(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２、２３又は２７に記載のアミノ酸配列を有し、フラボノイドの５位の糖に脂肪族アシル基を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、あるいはそれらのアミノ酸配列に対して１個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換によって修飾されており、且つフラボノイドの５位の糖に脂肪族アシル基を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項２】
配列番号：２、２３又は２７に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有し、且つフラボノイドの５位の糖に脂肪族アシル基を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の遺伝子を含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターにより形質転換された大腸菌。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の遺伝子によってコードされる蛋白質。
【請求項６】
請求項４に記載の大腸菌を培養し、又は生育させ、そして該大腸菌からフラボノイドの５位の糖に脂肪族アシル基を転移する活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする該蛋白質の製造方法。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の遺伝子が導入された、植物もしくは該植物の子孫又はそれらの組織。
【請求項８】
請求項７に記載の植物又は該植物の子孫の切り花。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明はフラボノイドの５位の糖に脂肪族アシル基を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子およびその利用方法に関するものである。
背景技術
花き産業においては多様性に富んだ新品種の顕花植物を開発することが重要である。なかでも、花の色は花きのもっとも重要な形質であり、交配に頼った従来の育種法により、さまざまな色の品種が育種されてきたが、交配可能な植物種の遺伝資源が限定されているため、単一の植物種がすべての色の品種を有することはまれである。
花の色の主な成分は、アントシアニンと総称される、フラボノイドの一群の化合物である。植物には多様なアントシアニンが存在することは知られており、それらの多くの構造が既に決定されている。アントシアニンの色は主としてその構造に依存している（Ｈａｒｂｏｒｎｅ（１９８６）Ｔｈｅ  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ，ｐ５６５）。アントシアニンの生合成に関わる酵素やその遺伝子に関しても研究が進んでおり、分子生物学的手法と植物への遺伝子導入により、アントシアニンの構造を変換し、花の色を変えた例もある（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，７（１９９５）Ｈｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｒｎｉｓｈ，ｐ．１０７１、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３９（１９９８）Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．ｐ１１１９）。アントシアニンの生合成経路はアントシアニジン３−グルコシドに至るまではほとんどの顕花植物で共通である（Ｈｏｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，７，ｐ１０７１）。その後アントシアニジン３−グルコシドは種および品種特異的に多様な修飾を受ける。この多様性が花色の多彩さの一因となっている。
アントシアニンは中性溶液中では不安定な化合物であるが、糖やアシル基により修飾されることにより安定性が向上する（Ｆｏｒｋｍａｎｎ（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，１０６，ｐ１）。また、配糖化により、アントシアニンの色はやや赤くなり、芳香族アシル基の付加により青くなる（Ｆｏｒｋｍａｎｎ（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，１０６，ｐ１）。アシル基は、大別すると芳香族アシル基（例えばカフェオイル基、クマロイル基等）と脂肪族アシル基（例えばマロニル基、アセチル基等）があるが、脂肪族アシル基の花色に関する生理的役割については、アントシアニンの溶解度を増加させるという以外にはわかっていない。
アントシアニンに脂肪族アシル基を転移する酵素の精製や生化学的性質については、これまでいくつか報告されている〔Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，１９８１，２０８，２３３−２４１（パセリのＦｌａｖｏｎｏｌ  ３ＭａＴ（フラボノールの３位の糖にマロニル基を転移する反応を触媒する酵素）とＦｌａｖｏｎｅ／Ｆｌａｖｏｎｏｌ  ７ＭａＴ（フラボンとフラボノールの７位の糖にマロニル基を転移する反応を触媒する酵素）の粗精製並びに分子量や基質特異性試験）；Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，１９８３，２２４，２６１−２７１（パセリのＦｌａｖｏｎｏｌ  ３ＭａＴとＦｌａｖｏｎｅ／Ｆｌａｖｏｎｏｌ  ７ＭａＴの各器官における活性測定）；Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，１９８３，２２６，２０６−２１７（パセリのＦｌａｖｏｎｏｌ  ３ＭａＴとＦｌａｖｏｎｅ／Ｆｌａｖｏｎｏｌ  ７ＭａＴの単一標品への精製並びに３ＭａＴ抗体の作成）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８３，１３３，４３９−４４８（パセリにはマロニル化されたＡｐｉｇｅｎｉｎ  ７−Ｏ−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅが存在することを、ＮＭＲなどで構造確認）；Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，１９８４，２３４，５１３−５２１（マメのイソフラボンに対する７ＭａＴの至適ｐＨ、分子量及びＫｍの決定）；Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９３，３２，１４２５−１４２６（キク科植物のＤｅｎｄｒａｎｔｈｅｍａ  ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍの花弁粗抽出液にシアニジン３−グルコシドに対する脂肪族アシル基転移酵素活性が存在することの確認）；Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，１１８，１０９−１１８（Ａｊｕｃａ  ｒｅｐｔａｎｓの培養細胞の粗抽出液中のマロニル基転移酵素活性の確認）；Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，５２，１５−１８（ダリアの花弁由来マロニル基転移酵素の基質特異性の決定）〕が、その蛋白質の一次構造を明らかにした例はなく、遺伝子クローニングの報告もない。
発明の開示
本発明では、アントシアニンの脂肪族アシル基転移酵素によるアシル化のうちマロニル化が花色に及ぼす影響を明らかにし、脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、好ましくはアントシアニンに対して脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を得ることを課題とした。本発明で得られた脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を植物に導入し、発現させることで、花色を変換することが可能である。
前記のように、アントシアニンのマロニル化が花色に及ぼす影響については報告がない。その効果を明らかにするために、３種のアントシアニンすなわちデルフィニジン３，５−ジグルコシド、アワバニン（デルフィニジン３−（クマロイル）グルコシド−５−グルコシド）、マロニルアワバニン（デルフィニジン３−（クマロイル）グルコシド−５−（マロニル）グルコシド）の溶液の色を比較したところ、マロニルアワバニンの色がもっとも青く、マロニル化がアントシアニンの青色化に貢献していることが示された。
そこで、サルビアの花を材料として、マロニル基転移酵素の精製を試みた。そして、精製蛋白質の部分アミノ酸配列を決定し、その情報をもとにＰＣＲにより、サルビアのマロニル基転移酵素遺伝子のＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をプローブとしてサルビア・グアラニティカ花ｃＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙをスクリーニングし、２種類のマロニル基転移酵素遺伝子を得た。さらに、これらをプローブにして、サルビア・スプレンデンス、シソ、ラベンダーからホモログを得た。
従って本発明は、配列番号：２、４、６、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列を有し、フラボノイドの５位の糖に脂肪族アシル基を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子、あるいはそれらのアミノ酸配列に対して１個又は複数個のアミノ酸の付加、欠失及び／または他のアミノ酸による置換によって修飾されており、且つフラボノイドの５位の糖に脂肪族アシル基を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を提供する。
本発明はまた、配列番号：２、４、６、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列に対して５０％以上の相同性を示すアミノ酸配列を有し、且つフラボノイドの５位の糖に脂肪族アシル基を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を提供する。
本発明はまた、配列番号：２、４、６、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列の一部または全部に対して、５ｘＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、且つフラボノイドの５位の糖に脂肪族アシル基を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を提供する。
本発明はさらに前記の遺伝子を含んでなるベクターを提供する。
本発明はまた、前記ベクターにより形質転換された宿主を提供する。
本発明はまた、上記いずれかの遺伝子によってコードされる蛋白質を提供する。
本発明はまた前記の宿主を培養し、又は生育させ、そして該宿主からフラボノイドの５位の糖に脂肪族アシル基を転移する活性を有する蛋白質を採取することによる該蛋白質の製造方法を提供する。
本発明はまた、上記の遺伝子が導入された植物もしくはこれと同じ性質を有する該植物の子孫またはそれらの組織を提供する。
本発明はさらに、上記の植物又はこれと同じ性質を有する該植物の子孫の切り花を提供する。
本発明はさらに、上記の遺伝子を用いて花の色を変える方法を提供する。
本発明はさらに、上記の遺伝子を用いて花の色を青くする方法を提供する。
発明の実施の形態
本発明の遺伝子としては、例えば配列番号：２、４、６、２３、２５、２７又は２９に記載するアミノ酸配列をコードするものが挙げられる。しかしながら、複数個のアミノ酸の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換によって修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質も、もとの蛋白質と同様の酵素活性を有することが知られている。従って本発明は、フラボノイドの５位の糖に脂肪族アシル基を転移する活性を有している蛋白質である限り、配列番号：２、４、６、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列に対して１個または複数個のアミノ酸配列の付加、欠失および／または他のアミノ酸による置換によって修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質および該蛋白質をコードする遺伝子も本発明に属する。
本発明はまた、配列番号：２、４、６、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列、またはそれらの塩基配列の一部分、好ましくはアミノ酸６個以上をコードする塩基配列、例えばコンセンサス領域の６個以上のアミノ酸配列をコードする塩基配列に対して、例えば５ｘＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつフラボノイドの５位の糖に脂肪族アシル基を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子に関するものである。なお、適切なハイブリダイゼーション温度は塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えばアミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとした場合には５０℃以下の温度が好ましい。
このようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば植物由来のもの、例えば、ペチュニアやトレニア由来の遺伝子が挙げられるが、植物以外の由来であってもよい。また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであってもよい。
本発明はさらに配列番号：２、４、６、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列に対して約５０％以上、好ましくは６０％または７０％以上、あるいはさらに、８０％又は９０％以上、の相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつフラボノイドの５位の糖に脂肪族アシル基を転移する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の花色変換への利用に関するものである。
生来の塩基配列を有する遺伝子は実施例に具体的に示すように、例えばｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡは生来の塩基配列を有するＤＮＡを基礎として、常用の部位特定変異誘発やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えば修飾を導入したいＤＮＡ断片を生来のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特異的変異誘発またはＰＣＲ法を実施し、所望の修飾を導入したＤＮＡ断片を得る。その後、この変異を導入したＤＮＡ断片を目的とする蛋白質の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
あるいはまた、短縮されたアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡを得るには、例えば目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。
また、得られた遺伝子を大腸菌および酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定することにより、得られた遺伝子が脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードすることを確認することができる。さらに、当該遺伝子を発現させることにより、遺伝子産物である脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質を得ることができる。あるいはまた、配列番号：２、４、６、２３、２５、２７又は２９に記載のアミノ酸配列に対する抗体を用いても、脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質を得ることができ、抗体を用いて他の生物由来の脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子をクローン化することもできる。
従って本発明はまた、前述の遺伝子を含む組換えベクター、特に発現ベクター、及び当該ベクターによって形質転換された宿主に関するものである。宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物としては細菌、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する細菌、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属微生物、例えばバシルス．スブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）など常用の宿主を用いることができる。真核性宿主としては、下等真核生物、例えば真核性微生物、例えば真菌である酵母または糸状菌が使用できる。
酵母としては例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、例えばサッカロミセス．セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等が挙げられ、また糸状菌としてはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、例えばアスペルギルス．オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス．ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物が挙げられる。さらに動物細胞または植物細胞が使用でき、動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞系が使用される。さらに昆虫細胞、例えばカイコ細胞、またはカイコの成虫それ自体も宿主として使用される。
本発明の発現ベクターはそれらを導入すべき宿主の種類に依存して発現制御領域、例えばプロモーターおよびターミネーター、複製起点等を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、常用のプロモーター、例えばｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えばグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター等が使用され、糸状菌用プロモーターとしては例えばアミラーゼプロモーター、ｔｒｐＣプロモーター等が使用される。また動物細胞宿主用プロモーターとしてはウイルス性プロモーター、例えばＳＶ４０アーリープロモーター、ＳＶ４０レートプロモーター等が使用される。発現ベクターの作製は制限酵素、リガーゼ等を用いて常用に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主の形質転換も常法に従って行うことができる。
前記の発現ベクターによって形質転換された宿主を培養、栽培または生育し、培養物等から常法に従って、例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等により目的とする蛋白質を回収、精製することができる。
本発明はサルビア由来の脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子のみに限定されるものではなく、脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子の利用に関するものである。脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質の起源としては、植物でも動物でも微生物であってもよく、脂肪族アシル基転移活性を持っていれば、同様に花色変換へ利用できる。さらに本発明は、脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を導入することにより、色合いが調節された植物もしくはその子孫又はこれらの組織に関するものであり、その形態は切り花であってもよい。
本発明で得た脂肪族アシル基転移活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を用いると、液胞内に蓄積しているアントシアニンをアシル化することで青くでき、結果として花の色を青くすることができる。現在の技術水準をもってすれば、植物に遺伝子を導入し、その遺伝子を構成的あるいは組織特異的に発現させることは可能であるし、またアンチセンス法やコサプレッション法によって目的の遺伝子の発現を抑制することも可能である。
形質転換可能な植物の例としては、バラ、キク、カーネーション、金魚草、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、イネ、オオムギ、小麦、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシなどがあげられるがこれらに限定されるものではない。
実施例
以下実施例に従って、発明の詳細を述べる。分子生物学的手法はとくに断らない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）に依った。
実施例１．種々のアントシアニンのｐＨによる色彩変化
デルフィニジン３，５−ジグルコシド、アワバニン（デルフィニジン３−（クマロイル）グルコシド−５−グルコシド）、マロニルアワバニン（デルフィニジン３−（クマロイル）グルコシド−５−（マロニル）グルコシド）をそれぞれ０．１ｍＭ、０．３ｍＭ、０．５ｍＭの濃度でマックルベイン緩衝液（ｐＨ５．３，ｐＨ５．６，ｐＨ６．０）に溶解し、その溶液の色をカラーチャート（Ｒｏｙａｌ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）で評価した。なお、デルフィニジン３，５−ジグルコシドは、その３，５−ジアセチルグルコシド体からアルカリ加水分解により、アセチル部分を除去することにより得られる（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４８，４３１３−４３２６，１９９２）。
アワバニンは、マロニルアワバニンの５−マロニル部分を除去することにより得られる（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，２４，４８６３−４８６６，１９８３）。また、マロニルアワバニンは、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，２４，４８６３−４８６６，１９８３に記載の方法により植物体から抽出して得られた。カラーチャートは数字が大きいほど青い色で、同じ数字の中ではＡがもっとも濃い。結果を表１にまとめた。いずれの濃度、ｐＨにおいてもマロニルアワバニンがもっとも青く、マロニル基がアントシアニンの青色化に貢献していることが示された。
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実施例２．サルビア・マロニル基転移酵素の活性測定
マロニル基転移酵素の活性測定は、反応液１００μｌ（終濃度２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０中に、０．０１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に溶解したシソニン１０μｇ、マロニルＣｏＡ１０μｇ、および測定する酵素標品を含む）を３０℃で２０分間反応させた後、氷冷０．０５％ＴＦＡ水溶液２００μｌを添加することにより、反応を停止した。シソニンおよびマロニルシソニンの定量はＳｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  ＯＤＰ−５０  ４Ｅカラムを用いた逆相高速液体クロマトグラフィー（ＤＹＮＡＭＡＸ  ＨＰＬＣシステム）により、０．５％ＴＦＡ水溶液をＡ液とし、０．５％ＴＦＡ，５０％アセトニトリル水溶液をＢ液として、分離開始から０分、３分、１７分、１８分、２３分、２４分、３０分におけるＢ液濃度がそれぞれ４５％，４５％，５５％，１００％，１００％，４５％，４５％になるよう直線濃度勾配で、毎分０．７ｍｌの流速で５２０ｎｍの吸収をモニターしながら、反応液５０μｌを用いて行った。
実施例３．サルビア・マロニル基転移酵素のタンパク精製
マロニル基転移酵素の精製はサルビア・スプレンデンス（Ｓａｌｖｉａ  ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ）の赤色花２，６６４ｇを材料として行った。サルビア花は開花直前までの萼を含む花全体を集め、実験に用いるまで−８０度で保存しておいた。
サルビア花５００ｇに対してポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）１００ｇ、抽出緩衝液（１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、３０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）３Ｌおよび終濃度０．５ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）を加え、ＨＥＡＶＹ  ＤＵＴＹ  ＢＬＥＮＤＥＲ（ＷＡＲＩＮＧ）にて破砕した。得られた破砕液を７，５００×Ｇ、２０分間遠心分離した。上清を吸引ろ過（ろ紙、Ｗｈａｔｍａｎ１１４）し、粗酵素液とした。２，６６４ｇから１０．４Ｌの粗酵素液を得た。
次に硫安分画を行い、硫酸アンモニウム２０−５０％飽和画分の沈殿として回収し、緩衝液Ａ（１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、３０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に溶解した（２９２０ｍｌ）。これにＯｃｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（アマシャム  ファルマシア  バイオテク株式会社）２８０ｍｌを加え、静かに攪拌しながら、終濃度３０％飽和になるように硫酸アンモニウムを徐々に添加した。十分に攪拌した後、一晩静置した。上清にマロニル基転移酵素活性の残っていないことを確認した後、泥漿液中のゲルを吸引ろ過（ろ紙、Ｗｈａｔｍａｎ１１４）により回収した。ゲルを緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、３０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２０％飽和硫酸アンモニウム）で吸引ろ過しながら十分に洗浄した。
ゲルに緩衝液Ｃ｛２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０％エチレングリコール、０．１％３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）｝２８０ｍｌを加え、３０分静かに攪拌した後、吸引ろ過にてマロニル基転移酵素活性画分を回収した。この緩衝液Ｃによる溶出操作を１０回繰り返し行い活性画分を集めた。Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（Ｂｉｏｍａｘ  ８Ｋ，ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）により濃縮した後、緩衝液Ｄ（１０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて脱塩し、１５５ｍｌの酵素液１を得た。
ＭＩＭＥＴＩＣ  Ｙｅｌｌｏｗ  ２（ナカライテスク株式会社）１００ｍｌをエコノカラム（φ１．０ｃｍ  ｘ  １２０ｃｍ，日本バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社）に充填し、緩衝液Ｄにて平衡化した。酵素液１全量をアプライ後、緩衝液Ｄにて洗浄したのち、緩衝液Ｅ（２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、３０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０５％ＣＨＡＰＳ）により、カラムに結合した蛋白質を溶出した。活性画分をＰｅｌｌｉｃｏｎおよび限外ろ過（ＹＭ−１０，ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ）により濃縮し、３２ｍｌの酵素液２を得た。
ＭＩＭＥＴＩＣ  Ｒｅｄ  ３（ナカライテスク株式会社）５０ｍｌをエコノカラム（φ１．５ｃｍ  ｘ  ３０ｃｍ、日本バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社）に充填し、緩衝液Ｆ（５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて平衡化した。酵素液２全量をアプライ後、緩衝液Ｆにて洗浄したのち、緩衝液Ｇ（５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、３０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，０．１ｍＭアセチルＣｏＡ）により、カラムに結合した蛋白質を溶出した。活性画分をＰｅｌｌｉｃｏｎ、限外ろ過およびセントリコンにより濃縮した後、緩衝液Ｈ（３０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、３０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）にて脱塩し、３ｍｌの酵素液３を得た。
ＭＩＭＥＴＩＣ  Ｒｅｄ  ３（ナカライテスク株式会社）５ｍｌをエコノカラム（φ１．０ｃｍ  ｘ  １０ｃｍ、日本バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社）に充填し、緩衝液Ｆにて平衡化した。酵素液３全量をアプライ後、緩衝液Ｆにて洗浄したのち、緩衝液Ｇにより、カラムに結合した蛋白質を溶出した。活性画分をセントリコンにより濃縮した後、１．５ｍｌの酵素液４を得た。
ＭｏｎｏＱ５／５カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク株式会社）を緩衝液Ｇで平衡化した後、酵素液４全量を流速０．０５ｍｌ／ｍｉｎでアプライし、緩衝液Ｆで洗浄した（流速０．０５ｍｌ／ｍｉｎ、６０分）。緩衝液Ｉ（２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、３０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１ｍＭ  ＮａＣｌ）の０−１００％直線勾配（流速０．０５ｍｌ／ｍｉｎ、４００分）により、カラムに結合した蛋白質を溶出し、活性画分をセントリコンにて濃縮し、０．８ｍｌの酵素液５を得た。
Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ＨＲ  ５／５（アマシャム  ファルマシア  バイオテク株式会社）を緩衝液Ｂで平衡化した後、終濃度２０％飽和になるよう硫酸アンモニウムを添加した酵素液５を流速０．０２ｍｌ／ｍｉｎでアプライした。緩衝液Ｂでカラムを洗浄後、緩衝液Ｃの０−１００％直線勾配（流速０．０２ｍｌ／ｍｉｎ、５００分）によりカラムに結合した蛋白質を溶出し、活性画分を得た。
さらに、調製用電気泳動システム（バイオ・フォレーシスＩＩＩ、アトー株式会社）にて分画し、得られたマロニル基転移酵素画分３．２ｍｌを限外ろ過膜濃縮、０．０２％ＳＤＳ／７５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）置換を行い４０μｌに濃縮した。その後、逆相カラム（ＰｏｒｏｓＲ２Ｈ、日本パーセプティブ株式会社）ＨＰＬＣにて最終精製を行った。分離条件は、０．１％ＴＦＡのもと、６０分でアセトニトリル濃度が８％から８０％の直線濃度勾配、毎分０．１ｍｌの流速で２８０ｎｍの吸収をモニターしながらピーク画分のみを分取した。最終的に得られた蛋白質は４７ｋＤａの単一バンドであったことから、マロニル基転移酵素の分子量は４７ｋＤａであることが判明した。
実施例４．サルビア・マロニル基転移酵素の部分アミノ酸配列の決定
実施例３で単一バンドとして回収した蛋白質に２ｐｍｏｌのトリプシン（プロメガ株式会社）を加えて３７℃で３０時間消化し、各ペプチド断片の構造決定を試みた。トリプシン消化液を逆相ＨＰＬＣ（μＲＰＣ  Ｃ２／Ｃ１８、アマシャム  ファルマシア  バイオテク株式会社）により各ペプチド断片を分離した。分離条件は、０．１％トリフルオロ酢酸のもと、６０分でアセトニトリル濃度が８％から８０％の直線濃度勾配、毎分０．１ｍｌの流速で２１５ｎｍの吸収をモニターしながら吸収のピーク画分のみを分取した。
各ピーク画分をスピードバックで濃縮・乾固させ、３７％アセトニトリル３０μｌに溶解させ、アミノ酸シークエンサー（ＰＳＱ−１、株式会社島津製作所）に供した。その結果、１２種のペプチドのアミノ酸シークエンスを判読することができた。以下にアミノ酸配列を示す。
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実施例５．サルビア・マロニル基転移酵素の遺伝子断片の増幅
実施例４で得られた部分アミノ酸配列ＭＴＴ２０とＭＴ１４２をもとにして以下のプライマーを作成した。
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サルビア花から調製したｃＤＮＡを鋳型として総量１００μｌとして、以下の反応液組成でＰＣＲを行った；１ｘＴＡＫＡＲＡ  ＰＣＲ緩衝液、２００ｍＭ  ｄＮＴＰｓ，サルビアｃＤＮＡ  １００ｎｇ，ＭＴＴ２０−１プライマー１ｐｍｏｌ／μｌ，ＡＴＣＲｒ２プライマー１ｐｍｏｌ／μｌ，ＴＡＫＡＲＡ  ｒＴａｑ  ２．５ユニット。反応は９６℃で１分反応させた後、９６℃にて１分、４２℃にて２分、７２℃にて３分で３０サイクル反応させ、さらに７２℃で７分間反応させた。
この反応産物を鋳型としてＭＴＴ２０−３、ＡＴＣＲｒ２プライマーを用いて上記と同様の反応液組成でｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行った。反応は９６度で１分反応させた後、９６℃にて１分、５０℃にて２分、７２℃にて３分で３０サイクル反応させ、さらに７２℃で７分反応させた。得られたＰＣＲ産物をサブクローニングしてシークエンスを行ったところ、約９００ｂｐの反応産物の推定アミノ酸配列内にプライマーの設計に用いたもの以外の部分アミノ酸配列ＭＴＴ１４１、ＭＴＴ２６、ＭＴＴ２７−２（配列番号：１５，１２及び１３）が見出されたことから、精製蛋白質をコードする遺伝子断片であることが明らかになった。
実施例６．サルビア・マロニル基転移酵素ｃＤＮＡの単離
サルビア・グアラニティカ（Ｓａｌｖｉａ  ｇｕａｒａｎｉｔｉｃａ）の花由来のｃＤＮＡライブラリーをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のλＺＡＰ  ＩＩ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔを用い製造者の推奨する方法で構築した。このライブラリーの約２０万個のクローンを実施例３で得られた８８９ｂｐのＤＮＡ断片をプローブとして洗浄条件（５ｘ  ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ，３７度）でスクリーニングし最終的に１０クローンの陽性クローンを得た。それらは３種類のグループに分類できそれぞれのグループで最長のクローンをＳｇＭａＴ１、ＳｇＭａＴ１’およびＳｇＭａＴ２と名づけた。なおライブラリーのスクリーニングは、公知の方法（例えば、Ｆｕｊｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ，１９９８，Ｐｌａｎｔ．Ｊ．１６，４２１）によった。
ＳｇＭａＴ１およびＳｇＭａＴ１’は、それぞれ１４１９ｂｐおよび１４７１ｂｐで、どちらも開始メチオニンを欠いていた。ＳｇＭａＴ１とＳｇＭａＴ１’はアミノ酸レベルで９８％の相同性を示したことから同一の酵素遺伝子をコードする対立遺伝子であると考えられた。ＳｇＭａＴ１の推定アミノ酸配列中に実施例４で明らかにした精製マロニル基転移酵素の部分アミノ酸配列が一部異なる部分もあったがすべて確認できた。一部の異なる部分は、使用したサルビアの種の違いによるものと思われる。
これらの結果からＳｇＭａＴ１及びＳｇＭａＴ１’遺伝子は、アントシアニンの５位の糖にマロニル基を転移する酵素をコードしていることが明らかになった。ＳｇＭａＴ２は、１５３０ｂｐのｃＤＮＡを持ち、その中には１２６０ｂｐからなるオープンリーディングフレームが存在し全長をコードしていた。アミノ酸レベルで、ＳｇＭａＴ１はＳｇＭａＴ２に対して５２％の同一性を示した。また、いずれの遺伝子も他の植物のアシル基転移酵素と３７〜４７％の同一性を示した。
リンドウでは、同一品種内でも機能の異なるアシル基転移酵素は、３５−４０％程度の同一性しか示さない（Ｙｏｎｅｋｕｒａ−Ｓａｋａｋｉｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４１：４９５−５０２）。よって、ＳｇＭａＴ１とＳｇＭａＴ２における５５％という同一性は、同一品種由来の遺伝子であることを差し引いても、ＳｇＭａＴ１とＳｇＭａＴ２が機能的に類似しており、ＳｇＭａＴ２もアントシアニンへのマロニル基の転移反応を触媒することを示している。ＳｇＭａＴ１、ＳｇＭａＴ１’及びＳｇＭａＴ２の塩基配列をそれぞれ配列番号：１、３及び５に示し、これらの塩基配列から推定されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：２、４及び６に示す。
実施例７．大腸菌でのマロニル基転移酵素活性の確認
終濃度５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地に、プラスミドｐＳｇＭａＴ１（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩ，ＸｈｏＩサイトにＳｇＭａＴ１遺伝子を含み、イソプロピルベータチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）添加によってＳｇＭａＴ１遺伝子産物をｌａｃＺ蛋白質との融合蛋白質として発現できる）を導入した大腸菌のシングルコロニーを植菌し、３７℃で一晩しんとうしながら前培養した。その培養液（２ｍｌ）を１００ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地に植菌し、３０度で６００ｎｍの吸光度が０．５になるまで本培養した。その後、培養液にＩＰＴＧを終濃度で１ｍＭとなるように添加し、さらに３０℃でＩＰＴＧ添加後９時間培養し集菌した。集菌した菌体を、緩衝液（０．１Ｍ  ＫＰＢ，ｐＨ７．０，３０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に懸濁し、氷冷しながら細胞を超音波破砕した。
遠心分離にて得た上清部分（可溶性画分）を用いて酵素活性を測定した。なお、コントロールとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−のみを含んだ大腸菌についても同様に処理した。活性測定は、シソニンを基質として用い、実施例２に従った。
ｐＳｇＭａＴ１遺伝子発現産物による反応産物には、シソニン（Ｒｔ９．７分）に加え、マロニルシソニン（Ｒｔ１２．２分）が検出されたが、コントロールでは、シソニンのみしか検出されなかった。このことからＳｇＭａＴ１遺伝子は、マロニル基転移活性を有する酵素をコードしていることが確認された。
実施例８．サルビア由来のマロニル基転移酵素ｃＤＮＡの単離（２）
サルビア（Ｓａｌｖｉａ  ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ）の花弁ｃＤＮＡライブラリーをλＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をベクターとするＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、製造者が推奨する方法により構築した。実施例６で得られたＳｇＭａＴ１をプローブとして実施例６に記載の方法でスクリーニングした。得られたクローンの中で最もｃＤＮＡの長かったクローンをＳｓＭａＴ１とした。この塩基配列を配列番号：２２に示し、該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号：２３に示す。このｃＤＮＡは、その配列から、完全長ではないと考えられる。
ＳｓＭａＴ１は、アミノ酸レベルでＳｇＭａＴ１に対して９２％、ＳｇＭａＴ２に対して５２％の同一性を示した。
また同様に同じライブラリーをＳｇＭａＴ２でスクリーニングし、ＳｓＭａＴ２を得た。この塩基配列を配列番号：２４に示し、該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号：２５に示す。
ＳｓＭａＴ２は、アミノ酸レベルでＳｇＭａＴ１に対して５３％、ＳｇＭａＴ２に対して９６％、ＳｓＭａＴ１に対して５２％の同一性を示した。
実施例９．シソ由来のマロニル基転移酵素ｃＤＮＡの単離
シソ（Ｐｅｒｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）から若い赤い葉を採集し、これをもとにｃＤＮＡライブラリーをλＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をベクターとするＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、製造者が推奨する方法により構築した。このライブラリーを実施例８と同様にＳｇＭａＴ１をプローブにしてスクリーニングし、得られたクローンの中で最もｃＤＮＡの長かったクローンをＰｆＭａＴ１とした。ＰｆＭａＴ１の塩基配列を配列番号：２６に示し、該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号：２７に示す。
ＰｆＭａＴ１は、アミノ酸レベルでＳｇＭａＴ１に対して６７％、ＳｇＭａＴ２に対して５７％、ＳｓＭａＴ１に対して６５％、ＳｓＭａＴ２に対して５７％の同一性を示した。
実施例１０．ラベンダー由来のマロニル基転移酵素ｃＤＮＡの単離
ラベンダー（Ｌａｖｅｎｄｕｌａ  ａｎｇｕｓｔｉｆｏｌｉａ）のｃＤＮＡライブラリーをλＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をベクターとするＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて、製造者が推奨する方法により構築した。このライブラリーを実施例６で得られたＳｇＭａＴ２をプローブとし、実施例６に記載の方法でスクリーニングし、ＬｎＭａＴ２を得た。この塩基配列を配列番号：２８に示し、該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号：２９に示す。
ＬｎＭａＴ２は、アミノ酸レベルでＳｇＭａＴ１に対して５３％、ＳｇＭａＴ２に対して６５％、ＳｓＭａＴ１に対して５１％、ＳｓＭａＴ２に対して６４％、ＰｆＭａＴ１に対して５６％の同一性を示した。
実施例１１．Ｓ．ｓｐｌｅｎｄｅｎｓ  ＭａＴ１の発現
実施例８で得られたＳｓＭａＴ１遺伝子の５’−末端にＢａｍＨＩサイトを導入するプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ＃１：５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＣ  ＧＡＧ  ＧＧＡ  ＣＧＣ  ＡＴＧ  ＡＣＡ  ＡＣＡ  ＡＣＡ  ＡＣＡ  ＡＣ−３’（配列番号：３０））、ＳｓＭａＴ１遺伝子の３’−末端にＢａｍＨＩサイトを導入するプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ＃２：５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＴＡ  ＣＡＡ  ＴＧＧ  ＴＴＣ  ＧＡＣ  ＧＡＧ  ＣＧＣ  ＣＧＧ  ＡＧＡ−３’（配列番号：３１））、およびＳｓＭａＴ１遺伝子中のＢａｍＨＩサイトを欠失させるプライマー（Ｐｒｉｍｅｒ＃３：５’−Ｇ  ＧＡＣ  ＣＣＧ  ＣＣＧ  ＡＴＡ  ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＡＡＴ  ＴＡＣ  ＴＴＣ−３’（配列番号：３２））を合成した。なおＰｒｉｍｅｒ＃１はＳｓＭａＴ１開始コドンのメチオニンの直前にＦａｃｔｏｒ  Ｘａ切断サイト（Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）をコードするよう設計した。
ｐＢＫ−ＣＭＶファージミドベクター（東洋紡績株式会社）のマルチクローニングサイト（ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ）にＳｓＭａＴ１  ｃＤＮＡが挿入されたプラスミド（ｐＢＫ−ＣＭＶ−ＳｓＭａＴ１）を鋳型とし、Ｐｒｉｍｅｒ＃２およびＰｒｉｍｅｒ＃３を用いた一回目のＰＣＲ（反応液組成：ｐＢＫ−ＣＭＶ−ＳｓＭａＴ１  １００ｎｇ、１×ｐｆｕ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、１μＭ  Ｐｒｉｍｅｒ＃２、１μＭ  Ｐｒｉｍｅｒ＃３、２．５Ｕ  ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社；反応条件：９６℃２分間、（９６℃１分、７０℃１分、７２℃３分）×３０サイクル、７２℃７分）を行ない、ＰＣＲ産物（約５００ｂｐ）を得た。
さらに、得られたＰＣＲ産物であるＳｓＭａＴ１の２本鎖ＤＮＡ断片とＰｒｉｍｅｒ＃１を用いて、ＰＣＲ（反応液組成：ｐＢＫ−ＣＭＶ−ＳｓＭａＴ１  １００ｎｇ、１×ｐｆｕ緩衝液、２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、１μＭ  Ｐｒｉｍｅｒ＃１、一回目のＰＣＲ産物１００ｎｇ、２．５Ｕ  ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）；反応条件：９６℃７分間、（９６℃２分、７０℃１分、７２℃７分）×３０サイクル、７２℃１０分）を行なった。
２回目のＰＣＲ産物はＡ−ｔａｉｌ付加（２回目のＰＣＲ産物１００ｎｇ、１×ＥｘＴａｑ緩衝液、２ｍＭ  ｄＡＴＰ、ＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ；７０℃、３０分）をほどこした後、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（クローンテック株式会社）にクローニングした。その結果、完全長ＳｓＭａＴ１を挿入するプラスミド（ｐＣＲ２．１−ＳｓＭａＴ１）を得た。ＤＮＡシークエンサーによりＳｓＭａＴ１遺伝子のＤＮＡ配列にＰＣＲ操作による誤ったヌクレオチドの取り込みがないことを確認した。
ｐＣＲ２．１−ＳｓＭａＴ１をＢａｍＨＩで完全消化し、生成した約１４００ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片を大腸菌発現ベクターｐＱＥ−３０（ＱＩＡＧＥＮ社）のＢａｍＨＩサイトにサブクローニングし、ｐＱＥ−３０Ｘａ−ＳｓＭａＴ１とした。
ｐＱＥ−３０Ｘａ−ＳｓＭａＴ１を含む大腸菌でのＳｓＭａＴ１発現は実施例７に記載の方法に従った。また、酵素の活性測定は実施例２に記載の方法に従った。
ＳｓＭａＴ１遺伝子を発現している大腸菌抽出物を用いて酵素活性を測定したところ、シソニンに加え、マロニルシソニンの産生が確認できた。すなわち、ＳｓＭａＴ１がフラボノイドの５位の糖にマロニル基を転移する活性を有する蛋白質をコードしていることが確認された。
また、基質としてマロニルＣｏＡの代わりに、アセチルＣｏＡ、メチルマロニルＣｏＡ、サクシニルＣｏＡを用いた場合でも、シソニンに加え新しいピークがＨＰＬＣによるカラムクロマトグラフィーで観察され、ＳｓＭａＴ１はこれらの基質をシソニンへ転移する活性を有することが判明した。
実施例１２．Ｐ．ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ  ＭａＴ１の発現
実施例７と同様に、実施例９で得られたＰｆＭａＴ１遺伝子をＬａｃＺ蛋白質との融合蛋白質として発現できるように作製したプラスミドを用いて、実施例７と同様に大腸菌で発現させ、活性測定に供した。酵素の活性測定は実施例２に記載の方法に従った。
ＰｆＭａＴ１遺伝子を発現している大腸菌抽出物を用いて酵素活性を測定したところ、シソニンに加え、マロニルシソニンの産生が確認できた。すなわち、ＰｆＭａＴ１がフラボノイドの５位の糖にマロニル基を転移する活性を有する蛋白質をコードしていることが確認された。
産業上の利用可能性
本発明により、脂肪族アシル基転移酵素が花の色の制御に関わっていることがはじめて明らかとなった。本蛋白質を花弁で発現させ、アントシアニンを修飾させることにより、花の色を変化させることができる。脂肪族アシル基転移酵素としては、ここで述べたサルビア、シソ、ラベンダー由来のものだけでなく、他の生物の同様な酵素活性をもつ遺伝子を用いることができる。
【配列表】
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