(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを用い、更にカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを含む酵素的測定試薬であって、少なくとも前記カップラーとフェロシアン化物とを同時に含む測定試薬に、グルコン酸、コハク酸、酒石酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、又はサリチル酸よりなる群から選択される少なくとも一つの物質を含有させることを特徴とする、酵素的測定試薬の安定化方法。
【請求項２】
前記カップラーが、４−アミノアンチピリンである、請求項１記載の酵素的測定試薬の安定化方法。
【請求項３】
前記フェロシアン化物が、前記酵素的測定試薬に含まれる試薬成分を劣化、分解若しくは変質させるものであるか、又は測定値に誤差を生じさせるものである、請求項１又は請求項２に記載の酵素的測定試薬の安定化方法。
【請求項４】
前記カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンが、酵素的測定試薬に含まれる試薬成分を安定化及び／又は活性化させるものである、請求項１〜３に記載の酵素的測定試薬の安定化方法。
【請求項５】
前記カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンにより安定化及び／又は活性化される試薬成分が、コレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ又はホスホリパーゼよりなる群から選択される少なくとも一つの試薬成分である、請求項１〜４に記載の酵素的測定試薬の安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、酵素的測定試薬の安定化方法に関するものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】  血液、尿などの生体試料中に含まれる生体成分を測定することは、疾病の診断において大変有用なものであり、臨床検査においては酵素学的測定法が普及し、様々な測定方法が開発されている。このような方法としては、例えば、酸化酵素を用いて、生体成分から直接又は間接的に、酸化性物質である過酸化水素を生成させ、これをペルオキシダーゼ及び被酸化性発色試薬と混合、接触させて発色系に導き、酸化縮合反応により被酸化性発色試薬から生成した色素を光学的に測定することにより生成した過酸化水素の測定を行い、これにより生体試料中に含まれる生体成分を測定する方法を挙げることができる。
例えば、コレステロール、尿酸、及びブドウ糖等の測定に、それぞれコレステロールオキシダーゼ、ウリカーゼ、及びグルコースオキシダーゼ等の酸化酵素を働かせて過酸化水素を生成させ、この生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ及び被酸化性発色試薬と混合、接触させて発色系に導き、酸化縮合反応により被酸化性発色試薬から生成した色素を光学的に測定することにより測定し、これより各生体成分を正確に測定することができる。
また、このような測定方法は、１ステップ法あるいは２ステップ法で行なわれており、前者は測定試薬成分が全部一緒になった１試薬系であり、後者は試薬成分を２つに分けた２試薬系を使う。【０００３】  従来、この方法に用いられる被酸化性発色試薬としては、主にフェノール又はその誘導体あるいはアニリン誘導体等の水素供与体である色原体と、その縮合対象物として、４−アミノアンチピリン等のカップラーとを組み合わせたものが用いられてきた。しかしながら、これらの被酸化性発色試薬は、生体試料中のビリルビンの影響を受け易いことも知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
また、この生体試料中のビリルビンの影響を回避する方法としては、測定試薬中にフェロシアン化物を含有させる方法が一般的に使用されている（例えば、非特許文献２参照。）。
【非特許文献１】    臨床化学  ８巻，１号，６３〜７２頁，１９８０年
【非特許文献２】    Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６巻，２号，２２７〜２３１頁，１９８０年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  しかしながら、これら従来の方法の場合、フェロシアン化物と被酸化性発色試薬とを共存させた状態で保存すると、保存中にフェロシアン化物が被酸化性発色試薬である色原体やカップラーを劣化、分解又は変質させることにより、測定値に負の誤差を生じさせてしまい、正確な測定が行えないという問題点があった。
また、２試薬系の測定試薬にして、フェロシアン化物を第１試薬（又は第２試薬）に、色原体及びカップラーを第２試薬（又は第１試薬）に別々に含有させることも可能であるが、この場合、第２試薬（又は第１試薬）中で色原体とカップラーが共存しているため、保存中に色原体及びカップラーが酸化を受けて発色し試薬ブランクが上昇するという問題点があった。
また、２試薬系の測定試薬で、被酸化性発色試薬である色原体を第１試薬（又は第２試薬）に、カップラーを第２試薬（又は第１試薬）に別々に含有させた場合には、色原体又はカップラーのいずれかがフェロシアン化物と共存することになるため、フェロシアン化物の影響により劣化してしまうという問題点があった。
すなわち、フェロシアン化物と被酸化性発色試薬とを共存させると、色原体又はカップラーが劣化してしまい、正確な測定が行えないという問題点がある。【０００５】  よって、本発明の課題は、１試薬系又は２試薬系の酵素的測定試薬であり、ビリルビンの影響回避のためにこの酵素的測定試薬中にフェロシアン化物を含有させた酵素的測定試薬において、フェロシアン化物と被酸化性発色試薬のいずれか一方又は両方とが共存した場合でも、フェロシアン化物による色原体及びカップラーの劣化、分解又は変質を防ぎ、長期保存時にも安定化し、誤差のない正確な測定を行うことができる、酵素的測定試薬の安定化方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】  本発明者は、上記の問題点の解決を目指して鋭意検討を行った結果、色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬、酸化酵素並びにペルオキシダーゼを用いる酵素的測定試薬にキレート剤を含有させることにより、前記被酸化性発色試薬のいずれか一方又は両方とフェロシアン化物とが共存した場合でも、前記被酸化性発色試薬を劣化させることなく、酵素的測定試薬を安定化できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１） 色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを用い、更にカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを含む酵素的測定試薬であって、少なくとも前記カップラーとフェロシアン化物とを同時に含む測定試薬に、グルコン酸、コハク酸、酒石酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、又はサリチル酸よりなる群から選択される少なくとも一つの物質を含有させることを特徴とする、酵素的測定試薬の安定化方法。
【０００８】（２）  前記カップラーが、４−アミノアンチピリンである、前記（１）記載の酵素的測定試薬の安定化方法。【０００９】
（３）前記フェロシアン化物が、前記酵素的測定試薬に含まれる試薬成分を劣化、分解若しくは変質させるものであるか、又は測定値に誤差を生じさせるものである、前記（１）又は（２）に記載の酵素的測定試薬の安定化方法。
【００１０】
（４）前記カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンが、酵素的測定試薬に含まれる試薬成分を安定化及び／又は活性化させるものである、前記（１）〜（３）に記載の酵素的測定試薬の安定化方法。
【００１１】
（５）前記カルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンにより安定化及び／又は活性化される試薬成分が、コレステロールエステラーゼ、リポプロテインリパーゼ又はホスホリパーゼよりなる群から選択される少なくとも一つの試薬成分である、前記（１）〜（４）に記載の酵素的測定試薬の安定化方法。
【発明の効果】
【００１９】  本発明の酵素的測定試薬の安定化方法では、色原体（水素供与体）及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを用いる酵素的測定試薬にキレート剤を含有させることにより、１試薬系又は２試薬系の酵素的測定試薬であり、ビリルビンの影響回避のためにこの酵素的測定試薬中にフェロシアン化物を含有させた酵素的測定試薬において、フェロシアン化物と被酸化性発色試薬のいずれか一方又は両方とが共存した場合でも、フェロシアン化物による色原体及びカップラーの劣化、分解又は変質を防ぎ、長期保存時にも安定化し、誤差のない正確な測定を行うことができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】（１）  被酸化性発色試薬
本発明において用いられる被酸化性発色試薬とは、酸化酵素の作用により生成した過酸化水素を測定することにより生体成分を測定する場合に、ペルオキシダーゼの作用により過酸化水素と酸化縮合させ色素を生成させるための、色原体とカップラーの組み合わせからなる試薬のことをいう。【００２１】  色原体とは、酸化縮合の反応時に水素を放出する水素供与体のことをいい、ペルオキシダーゼの作用により酸化され、後記の４−アミノアンチピリン等のカップラーとともに酸化縮合し色素を生成するものであれば特に限定されず、例えば、フェノール若しくはその誘導体、又はアニリン誘導体等を挙げることができる。【００２２】  ここで、フェノールの誘導体としては、例えば、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、若しくは２，４，６−トリクロロフェノール、又はこれらの塩等を挙げることができる。【００２３】  また、アニリン誘導体としては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＰＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン（ＣＥＭＢ）、若しくはＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メトキシアニリン（ＣＥＭＯ）、又はこれらの塩等を挙げることができる。【００２４】  また、色原体の濃度は、特に限定されないが、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．０５〜２０ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．１〜５ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。【００２５】  カップラーとは、ペルオキシダーゼの作用により酸化され、前記の色原体とともに酸化縮合し色素を生成するものであれば特に限定されず、例えば、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、フェニレンジアミン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等を挙げることができる。
なお、本発明においては、カップラーが４−アミノアンチピリンであることが好ましい。
また、カップラーの濃度は、特に限定されないが、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．０５〜１０ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．１〜５ｍＭの範囲が特に好ましい。【００２６】（２）  酸化酵素
本発明において、酸化酵素とは、生体成分から直接又は間接的に、酸化性物質である過酸化水素を生成させる反応を触媒する物質をいう。
ここで、酸化酵素としては、例えば、コレステロールオキシダーゼ、ウリカーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、又はピルビン酸オキシダーゼ等を挙げることができる。
また、本発明において、酸化酵素の濃度は、特に限定されないが、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、７〜８００単位／Ｌの範囲にあることが好ましい。【００２７】（３）  ペルオキシダーゼ
本発明において、ペルオキシダーゼとしては、いずれの由来のものも使用でき、例えば、ヒト若しくはウシなどの動物由来のもの、西洋ワサビなどの植物由来のもの、細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの等を挙げることができる。
なお、このペルオキシダーゼとしては、微生物等のペルオキシダーゼの遺伝子を大腸菌等の微生物等に組み込む遺伝子組み換え技術により調製したもの、又は遺伝子の改変等により性質を改良した微生物等から調製したペルオキシダーゼ等も含まれる。
また、ペルオキシダーゼの濃度は、特に限定されないが、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、２０単位／Ｌ以上であることが好ましい。【００２８】（４）  第１の金属イオン又はこれを含有する物質
本発明においては、酵素的測定試薬が、少なくとも前記被酸化性発色試薬のいずれか一方と第１の金属イオン又はこれを含有する物質とを、第１試薬又は第２試薬の同じ試薬中に含むものである。
そして、前記第１の金属イオン又はこれを含有する物質は、酵素的測定試薬に含まれる前記被酸化性発色試薬等の試薬成分を劣化、分解若しくは変質させるものであるか、又は測定値に誤差を生じさせるものである。
ここで、第１の金属イオンとしては、例えば、二価又は三価の鉄イオン等を挙げることができる。
また、第１の金属イオンとしての鉄イオンを含有する物質としては、例えば、フェロシアン化物等を挙げることができる。このフェロシアン化物としては、例えば、フェロシアン化カリウム、フェロシアン化ナトリウム等を挙げることができる。【００２９】（５）  キレート剤
本発明においては、酵素的測定試薬にキレート剤を含有させることを特徴とする。本発明においては、このキレート剤を酵素的測定試薬に含有させることにより、被酸化性発色試薬のいずれか一方又は両方とフェロシアン化物とが共存した場合でも、被酸化性発色試薬をフェロシアン化物の作用により劣化させることなく、正確な測定を行うことが可能となる。【００３０】  ここで、キレート剤は、第１の金属イオン又はこれを含有する物質に配位するものである必要がある。このようなキレート剤としては、例えば、グルコン酸、エチレンジアミン四酢酸〔ＥＤＴＡ〕、エチレンジアミンニプロピオン酸〔ＥＤＤＰ〕、ビス（アミノフェニル）エチレングリコール四酢酸〔ＢＡＰＴＡ〕、クエン酸、コハク酸、酒石酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン〔トリシン〕、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン〔ビシン〕、サリチル酸、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸〔ＡＤＡ〕、シュウ酸、チオ硫酸、若しくはチオシアン酸又はその塩等を挙げることができる。【００３１】  また、キレート剤の濃度は、酵素的測定試薬中に含まれる第１の金属イオンの全てと配位できる濃度であれば特に限定されないが、試料と測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．０７５〜２００ｍＭが好ましく、０．５〜５０ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。【００３２】  また、本発明の酵素的測定試薬の安定化方法は、酸化酵素を用いる従来より公知の１試薬系又は２試薬系の酵素的測定試薬、例えば、生体成分に酸化酵素を作用させて直接又は間接的に過酸化水素を生成させ、得られた過酸化水素を、ペルオキシダーゼ及び被酸化性発色試薬と混合し、生成した発色物を測定する従来公知の酵素的測定試薬に、前記したキレート剤の少なくとも１種類を含有させることによって実施することができる。
更に、本発明は、被酸化性発色試薬のいずれか一方又は両方と第１の金属イオン又はこれを含有する物質とを同時に含む酵素的測定試薬であれば、いずれにも実施することができる。
なお、このキレート剤は１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。【００３３】（６）  第２の金属イオン又はこれを含有する物質
本発明における酵素的測定試薬においては、前記の第１の金属イオン又はこれを含有する物質とは異なる、第２の金属イオン又はこれを含有する物質が含まれていてもよい。
この第２の金属イオン又はこれを含有する物質としては、例えば、酵素的測定試薬に含まれる試薬成分を安定化及び／又は活性化させるもの等を挙げることができる。
より具体的には、これらの第２の金属イオンとして、例えば、カルシウムイオン又はマグネシウムイオン等を挙げることができる。
なお、本発明は、前記した試薬成分に加えて、第２の金属イオン又はこれを含有する物質を含む酵素的測定試薬において好適である。【００３４】  すなわち、本発明者は、フェロシアン化物中の鉄イオンが被酸化性発色試薬である色原体及びカップラーの劣化に関わっていることを見出し、フェロシアン化物中の鉄イオンにキレート剤を配位させることにより、色原体及びカップラーの劣化が抑制できることを見出した。【００３５】  しかしながら、例えば、微生物由来のコレステロールエステラーゼのように、カルシウムイオン（第２の金属イオン）によって安定化及び／又は活性化される酵素を使用する酵素的測定試薬の場合、酵素的測定試薬中にカルシウムイオンを含有させることが必要となる。この場合、フェロシアン化物中の鉄イオンを配位する目的で添加したキレート剤がカルシウムイオンをも配位してしまい、コレステロールエステラーゼが不安定化されてしまう。【００３６】  このような場合には、フェロシアン化物中の鉄イオンには配位するが、カルシウムイオンには配位しない（又は配位しにくい）キレート剤を選択することで、フェロシアン化物が被酸化性発色試薬を劣化させることを抑制でき、かつ酵素等の試薬成分の安定化には影響を与えないことが可能となる。【００３７】  すなわち、第１の金属イオン又はこれを含有する物質には配位するが、第２の金属イオン又はこれを含有する物質には配位しないキレート剤を選択することにより、第１の金属イオンが被酸化性発色試薬を劣化等させることを抑制し、かつ第２の金属イオンによる酵素的測定試薬に含まれる試薬成分の安定化及び／又は活性化作用等は妨げないことができる。【００３８】  ここで、第１の金属イオン又はこれを含有する物質には配位するが、第２の金属イオン又はこれを含有する物質には配位しないキレート剤としては、例えば、グルコン酸、コハク酸、酒石酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン〔トリシン〕、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン〔ビシン〕、又はサリチル酸等を挙げることができる。【００３９】（７）  第２の金属イオン又はこれを含有する物質により安定化及び／又は活性化される試薬成分
本発明における、第２の金属イオン又はこれを含有する物質により安定化及び／又は活性化される試薬成分であるが、例えば、カルシウムイオン又はこれを含有する物質により安定化及び／又は活性化される試薬成分としては、コレステロールエステラーゼ又はホスホリパーゼ等を挙げることができる。
また、例えば、マグネシウムイオン又はこれを含有する物質により安定化及び／又は活性化される試薬成分としては、例えば、リポプロテインリパーゼ等を挙げることができる。
なお、本発明においては、第２の金属イオン又はこれを含有する物質により安定化及び／又は活性化される試薬成分が、コレステロールエステラーゼであることが好ましい。
【実施例】
【００４０】  以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこの実施例により限定されるものではない。【００４１】〔実施例１〕
（本発明による酵素的測定試薬の安定化効果の確認−１）
本発明において、キレート剤であるグルコン酸ナトリウムをフェロシアン化物と４−アミノアンチピリンが共存する酵素的測定試薬に含有させた場合の酵素的測定試薬の安定化効果を確かめた。【００４２】１．  酵素的測定試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを５．４、及び６．３（２０℃）に各々調整し、ｐＨ及びキレート剤であるグルコン酸ナトリウムの濃度が異なる６種類の第１試薬を調製した。
グッド緩衝液（埼京化成）    １００ｍＭ
４−アミノアンチピリン（第一化学）    ０．１１ｇ／Ｌ
フェロシアン化カリウム（国産化学）    ３１μＭ
塩化カルシウム（国産化学）            ２ｍＭ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡績）５００単位／Ｌ
グルコン酸ナトリウム（東京化成）      ２３ｍＭ、４６ｍＭ、又は無添加（０ｍＭ）【００４３】（２）  第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．９（２０℃）に調整し、第２試薬を調製した。
グッド緩衝液（埼京化成）  ２０ｍＭ
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−３，５−ジメトキシアニリン［ＨＤＡＯＳ］（埼京化成）  ２ｍＭ
ペルオキシダーゼ（東洋紡績）  ８０００単位／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ（天野製薬）  １３２０単位／Ｌ【００４４】２．  第１試薬及び第２試薬の保存
上記１の（１）で調製した６種類の第１試薬及び上記１の（２）で調製した第２試薬をそれぞれ、１０℃及び２５℃で各々１９６日間保存した。【００４５】３．  ４−アミノアンチピリンの含有量の測定
保存開始時及び保存１４７日後、並びに１９６日後に、６種類の第１試薬の各々の４−アミノアンチピリンの含有量を測定した。
４−アミノアンチピリンの含有量の測定は、波長５０５ｎｍおける吸光度を測定することにより行った。
そして、保存１４７日後及び１９６日後の吸光度（４−アミノアンチピリン含有量）をそれぞれ、保存開始時の吸光度（４−アミノアンチピリン含有量）で除して１００を乗ずることにより、保存１４７日後及び１９６日後の４−アミノアンチピリンの残存率（％）をそれぞれ算出した。【００４６】４．  測定結果
４−アミノアンチピリンの含有量の測定結果を表１に示した。
なお、この表で、カッコ内の数値は、前記の通りに算出した保存後の４−アミノアンチピリンの残存率（％）を示す。【００４７】
【表１】
0004639287.tif 000002
【００４８】  表１から明らかなように、第１試薬にグルコン酸ナトリウムを含有させていないもの（０ｍＭ）は、この第１試薬の保存により４−アミノアンチピリンの含有量（吸光度）が低下していることが分かる。【００４９】  すなわち、ｐＨ５．４に調整したものは、保存開始時の４−アミノアンチピリンの吸光度を１００％とした場合に、１０℃での保存１４７日後で３．７％に、１９６日後では２．０％にまで低下していることが分かる。また、２５℃での保存１４７日後で３．３％に、１９６日後では４．５％に低下していることが分かる。また、ｐＨ６．３に調整したものは、保存開始時の４−アミノアンチピリンの吸光度を１００％とした場合に、１０℃での保存では１４７日後で４４．２％に、１９６日後では１３．３％にまで低下していることが分かる。更に、２５℃での保存では１４７日後、１９６日後ともに３．５％にまで低下していることが分かる。【００５０】  これに対して、キレート剤であるグルコン酸ナトリウムを第１試薬に含有させた場合には、ｐＨ５．４に調整したものは、グルコン酸ナトリウム濃度が２３ｍＭ、４６ｍＭの場合の４−アミノアンチピリンの残存率は、１０℃での保存１４７日後で各々６１．０％、７４．９％となっており、１９６日後では各々５３．９％、７３．０％であった。また、２５℃での保存１４７日後では各々１８．９％、４８．６％となっており、１９６日後では各々５．０％、２８．８％となっている。【００５１】  また、ｐＨ６．３に調整したものは、グルコン酸ナトリウム濃度が２３ｍＭ、４６ｍＭの場合の４−アミノアンチピリンの残存率は、１０℃での保存１４７日後で各々９６．３％、１０１．４％となっており、１９６日後では各々９７．６％、１０５．８％であった。更に、２５℃での保存１４７日後では各々８５．２％、９７．９％となっており、１９６日後では各々８３．４％、１０１．６％となっている。【００５２】  これらの結果から、フェロシアン化カリウムと４−アミノアンチピリンが共存する酵素的測定試薬に、キレート剤であるグルコン酸ナトリウムを存在させることにより、４−アミノアンチピリンの残存率が著しく向上していることが分かる。また、グルコン酸ナトリウム濃度の増加に従って４−アミノアンチピリンの残存率が向上していることも分かる。
以上のことより、フェロシアン化物と４−アミノアンチピリンが共存している酵素的測定試薬にキレート剤であるグルコン酸ナトリウムを含有させることにより、４−アミノアンチピリンを安定化できることが確かめられた。【００５３】〔実施例２〕
（本発明による酵素的測定試薬の安定化効果の確認−２）
本発明において、キレート剤をフェロシアン化物と４−アミノアンチピリンが共存する酵素的測定試薬に含有させた場合の酵素的測定試薬の安定化効果を確かめた。【００５４】１．  酵素的測定試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
表２に記載の８種類のキレート剤それぞれについて３ｍＭ、１５ｍＭ、又は３０ｍＭの濃度で含有すること（又は含有しないこと）、及びｐＨを６．９に調整すること以外は実施例１の１の（１）の第１試薬と同様にして、２５種類の第１試薬をそれぞれ調製した。【００５５】（２）  第２試薬の調製
実施例１の１の（２）の第２試薬と同様にして、第２試薬を調製した。【００５６】２．  第１試薬及び第２試薬の保存
上記１の（１）で調製した２５種類の第１試薬及び上記１の（２）で調製した第２試薬をそれぞれ３７℃で３６日間保存した。【００５７】３．  ４−アミノアンチピリンの含有量の測定
保存開始時及び保存７日後、１９日後、並びに３６日後に、２５種類の第１試薬の各々の４−アミノアンチピリンの含有量を実施例１と同様の方法で測定した。【００５８】４．  測定結果
４−アミノアンチピリンの含有量の測定結果を表２に示した。
なお、この表で、カッコ内の数値は、実施例１の３の記載と同様にして算出した保存後の４−アミノアンチピリンの残存率（％）を示す。【００５９】
【表２】
0004639287.tif 000003
【００６０】  表２から明らかなように、第１試薬にキレート剤を含有させていないもの（０ｍＭ）は、保存日数の経過に従って４−アミノアンチピリンの含有量（吸光度）が低下していることが分かる。【００６１】  すなわち、保存開始時の４−アミノアンチピリンの吸光度を１００％とした場合に、保存７日後で８０．７％、１９日後で４８．５％、３６日後では１４．８％にまで低下していることが分かる。【００６２】  これに対して、グルコン酸ナトリウム、クエン酸、又は酒石酸を第１試薬に含有させた場合には、４−アミノアンチピリンの残存率は、保存７日後で９４％以上、１９日後では８４％以上、３６日後でも７１％以上となっている。また、その他のキレート剤についても、程度の差こそあれ、キレート剤を含有させない場合に比べて、４−アミノアンチピリンの残存率が高くなっていることが分かる。【００６３】  これらの結果から、フェロシアン化カリウムと４−アミノアンチピリンが共存する試薬に、キレート剤を含有させることにより、４−アミノアンチピリンの残存率が向上していることが分かる。
以上のことより、フェロシアン化物と４−アミノアンチピリンが共存する試薬にキレート剤を含有させることにより、４−アミノアンチピリンを安定化できることが確かめられた。【００６４】〔実施例３〕
（本発明による酵素的測定試薬の安定化効果の確認−３）
本発明において、キレート剤をフェロシアン化物と４−アミノアンチピリンが共存する酵素的測定試薬に含有させた場合の酵素的測定試薬の安定化効果を確かめた。【００６５】１．  酵素的測定試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
表３に記載の１０種類のキレート剤それぞれを表に記載した濃度で含有すること（又は含有しないこと）、及びｐＨを６．５に調整すること以外は実施例１の１の（１）の第１試薬と同様にして、３０種類の第１試薬をそれぞれ調製した。【００６６】（２）  第２試薬の調製
実施例１の１の（２）の第２試薬と同様にして、第２試薬を調製した。【００６７】２．  第１試薬及び第２試薬の保存
上記１の（１）で調製した３０種類の第１試薬及び上記１の（２）で調製した第２試薬を３７℃で３６日間保存した。【００６８】３．  ４−アミノアンチピリンの含有量の測定
保存開始時及び保存７日後、１９日後、並びに３６日後に、３０種類の第１試薬の各々の４−アミノアンチピリンの含有量（吸光度）を実施例１と同様の方法で測定した。【００６９】４．  測定結果
４−アミノアンチピリンの含有量の測定結果を表３に示した。
なお、この表で、カッコ内の数値は、実施例１の３の記載と同様にして算出した保存後の４−アミノアンチピリンの残存率（％）を示す。【００７０】
【表３】
0004639287.tif 000004
【００７１】  表３から明らかなように、第１試薬にキレート剤を含有させていないもの（０ｍＭ）は、保存日数の経過に従って４−アミノアンチピリンの含有量（吸光度）が低下していることが分かる。【００７２】  すなわち、保存開始時の４−アミノアンチピリンの含有量（吸光度）を１００％とした場合に、保存７日後で７９．５％、１９日後で９．０％、３６日後では−５．０％にまで低下していることが分かる。【００７３】  これに対して、グルコン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ二ナトリウム、クエン酸、酒石酸、又はサリチル酸を第１試薬に含有させた場合には、４−アミノアンチピリンの残存率は、保存７日後で８８％以上、保存１９日後でも６２％以上となっている。また、その他のキレート剤についても、程度の差こそあれ、キレート剤を含有させない場合に比べて、４−アミノアンチピリンの残存率が高くなっていることが分かる。【００７４】  これらの結果から、フェロシアン化カリウムと４−アミノアンチピリンが共存する酵素的測定試薬に、キレート剤を含有させることにより、４−アミノアンチピリンの残存率が向上していることが分かる。
以上のことより、フェロシアン化物と４−アミノアンチピリンが共存する酵素的測定試薬にキレート剤を含有させることにより、４−アミノアンチピリンを安定化できることが確かめられた。【００７５】〔実施例４〕
（本発明による酵素的測定試薬の安定化効果の確認−４）
本発明において、キレート剤をフェロシアン化物と４−アミノアンチピリンが共存する酵素的測定試薬に含有させた場合の酵素的測定試薬の安定化効果を確かめた。【００７６】１．  酵素的測定試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを７．０（２０℃）に調整し、第１試薬を調製した。
グッド緩衝液（埼京化成）  ２０ｍＭ
Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル
−３−メチルアニリン［ＣＥＭＢ］  １．５ｍＭ
グリセロールキナーゼ                    １５０単位／Ｌ
グリセロール−３−リン酸オキシダーゼ    ３，０００単位／Ｌ
アデノシン三リン酸二ナトリウム          ０．５ｍＭ【００７７】（２）  第２試薬の調製
表４に記載の１１種類のキレート剤それぞれを表に記載した濃度で、及び下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．０（２０℃）に各々調整し、２３種類の第２試薬をそれぞれ調製した。
グッド緩衝液（埼京化成）    ５０ｍＭ
４−アミノアンチピリン（第一化学）    ０．４５７ｇ／Ｌ
フェロシアン化カリウム（国産化学）    ３０μＭ
ペルオキシダーゼ（東洋紡績）  ６００単位／Ｌ
リポプロテインリパーゼ（旭化成）  １００，０００単位／Ｌ【００７８】２．  第１試薬及び第２試薬の保存
上記１の（１）で調製した第１試薬及び上記１の（２）で調製した２３種類の第２試薬を２５℃で２８日間保存した。【００７９】３．  ４−アミノアンチピリンの含有量の測定
保存開始時及び保存２８日後に、２３種類の第２試薬の各々の４−アミノアンチピリンの含有量（吸光度）を測定した。
４−アミノアンチピリンの含有量の測定は、波長５８５ｎｍおける吸光度を測定することにより行った。
そして、保存２８日後の吸光度（４−アミノアンチピリン含有量）を、保存開始時の吸光度（４−アミノアンチピリン含有量）で除して１００を乗ずることにより、保存２８日後の４−アミノアンチピリンの残存率（％）を算出した。【００８０】４．  測定結果
４−アミノアンチピリンの含有量の測定結果を表４に示した。
なお、この表で、カッコ内の数値は、実施例１の３の記載と同様にして算出した保存後の４−アミノアンチピリンの残存率（％）を示す。【００８１】
【表４】
0004639287.tif 000005
【００８２】  表４から明らかなように、第２試薬にキレート剤を含有させていないもの（０ｍＭ）は、４−アミノアンチピリンの含有量（吸光度）が低下していることが分かる。
すなわち、保存開始時の４−アミノアンチピリンの含有量（吸光度）を１００％とした場合に、２８日後で１５．５％にまで低下していることが分かる。【００８３】  これに対して、グルコン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ二ナトリウム、クエン酸、サリチル酸、又はチオ硫酸ナトリウムを第２試薬に含有させた場合には、４−アミノアンチピリンの残存率は、濃度による差はあるものの２８日後で５６％以上となっている。また、その他のキレート剤についても、程度の差こそあれ、キレート剤を含有させない場合に比べて、４−アミノアンチピリンの残存率が高くなっていることが分かる。【００８４】  これらの結果から、フェロシアン化カリウムと４−アミノアンチピリンが共存する酵素的測定試薬に、キレート剤を含有させることにより、４−アミノアンチピリンの残存率が向上していることが分かる。
以上のことより、フェロシアン化物と４−アミノアンチピリンが共存する酵素的測定試薬にキレート剤を含有させることにより、４−アミノアンチピリンを安定化できることが確かめられた。【００８５】〔実施例５〕
（本発明によるコレステロールエステラーゼ活性に対する影響の確認−１）
本発明において、キレート剤をフェロシアン化物と４−アミノアンチピリンが共存する酵素的測定試薬に含有させた場合の試薬中のコレステロールエステラーゼに対する影響を確かめた。【００８６】１．  酵素的測定試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
表５に記載の９種類のキレート剤それぞれを表に記載した濃度で含有すること（又は含有しないこと）、及びｐＨを６．９（２０℃）に調整すること以外は、実施例１の１の（１）の第１試薬と同様にして、２８種類の第１試薬をそれぞれ調製した。【００８７】（２）  第２試薬の調製
前記実施例１の１の（２）で調製した第２試薬をそのまま使用した。【００８８】２．  第１試薬及び第２試薬の保存
上記１の（１）で調製した２８種類の第１試薬及び上記１の（２）で調製した第２試薬を１０℃で３６日間保存した。【００８９】３．  コレステロールエステラーゼ活性値の測定
保存開始時及び保存７日後、並びに３６日後に、２８種類の第１試薬の各々のコレステロールエステラーゼの活性値（吸光度）を測定した。
なお、コレステロールエステラーゼ活性値（吸光度）の測定は、東洋紡績社カタログ「ＴＯＹＯＢＯ  ＥＮＺＹＭＥＳ」（２００２年７月１日発行）の第５４頁に記載されたコレステロールエステラーゼの活性測定方法に従って行った。
そして、保存７日後及び３６日後の吸光度（コレステロールエステラーゼ活性値）をそれぞれ、キレート剤無添加第１試薬の保存開始時の吸光度（コレステロールエステラーゼ活性値）で除して１００を乗ずることにより、保存７日後及び３６日後のコレステロールエステラーゼ活性の残存率（％）をそれぞれ算出した。【００９０】４．  測定結果
コレステロールエステラーゼ活性値の測定結果を表５に示した。
なお、この表で、カッコ内の数値は、前記の通りに算出した保存後のコレステロールエステラーゼ活性の残存率（％）を示す。【００９１】
【表５】
0004639287.tif 000006
【００９２】  表５から明らかなように、第１試薬にＥＤＴＡ二ナトリウムを含有させた場合には、試薬の保存開始時（０日）から、コレステロールエステラーゼの活性値（吸光度）が低下していることが分かる。【００９３】  すなわち、ＥＤＴＡ二ナトリウム濃度が３ｍＭ、１５ｍＭ、３０ｍＭの場合のコレステロールエステラーゼ活性の残存率は、保存開始時のコレステロールエステラーゼの活性値（吸光度）を１００％とした場合に、保存開始時で各々６７．５％、３１．６％、２７．０％となっており、７日後では各々４５．１％、１８．８％、１５．５％であり、３６日後では各々２６．１％、９．５％、７．９％に低下していることが分かる。
また、第１試薬にクエン酸又はＡＤＡを含有させた場合も、濃度や保存日数による差はあるものの保存開始時のコレステロールエステラーゼの活性値（吸光度）を１００％とした場合に、最低７０％台まで低下していることが分かる。【００９４】  これに対して、グルコン酸ナトリウム、トリシン、ビシン、コハク酸、酒石酸、又はサリチル酸を第１試薬に含有させた場合には、コレステロールエステラーゼ活性の残存率は、濃度や保存日数による差はあるものの、ほとんど低下していない。【００９５】  これらの結果から、ＥＤＴＡ二ナトリウム、クエン酸、又はＡＤＡはコレステロールエステラーゼの活性を低下させてしまうが、グルコン酸ナトリウム、トリシン、ビシン、コハク酸、酒石酸、又はサリチル酸はコレステロールエステラーゼの活性に悪影響を及ぼしていないことが分かる。【００９６】  以上の結果、及び実施例１〜４の結果より、フェロシアン化物中の鉄イオン（第１の金属イオン）には配位するが、カルシウムイオン（第２の金属イオン）には配位しない（又は配位しにくい）キレート剤を選択することにより、フェロシアン化物が４−アミノアンチピリン（被酸化性発色試薬）を劣化することを抑制し、かつ第２の金属イオンによるコレステロールエステラーゼ（酵素的測定試薬に含まれる試薬成分）の安定化には悪影響を及ぼさないことが確かめられた。【００９７】〔実施例６〕
（本発明によるコレステロールエステラーゼ活性に対する影響の確認−２）
本発明において、キレート剤をフェロシアン化物と４−アミノアンチピリンが共存する試薬に含有させた場合の試薬中のコレステロールエステラーゼに対する影響を確かめた。【００９８】１．  酵素的測定試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
表６に記載の１１種類のキレート剤それぞれを表に記載した濃度で含有すること（又はしないこと）、及びｐＨを６．５（２０℃）に調整すること以外は、実施例１の１の（１）の第１試薬と同様にして、３３種類の第１試薬をそれぞれ調製した。【００９９】（２）  第２試薬の調製
前記実施例１の１の（２）で調製した第２試薬をそのまま使用した。【０１００】２．  第１試薬及び第２試薬の保存
上記１の（１）で調製した３３種類の第１試薬及び上記１の（２）で調製した第２試薬を１０℃で３６日間保存した。【０１０１】３．  コレステロールエステラーゼ活性値の測定
保存開始時及び保存７日後、並びに３６日後に、３３種類の第１試薬の各々のコレステロールエステラーゼ活性値（吸光度）を実施例５と同様の方法で測定した。【０１０２】４．  測定結果
コレステロールエステラーゼ活性値の測定結果を表６に示した。
なお、この表で、カッコ内の数値は、実施例５の３の記載と同様にして算出した保存後のコレステロールエステラーゼ活性の残存率（％）を示す。【０１０３】
【表６】
0004639287.tif 000007
【０１０４】  表６から明らかなように、第１試薬にＥＤＴＡ二ナトリウム、クエン酸、ＡＤＡ、ＥＤＤＰ、又はＢＡＰＴＡを含有させた場合には、試薬の保存開始時（０日）から、コレステロールエステラーゼの活性値（吸光度）が低下していることが分かる。【０１０５】  すなわち、第１試薬にＥＤＴＡ二ナトリウム、クエン酸、ＡＤＡ、ＥＤＤＰ、又はＢＡＰＴＡを含有させた場合には、コレステロールエステラーゼ活性の残存率は、キレート剤の濃度が高い場合には大きく低下していることが分かる。【０１０６】  これに対して、グルコン酸ナトリウム、トリシン、ビシン、コハク酸、酒石酸、又はサリチル酸を第１試薬に含有させた場合には、コレステロールエステラーゼ活性の残存率は、濃度や保存日数による差はあるものの、ほとんど低下していない。【０１０７】  これらの結果から、ＥＤＴＡ二ナトリウム、クエン酸、ＡＤＡ、ＥＤＤＰ、又はＢＡＰＴＡはコレステロールエステラーゼの活性を低下させてしまうが、グルコン酸ナトリウム、トリシン、ビシン、コハク酸、酒石酸、又はサリチル酸はコレステロールエステラーゼの活性に悪影響を及ぼしていないことが分かる。【０１０８】  以上の結果、及び実施例１〜４の結果より、フェロシアン化物中の鉄イオン（第１の金属イオン）には配位するが、カルシウムイオン（第２の金属イオン）には配位しない（又は配位しにくい）キレート剤を選択することにより、フェロシアン化物が４−アミノアンチピリン（被酸化性発色試薬）を劣化することを抑制し、かつ第２の金属イオンによるコレステロールエステラーゼ（酵素的測定試薬に含まれる試薬成分）の安定化には悪影響を及ぼさないことが確かめられた。