(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的材料層（１０）の一部（３６）を単離する方法であって、
ａ）生物学的材料層（１０）が安定化層（１４）の一方の側に接着され、安定化層（１４）がその間に生物学的材料を有してスライドに塗布され、安定化層（１４）が生物学的材料を取り囲み、かつ汚染から生物学的材料を保護するためにスライドの縁部に沿って接着され、
ｂ）基板（２０）は、基板（２０）の少なくとも一方の側に結合層（２２）を設けて形成され、安定化層（１４）と基板（２０）との間の接着を促進するように結合層（２２）の材料が選択され、
ｃ）基板（２０）は、その結合層（２２）により、生物学的材料層（１０）から、安定化層（１４）の他方の側で安定化層（１４）と接触させられ、
ｄ）光拡散器として働く平らな底部（３０）と、底部（３０）の上方に立ち上がっている縁部（３２）と、底部（３０）から縁部（３２）の他方の側と連結されているハンドリング装置（３４）とを備える保持部（２６）が基板（２０）として用いられ、
ｅ）レーザビームの焦点により、単離されるべき生物学的材料層（１０）の一部（３６）の周囲に、閉じた曲線またはほぼ閉じた曲線が描かれ、曲線上の生物学的材料ならびに安定化層（１４）が切除され、
ｆ）次に、基板（２０）から、生物学的材料層（１０）の単離されるべき一部（３６）と接触していない安定化層（１４）の部分が分離される
方法。
【請求項２】
生物学的材料層（１０）の一部（３６）を単離する方法であって、
ｇ）生物学的材料層（１０）が安定化層（１４）の一方の側に塗布され、
ｈ）生物学的材料層（１０）を有する安定化層（１４）は、捕捉装置（１８，２６）上方に懸装して配置され、安定化層（１４）と捕捉装置（１８，２６）との間に間隙（４０）が設けられ、
ｉ）光拡散器として働く平らな底部（３０）と、底部（３０）の上方に立ち上がっている縁部（３２）と、底部から外方に向けられかつ底部（３０）から縁部（３２）の他方の側と連結されているハンドリング装置（３４）とを備える保持部（２６）が捕捉装置（１８）として用いられ、
ｊ）次に、レーザビームの焦点により、単離されるべき生物学的材料層（１０）の一部（３６）の周囲に閉じた曲線が描かれ、曲線上の生物学的材料ならびに安定化層（１４）が切除され、その結果、単離されるべき生物学的材料層（１０）の一部（３６）が生物学的材料層（１０）の残部から分離され、
ｋ）次に、単離されるべき生物学的材料層（１０）の一部（３６）が捕捉装置（１８，２６）上へ落下することにより捕捉される
方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、
凹部を有するスライド（１８）が捕捉装置として用いられ、
単離されるべき生物学的材料層（１０）の一部（３６）がスライド（１８）の凹部（４１）上方に置かれる方法。
【請求項４】
請求項２記載の方法において、
安定化層（１４）と捕捉装置（１８，２６）との間の間隙（４０）は、安定化層（１４）と捕捉装置（１８，２６）との間にスペーサ（３８）を配置することによって作り出される方法。
【請求項５】
請求項２記載の方法において、
ハンドリング装置（３４）の反対側の底部を超えて縁部が０．１〜２ｍｍ突出している保持部（２６）が用いられる方法。
【請求項６】
請求項１または５のいずれか記載の方法において、
光拡散器の近傍で底部（３０）がせいぜい２ｍｍの厚みを有する保持部（２６）が用いられる方法。
【請求項７】
請求項１，または５のいずれか記載の方法において、
ハンドリング装置（３４）の反対側で底部（３０）に結合層（２２）が設けられた保持部（２６）が用いられる方法。
【請求項８】
請求項１または５のいずれか記載の方法において、
保持部が可撓性連結帯（３４）を介して密封可能チューブ容器（２８）に一体的に接続され、前記連結帯は、可撓性連結帯（３４）により旋回させることによってチューブ容器を密封できるのでチューブ容器用のシール部材（２６）として働く方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物学的材料層の一部を単離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
疾病の分子的原因を見つけるため、いわゆる遺伝子発現研究が行われる。これらの研究は、実際に細胞において発現させられている遺伝子を決定しようとするものである。なぜならば、付属する蛋白質が細胞の病理発生の原因となるからである。どの蛋白質が実際に存在しているかを決定する１つの方法は、細胞内で合成されるｍＲＮＡを決定することである。なぜならば、蛋白質はそれから形成されるからである。
【０００３】
しかしながら、ｍＲＮＡは非常に短命な細胞産物であり、したがって、細胞内のｍＲＮＡ濃度は非常に低い。例えば腫瘍細胞のｍＲＮＡを決定しようとするのであれば、できるだけ多数の腫瘍細胞を集める必要がある。そのためには、腫瘍分子を病変組織から単離する必要がある。これを行うには、例えば、腫瘍細胞を組織切片から切除し、単離して集め得る。続いて、単離された腫瘍細胞は粉砕される。適切な精製段階を経て、ｍＲＮＡが細胞から単離される。次にこれは逆転写酵素によりｃＤＮＡに転写される。原則として、これはリニアＰＣＲを用いて行われる。このようにして得られたｃＤＮＡを、適切なＤＮＡチップを用いて定性的または定量的に分析される。
【０００４】
この関連において、本発明は、調査すべき細胞の単離、または抽出に関する。これの重要な局面の１つは、極めて清潔に、すなわち特にＲＮアーゼがないように作業することである。なぜならば、これらの酵素はｍＲＮＡを劣化させるからである。素手との接触さえも避けるべきである。
【０００５】
公知の組織切り取り方法（例えば、the American Journal of Pathology, Vol. 151 (1997), pages 63-67 参照）においては、組織切片はスライド上で作製される。レーザーを用いて、病変組織の周囲に閉曲線を描く。この曲線上の組織が切除され、その結果、単離されるべき病変組織が残りの組織から分離される。切除された組織片は、例えばピペットを用いて吸引できる。公知の方法に伴う欠点は、非常に時間がかかることである。１回の分析に必要な量のｍＲＮＡを集めるため、１人が組織の切り取り作業に数日間従事しなければならない。
【０００６】
改良された方法がＤＥ１９６  １６  ２１６  Ａ１に記載されている（Cell. Mol. Bio., Vol. 44 (1998), pages 735-746も参照）。スライド上に作製された組織切片は、倒立または正立顕微鏡に置かれる。密封可能チューブ容器のシール部材はスライド上の組織切片の上に配設される。シール部材の底部すなわち内側はオイルコートされている。ＵＶレーザーによる切除は、スライド上の組織の一部を切除するために用いられる。組織の切除部分は、ＵＶ光パルスによってスライドから引き離される。その際に、切除部分は、オイルコートされたシール部材にぶつかり、オイルに付着する。これにより、時間がかかるピペットによる吸引は行われない。しなしながら、欠点は、引き離された組織片の動きが制御しにくいことである。組織片は常にシール部材に達するわけではない。さらに、調査されるべきその当の組織がＵＶ光パルスにより損傷を受ける。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、より大量の組織をできるだけ無菌的かつ迅速に採取できる方法および付属の保持部を提供することである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
この目的は、本発明に従い、請求項１の特徴を有する方法により達成される。
【０００９】
生物学的材料層の一部を分離するための本発明による方法においては、生物学的材料層は最初に安定化層の１つの面に塗布される。基板は、基板の少なくとも１つの面に結合層を設けることにより成形される。この場合、結合層の材料は、安定化層と基板との間の接着を促進できるものが選択される。続いて、基板はその結合層により、生物学的材料層から安定化層の他方の面の安定化層と接触させられる。次に、レーザビームの焦点は、単離されるべき生物学的材料層の部分の周囲に閉曲線を描き、生物学材料ならびに曲線上の安定化層も切除する。これによって、単離されるべき部分は、生物学的材料層の残部から分離される。続いて、単離されるべき生物学的材料層の部分と接触していない安定化層の部分が基板と分離される。単離された部分は基板に付着する。
【００１０】
代わりに、単離されるべき部分を最初に、層の残部から分離することができる。そうして初めて、基板はその結合層により、生物学的材料層から安定化層の他方の側の安定化層と接触させられる。次に、再度、分離されるべき生物学的材料層の部分と接触してない安定化層の部分と基板が続いて分離される。単離された部分は、再度基板に付着する。
【００１１】
さらに、レーザビームの焦点は、単離されるべき生物学的材料層の部分の周囲に完全に閉じた曲線を描く必要はない。ほぼ閉じた曲線を描けば十分である。例えば単離されるべき部分がその上に保持されている１つ以上のブリッジ部を、単離されるべき部分と残部との間に残しておくことができる。基板と、単離されない部分とを分離する時には、ブリッジ部が切断され、単離されるべき部分が切り離される。次に、それらは要望どおりに、基板に再度付着する。
【００１２】
生物学的材料層は、例えば、組織切片、細胞スミアまたは接種細胞とし得る。
【００１３】
フィルムは、例えば、安定化層用に用い得る。本発明による方法の実行後、単離されるべき断片の部分、例えば腫瘍細胞は、基板に付着するのに対し、切片の残部、例えば健康な組織は、残っている安定化層に付着したままである。単離されるべき切片の部分は、かくして単離される。
【００１４】
目的は、請求項２の特徴を有する方法によってさらに達成される。
【００１５】
生物学的材料層の一部を分離するための本発明による方法において、生物学的材料層は、最初に安定化層の一方の面に塗布される。安定化層は、捕捉装置上方に懸装された生物学的材料層と共に配置され、安定化層と捕捉装置との間に間隙が残される。続いて、レーザビームの焦点は、単離されるべき生物学的材料層の部分の周囲に閉曲線を描き、曲線上の生物学的材料ならびに安定化層を切除する。これによって、単離されるべき部分は、生物学的材料層の残部から分離される。単離されるべき生物学的材料の部分、例えば腫瘍細胞は、捕捉装置上に直接落ちて容易に単離され、例えば、さらに搬送され得る。
【００１６】
安定化層と捕捉装置との間の間隙は、例えば空隙とし得るが、適切なガスで満たすか、減圧とすることができる。
【００１７】
安定化層と捕捉装置との間の間隙は、捕捉装置としての凹部を備えたスライドを用い、単離されるべき部分をスライド中の凹部上に置くことによって直接的に作製し得る。
【００１８】
代わりに、安定化層と捕捉装置との間の間隙は、安定化層と捕捉装置との間にスペーサを配置することによって作製し得る。
【００１９】
一般に、組織試料は最初に薄いウエハにカットされ、次にスライドに塗布され、任意に染色され、続いて透明なマウンティング媒体（アルコール、キシレン）が付与され、最後にカバーガラスで覆われる。そのようにして作製された組織切片は、顕微鏡下で良好な結像品質で観察できる。もし組織から個々の切片または細胞を切り取り（顕微解剖）、それらを他のなんらかの方法でさらに処理する必要があれば、マウンティング媒体およびカバーガラスはあきらめねばならない。この結果、顕微鏡における結像品質が劇的に低下する。なぜならば、試料、空気および光学系の間の屈折率の差が大きく、かつ試料表面が粗いため、光が強く屈折および散乱されるからである。
【００２０】
光拡散器、例えば散乱スクリーン、つや消しスクリーンまたはつや消しガラスを、照明装置と試料との間に配置することができる。これにより結像品質がはるかに改善され、その結果、光拡散器を用いた場合の結像品質が、マウンティング媒体とカバーガラスを用いた場合に近い品質を有していることが明らかにされている。
【００２１】
そのために、平らな底部を有する保持部を備えることができ、これが光拡散器として働く。この底部の上には縁部が立ち上がっている。底部から外方へ向けられているハンドリング装置が、底部からの縁部の他方の側に連結されている。
【００２２】
ハンドリング装置は、例えば、単純な取っ手または密封可能チューブ容器との連結部とし得る。
【００２３】
したがって、保持部は、一方では単離された組織を集め、他方では光拡散器として働き、さらにハンドリング装置により容易に操作できる。
【００２４】
光拡散器は、生物学的材料層からせいぜい２ｍｍ離して配置するのが有利である。それゆえ、シール部材の底は、光拡散器の範囲における厚みがせいぜい２ｍｍである。
【００２５】
もし保持部が下方から生物学的材料層まで達しているなら、縁部はハンドリング装置とは反対側の底部から０．１ｍｍ〜２ｍｍ突出すべきである。このように、必要な間隙が自動的に設定される。しかしながら、もし底部を生物学的材料層または安定化層と直接接触させる必要があれば、保持部の底部のそのようなデザインは使えない。
【００２６】
生物学的材料層の単離された部分を捕捉または収集するため、保持部の底部にはハンドリング装置と反対の側に結合層が設けてある。
【００２７】
本発明の改良においては、保持部は、可撓性連結帯を介して密封可能チューブ容器に一体的に連結されており、チューブ容器のシール部材として働く。可撓性連結帯により旋回させることにより、チューブ容器を密封できる。組織を捕捉または収集した後、シール部材で簡単に閉鎖し得る。単離された組織切片は無菌チューブ容器内に封入される。
【００２８】
そのようなチューブ容器は簡単に、試料の下で旋回させるか、旋回させて光および／または操作パスから外すことができる。このようにして、組織切片は、種々の操作、例えば試料を機械的に除去するためにアクセスできる。
【００２９】
保持部は、捕捉装置としてまたは単離された組織片を収集するための基板として用い得る。
【００３０】
本発明による方法により、非常に小さく、時には個別の、組織切片中の腫瘍細胞を、通常の作業段階で単離し、それらを通常の捕捉装置で収集することも可能である。
【００３１】
本発明のさらに有利な改良は、従属請求項において特徴付けられている。
【００３２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を、図面（尺度に忠実ではない）中で概要的に表した代表的実施例を用いてより詳細に説明する。これらの図面中では、個々の図中の同じ参照番号は同等の部材を示す。
【００３３】
以下、図１Ａを参照する。
【００３４】
凍結、またはパラフィン包埋した組織を、スライサで薄い組織切片１０に薄切する。概して、これらの切片は巻いた状態になる。
【００３５】
顕微鏡スライド１２にアルコールを噴霧する。サイズが数平方センチメートルで紙層で裏打ちしてある１片のフィルム１４を、アルコール噴霧した顕微鏡スライド１２の面上に載せる。このフィルム１４は、例えば厚みが２μｍのＵＶ吸収ＰＥＴまたはＰＥＭで構成される。続いて、紙を取り去る。次に、接着剤１６、例えばマウント接着剤で、フィルム１４をその縁部において顕微鏡スライド１２に固定する。
【００３６】
次に、巻いた状態の組織切片１０をフィルム１４上に載せる。フィルム１４と組織切片１０とを有する顕微鏡スライド１２を６０℃まで加熱することにより、パラフィンが溶融して組織切片１０が展開する。
【００３７】
方法１
以下、図１Ｂを参照する。現在好まれている代表的実施形態においては、組織切片１０を有するフィルム１４を、続いて顕微鏡スライド１２から取り去り、組織切片１０を下向きにして第２の顕微鏡スライド１８上に載せる。この第２の顕微鏡スライド１８上で、フィルム１４をその縁部において接着剤１６で再度固定する。次に第２の顕微鏡スライド１８を倒立顕微鏡の目標平面内に設置する。
【００３８】
１つの代表的実施形態においては、底面に結合剤２２が配置された接着テープ２０をフィルム１４表面、したがって組織切片１０の上部に置き得る。接着テープ２０、２２の代わりに、種々の結合フィルム、例えば結合剤２２としてシリコン樹脂を用いる半導体産業用のものを使うことも可能である。光拡散器２４は接着テープ２０上に置かれる。続いて、組織は上方から照明装置により照明される。接着テープ２０自身が光拡散器として働くことも可能である。
【００３９】
以下、図１Ｃを参照する。続いて、単離されるべき組織３６は、倒立顕微鏡内において、集束されたビーム、例えば波長が３３７ｎｍで出力密度が約１０8 〜１０9 Ｗ／ｃｍ2 の窒素レーザ、で切除される。これにより、ＵＶ吸収フィルム１４も切断される。次に、光拡散器を取り去る。
【００４０】
以下、図１Ｄを参照する。次に、接着テープ２０を顕微鏡から取り去る。その際に、切除された組織片３６は接着テープ２０に付着している。フィルム１４と組織切片１０の残部は、接着剤１６により第２の顕微鏡スライド１８に固定されており、それに付着したまま残る。
【００４１】
以下、図２Ａおよび図２Ｂを参照する。しかしながら、現在好まれている代表的な実施形態においては、密封可能プラスチック製チューブ容器２８のシール部材２６は、結合剤２２、例えばシリコン樹脂がその片面に塗布されている。この目的のため、チューブ容器をシール部材で密封する場合に、チューブ容器の内側と接触しているシール部材２６の側が選ばれる。
【００４２】
このシール部材２６は平らな底部３０を有し、これは光散乱性材料で構成されている。底部３０の上方に、円周状縁部３２が立ち上がっている。縁部３２は、可撓性連結帯３４を介してチューブ容器２８と一体的に接続されている。可撓性片３４によってシール部材２６を旋回することにより、チューブ容器２８を密封できる。シール部材２６は、結合剤２２を下に向けて、フィルム１４上方、したがって組織切片１０上方に配置される。組織切片１０は、照明装置により光散乱性シール部材２６を通して照明される。
【００４３】
以下、図２Ｃを参照する。続いて、単離されるべき組織３６は、倒立顕微鏡内において、集束されたビーム、例えば波長が３３７ｎｍで出力密度が約１０8 〜１０9 Ｗ／ｃｍ2 の窒素レーザ、で切除される。これにより、ＵＶ吸収フィルム１４も切断される。
【００４４】
以下、図２Ｄを参照する。次に、シール部材２６を顕微鏡から取り去る。その際に、切除された組織片３６はシール部材２６の底部３０に付着している。安定化層１４と組織切片１６の残部は接着剤１６により２番目の顕微鏡スライド１８に固定されており、それに付着したまま残る。
【００４５】
以下、図２Ｅを参照する。プラスチック製チューブ容器２８はシール部材２６により密封される。したがって、切除された組織片３６は、チューブ容器２８の無菌空間内に置かれる。したがって、この組織片は非常に純粋な方法で単離された。
【００４６】
方法２
以下、図３Ａおよび図３Ｂを参照する。代替的方法において、組織切片１０を備えたフィルム１４が顕微鏡スライド１２から取り去られ、組織切片１０を上向きまたは下向きにして、第２の顕微鏡スライド１８上に載せられる。このケースでは、高さが約０．１ｍｍのスペーサ３８が第２の顕微鏡スライド上に配置されている。したがって、組織切片１０を有するフィルム１４の下方には空隙４０が形成される。
【００４７】
以下、図３Ｃを参照する。代わりに、フィルム１４と第２のスライド１８との間の間隙４０は、スペーサ３８の代わりに、第２のスライド１８中の凹部４１により作り出すこともできる。
【００４８】
そのようにして作製された第２のスライド１８が、倒立顕微鏡の目標面内に置かれる。上部に延びる倒立顕微鏡の照明路内に拡散器２４が導入される。これは、試料１０の約０．１ｍｍ〜０．２ｍｍ上方に置かれる。
【００４９】
以下、図３Ｄを参照する。続いて、単離されるべき組織３６を、集束されたＵＶレーザビームで切除する。これによりＵＶ吸収フィルム１４も切断される。したがって、単離されるべき生物学的材料の部分３６は、第２のスライド１８上に落ち、その結果、より簡単に搬送できる（図３Ｅ参照）。
【００５０】
方法３
以下、図４Ａおよび図４Ｂを参照する。さらなる代替的方法においては、フィルム１４と組織切片１０とを下側に有する顕微鏡スライド１２が、正立顕微鏡の目標面内に置かれる。
【００５１】
この代表的実施形態においては、密封可能プラスチック製チューブ容器２８のシール部材２６には、結合剤２２、例えばシリコン樹脂、が設けてある。チューブ容器２８のシール部材２６は、試料１０の下方に置かれる。シール部材２６は平らな底部３０を有している。部材２６の、試料１０と同じ側で、円周状縁部４６が底部３０から０．１〜２ｍｍ上方へ立ち上がっている。底部３０の反対側には、さらなる縁部３２が立ち上がっている。この第２の縁部３２は、可撓性連結帯３４を介してチューブ容器２８に一体的に接続されている。可撓性連結帯３４によりシール部材２６を旋回することにより、チューブ容器２８を密封できる。
【００５２】
シール部材２６は、結合剤２２を上向きにして、試料１０の下方に置かれる。組織１０は、光拡散器として働くシール部材２６を通して、照明装置により下方から照明される。
【００５３】
以下、図４Ｃを参照する。単離されるべき組織３６は、集束されたビーム、例えば波長が３３７ｎｍで出力密度が約１０8 〜１０9 Ｗ／ｃｍ2 の上方から入射する窒素レーザで再度切除される。これにより、ＵＶ吸収フィルム１４も切断される。
【００５４】
したがって、単離されるべき生物学的材料の部分３６は、シール部材２６上に落ちる。プラスチック製チューブ容器２８は、シール部材２６により密封される（図４Ｄ参照）。したがって、切除された組織片３６は、チューブ容器２８の無菌空間内に置かれる。したがって、この組織片は非常に清浄な方法で単離された。
【図面の簡単な説明】
【図１】  生物学的材料層の一部を単離する方法の概略を示す。
【図２】  生物学的材料層の一部を単離する代替的方法の概略を示す。
【図３】  生物学的材料層の一部を単離するさらなる代替的方法の概略を示す。
【図４】  生物学的材料層の一部を単離するさらなる代替的方法の概略を示す。
【符号の説明】
１０  組織切片
１２  顕微鏡スライド
１４  フィルム
１６  接着剤
１８  第２の顕微鏡スライド
２０  接着テープ
２２  結合剤
２４  光拡散器
２６  シール部材
２８  密封可能プラスチック製チューブ容器
３０  底部
３２  シール部材２６の縁部
３４  可撓性接続部材
３６  単離されるべき組織
３８  スペーサ
４０  空隙
４１  凹部
４６  縁部
【図１Ａ】
0004639022.tif 000002
【図１Ｂ】
0004639022.tif 000003
【図１Ｃ】
0004639022.tif 000004
【図１Ｄ】
0004639022.tif 000005
【図２Ａ】
0004639022.tif 000006
【図２Ｂ】
0004639022.tif 000007
【図２Ｃ】
0004639022.tif 000008
【図２Ｄ】
0004639022.tif 000009
【図２Ｅ】
0004639022.tif 000010
【図３Ａ】
0004639022.tif 000011
【図３Ｂ】
0004639022.tif 000012
【図３Ｃ】
0004639022.tif 000013
【図３Ｄ】
0004639022.tif 000014
【図３Ｅ】
0004639022.tif 000015
【図４Ａ】
0004639022.tif 000016
【図４Ｂ】
0004639022.tif 000017
【図４Ｃ】
0004639022.tif 000018
【図４Ｄ】
0004639022.tif 000019