(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式(Ｉ)の化合物：
0004759762.tif 000111
ここで：
Ａは、CH2、Ｏ、NH、またはN-[(C1-C4)-アルキル]であり；
Ｂは、(C1-C6)-直鎖または分枝鎖アルキルであるか、あるいは(C2-C6)-直鎖または分枝鎖のアルケニルまたはアルキニルであり、ここで、Ｂの１個の炭素原子が、必要に応じて、Ｏ、Ｓ、SO、SO2、NH、またはN-[(C1-C4)-アルキル]で置換される；
Ｄは、1-[(C1-C4)-アルキル]-4-ピペリジニル、1-ピペラジニル、1-[(C1-C4)-アルキル]-4-ピペラジニル；必要に応じて環の３位および/または４位に置換基を含む、５員〜７員のシクロアルキル環またはシクロアルケニル環であり、ここで、該置換基が、オキソ、OH、(C1-C4)-アルキル、O-[(C1-C4)-アルキル]、O-[(C2-C4)-アルケニル]、NH2、N,Nジ-[(C1-C4)-アルキル]アミノ、またはハロゲンから選択され；あるいは、各環が５員〜６員でなり、必要に応じて、Ｎ、Ｏ、またはＳから独立して選択される４個までのヘテロ原子を含む、単環式または二環式の芳香族環構造であり；
Ｅは、SO2、または-C(O)-C(O)-であり；
Ｇは、1-[(C1-C4)-アルキル]-4-ピペリジニル、1-ピペラジニル、1-[(C1-C4)-アルキル]-4-ピペラジニル、(C1-C7)-直鎖または分枝鎖アルキル、(C2-C7)-直鎖または分枝鎖のアルケニルまたはアルキニル、(C5-C7)-シクロアルキルであるか、あるいは各環が５員〜６員でなる単環式または二環式の芳香族環構造であり；ここで、任意のＧ中の２個までの炭素原子が、必要に応じてＯ、Ｓ、SO、SO2、またはNHによって独立して置換され；
ここで、Ｇは、必要に応じて、以下から独立して選択される３個までの置換基を含む：ハロゲン、ヒドロキシル、(C1-C6)-直鎖または分枝鎖アルキル、(C2-C6)-直鎖または分枝鎖アルケニル、O-[(C1-C5)-直鎖または分枝鎖アルキル]、O-[(C2-C5)-直鎖または分枝鎖アルケニル]、O-ベンジル、アミノ、カルボキシル、NH-[(C1-C5)-直鎖または分枝鎖アルキル]、NH-[(C2-C5)-直鎖または分枝鎖アルケニル]、トリフルオロメチル、またはトリフルオロメトキシ；そしてここで、任意の独立した置換基の１個の炭素原子は、必要に応じてＯ、NH、またはＳで置換される；
Ｑは、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択される１個〜２個のヘテロ原子を含む５員芳香族環であるか、あるいはＮ、Ｏ、またはＳから選択される０個〜２個のヘテロ原子を含む６員芳香族環であり；
Ｊは、５員〜６員からなる、該化合物の残部へのＱの結合点に対してＱの３番目の原子で結合した、単環式または二環式の芳香族環構造であり、必要に応じて、Ｏ、Ｓ、またはＮから独立して選択される４個までのヘテロ原子を含む；
ここで、Ｊは、必要に応じて、以下から独立して選択される３個までの置換基を含む：ハロ、OH、CH2OH、NO2、SO3H、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、O-フェニル、1,2-メチレンジオキシ、NR1R2、アミノ、カルボキシル、N-[(C1-C5)-直鎖または分枝鎖アルキル]-カルボキサミド、N-[(C2-C5)-直鎖または分枝鎖アルケニル]-カルボキサミド、NH-モルホリノカルボキサミド、NH-ベンジルカルボキサミド、NH-チオモルホリノカルボキサミド、NH-ピコリノイルカルボキサミド、モルホリニル、ピペリジニル、O-R3、CH2-(CH2)q-R3、O-(CH2)q-R3、(CH2)q-O-R3、CH=CH-R3、(C1-C6)-直鎖または分枝鎖アルキル、あるいは(C2-C6)-直鎖または分枝鎖アルケニルであり、ここで、任意の置換基において、１個の炭素原子が、必要に応じて、Ｏ、Ｓ、SO、SO2、NH、またはN-[(C1-C4)-アルキル]からなる群から選択されるヘテロ原子で置換され；
ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、水素、(C1-C6)-直鎖または分枝鎖アルキル、(C2-C6)-直鎖または分枝鎖のアルケニルまたはアルキニルおよびベンジルからなる群から選択され；
Ｒ3は、4-メトキシフェニル、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、ピラジル、キノリル、3,5-ジメチルイソキサゾイル、2-メチルチアゾイル、チアゾイル、2-チエニル、3-チエニル、およびピリミジルからなる群から選択され；そして
ｑは、０〜２であり；
ｎは、１または２である；
ただし、Ｅが-C(O)-C(O)-であり、かつＪが単環式芳香族環である場合、Ｊは、Ｏ、Ｓ、またはＮから独立して選択される１個〜４個のヘテロ原子を含む。
【請求項２】
前記単環式環または前記二環式環の各々におけるＯ、Ｓ、またはＮから選択されるヘテロ原子の数が最大１個である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ａが酸素であり；そしてＥが-C(O)-C(O)-である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩、および薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、またはビヒクルを含む、薬学的組成物。
【請求項５】
化学療法剤、化学増感剤または神経栄養因子をさらに含む、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記化学療法剤が、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、アムサクリン、ミトキサントロン、テニパシド、タキソール、またはコルヒチンから選択される、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記化学増感剤が、シクロスポリンＡおよびそのアナログ、フェノチアジン、またはチオキサンテンから選択される、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記神経栄養因子が、神経成長因子(NGF)、インシュリン成長因子(IGF)およびそれらの活性な切断された誘導体、酸性繊維芽細胞成長因子(aFGF)、塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニューロトロフィン-3(NT-3)、およびニューロトロフィン-4/5(NT-4/5)から選択される、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
多剤耐性を処置もしくは予防するための薬学的組成物の調製のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩の使用。
【請求項１０】
多剤耐性を処置もしくは予防するための薬学的組成物であって、該組成物が、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物、またはその塩を含む、組成物。
【請求項１１】
以下の式(II)の化合物：
0004759762.tif 000112
ここで：
Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＱは、請求項１で定義した通りであり、
Ｋは、Ｈ、(C5-C7)シクロアルキル、(C5-C6)芳香族環、1-[(C1-C4)-アルキル]-4-ピペリジニル、1-ピペラジニル、1-[(C1-C4)-アルキル]-4-ピペラジニル、(C1-C7)-直鎖または分枝鎖アルキル、(C2-C7)-直鎖または分枝鎖のアルケニルまたはアルキニルであり、ここで、Ｋ中の２個までの炭素原子は、必要に応じて、Ｏ、Ｓ、SO、SO2、NH、NO、またはN-(C1-C4)アルキルで独立して置換され、
ここで、Ｋは、必要に応じて、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、メトキシ、または(C1-C3)アルキルから独立して選択される２個までの置換基を含み；そして
ＬおよびＭは、Ｈ、(C1-C7)-直鎖または分枝鎖アルキル、(C2-C7)-直鎖または分枝鎖のアルケニルまたはアルキニルから独立して選択され、ここで、ＬおよびＭ中の１個の炭素原子が、必要に応じてＯ、Ｓ、SO、SO2、NH、またはN-(C1-C4)アルキルで置換され；
ここで、ＬおよびＭは、必要に応じて、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、または５員〜６員の芳香族環から独立して選択される２個までの置換基を含み、該芳香族環は、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択される２個までのヘテロ原子を含み；
ｎは、１または２である；
ただし、Ｅが-C(O)-C(O)-である場合、Ｋ、Ｌ、およびＭは、それらが結合する炭素原子と一緒になって、非置換のC2-C6直鎖または分枝鎖アルケニルを形成しない。
【請求項１２】
前記単環式環または前記二環式環の各々におけるＯ、Ｓ、またはＮから選択されるヘテロ原子の数が最大１個である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ａが酸素であり；そしてＥが-C(O)-C(O)-である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１４】
以下の式を有する化合物：
0004759762.tif 000113
ここで：
Ｂは、プロピル、エチル、または1-メチルエテニルであり；
Ｄは、フェニル、N-モルホリニル、4-ヒドロキシシクロヘキシル、4-(N-メチル)-ピペリジニル、4-ピリジル、またはピラニルであり；
Ｇは、3,4,5-トリメトキシフェニル、3,4-ジメトキシフェニル、4-フルオロフェニル、2-フラニル、1,1-ジメチル-2-メトキシエチル、t-ブチル、4-(4-ヒドロキシ)ピラニル、4-ピラニル、イソブチル、イソプロピル、1-メチルシクロヘキシル、1,1,2-トリメチルプロピル、1-ヒドロキシシクロヘキシル、1-トリメチルプロピル、4-メトキシ-1-ヒドロキシ-シクロヘキシル、5-メトキシメチル-2-メチルフェニル、2-メチルシクロヘキシル、5-(1-メチル-1-メトキシエチル)-2-メチルシクロヘキシル-2-エニル、2-メチルシクロヘキシル、5-(1-メチル-1-メトキシエチル)-2-メチルシクロヘキシル、5-エトキシ-2-メチルシクロヘキシル、4-エトキシ-N-アセト-2-ピロリジニル、または5-イソプロピル-2-メチルシクロヘキシルであり；そして
Ｊは、4-フェニル-1-(3-ピリジル)-1-ブテニル、2,5-ジエトキシフェニル、4-フェニル-1-(3-ピリジル-N-オキシド)-1-ブテニル、2-メトキシフェニル、1-(3-ピリジル)-1-ペンテニル、2-エトキシフェニル、2,5-ジプロポキシフェニル、2,6-ジメトキシフェニル、1-(3-ピリジル)-1-ブテニル、1-(3-ピリジル)-1-ペンテニル、1-(3-ピリジル)-1-ヘキセニル、1-(4-メチルフェニル)-1-ペンテニル、2,6-ジメトキシメチルフェニル、1-シクロヘキシル-1-ペンテニル、2-エトキシメチル-N-インドリル、1-シクロヘキシル-3-メトキシ-1-プロペニル、2,6-ジエトキシメチルフェニル、1-(3-ピリジル)-1-ヘキサ-1,5-ジエニル、1-(4-ピラニル)-1-ヘキサ-1,5-ジエニル、1-シクロヘキシル-1-ヘキセニル、2,5-ジプロピル-N-ピロリル、2-メチル-5-ブチル-N-ピロリル、3-(1-メトキシ)-2-ヘキセニル、3-(1-メトキシ)-4-メチル-2-ペンテニル、2,5-ジメチル-N-ピロリル、3-(2-メチル)-3-ヘプテニル、または2-(2-ヘキセニル)であり；そして
Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、独立して、CH、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択される。
【請求項１５】
請求項１１に記載の化合物、またはその塩、および薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、またはビヒクルを含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
化学療法剤、化学増感剤または神経栄養因子をさらに含む、請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記化学療法剤が、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、アムサクリン、ミトキサントロン、テニパシド、タキソール、またはコルヒチンから選択される、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記化学増感剤が、シクロスポリンＡおよびそのアナログ、フェノチアジン、またはチオキサンテンから選択される、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記神経栄養因子が、神経成長因子(NGF)、インシュリン成長因子(IGF)およびそれらの活性な切断された誘導体、酸性繊維芽細胞成長因子(aFGF)、塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニューロトロフィン-3(NT-3)、およびニューロトロフィン-4/5(NT-4/5)から選択される、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
多剤耐性を処置もしくは予防するための薬学的組成物の調製のための、請求項１１に記載の化合物、またはその塩の使用。
【請求項２１】
多剤耐性を処置もしくは予防するための薬学的組成物であって、該組成物が、請求項１１に記載の化合物、またはその塩を含む、組成物。
【請求項２２】
請求項１４に記載の化合物、またはその塩、および薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、またはビヒクルを含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
多剤耐性を処置もしくは予防するための薬学的組成物の調製のための、請求項１４に記載の化合物、またはその塩の使用。
【請求項２４】
多剤耐性を処置もしくは予防するための薬学的組成物であって、該組成物が、請求項１４に記載の化合物、またはその塩を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、治療剤または予防剤に対する細胞の感受性を維持するか、高めるか、または回復できる新規化合物に関する。本発明はまた、これらの化合物を含有する薬学的組成物に関する。本発明の化合物および薬学的組成物は、多剤耐性(multi-drug resistance)の拡大を防止するためおよび多剤耐性癌の処置に使用するために、多剤耐性細胞の治療に、特によく適合する。本発明はまた、神経細胞中の神経突起の成長を刺激する方法および薬学的組成物に関する。
発明の背景
化学療法レジメの効能に影響を与える主要な問題点には、化学療法剤に曝すと、多数の構造的に無関係の薬物および治療剤に耐性になる細胞の進化がある。このような多剤耐性の出現は、しばしば、170-kD膜のP-糖タンパク質(gp-170またはMDR1)の過剰発現の存在下にて起こる。このgp-170タンパク質は、癌細胞株だけでなく、ある種の健康な組織の血漿膜にも存在し、細菌輸送タンパク質と同族である(Haitら、Cancer Communications、Vol. 1(1)、35(1989)；West、TIBS、Vol. 15、42(1990))。このタンパク質は、輸出ポンプとして作用し、毒性化学物質を積極的に押出すことにより、薬物耐性を与える。このポンプの機構は未知であるものの、このgp-タンパク質が、ある種の化学的特性または物理的特性(例えば、疎水性、カルボニル基の存在、またはグルタチオン結合体の存在)を共有する物質を追い出すことにより、機能すると推測されている(Westを参照)。
最近では、検出可能なP-糖タンパク質を欠いたMDR細胞株のH69AR細胞において、多剤耐性の原因となる他のタンパク質、すなわち、MRP(多剤耐性関連タンパク質)が同定された(S. P. C. Coleら、Science、258、pp. 1650-54(1992))。MRPはまた、他の非P-糖タンパク質MDR細胞株(例えば、HL60/ADRおよびMCF-7乳癌細胞)でも、検出されている(E. Schneiderら、Cancer Res.、54、pp. 152-58(1994)；およびN. Krishnamacharyら、Cancer Res.、53、pp. 3658-61(1993))。
このMRP遺伝子は、このATP結合カセット上科の他のメンバーである190kDの膜会合タンパク質をコードする。MRPは、P-糖タンパク質と同様に機能すると思われ、この細胞から天然産物薬物を除去するためのポンプとして、作用する。MRPに対する可能な薬理学作用は、グルタチオンS-結合体のATP依存性の輸送であり得る(G. Jedlitschkyら、Cancer Res.、54、pp. 4833-36(1994)；I. Leierら、J. Biol. Chem.、269、pp. 27807-10(1994)；およびMullerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、91、pp. 13033-37(1994))。
臨床的な薬物耐性におけるMRPの役割は、依然として、明確に規定すべきであるが、MRPは、抗癌剤に対する広範な耐性の原因となる他のタンパク質であり得ると思われる。
多剤耐性を抑制し、そして薬物感受性を回復するために、種々の化学薬剤が投与されている。ある薬物は、化学療法剤に対する多剤耐性(「MDR」)細胞の応答性を改善するものの、それらは、しばしば、望ましくない臨床上の副作用を伴う(Haitらを参照せよ)。例えば、シクロスポリンＡ(「CsA」)は、広く認められた免疫抑制剤であり、ある種の癌細胞を化学療法剤に対して敏感にできるものの(Slaterら、Br. J. Cancer、Vol. 54、235(1986))、この効果を得るのに必要な濃度では、その免疫系が化学療法によって既に傷つけられた患者において、著しい免疫抑制が生じる(Haitらを参照せよ)。さらに、CsAの使用は、しばしば、腎毒性、肝毒性および中枢神経系疾患を含めた好ましくない副作用を伴う。同様に、カルシウム輸送ブロッカーおよびカルモジュリンインヒビターの両方は、MDR細胞を敏感にするが、それぞれは、望ましくない生理学的効果を生じる(Haitら；Twentymanら、Br. J. Cancer、Vol. 56、55(1987)を参照せよ)。
最近では、MDR細胞の感作において、臨床的に価値が高い可能性があり得る薬剤が開発されている。これらの薬剤には、免疫抑制作用を示さないCsAアナログ(例えば、11-メチル-ロイシンシクロスポリン(11-met-leu CsA)(Haitら；Twentymanらを参照せよ))、または低用量で効果的であり得る薬剤(例えば、免疫抑制剤FK-506(Epand and Epand、Anti-Cancer Drug Design 6、189(1991)))が挙げられる。PCT公報WO 94/07858は、このイムノフィリンFK-506およびラパマイシンとある程度構造的に類似した、新規な種類のMDR改変剤に言及している。これらの開発にもかかわらず、依然として、MDR細胞を治療剤または予防剤に対して再感作するか、または多剤耐性の進行を防止するために使用できる、さらに効果的な薬剤が必要とされている。
興味深いことに、イムノフィリンFK506のような化合物は、多剤耐性に対して効果的であるだけでなく、神経突起の成長を刺激するのにも効果的であることが明らかになった。同時係属中の米国特許出願第08/486,004号では、本発明の共同出願人は、他のMDR逆転化合物(reversing compound)もまた、外来性または内在性NGFの存在下または非存在下にて、神経突起の成長を刺激できることを発見した。これらの化合物は、全て、細胞タンパク質FKBP12を結合する能力を有していた。FKBP12単独の発現は、神経細胞にて、神経突起の成長を刺激することが分かったので、FKBP21は、神経突起の成長と関連していると思われる。
W. E. Lyonsら[Proc. Natl. Acad. Sci. USA、91、pp. 3191-95(1994)]は、FK506が、ラット褐色細胞腫の細胞株にて、神経突起の成長を刺激する際に、神経成長因子(NGF)と相乗的に作用することを立証した。興味深いことに、別のイムノフィリンであるラパマイシンは、神経突起の成長に対するFK-506の効果を阻害せず、むしろ、それ自体、神経親和性であって、FK-506と共に、追加効果を示す。知覚神経節では、FK-506は、類似の神経親和性効果を示したが、そのような効果は、ラパマイシンにより妨害された。ラパマイシンおよびFK506の両方は、細胞タンパク質、FK506結合タンパク質またはFKBP12に結合する能力を有する。
これらの結果から、著者は、FK-506が、それがFKBP12およびカルシニウリン(calcineurin)との複合体化および後者のホスファターゼ活性の阻害によって、その神経親和性効果を発揮したとの推測に達した。他方、著者は、FK-506が、「ストリッピング」機構(例えば、膜レセプタ、RyRおよびIP3RからのFKBP12の除去に関与しているもの)を介して作用することを提案した。
神経突起の成長を刺激することにより処置できる広範囲の疾患、およびこの特性を有することが知られている比較的少数のFKBP12結合化合物を考慮すると、別の神経親和性FKBP12結合化合物が、非常に必要とされている。
発明の要旨
本発明は、先に記述のMDR改変剤と比べて、多剤耐性(「MDR」)細胞の薬物感受性を維持するか、高めるか、または回復させる能力を驚くほど改良した新規化合物、これらの化合物を含有する組成物およびそれらの使用方法を提供する。本発明の化合物は、単独で使用できるか、または細胞(特に、MDR細胞)における薬物の治療効果または予防効果を維持するか、高めるか、または回復させるか、またはMDR細胞の発育を防止する他の治療剤または予防剤と組み合わせて、使用できる。本発明の１実施態様に従って、これらの新規化合物、組成物および方法は、癌および他の疾患用の処置または予防用の化学療法レジメを補助するかまたは向上させるために、有利に使用される。本発明はまた、本発明の化合物の調製方法およびこれらの方法で有用な中間体を提供する。
他の実施態様では、本発明はまた、神経細胞内の神経突起の成長を刺激する方法および薬学的組成物に関する。本発明の化合物は、FKBP12を結合し、そして神経突起の成長の著しい増加を引き起こす。
提供された神経親和性組成物は、本発明の化合物を、単独でまたは公知の神経親和性因子と組み合わせて、含有する。本明細書中で記述の方法は、神経突起の成長を引き起こすこれらの組成物を使用し、それゆえ、種々の疾患および身体の外傷により生じる神経の損傷を処置するのに有用である。
発明の詳細な説明
本発明は、２種の関連した種類の化合物に関し、これらは、多剤耐性(MDR)細胞における薬物の効力を高めるか、または神経細胞における神経突起の成長を刺激するかのいずれかの能力を有する。これらの種類の化合物の１つは、式(Ｉ)により表わされる：
0004759762.tif 000002
ここで：
Ａは、CH2、Ｏ、NH、またはN-[(C1-C4)-アルキル]であり；
Ｂは、(C1-C6)-直鎖または分枝鎖アルキルであるか、あるいは(C2-C6)-直鎖または分枝鎖のアルケニルまたはアルキニルであり、ここで、Ｂの１個の炭素原子が、必要に応じて、Ｏ、Ｓ、SO、SO2、NH、またはN-[(C1-C4)-アルキル]で置換される；
Ｄは、1-[(C1-C4)-アルキル]-4-ピペリジニル、1-ピペラジニル、1-[(C1-C4)-アルキル]-4-ピペラジニル；必要に応じて環の３位および/または４位に置換基を含む、５員〜７員のシクロアルキル環またはシクロアルケニル環であり、ここで、該置換基が、オキソ、OH、(C1-C4)-アルキル、O-[(C1-C4)-アルキル]、O-[(C2-C4)-アルケニル]、NH2、N,Nジ-[(C1-C4)-アルキル]アミノ、またはハロゲンから選択され；あるいは、各環が５員〜６員でなり、必要に応じて、Ｎ、Ｏ、またはＳから独立して選択される４個までのヘテロ原子を含む、単環式または二環式の芳香族環構造であり；
Ｅは、SO2、または-C(O)-C(O)-であり；
Ｇは、1-[(C1-C4)-アルキル]-4-ピペリジニル、1-ピペラジニル、1-[(C1-C4)-アルキル]-4-ピペラジニル、(C1-C7)-直鎖または分枝鎖アルキル、(C2-C7)-直鎖または分枝鎖のアルケニルまたはアルキニル、(C5-C7)-シクロアルキルであるか、あるいは各環が５員〜６員でなる単環式または二環式の芳香族環構造であり；ここで、任意のＧ中の２個までの炭素原子が、必要に応じてＯ、Ｓ、SO、SO2、またはＮによって独立して置換され；
ここで、Ｇは、必要に応じて、以下から独立して選択される３個までの置換基を含む：ハロゲン、ヒドロキシル、(C1-C6)-直鎖または分枝鎖アルキル、(C2-C6)-直鎖または分枝鎖アルケニル、O-[(C1-C5)-直鎖または分枝鎖アルキル]、O-[(C2-C5)-直鎖または分枝鎖アルケニル]、O-ベンジル、アミノ、カルボキシル、N-[(C1-C5)-直鎖または分枝鎖アルキル]、N-[(C2-C5)-直鎖または分枝鎖アルケニル]、トリフルオロメチル、またはトリフルオロメトキシ；そしてここで、任意の独立した置換基の１個の炭素原子は、必要に応じてＯ、Ｎ、またはＳで置換される；
Ｑは、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択される１個〜２個のヘテロ原子を含む５員芳香族環であるか、あるいはＮ、Ｏ、またはＳから選択される０個〜２個のヘテロ原子を含む６員芳香族環であり；
Ｊは、５員または６員からなるＱの各環中の３位に結合した、単環式または二環式の芳香族環構造であり、必要に応じて、Ｏ、Ｓ、またはＮから独立して選択される４個までのヘテロ原子を含む；
ここで、Ｊは、必要に応じて、以下から独立して選択される３個までの置換基を含む：ハロ、OH、CH2OH、NO2、SO3H、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、O-フェニル、1,2-メチレンジオキシ、NR1R2、アミノ、カルボキシル、N-[(C1-C5)-直鎖または分枝鎖アルキル]-カルボキサミド、N-[(C2-C5)-直鎖または分枝鎖アルケニル]-カルボキサミド、N-モルホリノカルボキサミド、N-ベンジルカルボキサミド、N-チオモルホリノカルボキサミド、N-ピコリノイルカルボキサミド、モルホリニル、ピペリジニル、O-R3、CH2-(CH2)q-R3、O-(CH2)q-R3、(CH2)q-O-R3、CH=CH-R3、(C1-C6)-直鎖または分枝鎖アルキル、あるいは(C2-C6)-直鎖または分枝鎖アルキルであり、ここで、任意の置換基において、１個の炭素原子が、必要に応じて、Ｏ、Ｓ、SO、SO2、NH、またはN-[(C1-C4)-アルキル]からなる群から選択されるヘテロ原子で置換され；
ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、水素、(C1-C6)-直鎖または分枝鎖アルキル、(C2-C6)-直鎖または分枝鎖のアルケニルまたはアルキニルおよびベンジルからなる群から選択され；
Ｒ3は、4-メトキシフェニル、2-ピリジル、3-ピリジル、4-ピリジル、ピラジル、キノリル、3,5-ジメチルイソキサゾイル、2-メチルチアゾイル、チアゾイル、2-チエニル、3-チエニル、およびピリミジルからなる群から選択され；そして
ｑは、０〜２であり；
ｎは、１または２である。
上で挙げた「Qの３位」は、この化合物の残りの部分に対するQの結合点と関連している。本願の目的上、この結合点は、適当な化学専門用語と不一致である可能性があるにもかかわらず、その１位と称される。
O、S、SO、SO2、NHまたはN−[(C1−C4)−アルキル]「により必要に応じて置き換えた」ものに関連して、本明細書中で使用される「炭素原子」との用語には、その炭素原子がアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはシクロアルケニルの鎖または環のどこに位置しているかに依存して、C、CH、CH2またはCH3が含まれる。同様に、O、S、SO、SO2、NHまたはN−[(C1−C4)−アルキル]による置換が指示する内容には、また、この鎖または環における置換位置に依存して、O、OH、S、SH、SH2、SO、SOH、N、NH、NH2、N−[(C1−C4)−アルキル]およびN(H)−[(C1−C4)−アルキル]が含まれる。
本発明の他の種類の化合物は、式(II)により表わされる：
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ここで：
Ａ、Ｂ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、およびＱは、上記で定義した通りであり；
Ｋは、Ｈ、(C5-C7)シクロアルキル、(C5-C6)芳香族環、1-[(C1-C4)-アルキル]-4-ピペリジニル、1-ピペラジニル、1-[(C1-C4)-アルキル]-4-ピペラジニル、(C1-C7)直鎖または分枝鎖アルキル、(C2-C7)直鎖または分枝鎖のアルケニルまたはアルキニルであり、ここで、Ｋ中の２個までの炭素原子は、必要に応じて、Ｏ、Ｓ、SO、SO2、NH、NO、またはN-(C1-C4)アルキルで独立して置換され、
ここで、Ｋは、必要に応じて、ハロ、アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ、メトキシ、または(C1-C3)アルキルから独立して選択される２個までの置換基を含み；そして
ＬおよびＭは、Ｈ、(C1-C7)直鎖または分枝鎖アルキル、(C2-C7)直鎖または分枝鎖のアルケニルまたはアルキニルから独立して選択され、ここで、R2およびR3中の１個の炭素原子が、必要に応じてＯ、Ｓ、SO、SO2、NH、またはN-(C1-C4)アルキルで置換され、
ここで、ＬおよびＭは、必要に応じて、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、または５員〜６員の芳香族環から独立して選択される２個までの置換基を含み、該芳香族環は、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択される２個までのヘテロ原子を含み；そしてｎは、１または２である。
本発明の式(I)および(II)の化合物には、全ての光学異性体およびラセミ異性体が含まれる。１位および２位の立体化学は、RまたはSのいずれかであり得る。好ましい実施態様では、１位の立体化学は、Sである。
好ましくは、式(Ｉ)または式(II)のいずれかの化合物に存在し得る単環式または二環式の環のどれも、環１個あたり、１個を超えるヘテロ原子を含有しない。
さらに好ましくは、式(Ｉ)および式(II)の化合物では、Aは、酸素であり、そしてEは、−C(O)−C(O)−である。ｎが２であり、Qにおけるヘテロ原子の可能な位置に、１位および３位(すなわち、芳香環がこの分子の残りと結合している位置、およびJがこの芳香環と結合している位置)が含まれない化合物は、さらにより好ましい。これらの化合物は、式(III)および式(IV)により表わされる：
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好ましくは、式(III)および式(IV)の化合物では：
Ｂは、プロピル、エチル、または1-メチルエテニルであり；
Ｄは、フェニル、N-モルホリニル、4-ヒドロキシシクロヘキシル、4-(N-メチル)-ピペリジニル、4-ピリジル、またはピラニルであり；
Ｇは、3,4,5-トリメトキシフェニル、3,4-ジメトキシフェニル、4-フルオロフェニル、2-フラニル、1,1-ジメチル-2-メトキシエチル、t-ブチル、4-(４-ヒドロキシ)ピラニル、イソブチル、4-ピラニル、イソブチル、イソプロピル、1-メチルシクロヘキシル、1,1,2-トリメチルプロピル、1-ヒドロキシシクロヘキシル、1-トリメチルプロピル、4-メトキシ-1-ヒドロキシ-シクロヘキシル、5-メトキシメチル-2-メチルフェニル、2-メチルシクロヘキシル、5-(1-メチル-1-メトキシエチル)-2-メチルシクロヘキシル-2-エニル、2-メチルシクロヘキシル、5-(1-メチル-1-メトキシエチル)-2-メチルシクロヘキシル、5-エトキシ-2-メチルシクロヘキシル、4-エトキシ-N-アセト-2-ピロリジニル、または5-イソプロピル-2-メチルシクロヘキシルであり；そして
Ｊは、4-フェニル-1-(3-ピリジル)-1-ブテニル、2,5-ジエトキシフェニル、4-フェニル-1-(3-ピリジル-N-オキシド)-1-ブテニル、2-メトキシフェニル、1-(3-ピリジル)-1-ペンテニル、2-エトキシフェニル、2,5-ジプロポキシフェニル、2,6-ジメトキシフェニル、1-(3-ピリジル)-1-ブテニル、1-(3-ピリジル)-1-ペンテニル、1-(3-ピリジル)-1-ヘキセニル、1-(4-メチルフェニル)-1-ペンテニル、2,6-ジメトキシメチルフェニル、1-シクロヘキシル-1-ペンテニル、2-エトキシメチル-N-インドリル、1-シクロヘキシル-3-メトキシ-1-プロペニル、2,6-ジエトキシメチルフェニル、1-(3-ピリジル)-1-ヘキサ-1,5-ジエニル、1-(4-ピラニル)-1-ヘキサ-1,5-ジエニル、1-シクロヘキシル-1-ヘキセニル、2,5-ジプロピル-N-ピロリル、2-メチル-5-ブチル-N-ピロリル、3-(1-メトキシ)-2-ヘキセニル、3-(1-メトキシ)-4-メチル-2-ペンテニル、2,5-ジメチル-N-ピロリル、3-(2-メチル)-3-ヘプテニル、または2-(2-ヘキセニル)であり；そして
Ｗ、Ｘ、Ｙ、およびＺは、独立して、CH、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択される。
本発明の最も好ましい化合物は、式(III)および式(IV)により表わされ、以下の表で挙げた他の成分および配向(「R/S」)を有するものである。式(III)の化合物は、「W」成分がない(これは、この表では、「−」で示される)ことにより、式(IV)の化合物とは区別される。
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本発明の化合物は、任意の通常の方法を用いて、得ることができる。好ましくは、これらの化合物は、容易に入手できる出発物質(例えば、α−アミノ酸)から、化学的に合成される。これらの化合物の合成のためにモジュール法および収束法もまた、好ましい。収束法では、成長分子鎖への小断片の増加付加の代わりに、例えば、最終生成物の大部分が、合成の最終段階にて、一緒にされる。本願の実施例では、これらの化合物の種々の合成スキームが提示されている。
本発明の組成物および方法で使用する化合物は、選択的な生物学的特性を高める適当な官能性を付加することにより、修飾できる。このような修飾は、当該技術分野で公知であり、与えられた生物学的系(例えば、血液、リンパ系、中枢神経系)への生物学的貫入を高めること、経口受容可能性を高めること、注射による投与ができるように溶解性を高めること、代謝を変えることおよび排出速度を変えることを含む。
本発明の化合物は、細胞毒性化合物(例えば、化学療法において、典型的に用いられるもの)に対するMDR細胞の感受性を高め、回復しまたは維持する能力により特徴付けられる。この能力に基づいて、本発明の化合物は、薬物耐性の癌、腫瘍、転移または疾患を罹った患者において、化学療法の効率を高めるために、有利に使用される。さらに、本発明の化合物は、非耐性細胞において、処置剤または予防剤に対する感受性を維持できる。従って、本発明の化合物は、患者において、多剤耐性(「MDR」)を処置するかまたは防止するのに、有用である。さらに特定すると、これらの化合物は、P-糖タンパク質が媒介したMDR、およびMRPが媒介したMDRを処置し防止するのに、有用である。
本発明の化合物はまた、FKBP-12に対するそれらの結合親和性によって、神経突起の成長を刺激する能力により、特徴付けられる。その能力に基づいて、本発明の化合物は、外傷または疾患の結果として神経損傷を患った患者において、神経の成長を刺激するのに使用できる。
本明細書全体にわたって使用する「患者」の用語は、ヒトを含めた哺乳動物を意味する。
多剤耐性は、当該技術分野では、細胞内に、２種の独立したタンパク質(MDR1 P-糖タンパク質またはMRPタンパク質)が存在することにより、ある程度まで、説明されている。いずれかのタンパク質により生じる薬物感受性を回復することに対する本発明の化合物の有効性を定量する方法は、公知である。例えば、本発明の化合物を試験するには、薬物の抗増殖活性の回復を測定するのに公知のいずれかのアッセイが使用できる。これらのアッセイは、特定の薬物に耐性がありかつMDR1およびMRPの１個または両方の存在により特徴付けられる細胞株を使用する。これらの細胞株には、HL60/ADR、L1210、P338D、CHOおよびMCF7が挙げられる。次いで、この細胞株は、それが耐性のある薬物(例えば、ドキソルビシン)の存在下または非存在下にて、本発明の化合物に曝露される。
本発明の化合物の神経栄養活性は、それらのFKBP12に対する親和性およびそれらがFKBP12ロトマーゼ(rotomase)活性を阻害する能力に直接関係している。これらの特性を対象とするためには、当該技術分野で公知のいくつかのアッセイが使用できる。例えば、報告配位子として標識FK-506を用いた競合LH20結合アッセイが、M. W. Hardingら,Nature,341,758-60頁(1989)およびJ. J. Siekierkaら,Nature,341,755-57頁(1989)に記述されている。
好ましくは、このアッセイは、FKBP12ロトマーゼ活性の阻害を測定する。このようなアッセイはまた、M. W. Hardingら(前出)およびJ. J. Siekierkaら(前出)により、記述されている。このアッセイでは、人工基質(N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリド)の異性化に続いて、分光測光分析が行われる。このアッセイには、シス形態の基質FKBP12、インヒビターおよびキモトリプシンが含まれる。キモトリプシンは、この基質のトランス形から、p-ニトロアニリドを開裂できるが、シス形からはそれを開裂できない。p-ニトロアニリドの放出が測定される。
他の実施態様によれば、本発明は、多剤耐性の処置または防止に効果的な量で、本発明の化合物またはそれらの薬学的受容可能な誘導体を含有する薬学的組成物を提供する。他の実施態様によれば、本発明は、神経突起の成長を刺激するのに効果的な量で、本発明の化合物またはそれらの薬学的受容可能な誘導体を含有する薬学的組成物を提供する。「薬学的受容可能な誘導体」とは、患者に投与すると、(直接的または間接的に)本発明の化合物を提供できる本発明の化合物または任意の他のいずれかの化合物の任意の薬学的受容可能な塩、エステル、またはこのようなエステルの塩を表わす。
薬学的受容可能な塩は、無機または有機の酸および塩基から誘導される。このような酸塩には、以下が挙げられる：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウ硫酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモエート、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシレートおよびウンデカン酸塩。塩基性塩には、アンモニウム塩、アルカリ金属塩(例えば、ナトリウム塩およびカリウム塩)、アルカリ土類金属塩(例えば、カルシウム塩およびマグネシウム塩)、有機塩基を有する塩(例えば、ジシクロヘキシルアミン塩)、N-メチル-D-グルカミン、およびアミノ酸(アルギニン、リジン)を有する塩などが挙げられる。また、この塩基性窒素含有基は、低級アルキルハロゲン化物(塩化、臭化およびヨウ化メチル、エチル、プロピル、およびブチル)；硫酸ジアルキル(例えば、硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミル)；長鎖ハロゲン化物(例えば、塩化、臭化およびヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリル)、ハロゲン化アラルキル(例えば、臭化ベンジルおよびフェネチル)などのような試薬で四級化できる。それにより、水溶性または油溶性または水分散性または油分散性の生成物が得られる。
本発明の薬学的組成物は、さらに、いずれかの薬学的受容可能なキャリア、アバジェンドまたはビヒクルを含有する。本発明の薬学的組成物で使用できる薬学的受容可能なキャリア、アバジェンドおよびビヒクルには、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク(例えば、ヒト血清アルブミン)、緩衝液基質(例えば、リン酸塩)、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質(例えば、硫酸プロタミン)、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリル酸エステル、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロック重合体、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられるがこれらに限定されない。
本発明によれば、薬学的組成物は、無菌の非経口製剤の形状(例えば、無菌の注射可能な水性懸濁液または油性懸濁液)であり得る。本明細書で使用する「非経口的」の用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、鞘内、病巣内および頭蓋内の注射技術または注入技術を含める
この非経口的調製剤は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて、当該技術分野で公知の技術に従って、処方できる。この無菌の注射可能な製剤はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中(例えば、1,3-ブタンジオール中の溶液として)の無菌の注射可能な溶液または懸濁液であり得る。使用できる適当なビヒクルおよび溶媒には、水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、従来、溶媒または懸濁媒体として、無菌の不揮発性油が使用されている。この目的には、いずれかのブランドの不揮発性油が使用でき、これには、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドが含まれる。脂肪酸(例えば、オレイン酸)およびそのグリセリド誘導体は、天然の薬学的に受容可能なオイル(例えば、オリーブ油またはひまし油、特に、それらのポリオキシエチル化した型)と同様に、注射可能物の調製に有用である。これらのオイル溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤(例えば、Ph. Helvまたは類似のアルコール)を含有できる。
本発明の薬学的組成物は、いずれかの経口的に受容可能な投薬形状(これには、カプセル、錠剤、および水性懸濁液および水性溶液が含まれるが、それらに限定されない)で、経口的に投与できる。経口用途のための錠剤の場合には、通常使用されるキャリアには、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム)もまた、典型的に、添加される。カプセル形状での経口投与に有用な希釈剤には、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。経口用途に水性懸濁液が必要な場合、その活性成分は、乳化剤および懸濁剤と組み合わされる。所望ならば、ある種の甘味料、香料または着色剤を添加してもよい。
他方、本発明の薬学的組成物はまた、直腸投与のための座剤の形状で、投与できる。これらの組成物は、この試薬と、適切な非刺激性の賦形剤(これは、室温で固体であるが、直腸温では液体であり、従って、直腸で融けて薬物を放出する)と混合することにより、調製できる。このような物質には、ココアバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールが挙げられる。
本発明の薬学的組成物はまた、特に、処置の標的が、局所的な適用により容易にアクセスできる領域または器官(目、皮膚または下部腸道の疾患を含む)を含む場合、局所的に投与できる。これらの領域または器官のそれぞれに適切な局所製剤は、容易に調製できる。
下部腸道に対する局所適用は、直腸座剤製剤(上記参照)により、または適当な浣腸製剤にて、行うことができる。局所的な経皮パッチもまた、使用できる。
局所的に適用するためには、この薬学的組成物は、１種またはそれ以上のキャリアに懸濁するかまたは溶解した活性成分を含む適切な軟膏で、処方してもよい。本発明の化合物の局所投与用のキャリアには、鉱油、液状ワセリン、透明ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。他方、この薬学的組成物は、１種またはそれ以上の薬学的に受容可能なキャリアに懸濁するかまたは溶解した活性化合物を含む適切なローションまたはクリームで処方できる。適切なキャリアには、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。
眼科用途には、この薬学的組成物は、防腐剤(例えば、ベンジルアルコニウムクロライド)と共にまたはなしで、pHを調整した等張性の滅菌生理食塩水の微細化懸濁液として、または、好ましくは、pHを調整した等張性の滅菌生理食塩水の溶液として、処方できる。他方、眼科用途には、この薬学的組成物は、軟膏(例えば、ペトロラタム)で処方できる。
本発明の薬学的組成物はまた、鼻エアロゾルまたは鼻吸入により、投与できる。このような組成物は、薬学的処方の当該技術分野で公知の技術に従って、調製され、サリン中の溶液として、ベンジルアルコールまたは他の適切な防腐剤、生物学的利用能を高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン、および/または他の通常の可溶化剤または分散剤を使用して、調製できる。
単一の投薬形状を生成するこのキャリア物質と組み合わせ得る活性成分の量は、処置する対象、および特定の投与様式に依存して、変わる。しかしながら、任意の特定の患者に対する特定の投薬量および処置レジメは、種々の要因に依存し、これには、使用する特定の化合物の活性、その患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および常食、この化合物の投与時間および排出速度、特定の薬物の組合せ、および処置する医師の判断および処置すべき特定の疾患の重篤度が含まれる。活性成分の量はまた、もしこの成分と共に投与される処置剤または予防剤があればそれに依存する。
好ましい実施態様によれば、本発明の化合物は、所望の用途によって、処置剤または神経栄養剤と組み合わせて、投与される。
例えば、本発明の化合物は、この患者内のMDR細胞の感受性を高めるために、１種またはそれ以上の化学療法剤(例えば、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、アムサクリン、マイトキサントロン、テニパシド(tenipaside)、タキソールおよびコルチシン)と共に、投与できる。同じ目的のために、本発明の化合物はまた、化学感作剤(例えば、シクロスポリンＡおよびその類似物、フェノチアジンおよびチオキサンテン(thioxantheres))と組み合わせて、投与できる。本明細書で使用される場合、「化学感作剤」の用語は、本発明の化合物を除外する。
神経栄養用途には、本発明の化合物は、他の神経栄養因子、例えば、神経成長因子(NGF)、インシュリン成長因子(IGF-1)およびその活性トランケート誘導体(例えば、gIGF-1)、酸性および塩基性繊維芽細胞成長因子(それぞれ、aFGFおよびbFGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、ニューロトロフィン-3(NT-3)およびニューロトロフィン4/5(NT-4/5)と組み合わせることができる。本明細書で使用する「神経栄養因子」の用語は、FK-506およびラパマイシンだけでなく、本明細書で記述のFKBP12結合化合物も除外する。
この追加試薬は、単一の薬学的組成物の一部にしても良く、または別個に逐次または同時に患者に投与しても良い。それゆえ、好ましい１実施態様によれば、本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物および化学感作剤を含有する。他の好ましい実施態様によれば、本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物および化学療法剤を含有する。さらに他の好ましい実施態様によれば、本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物および神経栄養剤を含有する。
他の実施態様によれば、本発明は、本発明の組成物を投与することにより、患者における多剤耐性を処置するかまたは防止する方法を提供する。MDRを処置するかまたは防止するのに効果的な投薬量レベルは、約0.01mg/体重１kg/１日と約100mg/体重１kg/１日との間、好ましくは、約0.5mg/体重１kg/１日と約50mg/体重１kg/１日との間の範囲の本発明の化合物である。MDRを処置するのに使用する典型的な組成物は、それが本発明の化合物の単独でも、本発明の化合物と他の化学療法剤または化学感作剤との組合せでも、約５％と約95％の間の活性化合物(w/w)を含有する。好ましくは、このような調製物は、約20％と約80％の間の活性化合物を含有する。
本発明の化合物と組み合わせて使用される化学感作剤または化学療法剤の量は、同一組成物の一部でも別個に投与されても、単独処置で使用する量よりも少ない。好ましくは、化学感作剤または化学療法剤の量は、単独処置で使用する投薬量の80％未満である。このような試薬の単独処置投薬量は、当該技術分野で公知である。
他の実施態様では、本発明は、本発明の組成物を投与することにより、神経突起成長を刺激する方法を提供する。この化合物および必要に応じて神経栄養因子(単一投薬形状を形成するためにキャリア物質と組合せ得る)の量は、処置する患者、特定の投与様式に依存して変わる。本発明の薬学的組成物の２種の活性成分は、相乗的に作用し神経突起成長を刺激する。
多剤耐性の処置または神経突起成長の刺激では、約0.01mg/体重１kg/１日と約100mg/体重１kg/１日の間、好ましくは、約0.5mg/体重１kg/１日と約50mg/体重１kg/１日の間の投薬量レベルのこの活性成分化合物が、有用である。典型的な調製物は、約５％と約95％の間の活性化合物(w/w)を含有する。好ましくは、このような調製物は、約20％と約80％の間の活性化合物を含有する。
これらの組成物および組合せ療法における神経栄養因子の量は、その神経栄養因子だけを使用する単独処置で必要な量より少ない。好ましくは、この組成物は、0.01〜100mg/体重１kg/１日の間の投薬量の本発明の化合物を投与できるように、処方されるべきである。この神経栄養因子は、同一組成物の一部でも別個に投与されても、0.01μｇ/体重１kg/１日と100μｇ/体重１kg/１日の間の投薬量で、投与するべきである。
本発明の神経栄養方法および組成物は、種々の疾患または外傷により起こる神経損傷の修復を処置するのに使用できる。これらには、アルツハイマー病、パーキンソン病、ALS、卒中および卒中に関連する虚血、神経パロパシー(paropathy)、他の神経変性疾患、運動神経疾患、坐骨神経挫傷、脊髄傷害および顔面神経挫傷が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明をさらに充分に理解するために、以下の実施例を示す。これらの実施例は、例示の目的だけのためのものであり、いずれの様式でも、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
実施例１--化合物11の調製
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ブロモヒドロキノン(10.0ｇ、0.053mol)のDMF(70mL)溶液に、1-ブロモプロパン(39.0ｇ、0.318mol)および炭酸セシウム(50ｇ、0.153mol)を添加し、そして90℃で２日間加熱した。この反応混合物をセライトで濾過し、そして酢酸エチル(500mL)で洗浄した。この溶液を濃縮し、そして0.25％酢酸エチル−ヘキサンで溶出するシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、無色のオイルとして、ブロモベンゼン(136)(9.0g，62%)を得た；
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ブロモベンゼン(136)(6.6ｇ、24.2mmole)のTHF(50mL)溶液に、−78℃で、窒素雰囲気下にて、ヘキサン中のn-BuLi(1.6M、33ml、52.9mmole)を滴下し、そして同じ温度で１時間撹拌した。得られた混合物を、−78℃で、トリメチルボレート(9.0ml、79.5mmole)で処理し、そして３時間にわたって、室温まで暖めた。この反応混合物にHCl水溶液(100mL、７％)を添加し、そして室温で一晩撹拌した。その水層をCH2Cl2で洗浄した。全ての有機物を合わせ、そしてMgSO4で乾燥した。この溶液を濃縮し、そして0.5％メタノール−CH2Cl2〜２％メタノール−CH2Cl2で溶出するシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、無色の固形物として、ボロン酸(boronic acid)(137)(4.3ｇ、75％)を得た；
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CH2Cl2(50mL)およびDMF(５mL)の混合物中の5-ブロモニコチン酸(5.0ｇ、24.8mmole)の溶液に、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩(5.21ｇ、27.2mmole)、N,O-ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩(2.66ｇ、27.2mmole)およびジイソプロピルエチルアミン(4.74ml、27.2mmole)を添加し、この混合物を室温で一晩撹拌した。この反応混合物をCH2Cl2(200mL)で希釈し、そして水(100ml×３)で洗浄した。その有機相をMgSO4で乾燥し、そして濃縮した。その粗製油を、33％酢酸エチル−ヘキサンで溶出するシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、透明なオイルとして、ブロモピリジン(138)(4.5ｇ、74％)を得た；
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アミド(138)(4.2ｇ、17.1mmole)のTHF(40mL)溶液に、０℃で２時間にわたって、1-ブロモ-3-フェニルプロパンおよびマグネシウムから調製したフェニルプロピルマグネシウムブロマイド(0.5M、70ml、35.0mmole)を滴下した。この反応混合物をNH4Cl水溶液(５mL)で反応停止し、そして酢酸エチル(300mL)で抽出した。これらの有機物をMgSO4で乾燥し、濃縮し、そして20％酢酸エチル−ヘキサンで溶出するシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、無色のオイルとして、ケトン(139)(2.34ｇ、45％)を得た；
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ブロモピリジン(139)(304mg、1.0mmole)およびテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(30mg、0.024mmole)のトルエン(30mL)撹拌混合溶液に、エタノール２mlに溶解したボロン酸(137)(420mg、２mmole)、およびH2O(２ml)に溶解した炭酸ナトリウム(420mg、４mmole)を連続的に添加した。得られた溶液を還流状態で２時間加熱し、そして室温まで冷却した。この溶液を酢酸エチル(100mL)で希釈し、分離した有機相をMgSO4で乾燥した。この溶液を濃縮し、そして20％酢酸エチル−ヘキサンで溶出するシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、無色のオイルとして、ビアリール(140)(215mg、55％)を得た；
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ケトン(140)(210mg、0.54mmole)のメタノール(10mL)溶液に、０℃で、水素化ホウ素ナトリウム(30mg、0.79mmole)を添加し、この混合物を室温で20分間撹拌した。この反応混合物を水(１mL)で反応停止し、そして濃縮した。その残油をCH2Cl2で抽出し、その有機相をMgSO4で乾燥した。この溶液を濃縮し、そして50％酢酸エチル−ヘキサンで溶出するシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、無色のオイルとして、アルコール(141)(157mg、74％)を得た；
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アルコール(141)のCH2Cl2(10mL)溶液に、(S)-N-2-トリメチルシリルエトキシカルボニルピペコリン酸(210mg、0.77mmole)、N-エチル-N’-1-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(150mg、0.77mmole)およびジメチルアミノピリジン(３mg、0.025mmole)を添加した。得られた混合物を室温で14時間撹拌し、そしてH2O(５mL)を添加することにより、反応停止した。この混合物をCH2Cl2(20mL)で希釈した。その有機相をMgSO4で乾燥した。この溶液を濃縮し、そして20％酢酸エチル−ヘキサンで溶出するシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、無色のオイルとして、エステル(142)(230mg、93％)を得た；
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エステル(142)(220mg、0.34mmole)のアセトニトリル(15mL)溶液に、フッ化セシウム(800mg、5.26mmole)を添加し、この懸濁液を還流状態で14時間加熱した。この反応混合物を室温まで冷却し、そしてCH2Cl2(100mL)で希釈した。この混合物をセライトで真空濾過し、そしてCH2Cl2で洗浄した。この溶液を濃縮し、そして２％ MeOH-CH2Cl2〜５％ MeOH-CH2Cl2で溶出するシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、無色のオイルとして、アミン(143)(85mg、50％)を得た；
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アミン(143)(40mg、0.080mmole)のCH2Cl2(５mL)溶液に、3,4-ジメトキシベンゾイルギ酸(85mg、0.405mmole)およびN-エチル-N’-1-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(80mg、0.417mmole)を添加した。得られた混合物を室温で５日間撹拌し、そしてH2O(５mL)で反応停止した。この混合物をCH2Cl2(20mL)で希釈し、層分離し、その有機相をMgSO4で乾燥した。この溶液を濃縮し、そして0.5％ MeOH-CH2Cl2〜1.0％ MeOH-CH2Cl2で溶出するシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、無色のオイルとして、11(6.8mg、24%)および化合物11のジアステレオマー(8.9mg、32％)を得た；TLC Rf＝0.20(2.5％ CH2Cl2/MeOH)(化合物11)、Rf＝0.23(2.5％ CH2Cl2/MeOH)(化合物11のジアステレオマー)；
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実施例２--化合物79の調製
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メタノール(1.23L)中のD,L-ピペコリン酸300ｇ(2.32mole)の沸騰混合物に、D-酒石酸348ｇ(2.32mole)を添加した。この溶液を５分間撹拌し、次いで、室温まで冷却した。この塩を濾過し、メタノールで洗浄し、そして水/アセトンから２回再結晶することにより洗浄して、144(124.2ｇ)を得た。
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144(124.2ｇ、0.445mole)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン340ml(1.95mole)の０℃撹拌混合物に、クロロトリメチルシラン282ml(2.23mole)を滴下した。この混合物を室温まで暖め、そして１時間撹拌した。この混合物を０℃まで再冷却し、そしてN,N-ジイソプロピルエチルアミン85mL(0.49mole)で処理し、続いて、塩化メチレン(270ml)に溶解したジ-t-ブチルジカーボネート102ｇ(0.467mole)を滴下した。この反応系を室温まで暖め、そして一晩撹拌した。この溶媒を減圧下にて蒸発させ、1N NaOH水溶液で塩基化し、そしてエーテルで洗浄した。その水相をKHSO4で酸性化し、エーテルで抽出し、その有機相をMgSO4で乾燥した。この溶媒を減圧下にて蒸発させ、そして酢酸エチル/ヘキサンからの再結晶により精製して、光学的に純粋な145(76ｇ)を得た。
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145(3.6ｇ、15.7mmole)のエタノール(30ml)溶液を０℃まで冷却し、15分間にわたってHCl(気体)流にかけ、そして室温で48時間撹拌した。この溶媒を減圧下にて撹拌し、そして得られた残留物を塩化メチレンに溶解した。この溶液をNaHCO3(水溶液)で２回そしてブラインで１回洗浄し、Na2SO4で乾燥し、その溶媒を減圧下にて蒸発させて、146(2.5ｇ)を得た。
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146(2.5ｇ、14.0mmole)およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン3.4ml(19.1mmole)の０℃撹拌溶液に、メチルオキサリルクロリド(methyloxalyl chloride)1.6ml(17.5mmole)を添加した。この混合物を35分間撹拌し、塩化メチレンで希釈し、水で１回そしてブラインで１回洗浄し、そしてNa2SO4で乾燥した。この溶媒を減圧下にて蒸発させ、そして９：１ヘキサン：酢酸エチルを用いたシリカゲル上のクロマトグラフィーにより精製して、147(3.52ｇ)を得た。
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LiBr(12.3ｇ、142mmole)を、穏やかに加熱しつつ、1-メチルシクロヘキサノール(10.8ｇ、94.6mmole)に溶解した。これに、48％HBr(５mL)を添加し、この混合物を０℃まで冷却し、さらに、滴下様式で、HBr(水溶液)17mLを添加した。これを3.5時間撹拌し、その時点で、その上層を分離し、エチレングリコールで洗浄し、エーテルで希釈し、次いで、Na2SO4で乾燥した。濾過した溶液を注意深く濃縮して、淡黄色のオイルとして、1-ブロモ-1-メチルシクロヘキサン(148)12.4ｇ(70mmole、74％)を得たが、これは、tlcおよび1H NMRにより、95％より高い純度であった。
臭化物148(8.0ｇ、45.2mmole)をTHF(20mL)に溶解し、そしてMg°削り屑1.14ｇ(47.4mmole)で処理した。この反応系を、1,2-ジクロロメタン２滴での開始に続いて、全体で90分間にわたって、55℃まで加熱した。室温まで冷却し、そしてメチルシクロヘキシルグリニヤール試薬(149)として使用した。
室温でCH2Cl2(10mL)に溶解したメチルオキサミド(147、1.5ｇ、6.17mmole)を、上で調製したグリニヤール溶液の一部を滴下して処理した。この反応の進行は、出発物質の所望生成物への転化率により認められるように、tlcにより追跡した。出発物質の完全な消費には、このグリニヤール試薬５〜６当量が必要であった。この反応を10％ KHSO4の添加により停止し、そしてCH2Cl2で抽出した。これらの有機物を水およびブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥し、そして濃縮した。ヘキサン中の10％酢酸エチルを用いたシリカゲルからの溶出により、生成物(150)(712mg、37％)を得、これは、tlcおよび1H NMRにより純粋であった。
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このエチルエステル150(575mg、1.86mmole)を、０℃で、THF(４mL)に溶解し、そしてゆっくりとした滴下様式にて、１N LiOH(２当量)で処理した。30分後に室温まで上げ、そして一晩撹拌した。この反応系を10％ KHSO4で酸性化し、CH2Cl2で抽出し、その有機物をブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥し、そしてストリッピングして、酸151(510mg、1.81mmole、98％)を得、これは、1H NMRにより純粋であり、HPLC分析により決定したように、0.5％未満のエピマーを含有していた。
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2-ブロモ-m-キシレン(157ｇ、0.849mol)の四塩化炭素(1.5L)溶液に、N-ブロモスクシンイミド(362ｇ、2.034mol)および過酸化ベンゾイル(1.38ｇ、7.75mmole)を添加し、そして還流状態で３時間加熱した。この反応混合物を室温まで冷却し、そしてH2O(500ml×２)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、そして濃縮した。得られた固形物をn-ヘキサン(１L)で洗浄し、そしてi-PrOHから再結晶して、無色の固形物(98ｇ、34％)として、このトリブロマイド(152)を得た；
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水素化ナトリウム(鉱油0.62mol中の80％分散体として、18.6ｇ)の無水THF(80mL)懸濁液に、０℃で、エタノール(34.1mL、0.583mol)を添加し、そして30分間撹拌した。この混合物に、トリブロマイド(152)(33.0ｇ、0.096mol)を添加し、そして45℃で２時間加熱した。この反応混合物を室温まで冷却し、そして酢酸エチル(200mL)で希釈した。この溶液をH2Oで洗浄し、その有機物をMgSO4で乾燥した。この溶液を濃縮し、そして30％ CH2Cl2−ヘキサンで溶出するシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、無色のオイルとして、ジエチルエステル(153)(25.0ｇ、95％)を得た；
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ブロモベンゼン(153)(25.0ｇ、91.6mmole)のTHF(250mL)溶液に、−78℃で、N2雰囲気下にて、ヘキサン中のn-BuLi溶液(1.6M、63ml、101mmole)を滴下し、そして同じ温度で２時間撹拌した。得られた混合物に、−78℃で10分間にわたって、トリメチルボレート(34ml、0.3mol)を添加し、そして２時間撹拌した。この反応混合物を１時間にわたって室温まで暖め、そして一晩撹拌した。この反応混合物に、４N HCl(300mL)水溶液を添加し、そして４時間撹拌した。この混合物を約250mlまで濃縮し、そしてCH2Cl2(300ml×３)で抽出した。これらの有機物を２N NaOH(200ml×２)で抽出した。合わせた水層をCH2Cl2で洗浄し、そして６N HClでpH２まで酸性化した。この混合物をCH2Cl2で抽出し、MgSO4で乾燥し、そして濃縮して、無色の固形物として、ボロン酸(154)(10.5ｇ、48％)を得た。
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5-ブロモ-2-チオフェンカルボキシアルデヒド(10.0ｇ、52.4mmole)の無水THF(100mL)溶液に、−78℃で、ビニルマグネシウムブロマイド(THF中の1.0M溶液、60.0ml、60.0mmole)をゆっくりと添加し、そして１時間撹拌した。この反応混合物をNH4Cl飽和水溶液(10mL)の添加により反応停止し、そして室温まで暖めた。この混合物を酢酸エチル(200mL)で希釈し、MgSO4で乾燥し、そして濃縮した。得られたオイルを、10％酢酸エチル−ヘキサンで溶出するシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、無色のオイルとして、アルコール(155)(6.0ｇ、52％)を得た。
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このアルコール(155)(2.80ｇ、12.6mmole)のCH2Cl2(100mL)溶液に、酸化マンガン(IV)(5.0ｇ、57.5mmole)およびモルホリン(92.3ml、26.4mmole)を添加し、この懸濁液を室温で14時間撹拌した。この混合物をセライトで真空濾過し、そしてCH2Cl2で洗浄した。この溶液を濃縮し、そして10％酢酸エチル−ヘキサンで溶出するシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、無色のオイルとして、ケトン(156)(3.5ｇ、91％)を得た；
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トルエン(100mL)中のこのブロモチオフェン(156)(2.0ｇ、6.6mmole)およびテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム(0)(500mg、0.402mmole)の撹拌混合物に、エタノール７mlに溶解したボロン酸(154)(2.57ｇ、10.8mmole)、およびH2O(４mL)に溶解した炭酸ナトリウム一水和物(2.74ｇ、22.1mmole)を連続的に添加した。得られた溶液混合物を還流状態で14時間加熱し、そして室温まで冷却した。この溶液を酢酸エチル(200mL)で希釈し、分離した有機相をMgSO4で乾燥した。この溶液を濃縮し、そして10％酢酸エチル−ヘキサンで溶出するシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、無色のオイルとして、ビアリール(157)(2.16ｇ、79％)を得た；
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水素化アルミニウムリチウム(170mg、4.48mmole)の無水THF(20mL)懸濁液に、このケトン(157)(1.82ｇ、4.36mmole)の-40℃無水THF(10mL)溶液を滴下し、この混合物を20分間撹拌した。この反応混合物を、ロシェル塩水溶液(５mL)の添加により反応停止し、そして室温で一晩撹拌した。この溶液を酢酸エチル(50ml×２)で抽出し、これらの抽出物をMgSO4で乾燥し、濃縮し、そして2.5％ MeOH-CH2Cl2で溶出するシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、無色のオイルとして、このアルコール(158)(1.54ｇ、84％)を得た；
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アルコール(158)のCH2Cl2(10mL)溶液に、(R)-(-)-α-メトキシフェニル酢酸(1.22ｇ、7.36mmole)、N-エチル-N’-1-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(1.41ｇ、7.36mmole)および4-ジメチルアミノピリジン(３mg、0.025mmole)を添加した。得られた混合物を室温で２時間撹拌し、そしてH2O(５mL)を添加することにより、反応停止した。この混合物をCH2Cl2(20mL)で希釈した。その有機相をMgSO4で乾燥し、この溶液を濃縮し、そしてジエチルエーテルで溶出するシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、無色のオイルとして、これらのエステルのジアステレオマー混合物(1.51ｇ、72％)を得た。このエステル(159)を、ジエチルエーテルで溶出するシリカゲルクロマトグラフィーにさらにかけることにより、純粋形態で単離した(290mg、28％)；TLC Rf＝0.24(ジエチルエーテル)(化合物159)、Rf＝0.31(ジエチルエーテル)(化合物159のジアステレオマー)；
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このエステル(159)(290mg、0.511mmole)のメタノール(１mL)溶液に、室温で、１N NaOH溶液(４mL、４mmole)を添加し、その混合物を１時間撹拌した。この溶液を濃縮し、そしてCH2Cl2(10ml×２)で抽出した。これらの抽出物をMgSO4で乾燥し、濃縮し、そして５％ MeOH-CH2Cl2で溶出するシリカゲルでクロマトグラフィーにかけて、無色のオイルとして、このアルコール(160)(210mg、98％)を得た。
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このアルコール(160)(20mg、0.048mmole)のCH2Cl2(２mL)溶液に、この酸(151)(35mg、0.124mmole)および1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(25mg、0.121mmole)、(-)-ショウノウスルホン酸(8.0mg、0.0345mmole)および4-ジメチルアミノピリジン(4.0mg、0.0328mmole)を添加した。得られた混合物を室温で６日間撹拌し、そしてH2O(１mL)を添加することにより、反応停止した。その水層をCH2Cl2(５ml×２)で抽出した。合わせた有機物をMgSO4で乾燥し、そして濃縮した。得られたオイルを、１％ MeOH-CH2Cl2〜２％ MeOH-CH2Cl2で溶出するシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけた。このエステル(79)を含有する画分を集め、そして濃縮し、得られたオイルを30％酢酸エチル−ヘキサン〜50％酢酸エチル−ヘキサンで溶出するシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、無色の固形物として、このエステル(79)(11mg、34％)を得た。TLC Rf＝0.30(５％ CH2Cl2/MeOH)；
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実施例３--化合物78の調製
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138(6.17ｇ、25.2mmol)およびテトラキス(トリフェニルホスフィン)−パラジウム(0)(0.55ｇ、0.48mmole)のトルエン(300mL)溶液に、エタノール(20mL)中の154(5.00ｇ、21.0mmol)および水(20mL)中の炭酸ナトリウム一水和物(5.20ｇ、42mmol)を添加した。この溶液を還流状態で16時間加熱し、そして層分離した。その水層を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機物を乾燥し(MgSO4)、そしてオイルになるまで濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー(溶離液としての１：１の酢酸エチル：ヘキサン)による精製により、無色のオイルとして、152(6.00ｇ、80％)を得た。
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152’(485mg、1.35mmol)のTHF(５mL)０℃溶液に、ビニルグリニヤール試薬(1.0M THF溶液6.8ml、6.8mmol)を添加し、この反応系を０℃で１時間撹拌した。モルホリン(235mg、2.70mmol)を添加し、この反応を水で停止した。この反応混合物を酢酸エチルで抽出し、合わせた有機物を乾燥し(MgSO4)、そしてオイルになるまで濃縮した。酢酸エチル中の０〜５％エタノールで溶出するフラッシュクロマトグラフィーによる精製により、淡黄色のオイルとして、161(245mg、45％)を得た。
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161(240mg、0.58mmol)の−40℃THF溶液に、水素化アルミニウムリチウム(23mg、0.61mmol)を添加した。この反応系を20分間撹拌し、ロシェル塩で反応停止し、そして酢酸エチルで抽出した。合わせた有機物を乾燥し(MgSO4)、そしてオイルになるまで濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー(溶離液としての塩化メチレン中の２〜３％メタノール)による精製により、無色のオイルとして、化合物162(170mg、71％)を得た。
0004759762.tif 000072
162(170mg、0.41mmol)、S-(+)-α-メトキシフェニル酢酸(206mg、1.24mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド(238mg、1.24mmol)およびDMAP触媒の溶液を、無水塩化メチレン(５mL)中で配合し、そして３日間撹拌した。この反応混合物を塩化メチレンで希釈し、そして水および飽和重炭酸塩溶液で洗浄した。その塩化メチレン層を乾燥し(MgSO4)、そして黄色のオイルになるまで濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー(溶離液としてのエチルエーテル中の２％エタノール)による精製により、無色のオイルとして、極性の低いジアステレオマー163(45mg、20％)および極性の高いジアステレオマー164(29mg、13％)を得た。
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163(42mg、0.075mmol)の０℃メタノール(２mL)溶液に、１N NaOH(112μL、0.112mmol)を添加し、この反応混合物を1.5時間撹拌した。この混合物を水で希釈し、そして塩化メチレンで抽出した。合わせた有機物を乾燥し(MgSO4)、そして濃縮して、無色のオイルとして、165(30mg、97％)を得た。
0004759762.tif 000074
化合物165(23mg、0.055mmol)、151(24mg、0.0825mmol)、1,3-ジシクロヘキシルカルボジイミド(19mg、0.0935mmol)およびショウノウスルホン酸触媒およびDMAPを無水塩化メチレン(１mL)中で配合し、この溶液を一晩撹拌した。この塩化メチレンを真空中で除去し、得られたオイルを、塩化メチレン中の１〜５％エタノールで溶出するクロマトグラフィーにより精製して、無色のオイルおよびロートマー(rotomer)の混合物として、78(24mg、65％)を得た。
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実施例４--化合物82の調製
0004759762.tif 000076
エチルインドール-3-カルボキシレート21.45ｇ(113mmole)および3-ブロモベンズアルデヒド66ml(567mmole)のDMF(35ml)撹拌溶液に、酸化銅(Ｉ)81ｇ(567mmole)を添加し、この懸濁液を120℃で一晩加熱した。この反応混合物をセライトで濾過し、そして水および酢酸エチルで分配した。その有機相を重硫酸カリウム水溶液で２回、重炭酸ナトリウム水溶液で２回、水で２回、ブラインで１回洗浄し、そして硫酸マグネシウムで乾燥した。この溶媒を減圧下にて蒸発させ、その残留物を、３：１塩化メチレン/ヘキサンを用いて、シリカゲル上でのクロマトグラフィーにより精製して、166(4.21ｇ)を得た。
0004759762.tif 000077
166(3.0ｇ、10.2mmole)の−78℃THF(30ml)撹拌溶液に、THF中の１Mビニルマグネシウムブロマイド25.6ml(25.6mmole)を滴下した。この混合物を−30℃まで暖め、そして1/2時間撹拌した。塩化アンモニウム水溶液で反応停止し、そして酢酸エチルで抽出した。その有機相をブラインで１回洗浄し、そして硫酸マグネシウムで乾燥した。この溶媒を減圧下にて蒸発させ、その残留物を、７：３ヘキサン/ジエチルエーテルを用いて、シリカゲル上でのクロマトグラフィーにより精製して、167(1.80ｇ)を得た。
0004759762.tif 000078
167(1.2ｇ、3.7mmole)および2,6-ルチジン0.5ml(4.8mmole)の０℃塩化メチレン撹拌溶液に、トリイソプロピルシリルトリフルオロメタンスルホネート1.2ml(4.4mmole)を滴下した。この混合物を０℃で20分間撹拌した。この反応系を塩化メチレンで希釈し、そして重硫酸カリウム水溶液で２回、水で２回、ブラインで１回洗浄し、そして硫酸マグネシウムで乾燥した。この溶媒を減圧下にて蒸発させて、168(1.7ｇ)を得た。
0004759762.tif 000079
水素化アルミニウムリチウム170mg(4.5mmole)の０℃THF(５ml)撹拌溶液に、THF(３ml)中の168(1.7ｇ、3.6mmole)を添加した。この混合物を15分間撹拌し、そして硫酸ナトリウム水溶液で反応停止し、次いで、室温まで暖め、そして過剰の硫酸ナトリウム粉末で処理した。この混合物を15分間撹拌し、そして濾過した。この溶媒を減圧下にて蒸発させ、その残留物を、95：５ヘキサン/酢酸エチルを用いて、シリカゲル上でのクロマトグラフィーにより精製して、169(0.86ｇ)を得た。
0004759762.tif 000080
０℃でのTHF(６ml)中の水素化ナトリウム62mg(2.6mmole)の撹拌混合物に、169(0.86ｇ、2.0mmole)を添加した。この混合物を20分間撹拌し、次いで、ヨードメタン0.4ml(5.0mmole)で処理し、室温まで暖め、そして一晩撹拌した。この反応系を０℃まで再冷却し、そして水でゆっくりと反応停止した。水および酢酸エチルで分配した。その有機相を水で２回、ブラインで１回洗浄し、そして硫酸マグネシウムで乾燥した。この溶媒を減圧下にて蒸発させて、170(0.92ｇ)を得た。
0004759762.tif 000081
170(0.92ｇ、2.0mmole)の０℃THF(５ml)撹拌溶液に、THF中の１Mテトラブチルアンモニウムフルオライド2.4mL(2.4mmole)を添加した。この反応系を室温まで暖め、そして２時間撹拌した。酢酸エチルおよび希塩酸で分配した。次いで、その有機相を希塩酸で２回、ブラインで１回洗浄し、そして硫酸マグネシウムで乾燥した。その残留物を、溶離液として３：１ヘキサン：ジエチルエーテルを用いて、シリカゲル上でのクロマトグラフィーにより精製して、171(470mg)を得た。
0004759762.tif 000082
塩化メチレン(15mL)中の171(450mg、1.5mmole)、４Å粉末化シーブ1.3ｇおよびモルホリン0.25mL(2.9mmole)の撹拌混合物に、酸化マンガン(IV)1.3ｇ(15mmole)を添加した。この混合物を室温で２時間撹拌した。この反応系をセライトで濾過し、そして減圧下にて蒸発させて、172(448mg)を得た。
0004759762.tif 000083
−78℃でのTHF(４ml)中の水素化アルミニウムリチウム43mg(1.14mmole)の撹拌混合物に、THF(４ml)に溶解した172(448mg、1.14mmole)を添加した。この混合物を２時間撹拌し、そして硫酸ナトリウム水溶液でゆっくりと反応停止し、次いで、室温まで暖め、そして過剰の硫酸ナトリウム粉末で処理した。この混合物を15分間撹拌し、そして濾過した。この溶媒を減圧下にて蒸発させて、173(450mg)を得た。
0004759762.tif 000084
173(450mg、1.15mmole)、(+)-(s)-α-メトキシフェニル酢酸565mg(3.40mmole)および4-ジメチルアミノピリジン触媒の塩化メチレン(７ml)撹拌溶液に、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩650mg(3.4mmole)を添加した。この反応系を室温で一晩撹拌し、塩化メチレンで希釈し、そして重炭酸ナトリウム水溶液で２回、水で２回、ブラインで１回洗浄し、そして硫酸ナトリウムで乾燥した。この溶媒を減圧下にて乾燥し、その残留物を、溶離液としてジエチルエーテルを用いて、シリカゲル上でのクロマトグラフィーにより精製して、所望の高いRfのジアステレオマーである174(260mg)を得た。
0004759762.tif 000085
−78℃でのジエチルエーテル(１ml)中の水素化アルミニウムリチウム18mg(0.48mmole)の撹拌混合物に、ジエチルエーテル(１ml)に溶解した174を添加した。この混合物を２分間撹拌し、そして硫酸ナトリウム水溶液で反応停止し、次いで、室温まで暖め、そして過剰の硫酸ナトリウム粉末で処理した。この混合物を15分間撹拌し、そして濾過した。この溶媒を減圧下にて蒸発させ、その残留物を、溶離液として３：97エチルアルコール/酢酸エチルを用いて、シリカゲル上でのクロマトグラフィーにより精製して、175(154mg)を得た。
0004759762.tif 000086
147(250mg、1.02mmole)の０℃塩化メチレン撹拌溶液に、THF中の１M第三級ブチルマグネシウムクロライド3.08ml(3.08mmole)を添加した。この反応系を０℃で15分間撹拌し、そして塩化アンモニウム水溶液で反応停止した。その水相を塩化メチレンで３回抽出した。その有機層を合わせ、そしてブラインで１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、この溶媒を減圧下にて蒸発させた。その残留物を、溶離液として９：１ヘキサン/酢酸エチルを用いて、シリカゲル上でのクロマトグラフィーにより精製して、176(102mg)を得た。
0004759762.tif 000087
176(102mg、0.38mmole)の０℃THF(１mL)撹拌溶液に、１N水素化リチウム0.76ml(0.76mmole)を添加した。この反応系を室温まで暖め、そして４時間撹拌し、次いで、10％重硫酸カリウム水溶液で酸性化し、そして塩化メチレンで３回抽出した。その有機層を合わせ、そしてブラインで１回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、この溶媒を減圧下にて蒸発させて、177(85mg)を得た。
0004759762.tif 000088
175(20mg、0.051mmole)、177(18mg、0.076mmole)、ジシクロヘキシルカルボジイミド18mg(0.086mmole)およびショウノウスルホン酸触媒の室温での塩化メチレン(１ml)撹拌溶液に、N,N-ジメチルアミノピリジン触媒を添加した。この反応系を一晩撹拌した。この溶媒を減圧下にて蒸発させ、そして３：２酢酸エチル/ヘキサンを用いて、シリカゲル上でのクロマトグラフィーにより精製して、82(23mg)を得た。TLC Rf：0.12(３：２酢酸エチル/ヘキサン)、
0004759762.tif 000089
実施例５--化合物94の調製
0004759762.tif 000090
2,3-ジメチル-2-ブタノール16ｇ(157mmole)および臭化リチウム20.4ｇ(235mmole)の０℃溶液に、48％臭化水素酸水溶液36.4ml(314mmole)を滴下した。この反応系を２時間撹拌し、次いで、室温まで暖めた。その有機相をエチレングリコールで３回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して、176(20ｇ)を得た。
0004759762.tif 000091
176(５ｇ、30.3mmole)のTHF(５ml)溶液に、マグネシウム削り屑810mg(33.3mmole)を添加した。初期の発熱後、この反応系を、１時間にわたって、還流状態まで加熱した。この溶液を室温まで冷却し、そして塩化メチレン(５ml)中の147(900mg、3.7mmole)に添加し、そして一晩撹拌した。この反応系を０℃まで冷却し、そして0.5N塩酸水溶液で酸性化し、その有機相を水で２回、重炭酸ナトリウム水溶液で１回、水で２回、ブラインで１回洗浄し、そして硫酸ナトリウムで乾燥した。この溶媒を減圧下にて蒸発させ、その残留物を、９：１ヘキサン/酢酸エチルを用いて、シリカゲル上でのクロマトグラフィーにより精製して、177(121mg)を得た。
0004759762.tif 000092
177(121mg、0.41mmole)の０℃THF(１ml)溶液に、１N水素化リチウム水溶液1.0ml(1.04mmole)を滴下した。この反応系を室温まで暖め、一晩撹拌し、０℃まで再冷却し、１N塩酸1.1mlで酸性化し、そしてベンゼンで３回抽出した。その有機相を０℃まで冷却し、窒素流に0.5時間にかけ、次いで、硫酸ナトリウムで乾燥した。この溶媒を減圧下にて蒸発させて、178(95mg)を得た。
0004759762.tif 000093
175(13mg、0.033mmole)、178(14mg、0.052mmole)、ジシクロヘキシルカルボジイミド12mg(0.056mmole)およびショウノウスルホン酸触媒の室温での塩化メチレン(１ml)撹拌溶液に、N,N-ジメチルアミノピリジン触媒を添加した。この反応系を一晩撹拌した。この溶媒を減圧下にて蒸発させ、その生成物を、99：１塩化メチレン/エチルアルコールを用いたシリカゲル上でのクロマトグラフィーにより精製して、94(10mg)を得た。TLC Rf：0.41(95：５ジエチルエーテル/エチルアルコール)、
0004759762.tif 000094
実施例６--化合物27の調製
乾燥THF(500ml)中の1,3-ベンゼンジメタノール31.05ｇ(225mmol)(benzenedemethanol)(Aldrich Chemical Co.)の溶液に、80％水素化ナトリウムを7.76ｇ(232mmol)添加した。この懸濁液に、tert-ブチルジメチルシリルクロリド34.97ｇ(232mmol)を添加し、そして得られた混合物を室温で一晩撹拌した。次いで、反応混合物を水でクエンチして、酢酸エチル中で抽出し、MgSO4で乾燥し、そして濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル５：１で溶出)により、アルコール(179)を33.3ｇ得た(59％)。
0004759762.tif 000095
CH2Cl2(100ml)中のアルコール(179)33.2ｇ(131.5mmol)の溶液に、０℃において、TEMPO 350mg(2.2mmol)、0.67Ｍの次亜塩素酸ナトリウム295mL(197mmol)(重炭酸ナトリウム7.5ｇおよび臭化ナトリウム1.34ｇ(13.1mmol)を含有する)を添加した。得られた混合物を、０℃で0.5時間撹拌し、次いで酢酸エチル中で抽出した。有機相を、ヨウ化カリウム水溶液およびチオ硫酸ナトリウム水溶液で順番に洗浄し、次いでMgSO4で乾燥し、そして濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン中の20％酢酸エチルで溶出)により、アルデヒド180を31.4ｇ(95％)得た。
0004759762.tif 000096
乾燥エーテル(100mL)中の3-ブロモピリジン8.1ｇ(51.1mmol)の溶液に、-78℃において、31mLのn-BuLiの1.6Ｍヘキサン溶液(31mL)を添加し、そして得られた混合物を、-78℃で20分間撹拌した。この溶液に、乾燥エーテル(190mL)中のアルデヒド180 12.8ｇ(51.1mmol)の溶液を添加し、そしてこの溶液を-78℃で１時間撹拌した。反応混合物を飽和NH4Cl水溶液に注ぎ、層を分離させ、そして水層をエーテルで抽出した。有機層を合わせ、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。得られた残渣を、ヘキサン/酢酸エチル(５：３)を用いるシリカゲル上のクロマトグラフィーにかけ、アルコール181 12ｇ(71％)を無色のオイルとして得た。NMR(500MHz,CDCl3)0.06(6H,s)0.91(9H,s)4.71(2H,s)5.83(1H,s)7.68(6H,m)8.40(1H,m)8.52(1H,d,J=2.3Hz)。
0004759762.tif 000097
CH2Cl2(90mL)中のアルコール181 12ｇ(36.4mmol)、MnO2 21ｇ(241.5mmol)、および４Åモレキュラーシーブ6.8ｇの混合物を、室温で一晩撹拌した。反応混合物を、セライトを通して濾過し、減圧下で濃縮して、ケトン182 10.8ｇ(90％)を無色のオイルとして得た。NMR(500MHz,CDCl3)0.06(6H,s)0.89(9H,s)4.76(2H,s)7.3-7.7(6H,m)8.77(1H,d,J=1.7Hz)8.95(1H,d,J=1.7Hz)。
0004759762.tif 000098
乾燥THF(120mL)中のn-ブチルトリフェニルホスホニウムブロミド8.1ｇ(20.28mmol)の懸濁液中に、０℃において、n-BuLiの1.6Ｍヘキサン溶液11.5mLを添加した。得られた赤色溶液を、０℃で30分間撹拌した。この溶液に、乾燥THF(10mL)中のケトン182 4.0ｇ(12.21mmol)を０℃で添加し、そしてこの混合物を、１時間にわたって室温まで加温した。フラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン：酢酸エチル３：１を用いて溶出)により、E-オレフィン183および対応するZ-オレフィン異性体の混合物を得た。この混合物を、ヘキサン/酢酸エチル(４：１)を用いてシリカゲル上でさらにクロマトグラフィーにかけ、純粋なオレフィン183(970mg、19％)を無色のオイルとして得た。NMR(500MHZ,CDCl3)0.08(6H,s)0.91(12H,m)1.4-1.6(2H,m)2.1-2.2(2H,m)4.75(2H,s)6.11(1H,t,J=7.4Hz)7.0-7.5(6H,m)8.44(1H,d,J=4.5Hz)8.54(1H,d,J=1,1Hz)。
0004759762.tif 000099
THF中のオレフィン(183)960mg(2.61mmol)およびテトラブチルアンモニウムフルオリド１Ｍ溶液13mLの混合物を、室温で30分間撹拌した。次いで、この混合物を水に注ぎ、そして酢酸エチルで抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン/酢酸エチル(５：１)を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけ、アルコール184(700mg,87％)を無色のオイルとして得た。NMR(500MHz,CDCl3)0.88(3H,m)1.37(2H,m)2.05(2H,m)4.69(2H,s)6.12(1H,t,J=7.4Hz)7.0-7.5(6H,m)8.33(1H,m)8.46(1H,d,J=2.2Hz)。
0004759762.tif 000100
CH2Cl2(10mL)中のアルコール184 579mg(2.24mmol)、MnO2 1.2g(13.8mmol)、および４Åモレキュラーシーブ1.0ｇの混合物を、室温で一晩撹拌した。次いで、この混合物を濾過し、そしてこの濾液を減圧下で濃縮して、アルデヒド(185)(560mg、99％)を無色のオイルとして得た。NMR(500MHZ,CDCl3)0.91(3H,m)1.50(2H,m)2.09(2H,m)6.22(1H,t,J=7.4Hz)7.1-7.9(6H,m)8.4-8.6(2H,m)10.03(1H,s)。
0004759762.tif 000101
乾燥THF(10mL)中のアルデヒド185 560mg(2.23mmol)の溶液に、-10℃で、ビニルマグネシウムブロミドの１ＭTHF溶液4.5mLを添加し、そして得られた混合物を-10℃で30分撹拌した。次いで、混合物を、飽和NH4Cl水溶液中に注ぎ、そしてCHCl3を用いて抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をヘキサン/酢酸エチル(１：１)を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけ、アリルアルコール186(310mg,50％)を無色のオイルとして得た。NMR(500MHz,CDCl3)0.89(3H,t,J=7.3Hz)1.46(2H,m)2.10(2H,m)5.1-5.3(3H,m)5.9-6.2(2H,m)7.0-7.2(3H,m)7.3-7.5(3H,m)8.33(1H,m)8.44(1H,d,J=2.4Hz)。
0004759762.tif 000102
アリルアルコール186 310mg(1.12mmol)、MnO2 488mg(5.61mmol)、および４Åモレキュラーシーブ500mgの混合物を、室温で一晩撹拌した。次いで、反応混合物を濾過し、そして濾液を減圧下で濃縮して、エノン187(244mg、79％)を無色のオイルとして得た。NMR(500MHz,CDCl3)0.92(3H,J=7.3Hz)1.50(2H,m)2.11(2H,m)5.93(1H,m)6.22(1H,t,J=7.4Hz)6.44(1H,m)7.1-7.3(2H,m)7.3-7.6(3H,m)7.76(1H,s)7.92(1H,m)8.4-8.6(2H,m)。
0004759762.tif 000103
CH3CN(5.0mL)中のエノン187 244mg(0.88mmol)、モルホリン153mg(1.75mmol)、およびトリエチルアミン1.83mL(13.13mmol)の混合物を、室温で30分間撹拌し、次いで、混合物を減圧下で濃縮した。残渣を、CHCl3/MeOH(100:3)を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけ、ケトン(188)(240mg、75％)を、無色のオイルとして得た。NMR(500MHz,CDCl3)0.91(3H,t,J=7.3Hz)1.4-1.6(2H,m)2.0-2.2(2H,m)2.44(4H,m)2.82(2H,t,J=6.8Hz)3.17(2H,t,J=6.8Hz)3.70(4H,m)6.19(1H,t,J=7.3Hz)7.1-7.6(4H,m)7.76(1H,m)7.91(1H,m)8.49(2H,m)。
0004759762.tif 000104
MeOH(5.0mL)中のケトン(188)240mg(0.67mmol)の溶液に、０℃で、NaBH4 25mg(0.67mmol)を添加し、得られた混合物を０℃で30分撹拌した。次いで、反応混合物を、飽和NH4Cl水溶液に注ぎ、そしてCHCl3で抽出した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をCHCl3/MeOH(100：３)を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、アルコール(189)(208mg、85％)を無色のオイルとして得た。NMR(500MHz,CDCl3)0.94(3H,t,J=7.3Hz)1.4-1.6(2H,m)1.8-2.0(2H,m)2.0-2.2(2H,m)2.4-2.7(6H,m)3.71(4H,m)4.93(1H,m)6.11(1H,t,J=7.3Hz)7.0-7.2(2H,m)7.3-7.5(4H,m)8.41(1H,m)8.50(1H,d,J=1.5Hz)。
0004759762.tif 000105
CH2Cl2(2.0mL)およびDMF(2.0mL)中のBoc-L-ピペコリン酸141mg(0.61mmol)の溶液に、アルコール(189)205mg(0.56mmol)、EDC 119mg(0.62mmol)および触媒量のDMAPを添加した。混合物を室温で一晩撹拌し、次いで水に注いだ。層を分離し、そして有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をCHCl3/MeOH(100:１)を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、エステル(190)(207mg、64％)を無色のオイルとして得た。NMR(500MHz,CDCl3)0.91(3H,t,J=7.3Hz)1.2-1.8(15H,m)1.8-2.0(1H,m)2.0-2.3(4H,m)2.3-2.5(6H,m)2.7-2.9(2H,m)3.67(4H,m)3.7-4.1(1H,m)4.7-4.9(1H,m)5.90(1H,m)6.14(1H,t,J=7.3Hz)7.1-7.2(3H,m)7.3-7.5(3H,m)8.4-8.5(2H,m)。
0004759762.tif 000106
CH2Cl2(1.5mL)中のエステル(190)207mg(0.36mmol)の溶液に、室温で、トリフルオロ酢酸3.2mLを添加し、そして混合物を１時間室温で撹拌した。次いで、反応混合物を、飽和(satyrated)K2CO3水溶液の滴下により中和した。層を分離し、そして有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、そして濃縮してアミン(191)(155mg、89％)を淡い茶色のオイルとして得た。NMR(500MHz,CDCl3)0.95(3H,t,J=7.3Hz)1.3-1.7(6H,m)1.7-2-1(2H,m)2.1-2.3(3H,m)2.3-2.5(8H,m)2.5-2.7(1H,m)3.0-3.1(1H,m)3.3-3.5(1H,m)3.67(4H,m)5.89(1H,m)6.13(1H,t,J=7.3Hz)7.0-7.2(3H,m)7.3-7.5(3H,m)8.44(2H,m)。
0004759762.tif 000107
CH2Cl2(2.8mL)中のアミン(191)155mg(0.32mmol)の溶液に、室温で、3,4,5-トリメトキシベンゾイルギ酸80mg(0.33mmol)およびEDC 92mg(0.48mmol)を添加した。室温で一晩撹拌した後、反応混合物を、水を用いて分配し、そして有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、そして濃縮した。残渣をCHCl3/MeOH(100:５)を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、ジアステレオ異性体アミド(27)(166mg、74％)を、回転異性体の混合物として得た。NMR(500MHz,CDCl3)1.8-2.0(3H,m)1.4-1.6(6H,m)1.6-1.9(2H,m)2.0-2.2(3H,m)2.2-2.5(7H,m)3.0-3.3(1H,m)3.3-3.5(1H,m)3.68(4H,m)3.8-4.0(9H,m)5.38(1H,d,J=3.8Hz)5.90(1H,m)6.14(1H,m)7.1-7.3(3H,m)7.3-7.5(5H,m)8.42(2H,m)。２つのジアステレオ異性体の混合物を、HPLC(ODSカラム、73：27  MeOH-H2Oを用いる)によりさらに分離して、各異性体を38mgおよび21mg得た。
0004759762.tif 000108
実施例７--MDR感作アッセイ
本発明の化合物が薬物の抗増殖活性を増加させる能力をアッセイするために、特定の薬物に対して耐性であることが公知である細胞株が用いられ得る。これらの細胞株には、L1210、P388D、CHO、およびMCF7細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、耐性細胞株が開発され得る。細胞株を、それが耐性である薬物または試験化合物に曝露する；次いで、細胞の生存率を測定し、そして、試験化合物の存在下で薬物に曝露した細胞の生存率と比較する。
MDR1 cDNAを有するpHaMDR1/Aレトロウイルスを用いて形質転換されたL1210マウス白血病細胞を用いてアッセイを行うために、本発明者らは、Pastanら、Proc. Natl. Acad. Sci.、第85巻、4486-4490(1988)に記載の手順に従う。耐性株、標識化L1210VMDRC.06は、National Cancer InstituteのM. M. Gottesman博士から得られる。薬物耐性トランスフェクタントは、0.06mg/mlコルヒチン中で細胞を培養することにより選択される。
多剤耐性アッセイは、細胞(２×103、１×104、または５×104細胞/ウェル)を96ウェルのマイクロタイタープレート中でプレーティングし、そして本発明の多剤耐性変性剤化合物(「MDRインヒビター」)の存在下(１μM、2.5μM、または10μM)または非存在下で、濃度範囲が50nM〜10nMであるドキソルビシンに曝露することによって行われる(Fordら、Cancer Res.、第50巻、1748-1756(1990)に記載の通り)。３日の培養の後、細胞の生存率を、MTT(Mossman)またはXTT染料を用いて定量し、ミトコンドリアの機能を評価した。Mossman T.、J. Immunol. Methods、第65巻、55-63(1983)もまた参照のこと。
プロトン核磁気共鳴(1H NMR)スペクトルを、500MHzにおいてBruker AMX 500上で記録する。化学シフトを、Me4Si(σ0.0)に対する百万分率(σ)で報告する。分析高速液体クロマトグラフィーを、Waters 600EまたはHewlett Packard 1050液体クロマトグラフのいずれかを用いて行う。
ドキソルビシン単独についてのIC50を、ドキソルビシン＋MDRインヒビターについてのIC50と比較することにより、結果を決定した。MDR比は、(IC50Dox／IC50Dox＋インヒビター)から計算し、化合物の強度を比較するために、整数値を用いる。
本発明の化合物を、固有の抗増殖活性または細胞傷害活性について試験した。結果を以下の表２に要約する。
0004759762.tif 000109
実施例８--MRP媒介MDRの阻害
本発明の化合物が、P-グリコプロテイン媒介MDRに加えて、逆MPR媒介MDR(reversing MPR-mediated MDR)においても有用であることを示すために、本発明者らは、非P-グリコプロテイン発現細胞株における阻害をアッセイする。
本発明者らは、96ウェルマイクロタイタープレート中で、HL60/ADR細胞をプレーティングする(４×104細胞/ウェル)。次いで、細胞を、本発明の種々の化合物の存在下(0.5μM〜10μM)または非存在下で、種々の濃度(50nM〜10μM)のドキソルビシンに曝露する。細胞を３日間培養した後、それらの生存率を、XTT染料法を用いて定量し、ミトコンドリアの機能を評価する。結果は、ドキソルビシン＋MDRインヒビターについてのIC50に対するドキソルビシン単独についてのIC50の比として表される。IC50値は、nMで表される。この結果は、MRP媒介MDRが、本発明の化合物により阻害されていることを示す。
実施例９--FKBP12  結合アッセイ
本発明の組成物に存在する好ましいFKBP12結合化合物によるFKBPロトマーゼ活性の阻害がアッセイされた。このアッセイにおいて、種々の量のFKBP12結合化合物(0.1nM〜10μM)を、FKBP12およびキモトリプシンの存在下で、シス-N-スクシニル-Ala-Ala-Pro-Phe-p-ニトロアニリドに添加した。FKBP12は、基質のシス型を、トランス型に転換する。このことにより、キモトリプシンがp-ニトロアニリドを基質から切断する。p-ニトロアニリドの遊離は、分光学的に測定された。このアッセイにより、本発明者は、FKBP12結合化合物の濃度の関数としてのロトマーゼ活性の１次速度定数の変化を測定し、かつ、見かけのＫiを見積もることができた。本発明の組成物および方法において用いられた最も好ましいFKBP12結合化合物およびそれらの計算されたＫiを、以下の表にまとめた。
0004759762.tif 000110
実施例10--PC12培地中での神経突起成長(Neurite Outgrowth)アッセイ
本発明の化合物がFKBP-12に結合する能力およびそのロトマーゼ活性を阻害する能力はまた、神経成長を刺激し得ることを示唆した。
本発明で用いられる化合物の神経栄養活性を直接決定するために、W.E.Lyonsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 第3191-95頁(1994)に記載のアッセイが行われる。
PC12ラットクロム親和性細胞腫細胞を、10％熱不活性化ウマ血清(HS)および５％熱不活性化ウシ胎児血清(FBS)を補充したDulbecco変性Eagle培地(DMEM)中で、37℃および５％CO2に保持する。次いで、細胞を、５μg/cm2ラットテイルコラーゲンでコーティングして付着させた35mm培地ウェル当たり105個プレーティングした。次いで、培地をDMEM+２％HSおよび１％FBS、NGF(１〜100ng/ml)ならびに様々な濃度のFKBP12結合化合物(0.1nM-10μM)で置換した。コントロール培養物に、FKBP12結合化合物を含まないNGFを投与した。
本発明の化合物は、NGF単独で引き起こされる成長を越えて、これらの細胞中で神経突起成長を増加させることができる。
実施例11--脊椎神経節(dorsal root ganglion)培養物における神経突起成長のアッセイ
本発明で用いられるFKBP12結合化合物の神経栄養活性を直接決定する別の方法は、W.E.Lyonsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、91、3191〜95頁(1994)にまた記載されている、脊椎神経節培養アッセイである。
このアッセイにおいて、脊椎神経節を、16日目のラットの胚から切除し、そして37℃で15％CO2環境下において、N2培地を有する、コラーゲンでコーティングされた35mmの皿中で培養する。次いで、知覚神経(sensory ganglia)を、種々の濃度(０ng/ml〜100ng/ml)のNGFおよびFKB12結合化合物(0.1nM〜10μM)で処置する。位相差顕微鏡下で２日ごとに結節を観察し、そして軸索(axon)の長さを測定する。コントロール培養物は、FKBP12結合化合物を有さないか、あるいはFKBP12結合化合物とNGFとを有さないかのいずれかである。
本発明で用いられるFKBP12結合化合物は、NGFの存在下および非存在下の両方においてFKBP12結合化合物を有さないコントロール培養物に比べて、神経突起成長の増加を引き起こした。
本明細書の上記において本発明の多くの実施態様を記載してきたが、本発明者らの基本的構成は改変されて、本発明の方法を用いる他の実施態様を提供し得ることが明らかである。従って、本発明の範囲は、本明細書の上記で実施例により示される特定の実施態様によって規定されるべきではなく、添付の請求の範囲によって規定されるべきであることが理解される。