(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を処理する方法であって、
（ａ）核酸試料を変性させる工程；
（ｂ）重亜硫酸塩試薬と前記変性した核酸試料を反応させ、該反応物をインキュベートして、前記核酸試料中のメチル化シトシンは変換されず、非メチル化シトシンはウラシルに変換された、処理済み核酸試料を形成する工程；
（ｃ）核酸沈殿工程に実質的に影響を与えないレベルまで塩濃度を低減させるために、前記処理済み核酸試料を希釈する工程；
（ｄ）前記処理済み核酸試料から不要な試薬又は希釈剤を全て実質的に除去するために、前記希釈した処理済み核酸を沈殿させる工程；及び
（ｅ）前記処理済み核酸上に存在するスルホン酸塩基を除去し、スルホン酸塩基を実質的に含まない核酸試料を得るために、３７℃又は５５℃の温度で、緩衝液又はアルカリ試薬を用いて前記処理済核酸をｐＨ１０．５に調整することにより、前記沈殿した処理済み核酸の脱スルホン化を行う工程
を含む方法。
【請求項２】
（ｆ）前記処理済み核酸試料を加工又は分析する工程、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料がＤＮＡを含むか、前記試料がＲＮＡを含むか、前記試料がＤＮＡ及びＲＮＡの両方の組合せを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
反応容器の中で実施される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記反応容器が、チューブ、プレート、キャピラリー、ウェル、遠心分離用チューブ、マイクロフュージ管、スライド、カバースリップ及び表面からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記重亜硫酸塩試薬がメタ重亜硫酸ナトリウムである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記変性が、前記核酸試料にアルカリを添加することによって実施される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記アルカリが、ＮａＯＨ、ＫＯＨ又はヒドロキシル基を提供するあらゆる化合物又は作用物質である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記変性が、前記核酸試料を加熱することにより実施される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記加熱が約９５℃までである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記加熱が５０℃〜７０℃である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程（ｂ）が、前記重亜硫酸塩反応を増強可能な、キノール、尿素、メトキシアミン及びそれらの混合物からなる群から選択される添加剤の存在下で実施される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記添加剤がキノールである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸試料中のメチル化シトシンは変換されず、非メチル化シトシンがウラシルに変換される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程（ｃ）が、約０．５Ｍ未満まで塩濃度を低減させるように水を用いて行われる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程（ｄ）がアルコール沈殿剤を用いて行われる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記アルコール沈殿剤が、イソプロパノール、エタノール、ブタノール、メタノール及びそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アルコール沈殿剤がイソプロパノールである、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸特にメチル化された核酸を重亜硫酸塩を用いて処理するための修正された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自動化されたシーケンシング技術における進歩の結果として、ヒトゲノムを含む数多くの動物ゲノムの完全なシーケンシングもたらすＤＮＡのコーディング領域の決定に関する多くの研究作業が実施されてきた。しかしながら、長年にわたり、ゲノムＤＮＡの大部分は非コーディングＤＮＡであるものと認識されてきており、この部分はかつて「ジャンク」ＤＮＡとみなされていた。ＤＮＡの非コーディング領域の分析は現在、遺伝子発現及び機能の研究において重要なものとみなされている。核酸特にゲノムＤＮＡ中のメチル化状態又はパターンは、動物の体内での遺伝子の発現及び制御において機能的又は調節的役割をもつと考えられている。
【０００３】
一本鎖ＤＮＡ中において重亜硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ）は、５−メチルシトシンからチミンへの脱アミノ化の速度が非常に遅いのに比べ、シトシンを優先的にウラシルへと脱アミノ化することが示された（シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ）Ｒ．、ジフェート（ＤｉＦａｔｅ）Ｖ．、及びウェルチャー（Ｗｅｌｃｈｅｒ）Ｍ．、（１９７４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９６；９０６−９１２）。この観察事実は、フロマー（Ｆｒｏｍｍｅｒ）ら、１９９２〔本明細書に参照により援用されているフロマー（Ｆｒｏｍｍｅｒ）Ｍ、マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）ＬＥ、ミラー（Ｍｉｌｌａｒ）ＤＳ、コリス（Ｃｏｌｌｉｓ）ＣＭ、ワット（Ｗａｔｔ）Ｆ、グリッグ（Ｇｒｉｇｇ）ＧＷ、モロイ（Ｍｏｌｌｏｙ）ＰＬ及びポール（Ｐａｕｌ）ＣＬ。ＰＮＡＳ８９；１８２７−１８３１（１９９２）〕の重亜硫酸塩ゲノム配列決定プロトコルの開発のための基礎として役立った。要約すると、現在実践されているこの方法には、ＤＮＡのアルカリ変性；重亜硫酸ナトリウムを用いた脱アミノ化；脱塩による脱スルホン化とそれに続く水酸化ナトリウム処理；中和及び脱塩といった一般的工程が関与している。
【０００４】
重亜硫酸塩修飾手順及びその確立された変形手順がもつ主要な欠点の１つは、該手順が、結果としてもとの投入ＤＮＡの８４〜９６％を分解してしまうことが示された点にある（グルナウ（Ｇｒｕｎａｕ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）２９（１３）ｅ６５：（２００１））。該手順に付随する高い損失は、少数の細胞をそのメチル化状態についてうまく分析すること、又は、ＤＮＡがすでに部分的に分解した状態にある古いアーカイブ標本をうまく分析することが事実上非常に困難であるということを意味している。さらに、ＤＮＡは、細かく断片化され、配列中に莫大な数の「ギャップ」を有することから、現行の方法では、その固有の分解のため十分にクローニング、シーケンシング及びアセンブルができず、公共のヒトゲノムプロジェクト（国際ヒトゲノム配列決定共同事業体（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）、２００１、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、４０９、８６０−９２１）又は民間のＣＥＬＥＲＡ配列決定プロジェクト（Ｊ．クレイグ・ベンター（Ｃｒａｉｇ  Ｖｅｎｔｅｒ）ら、２００１、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２９１、１３０４−１３５１）によりうまく応用されてきたのと同じ要領でその全ゲノムメチル化プロフィールを決定するために１つの生体の完全なゲノムを配列決定し組立てることは不可能である。
【０００５】
現在実践されている重亜硫酸塩方法のさらなる欠点は、一般に小さなＤＮＡフラグメントしか増幅できないという点にある。経験は、一般に約５００未満の塩基対（ｂｐ）しかうまく処理及び増幅され得ないということを示している。現行の技術は、一般に約５０ｋｂまでという大きな未処理ゲノムＤＮＡ領域を増幅することを可能にした長距離ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）といったような新しい分子生物学的方法には応用できない。現在のところ、哺乳動物ゲノム内の多数の遺伝子の長さが５０ｋｂを超えることから、無傷の遺伝子のメチル化状態を分析することさえ不可能である。
【０００６】
比較的小さい遺伝子（＜４ｋｂ）のメチル化状態を見るためには、ＰＣＲ反応を、問題の遺伝子領域全体にわたって互い違いにしなくてはならなかった（Ｄ．Ｓミラー（Ｍｉｌｌａｒ）、Ｋ．Ｋオウ（Ｏｗ）、Ｃ．Ｌ．ポール（Ｐａｕｌ）、Ｐ．Ｊ．ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）、Ｐ．Ｌ．モロイ（Ｍｏｌｌｏｙ）、Ｓ．Ｊ．クラーク（Ｃｌａｒｋ）、１９９９、癌遺伝子（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）１８（６）：１３１３−２４；ミラー（Ｍｉｌｌａｒ）ＤＳ、ポール（Ｐａｕｌ）ＣＬ、モロイ（Ｍｏｌｌｏｙ）ＰＬ、クラーク（Ｃｌａｒｋ）ＳＪ．（２０００）、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ；２７５（３２）；２４８９３−９）。ここで、重亜硫酸塩ＤＮＡ処理のために用いられている方法は、同様に、労力と時間のかかるものでもあった。標準的方法は、ゲノムＤＮＡの一部の領域の非変換といったような問題の削減を試みるために、標準的に多数の管変更、カラム精製、透析、アガロースビーズ内へのＤＮＡの包埋又は反応に対する添加剤の添加を必要とする。かくして、実質的なＤＮＡ分解を導かず、現行のＤＮＡ処理に付随する多数の問題を克服するか又は少なくとも削減するより信頼性の高い方法が必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、数多くの異なる分子生物学技術と共に使用するために適合可能で、効率が良くかつ核酸の有意な維持を達成することのできる、本書でヒューマン・ジェネティック・シグネチャーズ（ＨＧＳ）重亜硫酸塩方法又は本発明の方法と呼ぶ核酸の改良型重亜硫酸塩処理方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、１つの実施形態においては、核酸を処理するための方法を提供している。該方法は、核酸試料を変性する工程；重亜硫酸塩試薬で核酸試料をインキュベートしかくしてスルホン酸塩基でメチル化ヌクレオチドを修飾する工程；修飾済み核酸試料を希釈する工程；修飾済み核酸試料を沈殿させる工程；及び修飾済み核酸試料を反応させてスルホン酸塩を除去する工程を含むことができる。核酸の変性は、例えばアルカリでの処理によって実施可能である。
【０００９】
もう１つの実施形態においては、本発明は、核酸を処理する方法において、
（ａ）核酸試料に対し変性環境を提供する工程；
（ｂ）重亜硫酸塩試薬と前記核酸試料を反応させ、該反応物をインキュベートして、前記核酸試料中のメチル化されたヌクレオチドは変換されず、非メチル化ヌクレオチドは別の形態に変換された、処理済み核酸試料を形成する工程；
（ｃ）核酸沈殿工程に実質的に影響を与えないレベルまで塩濃度を低減させるために、前記処理済み核酸試料を希釈する工程；
（ｄ）前記処理済み核酸試料から不要な試薬又は希釈剤を全て実質的に除去するために、前記希釈した処理済み核酸を沈殿させる工程；及び
（ｅ）スルホン酸塩基を実質的に含まない核酸試料を得るために、前記処理済み核酸上に存在するスルホン酸塩基を除去するように前記沈殿した処理済み核酸の脱スルホン化を行う工程を含む方法を提供している。
【００１０】
該方法は標準的に、試料中の出発核酸の約５０％以上、一般的には約７５％以上そして場合によっては約９５％以上を維持する。本発明の方法は、核酸試料の実質的な分解又は喪失を全くひき起こすことなく実施することができる。これに対して、現在使用されている又は先行技術で記述されている重亜硫酸塩方法は、核酸試料の約９６％までの喪失を標準的に結果としてもたらし、そのため分析のために実際利用可能であるのは核酸の約４％にすぎない。
【００１１】
該方法は、さらに、
（ｆ）処理済み核酸試料をさらに加工又は分析する工程を含んでいてよい。
【００１２】
試料はＤＮＡ又はＲＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡの両方の組合せを含むことができる。
【００１３】
先行技術の方法とは異なり、重亜硫酸塩試薬から処理済み核酸を完全に分離又は単離する必要は全く無い。例えば先行技術の方法により現在必要とされているように、クロマトグラフィ分離方法を利用する必要性は全く無い。本発明に従った希釈工程は、試料の損失を最小限におさえるのを助ける。
【００１４】
本発明は同様に、試薬の入ったキット及び本発明に従った方法を実施するための説明書にも関する。
【００１５】
本明細書全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」又は「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」というその変形形態は、記述された要素、整数又は工程又はその群の内含を意味するもののその他のあらゆる要素、整数又は工程又はその群の除外を意味しないものとして理解される。
【００１６】
本明細書の中に含み入れられた文献、行為、材料、デバイス、物品などについての論述は全て、本発明についての前後関係を提供することのみを目的としたものにすぎない。これは、これらの事項のいずれか又は全てが先行技術の基礎の一部を成す又は本出願の各請求項の優先日以前にオーストラリアに存在していた通りの本発明に関連する分野における共通の一般的知識であったということの是認として考えられるべきものではない。
【００１７】
本発明をより明確に理解できるようにするため、以下の図面及び実施例を参考にして、好ましい実施形態について説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
核酸を処理するための実施形態が以下の制限的意味のない詳細の中で記述されている。
【００１９】
本発明は、核酸の処理及び分析方法を提供する。該方法は、それらが核酸の修飾のための単純でかつきわめて効率の良い方法を提供し例えばゲノムＤＮＡ又はＲＮＡのメチル化パターン又はメチル化変化を検査するために使用可能であるという点で有利である。本発明の方法は、以前に知られていた方法に比べてさらに高い収量をもつ単純化された手順及びさらに高い分子量の分子を提供し、かくしてより少ない量の核酸の分析ならびに多数の試料に対する容易な応用を可能にする。
【００２０】
本発明は、
核酸を処理する方法において、
（ａ）核酸試料に対し変性環境を提供する工程；
（ｂ）重亜硫酸塩試薬と前記核酸試料を反応させ、該反応物をインキュベートして、前記核酸試料中のメチル化されたヌクレオチドは変換されず、非メチル化ヌクレオチドは別の形態に変換された、処理済み核酸試料を形成する工程；
（ｃ）核酸沈殿工程に実質的に影響を与えないレベルまで塩濃度を低減させるために、前記処理済み核酸試料を希釈する工程；
（ｄ）前記処理済み核酸試料から不要な試薬又は希釈剤を全て実質的に除去するために、前記希釈した処理済み核酸を沈殿させる工程；及び
（ｅ）スルホン酸塩基を実質的に含まない核酸試料を得るために、前記処理済み核酸上に存在するスルホン酸塩基を除去するように前記沈殿した処理済み核酸の脱スルホン化を行う工程を含む方法を提供する。
【００２１】
核酸試料の変性は、例えばＤＮＡ試料にアルカリ環境を提供することによって実施可能である。該方法は、ＤＮＡ核酸試料の分析において特に有用である。ＲＮＡ試料の変性は、二次構造を解消するためにＲＮＡを加熱することによって実施可能である。加熱は標準的には約９５℃まで、好ましくは約５０℃〜７０℃の間である。しかしながら、２次構造を除去するもののＲＮＡ分子を破壊又は分断しないようにＲＮＡを好ましく変性させるように温度が選択されるということは理解されるであろう。
【００２２】
脱スルホン化工程は一般に、処理済み核酸試料上に存在するスルホン酸塩基を除去するように制御された条件下で実施される。該方法は、それらが例えばＤＮＡストランドといった核酸試料が有意なレベルまで破断又はせん断されないような形で実施されるため、有利である。従来の重亜硫酸塩手順の中で記述されているようなアルカリの添加が結果として全ＲＮＡの分解をもたらすことになるため、かかる方法は、ＲＮＡ試料のために特に有利である。
【００２３】
本発明は、かくして１つの実施形態において、核酸を処理するための方法を提供している。該方法は、核酸試料を変性する工程；重亜硫酸塩試薬で核酸試料をインキュベートしかくしてスルホン酸塩基でメチル化ヌクレオチドを修飾する工程；修飾済み核酸試料を希釈する工程；修飾済み核酸試料を沈殿させる工程；及び修飾済み核酸試料を反応させてスルホン酸塩を除去する工程を含むことができる。核酸の変性は、例えばアルカリでの処理、加熱又は一本鎖核酸の形成をもたらすその他の化学物質又はタンパク質試薬の添加によって実施可能である。
【００２４】
該方法の結果として標準的に、試料中の出発核酸の約５０％以上、一般的には約７５％以上そして場合によっては約９５％以上が維持されることになる。本発明者らは、該方法が、核酸試料の実質的な分解又は喪失を全くひき起こすことなく実施することができるものであるということを発見した。これに対して、現在使用されている又は先行技術で記述されている重亜硫酸塩方法は、核酸試料の約９６％までの喪失を標準的に結果としてもたらす。
【００２５】
該方法は、さらに、
（ｆ）処理済み核酸試料を加工又は分析する工程を含んでいてよい。
【００２６】
試料はＤＮＡ又はＲＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡの両方の組合せを含むことができる。
【００２７】
該試料は、組織、細胞から調製することが可能であり、そうでなければ、血液、尿、糞便、精液、脳脊髄液、洗液；脳、結腸、泌尿生殖器、肺、腎臓、造血、乳房、胸腺、こう丸、卵巣、子宮といった供給源由来の細胞又は組織；胎芽又は胎芽外系統、環境試料、植物、細菌、細胞内寄生ウイルス、真菌、原生動物、ウイロイドなどを含めた微生物由来の組織といったあらゆる生体試料であり得る。本発明による処理に適した最も良く記述されてきた哺乳動物細胞型は、Ｂ．アルバート（Ａｌｂｅｒｔｓ）ら、１９８９年「細胞の分子生物学（Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ）」、第２版、ガーランド出版社（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．）ニューヨーク及びロンドン、ｐ９９５〜９９７）の中に要約されている。
【００２８】
ヒト、動物、植物、細菌及びウイルス由来の試料からのＤＮＡ又はＲＮＡ中の５−メチルシトシン残基の分析は、受精から死後４８時間までの全ての細胞、組織及び器官内の全てのライフサイクル段階、ならびに顕微鏡スライドといった組織学的供給源から誘導されうる試料、ブロック中に包埋された試料、体液又は合成又は天然の表面又は液体から抽出された試料を網羅するものとする。
【００２９】
分析は、健康な個体（ＷＨＯが定義づけしている健康）の細胞、組織及び器官ならびに病気の個体由来の細胞、組織及び器官の間の天然に発生する変異を含むことが意図されている。この意味での病気には、ジャン（Ｊｅａｎ）Ｄ．ウイルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら、マグローヒル社（ＭｃＧｒｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｉｎｃ．）編の「ハリソンの内科学原理（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）第１２版以降の中で記述され言及されている全てのヒトの疾病、苦痛、不快、及び逸脱身体条件、ならびにＯＭＩＭ（オンライン版ヒトメンデル遺伝（Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ）、
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）に記述されている全ての疾病、苦痛、不快及び逸脱身体条件が含まれるが、特に強調されるのは、主な死亡原因、すなわち、悪性新生物（癌）、虚血性心疾患、脳血管疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺炎及びインフルエンザ、動脈疾患（アテローム性動脈硬化及び大動脈瘤）、真性糖尿病、及び中枢神経系疾患、ならびに社会的衰弱状態例えば不安症、ストレス関連の神経精神的身体条件及び肥満症、及び染色体数又は染色体再配置異常から生じる全ての身体条件（常染色体ならびに性染色体が関与する異数性、重複、欠損、転位及び挿入）、ならびにミトコンドリア・ゲノムの類似の異常である。
【００３０】
正常な又は病気の個体は、（ｉ）さまざまな民族性及び進化上の系統の個体群；（ｉｉ）種族及び地理的隔離集団；（ｉｉｉ）亜種；（ｉｖ）同じ又は異なる性別の双生児又はより高位の多生児；（ｖ）正常な接合方法、人工授精、胚幹細胞方法又は核移植（体細胞又は生殖細胞系核から）によるクローニング、又はミトコンドリア又はその他の細胞小器官の投入又は修飾から生じた個体；（ｖｉ）トランスジェニックノックアウト、ノックイン又はノックダウン方法（インビボ、エクスビボ又は例えばＲＮＡｉ、リボザイム、トランスポゾン活性化、薬物又は小分子方法、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、層間核酸（ＩＮＡ）、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＮＡ）など、又はトロジャンペプチドを含む（ただしこれに制限されるわけではない）核酸ベースの接合体により過渡的に又は永久的に遺伝子活性が改変されるあらゆる方法のいずれかによる）から誘導された個体又は正常又は異所性の妊娠のあらゆる段階にある個体、に由来するものであってよい。
【００３１】
分析には同様に、正常に変動する及び病気の系の両方において、変化したパラメータ及び以下の状態の内在するメカニズムを見極めかつ治療的に改変させる目的で、細胞外又は細胞内様式でヒトの疾病に付随している原核生物又は真核生物及びウイルス（又はそれらの組合せ）からのＤＮＡ又はＲＮＡ内の５メチルシトシン残基も含まれる：
（Ｉ）遺伝的疾患
（ＩＩ）生体又は非生体由来のいずれであれ、環境的に誘発された因子によってひき起こされる非遺伝的又はエピジェネティックな疾患（この意味での環境的という語には、妊娠のあらゆる段階の間又は受胎能及び不妊治療の条件下での、生体自体の内部での環境も含むものと考えられる）；
（ＩＩＩ）「プリオン」クラスの因子、圧力変化及び無重力状態への暴露、又は放射線の効果によってもたらされる効果を含む遺伝的又は非遺伝的疾患に対する素因；
（ＩＶ）加齢に伴ううつ病、苦痛、神経精神及び神経変性病及び更年期前及び更年期後の身体条件（両方の性別での受胎能力の減少を含む）を含めた、全ての細胞型、組織、器官系及び生命ネットワークにおける加齢プロセスでの５−メチルシトシンの変化；
（Ｖ）（ＤＮＡ増幅、欠失、再配置、転位及び挿入事象から発生する異常な核型を伴う細胞内の変化を含めた）癌における５−メチルシトシンの変化、及び（日周期リズム、光周期、睡眠、記憶及び「時差ぼけ」に対する細胞周期の効果を含む）異なる細胞周期現象におけるその変動又は改変；
（ＶＩ）受精卵から胚形成、胎児の発育、誕生、青年期、成人期及び老齢期までの、最も広い意味で定義された代謝ネットワークにおける５−メチルシトシンの変化（（イオン化又は非イオン化タイプのいずれであれ、又化学療法治療、岩といった付近の天然源からの高地暴露放射線又は軍事又は政府後援活動からの「フォールアウト」から生じたものであれ）あらゆるタイプの低酸素状態、酸素欠乏症、放射線によって、又はストレスによって、又はミトコンドリア、核又は細胞小器官ゲノムの間の不均衡によってもたらされる代謝効果を含む）；
（ＶＩＩ）タンパク質、ポリペプチド、ペプチド及びＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＡＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡなど又はペプチドアプタマ−（翻訳後付加、翻訳後分割産物、翻訳後修飾（例えばインテイン及びエクステイン、ユビキネーション及び分解の産物）を伴うもの）；希少天然アミノ酸ならびに学習、脳成長及び細胞死に関与するＤ−セリンといったような単一の希少アミノ酸を含有するタンパク質、ポリペプチド及びペプチド；薬物、生物医薬品、化学物質（ここで化学物質及び生物医薬品の定義は、Ｇ．アシュトン（Ａｓｈｔｏｎ）、２００１、自然バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）１９、３０７−３１１１のものである）を含む）；代謝物、新規塩、プロドラッグ、既存の化合物のエステル、ワクチン、抗原、ポリケチド、非リポゾームペプチド、ビタミン、及び（植物由来のシクロパミンといった）あらゆる天然源の分子に対する、分子、細胞、組織、器官及び全生体レベルでの応答に起因する５−メチルシトシンの改変；
（ＶＩＩＩ）一本鎖又は二本鎖のいずれであれ、外部供給源からのものであれ、又は内因性トランスポゾン又はレトロトランスポゾン（ＳＩＮＥＳ及びＬＩＮＥＳ）といった内部的に活性化されたものであれ、ＲＮＡ及びＤＮＡウイルスに対する分子、細胞、組織、器官及び全生体レベルでの応答に起因する、５−メチルシトシンの改変；
（ＩＸ）遺伝子又は非遺伝子由来のいずれであれ（又イントロンを含有するか否かに関わらず）ＲＮＡ転写物の逆転写されたコピーに対する分子、細胞、組織、器官及び全生体レベルの応答に起因する、５−メチルシトシンの改変；
（Ｘ）（ａ）血液及び脳脊髄液ならびに妊娠前、中及び後の母性体液を含めた全ての流体の中を循環するＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＡＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡなどの分子を含めた、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＡＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡなど（又はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＡＮＡ、ＨＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、その全ての組合せの中のいずれかのもののアプタマー）、（ｂ）ペプチド及び核酸のキメラ；又はコレステロール部分、ホルモン及び核酸といったような天然分子のキメラである接合生体分子の組合せに対する分子、細胞、組織、器官及び全生体レベルでの応答に起因する５−メチルシトシンの改変；及び
（ＸＩ）以上の（ｉ）〜（ｘ）に記述した混乱のいずれかに対する、ヒト及び動物由来の（インビボ、エクスビボ又は新規環境又は天然及び合成の基質（又はそれらの組合せ）と結びつけた状態）基幹細胞の応答に起因する５−メチルシトシンの改変。
【００３２】
核酸材料を得るための適切なあらゆる方法を使用することができる。例としては、制限的な意味なく、当業者にとって周知のものである市販のＤＮＡ／ＲＮＡキット又は試薬、ワークステーション、プロテアーゼ試薬を含有する標準的細胞溶解緩衝液及び有機抽出手順である。
【００３３】
該方法は、反応容器の中で実施可能である。反応容器は、チューブ、プレート、キャピラリー、ウェル、遠心分離用チューブ、マイクロフュージ管、スライド、カバースリップ又は適切な任意の表面といった任意の適切な容器であり得る。該方法は一般に、核酸試料の分解又は損失の確率を削減するため１つの反応容器内で実施される。
【００３４】
一般に、変性環境は、ＮａＯＨといったようなアルカリを添加することによって、又は試料を含有する核酸を加熱することによって、試料に対して提供される。アルカリ環境は、分子が重亜硫酸塩試薬と直ちに反応する状態へと二本鎖ＤＮＡ酸性分子を変性するために提供される。しかしながら、熱処理といったその他の任意の変性方法又はＫＯＨといったその他の任意の適切なアルカリ又は変性剤及び変性用試薬がその後の工程を著しく阻害しないかぎりにおいて、その他の任意のアルカリを添加したり使用したりすることができるということは理解されるであろう。アルカリはＲＮＡ分子の分解を結果としてもたらし従って熱変性といったようなもう１つの方法が望ましくなるため、このことはＲＮＡ分析にとって重要であり得る。
【００３５】
一般に、重亜硫酸塩試薬はメタ重亜硫酸ナトリウムである。重亜硫酸塩試薬は、スルホン酸シトシンへのシトシン塩基のスルホン化とそれに続くスルホン化ウラシルへのスルホン化シトシンの加水分解的脱アミノ化をひき起こすために使用される。しかしながら、亜硫酸塩又は酢酸塩イオンといったようなその他の適切な任意の重亜硫酸塩試薬を使用することも可能であるということがわかるだろう（シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ）、Ｒ．、ジファーテ（Ｄｉｆａｔｅ）、Ｖ．及びウェルチャー（Ｗｅｌｃｈｅｒ）、Ｍ．（１９７４）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９６：９０６−９１２を参照のこと）。
【００３６】
スルホン化試薬によるインキュベーションは、７未満のｐＨでかつスルホン酸ウラシル基の形成に有利に作用する温度で実施可能である。シトシン塩基をスルホン酸シトシンへ変換しその後スルホン酸ウラシルに変換するスルホン化反応を実施するためには、約７未満のｐＨが好ましい。しかしながら、本発明の方法は、望まれる場合にはｐＨ７を上回るｐＨでのスルホン化反応により実施することもできる。
【００３７】
スルホン化反応は、重亜硫酸塩反応を増強させる能力をもつ添加剤の存在下で実施可能である。適切な添加剤の例としては、キノール、尿素、メトキシアミンがあるがこれらに制限されるわけではない。これらの試薬のうち、キノールは還元剤である。尿素及びメトキシアミンは、重亜硫酸塩反応の効率を改善するために添加される作用物質である。重亜硫酸塩反応を補助するためにその他の添加剤又は作用物質も提供できることがわかるだろう。
【００３８】
スルホン化反応の結果として非メチル化シトシンがウラシルへと変換される一方で核酸試料中のメチル化シトシンは変化の無い状態にとどまることになる。
【００３９】
うまく作用することがわかった反応条件は、以下の通りである。処理すべき変性ＤＮＡ又はその他の核酸を、２０μｌの体積となるように補給する。次に、ｐＨ５．０の作られたばかりの２Ｍのメタ重亜硫酸ナトリウム溶液（ＢＤＨ  ＡｎａｌａＲ＃１０３５６．４Ｄ）２０８μｌ（ｐＨは１０Ｍの水酸化ナトリウム（ＢＤＨ  ＡｎａｌａＲ＃１０２５２．４Ｘ）を添加することで調整する）を、１０ｍＭのキノール溶液（ＢＤＨ  ＡｎａｌａＲ＃１０３１２２Ｅ）１２μｌと共に添加する。添加されるキノールの濃度は、実験的に判定される通り約１０〜５００ｍＭの範囲内のいずれかである。次に溶液を混合し、２０８μｌの鉱油（シグマ分子生物学グレード（Ｓｉｇｍａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｇｒａｄｅ）Ｍ−５９０４）で覆う。次に試料を一晩適切な温度、例えば室温又は別の適切な温度で放置して、完全な重亜硫酸塩変換のための時間を与える。上述の体積、濃度及びインキュベーション時間及び温度が単なる一例であり、反応条件が核酸のスルホン化に適しているかぎり変動させることができるものであることは当業者には理解される。同様に、本発明の方法の工程の順序も、スルホン化及び脱スルホン化工程が充分に実施されるかぎり変動可能であるということも理解される。
【００４０】
希釈工程は、その後の反応を阻害する塩がスルホン化された核酸と共沈しないような形で実施される。塩濃度は、約１Ｍ未満まで希釈される。一般に希釈工程は、塩濃度を約０．５Ｍより低く減少させるべく水又は緩衝液を用いて実施される。例えば、塩濃度は一般に、約１ｍＭ未満〜約１Ｍ、特に約０．５Ｍ未満、約０．４Ｍ未満、約０．３Ｍ未満、約０．２Ｍ未満、約０．１Ｍ未満、約５０ｍＭ未満、約２０ｍＭ未満、約１０ｍＭ未満、さらには望まれる場合には約１ｍＭ未満にさえ希釈される。当業者であれば、核酸試料のさらなる浄化又は操作を最小限におさえてその後の工程を実施できるような形で、核酸との塩沈殿を減少させる適切な希釈度を容易に判定することができる。希釈は一般に水中で実施されるが、その緩衝液が核酸と共に著しく沈殿するか、又は塩を著しく沈殿させてその後の反応を阻害するのでないかぎり、任意の適切な緩衝液中、例えばトリス／ＥＤＴＡ又はその他の緩衝液中で実施することもできる。
【００４１】
先行技術の方法とは異なり、重亜硫酸塩試薬から処理済み核酸を完全に分離又は単離する必要は全く無い。例えば先行技術の方法により現在必要とされているように、クロマトグラフィ分離方法を利用する必要性は全く無い。本発明に従った希釈工程は、試料の損失を最小限におさえるのを助ける。
【００４２】
一般に、沈殿は、アルコールといったような沈殿剤を用いて実施される。核酸の沈殿のためのアルコールの例は、イソプロパノール、エタノール又はその他の適切なあらゆるアルコール中から選択可能である。
【００４３】
脱スルホン化工程は、沈殿した処理済み核酸のｐＨを約１２．５まで調整することにより実施可能である。アルカリ性環境に対する暴露は、酸性ｐＨに対する以前の暴露によって誘発される核酸内の脱プリン部位でのストランド破断を促進する傾向をもつ。従って、ストランド破断を回避すべきである場合には、アルカリ性ｐＨ処理は最小限におさえられる。この工程は、適切な緩衝液又はアルカリ試薬でｐＨ１０．５前後で効率良く実施することができる。適切な緩衝液又はアルカリ試薬の例としてはｐＨ７．０〜１２．５を有する緩衝液が含まれる。当業者であれば、適切な緩衝液又はアルカリ試薬を広い範囲の入手可能な既知の緩衝液及びアルカリ試薬の中から選択できるということがわかるだろう。
【００４４】
脱スルホン化工程のための温度範囲は、室温から約９６℃までであり、時間は、使用される条件に応じて２分から９６時間以上まで変動し得る。当業者であれば、脱スルホン化反応を実施するための適切な時間及び温度を容易に決定することができる。充分な脱スルホン化を可能にするべくインキュベーション時間が延長させられるかぎりにおいて、室温未満の温度を使用することも可能である。かくして、インキュベーション工程は、約１０℃、約２０℃、約２２℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃、及び約９６℃で実施することができる。脱スルホン化反応を実施するための特に有用な温度は約５５℃である。これらの及びその他のインキュベーション及び／又は反応工程は、充分な反応工程が実施されるかぎりにおいて、上述の通り、さまざまな温度で類似の要領で実施可能である。
【００４５】
本発明は、メチル化された核酸の効率の良い特徴づけのための方法を提供する。該方法は、核酸試料についての効率の良いスルホン化及及び脱スルホン化工程を実施できるようにする。しかしながら、スルホン化又は脱スルホン化工程のいずれも完全に実施する必要はなく、本書で開示する通り核酸のメチル化をその後特徴づけするのに充分なだけ実施すればよい、ということは理解される。当業者であれば、これらの工程をほぼ完全まで実施すべきか否か又は所望の分析のためには不完全な反応で充分であるか否かを容易に判定することができる。例えば、少数の細胞又は少量の核酸試料が使用される場合、より完全な反応を実施することが一般に望まれる。さらに大量の核酸試料が特徴づけされる場合、核酸試料のメチル化状態のその後の分析のために充分な反応産物をなおも提供する一方で、さほど完全でない反応を実施することが可能である。
【００４６】
本書で開示されている通り、本発明は、核酸を適切に処理するための方法を提供する。該方法は、本書に開示されているように１つの細胞、組織又は生体の状態の尺度として核酸集団のメチル化状態を分析するために使用可能である。本発明の方法は、核酸を処理するためにこれまでに使用された方法に比べいくつかの利点を提供する。１つの利点は、本発明の方法が、従来スルホン化の後に核酸試料を脱塩するのに使用されるクロマトグラフィ工程の省略を可能にするという点にある（クラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、１９９４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２９９０−２９９７）。該クロマトグラフィ工程はスルホン化された核酸の損失を導き、このことは、少量の出発材料で作業している場合に特に問題となる可能性がある。
【００４７】
本発明のもう１つの利点は、塩濃度を希釈し核酸を沈殿させることによりきわめて効率良く脱塩工程が実施されるという点にある。希釈工程は、核酸を沈殿させたときに脱スルホン化といったようなその後の工程と干渉しない量よりさらに低く塩濃度を減少させる。沈殿工程はかなり効率が良く、任意には核酸沈殿の効率を増大させる担体を内含することもできる。かくして、本発明の方法は、損失を最小限にし、核酸試料の回収を増大させる。従って、本発明の方法は、より少量の出発材料を使用しメチル化に関し効率良く特徴づけできるようにするという付加的な利点を提供する。本発明は、核酸から望ましくないあらゆる試薬又は希釈剤を除去する工程において、やっかいで効率の悪いクロマトグラフィ分離方法の代りに単純な希釈及び沈殿方法を使用することによってクラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、１９９４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２９９０−２９９７の方法を改良する方法を提供している。
【００４８】
さらに、わずかにアルカリ性のｐＨで緩衝溶液を使用することにより、問題の核酸が実質的に断片化される確率を減少させることができる。緩衝溶液のｐＨをｐＨ１２．５よりもはるかに高く増大させることで、高分子量の核酸の非常に実質的な断片化が導かれることが実証された。従って、かかる断片化を最小限におさえたい場合には、一般に約ｐＨ１１未満のアルカリ性ｐＨが用いられる。
【００４９】
本発明のさらにもう１つの利点は、各試料について単一の管又は容器の中で反応を実施し、かくして試料の損失を最小限におさえ数多くの試料の加工を可能にすることができるという点にある。本発明の方法のこれまでの方法と比べたさらなる利点は、ひとたびスルホン化された時点で、クラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、１９９４に記述した方法にあるように強塩基の添加及びその後の塩除去を必要とするのではなくむしろ脱スルホン化工程を実施するために塩基性ｐＨをもつ緩衝液中に該核酸を再懸濁させることができる、という点にある。
【００５０】
さらにもう１つの利点は、本発明の方法が処理に先立ち制限酵素での任意の消化を可能にするという点にある。従来の重亜硫酸塩処理方法は一般に、処理及び増幅をうまく行うために制限酵素での初期消化工程を含み、従って長距離ＰＣＲ反応には適用不可能である。しかしながら、本発明の方法は、スルホン化反応に先立つ制限酵素での予備消化を必要とせず、ここでも又より長いフラグメントについてＰＣＲを実施する選択肢と同様により少ない操作を可能にする。
【００５１】
本発明の方法は、細胞、組織又は生体のメチル化状態を特徴づけするために使用可能である。本発明の方法は同様に、本明細書に参照により援用されているフロマー（Ｆｒｏｍｍｅｒ）らのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ８９、１８２７〜１８３１（１９９２）に記述されているもののようなゲノム配列決定方法と併用することもできる。
【００５２】
本発明はさらに、１つの試料のメチル化状態を判定する方法をも提供する。該方法は、核酸の処理のための本発明の方法すなわちＨＧＳ方法を用いて試料について実施することができる。試料のメチル化状態の判定方法は、その試料のメチル化状態が基準試料との関係において比較され判定され得るように、テスト試料と対照試料で並行して実施することができる。例えば、試料は、全般的に又は特定の部位においてメチル化の増加又は減少が存在するか否かを判定するために比較され得る。かかる判定は、本書中で論述する通り１つの疾病の予後を診断及び／又は判定するために使用することができる。該方法は、例えば診断的利用分野において試料のメチル化状態の報告をさらに含むことができる。
【００５３】
本発明に従った方法は、キット内で使用するために特に適している。かかるキットは標準的に試薬及び本発明を実施するための説明書を含んでいる。適切なキットを提供することによって、エンドユーザーが、メチル化された核酸について作業を行ない再現可能で一貫性のある結果を得るようにすることが可能である。
【００５４】
本発明の方法の構成要素をキットの形で提供できることは理解される。該キットは、該当する化学的試薬、反応管及び本発明の方法を実施するための説明書を含むことができる。
【実施例】
【００５５】
方法及び試薬
化学物質は以下のとおりに入手した：アガロースはバイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）（カリフォルニハ州ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）：認証済み分子生物学グレード＃１６１−３１０１）より；氷酢酸はＢＤＨ（オーストラリア、キルシス（Ｋｙｌｓｙｔｈ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）；ＡｎａｌａＲ１０００１５Ｎ）より；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）はＢＤＨ（ＡｎａｌａＲ１００９３．５Ｖ）より；エタノールはアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）；２００プルーフＥ７０２−３）より；イソプロパノールはシグマ（Ｓｉｇｍａ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）；９９％＋シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｉ−９５１６）より；鉱油はシグマ（Ｓｉｇｍａ）（Ｍ−５９０４）より；酢酸ナトリウム溶液３Ｍはシグマ（Ｓｉｇｍａ）（Ｓ−７８９９）より；塩化ナトリウムはシグマ（Ｓｉｇｍａ）（ＡＣＳ試薬Ｓ９８８８）より；そして水酸化ナトリウムはＢＤＨ（ＡｎａｌａＲ＃１０２５２、４Ｘ）より。
【００５６】
酵素／試薬は以下の通りに入手した：ＥｃｏＲ１はロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）（インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）；＃８７９３０６２６、１０単位／μｌ）より；ＨｉｎｄＩＩＩはバイオラブ（Ｂｉｏｌａｂｓ）（マサチューセッツ州ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）；＃Ｒ０１０４５、１０単位／μｌ）より；ＰＣＲマスターミックスはプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（ウイスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）；＃Ｍ７５０５）より；そしてＤＮＡマーカーは、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（直接投入ＰＣＲ低ラダー１００〜１０００ｂｐ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｄ−３６８７及び１００−１０Ｋｂ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｄ−７０５８）より。
【００５７】
溶液は以下の通りであった：（１）１０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）／０．１ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０〜１２．５；（２）３ＭのＮａＯＨ（水５０ｍｌ中６ｇ；ＢＤＨ  ＡｎａｌａＲ＃１０２５２．４Ｘ）；（３）２Ｍメタ重亜硫酸塩（水２０ｍｌ中７．６ｇと４１６μｌの１０ＮのＮａＯＨ（ＢＤＨ  ＡｎａｌａＲ＃１０３５６．４Ｄ）；（４）１０ｍＭのキノール（水５０ｍｌ中０．０５５ｇ；ＢＤＨ  ＡｎａｌａＲ＃１０３１２２Ｅ）；（５）５０×ＴＡＥゲル電気泳動緩衝液（２４２ｇのトリズマ（Ｔｒｉｚｍａ）塩基、５７．１ｍｌの氷酢酸、３７．２ｇのＥＤＴＡ及び１ｌの水）；及び（６）５×アガロースゲル・ローディングバッファ（１ｍｌの１％ブロモフェノールブルー（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｂ６１３１）、１ｍｌのキシレンシアノール（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｘ−４１２６）、３．２ｍｌのグリセロール（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｇ６２７９）、８μｌの０．５ＭのＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、２００μｌの５０Ｘ  ＴＡＥ緩衝液及び１０ｍｌの水）。
【００５８】
組織及び細胞系
組織及び細胞系は以下の通り入手した：ＨｅＬａ（子宮頸がん細胞系、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）；ＬＮＣａＰ（前立腺癌細胞系、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１０９９５）；ＨｅｐＧ２（肝癌細胞系、ＡＴＣＣ＃ＨＢ−８０６５）；及びＭＣＦ−７（乳癌細胞系、ＡＴＣＣ＃ＨＴＢ−２２）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。
【００５９】
ＬＮＣａＰ細胞成長用のＴ培地の調製のためには、試薬は以下に記すもの以外、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＣ又はインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から入手した：ＤＭＥＭ粉末、１０袋（１０×１ｌ；＃３１６００−０３４）；Ｆ−１２Ｋ栄養素混合物、カイゲン（Ｋａｉｇｈｎ）の改変（５００ｍｌ；＃２１１２７−０２２）；Ｌ−グルタミン、２００ｍＭ（１００ｍｌ；＃２５０３０−０８１）；ペニシリン／ストレプトマイシン５０００Ｕ／ｍｌ、５０００μｇ／ｍｌ（１００ｍｌの＃１５０７０−０６３サーモトレース（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔｒａｃｅ））；ウシ胎児血清（５００ｍｌ；＃１５−０１０−０５００Ｖシグマ（Ｓｉｇｍａ））；インシュリン（ウシの膵臓）（１００ｍｇ；＃Ｉ１８８２）；トランスフェリン（ヒト）（１０ｍｇ；＃Ｔ５３９１）；ｄ−ビオチン（５００ｍｇ；＃Ｂ４６３９）；アデニン（５ｇ；＃Ａ３１５９）；Ｔ３（＃Ｔ６３９７又は＃Ｔ５５１６）。
【００６０】
Ｔ−培地（５００ｍｌ）を以下の通りに調製した：１リットルあたり３．７ｇの重亜硫酸ナトリウムを添加し７．２〜７．４の間までｐＨを調整することによってＤＭＥＭ原液を調製した。４００ｍｌのＤＭＥＭ原液に対して以下の試薬を添加した：１００ｍｌのＦ−１２Ｋ；２５０μｌのインシュリン（１０ｍｇ／ｍｌ）；１．０ｍｌのＴ３（５００×；トリ−ヨードチロニン；６．８２５ｎｇ／ｍｌ）；１．０ｍｌのトランスフェリン（５００×；２．５ｍｇ／ｍｌ）；１．０ｍｌのビオチン（５００×；０．１２２ｍｇ／ｍｌ）；４．０ｍｌのアデニン（１２５×；３．１２５ｍｇ／ｍｌ）；５．５ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン（１００×；５０００μｇ／ｍｌ）；及び５．５ｍｌのグルタミン（１００×；２００ｍＭ）。無菌ろ過の後、５０ｍｌのウシ胎児血清を添加して１０％を得た。
【００６１】
表１は、以下に説明する実験において使用される細胞系及び成長条件を列記している。
【００６２】
【表１】
0004740113.tif 000002
【００６３】
全血由来のＴ細胞及びＣＤ３４＋細胞の精製
シドニー（Ｓｙｄｎｅｙ）のロイヤルノースショア病院（Ｒｏｙａｌ  Ｎｏｒｔｈ  Ｓｈｏｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）において白血球搬出治療を受けている患者から試料を入手した。試料は予め倫理委員会の承認を得て入手した。Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  ｐｌｕｓ（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）＃１７−１４４０−０３；ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ））を用いてメーカーの使用説明書に従って白血球を濃縮した。Ｔ細胞及びＣＤ３４＋細胞を白血球集団からＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎＣＤ２  Ｄｙｎａｂｅａｄｓと（Ｄｙｎａｌ＃１１６．０３；Ｌａｋｅ  Ｓｕｃｃｅｓｓ）及びＤｙｎａｌ  ＣＤ３４始原細胞選択システム（Ｄｙｎａｌ＃１１３．０１）を用いそれぞれメーカーの使用説明書に従って単離した。
【００６４】
以下の機器を使用した。ＰＣＲ機は、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｈｙｂａｉｄ  ＰＸ２（シドニー、オーストラリア）であり、Ｇｅｌ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍはＫｏｄａｋ  ＵＶＩｔｅｃＥＤＡＳ２９０（ニューヨーク州ロチェスタ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ））であり、マイクロフュージは、エッペンドルフ５４１５−Ｄ（ブリンクマン・インストルメンツ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ；ニューヨーク州ウェストバリー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ））であった。
【００６５】
ＤＮＡ増幅
各プライマ６ｎｇ／μｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＰＣＲマスターミックスを用いて重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡ２μｌを含む２５μｌの反応混合物内で、ＰＣＲ増幅を実施した。重亜硫酸塩処理されたＤＮＡからのＧＳＴＰ１の増幅のために用いられたストランド特異的ネステッドプライマは、ＧＳＴ−９（９６７−９９３）ＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴ（配列番号１）；（Ｆ）ＧＳＴ−１０（１３０７−１３３２）ＡＡＣＣＴＡＡＴＡＣＴＡＣＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＣＡＴ（配列番号２）（Ｒ）；ＧＳＴ−１１（９９９−１０２７）ＧＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＡＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＴＴ（配列番号３）（Ｆ）；ＧＳＴ−１２（１２８１−１３０６）ＡＣＴＡＡＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣ（配列番号４）（Ｒ）である。プライマの場所は、ＧＳＴＰ１配列（受入番号；Ｍ２４４８５；ゲンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）引用、モロウ（Ｍｏｒｒｏｗ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）７５：３−１１（１９８９））に従って記されている。
【００６６】
ＲＮＡ精製
Ｄｕ１４５細胞を、上述の条件下でＴ７５組織培養フラスコ内の９０％の集密度になるまで成長させた。培地を廃棄し、３ｍｌのトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）カタログ＃１５５９６−０２６）を添加し、試料を以下の通りに加工した：
Ｉ．試料を充分に混合し５分間室温に放置して、核タンパク複合体を解離した。
ＩＩ．その後試料を４℃で１０分間１２，０００×ｇで回転させて高分子量ＤＮＡ及びその他の汚染物質を除去した。
ＩＩＩ．上清を清潔な管の中へと取出し、１００％クロロホルムを１００μｌ添加し、試料を手で１５秒間勢いよく混合し、次に２〜３分間室温でインキュベートした。
ＩＶ．相分離させるため４℃で１０分間１２，０００×ｇで試料を回転させた。
Ｖ．ピペットの先端が必ず界面から離れたところにとどまるようにしながら清潔な管の中に上部水相を取出し、２０ｍｇ／ｍｌのグリコーゲン１μｌを添加し、試料をボルテックスに付した。
ＶＩ．同体積の１００％（０．２５ｍｌ）を添加し、管をボルテックスに付し、次に１０分間室温に放置した。
ＶＩＩ．試料を次に１０分間４℃で１２，０００×ｇで回転させてＲＮＡをペレット化した。
ＶＩＩＩ．上清を除去し、ペレットを０．７５ｍｌの８０％エタノールで洗浄し、ｃＤＮＡ合成反応の阻害物質を除去し、短時間ボルテックスに付し、次に４℃で５分間７，５００×ｇで回転させてＲＮＡをペレット化した。
ＩＸ．工程ＶＩＩＩをさらに一回繰り返した。
Ｘ．１０秒間マイクロフュージ内でペレットを回転させ、残留エタノールを除去し、直ちにＲＮアーゼを含まない水２５μｌの中にペレットを再度懸濁させた。
注）ペレットが乾燥しきっていた場合、ＲＮＡを再懸濁させるのは非常にむずかしく、２６０／２８０比は１．６未満となる。
ＸＩ．このときＯＤ２６０／２８０／３１０が記録される。
ＸＩＩ．精製したＲＮＡを次に必要となるまで−７０℃で貯蔵する。
【００６７】
ｃＤＮＡ合成
メーカーの使用説明書によって推奨されるように１００ｎｇのランダムヒーマー（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）カタログ＃４８９１０−０１１）と共にスーパースクリプトＩＩＩ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）カタログ＃１８０８０−０４４）を用いてｃＤＮＡ合成を実施した。
【００６８】
ＲＮＡ増幅
各プライマ６ｎｇ／μｌ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ＰＣＲマスターミックスを用いて、重亜硫酸塩処理済み逆転写済みゲノムＲＮＡ２μｌを含む反応混合物２５μｌの中でＰＣＲ増幅を実施した。重亜硫酸塩処理されたＲＮＡからのアクチンの増幅のために使用されるストランド特異的プライマは、アクチンＢＳ−３Ａ（２０７６−２０９７）
ＴＴＡＡＴＡＴＴＴＴＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＧＴＴＧＴ  配列番号５）；アクチンＢＳ４（２７２０−２７４４）
ＣＴＴＣＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＡＴＡＣＣＡＡＡ（配列番号６）であった。
【００６９】
増幅されたＲＮＡが野生型ＲＮＡのものではなく重亜硫酸塩変換されたＲＮＡに由来するものであることを確実にするため、野生型アクチンＲＮＡに対する対照プライマも同様に含まれていた。以下の野生型プライマが合成された：アクチン野生型３Ａ（２０７６−２０９７）
ＴＣＡＡＣＡＣＣＣＣＡＧＣＣＡＴＧＴＡＣＧＴＴＧＣ（配列番号７）；アクチン野生型４（２７２０−２７４４）
ＧＡＴＣＴＴＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＧＧＴＧＣＣ（配列番号８）。プライマの場所は、ヒトベータ−アクチン遺伝子配列（受入番号；Ｍ１０２７７）に従って示されている。
【００７０】
核酸分離
５０ｍｌのアガロースにつき１滴の臭化エチジウム（ＣＬＰ＃５４５０）を含有する１％のＴＡＥ中で、１％又は２％のアガロースゲルを調製した。問題のＤＮＡ及びＲＮＡ試料（ゲノム又はＰＣＲ由来）を１／５体積の５×アガロースローディングバッファと混合し、水中水平電気泳動タンクを用いてＸ１  ＴＡＥ内で１２５ｍＡで電気泳動させた。
【００７１】
ＤＮＡの従来型重亜硫酸塩処理
（本明細書に参照により援用されているクラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２９９０−２９９７）（極端に低いＤＮＡ収量を結果としてもたらす先行技術の方法）。
【００７２】
ゲノムＤＮＡ（２μｇ）を、少なくとも２０μｌの最終体積で６０分間ＥｃｏＲ１で消化した。この消化物に対し、３ＭのＮａＯＨ（５０ｍｌの水中に６ｇのＮａＯＨ：作りたてのもの）２．２μｌを添加し、１５分間３７℃でインキュベートした。２０８μｌ体積の２Ｍのメタ重亜硫酸塩（２０ｍｌの水中の７．６ｇのメタ重亜硫酸塩及びｐＨ５．０になるまでの４１６μｌの１０Ｍ  ＮａＯＨ）を添加し、続いて１２μｌの１０ｍＭキノン（０．５５ｇのハイドロキノンが、１／１０希釈の１００ｍＭを提供する）を添加した。反応混合物を鉱油２００μｌで覆い、一晩５０〜５５℃でインキュベートした。インキュベーションが終った時点で鉱油を除去し、１μｇの酵母ｔＲＮＡ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｒ−８５０８）を添加した。
【００７３】
メーカーの使用説明書に従い、ウィザード（Ｗｉｚａｒｄ）ＤＮＡ浄化システム（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）＃Ａ７２８０）を用いて、ＤＮＡ脱塩を実施した。短時間で、１ｍｌの樹脂を試料に添加し、試料をボルテックスに付した。試料を、２．５ｍｌ入り注射器に取付けたカラムに適用し、注射器を通して穏やかに押した。カラムを２ｍｌの８０％イソプロパノールで洗浄し、次にマイクロフュージ内で１４，０００ｒｐｍで２０秒間回転させた。５０μｌの水をカラムに適用し、試料を室温で１分間放置した。カラム材料をきれいな１．５ｍｌ入り遠心分離用チューブに適用し、マイクロフュージ内で１４，０００ｒｐｍで２０秒間回転させた。ＤＮＡを、直ちに脱スルホン化可能な状態で溶出された体積の形で回収した。
【００７４】
ウラシルから硫酸塩基を除去するため、５．５μｌの３ＭのＮａＯＨを溶出したＤＮＡに添加し、混合物を１５分間３７℃でインキュベートした。アルカリを中和するため、３３．５μｌの体積のＮＨ４ＯＡＣ（ｐＨ７．０）を添加した。１００％エタノール３３０μｌを添加し、反応混合物を６０分間−２０℃でインキュベートした。試料を１４，０００ｒｐｍで１５分間回転させ、エタノールを廃棄した。ペレットを空気乾燥させ、１０μｌのＴ／Ｅ（ｐＨ８．０）中で再懸濁させた。
【００７５】
核酸のＨＧＳ重亜硫酸塩処理
本発明に従った重亜硫酸塩処理の有効性を実証するプロトコル例が以下に記されている。該プロトコルは、うまく処理済み核酸の全てを実質的に維持する結果となった。本発明のこの方法は、同様に本書にＨＧＳ重亜硫酸塩方法として言及されている。試料又は試薬の体積又は量は変動し得るということがわかるだろう。
【００７６】
ＤＮＡ変性
望まれる場合適切な制限酵素で予備消化され得るＤＮＡ２μｇに対して、２０μｌの最終体積で３ＭのＮａＯＨ（水５０ｍｌ中６ｇで作りたてのもの）２μｌ（１／１０体積）を添加した。重亜硫酸塩試薬が好ましくは一本鎖分子と反応することから、この工程は、二本鎖ＤＮＡ分子を一本鎖形態に変性させる。混合物を１５分間３７℃でインキュベートさせた。変性の効率を改善するためには、室温より高い温度でのインキュベーションを使用することができる。
【００７７】
ＲＮＡ変性
１μｌのＲＮアーゼ阻害物質（ＲＮアーゼＯＵＴインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）カタログ＃１０７７７−０１９４０Ｕ／μｌ）を含有する２０μｌの合計体積で２μｇのＲＮＡを再懸濁させた。この溶液を次に２分間５０℃で加熱し、その後氷上でスナップ冷蔵した（任意）。重亜硫酸塩試薬は好ましくは一本鎖分子と反応することから、この工程はＲＮＡ分子を基本的に二次構造の無い形態に変性させる。
【００７８】
ＤＮＡの重亜硫酸塩処理
インキュベーションの後、連続して２０８μｌの２Ｍのメタ重亜硫酸ナトリウム（２０ｍｌの水中に７．６ｇ及び４１６ｍｌの１０ＮのＮａＯＨ；ＢＤＨ  ＡｎａｌａＲ＃１０３５６．４Ｄで作りたてのもの）及び１２μｌの１０ｍＭのキノール（５０ｍｌの水中に０．０５５ｇ、ＢＤＨ  ＡｎａｌａＲ＃１０３１２２Ｅで作りたてのもの）を添加した。キノールは還元剤であり、試薬の酸化を低減させるのを助ける。例えばジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、キノン（ハイドロキノン）又はその他の適切な還元剤といったその他の還元剤も同様に使用可能である。２００μｌの鉱油で試料を覆った。鉱油で覆うことで、試薬の蒸発及び酸化が防がれるが、これは不可欠ではない。次に、試料を５５℃で一晩インキュベートした。
【００７９】
代替的には、試料を以下の通りにサーマルサイクラ内で循環させることが可能である。すなわち；工程１、５５℃／２時間、ＰＣＲ機内で循環；工程２、９５℃／２分間といった通りに一晩又は約４時間インキュベートする。工程１は約３７℃〜約９０℃の任意の温度で実施され得、５分〜８時間まで長さが変動し得る。工程２は、約７０℃〜約９９℃の任意の温度で実施され得、長さは約１秒から６０分以上に変動し得る。
【００８０】
メタ重亜硫酸ナトリウムでの処理の後、油を除去し、ＤＮＡ濃度が低かった場合には、１μｌのｔＲＮＡ（２０ｍｇ／ｍｌ）又は２μｌのグリコーゲンを添加した。これらの添加剤は任意であり、特にＤＮＡが低濃度で存在する場合、標的ＤＮＡと共沈させることによって得られるＤＮＡの収量を改善するために使用可能である。核酸のさらに効率の良い沈殿のための担体としての添加剤の使用は、核酸量が０．５μｇ未満である場合に一般に望まれる。
【００８１】
イソプロパノール浄化処理は以下のとおりに実施した。すなわち、試料に８００μｌの水を添加し、混合し、次に１ｍｌのイソプロパノールを添加した。水又は緩衝液は、反応答器内の重亜硫酸塩の濃度を、問題の標的核酸と共に塩が沈殿することになるレベルまで低減させる。本書で開示されているように、塩濃度が所望の範囲より低く希釈されるかぎりにおいて、希釈は一般に約１／４〜１／１０００である。
【００８２】
試料を再度混合し、最低５分間４℃で放置した。試料を１０〜１５分間マイクロフュージ内で回転させ、ペレットを２回８０％のＥＴＯＨで洗浄し、毎回ボルテックスに付した。この洗浄処理により、核酸と共に沈殿したあらゆる残留塩が除去される。
【００８３】
ペレットを乾燥させ、５０μｌといった適切な体積のＴ／Ｅ（１０ｍＭのトリス／０．１ｍＭのＥＤＴＡ）ｐＨ７．０〜１２．５の中で再懸濁させた。ｐＨ１０．５の緩衝液が特に有効であることが発見された。核酸を懸濁させるため必要に応じて１分〜９６時間、３７℃〜９５℃で試料をインキュベートした。
【００８４】
上述の方法の前には、単数又は複数の制限酵素での消化が先行し得る。以下で記述する通り、２つの独立した制限酵素消化物が同じＤＮＡ試料で構成される。消化用に選択される酵素は、増幅すべき配列に左右される。例えば、３７℃で１時間、２０μｌの体積のＥｃｏＲＩ中で２μｇのゲノムＤＮＡを消化させる。この工程は、ゲノムＤＮＡよりも重亜硫酸塩変換にさらに敏感に反応するさらに小さなフラグメントへとゲノムＤＮＡを消化させるために使用される。ＤＮＡをより小さいサイズのフラグメントへとせん断するために、音波処理又は物理的力を使用することもできる。音波処理の強度及び音波処理の長さは、ＤＮＡフラグメントの所望のサイズに基づいて選択させる。例えば、上述の通り、ＨｉｎｄＩＩＩで２μｇのゲノムＤＮＡを消化させることによって、別の消化反応が実施される。前処理消化のためには、これらの又はその他の適切な制限酵素を選択することができる。消化されたＤＮＡは、上述の通り、メタ重亜硫酸塩で処理される。
【００８５】
ＲＮＡの重亜硫酸塩処理
インキュベーションの後、２０８μｌの２Ｍのメタ重亜硫酸ナトリウム（２０ｍｌの水中７．６ｇと４１６ｍｌの１０ＮのＮａＯＨ；ＢＤＨ  ＡｎａｌａＲ＃１０３５６．４Ｄで作りたてのもの）を添加した。試料を２００μｌの鉱油で覆った。鉱油で覆うことで、試薬の蒸発及び酸化が防がれるが、これは不可欠ではない。次に、試料を３７℃〜５５℃で３時間〜一晩インキュベートした。代替的には、試料を以下の通りにサーマルサイクラ内で循環させることが可能である。すなわち；工程１、５５℃／２時間、ＰＣＲ機内で循環；工程２、７０℃／３０秒間といった通りに一晩又は約４時間インキュベートする。工程１は約３７℃〜約９０℃の任意の温度で実施され得、５分〜８時間まで長さが変動し得る。工程２は、約６０℃〜約９９℃の任意の温度で実施され得、長さは約１秒から６０分以上に変動し得る。
【００８６】
メタ重亜硫酸ナトリウムでの処理の後、油を除去し、ＲＮＡ濃度が低かった場合には、１μｌのグリコーゲンを添加した。この添加剤は任意であり、特にＲＮＡが低濃度で存在する場合、標的ＲＮＡと共沈させることによって得られるＲＮＡの収量を改善するために使用可能である。核酸のさらに効率の良い沈殿のための担体としての添加剤の使用は、核酸量が０．５μｇ未満である場合に一般に望まれる。
【００８７】
イソプロパノール浄化処理は以下のとおりに実施した。すなわち、試料に８００μｌの水を添加し、混合し、次に１ｍｌのイソプロパノールを添加した。水又は緩衝液は、反応答器内の重亜硫酸塩塩の濃度を、問題の標的核酸と共に塩が沈殿することになるレベルまで低減させる。本書で開示されているように、塩濃度が所望の範囲より低く希釈されるかぎりにおいて、希釈は一般に約１／４〜１／１０００である。
【００８８】
試料を再度混合し、１５分間室温に放置した。試料を１０〜１５分間マイクロフュージ内で回転させ、ペレットを２回８０％のＥＴＯＨで洗浄し、各洗浄の間でボルテックスに付した。この洗浄処理により、核酸と共に沈殿したあらゆる残留塩が除去される。
【００８９】
ペレットを乾燥させ、５０  ｌといった適切な体積のＴ／Ｅ（１０ｍＭのトリス／０．１ｍＭのＥＤＴＡ）ｐＨ７．０〜１２．５の中で再懸濁させた。ｐＨ１０．５の緩衝液が特に有効であることが発見された。核酸を懸濁させるため必要に応じて１分〜９６時間、３７℃〜９５℃で試料をインキュベートした。
【００９０】
ＲＮＡを小さなサイズのフラグメントへとせん断するために、音波処理又は物理的力を使用することもできる。音波処理の強度及びその長さは、ＲＮＡフラグメントのサイズに基づいて選択される。
【００９１】
結果
ＬＮＣａＰ細胞のＤＮＡ分析及びＰＣＲ増幅の感度
標準的条件の下で９０％の集密度に至るまでＬＮＣａＰ細胞の培養を成長させた。細胞をトリプシン処理し、洗浄し、次に血球計算板を用いて計数した。その後、表２に示されているとおりの概略数の細胞を含有するよう細胞を希釈した。その後、メーカーの使用説明書に記述されているようにマスターピュアＤＮＡ精製キット（Ｍａｓｔｅｒ  Ｐｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）＃ＭＣＤ８５２０１；ウイスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））を用いて細胞を溶解させ、次に上述の２つのスルホン化方法を用いてＤＮＡを修飾した。
【００９２】
細胞数を正確に決定した後、培養を、ｐＨ８．０の２５μｌのＴ／Ｅ中、１００、１０００、１００００及び１００，０００といった細胞数で１．５ｍｌ入りのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）遠心分離用チューブへとデュプリケートで分割した。その後、メーカーの使用説明書で記述されている通りにメーカーの使用説明書マスターピュアＤＮＡ精製キット（Ｍａｓｔｅｒ  Ｐｕｒｅ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）（エピセンター（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）＃ＭＣＤ８５２０１）により記述されている通りに、細胞について細胞溶解を実施した。
【００９３】
ＤＮＡをｐＨ８．０のＴ／Ｅ１０μｌの中に再懸濁させた。その後ＤＮＡを、最終体積２０μｌで３７℃で１時間、メーカーの使用説明書に従って１単位のＥｃｏＲ１（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）＃８７９３０６２６  １０単位／μｌ）で消化した。
【００９４】
ＤＮＡの従来の重亜硫酸塩処理（クラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、１９９４）を１つのデュプリケートセットについて実施し、その間もう一方のセットについて、ＤＮＡのＨＧＳ重亜硫酸塩処理を実施した。処理後、ＤＮＡをｐＨ８．０のＴ／Ｅ５μｌ中で再懸濁させた。
【００９５】
最終的再懸濁済み試料体積の５分の１体積である、１μｌの処理済みＤＮＡについてＰＣＲ増幅を実施した。各プライマ６ｎｇ／μｌ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ＰＣＲマスターミックスを用いて、重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡ１μｌを含む２５μｌの反応混合物内でＰＣＲ増幅を実施した。重亜硫酸塩処理済みＤＮＡからのＧＳＴＰ１の増幅のために用いられるストランド特異的ネステッドプライマは、ＧＳＴ−９（９６７−９９３）
ＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴ（配列番号１）（Ｆ）ＧＳＴ−１０（１３０７−１３３２）
ＡＡＣＣＴＡＡＴＡＣＴＡＣＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＣＡＴ（配列番号２）第１ラウンド増幅条件である。
【００９６】
第１ラウンドの増幅１μｌを、プライマ（Ｒ）ＧＳＴ−１１（９９９−１０２７）ＧＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＡＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＴＴ（配列番号３）（Ｆ）ＧＳＴ−１２（１２８１−１３０６）ＡＣＴＡＡＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣ（配列番号４）（Ｒ）を含む第２ラウンドの増幅反応混合物に移した。プライマの場所は、ＧＳＴＰ１配列（受入番号：Ｍ２４４８５）に従って示されている。ＰＣＲ産物の試料を、クラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、に記述された条件下でサーモハイバイド（ＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ）ＰＸ２サーマルサイクラの中で増幅させた。
【００９７】
アガロース５０ｍｌあたり１滴の臭化エチジラム（ＣＬＰ＃５４５０）を含む１％のＴＡＥの中でアガロースゲル（２％）を調製した。ＰＣＲ由来の産物５μｌを１μｌの５×アガロースローディングバッファと混合し、水中水平電気泳動タンクを用いてＸ１のＴＡＥで１２５ｍＡで電気泳動に付した。マーカーは低１００〜１０００ｂｐタイプであった。コダック（Ｋｏｄａｋ）ＵＶＩｄｏｃＥＤＡＳ２９０システムを用いてＵＶ照射下でゲルを視覚化した。
【００９８】
表２は、本発明のＨＧＳ方法とクラーク（Ｃｌａｒｋ）らの従来の方法の間のＰＣＲ増幅の感度の比較を示す。
【００９９】
【表２】
0004740113.tif 000003
【０１００】
重亜硫酸塩処理済みゲノミックＤＮＡの分解に対するｐＨの効果
２μｇのＬＮＣａＰ  ＤＮＡを、２０μｌの最終体積で３７℃で１時間メーカーの使用説明書に従って２単位のＥｃｏＲ１（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）＃８７９３０６２６  １０単位／μｌ）で消化させた。８つの個別の反応を準備した。
【０１０１】
消化物の各々について、ＤＮＡのＨＧＳ重亜硫酸塩処理を実施した。処理後、各々の個々の処理からのＤＮＡをｐＨ７．０、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５及び１２．５のいずれかで２０μｌのＴ／Ｅ中に再懸濁させた。
【０１０２】
その後、以下の方法を用いて、ＤＮＡをインキュベートした。
【０１０３】
処理１．ｐＨ１０．５の緩衝溶液中にＨＧＳ重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡを再懸濁させ、３０分間３７℃に放置し、次にＰＣＲ増幅させた。
【０１０４】
処理２．ｐＨ１０．５の緩衝溶液中にＨＧＳ重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡを再懸濁させ、１２０分間３７℃に放置し、次にＰＣＲ増幅させた。
【０１０５】
処理３．ｐＨ１０．５の緩衝溶液中にＨＧＳ重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡを再懸濁させ、３０分間５５℃に放置し、次にＰＣＲ増幅させた。
【０１０６】
アガロース５０ｍｌあたり１滴の臭化エチジラム（ＣＬＰ＃５４５０）を含む１％のＴＡＥの中で１％のアガロースゲルを調製した。ゲノムＤＮＡの試料１０μｌを１／５体積の５×アガロースローディングバッファ（２μｌ）と混合し、水中水平電気泳動タンクを用いてＸ１のＴＡＥ中１２５ｍＡで電気泳動に付した。マーカーは１００〜１０，０００の範囲であった。コダック（Ｋｏｄａｋ）ＵＶＩｄｏｃＥＤＡＳ２９０システムを用いてＵＶ照射下でゲルを視覚化し写真撮影した。
【０１０７】
試料についてのＰＣＲ分析
以下の通り、１μｌの重亜硫酸塩処理済みＤＮＡ再懸濁試料ＤＮＡについて、ＰＣＲ増幅を実施した。
【０１０８】
各プライマ６ｎｇ／μｌ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ＰＣＲマスターミックスを用いて、重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡ１μｌを含む２５μｌの反応混合物内でＰＣＲ増幅を実施した。重亜硫酸塩処理済みＤＮＡからのＧＳＴＰ１の増幅のために用いられるストランド特異的ネステッドプライマは、ＧＳＴ−９（９６７−９９３）ＴＴＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴ（Ｆ）ＧＳＴ−１０（１３０７−１３３２）ＡＡＣＣＴＡＡＴＡＣＴＡＣＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＣＡＴ第１ラウンド増幅条件である。
【０１０９】
第１ラウンドの増幅１μｌを、プライマ（Ｒ）ＧＳＴ−１１（９９９−１０２７）ＧＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＡＡＧＡＧＧＧＡＡＡＧＧＴＴＴＴＴＴ（配列番号３）；（Ｆ）ＧＳＴ−１２（１２８１−１３０６）ＡＣＴＡＡＡＡＡＣＴＣＴＡＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＣＣＣ（Ｒ）（配列番号４）を含む第２ラウンドの増幅反応混合物に移した。プライマの場所は、ＧＳＴＰ１配列（受入番号：Ｍ２４４８５）に従って示されている。ＰＣＲ産物の試料を、クラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、１９９４に記述された条件下でサーモハイバイド（ＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ）ＰＸ２サーマルサイクラの中で増幅させた。
【０１１０】
アガロース５０ｍｌあたり１滴の臭化エチジラム（ＣＬＰ＃５４５０）を含む１％のＴＡＥの中でアガロースゲル（２％）を調製した。ＰＣＲ由来の産物５μｌを１μｌの５×アガロースローディングバッファと混合し、水中水平電気泳動タンクを用いてＸ１のＴＡＥで１２５ｍＡで電気泳動に付した。マーカーは低１００〜１０００ｂｐタイプであった。コダック（Ｋｏｄａｋ）ＵＶＩｄｏｃＥＤＡＳ２９０システムを用いてＵＶ照射下でゲルを視覚化した。
【０１１１】
結果は表３にまとめられている。表３の結果の第１の目的は、重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡ溶液のｐＨが低い場合には標準的ＰＣＲ方法によって検出できる有意な増幅が全く無いことを実証することにある。これはおそらく、重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡの不完全な脱スルホニル化に起因するものと思われる。
【０１１２】
表３の結果は、重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡの脱スルホン化率との関係においてｐＨと温度の間に動的平衡が存在することを実証している。重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡが低ｐＨ溶液中に残っている場合には、脱スルホン化率は非常に低いが、溶液の温度を上昇させることにより改善可能である。例えば、ｐＨ７．０で重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡを有し、それを７２℃で加熱し、それを４８時間放置すると完全な脱スルホン化を達成することが可能であり得る。類似の要領で、ｐＨ１０．５で、反応を７２℃で５分以内に終了させることができる。かくして、室温から約９５℃までの温度の範囲が、本発明にとって適切であり得る。７．０〜１２．５までのｐＨ範囲及び約１分から約９６時間までのインキュベーション時間が適切であると思われる。ｐＨ、時間及び温度のさまざまな考えられる組合せが適切であるということがわかるだろう。
【０１１３】
さらに、試料が従来の方法で処理された場合には、溶液を脱塩するべくサイズ排除クロマトグラフィカラムを下へ重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡが通過させられた時点でＤＮＡの大量損失が存在することになる。先行技術で使用される従来のカラムは一本鎖ＤＮＡ材料のために設計されておらず、大きな損失があることから、少なくとも５０％以上の重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡが喪失する確率がきわめて高い。カラム精製の無いＨＧＳ手順を使用すると、ＨＧＳ手順による損失はごくわずかである。
【０１１４】
【表３】
0004740113.tif 000004
【０１１５】
処理１．ｐＨ１０．５の緩衝溶液中にＨＧＳ重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡを再懸濁させ、３０分間３７℃に放置し、次にＰＣＲ増幅させた。
【０１１６】
処理２．ｐＨ１０．５の緩衝溶液中にＨＧＳ重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡを再懸濁させ、１２０分間３７℃に放置し、次にＰＣＲ増幅させた。
【０１１７】
処理３．ｐＨ１０．５の緩衝溶液中にＨＧＳ重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡを再懸濁させ、３０分間５５℃に放置し、次にＰＣＲ増幅させた。
【０１１８】
さまざまな細胞系及び組織の重亜硫酸塩処理
以下の細胞系及び組織試料からの１μｇのＤＮＡを、２０μｌの最終体積で３７℃で１時間メーカーの使用説明書に従ってデュプリケートで２単位のＥｃｏＲ１（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）＃８７９３０６２６  １０単位／μｌ）で消化させた：ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞系ＤＮＡ、ＭＣＦ−７乳癌細胞系ＤＮＡ、ＢＬ−１３膀胱癌細胞系ＤＮＡ、ＨｅｐＧ２肝癌細胞系ＤＮＡ、ＨｅＬａ子宮癌細胞系ＤＮＡ、患者＃１から精製したＴ細胞及び患者＃１から精製したＣＤ３４＋細胞。
【０１１９】
ＤＮＡのＨＧＳ重亜硫酸塩処理を、１セットの消化物について実施した。処理の後、個々の試料の各々からのＤＮＡをｐＨ１０．５のＴ／Ｅ２０μｌ中に再懸濁させ、２時間５５℃でインキュベートした。もう一方のセットについては従来のＤＮＡ重亜硫酸塩処理（クラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、１９９４）を実施し、ここではＤＮＡの修飾後ｐＨ８．０のＴ／Ｅ２０μｌ中にそれを再懸濁した。
【０１２０】
試料についてのＰＣＲ分析
従来の及びＨＧＳでの重亜硫酸塩処理が施されたＤＮＡの両方１μｌについてＰＣＲ増幅を実施した。６つの個々のゲノム遺伝子座を各試料について分析して、ＨＧＳ及び従来の重亜硫酸塩修飾方法が表わすゲノムカバー度を決定した。
【０１２１】
第１ラウンドの各々の遺伝子特異的プライマ６ｎｇ／μｌ及びプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ＰＣＲマスターミックスを用いて、１μｌの重亜硫酸塩処理済みゲノムＤＮＡを含む２５μｌの反応混合物の中でＰＣＲ増幅を実施した。第１ラウンドの増幅１μｌを、第２ラウンドの遺伝子特異的プライマを含む第２ラウンドの増幅反応混合物に移した。クラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、１９９４中に記述された条件の下でサーモハイバイド（ＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ）ＰＸ２サーマルサイクラの中でＰＣＲ産物を増幅した。
【０１２２】
アガロース５０ｍｌあたり１滴の臭化エチジラム（ＣＬＰ＃５４５０）を含む１％のＴＡＥの中で２％のアガロースゲルを調製した。ＰＣＲ由来の産物の５μｌアリコートを１μｌの５×アガロースローディングバッファと混合し、水中水平電気泳動タンクを用いてＸ１のＴＡＥ中１２５ｍＡで電気泳動に付した。マーカーは低１００〜１０００ｂｐタイプであった。コダック（Ｋｏｄａｋ）ＵＶＩｄｏｃＥＤＡＳ２９０システムを用いてＵＶ照射下でゲルを視覚化した。
【０１２３】
ＨＧＳ重亜硫酸塩方法で処理されたゲノムＤＮＡを、ＧＳＴＰ１遺伝子を検出するように設計されたプライマで従来のＰＣＲ技術を用いて増幅させた。先行技術の方法と本発明に従った方法の間の比較の結果は表４に記されている。
【０１２４】
【表４】
0004740113.tif 000005
【０１２５】
表４の組織試料は以下の通りである：
ａ）  ＬＮＣａｐ前立腺癌細胞系ＤＮＡ
ｂ）  ＭＣＦ−７乳癌細胞系ＤＮＡ
ｃ）  ＨｅｐＧ２肝癌細胞系ＤＮＡ
ｄ）  ＨｅＬａ子宮頸癌細胞系ＤＮＡ
ｅ）  患者＃１から精製されたＴ細胞
ｆ）  患者＃１から精製されたＣＤ３４＋細胞
【０１２６】
図１は、ＨＧＳ重亜硫酸塩方法と従来の重亜硫酸塩方法（クラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、１９９４）の間のさまざまな組織試料からの重亜硫酸塩処理済みＤＮＡの回収の比較を示す。ウェル＃１は、２ＬＮＣａＰ細胞から抽出され重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡ。ウェル＃２は、２０ＬＮＣａＰ細胞から抽出され重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡ。ウェル＃３は、２００ＬＮＣａＰ細胞から抽出され重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡ。ウェル＃４は、２，０００ＬＮＣａＰ細胞から抽出され重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡ。そしてウェル＃５は、２０，０００ＬＮＣａＰ細胞から抽出され重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡ。
【０１２７】
図１を見るとわかるように、本発明に従った方法を用いたＤＮＡの回収は、先行技術の方法のものよりもはるかに優れている。
【０１２８】
ＲＮＡ結果
図２は、従来の重亜硫酸塩アプローチを用いた場合に比べた前立腺癌細胞系Ｄｕ１４５から抽出されたＲＮＡについてＨＧＳ重亜硫酸塩処理を用いて得られた結果を示している。
【０１２９】
ここでわかるように、４℃、室温及び５５℃でＨＧＳ方法で処理した全ての試料中で、高分子量のＲＮＡが観察された。２３Ｓ、１８Ｓ及び５ＳリポゾームＲＮＡバンドは明確に見え、対照に比べた場合ＲＮＡの分解がきわめてわずかしかないこともわかる。これとは対照的に、従来の方法で処理したＲＮＡは、完全に分解されていた。
【０１３０】
図３は、異なる温度のインキュベーションを用いたＲＮＡの安定性に関する経時的実験を示している。結果から、最初の３０分間のインキュベーションにおいて少量の分解が発生するがそれからほぼ定常状態に達し、その後５５℃で１６時間のインキュベーションの後でさえ、損失はきわめてわずかであるということがわかる。
【０１３１】
図４は、重亜硫酸塩で変換されたＲＮＡと野生型ＲＮＡの両方について実施された逆転写酵素ＰＣＲを示す。ここでわかるように、野生型ＲＮＡ内のバンドと同じサイズで重亜硫酸塩処理済みＲＮＡ内に強いＰＣＲ増幅シグナルが見うけられる。
【０１３２】
野生型プライマを用いたＲＴ−ＰＣＲのための鋳型として重亜硫酸塩処理済みＲＮＡが使用された場合、又は重亜硫酸塩で変換されたプライマのＲＴ−ＰＣＲのための鋳型として野生型ＲＮＡが使用された場合、いかなるバンドも検出されなかった。このことは、重亜硫酸塩反応がほぼ１００％の効率で野生型ＲＮＡを変換済みＲＮＡへと変換したことを表わしている。
【０１３３】
図５は、図４で生成されたＰＣＲ産物が重亜硫酸塩処理済みゲノムＲＮＡから誘導されたことの確認を示している。矢印は、ヒトベータ−アクチン転写物内のエクソン３及び４の間のスプライス部位を示す。
【０１３４】
当業者であれば、広義に記述されているような発明の精神又は範囲から逸脱することなく、特定の実施形態の中に示されている通りの発明に対し数多くの変更及び／又は修正を加えることができる、ということがわかるだろう。従って当該実施形態は、あらゆる面で制限的な意味のない例示を目的としたものとしてみなされるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】ＨＧＳ重亜硫酸塩方法と従来の重亜硫酸塩方法（クラーク（Ｃｌａｒｋ）ら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２：２９９０−２９９７）の間のさまざまな組織試料からの重亜硫酸塩処理済みＤＮＡの回収の比較を示す。ウェル＃１は、２ＬＮＣａＰ細胞から抽出され重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡ。ウェル＃２は、２０ＬＮＣａＰ細胞から抽出され重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡ。ウェル＃３は、２００ＬＮＣａＰ細胞から抽出され重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡ。ウェル＃４は、２，０００ＬＮＣａＰ細胞から抽出され重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡ。そしてウェル＃５は、２０，０００ＬＮＣａＰ細胞から抽出され重亜硫酸塩で処理されたＤＮＡ。ＨＧＳ方法は、左側（前述の通り、それぞれ１〜５と印づけされたレーン）に示され、従来の重亜硫酸塩方法は右側（上述の通りそれぞれ１〜５と印づけされたレーン）に示されている。
【図２】従来の重亜硫酸塩アプローチを用いた場合に比べた前立腺癌細胞系Ｄｕ１４５から抽出されたＲＮＡについてＨＧＳ重亜硫酸塩処理を用いて得られた結果を示している。レーン１：未処理対照ＲＮＡ。レーン２：一晩４℃での重亜硫酸塩処理済みＲＮＡ。レーン３：一晩室温での重亜硫酸塩処理済みＲＮＡ。レーン４：一晩５５℃での重亜硫酸塩処理済みＲＮＡ。レーン５：一晩室温での重亜硫酸塩処理済みＲＮＡ、複製＃２。レーン６：一晩室温での重亜硫酸塩処理済みＲＮＡ、複製＃３。レーン７：従来の方法（クラーク（Ｃｌａｒｋ）ら、１９９４）を用いた一晩室温での重亜硫酸塩処理済みＲＮＡ。Ｍ＝分子サイズマーカー。
【図３】異なる温度のインキュベーションを用いたＲＮＡの安定性に関する経時的実験を示している。結果から、最初の３０分間のインキュベーションにおいて少量の分解が発生するがそれからほぼ定常状態に達し、その後５５℃で１６時間のインキュベーションの後でさえ、損失はきわめてわずかであるということがわかる。
【図４】重亜硫酸塩で変換されたＲＮＡと野生型ＲＮＡの両方について実施された逆転写酵素ＰＣＲを示す。ここでわかるように、野生型ＲＮＡ内のバンドと同じサイズで重亜硫酸塩処理済みＲＮＡ内に強いＰＣＲ増幅シグナルが見うけられる。レーン１：重亜硫酸塩処理済みヒトベータ−アクチンＲＮＡのエクソン３及び４を増幅するための重亜硫酸塩プライマを用いたＲＴ−ＰＣＲ増幅。レーン２：重亜硫酸塩処理済みヒトベータ−アクチンＲＮＡのエクソン３を増幅するための重亜硫酸塩プライマを用いたＲＴ−ＰＣＲ増幅。レーン３：ヒトベータ−アクチンＲＮＡのエクソン３及び４を増幅するための野生型プライマを用いたＲＴ−ＰＣＲ増幅。レーン４：ヒトベータ−アクチンＲＮＡのエクソン３を増幅するための野生型プライマを用いたＲＴ−ＰＣＲ増幅。（注）：野生型ＲＮＡについて重亜硫酸塩処理済み増幅プライマが使用された場合いかなるＰＣＲ増幅も観察されず、さらに重亜硫酸塩処理済みＲＮＡについて野生型プライマが使用された場合、いかなるＰＣＲシグナルも観察されなかった。
【図５】図４で生成されたＰＣＲ産物が重亜硫酸塩処理済みゲノムＲＮＡから誘導されたことの確認を示している。矢印は、ヒトベータ−アクチン転写物の中のエクソン３及び４の間のスプライス部位を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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