(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において、ペプチド抗原またはタンパク質抗原に対する増強した免疫応答を誘発するための組成物であって、該組成物は、以下：
(i)該抗原に対してポリペプチド結合によって連結された、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含まず、かつ、免疫グロブリン重鎖定常領域を含む融合タンパク質；および
(ii)アジュバントタンパク質に対してポリペプチド結合によって連結された、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含まず、かつ、免疫グロブリン重鎖定常領域を含む融合タンパク質を含み、
前記(i)および(ii)の免疫グロブリン定常領域は同じ種に由来し、かつ、Ｆｃ受容体を結合できる、組成物。
【請求項２】
前記(i)および(ii)の免疫グロブリン定常領域がヒトに由来する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アジュバントタンパク質がサイトカインである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記サイトカインが、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦおよびＧＭＣＳＦからなる群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記サイトカインがＧＭＣＳＦである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗原が、前立腺特異膜抗原（PSMA）、サイトカインレセプターのエクトドメイン、ウイルスタンパク質、および癌特異タンパク質からなる群から選択される、請求項１から５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記(i)および(ii)の融合タンパク質の免疫グロブリン重鎖定常領域が、ヒンジ領域を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記(i)および(ii)の融合タンパク質の免疫グロブリン重鎖定常領域が、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記(i)および(ii)の融合タンパク質の免疫グロブリン部分がＦｃである、請求項１から８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
哺乳動物において、予め選択された抗原に対する増強した免疫応答を誘発するためのワクチンを製造するための、請求項に記載の１から９のいずれか１項によって定められる組成物の使用。
【請求項１１】
前記免疫応答は、抗原融合タンパク質がアジュバント融合タンパク質なしに投与する場合よりも強力である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記ワクチンは、抗原融合タンパク質およびアジュバント融合タンパクが同時に投与されるように使用されるものである、請求項１０または１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、１９９９年７月２１日付けで出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／１４４，９６５（この開示は、本明細書中で参考として援用される）に対する優先権およびその恩恵を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、哺乳動物において、予め選択されたタンパク質抗原およびペプチド抗原の免疫原性を増強するための方法および組成物に関する。より詳細には、本発明は、免疫グロブリン重鎖定常領域および予め選択された抗原を含む融合タンパク質をコードする核酸、およびその融合タンパク質を規定するアミノ酸配列を含む方法および組成物に関し、ここでこの融合タンパク質における予め選択された抗原は、この予め選択された抗原単独と比較して、この哺乳動物においてより強力な免疫応答を誘発し得る。
【０００３】
（発明の背景）
ワクチン開発は伝統的に、感染因子を中和し得る防御的抗体の産生に焦点を当ててきた。現在のところ、ワクチンとして使用される因子としては、代表的に、不活性化または弱毒化微生物（例えば、細菌またはウイルス）、それらの産物（例えば、毒素）、または精製された抗原が挙げられる。現代分子生物学および遺伝子クローニング方法論の到来に伴ない、より純粋であり、かつ明らかにより特異的なワクチンを作製することが可能となった。さらに、分子レベルでの免疫系の見識により、感染性因子によって刺激される免疫応答の単離および特徴付けが可能となった。免疫応答の首尾良い産生に対する中枢であると考えられる免疫系の２つの要素としては、以下が挙げられる：調節性Ｔ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の中心的役割；ならびに、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって、抗原がこれらのＴ細胞に提示される様式。例えば、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編（１９９３）ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【０００４】
代表的に、ＡＰＣの外側から受容されるタンパク質抗原またはペプチド抗原（外因性抗原）は、ＡＰＣのエンドサイトーシス性小胞またはエンドソーム内で分解され、ここで、生じたペプチドフラグメントは、主要組織適合遺伝子複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔａｂｉｌｉｔｙ  ｃｌａｓｓ）（ＭＨＣ）クラスＩＩタンパク質と複合体を形成する。生じた複合体は、細胞表面に移動し、この表面でこの複合体は、ＡＰＣ付近の免疫細胞に提示される。ペプチドフラグメントは、ＭＨＣ分子によって規定される溝に適合し、そしてこの複合体は、この複合体に対する結合特異性を有するＴ細胞レセプターを発現するＴ細胞によって認識され得る。ペプチド負荷ＭＨＣクラスＩＩ分子とヘルパーＴ細胞との間の相互作用は、当該分野ではＣＤ４  Ｔ細胞と呼ばれており、それ自身のＭＨＣクラスＩＩ分子とＴ細胞表面上のＣＤ４+レセプターとの間の別の相互作用によってさらに安定化される。従って、ＡＰＣ細胞内でプロセスされる外因性抗原は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を介して細胞表面上に提示される。ＣＤ４+Ｔ細胞に提示される場合、このＭＨＣクラスＩＩ複合体は、サイトカインを分泌するＣＤ４+ヘルパー細胞を生じ、これが、ペプチドに対する抗体を産生するようにＢ細胞を刺激する。Ｐａｕｌ（前出）を参照のこと。
【０００５】
外因性抗原でのワクチン接種は、代表的に、ＣＤ４細胞媒介性Ｔ細胞応答を生じさせ、これが一般的に、抗体産生を生じさせる。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、代表的に、このような経路によって刺激されない。明らかに、例えば、ウイルスに感染した細胞におけるウイルスタンパク質の産生または癌細胞における癌特異タンパク質の産生を介して、抗原がＡＰＣ自体の内側から生じる（内因性抗原）状況下では、ＣＴＬは刺激される。実際、多くのウイルス性疾患では、ＣＴＬの産生が、ウイルスに感染した細胞を排除し、それによって感染から回復するにおいて重要であると考えられている。
【０００６】
研究によって、内因性抗原と外因性抗原とは、示差的にプロセスされることが示されている。発生期のポリペプチドの合成の間、ポリペプチドの一部分は、プロテオソームと呼ばれる細胞内構造によって分解される。このプロセスに由来するフラグメントは、ＭＨＣクラスＩＩ分子ではなく、新たに合成されたＭＨＣクラスＩと複合体化し、ここで、生じたＭＨＣクラスＩ複合体含有抗原は、細胞表面に輸送される。再度、特異的ペプチドフラグメントに対する特異性を有するＴ細胞は、Ｔ細胞に結合するが、この場合、必要とされるコレセプター（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）相互作用は、ＭＨＣクラスＩ分子とＣＤ８分子との間で生じる。従って、ＡＰＣの表面上の内因性抗原は、ＣＤ８+Ｔ細胞に対して提示される。細胞傷害性ではないＣＤ８+Ｔ細胞のいくつかの型が存在するが、ＣＤ８+Ｔ細胞は、ＣＴＬの大半を構成する。
【０００７】
従って、強力なＣＴＬ応答を誘導し得るワクチンの設計は、抗原性分子（一般的に、タンパク質）が、細胞の内側で作製されるか、または適切な細胞区画内に送達されるかのいずれかであり、その結果、それがＭＨＣクラスＩプロセシング経路に入り得ることを必要とする。１つのストラテジーは、目的のタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子をウイルスに組み込み、次いで、この操作されたウイルスをワクチンとして使用することである（Ｌｏｒｅｎｚら（１９９９）ＨＵＭ．ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲ．１０：６２３−６３１）。別のストラテジーは、タンパク質をコードするＤＮＡベクターを細胞に注入し、次いで、この細胞を動物または患者に投与することであり、ここで、これは細胞内から発現され、次いで、ＭＨＣクラスＩ分子を介して細胞表面上に提示される（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（１９９７）ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１５：６１７）。ＤＮＡベクターを筋肉または皮膚中に直接注入する類似の技術によって、いくつかの抗原に対するＣＴＬおよび／または抗体応答を誘導することが示された（Ｌａｉら（１９８８）ＣＲＩＴ．ＲＥＶ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１８：４４９−８４、および米国特許第５，５８９，４６６号）。研究によって、抗原がＡＰＣによって取りこまれ、そしてプロセスされ、ここで免疫系に提示されることが示された（Ｌａｉら、前出）。
【０００８】
ＭＨＣクラスＩ経路への外因性ペプチドまたはタンパク質の送達は、化学的アジュバント（例えば、フロイントアジュバント、およびスクアレンと界面活性剤との混合物（Ｈｉｌｇｅｒｓら（１９９９）ＶＡＣＣＩＮＥ  １７：２１９−２２８））の使用を通して、そしてより近年では、マクロファージによって食作用を受け、そして代替的なＭＨＣクラスＩ経路を介してＣＴＬ応答を誘導する、抗原をコーティングした小ビーズの使用を通して、部分的に成功してきた（Ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎら（１９９５）ＥＵＲ．Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．２５：１２７４−１２８５）。さらに、抗原に対する免疫応答を増強する他の方法としては、組換え免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦなど）と組合せた化学的アジュバントの使用が挙げられ得る。例えば、１つの方法は、ハプテンと化学的に反応したタンパク質抗原に、このサイトカインを連結させる方法として、ＩＬ−２に融合された抗ハプテン抗体を使用する（Ｈａｒｖｉｌｌら（１９９６）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１５７：３１６５）。
【０００９】
別の技術は、免疫グロブリン可変領域の一部分をペプチド抗原で置換する、抗体の「抗原化（ａｎｔｉｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）」を使用する。一旦、組換え抗体が、ＡＰＣ表面上のＦｃレセプターとの相互作用を介してＡＰＣに結合すると、ハイブリッド分子のペプチド抗原はＡＰＣ上に提示される（Ｌａｎｚａら（１９９３）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１６８３−１１６８７）。このアプローチの延長は、「抗原化された」免疫グロブリン重鎖をコードするプラスミドＤＮＡの脾臓注射を利用し、この後、脾臓由来Ｂ細胞は、一旦免疫グロブリン軽鎖パートナーが与えられると、組換え抗体を分泌する。
【００１０】
しかし、抗原送達系の免疫原性は、現代のワクチン開発における主要な技術的ハードルの１つである。ワクチン接種の目標は、強力な免疫応答を誘発することである。しかし、宿主免疫系は、細菌およびウイルスと闘うように誘起されるので、細菌またはウイルスがベクターとして使用される場合、このメッセンジャーは代表的に、このメッセージに沿って破壊される。さらに、特定のウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルスおよびアデノウイルス）に対する強力な免疫応答は、その用途を制限し、そしてタンパク質ベクターとして細菌毒素を使用する間に、同様の問題が生じ得ることが予期される。同様に、本来、免疫系により「自己」とはみなされない可変領域を利用する、抗体に基づく「タンパク質ベクター」は、潜在的に免疫原性である。これらのキャリア分子を複数使用することは、抗イディオタイプ応答を誘導し得、それによって、この有効な用途を妨げることが予期される。従って、予め選択されたタンパク質抗原またはペプチド抗原に対する強力かつ長期持続的な免疫を生じるワクチンを提供することが、本発明の目的である。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、一部、予め選択された抗原を免疫グロブリン重鎖定常領域に融合することによって、哺乳動物における予め選択されたペプチド抗原またはタンパク質抗原の免疫原性を増強することが可能であるという発見に基づく。次いで、生じる融合タンパク質（本明細書中では、「Ｆｃ−抗原融合タンパク質」または「抗原融合タンパク質」ともいわれる）またはこの融合タンパク質をコードする核酸配列は、ワクチンの形態で哺乳動物に投与されて、この予め選択された抗原に対する免疫応答を誘発し得る。さらに、予め選択された抗原に対して誘発された免疫応答の強さおよび型は、Ｆｃ−抗原融合タンパク質またはＦｃ−抗原融合タンパク質をコードする核酸配列と共に特定のアジュバントを投与することによって調節され得ることが発見された。
【００１２】
従って、本発明は、哺乳動物において、予め選択された抗原の免疫原性を増強するための方法を提供する。１つの局面では、本方法は、免疫応答を誘発するに十分な量の予め選択された抗原に対してポリペプチド結合によって連結された免疫グロブリン重鎖定常領域を含むＦｃ−抗原融合タンパク質を、哺乳動物に投与する工程を包含する。別の局面では、本方法は、予め選択された抗原に融合された免疫グロブリン重鎖定常領域を含むＦｃ−抗原融合タンパク質をコードする、核酸配列（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ））を、哺乳動物に投与する工程を包含する。Ｆｃ−抗原融合タンパク質の部分の場合（融合タンパク質として投与されるか、核酸（これは、次いで、宿主において、融合タンパク質を産生するように発現される）として投与されるかのいずれか）、予め選択された抗原は、匹敵量（例えば、重量または分子数による）の予め選択された抗原単独（すなわち、免疫グロブリン重鎖定常領域に融合されていない、予め選択された抗原）よりも強力な免疫応答を、哺乳動物において刺激し得るという点で特徴付けられる。
【００１３】
さらに、Ｆｃ−抗原融合タンパク質の予め選択された抗原に対して誘発された免疫応答は、アジュバントと共にＦｃ−抗原融合タンパク質を投与することによって、増強または調節され得る。種々のアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントまたは非メチル化ＣｐＧ配列を含むオリゴヌクレオチドのような、化学的アジュバント）が、本発明の実施において有用であり得るが、Ｆｃ−抗原融合タンパク質と共に使用される現在好ましいアジュバントは、第２のＦｃ融合タンパク質（本明細書中では、「Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質」または「アジュバント融合タンパク質」といわれる）、またはこのようなＦｃ融合タンパク質をコードする核酸を含む。好ましいＦｃ−アジュバント融合タンパク質は、アジュバントタンパク質（例えば、サイトカイン）に対してポリペプチド結合によって連結された免疫グロブリン重鎖定常領域を含む。Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質の構築において有用な好ましいサイトカインとしては、例えば、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＩＬ−１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）が挙げられる。別のクラスのＦｃ−アジュバント融合タンパク質は、通常は、部分的（ｐａｒｔｉｃａｌｌｙ）または排他的に膜に結合したタンパク質の細胞外ドメインに対応するアジュバント部分に融合された免疫グロブリン重鎖領域を含む。例えば、ＣＤ４０リガンドは、Ｆｃ部分に融合されて、増強されたアジュバントタンパク質として使用される。
【００１４】
Ｆｃ−抗原融合タンパク質およびＦｃ−アジュバント融合タンパク質の同時投与（同時または順次（例えば、Ｆｃ−抗原に次いでＦｃ−アジュバント、またはＦｃ−アジュバントに次いでＦｃ−抗原）のいずれか）を使用して、予め選択された抗原に対して刺激される免疫応答の型を調節し得る。２つのクラスの免疫応答（Ｔｈ１およびＴｈ２と称される）が、異なる刺激および関与する異なるサイトカインに応答して開始される。Ｔｈ１媒介性免疫応答は代表的に、事実上細胞性であり、一方、Ｔｈ２媒介性免疫応答は代表的に、事実上体液性である。従って、Ｔｈ１応答は、改変された細胞（癌細胞またはウイルス感染細胞）を攻撃するにおいて有用であり得、一方、Ｔｈ２応答は、寄生生物のような細胞外因子を攻撃するにおいて有用であり得る。一般的免疫応答を刺激するためか、または特異的Ｔｈ１応答もしくはＴｈ２応答を開始もしくは調節するために、免疫グロブリン重鎖定常領域に融合されたサイトカインを投与することが、しばしば有用である。
【００１５】
例えば、ＧＭＣＳＦに対してペプチド結合によって連結された免疫グロブリン重鎖定常領域を含むＦｃ−アジュバント融合タンパク質は、免疫応答（Ｔｈ１応答およびＴｈ２応答の両方を含む）の強力な一般的刺激物質である。ＩＬ−１２またはＩＦＮ−γを含むＦｃ−アジュバント融合タンパク質は、同時に投与されて、主に細胞性またはＴｈ１媒介性の免疫応答を刺激し得る。あるいは、ＩＬ−４を含むＦｃ−アジュバント融合タンパク質を投与して、主に体液性またはＴｈ２媒介性の免疫応答を刺激し得る。
【００１６】
さらに、Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質中に存在する特定のサイトカインの選択は、Ｆｃ−抗原融合タンパク質の予め選択した抗原に対して産生された抗体のクラスに影響を与え得る。例えば、ＩＬ−１２含有Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質は、ヘルパーＴ細胞、およびＩｇＧ２ａクラスの抗体の産生を刺激し得る。あるいは、ＩＬ−４含有アジュバント融合タンパク質は、ＩｇＥクラスの抗体の産生を刺激し得る。
【００１７】
先に議論されたように、好ましい実施形態において、本発明は、Ｆｃ−抗原融合タンパク質またはＦｃ−抗原融合タンパク質をコードする核酸をＦｃ−アジュバント融合タンパク質と組み合わせて投与する工程を包含する。２つの融合タンパク質（各々は、免疫グロブリン重鎖定常領域を含む）を用いることによって、哺乳動物における同一または類似の細胞型において、予め選択された抗原およびアジュバントタンパク質（例えば、サイトカイン）の両方を同時に局在化することが可能である。例えば、マクロファージ、Ｂ細胞、顆粒球および樹状細胞は、それらの細胞表面上でＦｃレセプターを発現する。従って、Ｆｃレセプターを結合し得る、Ｆｃ−抗原融合タンパク質およびＦｃ−アジュバント融合タンパク質を同時投与することによって、同一の細胞型において抗原融合タンパク質の抗原およびアジュバント融合タンパク質のアジュバントを同時に局在化することが可能である。次いで、このアジュバントは、予め選択された抗原の付近での免疫応答を刺激、増強、または他の方法で調節し得る。
【００１８】
この好ましい実施形態において、本発明は、局在化または濃縮の２つの異なる形態を使用する。第１に、本発明は、抗原およびアジュバントの両方に融合され、身体の特定の領域に濃縮される共通部分を用いる。この方法では、このアジュバントの近傍における抗原の効果的な局所濃縮が増加される。第２に、本発明は、抗原を、免疫系の抗原プロセシングおよび提示機構へ標的化する。第１の濃縮工程は、抗原タンパク質およびアジュバントタンパク質を免疫系にアクセス可能である身体のいくつかの部分において濃縮を生じさせる部分に融合することによって実行され得る。第２の標的工程は、この抗原タンパク質を抗原提示系への送達、または抗原提示系によるプロセシングを増強する任意の部分に融合することによって実行され得る。
【００１９】
従って、本発明は、２つの代替の方法によるこれらの濃縮効果を達成する。１つの方法は、２つの異なる融合タンパク質（抗原局在化タンパク質融合物およびアジュバント局在化タンパク質融合物）を構築および投与することである。第２の方法は、抗原、アジュバント、および局在化タンパク質を含む融合物を構築および投与することである。Ｆｃ部分は、局在化タンパク質の１例である。
【００２０】
免疫グロブリン重鎖定常領域の重要な特徴は、Ｆｃ−抗原融合タンパク質における予め選択された抗原とは異なり、これが、好ましくは、非免疫原性または意図されたレシピエントにおけるわずかに弱い免疫原性であることである。換言すると、Ｆｃ−抗原融合タンパク質において、予め選択された抗原は、レシピエントにおける免疫原性を免疫グロブリン重鎖定常領域よりも高めるように設計される。同様に、Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質はまた、意図されるレシピエントにおいて非免疫原性か、または弱い免疫原性であるべきであることが考慮される。免疫グロブリン重鎖定常領域の免疫原性は、減少され得、そして特定の場合、意図されるレシピエントと同一種に存在する免疫グロブリン定常領域配列に由来する免疫グロブリン定常領域配列またはこの配列に類似の配列を用いることによって排除され得る。例えば、免疫グロブリン重鎖定常領域（好ましくは、ヒト起源の）を使用して、ヒトに投与されるべき融合タンパク質を生成する。同様に、意図されるレシピエントがヒトである場合、Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質におけるアジュバントタンパク質もまた、好ましくはヒト起源である。免疫グロブリン重鎖定常領域およびアジュバントタンパク質を規定する適切なアミノ酸配列の選択によって、主に予め選択された抗原に対する直接的な免疫応答を最適化することが可能である。
【００２１】
好ましい実施形態において、このＦｃ−抗原融合タンパク質の免疫グロブリン重鎖定常領域は、免疫グロブリンヒンジ領域、ならびに必要に応じて、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメインまたはそれらの組み合わせからなる群より選択される免疫グロブリン定常領域ドメインを含む。しかし、この免疫グロブリン重鎖定常領域は、好ましくは、少なくともＣＨ１ドメインを欠失する。さらに、本発明のＦｃ融合タンパク質は、好ましくは、免疫グロブリン重鎖可変領域ドメイン（ＶH）を欠失する。この融合タンパク質がヒトに投与される場合、免疫グロブリン重鎖定常領域は、好ましくは、ヒンジ領域、およびＣＨ２ドメインもしくはＣＨ３ドメインを含み、そして最も好ましくは、ヒンジ領域ならびにＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの両方を含む。本発明の実施において有用である免疫グロブリン重鎖定常領域がＩｇＡ（Ｉｇα）、ＩｇＤ（Ｉｇδ）、ＩｇＥ（Ｉｇε）、ＩｇＧ（Ｉｇγ）、およびＩｇＭ（Ｉｇμ）として当該分野において言及される５つの免疫グロブリンクラスのいずれかに属する免疫グロブリンに由来し得ることが意図される。しかし、ＩｇＧクラス由来の免疫グロブリン重鎖定常領域が好ましい。
【００２２】
目的の任意の予め選択された抗原が、本発明のＦｃ−抗原融合タンパク質において含まれ得ることが意図される。好ましい実施形態において、予め選択された抗原が、前立腺特異膜抗原、サイトカインレセプターのエクトドメイン（ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ）、ウイルスタンパク質、および癌特異抗原または腫瘍特異抗原からなる群より選択される。
【００２３】
種々の構造を有するＦｃ−抗原融合タンパク質は、本発明の実施において有用であり得る。例えば、予め選択された抗原のＮ末端は、免疫グロブリン重鎖定常領域のＣ末端に対してポリペプチド結合によって連結され得る。あるいは、予め選択された抗原のＣ末端は、免疫グロブリン重鎖定常領域のＮ末端に対してポリペプチド結合によって連結され得る。さらに、このＦｃ−抗原融合タンパク質が複数の１つ以上の予め選択された抗原を含み得、この１つ以上の予め選択された抗原は、互いにか、または免疫グロブリン重鎖定常領域に直接かまたはポリペプチドリンカーを介して連結され得ることが意図される。さらに、２つ以上のＦｃ−抗原融合タンパク質は、非共有的または共有的のいずれかで（例えば、１つ以上のジスルフィド結合を通じて）共に結合され、ダイマーまたはマルチマーの組成物を産生し得る。ダイマー構築物におけるＦｃ−抗原融合タンパク質は、同一か、または互いに異なり得ることが意図される。例えば、両方のＦｃ−抗原融合タンパク質が、同一の免疫グロブリン重鎖定常領域を含み得るが、予め選択された抗原は異なり得る。類似の構造が、またこのＦｃ−アジュバント融合タンパク質とともに使用され得ることが意図される。
【００２４】
さらに、Ｆｃ融合タンパク質をコードする種々の核酸配列は、本発明の実施において有用であり得る。例えば、この核酸配列は、５’から３’方向に、免疫グロブリン重鎖定常領域および予め選択された抗原、または予め選択された抗原および免疫グロブリン重鎖定常領域のいずれかをコードし得る。さらに、この核酸配列はまた、必要に応じて、例えば、免疫グロブリン重鎖定常領域のヒンジ領域に直接融合された免疫グロブリン軽鎖配列に基づいて「リーダー」または「シグナル」配列を含み得る。好ましい実施形態において、このＦｃ領域がＩｇＧ配列に基づく場合、このＦｃ領域は、５’から３’方向に、少なくとも免疫グロブリンヒンジ領域（すなわち、第２の免疫グロブリンヒンジ領域配列とジスルフィド結合を形成し得る少なくとも１つのシステインアミノ酸を含むヒンジ領域）、免疫グロブリンＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインをコードする。さらに、Ｆｃ−抗原融合タンパク質をコードする核酸配列はまた、例えば、細菌宿主、意図されるレシピエント、またはその両方のいずれかにおいてＦｃ融合タンパク質を発現し得る複製可能な発現ベクター内に組み込まれ得る。
【００２５】
Ｆｃ−抗原融合タンパク質をコードする核酸配列の、単独かまたはＦｃ−アジュバント融合タンパク質をコードする核酸配列とともにのいずれかでの注射は、細胞性免疫応答、体液性免疫応答またはその両方の生成を生じ得ることが意図される。核酸ベースの免疫およびタンパク質ベースの免疫の組み合わせ（例えば、Ｆｃ−抗原融合タンパク質をコードする核酸の、投与前、投与中または投与後のＦｃ−抗原融合タンパク質の投与）は、互いに相乗作用し、核酸またはタンパク質単独のいずれかでの免疫と比較して、予め選択された抗原に対するより強力な免疫応答を誘発し得る。
【００２６】
本発明の前記および他の目的、特徴ならびに利点は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲からより明らかにされる。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、哺乳動物において体液性（すなわち、抗体ベースの）免疫応答すなわちＴｈ２細胞性媒介免疫応答、細胞性免疫応答すなわちＴｈ１細胞性媒介応答、およびいくつかの場合、両方の型の免疫応答を誘導するためのインビボでのタンパク質抗原またはペプチド抗原の効率的な送達に関する。予め選択された抗原を免疫グロブリン重鎖定常領域に融合し、Ｆｃ−抗原融合タンパク質を産生することによって、哺乳動物においてこの予め選択されたタンパク質またはペプチド抗原の免疫原性を増強することが可能であることが、ここに発見された。次いで、得られるＦｃ−抗原融合タンパク質、またはＦｃ−抗原融合タンパク質をコードする核酸配列を、ワクチン形態で、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与し、予め選択された抗原に対する免疫応答を誘発し得る。
【００２８】
Ｆｃ−抗原融合タンパク質は、この抗原を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に選択的に標的化する。理論に拘束されることは望まないが、このＦｃ−抗原融合タンパク質のＡＰＣへの結合が、多数の免疫細胞型（例えば、樹状細胞；マクロファージ；Ｂ細胞；および顆粒球を含む）上で発現されるＦｃレセプターを通じて媒介されると考えられる。このＦｃ−抗原融合タンパク質が、哺乳動物に投与されると、Ｆｃレセプターを結合し、その後、このＦｃ−抗原融合タンパク質は、ＡＰＣによってエンドサイトーシスされる。次いで、このエンドサイトーシス化融合タンパク質（予め選択された抗原を含む）は、小さなペプチドに分解され、次いで、この小さなペプチドが細胞表面上に提示されると考えられる。次いで、提示されたペプチドは、体液性および／または細胞性の免疫応答を媒介する。刺激された免疫応答の特定の型は、Ｆｃ−抗原融合タンパク質をアジュバントとともに（例えば、アジュバント融合タンパク質）同時投与することによって調節され得る。
【００２９】
投与の１つの様式において、Ｆｃ−抗原融合タンパク質は、レシピエントに投与される。投与の別の様式において、Ｆｃ−抗原融合タンパク質をコードする核酸配列は、レシピエントに投与される。投与されるＦｃ−抗原タンパク質においてか、または投与される核酸から発現されるかのいずれかである予め選択された抗原は、この抗原単独（すなわち、免疫グロブリン重鎖定常領域に対してポリペプチド結合によって融合されない抗原）よりも免疫原性が高い。さらに、特定の環境において、融合タンパク質の連続的な投与、続いて、同一の融合タンパク質をコードする核酸の投与、または融合タンパク質をコードする核酸の投与、続いて、同一の融合タンパク質の投与を使用して、予め選択された抗原の免疫原性を最大化し得る。Ｆｃ−抗原融合タンパク質の両方の成分が活性である場合、最適な免疫応答が誘発されることが理解される。換言すると、Ｆｃ−抗原融合タンパク質における予め選択された抗原は、免疫応答を誘発し得、そして免疫グロブリン重鎖定常領域は、ＡＰＣの表面上でＦｃレセプターを結合し得る。
【００３０】
さらに、議論されるように、予め選択された抗原に対して誘発された免疫応答の強度および型は、Ｆｃ−抗原融合タンパク質および／またはＦｃ−抗原融合タンパク質をコードする核酸とともに特定のアジュバントを同時投与することによって調節され得る。化学的アジュバント（例えば、ミョウバンまたはフロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント）が、特定の環境下で（例えば、獣医学的適用において）本発明の実施において有用であり得るが、それらの副作用（例えば、組織瘢痕化）は、ヒト使用に対して受容不可能にし得る。従って、好ましいアジュバントは、第２のＦｃ融合タンパク質を含む。ここで免疫グロブリン重鎖定常領域は、アジュバントタンパク質に融合され、Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質を産生する。Ｆｃ−抗原融合タンパク質と同様に、最適な免疫応答は、Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質の両方の成分が活性である場合に誘発されることが理解される。換言すると、Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質におけるアジュバントは、免疫応答を調節し得、そして免疫グロブリン重鎖定常領域は、ＡＰＣの表面上でＦｃレセプターを結合し得る。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、Ｆｃ融合タンパク質またはこのような融合タンパク質をコードする核酸として抗原およびアジュバントの両方を投与する。換言すると、抗原を、Ｆｃ−抗原融合タンパク質として投与し、そしてアジュバントを、Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質として投与する。本発明の実施に有用なＦｃ融合タンパク質の特定の好ましい実施形態を、図１Ａ〜１Ｇに示す。
【００３２】
図１Ａは、代表的なＦｃ融合タンパク質を示す。このタンパク質は、免疫グロブリン重鎖定常領域１のＣ末端が、予め選択された抗原またはアジュバント２のＮ末端に直接にかまたはポリペプチドリンカーによってかのいずれかで連結されている。本明細書中に使用される場合、用語「ポリペプチドリンカー」は、２つのタンパク質をともに連結する１つ以上のアミノ酸残基の配列を意味することが理解される。このポリペプチドリンカーは、多くの場合、例えば、グリシン残基および／またはセリン残基の反復を含む約１０〜１５残基の長さの一連のアミノ酸である。図１Ｂは、代表的なＦｃ融合タンパク質を示す。このタンパク質は、予め選択された抗原またはアジュバント２のＣ末端が、免疫グロブリン重鎖定常領域１のＮ末端に直接にかまたはポリペプチドリンカーによってかのいずれかで連結されている。
【００３３】
図１Ｃは、２つのジスフィルド結合による共有結合によって連結されている２つのＦｃ融合タンパク質を含む二量体構築物を示す。この二量体構築物は、２つのＦｃ融合タンパク質を含む。これらのタンパク質は、免疫グロブリン重鎖定常領域１のそれぞれのＣ末端が予め選択された抗原のＮ末端またはアジュバント２に連結されている。同様に、図１Ｄは、２つのジスフィルド結合による共有結合によって連結されている２つのＦｃ融合タンパク質を含む二量体構築物を示す。この二量体構築物は、２つのＦｃ融合タンパク質を含む。このタンパク質では、予め選択された抗原またはアジュバント２のそれぞれのＣ末端が免疫グロブリン重鎖定常領域１のＮ末端に連結されている。
【００３４】
図１Ｅは、２つのジスフィルド結合によって連結されている２つのＦｃ融合タンパク質を含む二量体構築物を示す。この二量体構築物は、２つのＦｃ融合タンパク質を含む。これらのタンパク質では、免疫グロブリン重鎖定常領域１のそれぞれのＣ末端が、予め選択された抗原またはアジュバント２のＮ末端に、直接的にかまたはポリペプチドリンカーを介するかのいずれかで連結され、この予め選択された抗原またはアジュバント２のＣ末端は、第二の抗原またはアジュバント２’に直接的にかまたはポリペプチドリンカーを介するかのいずれかで連結されている。
【００３５】
図１Ｆは、２つのジスフィルド結合によってまた連結されている２つのＦｃ融合タンパク質を含む二量体構築物を示す。この二量体構築物は、２つのＦｃ融合タンパク質を含む。これらのタンパク質では、抗原またはアジュバント２のＣ末端が、免疫グロブリン重鎖定常領域１のＮ末端に、直接的にかまたはポリペプチドリンカーを介するかのいずれかで連結され、この免疫グロブリン重鎖定常領域１のＣ末端は、異なるアジュバントまたは抗原２’のＮ末端に直接的にかまたはポリペプチドリンカーを介するかのいずれかで連結されている。例えば、このような融合タンパク質は、予め選択された抗原−免疫グロブリン重鎖定常領域−アジュバントをＮ末端からＣ末端の方向に含み得る。
【００３６】
図１Ｇは、２つのジスフィルド結合によってまた連結されている２つのＦｃ融合タンパク質を含む二量体構築物を示す。この二量体構築物は、２つのＦｃ融合タンパク質を含む。これらのタンパク質では、抗原またはアジュバント２のＣ末端が、異なるアジュバントまたは抗原２’のＮ末端に直接的にかまたはポリペプチドリンカーを介するかのいずれかで連結されており、この異なるアジュバントまたは抗原２’のＣ末端は、免疫グロブリン重鎖定常領域１のＮ末端に直接的にかまたはポリペプチドリンカーを介するかのいずれかで連結されている。例えば、このような融合タンパク質は、予め選択された抗原−アジュバント−免疫グロブリン重鎖定常領域をＮ末端からＣ末端の方向に含み得る。
【００３７】
本発明の実施において、アジュバント部分に関してＮ末端の位置にＦｃ部分を配置することが、一般的に好ましい。次いで、このアジュバント部分がＦｃ部分のＮ末端に配置される場合、アジュバント−Ｆｃ融合物は、免疫細胞上のアジュバントレセプターに結合し得、そして、抗体が細胞表面に結合する場合、Ｆｃ部分は、採用される方向と同一の方向である。ＡＤＣＣまたは補体定着が生じ得る。しかし、Ｆｃ部分がアジュバント部分のＮ末端に配置される場合、ＡＤＣＣおよび補体定着は、生じないようである。
【００３８】
図１Ｃ〜１Ｇに示される構築物は、近接するヒンジ領域上のシステインの間のジスフィルド結合の対によってクロスリンクされた二量体として示される。図において、ジスフィルド架橋を、これらの分子のネイティブ形態に特徴的なヒンジ領域を介して、２つの免疫グロブリン重鎖定常領域の一部をともに連結するように示す。免疫グロブリンヒンジ領域を含む構築物が好ましいが、本発明は、他の部分におけるクロスリンクが所望されるように選択され得ることを意図する。さらに、いくつかの場合において、２つ以上のモノマーは、非共有結合で結合し、本発明の実施に有用なダイマーまたはマルチマーを産生し得る。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「免疫グロブリン重鎖定常領域」は、用語「Ｆｃ領域」と相互変換可能に使用され、かつ免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシ末端部分、またはＦｃレセプターを結合し得るそのアナログもしくは一部を意味することが理解される。公知のように、各々の免疫グロブリン重鎖定常領域は、４または５のドメインを含む。これらのドメインを、順に以下のように呼ぶ：ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）。ＣＨ４は、ＩｇＭに存在し、ＩｇＭは、ヒンジ領域を有さない。本発明の実施に有用である免疫グロブリン重鎖定常領域は、好ましくは免疫グロブリンヒンジ領域を含み、そして好ましくは、ＣＨ３ドメインもまた含む。免疫グロブリン重鎖定常領域は、最も好ましくは、免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。本明細書中で使用される場合、用語免疫グロブリン「ヒンジ領域」は、免疫グロブリンヒンジ領域全体、または第二の免疫グロブリンヒンジ領域と１つ以上のジスフィルド結合を形成するに十分な免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部を意味することが理解される。
【００４０】
安定な免疫グロブリン重鎖定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭと称される免疫グロブリンクラスの各々に属する抗体由来であり得ることが考えられる。しかし、ＩｇＧクラス由来の免疫グロブリン重鎖定常領域が好ましい。さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域は、ＩｇＧ抗体サブクラス（当該分野においてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４と称される）のいずれか由来であり得ると考えられる。
【００４１】
免疫グロブリン重鎖定常領域ドメインは、免疫グロブリンクラス間で交叉相同性を有する。例えば、ＩｇＧのＣＨ２ドメインは、ＩｇＡおよびＩｇＤのＣＨ２ドメインに相同であり、そしてＩｇＭおよびＩｇＥのＣＨ３ドメインに相同である。好ましい免疫グロブリン重鎖定常領域は、ＩｇＧのＣＨ２領域およびＣＨ３領域に対応するタンパク質ドメイン、または、その機能部分もしくは誘導体を含む。しかし、免疫グロブリン重鎖定常領域は、好ましくは、少なくともＣＨ１ドメインを欠く。さらに、Ｆｃ−抗原またはＦｃ−アジュバントの融合タンパク質は、必要に応じて免疫グロブリン可変領域を欠く。より好ましい実施形態において、免疫グロブリン重鎖定常領域は、Ｎ末端からＣ末端への方向において、免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、これらの全ては、ＩｇＧ分子由来の配列に基づく。適切な免疫グロブリン重鎖定常領域の選択は、米国特許第５，５４１，０８７号および同５，７２６，０４４号に詳細に考察される。特定の結果に到達するための特定の免疫グロブリンクラスおよびサブクラス由来の特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当業者のレベル内であると見なされる。
【００４２】
いくつかの環境において、免疫グロブリン重鎖定常領域を例えば、特定の活性（例えば、補体定着または抗体依存的細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の刺激）が減少または排除されるような変異、欠失または遺伝子操作もしくは他の手法によって媒介される他の変化によって、改変することが有用であり得る。しかし、免疫グロブリン重鎖定常領域のＦｃレセプターに結合する能力を維持することが必要であると見なされる。
【００４３】
本発明の実施において、Ｆｃ−抗原またはＦｃ−アジュバントの融合タンパク質の免疫グロブリン重鎖定常領域成分は、好ましくは、意図されるレシピエントにおいて非免疫原性であるか、または弱い免疫原性である。免疫グロブリン重鎖定常領域が免疫グロブリン重鎖定常領域に対して検出可能な抗体応答を生成しない場合、Ｆｃ領域は、非免疫原性であるか、または、弱い免疫原性である。従って、免疫グロブリン重鎖定常領域は、存在する免疫グロブリン由来であるべきか、または融合タンパク質の意図されるレシピエントと同じ種に存在する免疫グロブリンに対応するアミノ酸配列に基づくべきである。換言すると、ヒト免疫グロブリン定常重鎖領域配列は、Ｆｃ融合構築物（Ｆｃ−抗原および／またはＦｃ−アジュバントの融合タンパク質）がヒトに投与されるべき場合に使用されるべきである。ヒトＦｃ  ＩｇＧのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えば、Ｅｌｌｉｓｏｎら（１９８２）ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．１０：４０７１−４０７９に記載される。同様に、マウスＦｃ配列は、Ｆｃ融合物がマウスに投与される場合に使用されるべきである。マウスＦｃ  ＩｇＧ２ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、例えば、Ｂｏｕｒｇｏｉｓら（１９７４）ＥＵＲ．Ｊ．ＢＩＯＣＨＥＭ．４３：４２３−４３５に開示される。Ｆｃ融合タンパク質が愛玩動物（例えば、ネコおよびイヌ）ならびに家畜（例えば、ウシおよびウマ）を含むほかの動物に投与されるべき場合、同一の論理が適用される。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「予め選択された抗原」は、任意のタンパク質またはそのフラグメント、あるいは単独でかまたは他の薬剤と組み合わせてのいずれかで動物における免疫応答を誘導し得るポリペプチドを意味することが理解される。目的の予め選択された抗原のいずれかが本発明のＦｃ−抗原融合タンパク質に含まれ得ることが意図される。好ましい実施形態において、予め選択された抗原は、以下からなる群より選択される：前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）；サイトカインレセプターのエクトドメイン（例えば、ヒトＩＬ−４レセプターのエクトドメイン）；腫瘍特異的抗原（例えば、正常細胞と比較して腫瘍細胞においてアップレギュレートされたか、あるいは増加したレベルで存在する抗原）；およびウイルスタンパク質（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のゲノムによってコードされるタンパク質）。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「アジュバント」は、例えば、予め選択された抗原に対する免疫応答（体液性かまたは細胞性のいずれか）を増強することによって、免疫調節因子として作用し得る任意の物質を意味することが理解される。本明細書中で使用される場合、用語「体液性」免疫は、体液（例えば、血漿またはリンパ液）に生じた抗体によって媒介される免疫を意味することが理解される。ここで、当該分野において「細胞媒介性免疫」としてもまた称される用語「細胞性」免疫は、Ｔリンパ球によって開始し、そしてエフェクターＴリンパ球および／またはマクロファージによって媒介される免疫学的反応を意味することが理解される。
【００４６】
以前に記載されたように、種々の化学アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント）は、非ヒト動物を免疫するに有用であり得る。高力価の抗体または顕著な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を生成するために、動物で広範に使用されるにもかかわらず、このようなアジュバントの副作用（例えば、組織傷害）のために、ヒトへの使用は受容不可能である。従って、注射部位での炎症を伴わない強力な免疫応答を誘導する必要がある。本発明のＦｃ−アジュバント融合タンパク質を使用する明確な利点の１つは、化学アジュバント（例えば、フロイントアジュバント）の必要性なしに、強力な免疫応答を誘発する能力である。
【００４７】
本発明の実施に有用な好ましいアジュバントは、Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質またはＦｃ−アジュバント融合タンパク質をコードする核酸を含む。Ｆｃ融合タンパク質に包含される好ましいアジュバントタンパク質は、サイトカインを含む。本明細書中で使用される場合、用語「サイトカイン」は、任意のタンパク質またはそのペプチドアナログもしくは機能的フラグメント（これらは、動物における免疫細胞（例えば：Ｔ細胞；Ｂ細胞；マクロファージ；好中球；好酸球；好塩基球；樹状細胞；およびこれらの前駆細胞）の活性を調節し得る）を意味することが理解される。好ましいサイトカインは、例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦおよびＧＭＣＳＦを含む。ＣＤ４０リガンドの細胞外ドメインはまた、Ｆｃに融合しＦｃ−アジュバントを形成するために好ましいタンパク質である。Ｆｃ−アジュバントを投与する場合、Ｆｃ−抗原融合タンパク質中の抗原は、Ｆｃ−抗原融合タンパク質をＦｃ−アジュバント融合タンパク質なしに投与する場合よりも強力な免疫応答を誘発し得る。いくつかの場合において、Ｆｃ−アジュバントを伴うＦｃ−抗原の免疫を２回だけ行った後に達成される抗体のレベルは、フロイントアジュバントで達成した抗体のレベルに比べて同程度であるかまたはより高く、そして皮膚の反応は検出されない。
【００４８】
Ｆｃ−抗原またはＦｃ−アジュバント融合タンパク質の免疫グロブリン重鎖定常領域を用いる場合、アジュバントタンパク質は、好ましくは、意図されるレシピエントにおいて、免疫原性ではないか、または弱い免疫原性に過ぎない。このことは、意図されるレシピエントと同一の種から単離可能なサイトカインに対応するアミノ酸配列によって規定されるサイトカインがＦｃ−アジュバント融合タンパク質に組み込まれることによって達成され得る。例えば、Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質がヒトに投与されるべき場合、アジュバントタンパク質（例えば、サイトカイン）は、好ましくはヒト起源である。
【００４９】
Ｆｃ−抗原およびＦｃ−アジュバント融合タンパク質の同時投与（同時にか、または一方を他方の後にかのいずれか）を使用して、予め選択された抗原に対して刺激される免疫応答の型を調節し得る。２つのクラスの免疫応答（Ｔｈ１およびＴｈ２と呼ぶ）は、異なる型の感染に応じて刺激され、かつ異なるサイトカインを含む。代表的には免疫応答に媒介されるＴｈ１は、天然には細胞性であり、代表的には免疫応答に媒介されるＴｈ２は、天然には体液性である。従って、Ｔｈ１応答は、改変された細胞（例えば、腫瘍細胞またはウイルス感染細胞）を攻撃するに有用であり得、一方、Ｔｈ２応答は、規制動物のような細胞外因子を攻撃するに有用であり得る。場合によって、免疫グロブリン重鎖定常領域に融合されたサイトカインを投与して一般的な免疫応答を刺激するか、あるいは特異的Ｔｈ１応答または特異的Ｔｈ２応答を開始または調節するかのいずれかをすることは有用である。
【００５０】
さらに、Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質に存在する特定のサイトカインの選択は、Ｆｃ−抗原融合タンパク質の予め選択された抗原に対して作製された抗体のクラスを影響し得る。例えば、Ｆｃ−ＩＬ１２は、Ｔｈ１サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＴＮＦ）として公知のものの産生を刺激することによってヘルパーＴ細胞応答を刺激する。これは、強力な細胞性免疫および抗体のＩｇＧ２ａクラスの産生を促進する。逆に、Ｆｃ−ＩＬ−４は、Ｔｈ２サイトカイン（例えば、体液性免疫を促進するＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−４）の産生を刺激する。
【００５１】
以前に議論されたように、好ましい実施形態において、方法は、Ｆｃ−抗原融合タンパク質またはＦｃ−抗原融合タンパク質をコードする核酸を、Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質と組み合わせて投与する工程を包含する。２つの融合タンパク質（各々が免疫グロブリン重鎖定常領域を含有する）を使用することによって、哺乳動物における同一または類似の細胞型で、予め選択された抗原およびアジュバントタンパク質（例えば、サイトカイン）の両方が同時局在することが可能である。例えば、マクロファージ、Ｂ細胞、顆粒球および樹状細胞は、これらの細胞表面上にＦｃレセプターを発現する。従って、Ｆｃレセプターに結合し得るＦｃ−抗原およびＦｃ−アジュバント融合タンパク質を同時投与することによって、抗原融合タンパク質の抗原およびアジュバント融合タンパク質のアジュバントが、ＡＰＣの同じ細胞性成分に同時に局在し得る。次いで、アジュバントは、予め選択された抗原の近傍における免疫応答を増強し得るか、あるいは、調節し得る。
【００５２】
Ｆｃ−サイトカインの組合せをまた相乗的な様式で使用して一般的な応答を刺激し得、次いで、細胞性応答（Ｔｈ１）または体液性応答（Ｔｈ２）のいずれが生じるかを左右し得る。例えば、Ｆｃ−ＧＭＣＳＦは、免疫応答の強力な一般的刺激因子である。しかし、細胞性免疫またはＴｈ１媒介性免疫に関する応答をさらに調節するために、例えば、Ｆｃ−ＩＬ１２またはＦｃ−ＩＦＮγのアジュバントタンパク質を、Ｆｃ−ＧＭＣＳＦと同時投与し得る。より体液性な応答またはＴｈ２媒介性応答を促進するために、例えば、Ｆｃ−ＩＬ４アジュバントタンパク質を、Ｆｃ−ＧＭＣＳＦと同時投与して、Ｔｈ２細胞の生成に関する応答を調節し得る。Ｆｃとの融合物として使用した他のＴｈ１促進サイトカインまたはＴｈ２促進サイトカインをまた、所望の生理学的応答の正確な性質に依存して使用し得る。この一般的なアプローチをまた使用して、応答を特定の抗原に近づけ、かつ逆のＴｈ型の新たな応答について免疫することにより有害なものから遠ざけることによって、存在する病原性応答（例えば、自己免疫（Ｔｈ１媒介性疾患）およびアレルギー（Ｔｈ２媒介性疾患））を調節し得ることが意図される。
【００５３】
いくつかの環境において、Ｆｃ−抗原融合タンパク質で動物を免疫する場合、アジュバントとして核酸を使用することが有用である。核酸（例えば、シトシンホスホジエステラーゼ連結グアノシン（ＣｐＧ）に富んだ配列を含むオリゴヌクレオチド）は、免疫応答をＴｈ１応答に偏らせ得、そして必要に応じて、サイトカインのような他のアジュバントと組み合わせて利用され得る（例えば、Ｂｒａｚｏｌｅｔら（１９９８）ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１５５５３−８；Ｌｉｕら（１９９８）ＢＬＯＯＤ  ９２：３７３０−６；およびＫｌｉｎｍａｎら（１９９７）ＩＭＭＵＮＯＬ．１５８：３６３５−３６３９を参照のこと）。従って、ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドをＦｃ−抗原融合物と同時投与し、増強されかつ適切に調節された免疫応答を達成し得ることが意図される。このような核酸分子は任意の長さの核酸分子であり得るが、８ヌクレオチド長より長いヌクレオチドが好ましい。核酸配列は、好ましくは、配列ＣｐＧを含み、そしてより好ましくは、配列プリン−プリン−Ｃ−Ｇ−ピリミジン−ピリミジンであり、ここで、中央のＣｐＧのシトシンは、メチル化されていない。アジュバントＤＮＡ中のＣｐＧジヌクレオチドの頻度は、好ましくは、少なくとも約５％であり、そしてより好ましくは、約１０％である。例えば、二本鎖形態のオリゴヌクレオチドＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号２２）を、アジュバントとして使用し得る。求められる免疫応答の型に依存して、核酸をミョウバンに連結することが有用であり得る。
【００５４】
本発明は、本発明の実施に有用なＦｃ融合タンパク質を作製するために従来の組換えＤＮＡ法を利用する。Ｆｃ融合構築物を、好ましくは、ＤＮＡレベルで作製し、そして得られたＤＮＡを発現ベクターに組み込み、そして発現して、本発明のＦｃ−抗原またはＦｃ−アジュバントの融合タンパク質を産生する。本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」は、宿主細胞ゲノムと読み換えられ、そして宿主細胞のゲノムに組み込まれるか、またはエピソームとして自発的に複製するにコンピテントなヌクレオチド配列を含む任意の核酸を意味することが理解される。このようなベクターとしては、核酸ベクター、プラスミドベクター、ファージミドベクター、コスミドベクター、ＲＮＡベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。ウイルスベクターの限定されない例としては、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられる。本明細書中で使用される場合、用語Ｆｃ融合タンパク質の「遺伝子発現」または「発現」は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写物の翻訳、およびＦｃ融合タンパク質産物の分泌を意味することが理解される。Ｆｃ融合タンパク質は、いずれもＩＬ２、ＣＤ２６、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＯＳＦ−２、ｂＩＧ−Ｈ３、ＩｇＥレセプター、ＰＳＭＡまたはｇｐ１２０を含み、本明細書中で議論される型の発現系を使用して発現された。同一または類似の発現構築物は、米国特許第５，５４１，０８７号および同５，７２６，０４４号に開示される。
【００５５】
遺伝子操作技術によるタンパク質の融合の代わりに、従来の化学的クロスリンカーを用いる化学的接合を使用して、タンパク質部分を融合し得る。
【００５６】
本発明の実施に有用な基本ベクターとして、例えば、ＳＶ４０ウイルス由来の転写調節配列およびＥ．ｃｏｌｉでのプラスミドの選択および維持のための細菌性プラスミド配列によって駆動される選択マーカー（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ））が挙げられる。Ｆｃ融合タンパク質配列の発現を、プロモーター配列そして必要に応じて、エンハンサー配列（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のプロモーター配列およびエンハンサー配列）によって駆動する。
【００５７】
Ｆｃ融合タンパク質またはこのような融合タンパク質をコードする核酸がヒトに投与されるべき場合、Ｆｃ融合タンパク質をコードする配列は、好ましくは、５’から３’の方向に開始して、例えば、抗体軽（Ｌ）鎖由来で、免疫グロブリン重鎖またはその変異体形態の少なくとも一部（好ましくは、ヒト免疫グロブリン重鎖ｇ１遺伝子のＦｃγ１領域由来）とインフレームで融合した「リーダー配列」を有する。免疫グロブリンＦｃγ１遺伝子のＦｃγ１領域は、好ましくは、少なくともヒンジドメインの一部およびＣＨ３ドメインを含み、そしてより好ましくは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ融合タンパク質がマウスに投与されるべき場合、免疫グロブリン重鎖定常領域をコードする好ましい核酸配列は、マウスＩｇＧ２ａ抗体由来のヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインをコードする核酸配列を５’から３’の方向に含む。必要ならば、免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシ末端を、予め選択された抗原（Ｆｃ−抗原の場合）または免疫刺激サイトカイン（Ｆｃ−アジュバントサイトカインの場合）のいずれかをコードする配列とインフレームでの連結のために核酸レベルで改変する。選択カセットをコードするＤＮＡは、そのゲノムの立体構造中またはｃＤＮＡの立体構造中であり得る。
【００５８】
シグナル配列をコードするＤＮＡの一部は、好ましくは、Ｆｃ融合タンパク質の分泌を指向し、その後Ｆｃ融合タンパク質の残余から切断されるペプチドセグメントをコードする。本発明のシグナル配列は、小胞体の膜を横切るタンパク質の輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。本発明において有用なシグナル配列として、抗体軽鎖シグナル配列（例えば、抗体１４．１８（Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９８９）Ｊ．ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬ．ＭＥＴＨ．１２５：１９１））、抗体重鎖シグナル配列（例えば、ＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列（Ｓａｋａｎｏら（１９８０）ＮＡＴＵＲＥ  ２８６：５７７４））、および当該分野において公知の任意のほかのシグナル配列（例えば、Ｗａｔｓｏｎ（１９８４）ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  １２：５１４５を参照のこと）が挙げられる。
【００５９】
シグナル配列は、当該分野において十分特徴付けられており、そして１６〜３０アミノ酸残基を含むことが代表的に公知であり、より多いかまたはより少ないアミノ酸残基を含み得る。代表的なシグナルペプチドは、以下の３つの領域からなる：塩基性Ｎ末端領域、中央の疎水性領域、およびより極性のＣ末端領域。中央の疎水性領域は、４〜１２の疎水性残基を含み、これらの残基は、初期のポリペプチドの輸送の間、膜脂質二重層を横切るシグナルペプチドをアンカーする。開始に引き続き、シグナルペプチドは通常、シグナルペプチダーゼとして公知の細胞性酵素によって小胞体の内腔内で切断される。シグナルペプチドの潜在的な切断部位は、一般的に「（−３，−１）規則」に従う。従って、代表的なシグナルペプチドは、−１位および−３位で小さな中性のアミノ酸残基を有し、かつこの領域においてプロリン残基を欠く。シグナルペプチダーゼは、−１のアミノ酸と＋１のアミノ酸との間でこのようなシグナルペプチドを切断する。従って、シグナル配列を、分泌の間に、融合タンパク質のアミノ末端から切断し得る。これによって、Ｆｃ融合タンパク質の分解が生じる。本発明の実施に有用なシグナルペプチド配列は、当該分野において周知である。例えば、ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．１４：４６８３を参照のこと。
【００６０】
当業者に明白であるように、分泌カセットにおける使用について特定のシグナル配列の適合は、いくつかの慣用的実験を要求し得る。このような実験は、Ｆｃ融合タンパク質の分泌を指向するシグナル配列の能力の決定、および／またはＦｃ融合タンパク質の十分な分泌に達するために使用される配列の最適な立体構造（ゲノムまたはｃＤＮＡ）を決定する工程を含む。さらに、当業者は、上記で参照したｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅによって提示される規則に従う合成シグナルペプチドを作成し得、そして慣用的実験によってこのような合成シグナル配列の効力を試験し得る。用語「シグナル配列」「シグナルペプチド」「リーダー配列」または「リーダーペプチド」を、本明細書中で相互変換可能に使用する。
【００６１】
Ｆｃ融合タンパク質またはこの融合タンパク質をコードする核酸配列の多くの異なる投与形態を使用して、予め選択された抗原に対してレシピエントを免疫し得ることが意図される。本発明の異なる２つの適用を使用して、ＣＴＬ応答を産生し得る。一つは、Ｆｃ−抗原融合タンパク質をコードするＤＮＡの注射に基づき、そして２番目は、タンパク質をＭＨＣクラスＩの経路に送達し得るＦｃ−抗原融合タンパク質の投与に基づく。
【００６２】
代表的に、タンパク質抗原の注射を使用して、哺乳動物における免疫応答を誘発する。しかし、本発明はまた、ＤＮＡ注射によって抗原をＡＰＣへ送達する方法を提供する。一般に使用される技術は、抗原性タンパク質をコードするＤＮＡ発現ベクターを筋肉中に注射することである。報告は、タンパク質抗原が筋肉細胞によって発現されるが、この抗原はこれらの細胞によって免疫系に提示されないということを示唆する。代替には、特定化されたＡＰＣ（例えば、マクロファージおよび樹状細胞）が注射部位に移動し、未だ詳述されていないプロセスを介して抗原を拾い上げかつ提示するということが考えられている。Ｆｃ−抗原融合タンパク質発現ベクターの使用は、このプロセスをより効率よくする。なぜなら、選択された融合タンパク質は、ＡＰＣにネイティブな抗原タンパク質よりも効果的に結合するためである。
【００６３】
ＤＮＡ注射アプローチの１つの結果は、しばしば、体液性応答および細胞性応答の両方の生成を生じ得ることである。代表的には、外因性に投与されるタンパク質は、ＭＨＣクラスＩ分子の提示に関する経路に入るのに困難な時間を有する。にもかかわらず、本発明のＦｃ融合タンパク質の投与は、おそらく、予め選択された外因性抗原のＭＨＣクラスＩ提示を介して、細胞障害性の細胞の生成を増加する。ＤＮＡ免疫およびタンパク質免疫の組合せはまた相乗的に働き、まず免疫系をプライムし、次いで抗体産生および細胞傷害性の細胞性応答の両方の形態での応答のレベルをブーストする。Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質（例えば、Ｆｃ−ＩＬ−２、Ｆｃ−ＧＭＣＳＦ、Ｆｃ−ＩＬ−１２およびＦｃ−Ｆｌｔ３リガンド）をＦｃ−抗原融合タンパク質とともに同時投与することによって、融合タンパク質をＡＰＣの同一の細胞区画へ同時に局在させることを確保し、それによって、予め選択された抗原に対するより強力な免疫応答を刺激する。
【００６４】
本発明の組成物（すなわち、Ｆｃ−抗原および／またはＦｃ−アジュバントの融合タンパク質、またはこのような融合タンパク質をコードする核酸配列）を、任意の適切な手段で直接（例えば、局所的に（組織の位置への注射、移植または局所投与によって））にかまたは全身的（例えば、非経口でかまたは経口で）に動物へ提供し得る。組成物が非経口で提供される場合（例えば、静脈内、皮下、眼、腹腔内、筋肉内、頬、直腸、膣、眼窩内、経皮、大脳内、頭蓋内、脊椎内、脳室内、髄腔内、槽内、包内、鼻腔内によってかまたはエアロゾル投与によって）、この組成物は、好ましくは、水性または生理学的に適合性のある液体の懸濁物または溶液の一部を含む。従って、キャリアまたはビヒクルは、生理学的に受容可能であり、その結果、所望の組成物の患者への送達に加えて、その他の点で患者の電解質および／または容積バランスに悪影響を及ぼさない。従って、薬剤のための液体培地は、正常の生理学的な生理食塩水（例えば、９．８５％の水溶性ＮａＣｌ、０．１５Ｍ、ｐＨ７〜７．４）を含み得る
Ｆｃ−抗原融合タンパク質の一投与当たりの好ましい投薬量は、５０ｎｇ／ｍ2〜１ｇ／ｍ2、より好ましくは５μｇ／ｍ2〜２００ｍｇ／ｍ2、そして最も好ましくは０．１ｍｇ／ｍ2〜５０ｍｇ／ｍ2の範囲内である。Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質の一投与当たりの好ましい投薬量は、１ｎｇ／ｍ2〜０．１ｇ／ｍ2、より好ましくは０．５μｇ／ｍ2〜２０ｍｇ／ｍ2、そして最も好ましくは１０μｇ／ｍ2〜５ｍｇ／ｍ2の範囲内である。Ｆｃ−抗原またはＦｃ−アジュバントの融合タンパク質をコードする核酸の一投与当たりの好ましい投薬量は、１μｇ／ｍ2〜１００ｍｇ／ｍ2、より好ましくは２０μｇ／ｍ2〜１０ｍｇ／ｍ2、そして最も好ましくは４００μｇ／ｍ2〜４ｍｇ／ｍ2の範囲内である。
【００６５】
最大免疫は、多数の別々の免疫（例えば、約３週間〜６ヶ月空けて１〜３回の接種）を実施することによって達成され得ることが意図される。さらに、上記で議論したように、最大免疫応答を、Ｆｃ融合タンパク質とこのようなＦｃ融合タンパク質をコードする核酸の投与との間で相互に行うことによって特定の環境下で達成し得る。Ｆｃ−抗原融合タンパク質またはこの融合タンパク質をコードする核酸は、Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質またはＦｃ−アジュバント融合タンパク質をコードする核酸を動物に投与する前か同時にかまたは後に、投与され得ることが意図される。しかし、投与、投薬量およびブーストのレジメンの最適形態は、十分当業者のレベル内である慣用的な実験によって決定され得ることが意図される。
【００６６】
本発明をさらに、以下の非限定的な実施例によって例示する。
【００６７】
（実施例）
（実施例１．Ｆｃ−抗原およびＦｃ−アジュバントの発現ベクターの構築物）
マウスモデルにおけるＦｃ融合タンパク質の免疫原性を適切に試験するために、発現ベクターを、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域をコードする核酸配列を使用して構築した。このベクターは、それぞれの融合タンパク質のＦｃ領域が動物において誘導する免疫応答の危険性を減少する。さらに、マウスサイトカインを、Ｆｃ−アジュバント融合構築物における融合パートナーとして使用した。なぜなら、これらの生物学的活性は、高度に種特異的であり得るからである。従って、以前に報告されたベクター（Ｌｏら（１９９８）ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  １１：４９５−５００）を、マウスＩｇＧ２ａ  ＦｃをコードするｃＤＮＡ（米国特許第５，７２６，０４４号）由来の配列でヒトＩｇＧ１  Ｆｃ配列を置換することによって改変した（図２を参照のこと）。
【００６８】
マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって、マウス脾細胞ライブラリーからクローニングした。ＰＣＲプライマーは、リーダー配列を連結するためのアダプター配列を５’末端に、そして抗原またはアジュバントサイトカインのいずれかをコードする配列との連結のために独特なＳｍａＩ／ＸｍａＩ制限部位を３’末端に含んだ。抗原配列およびアジュバント（サイトカイン）配列を、５’ＳｍａＩ部位で調製し、Ｆｃと抗原またはアジュバントタンパク質との間のリーディングフレーム、そして翻訳終止シグナルの直後に位置される独特なＸｈｏＩ部位を維持した。
【００６９】
生じたＤＮＡ構築物は、マウスＩｇＧ２ａ  Ｈ鎖のヒンジ領域に直接融合された軽鎖リーダー配列をコードし、そしてマウスＩｇＧ２ａ  ＣＨ２エキソンおよびＣＨ３エキソンならびに融合パートナー（抗原またはアジュバントサイトカインのいずれか）を通って続く。転写を、培養におけるほとんどの細胞型での発現に、ならびにインビボでのＤＮＡ注射に引き続く筋肉および他の細胞型における発現に有用であることが見出されているＣＭＶプロモーター／エンハンサーによって駆動した。Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドＤＮＡの維持に必要な配列と同様に、選択可能なジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）マーカー遺伝子を、安定にトランスフェクトされたクローンの選択を容易にするために各々のベクターに含んだ。
【００７０】
以下の例示的なＦｃ−抗原構築物を、設計したベクター（ｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ）中の独特なＳｍａＩ部位からＸｈｏＩ部位の間に、適切に適合した配列を挿入することによって作製した。ここで、「ｍｕ」はＦｃがマウス起源であることを示す：
ヒトＩＬ４レセプター（ＩＬ−４Ｒ）のエクトドメイン（細胞外部分）を、ＰＣＲ増幅を介してヒト末梢血単核（ＰＢＭＣ）からクローニングした。以下のプライマーを使用した：
【００７１】
【化１】
0004764585.tif 000002
これらのプライマーは、ｐｄＣｓ−ｍｕＦｃベクターへの挿入のためにそれぞれＳｍａＩ部位およびＸｈｏＩ部位を含む。このクローニングおよび以下のクローニングのために使用されたＰＣＲ反応条件は以下の通りであった。Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＫｌｅｎＴａｑおよびＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）ならびに特異的プライマーを使用して、目的の遺伝子を増幅した。反応混合物は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．０１％  ゼラチン（ｗ／ｖ）、各々０．２ｍＭのｄＮＴＰおよび１．２５ユニットのＫｌｅｎＴａｑを総量１００ｍｌに含んだ。３０回のＰＣＲサイクルを実施し、各サイクルは、９４℃で１分間の熱変性、４２℃で４５秒間のアニーリング、および７２℃で１分間のプライマー伸長からなる。次いで、増幅された産物を、ＳＫベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）にサブクローニングし、そしてそのＤＮＡ配列は、標準的配列決定方法論によって確認した。
【００７２】
ヒト前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のエクトドメインを、以下のプライマーを使用するＰＣＲを介して、ＬｎＣＡＰ前立腺癌細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７４０）からクローニングした：
【００７３】
【化２】
0004764585.tif 000003
これらのプライマーは、それぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖についてのものである。ＤＮＡ配列を確認し、そしてＰＣＲフラグメントをｐｄＣｓ−ｍｕＦｃベクターに挿入して、ｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ−ＰＳＭＡ融合構築物を作製した。
【００７４】
ほとんどの癌細胞においてアップレギュレートされる上皮細胞表面タンパク質であるヒトＥｐＣＡＭ（ＫＳ抗原としても公知）のエクトドメインを、以下のプライマーを使用するＰＣＲを介して、ＬｎＣＡＰ細胞からクローニングした：
【００７５】
【化３】
0004764585.tif 000004
これらのプライマーは、それぞれセンス鎖およびアンチセンス鎖についてのものである。ＤＮＡ配列を、標準的配列決定方法論によって確認し、そしてＰＣＲフラグメントをｐｄＣｓ−ｍｕＦｃベクターに挿入して、ｐｄＣｓ−ｍｕＦｃ−ＥｐＣＡＭ融合構築物を作製した。Ｎ末端融合パートナーとしてＥｐＣＡＭエクトドメインを使用して別のベクターを構築した。この場合において、ＰＣＲ産物は、膜貫通（ｓｐａｎｎｉｎｇ）ドメインの境界にＥｐＣＡＭ  ｃＤＮＡの天然のリーダー配列および成熟エクトドメイン配列を含んだ。このＰＣＲ産物の３’末端に、マウスＦｃフラグメントの５’Ａｆｌ  ＩＩ部位との接合のための操作したＡｆｌＩＩ部位を含んだ。使用したＰＣＲプライマーは、以下を含んだ：
【００７６】
【化４】
0004764585.tif 000005
この場合において、マウスＦｃは、融合タンパク質の挿入のための３’挿入部位を欠くが、Ｆｃコード配列の最後に翻訳終止シグナルを含んだ。
【００７７】
ＨＩＶ  ｇｐ４１の膜近傍領域の相対的に保存される部分（ＨｉｎｄＩＩＩ部位から膜貫通領域に隣接するリジン残基に伸びている）を、短いペプチド抗原配列の例としてのＦｃ融合タンパク質として発現した。ＨＩＶ  ＩＩＩＢ株由来のタンパク質配列を使用したが、コード配列を、ＧＣ含量の高いコドンバイアスを使用することによって最適な真核生物細胞発現のために最適化した。以下の配列：
【００７８】
【化５】
0004764585.tif 000006
を有するアミノ酸残基６２６〜６６９をコードするＤＮＡ配列を、化学的に合成し、そしてｐｄＣｓ−ｍｕＦｃベクターに連結した。融合ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下であった：
【００７９】
【化６】
0004764585.tif 000007
。
【００８０】
他のＨＩＶタンパク質をコードする配列を使用して、以前に記載されたように（米国特許第５，５４１，０８７号および同第５，７２６，０４４号）、原文のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ以外のマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃを用いてＦｃ−抗原融合タンパク質を構築した。これらの構築物は、さらに本発明の実施形態に示される。
【００８１】
マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃおよびいくつかのマウスサイトカインを含む一連のＦｃ−アジュバント（サイトカイン）を、Ｆｃ−抗原融合タンパク質として同様の様式で構築した。特定のサイトカインおよびクローニングプライマーは、以下に議論される。
【００８２】
マウスＩＬ−２を、以下のＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲを介してマウス末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からクローニングした：
【００８３】
【化７】
0004764585.tif 000008
。
【００８４】
マウスＧＭＣＳＦを、以下のＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲを介してマウスＰＢＭＣからクローニングした：
【００８５】
【化８】
0004764585.tif 000009
。
【００８６】
マウスＦｌｔ３リガンドを、以下のＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲを介してマウス胸腺からクローニングした：
【００８７】
【化９】
0004764585.tif 000010
。
【００８８】
マウスＩＬ−１２ｐ３５を、以下のＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲを介してマウスＰＢＭＣからクローニングした：
【００８９】
【化１０】
0004764585.tif 000011
。
【００９０】
マウスＩＬ−１２ｐ４０を、以下のＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲを介してマウスＰＢＭＣからクローニングした：
【００９１】
【化１１】
0004764585.tif 000012
。
【００９２】
全てのＰＣＲ産物（マウスＩＬ−１２ｐ４０を除く）を、ＳｍａＩからＸｈｏＩのフラグメントとしてクローニングし、標準的ＤＮＡ配列方法論によって分析し、そしてそのＦｃ領域としてマウスＩｇＧ２ａのＦｃを含有するｐｄＣｓ−ｍｕＦｃベクターに連結した。マウスＩＬ−１２ｐ４０のＰＣＲ産物を、同一のＣＭＶプロモーター／エンハンサー、成熟マウスＩＬ−１２のｐ４０サブユニット直接融合した軽鎖にリーダー配列、およびｐｄＣｓ−ｍｕＦｃベクター中のＤＨＦＲ選択マーカー遺伝子の代わりにネオマイシン耐性遺伝子を含有するベクターにおいて（Ｆｃ融合タンパク質としてではなく）別々に発現した。生じたベクターを、ｐＮＣ−ｍｐ４０と称し、ここで、「Ｎ」はネオマイシン選択遺伝子を示す。
【００９３】
全てのプラスミド構築物は、ヒト腎臓２９３細胞での一過性の発現によって特異的融合タンパク質の合成および分泌を誘導した。簡単には、プラスミドを、リン酸カルシウムとの同時沈殿によってヒト腎臓単層細胞２９３に導入した（Ｓａｍｂｒｏｏｌら（１９８９）ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）。この細胞を一晩（１６時間）放置し、ＰＢＳでリンスし、そして新鮮な細胞培養培地（１０％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ）で給餌した。さらなる２〜３日の後に、培養培地を、マウスＩｇＧ−Ｆｃタンパク質に対して特異的な抗体を使用するＦｃ特異的ＥＬＩＳＡ（Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９８９）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．ＭＥＴＨＯＤＳ  １２５：１９１）によって、分泌された融合タンパク質について試験した。マウスＦｃ−ＩＬ１２の場合において、Ｆｃ−ｐ３５発現プラスミドＤＮＡおよびＦｃ−ｐ４０発現プラスミドＤＮＡの両方を、同一の細胞培養物に一過性に発現した。その結果、ヘテロ二量体のサイトカイン融合タンパク質がアセンブリされ、その後細胞外に分泌した（Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９９８）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１６０：６１９５）。
【００９４】
その後に、種々のＦｃ融合タンパク質を発現する安定にトランスフェクトされた細胞を、標準的なエレクトロポレーション技術によって、直線化したＤＮＡをマウスＮＳ／０ミエローマ細胞に導入することによって作製した。簡単には、細胞を、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｃｕｖｅｔｔｅ（ＢｉｏＲａｄ）に１０7細胞／ｍｌで懸濁し、０．５ｍｌの懸濁液を、１０μｇのＤＮＡと混合し、そしてこの混合液を、氷上で１０分間冷却した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ）を０．２５Ｖおよび５００μＦに設定して使用して、エレクトロポレーションを、実施した。細胞を、１０分間氷上で回復させた後、増殖培地中に再懸濁し、そして９６ウェルプレートに移した。この細胞を、０．１μＭ  メトトレキサートを含有する選択培地で２〜３日ごとに給餌した（エレクトロポレーションの２日後に開始した）。９６ウェルプレート中で増殖する薬物耐性コロニーを、Ｆｃ  ＥＬＩＳＡプロトコルによって発現について試験した。
【００９５】
マウスＦｃ−ＩＬ１２融合タンパク質の発現について、マウスＩＬ−１２のｐ４０サブユニットをすでに発現しているＮＳ／０のトランスフェクトした細胞株を、マウスＦｃ−ｐ３５サブユニット発現ベクターで上記のようにトランスフェクトした。上記のｐＮＣ−ｍｐ４０ベクターを用いたＮＳ／０細胞のエレクトロポレーションおよびネオマイシンアナログであるＧ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する培地中での選択によって、ｐ４０発現株を得た。２度目のトランスフェクションの後、生存する細胞クローンを、Ｆｃ  ＥＬＩＳＡおよびマウスＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡ（Ｇｅｎｚｙｍｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）によってスクリーニングした。
【００９６】
生じた融合タンパク質の構造の保全性を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって試験した。最初に、融合タンパク質を、少容量（培地１ｍｌ当たり１０〜２０μｌ）のプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ）に結合した。結合物質を、Ｔｗｅｅｎ−２０（０．０１％）を含有するＰＢＳで洗浄し、次いで、ＳＤＳ含有緩衝液中に溶出させ、次いで、５％の２−メルカプトエタノールの存在下で２分間煮沸した。次いで、還元したタンパク質を、ｐｒｅ−ｃａｓｔ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、そしてクーマシーブルーで染色した。安定な細胞クローンからの大容量精製を、プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ）を使用して、製造業者の説明書に従って実施した。
【００９７】
（実施例２．Ｆｃ−抗原の免疫原性および抗体産生に対する化学アジュバントまたはＦｃ−サイトカインアジュバントの効果）
実施例１で調製したマウスＦｃ−ｈｕＩＬ−４Ｒαサブユニット構築物を抗原として使用して、動物モデルにおいてこれらのタンパク質の潜在的ＡＰＣ標的化効果を試験した。ＩＬ−４Ｒαサブユニットのエクトドメインは、ヒトとマウスとの間で５０％より大きな配列同一性を有する種間で完全に保存された分子を示す。
【００９８】
マウスの群に、５０μｇのＦｃ−抗原融合タンパク質（Ｆｃ−ＩＬ−４Ｒ）をＰＢＳでかまたはフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）に乳化してかのいずれかで皮下注射した。いくつかの群はまた、５μｇ用量（Ｆｃ−ＩＬ−４Ｒと混合した）のＦｃ−ＩＬ２またはＦｃ−ＧＭＣＳＦのいずれかのＦｃ−アジュバントタンパク質を受けた。２週間後、このマウスに、同一の混合物を注射したが、腹腔に投与した。ＣＦＡ処方物は、徐放性抗原の元を形成するように働き、免疫系の連続刺激を可能にするミセルを作成する。ＣＦＡ中のミコバクテリウムタンパク質はまた、サイトカイン刺激を通じて強力な炎症応答を誘導し、これによって、免疫応答をさらに増強する。しかし、ＣＦＡは、ヒトでは利用不可能にする皮膚損傷を含む重篤な副作用を生じる。しかし、ＰＢＳ中でのＦｃ−アジュバント融合タンパク質との混合物は、任意の動物における毒性の任意の可視的皮膚反応または任意の他の明白な徴候を誘発しないようである。
【００９９】
ブーストの２週間後（すなわち、第１の注射の２８日後）、この動物から採血し、そして遠心管内で全血を塊らせることによって血清を調製し、細胞を遠心分離によって除き、そして物質を５分間の高速（１２０００ＲＰＭ）で凝塊し、そして上清を回収した。生じた血清をアッセイ緩衝液（０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）で希釈し、そしてヒトＩＬ−４Ｒに反応する抗体について試験した。抗原特異的ＥＬＩＳＡを、ヒトＦｃ−ｈｕＩＬ−４Ｒでコートした９６ウェルプレート（ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌを各ウェルに１００μｌ添加し、そして４℃で（一晩）インキュベートした）を使用して実施した。次いで、抗原でコートしたプレートを洗浄し、そしてブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中に１％  ＢＳＡ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）でブロックした後に使用した。試験血清の希釈液を、ウェル内で室温にて２時間インキュベートし、次いで、ウェルをアッセイ緩衝液で８回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＦｃ特異的二次抗体（１：２０００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、そしてプレートをさらに１時間インキュベートした。アッセイ緩衝液での８回のさらなる洗浄の後、２５ｍＭクエン酸、５０ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ５）および０．０３％の直前に添加したＨ2Ｏ2を含むｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）溶液を添加した。約３０分後に１００μＬの４Ｎ  Ｈ2ＳＯ4を添加することによって反応を停止した。生じたプレートを、６５０ｎｍで読み取られるバックグラウンドを自動的に差し引くプレートリーダーにおいて４９０ｎｍで読み取った。結果を、光学密度対抗血清の希釈としてプロットした。抗体の相対的力価を、光学密度が任意の値（例えば１Ｏ．Ｄ．単位）に低下するまで希釈されるべき血清の量によって決定した。
【０１００】
免疫プロトコルの結果を、図３に示す。このプロトコルによるＰＢＳ中のマウスＦｃ−ＩＬ−４Ｒ融合タンパク質単独の注射によって、１匹のマウスのみが抗体応答を誘導した（図３Ｂ）。しかし、ＣＦＡの添加は、反応するより多くのマウスを生じたが、これらの力価は、ＰＢＳ中のＦｃ−ＩＬ−４Ｒ融合タンパク質単独での注射に反応するマウスに大まかには同一であった（図３Ｃ）。マウスＦｃ−ＩＬ２アジュバントをＰＢＳ中のＦｃ−ＩＬ４Ｒとの同時投与によって、全ての動物において反応を誘導したが、しかし、各々の場合において産生される抗体の量は変動した（図３Ｄ）。ＣＦＡおよびマウスＦｃ−ＩＬ２アジュバントとの組合せ（図３Ａ）は、いずれかの因子単独よりも高い抗体力価を生じた（図３Ｃおよび３Ｄ）。ＰＢＳ中のマウスＦｃ−ＧＭＣＳＦアジュバントの同時投与は、Ｆｃ−ＧＭＣＳＦアジュバントおよびＣＦＡの両方の組合せで免疫された群を含む（図３Ｆ）全ての群で最も強力な免疫応答を誘導した（図３Ｅ）。換言すると、マウスＦｃ−ＩＬ４Ｒ抗原と同時投与した場合、ＰＢＳ中のマウスＦｃ−ＧＭＣＳＦアジュバントは、ＣＦＡの使用の必要性を除く。このような方法は、ヒトにおける使用のためにより適切であることが意図される。
【０１０１】
（実施例３．Ｆｃ−ＰＳＭＡ融合タンパク質における癌抗原、ＰＳＭＡに対して産生される抗体に対するＦｃ−ＧＭＣＳＦアジュバント用量の効果）
ＰＳＭＡは、その制限された正常な組織分布のため、魅力的なヒト腫瘍関連標的抗原を現在示す。ＰＭＳＡを、目下、腫瘍ワクチン候補として臨床試験において試験している。本実施例において、Ｆｃ−ＰＭＳＡ融合タンパク質におけるＰＭＳＡ抗原の免疫原性を評価した。
【０１０２】
マウスＦｃ−ＰＳＭＡ融合タンパク質を実施例１に議論されるように調製した。マウスの群に、異なる濃度のＦｃ−アジュバント融合タンパク質Ｆｃ−ＧＭＣＳＦと共に、ＰＢＳ中の５０μｇのマウスＦｃ−ＰＳＭＡを皮下注射し、次いで、１４日後に、腹腔内注射によりブーストした。抗体力価を、Ｆｃ−ＩＬ４Ｒ融合タンパク質について実施例２に記載される通り、Ｆｃ−ＰＳＭＡ抗原捕捉ＥＬＩＳＡを介して測定した。結果を、抗体力価（ＯＤが１まで減少する希釈）対最初の注射後の時間として、図４においてプロットした。
【０１０３】
Ｆｃ−ＧＭＣＳＦの非存在下において、マウスは、１０００〜およそ２０，０００までの範囲のＰＳＭＡに対する抗体力価を有した（図４Ａ）。しかし、０．０５μｇと同じくらい少ないＦｃ−ＧＭＣＳＦのの同時投与は、３０，０００〜１４０，０００の範囲の力価を生じた（図４Ｂ）。Ｆｃ−ＧＭＣＳＦの１０倍の増加は、さらに、この癌抗原に対する抗体力価を刺激した（図４Ｃおよび４Ｄ）。与えられた最も高い用量（１匹のマウスあたり５μｇのＦｃ−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質）は、なお、１回の注射あたり約２μｇのＧＭＣＳＦ（マウス皮膚または動物が免疫された任意の全身性の徴候に対して効果を有さない用量）だけ示した（図４Ｄを参照のこと）。さらに、ＣＦＡと違って、脾臓に明らかな拡大は存在しなかった。
【０１０４】
（実施例４．免疫に対する抗体応答に関するＰＳＭＡのＦｃ−媒介送達の効果）
Ｆｃ−抗原およびＦｃ−アジュバント融合タンパク質の、Ｆｃ成分の特異的な効果を、融合タンパク質、非融合抗原またはアジュバントタンパク質、あるいは前述の混合物を注射したマウスにおいて誘導された免疫応答を比較することにより試験した。ヒトＰＳＭＡ系を、この目的のために使用した。
【０１０５】
融合されないＰＳＭＡを、製造説明書に従って、プラスミンを用いてヒトＦｃ−ＰＳＭＡ融合タンパク質のタンパク分解消化により調製した（Ｌｏら、（１９９８）ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  １１：４９５−５００）。関連Ｆｃおよび未消化Ｆｃ−ＰＳＭＡを、プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ）に対する吸着により除去した。
【０１０６】
マウスの群（ｎ＝３）を、単回の皮下用量の５０μｇのＰＳＭＡを、単独（図５Ａ）あるいは０．２μｇの遊離ＧＭＣＳＦ（図５Ｂ）または０．５μｇのＦｃ−ＧＭＣＳＦ（図５Ｃ）（０．５μｇのＦｃ−ＧＭＣＳＦは、約０．２μｇのＧＭＣＳＦを含む）と組み合わせて注射した。マウスの別のセットにおいて、各マウスを、一回の皮下用量の５０μｇのマウスＦｃ−ＰＳＭＡ融合タンパク質単独（図５Ｄ）あるいは０．２μｇの遊離ＧＭＣＳＦ（図５Ｅ）または０．５μｇのＦｃ−ＧＭＣＳＦ（図５Ｆ）と共に注射した。全ての注射処方物は、化学的アジュバントを含まないＰＢＳ中にあった。マウスＦｃ−ＰＳＭＡと反応する抗体を、免疫して１４日後に測定した。
【０１０７】
ＰＳＭＡの免疫原性に対する、Ｆｃ−ＰＳＭＡ融合タンパク質におけるＦｃ−抗原融合タンパク質のＦｃ成分の重要性は、動物に化学的アジュバントを含有しないＰＢＳ処方物を注射した場合に著しかった。ＰＢＳ中で投与されたＰＳＭＡに対する１次免疫応答は、本質的に存在しなかった（図５Ａ）。免疫に対するＧＭＣＳＦまたはＦｃ−ＧＭＣＳＦの添加は、ある動物における弱い応答（図５Ｂ）を除いて、ほとんど効果を有さなかった（図５Ｂおよび５Ｃ）。対照的に、Ｆｃ−ＰＳＭＡ単独で注射された動物は、全ての場合において、強い１次免疫応答を示した（図５Ｄ）。Ｆｃ−ＰＭＳＡへの遊離ＧＭＣＳＦの添加は、わずかな効果をブーストしたが（図５Ｅ）、Ｆｃ融合タンパク質としての抗原およびサイトカイン両方の同時投与は、最も高いレベルの応答を与えた（図５Ｆ）。
【０１０８】
これらの結果は、Ｆｃ−抗原およびＦｃ−アジュバントの組み合わせが、免疫応答を生成するのに特に有用であることを示し、そしておそらくＡＰＣに対して、インビボでの抗原および刺激サイトカインを同時に局在化する明らかな利益を示す。
【０１０９】
（実施例５．融合タンパク質Ｆｃ−ＧＭＣＳＦまたはＦｃ−Ｆｌｔ３Ｌのアジュバント効果の比較）
Ｆｌｔ３についてのリガンド（これは、当該分野でＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）とも呼ばれる）は、樹状細胞の発生および成熟に重要な役割を果たすことが示されている（Ｓｏｌｉｇｏら（１９９８）ＢＲ．Ｊ．ＨＡＥＭＡＴＯＬ．１０１：３５２〜６３）。樹状細胞は、組織マクロファージ細胞とともに、最も重要なＡＰＣであると考えられる。マウスでの研究において、１０日間の毎日の注射が、リンパ組織および脾臓から回収可能な樹状細胞の数およびＡＰＣ活性を増加すること、ならびにこれらの細胞がＣＤ４+Ｔ細胞およびＣＤ８+Ｔ細胞の両方に対する抗原提示において非常に強力であることが示された。皮膚のランゲルハンス細胞は、局所のリンパ節への取り込みおよび移動の後、抗原を提示し得る樹状細胞の１つの型を示すと考えられる。ほとんどの樹状細胞は、マクロファージで典型的に見出されるＦｃレセプター（例えば、ＦｃγＲＩ）のアレイを発現しないと考えられるので、Ｆｃ融合タンパク質の同時局在化効果がこの系統のＡＰＣに関与するか否かは予測し得ない。
【０１１０】
Ｆｌｔ−３Ｌがアジュバントとして機能し得るか否かを試験するため、マウスの群に、マウスＦｃ−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質（マクロファージおよび顆粒球の強力な刺激因子）を用いるのではなく、マウスＦｃ−ＰＳＭＡおよびマウスＦｃ−ＦＬｔ３Ｌを注射した。この場合、なんらかのアジュバント効果が樹状細胞による活性化および取り込みを介して媒介されることが予期された。これは、最終的には、ＰＭＳＡに対する抗体応答を生じる。この結果を図６にまとめる。
【０１１１】
この研究は、マウスＦｃ−Ｆｌｔ３Ｌが、同じ用量のＦｃ−ＧＭＣＳＦと同様か、そうでなければより優れた、抗ＰＳＭＡ抗体を刺激する強力なアジュバントであることを示す。この結果は、Ｆｃ−抗原とＦｃ−アジュバントの組合せが、免疫応答を誘導することにおいて特に強力であり得るという観察を支持する。この結果はまた、樹状ＡＰＣが、明かにＦｃ−抗原およびＦｃ−サイトカインならびにマクロファージＡＰＣで標的され得ることを示し、このことは、Ｆｃレセプターの少なくとも１つの形態がこれらの細胞に存在することを示唆する。
【０１１２】
（実施例６．Ｆｃ−ＥｐＣＡＭおよびＥｐＣＡＭ−Ｆｃ融合タンパク質に対する免疫応答）
別の非常に重要なヒト癌抗原であるＥｐＣＡＭ（ＫＳＡ抗原および１７−１Ａ抗原とも呼ばれる）は、実施例１に記載のプラスミドおよび方法を用いて、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域との融合タンパク質として生成され、そして単独でか、またはアジュバントとしてＦｃ−ＧＭＣＳＦと組合せてのいずれかで投与された。マウスに皮下注射し、そして１０μｇのＦｃ−ＥｐＣＡＭおよび１μｇのＦｃ−ＧＭＣＳＦを含有するＰＢＳを用いて３週間後にブースト（追加免疫）した。コントロールマウスにはＦｃ−ＧＭＣＳＦを投与しなかった。ＥｐＣＡＭに対する抗体の力価を、ブースト後、７日（図７Ａ）および１４日（図７Ｂ）に測定した。この結果は、Ｆｃ−ＥｐＣＡＭが、単独で投与された場合、強力な免疫原であること（白の菱形）、およびＦｃ−ＧＭＣＳＦが、この抗原に対する応答をさらにブーストし得ること（黒の三角）を示す。
【０１１３】
さらに、ＥｐＣＡＭ抗原は、ＥｐＣＡＭ−ｍｕＦｃのようなＦｃフラグメントに関して反対方向に発現された（実施例１、図１Ｂを参照のこと）。この分子を用いて、皮下注射により、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫した。より高用量のＥｐＣＡＭ−Ｆｃ融合タンパク質を用い（１用量あたり２５μｇ）、そしてアジュバントの量（２．５μｇＦｃ−ＧＭＣＳＦ）をまた増加させた。ＥｐＣＡＭに対する抗体の力価を、免疫後、１４日（図８Ａ）および２１日（図８Ｂ）に測定した。ＥｐＣＡＭ−Ｆｃ融合タンパク質単独は、Ｆｃ−ＧＭＣＳＦの非存在下で、完全に免疫原性であった（図８Ａおよび８Ｂ（白の菱形））。Ｆｃ−サイトカインの添加は、約３倍まで抗体力価を改善した（図８Ａおよび８Ｂ（黒い三角））。
【０１１４】
ＥｐＣＡＭに対する免疫応答が、この抗原を発現する腫瘍細胞から哺乳動物を防御し得るか否かを試験するため、免疫していないマウスまたはＥｐＣＡＭ−Ｆｃ融合タンパク質（そして、ある場合は、Ｆｃ−サイトカイン）で免疫したマウスに、ヒトＥｐＣＡＭでトランスフェクトした、１０5のＣＴ２６マウス結腸癌細胞を尾静脈注射した（Ｇｉｌｌｉｅｓら（１９９８）Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．１６０：６１９５）。２１日後、この動物を屠殺し、そして肺転移の程度を、（１）肺表面範囲の段階付け；および（２）肺を秤量し、そしてこれを正常な動物の肺と比較して、腫瘍塊に起因する異なる重量増加を決定すること、によって評価した。表１にまとめる結果は、免疫した全てのマウスが、コントロールマウス（ＥｐＣＡＭ−Ｆｃ融合タンパク質単独で免疫した動物を含む）に比べて、腫瘍転移において、統計学的に有意な減少を示したことを示す。同様の結果が、抗原としてＦｃ−ＥｐＣＡＭ融合タンパク質を用いて得られた。
【０１１５】
【表１】
0004764585.tif 000013
転移スコアは、以下のランク付けを用いて、肺の表面範囲に基いた：１＝１〜２５％の範囲；２＝２６〜５０％の範囲；３＝５１〜７５％の範囲；そして４＝７６〜１００％の範囲。
【０１１６】
（実施例７．単一の融合タンパク質における抗原−Ｆｃおよびサイトカインアジュバントの組合せ）
実施例６に記載のタンパク質であるＥｐＣＡＭ−Ｆｃは、カルボキシルタンパク質ドメインとして免疫グロブリンＦｃ領域に連結された、Ｎ末端抗原を例示する。このタンパク質およびそのような他のタンパク質は、Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質（例えば、Ｆｃ−サイトカイン）と同時投与され、抗原に対する免疫応答をブーストし得る。あるいは、抗原、免疫グロブリン重鎖定常領域およびアジュバントタンパク質（例えば、サイトカイン）は、単一の融合タンパク質として（例えば、ＥｐＣＡＭ−Ｆｃ−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質）産生され得る。
【０１１７】
このタンパク質についての発現プラスミドは、マウスＩｇＧ２ａ  ＦｃおよびＧＭ−ＣＳＦの配列を用いて構築され、その結果この構築物はマウスモデルにおいて評価され得る。リーダー−ＥｐＣＡＭ−Ｆｃコード配列を含有する短いＸｂａＩ〜ＳｍａＩのフラグメントは、もとのＥｐＣＡＭ−Ｆｃ発現ベクターから得られ（実施例１）、そしてＦｃ−ＧＭＣＳＦ発現ベクターの大きいＳｍａＩ〜ＸｂａＩフラグメントに連結される（図９）。
【０１１８】
得られたベクターである、ｐｄＣｓ−ＥｐＣＡＭ−Ｆｃ−ＧＭＣＳＦを、一過性発現のため、リン酸カルシウム沈殿法を用いて２９３細胞に、そして安定な発現のためにエレクトロポレーションによりＮＳ／０細胞に導入する。安定なトランスフェクト体を、メトトレキセート含有培地中で細胞を培養することにより選択した（０．１μＭ）。発現クローンをＦｃ  ＥＬＩＳＡにより同定し（実施例１を参照のこと）、そして高レベルのプロデューサーを培養中で増殖させた。ＥｐＣＡＭ−Ｆｃ−ＧＭＣＳＦタンパク質を、プロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ）への結合およびそれからの溶出によって馴化培地から精製し、そして構造的完全性を、２メルカプトエタノールで還元後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。この結果は、このタンパク質が、ＥｐＣＡＭ、ＦｃおよびＧＭＣＳＦの単鎖融合について予期されるように、約９０ｋＤの分子量を有したことを示した。
【０１１９】
組合せた融合タンパク質の相対的免疫原性を比較するため、マウスに等用量のＥｐＣＡＭ−Ｆｃ−ＧＭＣＳＦ、および以下：ＥｐＣＡＭ−ＦｃおよびＦｃ−ＧＭＣＳＦと組合せた個々の融合タンパク質を皮下注射する。同じ注射を１４日後に行い、そしてブースト７日後、ヒトＥｐＣＡＭ７に対する特異的抗体反応性について血清サンプルを試験した。同じアプローチを、他のタンパク質またはペプチド抗原について、ならびに他の刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＦｌｔ３Ｌ）について用い得る。
【０１２０】
（実施例８．ＤＮＡ注射によるＦｃ−抗原での免疫）
哺乳動物細胞におけるマウスＦｃ−ＥｐＣＡＭおよびＥｐＣＡＭ−ＦＣのトランスフェクションおよび産生のために用いた同じ発現ベクター（実施例１を参照のこと）を、「裸の（ｎａｋｅｄ）」プラスミドＤＮＡとして、ＢＡｌｂ／ｃマウスの群の後肢筋肉に注射した。ＤＮＡを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で注射し、そして総量１００μｇをＰＢＳまたは２５％（ｗ／ｖ）のスクロース溶液のいずれかにおいて投与した。注射を３週間ごと、全部で３回の注射を繰り返した。抗体応答を、異なる時点で測定し、そして捕捉のためにヒトＦｃ−ＥｐＣＡＭでコートした９６ウェルプレートを用いて、そして検出のためにＨＲＰ−結合体化抗マウスＦｃ特異的ポリクローナル抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、ＥＬＩＳＡにより定量した。図１０に示されるデータは、注射後１４日（図１０Ａ）、２７日（図１０Ｂ）、５５日（図１０Ｃ）、および６９日（図１０Ｄ）で記録した抗体力価を示す。
【０１２１】
図１０に示される結果は、両方の処方物を用いて、最初の１ヶ月の間、低力価の抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体しか誘導されないことを示す（図１０Ａおよび１０Ｂ）。かなり高用量を、５５日（図１０Ｃ）で観察し、そして６９日（図１０Ｄ）でさらにより高いレベルを得た。同様の結果を、ＥｐＣＡＭ−Ｆｃを発現するベクターのＤＮＡ注射を用いて得たが、この力価はより低かった。これらのデータは、タンパク質抗原および免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合分子として発現された抗原が、裸のＤＮＡの注射により導入される場合、免疫応答を誘導し得ること、および永続的な抗原曝露がほとんどの動物において遅延型の応答を導くことを示す。
【０１２２】
インビトロで異なる濃度のＦｃ−ＥｐＣＡＭタンパク質で刺激した、ＤＮＡワクチン接種したマウスまたはタンパク質免疫したマウス（注射後７０日）由来の脾細胞を培養することにより細胞性免疫応答を試験した。図１１に示されるデータ（上部パネル）は、Ｆｃ−ＥｐＣＡＭタンパク質（十字）またはＣＭＶプロモーター−ＥｐＣＡＭ−Ｆｃ（白丸）を発現するベクターもしくはＣＭＶプロモーター−Ｆｃ−ＥｐＣＡＭ（黒の菱形）を発現するベクターでのＤＮＡワクチン接種のいずれかで免疫した動物における抗原に対する増殖性反応（3Ｈチミジン取り込みにより測定される場合）を示す。タンパク質免疫した動物は、非常に低い用量でも、抗原に対するより大きい応答を示した。ＤＮＡワクチン接種した動物からの応答（図１１の下部分パネルに異なるスケールで示される）は、用量依存性であるが、タンパク質注射されたマウスよりも程度が低かった。これらの応答は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４+Ｔ細胞応答の特徴であった。
【０１２３】
細胞傷害活性（一般に、ＭＨＣクラスＩ拘束Ｔ細胞応答の指標）について試験するため、ＤＮＡまたはタンパク質で免疫したマウスからの脾細胞培養を、約１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で、５日間培養した。エフェクター細胞は、培養した脾細胞であり、そして標的細胞は、標識したヒトＥｐＣＡＭ−発現ＣＴ２６結腸癌細胞（Ｂａｌｂ／ｃマウスと同系）、または標識した親（トランスフェクトしてないＣＴ２６細胞）のいずれかであった。エフェクター細胞および標的細胞を異なる比で混合し、そして溶解の程度を決定した。界面活性剤の存在下で標識した標的細胞をインキュベートすることにより、１００％の溶解の値を達成し、そして遊離した標識の量を測定した。
【０１２４】
この結果を図１２に示す。ここでは、図１２Ａは、ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣＴ２６細胞に対する脾細胞の活性を示すが、図１２Ｂは、親のＣＴ２６細胞に対する脾細胞の活性を示す。両方の図について、白い菱形は、ＥｐＣＡＭ構築物を運搬するＤＮＡで免疫されたマウスから単離された脾細胞を示し、白の四角は、Ｆｃ−ＥｐＣＡＭ融合構築物を運搬するＤＮＡで免疫したマウスから単離された脾細胞を示し、白い三角は、Ｅｐ−ＣＡＭ−Ｆｃ融合構築物を運搬するＤＮＡで免疫したマウスから単離した脾細胞を示し、そして十字は、Ｆｃ−ＥｐＣＡＭ融合タンパク質で免疫したマウスから単離した脾細胞を示す。
【０１２５】
図１２は、ＤＮＡワクチン接種が両方の標的細胞に対して弱い細胞傷害性応答を生成したが、有意により高い細胞傷害性が、タンパク質で免疫したマウスで見られたことを示す。親のＣＴ２６腫瘍細胞およびＥｐＣＡｍを発現するＣＴ２６腫瘍細胞の両方を、このアッセイにおいて殺傷した。親のＣＴ２６細胞に対して観察された細胞傷害性は、これらの細胞が高レベルのマウスＥｐＣＡＭホモログ（アミノ酸レベルでヒトタンパク質に約８１％同一である）を発現し得るためであり得る。それにもかかわらず、Ｆｃ−ＥｐＣＡＭタンパク質免疫は、ヒトＥｐＣＡＭを発現するＣＴ２６腫瘍細胞に対して有意な細胞傷害活性を生じ、これにより、実施例６に記載される強力な腫瘍防御活性を説明する。
【０１２６】
（実施例９．タンパク質癌抗原の小領域を含むＦｃ−融合タンパク質での免疫）
いくつかの全タンパク質は、免疫療法のための抗原として有用であるかもしれないが、このタンパク質のより小さい小領域が、ずっと効果的であるかもしれない。例えば、タンパク質はそれを低免疫原性にするために翻訳後修飾されるドメインを含み得、これにより実際のポリペプチド成分に対して免疫活性が低下する。大きいタンパク質は、抗原の非ポリペプチド部分とのみ反応する抗体、および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介しない抗体（抗腫瘍免疫応答の重要な成分）を誘導し得る。この状況の最適の実施例は、ヒト黒色腫特異的コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）抗原により例示される。この抗原は、実質的に全ての黒色腫およびいくつかの型の脳癌で発現される。このタンパク質は、重度にグリコシル化され、そしていくつかのグリコサミノグリカン鎖の付着によりさらに修飾される。９．２．２７として公知の抗体（Ｂｕｍｏｌら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７９：１２４５〜１２４９）は、高い親和性でこのタンパク質に結合するが、どんなエフェクター機能（ＡＤＣＣまたは補体媒介性細胞傷害（ＣＤＣ）のどちらか）も媒介しない。この抗体の部分的にヒト化された（キメラ）形態でさえ、このような活性を媒介し得ない。
【０１２７】
この高分子の最適標的領域に対してより集中した応答を惹起するため、タンパク質配列中の推定グリカン付着部位を同定した。（Ｐｌｕｓｋｅら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：９７１０〜９７１５）。細胞表面膜にまたがる配列から遠からぬ小領域およびグリカン付着部位からいくらか離れた小領域を選択した。
【０１２８】
以下のペプチド配列：
ＱＧＡＴＬＲＬＤＰＴＶＬＤＡＧＥＬＡＮＲＴＧＳＶＰＲＦＲＬＬＥＧＲＨＧＲＶＶＲＶＰＲＡＲＴＥＰＧＧＳＱＬＶＥＱＦＴＱＱＤＬＥＤＧＲＬＧＬＥＶＧＲＰＥＧＲＡＰＧＰＡＧＤ（配列番号２１）を逆翻訳し、得られたＤＮＡ配列を化学的に合成し、そして先の実施例において用いた同じ制限部位を用いてｐｄＣｓ−Ｆｃ−Ｘ発現ベクター中に連結した。翻訳終止部位を、３’末端（最終のアミノ酸をコードする配列の直後）に加え、これに唯一のＸｈｏＩ部位が続いた。最終発現プラスミドをＮＳ／０黒色腫細胞中にエレクトロポレーションし、そして所望のタンパク質を発現する安定なトランスフェクト体を、実施例１に記載のように得た。
【０１２９】
Ｆｃ−ＭＣＳＰタンパク質をプロテインＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ，Ｎｅｅｄｈａｍ，ＭＡ）を用いて培養上清から精製した。抗体力価を、アジュバントとして、５μｇのＦｃ−ＧＭＣＳＦと組合せて、または単独のいずれかで、５０μｇのＦｃ−ＭＣＳＰ融合タンパク質（ＰＢＳ中）を用いて皮下免疫したＢａｌｂ／ｃマウスで測定した。この結果を図１３に示す。黒の菱形は、正常血清における抗体力価を示し、白の四角は、Ｆｃ−ＭＣＳＰで免疫したマウスの血清中の抗体力価を示し、そして黒の三角は、Ｆｃ−ＭＣＳＰおよびＦｃ−ＧＭＣＳＦアジュバントで免疫したマウスの血清における抗体力価を示す。
【０１３０】
ＭＣＳＰのこの小領域に対する特異的免疫応答は、１４日までに検出され、そしてブースター免疫後有意に増加した。この結果は、Ｆｃ−ＧＭＣＳＦおよびＦｃ−ＭＣＳＰの両方で免疫したマウスが、Ｆｃ−ＭＣＳＰ単独で免疫したマウス（白の四角）よりも、ＭＣＳＰに対してより高い抗体力価（黒の三角）を刺激したことを示す。
【０１３１】
（実施例１０．ウイルス抗原を含有するＦｃ−融合タンパク質を用いた免疫）
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（このウイルスはＡＩＤＳを起こす）に対する効果的なワクチンの開発は、ワクチン研究の最も重要な目的の１つである。近年、いくつかの報告により、このウイルスエンベロープの特定の特性が、免疫応答を、無関係なエピトープに対して応答させるように働き、これによりこのウイルス粒子の重要な領域および潜在的な中和領域をマスクすることが示された。これらは、デコイとして働く、非常にイムノドミナントな抗原性領域の存在、ならびに重要なエンベロープの免疫原性を物理的にマスクおよび減じる、過剰なグリコシル化を含む（Ｗｙａｔｔら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：７０５〜１１）。
【０１３２】
このデコイ機構を回避する１つの可能性のある方法は、ウイルスエンベロープ遺伝子の小さい領域を発現して、防御的でないイムノドミナントな反応を回避し、そして中和反応を誘導することである。小さいサブユニットワクチンに伴う問題の１つは、合成ペプチドまたは小タンパク質のいずれかでは免疫原性が低下することである。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）のような免疫原性キャリアタンパク質に対してこのタンパク質またはペプチドを結合することが１つのアプローチであった。これにより、タンパク質またはペプチドに起因して、ＫＬＨに対して、強力な応答を同様に誘導する。別のアプローチは、例えば、ｇｐ４１のエクトドメイン（ウイルスエンベロープ、ｇｐ１６０のアンカードメイン）の小領域について、実施例１に記載のＦｃとの融合タンパク質を作製することである。他のキャリアと異なり、免疫グロブリン領域は、「自己」として示され、これによりいずれのイムノドミナンス効果も最小限にする。
【０１３３】
Ｆｃ−ｇｐ４１ｐｅｐ６２６融合構築物は、マウス免疫グロブリンＦｃ領域のカルボキシル末端に融合した４４アミノ酸ポリペプチドを含んだ。この領域におけるＨＩＶ株ＩＩＩＢの配列は、Ｎ連結グリコシル化のためのシグナルを含み、これにより、一過性発現によって２９３細胞でか、または安定なトランスフェクションによりＮＳ／０黒色腫細胞かのいずれかで生成された、Ｆｃ−ｇｐ４１ｐｅｒｐ６２６融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の移動度で高い程度の変異を示し、それによりグリコシル化の程度における異質性を示す。
【０１３４】
このウイルス抗原が全く小さく（４４アミノ酸残基長）、そして異質にグリコシル化されているという事実にもかかわらず、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて免疫応答を惹起することは可能であった（図１４を参照のこと）。この場合、５匹のマウスの群に、２５μｇのＦｃ−ｇｐ４１ｐｅｐ６２６を、単独でか（白菱形）、または２．５μｇのＦｃ−アジュバント融合タンパク質、Ｆｃ−ＧＭＣＳＦ（白四角）もしくはＦｃ−ＩＬ２（黒三角）と組合せるかのいずれかで、１日目、そして２週間間隔でさらに２回、皮内注射した。図１４Ａおよび１４Ｂは、それぞれ、第２のブースト後、７日および３３日後に得られた抗体力価を示す。
【０１３５】
免疫応答は、Ｆｃ−サイトカインの同時投与により依存性であり、そして高力価に達するにはより長くかかる。より高い免疫応答がグリコシル化シグナル（実際には、多くの株がこの部位をコードしない）を含まないこの配列の改変体を用いて、またはインビトロで炭水化物糖側鎖を酵素的に除去することにより、惹起され得ることが予想される。
【０１３６】
（実施例１１：細胞表面分子の細胞外ドメインを含有するＦｃ−融合タンパク質のアジュバント活性）
Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質を構築するため、膜結合し得るタンパク質の細胞外ドメインをＦｃに融合させることが、しばしば有用である。例えば、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をＦｃのＣ末端のＮ末端に融合する。必要に応じて、リンカーを用いる。
【０１３７】
ＣＤ４０Ｌは、有用である。なぜなら、そのレセプターであるＣＤ４０は、Ｂ細胞の表面で発現され、そしてＴ細胞によるＢ細胞の刺激に関与するからである。腫瘍壊死因子と同様、ＣＤ４０Ｌは、三量体であり、細胞表面上で、そのレセプターの二量体化または三量体化を生じる。結果として、細胞内レセプタードメインは、コンタクト内に入れられ、そしてシグナル伝達を生じる。またＴＮＦと同様、ＣＤ４０Ｌは、膜結合され得るが、また細胞表面から切断され得、そしてサイトカインのように機能し得る。
【０１３８】
Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌ融合タンパク質は、Ｆｃ−抗原融合タンパク質とともに動物に同時投与される。コントロール実験では、Ｆｃ−ＣＤ４０Ｌタンパク質およびＦｃ−抗原タンパク質は、異なるセットの動物に投与される。両方の融合タンパク質を注射された動物が、個々にそれぞれの融合タンパク質を注射された動物よりもより高い力価の抗体を産生するということが考えられる。
【０１３９】
あるいは、抗原およびＣＤ４０Ｌ部分の両方を含む単一のＦｃ融合タンパク質を、ＦｃとＣＤ４０Ｌと抗原部分との間の任意のリンカー（Ｌ）とともに用いる。この融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に順にＦｃ−（Ｌ）−抗原−（Ｌ）−ＣＤ４０Ｌ、ＦＣ−（Ｌ）−ＣＤ４０Ｌ−（Ｌ）−抗原、抗原）Ｌ）−ＣＤ４０Ｌ−（Ｌ）−Ｆｃ、ＣＤ４０Ｌ−（Ｌ）−抗原−（Ｌ）−Ｆｃ−抗原−（Ｌ）−Ｆｃ−（Ｌ）−ＣＤ４０Ｌ、またはＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ−（Ｌ）−抗原−（Ｌ）であり得る。Ｆｃ−抗原、およびＣＤ４０Ｌを含む融合タンパク質を、動物に注射し、次いで、抗体力価を測定する。ＣＤ４０Ｌおよび抗原の両方の融合タンパク質の注射により生成された抗体力価は、Ｆｃおよび抗原またはＦｃおよびＣＤ４０Ｌのみを含有する融合タンパク質の注射により得られる力価よりも高いことが考えられる。
【０１４０】
融合タンパク質の上記の投与において、動物を、静脈内注射、皮下注射、または投与の他の適切な様式で注射する。抗原および／またはアジュバントの初回投与およびブースト投与と、抗体力価の測定との間の時間は、前の実施例に記載されるとおりである。あるいは、標準的投与量およびアッセイレジメンを用いる。
【０１４１】
（等価物）
本発明は、その精神またはその本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。従って、前述の実施形態は、本明細書において記載される本発明を限定するのではなく、全ての例示的観点において考慮される。従って、本発明の範囲は、前述の発明の詳細な説明によるのではなく添付の特許請求の範囲により示される。従って、特許請求の範囲の意図および等価の範囲内である全ての変更は、本明細書に包含されることが意図される。
【０１４２】
（参考としての援用）
本明細書において上記される全ての特許書類および科学刊行物の教示は、参考として本明細書に特に援用される。
【図面の簡単な説明】
本発明の前記および他の目的、特徴、および利点ならびに本発明自体は、添付の図面とともに読まれる場合、好ましい実施形態の以下の説明からより十分に理解され得る。
【図１】  図１Ａ〜１Ｇは、本発明の実施において有用である例示のＦｃ融合タンパク質の略図である。図１Ａは、免疫グロブリン重鎖定常領域１が抗原またはアジュバント２のＮ末端に結合される、Ｆｃ−抗原融合タンパク質またはＦｃ−アジュバント融合タンパク質を示す。図１Ｂは、免疫グロブリン重鎖定常領域１が抗原またはアジュバント２のＣ末端に結合される、Ｆｃ−抗原融合タンパク質またはＦｃ−アジュバント融合タンパク質を示す。図１Ｃおよび１Ｄは、ポリペプチド鎖のいずれかもしくは両方が、Ｆｃ−抗原融合タンパク質またはＦｃ−アジュバント融合タンパク質を含むダイマータンパク質を示す。図１Ｃにおいて、少なくとも１つのポリペプチド鎖では、免疫グロブリン重鎖定常領域１は、抗原またはアジュバント２のＮ末端に結合され、そして図１Ｄでは、免疫グロブリン重鎖定常領域１は、抗原またはアジュバント２のＣ末端に結合される。図１Ｅは、ポリペプチド鎖のいずれかもしくは両方が、Ｆｃ−抗原−抗原融合タンパク質、Ｆｃ−アジュバントアジュバント融合タンパク質、Ｆｃ−アジュバント抗原融合タンパク質またはＦｃ−抗原−アジュバント融合タンパク質を含むダイマータンパク質を示す。図１Ｆは、ポリペプチド鎖のいずれかもしくは両方が、抗原−Ｆｃ−アジュバント融合タンパク質またはアジュバント−Ｆｃ−抗原融合タンパク質を含むダイマー融合タンパク質を示す。図１Ｇは、ポリペプチド鎖のいずれかもしくは両方が、抗原−アジュバント−Ｆｃ融合タンパク質またはアジュバント−抗原−Ｆｃ融合タンパク質を含むダイマー融合タンパク質を示す。
【図２】  図２Ａ〜２Ｂは、本発明の実施において有用であるＤＮＡ配列の略図である。図２Ａは、ヒトＦｃ融合タンパク質発現ベクターを示す。図２Ｂは、マウスＩｇＧ  ２ａ  Ｆｃ融合タンパク質の発現のための遺伝子融合を示す。
【図３】  図３Ａ〜３Ｆは、Ｆｃ−抗原融合タンパク質であるマウスＦｃ−ヒトＩＬ−４レセプターエクトドメイン（Ｆｃ−ＩＬ−４Ｒ）融合タンパク質を用いて免疫したマウスにおける抗体産生に対する化学的アジュバントおよびＦｃ−サイトカインアジュバントの効果を示すグラフである。図３Ａにおいて、マウスは、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）中Ｆｃ−ＩＬ−４ＲおよびＦｃ−ＩＬ−２を用いて免疫された。図３Ｂにおいて、マウスは、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中Ｆｃ−ＩＬ−４Ｒを用いて免疫された。図３Ｃにおいて、マウスは、ＣＦＡ中Ｆｃ−ＩＬ−４Ｒを用いて免疫された。図３Ｄにおいて、マウスは、ＰＢＳ中Ｆｃ−ＩＬ−４ＲおよびＦｃ−ＩＬ−２を用いて免疫された。図３Ｅにおいて、マウスは、ＣＦＡ中Ｆｃ−ＩＬ−４ＲおよびＦｃ−ＧＭＣＳＦを用いて免疫された。図３Ｆにおいて、マウスは、ＰＢＳ中Ｆｃ−ＩＬ−４ＲおよびＦｃ−ＧＭＣＳＦを用いて免疫された。図３Ａ〜３Ｆにおいて、四角、菱形および三角は、３匹の別個のマウス由来のデータを示す。抗原に対する抗体のレベルは、ＥＬＩＳＡによって測定された；Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡ読み出しの光学密度を示す。
【図４】  図４Ａ〜４Ｄは、アジュバントとしてＦｃ−ＧＭＣＳＦの種々の量を用いてＦｃ−抗原融合タンパク質の形態でヒト癌抗原、ＰＳＭＡを用いてマウスを免疫することの効果を示すグラフである。図４Ａにおいて、マウスは、５０μｇのＦｃ−ＰＳＭＡ融合タンパク質単独で免疫された。図４Ｂにおいて、マウスは、５０μｇのＦｃ−ＰＳＭＡおよびアジュバントとして０．０５μｇのＦｃ−ＧＭＣＳＦを用いて免疫された。図４Ｃにおいて、マウスは、５０μｇのＦｃ−ＰＳＭＡおよびアジュバントとして０．５μｇのＦｃ−ＧＭＣＳＦを用いて免疫された。図４Ｄにおいて、マウスは、５０μｇのＦｃ−ＰＳＭＡおよび５μｇのＦｃ−ＧＭＣＳＦを用いて免疫された。図４Ａ〜４Ｄにおいて、四角、菱形および三角は、３匹の別個のマウス由来のデータを示す。
【図５】  図５Ａ〜５Ｆは、ネイティブタンパク質（５Ａ〜５Ｃ）またはマウスＦｃ−ＰＳＭＡ融合タンパク質（５Ｄ〜５Ｆ）のいずれかとして投与されたＰＳＭＡ抗原に対する特異的抗体応答を比較するグラフである。図５Ａにおいて、マウスは、抗原として５０μｇのＰＳＭＡを用いて免疫された。図５Ｂにおいて、マウスは、抗原として５０μｇのＰＳＭＡおよびアジュバントとして０．２μｇのＧＭＣＳＦを用いて免疫された。図５Ｃにおいて、マウスは、抗原として５０μｇのＰＳＭＡおよびアジュバントとして０．５μｇのＦｃ−ＧＭＣＳＦを用いて免疫された。図５Ｄにおいて、マウスは、抗原として５０μｇのＦｃ−ＰＳＭＡを用いて免疫された。図５Ｅにおいて、マウスは、抗原として５０μｇのＦｃ−ＰＳＭＡおよびアジュバントとして０．２μｇのＧＭＣＳＦを用いて免疫された。図５Ｆにおいて、マウスは、抗原として５０μｇのＦｃ−ＰＳＭＡおよびアジュバントとして０．５μｇのＦｃ−ＧＭＣＳＦを用いて免疫された。図５Ａ〜５Ｆにおいて、三角、菱形、および三角は、３匹の別個のマウス由来のデータを示す。抗原に対する抗体のレベルは、ＥＬＩＳＡによって測定された；Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡ読み出しの光学密度を示す。
【図６】  図６は、ヒトＰＳＭＡに対する抗体産生への、Ｆｃ−ＰＳＭＡを用いて同時投与されたＦｃ−ＧＭＣＳＦまたはＦｃ−Ｆ３Ｌのアジュバント効果を比較する図である。全ての動物は、５０μｇのＦｃ−ＰＳＭＡ単独か、またはアジュバントとして示されたＦｃ−サイトカインと組み合わされてのいずれかを受けた。１回の実験あたりに３匹のマウスが試験された。
【図７】  図７Ａ〜７Ｂは、Ｆｃ−ＥｐＣＡＭ融合タンパク質単独か、またはＦｃ−ＧＭＣＳＦアジュバントと組み合わされてのいずれかの個々のマウスにおける免疫原性を示すグラフである。図７Ａおよび７Ｂは、それぞれブーストから７日後および１４日後に測定された抗体力価を示す。ブーストは、１次免疫から３週間後に与えられた。両方の図において、白菱形は、１０μｇのＦｃ−ＥｐＣＡＭ単独を用いて皮下に免疫されたマウスを示し、そして黒三角は、１０μｇのＦｃ−ＥｐＣＡＭおよびアジュバントとして１μｇのＦｃ−ＧＭＣＳＦを用いて皮下に免疫されたマウスを示す。抗原に対する抗体のレベルは、ＥＬＩＳＡによって測定された；Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡ読み出しの光学密度を示す。
【図８】  図８Ａ〜８Ｂは、ＥｐＣＡＭ−Ｆｃ（Ｆｃ領域および抗原が逆方向）単独またはＦｃ−ＧＭＣＳＦアジュバント融合タンパク質と組み合わされてのいずれかでのマウスにおける免疫原性を示すグラフである。図８Ａおよび８Ｂは、それぞれの免疫から１４日後および２１日後（すなわち、ブーストから７日後）に測定した抗体力価を示す。両方の図において、白菱形は、２５μｇのＥｐＣＡＭ−Ｆｃ融合タンパク質を用いて免疫された３匹のマウスの平均力価を示し、そして黒三角は、２５μｇのＥｐＣＡＭ−Ｆｃおよびアジュバントとして２．５μｇのＦｃ−ＧＭＣＳＦを用いて免疫したマウスを示す。抗原に対する抗体のレベルは、ＥＬＩＳＡによって測定された；Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡ読み出しの光学密度を示す。
【図９】  図９は、ＥｐＣＡＭ−Ｆｃ−ＣＭＣＳＦ融合タンパク質をコードするプラスミドベクターを構築するための図を示す。この場合、抗原ＥｐＣＡＭは、免疫グロブリン重鎖定常領域（Ｆｃ領域）のアミノ末端に融合され、そしてアジュバントＧＭＣＳＦは、このＦｃ領域のカルボキシ末端に融合される。
【図１０】  図１０Ａ〜１０Ｄは、キャリアビヒクルとしてＰＢＳまたは２５％（ｗ／ｖ）スクロース溶液のいずれかを用いてＦｃ−ＥｐＣＡＭ融合タンパク質をコードするプラスミドベクターを注射したマウスにおける抗体力価を示すグラフである。図１０Ａ〜１０Ｄは、それぞれ、最初の注射から１４日後、２７日後、５５日後および６９日後に記録された抗体力価を示す。この図全体にわたって、白菱形は、ＰＢＳ中Ｆｃ−ＥｐＣＡＭコードプラスミドを注射した個々のマウスについての力価を示し、そして黒三角は、スクロース中Ｆｃ−ＥｐＣＡＭコードプラスミドを注射した個々のマウスについての力価を示す。抗原に対する抗体のレベルは、ＥＬＩＳＡによって測定された；Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡ読み出しの光学密度を示す。
【図１１】  図１１Ａ〜１１Ｂは、ＤＮＡワクチン接種またはタンパク質注射によって免疫されたマウスから単離された脾細胞の抗原でのインビトロ刺激に対する3Ｈチミジン取り込みの刺激を示すグラフである。図１１Ｂは、図１１Ａのより低い区分におけるデータの拡大図を示す。この図全体にわたって、黒菱形は、ＣＭＶ−Ｆｃ−ＥｐＣＡＭ融合タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡの１００μｇを用いて免疫されたマウスから採取された脾細胞を示し、白丸は、ＣＭＶ−ＥｐＣＡＭ−Ｆｃ融合タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡの１００μｇを用いて免疫さされたマウスから採取された脾細胞を示し、そして×印は、１０μｇのＦｃ−ＥｐＣＡＭタンパク質を用いて免疫されたマウスから採取された脾細胞を示す。この脾臓は、プラスミドＤＮＡまたはタンパク質の第１の注射および３週間間隔での２回のブースター注射から７０日後にマウスから取り出された。
【図１２】  図１２Ａ〜Ｂは、プラスミドＤＮＡまたはＦｃ−ＥｐＣＡＭタンパク質で免疫したマウス由来の脾細胞を用いる細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）殺傷アッセイを示すグラフである。図１２Ａは、ヒトＥｐＣＡＭタンパク質を発現するマウスＣＴ２６腫瘍細胞に対する脾細胞の活性を示す。図１２Ｂは、親マウスＣＴ２６腫瘍細胞に対する脾細胞の活性を示す。両方の図について、白菱形は、（ＣＭＶプロモーター）−ＥｐＣＡＭ構築物を保有するＤＮＡを用いて免疫した脾細胞を示し、白四角は、（ＣＭＶプロモーター）−Ｆｃ−ＥｐＣＡＭ融合構築物を保有するＤＮＡを用いて免疫されたマウス由来の脾細胞を示し、白三角は、（ＣＭＶプロモーター）−ＥｐＣＡＭ−Ｆｃ融合構築物を保有するＤＮＡを用いて免疫されたマウス由来の脾細胞を示し、そして×印は、Ｆｃ−ＥｐＣＡＭ融合タンパク質を用いて免疫されたマウス由来の脾細胞を示す。このＣＴＬアッセイには、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を用いて５日間育てた免疫したマウス由来の脾細胞を用いた。標識化標的細胞は、示されたエフェクターと混合し、そして４時間インキュベートした。放射活性の放出を使用して、特異的溶解のパーセンテージを算定した。
【図１３】  図１３は、ＰＢＳ中５０μｇのＦｃ−ＭＣＳＰ融合タンパク質単独かまたはアジュバントとして５μｇのＦｃ−ＧＭＣＳＦと組み合わされてのいずれかで皮下に免疫されたマウスにおける抗体力価を示すグラフである。黒菱形は、正常血清中の抗体力価を示し、白四角は、Ｆｃ−ＭＣＳＰ融合タンパク質単独を用いて免疫されたマウスの血清中の抗体力価を示す。そして黒三角は、Ｆｃ−ＧＭＣＳＦアジュバントと組み合わされたＦｃ−ＭＣＳＰ融合タンパク質を用いて免疫されたマウスの血清中の抗体力価を示す。抗原に対する抗体のレベルは、ＥＬＩＳＡによって測定された；Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡ読み出しの光学密度を示す。
【図１４】  図１４Ａ〜Ｂは、Ｆｃ−ｇｐ４１  ｐｅｐ  ６２６融合タンパク質単独かまたはＦｃ−サイトカインアジュバントと組み合わせてのいずれかで免疫したマウスにおける抗体力価を示すグラフである。図１４Ａおよび１４Ｂは、それぞれ、第２のブーストから７日後および３３日後に達成した抗体力価を示す。この図全体にわたって、白菱形は、２５μｇのＦｃ−ｇｐ４１  ｐｅｐ  ６２６抗原単独での皮内注射によって免疫したマウスにおける抗体力価を示し、白四角は、２．５μｇのＦｃ−ＧＭＣＳＦアジュバントと組み合わされた２５μｇのＦｃ−ｇｐ４１  ｐｅｐ６２６抗原の皮内注射によって免疫したマウスにおける力価を示し、そして黒三角は、２．５μｇのＦｃ−ＩＬ２アジュバントと組み合わされた２５μｇのＦｃ−ｇｐ４１  ｐｅｐ６２６抗原の皮内注射によって免疫したマウスにおける抗体力価を示す。抗原に対する抗体のレベルは、ＥＬＩＳＡによって測定された；Ｙ軸は、ＥＬＩＳＡ読み出しの光学密度を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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