(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリカーゼ依存的反応において、標的の核酸を指数的かつ選択的に増幅するための方法であって、
（ａ）増幅すべき標的の核酸の少なくとも一部の一本鎖鋳型を提供する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の鋳型に対して、１以上の対のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせる工程と、
（ｃ）二本鎖を形成するＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成する工程と、
（ｄ）二本鎖を巻き戻すために、工程（ｃ）の二本鎖をヘリカーゼ調製物と接触させる工程であって、該ヘリカーゼ調製物は、ヘリカーゼおよび一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）を含み、但し、該ヘリカーゼが熱安定的である場合、ＳＳＢは随意である、工程と、
（ｅ）工程（ｂ）〜（ｄ）を反復して、該ヘリカーゼ依存的反応において、標的の核酸を指数的かつ選択的に増幅する工程であって、その結果、増幅が、ゲル電気泳動により決定される場合、該ヘリカーゼの非存在下で生じない、工程と
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
増幅は等温的であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）の核酸は、一本鎖核酸であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
一本鎖核酸は一本鎖ＤＮＡであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
一本鎖核酸は一本鎖ＲＮＡであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
標的の核酸は二本鎖核酸であり、該二本鎖核酸は工程（ａ）に先だって、熱によってまたは酵素的に変性されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
標的の核酸は、５０ｂｐ〜１００ｋｂの範囲の大きさを有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドプライマーは、１つのプライマーが５’末端にハイブリダイズし、１つのプライマーが該核酸の３’末端にハイブリダイズし、標的の核酸を選択的に増幅させる一対のオリゴヌクレオチドプライマーであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
オリゴヌクレオチドプライマーは、オリゴヌクレオチドプライマーが増幅中のハイブリダイゼーションの反応温度よりも１０℃〜３０℃高い融点を持つような、長さおよびＧＣ含量を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＤＮＡポリメラーゼは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標））、およびＢｓｔポリメラーゼラージフラグメント（ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）から選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠如していることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換活性を有することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヘリカーゼ調製物は、１つのヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ヘリカーゼ調製物は、複数のヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ヘリカーゼ調製物は、３’→５’ヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ヘリカーゼ調製物は、５’→３’ヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ヘリカーゼ調製物は、スーパーファミリー１ヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ヘリカーゼ調製物は、スーパーファミリー４ヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ヘリカーゼ調製物は、スーパーファミリー２ヘリカーゼ、スーパーファミリー３ヘリカーゼ、およびＡＡＡ＋ヘリカーゼから選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ヘリカーゼ調製物は、６量体ヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ヘリカーゼ調製物は、１量体または２量体ヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ヘリカーゼ調製物は、ＵｖｒＤヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ＵｖｒＤヘリカーゼは、熱安定性ヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ヘリカーゼ調製物は、大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ、Ｔ７  Ｇｐ４ヘリカーゼ、ＲｅｃＢＣＤヘリカーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ、ＭＣＭヘリカーゼ、Ｒｅｐヘリカーゼ、ＲｅｃＱヘリカーゼ、ＰｃｒＡヘリカーゼ、ＳＶ４０ラージＴ抗原ヘリカーゼ、ヘルペスウィルスヘリカーゼ、酵母Ｓｇｓ１ヘリカーゼ、ＤＥＡＨ＿ＡＴＰ依存性ヘリカーゼおよびパピローマウィルスヘリカーゼＥ１タンパク質からなる群より選択される１つ以上のヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
ＵｖｒＤヘリカーゼは、大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼであることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
熱安定性ヘリカーゼはＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ヘリカーゼ調製物は、ＲｅｃＢＣＤヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
ヘリカーゼ調製物は、Ｔ７遺伝子４ヘリカーゼおよび大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼを含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
【請求項２９】
ヘリカーゼ調製物中のエネルギー源が、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）またはデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
ＡＴＰ、ｄＡＴＰまたはｄＴＴＰは、０．１〜５０ｍＭの範囲の濃度であることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
熱安定性ヘリカーゼ調製物は、一本鎖結合タンパク質を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）は、Ｔ４遺伝子３２ＳＳＢ、大腸菌ＳＳＢ、Ｔ７遺伝子２．５ＳＳＢ、ファージφ２９ＳＳＢおよびそれらの誘導体より選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
ヘリカーゼ調製物は、アクセサリタンパク質を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
ＵｖｒＤヘリカーゼのためにアクセサリタンパク質は、ＭｕｔＬであることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ヘリカーゼ調製物は、大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼと、ＡＴＰと、大腸菌ＭｕｔＬタンパク質と、Ｔ４  Ｇｐ３２とを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
ヘリカーゼ調製物は、大腸菌ＲｅｃＢＣＤと、ＡＴＰと、Ｔ４  Ｇｐ３２ＳＳＢとを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
ヘリカーゼ調製物は、Ｔ７  Ｇｐ４Ｂヘリカーゼと、ｄＴＴＰと、Ｔ７  Ｇｐ２．５ＳＳＢとを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
ヘリカーゼ調製物は、熱安定性Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ、ｄＡＴＰまたはＡＴＰを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
ヘリカーゼ調製物は、熱安定性Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ、ｄＡＴＰまたはＡＴＰ、およびＴ４  Ｇｐ３２ＳＳＢを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
工程（ｂ）〜（ｅ）は、２０℃〜７５℃の範囲の１つの温度において実施することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
工程（ｂ）〜（ｅ）は、３７℃で実施することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
工程（ｂ）〜（ｅ）は、６０℃で実施することを特徴とする請求項２３に記載の方法。
【請求項４３】
標的の核酸は生物試料中の病原体から得られ、工程（ｅ）は、標的の核酸を増幅して病原体を検出する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
標的ＤＮＡは、染色体ＤＮＡであり、工程（ｅ）は、染色体ＤＮＡ内の配列の変化を検出する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
配列の変化は、一塩基変異多型であることを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項１に記載の方法を実施するための、ヘリカーゼ調製物とＤＮＡポリメラーゼとを含む、核酸増幅キット。
【請求項４７】
ヘリカーゼ調製物が、請求項１に記載の増幅を行うために、ＵｖｒＤヘリカーゼと、一本鎖結合タンパク質と、アデノシン三リン酸とを含むことを特徴とする、請求項４６に記載の核酸増幅キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態は、ヘリカーゼを用いた標的の核酸の指数的かつ選択的増幅の方法、および試料中の核酸を検出するための該方法の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の増幅は、研究、法科学、医学および農業において広く用いられている。最もよく知られた増幅方法のひとつに、標的の増幅方法であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がある（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号明細書、第４，６８３，２０２号明細書および第４，８００，１５９号明細書を参照のこと）。ＰＣＲ反応は典型的には、標的配列の５’および３’端部にハイブリダイズさせる２種のオリゴヌクレオチドプライマーと、各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）を加えることにより、アニールしたプライマーを伸長して、二本鎖産物を産生することのできるＤＮＡポリメラーゼとを用いる。反応混合物の温度を昇降することにより、ＤＮＡ産物の２本の鎖が分離し、次の回のアニーリングおよび伸長のための鋳型として機能できるようになり、このプロセスが繰り返される。
【０００３】
ＰＣＲは研究者によって広く用いられているが、２本のＤＮＡ鎖を分離するために、サーモサイクリングが必要である。この１０年の間に、いくつかの等温標的増幅方法が開発されてきた。その一つとして、鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＳＤＡ）が知られている。ＳＤＡは、エンドヌクレアーゼが標的ＤＮＡの非修飾鎖にニックを入れることができること、および、エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼによる、ニックにおいて３’末端を伸長し、下流ＤＮＡ鎖を置換する作用を組み合わせたものである。置換された鎖は、アンチセンス反応のための鋳型として、また逆も同様に機能し、標的ＤＮＡが指数的に増幅されることになる（例えば、米国特許第５，４５５，１６６号明細書および第５，４７０，７２３号明細書を参照のこと）。当初に設計されたＳＤＡにおいては、所定の３’および５’末端を有する増幅可能な標的断片を作成するために、最初にＤＮＡを制限酵素で開裂させていたが、制限酵素切断部位の要件が標的ＤＮＡ配列の選択に限界を与えていた（例えば、Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：３９２〜３９６（１９９２）を参照のこと）。この不便さは、増幅すべき領域の両側に位置する（ｆｌａｎｋ）バンパープライマーを利用することによって回避されてきた（前掲のＷａｌｋｅｒら（１９９２））。ＳＤＡ技術は、主として、クラミジアや淋病などの感染性疾患の臨床診断に用いられてきた。ＳＤＡの最も魅力ある特徴の１つは、操作を単一温度で行うことから、高価なサーモサイクリング装置が必要なくなることである。しかしながら、ＳＤＡは、長い標的配列の増幅には効率が悪い。
【０００４】
２つめの等温増幅系である転写媒介増幅（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＴＭＡ）は、ＲＮＡポリメラーゼの持つ、プライマー領域中に作られたプロモータからのＲＮＡの生成能と、逆転写酵素のもつＲＮＡ鋳型からのＤＮＡの生成能とを利用している。このＲＮＡ増幅技術は、第３の酵素活性、ＲＮａｓｅＨを導入して、熱変性工程なしにｃＤＮＡからＲＮＡを除去することにより、さらに改良されている。このようにサーモサイクリング工程を無くして、自己持続配列複製（３ＳＲ）と呼ばれる等温増幅方法が生み出された（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：１８７４〜１８７８（１９９０）を参照のこと）。しかしながら、ＴＭＡおよび３ＳＲのための出発物質は、ＲＮＡ分子に限定されている。
【０００５】
３つめの等温標的増幅方法であるローリングサークル増幅（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＲＣＡ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏローリングサークルＤＮＡ複製から改変したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＤＮＡ増幅において用いるための、複数コピーの配列を生産する（例えば、ＦｉｒｅとＸｕ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：４６４１〜４６４５（１９９５）；Ｌｕｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：１５８７〜１５９４（１９９６）；Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９：２２５〜２３２（１９９８）、米国特許第５，７１４，３２０号明細書および第６，２３５，５０２号明細書を参照のこと）。この反応においては、ＤＮＡポリメラーゼは環状鋳型上でプライマーを伸長し、タンデムに結合した鋳型の相補配列のコピーを生産する（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇとＢａｋｅｒ、ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（第２版（１９９２））を参照のこと）。最近になって、ＲＣＡは、複数置換換増幅（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＭＤＡ）と呼ばれる技術にさらに改良されており、このＭＤＡでは、全ゲノム増幅において非常に均一な発現を与える（例えば、Ｄｅａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９：５２６１〜５２６６（２００２）を参照のこと）。
【０００６】
さらなる核酸増幅方法としては、プローブ増幅技術であるリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：１８９〜１９３（１９９１）および米国特許第５，４９４，８１０号明細書を参照のこと）や、シグナル増幅技術であるブランチドＤＮＡ（ｂＤＮＡ）技術（Ｈｏｒｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：４８４２〜４８４９（１９９７））が挙げられる。
【０００７】
上記の増幅方法はいずれもそれぞれの限界を有している。例えば、ＰＣＲとＬＣＲは、関連する機器を備えたサーモサイクラーを必要とする。ＰＣＲを除く他のどの標的増幅方法も、遺伝子のクローニングおよび毒性因子や抗生物質耐性遺伝子の分析に有用な十分な長さを有するＤＮＡ標的を増幅することができない。ＰＣＲは１０〜２０ｋｂまでの標的を増幅することができるが、変異率が高いためにＰＣＲ増幅産物の使用に限界を与えるかもしれない（Ｃｌｉｎｅら、Ｎｕｃｉｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２４、３５４６〜３５５１（１９９６））。したがって、問題を最小限に抑えるために、長い標的のための忠実度（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）の高い増幅方法が必要とされている。さらに、すべての既存の増幅方法は、ＤＮＡポリメラーゼのための事前に準備された鋳型（ｐｒｉｍｅｄ  ｔｅｍｐｌａｔｅ）を与えるために、事前の熱変性およびアニーリング工程を必要とする。このために、増幅工程に余計な時間がかかる。
【０００８】
核酸増幅技術の潜在的用途は高まり続けている。例えば、核酸アレイは多数の増幅反応を利用する場合が多い。環境汚染場所の検出では、核酸増幅手順を含む診断試験に対する感度と分析能力が要求される。したがって、増幅手法を改良することが望ましい。
【発明の開示】
【課題を解決しようとする手段】
【０００９】
本発明の一実施形態において、標的の核酸を指数的かつ選択的に増幅するための方法が提供され、該方法は、増幅すべき標的の核酸の一本鎖鋳型を提供する工程と、前記鋳型にハイブリダイズさせるためのオリゴヌクレオチドプライマーを添加する工程と、二本鎖を形成するＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーの伸長産物を合成する工程と、二本鎖を巻き戻すために前記二本鎖をヘリカーゼ調製物と接触させる工程と、上記工程を反復して標的の核酸を指数的かつ選択的に増幅する工程とを含む。
【００１０】
本発明のさらなる実施形態において、増幅は等温で行ってもよいし、２０℃〜７５℃の範囲、好ましくは室温において行ってもよい。
本発明のさらなる実施形態において、標的の核酸は、一本鎖核酸、より詳細には一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡ、または二本鎖核酸、より詳細には二本鎖ＤＮＡのいずれであってもよい。核酸が二本鎖である場合には、熱または酵素によって変性させて、ＤＮＡポリメラーゼ依存性増幅のための一本鎖鋳型を作成してもよい。さらに、標的の核酸は、約５０ｂｐ〜１００ｋｂの範囲の大きさを有していてもよい。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態において、増幅方法において用いるオリ  ゴヌクレオチドプライマーは、一対のオリゴヌクレオチドプライマーであり、一方のプライマーは、選択的に増幅すべき標的の核酸の５’末端にハイブリダイズし、もう一方のプライマーは該核酸の３’末端にハイブリダイズする。多重化の状況下にあっては、同一の反応混合物中で複数のプライマー対を用いて、複数の標的の核酸を増幅するようにしてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドプライマーは、オリゴヌクレオチドプライマーの融点が、増幅の間のハイブリダイゼーションの反応温度よりも１０℃〜３０℃高くなるような、長さおよびＧＣ含量を有しているとよい。
【００１２】
本発明のさらなる実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）、およびＢｓｔポリメラーゼラージフラグメント（ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）から選択される。ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失し、鎖置換活性を有していることが好ましい。
【００１３】
本発明のさらなる実施形態において、ヘリカーゼ調製物は、１つのヘリカーゼを含むものであってもよいし、複数のヘリカーゼを含むものであってもよい。調製物中の１つまたは複数のヘリカーゼは、３’→５’ヘリカーゼのクラスまたは５’→３’ヘリカーゼのクラスから選択することができる。より詳細には、ヘリカーゼ調製物は、スーパーファミリー１〜４からのヘリカーゼ、またはＡＡＡ+ヘリカーゼを含むものであってよい。ヘリカーゼは、ヘリカーゼ６量体ヘリカーゼまたは単量体または２量体ヘリカーゼのいずれであってもよい。より詳細には、ヘリカーゼは、ＵｖｒＤヘリカーゼまたはそのホモログ、例えば、熱安定性ヘリカーゼまたはそのホモログであってよい。
【００１４】
本発明のさらなる実施形態において、ヘリカーゼ調製物は、大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ、Ｔ７  Ｇｐ４ヘリカーゼ、ＲｅｃＢＣＤヘリカーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼ、ＭＣＭヘリカーゼ、Ｒｅｐヘリカーゼ、ＲｅｃＱヘリカーゼ、ＰｃｒＡヘリカーゼ、ＳＶ４０ラージＴ抗原ヘリカーゼ、ヘルペスウィルスヘリカーゼ、酵母Ｓｇｓ１ヘリカーゼ、ＤＥＡＨ＿ＡＴＰ依存性ヘリカーゼおよびパピローマウィルスヘリカーゼＥ１タンパク質およびそのホモログからなる群より選択される１つ以上のヘリカーゼを含んでいてもよい。
【００１５】
さらに、ヘリカーゼ調製物は、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）またはデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、例えば、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）またはデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）を含んでいてもよい。エネルギー源のための適切な濃度は、約０．１〜５０ｍＭの範囲である。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態において、ヘリカーゼ調製物は、一本鎖結合タンパク質、例えば、Ｔ４遺伝子３２ＳＳＢ、大腸菌ＳＳＢ、Ｔ７遺伝子２．５ＳＳＢ、ファージφ２９ＳＳＢおよびそれらの誘導体、およびアクセサリタンパク質、例えばＭｕｔＬを含んでいてもよい。
【００１７】
本発明の実施形態は、ヘリカーゼ依存性増幅によって生物試料中の病原体を検出することを含み、この際の標的の核酸は該病原体由来の核酸である。あるいは、標的の核酸が染色体ＤＮＡの断片である場合には、染色体ＤＮＡ内の配列変化を判定することもできる。この手法は、異なる起源からの標的の核酸における一塩基変異多型を検出するために用いることができる。
【００１８】
本発明の一実施形態において、ヘリカーゼ調製物と、ヌクレオチド三リン酸またはデオキシヌクレオチド三リン酸と、ＤＮＡポリメラーゼと、ヘリカーゼ依存性増幅を行うための説明書とを含むキットが提供される。このキットは、例えば、現場において、標準的な機器を備えた実験室内の場所において、または試料の高出力スクリーニングのために用いられる。
【００１９】
本発明の一実施形態において、ヘリカーゼ調製物中で用いるヘリカーゼが、標的の核酸を指数的かつ選択的に増幅させるのに適しているかどうかを判定する方法が提供され、該方法は、ヘリカーゼと、ＮＴＰまたはｄＮＴＰと、トリス−酢酸またはトリス−ＨＣｌを含み、約ｐＨ６．０〜９．０の範囲のｐＨを与え、０〜２００ｍＭの濃度範囲のＮａＣｌまたはＫＣｌの濃縮物を含む緩衝液と、任意で一本鎖結合タンパク質および／またはアクセサリタンパク質とを含むヘリカーゼ調製物を調製する工程と；様々な濃度またはコピー数の標的の核酸と、オリゴヌクレオチドプライマーと、４種のｄＮＴＰと、ＤＮＡポリメラーゼとを、ヘリカーゼ調製物に添加する工程と；混合物を約２０℃〜７５℃の温度でインキュベートする工程と；増幅されたＤＮＡを分析して、選択的および指数的増幅が起こったかどうかを判定する工程とを含む。
【００２０】
反応混合物の組成、反応の条件、および反応物の濃度は、ヘリカーゼ依存性増幅のための最適な条件を同定するために、本明細書中で提供する一定の範囲内で変えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
ここで「ヘリカーゼ依存性増幅」（ＨＤＡ）と呼ぶ新しい増幅方法について記載する。ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）は、ＤＮＡヘリカーゼの巻き戻し活性に基づいている。この新しい方法では、ＤＮＡ二本鎖の２本の鎖を分離して標的の核酸のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅を行うための一本鎖鋳型を作成するために、熱ではなくヘリカーゼを使用する。配列特異的プライマーは鋳型にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されて、標的配列を増幅する。一定温度において指数的増幅が達成できるようにこのプロセスを繰り返す（図１）。
【００２２】
この増幅系の特性は、従来技術に記載の増幅方法よりも改善されている。この改善には、例えば、高い忠実度で、等温的に核酸の長い標的配列を増幅できることが含まれる。
【００２３】
ＨＤＡは、１つ以上のヘリカーゼに依存して、ＤＮＡ二本鎖の２本の鎖を分離（融解または巻き戻し）する。ＨＤＡはさらに、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼを利用して、一本鎖ヌクレオチドの配列にハイブリダイズしたプライマーを伸長し、相補的プライマー伸長産物を生成する。単一の温度において指数的増幅が達成されるように、このプロセスそのものを繰り返す。従来技術の増幅方法と比較しての本実施形態のいくつかの利点として、ＤＮＡおよびＲＮＡの長い（約２００ヌクレオチドより長い、より特定すると約５００ヌクレオチドを越える、より特定すると約１０００ヌクレオチドを越える、より特定すると約２０００ヌクレオチドを越える、より特定すると約５０，０００ヌクレオチドにのぼる、より特定すると約１００，０００ヌクレオチド）標的配列を等温的に増幅できること、および、最初から最後まで一定の温度で標的配列を増幅できることが挙げられる。
【００２４】
（定義）
便宜上、本明細書、実施例および添付の請求項において用いる用語についてここにまとめる。
【００２５】
「核酸」とは、二本鎖または一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのことをいう。二本鎖核酸分子である分子は、ニックが入ったもの、無傷（ｉｎｔａｃｔ）のもののいずれであってもよい。二本鎖または一本鎖核酸分子は線形または環状のいずれであってもよい。二本鎖は、平滑末端を持つものであってもよいし、一本鎖尾部を有していてもよい。一本鎖分子は、ヘアピンまたはループおよびステムの形状の二次構造を有していてもよい。核酸は、環境、食物、農業、発酵、例えば血液のような生体液、ミルク、脳脊髄液、痰、唾液、大便、肺吸引液、粘膜組織または組織試料を採取した綿棒、または細胞などを含む様々な供給源から単離したものであってよい。核酸試料は、細胞またはウィルスから得たものであってよく、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡを含む染色体外ＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、ＤＮＡ断片、メッセンジャーＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、または細胞またはウィルス内に見られる他のＲＮＡのいずれかを含む。核酸は、単離したもの、クローニングしたもの、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ化学合成により合成したもののいずれであってもよい。上述の核酸のいずれも、核酸内の個々のヌクレオチドを化学的に変えるように、修飾されてもよい（例えば、メチル化によって）。修飾は、自然に起こるものであっても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成によって起こるものであってもよい。「二本鎖」という用語は、全体または一部が二本鎖であるような核酸分子のことをいう。
【００２６】
「標的の核酸」とは、選択的に増幅すべき核酸の全体または一部のことをいい、その範囲は３’および５’端部によって規定される。標的の核酸は、増幅しようとする断片または配列と呼ぶ場合もある。増幅すべき標的の核酸の大きさは、例えば、約１００〜５０００ｂｐの範囲を含む、約５０ｂｐから約１００ｋｂの範囲であってよい。標的の核酸は、より長い二本鎖または一本鎖核酸内に含まれていてもよい。あるいは、標的の核酸は、全長二本鎖または一本鎖核酸であってもよい。
【００２７】
「融解させる（ｍｅｌｔｉｎｇ）」、「巻き戻す（ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ）」または「変性させる（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）」という用語は、核酸二本鎖の２本の相補鎖の全部または一部を分離することをいう。
【００２８】
「ハイブリダイゼーション」とは、プライマーが、鋳型鎖の一方上にある該プライマーの相補的配列に特異的に結合するものの鋳型内の他の領域には結合しない条件において、オリゴヌクレオチドプライマーが、一本鎖核酸鋳型の一領域に結合することをいう。ハイブリダイゼーションの特異性は、オリゴヌクレオチドプライマーの長さ、ハイブリダイゼーション反応が行われる温度、イオン強度、およびｐＨの影響を受ける。
【００２９】
「プライマー」とは、標的の核酸上の一本鎖領域に結合することができ、標的の核酸のポリメラーゼ依存性複製を容易にする一本鎖核酸のことをいう。
【００３０】
「アクセサリタンパク質」とは、ヘリカーゼ活性を刺激することのできる任意のタンパク質のことをいう。例えば、大腸菌ＭｕｔＬタンパク質は、ＵｖｒＤヘリカーゼ融解活性を強化するためのアクセサリタンパク質である（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：９１９７〜９２０１（１９９８）；Ｍｅｃｈａｎｉｃら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３８３３７〜３８３４６（２０００））。本方法の実施形態において、選択されたヘリカーゼとともにアクセサリタンパク質を使用することが望ましい。代替の実施形態において、核酸の巻き戻しは、アクセサリタンパク質の非存在下でヘリカーゼによって行ってもよい。
【００３１】
「補因子」とは、ヘリカーゼ巻き戻し活性に必要とされる小分子物質のことをいう。ヘリカーゼ補因子としては、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）およびデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびマグネシウム（または他の二価カチオン）が挙げられる。例えば、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を、ＵｖｒＤヘリカーゼのための補因子として、０．１〜１００ｍＭの範囲、好ましくは１〜１０ｍＭの範囲の濃度（例えば３ｍＭ）で使用してもよい。同様に、ｄＴＴＰ（デオキシチミジン三リン酸）を、Ｔ７  Ｇｐ４Ｂヘリカーゼのための補因子として、１〜１０ｍＭ（例えば３ｍＭ）の範囲の濃度で使用してもよい。
【００３２】
本明細書において「ヘリカーゼ」とは、二本鎖核酸を酵素的に巻き戻すことのできる任意の酵素のことをいう。たとえば、ヘリカーゼは、あらゆる有機体において、複製、組み換え、修復、転写、翻訳およびＲＮＡスプライシングなどの核酸が関与するすべてのプロセスにおいて見られる酵素である（ＫｏｒｎｂｅｒｇとＢａｋｅｒ、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（第２版（１９９２））、特に第１１章）。ＤＮＡまたはＲＮＡに沿って５’から３’の方向または逆に３’から５’の方向に移動する任意のヘリカーゼを、本発明の実施形態において用いることができる。これには、原核生物、ウィルス、古細菌、および真核生物または天然の酵素の組換え型から得られるヘリカーゼ、ならびに特定の活性を有するアナログまたは誘導体が含まれる。ＫｏｒｎｂｅｒｇとＢａｋｅｒによる書籍（ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（第２版（１９９２））の第１１章に記載されている天然のＤＮＡヘリカーゼの例としては、大腸菌ヘリカーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ、Ｒｅｐ、ＤｎａＢ、ＰｒｉＡ、ＰｃｒＡ、Ｔ４  Ｇｐ４１ヘリカーゼ、Ｔ４  Ｄｄａヘリカーゼ、Ｔ７  Ｇｐ４ヘリカーゼ、ＳＶ４０ラージＴ抗原、酵母ＲＡＤが挙げられる。ＨＤＡにおいて有用であるかもしれないさらなるヘリカーゼとしては、ＲｅｃＱヘリカーゼ（ＨａｒｍｏｎとＫｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２３２〜２４３（２００１））、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ（本発明の実施例ＸＩＩに記載）およびＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（ＣｏｌｌｉｎｓとＭｃＣａｒｔｈｙ、Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ．７：３５〜４１．（２００３））由来の熱安定性ＵｖｒＤヘリカーゼ、Ｔ．ａｑｕｑｔｉｃｕｓ由来の熱安定性ＤｎａＢヘリカーゼ（ＫａｐｌａｎとＳｔｅｉｔｚ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２７４：６８８９〜６８９７（１９９９））、および、古細菌および真核生物由来のＭＣＭヘリカーゼ（（Ｇｒａｉｎｇｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：４８８８〜４８９８（２００３））が挙げられる。
【００３３】
本実施形態において用いるヘリカーゼの例は、以下のウェブアドレス（http://blocks.fhcrc.org（キーワード「ｈｅｌｉｃａｓｅ」によってブロックを入手）で見つけることもできる。このサイトでは、４９のヘルペスヘリカーゼ、２２４のＤｎａＢヘリカーゼ、２５０のＵｖｒＤヘリカーゼおよびＵｖｒＤ／Ｒｅｐヘリカーゼ、２７６のＤＥＡＨ＿ＡＴＰ依存性ヘリカーゼ、１４７のパピローマウィルスヘリカーゼＥ１タンパク質、６０８のウィルスヘリカーゼ１ウィルス（スーパーファミリー１）ＲＮＡヘリカーゼ、および５５６のＤＥＡＤ＿ＡＴＰ依存性ヘリカーゼのリストがある。一般に５’から３’の方向に複製を行うヘリカーゼとしては、例えば、Ｔ７  Ｇｐ４ヘリカーゼ、ＤｎａＢヘリカーゼおよびＲｈｏヘリカーゼが挙げられ、３’から５’の方向に複製を行うヘリカーゼとしては、例えば、ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＰｃｒＡ、Ｒｅｐ、ＨＣＶのＮＳ３ＲＮＡヘリカーゼが挙げられる。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、ヘリカーゼは「ヘリカーゼ調製物」中で提供される。ヘリカーゼ調製物とは、ＤＮＡポリメラーゼ、核酸鋳型、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸、およびプライマーと組み合わせられた場合に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて等温的、指数的かつ特異的な核酸増幅を達成することのできる、物質の混合物のことをいう。
【００３５】
より詳細には、ヘリカーゼ調製物は、ヘリカーゼと、ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）またはデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）などのエネルギー源と、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）とを含む。１つ以上の追加の物質をヘリカーゼ調製物中に含めてもよいが、該物質は、１つ以上の追加のヘリカーゼ、アクセサリタンパク質、小分子、化学物質およびバッファのなかから選ばれる。
熱安定性ヘリカーゼをヘリカーゼ調製物中で利用する場合、一本鎖結合タンパク質を共存されるかどうかは随意である。
【００３６】
「ＨＤＡ系」という用語は、本明細書中においては、本明細書に記載のヘリカーゼ依存性増幅によって核酸を増幅する機能を遂行するために相互作用する一群の要素を記述するために用いてきた。ＨＤＡ系は、ヘリカーゼ調製物と、ポリメラーゼと、随意でトポイソメラーゼを含んでいる。
【００３７】
例えば、ＵｖｒＤ  ＨＤＡ系は、ＵｖｒＤヘリカーゼ調製物（例えば、大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ調製物またはＴｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ調製物）と、エキソ-Ｋｌｅｎｏｗ断片、ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント、エキソ+Ｋｌｅｎｏｗ断片、またはＴ７  ＳｅｑｕｅｎａｓｅなどのＤＮＡポリメラーゼとを混ぜ合わせることにより構成してもよい。
【００３８】
別の例として、Ｔ７ヘリカーゼ調製物（Ｔ７  Ｇｐ４Ｂヘリカーゼ、Ｔ７  Ｇｐ２．５ＳＳＢ、およびｄＴＴＰ）とＴ７  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅとを含むＴ７  ＨＤＡ系が挙げられる。
【００３９】
別の例として、ＲｅｃＢＣＤ調製物（Ｔ４  Ｇｐ３２を有するＲｅｃＢＣＤヘリカーゼ）とＴ７  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅとを含むＲｅｃＢＣＤ  ＨＤＡ系が挙げられる。
【００４０】
選択されるどのＨＤＡ系も、混合物中の要素の置換、加減によって最適化することができ、このことについては詳細に後述する。
【００４１】
「ＨＤＡ」とは、プライマーハイブリダイゼーションとそれに続くプライマー伸長のための鋳型を作成するための二本鎖核酸巻き戻しに、ヘリカーゼ調製物を用いる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ核酸増幅方法であるヘリカーゼ依存性増幅のことをいう。このプロセスは２種のオリゴヌクレオチドプライマーを利用し、そのそれぞれは、標的配列を含んだセンス鎖または逆相補標的配列を含むアンチセンス鎖の３’末端にハイブリダイズする。ＨＤＡ反応は、ヘリカーゼ依存性核酸増幅のための一般的な方法である。
【００４２】
「等温増幅」とは単一の温度で起こる増幅のことをいう。これには、増幅手順と同じ温度または高い温度で行ってもよいような増幅開始時の単一の短い時間（１５分未満）は含まれない。
【００４３】
（ヘリカーゼの作用機構）
ヘリカーゼは、ヌクレオチド三リン酸（例えばＡＴＰ）加水分解のエネルギーを利用して、二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ内の鎖同士を保持している水素結合を破壊する（ＫｏｒｎｂｅｒｇとＢａｋｅｒ、ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（第２版、（１９９２））、特に第１１章）。ヘリカーゼは、ＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復および組み換え、転写、およびＲＮＡプロセシングなどの細胞内での核酸代謝のあらゆる面で関与している。あらゆる生物において発見されている多数のヘリカーゼが、この広い利用性を反映しているのかもしれない。
【００４４】
（ヘリカーゼの分類）
ヘリカーゼは、いくつかの異なる特性に基づいて分類されてきた。例えば、異なるヘリカーゼの特徴は、単量体または多量体構造を有するヘリカーゼを含めた、それらのオリゴマー構造である。例えば、ヘリカーゼのあるファミリーは６量体構造を有する一方で、別のファミリーは単量体または２量体ヘリカーゼで構成される。
【００４５】
ヘリカーゼの別の特徴は、保存性のモチーフの出現である。すべてのヘリカーゼは、ＡＴＰ結合およびＭｇ2+結合を伴う古典的なＷａｌｋｅｒ  ＡおよびＢモチーフを有している（ＣａｒｕｔｈｅｒｓとＭｃＫａｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１２：１２３〜１３３（２００２）、ＳｏｕｌｔａｎａｓとＷｉｇｌｅｙ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２６：４７〜５４（２００１）に概説）。ヘリカーゼは、ヘリカーゼシグネチャーモチーフの数およびモチーフに対するコンセンサス配列の違いによって、いくつかのスーパーファミリーに分類されてきた（ＧｏｒｂａｌｅｎｙａとＫｏｏｎｉｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：４１９〜４２９（１９９３））。スーパーファミリー１および２は、７つの特徴的ヘリカーゼシグネチャーモチーフを有し、これには、古細菌、真正細菌、真核生物およびウィルスに由来するヘリカーゼが含まれ、ヘリカーゼは、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを３’→５’方向または５’→３’方向のいずれかに巻き戻す。スーパーファミリー１ヘリカーゼとしては、例えば、大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ  ＵｖｒＤヘリカーゼ、およびＲｅｃＢＣＤのＢサブユニットが挙げられる。スーパーファミリー３は、３つのモチーフを有し、スーパーファミリー４は５つのモチーフを有する。スーパーファミリー４ヘリカーゼとしては、例えば、Ｔ７  Ｇｐ４ヘリカーゼおよびＤｎａＢヘリカーゼが挙げられる。標準的なヘリカーゼとは異なる新しいファミリーは、ＡＡＡ+ファミリー（様々な細胞活動に関連するＡＴＰａｓｅの拡張ファミリー）である。
【００４６】
第３のタイプの分類は、ヘリカーゼの巻き戻し方向、すなわち、ヘリカーゼが核酸二本鎖を、ヘリカーゼが結合して移動する方の鎖を基準として５’→３’方向（Ｔ７  Ｇｐ４ヘリカーゼなど）または３’→５’方向（ＵｖｒＤヘリカーゼなど）のいずれに巻き戻すかに関係する。
【００４７】
分類の第４のタイプは、ヘリカーゼが平滑末端を有した核酸二本鎖またはフォークまたは一本鎖尾部を有する二本鎖のいずれを好んで巻き戻しを行うかに関係する。平滑末端を有する核酸二本鎖は、ヘリカーゼ依存性増幅の第１のサイクルには必要でないかもしれないが、後続の増幅サイクルにおいては望ましい。これは増幅反応の進行に伴って、平滑末端を有する標的断片が優占種となるためである（図３）。これらの平滑末端を有する標的の核酸は、後続の増幅回に対する鋳型基質を構成する（図３）。
【００４８】
本明細書に記載のＨＤＡを達成するために、上記のいずれによって分類されたヘリカーゼも、核酸増幅には適している。実際に、実施例ＩＩ〜ＩＸ、Ｘ，ＸＩおよびＸＩＩでは、本方法に従って使用しうる多様なヘリカーゼの試料によって、ヘリカーゼ依存性増幅が達成されることを実証している。
【００４９】
実施例Ｉは、ＵｖｒＤヘリカーゼ調製物について述べている。ＵｖｒＤヘリカーゼは、３’→５’極性の巻き戻しを行わせる一本鎖ＤＮＡ依存性ＡＴＰアーゼ活性を有し（Ｍａｔｓｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１０１６９〜１０１７５（１９８６））、ＤＮＡ修復と組み換えの両方に関与する。Ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、ＵｖｒＤは、第２のタンパク質であるＭｕｔＬと相互作用する。ＭｕｔＬはミスマッチ修復経路の主たる調整役であり、ＵｖｒＤによって触媒される巻き戻し反応を劇的に刺激する（例えば、Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、９１９７〜９２０１（１９９８）；Ｍｅｃｈａｎｉｃら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、３８３３７〜３８３４６（２０００）を参照のこと）。実施例ＸＩＩおよびＸＩＩＩからは、アクセサリタンパク質は、ＵｖｒＤなどのいくつかのヘリカーゼに対しては好ましく使用しうるが、最適化されたヘリカーゼ調製物において常に必要なわけではないことがわかる。ＨＤＡにおける個々のヘリカーゼに対するアクセサリタンパク質の要件は、実施例ＩＩからＶに記載のようなアッセイなどを用いることにより、またＨＤＡ産物をゲル電気泳動によって解析することにより、容易に決定することができる。
【００５０】
大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼは、スーパーファミリー１ヘリカーゼである。大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼは、ニックの入った環状ＤＮＡ分子のみならず、平滑末端ＤＮＡ二本鎖も巻き戻すことができる（ＲｕｎｙｏｎとＬｏｈｍａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５０２〜１７５１２（１９８９））。ＵｖｒＤの濃度が低い場合には、最適な巻き戻しには３’側一本鎖ＤＮＡ尾部が必要であるが、濃度が高ければ、巻き戻しはニックまたは平滑末端において開始することができる（Ｒｕｎｙｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：６３８３〜６３８７（１９９０））。
【００５１】
ＨＤＡの別の例において、Ｔ７遺伝子４タンパク質をヘリカーゼ調製物中で用いて、標的の核酸を増幅させる。Ｔ７遺伝子４タンパク質は、プライマーゼ活性と３’→５’ヘリカーゼ活性の両方を含む６量体の複製ヘリカーゼである（ＬｅｃｈｎｅｒとＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１１１８５〜１１１９６（１９８３））。遺伝子４タンパク質のアミノ末端切断型である、Ｔ７遺伝子４Ｂタンパク質（Ｔ７  Ｇｐ４Ｂヘリカーゼ）は、ＤＮＡヘリカーゼ活性しか含まない。Ｔ７  Ｇｐ４Ｂヘリカーゼのクローニングと精製については、ＢｅｒｎｓｔｅｉｎとＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４８９１〜１４８９９（１９８８））によって記載されている。Ｔ７遺伝子２．５タンパク質は、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であり、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ活性を刺激する（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５０３２〜１５０４０（１９９２））。Ｔ７  Ｇｐ２．５ＳＳＢの調製については、以前に記載されている（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１５０２２〜１５０３１（１９９２））。
【００５２】
ＨＤＡの別の実施形態において、ヘリカーゼ調製物中で大腸菌ＲｅｃＢＣＤタンパク質を使用する。大腸菌ＲｅｃＢＣＤは、１つのスーパーファミリー１ヘリカーゼ（ＲｅｃＢ）と１つの５’→３’ヘリカーゼ（ＲｅｃＤ）とを含むタンパク質複合体であり、標的断片を増幅するために用いられる。大腸菌ＲｅｃＢＣＤヘリカーゼは、３量体の多官能性酵素であり、ＡＴＰ依存性ヘリカーゼであるとともにＤＮＡヌクレアーゼでもある（ＲｏｍａｎとＫｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２８：２８６３〜２８７３（１９８９））。ＲｅｃＢサブユニットは、３’→５’ＤＮＡヘリカーゼ活性に加えて、エキソヌクレアーゼ活性も有している。エキソヌクレアーゼ活性は、二本鎖ＤＮＡを分解することなく巻き戻すことのできるエキソヌクレアーゼ欠失ＲｅｃＢD1067AＣＤをもたらす、部位特異的変異法によって除去することができる（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、５０７−５１３（２０００））。ＲｅｃＤタンパク質もまた、５’→３’極性を有するＤＮＡヘリカーゼである（ＴａｙｌｏｒとＳｍｉｔｈ、Ｎａｔｕｒｅ  ４２３、８８９〜８９３（２００３））。ＲｅｃＢおよびＲｅｃＤヘリカーゼは、いずれも二極性転座モデルを介して無傷のＲｅｃＢＣＤにおいて活性を有する。この２つのＤＮＡヘリカーゼは相補的であり、逆平行ＤＮＡ二本鎖の各鎖上で、相反する極性でもって同じ向きに移動する。この二極性モーター機構が、その指数的に高い速度（５００〜１０００ｂｐ／秒）とプロセッシビティ（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）（１回の結合あたり＞３０ｋｂ）を説明する助けとなる。Ｄｉｌｌｉｎｇｈａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ４２３、８９３〜８９７（２００３））。
【００５３】
ＨＤＡの別の例において、ヘリカーゼ調製物において、６量体複製ヘリカーゼであるＴ７  Ｇｐ４ヘリカーゼを使用して、１ｋｂよりも長い標的断片を増幅させる。Ｔ７  Ｇｐ４ヘリカーゼは、スーパーファミリー４に属し、このファミリーのメンバーには、ＤｎａＢやＴ４  Ｇｐ４１などのいくつかの６量体ヘリカーゼが含まれ、これらのヘリカーゼは、迅速な巻き戻し速度と、高度なプロセッシビティを有する。これらのヘリカーゼは、巻き戻しのために二本鎖領域の端部にある一本鎖尾部を認識する。例えば、ＤＮＡポリメラーゼの存在下において、大腸菌ＤｎａＢヘリカーゼはＤＮＡを７５０ｂｐ／秒の速度で５０ｋｂを越えるプロセッシビティで巻き戻し、Ｔ７  Ｇｐ４ヘリカーゼはＤＮＡを３００ｂｐ／秒の速度で高いプロセッシビティで巻き戻す（前掲のＫｏｒｎｂｅｒｇとＢａｋｅｒ（１９９２））。ＳＶ４０ラージＴ抗原は、ＤＮＡを、７５〜１００ｂｐ／秒の速度にて、高いプロセッシビティで巻き戻す（前掲のＫｏｒｎｂｅｒｇとＢａｋｅｒ（１９９２）；Ｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ．４２３：５１２〜５１８（２００３））。
【００５４】
理論に結び付けることは望まないが、Ｔ７  Ｇｐ４などのいくつかのヘリカーゼは、一本鎖尾部を有する二本鎖ＤＮＡを好むものの、それらは、平滑末端を有する二本鎖ＤＮＡ分子に対しても低い巻き戻し活性を有しているかもしれない。一本鎖尾部は、二本鎖ＤＮＡ分子の「末端ブリージング（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）」を介して二本鎖ＤＮＡの端部に維持的に存在することもできる（Ｒｏｙｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．６：１３２３〜３１２３（１９７９））。これらの一過性の一本鎖尾部はＴ７ヘリカーゼによって捕捉されることができ、その後、該ヘリカーゼは巻き戻しプロセスを続ける。
【００５５】
標的の核酸の起源に関係なく、二本鎖分子を巻き戻すことにより反応温度の変化無しに、ポリメラーゼ依存性増幅のための一本鎖分子を生産するために、核酸の増幅のあいだの熱変性工程の代わりにヘリカーゼ調製物を用いてもよい。したがって、Ｔａｑポリメラーゼを用いる標準的なＰＣＲ増幅において必要とされるサーモサイクリングを回避することができる。
【００５６】
一般に、プライマーと鋳型の間の認識特異性と、それに続くアニーリングを可能にするのに適した変性温度は、例えば２０℃〜７５℃などの温度範囲とすることができる。好ましい変性温度は、融解プロセスのためにどのヘリカーゼを選択したかに応じて選択するとよい。選択したヘリカーゼの存在下での核酸の増幅に対する最適温度を決定するための試験は、反応混合物の温度を変化させて、ゲル電気泳動を用いて増幅産物を比較することにより、常套的な実験によって決定することができる。
【００５７】
核酸二本鎖の変性は、たとえば４５℃〜７５℃の範囲よりも高い温度を含むインキュベーション条件下で、熱安定性ヘリカーゼ調製物を用いることにより加速することができる（実施例ＸＩＩ）。熱安定性ヘリカーゼ調製物および熱安定性ポリメラーゼを用いて高温でＨＤＡを行うことにより、プライマー結合の特異性を高めることができ、これにより、増幅の特異性を改善することができる。
【００５８】
ある状況において、増幅反応において複数の異なるヘリカーゼ酵素を用いることが望ましいかもしれない。複数のヘリカーゼを使用することで、異なるヘリカーゼが様々な機能を調整して二本鎖核酸の巻き戻しの効率を高めているような一定の状況下において、ＨＤＡにおける標的増幅の収率および長さを高めることができるかもしれない。たとえば、低プロセッシビティしか持たないものの、平滑末端を有するＤＮＡを融解することのできるヘリカーゼを、高いプロセッシビティを持つものの、巻き戻し開始のために二本鎖領域にある一本鎖尾部を認識する第２のヘリカーゼと組み合わせてもよい（実施例Ｘ）。この例において、第１のヘリカーゼが最初に長い核酸二本鎖の平滑末端を分離して５’および３’の一本鎖尾部とした後、その限られたプロセッシビティのためにその基質から解離する。この部分的に巻き戻された基質は次に第２のヘリカーゼによって認識され、該第２のヘリカーゼは優れたプロセッシビティで巻き戻しプロセスを続ける。このようにして、核酸二本鎖内の長い標的を、複数のヘリカーゼを含むヘリカーゼ調製物を使用することにより巻き戻して、続いてＨＤＡ反応において増幅させることができる。
【００５９】
（プライマー）
一般に、ＨＤＡにおいて使用するのに適したプライマー対は、例えば、１０ヌクレオチドよりも長く５０ヌクレオチド未満の長さを有する短い合成オリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドプライマー設計には、文字列に基づく（ｓｔｒｉｎｇ−ｂａｓｅｄ）アライメントスコア、融点、プライマーの長さ、およびＧＣ含量などの様々なパラメータが関与する（Ｋａｍｐｋｅら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１７：２１４〜２２５（２００３））。プライマーを設計する際の重要な因子の１つは、増幅すべき核酸分子に特異的な標的断片内の配列を選択することである。他の重要な因子は、ＨＤＡ反応のためにプライマーの融点を決定することである。プライマーの融点は、そのオリゴヌクレオチドの長さとＧＣ含量によって決まる。好ましくは、プライマーの融点は、ハイブリダイゼーションと増幅を行う温度よりも約１０〜３０℃高ければよい。例えば、大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ調製物を用いる場合でハイブリダイゼーションと増幅の温度を３７℃に設定するならば、この反応のために設計するプライマー対の融点は、約４７℃〜６７℃の範囲とする。ハイブリダイゼーションと増幅の温度が６０℃であるならば、この反応のために設計するプライマー対の融点は、約６５℃〜９０℃の範囲とする。ＨＤＡ反応のための最良のプライマーを選択するために、様々な融点をもつプライマーの組を平行アッセイにおいて調べることができる。プライマー設計に関するさらなる情報は、Ｋａｍｐｋｅら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１７：２１４〜２２５（２００３）に記載されている。
【００６０】
各プライマーは標的の核酸の各端部にハイブリダイズし、標的ヌクレオチド配列を鋳型として用いてポリメラーゼにより３’から５’の方向に伸長しうる（図３）。ハイブリダイゼーションの条件は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＲｉｃｈとＭａｎｉａｔｉｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ出版（２００３）に記載されるような標準的なものである。特異的増幅を達成するために、相同または完全に一致するプライマーが好ましい。しかしながら、プライマーは、５’末端に標的ヌクレオチド配列とは相補的でない配列を含んでいてもよい。あるいは、プライマーは、標的の核酸と正確には相補的でないようなヌクレオチドまたは配列を含んでいてもよい。所定の温度においてプライマーと鋳型間結合によって特異的ハイブリダイゼーションを達成できるのであれば、ＨＤＡにおいて使用するプライマーは、類似プライマーであってもよいし、あるいは非特異的またはユニバーサルプライマーであってもよい。
【００６１】
プライマーは、デオキシリボヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、ＧまたはＣおよび／または１つ以上のリボヌクレオチド塩基、Ａ、Ｃ、Ｕ、Ｇおよび／または１つ以上の修飾ヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド）のいずれを含んでいてもよい。上記修飾は、プライマーの核酸へのハイブリダイゼーション、またはプライマーの伸長、または二本鎖分子の変性を阻害しないものとする。プライマーは、その性能を高めるために、あるいは増幅産物のキャラクタリゼーションを容易にするために、ホスホロチオエートまたはメチルホスホロチオエートなどの物質群によって、あるいは非ヌクレオチドリンカーに修飾してもよい。
【００６２】
増幅産物を検出するために、プライマーに対して、蛍光または化学発光標識、およびビオチン標識などの修飾を行ってもよい（例えば、カルボキシフルオレセインのアミン反応性フルオレセインエステルなどの蛍光タグ：Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、バージニア州スターリング）。他の標識方法としては、放射性同位体元素、発色団と、ビオチンなどのリガンド、または直接は検出できないものの、標識されたその特異的結合相手であるアビジンなどとの反応によって容易に検出可能なハプテン、および抗体などが挙げられる。
【００６３】
本明細書に記載するプライマーは、当該技術分野における周知の方法によって調製することができる（例えば、米国特許第６，２１４，５８７号明細書を参照のこと）。
【００６４】
実施形態において、一方が標的配列の５’端部にハイブリダイズし、他方が標的配列の３’端部にハイブリダイズする２つの配列特異的プライマーの対（図３）をＨＤＡにおいて用い、標的配列の指数的増幅を達成する。この手法は、Ｌｅｅら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１６：１９〜３４（２００２））の方法とは容易に区別できる。多重反応における異なる検出タグを同時に用いて、複数の標的を増幅するために、１つのＨＤＡ反応において複数のプライマー対を用いることができる。多重化は、ＳＮＰ分析および病原体の検出において一般的に用いられている（Ｊｅｓｓｉｎｇら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１：４０９５〜４１００（２００３））。
【００６５】
（ポリメラーゼ）
ポリメラーゼは、プロセッシビティおよび鎖置換活性に基づいてＨＤＡ用に選択する。融解、およびプライマーとのハイブリダイゼーションに続き、核酸を重合工程に供する。増幅すべき核酸がＤＮＡである場合には、ＤＮＡポリメラーゼを選択する。最初の標的がＲＮＡである場合には、まず初めに逆転写酵素を用いてＲＮＡ標的をｃＤＮＡ分子に複写し、このｃＤＮＡをさらに、選択したＤＮＡポリメラーゼによるＨＤＡにおいて増幅する（実施例ＶＩＩ）。ＤＮＡポリメラーゼは、４種のｄＮＴＰの存在下において、標的の核酸上で作用して、核酸鋳型にハイブリダイズしたプライマーを伸長して、核酸鋳型上のヌクレオチド配列に相補的なプライマー伸長産物を作成する（図１および図３）。
【００６６】
ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失するポリメラーゼ、およびこれに加えて随意で３’−５’エキソヌクレアーゼ活性も欠失していてもよいポリメラーゼから成る群より選択される。
【００６７】
適切なＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠失Ｋｌｅｎｏｗ断片（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））、エキソヌクレアーゼ欠失Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ；ＵＳＢ（オハイオ州クリーブランド）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））、ＫｌｅｎＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡＢ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、（ミズーリー州セントルイス））、Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，７１６，８１９号明細書）、およびＰｏｌ  ＩＩＩＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第６，５５５，３４９号明細書）が挙げられる。ヘリカーゼ依存性増幅には、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠失Ｋｌｅｎｏｗ断片、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント、およびＳｅｑｕｅｎａｓｅなどの鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼが好ましい。Ｔ７ポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼよりもエラー率が３．５×１０5と有意に小さい高忠実度ポリメラーゼである（ＫｅｏｈａｖｏｎｇとＴｈｉｌｌｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６、９２５３〜９２５７（１９８９））。Ｔ７ポリメラーゼは、熱安定性ではないが、それ故に、サーモサイクリングを必要とする増幅系において使用するのに最適ではない。等温的に実施できるＨＤＡにおいて、Ｔ７  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅは、ＤＮＡ増幅のための好ましいポリメラーゼの１つである。
【００６８】
（一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質）
ヘリカーゼは、一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）の存在下で活性の向上を示す。こうした状況において、ＳＳＢの選択は一般に特異的タンパク質には限られない。一本鎖結合タンパク質としては、例えば、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、大腸菌ＳＳＢ、Ｔ７  Ｇｐ２．５ＳＳＢ、ファージφ２９ＳＳＢ（前掲のＫｏｒｎｂｅｒｇとＢａｋｅｒ（１９９２））および上述の切断型が挙げられる。
【００６９】
（他の化学物質）
塩およびｐＨに加えて、他の化学物質、例えば、尿素やジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの変性剤をＨＤＡ反応に加えて、二本鎖ＤＮＡを部分的に変性または不安定化するようにしてもよい。ＨＤＡ反応は、ＳＳＢタンパク質の存在下または非存在下にて、変性剤の濃度を変えて比較することができる。このようにして、ＨＤＡ効率を高めるか、および／または一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡ安定化においてＳＳＢの代わりとなる化学化合物を同定することができる。核酸やタンパク質などの生体マクロ分子の殆どが、生物細胞内ではｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験条件よりもはるかに高い濃度で機能および／またはそれらの天然の構造を形成するように設計される。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、水を排除し、溶質ポリカチオンと静電的相互作用を作り出すことにより、人工的な分子の込み合った状態を作り出すために用いられてきた（Ｍｉｙｏｓｈｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１：１５０１７−１５０２４（２００２））。ＰＥＧ（７．５％）をＤＮＡライゲーション反応に加えると、反応時間は５分間に短縮される（Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））。またＰＥＧは、反応の効率を高めるためにヘリカーゼ巻き戻しアッセイにも加えられてきた（Ｄｏｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：１４４５６〜１４４６１（１９９６））。ＨＤＡへのＰＥＧまたは他の分子込み合い剤は、ＨＤＡ反応における酵素および核酸の有効濃度を高めることにより、反応時間および反応に必要なタンパク質の濃度を低減するかもしれない。
【００７０】
（補因子）
ＡＴＰまたはＴＴＰは、高いプロセッシビティをもつ（ｈｉｇｈｌｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ）ヘリカーゼのための、広く好まれているエネルギー源である。平均的な１つのＡＴＰ分子は、１〜４塩基対を巻き戻すためにＤＮＡヘリカーゼによって消費される（前掲のＫｏｒｎｂｅｒｇとＢａｋｅｒ（１９９２））。本発明の一実施形態において、ＵｖｒＤに基づくＨＤＡ系は、３ｍＭの最適初期ＡＴＰ濃度を有していた。より長い標的を増幅するためには、短い標的の場合よりもより多くのＡＴＰが消費されるかもしれない。こうした状況において、ヘリカーゼとともに用いるための、ピルビン酸キナーゼに基づくＡＴＰ再生産系を含めることが好ましいかもしれない（ＨａｒｍｏｎとＫｏｗａｌｃｚｙｋｏｗｓｋｉ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７６：２３２〜２４３（２００１））。
【００７１】
（トポイソメラーゼ）
トポイソメラーゼは、長いＨＤＡ反応において、ＨＤＡが長い標的アンプリコンを増幅する能力を高めるために用いることができる。非常に長い線形ＤＮＡ二本鎖をヘリカーゼによって分離する場合には、トポイソメラーゼの旋回（弛緩）機能がよじれを除去し、巻きすぎ（ｏｖｅｒ−ｗｉｎｄｉｎｇ）を防ぐ（前掲のＫｏｒｎｂｅｒｇとＢａｋｅｒ（１９９２））。例えば、大腸菌トポイソメラーゼＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、ビルニウス、リトアニア）を用いて、一方のＤＮＡ鎖にニックを入れることにより、負の超らせん状ＤＮＡを弛緩させることができる。これに対し、大腸菌ＤＮＡジャイレース（トポイソメラーゼＩＩ）は、ＤＮＡ中に一時的な二本鎖破断をもたらし、ＤＮＡ鎖同士が互いに通り越すようにする（前掲のＫｏｒｎｂｅｒｇとＢａｋｅｒ（１９９２））。
【００７２】
（増幅核酸の検出）
増幅された核酸産物は、臭化エチジウム染色、および、放射性標識、蛍光標識および酵素からなる群より選択される標識によって、増幅された核酸を検出することを含む、様々な方法で検出することができる。例えば、ＨＤＡ増幅産物は、ヘアピン構造内の３’末端の近くに蛍光団を有するように設計されたオリゴヌクレオチドである蛍光標識ＬＵＸ（登録商標）プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で検出することができる。この構成は、別個の消光部分を必要とせずに、それ自体で本質的に蛍光消光能を与える。プライマーが二本鎖増幅産物に組み込まれると、蛍光団は脱消光されて、蛍光シグナルが著しく増大する。実施例ＸＩＶは、蛍光標識せれたプライマーを用いた標的配列のリアルタイム検出と、ＨＤＡ方法を実証するものである。
【００７３】
（ＨＤＡにおいて使用可能なヘリカーゼの同定）
ヘリカーゼを標的の核酸を増幅するためにＨＤＡにおいて使用できるかどうかを調べるために、ＨＤＡ反応を以下のように構成することができる。
【００７４】
（ａ）短い二本鎖オリゴヌクレオチド（１００ヌクレオチド未満）を増幅の基質として使用することができる。このオリゴヌクレオチドの５’および３’末端にハイブリダイズできるプライマーを準備する。前記二本鎖オリゴヌクレオチドを変性させ、標準的なトリス−酢酸バッファ（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）またはＴｈｅｒｍｏＰｏｌ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））バッファに溶解したプライマーと可変量のｄＮＴＰまたはＮＴＰとの第１の混合物中で一本鎖を形成させる。混合物は９５℃で１０分間加熱し、５３℃で１分間加熱する。
【００７５】
（ｂ）第２の混合物を調製するが、この第２の混合物は、ｐＨ６．０〜ｐＨ９．０の間で変えられるｐＨを有するＨＤＡバッファ中に、試験対象濃度のヘリカーゼを含んでいる。標準バッファは、それぞれ約０〜２００ｍＭの範囲の濃度の、一定濃度のＮａＣｌおよびＫＣｌを含んでいてもよい。ヘリカーゼの濃度を変えてもよい。Ｔ４  Ｇｐ３２などの一本鎖結合タンパク質を、ＤＮＡポリメラーゼおよび４種のｄＮＴＰｓとともに、増幅すべき核酸およびプライマーも含む増幅反応系中で用いる標準量で加える。
【００７６】
（ｃ）混合物を合わせて、３７℃（またはある温度で）で２時間インキュベートした後、３％ＧＰＧ  ＬＭＰアガロースゲル上で分析する。
【００７７】
上述の異なる条件下で反復反応を行うことにより、個々のヘリカーゼについて、ＨＤＡのための最適な条件を求めることができる。
【００７８】
次に、ヘリカーゼが、プラスミドやより長いＤＮＡ分子、および大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼに対する実施例で説明するようなゲノムＤＮＡ内の短い配列を増幅できるかどうかを調べてもよい。
【００７９】
ここで、ヘリカーゼ依存性増幅が、多種多様な用途に使用される改良された核酸増幅方法であることを実証する。これらには、逆転写に続く増幅、およびリアルタイムＨＤＡを用いた定量的増幅が含まれる。以下の実施例では、ＨＤＡが、広範な大きさの核酸を増幅するためのいかに高感度で効率的な方法であるかを説明する。ＨＤＡ反応の感度の一つの尺度は、核酸配列を１０倍から１０億倍の範囲で増幅できることである。
【００８０】
表１は、限定することなくいくつかの標本値を含んでいる。
【００８１】
【表１】
0004632788.tif 000002
【００８２】
（増幅条件−温度）
鎖置換増幅などの他の等温的核酸増幅方法でも、サーモサイクリングを用いない定温度での標的増幅を行うことができるものの、これらの方法には一本鎖鋳型を生成するための初期変性工程を必要とする。本方法の実施形態の利点は、ヘリカーゼによる巻き戻しと増幅の両方を、実施例ＩＸにおいて実証するように一貫して単一の温度において効率的に行うことができることにある。あるいは、ヘリカーゼによる標的の核酸の初期巻き戻しを助けるために温度を上げ、その後増幅を単一の温度で進行させる。
【００８３】
我々は、ＲＮＡの逆転写産物の増幅のためのＰＣＲの代わりに、ＨＤＡを使用できることも示した（実施例ＶＩＩ）。さらに、ＨＤＡは、遺伝子発現研究や環境分析において有用であることが分かっている定量的増幅に対しても有用であると予想される。したがって、標的の核酸の量を決定することが望ましい場合には、ＨＤＡをリアルタイムエンドポイントアッセイにおいて使用することができる。したがって、ＨＤＡは、遺伝子発現研究において、細胞内のメッセンジャーＲＮＡの相対量を決定するために用いてもよい。例えば、国際公開第０１/２５４７３号パンフレットに記載の校正された（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ）遺伝子発現プロファイルを、定量的ヘリカーゼ依存性増幅またはＱ−ＨＤＡを用いて作成することができる。
【００８４】
リアルタイムＨＤＡは、海水中の大腸菌などの汚染試料中の生物の量を決定するための高感度の技術として使用してもよい。ＨＤＡ反応において蛍光などの高感度マーカーを用いるリアルタイム検出は実施例ＸＩＶで実証する。
【００８５】
ＨＤＡは、野外作業および／または実験室での診断において使用するための小型装置に関連して開発してもよい。例えば、ＨＤＡは、ミクロ流体環境において実施してもよい。ミクロ流体技術（チップ上の実験室）は、通常はナノリットルスケールの小型環境において生化学分析を行うことによりコストと時間を削減するための重要な戦略として急速に普及してきている。ミクロ流体技術は、核酸増幅および検出方法と組み合わせた場合に、病原体検出における野外持ち出し可能な装置として使用できる大きな可能性を有している。ＨＤＡは、初期変性を行わずに等温条件において核酸を増幅できるという能力を持つことから、ミクロ流体装置における核酸増幅プロセスのための優れた候補となっている。同様に、ＨＤＡは、キット、あるいは、国際公開第０２/０２７４０号パンフレットに開示されている分類の反応プロファイルを作成するための実験室増幅手順において、あるいは疾病を監視するために（米国公報Ｎｏ．２００１０１８１８２）用いてもよい。
【００８６】
実施例ＩＩからＸＩＶでは、ＨＤＡが、異なる起源に由来する、異なる配列を有する標的の核酸を増幅するのに有用であることを説明する。実施例ＩＶでは、ＨＤＡを用いたＤＮＡプラスミドに由来する様々な長さの標的配列の増幅について説明する。実施例Ｘでは、Ｔ７  Ｇｐ４Ｂに基づくＨＤＡ系によって、より長い標的配列（＞２ｋｂ）を増幅できることを実証する。実施例Ｘは、核酸を増幅するためのヘリカーゼ依存性増幅を用いた方法が、異なるヘリカーゼ調製物、例えばＴ７  Ｇｐ４Ｂヘリカーゼを含むヘリカーゼ調製物、またはＴ７  Ｇｐ４ＢヘリカーゼやＵｖｒＤヘリカーゼなどの１つ以上のヘリカーゼを含むヘリカーゼ調製物を用いても実施できることをさらに実証するものである。
【００８７】
ＨＤＡを用いてわずか１０コピーの細菌ゲノムＤＮＡでもうまく増幅できることを実施例ＶＩＩＩにおいて実証するが、これは、例えばＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓやＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅなどの病原性細菌を原因とする感染性疾病の分子診断用途に対するＨＤＡの使用を立証するものである。ヒトゲノムＤＮＡ試料から標的配列を増幅できることを実証するが（実施例ＶＩ）、これは、一塩基変異多型を含む特定の疾病に対応する遺伝的対立遺伝子の同定における、また犯罪現場や考古学的な遺跡に残された少量の核酸を解析することによる法科学的用途における、ＨＤＡの使用を立証するものである。
【００８８】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために提供するものであって、本発明を限定するものではない。
【００８９】
上記および下記に挙げた参照文献は参照により本願に組み込む。
【実施例】
【００９０】
（実施例Ｉ）
ＵｖｒＤヘリカーゼとそのアクセサリタンパク質ＭｕｔＬのクローニングと精製
１．ＵｖｒＤヘリカーゼとＭｕｔＬタンパク質をコードする遺伝子のクローニング
大腸菌ヘリカーゼＩＩまたはＵｖｒＤヘリカーゼ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔアクセス番号：Ｐ０３０１８）、およびそのアクセサリタンパク質である大腸菌ＭｕｔＬタンパク質（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔアクセス番号：Ｐ２３３６７）をコードする遺伝子を、Ｉｍｐａｃｔ（登録商標）系を用いてクローニングした。このＩｍｐａｃｔ系は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＶＭＡインテインとキチン結合ドメインからなる２官能性タグのＣ末端翻訳融合体をもたらす（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））。タンパク質精製系では、標的タンパク質を親和性タグ（キチン結合ドメイン）から分離するために、タンパク質スプライシング要素（インテインと呼ばれる）のＤＴＴ誘導性自己開裂活性を利用する。大腸菌Ｋ１２ゲノムＤＮＡから、プライマー５Ａ（５’ＧＧＴＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＣＧＴＴＴＣＴＴＡＣＣＴＧＣＴＣ３’（配列番号：１））およびプライマー３Ａ（５’ＧＧＴＧＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＣＡＣＣＧＡＣＴＣＣＡＧＣＣＧＧＧＣ３’（配列番号：２））を用いてｕｖｒＤ遺伝子を増幅するために、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを用いた。ｍｕｔＬ遺伝子は、プライマー５Ｂ（５’ＧＧＴＧＧＴＣＡＴＡＴＧＣＣＡＡＴＴＣＡＧＧＴＣＴＴＡＣＣＧ３’（配列番号：３））およびプライマー３Ｂ（５’ＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＡＣＴＣＡＴＣＴＴＴＣＡＧＧＧＣＴＴＴＴＡＴＣ３’（配列番号：４））を用いて、大腸菌Ｋ１２ゲノムＤＮＡから増幅させた。大腸菌Ｋ−１２はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー）から得た。ゲノムＤＮＡは、ＱｉａｇｅｎゲノムＤＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を用いて単離した。プライマーには、ｍｕｔＬ遺伝子をｐＴＹＢ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））のＮｄｅＩおよびＳａｐＩ部位に、またｕｖｒＤ遺伝子をｐＴＹＢ３（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））のＮｃｏＩおよびＳａｐＩ部位にクローニングできるようにする制限酵素部位を含めた。ライゲーション産物をＥＲ２５０２細胞に形質転換した。陽性の形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ平板上で選択的に培養した後、コロニーＰＣＲおよびインサートの配列決定によりスクリーニングした。配列決定結果を分析した後、妥当な構築物を大腸菌ＥＲ２５６６細胞に形質転換した。ｐＴＹＢｌ−ＭｕｔＬまたはｐＴＹＢ３−ＵｖｒＤを含んだＥＲ２５６６細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えたＬＢ培地中、３７℃で培養した。ＯＤ550が〜０．５に達したところで、０．５ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によってタンパク質発現を誘導した。１５℃で一晩インキュベートした後、遠心分離により細胞を回収した。
【００９１】
２．ＵｖｒＤおよびＭｕｔＬ精製
インテインタグのキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）によって、融合タンパク質をキチンビーズカラム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））上でアフィニティ精製することができるようになる。すべての手順は４℃で行った。６リットルの培地に含まれるＵｖｒＤ発現細胞を２１０ｍＬの超音波処理用バッファ（２０ｍＭトリスｐＨ７．８、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０μＭ  ＰＭＳＦ、５％グリセロール）に再懸濁し、超音波破砕した。透明になった抽出物を、５００ｍＬのバッファＡ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）と５００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化した４５ｍＬキチンビーズカラムにロードした。カラムを５００ｍＬのバッファＡ＋１Ｍ  ＮａＣｌと、５００ｍＬのバッファＡ＋５００ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄した。自己開裂の誘導は、カラムに、カラムの３倍体積（１３５ｍＬ）の開裂バッファ（バッファＡ＋５００ｍＭ  ＮａＣｌ＋５０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ））を流すことにより行った。開裂反応は、開裂バッファ中、４℃で６４時間行った。タンパク質を６７ｍＬのバッファＢ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）＋５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。陽性の画分をプールし、予めバッファＢ＋５０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化しておいた１ｍＬのＭｏｎｏＱカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャージー州ピスカタウェイ））にロードした。素通り画分と溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。陽性画分におけるヘリカーゼ活性については、ヘリカーゼが、３０ヌクレオチド（ｎｔ）のオリゴヌクレオチドを相補的非標識７０ｎｔオリゴヌクレオチドにアニーリングすることによって調製した部分的二重鎖から、蛍光標識オリゴヌクレオチド（３０ｎｔ）を置換する能力を測定することにより、さらに調べた。置換された３０ｎｔ標識オリゴヌクレオチドは、別の非標識３０ｎｔ相補的オリゴヌクレオチドによって捕捉された。オリゴヌクレオチドは、２０％非変性ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動により分離し、置換されたオリゴヌクレオチドはＵＶ光によって可視化した。ＵｖｒＤタンパク質およびヘリカーゼ活性は、素通りおよび洗浄画分中で見られた。これらの画分を混合し、１ｍＬヘパリンＴＳＫカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャージー州ピスカタウェイ））上にロードした。この場合も、ＵｖｒＤはカラムに結合しなかった。１ｍＬのヒドロキシアパタイトカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ（ペンシルヴェニア州フィラデルフィア））がＵｖｒＤを保持したが、これは直線勾配（５０ｍＭ〜１Ｍ  ＮａＣｌ）における３４０ｍＭ  ＮａＣｌ付近で溶出した。精製画分をプールし、保存バッファ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０％グリコール）に対して一晩透析した。最終濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８〜２５４（１９７６））およびＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて決定した。
【００９２】
ＭｕｔＬもＵｖｒＤと同様に精製した。６リットルのＥＲ２５６６／ｐＴＹＢ１−ＭｕｔＬの培養液を使用した。すべての手順は４℃で行った。キチンビーズカラム精製の条件は、カラム体積を１４ｍＬとした以外はＵｖｒＤの場合と同様にした。カラムを１２５ｍＬのバッファＡ＋１Ｍ  ＮａＣｌ、および１２５ｍＬのバッファＡ＋５００ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄した。自己開裂の誘導は、カラムを４５ｍＬの開裂バッファ（バッファＡ＋５００ｍＭ  ＮａＣｌ＋５０ｍＭ  ＤＴＴ）で洗浄することにより誘導した。開裂反応は、開裂バッファ中、４℃で４０時間行った。タンパク質を３６ｍＬのバッファＢ＋５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出した。陽性の画分をプールし、１ｍＬ  ＭｏｎｏＱカラムにロードした。ＭｕｔＬは、カラムの素通り画分中に見られた。したがって、素通りおよび洗浄画分をプールし、バッファＢ＋４０ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析して、最終ＮａＣｌ濃度を５０ｍＭとした。試料を１ｍＬのヘパリンＴＳＫカラムにロードした。ＭｕｔＬが保持され、５６５ｍＭ  ＮａＣｌにおいて溶出した。しかしながら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上では他のタンパク質バンドも検出することができ、エキソヌクレアーゼアッセイにおいては、目的の画分中にエキソヌクレアーゼ活性が存在することが分かった。これらの画分をプールし、バッファＢ＋５０ｍＭ  ＮａＣｌに対して透析した。２回目の１ｍＬ  ＭｏｎｏＱカラムを用いて、混入タンパク質からＭｕｔＬを分離した。ＭｕｔＬは、２２０ｍＭ  ＮａＣｌにおいて溶出した。精製画分をプールし、ＣｅｎｔｒｉｐｌｕｓＹＭ１０（Ｍｉｉｌｉｐｏｒｅ、（マサチューセッツ州ベッドフォード））によって濃縮してから、保存バッファ（２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０％グリセロール）に対して一晩透析した。最終濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて決定した。
【００９３】
３．他のクローニングおよび精製系
Ｉｍｐａｃｔ（登録商標）に加えて、ヘリカーゼおよびそれらのアクセサリタンパク質は、いくつかの代替の方法、例えば直接クローニング（付加的タグなしに遺伝子をベクターに直接クローニングする）、Ｈｉｓ−Ｔａｇ（登録商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．（ウィスコンシン州マジソン））およびｐＭＡＬ（登録商標）タンパク質融合体と精製系（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｉａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））を用いて精製してもよい。大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼを、プラスミドｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（ウィスコンシン州マジソン））およびｐＭＡＬ−ｃ２Ｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））中にクローニングした。Ｈｉｓタグ融合体であるＵｖｒＤ−Ｈｉｓを、Ｈｉｓ．Ｂｉｎｄ（登録商標）カラムおよび製造業者（Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（ウィスコンシン州マジソン））によって提供されるプロトコールを用いて精製した。ＵｖｒＤ−Ｈｉｓタンパク質は、ヒドロキシアパタイトカラムによってさらに精製した。ＭＢＰ−ＵｖｒＤ融合タンパク質は、アミロースカラムおよび製造業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））によって提供されるプロトコールを用いて精製した。ＵｖｒＤ−Ｈｉｓタンパク質およびＭＢＰ−ＵｖｒＤ融合タンパク質のいずれも、機能的巻き戻し活性を示し、ヘリカーゼ−依存性増幅反応において使用しうることがわかった。
【００９４】
（実施例ＩＩ）
核酸二本鎖標的の増幅方法
ヘリカーゼ依存性増幅のモデル系として、合成ＤＮＡ二本鎖をＨＤＡ反応における鋳型として用いた。この実施例では、ＵｖｒＤ  ＨＤＡ系を用いた上記ＤＮＡ二本鎖の増幅について説明する。鋳型変性の方法、プライマーアニーリングおよび伸長について以下に示す。
【００９５】
３５μＬの反応成分Ａは、１０μＬの５×ＨＤＡバッファＡ（１７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＤＴＴ）と、上部オリゴデオキシヌクレオチド（２μＭ；５’ＴＧＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＧＧＴＧＧＣＧＣＧＧＡＣＣＧＡＧＴＧＣＧＣＴＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＧＴＡＧＡＧＣＡＧＧＣＡＧＣ３’（配列番号：５））および下部オリゴデオキシヌクレオチド（２μＭ；５’ＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＡＣＣＣＣＴＣＴＣＣＧＣＡＧＣＣＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＣＴＣＧＧＴＣＣＧＣＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＣＣＡ３’（配列番号：６））から得た０．５μＬの７０ｂｐＤＮＡ鋳型と、１μＬの５’プライマー（１０μＭ；５’ＣＡＴＧＴＴＡＧＧＴＴＣＴＡＴＧＧＡＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＣＴＧＧＴＣＡＣＣＡＧＡＧＧＧ３’（配列番号：７））と、１μＬの３’プライマー（１０μＭ；５’ＴＣＣＣＴＴＡＧＡＧＧＴＣＡＣＡＴＴＧＧＡＴＣＧＡＧＴＣＧＣＴＧＣＣＴＧＣＴＣＴＡＣＣＣＣ３’配列番号：８））と、１０μＬの４種のｄＮＴＰ（各２ｍＭ）と、１．５μＬのＡＴＰ（１００ｍＭ）と、１１μＬのｄＨ2Ｏとを混合することにより作成した。反応成分Ａを９５℃で２分間加熱して鋳型を変性させ、５３℃で３分間および３７℃で２分間加熱してプライマーをアニーリングさせた後、０．５μＬのＭｕｔＬタンパク質（８００ｎｇ／μＬ）を加えた。１５μＬの反応成分Ｂは、１０μＬの５×ＨＤＡバッファＢ（５ｍＭトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．９）、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、５５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ）、０．５μＬの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのｅｘｏ-Ｋｌｅｎｏｗ断片（５ユニット／μｌ）、０．５μＬのＵｖｒＤヘリカーゼ（２００ｎｇ／μＬ）、０．９μＬのＴ４遺伝子３２タンパク質（Ｇｐ３２；５μｇ／μＬ）、および３．１μＬのｄＨ2Ｏを混合することにより調製し、これをＭｕｔＬに続いて成分Ａに加えた。ｅｘｏ-Ｋｌｅｎｏｗ断片は市販されており（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））、Ｔ４遺伝子３２タンパク質もまた市販されている（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，（インディアナ州インディアナポリス））。反応は３７℃で３０分間続け、１２．５μＬの停止バッファ（１％ＳＤＳ、０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ、３０％グリセロール、０．２％ブロモフェノールブルー）を加えることにより停止した。反応産物は、トリスホウ酸ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）バッファおよび臭化エチジウム中、３％ゲノム処理グレード（ＧＰＧ）低融点（ＬＭＰ）アガロースゲル（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ（マサチューセッツ州ナティック））上で分析した（図２−２）。約１２０ｂｐのＤＮＡ断片が観察され（図２−２）、これは予想される１２３ｂｐの産物に一致した（図２−１）。
【００９６】
（実施例ＩＩＩ）
ＨＤＡによるプラスミドＤＮＡからの特定配列の増幅
ＤＮＡ鋳型から特定の標的配列を増幅するためにＨＤＡを用いることができるかどうかを調べるために、２つのｐＵＣ１９／Ｍ１３ユニバーサルプライマーであるプライマー１２２４およびプライマー１２３３を用いて、２６４７ｂｐのＤＮＡプラスミドであるｐＡＨ１（図１５（配列番号：９））から１１０ｂｐの配列をＵｖｒＤ  ＨＤＡ系を用いて増幅した。プライマー１２２４およびプライマー１２３３は、市販されており、それらの配列は会社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））で入手可能である。増幅スキームを図３にまとめる。
【００９７】
次の２つの酢酸ベースのバッファを予め調製しておいた。１０×ＨＤＡバッファＡは、３５０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．５）と１００ｍＭ  ＤＴＴとを含み、１０×ＨＤＡバッファＢは、１０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．５）と、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡと、９０ｍＭ酢酸マグネシウムとを含む。ＨＤＡ反応成分Ａは、以下のものを組み合わせることにより構成した。
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファＡ
１．５μＬの２３ｎＭ  ＡｈｄＩ開裂ｐＡＨ１プラスミド
１μＬの１０μＭプライマー１２２４
１μＬの１０μＭプライマー１２３３
２μＬの各ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
１．５μＬのＡＴＰ（１００ｍＭ）
８μＬのｄＨ2Ｏ
【００９８】
反応成分Ａを９５℃で２分間加熱して鋳型を変性させ、６９℃で３分間加熱することによりプライマーをアニールさせ、３７℃で２分間加熱してから成分Ｂを加えた。
【００９９】
以下のものを混合することにより、１５μＬの反応成分を調製した。
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファＢ
１μＬ  ｅｘｏ-Ｋｌｅｎｏｗ断片（５ユニット／μＬ）
０．５μＬ  ＵｖｒＤヘリカーゼ（２００ｎｇ／μＬ）
１μＬ  ＭｕｔＬタンパク質（４００ｎｇ／μＬ）
０．９μＬ  Ｔ４  Ｇｐ３２（５μｇ／μＬ）
２１．６μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１００】
次に成分Ｂを成分Ａに加えた。反応は３７℃でさらに１時間続け、１２．５μＬの停止バッファ（１％ＳＤＳ、０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ、３０％グリセロール、０．２％ブロモフェノールブルー）を加えることにより停止した。反応産物は、臭化エチジウムを含む２％ＧＰＧ  ＬＭＰゲル上で分析した（図４）。
【０１０１】
１１０ｂｐ増幅産物が２％アガロースゲル上で観察された。この産物の大きさは、予想される標的配列の長さと一致していた（図４、レーン１）。ＵｖｒＤヘリカーゼの非存在下では、増幅は全く観察されなかったことから、増幅にはヘリカーゼが必要とされることが確認された。さらに、これらの結果からは、ＵｖｒＤは、ＭｕｔＬおよびＴ４  Ｇｐ３２ＳＳＢの存在下での標的ＤＮＡの増幅において実質的により高い効率を示すことが分かった。
【０１０２】
（実施例ＩＶ）
ＤＮＡプラスミドからの様々な標的配列の増幅方法
ＵｖｒＤに基づくＨＤＡ系が様々な標的配列を増幅できるかどうかを調べるために、プライマー１２２４とプライマー１２３３の間に様々な配列および大きさのインサートを含んだｐＡＨＩ誘導プラスミドを用いて、いくつかの平行反応を行った。
【０１０３】
５０μＬのＨＤＡ反応は、後述するような２つの反応成分ＡおよびＢを用い、それらを順に混ぜ合わせることにより構成した。以下の２種の酢酸ベースのバッファを予め作成しておいた。１０×ＨＤＡバッファＡは、３５０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．５）と１００ｍＭ  ＤＴＴとを含み、１０×ＨＤＡバッファＢは、１０ｍＭトリス−酢酸と（ｐＨ７．５）、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡと、１００ｍＭ酢酸マグネシウムとを含む。
【０１０４】
以下のものを組み合わせることにより、３５μＬの成分Ａを作成した。
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファＡ
１μＬ  ｐＡＨ１プラスミドまたはｐＡＨ１誘導体（５０ｎｇ／μＬ）
１μＬの１０μＭプライマー１２２４
１μＬの１０μＭプライマー１２３３
１０μＬ  各ｄＮＴＰ（２ｍＭ）
１．５μＬ  ＡＴＰ（１００ｍＭ）
１５．５μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１０５】
以下のものを組み合わせることにより、１５μＬの成分Ｂを調製した。
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファＢ
１μＬ  ｅｘｏ-Ｋｌｅｎｏｗ断片（５ユニット／μＬ）
０．５μＬ  ＵｖｒＤヘリカーゼ（２００ｎｇ／μＬ）
０．５μＬ  ＭｕｔＬ（８００ｎｇ／μＬ）
０．９μＬ  Ｔ４  Ｇｐ３２（５μｇ／μＬ）
７．１μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１０６】
成分Ａを９５℃で２分間加熱して鋳型を変性させることにより、ＨＤＡ反応を開始した。次に、成分Ａを６９℃で３分間インキュベートして、プライマーをアニールさせ、３７℃で２分間インキュベートして反応物を冷却した。１５μＬの作りたての成分Ｂを、変性、アニーリングおよび冷却工程を行った後の３５μＬの成分Ａに添加した。反応を３７℃でさらに１時間続け、１２．５μＬの停止バッファ（１％ＳＤＳ、０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ、３０％グリセロール、０．２％ブロモフェノールブルー）を加えることにより停止した。反応産物は、ＴＢＥバッファおよび臭化エチジウム中において３％ＧＰＧ  ＬＭＰゲル上で分析した（図４）。すべての増幅産物が予想される標的の大きさに一致していた（図４、レーン１〜５）。さらに、ＵｖｒＤに基づくＨＤＡ系は、６５０ｂｐまでの標的ＤＮＡをＨＤＡ反応において増幅することができた（図４、レーン５）。
【０１０７】
（実施例Ｖ）
ＨＤＡによる細菌ゲノムＤＮＡからの特定配列の増幅
ＨＤＡは、ウィルスゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ、細菌ゲノムＤＮＡまたはヒトゲノムＤＮＡなどのさらに複雑な核酸試料から、特定の標的配列を増幅するためにも用いることができる。本例においては、口腔病原体であるＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ  ＡＴＣＣＮｏ．３５４０５の細菌ゲノムから、大腸菌ＵｖｒＤに基づくＨＤＡ系を用いて、特定の標的配列を増幅および検出する方法を開示する。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子ｅａｒＩＲを標的遺伝子（図１６（配列番号：１０））として選択し、ｅａｒＩＲの配列にハイブリダイズするように１つの５’プライマーと２つの３’プライマーを設計した。反応バッファおよびプロトコールは、ゲノムＤＮＡ増幅用に改変した。１０×ＨＤＡバッファＡは、３５０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．５）および１００ｍＭ  ＤＴＴを含む。１０×ＨＤＡバッファＢは、１０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７，５）と、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡと、１００ｍＭ酢酸マグネシウムとを含む。
【０１０８】
以下のものを組み合わせることにより、２０μＬの成分Ａを構成した。
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファＡ
２μＬのＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）
２μＬの１０μＭプライマー５８８６１（５’ＣＣＡＡＡＴＧＡＴＧＣＴＴＡＴＧＴＴＧＣＴＴ３’（配列番号：１１））
２μＬの１０μＭプライマー５８８６２（５’ＣＡＴＡＡＧＣＣＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＣＴ３’（配列番号：１２））または２μＬの１０μＭプライマー５８８６３（５’ＴＣＣＡＣＡＴＣＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＣＣＡＴ３’（配列番号：１３）
２μＬ  各ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
７μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１０９】
以下のものを混合することにより３０μＬの反応成分Ｂを調製した。
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファＢ
４μＬ  １００ｍＭ  ＡＴＰ
０．５μＬ  ＵｖｒＤヘリカーゼ（２００ｎｇ／μＬ）
０．５μＬ  ＭｕｔＬ（８００ｎｇ／μＬ）
０．９μＬ  Ｔ４  Ｇｐ３２（５μｇ／μＬ）
１μＬ  ｅｘｏ-Ｋｌｅｎｏｗ断片（５ユニット／μＬ）
１８．１μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１１０】
反応成分Ａを９５℃で１０分間、５３℃で１分間、および３７℃で２分間加熱した。作りたての成分Ｂを、３７℃まで冷却した後の成分Ａに加えた。反応を３７℃でさらに２時間続け、１２．５μＬの停止バッファを加えることにより停止した。反応産物は、３％ＧＰＧ  ＬＭＰアガロースゲル上で分析した（図５−１）。標的ＤＮＡの予想される大きさはプライマー５８８６１とプライマー５８８６２の間の９７ｂｐであり（図５−１、レーン１）、プライマー５８８６１とプライマー５８８６３の間の予想される長さは１２９ｂｐ（図５−１、レーン２）である。アガロースゲル上には２つの産物が観察され、いずれも標的ＤＮＡの予想される大きさに一致していた。増幅産物の配列決定を行い、配列決定の結果から、いずれも標的ＤＮＡの配列に一致することを確認した。
【０１１１】
ＵｖｒＤヘリカーゼ調製物が様々なＤＮＡポリメラーゼと協働するかどうかを調べるために、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａゲノムに由来する１２９ｂｐの標的配列を増幅するためのＨＤＡ反応を、ＵｖｒＤヘリカーゼ調製物およびＴ７  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ、（オハイオ州クリーブランド））を用いて行った。
【０１１２】
反応成分Ａ（２０μＬ）は、以下のものを混合することにより調製した。
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファＡ
２μＬのＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）
２μＬの１０μＭプライマー５８８６１（５’ＣＣＡＡＡＴＧＡＴＧＣＴＴＡＴＧＴＴＧＣＴＴ３’（配列番号：１１））
２μＬの１０μＭプライマー５８８６３（５’ＴＣＣＡＣＡＴＣＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＣＣＡＴ３’（配列番号：１３）
２μＬ  各ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
７μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１１３】
以下のものを混合することにより３０μＬの反応成分Ｂを調製した。
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファＢ
４μＬ  １００ｍＭ  ＡＴＰ
０．５μＬ  ＵｖｒＤヘリカーゼ（２００ｎｇ／μＬ）
０．５μＬ  ＭｕｔＬ（８００ｎｇ／μＬ）
０．９μＬ  Ｔ４  Ｇｐ３２（５μｇ／μＬ）
１μＬ  Ｔ７  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（１．５ユニット／μＬ、または３．５ユニット／μＬ）
１８．１μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１１４】
ＨＤＡ反応は上述と同様に行った。反応産物は、３％ＧＰＧ  ＬＭＰアガロースゲル上で分析した（図５−２）。アガロースゲル上に１３０ｂｐ付近の増幅産物が観察されたが、これは１２９ｂｐの標的配列の予想される大きさに一致していた（図５−２、レーン１および２）。
【０１１５】
（実施例ＶＩ）
ＨＤＡによる、ヒトゲノムＤＮＡ試料からの標的配列の増幅
本例においては、ヒトゲノムＤＮＡ試料から、大腸菌ＵｖｒＤに基づくＨＤＡ系を用いて標的配列を増幅する方法を開示する。乳癌細胞系列から調製したヒトゲノムＤＮＡ調製物をＡＴＣＣ  Ｎｏ．４５５３７より購入した。ヒトＤＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｄｎｍｔ１）に特異的な２種のプライマーを合成した。５０、７５、１００ｎｇ／μＬの異なる濃度のゲノムＤＮＡを用いた反応において、異なる開始量のヒトゲノムＤＮＡについて調べた。
【０１１６】
以下のものを組み合わせることにより、２０μＬの成分Ａを構成した。
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファＡ
２μＬのヒトゲノムＤＮＡ（５０〜１００ｎｇ／μＬ）
２μＬの１０μＭプライマーｄｎｍｔ５（５’ＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＡＡＧＧＡＣＴＡＧＴＴ３’（配列番号：１４））
２μＬの１０μＭプライマーｄｎｍｔ３（５’ＣＣＡＴＧＴＡＣＣＡＣＡＣＡＴＧＴＧＡＡＣ３’（配列番号：１５））
２μＬ  各ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
７μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１１７】
以下のものを混合することにより３０μＬの反応成分Ｂを調製した。
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファＢ
３μＬ  １００ｍＭ  ＡＴＰ
１μＬ  ｅｘｏ-Ｋｌｅｎｏｗ断片（５ユニット／μＬ）
０．５μＬ  ＵｖｒＤヘリカーゼ（２００ｎｇ／μＬ）
０．５μＬ  ＭｕｔＬ（８００ｎｇ／μＬ）
０．９μＬ  Ｔ４  Ｇｐ３２（５μｇ／μＬ）
１９．１μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１１８】
反応成分Ａを９５℃で１０分間、５３℃で１分間、および３７℃で２分間加熱した。３７℃まで冷却した後の成分Ａに、成分Ｂを加えた。反応を３７℃でさらに２時間続け、１２．５μＬの停止バッファを加えることにより停止した。反応産物は、３％ＧＰＧ  ＬＭＰアガロースゲル上で分析した（図６）。臭化エチジウム染色により１２４ｂｐ付近にバンドを検出することができたが、その大きさは最初のｄｎｍｔ１遺伝子内の標的の長さと一致していた。
【０１１９】
（実施例ＶＩＩ）  ＨＤＡによるＲＮＡ試料からの標的配列の増幅
本実施例においては、ＲＮＡ試料から標的配列を増幅するための方法について開示する。ラット全ＲＮＡを核酸基質として使用し、最初にＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー）製のＴｈｅ  ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔキットを用いて一本鎖ｃＤＮＡ産物に変換した。
【０１２０】
反応系は以下のものを組み合わせて構成し、７０℃で５分間インキュベートした後、氷上に保持した。
２μＬ  ラット全ＲＮＡ（０．５μｇ／μＬ）
２μＬ  プライマーｄＴ23ＶＮ（５０μＭ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））
４μＬ  ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）
８μＬ  Ｈ2Ｏ
【０１２１】
その後、以下の試薬を反応チューブに加えた。
２μＬ  １０×ＲＴバッファ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））
１μＬ  ＲＮａｓｅ阻害剤（１０Ｕ／μＬ）
１μＬ  Ｍ−ＭｕｌＶ逆転写酵素（２５Ｕ／μＬ）
【０１２２】
ＲＴ反応系は、４２℃で１時間インキュベートした後、９５℃で５分間インキュベートした。２μＬの一本鎖ｃＤＮＡ産物をＨＤＡにおける成分Ａに加え、ＨＤＡは、以下のものを組み合わせることにより開始した。
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファＡ
２μＬの第１鎖ｃＤＮＡ産物
１μＬの１０μＭプライマーｓｆｏ（５’ＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＡＴＧＣＡＴＧＴＧＧＡＴＣＴＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧＣ３’（配列番号：１６））
１μＬの１０μＭプライマーｓｒｅ（５’ＣＧＡＴＴＣＣＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＧＧＡＴＣＴＧＡＴＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴ３’（配列番号：１７））
２μＬの各ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
９μＬのｄＨ2Ｏ
【０１２３】
以下のものを混合することにより、３０μＬの反応成分Ｂを調製した。
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファＢ
２μＬ  １００ｍＭ  ＡＴＰ
１μＬ  ｅｘｏ-Ｋｌｅｎｏｗ断片（５ユニット／μＬ）
０．５μＬ  ＵｖｒＤヘリカーゼ（２００ｎｇ／μＬ）
０．５μＬ  ＭｕｔＬ（８００ｎｇ／μＬ）
０．９μＬ  Ｔ４  Ｇｐ３２（５μｇ／μＬ）
２０．１μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１２４】
反応成分Ａを９５℃で２分間、５３℃で１分間、および３７℃で２分間加熱した。作りたての成分Ｂ、３７℃に冷却した後の成分Ａに加えた。反応を３７℃でさらに２時間続け、１２．５μＬの停止バッファを加えることにより停止した。反応産物は、３％ＧＰＧ  ＬＭＰゲル上で分析した（図７）。アガロースゲル中には、予想される大きさである１３６ｂｐに合う１３０ｂｐ付近にバンドが見られた。増幅産物をアガロースゲルから精製し、配列決定した。増幅産物の配列は、最初の標的であるラットグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子の配列と合致したことから、増幅は配列特異的であることが確認された。
【０１２５】
（実施例ＶＩＩＩ）
ＨＤＡは、細菌ゲノムＤＮＡのわずか１０コピーからでさえ標的配列を増幅および検出することができる。
【０１２６】
ＨＤＡの増幅力を調べるために、様々な量のＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａゲノムＤＮＡを用いてＨＤＡ反応を行った。各反応は、ゲノムＤＮＡの量を除いては実施例Ｖに記載されているように行った。第１のチューブは、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａゲノムの約１０7コピーに相当する１００ｎｇのＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｉａゲノムＤＮＡを含み、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａゲノムのコピー数が１０に達するまで１０倍の系列希釈を行った。
【０１２７】
実施例Ｖにおけるプライマー５８８６１およびプライマー５８８６２を用いて、ＵｖｒＤに基づくＨＤＡ反応を行った。反応産物は３％ＧＰＧ  ＬＭＰアガロースゲル上で分析した（図８）。一般に、９７ｂｐＨＤＡ産物の強度は、初期コピー数が減少する関数として減少する（図８）。標的を付加せずに行った反応では、おそらくは試薬の汚染に起因すると考えられるわずかなバンドが図８に見られた。ＲＮＡインテイン試薬に、１０分子のスケールの標的ＤＮＡ汚染物を含まないようにすることは非常に困難である。しかしながら、強度は初期標的が１０コピーの場合であってもバックグラウンドよりは有意に高く、ＨＤＡが１コピーの標的配列を増幅できることが示唆された。１０コピーの初期標的を用いた場合、約１０ｎｇの産物がＨＤＡにより生成されたが、これは１０10分子の９７ｂｐ断片に相当する。したがって、本願に開示のＨＤＡ法は１０億倍を超える増幅を行うことができる。
【０１２８】
（実施例ＩＸ）
熱変性を行わないＨＤＡによる細菌ゲノムＤＮＡからの標的配列の増幅
等温的標的増幅方法の大半は、配列特異的プライマーが標的配列にアニールできるようにするために熱変性工程から始める。熱変性工程を回避することにより、増幅手順が簡単になる。したがって、ＵｖｒＤに基づくＨＤＡ反応は、最初の熱変性/アニーリング工程を行わずに３７℃で行った。ＨＤＡ反応成分Ａは、以下の試薬を１つのチューブ内に組み合わせることにより構成した。
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファＡ
２μＬのＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）
２μＬの１０μＭプライマー５８８６１（５’ＣＣＡＡＡＴＧＡＴＧＣＴＴＡＴＧＴＴＧＣＴＴ３’（配列番号：１１））
２μＬの１０μＭプライマー５８８６２（５’ＣＡＴＡＡＧＣＣＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＣＴ３’（配列番号：１２））
２μＬ  各ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファＢ
３μＬ  １００ｍＭ  ＡＴＰ
０．９μＬ  ｅｘｏ-Ｋｌｅｎｏｗ断片（５ユニット／μＬ）
０．５μＬ  ＵｖｒＤヘリカーゼ（２００ｎｇ／μＬ）
０．５μＬ  ＭｕｔＬ（８００ｎｇ／μＬ）
０．９μＬ  Ｔ４  Ｇｐ３２（５μｇ／μＬ）
２６．２μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１２９】
次に、５０μＬの反応系を３７℃で２時間インキュベートした。１２．５μＬの停止バッファを加えることにより反応を停止した。増幅産物は、３％ＧＰＧ  ＬＭＰアガロースゲル上で分析した（図９）。増幅産物の大きさは、予想された標的ＤＮＡの大きさ（９７ｂｐ）と一致していた。
【０１３０】
（実施例Ｘ）
複製ヘリカーゼ（Ｔ７遺伝子４ヘリカーゼ）を用いたＨＤＡによる長い標的配列の増幅方法
Ｔ７  Ｇｐ４Ｂなどの６量体複製ヘリカーゼを、さらに長い標的配列の増幅に用いることができるかを調べるために、また、異なるＨＤＡ系をＨＤＡ反応を行うために使用できるかどうかを調べるために、Ｔ７  Ｇｐ４Ｂヘリカーゼ調製物をＴ７  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ，（オハイオ州クリーブランド））とともに用いて、２．３ｋｂの標的配列を増幅した。この標的配列は、プラスミドｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中にクローニングされた大腸菌Ｒｅｐ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｕ０００９６）であり、得られた組み換えプラスミドはＰＣＲ−Ｒｅｐと呼ぶ。挿入部位の両脇に位置するプライマー１２２４とプライマー１２３３を用いて、２．３ｋｂの標的を増幅した。後述のように、２つの反応成分ＡおよびＢを用い、これらを順に混合することにより、５０μＬのＨＤＡ反応系を構成した。２種類の酢酸をベースとする反応バッファをあらかじめ作成した。１０×ＨＤＡバッファＡは、３５０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．５）および１００ｍＭ  ＤＴＴを含み、１０×ＨＤＡバッファＢは、１０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．５）、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、および１００ｍＭ酢酸マグネシウムを含む。３本の平行チューブを、各チューブ内に以下の成分を混合することにより、それぞれ２０μＬの反応成分Ａを含むように構成した。
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファＡ
１μＬのプラスミドｐＣＲ−Ｒｅｐ（５０ｎｇ／μＬ）
１μＬの１０μＭプライマー１２２４
１μＬの１０μＭプライマー１２３３
３μＬ  各ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
９μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１３１】
３本の平行チューブを、各チューブ内に以下の成分を混合することにより、それぞれ３０μＬの反応成分Ｂを含むように構成した。
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファＢ
９．３μＬ  ヘリカーゼ調製物（＊）
１μＬ  Ｔ７  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（１Ｕ／μＬ、ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）
１４．７μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１３２】
＊３種の異なるヘリカーゼ調製物をＨＤＡ反応において用いた。最初のものは、４．５μＬのＴ７  Ｇｐ４Ｂヘリカーゼ（７０ｎｇ／μＬ）と、１．３μＬのＴ７  Ｇｐ２．５ＳＳＢ（５μｇ／μｌ）と、１．５μＬの１００ｍＭ  ｄＴＴＰと、２μＬのＨ2Ｏ（図１０、レーン１）とを含むＴ７ヘリカーゼ調製物とした。第２のヘリカーゼ調製物は、複数の２つのヘリカーゼを含むものとし、４．５μＬのＴ７  Ｇｐ４Ｂヘリカーゼ（７０ｎｇ／μＬ）と、０．５μＬの大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ（２００ｎｇ／μＬ）と、０．５μＬのＭｕｔＬ（８００ｎｇ／μＬ）と、１．３μＬのＴ７  Ｇｐ２．５ＳＳＢ（５μｇ／μＬ）と、１．５μＬの１００ｍＭ  ｄＴＴＰと、１μＬの１００ｍＭ  ＡＴＰ（図１０、レーン２）とを含むものとした。第３のものは、１．３μＬのＴ７  Ｇｐ２．５ＳＳＢ（５μｇ／μＬ）と、１．５μＬの１００ｍＭ  ｄＴＴＰと、６．５μＬのＨ2Ｏとを含む負のコントロールとした（図１０、レーン３）。
【０１３３】
ＨＤＡ反応は、それぞれ等量の２０μＬの成分Ａを含む３本のチューブを、９５℃で２分間加熱して鋳型を変性させ、３７℃で１分間加熱プライマーをハイブリダイズさせることによって開始した。それぞれ異なるヘリカーゼ調製物を含む３つの作りたての成分Ｂ混合物を、各成分Ａ混合物に加えた。３７℃において反応をさらに２時間続け、１２．５μＬの停止バッファ（１％ＳＤＳ、０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ、３０％グリセロール、０．２％ブロモフェノールブルー）を加えることにより停止した。増幅産物は、ＴＢＥバッファおよび臭化エチジウム中において１％アガロースゲル上で可視化した（図１０）。Ｔ７  Ｇｐ４Ｂヘリカーゼ調製物の存在下では、２．３ｋｂ付近の増幅産物が観察されたが、これは、予想された標的大きさに一致していた（図１０、レーン１）。Ｔ７  Ｇｐ４Ｂヘリカーゼと大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼとからなるヘリカーゼ調製物においては、類似の２．３ｋｂ産物が観察された（図１０、レーン２）。さらに、ヘリカーゼ調製物中にヘリカーゼを全く含まない負のコントロールにおいては増幅産物は観察されなかった（図１０、レーン３）。その後、レーン１およびレーン２からの増幅産物の配列決定を行い、配列決定結果からは、産物がＲｅｐ遺伝子に由来するものであることが確認された。
【０１３４】
（実施例ＸＩ）
ＲｅｃＢＣＤを用いたＨＤＡによるＤＮＡ断片の増幅方法
ヌクレアーゼ欠失変異体ＲｅｃＢD1067AＣＤ（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：５０７〜５１３（２０００））を、ＨＤＡ反応において使用し、４００ｂｐＤＮＡ断片を増幅した。この平滑末端を持つ二本鎖ＤＮＡ鋳型は、プライマー１２２４とプライマー１２３３の間に４００ｂｐのインサートを含むｐＵＣ１９誘導体を用いたＰＣＲ反応によって作成した（Ｎｅｗ  Ｅｎｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｉａｂｓ、Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））。ＲｅｃＢD1067AＣＤタンパク質のクローニングと精製については以前に記載されている（Ｗａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：５０７〜５１３（２０００））。１本のチューブ中で以下の試料を組み合わせることにより、５０μＬの反応液を構成した。
【０１３５】
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファ（３６０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．５）、２５０ｍＭのＫＯＡＣ、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、および５０ｍＭ酢酸マグネシウム）
１μＬの４００ｂｐ鋳型（２ｎｇ／μＬ）
１．５μＬの１０μＭプライマー１２２４
１．５μＬの１０μＭプライマー１２３３
２μＬ  各ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
２μＬ  １００ｍＭ  ＡＴＰ
１μＬ  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０（１．３ユニット／μＬ）
０．５μＬ  ＲｅｃＢD1067AＣＤヘリカーゼ（１３０ｎｇ／μＬ）
１．３μＬ  Ｔ４  Ｇｐ３２（３．８μｇ／μＬ）
２６．２μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１３６】
５０μＬの反応液を３７℃で１時間インキュベートした。１２．５μＬの停止バッファを加えることにより反応を停止した。増幅産物は、１％アガロースゲル上で分析した（図１１、レーン２）。増幅産物の大きさは、予想された標的ＤＮＡの大きさ（４００ｂｐ）と一致していた。ＲｅｃＢD1067AＣＤヘリカーゼなしのコントロールの反応では生成物は得られなかった（図１１、レーン３）。
【０１３７】
（実施例ＸＩＩ）
特定配列の熱安定性ヘリカーゼ依存性増幅方法
熱安定性ヘリカーゼと熱安定性ポリメラーゼを用いて高温でＨＤＡを行うことにより、プライマー結合の特異性が高まり、増幅の特異性が向上するかもしれない。本実施例においては、口腔病原体であるＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ  ＡＴＣＣＮｏ．３５４０５の細菌性ゲノムから、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤに基づく熱安定性ヘリカーゼ依存性増幅またはｔ−ＨＤＡ系を用いて、特定の標的配列を増幅し検出する方法を開示する。
【０１３８】
１．熱安定性ヘリカーゼの入手
熱安定性ＵｖｒＤ様ヘリカーゼであるＴｔｅ−ＵｖｒＤは、完全に配列が決定されている熱安定細菌Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ（Ｂａｏら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２：６８９〜７００（２０００））からクローニングおよび精製した。Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼをコードするＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＵｖｒＤ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓゲノムの６０５，５２７と６０７，６６８の間に位置し、配列はＧｅｎＢａｎｋ（アクセス番号：ＮＣ  ００３８６９；Ｂａｏら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１２：６８９〜７００（２０００））において参照することができる。ＰＣＲにより、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）＋プライマーＴＵＦ（５’−ＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＴＴＧＧＡＧＴＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＡＡ−３’（配列番号：１８））およびプライマーＴＵＲ（５’−ＡＡＡＴＡＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＡＡＡＴＴＧＣＣＴＴＡＡＴＡＧＧＡＧ−３’（配列番号：１９））を用いて、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤ遺伝子を増幅した。プライマーには、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤ遺伝子を、ｐＴＹＢ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｉａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））のＮｄｅＩおよびＳａｐＩ部位にクローニングできるようにする制限酵素部位を含めた。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩおよびＳａｐＩで消化し、消化したｐＴＹＢＩにライゲーションした。ライゲーション産物をＥＲ２５０２細胞に形質転換した。陽性の形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ平板上での選択培養によりスクリーニングし、インサートのコロニーＰＣＲと配列決定を行った。配列決定結果の解析後、妥当な構築物を大腸菌ＥＲ２５６６細胞中に形質転換した。ｐＴＹＢ１−Ｔｔｅ−ＵｖｒＤを含むＥＲ２５６６細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを加えたＬＢ培地中、３７℃で培養した。ＯＤ550が〜０．６５に達したところで、０．４ｍＭ  ＩＰＴＧによってタンパク質発現を誘導した。１５℃で一晩インキュベートした後、細胞を遠心分離により回収した。
【０１３９】
インテインタグのキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）により、キチンビーズカラム上での融合タンパク質のアフィニティ精製が可能になる（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  ｌｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））。Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼは最初にキチンカラムおよび実施例Ｉに詳細に記載したプロトコールを用いて精製した（ＵｖｒＤおよびＭｕｔＬ精製）。次に、Ｔｔｅ−ＵｖｒＤは、１ｍＬヘパリンＴＳＫカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャージー州ピスカタウェイ））によってさらに精製した。Ｔｔｅ−ＵｖｒＤを含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。精製画分をプールし、保存バッファ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０％グリセロール）に対して一晩透析した。最終濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８〜２５４（１９７６））およびＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて決定した。
【０１４０】
２．熱安定性ヘリカーゼ依存性増幅（ｔ−ＨＤＡ）
精製した熱安定性Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼを、熱安定性ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））とともに用いて、ゲノムＤＮＡから高温で選択的に標的配列を増幅した。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子ｅａｒＩＲを標的遺伝子として選択した（図１６（配列番号：１０））。標的断片の末端ごとに１種類ずつ、高温にて標的配列にハイブリダイズできるように高い融点（〜７５℃）を有する２種類のプライマーを設計した。反応バッファとプロトコールは、ゲノムＤＮＡ増幅用に改変した。反応バッファは以下のとおりである。１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反応バッファ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））：２００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１００ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭ  ＭｇＳＯ4、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００。
【０１４１】
以下のものを組み合わせることにより、３５μＬの成分Ａを作成した。
３．５μＬ  １０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファ
２μＬの０．８３ｐＭ  Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａゲノムＤＮＡ
１μＬの１０μＭプライマーｐ５−７６（５’ＧＧＣＣＡＧＴＴＴＧＡＡＴＡＡＧＡＣＡＡＴＧＡＡＴＴＡＴＴ−３’（配列番号：２０））
１μＬの１０μＭプライマーｐ３−７６（５’−ＡＴＴＴＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＧ−３’（配列番号：２１））
２μＬ  各ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）
１．５μＬ  ｄＡＴＰ（１００ｍＭ）
２４μＬのｄＨ2Ｏ
【０１４２】
以下のものを混合することにより、１５μＬの反応成分Ｂを調製した。
１．５μＬ  １０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファ
２．６μＬ  ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ラージフラグメント（８ユニット／μＬ）
１μＬ  ＵｖｒＤ−ｔｔｅヘリカーゼ（１００  ｎｇ／μＬ）
０．９μＬ  Ｔ４  Ｇｐ３２（５μｇ／μＬ）
９μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１４３】
ＨＤＡ反応は、成分Ａを９５℃で２分間加熱して鋳型を変性させることにより開始した。次に成分Ａを６０℃まで冷却し、６０℃で３分間維持してプライマーをアニールさせた。１５μＬの作りたての成分Ｂを、変性とアニーリング工程を終えた後の３５μＬの成分Ａに加えた。反応を６０℃でさらに１時間行い、１２．５μＬの停止バッファ（１％ＳＤＳ、０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ、３０％グリセロール、０．２％ブロモフェノールブルー）を添加することにより停止した。増幅産物は、ＴＢＥバッファおよび臭化エチジウム中、２％ＧＰＧ  ＬＭＰアガロースゲル上で可視化した。増幅されたＤＮＡの大きさは、予想される標的大きさ８２ｂｐに一致する（図１２）。
【０１４４】
（実施例ＸＩＩＩＩ）
ｔ−ＨＤＡによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからの特定配列の増幅および検出方法
本実施例においては、異なる細菌ゲノムＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅからの特定の標的配列の増幅および検出方法を開示する。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅは、最も一般的な性感染症の一つである淋病の原因となるヒトの病原体である。Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅゲノムＤＮＡは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．７００８２５、（バージニア州マナサス））より購入した。標的配列（ＣＡＴＡＴＧＴＡＡＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＣＣＡＴＡＴＣＣＡＡＴＡＴＴＣＣＡＣＡＡＡＡＴＧＣＣＡＧＴＡＡＴＡＡＴＧＡＡＴＴＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＧＡＴＡＡＡＡＣＡＣＧＣＣＧＴＡＴＧＴＴＧ（配列番号：２２））の各末端に対して１つずつの２種類のプライマーを、〜７８℃の融点を有するように合成した。反応バッファおよびプロトコールは、ゲノムＤＮＡ増幅用に改変した。反応バッファは、１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反応バッファ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．（マサチューセッツ州ベバリー））である。
【０１４５】
以下のものを組み合わせることにより、３５μＬの成分Ａを作成した。
３．５μＬ  １０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファ
２μＬ  Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）
１μＬの１０μＭプライマーＨ１５３（５’−ＣＡＴＡＴＧＴＡＡＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＣＣＡＴＡＴ−３’（配列番号：２３）
１μＬの１０μＭプライマーＨ１５４（５’−ＣＡＡＣＡＴＡＣＧＧＣＧＴＧＴＴＴＴＡＴＣＧＣＴＧＡＴ−３’（配列番号：２４）
２μＬ  各ｄＮＴＰｓ（１０ｍＭ）
１．５μＬ  ｄＡＴＰ（１００ｍＭ）
２４μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１４６】
以下のものを混合することにより、１５μＬの反応成分Ｂを調製した。
１．５μＬ  １０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファ
２．６μＬ  ＢｓｔＤＮＡ  ポリメラーゼ、ラージフラグメント（８ユニット／μＬ）
１μＬ  ＵｖｒＤ−ｔｔｅヘリカーゼ（１００ｎｇ／μＬ）
０．９μＬ  Ｔ４  Ｇｐ３２（５μｇ／μＬ）
９μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１４７】
ＨＤＡ反応は、成分Ａを９５℃で２分間加熱して鋳型を変性させることによって開始した。次に成分Ａを６０℃に冷却し、６０℃において３分間維持してプライマーをアニールさせた。１５μＬの作りたての成分Ｂを、変性とアニーリング工程を行った後の３５μＬの成分Ａに加えた。反応は６０℃でさらに１時間続け、１２．５μＬの停止バッファ（１％ＳＤＳ、０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ、３０％グリセロール、０．２％ブロモフェノールブルー）を添加することにより停止させた。増幅産物は、ＴＢＥバッファおよび臭化エチジウム中、２％ＧＰＧ  ＬＭＰアガロースゲル上で可視化した。Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ、Ｇｐ３２  ＳＳＢ、およびＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼのラージフラグメントの存在下において、ゲル上の９５ｂｐ付近に優勢なバンドが観察され、これは予想される標的大きさに一致していた（図１３、レーン１）。Ｇｐ３２  ＳＳＢを平行反応において除去したところ、９５ｂｐの産物が観察され（図１３、レーン２）、このＨＤＡ系に対しては一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が必要でないことが示唆された。Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼを反応系に含まない場合、増幅は全く観察されず（図１３、レーン３）、このことから本反応がヘリカーゼ依存性増幅であることがさらに確証された。本実施例は、ＨＤＡが、ＤＮＡヘリカーゼ活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の最低限の２つの酵素活性しか必要としないことを実証するものである。
【０１４８】
（実施例ＸＩＶ）
試料中の病原体細菌の標的配列のリアルタイム検出
ＨＤＡは、他の技術と組み合わせて、一塩基変異多型（ＳＮＰ）の決定などのゲノムの類別や、感染性物質の同定などのためにも用いることもできる。例えば、ＨＤＡは、蛍光標識したＬＵＸ（商標）プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールスバッド）や、リアルタイム蛍光検出系（ｉＣｙｃｌｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．カリフォルニア州ヘラクレス）などの他の核酸検出方法と組み合わせて、リアルタイムで標的配列を増幅および検出するために用いることもできる。本実施例では、細菌病原体Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（ＡＴＣＣＮｏ．３５４０５）における、ＨＤＡ法およびＵｖｒＤ  ＨＤＡ系を用いた、標的配列（図１６（配列番号：１０）のリアルタイム増幅および検出を開示する。蛍光標識したプライマー、プライマー１７５−ＬＵＸ（５’ｃａｃａｔｔｔＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＴＧＴＧ３’（配列番号：２５））は、標的配列（図１６（配列番号：１０））に基づいて特注し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより入手した。反応バッファは予め調製しておいた。１０×ＨＤＡバッファＡは３５０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．５）と１００ｍＭ  ＤＴＴを含む。１０×ＨＤＡバッファＢは、１０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．５）と、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡと、１００ｍＭ酢酸マグネシウムとを含む。
【０１４９】
リアルタイムＨＡＤ反応の再現性を調べるために、２つの平行反応を行った（図１４、線１と線２）。各反応は、次のように構成した。
【０１５０】
以下のものを組み合わせることにより、２０μＬの成分Ａを作成した。
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファＡ
１μＬのＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａゲノムＤＮＡ（３０ｎｇ／μＬ）
２μＬの１０μＭプライマー１７５−ＬＵＸ（５’ｃａｃａｔｔｔＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＴＧＴＧ３’（配列番号：２５））
２μＬの１０μＭプライマー１７５−Ｒｅｖ（５’ＧＧＣＣＡＧＴＴＴＧＡＡＴＡＡＧＡＣＡＡＴＧ３’（配列番号：２６））
２μＬの１０ｍＭ各ｄＮＴＰ
８μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１５１】
以下のものを混合することにより、３０μＬの反応成分Ｂを調製した。
５μＬ  １０×ＨＤＡバッファＢ
１．５μＬ  １００ｍＭ  ＡＴＰ
１μＬ  ｅｘｏ-Ｋｌｅｎｏｗ断片（５ユニット／μＬ）
０．５μＬ  ＵｖｒＤヘリカーゼ（２００ｎｇ／μＬ）
０．８μＬ  ＭｕｔＬ（８００ｎｇ／μＬ）
１．２μＬ  Ｔ４  Ｇｐ３２（５μｇ／μＬ）
２０μＬ  ｄＨ2Ｏ
【０１５２】
反応成分Ａを９５℃で２分間、その後３７℃で１分間インキュベートした。作りたての成分Ｂを、３７℃に冷却後の成分Ａに加えた。反応は、ｉＣｙｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中、３７℃で行った。増幅産物は、リアルタイムＰＣＲ機器であるｉＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて５分間隔で蛍光シグナル（ＦＡＭに対して４９０ｎＭ）を測定することにより、リアルタイムで検出した。反応１および２からのシグナルは、４０分後に増加し始め、５０分前後にＴt（閾値の時間）と交差した（図１４、線１と線２）。これらの２つの反応に対するＴt値は約５０分であった。さらに、反応１および反応２から得られた曲線は非常に類似していることから、リアルタイムＨＤＡ反応の再現性は良好であることが示唆された。負のコントロールにおいて、蛍光シグナルはＴt線より下に止まっていた（図１４、線３）。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】ヘリカーゼ置換増幅の模式図であり、（１）一本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリングを示しており、（２）プライマーを伸長中のＤＮＡポリメラーゼであり、１つの二本鎖から２つの二本鎖に増幅されており、（３）プロセスを繰り返して指数的な増幅を行っている様子を示している。
【図２−１】増幅産物を生産するための、プライマーを用いたオリゴヌクレオチドのＨＤＡ（ヘリカーゼ依存性増幅）の模式図。
【図２−２】図２−１によるＨＤＡ反応であり、ＨＤＡ産物を３％ＬＭＰアガロースゲル（レーン１）上で解析し、レーン２はサイズマーカー（Ｍ）として用いたｐＢＲ３２２／ＭｓｐＩラダーを含んでいる。
【図３】標的配列を含む大きなＤＮＡ分子からの、ＨＤＡによる標的配列の選択的増幅の模式図であり、（４）は二本鎖ＤＮＡ分離／プライマーアニーリングであり、（５）はポリメラーゼによるプライマー伸長であり、（６）はヘリカーゼによる巻き戻しとそれに続くプライマーアニーリングであり、（７）はＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長であり、および（８）は巻き戻し、アニーリングおよび伸長を示す。
【図４】ＤＮＡプラスミドからの様々な大きさの標的配列の増幅。ＨＤＡ反応は、大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ、大腸菌ＭｕｔＬ、Ｔ４  Ｇｐ３２およびＡＴＰを含むＵｖｒＤヘリカーゼ調製物に加えて、ポリメラーゼ、２種のプライマー（１２２４および１２３３）、およびプラスミドｐＡＨ１に組み込んだ異なる長さの標的ＤＮＡを用いて行った。増幅産物は、３％ＬＭＰアガロースゲル上でのゲル電気泳動によって分析した。レーン１：１１０ｂｐ；レーン２：２００ｂｐ；レーン３：３００ｂｐ；レーン  ４：４００ｂｐ；レーン５：６５０ｂｐの長さの標的ＤＮＡ。Ｍ：１００ｂｐＤＮＡラダーサイズマーカー。
【図５−１】２つの異なるポリメラーゼを用いた細菌ゲノムＤＮＡからの標的配列の増幅。
【図５−２】２つの異なるポリメラーゼを用いた細菌ゲノムＤＮＡからの標的配列の増幅。標的の核酸は、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａゲノムＤＮＡから、大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ、大腸菌ＭｕｔＬ、Ｔ４  Ｇｐ３２およびＡＴＰを含むＵｖｒＤヘリカーゼ調製物に加えて、２つの異なるポリメラーゼを用いて増幅した。増幅産物は、３％ＬＭＰアガロースゲル上でのゲル電気泳動によって分析した。図５−１は、ＤＮＡポリメラーゼＩのｅｘｏ-Ｋｌｅｎｏｗ断片を用いたＨＤＡであり、レーン１：プライマー５８８６１およびプライマー５８８６２を用いたＨＤＡの産物。レーン２：プライマー５８８６１およびプライマー５８８６３を用いたＨＤＡの産物。図５−２は、Ｔ７  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅとプライマー５８８６１および５８８６３を用いたＨＤＡ。レーン１：１．５ユニットのＴ７  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ；レーン２：３．５ユニットのＴ７  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ；および、レーンＭはサイズマーカとして使用した１００ｂｐ  ＤＮＡのラダーを示す。
【図６】ヒトゲノムＤＮＡからの標的配列の増幅。ＨＤＡ反応は、大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＭｕｔＬ、Ｔ４  Ｇｐ３２、およびＡＴＰを含むＵｖｒＤヘリカーゼ調製物に加えて、ポリメラーゼ、２種のプライマー、およびヒトゲノムＤＮＡを用いて行った。ＨＤＡ産物は、３％ＬＭＰアガロースゲル上でのゲル電気泳動によって分析した。Ｍ：サイズマーカとして使用した１００ｂｐ  ＤＮＡのラダー。初期量１００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡから得られたＨＤＡ産物（レーン１）、初期量１５０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡから得られたＨＤＡ産物（レーン２）、初期量２００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡから得られたＨＤＡ産物（レーン３）。
【図７】ｃＤＮＡ合成と組み合わせた標的配列の増幅（ＲＴ増幅）。ＨＤＡ反応をｃＤＮＡ合成と組み合わせた。第１の鎖ｃＤＮＡ（ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド）を、大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＭｕｔＬ、Ｔ４  Ｇｐ３２、およびＡＴＰを含むヘリカーゼ調製物に加えて、ＤＮＡポリメラーゼ、およびラットＧＡＰＤＨ遺伝子に特異的な２種のプライマーを用いたＨＤＡによってさらに増幅した。増幅産物である、２μＬの第１のｃＤＮＡ鎖（レーン１）、４μＬの第１のｃＤＮＡ鎖（レーン２）を、３％ＬＭＰアガロースゲル上でのゲル電気泳動によって解析した。Ｍ：φＸ１７４  ＤＮＡ−ＨａｅＩＩＩ  ＤＮＡラダー。
【図８】細菌ゲノムＤＮＡからの様々なコピー数の標的配列の増幅の感度。ＨＤＡ反応は、大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＭｕｔＬ、Ｔ４  Ｇｐ３２、およびＡＴＰを含むヘリカーゼ調製物に加えて、ＤＮＡポリメラーゼ、２種のプライマー（プライマー５８８６１およびプライマー５８８６２）、および様々な量のＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｔａゲノムＤＮＡを用いて行った。増幅産物は、３％ＬＭＰアガロースゲル上でのゲル電気泳動により解析した。各ＨＤＡ反応中に最初に存在していた単一のＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ染色体のコピー数を、１０7、１０6、１０5、１０4、１０3、１０2、１０および０というように大きい方から順に各レーンの上に示している。
【図９】事前変性を行わない細菌ゲノムＤＮＡからの標的配列の増幅。  ＨＤＡ反応は、大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＭｕｔＬ、Ｔ４  Ｇｐ３２、およびＡＴＰを含むヘリカーゼ調製物に加えて、ＤＮＡポリメラーゼ、２種のプライマー（プライマー５８８６１およびプライマー５８８６２）、およびＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｔａゲノムＤＮＡを用いて行った。ＨＤＡ産物は、３％ＬＭＰアガロースゲル上でのゲル電気泳動により解析した。Ｍ：サイズマーカとして用いたφＸ１７４  ＤＮＡ−ＨａｅＩＩＩ  ＤＮＡのラダー。
【図１０】１つのヘリカーゼ（Ｔ７  Ｇｐ４Ｂヘリカーゼ）または２つのヘリカーゼ（ＵｖｒＤヘリカーゼおよびＴ７  Ｇｐ４Ｂヘリカーゼ）を用いた２．３Ｋｂ標的ＤＮＡの増幅。ＨＤＡ反応は、２種のプライマー（１２２４および１２３３）と、プラスミドｐＣＲ−Ｒｅｐとを用いて、Ｔ７  Ｇｐ４ＢヘリカーゼおよびＴ７  Ｇｐ２．５  ＳＳＢを含むＴ７  Ｇｐ４Ｂヘリカーゼ調製物の存在下（レーン１）；Ｔ７  Ｇｐ４ＢヘリカーゼおよびＵｖｒＤヘリカーゼの両方を含むヘリカーゼ調製物の存在下（レーン２）；負のコントロールとしてヘリカーゼの非存在下（レーン３）で行った。Ｍ：サイズマーカとして用いた２−ｌｏｇＤＮＡラダーである。ＨＤＡの産物は、１％ゲル電気泳動によって示されている。
【図１１】ＲｅｃＢＣＤヘリカーゼを用いた４００ｂｐ標的ＤＮＡの増幅。  ＨＤＡ反応は、ＲｅｃＢD1067AＣＤヘリカーゼ、Ｔ４  Ｇｐ３２およびＡＴＰを含むＲｅｃＢＣＤヘリカーゼ調製物に加えて、ポリメラーゼ（Ｔ７  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）、２種のプライマー（１２２４および１２３３）、および標的ＤＮＡを用いて行った。ＨＤＡ産物の１％アガロースゲル上でのゲル電気泳動を示したが、レーン２はＲｅｃＢD1067AＣＤヘリカーゼとＴ７  Ｓｅｑｕｅｎａｓｅの両方を含むヘリカーゼ調製物からの増幅産物を示し、レーン３は、ヘリカーゼを使わない負のコントロールである。マーカー：サイズマーカとして用いた２−ｌｏｇＤＮＡのラダー（ＮＥＢ）。
【図１２】熱安定性ＨＤＡによる細菌ゲノムＤＮＡからの標的配列の増幅。ＨＤＡ反応は、熱安定性Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ、Ｔ４  Ｇｐ３２、およびｄＡＴＰを含むヘリカーゼ調製物に加えて、熱安定性ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、２種のプライマー、およびＴ．ｄｅｎｔｉｃｏｔａゲノムＤＮＡを用いて行った。増幅産物は、２％ＬＭＰアガロースゲル上でのゲル電気泳動によって解析した。Ｍ：サイズマーカとして用いた１００ｂｐＤＮＡのラダー（ＮＥＢ）。レーン１：８２ｂｐ産物。
【図１３】いくつかまたは全てのアクセサリタンパク質の非存在下での、熱安定性ヘリカーゼによる、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのゲノムＤＮＡからの標的配列の増幅。ＨＤＡ反応は、様々なヘリカーゼ調製物に加えて、熱安定性ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、２種のプライマー、およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅゲノムＤＮＡを用いて行った。１つ目のヘリカーゼ調製物は、熱安定性Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼ、Ｔ４  Ｇｐ３２、およびｄＡＴＰ（レーン１）を含むものとする。２つめのヘリカーゼ調製物は、熱安定性Ｔｔｅ−ＵｖｒＤヘリカーゼとｄＡＴＰ（レーン２）を含むものとする。コントロール反応においては、Ｔ４  Ｇｐ３２およびＡＴＰを調製物中に共存させる（レーン３）。Ｍ：サイズマーカとして使用した１００ｂｐ  ＤＮＡのラダー（ＮＥＢ）。
【図１４】口腔病原体、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａのＨＤＡ法によるリアルタイム検出。  ＨＤＡ反応は、大腸菌ＵｖｒＤヘリカーゼ、ＭｕｔＬ，Ｔ４  Ｇｐ３２、およびＡＴＰを含むＵｖｒＤヘリカーゼ調製物に加えて、ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａゲノムＤＮＡ、蛍光標識ＬＵＸプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびリバースプライマーを用いて行った。増幅産物は、リアルタイムＰＣＲ機器ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢＩｏ−Ｒａｄ）を用いてＦＡＭ蛍光シグナルを測定することによってリアルタイムで検出した。１および２：ゲノムＤＮＡ、プライマー、およびＵｖｒＤ  ＨＤＡ系の存在下でＨＤＡを行った２つの同一の反応。３：ゲノムＤＮＡを存在させないこと以外は１および２と同様に行ったＨＤＡ（負のコントロール）。
【図１５−１】プラスミドｐＡＨＩの配列（配列番号：９）。
【図１５−２】プラスミドｐＡＨＩの配列（配列番号：９）。
【図１５−３】プラスミドｐＡＨＩの配列（配列番号：９）。
【図１６】ｅａｒＲＩ遺伝子Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａの配列（配列番号：１０）。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【配列表】
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