(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
比表面積が２００〜３００ｍ２／ｇであるシリカゲルにＯＤＳ基を化学結合させた後に、残存する活性シラノールを、常圧下で、２００〜３００℃の範囲で行う高温エンドキャッピングによって不活化してなる、親水性を保持したＯＤＳ充填剤の製造方法。
【請求項２】
高温エンドキャッピングが、トリメチルクロロシランとヘキサメチルジシラザンとを用いて行われることを特徴とする、請求項１に記載の親水性を保持したＯＤＳ充填剤の製造方法。
【請求項３】
高温エンドキャッピングを、流動パラフィン中で行うことを特徴とする、請求項１または２に記載の親水性を保持したＯＤＳ充填剤の製造方法。
【請求項４】
高温エンドキャッピングが、トルエンの還流温度での通常のエンドキャッピングの後に行われることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の親水性を保持したＯＤＳ充填剤の製造方法。
【請求項５】
ＯＤＳ基が、ジメチルオクタデシル基、メチルオクタデシル基またはオクタデシル基である、請求項１〜４のいずれかに記載の親水性を保持したＯＤＳ充填剤の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法により製造される、親水性を保持したＯＤＳ充填剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、水系溶離液を用いても撥水現象が生じにくく、化学的安定性に優れた液体クロマトグラフィー用親水性ＯＤＳ充填剤の製造方法に関する。
【０００２】
【従来技術】
オクタデシルシリル化シリカゲル（ＯＤＳシリカゲル）は、液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）用充填剤として現在広く使用されている。
ＯＤＳシリカゲルは、従来、水系１００％の溶離液を使用する測定条件下における分析を繰り返すと、化学修飾基であるＯＤＳの寝込み（ワックス化による親水性の喪失）から生じるといわれている撥水現象のため、次第に分析目的化合物の保持時間が短くなり化学分析が困難になるという欠点を有していた。
【０００３】
そのため、水系１００％の溶離液を使用しても分析目的化合物の保持時間が変化しにくく、かつ化学的安定性に優れた充填剤の開発が強く望まれ、それを目的とした研究が重ねられた結果、前記目的に叶うＯＤＳ充填剤（親水性ＯＤＳ充填剤）が開発され、市販されるに至っている。
【０００４】
前記親水性ＯＤＳ充填剤は、シリカゲル表面のシラノール基にＯＤＳを化学修飾した後、ＨＰＬＣ分析実施の際にテーリング現象や再現性欠如の原因となる未反応のシラノール基（活性シラノール基）に短鎖アルキル基を結合させる手法（エンドキャッピング）によって製造されている。該活性シラノール基は、特に塩基性物質との相互作用が強いため、塩基性物質の分析の際にテーリング現象の原因となる。
【０００５】
上記製造法によって水系１００％で使用可能な親水性ＯＤＳ充填剤を製造するに際しては、以下の３種類の技術が用いられている：
（１） シリカゲルのＯＤＳによる化学修飾密度を下げて親水性を保持することにより、ＯＤＳの寝込みを防止する技術
（２） 親水性官能基を導入して親水性を保持させ、ＯＤＳの寝込みを防止する技術
（３） 固定相を変えることにより寝込みを防ぐ技術。
【０００６】
しかしながら、これらの技術を用いて製造した親水性ＯＤＳ充填剤を用いた場合、それぞれにおいて次のような分析上の欠点が生じる。
すなわち、上記（１）の場合、活性シラノール（イオン交換型シラノール）の残存量が多いため塩基性物質との二次相互作用が強くなり、ピークのテーリング現象が起きやすい。また活性シラノールの残存によって、カラムの化学的安定性、特にアルカリ性領域における化学的安定性が低くなる。
【０００７】
上記（２）においては、選択される官能基により溶離特性（選択性）が大きく変化してしまう。また、塩基性物質分析時のみならず、酸性物質分析時にもピークのテーリング現象が起きやすくなる。
上記（３）は、化学修飾基を変更すること、例えば炭素鎖がより長いシラン化剤を用いて充填剤を固体化することにより化学修飾基の寝込みを防止するものであるが、有機溶媒系の溶離液を使用した場合、一般的に使用されているＯＤＳ充填剤に比べ、選択性の変化が大きい。
すなわち、現有のいずれの技術を用いた製造方法による親水性ＯＤＳ充填剤も、水系溶媒を用いた場合、その性能は必ずしも満足できるものではない。
【０００８】
そのため、親水性化合物の分析には水系溶離液を用いることが理想的であるにも拘わらず、従来のＯＤＳカラムを使用する際には保持力強化のためにイオンペア剤を添加する等、有機溶媒系の溶離液が多用されている。その結果、現在でもＨＰＬＣの移動相としては有機溶媒が用いられることが多く、環境保護の観点から好ましくない状況にある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記のような問題のない、すなわち水系溶離液を用いてもピークのテーリング現象がほとんどなく、かつ化学的安定性に優れた親水性ＯＤＳ充填剤の製造方法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、上記（１）の技術において、従来より比表面積が小さいシリカゲルに対し、高温エンドキャッピングを含む１または２段階のエンドキャッピングによって活性シラノールを不活化させることによって上記課題を克服できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、比表面積が２００〜３００ｍ２／ｇであるシリカゲルにＯＤＳ基を化学結合させた後に、残存する活性シラノールを高温エンドキャッピングによって不活化してなるＯＤＳ充填剤の製造方法に関する。
【００１１】
また、本発明は、高温エンドキャッピングが２００〜３００℃の範囲で行われることを特徴とする、前記ＯＤＳ充填剤の製造方法に関する。
さらに、本発明は、高温エンドキャッピングが、トルエンの還流温度での通常のエンドキャッピングの後に行われることを特徴とする、前記ＯＤＳ充填剤の製造方法に関する。
また、本発明は、ＯＤＳ基がジメチルオクタデシル基、メチルオクタデシル基またはオクタデシル基である、ＯＤＳ充填剤の前記製造方法に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
比表面積が比較的小さいシリカゲルにおいては、比表面積が大きいものに比べて活性シラノールの成因となり得る水酸基の数が元々少ないため、化学修飾をより高効率に行い得る。好ましいシリカゲルの比表面積は、２００〜３００ｍ２／ｇであり、より好ましくは２４０〜２７０ｍ２／ｇである。シリカゲルの比表面積が小さすぎると、炭化水素量が小さくなりすぎ、化学修飾の効率は低下する。
【００１３】
ここに、適度の比表面積を有するシリカゲルに対して高温エンドキャッピングを行うと、活性シラノールの不活化、すなわち活性シラノールと試料内の塩基性物質との相互作用の低減が効率的に行われることが見出された。即ち、高温エンドキャッピングを、比表面積が２００〜３００ｍ２／ｇであるシリカゲルに実施すれば、該シリカゲルを用いた充填剤における活性シラノールの不活化が極めて効率的に行われる。
【００１４】
高温エンドキャッピングは、トリメチルクロロシランとヘキサメチルジシラザンを加えた流動パラフィン中、２３０〜２５０℃の温度で加熱すると特に好適に行われる。
【００１５】
シリカゲルにＯＤＳ基を化学結合させた後、トルエンの還流温度でエンドキャッピング（一次エンドキャッピング）を行うと、水素結合性シラノールを除去することができる。したがって、該一次エンドキャッピング行ってから高温エンドキャッピング（二次エンドキャッピング）を行うと、活性シラノール基の影響をさらに効率的に除去することができる。
【００１６】
前記一次エンドキャッピングに用いるエンドキャッピング剤の例としては、クロロシラン化合物がある。例えば、トリメチルクロロシランとピリジンの存在下、溶媒として用いるトルエンを加熱還流しながら行うエンドキャッピングは好適に行われる。
【００１７】
シリカゲルに化学結合させるＯＤＳ基として、ジメチルオクタデシル基、メチルオクタデシル基およびオクタデシル基のようなオクタデシル基を用いれば、ＯＤＳによる化学修飾を好適に行うことができる。
【００１８】
本発明の製造方法によるＯＤＳ充填剤の特徴は、後述する図１が示すとおり、シリカゲル表面にシラノール基（図１のピーク１）が残存しているにも拘わらず、該シラノール基のテーリング現象や化学的安定性への影響がほとんどないことである。したがって、本発明によるＯＤＳ充填剤のシリカゲル表面に残存するシラノールは、不活性シラノールとも言うべきものである。
【００１９】
本発明の製造方法によれば、オクタデシルシリル基によるシリカゲルの化学修飾密度を分離に影響のない範囲に調整するとともに、残存シラノールのうち不活性シラノールのみを残存させることによってＯＤＳ充填剤に親水性を保たせることができるので、水系１００％の溶離液を使用したＨＰＬＣ分析においても試料の保持時間が安定なＯＤＳ充填剤を製造することが可能である。
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２０】
【実施例】
実施例１
液体クロマトグラフィー用に製造されたシリカゲル（比表面積２７０ｍ２／ｇ，細孔直径１３ｎｍ，細孔容積１．１ｍｌ／ｇ）５０ｇを６ｍｏｌ／ｌ塩酸２００ｍｌで５時間加熱還流し洗浄する。ろ過後純水にてろ液が中性になるまで洗浄する。その後アセトンにて洗浄し１３０℃で４時間乾燥する。
塩酸洗浄したシリカゲル１８ｇを乾燥トルエン２００ｍｌに分散させモノクロロジメチルオクタデシルシラン２２ｇとピリジン５ｇを加え約６時間加熱還流することによりＯＤＳシリカゲルを合成した。生成物はろ別した後、テトラヒドロフラン２００ｍｌ・メタノール１００ｍｌで順次洗浄し１３０℃で４時間乾燥した。
このようにして得られたＯＤＳシリカゲル１０ｇを、トリメチルクロロシラン２ｇとピリジン１．５ｇを加えたトルエン中で約５時間加熱還流することで一次エンドキャッピングを実施する。反応終了後、生成物をろ別し、テトラヒドロフラン５０ｍｌ、メタノール５０ｍｌで順次洗浄し１３０℃で３時間乾燥する。
一次エンドキャップが終了したＯＤＳシリカゲル１０ｇを、活性シラノールを完全に不活性化するためトリメチルクロロシラン１ｇとヘキサメチルジシラザン３ｇを加えた流動パラフィン１００ｍｌ中、２３０〜２５０℃の温度で約３時間加熱し二次エンドキャッピングを実施する。反応終了後、ヘキサン１００ｍｌを反応液に加え内容物をろ過する。残渣はテトラヒドロフラン２００ｍｌ、メタノール１００ｍｌで順次洗浄し１３０℃で４時間乾燥した。
【００２１】
実験例１
実施例１のＯＤＳシリカゲルを、一般的に実施されているスラリー法を使用して内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍのステンレススチール製のカラムに充填した。このカラムを用いて、ピリジン、フェノール混合試料を、溶離液としてアセトニトリル：水＝３０：７０（容量比）を用い、流速１ｍｌ／分、測定温度４０℃、検出波長２５４ｎｍで分析した。
その結果、ほとんどテーリング現象のない、前記試料のクロマトグラムが得られた（図２）。同様に従来の親水性ＯＤＳシリカゲルを充填したカラム及び実施例１において一次エンドキャッピングが終了した段階のＯＤＳシリカゲルを充填したカラムを用い、同じ試料を同じ条件で分析した。
従来の親水性ＯＤＳシリカゲルの結果を図３に、一次エンドキャッピングが終了した段階のＯＤＳシリカゲルの結果を図４に示す。これらのカラムは、最初に溶出するピリジンのピークがテーリング現象を生じている。従って、本発明の製造方法によるＯＤＳシリカゲルを用いたカラムは、塩基性物質との相互作用のない分析が可能であることが明らかとなった。
【００２２】
実験例２
親水性ＯＤＳシリカゲルとしての特性を確認するため、実験例１と同様にして得たカラムを用い、リン酸二水素カリウム溶液を溶離液に使用して、平均２時間／日ずつ、１ヶ月間使用した場合の核酸類に対する分離能を調べた。溶離液として５ｍｍｏｌ／ｌリン酸二水素カリウム水溶液、流速０．５ｍｌ／分、測定温度３５℃、検出波長２５４ｎｍで核酸類混合液（ピークＮｏ．１ ＣＭＰ、Ｎｏ．２  ＵＭＰ、Ｎｏ．３  ＩＭＰ、Ｎｏ．４  ＡＭＰ）各０．０５ｍｇ／ｍｌを５μｌ注入する測定条件によって、各クロマトグラムを測定した。
その結果、図５Ａ（測定開始直後）およびＢ（１ヶ月後）に示すように、１ヶ月を経過しても、カラムの分離能はほとんど変わらなかった。
【００２３】
実験例３
化学的安定性を確認するため、酸性およびアルカリ性領域でカラムの化学的安定性試験を実施した。酸性領域の試験においては、２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸溶液（ｐＨ２．２）を使用した。その結果、５００時間を経過した後においても、実施例１のカラムの理論段数は初期性能の９０％以上の値を示していた。アルカリ性領域の試験においては、２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウム（ｐＨ８．０を調製）を使用し耐久試験を実施したが、その化学的安定性は３００時間を経過してもその理論段数は初期性能の９０％を示していた。
理論段数の測定は、溶離液としてアセトニトリル／水＝７５／２５（容量比）、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、測定温度４０℃、検出波長２５４ｎｍでアントラセンを試料に使用した。
従来の親水性ＯＤＳシリカゲルを充填したカラムおよび実施例１において一次エンドキャッピングが終了した段階のＯＤＳシリカゲルを、実施例１と同様にカラムに充填し、同じ試料を分析した。
その結果、アルカリ性下（ｐＨ８．０）で測定した場合、従来の親水性ＯＤＳ充填剤を充填したカラムにおいては、約７０時間後に、理論段数が初期値の６５％まで低下した。また、二次エンドキャッピング実施前のＯＤＳシリカゲルを充填したカラムにおいては、７０時間後における理論段数は、初期性能の２０％以下にまで低下した。これらのカラムの、アルカリ性領域の化学的安定性の比較を表１に示す。
【表１】
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以上の結果から、本発明の製造方法によるＯＤＳ充填剤は、化学的な安定性が極めて優れていることが明らかになった。
【００２４】
以上の結果から、本発明の製造方法によるＯＤＳシリカゲル充填カラムは、従来の親水性ＯＤＳシリカゲル充填カラムより化学的安定性が優れ、それには二次キャッピングの寄与が大きいことが明らかになった。
【００２５】
【発明の効果】
本発明の製造方法によるＨＰＬＣ用親水性ＯＤＳ充填剤によれば、親水性溶媒を用いた塩基性物質の分析においても、ピークのテーリング現象が抑制されることに加え、化学的安定性が高い、確実な定量分析が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の製造方法による親水性ＯＤＳ充填剤の２９Ｓｉ ＣＰ／ＭＡＳ ＮＭＲ（Ａ）および一般的なフルエンドキャッピングＯＤＳ充填剤（Ｂ）の２９Ｓｉ ＣＰ／ＭＡＳ ＮＭＲ（Ｂ）である。
【図２】  実施例１のカラムによって、ピリジンとフェノールの混合試料を分析した際に得られたクロマトグラムである。
【図３】  従来のＯＤＳシリカゲルによりピリジンとフェノールの混合試料を分析した際に得られたクロマトグラムである。
【図４】  二次エンドキャッピング実施前のＯＤＳシリカゲルによってピリジンとフェノールの混合試料を分析した際に得られたクロマトグラムである。
【図５】  実施例１のカラムの測定開始直後（Ａ）および1ヶ月後（Ｂ）の分離能を示す図である。
【符号の説明】
１・・・残存シラノールのピーク
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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