(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造変化により第１の糖鎖及び第２の糖鎖として存在し得る標的糖鎖と、第１の糖鎖及び第２の糖鎖に結合し得る第１〜第ｎのレクチン（ｎは２以上の整数である。）とを混合したときの、標的糖鎖に対する第１のレクチンの結合量及び第２のレクチンの結合量の比を指標として、標的糖鎖における構造変化の有無を検出する方法であって、次式（Ｉ）：
【数１】
0004725519.tif 000008
［式中、Ａ１１は、第１の糖鎖と第１のレクチンとを他のレクチンの不存在下で混合したときの、第１の糖鎖１分子に対する第１のレクチンの結合量を表し、Ａ１２は、第１の糖鎖と第２のレクチンとを他のレクチンの不存在下で混合したときの、第１の糖鎖１分子に対する第２のレクチンの結合量を表し、Ａ２１は、第２の糖鎖と第１のレクチンとを他のレクチンの不存在下で混合したときの、第２の糖鎖１分子に対する第１のレクチンの結合量を表し、Ａ２２は、第２の糖鎖と第２のレクチンとを他のレクチンの不存在下で混合したときの、第２の糖鎖１分子に対する第２のレクチンの結合量を表し、Ｂ１１は、第１の糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときの、第１の糖鎖１分子に対する第１のレクチンの結合量を表し、Ｂ１２は、第１の糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときの、第１の糖鎖１分子に対する第２のレクチンの結合量を表し、Ｂ２１は、第２の糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときの、第２の糖鎖１分子に対する第１のレクチンの結合量を表し、Ｂ２２は、第２の糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときの、第２の糖鎖１分子に対する第２のレクチンの結合量を表す。］
を満たす第１〜第ｎのレクチンを用いる方法。
【請求項２】
第１の糖鎖は第１のレクチンが結合し得る第１の糖鎖構造を有するが、第２の糖鎖は第１の糖鎖構造を有しない点で両糖鎖の構造は異なり、それ以外の点で両糖鎖の構造は実質的に同一である請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１の糖鎖において、第１の糖鎖構造に対して第１のレクチンが結合すると、第１の糖鎖に対する第２のレクチンの結合が抑制される請求項２記載の方法。
【請求項４】
第１の糖鎖及び第２の糖鎖が、第２のレクチンが結合し得る第２の糖鎖構造を有しており、
第１の糖鎖において、第１の糖鎖構造に対して第１のレクチンが結合すると、第２の糖鎖構造に対する第２のレクチンの結合が抑制される請求項３記載の方法。
【請求項５】
第１のレクチン及び第２のレクチンにそれぞれ区別して検出可能な標識物質が結合しており、標識物質の量に基づいて、標的糖鎖に対する第１のレクチンの結合量及び第２のレクチンの結合量を測定する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
第１〜第ｎのレクチンと混合する標的糖鎖が固体支持体に固定されている請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
固体支持体が粒子又は磁性粒子である請求項６記載の方法。
【請求項８】
標的糖鎖が、糖タンパク質に含まれる糖鎖である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的糖鎖における構造変化を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖鎖の構造は、種々の原因により変化し得る。例えば、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）に含まれる糖鎖に関しては、肝細胞ガンの進行に伴って、α−Ｌ−フコース残基、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン）等が付加される。したがって、ＡＦＰに含まれる糖鎖の構造変化を検出することにより、肝細胞ガンの診断が可能になると考えられる。【０００３】
構造変化により第１の糖鎖及び第２の糖鎖として存在し得る標的糖鎖における構造変化の検出は、例えば、標的糖鎖と、第１の糖鎖に対する結合性及び第２の糖鎖に対する結合性が異なるレクチンとを混合したときの、標的糖鎖に対するレクチンの結合性を指標として行うことができる（特許文献１参照）。しかしながら、この場合、標的糖鎖とレクチンとの結合挙動を詳細に調べ、結合定数等の結合性に関する情報を求める必要がある。【０００４】
また、第１の糖鎖及び第２の糖鎖が、糖鎖構造は異なるがタンパク質構造は実質的に同一な糖タンパク質である場合、標的糖鎖における構造変化の検出は、例えば、標的糖鎖と、第１の糖鎖は有するが第２の糖鎖は有しない特定の糖鎖構造を認識するレクチンと、当該レクチンが結合していない第１の糖鎖及び第２の糖鎖に結合する性質を有するが、当該レクチンが結合した第１の糖鎖への結合が妨げられる性質を有する抗体とを混合し、標的糖鎖に抗体がしたか否かを指標として行うことができる（特許文献２参照）。しかしながら、この場合、レクチンが結合していない第１の糖鎖及び第２の糖鎖に結合する性質を有するが、当該レクチンが結合した第１の糖鎖への結合が妨げられる性質を有する特殊な抗体を用いる必要がある。
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００２／０６６６３４号パンフレット
【特許文献２】特許第３０７０４１８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、構造変化により第１の糖鎖及び第２の糖鎖として存在し得る標的糖鎖における構造変化を容易かつ効率的に検出することができる方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は、構造変化により第１の糖鎖及び第２の糖鎖として存在し得る標的糖鎖と、第１の糖鎖及び第２の糖鎖に結合し得る第１〜第ｎのレクチン（ｎは２以上の整数である。）とを混合したときの、標的糖鎖に対する第１のレクチンの結合量及び第２のレクチンの結合量の比を指標として、標的糖鎖における構造変化の有無を検出する方法であって、次式（Ｉ）：【０００７】
【数１】
0004725519.tif 000002
【０００８】
［式中、Ａ１１は、第１の糖鎖と第１のレクチンとを他のレクチンの不存在下で混合したときの、第１の糖鎖１分子に対する第１のレクチンの結合量を表し、Ａ１２は、第１の糖鎖と第２のレクチンとを他のレクチンの不存在下で混合したときの、第１の糖鎖１分子に対する第２のレクチンの結合量を表し、Ａ２１は、第２の糖鎖と第１のレクチンとを他のレクチンの不存在下で混合したときの、第２の糖鎖１分子に対する第１のレクチンの結合量を表し、Ａ２２は、第２の糖鎖と第２のレクチンとを他のレクチンの不存在下で混合したときの、第２の糖鎖１分子に対する第２のレクチンの結合量を表し、Ｂ１１は、第１の糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときの、第１の糖鎖１分子に対する第１のレクチンの結合量を表し、Ｂ１２は、第１の糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときの、第１の糖鎖１分子に対する第２のレクチンの結合量を表し、Ｂ２１は、第２の糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときの、第２の糖鎖１分子に対する第１のレクチンの結合量を表し、Ｂ２２は、第２の糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときの、第２の糖鎖１分子に対する第２のレクチンの結合量を表す。］
を満たす第１〜第ｎのレクチンを用いる方法を提供する。【０００９】
標的糖鎖は、第１の糖鎖のみとして存在する可能性、第２の糖鎖のみとして存在する可能性、並びに第１の糖鎖及び第２の糖鎖の混合状態として存在する可能性がある。すなわち、標的糖鎖の総分子数（Ｎ）は、［第１の糖鎖として存在する標的糖鎖の分子数（Ｎ１）］＋［第２の糖鎖として存在する標的糖鎖の分子数（Ｎ２）］で表される。なお、Ｎ１及びＮ２は０以上の整数を表すが、Ｎ１及びＮ２が同時に０となることはない。【００１０】
標的糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときの、標的糖鎖に対する第１のレクチンの結合量（Ｄ１）は、［第１の糖鎖１分子に対する第１のレクチンの結合量（Ｂ１１）］×［第１の糖鎖として存在する標的糖鎖の分子数（Ｎ１）］＋［第２の糖鎖１分子に対する第１のレクチンの結合量（Ｂ２１）］×［第２の糖鎖として存在する標的糖鎖の分子数（Ｎ２）］で表され、標的糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときの、標的糖鎖に対する第２のレクチンの結合量（Ｄ２）は、［第１の糖鎖１分子に対する第２のレクチンの結合量（Ｂ１２）］×［第１の糖鎖として存在する標的糖鎖の分子数（Ｎ１）］＋［第２の糖鎖１分子に対する第２のレクチンの結合量（Ｂ２２）］×［第２の糖鎖として存在する標的糖鎖の分子数（Ｎ２）］で表される。【００１１】
上記式（Ｉ）を満たす第１〜第ｎのレクチンを使用すると、標的糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときの、標的糖鎖に対する第１のレクチンの結合量（Ｄ１）と、標的糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときの、標的糖鎖に対する第２のレクチンの結合量（Ｄ２）との比（Ｄ１／Ｄ２又はＤ２／Ｄ１）は、標的糖鎖の存在状態（すなわち、Ｎ１及びＮ２の値）に応じて、次のように変動する。【００１２】
（１）標的糖鎖が第１の糖鎖のみとして存在する場合（Ｎ１≧１，Ｎ２＝０）
Ｄ１／Ｄ２＝Ｂ１１／Ｂ１２
Ｄ２／Ｄ１＝Ｂ１２／Ｂ１１【００１３】
（２）標的糖鎖が第２の糖鎖のみとして存在する場合（Ｎ１＝０，Ｎ２≧１）
Ｄ１／Ｄ２＝Ｂ２１／Ｂ２２
Ｄ２／Ｄ１＝Ｂ２２／Ｂ２１【００１４】
（３）標的糖鎖が第１の糖鎖及び第２の糖鎖の混合状態として存在する場合（Ｎ１≧１，Ｎ２≧１)
Ｂ１１／Ｂ１２ ＞ Ｄ１／Ｄ２ ＞ Ｂ２１／Ｂ２２
Ｂ１２／Ｂ１１ ＜ Ｄ２／Ｄ１ ＜ Ｂ２２／Ｂ２１【００１５】
なお、「Ｂ１１／Ｂ１２」、「Ｂ１２／Ｂ１１」、「Ｂ２１／Ｂ２２」、「Ｂ２２／Ｂ２１」、「Ｄ１／Ｄ２」及び「Ｄ２／Ｄ１」は、一定の値を意味する他、一定の値域を意味する。また、「＝」は完全に同一であることを意味する他、実質的に同一であることを意味する。【００１６】
したがって、標的糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときの、標的糖鎖に対する第１のレクチンの結合量（Ｄ１）と、標的糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときの、標的糖鎖に対する第２のレクチンの結合量（Ｄ２）との比（Ｄ１／Ｄ２又はＤ２／Ｄ１）は、標的糖鎖における構造変化の有無を検出するための指標とすることができる。すなわち、第１の糖鎖が構造変化前の糖鎖であり、第２の糖鎖が構造変化後の糖鎖である場合、Ｂ１１／Ｂ１２ ＞Ｄ１／Ｄ２ ≧ Ｂ２１／Ｂ２２ 又は Ｂ１２／Ｂ１１ ＜Ｄ２／Ｄ１ ≦ Ｂ２２／Ｂ２１であれば、標的糖鎖が第２の糖鎖のみとして又は第１の糖鎖及び第２の糖鎖の混合状態として存在している、すなわち、標的糖鎖において構造変化が生じていると判別することができる。また、第２の糖鎖が構造変化前の糖鎖であり、第１の糖鎖が構造変化後の糖鎖である場合、Ｂ１１／Ｂ１２ ≧ Ｄ１／Ｄ２ ＞ Ｂ２１／Ｂ２２ 又は Ｂ１２／Ｂ１１ ≦Ｄ２／Ｄ１ ＜Ｂ２２／Ｂ２１であれば、標的糖鎖が第１の糖鎖のみとして又は第１の糖鎖及び第２の糖鎖の混合状態として存在している、すなわち、標的糖鎖において構造変化が生じていると判別することができる。【００１７】
一方、標的糖鎖と第１のレクチンとを他のレクチンの不存在下で混合したときの、標的糖鎖に対する第１のレクチンの結合量（Ｃ１）と、標的糖鎖と第２のレクチンとを他のレクチンの不存在下で混合したときの、標的糖鎖に対する第２のレクチンの結合量（Ｃ２）との比（Ｃ１／Ｃ２又はＣ２／Ｃ１）も、Ｄ１／Ｄ２又はＤ２／Ｄ１と同様に、標的糖鎖における構造変化の有無を検出するための指標とすることができる。【００１８】
しかしながら、Ｃ１／Ｃ２又はＣ２／Ｃ１を指標とする場合、Ｃ１の測定は、標的糖鎖と第１のレクチンとを他のレクチンの不存在下で混合するという条件下で行われ、Ｃ２の測定は、標的糖鎖と第２のレクチンとを他のレクチンの不存在下で混合するという条件下で行われるため、Ｃ１及びＣ２の測定は、別々の反応系で行われる必要がある。しかも、各反応系における標的糖鎖の存在状態（すなわち、Ｎ１及びＮ２の値）は同一である必要がある。【００１９】
これに対して、Ｄ１／Ｄ２又はＤ２／Ｄ１を指標とする場合、Ｄ１及びＤ２の測定は、標的糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合するという同一の条件下で行われるので、同一の反応系で行うことができる。同一の反応系で測定すれば、Ｄ１及びＤ２の測定時における標的糖鎖の存在状態（すなわち、Ｎ１及びＮ２の値）は同一である。【００２０】
したがって、Ｄ１／Ｄ２又はＤ２／Ｄ１を指標とする場合は、Ｃ１／Ｃ２又はＣ２／Ｃ１を指標とする場合よりも容易かつ効率的に、標的糖鎖における構造変化の有無を検出することができる。【００２１】
また、同一の反応系でＤ１及びＤ２を複数回測定した場合における各測定値のバラツキは、異なる反応系でＣ１及びＣ２を複数回測定した場合における各測定値のバラツキよりも小さくなる。【００２２】
したがって、Ｄ１／Ｄ２又はＤ２／Ｄ１を指標とする場合は、Ｃ１／Ｃ２又はＣ２／Ｃ１を指標とする場合よりも精度よく、標的糖鎖における構造変化の有無を検出することができる。【００２３】
さらに、上記式（Ｉ）を満たす第１〜第ｎのレクチンを使用すると、Ｂ１１／Ｂ１２及びＢ２１／Ｂ２２の区別を、Ａ１１／Ａ１２及びＡ２１／Ａ２２の区別よりも明確に行うことができるとともに、Ｂ１２／Ｂ１１及びＢ２２／Ｂ２１の区別を、Ａ１２／Ａ１１とＡ２２／Ａ２１の区別よりも明確に行うことができる。【００２４】
したがって、Ｄ１／Ｄ２又はＤ２／Ｄ１を指標とする場合、Ｃ１／Ｃ２又はＣ２／Ｃ１を指標とする場合よりも精度よく、標的糖鎖における構造変化の有無を検出することができる。【００２５】
第１の糖鎖及び第２の糖鎖の間には、構造変化により生じた糖鎖構造上の相違があるので、Ａ１１はＡ２１と異なる値又は値域を示し得る。同様に、Ａ１２はＡ２２と異なる値又は値域を示し得る。したがって、Ａ１１／Ａ１２はＡ２１／Ａ２２と異なる値又は値域を示し得る。本発明の方法においては、Ａ１１／Ａ１２ ＞ Ａ２１／Ａ２２を満たす第１のレクチン及び第２のレクチンを選択する。【００２６】
Ａ１１は、第１の糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときに、第１の糖鎖に対する第１のレクチンの結合が、第１の糖鎖に対する他のレクチンの結合によって影響を受けない場合の、第１の糖鎖１分子に対する第１のレクチンの結合量と実質的に同一である。したがって、第１の糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときに、第１の糖鎖に対する第１のレクチンの結合が、第１の糖鎖に対する他のレクチンの結合によって影響を受けることにより、Ｂ１１はＡ１１と異なる値又は値域を示し得る。同様に、第１の糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときに、第１の糖鎖に対する第２のレクチンの結合が、第１の糖鎖に対する他のレクチンの結合によって影響を受けることにより、Ｂ１２はＡ１２と異なる値又は値域を示し得る。したがって、第１の糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときに、第１の糖鎖に対する第１のレクチン及び第２のレクチンの結合が、それぞれ第１の糖鎖に対する他のレクチンの結合によって影響を受けることにより、Ｂ１１／Ｂ１２はＡ１１／Ａ１２と異なる値又は値域を示し得る。同様に、第２の糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときに、第２の糖鎖に対する第１のレクチン及び第２のレクチンの結合が、それぞれ第２の糖鎖に対する他のレクチンの結合によって影響を受けることにより、Ｂ２１／Ｂ２２はＡ２１／Ａ２２と異なる値又は値域を示し得る。本発明の方法においては、上記式（Ｉ）を満たす第１〜第ｎのレクチンを選択する。【００２７】
なお、上記式（Ｉ）が成立する場合としては、例えば、以下の次式（i）〜（iv）のいずれかが成立する場合が挙げられる。
Ｂ１１／Ｂ１２ ＞ Ａ１１／Ａ１２ ＞ Ａ２１／Ａ２２ ≧ Ｂ２１／Ｂ２２  （i）
Ｂ１１／Ｂ１２ ≧ Ａ１１／Ａ１２ ＞ Ａ２１／Ａ２２ ＞ Ｂ２１／Ｂ２２  （ii）
Ａ１１／Ａ１２ ≧ Ｂ１１／Ｂ１２ ＞ Ａ２１／Ａ２２ ＞ Ｂ２１／Ｂ２２  （iii）
Ｂ１１／Ｂ１２ ＞ Ａ１１／Ａ１２ ＞ Ｂ２１／Ｂ２２ ≧ Ａ２１／Ａ２２  （iv）【００２８】
本発明の方法において、第１〜第ｎのレクチンは、上記式（Ｉ）を満たすように第１の糖鎖及び第２の糖鎖に結合し得る限り特に限定されるものではない。第１〜第ｎのレクチンは、それぞれ所定の糖鎖構造に特異的に結合し得ることが好ましい。この場合、第１の糖鎖及び第２の糖鎖に対する第１〜第ｎのレクチンの結合挙動が把握しやすいので、上記式（Ｉ）を満たす第１〜第ｎのレクチンの選択が容易となる。但し、一般的に、所定の糖鎖構造に対するレクチンの特異的親和性は厳密なものではなく、レクチンは、通常、所定の糖鎖構造以外の糖鎖構造に対しても親和性を示し得る。【００２９】
本発明の方法において、ｎが小さい場合、第１の糖鎖及び第２の糖鎖に対する第１〜第ｎのレクチンの結合挙動が把握しやすいので、上記式（Ｉ）を満たす第１〜第ｎのレクチンの選択が容易となる。ｎは２以上の整数である限り特に限定されるものではないが、好ましくは２〜５であり、さらに好ましくは２〜３である。【００３０】
本発明の方法において、第１の糖鎖と第２の糖鎖との糖鎖構造上の相違が微小である場合、第１の糖鎖に対する第１〜第ｎのレクチンの結合挙動と、第２の糖鎖に対する第１〜第ｎのレクチンの結合挙動との相違を把握しやすいので、上記式（Ｉ）を満たす第１〜第ｎのレクチンの選択が容易となる。【００３１】
第１の糖鎖と第２の糖鎖との糖鎖構造上の相違が微小である場合としては、例えば、第１の糖鎖は第１のレクチンが結合し得る第１の糖鎖構造を有するが、第２の糖鎖は第１の糖鎖構造を有しない点で両糖鎖の構造は異なり、それ以外の点で両糖鎖の構造は実質的に同一である場合が挙げられる。この場合、Ａ１１はＡ２１よりも大きい一方、Ａ１２はＡ２２と実質的に同一であるので、Ａ１１／Ａ１２ ＞ Ａ２１／Ａ２２が成立する。なお、「両糖鎖の構造が実質的に同一である」には、第１の糖鎖及び第２の糖鎖のうち、第１〜第ｎのレクチンが結合し得ない部分に糖鎖構造上の相違がある場合も含まれる。【００３２】
第１の糖鎖は第１のレクチンが結合し得る第１の糖鎖構造を有するが、第２の糖鎖は第１の糖鎖構造を有しない点で両糖鎖の構造は異なり、それ以外の点で両糖鎖の構造は実質的に同一である場合、第１の糖鎖において、第１の糖鎖構造に対して第１のレクチンが結合すると、第１の糖鎖に対する第２のレクチンの結合が抑制されるように、第１〜第ｎのレクチンを選択することにより、Ｂ１１／Ｂ１２ ＞ Ａ１１／Ａ１２が成立する。なお、第１の糖鎖における複数の糖鎖構造に対して第２のレクチンが結合し得る場合、そのうち１以上の糖鎖構造に対する第２のレクチンの結合が抑制されればよい。【００３３】
Ｂ１１／Ｂ１２ ＞ Ａ１１／Ａ１２が成立する場合において、第２の糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとを混合したときに、第２の糖鎖に対する第１のレクチン及び第２のレクチンの結合が、それぞれ第２の糖鎖に対する他のレクチンの結合によって影響を受けなければ、Ｂ２１／Ｂ２２ ＝ Ａ２１／Ａ２２が成立する結果、上記式（Ｉ）が成立する。また、第２の糖鎖に対して第２〜第ｎのレクチンが結合すると、第２の糖鎖に対する第１のレクチンの結合が抑制されれば、Ｂ２１／Ｂ２２ ＜ Ａ２１／Ａ２２が成立する結果、上記式（Ｉ）が成立する。【００３４】
第１の糖鎖において、第１の糖鎖構造に対して第１のレクチンが結合すると、第１の糖鎖に対する第２のレクチンの結合が抑制される場合としては、例えば、第１の糖鎖及び第２の糖鎖が、第２のレクチンが結合し得る第２の糖鎖構造を有しており、第１の糖鎖において、第１の糖鎖構造に対して第１のレクチンが結合すると、第２の糖鎖構造に対する第２のレクチンの結合が抑制される場合が挙げられる。【００３５】
第１の糖鎖において、第１の糖鎖構造に対して第１のレクチンが結合すると、第２の糖鎖構造に対する第２のレクチンの結合が抑制される場合としては、例えば、第１の糖鎖において、第１の糖鎖構造と第２の糖鎖構造とが近接しており、第１の糖鎖構造に対する第１のレクチンの結合力が、第２の糖鎖構造に対する第２のレクチンの結合力よりも大きい場合が挙げられる。この場合、第１の糖鎖構造に対する第１のレクチンの結合と、第２の糖鎖構造に対する第２のレクチンの結合とが競合するが、第１の糖鎖構造に対する第１のレクチンの結合力の方が大きいため、第１の糖鎖構造に対する第１のレクチンの結合が優先的に起こり、第１の糖鎖構造に対して結合した第１のレクチンが立体障害となって、第２の糖鎖構造に対する第２のレクチンの結合が抑制される。なお、「第１の糖鎖構造と第２の糖鎖構造とが近接する」には、第１の糖鎖構造の一部と第２の糖鎖構造の一部とが重複している場合も含まれる。【００３６】
本発明の方法において、標的糖鎖に対する第１のレクチンの結合量及び第２のレクチンの結合量の測定方法は特に限定されるものではない。例えば、第１のレクチン及び第２のレクチンにそれぞれ区別して検出可能な標識物質が結合している場合、標識物質の量に基づいて、標的糖鎖に対する第１のレクチンの結合量及び第２のレクチンの結合量を測定することができる。【００３７】
本発明の方法において、第１〜第ｎのレクチンと混合する標的糖鎖が固体支持体に固定されていることが好ましい。この場合、固体支持体を洗浄することにより、固体支持体に付着した夾雑物（例えば、試料中に標的糖鎖とともに含まれていた標的糖鎖以外の糖鎖等）や、標的糖鎖に対して未結合のレクチンを容易に除去することができる。【００３８】
標的糖鎖が固定されている固体支持体の材質、形状等は特に限定されるものではないが、粒子又は磁性粒子であることが好ましい。この場合、標的糖鎖が固定された粒子又は磁性粒子を第１〜第ｎのレクチンとともに液体中に分散させることにより、標的糖鎖と第１〜第ｎのレクチンとの結合を効率よく進行させることができる。特に磁性粒子である場合、粒子の操作性が向上し、磁石を作用させることにより液体中に分散した磁性粒子を容易に捕集することができるとともに、磁石の作用を解除することにより磁性粒子を液体中に分散させることができる。【００３９】
本発明の方法において、標的糖鎖は、タンパク質、脂質等に結合した糖鎖（すなわち、糖タンパク質、糖脂質等に含まれる糖鎖）であってもよいし、タンパク質、脂質等に結合していない糖鎖であってもよいが、糖タンパク質に含まれる糖鎖であることが好ましい。この場合、糖タンパク質のタンパク質部分に対して特異的に結合し得る抗体又はその断片を固体支持体に固定しておき、試料と固体支持体とを接触させることにより、試料中の標的糖鎖を固体支持体に固定することができる。また、試料中の標的糖鎖を固体支持体に固定した後、固体支持体を洗浄することにより、試料中に含まれる夾雑物と標的糖鎖とを分離することができる。
【発明の効果】
【００４０】
本発明によれば、構造変化により第１の糖鎖及び第２の糖鎖として存在し得る標的糖鎖における構造変化を容易かつ効率的に検出することができる方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】Ｔ検定に関する図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本実施形態に係る方法は、構造変化により糖鎖Ｇ１及び糖鎖Ｇ２として存在し得る標的糖鎖Ｔと、糖鎖Ｇ１及び糖鎖Ｇ２に結合し得るレクチンＬ１及びレクチンＬ２とを混合したときの、標的糖鎖Ｔに対するレクチンＬ１の結合量（Ｄ１）及びレクチンＬ２の結合量（Ｄ２）の比（Ｄ１／Ｄ２）を指標として、標的糖鎖Ｔにおける構造変化の有無を検出する方法である。【００４３】
標的糖鎖Ｔは、糖タンパク質に含まれる糖鎖である。標的糖鎖Ｔを含む糖タンパク質は特に限定されるものではないが、例えば、トランスフェリン、血液型糖タンパク質、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）等の生理活性物質；前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、α２−マクログロブリン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）等の癌関連抗原；ＣＡ１９−９、ＣＡ１２５等の糖鎖抗原等が挙げられる。なお、糖鎖抗原には、細胞表面に結合していないものであってもよいし、細胞表面に結合しているもの（細胞表面糖鎖抗原）であってもよい。【００４４】
標的糖鎖Ｔは、糖鎖構造により糖鎖Ｇ１及びＧ２として存在し得る糖鎖である。
糖鎖Ｇ１はレクチンＬ１が結合し得る糖鎖構造Ｓ１を有するが、糖鎖Ｇ２は糖鎖構造Ｓ１を有しない点で糖鎖Ｇ１及びＧ２の構造は相違し、それ以外の点で糖鎖Ｇ１及びＧ２の構造は実質的に同一である。なお、「糖鎖Ｇ１及びＧ２の構造が実質的に同一である」には、糖鎖Ｇ１及び糖鎖Ｇ２のうち、レクチンＬ１及びＬ２が結合し得ない部分に糖鎖構造上の相違がある場合も含まれる。【００４５】
糖鎖Ｇ１は、糖鎖構造上の相違がない１種類の糖鎖として存在することが好ましいが、糖鎖Ｇ１とレクチンＬ１とレクチンＬ２とを混合したときの、糖鎖Ｇ１１分子に対するレクチンＬ１の結合量（Ｂ１１）及びレクチンＬ２の結合量（Ｂ１２）の比（Ｂ１１／Ｂ１２）が一定の値又は値域をとる限り、糖鎖構造上の相違がある２種類以上の糖鎖として存在していてもよい。【００４６】
糖鎖Ｇ２は、糖鎖構造上の相違がない１種類の糖鎖として存在することが好ましいが、糖鎖Ｇ２とレクチンＬ１とレクチンＬ２とを混合したときの、糖鎖Ｇ２１分子に対するレクチンＬ１の結合量（Ｂ２１）及びレクチンＬ２の結合量（Ｂ２２）の比（Ｂ２１／Ｂ２２）が一定の値又は値域をとる限り、糖鎖構造上の相違がある２種類以上の糖鎖として存在していてもよい。【００４７】
標的糖鎖Ｔにおける構造変化としては、例えば、糖鎖構造Ｓ１の付加、糖鎖構造Ｓ１の欠失、糖鎖構造Ｓ１から糖鎖構造Ｓ１’への変化、糖鎖構造Ｓ１’’から糖鎖構造Ｓ１への変化等が挙げられる。構造変化が糖鎖構造Ｓ１の付加である場合、構造変化前の糖鎖が糖鎖Ｇ２であり、構造変化後の糖鎖が糖鎖Ｇ１であり、構造変化が糖鎖構造Ｓ１の欠失である場合、構造変化前の糖鎖が糖鎖Ｇ１であり、構造変化後の糖鎖が糖鎖Ｇ２であり、構造変化が糖鎖構造Ｓ１から糖鎖構造Ｓ１’への変化である場合、構造変化前の糖鎖が糖鎖Ｇ１であり、構造変化後の糖鎖が糖鎖Ｇ２であり、構造変化が糖鎖構造Ｓ１’’から糖鎖構造Ｓ１への変化である場合、構造変化前の糖鎖が糖鎖Ｇ２であり、構造変化後の糖鎖が糖鎖Ｇ１である。【００４８】
標的糖鎖Ｔにおける構造変化の原因としては、例えば、肝細胞ガン、直腸ガン、肺ガン、膵ガン、甲状腺ガン、骨髄腫、慢性関節リウマチ等の疾患；シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、マンノシダーゼ、フコシダーゼ等のグリコシダーゼによる処理；血液型の相違等が挙げられる。糖タンパク質に含まれる糖鎖に構造変化が生じても、糖タンパク質に含まれるタンパク質に構造変化は生じない。したがって、糖鎖Ｇ１に結合しているタンパク質及び糖鎖Ｇ２に結合しているタンパク質は、実質的に同一の構造を有する。【００４９】
標的糖鎖Ｔがα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）に含まれる糖鎖である場合、標的糖鎖Ｔには、肝細胞ガンの進行に伴って、α−Ｌ−フコース残基、Ｎ−アセチルグルコサミン残基（バイセクティングＮ−アセチルグルコサミン）等が付加される。この場合、肝細胞ガンの進行に伴って付加される糖鎖構造が糖鎖構造Ｓ１であり、糖鎖構造Ｓ１の付加前の糖鎖が糖鎖Ｇ２であり、糖鎖構造Ｓ１の付加後の糖鎖が糖鎖Ｇ１である。
レクチンＬ１及びＬ２は、次式（Ｉ）：【００５０】
【数２】
0004725519.tif 000003
【００５１】
［式中、Ａ１１は、糖鎖Ｇ１とレクチンＬ１とをレクチンＬ２の不存在下で混合したときの、糖鎖Ｇ１１分子に対するレクチンＬ１の結合量を表し、Ａ１２は、糖鎖Ｇ１とレクチンＬ２とをレクチンＬ１の不存在下で混合したときの、糖鎖Ｇ１１分子に対するレクチンＬ２の結合量を表し、Ａ２１は、糖鎖Ｇ２とレクチンＬ１とをレクチンＬ２の不存在下で混合したときの、糖鎖Ｇ２１分子に対するレクチンＬ１の結合量を表し、Ａ２２は、糖鎖Ｇ２とレクチンＬ２とをレクチンＬ１の不存在下で混合したときの、糖鎖Ｇ２１分子に対するレクチンＬ２の結合量を表し、Ｂ１１は、糖鎖Ｇ１とレクチンＬ１とレクチンＬ２とを混合したときの、糖鎖Ｇ１１分子に対するレクチンＬ１の結合量を表し、Ｂ１２は、糖鎖Ｇ１とレクチンＬ１とレクチンＬ２とを混合したときの、糖鎖Ｇ１１分子に対するレクチンＬ２の結合量を表し、Ｂ２１は、糖鎖Ｇ２とレクチンＬ１とレクチンＬ２とを混合したときの、糖鎖Ｇ２１分子に対するレクチンＬ１の結合量を表し、Ｂ２２は、糖鎖Ｇ２とレクチンＬ１とレクチンＬ２とを混合したときの、糖鎖Ｇ２１分子に対するレクチンＬ２の結合量を表す。］
を満たすように、糖鎖Ｇ１及びＧ２に対して結合し得る。【００５２】
レクチンＬ１は、糖鎖Ｇ１のうち糖鎖構造Ｓ１に対して結合し得るとともに、糖鎖構造Ｓ１以外の糖鎖構造に対しても結合し得る。レクチンＬ１は糖鎖構造Ｓ１に対して特異的親和性を示すことが好ましい。但し、レクチンＬ１の糖鎖構造Ｓ１に対する特異的親和性は厳密なものではなく、レクチンＬ１が糖鎖構造Ｓ１に対して特異的親和性を示す場合であっても、レクチンＬ１は糖鎖構造Ｓ１以外の糖鎖構造に対しても親和性を示し得る。【００５３】
糖鎖Ｇ１はレクチンＬ１が結合し得る糖鎖構造Ｓ１を有するが、糖鎖Ｇ２は糖鎖構造Ｓ１を有しない点で糖鎖Ｇ１及びＧ２の構造は相違し、それ以外の点で糖鎖Ｇ１及びＧ２の構造は実質的に同一であるから、糖鎖Ｇ１１分子に対するレクチンＬ１の結合量（Ａ１１）は、糖鎖Ｇ２１分子に対するレクチンＬ１の結合量（Ａ２１）よりも大きい一方、糖鎖Ｇ１１分子に対するレクチンＬ２の結合量（Ａ１２）と、糖鎖Ｇ２１分子に対するレクチンＬ１の結合量（Ａ２１）とは実質的に同一である。
したがって、Ａ１１／Ａ１２ ＞ Ａ２１／Ａ２２が成立する。【００５４】
よって、例えば、Ｂ１１／Ｂ１２ ＞ Ａ１１／Ａ１２ 及び Ａ２１／Ａ２２ ≧Ｂ２１／Ｂ２２を満たすようにレクチンＬ１及びＬ２を選択することにより、上記式（Ｉ）は満たされる。また、Ｂ１１／Ｂ１２ ≧ Ａ１１／Ａ１２ 及び Ａ２１／Ａ２２ ＞ Ｂ２１／Ｂ２２となるようにレクチンＬ１及びＬ２を選択することにより、上記式（Ｉ）は満たされる。【００５５】
糖鎖Ｇ１とレクチンＬ１とレクチンＬ２とを混合したときに、糖鎖Ｇ１に対するレクチンＬ１の結合及びレクチンＬ２の結合のうち一方が他方によって影響を受けることにより、Ｂ１１／Ｂ１２はＡ１１／Ａ１２と異なる値又は値域を示し得る。同様に、糖鎖Ｇ２とレクチンＬ１とレクチンＬ２とを混合したときに、糖鎖Ｇ２に対するレクチンＬ１の結合及びレクチンＬ２の結合のうち一方が他方によって影響を受けることにより、Ｂ２１／Ｂ２２はＡ２１／Ａ２２と異なる値又は値域を示し得る。したがって、Ｂ１１／Ｂ１２ ＞ Ａ１１／Ａ１２ 及び Ａ２１／Ａ２２ ≧Ｂ２１／Ｂ２２を満たすようにレクチンＬ１及びＬ２を選択することが可能であるとともに、Ｂ１１／Ｂ１２ ≧ Ａ１１／Ａ１２ 及び Ａ２１／Ａ２２ ＞ Ｂ２１／Ｂ２２となるようにレクチンＬ１及びＬ２を選択することが可能である。【００５６】
糖鎖Ｇ１とレクチンＬ１とレクチンＬ２とを混合したときに、糖鎖Ｇ１に対するレクチンＬ１の結合及びレクチンＬ２の結合のうち一方が他方に影響によって影響を受ける場合としては、例えば、糖鎖Ｇ１において、糖鎖構造Ｓ１に対してレクチンＬ１が結合すると、糖鎖Ｇ１に対するレクチンＬ２の結合が抑制される場合が挙げられる。この場合、Ｂ１１はＡ１１と実質的に同一であるが、Ｂ１２はＡ１２よりも小さくなるので、Ｂ１１／Ｂ１２ ＞ Ａ１１／Ａ１２が成立する。なお、糖鎖Ｇ１における複数の糖鎖構造に対してレクチンＬ２が結合し得る場合、そのうち１以上の糖鎖構造に対するレクチンＬ２の結合が抑制されればよい。【００５７】
Ｂ１１／Ｂ１２ ＞ Ａ１１／Ａ１２が成立する場合において、糖鎖Ｇ２とレクチンＬ１とレクチンＬ２とを混合したときに、糖鎖Ｇ２に対するレクチンＬ１及びＬ２の結合が、それぞれ糖鎖Ｇ２に対する他のレクチンの結合によって影響を受けなければ、Ｂ２１／Ｂ２２ ＝ Ａ２１／Ａ２２が成立する結果、上記式（Ｉ）が成立する。また、糖鎖Ｇ２に対してレクチンＬ２が結合すると、糖鎖Ｇ２に対するレクチンＬ１の結合が抑制されれば、Ｂ２１／Ｂ２２ ＜ Ａ２１／Ａ２２が成立する結果、上記式（Ｉ）が成立する。【００５８】
糖鎖Ｇ１において、糖鎖構造Ｓ１に対してレクチンＬ１が結合すると、糖鎖Ｇ１に対するレクチンＬ２の結合が抑制される場合としては、例えば、糖鎖Ｇ１及びＧ２が、レクチンＬ２が結合し得る糖鎖構造Ｓ２を有しており、糖鎖Ｇ１において、糖鎖構造Ｓ１に対してレクチンＬ１が結合すると、糖鎖構造Ｓ２に対するレクチンＬ２の結合が抑制される場合が挙げられる。【００５９】
糖鎖Ｇ１において、糖鎖構造Ｓ１に対してレクチンＬ１が結合すると、糖鎖構造Ｓ２に対するレクチンＬ２の結合が抑制される場合としては、例えば、糖鎖Ｇ１において、糖鎖構造Ｓ１と糖鎖構造Ｓ２とが近接しており、糖鎖構造Ｓ１に対するレクチンＬ１の結合力が、糖鎖構造Ｓ２に対するレクチンＬ２の結合力よりも大きい場合が挙げられる。この場合、糖鎖構造Ｓ１に対するレクチンＬ１の結合と、糖鎖構造Ｓ２に対するレクチンＬ２の結合とが競合するが、糖鎖構造Ｓ１に対するレクチンＬ１の結合力の方が大きいため、糖鎖構造Ｓ１に対するレクチンＬ１の結合が優先的に起こり、糖鎖構造Ｓ１に対して結合したレクチンＬ１が立体障害となって、糖鎖構造Ｓ２に対するレクチンＬ２の結合が抑制される。なお、「糖鎖構造Ｓ１と糖鎖構造Ｓ２とが近接する」には、糖鎖構造Ｓ１の一部と糖鎖構造Ｓ２の一部とが重複している場合も含まれる。【００６０】
レクチンＬ１及びＬ２は、上記式（Ｉ）を満たすように糖鎖Ｇ１及びＧ２に結合し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、ヒイロチャワンタケレクチン（AAL）、マッシュルームレクチン（ABA）、ムラサキソシンカレクチン（BPA）、バンデリアマメアグルチニン（BSA-II）、コンカナバリンＡ（ConA）、ドリコスマメレクチン（DBA）、チョウセンアサガオレクチン（DSA）、デイゴマメレクチン（ECA）、レンズマメレクチン（LCA）、イヌエンジュレクチン（MAA（MAH））、イヌエンジュレクチン（MAM（MAL））、ピーナッツレクチン（PNA）、エンドウマメレクチン（PSA）、アメリカヤマゴボウレクチン（PWM）、ヒママメレクチン（RCA120又はRCA60）、ダイズレクチン（SBA）、ニワトコレクチン（SNA）、ジャガイモレクチン（STA）、ニホンニワトコレクチン（SSA）、ハリエニシダレクチン（UEA-I）、小麦胚芽レクチン（WGA）等の公知のレクチンの中から適宜選択することができる。【００６１】
標的糖鎖ＴとレクチンＬ１とレクチンＬ２とを混合したときの、糖鎖糖鎖Ｔに対するレクチンＬ１の結合量（Ｄ１）及びレクチンＬ２の結合量（Ｄ２）の比（Ｄ１／Ｄ２）は、以下の工程（ａ）〜（ｅ）により求めることができる。【００６２】
工程（ａ）：試料中の標的糖鎖Ｔを固体支持体に固定する。【００６３】
試料は、標的糖鎖Ｔを含む限り特に限定されるものではなく、例えば、血清、血液、血漿、尿、リンパ球、血球、細胞等の生体由来の試料が挙げられる。試料には、複数分子の標的糖鎖Ｔが含まれており、全ての分子が構造変化を生じている可能性、一部の分子が構造変化を生じている可能性、及び全ての分子が構造変化を生じていない可能性がある。【００６４】
標的糖鎖Ｔの固体支持体への固定方法は特に限定されるものではなく、常法に従って行うことができる。例えば、標的糖鎖Ｔを含む糖タンパク質のタンパク質部分に対して特異的に結合し得る抗体又はその断片を固体支持体に固定しておき、試料と固体支持体とを接触させることにより、試料中の標的糖鎖Ｔを固体支持体に固定することができる。【００６５】
固体支持体の材質は特に限定されるものではなく、例えば、ガラス；シリコン；セラミックス；ポリスチレン等のポリスチレン系樹脂、ポリメチルメタクリレート等のアクリル樹脂（メタクリル樹脂）、ポリアミド樹脂、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル、ポリカーボネート等の合成樹脂；アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類；ゼラチン、コラーゲン、カゼイン等の蛋白質等が挙げられる。【００６６】
固体支持体の形状は特に限定されるものではなく、例えば、プレート状、粒子状等が挙げられるが、粒子状であることが好ましい。固体支持体が粒子である場合、試料中に粒子を分散させることにより、試料中の標的糖鎖Ｔを効率よく粒子に固定することができる。固体支持体が粒子である場合、粒子は磁性を有することが好ましい。固体支持体が磁性粒子である場合、粒子の操作性が向上し、磁石の作用により試料中に分散した粒子を容易に捕集することができるとともに、磁石の作用を解除することにより粒子を試料中に分散させることができる。このような磁性粒子の特性は、固体支持体の洗浄（工程（ｂ）、（ｄ）参照）のときにも有利である。【００６７】
固体支持体への抗体又はその断片の固定方法は特に限定されるものではなく、常法に従って行うことができる。固体支持体への抗体又はその断片の固定方法としては、例えば、固体支持体が表面に有する官能基と、抗体又はその断片が有する官能基とを反応させ、固体支持体の表面に抗体又はその断片を共有結合させる方法が挙げられる。共有結合を形成し得る官能基としては、例えば、カルボキシル基、アミノ基等が挙げられ、これらの官能基は常法に従って固体支持体及び抗体又はその断片に導入することができる。固体支持体がカルボキシル基を表面に有する場合、カルボジイミド類でカルボキシル基を活性化させた後、抗体又はその断片が有するアミノ基と反応させることにより、アミド結合を介して、抗体又はその断片を固体支持体へ固定することができる。また、固体支持体がアミノ基を表面に有する場合、無水コハク酸等の環状酸無水物を用いてアミノ基をカルボキシル基に変換した後、抗体又はその断片が有するアミノ基と反応させることにより、アミド結合を介して、抗体又はその断片を固体支持体へ固定することができる。この他、ビオチン−アビジン系を用いた方法、例えば、ビオチン化抗体又はその断片を、アビジン又はストレプトアビジンでコーティングされた固体支持体の表面に固定する方法を用いることができる。【００６８】
工程（ｂ）：標的糖鎖Ｔが固定された固体支持体を洗浄する。【００６９】
試料と固体支持体とを接触させると、試料中に含まれる夾雑物（例えば、標的糖鎖Ｔ以外の糖鎖等）が固体支持体に付着するが、固体支持体の洗浄により、固体支持体に付着した夾雑物を除去することができる。【００７０】
固体支持体を洗浄する際、洗浄液としては、例えば、水、アルコール等の比較的極性の高い溶媒；塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の塩類を含む水溶液；アルコール類を含む水溶液；タンパク質、核酸等を含む水溶液；リン酸、トリス等の適当なｐＨ緩衝剤を含む上記溶媒又は水溶液等を用いることができる。
試料に夾雑物が含まれていない場合、工程（ｂ）は省略してもよい。【００７１】
工程（ｃ）：固体支持体に固定された標的糖鎖ＴとレクチンＬ１とレクチンＬ２とを混合する。【００７２】
レクチンＬ１及びＬ２にはそれぞれ区別して検出可能な標識物質ＬＢ１及びＬＢ２を予め結合しておく。標識物質ＬＢ１及びＬＢ２は区別して検出可能である限り特に限定されるものではなく、例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン等の蛍光物質；ルミノール、ルシゲニン、アクリジウムエステルの化学発光物質；ルシフェラーゼ、ルシフェリン等の生物発光物質；アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素；99mＴｃ、131Ｉ、125Ｉ、14Ｃ、3Ｈ等の放射性同位元素；半導体ナノ粒子；オリゴヌクレオチド；磁性体；抗体等が挙げられる。レクチンＬ１１分子に結合している標識物質量は、分子間で実質的に同一であることが好ましい。レクチンＬ２についても同様である。レクチン１分子に結合している標識物質量が分子間で実質的に同一であることにより、標識物質量からレクチン量を正確に求めることができる。【００７３】
混合順序は特に限定されるものではなく、レクチンＬ１及びＬ２を混合した後、標的糖鎖Ｔを混合してもよいし、レクチンＬ１及びＬ２のうち一方のレクチンと標的糖鎖とを混合した後、他方のレクチンを混合してもよい。【００７４】
標的糖鎖ＴとレクチンＬ１とレクチンＬ２とを混合すると、標的糖鎖ＴとレクチンＬ１とが接触するとともに、標的糖鎖ＴとレクチンＬ２とが接触する。標的糖鎖Ｔが糖鎖Ｇ１として存在する場合、標的糖鎖Ｔの糖鎖構造Ｓ１及び糖鎖構造Ｓ１以外の糖鎖構造にレクチンＬ１が結合するとともに、標的糖鎖Ｔの所定の糖鎖構造にレクチンＬ２が結合する。標的糖鎖Ｔが糖鎖Ｇ２として存在する場合には、標的糖鎖Ｔの所定の糖鎖構造にレクチンＬ１が結合するとともに、標的糖鎖Ｔの所定の糖鎖構造にレクチンＬ２が結合する。標的糖鎖Ｔに対するレクチンＬ１及びＬ２の結合はやがて平衡状態に達する。【００７５】
標的糖鎖ＴとレクチンＬ１とレクチンＬ２とを混合させる際、溶媒としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の塩類を含む水溶液；アルコール類を含む水溶液；タンパク質、核酸等を含む水溶液；リン酸、トリス等の適当なｐＨ緩衝剤を含む上記溶媒又は水溶液等を使用することができる。温度は、通常４〜６０℃、好ましくは２５〜３７℃であり、時間は、通常１〜１２０分間、好ましくは５〜６０分間であり、ｐＨは、通常２〜１０、好ましくは５〜８である。レクチンＬ１及びＬ２の混合量は、標的糖鎖Ｔの混合量に対して過剰量とする。【００７６】
工程（ｄ）：固体支持体を洗浄し、標的糖鎖Ｔに結合していないレクチンＬ１及びＬ２を除去する。【００７７】
洗浄液としては、例えば、水、アルコール等の比較的極性の高い溶媒；塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム等の塩類を含む水溶液；アルコール類を含む水溶液；タンパク質、核酸等を含む水溶液；リン酸、トリス等の適当なｐＨ緩衝剤を含む上記溶媒又は水溶液等を用いることができる。【００７８】
工程（ｅ）：標識物質ＬＢ１及びＬＢ２の量を測定し、標識物質ＬＢ１及びＬＢ２の量に基づき、糖鎖糖鎖Ｔに対するレクチンＬ１の結合量（Ｄ１）及びレクチンＬ２の結合量（Ｄ２）の比（Ｄ１／Ｄ２）を測定する。【００７９】
標識物質ＬＢ１及びＬＢ２の量の測定方法は、標識物質ＬＢ１及びＬＢ２の種類に応じ、常法に従って行うことができる。【００８０】
レクチンＬ１の量と標識物質ＬＢ１の量とを予め対応付けておくことにより、標識物質ＬＢ１の量に基づき、糖鎖糖鎖Ｔに対するレクチンＬ１の結合量（Ｄ１）を求めることができる。同様にして、標識物質ＬＢ２の量に基づき、標的糖鎖Ｔに対するレクチンＬ２の結合量（Ｄ２）を求めることができる。【００８１】
糖鎖Ｇ１が構造変化前の糖鎖であり、糖鎖Ｇ２が構造変化後の糖鎖である場合、Ｂ１１／Ｂ１２ ＞ Ｄ１／Ｄ２ ≧ Ｂ２１／Ｂ２２であれば、標的糖鎖Ｔが糖鎖Ｇ２のみとして又は糖鎖Ｇ１及び糖鎖Ｇ２の混合状態として存在している、すなわち、標的糖鎖Ｔにおいて構造変化が生じていると判別することができる。また、糖鎖Ｇ２が構造変化前の糖鎖であり、糖鎖Ｇ１が構造変化後の糖鎖である場合、Ｂ１１／Ｂ１２ ≧ Ｄ１／Ｄ２ ＞Ｂ２１／Ｂ２２であれば、標的糖鎖Ｔが糖鎖Ｇ１のみとして又は糖鎖Ｇ１及び糖鎖Ｇ２の混合状態として存在している、すなわち、標的糖鎖Ｔにおいて構造変化が生じていると判別することができる。【００８２】
本実施形態では、標的糖鎖Ｔに対するレクチンＬ１の結合量（Ｄ１）及びレクチンＬ２の結合量（Ｄ２）の比としてＤ１／Ｄ２を用いたが、Ｄ２／Ｄ１を用いてもよい。この場合、Ｂ１２／Ｂ１１ ＜ Ｄ２／Ｄ１ ≦ Ｂ２２／Ｂ２１であれば、標的糖鎖Ｔが糖鎖Ｇ２のみとして又は糖鎖Ｇ１及び糖鎖Ｇ２の混合状態として存在していると判別することができる。また、Ｂ１２／Ｂ１１ ≦ Ｄ２／Ｄ１ ＜ Ｂ２２／Ｂ２１であれば、標的糖鎖Ｔが糖鎖Ｇ１のみとして又は糖鎖Ｇ１及び糖鎖Ｇ２の混合状態として存在していると判別することができる。【００８３】
本実施形態では、糖タンパク質に含まれる糖鎖を標的糖鎖Ｔとしたが、糖脂質に含まれる糖鎖、タンパク質、脂質等に結合していない糖鎖等を標的糖鎖Ｔとしてもよい。標的糖鎖Ｔを含む糖脂質としては、例えば、ガラクトセレブロシド、グルコセレブロシド、グロボシド、ラクトシルセラミド、トリヘキソシルセラミド、パラグロボシド、フォルスマン抗原糖脂質、フコシルガングリオシド、フコシルセラミド、血液型活性糖脂質等が挙げられる。
【実施例】
【００８４】
〔実施例１〕
抗トランスフェリン抗体結合磁気ビーズの作製及びトランスフェリン糖鎖の混合レクチンによる構造解析
トランスフェリン（TF）（Serologicals proteins,Inc.）を抗トランスフェリン抗体（INTER-CELL TECHNOLOGIES,INC.）結合磁気ビーズに特異的に吸着させた。その後、トランスフェリンの糖鎖を部分分解する場合にのみ、磁気ビーズ懸濁液にシアリダーゼを加えて反応させ、糖鎖非還元末端に存在するシアル酸を除いた。その後、磁気ビーズ懸濁液にビオチン標識RCAレクチン及びFITC標識SSAレクチンを混合して反応させ、さらにCy5標識ストレプトアビジンを反応させることでRCAレクチンにCy5を特異的に結合させた。SSAレクチンは糖鎖非還元末端に存在するシアル酸を含むSiaα2-6Gal/GalNAc構造を強く認識し、RCAレクチンは糖鎖の中のGalβ1-4GlcNAc構造を認識する。シアリダーゼ処理サンプル及びシアリダーゼ未処理サンプルについて、磁気ビーズ群のCy5量及びFITC量を蛍光光度計で測定し、その比R1（Cy5量/FITC量）を求めるとともに、シアリダーゼ未処理サンプルのR1に対するシアリダーゼ処理サンプルのR1の比R2（シアリダーゼ処理サンプルのR1/シアリダーゼ未処理サンプルのR1）を求めた。【００８５】
また、シアリダーゼ処理サンプル及びシアリダーゼ未処理サンプルについて、磁気ビーズ懸濁液にビオチン標識RCAレクチンをFITC標識SSAレクチンの不存在下で混合したときの、及び磁気ビーズ懸濁液にFITC標識SSAレクチンをビオチン標識RCAレクチンの不存在下で混合したときの、磁気ビーズ群のCy5量及びFITC量を蛍光光度計で測定し、その比R1（Cy5量/FITC量）を求めるとともに、シアリダーゼ未処理サンプルのR1に対するシアリダーゼ処理サンプルのR1の比R2（シアリダーゼ処理サンプルのR1/シアリダーゼ未処理サンプルのR1）を求めた。【００８６】
なお、以下、磁気ビーズ懸濁液にビオチン標識RCAレクチン及びFITC標識SSAレクチンを混合する系を「混合系」といい、磁気ビーズ懸濁液にビオチン標識RCAレクチン及びFITC標識SSAレクチンのうち一方を他方の不存在下で混合する系を「非混合系」という。【００８７】
実験方法の詳細は以下の通りである。
磁気ビーズ Dynabeads M-270 Carboxylic acid（Dynal社製）の添付書類に記載された方法で作製した。まず、Dynabeads懸濁液原液 10μl（ビーズ30μg分）を1.5ml容のエッペンドルフチューブに入れ、磁石台にエッペンチューブを立てることで磁気ビーズを分離し、磁気ビーズの洗浄を行った。磁気ビーズの洗浄はMiliQ 100μlを用いて3回行った。洗浄後、MiliQに溶解した0.005M CMC [N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl) carbodiimide methyl-p-toluensulfonate] 10μlに磁気ビーズを懸濁し、4℃で10分間回転混和してカルボキル基を活性化した。磁気ビーズ液の上澄みを除いた後、そこに0.3M MES [2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid] バッファー (pH 4.8) 6μl及び0.005 M CMC 4 μlを加えて懸濁し、4℃で30分間回転混和した。次いで、磁気ビーズ液の上澄みを除いた後、0.1 M MESバッファー (pH 4.8) 100μlで2回洗浄し、磁気ビーズを同バッファー 2μl及び抗トランスフェリン抗体（1mg/ml）8μlに懸濁し、4℃で20分間回転混和した。次いで、MiliQで作製した10mg/mlのBSA液を磁気ビーズ液に5μl添加し、混合後、4℃で一晩回転混和した。翌日、磁気ビーズをPBSバッファー200μlで3回洗浄した後、磁気ビーズにMiliQで作製した10mg/mlのBSA液 1.1μl及びトランスフェリン原液（1mg/ml）10μlを順に加えて懸濁し、室温で1時間回転混和した。次いで、磁気ビーズ液の上澄みを除いた後、磁気ビーズをTBSバッファー 200μlで3回洗浄した。次いで、磁気ビーズにC-Pバッファー (50mM Na2PO4, 1M Citric acid) 97μl及びシアリダーゼ（10mU/μl）3μlを順に加えて懸濁し、37℃で3.5時間回転混和した。シアリダーゼ処理を行わない場合はシアリダーゼの代わりにMiliQで作製した1mg/mlのBSA液を3μl加えた。次いで、磁気ビーズ液の上澄みを除いた後、磁気ビーズをTBSバッファー 200μlで3回洗浄した。次いで、磁気ビーズにビオチン標識RCAレクチン（0.3 mg/ml）及びFITC標識SSAレクチン（0.3 mg/ml）各35μl、並びにMiliQで作製した10mg/mlのBSA液 3.85μlを順に加え、懸濁後、室温で1時間回転混和した。非混合系においては、磁気ビーズにビオチン標識RCAレクチン及びFITC標識SSAレクチンの一方のみを加えた。次いで、磁気ビーズ液の上澄みを除いた後、磁気ビーズをTBSバッファー 200μlで3回洗浄した。次いで、磁気ビーズに2×BWバッファー [10mM Tris-HCl (pH-7.5), 1mM EDTA, 2.0M NaCl] 20 μl、及びCy5標識ストレプトアビジン（0.3mg/ml）20μlを順に加え、懸濁後、室温で40分間回転混和した。次いで、磁気ビーズ液の上澄みを除いた後、磁気ビーズを1×BWバッファー 200μlで3回洗浄した。次いで、磁気ビーズをTBSバッファー 100μlに懸濁し、それを20μl取り、TBSバッファー 100μlで希釈したものを96ウェル黒色平底プレートのウェルに入れ、蛍光プレートリーダーによりCy5及びFITCの蛍光強度を測定した。
混合系における測定結果を表１に、非混合系における測定結果を表２に示す。【００８８】
【表１】
0004725519.tif 000004
【００８９】
【表２】
0004725519.tif 000005
【００９０】
表１及び２に示すように、混合系における比R2（平均9.66）は、非混合系における比R2(平均6.31)よりも大きかった。
この理由は次のように考えられる。【００９１】
トランスフェリン糖鎖のうちSSA結合部位とRCA結合部位とは一部が重複しているため、混合系のシアリダーゼ未処理サンプルにおいては、トランスフェリン糖鎖に対するSSAの結合とRCAの結合とが競合し、SSAの結合の方が優先的に起こる結果、RCAの結合が抑制される。一方、混合系のシアリダーゼ処理サンプルにおいては、シアル酸の除去によりトランスフェリン糖鎖に対するSSAの結合が抑制される結果、トランスフェリン糖鎖に対するRCAの結合は抑制されない。【００９２】
これに対して、非混合系のシアリダーゼ未処理サンプル及びシアリダーゼ処理サンプルにおいては、トランスフェリン糖鎖に対するSSAの結合とRCAの結合とは競合しないので、トランスフェリン糖鎖に対するRCAの結合は抑制されない。【００９３】
したがって、トランスフェリン糖鎖１分子に対するRCAの結合量は、混合系のシアリダーゼ未処理サンプルの方が非混合系のシアリダーゼ未処理サンプルよりも小さい一方、混合系のシアリダーゼ処理サンプルと非混合系のシアリダーゼ処理サンプルとの間で実質的に同一である。なお、トランスフェリン糖鎖１分子に対するSSAの結合量は、混合系のシアリダーゼ未処理サンプルと非混合系のシアリダーゼ未処理サンプルとの間、及び混合系のシアリダーゼ処理サンプルと非混合系のシアリダーゼ処理サンプルとの間で実質的に同一であると考えられる。【００９４】
このため、混合系における比R１はシアル酸の有無をより反映した値又は値域を示し、混合系におけるシアリダーゼ未処理サンプルの比R1（2.85）とシアリダーゼ処理サンプルの比R1（28.54）との差は、非混合系におけるシアリダーゼ未処理サンプルの比R1（1.33）とシアリダーゼ処理サンプルの比R1（9.46）との差よりも大きくなり、この結果、混合系における比R2（平均9.66）は、非混合系における比R2(平均6.31)よりも大きくなる（混合系における比R2の平均値／非混合系における比R2の平均値＝1.53）。このような傾向は、RCA及びSSAの組み合わせの代わりに、コンカナバリンＡ（ConA）及び小麦胚芽レクチン（WGA）の組み合わせを使用して、β−マンノシダーゼ処理によるトランスフェリン糖鎖構造の変化を検出した場合にも観察された。すなわち、トランスフェリン（TF）（Serologicals proteins,Inc.）を抗トランスフェリン抗体（INTER-CELL TECHNOLOGIES,INC.）結合磁気ビーズに特異的に吸着させた後、トランスフェリンの糖鎖を部分分解する場合にのみ、磁気ビーズ懸濁液にβ−マンノシダーゼを加えて反応させた。その後、磁気ビーズ懸濁液にビオチン標識ConA及びFITC標識WGAを混合して反応させ（反応溶媒：TBS＋0.5M NaCl，各レクチン濃度：0.3mg/mL）、さらにCy5標識ストレプトアビジンを反応させることでConAにCy5を特異的に結合させた。β−マンノシダーゼ処理によってトランスフェリン糖鎖からマンノースが切り取られるため、トランスフェリン糖鎖に対するWGAの結合はほぼそのままであるのに対して、トランスフェリン糖鎖に対するConAの結合は弱くなる。β−マンノシダーゼ処理サンプル及びβ−マンノシダーゼ未処理サンプルについて、磁気ビーズ群のCy5量及びFITC量を蛍光光度計で測定し、その比R1（Cy5量/FITC量）を求めるとともに、β−マンノシダーゼ未処理サンプルのR1に対するβ−マンノシダーゼ処理サンプルのR1の比R2（β−マンノシダーゼ処理サンプルのR1/β−マンノシダーゼ未処理サンプルのR1）を求めた（混合系における比R2）。また、β−マンノシダーゼ処理サンプル及びβ−マンノシダーゼ未処理サンプルについて、磁気ビーズ懸濁液にビオチン標識ConAをFITC標識WGAの不存在下で混合したときの、及び磁気ビーズ懸濁液にFITC標識WGAをビオチン標識ConAの不存在下で混合したときの、磁気ビーズ群のCy5量及びFITC量を蛍光光度計で測定し、その比R1（Cy5量/FITC量）を求めるとともに、β−マンノシダーゼ未処理サンプルのR1に対するβ−マンノシダーゼ処理サンプルのR1の比R2（β−マンノシダーゼ処理サンプルのR1/β−マンノシダーゼ未処理サンプルのR1）を求めた（非混合系における比R2）。その結果、混合系における比R2の平均値（1.24）／非混合系における比R2の平均値（0.77）＝1.61であった。【００９５】
したがって、混合系における比R１を指標とすれば、非混合系における比R1を指標とするよりも精度よく、シアリダーゼ処理又はβ−マンノシダーゼ処理によるトランスフェリン糖鎖の構造変化を検出することができる。また、混合系における測定値のバラツキは、非混合系における測定値のバラツキよりも小さくなり、混合系における比R1を指標とすれば、非混合系における比R1を指標とするよりも精度よく、シアリダーゼ処理によるトランスフェリン糖鎖の構造変化を検出することができる。
このことは、以下の信頼性−統計処理によって証明される。【００９６】
シアリダーゼ未処理サンプル又はシアリダーゼ処理サンプルが与えられたときに、それがどちらのサンプルであるかを評価する試験を想定し、混合系の測定結果及び非混合系の測定結果を２つの母平均と仮定して、２つの母平均の差を検定した（Ｔ検定）。【００９７】
仮説Ｈ０：μ１＝μ２
母分散未知だが、σ１＝σ２と考える、場合において検定統計量Ｔは図１に示す式（１）及び（２）に基づいて計算した。【００９８】
ここで、各変数の意味は以下の通りである。
μ：正規母集団の平均値
σ：正規母集団の分散
ｍ：標本の平均値
ｓ：標準偏差
Ｎ：自由度又は標本（サンプル）の大きさ
ｔ：ｔ分布
Ｔ：Ｔ検定により得られたＴの値
mean：平均値【００９９】
有意水準5％のときのＴ値は、混合系では5.1976であり、ｔ(Ｎ１＋Ｎ２−２)α／２のパーセント点は2.04227である。一方、非混合系では3.3411となっており、ｔ(Ｎ１＋Ｎ２−２)α／２のパーセント点は2.085962である。混合系及び非混合系のＴ値≧ｔ(Ｎ１＋Ｎ２−２)α／２となっており、Ｔ∈Ｒ（棄却域）（図１参照）である。有意水準５％のとき仮説Ｈ０は棄てられる。つまり、混合系と非混合系で、２つの母平均は同じではない。【０１００】
正規母集団の平均値を図１の式（３）に基づいて求めると、シアリダーゼ未処理サンプルについて、混合系の信頼空間は、2.85−0.58≦μ≦2.85＋0.58であり、非混合系の信頼空間は、1.33−0.47≦μ≦1.33＋0.47である。シアリダーゼ処理サンプルについて、混合系の信頼空間は、28.54−10.53≦μ≦28.54＋10.53であり、非混合系の信頼空間は、9.46−5.40≦μ≦9.46＋5.40である。【０１０１】
有意水準５％のとき、２つの母平均差の信頼区間100(1−α)％を図１の式（４）に基づいて求めると、混合系の場合、25.69±10.09であり、非混合系の場合、8.13±5.07である。【０１０２】
例えば、非混合系の場合には混合系と同じ誤差範囲10.09（95％信頼性）と仮定した場合に求めたｔ(Ｎ１＋Ｎ２−２)α／２のパーセント点は4.1483となり、信頼空間は99.9％と推測される。したがって、混合系の方が信頼性は高いと考えられる。【０１０３】
〔実施例２〕
腫瘍マーカーの１つであるチログロブリンの糖鎖構造の識別を、実施例１に記した方法においてトランスフェリン及び抗トランスフェリン抗体をそれぞれチログロブリン（Biogenesis）及び抗チログロブリン抗体（SIGMA）に変更して行った。混合系の測定結果を表３に、非混合系の測定結果を表４示す。【０１０４】
【表３】
0004725519.tif 000006
【０１０５】
【表４】
0004725519.tif 000007
【０１０６】
表３及び４に示すように、混合系におけるシアリダーゼ未処理サンプルの比R1とシアリダーゼ処理サンプルの比R1との差は、非混合系におけるシアリダーゼ未処理サンプルの比R1とシアリダーゼ処理サンプルの比R1との差よりも大きく、その結果、混合系における比R2は、非混合系における比R2よりも大きかった。
したがって、混合系における比R１を指標とすれば、非混合系における比R1を指標とするよりも精度よく、シアリダーゼ処理によるチログロブリン糖鎖の構造変化を検出することができる。
【図１】
0004725519.tif 000009