(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍転移を阻害するための医薬の製造における、ＩＬ−１８産生および／または作用の阻害剤の使用であって、ＩＬ−１８産生の阻害剤がＩＣＥｉであり、ＩＬ−１８作用の阻害剤がＩＬ−１８に対する抗体またはＩＬ−１８ＢＰである使用。
【請求項２】
ＩＬ−１８産生および／または作用の阻害剤を含む腫瘍転移を阻害するための医薬組成物であって、ＩＬ−１８産生の阻害剤がＩＣＥｉであり、ＩＬ−１８作用の阻害剤がＩＬ−１８に対する抗体またはＩＬ−１８ＢＰである医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［本発明の分野］
本発明は、腫瘍転移（tumor metastasis）および腫瘍転移の阻害に関する。さらに詳細には、本発明は、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）の産生および／または作用を阻害することによる、腫瘍転移の予防に関する。
【０００２】
［本発明の背景］
循環する癌細胞の毛細血管内皮に対する接着は、転移発生における臨界段階である（１、２）。免疫グロブリンスーパーファミリーの１種である血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）は、造血細胞および活性化された白血球の、炎症前サイトカイン活性化内皮細胞（proinflammatory cytokine-activated endothelial cells）に対する接着を仲介する。しかしながら、ＶＣＡＭ−１の接着機能は、実験的な転移の広がりを増大するために、動物および人間の癌細胞により使用され得る（６）。
【０００３】
たとえば、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αは、内皮細胞によるＶＣＡＭ−１のアップレギュレーションに関連する機構によって、肺組織におけるＶＬＡ−４発現メラノーマ細胞の転移を増大することが知られている（７〜９）。また、ＩＬ−１およびＴＮＦ−αは、正常マウスおよびリポ多糖処理マウス双方において、Ｂ１６Ｍ細胞の肝転移増殖（hepatic colonization）に著しく寄与することも明らかにされてきた（７、８、１０〜２０）。さらに、マンノース受容体介在性肝洞様毛細血管内皮（ＨＳＥ）細胞活性化は、自己分泌ＩＬ−１β介在性ＨＳＥ細胞のＶＣＡＭ−１の発現に関連し、Ｂ１６Ｍ細胞の接着および転移の増強を導く（２１）。また、ＩＬ−１βで活性化されるＨＳＥ細胞はＶＬＡ−４刺激因子を放出し、ＶＬＡ−４刺激因子はＢ１６Ｍ細胞のＨＳＥ細胞に対する接着を増大させることも知られている（１１）。したがって、ＩＬ−１βは、ＨＳＥ細胞由来のＶＣＡＭ−１発現およびＶＬＡ−４刺激因子の放出を誘導し、洞様毛細血管内に拘束されたＶＬＡ−４発現癌細胞に対する転移前の微小環境（microenvironment）をつくる能力をＨＳＥ細胞に与えるのかもしれない。
【０００４】
しかしながら、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの遮断は部分的な転移の途絶を導くにすぎず、それらの欠如を補うほかの因子または代替経路を介して作用するほかの因子のいずれかもまた関連していることを示している。さらに、転移する癌細胞およびその標的組織の多くは、これら炎症前サイトカインを産生することができない。そのうえ、エンドトキシンまたはマンノース受容体リガンドの濃度は、通常、炎症前サイトカイン放出を誘導するほど充分に増加しない。したがって、ＶＣＡＭ−１アップレギュレーションを誘導し、そして癌細胞の毛細血管通中のＶＣＡＭ−１の関与を誘導する多数のメディエーターは、充分に調べられていない。
【０００５】
ＩＬ−１８（ＩＦＮγ誘導因子）は、タンパク質のＩＬ−１ファミリーと構造的特徴を共有し（２２）、かつＩＬ−１２と機能的特性を共有する（２３）新規サイトカインである。クッパー細胞由来のＩＬ−１８産生は、エンドトキシン誘導性肝障害において、ＴＮＦ−αおよびＦＡＳリガンドが介在する肝毒性経路双方を活性化することが報告されている（２４）。より最近になって、ＩＬ−１８はまた、ＣＤ３+／ＣＤ４+およびナチュラルキラー細胞由来のＴＮＦ−αの遺伝子発現と合成の直接的刺激ならびに引き続き起こるＣＤ１４+群由来のＩＬ−１βおよびＩＬ−８の産生による、炎症前特性を有することが明らかにされ、それにより、サイトカインの階層（hierarchy）におけるＩＬ−１８の予期せぬ重要な位置が明らかになった（２５）。しかしながら、癌転移におけるＩＬ−１８の可能性のある役割は、今のところ解明されていない。
【０００６】
インターロイキン１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）は、ＩＬ−１８ビーズでのクロマトグラフィーにより尿から精製され、配列決定され、クローン化され、ＣＯＳ７細胞にて発現された。ＩＬ−１８ＢＰはインビトロにおいて、ＩＬ−１８のインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、ＩＬ−８、およびＮＦ−κＢの活性化の誘導を途絶した。マウスへのＩＬ−１８ＢＰの投与は、ＬＰＳに続くＩＦＮ−γの循環を途絶した。したがって、ＩＬ−１８ＢＰは早期Ｔｈ１サイトカイン反応の阻害剤として機能する。ＩＬ−１８ＢＰは脾臓にて構成的に発現され、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、そしてＩＬ−１ＩＩ型受容体に限定的な相同性を有する。ＩＬ−１８ＢＰ遺伝子はヒト染色体１１ｑ１３に位置しており、８．３ｋｂのゲノム配列には膜貫通ドメインをコードするエキソンはみられなかった。数種のポックスウイスルは、ＩＬ−１８ＢＰに高い相同性を有する推定タンパク質をコードしており、ウイルスの産物がＩＬ−１８の作用を減じて細胞毒性Ｔ細胞反応を妨げ得ることを示唆する（２８および国際公開第９９／０９０６３号パンフレット）。国際公開第９９／０９０６３号パンフレットに詳細に記載されているように、ＩＬ−１８ＢＰおよびその突然変異タンパク質、融合タンパク質、機能的誘導体、活性断片もしくは環状変更誘導体（circularly permutated derivatives）ならびにそれらの混合物は、ＩＬ−１８に結合することができ、および／またはＩＬ−１８の活性を調節することができ、および／またはＩＬ−１８の活性を遮ることができる。
【０００７】
［本発明の要旨］
本発明は、腫瘍転移を阻害するための医薬の製造における、ＩＬ−１８の産生および／または作用の阻害剤の用途を提供する。
【０００８】
ＩＬ−１８産生の阻害剤は、たとえばカスパーゼ−１の阻害剤である。
【０００９】
ＩＬ−１８作用の阻害剤は、ＩＬ−１８に対する抗体、ＩＬ−１８受容体サブユニットのいずれかに対する抗体、ＩＬ−１８受容体シグナル伝達経路の阻害剤、ＩＬ−１８と競合しＩＬ−１８受容体を遮るＩＬ−１８のアンタゴニスト、およびＩＬ−１８ＢＰ、ＩＬ−１８に結合するその突然変異タンパク質、融合タンパク質、機能的誘導体、活性断片もしくは環状変更誘導体から選択される。
【００１０】
好ましくは、使用される阻害剤はＩＬ−１８ＢＰ、またはＩＬ−１８ＢＰと同じ活性を有するその突然変異タンパク質、融合タンパク質、機能的誘導体、活性断片もしくは環状変更誘導体である。
【００１１】
腫瘍転移を阻害するための、ＩＬ−１８の産生および／または作用の阻害のための医薬組成物もまた、本発明により提供される。
【００１２】
腫瘍転移を阻害するために、ＩＬ−１８の産生および／または作用を阻害するほかの方法は、ＩＬ−１８ＢＰなどのＩＬ−１８の産生および／または作用の阻害剤のコード配列を含む発現ベクターの体内への導入である。
【００１３】
［本発明の詳細な説明］
インターロイキン（ＩＬ）−１βおよび腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）を含むいくつかの炎症前サイトカインは、内皮細胞に対する癌細胞の接着を促進し、それにより腫瘍の転移拡大を導く。それらの炎症前サイトカインは、おそらく血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）を誘導することにより、接着および転移を促進する。本発明は、Ｂ１６メラノーマ（Ｂ１６Ｍ）細胞培養物から調整した培地（ＣＭ）（Ｂ１６Ｍ−ＣＭ）を用いる初代培養マウスＨＳＥ細胞の処理は、インビトロにて、Ｂ１６Ｍ細胞とＨＳＥ細胞との間の接着を促進することを示す。Ｂ１６Ｍ−ＣＭはまた、インビトロにおいて、ＨＳＥ細胞によるＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α産生を誘導する。しかしながら、腫瘍転移が実際にＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αにより仲介されていることは、明確に立証されていない。
【００１４】
本発明は、Ｂ１６Ｍ−ＣＭはＨＳＥ細胞によるＩＬ−１８の産生を誘導すること、およびＩＬ−１８はＢ１６Ｍ細胞のＨＳＥ細胞に対する接着の増大に寄与するサイトカインであることを示す。ＩＬ−１８は、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−１βに関係なくＨＳＥ細胞におけるＶＣＡＭ−１発現を活性化することにより、接着を増強する。ＨＳＥ細胞と特異的カスパーゼ−１阻害剤とのインキュベーション（１０μＭ、１８時間）は、ＴＮＦ−α産生を減少させることなくＢ１６Ｍ−ＣＭ誘導性接着を完全に途絶し、その効果はマウスＩＬ−１βの添加により復帰しない。ＨＳＥ細胞への抗マウスＩＬ−１８抗体の添加は、Ｂ１６Ｍ−ＣＭのＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α誘導を妨げることなく、Ｂ１６Ｍ−ＣＭ誘導性接着を予防する。同様に、最近クローン化されたＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）もまた、インビトロにおいて、Ｂ１６Ｍ細胞のＨＳＥ細胞に対するＢ１６Ｍ−ＣＭ誘導性接着を予防する。ｐ５５可溶性ＴＮＦ受容体またはＩＬ−１受容体アンタゴニストなどのＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの阻害剤は、ＩＬ−１８誘導性接着を無効にすることはできなかった。したがって、本発明は、腫瘍転移を阻害する手段として、ＩＬ−１８産生および作用の阻害剤を提供する。ＩＬ−１８産生の阻害剤はカスパーゼ−１の阻害剤を含む。ＩＬ−１８作用の阻害剤は、ＩＬ−１８に対して誘導された抗体、２つの既知のＩＬ−１８受容体サブユニットのいずれかに対して誘導された抗体、ＩＬ−１８受容体シグナル伝達経路の阻害剤、ＩＬ−１８と競合しＩＬ−１８受容体を遮るＩＬ−１８のアンタゴニスト、およびＩＬ−１８と結合しＩＬ−１８の生物学的活性を遮るＩＬ−１８結合タンパク質からなる群より選択される。
【００１５】
本発明は、ＶＣＡＭ−１発現の炎症前サイトカイン介在性アップレギュレーションにおけるＩＬ−１８の可能性のある役割、ほかのサイトカインとの可能性のある相互作用、およびこのＶＣＡＭ−１誘導を予防する手段に関する。本発明により、肝洞様毛細血管壁におけるＶＣＡＭ−１のアップレギュレーションを導き、したがって、癌細胞の接着および転移を容易にする炎症前の事象の開始時に、ＩＬ−１８が作用することが見出された。Ｂ１６Ｍ−ＣＭで処理された初代培養マウスＨＳＥ細胞は、ＶＣＡＭ−１依存性の機構によるＨＳＥに対するＢ１６Ｍ細胞接着の機構に関して、Ｂ１６Ｍ細胞誘導性ＩＬ−１８の役割を調べるために、癌細胞依存性内皮細胞活性化モデルとして使用された。ＩＬ−１８の特定の役割は、ＩＬ−１Ｒａ、不可逆性ＩＬ−１変換酵素阻害剤（ＩＣＥｉ）を使用する成熟ＩＬ−１βおよびＩＬ−１８の分泌阻害、ｐ５５ＴＮＦ可溶性受容体（ＴＮＦ−ｓＲ  ｐ５５）を用いるＴＮＦ遮断、ならびに抗ＩＬ−１８抗体およびＩＬ−１８結合タンパク質を用いるＩＬ−１８機能遮断による、特異的なＩＬ−１受容体遮断の条件のもとで調べられた。さらに、Ｂ１６Ｍ細胞は、ＩＣＥ-/-およびＩＬ−１β-/-マウスに脾臓内注射された。正常コントロールと比較した際に欠損マウスで観察された低い転移密度は、炎症の転移前役割（the prometastatic role of inflammation）におけるＩＬ−１βおよびおそらくはＩＬ−１８の関与を示唆する（表１）。
【００１６】
実施されたインビトロ実験は、ＩＬ−１８産生が、Ｂ１６Ｍ細胞由来の上清により誘導されるＨＳＥ接着刺激効果の原因であることを示す。ＶＣＡＭ−１アップレギュレーションがＢ１６Ｍ−ＣＭで処理したＨＳＥのすべての接着刺激活性の原因であるので、データは、ＩＬ−１８がサイトカイン誘導性ＨＳＥからのＶＣＡＭ−１の発現を仲介することを示す。さらに、ＩＬ−１８に対する抗体は、ＨＳＥ細胞からのＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの産生に影響することなく、Ｂ１６Ｍ−ＣＭ阻害性細胞接着を減少させる。したがって、ＨＳＥ細胞におけるＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの産生は、ＩＬ−１８非依存性であって、接着に寄与しなかった。逆に、ＴＮＦ−ｓＲ  ｐ５５およびＩＬ−１Ｒａのいずれも、ＩＬ−１８で処理したＨＳＥ細胞の接着増大を阻害することができず、自己分泌ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βのいずれも、ＩＬ−１８誘導性ＨＳＥ接着の原因でないことを立証した。
【００１７】
ＨＳＥ細胞における結果は、たとえば非ＣＤ１４+ヒト血液単核細胞（２５）など、ＩＬ−１８がＴＮＦ−α産生を介してＩＬ−１βを誘導したほかの細胞系で得られる結果と、対照的である。ＨＳＥ特異的な炎症前サイトカインの階層は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βはＩＬ−１８の制御に非依存的であるがＶＣＡＭ−１アップレギュレーションの下流メディエーターとしてＩＬ−１８を用いているようなところに、存在するようである。
【００１８】
マウスＨＳＥ細胞と異なり、ＲＴ−ＰＣＲにより調査したかぎりでは、Ｂ１６Ｍ細胞はＩＬ−１８遺伝子を発現しておらず、また、ＩＣＥｉとの１８時間のインキュベーションは、ＨＳＥ細胞に対するＢ１６Ｍ−ＣＭのサイトカイン刺激活性および接着刺激活性を途絶しなかった。しかしながら、肝臓の微小血管系におけるＢ１６Ｍ細胞の通過または拘束のあいだに、ＩＬ−１８の局部的な産生は、Ｂ１６Ｍ細胞の作用に影響するかもしれない。さらなる研究結果は、Ｂ１６Ｍ細胞を１ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−１８とともに６時間インキュベーションすることにより、未処理ＨＳＥに対するＢ１６Ｍ細胞の接着を２倍増加させたということ、およびＨＳＥに抗ＶＣＡＭ−１抗体を添加するとＩＬ−１８介在性接着を８０％減少させたということであって、ＶＣＡＭ−１／ＶＬＡ−４相互作用が関連することを示唆した。同様に、Ｂ１６Ｍ−ＣＭ処理ＨＳＥ由来の上清を６時間与えているＢ１６Ｍ細胞もまた、ＶＣＡＭ−１依存性機構によるＨＳＥ対するＢ１６Ｍの接着を２倍著しく（Ｐ＜０．０１）増加させ、抗ＩＬ−１８抗体はその接着刺激効果を撤廃した。
【００１９】
本発明による研究結果は、ＩＬ−１８が、炎症前サイトカインの肝性放出と転移進行との間の新しい連絡経路であることを示唆する。腫瘍活性化ＨＳＥ細胞からのＩＬ−１８産生は、ＨＳＥ細胞に対するメラノーマ細胞接着の制御に関連する２つの相補的な機構を決定する。２つの相補的な機構は、ＴＮＦ−α／ＩＬ−１β介在性ＶＣＡＭ−１アップレギュレーションを調整するＨＳＥの自己分泌機構、およびメラノーマ細胞のＶＬＡ−４をアップレギュレーションし、ＶＣＡＭ−１依存性接着能を促進するＢ１６Ｍ細胞のパラ分泌機構である。この同時に生じる双方の細胞接着対応物の分子アップレギュレーションは、癌−毛細血管内皮細胞相互作用経路を非常に重要とする。
【００２０】
Ｂ１６Ｍ細胞のＩＬ−１８誘導性接着は、ＩＬ−１８産生および／または作用の阻害剤により途絶される。ＩＬ−１８産生の阻害剤は、カスパーゼ−１の阻害剤を含む。ＩＬ−１８作用の阻害剤は、ＩＬ−１８に対して誘導された抗体、２つの既知ＩＬ−１８受容体サブユニットのいずれかに対して誘導された抗体、ＩＬ−１８受容体シグナル伝達経路の阻害剤、ＩＬ−１８と競合しＩＬ−１８受容体を遮るＩＬ−１８のアンタゴニスト、およびＩＬ−１８に結合してその生物活性を遮るＩＬ−１８結合タンパク質から選択される。
【００２１】
ＩＬ−１８産生および／または作用の阻害剤の直接的な用途に加えて、本発明はまた、ＩＬ−１８産生および／または作用の阻害効果が望まれる細胞への導入も意図する。この目的のために、たとえばＩＬ−１８ＢＰをコードするＤＮＡの、細胞への特定の導入のための系が必要である。これを行うためのいくつかの実行可能な手段は、本分野において知られている。たとえば、前記ＤＮＡを運搬する適当なベクターであって、ＤＮＡが細胞内で発現するような手段で細胞へのＤＮＡの挿入を達成することができるベクターを、細胞に導入し得る。細胞への送達方法は、ほかのもの、たとえば米国特許第５，９１０，４８７号、国際公開第９９／２９３４９号パンフレットおよびそのほかのものに、記載されている。
【００２２】
本発明によると、ＩＬ−１８産生および／または作用の阻害のための医薬組成物は、カスパーゼ−１阻害剤、ＩＬ−１８に対する抗体、ＩＬ−１８受容体サブユニットのいずれかに対する抗体、ＩＬ−１８受容体シグナル伝達経路の阻害剤、ＩＬ−１８と競合しＩＬ−１８受容体を遮るアンタゴニストならびにＩＬ−１８ＢＰまたは同じ活性を有するその突然変異タンパク質、融合タンパク質、機能的誘導体、活性断片もしくは環状変更誘導体から選択される阻害剤を、活性成分として含有するものである。
【００２３】
突然変異タンパク質、融合タンパク質、機能的誘導体、活性断片および環状変更誘導体という用語は、国際公開第９９／０９０６３号パンフレットの場合と同じ意味を有する。
【００２４】
ＩＬ−１８に対する抗体およびＩＬ−１８ＢＰ類は、医薬組成物の好ましい活性成分である。
【００２５】
医薬組成物はまた、適用方法すなわち注射、経口または本分野において知られるほかの方法に依存する従来の担体、賦形剤および本分野において知られるそのほかの成分を含有してもよい。
【００２６】
特定の投薬量は、適用の様式、患者の体重およびほかの要因に依存するであろうし、いずれの病状においても、医師により決定されるであろう。
【００２７】
本発明を開示しているが、同様なことが、実例として提供されたものであって本発明の限定を意図するものでない以下の実施例を参照することにより、より容易に理解されるであろう。
【００２８】
実施例
試薬
ラットの抗マウスＩｇＧおよびラットの抗マウスＶＣＡＭ−１モノクローナル抗体は、セロテック社（Serotec Ltd.）（オックスフォード、イギリス）から入手した。組換え体マウスＩＬ−１βはＲ＆Ｄシステム社（R&D System Inc.）（ミニアポリス、ＭＮ）から入手した。組換え体ヒトＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａは、アップジョン社（Upjohn Co.）、カラマズー（Kalamazoo）、ＭＩからの寛大な寄贈品である）およびヒトｐ５５ＴＮＦ可溶性受容体（ＴＮＦｓＲ  ｐ５５）はセロノ社（Serono Inc）、ノーウェル（Norwel）、ＭＡからの寛大な寄贈品であった。ＩＬ−１β変換酵素阻害剤（ＩＣＥｉ）は、アレクシス社（Alexis Co.）（サンディエゴ、ＣＡ）から入手した。組換え体マウスＩＬ−１８およびウサギの抗マウスＩＬ−１８ポリクローナル抗体ＩｇＧはペプロテックＥＣ社（PeproTechEC Ltd.）（ロンドン、ＵＫ）から購入した。ＩＬ−１８結合タンパク質（ＩＬ−１８ＢＰ）は記載されているように産生した（２８）。
【００２９】
Ｂ１６Ｍ細胞の培養。Ｂ１６Ｍ細胞は、以前に記載されたように（１１）、培養し、維持しそして継代した。Ｂ１６Ｍ調整培地（Ｂ１６Ｍ−ＣＭ）を以下のように製造した。５×１０5細胞を２５ｃｍ2のＴフラスコに播種し、２４時間培養した。そののち、５ｍｌの血清を含まない培地にて、さらに２４時間培養した（最終的な細胞密度は６×１０4細胞個／ｃｍ2）。上清を回収し、血清を含まない新鮮な培地において３：１に希釈し、
【外１】
0004827352.tif 000002
【００３０】
を通過させた。
【００３１】
サイトカイン分析。初代培養ＨＳＥ細胞およびＢ１６Ｍ細胞からのサイトカインの放出は、製造会社（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミニアポリス、ＭＮ）に示されたとおりに、抗マウスＩＬ−１βモノクローナル抗体および抗マウスＴＮＦ−αモノクローナル抗体による特異的なＥＬＩＳＡキットを用いて、測定された。
【００３２】
実施例１：初代ＨＳＥ培養物に対する定量的Ｂ１６Ｍ細胞接着。ＨＳＥは、以前に記載されたように（２６）、同系マウスから分離され、同定されて培養された。Ｂ１６Ｍ細胞は、報告されているように（１６）、２′，７′−ビス−（２−カルボキシエチル）−５，６−カルボキシフルオレセイン−アセトキシメチルエステル溶液（ＢＣＥＣＦ−ＡＭ、モレキュラープローブス社（Molecular Probes）製、ユージーン（Eugene）、ＯＲ）で標識された。ついで、２×１０5細胞個／穴を、ＨＳＥを培養した２４穴プレートに添加し、８分後、新鮮な培地で穴を３回洗った。接着した細胞の数を、以前に記載された蛍光測定システム（１６）に基づく定量法を用いて決定した。いくつかの実験において、Ｂ１６Ｍ細胞を添加する前に、数時間、ＨＳＥ細胞をＢ１６Ｍ−ＣＭを用いて前培養した。
【００３３】
実施例２：肝転移検定。以前に記載されているように（２７）、野生型、ＩＬ−１β-/-およびＩＣＥ-/-の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを作製した。１ケージ当たり５匹収容した６から８週齢のマウスを使用した。肝転移は、麻酔したマウス（ネンブタール、腹腔内に５０ｍｇ／ｋｇ）に、ハンクス平衡化食塩水（Hanks' balanced salt solution）０．１ｍｌに懸濁した３×１０5の生きたＢ１６メラノーマ細胞を脾臓内注射することにより、引き起こされた。マウスは、癌細胞の注射から１０日後に麻酔をかけて殺された。肝組織は、組織学用に処理された。正常肝組織と転移Ｂ１６Ｍとを識別するためにデジタル化顕微鏡画像の密度検定を使用し、肝臓１００ｍｍ3当たりの転移数（１肝臓当たり１５の１０×１０ｍｍ2切片において検出した病巣の平均数に基づく）である肝転移密度を、以前に記載された立体的解析法（１７）を用いて計算した。
【００３４】
実施例３：ＩＬ−１βおよびＩＣＥ欠損マウスに注射したＢ１６Ｍ細胞の減少した転移および増殖。成体のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ野生型、ＩＣＥ-/-およびＩＬ−１β-/-のマウスに脾臓内注射される同じＢ１６Ｍ細胞の２つの異なる群を用い、２つの独立した実験を１年ずらして実施した。剖検調査により、脾臓の重量により評価したサイズにおいて著しい差もなく、検定されたすべてのマウス由来の脾臓において、明らかなメラニン性腫瘍が立証された（表１）。対照的に、野生型マウスの肝臓と比較すると、転移の顕著な減少がＩＬ−１β-/-およびとくにＩＣＥ-/-マウスの肝臓においてみられた（図１）。調査したマウスの肝臓における転移密度（病巣数／１００ｍｍ3として）パラメーターおよび転移量（器官占有百分率（percent organ occupancy））パラメーターを決定するために、転移病巣の数およびサイズに関する定量組織分析を実施した。野生型マウスと比較して（表１）、肝転移密度は、ＩＬ−１β-/-およびＩＣＥ-/-マウス肝臓において、８４％から９０％まで、著しく（Ｐ＜０．０１）減少しており、注射したＢ１６Ｍ細胞の多くが、これらのマウス由来の肝組織に付着することができないことを示した。さらに、転移量もまた、野生型マウスの肝臓における量と比較すると、６から７倍、ＩＬ−１β-/-およびＩＣＥ-/-マウス肝臓で著しく（Ｐ＜０．０１）減少しており、肝臓に転移増殖するＢ１６Ｍ細胞もまた、増殖率が減少することを示した。本発明者らはまた、ＩＬ−１β-/-およびＩＣＥ-/-のマウス肝臓間のこれら転移パラメーターにおける相違を観察し、実験Ｉ由来のほぼすべてのＩＣＥ-/-マウス肝臓において転移根絶を導いた（図１）。
【００３５】
【表１】
0004827352.tif 000003
【００３６】
実施例４：自己分泌ＩＬ−１８は、Ｂ１６Ｍ−ＣＭで活性化されたＨＳＥ由来のＴＮＦ−αおよびＩＬ−１β誘導性接着を仲介する。Ｂ１６Ｍ−ＣＭは、ＨＳＥ細胞によるＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βの産生、ならびに他方のＢ１６Ｍ細胞に対する接着性を、インビトロにおいて著しく（Ｐ＜０．０１）増大した（図２）。ＨＳＥと１０μＭのＩＣＥｉとを１８時間インキュベーションすることにより、ＨＳＥからのＴＮＦ−α産生を減少することなく、Ｂ１６Ｍ−ＣＭに誘導される接着性を完全に途絶した。外因的に添加したマウスＩＬ−１βは、ＩＣＥｉのＨＳＥに対する遮断効果を補うものではなく、ＩＬ−１β処理コントロールＨＳＥの著しいＢ１６Ｍ細胞接着増大と対照的である（図３）。高い濃度の内因的に産生されたＴＮＦ−αおよび外因的に添加されたＩＬ−１βの存在下でＢ１６Ｍ−ＣＭ誘導性接着増強が撤廃されたという事実は、それらのサイトカインのいずれも、ＨＳＥ接着を直接アップレギュレーションしなかったということを示す。重要なことに、Ｂ１６Ｍ−ＣＭでの刺激前にＨＳＥに添加した抗マウスＩＬ−１８抗体の存在で、ＨＳＥからの誘導ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−α産生に影響することなく、Ｂ１６Ｍ−ＣＭ誘導性の接着性が予防された（図２）。そのうえ、抗ＩＬ−１８抗体はまた、ＨＳＥに対するマウスＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの接着刺激効果を予防しており（図３）、ＨＳＥに対するそれらのサイトカインの接着前作用はどちらもＩＬ−１８介在性であることを示す。ＲＴ−ＰＣＲは、ＨＳＥ細胞がＩＬ−１８遺伝子を発現することを立証した（データ示さず）。逆に、マウスＩＬ−１８は、ＨＳＥに対するＢ１６Ｍ細胞接着を著しく（Ｐ＜０．０１）増大し（図４）、そしてＴＮＦ−ｓＲ  ｐ５５およびＩＬ−１ＲａはいずれもＩＬ−１８を阻害することができないことから、自己分泌ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１βはいずれも、ＩＬ−１８誘導性のＨＳＥ接着性の原因ではないことを立証した。しかしながら、図４に示したように、抗ＶＣＡＭ−１抗体はＩＬ−１８処理ＨＳＥに対するＢ１６Ｍ細胞の接着を完全に阻害した。コントロールの非特異的ＩｇＧは、ＩＬ−１８処理ＨＳＥに対するＢ１６Ｍ細胞接着のアップレギュレーションに影響しなかった。
【００３７】
実施例５：ＩＬ−１８ＢＰは、Ｂ１６調整培地で誘導されるＢ１６メラノーマ細胞の接着を予防する。表２に示したように、Ｂ１６−ＣＭで刺激されたＨＳＥへのＩＬ−１８ＢＰの添加は、接着している細胞の百分率を３５％から８．７０％まで下げた（Ｐ＜０．０１）。これは、その接着のレベルが基本培地を用いる接着細胞のレベルより低いので、１００％の阻害を示している。この結果は、Ｂ１６Ｍ−ＣＭに存在するＩＬ−１８に加え、ＨＳＥ由来の内因性ＩＬ−１８は、ＩＬ−１８の内因性の根源であるかもしれないことを示唆する。
【００３８】
【表２】
0004827352.tif 000004
【００３９】
［参考文献］
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【図面の簡単な説明】
【図１】  野生型、ＩＬ−１β-/-およびＩＣＥ-/-マウスにおける、脾臓内Ｂ１６Ｍ細胞注射後の実験的肝転移増殖。Ｂ１６Ｍ細胞注射の１０日後に肝臓を摘出し、１０％ホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液添加食塩水（phosphate buffered saline）で固定した。ほぼすべての実験的転移（黒色のメラニン性小結節）が、ＩＬ−１β-/-およびＩＣＥ-/-マウスの肝臓から一掃された。
【図２】  ＨＳＥ細胞に対するＢ１６Ｍ細胞接着における、不可逆性ＩＣＥ阻害剤および抗マウスＩＬ−１８抗体の効果、ならびに未処理およびＢ１６Ｍ−ＣＭ処理ＨＳＥからのＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの産生。培養したＨＳＥ細胞を、Ｂ１６Ｍ−ＣＭの存在下で１０時間インキュベートした。いくつかの実験においては、未処理および処理ＨＳＥ細胞の双方に、Ｂ１６Ｍ−ＣＭ前に１０μＭのＩＣＥｉまたは１０μｇ／ｍｌの抗マウスＩＬ−１８抗体を与えた。ＨＳＥ基質に対して接着したＢ１６Ｍ細胞の百分率は、添加する細胞の最初の数に関する相対値として計算された。さらに、ＥＬＩＳＡによりＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αの濃度を決定するため、接着前に培養上清を回収した。データは、６つ１組で、４つの独立した実験の平均値±ＳＤを示す（ｎ＝２４）。スチューデントの両側、不対ｔ検定（Student's two-tailed, unpaired t-test）によると、Ｂ１６Ｍ−ＣＭ処理ＨＳＥに対するＢ１６Ｍ細胞接着の増大ならびにＩＬ−１βもしくはＴＮＦ−α産生の増大は（*Ｐ＜０．０１）、未処理ＨＳＥに対して統計学的に著しいものであった。Ｂ１６Ｍ−ＣＭがない状態で、ＨＳＥ細胞をＩＣＥｉまたは抗ＩＬ−１８抗体で処理すると、ＩＬ−１βもしくはＴＮＦ−α産生ならびにＨＳＥ細胞に対するＢ１６Ｍ細胞の接着において、非統計学的に著しい変化があった（データ示さず）。
【図３】  インビトロにおける、Ｂ１６Ｍ−ＣＭ処理ＨＳＥに対するＢ１６Ｍ細胞接着におけるＩＣＥｉの効果。ＨＳＥ細胞を、基本培地またはＢ１６Ｍ−ＣＭとともに８時間インキュベーションした。ＨＳＥ細胞によっては、Ｂ１６Ｍ−ＣＭの前に、１０μＭのＩＣＥｉを１８時間与えた。さらに、ＨＳＥ細胞によっては、Ｂ１６Ｍ−ＣＭとともに１ｎｇ／ｍｌの組換え体マウスＩＬ−１βも８時間添加した。ほかの実験においては、ＨＳＥ細胞に１ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−１または１００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦ−αを６時間与え、そして１０μｇ／ｍｌのウサギ抗マウスＩＬ−１８ポリクローナル抗体をサイトカイン処理１時間前に添加、または添加しなかった。非特異的ＩｇＧポリクローナル抗体もまた、未処理ＨＳＥ細胞およびサイトカイン処理ＨＳＥ細胞に添加された。ついで、ＨＳＥ細胞を洗い、そしてＢＣＥＦＣＦ−ＡＭで標識されたＢ１６細胞を添加し、８分後に再び洗いを行った。ＨＳＥ基質に対して接着したＢ１６Ｍ細胞の百分率を、始めに添加した細胞数に関する相対値として計算した。その結果は、それぞれ６匹１組でなされた３つの独立実験の平均±ＳＤを示す（ｎ＝１８）。スチューデントの両側、不対ｔ検定によると、未処理ＨＳＥ（*）、ならびにＩＬ−１βもしくはＴＮＦ−α処理ＨＳＥ（**）に関する接着の程度の差は、統計学的に著しいものであった（Ｐ＜０．０１）。さらに１ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−１βを８時間与えたまたは与えなかったほかのＩＣＥｉ処理コントロールＨＳＥに対するＢ１６Ｍ細胞の接着においては、非統計学的に著しい変化であった（データは示していない）。
【図４】  インビトロにおける、ＩＬ−１８処理ＨＳＥに対するＢ１６Ｍ細胞接着。ＨＳＥ細胞を、１ｎｇ／ｍｌの組換え体マウスＩＬ−１８とともに６時間インキュベーションした。いくつかの実験では、１０μｇ／ｍｌのＴＮＦ−ｓＲｐ５５または１００ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１Ｒａを、ＩＬ−１８の１０分前に添加した。ほかの実験では、１０μｇ／ｍｌの抗ＶＣＡＭ−１抗体または同様の濃度の非特異的抗マウスＩｇＧを、Ｂ１６Ｍ細胞の３０分前にＨＳＥ細胞に添加した。ついで、Ｂ１６Ｍ細胞接着の百分率は、本明細書中における実施例に記載のようにして決定した。その結果は、それぞれ６匹１組でなされた３つの独立実験の平均±ＳＤを示す（ｎ＝１８）。スチューデントの両側、不対ｔ検定によると、基本培地処理ＨＳＥ（*）およびＩＬ−１８処理ＨＳＥ（**）に関する接着の程度の差は、統計学的に著しいものであった（Ｐ＜０．０１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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