(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−７５４７のハイブリドーマにより産出される、配列番号３記載のアミノ酸配列中、−１１位のＧｌｕから−１位のＡｒｇまでのアミノ酸から成るポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】
受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−７３９３のハイブリドーマにより産生される、配列番号３記載のアミノ酸配列中、１位のＧｌｙから１２３位のＡｓｐまでのアミノ酸から成るポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項３】
配列番号３記載のアミノ酸配列中、−１１位のＧｌｕから−１位のＡｒｇまでのアミノ酸から成るポリペプチドまたは１位のＧｌｙから１２３位のＡｓｐまでのアミノ酸から成るポリペプチドを特異的に認識する抗体を含むことを特徴とする癌診断用キット。
【請求項４】
癌が、大腸癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、腎臓癌、胆嚢癌、前立腺癌、膵臓癌、精巣癌、卵巣癌または皮膚癌である請求項３に記載の癌診断用キット。
【請求項５】
配列番号３記載のアミノ酸配列中、−１１位のＧｌｕから−１位のＡｒｇまでのアミノ酸から成るポリペプチドまたは１位のＧｌｙから１２３位のＡｓｐまでのアミノ酸から成るポリペプチドを特異的に認識する抗体を含むことを特徴とするアルツハイマー病診断用キット。
【請求項６】
配列番号３記載のアミノ酸配列中、−１１位のＧｌｕから−１位のＡｒｇまでのアミノ酸から成るポリペプチドまたは１位のＧｌｙから１２３位のＡｓｐまでのアミノ酸から成るポリペプチドを特異的に認識する抗体を含むことを特徴とする肝硬変診断用キット。
【請求項７】
配列番号３記載のアミノ酸配列中、−１１位のＧｌｕから−１位のＡｒｇまでのアミノ酸から成るポリペプチドまたは１位のＧｌｙから１２３位のＡｓｐまでのアミノ酸から成るポリペプチドを検出することを特徴とする癌、アルツハイマー病または肝硬変のスクリーニング方法。
【請求項８】
癌が、大腸癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、腎臓癌、胆嚢癌、前立腺癌、膵臓癌、精巣癌、卵巣癌または皮膚癌である請求項７に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、Ｘ型ホスホリパーゼＡ２（Ｘ型ｓＰＬＡ２）の一部を特異的に認識する抗体；該抗体を用いた活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２の測定方法；該抗体を含む診断用キットに関する。
背景技術
ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２；ＥＣ  ３．１．１．４）は、３−ｓｎ−ホスホグリセリドの２−アシルエステル結合を加水分解するリン脂質分解酵素の総称である。ＰＬＡ２は、食物中のリン脂質消化や生体膜リン脂質の新生と代謝などに関わるとともに、プロスタグランジン、ロイコトリエン、血小板活性化因子（ＰＡＦ）、リゾリン脂質などの脂質メディエーター産生にいたるアラキドン酸カスケードの開始酵素として機能する。哺乳動物では多様なＰＬＡ２の存在が明らかになっており、その局在性、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）要求性、基質特異性に基づいて、分泌型ＰＬＡ２、細胞質型ＰＬＡ２、Ｃａ２＋非依存型ＰＬＡ２、ならびにＰＡＦ−アセチルヒドロラーゼの４つのファミリーに分類されている（Ｂａｌｓｉｎｄｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１６０６９−１６０７２（１９９７））。
このうち分泌型ＰＬＡ２（ｓＰＬＡ２）ファミリーは、細胞外に分泌される低分子量（１３，０００〜１５，０００）のＰＬＡ２分子群であり、ヒトでは、ＩＢ型、ＩＩＡ型、ＩＩＤ型、ＩＩＥ型、Ｖ型、ならびにＸ型の６種類が知られている。いずれの分子種も、その構造中に１２〜１６個のＣｙｓ残基を持ち、分子内ジスルフィド結合を形成しており、またＨｉｓ−Ａｓｐ残基からなる活性中心部位が保存されている。さらに、共通のＣａ２＋結合領域を持ち、酵素活性の発現にはｍＭオーダーのＣａ２＋を要求する（Ｔｉｓｃｈｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１７２４７−１７２５０（１９９７）、Ｃｕｐｉｌｌａｒｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，１５７４５−１５７５２（１９９７）、Ｉｓｈｉｚａｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２４９７３−２４９７９（１９９９）、およびＳｕｚｕｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，５７８５−５７９３（２０００））。
ヒトＸ型ｓＰＬＡ２は、ＤＮＡデータベースよりｓＰＬＡ２関連配列に基づき、胎児肺組織よりクローニングされた（Ｃｕｐｉｌｌａｒｄ，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１５７４５−１５７５２（１９９７））。ヒトＸ型ｓＰＬＡ２の遺伝子は、他のｓＰＬＡ２と異なり第１６番染色体上に位置する。
ヒトＸ型ｓＰＬＡ２タンパクは、ｓＰＬＡ２ファミリーの中で最も酸性（ｐＩ＝５．３）で、Ｎ−結合型糖鎖結合可能な部位を含んでいる。本ｓＰＬＡ２は、分子内に１６システイン残基を有し、ＩＢ型ｓＰＬＡ２とＩＩＡ／ＩＩＤ／ＩＩＥ型ｓＰＬＡ２のそれぞれに存在する特徴的な分子内ジスルフィド架橋をすべて含んでいる。さらに、ＩＩＡ／ＩＩＤ／ＩＩＥ型ｓＰＬＡ２に特有のカルボキシル基末端延長構造を有する。ノザン解析により、Ｘ型ｓＰＬＡ２  ｍＲＮＡ（１．５キロベース）の発現は、ヒト脾臓、胸腺で検出された。したがって、Ｘ型ｓＰＬＡ２の生理学的、病理学的な機能に関して詳細は不明であるが、その発現部位の局在から、本酵素が免疫系や炎症病態の調節に関与している可能性が推定される。
Ｘ型ｓＰＬＡ２のｃＤＮＡクローニングにより、１２３個のアミノ酸から成る活性Ｘ型ｓＰＬＡ２とプレプロペプチドの存在が想定された（配列番号１；Ｃｕｐｉｌｌａｒｄ，ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１５７４５−１５７５２（１９９７））。しかしながら、Ｃｕｐｉｌｌａｒｄらもその困難性を指摘しているように、プレプロペプチド上のシグナルペプチダーゼによる切断部位、すなわちシグナルペプチドおよびプロペプチドは特定されていなかった。
発明の開示
本発明の目的は、Ｘ型ｓＰＬＡ２の一部を特異的に認識する抗体；該抗体を用いた活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２の測定方法；該抗体を含む診断用キットを提供することにある。
本発明者らは、ヒトＸ型ｓＰＬＡ２の生理機能の解明を目指して鋭意研鑚を重ねてきたが、その過程で、Ｘ型ｓＰＬＡ２には、プロペプチド配列をＮ−末端に有する非活性型のプロ型と、そのプロペプチド部分が切断されて生じる活性型の２つの分子種が存在することを証明し、その活性化過程で切断されるプロペプチド部分のアミノ酸配列を特定した。更に、そのプロペプチド量、あるいは活性型のＸ型ｓＰＬＡ２それ自身の量を測定することにより、活性化状態のＸ型ｓＰＬＡ２濃度を特異的に検出する測定方法を見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）配列番号３記載のアミノ酸配列中、−１１位のＧｌｕから１２３位のＡｓｐまでのアミノ酸から成るポリペプチドの一部を特異的に認識する抗体；
（２）配列番号３記載のアミノ酸配列中、−１１位のＧｌｕから−１位のＡｒｇまでのアミノ酸から成るポリペプチドを特異的に認識する上記（１）に記載の抗体；
（３）配列番号３記載のアミノ酸配列中、１位のＧｌｙから１２３位のＡｓｐまでのアミノ酸から成るポリペプチドを特異的に認識する上記（１）に記載の抗体；
（４）ポリクローナル抗体であることを特徴とする、上記（１）から（３）のいずれかに記載の抗体；
（５）モノクローナル抗体であることを特徴とする、上記（１）から（３）のいずれかに記載の抗体；
（６）受託番号がＦＥＲＭ  ＢＰ−７３９３のハイブリドーマにより産生される上記（３）に記載のモノクローナル抗体；
（７）上記（３）または（６）に記載の抗体を含むことを特徴とするＰＬＡ２関連疾患の治療薬；
（８）配列番号３記載のアミノ酸配列中、−１１位のＧｌｕから−１位のＡｒｇまでのアミノ酸から成るポリペプチド；
（９）配列番号３記載のアミノ酸配列中、１位のＧｌｙから１２３位のＡｓｐまでのアミノ酸から成るポリペプチド；
（１０）上記（８）または（９）に記載のポリペプチドから成る標準抗原；
（１１）上記（１）から（６）のいずれかに記載の抗体を用いることを特徴とする上記（８）または（９）に記載のポリペプチドの測定方法；
（１２）活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２を測定することを特徴とする上記（１１）に記載の測定方法；
（１３）上記（１）から（６）のいずれかに記載の抗体を含むことを特徴とする上記（８）または（９）に記載のポリペプチドの測定キット；
（１４）活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２を測定することを特徴とする上記（１３）に記載の測定キット；
（１５）上記（８）または（９）に記載のポリペプチドを検出しえる試薬を含むことを特徴とする癌診断用キット；
（１６）試薬が上記（１）から（６）のいずれかに記載の抗体であることを特徴とする上記（１５）に記載の癌診断用キット；
（１７）癌が、大腸癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、腎臓癌、胆嚢癌、前立腺癌、膵臓癌、、精巣癌、卵巣癌または皮膚癌である上記（１５）または（１６）に記載の癌診断用キット；
（１８）上記（８）または（９）に記載のポリペプチドを検出しえる試薬を含むことを特徴とするアルツハイマー病診断用キット；
（１９）試薬が上記（１）から（６）のいずれかに記載の抗体であることを特徴とする上記（１８）に記載のアルツハイマー病診断用キット；
（２０）上記（８）または（９）に記載のポリペプチドを検出しえる試薬を含むことを特徴とする肝硬変診断用キット；
（２１）試薬が上記（１）から（６）のいずれかに記載の抗体であることを特徴とする請求項２０に記載の肝硬変診断用キット；
（２２）上記（８）または（９）に記載のポリペプチドを検出することを特徴とする癌、アルツハイマー病または肝硬変のスクリーニング方法；および
（２３）癌が、大腸癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、腎臓癌、胆嚢癌、前立腺癌、膵臓癌、精巣癌、卵巣癌または皮膚癌である上記（２２）に記載のスクリーニング方法、に関する。
Ｘ型ｓＰＬＡ２には、成熟の度合いにより、プレプロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２、プロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２及び活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２（成熟型Ｘ型ｓＰＬＡ２とも呼ぶ）の３種類が存在する。
ｍＲＮＡから翻訳された直後は、Ｘ型ｓＰＬＡ２はシグナルペプチドを有するプレプロ型として産生される。プレプロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２とは、配列番号３に記載のアミノ酸配列中、−３２位のＭｅｔから１２３位のＡｓｐまでのアミノ酸からなるポリペプチドを意味する。そのうち、シグナルペプチドは、配列番号３に記載のアミノ酸配列中、−３２位のＭｅｔから−１２位のＧｌｙまでのアミノ酸からなるポリペプチドである。
プロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２は、プレプロ型よりシグナルペプチドが切断されることによって生じる。プロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２とは、配列番号３に記載のアミノ酸配列中、−１１位のＧｌｕから１２３位のＡｓｐまでのアミノ酸からなるポリペプチドを意味する。
更に、プロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２は、配列番号３に記載のアミノ酸配列中、−１位のＡｒｇと１位のＧｌｙの間で開裂され、プロペプチド（配列番号３に記載のアミノ酸配列中、−１１位のＧｌｕから−１位のＡｒｇまでの１１アミノ酸からなるポリペプチド）と、活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２（配列番号３に記載のアミノ酸配列中、１位のＧｌｙから１２３位のＡｓｐまでのアミノ酸からなるポリペプチド）に分断される。生体内では、この活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２がホスホリパーゼＡ２としての機能を有するものと考えられる。
なお、本発明においては、シグナルペプチドおよびプロペプチドからなる断片をプレプロペプチドと称する場合もある。プレプロペプチドとは、配列番号３に記載のアミノ酸配列中、−３２位のＭｅｔから−１位のＡｒｇまでのアミノ酸からなるポリペプチドを意味する（図１）。
本発明において、「配列番号３に記載のアミノ酸配列中、−１１位のＧｌｕから１２３位のＡｓｐまでのアミノ酸配列から成るポリペプチドの一部」とは、プロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２の一部を意味する。好ましくは、プロペプチド又は活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２を意味する。また、「上記（６）または（７）に記載のポリペプチド」とは、プロペプチド又は活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２を意味する。
本発明は、活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２を免疫学的手段により測定することを目的とするものである。
活性化の過程で、プロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２から、活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２とともにプロペプチドが対として産生される。本発明者らは、活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２または活性化の過程で活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２と等モル量産生されるプロペプチドを特異的に測定することで、活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２の測定方法を完成させた。
本発明において、「配列番号３記載のアミノ酸配列中、−１１位のＧｌｕから−１位のＡｒｇまでのアミノ酸から成るポリペプチドを特異的に認識する抗体」とは、プロペプチドを特異的に認識する抗体を意味する。「プロペプチドを特異的に認識する」とは、プロペプチドとは反応するものの、活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２との交叉反応性が５％以下であることを意味する。また、「配列番号３記載のアミノ酸配列中、１位のＧｌｙから１２３位のＡｓｐまでのアミノ酸から成るポリペプチドを特異的に認識する抗体」とは、活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２を特異的に認識する抗体を意味する。「活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２を特異的に認識する」とは、活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２とは反応するものの、プロペプチドやプロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２との交叉反応性が５％以下であることを意味する。このような抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。例えば、活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２を特異的に認識するモノクローナル抗体としては、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、２０００年１２月１２日に受託されたハイブリドーマ３Ｃ１０（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３９３）により産生されるモノクローナル抗体が例示される。また、これら抗体の特異性を検討するために用いられるプロペプチドまたは活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２は、標準曲線を作製するための「標準抗原」として用いることができる。
本発明の抗体を用いることにより、活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２のみを測定することが可能となる。
分泌型ＰＬＡ２は、細胞膜やリポタンパク質などに存在するリン脂質からの脂肪酸（例えば、アラキドン酸）の放出に関与している。過剰な脂肪酸の放出ならびにその代謝による種々の脂質メディエーターの産生は、敗血症ショック、成人呼吸困難症候群、膵炎、外傷、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、慢性関節リウマチ等の疾病の原因となる。本発明の「ＰＬＡ２関連疾患」とは、これら疾患を意味する。本発明の活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２に対する抗体は、これら疾患の治療に有用である。また、本発明の測定方法を用いることにより、活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２に起因するこれら疾患の診断が可能になるものと考えられる。従って、本発明は、「活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２の測定方法」を提供する。
さらに、本発明者らは、免疫組織化学的解析により、大腸癌患者の大腸癌組織、肺癌患者の肺癌組織、肝臓癌患者の肝臓組織、胃癌患者の胃組織、腎臓癌患者の腎臓組織、胆嚢癌患者の胆嚢組織、前立腺癌患者の前立腺組織、膵臓癌患者の膵臓組織、精巣癌患者の精巣組織、卵巣癌患者の卵巣組織、皮膚癌患者の皮膚組織、アルツハイマー病患者の大脳組織及び肝硬変患者の肝臓組織において、正常人のそれら組織に比べてＸ型ｓＰＬＡ２が顕著に高発現していることを確認した。従って、ｓＰＬＡ２の基質であるリン脂質または本発明の抗体を「試薬」として用いて、Ｘ型ｓＰＬＡ２の活性又は発現を確認することにより、癌、アルツハイマー病または肝硬変の診断が可能となる。本発明は、「癌診断用キット」、「アルツハイマー病診断用キット」または「肝硬変診断用キット」を提供するものである。各診断用キットは、少なくとも本発明のポリペプチドを検出しうる試薬を含む。試薬としては、ｓＰＬＡ２の基質であるリン脂質または本発明の抗体などが例示される。検出方法としては、沈降反応法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロッティング法等が挙げられる。例えば、抗体を固相したマイクロプレート上で、適当に希釈された患者血清と抗体とを反応させ、洗浄後、２次抗体であるペルオキシダーゼで標識した抗ウサギＩｇＧ抗体などを加えて反応させ、その後、ペルオキシダーゼ基質を加えて発色させ、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより、本発明のポリペプチドが検出され得る。
検出試薬が抗体である場合には、本発明のキットには、本発明の抗体の他に、必要により発色試薬、反応停止用試薬、標準抗原試薬、サンプル前処理用試薬等の各種試薬から測定方法に応じた適切な試薬が適宜選択され得、本発明のキットに添付しえる。
また、本発明の診断用キットを用いることにより、癌、特に大腸癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、腎臓癌、胆嚢癌、前立腺癌、膵臓癌、精巣癌、卵巣癌もしくは皮膚癌、アルツハイマー病または肝硬変の早期発見を目的とした集団検診などが可能となる。具体的には、被験者の生体試料、例えば、血液を試料として、本発明の診断用キットなどを用いることにより、活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２が関与する癌、アルツハイマー病または肝硬変の発症前診断のための「スクリーニング方法」をも本発明は提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、おもにプロペプチドを用いた活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２の測定に関する。
以下にプロペプチドの調製工程、抗体の調製工程、抗体を用いた免疫測定方法を説明する。本明細書において、特に指示のない限り、当該分野で公知である遺伝子組換え技術、動物細胞、昆虫細胞、酵母および大腸菌での組換えタンパク質の生産技術、発現したタンパク質の分離精製法、分析法および免疫学的手法が採用される。
Ｘ型ｓＰＬＡ２をコードするＤＮＡの調製
Ｘ型ｓＰＬＡ２をコードするＤＮＡは本発明により教示された配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｄ  Ｅｄ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等参照）。具体的にはＸ型ｓＰＬＡ２が発現される適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーからＸ型ｓＰＬＡ２の塩基配列に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望のクローンを選択することにより実施できる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７８，６６１３（１９８１）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２，７７８（１９８３）等参照）。ｃＤＮＡの起源としては、Ｘ型ｓＰＬＡ２を発現する各種の細胞、組織やこれらに由来する培養細胞等が例示される。これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離・精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従い実施できる。また、ｃＤＮＡライブラリーは市販されており、本発明においてはそれらｃＤＮＡライブラリー、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社より市販の各種ｃＤＮＡライブラリー等を用いることもできる。
Ｘ型ｓＰＬＡ２のＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に限定されず、通常の方法に従うことができる。具体的には、例えばｃＤＮＡによって産生されるタンパク質に対して、該タンパク質特異的抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組み合わせ等を例示できる。ここで用いられるプローブとしては、Ｘ型ｓＰＬＡ２の塩基配列に関する情報をもとに化学合成されたＤＮＡ等が一般的に例示できるが、勿論既に取得された本発明ＤＮＡそのものや断片も良好に利用できる。また、本発明ＤＮＡの塩基配列情報に基づき設定したセンス・プライマー、アンチセンス・プライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。
また、Ｘ型ｓＰＬＡ２をコードするＤＮＡは、慣用の化学的方法、例えばリン酸三エステル法（Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８，９０−１０８（１９７９））またはリン酸二エステル法（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８，１０９−１５１（１９７９））により合成され得る。
Ｘ型ｓＰＬＡ２タンパク質の調製
（１）  組換え型Ｘ型ｓＰＬＡ２タンパク質の発現
Ｘ型ｓＰＬＡ２タンパク質は、Ｘ型ｓＰＬＡ２の塩基配列情報に従って、遣伝子工学的手法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１３０，６９２（１９８５）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８０，５９９０（１９８３）等）により、組換えタンパク質として得ることができる。より詳細には、所望のタンパク質をコードする遺伝子を適当なベクターに組み込む。このベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作成する。該形質転換体を培養することにより組換えタンパク質を得ることができる。
ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のいずれも用いることができる。該真核生物の細胞には、脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊稚動物細胞としては、例えばサルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｃｅｌｌ，２３，１７５（１９８１））やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞等がよく利用される。
発現ベクターとしては、通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、これは更に必要により複製起点を有していても良い。該発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターを保有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１，８５４（１９８１））等を例示できる。また、真核微生物としては、酵母が一般によく用いられ、中でもサッカロミセス属酵母を利用できる。該酵母の発現ベクターとしては、例えば酸性ホスファターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するｐＡＭ８２（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，８０，１（１９８３））等を利用できる。
原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によく利用される。これらを宿主とする場合、例えば該宿主菌中で複製が可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に所望の遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びＳＤ配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドンを付与した発現プラスミドを利用するのが好ましい。上記宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株等が利用される。ベクターとしては一般にｐＢＲ３２２及びその改良ベクターがよく利用されるが、これらに限定されず公知の各種の菌株及びベクターも利用できる。プロモーターとしては、例えばｔｒｐプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬ／ＰＲプロモーター等を使用できる。
所望の組換えＤＮＡの宿主細胞への導入方法及びこれによる形質転換方法としては、一般的な各種方法を採用できる。また得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により所望のタンパク質が産生される。該培養に用いられる培地としては、宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、その培養も宿主細胞に適した条件下で実施できる。例えば、ｐＳＶＬ  ＳＶ４０後期プロモーターの下流に本発明のヒトＸ型ｓＰＬＡ２遺伝子を含むベクターを、サル由来細胞ＣＯＳ−７に導入することによって形質転換体を作成し、この形質転換体を５％ＣＯ２存在下、３７℃で３日間培養することにより、組換えヒトＸ型ｓＰＬＡ２タンパク質が産生され得る。
蛋白質は、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５（２５），８２７４（１９８６）；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６３，３１３（１９８７）等）により分離・精製できる。該方法としては、塩析法、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外濾過、ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組み合わせ等を例示できる。
精製されたＸ型ｓＰＬＡ２は、プロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２を含むため、適切なプロテアーゼ（例えば、スブチリシン様エンドプロテアーゼ、トリプシンなど）により切断することで、活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２を得ることが出来る。
また、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質、あるいはＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質の断片（例えばプロペプチド）は、本発明により教示されたアミノ酸配列情報に基づいて、ペプチド合成機により合成することもできる。
本発明タンパク質に対する抗体の調製
本発明のタンパク質に対する抗体は、以下の方法により作製される。
（１）ポリクローナル抗体の作製
Ｘ型ｓＰＬＡ２のアミノ酸配列に基づいて、通常のペプチド合成機で合成した合成ペプチドや、Ｘ型ｓＰＬＡ２を発現するベクターで形質転換した細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などにより産生されたタンパク質を通常のタンパク化学的方法で精製し、これらを免疫原とする。この免疫原を用いて、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｌａｎｅ，Ｈ．Ｄ．ら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ出版Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ１９８９年などに記載の方法に従って、適切な方法で動物を免疫することにより、抗原となるタンパク質を特異的に認識するポリクローナル抗体を容易に作製し、精製することができる。マウス、ラット、ハムスター、ウサギなどの動物を免疫し、その血清由来のポリクローナル抗体を作製すればよい。（２）モノクローナル抗体
前述の免疫原で免疫したマウスやラットの脾臓またはリンパ節からリンパ球を取りだし、ミエローマ細胞と融合させてＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））に従ってハイブリドーマを作製した後、該ハイブリドーマから単クローン抗体を産生させ得る。例えば以下の工程によりプロペプチド又は活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２に対するモノクローナル抗体を得ることができる：
（ａ）  タンパク質によるマウスの免疫、
（ｂ）  免疫マウスからの脾臓の除去および脾臓細胞の分離、
（ｃ）  分離された脾臓細胞とマウスミエローマ細胞との融合促進剤（例えばポリエチレングリコール）の存在下での上記のＫｏｈｌｅｒらに記載の方法による融合、
（ｄ）  未融合ミエローマ細胞が成長しない選択培地で得られたハイブリドーマ細胞の培養、
（ｅ）  酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロットなどの方法による所望の抗体を生産するハイブリドーマ細胞の選択および限定希釈法等によるクローニング、
（ｆ）  モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞を培養し、モノクローナル抗体を収穫する。
活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２の測定方法
本発明においては、プロペプチド又は活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２に対する抗体を用いて、活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２タンパク質の測定を行なうことができる。本発明の測定法は、被測定液中の抗原量（プロペプチド又は活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作成した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法を用いることができる。
抗原または抗体の固相化に当たっては、また通常、タンパク質あるいは酵素等の固相化するのに用いられる化学的結合を用いることができる。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が用いられる。
標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質が用いられる。放射性同位元素としては、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃなどが用いられる。酵素としては、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼなどが用いられる。
実施例
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。
実施例１  ヒトＸ型ｓＰＬＡ２発現ベクターの調製
ヒトＸ型ｓＰＬＡ２をコードするｃＤＮＡは、ヒト胎盤ｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法により得た。ＰＣＲには、以下のプライマーを用いた。
0004726031.tif 000002
ｈＧＧＸ−Ｓは、コザック配列およびＭｌｕＩ認識部位を有する。また、ｈＧＸ−ＡＳは、ＮｏｔＩ認識部位を有する。
ＰＣＲは、９４度で３０秒、５０度で５０秒、７２度で２分の条件で３５サイクル行った。ＰＣＲ増幅断片は、ＭｌｕＩ及びＮｏｔＩで切断し、ｐＢＳ−ＳＫ（−）に挿入した。配列を確認後、カルボキシル基末端に６個のＨｉｓ残基を付加したＸ型ｓＰＬＡ２−ＨｉｓＴａｇ体は、ｈＧＸ−Ｓプライマー及びｈＧＸ−Ｈ６ＡＳプライマー（５’−ｔｃａａｇｔｇｃｇｇｃｃｇｃｔｃａａｔｇｇｔｇａｔｇｇｔｇａｔｇａｔｇｇｔｃａｃａｃｔｔｇｇｇｃｇａｇｔｃｃｇｇｃｔ−３’：配列番号７）を用い、ＰＣＲにより構築した。ＰＣＲ増幅断片は、ＮｏｔＩ及びＸｈｏＩで切断し、Ｘ型ｓＰＬＡ２プラスミドの対応する部位で置換した。ＰＣＲで増幅した領域の配列を確認した後、そのｃＤＮＡを哺乳類細胞用発現ベクターのＳＲ−αプロモーター下流に挿入した。
実施例２  ヒトＸ型ｓＰＬＡ２−ＨｉｓＴａｇ組換え蛋白質の発現、精製及び性状解析
Ｘ型ｓＰＬＡ２−ＨｉｓＴａｇ  ｃＤＮＡを含んだプラスミド２０μｇとともに、０．５μｇのｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ抵抗遺伝子をＳＶ−４０で形質転換したヒト胎児腎臓由来２９３細胞（２９３Ｔ細胞）にＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）によりトランスフェクトした。Ｘ型ｓＰＬＡ２−ＨｉｓＴａｇを安定的に発現する２９３Ｔクローンをｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂに対する抵抗性を基に選択することにより得た。組換え蛋白質の発現は、発色性ＰＬＡ２活性測定法により検出した。本２９３Ｔクローンを１０％仔ウシ胎児血清含有培地で培養し、Ｘ型ｓＰＬＡ２−ＨｉｓＴａｇ発現タンパクを含んだ培養上清を調製した。本培養上清を、１０ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾール、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＮｉ２＋−ｃｈａｒｇｅｄ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に添加した。その後、本カラムに結合したＸ型ｓＰＬＡ２−ＨｉｓＴａｇタンパクを、５００ｍｍｏｌ／Ｌイミダゾール、０．５ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）により溶出した。
得られたＸ型ｓＰＬＡ２−ＨｉｓＴａｇタンパクを含む画分を、１ｍｍｏｌ／Ｌフッ化フェニルメチルスルホン酸を含む２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液にて透析し、ＨｉＴｒａｐ  Ｑカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に添加した。結合したタンパクを、０から０．５ｍｏｌ／Ｌまでの塩化ナトリウムの濃度勾配で溶出し、Ｘ型ｓＰＬＡ２−ＨｉｓＴａｇタンパクを含む画分を、次に逆相ＨＰＬＣカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ、５Ｃ１８  ３００ＡＲ、４．６×１５０ｍｍ、ナカライテスク社）に添加した。０．０５％トリフルオロ酢酸中で、２０から９５％までのアセトニトリルの濃度勾配で溶出し、得られた画分について発色性ＰＬＡ２活性測定を行った結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２−ＨｉｓＴａｇは４３％のアセトニトリルで溶出されていた。溶出された各画分について、１５−２５％のアクリルアミド濃度勾配ゲル（第一化学）を用いて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析した。別の実験として、精製したＸ型ｓＰＬＡ２−ＨｉｓＴａｇタンパクを、０．２ユニットのＮ−グリコシダーゼＦ（Ｅ−５００３；Ｏｘｆｏｒｄ  ＧｌｙｃｏＳｙｓｔｅｍ）、５％  ２−メルカプトエタノール、３％  ノニデットＰ−４０を含む０．５％ＳＤＳ中にて３７℃、１８時間処理した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、既報に従ってＩｍｍｏｂｉｌｉｎ−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏ．，）へ電気的にブロットした（Ｈａｎａｓａｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，７５４３−７５５０（１９９５））。ブロットされたタンパクをクーマシー  ブリリアント  ブルーで染色した後、Ｘ型ｓＰＬＡ２−ＨｉｓＴａｇタンパクに相当するバンドを切り取り、そのＮ末端のアミノ酸配列を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｏｃｉｓｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒにより解析した。
以上より得られたＣ末端にＨｉｓ残基を付加したＸ型ｓＰＬＡ２の精製タンパク標品は、ＰＬＡ２活性を有していた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果、ほとんどが１６−ｋＤａの分子量を持つ分子種であったが、一部が１４−ｋＤａの分子量を示した。Ｎ−グリコシダーゼＦ（糖タンパク質からＮ−結合型糖鎖を遊離させる酵素）で処理した結果、１６−ｋＤａの分子種が消失し、すべて１４−ｋＤａの単一の分子種に集約した。この１４−ｋＤａタンパク質のＮ末端アミノ酸配列の解析を行なった結果、ヒトＸ型ｓＰＬＡ２の活性型の配列（配列番号３記載のアミノ酸配列中、１位のＧｌｙから８位のＴｈｒまでのアミノ酸配列）と一致した。Ｘ型ｓＰＬＡ２の配列中には、７１位にＮ−結合型糖鎖付加可能な部位が存在する。従って、これらの知見は、２９３Ｔ細胞において、ｃ末端にＨｉｓ残基を付加したＸ型ｓＰＬＡ２のほとんどは、Ｎ−結合型糖鎖が付加された活性型の糖タンパク質として発現していることを示している。
実施例３  抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体の調製ならびにその性状解析
精製したヒトＸ型ｓＰＬＡ２−ＨｉｓＴａｇタンパクでウサギを免疫した後、抗血清を調製し、そのＩｇＧ画分をＨｉＴｒａｐプロテインＧ−カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製した。抗血清及び精製した抗体の特異性と力価は、以下のＥＬＩＳＡ法により測定した。精製したヒトＩＢ型、ＩＩＡ型ならびにＸ型ｓＰＬＡ２−ＨｉｓＴａｇタンパク（各１００ｎｇ）をコートした９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  プレート）を調製し、ブロック・エース溶液（大日本製薬）で非特異的吸着をブロック後、抗ヒトＸ型ｓＰＬＡ２−ＨｉｓＴａｇ抗体、抗ヒトＩＢ型ｓＰＬＡ２抗体（生化学）及び抗ヒトＩＩＡ型ｓＰＬＡ２血清（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）を加えて２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７．４）で洗浄後、さらにペロキシダーゼ結合型ヒツジ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）と反応させ、最終的に０．５ｍｇ／ｍＬのｏ−フェニレンジアミンと０．０１％（ｖ／ｖ）のＨ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．３）を添加して発色させた。発色反応を２ｍｏｌ／Ｌ硫酸を添加して終了させ、発色強度を４９２ｎｍの波長で測定した。別の試験では、プレートをＸ型ｓＰＬＡ２−ＨｉｓＴａｇあるいはＡｘｌ−ＨｉｓＴａｇ蛋白質でコートし、前述の方法で解析した。
ＰＬＡ２活性に対する抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体の阻害作用は、発光性アッセイにより行った。すなわち、精製した各ｓＰＬＡ２蛋白質（５０ｎｇ）、あるいはＩＩＤ型、Ｖ型ｓＰＬＡ２を発現するＣＨＯ細胞の培養上清を抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体とともに２時間反応させ、その後ＰＬＡ２活性を前述のとおり測定した。抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体の阻害作用は、それぞれのｓＰＬＡ２反応が３７℃でほぼ最大に到達する条件下で試験した。
このようにして得た抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体は、ＨｉｓＴａｇ付加したヒトＸ型ｓＰＬＡ２は認識するものの、ＩＢ型やＩＩＡ型ｓＰＬＡ２とは反応しなかった。また、調製した抗体は、Ｘ型ｓＰＬＡ２とは関係のないＨｉｓＴａｇ付加タンパク質とは反応しなかった。このことから、ＨｉｓＴａｇ付加部分は、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体のエピトープではないことが明らかとなった。さらに、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体による前処理によって、ＨｉｓＴａｇ付加したヒトＸ型ｓＰＬＡ２の酵素活性が濃度依存的に抑制され、１００μｇ／ｍＬの濃度では、他の５種類のｓＰＬＡ２活性には影響は認められず、Ｘ型ｓＰＬＡ２の酵素活性のみが約９０％阻害された。以上の結果から、調製した抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体は、ヒトＸ型ｓＰＬＡ２のタンパク部分に対し特異的であることが証明された。
実施例４  組換えＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質の発現、精製および性状解析
Ｘ型ｓＰＬＡ２発現プラスミドを用いて、本酵素を安定発現させたＣＨＯ細胞を前述のとおり作製した。このＣＨＯ細胞を、１０％仔ウシ胎児血清含有ダルベッコ修飾イーグル培地で培養し、細胞がコンフエントになった段階で、血清を含まないＰＭ−１０００培地（栄研、日本）に変え、細胞をさらに３日間培養した。得られた培養上清を、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を結合させたアフィニティーカラムに添加した。本カラムは、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２  ＩｇＧ（３０ｍｇ）を、常法に従ってＨｉＴｒａｐ  Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド活性化カラム（５ｍＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に結合させて調製した。カラムをリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した後、結合した蛋白質を０．１ｍｏｌ／Ｌグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．７）で溶出した。この溶出画分を、前述の逆相ＨＰＬＣカラムに添加し、０．１％トリフルオロ酢酸中、２０から４０％までのアセトニトリルの濃度勾配で分離した。３つの大きな画分を得たので、回収し、乾燥させ、０．３ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウムを含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶解した。
以上の方法により、ヒトＸ型ｓＰＬＡ２の組換えタンパク質を精製した。抗体カラムにて得られた酸溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果、１５〜１８−ｋＤａにわたる幅広い分子量を示す分子種と、１４−ｋＤａ及び１３−ｋＤａに単一のバンドを示す２種の分子種の存在が認められた。Ｎ−グリコシダーゼＦ処置により、２つの分子種（１４−ｋＤａと１３−ｋＤａ）に集約し、それらのＮ末端アミノ酸配列解析の結果、過半数を占める１３−ｋＤａの蛋白質（ＧＩＬＥＬＡＧＴ：配列番号８）はヒトＸ型ｓＰＬＡ２の推定成熟体（配列番号３に記載のアミノ酸配列中、１位のＧｌｙから１２３位のＡｓｐからなるポリペプチド）であり、一方、少数の１４−ｋＤａの蛋白質は、活性Ｘ型ｓＰＬＡ２のＮ末端に１１残基からなるペプチド（ＥＡＳＲＩＬＲＶＨＲＲ：配列番号９）が付加したプロ型（配列番号３に記載のアミノ酸配列中、−１１位のＧｌｕから１２３位のＡｓｐからなるポリペプチド）であることが判明した。したがって、１５〜１８−ｋＤａにわたって幅広い分子量を示す分子種は、これらプロ型と活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２にＮ−結合型糖鎖が付加されたＸ型ｓＰＬＡ２と考えられた。
逆相ＨＰＬＣによりさらに分離された３つの画分についてもＮ−グリコシダーゼＦ処理後にＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した結果、画分１は糖鎖非結合型の１３−ｋＤａ活性型のＸ型ｓＰＬＡ２とＮ−結合型糖鎖が付加されたプロ型と活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２の混合物であり、画分２はＮ−結合型糖鎖付加された活性型のＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質であり、画分３は糖鎖非結合型の１３−ｋＤａの活性型蛋白質であることが明らかとなった。
実施例５  ヒトＸ型ｓＰＬＡ２の基質特異性の解析
精製したヒトＸ型ｓＰＬＡ２各精製標品の基質特異性について、ｓｎ−１位にパルミチン酸を有し、ｓｎ−２位に種々の異なる脂肪酸を持つ極性基の異なる１２種類のリン脂質を市販購入し、それらを基質として試験した。各ｓＰＬＡ２タンパク質（ＩＢ型、ＩＩＡ型ｓＰＬＡ２及びヒトＸ型ｓＰＬＡ２のＨＰＬＣ３画分）の酵素活性について、１ｍｍｏｌ／Ｌの各リン脂質と３ｍｍｏｌ／Ｌのデオキシコール酸から成る混合ミセル条件下で測定した。その結果、ＨＰＬＣ画分１（プロ型と活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２の混合物）は、活性型のみから成る画分２又は画分３に比べて３０〜４０％のＰＬＡ２活性しか示さなかった。この減少は、画分１に含まれる１４−ｋＤａのプロ型酵素の存在に起因するものと考えられ、プロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２が活性型に比べて酵素活性が弱いことを示唆している。一方、糖鎖非結合型の活性型から成る画分３の活性は、Ｎ−結合型糖鎖を持つ活性型酵素である画分２の活性とほぼ同じ活性を示したことから、Ｘ型ｓＰＬＡ２に結合するＮ−結合型糖鎖はＰＬＡ２活性の発現には本質的に影響していないと考えられた。用いた１２種類のリン脂質基質の中で、Ｘ型ｓＰＬＡ２の活性型（画分２及び３）は、ｓｎ−２位にアラキドン酸を保持するホスファチジルコリンに対して最も高い活性を示した。これに対して、ＩＢ型ならびにＩＩＡ型ｓＰＬＡ２は、ｓｎ−２位にオレイン酸を保持するホスファチジルグリセロールに対して最も高い活性を示した。
本発明者らは、組換えヒトＸ型ｓＰＬＡ２タンパク質の精製の過程で、活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質のＮ末端に１１個のアミノ酸からなるプロペプチドが付加されたプロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２の存在を明らかにし、さらに基質特異性解析により、プロ型酵素が活性型に比べて酵素活性が非常に低い可能性を示した。さらに、シグナル配列の切断部位を予測するためのＳｉｇｎａｌＰコンピューター解析（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１２，３−９（１９９９））を用いて、シグナルペプチダーゼにより最も切断されやすい部位が活性蛋白質のＮ末端より前の−１１と−１２番目の間であることを示すことにより、１１アミノ酸残基がプロペプチドであることを証明した。したがって、Ｘ型ｓＰＬＡ２の最大酵素活性の発現には、サブチリジン様あるいはトリプシン様のプロテアーゼによるプロ型からのプロペプチドの切断が必須であることが示されるとともに、本プロペプチドの産生量を測定することにより、対として生じる活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２の産生量を予測することが可能となった。
実施例６  抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト大腸癌組織の免疫組織化学的解析
健常成人大腸組織ならびに大腸癌患者由来大腸癌組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ含有アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常大腸組織にはほとんど検出されず、大腸腺癌組織中の癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、大腸癌ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。
実施例７  抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト肺組織の免疫組織化学的解析
健常成人肺組織ならびに肺癌患者由来肺組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ含有アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常肺組織ではＩＩ型肺胞上皮細胞において低レベルながら検出されたが、肺癌患者由来肺組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、肺癌ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。
実施例８  抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト肝臓組織の免疫組織化学的解析
健常成人肝臓組織ならびに肝臓癌患者由来肺組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ含有アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常肝臓組織では肝小葉およびＫｕｐｆｆｅｒ星細胞において低レベルながら検出されたが、肝臓癌患者由来肝臓組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、肝臓癌ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。
実施例９  抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト胃組織の免疫組織化学的解析
健常成人胃組織ならびに胃癌患者由来肺組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ含有アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常胃組織ではほとんど検出されず、胃癌患者由来胃組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、胃癌ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。
実施例１０  抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト腎臓組織の免疫組織化学的解析
健常成人腎臓組織ならびに腎臓癌患者由来肺組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ含有アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常腎臓組織では糸球体メサンギウム細胞において低レベルながら検出されたが、腎臓癌患者由来腎臓組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、腎臓癌ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。
実施例１１  抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト胆嚢組織の免疫組織化学的解析
健常成人胆嚢組織ならびに胆嚢癌患者由来肺組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ含有アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常胆嚢組織ではほとんど検出されず、胆嚢癌患者由来胆嚢組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、胆嚢癌ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。
実施例１２  抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト前立腺組織の免疫組織化学的解析
健常成人前立腺組織ならびに前立腺癌患者由来前立腺組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ含有アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常前立腺組織ではほとんど検出されず、前立腺癌患者由来前立腺組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、前立腺癌ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。
実施例１３  抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト膵臓組織の免疫組織化学的解析
健常成人膵臓組織ならびに膵臓癌患者由来膵臓組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ含有アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常膵臓組織ではほとんど検出されず、膵臓癌患者由来膵臓組織においては、癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、膵臓癌ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。
実施例１４  抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト大脳組織の免疫組織化学的解析
健常成人大脳組織ならびにアルツハーマ患者由来大脳組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ含有アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍｌのジアミノベンジジンと０．００６％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常大脳組織にはほとんど検出されず、アルツハイマー患者由来大脳組織中の神経細胞群の一部、特に老人班（ｓｅｎｉｌｅｐｌａｑｕｅ）や神経原繊維変化部位（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｔａｎｇｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ）に強く検出された。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、アルツハイマー患者大脳ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。
実施例１５  抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体を用いたヒト肝硬変組織の免疫組織化学的解析
健常成人肝臓組織ならびに肝硬変患者由来肝臓組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ中で、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体（６μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。ＰＢＳで洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ含有アビジン−ビオチン複合体試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で処置した。洗浄後、２００μｇ／ｍｌのジアミノベンジジンと０．００６％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２を可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２陽性シグナルは、濃い茶色のジアミノベンジデンの沈着として検出した。Ｘ型ｓＰＬＡ２シグナルの中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、精製したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質（６０μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行なった。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２の陽性シグナルは、正常肝臓組織では肝小葉およびＫｕｐｆｆｅｒ星細胞において低レベルながら検出されたが、肝硬変患者由来肝臓組織では、偽小葉において顕著な発現増強が認められた。これらのシグナルは、Ｘ型ｓＰＬＡ２蛋白質の添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２に特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、肝硬変組織ではＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質の発現が顕著に高発現していることが示唆された。
実施例１６  マウスＸ型ｓＰＬＡ２をコードする遺伝子のクローニング
Ｘ型ｓＰＬＡ２のマウスホモローグを単離するために、ヒトＸ型ｓＰＬＡ２配列に基づき２種類のプライマーを設計し、マウス胸腺ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行なった。
0004726031.tif 000003
ＰＣＲは、９２℃で１分、５８℃で１分、７２℃で１分の条件で４０サイクル行なった。
次に、マウス脾臓ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて、ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）法により３’−、５’−末端のクローニングを行い、最終的に以下のプライマーを用いて、マウスＸ型ｓＰＬＡ２ｃＤＮＡのコード領域を、マウス脾臓ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより得た。
0004726031.tif 000004
マウスＸ型ｓＰＬＡ２は、Ｖａｌｅｎｔｉｎら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，４４，３１１９５−３１２０２（１９９９））が報告するように、１５１個のアミノ酸から成り（配列番号１４）、ヒトＸ型ｓＰＬＡ２に対して７０．９％の相同性を有することが推定された。マウスＸ型ｓＰＬＡ２は、ヒトＸ型ｓＰＬＡ２と同様にＮ末端に２８アミノ酸から成るプレプロペプチドを有し、Ｃ末端に延長構造を有する。しかしながら、マウスＸ型ｓＰＬＡ２は、ヒトＸ型ｓＰＬＡ２とは異なり、Ｎ−結合型糖鎖付加部位は有していなかった。
実施例１７  マウスプロ型及び活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２の酵素活性
マウスＸ型ｓＰＬＡ２の発現及び精製は、実施例４に記載の方法と同様にして行なった。
精製したプロ型及び活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２の酵素活性は、１−ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−２−ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＰＬＰＣ）を基質として測定した。図２に示すように、プロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２は、活性型に比べてわずか８％の活性しか有していなかった。プロペプチドのＣ末端にはＡｒｇが存在していることから、トリプシン様エンドプロテアーゼが切断に関与している可能性が推察された。そこで、プロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２をトリプシンで消化後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて解析した結果、トリプシン処理によって活性型への変換が確認され、それに対応して、ＰＬＡ２活性が約５倍にまで上昇した（図２）。以上の解析から、エンドプロテアーゼによるプロ型からのプロペプチド部分の切断除去が、Ｘ型ｓＰＬＡ２の最大活性発現には不可欠であることが示唆された。
実施例１８  抗Ｘ型ｓＰＬＡ２プロペプチド抗体の調製ならびにその測定系
Ｘ型ｓＰＬＡ２プロペプチドは本発明により教示されたアミノ酸配列情報に基づいてペプチド合成機により合成した。得られたプロペプチドは牛サイログロブリンと結合させ免疫原とし、ウサギを免疫し抗血清を調製した。ＩｇＧ画分はＨｉＴｒａｐプロテインＧ−カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製した。抗血清及び精製した抗体の特異性と力価は、以下のＥＬＩＳＡ法により測定した。牛血清アルブミンと結合させたＸ型ｓＰＬＡ２プロペプチドをコートした９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐプレート）を調製し、１％牛血清アルブミン溶液で非特異的吸着をブロック後、抗ヒトＸ型ｓＰＬＡ２プロペプチド抗体を加えて反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７．４）で洗浄後、さらにペルオキシダーゼ結合型ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ）と反応させ、ＴＢＭｐｌｕｓ（ＤＡＫＯ）を添加して発色させた。発色反応を０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸を添加して終了させ、発色強度を４５０ｎｍの波長で測定した。
このようにして得た抗Ｘ型ｓＰＬＡ２プロペプチド抗体は、実施例３に示したＥＬＩＳＡ系においてプロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２や活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２とは反応せず、プロペプチドのみを認識するものであった。この抗血清を用い、以下のＥＬＩＳＡ系第１法によりプロペプチドを測定した。プロペプチドをＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）を反応させ、逆相ＨＰＬＣにより分離し、ビオチン化プロペプチドを調製した。アビジンをコートした９６ウェルプレートを調製し、１％牛血清アルブミン溶液で非特異的吸着をブロック後、ビオチン化プロペプチドを加えて２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ，ｐＨ７．４）で洗浄後、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２プロペプチド抗体と測定するべき検体または標準溶液を同時に添加し、１８時間反応させた。洗浄後、さらにペルオキシダーゼ結合型ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ）と反応させ、洗浄後ＴＢＭｐｌｕｓ（ＤＡＫＯ）を添加して発色させた。発色反応を１Ｎ硫酸を添加して終了させ、発色強度を４５０ｎｍの波長で測定した。０ｎｇ／ｍＬの標準溶液で得られる吸光度Ｂ０に対する各濃度の標準溶液で得られる吸光度Ｂの百分率Ｂ／Ｂ０％を求めて標準曲線（図３）を作成し、それを用いて未知検体で得られる吸光度から求めたＢ／Ｂ０％から未知検体中に含まれるプロペプチド濃度を算出した。また、以下のＥＬＩＳＡ系第２法によってもプロペプチドを測定した。牛血清アルブミンと結合させたＸ型ｓＰＬＡ２プロペプチドをコートした９６ウェルプレートを調製し、１％牛血清アルブミン溶液で非特異的吸着をブロック後、抗Ｘ型ｓＰＬＡ２プロペプチド抗体と測定するべき検体または標準溶液を同時に添加し、１８時間反応させた。洗浄後、第１法と同様に発色反応を行い、未知検体中に含まれるプロペプチド濃度を算出した。
実施例１９  抗Ｘ型ｓＰＬＡ２プロペプチド抗体を用いたヒト大腸癌組織の免疫組織化学的解析
本試験には、抗ヒトＸ型ｓＰＬＡ２プロペプチド抗体を用いた。健常成人の大腸組織ならびに大腸癌患者由来大腸癌組織の標本は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）より購入した。組織切片のスライドは、パラフィンワックスを取り除き、０．３％Ｈ２Ｏ２を含むメタノールに３０分間反応させ内因性ペルオキシターゼを除去した後、５％の正常ヤギ血清で２０分間処置した。その後、０．１％牛血清アルブミンを含むＰＢＳ水溶液中で、抗ヒトＸ型ｓＰＬＡ２（ウサギ）プロペプチド抗体（２４μｇ／ｍＬ）と１４時間、４℃で反応させた。０．１％Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（２０）ｓｏｒｂｉｔａｎ  ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ（Ｔｗｅｅｎ２０；Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｌｔｄ．Ｏｓａｋａ）含有のＰＢＳ水溶液で洗浄後、ビオチンを結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と３０分間反応させ、ペルオキシダーゼ含有のストレプトアビジン試薬（ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を１５分間処置した。ＰＢＳ水溶液で洗浄した後、ビオチン標識タイラマイド溶液（ＤＡＫＯ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を１５分間反応させ、引き続き０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳ水溶液で充分洗浄した。さらにペルオキシターゼ標識ストレプトアビジン溶液を１５分間処理し、同様に０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳ水溶液で充分に洗浄した。洗浄後、２００μｇ／ｍＬのジアミノベンジジンと０．００６％Ｈ２Ｏ２を含む５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）緩衝液中で１０分間反応させることによりペルオキシダーゼ活性を呈色し、組織標本中のＸ型ｓＰＬＡ２プロペプチドを可視化した。また、０．４％ヘマトキシリン水溶液との反応により、細胞核を対比染色した。Ｘ型ｓＰＬＡ２プロペプチド陽性シグナルは、ジアミノベンジデンの茶褐色の沈着として検出した。プロペプチド陽性シグナルの吸収中和実験は、抗体をスライドに添加する前に、プロペプチド結合型牛血清アルブミン（３００μｇ／ｍＬ）と２時間反応させることにより行った。
その結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２プロペプチド陽性シグナルは、正常大腸組織にはほとんど検出されず、大腸腺癌組織中の癌細胞に強く検出された。これらのシグナルは、組織への抗体処理前のプロペプチド結合型牛血清アルブミンの添加で消失したことからＸ型ｓＰＬＡ２プロペプチドに特異的であることが確認された。また、これら陽性シグナルは、非免疫のウサギから調製したＩｇＧでは認められなかった。以上の結果から、大腸癌ではプロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２から活性化に伴って遊離されたプロペプチド量が顕著に増加していることが示唆された。
実施例２０  ヒト活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２に対するマウスモノクローナル抗体の調製
本発明によって教示されたアミノ酸配列情報に基づいて、ヒト活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２のＮ末端配列を含むペプチド（ＧＩＬＥＬ  ＡＧＧＧＣ：配列番号１６）を合成し、それをＫＬＨに結合させたものを免疫原としてマウスを免疫した。抗体価の上昇は、以下のＰＥＧ法により測定した。チューブにマウス抗血漿および放射性沃素標識したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質を添加し、４度で１８時間以上反応させた。反応後、１％牛ガンマーグロブリン溶液および２５％ＰＥＧ６０００溶液を添加し、遠心分離により抗体と結合して沈澱した放射活性をガンマーカウンターで測定した。
最も抗体価の上昇したマウスから脾細胞を調製し、マウスミエローマ細胞とＰＥＧ１５００の存在下で細胞融合を行った。生成した抗体産生ハイブリドーマは、以下に示すＲＩＡ法で検出した。９６ウエルプレートにヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を固相し、ブロックエース（大日本製薬）で非特異的吸着をブロック後、ハイブリドーマ培養上精を反応させ含まれるモノクローナル抗体を捕捉した。洗浄後、放射性沃素標識したＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質を反応させ、洗浄後残存した放射活性を測定した。検出したハイブリドーマを限界希釈法によるクローニングを繰り返し、活性型Ｘ型ＰＬＡ２に反応するマウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株３Ｃ１０を樹立した。該ハイブリドーマは、２０００年１２月１２日にＦＥＲＭ  ＢＰ−７３９３（受託番号）として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託されている。
３Ｃ１０抗体の特異性を上述のＰＥＧ法において検討した結果、Ｘ型ｓＰＬＡ２プロペプチドおよび配列番号３記載のアミノ酸配列中−１１位から１０位のアミノ酸配列を含むペプチドを添加した場合には結合する放射活性の減少は認められず、活性型を含むＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質を添加した場合にのみ結合の阻害が認められたことから、本抗体が活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２を特異的に認識している事が示された（図４）。
実施例２１  Ｘ型ｓＰＬＡ２プロペプチドに対するマウスモノクローナル抗体の調製
本発明によって教示されたアミノ酸配列情報に基づいて、Ｘ型ｓＰＬＡ２プロペプチドを含むペプチド（ＥＡＳＲＩ  ＬＲＶＨＲ  ＲＣ：配列番号１７）を合成し、それをＫＬＨに結合させたものを免疫原とし、マウスを免疫した。抗体価の上昇は以下のＥＬＩＳＡ法により測定した。９６ウエルプレートにヤギ抗マウスＩｇＧ抗体を固相し、ブロックエース（大日本製薬）で非特異的吸着をブロック後、マウス抗血漿を反応させ含まれる抗体を捕捉した。洗浄後、ビオチン化した配列番号３記載のアミノ酸配列中−１１位から１０位のアミノ酸配列を含むペプチドを反応させた。洗浄後、さらにペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させ、最終的にＤＡＫＯ  ＴＭＢ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ）を添加して発色させ、発色強度を４５０ｎｍの波長で測定した。
最も抗体価の上昇したマウスから脾細胞を調製し、マウスミエローマ細胞とＰＥＧ１５００の存在下で細胞融合を行った。生成した抗体産生ハイブリドーマは上述のＥＬＩＳＡ法で検出した。検出したハイブリドーマを限界希釈法によるクローニングを繰り返し、Ｘ型ｓＰＬＡ２プロペプチドに反応するマウスモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株ＨＰＸ−６Ｅ１を樹立した。該ハイブリドーマは、２００１年４月１７日にＦＥＲＭ  ＢＰ−７５４７（受託番号）として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託されている。
ＨＰＸ−６Ｅ１抗体の特異性を上述のＥＬＩＳＡ法において検討した結果、活性型を含むＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質を添加した場合には吸光度の減少は認められず、Ｘ型ｓＰＬＡ２プロペプチドを添加した場合にのみ結合の阻害が認められ、本抗体がＸ型ｓＰＬＡ２プロペプチドを特異的に認識している事が示された（図５）。
実施例２２  プロ型、活性型ヒトＸ型ｓＰＬＡ２の精製
前述のごとく確立された活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２特異モノクローナル抗体３Ｃ１０産生ハイブリドーマを大量培養後、ヌードマウス腹腔内に移植し、腹水を作製した。得られた腹水をＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  カラム（Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に添加し、洗浄後１０ｍＭ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ３．０）で溶出し、精製抗体画分を得た。
Ｘ型ｓＰＬＡ２プロペプチド特異モノクローナル抗体ＨＰＸ−６Ｅ１については、無血清培地で大量培養を行い、その培養上清をＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  カラムに直接添加し、上記条件にて溶出することにより精製抗体を得た。
得られたそれぞれの精製抗体について、ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に固相化し、３Ｃ１０抗体架橋カラム及びＨＰＸ−６Ｅ１抗体架橋カラムを作製した。
これらの３Ｃ１０抗体カラム及びＨＰＸ−６Ｅ１抗体カラムを用いて、活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２及びプロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２を単離した。本発明実施例４記載のＣＨＯ細胞発現組換えＸ型ｓＰＬＡ２蛋白質を３Ｃ１０抗体カラムあるいはＨＰＸ−６Ｅ１抗体カラムに添加し、洗浄後、０．３Ｍ  ＮａＣｌを含む０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ１２）で溶出した。溶出した画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、３Ｃ１０抗体カラム吸着画分には活性型が、またＨＰＸ−６Ｅ１抗体カラム吸着画分にはプロ型が回収された。
３Ｃ１０抗体カラム吸着画分には微量のプロ型が、またＨＰＸ−６Ｅ１抗体カラム吸着画分には微量の活性型蛋白質が混入していたが、電気泳動像の画像解析により、その比率はそれぞれ４．０％および８．７％であった。
実施例２３  活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２特異的ＥＬＩＳＡ系の確立
本発明実施例３記載の抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体から製したＩｇＧ画分を９６ウエルプレートに固相し、ブロックエース（大日本製薬）で非特異的吸着をブロック後、抗体カラムを用いて精製した活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２またはプロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２を含む溶液を反応させ、溶液中に含まれるＸ型ｓＰＬＡ２を捕捉した。洗浄後、ビオチン化した３Ｃ１０抗体を反応させた。洗浄後さらにペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させ、最終的にＤＡＫＯ  ＴＭＢ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ）を添加して発色させ、発色強度を４５０ｎｍの波長で測定した。
その結果、検体として活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２を用いた場合には強い発色が認められ、得られる吸光度は活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２濃度に比例した。しかし、プロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２を用いた場合には、活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２を抗原とした場合に比べて得られる反応性は微弱で、約５％の交叉反応性として検出されたが、前述のようにプロ型画分にはわずかに活性型の混在が認められる（８．７％）ことから、本ＥＬＩＳＡ系の活性型Ｘ型ＰＬＡ２に対する特異性はきわめて高いと判断できる（図６）。
実施例２４  プロ型ｓＰＬＡ２特異的ＥＬＩＳＡ系の確立
ＨＰＸ−６Ｅ１精製抗体を９６ウエルプレートに固相し、ブロックエース（大日本製薬）で非特異的吸着をブロック後、検体として、さまざまな濃度の活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２またはプロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２を含む溶液を反応させ、溶液中に含まれるｓＰＬＡ２を捕捉した。洗浄後、ビオチン化した抗Ｘ型ｓＰＬＡ２抗体ＩｇＧ画分を反応させた。洗浄後さらにペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）と反応させ、最終的にＤＡＫＯ  ＴＭＢ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ）を添加して発色させ、発色強度を４５０ｎｍの波長で測定した。
その結果、検体としてプロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２を用いた場合には強い発色が認められ、得られる吸光度はプロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２濃度に比例した。活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２を用いた場合には、プロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２を抗原とした場合に比べて得られる反応性は微弱で、約４％の交叉反応性として検出されたが、活性型画分にはわずかにプロ型の混在が認められる（４．０％）ことから、本ＥＬＩＳＡ系のプロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２に対する特異性はきわめて高いと判断できる（図７）。
実施例２５  血清中Ｘ型ｓＰＬＡ２検出の検討
モノクローナル抗体を用いた活性型及びプロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２特異的ＥＬＩＳＡ系と、ポリクローナル抗体を用いた型非特異的Ｘ型ｓＰＬＡ２測定系を用いて、正常者血清及び大腸癌患者血清中のＸ型ｓＰＬＡ２濃度を測定した。
正常者血清５例のＸ型ｓＰＬＡ２濃度の平均値を１としたときの大腸癌患者血清６例中のＸ型ｓＰＬＡ２濃度は図８に示すとおりであり、活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２特異的測定系では大腸癌患者群の中に高値を示す検体を検出することが出来た。これに対して、プロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２特異的測定系及び型非特異的測定系においては患者群における高値検体を検出することが出来なかった。この成績は、本発明において作製した活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２特異抗体を用いた活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２特異的測定系が、大腸癌の診断において臨床上有用である可能性を示している（図８）。
産業上の利用可能性
本発明によれば、Ｘ型ｓＰＬＡ２の一部を特異的に認識する抗体；該抗体を用いた活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２の測定方法；該抗体を含む診断用キットなどが提供される。
本発明の測定方法を用いることで、Ｘ型ｓＰＬＡ２が特異的に関与する疾病の特定が可能となるとともに、Ｘ型ｓＰＬＡ２に起因する特定疾患、特に大腸癌、肺癌、肝臓癌、胃癌、腎臓癌、胆嚢癌、前立腺癌、膵臓癌、精巣癌、卵巣癌、皮膚癌、アルツハイマー病、肝硬変の診断用キットなどが提供される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、プレプロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２、プロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２及び活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２の関係を示す図である。
図２は、マウス活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２、マウスプロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２およびトリプシン消化したプロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２の酵素活性を示す図である。図中、Ｍ、ＰおよびＰ＋Ｔは、それぞれ活性型、プロ型およびトリプシンにて消化されたプロ型Ｘ型ｓＰＬＡ２を意味する。
図３は、本発明の抗Ｘ型ｓＰＬＡ２プロペプチド抗体を用いたＥＬＩＳＡ法における標準曲線を示す。
図４は、本発明の活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２モノクローナル抗体（３Ｃ１０）の特異性を示す図である。
図５は、本発明のプロペプチドモノクローナル抗体（ＨＰＸ−６Ｅ１）の特異性を示す図である。
図６は、本発明の活性型Ｘ型ｓＰＬＡ２モノクローナル抗体（３Ｃ１０）を用いたＥＬＩＳＡ系の標準曲線性および特異性を示す図である。
図７は、本発明のプロペプチドモノクローナル抗体（ＨＰＸ−６Ｅ１）を用いたＥＬＩＳＡ系の標準曲線性および特異性を示す図である。
図８は、各種測定系を用いた大腸癌患者由来サンプルの測定結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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