(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
いびき音を抑制するための筋肉内投与される治療剤を製造するためのクロストリジウム毒素であるＡ型ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ/Ａ）の使用。
【請求項２】
いびき音を抑制するための筋肉内投与される治療剤を製造するためのクロストリジウム毒素であるＢ型ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ/Ｂ）、Ｃ１型ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ/Ｃ1）、Ｄ型ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ/Ｄ）、Ｅ型ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ/Ｅ）、Ｆ型ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ/Ｆ）および/またはＧ型ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ/Ｇ）の使用。
【請求項３】
いびき音を抑制するための筋肉内投与される治療剤を製造するための、
(ｉ)Ａ型ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ/Ａ）、Ｂ型ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ/Ｂ）、Ｃ1型ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ/Ｃ1）、Ｄ型ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ/Ｄ）、Ｅ型ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ/Ｅ）、Ｆ型ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ/Ｆ）、Ｇ型ボツリヌス毒素（ＢｏＮＴ/Ｇ）を含む群のクロストリジウム毒素の軽サブユニットおよび同じ群の異なるクロストリジウム毒素の重サブユニットを含む、クロストリジウム毒素としてのハイブリッド蛋白質、または
(ｉｉ)(ｉ)に記載のハイブリッド蛋白質の混合物の使用。
【請求項４】
いびき音を抑制するための筋肉内投与される治療剤を製造するための請求項１乃至３のいずれか１項に記載のクロストリジウム毒素または請求項３に記載のハイブリッド蛋白質と、治療的に耐用性が良好な１種以上の赤血球凝集素および/または製薬学的に耐用性が良好な非毒性蛋白質からなる複合体の使用。
【請求項５】
クロストリジウム毒素が組換え蛋白質であることによって特徴づけられる請求項１乃至４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
クロストリジウム毒素が凍結乾燥製品であることによって特徴づけられる請求項１乃至５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
クロストリジウム毒素が水溶液として存在することによって特徴づけられる請求項１乃至５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記水溶液が、注射用水溶液として存在することによって特徴づけられる請求項７に記載の使用。
【請求項９】
クロストリジウム毒素またはその複合体が生理食塩液として存在することによって特徴づけられる請求項７または請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
リポソームがクロストリジウム毒素またはその複合体にとって担体であることによって特徴づけられる請求項１乃至５のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
背景技術
毎夜のいびきは心理社会的な問題だけではない。この障害は、高血圧（Kleitman, 1963; Lugaresi et al., 1983; Hoffstein et al., 1991）並びに心筋虚血（Waller and Bhopal, 1989; Koskenvuo et al., 1985）および脳虚血（Kosekenvuo et al., 1987）などの循環系の疾患のリスク因子となる。さらに、気道狭窄患者は、特に、死亡率の増加に関連する睡眠無呼吸を発症するリスクがある（He et al., 1988; Hoch et al., 1986）。
【０００２】
軟口蓋は、横紋筋口蓋帆張筋、翼突筋、頤舌筋、頤舌骨筋および胸骨下骨筋を含む。呼吸時に、これらの筋肉のいくつかが活性化される。活性化の程度は、まだ詳細に解明されていないいくつかの他の要因に依存する。筋肉の相互作用が妨害されるといびきを生じることがある。いびきの1つの理由は、深い睡眠相中の口蓋帆張筋の緊張の増加である。レム相では、筋肉の緊張は低く、いびきは少なくなるか、または止まる（Lugaresi et al., 1994）。しかし、筋肉の緊張が増加すると、通過する呼吸空気の結果として振動を生ずる共鳴板が形成される。振動数が20〜30 Hzを上回ると、聞こえるようになる。振動数が高くなればなるほど、いびきの音の高さは高くなる。振動数は筋肉の緊張に依存する：より強力に緊張した筋肉は、わずかにしか緊張していない筋肉より高い周波数で振動し、弛緩している筋肉は振動しない。いびきの程度は、呼吸空気通過速度によって決定される振幅に相関する。
【０００３】
異常に緊張した横紋筋を長時間作用型筋弛緩剤で麻痺させると、この深い睡眠相中の筋緊張の増加は抑制され、いびきは生じない。
【０００４】
A、B、C1、D、E、FおよびG型ボツリヌス（Botulinum）毒素（BoNT/X）は、数週間持続する横紋筋の麻痺を誘導する強力な神経毒素である（Ahnert-Hilger and Bigalke, 1995）。麻痺の原因は、神経に供給されている神経末端からのアセチルコリン放出の阻害である。毒素は蛋白質であり、互いに共有結合して、総分子量がMR 150,000である異なるサイズの2つのサブユニットを含む。これらの神経毒素の一部は、赤血球凝集素および非毒性蛋白質を含む複合体（総分子量: MR 900,000）に包埋される。主に、神経毒素の存在が神経麻痺に必要であり、神経毒素は、長鎖、すなわち、毒素のC-末端サブユニットで、神経細胞だけに存在する受容体に結合する。受容体性細胞内取り込み作用によって、毒素は神経細胞によって取り込まれる。ここで、軽鎖、すなわち、N-末端サブユニットは、神経伝達物質含有小胞と形質膜との融合に主要な役割を果たす細胞自身の蛋白質を切断する（Schiavo and Montecucco, 1997）。切断の結果として、融合が抑制されると、神経伝達物質の放出が遮断され、筋肉は収縮できない。分泌胞膜および/または形質膜に存在する細胞自身の蛋白質（融合蛋白質）のいくつかが分泌過程または放出に関与する。これらの蛋白質には、SNAP 25、シナプトブレビン（VAMP）およびシンタキシン、それぞれ異性体型が挙げられる。これらの蛋白質は、分泌胞を形質膜の内側に固定するいわゆる融合複合体を形成する。固定の前には、緊張誘導性Ca++流入によって誘引される膜融合が生じる。例えば、蛋白質分解性切断による融合蛋白質のわずかに1つの不活性化の結果として、融合複合体の形成が妨害される。融合蛋白質は、上記神経毒素の軽鎖の標的分子である。例えば、BonNT/B、D、FおよびGはVAMPを切断するが、BoNT/A、C1およびEはSNAP 25を不活性化し、シンタキシンはBoNT/C1によって切断される。VAMPは、クロストリジウム（Clostridium）神経毒素群に属する蛋白質である破傷風毒素（TeNT）によっても不活性化される（Ahnert-Hilger and Bigalke, 1995）。
【０００５】
BoNT/Aは、例えば、痙性斜頚、眼瞼痙攣、種々の痙性等のような患者に大きな苦痛を与える局所的で、しばしば激痛を伴う種々の形態の筋緊張を治療するために治療用にすでに使用されている（Cardoso and Jankovic, 1995）。毒素はそれぞれの筋肉に注射される。数日後、筋肉は麻痺する。患者は痛みを感ずることはなく、再び自身の日常の業務に従事することができる。望ましくない副作用がまれに生ずることがあるが、望ましい作用と同様に、完全に回復可能である。
【０００６】
発明の説明
深い睡眠相中に口蓋筋の緊張亢進を抑制することができれば、いびきを生じなくすることができるだろう。緊張亢進はアセチルコリン放出の増加によって生ずるので、放出を遮断することにより筋肉を弛緩させることができ、いびきを生じなくすることができる。
【０００７】
ここで、本発明の目的は、クロストリジウム（Clostridium）毒素および/またはこの毒素の複合体または毒素もしくは複合体の含有物によって特徴づけられるいびき音を抑制するための治療剤によって解決される。
【０００８】
従って、本発明は、高純度クロストリジウム（Clostridium）毒素BoNT/Aによって特徴づけられるいびき音を抑制するための治療剤に関する。
【０００９】
従って、BoNT/Aは、軟口蓋のそれぞれの筋肉、例えば、口蓋帆張筋に小用量を注射することができる。同じ注射技術を使用して、軟口蓋のある種の筋肉の亢進した緊張の結果である痙攣性発生障害がすでに治療されている（Schonweiler et al., 1998）。
【００１０】
さらに、本発明は、高純度クロストリジウム（Clostridium）毒素BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/Fおよび/またはBoNT/Gによって特徴づけられるいびき音を抑制するための治療剤に関する。
【００１１】
さらに、本発明は、高純度クロストリジウム（Clostridium）毒素TeNTによって特徴づけられるいびき音を抑制するための治療剤に関する。
【００１２】
さらに、本発明は、
(i) BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/GおよびTeNTを含む群のクロストリジウム（Clostridium）毒素の軽サブユニットおよび同じ群の異なるクロストリジウム（Clostridium）毒素の重サブユニットを含む、クロストリジウム（Clostridium）毒素としてのハイブリッド蛋白質、または
(ii)(i)に記載のハイブリッド蛋白質の混合物
によって特徴づけられるいびき音を抑制するための治療剤に関する。
【００１３】
さらに、本発明は、
(i)クロストリジウム（Clostridium）毒素またはハイブリッド蛋白質および
(ii)治療的に耐用性が良好な1種以上の赤血球凝集素および/または製薬学的に耐用性が良好な非毒性蛋白質
を含む、複合体によって特徴づけられる治療剤に関する。
【００１４】
さらに、本発明は、野生型の複合体によって特徴づけられる治療剤に関する。
【００１５】
さらに、本発明は、クロストリジウム（Clostridium）毒素が組換え蛋白質であることによって特徴づけられる治療剤に関する。
【００１６】
さらに、本発明は、クロストリジウム（Clostridium）毒素が凍結乾燥製品であることによって特徴づけられる治療剤に関する。
【００１７】
さらに、本発明は、クロストリジウム（Clostridium）毒素が水溶液、詳細には、注射用水溶液として存在することによって特徴づけられる治療剤に関する。
【００１８】
さらに、本発明は、クロストリジウム（Clostridium）毒素またはその複合体が生理食塩液として存在することによってことによって特徴づけられる治療剤に関する。
【００１９】
最後に、本発明は、クロストリジウム（Clostridium）毒素またはその複合体の担体としてのリポソームによって特徴づけられる治療剤に関する。
【００２０】
純粋な神経毒素の投与は、神経毒素だけが活性を提供するので、複合体の注射と比較して好ましい。神経毒素は複合体より分子量が小さいので、拡散によって筋組織により迅速に分布され、受容体に結合し、神経終末部によって取り込まれることによりアセチルコリン放出を阻害する。他の外来蛋白質は、筋肉麻痺に関しては作用を持たないと思われる。しかし、それらは、免疫アジュバントとして作用して、免疫反応を増強するので、免疫系の刺激に寄与すると思われる。接種にはより強力な免疫応答が望まれる。しかし、いびきの治療剤の場合には、免疫反応により、抗体を望ましくなく形成し、追加投与の場合に作用を発揮する前に毒素を中和すると思われる。
【００２１】
生体の全ての開口部、従って、鼻-咽喉領域には、障害性物質の侵入を防止するリンパ組織が豊富である。この領域に傷害が生じたり、外来物質が侵入すると、マクロファージが誘引され、外来物質を取り込み、それらを消化し、細胞表面の細胞自身の蛋白質と共に外来物質の断片を排出する。脾臓および他のリンパ組織では、リンパ球が外来物質の断片を検出し、組織に遊離の状態で含有される外来物質に結合して中和する免疫グロブリンを形成する。
【００２２】
マクロファージの誘引の程度は、特に、外来物質の濃度およびマクロファージの利用率に依存する。マクロファージの利用率は影響されず、口蓋領域はこれらの細胞が豊富である。免疫反応の可能性を最小にするために、外来蛋白質、すなわち神経毒素および赤血球凝集素の質量をできるだけ小さくしなければならない。その理由は、作用のない外来物質（免疫アジュバント）によって大量に誘引されるマクロファージが、当然のことながら、組織内に存在する神経毒素も取り込むからである。神経毒素の質量は、高い生物活性を有するBoNTによって、わずかにしか活性を持たない用量まで低下することができる。随伴する蛋白質は望ましい作用には寄与しないので、本発明により除去することができる。
【００２３】
実施例1:
ビデオ喉頭鏡による間接的な注射を、直立座位の3人の健常人に実施した。唾液の分泌を抑制するために、毒素注射の30分前に、硫酸アトロピン（0.5 mg）を皮下投与した。局所的な血管収縮を形成するために、塩酸アドレナリン（1.2 mg）に塩酸テトラカイン（1%）添加したもので、咽頭口腔部、中咽頭および喉頭を表面麻酔した。凍結乾燥した精製BoNT/A（すなわち、随伴の外来蛋白質、BioteCon、Berlinを含有しない）を生理食塩液p.i.に溶解した（300pg/ml）。注射は、ビデオによる監視下で湾曲したカニューレを用いて実施した。カニューレを挿入中、通常に呼吸ができるかどうかを被験者に尋ねた。口蓋帆張筋の3箇所に、それぞれ、第1の被験者の場合には100 lを注射し、第2の被験者の場合には200 lを注射し、第3の被験者の場合には300 lを注射した。従って、毒素の投与量は50〜150 pg/口蓋であり、8〜25 Uに相当する。口蓋筋は3〜5日以内に弛緩した。毒素の作用は3〜4ヶ月持続した。この期間の後、いびき音が再び生じ、最初は軽く、次いで徐々にうるさくなった。
【００２４】
主観的（パートナーのインタビュー）および客観的測定により、いびきの低下を測定した。口蓋筋の弛緩の程度は、いびき音の周波数分析によって求めた。毒素の投与量に応じて、いびき音の周波数は低下した。さらに、いびきの音レベルが低下し、これは上気道の断面の拡大の結果であった。拡大の結果として、呼吸空気の流動速度が低下し、結果として軟口蓋の振動振幅が低下した。嚥下または言語障害は生じなかった。
【００２５】
実施例2:
実施例1に関して記載したように、被験者の口蓋帆張筋にBoNT/Bを注射した。総用量は15 pgで、4箇所の注射箇所に分けて注射した。注射容量は1 mlであった。口蓋筋は3〜5日以内に弛緩した。毒素の作用は約6週間持続した。この期間の後、いびき音が再び生じ、最初は軽く、次いで徐々にうるさくなった。
【００２６】
主観的（パートナーのインタビュー）および客観的測定により、いびきの低下を測定した。口蓋筋の弛緩の程度は、すでに実施例1に記載したように、客観的に求めた。このサブタイプの注射により、嚥下または言語障害は生じなかった。
【００２７】
実施例3:
実施例1に記載したように、被験者の口蓋帆張筋にBoNT/C1を注射した。この被験者は、痙性斜頚のために、BoNT/A複合体（BOTOX、Merz GmbH & Co. KG）で数年間治療されていた。1年前（1997年）、用量を150 Uから300 Uに倍にしても、頚部筋肉の麻痺は誘発されなかった。これに基づいて、単離された神経-筋肉調製物によって中和抗体が見出された（Goschel et al., 1997）。この患者のいびきを軽減するために、患者にBoNT/C1を投与した。総投与量は50 pgで、4箇所の注射箇所に分けて注射した。A型およびB型と比較して、C1型は特異的な毒性が低いので、用量の増加が必要であった。注射容量は1 mlであった。口蓋筋は3〜5日以内に弛緩した。毒素の作用は約14週間持続した。この期間の後、いびき音が再び生じ、最初は軽く、次いで徐々にうるさくなった。
【００２８】
主観的（パートナーのインタビュー）および客観的測定により、いびきの低下を測定した。口蓋筋の弛緩の程度は、すでに実施例1に記載したように、客観的に求めた。このサブタイプの注射により、嚥下または言語障害は生じなかった。
【００２９】
＜参考文献＞
Ahnert-Hilger, G., Bigalke, H.: Molecular aspects of tetanus and botulinum neurotoxin poisoning.  Progress Neurobiol. 46: 83-96, 1995.
Cardoso, F., Jankovic, J.: Clinical use of botulinum neurotoxins. Top Microbiol. Immunol. 195: 123-1 41, 1995.
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He, J., Kryger, M.H., Zorich, F.J., et al.: Mortality and apnea index in obstructive sleep apnea.  Chest 94: 9-14, 1988.
Hoch, C.C., Reynolds, C.F. III, Kupfer, D.J, et al.: Sleep disordered breathing in normal and pathologic aging. J. Clin. Psychol. 47: 4 99-503, 1986.
Hoffstein, V., Mateika, J.H., Mateika, S.: Snoring and sleeping architecture. Am. Rev. Respir. Dis. 143: 92-96, 1991.
Kleitman, N.: Sleep and wakefulness.  Chicago, The University of Chicago Press, 1963.
Koskenvuo, M., Kaprio, J., Partinen, M., et al.: Snoring as a risk factor for hypertension and angina pectoris.  Lancet i: 893-896, 1985.
Koskenvuo, M., Kaprio, J., Telakivi, T., et al.: Snoring as a risk factor for ischaemic heart disease and stroke in men. Br. Med. J. 294: 16-19, 1987.
Lugaresi, E., Cirignotta, F., Montagna, P., et al.: Snoring: Pathogenic, Clinical, and Therapeutic aspects.  In Abnormal sleep.  621-629, 1994.
Lugaresi, E., Mondini, S., Zucconi, M., et al.: Staging of heavy snorers disease.  A proposal. Bull. Eur. Physiopathol. Respir. 19: 590-594, 1983.
Schiavo, G., Montecucco, C.: The structure and mode of action of botulinum and tetanus toxin.  Clostridia: Mol. Biol. Pathog., 295-321, 1997.
Schonweiler, R., Wohlfahrt, K., Dengler, R., Ptok, M.: Supraglottal injection of botulinum toxin type A in adductor type spasmodic dysphonia with both intrinsic and extrinsic hyperfunction. Laryngoscope 108: 55-63, 1998.
Waller, P.C., Bhopal, R.S.: Is soaring a cause of vascular disease? An epidemiological review. Lancet i: 143-146, 1989.