(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２種のフラロールまたはその誘導体の混合物からなり励起光照射により可視光を発光する発光体混合物を、ゲル電気泳動により、泳動距離ごとに、可視光発光スペクトルの異なる少なくとも２種の可視光発光体に分離する工程を含むことを特徴とする可視光発光体の調製方法。
【請求項２】
フラロールまたはその誘導体は、次式
Ｃｎ（ＯＲ）ｍ（ＯＨ）ｐ
（Ｃｎはフラーレンを示し、ｎはフラーレンを構成する炭素原子の数を示す。Ｒは、炭化水素基またはアシル基を示し、ｍおよびｐは、各々結合数を示し、ｍとｐの和が０になることはない。）
で表わされるものであることを特徴とする請求項１に記載の可視光発光体の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物化学、医療、環境等の諸分野における分子識別等に有用な、可視光の広い範囲においても発光プローブとして利用することのできる、フラーレン誘導体のナノ発光プローブに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞イメージング等の分野では、発光プローブとして、径が数十ナノメートルの有機（蛍光）色素含有・表面親水化ポリスチレン微粒子が多く用いられてきた。しかし、数十ナノメートルのプローブは、ラベルされるタンパク質等の分子から見て、大変大きな存在であり、プローブをつけることによる影響が出てしまうことが指摘されている。これに対し、蛍光分子を１分子単位で発光プローブとして用いる手法もあるが、微弱発光の測定となり、高価な高感度の検出系が必要であること、また強い励起光により短時間で蛍光分子が分解・退色することが問題点として指摘されている。
【０００３】
このような状況において、近年ナノサイズの発光プローブの検討が進められてきており、たとえば貴金属ナノクラスターをデンドリマーやペプチドによって被包させた発光プローブ（特許文献１）等が提案されており、また、半導体微粒子を用いた多色性（径により発光波長が異なる）発光プローブが、Quantum Dot 社により製造・市販されている。しかしながら、これらの発光プローブは高価で、その取扱いや安全性の点において万全ではない貴金属や半導体としてのＣｄＳ，ＣｄＳｅ，ＣｄＴｅ等といった第四族原子を用いている。またこれら従来のプローブはその調製が必ずしも容易ではないという問題もある。
【０００４】
なお、シリコンを用いたquantum dot もあるが、発光が近赤外領域となり、検出系が高価になってしまうことが欠点として挙げられる。
【特許文献１】特表２００５−５３０５１７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記のとおりの背景から、従来技術の問題点を解消し、貴金属や半導体等の、高価で、取扱いや安全性の点で万全でなく、プローブとしての調製も容易ではない金属材料を用いることなく、高感度で、可視光域における検出をも容易とすることのできる、新しいナノサイズの発光プローブを提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記の課題を解決するものとして以下の手段を提供する。
【０００７】
第１：フラロールとその誘導体のうちの少くともいずれかを含むことを特徴とするナノ発光プローブ。
【０００８】
第２：フラロールとその誘導体は次式
Ｃｎ（ＯＲ）ｍ（ＯＨ）ｐ
（Ｃｎはフラーレンを示し、ｎはフラーレンを構成する炭素原子の数を示す。Ｒは、炭化水素基またはアシル基を示し、ｍおよびｐは、各々結合数を示し、ｍとｐがいずれも０になることはない。）
で表わされるものであることを特徴とする上記のナノ発光プローブ。
【０００９】
第３：フラロールとその誘導体のうちの複数種を含み、多色性発光可能なことを特徴とするナノ発光プローブ。
【００１０】
第４：上記いずれかのナノ発光プローブの水性溶液または有機溶媒溶液であることを特徴とするナノ発光プローブ組成物。
【００１１】
第５：上記いずれかのナノ発光プローブもしくは組成物を用いる分子検出方法であって、少くとも以下のプロセスを含むことを特徴とする分子検出方法。
（Ａ）フラロールもしくはその誘導体、あるいはその両者を被検出分子に結合させる。
（Ｂ）励起光を照射して結合されたフラロールまたはその誘導体の発光を検知して被検出分子を認識する。
【００１２】
第６：上記いずれかのナノ発光プローブの調製方法であって、フラロールまたはその誘導体、あるいはこれら両者の各々の混合物から所要の発光波長のものを分離することを特徴とするナノ発光プローブの調製方法。
【００１３】
第７：分離調製された複数種の発光プローブを混合して所要の多色性発光を可能とすることを特徴とするナノ発光プローブの調製方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のナノ発光プローブは、水溶液系のみならず、幅広い溶媒中で用いることが可能であり、また、幅広い種類の分子と結合させることのできる発光プローブとして、可視光の広い領域で用いることが可能である。さらに、元素として炭素・水素・酸素を含有し、カドミウムやヒ素などの有毒な元素を含まない点も、従来技術に比べて優れている。
【００１５】
フラロールは、その親水性から重金属原子を内包させて造影剤に用いたり、金属イオンの配位子として発光により金属イオン濃度の測定に用いたり、一部生理活性の研究なども行われてきたが、反応性の低さ等もあり、あまり積極的に用いられてきたとはいえない。近年カーボンナノチューブが多用されているが、有害性については研究が進んでおらず、フラーレン類は、ナノチューブ類よりも毒性が低いと予想されており、この点でもフラーレン誘導体の使用方法が広がることは望ましい。また、フラロール及びその誘導体としてのフラロールエステル等は、多くの水酸基を含有するため、水溶液中ではイオン化することで安定化しやすく、高イオン（特に金属イオン）濃度下でも凝集しにくい。またフラロールエステルは、有機溶媒下では中性化し安定化しやすい。発光波長（発光色）については、フラロール及びフラロールエステル等の誘導体は、その調製（合成）方法に対して幅広い発光波長を示すが、これをたとえば電気泳動により泳動距離毎に分離することで、赤または橙赤〜黄〜青まで幅広い色が選べる。励起波長（照射光）については、フラロールやフラロールエステル（或いはエステル化の度合）を適宜選択・混合することで、短波長（ＵＶ）から可視光まで選択可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
上記のとおりの特徴を有する本発明について以下にその実施の形態について説明する。
【００１７】
本発明におけるナノ発光プローブは、フラロールとその誘導体のうちの少くともいずれかを含むことを特徴としているが、この場合のフラロールは、フラーレンを水酸化して水酸基（ＯＨ）をフラーレン骨格の炭素原子に結合させたものである。フラーレンの水酸化のための反応法はすでに各種のものが知られており、本発明のフラロールはこれらいずれの方法によって合成されたものであってよい。
【００１８】
通常、フラーレンの水酸化によって合成されたフラロールは、フラーレン炭素原子に結合する水酸基（ＯＨ）の数や水酸基（ＯＨ）の結合位置の異なる複数種のものが生成される。これら複数種のものの各々は発光波長、発光スペクトルは異っていることが多いことから、これら複数種の混合物を多色性発光プローブとして利用してもよいし、特定発光波長のものを分離し、さらに必要に応じてこれらを混合して特定の波長で発光するナノ発光プローブとすることができる。
【００１９】
一方、本発明におけるフラロールの誘導体としては、
１）フラロールの水酸基（ＯＨ）がエステル化、あるいはエーテル化されているもの、
２）フラロール、そのエステル、あるいはエーテルとして、さらに他の有機基を有しているもの
が考慮される。
【００２０】
水酸化フラーレンとしてのフラロールの種類とその組成によって、これらの誘導体も複数種の混合物として得られることがある。このものも上記同様にしてナノ発光プローブとすることができる。
【００２１】
フラロールは水溶性フラーレン誘導体であるが、たとえばフラロールエステルは、有機溶媒にも可溶である。フラロール、フラロールエステル等は、その混合物からゲル電気泳動、特にはＰＡＧＥにより、発光波長ごとに分離することが可能である。具体的なフラロールのゲル電気泳動の結果とその分離したフラロールの発光スペクトルの結果を後述の実施例において示している。
【００２２】
本発明のフラロールとその誘導体は、前記のとおりの式：Ｃｎ（ＯＲ）ｍ（ＯＨ）ｐで表わすことができる。ここでフラーレンを示すＣｎについては、代表的なＣ６０だけでなく、より炭素数の多い高次のフラーレンや、発光プローブとしての機能を阻害しない限りこれらに炭化水素基等の有機基が結合したものであってもよい。
【００２３】
符号Ｒは炭化水素基またはアシル基であるが、これらも同様に有機基を有していてもよい。
【００２４】
なかでも、本発明においては、フラロールとその誘導体としてＣ６０の水酸化物であるＣ６０（ＯＨ）ｐあるいはその水酸基の一部をエステル化したＣ６０（ＯＲ）ｍ（ＯＨ）ｐを好適に用いることができる。ここで、水酸基（ＯＨ）の数：ｐとしては、たとえば５０程度までが好適に考慮される。また数：ｍとしては、たとえば２０程度までが好適に考慮される。
【００２５】
以上のような本発明のナノ発光プローブは、様々な分子に結合させることで、可視光の広い範囲において発光プローブとして使用することができる。この場合、たとえば水性溶液あるいは有機溶媒溶液の形態として被検物質と接触させ、被検分子に発光プローブを化学的に、あるいは物理的に結合し、励起光の照射により蛍光発光等を検知することで、被検物質における分子識別を可能とすることができる。
【００２６】
そこで以下に実施例を示し、本発明のナノ発光プローブの発光能について説明する。
【実施例】
【００２７】
＜１＞Ｃ６０フラーレンを発煙硫酸と五酸化リンと、６０℃の温度において約１時間反応させ、その後、８０℃の温度で約１０時間加水分解し、水酸基（ＯＨ）の平均結合数、つまりＣ６０の１分子あたりの結合数の平均が１２のフラロール（fullerol−Ａ）を合成した。
＜２＞一方、Ｃ６０フラーレンを水酸化テトラブチルアンモニウムと水酸化ナトリウム水溶液と、室温で約３時間反応させ、水酸基（ＯＨ）の平均結合数２０〜２５のフラロール（fullerol−Ｂ）を合成した。
＜３＞また、発煙硫酸を用いて合成したfullerol−Ａを塩化アセチル（ＡｃＣｌ）で処理したもの（ＡＲＣ）、アルカリ条件下での酸化処理を用いて合成したfullerol−Ｂを塩化アセチル（ＡｃＣｌ）で処理したもの（ＢＲＣ）、発煙硫酸を用いて合成したfullerol−Ａを酢酸無水物（ＡｃＯＡｃ）で処理したもの（ＡＲＡ）をそれぞれ合成した。
＜４＞上記の方法＜１＞＜２＞＜３＞で合成したフラロールのゲル電気泳動の結果を図１に示した。電気泳動の条件は、１２％−ポリアクリルアミドゲル、１００Ｖ、３０分、トリス−ボレート緩衝液の使用とした。
【００２８】
図１におけるレーンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅは以下のものを示している。
【００２９】
Ａ：ＢＲＣ
Ｂ：fullerol−Ｂ
Ｃ：fullerol−Ａ
Ｄ：ＡＲＣ
Ｅ：ＡＲＡ
いずれの場合も、２５μｇを用いている。
【００３０】
また、図２は、fullerol−Ａ、fullerol−Ｂの各々について電気泳動により分離したフラロール化合物の発光スペクトルを示したものである。図中の符号は電気泳動の分離距離を示している。
【００３１】
Ａ：0.5cm
Ｂ：２cm
Ｃ：３cm
Ｄ：４cm
以上のことから蛍光発光の波長（スペクトル）の異なるものを各々単独のプローブとして、あるいは所望の複数の組合による多色性の発光プローブとして利用可能であることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ゲル電気泳動の結果を例示した図である。
【図２】分離されたフラロール化合物の発光スペクトルを例示した図である。
【図２】
0004827489.tif 000002
【図１】
0004827489.tif 000003