(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水部と親水部をもち、分子量５０００以下である両親媒性化合物を水中で加熱溶解し、次いで冷却することによって長尺状の自己集合体からなるヒドロゲルを形成させることを特徴とする電気泳動のための分離・分析用充填材組成物。
【請求項２】
ヒドロゲルが、加熱後の冷却工程で物理的な架橋構造によって形成されたものであって、加熱することで流動性のゾル又は分子分散状態まで再溶解可能なものであることを特徴とする請求項１に記載の充填材組成物。
【請求項３】
ヒドロゲルが、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びポリアクリルアミドからなる群から選ばれるヒドロゲル剤を含有するものである請求項２に記載の充填材組成物。
【請求項４】
疎水部と親水部をもち、分子量５０００以下である両親媒性化合物が、両親媒性脂質である請求項１〜３のいずれかに記載の充填材組成物。
【請求項５】
前記両親媒性脂質が、チミジル酸双頭型脂質である請求項４に記載の充填材組成物。
【請求項６】
疎水部と親水部をもち、分子量５０００以下である両親媒性化合物と水を混合し、これを水中で加熱溶解し、次いで冷却することによって長尺状の自己集合体からなるヒドロゲルを形成させることを特徴とする電気泳動のための分離・分析用充填材組成物を製造する方法。
【請求項７】
ヒドロゲルが、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びポリアクリルアミドからなる群から選ばれるヒドロゲル剤を含有するものである請求項６に記載の充填材組成物の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれかに記載の充填材組成物が充填された電気泳動用の分離媒体の容器。
【請求項９】
電気泳動用の分離媒体の容器が、キャピラリーである請求項８に記載の分離媒体の容器。
【請求項１０】
充填材組成物が交換可能に充填されているものである請求項８又は９に記載の分離媒体の容器。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれかに記載の分離媒体の容器を有することを特徴とする電気泳動装置。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれかに記載の充填材組成物が充填された電気泳動用のキャピラリーを用いて試料を電気泳動により分離・分析する方法。
【請求項１３】
電気泳動法が、キャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動、キャピラリー等速電気泳動、ミセル動電クロマトグラフィー、キャピラリーゲル電気泳動、又はＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動である請求項１２に記載の分離・分析方法。
【請求項１４】
電気泳動法が、スラブ電気泳動法、デスクゲル電気泳動法、SDS-PAGE法、Native-PAGE法、等電点電気泳動（焦点電気泳動）、又は免疫電気泳動法である請求項１２に記載の分離・分析方法。
【請求項１５】
電気泳動において、さらにブロッティング操作が併用されることを特徴とする請求項１４に記載の分離・分析方法。
【請求項１６】
分析対象物となる試料が、タンパク質、核酸、糖質、又は脂質である請求項１２〜１５のいずれかに記載の分離・分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学分析用の電気泳動装置などに利用される分離媒体、それを充填したキャピラリーカラムとそれを用いた分離システムに関する。より詳細には、本発明は、疎水部と親水部をもつ両親媒性化合物の水中での加熱溶解と冷却によって製造することができる長尺状の自己集合体を含有してなる電気泳動のための分離・分析用充填材組成物、その製造方法、それを用いた分離・分析方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の機能を細胞レベルで明らかにするために、生体内のタンパク質、ペプチド、核酸、アミノ酸、糖質、神経伝達関連物質などの解析、分析が行われている。その手段として、質量分析計を組み合わせた高速液体クロマトグラフィー等が行われてきたが、その理論段数はキャピラリー電気泳動に及ばない。具体的には、例えば「J.Chormatography」誌第558号1991年pp280のオリゴヌクレオチドの分離分析に見られるように、キャピラリー電気泳動では1,000,000、高速液体クロマトグラフィーでは30,000程度である。加えて、分析に必要なサンプルの絶対量が高速液体クロマトグラフィーと比較して微量である（高速液体クロマトグラフィーでは数ｍｌ、キャピラリー電気泳動法ではｐｌレベルである）ので分離分析にはキャピラリー電気泳動法が利用される。また、キャピラリー電気泳動はヒューマンゲノムプロジェクトで使用されているように、その高分解能には定評があり、最近ではタンパク質、アミノ酸などの分析にも多く利用される。このように簡便で、高分解能、高感度のキャピラリー電気泳動はDNA、RNA、タンパク質などの分離分析の重要な技術である。これまでのキャピラリー電気泳動では、内径２０〜１００μｍのキャピラリーの内部に充填するポリマーの細孔（正確にはポリマーのネットワークによって作られる網目の大きさ）を利用して分離を行っている（非特許文献１参照）。その過程は物理的な「分離媒体」の効果であり、多くの場合水溶性のポリマーをキャピラリーの内部に充填することにより分析が行われている。この分離媒体には、内部に固定化されて、交換が困難な固定型と、単にキャピラリー内に溶液として充填しただけで、交換が容易な可換型に分類できる。いずれの場合にも、代表的な篩いとして水溶性のポリマーが用いられている。【０００３】
固定型の分離媒体としては、ポリアクリルアミドがその代表例である。具体的には、ガラス表面に結合するシランカップリング剤の一種であるメタアクリル型モノマー（3-methacryloxypropyltrimethoxysilane: MPTS）とアクリルアミドモノマー、および架橋化用の少量のビスアクリルアミドモノマーをキャピラリー中で混合した後、ラジカル共重合を行う。このようにして網目状のゲルからなる固相型の分離媒体（高分子ネットワーク）を得る。この系の短所は、試料や不純物などの吸着によって分離媒体の分離能が低下することを原因とするキャピラリーの寿命が短い点である。このため通常は２０〜１００回の使用後はキャピラリー全体の交換が必要である。また、これらの分離媒体の高分子固定化作業はキャピラリー内で重合を行うために、キャピラリーの調製に時間と多くの手順を要すること、得られたゲルが分離能の低下を招く不均一な網目構造を部分的に含む点、キャピラリーの交換にともなう定量性の低下があげられる。これらの固定型の分離媒体（ゲル充填キャピラリー）も市販されているが、それぞれの分子量に合わせて最適化されているものを選ぶことが困難であり、本来は試料の大きさや種類に合わせてゲル濃度などを調整する必要がある。【０００４】
可換型の分離媒体ではヒドロキシエチルセルロース（HEC）、ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）、非架橋型の鎖状ポリアクリルアミドが挙げられる（非特許文献２参照）。これらの長所は、これらの分離媒体はポリマー溶液であり詰め替えが容易である点、キャピラリーの寿命が飛躍的に向上する点、さらにはこの長寿命故の分析における再現性の高さである。またこの詰め替えの容易さから分離媒体の自動充填が可能となり、分析の完全自動化、省力化、高速化に大きく貢献できる可能性が高い。短所は、分離する試料（DNA、RNA、タンパク）の長さ（分子量）に応じて、分離媒体の濃度や分子量等を最適化する必要性がある点である。つまり高分子量のサンプルに対しては、粘性の高い高濃度の高分子（篩い）溶液が必要になるため、ポリマーやサンプルの充填が困難になる点である。さらに試料の移動度も低下することから、分析にも長時間を要する。つまり二本鎖ＤＮＡを試料とした場合、可換型の分離媒体である高分子溶液を用いるとキャピラリー電気泳動による分離分析の限界は10,000塩基対程度である。
このような可換型の分離媒体の長所を生かし、なおかつ高濃度での分離媒体溶液の粘度上昇を抑えるため、新しいナノ構造をもつ分離媒体の試みがなされている。これらは、これまで分離媒体として用いられてきた柔軟でランダムな１次元の鎖状高分子とは異なる構造、サイズを持つことが特徴である。例えば、分離媒体である高分子ゲルの架橋点を減らすことでミクロなゲル状網目構造を持ちながら、溶媒に分散可能なため交換が容易な分離媒体（非特許文献３参照）、球状の金ナノ微粒子の表面に高分子を修飾することで分離媒体の溶液粘度を抑えることに成功した例（非特許文献４参照）、またゲルでありながら加熱することで交換可能な可換型の有機ゲルを用いた例（非特許文献５参照）などが挙げられる。しかし、非特許文献３及び４もそれぞれ、ゲルの微細構造は柔軟でランダムな構造あるいは球状に限られること、非特許文献５では、ゲル形成に有機溶媒を用いることから、有機溶媒に不溶な分子は分析、測定することが出来ないし、DNA,RNA,タンパクなどの様に試料が高次構造を持つ場合、これらの有機溶媒によって変性する可能性がある。【０００５】
一方、親水性と疎水性をもつ両親媒性化合物が水中で、加熱による溶解後、冷却すること、あるいは単に分散させることで自ら集合して（自己集合という）、安定なナノメートルサイズの分子集合体を形成することはすでに知られている（非特許文献６参照）。分子の自己集合によるこのような分子集合体は、従来、アルキルベンゼンスルホン酸（SDS：Sodium Dodecyl Sulfate）などが形成する球状のミセルや、天然由来のリン脂質から形成される球状の分子集合体（リポソーム、あるいはベシクルと呼ばれる二分子膜からなる細胞膜の基本構造）が知られている。これらの両親媒性化合物からなる集合体の特徴は、室温では分子が液晶状態であるために流動性を持つことである。このため、最安定な球状の集合形態を通常もち、外部からの刺激により容易に変形する。このような液晶状態での構造は、冷却により流動性の無い固体状態に変えることができるが、通常は液晶状態での球状構造を反映した状態のままで固体状になる。このように両親媒性化合物が流動状態から固体状態への変化を起こす温度をゲル−液晶相転移温度という。
このような両親媒性化合物に、分子間結合力とその空間的な方向性（異方性という）を増すような官能基を導入することで、固体状態での構造形態が球状から、以下に記載するような特異な形態に変化する。ここで、上述の様な分子間相互作用とその異方性を増す官能基としては、水素結合を形成可能なアミド基、水酸基、尿素基、イミド基、ウレタン基、カルボキシル基、リン酸基さらには剛直なユニットである芳香環、炭化フッ素基などがあげられる。特に、これらを有する糖、アミノ酸類の導入が有効である。さらには、このような特異な形態を安定化するために、疎水部が比較的長く大きい両親媒性化合物がよく用いられる。この様な分子間結合力を増加させた両親媒性化合物の水中での自己集合形態は、加熱状態（つまりゲル−液晶相転移温度以上）では流動性が増加し、通常の両親媒性化合物と同様に球状になる。しかし、これをゲル−液晶相転移温度以下に冷却して固体状態に相転移させると、集合構造が変化して、幅３ｎｍ〜５００μｍ、長さ１００ｎｍ〜数ｍｍの軸比の高い極微細繊維、テープ、およびこれらがねじれた形態に変化したらせん状テープや、外径２０ｎｍ〜数十μｍ、長さ１００ｎｍ〜数ｍｍのチューブなどの微細構造を持つ長尺状構造体を与える（非特許文献７、８参照）。これらはさらに化合物の濃度を上げたり、金属塩を添加することでこれらの構造体同士が物理的に接触（架橋）し、絡み合うため、溶媒である水を多く含んだヒドロゲルになる。【０００６】
これらの自己集合による長尺状構造体やそれらからなるヒドロゲルの特徴は、（１）可逆的に出発材料である両親媒性化合物に戻すことができる点と、（２）自己集合によって長尺状構造体にするときに、その条件によって微細な形態やサイズが精密に制御出来る点である。具体的には、これらの構造体は一般的に分散させた溶媒中で安定であるが、物理的振動や衝撃を加えたり、両親媒性化合物がよく溶ける溶媒（良溶媒）の添加によりこの様な特異的な構造は崩壊し、球状の分子集合体や分子分散状態にまで戻ってしまう。しかし、これらの崩壊した構造体は再冷却、水などの貧溶媒の添加、振動を取り除いた静置によって、可逆的に自己集合させて、半永久的に元の長尺状構造体やその物理架橋物であるヒドロゲルにもどすことができる。またこのとき、分子の種類、冷却速度や両親媒性化合物の濃度ばかりでなく、溶液のｐＨ，無機塩や水以外の有機溶媒の添加などで、その微細な形態（繊維状、テープ状、らせんテープ状、チューブ状など）、ゾル−ゲルなどのマクロな形態（長尺構造が分散したゾル状分散物、それらが物理架橋しあうことによるヒドロゲル）、各微細構造のサイズなどを作り分けることもできる。【０００７】
このような両親媒性化合物を電気泳動分析に使用する例としては、SDS−PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）法や、SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）キャピラリー電気泳動法、ミセル動電クロマトグラフィー法などが従来から用いられている。しかし、SDS-PAGE法やSDSキャピラリー電気泳動法では、両親媒性化合物としてSDS（Sodium Dodecyl Sulfate）が用いられている。これらの方法でのＳＤＳの役割は、SDSのミセルがタンパク質に吸着することで、その高次構造を破壊し、一本の高分子鎖に変性させることであり、本発明のように両親媒性化合物を分離や分析用の媒体として使用するものではない。また、ミセル動電クロマトグラフィー法ではミセルは疎水場をもつ移動相として作用するだけである（非特許文献１）。【０００８】
【非特許文献１】本田進、寺部茂  編、「キャピラリー電気泳動、基礎と実際」、講談社サイエンティフィック、１９９５年．
【非特許文献２】A. Lagu et al.,  Anal. Chem., 1991, 63, 1233.
【非特許文献３】A.E. Barron et al.  Anal. Chem., 2004, 76, 5249.
【非特許文献４】H.-T. Chang et al.,  Anal. Chem., 2004, 76, 192.
【非特許文献５】O. Lev et al.  Anal. Chem., 2004, 76, 5399.
【非特許文献６】野島庄七，砂本順三、井上圭三  編、“リポソーム”，南江堂（１９８８）.
【非特許文献７】L.A.Estroff and A.D. Hamilton, Chem. Rev. 2004, 104, 1201.
【非特許文献８】平尾一之  編，“基礎から学ぶナノテクノロジー”東京化学同人，第５章（２００３）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このような自己集合によるナノ構造体を利用した例としては、前記非特許文献５に示した自己集合性有機ゲルの例が挙げられる。しかし、これはアセトニトリル、あるいはこれにメタノールを加えた混合溶媒などの有機溶媒中でしか自己集合してゲルを与えないオルガノゲルである。つまり、電気泳動分析が有機溶媒系に限られる点である。このような有機溶媒に多くの生体高分子の試料は不溶である。また分離媒体の交換が可能かどうかの記述はない。従って本発明は、電気泳動のための新規な分離媒体としての分離・分析用充填材組成物、及びそれを用いた電気泳動法、より詳細にはキャピラリー電気泳動におけるキャピラリー交換が容易な新規な分離媒体としての分離・分析用充填材組成物、並びにその製造方法とそのキャピラリーへの充填方法、及びそれを用いたキャピラリー電気泳動法などの電気泳動法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは鋭意検討した結果、（１）水中で自己集合可能な親水部と疎水部を持つ低分子の両親媒性化合物を加熱により水溶液として電気泳動分析機器の分離用カラムに充填し、（２）これを冷却することで電気泳動の分離媒体として働く長尺状構造をもつ自己集合体、あるいはこれらからなるヒドロゲルを形成させ、（３）これを分離媒体として用いた電気泳動分析法を行うことにより、極めてシャープな分離・分析ができることを見出した。さらに本発明者らは、（４）この長尺状構造が目詰まり、劣化などで交換を要する場合は、加熱しながら再溶解させ、排出した後に再び（１）の処理をすることで分離媒体を詰め替えることが可能な新しい分離・分析用の媒体を提供することができることを見出した。このような詰め替えは、分離媒体の劣化だけでなく、分析試料に応じた適切な分離媒体の選択において重要である。特にキャピラリー電気泳動におけるキャピラリー中の分離媒体の交換を極めて容易にするものである。【００１１】
即ち、本発明は、疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性化合物の水中での加熱溶解と冷却によって製造することができる長尺状の自己集合体を含有してなる電気泳動のための分離・分析用充填材組成物に関する。
また、本発明は、疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性化合物と水を混合し、これを水中で加熱溶解し、次いで冷却することからなる長尺状の自己集合体を含有してなる電気泳動のための分離・分析用充填材組成物を製造する方法に関する。
さらに、本発明は、前記した本発明の電気泳動のための分離・分析用充填材組成物が充填された電気泳動用の分離媒体の容器、好ましくはキャピラリー、及び当該分離媒体の容器、好ましくはキャピラリーを有することを特徴とする電気泳動装置に関する。
また、本発明は、前記した本発明の電気泳動のための分離・分析用充填材組成物が充填された電気泳動用の分離媒体の容器、好ましくはキャピラリーを用いて試料を電気泳動により分離・分析する方法に関する。
さらに、本発明は、キャピラリー電気泳動において、キャピラリー中の劣化した分離・分析用充填材組成物が充填されているキャピラリーカラムを加熱して、分離・分析用充填材組成物を流動性のゾル又は分子分散状態まで再溶解し、これを吸引又は加圧することによりキャピラリーカラム内の溶液化された劣化後の分離・分析用充填材組成物を除去し、次いで新しい分離・分析用充填材組成物を当該キャピラリーカラムに充填することからなる、キャピラリーカラムの分離・分析用充填材組成物を交換する方法に関する。【００１２】
本発明は、さらに次に示す１〜５の事項を特徴とするものである。
１．電気泳動分析、たとえばキャピラリー電気泳動やスラブゲル電気泳動の分離媒体として用いるための、長尺状の自己集合体、及びその製造方法。特に疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性化合物の水中での加熱溶解、その後の冷却によって得られる、長尺状の自己集合体。
２．上記１の長尺状自己集合体の架橋構造に基づく、電気泳動分析の分離媒体用ヒドロゲル状組織、及びその製造方法
３．上記２の長尺状の自己集合体あるいはそれからなるヒドロゲル状分離媒体の充填材、及びその交換方法。
４．さらには、分離媒体の劣化時には、まずキャピラリーを再度加熱して、上記ヒドロゲルを分子分散状態まで再溶解する。つぎにこれをポンプなどで吸引または加圧することでキャピラリー内の溶液を新しい分離媒体の溶液とすみやかに入れ替える、最後にこれを冷却することで新しい分離媒体を充填する。このような分離媒体の交換方法。
５．上記の１〜４の分離媒体を組み込んだキャピラリーに対してタンパク、核酸、または脂質などを導入した後、電気泳動を行うことを特徴とする分析方法。【００１３】
本発明は、電気泳動の分離媒体として用いるための、疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性化合物の水中での加熱溶解と冷却によって得られる長尺状の自己集合体の使用、及びその製造方法を提供するものである。
即ち、本発明で用いる両親媒性化合物は、その自己集合によって得られた軸比の高い極微細繊維、テープ、らせん状テープやチューブ構造などの微細構造によってネットワーク状の媒体をつくり、篩いとしての役割を果たさせるものであり、この点が従来のＳＤＳなどとの本質的な相違点である。
本発明の電気泳動のための分離・分析用充填材組成物は、疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性化合物によって得られる長尺状の自己集合体、及び分離・分析用充填材用の担体を含有してなるものである。
本発明における電気泳動としては、電気により試料の大きさ、重さ、形状、電荷の種類とその密度などの性質により泳動させることができ、そして、試料の有する性質に基づいて分離又は分析することができる方法であれば特に制限はないが、好ましくはキャピラリーを用いる電気泳動法が好ましい。本発明の好ましい電気泳動法としては、例えば、キャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、キャピラリー等電点電気泳動、キャピラリー等速電気泳動、ミセル動電クロマトグラフィー、キャピラリーゲル電気泳動、ＳＤＳキャピラリーゲル電気泳動、スラブ電気泳動法、デスクゲル電気泳動法、SDS-PAGE法、Native-PAGE法、等電点電気泳動（焦点電気泳動）、免疫電気泳動法などが挙げられる。
また、本発明の電気泳動法としては、通常の電気泳動法にさらにブロッティング操作などの方法を必要に応じて併用されるものも包含している。【００１４】
次に、本発明に従い両親媒性化合物の水中での自己集合によって得られた分離媒体を用いたキャピラリー電気泳動分析をするための好ましい態様について説明する。
本発明の電気泳動のための分離・分析用充填材組成物は、疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性化合物の水中での加熱溶解と冷却によって製造することができる長尺状の自己集合体を含有してなることを特徴とするものである。また、本発明は、疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性化合物の水中での加熱溶解と冷却によって製造することができる長尺状の自己集合体の電気泳動の分離・分析用の充填材又は媒体としての使用を提供するものである。
本発明における長尺状の自己集合体とは、分子間結合力とその空間的な方向性（異方性という）を増すような官能基が導入された両親媒性化合物により、幅３ｎｍ〜５００μｍ、長さ１００ｎｍ〜数ｍｍの軸比の高い極微細繊維、テープ、およびこれらがねじれた形態に変化したらせん状テープや、外径２０ｎｍ〜数十μｍ、長さ１００ｎｍ〜数ｍｍのチューブなどの微細構造を持つ長尺状構造体（非特許文献７、８参照）のことをいう。このような構造は、ＳＤＳなどが形成する球状のミセルや、天然由来のリン脂質から形成される球状の分子集合体とは基本的に相違するものである。
本発明の疎水部と親水部をもつ低分子の両親媒性化合物としては、水中での加熱溶解と冷却により長尺状の自己集合体を形成することができる疎水部と親水部をもつ両親媒性化合物であれば特に制限はないが、好ましくは比較的長鎖の両親媒性の脂質が挙げられ、例えば、チミジル酸、糖、ペプチド、リン酸、ピリジニウム基、カルボキシル基、アンモニウム基、リン酸アンモニウム基などが、疎水部である鎖状、分岐状、環状の炭化水素、フッ化炭素鎖などに片端あるいは両端で連結された脂質が例示できる。このうち、後者の疎水部の両端が連結された両親媒性脂質を双頭型脂質と呼ぶ。
本発明の両親媒性化合物における「低分子」とは、モノマーを重合させて多数の繰り返し単位を有する高分子量の重合体以外の化合物と定義されるものであり、例えば、分子量が５００００以下、好ましくは３００００以下、２００００以下、１００００以下、又は５０００以下のものであり、分子中にモノマーの繰り返し単位が５０以上、好ましくは４０以上の繰り返しが無い分子をいう。
このような低分子の両親媒性化合物としては、例えば、非特許文献７又は８に記載されているような物質をあげることができる。非特許文献７及び８の記載を参考のために本明細書に取り入れる。【００１５】
本発明の低分子の両親媒性化合物として好ましい化合物を例示すれば以下に示す化合物が挙げられるが、これらの例示される化合物に限定されるものではない。
次の一般式（１）
Ｇ−ＮＨＣＯ−Ｒ          （１）
（式中、Ｇはグルコピラノース、ガラクトピラノース、マルトース、ラクトース、セルビオースなどの糖のアノマー炭素原子に結合するヘミアセタール水酸基を除いた糖残基を表し、Ｒは炭素数が１０〜３９の不飽和炭化水素基を表す。）
で表されるＮ−グリコシド型脂質（特開２００４−２２４７１７号参照）。
このような化合物の具体例としては、例えば、次の一般式（２）、一般式（３）、一般式（４）、又は一般式（５）【００１６】
【化１】
0004706026.tif 000002
【００１７】
【化２】
0004706026.tif 000003
【００１８】
【化３】
0004706026.tif 000004
【００１９】
【化４】
0004706026.tif 000005
【００２０】
などの化合物、及びこれらの混合物が挙げられる。
これらのＮ−グリコシド型脂質の類似した化合物としては、飽和の側鎖を持った次の一般式（６）【００２１】
【化５】
0004706026.tif 000006
【００２２】
で表されるグリコリピッド類（T. Shimizu et al., Langmuir., 2005, 21, 743-750参照）などが挙げられる。【００２３】
次の一般式（７）
Ｘ１−Ｏ−Ｐｈ−Ｒ          （７）
（式中、Ｘ１はグリコシル基、又は２〜２９個、好ましくは２〜５個の単糖が結合したオリゴ糖残基を表し、Ｒは前記一般式（１）と同様の炭素数が１０〜３９、好ましくは１４〜１６の不飽和炭化水素基を表し、Ｐｈはベンゼン環を表し、当該ベンゼン環における基Ｘ１−Ｏ−と基Ｒ−との置換位置は任意であるが、好ましくはメタ位であることを表す。）
で表される構造を有するＯ−グリコシド型糖脂質（脂質の製造方法は特開２００１−２６１６９３号、集合体は特開２００３−２５２８９３号、その製造方法は特開２００３−２５９８９３号参照）。【００２４】
次の一般式（８）
Ａ−Ｐｈ−ＮＨＣＯ−Ｒ１        （８）
（式中、Ａはグルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、キシロースなどの糖の残基を表し、Ｒ１は炭素数６〜２０、好ましくは１０〜２０の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基を表し、Ｐｈはベンゼン環を表し、当該ベンゼン環における基Ａ−と基−ＮＨＣＯ−Ｒ１との置換位置は任意であるが、好ましくはパラ位であることを表す。）
で表される糖脂質（特開２００３−４９１５４号参照）。
このような一般式（８）で表される糖脂質をさらに具体的に例示すれば、次の一般式（９）及び一般式（１０）【００２５】
【化６】
0004706026.tif 000007
【００２６】
【化７】
0004706026.tif 000008
【００２７】
（式中、Ｒ２は、炭素数６〜２０，好ましくは１０〜２０の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状の飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基を示す。）
で表される化合物などが挙げられる。一般式（９）における−ＮＨＣＯ−Ｒ２基の具体例としては、例えば次に示すような基が挙げられる（T.Shimizu, et al., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 10675参照）。【００２８】
【化８】
0004706026.tif 000009
【００２９】
【化９】
0004706026.tif 000010
【００３０】
【化１０】
0004706026.tif 000011
【００３１】
【化１１】
0004706026.tif 000012
【００３２】
また、これらの化合物に類似した、Ｎ−アシル化−Ｏ−グリコシル化−アミノフェノールの誘導体としては、次の一般式（１１）又は一般式（１２）、【００３３】
【化１２】
0004706026.tif 000013
【００３４】
【化１３】
0004706026.tif 000014
【００３５】
（式中、Ｒ３は、炭素数４〜１５，好ましくは６〜１２の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキレン基を示す。）
で表される糖−アミノフェノール誘導体（T. Shimizu et al., Chem. Eur. J., 2002, 8, 160参照）などが挙げられる。さらに、アゾベンゼン誘導体の例としては次の一般式（１３）、【００３６】
【化１４】
0004706026.tif 000015
【００３７】
で表されるアゾベンゼン誘導体（S. Shinkai et al., Org. Lett. 2002, 4, 1423-1426参照）が挙げられる。【００３８】
次の一般式（１４）
Ｇ１−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ          （１４）
（式中、Ｇ１は還元性末端水酸基を除いたアルドース残基を表し、ｎは６〜２０の整数を表す。）
で表されるカルボキシル基を有する非対称双頭型糖脂質（特開２００２−３２２１９０号、特開２００１−２６１６９０号、T. Shimizu et al. Lamgmuir 2004, 20, 5969-5977.参照）。これらのアルドース残基における水酸基は遊離であってもよいが、一部又は全部の水酸基がアセチル基、ベンジル基、イソプロピル基、メチレン基、ベンジリデン基などの糖類合成法における慣用的な保護基で保護されていてもよい。【００３９】
次の一般式（１５）
Ｇ２−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＮＨ−Ｇ３              （１５）
（式中、Ｇ２及びＧ３はそれぞれ独立して、例えばグルコピラノシル基やＤ−ガラクトピラノシル基などの、アルドピラノースの還元末端水酸基を除いた残基を表し、ｍは６〜１８の整数を表す。）
で表される両端に糖残基を有する双頭型脂質（特開平９−１４３１９２号参照）。より具体的には、次の一般式（１６）【００４０】
【化１５】
0004706026.tif 000016
【００４１】
（式中、ｍは、６〜１８，好ましくは６〜１２の整数を示す。）
で表される双頭型糖脂質（特開平９−１４３１９２号、 T. Shimizu et al.J.Am.Chem.Soc. 1997, 119, 2812-2818. , 参照）が挙げられる。
次の一般式（１７）【００４２】
【化１６】
0004706026.tif 000017
【００４３】
（式中、Ｇ４及びＧ５はそれぞれ独立して、アルドピラノースの還元末端水酸基を除いた残基またはその中の水酸基の少なくとも一部が保護されたものを表し、ｘ及びｙはそれぞれ独立して３〜１６の整数を表す。）
で表される重合性双頭型糖脂質（特開平１１−２５５７９１号参照）。【００４４】
次の一般式（１８）のＤ−ガラクトース誘導体、一般式（１９）のＬ−ガラクトース誘導体、一般式（２０）のＤ−マンノース誘導体、一般式（２１）のＬ−マンノース誘導体、一般式（２２）のＤ−グルコース誘導体、一般式（２３）のＬ−グルコース誘導体、及び一般式（２４）のＤ−タロース誘導体、【００４５】
【化１７】
0004706026.tif 000018
【００４６】
【化１８】
0004706026.tif 000019
【００４７】
【化１９】
0004706026.tif 000020
【００４８】
【化２０】
0004706026.tif 000021
【００４９】
【化２１】
0004706026.tif 000022
【００５０】
【化２２】
0004706026.tif 000023
【００５１】
【化２３】
0004706026.tif 000024
【００５２】
（式中、Ｒ４は、炭素数６〜１５，好ましくは８〜１２の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基、又は炭素数８〜１５の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキニル基、好ましくは次式【００５３】
【化２４】
0004706026.tif 000025
【００５４】
（式中、ｐは１〜５の整数を示し、ｑは２〜５の整数を示す。）で表されるアルキニル基を示す。）
で表されるＮ−炭化水素化アミノ糖型化合物（飽和炭化水素型疎水部のものは、J.-H. Fuhrhop et al. J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 2861-2867参照、ジアセチレン型疎水部のものは、J.-H. Fuhrhop et al. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 7437-7439、 D.F.O’Brien et al. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 7436-7437、及び D.F.O’Brien et al. J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 10057-10069,参照）。
次の一般式（２５）【００５５】
【化２５】
0004706026.tif 000026
【００５６】
（式中、Ｒ５は、炭素数１〜１５，好ましくは１〜９の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基を示し、Ｒ６は水素原子、水酸基、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、又は−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２を示す。）
で表されるアミドカルボン酸型化合物（J.-H. Fuhrhop et al. Langmuir 2001, 17, 873-877参照）。
次の一般式（２６）【００５７】
【化２６】
0004706026.tif 000027
【００５８】
（式中、Ｒ７は、炭素数３〜１５，好ましくは３〜６の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基を示し、Ｒ８は炭素数１〜１０，好ましくは１〜４の直鎖状又は分枝状のアルキル基、又はベンジル基を示す。）
で表される尿素カルボン酸型化合物（A.D. Hamilton, Chem.Comm. 2003, 310-311参照）。
次の一般式（２７）【００５９】
【化２７】
0004706026.tif 000028
【００６０】
で表されるフッ素化グルコホスホリピッド（M.-P. Krafft et al., Chem. Eur. J. 1996, 2, 1335-1339参照）。
次の一般式（２８）【００６１】
【化２８】
0004706026.tif 000029
【００６２】
（式中、Ｒ９は、炭素数１〜５，好ましくは１〜３の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基を示し、ｋは６〜１０，好ましくは８〜１０の整数を示し、ｌは８〜１５、好ましくは１０〜１２の整数を示す。）
で表されるピリジニウム化合物（K. Hanabusa, Chem. Eur. J. 2003, 9, 348-354参照）。
次の一般式（２９）【００６３】
【化２９】
0004706026.tif 000030
【００６４】
（式中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２及びＲ１３は、それぞれ独立して水素原子、又はアミノ酸の側鎖の残基を示し、好ましくはメチル基（つまりアラニン）、イソプロピル基（つまりバリン）、ブチル基（つまりロイシン）、又はイソブチル基（つまりイソロイシン）を示すが、これらの４種のアミノ酸以外にグリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、リジン、ヒドロキシリジン、アルギニン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、プロリン、ヒドロキシプロリン、βアラニン、及びアラニンイソブチル酸からなる群から選ばれる１種又は２種以上のアミノ酸を形成する残基であってもよい。ｒは４〜２４，好ましくは７〜１８の整数を示す。）
で表される双頭型ぺプチド脂質。
一般式（２９）で表される双頭型ペプチド脂質において、好ましくはＲ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３としては、これらの基がイソプロピル基である場合（即ち、Ｖａｌ−Ｖａｌ）、若しくはイソブチル基である場合（即ち、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ）、Ｒ１０、Ｒ１３がイソプロピル基でＲ１１、Ｒ１２がイソブチル基ある場合（即ち、Ｖａｌ−Ｉｌｅ又はこの逆）、Ｒ１０、Ｒ１３がイソブチル基でＲ１１、Ｒ１２がイソプロピル基である場合（即ち、Ｉｌｅ−Ｖａｌ又はこの逆）、Ｒ１０、Ｒ１３、がイソブチル基でＲ１１、Ｒ１２が−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３である場合（即ち、Ｉｌｅ−Ｍｅｔ又はこの逆）、又はＲ１０、Ｒ１３が−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３でＲ１１、Ｒ１２がイソブチル基である場合（即ち、Ｍｅｔ−Ｉｌｅ又はこの逆）などが挙げられる。これらのアミノ酸は、ラセミ体でも、Ｄ体又はＬ体の光学活性体であってもよい。全てのアミノ酸がＤ体又はＬ体の光学活性体であるものが好ましい。
さらに、一般式（２９）で表される双頭型ペプチド脂質は、次の一般式（３０）又は一般式（３１）【００６５】
【化３０】
0004706026.tif 000031
【００６６】
【化３１】
0004706026.tif 000032
【００６７】
（式中、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、及びｒは前記の一般式（２９）と同じものを示し、Ｒ１４及びＲ１５はそれぞれ独立して前記Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、又はＲ１３と同じものを示す。）
で表されるトリペプチド型の双頭型ペプチド脂質であってもよい。一般式（３０）又は一般式（３１）で表される双頭型ペプチド脂質におけるトリペプチド部分におけるトリペプチド部分のアミノ酸配列としては、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ、Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ、又はこれらの逆の配列などが好ましい。これらのアミノ酸もラセミ体、光学活性体のいずれであってもよいが、好ましくはすべてのアミノ酸がＤ体又はＬ体の光学活性体であるものが挙げられる。これらの双頭型ペプチド脂質については、清水らの文献（T. Shimizu et al., Chem. Commun, 1998, 1791.）、及び特許第３０１２９３２号を参照されたい。
次の一般式（３２）【００６８】
【化３２】
0004706026.tif 000033
【００６９】
（式中、ｓは１２〜２４，好ましくは１８〜２０の整数を示す。）
で表されるデオキシリボース型化合物（R.Iwaura et al. Chem. Mater. 2002, 14, 3047.及び特開２００３−５５６４２号参照）。
次の一般式（３３）【００７０】
【化３３】
0004706026.tif 000034
【００７１】
で表されるジアセチレン化合物（R.C. Stevens, J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, 3205-3213参照）。
次の一般式（３４）【００７２】
【化３４】
0004706026.tif 000035
【００７３】
で表されるホスホアンモニウム化合物（F.M. Menger et al., J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 12408-12409参照）。
次の一般式（３５）【００７４】
【化３５】
0004706026.tif 000036
【００７５】
（式中、２Ｘ−は、式【００７６】
【化３６】
0004706026.tif 000037
【００７７】
で表される酒石酸塩、その鏡像体、メソ体、又は２個の臭素イオンを示す。）
で表されるエチレンジアンモニウム化合物（I. Huc et al., Angew. Chem., Int. Ed. 1998, 37, 2689-2691.参照）。
次の一般式（３６）【００７８】
【化３７】
0004706026.tif 000038
【００７９】
（式中、Ｒ１６は、水素原子又はニトロ基を示す。）
で表される糖ヘミアセタール化誘導体（S. Shinkai et al., Chem. Eur. J. 1999, 5, 2722-2728参照）。
次の一般式（３７）【００８０】
【化３８】
0004706026.tif 000039
【００８１】
（式中、Ｒ１７及びＲ１８は、それぞれ独立して、炭素数６〜１０，好ましくは６〜８の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基、又はシクロペンチルメチル基若しくはシクロヘキシルメチル基を示し、ｔは０〜３、好ましくは０〜１の整数を示す。）
で表されるグリコシル化アミノ酸誘導体（I. Hamachi et al., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 10954-10955参照）。
次の一般式（３８）【００８２】
【化３９】
0004706026.tif 000040
【００８３】
（式中、ａはそれぞれ独立して３〜１５、好ましくは７〜１４の整数を示し、ｂは４〜１５、好ましくは４〜１２の整数を示す。）
で表される尿素型長鎖アルキルエステル系化合物（A.D. Hamilton, et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2000, 39, 3448.参照）。
次の一般式（３９）、一般式（４０）、一般式（４１）、又は一般式（４２）【００８４】
【化４０】
0004706026.tif 000041
【００８５】
【化４１】
0004706026.tif 000042
【００８６】
【化４２】
0004706026.tif 000043
【００８７】
【化４３】
0004706026.tif 000044
【００８８】
で表される長鎖フェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（T. Shimizu, et al., Adv. Mater., 2001, 13, 715-718.参照）、又はこれらの化合物の混合物。
次の一般式（４３）【００８９】
【化４４】
0004706026.tif 000045
【００９０】
（式中、ｄは２２〜４０の整数を示す。）
で表される両端に極性のあるホスホコリンを有する化合物（A. Blume, et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2004, 43, 245-247.参照）。
次の一般式（４４）【００９１】
【化４５】
0004706026.tif 000046
【００９２】
で表される尿素ジカルボン酸半エステル誘導体（A.D. Hamilton et al., Chem. Commun. 2003-2958-2959参照）。
次の一般式（４５）【００９３】
【化４６】
0004706026.tif 000047
【００９４】
（式中、Ｒ１９は、炭素数８〜１５，好ましくは１０〜１２の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基、又は炭素数８〜１５，好ましくは１０〜１２の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のフッ素化アルキル基を示す。好ましいＲ１９としては、−Ｃ１０Ｈ２１、又はＣ８Ｆ１７−Ｃ２Ｈ４−基が挙げられる。）
で表されるジモルホリノホスホルアミデート誘導体（Angew. Chem. Int. Ed., 1994, 33, 1514参照）。
次の一般式（４６）【００９５】
【化４７】
0004706026.tif 000048
【００９６】
（式中、Ｒ２０は、炭素数８〜１５，好ましくは１０〜１５の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基、又は炭素数８〜１５，好ましくは１０〜１５の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のフッ素化アルキル基を示す。好ましいＲ２０としては、−Ｃ１０Ｈ２１、−Ｃ１５Ｈ３１、又はＣ８Ｆ１７−Ｃ２Ｈ４−基が挙げられる。）
で表されるホスホコリン誘導体（M.-P.Krafft, et al., Angew. Chem. Int. Ed., 1994, 33, 1514.参照）。
次の一般式（４７）【００９７】
【化４８】
0004706026.tif 000049
【００９８】
（式中、Ｒ２１は、ｎ−ブチル基、４−ブロモベンジル基、又はメタクリルオキシエチル基を示し、Ｒ２２は、炭素数１〜４の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基を示す。）
で表される尿素ヒドロキシカルボン酸エステル誘導体（A.D. Hamilton, Chem. Commun. 2003, 310-311.参照）。
次の一般式（４８）【００９９】
【化４９】
0004706026.tif 000050
【０１００】
で表されるジアセチレン基を含有するグリセライド誘導体（P.Yager，et  al., Mol.Cryst.Liq.Cryst., 1984, 106, 371-381. J.M. Schnur, Science, 1993, 262, 1669-1676.参照）。
次の一般式（４９）【０１０１】
【化５０】
0004706026.tif 000051
【０１０２】
で表されるリジンの長鎖アミド誘導体。
次の一般式（５０）【０１０３】
【化５１】
0004706026.tif 000052
【０１０４】
で表されるトリスメチオニンシクロヘキサン誘導体（B.L. Feringa et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 14252-14253.参照）。
次の一般式（５１）【０１０５】
【化５２】
0004706026.tif 000053
【０１０６】
（式中、Ｘは、それぞれ独立して、−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＯＨ基、又は−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＯＨ基を示す。）
で表されるトリスフェニルアラニンシクロヘキサン誘導体（B.L. Feringa, et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 14252-14253.参照）。
次の一般式（５２）【０１０７】
【化５３】
0004706026.tif 000054
【０１０８】
で表されるリトコール酸（Y. Talmon et al., Langmuir, 2002, 18, 7240-7244.参照）。
次の一般式（５３）【０１０９】
【化５４】
0004706026.tif 000055
【０１１０】
（式中、Ｒ２３は、炭素数４〜２４、好ましくは７〜１８の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基を示し、ｆは１〜３の整数を示す。）
で表されるポリグリシン誘導体、又はそのナトリウム塩（特願２００３−０３９２７６号参照）。
次の一般式（５４）【０１１１】
【化５５】
0004706026.tif 000056
【０１１２】
（式中、Ｒ２４は、炭素数４〜２４、好ましくは７〜１８の直鎖状又は分枝状、好ましくは直鎖状のアルキル基を示し、ｇは１〜３の整数を示す。）
で表されるポリグリシン誘導体、又はその塩酸塩。
次の一般式（５５）【０１１３】
【化５６】
0004706026.tif 000057
【０１１４】
(式中、Ｇ６はアルドピラノースの還元末端水酸基を除いた残基、好ましくはＤ−グルコピラノシル基又はＬ−グルコピラノシル基を表し、Ｚは水素原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、又はアミノエチルカルバモイル基を表し、Ｒ２５及びＲ２６はそれぞれ独立して炭素数が０〜２０の２価の炭化水素基、好ましくは炭素数が０〜２０のポリメチレン基を表す。）で表わされる重合性双頭型糖脂質。【０１１５】
また、オレイン酸ナトリウム塩やドデシルトリメチルアンモニウムクロライドのようなイオン性界面活性剤、オクタエチレングリコールテトラデシルエーテル、ドデシルジメチルアミンオキシドなどの非イオン性界面活性剤、パルミトイルリソホスファチジルコリン、オレオイルリソホスファチジルコリン、リノレオイルリソホスファチジルコリンなどのリン脂質（双性イオン性）なども挙げられる。【０１１６】
本発明の電気泳動のための分離・分析用充填材組成物は、前記した本発明の両親媒性化合物からなる長尺状の自己集合体を含有するものであれば特に制限はない。また、この長尺状の自己集合体を含む分離分析用充填剤組成物、あるいはそのヒドロゲル状化物は以下の様な高分子化合物を混合物として含有していてもよい。このような高分子化合物としては、例えば、数平均分子量が１０，０００〜１，０００，０００、好ましくは１０，０００〜５００，０００のヒドロキシエチルセルロース、数平均分子量が１０，０００〜１，０００，０００、好ましくは１０，０００〜５００，０００のヒドロキシプロピルセルロース、数平均分子量が１０，０００〜１，０００，０００、好ましくは１０，０００〜５００，０００のポリアクリルアミドなどが挙げられる。これらの分離媒体及び上記高分子混合物は、水溶液として０．０１％〜３０％、好ましくは０．１〜２０％、より好ましくは０．１〜１０％程度の濃度で用いられる。
したがって、本発明は、前記した本発明の両親媒性化合物からなる長尺状の自己集合体を含有してなる分離媒体、又はそれらの物理的な架橋構造によって形成されることを特徴とする分離媒体用ヒドロゲル状分離媒体からなる分離・分析用充填材組成物を提供するものである。さらに、本発明は、当該長尺状の自己集合体やヒドロゲルが、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びポリアクリルアミドなどの篩いを含有する充填材組成物を提供するものである。【０１１７】
本発明の長尺状の自己集合体を製造する方法としては、通常は、本発明の長尺状の自己集合体の構造を形成する両親媒性化合物を、水などの溶媒に溶解し、必要に応じて撹拌、脱気した後、加熱してゾル化し、これを冷却することにより製造することができる。使用される両親媒性化合物によっては、前記した加熱処理に代えて、ｐＨの調節や、紫外線などの光の照射などの処理によりゾル化する場合もある。本発明の両親媒性化合物の濃度としては、０．１〜３０ｗｔ％、好ましくは０．１〜２０ｗｔ％、０．１〜１５ｗｔ％程度が挙げられる。使用される溶媒としては、ｐＨの調整された水が挙げられ、より好ましくは各種の緩衝液が挙げられる。好ましい緩衝液としては、ｐＨ８のＴＥバッファー（10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA）、pH2.5〜7.5リン酸バッファー、ホウ酸バッファー、2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid(HEPES),N-tris(hydoroxymethyl)methyl-e-aminoethanesulfonic acid(TES), Tris-HCl-グリシンバッファー、トリス−リン酸緩衝液、あるいはこれらの混合物などが挙げられる。より好ましい緩衝液としてはｐＨ８のＴＥバッファー（10mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM EDTA）が挙げられる。
ゲルを調整する水溶液のｐＨとしては特に制限はなく、使用する両親媒性化合物によるが、ｐＨ１〜１０、好ましくはｐＨ２〜１０程度であればいずれでもよい。
また、添加剤として、必要によりメタノール、エタノール、アセトニトリル、ＴＨＦ、ジオキサンなどを０〜５０％ほど含んでいてもよい。【０１１８】
本発明の分離・分析用組成物の自己集合体の調製方法をより詳細に説明すれば、両親媒性化合物の溶液を室温で超音波処理してよく脱気した後、ゾル状になるまで加熱し、具体的には５０℃〜１００℃に加熱して完全にゾル状態にする。これを、分離媒体の容器に入れゲル化させる。分離媒体の容器としてキャピラリーを用いる場合には、これをシリンジまたはキャピラリー電気泳動装置の試料導入装置に、吸引又は加圧などにより、必要により後述する前処理を行ったキャピラリーに導入した後、このキャピラリー全体を空冷、あるいは電気泳動装置に付属しているキャピラリーの温度制御装置を用いて冷却し、長尺状自己集合体からなる分離媒体用ヒドロゲル組織を製造することができる。
本願の分離媒体の容器としては、電気泳動における分離媒体としてのゲルを収納できる容器であれば特に制限はなく、具体的には、例えば、スラブゲルを入れる容器、キャピラリー電気泳動などにおけるキャピラリーなどが挙げられる。
本願の分離媒体の容器としてキャピラリーを用いる場合のキャピラリーの内径としては約５００nm〜３mmのものが使えるが、分離能とサンプル量などの点から約50μm〜100μmのものがもっとも良い。長さは、試料によって異なるが、２cm〜３mであることが望ましい。キャピラリーの材質はパイレックス（登録商標）ガラス、フューズドシリカ（溶融石英）、テフロン（登録商標）のいずれでもよいが、フューズドシリカが好適である。上記ガラスまたはシリカの場合には強度と柔軟性をもたせるために外壁をポリイミドで覆っていてもよいし、いなくても良い。
キャピラリーの前処理として、分離・分析用充填材組成物の充填の前に、以下のような操作を行うことが好ましい。例えば、あらかじめ内壁をクロロホルムやメタノールなどの溶媒で洗浄し、付着している有機物を除去する。そしてさらに強酸ついで強アルカリで洗浄し、内壁の無機物を除くと共に、表面をシラノール基に変える。その後、シランカップリング剤である(3-メタクリオキシプロピルトリメトキシシラン、3-methacryloxypropyltrimethoxysilane)で表面処理し、続いてアクリルアミドを導入してグラフト重合したもの（非架橋ポリアクリルアミドで内壁処理した物）を用いる。
両親媒性化合物の熱水溶液を充填したキャピラリーの冷却は、空冷による急冷でもよいが約２０℃／秒〜０．１℃／分まで変化させてもよい。【０１１９】
このようにして得られた分離媒体を用いたキャピラリー電気泳動は、例えば、以下のようにして行える。まず分離媒体を充填した長さ３０ｃｍのキャピラリーをキャピラリー電気泳動装置に装着し、温度を５℃〜５０℃、好ましくは約２０℃前後にすることが望ましい。試料としては、DNA、RNA、タンパクなどが測定可能であるが、DNA、タンパクが望ましい。特にタンパクの場合、SDSなどであらかじめ変性させておくことが好適である。また電気泳動に用いる溶媒は、長尺状自己集合構造やそのヒドロゲルを形成したときの溶媒と同一であることが望ましい。とくにDNAの分離においては前述のTEバッファーが最適である。
分離の前に、試料をキャピラリーに導入する時は、電気泳動、吸引、加圧のいずれでも良いが、分離媒体であるヒドロゲルや高分子溶液がキャピラリーから侵出するのを防ぐため、キャピラリーの両側の受容相と供給層は５psi程度加圧しながら電圧の印可によって導入することが最適である。試料をキャピラリーに導入した後に、電気泳動を行うが、印可電圧はキャピラリーの長さによって変化するが、５０V/cm〜５００V/cmであることが望ましい。
検出はDNAの場合は２５４nmあるいは２３４nmの吸収をモニターして行う。またサンプルが微量の場合には、試料を蛍光ラベル化して蛍光により検出することも可能である。
ゲルが劣化して分離能が低下したり、経時変化が著しいとき、また篩に試料やゴミなどが詰まって圧力が高まったときは以下のようにして簡単に分離媒体を交換することが可能である。まずキャピラリー全体を５０℃〜１００℃まで加熱してゾル状態にもどす。次にこの温度を保持したまま、このゾルを供給漕側の加圧、あるいは受容漕側の吸引によりキャピラリー外部に取り出す。同時に、５０℃〜１００℃まで加熱してある新しい分離媒体溶液を同様に供給漕側の加圧、あるいは受容漕側の吸引によりキャピラリー内部に充填する。この後に、キャピラリーを、空冷による急冷あるいは約２０℃／秒〜０．１℃／分の範囲で徐例して新たな分離媒体を装着したキャピラリーを得る。【０１２０】
本発明の分離・分析用充填材組成物は、加熱やｐＨの調整などにより流動性のあるゾル状にすることで、キャピラリーを取り外すことなく分離媒体のみの交換を可能にすることを特徴とするものである。したがって、本発明の分離・分析用充填材組成物を使用することにより、キャピラリーを取り外すことなくキャピラリーは半永久的に使用することができるようになる。
この交換は、キャピラリー電気泳動装置のキャピラリー恒温装置に０℃〜１００℃まで温度を変えられるプログラムを装着し、さらに温度制御可能な加熱装置を装着したサンプルトレイにゾル溶液を装備することで、コンピューターによる制御装置と連動させて完全無人化しておこなうこともできる。
【発明の効果】
【０１２１】
本発明は、可逆的、かつ容易に充填可能な両親媒性化合物の自己集合によってできる長尺状構造、およびその物理的な架橋構造によるヒドロゲル分離媒体を電気泳動、特にはキャピラリー電気泳動での分離媒体として用い、安価で、再現性が高く、分離媒体の交換が容易な電気泳動法、例えば、キャピラリー電気泳動法を提供するものである。
本発明の分離媒体のための親水部と疎水部を持つ分子の自己集合によって形成される長尺状構造を、あるいはそれからなるヒドロゲル状組織を充填したキャピラリーカラムは、高理論段数を持ち、従来の充填剤に比べて極めてシャープな分離能を有しており、しかも長期間にわたって安定である。また、前述してきたように長尺状構造の自己集合を行うことができる両親媒性化合物としては、多種多様のものが知られており、分析する試料や分析の目的に応じて、多種多様な両親媒性化合物の中から分析に適した両親媒性化合物を選択することもできる。さらに、本発明の分離・分析用充填材組成物は、加熱処理などによって再溶解するので、分離媒体が目詰まりなどで劣化した場合も、キャピラリーを取り外すことなく篩としての充填剤のみを詰め替えることも可能である。このため、この詰め替えによってキャピラリーは半永久的に使用することができる。また詰め替え時に濃度やそのヒドロゲルの原料となる両親媒性化合物の種類を変えることで、篩の網目の大きさや形を試料の種類や分子量に対して調節可能である。
また、これらの長尺状構造が架橋していない場合（ヒドロゲルを形成しない場合）にもこれまでの鎖状高分子溶液からなる分離媒体と同様に、交換が非常に簡単であること、また篩の形態やサイズ（つまり物理的な網目の大きさ）、堅さが冷却速度や溶媒、両親媒性化合物の濃度などによって制御できる。これらの特徴から、広い範囲の分子量をもつＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などの高分子はもとより糖鎖、ペプチド、脂質、および天然生理活性物質、アミノ酸などの低分子の高理論段数をもつ電気泳動法、例えばキャピラリー電気泳動分析に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１２２】
【図１】図１は、キャピラリー電気泳動装置の概略を示すものである。
【図２】図２は、キャピラリー内部をＴＥバッファーで満たし、ラダーＤＮＡ５０〜１０，０００ｂｐを分析したクロマトグラム（エレクトロフェログラム）を示すものである。
【図３】図３は、キャピラリー内部をゲルバッファーで満たし、ラダーＤＮＡ５０〜１０，０００ｂｐを分析したクロマトグラム（エレクトロフェログラム）を示すものである。
【図４】図４は、キャピラリー内部を本発明の分離・分析用充填材組成物の自己集合性ヒドロゲル０．５ｗｔ％で満たし、ラダーＤＮＡ５０〜１０，０００ｂｐを分析したクロマトグラム（エレクトロフェログラム）を示すものである。
【図５】図５は、キャピラリー内部を本発明の分離・分析用充填材組成物の自己集合性ヒドロゲル２ｗｔ％で満たし、ラダーＤＮＡ５０〜１０，０００ｂｐを分析したクロマトグラム（エレクトロフェログラム）を示すものである。
【図６】図６は、キャピラリー内部をＴＥバッファーで満たし、ラダーＤＮＡ５０〜８００ｂｐを分析したクロマトグラム（エレクトロフェログラム）を示すものである。
【図７】図７は、キャピラリー内部をゲルバッファーで満たし、ラダーＤＮＡ５０〜８００ｂｐを分析したクロマトグラム（エレクトロフェログラム）を示すものである。
【図８】図８は、キャピラリー内部を本発明の分離・分析用充填材組成物の自己集合性ヒドロゲル２ｗｔ％で満たし、ラダーＤＮＡ５０〜８００ｂｐを分析したクロマトグラム（エレクトロフェログラム）を示すものである。
【図９】図９は、図３で示したキャピラリー内部をゲルバッファーで満たし、ラダーＤＮＡ５０〜１０，０００ｂｐを分析したクロマトグラム（エレクトロフェログラム）（ａ）、及び図５で示したキャピラリー内部を本発明の分離・分析用充填材組成物の自己集合性ヒドロゲル２ｗｔ％で満たし、ラダーＤＮＡ５０〜１０，０００ｂｐを分析したクロマトグラム（エレクトロフェログラム）（ｂ）をまとめて示したものである。
【図１０】図１０は、実施例２で使用したスラブ電気泳動装置の概略を示すものである。
【図１１】図１１は、従来の４％ポリアクリルアミドゲルをスラブゲルとして用い、ラダーＤＮＡ（図中の番号１，２，３が２０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐのラダーに対応する）を電気泳動したクロマトグラム（エレクトロフェログラム）を示すものである。
【図１２】図１２は、４％ポリアクリルアミドゲルと０．００４％の本発明の化合物３５のＬ−酒石酸塩から成る長尺状の自己集合体を混合したものをスラブゲルとして用い、ラダーＤＮＡ（図中の番号１，２，３が２０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐのラダーに対応する）を電気泳動したクロマトグラム（エレクトロフェログラム）を示すものである。
【符号の説明】
【０１２３】
１    キャピラリーカラム
２    緩衝液容器
３    試料容器
４    緩衝液容器
５    紫外可視吸光検出器
６    直流電源
１１    図１０のゲル板
１２    図１０の緩衝液容器
１３    図１０の直流電源
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【０１２５】
（１）   自己集合性ヒドロゲルのキャピラリーへの充填
まず、ガラス容器に自己集合性の両親媒性化合物である次式【０１２６】
【化５７】
0004706026.tif 000058
【０１２７】
１，２０−３’−チミジル酸双頭型脂質（R.Iwaura et al. Chem. Mater. 2002, 14, 3047.、及び特開２００３−５５６４２号公報参照）（１０ｍｇ、０．０１ミリモル、または５ｍｇ、０．００５ミリモル）を量り、これにｐＨ値８のＴＥバッファー（和光純薬工業株式会社製、商品番号３１６−９００２５）０．５ｍＬを加え、ヒートガンで熱しながら溶解し、２ｗｔ％および０．５ｗｔ％の両親媒性化合物を含む溶液を調製した。この溶液を、０．４５ミクロンのメンブランフィルター（ゲルマンサイエンスジャパン社製、商品番号４４５７）で濾過した。
次に、上述の両親媒性化合物を含む溶液で温度が４０〜６０℃のものをキャピラリー電気泳動装置（ベックマンコールター社製、Ｐ/ＡＣＥシステムＭＤＱ）にセットし、１０ｐｓｉで３分間加圧することによって、内径７５ミクロン、長さ３０ｃｍのポリアクリルアミド被覆シリカゲルキャピラリー（ベックマン社製、商品番号４７７４７７）内へ充填した。この後、キャピラリー内部が乾燥しないように、両端を上述の両親媒性化合物を含む溶液に浸したまま、室温で３日間静置した。これによって、内径７５ミクロンのシリカゲルキャピラリー中に、両親媒性化合物の自己集合からなるヒドロゲルを得た。
上述のキャピラリー中には、幅１００ｎｍ程度の繊維状自己集合体が、三次元網目状に絡み合った構造で存在していることが、キャピラリー断面の電子顕微鏡観察によって確かめられた。【０１２８】
（２）   装置
上述の方法によって得られたヒドロゲル充填キャピラリーを、図１に示す電気泳動装置に取り付け、ＴＥバッファー、ｐＨ＝８の緩衝液を用いて、２０℃において１０ｋＶの印可電圧をかけてＤＮＡの検出を行った。なお、図１中、１はキャピラリーカラム、２は緩衝液容器、３は試料容器、４は緩衝液容器、５は紫外可視吸光検出器、６は直流電源であり、２〜４には電極が挿入される。試料を負荷する時は、試料容器３にキャピラリーカラム１と電極を移動し、６ｋＶ、１０秒間の電圧を印加した。また、ＤＮＡの分離においては、キャピラリーカラム１と電極を、緩衝液容器２および４に移動し、１０ｋＶの電圧を印加した。さらに、キャピラリー内部から自己集合性ヒドロゲルが浸出することを防ぐため、キャピラリーの両端から５ｐｓｉの圧力をかけた。ＤＮＡの検出は、紫外可視吸光検出器５によって２５４ｎｍの波長をモニターすることにより行った。【０１２９】
（３）   分析結果１
図２にキャピラリー内部をＴＥバッファーで満たした場合、図３にキャピラリー内部をゲルバッファー（ベックマン社製、商品番号４７７６２８）で満たした場合、図４にキャピラリー内部を０．５ｗｔ％の両親媒性化合物の濃度で自己集合によって得たヒドロゲル（以下０．５ｗｔ％のヒドロゲルと称する）を充填した場合、図５にキャピラリー内部を２ｗｔ％の両親媒性化合物の濃度で自己集合によって得たヒドロゲル（以下２ｗｔ％のヒドロゲルと称する）を充填した場合の、ラダーＤＮＡ（５０〜１０，０００ｂｐ、タカラバイオ社製、商品番号３４１５Ａ）分析結果を示す。図２〜５中、横軸は時間、縦軸は信号強度である。これらの分析結果より、図２と図４に示す、ＴＥバッファーのみで満たしたキャピラリーおよび０．５ｗｔ％のヒドロゲルを充填したキャピラリーではラダーＤＮＡはほとんど分離されていない。一方、図５に示す２ｗｔ％のヒドロゲルでは、ｒｔ＝５〜７分の付近に図３のゲルバッファーを満たしたキャピラリーと比較して非常に鋭いピークが得られた。
このように、本発明の分離・分析用充填材組成物では、加熱やｐＨの調整などにより交換可能であるだけでなく、長尺状の自己集合体という独特の構造をした篩いの作用を利用することにより、従来の分離・分析用充填材組成物に比べて非常にシャープな分離・分析が可能となる。【０１３０】
（４）   分析結果２
図６にキャピラリー内部をＴＥバッファーで満たした場合、図７にキャピラリー内部をゲルバッファー（ベックマン社製、商品番号４７７６２８）で満たした場合、図８にキャピラリー内部を自己集合性２ｗｔ％のヒドロゲルで満たした場合の、ラダーＤＮＡ（５０ｂｐ〜８００ｂｐ、インビトロジェン社製、商品番号１０４１６−０１４）分析結果を示す。これらの分析結果より、５０ｂｐから８００ｂｐの範囲で、図８に示すキャピラリー中での自己集合によって得たヒドロゲル分離媒体２ｗｔ％を用いてＤＮＡの分離が可能であることが示された。【０１３１】
（５）  理論段数の解析
前記した図３（ゲルバッファーで満たし、ラダーＤＮＡ５０〜１００００ｂｐを分析したエレクトロフェログラム）に示した結果と、図５（本発明の分離・分析用充填剤組成物で、化合物３２からなる自己集合体ヒドロゲル２ｗｔ％で満たし、ラダーＤＮＡ５０〜１００００ｂｐを分析したエレクトロフェログラム）に示した結果とを比較するために、これらをそれぞれ図９（ａ）及び（ｂ）として示す。そして、それぞれのピークを左側から図９に示されるように１〜６番の番号を付した。図９に示したそれぞれのピークに対する理論段数を計算した。理論段数は以下の式を用いて求めた。
理論段数  ＝  １６  ［ｔｒ  ／  Ｗ］２
ここに、ｔｒは泳動時間を示し、Ｗはピーク幅（半値幅の２倍）の値を示す。
この計算式により計算された各ピークにおける理論段数を次の表１に示す。【０１３２】
【表１】
0004706026.tif 000059
【０１３３】
表１に示されるようにピーク２〜５において、本発明の分離媒体は、従来のゲルバッファー（ベックマン社製、商品番号４７７６２８）（図９（ａ））よりも大きな理論段数を示し、本発明のヒドロゲル分離媒体によってよりシャープな分離分析が可能となることが示された。
【実施例２】
【０１３４】
自己集合性の化合物であるエタンジイル−１，  ２−ビス（ヘキサデシルジメチルアンモニウムブロミド）（化合物３５、（合成はI.Huc et al., Angew. Chem., Int. Ed. 1998, 37, 2689-2691.参照））（１９．９４ｍｇ、０．０３５２ｍｍｏｌ）と一当量のＬ−酒石酸（６．８２ｍｇ、０．０３５１ｍｍｏｌ）に、滅菌水４．９５８ｍＬを加え加熱溶解して、０．４ｗｔ％の化合物３５のＬ−酒石酸塩熱水溶液を調整した。
次に、４０％アクリルアミド／ビス溶液（ＢＩＯＲＡＤ社製、商品番号１６１−０１４６）１．５ｍＬ、０．５×ＴＢＥ緩衝液（ＢＩＯＲＡＤ社製、商品番号１６１−０７３３の１０×ＴＢＥを５０倍希釈したもの）３．９ｍＬ、滅菌水９．３７５ｍＬ、過硫酸アンモニウム（和光純薬工業株式会社製、商品番号０１８−０３２８２）０．１ｇを１ｍＬの滅菌水に溶解して得られた溶液０．０７５ｍＬを混合したゲル溶液に、上述した化合物３５のＬ−酒石酸塩から成る熱水溶液を９０−１００℃に保った状態で０．１５ｍＬ加えた。さらに、Ｎ，  Ｎ，  Ｎ’，  Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（和光純薬工業株式会社製、商品番号２０５−０６３１３）７．５ｍＬを加え、すばやくゲル板にゲル溶液を充填し、室温で一時間静置してゲルを形成した。
図１０に示すように、前記した方法によってゲルを充填したゲル板１１を、緩衝液容器１２、及び直流電源１３を備えた電気泳動装置に取り付け、泳動バッファーに０．５×ＴＢＥ緩衝液を用いて室温で８０Ｖの定電圧を印加してＤＮＡの分離を行った。泳動後、ゲルをエチジウムブロミド溶液（１０−４  ｍｇ／ｍＬ，０．５×ＴＢＥ緩衝液）に３０分間浸した後、紫外線照射装置を用いて紫外線を照射しＤＮＡのバンドを観測した。【０１３５】
分析結果
図１１に４％ポリアクリルアミドゲルと図１２に０．００４％の化合物３５のＬ−酒石酸塩から成る長尺状の自己集合体を含む４％ポリアクリルアミドゲルを用いて、７４０〜２０ｂｐのＤＮＡ分子の２０ｂｐ刻みの２０ｂｐＤＮＡラダー標準サンプル、１５００ｂｐ〜１００ｂｐのＤＮＡ分子の１００ｂｐ刻みの１００ｂｐＤＮＡラダー標準サンプル、又は５０００〜２００ｂｐのＤＮＡ分子の２００ｂｐ刻みの２００ｂｐＤＮＡラダー標準サンプルの３種類のラダーＤＮＡサンプル（タカラ社製、２０ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ商品番号３４０９Ａ、１００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ商品番号３４０７Ａ、２００ｂｐ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ商品番号３４１０Ａ）を、それぞれ分離した結果を示す。図１１，１２中の番号１，  ２，  ３がこの順で三種のラダーＤＮＡに対応する。長尺型自己集合体を含む４％ポリアクリルアミドゲルを用いて泳動した場合、ポリアクリルアミドゲルを用いた場合よりバンドの幅が狭くなっており、特に２０００−３０００ｂｐのＤＮＡの分離能が向上したことがわかる。
これらの結果より、スラブ電気泳動法においても長尺状の自己集合体を少量添加することで従来のアクリルアミドゲルを用いた分離法より優れた分離が可能となることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明は、産業上有用な電気泳動装置及びそれを用いた分離又は分析方法における新規な分離・分析用充填材組成物を提供するものであり、産業上の利用性を有している。
蛋白質た核酸の分離や分析方法は研究開発のみならず、治療や診断のための基礎データとして極めて有用なものであり、本発明の装置及び方法は産業上有用なデータの収集に寄与するものであり、産業上の利用性を有している。
【図１】
0004706026.tif 000060
【図２】
0004706026.tif 000061
【図３】
0004706026.tif 000062
【図４】
0004706026.tif 000063
【図５】
0004706026.tif 000064
【図６】
0004706026.tif 000065
【図７】
0004706026.tif 000066
【図８】
0004706026.tif 000067
【図９】
0004706026.tif 000068
【図１０】
0004706026.tif 000069
【図１１】
0004706026.tif 000070
【図１２】
0004706026.tif 000071