(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
NOまたはNO供与体の制御放出のための、生体適合性で重合可能なマクロマー組成物であって、少なくとも１つのＮＯ保持領域またはＮＯ供与体を含み、
ＮＯまたはＮＯ供与体が、組織上での重合後に、生理条件下で前記マクロマー組成物から放出され、
前記マクロマー組成物が、水溶性領域、組織接着領域、および重合可能末端基領域からなる群から選択される領域と、タンパク質、炭水化物、核酸、有機分子、無機分子、生理活性分子、細胞、組織、および組織凝集体からなる群から選択される少なくとも１つの治療薬または診断薬とを含み、
前記マクロマー組成物が、アクリロイル-PEG-Cys-NOマクロマー、アクリロイル-PEG-Lys5-NOマクロマー、アクリロイル-PEG-DETA-NOマクロマー、PVA-NH2-NOマクロマー、PVA-Cys-NOマクロマー、およびPVA-NO-bFGFマクロマーからなる群より選択されるマクロマーを含む、
マクロマー組成物。
【請求項２】
マクロマー組成物が、重合後にＮＯを放出しないマクロマーをさらに含む、請求項１に記載のマクロマー組成物。
【請求項３】
マクロマーが架橋可能な側基をさらに含む、請求項１に記載のマクロマー組成物。
【請求項４】
マクロマー組成物が少なくとも１つの分解性領域を含む、請求項１に記載のマクロマー組成物。
【請求項５】
マクロマー組成物が水溶性である、請求項１に記載のマクロマー組成物。
【請求項６】
マクロマー組成物が組織に接着する、請求項１に記載のマクロマー組成物。
【請求項７】
マクロマー組成物が、分解性領域に結合する水溶性領域、水溶性領域に結合する少なくとも１つの重合可能領域、および分解性領域に結合する少なくとも１つの重合可能領域を含む、請求項１に記載のマクロマー組成物。
【請求項８】
分解性領域が中央核であり、少なくとも２つの水溶性領域が前記核に結合し、少なくとも１つの重合可能領域が各水溶性領域に結合している、請求項１に記載のマクロマー組成物。
【請求項９】
マクロマー組成物が、中央核を形成する水溶性領域、前記核に結合する少なくとも２つの分解性領域、および前記分解性領域に結合する少なくとも２つの重合可能領域を含む、請求項１に記載のマクロマー組成物。
【請求項１０】
マクロマー組成物が、少なくとも１つの水溶性領域、少なくとも１つのＮＯ保持領域、および少なくとも１つのフリーラジカル重合可能領域を含む、請求項１に記載のマクロマー組成物。
【請求項１１】
少なくとも１つの分解性領域をさらに含む、請求項１０に記載のマクロマー組成物。
【請求項１２】
生理条件下でＮＯを生成するＮＯ供与体を含むか、または放出可能に結合している、請求項１に記載のマクロマー組成物。
【請求項１３】
生理条件下でＮＯを放出する、請求項１に記載のマクロマー組成物。
【請求項１４】
NOまたはNO供与体の制御放出のための、生体適合性で重合可能なマクロマー組成物の製造におけるマクロマーの使用であって、
前記マクロマー組成物が、少なくとも１つのＮＯ保持領域またはNO供与体を含み、ＮＯまたはNO供与体が、組織上での重合後に、生理条件下で前記マクロマー組成物から放出され、
前記マクロマー組成物が、水溶性領域、組織接着領域、および重合可能末端基領域からなる群から選択される領域と、タンパク質、炭水化物、核酸、有機分子、無機分子、生理活性分子、細胞、組織、および組織凝集体からなる群から選択される少なくとも１つの治療薬または診断薬を含み、
前記マクロマー組成物が、アクリロイル-PEG-Cys-NOマクロマー、アクリロイル-PEG-Lys5-NOマクロマー、アクリロイル-PEG-DETA-NOマクロマー、PVA-NH2-NOマクロマー、PVA-Cys-NOマクロマー、およびPVA-NO-bFGFマクロマーからなる群より選択されるマクロマーを含む、
使用。
【請求項１５】
マクロマー組成物溶液が重合される部位に、重合開始剤が最初に適用される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
重合開始剤が組織に結合し、そしてマクロマー組成物溶液を適用する前に未結合重合開始剤が除去される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
障害または症状をNOによって治療するための薬剤の製造における、少なくとも１つのＮＯ保持領域またはNO供与体を含む生体適合性で重合可能なマクロマー組成物の使用であって、
ＮＯまたはNO供与体が、組織上での重合後に、生理条件下でマクロマー組成物から放出され、
マクロマー組成物が、水溶性領域、組織接着領域、および重合可能末端基領域からなる群から選択される領域を含み、
前記マクロマー組成物が、アクリロイル-PEG-Cys-NOマクロマー、アクリロイル-PEG-Lys5-NOマクロマー、アクリロイル-PEG-DETA-NOマクロマー、PVA-NH2-NOマクロマー、PVA-Cys-NOマクロマー、およびPVA-NO-bFGFマクロマーからなる群より選択されるマクロマーを含む、
使用。
【請求項１８】
マクロマー組成物が分解性領域をさらに含む、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
障害または症状が、創傷治療、再狭窄、血栓、喘息、関節炎、および勃起障害よりなる群より選択される、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
マクロマー組成物が組織に接着することにより、外科的癒着を防止するか、組織を接着させるか、組織に支持を与えるか、または組織をコートする、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
生理学的量のＮＯを長期に渡って放出または生成する生体適合性ポリマー物質は、再狭窄、血栓症、喘息、創傷治癒、関節炎、勃起障害等の障害、またはＮＯが重要な役割を果たす他の状態等の治療を必要とする患者の体外または体内部位に適用される。ポリマー物質は、フィルム、コーティングまたは微粒子として形成されることもできる。ポリマーは一般にマクロマーから形成され、マクロマーは生分解性領域を含み、その領域に原位置で放出される基が結合されており、治療が必要な部位におけるＮＯ濃度を上昇、あるいはそうでなければ調整する。マクロマーはホモまたはヘテロ分散液または溶液を形成可能であり、これが重合されてポリマー物質が形成される。後者の場合は半相互貫通網目構造または相互貫通網目構造となることがある。放出される化合物は、物理的に捕捉されるか、マクロマーに共有結合またはイオン結合されるか、実際にポリマー物質の一部を形成する。ヒドロゲルは、イオン架橋および／または共有架橋によって形成できる。治療薬、予防薬または診断薬を含む他の活性剤も、ポリマー物質に含有させることが可能である。
【０００２】
Ｉ．ＮＯ放出のためのポリマー物質
ポリマー物質は生体適合性であり、ＮＯを放出または生成する。様々な好ましい実施形態において、ポリマーはまた生体適合性であり、ヒドロゲルを生成し、原位置で重合し、組織接着性である。これらの特性は、マクロマー成分の選択はもちろんのこと、各種グループの成分への添加によっても付与される。
【０００３】
「重合可能な」という用語は、アクリル酸塩−型分子の、例えば炭素−炭素二重結合のマクロマー連結を生じる追加の共有結合を生成する領域を意味する。このような重合は特徴として、最終的にフリーラジカルを生成する、ある染料および化学化合物の光子吸着から生じるフリーラジカル形成によって開始される。しかしフリーラジカルは、当業者に知られているの他の方法および試薬を用いても得ることができる。
【０００４】
Ａ．ポリマー物質
ポリマー物質は生体適合性でなければならない、すなわち患者に投与またはインプラント後に、重大なまたは許容できない毒性または免疫反応を誘発してはならない。
【０００５】
天然および合成ポリマーの両者を含め、生体適合性ポリマー物質が多数知られている。例としては、タンパク質（レシピエントと同一の起源の）、硫酸コンドロイチン、およびヒアルロン酸等の多糖類、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、およびアクリル酸塩が挙げられる。ポリマーは分解性でも、非分解性でもよい。
【０００６】
大半のポリマー物質は、様々な成分によって付与される特性の組合わせに基づいて選択する。これらとしては、ＰＥＧまたはＰＶＡ等の水溶性領域、加水分解によって分解する領域等の生分解性領域、マクロマーを原位置で重合するのに使用できる基等があげられる。
【０００７】
（水溶性および／または組織接着領域）
各種の水溶性物質をポリマーに混入することができる。「少なくとも実質的に水溶性」という用語は、溶解度が少なくとも約５ｇ／１００ｍｌの水溶液であることを示す。好ましい実施形態において、核となる水溶性領域は、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（エチレンオキシド）、ポリ（酢酸ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキザゾリン）、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）ブロック共重合体、ポリサッカロース、ヒアルロン酸、デキストラン、硫酸ヘパリン、硫酸コンドロイチン、ヘパリンまたはアルギン酸塩等の多糖類または炭水化物、あるいはゼラチン、コラーゲン、アルブミンまたはオボアルブミン等のタンパク質から構成できる。
【０００８】
親水性（すなわち水溶性）領域は一般に、組織接着性である。大量の露出カルボン酸基を含む疎水性および親水性ポリマーはどちらも、組織接着性または生体接着性である。細胞の炭水化物分子に結合するＲＧＤペプチドおよびレクチン等のリガンドは、ポリマーにも接着可能であり、組織接着性を向上させる。
【０００９】
（分解性領域）
αーヒドロキシ酸（すなわち、乳酸、グリコール酸）のポリエステル（Ｈｏｌｌａｎｄら，１９８６  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，４：１５５−１８０）は、クロージャデバイス（縫合および止め金）からドラッグデリバリーシステム（Ｓｍｉｔｈらへの米国特許第４，７４１，３３７号；Ｓｐｉｌｉｚｅｗｓｋｉら，１９８５  Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．２：１９７−２０３）に渡る応用について、最も広範に使用される生分解性物質である。Ｄｏｍｂら、１９８９  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２２：３２００；Ｈｅｌｌｅｒら、１９９０  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｈａｓｉｎ，Ｍ．およびＬａｎｇｅｒ，Ｒ．編、Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１２１−１６１によって報告されているように、ポリ（ヒドロキシ酸）に加え、不安定な主鎖結合を利用するポリ無水物およびポリオルトエステルを含む他の複数のポリマーも生分解性であることが知られている。Ｍｉｙａｋｅら、１９７４が報告したように、インビボで使用する場合には天然型物質中に分解するポリマーを含むことが望ましいため、ポリアミノ酸も合成されている。
【００１０】
ポリマーの分解に必要な時間は、適切なモノマーを選択して調整することができる。結晶度の違いも分解速度を変化させる。これらのポリマーは比較的疎水性であるため、実際の質量損失は、オリゴマーフラグメントが水に溶けるほど小さい場合にのみ開始する。したがって、最初のポリマー分子量が分解速度に影響を与える。
【００１１】
生分解性領域は、インビボ条件下で加水分解できることが好ましい。加水分解性基は、グリコリド、ラクチド、ε−カプロラクトン、他のαーヒドロキシ酸のポリマーおよびオリゴマー、および非毒性であるか、または体内で正常な代謝産物として存在する他の生分解性ポリマーである。好ましいポリ（αーヒドロキシ酸）は、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸）およびポリ（Ｌ−乳酸）である。他の有用な物質としては、ポリ（アミノ酸）、ポリ（無水物）、ポリ（オルトエステル）、およびポリ（リン酸エステル）である。例えば、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ（δ−バレロラクトン）、およびポリ（γ−ブチロラクトン）等のポリラクトンも有用である。
【００１２】
生分解性領域は、エステル、ペプチド、無水物、オルトエステルおよびリン酸エステル結合等の、酵素による生分解を受ける結合を用いて、ポリマーまたはモノマーから構成されることもできる。例えば、架橋ゼラチン等の生物起源の分解性物質は知られている。ヒアルロン酸は架橋して、分解性膨潤ポリマーとして生医学用途に使用されている（Ｄｅｌｌａ  Ｖａｌｌｅらへの米国特許第４，９８７，７４４号、Ｄｅｌｌａ  Ｖａｌｌｅらへの米国特許第４，９５７，７４４号（１９９１）Ｐｏｌｙｍ．Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｅｎｇ．，６２：７３１−７３５）。
【００１３】
（生分解性ヒドロゲル）
水溶性領域と生分解性領域の両方を含む多くのポリマーについて述べられている。Ｓａｗｈｎｅｙら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２４：１３９７−１４１１は、親水性および分解速度を向上させるためにラクチドおよびε−カプロラクトンをＰＥＧと共重合した。Ｃａｓｅｙらへの米国特許第４，７１６，２０３号（１９８７）は、５−２５質量％の範囲のＰＥＧを含むＰＧＡ−ＰＥＧ−ＰＧＡブロック共重合体を合成した。Ｃａｓｅｙらへの米国特許第４，７１６，２０３号（１９８７）は、再度５−２５質量％の範囲のＰＥＧを含むＰＧＡ−ＰＥＧジブロック共重合体の合成も報告している。Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌらへの米国特許第４，５２６，９３８号（１９８５）は、ＰＥＧを同様の組成物に基づく、分子量５，０００を超える非架橋物質について述べている。しかし、これらの物質は水溶性ではない。Ｃｏｈｎら（１９８８）のＪ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２２：９９３−１００９は、水中で６０％まで膨潤するＰＬＡ−ＰＥＧ共重合体について述べた。これらのポリマーも水溶性ではなく、架橋していない。これらの物質に共通の特徴は、水溶性ポリマーと分解性ポリマーの両方を使用し、水に不溶であり、合計で６０％まで膨潤することである。
【００１４】
１９９５年４月２５日にＨｕｂｂｅｌｌらに発行された米国特許第５，４１０，０１６号は、高い生体適合性と抗血栓性のために、生分解性を付与する短いポリラクチド延長部分および観察可能な熱生成なしで迅速な光重合を可能にするアクリル酸末端を有する、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をベースとする物質について述べている。これらの物質は、ＮＯを放出または生成するヒドロゲルを生成するために容易に修正される。
【００１５】
重合可能部分は、インビボでの均一分解を促進するために、少なくとも１つの分解性領域によって分離されている。これらのポリマーには複数の変形がある。例えば、重合可能領域が分解性領域によって分離されている限り、直接、分解性延長部に結合させたり、水溶性非分解性部分を通じて間接的に結合させることができる。例えば、マクロマー組成物が分解性領域に結合した簡単な水溶性領域を含む場合、ある重合可能領域は水溶性領域に結合し、別の重合可能領域は分解性延長部または領域に結合する。別の実施形態において、水溶性領域はマクロマー組成物の中核を形成し、中核に結合した少なくとも２つの分解性領域を有する。少なくとも２つの重合可能領域が前記分解性領域に結合しているため、重合可能領域は分解時に、特に重合ゲル形の場合に、分離されている。逆にマクロマー組成物の中核が分解性領域によって形成されていると、少なくとも２つの水溶性領域を中核に結合させることが可能であり、重合可能領域を各水溶性領域に結合させることができる。最終的な結果は、ゲル形成およびインビボ分解条件への露出後と同じになる。
【００１６】
別の実施形態において、マクロマー組成物は水溶性主鎖領域およびマクロマー主鎖に結合した分解性領域を有する。少なくとも２つの重合可能領域が分解性領域に結合しているため、分解時にそれらが分離され、結果としてゲル生成物が溶解する。さらなる実施形態において、マクロマー主鎖は、分解性主鎖に結合した分岐またはグラフトとしての水溶性領域を持つ非分解性主鎖で形成されている。２つ以上の重合可能領域が水溶性分岐またはグラフトに結合している。別の変形において、主鎖は星形であり、水溶性領域、生分解性領域または生分解性でもある水溶性領域を含むことがある。この一般的な実施形態において、星形領域は、重合可能領域が結合した水溶性または生分解性分岐またはグラフトのいずれかを含む。再び重合可能領域は分解性領域により、ある点で分離される。
【００１７】
（重合可能基）
重合可能基は、最も好ましくは可視または長波長紫外線照射におけるフリーラジカル生成による光開始によって重合可能である。好ましい重合可能領域はアクリル酸塩、ジアクリル酸塩、オリゴアクリル酸塩、ジメタクリル酸塩、オリゴメタクリル酸塩または他の生物学的に許容可能な光重合基である。好ましい三級アミンはトリエタノールアミンである。
【００１８】
使用可能な光開始剤は、細胞毒性なしで、多くて数分、最も好ましくは数秒という短い時間枠内でのマクロマーのフリーラジカル生成重合による開始に使用できる光開始剤である。ＬＷＵＶ開始の開始剤として選択される好ましい染料は、エチルエオシン、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン、他のアセトフェノン誘導体、およびカンファーキノンである。全ての場合において、架橋および重合は、例えば２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノンまたはエチルエオシン（１０−４−１０−２ミリＭ）およびトリエタノールアミン（０．００１〜０．１Ｍ）の組合わせ等の光活性化フリーラジカル重合開始剤によって共重合体内で開始される。
【００１９】
光開始剤の選択は、光重合可能領域に大きく依存している。例えば、マクロマーが少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む場合、染料による光吸収によって染料が三重項状態をとり、三重項状態は次にアミンと反応して、重合を開始するフリーラジカルを形成する。これらの物質と使用するのに好ましい染料としては、エオシン染料、および２，２−ジメチル−２−フェニルアセトフェノン、２−メトキシ−２−フェニルアセトフェノン等の開始剤、およびカンファーキノンが挙げられる。このような開始剤を使用すると、共重合体は、例えば長波長紫外線または約５１４ｎｍのレーザー光によって原位置で重合される。
【００２０】
重合は、波長約２００〜７００ｎｍの波長の光、最も好ましくは長波長紫外範囲または可視範囲の３２０ｎｍ以上の光、最も好ましくは約５１４ｎｍまたは３６５ｎｍの光による照射によって開始される。
【００２１】
複数の光酸化および光還元染料が、重合開始に使用できる。これらは例えば、アクリブラリン等のアクリジン染料；チオニン等のチアジン染料；ローズベンガル等のキサンチン染料；およびメチレンブルー等のフェナジン染料が含まれる。これらは、例えばトリエタノールアミン等のアミン；ＲＳＯ２Ｒ１等の硫黄化合物；イミダゾール等の複素環；エノラート；有機金属；およびＮ−フェニルグリシン等の他の化合物、等の共触媒とともに使用される。他の開始剤としては、カンファーキノンおよびアセトフェノン誘導体が挙げられる。
【００２２】
熱重合開始剤系も使用できる。３７℃で不安定であり、生理温度でフリーラジカル重合を開始するこのような系としては、例えばテトラメチルエチレンジアミンが存在する、または存在しない過硫酸カリウム；トリエタノールアミンが存在する、または存在しない過酸化ベンゾイル；および重亜硫酸ナトリウムが存在する過硫酸アンモニウムがある。
【００２３】
光開始以外に、他の開始化学作用も使用できる。これらには、例えば重合可能領域として使用するマクロマーを含むイソシアネートまたはイソチオシアネートを用いた水およびアミン開始方式がある。
【００２４】
（好ましい実施形態）
好ましい実施形態において、ポリマー物質は生分解性で、重合可能な、少なくとも実質的に水溶性マクロマー組成物である。第１のマクロマーは少なくとも１つの水溶性領域、少なくとも１つのＮＯ保持領域および少なくとも１つのフリーラジカル重合可能領域を含む。第２のマクロマーは少なくとも１つの水溶性領域および少なくとも２つのフリーラジカル重合可能領域を含む。前記領域はある実施形態において、水溶性かつ生分解性であってもよい。前記マクロマー組成物は、重合可能領域を、例えば光感受性化学物質および染料によって生成したフリーラジカルに曝露することによって重合される。
【００２５】
これらのマクロマーの例は、ＰＶＡまたはＰＥＧ−オリゴグリコリル−アクリル酸塩である。適切なエンドキャップを選択すると、重合とゲル化が迅速になる。アクリル酸塩は、紫外または可視光に短時間曝露することによって、例えばエオシン染料等の複数の開始系を使用して重合できるため好ましい。ポリ（エチレングリコール）またはＰＥＧ中央構造単位（核）は、優れた生体適合性を伴う、その高い親水性および水溶性に基づいて好ましい。ポリグリコール酸等の短いオリゴまたはポリ（αーヒドロキシ酸）は、エステル結合の無害の代謝産物であるグリコール酸内への加水分解によって迅速に分解するため、好ましい鎖延長部として選択される。結晶性の高いポリグリコール酸は水や大半の一般的な有機溶媒に不溶であるが、マクロマー組成物全体は水溶性であり、水性組織液に接触しながら生分解性網目内で迅速にゲル化される。このような網目は、水溶性薬剤および酵素を捕捉および均一に分散させ、それらを制御された速度で送達するのに使用できる。さらに前記網目は、水溶性薬剤の粒子懸濁液を捕捉するのに使用される。他の好ましい鎖延長部は、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、およびポリ無水物である。ポリペプチドも使用できる。このような「ポリマー」ブロックは、ダイマー、トリマーおよびオリゴマーブロックを含むことを理解されたい。
【００２６】
ＰＶＡは多くのペンダントヒドロキシル基を含む。これらのヒドロキシル基は容易に反応して、様々な架橋剤および酸化窒素供与体等の側鎖を形成する。ＰＶＡは水溶性で、優れた生体適合性を有する。ＰＶＡがペンダントヒドロキシル基を持つジアセタール結合によってメタクリル酸塩基に結合するように修飾し、適切な光開始剤を加えると、ＰＶＡは長波長紫外線によって光重合し、ヒドロゲルを生成する。別の好ましい実施形態において、米国特許第５，５０８，３１７号、第５，６６５，８４０号、５，８４９，８４１号、第５，９３２，６７４号、第６，０１１，０７７号、第５，９３９，４８９号および第５，８０７，９２７号に記載されているように、修飾ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）マクロマーからヒドロゲルが生成される。例えば、米国特許第５，５０８，３１７号で開示されたマクロマーは、架橋可能なオレフィン不飽和基を含むアクリルアミド基等のペンダント架橋可能基によって修飾されたＰＶＡプレポリマーである。これらのマクロマーは、例えば光重合または酸化還元フリーラジカル重合によって重合できる。開始ポリマーは特に、ポリビニルアルコールの誘導体、または例えば１，３−ジオール骨組を含むビニルアルコールの共重合体である。架橋可能な基またはさらなる修飾因子は、様々な方法で、例えば１，３−ジオール単位の数パーセントを修飾して、架橋可能なラジカルを含む１，３−ジオキサンにすることによって、あるいは２−位置のさらなる修飾因子によって、開始ポリマーの骨組に結合できる。別の可能性は、開始ポリマーの数パーセントのヒドロキシル基を不飽和有機酸によってエステル化することであり、これらのエステル結合ラジカルは架橋可能な基を含んでいる。これらのマクロマーの疎水性は、一部のペンダントヒドロキシル基をさらに疎水性の高い置換基と置換することによって向上させることができる。疎水性等のマクロマーの特性は、マクロマー主鎖にコモノマーを組込むことによって修飾できる。他の手段によって架橋可能なペンダント基を持つマクロマーも形成できる。
【００２７】
Ｂ．ＮＯ基または調整化合物
Ｓ−ニトロソチオール、有機硝酸塩および求核原子を持つＮＯ錯体を含め、生理条件下でＮＯを生成する多数の分子（Ｎｏ供与体）が、インビトロおよびインビボの両方で同定および評価されている。Ｌ−アルギニンはＮＯ合成酵素の基質であるため、ＮＯ供与体であり、それゆえＬ−アルギニンを投与すると内因性ＮＯ生産が向上し、大半の場合、ＮＯ供与体によって生じるのと同様の反応が誘発される。他のＮＯ供与体としては、モルシドニン、ＣＡＳ７５４、ＳＰＭ−５１８５およびＳＩＮ−１が挙げられる。ＮＯを生成および／または供与できる他の化合物を使用してもよい。これらとしては、有機硝酸塩、ニトロシル化化合物、ニトロソエステルおよびＬ−アルギニンが挙げられる。
【００２８】
ＮＯを生成する、あるいはＮＯを放出または発生する分子は、ＮＯとの錯体を生成可能な求核原子および／またはＳ−ニトロソチオール等のチオールを含む領域に結合されていることが好ましい。
【００２９】
Ｃ．予防薬、治療薬および診断薬
ポリマー物質は、全身的に放出される薬剤を装填することもできるが、ドラッグデリバリー、好ましくは前記物質が必要とされる部位におけるに予防薬、治療薬および診断薬の局所放出にも使用できる。これらの薬剤としては、タンパク質またはペプチド、多糖類、核酸分子、および天然および合成の簡単な分子が挙げられる。代表的な物質として、抗生物質、抗ウィルス剤および抗菌剤、抗炎症剤（ステロイド系または非ステロイド系）、ホルモン、成長因子、サイトカイン、神経刺激剤、血管収縮剤、および心血管反応に関与する他の分子、酵素、抗腫瘍剤、局部麻酔剤、抗血管形成剤、抗体、生殖器官に影響する薬剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドが挙げられる。診断物質は、放射性で、色素形成基質に結合または色素形成基質を切断するか、超音波、ｘ−線、ＭＲＩまたは他の標準画像診断方法によって検出される。
【００３０】
これらの薬剤は、ポリマーが適用される部位において（酵素または加水分解による）分解または拡散のどちらかによって放出されるように、重合前のマクロマーに混合するか、ポリマー内またはポリマー上に塗布するか、重合前または重合中にマクロマーに共有またはイオン結合させることが可能である。
【００３１】
ＩＩ．使用方法
Ａ．コーティング；フィルム；微粒子
インビボ治療に関して述べられたが、本明細書で記載されるポリマー物質が細胞培養、細胞培養基質、またはステントまたはカテーテル等の医療用インプラントまたは機器のコーティングに使用可能であり、標準手法を用いて、患者に使用または投与される微粒子または他の種類の調合物に形成できることは明白である。
【００３２】
Ｂ．治療用途
ＮＯの生理学的量を長期に渡って放出可能なポリマー物質は、そのような治療が必要な部位または患者に適用できる。ＮＯによって治療できる代表的な障害または症状としては、再狭窄、血栓症、喘息、創傷治療、関節炎、ペニスまたは婦人の勃起障害が挙げられる。前記物質は、通常マクロマー溶液として適用され、適用前に重合を開始できるが、原位置で重合される。
【００３３】
（創傷治療）
前記調合物は、火傷、手術による創傷、開放性の脚および足の創傷等、あらゆる種類の創傷の治療に特に有用である。潰瘍と呼ばれる、開放性の脚の創傷には一般に３種類ある。いつも座っている年配者において、脚への血流が停滞した場合によく見られる、静脈鬱血性潰瘍；寝たきりで頻繁に寝返りを打てない人に最もよく起こる、圧力ずれまたは床ずれとも呼ばれる臥位潰瘍；足への血液循環の停滞によって起きる、糖尿病性足潰瘍である。老化人口の増加により、近い将来、効果的で使用者にとって扱いやすい潰瘍治療法に対する要求がますます高まるであろう。
【００３４】
本明細書で使用される「創傷」という用語は、手術および外傷によって与えられたものを含め、火傷を含め、アテローム硬化症また糖尿病等の慢性または急性的な病状による損傷と同様に、あらゆる種類の組織損傷を指す。
【００３５】
（再狭窄の治療）
好ましい用途は、手術後の患者での再狭窄の影響を減少させる方法である。前記方法は、動脈内表面を、感光性フリーラジカル重合可能開始剤および多数のマクロマーの水溶液によってコーティングすることである。コートした動脈に、マクロマーの重合を誘起するキセノンアークレーザ（Ｘｅｎｏｎ  ａｒｃ  ｌａｓｅｒ）を照射する。新たに重合したポリマー組成物が生成すると、動脈内の生理条件によってＮＯの放出が誘起される。この放出は、長期間にわたって厳密に局在化される。
【００３６】
（手術による癒着防止）
好ましい用途は、患者の外科手術後の癒着形成を低減する方法である。ある実施形態において前記方法は、患者の損傷した組織表面を、上記の感光性フリーラジカル重合可能開始剤の水溶液およびマクロマー水溶液によってコーティングすることを含む。コートした組織表面を、マクロマーの重合に十分な光に曝露させる。感光性フリーラジカル重合開始剤は、単一の化合物（例えば２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン）または染料および共触媒（例えばエチルエオシンおよびトリエタノールアミン）の組合わせでもよい。
【００３７】
（組織の接着）
前記ポリマーの別の用途は、患者の組織表面を接着する方法である。ある実施形態において、マクロマーを光開始剤または光開始剤／共触媒混合物と混合し、水性混合物を形成し、前記混合物を組織接着が望ましい組織の表面に塗布する。前記組織表面は接着が望ましい組織と接触し、組織結合を生成する。次に、マクロマーが重合するまで、組織結合に照射する。
【００３８】
（組織のコーティング）
これらのマクロマーの特に好ましい用途において、極薄コーティングは組織の表面、最も好ましくは血管等の組織の内腔に適用される。このようなコーティングのある用途は、再狭窄、突発的な再閉鎖、血管介入後の血管収縮等の治療または予防においてである。ある開始剤を組織表面に適用して、反応、吸収または組織に結合させると、未結合開始剤は希釈またはすすぎによって除去され、マクロマー溶液が塗布および重合される。この方法は、厚さ１〜５００ミクロン、最も好ましくは約２０ミクロンの均一なポリマーコーティングを生成することができ、血栓形成や局所炎症を引き起こさない。
【００３９】
（組織支持体）
前記ポリマー物質は、体内で機械的機能を担わせるための成型品を形成することによって、組織支持体の生成にも使用できる。このような支持体としては、例えば出血器官用のシーラントと、骨欠陥用のシーラントおよび動脈瘤用の充填材が挙げられる。さらにこのような支持体は、器官、血管および管を管理時間の間、特殊な位置に保持するための狭窄を含むことも可能である。
【００４０】
（制御ドラッグデリバリー）
上述したように、前記ポリマー物質は、ホルモン、酵素、抗生物質、抗腫瘍薬、細胞懸濁液を含む、治療薬、予防薬および診断薬としての生理活性物質の担体としても使用できる。前記ポリマー物質は、放出される薬剤の機能特性の一時的な維持はもちろんのこと、局所組織または全身循環のための薬剤の長期に渡る制御放出にも使用できる。
【００４１】
薬剤をマクロマー溶液に混合し、次いで原位置で重合させる制御ドラッグデリバリーのための方法の変形において、マクロマーは生理活性物質と重合され、生理活性物質を含む小球体またはナノ粒子を形成する。前記マクロマー、光開始剤およびカプセル化される薬剤は水性混合物中で混合される。例えば、エマルジョンを形成するために油中で混合したり、ノズルを用いて油中で小滴を形成したり、またはノズルを使用して空気中で小滴を形成したりすることによる標準手法を用いて、混合物の粒子を形成する。懸濁液または小滴は、マクロマーの光重合に適した光を照射する。
【００４２】
これらの物質は、前記ポリマーの水溶性領域によって、水がポリマー内に捕捉された物質に到達できるため、親水性物質の制御ドラッグデリバリーに特に有用である。さらに、前記物質を有機溶媒に曝露させずに、物質を含むマクロマー組成物を重合することが可能である。放出は、架橋間の分子量および架橋密度によって制御されるポリマー内の特徴的孔径によって、分解前のポリマーからの物質の拡散、および／または分解時のポリマーからの物質の拡散によって生じる。ゲルの固定ならびに保護効果によって、捕捉物質の不活性化は低減され、他の制御放出系に関係する破局的なバースト効果は回避される。捕捉物質が酵素である場合、基質がゲルを透過できるようにゲル比が選択されているならば、前記酵素は捕捉されながら基質に曝露される。末端エステル結合の漸進的な加水分解によるポリマーの分解により、インビボの自由巨大分子の最終的な制御放出が促進される。
【００４３】
ＩＩＩ．実施例
実施例１−３に示すように、３種類のＮＯ生成、ＰＥＧベースポリマーを合成し、その放出速度をインビトロで整理条件下で決定した。適切な物質に対する生理反応は、培養した平滑筋細胞および内皮細胞を用いてインビトロで、ヒトの再狭窄に似たラットの頸動脈損傷モデルを使用してインビボで評価した。前記物質は、次にＮａＮＯ２と反応してＳ−ニトロソチオールを生成する、ポリエチレングリコール（Ａ）とポリシステイン（Ｂ）のＢＡＢブロック共重合体、次にＮＯガスと反応して求核試薬／ＮＯ錯体を生成する、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）（Ａ）とジエチレントリアミン（「ＤＥＴＡ」）（Ｂ）のＢＡＢブロック共重合体、次にＮＯガスと反応して求核試薬／ＮＯ錯体を生成する、ポリエチレングリコール（Ａ）およびポリリジン（Ｂ）のＢＡＢブロック共重合体が含まれる。すべてのポリマーは、原位置で迅速に光重合させるために、活性アクリル酸塩基によってさらに終結させた。
【００４４】
ＰＥＧ等の水溶性、生体適合性ポリマーが大量の前記物質を含み、分子量が十分大きいならば、このような物質は生体適合性が良好であり、各ポリマー鎖における２つのエステル結合および２つのアミド結合の存在によってゆっくりと生分解することが予想される。これら３種類の物質は、放出動態が大きく異なるものと予想されたために選択された：求核試薬／ＮＯ錯体は、５週間にわたってＮＯを放出することが示されているが（Ｓｍｉｔｈら，（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：１１４８−５６）、Ｓ−ニトロソシステインの半減期は０．０２３時間である（Ｍａｔｈｅｗｓら，（１９９３）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐ．，２６７：１５２９−３７）。これらの共重合体によって生成されるＮＯの量は、システインまたはリジンに対するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の比を変化させて調整してもよい。
【００４５】
これらのマクロマー組成物が有利なのは、水性環境で迅速に重合できることである。したがって、生分解性バリア、生細胞または生理活性物質の担体、外科用接着剤として役立つ、組織上の原位置で正確に適合する半透過性、生分解性フィルムまたは膜を形成することができる。前記ポリマーは、インプラントサンプル上の最小繊維の過成長からわかるように、優れた生体適合性を示す。モデルのヒドロゲルは、長波長紫外線（ＬＷＵＶ）光に短時間曝露させると、水溶性前駆体から原位置でゲル化し、結果として、組織のタンパク質およびグリコサミノグリカン成分を含むヒドロゲルの相互貫通網目構造を形成した。
【００４６】
実施例４および５に示すように、次の３種類のＰＶＡヒドロゲルを作成し、ＮＯおよび含有薬剤（ｂＦＧＦ）の放出を示した。ＰＶＡ−ＮＨ２−ＮＯヒドロゲル；ＰＶＡ−Ｃｙｓ−ＮＯヒドロゲル；ＰＶＡ−ＮＯ−ｂＦＧＦヒドロゲル。結果は、ＰＥＧベースのヒドロゲルと同様である。
【００４７】
実施例１：ＰＥＧ−Ｃｙｓ−ＮＯマクロマーおよびヒドロゲルの合成
図１に示すように、アクリロイルＰＥＧ−Ｃｙｓ−ＮＯポリマーは最初に、５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中でポリエチレングリコールＮ−ヒドロキシスクシンイミドモノアクリレート（ＡＣＲＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳ、分子量３４００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓより市販で入手可能、Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ，ＡＬ）をＬ−システインと１：２のモル比で２時間反応させて形成された。次に生成物をｄｉＨ２Ｏ中でセルロースエステル膜（分子量カットオフ５００、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ，Ｌａｇｕｎａ  Ｈｉｌｌｓ，ＣＡ）によって透析し、凍結乾燥した。アクリロイルＰＥＧ−Ｃｙｓ−ＮＯ共重合体の分析は、光散乱検出器および２６０ｎｍのＵＶ検出器を備えたゲル透過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ，ＭＡ）を用いて行った。アクリロイル−ＰＥＧ−Ｃｙｓの合成が成功したかどうかは、蒸発光散乱検出器のピーク位置のシフトによって判定した。次に共重合体を問うモル量のＮａＮＯ２とｐＨ２および３７℃にて２０分間反応させ、Ｓ−ニトロソシステインを形成した。チオール基のＳ−ニトロソチオールへの変換は、Ｅｌｌｍａｎのアッセイ（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，（１９９５）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；８８−９０）を用いて測定した。溶液のｐＨを７．４に調整した後、アクリロイル−ＰＥＧ−Ｃｙｓ−ＮＯポリマーを、１５００ｐｐｍの２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノンを長波長紫外線開始材として含む水性溶液中でＰＥＧ−ジアクリレート（分子量３４００）と１：１０のモル比で混合して、光重合可能なヒドロゲル中に混入した。この混合物中に含まれる０．１５％のＮ−ビニルピロリドンは、光開始剤の溶媒として使用された。ＵＶ光（３６５ｎｍ、１０ｍＷ／ｃｍ２）への曝露を用いてポリマーを架橋すると、ヒドロゲルに変換された（Ｓａｗｈｎｅｙら，（１９９３）Ｍａｃｒｏｍｏｌ  ２６：５８１−７）。
【００４８】
実施例２：ＰＥＧ−Ｌｙｓ５−ＮＯマクロマーおよびヒドロゲルの合成
図２に示すように、アクリロイル−ＰＥＧ−Ｌｙｓ５−ＮＯヒドロゲル用に、ＡＣＲＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（分子量３４００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）およびポリ−Ｌ−リジン（ＤＰ＝５）を５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中で等モル比で反応させて共重合体を合成した。得られた共重合体をＧＰＣで分析した後、水に溶解し、真空容器中でＮＯガスと反応させると、リジン側鎖基にアミン基を持つＮＯ−求核試薬錯体が生成した。アミン基のＮＯ−求核試薬錯体への変換度は、ニンヒドリンアッセイを用いて測定し、実施例１で述べたようなヒドロゲルが形成された。
【００４９】
実施例３：ＰＥＧ−ＤＥＴＡ−ＮＯマクロマーおよびヒドロゲルの合成
ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ，Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）は、ポリ−Ｌ−リジン（ＤＰ＝５）を５０ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）中のＡＣＲＬ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（分子量３４００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ）で等モル比で反応させ、凍結乾燥させて、上述したようにＧＰＣで分析した。次に共重合体を水に溶解し、ＮＯガスに曝露して、ＰＥＧ−Ｌｙｓ５−ＮＯで述べたようにＮＯ−求核試薬錯体を形成させ、ニンヒドリンアッセイを用いてアミン含有量を分析した。ＰＥＧ−ＤＥＴＡ−ＮＯを凍結乾燥した後、図３に示すように、上述したように光重合させてヒドロゲルを形成した。
【００５０】
実施例４：ＰＶＡ−ＮＨ２−ＮＯマクロマーおよびヒドロゲルの合成
ポリ（ビニルアルコール）（Ｈｏｅｃｈｓｔ，Ｍｏｗｉｏｌ  ４−８８）をｄｉＨ２Ｏに溶解し、絶えず攪拌しながら丸底フラスコ中で９５℃まで加温した。１時間後、前記溶液を室温まで冷却し、架橋化可能なアセタール基である、メタクリルアミドアセトアルデヒドジメチルアセタール（ＮＡＡＡＤＡ）を加えた。アミンアセタール、ガンマ−ブチルアルデヒドジエチルアセタールも加え、氷酢酸および３７％塩酸を用いて混合物を酸性とした。混合物を室温で９時間攪拌した後、トリエチルアミンを用いてｐＨを３．６に調整した。ポリマーを精製するために、次に溶液を分子量３０００のセルロース膜を用いて、ポリマーの６倍の体積のｄｉＨ２Ｏ中でダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションを用いてポリマー濃度を２２％ｗ／ｖに調整し、１Ｎ  ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整した。ポリマーのアミン濃度は、ニンヒドリンアッセイを用いて決定した。
【００５１】
ＰＶＡ−ＮＨ２に結合したＮＯ供与体を作成するために、中和したアミン修飾ポリマーを活栓付きの丸底フラスコに入れた。フラスコを真空にして、アミンのＮＯ求核試薬錯体への変換が望ましい程度に行われるまで、酸化窒素ガスを満たした。光架橋ヒドロゲルは、ＰＶＡ−ＮＨ２−ＮＯに０．１％ＩＲＧＡＣＵＲＥＴＭ２９５９（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ）光開始剤（溶液の総体積に基づく）を加え、次にＵＶ光（２ｍＷ／ｃｍ２、３６５ｎｍ）に３０秒間曝露して形成した。光開始剤を添加すると、最終的なポリマー濃度は２０％ｗ／ｖとなる。
【００５２】
実施例５：ＰＶＡ−Ｃｙｓ−ＮＯマクロマーおよびヒドロゲルの合成
ＰＶＡ−ＮＨ２は上記のように合成した。システインのアミン末端は無水酢酸を用いてアセチル貸し、システインのカルボキシル末端は、水溶性ＥＤＡＣ化学作用を用いてＰＶＡ−ＮＨ２に結合させた。得られたＰＶＡ−Ｃｙｓは次に、ダイアフィルトレーションを用いて精製し、濃度を２２％ｗ／ｖとした。ＰＶＡ−Ｃｙｓ−ＮＯは、システイン残基に亜硝酸ナトリウムを等モル量加え、ｐＨを２に調整し、３７℃で１５分間インキュベートした。システインのＣｙｓ−ＮＯに対する反応程度は、ＥｌｌｍａｎおよびＧｒｉｅｓｓの反応の両者を用いて分析した。光開始剤２，２−メチル−２−フェニルアセトフェノンをＮ−ビニルピロリドンに６００ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、ポリマー溶液に加えた（溶液の総体積に基づいて０．１％）。次に、ＵＶ光に３０秒間曝露してポリマーを架橋し、ｐＨ７．４、３７℃のＨＥＰＥＳ緩衝生理的食塩水中に入れた。
【００５３】
実施例６：ＰＶＡ−ＮＯ−ｂＦＧＦヒドロゲルの合成
ＰＶＡ−ＮＯ−ｂＦＧＦヒドロゲルの場合、上の手順を用いてＰＶＡ−ＮＯポリマーを作成した。ＵＶ光に曝露させる直前に、２５μｇ／ｍｌのｂＦＧＦをポリマー溶液に加え、よく混合した。ゲルは前述のように架橋され、ｐＨ７．４、３７℃のＨＥＰＥＳ緩衝生理的食塩水中で保存された。
【００５４】
実施例７：ヒドロゲルからのＮＯ放出
上述したようにＮＯ放出物質の調製および光重合の後、ヒドロゲルを秤量し、ｐＨ７．４、３７℃のＨＥＰＥＳ緩衝生理的食塩水中で保存した。緩衝液の一部を各時点で除去し、新しい緩衝液を加えた。各時点で取り出したサンプルは次に、Ｇｒｉｅｓｓ反応に基づく比色アッセイを用いて亜硝酸塩含有量を分析した。
【００５５】
ヒドロゲルの可能な保存条件を探るために、各種のｐＨレベルの緩衝液で保存したヒドロゲルのＮＯ放出動態も調べた。ヒドロゲルからのＮＯの放出は、酸性ｐＨレベルで著しく抑制された。
【００５６】
アクリロイル−ＰＥＧ−Ｌｙｓ５−ＮＯヒドロゲルからのＮＯ放出を図４に示す。
【００５７】
アクリロイル−ＰＥＧ−ＤＥＴＡ−ＮＯヒドロゲルからのＮＯ放出を図５に示す。
【００５８】
アクリロイル−ＰＥＧ−Ｃｙｓ−ＮＯヒドロゲルからのＮＯ放出を図６に示す。
【００５９】
実施例８：ＰＶＡ−ＮＯ−ｂＦＧＦヒドロゲルからのＮＯおよびｂＦＧＦの放出
実施例６で述べたように調製したＰＶＡ−ＮＯ−ｂＦＧＦヒドロゲルからのＮＯ放出は、実施例７と同じ方法で決定し、図７Ａに示す。ｂＦＧＦの放出は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて定量し、図７Ｂに示す。ＮＯの放出は１２時間を大幅に超えて続くが、増大係数は最初の５時間以内で完全に放出される。
【００６０】
実施例９：培養平滑筋細胞に対するＮＯ放出マクロマーの影響：増殖および生存度
血管損傷後の平滑筋細胞（ＳＭＣ）増殖を低減する物質の可能性を評価するため、培養平滑筋細胞をＮＯ放出物質の存在下で培養し、これらの物質の細胞に対する影響を評価した。Ｗｉｓｔａｒ−Ｋｙｏｔｏラットから単離した平滑筋細胞（継代１１−１５、Ｔ．Ｓｃｏｔｔ−Ｂｕｒｄｅｎ提供）を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５００単位のペニシリン、１００ｍｇ／ｌのストレプトマイシンを追加した最小必須培地を用いて３７℃のＣＯ２環境にて培養した。前記細胞を２４ウェル組織培養プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に１０，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種した。播種１日後に、溶解形またはヒドロゲル形のいずれかのＮＯ供与体をウェル内の培地に加えた。培養第４日に、トリプシンの単一細胞懸濁液を調製し、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンタ（Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ番号０６４６，Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）を用いて各グループの３個のサンプルをカウントして、細胞数を決定した。
【００６１】
ＳＭＣ増殖に対する溶液中のＮＯ供与体の影響は、最初にＮＯ用量反応曲線を実施して調べた。そこでは、ヒドロゲル研究に適切な用量を確認するために、細胞をある範囲のＮＯ供与体濃度（１μＭ〜１０ｍＭ）で培養した。ＮＯ−求核試薬錯体（Ｌｙｓ−ＮＯおよびＤＥＴＡ−ＮＯ）は、水中でＬ−リジンまたはＤＥＴＡのどちらかをＮＯガスと２４時間反応させて作成した。可溶性Ｃｙｓ−ＮＯは、ｐＨ２および３７℃で等モル量のＬ−システインをＮａＮＯ２と２０分間反応させて合成した。すべてのＮＯ供与体溶液は、細胞培養物に加える前にｐＨ７．４に調整した。
【００６２】
次に、上で決定したＮＯの最適用量を用いて、ＮＯ生成および制御ヒドロゲルの存在下での平滑筋細胞の増殖を調べた。アクリロイル−ＰＥＧ−Ｌｙｓ５−ＮＯ、アクリロイル−ＰＥＧ−ＤＥＴＡ−ＮＯ、アクリロイル−ＰＥＧ−Ｃｙｓ−ＮＯを含むヒドロゲルは、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノンを加える前にゲル溶液を０．２μｍシリンジフィルタ（Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）によって滅菌濾過したことを除いて、上記のように形成した。ＮＯ供与体を含まないＰＥＧ−ジアクリレートヒドロゲルは対照として使用した。ヒドロゲルは細胞培養インサート（８μｍ孔径、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）中で光重合させ、培養細胞上の培地中に置いた。
【００６３】
３種類のヒドロゲルＮＯ供与体すべてが、著しいＳＭＣ成長を示した（ｐ＜０．０００１）。平滑筋細胞の数は播種密度の数に近いままであり、すべての実験で最終対照細胞数の１０−１５％の範囲であった。
【００６４】
アクリロイル−ＰＥＧ−Ｌｙｓ５−ＮＯヒドロゲルによるＳＭＣ増殖の阻害を、図８Ｂに示したマクロマー溶液対照と比較して、図８Ａに示す。どちらもＳＭＣの増殖を著しく阻害した。
【００６５】
アクリロイル−ＰＥＧ−ＤＥＴＡ−ＮＯ−求核試薬錯体ヒドロゲルによるＳＭＣ増殖の阻害を、図９Ｂに示したマクロマー溶液対照と比較して、図９Ａに示す。どちらもＳＭＣの増殖を著しく阻害した。
【００６６】
アクリロイル−ＰＥＧ−Ｃｙｓ−ＮＯヒドロゲルによるＳＭＣ増殖の阻害を、図１０Ｂに示したマクロマー溶液対照と比較して、図１０Ａに示す。どちらもＳＭＣの増殖を著しく阻害した。
【００６７】
アクリロイル−ＰＥＧ−Ｃｙｓ−ＮＯヒドロゲル、アクリロイル−ＰＥＧ−ＤＥＴＡ−ＮＯヒドロゲル、アクリロイル−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＮＯヒドロゲルによるＳＭＣ増殖の阻害は、図１１対照ヒドロゲルと比較した。すべてのＮＯヒドロゲルはＳＭＣ成長を著しく阻害した。
【００６８】
実施例１０：インビトロでの血小板接着に対するＮＯ放出マクロマーの影響
これらの物質の血栓症予防に対する可能性を評価するために、血小板接着に対するＮＯ放出マクロマーの影響を調べた。健康な志願者から静脈穿刺によって血液を採取し、１０Ｕ／ｍｌヘパリンで抗凝血処理をした。血小板および白血球細胞に対して、１０μＭの濃度のメパクリンで蛍光標識した。３％氷酢酸のｄｉＨ２Ｏによる２．５ｍｇ／ｍｌコラーゲンＩ溶液を調製し、ガラススライドに塗布して、室温の加湿環境で４５分間置いた。アクリロイル−ＰＥＧ−Ｃｙｓ−ＮＯおよびＰＥＧ−ジアクリレートヒドロゲルを上述のように調製し、標識した全血とともに３７℃で３０分間インキュベートした。ヒドロゲルを除去し、次に血液をコラーゲンでコートしたガラススライドとともに３７℃で２０分間インキュベートし（グループごとに２枚）、その後、ＨＢＳですすいだ。スライド１枚に付き、４個の領域を無作為に選択し、４０ｘでの視野当たりの血小板数を蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １３５，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）の下でカウントした。
【００６９】
対照のＰＥＧ−ジアクリレートまたはアクリロイル−ＰＥＧ−Ｃｙｓ−ＮＯヒドロゲルに曝露した血小板の写真は、ＮＯ放出ヒドロゲルへの曝露によって、血小板が血栓形成表面に接着するのを阻害することを示している。血小板が通常接着する血栓形成表面として、コラーゲンでコートしたガラススライドを用いた。血液を対照ＰＥＧ−ジアクリレートヒドロゲルとインキュベートすると、視野当たり６９．２５±４．４６（平均±標準偏差）の接着血小板が見られた。血液を事前にアクリロイル−ＰＥＧ−Ｃｙｓ−ＮＯヒドロゲルに曝露させると、この数は視野当たり７．６５±６．１６個に減少した（ｐ＜０．０００１）。
【００７０】
本明細書で記載された方法および物質の修正または変形は、上述の詳細な説明および添付図から当業者には明らかとなるであろう。これらの方法および物質は、特許請求に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｓ−ニトロソシステインヒドロゲル（アクリロイル−ＰＥＧ−Ｃｙｓ−ＮＯ）の合成の概略図である。
【図２】図２は、アクリロイル−ＰＥＧ−リジン５−ＮＯ−求核試薬錯体ヒドロゲルの合成の概略図である。
【図３】図３は、アクリロイル−ＰＥＧ−ＤＥＴＡ−ＮＯ−求核試薬錯体ヒドロゲルの合成の概略図である。
【図４】図４は、ｐＨ７．４（丸）およびｐＨ３．０（四角）におけるアクリロイル−ＰＥＧ−Ｌｙｓ５−ＮＯヒドロゲルからのＮＯの時間放出（日数に対するＮＯ放出％）を示すグラフである。
【図５】図５は、ｐＨ７．４（丸）およびｐＨ２．０（四角）におけるアクリロイル−ＰＥＧ−ＤＥＴＡ−ＮＯヒドロゲルからのＮＯの時間放出（日数に対するＮＯ放出％）を示すグラフである。
【図６】図６は、ｐＨ７．４（丸）およびｐＨ２．０（四角）におけるアクリロイル−ＰＥＧ−Ｃｙｓ−ＮＯヒドロゲルからのＮＯの時間放出（日数に対するＮＯ放出％）を示すグラフである。
【図７Ａおよび図７Ｂ】図７Ａは、ｐＨ７．４、３７℃におけるＰＶＡ−ＮＯ−ｂＦＧＦヒドロゲルからのＮＯの時間放出（時間に対するポリマー１ｇ当たりの放出ＮＯμｍｏｌ）を示すグラフである。図７Ｂは、ｐＨ７．４、３７℃におけるＰＶＡ−ＮＯ−ｂＦＧＦヒドロゲルからのＮＯの時間放出（時間に対するポリマー１ｇ当たりの理論放出ｂＦＧＦ％）を示すグラフである。
【図８Ａおよび図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、アクリロイル−ＰＥＧ−リジン−ＮＯヒドロゲルが平滑筋細胞の増殖を阻害することを示すグラフである。図８Ａ、対照細胞数の％、ヒドロゲル調合物。図８Ｂ、対照細胞数の％、可溶性ポリマー。
【図９Ａおよび図９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、アクリロイル−ＰＥＧ−ＤＥＴＡ−ＮＯヒドロゲル（図９Ａ）および可溶性ポリマー（図９Ｂ）から放出されたＮＯによる、ＳＭＣ増殖の阻害を対照のパーセンテージとして示すグラフである。
【図１０Ａおよび図１０Ｂ】図１０Ａおよび１０Ｂは、アクリロイル−ＰＥＧ−ＣＹＳＮＯ、Ｌｙｓ−ＮＯヒドロゲル（図１０Ａ）および可溶性ポリマー（図１０Ｂ）から放出されたＮＯによる、ＳＭＣ増殖の阻害を対照のパーセンテージとして示すグラフである。
【図１１】図１１は、ＮＯを含む対照ヒドロゲルと比較した、ヒドロゲル：アクリロイル−ＰＥＧ−Ｌｙｓ−ＮＯ、アクリロイル−ＰＥＧ−ＤＥＴＡ−ＮＯおよびアクリロイル−ＰＥＧ−Ｃｙｓ−ＮＯからのＮＯ放出による平滑筋細胞成長の阻害の程度を比較するグラフである。平滑筋細胞成長の阻害パーセントは、対照のＰＥＧ−ジアクリレートヒドロゲルと比較した各ＮＯ−放出ヒドロゲルの細胞成長と比較して決定する。
（発明の背景）
通常は動脈壁の内膜層中の単層として存在する内皮細胞は、インビボで平滑筋細胞（ＳＭＣ）の増殖の調節に重要な役割を果たしていると考えられている。内皮細胞は、経皮経腔冠状動脈血管形成および同様の手順によるものを含め、ほどんどの形の血管損傷によって深刻に阻害される。経皮経腔冠状動脈血管形成を受けた患者の約３５〜５０％が最初の治療の６ヶ月以内に、動脈の深刻な再狭窄化、すなわち再狭窄を臨床的に経験する。再狭窄は、動脈壁内の閉塞性新内膜層を作成するための基質タンパク質の分泌増加とともに、少なくとも部分的には、動脈壁内の平滑筋細胞の移動および増殖によるものである。同様の問題により、血管移植片の性能も制限される。血管形成術等によって起きる血管損傷後の動脈創傷治癒を調節するプロセスは、いまだによく理解されていないが、血液および血管壁由来の因子の複雑なカスケードを含むと思われる。
内膜肥厚および再狭窄を促進する多数の因子が、外因性タンパク質の投与、細胞の遺伝子変更、または抗体または他の特異性成長因子阻害剤を用いたある信号の遮断によって確認されている。これらの平滑筋細胞の有糸分裂誘発因子および化学遊走物質は、血液または血栓形成および血管壁自体の両方に由来するものである。内皮細胞は、平滑筋細胞の増殖をダウンレギュレートすることが知られている、硫酸ヘパリン、プロスタサイクリン（ＰＧ１２）よびＮＯを含む多くの物質を生成する。
ＮＯは、再狭窄予防に有用な内皮細胞由来の標的分子である。なぜなら、平滑筋細胞の増殖を制限することに加え（Ｇａｒｇら，（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８３：１７７４−７）、血小板の凝集を低減し（ｄｅ  Ｇｒａａｆら，（１９９２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８５：２２８４−９０；Ｒａｄｏｍｓｋｉら，（１９８７）Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，９２：１８１−７）、内皮細胞の増殖を増大させ（Ｚｉｃｈｅら，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９２：１１９８−１２０３）、白血球凝着を減少させる（Ｌｅｆｅｒら，（１９９３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８８：２３３７−５０）ためであり、これらはすべて内膜肥厚および再狭窄の低下にたいへん望ましい（Ｌｏｓｃａｌｚｏ，（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ａｐｐｌ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔａｓ．，２：７−１０）。再狭窄プロセスは複雑であるため、複数の標的に作用するアプローチが最も成功すると思われる。
ＮＯがこれらの複数の反応に影響するメカニズムは、今のところ十分に理解されていないが、ＮＯは可溶性グアニル酸シクラーゼのヘモ部分に結合し、複数の細胞効果を持つ細胞間の第２のメッセンジャーである環状グアノシンモノリン酸塩（ｃＧＭＰ）のレベルを向上させることによって、グアニル酸シクラーゼを活性化することが知られている（Ｍｏｒｏら，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１４８０−５）。ＮＯの効果は、ｃＧＭＰまたはより安定なｃＧＭＰの誘導体の投与によって模倣できることが多い（Ｇａｒｇら，（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８３：１７７４−７）。さらにＮＯは、細胞呼吸に関与する複数の酵素（Ｓｔｕｅｈｒら，（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６９：１５４３−５５）と同様に、リボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドに変換し、ひいてはＤＮＡ合成に著しい影響を与える（Ｌｅｐｏｉｖｒｅら，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１７９：４４２−８；Ｋｗｏｎら，（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７４：７６１−７）酵素である、リボヌクレオチドラクターゼを阻害することがわかっている。
生理条件下でＮＯを生成する多数の分子（ＮＯ供与体）がインビトロとインビボの両方で確認および評価されている。ＮＯ供与体分子は、ＮＯを模倣する生理効果を及ぼし、Ｓ−ニトロソチオール（Ｄｉｏｄａｔｉら，（１９９３）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍ．，７０：６５４−８；Ｌｅｆｅｒら，（１９９３）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，８８：２３３７−５０；ＤｅＭｅｙｅｒら，（１９９５）Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２６：２７２−９）、有機硝酸塩（Ｉｇｎａｒｒｏら，（１９８１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２１８：７３９−４９）およびＮＯと求核試薬の錯体（Ｄｉｏｄａｔｉら，（１９９３）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍ．，７０：６５４−８；Ｄｉａｄａｔｉら，（１９９３）Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２２：２８７−９２；Ｍａｒａｇｏｓら，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３：５６４−８）が挙げられる。これらの多くは、全身的に投与される低分子量分子であり、生理条件下での半減期が短いため、多くの組織タイプに活性を短期間及ぼす。さらに、Ｌ−アルギニンはＮＯ供与体と考えられることが多く、Ｌ−アルギニンはＮＯ合成酵素の基質であるため、Ｌ−アルギニンの投与によって、内因性のＮＯ生成が向上し、大半の場合、ＮＯ供与体によって引き起こされる反応と似た反応を誘発する（Ｃｏｏｋら，（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９０：１１６８−７２）。
ＮＯ／求核試薬錯体を含むＮＯ放出ポリマーの開発がＳｍｉｔｈら，（１９９６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９：１１４８−５６によって報告されている。これらの物質は、インビトロで５週間にもわたってＮＯを放出可能であり、培養中の平滑筋細胞の増殖を制限し、動脈−静脈シャントモデルにおいて、血小板の血管移植片物質への凝着を低減することができた。これらの物質は、カテーテル用抗血栓コーティング物質等の、局所的なＮＯ生成が望ましい場合に、多くの臨床用途として有望であるが、これらの物質は多数の欠点を被っているため、インビボの組織の直接治療にはおそらく有用ではないだろう。これらのポリマーはフィルム、粉末または微粒子として作成できるが、細胞および組織に直接接触させて原位置で形成させることはできないため、ある組織に対するＮＯ治療を厳密に局所化することが困難となり、適用部位にポリマーを保持しておくことに関する問題が起きる可能性がある。調合の問題によっても、腹腔鏡検査またはカテーテルに関する手順の間の局所投与が困難または不可能になる。さらに、ベースポリマーの生体適合性はインプラント可能なＮＯ放出ポリマーにとって、特に長期使用向けの場合にはＮＯ放出停止後に炎症または血栓反応が発生するおそれがあるため、重大な問題となる。
これらの化合物を治療が必要な部位に単独で投与したり、場合によっては、前記薬剤の全身的投与による副作用を低減および消滅できれば、特に長期に渡る場合は、さらに効果的である。
したがって、本発明の目的は、局部または局所的投与後に、ＮＯおよび／またはＮＯレベルを調節する化合物の特定部位での制御放出用の薬剤を提供することである。
本発明のさらなる目的は、適用部位においてＮＯレベルを調節する化合物を放出するヒドロゲル物質を提供することによって、炎症反応を含む症状の治療方法を提供することである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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