(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相表面に生理活性物質が固定化されている固相担体の製造方法であって、生理活性物質及びホスホリルコリン基を有するポリマーを固相表面に塗布する工程を含み、
前記ポリマーが、第１の官能基を有する生理活性物質と、第２の官能基及びホスホリルコリン基を有するポリマーとを、第１の官能基と第２の官能基において反応させて、塗布工程前にあらかじめ得られるものである
ことを特徴とする固相担体の製造方法。
【請求項２】
前記生理活性物質の有する第１の官能基が、アミノ基である請求項１記載の固相担体の製造方法。
【請求項３】
第２の官能基が、アルデヒド基、活性エステル基、および酸無水物基から選ばれる少なくとも一つの官能基である請求項１記載の固相担体の製造方法。
【請求項４】
第２の官能基が、ｐ−ニトロフェニルエステル基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である請求項１又は３記載の固相担体の製造方法。
【請求項５】
前記ポリマーがブチルメタクリレート基を含む共重合体である請求項１〜４いずれか記載の固相担体の製造方法。
【請求項６】
前記ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である請求項１〜５いずれか記載の固相担体の製造方法。
【請求項７】
固相担体が平板状基板、マイクロプレート、マイクロチューブ、マイクロビーズ、及び微細流路を有した基板のいずれかである請求項１〜６いずれか記載の固相担体の製造方法。
【請求項８】
固相担体がプラスチック製である請求項１〜７いずれか記載の固相担体の製造方法。
【請求項９】
プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである請求項８記載の固相担体の製造方法。
【請求項１０】
前記生理活性物質が核酸、ペプチド核酸、アプタマー、オリゴペプチド、糖鎖、およびそれらの誘導体の中から選ばれる少なくとも１つであるか、又はこれらの中から少なくとも１つを含む複合体である請求項１〜９いずれか記載の固相担体の製造方法。
【請求項１１】
前記生理活性物質が核酸の誘導体である請求項１〜９いずれか記載の固相担体の製造方法。
【請求項１２】
前記核酸の誘導体がチミン多量体からなる請求項１１記載の固相担体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相表面に生理活性物質が固定化されている固相担体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
医学、生物学、分子生物学において、検査対象となる試料の中から、ある特定の核酸、タンパクなどの生理活性物質を定量する方法は大変重要な技術である。近年、試料中に微量にしか存在しない生理活性物質を定量する検査が重要になってきている。
微量の生理活性物質を測定する場合、存在検査対象となる試料には、非常に多くの種類の蛋白質やペプチドが含まれている場合が多いため、特異性の高さ（目的の物質を狭雑する他の蛋白質からどれだけ正確に区別できるか）と定量性の良さ（どれだけ微量まで正確に量れるか）、再現性の良さ（測定のばらつきがいかに抑えられるか）が特に要求される。
【０００３】
このような目的に合致する検査法として、抗原抗体反応を利用した酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）、ＤＮＡマイクロアレイ法、プロテインアレイ法などが挙げられる。これらの方法において、タンパク質、核酸、またはそれを捕捉する分子をプラスチックチューブやマイクロプレートのウェルなどの固相表面に固定化することが重要な技術のひとつである。また、固相表面への検出対象物の非特異的な
吸着は、はＳ／Ｎ比を低下させる原因となり、検出精度を低下させる（例えば、非特許文献１）。Ｓ／Ｎ比とは、試料検体から得られる本来のシグナル量（シグナル）を試料検体から得られたシグナル物質以外の部位から発生したシグナル量（ノイズ）で除した値のことをいい、Ｓ／Ｎ比が高いと検出感度が高くなる。非特異的な吸着を防止するために、吸着防止剤のコーティングが行なわれているが、これらの非特異的吸着能は充分ではなく、これに伴ない、目的の物質を捕捉する能力も低下してしまうという問題点がある。
【０００４】
これらの問題を改善する方法として、ホスホリルコリン基及び活性エステル基を有するポリマーをコーティングする方法が開発された（特許文献１）。この方法によると、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑制し、検出対象物質の捕捉能が高い、検出感度の高いバイオチップが提供されている。しかしながら、この方法では、再現性の良さ（測定のバラツキ）は解決されていなかった。
一般的に、生理活性物質と親和性を有する物質を固相表面に固定化した固相基板におけるバラツキの原因としてはいくつか考えられ、生理活性物質と親和性を有する物質の固定化反応の問題、基板表面に前記物質を固定化するために必要な官能基を導入する際の問題などが挙げられる。コーティングが均一に行なわれたとしても、生理活性物質の固定化が均一に行なわれないと、バラツキの原因になっていたため、大きな問題となっていた。
【０００５】
【非特許文献１】「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、２０００年、ｐ.５７
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／０２９０９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、検出対象物の非特異的な吸着・結合を抑制し、かつ、固相表面に簡便にかつ均一に生理活性物質を固定化することのできる固相担体の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、
（１）固相表面に生理活性物質が固定化されている固相担体の製造方法であって、生理活性物質及びホスホリルコリン基を有するポリマーを固相表面に塗布する工程を含み、前記ポリマーが、第１の官能基を有する生理活性物質と、第２の官能基及びホスホリルコリン基を有するポリマーとを、第１の官能基と第２の官能基において反応させて、塗布工程前にあらかじめ得られるものであることを特徴とする固相担体の製造方法、
（２）前記生理活性物質の有する第１の官能基が、アミノ基である（１）記載の固相担体の製造方法、
（３）第２の官能基が、アルデヒド基、活性エステル基、および酸無水物基から選ばれる少なくとも一つの官能基である（１）記載の固相担体の製造方法、
（４）第２の官能基が、ｐ−ニトロフェニルエステル基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基である（１）又は（３）記載の固相担体の製造方法、
（５）前記ポリマーがブチルメタクリレート基を含む共重合体である（１）〜（４）いずれか記載の固相担体の製造方法、
（６）前記ホスホリルコリン基が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基である（１）〜（５）いずれか記載の固相担体の製造方法、
（７）固相担体が平板状基板、マイクロプレート、マイクロチューブ、マイクロビーズ、及び微細流路を有した基板のいずれかである（１）〜（６）いずれか記載の固相担体の製造方法、
（８）固相担体がプラスチック製である（１）〜（７）いずれか記載の固相担体の製造方法、
（９）プラスチックが飽和環状ポリオレフィンである（８）記載の固相担体の製造方法、
（１０）前記生理活性物質が核酸、ペプチド核酸、アプタマー、オリゴペプチド、糖鎖、およびそれらの誘導体の中から選ばれる少なくとも１つであるか、又はこれらの中から少なくとも１つを含む複合体である（１）〜（９）いずれか記載の固相担体の製造方法、
（１１）前記生理活性物質が核酸の誘導体である（１）〜（９）いずれか記載の固相担体の製造方法、
（１２）前記核酸の誘導体がチミン多量体からなる（１１）記載の固相担体の製造方法、
である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、検出対象物の非特異的な吸着・結合を抑制し、かつ、固相表面に簡便にかつ均一に生理活性物質を固定化した固相担体が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
固相表面へ生理活性物質を固定化させようとする場合、固定化量のバラツキが非常に大きな問題となってくる。
バラツキの原因としては、生理活性物質と親和性を有する物質の固定化反応の問題、固相表面に前記物質を固定化するために必要な官能基を導入する際の問題などが挙げられる。たとえ固相表面への官能基の導入が均一に行なわれたとしても、生理活性物質の固定化が均一に行なわれにくい。
【００１０】
本発明における固相担体の製造方法は、固相表面へ生理活性物質及びホスホリルコリン基を有するポリマーを塗布することにより、固相表面への生理活性物質の固定化を均一に行ない、バラツキを低減することを目的とする。
【００１１】
本発明に使用する生理活性物質及びホスホリルコリン基を有するポリマーは、第１の官能基を有する生理活性物質と第２の官能基及びホスホリルコリン基を有するポリマーとを、第１の官能基と第２の官能基において反応させてなるポリマーであることが好ましい。
【００１２】
生理活性物質に存在する第１の官能基としては、アミノ基であることが好ましい。
【００１３】
生理活性物質に存在する第１の官能基と反応する第２の官能基としては、アミノ基、アルデヒド基、活性エステル基、酸無水物などが挙げられるが、活性エステル基であることが好ましい。
【００１４】
本発明に使用する「活性エステル基」は、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
【００１５】
このような活性エステル基としては、例えばｐ−ニトロフェニルエステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基、コハク酸イミドエステル基、フタル酸イミドエステル基、５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミドエステル基等が挙げられるが、ｐ−ニトロフェニルエステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基が好ましい。
【００１６】
本発明に使用するホスホリルコリン基は、例えば２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基 、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基、１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基 、アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基 、オクテニルホスホリルコリン基 、デセニルホスホリルコリン基等が挙げられるが、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基が好ましい。ホスホリルコリン基を有するポリマーは、生体膜（リン脂質二重層膜）類似の構造を有しているポリマーであって、生理活性物質の吸着を抑制する効果を有する（例えばIshihara K, Tsuji T, Kurosaki T, Nakabayashi N, Journal of Biomedical Materials Research, 28(2), pp.225-232, (1994)）。
【００１７】
また、本発明に使用するポリマーは、生理活性物質及びホスホリルコリン基以外に他の基を含んでもよく、ブチルメタクリレート基を含む単量体との共重合体であることが好ましい。
【００１８】
固相表面とポリマーとの結合は、共有結合、静電的相互作用、水素結合、疎水効果による結合などどのような結合様式であっても良いが、表面処理の簡易性などの観点から、基板表面とポリマーとの疎水効果によって結合していることが好ましい。
【００１９】
本発明に使用する固相担体としては、固相担体であれば特に限定しないが、平板状基板、マイクロプレート、マイクロチューブ、マイクロビーズ、微細流路形状を有した基板であることが好ましい。
【００２０】
固相担体の素材としては、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができるが、プラスチックの場合が、本発明の効果が最も発揮される。プラスチックとしては、バックグランドを抑えるために蛍光発生量の少ない熱可塑性樹脂が好ましい。たとえばポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン、環状ポリオレフィン、含フッ素樹脂等を用いることが好ましく、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィンを用いることがより好ましい。ここで飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体をさす。
【００２１】
本発明で用いる生理活性物質としては、核酸、ペプチド核酸、アプタマー、オリゴペプチド、糖鎖、およびそれらの誘導体の中から選ばれる少なくとも１つであるか、又はこれらの中から少なくとも１つを含む複合体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００２２】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、実施例の範囲に限定されるものではない。
【００２３】
《実施例１》
（生理活性物質及びホスホリルコリン基を有するポリマーの作製）
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン／ブチルメタクリレート／p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（各基は、モル％で２１：７６：３）の１０．０重量％エタノール溶液１０００μｌと５’末端にアミノ基を導入した鎖長５０ｂｐのオリゴＤＮＡ（ATAGAAGTTTGTCCATTTGTAAACTCCCGGATTGCGCTCCCTCCCGCCTT（配列番号１））１０μＭの水溶液２８３μｌを室温で３時間反応させた。
（プレートへのポリマーの導入）
前記で得られたポリマーをエタノールで０．３重量％に希釈した溶液をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（ポリスチレン製、住友ベークライト製ＭＳ−８４９６Ｆ）のウェル中に浸漬することにより、ウェル内に生理活性物質かつホスホリルコリン基を有するポリマーを導入した。
【００２４】
（比較例１）
ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（ポリスチレン製、住友ベークライト製ＭＳ−８４９６Ｆ）のウェル中に  ２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン／ブチルメタクリレート／p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（各基は、モル％で２１：７６：３）の０．３重量％エタノール溶液を浸漬することにより、ウェル内に活性エステルとホスホリルコリン基を有するポリマーを導入した。次に、ウェル内に実施例１と同様の５’末端にアミノ基を導入した鎖長５０ｂｐのオリゴＤＮＡ１０μＭの水溶液を注入し、８０℃で３時間反応させた。
【００２５】
（ブロッキング、ハイブリダイゼーション）
実施例１および比較例１のプレートのウェル中に０．１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を５分間浸漬することによって活性エステルを不活性化させ、ブロッキング処理を行なった。次いで純水で洗浄した後、ハイブリダイゼーション反応を６５℃で３時間行なった。ハイブリダイゼーション反応は、５’末端にビオチンを導入した鎖長５０ｂｐのオリゴＤＮＡ（AAGGCGGGAGGGAGCGCAATCCGGGAGTTTACAAATGGACAAACTTCTAT（配列番号２））を５×ＳＳＣ、０．３％ＳＤＳの緩衝液に溶かした溶液で行なった。ハイブリダイゼーション終了後、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、１０分浸漬した。その後、０．２×ＳＳＣ、０．０２×ＳＳＣの順に洗浄を行なった。次いで、基板を遠心することにより乾燥した。
【００２６】
（発色反応）
ハイブリダイゼーション済みのプレートにＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（アマシャムバイオサイエンス（株）ＲＰＮ１２３１）の原液を１０００倍希釈したリン酸バッファー（ｐＨ７．４）をアプライし、３７℃で３０分浸漬した。リン酸バッファーで洗浄後、ペルオキシダーゼ発色キット（住友ベークライト（株）製ＭＬ−１１２０Ｔ）を使用することにより、ウェル内に残存しているペルオキシダーゼを発色させた。プレートリーダーにより、その吸光度を測定した。吸収波長は４５０ｎｍであった。
【００２７】
実施例１、比較例１で得られた、吸光値、ＣＶ値を表１に示す。ＣＶ値は、９６ウェルの各吸光値の平均値を９６ウェルの各吸光値の標準偏差で除した値であり、シグナルのバラツキを表すものである。
実施例１では比較例１と比較して、ＣＶ値の大幅な低下が観察された。また、吸光シグナル値においても若干の増加が観察された。この結果は、本発明の効果を支持するものであった。
【００２８】
【表１】
0004706502.tif 000002
【配列表】
0004706502000001.app