合は、本発明の医療用組成物中に塩化第一スズ等の安定量の医薬品添加物として許容されうる還元剤を加え、過テクネチウム酸ナトリウム溶液、または過レニウム酸ナトリウム溶液と混合する常套の方法により標識化合物を調製することができる。Ｃｕ、Ｃｕ−６４、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｇｄ、Ｉｎ−１１１、Ｓｎ−１１７ｍ、Ｓｍ−１５３、Ｄｙで標識する場合は、本発明に係る医療用組成物とＣｕ、Ｃｕ−６４、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｇｄ、Ｉｎ−１１１、Ｓｎ−１１７ｍ、Ｓｍ−１５３、Ｄｙイオンを含む弱酸性水溶性溶液とを混合することで調製できる。この場合、最終ｐＨが８以上となるようｐＨの調整をすることが望ましい。Ｇａ−６７、Ｇａ−６８またはＹ−９０で標識する場合は、本発明に係る医療用組成物とＧａ−６７、Ｇａ−６８またはＹ−９０イオンを含む弱酸性ないし弱アルカリ性の水溶性溶液とを混合することにより行うことが可能である。この場合、最終ｐＨが８以上となるようｐＨの調整をすることが望ましい。
金属で標識する際の条件としては、室温で５分〜２４時間、好ましくは５〜６０分、より好ましくは１０〜３０分、攪拌や振倒する等の条件を用いることができる。【００２７】
放射性金属または常磁性金属で標識されたペプチドを含有する医療用製剤は、必要に応じて薬学的に許容される添加物を更に添加して、好ましい放射性診断剤、放射性治療剤とすることができる。かかる添加物としては、薬学的に許容されるアスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、ｐ−アミノ安息香酸、ｐ−アミノ安息香酸ナトリウム、ゲンチシン酸、ゲンチシン酸ナトリウム等の安定化剤、水性緩衝液等のｐＨ調整剤、Ｄ−マンニトール等の賦形剤、および放射化学的純度を改良するのに役立つクエン酸、酒石酸、マロン酸、グルコン酸ナトリウム、グルコヘプトン酸ナトリウム等が挙げられる。【００２８】
放射性金属あるいは常磁性金属で標識したペプチドを含む本発明の医療用製剤を、放射性診断剤、放射性治療剤またはＭＲＩ造影剤として用いる場合は、静脈内投与等の一般的に用いられる非経口手段により投与でき、その投与量は患者の体重、年令、適当な放射線イメージング装置、ＭＲＩ測定装置および対象疾患状態等の諸条件を考慮して決定される。
例えば、ヒトを対象とする場合、Ｔｃ−９９ｍ標識ペプチドを用いた診断剤の投与量は、Ｔｃ−９９ｍの放射能量として３７ＭＢｑ〜１１１０ＭＢｑの範囲であり、好ましくは１８５ＭＢｑ〜１１１０ＭＢｑである。Ｒｅ−１８６またはＲｅ−１８８標識ペプチドを用いた治療剤の場合は、放射能量として３７ＭＢｑ〜１８５００ＭＢｑの範囲であり、好ましくは３７０ＭＢｑ〜７４００ＭＢｑである。Ｙ−９０標識ペプチドを用いた治療剤の場合は、放射能量として３７ＭＢｑ〜３７００ＭＢｑの範囲であり、好ましくは３７ＭＢｑ〜１１１０ＭＢｑの範囲である。他の放射性金属で標識した標識ペプチドの投与量もほぼ同様である。Ｇｄ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｕ、Ｄｙなどの常磁性金属で標識した標識ペプチドを用いた診断剤の投与量は、ＭＲＩ画像化装置の感度、標的組織、投与の特定の様式および使用の意図される効果に応じて適宜選択される。
例えば、ヒトに対して静脈内投与する場合であって、用いる金属がＧｄである場合は、通常は、体重当り０．０１〜０．３ｍｍｏｌ／ｋｇの範囲の投与量が好ましく用いられる。【００２９】
以下、本発明の実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例になんら限定されるものではない。
実施例において得られた物質の測定方法、使用した試薬等を下記に示す。
（１）ガンマカウンター：  血液内分布は、オートウェルガンマカウンター（アロカ株式会社製）を用いて測定した。体内分布検討は、ＮａＩシングルチャンネルアナライザー（応用光研工業株式会社製）を用いて測定した。
（２）ガンマカメラ：ＧＭＳ−５５０Ｕ（東芝メディカル株式会社製）、またはＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  ＭＧ（ＧＥ横河メディカルシステム株式会社製）を用いて測定した。
（３）逆相ＨＰＬＣ：逆相カラムＣｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−３００（ナカライテスク株式会社製、４．６×１５０ｍｍ）を用いた。
（４）ペプチド化合物は全て、固相合成法により作製した。
（５）９９ｍＴｃＯ４−：９９Ｍｏ／９９ｍＴｃジェネレーター（商品名；メジテック、日本メジフィジックス株式会社製）を用い、生理食塩液にて溶出したものを用いた。
（６）試薬はすべて特級試薬以上の製品を用いた。
（７）すべての実験動物は実験に先立ち１週間１２時間毎の明暗サイクル条件下で飼育した。その期間、餌および水は自由に摂取させた。【００３０】
（８）本実施例に用いたペプチドは、次に記すペプチドを用いた。
ペプチド１：ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−e（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）
ペプチド２：ホルミル−Ｎｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−e（−Ｓｅｒ−Ｄ−Ａｒｇ−ＤＴＰＡ＊）
ペプチド３：ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−e（−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｃ−Ｓ−Ｂｚｌ）
＊：ＤＴＰＡ：ジエチレントリアミンペンタ酢酸【００３１】
（９）ペプチド１の合成
ペプチド１を、固相合成法により製造し、以下の実施例に用いた。
アプライドバイオシステムズ社製ペプチド合成機（モデル４３０Ａ）を用い、Ｂｏｃ法によりＭＢＨＡ樹脂（p-Methoxy-Benzhydrylamine Resin hydrochloride,1%Divinylbenzene-polystyrene copolymer）を用いて０．５ｍＭスケールの条件で合成を行った。この際Ｃ末端、Ｌｙｓ残基の側鎖はＦｍｏｃ基で保護した。ペプチド鎖を伸長、Ｎ末端アミノ基をホルミル化した後、Ｌｙｓ残基の側鎖Ｆｍｏｃ基を２０％ピペリジン／ＤＭＦで切断し、側鎖側にペプチド鎖を伸長した。ペプチドの切出しは、無水フッ化水素：ｐ−クレゾール（８０：２０）中、−２℃から−５℃において１．０時間反応させて行った。
合成したペプチドにつき、ＨＰＬＣ法（カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ  ＳＨ−３６５−５（商品名、株式会社ワイエムシイ製、３０×２５０ｍｍ）、カラム温度：室温、溶出速度：２０ｍＬ／分、検出器：紫外可視吸光光度計（吸収波長：２２０ｎｍ）、溶出液Ａ：０．１％  ＴＦＡ／精製水、溶出液Ｂ：０．１％  ＴＦＡ／アセトニトリル、（Ａ／Ｂ（８０％／２０％）→Ａ／Ｂ（３０％／７０％）９０分））を用いて主ピークを分取し、凍結乾燥した。得られたペプチドにつき、逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ−Ｃ１８（商品名、横河アナリティカルシステムズ株式会社製、４．６×１５０ｍｍ）、カラム温度：５０℃、流速：１．０ｍＬ／分、検出器：紫外可視吸光光度計（吸収波長：２２０ｎｍ）、溶出液Ａ：０．１％ＴＦＡ／精製水、溶出液Ｂ：０．１％  ＴＦＡ／アセトニトリル（Ａ／Ｂ（８０％／２０％）→Ａ／Ｂ（３０％／７０％）２５分））を用いて、分析を行った。その結果、得られたペプチドの純度は９３．２％（面積百分率）であった。
なお、ＭＢＨＡ樹脂のかわりにプレロードレジンを用いても同様に合成が可能であった。【００３２】
上記精製したペプチドにつき、６Ｍの塩酸内にて１１０℃、２２時間の加水分解を行って各アミノ酸に分解した。Ｌ−８８００形日立高速アミノ酸分析計（商品名、株式会社日立ハイテクノロジーズ製）を用い、以下の条件にてアミノ酸組成を求め、ペプチド１と同様のアミノ酸組成を有することを確認した。また、質量分析（以下、ＥＳＩ−ＭＳ）を行い、ペプチド１の理論値と一致することを確認した。
アミノ酸組成分析条件
機種：Ｌ−８８００形日立高速アミノ酸分析計
クロマト条件
カラムサイズ：４．６ｍｍ  Ｉ．Ｄ．ｘ６０．０ｍｍ
固定相：日立カスタムイオン交換樹脂＃２６２２
移動相：クエン酸ナトリウム系緩衝液（４種類及び分析カラム再生用０．２Ｎ−
ＮａＯＨ試液）の段階的溶出法
（１）Ｌ−８５００−ＰＨ１：０．１６Ｎ，ｐＨ３．３
（２）Ｌ−８５００−ＰＨ２：０．２Ｎ，ｐＨ３．２
（３）Ｌ−８５００−ＰＨ３：０．２Ｎ，ｐＨ４．０
（４）Ｌ−８５００−ＰＨ４：１．２Ｎ，ｐＨ４．９
流速：０．４０ｍＬ／分
カラム温度：５７℃
検出
試薬：（１）ニンヒドリン試液（２）ニンヒドリン用緩衝液（Ninhydrin Re agent L-8500 Set)
反応試薬流速：０．３５ｍＬ／分
反応装置：電子加熱反応カラム，設定温度：１３５℃
検出波長：５７０ｎｍおよび４４０ｎｍ
標準アミノ酸
試薬：味の素Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｍｉｘｔｕｒｅ
濃度：各５０ｎｍｏｌ／ｍＬ  （但しＰｒｏは１００ｎｍｏｌ／ｍＬ）
希釈液：０．２Ｍ  Ｎａ  Ｃｉｔｒａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ２．２）
注入量：４０μＬ（各アミノ酸２ｎｍｏｌ，Ｐｒｏは４ｎｍｏｌ））
定量計算方法：面積値による１点絶対検量線法
以下に得られたペプチド１のアミノ酸組成の分析値（分子当たりの個数）及び質量分析の結果を示す。なお、丸かっこ内は、目的ペプチドのアミノ酸組成の理論値を示す。【００３３】
ペプチド１＝Ａｓｐ：（３）３．１９、Ｓｅｒ：（１）０．９７、Ｔｙｒ：（１）０．９７、Ｐｈｅ：（１）０．９８、Ｌｙｓ：（１）１．００、ＮＨ３（１）１．２０、Ｌｅｕ（１）＋Ｎｌｅ（２）２．８０、Ａｒｇ：（１）１．０６、Ｃｙｓ：（１）０．９２
また、得られたペプチド１のＥＳＩ−ＭＳの分析値を示す。丸かっこ内は、目的ペプチドの分子量の理論値を示す。
ＥＳＩ−ＭＳ：ＭＷ＝５１４．４（１５１４．７）
【実施例１】
【００３４】
アルギニンによるペプチドの溶解性
（１）方法
ペプチド１、ペプチド２及びペプチド３の各１００μｇを４１０ｍＭのアルギニン溶液（ｐＨ１１）に加え、全量を７００μＬとした。この時のモル濃度は、ペプチド１は９４μＭ、ペプチド２は９９μＭ、ペプチド３は１６１μＭとなる。外観観察により白濁の有無を確認した後、各試料液から２００μＬを孔径０．２２μｍのフィルター、マイレクス（登録商標）−ＧＶ（商品名、日本ミリポア株式会社製）にてろ過し、フィルターろ過前の試料液とフィルターろ過後の試料液をそれぞれ逆相ＨＰＬＣにて分析し、フィルター前後のペプチドのピーク面積値からピーク面積百分率を求め、溶出率とした。ＨＰＬＣ分析条件を下記に示す。
比較例として、水、ジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）それぞれに、ペプチド１、ペプチド２およびペプチド３を溶解させ、それぞれ９４μＭ、９９μＭ、１６１μＭのペプチド濃度とした試料について、同様に検討を行った。
ＨＰＬＣ条件
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−３００（ナカライテスク株式会社製、４．６×１５０ｍｍ）
溶出速度：１ｍＬ／分
検出：紫外可視吸光光度計（検出波長：２２０ｎｍ）
ＨＰＬＣシステム：Ａｌｌｉａｎｃｅ（日本ウォーターズ株式会社製）
溶出液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸（以下ＴＦＡ）／精製水
溶出液Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル
濃度勾配：０分（溶出液Ｂ２０％）→２５分（溶出液Ｂ７０％）【００３５】
（２）結果
得られた結果を表１および図１に示す。各ペプチドを溶解後、外観を観察した結果、３種のペプチドは水では白濁がみられたのに対し、アルギニン水溶液では３種のペプチドの全てが無色澄明な外観を示した。これはＤＭＳＯの試料溶液と同様な外観を示した。逆相ＨＰＬＣを用いた溶出率においては、アルギニンおよびＤＭＳＯの各試料溶液のいずれもが、約１００％の溶出率を示した。これらの結果より、ＤＭＳＯと同様に、アルギニンはペプチドの溶解性を高めていることが確認された。【００３６】
【表１】
0004759508.tif 000002
【実施例２】
【００３７】
アルギニン、リジン及びヒスチジンによるペプチド１の各ｐＨにおける溶解性
（１）方法
アルギニン、リジンおよびヒスチジンを水に溶解し、アルギニン溶液は４１０ｍＭ、リジン溶液は４８９ｍＭ、ヒスチジン溶液は９０ｍＭの濃度にて調製した。これらの溶液に水酸化ナトリウム水溶液および塩酸にて、リジンおよびヒスチジン水溶液はｐＨ８、９、１０、１１に、アルギニン水溶液はｐＨ８、８．５、９、９．５、１０、１１に調整した。続いてペプチド１をこれら水溶液に加えて９４μＭの濃度にて調製し、外観観察により白濁の有無を確認した。各試料液から２００μＬを孔径０．２２μｍのフィルター、マイレクス（登録商標）−ＧＶ（商品名、日本ミリポア株式会社製）にてろ過し、フィルターろ過前の試料液とフィルターろ過後の試料液をそれぞれ逆相ＨＰＬＣにて分析し、フィルター前後のペプチド１のピーク面積値からピーク面積百分率を求め、溶出率とした。ＨＰＬＣ分析条件は実施例１記載と同じ条件にて実施した。【００３８】
（２）結果
得られた結果を表２に示す。アルギニン水溶液はｐＨ８で明らかな白濁が認められた。アルギニン、リジン、及びヒスチジンの各水溶液ではｐＨ８．５以下では弱い白濁が見られたが、リジン及びヒスチジン水溶液は、ｐＨ８においても２０％強の溶出率が認められ、リジン及びヒスチジンは、ｐＨ８においてもペプチドを溶解させる効果があることが確認された。さらに、アルギニン、リジン、及びヒスチジン水溶液において、ｐＨ９以上では無色澄明な溶液となり、ペプチドの溶出率も８５％以上であった。従って、これらの塩基性アミノ酸は、ｐＨ８以上で、ペプチドの溶解性を奏し得ることが示された。【００３９】
【表２】
0004759508.tif 000003
【実施例３】
【００４０】
イミダゾールによるペプチド１の各ｐＨにおける溶解性
（１）方法
イミダゾールを水に溶解し、１ｍＭの濃度にて調製した。この溶液に塩酸を適当量加えることにより、ｐＨ８、８．５、９に調整した。続いてペプチド１をこれらイミダゾール溶液に加えて９４μＭの濃度にて調製し、外観観察により白濁の有無を確認した。各試料液から２００μＬを孔径０．２２μｍのフィルター、マイレクス（登録商標）−ＧＶ（商品名、日本ミリポア株式会社製）にてろ過し、フィルターろ過前の試料液とフィルターろ過後の試料液をそれぞれ逆相ＨＰＬＣにて分析し、フィルター前後のペプチド１のピーク面積値からピーク面積百分率を求め、溶出率とした。ＨＰＬＣ分析条件は実施例１記載と同じ条件にて実施した。【００４１】
（２）結果
得られた結果を表３に示す。ｐＨ８、８．５、９のいずれの溶液においても無色澄明であり、またｐＨ８．５、９以上では８０％以上の溶出率を示した。よって、ペプチド１に対しイミダゾールは高い溶解性を示すことが確認された。【００４２】
【表３】
0004759508.tif 000004
【実施例４】
【００４３】
各種添加剤によるペプチド１の溶解性
（１）方法
リン酸水素二ナトリウム、クエン酸二水素ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、イミダゾールを水に溶解し、ｐＨ９の各水溶液を表４に記載の濃度にて調製した。ｐＨ調整は塩酸および水酸化ナトリウム水溶液を用いて実施した。秤量したペプチド１に前記の水溶液を加え、９４μＭとし、外観観察により白濁の有無を確認した。また同様に、実施例２で得られた、アルギニン、リジンおよびヒスチジン水溶液に溶解されたペプチド１水溶液についても白濁の有無を確認し、比較対照であるリン酸水素二ナトリウム、クエン酸二水素ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムの各水溶液によるペプチド１試料溶液と比較した。続いて各試料液から２００μＬを孔径０．２２μｍのフィルター、マイレクス（登録商標）−ＧＶ（商品名、日本ミリポア株式会社製）にてろ過し、フィルターろ過前の試料液とフィルターろ過後の試料液をそれぞれ逆相ＨＰＬＣにて分析し、フィルター前後のペプチド１のピーク面積値からピーク面積百分率を求め、溶出率とした。また、ＨＰＬＣ測定後にｐＨを測定し、ｐＨ実測値とした。ＨＰＬＣ分析条件は実施例１記載と同じ条件にて実施した。【００４４】
【表４】
0004759508.tif 000005
【００４５】
（２）結果
得られた結果を表５および図２に示す。ペプチド１を溶解した結果、３種の塩基性アミノ酸であるアルギニン、リジンおよびヒスチジンのｐＨ９における水溶液は、無色澄明の外観を示し、またイミダゾールもその水溶液を用いたペプチド１の試料溶液は無色澄明の外観を示した。
一方、比較対照であるアスコルビン酸ナトリウム、クエン酸二水素ナトリウムの各水溶液は、ペプチド１を添加後白濁を示し、またリン酸水素二ナトリウムの水溶液は、ペプチド１を添加後、無色澄明の外観を示したが、ＨＰＬＣ分析により算出した溶出率は５３．８％という値を示し、３種の塩基性アミノ酸やイミダゾールと比較して低かった。よって、３種の塩基性アミノ酸やイミダゾールは、単にｐＨによる溶解性亢進の作用の他に、ペプチド１の溶解性を高める作用を有していることが確認された。【００４６】
【表５】
0004759508.tif 000006
【実施例５】
【００４７】
実施例５
アルギニンによるＴｃ９９ｍ標識促進効果
（１）方法
実施例２で得られたｐＨ１０のアルギニン水溶液にペプチド１を溶解し、９．４μＭのペプチド／アルギニン溶液を調製した。０．０１Ｍ塩酸１０ｍＬに塩化第一スズ溶液５ｍｇを加えた溶液の２５μＬをペプチド／アルギニン溶液７００μＬに加え、速やかにＴｃ−９９ｍ−過テクネチウム酸ナトリウム（以下９９ｍＴｃＯ４−）溶液０．６〜１．０ＧＢｑを加え、全量を１ｍＬとした。標識操作後のペプチド濃度は６．６μＭに希釈された。数秒間の振倒後、室温で反応させた。標識操作後１０分、９０分において、その一部を取り、ＨＰＬＣ、ＴＬＣにより各Ｔｃ−９９ｍ標識率を求めた。ＨＰＬＣ、ＴＬＣ分析は下記の条件で実施した。
比較対照として、ジメチルスルホオキシド（DMSO）にペプチド１を溶解した後、ｐＨ１０の１００ｍＭリン酸緩衝液（以下ＰＢ）で１０倍に希釈し、ペプチドの終濃度を９．４μＭとしたペプチド／ＤＭＳＯ／ＰＢ溶液、およびＰＢにペプチド１を溶解し、ペプチドの終濃度を９．４μＭとしたペプチド／ＰＢ溶液をペプチド／アルギニン溶液と同様に標識を行い、ＨＰＬＣ、ＴＬＣにより各Ｔｃ−９９ｍ標識率を求めた。標識操作後のペプチド濃度は６．６μＭに希釈された。
ＨＰＬＣ条件
カラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ１８−ＡＲ−３００（ナカライテスク株式会社製、４．６×１５０ｍｍ）
溶出速度：１ｍＬ／分
検出：紫外可視吸光光度計（検出波長：２２０ｎｍ）
放射能検出器：ＳＴＥＦＦＩ  ＮａＩシンチレーター（Ｒａｙｔｅｓｔ社製）
溶出液Ａ：０．１％ＴＦＡ／精製水
溶出液Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル
濃度勾配：０分（溶出液Ｂ２０％）→２５分（溶出液Ｂ７０％）
ＴＬＣ  条件
プレート：Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ  ６０Ｆ２５４（メルク株式会社製）
展開溶媒：２８％アンモニア水／アセトニトリル＝１／２
放射能検出器：Ｇｉｔａ  ＮａＩシンチレーター（Ｒａｙｔｅｓｔ社製）【００４８】
（２）結果
得られた結果のピーク面積から算出された放射化学的純度を表６に示す。４１０ｍＭのアルギニン水溶液は、ＨＰＬＣ分析において標識後１０分に放射化学的純度９０％以上、標識後９０分まで放射化学的純度９５％以上を示した。さらにＴＬＣ分析においても標識後１０分および９０分では放射化学的純度８５％以上を示し、加熱を必要とせずに、高いＴｃ９９ｍ標識率と高い標識安定性が示された。
一方、比較対照であるペプチド／ＤＭＳＯ／ＰＢ溶液及びペプチド／ＰＢ溶液の放射化学的純度は、ペプチド／ＤＭＳＯ／ＰＢ溶液がＨＰＬＣ分析で標識後１０分：７２．０％、標識後９０分：７５．４％、およびＴＬＣ分析で標識後１０分：４５．７％、標識後９０分：４１．９％を示し、またペプチド／ＰＢ溶液がＨＰＬＣ分析で標識後１０分：５５．３％、およびＴＬＣ分析で標識後１０分：２８．０％、標識後９０分：３３．６％を示した。
以上の結果より、いずれの時間点においても、ペプチド／アルギニン溶液は比較対照よりも放射化学的純度が高いことが確認された。よって、アルギニン添加を伴う溶解法を用いることで、非加熱で高い標識率を達成することができ、かつ調製した標識体の安定性も向上することが示された。【００４９】
【表６】
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【実施例６】
【００５０】
各種アルギニン濃度におけるＴｃ９９ｍ標識とその安定性の確認
（１）方法
アルギニン１２．５、２５および５０ｍｇを秤りとり、水に溶解し、塩酸にてｐＨ１０  に調整し、全量をそれぞれ７００μＬにした。このときのモル濃度はそれぞれ１０２．５ｍＭ、２０５ｍＭ、４１０ｍＭである。これらアルギニン水溶液にペプチド１を溶解させ、９．４μＭのペプチド／アルギニン溶液をそれぞれ調製した。０．０１Ｍ塩酸１０ｍＬに塩化第一スズ溶液５ｍｇを加えた溶液の２５μＬをそれぞれのペプチド／アルギニン溶液に加え、速やかに９９ｍＴｃＯ４−溶液０．６〜１．０ＧＢｑを加え、全量を１ｍＬとした。数秒間の振倒後、室温で反応させた。標識操作後３０分、９０分、１８０分、３６０分、２４時間、３０時間において、その一部を取り、実施例５記載の条件によるＴＬＣ分析にて、放射化学的純度を求めた。【００５１】
（２）結果
ピーク面積から算出された放射化学的純度を表７に示す。標識後３０時間までの全ての結果において放射化学的純度８０％以上を示し、さらにアルギニン濃度が２０５ｍＭ以下では、標識後３０時間まで放射化学的純度８５％以上を示した。よって、アルギニンを使用する溶解法は、アルギニンの濃度に依存することなく、加熱を必要とせずに、高いＴｃ９９ｍ標識率と高い標識安定性を示すＴｃ９９ｍ標識されたペプチドを供することが可能であることが確認された。【００５２】
【表７】
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【実施例７】
【００５３】
アルギニン添加により調製したＴｃ９９ｍ−ペプチド１溶液のウサギ感染症モデルにおけるイメージング
（１）方法
黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の約１０８個の生菌を生理食塩液１ｍＬに懸濁させ、その内の１００μＬをウサギ（ニュージーランドホワイト系、オス、体重約２ｋｇ）の右大腿部に筋肉内投与し、２４時間経過後、明らかに炎症が認められたモデルウサギにペントバルビタール麻酔を施し、実施例５で得られたＴｃ９９ｍで標識したペプチド１（アルギニン／非加熱）の３７〜７４ＭＢｑを耳静脈内投与し、投与後５分、１時間、２時間、３時間、４時間及び５時間にガンマカメラにてイメージを撮像した。また比較対照としてペプチド／ジメチルホルムアミド（DMF）／水により調製し加熱したＴｃ９９ｍ標識ペプチド１（ＤＭＦ／加熱）を同様に投与し検討をおこなった。比較対照の調製法は次の通りである。１３４ｍＭのグルコヘプトン酸３００μＬと２．６ｍＭの塩化第一スズ溶液５０μＬの混合液を含有するバイアル中に９９ｍＴｃＯ４−溶液１．１〜３．０ＧＢｑを加え、全量を１．３５ｍＬとした。時折転倒させることにより撹拌しながら室温で３０分間反応させ、その一部を取り、セルロースアセテート膜電気泳動法にてＴｃ−９９ｍ−グルコヘプトン酸のＴｃ−９９ｍ標識率が９５％以上であることを確認した。次に、ペプチド１を、ジメチルホルムアミド（DMF）に溶解し９４３μＭに調製し、ついで水を用いて１０倍に希釈し９４μＭの濃度に調製した。この溶液７００μＬに、Ｔｃ−９９ｍグルコヘプトン酸溶液３００μＬを各々加え、混合攪拌し、１００℃から１２０℃に加熱して１０分間反応させた。標識後、その一部を取り、ＨＰＬＣにより各Ｔｃ−９９ｍ標識率を求めた。ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。
ＨＰＬＣ条件
カラム：Ｐｕｒｅｓｉｌ  ５μｍ  Ｃ１８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、４．６×１５０ｍｍ）
溶出速度：１ｍＬ／分
検出：紫外可視吸光光度計（検出波長：２２０ｎｍ）
放射能検出器：ＳＴＥＦＦＩ  ＮａＩシンチレーター（Ｒａｙｔｅｓｔ社製）
溶出液Ａ：０．１％  ＴＦＡ／精製水
溶出液Ｂ：０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル
濃度勾配：０分（溶出液Ｂ２０％）→２５分（溶出液Ｂ７０％）【００５４】
（２）結果
得られた結果の代表図を、図３および図４に示す。イメージ上に関心領域を設定し、全身カウントに対する各関心領域１０００画素あたりのカウントの割合（％投与量／Ｋ  ｐｉｘｅｌ）を求めた結果を表８および図５に示す。その結果、従来技術のＴｃ９９ｍ−ペプチド１（ＤＭＦ／加熱）および、本発明のＴｃ９９ｍ−ペプチド１（アルギニン／非加熱）は、いずれも感染部位を明瞭に描出することができ、また両者の描出パターンは共通していた。炎症への集積は全ての時間点において本発明にかかる処方、すなわち、アルギニンを添加し非加熱条件下で調製した溶液が、従来法、すなわち、ＤＭＦを添加し１００℃以上に加熱して調製した溶液よりも、上回っており、投与後１時間の１．５９±０．３２％投与量／Ｋ  ｐｉｘｅｌから、投与後５時間では２．６２±０．５５％投与量／Ｋ  ｐｉｘｅｌと増大した。よって、本発明である、白血球結合性化合物をアルギニンを用いて溶解し非加熱によりＴｃ９９ｍ標識する方法は、従来技術で得られる標識体よりも炎症集積性の高い標識体を提供することができることが確認された。【００５５】
【表８】
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【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明に係る医療用組成物を用いることにより、水系溶媒に不溶もしくは難溶である金属標識可能なペプチドの溶解性が向上し、更に加温することなく該ペプチドを金属標識することが可能である。本発明に係る金属標識方法を用いることにより、該ペプチドに非加熱条件下で金属を標識させることが可能である。更に、本発明に係る医療用組成物における該ペプチドを金属で標識した製剤は、例えば、ペプチドとして炎症のイメージングに用いることのできるペプチドを用いた場合には、ペプチドの炎症への集積率が、従来法により調製した組成物と比較して向上するという効果も奏する。本発明により、例えば、ペプチドとして白血球結合性化合物を用いた場合には、個体の免疫応答反応を伴う白血球浸潤の盛んな部位のイメージングを行うＰＥＴ画像診断、ＳＰＥＣＴ画像診断、ＭＲＩ画像診断あるいは放射線治療等に有用な医療用組成物及び医療用製剤、並びにその標識方法を提供することが可能となる。
【図２】
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【図５】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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