(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
恐怖条件付けストレス動物モデルに被験物質を投与し、排便状態及び／又は大腸運動を測定することを特徴とする過敏性腸症候群治療薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
小型哺乳動物にある特定の条件の下で不愉快な経験を与え、一定時間経過後に小型哺乳動物に被験物質を投与した上で再び同じ条件下に置き、排便状態及び／又は大腸運動を測定することを特徴とする、過敏性腸症候群治療薬のスクリーニング方法。
【請求項３】
更に、すくみ行動を測定することを含む請求項１又は２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
亢進した排便状態及び大腸運動を改善し、且つ、すくみ行動に影響しない被験物質を選択することを特徴とする請求項３記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
亢進した排便状態及び大腸運動を改善し、且つ、すくみ行動を改善する被験物質を選択することを特徴とする請求項３記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬のスクリーニング方法、とりわけ過敏性腸症候群治療薬のスクリーニング方法に係るものである。
【背景技術】
【０００２】
過敏性腸症候群（ＩＢＳ）は、腸組織に器質的な病変が認められないにもかかわらず、腹痛や腹部膨満感などの症状や便通異常を呈する機能的腸疾患であり、下痢型、便秘型、および交換型の３つのタイプに分類される。ＩＢＳの病因は複雑であるが、主に精神的なストレスによる自律神経系の異常が基本にあり、これによる腸運動の異常や腹痛がさらにストレスとなって病態を悪化させると考えられている（例えば、非特許文献１参照。）。
従来、過敏性腸症候群の治療薬のスクリーニングには、拘束によるストレスや薬剤で排便異常を誘発した動物モデルが使用されていた。前者としては、非絶食下のラットを拘束ゲージに挿入してストレス負荷することにより排便回数が亢進した動物モデルや、絶食下のラットを同様にストレス負荷することにより下痢が発現した動物モデルが報告されている。後者としては、非絶食下のラットにＴＲＨを投与することにより排便回数が亢進した動物モデル、マウスに５ＨＴ、ＰＧＥ2又はヒマシ油を投与することにより下痢が発現した動物モデルが報告されている（例えば、非特許文献２、３参照。）。【０００３】
一方、うつ病などの治療に用いる抗精神薬の評価に使用される動物モデルとして恐怖条件付けストレス動物モデルが知られている。例えば、ショック箱の中でラットにフットショックを与え、２４時間後に再び同じショック箱にラットを入れると、ラットは恐怖あるいは不安に関連した行動であるすくみ行動（フリージング）を示す。係るすくみ行動はジアゼパムやミダゾラムのような抗不安薬や鎮静薬で抑制されることが報告されている（例えば、非特許文献４参照。）。
また、この恐怖条件付けストレス動物モデルは、すくみ行動の他に大腸運動も亢進することが報告されており、うつ病治療薬であるフルオキセチンがすくみ行動と大腸運動亢進をいずれも抑制したことが報告されている（例えば、非特許文献５、６、７参照。）。【０００４】
【非特許文献１】Journal of Clinical Psychiatry，2001年，第62号，p38-45
【非特許文献２】The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 1992年, 第261巻, 第1号, p297-303
【非特許文献３】Gastroenterology, 1988年, 第94巻, p611-621
【非特許文献４】Behavioral Neuroscience, 1988年, 第102巻, 第2号, p233-243
【非特許文献５】Pharmacology Biochemistry and Behavior, 1993年, 第44巻, p371-374
【非特許文献６】Gastroenterology, 1991年, 第100巻, p964-970
【非特許文献７】Brain Research, 2000年, 第855巻, p58-66
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
過敏性腸症候群の新規な治療薬の創製の為には、多数の被験物質を効率的に評価できる動物モデルを用いたスクリーニングが不可欠である。しかし、従来使用されている動物モデルは精神的なストレスによって発症する過敏性腸症候群の病態を十分に反映したものとは言い難かった。即ち、拘束によるストレスによって排便異常を誘発させた動物モデルは、腸運動への影響が避けられない腹部への圧迫や、痛み等の身体的な刺激の要素が強く、得られる排便異常が精神的ストレスによるものとは言い切れない。一方、薬剤誘発性の排便異常の動物モデルの場合は、外因的に大量のストレス関連物質を投与するため、被験物質や生体内物質との相互作用が起こる可能性を排除できない。
そこで、本発明者らは、過敏性腸症候群の病態を反映したスクリーニング方法の開発を目的として、鋭意検討を行った。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
その結果、恐怖条件付けストレス動物モデルが過敏性腸症候群治療剤の評価に有効であることを見出した。更に、過敏性腸症候群患者に対する有効性が確認されている塩酸ラモセトロン等が、恐怖条件付けストレス動物モデルに対して、すくみ行動には影響せずに排便状態と腸運動のみを改善することを確認して発明を完成させた。
すなわち、本発明は、恐怖条件付けストレス動物モデルに被験物質を投与し、排便状態及び腸運動を測定することを特徴とする過敏性腸症候群治療薬のスクリーニング方法に関する。換言すれば、本発明は、小型哺乳動物にある特定の条件の下で不愉快な経験を与え、一定時間経過後に小型哺乳動物に被験物質を投与した上で再び同じ条件下に置き、排便状態及び／又は腸運動を測定することを特徴とする、過敏性腸症候群治療薬のスクリーニング方法に関する。好ましくは、更に、すくみ行動を測定することを含むスクリーニング方法であり、具体的には、恐怖条件付けストレス動物モデルに被検物質を投与し、１）排便状態及び腸運動を改善し、且つ、すくみ行動に影響しない披験物質を選択することを特徴とするスクリーニング方法、又は、２）排便状態及び腸運動を改善し、且つ、すくみ行動を改善する被験物質を選択することを特徴とするスクリーニング方法である。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、精神的ストレスによって発症する過敏性腸症候群の治療薬を効率的に評価することができる。本発明のスクリーニング方法は、従来の拘束ストレスや薬剤によって排便異常を誘発した動物モデルを使用する方法に比べて、純粋に精神性ストレスに基づいた排便異常を評価出来る点で優れている。他方、過敏性腸症候群患者への有効性が報告されている物質が、ストレス性の情動行動を抑制することにより排便異常を改善するのか、あるいは大腸運動異常を改善することにより排便異常を改善するのかを検定する評価系としても有用である。更には、本発明のスクリーニング方法は、抗精神作用を有さずに過敏性腸症候群を治療できる副作用の危険の少ない物質を選択的にスクリーニングすることもできる一方、過敏性腸症候群の主たる病因と考えられる精神的ストレスを緩和させることにより過敏性腸症候群を治療できる物質を選択的にスクリーニングする方法としても優れている。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】CFS負荷後のすくみ行動および排便数の推移を示す図である。（各群12例の平均値±SEM、*＜0.05, **＜0.01  対正常群（Studentのt検定））
【図２】CFS負荷後のすくみ行動に対する被験薬の効果を示す図である。各群12例の平均値±SEM、N：正常群，C：対照群、#＜0.05, ##＜0.01  対正常群（Studentのt検定）、*＜0.05  対対照群（Dunnett検定）
【図３】CFS負荷後の近位大腸輸送能の亢進に対する被験薬の効果を示す図である。各群13例の平均値±SEM、N：正常群，C：対照群、RAM：塩酸ラモセトロン、ALO：塩酸アロセトロン、CIL：塩酸シランセトロン、LOP：塩酸ロペラミド、##＜0.01  対正常群（Studentのt検定）、**＜0.01  対対照群（Dunnett検定）
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明で用いる恐怖条件ストレス動物モデルとは、小型哺乳動物にある特定の条件の下で不愉快な経験を与え、一定時間経過後に再び同じ条件下に置くことにより、精神的ストレスを与えた動物モデルである。
特定の条件としては、例えば、小型哺乳動物を身体を拘束しない程度の大きさの箱や檻の中に入れて、不愉快な経験から逃げることが出来ないようにした状態が挙げられる。一定時間、音を鳴らしたり、光を照射することにより、不愉快な経験に対する条件付けを強めることが出来るが、これには限られない。好ましくは、小型哺乳動物を箱の中に入れて、数秒〜数十秒間の警告音の後に、数秒〜数十秒間の不快な経験と同時に光を照射することを数回〜数十回繰り返すことが挙げられる。【００１０】
不愉快な経験としては、例えば、足への電気的ショックや熱によるショックなど、身体へ可逆的な刺激を与えることが挙げられる。
恐怖条件付けと被験物質投与後の試験との間の一定期間としては、恐怖条件付けによるストレス状態が収まり且つ条件付けを忘れない程度の期間であれば特に制限されない。例えば、数時間〜４８時間程度が挙げられ、２０〜２４時間程度がより好ましい。
小型哺乳動物としては、ラット、マウス、スナネズミ、ウサギ、モルモット、ハムスター等が挙げられる。小型哺乳動物の雌雄、週齢、体重、分娩の有無等については、目的とするスクリーニングに適用可能である限り、特に制限はない。
恐怖条件ストレス動物モデルは、既知の方法（例えば、非特許文献５、６、７）に従って、或いは、既知の方法を適宜改変して製造することができる。【００１１】
排便状態の測定は、排便数、糞の重量、糞の性状の観察または水分含有率の測定等により行うことができるが、これらに限られない。
腸運動の測定は、実施例２に示すマーカー法（Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，1993年，第266巻，p74−80）による近位大腸輸送能の測定や、実施例３に示すビーズ排出法（British Journal of Pharmacology，1999年，第128号，p.1554-60，1999年，第128号，p1554-60）による遠位大腸輸送速度の測定、更には大腸にセンサーを設置し、運動を測定する方法（Gastroenterology，1991年，第100巻，p964−970）等により行うことができるが、これらに限られない。
すくみ行動（フリージング）とは、一定期間（例えば、１０〜３０秒）以上、呼吸に伴う動き以外の動きをしない状態を言う。
被験物質が排便状態及び腸運動を改善し、且つ、すくみ行動に影響しないとは、被験物質が排便状態及び腸運動を改善する用量において、すくみ行動の時間を短縮又は延長しないことを言う。同様に、すくみ行動を改善するとは、被験物質が排便状態及び腸運動を改善する用量において、すくみ行動の時間を短縮させることを言う。【００１２】
被験物質としては、公知又は新規な合成化合物、ペプチド、タンパク質等の他に、例えば、温血哺乳動物の組織抽出物、細胞培養上清等が用いられる。
被験物質の投与は、被験物質の特性に合わせて経口投与、静注投与、経皮投与等により行うが、経口投与が最も好ましい。被験物質を経口投与する場合は、水や有機溶媒に溶解して液状にし、シリンジやスポイト等で動物に強制投与する方法が好ましい。
被験物質の投与後、試験までの時間は、小型哺乳動物の種類や被験物質の投与方法によって適宜調整できる。例えば、後記の実施例に用いたラットでは経口投与の場合には投与後１時間前後が好ましいが、静注投与の場合には投与後５〜３０分に試験を実施できる。【００１３】
本発明のスクリーニング方法の実施に際しては、恐怖条件付けをしていない正常な小型哺乳動物、即ち、ある特定の条件下においたが不愉快な経験を与えていない小型哺乳動物を正常群として恐怖条件付け(CFS)群との比較対照に用いることが好ましい。
【実施例】
【００１４】
以下に実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
〔実験方法〕
雄性Sprague-Dawleyラット（6週齢，日本クレア）を用いた。入荷後約１週間以上経過したラットを、体重の平均値および標準偏差が同程度になるように１群１２匹に群分けした。電撃条件は予備検討の結果に従い設定した。即ち、電極グリッドを床にはめ込んだ電撃装置（17×17×39 cm, CB2000型，O’Hara株式会社）にラットを入れ、3秒間の警告音の後、最大2-mAの電流を1回１分あたり5秒間、計15回加え、電撃時には40 w電球3個による光照射を行い条件付けを行った。正常群は同様のプロトコールで電撃装置に入れたものの、電撃は加えなかった。18〜24時間後、動物に各被験薬を5 mL/kgの容量で強制経口投与し、その後1時間に再度電撃装置に入れ、3秒間の警告音および5秒間の光照射を30分間加える恐怖条件付けストレス(CFS)負荷を行った。【００１５】
排便数はCFS負荷開始後2, 4, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 30分に記録し、測定終了時に糞を回収して糞湿重量を測定した。さらに糞を70℃で22時間乾燥後、その乾燥重量を測定し、水分含有率を算出した。なお、排便数および糞重量については、測定装置に入れた直後の排便は測定値から除外した。
すくみ行動（フリージング）の測定は30秒間の間に呼吸に伴う動き以外の動きを一切しなかった場合をすくみ行動として評価した。評価時間はCFS負荷後0, 1, 3, 5, 7, 9, 12, 13,14, 17, 18, 19, 22, 23, 24, 27, 28, 29分とし、1分あたり30秒間隔で測定した。負荷後0〜9分（Block 1）、10〜19分（Block 2）、20〜29分（Block 3）の3区分において、各動物がすくみ行動を示した割合（%）を算出した。【００１６】
〔結果〕
（１）恐怖条件付けストレス(CFS)負荷によるすくみ行動と排便増加作用
CFS負荷後、測定までの体重増加量は正常群と比較して有意な差は認められず、電撃を用いた条件付けによる侵襲は低いことが確認された。ラットがストレスを受けた際の情動行動の一つであるすくみ行動はCFS負荷直後より見られ、３０分の測定期間のうち、0-9分（Block 1）および10-19分（Block 2）で正常群と比較して有意であった（図１）。さらにすくみ行動が強く見られるCFS負荷後0-10分に正常群と比較して有意な排便数の増加がみられた。【００１７】
（２）排便異常に対する過敏性腸症候群治療薬の効果
過敏性腸症候群患者に対する治療有効性が報告されている物質が本評価系でみられる異常排便に対し有効性を示すかを検討するために、5-HT3受容体拮抗薬である塩酸ラモセトロン、塩酸アロセトロンおよび塩酸シランセトロン、ならびに止瀉薬である塩酸ロペラミドの効果を検討した。これらの被験薬は恐怖条件付けストレス(CFS)負荷により増加した糞湿重量を用量依存的に低下させ、その抑制率のED50値は表１の通りであった。ED50値は直線回帰法で算出した（n=12）。
【表１】
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【００１８】
（３）すくみ行動に対する過敏性腸症候群治療薬の効果
恐怖条件付けストレス(CFS)誘発性のすくみ行動に対して、塩酸ラモセトロン、塩酸アロセトロンおよび塩酸シランセトロンはCFS負荷後30分までの観察時間においていずれの被験薬も検討した全ての用量で影響を及ぼさず、これらの物質はストレス性の反応に対して影響を与えないことが確認された（図２）。一方、塩酸ロペラミドはCFS負荷後20〜29分（Block 3）のすくみ行動発現時間を用量依存的に延長させ、その作用は30 mg/kgの投与量で有意であった（図２）。この結果から、塩酸ロペラミドは排便異常改善作用以外の作用を持つことが予想される。【００１９】
実施例２
〔実験方法〕
雄性Sprague-Dawleyラット（6〜7週齢，日本クレア）を用いた。入荷後約１週間経過したラットを実験に使用した。電撃条件は実施例１に従い設定した。即ち、電極グリッドを床にはめ込んだ電撃装置（17×17×39 cm, CB2000型，O’Hara株式会社）にラットを入れ、3秒間の警告音の後，2.5-mAの電流を1回１分あたり5秒間、計15回加え、電撃時には40 w電球3個による光照射を行い条件付けを行った。正常群は同様のプロトコールで測定装置に入れたものの、電撃は加えなかった。20〜24時間後、動物に各被験薬を5 mL/kgの容量で強制経口投与し、その後1時間に再度電撃装置に入れ、3秒間の警告音および5秒間の光照射を30分間加えることにより恐怖条件付けストレス(CFS)の負荷を行った。【００２０】
マーカー法による近位大腸輸送能の測定はKadowakiらの方法（Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，1993年，第266巻，p. 74−80）を改変して測定した。即ち、ラットをペントバルビタール（50 mg/kg ip）麻酔下に腹部を正中切開（約1cm）し、盲腸−大腸接合部を取り出した。接合部から約1 cmの大腸部にカニューレ（SP50）を挿入し、頸部より取り出した。実験まで自由摂食、自由摂水の条件で5日間以上個別飼育した。カニューレよりカルミンレッド溶液（カルミンレッド 3 g, アラビアゴム 5gを含む0.5% メチルセルロース溶液0.2 mL）を注入し、上記の方法でCFSを30分間負荷後，断頭器により屠殺した。素早く正中切開し、大腸起始部−肛門部を摘出し、カニューレ挿入部を起点として全長およびマーカー移動距離を測定した。大腸輸送能（％）は（マーカー移動距離）÷（全長）×100として算出した。【００２１】
〔結果〕
カルミンレッド溶液を大腸起始部に注入し、CFS負荷後30分の近位大腸輸送能を測定した。CFS群の近位大腸輸送能は正常群と比較して有意に増加し、本評価系による排便異常が病態に即し大腸運動の異常促進に基づくことが示唆された（図３）。また、CFS誘発排便異常を有意に抑制した塩酸ラモセトロン（0.1 mg/kg）、塩酸アロセトロン（0.3 mg/kg）、塩酸シランセトロン（0.3 mg/kg）及び塩酸ロペラミド（10 mg/kg）はCFS負荷により増加した近位大腸輸送速度を低下させた。【００２２】
実施例３
〔実験方法〕
雄性Sprague-Dawleyラット（6〜7週齢，日本クレア）を用いた。入荷後約１週間経過したラットを１群１６匹で実験に使用した。電撃条件は実施例１に従い設定した。即ち、電極グリッドを床にはめ込んだ電撃装置（17×17×39 cm, CB2000型，O’Hara株式会社）にラットを入れ、3秒間の警告音の後、2.5-mAの電流を1回１分あたり5秒間、計15回加え、電撃時には40 w電球3個による光照射を行い条件付けを行った。正常群は同様のプロトコールで測定装置に入れたものの、電撃は加えなかった。20〜24時間後、動物に各被験薬を5 mL/kgの容量で強制経口投与し、その後1時間に再度電撃装置に入れ、3秒間の警告音および5秒間の光照射を30分間加えることにより恐怖条件付けストレス(CFS)の負荷を行った。【００２３】
ビーズ排出法による大腸輸送能の測定はNegriらの方法（British Journal of Pharmacology，1999年，第128号，p.1554-60）を改変して測定した。即ち、軽度のエーテル麻酔下にシリコンビーズ（直径3 mm）をシリコン棒で肛門部より直腸側に3 cm挿入した。覚醒後、速やかにシリコン棒を除去し、CFS負荷を行った。CFS負荷開始時間およびシリコンビーズ排出時間を記録し、測定打ち切り時間はCFS負荷時には開始後90分、正常時には開始後8時間とした。遠位大腸輸送能（mm/min）は 30 mm ÷ ビーズ排出所用時間（min）として算出した。【００２４】
〔結果〕
結果を表２に示す。恐怖条件付けストレス(CFS)を負荷することにより、遠位大腸輸送速度は正常群と比較して増加した。また、塩酸ラモセトロン（0.1 mg/kg）、塩酸アロセトロン（0.3 mg/kg）、塩酸シランセトロン（0.3 mg/kg）及び塩酸ロペラミド（10 mg/kg）はCFS負荷により増加した遠位大腸輸送速度を低下させた。
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００２５】
本発明のスクリーニング方法により、精神的ストレスによって発症する過敏性腸症候群の治療薬を効率的に評価することができる。
【図１】
0004725579.tif 000004
【図２】
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【図３】
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