(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオグリカンの分子構造に類似した構造を有する人工分子であることを特徴とするシュードプロテオグリカンであって、その人工分子が、１以上のグリコサミノグリカン多糖鎖が、コアタンパク質に代わる１本の直鎖状ポリマー鎖に共有結合する人工分子であり、その直鎖状ポリマー鎖が、グリコサミノグリカン多糖鎖が結合する以外のアミノ基がアセチル化された１本の直鎖状ポリアクリルアミド鎖からなることを特徴とするシュードプロテオグリカン。
【請求項２】
請求項１のシュードプロテオグリカンのプローブとしての使用。
【請求項３】
請求項１のシュードプロテオグリカンの吸着体としての使用。
【請求項４】
請求項１のシュードプロテオグリカンにビオチン標識を導入したシュードプロテオグリカンプローブ。
【請求項５】
請求項１のシュードプロテオグリカンをリガンドとして固定化したシュードプロテオグリカン吸着体。
【請求項６】
生体高分子ビーズまたは合成高分子ビーズに共有結合させたものである請求項５のシュードプロテオグリカン吸着体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シュードプロテオグリカンおよびそのプローブ、吸着体などの用途に関する。
シュードプロテオグリカンプローブおよびシュードプロテオグリカン吸着体は、例えばグリコサミノグリカン結合性物質を検出または単離する目的や、グリコサミノグリカン結合性物質をターゲットとしたＤＤＳや遺伝子導入に用いることができる。
本発明において用いる「シュードプロテオグリカン」は、本発明者らが実験によりその機能等を裏付けした後に、プロテオグリカンの分子構造を模倣した人工分子、すなわちプロテオグリカンの分子構造に類似した構造を有する人工分子に命名した新しい技術用語である。
本発明において用いる略語は以下のとおりである。
ＡＢＣ               Ａｖｉｄｉｎ−ｂｉｏｔｉｎ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ
ＡＦＣ               Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
ＡＴ−ＩＩＩ         Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ＩＩＩ
ＢＰＬ−Ｈｅｐ       Ｂｉｏｔｉｎ ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｈｅｐａｒｉｎ
ＢＳＡ               Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ
ＣＢＢ               Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｂｌｕｅ
Ｃｙｐ               Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ Ａ
ＤＡＢ               ３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ
ＥＤＴＡ             Ｅｔｙｌｅｎｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ
ＥＥＤＱ             Ｎ−ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−２−ｅｔｈｏｘｙｌ，２−ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ
Ｄ−ＧｌｃＡ         Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ
ＧＡＧ               ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ
Ｈｅｐ               Ｈｅｐａｒｉｎ
ＨＲＰ               Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
Ｌ−ＩｄｏＡ         Ｌ−Ｉｄｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ
ｋＤａ               ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ
Ｍｗ                 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ
ＮＨＳ               Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ
ＰＡ                 ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ
ＰＡＧＥ             ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ＰＢ                 １０ｍＭ Ｎａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．７）
ＰＢＳ               ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ
ＰＬＬ               ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ
ＰＧ                 ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ
ＰＭＳＦ             Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ
ＰＶＤＦ             Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ     Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
ＴＢＳ               ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ
ＴＥＭＥＤ           Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ
Ｔｒｉｓ             Ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ
ＢＰＡ−Ｈｅｐ       Ｂｉｏｔｉｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ−Ｈｅｐ
【背景技術】
【０００２】
プロテオグリカン（ＰＧ）モノマーはコアタンパク質に複数のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）が共有結合した超分子であり、細胞外マトリックス中の種々のリガンド分子との相互作用により、細胞接着、凝集、移動、組織形成の調節等において、重要な役割を果たしている。ＧＡＧはウロン酸とアミノ糖の二糖繰り返し構造を基本骨格とする酸性多糖であり、構成二糖の種類およびエピマー化や硫酸化などの修飾により、その構造は多様である。主要なＧＡＧはヘパリン／ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸などに分類される。
第１０図は、プロテオグリカン（ＰＧ）モノマーの構造を表した図面である。ＰＧモノマーはコアタンパク質（ｃｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）に１ないし複数のグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ，ＧＡＧ）が共有結合した超分子である。ＰＧは細胞膜表面や細胞外マトリックスに存在し、そのグリコサミノグリカン鎖を介して、成長因子、接着性糖タンパク質、インテグリンなど、種々のリガンド分子と相互作用することにより、細胞接着、凝集、移動、組織形成等において、重要な調節機能を果たしている。
プロテオグリカンのうち最も構造的多様性を持ち、様々な細胞活動に影響を与える分子の一つがヘパリン／ヘパラン硫酸プロテオグリカンである。ヘパリン／ヘパラン硫酸は、第１１図に示すように、グルクロン酸またはイズロン酸と、グルコサミンの二糖単位をもち、ウロン酸の２位、グルコサミンの２位、３位、６位に硫酸基が付加されることが多く、他のグリコサミノグリカンと比べても非常に高度に硫酸化されている。
また、硫酸基が付加される位置やウロン酸の種類などによって多数の異性体が存在するため、その構造は極めて多様性に富んでいる。この硫酸化は、成長因子、マトリックス糖タンパク質、抗血液凝固因子をはじめとするヘパリン結合性タンパク質との反応に重要な関与をしていると考えられている（非特許文献１）。これまでは、単独のＧＡＧ多糖鎖をプローブあるいは支持体に固定化して、ＧＡＧ結合物質の探索や研究が行われてきた（非特許文献２）。しかしＧＡＧがコアタンパク質さらにはヒアルロン酸と結合してＰＧ超分子構造をとった時にはその反応性が変化する可能性が考えられる。
【０００３】
【非特許文献１】Ｃａｓｕ，Ｂ．，ａｎｄ Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｕ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｅｐａｒｉｎａｎｄ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ．（２００１）Ａｄｖ．Ｃａｒｂｏｈｙｄ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７，１５９−２０６．
【非特許文献２】Ｏｇａｗａ，Ｈ．，Ｕｅｄａ，Ｈ．，Ｎａｔｓｕｍｅ，Ａ．，ａｎｄ Ｓｕｚｕｋｉ，Ｒ．Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｔｙ ｏｆｎｅｏｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ｐｒｏｂｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅｓ ｗｉｔｈ ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ−ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ．（２００３）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，３６２，１９６−２０９．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
プロテオグリカン（ＰＧ）に結合するリガンドタンパク質を見出し、それらの結合の生物学的意義を解明することは、発生分化、神経成長、細胞増殖、組織形成と修復、止血系などの調節に結びつき、医療や薬剤開発において非常に重要である。
上記のとおり従来法はコアタンパク質と結合した天然のＧＡＧの存在形態を考慮に入れず、全く異なる合成プローブや単独のＧＡＧ鎖に非常に近い誘導体を研究に利用してきたため、生体内リガンドを的確に捕らえているか、疑わしい。ＧＡＧがコアタンパク質さらにはヒアルロン酸と結合してＰＧ超分子構造をとった時にはその反応性が変化する可能性が考えられるためである。
本発明者らは、これまで研究に用いられたネオプロテオグリカンプローブやヘパリン吸着体と、生体内での実際のＧＡＧ存在形態とのギャップに着目したのであり、それゆえ本発明は、これまでのＧＡＧプローブや吸着体に代わる、より有用なＰＧ機能研究ツールを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、以下の（１）のシュードプロテオグリカンを要旨とする。
（１）プロテオグリカンの分子構造に類似した構造を有する人工分子であることを特徴とするシュードプロテオグリカンであって、その人工分子が、１以上のグリコサミノグリカン多糖鎖が、コアタンパク質に代わる１本の直鎖状ポリマー鎖に共有結合する人工分子であり、その直鎖状ポリマー鎖が、グリコサミノグリカン多糖鎖が結合する以外のアミノ基がアセチル化された１本の直鎖状ポリアクリルアミド鎖からなることを特徴とするシュードプロテオグリカン。
【０００６】
本発明は、以下の（２）のプローブとしての使用を要旨とする。
（２）上記（１）のシュードプロテオグリカンのプローブとしての使用。
【０００７】
本発明は、以下の（３）の吸着体としての使用を要旨とする。
（３）上記（１）のシュードプロテオグリカンの吸着体としての使用。
【０００８】
本発明は、以下の（４）のシュードプロテオグリカンプローブを要旨とする。
（４）上記（１）のシュードプロテオグリカンにビオチン標識を導入したシュードプロテオグリカンプローブ。
【０００９】
本発明は、以下の（５）および（６）のシュードプロテオグリカン吸着体を要旨とする。
（５）上記（１）のシュードプロテオグリカンをリガンドとして固定化したシュードプロテオグリカン吸着体。
（６）生体高分子ビーズまたは合成高分子ビーズに共有結合させたものである上記（５）のシュードプロテオグリカン吸着体。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、初めてシュードプロテオグリカンプローブとその固定化吸着体を調製し、これらをグリコサミノグリカン結合レセプターの探索に利用し、その有効性を見出した。より詳細には、本発明は、これまで研究に用いられたネオプロテオグリカンプローブやヘパリン吸着体と、生体内での実際のＧＡＧ存在形態とのギャップに着目し、コアタンパク質に代わる直鎖状ポリＬ−リジン鎖またはポリアクリルアミド鎖に複数のＧＡＧを共有結合させ、ＰＧの構造を模倣したシュードＰＧを調製し、これを誘導化してビオチン標識プローブならびにアフィニティー吸着体を調製した。
第１図に、本発明のＰＧ構造を模倣したシュードＰＧを含むプローブおよびアフィニティー吸着体を、従来のプローブおよび吸着体と比較して図示する。シュードプロテオグリカン（シュードＰＧ）は、本発明者らによりはじめて創り出され、実験的にその機能等を裏付けされ、命名された天然のＰＧモノマーの構造を模倣した構造をもつ物質である。
脳抽出液からのリガンドタンパク質探索に、シュードＰＧプローブと吸着体を適用し、ＰＧの新規な生体内機能および超分子構造の重要性を示唆する結果を得た。シュードＰＧプローブと吸着体は、これまでのＧＡＧプローブや吸着体に代わる、より有用なＰＧ機能研究ツールと期待される。
すなわち、本発明は、グリコサミノグリカン結合性物質を検出または単離し、相互作用を解析する目的や、グリコサミノグリカン結合性物質をターゲットとした特定の細胞・組織・微生物などへのＤＤＳや遺伝子導入に用いることができるシュードプロテオグリカンプローブおよびシュードプロテオグリカン吸着体を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
シュードプロテオグリカンについて説明する。
本発明において用いる「シュードプロテオグリカン」は、本発明者らが実験によりその機能等を裏付けした後に、プロテオグリカンの分子構造を模倣した人工分子、すなわちプロテオグリカンの分子構造に類似した構造を有する人工分子に命名した新しい技術用語である。
プロテオグリカン（ＰＧ）はそのグリコサミノグリカン鎖を介して、成長因子、接着性糖タンパク質、インテグリンなど、細胞外マトリックス中や細胞表面の種々のリガンド分子と相互作用することにより、細胞接着、凝集、移動、組織形成等において、重要な調節機能を果たしている。シュードプロテオグリカンは、ビオチン標識をはじめとする適切なタグ（標識）を導入したり、アガロース、デキストラン、セルロース、ポリアクリルアミドなどから作られた支持体、例えば成形された生体高分子ビーズ（生体高分子を材料とするビーズ、バイオビーズ）、合成高分子ビーズ、センサーチップ表面などに共有結合させることによって、グリコサミノグリカン結合レセプターの探索、分離精製、相互作用解析、ならびに特定の細胞・組織・微生物などへのターゲティングに利用でき、その新しい構造に基づき、従来のグリコサミノグリカンプローブに比べて優れた機能をもつことを発明者らが実験により見出した。
【００１２】
プロテオグリカンの分子構造について説明する。
プロテオグリカン（ＰＧ）モノマーはコアタンパク質に複数のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）が共有結合した超分子である（第１０図）。本発明者らは、種々の糖鎖誘導化プローブや糖鎖固定化吸着体の調製技術を活用して、ＧＡＧ鎖が生体内でとっている超分子複合体構造（ＧＡＧ以外にコアタンパク質、ヒアルロン酸などから構成される）を模倣して、１つ以上〜複数のＧＡＧ鎖を、コアタンパク質に代わる直鎖状ポリＬ−リジン鎖またはポリアクリルアミド鎖などの直鎖状高分子に共有結合させて人工複合糖質を調製した。
【００１３】
プロテオグリカンの分子構造を模倣した人工分子について説明する。
プロテオグリカンの構造的特徴を保有するシュードプロテオグリカンは本発明者らによりはじめて創り出されものである。
従来のプローブや吸着体は、天然のプロテオグリカン構造をもたず、グリコサミノグリカン鎖を直接ビオチン標識、あるいは支持体ビーズに固定化して吸着体を調製した。またはアルブミンやペルオキシダーゼなどのタンパク質に直接結合させたネオプロテオグリカンプローブが用いられた（第１図参照）。これらは上記背景技術に記載の通り、天然のプロテオグリカンの性質とは異なりＤＮＡ結合タンパク質などとの交差反応性や、タンパク質部分による非特異的結合などの問題点があった［非特許文献２］。
また、直鎖状ポリＬ−リジン鎖を、遺伝子ＤＮＡのターゲティングプローブとして利用する方法は以前より検討され、これにＧＡＧ鎖を結合させて誘導頭とする試みが報告されている（（１９９８）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．９，４７６−４８１．他）が、この複合体も一種のネオプロテオグリカンであって、シュードプロテオグリカンとは異なる。すなわち、シュードプロテオグリカンは、ポリＬ−リジン鎖をＮ−アセチル化することによりその正電荷を中和して、ＧＡＧ鎖が空間的に自由度のある立体構造をもつ点で天然のプロテオグリカンに近い立体構造をもつが、既報のＤＮＡのターゲティングプローブでは、骨格のポリＬ−リジン鎖のアミノ基をＮ−アセチル化しないため、ポリアニオンであるＧＡＧ鎖やＤＮＡが、解離したポリＬ−リジン鎖に静電的に絡みつく構造をもつと推定される。
さらにビオチン標識することにより検出プローブとして、または支持体に固定化して吸着体として利用する用途は、シュードプロテオグリカンに特有のものである。本発明者らは、シュードプロテオグリカンが検出・分離・相互作用解析に用いるプローブとして優れた性質をもつことを実験的に示した。たとえばＨＩＶ感染初期過程にかかわるシクロフィリンと強く結合する性質をもつなど、その機能に拠って、新規なプローブならびに吸着体の用途に使用することができる。従来のプローブに比べ、すなわち静電的な結合による非特異的反応が少なく、プロテオグリカンと結合する物質に対して特異性または親和性の高いプローブや吸着体として活用できる。
天然プロテオグリカンには、１つのコアタンパク質に１本のＧＡＧ鎖をもつデコリン、数本のＧＡＧ鎖をもつパールカン、バーシカン等から、数十本のＧＡＧ鎖をもつアグリカンまでＧＡＧ鎖の構造ばかりでなく、数の点でも非常に多様性が高い。その構造多様性が機能の多様性と関係し、各プロテオグリカン構造はそれぞれに特徴的な機能と結びつく。シュードプロテオグリカンの概念も、ＧＡＧ鎖の構造ばかりでなく、数についても、１〜数十本の幅広い範囲を含んでいる。
【００１４】
コアタンパク質に代わる１本の直鎖状ポリマー鎖について説明する。
プロテオグリカンでは、コアタンパク質にＧＡＧ鎖の還元末端がＯ−グリコシド結合により共有結合している。プロテオグリカン構造の安定性は、多糖鎖とタンパク質との強固で安定な結合に拠るので、シュードプロテオグリカンも直鎖状ポリマーと多糖鎖との結合は共有結合で合成されなければならない。生体組織からプロテオグリカンを調製するには、動物組織の細胞外マトリックスからグアニジン塩酸などの変性剤を用いて抽出し、多段階の密度勾配遠心やイオン交換クロマトグラフィーにより精製するが、収量が少なく、ＧＡＧ鎖の構造不均一性の点でそのままプローブや吸着体として使用するには、困難が多い。一方、シュードプロテオグリカンは調製が容易で、ＧＡＧ鎖として精製品を用いると、構造的に均一性の高いシュードプロテオグリカンを合成できるので、結合特異性の高いプローブや吸着体を得ることができる。また直鎖状ポリマーとして、実験ではＤＮＡ導入または支持体として汎用されるポリＬ−リジン鎖、ポリアクリルアミド鎖を例に用いて行ったが、他の直鎖状または分枝状ポリマーも使用可能であり、それぞれから調製されるシュードプロテオグリカン分子の特性はポリＬ−リジン鎖、ポリアクリルアミド鎖を用いた例と同様に実験的に確認することができるものと考えている。さらに人工分子では、天然に存在しない多糖鎖をもつ分子を作ることも可能で、２種類以上のＧＡＧ鎖を種々の組み合わせで直鎖状ポリマーに結合させたハイブリッドプロテオグリカンの創製や、直鎖状ポリマーや標識タグの種類を選択することにより、シュードプロテオグリカンに新規な機能や用途を付与することも可能と考えられる。
【００１５】
シュードプロテオグリカンのプローブとしての使用について説明する。
プローブとは探索針の意味で、ある特性をもつ物質を探索するための道具を指す。すなわち、ここではプロテオグリカンに結合する物質を探りあてる目的、ならびに結合を検出する目的で使用する、プロテオグリカンに適切な標識を導入した試薬である。
上記の標識として、非特異的結合が少なく、高感度検出が可能な標識、たとえばビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光（フルオレセイン、ローダミン等）、放射性同位元素（３Ｈ，１４Ｃ，１２５Ｉ等）が例示される。
たとえば、ビオチン標識を導入すると、アビジン−ペルオキシダ−ゼまたはアビジン−アルカリフォスファターゼとそれぞれの発色基質により検出することで非常に高感度化が可能である。欠点はアビジンを含む試料（脳抽出液など）ではアビジンタンパク質も検出されることと、アビジン自身がヘパリンを始めとするＧＡＧに結合する性質があるため、ＧＡＧを含む物質による妨害バンドが出現することである。
またビオチン標識を、Ｈｉｓタグ標識に変えることで、スクリーニングでの分離回収を容易にすることもできる。
【００１６】
シュードプロテオグリカンの吸着体としての使用について説明する。
吸着体とは、クロマトグラフィーにおいて目的の物質を混合物から単離するために使用される道具で、目的物質のみと結合し、洗浄後、条件を適切に変えることにより目的物質と解離して溶出する性質をもつ物が最も望ましい吸着体である。したがって、生体物質に対する吸着体は、生物学的リガンドをもともとの構造中に含む物質か、あるいは適切な支持体上に安定な形で結合させた人工的な吸着体を使用する。
バイオビーズとは、生物材料を用いた支持体で、多孔性ビーズに成形したもの、例えばアガロース、セルロース、デキストラン及びこれらのハイブリッド分子である。合成高分子ビーズとは、非生物材料を素材とする合成高分子支持体、例えばポリアクリルアミドなどである。
【００１７】
本願発明の詳細を実施例で説明する。本願発明はこれら実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００１８】
シュードプロテオグリカンプローブの調製方法
１）ビオチニルポリＬ−リジンヘパリン（Ｂｉｏｔｉｎ ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ Ｈｅｐ：ＢＰＬ−Ｈｅｐ）またはビオチニルポリＬ−アクリルアミドヘパリン（Ｂｉｏｔｉｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｈｅｐ： ＢＰＡ−Ｈｅｐ）
ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ，分子量：１．５万〜３万）水溶液（８ｍｇ／ｍｌ）２５０μｌとヘパリン６ｍｇを０．５Ｍ ＰＢ８０μｌに加えて混合し、沈殿を生じなくなるまで４Ｍ ＮａＣｌ水溶液（２１０μｌ）を加え撹拌した。還元剤ＮａＢＨ３ＣＮ水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）２０μｌをＰＬＬ−Ｈｅｐ混合溶液に加え、４０℃で７５時間振盪しながら反応させた（（１９９８）Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．９，４７６−４８１．）。
カップリング後０．１Ｍ酢酸ナトリウム水溶液に対して透析し、還元剤を除いた。透析後、ＰＬＬ−Ｈｅｐの沈殿を生じなくなるまで４Ｍ ＮａＣｌを加えて混合し、スルホ−ＮＨＳ−ビオチン水溶液（２００μｇ／２００μｌ）を加え、室温で１時間振盪しながらＰＬＬ中のアミノ基にビオチン基を導入した〔Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍａｎｕａｌ ｔｏ ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ−ＬＣ−ｈｙｄｒａｚｉｄｅ．（ＰＩＥＲＣＥ．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）〕。この反応液に無水酢酸を１００μｌ加えて氷上で３０分間反応させ、さらに無水酢酸を１００μｌ加え、室温で振盪しながら３０分間アセチル化した。その後、１ＭのＮａＣｌを含むＰＢに対して透析し、未反応ビオチン試薬や無水酢酸を除去した。
シュードＰＧのコアタンパク質として、ＰＬＬの代わりにポリアクリルアミド（ＰＡＡ，分子量：１万、６０万〜１００万の二種類を使用）を用いた場合には沈殿を生じないので、４Ｍ ＮａＣｌを添加せずに同じ操作を行い、ＢＰＡ−Ｈｅｐを調製した。
２）ビオチニルポリＬ−リジングリコサミノグリカン（Ｂｉｏｔｉｎ ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ ＧＡＧ：ＢＰＬ−ＧＡＧ，ヘパリン以外のグリコサミノグリカンプローブ）
上記１）と同様にして、ＧＡＧ鎖として、ヘパリンの代わりにコンドロイチン硫酸−ＡおよびＢ、コロミン酸、またはグルクロン酸をＰＬＬに導入し、ＢＰＬ−ＧＡＧプローブを調製した。
３）ビオチニルポリＬ−リジン（Ｂｉｏｔｉｎ ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ：ＢＰＬ）
ＢＰＬ−ＧＡＧのネガティブコントロールとして、ＧＡＧ鎖を導入していないＢＰＬプローブを調製した。ＰＬＬ ３ｍｇを０．１Ｍ ＡｃＯＮａ ４０５μｌに溶解し、０．１Ｍ ＮａＯＨでｐＨ９．０−９．５に調整した。スルホ−ＮＨＳ−ビオチン（７５μｇ／７５μｌ）を加えてＢＰＬＨと同様にＰＬＬ中のアミノ基にビオチン基を導入し、ついで未反応アミノ基をＮ−アセチル化した。その後、１ＭのＮａＣｌを含むＰＢに対して透析した。
【実施例２】
【００１９】
実施例１のＢＰＬ−ＧＡＧプローブのセルロースアセテート膜電気泳動による確認
セルロースアセテート膜電気泳動によりＰＬＬとＧＡＧのカップリング状況を調べた。実施例１のいずれのプローブについてもカップリングの進行は、反応液を２μｌずつセルロースアセテート膜にスポットして、１Ｍ酢酸−ピリジン（ｐＨ３．５）中で０．５ｍＡ／ｃｍ，２０分間泳動して５分間ＣＢＢ染色またはトルイジンブルー染色後、水洗して染色バンドの移動度の変化から確認した。さらにＨＰＬＣによるゲルろ過クロマトグラフィー（カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ８０４，６．４ｘ３０ｍｍ）における溶出挙動の変化から、分子量または分子形状の変化した複合体が生成することを確認した。結果を第２図に示す。
第２図に示すように、ＣＢＢ染色（ａ）により、出発物質であるＰＬＬは陰極付近に検出されたが（ｌａｎｅ１）、ＢＰＬ−Ｈｅｐプローブ（ｌａｎｅ５）、ＢＰＬプローブ（ｌａｎｅ６）、ＢＰＬ−コンドロイチン硫酸−Ａ（ＣＳ−Ａ）プローブ（ｌａｎｅ７）、ＢＰＬ−コンドロイチン硫酸−Ｂ（ＣＳ−Ｂ）プローブ（ｌａｎｅ８）では、原点付近に染色された。それぞれ陰極側に残っているのは、未反応ＰＬＬと考えられる。また、ＢＰＬ−コロミン酸プローブはやや陰極側に泳動された（ｌａｎｅ９）。
トルイジンブルー染色（ｂ）により、酸性多糖もプローブでは全て原点付近に検出され、カップリングが完了していることが示された。
【実施例３】
【００２０】
プローブの適用例
ラット脳抽出液中のプロテオグリカン結合物質の検出（ウエスタンブロット法）
Ｗｉｓｔａｒラット脳（８週令，♂）を４倍容（ｖ／ｗ）の緩衝液（１０ｍＭ Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．７），１３０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，２０ｍＭ ε−アミノカプロン酸，０．０２％ＮａＮ３）中でホモゲナイズし、４℃で一晩振盪抽出し、遠心上清を脳抽出液として用いた。タンパク質濃度はトネイン−ＴＰ（大塚製薬）により定量した。この８μｌを、９．５％ポリアクリルアミド泳動ゲル（３％濃縮ゲル）を用い、Ｌａｅｍｍｌｉ法に従い２％ＳＤＳ，１％２−メルカプトエタノール存在下で泳動した。泳動後のポリアクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ，Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ）に１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノールに１００ｍＡで１００分間、室温で転写した（（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，１００３５−１００３８）。
プローブによる検出反応は全て振盪しながら行った。脳抽出液試料をブロットした膜を５％ＢＳＡを含むＴＢＳ中で４℃で一晩、ブロッキングした後、ＰＢＳで希釈した各プローブ溶液（Ｈｅｐとして約２０μｇ／ｍｌ ｉｎ ＰＢＳ）を加え、４℃で１．５時間結合反応を行った。氷冷した０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（以下洗浄液とする）で３分間ずつ３回洗浄後、５％ＢＳＡを含むＴＢＳ中、４℃で３０分ブロッキングした。市販標品をＴＢＳで５００倍希釈したＨＲＰ−ＡＢＣ溶液と２時間反応させ、洗浄液で１分間ずつ４回洗浄後、用時調製した３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ，ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＤＡＢ）２０ｍｇ、ＴＢＳ１００ｍｌ、３０％過酸化水素水２０μｌ混合液（以下発色液とする）を加えて発色反応させた（（１９８５）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４７，２２２−２２９．）。
【００２１】
実施例１のＢＰＬ−ＧＡＧプローブの反応性
正常ラット脳抽出液８ｍｌを試料として、ウエスタンブロット法によってＢＰＬ−ＧＡＧプローブ、ビオチンヒドラジド−Ｈｅｐプローブとの反応性を比較した。
Ｗｉｓｔａｒラット脳抽出液の各８μｌを、９．５％ポリアクリルアミド泳動ゲル（３％濃縮ゲル）を用いて還元条件下で泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写し、各プローブ（Ｈｅｐとして約２０μｇ／ｍｌ ｉｎＰＢＳ）との結合性を調べた。結果を第３図の（ａ）、（ｂ）に示す。
（ａ）は、ＢＰＬ−ＧＡＧプローブとビオチンヒドラジド−Ｈｅｐプローブとの反応性の比較であり、レーン１は分子量マーカー（ＣＢＢ）、レーン２〜９はラット脳抽出液試料を泳動した。レーン２（ＣＢＢ）、レーン３（ビオチンヒドラジド−Ｈｅｐ）、レーン４（ＢＰＬ−Ｈｅｐ）、レーン５（ＢＰＬ−ＣＳ−Ａ）、レーン６（ＢＰＬ−ＣＳ−Ｂ）、レーン７（ＢＰＬ−コロミン酸）、レーン８（ＢＰＬ−グルクロン酸）、レーン９（ＢＰＬ、ネガティブコントロール）の反応性の比較である。
（ｂ）は、ＢＰＬ−ＨｅｐとＰＬＬの代わりにポリアクリルアミド鎖を骨格に用いて調製したＢＰＡ−Ｈｅｐの反応性の比較である。全レーンにラット脳抽出液試料を泳動した。レーン１（ＣＢＢ）、レーン２（ＢＰＬ−Ｈｅｐ）、レーン３（ＢＰＡ−Ｈｅｐ、ＭＷ＝１０ｋＤａのアクリルアミドを使用して調製）、レーン４（ＢＰＡ−Ｈｅｐ，ＭＷ＝６０−１０００ｋＤａのアクリルアミドを使用して調製）。
第３図（ａ）に示すように、ＢＰＬ−Ｈｅｐプローブは、２５−１４５ｋＤａの多数のバンド中、３８，４０，４６ｋＤａが強く染色され（ｌａｎｅ４）、多糖鎖単独構造（単鎖構造）をもつビオチンヒドラジドＨｅｐプローブとの反応性の差が示された。また、ビオチンヒドラジドＨｅｐプローブと、共通な染色バンドも存在したがバンド間の相対的な染色強度には差がみられ、ＢＰＬ−Ｈｅｐではより多くのバンドが強く検出された。
よってシュードＰＧ構造をもつＢＰＬ−Ｈｅｐプローブの方が、リガンドタンパク質との結合が強く、また単鎖構造の場合とは結合特異性が異なることが示唆された。すなわちＢＰＬ−Ｈｅｐプローブにより検出されたバンドには、ヘパリン鎖の糖鎖配列だけでなく、シュードＰＧ構造を認識して結合するものが含まれている。また、他のＢＰＬ−ＧＡＧプローブ、ＢＰＬプローブでの結果と比較することにより、多くの染色バンドはヘパリンに対して特異的である可能性が示唆された。
すなわち、ＢＰＬ−Ｈｅｐは脳内リガンドタンパク質を検出する際に、非常に有効な検出手法であることが示された。ＢＰＬ−ＣＳ−Ａ，ＢＰＬ−ＣＳ−ＢおよびＢＰＬ−コロミン酸プローブでは、３１−１４５ｋＤａ中、特に４８ｋＤａが強く染色され（ｌａｎｅ５，６および７）、これら３プローブ間で共通性がみられた。このバンドはＢＰＬ−Ｈｅｐプローブでは検出されなかったことから、静電的な相互作用によるものではなく、これら多糖鎖に共通するほかの構造要素がかかわると考えられた。どのプローブでも強く染色された７０ｋＤａのバンドは、ＨＲＰ−ＡＢＣのみで発色させた際にも検出され、また分子量から脳内在性のアビジンであることが示唆された。
第３図（ｂ）に示すように、ＢＰＬ−ＨｅｐとＰＬＬの代わりにポリアクリルアミド鎖を骨格に用いて調製したＢＰＡ−Ｈｅｐの反応性を脳抽出液について比較したところ、骨格の種類および長さが異なっても検出されるタンパク質は主に同じ物であるが、タンパク質によっては多少反応性に差があった。特に分子量１万のポリアクリルアミドを用いたＢＰＡ−Ｈｅｐプローブは最も検出感度が向上した。
【実施例４】
【００２２】
プローブの適用例
表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によるプローブとヘパリン結合タンパク質との相互作用の定量的解析
ＢＩＡＣＯＲＥ用のストレプトアビジン（ＳＡ）固定化チップの４つのフローセルに、１）ＢＰＬ−Ｈｅｐ、２）ビオチンヒドラジドＨｅｐ、それらのコントロールとして、３）ＢＰＬ、４）ビオチンをそれぞれ結合させた。アナライトにラクトフェリン、トロンビン、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴ−ＩＩＩ）溶液を流速２０μｌ／ｍｉｎで流し２５℃で相互作用を測定した。解析はＢＩＡ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ３．１解析ソフトにより行った。
ＳＰＲによるプローブとヘパリン結合タンパク質との相互作用の定量的解析
第８図に、ＳＰＲにおけるＢＰＬ−Ｈｅｐプローブとヘパリン結合タンパク質との相互作用のセンソグラムを示す。
ＢＰＬ−ＨｅｐプローブまたはビオチンヒドラジドＨｅｐプローブとヘパリン結合タンパク質であるラクトフェリン（ａ）、トロンビン（ｂ）、ＡＴ−ＩＩＩ（ｃ）とのセンソグラム（第８図）から、結合・解離の速度定数、ならびに親和定数を算出した。センソグラムは、プローブを結合させたフローセルへのアナライト結合量からそれぞれのコントロールフローセルへの結合量を差し引いて補正した。グローバルフィッティングにより求めた相互作用パラメータを表１にまとめた。シュードＰＧプローブが定量的解析にも適用できることが示され、ラクトフェリンおよびトロンビンにおいて、ＢＰＬ−ＨｅｐプローブはビオチンヒドラジドＨｅｐプローブよりも解離定数が小さく、３〜６倍高い親和力を示した。
【００２３】
【表１】
0004759736.tif 000002
【実施例５】
【００２４】
プローブの適用例
アビジン吸着体およびプローブを利用した結合タンパク質の分離と検出
ラット脳に含まれるＧＡＧ結合タンパク質を精製するために、アビジン吸着体およびＢＰＬ−ＧＡＧプローブを用いて実験を行った。アビジンセファロースは、アビジン５．５ｍｇをＮＨＳ−活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（４ Ｆａｓｔ ｆｌｏｗ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）３ｇに付属のプロトコールに従い、固定化して調製した。
《実験》脳抽出液（Ｎｏｒｍａｌ）１ｍｌと各プローブ５０μｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブ中で混合し、４℃で２時間振盪した後、この反応液にアビジンセファロースゲル懸濁液を６００μｌずつ加え、４℃で一晩振盪した。遠心して上清を取り除き、ゲルに泳動用試料緩衝液８０μｌを加えて１０分以上煮沸し、遠心上清を泳動試料とした。泳動は、Ｌａｅｍｍｌｉ法に従って９．５％アクリルアミド泳動ゲル、３％アクリルアミド濃縮ゲルを用いて行い、銀染色によりタンパク質を検出した。
分離方法は実験で示したとおりに行い、銀染色によってタンパク質の検出を行った結果を第９図に示す。
多種類のタンパク質が結合したため、各プローブについてバンドパターンの差を見分けにくいが、アビジンゲルと組み合わせることによって微量の溶液からの結合リガンドの吸着分離検出にもシュードＰＧプローブが利用できることが示唆された。
【実施例６】
【００２５】
吸着体の調製方法
１）Ｈｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ
ＰＬＬとヘパリンのカップリングは、実施例１の１）の操作を５．４倍にスケールアップして行い、４０℃で三〜七晩振盪しながらカップリング反応させた。ＰＬＬ−ヘパリン溶液を別に調製したホルミルセファロース４Ｂゲル１０ｇ（（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｔｏｋｙｏ，９７，１６８９−１６９４．）に加え、混合し、ＮａＢＨ３ＣＮ ６０ｍｇを加え４℃で５晩振盪した。カップリングの進行は、この反応懸濁液の一部（ゲル約１０ｍｇを含む）を遠心し、上清の未反応ＰＬＬ−Ｈｅｐを取り除き、ゲルをヌッチェ上で十分水洗し、ＴＮＢＳテストによりＰＬＬのアミノ基の発色から確認した。カップリング後のゲルに１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）２０ｍｌとＮａＢＨ３ＣＮ ６０ｍｇを加え、室温で１時間振盪し残存ホルミル基をブロックした（（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｔｏｋｙｏ，９７，１６８９−１６９４．）。ついでＰＬＬの未反応アミノ基を無水酢酸によりアセチル化してブロックした（（１９９０）Ｂｉｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０３３，４９−５６．）。ゲルのアセチル化操作は２回行い、最後に純水、０．１Ｍ ＮａＯＨ、純水の順によく洗浄した。
２）Ｈｅｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ
エポキシ活性化セファロース４Ｂ １０ｇをアミノ化し、ヘパリン水溶液（２００ｍｇ／６ｍｌ）とＥＥＤＱ水溶液（２００ｍｇ／４ｍｌ）を加え、ＴＮＢＳテストでアミノ基の減少によりカップリングの進行を追跡しつつ、４０℃で三晩振盪した（（１９９０）Ｂｉｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０３３，４９−５６．）。ヘパリン−セファロース４Ｂを純水−ＥｔＯＨ（６：４）、ＥｔＯＨ、１Ｍ ＮａＣｌ、純水の順で洗浄後、氷冷した０．２Ｍ酢酸ナトリウム５ｍｌと無水酢酸２．５ｍｌを加えて氷上で３０分間反応させ、さらに無水酢酸２．５ｍｌを加え室温で３０分間反応させて、残存アミノ基をアセチル化した。アセチル化操作は２回行い、ＴＮＢＳテストで残存アミノ基の消失を確認した。その後、純水、０．１Ｍ ＮａＯＨ、純水の順によく洗浄しヘパリン−セファロースを得た。
３）ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ
ホルミルセファロース４Ｂゲル２０ｇにＰＬＬ水溶液（２１．６ｍｇ／２．７ｍｌ）を加えて混合し、さらにＮａＢＨ３ＣＮ １２０ｍｇを加え、４℃で七晩振盪した。この反応懸濁液の一部を遠心し、実施例６の１）と同様にゲルを水洗し、ＴＮＢＳテストによるアミノ基の発色からカップリングを確認した。残存ホルミル基のブロックならびに未反応アミノ基のブロックは、実施例６の１）と同様に行い、純水、０．１Ｍ ＮａＯＨ、純水の順によく洗浄した。
４）ヘパリン固定化量の定量
純水で洗浄したヘパリン−ＰＬＬ−セファロース４Ｂ ２０ｍｇに４Ｍ ＨＣｌ １ｍｌを加え、封管にした。封管を加水分解炉を用いて、１００℃で１６時間加熱した。この反応を妨害するリジンを除くため、Ｄｏｗｅｘ ５０（Ｈ＋型）をセパコールカラム（直径７．５ｍｍ，長さ５０ｍｍ）につめ、これに加水分解液を加え純水で洗浄することにより中性糖を洗い流し、さらに２Ｍ ＨＣｌによってヘキソサミンを溶出させた。溶出液のＨＣｌを除くために、ナスフラスコを用いて減圧濃縮し、底に乾固したら少量の水に溶解した。その後、Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ反応（Ｂｏａｓの改良法）の比色定量法に従って、ゲルのヘキソサミン含量からヘパリン固定化量を算出した（瀬野信子外２，（１９８６）グリコサミノグリカン固定化量の定量 続生化学実験講座４ 複合糖質実験法ＩＩ ｐ．４０５，（日本生化学会編）東京化学同人）。
【実施例７】
【００２６】
吸着体の適用例
ラット脳抽出液からのプロテオグリカン結合物質の分離（アフィニティークロマトグラフィー）
１）Ｈｅｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ，Ｈｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラムによるヘパリン結合画分の調製
ＳｅｐｈａｒｏｓｅをプレカラムとしてＨｅｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラム（７．５ｍｍ ｘ ５０ｍｍ）を１３０ｍＭ ＮａＣｌ−ＰＢ（ｐＨ７．７）で平衡化後、正常ラット脳抽出液可溶性画分８ｍｌをかけて洗浄し、０．５Ｍ ＮａＣｌ−ＰＢで溶出した。溶出は０．１ｍｌ／ｍｉｎの流速で行い、１ｍｌずつ分取し、各画分の２８０ｎｍにおける吸光度をハーフセル（光路長０．５ｃｍ）で測定した。一方、Ｈｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラムでは、ＰＬＬ−セファロース４Ｂカラム（７．５ｍｍ ｘ ５０ｍｍ）をプレカラムとして、アフィニティークロマトグラフィーを同条件で行った。Ｈｅｐ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅおよびＨｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムからの０．５Ｍ ＮａＣｌ−ＰＢ溶出画分について、タンパク質の分析をＳＤＳ−ＰＡＧＥ，シュードプロテオグリカンプローブ反応性、およびＮ−末配列分析により行った。溶出ピーク画分をプールし、アミコン濃縮装置および分画分子量１０，０００のＹＭ１０膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて、１３０ｍＭ ＮａＣｌ−ＰＢ（ｐＨ７．７）へのバッファー置換および濃縮を行った。
２）結合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥとＮ末端アミノ酸配列分析
上記１）の２種類のカラムからの０．５Ｍ ＮａＣｌ−ＰＢ溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、ＰＶＤＦ膜に転写し、ＣＢＢで染色した。またシュードプロテオグリカンプローブとの反応性を実施例３の方法で調べた。タンパク質バンドの内、２種類のカラムで差のみられたバンドを切り取り、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で十分洗浄した後、アミノ酸配列分析（（株）東レリサーチ）を委託した。プロテインシークエンサー（Ｐｒｏｃｉｓｅ ｃＬＣ ４９２ｃＬＣ型 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＰＴＨアナライザー（１４０Ｄ型 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＵＶ検出器（Ｓ２００型 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、分析プログラム（Ｐｕｌｓｅｄ−Ｌｉｑｕｉｄ ＰｒｏＳｏｒｂ ｃＬＣ）により分析した。
【実施例８】
【００２７】
本実施例は実施例６と実施例７の結果を示すものである。
実施例６のヘパリンシュードＰＧ吸着体について、調製したＨｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ中のヘパリンを４Ｎ ＨＣｌで加水分解し、グルコサミンとして遊離させ、Ｅｌｓｏｎ−Ｍｏｒｇａｎ反応（Ｂｏａｓの改良法）によりヘキソサミンを定量した結果、ゲルに固定化されているヘパリン量は、１．０２ｍｇ／ｇ ｗｅｔ ｇｅｌ（ヘパリン中のグルコサミン含量２３．８％として計算）であった。ＥＥＤＱ法で調製したＨｅｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂでは７．２ｍｇ／ｇ ｗｅｔ ｇｅｌの固定化ヘパリン量が報告されている（（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０３３，４９−５６．）。
ヘパリンシュードＰＧ吸着体と従来のヘパリン−吸着体を用いたアフィニティークロマトグラフィーとの比較をした。結果を第４図に示す。
正常ラット脳抽出液について実施例６の操作に従い、Ｈｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラム（ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂをプレカラムとする）またはＨｅｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラム（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂをプレカラムとする）にかけ、アフィニティークロマトグラフィーを行い、０．５Ｍ ＮａＣｌ（第４図中１番目の矢印）、２Ｍ ＮａＣｌ（第４図中２番目の矢印）を含むＰＢによって結合タンパク質を溶出した。
正常ラット脳抽出液のヘパリン結合画分に対するＢＰＬ−ＧＡＧプローブの反応性を調べた。０．５Ｍ ＮａＣｌピーク画分を濃縮し、ウエスタンブロット法により各プローブとの結合実験を行った。結果を第５図に示す。
Ｈｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＢカラムまたはＨｅｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラムから溶出された０．５Ｍ ＮａＣｌ画分を１１％ポリアクリルアミド泳動ゲル（３％濃縮ゲル）を用いて還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ膜に転写し、各プローブ（ＧＡＧとして約２０μｇ／ｍｌ ｉｎＰＢＳ）との結合性を調べた。第５図中、レーン１，分子量マーカー（ＣＢＢ）、レーン２，４，６，８，１０，１２，Ｈｅｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラムの溶出画分、レーン３，５，７，９，１１，１３，Ｈｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラムの溶出画分。レーン２，３（ＣＢＢ），レーン４，５（ＢＰＬ−Ｈｅｐ），レーン６，７（ＢＰＬ−ＣＳ−Ａ），レーン８，９（ＢＰＬ−ＣＳ−Ｂ），レーン１０，１１（ＢＰＬ−コロミン酸），レーン１２，１３（ＢＰＬ−グルクロン酸）。
正常ラット脳抽出液のヘパリン結合画分に対するＢＰＬ−Ｈｅｐプローブの反応性を調べた。０．５Ｍ ＮａＣｌピーク画分を濃縮し、ウエスタンブロット法により各プローブとの結合実験を行った。結果を第６図に示す。
Ｈｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＢカラムまたはＨｅｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラムからの０．５Ｍ ＮａＣｌ溶出画分を１１％ポリアクリルアミド泳動ゲル＋３％濃縮ゲル（ａ）、または６％ポリアクリルアミド泳動ゲル＋３％濃縮ゲル（ｂ）を用いて還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ＰＶＤＦ膜に転写し、ＣＢＢ染色〔（ａ）のレーン１〜３、および（ｂ）のレーン１、２〕またはＢＰＬ−Ｈｅｐとの結合性〔（ａ）のレーン４、５〕を調べた。（ａ）レーン１、分子量マーカー、レーン２，４、Ｈｅｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラム溶出画分、レーン３，５、Ｈｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラム溶出画分。（ｂ）レーン１、Ｈｅｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラム溶出画分、レーン２、Ｈｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラム溶出画分。
第５図のレーン２，３および第６図（ａ）（ｂ）に示すように、Ｈｅｐ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅとＨｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの溶出画分をタンパク質染色で比較すると、Ｈｅｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでは３２ｋＤａバンドが増加しており、一方Ｈｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでは１８ｋＤａと９５ｋＤａバンドが増加していた。この３つのバンドについてＮ末端アミノ酸配列分析を行った。ＢＰＬ−Ｈｅｐプローブを用いた結合実験〔第５図のレーン４，５および第６図（ａ）右端〕でも、１８ｋＤａバンドが強く反応し、このタンパク質がシュードＰＧに高い反応性をもつことが示された。
各ＢＰＬ−ＧＡＧプローブとの結合実験から（第５図）、ＢＰＬ−ＣＳ−Ａ（レーン６，７）およびＢＰＬ−ＣＳ−Ｂプローブ（レーン８，９）ならびにＢＰＬ−コロミン酸プローブにより（レーン１０，１１）、１８−１１６ｋＤａの広範囲にわたるバンドがいくつか検出された。Ｈｅｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの溶出画分では、３２，４８ｋＤａのバンドが特に強く染色された。Ｈｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの溶出画分では、４８ｋＤａのバンドが特に強く染色された。ＢＰＬ−グルクロン酸プローブを用いて染色したレーン１２，１３では、７０〜７３ｋＤａのバンドが検出された。
Ｎ末端アミノ酸配列分析
ウエスタンブロットの分析により、Ｈｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出画分にのみ検出された１８ｋＤａ、９５ｋＤａのタンパク質と、Ｈｅｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出画分に多量に検出された３２ｋＤａのタンパク質について、ＰＶＤＦ膜からＮ末端アミノ酸配列分析を行った結果、両者ともに１０アミノ酸残基を決定することができた（表２）。
プロテインデータベースでのホモロジー検索の結果、それぞれサイクロフィリン（１８ｋＤａ）、Ｈｓｐ９０（熱ショックタンパク質）（９５ｋＤａ）およびＨＭＧ １（ｈｉｇｈ ｍｏｂｉｌｉｔｙ ｇｒｏｗｔｈ １ ｐｒｏｔｅｉｎ）（３２ｋＤａ）のＮ末端アミノ酸配列ならびに報告されている分子量と完全に一致し、タンパク質が同定された。Ｈｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出画分に検出された１８ｋＤａのバンドは、抗ヒトサイクロフィリン抗体と反応したことからも、サイクロフィリンであることが確認された（データ示さず）。
【００２８】
【表２】
0004759736.tif 000003
【００２９】
Ｈｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂの溶出画分に検出された１８ｋＤａのタンパク質、サイクロフィリンは、免疫抑制剤サイクロスポリンＡに結合するタンパク質ファミリーの総称であり、すべての細胞に豊富に存在する。細胞質型のサイクロフィリンＡと膜結合型のサイクロフィリンＢが知られている。今回Ｈｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂによって精製されたサイクロフィリンは、可溶性抽出液に含まれていたので、細胞質型であるサイクロフィリンＡであると思われる。サイクロフィリンはすべての生物細胞に大量に存在するタンパク質であり、生命活動の維持に不可欠な機能を果たすと考えられるのにもかかわらず、その生理学的な役割は未だ結論が得られていない。サイクロフィリンはｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（ＰＰＩａｓｅ）でもあり、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてポリペプチドのプロリンのアミド結合のシスからトランスへの異性化を触媒し、タンパク質のフォールディングに関わるのではないかとも考えられている。
興味深いことに、サイクロフィリンＡは細胞外にも存在し、ＨＩＶ−１ウイルス表面のタンパク質と特異的に結合してウイルス内に取り込まれ、宿主の抵抗性を抑制調節してＨＩＶ−１ウイルスの複製を助けていることが明らかになった（（２００３）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９（９）１１３８−１１４３）。またこれまではＨＩＶ−１ウイルスが体内に侵入してきた際に、ウイルス由来のｇｐ１２０と細胞側のＣＤ４が最初に相互作用し、その後ウイルスが細胞に進入していくと考えられていたが、マクロファージではまずサイクロフィリンＡが細胞表面に存在するヘパラン硫酸と結合することが、最近報告された。ヘパラン硫酸は硫酸含量がヘパリンよりも低いが、非常に類似した構造をもつＧＡＧである〔（第１１図参照）、（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５，９１８７−９２００．〕。
また、サイクロフィリンＡのヘパリン結合部位の４アミノ酸が同定されており、これを欠くとサイクロフィリンＡがリンパ球表面のヘパラン硫酸ＰＧと結合できず、ＨＩＶ−１ウイルスは細胞に近寄ることができない（（１９９９）Ｔｈｅ
ＥＭＢＯ Ｊ．１８，６７７１−６７８５．）。
上記の事実を踏まえ、シュードＨｅｐ−ＰＧプローブ（ＢＰＬ−Ｈｅｐ）に結合するタンパク質について第７図で説明する。
Ｈｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂの溶出画分に検出された１８ｋＤａのタンパク質、サイクロフィリンは、免疫抑制剤サイクロスポリンＡに結合するタンパク質ファミリーの総称であり、すべての細胞に豊富に存在する。サイクロフィリンはｉｎ
ｖｉｔｒｏにおいてポリペプチド中のプロリンアミド結合のシスからトランスへの異性化を触媒するペプチジルプロリル シス／トランスイソメラーゼでもあるが、ＨＩＶ−１ウイルスが体内に侵入してきた際に、まずウイルスに結合したサイクロフィリンＡがマクロファージ細胞表面に存在するヘパラン硫酸と結合することが、最近報告された。本研究から、サイクロフィリンＡとヘパリンとの結合においては、ヘパリンプロテオグリカン構造をとることが、ヘパリン多糖鎖単独の構造よりもたいへん有効であることが示唆された。すなわちＨＩＶ感染において、シュードプロテオグリカン構造が、初期過程のより有効な感染阻害薬となる可能性が示唆された。さらに宿主のウィルス抵抗性を調節するサイクロフィリンのはたらきを制御する薬剤となる可能性も考えられる。
Ｈｓｐ９０は、主要な細胞内分子シャペロンの一つであり、細胞ストレス状況下で発現量が増大するが、通常でも細胞質にもっとも多く存在するタンパク質の一つである。ＨＳＰ９０は様々な細胞内タンパク質と相互作用してその正確なフォールディングと機能を保証する役割を持つ。Ｈｅｐ−ＰＬＬ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＢＰＬＨが細胞質に存在するシャペロン分子と結合することがプロテオグリカンのどのような機能と結びつくのかまだ不明である。しかしプロテオグリカンは細胞外ばかりでなく、核内にも存在することが報告されており、Ｈｓｐ９０やサイクロフィリンなど本来細胞質に存在するたんぱく質との結合が未知の機能をもっている可能性も考えられる。
今後はこれら結合分子の局在やその活性に与える影響を研究するためにも、シュードＰＧプローブを活用することができる。
ＨＭＧ１は神経細胞突起の伸長作用を有する分子量３万前後のヘパリン結合性タンパク質で、核内タンパク質である。ＤＮＡに結合し染色体やＤＮＡの構造変動を促す構造スイッチ装置の役割を果たし、ＨＭＧタンパク質に見出されたＤＮＡ結合の構造モチーフが、男女の性を決定する因子であるなど、遺伝子情報の発現を調節する様々な因子に広く存在することが明らかになり、ＨＭＧボックスと呼称されている。本実験では、ＨＭＧ１はＨｅｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂの溶出画分に多量に検出されたが、Ｈｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂにはあまり結合しなかったことから、これはＨＭＧ１がＤＮＡのようなポリアニオン分子と静電的に結合するため、Ｈｅｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂに結合したが、Ｈｅｐ−ＰＬＬ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂでは立体障害や電荷の中和が起きているため結合性が低下したと考えられた。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明では、初めてシュードプロテオグリカンプローブとその固定化吸着体を調製し、グリコサミノグリカン結合レセプターの探索、ならびに分離精製に利用し、その有効性を見出した。
本研究で、ＧＡＧとしてヘパリン鎖をもつシュードＰＧを脳抽出液からのリガンドタンパク質探索に適用し、サイクロフィリンおよびＨｓｐ９０（熱ショックタンパク質）との結合が認められた。一方、従来のヘパリンプローブ・吸着体とは、ＨＭＧ１（ＤＮＡ結合タンパク質）が強く結合した。すなわち、ＧＡＧがコアタンパク質と結合してＰＧ超分子構造をとると、単独のＧＡＧ鎖とは反応性が著しく変化すること、ならびにシュードＰＧプローブと吸着体は、これまでのＧＡＧプローブや吸着体より特異性と親和性の点ですぐれ、ＰＧ機能研究ツールならび生体機能を調節する薬剤開発の基礎として有用であることを見出した。例えば、シュードプロテオグリカンはマクロファージとサイクロフィリンとの結合を有効に阻害したり、宿主抵抗性を抑制するサイクロファリンの活性に影響して感染をブロックする薬剤に発展すると期待されるほか、プロテオグリカンと結合する特定の分子、細胞、組織をターゲットとした薬剤送達・微生物感染・組織形成・細胞増殖・凝固系・免疫機構等の新規な制御方法に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】第１図は、ＰＧ構造を模倣したシュードＰＧを含むプローブおよびアフィニティー吸着体と従来のプローブおよび吸着体との比較を示す図面である。
【図２】第２図は、実施例１で調製した種々のＢＰＬ−ＧＡＧプローブのセルロースアセテート膜電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。（ａ）ＣＢＢによるタンパク質染色、（ｂ）トルイジンブルーによるポリアニオンの染色。
【図３】第３図は、実施例１のＢＰＬ−ＧＡＧプローブとＢＰＡ−ＧＡＧプローブのウエスタンブロッティングにおけるラット脳抽出液との反応性を示す図面に代わる写真である。（ａ）ＢＰＬ−ＧＡＧプローブとビオチンヒドラジド−Ｈｅｐプローブとの反応性の比較。（ｂ）ＢＰＬ−ＨｅｐとＰＬＬの代わりにポリアクリルアミド鎖を骨格に用いて調製したＢＰＡ−Ｈｅｐの反応性の比較。全レーンにラット脳抽出液試料を泳動した。
【図４】第４図は、ヘパリンシュードＰＧ吸着体と従来のヘパリン−吸着体を用いたアフィニティークロマトグラフィーとの比較を示す図面である。
【図５】第５図は、正常ラット脳抽出液のヘパリン結合画分に対するＢＰＬ−ＧＡＧプローブの反応性を示す図面に代わる写真である。
【図６】第６図は、正常ラット脳抽出液のヘパリン結合画分に対するＢＰＬ−Ｈｅｐプローブの反応性を示す図面に代わる写真である。（ａ）１１％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロティングによるプローブ反応性、（ｂ）６％ポリアクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングによるタンパク質検出。
【図７】第７図は、シュードＨｅｐ−ＰＧプローブ（ＢＰＬ−Ｈｅｐ）に結合するタンパク質について説明する図面である。図中Ｃｙｐはサイクロフィリンであり、免疫抑制剤サイクロスポリンＡに結合するタンパク質ファミリーの総称であり、すべての細胞に豊富に存在する。
【図８】第８図は、ＳＰＲにおけるＢＰＬ−Ｈｅｐプローブとヘパリン結合タンパク質との相互作用のセンソグラムである。（ａ）はヘパリン結合タンパク質がラクトフェリン、（ｂ）はトロンビン、（ｃ）はＡＴ−ＩＩＩである。
【図９】第９図は、アビジン吸着体およびＢＰＬ−ＧＡＧプローブを利用したタンパク質の分離と検出の結果を示す図面に代わる写真である。
【図１０】第１０図は、プロテオグリカン（ＰＧ）モノマーの構造（細胞膜に存在する形）を表した図面である。
【図１１】第１１図は、ヘパリン・ヘパラン硫酸の化学構造を表した図面である。式中、Ｒ：ＨまたはＳＯ３−、Ｒ´：Ｈ，ＳＯ３−またはＣＯＣＨ３、ｎは整数。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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