(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エチル・tert−ブチルエーテル（ＥＴＢＥ）および／またはメチル・tert−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）および／またはtert−アミルメチルエーテル（ＴＡＭＥ）を含む水性廃液の処理方法であって、ＥＴＢＥおよび／またはＭＴＢＥおよび／またはＴＡＭＥの濃度を低下させるために、少なくとも1種のバクテリアとして、ゴルドニア・テレ（Gordonia terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４を増殖基質の存在下に好気性条件下で増殖させ、その廃液中に含まれるＥＴＢＥおよび／またはＭＴＢＥおよび／またはＴＡＭＥを当該基質の存在下にそこで産生された当該バクテリアのバイオマスにより分解することを特徴とする方法。
【請求項２】
水性廃液が必須の要件としてＭＴＢＥを含み、かつ、該廃液に含まれるＭＴＢＥを、ブルコールデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）ＣＩＰ Ｉ−２０５２、アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６１、マイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６２、アースロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）ＡＴＣＣ５３５９６、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）ＡＴＣＣ５３５９５、シュードモナス・スタッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＡＴＣＣ５３６０２およびマイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）ＪＯＢ５ＡＴＣＣ２９６７８からなる群より選択される少なくとも1種のバクテリアを接合様式または会合様式でそこに導入することにより分解するものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
水性廃液が必須の要件としてＴＡＭＥを含み、かつ、該廃液に含まれるＴＡＭＥを、バクテリアであるブルコールデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）ＣＩＰ Ｉ−２０５２またはアルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６１またはマイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６２を接合様式または会合様式でそこに導入することにより分解するものである請求項１記載の方法。
【請求項４】
ゴルドニア・テレ（Gordonia terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４がゴルドニア・テレ（Gordonia terrae）ＣＩＰ Ｉ−１８８９から選択されるものである請求項１から３の１つに記載の方法。
【請求項５】
ブルコールデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）ＣＩＰ Ｉ−２０５２またはアルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６１またはマイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６２が、tert−ブチルアルコールおよび／またはtert−アミルアルコールおよび少なくとも1種のコバルト塩の存在下で増殖する請求項２から４の１つに記載の方法。
【請求項６】
コバルト塩が塩化コバルトである請求項５記載の方法。
【請求項７】
tert−ブチルおよび／またはtert−アミルアルコールの濃度が廃液に対し０.０１から１０ｇ／Ｌであり、コバルト塩濃度が０.０１から４ｍｇ／Ｌである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
増殖基質がエタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、単糖類、二糖類、ジブチルエーテル、エチルブチルエーテル、エチル・tert−ブチルエーテル、アセトン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、グリセロール、およびトリプトファンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物であり、その濃度が分解されるエーテルの濃度に少なくとも等しい請求項１から７の１つに記載の方法。
【請求項９】
増殖基質がエタノールおよび／またはアセトンである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
廃液のＭＴＢＥ、ＥＴＢＥおよびＴＡＭＥ濃度が、多くとも５ｇ／Ｌである請求項１から９の１つに記載の方法。
【請求項１１】
廃液のＭＴＢＥ、ＥＴＢＥおよびＴＡＭＥ濃度が、０.０１ｍｇ／Ｌから４００ｍｇ／Ｌである請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
当該バクテリアが適当な容量のバイオフィルター上で成長し、該エーテルを含む廃液が、空気または酸素の存在下に０.１から２Ｌ／Ｌバイオフィルター／時間の供給速度でバイオフィルターに導入され、そしてＭＴＢＥおよび／またはＴＡＭＥの少なくとも一部が取り除かれた廃液が取り出される請求項１から１１の１つに記載の方法。
【請求項１３】
水性廃液が帯水層であり、そこに当該バクテリアを、空気または酸素の存在下、当該帯水層にあけた穿孔から増殖基質とともに接種物として注入する請求項１から１１の１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は水性廃液中に含まれる少なくとも１種のエーテル、特に、エチル・tert−ブチルエーテル（ＥＴＢＥ）および／またはメチル・tert−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）および／またはtert−アミルメチルエーテル（ＴＡＭＥ）を分解し得る微生物によるバクテリア処理方法に関する。
【０００２】
本発明は特に水処理工業に関係する。
【０００３】
【従来の技術】
メチル・tert−ブチルエーテル（以下、ＭＴＢＥという）ならびにtert−アミルメチルエーテル（以下、ＴＡＭＥという）は取分け無鉛ガソリンのオクタン価を上げる目的で酸素化添加物として使用し得るエーテルであることが知られている。ＭＴＢＥ、ＴＡＭＥまたはエチル・tert−ブチルエーテル（以下、ＥＴＢＥという）などの添加物使用量の増加は、特にガソリンと混合した大容量の貯蔵と輸送を必要とする。従って、これらの化合物が事故により漏出した場合、土壌および地下水または表層水の汚染を引き起こす性質のあることを知る必要がある。ＭＴＢＥはメタノールとイソブテンとの縮合により製造されるエーテルであり、ＴＡＭＥはメタノールとイソペンテンとの縮合により製造されるエーテルであり、またＥＴＢＥはエタノールとイソブテンとの縮合により製造されるエーテルである。エーテル結合ならびに三級炭素を含んでなるこれら化合物の構造はそれ自体、環境に存在する微生物による生物分解に非常に抵抗するものである。
【０００４】
ガソリンの添加物として使用されるこれらの異なるエーテル類の生物分解に関する文献は、これら化合物の代謝が、大多数の場合に、環境での存在が一般的ではないような、あらかじめ選択したバクテリアまたは混合培養物の使用を必要とすることを示している（J.P. Salanitro et al., Demonstration of the enhanced MTBE bioremeidation (EMB) in situ process（in situ過程での増強されたＭＴＢＥバイオリメディエーション（ＥＭＢ）の証明）, In Situ and On-Site Bioremediation, 19-22 April 1999, San Diego, Ca.）。
【０００５】
本出願人は以前にバクテリア・ゴルドニア・テレ（Gordonia terrae）（以前はゴルドナ・テレ（Gordona terrae））ＣＩＰ Ｉ−１８８９を単離し、このバクテリアが一部ＥＴＢＥを炭素源およびエネルギー源として使用し増殖し得ることを証明した。ＥＴＢＥはtert−ブチルアルコール（ＴＢＡ）の段階に分解され、これが次いで、本出願人により単離された別のバクテリア・ブルコールデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）（以前はシュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia））ＣＩＰ Ｉ−２０５２（特許出願ＦＲ２ ７６６ ４７８）により、または同様に本出願人により単離されたバクテリア・アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６１またはバクテリア・マイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６２により、炭素源およびエネルギー源として使用される。ＭＴＢＥまたはＴＡＭＥを分解し、それを炭素源およびエネルギー源として使用できないバクテリア・ゴルドニア・テレＣＩＰ Ｉ−１８８９は、例えば、ＥＴＢＥまたはエタノールなどの適当な増殖基質の存在下に培養するとき、共代謝によりこれらの化合物を分解し得ることが判明した（特許出願ＦＲ２ ７８７ ７８３）。バクテリア・ゴルドニア・テレＣＩＰ Ｉ−１８８９をエタノール上、かつ、ＭＴＢＥおよび／またはＴＡＭＥの存在下に、バクテリア・ブルコールデリア・セパシアＣＩＰ Ｉ−２０５２との混合培養物中で培養するなら、ＭＴＢＥおよびＴＡＭＥはそれぞれＴＢＡとtert−アミルアルコールに分解され、それらがブルコールデリア・セパシアＣＩＰ Ｉ−２０５２により（特許出願ＦＲ２ ７８７ ７８３）またはバクテリア・アルカリゲネス・エスピーＣＩＰ Ｉ−２５６１もしくはバクテリア・マイコバクテリウム・エスピーＣＩＰ Ｉ−２５６２により、炭素源およびエネルギー源として使用され得る。
【０００６】
しかしながら、バクテリア・ゴルドニア・テレＣＩＰ Ｉ−１８８９はその増殖期において潜伏期をもつという欠陥を有する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的の一つは先行技術の上記欠陥を修復することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は汚染水の処理にこれら新規なバクテリアを使用する好気的方法を提供することであって、溶液中に含まれるまたはより一般的には少なくとも１個のアルコキシ基、取分けtert−アルコキシ基を有する化合物類に含まれるＭＴＢＥ、ＥＴＢＥまたはＴＡＭＥを分解することを目的とする。これを実施することで、これらの産物により、またはこれら酸素化産物を含む可能性のある燃料により汚染された都市廃水または工場廃水または帯水層（aquifers）中の残存エーテル濃度が顕著に低下する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、より詳しくは、少なくとも１種のエーテル、好ましくは、エチル・tert−ブチルエーテル（ＥＴＢＥ）および／またはメチル・tert−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）および／またはtert−アミルメチルエーテル（ＴＡＭＥ）を含む水性廃液を処理する方法に関し、当該エーテル濃度を低下させることを目的とし、少なくとも１種のバクテリア・ゴルドニア・テレ（Gordonia terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４を増殖基質の存在下に好気性条件下で増殖させ、その廃液中に含まれる上記エーテルを当該基質の存在下にそこで産生された当該バクテリアのバイオマスにより分解することを特徴とする。
【００１０】
本方法の態様によると、該水性廃液が必須の要件としてＭＴＢＥを含有する場合、該廃液に含まれるＭＴＢＥを、ブルコールデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）ＣＩＰ Ｉ−２０５２、アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６１、マイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６２、アースロバクター・グロビフォルミス（Arthrobacter globiformis）ＡＴＣＣ５３５９６、バシラス・コアギュランス（Bacillus coagulans）ＡＴＣＣ５３５９５、シュードモナス・スタッツェリ（Pseudomonas stutzeri）ＡＴＣＣ５３６０２およびマイコバクテリウム・バッカエ（Mycobacterium vaccae）ＪＯＢ５ＡＴＣＣ２９６７８からなる群より選択される少なくとも1種のバクテリアを接合（joint）様式または会合（dissociated）様式でそこに導入することにより分解することができる。
【００１１】
この方式に使用する場合、該tert−ブチルエーテルはtert−ブチルアルコール（ＴＢＡ）に分解され、また、ＴＢＡの二酸化炭素および水への略完全な分解は、このように産生されたＴＢＡ上で増殖する能力を有する上記のバクテリアを添加することにより実施する。これらの菌株、ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４、ブルコールデリア・セパシア（B. cepacia）ＣＩＰ Ｉ−２０５２、アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６１およびマイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６２は、本出願人によりパスツール研究所（ＣＮＣＭ，２５、ドクター・ルー通り（rue du Docteur-Roux）、 Ｆ−７５７２４、パリ、セデックス（ＣＥＤＥＸ））に寄託されている。ＴＢＡ上で増殖し得る他のバクテリアも本発明の範囲に包含し得る。
【００１２】
本方法の他の態様によると、廃液が必須の要件としてＴＡＭＥを含有する場合、該廃液に含まれるＴＡＭＥは、バクテリア・ブルコールデリア・セパシア（B. cepacia）ＣＩＰ Ｉ−２０５２またはバクテリア・アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６１またはバクテリア・マイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６２を接合様式または会合様式でそこに導入することにより分解することができる。これらのバクテリアはＴＡＭＥの分解産物であるtert−アミルアルコール（ＴＡＡ）上でも増殖し、それを二酸化炭素と水に略完全に分解する。ＴＡＡ上で増殖し得る他のバクテリアも本発明の範囲に包含し得る。
【００１３】
バクテリア・ブルコールデリア・セパシア（B. cepacia）ＣＩＰ Ｉ−２０５２またはバクテリア・アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６１またはバクテリア・マイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６２の増殖改善を可能とする他の態様によると、該バクテリアは、ＴＢＡおよび／またはＴＡＡおよび少なくとも１種のコバルト塩、好ましくは塩化コバルトの存在下に増殖することが可能である。これらの条件下、ＴＢＡおよび／またはＴＡＡの濃度は廃液あたり０.０１から１０ｇ／Ｌであり、コバルト塩の濃度は０.０１から４ｍｇ／Ｌである。
【００１４】
本発明の態様によると、ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−１８８９から選択されるバクテリア・ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４は、一般に、例えば、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｎ−ペンタノール、単糖類、二糖類、ジブチルエーテル、エチルブチルエーテル、エチル・tert−ブチルエーテル、アセトン、エチレングリコール、ジエチレングリコール、グリセロール、およびトリプトンからなる群より選択される少なくとも１種の化合物である増殖基質に接種する。
【００１５】
炭素および水素に基づく他の増殖基質が提供され得る。
【００１６】
各バクテリアは所定のタイプの基質存在下に異なった増殖をする可能性がある。卓越した結果は増殖基質としてエタノールおよび／またはアセトンを使用して得られた。
【００１７】
この特定の増殖基質は検討されるバクテリアに対するこの基質の毒性閾値を超えない濃度、例えば、分解すべきエーテルの濃度に少なくとも等しい濃度で、有利には廃液に対し０.１ｍｇ／Ｌから５５００ｍｇ／Ｌの濃度で導入することができる。
【００１８】
このように、留意すべきことは、本発明によるバクテリアを増殖基質ＥＴＢＥの存在下、すなわち、ＥＴＢＥを含む処理しようとする水性廃液の存在下に培養する場合、ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−１８８９を使用した場合に観察されたのとは逆に、該バクテリアは増殖時に潜伏期を提示しないことである。
【００１９】
浄化すべき水性廃液に含まれるＭＴＢＥおよび／またはＴＡＭＥの分解に疑問のある場合、留意すべきことは、本発明によるバクテリアが、増殖基質が存在しなくとも、これらのエーテルの分解を開始し得ると証明されたことである。しかしながら、上記の増殖基質、例えば、エタノールまたはイソプロパノールなどを使用することは好ましい。
【００２０】
このバクテリア・ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４はエーテル類の分解に対し本質的（constitutive）であると言われる。すなわち、エーテル類を最初に攻撃する役割を有する酵素が本質的様式で産生され、使用するためにあらかじめ誘導する必要がない。エタノールなどの増殖基質の存在下に増殖するかかる菌株は、混合培養物の範囲内で、塩化コバルトの存在下に増殖するバクテリア・ブルコールデリア・セパシア（B. cepacia）ＣＩＰ Ｉ−２０５２とまたはバクテリア・アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６１またはバクテリア・マイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６２と有利に組合され、エーテル類ＥＴＢＥ、ＭＴＢＥおよび／またはＴＡＭＥを分解する。これらの条件下、エーテルの分解が直ちに始まり、生成するＴＢＡおよび／またはＴＡＡが次いで略完全に、かつ極めて急速に分解される。
【００２１】
該バクテリアは広範囲のエーテル濃度に耐性である。好ましくは、水性廃液は、そのエーテル濃度、特にＭＴＢＥまたはＴＡＭＥまたはＥＴＢＥの濃度が、多くとも５,０００ｍｇ／Ｌに等しく、特に０.０１ｍｇ／Ｌから４００ｍｇ／Ｌのものが分解され得る。それにもかかわらず、最適条件下で操作するために、バクテリア株の分解能力に合わせて廃液を希釈することがさらに可能である。
【００２２】
水性廃液が汚染物質としてエチル・tert−ブチルエーテル（ＥＴＢＥ）を含む場合には、このＥＴＢＥを少なくとも一部増殖基質として用いること、従ってエネルギー源として使用することができる。
【００２３】
これらバクテリアの使用による本方法は、取分け、ＭＴＢＥ、ＴＡＭＥおよび／またはＥＴＢＥにより汚染された廃液の処理に適用可能であり、その結果、排出物中のＭＴＢＥまたはＴＡＭＥまたはＥＴＢＥの濃度が施行されている規制に合致することになる。
【００２４】
増殖基質は生物分解に必要とされるエネルギー供給を確実にする濃度、例えば、分解すべきエーテルの濃度に少なくとも等しい濃度で、連続的にまたは断続的に供給することができる。
【００２５】
ＭＴＢＥまたはＥＴＢＥまたはＴＡＭＥにより汚染された廃液処理のためのこれらバクテリアの使用は、以下の方法で実施し得る；例えば、バクテリアを無機質または有機質の支持体上に固定したバイオフィルターとするか、またはバクテリアを汚水プラントスラッジに接種物として加える。
【００２６】
これらのバクテリアは汚染された帯水層のその位置での処理（in situ）のために、該帯水層にあけた穿孔から適切な増殖基質とともに接種物として注入することにより使用することもできる。
【００２７】
当該バクテリアを適当容量のバイオフィルターシステム上で成長させる場合、エーテル、特にＭＴＢＥ、ＥＴＢＥおよび／またはＴＡＭＥを含む廃液は、空気または酸素の存在下に、０.０５から５Ｌ／Ｌ／時間の適切な供給速度、例えば、処理すべき汚染物の濃度に応じて０.１から２Ｌ／Ｌバイオフィルター／時間の速度でバイオフィルターに導入可能であり、汚染エーテルの少なくとも一部の取り除かれた廃液が取り出される。
【００２８】
【発明の実施の形態】
実施例１（比較例）
新菌株ゴルドニア・テレ（Gordonia terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４の単離とＥＴＢＥ存在下ゴルドニア・テレ（Gordonia terrae）ＣＩＰ Ｉ−１８８９との増殖比較
バクテリア・ゴルドニア・テレ（Gordonia terrae）ＣＩＰ Ｉ−１８８９はＥＴＢＥ上で増殖可能（フランス特許ＦＲ２７６６４７８）であり、ＥＴＢＥを炭素およびエネルギー源として使用し、結果としてtert−ブタノール（ＴＢＡ）を蓄積する。このバクテリアを、炭素およびエネルギー源としてのＥＴＢＥを含有する最小栄養素培地ＭＭ１上、数回の連続継代培養により培養した。その培地組成は以下の通りである：
−ＫＨ２ＰＯ４                  ６.８ｇ
−Ｋ２ＨＰＯ４                  ８.７ｇ
−Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ      ０.３３４ｇ
−ＮＨ４Ｃｌ                  １.５ｇ
−ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ          ０.０３６４ｇ
−ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ          ０.００１２ｇ
−ビタミン溶液                １ｍＬ
−Ｈ２Ｏ                      １リットルとする適量
ｐＨ＝６.９５
ビタミン溶液は蒸留水１リットルあたり以下の組成を有する：
−ビオチン                            ２００ｍｇ
−リボフラビン                        ５０ｍｇ
−ニコチンアミン（nicotinamic）酸     ５０ｍｇ
−パントテン酸塩                      ５０ｍｇ
−ｐ−アミノ安息香酸                  ５０ｍｇ
−葉酸                                ２０ｍｇ
−チアミン                            １５ｍｇ
−シアノコバラミン                    １.５ｍｇ
ＥＴＢＥは高濃度、すなわち、３００から５００ｍｇ／Ｌの濃度でこの培地に添加する。
【００２９】
これらの異なる継代培養の終末点で、バクテリア・ゴルドニア・テレ（Gordonia terrae）ＣＩＰ Ｉ−１８８９由来の新規バクテリアを得た。その形態学的および通常の特徴は親株のものと一致している。このものはパスツール研究所（パリ、フランス）のコレクションにゴルドニア・テレ（Gordonia terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４として寄託した。この新しい菌株はＥＴＢＥの分解を可能とする遺伝子発現に対して本質的である；すなわち、この菌株とＥＴＢＥとを事前に接触させる必要なしにＥＴＢＥの分解が起こる。親株のゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−１８８９は、ＥＴＢＥの分解に誘導性であると言われており（ＥＴＢＥ＋ｉ）、新株のゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４は、ＥＴＢＥの分解に本質的であると言われる（ＥＴＢＥ＋ｃ）。
【００３０】
比較のために、一方のバクテリア・ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−１８８９と他方のバクテリア・ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４を、炭素およびエネルギー源としてＥＴＢＥを最終濃度１ｇ／Ｌの量で添加した上記のＭＭ１培地のバイアル中で別々に培養する。
【００３１】
培養物は３０℃でインキュベートする。
【００３２】
ＥＴＢＥの残留濃度は各培養物から採ったサンプルから定量し、インテグレーターを備えたガス・クロマトグラフ装置にインジェクトしてクロマトグラムにおいて得られる異なるピークを積分して生じるＥＴＢＥとＴＢＡの残留濃度を計算する。得られる結果を表１に示す。
【００３３】
【表１】
ＥＴＢＥの存在下バクテリア・ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−１８８９とＣＩＰ Ｉ−２１９４との増殖比較
0004706160.tif 000002
【００３４】
この実験から分かるように、菌株ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４ではＥＴＢＥ分解のための潜伏期（遅延）は観察されない。これは当業者が本菌株を使用するに際しての利点と考えられる。
【００３５】
実施例２
ゴルドニア・テレ（Gordonia terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４によるＭＴＢＥとＴＡＭＥの分解
バクテリア・ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４のＭＴＢＥおよびＴＡＭＥに対する分解能力を検討した。
【００３６】
炭素源としてＭＴＢＥまたはＴＡＭＥのいずれかを２００ｍｇ／Ｌ量の濃度で含む実施例１記載のＭＭ１無機質培地を容れたフラスコにバクテリア・ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４を接種する。
【００３７】
培養物を３０℃でインキュベートする。
【００３８】
これらの培養物から一定間隔でサンプルを採取し、ＭＴＢＥおよびＴＡＭＥの残留含量をガスクロマトグラフィーにより定量する。
【００３９】
結果を図１および２に示す。
【００４０】
これらの図に見られるように、バクテリア・ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４は接種時からＭＴＢＥおよびＴＡＭＥを分解することが可能である。各エーテルのこの濃度低下は、同時に起こる相当するアルコールの出現、すなわち、ＭＴＢＥの場合にはＴＢＡ、またＴＡＭＥの場合にはtert−アミルアルコール（ＴＡＡ）の出現に相関する。しかしながら、この分解は潜伏期を伴わずに起きはするが、完全ではなく、接種から、４０から６０時間後には停止してしまう。
【００４１】
ここで培養物にエタノールを添加すると（図では約１５０時間後）、ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４によるＭＴＢＥまたはＴＡＭＥの分解が再び始まり、約３０時間後には完全となる。
【００４２】
この実験は事実上、バクテリア・ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４の挙動が親株バクテリア・ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−１８８９の挙動とは異なることを確認している。と言うのは、後者は増殖基質がなければＭＴＢＥまたはＴＡＭＥの分解を開始し得なかったからである（特許番号９８／１６５２０の実施例２）。バクテリア・ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４はエーテル結合を攻撃する役割の酵素に対し本質的であるので、ＭＴＢＥとＴＡＭＥが炭素源およびエネルギー源を構成していないとしても、これらの化合物の分解を開始し得るが、それにもかかわらずこの分解はバクテリア内に間もなく制限が生じるために一部に制限されてしまう。増殖基質であるエタノールを添加すると、バクテリア・ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−１８８９について記載したように、共代謝により終了すべきＭＴＢＥまたはＴＡＭＥの分解を可能とする。
【００４３】
増殖基質なしにＭＴＢＥまたはＴＡＭＥの分解を開始するこの能力は、バクテリア・ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−１８８９と比較してのバクテリア・ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４の利点を構成する。
【００４４】
実施例３
塩化コバルト存在下ゴルドニア・テレ（Gordonia terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４およびブルコールデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）ＣＩＰ Ｉ−２０５２の混合培養物によるＭＴＢＥの分解
発酵槽中、ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４およびブルコールデリア・セパシア（B.cepacia）ＣＩＰ Ｉ−２０５２の混合培養物によるＭＴＢＥの分解につき検討した。ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４の前培養はルリア（Luria）培地２００ｍＬ上で実施した。ブルコールデリア・セパシア（B. cepacia）ＣＩＰ Ｉ−２０５２の前培養は２００ｍＬのＭＭ２培地上で実施した。培地の組成は以下の通りである。
【００４５】
−ＫＨ２ＰＯ４                      １.４ｇ
−Ｋ２ＨＰＯ４                      １.７ｇ
−ＮａＮＯ３                        １.５ｇ
−ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ              ０.５ｇ
−ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ              ０.０４ｇ
−ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ              ０.０１２ｇ
−ビタミン溶液                    １ｍＬ
−Ｈ２Ｏ                          １リットルとする適量
ビタミン溶液は蒸留水１リットルあたり以下の組成を有する：
−ビオチン                    ２００ｍｇ
−リボフラビン                ５０ｍｇ
−ニコチンアミン酸            ５０ｍｇ
−パントテン酸塩              ５０ｍｇ
−ｐ−アミノ安息香酸          ５０ｍｇ
−葉酸                        ２０ｍｇ
−チアミン                    １５ｍｇ
−シアノコバラミン              １.５ｍｇ
該溶液はさらにグルコースを５００ｍｇ／Ｌの濃度で含み、これにバクテリアの増殖改善を可能とする塩化コバルト含有微量要素溶液をＭＭ２培地に１０ｍＬ／Ｌの割合で添加する。この微量要素溶液は以下の組成を有する：
−ニトリロトリ酢酸              １.５ｇ
−Ｆｅ(ＮＨ４)２(ＳＯ４)２・６Ｈ２Ｏ  ０.２ｇ
−Ｎａ２ＳｅＯ３                  ０.２ｇ
−ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ            ０.１ｇ
−ＭｎＳＯ４・２Ｈ２Ｏ            ０.１ｇ
−Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ          ０.１ｇ
−ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ            ０.１ｇ
−ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ            ０.０４ｇ
−ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ            ０.０２５ｇ
−Ｈ３ＢＯ３                      ０.０１ｇ
−ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ            ０.０１ｇ
蒸留水                          １リットルとする適量
これらの前培養物を上記のＭＭ２培地４Ｌへの接種に用い、これに塩化コバルト含有微量要素溶液を培地に１０ｍＬ／Ｌの割合で添加する。これらの条件下で、これら２種の菌株は接種後の細胞濃度が、ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４については１０８u.f.c.／ｍＬ、また、ブルコールデリア・セパシア（B. cepacia）ＣＩＰ Ｉ−２０５２については１０７u.f.c.／ｍＬである。発酵槽はバッチ様式で、すなわち、抜き出すことなく供給する。供給物は基質である炭素およびエネルギー源としてのエタノール１００ｇ／Ｌおよび分解される補助基質（CO-Substrate）ＭＴＢＥ５０ｇ／Ｌからなる混合物を含む。供給速度は１ｍＬ／時に設定する。発酵槽の温度は３０℃に設定する。攪拌は１２.５Ｌ／Ｌ／時を通気しながら９００revs／min（回転／分）とする。
【００４６】
培地からサンプルを採取し、エタノール、ＭＴＢＥおよびＴＢＡの残留濃度を濾過後にＧＣ測定により定量した。同時に、２種の菌株、ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４およびブルコールデリア・セパシア（B. cepacia）ＣＩＰ Ｉ−２０５２を、５００ｍｇ／Ｌの割合でＴＢＡを含むルリア（Luria）培地シャーレおよび凝結塊ＭＭ２培地シャーレ上に塗布し、一定間隔で計測した。これらの実験結果を図３および４に示す。供給したエタノールはゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４により急速に使用され、同時に、ＭＴＢＥも基質エタノールと補助基質の同時使用の間、潜伏期を生じることなくＴＢＡに分解される。このように形成されたＴＢＡは３０ｍｇ／Ｌを超えない濃度で蓄積し、次いでブルコールデリア・セパシア（B. cepacia）ＣＩＰ Ｉ−２０５２により急速に再消費される。４０時間後、エタノール、ＭＴＢＥおよびＴＢＡの残留濃度はゼロとなる。２種菌株のそれぞれの母集団は、培養の８０時間目まで上昇し、その後、基質（エタノールまたはＴＢＡ）制限のために安定化する。２１０時間継続したこの実験の間、注入したＭＴＢＥ２.４ｇが分解され、同様にエタノール５.２ｇが分解された。ＭＴＢＥから形成されたＴＢＡ量は２ｇであり、この２ｇも完全に分解された。
【００４７】
実施例４
エタノールまたはイソプロパノールの存在下下記２種類の混合培養物によるＭＴＢＥの分解：１）ゴルドニア・テレ（Gordonia terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４およびアルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６１、または２)ゴルドニア・テレ（Gordonia terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４およびマイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６２
３種の異なる前培養を実施する：
−炭素源としてＥＴＢＥ５００ｍｇ／Ｌを含む実施例３記載のＭＭ２培地上、ゴルドニア・テレ（Gordonia terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４の前培養。
【００４８】
−炭素源としてＴＢＡ１ｇ／Ｌを含むＭＭ２培地上、アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６１の前培養。
【００４９】
−炭素源としてＴＢＡ１ｇ／Ｌを含むＭＭ２培地上、マイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６２の培養。
【００５０】
３０℃通気下に４８時間増殖させた後、これら異なる前培養物を遠心分離し、各菌株のバクテリアペレットを回収する。各ペレットをＭＭ２培地で洗浄し、遠心分離により収集する。
【００５１】
ゴルドニア・テレ（Gordonia terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４のぺレットをＭＭ２培地４.５ｍＬに採り、同様にアルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６１のペレットならびにマイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６２のペレットをそれぞれ２０ｍＬに採る。
【００５２】
これら懸濁液の６００ｎｍ（Ｏ.Ｄ.６００ｎｍ）での光学濃度はゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４およびマイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６２について測定可能であり、それぞれ７.３２および２.７２であった。アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６１についてはこの菌株は綿状沈降物を形成するためにＯ.Ｄ.６００ｎｍを測定できなかった。
【００５３】
これらの細胞懸濁液を、イソプロパノール（最終３００ｍｇ／Ｌ）とＭＴＢＥ（最終１００ｍｇ／Ｌ）またはエタノール（最終３００ｍｇ／Ｌ）とＭＴＢＥ（最終１００ｍｇ／Ｌ）のいずれかを含有するＭＭ２培地（５０ｍＬ）のフラスコへの接種に用いた。この懸濁液は、ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４ついては１ｍＬの割合で、また、アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６１およびマイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６２の懸濁液のいずれか一方については０.５ｍＬを使用する。
【００５４】
イソプロパノールとＭＴＢＥまたはエタノールとＭＴＢＥを含有するＭＭ２培地のフラスコにより構成される非接種対照実験も同様の条件下で実施する。フラスコは３０℃の通気下に７２時間インキュベートする。
【００５５】
初期Ｏ.Ｄ.６００ｎｍはゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４およびマイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６２の混合培養物の場合に計算し得たが、約０.１７であった。
【００５６】
７２時間後に各培養物と対照のサンプルを採り、濾過（０.２２μｍ）して、ＧＣにより測定し、残留基質を定量する。結果を表２に示す。
【００５７】
【表２】
ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４とアルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６１またはマイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６２との混合培養物の残留ＭＴＢＥおよびエタノールまたはイソプロパノール含量
0004706160.tif 000003
【００５８】
対照では、混合物中のＭＴＢＥもエタノールもイソプロパノールも分解されないことが確認された。
【００５９】
この実験結果から分かるように、ＭＴＢＥはイソプロパノールまたはエタノールの存在下、ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４により完全に分解される。この分解に際して形成されるＴＢＡは次いでアルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６１により、またはマイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６２により炭素およびエネルギー源として用いられる。エタノールまたはイソプロパノールは完全に消費される。
【００６０】
ＭＴＢＥおよび基質エタノールまたはイソプロパノールの２度目の添加は、１回目と同量を添加し、フラスコを再度インキュベートした。測定はインキュベーションの２４時間後、次いで４８時間後に実施した。
【００６１】
２４時間のインキュベーションの後、ＭＴＢＥ、エタノールまたはイソプロパノールはどのフラスコにももはや存在しなかった。また、ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４／アルカリゲネス・エスピー（Alcaligenes sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６１の混合培養物のフラスコにも残余のＴＢＡはもはや存在しなかった。他方、ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４／マイコバクテリウム・エスピー（Mycobacterium sp.）ＣＩＰ Ｉ−２５６２の混合培養物には残留ＴＢＡが残っていたが、４８時間の培養後、これらの混合培養物にはもはや残留ＴＢＡが存在しなかった。
【００６２】
２度目に添加されたＭＴＢＥ／エタノールまたはＭＴＢＥ／イソプロパノールの完全な分解が、試験した異なる混合培養物の分解能力を実際に確認する。
【図面の簡単な説明】
本発明は以下の図面からより良く理解されよう。
【図１】  エタノールの存在下にゴルドニア・テレ（Gordonia terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４培養物のＭＴＢＥ分解能力を示す時間Ｔ(h)と濃度（Ｃ）のグラフである。
【図２】  エタノールの存在下にゴルドニア・テレ（Gordonia terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４培養物のＴＡＭＥ分解能力を示す時間Ｔ(h)と濃度（Ｃ）のグラフである。
【図３】  基質としてのエタノールとＭＴＢＥの残留濃度（ＲＣ）を時間Ｔ(h)関数として示すグラフである。
【図４】  ゴルドニア・テレ（G. terrae）ＣＩＰ Ｉ−２１９４およびブルコールデリア・セパシア（B. cepacia）ＣＩＰ Ｉ−２０５２の混合培養物についての微生物増殖を時間Ｔ(h)関数として表す光学濃度（ＯＤ６００ｎｍ）を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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