(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲラニルゲラニルアセトンを含有する、上気道粘膜、肝臓、胃、血管、リンパ及び神経からなる群から選ばれる少なくとも１種においてチオレドキシンを誘導するためのチオレドキシン誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、チオレドキシン誘導物質、該誘導物質を含む医薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術及びその課題】
細胞内の酸化還元制御因子の有力な候補としてチオレドキシン（以下、「ＴＲＸ」という）が注目されている。ＴＲＸは生体内に普遍的に存在するタンパク質で、２つのシステインを有する部位−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−を活性中心に有し、活性中心にあるジチオールの可逆的な酸化を通して酸化還元反応に関わる多面発現性の細胞性因子である。
【０００３】
従って、ＴＲＸを誘導すれば細胞内で引き起こされる各種の酸化還元現象に基づく病的状態またはその前段階の状態から、細胞、組織、器官等を保護し得ることが期待される。
【０００４】
しかしながら、現在までのところ、TRXを誘導しうる物質は知られていなかった。
【０００５】
本発明は、TRXを誘導しうるチオレドキシン誘導物質、及び該誘導物質を有する医薬組成物を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明は、チオレドキシン誘導物質及び該誘導物質を有する医薬組成物を提供するものである。
項１．  上気道粘膜、肝臓、胃、血管、リンパ及び神経からなる群から選ばれる少なくとも１種においてチオレドキシンを誘導し得るチオレドキシン誘導物質。
項２．  イソプレノイド系化合物である項１に記載のチオレドキシン誘導物質。
項３．  ゲラニルゲラニルアセトン（ＧＧＡ）からなる項１に記載のチオレドキシン誘導物質。
項４．  項１または２に記載のチオレドキシン誘導物質を含む医薬組成物。
項５．  上気道粘膜保護剤、二日酔いを含む肝細胞障害ないし疾患の予防ないし治療剤、動脈硬化、心筋梗塞、脳梗塞、虚血再灌流障害及び臓器移植に伴う疾患を含む血管系疾患の予防ないし治療剤、エイズ及び細菌感染症を含むリンパ系疾患の予防ないし治療剤、アルツハイマー病、パーキンソン病及び老人性痴呆を含む神経系疾患の予防ないし治療剤を包含する項４に記載の医薬組成物。
【０００７】
【発明の実施の形態】
チオレドキシン誘導物質は、本発明で初めて見出されたものである。該誘導物質は、上気道粘膜、肝臓、血管内皮細胞、リンパ球、神経細胞、胃粘膜上皮細胞の少なくとも１つにおいて、ＴＲＸを誘導することができる物質である。
【０００８】
このようなチオレドキシン誘導物質としては、例えばイソプレノイド系化合物が好ましく例示される。イソプレノイド系化合物としては、イソプレンユニット（CH3-C(CH3)=CH-CH2）を有する化合物であれば特に限定されず、各種のイソプレノイド系化合物（誘導体を含む）が包含され、好ましくはモノテルペン系化合物、セスキテルペン系化合物、ジテルペン系化合物、トリテルペン系化合物が挙げられ、特に好ましくは一般式（Ｉ）で表される化合物が挙げられる：
【０００９】
【化１】
0004632480.tif 000002
【００１０】
〔式中、Ｒ1はＯＨ、（ＣＨ2）−アシル基またはヒドロキシアルキル基を示す。ｎは２〜６の整数を示す。〕
アシル基としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ラウロイル基、ミリストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、オレオイル基、ベンゾイル基等の炭素数１〜１８のアシル基が挙げられる。
【００１１】
ヒドロキシアルキル基としては、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシブチル基、２−ヒドロキシヘキシル、２−ヒドロキシオクチル、２−ヒドロキシデシル、２−ヒドロキシドデシル、２−ヒドロキシヘキサデシル、２−ヒドロキシオクタデシル等の炭素数１〜１８のアルコキシカルボニル基が挙げられる。
【００１２】
好ましいチオレドキシン誘導物質としては、下記のゲラニルゲラニルアセトン（ＧＧＡ）が例示される：
【００１３】
【化２】
0004632480.tif 000003
【００１４】
チオレドキシン誘導物質は公知の化合物であるか、例えば特開昭６２−１００１３号公報、特開平６−１９２０７３号公報などの公知の方法に従い、公知の化合物から容易に調製できる。
【００１５】
本発明のチオレドキシン誘導物質は、酸化に伴う疾患ないし障害の予防作用を発揮するために、飲料を含む食品（例えば健康食品、特定保健用食品、食品添加物を含む）として、摂取することもできる。
【００１６】
チオレドキシン誘導物質は、特に上気道粘膜障害、二日酔いを含む肝障害、動脈硬化、心筋梗塞、脳梗塞、虚血再灌流障害及び臓器移植に伴う疾患を含む血管系疾患、エイズ及び感染症を含むリンパ系疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病及び老人性痴呆を含む神経系疾患の予防ないし治療用の医薬ないし食品として有用である。
【００１７】
本発明のチオレドキシン誘導物質は、心血管系、リンパ系、神経系、肝臓、上気道粘膜などにおいて、過酸化水素、スーパーオキサイドなどの活性酸素による障害を効果的に予防できる。
【００１８】
本発明のチオレドキシン誘導物質を医薬として用いるに当たっては、予防又は治療目的に応じて各種の投与形態を採用可能であり、該形態としては、例えば、経口剤、注射剤、坐剤、軟膏剤、貼付剤等のいずれでも良く、これらの投与形態は、各々当業者に公知慣用の製剤方法により製造できる。
【００１９】
経口用固形製剤を調整する場合は、本発明チオレドキシン誘導物質に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等を、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等を、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等を、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等を、着色剤としては、酸化チタン、酸化鉄等を、矯味・矯臭剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等を例示できる。
【００２０】
経口用液体製剤を調整する場合は、本発明チオレドキシン誘導物質に矯味剤、緩衡剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合矯味・矯臭剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衡剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等が挙げられる。
【００２１】
注射剤を調整する場合は、本発明チオレドキシン誘導物質にｐＨ調節剤、緩衡剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のｐＨ調節剤及び緩衡剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が例示できる。
【００２２】
坐剤を調整する場合は、本発明チオレドキシン誘導物質に当業界において公知の製剤用担体、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセライド等を、さらに必要に応じてツイーン（登録商標）のような界面活性剤等を加えた後、常法により製造することができる。
【００２３】
軟膏剤を調整する場合は、本発明チオレドキシン誘導物質に通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等が挙げられる。保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等が挙げられる。
【００２４】
貼付剤を製造する場合は、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すれば良い。支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルムあるいは発泡体シートが適当である。
【００２５】
上記の各投与単位形態中に配合されるべき本発明化合物の量は、これを適用すべき患者の症状によりあるいはその剤型等により一定ではないが、一般に投与単位形態あたり経口剤では約１〜１０００ｍｇ、注射剤では約０．１〜５００ｍｇ、坐剤では約１〜１０００ｍｇとするのが望ましい。また、上記投与形態を有する薬剤の１日あたりの投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり一概には決定できないが、通常成人１日あたり約０．１〜１０００ｍｇとすれば良く、これを１日１回又は２〜４回程度に分けて投与するのが好ましい。
【００２６】
【実施例】
以下に、実施例を示して本発明を更に具体的に説明する。
実施例１
マウス血管内皮細胞(F-2)をＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２培地（２０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリンを含む）の１：１混合物中３７℃、５％ＣＯ2下で培養した。次いで、該細胞を３ｍｌの培地を用い、６ウェルの培養プレートで３×１０5細胞／ウェルで終夜培養した。各ウェルに各種濃度（０．１μＭ、１μＭ）のゲラニルゲラニルアセトン（ＧＧＡ）またはエタノール（最終濃度０．１％ｖ／ｖ）を加え、さらに２４時間インキュベートした。
【００２７】
インキュベートした細胞を集め、溶解した。細胞ライゼートを３分間１００℃に維持し、12%SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い（各レーン当たり５μｇの蛋白質）、ＰＶＤＦ転移膜（Millipore Bedford, MA, USA)に移した。ブロッキング緩衝液（０．０５％Tween20を含むPBS中５％スキムミルク）中でブロック後、膜を１時間抗マウスTRX抗体とインキュベートし、次いでペルオキシダーゼ共役抗ウサギ免疫グロブリン抗体（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック）とインキュベートした。結合型ペルオキシダーゼを製造業者の仕様書に従い増強化学蛍光分析(ECL,アマーシャム・ファルマシア・バイオテック）した。
【００２８】
各サンプル中のＴＲＸ量をコンピューターで計算する濃度計でバンド密度を分析することにより評価した。結果を図１（Ａ）に示す。
【００２９】
また、１０μＭのＧＧＡを用い、０〜１５時間インキュベートした結果を図１（Ｂ）に示す。
【００３０】
図１に示されるように、ＧＧＡは濃度及び時間依存的にＴＲＸを誘導し、その誘導活性は０．１％ｖ／ｖのエタノールよりも強力であった。
実施例２
マウス血管内皮細胞(F-2)に代えてヒト正常末梢血リンパ球を用い、ＧＧＡの濃度を（０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ）にした以外は実施例１と同様にして蛋白質レベルのＴＲＸ発現を調べた。結果を図２に示す。
【００３１】
図２に示されるように、ＧＧＡは濃度依存的にＴＲＸを誘導し、その誘導活性は０．１％ｖ／ｖのエタノールよりも強力であった。
実施例３
マウス血管内皮細胞(F-2)に代えてラット神経細胞株(PC-12)を用い、ＧＧＡの濃度を（０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ）にした以外は実施例１と同様にして蛋白質レベルのＴＲＸ発現を調べた。結果を図３に示す。
【００３２】
図３に示されるように、ＧＧＡは濃度依存的にＴＲＸを誘導し、その誘導活性は０．１％ｖ／ｖのエタノールよりも強力であった。
実施例４
マウス血管内皮細胞(F-2)に代えてラット胃粘膜上皮細胞(RGM-1、RIKEN細胞バンク)を用い、ＧＧＡの濃度を（０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ）にした以外は実施例１と同様にして蛋白質レベルのＴＲＸ発現を調べた。結果を図４に示す。
【００３３】
図４に示されるように、ＧＧＡは濃度依存的にＴＲＸを誘導し、その誘導活性は０．１％ｖ／ｖのエタノールよりも強力であった。
実施例５
マウス血管内皮細胞(F-2)に代えてラット初代培養肝細胞を用い、ＧＧＡの濃度を（０．１μＭ、１μＭ）にした以外は実施例１と同様にして蛋白質レベルのＴＲＸ発現を調べた。結果を図５、図６に示す。上記実施例と同様に、肝細胞株においてもＧＧＡはＴＲＸを誘導した。ラット初代培養肝細胞において、ＧＧＡを０．１μＭ、１μＭを添加し１２時間後のＴＲＸ誘導は、ＴＮＦα１００ng/mlと同程度であることが判る（図５）。また、ＧＧＡ（１μＭ）によるＴＲＸ誘導作用は、抗酸化剤であるＮＡＣ（Ｎ−アセチルシステイン）２０μＭ存在下でも減少しないことが示された（図６）。このことは、ＴＲＸが酸化ストレスで誘導されたのではないことを示す。
実施例６
マウス血管内皮細胞(F-2)に代えてヒト気管上皮細胞（ＢＥＣ）株を用い、ＧＧＡの濃度を（０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ）にした以外は実施例１と同様にして蛋白質レベルのＴＲＸ発現を行うと、上気道粘膜細胞株においてもＧＧＡはＴＲＸを誘導する。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＧＡによるマウス血管内皮細胞(F-2)でのＴＲＸ誘導結果を示す。
【図２】ＧＧＡによるヒト正常末梢血リンパ球でのＴＲＸ誘導結果を示す。
【図３】ＧＧＡによるヒト神経細胞株(PC-12)でのＴＲＸ誘導結果を示す。
【図４】ＧＧＡによるラット胃粘膜上皮細胞(RGM-1)でのＴＲＸ誘導結果を示す。
【図５】ＧＧＡによるラット初代培養肝細胞でのＴＲＸ誘導結果を示す。
【図６】ＧＧＡによるラット初代培養肝細胞でのＴＲＸ誘導結果を示す。
【図１】
0004632480.tif 000004
【図２】
0004632480.tif 000005
【図３】
0004632480.tif 000006
【図４】
0004632480.tif 000007
【図５】
0004632480.tif 000008
【図６】
0004632480.tif 000009