(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)  イノシトール-1,4,5-三リン酸に特異的に結合し、この結合によってその構造が変化するポリペプチド、および
(b)  前記ポリペプチドの両末端に連結され、このポリペプチドの構造変化による互いの接近によって蛍光共鳴エネルギー移動が生起し、信号が検出可能となる二つのマーカー部位、
を有し、前記ポリペプチドが、イノシトール-1,4,5-三リン酸受容体タイプ１サブユニットのイノシトール-1,4,5-三リン酸結合ドメインにおける第２２４−５７９位の連続アミノ酸残基からなるポリペプチドであることを特徴とするイノシトール-1,4,5-三リン酸検出・定量用プローブ。
【請求項２】
二つのマーカー部位が、黄色蛍光タンパク質とシアン蛍光タンパク質である請求項１のプローブ。
【請求項３】
二つのマーカー部位のいずれか一方には、核局在化配列が連結されている請求項１または２のプローブ。
【請求項４】
請求項１、２または３のイノシトール-1,4,5-三リン酸検出・定量用プローブとイノシトール-1,4,5-三リン酸を共存させ、イノシトール-1,4,5-三リン酸非共存下および共存下におけるシグナル変化を測定することを特徴とするイノシトール-1,4,5-三リン酸の検出・定量方法。
【請求項５】
請求項１、２または３のイノシトール-1,4,5-三リン酸検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、該細胞において該プローブとイノシトール-1,4,5-三リン酸を共存させる請求項４の検出・定量方法。
【請求項６】
請求項１、２または３のイノシトール-1,4,5-三リン酸検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞において該プローブとイノシトール-1,4,5-三リン酸を共存させる請求項４の検出・定量方法。
【請求項７】
細胞内でのイノシトール-1,4,5-三リン酸の産生に対する刺激の影響をモニタリングする方法であって、請求項１、２または３のイノシトール-1,4,5-三リン酸検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、該細胞に刺激を付与し、刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することを特徴とするモニタリング方法。
【請求項８】
生体内でのイノシトール-1,4,5-三リン酸の産生に対する刺激の影響をモニタリングする方法であって、請求項１、２または３のイノシトール-1,4,5-三リン酸検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより得られる非ヒト動物またはその子孫動物に刺激を付与し、刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することを特徴とするモニタリング方法。
【請求項９】
イノシトール-1,4,5-三リン酸誘導Ca2+放出を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、請求項１、２または３のイノシトール-1,4,5-三リン酸検出・定量用プローブと、イノシトール-1,4,5-三リン酸と、候補物質を共存させ、該候補物質非共存下および共存下におけるシグナル変化を測定することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項１０】
請求項１、２または３のイノシトール-1,4,5-三リン酸検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、該細胞においてイノシトール-1,4,5-三リン酸検出・定量用プローブと、イノシトール-1,4,5-三リン酸と、候補物質を共存させる請求項９のスクリーニング方法。
【請求項１１】
請求項１、２または３のイノシトール-1,4,5-三リン酸検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞においてイノシトール-1,4,5-三リン酸検出・定量用プローブと、イノシトール-1,4,5-三リン酸と、候補物質を共存させる請求項９のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この出願の発明は、イノシトール−１，４，５−三リン酸の産生を、非襲撃的に時空間可視化するためのプローブと、それを用いてイノシトール−１，４，５−三リン酸を検出・定量する方法、細胞内でのイノシトール−１，４，５−三リン酸産生に対する刺激の影響をモニタリングする方法、並びに、イノシトール−１，４，５−三リン酸誘導Ｃａ２＋放出に対する阻害物質をスクリーニングする方法に関するものである。
【背景技術】  イノシトール−１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）は、ホルモン、増殖因子、神経伝達物質などの刺激でホスホリパーゼＣが活性化され、ホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）が加水分解されることにより細胞内に生成するセカンドメッセンジャーであり、滑面小胞体や筋小胞体膜上のＣａ２＋チャンネル、すなわち、ＩＰ３受容体に結合して、Ｃａ２＋ストアに貯蔵されたＣａ２＋の細胞質への放出を誘導する。
ＩＰ３は、ほとんどの動物種の組織や器官において一様に産生されており、受精、形態形成、血管新生、神経機能など、膨大な数の生物応答を制御している最も重要な情報分子の一つである。したがって、ＩＰ３が、細胞内のどの部分で、どのようなタイミングで生成しているのかを検出することができれば、様々な生物応答に関する知見が得られると期待される。
細胞内でのＩＰ３の濃度変化を評価する方法としては、ＰＩＰ２とＩＰ３の両方に結合するプレクストリン相同ドメイン（ＰＨドメイン）と緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の融合タンパク質をプローブとして用いる方法が知られている（非特許文献１）。これは、ＰＩＰ２と結合して細胞膜に存在していたプローブが、ＩＰ３の産生により細胞質中に流れ出すことを利用した方法であり、細胞膜と細胞質の蛍光強度比を測定することによりＩＰ３の生成を検出できるというものである。
しかしながら、このような方法では、細胞間でのＰＩＰ２量の違いや細胞の形状変化の影響を受けやすく、定量性が損なわれ易いという問題があった。また、神経細胞においては、その軸索・樹状突起が非常に細いため、細胞膜と細胞質における蛍光強度比を正確に分離して測定することが困難であり、ＩＰ３濃度変化を見極めることができないという問題もあった。したがって、ＩＰ３の産生を、非襲撃的に精度高く時空間可視化する方法の実現が望まれていたのが実情である。
そこで、この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、イノシトール−１，４，５−三リン酸が生細胞内のどの部位でいつ産生されたかを、非襲撃的に精度高く検出・定量するためのプローブと、それを用いたイノシトール−１，４，５−三リン酸の検出・定量方法を提供することを課題としている。
文献
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，１５２７−１５３０，１９９９
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７；７３８０−７３８４，１９８０
【発明の開示】
この出願の発明は、上記の課題を解決するものとして、第１には、少なくとも、イノシトール−１，４，５−三リン酸受容体のイノシトール−１，４，５−三リン酸結合ドメインを含むイノシトール−１，４，５−三リン酸認識部位と、イノシトール−１，４，５−三リン酸認識部位の両末端に連結された、互いの接近により蛍光共鳴エネルギー移動が生起し、信号が検出可能となる二つのマーカー部位を有してなることを特徴とするイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブを提供する。
また、この出願の発明は、第２には、互いの接近が検出可能な二つのマーカー部位が、黄色蛍光タンパク質とシアン蛍光タンパク質である前記のプローブを、さらに、第３には、イノシトール−１，４，５−三リン酸に特異的に結合し、イノシトール−１，４，５−三リン酸との結合によりその構造が変化するポリペプチドが、イノシトール−１，４，５−三リン酸受容体のイノシトール−１，４，５−三リン酸結合ドメインである前記のプローブを提供する。
この出願の発明は、第４には、互いの接近が検出可能な二つのマーカー部位のいずれか一方には、核局在化配列が連結されている前記のプローブを提供する。
さらに、この出願の発明は、第５には、前記いずれかのイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブとイノシトール−１，４，５−三リン酸を共存させ、イノシトール−１，４，５−三リン酸非共存下および共存下におけるシグナル変化を測定することを特徴とするイノシトール−１，４，５−三リン酸の検出・定量方法を提供する。
この出願の発明は、第６には、前記いずれかのイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、該細胞において該プローブとイノシトール−１，４，５−三リン酸を共存させるイノシトール−１，４，５−三リン酸の検出・定量方法を、第７には、前記いずれかのイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞において該プローブとイノシトール−１，４，５−三リン酸を共存させるイノシトール−１，４，５−三リン酸の検出・定量方法を提供する。
この出願の発明は、また、細胞内におけるイノシトール−１，４，５−三リン酸生成に係る刺激の影響をモニタリングする方法として、第８には、前記いずれかのイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、該細胞に刺激を付与し、刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することを特徴とするモニタリング方法を、第９には、前記いずれかのイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより得られる非ヒト動物またはその子孫動物に刺激を付与し、刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することを特徴とするモニタリング方法を提供する。
第１０には、この出願の発明は、イノシトール−１，４，５−三リン酸誘導Ｃａ２＋放出を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、前記第３の発明のイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブと、イノシトール−１，４，５−三リン酸と、候補物質を共存させ、該候補物質非共存下および共存下におけるシグナル変化を測定することを特徴とするスクリーニング方法を提供する。
また、この出願の発明は、第１１には、前記第３の発明のイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、該細胞においてイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブと、イノシトール−１，４，５−三リン酸と、候補物質を共存させるスクリーニング方法を、そして、第１２には、前記第３の発明のイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞においてイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブと、イノシトール−１，４，５−三リン酸と、候補物質を共存させるスクリーニング方法を提供する。
そして、上記第１〜３の発明のイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブは、少なくとも、イノシトール−１，４，５−三リン酸に特異的に結合し、イノシトール−１，４，５−三リン酸との結合によりその構造が変化するポリペプチドを含むイノシトール−１，４，５−三リン酸認識部位と、該イノシトール−１，４，５−三リン酸認識部位の両末端に連結された、互いの接近が検出可能な二つのマーカー部位を有してなるものである。したがって、イノシトール−１，４，５−三リン酸が共存する場合には、該プローブのイノシトール−１，４，５−三リン酸認識部位におけるポリペプチドがイノシトール−１，４，５−三リン酸を認識し、特異的に結合する。このとき、ポリペプチドの構造変化が起こるため、イノシトール−１，４，５−三リン酸認識部位に連結された二つのマーカー部位の間の距離や配向が変化する。したがって、これらのマーカー部位によるシグナルの変化を測定することにより、イノシトール−１，４，５−三リン酸の検出・定量が可能となる。
また、上記第４の発明のイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブでは、さらに核局在化配列が連結されていることから、該プローブを核内に局在化させることが可能となる。したがって、核内におけるイノシトール−１，４，５−三リン酸の産生を検出したり、核内のイノシトール−１，４，５−三リン酸を定量したりすることが可能となる。
また、上記第５〜７の発明では、イノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブをイノシトール−１，４，５−三リン酸と共存させ、シグナル変化を測定することにより、簡便かつ非襲撃的にイノシトール−１，４，５−三リン酸を検出・定量することが可能となる。例えば、細胞内や、非ヒト動物またはその子孫動物の全細胞内において、イノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブとイノシトール−１，４，５−三リン酸を共存させることができる。
さらに、上記第８〜９の発明では、イノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入して得られる細胞、あるいは、イノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより得られる非ヒト動物またはその子孫動物に対し、刺激を付与する。このとき、刺激付与前後のシグナル変化を測定すれば、細胞あるいは生体におけるイノシトール−１，４，５−三リン酸産生に対する該刺激の影響をモニタリングすることが可能となる。
さらにまた、上記第１０〜１２の発明では、イノシトール−１，４，５−三リン酸認識部位にイノシトール−１，４，５−三リン酸結合ドメインを有するイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブと、イノシトール−１，４，５−三リン酸と、候補物質を共存させ、候補物質の共存下および非共存下でのシグナル変化を測定する。これにより、該候補物質が、イノシトール−１，４，５−三リン酸とイノシトール−１，４，５−三リン酸受容体の結合を阻害するか否かを確認することができ、イノシトール−１，４，５−三リン酸誘導Ｃａ２＋放出を阻害する物質をスクリーニングすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】  図１は、この出願の発明のイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブの構成を示す概略模式図である。
図２は、この出願の発明のイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブを用いて、ＭＤＣＫ細胞でのＡＴＰ濃度依存的なＩＰ３産生を可視化した結果を示した図である。（ａ）は１００μＭ  ＡＴＰ、（ｂ）は１０μＭ  ＡＴＰ、（ｃ）は１μＭ  ＡＴＰを示す。
図３は、この出願の発明のイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブを用いて、神経細胞の樹状突起におけるＩＰ３濃度変化を可視化した結果を示した図である。
図４は、この出願の発明のイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブを用いて、ＭＤＣＫ細胞核内でのＩＰ３産生を可視化した結果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】  この出願の発明のイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブは、少なくとも、異なる機能を有する２つの部位、すなわち：
（１）イノシトール−１，４，５−三リン酸と特異的に結合し、イノシトール−１，４，５−三リン酸との結合によりその構造が変化するポリペプチドを含むイノシトール−１，４，５−三リン酸認識部位と、
（２）前記ポリペプチドとイノシトール−１，４，５−三リン酸との結合により互いに接近した場合にシグナルを発信する、前記ポリペプチドの両末端に連結された二つのマーカー部位を有してなるものである。なお、以下、この明細書においては、イノシトール−１，４，５−三リン酸をＩＰ３と記載することがある。
この出願の発明のＩＰ３検出・定量用プローブは、ＩＰ３認識部位のポリペプチドがＩＰ３を認識し、結合することにより、該ポリペプチドの構造変化が誘起され、ＩＰ３認識部位の両末端に連結された二つのマーカー部位の立体配座が変化し、この変化がシグナル変化として現れるという原理に基づくものである。
この出願の発明のＩＰ３検出・定量用プローブにおいて、ＩＰ３と特異的に結合し、ＩＰ３との結合によりその構造が変化するポリペプチドとしては、ＩＰ３受容体のＮ末端側に存在するＩＰ３結合ドメインが好ましく例示される。
ＩＰ３受容体は四量体複合体であり、ＩＰ３受容体サブユニットには、各々、異なるＩＰ３誘導Ｃａ２＋放出活性と細胞・組織発現分布を示すタイプ１、２、３の３種類が存在することが知られている。ＩＰ３と特異的に結合し、ＩＰ３との結合によりその構造が変化するポリペプチドとしてのＩＰ３結合ドメインは、これらタイプ１〜３のいずれのＩＰ３受容体サブユニット由来のものであってもよい。この出願の発明者らの研究によれば、これら各種のＩＰ３受容体の中でも、タイプ１ＩＰ３受容体の２２４番目のアミノ酸から５７９番目のアミノ酸までをＩＰ３結合ドメインとして使用した場合に、とくに良好な応答性が得られる。もちろん、このようなポリペプチドは、ＩＰ３結合ドメインに限定されず、合成および天然のあらゆるペプチド鎖を用いることができる。
この出願の発明のＩＰ３検出・定量用プローブにおいて、互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位としては、ＩＰ３とポリペプチドの結合により生じるポリペプチドの構造変化に応答して精度高くシグナル変化を生じるものであればよい。生化学の分野においては、一般的に種々の蛍光発色団が用いられるが、構造変化に敏速に応答するものとしては、蛍光共鳴エネルギー移動（以下、ＦＲＥＴ）の生起により蛍光強度比に変化を来たす発色団がある。したがって、二つのマーカー部位としては、異なる蛍光波長を有する二つの蛍光発色団、具体的には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のレッドシフト変異タンパク質である黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）や、ＧＦＰのブルーシフト変異タンパク質であるシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）が適用できる。もちろん、互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位としては、ＹＦＰとＣＦＰの組み合わせ以外にも、各種の蛍光タンパク質やスプリットしたレニラルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ等が適用できる。
この出願の発明のＩＰ３検出・定量用プローブは、以上のとおりに、ＩＰ３と特異的に結合し、ＩＰ３との結合によりその構造が変化するポリペプチドを有するＩＰ３認識部位と、互いの接近が検出可能な、ＩＰ３認識部位の両末端に連結された二つのマーカー部位を有していればよいが、ＩＰ３との結合や二つのマーカー部位の接近を阻害しない限り、その他の部位を有していてもよい。
例えば、この出願の発明のＩＰ３検出・定量用プローブは、互いの近接が検出可能な二つのマーカー部位のいずれか一方に、核局在化配列（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＮＬＳ）を連結したものとしてもよい。ＮＬＳはとくに限定されないが、例えば、配列番号１のものが適用される。もちろん、これ以外にも、Ｎｕｃｌｅｏｐｌａｓｍｉｎ由来のもの（配列番号２）、ＨＩＶ−１  Ｒｅｖ由来のもの（配列番号３）等の公知の核局在化配列（ＮＬＳ）が適用できる。これにより、ＩＰ３検出・定量用プローブを核内に局在化させることが可能となり、ＩＰ３の核内への移動や、核内のＩＰ３量を検出・定量することが可能となる。
あるいは、二つのマーカー部位がＩＰ３非共存下では立体的に離れた位置にあり、ポリペプチドとＩＰ３の結合により敏速に近接するようにするために、ＩＰ３認識部位と各マーカー部位との間にリンカー配列を設けてもよい。また、前記の核局在化配列とマーカー部位についても、直接連結されていてもよいし、リンカー配列を介して連結されていてもよい。
以上のとおりのこの出願の発明のＩＰ３検出・定量用プローブは、ＩＰ３と共存するとき、ＩＰ３と結合し、シグナル変化を生じるものである。したがって、前記のＩＰ３検出・定量用プローブと、ＩＰ３を共存させ、ＩＰ３非共存下および共存下でのシグナル変化を種々の化学的あるいは生化学的分析方法を用いて測定することにより、ＩＰ３を検出することが可能となる。
また、蛍光強度とＩＰ３量の関係を予め検量することにより、ＩＰ３を定量することもできる。
さらに、この出願の発明では、ＩＰ３認識部位のポリペプチドが前記のＩＰ３結合ドメインであるＩＰ３検出・定量用プローブを用いて、ＩＰ３誘導Ｃａ２＋放出を阻害する物質をスクリーニングすることもできる。すなわち、ＩＰ３認識部位のポリペプチドがＩＰ３結合ドメインであるＩＰ３検出・定量用プローブと、ＩＰ３と、候補物質を共存させ、該候補物質非共存下および共存下におけるシグナル変化を測定し、ＩＰ３とＩＰ３結合ドメインの結合を阻害する候補物質を、ＩＰ３誘導Ｃａ２＋放出阻害物質として判定できるのである。
このような、ＩＰ３検出・定量方法やＩＰ３誘導Ｃａ２＋放出阻害物質のスクリーニング方法において、ＩＰ３検出・定量用プローブとＩＰ３、あるいはＩＰ３検出・定量用プローブとＩＰ３と候補物質を共存させる方法としては、様々な方法が考えられる。例えば、細胞を破壊して細胞内からＩＰ３を溶出させ、その溶液にＩＰ３検出・定量用プローブや候補物質を添加して、これらの物質を共存させる方法が挙げられる。
あるいは、ＩＰ３検出・定量用プローブを組み込んだ発現ベクターを個々の培養細胞に導入する方法により、ＩＰ３検出・定量用プローブとＩＰ３を細胞内で共存させることもできる。さらに、細胞に候補物質を導入して共存させることも可能となる。このような方法では、細胞を破壊することなく、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＰ３の検出・定量が可能となる。なお、発現ベクターとしては、動物細胞発現用のプラスミドベクターが好ましく用いられる。また、このようなプラスミドベクターを細胞に導入する方法としては、電気穿孔法、リン酸化カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知の方法を採用することができる。
さらに、この出願の発明では、ＩＰ３検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、公知の作成法（例えば、非特許文献２）に従って非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、この動物またはその子孫動物の全細胞においてＩＰ３検出・定量用プローブとＩＰ３を共存させることもできる。このようなトランスジェニック非ヒト動物は、すべての体細胞にＩＰ３検出・定量用プローブを保有しているため、例えば、その体内に候補物質を導入し、細胞や組織におけるＩＰ３の濃度を測定することによって、ＩＰ３誘導Ｃａ２＋放出を阻害する物質をスクリーニングすることが可能となる。
この出願の発明では、また、前記のＩＰ３検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、該細胞に刺激を付与し、刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することにより、細胞内でのＩＰ３の産生に対する刺激の影響をモニタリングすることもできる。すなわち、ＩＰ３検出・定量用プローブを発現した細胞に刺激を与えた際のシグナル変化から、ＩＰ３産生量を測定でき、この結果から、該刺激がＩＰ３の産生にどのような影響を与えるかを知ることができるのである。このとき付与される刺激は、ホルモン、内分泌攪乱物質等の生化学的刺激であってもよいし、電気、放射線、熱等の物理的刺激であってもよい。
同様に、前記のＩＰ３検出・定量用プローブを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、非ヒト動物全能性細胞を個体発生することにより得られる非ヒト動物またはその子孫動物に刺激を付与し、刺激付与前後におけるシグナル変化を測定することにより、生体内でのＩＰ３の産生に対する刺激の影響とともに、ＩＰ３産生量の生命活動に対する影響をもモニタリングすることが可能となる。
以下、添付した図面に沿って実施例を示し、この発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、この発明は以下の例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることは言うまでもない。
【実施例】＜実施例１＞
ＩＰ３検出・定量用プローブ（図１）をコードするｃＤＮＡを遺伝子工学的手法により作成し、これをＭＤＣＫ細胞に導入した。次いで、このＭＤＣＫ細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ、細胞質内から蛍光が観察されたことから、プローブが細胞質に発現されたことが確認された。
＜実施例２＞
実施例１で得られたＩＰ３検出・定量用プローブ発現ＭＤＣＫ細胞に、マイクロインジェクション法によりＩＰ３を導入したところ、少量導入する毎にＣＦＰとＹＦＰの蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）が段階的に増加し、やがて飽和する様子が観察された。これより、ＩＰ３検出・定量用プローブがＩＰ３を認識し、ＩＰ３濃度に依存してＦＲＥＴが抑制されることが明らかになった。
＜実施例３＞
実施例１で得られたＩＰ３検出・定量用プローブ発現ＭＤＣＫ細胞のプリン受容体を１００μＭ  ＡＴＰで刺激したところ、蛍光強度比（ＣＦＰ／ＹＦＰ）の増加が観察された（図２ａ）。また、１０μＭ  ＡＴＰおよび１μＭ  ＡＴＰによる刺激でも、ＡＴＰ濃度に依存してプローブの応答が観察された（図２ｂ、２ｃ）。
これより、ＭＤＣＫ細胞において生理的条件下で生じた一過性のＩＰ３産生を、本願発明のＩＰ３検出・定量用プローブを用いて可視化できることが確認された。
＜実施例４＞
次にラット胎児脳の海馬より調製した神経細胞（ニューロン）にＩＰ３検出・定量用プローブを発現させ、神経細胞内のＩＰ３動態の観察を試みた。
神経細胞を２０μＭのグルタミン酸で刺激したところ、細胞体のみならず、樹状突起においてもＩＰ３濃度が一過性に上昇することが確認された（図３）。
＜実施例５＞
さらに、ＩＰ３検出・定量用プローブのＣ末端に配列番号４の核局在化配列を連結し、これをＭＤＣＫ細胞に発現させ、観察した。殆どの蛍光が核から観察されたことから、プローブが核内に局在化したことが確認された。また、このＭＤＣＫ細胞を１００μＭのＡＴＰで刺激したところ、ＩＰ３濃度が一過性に上昇することが確認された（図４）。
核内には、ＩＰ３受容体や、ＩＰ３をさらにリン酸化してＩＰ４、ＩＰ５、ＩＰ６等の異なる役割を有するセカンドメッセンジャーを産生する酵素群が局在化していることが明らかになっている。しかし、核内にそれらの基質となるＩＰ３がどの程度存在するのか、ＩＰ３が核膜孔を透過できるのか等については明らかにされていなかった。
この出願の発明のＩＰ３検出・定量用プローブを使用することにより、細胞外刺激により、細胞質のみならず、核内でもＩＰ３濃度が上昇するという新たな知見が得られた。
【産業上の利用可能性】  以上詳しく説明したとおり、この発明によって、イノシトール−１，４，５−三リン酸が生細胞内のどの部位でいつ産生されたかを、非襲撃的に精度高く検出・定量するためのプローブが提供される。また、この発明では、このようなイノシトール−１，４，５−三リン酸検出・定量用プローブを用いて、イノシトール−１，４，５−三リン酸を検出・定量する方法、細胞内でのイノシトール−１，４，５−三リン酸産生に対する刺激の影響をモニタリングする方法、並びに、イノシトール−１，４，５−三リン酸誘導Ｃａ２＋放出に対する阻害物質をスクリーニングする方法も提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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