(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスミド上の外来遺伝子により形質転換された細胞における該プラスミド上の外来遺伝子の発現を上昇させるための方法であって、アセチル−Ｌ−カルニチンを細胞の培地に添加することを含む方法。
【請求項２】
アセチル−Ｌ−カルニチンを含む、プラスミド上の外来遺伝子により形質転換された細胞における該プラスミド上の外来遺伝子の発現を上昇させるための、遺伝子治療用組成物。
【請求項３】
アセチル−Ｌ−カルニチンを含む、プラスミド上の外来遺伝子により形質転換された細胞における該プラスミド上の外来遺伝子の発現を上昇させるための、細胞培地添加用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本明細書に開示する発明は、組換えタンパク質の製造におけるＣ１−Ｃ６アルカノイルＬ−カルニチン、特にアセチルＬ−カルニチンの使用に関する。
例えば形質転換により遺伝子が挿入された細胞クローンを用いる、遺伝子操作法によるタンパク質の製造が公知である。形質転換したクローンを使用するにつき遭遇する問題の一つは、一定期間後、所望のタンパク質を製造するために細胞に人工的に挿入された遺伝子がサイレントになることである。遺伝子のサイレント化の問題は、遺伝子治療においてよりいっそう強く認められている。この場合、患者に挿入された遺伝子が、治療上必要なタンパク質を産生することを止める。
【０００２】
Ｃ１−Ｃ６アルカノイルＬ−カルニチンおよび好ましくはアセチルＬ−カルニチンまたはＬ−カルニチンが、形質転換遺伝子の遺伝子発現を増すことが今回見出された。
本発明の意図に関して、「カルニチン」が意味するのは、Ｃ１−Ｃ６アルカノイルＬ−カルニチンまたはＬ−カルニチンである。以下の記載では、純粋に例として、アセチルＬ−カルニチンを用いる好ましい具体例を引用する。
【０００３】
公知の方法、例えばリポソームを用いて形質転換された細胞クローンに、アセチルＬ−カルニチンによる処置を施すことにより、該形質転換遺伝子によりコードされるタンパク質の発現がかなり増す。
形質転換遺伝子の遺伝子発現を増すための、アセチルＬ−カルニチンの投与を含む方法が、本発明の対象である。
産業上の利用分野の側面において、本明細書中に開示する発明は、組換えタンパク質の発現を増すためのアセチルＬ−カルニチンの使用、ならびに組換えタンパク質の製造のための方法であって、改良点がアセチルＬ−カルニチンを使用して該タンパク質の発現を増すことから成る方法に関する。
【０００４】
一般の治療部門および遺伝子工学の分野において、本明細書に開示する発明の主要事項は、タンパク質の発現を改善するための遺伝子治療において有用な製品の調製のためのアセチルＬ−カルニチンの使用、ならびにクローン中の形質転換遺伝子を維持するのに有用な製品の調製のためのアセチルＬ−カルニチンの使用である。
本明細書に開示する発明を、以下に示す実施例部分を用いてさらに示す。
【０００５】
材料および方法
インビトロ実験
細胞培養。子宮頚癌細胞系統ヒーラー、ＡＴＣＣを用いた。細胞を、抗生物質および１０％の子牛血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地（eurobio)中で培養した。
【０００６】
アセチル−Ｌ−カルニチン（ＡＬＣ）を用いた処置。ＡＬＣをそれぞれ５ｍＭおよび１０ｍＭの最終濃度で含む培地中で培養した４×１０６および５×１０６の細胞を２つの１２５ｃｍ３フラスコに播種し、一方、ＡＬＣで処置しなかった２×１０６の細胞を７５ｃｍ３フラスコに入れた。処置を４８時間（形質転換用の細胞の播種と同時に）後および７２時間後（形質変換終了時に）に繰り返し、次いで溶菌用に７２時間で形質転換したサンプルの場合のみ１２０時間後にさらに繰り返した。
【０００７】
ｐＲＬ−ＣＭＶプラスミドのトランジェント形質転換。細胞を形質転換の２４時間前に１２ウェルのプレート(Corning)に、ウェル当たり１０５の細胞に対応する量で播種した。形質転換を各サンプルに関して三連で、リポソームＤＯＴＡＰ(Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN)およびプラスミドｐＲＬ−ＣＭＶ(Promega cat. N°E2261)を用いて行った。簡単には、１０５０μｌ/サンプルの最終体積を考慮して、１．５μｇ／ウェルのＤＮＡと９．２μＭ／ウェルのリポソームをサンプル当たりに用いた。形質転換混合液（２５μｌ／サンプル）を室温に３０分間置き、次いでＨＢＳ２×（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を２５μｌ／サンプルで添加し、次いでこうして得られた溶液の５０μｌ／サンプルを５時間細胞に添加した。カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ（リン酸バッファーｐＨ７．４）で３回洗浄した後、ＡＬＣを当該処置に関して示した濃度で含む増殖培地中で、細胞をルシフェラーゼアッセイのための細胞溶解時まで培養した。対照として１×ＨＢＳ溶液中の裸のＤＮＡを添加した。
【０００８】
インビトロでの形質転換サンプルにおけるルシフェラーゼアッセイ
カルシウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳ（リン酸バッファーｐＨ７．４）で細胞を洗浄し、ルシフェラーゼアッセイに用いられるGeneLux L002-100キット（Wallac)中に含まれる溶解バッファー２００μｌの添加による溶解に供した。２０分後、全タンパク質を回収し、各サンプルの１０μｌを、キットに示される方法に従いルシフェラーゼに関してアッセイした；アッセイは、９６マルチウェルプレート中、Ｖｉｃｔｏｒ２ルシノメーター（Wallac)を用いて行った。相対光単位（ＲＬＵ)で表される得られた発光度を、ブラッドフォード法を用いて評価する全タンパク質のｍｇに関して正規化した。
【０００９】
インビボ実験
アセチルＬ−カルニチン（ＡＬＣ）を用いる処置。インビボ実験のために用いた動物はＢａｌｂ／ｃ（Harlan)マウスであり、１グループにつき５匹とした。グループを非処置動物（３グループ）と、１００ｍｇ／ｋｇの経口投与量でＡＬＣ処置した処置動物（６グループ）に区分した。処置は形質転換の４日前に開始し、毎日投与し、そして屠殺時まで毎日繰り返した。
動物の屠殺
動物を形質転換の２４時間後、４８時間後および７２時間後に屠殺した。
肺を各動物から取り出し、塩水溶液で洗浄し、重量を測定し、液体窒素中で凍結し、次いでタンパク質抽出時まで−８０℃にて保存した。
【００１０】
ｐＲＬ−ＣＭＶプラスミドの形質転換。非処置のグループおよびＡＬＣで処置した動物のグループのうちの３つのグループを構成する動物に、２５μｇ／マウスのｐＲＬ−ＣＭＶプラスミドの静脈注射を、リポソームを１２μｍ／注入ＤＮＡμｇの濃度にて用いて施した。リポソームとＤＮＡはＰＢＳ溶液に混合し、注射前の１時間、氷中に保存した。処置動物の他の３グループには、ＰＢＳのみを含む溶液中２５μｇ／マウスのｐＲＬ−ＣＭＶプラスミドの注射を施した。各動物における注射した溶液の最終体積は、２０８μｌであった。
【００１１】
肺からのタンパク質の抽出およびルシフェラーゼアッセイ
結果
インビトロでの形質転換におけるルシフェラーゼ発現
２４時間での溶解物。ＡＬＣで処置したサンプルにおいて得られたルシフェラーゼの発現は、未処置の細胞のサンプルにおけるよりも高かった。三連のサンプルに基づいて評価した全タンパク質のｍｇ当たりの平均ＲＬＵ値は、５ｍＭのＡＬＣで処置したサンプルにおいて、未処置のサンプルと比較して約１．６倍増を示した。加えて、１０ｍＭのＡＬＣで処置したサンプルでは、さらなる増加がないことが認められた。得られた結果は、ＡＬＣとルシフェラーゼの発現の間に、少なくとも我々の実験において用いた濃度では投与量依存的な関連性はないことを示しているが、形質転換されたルシフェラーゼの発現に関してはポジティブな効果を示していると考えられる。ＤＮＡのみで形質転換した対照グループを構成するサンプルでは、ルシフェラーゼ活性は認められなかった。
４８時間での溶解物。２４時間で溶解に供したサンプルにて認められた効果は、形質転換後４８時間では維持されず、ルシフェラーゼの発現は全形質転換サンプルにおいて確実に低下した。タンパク質のｍｇ当たりで得られたＲＬＵは、処置サンプルおよび非処置サンプル間で有意な違いを示さない。
７２時間での溶解物。有意なＲＬＵ／ｍｇ値を測定することができず、従って、サンプルはルシフェラーゼの発現を示さない。
【００１２】
インビボでのルシフェラーゼの発現
実施例２  ヒーラー１０００００／１２ウェルプレート  １．５μｇ／ウェル
【００１３】
【表１】
0004726378.tif 000002
【００１４】
ルシフェラーゼ活性におけるＡＬＣのポジティブな効果が転写機構の活性化に関連するものか、または細胞透過性の増加に関連するものかどうかを調べるために、形質転換細胞内プラスミドＤＮＡの全量を、スロットブロット分析により定量することにした。
【００１５】
スロットブロット
細胞培養。子宮頚癌細胞系統ヒーラー（ＡＴＣＣ）を、５％ＣＯ２を含む湿った雰囲気中、１０％の子牛血清、１％のＰ／Ｓを補充したＲＰＭＩ培地（Europio)に維持した。
ＡＬＣ処置。５×１０６の細胞を１２５ｃｍ３のフラスコ中に入れ、そして、２の濃度（５ｍＭおよび１０ｍＭ）でＡＬＣを含む前記のように補充したＲＰＭＩに形質転換の４日前に置いた。処置を形質転換の終了時に繰り返した。非処置の細胞を同じ濃度で培養し、対照として用いた。
【００１６】
ｐＲＬ−ＣＭＶのトランジェントな発現。１０５の細胞／ウェルを形質転換の１日前に、１２マルチウェルのプレート(Corning)に播種した。ＤＯＴＡＰリポソーム(Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN)およびｐＲＬ−ＣＭＶプラスミド(Promega cat. N°E2261)を形質転換のために用いた。６ウェル/サンプル。簡単には、１．５μｇ／ウェルのＤＮＡおよび９．２μＭのリポソーム水溶液を室温で混合して（２５μｌ／サンプル）、ＤＮＡ−リポソーム複合体を作成した。３０分間インキュベーションした後、同体積／ウェルのＨＢＳ２×（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を添加し、次いで形質転換混合液を等分した（補充培地中５０μｌ／ウェル）。細胞を複合体と共に５時間インキュベートし、次いでＰＢＳ（リン酸緩衝処理塩水、ｐＨ７．４、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋不含）で洗浄することにより複合体を除去した。細胞をＡＬＣを含む補充倍地に２４時間維持し、次いで分析に用いた。対照としてＨＢＳ１×中の裸のＤＮＡ（ｐＲＬ−ＣＭＶ）で形質転換した。
【００１７】
ＤＮＡの抽出。全細胞ＤＮＡを、Maniatisにより報告される方法に従って形質転換細胞からアルカリ溶解により抽出した。ＰＢＳで洗浄後、細胞をＰＢＳ（１ｍｌ／ウェル）にて収集し、次いで１５００×ｇにて１０分間室温にて遠心分離した。
プロトコルに従い、氷上に置いた各ペレットを、１００μｌの溶液Ｉ[５０ｍＭグルコース、２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ＝８）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ＝８）]、２００μｌの溶液ＩＩ[０．２Ｎ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ]、１５０μｌの溶液ＩＩＩ[５Ｍ酢酸カリウム、氷酢酸]を用いて溶解した。１２０００×ｇにて５分間４℃にて遠心分離後、上清を集め、次いでＤＮＡをＥｔＯＨを用いて沈殿した。ペレットをＴＥ１×（５０μｌ／サンプル）に再懸濁した。
【００１８】
プローブの標識化。プローブ、ルシフェラーゼ遺伝子は、ＨｉｎｄＩＩＩを２時間３７℃で用い、次いでＢａｍＨＩを同じ条件で用いるｐＲＬ−ＣＭＶの消化により得た。消化後、混合液をＴＡＥ１×バッファー（４０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１．１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび３７ｍＭ酢酸ナトリウム）中０．８％のアガロースゲル上で電気泳動し、次いでルシフェラーゼ遺伝子に対応するフラグメントを切り出しにより単離した。ルシフェラーゼ遺伝子の標識化を、Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ＩＩ  ＤＮＡラベリングシステム（Amersham Pharmacia biotech, cat n. RPN 1633)およびＲｅｄｉｖｕｅの安定化された[α−３２Ｐ]ｄＣＴＰ(Amersham Pharmacia biotech, cat n. AA 0005)を用いて、購入したプロトコルに従って用いて行った。
【００１９】
スロットブロット。ＤＮＡサンプルを、陽性に荷電したナイロン膜(Boehringer, cat. n. 1209299)上に、Ｂｉｏｒａｄスロットブロット装置を用いて吸着した。ＤＮＡをＵ.Ｖ．Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ−２４００（Stratagene)によりフィルターに結合した。フィルターをＱｕｉｋＨｙｂハイブリダイゼーション溶液(Stratagene, cat. n. 201220)を２０分間６８℃にて用いて前インキュベーションした後、２．５×１０６ｃｐｍ／ｍｌの標識プローブをサケ精子ＤＮＡと共に２分間沸騰し、その後、添加した。ハイブリダイゼーションを６８℃にて１時間行い、次いでフィルターをバッファーＩ（ＳＳＣ２×、ＳＤＳ０．１％）を１５分間室温で用いて、次いでバッファーＩＩ（ＳＳＣ０．１×、ＳＤＳ０．２％）を３０分間６０℃で用いて２回洗浄した。フィルターを「リン光体画像処理(phosphor Imager)」ボックスに曝し、次いでＩＰｌａｂ  Ｇｅｌソフトウェアを用いて濃度計により分析した。
【００２０】
スロットブロット濃度計により（表を参照されたい）ＡＬＣの存在下または不在下で形質転換された細胞から得られた値の間に違いがないことが明らかになった。１０ｍＭのＡＬＣを用いてわずかな低下が認められた。これらの結果は、ＡＬＣの存在によりＤＮＡ／リポソーム複合体の細胞への取り込みは変化せず、ＡＬＣが転写レベルでルシフェラーゼの発現に影響を及ぼす可能性があることを示唆する。
【００２１】
【表２】
0004726378.tif 000003
【００２２】
結論。ＡＬＣの存在下または不在下で行った形質転換にて得られた濃度計の値の比較により、ＤＮＡ／Ｄｏｔａｐ複合体の細胞透過性とルシフェラーゼに関するＡＬＣのポジティブな効果の間に関連はなかったことが明らかである。