(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
接着依存性細胞を培養容器内で単層培養する際に、個々の細胞像を観察測定して細胞集団の増殖能力を評価する細胞増殖能評価方法であって、
細胞が培養容器の底面に付着した後からその容器底面上での細胞の伸展が停止するまでの細胞接着期において、個々の細胞の培養容器底面に対する投影面積の時間変化を表す細胞の伸展速度を増殖能力関連指標として測定し、
前記伸展速度に基づいて、前記細胞接着期より後の期間における細胞の増殖速度を予測することを特徴とする細胞増殖能評価方法。
【請求項２】
接着依存性細胞を培養容器内で単層培養する際に、個々の細胞像を観察測定して細胞集団の増殖能力を評価する細胞増殖能評価方法であって、
細胞が培養容器内で第１回目の細胞分裂を終了した後の細胞増殖期において、個々の細胞の定常状態での培養容器底面に対する投影面積を増殖能力関連指標として測定し、
前記定常状態での投影面積に基づいて、当該投影面積を測定した後の期間における細胞の増殖速度を予測することを特徴とする細胞増殖能評価方法。
【請求項３】
前記細胞を培養容器に接種する工程と、培養容器内の培養状態を撮影する工程と、その培養状態の画像から個々の細胞の画像を抽出する工程とを備え、
前記個々の細胞の画像から細胞の増殖能力関連指標を測定することを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の細胞増殖能評価方法。
【請求項４】
前記細胞が培養容器内で第１回目の細胞分裂を終了してから後の細胞増殖期において、前記観察測定されている個々の細胞に接触して存在する接触細胞数を増殖能力関連指標として測定し、前記接触細胞数に基づいて、当該接触細胞数を測定した後の期間における細胞の増殖速度を予測することを特徴とする請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞増殖能評価方法。
【請求項５】
接着依存性細胞を培養容器内で単層培養する際に、個々の細胞像を観察測定して細胞集団の増殖能力を評価するための細胞増殖能評価装置であって、
前記細胞が接種される培養容器を収容するインキュベータと、前記培養容器内の培養状態を撮影する撮影装置と、前記撮影装置に接続されたコンピュータとを備え、
前記撮影装置は、細胞が培養容器の底面に付着した後からその容器底面上での細胞の伸展が停止するまでの細胞接着期における培養状態を撮影し、
前記コンピュータは、撮影された画像を解析して前記細胞接着期における個々の細胞の培養容器底面に対する投影面積の時間変化を表す細胞の伸展速度を増殖能力関連指標として測定し、前記伸展速度に基づいて、前記細胞接着期より後の期間における細胞の増殖速度を予測することを特徴とする細胞増殖能評価装置。
【請求項６】
接着依存性細胞を培養容器内で単層培養する際に、個々の細胞像を観察測定して細胞集団の増殖能力を評価するための細胞増殖能評価装置であって、
前記細胞が接種される培養容器を収容するインキュベータと、前記培養容器内の培養状態を撮影する撮影装置と、前記撮影装置に接続されたコンピュータとを備え、
前記撮影装置は、細胞が培養容器内で第１回目の細胞分裂を終了した後の細胞増殖期における培養状態を撮影し、
前記コンピュータは、撮影された画像を解析して前記細胞増殖期における個々の細胞の定常状態での培養容器底面に対する投影面積を増殖能力関連指標として測定し、前記定常状態での投影面積に基づいて、当該投影面積を測定した後の期間における細胞の増殖速度を予測することを特徴とする細胞増殖能評価装置。
【請求項７】
接着依存性細胞を培養容器内で単層培養する際に、個々の細胞像を観察測定して細胞集団の増殖能力を評価するための細胞増殖能評価プログラムであって、
前記プログラムは、
前記培養容器内の培養状態を撮影する撮影装置に、細胞が培養容器の底面に付着した後からその容器底面上での細胞の伸展が停止するまでの細胞接着期における培養状態を撮影する工程を実行させ、
前記撮影装置に接続されたコンピュータに、撮影された画像を解析して前記細胞接着期における個々の細胞の培養容器底面に対する投影面積の時間変化を表す細胞の伸展速度を増殖能力関連指標として測定する工程を実行させるとともに、
前記コンピュータに、前記伸展速度に基づいて、前記細胞接着期より後の期間における細胞の増殖速度を予測する工程を実行させることを特徴とする細胞増殖能評価プログラム。
【請求項８】
接着依存性細胞を培養容器内で単層培養する際に、個々の細胞像を観察測定して細胞集団の増殖能力を評価するための細胞増殖能評価プログラムであって、
前記プログラムは、
前記培養容器内の培養状態を撮影する撮影装置に、細胞が培養容器内で第１回目の細胞分裂を終了した後の細胞増殖期における培養状態を撮影する工程を実行させ、
前記撮影装置に接続されたコンピュータに、撮影された画像を解析して前記細胞増殖期における個々の細胞の定常状態での培養容器底面に対する投影面積を増殖能力関連指標として測定する工程を実行させるとともに、
前記コンピュータに、前記定常状態での投影面積に基づいて、当該投影面積を測定した後の期間における細胞の増殖速度を予測する工程を実行させる
ことを特徴とする細胞増殖能評価プログラム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞の増殖能力を評価する方法、装置及びプログラムに関し、詳しくは、培養容器内での接着依存性細胞の単層培養時に、接着依存性細胞の増殖能力を評価する方法、装置及びプログラムに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、この種の細胞増殖能評価方法としては、例えば、培養容器内の接着依存性細胞の生存細胞数を経時的にモニタリングした結果を用いて、その細胞の標準的な増殖曲線を作製し、その増殖曲線に基づいて培養細胞の増殖能力が推定及び評価されていた。前記生存細胞数としては、例えば、培養容器の底面に接着している接着細胞の画像を取り込んで画像処理することによって求めたり、或いは前記接着細胞をトリプシン等により剥離させた後、血球計算盤やコールターカウンター等を用いて計測したりして求められる。そして、所定時間毎に前記生存細胞数を計測して記録することによって、その細胞の標準的な増殖曲線が求められていた。
【０００３】
一方、3Ｈ−チミジン等の標識化細胞増殖マーカーの細胞内への取り込みを調べることによって増殖曲線を作製することも行われていた。また、細胞内に色素を取り込ませてその細胞集団を染色し、フローサイトメータ等で分析した結果を用いて、例えば細胞分裂や細胞周期等の研究も行われており、得られた結果を用いてその観察測定されている集団の細胞の増殖能力が推定及び評価されていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、前記従来の生存細胞数の計測結果を利用した細胞増殖能評価方法では、培養容器内の細胞の増殖能力が、生存細胞数を計測することによる単なる統計学的解析処理のみによって評価されていた。このため、この生存細胞数の計測時以降に予想される生存細胞数の推移は、細胞の状態をリアルタイムに反映させたものではなく、予め調査された標準的な増殖曲線に従うものであるという仮定のもとにその増殖能力の評価が行われていた。従って、この方法では、現実に起こりつつある現象を的確に予測することは困難であった。
【０００５】
一方、前記従来のマーカーや色素を利用した細胞増殖能評価方法では、細胞の状態を間接的に定量化することができるように構成されたマーカーや色素が利用されていることから、細胞の状態を一部反映させることは可能である。しかしながら、この方法では、細胞に対して直接又は間接的にダメージを与えたり破壊したりしてしまうという問題点があった。
【０００６】
この発明は、上記のような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、個々の接着依存性細胞を無襲撃、非破壊で形態観察測定することによって、その細胞集団全体の増殖能力を容易かつ的確に把握することができるように構成された細胞増殖能評価方法、装置及びプログラムを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記の目的を達成するために、請求項１及び請求項２に記載の発明の細胞増殖能評価方法は、接着依存性細胞を培養容器内で単層培養する際に、個々の細胞像を観察測定して細胞集団の増殖能力を評価するための細胞増殖能評価方法である。
特に、請求項１に記載の発明は、細胞が培養容器の底面に付着した後からその容器底面上での細胞の伸展が停止するまでの細胞接着期において、個々の細胞の培養容器底面に対する投影面積の時間変化を表す細胞の伸展速度を増殖能力関連指標として測定し、前記伸展速度に基づいて、前記細胞接着期より後の期間における細胞の増殖速度を予測することを特徴とするものである。
特に、請求項２に記載の発明は、細胞が培養容器内で第１回目の細胞分裂を終了した後の細胞増殖期において、個々の細胞の定常状態での培養容器底面に対する投影面積を増殖能力関連指標として測定し、前記定常状態での投影面積に基づいて、当該投影面積を測定した後の期間における細胞の増殖速度を予測することを特徴とするものである。
【０００８】
請求項３に記載の発明の細胞増殖能評価方法は、請求項１又は請求項２に記載の発明において、前記細胞を培養容器に接種する工程と、培養容器内の培養状態を撮影する工程とを備え、前記個々の細胞の画像から細胞の増殖能力関連指標を演算することを特徴とするものである。
【００１０】
請求項４に記載の発明の細胞増殖能評価方法は、請求項１から請求項３のいずれかに記載の発明において、前記細胞が培養容器内で第１回目の細胞分裂を終了してから後の細胞増殖期において、前記観察測定されている個々の細胞に接触して存在する接触細胞数を増殖能力関連指標として測定し、前記接触細胞数に基づいて、当該接触細胞数を測定した後の期間における細胞の増殖速度を予測することを特徴とするものである。
【００１２】
請求項５及び請求項６に記載の発明の細胞増殖能評価装置は、接着依存性細胞を培養容器内で単層培養する際に、個々の細胞像を観察測定して細胞集団の増殖能力を評価するための細胞増殖能評価装置であって、前記細胞が接種される培養容器を収容するインキュベータと、前記培養容器内の培養状態を撮影する撮影装置と、前記撮影装置に接続されたコンピュータとを備える。
特に、請求項５に記載の発明は、前記撮影装置は、細胞が培養容器の底面に付着した後からその容器底面上での細胞の伸展が停止するまでの細胞接着期における培養状態を撮影し、前記コンピュータは、撮影された画像を解析して前記細胞接着期における個々の細胞の培養容器底面に対する投影面積の時間変化を表す細胞の伸展速度を増殖能力関連指標として測定し、前記伸展速度に基づいて、前記細胞接着期より後の期間における細胞の増殖速度を予測することを特徴とするものである。
特に、請求項６に記載の発明は、前記撮影装置は、細胞が培養容器内で第１回目の細胞分裂を終了した後の細胞増殖期における培養状態を撮影し、前記コンピュータは、撮影された画像を解析して前記細胞増殖期における個々の細胞の定常状態での培養容器底面に対する投影面積を増殖能力関連指標として測定し、前記定常状態での投影面積に基づいて、当該投影面積を測定した後の期間における細胞の増殖速度を予測することを特徴とするものである。
【００１３】
請求項７及び請求項８に記載の発明の細胞増殖能評価プログラムは、接着依存性細胞を培養容器内で単層培養する際に、個々の細胞像を観察測定して細胞集団の増殖能力を評価するための細胞増殖能評価プログラムである。
特に、請求項７に記載の発明は、前記培養容器内の培養状態を撮影する撮影装置に、細胞が培養容器の底面に付着した後からその容器底面上での細胞の伸展が停止するまでの細胞接着期における培養状態を撮影する工程を実行させ、前記撮影装置に接続されたコンピュータに、撮影された画像を解析して前記細胞接着期における個々の細胞の培養容器底面に対する投影面積の時間変化を表す細胞の伸展速度を増殖能力関連指標として測定する工程を実行させるとともに、前記コンピュータに、前記伸展速度に基づいて、前記細胞接着期より後の期間における細胞の増殖速度を予測する工程を実行させることを特徴とするものである。
特に、請求項８に記載の発明は、前記培養容器内の培養状態を撮影する撮影装置に、細胞が培養容器内で第１回目の細胞分裂を終了した後の細胞増殖期における培養状態を撮影する工程を実行させ、前記撮影装置に接続されたコンピュータに、撮影された画像を解析して前記細胞増殖期における個々の細胞の定常状態での培養容器底面に対する投影面積を増殖能力関連指標として測定する工程を実行させるとともに、前記コンピュータに、前記定常状態での投影面積に基づいて、当該投影面積を測定した後の期間における細胞の増殖速度を予測する工程を実行させることを特徴とするものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、この発明の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。
本実施形態の細胞増殖能評価方法は、図２に模式的に示すように、接着依存性細胞（以下、細胞と記載する）１１を培養液１２を満たした培養容器１３内で単層培養する際に、その細胞集団全体の増殖能力を評価して把握するためのものである。さらに、この細胞増殖能評価方法は、培養容器１３内で培養されている個々の細胞像を形態観察測定した個別細胞観察測定結果を用いて、その培養容器１３内の細胞集団全体の増殖能力を定量評価するものである。
【００１５】
前記細胞１１は、培養容器１３の底面に直接又は細胞外マトリックスを介して接着することができるとともに、その容器１３の底面上で単層培養することができる性質を有する。この細胞１１の増殖能力は、図１０に模式的に示される細胞増殖能評価装置１００により評価される。評価装置１００は、培養容器１３を収容するインキュベータ１０１、培養容器１３に所定の組成を有するガスを供給するガス供給装置１０２、培養容器１３内の培養状態を撮影する撮影装置１０３、及び撮影装置１０３に接続されたパーソナルコンピュータ１０４を含む。
【００１６】
インキュベータ１０１は細胞１１の成長に適した環境を提供する。撮影装置１０３は培養容器１３の下方に配置され、培養容器１３の底に接着した細胞１１の画像を含む原画像をパーソナルコンピュータ１０４に供給する。撮影装置１０３は好ましくはＣＣＤカメラである。パーソナルコンピュータ１０４は、好ましくは、ＣＰＵと、主記憶装置１０５ａと、補助記憶装置１０５ｂと、ディスプレイ１０６とを有する画像処理装置である。
【００１７】
図１１に示すように、コンピュータ１０４は、撮影装置１０３から原画像を受け取り（Ｓ１００）、その原画像を解析して、個々の細胞１１の画像を抽出する（Ｓ１１０）。コンピュータ１０４は、抽出された細胞像から、細胞１１の増殖能力に関連する指標（増殖能力関連指標）を算出する（Ｓ１２０）。コンピュータ１０４はその指標を用いて細胞集団の増殖能力を評価する（Ｓ１３０）。コンピュータ１０４は、評価結果をディスプレイ１０６に表示する（Ｓ１４０）。
【００１８】
コンピュータ１０４は、図１１の処理方法が記載されたコンピュータプログラムを実行する。コンピュータプログラムは、フロッピーディスクやＣＤ−ＲＯＭ等の可搬型記録媒体１０７やネットワーク接続された他の計算機の主記憶装置や補助記憶装置等に格納されて提供される。
【００１９】
コンピュータプログラムは、可搬型記録媒体１０７から補助記憶装置１０５ｂにコピー又はインストールされ、その後、主記憶装置１０５ａにロードされる。或いは、コンピュータプログラムは可搬型記録媒体１０７から主記憶装置１０５ａに直接ロードされ実行される。
【００２０】
図１（ａ）に模式的に示すように、細胞１１の単層培養過程は、細胞接着期２１、細胞誘導期２２及び細胞増殖期２３からなる３種のステージに分類される。
細胞接着期２１は、培養液１２とともに培養容器１３内に接種された細胞１１が、その容器１３底面に接触（付着）した後から、その容器１３底面上で平面的な細胞伸展を終了するまでの期間ｔａである。このステージの細胞１１は、図２（ａ）に示すように接種直後には球状のまま培養液１２中で浮遊していた状態から、図２（ｂ）に示されるように細胞１１の下端面を培養容器１３の底面上に接触させて付着した後、図２（ｃ）に示されるようにその付着位置で徐々に接着面積及び投影面積Ｓａを増大させて扁平形状（平板状）に形を変化させる。そして、前記培養容器１３底面上における投影面積Ｓａの増大が停止された時点で細胞接着期２１は終了する。
【００２１】
このステージの細胞１１は、接種するための細胞懸濁液を調製する際に加えられたダメージの程度に応じてその機能回復に時間を要することから、通常の細胞分裂とはやや異なる行動様式をとる。また、生存不能となる細胞も見られる。前記ダメージとしては、例えば、採取された組織から細胞１１を単離するための単離操作や、培養容器１３の底面から細胞１１を剥離させるための剥離操作を行うための酵素（プロテイナーゼ等）処理によるダメージや、凍結保存された細胞１１を培養温度に戻すための温度変化ダメージ等である。そして、前記生存不能細胞１１は培養容器１３の底面に接着せずに死滅し、生存細胞１１はダメージの程度にほぼ比例するように所定時間経過後に培養容器１３の底面に接着して生存する。
【００２２】
細胞誘導期２２は、前記細胞接着期２１の終了後から第１回目の細胞分裂を完了するまでの期間である。このステージの細胞１１は、前記培養容器１３の底面に接着した後の新しい環境に順応するための期間であり、図２（ｄ）及び（ｅ）に示される細胞分裂直前の僅かな期間以外は、図２（ｃ）に示される状態（培養容器１３底面上に扁平形状に接着した状態）のままで生存し、投影面積Ｓａの増大はほとんど見られず、投影面積Ｓａ＝Ｓａ1のままで推移する。一方、前記細胞分裂直前の僅かな期間では、細胞１１はほぼ球状となり、投影面積Ｓａは一時的に減少する。そして、この細胞誘導期２２の細胞（親細胞）１１は、所定のラグタイムｔLの後に、図２（ｆ）に示されるような正常な第１回目の細胞分裂を完了して２個の娘細胞１１ａとなる。
【００２３】
細胞増殖期２３は、前記細胞誘導期２２の終了後（第１回目の細胞分裂終了後）以降の期間である。このステージの細胞１１は、図２（ｆ）に示されるように、その細胞１１（１１ａ）の周囲に隣接する娘細胞１１ａ等の接触細胞がほとんどない状況では、ほぼ一定の世代時間ｔｇ毎に細胞分裂を繰り返しながら増殖するが、前記接触細胞数の増大に伴って世代時間ｔｇが徐々に長くなる。そして、培養容器１３の底面がコンフルエント状態（培養容器１３底面全体が細胞１１によって単層に覆われている状態）になったところで、すなわち前記細胞１１の周囲が接触細胞により完全に覆われたときに細胞分裂を停止する。図１（ａ）に示されるように、この細胞増殖期２３における各細胞１１の投影面積Ｓａは、細胞分裂の直後に急激に増大した後、所定時間ほぼ一定の投影面積Ｓａ＝Ｓａ’を維持し、次の細胞分裂の直前に急激に減少するという周期を繰り返す。
【００２４】
培養容器１３内の個々の細胞１１は、好ましくはＣＣＤカメラ１０３を用いて継続的に撮影されモニタリングされる。撮影された原画像には、細胞１１以外の像が含まれるので、培養容器１３の底面に接着した個々の細胞１１の投影像やその投影像周縁の輪郭を明確化させるための適切な画像処理が行われる。原画像の画像処理により、細胞像が抽出される。好ましくは、抽出された細胞像の画素数や輪郭等を用いて、モニタリングされている個々の細胞１１の投影面積Ｓａが算出される。さらに、抽出された細胞像から、個々の細胞１１に隣接する接触細胞数を計測するように構成するのが好ましい。算出結果すなわち投影面積Ｓａ及び／又は接触細胞数が、細胞１１の増殖能力関連指標（個別細胞観察測定結果）として、その細胞集団の増殖能力を評価するために利用される。
【００２５】
前記個々の細胞１１の投影面積Ｓａをモニタリングする場合には、図１（ａ）に示されるように、その投影面積Ｓａの経時変化から細胞分裂等の細胞１１の状態を容易に把握することができる。すなわち、培養容器１３内に接種された細胞１１は、細胞接着期２１の極初期にはほぼ球状であることから投影面積Ｓａが極めて小さいが、時間経過に伴って培養容器１３の底面上で徐々に投影面積Ｓａを増大させながら扁平形状になる。そして、細胞接着期２１の終了時には、細胞１１の変形は停止し、前記投影面積Ｓａの増大は停止される。
【００２６】
次に、前記細胞１１は、細胞誘導期２２においてほぼ一定の投影面積Ｓａ＝Ｓａ1のまま接着後第１回目の細胞分裂のための準備（細胞周期におけるＤＮＡ合成準備期（Ｇ1期）からＤＮＡ合成期（Ｓ期））を行った後、分裂準備期（Ｇ2期）に至る段階で有糸分裂を行うために再び球状に形を変える。このＧ2期は、図１（ａ）に示される細胞誘導期２２の終了直前における投影面積Ｓａが急激に低下する期間である。
【００２７】
続いて、前記細胞１１の投影面積Ｓａは、分裂期（Ｍ期）において一旦極小値（図１（ａ）に示される細胞誘導期２２と細胞増殖期２３との境界部）をとった後、細胞増殖期２３に進行して再び増大する。このとき、前記細胞（親細胞）１１は、細胞分裂を行って複数（通常は２個）の娘細胞１１ａとなった後、培養容器１３底面上のほぼそのままの位置で側部を互いに接触させながら前記底面上に接着し（図２（ｆ）参照）、上記細胞接着期２１の場合と同様にその投影面積Ｓａを徐々に増大させる。
【００２８】
続いて、この細胞１１（１１ａ）は、上記細胞誘導期２２の場合と同様に、ほぼ一定の投影面積Ｓａ＝Ｓａ’のまま接着後第２回目の細胞分裂のための準備を行った後、再び球状に変形して有糸分裂を行う。この細胞１１（１１ａ）は細胞増殖期２３において、コンフルエント状態になるまでほぼ同様な一連の細胞分裂過程を複数回繰り返しながら増殖する。
【００２９】
そして、この培養容器１３内に接着している細胞集団全体の増殖能力は、前記個別細胞観察測定結果としての細胞接着期２１における個々の細胞１１の投影面積Ｓａの変化（増加速度）を表す伸展速度ｒｓに大きく依存しており、それをこの細胞集団全体の増殖能力を評価するための増殖能力関連指標として利用することができる。前記個々の細胞１１の伸展速度ｒｓは、細胞接着期２１における投影面積Ｓａの最大値と最小値との差を培養時間ｔａで割った値であり、図１（ａ）に示されるグラフの細胞接着期２１における傾き（平均値）を示している。
【００３０】
さらに、この細胞集団全体の増殖能力は、前記個別細胞観察測定結果としての細胞増殖期２３における個々の細胞１１の接触細胞数に大きく依存しており、これをこの細胞集団全体の増殖能力を評価するための増殖能力関連指標として利用することができる。すなわち、この細胞１１は、単層培養を行う性質を有するとともに、細胞分裂後の娘細胞１１ａ同士が互いに接触しながら生存する性質を有していることから、細胞分裂後の娘細胞１１ａが接着を許容するための余剰スペースがなくなった時点で、接触阻害により細胞分裂を停止するようになっている。そして、前記接触阻害の程度は、個々の細胞１１の接触細胞数とほぼ比例して高められる。
【００３１】
また、この細胞集団全体の増殖能力は、前記個別細胞観察測定結果としての細胞増殖期２３における個々の細胞１１の投影面積Ｓａ＝Ｓａ’に大きく依存しており、この細胞集団全体の細胞寿命を考慮した増殖能力を評価するための増殖能力関連指標として利用することができる。すなわち、この細胞１１は、単層培養を行う性質を有するとともに、分化後からの細胞分裂回数と直接的にリンクした有限の細胞寿命を持つ性質を有していることから、その細胞寿命の限界に達した細胞１１は増殖能力がなくなる。前記細胞寿命の程度は、同種において細胞株にほとんど関係がなく、個々の細胞１１の投影面積Ｓａ’に対してほぼ負に比例している。
【００３２】
なお、前記投影面積Ｓａ’は、細胞増殖期２３における個々の細胞１１の定常状態（投影面積Ｓａが一定の状態（Ｇ0、Ｇ1及びＳ期））における投影面積を表し、通常は細胞１１の分裂回数の増加に伴って僅かずつ増大する傾向があるが、培養容器１３内に接種されてからコンフルエント状態になるまでの間における増大幅はあまり大きくはない。従って、前記投影面積Ｓａ’としては、第１回目の細胞分裂以降の投影面積Ｓａ’の平均値を利用するのが好ましいが、第２回目の細胞分裂直前の投影面積Ｓａ’を利用しても構わない。この第２回目の細胞分裂直前の投影面積Ｓａ’を利用した場合には、培養の早い段階でその細胞集団の増殖能力を評価することができて大変便利である。
【００３３】
これらの増殖能力の評価においては、予め試験的に同種の細胞１１について同じ条件で個別細胞観察測定結果をモニタリングしながら、その細胞集団全体の増殖曲線を作製したり、世代時間ｔｇ、所定時間ｔまでの細胞分裂割合Ｎｔ／Ｎｏ、見かけの倍加時間ｔｄ、平均の比増殖速度μ、増殖度Ｙ（ｔ）、平均の細胞分裂回数Ｎｄ等の細胞集団全体の増殖能力について調べた予備試験結果を求めた後、それら予備試験結果と比較する形で実際の評価が行われるように構成される。さらに、評価結果の誤差を低減させるために、任意に選ばれた複数の細胞１１について個々に観察測定した個別細胞観察測定結果を用いて平均化するのが最も好ましい。また、上記複数の個別細胞観察測定結果（例えば伸展速度ｒｓ、接触細胞数及び投影面積Ｓａ’）を組み合わせて評価するとさらに的確な評価を行うことができる。
【００３４】
前記見かけの倍加時間ｔｄは、隣接する細胞１１同士が接触しない細胞接種濃度Ｘｏ（cells／ｃｍ2）で培養容器１３内に細胞１１を接種した後、対数増殖を行っているときの細胞接着濃度Ｘａ（cells／ｃｍ2）変化を経時的にモニタリングすることによって平均の比増殖速度μを測定し、その測定結果から算出される。前記増殖度Ｙ（ｔ）は、ある細胞接種濃度Ｘｏで細胞１１を接種して培養する際に、細胞増殖期２３の所定の培養時間ｔにおける細胞接着濃度Ｘａtを計測し、その細胞接着濃度Ｘａtに対する前記細胞接種濃度Ｘｏの割合としての接着率（Ｘａt／Ｘｏ）を算出することによって決定される。
【００３５】
前記平均の細胞分裂回数Ｎｄは、ある時点での細胞接着濃度Ｘａが細胞接種濃度Ｘｏに対して下記数式（１）に示される関係を有していることから、前記ＸａとＸｏとを下記数式（２）に代入することによって求められる。
【００３６】
Ｘａ＝Ｘｏ×２Nd      ……（１）
Ｎｄ＝ｌｎ（Ｘａ／Ｘｏ）／ｌｎ２      ……（２）
また、この細胞増殖能評価方法は予備試験結果のデータ種類を増やすことによって、前記増殖能力の評価に加えて、細胞集団全体の代謝活性、細胞寿命、ストレスに対する修復能力、分化の程度、移植用組織に使用される場合の品質（患部修復速度）等を評価することもできる。
【００３７】
上記実施形態によって発揮される効果について以下に記載する。
・  本実施形態の細胞増殖能評価方法は、培養容器１３内で培養されている個々の細胞像を形態観察測定した個別細胞観察測定結果を用いて、その培養容器１３内の細胞集団全体の増殖能力を定量評価するように構成されている。このため、個々の細胞１１を無襲撃（無染色）、非破壊で形態観察測定することによって、その細胞集団全体の増殖能力を容易かつ的確に把握することができる。
【００３８】
・  この細胞増殖能評価方法は、細胞１１を培養容器１３に接種する工程と、培養容器１３内の培養状態を撮影する工程と、その培養状態の画像から個々の細胞１１の画像を抽出する工程と、その個々の細胞１１の画像から増殖能力関連指標を演算する工程と、その指標を用いて細胞集団全体の増殖能力を評価する工程とを備えている。このため、細胞１１を培養容器１３に接種した時点からその培養状態をモニタリングすることによって、細胞接着期２１において観察測定された個々の細胞１１の個別細胞観察測定結果を細胞集団全体の増殖能力の評価に反映させることが容易である。従って、細胞集団全体の増殖能力をより一層的確に把握することができるうえ、細胞誘導期２２や細胞増殖期２３における個別細胞観察測定結果と組合わせることにより、細胞集団全体の増殖能力を極めて的確に評価することが可能となる。
【００３９】
・  細胞接着期２１における個々の細胞１１の伸展速度ｒｓを個別細胞観察測定結果とすることによって、培養初期において細胞１１の増殖能力を容易に把握することができる。細胞増殖期２３における個々の細胞１１の接触細胞数を個別細胞観察測定結果とすることによって、培養後期の細胞１１の増殖能力を容易に推定することができる。細胞増殖期２３における個々の細胞１１の投影面積Ｓａ’を個別細胞観察測定結果とすることによって、測定時以降の細胞１１の増殖能力（細胞寿命）をさらに容易に推定することができる。
【００４０】
・  本実施形態の細胞増殖能評価装置１００及び細胞増殖能評価プログラムは、前記細胞増殖能評価方法に従って培養容器１３内の細胞集団全体の増殖能力を定量評価するように構成されている。このため、前記細胞増殖能評価方法と同様に、個々の細胞１１を無襲撃（無染色）、非破壊で形態観察測定することによって、その細胞集団全体の増殖能力を容易かつ的確に把握することができる。
【００４１】
【実施例】
以下、上記実施形態を具体化した実施例について説明する。
＜試験条件＞
細胞：マウス ＮＩＨ ３Ｔ３ p-7 cl-3 IFO 50019 細胞株（（財）発酵研究所）
培養液：ＤＭＥＭ＋１０％ウシ新生児血清（シグマ社）
培養容器：２５ｃｍ2  Ｔ−フラスコ（ファルコン社）
培養液量：約１０ｍｌ（前記Ｔ−フラスコに４ｍｍ深さ）
培養温度：３７℃（湿度１００％）
通気条件：エアー（５％ＣＯ2）、５ｍｌ／分（通気流量）
細胞接種濃度ＸO：１．０×１０4 cells／ｃｍ2
撮影装置：ＣＣＤカメラ（東京電子工業社）
撮影範囲：９００μｍ×６８０μｍ（６．１×１０-3ｃｍ2）
画像処理装置：パーソナルコンピュータ（ＩＢＭ社）
画像処理１：個々の細胞の投影面積Ｓａの定量化
原画像（１０分毎に取り込み）→背景分離処理→ルックアップテーブル変換→平滑化処理→二値化抽出処理→孤立点除去処理→クロージング処理→穴埋め処理→エリア抽出処理→画素数計測
画像処理２：撮影範囲内の全細胞数を計測した後、その計測値から培養容器内の細胞接着濃度Ｘａ（cells／ｃｍ2）を算出
＜試験１：培養初期における１細胞の観察測定＞
前記細胞を培養容器内に接種した後、容器底面に付着した１個の細胞について、撮影装置１０３を用いて撮影し、画像処理装置１０４を用いて画像処理１を行い、投影面積Ｓａを経時的にモニタリング（測定）した。結果を図１（ｂ）に示す。なお、図１（ｂ）に示される培養時間は、前記細胞が培養容器の底面に付着した後からの経過時間を示す。
【００４２】
図１（ｂ）の結果及び原画像を目視した結果より、培養初期には細胞は球状で比較的投影面積Ｓａが小さかったが、その後徐々に培養容器底面上で細胞が伸展を開始したことが確認された。そして、培養時間が約６時間後までは投影面積Ｓａはほぼ直線的に増加したことも確認された。さらに、培養時間が約６〜８時間において投影面積Ｓａはほぼ一定値をとり、培養時間が約８〜９時間の間に急激に投影面積Ｓａが減少して細胞分裂を行ったことも確認された。
【００４３】
従って、この細胞は、付着後約０〜６時間までが細胞接着期２１であり、約６〜９時間までが細胞誘導期２２であり、９時間後以降が細胞増殖期２３であったことが確認された。以上より、細胞接着期２１の期間ｔａは約６時間、ラグタイムｔLは約３時間、伸展速度ｒｓは約６２μｍ2／ｈであった。
【００４４】
＜試験２：細胞集団の増殖曲線の作製＞
前記試験１の観察測定時及び観察測定後において、その培養容器内に接種された細胞集団についてさらに継続して追跡調査を行うことによってその増殖能力を評価した。すなわち、前記培養容器内に接種された細胞集団全体を上記画像処理２の処理方法により観察測定し、培養容器の底面に接着している細胞についてその細胞接着濃度Ｘａを経時的にモニタリング（測定）することによって、その細胞集団の増殖曲線を作製した。結果を図３に示す。
【００４５】
その結果、この細胞集団は、細胞接種後２０〜６０時間の期間にほぼ対数増殖を行ったことが示された。さらに、その期間における増殖曲線（グラフ）の傾きから、この細胞集団の見かけの倍加時間ｔｄは約１１．２時間であったことも示された。このため、伸展速度ｒｓが約６２μｍ2／ｈのときの細胞集団は、図３に示される増殖曲線に従って増殖することが予想される。さらに、この細胞集団が対数増殖を行うときの見かけの倍加時間ｔｄは約１１．２時間となることも予想される。
【００４６】
＜試験３：培養中後期における個々の細胞の観察測定＞
前記試験１の観察測定後の培養中後期（２０〜６０時間）において、その培養容器内の個々の細胞（ｎ＝８０）について、画像処理１の処理方法により観察測定することによって世代時間ｔｇを測定し、培養時間に対してグラフ上にプロットした。結果を図４に示す。図４の結果より、培養時間の進行に伴って個々の細胞の世代時間ｔｇが徐々に長くなることが示された。
【００４７】
さらに、前記各細胞の原画像を適時目視することによって接触細胞数を計測し、前記世代時間ｔｇに対してグラフ上にプロットした。結果を図５に示す。図５の結果より、接触細胞数の増加に伴って世代時間ｔｇが長くなることが確認された。従って、この世代時間ｔｇの延長は、接触阻害を主な原因とするものであることが推定される。
【００４８】
＜試験４：トリプシンを利用した増殖能力の評価試験Ｉ＞
培養容器内で培養されていた細胞を１分間のトリプシン処理によってその底面から剥離させて継代培養用の細胞懸濁液を調製した後、その細胞懸濁液を別の新しい培養容器内に接種した（１分間トリプシン処理細胞）。同様に１５分間のトリプシン処理を行った後に継代培養した細胞を準備した（１５分間トリプシン処理細胞）。
【００４９】
これら培養容器内の個々の細胞（それぞれｎ＝９）について、撮影装置１０３と画像処理１を用いて、各細胞の投影面積Ｓａを経時的にモニタリングして伸展速度ｒｓの平均値を算出した。その結果、１分間トリプシン処理細胞の伸展速度ｒｓは約７２μｍ2／ｈであり、１５分間トリプシン処理細胞の伸展速度ｒｓは約２４μｍ2／ｈであった。
【００５０】
一方、前記１分間トリプシン処理細胞及び１５分間トリプシン処理細胞について、前記伸展速度ｒｓの算出と同時並行して、画像処理２の処理方法により細胞接着濃度Ｘａを経時的にモニタリングした。そして、各細胞集団の増殖曲線を作製した。結果を図６に示す。図６の結果より、個々の細胞を観察測定した個別細胞観察測定結果としての伸展速度ｒｓが高い（１分間トリプシン処理細胞）ほど、その細胞集団全体の増殖能力は高められることが確認された。従って、培養初期における個々の細胞の伸展速度ｒｓが、その細胞集団全体の増殖能力に大きな影響を与えることが確認された。
【００５１】
＜試験５：トリプシンを利用した増殖能力の評価試験II＞
培養容器内で培養されていた細胞を適宜異なるトリプシン処理時間で処理した後、各培養容器底面から細胞を剥離させて継代培養用の細胞懸濁液を調製した後、各細胞懸濁液を別の新しい培養容器内に接種した。これら各培養容器内の個々の細胞（それぞれｎ＝８）について、撮影装置１０３と画像処理１を用いて投影面積Ｓａを経時的にモニタリングし、伸展速度ｒｓの平均値を算出した。
【００５２】
さらに、前記各培養容器内の個々の細胞について、細胞分裂回数（０回又は１回）を接種２４時間後までモニタリングした。そして、各培養容器内の解析細胞数Ｎｏに対する２４時間以内の分裂細胞数Ｎ24の割合（細胞分裂割合；Ｎ24／Ｎｏ）を求めた。結果を図７に示す。
【００５３】
図７の結果より、伸展速度ｒｓの上昇に伴って細胞分裂割合Ｎ24／Ｎｏが増大することが示された。従って、培養初期における個々の細胞の伸展速度ｒｓを求めることにより、その細胞集団全体の増殖能力を容易に評価することができることが確認された。
【００５４】
＜試験６：一連の継代培養中に対する細胞増殖能の評価試験＞
＜試験条件＞
細胞：ヒト角化細胞（正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞株、正常ヒト成人乳房表皮角化細胞成人細胞株）（クラボウ社）
培養液：角化細胞用無血清培地（HuMedia-KG2，クラボウ社）
その他の条件は前記試験条件と同じ
培養容器内で培養されている個々の細胞（ｎ＝２０）について、撮影装置１０３と画像処理１を用いて、細胞増殖期２３における各細胞の投影面積Ｓａを経時的にモニタリングして平均の投影面積Ｓａ’を算出した。この操作を、ドナーの年齢の異なる上記２種類の細胞株を用いて行うとともに、継代培養操作を数回行うことによって長期的にモニタリングした。結果を図８に示す。なお、図８において、▲、●、■、◆及び▼は連続して継代培養された新生児由来の細胞株を示し、△、○、□、◇及び▽は連続して継代培養された２０歳の成人由来の細胞株を示しており、これらは継代培養する度毎にマークを変更して示してある。
【００５５】
図８の結果より、平均の投影面積Ｓａ’は、第１回目の継代培養時には徐々に減少していったが、第２回目の継代培養以降は徐々に増加していくことがわかった。前記第１回目の継代培養時における投影面積Ｓａ’の減少は、凍結保存されていた細胞を解凍する際に加えられたダメージによるストレス状態から解放され、その細胞本来の投影面積Ｓａ’になったためであると推定される。
【００５６】
一方、前記投影面積Ｓａ’の算出と同時並行して、画像処理２の処理方法により細胞接着濃度Ｘａを経時的にモニタリングし、その細胞集団の平均の比増殖速度μ及び平均の細胞分裂回数Ｎｄを算出した。結果を図８に示す。図８の結果より、どちらの細胞株も同様な結果を示し、培養時間の増大に伴って平均の細胞分裂回数Ｎｄ及び細胞の投影面積Ｓａ’が増大し、細胞集団の平均の比増殖速度μは減少した。
【００５７】
さらに、前記細胞の投影面積Ｓａ’と、細胞集団の平均の比増殖速度μとの関係を整理したグラフを図９に示す。なお、図９において、●は前記新生児由来の細胞株を示し、○は前記成人由来の細胞株を示す。
【００５８】
図９の結果より、細胞集団の平均の比増殖速度μに対する細胞の投影面積Ｓａ’は負に比例し、かつ細胞株によらずほぼ同一の履歴を追うことが確認された。従って、ある時点での細胞の投影面積Ｓａ’を測定することにより、その細胞が将来どのように増殖していくかを予測することができることが確認された。さらに、その結果は細胞株の差異にかかわらずほぼ同一の経過をたどることから、細胞の投影面積Ｓａ’の測定により細胞寿命の程度を容易に予測することができることも確認された。
【００５９】
なお、上記実施形態は、次のように変更して具体化することも可能である。
・  上記実施形態では、投影面積Ｓａ’に基づいて細胞増殖能の評価を行ったが、投影面積Ｓａ’の代わりに細胞１１の接着面積を利用してもよい。この場合、接着面積の測定には、細胞１１の接着面やその接着面周辺の輪郭を明確に撮像することのできる走査型共焦点レーザ顕微鏡をＣＣＤカメラの代わりに使用することが好ましい。
【００６０】
・  細胞接着期２１及び細胞誘導期２２をモニタリングせずに、細胞増殖期２３のみをモニタリングすることにより、細胞集団の増殖能力を評価するように構成してもよい。このように構成した場合でも、細胞増殖期２３における接触細胞数により接触阻害の状況を把握することができる。或いは、細胞増殖期２３における投影面積Ｓａ’により、世代時間ｔｇ、見かけの倍加時間ｔｄ、平均の比増殖速度μ等を求めることが可能である。
【００６１】
さらに、前記実施形態より把握できる技術的思想について以下に記載する。
（あ）  前記細胞像は、ＣＣＤカメラを用いて前記細胞を含む培養状態を撮影した画像を画像処理することにより、個々の細胞の画像を抽出したものであることを特徴とする細胞増殖能評価方法。
このように構成した場合、個々の接着依存性細胞を無襲撃、非破壊で極めて容易に形態観察測定することができる。
【００６２】
（か）  前記演算工程は、前記観察測定されている個々の細胞の培養容器底面に対する投影面積を演算する工程を含み、前記指標は前記投影面積を含むことを特徴とする細胞増殖能評価方法。
【００６３】
（き）  前記投影面積は、前記細胞が培養容器内で第１回目の細胞分裂を終了してから後の細胞増殖期における個々の細胞の投影面積を含むことを特徴とする前記（か）に記載の細胞増殖能評価方法。
【００６４】
（く）  前記演算工程は、前記観察測定されている個々の細胞に接触して存在する接触細胞数を演算する工程を含み、前記指標は前記接触細胞数を含むことを特徴とする細胞増殖能評価方法。
【００６５】
（け）  前記接触細胞数は、前記細胞が培養容器内で第１回目の細胞分裂を終了してから後の細胞増殖期における個々の細胞の接触細胞数を含むことを特徴とする前記（く）に記載の細胞増殖能評価方法。
【００６６】
（こ）  前記撮影工程は所定時間毎に前記培養状態を撮影することを含むことを特徴とする細胞増殖能評価方法。
（さ）  前記演算工程は、個々の細胞の培養容器底面に対する投影面積を所定時間毎に演算する工程を含み、前記評価工程は、前記投影面積の時間変化に基づいて前記細胞集団の増殖能力を評価する工程を含むことを特徴とする前記（こ）に記載の細胞増殖能評価方法。
【００６７】
（し）  前記投影面積の時間変化は、前記細胞が培養容器の底面に付着した後からその容器底面上での細胞の伸展が停止するまでの細胞接着期における個々の細胞の投影面積の変化速度を含むことを特徴とする前記（さ）に記載の細胞増殖能評価方法。
【００６８】
（す）  前記演算工程は、前記観察測定されている個々の細胞に接触して存在する接触細胞数を所定時間毎に演算し、前記評価工程は前記接触細胞数の時間変化に基づいて評価する工程を含むことを特徴とする前記（こ）に記載の細胞増殖能評価方法。
【００６９】
（た）  前記演算回路は、個々の細胞の培養容器底面に対する投影面積を演算し、前記指標は前記個々の細胞の投影面積を含むことを特徴とする細胞増殖能評価装置。
【００７０】
（ち）  前記指標は、前記細胞が培養容器内で第１回目の細胞分裂を終了してから後の細胞増殖期における個々の細胞の投影面積を含むことを特徴とする前記（た）に記載の細胞増殖能評価装置。
【００７１】
（つ）  前記演算回路は、前記観察測定されている個々の細胞に接触して存在する接触細胞数を演算し、前記指標は前記接触細胞数を含むことを特徴とする細胞増殖能評価装置。
【００７２】
（て）  前記指標は、前記細胞が培養容器内で第１回目の細胞分裂を終了してから後の細胞増殖期における個々の細胞の接触細胞数を含むことを特徴とする前記（つ）に記載の細胞増殖能評価装置。
【００７３】
（と）  前記撮影装置は前記培養状態を所定時間毎に撮影することを特徴とする細胞増殖能評価装置。
（な）  前記演算回路は、前記観察測定されている個々の細胞の培養容器底面に対する投影面積を所定時間毎に演算し、前記評価回路は、前記投影面積の時間変化に基づいて前記細胞集団の増殖能力を評価することを特徴とする前記（と）に記載の細胞増殖能評価装置。
【００７４】
（に）  前記指標は、前記細胞が培養容器の底面に付着した後からその容器底面上での細胞の伸展が停止するまでの細胞接着期における個々の細胞の投影面積の変化速度を含むことを特徴とする前記（な）に記載の細胞増殖能評価装置。
【００７５】
（ぬ）  前記演算回路は、前記観察測定されている個々の細胞に接触して存在する接触細胞数を所定時間毎に演算し、前記評価回路は、前記接触細胞数の時間変化に基づいて評価することを特徴とする前記（と）に記載の細胞増殖能評価装置。
【００７６】
（ね）  前記撮影装置は前記培養容器の下方に配置され、前記培養容器の底に接着した細胞を撮影するＣＣＤカメラであることを特徴とする細胞増殖能評価装置。
【００７７】
（の）  前記コンピュータは、さらに、評価結果を表示するディスプレイを含むことを特徴とする細胞増殖能評価装置。
（ま）  接着依存性細胞を培養容器内で単層培養する際に、その細胞集団の増殖能力を評価するための細胞増殖能評価プログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、前記プログラムは、コンピュータに、前記培養容器内の培養状態の画像を解析して個々の細胞の画像を抽出する工程と、その個々の細胞の画像から細胞の増殖能力関連指標を演算する工程と、その指標を用いて前記細胞集団の増殖能力を評価する工程とを実行させることを特徴とする記録媒体。このように構成した場合、個々の接着依存性細胞を無襲撃、非破壊で形態観察測定することによって、その細胞集団全体の増殖能力を容易かつ的確に把握することができる。
【００７８】
【発明の効果】
以上詳述したように、各請求項に記載の発明の培養細胞評価方法によれば、個々の接着依存性細胞を無襲撃、非破壊で形態観察測定することによって、その細胞集団全体の増殖能力を容易かつ的確に把握することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  （ａ）は実施形態の個々の細胞の投影面積の推移を模式的に示すグラフ、（ｂ）は実施例の試験１の結果を示すグラフ。
【図２】  （ａ）及び（ｂ）はいずれも、実施形態の培養容器内の細胞の状態を模式的に示す断面図、（ｃ）から（ｆ）は同じく部分拡大断面図。
【図３】  実施例の試験２の結果を示す片対数グラフ。
【図４】  実施例の試験３の結果を示すグラフ。
【図５】  実施例の試験３の結果を示すグラフ。
【図６】  実施例の試験４の結果を示す片対数グラフ。
【図７】  実施例の試験５の結果を示すグラフ。
【図８】  実施例の試験６の結果を示すグラフ。
【図９】  実施例の試験６の結果を示すグラフ。
【図１０】  実施形態の細胞増殖能評価装置を示す概略図。
【図１１】  実施形態の細胞増殖能評価方法の流れを示すフローチャート。
【符号の説明】
１１…接着依存性細胞、１１ａ…接着依存性細胞としての娘細胞、１３…培養容器、２１…細胞接着期、２３…細胞増殖期、１００・・・細胞増殖能評価装置、１０１・・・インキュベータ、１０３・・・撮影装置としてのＣＣＤカメラ、１０４・・・コンピュータとしてのパーソナルコンピュータ、Ｓａ…投影面積、Ｓａ’…投影面積としての細胞増殖期における投影面積、ｒｓ…伸展速度。
【図１】
0004841770.tif 000002
【図２】
0004841770.tif 000003
【図３】
0004841770.tif 000004
【図４】
0004841770.tif 000005
【図５】
0004841770.tif 000006
【図６】
0004841770.tif 000007
【図７】
0004841770.tif 000008
【図８】
0004841770.tif 000009
【図９】
0004841770.tif 000010
【図１０】
0004841770.tif 000011
【図１１】
0004841770.tif 000012