(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
弱毒化デング−２ウイルス由来の非構造タンパク質およびキャプシド（Ｃ）タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、およびデング−３ウイルスの前膜（ｐｒＭ）タンパク質およびエンベロープ（Ｅ）タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸キメラ構築物であって、該Ｅタンパク質がアミノ酸位置３４５位にロイシンを含むところの、核酸キメラ構築物。
【請求項２】
デング−３ウイルスが毒性株である、請求項１に記載の核酸キメラ構築物。
【請求項３】
弱毒化デング−２ウイルス由来の非構造タンパク質およびキャプシド（Ｃ）タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、およびデング−４ウイルスのｐｒＭタンパク質およびＥタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸キメラ構築物であって、該Ｅタンパク質がアミノ酸位置４４７位にロイシンを含むところの、核酸キメラ構築物。
【請求項４】
前記デング−２ウイルスのＣタンパク質が１００位にセリンを含む、請求項３に記載の核酸キメラ構築物。
【請求項５】
前記Ｅタンパク質が３６４位にバリンを 含む、請求項４に記載の核酸キメラ構築物。
【請求項６】
前記デング−４ウイルスが毒性株である、請求項３〜５のいずれか１項記載の核酸キメラ構築物。
【請求項７】
弱毒化デング−２ウイルス由来の非構造タンパク質およびキャプシド（Ｃ）タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、および西ナイルウイルスのｐｒＭシグナル配列、および西ナイルウイルスのｐｒMタンパク質およびEタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸キメラ構築物。
【請求項８】
西ナイルウイルスが毒性株である、請求項７に記載の核酸キメラ構築物。
【請求項９】
弱毒化デング−２ウイルスがワクチン株ＰＤＫ−５３である、請求項１〜８のいずれか１項記載の核酸キメラ構築物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項記載の核酸キメラ構築物の１以上および薬学的に受容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項１１】
デングウイルスワクチン、黄熱病ウイルスワクチン、ダニ媒介脳炎ウイルスワクチン、日本脳炎ウイルスワクチン、西ナイルウイルスワクチン、Ｃ型肝炎ウイルスワクチンまたはそれらの 組み合わせからなる群から選択される免疫組成物をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
免疫応答を誘導するための、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
免疫応答を誘導するための、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
配列番号９のヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の核酸キメラ構築物。
【請求項１５】
配列番号１０をコードしている、請求項１４に記載の核酸キメラ構築物。
【請求項１６】
配列番号１１のヌクレオチド配列を有する、請求項３に記載の核酸キメラ構築物。
【請求項１７】
配列番号１２をコードしている、請求項１６に記載の核酸キメラ構築物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、米国仮出願番号６０／１８２，８２９号（２０００年２月１６日出願）（これは、本明細書中でその全体が援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、米国政府機関である、疫病管理予防センター（ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）によってなされた。従って、米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、免疫学およびウイルス学の分野に関し、そしてより詳細には、免疫原性の生きた弱毒化フラビウイルスワクチンの産生のための、無発病性の免疫原性フラビウイルスキメラに関する。
【０００４】
（発明の背景）
デング熱ウイルスは、フラビウイルス属（フラビウイルス科）の蚊媒介性の病原体である。デング熱ウイルス（しばしば、「ＤＥＮ」と省略される）の４つの血清型が、同定されており、これらには、デング熱−１、デング熱−２、デング熱−３およびデング熱−４（ＤＥＮ−１〜ＤＥＮ−４）が含まれる。このフラビウイルスゲノムは、約１１ｋｂ長の一本鎖ポジティブセンスＲＮＡであり、これは、５’−非コード領域（５’ＮＣ）；コード領域（ウイルス構造タンパク質；５つの非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５と名付けられる）をコードする）；および３’−非コード領域（３’ＮＣ）を含む。このウイルス構造タンパク質には、キャプシド、前膜／膜およびエンベロープが含まれる。これらの構造タンパク質および非構造タンパク質は、単一のポリタンパク質として翻訳される。次いで、このポリタンパク質が、細胞プロテアーゼおよびウイルスプロテアーゼによってプロセシングされる。
【０００５】
世界の熱帯および亜熱帯地域における、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ蚊によるヒトへの感染によって、デング熱ウイルスは、デング熱からしばしば致死性のデング熱出血熱／デング熱ショック症候群（ＤＨＦ／ＤＳＳ）の範囲にわたる、毎年、何百万もの病例を引き起こす。ＤＥＮウイルスの異種血清型によるヒトの二次感染は、免疫病理学的応答を誘導し得、そしてこれは、ＤＨＦ／ＤＳＳに対する潜在的な危険因子であると考えられる。従って、全てのデング熱ウイルスに対する同時防御を付与するワクチンの開発の必要性が存在する。
【０００６】
Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ蚊の根絶は、実際上不可能であると思われるので、デング熱ウイルスの４つの全ての血清型に対する安全で効果的なワクチンの開発は、世界保健機構の優先事項である。しかし、いずれのデング熱ウイルス株に対する承認された効果的なワクチンも、現在利用可能でない。種々の細胞培養物（例えば、初代イヌ腎臓（ＰＤＫ）細胞）における野生型フラビウイルスの連続継代は、ビルレンスが減少し、免疫原性を保持しそして不都合な臨床症状を生じない、ウイルス改変体を生成することが実証されている。
【０００７】
４つ全ての血清型の生きた弱毒化デング熱ウイルスが、細胞培養物における野生型ワクチンの継代によって、タイ国のＭａｈｉｄｏｌ大学で開発された。これらは、デング熱ウイルスの感染および／または疾患に対する免疫化のための、現在最も有望な、生きた弱毒化ワクチン候補である。これらのワクチン候補は、それらのデング熱血清型、これらが継代された細胞株およびこれらが継代された回数を組み合わせることによって命名されている。従って、ＰＤＫ細胞に１３回継代されたデング熱血清型１野生型ウイルスは、ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ウイルス（ヌクレオチド配列、配列番号３；アミノ酸配列、配列番号４）と命名される。他のワクチン候補は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３（ヌクレオチド配列、配列番号１５；アミノ酸配列、配列番号１６）、ＤＥＮ−３  ＰＧＭＫ−３０／ＦＲｈＬ−３（初代ミドリザル腎臓細胞における３０回の継代、その後の胎児アカゲザル肺細胞における３回の継代）（ヌクレオチド配列、配列番号２１；アミノ酸配列、配列番号２２）およびＤＥＮ−４  ＰＤＫ−４８（ヌクレオチド配列、配列番号２５；アミノ酸配列、配列番号２６）である。これら４つの候補ワクチンウイルスは、それぞれ、野生型親ＤＥＮ−１  １６００７ウイルス（ヌクレオチド配列、配列番号１；アミノ酸配列、配列番号２）、ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルス（ヌクレオチド配列、配列番号１３；アミノ酸配列、配列番号１４）、ＤＥＮ−３  １６５６２ウイルス（ヌクレオチド配列、配列番号１９；アミノ酸配列、配列番号２０）およびＤＥＮ−４  １０３６ウイルス（ヌクレオチド配列、配列番号２３；アミノ酸配列、配列番号２４）の組織培養継代によって誘導された。
【０００８】
これらの弱毒化ウイルスでの予備ヒト臨床試験は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３が、ヒトにおける最も低い感染用量（５プラーク形成単位（ＰＦＵ）の５０％最小感染用量）を有し、強力に免疫原性であり、そして受け入れ難い臨床症状を生じないことを示した。ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３、ＤＥＮ−３  ＰＧＭＫ−３０／ＦＲｈＬ−３およびＤＥＮ−４  ＰＤＫ−４８ワクチンウイルス候補は、それぞれ、１０，０００ＰＦＵ、３５００ＰＦＵおよび１５０ＰＦＵの、ヒトにおけるより高い５０％最小感染用量を有する。この後者の３つのワクチン候補に必要とされる、このより高い感染用量は、四価のデング熱ウイルスワクチンにおける各血清型成分の相対的な効力に関する問題を生じる。一価のＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルスまたはＤＥＮ−４  ＰＤＫ−４８ウイルスでは、たった一回の免疫のみが、ヒト被験体における１００％のセロコンバージョン達成するために必要とされるが、ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ウイルスおよびＤＥＮ−３  ＰＧＭＫ−３０／ＦＲｈＬ−３ウイルス（これらは、ヒトに対する２つの最も高い感染用量を有する）について、同セロコンバージョン率を達成するためには、ブースターが必要とされる。
【０００９】
ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルスワクチン候補（以降、ＰＤＫ−５３と省略する）は、弱毒化に関連するいくつかの測定可能な生物学的マーカーを有し、これらには、温度感受性、小さいプラークサイズ、蚊Ｃ６／３６細胞培養物における複製の減少、インタクトな蚊における複製の減少、乳児マウスに対する神経毒性の損失およびサルにおけるウイルス血症の発生率の減少が挙げられる。この候補ＰＤＫ−５３ワクチンの臨床試験は、ヒトにおけるその安全性および免疫原性を実証した。さらに、ＰＤＫ−５３ワクチンは、ヒトワクチンレシピエントにおけるデング熱ウイルス特異的Ｔ細胞記憶応答を誘導する。
【００１０】
ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルスを除いて、細胞培養物における複数回の継代中に生じそしてこれらのワクチン候補の弱毒化された表現型に関連する、遺伝子変異の数および正体は、未知である。弱毒化の実際の機構に対するこのような弱毒化関連変異の相対的な寄与も、野生型デング熱ウイルスの毒性の生物学的表現型に対してこれらの任意のワクチン候補を復帰するための逆性の変異の潜在性も、これら４つのワクチン候補のいずれについても知られていない。ワクチン候補の弱毒化マーカーの理解は、その安定性および安全性の予測に重要である。
【００１１】
従って、１以上のデング熱ウイルス血清型に対する防御を付与するようなデング熱ウイルスワクチンの開発に使用するための、無発病性で、なお免疫原性のデング熱ウイルスの必要性が存在する。この潜在的に危険性のあるウイルス科（フラビウイルス科）のいくつかの毒性株に対して個体を同時に防御するワクチンが、理想的である。従って、４つ全てのデング熱血清型に対して個体を免疫するために使用され得る四価のワクチンが、特に必要とされる。
【００１２】
（発明の要旨）
免疫原性フラビウイルスキメラ、このフラビウイルスキメラを調製するためのデング熱−２ウイルス骨格、およびこのフラビウイルスキメラを生成するための方法を記載する。免疫原性フラビウイルスキメラは、免疫原性組成物として、薬学的に受容可能なキャリア中に単独でかまたは組み合わせて提供され、１以上のフラビウイルスまたはフラビウイルス株（特に、デング熱ウイルス血清型ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４の株）による感染を最小化、阻害またはそれらの感染に対して個体を免疫する。組み合わされた場合、これらの免疫原性フラビウイルスキメラは、多価ワクチンとして使用され、フラビウイルスの１より多い種または株による感染に対する同時防御を付与する。好ましくは、フラビウイルスキメラは、これらの４つの公知のデング熱ウイルス血清型に対する四価のワクチンとして有用な免疫原性組成物中に組み合わされる。ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４ウイルスの各々についての核酸配列もまた、生物学的サンプルにおいてデング熱ウイルスを検出するためのプローブとして使用するために提供される。
【００１３】
本明細書中に提供される無発病性の免疫原性フラビウイルスキメラは、弱毒化されたデング熱−２ウイルスの非構造タンパク質遺伝子またはそれらの等価物、および免疫原性が付与されるフラビウイルスの１以上の構造タンパク質遺伝子またはそれらの免疫原性部分を含む。例えば、好ましいキメラは、ウイルス骨格として弱毒化されたデング熱−２ウイルスＰＤＫ−５３ゲノムを含み、そしてＰＤＫ−５３ゲノムのキャプシド、前膜／膜、またはエンベロープをコードする構造タンパク質遺伝子、あるいはそれらの組み合わせは、防御されるべきフラビウイルス（例えば、異なるフラビウイルスまたは異なるデング熱ウイルス血清型）由来の対応する構造タンパク質遺伝子と置き換えられる。この得られたウイルスキメラは、弱毒化デング熱−２ウイルスの機能的特性を有し、従って、無発病性であるが、これらの構造遺伝子産物の抗原性エピトープを発現し、従って、免疫原性である。
【００１４】
別の実施形態において、好ましいキメラは、弱毒化されたデング熱−２ウイルス由来の非構造タンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列、および第２のフラビウイルス由来の構造タンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列を含む、核酸キメラである。さらに好ましい実施形態において、弱毒化されたデング熱−２ウイルスは、ワクチン株ＰＤＫ−５３である。さらに好ましい実施形態において、構造タンパク質は、フラビウイルスのＣタンパク質、ｐｒＭタンパク質またはＥタンパク質であり得る。構造タンパク質が選択され得るフラビウイルスの例としては、デング熱−１ウイルス、デング熱−２ウイルス、デング熱−３ウイルス、デング熱−４ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、黄熱病ウイルスおよびダニ媒介脳炎ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、構造タンパク質は、フラビウイルスに近縁の非フラビウイルス種（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）から選択され得る。
【００１５】
本発明のキメラウイルスの評価において、予想外にも、弱毒化されたＰＤＫ−５３の無発病性が、非構造タンパク質における特定のアミノ酸置換変異および５’非コード領域におけるヌクレオチド置換変異の存在に起因することが、発見された。このヌクレオチド置換変異は、４つ全てのデング熱血清型において保存される、ステム−ループ構造のステム中に生じる。特に、ＮＳ１−５３での単一の変異、ＮＳ１−５３および５’  ＮＣ−５７での二重変異、ＮＳ１−５３およびＮＳ３−２５０での二重変異、およびＮＳ１−５３、５’ＮＣ−５７およびＮＳ３−２５０での三重変異は、本発明の弱毒化されたＤＥＮ−２ウイルスを提供し得る。
【００１６】
さらに、これらの遺伝子座で非保存的アミノ酸置換を含む任意のデング熱−２ウイルスのゲノムは、本明細書中に記載される無発病性キメラにおける骨格として使用され得る。さらに、同じ遺伝子座での類似の変異を含む他のフラビウイルスゲノムもまた、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列の整列化およびステム構造の分析後に、この骨格構造として使用され得、そして本明細書中で、デング熱−２  ＰＤＫ−５３ゲノムの弱毒化変異に等価であると定義される。
【００１７】
この骨格（５’および３’非コード領域および非構造タンパク質をコードする領域を含む、キメラの領域）はまた、無発病性表現型の安定性を維持するため、および無発病性ウイルスまたはキメラが毒性の野生型ウイルスに復帰し得る可能性を減少するために、さらなる変異を含み得る。例えば、所望の場合、５’非コード領域中のステム／ループ構造のステムにおける第２の変異が、さらなる安定性を提供する。
【００１８】
これらのキメラウイルスは、本明細書中に特定に記載した置換、欠失または挿入に加え、それらの構造タンパク質および非構造タンパク質におけるヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、欠失または挿入を含み得る。
【００１９】
本発明の構造タンパク質または非構造タンパク質には、完全タンパク質、そのタンパク質のエピトープ、または例えば、それらの２以上のアミノ酸残基を含む任意のフラグメントを含む任意のタンパク質、またはそれらの配列をコードする任意の遺伝子が含まれることが、理解される。
【００２０】
本発明はまた、適切な骨格ゲノムへの必要な置換の挿入による、組換え技術を使用して本発明のキメラウイルスを作製するための方法を提供する。
【００２１】
本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリアおよび本発明の弱毒化されたキメラウイルス（これは、他のデング熱ウイルス血清型、他のフラビウイルス種または他の近縁種（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）に由来するアミノ酸配列を含む）を含む組成物を提供する。本発明の目的として、他のデング熱ウイルス血清型、他のフラビウイルス種または他の近縁種（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）に由来するアミノ酸配列が、宿主、宿主細胞または細胞培養物中で発現される。本発明のさらなる目的として、他のデング熱ウイルス血清型、他のフラビウイルス種または他の近縁種に由来するアミノ酸配列を含むタンパク質またはポリペプチドは、免疫原として作用し得、従って、他のデング熱ウイルス血清型、他のフラビウイルス種または他の近縁種に対する免疫原性応答を誘導するために使用され得る。
【００２２】
本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリア、本発明の１以上の弱毒化されたキメラウイルスおよびさらなる免疫組成物を含む組成物を提供する。さらなる免疫組成物の例としては、デング熱ウイルスワクチン、黄熱病ウイルスワクチン、ダニ媒介性脳炎ウイルスワクチン、日本脳炎ウイルスワクチン、西ナイルウイルスワクチン、Ｃ型肝炎ワクチンまたは他のウイルスワクチンが挙げられるが、これらに限定されない。このようなワクチンは、生きた弱毒化されたウイルスワクチン、死化ウイルスワクチン、サブユニットワクチン、組換えＤＮＡベクターワクチンまたはそれらの組み合わせであり得る。
【００２３】
本発明の別の利点は、本発明が、いくつかのフラビウイルス種に対する免疫を同時に付与するためのワクチンとして使用される、弱毒化されたフラビウイルスキメラの混合物を提供することである。
【００２４】
従って、本発明の目的は、ウイルスの任意の病原性効果を妨げながら、そのウイルスの免疫原性を保持するアミノ酸置換またはヌクレオチド置換を含む、ウイルスキメラを提供することである。
【００２５】
本発明の別の目的は、弱毒化されたデング熱−２ウイルス由来のヌクレオチド配列および第２のフラビウイルス由来のヌクレオチド配列を含む、核酸キメラを提供することであり、ここで、第２のフラビウイルス由来のヌクレオチド配列は、フラビウイルス抗原の合成を指向する。
【００２６】
本発明の別の目的は、１より多いフラビウイルス種を含むワクチンのための組成物を提供することである。
【００２７】
本発明の別の目的は、適切なフラビウイルスゲノムへの必要な置換の挿入による、組換え技術を使用して免疫原性組成物またはワクチン組成物を作製するための方法を提供することである。
【００２８】
本発明の別の目的は、１より多いフラビウイルスに対する免疫を同時に付与するための組成物および方法を提供することである。
【００２９】
本発明の別の目的は、本発明のウイルスワクチンの各々について診断的な、多くの迅速な遺伝子試験のいずれかにおける使用のための、核酸プローブおよびプライマーを提供することである。本発明のこの目的は、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイまたは他の当該分野で公知の核酸配列検出技術において具体化され得る。この目的の特定の実施形態は、自動化ＰＣＲベースの核酸検出系である。
【００３０】
本発明のこれらおよび他の目的、特徴および利点は、以下の開示された実施形態の詳細な説明および添付の特許請求の範囲を参照して明らかになる。
【００３１】
（発明の詳細な説明）
以下の説明は、本発明を実行するために現在考えられる最適の形態を含む。この説明は、本発明の一般的原理を例示する目的でなされ、そして限定する意味に取られるべきではない。
【００３２】
本発明のフラビウイルスキメラを調製するための骨格である、免疫原性フラビウイルスキメラ、デング−２ウイルスまたはデング−２ウイルス等価物、およびフラビウイルスキメラを調製するための方法が、本明細書において提供される。免疫原性フラビウイルスキメラは、１つ以上のフラビウイルスまたはフラビウイルス株、特にデングウイルス血清型ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４の株による感染を最小にするか、阻害するか、その感染に対して個体を免疫するための免疫原性組成物として、薬学的に受容可能なキャリア中で、単独で、または組み合わせて、有用である。組み合わせた場合、免疫原性フラビウイルスキメラは、多価ワクチンとして用いられて、感染に対する同時防御を付与し得る。好ましくは、デングウイルスキメラは、４つの公知のデングウイルス血清型に対する４価ワクチンとして有用な免疫原性組成物に組み合わせられる。
【００３３】
本発明の免疫原性フラビウイルスキメラはまた、非病原性（非毒性）のウイルス株と組み合わせて、薬学的に受容可能なキャリア中で、複数の病原性種による個体の感染を最小にするか、阻害するか、または免疫するための免疫原性組成物として、有用である。例えば、本発明の免疫原性フラビウイルスキメラの１つ以上を、選択されたフラビウイルスの非毒性ウイルス血清型と組み合わせて、４つの公知のデングウイルス血清型に対して安全かつ有効なワクチンを提供し得る。さらなる実施形態では、本発明のフラビウイルスキメラを、非毒性ウイルスワクチンと組み合わせて、複数の病原性種による感染に対して安全かつ有効なワクチンを提供し得る。
【００３４】
本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリア、本発明の１つ以上の弱毒化キメラウイルス、およびさらなる免疫組成物を含む、組成物を提供する。このようなさらなる免疫組成物の例としては、デングウイルスワクチン、黄熱病ワクチン、ダニ媒介性脳炎ワクチン、日本脳炎ワクチン、西ナイルウイルスワクチン、Ｃ型肝炎ウイルスワクチン、または他のウイルスワクチンが挙げられるがこれらに限定されない。このようなワクチンは、生の弱毒化ウイルスワクチンであっても、不活化ウイルスワクチンであっても、サブユニットワクチンであっても、組み換えＤＮＡベクターワクチンであっても、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００３５】
各々のＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４ウイルスの核酸配列はまた、生物学的サンプルにおいてデングウイルスを検出するために、プローブとしての用途に提供される。
【００３６】
本発明のキメラは、弱毒化デング−２ウイルスのデング−２ウイルスの骨格、および１つ以上のデングウイルス血清型、他のフラビウイルス種、他の密接に関連する種（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）、またはそれらの任意の組み合わせから選択されたさらなるヌクレオチド配列を含み得る。これらのキメラは、デングウイルス血清型、フラビウイルス種、他の密接に関連した種、またはそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の種に対して免疫原性応答を誘導するために用いられ得る。
【００３７】
別の実施形態において、好ましいキメラは、弱毒化デング−２ウイルス由来の非構造的タンパク質をコードする第一のヌクレオチド配列、および第二のフラビウイルス由来の構造タンパク質をコードする第二のヌクレオチド配列を含む核酸キメラである。さらに、好ましい実施形態において、弱毒化デング−２ウイルスは、ワクチン株ＰＤＫ−５３である。さらに好ましい実施形態では、構造タンパク質は、フラビウイルスのＣタンパク質、フラビウイルスのｐｒＭタンパク質、フラビウイルスのＥタンパク質、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。構造タンパク質が選択され得るフラビウイルスの例としては、デング−１ウイルス、デング−２ウイルス、デング−３ウイルス、デング−４ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、およびダニ媒介性脳炎ウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。さらなる実施形態において、構造タンパク質は、フラビウイルスに密接に関連する非フラビウイルス種（例えば、Ｃ型肝炎ウイルス）から選択され得る。
【００３８】
本明細書において用いる場合、用語１つ（の）（「ａ」、「ａｎ」）およびこの（その）（「ｔｈｅ」）とは、この文脈が不適切でない限り、１つ以上を意味し、そして複数を含むことが規定される。
【００３９】
本明細書において用いる場合、用語「残基」とは、アミノ酸（ＤまたはＬ）またはアミノ結合によってペプチドに組み込まれるアミノ酸模倣物をいう。従って、アミノ酸は天然に存在するアミノ酸であり得るか、または他に限定しない限り、天然に存在するアミノ酸（すなわち、アミノ酸模倣物）と類似の様式で機能する天然のアミノ酸の公知のアナログを包含し得る。さらに、アミド結合模倣物は、当業者に周知のペプチド骨格改変を含む。
【００４０】
さらに、当業者は、アミノ酸配列、またはアミノ酸をコードするヌクレオチド配列における個々の置換、欠失もしくは付加（これは、コードされた配列中の単一のアミノ酸またはわずかなパーセンテージ（代表的には５％未満、より代表的には１％未満）のアミノ酸を、変更、付加、または欠失する）が、保存的に改変されたバリエーションであり、ここで、この変化は、化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じることを認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野で周知である。以下の６つのグループは、各々お互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００４１】
本明細書において用いる場合、用語「ウイルスキメラ」、「キメラウイルス」、「フラビウイルスキメラ」、および「キメラフラビウイルス」とは、デング−２ウイルスのヌクレオチド配列の一部、および同じデング−２ウイルス由来ではないさらなるヌクレオチド配列を含む、本発明の感染性構築物を意味する。従って、さらなるヌクレオチド配列の例としては、デング−１ウイルス、デング−２ウイルス、デング−３ウイルス、デング−４ウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、およびそれらの任意の組み合わせ由来の配列が挙げられるがこれらに限定されない。
【００４２】
本明細書において用いる場合、「感染性構築物」とは、ウイルス、ウイルス構築物、ウイルスキメラ、ウイルス由来の核酸、または細胞を感染させるために用いられ得る、それらの任意の組み合わせを示す。
【００４３】
本明細書において用いる場合、「核酸キメラ」とは、デング−２ウイルスのヌクレオチド配列の一部、およびデング−２ウイルスと同じ起源ではないさらなるヌクレオチド配列を含む、核酸を含む本発明の構築物を意味する。対応して、本発明のキメラフラビウイルスまたはフラビウイルスキメラは、核酸キメラの例として認識されるべきものである。
【００４４】
本発明の構造的および非構造的タンパク質は、完全なタンパク質、このタンパク質のエピトープ、または例えば、それらの２つ以上のアミノ酸残基を含む任意のフラグメントの配列を含む任意のタンパク質またはこのような配列をコードする任意の遺伝子を含むことが理解されるべきである
本発明のウイルスまたはキメラのＲＮＡゲノムのヌクレオチド配列は、ＤＮＡの場合に、配列表に記載される。
【００４５】
他に規定しない限り、本明細書において用いる全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する当該分野の当業者に通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載される材料および方法に類似または等価である他の材料および方法は、本発明の実施または試験において用いられ得る。好ましい方法および材料をここに記載している。
【００４６】
（フラビウイルスキメラ）
デングウイルス１〜４型（ＤＥＮ−１〜ＤＥＮ−４）は、蚊媒介性フラビウイルス病原である。フラビウイルスゲノムは、５’非コード領域（５’−ＮＣ）、続いてカプシドタンパク質（Ｃ）コード領域、続いて前膜／膜タンパク質（ｐｒＭ）コード領域、続いて、エンベロープタンパク質（Ｅ）コード領域、続いて、非構造タンパク質をコードする領域（ＮＳ１−ＮＳ２Ａ−ＮＳ２Ｂ−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５）、および最後に３’非コード領域（３’ＮＣ）を含む。ウイルス構造タンパク質は、Ｃ、ｐｒＭおよびＥであり、そして非構造タンパク質は、ＮＳ−１−ＮＳ５である。構造タンパク質および非構造タンパク質は、単一のポリタンパク質として翻訳され、そして細胞およびウイルスのプロテアーゼによって処理される。
【００４７】
本発明のフラビウイルスキメラは、デングウイルスまたはフラビウイルス科のウイルス種の１つの型または血清型に由来する非構造タンパク質遺伝子を、デングウイルスまたはフラビウイルス科のウイルス種の異なる型または血清型に由来する、タンパク質遺伝子（例えば、構造タンパク質遺伝子）と融合することによって形成された構築物である。あるいは、本発明のフラビウイルスキメラは、デングウイルスまたはフラビウイルス科のウイルス種の１つの型または血清型に由来する非構造タンパク質遺伝子を、他のデングウイルス血清型またはフラビウイルス科の他のウイルスから選択されるポリペプチドまたはタンパク質の合成を指向するさらなるヌクレオチド配列と融合することによって形成された構築物である。
【００４８】
本明細書において提供される、非毒性の免疫原性フラビウイルスキメラは、弱毒化デンス−２ウイルスの非構造的タンパク質遺伝子、またはその等価物、およびフラビウイルス（これに対して免疫原性が付与される）の１つ以上の構造タンパク質遺伝子、またはその抗原性部分を含む。適切なフラビウイルスとしては、表１に列挙されるウイルスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４９】
本発明のフラビウイルスキメラを構築するのに用いるための他の適切なフラビウイルスは、野生型、毒性ＤＥＮ−１  １６００７（配列番号１、配列番号２）、ＤＥＮ−２  １６６８１（配列番号１３、配列番号１４）、ＤＥＮ−３  １６５６２（配列番号１９、配列番号２０）およびＤＥＮ−４  １０３６（配列番号２３、配列番号２４）、ならびに弱毒化、ワクチン株  ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３（配列番号３、配列番号４）、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３（配列番号１５、配列番号１６）、ＤＥＮ−３  ＰＭＫ−３０／ＦＲｈＬ−３（配列番号２１；配列番号２２）およびＤＥＮ−４  ＰＤＫ−４８（配列番号２５、配列番号２６）である。さらに適切なフラビウイルス、または上記列挙されるフラビウイルスの改変体は、本明細書において記載されている。ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３、およびＤＥＮ−４野生型／弱毒化ウイルスペアの間の遺伝的差異は、ウイルスゲノムによってコードされるアミノ酸配列における変化とともに表２−５に示される。
【００５０】
本明細書に提供されるＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３の配列表（配列番号１５、配列番号１６）は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３−Ｖ改変体に相当し、ここでゲノムヌクレオチド位置５２７０は、ＡからＴに変異されており、そしてポリタンパク質のアミノ酸位置１７２５またはＮＳ３タンパク質のアミノ酸位置２５０は、バリン残基を含む。このヌクレオチド変異ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３−ＥのないＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３改変体は、この１つの位置だけでＰＤＫ−５３−Ｖと異なっている。ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３−Ｅは、ヌクレオチド位置５２７０でＡを有し、そしてポリタンパク質アミノ酸位置１７２５でグルタメート、アミノ酸位置２５０でＮＳ３タンパク質（表３）。
【００５１】
本明細書において提供されるＤＥＮ−３  １６５６２の配列表（配列番号２１、配列番号２２）は、改変体に相当し、ここでゲノムヌクレオチド位置１５２１は、Ｔであり、ポリタンパク質のアミノ酸位置４７６またはＥタンパク質のアミノ酸位置１９６はロイシンを含む。ＤＥＮ−３  １６５６２培養物に存在する、第二の改変体は、ヌクレオチド位置１５２１でＴを有し、そしてポリタンパク質のアミノ酸位置４７６またはＥタンパク質のアミノ酸位置１９６は、セリンを含む（表４）。
【００５２】
ＤＥＮ−４  ＰＤＫ−４８の配列表（配列番号２５、配列番号２６）は、改変体に相当する。ここで、ゲノムヌクレオチド位置：６９５７は、Ｔであり、そしてポリタンパク質のアミノ酸位置２２８６およびＮＳ４Ｂタンパク質のアミノ酸位置４４は、フェニルアラニンであり、７５４６は、Ｔであり、そしてポリタンパク質のアミノ酸位置２３６６およびＮＳ４Ｂタンパク質のアミノ酸位置２４０はバリンであり、そして７６２３は、Ｔであり、そしてポリタンパク質のアミノ酸位置２５０８およびＮＳ５タンパク質のアミノ酸位置２１はチロシンである（表５）。
【００５３】
本明細書を通して、キメラの命名は、ＤＥＮ−２ウイルス特異的感染クローン骨格および他のフラビウイルスの構造遺伝子（ｐｒＭ−Ｅ、またはＣ−ｐｒＭ−Ｅ）インサートに基づく。各命名は、デング−２骨格については、ＤＥＮ−２で始まり、その後にこの構造遺伝子が挿入される株が続く。特定の骨格改変体は、次の文字に反映される。特定のＤＥＮ−２骨格改変体（これからキメラが構築された）は、ハイフンの後に置かれる以下の文字によって示される。親  １６６８１（Ｐ）、ＰＤＫ５３−Ｅ（Ｅ）、またはＰＤＫ５３−Ｖ（Ｖ）；最後の文字は、親（Ｐ）株由来のＣ−ｐｒＭ−Ｅ構造遺伝子もしくはそのワクチン誘導体（Ｖ）または親（Ｐ１）由来のｐｒＭ−Ｅ構造遺伝子もしくはそのワクチン誘導体（Ｖ１）を示す。例えば；ＤＥＮ−２／１−ＶＰ（配列番号５、配列番号６）は、ＮＳ３−２５０にバリンを、そして野生型ＤＥＮ−１  １６００７からＣ−ｐｒＭ−Ｅ遺伝子を含む、弱毒化ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３Ｖ骨格を含むキメラを示す；ＤＥＮ−２／１−ＶＶ（配列番号７、配列番号８）は、デング−１、ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３のワクチン株を有するＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３Ｖ骨格を示す；ＤＥＮ−２／１−ＶＰ１（配列番号２７、配列番号２８）は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３Ｖ骨格およびｐｒＭ−Ｅ遺伝子（野生型ＤＥＮ−１  １６００７由来）を示す；ＤＥＮ−２／３−ＶＰ１（配列番号９、配列番号１０）は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３Ｖ骨格およびｐｒＭ−Ｅ遺伝子（野生型ＤＥＮ−３  １６５６２由来）を示す；ＤＥＮ−２／４−ＶＰ１（配列番号１１、配列番号１２）は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３Ｖ骨格およびｐｒＭ−Ｅ遺伝子（野生型ＤＥＮ−４  １０３６由来）を示す；そしてＤＥＮ−２／ＷＮ−ＰＰ１（配列番号１７、配列番号１８）は、ＤＥＮ−２  １６６８１骨格およびｐｒＭ−Ｅ遺伝子（西ナイル  ＮＹ９９由来）を示す。本発明の他のキメラ（同じ様式で示される）は、開示される配列によって本明細書に明確に規定される。例えば、ＤＥＮ−２／１−ＰＶは、本明細書において、野生型デング−２骨格、ＤＥＮ−２  １６６８１、およびデング−１、ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３のワクチン株のＣ−ｐｒＭ−Ｅ遺伝子からなるとして、規定される。
【００５４】
本発明の好ましいキメラは、例えば、ウイルス骨格として弱毒化デング−２ウイルスＰＤＫ−５３ゲノムを含む。ここでは、ＰＤＫ−５３ゲノムのＣ、ｐｒＭおよびＥタンパク質をコードする構造タンパク質遺伝子、またはそれらの組み合わせが、例えば、異なるフラビウイルスまたは異なるデングウイルス株などに対して防御されるべきフラビウイルス由来の対応するウイルス構造タンパク質遺伝子で置換されている。新しく発見されたフラビウイルスまたはフラビウイルス病原因子はまた、ＤＥＮ−２骨格中に取り込まれ得る。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のような関連ウイルスとの遺伝的組み換えはまた、本発明のキメラを生成するために用いられ得る。得られたウイルスキメラは、弱毒化デング−２ウイルスの機能的特性を有し、従って、無毒であるが、構造遺伝子産物の抗原性エピトープを発現し、従って免疫原性である。
【００５５】
野生型ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスと２つの弱毒化ＰＤＫ−５３ウイルス株のゲノムの間の９つのヌクレオチド変異が、本明細書において同定されている（表３）。これらの変異のうち３つは、サイレントな変異であり、すなわち、それらの変異は、野生型ウイルスの同じ位置でのアミノ酸とは異なるアミノ酸を生成しない。１つ目の変異は、５’非コード領域におけるゲノムヌクレオチド位置５７（ｎｔ５７）のＣからＴ（野生型からＰＤＫ−５３）のヌクレオチド変異である。第二の変異は、ゲノムヌクレオチド位置５２４でのＡからＴの変異であり、これは、構造的タンパク質前膜領域ｐｒＭ−２９でのアミノ酸置換ＡｓｐからＶａｌをコードする。
【００５６】
非構造的タンパク質領域において、ＧｌｙからＡｓｐ（野生型からＰＤＫ−５３）の変異が、非構造的タンパク質ＮＳ１−５３（ゲノムヌクレオチド位置２５７９）で発見された；ＬｅｕからＰｈｅ（野生型からＰＤＫ−５３）の変異は、非構造的タンパク質ＮＳ２Ａ−１８１（ゲノムヌクレオチド位置４０１８）で発見された；ＧｌｕからＶａｌ（野生型からＰＤＫ−５３）の変異は、非構造タンパク質ＮＳ３−２５０（ゲノムヌクレオチド位置５２７０）で発見された；そしてＧｌｙからＡｌａの変異（野生型からＰＤＫ−５３）は、非構造タンパク質ＮＳ４Ａ−７５（ゲノムヌクレオチド位置６５９９）で発見された。
【００５７】
弱毒化ＰＤＫ−５３ウイルス株は、ゲノムｎｔ５２７０で混合した遺伝子型を有する。ウイルス集団のかなりの割合（約２９％）が、変異していないＮＳ３−２５０−Ｇｌｕをコードする。この変異していないＮＳ３−２５０−Ｇｌｕは、ＮＳ３−２５０−Ｖａｌ変異ではなく野生型ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスに存在する。両方の遺伝子改変体とも非毒性であるので、この変異体は、非毒性のキメラにある必要はない。
【００５８】
弱毒化ＰＤＫ−５３ウイルス株の無発病性が、非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列および５’非コード領域における特定の変異の存在に起因し得ることが、予想に反して発見された（実施例５）。特に、ＮＳ１−５３における単一の変異、ＮＳ１−５３および５’ＮＣ−５７における二重の変異、ＮＳ１−５３およびＮＳ３−２５０における二重の変異、ならびにＮＳ１−５３、５’ＮＣ−５７およびＮＳ３−２５０における三重の変異が、ＤＥＮ−２ウイルスの弱毒化を生じる。従って、このような非保存的アミノ酸置換またはヌクレオチド置換をこれらの遺伝子座において含む、任意のデング−２ウイルスのゲノムが、本明細書中に記載される無発病性のキメラの骨格として使用され得る。この骨格はまた、さらなる変異を含んで、無発病性の表現型の安定性を維持し得、そして無発病性のウイルスまたはキメラが有毒の野生型ウイルスに戻り得る可能性を低下させ得る。例えば、５’非コード領域のステム／ループ構造のステムの第２の変異は、所望である場合には、さらなる無発病性表現型の安定性を提供する。ステム−ループ構造のステムは、デング−２ウイルスＲＮＡセンス配列のヌクレオチド残基１１〜１６（ＣＵＡＣＧＵ）（配列番号２９）およびヌクレオチド残基５６〜６１（ＡＣＧＵＡＧ）（配列番号３０）から構成され、ここで、下線を引いたヌクレオチドは、野生型ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスのＣおよびＰＤＫ−５３ウイルスのＵである。この領域への変異は、ウイルス複製のために重要な潜在的な二次構造を破壊する。特に、５’非コード領域における変異は、複製の間のポジティブセンスＲＮＡ鎖の機能およびネガティブセンス鎖の機能を破壊する能力を有する。ＤＥＮウイルスとベネズエラウマ脳炎ウイルスとの両方における、この短い（ほんの６ヌクレオチド残基長）のステム構造における単一の変異は、ヘアピン型構造の形成を妨害する（Ｋｉｎｎｅｙら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６７，１２６９−１２７７（１９９３））。このステム構造におけるさらなる変異は、この遺伝子座における反転の可能性を減少させ、一方でウイルスの生活力を維持する。さらに、５’非コード領域に位置する短いヌクレオチド配列からなる類似のステム構造（ステム−ループ構造中の６以上の塩基対からなるステム）を含み、そしてステム構造に１つ以上の変異を有するフラビウイルスゲノムもまた、本発明の骨格構造として有用であり得る。
【００５９】
このような変異は、当業者に公知の技術を使用する部位特異的変異誘発によって、達成され得る。さらに、アミノ酸配列の整列の後に同じ遺伝子座において類似の変異を含む、他のフラビウイルスゲノムが、本発明のキメラの骨格構造として使用され得、そして本明細書中において、デング−２  ＰＤＫ−５３ゲノムと等価であると定義される。毒力スクリーニングアッセイ（本明細書中に記載されるもの、および当該分野において公知のもののような）を使用して、有毒な骨格構造と無発病性骨格構造との間を区別し得ることが、当業者によって理解される。
【００６０】
（フラビウイルスキメラの構築）
本明細書中に記載されるフラビウイルスキメラは、当業者に周知の組換え操作技術を使用して、上記のように、免疫性が所望されるフラビウイルスの１つ以上の構造タンパク質遺伝子を、ＰＤＫ−５３デング熱ウイルスゲノム骨格またはその等価物にスプライシングし、対応するＰＤＫ−５３遺伝子を除去し、そしてこれを所望の遺伝子で置換することによって、産生され得る。あるいは、配列表に提供される配列を使用して、フラビウイルスタンパク質をコードする核酸分子を、公知の核酸合成技術を使用して合成し得、そして適切なベクターに挿入し得る。従って、無発病性の免疫原性ウイルスは、当業者に公知の組換え操作技術を使用して、産生され得る。
【００６１】
上記のように、骨格に挿入される遺伝子は、フラビウイルス構造タンパク質をコードする。好ましくは、挿入されるフラビウイルス遺伝子は、Ｃタンパク質、ＰｒＭタンパク質および／またはＥタンパク質をコードする遺伝子である。デング−２骨格に挿入される配列は、ＰｒＭ構造タンパク質とＥ構造タンパク質との両方をコードし得る。デング−２骨格に挿入される配列は、Ｃ構造タンパク質、ｐｒＭ構造タンパク質、およびＥ構造タンパク質をコードし得る。デング熱ウイルス骨格は、ＰＤＫ−５３デング−２ウイルスゲノムであり、そしてデング−１（ＤＥＮ−２／１）のＣ構造タンパク質、ＰｒＭ構造タンパク質、および／またはＥ構造タンパク質をコードするスプライス遺伝子、デング−３（ＤＥＮ−２／３）のＰｒＭ構造タンパク質および／またはＥ構造タンパク質をコードするスプライス遺伝子、あるいはデング−４（ＤＥＮ−２／４）のＰｒＭ構造タンパク質および／またはＥ構造タンパク質をコードするスプライス遺伝子の、いずれかを含む。本発明の特定の実施形態において、デング−３ウイルスの構造タンパク質をコードするスプライス遺伝子は、アミノ酸３４５位にロイシンを含むＥタンパク質の合成を指向する。
【００６２】
特定の実施形態において、本発明のキメラは、デング−２ウイルスのＣ構造タンパク質をコードし、そしてアミノ酸１００位にセリンを含むＣタンパク質の合成を指向し、そしてアミノ酸４４７位にロイシンを含むＥタンパク質の合成を指向するデング−４の構造タンパク質をコードするスプライス遺伝子を含む。
【００６３】
さらなる実施形態において、本発明のキメラは、デング−２ウイルスのＣ構造タンパク質をコードし、そしてアミノ酸１００位にセリンを含むＣタンパク質の合成を指向し、そしてアミノ酸４４７位にロイシンを含みかつアミノ酸３６４位にバリンを含むＥタンパク質の合成を指向するデング−４の構造タンパク質をコードするスプライス遺伝子を含む。本明細書中に記載される構造タンパク質は、フラビウイルス構造タンパク質のみとしてか、または本発明のウイルス性キメラにおけるフラビウイルス構造タンパク質の任意の組み合わせで、存在し得る。
【００６４】
本発明のキメラは、ＤＥＮ−２  １６６８１野生型ウイルスと、ＰＤＫ−５３デング−２ウイルス改変体（−Ｅまたは−Ｖ（配列番号１５））のいずれかとの両方由来の全ゲノム長ｃＤＮＡクローンの組換えによって、操作される。クローンされていないＰＤＫ−５３ワクチンは、２つの遺伝子型改変体（本明細書中においてＰＤＫ５３−ＥおよびＰＤＫ５３−Ｖと指定される）の混合物を含む。ＰＤＫ−５３−Ｖ改変体は、９つ全てのＰＤＫ−５３ワクチン特異的ヌクレオチド変異（アミノ酸ＮＳ３−２５０位におけるＧｌｕからＶａｌへの変異を含む）を含む。ＰＤＫ５３−Ｅ改変体は、ＰＤＫ−５３ワクチンの９つの変異のうちの８つ、および親１６６８１ウイルスのＮＳ３−２５０−Ｇｌｕを含む。感染性ｃＤＮＡクローンは、両方の改変体に対して構築され、そして両方のクローン由来のウイルスが、マウスにおいて弱毒化される。ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルスの弱毒化の表現型マーカーとしては、小さなプラークサイズ、温度感受性（特に、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞において）、制限された複製（特に、Ｃ６／３６細胞において）、新生マウスに対する弱毒化（吸引するマウスに対する神経毒力の特異的損失）およびサルにおけるウイルス血症の減少した発生数が挙げられる。ワクチン候補として有用なキメラを、２つのＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３改変体の遺伝背景において構築し、これらは全て、ゲノムの非構造領域における変異（５’非コード領域における５’ＮＣ−５７のＣからＴ（１６６８１からＰＤＫ−５３）を含む）、および非構造タンパク質のアミノ酸配列の変異（例えば、ＮＳ１−５３のＧｌｙからＡｓｐ、およびＮＳ３−２５０のＧｌｕからＶａｌなど）を含む。
【００６５】
他のフラビウイルスまたはデング熱ウイルスの血清型の構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、適切なキメラウイルスまたは核酸キメラを、無発病性を示す弱毒化の上記表現型マーカーについてスクリーニングすることによって、そして免疫原性についてスクリーニングすることによって、ワクチンとしての有用性について評価し得る。抗原性および免疫原性を、当業者に公知の慣用的なスクリーニング手順を使用して、フラビウイルス抗体または免疫反応性血清とのインビトロまたはインビボでの反応性を使用して、評価し得る。
【００６６】
（フラビウイルスワクチン）
好ましいキメラウイルスおよび核酸キメラは、免疫原またはワクチンとして有用な生存した弱毒化ウイルスを提供する。好ましい実施形態において、これらのキメラは、高い免疫原性を示し、同時に危険な病原性効果も致死効果も生じない。
【００６７】
現在まで、デング熱ウイルスの全ての株に対する効果的なワクチンは、利用可能ではなかった。４つ全ての血清型に対する個々の生存弱毒化ワクチン候補が、一次イヌ腎臓（ＰＤＫ）細胞または他の細胞型における野生型ウイルスの連続継代によって、開発された。上記のように、ＰＤＫ−５３ウイルスは、有用なデング熱ワクチンの候補である。しかし、ＰＤＫ−５３由来のワクチンは、ＤＥＮ−２血清型に対してのみ、免疫性を提供する。
【００６８】
デング熱ウイルスの１つのみの血清型に対してワクチン接種された患者において、ＤＨＦ／ＤＳＳの可能な発生を予防するためには、このウイルスの４つ全ての血清型に対して同時の免疫を提供するために、四価のワクチンが必要である。四価のワクチンは、適切な薬学的キャリア中で、デング−２  ＰＤＫ−５３を、上記デング−２／１、デング−２／３、およびデング−２／４キメラと、多価ワクチンとしての投与のために組み合わせることによって、生成される。
【００６９】
本発明のキメラウイルスまたは核酸キメラは、有毒ＤＥＤ−２ウイルス骨格または弱毒化ＤＥＮ−２ウイスル骨格における、野生型かまたは弱毒化ウイルスのいずれかの構造遺伝子を含み得る。例えば、このキメラは、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３骨格のいずれかにおいて、野生型ＤＥＮ−１  １６００７ウイルスまたはその候補ＰＤＫ−１３ワクチン誘導体の構造タンパク質遺伝子を、発現し得る。
【００７０】
実施例１に記載されるように、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３の骨格にＤＥＮ−１  １６００７ウイルス（ＤＥＮ−２／１−ＥＰおよび−ＶＰキメラ）またはＰＤＫ−１３ウイルス（ＤＥＮ−２／１−ＥＶおよび−ＶＶ（配列番号７）キメラ）のいずれかのＣ、ｐｒＭおよびＥタンパク質を含むキメラＤＥＮ−２／１ウイルスの全てが、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルスの表現型弱毒化マーカーの全てを維持する。ＤＥＮ−１  １６００７ウイルスのＣ、ｐｒＭおよびＥタンパク質を含むキメラＤＥＮ−２／１−ＥＰおよび−ＶＰ（配列番号５）ウイルスは、細胞培養の通過後、ＤＥＮ−２／１−ＥＶおよび−ＶＶウイルスより遺伝子的により安定である。ＤＥＮ−１  １６００７ウイルスの構造タンパク質を発現するキメラウイルスの免疫原性は、ＰＤＫ−１３ワクチンウイルスおよびＰＤＫ−１３ウイルスの構造タンパク質を発現するキメラによって惹起される中和抗体力価と比較して、高かった。従って、キメラＤＥＮ−２／１−ＥＰおよび−ＶＰウイルス（これらは、２つのＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３改変体の遺伝背景において、野生型ＤＥＮ−１  １６００７ウイルスの構造遺伝子を発現する）は、候補ＰＤＫ−１３ワクチンより優れた潜在的なＤＥＮ−１ワクチン候補である。これら２つのキメラは、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞において十分に複製し、そしてＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルスに関連する弱毒化マーカー（小さなプラークサイズ、温度感受性、カ細胞における制限された複製およびマウスに対する弱毒化を含む）を維持する。これらは少なくとも、マウスにおいて、野生型ＤＥＮ−１  １６００７ウイルスと同程度に免疫原性である。
【００７１】
他の例（例えば、実施例２〜４におけるＤＥＮ−２／３およびＤＥＮ−２／４キメラ）もまた、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３骨格において野生型ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４ウイルス由来の構造タンパク質遺伝子を含むキメラウイルスが、適切なワクチン候補であり、これらがＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルスの弱毒化表現型マーカーの全てを維持し（表１４）、同時にＤＥＮ−３またはＤＥＮ−４ウイルスに対する免疫原性を提供することを示した。本明細書中に記載される、ゲノムの非構造領域の弱毒化の決定因子を含むゲノム骨格を使用して異種ウイルスの構造タンパク質遺伝子を発現するストラテジーが、最適な免疫原性の野生型構造タンパク質遺伝子を発現する生存弱毒化フラビウイルスワクチン候補の開発を導いた。従って、複数のフラビウイルス病原体の免疫原性改変体に対するワクチン候補が、設計され得る。
【００７２】
本明細書中に記載されるキメラにおいて使用されるウイルスは、代表的に、当該分野において公知の技術を使用して、増殖される。次いで、増殖中の培養物の生育能力および表現型特性を評価するために、ウイルスプラークの滴定が実施され、そしてプラークが計数される。野生型ウイルスは、培養された細胞株に通されて、弱毒化候補出発物質を誘導する。
【００７３】
キメラ感染性クローンが、利用可能な種々のデング熱血清型クローンから構築される。ウイルス特異的ｃＤＮＡフラグメントのクローニングもまた、所望であれば、達成され得る。構造タンパク質遺伝子または非構造タンパク質遺伝子を含むｃＤＮＡフラグメントが、種々のプライマーを用いて、デング熱ウイルスＲＮＡから逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅される。増幅されたフラグメントが、他の中間クローンの切断部位にクローニングされる。次いで、中間のキメラデング熱ウイルスクローンが、配列決定されて、挿入されたデング熱ウイルス特異的ｃＤＮＡの正確さが確認される。
【００７４】
デング熱血清型ウイルスの構造タンパク質遺伝子領域または非構造タンパク質遺伝子領域をベクターに挿入することによって構築される、全ゲノム長キメラプラスミドは、当業者に周知の組換え技術を使用して、得られ得る。
【００７５】
（ヌクレオチドおよびアミノ酸の分析）
ＤＥＮ−２  １６６８１および対応するＰＤＫ−５３−Ｖに対するヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号１３および配列番号１５に提供する。ＤＥＮ−２  １６６８１および対応するＰＤＫ−５３−Ｖに対するアミノ酸配列を、配列番号１４および配列番号１６に提供する。ＰＤＫ−５３の−Ｅ改変体（これは、ＰＤＫ−５３−Ｖのヌクレオチド５２７０位およびアミノ酸１７２５位で、このポリタンパク質から変化している）を、表３にさらに記載する。親鎖と弱毒化ウイルスとの間に発見された重要なヌクレオチド置換およびアミノ酸置換の比較を、表３に示す。ＤＥＮ−２  ｃＤＮＡアンプリコンの配列を、ＤＥＮ−２ウイルスゲノムＲＮＡから、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅した。
【００７６】
ＰＤＫ−５３（これは、野生型デング−２ウイルスに関連するＥタンパク質において、アミノ酸変異を含まない）とは異なり、Ｍａｈｉｄｏｌ  ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４の弱毒化ウイルスは、全て、Ｅタンパク質においてアミノ酸変異を有する（表２、４および５）。配列表に列挙される野生型ＤＥＮ−３  １６５６２（ヌクレオチド配列である配列番号１９；アミノ酸配列である配列番号２０）は、ヌクレオチド１５２１位にＴを含む、微量の改変体を含むことが示された。これは、Ｅタンパク質のポリタンパク質４７６位、アミノ酸残基４７６位において、ロイシンの組み込みを指向する。
【００７７】
後者３つのウイルスの各々は、ＧｌｕからＬｙｓ（親からワクチン）の変異をＥタンパク質において有するが、この変異は、Ｅタンパク質における異なるアミノ酸残基に位置する。この置換は、負に荷電したアミノ酸から正に荷電したアミノ酸へのシフトを引き起こす。ＤＥＮ−４ワクチンウイルスのＥタンパク質におけるＧｌｕからＬｙｓの置換は、このＥタンパク質に存在する唯一の変異であったが、ＤＥＮ−１およびＤＥＮ−３ワクチンウイルスのＥタンパク質は、それぞれ５つおよび３つのアミノ酸変異を有した。
【００７８】
ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ワクチンウイルスにおけるＮＳ１−５３変異は、このウイルスの弱毒化表現型のために重要である。なぜなら、ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスのＮＳ１−５３−Ｇｌｙは、現在までに配列決定されたほぼ全てのフラビウイルス（ダニ媒介ウイルスを含む）において、保存されているからである。Ｍａｈｉｄｏｌ  ＤＥＮ−４ワクチンウイルスもまた、２５３位において、ＮＳ１タンパク質にアミノ酸変異を含む。この遺伝子座（これは、ＤＥＮ−４  ＰＤＫ−４８ワクチンウイルスにおけるＧｌｎからＨｉｓへの変異である）は、デング熱ウイルスの４つ全ての野生の血清型において、Ｇｌｎである。このＧｌｎ残基は、フラビウイルス属におけるデング熱ウイルスに独特である。ＮＳ１タンパク質は、フラビウイルスに感染した細胞から分泌された、糖タンパク質である。これは、感染した細胞の表面に存在し、そしてＮＳ１特異的抗体は、ウイルス感染した個体の血清中に存在する。ＮＳ１タンパク質で免疫されたかまたはＮＳ１特異的抗体で受動的に免疫された動物の保護が、報告されている。ＮＳ１タンパク質は、初期のウイルスＲＮＡ複製に関与するようである。
【００７９】
ＤＥＮ−１、−２、−３および−４弱毒化株のＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ４Ａ、およびＮＳ４Ｂタンパク質において起こった変異は、全て、本質的に保存的であった。それぞれＤＥＮ−２およびＤＥＮ−４ワクチンウイルスのＮＳ４Ａ７５およびＮＳ４Ａ−９５変異は、デングウイルスの間ではアミノ酸保存の部位であるが一般にはフラビウイルスの間ではアミノ酸保存の部位ではない部位において、起こった。
【００８０】
フラビウイルスＮＳ３タンパク質は、以下の少なくとも２つの組換え機能を有する：ウイルス性プロテイナーゼおよびＲＮＡヘリカーゼ／ＮＴＰａｓｅ。６９８アミノ酸長（ＤＥＮ−２ウイルス）のＮＳ３タンパク質は、アミノ末端セリンプロテアーゼドメイン（ＮＳ３−５１−Ｈｉｓ、−７５−Ａｓｐ、−１３５−Ｓｅｒ触媒性三つ組）を含み、これに続いて、ＲＮＡヘリカーゼ／ＮＴＰａｓｅ機能に関する配列モチーフ（ＮＳ３−１９６−ＧＡＧＫＴ（配列番号１４７）、−２８４−ＤＥＡＨ、−４５９−ＧＲＩＧＲ（配列番号１４８））が存在する。ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、またはＤＥＮ−３ウイルスのＮＳ３タンパク質における変異のいずれも、認識されたモチーフにおいて起こらなかった。ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ウイルスにおけるＮＳ３−５１０のＴｙｒからＰｈｅへの変異は、保存的であった。野生型ＤＥＮ−２、−３および−４ウイルスは、この位置でＰｈｅを含むので、ＴｙｒからＰｈｅへの変異が、ＤＥＮ−１ウイルスの弱毒化において、役割を果たすとは考えられない。ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ウイルスにおけるＮＳ３−１８２のＧｌｕからＬｙｓへの変異は、大部分のカ媒介フラビウイルスにおいてＡｓｐまたはＧｌｕとして保存された位置において起こり、そして弱毒化において何らかの役割を果たし得る。この変異は、ＧＡＧＫＴ（配列番号１４７）ヘリカーゼモチーフの１５アミノ酸残基上流に位置した。以前の報告において注目されたように、ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスにおけるＮＳ３−２５０−Ｇｌｕは、黄熱病ウイルスを除く全てのカ媒介フラビウイルスにおいて、保存される。
【００８１】
（投与の方法）
本明細書中に記載されるウイルスキメラは、免疫原またはワクチンとしてヒトまたは動物に投与されるために、個々にかまたは共同で、薬学的に受容可能なキャリアもしくはビヒクルと組み合わせられる。用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「薬学的に受容可能なビヒクル」とは、本明細書中において、有害な生理学的応答を引き起こすことなく、生存した動物またはヒトの組織と接触して使用するために適切であり、そしてその組成物の他の成分と有害な様式で相互作用しない、任意の組成物または化合物を意味するよう使用され、水または生理食塩水、ゲル、軟膏剤、溶媒、希釈剤、流体軟膏ベース、リポソーム、ミセル、巨大ミセルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
免疫原性処方物またはワクチン処方物は、ウイルス性のＰＦＵ単位投薬形態で好都合に提供され得、そして従来の製薬技術を使用することによって調製され得る。このような技術は、活性成分および薬学的キャリアまたは賦形剤を会合させる工程を包含する。一般に、これらの処方物は、活性成分を液体キャリアと均一に密接に会合させることによって、調製される。非経口投与のために適した処方物は、水性および非水性の滅菌注射溶液（これは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、およびこの処方物を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有し得る）、ならびに水性および非水性の滅菌懸濁液（これは、懸濁剤および濃厚化剤を含有し得る）を含む。この処方物は、単位用量容器または複数用量容器（例えば、密封されたアンプルおよびバイアル）に提供され得、そして凍結乾燥条件下で貯蔵され得、使用の直前に、滅菌液体キャリア（例えば、注射用水）を添加することのみが必要とされる。即時調合注射溶液および懸濁液が、当業者によって通常使用される滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【００８３】
好ましい単位投薬処方物は、投与される成分の用量または単位、あるいはその適切な画分を含む処方物である。上に特に記載した成分に加えて、本発明の処方物は、当業者によって通常使用される他の薬剤を含有し得ることが、理解されるべきである。
【００８４】
免疫原性組成物またはワクチン組成物は、種々の経路（例えば、経口または非経口（限定しないが、口腔および舌下、直腸、非経口、エアロゾル、鼻腔、筋肉内、皮下、皮内、および局所を含む））を介して投与され得る。組成物は、種々の形態（限定しないが、溶液、乳濁液および懸濁液、ミクロスフェア、粒子、ミクロ粒子、ナノ粒子およびリポソームを含む）で投与され得る。約１〜約５用量が免疫レジメン当たりに必要とされ得ることが予期される。最初の用量は、約１００〜約５０，０００ＰＦＵの範囲であり得、好ましい投薬量は、約５００〜約２０，０００ＰＦＵの範囲であり、より好ましい投薬量は、約１０００〜約１２，０００ＰＦＵの範囲であり、そして最も好ましい投薬量は、約１０００〜約４０００ＰＦＵの範囲である。ブースター注入は、約１００〜約２０，０００ＰＦＵの投薬量の範囲であり得、好ましい投薬量は、約５００〜約１５，０００の範囲であり、より好ましい投薬量は、約５００〜約１０，０００ＰＦＵの範囲であり、そして最も好ましい投薬量は、約１０００〜約５０００ＰＦＵの範囲である。例えば、投与容積は、投与経路に依存して変化する。筋肉内注入は、約０．１ｍｌ〜１．０ｍｌの容積で変化し得る。
【００８５】
組成物は、約−１００℃〜約４℃の温度で保存され得る。組成物はまた、室温を含む種々の温度で、凍結乾燥状態で保存され得る。組成物は、当業者に公知の従来の手段によって滅菌化され得る。このような手段としては、限定しないが、濾過が挙げられる。組成物はまた、細菌の増殖を阻害するために、チメロサールのような静菌剤と組み合わせられ得る。
【００８６】
（投与スケジュール）
本明細書中に記載される免疫原性組成物またはワクチン組成物は、ヒト、特に、デング熱ウイルス感染が存在する領域に旅行する個体およびまたそれらの領域の居住者に投与され得る。組成物の投与に最適な時間は、最初の感染の約１〜３か月前である。しかし、組成物はまた、疾患の進行を軽減するために最初の感染の後に、またはこの疾患を処置するために最初の感染の後に投与され得る。
【００８７】
（アジュバント）
当業者に公知の種々のアジュバントが、本発明の免疫原性組成物またはワクチン組成物中のキメラウイルスとともに投与され得る。このようなアジュバントとしては、限定しないが、以下が挙げられる：ポリマー、コポリマー（例えば、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー（ブロックコポリマーを含む））、ポリマーＰ１００５、フロイント完全アジュバント（動物について）、フロイント不完全アジュバント、ソルビタンモノオレエート、スクアレン、ＣＲＬ−８３００アジュバント、アラム、ＱＳ２１、ムラミルジペプチド、ＣｐＧオリゴヌクレオチドモチーフおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドモチーフの組み合わせ、トレハロース、細菌抽出物（ミコバクテリア抽出物を含む）、解毒内毒素、膜脂質、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００８８】
（核酸配列）
ＤＥＮ−１  １６００７ウイルス（配列番号１）、ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ウイルス（配列番号３）、ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルス（配列番号１３）、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルス（配列番号１５）、ＤＥＮ−３  １６５６２ウイルス（配列番号１９）、ＤＥＮ−３  ＰＧＭＫ−３０／ＦＲｈＬ−３ウイルス（配列番号２１）、ＤＥＮ−４  １０３６ウイルス（配列番号２３）およびＤＥＮ−４  ＰＤＫ−１３ウイルス（配列番号２５）の核酸配列は、高い感度および特異性を有した、サンプルまたは試料中のデング熱ウイルスの検出のための核酸プローブおよびプライマーを設計するのに有用である。各ウイルスサブタイプに対応するプローブまたはプライマーは、ＤＥＮ−１ウイルス、ＤＥＮ−３ウイルスおよびＤＥＮ−４ウイルスそれぞれの存在を検出するため、サンプル中において一般にデング熱ウイルス感染を検出するため、デング熱ウイルスの感染を診断するため、種々のデング熱ウイルスのサブタイプ間を区別するため、サンプルにおけるデング熱ウイルスの量を定量化するため、またはデング熱ウイルス感染を処置するために使用される治療法の進行をモニターするために使用され得る。核酸および対応するアミノ酸配列はまた、生物およびこの疾患を研究するためおよびこの疾患に対する治療法および処置を開発するための実験室研究ツールとして有用である。
【００８９】
核酸プローブは、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３およびＤＥＭ−４をコードする核酸分子またはその相補的な配列と選択的にハイブリダイズする。「選択性」または「選択的」とは、デング熱ウイルスの適切な検出を妨げる他の核酸とハイブリダイズしない配列を意味する。従って、核酸をハイブリダイズする設計において、選択性は、サンプル中に存在する他の成分に依存する。ハイブリダイズする核酸は、それがハイブリダイズする核酸のセグメントと少なくとも７０％相補性を有するべきである。核酸を記載するために本明細書中で使用されるように、用語「選択的にハイブリダイズする」は、時折ランダムハイブリダイズする核酸を除外し、従って、「特異的にハイブリダイズする」と同じ意味を有する。本発明の選択的にハイブリダイズする核酸は、それがハイブリダイズするセグメントと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％および９９％の相補性を有し得、好ましくは、８５％以上である。
【００９０】
本発明はまた、コードする核酸、またはその核酸の相補的または反対の鎖と選択的にハイブリダイズする配列、プローブおよびプライマーを意図する。核酸との特異的なハイブリダイゼーションは、機能的な種に特異的にハイブリダイズする能力が維持される限り、この核酸の小さな改変または置換とともに生じ得る。「プローブ」とは、核酸配列の検出または増幅のために相補的な核酸配列と選択的にハイブリダイズするためのプローブまたはプライマーとして使用され得る核酸配列を意味し、このプローブは、約５〜１００ヌクレオチド、または約１０〜５０ヌクレオチド、または最も好ましくは約１８〜２４ヌクレオチドの長さで変化し得る。従って、本明細書中で使用される用語「プローブ」は、「プライマー」を含むように定義される。ストリンジェントな条件下で種特異的核酸と選択的にハイブリダイズし、そしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８９）に記載されるように、目的の配列に対して少なくとも５ヌクレオチド相補性を有するべきである、単離された核酸が、本明細書中に提供される。
【００９１】
プライマーとして使用される場合、組成物は、好ましくは、所望の領域を増幅するために標的分子の異なる領域にハイブリダイズする少なくとも２つの核酸分子を含む。プローブまたはプライマーの長さに依存して、標的領域は、７０％相補的な塩基と完全な相補性との間の範囲であり得、そしてなおストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る。例えば、デング熱ウイルスの存在を検出のために、ハイブリダイズする核酸（プローブまたはプライマー）とそれがハイブリダイズする配列との間の相補性の程度は、他の生物由来に核酸とのハイブリダイゼーションを区別するのに少なくとも十分である。
【００９２】
ＤＥＮ−１ウイルス、ＤＥＮ−３ウイルスまたはＤＥＮ−４をコードする核酸配列は、ベクター（例えば、プラスミド）に挿入され得、そして生きた生物において組換え的に発現されて組換えデング熱ウイルスペプチドおよび／またはポリペプチドを産生し得る。
【００９３】
（核酸検出方法）
本明細書中に記載されるワクチンウイルスのそれぞれについて診断的な迅速な遺伝的試験は、本発明によって提供される。本発明のこの実施形態は、ウイルス血症を発症した、ワクチン接種したヒトの血清から単離されたウイルスの分析を高め、そしてＭａｈｉｄｏｌ候補ワクチンウイルスで免疫された非ヒト霊長類動物におけるウイルス血症の特徴付けを高める。
【００９４】
野生型親菌株およびワクチン菌株の完全ヌクレオチド配列、および表１６に提供されるプライマー配列に提供されるように、本発明は、核ワクチンウイルスのゲノムにおいて同定された変異の１つ以上を検出するためのウイルス特異的プローブおよびプライマーを含む。２つ以上のウイルス特異的な遺伝子座の特異的な検出は、ワクチニーの血清内で循環する特定のワクチンの特異的な同定を可能にする。ＴａｑＭａｎアッセイにおいてＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４ワクチンウイルス特異的遺伝子座のそれぞれの検出を可能にするように特異的に設計されたこのようなプローブの例は、表１６に提供される。
【００９５】
これらの配列は、逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ／ＰＣＲ）を使用することによってウイルスゲノムＲＮＡテンプレートから増幅されたｃＤＮＡアンプリコンの検出を報告するのに役立つ診断的ＴａｑＭａｎプローブ、ならびに以下に記載されるように、ｃＤＮＡアンプリコンを増幅するために設計される順方向アンプリマー（表１６のＦ）および逆方向アンプリマー（表１６のＲ）を含む。特定の例において、アンプリマーの１つは、アンプリマーの３’末端にワクチンウイルス特異的変異（表１６において下線を引かれた残基）を含むように設計されており、これによって、この試験がワクチン菌株に対してさらにより特異的になる。なぜなら、標的部位におけるプライマーの伸長、結果的に増幅が、ウイルスＲＮＡテンプレートが特定の変異を含む場合のみ生じるからである。表１５および表１６に列挙されるプローブおよびプライマーは、有用な診断的配列の例として役立ち、Ｍａｈｉｄｏｌワクチンウイルス特異的遺伝子変異を検出するために設計され得る他のプローブおよびアンプリマー配列の設計および範囲を限定するようには意図されない。
【００９６】
最近開発された、自動ＰＣＲに基づく核酸配列検出システムは、ＴａｑＭａｎアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）であり、これは、診断的実験室で広く使用されている。ＴａｑＭａｎアッセイは、サンプル核酸テンプレートからＰＣＲ生成したアンプリコンの自動化した実時間視覚化および定量化を可能にする高い特異性で感度の高いアッセイである。ＴａｑＭａｎは、特定の配列の存在または非存在を決定し得る。このアッセイにおいて、順方向プライマーおよび逆方向ププライマーは、それぞれ、標的変異部位の上流および下流をアニールするように設計される。アンプリマーのいずれかよりも約１０℃高い融点を有するように設計され、そしてワクチン特異的ヌクレオチド変異またはその相補体（検出されるＲＴ／ＰＣＲアンプリコンの鎖に依存する）を含む特定の検出プローブは、このアッセイの第３のプライマー成分を構成する。
【００９７】
プローブは、５’−レポーター色素および３’−クエンチャー色素を含む蛍光ディテクターまたはレポーターオリゴヌクレオチドである。ヌクレオチドの５’末端は、多くの種々の蛍光レポーター色素（例えば、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）またはＴＥＴ（テトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン））の１つに連結される。プローブの３’末端において、クエンチング色素ＹＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）は、リンカーを介して接続される。クエンチング色素は、インタクトなプローブにおいてレポーター色素の蛍光を抑制し、ここで、両方の色素は、近位にある。プローブ特異的標的配列がＲＴ／ＰＣＲアンプリコンに存在する場合、プローブは、アンプリコンの順方向プライマーと逆方向プライマーとの間でアニールする。プローブが標的配列にハイブリダイズする場合、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の５’−３’ヌクレアーゼ活性は、レポーター色素とクエンチャー色素との間のプローブを切断する。ポリメラーゼは、遊離のプローブを消化しない。ポリメラーゼがプローブを置換するので、重合およびＰＣＲ増幅が続く。一旦、クエンチャー色素から分離されると、レポーター色素は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍによって測定される蛍光を生成する。プローブ特異的標的配列がアンプリコンに存在する場合、蛍光のレベルが、それぞれの増幅するＰＣＲサイクルとともに増加し、自動的に測定される。
【００９８】
Ｍａｈｉｄｏｌワクチンウイルスゲノムの１つの変異遺伝子座を特異的に検出するように設計されたプローブは、プローブの中間においてワクチン特異的ヌクレオチドを含む。このプローブは、ウイルスＲＮＡテンプレートがワクチンウイルス特異的である場合、ＴａｑＭａｎアッセイにおける検出可能な蛍光を生じる。しかし、野生型ＤＥＮウイルス由来のゲノムＲＮＡテンプレートは、単一ヌクレオチドミスマッチ（親ウイルスＤＥＮウイルスの場合）またはおそらく１つより多くのミスマッチ（他の野生型ＤＥＮウイルスにおいて生じ得る）が理由で、プローブハイブリダイゼーションの効率が減少しており、有意な蛍光を生じない。ＤＮＡポリメラーゼは、レポーター色素を放出するためにミスマッチプローブを切断するよりも、ＲＴ／ＰＣＲアンプリコンテンプレートからミスマッチプローブを置換する傾向が強い（ＴａｑＭａｎ  Ａｌｌｅｌｉｃ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
【００９９】
診断的遺伝子試験についてより最近開発された戦略は、分子ビーコンを利用する（Ｔｙａｇｉ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０３−３０８（１９９６））。分子ビーコン戦略はまた、アンプリコンのＲＴ／ＰＣＲ増幅のため、およびプローブ末端におけるレポーター色素およびクエンチャー色素を含むプローブによるアンプリコン内の特定の配列の検出のためにプライマーを利用する。このアッセイにおいて、プローブは、プローブは、ステム−ループ構造を形成する。５’および３’末端レポーター色素およびクエンチャー色素は、短いステム構造の末端に位置し、これは、このレポーター色素の近くに並んだクエンチャー色素を有する。ステム−構造は、ＲＴ／ＰＣＲアッセイの変性工程の間に融解する。標的ウイルスＲＮＡが標的配列を含み、そして順方向アンプリコンおよび逆方向アンプリコンによって増幅される場合、プローブの開いたループは、サイクルのアニーリング工程の間に標的配列にハイブリダイズする。プローブがアンプリコンテンプレートのいずれかの鎖にアニールされる場合、クエンチャー色素およびレポーター色素は分離され、そしてレポーター色素の蛍光が検出される。これは、ＴａｑＭａｎアッセイに非常に類似した実時間同定および定量化アッセイである。分子ビーコンアッセイは、ＴａｑＭａｎアッセイに使用されるものとは異なるクエンチャー色素およびレポーター色素を使用する。
【０１００】
本発明は、さらに、以下の非制限的な実施例によって説明され、これらの実施例は、本発明の範囲に制限を課すようないかなるようにも解釈されない。対照的に、その種々の他の実施形態、改変および等価物に対する手段が与えられ得、これらは、本明細書中の記載を読んだ後に、本発明の精神または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、当業者に提案されることが明かに理解されるべきである。
【０１０１】
（実施例１）
（キメラＤｅｎｇｕｅ−１ワクチン：ＰＤＫ−５３／Ｄｅｎｇｕｅ−１の調製）
（ウイルスおよび細胞培養物）
野生型ＤＥＮ−１  １６００７ウイルスおよびＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスが、Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ（Ａｔｌａｎｔａ，ＧＡ）のウイルスコレクションで入手可能であった。ＤＥＮ−１１６００７ウイルスは、タイにおいて１９６４年にＤＨＦ／ＤＳＳを有する患者の血清から回収された。ウイルスは、グリベットモンキー腎臓ＢＳ−Ｃ−１細胞において３継代およびＬＬＣ−ＭＫ２細胞において１継代、Ｔｏｘｏｒｈｙｎｃｈｉｔｅｓ  ａｍｂｏｉｎｅｎｓｉｓ  ｍｏｓｑｕｉｔｏｅｓにおいて２回継代させ、次いで、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｍａｈｉｄｏｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｈａｉｌａｎｄにおいて初代イヌ腎臓（ＰＤＫ）において継代させて、候補ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ワクチンウイルスを駆動して単離した（Ｙｏｋｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｕｎｃｌｏｎｅｄ  ｄｅｎｇｕｅ  １−４  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｓｅｒｉａｌｌｙ  ｐａｓｓａｇｅｄ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｋｉｄｎｅｙ  ｃｅｌｌｓ」，ｐｐ．３５−３８，Ｉｎ  Ａｒｂｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｏｕｒｔｈ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ．ＣＳＩＲＯ／ＱＩＭＲ，Ｂｒｉｓｂａｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ（１９８６）；Ｂｈａｍａｒａｐｒａｖａｔｉ  ＆  Ｓｕｔｅｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：４４−４７（２０００））。他に記載しない限り、候補ワクチンウイルスの単一ＬＬＣ−ＭＫ２継代（ｌｏｔ  １９８９年３月１０日）を使用した。前述の蚊の継代に続いて、１６００７ウイルスは、使用のためにＬＬＣ−ＭＫ２細胞において一度継代させた。
【０１０２】
ウイルスを、ペニシリン／ストレプトアビジンおよび５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変最小必須培地（ＤＭＥＭ）中のＬＬＣ−ＭＫ２およびＣ６／３６細胞で増殖させた。ウイルスプラーク滴定を、先に記載された（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．＆  Ｈｙｇ．３５：１３０２−１３０９（１９８６））ように、コンフルエントなＶｅｒｏまたはＬＬＣ−ＭＫ２細胞の６ウェルのプレートで行った。３７℃で１．５時間の２００μｌウイルス接種材料の吸収の後に、最初の４ｍｌのオーバーレイ培地（栄養培地（０．１６５％  ラクトアルブミン加水分解産物［Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．］）中の１％ＳｅａＫｅｍ  ＬＥ  ａｇａｒｏｓｅ（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）、０．０３３％酵母抽出物［Ｄｉｆｃｏ］，アール平衡化溶液塩溶液、２５ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンスルフェート［Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．］、１．０ｍｇ／ＬのアンホテリシンＢ［Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ，Ｅ．Ｒ．Ｓｑｕｉｂｂ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．］および２％ＦＢＳを含む）を加えた。３７℃で７日間のインキュベーションに続いて、さらに８０μｇ／ｍｌのニュートラルレッドバイタル染色（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、Ｍｄ．）を含む第２の２ｍｌのオーバーレイを加えた。プラークは、感染の８〜１１日後に計数した。
【０１０３】
（キメラＤ２／１感染クローンの構築）
（ｐＤ２−１６６８１−Ｐ４８ベクター、ｐＤ２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８ベクター、ｐＤ２−ＰＤＫ５３−Ｖ４８ベクター）
３つのＤＥＮ−２ベクターを、キメラＤ２／１クローンの構築のために使用した。これらは、Ｋｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３０：３００−３０８（１９９７））によって報告されるＤＥＮ−２感染クローンから改変した。ヌクレオチドの４５１位および２３８０位にそれぞれクローニング部位ＭｌｕＩおよびＮｇｏＭＩＶを含むように、クローンｐＤ２−１６６８１−Ｐ４８をｐＤ２／ＩＣ−３０Ｐ−Ａから改変した。同じクローニング部位を、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルス特異的クローン、ｐＤ２／ＩＣ−１３０Ｖｘ−４および−１３０Ｖｃ−Ｋとの両方に導入し、そして改変クローンを、それぞれｐＤ２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８およびｐＤ２−ＰＤＫ５３−Ｖ４８と名付けた。もとのｐＤ２／ＩＣ−１３０Ｖｘ−４および−１３０Ｖｃ−Ｋのヌクレオチド６６６５およびヌクレオチド８８４０において２つのクローニングエラーが見出された。これらの欠陥は、ｐＤ２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８および−Ｖ４８において訂正された。導入されたＮｇｏＭＩＶクローニング部位は、２つのヌクレオチド変異（ヌクレオチド２３８１および２３８２；ＴＧ〜ＣＣ）を生じ、これは、Ｅ−４８２においてＶａｌ〜Ａｌａ置換をコードした。Ｍ１ｕＩ部位に導入されるヌクレオチドの変化は、サイレントであった。Ｃ／ｐｒＭ接合において導入されるＭ１ｕＩ部位を使用して、異種のウイルスのｐｒＭ−Ｅ遺伝子をクローニングした。
【０１０４】
（キメラｐＤ２／１−ＰＰ、−ＥＰ、−ＶＰ、−ＰＶ、−ＥＶ、および−ＶＶ）
２個の中間体ＤＥＮ−２クローン、ｐＤ２Ｉ−ＰおよびｐＤ２Ｉ−Ｅを、それぞれ、ｐＤ２−１６６８１−Ｐ４８およびｐＤ２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８のＨｐａＩ（ｎｔ−２６７６）〜ＸｂａＩ（ウイルス性遺伝子ｃＤＮＡの３’末端）フラグメントを欠失することによって構築した。これらの中間体クローンを使用して、ＤＥＮ−１ウイルス特異的ｃＤＮＡフラグメントをサブクローニングした。プライマーＤＥＮ−Ｂｇｌ．５ＮＣ：
【０１０５】
【化１】
0004656794.tif 000002
（デングイルスゲノムの５’ＮＣＲ中の保存配列（下線を付した配列は、ＢｇｌＩＩ部位である）、およびプライマーｃＤ１−２３９４．Ｎｇｏ：
【０１０６】
【化２】
0004656794.tif 000003
（ＤＥＮ−１ウイルスのＥ遺伝子の３’末端近傍の相補配列が引き続くＮｇｏＭＩＶ部位に下線を付した）を用いて、ＤＥＮ−１  １６００７またはＰＤＫ−１３ウイルスのｐｒＭ−Ｅ遺伝子を含むｃＤＮＡフラグメントを、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってＤＥＮ−１ウイルスＲＮＡより増幅した。増幅フラグメントを、中間体ｐＤ２Ｉ−ＰおよびｐＤ２Ｉ−ＥクローンのＢｇｌＩＩ−ＮｇｏＭＩＶ部位にクローニングした。中間体（キメラｐＤ２／１クローン）を、インサートＤＥＮ−１ウイルス特異的ｃＤＮＡの精度を確認するために配列決定した。ＳｓｔＩ（Ｔ７プロモーターの前にある）を有する中間体（ｐＤ２／１クローン）から切除したフラグメントおよびＮｇｏＭＩＶを、完全遺伝子長ＤＥＮ−２ウイルス、ｐＤ２−１６６８１−Ｐ４８、ｐＤ２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８、およびｐＤ２−ＰＤＫ５３−Ｖ４８にクローニングした。ＤＥＮ−１  １６００７またはＰＤＫウイルスのＣ−ｐｒＭ−Ｅ遺伝子領域をこれらの３個のベクターに挿入することによって、６本の完全遺伝子長キメラｐＤ２／１プラスミドを構築する（図１）。このプラスミドは、指定ｐＤ２／１−ＸＹであり、そしてそれらのウイルス誘導体は、指定ＤＥＮ２／１−ＸＹであり、ここで、Ｘは、感染性ＤＥＮ−２クローンバックグラウンドであり（Ｐは、親１６８８１クローンであり、Ｅは、ＰＥＫ５３−Ｅ改変体であり、Ｖは、ＰＤＫ５３−Ｖ改変体である）、そしてＹは、ＤＥＮ−１ウイルス特異的Ｃ−ｐｒＭ−Ｅインサートである（Ｐは、親１６００７株であり、Ｖは、ＰＤＫ−１３ワクチン候補物である）。ＰＤＫ５３−Ｅ骨格は、３つのＤＥＮ−２ＰＤＫ−５３ウイルス特異的アミノ酸変異体（ＮＳ１−５３−Ａｓｐ、ＮＳ２Ａ−１８１−ＰｈｅおよびＮＳ４Ａ−７５−Ａｌａ）ならびにＰＤＫ−５３ウイルスの５’ＮＣ−５７変異体を含む。ＰＤＫ５３−Ｖ骨格は、これらの同一のＰＤＫ−５３ウイルス特異的遺伝子座およびさらなるＰＤＫ−５３ウイルス特異的ＮＳ３−２５０−Ｖａｌ遺伝子座を含む。
【０１０７】
（組換えウイルスの回収）
全組換えプラスミドを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞中で増殖させた。組換えウイルスＲＮＡを、ＸｂａＩ−直線化ｃＤＮＡの２００ｎｇ〜４００ｎｇのキャップアナログｍ７ＧｐｐｐＡでキャップし、そして３〜４×１０６ＬＬＣ−ＭＫ２またはＢＨＫ−２１細胞にエレクトロポレーションによって形質移入させた。形質移入した細胞を、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ媒地中で、７５ｃｍ２フラスコまで形質移入した。形質移入した細胞中で発現されるウイルスタンパク質を、間接的な免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によって分析した。ウイルス感染した細胞を、３０分間、氷冷アセトン中で固定した。ＤＥＮ１−１およびＤＥＮ−２ウイルス特異的モノクローナル抗体１Ｆ１および３Ｈ５を、それぞれ、アッセイにおいて使用し、そして結合は、蛍光標識ヤギ抗マウス抗体で検出した。ウイルスを、６日から８日後に収集し、次いで、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を一度（ＤＥＮ−２−１６６８１−Ｐ４８、ＤＥＮ−２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８および−Ｖ４８、ＤＥＮ−２／１−ＰＰ、−ＥＰ、および−ＶＰ）、または二度（ＤＥＮ−２／１−ＰＶ、−ＥＶ、および−ＶＶ）継代することによって作用シードを得た。Ｄ２／１−ＥＶおよび−ＶＶウイルスを、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞中で、三度継代して、マウスのチャレンジまたは免疫に必要とされる、より高度なウイルスタイターが得られる。
【０１０８】
（細胞培養中でのキメラウイルスの複製表現型の特徴付け）
プラークサイズを、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞での感染の１０日後に測定した。平均プラーク直径を、各ウイルスに対して１０個のプラークから計算した。ウイルス成長曲線を、感染の約０．００１の多重度（ｍ．ｏ．ｉ）の、７５ｃｍ２フラスコのＬＬＣ−ＭＫ２またはＣ６／３６細胞中で実施した。２時間の吸収後に、３０ｍｌのＤＭＥＭ培地（ＬＬＣ−ＭＫ２細胞）または５％のＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシンを含む、オーバーレイ栄養素培地（Ｃ６／３６細胞）を添加し、そしてこの培地を、５％のＣＯ２中で、それぞれ３７℃または２９℃でインキュベートした。培養培地のアリコートを、１２日間、４８時間の間隔で収集し、１２．５％のＦＢＳに調整し、そして滴定前に−８０℃で貯蔵した。
【０１０９】
温度感受性を、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞中で試験した。７５ｃｍ２フラスコの２個のセット中で増殖した細胞を、増殖曲線研究のために記載したように、感染およびインキュベートした。１つのセットの培養物を、８日間３７℃でインキュベートし、その他を３８．７℃でインキュベートした。３８．７℃のウイルスタイター  対  ３７℃のタイターの比を、計算した。３８．７℃のウイルスタイターが、その３７℃のタイターと比較して、６０％以上に減少した場合、このウイルスは、温度−感受性と呼ばれる。
【０１１０】
（ウイルスｃＤＮＡのシークエンシング）
ウイルスＲＮＡを、ウイルスシードから、ＱＬＡｍｐウイルスＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ）を使用することによって抽出した。ＤＥＮ−１ウイルス特異的プライマーを、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ株Ｓ２７５／９０の刊行されたデータを基礎とした（Ｆｕら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８８：９５３−９５８（１９９２））。５〜７個のオーバーラップウイルスｃＤＮＡフラグメントを、Ｔｉｔａｎ  Ｏｎｅ−Ｔｕｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）を用いたＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。ｃＤＮＡアンプリコンの両方の標準を、直接的にシークエンスした。ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ウイルスゲノムのシークエンシングのために、テンプレート遺伝子ＲＮＡを、候補ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ワクチンから直接的に抽出した（ｌｏｔ  １９８９年、３月１０日）。ＤＥＮ−１  １６００７の５’−末端配列および３’−末端配列およびＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ウイルス遺伝子を、５’ＲＡＣＥキット（ＧＩＢＯ  ＢＲＬ）を用いて、遺伝子ＲＮＡをポリ（Ａ）で追跡することで決定した。ＰＲＩＳＭ３７７シークエンサーで奨められるように、自動化シークエンシングを実施した（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）。
【０１１１】
（マウスの研究）
新生児の同腹子、１日齢の非近交系の白色ＩＣＲマウスを、３０ｍｌの容積中で、頭蓋内に５，０００ＰＦＵのウイルスで播種した。これらを、麻酔および死について毎日観測し、そして生存しているマウスを、５週間の間、各週に１回個々に重量を測定した。
【０１１２】
中和抗体応答を、３週齢のＩＣＲマウス中で試験した。これらを、１０４ＰＦＵのウイルスで腹腔内に播種し、そして３週または６週間後に同一量のウイルスでブーストした。マウスは、ブースト前に２日間およびブースト後の３週間、出血した。
【０１１３】
上で使用した近交系マウスのＩＣＲ株は、野生型ＤＥＮ−１ウイルスでチャレンジするために、通常致命的に感受性ではない。従って、効果的な免疫応答を減少させるために、ＤＥＮ−２／１ウイルスキメラの能力を完全に試験するために、インターフェロンα／βおよびインターフェロンγの両方に対するレセプターを欠く、近交系ＡＧ−１２９マウスを利用することが必要であり（Ｍｕｌｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：１９１８−１９２１（１９９４））、これらのマウスは、高用量の野生型ＥＥＮ−１ウイルス、Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ菌株を含む、腹腔内のチャレンジに対して感受性であることが見出されている。従って、３．５−４．５週齢の近交系ＡＧ−１２９マウスは、１０４のＰＦＵの野生型ＤＥＮ−１  １６００７、Ｍａｈｉｄｏｌ候補物ワクチンＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３、キメラＤＥＮ−２／１−ＥＰまたはキメラＤＥＮ−２／１−ＶＰウイルスで腹腔内で免疫される。これらの免疫化されたマウスは、ＤＥＮ−１  Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉウイルスで腹腔内でチャレンジされる。
【０１１４】
（中和アッセイ）
マウス血清サンプルを、血清希釈プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）によって抗体を中和するために試験した。６０のＰＦＵのＤＥＮ−１  １６００７ウイルスを、熱インキュベートした（５６℃で３０分）マウス血清試料の連続の２倍希釈でインキュベートした。中和抗体タイターを、試験中のウイルスプラークを５０％以上まで減少させる、最も高度の血清希釈物として同定した。
【０１１５】
（結果）
ワクチン開発のためのベクターとして利用するために、ＤＥＮ−２  １６６８１  ＰＤＫ−５３ウイルスの２個の改変体から誘導される感染性ｃＤＮＡクローンの能力を評価するために、本研究者は、これらの２つのベクターの骨格内に、野生型ＤＥＮ−１  １６００７ウイルスまたはそのワクチン誘導体（株ＰＤＫ−１３）の構造遺伝子（Ｃ−ｐｒＭ−Ｅ）を含む、キメラＤＥＮ−２／ＤＥＮ−１  ｃＤＮＡクローン（Ｄ２／１−ＥＰ、Ｄ２／１−ＶＰ、Ｄ２／１−ＥＰ、およびＤ２／１−ＶＶ）を操作した（図１）。ＤＥＮ−１  １６００７の構造遺伝子（Ｃ−ｐｒＭ−Ｅ）または野生型ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスの骨格中のＰＤＫ−１３を含む、２つの他のキメラクローン（Ｄ２／１−ＰＰおよびＤ２／１−ＰＶ）をまた、比較のために構築した（図１）。本発明者は、感染クローンの全てにおいて、全体の全長遺伝子ｃＤＮＡを配列決定した。サイレントｃＤＮＡ人工産物を、キメラクローンｎｔ−２９７（Ｔ〜Ｃ）に取り込んだ。ｎｔ−１５７５（Ｔ〜Ｃ）でのサイレント変異体を、キメラクローンの全てに操作し、ＤＥＮ−１ウイルスのＥ遺伝子中の天然ＸｂａＩ部位を除去した。
【０１１６】
ＬＬＣ−ＭＫ２またはＢＨＫ−２１細胞のトランスフェクト後のタイターは、ＤＥＮ−１  １６００７を含む、キメラウイルスＤ２／１−ＰＰ、−ＥＰ、および−ＶＰに関して、Ｃ−ｐｒＭ−Ｅ１０４〜１０６ＰＦＵ／ｍｌであった。これらのタイターは、親のウイルスのために得られたタイターと比較して、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞中の１回の継代後に、１０６．５〜１０７．５ＰＦＵ／ｍｌまで増加した。１０２〜１０４ＰＦＵ／ｍｌのより低いタイターを、ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ウイルスのＣ−ｐｒＭ−Ｅを含む、キメラＤＥＮ−２／１−ＰＶ、−ＥＶ、および−ＶＶウイルスのためにトランスフェクトされた細胞中で得た。Ｄ２／１−ＰＶウイルスは、ＬＬＣ−ＭＣ２細胞中での２回の継代後に１０６ＰＦＵ／ｍｌに達し、一方で、Ｄ２／１−ＥＶおよび−ＶＶウイルスは、２または３回の継代後に、１０３．３〜１０５．３ＰＦＵ／ｍｌのタイターに達した。任意のキメラＤＥＮ−２／１ウイルスで感染された細胞は、モノクローナル抗体１Ｆ１（ＤＥＮ−１  Ｅタンパク質に対して特異的）でＩＦＡによってポジティブ、モノクローナル抗体３Ｈ５（ＤＥＮ−２Ｅタンパク質に対して特異的）でネガティブであり、適切なＤＥＮ−１  Ｅタンパク質が、キメラによって発現されることを示した。ＤＥＮ−２／１−ＰＰ、ＤＥＮ−２／１−ＥＰ、およびＤＥＮ−２／１−ＶＰウイルスゲノムを、マスターシードから抽出されたゲノムウイルスＲＮＡから増幅された、オーバーラップＲＴ−ＰＣＲフラグメントを直接的に分析することによって、完全に配列決定した。全ての３つのゲノムは、発現された配列を有した。
【０１１７】
（ＬＬＣ−ＭＫ２およびＣ６／３６細胞培養中でのキメラウイルスの増殖）
キメラＤＥＮ−２／１ウイルスの全ては、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞中の野生型ＤＥＮ−１  １６００７ウイルスの６．８±０．４ｍｍプラークと比較して、より少ないプラークを産生した（図２）。ＤＥＮ−２／１−ＥＰ（３．１±０．３ｍｍ）および−ＶＰ（２．８±０．３ｍｍ）の両方のウイルスプラークは、ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ウイルスのプラークのサイズ（２．９±０．３ｍｍ）と似ていた。ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ウイルスのＣ−ｐｒＭ−Ｅを含む、キメラウイルスＤＥＮ−２／１−ＰＶ、ＤＥＮ−２／１−ＥＶ、およびＤＥＮ−２／１−ＶＶは、タイニープラーク（１．３±０．３ｍｍ）またはピンポイントプラーク（１ｍｍ未満）を形成した。ＤＥＮ−２  １６６８１−Ｐ４８ウイルスは、野生型ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスと類似している３．５±０．３ｍｍプラークを産生した。ＤＥＮ−２  ＰＤＫ５３−Ｖ４８ウイルスは、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ５３−Ｅ４８ウイルスのプラークより、小さくかつファジーであるプラークを形成した。ＤＥＮ−２／１−ＰＰウイルスの５．１±０．３ｍｍのプラークは、他のキメラウイルスのプラークよりも大きかった。
【０１１８】
ウイルスを、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞中において温度感受性について試験した。温度感受性は、図２Ｂにおいて示されるように、感染の８日または１０日後に決定された。温度感受性は、３７℃のウイルスタイターから３８．７°のウイルスタイターの減少に基づく。温度感受性は、少なくとも３回の実験で取られた測定から計算した。
【０１１９】
ＤＥＮ−２  ＰＤＫ５３−Ｖ改変体（Ｄ２−ＰＤＫ５３−Ｖ４８）は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ５３−Ｅウイルス（Ｄ２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８）よりもより温度感受性であり、そしてＤＥＮ−２  １６６８１ウイルス（ＤＥＮ−２−１６６８１−Ｐ４８）は、いくらか温度感受性であった（３８．７℃で７０〜８７％のタイターの減少）。ＤＥＮ−２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８ウイルスの複数の温度感受性試験により、８３％〜９７％の増殖減少が得られた。ＤＥＮ−１  １６００７ウイルスのタイターは、３８．７℃未満で４０％減少し、この研究において、少なくとも温度感受性ウイルスにした。キメラウイルスの全ては、ＤＥＮ−１  １６００７ウイルスと比較して温度感受性であり、そしてＰＤＫ−１３と少なくとも同程度に温度感受性であった。
【０１２０】
ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、およびキメラＤ２／１ウイルスの全ては、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞の感染の８日後と１０日後との間に、ピークタイターに達する（図２Ｂ）。このクローン由来のウイルスＤＥＮ−２−１６６８１−Ｐ４８、ＤＥＮ−２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８、およびＤＥＮ−２−ＰＤＫ５３−Ｖ４８は、ＤＥＮ−２  １６６８１およびＰＤＫ−５３ウイルスが複製されるように、１０７．０ＰＦＵ／ｍｌ以上で複製された。類似のピークタイターに到達したが、ＤＥＮ−２−ＰＤＫ５３−Ｖ４８ウイルスは、感染の最初の４日後の間に、ＤＥＮ−２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８ウイルスよりも短く複製された。キメラＤＥＮ−２／１−ＰＰ、ＤＥＮ−２／１−ＥＰ、ＤＥＮ−２／１−ＶＰ、およびＤＥＮ−２／１−ＰＶウイルスは、親のＤＥＮ−１およびＤＥＮ−２ウイルスのピークタイターと比較して、１０６．７ＰＦＵ／ｍｌを超えるピークタイターに達した。いくつかの別個の実験において、１０５．６〜１０５．９ＰＦＵ／ｍｌのピークタイターを有する、キメラＤＥＮ−２／１−ＥＶおよび−ＶＶウイルスは、他のウイルスよりも低い効率で複製された。
【０１２１】
ＰＤＫ−１３ウイルス特異的キメラによって、１６００７ウイルス特異的キメラと比較して、トランスフェクトされた細胞から回収された低いウイルスタイターが得られた。ＤＥＮ−２／ＤＥＮ−１およびＤＥＮ−２／ＤＥＮ−４キメラを用いた以前の実験により、トランスフェクションの間に無能力の複製を示し、そして細胞培地における継代後に高いウイルスタイターを手介するキメラウイルスが、しばしば予想外の変異を発生することを示す。増加した複製能力のウイルスは、ウイルス改変体の分集団の選択を介して上昇し得、これは、ｃＤＮＡのインビトロでの転写の間の取り込みミスから生じる。転写された細胞中で十分に複製するキメラウイルスは、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞中の継代後に、より遺伝子的に安定であった。動物細胞の培地中において、最小の継代での効率的な複製は、感染クローン誘導ワクチンウイルスの遺伝子的な安定性および適合性の重要な判断基準であり得る。
【０１２２】
約０．００１  ＰＦＵ／ｍｌの多重度でのＣ６／３６感染後の、Ｃ６／３６細胞中でのウイルス増殖をモニターした。３つのＤＥＮ−２骨格ウイルス（ＤＥＮ−２−１６６８１−Ｐ４８、ＤＥＮ−２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８およびＤＥＮ−２−ＰＤＫ５３−Ｖ４８）は、オリジナルのＤＥＮ−２  １６６８１および２個のＰＤＫ−５３改変体のそれぞれと同様に複製した。ＤＥＮ−２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８およびＤＥＮ−２−ＰＤＫ５３−Ｖ４８ウイルスは、Ｃ６／３６細胞中で、ＤＥＮ−２−１６６８１−Ｐ４８、ＤＥＮ−１  １６００７およびＰＤＫ−１３ウイルスよりも約４０００分の１の効率で複製した。ＤＥＮ−１  １６００７およびＰＤＫ−１３ウイルスは、それぞれ、１０８．７および１０８．４ＰＦＵ／ｍｌの高いタイターで複製した。キメラＤＥＮ−２／１−ＰＰウイルスは、１０５．２ＰＦＵ／ｍｌまで複製し、これは、２個のＤＥＮ−２−ＰＤＫ５３改変体のピークタイターと等しかった。キメラＤＥＮ−２／１−ＥＰおよびＤＥＮ−２／１−ＶＰウイルスの複製は、Ｃ６／３６細胞中で非常に非効率的であった。これらのウイルスは、１０２ＰＦＵ／ｍｌ未満のピークタイターに達した。
【０１２３】
（哺乳マウスの神経毒性）
新生から１日齢のＩＣＲマウスのグループ（ｎ＝１６）を、５０００ＰＦＵのウイルスで頭蓋内に播種した。野生型ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスは、１４．１±１．６日の平均生存時間を有する１００％致死であったが、両方のクローン誘導ＤＥＮ−２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８およびＤＥＮ−２−ＰＤＫ５３−Ｖ４８ウイルスは、任意のＩＣＲマウスを殺すことができなかった。代表的にチャレンジマウスの５０％以上を殺す、ＤＥＮ−２  １６６８１のようではなく、この野生型マウスＤＥＮ−１  １６００７ウイルスは、ＩＣＲマウスにおいて単一の死亡率のみで生じた（チャレンジ２１日後）。このＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ウイルスは、ＩＣＲマウスのいずれも殺さなかった。ＤＥＮ−１  １６００７ウイルス感染したＩＣＲマウスは、チャレンジの２１日後と３５日後の間に、希釈剤を用いて継代したコントロールグループと比較して、顕著に低い平均体重を有した（ｐ＜０．００００３、スチューデントｔ検定）。５匹のキメラＤＥＮ−２／１ウイルス（ＤＥＮ−２／１−ＶＶウイルスは、試験しなかった）を用いてチャレンジしたＩＣＲマウスグループの全ては、コントロールグループと比較した場合に、より低い平均重量（ｐ＜０．０２）を有するが、それらの平均重量は、感染の２８日後に、ＤＥＮ１  １６００７グループよりも顕著に大きかった（ｐ＜０．００４）。ＤＥＮ−１  １６００７またはＰＤＫ−１３ウイルスでチャレンジしたＩＣＲマウスグループの平均体重は、チャレンジの７日後と３５日後との間に、ＤＥＮ−１  １６００７ウイルスの５０００ＰＦＵでチャレンジしたＩＣＲマウスのウイルスとほぼ同一であった。
【０１２４】
（マウス中でのキメラＤＥＮ−２／１ウイルスの免疫原性）
非近交系のマウス：キメラウイルスの免疫原性を試験するために、３週齢のＩＣＲマウスのグループ（ｎ＝８）を、実施例１および実施例２のウイルスの１０４ＰＦＵで心膜内に免疫した（表７）。実施例１において、このマウスは、一次免疫の２０日後に出血させ、次いで２日後にブーストした。実施例２において、マウスを、一次免疫の４１日後に出血させ、次いで、２日後にブーストした。表７は、各免疫したグループからプールされた血清サンプルの、相反的な５０％のプラーク減少エンドポイントＰＲＮＴタイターを示す。このグループの多くにおいて、８匹のマウスに対する個々のタイターの範囲がまた、示されている。両方の実験において、１６００７ウイルス免疫マウス由来のプールされた血清の相反的なタイターは、ブーストの前に８０、そしてブーストの後に２５６０であった。両方の実験において、キメラＤＥＮ−２／１−ＰＰ、−ＥＰ、またはＥＥＮ−２／１−ＶＰウイルスで免疫したマウスは、プールされた血清タイターを有し、このタイターは、ブースト前（４０〜１６０の相反的タイター）およびブースト後（２５６０〜５２１０の相反的タイター）の１６００７ウイルス免疫グループのタイターと少なくとも同程度に高かった。これらのウイルスグループ中のマウスの免疫応答は、実施例１および実施例２の両方においてほぼ等しかった。
【０１２５】
ＰＤＫ−１３ウイルスおよびＰＤＫ−１３構造遺伝子を含むキメラの全３種は、実施例１の一次免疫の２０日後までに、ＤＥＮ−１  １６００７ウイルスに対して、１０〜２０の最低または低い相反的ＰＲＮＴタイターを誘導した。４０のいくらかより高い相反的なＰＮＲＴタイターを、実施例２の免疫の４１日後までにこれらのウイルスの各々によって誘発した。中和抗体の開発は、これらのマウス中で１６００７、ＤＥＮ−２／１−ＰＰ、−ＥＰ、または−Ｖｐウイルスでよりも、ＰＤＫ−１３、ＤＥＮ−２／１−ＰＶ、−ＥＶ、または−ＶＶウイルスでの免疫後により小さな大きさであり、そして緩やかであった。実施例１のＤＥＮ−２／１−ＰＶグループの１匹のマウスおよび両方の実施例におけるＤＥＮ−２／１−ＥＰグループの各々の１匹のマウスは、ブース前に検出可能なＰＲＮＴタイターを産生し得ない。ブースとしたタイターはまた、実施例１（８０のプールされた相反的タイター）でよりも、実施例２のＰＤＫ−１３、ＤＥＮ−２／１−ＰＶ、−ＥＶ、および−ＶＶ免疫化グループ（１６０〜２５６０のプールされた相反的タイター）でより高かった。実施例２のＤＥＢ−２／１−ＰＶグループを除いて、これらのブーストされたタイターは、野生型１６００７ウイルスおよび野生型ＤＥＮ−１  １６００７ウイルスの構造遺伝子を含むキメラＤＥＮ−２／１−ＰＰ、−ＥＰ、および−ＶＰウイルスによって誘導された（表７）。ＤＥＮ−２／１−ＰＶウイルスでブースとされたマウスのプールされた血清のための、得られた高ＰＲＮＴタイターが、２５６０および１０，２４０の相反的なタイターを有する２種のマウス血清から得られた。このグループの残る６匹は、２０〜６４０の相反的タイターを有し、これは、ＰＤＫ−１３、ＤＥＮ−２／１−ＥＶ、および−ＶＶグループのマウスの個々のタイターと類似していた。このＰＤＫ−１３、ＤＥＮ−２／１−ＰＶ、ＤＥＮ−２／１−ＥＶ、およびＤＥＮ−２／１−ＶＶウイルスは、これらの非近交系のマウス中の、１６００７、ＤＥＮ−２／１−ＰＰ、−ＥＰ、および−ＶＰウイルスよりも低い免疫原性であるようであった。ＤＥＮ−２−１６６８１−Ｐ４８、ＤＥＮ−２−ＰＤＫ−５３−Ｅ４８、またはＤＥＮ−２−ＰＤＫ−５３−Ｖ４８ウイルスで免疫したマウス由来のプールした血清サンプルは、ＤＥＮ−１  １６００７ウイルスに対する検出可能なクロス中和抗体を含まなかった。
【０１２６】
近交系ＡＧ−１２９マウス：キメラウイルスの免疫原性を試験するために、３．５〜４．５週齢の非近交系のＡＧ−１２９マウスのグループを、１０４ＰＦＵの野生型ＤＥＮ−１  １６００７、マヒドール候補物ワクチンＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３、キメラＤＥＮ−２／１−ＥＰ、またはキメラＤＥＮ−２／１−ＶＰウイルスを用いて腹腔内で免疫した。一次免疫の２６日後に、キメラＤＥＮ−２／１−ＥＰまたはＤＥＮ−２／１−ＶＰウイルスで免疫したマウス由来のプールした血清は、相反的な７０％の血清希釈−プラーク減少中和抗体タイター（ＰＲＮＴ７０）を有した。これらのタイターは、候補物ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ワクチンによって惹起された中和抗体応答と等しいが（２倍以内）、野生型ＤＥＮ−１  １６００７ウイルスによって惹起される６４０タイターよりも低かった。リン酸生理食塩水緩衝液を用いて腹腔内に注射されたコントロールマウスは、１０未満のタイターを有した。全てのマウスを、１０７ＰＦＵの野生型、病原性ＤＥＮ−１ウイルス、Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ株を用いて、一次免疫の２８日後に腹腔内にチャレンジした。チャレンジ後に、コントロールの全１１匹の非免疫マウスは、２１日以内（１１．５±４．２日の平均生存時間［平均±標準偏差］）に死んだが、ＤＥＮ−１の全て（１６００７、ＤＥＮ−２／１−ＥＰ、ＤＥＮ−２／１−ＶＰ）ウイルス免疫マウスは、ＤＥＮ−１  Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉウイルスでのチャレンジで生存した。ＤＥＮ−１  Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉでのチャレンジの３４日後に、ウイルス免疫マウスの全ては、１２８０〜２５６０の相反的なＰＲＮＴ７０タイターを有した。キメラＤＥＮ−２／１−ＥＰおよびＤＥＮ−２／１−ＶＰウイルスは、ＡＧ−１２９に対して高度に免疫原性および保護性であった。
【０１２７】
（ＤＥＮ−１  １６００７およびＰＫＤ−１３のウイルス遺伝子のヌクレオチド配列分析）
本研究者は、野生型ＤＥＮ−１  １６００７ウイルスのゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ１８０８１７）およびＰＤＫ−１３ワクチン誘導体（寄託番号ＡＦ１８０８１８）のゲノムを配列決定した。１６００７とＰＤＫ−１３ウイルスとの間に異なる、１４個のヌクレオチドおよび８個のコードされたアミノ酸が存在する（表２）。Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ４Ｂ、およびＮＳ５遺伝子中に、ゲノムヌクレオチド位置１５６７、２６９５、２７８２、７３３０、および９４４５に存在した。Ｅタンパク質中のアミノ酸変異体を有しない、候補物ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ワクチンのようではなく、このＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ウイルスは、Ｅ中に５個のアミノ酸変異体を有し、これらには、Ｅ−１３０  Ｖａｌ〜Ａｌａ、Ｅ２０３  Ｇｌｕ〜Ｌｙｓ、Ｅ−２０４  Ａｒｇ〜Ｌｙｓ、Ｅ−２２５  Ｓｅｒ〜Ｌｅｕ、およびＥ−４４７  Ｍｅｔ〜Ｖａｌが挙げられる。非構造遺伝子中のアミノ酸変異体には、ＮＳ３−１８２  Ｇｌｕ〜Ｌｙｓ、ＮＳ３−５１０  Ｔｒｙ〜Ｐｈｅ、およびＮＳ４Ａ−１４４  Ｍｅｔ〜Ｖａｌが挙げられる。このＰＤＫ−１３ウイルス特異的Ｅ−４７７−Ｖａｌは、キメラ構造の全てに取り込まれた。
【０１２８】
（キメラＤＥＮ−２／１−ウイルスを用いたサルの免疫）
成体カニ食いサル（ｃｒａｂ−ｅａｔｉｎｇ  ｍｏｎｋｅｙ）（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）キメラＤＥＮ−２／１−ＥＰおよびＤＥＮ−２／１−ＶＰウイルスの免疫原性を試験した。サルの免疫を、１０６ＰＦＵのキメラＤＥＮ−２／１−ＥＰまたはＤＥＮ−２／１−ＶＰウイルスの皮下注射により達成した。免疫したサル由来の血清を、６ウェルプレートに覆ったアガロースゲル下に保持されたＬＬＣ−ＭＣ２細胞の単層中の血清アリコートの直接的なプラークアッセイにより、そして液体媒体中に維持されたＬＬＣ−ＭＫ２の培地中での血清アリコートの継代によって、ウイルス血漿の存在について分析した。感染性のウイルスは、これらの２種の古典的なアッセイ方法のいずれかによってサルの任意の血清において同定された。これらのウイルスアッセイによって、ウイルス血漿は、キメラＤＥＮ−２／１−ＥＰまたはＤＥＮ−２／１−ＶＰウイルスのいずれかの免疫後に、検出可能ではなかった。サルの血清により、ＤＥＮ−１ウイルス特異的中和抗体について試験した。一次免疫の３０日後に、キメラＤＥＮ−２／１−ＥＰを用いて免疫した、これらの３匹の個々のサル由来の血清を、８０、１６０および１２８０の相反的な５０％の血清希釈−プラーク減少中和抗体タイター（ＰＲＮＴ５０）を有した。キメラＤＥＮ−２／１−ＶＰで免疫した、これらの３匹の個々のサルは、１６０、１６０および６４０の相反的なＰＲＮＴ５０を有した。実験のために、コントロールとして希釈剤を注射したサルは、免疫前に全てのサルにおいて実施したように、１０未満の相反的なＰＲＮＴ５０タイターを有した。このキメラＤＥＮ−２／１−ＥＰおよび−Ｖｐウイルスは、非ヒトプライマー中でＤＥＮ−１ウイルス特異的中和抗体を惹起した。
【０１２９】
（実施例２：キメラＤＥＮ−２／３感受性クローンの構築）
インビトロでの連結戦略を、ゲノム全長ＤＥＮ−２／３感染性クローンについて使用した。
【０１３０】
（ｉ）５’末端ＤＥＮ−２／３中間体クローン：ｐＤ２Ｉ／Ｄ３−Ｐ１−ＡｓｃおよびｐＤ２Ｉ／Ｄ３−Ｅ１−Ａｓｃ
中間体ＤＥＮ−２クローンである、ｐＤ２Ｉ−ＰおよびｐＤ２Ｉ−Ｅを使用して、ＤＥＮ−３  １６５６２ウイルス特異的ｃＤＮＡフラグメントをサブクローニングした。プライマーＤ３−４３５．Ｍｌｕ：
【０１３１】
【化３】
0004656794.tif 000004
（ｐｒＭ遺伝子の５’末端近傍のＤＥＮ−３ウイルス配列が引き続くＭｌｕＩ部位に下線を付した）およびプライマーｃＤ３−２３９４．Ｎｇｏ：
【０１３２】
【化４】
0004656794.tif 000005
（ＤＥＮ３ウイルスのＥ遺伝子の３’末端近傍の相補配列が引き続くＮｇｏＭＩＶ部位に下線を付した）を用いて、野生型ＤＥＮ−３  １６５６２ウイルスのｐｒＭ−Ｅ遺伝子を含むｃＤＮＡフラグメントを、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってＤＥＮ−３ウイルスＲＮＡより増幅した。ＭｌｕＩ部位は、アミノ酸ｐｒＭ−５−ＴｈｒにおいてＤＥＮ−２ウイルスについてサイレントな変異を含んだ。この位置は、ＤＥＮ−３ウイルスではＳｅｒであるが、キメラＤＥＮ−２／３ウイルスではＴｈｒである。ＮｇｏＭＩＶ部位は、ＤＥＮ−２ウイルスのＥ−４８２でＶａｌからＡｌａへの置換、およびＤＥＮ−３ウイルスのＥ−４８０でＩｌｅからＡｌａへの置換を生じた。増幅されたフラグメントを、中間体ｐＤ２Ｉ−ＰクローンおよびｐＤ２Ｉ−ＥクローンのＭｌｕＩ−ＮｇｏＭＩＶ部位にクローニングした。インビトロ連結を容易にするために、制限部位、ＡｓｃＩを、部位特異的変異誘発によってＮｇｏＭＩＶ部位の下流に導入した。この独特なＡｓｃＩ部位は、ＮｇｏＭＩＶ部位からほんの１６ｎｔ下流であり、そして全長ＤＥＮ−２／３クローンのインビトロ連結の前に切除した。以下に説明するように、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞で生存可能なキメラウイルスの誘導を可能にするために、アミノ酸Ｅ−３４５をＨｉｓからＬｅｕに変更するｎｔ１９７０でのさらなる変異誘発（ＡからＴ）を、導入した。これらの中間体キメラＤＥＮ−２／３クローンである、ｐＤ２Ｉ／Ｄ３−Ｐ−ＡｓｃおよびｐＤ２Ｉ／Ｄ３−Ｅ−Ａｓｃを、挿入されたＤＥＮ−３ウイルス特異的ｃＤＮＡの精度を立証するために配列決定した。サイレントな変異を、両方の中間体キメラクローン中のｎｔ５５２（ＣからＴ）にて組み込んだ。
【０１３３】
（ｉｉ）３’末端ＤＥＮ−２中間体クローン：ｐＤ２／Ｐｍ＾ｂ−Ａｓｃ、ｐＤ２／Ｅｍ＾ｂ−ＡｓｃおよびｐＤ２／Ｖｍ＾ｂ−Ａｓｃ
ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルス、ＰＤＫ５３−ＥウイルスまたはＰＤＫ−５３−Ｖウイルスのｎｔ２２０３〜１０７２３（３’末端）からの短縮型ＤＥＮ−２ウイルス特異的ｃＤＮＡ配列を含む中間体ＤＥＮ−２クローンを、それぞれｐＤ２−１６６８１−Ｐ４８、ｐＤ２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８、およびｐＤ２−ＰＤＫ５３−Ｖ４８の全長クローン中のウイルス特異的配列ｃＤＮＡの５’末端（Ｔ７プロモーター配列およびＤＥＮ−２のｎｔ１〜２０２２を含む）の欠失によって得た。ＡｓｃＩ部位をまた、インビトロ連結を容易にするためにｎｔ２３５８（ＮｇｏＭＩＶ部位の２２ｎｔ上流）で導入した。このＡｓｃＩ部位を、全長ゲノムであるキメラＤＥＮ−２／３感染性クローンのインビトロ連結を実施する前に切除した。
【０１３４】
（ｉｉｉ）全長キメラＤＥＮ−２／３  ｃＤＮＡ：ＤＥＮ−２／３−ＰＰ１、ＤＥＮ−２／３−ＥＰ１およびＤＥＮ−２／３−ＶＰ１
３〜１０ｍｇの５’末端ｐＤ２Ｉ／Ｄ３中間体クローンおよび３’末端Ｄ２中間体クローンを、ＡｓｃＩで消化し、仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理し、次いでＮｇｏＭＩＶで消化した。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ−ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎに消化したＤＮＡを通すことによって、切除したＡｓｃＩ−ＮｇｏＭＩＶの小フラグメントを、除去した。次いで、大きな５’末端および３’末端の、直線化中間体クローンを、一緒に連結して（５’：３’＝１：３モル比）、全長ゲノムＤＥＮ−２／３−ＰＰ１（ｐＤ２／Ｐｍ＾ｂ−Ａｓｃと連結したｐＤ２Ｉ／Ｄ３−Ｐ１−Ａｓｃ）、ＤＥＮ−２／３−ＥＰ１（ｐＤ２／Ｅｍ＾ｂ−Ａｓｃと連結したｐＤ２Ｉ／Ｄ３−Ｅ１−Ａｓｃ）およびＤＥＮ−２／３−ＶＰ１（ｐＤ２／Ｖｍ＾ｂ−Ａｓｃと連結したｐＤ２Ｉ／Ｄ３−Ｅ１−Ａｓｃ）を得た。次いで、これらの連結したＤＮＡを、ＸｂａＩで切断し、組換えウイルスＲＮＡの転写のために必要なウイルスｃＤＮＡの直線化３’末端を作製した。
【０１３５】
（キメラＤＥＮ−２／３ウイルスの回収率）
組換え体ウイルスＲＮＡを、ＸｂａＩ直線化ｃＤＮＡより転写し、そしてｃａｐアナログであるｍ７ＧｐｐｐＡでキャップした。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞またはＢＨＫ−２１細胞（３〜５×１０６細胞）を、Ｋｉｎｎｅｙら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ２３０：３００−３０８（１９９７））によって記載されるようにエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、７５ｃｍ２フラスコの１０％  ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地に移した。トランスフェクトされた細胞において発現したウイルスタンパク質を、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によって分析した。ウイルス感染した細胞を、氷冷アセトン中で３０分間固定した。ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−２それぞれのウイルス特異的モノクローナル抗体８Ａ１および３Ｈ５をアッセイに使用して、そしてフルオレセイン標識したヤギ抗マウス抗体を用いて、結合を検出した。ウイルスを、５〜１１日後に回収し、次いで、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞に一度パッセージして生産種を得た。これらの種から抽出したウイルスゲノムを配列決定して、子孫ウイルスの遺伝子型を確認した。正しいＤＥＮ−３  １６５６２  ｐｒＭ−Ｅ遺伝子を含有する５’末端Ｄ２Ｉ／Ｄ３中間体クローンを使用する初期の戦略は、トランスフェクトされたＬＬＣ−ＭＫ２細胞またはＢＨＫ−２１細胞より回収しかつＬＬＣ−ＭＫ２細胞に一度パッセージしたウイルスのゲノムにおけるいくつかの異なる位置での変異を生じた。アミノ酸Ｅ−３４５をＨｉｓからＬｅｕに変更するｎｔ１９７０でのＡからＴへの変異を、独立して回収した９つの組換え体ウイルスのうち７つにおいて見出した。元々のＤＥＮ−２／３キメラウイルスがＬＬＣ−ＭＫ２細胞および／またはＢＨＫ−２１細胞において非安定的であることは、自明であった。Ｅ−３４５での単一の変異は、回収した３つのウイルスのゲノムにおいて生じた唯一の変異であった。このことは、この変異が培養物においてウイルスを安定化するように補助し得ることを示した。本発明者らは、全ての感染性ＤＥＮ−２／３クローン、および細胞培養物中で安定であることが立証されたこのような変異誘発クローンから回収された組換え体ウイルスにこの変異を導入した。
【０１３６】
（実施例３：キメラＤＥＮ−２／４感染性クローンの構築）
（ｐＤ２−１６６８１−Ｐ４８ベクター、ｐＤ２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８ベクター、ｐＤ２−ＰＤＫ５３−Ｖ４８ベクター）
キメラＤＥＮ−２／４クローンの構築に使用した３つのＤＥＮ−２骨格ベクターを、上記のように改変した。ＤＥＮ−２感染性クローンは、Ｋｉｎｎｅｙら、１９９７において以前に報告された。クローンｐＤ２−１６６８１−Ｐ４８を、ヌクレオチド位４５１および２３８０でそれぞれクローニング部位ＭｌｕＩおよびＮｇｏＭＩＶを含むようにｐＤ２・ＩＣ−３０Ｐ−Ａから改変した。同一のクローニング部位を、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルス特異的クローンであるｐＤ２／ＩＣ−１３０Ｖｘ−４および−１３０Ｖｃ−Ｋの両方に導入し、そして改変されたクローンを、それぞれｐＤ２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８およびｐＤ２−ＰＤＫ５３−Ｖ４８と称した。２つのクローニングエラーを、元々のｐＤ２／ＩＣ−１３０Ｖｘ−４および−１３０Ｖｃ−Ｋにおいてｎｔ６６６５およびｎｔ８８４０で見出した。３つの欠損を、ｐＤ２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８および−Ｖ４８において補正した。導入したＮｇｏＭＩＶクローニング部位は、２つのヌクレオチド変異（ｎｔ２３８１および２３８２；ＴＧからＣＣ）を生じ、これは、ＤＥＮ−２ウイルスのＥ−４８２でのＶａｌからＡｌａへの置換をコードした。ＭｌｕＩ部位に導入されたヌクレオチド変化は、ＤＥＮ−２ウイルスおよびキメラＤＥＮ−２／４ウイルスについてサイレントであった。ＭｌｕＩ部位（Ｃ／ｐｒＭ連結のそば）およびＮｇｏＭＩＶ部位（Ｅ／ＮＳ１連結に近接）を使用して、異種ウイルスのｐｒＭ−Ｅ遺伝子をクローニングした。
【０１３７】
（キメラｐＤＥＮ−２／４−ＰＰ１、−ＥＰ１および−ＶＰ１）
２つの中間体ＤＥＮ−２クローンであるｐＤ２Ｉ−ＰおよびｐＤ２Ｉ−Ｅを、それぞれｐＤ２−１６６８１−Ｐ４８およびｐＤ２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８のＨｐａＩ（ｎｔ−２６７６）からＸｂａＩ（ウイルスゲノムｃＤＮＡの３’末端）のフラグメントを欠失することによって構築した。これらの中間体クローンを使用して、ＤＥＮ−４  １０３６ウイルス特異的ｃＤＮＡフラグメントをサブクローニングした。プライマーＤ４−４５３Ｍｌｕ：
【０１３８】
【化５】
0004656794.tif 000006
（ＤＥＮ−４  １０３６ウイルスゲノムの５’末端近傍の配列が引き続くＭｌｕＩ部位に下線を付した）およびプライマーｃＤ４−２３９４．Ｎｇｏ：
【０１３９】
【化６】
0004656794.tif 000007
（ＤＥＮ４ウイルスのＥ遺伝子の３’末端近傍の相補配列が引き続くＮｇｏＭＩＶ部位に下線を付した）を用いて、ＤＥＮ−４  １０３６ウイルスのｐｒＭ−Ｅ遺伝子を含有するｃＤＮＡフラグメントを、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によってＤＥＮ−４ウイルスＲＮＡより増幅した。増幅されたフラグメントを、中間体ｐＤ２Ｉ−ＰクローンおよびｐＤ２Ｉ−ＥクローンのＭｌｕＩ−ＮｇｏＭＩＶ部位にクローニングした。中間体キメラＤＥＮ−２／４クローンを、挿入されたＤＥＮ−４ウイルス特異的ｃＤＮＡの精度を立証するために配列決定した。サイレントな変異を、両方の中間体クローンにおいてｎｔ１４０１（ＡからＧ）にて組み込んだ。ＮｇｏＭＩＶおよびＳｃａＩ（これらのプラスミドにおけるＤＥＮ−２  ｃＤＮＡ配列の下流）でＤＥＮ−２／ＩＣ−Ｐ４８クローン、−ＶＥ４８クローンおよび−ＶＶ４８クローンより切除したフラグメントを、ＮｇｏＭＩＶ／ＳｃａＩ切断キメラＤ２／４中間体クローンにクローニングして全長キメラＤ２／４−ＰＰクローン、−ＥＰクローンおよび−ＶＰクローンを得た。しかし、これらのキメラクローンより転写されたＲＮＡのみが、トランスフェクトされたＣ６／３６細胞中で生存可能なＤＥＮ−２／４キメラウイルスを産生するが、トランスフェクトされたＬＬＣ−ＭＫ２細胞中ではしなかった。高力価を得るためにＣ６／３６細胞中のキメラウイルスを１回以上パッセージした後に、これらのウイルスをＬＬＣ−ＭＫ２細胞中で５回パッセージして、安定なキメラＤＥＮ−２／４ウイルスを得た。このウイルスは、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞中で効率的に複製した。これらのウイルス種の力価は、第一のＬＬＣ−ＭＫ２細胞パッセージでの２００ＰＦＵ／ｍｌから第５のＬＬＣ−ＭＫ２細胞パッセージでの１０６ＰＦＵ／ｍｌを超えるまで増加した。
【０１４０】
キメラＤＥＮ−２／４−ＰＰウイルスの第一、第二、第三および第四のＬＬＣ−ＭＫ２細胞パッセージからのウイルスのゲノムを、配列決定した。４つの変異体、ＤＥＮ−２ウイルス特異的Ｃ−１００（ＡｒｇからＳｅｒ）、ＤＥＮ−４ウイルス特異的Ｅ−３６４（ＡｌａからＡｌａ／Ｖａｌ混合）、ＤＥＮ−４ウイルス特異的Ｅ−４４７（ＭｅｔからＬｅｕ）およびＤＥＮ−２ウイルス特異的ＮＳ４Ｂ−２３９（ＩｌｅからＬｅｕ）を同定した（キメラＤＥＮ−２／４ウイルス配列に基づくアミノ酸位置）。構造遺伝子（ＣおよびＥ）に位置する３つの変異を、キメラＤＥＮ−２／４−ＰＰ、−ＥＰ、および−ＶＰの感染性ｃＤＮＡクローンに導入して、それぞれＤＥＮ−２／４−ＰＰ１クローン、−ＥＰ１クローンおよび−ＶＰ１クローンを得た。これら３つ全てのキメラＤＥＮ−２／４クローンは、トランスフェクション後直ちにＬＬＣ−ＭＫ２細胞中で生存可能な、高力価のキメラウイルスを産生した。このことは、これらのウイルスがＬＬＣ−ＭＫ２細胞中で複製することをこれら３つの変異体が補助したことを示した。キメラＤＥＮ−２／４クローンをまた、４つの変異の異なる組合せを含むように変異誘発して、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞中でのキメラＤＥＮ−２／４ウイルスの複製効率にどの変異が必要なのかを決定した。ＤＥＮ−２  Ｃ−１００（ＡｒｇからＳｅｒ）変異と組合わせた、ＤＥＮ−４  Ｅ−４４７（ＭｅｔからＬｅｕ）変異単独またはＤＥＮ−４  Ｅ−３６４変異と一緒のものは、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞中でＤＥＮ−２／４ウイルスの誘導を可能にするに適当であった。
【０１４１】
（組換え体ウイルスの回収率）
組換え体プラスミドｐＤ２／４−ＰＰ１、−ＥＰ１、および−ＶＰ１の全てを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ−１−Ｂｌｕｅ細胞中で増殖した。組換え体ウイルスＲＮＡを転写し、そして２００〜４００ｎｇのＸｂａＩ直線化ｃＤＮＡからのｃａｐアナログであるｍ７ＧｐｐｐＡでキャップし、そして３〜５×１０６のＬＬＣ−ＭＫ２細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、７５ｃｍ２フラスコの１０％  ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地に移した。トランスフェクトされた細胞において発現したウイルスタンパク質を、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によって分析した。ウイルス感染した細胞を、氷冷アセトン中で３０分間固定した。ＤＥＮ−４およびＤＥＮ−２それぞれのウイルス特異的モノクローナル抗体１Ｈ１０および３Ｈ５を、アッセイに使用して、そしてフルオレセイン標識したヤギ抗マウス抗体を用いて、結合を検出した。ウイルスを、８〜１０日後に回収し、次いで、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞に一度パッセージして生産種を得た。これら３つ全ての生産種のゲノムを完全に配列決定して、そしてキメラＤＥＮ−２／４ウイルスゲノムの全てが、期待された配列を含んだ。ＤＥＮ−２／４キメラについてのヌクレオチド配列および核酸配列は、本明細書中にそれぞれ配列番号１３および配列番号１４として提供される。
【０１４２】
（実施例４：ＤＥＮ−２／３キメラウイルスおよびＤＥＮ−２／４キメラウイルスの特徴付け）
野生型ＤＥＮ−３  １６５６２または野生型ＤＥＮ−４  １０３６ウイルスのｐｒＭ／Ｅ遺伝子領域をそれぞれ発現する、生存可能な感染性キメラＤＥＮ−２／３ウイルスおよびＤＥＮ−２／４ウイルスは、ウイルス特異的抗Ｅモノクローナル抗体を用いてウイルス感染されたＬＬＣ−ＭＫ２細胞の間接免疫蛍光によって分析したように、適切なＤＥＮ−３またはＤＥＮ−４のウイルス特異的エンべロープタンパク質（Ｅ）エピトープを発現した。血清希釈プラーク減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）中和試験において標準の多価マウス腹水またはモノクローナル抗体に対して試験した場合に、これらのキメラウイルス、ならびにキメラＤＥＮ−２／１ウイルスはまた、適切なＤＥＮ血清型特異的中和エピトープを発現した（表８）。キメラＤＥＮ−２／１−ＥＰウイルス、ＤＥＮ−２／３−ＥＰ１ウイルスおよびＤＥＮ−２／４−ＥＰ１ウイルスを、これらの標準ＤＥＮウイルス特異的抗体によって、それぞれ野生型ＤＥＮ−１ウイルス、ＤＥＮ−３ウイルスおよびＤＥＮ−４ウイルスについて生じたものと少なくとも同等の逆数（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）ＰＲＮＴ５０力価に中和した（表８）。これらの中和データは、キメラＤＥＮ−２／１ウイルス、ＤＥＮ−２／３ウイルスおよびＤＥＮ−２／４ウイルスがそれぞれＤＥＮ−１ウイルス、ＤＥＮ−３ウイルスおよびＤＥＮ−４ウイルスの適切なＤＥＮ血清型特異的中和エピトープを発現したことを示した。
【０１４３】
（ＬＬＣ−ＭＫ２細胞における複製）
ＬＬＣ−ＭＫ２細胞におけるＤＥＮ−２／３キメラの複製感受性および温度感受性を、ＤＥＮ−２／１キメラの複製感受性および温度感受性を実施例１において試験したように観察した。ＤＥＮ−３  １６５６２ウイルスまたはＤＥＮ−４  １０３６ウイルスのｐｒＭ／Ｅ遺伝子領域を、それぞれＤＥＮ−２  １６６８１（−ＰＰ１）、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３−Ｅ改変体（−ＥＰ１）、またはＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３−Ｖ改変体（−ＶＰ１）の遺伝的背景において発現する、キメラＤＥＮ−２／３−ＰＰ１ウイルス、−ＥＰ１ウイルスおよび−ＶＰ１ウイルス、ならびにキメラＤＥＮ−２／４−ＰＰ１ウイルス、−ＥＰ１ウイルスおよび−ＶＰ１ウイルスは全て、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞中で少なくとも１０６．３ＰＦＵ／ｍｌの高いピーク力価で複製した。３８．７℃でのウイルス力価の減少  対  ３７℃でのウイルス力価の減少に関して規定されるように、−、＋、２＋、３＋は、少なくとも３回の実験から計算された、それぞれ６０％以下、６１〜９０％、９１〜９９％、９９％を超える力価減少を示す。キメラＤＥＮ−２／３−ＰＰ１ウイルスおよびＤＥＮ−２／４−ＰＰ１ウイルスは、境界温度感受性（ＤＥＮ−２／３−ＰＰ１）または温度感受性なし（ＤＥＮ−２／４−ＰＰ１）のいずれかを示した。キメラＤＥＮ−２／３−ＥＰ１ウイルスおよび−ＶＰ１ウイルスならびにキメラＤＥＮ−２／４−ＥＰ１ウイルスおよび−ＶＰ１ウイルス（これらの全てがＤＥＮ−２  ＰＤ−５３−Ｅ改変体または−Ｖ改変体の遺伝的背景において構築される）は、２つのＰＤＫ−５３改変体ウイルス（それぞれＤＥＮ−２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８ウイルスおよび−Ｖ４８ウイルス）によって示される温度感受性表現型を残す。ＰＤＫ−５３−Ｖ改変体の背景において構築されるキメラは、ＰＤＫ−５３−Ｅ改変体の背景において構築されるものよりも高度の温度感受性を示した。
【０１４４】
（ＬＬＣ−ＭＫ２細胞におけるプラークサイズ）
実施例１に記載されるような減弱を決定するための生物学的マーカーとして使用される、アガロースオーバーレイ下に置かれたＬＬＣ−ＭＫ２細胞の播種より生じるプラークサイズをまた、キメラＤＥＮ−２／３ウイルスおよびＤＥＮ−２／４ウイルスについて試験した。ｍｍでの平均プラークサイズは、以下の各ウイルスまたはキメラの括弧内である：ＤＥＮ−３−１６５６２（６．６）、ＤＥＮ−２／３−ＰＰ１（５．４）、ＤＥＮ−２／３−ＥＰ１（４．５）、ＤＥＮ−２／３−ＶＰ１（２．３）、ＤＥＮ−４−１０３６（８．６）、ＤＥＮ−２／４−ＰＰ１（３）、ＤＥＮ−２／４−ＥＰ１（１．５）、ＤＥＮ−２／４−ＶＰ１（１．２）、ＤＥＮ−２−１６６８１−Ｐ４８（４．２）、ＤＥＮ−２−ＰＤＫ５３−  Ｅ４８（２．５）およびＤＥＮ−２−ＰＤＫ−５３−Ｖ４８（１．８）。
【０１４５】
ＤＥＮ−２／３−ＰＰ１ウイルスおよびＤＥＮ−２／４−ＰＰ１ウイルスのプラークサイズは、平均プラーク直径を示し、これは、（実施例１に記載されるような）ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスまたはＰＤＫ−５３ウイルスのものよりも大きいが、それぞれ野生型ＤＥＮ−３  １６５６２ウイルスおよびＤＥＮ−４  １０３６ウイルスのものよりも小さい。このことは、ドナーＤＥＮ−３ウイルスおよびＤＥＮ−４ウイルスおよびカプシドからの構造遺伝子ならびに／またはＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスのレシピエント遺伝的背景における非構造遺伝子の両方がプラークサイズに影響することを示す。キメラＤＥＮ−２／３−ＥＰ１ウイルスおよび−ＶＰ１ウイルスならびにＤＥＮ−２／４−ＥＰ１ウイルスおよび−ＶＰ１ウイルスは、それぞれ野生型ＤＥＮ−３  １６５６２ウイルスおよびＤＥＮ−４  １０３６ウイルスと比べてプラークサイズにおける顕著な減少を示した。プラークサイズに対するＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３背景特異的効果は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ５３ウイルスのＮＳ１−５３遺伝子座およびＮＳ３−２５０遺伝子座での変異の相乗的相互作用より生じ得る。従って、−ＶＰ１キメラは、プラークサイズにおいて−ＥＰ１キメラが示したものよりもより大きな減少を示した。候補ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ワクチンウイルスの遺伝的背景において構築される、キメラＤＥＮ−２／１ウイルス、ＤＥＮ−２／３ウイルスおよびＤＥＮ−２／４ウイルスは、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルスによって示されるような減少したプラークサイズの表現型を残した。
【０１４６】
（Ｃ６／３６細胞における複製）
実施例１に記載されるような減弱を決定するための生物学的マーカーとして使用される、これらのウイルスの蚊Ｃ６／３６細胞培養物中で複製する能力をまた、キメラＤＥＮ−２／３ウイルスおよびＤＥＮ−２／４ウイルスについて試験した。Ｌｏｇ１０ＰＦＵ／ｍｌの単位における平均ピーク力価は、以下の各ウイルスまたはキメラの括弧内である：Ｄ３−１６５６２（７．３）、ＤＥＮ−２／３−ＰＰ１（７．６）、ＤＥＮ−２／３−ＥＰ１（５．２）、ＤＥＮ−２／３−ＶＰ１（５．７）、Ｄ４−１０３６（８．７）、ＤＥＮ−２／４−ＰＰ１（７．８）、ＤＥＮ−２／４−ＥＰ１（４．５）、ＤＥＮ−２／４−ＶＰ１（４．４）、ＤＥＮ−２−１６６８１−Ｐ４８（８．３）、ＤＥＮ−２−ＰＤＫ５３−Ｅ４８（５．４）およびＤＥＮ−２−ＰＤＫ−５３−Ｖ４８（５）。
【０１４７】
マヒドール（Ｍａｈｉｄｏｌ）候補ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３改変体の両方は、蚊Ｃ６／３６細胞培養物中で野生型ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスと比べて減少した複製効率を示す（ＤＥＮ−２−ＰＤＫ−５３−Ｅ４８および−Ｖ４８  対  ＤＥＮ−２−１６６８１−Ｐ４８ウイルス）。Ｃ６／３６細胞中での減少した複製能は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルス中の２つの遺伝子座５’−ＮＣ−５７およびＮＳ１−５３での変異に帰した；この観点と一致して、両方の改変体は、これらの細胞において同等に減少したピーク力価で複製した。この不全にされたＣ６／３６細胞における複製表現型を、キメラＤＥＮ−２／３−ＥＰ１ウイルスおよび−ＶＰ１ウイルスならびにＤＥＮ−２／４−ＥＰ１ウイルスおよび−ＶＰ１ウイルスにおいて保持した。これらのウイルスの全ては、それぞれ野生型ＤＥＮ−３  １６５６２ウイルスまたはＤＥＮ−４  １０３６ウイルスが複製するよりも低いピーク力価で複製した。野生型ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスの遺伝的背景において構築されるキメラＤＥＮ−２／３−ＰＰ１ウイルスおよびＤＥＮ−２／４−ＰＰ１ウイルスは、それぞれ野生型ＤＥＮ−３  １６５６２ウイルスおよびＤＥＮ−４  １０３６ウイルスと実質的に同程度（ＤＥＮ−２／３−ＰＰ１）、または幾分低く（ＤＥＮ−２／４−ＰＰ１）複製した。これらの結果は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルス遺伝的背景において５’−ＮＣ−５７遺伝子座およびＮＳ１−５３遺伝子座の複製不全効果がＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３遺伝的背景内に構築されたこれらのキメラウイルスにおいて保存されたことを示す。
【０１４８】
（新生マウスについての神経毒性（ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ））
新生の、異系交配の、白色ＩＣＲマウス（各群についてｎ＝１６）を、１０４ＰＦＵの野生型ＤＥＮ−３ウイルスおよびＤＥＮ−４ウイルス、マヒドール候補ワクチンＤＥＮ−３ウイルスおよびＤＥＮ−４ウイルス、キメラＤＥＮ−２／３−ＰＰ１ウイルス、−ＥＰ１ウイルス、−ＶＰ１ウイルスおよびキメラＤＥＮ−２／４−ＰＰ１ウイルス、−ＥＰ１ウイルスおよび−ＶＰ１ウイルスを用いて、頭蓋内にチャレンジした（表９）。野生型ＤＥＮ−３  １６５６２ウイルスおよびＤＥＮ−４  １０３６ウイルス（これらは、新生マウスにおいて１００％致死率を確実に引き起こす）は、ウイルス神経毒性の減弱についてＤＥＮ−２  １６６８１チャレンジモデル（これは、このウイルスでチャレンジされた新生マウスにおいて５０〜１００％致死率を生じる）よりも感受性なモデルを構築した。驚くことに、マヒドール候補ＤＥＮ−４  ＰＤＫ−４８ワクチンウイルスはまた、チャレンジされたマウスにおいて１００％致死率を生じたが、これらのマウスの平均生存期間は、野生型ＤＥＮ−４  １０３６ウイルスで頭蓋内にチャレンジされたマウスよりも約２日長かった（表９）。ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ワクチンウイルスおよびこの改変体集団の両方と同様に、キメラＤＥＮ−２／３−ＥＰ１ウイルスおよび−ＶＰ１ウイルスならびにキメラＤＥＮ−２／４−ＥＰ１ウイルスおよび−ＶＰ１ウイルスは、新生マウスについて減弱された（致死率０）。この減弱は、少なくとも一部はこれらのキメラウイルスの減弱ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３遺伝的背景に帰し得る。なぜなら、キメラＤＥＮ−２／４−ＰＰ１ウイルスは、これらのマウスにおいて顕著な神経毒性（６２．５％致死率）を示したからである。この後者のキメラを、野生型ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスの遺伝的背景において構築した。
【０１４９】
（キメラＤＥＮ−２／３およびＤＥＮ−２／４ウイルスを用いる、ＡＧ−１２９マウスの免疫）
近交系のＡＧ−２９マウスを、１０５ＰＦＵの野生型またはＭａｈｉｄｏｌワクチン候補ＤＥＮ−３またはＤＥＮ−４ウイルスを用いて、あるいは１０５ＰＦＵのキメラＤＥＮ−２／３−ＥＰ１またはＤＥＮ−２／４−ＥＰ１ウイルスを用いて、腹腔内免疫した（表１０）。このキメラＤＥＮ−２／３−ＥＰ１ウイルスは、一次免疫後４〜６週間で８０〜３２０の相互（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）ＰＲＮＴ７０力価を惹起した。これらの力価は、本質的に、Ｍａｈｉｄｏｌ  ＤＥＮ−３ワクチンウイルス（株ＰＧＭＫ−３０／ＦＲｈＬ−３）によって惹起される力価に等しかった。しかし、キメラＤＥＮ−２／４−ＥＰ１ウイルスは、２０〜４０の中和抗体力価を惹起し、これは、Ｍａｈｉｄｏｌワクチン候補ＤＥＮ−４  ＰＤＫ−４８ワクチンウイルスによって惹起される８０〜３２０の力価よりも低かった。それにも関わらず、両方のキメラＤＥＮ−２／３およびＤＥＮ−２／４ウイルスは、ＡＧ−２９マウスにおいて中和抗体応答を惹起した。
【０１５０】
（実施例５）
（Ｄｅｎｇｕｅ−２ワクチンウイルス：株１６６８１（ＰＤＫ−５３）の弱毒化）
（ウイルスおよび細胞培養）
親ＤＥＮ−２１６６８１ウイルス、１６６８１ウイルスのいくつかの中間ＰＤＫ継代（ＰＤＫ−５、１０、−１４、−３５、および−４５）、組換え１６６８１／ＰＤＫ−５３ウイルス、および候補ＰＤＫ−５３ワクチンウイルスの遺伝子的に特徴付けられたＬＬＣ−ＭＫ２−１継代が調べられた。
【０１５１】
ＢＨＫ−２１（クローン１５）、ＬＬＣ−ＭＫ２、Ｖｅｒｏ、およびＣ６／３６の細胞培養物が、１０％熱非働化（５６℃で３０分間）胎児ウシ血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）、３．７ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウム（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  Ｍｄ．）、１００単位／ｍｌのペニシリンＧ、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンスルフェート（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）で補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ改変最小基本培地（ＤＭＥＭ）において増殖された。
【０１５２】
以前に記載されたように、プラスティックの６−ウェルにおいて、Ｖｅｒｏ細胞のコンフルエントな単層において、プラーク力価決定を行った（Ｍｉｌｌｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．  ＆  Ｈｙｇ．３５：１３０２−１３０９（１９８６））。２００μｌの種菌のウイルスが３７℃で１．５時間吸収され、続いて、栄養培地（０．１６５  ％ラクトアルブミン加水分解産物［Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．］、０．０３３％酵母抽出物［Ｄｉｆｃｏ］、Ｅａｒｌバランス塩溶液、２５ｍｇ／Ｌのゲンタマイシンスルフェート［Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．］、１．０ｍｇ／ＬのアンホテリシンＢ［Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ（登録商標）、Ｅ．Ｒ．Ｓｑｕｉｂｂ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．］、および２％ＦＢＳ）中の、４ｍｌのアガロースオーバーレイ培地（１％  ＳｅａＫｅｍ  ＬＥアガロース（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍｄ．）を含む）を添加した。３７℃で７日間のインキュベーションに続いて、第二の２ｍｌのアガロースオーバーレイ（８０μｇ／ｍｌの中性赤色生体染色液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を含む）を添加した。
【０１５３】
（組換えＤＥＮ−２  １６６８１／ＰＤＫ−５３ウイルスの構築）
現在の研究におけるクローン誘導ＤＥＮ−２ウイルスの遺伝的確認の間に、先に報告されたＰＤＫ−５３ウイルス特異的ｐＤ２／ＩＣ−１３０Ｖｃ−Ｋ（ＮＳ３−２５０−Ｖａｌ改変体）クローンにおいて、２つのｃＤＮＡクローニングエラーが発見され、それは、ｎｔ−６６６５  Ａ〜Ｇ（ＮＳ４Ａ−９７  Ｔｙｒ〜Ｃｙｓ）およびｎｔ−８８４０  Ａ〜Ｇ（ＮＳ５−４２４  Ｇｌｕ〜Ｇｌｙ）であった（Ｋｉｎｎｅｙら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３０：３００−３０８  （１９９７））。これらの欠陥は、新たに誘導されたＰＤＫ−５３ウイルス特異的（ＮＳ３−２５０−Ｖａｌ改変体）クローン、ｐＤ２／ＩＣ−ＶＶ４５Ｒにおいて、修正された。
【０１５４】
予備研究において、組換え１６６８１／ＰＤＫ−５３ウイルス（１６６８１ウイルスの遺伝子バックグラウンド内のＰＤＫ−５３ウイルス特異的遺伝子領域を含む）を使用して、ＰＤＫ−５３ウイルスの弱毒化マーカーに関係する遺伝子座を調べた。これらのウイルスの分析は、５’ＮＣ領域におけるｎｔ−５７でのＰＤＫ−５３変異およびＮＳ１−５３（ＮＳ２Ａ−１８１変異と関連した様式で分析した）およびＮＳ３−２５０でのアミノ酸変異がＰＤＫ−５３ウイルス特異的表現型の決定因子であることを示した。このｐｒＭ−２９変異は、ビルレンスに対してほとんど影響を有さない。配列分析および比較に基づいて、５’ＮＣ、ＮＳ１およびＮＳ３は、さらなる変異分析に供された。この５’ＮＣ変異は、可能な幹構造において生じた。このＮＳ１およびＮＳ３変異の両方は、いくつかのフラビウイルス属に保存された遺伝子座において生じた。１４の組換えｐＤ２／ＩＣ−１６６８１／ＰＤＫ−５３プラスミドが、制限酵素部位ＳｓｔＩ（Ｔ７プロモーターに先行する）、ＳａｌＩ（ｎｔ−１６５）、ＳｐｈＩ（ｎｔ−１３８０）、ＳｐｅＩ（ｎｔ−２３７０およびｎｔ−３５７９）、ＫｐｎＩ（ｎｔ−４４９３）、ＸｈｏＩ（ｎｔ−５４２６）、ならびにＸｂａＩ（クローンの３’末端）での、ｐＤ２／ＩＣ−３０Ｐ−Ａ  （１６６８１クローン）とｐＤ２／ＩＣ−ＶＶ４５Ｒ（ＰＤＫ−５３クローン）との間でｃＤＮＡを交換することによって構築された。全ての組換えプラスミドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、株ＸＬＩ−ｂｌｕｅにおいて増殖され、そしてｃＤＮＡの３’末端で操作された固有のＸｂａＩ部位で線状化された。ＢＨＫ−２１細胞は、Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍら（Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６３：４１０７−４１１３  （１９９１））の方法によって、転写されたウイルスＲＮＡを用いてトランスフェクトされた。
【０１５５】
組換えＤ２／ＩＣ−Ｐｘ（ここで、ｘ＝５、１、および／または３である（親［ウイルス表記におけるＰ］１６６８１ウイルス特異的５’ＮＣ−５７、ＮＳ１−５３、および／またはＮＳ３−２５０遺伝子座のｐＤ２／ＩＣ−ＶＶ４５Ｒ［ＰＤＫ−５３］骨格への組込みを示す）およびＤ２／ＩＣ−Ｖｘ（ここで、ｘは、ｐＤ２／ＩＣ−３０Ｐ−Ａ［１６６８１］骨格内の３つの候補ＰＤＫ−５３ワクチン［ウイルス表記におけるＶ］ウイルス特異的遺伝子座の相互組込みを示す）ウイルスを、表１１に示す。５’ＮＣ、ＮＳ１、およびＮＳ３遺伝子座が、ＰＤＫ−５３ウイルス特異的表現型の主要な決定因子である場合、Ｄ２／ＩＣ−Ｐ５およびＤ２／ＩＣ−Ｖ１３ウイルスは、等価（同族）であるべきである。なぜなら、両方のウイルスは、５’ＮＣ−５７−Ｃ、ＮＳ１−５３−Ａｓｐ、およびＮＳ３−２５０−Ｖａｌを含むからである。１６６８１およびＰＤＫ−５３ウイルス特異的感染クローンの相互変異誘発から誘導される同族ウイルス対が、表１１に示される。ｐｒＭ−２９遺伝子座をさらに調べるために、本発明者らは、ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスのｐｒＭ−２９−Ａｓｐ遺伝子座を、ｐＤ２／ＩＣ−ＶＶ４５ＲおよびｐＤ２／ＩＣ−Ｐ５に移動させて、それぞれ、組換えＤ２／ＩＣ−Ｖｐおよび−Ｐ５ｐウイルスを誘導した。相互組換えにより、Ｄ２／ＩＣ−Ｖｐおよび−Ｖ５ｐウイルスを得た。
【０１５６】
各クローン誘導ウイルス（トランスフェクトされたＢＨＫ−２１シード）が、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞において一度増殖される。ＬＬＣ−ＭＫ２継代の組換え１６６８１／ＰＤＫ−５３ウイルスの全ての遺伝子型は、それらのゲノムの完全なヌクレオチド配列分析によって確認された。全てのウイルスは、期待されたヌクレレオチド配列を有したので、本発明者らは、それらのｃＤＮＡクローンもまた修正されたことを推論した。全てのクローン誘導ウイルスは、１６６８１ウイルス特異的ｎｔ−８５７１−Ｃ遺伝子座を含み、これは、ＰＤＫ−５３ウイルスにおける非表現突然変異の部位である。逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用する、ＤＥｎ−２ウイルスゲノムＲＮＡから生成されたオーバーラッピングｃＤＮＡアンプリコンの直接的な配列決定は、ｃＤＮＡの末端を除いて、全ての配列を決定するために使用された。ゲノムの５’末端および３’末端の３０のヌクレオチドの配列を、プラスミドｐＢＲＵＣ−１３９における感染クローンｃＤＮＡの直接的な配列決定によって決定した。このＤ２／ＩＣ−ｐｒｅｆｉｘは、表１１および以下の本文におけるウイルス表記において排除される。
【０１５７】
（組換え１６６８１／ＰＤＫ−５３ウイルスの複製表現型の特徴付け）
ウイルスを、ＬＬＣ−ＭＫ２およびＣ６／３６細胞におけるプラークサイズ、温度感受性、および複製について分析した。プラークサイズを、６ウェルプレートにおけるＬＬＣ−ＭＫ２細胞単層におけるアガロース下での９日間のインキュベーションの後に評価した。ウイルス増殖曲線を、約０．００１ＰＦＵ／細胞の感染効率（ｍ．ｏ．ｉ）で接種したＬＬＣ−ＭＫ２またはＣ６／３６の７５ｃｍ２フラスコにおいて得た。３７℃で２時間の吸着後、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび５％ＦＢＳを含む３０ｍｌのＤＭＥＭ培地（ＬＬＣ−ＭＫ２細胞）またはオーバーレイ栄養培地（Ｃ６／３６細胞）を添加し、そしてこの培養物を、各々、５％ＣＯ２で、３７℃または２９℃でインキュベートした。培養培地のアリコートを４８時間間隔で除去し、１２．５％ＦＢＳに調節し、そしてウイルス力価決定の前に−８０℃で保存した。
【０１５８】
温度感受性アッセイを、７５ｃｍ２フラスコ中で増殖されたＬＬＣ−ＭＫ２細胞において実施した。これらの細胞を約０．００１ＰＦＵ／細胞のｍ．ｏ．ｉで接種した。３７℃で２時間の吸着後、５％ＦＢＳを含む３０ｍｌのＤＭＥＭ培地を添加した。１つのセットの培養物を、３７℃８日間接種し、他のものを３８．７℃で接種した。３８．７℃でのウイルス力価  対  ３７℃での力価の比を計算した。
【０１５９】
（マウス神経毒性アッセイ）
新生の、非近交系の白色ＩＣＲマウスの同腹仔を、３０ｍｌの容積で、１０４ＰＦＵのウイルスで腹腔内接種した。マウスを１週間に一度個々に重量測定し、３５日間の麻痺または死亡について観測した。
【０１６０】
（組換え１６６８１／ＤＫ−５３ウイルスのプラーク表現型）
ＬＬＣ−ＭＫ２細胞におけるアガロースオーバーレイ下での感染の９日後にウイルスプラーク（ｎ＝１２）の平均直径を測定した（図４）。最も大きなプラー（３．２〜３．４平均直径）が、野生型１６８８１ウイルス、そのクローン誘導３０Ｐ−Ａウイルス、および組換えＰ５１３ウイルスによって生成され、これらは、ＶＶ４５Ｒ（ＰＫＤ−５３）ウイルス遺伝子バックグラウンドにおける５’ＮＣ、ＮＳ１、およびＮＳ３  １６６８１ウイルス特異的遺伝子座を含んだ（表１１）。ＰＤＫ−５３位遺伝子バックグランド内のこれらの３つの１６６８１特異的遺伝子座は、１６６８１ウイルスの大きなプラーク表現型を再構成するに十分であった。
【０１６１】
１６６８１表現型に組込まれた個々のＰＤＫ−５３ウイルス特異的５’−ＮＣ−５７−Ｔ、ＮＳ１−５３−Ａｓｐ、およびＮＳ３−２５０−Ｖａｌ変異は、各々、１６６８１ウイルスのプラークサイズに比べて、それぞれＶ５、Ｖ１、およびＶ３のおける２．１〜２．３ｍｍの有意に（ｐ＜０．００００３）減少したプラークサイズを生じた。Ｐ１３およびＰ５１ウイルスのプラーク表現型は、それらの同族Ｖ５およびＶ３ウイルスの表現型に類似した（図４の同一の中実または平行線模様のグラフの棒によって示される）。２．８ｍｍのプラークサイズのＰ５３ウイルスは、１６６８１ウイルスプラークから、その同族のＶ１ウイルウスの２．１ｍｍより少ない程度（ｐ＜０．０３）、異なった。１．１〜１．６ｍｍのプラークの同族ウイルス  対  Ｖ１３（Ｐ５）（ＰＤＫ−５３ウイルス特異的ＮＳ１およびＮＳ３遺伝子座を含む）、Ｖ５３（Ｐ１）（ＰＤＫ−５３ウイルス特異的５’ＮＣおよびＮＳ遺伝子座）、およびＶ５１（Ｐ３）ウイルス（ＰＤＫ−５３ウイルス特異的５’ＮＣおよびＮＳ１遺伝子座）は、本質的に１．３ｍｍプラークのＰＤＫ−５３ウイルスと等価であった。これら結果は、１６６８１骨格におけるこれら３つのＰＤＫ−５３ウイルス特異的遺伝子座の全ての２つの組合せが、ＰＤＫ−５３に類似する小さなプラークを生成したことを示す。Ｖ５１は、ＰＤＫ−５３ウイルスのプラーク表現型に類似するプラーク表現型を生成したが、全ての３つの１６６８１ウイルス特異的５’ＮＣ−Ｃ、ＮＳ１−５３−Ｇｌｙ、およびＮＳ３−２５０−Ｇｌｕ遺伝子座が、１６６８１ウイルスのプラーク表現型を再構成するために、ＰＤＫ−５３バックグラウンド内に必要とされた。１６６８１骨格におけるすべての３つのＰＤＫ−５３遺伝子座の存在は、Ｖ５１３ウイルスを生成し、これはＰＤＫ−５３またはＶＶ４５Ｒウイルスのいずれかのプラーク表現型より小さい（ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定）プラーク表現型を有した。ＰＤＫ−５３ウイルスのプラークサイズとＶＶ４５Ｒウイルスのプラークサイズとの間の差は、有意ではなかった。
【０１６２】
組換えＶｐウイルス（これは、１６６８１バックグラウンドにＰＤｋ−５３ウイルス特異的ｐｒＭ−２９−Ｖａｌ遺伝子座を含む）は、２．６ｍｍの有意に（ｐ＜０．００２）に減少したプラークサイズを有した。しかし、Ｐｐウイルス（ＰＤＫ−５３バックグラウンドにおける１６６８１ｐｒＭ−２９−Ａｓｐ遺伝子座）の１．０ｍｍプラーク表現型は、それぞれ、ＶＶ４５ＲおよびＰＤＫ−５３ウイルスの１．１ｍｍおよび１．３ｍのプラークに本質的に等しかった（図４Ａ）。ｐｒＭ−２９遺伝子座は、Ｐ５ｐ（１．０±０．０ｍｍ）およびＶ５ｐ（２．０±０．４ｍｍ）ウイルスのプラーク表現型に影響せず、これらは、それぞれ、Ｐ５（１．１±０．３ｍｍ）およびＶ５（２．３±０．４ｍｍ）ウイルスのそれに類似するプラークを生成した。
【０１６３】
（ＬＬＣ−ＭＫ２およびＣ６／３６細胞における組換え１６６８１／ＰＤＫ−５３ウイルスの複製）
全てのウイルスは、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞において十分に複製し、感染の６〜８日後１０７．３〜１０７．９ＰＦＵ／ｍｌのピーク力価に達した。ＰＤＫ−５３およびその誘導ＶＶ４５Ｒウイルスは、感染の最初の４日間の間に、減少した割合で複製した。温度感受性を決定するために、ウイルス感染ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を、２〜５回の実験において、３７℃または３８．７℃で接種した（４Ｂ図）。温度感受性スコアを感染後８日目に決定した。全てのウイルスは、これらの条件下で、いくらかの程度の温度感受性を示した。個々の実験において、野生型１６６８１ウイルスは、３８．７℃で７５〜８０％の力価減少を示した。ウイルスＶ１および同族ウイルスＰ３（Ｖ５１）（これらは、力価の平均８４〜８６％の減少を示した）は、１６８８１ウイルスより、多少より温度感受性であった。しかし、ＰＤＫ−５３、ＶＶ４５Ｒ、Ｖ５１３、Ｐ５ｐ、Ｐｐおよび同族組換えウイルスＶ１３およびＰ５（これらの全ては、ＮＳ１−５３−ＡｓｐおよびＮＳ３−２５０−Ｖａｌ  ＰＤＫ−５３ウイルス特異的遺伝子座の両方を含む）は、３８．７℃において平均９０〜９７％の力価の減少を再現可能に示した。
【０１６４】
１６６８１ウイルスおよびそのクローン誘導３０Ｐ−Ａウイルスは、Ｃ６／３６細胞における２つの独立した増殖曲線実験において、感染の１２日後に１０８．６〜１０８．８ＰＦＵ／ｍｌの平均ピーク力価に複製した（図４Ｃ）。ＰＤＫ−５３ウイルス（１０４．５ＰＦＵ／ｍｌのピーク力価）およびそのクローン誘導ＶＶ４５Ｒ（１０４．６ＰＦＵ／ｍｌのピーク力価）ウイルスの複製は、Ｃ６／Ｂ３６細胞において、約１５，０００倍効率的でなかった。Ｐ５１ウイルスのＰＤＫ−５３バックグランド内のこの１６６８１ウイルス特異的５’ＮＣおよびＮＳ１遺伝子座は、野生型１６６８１ウイルスのそれに対する複製効力を完全に再構成した。逆に、Ｖ５１ウイルスの１６６８１バックグラウンド内のＰＤＫ−５３ウイルス特異的５’ＮＣおよびＮＳ１遺伝子座は、ＰＤＫ−５３ウイルスの無能な複製表現型を確立するために十分であった。組換え同族ウイルス  対  Ｖ５（Ｐ１３）およびＶ１（Ｐ３５）（これは、ＰＤＫ−５３ウイルス特異的５’ＮＣ領域またはＮＳ１遺伝子座の各々を含む）は、１０５．９〜１０６．７ＰＦＵ／ｍｌの平均ピーク力価に複製した。Ｖ５３ウイルスの平均ピーク力価は、Ｃ６／３６細胞においてＶ５ウイルスのそれより約４０倍大きかったが、Ｐ５１３、Ｐ１３、Ｐ５３、Ｖ３、Ｖ１３、Ｖ５１３、およびＰ３ウイルスのピーク力価は、各々、Ｐ５１、Ｐ１、Ｐ５、３０Ｐ−Ａ、Ｖ１、Ｖ５１、およびＶＶ４５Ｒウイルスのピーク力価に非常に類似した。これらのデータは、ＮＳ３−２５０遺伝子座が、Ｃ６／３６細胞における複製に対してほとんどまたは全く観測可能な効果を有さないことを示す（図４Ｃ）。Ｖｐおよび１６６８１ウイルスは、Ｐ５およびＶ５ｐウイルスと同様にＣ６／３６細胞においてほぼ等しい平均ピーク力価を有した。ＰｐおよびＶ５ｐウイルスは、各々、ＰＤＫ−５３およびＶ５ウイルスの平均ピーク力価より多少高い（各々８倍および４０倍）平均ピーク力価を生じた。このｐｒＭ−２９遺伝子座は、Ｃ６／３６細胞におけるウイルス複製に対する効果をほとんどまたは全く有さないようであった。
【０１６５】
（新生マウスにおける組換え１６８８１／ＰＤＫ−５３ウイルスの神経毒性）
組換えウイルスの神経毒性を調べるために、新生の白色ＩＣＲマウスの２つの同腹仔（１同腹仔あたり８匹のマウス）を、１０４ＰＦＵのウイルスで腹腔内感染させた。ＤＥＮ−２  １６８８１ウイルスおよびこのクローン誘導３０Ｐ−Ａウイルスは、これらのマウスにおいて５０％〜１００％の死亡率を引き起こした。１６８８１または３０Ｐ−Ａウイルスでのチャレンジに屈したマウスについての平均生存時間（ＡＳＴ）は、種々の実験において１５．２〜１６．８日間の範囲であった。マウスは、それぞれ、感染後７日ごとに重量を測定された。１匹のマウスが、Ｐ５３およびＶｐ群の各々において、おそらく接種外傷の結果として、感染後１日で死亡した（表１２）。これらの２つのマウスは、分析から排除された。コントロールの、希釈剤接種群において、死亡および重量欠損はなかった。
【０１６６】
３つのマウス神経毒性表現型が観察された（表１２）。第一の表現型は、マウス毒性ウイルスＤＥＮ−２  １６６８１、３０Ｐ−Ａ、Ｐ５１３、Ｐ５１、Ｖ３、およびＶｐからなり、これは、１３．２〜１７．０日のＡＳＴで少なくとも５０％の死亡率を生じた（表１２）。他の２つの独立した実験において、このＶｐウイルスは、１７．４±１．４日のＡＳＴで４６．６７％の死亡率（ｎ＝１６）を生じ、そして１８．３±１．３日のＡＳＴで、５６．２５％の死亡率（ｎ＝１６）を生じた。独立した実験において、Ｐ５１ウイルスは、１５．９±５．５日のＡＳＴで２５のみの死亡率を生じた。第二の表現型は、マウス弱毒化ＰＤＫ−５３、ＶＶ４５Ｒ、Ｖ５１３、Ｐｐ、および同族Ｖ５１（Ｐ３）ウイルス（これらは、死亡を引き起こさない）、ならびにほぼ弱毒化されたＶ１、同族Ｖ１３（Ｐ５）、Ｐ５ｐ、およびＶ５ｐ（これらは、１６匹のマウスのうちの１匹を死亡させるのみであった）からなった（表１２）。１６８８１遺伝子バックグラウンド内での、２つのＰＤＫ−５３ウイルス特異的５’ＮＣ−５７−ＴおよびＮＳ１−５３−Ａｓｐ遺伝子座の存在は、同族ウイルスＶ５１（Ｐ３）における弱毒化を生じるかまたは維持するに十分であった。Ｐ５３ウイルスを除いて、ＰＤＫ５３ウイルス特異的ＮＳ１−５３−Ａｓｐ遺伝子座を含むウイルスの全てが、弱毒化されたかまたはほぼ弱毒化された。
【０１６７】
中間の病原性の第３の表現型は、同族のウイルス対Ｖ５（Ｐ１３）およびＶ５３（Ｐ１）、ならびにＰ５３ウイルス（これは、１８．７５％〜３７．５％のマウスの死亡率を生じ、そしてウイルスチャレンジで生存したマウスにおける有意な体重の減少（ｐ＜０．００１，研究者の試験、感染の３週間後、希釈物接種したコントロールマウスに対して）を引き起こした）を特徴付けた。ウイルスＶ５（Ｐ１３）およびＶ５３（Ｐ１）は、ＰＤＫ−５３ウイルスの５’ＮＣ−５７−Ｔを含んだが、ＮＳ１−５３−Ａｓｐの遺伝子座は含まなかった。Ｖ１ウイルス（死亡率６．２５％）は、Ｖ５ウイルス（これは、１８．７５％の死亡率および生存者における有意な体重の減少を生じた）よりも、より弱毒化された。逆に、１６６８１ウイルス特異的５’−ＮＣ−５７−Ｃ遺伝子座は、Ｐ５ウイルス（死亡率６．２５％）における病原性に対してほとんど逆転を生じなかったが、一方、Ｐ１ウイルスにおけるＮＳ１−５３−Ｇｌｙ部分は、中間レベル（３７．５％）の死亡率および生存者における有意な体重の減少を生じた。ほとんど弱毒化された同族のＶ１ウイルスとは異なり、Ｐ５３ウイルスは、中間の病原性表現型を有した。ＮＳ１−５３遺伝子座は、５’−ＮＣ−５７遺伝子座よりも、病原性表現型に対してより有意な影響を有した。
【０１６８】
ｐｒＭ−２９遺伝子座は、Ｐ５、ＰＤＫ−５３、および１６６８１ウイルスと比較して、それぞれＰ５ｐ、Ｐｐ、およびＶｐウイルスに対して影響を示さなかった。Ｖ５ｐウイルス（これは、ＰＤＫ５３ウイルス特異的５’ＮＣ−５７−ＴおよびｐｒＭ−２９−Ｖａｌ遺伝子座の両方を含む）は、ほとんど弱毒化された（表２）。ＮＳ３−２５０遺伝子座は、Ｖ３、Ｐ１３、Ｖ５３、Ｖ１３、およびＰ３ウイルス（これは、それぞれ１６６８１、Ｐ１、Ｖ５、Ｖ１、およびＰＤＫ−５３と等価な表現型を示す）におけるマウスの神経毒性表現型に対して有意に寄与しているようではなかった。Ｐ５３およびＰ５ウイルスによって引き起こされる死亡率のレベルにおける差異は、１６６８１ウイルス特異的ＮＳ３−２５０−Ｇｌｕ遺伝子座が、特定の遺伝的状況における病原性表現型に対していくらか寄与していることを示唆した。
【０１６９】
（ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ワクチンウイルスにおける変異の発展）
１６６８１ウイルスの中間の継代ＰＤＫ−５、−１０、−１４、−３５、および−４５を、ＰＤＫ−５３ワクチン菌株における９つのヌクレオチドの変異の発生（ａｃｃｒｕａｌ）を決定するために分析した。アンプリコンを、ＲＴ／ＰＣＲによってウイルスシードから抽出したゲノムｍＲＮＡから、直接増幅した。小さなゲノム領域（これは、９つの関連する遺伝子座を含む）の自動化配列決定を、適切なプライマーを使用して行った。これらのウイルスについての９つの遺伝子座の各々で同定されたヌクレオチド残基を、表１３に示す。ＮＳ２Ａ−１８１のＬｅｕからＰｈｅへの変異、ならびにＥ−３７、ＮＳ３−３４２、およびＮＳ５−３３４でのサイレントな変異は、継代ＰＤＫ−５によって明らかになり、そしてこれは継代ＰＤＫ−１０（ＮＳ２Ａ−１８１）、ＰＤＫ−１４（Ｅ−３７３、ＮＳ３−３４２）、またはＰＤＫ−３５（ＮＳ５−３３４）による優性な部分であった。変異５’−ＮＣ−５７のＣからＴ、ｐｒＭ−２９のＡｓｐからＶａｌ、ＮＳ１−５３のＧｌｙからＡｓｐ、およびＮＳ４Ａ−７５のＧｌｙからＡｌａは、継代ＰＤＫ−３５で生じた。５’−ＮＣ−５７−Ｔは継代ＰＤＫ−３５で優性であり、一方、列挙される他の変異は、継代ＰＤＫ−４５によって優性となった。ＮＳ３−２５０のＧｌｕからＶａｌの変異は、継代ＰＤＫ−４５によって明らかとなり、そしてこれは、現代のＰＤＫ−５３ワクチン候補においてウイルス特異的Ｖａｌに完全には変異されていない（表１３）。ＰＤＫ−５３ワクチンにおけるウイルス集団の約２９％は、ＮＳ３−２５０−Ｇｌｕを含む。ＰＤＫ−４５ウイルスは、ＰＤＫ−５３ワクチンウイルスと遺伝的に等価であった。この研究において、表１３に示される混合遺伝子座での、２つのヌクレオチドの相対比を決定するための試みはなされなかった。
【０１７０】
（実施例６  キメラＤＥＮ−２／Ｗｅｓｔ  Ｎｉｌｅクローンおよびウイルスの構築）
ＤＥＮ−２ウイルスの遺伝的背景に、ＷＮウイルスの構造遺伝子を含むゲノム長のキメラＤＥＮ−２／ＷＮ感染性ｃＤＮＡクローンを、以前に記載したＤＥＮ−２／３ウイルスを誘導するために用いられるインビトロ連結戦略を使用して、構築した。
【０１７１】
最初の例において、５’末端サブクローンのｐｒＭ−ＥをコードするｃＤＮＡ（これは、キメラＤＥＮ−２／３−ＰＰ１ウイルスクローンを誘導するために使用された（実施例２を参照のこと））を、ＷＮウイルス、菌株ＮＹ９９（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９９）のｐｒＭ−Ｅ遺伝子領域で置き換えた。ＷＮウイルスのｐｒＭ−Ｅ遺伝子領域を含むｃＤＮＡフラグメントを、順方向プライマーＷＮ−Ｍ
【０１７２】
【化７】
0004656794.tif 000008
；下線のＭｌｕＩ部位に、ｐｒＭ遺伝子の５’末端付近のＷＮウイルス配列が続く）および逆方向プライマーｃＷＮ−Ｅ
【０１７３】
【化８】
0004656794.tif 000009
；下線のＮｇｏＭＩＶ部位に、ＷＮウイルスのＥ遺伝子の３’末端付近のＷＮゲノム配列に相補的な配列が続く）を有するＷＮウイルス特異的ゲノムＲＮＡから、逆トランスクリプターゼ−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅した。ＤＥＮ−３  １６５６２ウイルスのｐｒＭ／Ｅ領域を置き換えるために、増幅したｐｒＭ−Ｅ  ｃＤＮＡフラグメントを、キメラＤＥＮ−２／３ウイルスの誘導の間に行ったように正確に、中間のｐＤ２Ｉ／Ｄ３−Ｐ１−ＡｓｃＩクローンのＭｌｕＩ−ＮｇｏＭＩＶ部位にクローニングした（実施例２、キメラＤＥＮ−２／３感染性クローンの構築を参照のこと）。このキメラＤＥＮ−２／ＷＮ  ｃＤＮＡにおいて、ｐｒＭスプライス部位は、アミノ酸配列（一文字アミノ酸略語で示され、そしてアミノからカルボニルの順序で示される）
【０１７４】
【化９】
0004656794.tif 000010
（配列番号３９）をコードした。この配列中のハイフンは、キャプシドとｐｒＭ遺伝子との間に位置するポリタンパク質切断部位を示す；このアミノ末端配列は、ＤＥＮ−２ウイルス特異的である；太字、下線、斜体の字体のカルボキシル末端配列は、このキメラ構築物によってコードされるｐｒＭタンパク質のアミノ末端付近の、ＷＮウイルス特異的配列（ＱＧＫＶＭＭＴＶ）（配列番号４０）を示す。この中間のＤＥＮ−２／ＷＮサブクローンは、実施例２（キメラＤＥＮ−２／３感染性クローンの構築）に記載されるものと同じプロトコルによって、インビトロで３’末端中間ＤＥＮ−２サブクローン、ｐＤ２−Ｐｍ＾ｂ−Ａｓｃを用いて連結されて、キメラＤＥＮ−２／ＷＮウイルス特異的ゲノムＲＮＡを転写するために使用される全ゲノム長のキメラＤＥＮ−２／ＷＮウイルスｃＤＮＡを産生する。実施例２に記載されるのと同じプロトコルを使用して、哺乳動物のＬＬＣ−ＭＫ２または蚊のＣ６／３６細胞を、転写されたキメラＤＥＮ−２／ＷＮ  ＲＮＡを用いてトランスフェクトした。キメラＤＥＮ−２／３およびＤＥＮ−２／４ウイルスを誘導するために使用される同じＭｌｕＩ制限酵素スプライス部位の使用を含むこの戦略は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞中での転写されたキメラＤＥＮ−２／ＷＮ  ＲＮＡのトランスフェクション後での、生存可能なキメラウイルスの産生を失敗し、そしてＣ６／３６細胞において非常に低い力価（＜１００ＰＦＵ／ｍｌ）のみを生じた。この失敗は、ウイルスキャプシドタンパク質のカルボキシル末端の間、およびＤＥＮ−２とＷＮウイルスとのｐｒＭタンパク質のアミノ末端の間の有意な遺伝子配列変化におそらく起因する。フラビウイルスキャプシドタンパク質のカルボキシル末端領域は、ｐｒＭタンパク質の変異および切断の間の、細胞内の膜（内質細網）へのｐｒＭの挿入のためのシグナルペプチド配列として役立つ。このＤＥＮ−２／ＷＮ構築物（これは、ＤＥＮ−２骨格のｐｒＭタンパク質のキャプシド−カルボキシル末端シグナル配列、ならびにアミノ末端残基を含む）は、明らかにキメラウイルスの適切な変異を許容しない。
【０１７５】
第２の例において、このキメラＤＥＮ−２／ＷＮ  ｃＤＮＡクローンを、キャプシドタンパク質のカルボキシル末端領域、ならびにＷＮウイルスのｐｒＭタンパク質全体およびＥタンパク質の大部分をコードするように、改変した。ＷＮキャプシド−カルボキシル末端／ｐｒＭ／Ｅ遺伝子領域についての新しい５’スプライス部位として役立つように、独特のＳｓｔＩＩ制限部位を、ＤＥＮ−２ウイルス特異的キャプシド遺伝子の３’末端付近に部位特異的変異誘発によって導入した。このＳｓｔＩＩ部位は、アミノ酸三連構造（ｔｒｉａｄ）ＳＡＧ（一文字略語）をコードするＤＥＮ−２ウイルス特異的配列中に、２つのサイレントな変異を導入した。この適切な遺伝子領域を、ＷＮウイルスＲＮＡから、順方向プライマーＷＮ−４５２．ＳＡＧ
【０１７６】
【化１０】
0004656794.tif 000011
；下線のＳｓｔＩＩ部位に、ＷＮウイルス特異的配列が続く）および以前の構築物（上記に記載されるような）において利用したものと同じ逆ｃＷＮ−Ｅプライマーを使用することによって増幅した。この増幅したｃＤＮＡをクローニングして、中間のサブクローンｐＤＥＮ−２／ＷＮ−Ｐ−ＳＡ（これは、５’非コード領域およびＤＥＮ−２  １６６８１ウイルス由来のキャプシド遺伝子の大部分をコードするｃＤＮＡ、およびカルボキシル末端キャプシド、ｐｒＭ全体、ならびにＷＮウイルス由来のＥ遺伝子の大部分、ならびにＮｇｏＭＩＶ部位の下流の独特のＡｓｃＩ部位を含んだ）を作製する。このキメラＤＥＮ−２／ＷＮ  ｃＤＮＡにおいて、ｐｒＭスプライス部位は、アミノ酸配列（一文字アミノ酸略語で示され、そしてアミノからカルボキシルへの順序で示される）
【０１７７】
【化１１】
0004656794.tif 000012
（配列番号４２）をコードした。この配列中のハイフンは、キャプシドとｐｒＭ遺伝子との間に位置するポリタンパク質切断部位を示す；このアミノ末端配列は、ＤＥＮ−２ウイルス特異的である；太字、下線、斜体の字体のカルボキシル末端配列は、このキメラ構築物によってコードされるＷＮウイルス特異的配列（ＴＧＩＡＶＭＩＧＬＩＡＳＶＧＡ−ＶＴＬＳＮＦＱＧＫＶＭＭＴＶ）（配列番号４３）を示す。実施例２のキメラＤＥＮ−２／３ウイルスについて記載される、キメラＤＥＮ−２／３クローンのインビトロ連結プロトコルに続いて、５’末端中間サブクローンｐＤＥＮ−２／ＷＮ−Ｐ−ＳＡを、３’末端ｐＤ２−Ｐｍ＾ｂ−Ａｓｃサブクローンに連結して、キメラＲＮＡの転写のためのキメラＤＥＮ−２／ＷＮ−ＰＰ１ウイルスの全ゲノム長ｃＤＮＡを産生する。このキメラＤＥＮ−２／ＷＮ−ＰＰ１構築物は、野生型ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスの遺伝的背景に、示されるＷＮ構造遺伝子領域をコードした。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞およびＣ６／３６細胞の両方を、このインビトロで連結されたキメラＤＥＮ−２／ＷＮ−ＰＰ１クローンから転写されたＲＮＡを用いてトランスフェクトした。培養培地の１０３〜１０６ＰＦＵ／ｍｌのウイルス力価で、生存可能なキメラＤＥＮ−２／ＷＮ−ＰＰ１ウイルスを、両方のトランスフェクトされた細胞培養物から首尾良く回収した。クローン誘導キメラＤＥＮ−２／ＷＮウイルスのゲノム全体のヌクレオチド配列分析は、予期されたゲノム配列を示した。これらの結果は、本発明のＤＥＮ−２感染性クローンが、ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−３、およびＤＥＮ−４ウイルス以外の異種フラビウイルスの構造遺伝子を発現するキメラウイルスを構築するために使用され得ることを実証する。
【０１７８】
本明細書中で言及される全ての特許、刊行物および他の参考文献は、その全体において本明細書中で参考として援用される。本発明の方法および組成物の改変および変更は、上記の詳細な説明から当業者に明らかである。このような改変および変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【０１７９】
【表１】
0004656794.tif 000013
【０１８０】
【表２】
0004656794.tif 000014
【０１８１】
【表３】
0004656794.tif 000015
【０１８２】
【表４】
0004656794.tif 000016
【０１８３】
【表５】
0004656794.tif 000017
【０１８４】
【表６】
0004656794.tif 000018
【０１８５】
【表７】
0004656794.tif 000019
ａ力価は、少なくとも５０％のプラーク減少を生じる相互希釈である。
ｂ３週齢の非交近ＩＣＲマウスを１０４ＰＦＵのウイルスで腹腔内免疫し、そして実験１の３週間後または実験２の６週間後に、同じウイルス用量でブーストした。Ｐｒｉｍａｒｙ＝一次免疫化から２０日後（実験１）または４１日後（実験２）に採取した血清。Ｂｏｏｓｔ＝両方の実験においてブースト後２１日に採取した血清。
ｃ個々の力価は決定しなかった。
ｄこれらのグループにおいて、１匹のみの血清力価が１０未満であった。
ｅ太字の力価は、プールした血清が、７０％のプラーク減少で計算したものよりも４倍高かったことを示す。他の全てのプールした力価は、７０％プラーク減少力価と違わないか、または２倍高いかのいずれかであった。
【０１８６】
【表８】
0004656794.tif 000020
【０１８７】
【表９】
0004656794.tif 000021
【０１８８】
【表１０】
0004656794.tif 000022
ａＡＧ−１２９マウスは、インターフェロンα／βおよびインターフェロンγに対するレセプターを欠く近交系株である。３．５〜４．５週齢のマウスを、１０５ＰＦＵのウイルスで腹腔内免疫した。
ｂ野生型ＤＥＮウイルス。
ｃＤＥＮ−３またはキメラＤＥＮ−２／３−ＥＰ１ウイルスで免疫されたマウス由来の血清を試験するために使用された投入（ｉｎｐｕｔ）野生型ＤＥＮ−３  １６５６２ウイルス、またはＤＥＮ−４またはキメラＤＥＮ−２／４−ＥＰ１ウイルスで免疫されたマウス由来の血清を試験するために使用された投入野生型ＤＥＮ−４  １０３６ウイルスの７０％以上を中和するプールされた血清の相互希釈。
ｄＭａｈｉｄｏｌ候補ワクチンウイルス、ＤＥＮ−３  ＰＧＭＫ−３０／ＦＲｈＬ−３  （Ｐ３０／ＦＲｈＬ−３）、ＤＥＮ−４  ＰＤ−４８。
ｅ各々、ＤＥＮ−３  １６５６２またはＤＥＮ−４  １０３６ウイルスのｐｒＭ／Ｅ遺伝子領域を発現するキメラＤＥＮ−２／３−ＥＰ１またはＤＥＮ−２／４−ＥＰ１。
【０１８９】
【表１１】
0004656794.tif 000023
ａ候補ｄｅｎｇｕｅ−２  ＰＤＫ−５３ワクチンウイルスは、９個のヌクレオチド遺伝子座において、その１６６８１親のそれとは異なり、３つの非表現突然変異（示されず）、５’非コード領域におけるゲノムヌクレオチド位置５７（５’ＮＣ−５７；小文字）での変異、およびウイルスポリペプチド位置プレメンブラン（ｐｒＭ）−２９、非構造タンパク質１（ＮＳ１）−５３、ＮＳ２Ａ−１８１、ＮＳ３−２５０、およびＮＳ４Ａ−７５（３２）にアミノ酸変異をコードする５つのヌクレオチド（大文字、一文字表記）。親１６６８１ウイルスからの遺伝子座を、ＰＤＫ−５３ウイルス特異的感染クローンｐＤ２／ＩＣ−Ｗ４５ＲのｃＤＮＡの遺伝子バックグラウンドに操作した。ドットは、ＰＤＫ−５３（ＮＳ３−２５０−Ｖａｌ改変体）との配列同一性を示す。この候補はまた、ＮＳ３−２５０（３２）にＧｌｕを得する遺伝的改変体を含む。
ｂ野生型ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルス、その弱毒化ワクチン誘導体、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルス、感染性クローン誘導ＶＶ４５Ｒ（遺伝子的に、ＰＤＫ−５３  ＮＳ３−２５０−Ｖａｌ改変体に等価である）および３０Ｐ−Ａ（野生型１６６８１に等価である）ウイルス、ならびに組換え１６６８１／ＰＤＫ−５３ウイルスが示される。組換えＰｘおよびＶｘウイルス（ここで、ｘ＝５’ＮＣ、ＮＳＩ、および／またはＮＳ３遺伝子座）についての数字表記は、それぞれ、ＰＤＫ−５３ウイルス特異的感染性ｃＤＮＡクローンに操作された親（ウイルス表記におけるＰ）１６６８１ウイルス特異的遺伝子座（上部に一連のもの）または１６８８１クローンに操作された相互候補ＰＤＫ−５３ワクチン（ウイルス表記におけるＶ）ウイルス特異的遺伝子座（下部の一連のもの）を示す。Ｐ５およびＶ１３は、ＰＤＫ−５３ウイルス特異的表現型が、５’ＮＣ−５７、ＮＳ  １−５３、およびＮＳ３−２５０遺伝子座によって主に決定されることを仮定して、同族ウイルスである。Ｐ５およびＶ１３ウイルスの両方は、それぞれ、ＰＤＫ−５３および１６８８１ウイルスの遺伝子バックグラウンドの内の５’ＮＣ５７−ｃ、ＮＳｌ−５３−Ａｓｐ、およびＮＳ３−２５０−Ｖａｌ遺伝子座を含む。
ｃＰＤＫ−５３ウイルスからの遺伝子座を、１６６８１ウイルス特異的感染性クローンｐＤ２／ＩＣ−３０Ｐ−Ａに操作した。ドットは、１６６８１ウイルスとの配列同一性を示す。
【０１９０】
【表１２】
0004656794.tif 000024
ａ１０４ＰＦＵのウイルスで腹腔内にチャレンジされた新生の、非近交系の白色ＩＣＲマウスの％死亡率および平均生存時間（ＡＳＴ）±標準偏差（ＳＤ）。１つの郡あたり１６匹のマウスであるが、おそらく接種外傷の結果として、感染後１日目までに、１匹のマウスが死亡したＰ５３およびＶｐの群を除く。これらの２匹のマウスを、この研究から除外した。
ｂウイルス表現型の説明については明細書を参照のこと。中実ドットは、１６６８１ウイルスとの配列同一性を示す。
ｃウイルスウイルスおよび同族ウイルス表記については、明細書を参照のこと。ｄ生存マウスの平均体重は、感染後３週間での希釈剤接種されたコントロールマウスの平均体重（示さず）よりも、有意に（ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定）に低かった。
ｅ平均生存時間は、適用可能ではない。なぜなら、このマウスには死亡が存在しなかったからである。
【０１９１】
【表１３】
0004656794.tif 000025
ａ１６６８１ウイルスとＰＤＫ−５３ウイルスとの間の、９つのヌクレオチド配列のゲノムヌクレオチド位置。ヌクレオチド位置５７は、このウイルスゲノムの５’非コード領域にある。
ｂタンパク質の命名は、以下の通りである：ｐｒＭ＝膜前タンパク質（ｐｒｅｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）；Ｅ＝外被糖タンパク質；ＮＳ＝非構造タンパク質。
ｃこのウイルス特異的アミノ酸残基（１６６８１〜ＰＤＫ−５３）は、各アミノ酸位置について示される。
ｄＡ，Ｃ，Ｇ，およびＴ（ｃＤＮＡセンス）ヌクレオチドを示す。
ｅ２つの遺伝的集団を、このウイルスにおける遺伝子座について同定した。２つのヌクレオチドの順序は、配列クロマトグラムにおけるヌクレオチドシグナルの相対ピーク高さを反映する。
【０１９２】
【表１４】
0004656794.tif 000026
ａＭａｈｉｄｏｌ候補ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ワクチンウイルス。キメラＤＥＮ−２／１、ＤＥＮ−２／３、およびＤＥＮ−２４ウイルスを、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３遺伝的背景、ＮＳ３−２５０−ＶａｌまたはＧｌｕ改変体に構築した。キメラウイルスについて示されるこの表現型は、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルスのいずれかの背景で構築されたキメラウイルスの代表である。
【０１９３】
【表１５】
0004656794.tif 000027
0004656794.tif 000028
0004656794.tif 000029
0004656794.tif 000030
（表１６）
（配列番号：ＴａｑＭａｎプローブおよびアンプリマーについて）
下線の残基は、プライマー配列内の候補ワクチンウイルス変異の位置を示すか、または配列番号５２の場合、下線の残基は、ＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスのヌクレオチド５２７０位を示す。
配列番号：
【０１９４】
【表１６】
0004656794.tif 000031
0004656794.tif 000032
0004656794.tif 000033
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、キメラＤＥＮ−２／ＤＥＮ−１ウイルスのゲノム組織を概略的に示す。キメラ名は、ＤＥＮ−２ウイルス特異的感染性クローン骨格およびＤＥＮ−１ウイルスの構造遺伝子（Ｃ−ｐｒＭ−Ｅ）挿入物に基づく。骨格および挿入物ウイルスの下線を付した文字を、これらの名前において使用する。Ｄ２／１は、ＤＥＮ−２／ＤＥＮ−１キメラを示し；ハイフン後の最初の文字はＤＥＮ−２ウイルス骨格、親１６６８１（Ｐ）、ＰＤＫ５３−Ｅ（Ｅ）またはＰＤＫ５３−Ｖ（Ｖ）であり；最後の文字は、親ＤＥＮ−１  １６００７（Ｐ）株またはそのワクチン誘導体ＰＤＫ−１３（Ｖ）株由来の構造遺伝子を示す。ＰＤＫ５３−Ｅ骨格は、３つのＤＥＮ−２  ＰＤＫ−５３ウイルス特異的アミノ酸変異（ＮＳ１−５３−Ａｓｐ、ＮＳ２Ａ−１８１−Ｐｈｅ、およびＮＳ４Ａ−７５−Ａｌａ）ならびにＰＤＫ−５３ウイルスの５’ＮＣ−５７変異を含む。ＰＤＫ５３−Ｖ骨格は、３つの同じＰＤＫ−５３ウイルス特異的遺伝子座＋さらなるＰＤＫ−５３ウイルス特異的ＮＳ３−２５０−Ｖａｌ遺伝子座を含む。
【図２】  図２Ａおよび２Ｂは、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞におけるキメラＤＥＮ−１／ＤＥＮ−１ウイルスの増殖特性を示す。点線棒は、ＤＥＮ−１  １６００７ウイルスおよびＤＥＮ−１  １６００７ウイルスの構造タンパク質を発現するキメラウイルスを示す。縞模様の棒は、ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３ウイルスおよびＰＤＫ−１３ウイルスの構造タンパク質を発現するキメラウイルスを示す。無地の棒はＤＥＮ−２  １６６８１ウイルスの感染性クローン（Ｐ４８）および２つの改変体（それぞれ、ＰＤＫ５３−ＥおよびＰＤＫ−５３Ｖ；Ｅ４８およびＶ４８）由来の３つのＤＥＮ−２骨格ウイルスを示す。図２Ａ：平均（±ＳＤ）プラーク直径。値は、感染後１０日目に各ウイルスの１０個の個々のプラークから計算した。ｐｐ：１ｍｍ未満のピンポイントサイズのプラーク。図２Ｂ：感染後８日後または１０日後のキメラウイルスの温度感受性（ｔｓ）および平均力価。ｔｓスコアは、３７℃でのウイルス力価に対する３８．７℃でのウイルス力価の減少に基づく（−、＋、２＋、３＋は、少なくとも３回の実験から計算した、それぞれ、６０％以下、６１〜９０％、９１〜９９％、＞９９％の力価の減少を示す）。棒グラフの高さは、３７℃でのウイルスのｌｏｇ１０力価を示す。感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）は、約０．００１ＰＦＵ／細胞であった。
【図３】  図３は、Ｃ６／３６細胞におけるＤＥＮ−１  １６００７、ＤＥＮ−１  ＰＤＫ−１３、ＤＥＮ−２  １６６８１−Ｐ４８、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ５３−Ｅ４８、ＤＥＮ−２  ＰＤＫ５３−Ｖ４８およびキメラＤＥＮ−２／ＤＥＮ−１ウイルスの増殖曲線を示す。細胞は、約０．００１ＰＦＵ／ｍｌのｍ．ｏ．ｉ．で感染させた。
【図４】  図４Ａ〜Ｃ。図４Ａ：ＬＬＣ−ＭＫ２細胞における感染後９日でのＤＥＮ−２  １６６８１、ＰＤＫ−５３および組換え１６６８１／ＰＤＫ−５３ウイルスの平均プラーク直径±ＳＤ（ｍｍ）（ｎ＝１２）。図４Ｂ：１回の実験における約０．００１ＰＦＵ／ｍｌのｍ．ｏ．ｉ．でのＬＬＣ−ＭＫ２細胞の感染後６〜８日目でのピーク複製力価。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞における３７℃または３８．７℃で増殖されたウイルスについての温度感受性（ｔｓ）スコアを、ピーク複製力価についての棒グラフの上に示す。（−）、（＋／−）および（＋）のスコアは、それぞれ、３８．７℃でのウイルス力価における８１％未満、８１〜８９％および９０〜９７％の減少を示す。スコアは、感染後８日で決定した。図４Ｃ：２つの独立した実験における約０．００１ＰＦＵ／細胞の多重度でのＣ６／３６細胞の感染後１２日目での平均ピーク複製。２つの実験からの個々のピーク力価を、各棒グラフ中の垂直線によって示す。組換えＰｘおよびＶｘウイルスの数字表示（ここで、ｘ＝５’ＮＣ、ＮＳ１、および／またはＮＳ３遺伝子座）は、それぞれ、ＰＤＫ−５３ウイルス特異的感染性ｃＤＮＡクローンに操作された親（ウイルス名においてＰ）１６６８１ウイルス特異的遺伝子座、またはこの１６６８１クローンに操作された相互の（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）候補ＰＤＫ−５３ワクチン（ウイルス名においてＶ）ウイルス特異的遺伝子座を示す。同族のウイルスは、３つ全てのグラフにおいて、同じ模様または平行斜線パターンの棒グラフによって示される。Ｐ５ウイルスに対する同族体は、Ｖ１３ウイルスであり、これは、ウイルス表現型が、５’ＮＣ−５７、ＮＳ１−５３およびＮＳ３−２５０遺伝子座によって優性に決定されることを想定する。Ｐ５およびＶ１３の両ウイルスは、それぞれ、ＰＤＫ−５３および１６６８１ウイルスの遺伝子バックグラウンド内に、５’ＮＣ−５７−Ｃ（１６６８１）、ＮＳ１−５３−Ａｓｐ（ＰＤＫ−５３）およびＮＳ３−２５０−Ｖａｌ（ＰＤＫ−５３）遺伝子座を含む。
【配列表】
0004656794.tif 000034
0004656794.tif 000035
0004656794.tif 000036
0004656794.tif 000037
0004656794.tif 000038
0004656794.tif 000039
0004656794.tif 000040
0004656794.tif 000041
0004656794.tif 000042
0004656794.tif 000043
0004656794.tif 000044
0004656794.tif 000045
0004656794.tif 000046
0004656794.tif 000047
0004656794.tif 000048
0004656794.tif 000049
0004656794.tif 000050
0004656794.tif 000051
0004656794.tif 000052
0004656794.tif 000053
0004656794.tif 000054
0004656794.tif 000055
0004656794.tif 000056
0004656794.tif 000057
0004656794.tif 000058
0004656794.tif 000059
0004656794.tif 000060
0004656794.tif 000061
0004656794.tif 000062
0004656794.tif 000063
0004656794.tif 000064
0004656794.tif 000065
0004656794.tif 000066
0004656794.tif 000067
0004656794.tif 000068
0004656794.tif 000069
0004656794.tif 000070
0004656794.tif 000071
0004656794.tif 000072
0004656794.tif 000073
0004656794.tif 000074
0004656794.tif 000075
0004656794.tif 000076
0004656794.tif 000077
0004656794.tif 000078
0004656794.tif 000079
0004656794.tif 000080
0004656794.tif 000081
0004656794.tif 000082
0004656794.tif 000083
0004656794.tif 000084
0004656794.tif 000085
0004656794.tif 000086
0004656794.tif 000087
0004656794.tif 000088
0004656794.tif 000089
0004656794.tif 000090
0004656794.tif 000091
0004656794.tif 000092
0004656794.tif 000093
0004656794.tif 000094
0004656794.tif 000095
0004656794.tif 000096
0004656794.tif 000097
0004656794.tif 000098
0004656794.tif 000099
0004656794.tif 000100
0004656794.tif 000101
0004656794.tif 000102
0004656794.tif 000103
0004656794.tif 000104
0004656794.tif 000105
0004656794.tif 000106
0004656794.tif 000107
0004656794.tif 000108
0004656794.tif 000109
0004656794.tif 000110
0004656794.tif 000111
0004656794.tif 000112
0004656794.tif 000113
0004656794.tif 000114
0004656794.tif 000115
0004656794.tif 000116
0004656794.tif 000117
0004656794.tif 000118
0004656794.tif 000119
0004656794.tif 000120
0004656794.tif 000121
0004656794.tif 000122
0004656794.tif 000123
0004656794.tif 000124
0004656794.tif 000125
0004656794.tif 000126
0004656794.tif 000127
0004656794.tif 000128
0004656794.tif 000129
0004656794.tif 000130
0004656794.tif 000131
0004656794.tif 000132
0004656794.tif 000133
0004656794.tif 000134
0004656794.tif 000135
0004656794.tif 000136
0004656794.tif 000137
0004656794.tif 000138
0004656794.tif 000139
0004656794.tif 000140
0004656794.tif 000141
0004656794.tif 000142
0004656794.tif 000143
0004656794.tif 000144
0004656794.tif 000145
0004656794.tif 000146
0004656794.tif 000147
0004656794.tif 000148
0004656794.tif 000149
0004656794.tif 000150
0004656794.tif 000151
0004656794.tif 000152
0004656794.tif 000153
0004656794.tif 000154
0004656794.tif 000155
0004656794.tif 000156
0004656794.tif 000157
0004656794.tif 000158
0004656794.tif 000159
0004656794.tif 000160
0004656794.tif 000161
0004656794.tif 000162
0004656794.tif 000163
0004656794.tif 000164
0004656794.tif 000165
0004656794.tif 000166
0004656794.tif 000167
0004656794.tif 000168
0004656794.tif 000169
0004656794.tif 000170
0004656794.tif 000171
0004656794.tif 000172
0004656794.tif 000173
0004656794.tif 000174
0004656794.tif 000175
0004656794.tif 000176
0004656794.tif 000177
0004656794.tif 000178
0004656794.tif 000179
0004656794.tif 000180
0004656794.tif 000181
0004656794.tif 000182
0004656794.tif 000183
0004656794.tif 000184
0004656794.tif 000185
0004656794.tif 000186
0004656794.tif 000187
0004656794.tif 000188
0004656794.tif 000189
0004656794.tif 000190
0004656794.tif 000191
0004656794.tif 000192
0004656794.tif 000193
0004656794.tif 000194
0004656794.tif 000195
0004656794.tif 000196
0004656794.tif 000197
0004656794.tif 000198
0004656794.tif 000199
0004656794.tif 000200
0004656794.tif 000201
0004656794.tif 000202
0004656794.tif 000203
0004656794.tif 000204
0004656794.tif 000205
0004656794.tif 000206
0004656794.tif 000207
0004656794.tif 000208
0004656794.tif 000209
0004656794.tif 000210
0004656794.tif 000211
0004656794.tif 000212
0004656794.tif 000213
0004656794.tif 000214
0004656794.tif 000215
0004656794.tif 000216
0004656794.tif 000217
0004656794.tif 000218
0004656794.tif 000219
0004656794.tif 000220
0004656794.tif 000221
0004656794.tif 000222
0004656794.tif 000223
0004656794.tif 000224
0004656794.tif 000225
0004656794.tif 000226
0004656794.tif 000227
0004656794.tif 000228
0004656794.tif 000229
0004656794.tif 000230
0004656794.tif 000231
0004656794.tif 000232
0004656794.tif 000233
0004656794.tif 000234
0004656794.tif 000235
0004656794.tif 000236
0004656794.tif 000237
0004656794.tif 000238
0004656794.tif 000239
0004656794.tif 000240
0004656794.tif 000241
0004656794.tif 000242
0004656794.tif 000243
0004656794.tif 000244
0004656794.tif 000245
0004656794.tif 000246
0004656794.tif 000247
0004656794.tif 000248
0004656794.tif 000249
0004656794.tif 000250
0004656794.tif 000251
0004656794.tif 000252
0004656794.tif 000253
0004656794.tif 000254
0004656794.tif 000255
0004656794.tif 000256
0004656794.tif 000257
0004656794.tif 000258
0004656794.tif 000259
0004656794.tif 000260
0004656794.tif 000261
0004656794.tif 000262
0004656794.tif 000263
0004656794.tif 000264
0004656794.tif 000265
0004656794.tif 000266
0004656794.tif 000267
0004656794.tif 000268
0004656794.tif 000269
0004656794.tif 000270
0004656794.tif 000271
0004656794.tif 000272
0004656794.tif 000273
0004656794.tif 000274
0004656794.tif 000275
0004656794.tif 000276
0004656794.tif 000277
0004656794.tif 000278
0004656794.tif 000279
0004656794.tif 000280
0004656794.tif 000281
0004656794.tif 000282
0004656794.tif 000283
0004656794.tif 000284
0004656794.tif 000285
0004656794.tif 000286
0004656794.tif 000287
0004656794.tif 000288
0004656794.tif 000289
0004656794.tif 000290
0004656794.tif 000291
0004656794.tif 000292
0004656794.tif 000293
0004656794.tif 000294
0004656794.tif 000295
0004656794.tif 000296
0004656794.tif 000297
0004656794.tif 000298
0004656794.tif 000299
0004656794.tif 000300
0004656794.tif 000301
0004656794.tif 000302
0004656794.tif 000303
0004656794.tif 000304
0004656794.tif 000305
0004656794.tif 000306
0004656794.tif 000307
0004656794.tif 000308
0004656794.tif 000309
0004656794.tif 000310
0004656794.tif 000311
0004656794.tif 000312
0004656794.tif 000313
0004656794.tif 000314
0004656794.tif 000315
0004656794.tif 000316
0004656794.tif 000317
0004656794.tif 000318
0004656794.tif 000319
0004656794.tif 000320
0004656794.tif 000321
0004656794.tif 000322
0004656794.tif 000323
0004656794.tif 000324
0004656794.tif 000325
0004656794.tif 000326
0004656794.tif 000327
0004656794.tif 000328
0004656794.tif 000329
0004656794.tif 000330
0004656794.tif 000331
0004656794.tif 000332
0004656794.tif 000333
0004656794.tif 000334
0004656794.tif 000335
0004656794.tif 000336
0004656794.tif 000337
0004656794.tif 000338
0004656794.tif 000339
0004656794.tif 000340
0004656794.tif 000341
0004656794.tif 000342
0004656794.tif 000343
0004656794.tif 000344
0004656794.tif 000345
0004656794.tif 000346
0004656794.tif 000347
0004656794.tif 000348
0004656794.tif 000349
0004656794.tif 000350
0004656794.tif 000351
0004656794.tif 000352
0004656794.tif 000353
0004656794.tif 000354
0004656794.tif 000355
0004656794.tif 000356
0004656794.tif 000357
0004656794.tif 000358
0004656794.tif 000359
0004656794.tif 000360
0004656794.tif 000361
0004656794.tif 000362
0004656794.tif 000363
0004656794.tif 000364
0004656794.tif 000365
0004656794.tif 000366
0004656794.tif 000367
0004656794.tif 000368
0004656794.tif 000369
0004656794.tif 000370
0004656794.tif 000371
0004656794.tif 000372
0004656794.tif 000373
0004656794.tif 000374
0004656794.tif 000375
0004656794.tif 000376
0004656794.tif 000377
0004656794.tif 000378
0004656794.tif 000379
0004656794.tif 000380
0004656794.tif 000381
0004656794.tif 000382
0004656794.tif 000383
0004656794.tif 000384
0004656794.tif 000385
0004656794.tif 000386
0004656794.tif 000387
0004656794.tif 000388
0004656794.tif 000389
0004656794.tif 000390
0004656794.tif 000391
0004656794.tif 000392
0004656794.tif 000393
0004656794.tif 000394
0004656794.tif 000395
0004656794.tif 000396
0004656794.tif 000397
0004656794.tif 000398
0004656794.tif 000399
【図１】
0004656794.tif 000400
【図２】
0004656794.tif 000401
【図３】
0004656794.tif 000402
【図４】
0004656794.tif 000403