(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第VII因子応答性症候群を治療するための薬学的組成物であって、
第VII因子ポリペプチド、
メチオニン、並びに
スクロースおよびマンニトールの組み合わせ
を含み；
3%以下の水分含量を有し；
前記組成物を30℃で8ヶ月間保存した際に、第VII因子ポリペプチドの初期含量の5% w/w以下が、凝集物に変換される程度に、前記組成物が安定であり；
水分含量を3%以下に調整する前の組成物において、第VII因子ポリペプチドの濃度が0.6〜10.0 mg/mL、メチオニンの濃度が0.05〜10 mg/ml、スクロースの濃度が0.5〜75 mg/ml、マンニトールの濃度が0.5〜75 mg/mlである、薬学的組成物。
【請求項２】
前記組成物を30℃で8ヶ月間保存した際に、第VII因子ポリペプチドの初期含量の6% w/w以下が、酸化型に変換される程度に、前記組成物が安定である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記マンニトールの前記スクロースに対する重量比が、100:1〜1:50の範囲にある、先行する請求項の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
水性溶媒に溶解したときに、前記組成物のpHを、3〜9の範囲に維持するのに適した薬剤を更に含む、先行する請求項の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記薬剤が、クエン酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、リンゴ酸塩、リン酸塩、酒石酸、コハク酸、MES、HEPES、PIPES、イミダゾール、TRIS、乳酸塩、グルタミン酸塩およびグリシルグリシンから成る群より選択される、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
張度調整剤を更に含む、先行する請求項の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記張度調整剤が、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化カルシウムから成る群より選択される、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
界面活性剤を更に含む、先行する請求項の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記界面活性剤が、ポリソルベート；ポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはポロキサマー；および他のエチレン/ポリプロピレンブロックポリマーまたはポリエチレングリコール(PEG)から成る群より選択される、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
増量剤として機能する他の薬学的賦形剤を更に含む、先行する請求項の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記第VII因子ポリペプチドが、ヒト第VIIa因子、組換えヒト第VIIa因子および第VII因子配列変異体から成る群より選択される、先行する請求項の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記第VII因子ポリペプチドが、ヒト第VIIa因子または組換えヒト第VIIa因子である、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記第VII因子ポリペプチドが、第VII因子関連ポリペプチドであり、前記第VII因子関連ポリペプチドの活性と野生型第VII因子の活性との比が、本明細書に記載される「インビトロタンパク質分解アッセイ」および「インビトロ加水分解アッセイ」の一または複数で試験したときに、少なくとも1.25である、請求項１〜１２の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記水分含量が、2.5% w/w以下である、先行する請求項の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、凍結乾燥ケーキである、先行する請求項の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記組成物が、第VII因子ポリペプチド、マンニトール、スクロース、メチオニン、およびポリソルベートまたはポロキサマーから選択される界面活性剤を含む、先行する請求項の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
L-ヒスチジンを更に含有する、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
CaCl2、NaCl、およびグリシルグリシンのリストから選択される一以上の構成成分を更に含有する、請求項１６または１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、調合物Ａ、Ｄのリストから選択される、先行する請求項の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【表ａ】
0004648002.tif 000018
【請求項２０】
前記組成物が、調合物Ex〜Hxのリストから選択される、先行する請求項の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【表ｂ】
0004648002.tif 000019
【請求項２１】
前記第VII因子ポリペプチドが、ヒト第VIIa因子である、請求項１６〜２０の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
安定な第VII因子ポリペプチドを含有する、第VII因子応答性症候群を治療するための薬学的組成物を調製する方法であって、
ｉ）第VII因子ポリペプチドを、メチオニン、並びにスクロースおよびマンニトールの組み合わせを含む溶液中に提供して、0.6〜10.0 mg/mLの第VII因子ポリペプチド、0.05〜10 mg/mlのメチオニン、0.5〜75 mg/mlのスクロース、および0.5〜75 mg/mlのマンニトールを含有する液体組成物を得る工程と、
ii）3% w/w以下の水分含量を有する固形組成物が得られるように、前記液体組成物を処理する工程と
を含み；
得られた固形組成物を30℃で8ヶ月間保存した際に、第VII因子ポリペプチドの初期含量の5% w/w以下が、凝集物に変換される程度に、前記組成物が安定である、方法。
【請求項２３】
前記処理が、フリーズドライを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第VII因子応答性症候群が、血友病Ａ、血友病Ｂ、第XI因子欠損症、第VII因子欠損症、血小板減少症、フォン・ビルブラント病、凝固因子阻害剤の存在、外科手術、外傷、希釈性凝固障害、および抗凝固療法からなる群より選択される、請求項１〜２１の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
前記薬学的組成物が、溶解されるのに適している、請求項１〜２１および２４の何れか１項に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、室温で保存、取り扱い、使用することができる、第VII因子または第VII因子関連ポリペプチドを含んだ化学的かつ物理的に安定な組成物に関する。
【発明の背景】
【０００２】
第VII因子は、血液凝固プロセスに関与するポリペプチドである。今日、第VIIa因子は、組換え技術により作成することができ（rFVIIa）、前止血性（pro-haemostatic）薬剤として広く使用されている。第VII因子（ヒト野生型）は、米国特許第4,784,950号に記載されている。rFVIIaは、今日、出血を経験する血友病個体において迅速かつ非常に効果的な前止血性の応答を提供する。好都合なことに、rFVIIaは、抗体形成のために他の凝固因子産物で治療することができない血友病個体を治療するために使用することができる。また、第VII因子欠損症に罹患している個体、または正常な凝固系を有するが過剰な出血を経験する個体は、rFVIIaでうまく治療することができる。
【０００３】
たとえば第VIIa因子などのポリペプチドを含む医薬を開発する場合、幾つかのパラメーターを考慮する必要がある。たとえば、医薬は、効果的であり、安全であり、かつ十分な患者のコンプライアンスにつながる必要がある。更に、医薬は、薬学的に許容可能な賦形剤を用いて非経口投与のために調合することできるが、世界の種々の医療監督官庁の承認を得なければならない。非経口投与のためには、調合物はおよそ等張であること、調合物のｐＨは注射/注入の際に生理学的に適切な範囲であることが非常に望ましく、そうでなければ、患者に痛みや不快感を引き起こすかもしれない。タンパク質調合物の概説に関しては、たとえば、Cleland et al.: The development of stable protein formulations: A closer look at protein aggregation, deamidation and oxidation, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1993, 10(4): 307-377; およびWang et al., Parenteral formulations of proteins and peptides: Stability and stabilizers, Journal of Parenteral Science and Technology 1988 (Supplement), 42 (2S) を参照されたい。
【０００４】
しかし、ポリペプチドを含む医薬については、その安全性は、ポリペプチドの物理的および化学的安定性と直接関係し得る。第VII因子または第VII因子関連ポリペプチドは、ポリペプチドであるため、物理的な分解、たとえば変性および凝集、たとえばダイマー、オリゴマーおよびポリマー型の可溶性または不溶性凝集物の形成や、化学的な分解、たとえば加水分解、アミド分解および酸化を受けやすい。その結果、かかる物理的および化学的な不安定性は、２〜３例を挙げると、第VII因子ポリペプチドの活性の損失、毒性および免疫原性分解産物の生成、分解された第VII因子ポリペプチドの注射により血栓症を誘導する重大な危険、注射に使用される針の目詰まり、並びに非均質性の危険につながるかもしれない。
【０００５】
よって、物理的および化学的な分解に対して安定化された第VII因子ポリペプチドを含む組成物を提供することが絶対必要である。
【０００６】
今日、組換えにより作成されたFVIIポリペプチドが、約２〜８℃の温度で保存することが意図されたフリーズドライ製品として提供される。冷却状態の要件は、製造者または提供者並びにエンドユーザー（患者）にとって負担であり不便である。
【０００７】
組換えにより作成された実際のFVII製品は、1.2 mg  組換えヒト第VIIa因子、5.84 mg  NaCl、2.94 mg  CaCl2,2H2O、2.64 mg  グリシルグリシン、0.14 mg  ポリソルベート80および60.0 mg  マンニトールから成るNovoSeven(登録商標) (Novo Nordisk A/S, Denmark) である。2.0 mLの注射用蒸留水（WFI）を加えて元に戻したとき、ｐＨは5.5であり、このようにして調製されたFVII含有溶液は、室温で24時間十分に安定である。
【０００８】
本発明者らは、凍結乾燥されたNovoSeven(登録商標)製品を25℃で6ヶ月間保存すると、rFVIIaの初期含有量の約6〜7% w/wが凝集物の形態で存在することを見出した。
【０００９】
よって、第VII因子ポリペプチドを含む組成物は、大気温度での保存および処理が許容される程度に安定化される必要がある。しかし、ポリペプチドの不安定性は、幾つかのパラメーターに関係し、第VIIa因子または第VII因子関連ポリペプチドを安定化させる適切な方法を予測することは不可能である。
【００１０】
タンパク質を安定化させるアプローチの一つは、タンパク質から水を除去すること、たとえば、フリーズドライ処理により得られる最終物質である凍結乾燥ケーキの形態のタンパク質を提供することに関する。しかし、フリーズドライ処理自体、タンパク質に対して有害でもあり；フリーズドライの間、タンパク質溶液は、十分凍結するまでまず冷却され、タンパク質溶液中の大部分の水が、この段階で氷を形成する。これによりタンパク質は、凍結により誘導されるストレスを受けやすくなり、その結果変形し沈殿する。第一乾燥段階と称される次のステップにおいて氷は昇華し、第二乾燥段階において吸着水または結合水が高温下で除去される。この水の除去の間に、主に水素結合によって提供されるタンパク質の適切な立体配座が緩くなることがある。
【００１１】
したがって、フリーズドライの間にタンパク質の立体配座、活性および安定性を保持するために、そのポリペプチド溶液に、凍結保護物質および/または凍結乾燥保護物質の特性を備えた適切な賦形剤を充分な量補充し、凍結により誘導されるストレスおよび/または水の除去の間のストレスのそれぞれからタンパク質を保護する必要がある。
【００１２】
更に、凍結乾燥された製品を提供するときに必須の特徴は、凍結乾燥ケーキの特性に関する。凍結乾燥ケーキは、形態および構造に関して優れた特性を有している必要があり、すなわち、崩壊したケーキは使用前に溶解（再構成）することが難しいか不可能であるため、凍結乾燥ケーキは崩壊してはいけない。逆に凍結乾燥ケーキの物理的構造は、あまり緩すぎても柔らすぎてもいけない。従って、一以上のいわゆる増量剤が、フリーズドライの前にタンパク質溶液に添加される。
【００１３】
ポリペプチドの安定化に関する他の関連する文献は、以下のとおりである：
U.S.20010031721 A1 (American Home Products) は、高度に濃縮され、凍結乾燥された、液体の第IX因子調合物に関する。
【００１４】
WO 97/26909 (Genetics Institute) は、保存および投与に適した第IX因子の凍結乾燥調製物に関する。この調製物は、凍結防止剤としてスクロースまたはマンニトールを含み得る。
WO 95/28954 (Genetics Institute) は、保存および投与に適した第IX因子の調製物に関する。この調製物は、凍結防止剤としてスクロースを含んでいてもよい。
【００１５】
本発明の目的は、好ましくは外界条件（ambient condition）で長期にわたって、たとえば少なくとも６ヶ月間保存した後でも、実質的に分解生成物が存在せず且つ第VII因子ポリペプチドの活性が低下していない、第VII因子ポリペプチドの安定な組成物を提供することである。さらに、本発明の目的は、患者に何の不都合も生じさせないようにするために、その安定な組成物が非経口投与に適していることである。
【発明の概要】
【００１６】
本研究者らは、室温で少なくとも約８ヶ月間保存できる十分安定な組成物中に第VII因子ポリペプチドを提供できることを見出した。本発明者らは、安定化は、薬学的に許容可能な賦形剤を適切に組み合わせることに関係することを見出した。
【００１７】
よって、本発明は、第一の側面において、
第VII因子ポリペプチド、並びにａ）〜ｅ）：
ａ）抗酸化剤およびマンニトールの組み合わせ；
ｂ）メチオニンおよびポリオールの組み合わせ；
ｃ）サッカリドおよびマンニトールの組み合わせ；
ｄ）スクロースおよびポリオールの組み合わせ；および
ｅ）メチオニン
から成る群より選択される少なくとも一の安定化剤を含み、約3%以下の水分含量を有する安定化組成物に関する。
【００１８】
さらなる側面において、本発明は、安定な第VII因子ポリペプチドを調製する方法であって、
ｉ）前記第VII因子ポリペプチドを、ａ）〜ｅ）：
ａ）抗酸化剤およびマンニトールの組み合わせ；
ｂ）メチオニンおよびポリオールの組み合わせ；
ｃ）サッカリドおよびマンニトールの組み合わせ；
ｄ）スクロースおよびポリオールの組み合わせ；および
ｅ）メチオニン
から成る群より選択される少なくとも一の安定化剤を含む溶液中に提供する工程と；
ii）約3% w/w以下の水分含量を有する固形組成物が得られるように、前記溶液を処理する工程と
を含む方法に関する。
【００１９】
先に述べたとおり、治療目的のために第VII因子ポリペプチドを投与した際に、不利な現象が生じるリスクを最小限にし、安全性と薬効を向上させることが、安定化された第VII因子ポリペプチドに求められる。従って、本発明のさらなる側面は、第VII因子応答性症候群を治療するための医薬であって、
第VII因子ポリペプチド、並びに
ａ）抗酸化剤およびマンニトールの組み合わせ；
ｂ）メチオニンおよびポリオールの組み合わせ；
ｃ）サッカリドおよびマンニトールの組み合わせ；
ｄ）スクロースおよびポリオールの組み合わせ；および
ｅ）メチオニン
から成る群より選択される少なくとも一の安定化剤
を含み、かつ約3%以下の水分含量を有する組成物を含む医薬を調製するための第VII因子ポリペプチドの使用に関する。
【００２０】
最後に、本発明は、第VII因子応答性症候群を治療するために前記第VII因子ポリペプチドを投与することに関し、この投与は、
第VII因子ポリペプチド、並びに
ａ）抗酸化剤およびマンニトールの組み合わせ；
ｂ）メチオニンおよびポリオールの組み合わせ；
ｃ）サッカリドおよびマンニトールの組み合わせ；
ｄ）スクロースおよびポリオールの組み合わせ；および
ｅ）メチオニン
から成る群より選択される少なくとも一の安定化剤を含み、かつ約3%以下の水分含量を有する組成物を、それを必要としている患者に有効量投与することを含むものである。
【発明の詳細な説明】
【００２１】
本発明は、第VII因子ポリペプチドを含む保存安定性組成物に関する。本組成物は、第VII因子ポリペプチドの実質的な分解を引き起こすことなく、長期にわたって室温で保存することができる。室温とは、室内の外界温度を意味し；通常約5℃〜約40℃、たとえば約10℃〜30℃、または15℃〜25℃の範囲である。
【００２２】
特定の薬学的に許容可能な賦形剤の適切な所定の組み合わせにより、本発明者らは、第VII因子ポリペプチドを含む安定化組成物を提供し、これにより、たとえば少なくとも約8ヶ月の長期にわたって室温で本組成物を保存することを可能にした。有利なことに、安定化組成物は、たとえば2〜8℃の冷却条件で保存する必要がない。
【００２３】
また本発明は、約30℃で保存した際に少なくとも約8ヶ月間安定である保存安定性組成物に関する。本組成物は好ましくは暗所で保存される。このように、本発明によれば、かかる組成物を投与する患者に不利な現象が生じるリスクを増大させることなく、室温でかかる組成物を保存することが可能となる。有利なことに、保存安定性が向上していることにより、保存時に特別な冷却条件が不要となるためコストも低減し、使用者による本組成物の取り扱いがさらに便利になるであろう。
【００２４】
「第VII因子ポリペプチド」の用語は、出血を予防または治療するのに有効である任意の第VII因子ポリペプチドを意味するものである。これには、血液または血漿に由来する第VII因子ポリペプチド、または組換え手段により産生された第VII因子ポリペプチドが含まれる。
【００２５】
本明細書で使用される「第VII因子ポリペプチド」は、第VII因子、並びに第VII因子関連ポリペプチドを包含するが、これに限定されない。「第VII因子」の用語は、（米国特許第4,784,950号に開示される）野生型ヒト第VII因子のアミノ酸配列1〜406を有するポリペプチド、並びに他の種、たとえばウシ、ブタ、イヌ、マウス、およびサケに由来する野生型第VII因子であって、血液または血漿に由来する第VII因子、または組換え手段により産生された第VII因子を包含することを意図するが、これに限定されない。更に、この用語は、個体によって存在、発生し得る第VII因子の天然の対立遺伝子変異体を包含する。また、グリコシル化または他の翻訳後修飾の程度および位置は、選択された宿主細胞および宿主細胞の環境の性質に依存して変化し得る。また、「第VII因子」は、未切断の（チモーゲン）形態の第VII因子ポリペプチド、並びにタンパク分解処理され、それぞれの生物活性な形態を産生した第VII因子ポリペプチド（これは、第VIIa因子と称され得る）を包含することを意図する。典型的には、第VII因子は、152残基と153残基の間で切断され、第VIIa因子を産生する。
【００２６】
先に述べたとおり、「第VII因子ポリペプチド」は、「第VII因子関連ポリペプチド」も意味するものである。「第VII因子関連ポリペプチド」の用語は、未切断の（チモーゲン）形態のかかるポリペプチド、並びにタンパク分解処理され、それぞれの生物活性な形態を産生したかかるポリペプチドを包含することを意図する。本明細書で使用される「第VII因子関連ポリペプチド」は、野生型ヒト第VII因子と比べて実質的に同じであるかまたは高い生物学的活性を示すポリペプチドを包含するが、これに限定されない。これらポリペプチドには、化学的に修飾された第VII因子または第VIIa因子、およびポリペプチドの生物学的活性を僅かに改変または改良する特定のアミノ酸配列変化が導入された第VII因子変異体が含まれるが、これに限定されない。
【００２７】
更に、野生型第VII因子と実質的に同じであるかまたはそれより優れた生物学的活性を示す第VII因子変異体を含む第VII因子関連ポリペプチドは、一以上のアミノ酸の挿入、欠失、または置換により野生型第VII因子の配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むが、これに限定されない。
【００２８】
野生型第VIIa因子と比べて実質的に同じであるかまたは高い生物学的活性を有する、変異体を含む第VII因子関連ポリペプチドは、本明細書に記載される凝固アッセイ、タンパク質分解アッセイ、またはＴＦ結合アッセイの一以上で試験したときに、同じ細胞タイプで産生された野生型第VIIa因子の特異的活性の少なくとも約25％、好ましくは少なくとも約50％、より好ましくは少なくとも約75％、より好ましくは少なくとも約100％、より好ましくは少なくとも約110％、より好ましくは少なくとも約120％、最も好ましくは少なくとも約130％の特異的活性を示すものを包含する。
【００２９】
幾つかの態様において、第VII因子ポリペプチドは、「インビトロ加水分解アッセイ」（後述の実施例９参照）で試験したときに、前記第VII因子ポリペプチドの活性と天然のヒト第VIIa因子（野生型FVIIa）の活性との比率が、少なくとも約1.25である第VII因子関連ポリペプチド、とりわけ変異体である；他の態様において、その比率は少なくとも約2.0であり；更なる態様において、その比率は少なくとも約4.0である。本発明の幾つかの態様において、第VII因子ポリペプチドは、「インビトロタンパク質分解アッセイ」（後述の実施例９参照）で試験したときに、前記第VII因子ポリペプチドの活性と天然のヒト第VIIa因子（野生型FVIIa）の活性との比率が、少なくとも約1.25である第VII因子関連ポリペプチド、とりわけ変異体である；他の態様において、その比率は少なくとも約2.0であり；更なる態様において、その比率は少なくとも約4.0であり；更なる態様において、その比率は少なくとも約8.0である。
【００３０】
野生型第VII因子と実質的に同じであるかまたは高い生物学的活性を有する第VII因子変異体の非限定的な例には、以下のものが含まれる：S52A-FVII、S60A-FVII (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII、およびS336G-FVII; 米国特許第5,580,560に開示される高いタンパク質分解安定性を示すFVIIa変異体;残基290と291の間または残基315と316の間でタンパク質分解により切断された第VIIa因子 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48: 501-505, 1995); 酸化型の第VIIa因子 (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363: 43-54, 1999); PCT/DK02/00189に開示されるFVII変異体; WO 02/38162 (Scripps Research Institute) に開示される高いたんぱく質分解安定性を示すFVII変異体; WO 99/20767 (University of Minnesota) に開示される、改変Gla-ドメインを有し高い膜結合を示すFVII変異体; WO 01/58935 (Maxygen ApS) に開示されるFVII変異体; WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、PCT/DK02/00635、デンマーク特許出願 PA 2002 01423、デンマーク特許出願 PA 2001 01627; WO 02/38162 (Scripps Research Institute) に開示される、野生型FVIIaと比較して高い生物学的活性を有するFVII変異体; およびJP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.) に開示される高い活性を有するFVIIa変異体。
【００３１】
第VII因子または第VII因子関連ポリペプチドの例には、以下のものが含まれるがこれに限定されない：野生型第VII因子、L305V-FVII、L305V/M306D/D309S-FVII、L305I-FVII、L305T-FVII、F374P-FVII、V158T/M298Q-FVII、V158D/E296V/M298Q-FVII、K337A-FVII、M298Q-FVII、V158D/M298Q-FVII、L305V/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII、V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII、K157A-FVII、E296V-FVII、E296V/M298Q-FVII、V158D/E296V-FVII、V158D/M298K-FVII、およびS336G-FVII、L305V/K337A-FVII、L305V/V158D-FVII、L305V/E296V-FVII、L305V/M298Q-FVII、L305V/V158T-FVII、L305V/K337A/V158T-FVII、L305V/K337A/M298Q-FVII、L305V/K337A/E296V-FVII、L305V/K337A/V158D-FVII、L305V/V158D/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V-FVII、L305V/V158T/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V-FVII、L305V/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/K316H-FVII、S314E/K316Q-FVII、S314E/L305V-FVII、S314E/K337A-FVII、S314E/V158D-FVII、S314E/E296V-FVII、S314E/M298Q-FVII、S314E/V158T-FVII、K316H/L305V-FVII、K316H/K337A-FVII、K316H/V158D-FVII、K316H/E296V-FVII、K316H/M298Q-FVII、K316H/V158T-FVII、K316Q/L305V-FVII、K316Q/K337A-FVII、K316Q/V158D-FVII、K316Q/E296V-FVII、K316Q/M298Q-FVII、K316Q/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D-FVII、S314E/L305V/E296V-FVII、S314E/L305V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/V158T-FVII、S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/K337A/E296V-FVII、S314E/L305V/K337A/V158D-FVII、S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V-FVII、S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V-FVII、S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D-FVII、K316H/L305V/E296V-FVII、K316H/L305V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/V158T-FVII、K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/K337A/E296V-FVII、K316H/L305V/K337A/V158D-FVII、K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V-FVII、K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V-FVII、K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D-FVII、K316Q/L305V/E296V-FVII、K316Q/L305V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII、K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII、K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII、K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII、K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII、K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/K337A-FVII、F374Y/V158D-FVII、F374Y/E296V-FVII、F374Y/M298Q-FVII、F374Y/V158T-FVII、F374Y/S314E-FVII、F374Y/L305V-FVII、F374Y/L305V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D-FVII、F374Y/L305V/E296V-FVII、F374Y/L305V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T-FVII、F374Y/L305V/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E-FVII、F374Y/K337A/V158T-FVII、F374Y/K337A/M298Q-FVII、F374Y/K337A/E296V-FVII、F374Y/K337A/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q-FVII、F374Y/V158D/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q-FVII、F374Y/V158T/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E-FVII、F374Y/S314E/M298Q-FVII、F374Y/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII、F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII、F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII、F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII、F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII、F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII、F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII、F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII、F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII、F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII、F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII、F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII、F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII、F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII、F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII、F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII、S52A-第VII因子、S60A-第VII因子; およびP11Q/K33E-FVII、T106N-FVII、K143N/N145T-FVII、V253N-FVII、R290N/A292T-FVII、G291N-FVII、R315N/V317T-FVII、K143N/N145T/R315N/V317T-FVII; 233Thrから240Asnまでのアミノ酸配列に置換、付加または欠失を有するFVII、304Argから329Cysまでのアミノ酸配列に置換、付加または欠失を有するFVII、およびIle153-Arg223のアミノ酸配列に置換、付加または欠失を有するFVII。
【００３２】
本発明のために、第VII因子ポリペプチドの生物学的活性（「第VII因子の生物学的活性」）は、例えば米国特許第5,997,864号に記載されるとおり、第VII因子を欠損した血漿およびトロンボプラスチンを用いて、調製物が血液凝固を促進する能力を測定することによって定量することができる。このアッセイにおいて生物学的活性は、コントロール試料に対する凝固時間の減少により表され、1ユニット/mLの第VII因子活性を有するプールされたヒト血清スタンダードと比較することにより「第VII因子ユニット」に変換される。あるいは、
（i）脂質膜中に埋め込まれたTFと第X因子とを含む系において、第VIIa因子または第VIIa因子関連ポリペプチドが、活性化された第X因子（第Xa因子）を生成する能力を測定すること（Persson et al., J. Biol. Chem. 272: 19919-19924, 1997）；
（ii）水系において第X因子の加水分解を測定すること（「インビトロタンパク質分解アッセイ」、後述の実施例１２参照）；
（iii）第VIIa因子または第VIIa因子関連ポリペプチドのTFへの物理的結合を、表面プラズモン共鳴に基づく装置を用いて測定すること（Persson, FEBS Letts. 413: 359-363, 1997）；
（iv）第VIIa因子および/または第VIIa因子関連ポリペプチドによる合成基質の加水分解を測定すること（「インビトロ加水分解アッセイ」、後述の実施例１２参照）；
（v）ＴＦ非依存性インビトロ系においてトロンビンの生成を測定すること
により定量することができる。
【００３３】
「第VII因子の生物学的活性」または「第VII因子の活性」の用語は、トロンビンを生成する能力を含むものであり；またこの用語は、組織因子の非存在下において、活性化された血小板の表面でトロンビンを生成する能力も含む。
本明細書の実施例１２は、FVIIの生物学的活性をアッセイするために有効なアッセイを詳細に説明する。
【００３４】
更に、本明細書を通して、以下の用語は以下の意味を有する：
「安定化（stabilising）」の用語は、生物学的活性およびタンパク質の安定性が維持されるように、凝集物（不溶性および/または可溶性）の形成および/または化学的分解を最小限にすること、並びに組成物の保存または製造の間にpHおよびタンパク質の適切なコンフォメーションを維持することを包含するものである。更に、安定化は、フリーズドライ条件で組成物を製造する間に、タンパク質の凍結乾燥保護および凍結保護を行うことも意味するものである。
【００３５】
「構造的安定化（structural stabilization）」または「構造的安定性（structural stability）」の用語は、たとえば使用前に崩壊して容易に溶解しないような、優れた特性および外観を備えた凍結乾燥プラグまたはケーキを形成する能力を包含するものである。
【００３６】
「保存安定性（storage-stable）」の用語は、5〜40℃の温度で保存した際に安定化されており、適切な期間（しばしば数ヶ月）にわたって、予め選択された製品の規格の範囲に保たれる製品を規定するものである。
【００３７】
第VII因子ポリペプチドの「物理的安定性」の用語は、第VII因子ポリペプチドのダイマー、オリゴマーおよびポリマー型の形態にある不溶性および/または可溶性凝集物の形成、並びに当該分子の任意の構造的変形および変性に関する。
【００３８】
「化学的安定性」の用語は、加速された条件において、溶解状態または固体状態で保存した際に、第VII因子ポリペプチドに任意の化学的変化が生じることに関するものである。例として、加水分解、アミド分解および酸化が挙げられる。とりわけ、含硫アミノ酸は酸化を受けて、対応するスルホキシドを形成しやすい。
【００３９】
本明細書で使用される「凍結保護物質（cryoprotectant）」の用語は、一般に、凍結により誘導されるストレスからタンパク質に対して安定性を与える物質を含む。凍結保護物質の例には、例えばマンニトールなどのポリオール、例えばスクロースなどのサッカリド、並びに例えばポリソルベート、ポロキサマーまたはポリエチレングリコールなどの界面活性剤が含まれる。また凍結保護物質は、調合物の張度にも寄与する。
【００４０】
本明細書で使用される「凍結乾燥保護物質（lyoprotectant）」の用語は、例えばタンパク質の適切なコンフォメーションを維持することなどによって、凍結乾燥プロセスの乾燥プロセスにおいて水分が除去される間にタンパク質に対して安定性を与える物質を含む。凍結乾燥保護物質の例には、サッカリド、とりわけ二糖または三糖が含まれる。また凍結保護物質が、凍結乾燥保護効果を有していてもよい。
【００４１】
「pHを3ないし9の範囲に維持するのに適した物質」という用語は、3.0ないし9.0の間の許容可能な範囲内に溶液のpHを維持する物質を包含する。pHを3ないし9の範囲内に維持することができる物質の典型的な例は、クエン酸、酢酸、ヒスチジン、リンゴ酸、リン酸、酒石酸、コハク酸、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、イミダゾール、ＴＲＩＳ、乳酸、グルタミン酸およびグリシルグリシンの酸の形態またはその塩である。また、pHを上記範囲に維持するのに適している物質の組み合わせが、本発明で使用可能であることを理解すべきである。
【００４２】
本明細書において使用される「凍結乾燥ケーキ」の用語は、溶解／一部溶解した組成物を冷却して凍らせる少なくとも１つの工程を行った後に真空乾燥させる少なくとも１つの工程を行う条件下で、溶解または少なくとも一部溶解した組成物を処理することにより得られる固形組成物を包含するものである。
【００４３】
「凍結乾燥」および「フリーズドライ」の用語は、溶解または一部溶解した溶液を冷却して凍らせる少なくとも１つの工程を行った後に真空乾燥工程を行う条件下で、溶解または少なくとも一部溶解した組成物から液体を除去するプロセスを包含する。凍結乾燥またはフリーズドライは、固体のタンパク質医薬品を製造するための最も一般的なプロセスである。このプロセスは、タンパク質溶液の凍結と、凍結した固体の真空下での乾燥という２つの主要な工程からなる。乾燥工程は、さらに、一次乾燥と二次乾燥という２つの段階に分けられる。一次乾燥では、凍結した水を除去し（氷の昇華）、二次乾燥では、凍結していない「結合」水を除去する（水の脱着）。各凍結乾燥工程のさらに詳細な分析は、例えば、Wang et al, International Journal of Pharmaceutics 203 (2000): 1-60に記載されている（第4セクション、16ページ以降を参照）。
【００４４】
典型的には、バイアル中に充填し、凍結乾燥機の棚上で凍結させた後、真空状態を確立し、棚を加熱して一次乾燥（すなわち氷の昇華）を行うことにより、組成物をフリーズドライする。次いで、プロセスが完了するまで、すなわち組成物の水分（水）含量が十分に少なくなるまでさらに高い温度で、二次乾燥（すなわち吸着された水の脱着）を行う。フリーズドライの方法は本技術分野において一般に公知であり、例えば、Wang et al, International Journal of Pharmaceutics 203 (2000): 1-60を参照されたい。特定の組成物のために当該プロセスの間に使用すべき温度、各温度における時間、および圧力に関してフリーズドライ条件を最適化することは、当業者の通常の知識の範囲内に属することである。
【００４５】
「水分含量（moisture content）」の用語には、製品に結びついた水が包含され、たとえば、凍結した溶質相中に捕捉または吸着された不凍結水および／または非晶質相に結びつくかまたは結晶性固体に吸着された不凍結水などの吸着された形態の水が含まれるが、これらに限定されるものではない。「水含量（water content）」の用語は、「水分含量」と交換可能に使用される。所望の残存水分レベル（水分含量）は、二次乾燥工程の期間と温度の関数として表される。凍結乾燥中の残存水分含量を測定する方法が、本技術分野で幾つか知られており；例えば、電子湿度計または残存ガス分析計を使用することができる。フリーズドライされた調合物の水分含量は、本技術分野で公知の幾つかの方法、例えば、乾燥減量、カール・フィッシャー(Karl Fischer)滴定、熱重量分析（ＴＧＡ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、または近赤外線などによって測定することができる（例えば、Wang et al, International Journal of Pharmaceutics 203 (2000): 1-60を参照）。また、水含量（水分含量）を測定する方法は、欧州薬局方および米国薬局方の何れにも記載されている。例えば、水含量の測定は、米国薬局方（USP<921,IC>）または欧州薬局方（EP<2.5.32>）に記載されているように、カール・フィッシャー(Karl Fischer)電量滴定によって行うことができる。
【００４６】
簡単に述べると、この方法は、以下のとおりである：
電量滴定による水含量の測定：カール・フィッシャー反応は、無水溶媒中の二酸化硫黄およびヨウ素と水との定量的反応に基づいた水の電量測定において使用される。ヨウ素は、ヨウ化物の酸化により、反応セル中に電気化学的に生じる。陽極に産生されたヨウ素は、反応セル中に含有される水および二酸化硫黄と直ちに反応する。物質中に存在する水の量は、滴定の終点に達するまで、電気の量と正比例する。セル中の水が全て消費されると、終点に達し、過剰なヨウ素が現れ、これが電気測定によって検出され、終点を示す。次いで、物質中に存在するパーセンテージ水含量が計算される。
【００４７】
水分含量は、分析時にバイアル中に存在するサンプルの重量で規定してもよいし（すなわち、存在する固体プラス水−湿重量ベースと称される）、あるいは測定されるサンプル中の水のために、それを補正して規定してもよい（すなわち、乾燥重量ベース）。水分含量が低いフリーズドライ製品の場合、２つの測定（湿重量ベースと乾燥重量ベース）は、極めて似通った結果を示す。本明細書で使用されるとおり、水分含量は、存在する固体プラス水で規定する（すなわち、湿重量ベース）。
【００４８】
「充填剤」の用語には、一般に、優れた凍結乾燥ケーキ特性を与え、薬学的に優れた生成物を形成し、凍結乾燥処理に伴う様々なストレス（例えば、剪断(shear)／凍結）をタンパク質が克服するのを助け、フリーズドライ処理とその後の保存中にタンパク質の活性レベルが維持されるように助ける物質が含まれる。充填剤の例には、マンニトール、グリシン、スクロース、ラクトースが含まれる。またこれらの物質は、調合物の張度にも寄与し得る。
【００４９】
「張度調節剤」の用語は、使用時に組成物を溶解したときに、組成物が血液、腹水、または他の関連する体液の生理的範囲内にある張度を有するように、組成物の張度を調整することができる任意の物質を意味するものである。明らかに、張度は、再構成溶液が張度調節物質を含有しているか否かにも依存し得る。
【００５０】
「界面活性剤」の用語は、一般に、空気／溶液界面により誘導されるストレスおよび溶液／表面により誘導されるストレスからタンパク質を保護する物質を含む。例えば、界面活性剤は、タンパク質を凝集から保護することができる。適切な界面活性剤には、たとえば、ポリソルベート、Brij 35(登録商標)などのポリオキシエチレンアルキルエーテル、またはTween 20、Tween 80、またはポロキサマー188などのポロキサマーが含まれ得る。好ましい洗浄剤は、ポロキサマー、たとえばポロキサマー188、ポロキサマー407；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、たとえばBrij 35(登録商標)、Cremophor A25、Sympatens ALM/230；およびポリソルベート/Tweens、たとえばポリソルベート20、ポリソルベート80である。更に好ましくは、ポロキサマー、たとえばポロキサマー188、およびTweens、たとえばTween 20およびTween 80である。
【００５１】
「初期含量」の用語は、調製時に組成物に添加される第VII因子ポリペプチドの量に関する。本明細書で示される濃度（mg／mL）は、水分を除去する前（たとえば、フリーズドライの前）の第VII因子ポリペプチドの溶液中の濃度または再構成された組成物中の濃度を指すか、あるいは％  w/wで表される固体組成物（たとえば凍結乾燥ケーキ）中の濃度に関する。
【００５２】
本明細書で使用されるとおり、明記される量は±約10％と理解される；よって約50 mMは50 mM±5 mMを含み、4％は4％±0.4％を含む。
上述したとおり、本発明者らは、第VII因子ポリペプチドを安定化させ、これにより使用者に対するリスクや不便を増加させることなく長期保存を可能にしたことにより、本技術分野に本質的に貢献した。
【００５３】
本発明者らは、第VII因子ポリペプチドを安定化させる際に、数多くの重大なパラメーターを調整する必要があることを見出した。重要なパラメーターの一つは、少なくとも一部は、水分含量（例えば、水）に関する。水分含量は制限されるべきである。さらに不可欠なパラメーターとして、組成物は、少なくとも一つの安定化剤を含むべきである。本発明によれば、適切な安定化剤は、抗酸化剤、サッカリドおよびポリオールから成る群より選択される薬学的に許容可能な賦形剤の少なくとも２つの群の組み合わせを含む。サッカリドおよびポリオールは、組成物をフリーズドライする場合に少なくとも部分的に重要であり得る凍結乾燥保護物質および/または凍結保護物質の特性を有する。一般に、安定性は、これら群の賦形剤の少なくとも２つの適切な組み合わせにより、部分的に高めることができる。しかし、より具体的には、前記組み合わせがサッカリド（スクロース）または抗酸化剤（メチオニン）を含んでいると、安定化効果が更に顕著になり得ることが見出された。更に、メチオニンが第VII因子ポリペプチドの酸化的分解を防ぐことも驚くべきことに見出された。
【００５４】
したがって、第一の側面において、本発明は、第VII因子ポリペプチド、並びに
ａ）抗酸化剤およびマンニトールの組み合わせ；
ｂ）メチオニンおよびポリオールの組み合わせ；
ｃ）サッカリドおよびマンニトールの組み合わせ；
ｄ）スクロースおよびポリオールの組み合わせ；および
ｅ）メチオニン
から成る群より選択される少なくとも一の安定化剤を含み、約3%以下の水分含量を有する組成物に関する。
【００５５】
すなわち、本発明の一つの態様は、抗酸化剤およびマンニトールの組み合わせを含み；第二の態様は、メチオニンおよびポリオールの組み合わせを含み；別の態様は、サッカリドおよびマンニトールの組み合わせを含み；更に別の態様において組成物は、スクロースおよびポリオールの組み合わせを含み；最後に、別の適切な態様において組成物は、メチオニンを含む。
【００５６】
上述のとおり、本発明による安定化剤は、薬学的に許容可能な賦形剤の少なくとも２つの群を組み合わせることを含む。その適切な態様において、安定化剤は、第３の群の賦形剤を更に含む。したがって、一つの態様において、抗酸化剤およびマンニトールの組み合わせは、サッカリドを更に含む。その第二の態様において、メチオニンおよびポリオールの組み合わせは、サッカリドを更に含む。更に興味深い態様において、サッカリドおよびマンニトールの組み合わせは、抗酸化剤を更に含み、スクロースおよびポリオールの組み合わせは、抗酸化剤を更に含む。一つの態様において、本発明の組成物は、マンニトールおよびスクロースを含み；別の態様において本組成物は、マンニトール、スクロースおよびメチオニンを含み；別の態様において本組成物は、マンニトールおよびトレハロースを含み；別の態様において本組成物は、マンニトール、トレハロースおよびメチオニンを含む。
【００５７】
本発明によれば、第VII因子ポリペプチドは、上述のポリペプチドを包含することを意味する。本発明の適切な態様において、第VII因子ポリペプチドは、ヒト第VIIa因子、組換えヒト第VIIa因子および第VII因子配列の変異体から成る群より選択される。好ましくは、第VII因子ポリペプチドは、ヒト第VIIa因子、または組換えヒト第VIIa因子、または本明細書に記載されるとおり「インビトロタンパク質分解アッセイ」および「インビトロ加水分解アッセイ」の一以上で試験したときに、第VII因子関連ポリペプチドと野生型第VII因子の活性の比率が少なくとも1.25である、第VII因子関連ポリペプチドである。
【００５８】
上述したとおり、水分含量は制限されるべきである。本発明のために、第VII因子ポリペプチドをバルクで提供する場合、固体形態または液体形態で提供することができる。しかし典型的には、第VII因子ポリペプチドをバルクで提供する場合、液体形態である。よって、組成物を製造するためのバルクタンパク質の更なる処理には、適切な賦形剤を添加し、バルクから液体を除去する工程が必要であり、ここで賦形剤の添加は、液体を除去する前またはその後の何れに行ってもよい。タンパク質から液体を除去するためのかかる手段の一つは、フリーズドライに関する。したがって、本発明の好ましい態様において組成物は、凍結乾燥ケーキの形態にある。しかし、本発明は、固体組成物が約3% w/w以下の水分含量になるようにバルクポリペプチドから液体を除去するのに適した他の処理を除外するものではない。
【００５９】
更に、本発明によれば、水分含量は、好ましくは約2.5% w/w以下、好ましくは約2% w/w以下、最も好ましくは約1.5% w/w以下である。
【００６０】
理解され得るとおり、本発明は、部分的には、調製の間（たとえば、固体組成物が最大3% w/wの水分含量になるように賦形剤を混合し液体を除去する間）の第VII因子ポリペプチドの分解を制限すること、並びに固体組成物の製造時から使用時まで（たとえば組成物が患者により投与される時まで）の第VII因子ポリペプチドの分解を制限することに関する。
【００６１】
したがって、第VII因子ポリペプチドを含む組成物を安定化する際の更なるパラメーターとして、pHを、水性溶媒（たとえば、純粋または水性バッファー）中に溶解したときに、3ないし9のpH範囲に維持すべきである。すなわち、水分含量を除去する前（たとえば、フリーズドライの前）におけるポリペプチド溶液のpHは、約3ないし約9のpH範囲に維持すべきである。また、このpH範囲を所望の生理的範囲内にし、これにより、非経口手段により組成物を投与したときに使用者に害を引き起こさないようにすることも有利である。好ましくは、溶液のpHは、約4.0〜約9.0、たとえば、4.0〜8.0、4.0〜7.5、4.0〜7.0、4.5〜7.0、4.5〜6.8、4.5〜6.5、5.0〜7.0、5.0〜6.5、5.0〜6.0、5.5〜6.5、または約5.5〜約6.0、たとえば、約5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、または6.0である。
【００６２】
このため、本発明の興味深い態様は、水溶液（たとえば水）中に溶解したときに、組成物のpHを3ないし9の範囲に維持するのに適した物質を更に含む。よって、その適切な態様において、pHを3ないし9の範囲に維持するのに適した物質は、クエン酸、酢酸、ヒスチジン、リンゴ酸、リン酸、酒石酸、コハク酸、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、イミダゾール、ＴＲＩＳ、乳酸、グルタミン酸、ＰＩＰＥＳおよびグリシルグリシンの酸または塩からなる群より選択される。
【００６３】
更に、pHを3ないし9の範囲に維持するのに適した物質は、ここで列挙した物質の少なくとも二つの混合物であって、pH値を特定の範囲にすることができるものであってもよい。適切な物質の濃度は、約0.1 mM〜100 mM；約0.2 mM〜50 mM；約0.5 mM〜25 mM；約1 mM〜20 mM；または約1 mM〜10 mMの範囲内にある。
【００６４】
実施例５および６から理解されるとおり、本発明者らは、適切な量のマンニトール（ポリオール）、スクロース（サッカリド）および抗酸化剤（メチオニン）を組み合わせることにより、製造プロセスの終了時（すなわち、フリーズドライプロセスの終了時）に酸化型および凝集物の含量が少ない組成物を提供した。このように、本発明の組成物は、保存される前に酸化型および凝集物の初期含量が少ないことにより特徴づけられる。
【００６５】
酸化経路並びに凝集経路による第VII因子ポリペプチドの分解は、安定性のセンシティブなパラメーターである。
【００６６】
典型的には、第VII因子ポリペプチドの初期含量の5 % w/w未満、たとえば4、3または2 % w/w未満が、その酸化型に変換されるように、組成物はフリーズドライの終了時に安定化されている。第VII因子ポリペプチドの初期含量は、フリーズドライ工程の前の組成物の調製時に組成物に添加される量である。更に、第VII因子ポリペプチドの初期含量の5 % w/w未満、たとえば4.0 %、3.0 %、2.5 %、2 %、1.5 %未満、または1 %未満が、（例えば、本明細書の実施例に記載される）慣用的な分析方法により測定されるように、凝集物の形態で回収される。
【００６７】
本発明者らは、外界条件下で保存した際に、第VII因子ポリペプチドの更なる分解（すなわち、製造プロセスの終了時から30℃で8ヶ月の保存まで計算された分解）が最小になることを見出した。実施例５から理解されるとおり、30℃で8ヶ月間保存すると、フリーズドライの終了時に存在する酸化型の含量に加えて、第VII因子ポリペプチドの初期含量の10 % w/w未満が酸化型として回収される程度の増加がみられる。極めて重要なことに、抗酸化剤（メチオニン）を含む組成物は、第VII因子ポリペプチドの酸化的分解に対して更に安定であることが見出された。
【００６８】
したがって、本発明によれば、適切な組成物は、外界条件で少なくとも8ヶ月間保存した際の酸化型の含量の増大が制限されている。すなわち、更に興味深い態様において、製造プロセス（たとえばフリーズドライプロセス）の終了後、組成物を30℃で8ヶ月間保存すると、第VII因子ポリペプチドの初期含量の約6 % w/w未満が酸化型に更に分解され、組成物は安定である。更に適切な態様において、製造プロセスの終了時から30℃で8ヶ月の保存まで計算すると、第VII因子ポリペプチドの初期含量の約5、4、3、2、または1.5 % w/w未満が酸化型に更に変換される。本発明のこれらの態様において、組成物を30℃で8ヶ月間保存すると、第VII因子ポリペプチドの初期含量の約5 %（4、3、2、または1.5 %）w/w未満が酸化型に変換され、組成物は安定である。上述のとおり、初期含量は、フリーズドライ工程の前の組成物の調製時に組成物に添加された第VII因子ポリペプチドの量に関する。
【００６９】
記載されるとおり、凝集経路による第VII因子ポリペプチドの分解は、安定性を示す不可欠なパラメーターとして理解することもできる。
本発明者らは、外界条件下で保存した際に、第VII因子ポリペプチドの更なる分解（すなわち、製造プロセスの終了時から30℃で8ヶ月の保存まで計算された分解）が最小になることを見出した。実施例６から理解されるとおり、30℃で8ヶ月間保存すると、第VII因子ポリペプチドの初期含量の約5 % w/w未満、たとえば約4、3、2.5、2.0、1.5、または1.0 w/w未満が、凝集物として更に回収される。極めて重要なことに、サッカリド（スクロース）を含む組成物は、凝集物の形成に対して更に安定であることが見出された。
【００７０】
よって、本発明の興味深い態様は、組成物を30℃で8ヶ月間保存した際に第VII因子ポリペプチドの初期含量の約5 % w/w未満が凝集物に変換される安定な組成物に関する。上述のとおり、第VII因子ポリペプチドの初期含量は、フリーズドライ工程の前の組成物の調製時に組成物に添加される量である。サッカリド、ポリオールおよび抗酸化剤の含量を少なくとも部分的に適切に最適化することにより、組成物を30℃で8ヶ月間保存した際に第VII因子ポリペプチドの初期含量の約4.0 %、3.0 % w/w未満、たとえば約2.5、2.0、1.5、または1.0 % w/wが凝集物に変換され、組成物は安定である。
【００７１】
よって、本発明の組成物は、製造プロセスの終了時（すなわち、フリーズドライプロセスの終了時）に酸化型および凝集物の含量が少ないことが有利であり、そのため本発明の組成物は、保存される前の酸化型および凝集物の初期含量が少ないことにより特徴づけられ、たとえば、製造プロセスの終了時に、第VII因子ポリペプチドの初期含量の約5 % w/w未満、たとえば4 %、3 %、または2 % w/wが酸化型に変換され、5 % w/w未満、たとえば約4.0 %、3.0 %、2.5 %、2 %、1.5 %、または約1 % w/w未満がダイマーまたは高次ポリマーの形態に変換される。
【００７２】
更に本発明の組成物は、保存安定性であることが有利であり、たとえば、30℃で少なくとも8ヶ月間暗所において保存すると、第VII因子ポリペプチドの初期含量の10 % w/w未満、たとえば6 %、5 %、4 %、3 %、2 %、または1.5 % w/wが酸化型に変換され、5 % w/w未満、たとえば4 %、3 %、2.5 %、2 %、1.5 %、または1 % w/w未満がダイマーまたは高次ポリマーの形態に変換される。
【００７３】
以上述べたとおり、前述の安定性の向上は、特定の賦形剤の適切な組み合わせに関する。本発明によれば、サッカリドおよびポリオールが凍結乾燥保護および/または凍結保護特性を示すという理由から、賦形剤は、サッカリド、ポリオールおよび抗酸化剤から成る群より選択すべきである。より具体的には、本発明の適切な態様において、対象のサッカリドは、ジ−およびトリ−サッカリド並びにポリサッカリドであり、そのためサッカリドは、スクロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、シクロデキストリン、マルトデキストリン、デキストランから成る群より選択され得る。更に、幾つかの態様において、ポリオールは、マンニトール、ソルビトールおよびキシリトールから成る群より選択される。更に興味深い態様において、抗酸化剤は、ホモシステイン、システイン、シスタチオニン、メチオニン、グルタチオン、並びにホモシステイン、システイン、シスタチオニン、メチオニンおよびグルタチオンの何れか一つを含有するペプチドから成る群より選択される。
【００７４】
サッカリドおよびポリオールの賦形剤は、それぞれ、ここで列挙した物質の少なくとも２つの混合物であってもよいことが理解される。本発明の一連の態様において、使用されるサッカリドの賦形剤は、ジ−、トリ−および/またはポリサッカリドの少なくとも２つの組み合わせであり、たとえば、スクロースとシクロデキストリンの組み合わせ、トレハロースとシクロデキストリンの組み合わせ、スクロースとデキストランの組み合わせ、またはスクロースとラクトースの組み合わせである。本発明の一連の態様において、使用されるポリオールの賦形剤は、ポリオールの少なくとも２つの組み合わせであり、たとえば、マンニトールとソルビトールの組み合わせ、マンニトールとキシリトールの組み合わせ、またはソルビトールとキシリトールの組み合わせである。本発明の一連の態様において、使用される抗酸化剤の賦形剤は、抗酸化剤の少なくとも２つの組み合わせであり、たとえば、ホモシステイン、システイン、シスタチオニン、グルタチオン、並びにホモシステイン、システイン、シスタチオニン、メチオニンおよびグルタチオンの何れか一つを含有するペプチドの一または複数とメチオニンとの組み合わせである。
【００７５】
本発明者らは、好ましい安定性を少なくとも部分的に達成するための、ポリオールとサッカリドの適切な組み合わせ並びにその含量を認識した。
【００７６】
このため、本発明の更に興味深い態様において、ポリオールは、約5 % w/w〜約90 % w/wの範囲の量で存在すべきである。好ましくは、ポリオールの量は、約18 % w/w〜約88 % w/w、たとえば、約18 % w/w〜約83 % w/w、25 %〜80 %、30 %〜65 %、30 %〜80 %、40 %〜80 %、50 %〜80 %、30 %〜75 %、40 %〜75 %、50 %〜75 %、または約50 %〜約70 % w/wの範囲で存在すべきである。ポリオールは、約0.5〜75 mg/mL、たとえば、約2〜60 mg/mL、5 mg/mL〜55 mg/mL、8〜45 mg/mL、10〜40 mg/mL、10〜30 mg/mL、または約2〜45 mg/mL、5 mg/mL〜45 mg/mL、5〜35 mg/mL、5〜25 mg/mL、5〜20 mg/mL、20〜40 mg/mL、またはたとえば約20〜30 mg/mLの範囲の量で存在すべきである。
【００７７】
更に、その興味深い態様において、並びに本発明の他の興味深い態様において、サッカリドは、約0〜約85 % w/wの範囲の量で組成物中に存在すべきである。更に興味深い態様において、その量は、約3 % w/w〜約80 % w/w、たとえば約 7 % w/w〜約75 % w/w、10 %〜70 %、10 %〜50 %、20 %〜50 %、10 %〜40 %、または約10 % w/w〜約35 % w/wの範囲である。サッカリドは、約0.5〜75 mg/mL、たとえば約2〜60 mg/mL、約5 mg/mL〜55 mg/mL、約8〜45 mg/mL、約10〜40 mg/mL、約10〜30 mg/mL、または約2〜45 mg/mL、約5 mg/mL〜45 mg/mL、約5〜35 mg/mL、約5〜25 mg/mL、たとえば約5〜20 mg/mLの範囲の量で存在すべきである。
【００７８】
更に、本発明者らは、抗酸化剤の適切な量は、約0.05〜10 mg/mL、たとえば約0.1〜5 mg/mL、0.1 mg/mL〜2.5 mg/mL、0.1〜2 mg/mL、または約0.1〜1 mg/mLの範囲にすべきであることを認識した。
【００７９】
重要なことに、ポリオールとサッカリドの比率は、適切に調整される必要がある。本発明の適切な態様において、前述のポリオールは、前述のサッカリドに対して約100：1〜1：50の範囲の重量比で存在する。更に適切な態様において、前述の重量比は、約50：1〜1：10であり、更に好ましくは約20：1〜1：5である。他の適切な態様において、重量比は、約10：1〜1：2、および約6：1〜1：2の範囲に関する。しかし、本発明者らにより見出されたように（実施例５参照）、凍結乾燥ケーキは、多量のサッカリドを含有していると崩壊した。そのような事情なので、非常に適切な態様は、前述の糖アルコールが、前述のサッカリドに対して約4：1〜1：1、たとえば約4：1〜3：2または約1：1〜3：2の範囲の重量比で存在するものに関する。
【００８０】
本発明の幾つかの態様において、ポリオールはマンニトールであり、更なる態様において、サッカリドはスクロースである。また、更なる態様において、抗酸化剤はメチオニンである。
【００８１】
更に本組成物は、非経口投与、とりわけ静脈内投与に許容される組成物を得るために、薬学的に許容可能な他の賦形剤を含むことにより適切に調合されてもよい。非経口投与用の組成物を調製する実際の方法は、当業者に公知または自明であり、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1995)に詳述されている。「賦形剤（excipient）」という用語には、生物学的活性とタンパク質の安定性が実質的に保持されるように、優れた凍結乾燥ケーキ特性を与え、並びにタンパク質の凍結乾燥保護や凍結保護を与え、ｐＨを維持し、許容可能な張度およびタンパク質の適切なコンフォメーションを保存の間維持する薬学的に許容可能な試薬（充填剤）が含まれる。
【００８２】
このように本発明によれば、本組成物は、さらに張度調節物質を含む。張度調節剤は、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化カルシウムから成る群より選択され得る。しかし、他の適切な張度調節剤を除外するものではない。また、使用前に組成物を等張にするか、またはほぼ等張にする（たとえば、僅かに高張または低張にする）ものであれば、組成物がずっと高濃度の張度調節物質を含んでいてもよく、例えば、バルク組成物は生理的範囲と等張にする必要はないことに留意されたい。
【００８３】
界面活性剤を添加することにより、第VII因子ポリペプチドを含む組成物をさらに安定化することができる。このため、本発明の更に興味深い態様では、本組成物はさらに界面活性剤を含み、界面活性剤は、ポリソルベート、たとえばTween(登録商標)、たとえばポリソルベート20または80；ポリオキシエチレンアルキルエーテル、たとえばポリオキシル23ラウリルエーテル（Brij 35(登録商標)）またはポロキサマー、たとえばポロキサマー188（例えば、Pluronic(登録商標)）またはポロキサマー407（例えば、Lutrol(登録商標)）、およびその他のエチレン／ポリプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、たとえばＰＥＧ８０００から成る群より選択される。典型的には、界面活性剤は、0.005〜5 mg/mLの量で添加される。好ましい量は、Tween 20および/またはTween 80については0.01〜3 mg/mL、より好ましくは0.01〜0.3 mg/mLであり、ポロキサマー188については、0.05〜3.0 mg/mLである。
【００８４】
本発明の更に好ましい態様において、本組成物は、充填剤として作用する他の薬学的な賦形剤をさらに含む。すなわち、マンニトール以外の充填剤を本組成物中に含めてもよい。特に、フリーズドライによって調製された組成物中には、充填剤が含められる。
【００８５】
本組成物中の第VII因子ポリペプチドの初期含量は、好ましくは約0.6 mg/mL〜約10.0 mg/mL、たとえば約0.6 mg/mL〜約6.0 mg/mL、約0.6 mg/mL〜約5 mg/mL、または約0.6 mg/mL〜約4 mg/mLである。
【００８６】
一つの態様において、本組成物は、第VII因子ポリペプチド、マンニトール、スクロース、およびTween 80を含み、約3％以下の水分含量を有し、組成物を水に溶かしたときに5.0ないし7.0の範囲のpHを有する。一つの態様において、本組成物は、CaCl2、NaCl、およびグリシルグリシンのリストから選択される一以上の構成成分をさらに含む。一つの態様において、第VII因子ポリペプチドはヒト第VIIa因子である。
【００８７】
一つの態様において、本組成物は、第VII因子ポリペプチド、マンニトール、スクロース、メチオニン、およびTween 80を含み、約3％以下の水分含量を有し、組成物を水に溶かしたときに5.0ないし7.0の範囲のpHを有する。一つの態様において、本組成物は、CaCl2、NaCl、およびグリシルグリシンのリストから選択される一以上の構成成分をさらに含む。一つの態様において、第VII因子ポリペプチドはヒト第VIIa因子である。
【００８８】
別の態様において、本組成物は、第VII因子ポリペプチド、マンニトール、スクロース、ヒスチジン、およびTween 80を含み、約3％以下の水分含量を有し、組成物を水に溶かしたときに5.0ないし7.0の範囲のpHを有する。一つの態様において、本組成物は、CaCl2、NaCl、およびグリシルグリシンのリストから選択される一以上の構成成分をさらに含む。一つの態様において、第VII因子ポリペプチドはヒト第VIIa因子である。
【００８９】
一つの態様において、本組成物は、第VII因子ポリペプチド、マンニトール、スクロース、メチオニン、ヒスチジン、およびTween 80を含み、約3％以下の水分含量を有し、組成物を水に溶かしたときに5.0ないし7.0の範囲のpHを有する。一つの態様において、本組成物は、CaCl2、NaCl、およびグリシルグリシンのリストから選択される一以上の構成成分をさらに含む。一つの態様において、第VII因子ポリペプチドはヒト第VIIa因子である。
【００９０】
別の態様において、本組成物は、第VII因子ポリペプチド、マンニトール、スクロース、およびポロキサマー188を含み、約3％以下の水分含量を有し、組成物を水に溶かしたときに5.0ないし7.0の範囲のpHを有する。一つの態様において、本組成物は、CaCl2、NaCl、およびグリシルグリシンのリストから選択される一以上の構成成分をさらに含む。一つの態様において、第VII因子ポリペプチドはヒト第VIIa因子である。
【００９１】
別の態様において、本組成物は、第VII因子ポリペプチド、マンニトール、スクロース、メチオニン、およびポロキサマー188を含み、約3％以下の水分含量を有し、組成物を水に溶かしたときに5.0ないし7.0の範囲のpHを有する。一つの態様において、本組成物は、CaCl2、NaCl、およびグリシルグリシンのリストから選択される一以上の構成成分をさらに含む。一つの態様において、第VII因子ポリペプチドはヒト第VIIa因子である。
【００９２】
別の態様において、本組成物は、第VII因子ポリペプチド、マンニトール、スクロース、ヒスチジン、およびポロキサマー188を含み、約3％以下の水分含量を有し、組成物を水に溶かしたときに5.0ないし7.0の範囲のpHを有する。一つの態様において、本組成物は、CaCl2、NaCl、およびグリシルグリシンのリストから選択される一以上の構成成分をさらに含む。一つの態様において、第VII因子ポリペプチドはヒト第VIIa因子である。
【００９３】
別の態様において、本組成物は、第VII因子ポリペプチド、マンニトール、スクロース、ヒスチジン、メチオニン、およびポロキサマー188を含み、約3％以下の水分含量を有し、組成物を水に溶かしたときに5.0ないし7.0の範囲のpHを有する。一つの態様において、本組成物は、CaCl2、NaCl、およびグリシルグリシンのリストから選択される一以上の構成成分をさらに含む。一つの態様において、第VII因子ポリペプチドはヒト第VIIa因子である。
【００９４】
更なる態様において、本組成物は、以下の表Ａに示すとおりである。
【表Ａ】
0004648002.tif 000002
【００９５】
更なる態様において、本組成物は、以下の表Ｂに示すとおりである。
【表Ｂ】
0004648002.tif 000003
【００９６】
更なる態様E1〜L1において、本組成物は賦形剤を含有し、その量は上記表Ｂに記載されるが、pH 5.9に調合される。
更なる態様E2〜L2において、本組成物は賦形剤を含有し、その量は上記表Ｂに記載されるが、pH 5.8に調合される。
更なる態様E3〜L3において、本組成物は賦形剤を含有し、その量は上記表Ｂに記載されるが、pH 5.7に調合される。
更なる態様E4〜L4において、本組成物は賦形剤を含有し、その量は上記表Ｂに記載されるが、pH 5.6に調合される。
更なる態様E5〜L5において、本組成物は賦形剤を含有し、その量は上記表Ｂに記載されるが、pH 5.5に調合される。
【００９７】
上述したように、本発明者らは、安定化剤を含むことが重要である薬学的に許容可能な選択された賦形剤を含む固形組成物中に第VII因子ポリペプチドタンパク質を与えることによって、第VII因子ポリペプチドを安定化する方法を提供した。本発明によれば、かかる安定化剤は、サッカリド、ポリオールまたは抗酸化剤である賦形剤から選択される少なくとも２群の賦形剤の組み合わせから成る。更に本発明者らは、サッカリド（スクロース）および抗酸化剤（メチオニン）が、第VII因子ポリペプチドの安定性を向上させるのに不可欠であることを見出した。
【００９８】
従って、本発明のさらなる側面は、安定な第VII因子ポリペプチドを調製する方法に関する。本方法は、
ｉ）前記第VII因子ポリペプチドを、
ａ）抗酸化剤およびマンニトールの組み合わせ；
ｂ）メチオニンおよびポリオールの組み合わせ；
ｃ）サッカリドおよびマンニトールの組み合わせ；
ｄ）スクロースおよびポリオールの組み合わせ；および
ｅ）メチオニン
から成る群より選択される少なくとも一の安定化剤を含む溶液中に提供する工程と、
ii）約3% w/w以下の水分含量を有する固形組成物が得られるように、前記溶液を処理する工程と
を含む。
【００９９】
特定の興味深い態様において、本方法は、前記抗酸化剤が、ホモシステイン、システイン、シスタチオニン、メチオニン、グルタチオニン、並びにホモシステイン、システイン、シスタチオニン、メチオニンおよびグルタチオニンの何れか一つを含有するペプチドから成る群より選択されることを含む。好ましい態様において、抗酸化剤はメチオニンである。更に興味深い態様において、前記サッカリドは、スクロース、デキストロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、シクロデキストリン、マルトデキストリンおよびデキストランから成る群より選択される。好ましい態様において、ポリオールはマンニトールであり、サッカリドはスクロースである。その上、更に好ましい態様において、抗酸化剤はメチオニンである。
【０１００】
好ましくは、前記溶液中に存在するサッカリドの含量および必要に応じて加えられる抗酸化剤の含量は、ｉ）卓越して安定化された第VII因子ポリペプチドが得られるように調節すべきである。
【０１０１】
本発明によれば、サッカリドは、約0.5〜75 mg/mL、たとえば約2〜60 mg/mL、約5 mg/mL〜55 mg/mL、約8〜45 mg/mL、約10〜40 mg/mL、約10〜30 mg/mL、または約2〜45 mg/mL、約5 mg/mL〜45 mg/mL、約5〜35 mg/mL、約5〜25 mg/mL、たとえば約5〜20 mg/mLの範囲の量で存在すべきである。
【０１０２】
本発明によれば、ポリオールは、約0.5〜75 mg/mL、たとえば約2〜60 mg/mL、約5 mg/mL〜55 mg/mL、約8〜45 mg/mL、約10〜40 mg/mL、約10〜30 mg/mL、または約2〜45 mg/mL、約5 mg/mL〜45 mg/mL、約5〜35 mg/mL、約5〜25 mg/mL、たとえば約5〜20 mg/mLの範囲の量で存在すべきである。
【０１０３】
抗酸化剤は、約0.05〜10 mg/mL、好ましくは約0.1〜5 mg/mL、より好ましくは約0.1 mg/mL〜2.5 mg/mL、更に好ましくは約0.1〜2 mg/mL、最も好ましくは約0.1〜1 mg/mLの範囲の量で提供されるべきである。
【０１０４】
好ましい態様において、安定な第VII因子ポリペプチドを調製する方法は、フリーズドライを含む。フリーズドライは、前記第VII因子ポリペプチドを含む溶液を凍結乾燥バイアル中などに充填するプロセスに関する。フリーズドライを開始する前に、前記第VII因子ポリペプチドには、必要に応じて、無菌ろ過を行ってもよい。凍結乾燥機の棚を冷却して、バイアルと溶液を臨界生成物温度以下に凍結させる。真空を導入することにより水を除去し、凍結乾燥機のアイスコンデンサ上で水蒸気を凝結させる。生成物が乾燥した時点（例えば、上述したKarl Fischer電量滴定によって測定された）残余水分含量が通常3 %未満となった時点で、バイアルを閉めて封をする。製造が終了し、この時点で、組成物は凍結乾燥ケーキの形態にある。
【０１０５】
かかる組成物は、注射可能な手段で患者に投与するときには、使用前に、適切な液体中に再構成させる必要がある。かかる組成物は、他の目的、例えば、他の薬学的組成物に再調合する目的で再構成させることもできる。しかしながら、本発明は、組成物を固体の形態で患者に投与し得ることを除外するものではない。
【０１０６】
本組成物は、許容可能な、好ましくは無菌性希釈剤またはキャリア、好ましくは水性キャリアを用いて再構成される。様々な水性キャリア、例えば、水（例えば、注射用蒸留水(Water for Injection)／ＷＦＩ）、緩衝化された水、食塩水（例えば、0.4 %食塩水）、グリシン（例えば、0.3 %グリシン）、ヒスチジンなどを使用することができる。また、再構成希釈剤は、たとえばカルシウム塩（例えば、CaCl2）またはナトリウム塩とカルシウム塩の組み合わせ（例えば、NaClとCaCl2）などの一以上の塩を含有していてもよい。
【０１０７】
再構成された組成物は、予防および／または治療的処置のために非経口投与することが意図される。好ましくは、薬学的組成物は、非経口投与、すなわち、静脈内、皮下、または筋内投与されるか、あるいは連続的または間歇的な注入によって投与される。
【０１０８】
従って、本発明のさらなる側面は、第VII因子応答性症候群を治療するための医薬を調製するための、安定化された固形組成物の使用に関する。
【０１０９】
すなわち、本発明の１つの側面は、第VII因子応答性症候群を治療するための医薬であって、
第VII因子ポリペプチド、並びに
ａ）抗酸化剤およびマンニトールの組み合わせ；
ｂ）メチオニンおよびポリオールの組み合わせ；
ｃ）サッカリドおよびマンニトールの組み合わせ；
ｄ）スクロースおよびポリオールの組み合わせ；および
ｅ）メチオニン
から成る群より選択される少なくとも一の安定化剤
を含み、かつ約3%以下の水分含量を有する組成物を含む医薬を調製するための第VII因子ポリペプチドの使用に関する。
【０１１０】
さらに、別の側面において、本発明は、第VII因子応答性症候群を治療するために、前記安定化された第VII因子ポリペプチドを患者に投与することに関する。このように、本発明は、第VII因子応答性症候群を治療する方法であって、
第VII因子ポリペプチド、並びに
ａ）抗酸化剤およびマンニトールの組み合わせ；
ｂ）メチオニンおよびポリオールの組み合わせ；
ｃ）サッカリドおよびマンニトールの組み合わせ；
ｄ）スクロースおよびポリオールの組み合わせ；および
ｅ）メチオニン
から成る群より選択される少なくとも一の安定化剤
を含み、かつ約3%以下の水分含量を有する組成物の有効量を、それを必要とする被検体に投与することを含む方法に関する。
【０１１１】
異なる態様において、前記第VII因子応答性症候群は、血友病Ａ、血友病Ｂ、第XI因子欠損症、第VII因子欠損症、血小板減少症、フォン・ビルブラント病、凝固因子阻害剤の存在、外科手術または外傷である。加えて、第VII因子応答性症候群は、抗凝固療法と関連する場合がある。
【０１１２】
上述のとおり、本組成物は固形状である。従って、適切な態様において、医薬を非経口投与できるようにするため、医薬は溶解されるのに適していなければならない。このため、本組成物を患者に投与する場合、投与工程の前に、本組成物を適切な液体中に溶解させる工程を含む。
【０１１３】
本明細書で使用される略語：
FVII              単一鎖形態の凝固第VII因子
FVIIa             切断され活性化された二本鎖形態の凝固第VII因子
rFVII(rFVIIa)    組換え第VII因子（組換え第VIIa因子）
以下の実施例は、説明のために記載され、限定するためのものではない。
【実施例】
【０１１４】
［実施例１］
第VII因子ポリペプチドを含み、実施例２に従って調製された組成物を示す。典型的な賦形剤およびその典型的な量を示す。
表１は、組成物が液体の形態である場合、すなわち、製造を完了する（たとえば、フリーズドライを完了する）前の組成物、または再構成された溶液である場合の、活性成分と賦形剤の濃度を示す。
表２は、組成物が固体の形態である場合、すなわち、フリーズドライされた形態である場合の、活性成分と賦形剤の濃度を示す。
【０１１５】
【表１】
0004648002.tif 000004
【０１１６】
【表２】
0004648002.tif 000005
【０１１７】
［実施例２］
組成物の製造
一般に、組成物は、精製されたバルク溶液から調製した。賦形剤を添加し、溶液を所望のrFVIia濃度に希釈した。得られた溶液を、滅菌されたメンブレンフィルター（0.2ミクロン相当の孔サイズ）を用いて無菌ろ過を行い、無菌のガラスバイアルに充填した。バイアルをフリーズドライし、アルミニウム・フリップオフタイプのキャップで閉めて封をした。
【０１１８】
［実施例３］
種々の量の塩化ナトリウム、マンニトール、スクロースおよびメチオニンを含み、種々のpH値を有する組成物１〜１９を、実施例２に記載される方法に従って調製した。組成物は、固定した濃度の第VII因子（1.0 mg/mL）、塩化カルシウム、2H2O（1.47 mg/mL）、グリシルグリシン（1.32 mg/mL）およびポリソルベート80（1.0 mg/mL）を含有していた。
【０１１９】
【表３】
0004648002.tif 000006
【０１２０】
［実施例４］
安定性を示すパラメーターを測定する際に使用する分析法：
Ａ．逆相HPLC（RP-HPLC)による酸化型の測定:
HPLCカラム：5μmの粒径と300Åの孔径を有するブチル結合シリカを充填した4.5×250 mmカラム。カラム温度：70℃。溶出液Ａ：水99.9% v/vおよびトリフルオロ酢酸0.1% v/v。溶出液Ｂ：アセトニトリル80% v/v、トリフルオロ酢酸0.09% v/v、および水19.91% v/v。30分でX %のＢが(X+13)%のＢまで増加する線形グラジエントで、カラムを溶出した。流速：1.0 mL/分。検出：214 nm。
酸化型は、第VII因子ポリペプチドのメチオニンスルホキシドである。たとえば、２つの主なFVII誘導体は、Met(O)298 FVIIとMet(O)306 FVIIである。
酸化型の含量は、酸化型の第VII因子として回収される調製時の組成物中の第VII因子の初期量に対するパーセントとして表される。
【０１２１】
Ｂ．高性能ゲル浸透クロマトグラフィー（GP-HPLC）による第VII因子ポリペプチドの凝集物の測定
GP-HPLCは、移動相として5 %イソプロパノールを含有する0.2 M硫酸アンモニウム  pH 7.0を用いて、Waters Protein Pak 300 SWカラム、7.5×300 mm上で行った。流速：0.5 mL/分、検出：215 nm。
凝集物の含量は、ダイマー、オリゴマーおよびポリマー型の第VII因子として回収された調製時の組成物中の第VII因子の初期量に対するパーセントとして表される。
【０１２２】
［実施例５］
フリーズドライプロセスを終了した後および保存時の第VIIa因子の酸化型の含量：
実施例３の組成物１〜１９について、フリーズドライを終了した時および30℃で2ヶ月および8ヶ月保存した時の酸化型の含量を、方法Ａ（実施例４）により分析した。
【０１２３】
【表４】
0004648002.tif 000007
【０１２４】
統計的解析により、メチオニンを含む組成物が、酸化的分解に対して高い安定性を有することが分かる。
【０１２５】
［実施例６］
フリーズドライプロセスを終了した後および保存時の第VIIa因子の凝集物の含量：
実施例３の組成物１〜１９について、フリーズドライを終了した時および30℃で2ヶ月および8ヶ月保存した時の凝集物の含量を、方法Ｂ（実施例４）により分析した。
【０１２６】
【表５】
0004648002.tif 000008
【０１２７】
統計的解析により、組成物中のスクロースの存在が、凝集物の生成を減少させるために重要であることが分かる。
【０１２８】
［実施例７］
フリーズドライプロセスを終了した後の第VIIa因子のダイマーおよびオリゴマー型の含量：
以下の表に記載されるポリオールおよびサッカリドを含む組成物Ａを、実施例２に記載される方法に従って調製した。組成物は、第VIIa因子（1.0 mg/mL）、塩化カルシウム、2H2O（1.47 mg/mL）、グリシルグリシン（1.32 mg/mL）およびポリソルベート80（0.7 mg/mL）、pH 5.0を更に含有していた。
組成物Ａについて、フリーズドライを終了した時および30℃で1ヶ月および2ヶ月保存した時の凝集物の含量を、方法Ｂ（実施例４）により分析した。表には、凝集物として回収された第VIIa因子の初期含量に対する％を示す。
【０１２９】
【表６】
0004648002.tif 000009
【０１３０】
［実施例８］
フリーズドライケーキの構造的安定性を、種々の組成物１〜１９（実施例３参照）について示す。スクロースに対するマンニトールの比率を、各組成物について報告する。
【０１３１】
【表７】
0004648002.tif 000010
【０１３２】
［実施例９］
以下の調合物を、1 mLおよび5 mLの充填体積を用いて、実施例２に記載されるとおり調製した：
【表８】
0004648002.tif 000011
【０１３３】
調合物の安定性は、25℃、30℃、および40℃で調査し、以下の結果を得た。分析前に、バイアルを水で再構成した。
ダイマーおよびオリゴマー型
ダイマーおよびオリゴマー型については、実施例４に記載されるとおりGP-HPLCにより測定した。すべての結果を%で記載する。
【０１３４】
【表９】
0004648002.tif 000012
【０１３５】
更に、調合物Ａ（＝Ref）および調合物Ｂ（＝New）、充填体積5 mLの凝集物の形態の含量は、図２ａから理解できる。
酸化型
酸化型の含量は、実施例４に記載されるとおりRP-HPLCにより測定した。
【０１３６】
【表１０】
0004648002.tif 000013
【０１３７】
更に、調合物Ａ（＝Ref）および調合物Ｂ（＝New）、充填体積5 mLの酸化型の含量は、図２ｂから理解できる。
活性
30℃で3ヶ月間保存された調合物について、実施例１２に記載されるとおり一段階の凝固アッセイを行うことにより活性を測定した。調合物中のrFVIIaの含量に基づいて比活性を計算し、以下の結果を得た：
【０１３８】
【表１１】
0004648002.tif 000014
【０１３９】
結果の解釈：
この結果は、マンニトール、スクロース、およびメチオニンを含有する調合物ＢおよびＣは、安定性が高いこと、すなわち、ダイマーおよびオリゴマー型並びに酸化型の含量がゆっくり増加することを示す。従って、これら調合物の活性は、30℃で3ヶ月保存した後に測定すると高い。
【０１４０】
［実施例１０］
以下の調合物を、5 mLの充填体積を用いて、実施例２に記載されるとおり調製した。
【表１２】
0004648002.tif 000015
【０１４１】
バイアルを水で再構成し、調合物の物理的安定性を試験するために19時間振盪した。視覚による観察と400 nmにおけるUV吸光度（以下の表のAbs）の測定により、振盪の効果を調査した。以下の結果は、界面活性剤を添加することにより物理的安定性が高まることを示している。
【０１４２】
【表１３】
0004648002.tif 000016
【０１４３】
［実施例１１］
6つの調合物を、実施例２に記載されるとおり調製した。調合物の組成は以下のとおりである：
rFVIIa                    1.0 mg/mL
CaCl2                         10 mM
グリシルグリシン              10 mM
L-ヒスチジン                  10 mM
NaCl                          39 mM
Tween 80                 0.07 mg/ml
マンニトール               25 mg/ml
スクロース                 10 mg/ml
【０１４４】
6つの調合物のそれぞれを、様々なpHに調整した：
調合物 A: pH 5.0
調合物 B: pH 5.5
調合物 C: pH 6.0
調合物 D: pH 6.5
調合物 E: pH 7.0
調合物 F: pH 7.5
6つの調合物の安定性を、25℃および40℃で保存したバイアルについて調査した。以下の表に示す結果（および図１ａおよび１ｂ）を得た。
【０１４５】
【表１４】
0004648002.tif 000017
【０１４６】
ダイマーおよびオリゴマー型および酸化型の含量は、実施例４に記載されるとおり測定した。
【０１４７】
［実施例１２］
第VII因子ポリペプチドの生物学的活性を試験するためのアッセイ：
第VIIa因子活性の試験
第VIIa因子活性を試験しこれにより適切な第VIIa因子変異体を選択するために適したアッセイは、簡単な予備的なインビトロ試験として実施することができる：（「インビトロ加水分解アッセイ」）。
【０１４８】
インビトロ加水分解アッセイ
天然の（野生型）第VIIa因子および第VIIa因子変異体（両者とも、これ以降「第VIIa因子」と称する）の比活性をアッセイすることができる。これらは、並行してアッセイし、直接これらの比活性を比較してもよい。アッセイは、マイクロタイタープレート（MaxiSorp、Nunc、Denmark）で実施される。最終濃度1 mMの色素生産性基質D-Ile-Pro-Arg-p-ニトロアニリド（S-2288、Chromogenix、Sweden）を、0.1 M NaCl、5 mM CaCl2および1 mg/mL ウシ血清アルブミンを含む50 mM Hepes、pH 7.4中の第VIIa因子（最終濃度100 nM）に添加する。405 nmにおける吸光度を、SpectraMaxTM 340プレートリーダー（Molecular Devices、USA）で連続的に測定する。20分のインキュベーションの間に発生した吸光度を、酵素を含んでいないブランクのウェルの吸光度を減算した後に、変異体および野生型の第VIIa因子の活性の間の比を算出するために使用する：
比 =（Ａ405 nm 第VIIa因子変異体）/（Ａ405 nm 第VIIa因子野生型）。
【０１４９】
その結果に基づいて、天然の第VIIa因子に匹敵するか、それよりも高い活性を有する第VIIa因子変異体、たとえば変異体の活性および天然の第VII因子（野生型FVII）の活性の間の比が、対1.0を超える周辺にある変異体などを、同定することができる。
【０１５０】
また、第VIIa因子または第VIIa因子変異体の活性は、第X因子などの生理学的な基質を適切には100〜1000 nMの濃度で使用して測定してもよく、この場合、第Xa因子の生成を、適切な色素生産性基質（例えば、S-2765）を添加した後に測定する（「インビトロタンパク質分解アッセイ」）。加えて、この活性アッセイは、生理的な温度で実行してもよい。
【０１５１】
インビトロタンパク質分解アッセイ
天然の（野生型）第VIIa因子および第VIIa因子変異体（両者とも、これ以降「第VIIa因子」と称する）を、並行してアッセイし、直接これらの比活性を比較する。アッセイは、マイクロタイタープレート（MaxiSorp、Nunc、Denmark）で実施される。0.1 M NaCl、5 mM CaCl2および1 mg/mL ウシ血清アルブミンを含む100μLの50 mM Hepes、pH7.4中で第VIIa因子（10 nM）および第X因子（0.8μM）を、15分間インキュベートする。次いで、0.1 M NaCl、20 mM EDTAおよび1 mg/mL ウシ血清アルブミンを含む50μLの50 mM Hepes、pH 7.4を添加することにより、第X因子の切断を停止する。生成した第Xa因子の量は、色素生産性基質Z-D-Arg-Gly-Arg-p-ニトロアニリド（S-2765、Chromogenix、Sweden）（最終濃度0.5 mM）を添加することにより測定する。405 nmにおける吸光度を、SpectraMaxTM 340プレートリーダー（Molecular Devices、USA）で連続的に測定する。10分間に発生した吸光度を、FVIIaを含んでいないブランクのウェルの吸光度を減算した後に、変異体および野生型の第VIIa因子のタンパク分解活性の間の比を算出するために使用する：
比=（Ａ405 nm第VIIa因子変異体）/（Ａ405 nm第VIIa因子野生型）。
【０１５２】
その結果に基づいて、天然の第VIIa因子に匹敵するか、それよりも高い活性を有する第VIIa因子変異体、たとえば変異体の活性および天然の第VII因子（野生型FVII）の活性の間の比が、対1.0を超える周辺にある変異体などを、同定することができる。
【０１５３】
トロンビン生成アッセイ：
第VII因子もしくは第VII因子関連ポリペプチド、または第VIII因子もしくは第VIII因子関連ポリペプチド（たとえば、変異体）がトロンビンを生成する能力は、全ての関連した凝固因子および生理学的濃度の阻害剤および活性化された血小板を含むアッセイで測定することができる（参照により本明細書の開示内容の一部とする、Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547の543ページに記載される）。
【０１５４】
凝固アッセイ：
第VII因子ポリペプチドの活性は、本質的にはWO 92/15686またはUS 5,997,864に記載されるとおり、一段階の凝固アッセイを用いて測定することもできる。簡単に述べると、試験するサンプルを、50 mM Tris (pH 7.5)、0.1 % BSA中に希釈し、100μLを、100μLの第VII因子欠損血漿および10 mM Ca2+を含有する200μLのトロンボプラスチンCとともにインキュベートする。凝固時間を測定し、レファレンススタンダードまたはクエン酸塩含有の正常なヒト血漿プールを順次希釈して用いた標準曲線と比較する。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】安定性を調査した結果を示すグラフ。
【図２】安定性を調査した結果を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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