(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質。
（ａ）配列番号１２、１４、１６、１８又は２０に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１２、１４、１６、１８又は２０に記載のアミノ酸配列において１から２０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光特性を光照射依存的に変換できるアミノ酸配列：
【請求項２】
請求項１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
以下の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ）配列番号１３、１５、１７、１９又は２１に記載の塩基配列；又は、
（ｂ）配列番号１３、１５、１７、１９又は２１に記載の塩基配列において１から６０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、蛍光特性を光照射依存的に変換できる蛍光蛋白質をコードする塩基配列：
【請求項４】
請求項２又は３に記載のＤＮＡを有する組み換えベクター。
【請求項５】
請求項２又は３に記載のＤＮＡ又は請求項４に記載の組み換えベクターを有する形質転換体。
【請求項６】
請求項１に記載の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光蛋白質。
【請求項７】
他の蛋白質が細胞内に局在する蛋白質である、請求項６に記載の融合蛍光蛋白質。
【請求項８】
他の蛋白質が細胞内小器官に特異的な蛋白質である、請求項６又は７に記載の融合蛍光蛋白質。
【請求項９】
請求項１に記載の蛍光蛋白質、請求項２又は３に記載のＤＮＡ、請求項４に記載の組み換えベクター、請求項５に記載の形質転換体、又は請求項６から８の何れかに記載の融合蛍光蛋白質を含む、蛍光試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規な蛍光蛋白質に関する。より詳細には、本発明は、スボミキクメイシ（ｆａｖｉａ  ｆａｖｕｓ）由来の新規な蛍光蛋白質及びその利用に関する。
【背景技術】  クラゲのエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）に由来する緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）は、生物系において多くの用途を有する。最近、ランダム突然変異誘発法および半合理的（ｓｅｍｉ−ｒａｔｉｏｎａｌ）突然変異誘発法に基づいて、色を変化させたり、折りたたみ特性を改善したり、輝度を高めたり、あるいはｐＨ感受性を改変したといった様々なＧＦＰ変異体が作製されている。遺伝子組み換え技術により他の蛋白質をＧＦＰ等の蛍光蛋白質に融合させて、それらの発現および輸送のモニタリングを行うことが行われている。
最もよく使用されるＧＦＰ変異体の一つとして黄色蛍光蛋白質（ＹＦＰ）が挙げられる。ＹＦＰは、クラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ）ＧＦＰ変異体の中でも最長波長の蛍光を示す。大部分のＹＦＰのεおよびΦは、それぞれ６０，０００〜１００，０００Ｍ−１ｃｍ−１および０．６〜０．８であり（Ｔｓｉｅｎ，Ｒ．Ｙ．（１９９８）．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，５０９−５４４）、これらの値は、一般的な蛍光団（フルオレセインおよびローダミンなど）の値に匹敵する。従ってＹＦＰの絶対的輝度の改善は、ほぼ限界に達しつつある。
また、ＧＦＰ変異体の他の例として、シアン蛍光蛋白質（ＣＦＰ）があり、ＥＣＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｙａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が知られている。また、イソギンチャク（Ｄｉｓｃｏｍａ  ｓｐ．）からは赤色蛍光蛋白質（ＲＦＰ）も単離されており、ＤａｓＲｅｄが知られている。このように蛍光蛋白質は、緑色、黄色、シアン色、赤色の４種が次々と開発されスペクトルの範囲は大幅に広がっている。
また、刺胞動物には、蛍光を発するものが存在する。刺胞動物由来の蛍光蛋白質遺伝子のクローニングが試みられているが、蛍光および生化学的な特性のレパートリーを増やすためには、より多くの遺伝子のクローニングが必要である。
【発明の開示】
本発明は、スボミキクメイシ（ｆａｖｉａ  ｆａｖｕｓ）に由来する、新規な蛍光蛋白質を提供することを解決すべき課題とした。
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意検討し、既知の蛍光蛋白質のアミノ酸配列の情報に基づいて好適なプライマーを設計し、スボミキクメイシ（ｆａｖｉａ  ｆａｖｕｓ）由来のｃＤＮＡライブラリーから上記プライマーを用いて新規な蛍光蛋白質をコードする遺伝子を増幅してクローニングすることに成功した。さらに本発明者らは、得られたスボミキクメイシ（ｆａｖｉａ  ｆａｖｕｓ）由来の蛍光蛋白質の蛍光特性及びｐＨ感受性を解析した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、スボミキクメイシ（ｆａｖｉａ  ｆａｖｕｓ）由来の下記の特性を有する蛍光蛋白質が提供される。
（１）励起極大波長が５０７ｎｍである；
（２）蛍光極大波長が５１７ｎｍである；
（３）４８２ｎｍにおけるモル吸光係数が８００００である；
（４）量子収率が０．６８である；
（５）蛍光極大のｐＨ感受性がｐＨ＝５〜１１で安定である：
本発明の別の側面によれば、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光を有するアミノ酸配列：
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかのアミノ酸配列において６２番目にアミノ酸残基であるアスパラギン酸をヒスチジンに置換したアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光を有するアミノ酸配列：
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかのアミノ酸配列において４０番目のアミノ酸残基であるメチオニンをバリンに、６２番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸をヒスチジンに、１９８番目のアミノ酸残基であるイソロイシンをメチオニンに置換したアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光を有するアミノ酸配列：
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかのアミノ酸配列において１０番目のアミノ酸残基であるメチオニンをイソロイシンに、１２番目のアミノ酸残基であるロイシンをバリンに、４０番目のアミノ酸残基であるメチオニンをバリンに、６０番目のアミノ酸残基であるバリンをアラニンに、６２番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸をヒスチジンに、１１９番目のアミノ酸残基であるチロシンをアスパラギンに、１４４番目のアミノ酸残基であるプロリンをセリンに、１９７番目のアミノ酸残基であるアルギニンをロイシンに、１９８番目のアミノ酸残基であるイソロイシンをメチオニンに置換したアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光を有するアミノ酸配列：
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかのアミノ酸配列において１０番目のアミノ酸残基であるメチオニンをイソロイシンに、４０番目のアミノ酸残基であるメチオニンをバリンに、６０番目のアミノ酸残基であるバリンをアラニンに、６２番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸をヒスチジンに、７０番目のアミノ酸残基であるリジンをグルタミン酸に、１１９番目のアミノ酸残基であるチロシンをアスパラギンに、１９７番目のアミノ酸残基であるアルギニンをグルタミンに、１９８番目のアミノ酸残基であるイソロイシンをメチオニンに置換したアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光を有するアミノ酸配列：
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかのアミノ酸配列において６０番目のアミノ酸残基であるバリンをアラニンに、６２番目のアミノ酸残基であるアスパラギン酸をグリシンに、６３番目のアミノ酸残基であるチロシンをヒスチジンに、１９６番目のアミノ酸残基であるヒスチジンをロイシンに、１９８番目のアミノ酸残基であるイソロイシンをトレオニンに置換したアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光を有するアミノ酸配列：
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の蛋白質をコードするＤＮＡが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかのＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ：
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかの塩基配列を有するＤＮＡが提供される。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列；又は、
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、蛍光蛋白質をコードする塩基配列：
本発明のさらに別の側面によれば、以下の何れかの塩基配列を有するＤＮＡ。
（ａ）配列番号１３、１５、１７、１９又は２１に記載の塩基配列；又は、
（ｂ）配列番号１３、１５、１７、１９又は２１に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、蛍光蛋白質をコードする塩基配列：
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のＤＮＡを有する組み換えベクターが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを有する形質転換体が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質とから成る融合蛍光蛋白質が提供される。
好ましくは、他の蛋白質は細胞内に局在する蛋白質であり、さらに好ましくは、細胞内小器官に特異的な蛋白質である。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させることを特徴とする、細胞内における蛋白質の局在または動態を分析する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明の蛍光蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター、形質転換体、又は融合蛍光蛋白質を含む、蛍光試薬キットが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、ＧｒｅｅｎからＲｅｄへと蛍光特性を光照射依存的に変換できない蛍光蛋白質において、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の６２番目に相当するアミノ酸をヒスチジンに置換することを含む、蛍光特性をＧｒｅｅｎからＲｅｄへと光照射依存的に変換できる蛍光蛋白質を製造する方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、ＧｒｅｅｎからＲｅｄへと蛍光特性を光照射依存的に変換できない蛍光蛋白質において、下記の置換のうちの少なくとも１以上のアミノ酸置換を行うことを含む、蛍光特性をＧｒｅｅｎからＲｅｄへと光照射依存的に変換できる蛍光蛋白質を製造する方法が提供される。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の６２番目に相当するアミノ酸についてヒスチジンへの置換；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の１０番目に相当するアミノ酸についてイソロイシンへの置換；
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の１２番目に相当するアミノ酸についてバリンへの置換；
（４）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の４０番目に相当するアミノ酸についてバリンへの置換；
（５）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の６０番目に相当するアミノ酸についてアラニンへの置換；
（６）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の７０番目に相当するアミノ酸についてグルタミン酸への置換；
（７）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の１１９番目に相当するアミノ酸についてアスパラギンへの置換；
（８）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の１４４番目に相当するアミノ酸についてセリンへの置換；
（９）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の１９７番目に相当するアミノ酸についてロイシンまたはグルタミンへの置換；又は
（１０）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の１９８番目に相当するアミノ酸についてメチオニンへの置換；
本発明のさらに別の側面によれば、蛍光蛋白質において、下記の置換のうちの少なくとも１以上のアミノ酸置換を行うことを含む、ＧｒｅｅｎからＲｅｄに蛍光特性を変換する速度が上がり、且つ、蛍光強度が増大した蛍光蛋白質を製造する方法が提供される。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の６２番目に相当するアミノ酸についてヒスチジンへの置換；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の５４番目に相当するアミノ酸についてフェニルアラニンへの置換；
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の６９番目に相当するアミノ酸についてバリンへの置換；
（４）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の８７番目に相当するアミノ酸についてチロシンへの置換；
（５）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の９３番目に相当するアミノ酸についてメチオニンへの置換；
（６）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の１０９番目に相当するアミノ酸についてメチオニンへの置換；
（７）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の１２１番目に相当するアミノ酸についてイソロイシンへの置換；
（８）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の１４０番目に相当するアミノ酸についてバリンへの置換；又は
（９）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の１６０番目に相当するアミノ酸についてバリンへの置換；
本発明のさらに別の側面によれば、ＰｕｒｐｌｅからＢｌｕｅへと蛍光特性を光照射依存的に変換できない蛍光蛋白質において、下記の置換のうちの少なくとも１以上のアミノ酸置換を行うことを含む、蛍光特性をＰｕｒｐｌｅからＢｌｕｅへと光照射依存的に変換できる蛍光蛋白質を製造する方法が提供される。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の６０番目に相当するアミノ酸についてアラニンへの置換；
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の６２番目に相当するアミノ酸についてグリシンへの置換；
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の６３番目に相当するアミノ酸についてヒスチジンへの置換；
（４）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の１９６番目に相当するアミノ酸についてロイシンへの置換；又は
（５）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質の１９８番目に相当するアミノ酸についてトレオニンへの置換；
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明のスボミキクメイシ（ｆａｖｉａ  ｆａｖｕｓ）由来の蛍光蛋白質（ＫｋＧ）の蛍光スペクトル及び励起スペクトルを測定した結果を示す。
図２は、本発明のスボミキクメイシ（ｆａｖｉａ  ｆａｖｕｓ）由来の蛍光蛋白質（ＫｋＧ）のｐＨ依存性を示す。
図３は、アミノ酸配列の比較（＊＊＊は発色団形成アミノ酸を示す）を示す。
図４は、光照射（３６５ｎｍ）によるスペクトル特性の変化を示す。
Ａ１：ＫｋＧ吸収スペクトル
Ａ２：光照射後のＫＫＨ吸収スペクトル
Ａ３：ＫｉｋＧＲ光照射による吸収スペクトルの推移
Ａ４：ＫｉｋＧＲ光照射による励起、蛍光スペクトルの変化
図５は、大腸菌・Ｈｅｌａ細胞での蛍光強度の比較を示す。
Ａ左：３６５ｎｍ照射前    Ａ右：３６５ｎｍ照射後
Ｂ：ＨｅＬａ細胞での発現
上から順に７時間後、１２時間後、１８時間後
４７５ＡＦ２０／５３０ＤＦ３５  ｅｘｐ  １ｓｅｃ  Ｄｉｃｈｒｏｉｃ  ｍｉｒｒｏｒ  ４３０ＤＣＬＰ
Ｘｅｎｏｎ  ７５Ｗ  ＮＤ  １０％Ｔ    Ｘ１０  ＵｐｌａｎＦＩ  ＮＡ０．３
図６は、緑から赤への変換と明るさの比較を示す。
Ａ：ＫｉｋＧＲ蛍光値の推移    Ｂ：ＫｉｋＧＲ発現細胞の画像
Ｃ：Ｋａｅｄｅ蛍光値の推移    Ｄ：Ｋａｅｄｅ発現細胞の画像
Ｇｒｅｅｎ  ４７５ＡＦ２０／５３０ＤＦ３５  ｅｘｐ  ５０ｍｓ
Ｒｅｄ      ５５０ＤＦ３０／５７５ＡＬＰ    ｅｘｐ  １００ｍｓ
Ｖｉｏｌｅｔ  ４００ＤＦ１０                ｅｘｐ  １００ｍｓ
Ｄｉｃｒｏｉｃ  ｍｉｒｒｏｒ        ：４３０ＤＣＬＰ
Ｘｅｎｏｎ  ７５Ｗ  ＮＤ１０％Ｔ
Ｂｉｎ４  ＣｏｏｌＳＮＡＰ  ＨＱ
Ｘ４０  ＵＡｐｏ３４０／ＮＡ１．３５
図７は、ＫＢＬ２の紫外線（２７０ｎｍ）照射による蛍光スペクトル特性の変化を示す。（Ｇｒａｔｉｎｇの２次光をふくむ）
３８０ｎｍの蛍光が紫外線照射により減少し、４５０ｎｍの蛍光が増加する。
図８は、ＫＢＬ２の変換後の励起・蛍光スペクトルを示す（Ｇｒａｔｉｎｇの２次光を含む）。
図９は、３６５ｎｍ照射による吸収スペクトルの変化を示す。照射前（細線）、照射後（太線）
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の蛍光蛋白質
本発明の蛍光蛋白質は、スボミキクメイシ（ｆａｖｉａ  ｆａｖｕｓ）由来のものであり、下記の特性を有することを特徴とする。
（１）励起極大波長が５０７ｎｍである；
（２）蛍光極大波長が５１７ｎｍである；
（３）４８２ｎｍにおけるモル吸光係数が８００００である；
（４）量子収率が０．６８である；
（５）蛍光極大のｐＨ感受性がｐＨ＝５〜１１で安定である：
スボミキクメイシ（ｆａｖｉａ  ｆａｖｕｓ）は、刺胞動物門花虫綱六放サンゴ亜綱キクメイシ科に属するサンゴの１種である。
本発明の蛍光蛋白質は、以下の実施例で示す通り、励起極大波長が５０７ｎｍであり、蛍光極大波長が５１７ｎｍである。また、４８２ｎｍにおけるモル吸光係数は８００００であり、量子収率は０．６８である。モル吸光係数は蛍光分子１モルあたりの光子の吸収量を表し、量子収率は吸収した光子のどれだけを蛍光として発することができるかを表した数値である。
本発明の蛍光蛋白質の具体例としては、以下の何れかのアミノ酸配列を有する蛍光蛋白質が挙げられる。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、かつ蛍光を有するアミノ酸配列：
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
本明細書で言う「蛍光を有する」および「蛍光蛋白質」とは、蛍光を発することができる全ての場合を包含し、蛍光強度、励起波長、蛍光波長、ｐＨ感受性などの諸特性は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と比較して、変動していてもよいし、同様のままでもよい。
本発明の蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列並びに配列番号２に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、それらを用いてスボミキクメイシ（ｆａｖｉａ  ｆａｖｕｓ）由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを取得することができる。本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの一部の断片を上記したＰＣＲにより得た場合には、作製したＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の蛍光蛋白質を産生することができる。発現系での発現については本明細書中後記する。
（２）本発明のＤＮＡ
本発明によれば、本発明の蛍光蛋白質をコードする遺伝子が提供される。
本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡの具体例としては、以下の何れかのＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列をコードし、かつ蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ。
本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡのさらなる具体例としては、以下の何れかのＤＮＡが挙げられる。
（ａ）配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡ；又は、
（ｂ）配列番号２に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、かつ蛍光蛋白質をコードするＤＮＡ：
本発明のＤＮＡは、例えばホスホアミダイト法などにより合成することができるし、特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造することもできる。本発明のＤＮＡ又はその断片の作製方法については、本明細書中上述した通りである。
また、所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤又は放射線への露出等の公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築することができる。このような公知の技術は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，２ｎｄＥｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、並びにＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）に記載されている。
（３）本発明の組み換えベクター
本発明のＤＮＡは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明のＤＮＡは、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜することができる。
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ａｌｐｈａ−ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・アミロリケファチエンス・ＢＡＮアミラーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  ＢＡＮ  ａｍｙｌａｓｅ  ｇｅｎｅ）、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｇｅｎｅ）もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ  ｘｙｌｏｓｌｄａｓｅ  ｇｅｎｅ）のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰＲ若しくはＰＬプロモータ、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ若しくはｔａｃプロモータなどが挙げられる。
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ２−４ｃプロモータなどが挙げられる。
糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
また、本発明のＤＮＡは必要に応じて、例えばヒト成長ホルモンターミネータまたは真菌宿主についてはＴＰＩ１ターミネータ若しくはＡＤＨ３ターミネータのような適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）および翻訳エンハンサ配列（例えばアデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードするもの）のような要素を有していてもよい。
本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。
本発明のＤＮＡ、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
（４）本発明の形質転換体
本発明のＤＮＡ又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明のＤＮＡまたは組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明のＤＮＡ構築物を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行なえばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｌａｅ）またはサッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができる（例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載）。
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ（インビトロジェン社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
上記の形質転換体は、導入されたＤＮＡ構築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の蛍光融合蛋白質を単離精製するには、通常の蛋白質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常の蛋白質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
（５）本発明の蛍光蛋白質及びそれを含む融合蛍光蛋白質の利用
本発明は蛍光蛋白質を他の蛋白質と融合させることにより、融合蛍光蛋白質を構築することができる。
本発明の融合蛍光蛋白質の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術による作製した組み換え蛋白質でもよい。
組み換え蛋白質を作製する場合には、先ず当該蛋白質をコードするＤＮＡを入手することが必要である。本明細書の配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列及び配列番号２に記載した塩基配列の情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、本発明の蛍光蛋白質の遺伝子を含むＤＮＡ断片を鋳型にしてＰＣＲを行うことにより、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを構築するのに必要なＤＮＡ断片を作製することができる。また同様に、融合すべき蛋白質をコードするＤＮＡ断片も入手する。
次いで、これらのＤＮＡ断片を順番に遺伝子組み換え技術により連結することにより、所望の融合蛍光蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛍光蛋白質を産生することができる。
本発明の蛍光蛋白質は、特に、標識としての利用価値が高い。即ち、本発明の蛍光蛋白質を被検アミノ酸配列との融合蛋白質として精製し、マイクロインジェクション法などの手法により細胞内に導入し、該融合蛋白質の分布を経時的に観察すれば、被検アミノ酸配列の細胞内におけるターゲッティング活性を検出することが可能である。
本発明の蛍光蛋白質を融合させる他の蛋白質（被検アミノ酸配列）の種類は特に限定されるものではないが、例えば、細胞内に局在する蛋白質、細胞内小器官に特異的な蛋白質、ターゲティングシグナル（例えば、核移行シグナル、ミトコンドリアプレ配列）等が好適である。なお、本発明の蛍光蛋白質は、マイクロインジェクション法などにより細胞内に導入する以外に、細胞内で発現させて用いることも可能である。この場合には、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが発現可能に挿入されたベクターが宿主細胞に導入される。
また、本発明の蛍光蛋白質は、レポーター蛋白質としてプロモーター活性の測定に用いることも可能である。即ち、被検プロモーターの下流に、本発明の蛍光蛋白質をコードするＤＮＡが配置されたベクターを構築し、これを宿主細胞に導入し、該細胞から発せられる本発明の蛍光蛋白質の蛍光を検出することにより、被検プロモーターの活性を測定することが可能である。被検プロモーターとしては、宿主細胞内で機能するものであれば、特に制限はない。
上記被検アミノ酸配列のターゲティング活性の検出やプロモーター活性の測定において用いられるベクターとしては、特に制限はないが、例えば、動物細胞用ベクターでは、「ｐＮＥＯ」（Ｐ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，ａｎｄ  Ｐ．Ｂｅｒｇ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７）、「ｐＣＡＧＧＳ」（Ｈ．Ｎｉｗａ，Ｋ．Ｙａｍａｍｕｒａ，ａｎｄ  Ｊ．Ｍｉｙａｚａｋｉ．Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００（１９９１））、「ｐＲｃ／ＣＭＶ」（インビトロゲン社製）、「ｐＣＤＭ８」（インビトロゲン社製）などが、酵母用ベクターでは、「ｐＲＳ３０３」，「ｐＲＳ３０４」，「ｐＲＳ３０５」，「ｐＲＳ３０６」，「ｐＲＳ３１３」，「ｐＲＳ３１４」，「ｐＲＳ３１５」，［ｐＲＳ３１６］（Ｒ．Ｓ．Ｓｉｋｏｒｓｋｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｈｉｅｔｅｒ（１９８９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２２：１９−２７）、「ｐＲＳ４２３」，「ｐＲＳ４２４」，「ｐＲＳ４２５」，「ｐＲＳ４２６」（Ｔ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｍ．Ｄａｎｔｅ，Ｊ．Ｈ．Ｓｈｅｒｏ，ａｎｄ  Ｐ．Ｈｉｅｔｅｒ（１９９２）Ｇｅｎｅ  １１０：１１９−１２２）などが好適に用いられる。
また、使用可能な細胞の種類も特に限定されず、各種の動物細胞、例えば、Ｌ細胞、ＢａｌｂＣ−３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＮＲＫ（ｎｏｒｍａｌ  ｒａｔ  ｋｉｄｎｅｙ）細胞、「Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ」などの酵母細胞や大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞などを使用することができる。ベクターの宿主細胞への導入は、例えば、リン酸カルシウム法やエレクトロポレーション法などの常法により行うことができる。
上記のようにして得た、本発明の蛍光蛋白質と他の蛋白質（蛋白質Ｘとする）とを融合させた融合蛍光蛋白質を細胞内で発現させ、発する蛍光をモニターすることにより、細胞内における蛋白質Ｘの局在や動態を分析することが可能になる。即ち、本発明の融合蛍光蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換またはトランスフェクトした細胞を蛍光顕微鏡で観察することにより細胞内における蛋白質Ｘの局在や動態を可視化して分析することができる。
例えば、蛋白質Ｘとして細胞内オルガネラに特異的な蛋白質を利用することにより、核、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、分泌小胞、ペルオキソームなどの分布や動きを観察できる。
また、例えば、神経細胞の軸索、樹状突起などは発生途中の個体の中で著しく複雑な走向の変化を示すので、こういった部位を蛍光ラベルすることにより動的解析が可能になる。
本発明の蛍光蛋白質の蛍光は、生細胞のまま検出することが可能である。この検出は、例えば、蛍光顕微鏡（カールツァイス社  アキシオフォト  フィルターセット  ０９）や画像解析装置（ＡＴＴＯ  デジタルイメージアナライザー）などを用いて行うことが可能である。
顕微鏡の種類は目的に応じて適宜選択できる。経時変化を追跡するなど頻回の観察を必要とする場合には、通常の落射型蛍光顕微鏡が好ましい。細胞内の詳細な局在を追及したい場合など、解像度を重視する場合は、共焦点レーザー顕微鏡の方が好ましい。顕微鏡システムとしては、細胞の生理状態を保ち、コンタミネーションを防止する観点から、倒立型顕微鏡が好ましい。正立顕微鏡を使用する場合、高倍率レンズを用いる際には水浸レンズを用いることができる。
フィルターセットは蛍光蛋白質の蛍光波長に応じて適切なものを選択できる。本発明の蛍光蛋白質の場合、励起光４９０〜５１０ｎｍ、蛍光５１０〜５３０ｎｍ程度のフィルターを使用することが好ましい。
また、蛍光顕微鏡を用いた生細胞での経時観察を行う場合には、短時間で撮影を行うべきなので、高感度冷却ＣＣＤカメラを使用する。冷却ＣＣＤカメラは、ＣＣＤを冷却することにより熱雑音を下げ、微弱な蛍光像を短時間露光で鮮明に撮影することができる。
（６）本発明のキット
本発明によれば、本明細書に記載した蛍光蛋白質、融合蛍光蛋白質、ＤＮＡ、組み換えベクター又は形質転換体から選択される少なくとも１種以上を含むことを特徴とする、細胞内成分の局在の分析及び／又は生理活性物質の分析のためのキットが提供される。本発明のキットは、それ自体既知の通常用いられる材料及び手法で調製することができる。
蛍光蛋白質又はＤＮＡなどの試薬は、適当な溶媒に溶解することにより保存に適した形態に調製することができる。溶媒としては、水、エタノール、各種緩衝液などを用いることができる。
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】実施例１：珊瑚（キクメイシ）からの新規蛍光蛋白遺伝子の単離
（１）ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出
蛍光を放つ珊瑚より蛍光蛋白遺伝子の単離を行った。材料にはスボミキクメイシ（ｆａｖｉａ  ｆａｖｕｓ）を用いた。キクメイシをハンマーで砕き、湿重量１１グラムに”ＴＲＩｚｏｌ”（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を１５ｍｌ加えて攪拌し、１５００×ｇで１０分間遠心した。上清にクロロホルム３ｍｌをくわえ、１５秒間攪拌した後３分間静置した。７５００×ｇで１５分間遠心した。上清にイソプロパノール３．７５ｍｌをくわえ、１５秒間攪拌した後１０分間静置した。１７０００×ｇで１０分間遠心した。上清を捨て７０％エタノールを６ｍｌ加えて１７０００×ｇで１０分間遠心した。上清を捨て沈殿をＤＥＰＣ水２００μｌで溶解した。ＤＥＰＣ水で溶解したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを１００倍に希釈してＯ．Ｄ．２６０とＯ．Ｄ．２８０の値を測定してＲＮＡ濃度を測った。２０μｇのｔｏｔａｌ  ＲＮＡを得た。
（２）Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成
ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ３μｇを使用し、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡの合成キット”Ｒｅａｄｙ  Ｔｏ  Ｇｏ”（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によりｃＤＮＡ（３３μｌ）を合成した。
（３）Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲ
合成したＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ（３３μｌ）のうち３μｌを鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーのデザインは既知の蛍光蛋白のアミノ酸配列を見比べて、似ている部分を抜き出し、塩基配列に変換し直し作製した。
使用プライマー
0004648834.tif 000002
Ｒ＝Ａ又はＧ、Ｙ＝Ｃ又はＴ、Ｖ＝Ａ，Ｃ又はＧ、Ｄ＝Ａ，Ｇ又はＴ
ＰＣＲ反応液組成
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）３μｌ
Ｘ１０  ｔａｑ  バッファー                        ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                            ４μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ１                        １μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ２                        １μｌ
ミリＱ                                          ３５μｌ
ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）        １μｌ
ＰＣＲ反応条件
９４℃  １ｍｉｎ（ＰＡＤ）
９４℃  ３０ｓｅｃ（変性）
５２℃  ３０ｓｅｃ（鋳型へのプライマーのアニーリング）
７２℃  １ｍｉｎ（プライマー伸長）
７２℃  ７ｍｉｎ（最後の伸長）
４℃  保持
一回目のＰＣＲ反応で得られた増幅産物１μｌをテンプレートとして、もう一度同じ温度条件でＰＣＲを行った。ただし、使用プライマーは、
0004648834.tif 000003
0004648834.tif 000004
アガロースゲル電気泳動で、予想された大きさの３５０ｂｐのバンドを切り出し、精製した。
（４）サブクローニング及び塩基配列の決定
精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。得られた塩基配列を他の蛍光蛋白遺伝子の塩基配列と比較してそのＤＮＡ塩基配列が蛍光蛋白由来のものであるかを判断した。蛍光蛋白遺伝子の一部であると判断したものに関して、５’−ＲＡＣＥ法および３’−ＲＡＣＥ法による遺伝子全長のクローニングを行った。
（５）５’−ＲＡＣＥ法
Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片の５’側の塩基配列を決定するために５’−ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて、５’−ＲＡＣＥ法を行った。鋳型として１）で調整したｔｏｔａｌ  ＲＮＡを３μｇ使用した。
ＤＣ−ｔａｉｌｅｄ  ｃＤＮＡの一回目の増幅には
0004648834.tif 000005
のプライマーを用いた。
Ｉ＝イノシン
二回目の増幅には
0004648834.tif 000006
のプライマーを用いた。ＰＣＲ反応条件等はキットのプロトコールに準じた。
アガロースゲル電気泳動で、増幅された７００ｂｐのバンドを切り出し、精製した。精製したＤＮＡ断片をｐＴ７−ｂｌｕｅ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。大腸菌株（ＴＧ１）にトランスフォーメーションしてブルーホワイトセレクションを行い、白いコロニーの大腸菌よりｐｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡを精製して、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシークエンサーにより決定した。
（６）全塩基配列の決定、及び大腸菌での蛋白発現
（５）により得られた蛋白のＮ末端に相当する部分でプライマーを作製し、Ｃ末端側はオリゴｄＴプライマーを使用して、（２）で調製したＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。
使用プライマー
0004648834.tif 000007
ＰＣＲ反応液組成
テンプレート（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ）  ３μｌ
Ｘ１０  ｐｙｒｏｂｅｓｔ  バッファー                ５μｌ
２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ                              ４μｌ
１００μＭ  ｐｒｉｍｅｒ７                          １μｌ
１００μＭ  オリゴｄＴプライマー                    １μｌ
ミリＱ                                            ３５μｌ
ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５Ｕ／μｌ）１μｌ
ＰＣＲ反応条件
９４℃  １ｍｉｎ（ＰＡＤ）
９４℃  ３０ｓｅｃ（変性）
５２℃  ３０ｓｅｃ（鋳型へのプライマーのアニーリング）
７２℃  １ｍｉｎ（プライマー伸長）
上記３ステップを３０サイクル行った。
７２℃  ７ｍｉｎ（最後の伸長）
４℃  保持
アガロースゲルの電気泳動で、増幅された約９００ｂｐのバンドを切り出し、精製してｐＲＳＥＴ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングして、大腸菌株（ＪＭ１０９−ＤＥ３）で発現させた。またプラスミドを回収し、挿入された全塩基配列を決定した。クローン名をＫｋＧとした。得られた全長の塩基配列を配列表の配列番号２に示し、全長のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。
発現蛋白はＮ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付くようにコンストラクトしたので発現蛋白はＮｉ−Ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製の方法は付属のプロトコールに準じた。次に精製した蛋白の性質を解析した。
（７）蛍光特性の解析
１０μＭ蛍光蛋白（ＫｋＧ）のＰＢＳ溶液を用いて吸収スペクトルを測定した。このスペクトルのピークの値よりモル吸光係数を計算した。５０７ｎｍに吸収のピークが認められ、４５０ｎｍにおける吸収が０．００５となるように蛍光蛋白を上記の緩衝液で希釈して、４５０ｎｍで励起した時の蛍光スペクトルを測定した（図１）。ＥＧＦＰ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を同様に４５０ｎｍにおける吸収が０．００５となるようにして蛍光スペクトルを測定し、ＥＧＦＰの量子収率を０．６として本発明の蛋白質の量子収率を求めた。結果を表１に示す。
0004648834.tif 000008
（８）ｐＨ感受性の測定
下記の緩衝液で希釈して蛍光スペクトルを測定した。
各ｐＨの緩衝液は次の通り、
ｐＨ４、５  ：酢酸バッファー
ｐＨ６      ：ＭＥＳバッファー
ｐＨ７      ：ＭＯＰＳバッファー
ｐＨ８      ：ＨＥＰＥＳバッファー
ｐＨ９、１０：グリシンバッファー
ｐＨ１１    ：リン酸バッファー
蛍光極大のｐＨ依存性を測定した結果を図２に示す。
実施例２：蛍光特性を改善した各種蛍光蛋白質の作製
（１）ＧｒｅｅｎからＲｅｄへと蛍光特性を光（紫外線及び紫光）照射依存的に変換できる蛍光蛋白質の作製
ＧｒｅｅｎからＲｅｄへと蛍光特性を光照射依存的に変換できない蛍光蛋白質ＫｋＧの６２番目のアスパラギン酸（Ｄ）をヒスチジン（Ｈ）に置換することにより、蛍光蛋白質ＫｋＧの蛍光特性をＧｒｅｅｎからＲｅｄへと光照射依存的に変換できる蛍光蛋白質（ＫＫＨ）（ＫＫＨのアミノ酸配列を配列番号１２に示し、塩基配列を配列番号１３に示す）へと性質を変化することが出来た（図３、図４）。図４Ａ２の矢印は光照射後のＲｅｄの蛍光を放つ部分の吸収（５８３ｎｍ）の増加を示す。蛍光蛋白質ＫｋＧの４０番目のメチオニン（Ｍ）をバリン（Ｖ）に、６２番目のアスパラギン酸（Ｄ）をヒスチジン（Ｈ）に、１９８番目のイソロイシン（Ｉ）をメチオニン（Ｍ）に置換することにより蛍光特性をＧｒｅｅｎからＲｅｄへと光照射依存的にできる蛍光蛋白質（ＫＫＨ）よりも光感受性の高い、つまり、弱い光で蛍光特性をＧｒｅｅｎからＲｅｄへと変換できる蛍光蛋白質（Ｈ８ＰＶ）（Ｈ８ＰＶのアミノ酸配列を配列番号１４に示し、塩基配列を配列番号１５に示す）にすることが出来た（図３）。
蛍光蛋白質ＫｋＧの１０番目のメチオニン（Ｍ）をイソロイシン（Ｉ）に、１２番目のロイシン（Ｌ）をバリン（Ｖ）に、４０番目のメチオニン（Ｍ）をバリン（Ｖ）に、６０番目のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に、６２番目のアスパラギン酸（Ｄ）をヒスチジン（Ｈ）に、１１９番目のチロシン（Ｙ）をアスパラギン（Ｎ）に、１４４番目のプロリン（Ｐ）をセリン（Ｓ）に、１９７番目のアルギニン（Ｒ）をロイシン（Ｌ）に、１９８番目のイソロイシン（Ｉ）をメチオニン（Ｍ）に置換することにより蛍光特性をＧｒｅｅｎからＲｅｄへと光照射依存的にできる蛍光蛋白質（Ｈ８ＰＶ）よりも光感受性の高い、つまり、弱い光で蛍光特性をＧｒｅｅｎからＲｅｄへと変換できる蛍光蛋白質（Ｈ３８ＰＶＬＭ）（Ｈ３８ＰＶＬＭのアミノ酸配列を配列番号１６に示し、塩基配列を配列番号１７に示す）にすることが出来た（図３）。
蛍光蛋白質ＫｋＧの１０番目のメチオニン（Ｍ）をイソロイシン（Ｉ）に、４０番目のメチオニン（Ｍ）をバリン（Ｖ）に、６０番目のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に、６２番目のアスパラギン酸（Ｄ）をヒスチジン（Ｈ）に、７０番目のリジン（Ｋ）をグルタミン酸（Ｅ）に、１１９番目のチロシン（Ｙ）をアスパラギン（Ｎ）に、１９７番目のアルギニン（Ｒ）をグルタミン（Ｑ）に、１９８番目のイソロイシン（Ｉ）をメチオニン（Ｍ）に置換することにより蛍光特性をＧｒｅｅｎからＲｅｄへと光照射依存的にできる蛍光蛋白質（Ｈ３８ＰＶＬＭ）よりも光感受性の高い、つまり、弱い光で蛍光特性をＧｒｅｅｎからＲｅｄへと変換できる蛍光蛋白質（ＫｉｋＧＲ）（ＫｉｋＧＲのアミノ酸配列を配列番号１８に示し、塩基配列を配列番号１９に示す）にすることが出来た（図３、図４）。
図４Ａ３、Ａ４はＧｒｅｅｎの蛍光（５１７ｎｍ）を放つ部分の吸収（５０７ｎｍ）が光照射により徐々に減少し、Ｒｅｄの蛍光（５９３ｎｍ）を放つ部分の吸収（５８３ｎｍ）が徐々に増加したことを示す。即ち、ＧｒｅｅｎからＲｅｄへと蛍光特性を光照射依存的に変換できない任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの６２番目に相当するアミノ酸、具体的には発色団を形成する３つのアミノ酸ＸＹＧ（図３のアスタリスク部分、Ｘは任意のアミノ酸、Ｙは一般的にはチロシン、場合によってはフェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンなどの芳香族アミノ酸もとりうる。Ｇはグリシン。）のＸをヒスチジンに置換することにより、蛍光特性をＧｒｅｅｎからＲｅｄへと光照射依存的に変換できる蛍光蛋白質をつくりだすことが出来る。さらに、ＧｒｅｅｎからＲｅｄへと蛍光特性を光照射依存的に変換できない任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの６２番目に相当するアミノ酸をヒスチジン（Ｈ）に置換したものに、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの１０番目に相当するアミノ酸をイソロイシン（Ｉ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの１２番目に相当するアミノ酸をバリン（Ｖ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの４０番目に相当するアミノ酸をバリン（Ｖ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの６０番目に相当するアミノ酸をアラニン（Ａ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの７０番目に相当するアミノ酸をグルタミン酸（Ｅ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの１１９番目に相当するアミノ酸をアスパラギン（Ｎ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの１４４番目に相当するアミノ酸をセリン（Ｓ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの１９７番目に相当するアミノ酸をロイシン（Ｌ）またはグルタミン（Ｑ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの１９８番目に相当するアミノ酸をメチオニン（Ｍ）にアミノ酸置換するうちの何れかのアミノ酸置換を含むことにより、蛍光特性をＧｒｅｅｎからＲｅｄへと光照射依存的に変換できる蛍光蛋白質をつくりだすことが出来、且つ、光感受性の高い、つまり、弱い光で蛍光特性をＧｒｅｅｎからＲｅｄへと変換できる蛍光蛋白質を作製することが出来る。
ＧｒｅｅｎからＲｅｄへと蛍光特性を光照射依存的に変換できる蛍光蛋白質ＫａｅｄｅとＫｉｋＧＲを大腸菌で発現させ比較するとＫｉｋＧＲの方がＧｒｅｅｎのときも、光照射特性変換後も蛍光強度が強いことが示された（図５Ａ）。ＫａｅｄｅとＫｉｋＧＲの遺伝子をＨｅＬａ細胞に導入し発現させると、ＫｉｋＧＲのほうがＫａｅｄｅよりも早く蛍光を発した（図５Ｂ）。また、ＨｅＬａ細胞で発現させたＫｉｋＧＲとＫａｅｄｅを光照射により細胞内でＧｒｅｅｎからＲｅｄに蛍光特性を変化させたとき、ＫｉｋＧＲはＫａｅｄｅに較べて明らかに速くＧｒｅｅｎからＲｅｄへの蛍光特性の変換が観察され、且つ、蛍光強度が強いことが示された（図６Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。つまり、ＫａｅｄｅとＫｉｋＧＲのアミノ酸配列を比較したときに、アミノ酸が違っている部分はＫｉｋＧＲと同じアミノ酸置換により、ＧｒｅｅｎからＲｅｄに蛍光特性を変換する速度が上がり、且つ、蛍光強度が強くなることが容易に予想される。特に図３のグレー部分は蛋白質が立体構造をとったときにアミノ酸側鎖が蛋白質内部に向くものであり、蛍光特性に大きな影響を与える可能性があると容易に考えられる。具体的には、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの６２番目に相当するアミノ酸をヒスチジン（Ｈ）に置換したものに、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの５４番目に相当するアミノ酸をフェニルアラニン（Ｆ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの６９番目に相当するアミノ酸をバリン（Ｖ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの８７番目に相当するアミノ酸をチロシン（Ｙ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの９３番目に相当するアミノ酸をメチオニン（Ｍ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの１０９番目に相当するアミノ酸をメチオニン（Ｍ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの１２１番目に相当するアミノ酸をイソロイシン（Ｉ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの１４０番目に相当するアミノ酸をバリン（Ｖ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの１６０番目に相当するアミノ酸をバリン（Ｖ）にアミノ酸置換するうちの何れかのアミノ酸置換を含むことにより、ＧｒｅｅｎからＲｅｄに蛍光特性を変換する速度が上がり、且つ、蛍光強度が強い蛍光蛋白質を作製することができる。
（２）ＰｕｒｐｌｅからＢｌｕｅへと蛍光特性を光（紫外線及び紫光）照射依存的に変換できる蛍光蛋白質の作製
ＰｕｒｐｌｅからＢｌｕｅへと蛍光特性を光照射依存的に変換できない蛍光蛋白質ＫｋＧの６０番目のバリン（Ｖ）をアラニン（Ａ）に、６２番目のアスパラギン酸（Ｄ）をグリシン（Ｇ）に、６３番目のチロシン（Ｙ）をヒスチジン（Ｈ）に、１９７番目のヒスチジン（Ｈ）をロイシン（Ｌ）に、１９９番目のイソロイシン（Ｉ）をトレオニン（Ｔ）に置換することにより、蛍光蛋白質ＫｋＧの蛍光特性をＰｕｒｐｌｅ（３８０ｎｍ）からＢｌｕｅ（４５０ｎｍ）へと光照射依存的に変換できる蛍光蛋白質（Ｋｂｌ２）へと性質を変化することが出来た（Ｋｂｌ２のアミノ酸配列を配列番号２０に示し、塩基配列を配列番号２１に示す）（図３、図７、図８、図９）。つまり、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの６０番目に相当するアミノ酸をアラニン（Ａ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの６２番目に相当するアミノ酸をグリシン（Ｇ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの６３番目に相当するアミノ酸をヒスチジン（Ｈ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの１９６番目に相当するアミノ酸をロイシン（Ｌ）に、任意の蛍光蛋白質でＫｋＧの１９８番目に相当するアミノ酸をトレオニン（Ｔ）に置換することにより、また、前記アミノ酸置換の何れかを含むことによって蛍光特性をＰｕｒｐｌｅからＢｌｕｅへと光照射依存的に変換できる蛍光蛋白質を作製することができる。
【産業上の利用可能性】  本発明により、スボミキクメイシ（ｆａｖｉａ  ｆａｖｕｓ）由来の新規な蛍光蛋白質が提供されることになった。本発明の蛍光蛋白質は、従来の蛍光蛋白質とは一次構造が異なる新規な蛋白質である。本発明の蛍光蛋白質は、所定の蛍光特性を有し、分子生物学的分析において有用である。即ち、本発明の蛍光蛋白質を用いることにより哺乳類細胞で毒性を発揮することなく蛍光ラベルができるようになった。今回のように全く新しい遺伝子を出発材料にすることで、より多くの異なる特性を示す蛍光物質が得られる可能性がある。
【図１】
0004648834.tif 000009
【図２】
0004648834.tif 000010
【図３】
0004648834.tif 000011
【図４】
0004648834.tif 000012
【図５】
0004648834.tif 000013
【図６】
0004648834.tif 000014
【図７】
0004648834.tif 000015
【図８】
0004648834.tif 000016
【図９】
0004648834.tif 000017
【配列表】
0004648834000001.xml