(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
American Type Culture CollectionにＡＴＣＣ＃ＨＢ−１２６９８として寄託され、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃに結合し、ＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３への結合を干渉し、ＶＥＧＦ−Ｃには結合せず、ＶＥＧＦＲ−２によって仲介されるＶＥＧＦの活性は干渉しない、マウスのハイブリドーマ細胞４Ａ５Ａから産生される４Ａ５抗体。
【請求項２】
前記抗体は検出可能標識によって標識される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記検出可能標識は放射性同位体である、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体はヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
請求項１に記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項６】
ＶＥＧＦ−Ｄのためのテストキットであって、請求項１又は４に記載の抗体と、前記抗体の結合を検出するための手段とを有するキット。
【請求項７】
生物サンプル中のＶＥＧＦ−Ｄを検出する方法であって、前記サンプルを請求項１又は４に記載の抗体と接触させる工程と、前記抗体の結合の発生を検出する工程とを有する生物サンプル中のＶＥＧＦ−Ｄを検出する方法。
【請求項８】
組織中のリンパ管構造を生体外でイメージングする方法であって、生体から採取された前記組織を請求項１又は４に記載の抗体に生体外で接触させる工程と、前記抗体の結合の発生を検出する工程とを有する組織中のリンパ管構造を生体外でイメージングする方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体を含む、ＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦＲ−２又はＶＥＧＦＲ−３との結合を阻害する結合阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、図１（配列識別番号１）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して特異的に反応する抗体を有する組成物に関する。前記抗体は、モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）、免疫反応性フラグメント、又はその組換え体を含む。本発明は、更に、これらの抗体を利用した薬用及び診断用組成物及び方法にも関する。
【０００２】
発明の背景
発育途上の胎児に於いて、一次血管網状組織が、血管生成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）と呼ばれるプロセスに於いて中胚葉細胞のインサイチュ分化によって確立される。胎児における新しい血管の生成に関連するすべてのその後のプロセスと、成体に於ける新血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）は、脈管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）と呼ばれるプロセスに於ける既存の血管からの新しい毛細管の発芽又は分裂によって支配されているものと考えられている（ペッパー（Ｐｅｐｐｅｒ）等、Ｅｎｚｙｍｅ＆Ｐｒｏｔｅｉｎ，１９９６  ４９  １３８−１６２；ブライアー（Ｂｒｅｉｅｒ）等、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．１９９５  ２０４  ２２８−２３９；リソー（Ｒｉｓａｕ）、Ｎａｔｕｒｅ，１９９７  ３８６  ６７１−６７４）。脈管形成は、胚発達と正常な組織成長、修復及び再生のみならず、女性の生殖サイクル、妊娠状態の確立及び維持、そして、損傷及び破損の修復にも関連している。正常な個体に於いて行われる脈管形成の他に、脈管形成現象は、多数の病理プロセス、特に腫瘍の成長と転移、そして、糖尿病網膜症、乾癬症、及び関節疾患（ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｉｅｓ）等のように、血管増殖、特に微小血管系の血管形成、が増加する、その他の状態、に関連している。脈管形成の抑制は、これらの病理的プロセスを防止又は軽減するのに有用である。
【０００３】
他方、たとえば、組織又は器官移植後等、血管新生を確立又は拡張したり、或いは、冠状動脈心臓疾患や血栓性閉塞性動脈炎等に於けるように、組織梗塞又は動脈狭窄に於いて側副血行の形成を刺激する為、等の状況においては脈管形成を促進することが望ましい。
【０００４】
脈管形成プロセスは高度に複雑であって、細胞サイクルに於ける内皮細胞の維持、細胞外マトリクスの分解、周囲の組織の遊走と浸潤、そして最後に管腔形成、に関連している。これら複雑な脈管形成プロセスの背後の分子メカニズムはまだほとんど判っていない。
【０００５】
脈管形成は非常に多くの生理的、及び、病理的プロセスに重要な役割を果たしているので、脈管形成の制御に関連している因子が集中的に研究されている。多くの増殖因子が、脈管形成の調節に関連していることが示されている。これらのものとしては、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦα）、及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）がある。たとえば、フォークマン（Ｆａｌｋｍａｎ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２  ２６７  １０９３１−１０９３４を参照。
【０００６】
特定のファミリーの内皮細胞特異的増殖因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、それらに対応するレセプターが、内皮細胞の増殖と分化の刺激と、分化細胞の或る種の機能とに主に寄与していることが示唆されている。これらの因子は、ＰＤＧＦファミリーのメンバーであって、主に内皮レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を介して作用しているように思える。
【０００７】
ＰＤＧＦファミリー中に於いて９種類のタンパク質、即ち、二つのＰＤＧＦ（Ａ及びＢ）と、ＶＥＧＦと、ＶＥＧＦに密接に関連している６つのメンバー、が同定された。ＶＥＧＦに密接に関連する前記６つのメンバーは、Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈとヘルシンキ大学とによる、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７（ＷＯ９６／２６７３６）及び米国特許５，８４０，６９３号及び５，６０７，９１８号とに記載のＶＥＧＦ−Ｂと、ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）等、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９６  １５  ２９０−２９８及びリー（Ｌｅｅ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６  ９３  １９８８−１９９２に記載のＶＥＧＦ−Ｃと、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）及びアチェン（Ａｃｈｅｎ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８  ９５  ５４８−５５３に記載のＶＥＧＦ−Ｄと、マグリオン（Ｍａｇｌｉｏｎｅ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１  ８８  ９２６７−９２７１に記載の胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）と、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５２９１（ＷＯ  ９５／２４４７３）に記載のＶＥＧＦ２と、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７２８３（ＷＯ  ９６／３９４２１）に記載のＶＥＧＦ３とである。これら各ＶＥＧＦファミリーメンバーは、ＶＥＧＦに対して３０％ないし４５％のアミノ酸配列同一性を有する。これらＶＥＧＦファミリーメンバーは、システイン・ノット・モチーフ（ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｋｎｏｔ  ｍｏｔｉｆ）を形成する６つのシステイン残基を含むＶＥＧＦ相同性ドメインを共有している。ＶＥＧＦファミリーの機能的特徴には、内皮細胞に対する種々の程度のマイトジェン活性の誘発、血管透過性及び脈管形成及びリンパ管形成特性の誘発、が含まれる。
【０００８】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、複数のソースから単離されているホモダイマー糖タンパク質である。ＶＥＧＦは、内皮細胞に対して高度に特異的なマイトジェン活性を示す。ＶＥＧＦは、胎児血管形成中の新しい血管の形成と、成体の脈管形成とに於いて重要な調節機能を有する（カーメリエット（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ）等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９６  ３８０  ４３５−４３９；ファーララ（Ｆｅｒｒａｒａ）等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９６  ３８０  ４３９−４４２；ファーララ（Ｆｅｒｒａｒａ）及びデイヴィス−スミス（Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ），Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．，１９９７  １８  ４−２５によって検討されている）。ＶＥＧＦが果す役割の重要性は、一つのＶＥＧＦ対立遺伝子が不活性化するだけで、血管の発達不全によって胎児が致死することを示す研究によって示されている（カーメリエット（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ）等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９６  ３８０  ４３５−４３９；ファーララ（Ｆｅｒｒａｒａ）等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９６  ３８０  ４３９−４４２）。更に、ＶＥＧＦは、単球に対する強力な化学誘引活性を有し、内皮細胞に於いてプラスミノーゲンアクチベーターとプラスミノーゲンアクチベーターインヒビターとを誘発することができ、又、微小血管透過性を誘発することができる。その後者の活性に依り、それは、時として、血管透過性因子（ＶＰＦ）と称される。ＶＥＧＦの単離と性質は既に研究されている。ファーララ（Ｆｅｒｒａｒａ）等、Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１  ４７  ２１１−２１８とコノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９１  ４７  ２１９−２２３を参照。一つのＶＥＧＦ遺伝子の選択的ｍＲＮＡスプライシングによってＶＥＧＦの５つのアイソフォームが得られる。
【０００９】
ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦに類似の血管形成及びその他の特性を有するが、それは、ＶＥＧＦと異なる組織に分布し、発現される。具体的には、ＶＥＧＦ−Ｂは心臓に於いて非常に強力に発現されるが、肺に於いては弱くしか発現されない。これに対して、ＶＥＧＦの場合はその反対である。これは、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ−Ｂとは、それらが多くの組織に於いて共発現されるという事実にも拘わらず、機能的な相違を有するものである可能性があることを示唆している。
【００１０】
ＶＥＧＦ−Ｂは、細胞レジノイド酸結合タンパク質タイプＩ（ＣＲＡＢＰ−Ｉ）と相互作用する可能性のある細胞タンパク質をスクリーニングすることによる酵母共ハイブリッド相互作用トラップスクリーニング法（ｃｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｒａｐ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用して単離された。その単離と特徴は、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７と、オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６  ９３  ２５７６−２５８１とに詳細に記載されている。
【００１１】
ＶＥＧＦ−Ｃは、ＰＣ−３前立腺癌細胞ライン（ＣＲＬ１４３５）の培養上清（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉａ）から、ＶＥＧＦＲ−３を発現するべくトランスフェクトされた細胞を使用して、この培地が内皮細胞特異性レセプターチロシンキナーゼＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）を生成する能力をスクリーニングすることによって単離された。ＶＥＧＦ−Ｃは、組換えＶＥＧＦＲ−３でのアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され、ＰＣ−３ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた。その単離と特徴とは、ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）等、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９６  １５  ２９０−２９８に詳述されている。
【００１２】
ＶＥＧＦ−Ｄは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから市販されているヒト胸ｃＤＮＡライブラリーから、ハイブリダイゼーションプローブとして“Ｓｏａｒｅｓ  Ｂｒｅａｓｔ  ３ＮｂＨＢｓｔ”と命名されているヒトｃＤＮＡライブラリーから得た発現配列タグによるスクリーニングによって単離された（アチェン（Ａｃｈｅｎ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８  ９５  ５４８−５５３）。その単離と特徴とは、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）に詳細に記載されている。
【００１３】
前記ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子は、成人ヒトに広く発現されるが、もちろん、遍在的に発現されるものではない。ＶＥＧＦ−Ｄは、心臓、肺及び骨格筋に於いて強力に発現される。ＶＥＧＦ−Ｄは脾臓と、卵巣、小腸、及び結腸に於いて中レベルで発現され、より低い発現が腎臓、膵臓、胸腺、前立腺、及び精巣で発生する。脳、胎盤、肝臓又は末しょう血液白血球からのＲＮＡにはＶＥＧＦ−ＤｍＲＮＡは検出されなかった。
【００１４】
ＰｌＧＦは、(妊娠の)満期胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離された。その単離と特徴とは、マグリオン（Ｍａｇｌｉｏｎｅ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１  ８８  ９２６７−９２７１に詳細に記載されている。現在に於いて、その生物学的機能はよく理解されていない。
【００１５】
ＶＥＧＦ２は、高度に腫瘍生成的なエストロゲン非依存ヒト胸部ガン細胞ラインから単離された。この分子は、ＰＤＧＦに対する約２２％の相同性と、ＶＥＧＦに対する３０％の相同性を有すると述べられているものの、ＶＥＧＦ２をコードする遺伝子を単離する方法は明らかでなく、その生物学的活性の特徴付けは開示されていない。
【００１６】
ＶＥＧＦ３は、結腸組織由来のｃＤＮＡライブラリーから単離された。ＶＥＧＦ３は、ＶＥＧＦに対する約３６％の同一性と、６６％の類似性を有すると記載されている。ＶＥＧＦ３をコードする遺伝子を単離する方法は明らかでなく、その生物学的活性の特徴付けは開示されていない。
【００１７】
二つのタンパク質の間の類似性は、これらタンパク質の一方のアミノ酸配列と保存アミノ酸置換を、第２のタンパク質の配列と比較することによって判定されるのに対して、同一性は、保存アミノ酸置換を含めることなく判定される。
【００１８】
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーメンバーは、主として、レセプターチロシンキナーゼに結合することによって作用する。５つの内皮細胞特異的レセプターチロシンキナーゼが同定されている。即ち、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−２）、ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）、ＴｉｅそしてＴｅｋ／Ｔｉｅ−２である。これらの全ては、シグナル伝達に必要な内在性チロシンキナーゼ活性を有する。ＶＥＧＦＲ−１，ＶＥＧＦＲ−２，ＶＥＧＦＲ−３、Ｔｉｅ及びＴｅｋ／Ｔｉｅ−２の、血管形成及び脈管形成に於ける本質的で特異的な役割は、マウス胎児に於いてこれらのレセプターを不活性化する標的化突然変異によって示されている。
【００１９】
ＶＥＧＦに結合することが知られているレセプターチロシンキナーゼは、ＶＥＧＦＲ−１，ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３だけである。ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２とは、高い親和性でＶＥＧＦと結合し、ＶＥＧＦＲ−１は、ＶＥＧＦ−ＢとＰｌＧＦとにも結合する。ＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦＲ−３のリガンドであることが示されており、これは、又、ＶＥＧＦＲ−２を活性化する（ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）等、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９６  １５  ２９０−２９８）。ＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３の双方に結合する。Ｔｅｋ／Ｔｉｅ−２のリガンドは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，社の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２９３５（ＷＯ  ９６／１１２６９）に記載されている。Ｔｉｅのリガンドは、まだ同定されていない。
【００２０】
最近、新規な１３０−１３５ｋＤａ  ＶＥＧＦアイソフォーム特異的レセプターが精製されクローニングされた（ソーカー（Ｓｏｋｅｒ）等、Ｃｅｌｌ，１９９８  ９２  ７３５−７４５）。このＶＥＧＦレセプターは、ヘパリンに対する弱い親和性を示すエクソン７コード化配列を介してＶＥＧＦ165アイソフォームに結合することが判った（ソーカー（Ｓｏｋｅｒ）等、Ｃｅｌｌ，１９９８  ９２  ７３５−７４５）。驚くべきことに、前記レセプターは、ヒトニューロピリン（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ）−１（ＮＰ−１）、初期段階の神経形態形成に関わるレセプター、と同一であることが示された。Ｐ１ＧＦ−２も、ＮＰ−１と相互作用するようである（ミグダール（Ｍｉｇｄａｌ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９８  ２７３  ２２２７２−２２２７８）。
【００２１】
ＶＥＧＦＲ−１，ＶＥＧＦＲ−２，ＶＥＧＦＲ−３は、内皮細胞によって異なる状態で発現される。ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２は、共に、血管内皮に発現され（エールリッヒス（Ｏｅｌｒｉｃｈｓ）等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１９９２  ８  １１−１８；カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９３  １７８  ２０７７−２０８８；デュモント（Ｄｕｍｏｎｔ）等、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，１９９５  ２０３  ８０−９２；フォン（Ｆｏｎｇ）等、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，１９９６  ２０７  １−１０）、ＶＥＧＦＲ−３は、ほとんど、成体組織のリンパ内皮に発現される（カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５  ９  ３５６６−３５７０）。ＶＥＧＦＲ−３は、又、腫瘍周囲の血管にも発現される。
【００２２】
ＶＥＧＦＲ遺伝子が崩壊すると、血管の発達の異常が起こり、妊娠期間中に未熟致死となる。完全に不活性化されたＶＥＧＦＲ−１遺伝子を有する胎児の分析は、このレセプターが内皮の機能的組織化に必要であるということを示唆している（フォン（Ｆｏｎｇ）等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９５  ３７６  ６６−７０）。しかしながら、ＶＥＧＦＲ−１の細胞内チロシンキナーゼドメインの欠失は、正常な血管を有する生育可能なマウスを作り出す（ヒラツカ（Ｈｉｒａｔｓｕｋａ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９８  ９５  ９３４９−９３５４）。これらの相違の理由は、今後の説明を必要とするが、これは、ＶＥＧＦＲ−１の適切な機能の為にチロシンキナーゼを介したレセプターシグナリングが必要とされない、ということを示唆している。ＶＥＧＦＲ−２の不活性化対立遺伝子を有する同型接合体マウスの分析は、このレセプターが、内皮細胞増殖、血液生成及び血管形成のために必要であることを示唆している（シャラビー（Ｓｈａｌａｂｙ）等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９５  ３７６  ６２−６６；シャラビー（Ｓｈａｌａｂｙ）等，Ｃｅｌｌ，１９９７  ８９  ９８１−９９０）。ＶＥＧＦＲ−３の不活性化によって、大きな血管の組織異常によって心血管不全が起こる（デュモント（Ｄｕｍｏｎｔ）等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８  ２８２  ９４６−９４９）。
【００２３】
ＶＥＧＦＲ−１は、主として、発育中の内皮細胞に発現されるが、それは、又、胚形成の初期段階に於いて造血前駆細胞にも見られる（フォン（Ｆｏｎｇ）等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９５  ３７６  ６６−７０）。成体に於いて、単球とマクロファージも、このレセプターを発現する（バーレオン（Ｂａｒｌｅｏｎ）等、Ｂｌｏｏｄ，１９９５  ８７  ３３３６−３３４３）。胚に於いて、それは、ほとんどが、全部ではないにせよ、血管に発現される（ブライアー（Ｂｒｅｉｅｒ）等、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，１９９５  ２０４  ２２８−２３９）；フォン（Ｆｏｎｇ）等、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，１９９６  ２０７  １−１０）。
【００２４】
レセプターＶＥＧＦＲ−３は、初期の胚成長中に内皮細胞に広く発現されるが、胚形成が進むにつれて、静脈内皮に徐々に限定され、その後、リンパ内皮に限定される（カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  １９９４  ５４  ６５７１−６５７７、カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５  ９２  ３５６６−３５７０）。ＶＥＧＦＲ−３は、成体に於いてリンパ内皮細胞に発現され続ける。このレセプターは、胚形成中の血管発達のために必須である。マウスに於けるＶＥＧＦＲ−３遺伝子の両方の複製を完全に不活性化したところ、性交後９．５日に於いて、欠陥管腔を有する組織化が異常な大きな血管によって特徴付けられる欠陥血管形成が発生し、心膜腔に於いて体液が貯留し、心血管不全が発生した。これらの知見に基づき、ＶＥＧＦＲ−３は、一次血管網状組織がより大きな血管に成熟するために必要であることが示唆されている。しかしながら、リンパ管の発達に於けるＶＥＧＦＲ−３の役割は、胚がリンパ系が現れる前に死亡した為、これらのマウスでは研究することができなかった。それにも拘わらず、ＶＥＧＦＲ−３は、胚形成及び成体生涯に於けるリンパ内皮細胞でのその特異的発現に依り、リンパ管系の発達とリンパ管形成（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）に役割を果しているものと推定される。これは、ＶＥＧＦＲ−３のリガンドであるＶＥＧＦ−Ｃのトランスジェニックマウスの皮膚に於ける偏位発現によって、リンパ内皮細胞の増殖と真皮に於ける血管の拡大が発生したという知見によってサポートされる。更に、これは、ＶＥＧＦ−Ｃが、リンパ内皮に於いて一次機能を有し、ＶＥＧＦと共通する脈管形成及び透過性調節に於いて二次機能を有している可能性があることを示唆している（ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）等、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９６  １５  ２９０−２９８）。
【００２５】
ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦレセプター系のインヒビターのいくつかは、抗脈管形成メカニズムを介して腫瘍の増殖を防ぐことが示されている。キム（Ｋｉｍ）等、Ｎａｔｕｒｅ，１９９３  ３６２  ８４１−８４４及びサレー（Ｓａｌｅｈ）等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９６  ５６  ３９３−４０１を参照。
【００２６】
発明の要旨
本発明は、一般に、図１（配列識別番号１）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して特異的に反応する抗体を有する組成物に関する。前記抗体は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）、免疫反応性フラグメント、又はその組換え体である。本発明の別実施例に於いて、前記組成物は、哺乳動物ＶＥＧＦＲ−２によって仲介されるＶＥＧＦ−Ｄの活性を干渉（ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ）する、および／又は、ＶＥＧＦ−Ｄの哺乳動物ＶＥＧＦＲ−３に対する結合を干渉することが可能な抗体を有する。特に好適な抗体は、ＶＥＧＦＲ−２によって仲介されるＶＥＧＦ−Ｄの活性を干渉する、および／又は、ＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦＲ−３に対する結合は干渉するが、ＶＥＧＦＲ−２に仲介されるＶＥＧＦの活性は干渉せず、ＶＥＧＦ−Ｃには結合しない。本発明は、更に、前記抗体を利用した薬用及び診断用組成物と方法とに関する。
【００２７】
第１の態様に依れば、本発明は、図１（配列識別番号１）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して特異的に反応する抗体を有する組成物を提供する。それら抗体の具体例は、２Ｆ８，４Ａ５，４Ｅ１０，５Ｆ１２，４Ｈ４及び３Ｃ１０と称されるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。
【００２８】
第２の態様に依れば、本発明は、ＶＥＧＦＲ−２によって仲介されるＶＥＧＦ−Ｄの活性を干渉する抗体を有する組成物を提供する。一好適実施例に於いて、この抗体は、更に、ＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦＲ−３に対する結合は干渉するが、ＶＥＧＦＲ−２に仲介されるＶＥＧＦの活性は干渉せず、ＶＥＧＦ−Ｃには結合しない。そのような抗体の具体例は、アイソタイプＩｇＧ1を有する抗体ＭＡｂ  ４Ａ５である。
【００２９】
第３の態様に於いて、本発明は、ＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦＲ−３に対する結合を干渉する抗体を有する組成物を提供する。
【００３０】
抗体は、従来技術の標準方法を使用して、図１（配列識別番号１）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は、このポリペプチドのフラグメントに対して育成することができる。更に、このポリペプチドは、アフィニティー精製を補助するべく、ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド（Ｓｉｇｍａ，セントルイス，ＭＯ）等の、エピトープタグにリンクさせることが可能である。いくつかの目的の為に、たとえば、抗体が臨床状況に於いてＶＥＧＦ−Ｄの作用を抑制するために使用される場合、等に於いては、ヒト化又はキメラモノクローナル抗体又は免疫反応性フラグメント、を使用することが望ましいかもしれない。これらを作成する方法を以下に示すが、これらは、又、組換えＤＮＡ法を含めて、当該技術に於いて周知である。
【００３１】
本発明のこれらの態様は、更に、ＭＡｂ、免疫反応性フラグメントや組換体を含み、それらは適切に標識出来る。
【００３２】
本発明の抗体は、検出可能標識で標識し、診断目的の為に利用することができる。前記抗体は、イメージングのために、適切な超磁性体、常磁性体、高電子密度、エコジェニック（ｅｃｏｇｅｎｉｃ）又は放射性物質と共役又は非共役結合させることができる。診断上のアッセイにおける使用では、放射性あるいは非放射性標識が使用される。放射性標識の具体例としては、125Ｉや32Ｐ等の、放射性原子又は原子団がある。非放射性標識の具体例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、又は、フルオレシン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等の蛍光標識がある。標識は、直接的あるいは間接的、共役あるいは非共役のものとすることができる。
【００３３】
本発明の第４の態様は、図１（配列識別番号１）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して特異的に反応するモノクローナル抗体の製造方法に関する。更に、このポリペプチドは、ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）等の、エピトープタグにリンクさせることが可能である。この方法は、免疫適格哺乳動物（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｍａｍｍａｌ）を、図１（配列識別番号１）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又は該ポリペプチドのフラグメントと、オプションとして、リンクされたエピトープタグとを有する免疫原によって免疫する工程と、前記免疫された免疫適格哺乳動物のリンパ球を、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記ハイブリドーマ細胞によって作り出されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を図１（配列識別番号１）に記載のアミノ酸配列を有する前記ポリペプチドに対する特異的結合活性に関してスクリーニングする工程と、図１（配列識別番号１）に記載のアミノ酸を有する前記ポリペプチドに対する特異的結合活性を有するＭＡｂを産生するハイブリドーマ細胞を、培地で培養して、増殖させ、および／又は、前記モノクローナル抗体を分泌させる工程と、前記モノクローナル抗体を前記培養上清から回収する工程、とを有する。
【００３４】
更に、ＶＥＧＦＲ−２に仲介されるＶＥＧＦ−Ｄの活性を干渉する、および／又は、ＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦＲ−３に対する結合を干渉するモノクローナル抗体を作る方法が提供される。この方法は、免疫適格哺乳動物を、図１（配列識別番号１）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又は該ポリペプチドのフラグメントと、オプションとして、リンクされたエピトープタグとを有する免疫原によって免疫する工程と、前記免疫された免疫適格哺乳動物のリンパ球を、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記ハイブリドーマ細胞によって作り出されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）をＶＥＧＦ−Ｄ干渉活性（ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）および／又はＶＥＧＦ−Ｄ結合干渉活性に関してスクリーニングする工程と、ＶＥＧＦ−Ｄ干渉活性および／又はＶＥＧＦ−Ｄ結合干渉活性を有するＭＡｂを産生するハイブリドーマ細胞を、培地で培養して、増殖させ、および／又は、前記モノクローナル抗体を分泌させる工程と、前記モノクローナル抗体を前記培養上清から回収する工程、とを有する。これら両方の方法に於いて、好適な免疫適格哺乳動物は、マウス又はラットである。
【００３５】
本発明の第５の態様は、図１（配列識別番号１）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して特異反応性の、又は、ＶＥＧＦ−２に仲介されるＶＥＧＦ−Ｄの活性を干渉する、および／又は、ＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦ−３に対する結合を干渉する、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞である。
【００３６】
本発明の第６の態様は、図１（配列識別番号１）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対して特異反応性の、又は、ＶＥＧＦ−２に仲介されるＶＥＧＦ−Ｄの活性を干渉する、および／又は、ＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦ−３に対する結合を干渉する、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作る方法を提供し、この方法は、免疫適格哺乳動物を、図１（配列識別番号１）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド又は該ポリペプチドのフラグメントと、オプションとして、リンクされたエピトープタグとを有する免疫原によって免疫する工程と、前記免疫された免疫適格哺乳動物のリンパ球を得る工程と、前記リンパ球を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を形成する工程と、前記ハイブリドーマ細胞によって作り出されたモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を図１（配列識別番号１）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異的結合活性および／又はＶＥＧＦ−Ｄ干渉活性および／又はＶＥＧＦ−Ｄ結合干渉活性に関してスクリーニングする工程と、図１（配列識別番号１）に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異的結合活性および／又はＶＥＧＦ−Ｄ干渉活性および／又はＶＥＧＦ−Ｄ結合干渉活性を有する前記モノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞を培養する工程、とを有する。
【００３７】
ここで、前記「培養」という用語は、それを増殖させることによる前記ハイブリドーマ細胞のクローニングと、上記抗体を分泌させるための前記ハイブリドーマの誘導、とをいう。
【００３８】
本発明の更に別の態様は、哺乳動物又は細胞培地中に於いてＶＥＧＦ−Ｄにより誘導される少なくとも一つの生物活性を干渉する方法であって、この方法は、効果的に生物活性を干渉する量の前記モノクローナル抗体を、前記哺乳動物に対して投与する、又は、前記細胞培地に対して添加する工程を有する。
【００３９】
「ＶＥＧＦ−Ｄによって誘導される生物活性」は、公知の方法によって容易にテストすることができる。具体的には、ＶＥＧＦ−Ｄは、血管内皮細胞および／又はリンパ内皮細胞の増殖又は分化を非限定的に含む、内皮細胞の増殖又は分化を刺激する能力を有する。考慮されるその他の生物活性としては、脈管形成、リンパ管形成、及び血管及びリンパ管の透過性の誘導、がある。
【００４０】
「抗体群」又は「抗体」という用語は、哺乳動物ＶＥＧＦＲ−２によって仲介されるＶＥＧＦ−Ｄの活性を干渉可能な、および／又は、ＶＥＧＦ−Ｄの哺乳動物ＶＥＧＦＲ−３に対する結合を干渉可能な、抗体を含む組成物をいう。特に好適な抗体は、ＶＥＧＦ−２よってに仲介されるＶＥＧＦ−Ｄの活性を干渉する、および／又は、ＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦ−３に対する結合は干渉するが、ＶＥＧＦ−２に仲介されるＶＥＧＦの活性は干渉せず、ＶＥＧＦ−Ｃには結合しない。
【００４１】
本発明の更に別の態様は、治療有効量の抗体と、その薬用的に許容可能な非毒性塩と、薬用的に許容可能な固体又は液体キャリア又はアジュバントとを有する薬用組成物の提供に関する。そのようなキャリア又はアジュバントの具体例としては、非限定的に、食塩水、緩衝食塩水、Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ溶液、ミネラルオイル、タルク、コーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、燐酸二カルシウム、塩化ナトリウム、アルギニン酸、デキストローズ、水、グリセロール、エタノール、濃化剤、安定化剤、懸濁剤、及びそれらの組み合わせがある。それらの組成物は、溶液、懸濁液、タブレット、カプセル、クリーム、塗剤（ｓａｌｖｅ）、エリキシル、シロップ、ウエハース、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、その他の従来の形状とすることができる。その製剤形態は、投与形態に適したものとされる。ＰＤＧＦ−Ｃを有する組成物は、約０．１ｗｔ．％〜９０ｗｔ．％、最も一般的には約１０％〜３０％の前記活性化合物（単数又は複数）を含んだものとなる。
【００４２】
投与の量と経路は、患者の性質と治療される状態とに応じたものとされ、それは担当医師又は獣医の裁量によったものとなる。適当な投与経路としては、経口、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈注射、非経口、局所塗布、移植、等がある。たとえば、有効量の抗体を、それを必要とする生物に対して、体重の約０．１〜１０００μｇ／ｋｇの投与量、投与する。
【００４３】
本発明の臨床応用としては、診断用途、及び、ガン、糖尿病網膜症、乾癬症、及び関節疾患（ａｒｔｈｏｐａｔｈｉｅｓ）の治療に於ける、脈管形成および／又はリンパ管形成の抑止（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）又は抑制（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）がある。従って、本発明は、更に、そのような治療を必要とする哺乳動物に於いて、脈管形成、リンパ管形成および／又は新血管形成、を干渉する方法であって、前記哺乳動物に対して有効量の抗体を投与する工程を有する方法にも関する。前記抗体は、少なくともＶＥＧＦＲ−２の活性化を阻止することによって、ＶＥＧＦ−Ｄの活性を干渉する。
【００４４】
更に、本発明のこの態様は、ガン、糖尿病網膜症、乾癬症、及び関節疾患のグループから選択される哺乳動物の病気に於いて、脈管形成、リンパ管形成および／又は新血管形成から成るグループから選択される少なくとも一つの生物活性を干渉する方法であって、効果的に脈管形成、リンパ管形成又は新血管形成を干渉する量の抗体を前記哺乳動物に投与する工程を有する方法を提供する。上述したように、前記抗体は、少なくとも部分的には、ＶＥＧＦＲ−２によって仲介されるＶＥＧＦ−Ｄの活性、および又はＶＥＧＦＲ−３に対するＶＥＧＦ−Ｄの結合、を干渉することによって、ＶＥＧＦ−Ｄの作用を干渉する。
【００４５】
前記抗体は、たとえば、血管透過性の増大から発生する肺に於ける体液の貯留に関連する圧迫性心不全等の状態を、前記体液貯留を妨げるために血管透過性に対して相殺作用（ｏｆｆｓｅｔｔｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）を提供することによって治療するために使用することができる。従って、本発明は、哺乳動物に於ける血管透過性の増大に依る、心臓および／又は肺の体液貯留を治療する方法を提供する。この方法は、その治療を必要とする前記哺乳動物に対して、効果的に血管透過性を減少させる量の抗体を投与する工程を有する。
【００４６】
本発明は、更に、生物サンプル中に於いてＶＥＧＦ−Ｄを検出する方法であって、前記サンプルを抗体に接触させる工程と、前記抗体に関係する結合を検出する工程とを有する方法を提供する。一好適実施例に於いて、前記結合および／又は結合の程度は、検出可能な標識によって検出され、適当な標識は上述した通りである。
【００４７】
更に別の態様に於いて、本発明は、典型的にはテストキット形態である診断／予後判定装置を提供する。たとえば、本発明の一実施例に於いて、図１（配列識別番号１）のポリペプチドに対する前記抗体と、この抗体とＶＥＧＦ−Ｄとの結合を検出するための手段とを有する、診断／予後判定装置が提供される。本発明のこの診断／予後判定装置の一好適実施例に於いて、図１（配列識別番号１）のポリペプチドに対する前記抗体（１次抗体）と同じアイソタイプで同じ動物源の抗体に対する第２の抗体（２次抗体）が提供される。この２次抗体は、検出可能標識に結合され、その後、非標識１次抗体又はＶＥＧＦ−Ｄが基質結合され、これによって、前記１次抗体とＶＥＧＦ−Ｄとの間の結合と、その後の前記標識２次抗体の前記１次抗体に対する結合との後の、基質に結合した標識の量を測定することによって、ＶＥＧＦ−Ｄ／１次抗体相互作用を確立することができる。本発明の特に好適な実施例に於いて、前記診断／予後判定装置は、従来式の酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）キットとして提供することができる。
【００４８】
更に別の態様に於いて、本発明は、ＶＥＧＦＲ−３とＶＥＧＦ−Ｄとの間の相互作用を干渉する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインを有するポリペプチドを基質に供する工程と、前記基質をＶＥＧＦ−Ｄと共に、同定対象化合物の存在下でインキュベートする工程と、ＶＥＧＦＲ−３とＶＥＧＦ−Ｄとの間の相互作用を検出する工程、とを有する。
【００４９】
更に別の態様に依れば、本発明は、組織中のリンパ管構造をイメージングする方法であって、前記組織を抗体に接触させる工程と、前記抗体の結合の発生を検出する工程とを有する方法、を提供する。
【００５０】
図面の簡単な説明
図１は、抗体を産生するのに使用されたポリペプチド（ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド無し）のアミノ酸配列（配列識別番号１）を図示している。
図２は、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△ＣへのＢａ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲ細胞の応答に対する前記モノクローナル抗体の作用を図示している。
図３Ａと図３Ｂは、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃに対する前記モノクローナル抗体の相対結合アフィニティーを図示している。
図４は、マウスＶＥＧＦ164へのＢａ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲ細胞の応答に対する前記モノクローナル抗体の作用を図示している。
図５は、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへのＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの結合に対する抗−ＶＥＧＦ−Ｄ  ＭＡｂの作用を図示している。
【００５１】
好適実施例の詳細な説明
図１は、抗体を育成するのに使用された、ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド無しのポリペプチドアミノ酸配列（配列識別番号１）を図示している。
【００５２】
例Ｉ：抗体産生
図１（配列識別番号１）に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドに対するモノクローナル抗体をマウス中で産生した。本発明の抗体を産生するために免疫源として使用されたポリペプチドは、そのＮ末端でタグされたＦＬＡＧ（登録商標）であった（下記の説明を参照）。このアミノ酸配列は、ＶＥＧＦ−Ｄの中心領域であり、それは、ＶＥＧＦファミリーのその他すべてのメンバと配列に於いて類似している。従って、ＶＥＧＦ−Ｄの生物活性部位は、その保存領域に恐らく存在しているものと考えられる。ヒトＶＥＧＦ−Ｄの残基９３から２０１の、即ちＮ及びＣ末端領域が除去された、切断部分（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｐｏｒｔｉｏｎ）をコードするＤＮＡフラグメントを、全長ヒトＶＥＧＦ−ＤｃＤＮＡを有するプラスミドをテンプレートとして使用して、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼによりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。その配列をヌクレオチド配列決定によって確認したこの増幅されたＤＮＡフラグメントを、次に、発現ベクターｐＥＦＢＯＳＳＦＬＡＧ（Ｗａｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｅｌｉｚａ  Ｈａｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＷＥＨＩ），メルボルン、オーストラリア、のクレア・マクファーレン（Ｃｌａｒｅ  ＭｃＦａｒｌａｎｅ）博士からの贈呈物）に挿入して、ｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃと称するプラスミドを得た。このｐＥＦＢＯＳＳＦＬＡＧベクターは、インターロイキン−３（ＩＬ−３）遺伝子及びＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチドからのタンパク質分泌物のためのシグナル配列をコードするＤＮＡを含んでいる。前記ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド（Ｓｉｇｍａ，セントルイス，ＭＯ）は、Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ，セントルイス，ＭＯ）等の市販の抗体によって認識可能である。ＶＥＧＦ−Ｄ  ＰＣＲフラグメントを、前記ベクターに挿入すると、ＩＬ−３シグナル配列は、前記ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチドのすぐ上流側に位置しているので、このオクタペプチドは前記切断ＶＥＧＦ−Ｄ配列のすぐ上流側に位置することになった。これら三つの配列はすべて、同じ読み取り枠内にあったので、ｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの哺乳動物細胞へのトランスフェクションから起こったｍＲＮＡの翻訳によって、そのＮ末端にＩＬ−３シグナル配列を有し、その後に、前記ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチドと前記切断ＶＥＧＦ−Ｄ配列を有するタンパク質が得られるであろう。前記シグナル配列の開裂と、それに続く細胞からの前記タンパク質の分泌とによって、Ｎ末端の近傍で前記ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチドによってタグされたＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドが得られるであろう。このタンパク質を、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃと命名した。ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを、前記プラスミドｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃと過渡的にトランスフェクトしておいたＣＯＳ細胞の培地から抗−ＦＬＡＧ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィーによって精製した（国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６の例９を参照）。
【００５３】
免疫されたマウスからの脾臓細胞の採収と、その後のこれら脾臓細胞のマウスミエローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＮＳ−１）細胞への融合の前の、８５日目（腹膜内）、７１日目（腹膜内）及び４日目（静脈内）に、精製されたＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを使用して、メスＢａｌｂ／Ｃマウスを免疫した。最初の二回の免疫に於いては、約１０μｇのＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃと、燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）とＴｉｔｅｒＭａｘアジュバント（＃Ｒ−１  リサーチアジュバント：ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）との１：１の混合物と、注射した。これに対して第３回目の免疫に於いては、ＰＢＳ中に含まれた３５μｇのＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを使用した。
【００５４】
ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃに対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を、酵素イムノアッセイを使用して精製ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ上でハイブリドーマによって産生されたＭＡｂをスクリーニングすることによって選択した。簡単に説明すると、９６−ウェルのマイクロタイタープレートを、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃでコーティングし、その後、ハイブリドーマ上澄みを添加し、４℃で２時間インキュベートし、その後、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中で６回洗浄した。その後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）とのインキュベーションを１時間、４℃で行った。洗浄後、前記アッセイを、２，２‘−アジノ−ジ−（３−エチルベンズ−チアゾリンスルホン酸（ＡＢＴＳ）基質システム（Ｚｙｍｅｄ，サンフランシスコ，ＣＡ）で発現させ（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）、そのアッセイを、マルチウェルプレートリーダー（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＭＣＣ／３４０，ＭｃＬｅａｎ，ＶＡ）で４０５ｎｍでの吸光度を読み取ることによって量化した。更なる分析のために６の抗体を選択し、これらを、制限希釈によって２回サブクローニングした。これらの抗体を２Ｆ８，３Ｃ１０，４Ａ５，４Ｅ１０，４Ｈ４及び５Ｆ１２と命名した。これらの抗体のアイソタイプを、ＩｓｏｓｔｒｉｐTMアイソタイプキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，インディアナポリス，ＩＮ）を使用して判定した。抗体２Ｆ８，４Ａ５，４Ｅ１０及び５Ｆ１２はＩｇＧ1クラスであったのに対して、４Ｈ４と３Ｃ１０はＩｇＭクラスであった。これら６つの抗体はすべてカッパＬ鎖（ｋａｐｐａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）を含んでいた。
【００５５】
例ＩＩ：抗体の精製
ハイブリドーマ細胞ラインを、５％ｖ／ｖのＩｇＧ−欠乏血清（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、５ｍＭのＬ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び１０μｇ／ｍｌの組換えＩＬ−６を含むでダルベッコ調整イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で育成した。抗体２Ｆ８，４Ａ５，４Ｅ１０及び５Ｆ１２を、ダービー（Ｄａｒｂｙ）他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５９：１２５−１２９，１９９３の方法によって、プロテインＧ−セファロースを使用したアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、その産物を２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって評価した。
【００５６】
例ＩＩＩ：ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃに対する抗体の結合アフィニティー
ヒトＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃに対する、前記４つの抗−ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ  ＭＡｂ、２Ｆ８，４Ａ５，４Ｅ１０及び５Ｆ１２の相対的結合アフィニティーを、ナイス（Ｎｉｃｅ）とカチメル（Ｃａｔｉｍｅｌ）の方法，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ２１：３３９−３５２，１９９９に依る表面プラスモン共振を使用したバイオセンサ研究によって、これらの相互作用に対する結合反応（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）の分析によって判定した。ＶＥＧＦＲ−２−ＦＬＡＧ，ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇ及び抗−ＶＥＧＦ−Ｄモノクローナル抗体を、ナイス（Ｎｉｃｅ）とカチメル（Ｃａｔｉｍｅｌ），Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ２１：３３９−３５２，１９９９に記載されているように標準アミン結合化学作用を使用したセンサーチップのカルボキシメチル化デキストラン層に結合させた（それぞれ、４．７，５．２，５．７及び５．６ｎｇ／ｍｍ2に対応して固定化されたＶＤＩ  ４７３９ＲＵ，ＶＤ２  ５２６８  ＲＵ，ＶＤ３  ５７８１  ＲＵ及びＶＤ４  ５６３４  ＲＵ（ステンバーグ（Ｓｔｅｎｂｅｒｇ）他、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ４３：５１３−５２６，１９９０））。リガンド結合を、ＢＩＡｃｏｒｅ３０００光学バイオセンサ（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用して、分析した。固定化レベルの自動的標的化を、ＢＩＡｃｏｒｅ３．１制御ソフトウエア（カチメル（Ｃａｔｉｍｅｌ）他、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．７７６：１５−３９，１９９７）を使用して達成した。固定化後、残余の活性化エステル基を、１ＭのエタノールアミンヒドロクロリドｐＨ８．５による処理によってブロックした。その後、１０ｍＭのジメチルアミンでの洗浄によって、非共役結合物質を除去するとともに、分析間のセンサ表面を再生した。アッセイのサンプルを、ランニングバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で希釈した。ヒトＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを表面（４１−６８９ｎＭ）上で１０μｌ／分の流量で流すことによって結合曲線が得られた。ヒトＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃに対する抗体の相対結合アフィニティーの判定の為に、カチメル（Ｃａｔｉｍｅｌ）他、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ．７７６：１５−３９，１９９７に記載されているように、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用してデータを分析した。最初の分離相を分析したｋdを得て、次に、これを使用して１：１ラングミュアモデルが有効である曲線の関連領域のグローバル分析を固定（ｃｏｎｓｔｒａｉｎ）することによって結合定数が得られた。ヒトＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃに対する抗体の相対的結合アフィニティーのこれらの分析を下記の表に示す。抗体は固定化されていたので、前記リガンドの原子価（ｖａｌｅｎｃｙ）は１と見做された。全ての抗体は、ｋsが７．４〜１０．７ｘ１０4Ｍ-1ｓ-1、ｋdが２．１〜５．２ｘ１０-3ｓ-1で、類似のアフィニティー（ｋDが３０〜６０ｎＭ）を示した。
【００５７】
【表１】
0004632543.tif 000002
【００５８】
例ＩＶ：ＶＥＧＦＲ−２によって仲介されるＶＥＧＦ−Ｄの活性を干渉する抗体
国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１４６９６の例７に記載されているバイオアッセイを使用して、前記精製モノクローナル抗体（ＭＡｂ）２Ｆ８，４Ａ５，４Ｅ１０及び５Ｆ１２の、マウスＶＥＧＦＲ−２（ＦｌｋｌとＮｙｋとしても知られている）によって仲介されるＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの活性を干渉する能力をテストした。前記バイオアッセイは、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１６７５５にも記載されている。このアッセイは、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと、エリトロポイエチンレセプター（ＥｐｏＲ）の細胞質ドメインとから成るキメラレセプターをコードするプラスミド構造物でトランスフェクトされたＢａ／Ｆ３  ｐｒｅ−Ｂ細胞（Ｂａ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲ細胞）を使用するものである。これらの細胞は、ルーチン的にインターロイキン−３（ＩＬ−３）で継代（ｐａｓｓａｇｅｄ）され、ＩＬ−３の不在下では死滅する。しかしながら、もしも前記キメラレセプターの細胞質ドメインからシグナリングが誘導されれば、これらの細胞はＩＬ−３の不在下で生存し増殖する。そのようなシグナリングは、前記キメラレセプターのＶＥＧＦＲ−２細胞外ドメインに結合するリガンドによって誘導される。従って、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ又はＶＥＧＦのＶＥＧＦＲ−２細胞外ドメインへの結合によって、前記細胞は、ＩＬ−３の不在下で生存、増殖される。そのようなリガンドの前記細胞外ドメインへの結合、又は、前記細胞質ドメインの活性化、を干渉する抗体の添加によって、ＩＬ−３の不在下に於ける細胞死が起こる。前記キメラレセプターを欠く親Ｂａ／Ｆ３細胞は、ＩＬ−３の不在下に於いてＶＥＧＦ／Ｄ△Ｎ△Ｃ又はＶＥＧＦによって誘導されて増殖せず、これは、これらのリガンドに対するＢａ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲ細胞の応答が前記キメラレセプターに完全に依存するものであることを示している。
【００５９】
精製されたＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃのサンプルを、種々の量の抗体と、１時間４℃で、この混合物をＩＬ−３欠如細胞培養培地との１：１０の希釈の前に、ＰＢＳ中でインキュベートした。これによって得られた媒質（ｍｅｄｉａ）は、約５００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃと、最高１００μｇ／ｍｌまでの種々の濃度の抗体とを含有していた。次に、Ｂａ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲ細胞を、前記媒質中で４８時間、３７℃でインキュベートした。次に、ＤＮＡ分析を、採収の前に、１μＣｉの3Ｈ−チミジンの添加と、更に４時間インキュベーションすることによって、量化した。導入された3Ｈ−チミジンを、セル-ハーベスター（Ｔｏｍｔｅｃ（登録商標），オレンジ、Ｃｏｎｎ）とベータ計数とを使用して測定した。ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃに対するＢａ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲの増殖応答に対する抗体２Ｆ８，４Ａ５，４Ｅ１０及び５Ｆ１２の作用が図２に図示されており、ここで、データポイントは、二つの実験の平均を示し、エラーバーは、各ポイントに於ける二つの実験の範囲を表わしている。
【００６０】
抗体４Ａ５は、投与量依存的にＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃに対するＢａ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲ細胞の応答を阻止した（図２）。培養培地に抗体４Ａ５を４０μｇ／ｍｌ添加することで、細胞の応答を完全に阻止するのに十分であった。これに対して、その他の三つの抗体は、ほぼ８０μｇ／ｍｌの濃度に於いても、応答に対して検出可能な作用を示さなかった。これらの結果は、抗体４Ａ５が、ＶＥＧＦＲ−２によって仲介されるＶＥＧＦ−Ｄの活性を干渉することを示している。抗体４Ａ５を産生するマウスハイブリドーマ細胞４Ａ５Aは、既にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｍａｎａｓｓａｓ，ｖａ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡに１９９９年４月１６日に寄託されている（ＡＴＣＣ＃ＨＢ−１２６９８）。この寄託は、特許手続の為の微生物寄託の国際認識に関するブタペスト条約の要求に基づいて行われた。
【００６１】
例Ｖ：抗体の、ＶＥＧＦ−Ｄが固定化ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３に結合することを干渉する能力のテスト
例ＩＶのバイオアッセイに於ける抗体４Ａ５の抑制作用は、この抗体が、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃのレセプターへの結合、又は、その後のレセプタークロスリンクを妨げる作用である可能性がある。例ＩＶのバイオアッセイでは、これら二つによる干渉の異なるメカニズムを区別することができない。前記４種類の抗−ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ  ＭＡｂ，２Ｆ８，４Ａ５，４Ｅ１０及び５Ｆ１２の、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃのそれぞれのレセプターへの結合に対する作用を直接調べるために、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃと固定化レセプター細胞外ドメインとの相互作用をバイオセンサーを使用して分析した。マウスＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイン（ＶＥＧＦＲ−２−ＦＬＡＧ）と、ヒトＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと、ヒトＩｇＧ1のＦｃ部分（ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇ）とから成るキメラタンパク質とを、例ＩＩＩに記載したようにセンサーチップ上に固定した（４６７７と５１１３ＲＵとは、それぞれ４．７，５．１ｎｇ／ｍｍ2に均等に固定）。前記抗体のレセプター相互作用に対する影響を、種々の濃度（３７．５〜１２００ｎＭ）のＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの抗体とＰＢＳ中で４℃で１時間予めインキュベートしておいた精製ヒトＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ（６１ｎＭ）との混合物を流すことによって測定した。図３Ａ及び３Ｂに図示されているように、２ｎｇ／ｍｌのヒトＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃと、種々の濃度の抗体とを含む前記混合物の３０μｌのアリコットを、１０μｌ／ｍｌの流率で前記センサーチップ上に注入した。図３Ａ及び３Ｂは、このアッセイの結果を示している。抗体４Ａ５は、両方のレセプターへの結合をほぼ完全に阻止するのに十分であった。抗体２Ｆ８と５Ｆ１２とも、両方のレセプターとの相互作用を抑制したが、但し、４Ａ５よりも遥かに高い抗体濃度に於いてであった。両方のレセプターに対する結合をほぼ完全に阻止するために、約４０倍のモルの２Ｆ８及び５Ｆ１２が必要であった。これに対して、４Ｅ１０は、僅かな作用しかなかった。これらのデータは、抗体４Ａ５，２Ｆ８及び５Ｆ１２は、ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的機能の分析と、臨床用途に於いてＶＥＧＦ−Ｄの生物活性を抑制するのとに有用であろう、ということを示している。結合の抑制の率を、競合物質（ＲＵｃ）の存在下に於ける分離段階の初期に観察されたバイオセンサシグナルと、非特異的対照抗体（抗−ＥＧＦＲ  ＭＡｂ  ５２８（８））（ＲＵｔ）の存在下に於いてＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを２μｇ／ｍｌで注入した時に観察されたシグナルとを使用して、次の式：％競合＝ＲＵｔ−ＲＵｃ／ＲＵｔ  ｘ  １００によって計算した。
【００６２】
例ＶＩ：抗体の、ＶＥＧＦＲ−２によって仲介されたＶＥＧＦの活性を干渉する能力のテスト
対照として、抗体の、Ｂａ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲ細胞の精製マウスＶＥＧＦ164に対する増殖反応を干渉する能力をテストした。これらのテストの結果を図４に示す。前記抗体はいずれも、前記細胞のマウスＶＥＧＦ164に対する増殖反応に対して有意な作用を示さなかった。これらの結果は、抗体４Ａ５は、ＶＥＧＦＲ−２によって仲介されるＶＥＧＦ−Ｄの活性は干渉するが、このレセプターによって仲介されるＶＥＧＦの活性は干渉しないということを示している。
【００６３】
例ＶＩＩ：抗体のＶＥＧＦ−Ｃに結合する能力のテスト
上述したものと同じ酵素イムノアッセイを使用して、前記６種類のＶＥＧＦ−Ｄ  ＭＡｂの、ＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃに結合する能力をテストした。ＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃは、ＶＥＧＦ−ＣのＶＥＧＦ相同ドメイン（ＶＨＤ）（残基１０３〜２１５）から成り、これは、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃに対してほぼ同一であるＶＥＧＦ−Ｃの領域である。そのＣ末端に予め６Ｘヒスチジンタグを添加しておいたＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃを、製造業者の指示に従って、発現ベクタｐＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，サンディエゴ，ＣＡ）を使用して酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのＧＳ１１５株において発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ，バレンシア、ＣＡ）を使用して精製した。このイムノアッセイによってテストされた前記６種類の抗体の内、４Ｅ１０のみがＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃに結合した。
【００６４】
例ＶＩＩＩ：ＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦＲ−３への結合を干渉する抗体
イン・ヴィトロレセプター結合アッセイを使用して、前記４種類の抗−ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ  ＭＡｂ、２Ｆ８，４Ａ５，４Ｅ１０及び５Ｆ１２が、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへのＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの結合を干渉する能力をテストした。ヒトＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインと、ヒトＩｇＧのＦｃ部分とから成るキメラタンパク質をコードするプラスミド構造物（Ｋ．Ｐａｊｕｓｏｌａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ヘルシンキ）を、その製造業者の指示に従って、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）を使用して２９３−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトした。前記キメラタンパク質を、プロテインＡセファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＫ）と一晩４℃でゆっくりと攪拌させ、１００ｍＭのグリシン−ＨＣｌ，ｐＨ２．８で溶出させることによって細胞上清から精製した。溶出液中の前記キメラタンパク質の存在を、ウェスタンブロット分析用のサンプルの小部分を、ペルオキシダーゼ結合アフィニティー精製ヤギ抗−ヒトＩｇＧ，Ｆｃフラグメント−特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ．，ウエストグルーブ，ＰＡ）と使用して確認した。前記サンプルの残りを、５０ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ９．６）と１：３で希釈し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，ベバリー，ＭＡ）を使用して約４倍に濃縮し、９６−ウェルマイクロタイタープレート（Ｌｉｎｂｒｏ／Ｔｉｔｅｒｔｅｋ，ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，オーロラ、ＯＨ）のウェル中で、３７℃で１時間インキュベートした。前記キメラタンパク質を含有する溶液を除去した後、プレートを、ＰＢＳと０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＴ２０）とでよく洗浄し、ＰＢＳ中で１％のウシ血清アルブミンで、室温で３０分間ブロックした。これらのプレートを、ＰＴ２０で再度洗浄し、次に、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ（７．３μｇ／ｍｌ）とＭＡｂとを含有するＰＢＳと共に室温で１時間インキュベートした。前記マイクロタイタープレートを添加する前に、前記ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△ＣとＭＡｂとは、予め、１時間、４℃でインキュベートしておいた。ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△ＣとＭＡｂとの溶液とのインキュベーション後、前記プレートを、ＰＴ２０で洗浄し、３．５μｇ／ｍｌのビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）Ｍ２抗−ＦＬＡＧ  ＭＡｂ（Ｓｉｇｍａ，セントルイス、ＭＯ）を含有するＰＢＳと、２時間４℃で振とうすることによってインキュベートした。ポリヌクレオチドがＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド（Ｓｉｇｍａ，セントルイス、ＭＯ）によつてＮ末端にタグされているので、Ｍ２  ＭＡｂを使用して、前記レセプター−結合アッセイに於いてＶＥＧＦＲ−３に結合したＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを検出するために使用することができた。これらプレートを、次に、ＰＴ２０で洗浄し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ共役物（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ）と１時間４℃で振とうすることによってインキュベートし、ＰＴ２０で再び洗浄した。次に、このアッセイを、ＡＢＴＳ基質システム（Ｚｙｍｅｄ，サンフランシスコ、ＣＡ）で発現させ、マルチウェルプレートリーダ（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＭＣＣ／３４０，ＭｃＬｅａｎ，ＶＡ）で４１４ｎｍでの吸光度を読み取ることによって量化した。
【００６５】
前記アッセイに於いて二つのネガティブコントロールが発現した。第１に、２９３−ＥＢＮＡ細胞を、ヒトＶＥＧＦＲ−１の細胞外ドメインと、ヒトＩｇＧのＦｃ部位とから成るキメラタンパク質を発現するプラスミド構造物（Ｅ．Ｋｏｒｐｅｌａｉｎｅｎ，Ｈａａｒｔｍａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ヘルシンキ）とトランスフェクトした。２９３−ＥＢＮＡ細胞のトランスフェクション、キメラタンパク質の精製、ウェスタンブロットによる分析、及び結合アッセイ（ＭＡｂの不在下）は、全く上述したものと同様に行われた。ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△ＣはＶＥＧＦＲ−１に結合しないので、ＶＥＧＦＲ−１／Ｉｇタンパク質は、前記アッセイのネガティブコントロールとして作用する。第２に、２９３−ＥＢＮＡ細胞を、ＶＥＧＦレセプターをコードする配列が欠如した発現ベクターとトランスフェクトした。これらの細胞からの培養上清を、ＶＥＧＦＲ−３／ＩｇとＶＥＧＦＲ−１／Ｉｇキメラタンパク質とを含むものと全く同様に使用した。
【００６６】
前記４種類のＭＡｂがＭ２  ＭＡｂのＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃへの結合を干渉するか否かをテストするために、アフィニティー精製ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを、５０ｍＭの重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中で３７℃、１時間のインキュベーションによってマイクロタイタープレートの表面上にコーティングした。次に、これらプレートを、ＰＴ２０で洗浄し、抗−ＶＥＧＦ−Ｄ  ＭＡｂの存在下又は不在下で、１時間４℃でインキュベートし、ＰＴ２０で再び洗浄し、ビオチン化Ｍ２  ＭＡｂとインキュベートし、洗浄し、発現し、上述したようにして量化した。これらのコントロールアッセイは、一定量のＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃと、前記レセプター結合アッセイに於いて使用したものと同じ濃度範囲の前記４種類の抗−ＶＥＧＦ−Ｄ  ＭＡｂとを使用して行われた。更に、一定濃度の各ＭＡｂ（２００μｇ／ｍｌ）と、約１００倍の濃度範囲のＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃとで対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）を行った。これら両セットのコントロールに於いて、ビオチン化Ｍ２  ＭＡｂによるＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの検出は、これらアッセイに於ける抗−ＶＥＧＦ−Ｄ  ＭＡｂ又はＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの濃度と関係無く、抗−ＶＥＧＦ−Ｄ  ＭＡｂの存在下又は不在下に於いて同じであった。これらのコントロールアッセイは、テストされたこれら４種類のＭＡｂのいずれも、Ｍ２  ＭＡｂのＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃへの結合に対してなんら影響しないことを示した。
【００６７】
前記４種類のＶＥＧＦ−Ｄ  ＭＡｂの、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△ＣのＶＥＧＦＲ−３への結合に対する作用を図４に示す。ＭＡｂ濃度は、前記マイクロタイタープレートのウェル中に於けるＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃとの溶液中の各ＭＡｂの濃度を示している。各曲線は、二つのアッセイの結果を表わし、エラーバーは、各抗体濃度に於いて二つの実験で測定された吸光度の範囲を示している。ＭＡｂ  ４Ｅ１０は、２００μｇ／ｍｌの濃度までは、この相互作用にたいして作用を示さなかった。これに対して、ＭＡｂ  ４Ａ５は、２５μｇ／ｍｌの濃度で、前記リガンドとＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインとの間の相互作用をほぼ完全に妨げるのに十分であった。ＭＡｂ  ２Ｆ８と５Ｆ１２とは、９０μｇ／ｍｌ以上の濃度に於いて僅かな抑制作用しか示さず、これらは、４Ａ５の作用と比較すると顕著に低いものであった。ＶＥＧＦＲ−１／Ｉｇキメラタンパク質を発現する細胞、又はＶＥＧＦレセプター誘導体を発現しない細胞は、ＭＡｂ  ４Ａ５が２００μｇ／ｍｌの濃度で含まれていた時、即ち、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△ＣとＶＥＧＦＲ−３との相互作用が完全に妨げられた時、のＶＥＧＦＲ−３／Ｉｇアッセイのそれに等しい吸光度を示した。これは、これらアッセイに於けるＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃのマイクロタイタープレートに対する結合が、ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインに依存していることを示すものであった。
【００６８】
以上の説明及び例は、本発明を単に例示するためのものであって、限定的なものではない。当業者は本発明の精神及び要旨を含むここに開示した実施例の改変を想到する可能性があるので、本発明は、添付のクレームの範囲に含まれるそれらすべての改変構造及びそれらの均等物を含むものと広く解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】抗体を育成するのに使用されたポリペプチド（ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド無し）のアミノ酸配列（配列識別番号１）を示している図
【図２】ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△ＣへのＢａ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲ細胞の応答に対する前記モノクローナル抗体の作用を示している図
【図３Ａ】ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃに対する前記モノクローナル抗体の相対結合アフィニティーを示している図
【図３Ｂ】ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃに対する前記モノクローナル抗体の相対結合アフィニティーを示している図
【図４】マウスＶＥＧＦ164へのＢａ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲ細胞の応答に対する前記モノクローナル抗体の作用を示している図
【図５】ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインへのＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの結合に対する抗−ＶＥＧＦ−Ｄ  ＭＡｂの作用を示している図
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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