(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パラミクソウイルスのＨＮ蛋白質を含むシュードタイプレトロウイルスベクターであって、下記（ａ）および（ｂ）からなる群より選択される蛋白質を含むベクター；
（ａ）該ＨＮ蛋白質であって、該ＨＮ蛋白質の細胞質側領域に図１４または１５の下線で示したアミノ酸配列を含むＨＮ蛋白質；
（ｂ）パラミクソウイルスのＦ蛋白質であって、該Ｆ蛋白質の細胞質側領域を少なくとも１５アミノ酸欠失しているＦ蛋白質。
【請求項２】
該（ａ）において、該アミノ酸配列が、該ＨＮ蛋白質由来の細胞質側領域に付加されている、請求項１に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター。
【請求項３】
該（ａ）において、該アミノ酸配列が、該ＨＮ蛋白質由来の細胞質側領域と置換されている、請求項１に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター。
【請求項４】
該（ｂ）において、細胞質側領域を少なくとも２８アミノ酸欠失している、請求項１に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター。
【請求項５】
該（ｂ）において、細胞質側領域を少なくとも３８アミノ酸欠失している、請求項１に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター。
【請求項６】
該（ｂ）のＦ蛋白質がレトロウイルスのエンベロープ蛋白質の細胞質側領域を含む、請求項１、４、または５に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター。
【請求項７】
オルトミクソウイルスＨＡ蛋白質をさらに含む、請求項１に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター。
【請求項８】
パラミクソウイルスのＦ蛋白質を含む、請求項１から３のいずれかに記載のシュードタイプレトロウイルスベクター。
【請求項９】
該Ｆ蛋白質が、該（ｂ）に記載の蛋白質である、請求項８に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター。
【請求項１０】
ヒト細胞に感染するウイルスに由来するエンベロープ蛋白質をさらに含む、請求項１から９のいずれかに記載のシュードタイプレトロウイルスベクター。
【請求項１１】
レトロウイルス由来のアンフォトロピックエンベロープ蛋白質を含む、請求項１０に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター。
【請求項１２】
水疱性口内炎ウイルス由来のＶＳＶ−Ｇ蛋白質を含む、請求項１０または１１に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター。
【請求項１３】
レトロウイルスベクターがオンコウイルスに由来する、請求項１から１２のいずれかに記載のシュードタイプレトロウイルスベクター。
【請求項１４】
レトロウイルスベクターがレンチウイルスに由来する、請求項１から１２のいずれかに記載のシュードタイプレトロウイルスベクター。
【請求項１５】
レンチウイルスがサル免疫不全ウイルスに由来する、請求項１４に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター。
【請求項１６】
パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、請求項１から１５のいずれかに記載のシュードタイプレトロウイルスベクター。
【請求項１７】
外来遺伝子を発現可能に含む、請求項１から１６のいずれかに記載のシュードタイプレトロウイルスベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のシュードタイプレトロウイルスベクターを含む、粘液を有する細胞への遺伝子導入用組成物。
【請求項１９】
粘液を有する細胞が粘膜上皮細胞である、請求項１８に記載の遺伝子導入用組成物。
【請求項２０】
粘膜上皮細胞が鼻腔または肺の気管支の粘膜上皮細胞である、請求項１９に記載の遺伝子導入用組成物。
【請求項２１】
血球系または造血系細胞への遺伝子導入用である、請求項１７に記載の遺伝子導入用組成物。
【請求項２２】
血球系または造血系細胞が造血幹細胞である、請求項２１に記載の遺伝子導入用組成物。
【請求項２３】
請求項１７に記載のシュードタイプレトロウイルスベクターを含む遺伝子導入用組成物。
【請求項２４】
医薬である、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項１７に記載のシュードタイプレトロウイルスベクターを非ヒト動物の細胞またはインビトロで細胞に接触させる工程を含む、外来遺伝子を細胞に導入する方法。
【請求項２６】
請求項１に記載のシュードタイプレトロウイルスベクターの産生用パッケージング細胞であって、下記（ａ）および（ｂ）からなる群より選択される蛋白質を発現する細胞；
（ａ）パラミクソウイルスのＨＮ蛋白質であって、該ＨＮ蛋白質の細胞質側領域に図１４または１５で下線で示したアミノ酸配列を含む蛋白質；
（ｂ）パラミクソウイルスのＦ蛋白質であって、該Ｆ蛋白質の細胞質側領域を少なくとも１５アミノ酸欠失しているＦ蛋白質、およびパラミクソウイルスのＨＮ蛋白質。
【請求項２７】
請求項１に記載のシュードタイプレトロウイルスベクターの製造方法であって、請求項２６に記載のパッケージング細胞内でレトロウイルス由来のジーントランスファーベクターＤＮＡを転写させる工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、パラミクソウイルスのＨＮ蛋白質を含むシュードタイプレトロウイルスベクターに関する。
背景技術
研究目的や遺伝子治療などにおいて外来遺伝子を標的細胞で発現させるために、レトロウイルスベクターが用いられている。レトロウイルスベクターは比較的容易に製造することが可能であり、導入遺伝子を宿主の染色体に組み込むことができるなどの利点を持っている。レトロウイルスベクターの感染には、一般にウイルスのエンベロープに存在するウイルス蛋白質が重要な役割を果たしている。これまで、レトロウイルスベクターのエンベロープ蛋白質を改変することにより、感染可能な宿主細胞を拡大させたり、または特異的な細胞にのみ感染するウイルスの開発が試みられてきた。
例えば、より広い宿主細胞に対して高い感染性を実現するために、レトロウイルスベクターのエンベロープにＶＳＶ−Ｇ蛋白質を組み込む系が開発されている（Ｈ．Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，６，１８７６−１８８３）。ＶＳＶ−Ｇは、水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）のエンベロープ表面に発現する蛋白質であり、非常に広い宿主細胞に対して感染性を示す。これ以外にも、例えばセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）のＦ蛋白質をエンベロープ蛋白質として用いる試みも行われている。Ｆ蛋白質によりシュードタイプ化されたレトロウイルスは、アシアログリコプロテイン受容体陽性細胞に対し特異的な感染性を示した（Ｍ．Ｓｐｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２８，１４２９−１４２９；Ｍ．Ｓｐｉｅｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７２，５２９６−５３０２）。
しかし、このような従来のシュードタイプレトロウイルスにおいても、様々な組織や細胞に対し十分な感染性を実現できてはいない。例えば、造血幹細胞をはじめとする各種の幹細胞は、遺伝子治療などにおける標的細胞として重要である（花園豊、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．７，１９９９）が、幹細胞の多くは非分裂状態にあり（Ａｂｋｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ，２（２），１９０−７，１９９６）、非分裂細胞に対する感染効率が低いレトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入は一般に困難である。また、従来の技術を用いたベクターシステムでは、肺の気道粘膜上皮細胞など、細胞外マトリックスに富んだ細胞への遺伝子導入は困難であった。これらの細胞に対して遺伝子を導入する場合、粘液などの細胞外マトリックスを洗浄して物理的に除去する方法が試みられている。しかしこの方法は煩雑であり、組織を傷つける危険が存在する。
発明の開示
本発明は、ヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質を含むシュードタイプレトロウイルスベクターを提供することを課題とする。
本発明者らは、レトロウイルスをシュードタイプ化するための蛋白質として、ヘマグルチニン活性を持つ蛋白質を選択した。ヘマグルチニン（ｈａｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，ＨＡｉｎ；赤血球凝集素）とはヘマグルチネーション（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ，ＨＡ；赤血球凝集反応）を起す蛋白質であり、多くのウイルスがこの活性を有することが知られている。本発明者らは、ヘマグルチニン活性を持つ膜蛋白質をエンベロープに含むレトロウイルスを作製することにより、様々なタイプの細胞や組織に対して高い遺伝子導入力を有するレトロウイルスベクターを構築することができると考えた。このようなレトロウイルスを製造するため、本発明者らは、広い宿主域を有するパラミクソウイルスのエンベロープ蛋白質を用いた。まず、センダイウイルス（ＳｅＶ）のエンベロープ蛋白質を発現するベクターを利用して、マウスレトロウイルス由来のウイルスベクターをＳｅＶ  Ｆおよび／またはＨＮ蛋白質でシュードタイプ化した。具体的には、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）を材料に、エコトロピックエンベロープ蛋白またはアンフォトロピックエンベロープ蛋白に加え、ＳｅＶのＦおよび／またはＨＮ蛋白を持つレトロウイルスを構築し、ヒト細胞に対する遺伝子導入効率を調べた（実施例１および２）。
ヒトの細胞に感染性のないエンベロープ蛋白質であるエコトロピックエンベロープ蛋白によりパッケージングを行った場合、Ｆ蛋白或いはＨＮ蛋白単独でシュードタイプ化したウイルスはヒト細胞への遺伝子導入は認められなかったが、Ｆ蛋白とＨＮ蛋白を同時に発現させてシュードタイプ化したウイルスでは本来感染性のないヒト細胞への遺伝子導入が認められた（図１  Ｅｃｏ）。この結果からセンダイウイルス以外のウイルス由来のベクターをセンダイウイルスのＦ蛋白とＨＮ蛋白でシュードタイプ化することによりそのウイルスベクターの感染宿主域を拡大しうることが明らかとなった。
ヒトの細胞に感染性をもつエンベロープ蛋白質であるアンフォトロピックエンベロープ蛋白によってパッケージングを行った場合、ＨＮ蛋白単独、或いはＦ蛋白とＨＮ蛋白を同時に発現させてシュードタイプ化させた場合のどちらにおいても、遺伝子導入効率が著しく向上することが明らかとなった（図１  Ａｍｐｈｏ）。この結果からレトロウイルスベクターをセンダイウイルスＨＮ蛋白単独でもシュードタイプ化しうること、センダイウイルスＨＮ蛋白単独によるシュードタイプ化或いはセンダイウイルスＦ蛋白とＨＮ蛋白でシュードタイプ化することによりレトロウイルスベクターの遺伝子導入効率を向上しうることが明らかとなった。
本発明者らは、また、ＨＮ蛋白でシュードタイプ化したアンフォトロピックレトロウイルスベクターを生産し、造血幹細胞を含むヒト骨髄細胞に対する遺伝子導入効率を検討した（実施例３）。ヒト骨髄ＣＤ３４陽性細胞にＨＮ蛋白でシュードタイプ化したベクターを感染させ、フローサイトメーターによりＣＤ３４をマーカーにして細胞を分画して遺伝子が導入された細胞を検出したところ、ＨＮ蛋白によるシュードタイプ化により、ＣＤ３４陽性細胞およびＣＤ３４陰性細胞共に遺伝子導入の効率が著しく上昇することが判明した（図３）。ＣＤ３４陽性細胞は造血幹細胞を含む細胞分画と言われており、ＨＮ蛋白によるシュードタイプ化が造血幹細胞を含む血球系・造血系細胞への遺伝子導入にも有効であることが示された。
本発明者らは次に、レトロウイルスの中でも遺伝子治療ベクターとしての利用が期待されているレンチウイルスを用いて、パラミクソウイルスのＦ蛋白質および／またはＨＮ蛋白質でシュードタイプ化したベクターの構築を行った。レンチウイルスとしては、遺伝子治療の分野において従来から用いられてきたヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）と比較して、安全性が高いなど様々な利点を有するサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を用いた（実施例５）。センダイウイルス（ＳｅＶ）からエンベロープを再構成させたビロソームまたは不活化センダイウイルスを調製し、これらを、ＶＳＶ−Ｇ蛋白でシュードタイプ化されているＳＩＶと融合させてＳｅＶのエンベロープ蛋白質を持つＳＩＶウイルスを作製した。このウイルスをヒト細胞と共にインキュベートし、ベクターの感染効率を検証した（実施例６および７）。その結果、ＶＳＶ−Ｇ蛋白でシュードタイプ化されたＳＩＶの場合と比べ、ＳｅＶのエンベロープを融合させたＳＩＶはより高い感染効率を示すことが判明した（図８）。感染効率の上昇には、センダイウイルスのＨＮ蛋白の寄与が高いことが示唆された。
ＳｅＶのエンベロープ蛋白の寄与を詳しく調べるため、本発明者らはＦＨＮビロソーム、Ｆビロソーム、およびＨＮビロソームを調製し、それぞれをＶＳＶ−Ｇシュードタイプ化ＳＩＶと融合させたベクターを作製し、その感染実験を行った（実施例７）。ＦＨＮビロソームを融合させたベクターは、ＳＩＶ単独よりも有意に高い遺伝子導入効率を示した（図１０）。ＨＮビロソームを用いた場合にも遺伝子導入効率の上昇が認められたが、Ｆビロソームを融合させた場合は、ＦＨＮビロソームで認められたような遺伝子発現の上昇は得られず、遺伝子導入効率の上昇にはＨＮ蛋白質が重要であることが裏付けられた。
本発明者らはさらに、ＳｅＶのエンベロープ蛋白質の発現ベクターを用いて、パッケージングの段階でＳｅＶのエンベロープ蛋白によりシュードタイプ化されたレンチウイルスベクターの製造を行った（実施例８）。ＶＳＶ−Ｇ蛋白に加え、Ｆ蛋白およびＨＮ蛋白でシュードタイプ化されたＳＩＶベクターは高い力価で産生され、このウイルスベクターは遠心によりさらに濃縮することが可能であった。本発明者らは、このベクターを用いてインビボにおける遺伝子導入試験を行った。
気管上皮粘膜細胞は、従来のウイルスベクターでは遺伝子導入が困難であり、導入に際して物理的障害を取り除く処理がされており、例えばＶＳＶ−ＧシュードタイプＨＩＶベクターを用いた遺伝子導入では二酸化硫黄などにより傷害しないと十分な導入効果が認められていない（Ｌ．Ｇ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７，５６８−５７４，２０００）。ＶＳＶ−Ｇ蛋白、並びにセンダイウイルスのＦおよびＨＮ蛋白によりシュードタイプ化したＳＩＶベクターが、傷害を与える必要なく気管上皮粘膜細胞に効率よく遺伝子を導入できるかを検討した（実施例９）。ＧＦＰを発現する上記のシュードタイプＳＩＶベクターをマウスに経鼻的に投与し、３日目の気管の組織切片におけるＧＦＰ蛋白を観察したところ、気管上皮細胞にＧＦＰの蛍光が観察された（図１１）。また、同じ個体の鼻中隔粘膜においても粘膜上皮に発現が観察され、多列線毛上皮にもＧＦＰの蛍光が認められた（図１２）。このように、本発明のウイルスベクターは、粘膜上皮などの粘液を有する細胞に対しても、細胞や組織を傷害することなく遺伝子を導入できることが証明された。
さらに本発明者らは、ＨＮ蛋白質の細胞質領域を改変した蛋白質を発現するベクターを構築し、これを用いて新たなシュードタイプ化ウイルスベクターの産生を行った。具体的には、ＳＩＶエンベロープ蛋白質の細胞質領域をＳｅＶ  ＨＮ蛋白質に付加、またはＨＮ蛋白質の細胞質領域をＳＩＶエンベロープ蛋白質の細胞質領域に置換した蛋白質、さらにＳｅＶ  Ｆ蛋白質の細胞質領域の全部または一部を欠失またはＳＩＶエンベロープ蛋白質の細胞質領域に置換した蛋白質を発現するベクターを構築し、これらの蛋白質を有するシュードタイプ化ＳＩＶベクターを構築した（実施例１１〜１２）。その結果、これらのベクターは、２９３Ｔ細胞やＢＥＡＳ−２Ｂ細胞などのヒト細胞に遺伝子導入する能力を有しており、ＨＮシュードタイプ化ベクターが、ＶＳＶ−Ｇなどの他のエンベロープ蛋白質を共存させることなしにヒト細胞へ遺伝子を導入し得ることが判明した。また、これらの改変ＨＮ蛋白質発現プラスミドを用いて構築した、ＭＳＣＶをベースとしたシュードタイプレトロウイルスベクターは、ヒト細胞に対して遺伝子を導入できることが明らかとなった（実施例１３）。改変ＨＮ蛋白質を有するシュードタイプ化ＳＩＶベクターを大量調製・濃縮し、ヒト骨髄細胞へ感染させたところ、ＣＤ３４＋骨髄細胞に高い効率で遺伝子を導入できることが判明した（実施例１４）。
さらに本発明者らは、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）蛋白質の発現ベクターを用いて、ＨＡシュードタイプ化レンチウイルスベクターを作製した。得られたウイルスはヒト細胞に遺伝子を導入する能力を有しており、遠心による高度の濃縮が可能であった（実施例１６）。また、インフルエンザウイルスＨＡ蛋白質とセンダイウイルスＨＮ改変蛋白質とを有するＨＡ／ＨＮシュードタイプ化レンチウイルスベクターを作製し、このベクターがヒト細胞に遺伝子を導入する能力を有することを確認した（実施例１７）
以上のように、本発明者らは、ヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質によりレトロウイルスをシュードタイプ化することにより、高い遺伝子導入効率を有するウイルスベクターを構築することに成功した。さらに該ウイルスベクターが、造血幹細胞を含む血球系および造血系細胞、および粘膜上皮細胞などの粘液を有する細胞に対し、エクスビボまたはインビボ投与において高い効率で遺伝子を導入できることを証明した。
本発明は、より詳しくは、
（１）ヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質を含む、実質的に純粋なシュードタイプレトロウイルスベクター、
（２）ヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質が一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスに含まれるヘマグルチニン活性を有する蛋白質に由来する、（１）に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター、
（３）ヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質がパラミクソウイルスのＨＮ蛋白質および／またはオルトミクソウイルスＨＡ蛋白質に由来する、（２）に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター、
（４）ヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質が一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスに含まれるヘマグルチニン活性を有する蛋白質の細胞質側領域の一部または全部が置換、欠失、および／または付加により改変された蛋白質である、（２）に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター、
（５）パラミクソウイルスのＦ蛋白質をさらに含む、（１）から（３）のいずれかに記載のシュードタイプレトロウイルスベクター、
（６）該Ｆ蛋白質の細胞質側領域の一部または全部が欠失および／または付加により改変されている、（５）に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター、
（７）ヒト細胞に感染するウイルスに由来するエンベロープ蛋白質をさらに含む、（１）から（６）のいずれかに記載のシュードタイプレトロウイルスベクター、
（８）レトロウイルス由来のアンフォトロピックエンベロープ蛋白質を含む、（７）に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター、
（９）水疱性口内炎ウイルス由来のＶＳＶ−Ｇ蛋白質を含む、（７）または（８）に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター、
（１０）レトロウイルスベクターがオンコウイルスに由来する、（１）から（９）のいずれかに記載のシュードタイプレトロウイルスベクター、
（１１）レトロウイルスベクターがレンチウイルスに由来する、（１）から（９）のいずれかに記載のシュードタイプレトロウイルスベクター、
（１２）レンチウイルスがサル免疫不全ウイルスに由来する、（１１）に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター、
（１３）パラミクソウイルスがセンダイウイルスである、（３）または（５）に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター、
（１４）外来遺伝子を発現可能に含む、（１）から（１３）のいずれかに記載のシュードタイプレトロウイルスベクター、
（１５）粘液を有する細胞への遺伝子導入用である、（１４）に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター、
（１６）粘液を有する細胞が粘膜上皮細胞である、（１５）に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター、
（１７）粘膜上皮細胞が鼻腔または肺の気管支の粘膜上皮細胞である、（１６）に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター、
（１８）血球系または造血系細胞への遺伝子導入用である、（１４）に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター、
（１９）血球系または造血系細胞が造血幹細胞である、（１８）に記載のシュードタイプレトロウイルスベクター、
（２０）（１４）から（１９）のいずれかに記載のシュードタイプレトロウイルスベクターを含む遺伝子導入用組成物、
（２１）医薬である、（２０）に記鎖の組成物、
（２２）（１４）から（１９）のいずれかに記載のシュードタイプレトロウイルスベクターを細胞に接触させる工程を含む、外来遺伝子を細胞に導入する方法、
（２３）ヘマグルチニン活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを発現可能に含む、（１）から（１９）のいずれかに記載のシュードタイプレトロウイルスベクターの産生用パッケージング細胞、
（２４）（１）から（１９）のいずれかに記載のシュードタイプレトロウイルスベクターの製造方法であって、（２３）に記載のパッケージング細胞内でレトロウイルス由来のジーントランスファーベクターＤＮＡを転写させる工程を含む方法、
に関する。
本発明のレトロウイルスベクターは、ヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質によりシュードタイプ化されていることを特徴とする、実質的に純粋なシュードタイプレトロウイルスベクターである。本発明において「ウイルスベクター」とは、宿主内に核酸分子を導入する能力を有するウイルス粒子を指す。「レトロウイルスベクター」とは、ベクターがレトロウイルスのバックボーンを有することを指す。「レトロウイルスのバックボーンを有する」とは、該ベクターを構成するウイルス粒子に含まれる核酸分子がレトロウイルスゲノムに基づくことを言う。例えば、ウイルス粒子に含まれる核酸分子がレトロウイルスゲノム由来のパッケージングシグナル配列を有するベクターは、本発明においてレトロウイルスベクターに含まれる。
「ヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質によりシュードタイプ化されているレトロウイルスベクター」とは、該レトロウイルスベクターの天然型が保持していない１つまたはそれ以上のヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質を保持しているレトロウイルスベクターをいう。本発明において「実質的に純粋なシュードタイプレトロウイルスベクター」とは、該シュードタイプレトロウイルスベクターが、レトロウイルス以外のヘマグルチニン活性を持つ複製型ウイルスを実質的に有さないことを指す。本発明のシュードタイプレトロウイルスベクターとしては、レトロウイルス以外の複製能を有するウイルスを実質的に有さないことが好ましい。複製能を有するとは、ウイルスベクターが宿主細胞に感染した場合、該細胞においてウイルスが複製され、感染性ウイルス粒子が産生されることを指す。例えば、シュードタイプレトロウイルスベクターを感染させた細胞において、ベクターの感染後にヘマグルチニン活性を表すＨＡ価（赤血球凝集反応）が感染初期の値より有意に上昇しなければ、このベクターは、ヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質を持つ複製能を有するウイルスを実質的に有さないと判定される。
ヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質としては、天然の蛋白質であるか人工的な蛋白質であるかは特に制限されないが、ウイルスが持つヘマグルチニン活性を有する蛋白質が好適である。これまでに様々なウイルスにおいてヘマグルチニン活性が検出されている。ヘマグルチニン活性の検出に用いられる赤血球の種類および反応の至適温度は、各ウイルスによって様々である。また、風疹ウイルスなどにおいては、反応にカルシウムイオンが必要であると言われている。アルボウイルスにおいては、反応の至適ｐＨは厳密である。ウイルスのヘマグルチニンとしては、エンテロ、風疹ウイルスなどではビリオンそのもの、アルボ、アデノなどではビリオン以外にもビリオンより小さい粒子としても存在する。ポックスウイルスのヘマグルチニンはビリオンとは別の脂質を含む粒子として存在する。本発明のシュードタイプレトロウイルスにおいては、このような蛋白質を含むものであってもよい。アデノＩＩＩ亜群のウイルスなどは、ラットの赤血球を部分凝集させる不完全凝集を起すが、このような蛋白質もヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質として用いることができる。
ヘマグルチニン活性（赤血球凝集反応；ＨＡ価）は公知の方法により試験することができる（国立予防衛生研究所学友会編，改訂二版  ウイルス実験学  総論，ｐｐ．２１４−２２５，丸善株式会社）。赤血球としては、例えばニワトリ（ヒヨコおよび成鶏を含む）、ガチョウ、ラット、モルモット、アカゲザル、ミドリザル、またはヒトなどの赤血球が用いられ得る。反応温度は、０℃、４℃、室温、または３７℃など、蛋白質により適した条件で行う。各ウイルスの赤血球凝集反応の反応条件の例を以下に示す。
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本発明シュードタイプレトロウイルスに含まれるヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質としては、特にウイルス蛋白に由来する蛋白質が好ましく、このような蛋白質としては、具体的には、パラミクソウイルスのＨＮ蛋白質、オルソミクソウイルスのＨＡ蛋白質、インフルエンザウイルスのＨＡ蛋白質、トガウイルスのＥ１蛋白質、ワクシニアウイルスのＡ２７Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｄ８Ｌ蛋白質、フラビウイルスのＭ、Ｅ蛋白質、コロナウイルスのＥ１、Ｅ２蛋白質、ブンヤウイルスのＧ１蛋白質などが挙げられる。中でも、本発明シュードタイプレトロウイルスに含まれるヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質としては、一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルスが有する蛋白質が好ましく、特にパラミクソウイルスのＨＮ蛋白質が好ましい。
本発明において「一本鎖ネガティブ鎖ＲＮＡウイルス」とは、一本鎖ネガティブ鎖［すなわち（−）鎖］ＲＮＡをゲノムに有するウイルスを言う。このようなウイルスとしは、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ，Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ，Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ，およびＰｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ，Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓ，およびＥｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、フィロウイルス（Ｆｉｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｉｎｆｕｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ  Ａ，Ｂ，Ｃ，およびＴｈｏｇｏｔｏ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ属等を含む）、ブニヤウイルス（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ，Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ，Ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ，およびＰｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ属等を含む）、アレナウイルス（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）などの科に属するウイルスが含まれる。
本発明において「パラミクソウイルス」とは、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）に属するウイルスを指す。パラミクソウイルスとしては、例えばセンダイウイルス（Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ）、ニューカッスル病ウイルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、おたふくかぜウイルス（Ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）、牛疫ウイルス（ｒｉｎｄｅｒｐｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ）、ジステンパーウイルス（ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、サルパラインフルエンザウイルス（ＳＶ５）、ヒトパラインフルエンザウイルス１，２，３型等が挙げられる。センダイウイルスは、野生株、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などが含まれる。ＤＩ粒子（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８，８４１３−８４１７（１９９４））等の不完全ウイルスや、合成したオリゴヌクレオチド等も、本発明のワクチンを製造するための材料として使用することができる。ＨＮ蛋白質はパラミクソウイルスが持つウイルス蛋白の１つである。パラミクソウイルスのウイルスタンパク質をコードする遺伝子としては、ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子が知られている。「ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、およびＬ遺伝子」とは、それぞれヌクレオキャプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ、およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のことを指す。パラミクソウイルス亜科に属する各ウイルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に、ＮＰ遺伝子は「Ｎ遺伝子」と表記されることもある。
0004700888.tif 000003
例えばパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）のパラミクソウイルス属（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）に分類されるセンダイウイルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのアクセッション番号は、ＮＰ遺伝子についてはＭ２９３４３、Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５１３３１，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ１７２１８、Ｐ遺伝子についてはＭ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ５５５６５，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８３，Ｘ１７００７，Ｘ１７００８、Ｍ遺伝子についてはＤ１１４４６，Ｋ０２７４２，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｕ３１９５６，Ｘ００５８４，Ｘ５３０５６、Ｆ遺伝子についてはＤ００１５２，Ｄ１１４４６，Ｄ１７３３４，Ｄ１７３３５，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００１５２，Ｘ０２１３１、ＨＮ遺伝子についてはＤ２６４７５，Ｍ１２３９７，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４６，Ｘ００５８６，Ｘ０２８０８，Ｘ５６１３１、Ｌ遺伝子についてはＤ０００５３，Ｍ３０２０２，Ｍ３０２０３，Ｍ３０２０４，Ｍ６９０４０，Ｘ００５８７，Ｘ５８８８６を参照のこと。
例えば、パラミクソウイルスのエンベロープ蛋白質によりシュードタイプ化されたレトロウイルスベクターは、例えば実施例に記載されたように、不活化パラミクソウイルス、またはパラミクソウイルスのエンベロープ蛋白質を持つビロソームなどを調製し、これをレトロウイルスに融合させることにより製造することができる。また、パラミクソウイルスのエンベロープ蛋白質を発現する発現ベクターを、レトロウイルスのパッケージング細胞で発現させることにより製造することができる。
本発明のシュードタイプレトロウイルスベクターは、例えばパラミクソウイルスのＨＮ蛋白質などのヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質に加えてパラミクソウイルスのＦ蛋白質をさらに含むことができる。本発明において、ＨＮおよびＦ蛋白を持つシュードタイプレトロウイルスベクターが、高い遺伝子導入効率を示すことが実証された。本発明には、このＦおよびＨＮ蛋白質を含むシュードタイプレトロウイルスベクターが含まれる。また、本発明のシュードタイプレトロウイルスベクターは、パラミクソウイルスのＭ蛋白質をさらに含んでもよい。
さらに、本発明のシュードタイプレトロウイルスベクターは、他のウイルス由来のエンベロープ蛋白質をさらに含むことができる。例えば、このような蛋白質として、ヒト細胞に感染するウイルスに由来するエンベロープ蛋白質が好適である。このような蛋白質としては、特に制限はないが、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧ蛋白質などが挙げられる。また、ヘルペスウイルス科の蛋白質としては、例えば単純ヘルペスウイルスのｇＢ、ｇＤ、ｇＨ、ｇｐ８５蛋白質、ＥＢウイルスのｇｐ３５０、ｇｐ２２０蛋白質などが挙げられる。ヘパドナウイルス科の蛋白質としては、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ蛋白質などが挙げられる。
例えば、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ（アンフォトロピックｅｎｖ）蛋白質およびＨＮ蛋白質を含むベクターは、本発明のベクターとして好適である。また、例えば水疱性口内炎ウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ；ＶＳＶ）の表面糖蛋白質であるＶＳＶ−Ｇ蛋白質を含むことができる。ＶＳＶ−Ｇはほとんどの動物細胞に存在するリン脂質をレセプターとしていると考えられており、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質およびＨＮ蛋白質を含むベクターを用いることにより遺伝子導入できる細胞種が飛躍的に増え、導入効率も上昇する。実際、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質およびＨＮ蛋白質を含むベクターは、ＶＳＶ−Ｇ単独を有するベクターよりも高い遺伝子導入効率を示した。従って、ＶＳＶ−Ｇ蛋白質およびＨＮ蛋白質を含むベクターは本発明のベクターとして好適である。これらのベクターは、さらにパラミクソウイルスのＦ蛋白質を含むことができる。すなわち、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質、Ｆ蛋白質、およびＨＮ蛋白質を含むベクター、並びにＶＳＶ−Ｇ蛋白質、Ｆ蛋白質、およびＨＮ蛋白質を含むベクターは本発明に含まれる。さらに、これらのベクターは、パラミクソウイルスのＭ蛋白質を含むことができる。すなわち、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質、Ｆ蛋白質、ＨＮ蛋白質、およびＭ蛋白質を含むベクター、並びにＶＳＶ−Ｇ蛋白質、Ｆ蛋白質、ＨＮ蛋白質、およびＭ蛋白質を含むベクターは本発明に含まれる。上記のような、パラミクソウイルス由来のＦおよびＨＮ蛋白質を含むベクター、並びにＦ、ＨＮおよびＭ蛋白質を含むベクターは、粘液を有する細胞や造血幹細胞を含む細胞分画など、従来では遺伝子の導入が困難であった細胞に対しても高い遺伝子導入能を示した。
ＶＳＶ−Ｇ蛋白質は１種類の糖蛋白が安定な３量体を形成して膜上に存在するため、精製過程でのベクター粒子の破壊が起こりにくく、遠心による高濃度の濃縮が可能となる（Ｙａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ：Ｓｅｐ，６（９），１２０３−１３．１９９５）。本発明者らはＶＳＶ−Ｇ、およびＦ，ＨＮでシュードタイプ化したＳＩＶベクターが遠心濃縮可能であることを確認した。
ベクターのシュードタイプ化のために用いるパラミクソウイルスのＨＮ、Ｆ、およびＭ蛋白質としては特に制限はない。特に、センダイウイルスを含むレスピロウイルス属の蛋白質は好適に用いられ得る。センダイウイルスのＨＮ、Ｆ、およびＭ蛋白質としては、例えばＺ株由来の蛋白質を用いることができる。また、レトロウイルスのアンフォトロピックエンベロープ蛋白質としては、例えばマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）４０７０Ａ株由来のエンベロープ蛋白質を用い得る。また、ＭｕＭＬＶ  １０Ａ１由来のエンベロープ蛋白質を用いることもできる（例えばｐＣＬ−１０Ａ１（Ｉｍｇｅｎｅｘ）（Ｎａｖｉａｕｘ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５７０１−５７０５（１９９６））。エコトロピックエンベロープ蛋白質としては、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）由来のエンベロープ蛋白質を用いることができる。水疱性口内炎ウイルスＧ蛋白（ＶＳＶ−Ｇ）としては、例えばＩｎｄｉａｎａ血清型株（Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９：５１９−５２８（１９８１））由来の蛋白を用いることができる。これら以外にも、所望の株由来の蛋白質を用いることができる。
ＨＮ、Ｆ、Ｍ、ＶＳＶ−Ｇ、およびレトロウイルスエンベロープ蛋白質など、上記のエンベロープ蛋白質は、野生型ウイルスが持つインタクトな蛋白質であってもよいし、天然または人為的に変異が導入されていてもよい。例えば、構造体蛋白質の１つであるＨＮ蛋白質は、赤血球凝集素であるヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）活性とノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることができれば、血液中でのウイルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば後者の活性を改変することにより、ＨＮ蛋白質による感染能を調節することも可能である。また、膜融合に関わるＦ蛋白質を改変することにより融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の抗原分子となりうるＦ蛋白質やＨＮ蛋白質の抗原提示エピトープ等を解析し、これを利用して抗原提示能を弱めた蛋白質を用いて本発明のシュードタイプレトロウイルスを作成することも可能である。また、病原性パラミクソウイルス等における弱毒株由来のエンベロープ蛋白質などを用いることもできる。
例えば、ヘマグルチニン活性を有するウイルスエンベロープ蛋白質や、他のエンベロープ蛋白質の細胞質側領域を欠失、置換、および／または付加により改変した蛋白質を用いて本発明のレトロウイルスベクターをシュードタイプ化することにより、より高い遺伝子導入能を有するベクターを製造することが可能である。本発明は、天然に存在するヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質の細胞質側領域の一部または全部が、置換、欠失、および／または付加により改変された蛋白質を含む、シュードタイプレトロウイルスベクターに関する。具体的には、例えばパラミクソウイルスのＨＮ蛋白質および／またはＦ蛋白質の細胞質側領域を欠失させたり、他の膜蛋白質（例えばレンチウイルスを含むレトロウイルスのエンベロープ蛋白質）の細胞質側領域で置換または付加した改変蛋白質は、感染効率の高いウイルスベクターを製造するために好適に用いられる。本発明は、ヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質であって、該蛋白質の天然型の細胞質側領域の一部または全部が、置換、欠失、および／または付加により改変されている蛋白質、およびこの蛋白質をコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）を提供する。特に本発明は、ウイルスが有するヘマグルチニン蛋白質の細胞質側領域が、置換、欠失、および／または付加により改変されている蛋白質、およびこの蛋白質をコードする核酸を提供する。例えば、配列番号：４０または４１に記載のアミノ酸配列を含む改変ＨＮ蛋白質は好適である。これらの改変蛋白質および該蛋白質をコードする核酸は、本発明のシュードタイプ化ウイルスの製造のために有用である。
具体的には、パラミクソウイルスのＨＮ蛋白質の細胞質側領域を、ＳＩＶ等のレンチウイルスまたはレトロウイルスのエンベロープ蛋白の細胞質側領城に置換した蛋白質（例えば実施例１１に記載のｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ／ＨＮがコードする蛋白質）、およびパラミクソウイルスのＨＮ蛋白質にレンチウイルス等のレトロウイルスのエンベロープ蛋白の細胞質側領域を付加した蛋白質（例えば実施例１１に記載のｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ＋ＨＮ）などでレトロウイルスをシュードタイプ化することにより、ヒト細胞を含む広い細胞に高率で外来遺伝子を導入することが可能となる。ＨＮ蛋白質において欠失させる細胞質側領域の範囲、および付加されるレトロウイルスのエンベロープ蛋白の細胞質側領域の範囲は特に制限はなく、細胞質側領域の一部または全部を欠失、置換、および／または付加させることができる。
このようなウイルスベクターは、さらにパラミクソウイルスの改変されたＦ蛋白質を含むことができる。例えば、パラミクソウイルスのＦ蛋白質の細胞質側領域を欠失させた蛋白質、および、このような欠失蛋白質にＳＩＶ等のレンチウイルスまたはレトロウイルスのエンベロープ蛋白の細胞質側領域を付加した蛋白質などが用いられ得る。具体的には、例えばＦ蛋白細胞質側領域のアミノ酸を欠失させた蛋白質を発現するプラスミドを構築する。欠失させる範囲は特に制限はなく、細胞質側領域の一部または全部を欠失させることができる。センダイウイルスＦ蛋白質を細胞質側領域を４アミノ酸残した欠失側Ｆ蛋白質（Ｆｃｔ４）を持つシュードタイプウイルスは、有意に高い遺伝子導入効率を示した。従って、０〜数個のアミノ酸を残して細胞質側領域を欠失させた蛋白質は、本発明のシュードタイプ化ウイルスの製造に好適と考えられる。これらの欠失型Ｆ蛋白質に、他のウイルスエンベロープ蛋白質（例えばレンチウイルスエンベロープ蛋白質）の細胞質側領域の一部または全部を付加することにより、Ｆ蛋白質の細胞質側領域を他のペプチドに置換した蛋白質を製造することができる。例えば、ＳＩＶのエンベロープ蛋白質の細胞質側領城の５’側より１１アミノ酸（ＳＩＶｃｔ１１）を付加した蛋白質などを例示することができる。このように本発明は、パラミクソウイルスのＦ蛋白質であって、該蛋白質の天然型の細胞質側領域の一部または全部が、置換、欠失、および／または付加により改変されている蛋白質、およびこの蛋白質をコードする核酸を提供する。特に本発明は、Ｆ蛋白質の細胞質側領域が、レンチウイルスを含むレトロウイルスのエンベロープ蛋白質の細胞質側領域の一部または全部と置換されている蛋白質、およびこの蛋白質をコードする核酸を提供する。例えば、配列番号：４２、４３、４４、４５、４６、または４７に記載のアミノ酸配列を含む改変Ｆ蛋白質は好適である。これらの改変蛋白質および該蛋白質をコードする核酸は、本発明のシュードタイプ化ウイルスの製造のために有用である。
また、ヘマグルチニン活性を有するウイルスのエンベロープ蛋白質として、オルトミクソウイルス科ウイルスのＨＡ蛋白質を用いることも好ましい。例えば、インフルエンザウイルスのエンベロープ蛋白発現プラスミドを用いて製造されたシュードタイプウイルスは、ヒト細胞を含めた広い哺乳動物細胞に感染可能である。インフルエンザウイルスエンベロープには所望の単離株由来のものが用いられ得る。インフルエンザウイルスのｂｕｄｄｉｎｇにおいては、ノイラミニダーゼがシアル酸との結合を切断する役割を担っている。このため、ＨＡシュードタイプ作製においてはノイラミニダーゼで処理することで感染性ウイルスを得ることができる。あるいは、ノイラミニダーゼ活性を有する蛋白質を共存させたウイルスベクターを作製することによって、自動的にシアル酸との結合を切断させることができる。この場合、パラミクソウイルスのＨＮ蛋白質などの、ノイラミニダーゼ活性を有するウイルスエンベロープ蛋白質を用いることが特に好適である。このように本発明は、ＨＡ／ＨＮ蛋白質でシュードタイプ化されたレトロウイルスベクターを提供する。
本発明のレトロウイルスベクターは、オンコウイルスに由来するものが含まれる。「オンコウイルス」とは、オンコウイルス亜科（Ｏｎｃｏｖｉｒｕｓ）に属するレトロウイルスを指す。オンコウイルスには、肉腫ウイルス、白血病ウイルス、および乳癌ウイルスなど、発癌に関連するレトロウイルスが含まれる。例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋａｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ；ＭｏＭＬＶ）は、もっとも初期に開発されたレトロウイルスベクターの１つであり、これまでに多くの改良がなされ広く用いられている。ＭｏＭＬＶをパラミクソウイルスＨＮ蛋白質などのヘマグルチニン活性を有する蛋白質でシュードタイプ化したウイルスベクターは本発明において好適に用いられ得る。また、実施例で用いられたマウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ；ＭＳＣＶ）も、特に血球系・造血系細胞および胎児性幹細胞などに対する遺伝子導入のためのベクターとして好適である。
また、本発明のレトロウイルスベクターは、レンチウイルスに由来するものが含まれる。レンチウイルスとは、レンチウイルス亜科（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）に属するレトロウイルスを指す。レンチウイルスには、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；ＨＩＶ）（例えばＨＩＶ１またはＨＩＶ２）、サル免疫不全ウイルス（ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ；ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、マエディ・ビスナウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）などが含まれる。本発明のレトロウイルスベクターは、所望の株およびサブタイプに由来するものであってよい。例えばＨＩＶ−１としては、全てのメジャー（Ｍ）サブタイプ（ＡからＪを含む）、Ｎおよびｏｕｔｌｉｅｒ（Ｏ）が含まれる（Ｈｕ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  １９９６；２７５：２１０−２１６；Ｚｈｕ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９８，５；３９１（６６６７）：５９４−７；Ｓｉｍｏｎ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９８，４（９）：１０３２−７）。ＳＩＶ単離株としては、ＳＩＶａｇｍ、ＳＩＶｃｐｚ、ＳＩＶｍａｃ、ＳＩＶｍｎｄ、ＳＩＶｓｎｍ、ＳＩＶｓｙｋ等が例示できる。
レンチウイルスの特徴は、非分裂細胞に対しても感染し、宿主細胞の染色体へウイルスゲノムを組み込む性質を持つことである。これにはｇａｇおよびｖｐｒにコードされている核移行シグナルが重要な働きをしているものと考えられている。この性質を利用し、レンチウイルスをベースとした本発明のウイルスベクターを作れば、生体内組織の非分裂細胞、種々の組織の幹細胞のようにほとんど分裂しない細胞へも遺伝子を導入し、長期間の遺伝子発現が可能となると考えられる。
レンチウイルスの中でもっとも早くベクター化の試みが行われたのはヒト免疫不全ウイルスＨｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ（ＨＩＶ）であり、本発明においても好適に用いられ得る。また、ネコ免疫不全ウイルスＦｅｌｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ（ＦＩＶ）（Ｐｏｅｓｃｈｌａ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４（３），３５４−７，１９９８）やヤギ関節炎脳炎ウイルスＣａｐｒｉｎｅ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ（ＣＡＥＶ）（Ｍｓｅｌｌｉ−Ｌａｋｈａｌ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１４３（４），６８１−９５，１９９８）をベースとしたベクターの開発が行われている。これらのベクターを本発明のベクターの製造に用いることも可能である。
サル免疫不全ウイルス（Ｓｉｍｉａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｉｒｕｓ，ＳＩＶ）はサルにおけるＨＩＶ類似ウイルスとして発見され、ＨＩＶとともにＰｒｉｍａｔｅｓ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓグループを形成している（井戸栄治，速水正憲，サル免疫不全ウイルスの遺伝子と感染・病原性，蛋白質核酸酵素：Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．８，１９９４）。このグループはさらに大きく４つのグループに分類され、１）ヒトにおいて後天性免疫不全症候群（ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＩＤＳ）の原因となるＨＩＶ−１とチンパンジーより分離されたＳＩＶｃｐｚを含むＨＩＶ−１グループ、２）スーティーマンガベイＣｅｒｃｏｃｅｂｕｓ  ａｔｙｓより分離されたＳＩＶｓｍｍとアカゲザルＭａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａより分離されたＳＩＶｍａｃ、およびヒトに対し低頻度ではあるが病原性を示すＨＩＶ−２（Ｊａｆｆａｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．，１６（５），３２７−３２，１９９７）よりなるＨＩＶ−２グループ、３）アフリカミドリザルＣｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ  ａｅｔｈｉｏｐｓから分離されたＳＩＶａｇｍに代表されるＳＩＶａｇｍグループ、４）マンドリルＰａｐｉｏ  ｓｐｈｉｎｘから分離されたＳＩＶｍｎｄに代表されるＳＩＶｍｎｄグループからなっている。
このうち、ＳＩＶａｇｍおよびＳＩＶｍｎｄでは自然宿主における病原性の報告はなく（Ｏｈｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１５，４１（１），１１５−２２，１９８８；Ｍｉｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．，１８（３−４），２５５−９，１９８９；速水正憲，日本臨床，４７，１，１９８９）、特に本実施例で用いたＳＩＶａｇｍの一種であるＴＹＯ−１株は自然宿主でも、カニクイザルＭａｃａｃａ  ｆａｃｉｃｕｌａｒｉｓ、アカゲザルＭａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａに対する実験感染でも病原性を示さないことが報告されている（Ａｌｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１（６），：３６７−８４，１９９４；Ｈｏｎｊｏ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．，１９（１），９−２０，１９９０）。ＳＩＶａｇｍのヒトに対する感染、発症については報告がなく、ヒトに対する病原性は知られていないが、一般に霊長類におけるレンチウイルスは種特異性が高く、自然宿主から他種に感染、発症した例は少なく、その発症も低頻度あるいは進行が遅いという傾向がある（Ｎｏｖｅｍｂｒｅ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１（５），４０８６−９１，１９９７）。従って、ＳＩＶａｇｍ、特にＳＩＶａｇｍ  ＴＹＯ−１をベースとして作製したウイルスベクターは、ＨＩＶ−１や他のレンチウイルスをベースとしたベクターと比べて安全性が高いと考えられ、本発明において好適に用いられ得る。
また、本発明のレトロウイルスベクターは、スプーマウイルス（Ｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ）に由来するものが含まれる。スプーマウイルスには、例えばフォーミーウイルス（Ｆｏａｍｙｖｉｒｕｓ）が含まれる（ＤＥ４３１８３８７；ＷＯ９６０７７４９；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９５）２１０，１，１６７−１７８；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０，１，２１７−２２）。フォーミーウイルスに由来する本発明のベクターは、ヒト細胞への外来遺伝子導入、特に遺伝子治療および組換えワクチンの投与などに利用され得る。
本発明のレトロウイルスベクターとしては、ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）に改変を加えることもできる。ＬＴＲはレトロウイルスに特徴的な配列であり、ウイルスゲノムの両端に存在している。５’ＬＴＲはプロモーターとして働き、プロウイルスからのｍＲＮＡの転写を促す。したがって、ジーントランスファーベクターの５’ＬＴＲのプロモーター活性をもつ部分を別の強力なプロモーターと置換すれば、ジーントランスファーベクターのｍＲＮＡ転写量が増大し、パッケージング効率が上昇、ベクター力価を上昇させる可能性がある。さらに、例えばレンチウイルスの場合、５’ＬＴＲはウイルス蛋白質ｔａｔによる転写活性の増強を受けることが知られており、５’ＬＴＲをｔａｔ蛋白質に依存しないプロモーターに置換することで、パッケージングベクターからｔａｔを削除することが可能となる。また、細胞に感染し細胞内に侵入したウイルスＲＮＡは逆転写された後、両端のＬＴＲを結合させた環状構造となり、結合部位とウイルスのインテグラーゼが共役して細胞の染色体内にインテグレートされる。プロウイルスから転写されるｍＲＮＡは５’ＬＴＲ内の転写開始点より下流、３’ＬＴＲのｐｏｌｙＡ配列までであり、５’ＬＴＲのプロモーター部分はウイルス内にパッケージングされない。したがって、プロモーターを置換したとしても標的細胞の染色体に挿入される部分には変化が無い。以上のことから、５’ＬＴＲのプロモーターの置換は、より高力価で安全性の高いベクターを作成することにつながると考えられる。従って、ジーントランスファーベクターの５’側プロモーターの置換を行い、パッケージングされるベクターの力価を上昇させることができる。
また、３’ＬＴＲの配列を部分的に削除し、標的細胞から全長のベクターｍＲＮＡが転写されることを防止するＳｅｌｆ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ（ＳＩＮベクター）（自己不活性化型ベクター）の作成により、安全性を上昇させることも可能である。標的細胞の染色体に侵入したレンチウイルスのプロウイルスは、３’ＬＴＲのＵ３部分を５’端に結合した形となる。したがってジーントランスファーベクターは、標的細胞の染色体では５’端にＵ３が配置され、そこからジーントランスファーベクター全体のＲＮＡが転写されることになる。仮に、標的細胞内にレンチウイルスあるいはその類似の蛋白質が存在した場合、ジーントランスファーベクターが再びパッケージングされ、他の細胞に再感染する可能性がある。また３’ＬＴＲのプロモーターにより、ウイルスゲノムの３’側に位置する宿主由来の遺伝子が発現されてしまう可能性がある（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｎ．，Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ，Ｐ．，Ｒｅｔｏｒｏｖｉｒａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｌｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，４７５−５８５，１９９７）。この現象はレトロウイルスベクターにおいてすでに問題とされ、回避の方法としてＳＩＮベクターが開発された（Ｙｕ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３（１０），３１９４−８，１９８６）。ジーントランスファーベクター上の３’ＬＴＲのＵ３部分を欠失させることにより、標的細胞内では５’ＬＴＲや３’ＬＴＲのプロモーターが無くなるため、全長のＲＮＡや宿主遺伝子の転写が起こらない。そして、内部プロモーターからの目的遺伝子の転写のみが行われることになり、安全性が高く、高発現のベクターとなることが期待される。このようなベクターは、本発明において好適である。ＳＩＮベクターの構築は、公知の方法および実施例５に記載の方法などに従えばよい。
レトロウイルスの産生には、宿主細胞でパッケージングシグナルを有するジーントランスファーベクターＤＮＡを転写させ、ｇａｇ，ｐｏｌ蛋白質およびエンベロープ蛋白質の存在下でウイルス粒子を形成させる。ジーントランスファーベクターＤＮＡは、プラスミドのようなＤＮＡベクターであってもよく、あるいはパッケージング細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれていてもよい。ジーントランスファーベクターＤＮＡにコードされるパッケージングシグナル配列は、この配列により形成される構造を保持できるように可能な限り長く組み込むことが好ましい一方で、該ベクターＤＮＡ上のパッケージングシグナルと、ｇａｇ，ｐｏｌ蛋白質を供給するパッケージングベクターとの間で起こる組み換えによる野生型ウイルスの出現頻度を抑制するためにはこれらベクター間の配列の重複を最小限にする必要がある。従って、ジーントランスファーベクターＤＮＡの構築においては、パッケージング効率および安全性の両者を満足させるために、パッケージングに必要な配列を含むできる限り短い配列を用いることが好ましい。
パッケージングシグナルとしては、パッケージングベクターが導入された細胞によりパッケージングされる限り制限はなく、パッケージングベクターの種類に合わせて、レトロウイルス由来、レンチウイルス由来、免疫不全ウイルス由来のシグナルなどが用いられる。
例えば、実施例で用いたＳＩＶａｇｍ由来のパッケージングベクターの場合は、ＨＩＶベクターはパッケージングされないため、用いられるシグナルの由来としてはＳＩＶのみに制限されると考えられる。但し、ＨＩＶ由来のパッケージングベクターを用いた場合、ＳＩＶ由来のジーントランスファーベクターもパッケージングされるので、組換えウイルスの出現頻度を低下させるために、異なるレンチウイルス由来のジーントランスファーベクターとパッケージングベクターとを組み合わせてベクター粒子を形成させることが可能であると考えられる。この場合、霊長類のレンチウイルスの間の組み合わせ（例えば、ＨＩＶとＳＩＶ）であることが好ましい。
ジーントランスファーベクターＤＮＡでは、ｇａｇタンパク質が発現しないように改変されていることが好ましい。ウイルスｇａｇタンパク質は、生体にとって異物として認識され、抗原性が現れる可能性がある。また、細胞の機能に影響を及ぼす可能性もある。ｇａｇタンパク質を発現しないようにするためには、ｇａｇの開始コドンの下流に塩基の付加や欠失等によりフレームシフトするように改変することができる。また、ｇａｇタンパク質のコード領域の一部を欠失させることが好ましい。一般にウイルスのパッケージングには、ｇａｇタンパク質のコード領域の５’側が必要であるとされている。従って、ジーントランスファーベクターにおいては、ｇａｇタンパク質コード領域のＣ末側を欠失していることが好ましい。パッケージング効率に大きな影響を与えない範囲でできるだけ広いｇａｇコード領域を欠失させることが好ましい。また、ｇａｇタンパク質の開始コドン（ＡＴＧ）をＡＴＧ以外のコドンに置換することも好ましい。置換するコドンは、パッケージング効率に対する影響が少ないものを適宜選択する。これにより構築されたパッケージングシグナルを有するジーントランスファーベクターＤＮＡを、適当なパッケージング細胞に導入することにより、ジーントランスファーベクターＤＮＡの転写産物が取りこまれたウイルスベクターを生産させることができる。生産させたウイルスベクターは、パッケージング細胞の培養上清等から回収することができる。
パッケージング細胞に使われる細胞としては、一般的にウイルスの産生に使用される細胞株であれば制限はない。ヒトの遺伝子治療用に用いることを考えると、細胞の由来としてはヒトまたはサルが適当であると考えられる。パッケージング細胞として使用されうるヒト細胞株としては、例えば２９３細胞、２９３Ｔ細胞、２９３ＥＢＮＡ細胞、ＳＷ４８０細胞、ｕ８７ＭＧ細胞、ＨＯＳ細胞、Ｃ８１６６細胞、ＭＴ−４細胞、Ｍｏｌｔ−４細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＴＥ６７１細胞などが挙げられる。サル由来細胞株としては、例えば、ＣＯＳ１細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＶ−１細胞、ＢＭＴ１０細胞などが挙げられる。また、既存のパッケージング細胞を用いることも可能である。パッケージング細胞としては、例えばＢｏｓｃ２３細胞、ＰＥ５０１細胞などが挙げられる。
ベクターが保持する外来遺伝子としては特に制限はなく、蛋白質をコードする核酸に加え、例えば、アンチセンスまたはリボザイムなどのタンパク質をコードしない核酸であってもよい。
近年、遺伝子治療の標的として造血幹細胞をはじめとする各種の幹細胞が注目されている（花園豊，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．７，１９９９）。実施例に示したように、本発明のシュードタイプレトロウイルスベクターは、ヒト骨髄由来ＣＤ３４陽性細胞に対し高い効率で遺伝子を導入することができるが、このＣＤ３４陽性細胞は造血幹細胞を含む分画として近年注目されている。ＣＤ３４陽性細胞は、メチルセルロースを含む培地を用いたコロニーアッセイにおいて多分化能を持つこと（Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（３），７７２−７，１９９２）や、複合免疫不全系統であるＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにＣＤ３４陽性細胞を移植するとマウス骨髄に生着し造血系の再建が認められること（Ｌａｒｏｃｈｅｌｌｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２（１２），１３２９−３７，１９９６）が報告されており、少なくともＣＤ３４陽性細胞分画中に非常に未熟で幹細胞に近い状態の細胞が存在すると考えられている。また、ＣＤ３４陽性細胞中の造血幹細胞は非分裂状態であり、一般にレトロウイルスベクターでは遺伝子導入効率が低いが（Ｋｉｅｍ，Ｈ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，７（２），１０７−１４，１９９５．）、本発明のシュードタイプ化ベクターにより感染効率を大幅に改善することが可能であると考えられる。特に、ＨＩＶやＳＩＶベクターなどのレンチウイルスベクターを用いれば、非分裂細胞に対する遺伝子導入効率はさらに上昇することが期待される。本発明は、ヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質を含むシュードタイプレトロウイルスベクターを血球系または造血系細胞に接触させる工程を含む、血球系または造血系細胞へ遺伝子を導入する方法、および血球系または造血系細胞への遺伝子導入のための、ヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質を含むシュードタイプレトロウイルスベクターの使用に関する。ヘマグルチニン活性を有する蛋白質によりシュードタイプ化された本発明のレトロウイルスベクターは、血球系細胞および造血系細胞に対する高率な遺伝子導入が可能であるので、ＡＤＡ欠損症（Ｂｌａｅｓｅ，Ｒ．Ｍ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．，３３（１  Ｓｕｐｐｌ），Ｓ４９−５３，１９９３）、血友病（Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６（１８），９９７３−５，１９９９）、およびＦａｎｃｏｎｉ貧血症などの血液細胞を対象とした遺伝子治療において有用である。投与は例えばエクスビボ法により行うことができる。
血球系および造血系細胞に対する外来遺伝子導入の評価は、例えば既知の様々な表面抗原に対する抗体を用いたフローサイトメーターによる解析やコロニーアッセイ、造血系を破壊したマウスなどに造血細胞を移植して行う造血系再構築などにより検証することが可能である。
本発明のベクターが適用可能な造血細胞系を対象とした遺伝子治療としては、例えは、腫瘍を化学抗癌剤治療するときの幹細胞の保護を目的とした薬剤耐性遺伝子ＭＤＲ１の利用（Ｌｉｃｈｔ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（２０００）７，４，３４８−５８）、ファンコーニ貧血症のための正常ＦＡＮＣＣ遺伝子の導入（Ｌｉｕ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９９）１０，１４，２３３７−４６）、エクスビボ幹細胞増殖を補助するためのサイトカインの組み合わせ（トロンボポエチン、インターロイキン６および１１、並びにＦｌｔ−３リガンド）の導入（ＷＯ９９０７８３１）、血球減少症を治療するためのＦｌｔ−３アゴニストなどのキメラ蛋白質の発現（ＷＯ９８４６７５０）、βセラミアを治療するためのヒトβグロビン遺伝子の導入（ＷＯ９７４１１４１）、ＩＬ−６依存的な多発性骨髄腫治療のためのＩＬ−６アンタゴニストと自殺遺伝子の発現の組み合わせ治療（独国特許ＤＥ１９７０４９７９）、造血因子の組み合わせによる受容体アゴニスト［インターロイキン（ＧＭ−ＣＳＦ，Ｇ−ＣＳＦ−Ｓｅｒ１７，Ｍ−ＣＳＦ，エリスロポエチン，ＩＬ−１，ＩＬ−１４，ＩＬ−２，ＩＬ−５，ＩＬ−６，ＩＬ−７，ＩＬ−８，ＩＬ−９，ＩＬ−１０，ＩＬ−１１，ＩＬ−１２，ＩＬ−１３，ＩＬ−１５）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｆｌｔ３／ｆｌｋ２リガンド、ヒトソマトトロピン、Ｂ細胞増殖因子、Ｂ細胞分化因子、赤血球分化因子（ＥＤＦ）、または幹細胞因子（ＳＣＦ）］（ＷＯ９７１２９８５）、幹細胞培養および造血疾患の遺伝子治療に用いられるｃ−ｍｐｌ受容体アゴニスト（ＷＯ９７１２９７８）、ヒト造血始原細胞の増殖に用いられるＩＬ−６およびＩＬ−６可溶型受容体の融合蛋白質（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９７）１５，２，１４２−４５）、造血始原細胞の増殖に用いられるＩＬ−６スーパーアゴニストおよびスーパーアンタゴニスト（ＷＯ９６１８６４８）、血液疾患の治療に用いられるＦａｃｔｏｒ−Ｘ（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅ．（１９９５）Ｓｕｐｐｌ．２１Ａ，４１０）、ヒト造血始原細胞の増殖に用いられる幹細胞因子、ＩＬ−６、および可溶型ＩＬ−６受容体複合体（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９５）２，９，６９４）、ＲＮＡウイルスを標的とするリボザイムおよびＨＩＶ感染防御および細胞内免疫に有用なアンチセンスおよび／またはＲＮＡデコイ（ＷＯ９６２２３６８）などの遺伝子導入が挙げられる。
また本発明のＨＮ蛋白シュードタイプレトロウイルスベクターは、鼻腔の粘膜上皮細胞および肺の気管支粘膜上皮細胞など、粘液を持つ細胞に対する感染能力が高い。本発明のベクターは、従来では遺伝子導入が困難であった粘液を持つ細胞への高率な外来遺伝子の導入に有用である。本発明は、ヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質を含むシュードタイプレトロウイルスベクターを粘液を有する細胞に接触させる工程を含む、粘液を有する細胞へ遺伝子を導入する方法、および粘液を有する細胞への遺伝子導入のための、ヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質を含むシュードタイプレトロウイルスベクターの使用に関する。粘液を有する細胞としては、特に粘膜上皮細胞、具体的には、例えば鼻腔または肺の気管支の粘膜上皮細胞などが挙げられる。
具体的な適用例としては、例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の濃度が高いことを利点として応用した皮膚・粘膜への遺伝子（ＩＬ−２，ＩＦＮ−γ，ＴＧＦ−β等）導入による免疫誘導（ＷＯ９５０５８５３）、遺伝子の経口的粘膜投与によるロタウイルスワクチン（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２，７，５７５７−６１）、自己免疫疾患を治療するための粘膜投与（ＷＯ９７４６２５３）、感染予防のための粘膜投与（ＷＯ９６２１３５６）、性病またはパピローマウイルス感染による子宮頚癌を予防するための、女性性器粘膜への遺伝子投与（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９８）６６，１，３２２−２９）、粘膜投与による投与の容易性と安全性の向上（Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９５）３６，８６  Ｍｅｅｔ．，４１８）などが挙げられる。
本発明のシュードタイプレトロウイルスベクターは、薬学的に許容される担体または媒体と適宜組み合わせて組成物とすることができる。具体的には、例えば滅菌水、生理食塩水、培養液、血清、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などと適宜組み合わせて製剤化することが考えられる。さらに、その他にも、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。本発明の組成物は、水溶液、カプセル、懸濁液、シロップなどの形態であり得る。本発明のシュードタイプレトロウイルスベクターを含む組成物は試薬または医薬として有用である。例えば、各種細胞に対するインビトロまたはインビボでの遺伝子導入試薬として、または、エクスビボまたはインビボでの遺伝子治療のための医薬として、本発明の組成物を用いることができる。患者への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、経腸投与、経口投与、鼻腔内投与、エクスビボ投与など当業者に公知の方法により行いうる。特に鼻腔または気管支粘膜への投与、および血球系・造血系細胞へのエクスビボ投与は好適である。
本発明のウイルスベクターは、その他の各種遺伝性疾患の遺伝子治療にも応用が可能である。対象となる疾患は特に制限されない。例えば、対象となり得る疾患とその単一原因遺伝子としては、ゴーシェ病においてはβ−セレブロシダーゼ（第２０染色体）、血友病においては血液凝固第８因子（Ｘ染色体）および血液凝固第９因子（Ｘ染色体）、アデノシンデアミナーゼ欠損症においてはアデノシンデアミナーゼ、フェニルケトン尿症においてはフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（第１２染色体）、Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型筋ジストロフィーにおいてはジストロフィン（Ｘ染色体）、家族性高コレステロール血症においてはＬＤＬレセプター（第１９染色体）、嚢ほう性繊維症においてはＣＦＴＲ遺伝子の染色体への組み込み等が挙げられる。それら以外の複数の遺伝子が関与していると思われている対象疾患としては、アルツハイマー、パーキンソン病等の神経変性疾患、虚血性脳障害、痴呆、またエイズ等の難治性の感染症等が考えられる。エイズ患者の造血幹細胞を細胞外にとりだしｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳＩＶベースの本発明のベクターを作用させて、ＨＩＶの感染が起こる前にＳＩＶに由来するゲノム転写を優勢にして、患者の体に戻し、ＨＩＶの転写因子を無効にする治療方法が考えられる。さらには、慢性疾患への応用として、虚血性心疾患においてはＶＥＧＦならびにＦＧＦ２遺伝子、動脈硬化の遺伝子治療に関しては、細胞増殖関連遺伝子、例えば細胞増殖因子（ＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β等）、Ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ等の発現抑制への応用が可能となる。また糖尿病においてはＢＤＮＦ遺伝子が候補となりうる。またこの方法により、遺伝子変異が癌化を引き起こす癌抑制遺伝子ｐ５３等の遺伝子を染色体に組み込む補充治療への応用、多剤耐性遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨髄由来造血幹細胞に導入した後、患者の血液に戻すことによって、癌の薬物治療の限界を超えた治療が可能となる。自己免疫疾患、例えば多発性硬化症、慢性関節リウマチ、ＳＬＥ、糸球体腎炎等の遺伝子治療に関しては、Ｔ細胞レセプター、各種接着因子（例えばＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＣＡＭ−１、ＬＦＡ−４等）、サイトカインおよびサイトカインレセプター（例えばＴＮＦ、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＩＬ−１等）細胞増殖因子（例えばＰＤＧＦ、ＴＧＦ−β等）、作用因子（例えばＭＭＰ等）のアンチセンス発現による発現抑制への応用が可能となる。アレルギー性疾患の遺伝子治療に関しては、ＩＬ−４、ＦｃεＲ−Ｉ等のアンチセンス発現による発現抑制への応用が可能となる。臓器移植に関連する遺伝子治療に関しては、ヒト以外の動物ドナーの組織適合性抗原をヒト型に変えて異種移植の成功率を高める応用が可能となる。さらにはヒトＥＳ細胞の染色体に外来遺伝子を導入し、胚の段階で欠損する遺伝子を補って、体循環する酵素、成長因子等の不足を補充する治療が考えられる。
例えば、ＩＬ−４はヘルパーＴリンパ球のＴｈ２リンパ球への分化を促す。Ｔｈ２リンパ球はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１３といった喘息の炎症を媒介するサイトカインを分泌する。ＩＬ−４は呼吸障害に関与する肺粘液膜からの粘液分泌を誘導する分子の１つである。ＩＬ−４は、好酸球表面に存在するＶＬＡ  ４分子と相互作用する細胞接着分子であるＶＣＡＭ−１の発現を制御している。この相互作用により、好酸球は血液中から肺組織の炎症部位へ移動することができる。ＩＬ−４はＢ細胞の増強と、アレルギー反応を引き起こすために必要な抗原特異的ＩｇＥの産生を誘導する。抗原特異的ＩｇＥはマスト細胞がヒスタミン、ロイコトリエンといった炎症の媒介となる物質の放出を引き起こし、これらが、気管支収縮を引き起こす、このようなＩＬ−４の役割から、喘息患者を対象とした可溶性インターロイキン４（ＩＬ−４）受容体などを発現するベクターも有用である。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に制限されるものではない。なお、本明細書に引用された文献は、全て本明細書の一部として組み込まれる。
［実施例１］  センダイウイルスエンベロープ蛋白によるシュードタイプレトロウイルスベクターの調製
センダイウイルスＺ株の全長ゲノムＤＮＡ  ｐＳｅＶ１８＋ｂ（＋）（Ｈａｓａｎ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７８：２８１３−２８２０）から切り出したＦ、ＨＮ、およびＭ蛋白遺伝子をｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ：１０８，１９３−９，１９９１）のＸｈｏＩサイトに導入することにより、センダイウイルス由来Ｆ、ＨＮおよびＭ蛋白発現ベクター（それぞれｐＣＡＧＧＳ  Ｆ、ｐＣＡＧＧＳ  ＨＮ、およびｐＣＡＧＧＳ  Ｍと称す）を作製した。
レトロウイルス産生に用いたヒト胎児腎細胞由来細胞株２９３Ｔ細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０，ｐｐ．８３９２−８３９６，１９９３）は、１０％非動化ウシ胎児血清を含むＤ−ＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で培養した。培養はすべてプラスチックプレート（住友ベークライト）で行った。ベクターのトランスフェクションはＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて添付説明書に従って行った。２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックプレート（住友ベークライト）へ１ウェルあたり１×１０６個の細胞密度でまき、炭酸ガスインキュベーター中（３７℃、１０％炭酸ガス存在下）で４８時間培養した。トランスフェクションの３０分前に培養液を１ウェルあたり８００μｌの１％ウシ血清アルブミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含むＤ−ＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に培地交換し培養を続けた。
ジーントランスファーベクターとしては、マウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ；ＭＳＣＶ）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）（Ｒ．Ｇ．Ｈａｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１０２９７−１０３０２（１９９６）；Ｒ．Ｇ．Ｈａｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｒａｐｙ  １：１３６−１３８（１９９４））をベースとするベクターでレポーター遺伝子としてＥＧＦＰ遺伝子を組み込んだものを使用した。トランスフェクションに使用するＤＮＡ量は１ウェルあたり７００ｎｇのジーントランスファーベクターと、３００ｎｇのパッケージングベクター（ｐＣＬ−Ｅｃｏ，ｐＣＬ−Ａｍｐｈｏ（ＭｕＭＬＶ  ４０７０Ａ）、共にＩＭＧＥＮＥＸ社）（Ｎａｖｉａｕｘ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５７０１−５７０５（１９９６））とを使用し、それらに加えて２００ｎｇのセンダイウイルスエンベロープ蛋白発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ  ＦとｐＣＡＧＧＳ  ＨＮ）や２００ｎｇのセンダイウイルスＭ蛋白発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ  Ｍ）とを組み合わせて使用した（表２）。ＤＮＡを１００μｌのＯｐｔｉＭＥＭに溶解後に６μｌのＰＬＵＳ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を加えて撹拌後１５分室温で静置した。ＤＮＡとＰＬＵＳ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）との混合液に、１００μｌのＯｐｔｉＭＥＭで希釈した４μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥを添加して撹拌後さらに１５分室温で静置した。以上の方法により調製したＤＮＡとＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥとの複合体を含む溶液を６ウェルプレートで培養している２９３Ｔ細胞へ滴下してゆるやかに撹拌した後に炭酸ガスインキュベーター中（３７℃，１０％炭酸ガス存在下）で３時間培養した。培養後１ウェルあたり１ｍｌの１％ウシ血清アルブミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）と１５μｇ／ｍｌの濃度のトリプシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含むＤ−ＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を添加し、炭酸ガスインキュベーター中（３７℃，１０％炭酸ガス存在下）で２４時間培養した後に培養上清を０．４５μｍのポアサイズのフィルター（ＤＩＳＭＩＣ−２５ＣＳフィルター、ＡＤＶＡＮＴＥＣ）で濾過してベクター溶液として使用した。
［実施例２］  センダイウイルスエンベロープ蛋白によるレトロウイルスベクターのシュードタイプ化の効果
センダイウイルスエンベロープ蛋白によりシュードタイプ化したレトロウイルスベクターを上記のようにして製造し、その効果を検討した。
標的細胞である２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックプレート（住友ベークライト）へ１ウェルあたり１×１０６個の細胞密度でまき、炭酸ガスインキュベーター中（３７℃、１０％炭酸ガス存在下）で４８時間培養した。標的細胞にはウイルスベクターを含む溶液に非動化ウシ胎児血清を最終濃度１０％、ポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を最終濃度８μｇ／ｍｌになるように添加した溶液を重層する事でウイルスベクターの導入を行った。ベクター導入してから４８時間後に標的細胞を２％ホルムアルデヒドと０．２％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で室温２０分間固定し、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で１回洗浄後に蛍光倒立型顕微鏡（ＤＭＩＲＢ（ＳＬＲ），ライカ）で検鏡して標的細胞でのＥＧＦＰの発現を検出した。
まずレトロウイルスベースのジーントランスファーベクター（ｐＭＳＣＶ  ＥＧＦＰ）をパッケージングベクターの非存在下で２９３Ｔ細胞に導入する際にセンダイウイルスのエンベロープ蛋白であるＦ蛋白発現プラスミド（ｐＣＡＧＧＳ  Ｆ）、またはＨＮ蛋白発現プラスミド（ｐＣＡＧＧＳ  ＨＮ）のいずれか、或いは両者を同時に導入して培養上清を回収し、標的細胞である２９３Ｔ細胞へＥＧＦＰ遺伝子の導入やＥＧＦＰ蛋白の導入が認められるかを検討した。表２の下半分“（▲１▼）”以降の１２種類の組み合わせで作製したベクターを２９３Ｔ細胞へ感染させた結果を図１に示す。図１のＮｕｌｌのパネルに示すようにＦ蛋白、ＨＮ蛋白を発現させてもパッケージングベクターの非存在下ではヒト細胞への遺伝子や蛋白の導入は認められなかった。従ってＦ蛋白やＨＮ蛋白のみの発現では遺伝子導入能を有するレトロウイルスベクターの産生や、ＥＧＦＰ蛋白の標的細胞への導入は起こらないと考えられた。
ヒトの細胞に感染性のないエンベロープ蛋白質であるエコトロピックエンベロープ蛋白によりパッケージングを行った場合、図１のＥｃｏのパネルに示すようにＦ蛋白或いはＨＮ蛋白単独でシュードタイプ化した場合はヒト細胞への遺伝子導入は認められなかったが、Ｆ蛋白とＨＮ蛋白を同時に発現させてシュードタイプ化した場合には本来感染性のないヒト細胞への遺伝子導入が認められた。この結果からセンダイウイルス以外のウイルス由来のベクターをセンダイウイルスのＦ蛋白とＨＮ蛋白でシュードタイプ化しうること、それによりセンダイウイルス以外のベクターの感染宿主域を拡大しうることが明らかとなった。
ヒトの細胞に感染性をもつエンベロープ蛋白質であるアンフォトロピックエンベロープ蛋白によってパッケージングを行った場合、図１のＡｍｐｈｏのパネルに示すようにＨＮ蛋白単独、或いはＦ蛋白とＨＮ蛋白を同時に発現させてシュードタイプ化させた場合に遺伝子導入効率が向上することが明らかとなった。この結果からセンダイウイルス以外のウイルス由来のベクターをセンダイウイルスＨＮ蛋白単独でもシュードタイプ化しうること、センダイウイルスＨＮ蛋白単独によるシュードタイプ化或いはセンダイウイルスＦ蛋白とＨＮ蛋白でシュードタイプ化することによりセンダイウイルス以外のウイルス由来のベクターの遺伝子導入効率を向上しうることが明らかとなった。
またセンダイウイルスは本来肺の気管支粘膜上皮細胞など粘液を持つ細胞に対する感染能力が高い事から、ＨＮ蛋白単独、或いはＦ蛋白とＨＮ蛋白を用いて他のベクターをシュードタイプ化することは粘液を持つ細胞への遺伝子導入に有用であると考えられる。
［実施例３］  ＨＮ−Ａｍｐｈｏシュードタイプレトロウイルスベクターの生産および造血幹細胞を含むヒト骨髄細胞に対する遺伝子導入効率のアンフォトロピックレトロウイルスベクターとの比較
１．２９３Ｔ細胞の培養
２９３Ｔ細胞は１０％ＦＣＳ、８００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８添加ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）にて通常の方法を用いて培養した。トランスフェクション前日に８×１０６細胞／１０ｃｍプレートになるように希釈し、１０％ＦＣＳ添加ＤＭＥＭにて培養した。
２．トランスフェクション
ｐＭＳＣＶ  ＥＧＦＰ、ｐＣｌ−Ａｍｐｈｏ（ＩＭＧＥＮＥＸ社）、ｐＣＡＧＧＳ−ＨＮを、それぞれ５．６、２．４、１．６μｇを混ぜ合わせＯＰＴＩＭＥＭを８００μｌ加え、さらにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ｐｌｕｓ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）キットのｐｌｕｓ液を４８μｌ加え混ぜ合わせた後１５分放置した。別のチューブにＯＰＴＩＭＥＭ  ８００μｌとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ液３２μｌを混ぜ合わせておいた。ＤＮＡ混合液とＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ混合液を混ぜ合わせ、１５分放置した。培地を除いて、１％ＢＳＡ添加ＤＭＥＭを５００μｌ加えた２９３Ｔ細胞にトランスフェクション混合液をまんべんなく滴下し、３７℃、５％炭酸ガス環境下で培養した。コントロールとしては、ｐＭＳＣＶ  ＥＧＦＰ、ｐＣｌ−Ａｍｐｈｏを５．６μｇ、４．０μｇを用いてトランスフェクションを行った。トランスフェクション３時間後に培地を１０％ＦＣＳ添加イスコフ変法ＤＭＥＭ（ＩＭＤＭ）１０ｍｌに置き換えた。翌日再び１０％ＦＣＳ入りＩＭＤＭに培地を交換し、さらに２４時間培養を続けた。
３．ウィルス液の回収
トランスフェクション４８時間後に細胞培養上清を回収し、０．４５μｍのフィルターにて濾過し、−８０℃にて保存した。
４．ヘマグルチニン活性の測定
ｐＭＳＣＶ  ＥＧＦＰ、ｐＣｌ−Ａｍｐｈｏ、ｐＣＡＧＧＳ−ＨＮの量比を幾つかに変えて、上記と同様にＨＮによりシュードタイプ化されたアンフォトロピックｅｎｖを持つレトロウイルスを調製した。このウイルスのヘマグルチニン活性（赤血球凝集活性；ＨＡ活性）を調べた。対照として、アンフォトロピックｅｎｖを持つレトロウイルスのヘマグルチニン活性も調べた。ＨＡ活性の測定は常法に従って行った。その結果、ＨＮおよびアンフォトロピックｅｎｖによりシュードタイプ化されたレトロウイルスにおいてＨＡ価が確認され、ウイルス粒子にヘマグルチニン活性を有する蛋白質が含まれていることが確認された（図２）。
５．ヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞への遺伝子導入
ヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞はＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社より購入した。解凍後、５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、１００ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３リガンド（Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）（いずれもヒトレコンビナント）、１０％ＦＣＳ添加ＩＭＤＭにて、３で回収した組換えウイルス１×１０５／ｍｌにて３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。培養開始４８、５１、７２、７５時間後培地を新しく解凍したウィルス液に交換し５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ、１００ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３リガンドを添加した。培養開始１２０時間後、細胞を回収した。
６．フローサイトメーターによる解析
回収した細胞はＰＥ標識抗ヒトＣＤ３４抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて染色した後、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ、Ｃｏｕｌｔｅｒ）にてＧＦＰ、ＰＥの２蛍光にて解析を行った。その結果、野生型エンベロープを持つアンフォトロピックレトロウイルスベクター（ａｍｐｈｏ）のＣＤ３４陰性細胞（ＣＤ３４−）およびＣＤ３４陽性細胞（ＣＤ３４＋）におけるＧＦＰ陽性細胞の比率はそれぞれ０．３％および３．６％に過ぎなかったのに対し、シュードタイプエンベロープを持つＨＮ−アンフォトロピックレトロウイルスベクター（ＨＮ−ａｍｐｈｏ）のＣＤ３４陰性細胞およびＣＤ３４陽性細胞におけるＧＦＰ陽性細胞の比率はそれぞれ３３％および２５％に達し、ＨＮタンパク質によるシュード化により、造血幹細胞を含むヒト骨髄細胞に対する遺伝子導入の効率が有意に上昇することが判明した（図３）。
［実施例４］  シュードタイプウイルスベクターの作製方法
ジーントランスファーベクターとして、上記のｐＭＳＣＶ  ＥＧＦＰまたはモロニーマウス肉腫ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）由来のＬＴＲの制御下にｌａｃＺを発現するｐＬＺＲＮＬ（Ｙｅｅ，Ｊ．−Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．４３，ｐｐ．９９−１１２（１９９４）；Ｘｕ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７１，３３１−３４１（１９８９））を用いて、様々なエンベロープ蛋白質でシュードタイプ化したレトロウイルスベクターを作製した。  ２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞株）は、１０％非働化仔ウシ血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）高グルコース（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて、３７℃、１０％ＣＯ２で培養した。この２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートへ１ウェルあたり５×１０５個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーした。培養液を１ウェルあたり８００μｌの１％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭに置換してトランスフェクションに用いた。１ウェルあたりジーントランスファーベクター（ｐＭＳＣＶ  ＥＧＦＰまたはｐＬＺＲＮＬ）７００ｎｇ、ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドｐＶＳＶ−Ｇ（Ｉｎｄｉａｎａ血清型株由来）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）１００ｎｇ、Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ＨＮ、Ｆ、およびＭ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＨＮ、ｐＣＡＧＧＳ−ＦおよびｐＣＡＧＧＳ−Ｍをそれぞれ２００ｎｇ、並びにマウスレトロウイルス外殻蛋白発現プラスミドｐＣＬ−Ｅｃｏ、およびｐＣＬ−Ａｍｐｈｏ（Ｉｍｇｅｎｅｘ）（Ｎａｖｉａｕｘ，Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５７０１−５７０５（１９９６））３００ｎｇを、以下の表２のような組み合わせで１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭに溶解後６μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えて攪拌、１５分間室温で静置した。これに、１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭで希釈した４μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加して攪拌後さらに室温で１５分間静置し、これを上記の２９３Ｔ細胞に滴下して緩やかに攪拌し、３７℃、１０％ＣＯ２下で３時間カルチャーした。１ウェルあたり１ｍｌの１％ウシ血清アルブミンおよび１５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭを加え、３７℃、１０％ＣＯ２で、４８時間培養後に培養上清を回収、０．４５μｍのフィルターで濾過したものをベクター浮遊液とした。
0004700888.tif 000004
（表中、「Ｅｎｖ」の欄は、ウイルスの製造に用いたレトロウイルス（Ｒｅｔｒｏ）、センダイウイルス（ＳｅＶ）、または水疱生口内炎ウイルス（ＶＳＶ）由来のエンベロープ蛋白質等を示す。ジーントランスファーベクターとしてはｐＭＳＣＶ  ＥＧＦＰまたはｐＬＺＲＮＬを用い、表に示したようにインビトロおよびインビボにおける遺伝子導入に使用した。ジーントランスファーベクターにｐＭＳＣＶ  ＥＧＦＰを用いて作製した上段の“▲９▼”のベクターは図１３の実験で使用したベクターである。ｐＬＺＲＮＬを用いて作製した下段の“（▲１▼）”以降の１２種類のベクターは図１の実験で使用したベクターである。）
［実施例５］  ＶＳＶ−Ｇシュードタイプレンチウイルスベクターの構築
ベクター系の構築には、非病原性のアフリカミドリザル免疫不全ウイルスのクローンであるＳＩＶａｇｍ  ＴＹＯ−１株を用いた。ヌクレオチドの番号は以下すべてウイルスＲＮＡの転写開始点を＋１として表記した。ＳＩＶａｇｍ  ＴＹＯ−１を組み込んだプラスミドとしてはｐＳＡ２１２（Ｊ．Ｖｉｏｌ．，ｖｏｌ．６４，ｐｐ．３０７−３１２，１９９０）を用いた。また、ライゲーション反応は、すべてＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（東洋紡）を用い添付説明書に従って行った。合成オリゴヌクレオチドは、すべて（株）グライナージャパンＤＮＡ受託合成事業部に依頼し、日本製粉（株）生物化学研究部にて合成、逆相カートリッジ精製または逆相ＨＰＬＣ精製したものを使用した。合成オリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである。
0004700888.tif 000005
0004700888.tif 000006
＜ＰＣＲによるＤＮＡ断片の調整＞
ＰＣＲはすべてＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて行った。反応液９０μｌに１μｇのテンプレートＤＮＡ、プライマーとして２種の合成オリゴヌクレオチドを最終濃度１ｎｍｏｌ／ｍｌになるように添加し、蒸留水で全量を１００μｌとした後、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて反応を行った。９４℃１分間の反応後に９４℃３０秒→５５℃３０秒→６８℃９０秒の反応を１０サイクル行い、最後に６８℃で５分間の反応を行った。反応後のサンプルをＷｉｚａｒｄ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製し、末端をそれぞれの制限酵素で切断し、１％低融点アガロースゲル（ＳｅａＰｌａｑｕｅ  ＧＴＧ  ａｇａｒｏｓｅ，ＦＭＣ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，ＴＡＥバッファーに溶解）で分離後に目的のサイズのＤＮＡ断片をゲルより切り出しＷｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製し、ライゲーションに用いた。
＜ベクターの構築＞
ベクターの基本構造となるプラスミドを構築した（図４）。ベクター粒子形成に必須な蛋白質をトランスに供給する「パッケージングベクター」、ベクターにパッケージングされるｍＲＮＡを供給し、標的細胞に対して目的の遺伝子を運搬、導入する「ジーントランスファーベクター」、シュードタイプベクター粒子を形成するための外殻蛋白質供給ベクターのＶＳＶ−Ｇである。
ベクター粒子形成に必要な蛋白質を供給するため、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ／ｘの各配列をプロモーター下流に配置した発現プラスミドを構築した。野生型ウイルスの産生を回避するためパッケージングシグナルΨおよびｅｎｖの大部分を除去した。ｇａｇ上流にＳＤ配列、ｔａｔ／ｒｅｖの第一エクソンの下流にＲＲＥ配列を挿入し、パッケージングベクター上のすべての遺伝子が発現しうるようにした。さらに、ベクターのパッケージングに必須ではないと考えられたためｎｅｆの全配列を除外した（図４ｂ）。
ベクター内にパッケージングされるＲＮＡを供給するジーントランスファーベクターには、ゲノム両端のＬＴＲ配列、ＳＤ、Ψ、ＲＲＥを組み込んだ。さらに、ジーントランスファーベクターの５’ＬＴＲプロモーター領域を外来のプロモーターと置換した。また、３’ＬＴＲの配列を部分的に削除し、標的細胞から全長のベクターｍＲＮＡが転写されることを防止するＳｅｌｆ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒ（ＳＩＮベクター）を作製し、レポーター遺伝子のプロモーターとしてＣＭＶプロモーター、レポーター遺伝子としてβガラクトシダーゼ遺伝子を組み込んだ（図４ｃ）。
ＶＳＶ−Ｇ供給ベクターとして、これまでにレトロウイルスベクター、ＨＩＶベクターのシュードタイプ化において実績のあるｐＶＳＶ−Ｇを使用した（図４ｄ）（Ｂｕｒｎｓ，Ｊ．Ｃ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８０３３−８０３７）。
以下にその詳細を記載する。
＜パッケージングベクターの構築＞
ｖｉｆとｔａｔ／ｒｅｖの第１エクソンを含む領域（５３３７−５７７０）に相当するＤＮＡ断片をプライマー１Ｆおよび１Ｒを用いてｐＳＡ２１２をテンプレートとしたＰＣＲにより得た。ＰＣＲプライマーに制限酵素部位であるＥｃｏＲＩ部位を付加することでＤＮＡ断片の３’端にＥｃｏＲＩ部位を持つ断片を調節した。ＰＣＲ断片をＢｇｌＩＩとＥｃｏＲＩにより切断した後、アガロースゲル電気泳動とＷｉｚａｒｄ  ＰＣＲ  Ｐｒｅｐｓ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で精製した。以上のようにして得たＤＮＡ断片と、ｇａｇ／ｐｏｌ領域をコードするＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ（３５６）部位からＢｇｌＩＩ（５３３８）部位まで）を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ部位へライゲーションした。次に、Ｒｅｖ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ（ＲＲＥ）とｔａｔ／ｒｅｖの第２エクソンを含む領域（６９６４−７９９３）に相当するＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。上記のＰＣＲ断片と同様にプライマー２Ｆと２Ｒを用いてｐＳＡ２１２をテンプレートとしたＰＣＲにより３’端にＮｏｔＩ部位を付加し、ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで切断後に精製し、ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖを組み込んだｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ部位へ組み込んだ。
スプライシングドナー（ＳＤ）部位は、この配列を含むＤＮＡ断片を合成（３Ｆと３Ｒ）し、合成時に５’端にＸｈｏＩ部位、３’端にＳａｌＩ部位を付加し、上記のｇａｇ−ＲＲＥ−ｔａｔ／ｒｅｖを組み込んだｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋のＸｈｏＩ部位に組み込んだ。得られたプラスミドをＸｈｏＩとＮｏｔＩにより切断し、ＳＤ−ｇａｇ−ＲＲＥ−ｔａｔ／ｒｅｖを含む断片を精製した。ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．１９３−２００，１９９１）のＥｃｏＲＩ部位にＸｈｏＩ／ＮｏｔＩリンカー（４Ｆと４Ｒ）を組み込んだプラスミドを作製し、ＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ部位に上記のＳＤ−ｇａｇ−ＲＲＥ−ｔａｔ／ｒｅｖ断片を組み込んだ。以上の方法により得られたプラスミドをパッケージングベクターｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖとして使用した。
＜ジーントランスファーベクターの構築＞
ＳＩＶａｇｍＴＹＯ１由来の５’ＬＴＲ領域（８５４７−９０５３＋１−９８２、５’端にＫｐｎＩ部位、３’端にＥｃｏＲＩ部位を付加）をプライマー５−１Ｆと５−１Ｒで、３’ＬＴＲを含む領域（８５２１−９１７０、５’端にＮｏｔＩ部位とＢａｍＨＩ部位、３’端にＳａｃＩ部位を付加）をプライマー５−３Ｆと５−３Ｒで、ＲＲＥ配列（７３８０−７９９３、５’端にＥｃｏＲＩ部位、３’端にＳａｃＩＩ部位を付加）をプライマー５−２Ｆと５−２Ｒで、ｐＳＡ２１２をテンプレートとしたＰＣＲでそれぞれ増幅した。ｐＥＧＦＰＮ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のＣＭＶプロモーター領域（１−６００、５’端にＳａｃＩＩ部位、３’端にＮｏｔＩ部位を付加）をプライマー６Ｆと６Ｒで増幅した。これらのＤＮＡ断片の末端を切断、精製後にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋のＫｐｎＩ−ＳａｃＩ部位に５’ＬＴＲ→ＲＲＥ→ＣＭＶプロモーター→３’ＬＴＲの順でライゲーションし組み込んだ。レポーター遺伝子としてｐＣＭＶβ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のβガラクトシダーゼ遺伝子を含むＮｏｔＩ断片をＮｏｔＩ部位へ組み込み、ＫｐｎＩ−ＳａｃＩで切断して５’ＬＴＲから３’ＬＴＲまでを含むＤＮＡ断片を切り出し、ｐＧＬ３  ＣｏｎｔｒｏｌベクターのＫｐｎＩ−ＳａｃＩ部位へ組み込み、ジーントランスファーベクターｐＧＬ３Ｃ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶ  Ｆ  β−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲとした。
また、ｐＥＧＦＰＣ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）由来のＣＭＶプロモーター領域とＥＧＦＰをコードする領域（１−１３３０、５’端にＳａｃＩＩ部位、３’端にＮｏｔＩ部位とＢａｍＨＩ部位と翻訳ストップコドンを付加）をプライマー６Ｆと６Ｒを用いてｐＥＧＦＰＣ２をテンプレートとしたＰＣＲにより増幅した。４種のＰＣＲ断片をそれぞれ制限酵素ＫｐｎＩとＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩとＳａｃＩＩ、ＢａｍＨＩとＳａｃＩ、ＳａｃＩＩとＢａｍＨ切断した後に精製し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋のＫｐｎＩ−ＳａｃＩの間に５’ＬＴＲ→ＲＲＥ→ＣＭＶプロモーターＥＧＦＰ→３’ＬＴＲの順にライゲーションして組み込んだ（ｐＢＳ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／ＷＴ３’ＬＴＲ）。プラスミドｐＢＳ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／ＷＴ３’ＬＴＲをＫｐｎＩ−ＳａｃＩで切断して５’ＬＴＲ−３’ＬＴＲを含むＤＮＡ断片を調製し、ｐＧＬ３  Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ベクターのＫｐｎＩ−ＳａｃＩ部位へ組み込み、ベクター（ｐＧＬ３Ｃ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／ＷＴ３’ＬＴＲ）を構築した。
＜５’ＬＴＲの改変＞
５’ＬＴＲのＴＡＴＡボックスの下流からｇａｇ領域（９０３９−９１７０＋１−９８２）を含む断片をプライマー９−１Ｆ、２Ｆ、３Ｆと９Ｒを用いてｐＳＡ２１２をテンプレートとしたＰＣＲで増幅した。サイトメガロウイルス由来のＣＭＶ  Ｌプロモーター（ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）由来、１−７２１）をプライマー１０−１Ｆと１０−１Ｒを用いてＰＣＲにより増幅した。５’ＬＴＲのＴＡＴＡボックス下流を含む断片と、プロモーターを含む断片とを混合し、これをテンプレートとして、プロモーターの５’側プライマー（１０−１Ｆ）とＬＴＲの３’側プライマー（９Ｒ）を用いてＰＣＲを行い、プロモーターと５’ＬＴＲとのキメラプロモーターのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をジーントランスファーベクター（ｐＧＬ３Ｃ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲ）のＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ部位に組み込んだ。（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲ）。同様に、上記のＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片を、ベクターｐＧＬ３Ｃ／５’ＬＴＲ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／ＷＴ３’ＬＴＲのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ部位にも組み込んだ（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／ＷＴ３’ＬＴＲ）。
＜３’ＬＴＲの改変  ＳＩＮ（ｓｅｌｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ）ベクターの作製＞
３’ＬＴＲのＵ３領域５’側２７ｂｐと３’側１５ｂｐおよびＲ領域を含むＤＮＡ断片をプライマー１１Ｆと１１Ｒを用いてｐＳＡ２１２をテンプレートとしたＰＣＲで増幅した。この断片を、前節で得られたキメラプロモーター導入ジーントランスファーベクターｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／ＷＴ３’ＬＴＲのＳａｌＩ−ＳａｃＩ部位に組み込んだ。（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／３’ＬＴＲΔＵ３）。同様に、この断片をｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／ＷＴ３’ＬＴＲのＳａｌＩ−ＳａｃＩ部位へも組み込み込んだ（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／３ＬＴＲΔＵ３）。
＜構築したプラスミド調製および構造確認＞
プラスミドを定法に従いＤＨ５α（東洋紡）にトランスフォームし、寒天培地上で培養、出現したコロニーをテンプレートとして、組み込んだＤＮＡ断片と、プラスミドの組み込み部位周辺のＤＮＡ配列を認識するプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲにはＰＬＡＴＩＮＵＭ  ＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用した。増幅された産物の有無、サイズをアガロースゲルによる電気泳動で確認し、予想される産物が検出されたクローンを選択し、１０ｍｌのＬＢ培地中で培養、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）でプラスミドを精製した。精製したプラスミドを組み込んだＤＮＡ断片の両端を切断する制限酵素で処理し、アガロースゲル電気泳動でＤＮＡ断片の大きさを確認した。ここで正しい大きさの断片の組み込みが確認されたクローンについて、１００ｍｌのＬＢ培地で培養し、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。ＰＣＲにより増幅した断片を組み込んだプラスミドは、３クローン以上についてシークエンスを行い、ｐＳＡ２１２の配列と比較し、変異のないものを選択した。
＜ベクター回収＞
２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートへ１ウェルあたり５×１０５個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーした。培養液を１ウェルあたり８００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭに置換してトランスフェクションに用いた。１ウェルあたり上記のジーントランスファーベクター３００ｎｇ、上記のパッケージングベクター６００ｎｇ、ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドｐＶＳＶ−Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）１００ｎｇを、１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭに溶解後６μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えて攪拌、１５分間室温で静置した。これに、４μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えた１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭを添加し攪拌後さらに室温で１５分間静置し、これを上記の２９３Ｔ細胞に滴下して緩やかに攪拌し、３７℃、１０％ＣＯ２で３時間カルチャーした。１ウェルあたり１ｍｌの２０％非働化ウシ血清を含むＤ−ＭＥＭを加え、３７℃、１０％ＣＯ２で１２時間カルチャーした後に、１ウェルあたり２ｍｌの１０％非働化ウシ血清を含むＤ−ＭＥＭに培地交換し、２４時間培養後に培養上清を回収、０．４５μｍのフィルターで濾過したものを使用した。
＜ＳＩＶａｇｍベクターによる遺伝子導入＞
２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートへ１ウェルあたり５×１０５個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーした。カルチャーより培養液を除去し、ベクター液にｐｏｌｙｂｒａｎｅ（Ｓｉｇｍａ）を最終濃度８μｇ／ｍｌで添加したものを１ｍｌ重層し、３７℃、１０％ＣＯ２で３時間カルチャーし、ベクターを感染させた。３時間後に培養液を１ｍｌ加え、１日後に培養液を交換した。さらに１日後に、β−Ｇａｌ発現ベクターの場合は、β−Ｇａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＸ−ｇａｌを基質とした染色を行い、標的細胞でのβガラクトシダーゼの発現を光学顕微鏡による検鏡で確認した。ＥＧＦＰ発現ベクターの場合は、蛍光顕微鏡により解析した。
＜ベクターの力価測定＞
ベクターの力価測定は、ベクター液１ｍｌによって遺伝子導入される細胞の数によって計算した。２９３Ｔ細胞を１×１０６／ｐｌａｔｅで６ウェルカルチャープレートにまき、４８時間カルチャーした。ここに、上記と同様の方法で１ｍｌのベクター液を感染、感染後４８時間後にＸ−ｇａｌ染色を行った。光学顕微鏡で２００倍の倍率で検鏡、視野内の遺伝子導入細胞数を測定し、３視野の平均を求め、視野の面積とプレートの面積よりもとめた係数８５４．８６５をかけることにより力価の算出を行った。力価の単位はＴｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  Ｕｎｉｔ（Ｔ．Ｕ．）／ｍｌで表記することとした。また、ベクター液に含まれるｐ２７蛋白質量をＳＩＶ  ｃｏｒｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＥＩＡ  ｋｉｔ（Ｃｏｕｌｔｅｒ）により定量した。
＜ベクターの評価＞
ジーントランスファーベクターの５’プロモーター活性の増強によってＲＮＡの転写量が増加し、パッケージング効率が上がり、ベクター力価が上昇すると考えられる。そこで、５’プロモーターを置換したベクターの評価は、２９３Ｔ細胞に対する遺伝子導入効率をみることによって行った。前述の方法で遺伝子導入を行い、βガラクトシダーゼの発現をＸ−ｇａｌ染色と光学顕微鏡による検鏡で確認した。
３’ＬＴＲのプロモーターを欠失させたＳＩＮジーントランスファーベクターより、ＳＩＮ  ＳＩＶベクターを作製した。同時に従来型の野生型３’ＬＴＲをもつジーントランスファーベクターによりＳＩＶベクターを作製し、両者による２９３Ｔ細胞に対する導入力価を比較した。また、ｐ２７蛋白質量を測定し、蛋白質量あたりの導入力価を比較した。また、放射線照射し細胞周期を停止させた２９３Ｔ細胞、レチノイン酸により終末分化させたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対するＥＧＦＰ遺伝子の導入を蛍光顕微鏡による検鏡で確認した。
＜２９３Ｔ細胞に対する遺伝子導入の結果＞
ＳＩＶａｇｍベクターにより、ヒト胎児腎臓由来細胞２９３Ｔに対しβガラクトシダーゼ遺伝子を導入した。導入細胞をＸ−ｇａｌを基質として染色したところ、図５にみられるように青く染色される細胞が検出され、βガラクトシダーゼ遺伝子の発現が確認された。実験時の遺伝子導入効率は、ベクター液１ｍｌあたり０．５〜１×１０６Ｔ．Ｕ．であった。またベクター液中のｐ２７量は０．５〜１μｇ／ｍｌであり、ｐ２７量１００ｎｇあたりの導入力価は１０５Ｔ．Ｕ．であった。
＜ＳＩＮベクターの性能確認の結果＞
ＳＩＮベクターの導入力価を同一条件で作製した従来の野生型３’ＬＴＲをもつベクターと比較した。従来型の力価が２．４〜２．８Ｔ．Ｕ．／ｍｌ、ＳＩＮベクターでは２．５〜２．９Ｔ．Ｕ．／ｍｌであり、従来型の導入力価を１００％とした場合ＳＩＮベクターは１０５％であった。また導入力価とｐ２７蛋白質量の関係を２９３Ｔ細胞に対する導入力価の測定およびＥＩＡによるｐ２７量の測定により検討したところ、ＳＩＮベクターではｐ２７  １００ｎｇあたり７×１０５Ｔ．Ｕ．であった。
ＳＩＮベクターにより、細胞周期を停止した２９３Ｔ細胞および終末分化したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対するＥＧＦＰ遺伝子の導入を試みた。２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ、３７℃、１０％ＣＯ２で培養しし、細胞周期を停止させるため、Ｇ１−Ｓ期停止ではアフィディコリン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を最終濃度２０μｇ／ｍｌで添加した（Ｈｕｂｅｒｍａｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ：Ｖｏｌ．２３，６４７−６４８．１９８１；Ｂｙｒｎｅｓ，Ｊ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．：Ａｐｒ，６２（１），：１３−２４．１９８４）。Ｇ２−Ｍ期停止では、２×１０７の細胞に対し、Ｘ線を４０００ｒａｄ照射した（Ｋａｓｔａｎ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ：Ｎｏｖ  １３，７１（４），：５８７−９７．１９９２）。分裂停止処理後２４時間後にコラーゲンＩコート６ウェルカルチャープレート（スミロン）に１×１０６／ｗｅｌｌでまき、２４時間後に遺伝子導入を行った。また、ヒト由来神経芽細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（Ｋｏｓｈｉｚａｗａ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．：Ｊａｎ  １，１１１（１−２），１１７−２５．１９９７）を、１０％非働化仔ウシ血清を含むＲＰＭＩ１６４０、３７℃、５％ＣＯ２で培養した後、培地に全トランス型レチノイン酸（ＳＩＧＭＡ）を最終濃度５μＭで添加し、７日間培養し、その後遺伝子導入を行った（Ｏｄｅｌｓｔａｄ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．：Ｎｏｖ  ９，２２４（１），６９−８２．１９８１）。
図６上段は、２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡で見たものである。高い効率で遺伝子の発現が認められた。図６下段はＳＨ−ＳＹ５ＹにおけるＥＧＦＰの発現を示している。神経細胞に分化していると考えられる、突起を伸長した細胞におけるＥＧＦＰの発現が確認された。
本実施例で作製したＳＩＶａｇｍベクターは、培養細胞において高い遺伝子導入能を持つことが確認された。３種の独立したプラスミドのコトランスフェクションによるベクターのパッケージングにおいては、野生型ウイルスの再構成の確率は極めて低いと考えられる。また、ベースであるＳＩＶａｇｍＴＹＯ−１は、自然感染および実験的な感染の両方において病原性を示さないことが確認されている（Ｏｈｔａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：４１，１１５−２２，１９８８；Ｍｉｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．：１８（３−４），２５５−９．１９８９；Ｈｏｎｊｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．１９（１），９−２０，１９９０）。さらに、一般にレンチウイルスは種特異性が強く、他種の動物では病原性が低い傾向がある（Ｎｏｖｅｍｂｒｅ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．：７１（５），４０８６−９１．１９９７）ことからもベクターの安全性は高いものと考えられる。
本実施例のベクター構築において、パッケージングベクター上からはパッケージングシグナル配列が削除されているため、ウイルス蛋白質をコードするＲＮＡは粒子内にパッケージングされない。また、ｒｅｖ蛋白質はＲＲＥに結合し、ＲＮＡの細胞質への輸送やスプライシングの抑制などを行うことでウイルス蛋白質の発現、全長ＲＮＡのウイルス内への取り込みが行われるため、パッケージングベクターおよびジーントランスファーベクターの双方にＲＲＥを組み込んだことにより、パッケージングベクターのｍＲＮＡスプライシングが制御され、すべての遺伝子の発現が可能となると考えられる。さらに、ジーントランスファーベクターのｍＲＮＡが細胞質に運搬され、ベクター粒子内にパッケージングされると考えられる。ｖｉｆ、ｖｐｒ／ｘについては、ＨＩＶ−１ベクターでは除去している場合もあり（Ｄｕｌｌ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．：Ｎｏｖ，７２（１１），８４６３−７１．１９９８）、ベクター粒子のパッケージングおよび機能にとって必須ではない可能性がある。ｖｐｒは非分裂細胞に対する感染性の一因であるとも考えられており（Ｈｅｉｎｚｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：Ｊｕｌ  １９，９１（１５），７３１１−５，１９９４）、ＨＩＶ−１ベクターではｖｐｒの有無により遺伝子導入できる細胞が異なるという報告がある（Ｋｉｍ，Ｖ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．：Ｊａｎ，７２（１），８１１−６．１９９８）。今回パッケージングベクターから完全に除去したｎｅｆは、ＳＩＶによる免疫不全症を引き起こす原因の一つであることがサルを用いた感染実験で報告されている（ｖｏｎ  Ｇｅｇｅｒｆｅｌｔ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３，６１５９−６５，１９９９；Ｋｅｓｔｌｅｒ，Ｈ．Ｗ．３ｄ．，Ｎａｉｄｕ，Ｙ．Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｔ．，Ｋｉｎｇ，Ｎ．Ｗ．，Ｄａｎｉｅｌ，Ｍ．Ｄ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｄｅｓｒｏｓｉｅｒｓ，Ｒ．Ｃ．Ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｅｓ  ｏｆ  ｓｉｍｉａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｆｏｒ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｓｔｕｄｉｅｓ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．１８（３−４）：３０５−９，１９８９）。本実施例で構築したＳＩＶａｇｍベクターではこの配列を完全に除去しているため、仮にパッケージングベクター由来のウイルス遺伝子を含む再構成ウイルス粒子ができたとしても、病原性を持つ危険性がさらに低下していると考えられる。
レンチウイルスをベースとしたベクターは、ベースのウイルスが非分裂状態の細胞に対し感染性を持つことから、細胞周期を停止した培養細胞や神経細胞に対して遺伝子導入能を持つことが期待される（Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ：２７２２６３−２６７，１９９６；Ｓｕｔｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３（５），３６４９−６０，１９９９）。さらに、ＶＳＶ−Ｇによるシュードタイプ化を行ったことにより、感染指向性はベースであるＳＩＶのようにＣＤ４およびケモカインレセプター陽性細胞に限定されない。ＶＳＶ−Ｇのレセプターはリン脂質の一種であるホスファチジルセリンであることが知られており、この分子はさまざまな細胞上に存在する（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３２（２），６３９−４６，１９８３）。このためＶＳＶ−Ｇによってシュードタイプ化を行ったＳＩＶａｇｍベクターの感染指向性は非常に広い。このベクターを基にヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質によりシュードタイプ化されたウイルスを作製することにより、ほぼすべての動物細胞に高い効率で遺伝子導入が可能となると予想される。
［実施例６］  ビロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅ）の調製
野生型ＳｅＶ（Ｚ株）のシードを有性卵（１０日卵）に接種し、３５．３℃で３日間培養し、漿尿液を回収した。４，０００ｒｐｍ、１５分の遠心後、上清を１０，０００ｒｐｍ、１時間遠心してウイルスを沈殿させた。ＢＳＳに再懸濁して、蔗糖密度勾配（３０％／５０％）に重層し、２５，０００ｒｐｍ、１時間遠心した。３０％と５０％蔗糖の界面に形成されたウイルスのバンドを回収し、大量のＢＳＳで希釈した後、９，０００ｒｐｍ、１時間遠心処理してウイルスを沈殿させた。ウイルスはＢＳＳに再懸濁して、−８０℃で使用時まで保存した。
得られたセンダイウイルスから、Ｆ，ＨＮビロソーム、およびＦビロソームを文献（Ｂａｇａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１５２，１５−２５）に従って調製した。すなわち、センダイウイルスを界面活性剤で可溶化した後、不溶性のＲＮＰを遠心除去した。Ｆ，ＨＮ蛋白質および脂質（エンベロープ脂質）を含む可溶化液から界面活性剤を除くことにより粒子を再構成させ、Ｆ，ＨＮビロソームを調製した。遠心分離前のトリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の濃度は１％（ｖ／ｖ）である以外は、実施例７と同様の条件で調製した。センダイウイルスを予めＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）処理し、ＨＮ蛋白質を還元した後、上記と同様に界面活性剤で可溶化した。不溶性となったＨＮ蛋白質をＲＮＰと共に遠心除去した。上記と同様に可溶化液から界面活性剤を除くことにより粒子を再構成させ、Ｆビロソームを調製した。
得られたビロソームは粒子径が不均一であった。そこで、遠心分離（１２０００ｒｐｍ，１０分）により粒子サイズの異なるビロソーム（ｓｍａｌｌ  ｖｉｒｏｓｏｍｅ：平均粒子径１４０ｎｍ、およびｌａｒｇｅ  ｖｉｒｏｓｏｍｅ：平均粒子径１．４μｍ）に分離した。分離されたビロソームをＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した結果、Ｆ，ＨＮビロソームではＦ蛋白質およびＨＮ蛋白質が、ＦビロソームではＦ蛋白質が検出され、ほぼ所望のビロソームが得られたことが確認された（図７）。
上記のようにして調製したビロソームまたはＵＶ照射により不活化したセンダイウイルスを、下表の組成で３７℃、２時間の条件で、実施例７（３）記載の方法により得られた濃縮したＥＧＦＰ発現ＳＩＶウイルスと融合（ｆｕｓｉｏｎ）させた。ＶＳＶ−Ｇとリポソームとの融合効率は弱酸性で高くなることが報告されていることから、ｐＨ条件としてｐＨ５．５および中性で融合を行った（Ｙａｍａｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５，３７０３−３７０８）。
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上記混合物をＨｅＬａ細胞の培養上清にＭＯＩ＝１０で添加した。ＳＩＶとセンダイウイルスを単に共存させて感染させる対照実験も行った。この場合、まずＳＩＶを培地に添加し、５分後にセンダイウイルスをＳＩＶの１０倍量添加した。培地に添加後、１０分、３０分、および１８０分インキュベートして感染させた。時間経過後新鮮な培養液に置換し、感染処理開始の４８時間後にＧＦＰの蛍光を観察した（図８）。
その結果、ＳＩＶ単独でＨｅＬａ細胞に感染させた場合、３０分以内の接触では、感染効率が非常に低かった。ＳＩＶとＵＶ不活化センダイウイルスを融合させた混合物の場合、ＳＩＶ単独に比べ、感染が早くなる傾向が認められた。ｐＨは、５．５よりも中性の方が高い感染効率を示した。これは、中性付近がＳＩＶへの影響が少ないことによるのかも知れない。
Ｆ，ＨＮビロソームとの融合でも、短時間での感染が促進され、感染効率の有意な改善が見られた。Ｆビロソームは、Ｆ，ＨＮビロソームよりも感染の改善が小さかった。ＳＩＶとセンダイウイルスを単に共存させて感染した場合は、ＳＩＶ単独とほぼ同じ感染を示したに過ぎなかった。
これらの結果から、センダイウイルスまたはＦ，ＨＮビロソームとＳＩＶとを融合させることにより、ＳＩＶの感染性が上昇することが実証された。また、感染効率の上昇には、センダイウイルスのＨＮ蛋白質の寄与が大きいことが示唆された。
［実施例７］  ＳＩＶ−ＳｅＶ  ｆｕｓｉｏｎベクターの調製と評価
（１）野生型ＳｅＶの調製
野生型ＳｅＶ（Ｚ株）のシードを有性卵（１０日卵）に接種し、３５．３℃で３日間培養し、漿尿液を回収した。４０００ｒｐｍ、１５分の遠心後、上清を１０，０００ｒｐｍ、１時間遠心してウイルスを沈殿させた。ＢＳＳに再懸濁して、蔗糖密度勾配（３０％／５０％）に重層し、２５，０００ｒｐｍ、１時間遠心した。３０％と５０％蔗糖の界面に形成されたウイルスのバンドを回収し、大量のＢＳＳで希釈した後、９，０００ｒｐｍ、１時間遠心処理してウイルスを沈殿させた。ウイルスはＢＳＳに再懸濁して、−８０℃で使用時まで保存した。
（２）ＳｅＶ膜蛋白からのビロソームの再構成
１．ＦＨＮビロソーム
ＳｅＶ（ＯＤ５４０＝５、ＢＳＳ）１．８ｍＬに２０％（Ｖ／Ｖ）トリトンＸ−１００／ＢＳＳ０．２ｍＬを加え、室温、１時間放置してＳｅＶを可溶化した。実施例６でビロソーム粒子径が不均一であったため、遠心分離前にトリトンＸ−１００濃度を２％（ｖ／ｖ）とした。不溶性のＲＮＰを遠心沈殿させ（１００，０００×ｇ、１時間、４℃）、Ｆ及びＨＮタンパクの可溶化上清を回収した。上清にバイオビーズＳＭ−２（ＢＩＯＲＡＤ）を３回に分けて加え（０．５ｇ×２回、室温１時間、１ｇ×１回、４℃１５時間＋室温１時間インキュベーション）界面活性剤を吸着除去した。ビーズを除き、ＦＨＮビロソームを約１．５ｍＬ得た。
２．Ｆビロソーム
ＳｅＶ（ＯＤ５４０＝５、ＢＳＳ）２ｍＬに３０ｍＭジチオスレイトール／ＢＳＳ０．２ｍＬを加え、３７℃、２時間処理してＨＮタンパクを非可逆的に還元した。ＢＳＳ希釈後、ウイルスを遠心分離して、１．８ｍＬのＢＳＳに再懸濁した。ウイルス懸濁液に２０％（Ｖ／Ｖ）トリトンＸ−１００／ＢＳＳを０．２ｍＬ加え、室温、１時間放置してＳｅＶを可溶化した後、不溶性のＲＮＰおよび還元されたＨＮタンパクを上記同様に除去して、Ｆタンパクの可溶化上清を回収した。以下ＦＨＮビロソームと同様に処理してＦビロソームを約１．５ｍＬ得た。
３．ＨＮビロソーム
ＳｅＶ（ＯＤ５４０＝５、ＢＳＳ）２ｍＬに１５０ｕｎｉｔｓ／ｍＬのトリプシン（Ｓｉｇｍａ）／ＢＳＳ２ｍＬを加え、３７℃、２時間処理してＦタンパクを分解した後、１ｍｇ／ｍＬのトリプシン−キモトリプシンインフィビター（Ｓｉｇｍａ）／ＢＳＳを加え、反応を停止させた。ＢＳＳで希釈後、ウイルスを遠心分離して、１．８ｍＬのＢＳＳに再懸濁した。以下、ＦＨＮビロソームと同様に処理して、Ｆタンパクの機能を不活化させたＨＮビロソームを約１．５ｍＬ得た。
下表に３種のビロソームの特性を示す。ＦおよびＨＮタンパクの機能を示すＨＡ活性、溶血活性ならびに電気泳動パターンの結果から所望のビロソームが得られたことが確認された（図９）。
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（３）ＳＩＶ−ＬａｃＺの調製
ＬａｃＺ遺伝子を搭載したＳＩＶ（ＳＩＶ−ＬａｃＺ）の調製は以下の３種類のプラスミドを用いた。
・パッケージングベクター：ｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ
・ジーントランスファーベクター：ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／３ＬＴＲΔＵ３またはｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／３ＬＴＲΔＵ３
・ＶＳＶ−Ｇプラスミド：ｐＶＳＶ−Ｇ
パッケージングベクター１５０μｇ、ジーントランスファーベクター３００μｇ、ＶＳＶ−Ｇプラスミド５０μｇを７５ｍＬのＤＭＥＭに溶解した。２ｍＬのＰｌｕｓ  ｒｅａｇｅｎｔ（ライフテックオリエンタル（株））を加えて室温で１５分放置した。７５ｍＬのＤＭＥＭに懸濁した３ｍＬのＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ｒｅａｇｅｎｔ（ライフテックオリエンタル（株））を加え、室温で１５分放置してＤＮＡコンプレックスを形成させた。３ｍＬのＤＮＡコンプレックス溶液を２９３Ｔ細胞（トランスフェクション２日前に２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／１５０ｍｍシャーレ×５０枚，１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭで準備）に滴下して、３７℃、１０％ＣＯ２下で３時間トランスフェクションした。１０ｍＬの１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭを加え、さらに培養を続けた。４８時間後に培養上清を回収し、０．４５μｍのメンブランフイルターで濾過し、濾液を４２５００×ｇ１．５時間遠心してウイルスを沈殿させた。沈殿を併せて１５ｍＬの逆転写反応液（１００μＭ  ｄＮＴＰｓ，３ｍＭ  Ｓｐｅｒｍｉｎｅ，０．３ｍＭ  Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２／ＴＢＳ）に再懸濁して、３７℃、２時間逆転写反応を行った。その後、ウイルスを遠心分離（４２５００×ｇ，２時間）し、５００μＬのＰＢＳ（５％ＦＣＳ，２μｇ／ｍＬポリブレン含有）に再懸濁してＳＩＶ−ＬａｃＺの濃縮液を得た。ＳＩＶ−ＬａｃＺのタイターは約５×１０８Ｔ．Ｕ．／ｍＬであった（２９３Ｔ細胞）。
（４）Ｆｕｓｉｏｎベクターの調製
ＳＩＶ−ＬａｃＺをＢＳＳで希釈して１×１０８Ｔ．Ｕ．／ｍＬに調製した。この溶液に等容のＶｉｒｏｓｏｍｅ／ＢＳＳ溶液を加え、４℃で３０分静置して吸着させた。その後、３７℃で２時間Ｆｕｓｉｏｎを行った後、氷冷したＰＢＳで１０倍希釈して（ＳＩＶ終濃度５×１０６Ｔ．Ｕ．／ｍＬ）、直ちに感染実験に用いた。
（５）感染実験
２９３Ｔ細胞を１２ｗｅｌｌプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ，１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ（以下培地）１ｍＬでまき、３７℃、１０％ＣＯ２下、４８時間培養し、感染直前に培地を０．５ｍＬに減らした。ＳＩＶおよびＶｉｒｏｓｏｍｅとのＦｕｓｉｏｎベクターを５×１０６Ｔ．Ｕ．／ｍＬ，１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、３７℃、１０％ＣＯ２下で１０分間感染を行った。培地で２回洗浄した後、２ｍＬの培地を加え培養を続けた。４８時間後に細胞をＰＢＳで２回洗浄後、細胞溶解液（ピカジーンＬＣ−β；東洋インキ製造（株））０．２５ｍＬで溶解した。１２，０００ｒｐｍ、３分遠心分離を行い、上清を適宜希釈して、ＬａｃＺ遺伝子の発現量をＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  ＰｌｕｓＴＭ（ＴＲＯＰＩＸ，Ｉｎｃ．）を用いて測定した。結果は細胞蛋白１μｇ当たりのＬａｃＺ相対活性（ＲＬＵ／μｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を３例の平均値±標準誤差で示した。
ＦＨＮ−ＶｉｒｏｓｏｍｅでＦｕｓｉｏｎすることによりＬａｃＺ発現量がＳＩＶ単独に比べて有意に増加した（ｐ＜０．０５）。Ｆ−Ｖｉｒｏｓｏｍｅの場合、ＦＨＮで認められた遺伝子発現の上昇は得られなかった。ＨＮ−Ｖｉｒｏｓｏｍｅでも上昇する傾向が認められたが、その度合いはＦＨＮに比べると小さかった（図１０）。
上記ベクターにおいては、Ｆｕｓｉｏｎの役割を担うタンパクとして、ＳＩＶのＶＳＶ−ＧおよびＶｉｒｏｓｏｍｅのＦタンパクが存在する。ＶＳＶ−ＧタンパクのＦｕｓｉｏｎは弱酸性ｐＨ域に至適値があり、一方Ｆタンパクは中性域でもＦｕｓｉｏｎ可能であることが報告されている。本実施例では、Ｆｕｓｉｏｎを中性ｐＨで行っていることから、主としてＳｅＶのＦタンパクがＦｕｓｉｏｎのメインを担っていると考えられる。ＳｅＶとリポソームのＦｕｓｉｏｎではＦタンパクの機能が保持されていれば成立することが報告されている。そこで、ＦＨＮ及びＦ−ＶｉｒｏｓｏｍｅのＦｕｓｉｏｎ効率は同程度と仮定すると、ＦＨＮ−Ｖｉｒｏｓｏｍｅのみで遺伝子発現の上昇が認められたのは付加されたＨＮの寄与が大きいと推測された。ＨＮ−Ｖｉｒｏｓｏｍｅでも若干の効果が見られたことから、ＶＳＶ−Ｇ側からのＦｕｓｉｏｎもある程度生じ、ＨＮタンパクがＳＩＶに付与されたと推測された。
一方、単純にＳＩＶとＶｉｒｏｓｏｍｅを共存させたときには、ＳＩＶ単独と同程度であった（図１０）。このことから、両者を混合して３７℃で反応させることによりＦｕｓｉｏｎが成立し、ＳＩＶのエンベロープ上にＳｅＶの膜タンパクが付加され、主にＨＮタンパクの寄与により感染速度が向上したと考えられた。
［実施例８］  ＨＮシュードタイプレンチウイルスベクターの調製および性能解析
１．細胞培養
２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞株）は、１０％非働化仔ウシ血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）高グルコース（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて、３７℃、１０％ＣＯ２で培養した。
２．ベクターの作製
２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートへ１ウェルあたり５×１０５個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーした。培養液を１ウェルあたり８００μｌの１％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭに置換してトランスフェクションに用いた。１ウェルあたリジーントランスファーベクター（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／３ＬＴＲΔＵ３またはｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／３ＬＴＲΔＵ３）１２００ｎｇ、パッケージングベクター（ｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ）３６０ｎｇ、ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドｐＶＳＶ−Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）１２０ｎｇ、Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ＨＮ、Ｆ、およびＭ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＨＮ、ｐＣＡＧＧＳ−ＦおよびｐＣＡＧＧＳ−Ｍをそれぞれ２４０ｎｇを、以下の表５のような組み合わせで１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭに溶解後６μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えて攪拌、１５分間室温で静置した。これに、１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭで希釈した４μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加して攪拌後さらに室温で１５分間静置し、これを上記の２９３Ｔ細胞に滴下して緩やかに攪拌し、３７℃、１０％ＣＯ２下で３時間カルチャーした。１ウェルあたり１ｍｌの１％ウシ血清アルブミンおよび１５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭを加え、３７℃、１０％ＣＯ２で、４８時間培養後に培養上清を回収、０．４５μｍのフイルターで濾過したものをベクター浮遊液とした。
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（表中、加えたプラスミドを黒で示した。「ＰＶ」はパッケージングベクターｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ、「ＧＴＶ」はジーントランスファーベクターｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／３ＬＴＲΔＵ３またはｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦβ−ｇａｌ／３ＬＴＲΔＵ３、「ＶＳＶ−Ｇ」はＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドｐＶＳＶ−Ｇ、そして、「ＨＮ」、「Ｆ」および「Ｍ」はそれぞれセンダイウイルスＨＮ、Ｆ、およびＭ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＨＮ、ｐＣＡＧＧＳ−ＦおよびｐＣＡＧＧＳ−Ｍを示す）
３．ベクターの大量調製および濃縮
２９３Ｔ細胞を１５ｃｍのプラスチックシャーレへ１枚あたり５×１０６個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーした。培養液を１ウェルあたり１０ｍｌの１％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭに置換してトランスフェクションに用いた。シャーレ１枚あたりジーントランスファーベクター８μｇ、パッケージングベクター２．４μｇ、ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドｐＶＳＶ−Ｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）０．８μｇ、Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ＨＮおよびＦ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＨＮ、ｐＣＡＧＧＳ−ＦおよびｐＣＡＧＧＳ−Ｍをそれぞれ１．６μｇを、上記の表５の組み合わせで１．５ｍｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭに溶解後、４０μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えて攪拌、１５分間室温で静置した。これに、６０μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加した１．５ｍｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭを加え攪拌後さらに室温で１５分間静置し、これを上記の２９３Ｔ細胞に滴下して緩やかに攪拌し、３７℃、１０％ＣＯ２下で３時間カルチャーした。シャーレ１枚あたり１０ｍｌの１％ウシ血清アルブミンおよび１５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭを加え、３７℃、１０％ＣＯ２で、４８時間培養した。培養上清を回収、０．４５μｍのフィルターで濾過し、４２，４９０×ｇ（ＴＯＭＹ  ＳＲＸ−２０１，ＴＡ２１ＢＨ）、４℃、９０分遠心した。ペレットを１／１００量の逆転写反応液（ＴＢＳ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，３ｍＭ  ＳＰＥＲＭＩＮＥ，０．３ｎＭ  ＳＵＰＥＲＭＩＤＩＮＥ，１００ｍＭ  ｄＮＴＰｓ）に溶解し、３７℃で２時間反応させた。逆転写反応後、４２，４９０×ｇ（ＴＯＭＹ  ＳＲＸ−２０１，ＴＡ２１ＢＨ）、４℃、２時間遠心し、ペレットをＰＢＳ（５％ＦＣＳ，２μｇ／ｍｌ  ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）に溶解し、使用まで−８０℃に保存した。
パッケージングベクター、ジーントランスファーベクターおよび外殻蛋白発現ベクターの３種のプラスミドを細胞にコトランスフェクションすると、ジーントランスファーベクターのｍＲＮＡが転写され、パッケージングベクターより供給されるウイルス蛋白によりΨ配列が認識されることによりベクター粒子内にＲＮＡがパッケージングされる。次に、外殻蛋白発現ベクターにより供給されるエンベロープ蛋白によってシュードタイプ化され、ベクター粒子が完成する。作製したシュードタイプウイルスベクターを供試して細胞に対する遺伝子導入について検討した。
＜ベクターの力価測定および導入細胞の検出＞
２９３Ｔ細胞を供試し、前述の方法によりベクターによる遺伝子導入を実施した。ベクター液１ｍｌによって遺伝子導入される細胞の数によって力価を算出した。また、レポーター遺伝子としてＥＧＦＰをコードしたジーントランスファーベクターを供試した場合は、標的細胞を２％ホルムアルデヒドおよび０．２％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で室温２０分間固定し、ＰＢＳで１回洗浄後に蛍光倒立型顕微鏡（ＤＭＩＲＢ（ＳＬＲ）、ライカ）で鏡検してＥＧＦＰの発現を検索した。
パッケージングベクター（ｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ）、ジーントランスファーベクター（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦＥＧＦＰ／３ＬＴＲΔＵ３）およびＳｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ由来の外殻蛋白発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−Ｆ，ｐＣＡＧＧＳ−ＨＮ，およびｐＣＡＧＧＳ−Ｍ）の３種のプラスミドを、表５の▲２▼〜▲５▼のような組み合わせで細胞にコトランスフェクションした結果、いずれの場合も２９３Ｔ細胞への遺伝子導入は認められなかった。しかしながら、ＶＳＶ−Ｇを共発現させることにより遺伝子導入が認められた。これらの結果より、ＦおよびＨＮ蛋白のみではシュードタイプＳＩＶａｇｍベクターの十分な遺伝子導入効率は得られないが、ＶＳＶ−Ｇなどのヒト細胞感染性ウイルスのエンベロープ蛋白質を共存させることにより高い感染力を持つシュードタイプウイルスベクターが生産されることが判明した。
シュードタイプＳＩＶａｇｍベクターにより、２９３Ｔ細胞に対しＥＧＦＰ遺伝子を導入し、ベクターの力価を測定した結果、作製したウイルスベクターの力価は、ベクター液１ｍｌあたり０．５〜１×１０５Ｔ．Ｕ．であった。さらに、遠心により濃縮したウイルスベクターの力価は、濃縮により１．０×１０７Ｔ．Ｕ．／ｍｌと高い値を示した。この結果から、センダイウイルス由来ＦおよびＨＮ蛋白によりシュードタイプ化したＳＩＶａｇｍベクターが遠心により濃縮可能であることが示された。
［実施例９］  シュードタイプウイルスベクターのインビボ投与
従来のウイルスベクターにより遺伝子導入が困難であるとされている気管上皮粘膜細胞においては、導入時に物理的障害を取り除く処理がされており、ＶＳＶ−ＧシュードタイプＨＩＶベクターを用いた遺伝子導入では二酸化硫黄などにより傷害しないと十分な効果が認められていない（Ｌ．Ｇ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：７，５６８−５７４．２０００）。センダイウイルス由来ＦおよびＨＮ蛋白によりシュードタイプ化したＳＩＶａｇｍベクターは、傷害を与える必要なく気管上皮粘膜細胞に効率よく遺伝子を導入することができるか否かを検証した。
６週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（オス）をｓｅｂｏｆｌｕｒｅｎｅ吸入麻酔下に、上記のように
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現ベクター）（ＳＩＶ−Ｆ／ＨＮ／Ｍ−ＥＧＦＰと称す）を経鼻的に投与した。組織はＯＣＴ  ｃｏｍｐａｕｎｄにて凍結切片を作成し、蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で観察した。
ＳＩＶ−Ｆ／ＨＮ／Ｍ−ＥＧＦＰ  １０８Ｔ．Ｕ．を鼻より１００μｌ投与し、３日目の気管を観察したところ、気管上皮細胞にＥＧＦＰの蛍光が観察された（図１１）。また、同じ個体の鼻中隔粘膜においても、粘膜上皮に発現が観察され、多列線毛上皮にも蛍光が認められた（図１２）。
［実施例１０］  シュードタイプウイルスベクターのインビボ投与における長期間の外来遺伝子発現
ＥＧＦＰを発現するジーントランスファーベクターを用いて、上記と同様にＦおよびＨＮ蛋白質を含むシュードタイプレトロウイルスを製造した。具体的には、表２
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”に相当するシュードタイプＳＩＶ（ＳＩＶ−Ｆ／ＨＮ／Ｍ−ＥＧＦＰ）を製造した。対照として、表５の“▲１▼”に相当するＶＳＶ−ＧシュードタイプＳＩＶ（ＳＩＶ−ＶＳＶ−ＥＧＦＰ）を用いた。マウスに経鼻的にこれらのＥＧＦＰ発現ウイルスベクターを投与し、投与９０日後に鼻粘膜組織切片を作製し、ＥＧＦＰの発現を観察した。
その結果、いずれのベクターにおいてもＥＧＦＰの発現が観察されたが、Ｆ，ＨＮ蛋白を持つＭＳＣＶ−Ｆ／ＨＮ／Ｍ−ＥＧＦＰおよびＳＩＶ−Ｆ／ＨＮ／Ｍ−ＥＧＦＰの投与においてＥＧＦＰの強い蛍光が確認された。特に、ＳＩＶ−Ｆ／ＨＮ／Ｍ−ＥＧＦＰベクター投与した場合には他のベクターに比べ強い蛍光が観察され、このベクターが高い遺伝子導入能を有することが確認された（図１３）。
［実施例１１］  新規センダイウイルスエンベロープ蛋白発現プラスミドの構築
▲１▼細胞質側領域置換型ＨＮ発現プラスミドの構築
ＨＮ蛋白の細胞質側領域をＳＩＶエンベロープ蛋白の細胞質側領域に置換したＨＮ発現プラスミドを構築した（図１４）。３組の合成オリゴヌクレオチド（Ｘｈｏ＋Ｘｍａ／Ｘｍａ−Ｘｈｏ、Ｘｍａ＋１３１／１３５−Ｘｍａ、１３２＋Ｂａｍ／Ｂａｍ−１３６）をアニーリング後、順にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ部位へ組み込んだ。ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．１９３−２００，１９９１）のＸｈｏＩ−Ｂｓｕ３６Ｉ部位に前記組み換えプラスミドをＸｈｏＩとＤｒａＩＩＩで切断した合成オリゴヌクレオチド連結断片を精製したもの、ＨＮ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＨＮをＤｒａＩＩＩとＢｓｕ３６Ｉで切断したＨＮ蛋白３’側を含む断片を精製したものを組み込んだ。以上の方法により得られたプラスミドをＳＩＶ細胞質側領域置換型ＨＮ発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ／ＨＮとした。
▲２▼ＳＩＶ細胞質側領域付加型ＨＮ発現プラスミドの構築
ＳＩＶエンベロープ蛋白の細胞質側領域をＨＮ蛋白に付加したＨＮ発現プラスミドを構築した（図１５）。ＳＩＶエンベロープ蛋白の細胞質側と一部のＨＮ蛋白を含む領域を上記細胞質側領域置換型ＨＮ発現プラスミドをテンプレートとし、プライマーＦＳＩＶｈｎおよびＲｈｎＳＩＶを用いたＰＣＲにより増幅した。増幅断片をＸｈｏＩおよびＡｃｃＩにより切断後、上記▲１▼にて作製した３組の合成オリゴヌクレオチドを組み込んだｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＸｈｏＩ−ＡｃｃＩ部位へ組み、ＳＩＶエンベロープの細胞質側領域を含む断片と置換した。
この組み換えプラスミドをＸｈｏＩとＤｒａＩＩＩで切断した合成オリゴヌクレオチド連結断片を精製したもの、ＨＮ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＨＮをＤｒａＩＩＩとＢｓｕ３６Ｉで切断したＨＮ蛋白３’側を含む断片をｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．１９３−２００，１９９１）のＸｈｏＩ−Ｂｓｕ３６Ｉ部位に組み込んだ。以上の方法により得られたプラスミドをＳＩＶ細胞質側領域付加型ＨＮ発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ＋ＨＮとした。
▲３▼細胞質側領域欠失型Ｆ蛋白発現プラスミドの構築
Ｆ蛋白細胞質側領域のアミノ酸を５’側より２７、１４および４個残し、それぞれ１５、２８および３８個のアミノ酸を欠失させたＦ蛋白発現プラスミドを構築した（図１６）。Ｆ蛋白の全領域をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｍａＩ部位へ組み込んだプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋／ＳｍａＩ／Ｆをテンプレートとし、１５、２８および３８アミノ酸欠失型をそれぞれプライマーＸｈＦＦとＮｏｔＦ１６５０、ＮｏｔＦ１６１１およびＮｏｔＦ１５８１を用いたＰＣＲにより増幅した。増幅断片をＸｈｏＩおよびＮｏｔＩにより切断後、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．１９３−２００，１９９１）のＥｃｏＲＩ部位にＸｈｏＩ／ＮｏｔＩリンカーを組み込んだプラスミドのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ部位に組み、プラスミド（１５アミノ酸欠失型：ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ２７、２８アミノ酸欠失型：ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ１４および３８アミノ酸欠失型：ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ４）を構築した。
▲４▼ＳＩＶ細胞質側領域を付加した細胞質側領域欠失型Ｆ蛋白発現プラスミドの構築
細胞質側領域欠失型Ｆ蛋白（Ｆ蛋白細胞質側領域のアミノ酸数は▲３▼で作製したプラスミドと同数）にＳＩＶ細胞質側領域５’側より１１アミノ酸（ＳＩＶｃｔ１１）を付加したプラスミドを構築した（図１７）。Ｆ蛋白の全領域をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｍａＩ部位へ組み込んだプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋／ＳｍａＩ／Ｆをテンプレートとし、上記３種のアミノ酸欠失型にＳＩＶ細胞質側領域を付加したものをそれぞれプライマーＸｈＦＦとＳＡ−Ｆ１６５０、ＳＡ−Ｆ１６１１およびＳＡ−Ｆ１５８１を用いたＰＣＲにより増幅した。増幅断片をＸｈｏＩおよびＮｏｔＩにより切断後、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．１９３−２００，１９９１）のＥｃｏＲＩ部位にＸｈｏＩ／ＮｏｔＩリンカーを組み込んだプラスミドのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ部位に組み、プラスミド（ＳＩＶｃｔ１１付加１５アミノ酸欠失型：ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ２７／ＳＩＶｃｔ１１、ＳＩＶｃｔ１１付加２８アミノ酸欠失型：ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ１４／ＳＩＶｃｔ１１およびＳＩＶｃｔ１１付加３８アミノ酸欠失型：ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ４／ＳＩＶｃｔ１１）を構築した。
［実施例１２］  センダイウイルスエンベロープシュードタイプレンチウイルスベクターの調製および性能解析
＜細胞培養＞
２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞株）は、１０％非働化仔ウシ血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）高グルコース（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて、３７℃、１０％ＣＯ２で培養した。
ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞（ヒト気管上皮由来細胞株）は、１０％非働化仔ウシ血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を含むＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）とＲＰＭＩ１６４０を１：１の比率で混合したものを用いて、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
＜ベクターの作製＞
２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートへ１ウェルあたり５×１０５個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーした。培養液を１ウェルあたり８００μｌの１％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭに置換してトランスフェクションに用いた。１ウェルあたりジーントランスファーベクター（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦ  ＥＧＦＰ／３ＬＴＲΔＵ３）１２００ｎｇ、パッケージングベクター（ｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ）３６０ｎｇ、Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ＨＮ、Ｆ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ／ＨＮ、ｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ＋ＨＮ、ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ４、ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ１４、ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ２７、ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ４／ＳＩＶｃｔ１１、ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ１４／ＳＩＶｃｔ１１およびｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ２７／ＳＩＶｃｔ１１をそれぞれ以下の表６に示す組み合わせで１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に溶解後６μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えて攪拌、１５分間室温で静置した。これに、１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭで希釈した４μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加して攪拌後さらに室温で１５分間静置し、これを上記の２９３Ｔ細胞に滴下して緩やかに攪拌し、３７℃、１０％ＣＯ２で３時間カルチャーした。１ウェルあたり１ｍｌの１％ウシ血清アルブミンおよび１５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭを加え、３７℃、１０％ＣＯ２で１６〜２４時間カルチャーした後に、１ウェルあたり２ｍｌの１％ウシ血清アルブミンおよび７．５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭに培地交換し、その２４時間培養後に培養上清を回収、０．４５μｍのフィルターで濾過したものを使用した。
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＜ＳＩＶａｇｍベクターによる遺伝子導入＞
標的となる２９３ＴおよびＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートへ１ウェルあたり１×１０６個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で２９３Ｔ細胞は４８時間、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞は２４時間カルチャーした。カルチャープレートより培養液を除去し、ベクター液にポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を最終濃度８μｇ／ｍｌで添加したものを１ｍｌ重層し、３７℃で２９３Ｔ細胞は１０％、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞５％ＣＯ２で３時間カルチャーし、ベクターを感染させた。３時間後に２０％非働化仔ウシ血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を含む培養液を１ｍｌ加え、３７℃で２９３Ｔ細胞は１０％、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞５％ＣＯ２で４８時間培養した。
＜ベクターの力価測定＞
ベクターの力価測定は、ベクター液１ｍｌによって遺伝子導入される細胞の数によって計算した。上記の方法で１ｍｌのベクター液を感染、感染後４８時間後に２％ホルムアルデヒドおよび０．２％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で室温２０分間固定し、ＰＢＳで１回洗浄後に蛍光倒立型顕微鏡（ＤＭＩＲＢ（ＳＬＲ）、ライカ）にて２００倍の倍率で検鏡、視野内の遺伝子導入細胞数を測定し、３視野の平均を求め、視野の面積とプレートの面積よりもとめた係数８５４．８６５をかけることにより力価の算出を行った。力価の単位はＴｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  Ｕｎｉｔ（Ｔ．Ｕ．）／ｍｌで表記することとした。
＜ベクターの大量調製および濃縮＞
２９３Ｔ細胞を１５ｃｍのプラスチックシャーレへ１枚あたり５×１０６個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーした。培養液をシャーレ１枚あたり１０ｍｌの１％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭに置換してトランスフェクションに用いた。シャーレ１枚あたりジーントランスファーベクター（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦ  ＬａｃＺ／３ＬＴＲΔＵ３）８μｇ、パッケージングベクター（ｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ）２．４μｇ、Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ＨＮ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ＋ＨＮおよびＦ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ４をそれぞれ１．６μｇを１．５ｍｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に溶解後、４０μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えて攪拌、１５分間室温で静置した。これに、１．５ｍｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭで希釈した６０μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加して攪拌後さらに室温で１５分間静置し、これを上記の２９３Ｔ細胞に滴下して緩やかに攪拌し、３７℃、１０％ＣＯ２で３時間カルチャーした。シャーレ１枚あたり１０ｍｌの１％ウシ血清アルブミンおよび１５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭを加え、３７℃、１０％ＣＯ２で１６〜２４時間カルチャーした後に、シャーレ１枚あたり２０ｍｌの１％ウシ血清アルブミンおよび７．５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭに培地交換し、その２４時間培養後に培養上清を回収、０．４５μｍのフイルターで濾過した。１６，０００×ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ−２５Ｉ、ＪＡ−１８）、４℃、１時間遠心した。ペレットをＰＢＳ（５％ＦＣＳ、２μｇ／ｍｌポリブレンを含む）に溶解し、−８０℃で保存した。
＜結果＞
ジーントランスファーベクター（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦ  ＥＧＦＰ／３ＬＴＲΔＵ３）、パッケージングベクター（ｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ）およびＳｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ＨＮ（ｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ／ＨＮまたはｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ＋ＨＮ）、Ｆ蛋白発現プラスミド（ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ４、ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ１４、ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ２７、ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ４／ＳＩＶｃｔ１１、ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ１４／ＳＩＶｃｔ１１、ｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ２７／ＳＩＶｃｔ１１）を組み合わせて細胞にコトランスフェクションした結果、２９３ＴおよびＢＥＡＳ−２Ｂ細胞への遺伝子導入が認められ（図１８、１９および２０）、ＨＮおよびＦ蛋白発現プラスミドにおける改変によりＶＳＶ−Ｇを共発現させることなく遺伝子導入が認められることから、Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ＦおよびＨＮ蛋白によるＳＩＶａｇｍをベースとしたシュードタイプレンチウイルスベクターの作製が可能であることが示された。これらシュードタイプベクターの２９３Ｔ細胞を用いた力価は約３．６×１０４Ｔ．Ｕ．／ｍｌであり、Ｆ蛋白発現プラスミドにおいてはｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ４およびＦｃｔ４／ＳＩＶｃｔ１１を用いた場合が最も高く、これら２種のＦ蛋白発現プラスミドとＨＮ蛋白発現プラスミド３種との組み合わせにおいては、ＨＮ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ＋ＨＮとの組み合わせで最も高かった。
最もベクター力価の高かったＦ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ４およびＨＮ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ＋ＨＮをコトランスフェクションして作製したベクターについて遠心による濃縮について検討した。その結果、Ｆ、ＨＮシュードタイプベクターは遠心により高度の濃縮が可能であることが確認された（図２１）。
＜供試したオリゴヌクレオチド＞
合成オリゴヌクレオチドは、ＳＡ−Ｆ１６１１およびＳＡ−Ｆ１５８１を除き（株）グライナージャパンＤＮＡ受託合成事業部に依頼し、日本製粉（株）生物化学研究部にて合成、逆相カートリッジ精製またはＰＡＧＥ精製したものを使用した。ＳＡ−Ｆ１６１１およびＳＡ−Ｆ１５８１は、（株）サワディー・テクノロジーに依頼し、ＨＰＬＣ精製したものを使用した。
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［実施例１３］  センダイウイルスエンベロープシュードタイプレトロウイルスベクターの調製および性能解析
＜細胞培養＞
２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞株）は、１０％非働化仔ウシ血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）高グルコース（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて、３７℃、１０％ＣＯ２で培養した。
＜ベクターの作製＞
２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートへ１ウェルあたり５×１０５個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーした。培養液を１ウェルあたり８００μｌの１％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭに置換してトランスフェクションに用いた。１ウェルあたりジーントランスファーベクターｐＭＳＣＶ  ＥＧＦＰ  ７００ｎｇ、エコトロピックエンベロープおよびｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド（ＩＭＧＥＮＥＸ社）３００ｎｇ、Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  Ｆ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ４  ２００ｎｇ、ＨＮ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＨＮ、ｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ／ＨＮおよびｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ＋ＨＮ  ２００ｎｇをそれぞれ以下の表７に示す組み合わせで１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に溶解後６μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えて攪拌、１５分間室温で静置した。これに、１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭで希釈した４μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加して攪拌後さらに室温で１５分間静置し、これを上記の２９３Ｔ細胞に滴下して緩やかに攪拌し、３７℃、１０％ＣＯ２で３時間カルチャーした。１ウェルあたり１ｍｌの１％ウシ血清アルブミンおよび１５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭを加え、３７℃、１０％ＣＯ２で１６〜２４時間カルチャーした後に、１ウェルあたり２ｍｌの１％ウシ血清アルブミンおよび７．５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭに培地交換し、その２４時間培養後に培養上清を回収、０．４５μｍのフィルターで濾過したものを使用した。
0004700888.tif 000015
＜ＳＩＶａｇｍベクターによる遺伝子導入＞
標的となる２９３Ｔを６ウェルのプラスチックカルチャープレートへ１ウェルあたり１×１０５個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーした。カルチャープレートより培養液を除去し、ベクター液にポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を最終濃度８μｇ／ｍｌで添加したものを１ｍｌ重層し、３７℃、１０％ＣＯ２で３時間カルチャーし、ベクターを感染させた。３時間後に２０％非働化仔ウシ血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を含む培養液を１ｍｌ加え、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間培養した。
＜ベクターの力価測定＞
ベクターの力価測定は、ベクター液１ｍｌによって遺伝子導入される細胞の数によって計算した。上記の方法で１ｍｌのベクター液を感染、感染後４８時間後に２％ホルムアルデヒドおよび０．２％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で室温２０分間固定し、ＰＢＳで１回洗浄後に蛍光倒立型顕微鏡（ＤＭＩＲＢ（ＳＬＲ）、ライカ）にて２００倍の倍率で検鏡、視野内の遺伝子導入細胞数を測定し、３視野の平均を求め、視野の面積とプレートの面積よりもとめた係数８５４．８６５をかけることにより力価の算出を行った。力価の単位はＴｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  Ｕｎｉｔ（Ｔ．Ｕ．）／ｍｌで表記することとした。
＜結果＞
ジーントランスファーベクターｐＭＳＣＶ  ＥＧＦＰ、エコトロピックエンベロープおよびｇａｇ−ｐｏｌ発現プラスミド、Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  Ｆ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ４、ＨＮ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＨＮ、ｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ／ＨＮおよびｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ＋ＨＮを組み合わせて細胞にコトランスフェクションした結果、２９３Ｔ細胞への遺伝子導入が認められた（図２２）。ＨＮおよびＦ蛋白発現プラスミドにおける改変により、エコトロピックエンベロープを保有するウイルスが感染性を示さないヒト由来２９３Ｔ細胞に対し遺伝子導入が認められることから、Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ＦおよびＨＮ蛋白によるＭＳＣＶをベースとしたシュードタイプレトロウイルスベクターの作製が可能であることが示された。さらにＦ蛋白発現プラスミドにｐＣＡＧＧＳ−Ｆｃｔ４を用いた場合、シュードタイプレトロウイルスベクターの力価は、ＨＮ蛋白発現プラスミド３種との組み合わせにおいてＨＮ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ＋ＨＮとの組み合わせで最も高く、１．１×１０５Ｔ．Ｕ．／ｍｌであった。
［実施例１４］  ＶＳＶ−Ｇ／ＨＮシュードタイプレンチウイルスベクターの生産および造血幹細胞を含むヒト骨髄細胞に対する遺伝子導入効率のＶＳＶ−Ｇシュードタイプレンチウイルスベクターとの比較
＜細胞培養＞
２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞株）は、１０％非働化仔ウシ血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）高グルコース（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて、３７℃、１０％ＣＯ２で培養した。
＜ベクターの力価測定＞
ベクターの力価測定は、ベクター液１ｍｌによって遺伝子導入される細胞の数によって計算した。上記の方法で１ｍｌのベクター液を感染、感染後４８時間後に２％ホルムアルデヒドおよび０．２％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で室温２０分間固定し、ＰＢＳで１回洗浄後に蛍光倒立型顕微鏡（ＤＭＩＲＢ（ＳＬＲ）、ライカ）にて２００倍の倍率で検鏡、視野内の遺伝子導入細胞数を測定し、３視野の平均を求め、視野の面積とプレートの面積よりもとめた係数８５４．８６５をかけることにより力価の算出を行った。力価の単位はＴｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  Ｕｎｉｔ（Ｔ．Ｕ．）／ｍｌで表記することとした。
＜ベクターの大量調製および濃縮＞
２９３Ｔ細胞を１５ｃｍのプラスチックシャーレへ１枚あたり５×１０６個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーした。培養液をシャーレ１枚あたり１０ｍｌのＤＭＥＭに置換してトランスフェクションに用いた。シャーレ１枚あたリジーントランスファーベクター（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦ  ＥＧＦＰ／３ＬＴＲΔＵ３）８μｇ、パッケージングベクター（ｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ）２．４μｇ、ＶＳＶ−Ｇ発現プラスミドｐＶＳＶ−ＧとＳｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ＨＮ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＨＮ、ｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ／ＨＮおよびｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ＋ＨＮ  １．６μｇの３種を以下の表８に記載の組み合わせで１．５ｍｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に溶解後、４０μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えて攪拌、１５分間室温で静置した。これに、１．５ｍｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭで希釈した６０μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加して攪拌後さらに室温で１５分間静置し、これを上記の２９３Ｔ細胞に滴下して緩やかに攪拌し、３７℃、１０％ＣＯ２で３時間カルチャーした。シャーレ１枚あたり２０ｍｌの２０％非働化仔ウシ血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を含むＤＭＥＭを加え、３７℃、１０％ＣＯ２で１６〜２４時間カルチャーした後に、シャーレ１枚あたり２０ｍｌの非働化仔ウシ血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を含むＤＭＥＭに培地交換し、その２４時間培養後に培養上清を回収、０．４５μｍのフィルターで濾過した。４２，３９０×ｇ（ＴＯＭＹ  ＳＲＸ−２０１，ＴＡ２１ＢＨ）、４℃、９０分遠心した。ペレットを１／１００の逆転写反応液（ＴＢＳ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，３ｍＭ  ＳＰＥＲＭＩＮＥ，０．３ｎＭ  ＳＵＰＥＲＭＩＤＩＮＥ，１００ｍＭ  ｄＮＴＰｓ）に溶解し、３７℃、２時間反応させた。逆転写反応後、４２，３９０×ｇ（ＴＯＭＹ  ＳＲＸ−２０１，ＴＡ２１ＢＨ）、４℃、２時間遠心し、ペレットをＰＢＳ（５％ＦＣＳ、２μｇ／ｍｌポリブレンを含む）に溶解し、使用まで−８０℃で保存した。
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＜ヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞への遺伝子導入＞
ヒト骨髄ＣＤ３４＋細胞はＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社より購入した。解凍後、５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、１００ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３リガンド（Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）（いずれもヒトリコンビナント）、１０％ＦＣＳ添加イスコフ変法ＤＭＥＭ（ＩＭＤＭ）にて３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した。培養後、細胞２×１０５個に対し、ウイルスベクターを２×１０６および１０７Ｔ．Ｕ．／ｍｌで調製したウイルス液に交換し、５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６、１００ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）、１００ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３リガンドを添加した。培養開始９６時間後に細胞を回収した。
＜フローサイトメーターによる解析＞
回収した細胞はＰＥ標識抗ヒトＣＤ３４抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて染色した後、フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ  ＥＬＩＴＥ、Ｃｏｕｌｔｅｒ）にてＧＦＰおよびＰＥの２蛍光により解析した。
＜結果＞
ｍ．ｏ．ｉ．＝１０においてＶＳＶ−ＧシュードタイプベクターのＣＤ３４＋細胞におけるＧＦＰ陽性細胞の比率が９．７％であったのに対し、ＶＳＶ−ＧとＨＮ、ＳＩＶｃｔ／ＨＮおよびＳＩＶｃｔ＋ＨＮとのシュードタイプベクターのＣＤ３４＋細胞におけるＧＦＰ陽性細胞の比率はそれぞれ４３．９、２５．２および１９．７％であった（表９）。一方、ｍ．ｏ．ｉ．＝５０においてはＶＳＶ−ＧシュードタイプベクターのＣＤ３４＋細胞におけるＧＦＰ陽性細胞の比率は５１．４％であり、ＶＳＶ−ＧとＨＮ、ＳＩＶｃｔ／ＨＮおよびＳＩＶｃｔ＋ＨＮとのシュードタイプベクターのＣＤ３４＋細胞におけるＧＦＰ陽性細胞の比率はそれぞれ４３．０、７０．８および６８．４％であった（表１０）。
以上の結果より、ＶＳＶ−Ｇ蛋白に加えＨＮ蛋白を共発現させることにより作製したシュードタイプベクターは造血幹細胞を含むヒト骨髄細胞に対する遺伝子導入の効率が上昇することが確認された。
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［実施例１５］  インフルエンザウイルスエンベロープ蛋白発現プラスミドの構築
インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１）由来ヘムアグルチニン蛋白（ＨＡ）発現プラスミドを構築した。プラスミドｐＤＲＥＦ  ＨｉｓＤ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４（８），６７７−６８５，２０００）をテンプレートとし、プライマーＨＡＦＮｏｔおよびＨＡＲＮｏｔを用いたＰＣＲにより増幅した。増幅断片をＮｏｔＩにより切断後、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．１９３−２００，１９９１）にＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ部位を付加したベクターのＮｏｔＩ部位に組み込んだ。以上の方法により得られたプラスミドをＨＡ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＨＡとした。
供試した合成オリゴヌクレオチドは、（株）グライナージャパンＤＮＡ受託合成事業部に依頼し、日本製粉（株）生物化学研究部にて合成、逆相カートリッジ精製またはＰＡＧＥ精製したものを使用した。
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［実施例１６］  インフルエンザウイルスエンベロープシュードタイプレンチウイルスベクターの調製および性能解析
＜細胞培養＞
２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞株）は、１０％非働化仔ウシ血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）高グルコース（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて、３７℃、１０％ＣＯ２で培養した。
＜ベクターの作製＞
２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートへ１ウェルあたり５×１０５個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーした。培養液を１ウェルあたり８００μｌの１％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭに置換してトランスフェクションに用いた。１ウェルあたりジーントランスファーベクター（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦ  ＥＧＦＰ／３ＬＴＲΔＵ３）１２００ｎｇ、パッケージングベクター（ｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ）３６０ｎｇ、ＨＡ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＨＡ  ２４０ｎｇを１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に溶解後６μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えて攪拌、１５分間室温で静置した。これに、１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭで希釈した４μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加して攪拌後さらに室温で１５分間静置し、これを上記の２９３Ｔ細胞に滴下して緩やかに攪拌し、３７℃、１０％ＣＯ２で３時間カルチャーした。１ウェルあたり１ｍｌの１％ウシ血清アルブミンおよび１０μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭを加え、３７℃、１０％ＣＯ２で１６〜２４時間カルチャーした後に、１ウェルあたり２ｍｌの１％ウシ血清アルブミン、５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および５０ｕｎｉｔのノイラミニダーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を含むＤＭＥＭに培地交換し、その２４時間培養後に培養上清を回収、０．４５μｍのフィルターで濾過したものを使用した。
＜ＳＩＶａｇｍベクターによる遺伝子導入＞
標的となる２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートへ１ウェルあたり１×１０６個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーした。カルチャープレートより培養液を除去し、ベクター液にポリブレン（Ｓｉｇｍａ）を最終濃度８μｇ／ｍｌで添加したものを１ｍｌ重層し、３７℃、１０％ＣＯ２で３時間カルチャーし、ベクターを感染させた。３時間後に２０％非働化仔ウシ血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を含む培養液を１ｍｌ加え、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間培養した。
＜ベクターの力価測定＞
ベクターの力価測定は、ベクター液１ｍｌによって遺伝子導入される細胞の数によって計算した。上記の方法で１ｍｌのベクター液を感染、感染後４８時間後に２％ホルムアルデヒドおよび０．２％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で室温２０分間固定し、ＰＢＳで１回洗浄後に蛍光倒立型顕微鏡（ＤＭＩＲＢ（ＳＬＲ）、ライカ）にて２００倍の倍率で検鏡、視野内の遺伝子導入細胞数を測定し、３視野の平均を求め、視野の面積とプレートの面積よりもとめた係数８５４．８６５をかけることにより力価の算出を行った。力価の単位はＴｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  Ｕｎｉｔ（Ｔ．Ｕ．）／ｍｌで表記することとした。
＜ベクターの大量調製および濃縮＞
２９３Ｔ細胞を１５ｃｍのプラスチックシャーレへ１枚あたり５×１０６個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーした。培養液をシャーレ１枚あたり１０ｍｌの１％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭに置換してトランスフェクションに用いた。シャーレ１枚あたりジーントランスファーベクター（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦ  ＬａｃＺ／３ＬＴＲΔＵ３）８μｇ、パッケージングベクター（ｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ）２．４μｇ、ＨＡ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＨＡ  １．６μｇを１．５ｍｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に溶解後、４０μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えて攪拌、１５分間室温で静置した。これに、１．５ｍｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭで希釈した６０μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加して攪拌後さらに室温で１５分間静置し、これを上記の２９３Ｔ細胞に滴下して緩やかに攪拌し、３７℃、１０％ＣＯ２で３時間カルチャーした。シャーレ１枚あたり１０ｍｌの１％ウシ血清アルブミンおよび１０μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭを加え、３７℃、１０％ＣＯ２で１６〜２４時間カルチャーした後に、シャーレ１枚あたり２０ｍｌの１％ウシ血清アルブミン、５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および５００ｕｎｉｔのノイラミニダーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を含むＤＭＥＭに培地交換し、その２４時間培養後に培養上清を回収、０．４５μｍのフィルターで濾過した。１６，０００×ｇ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｊ−２５Ｉ、ＪＡ−１８）、４℃、１時間遠心した。ペレットをＰＢＳ（５％ＦＣＳ、２μｇ／ｍｌポリブレンを含む）に溶解し、−８０℃で保存した。
＜結果＞
ジーントランスファーベクター（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦ  ＥＧＦＰ／３ＬＴＲΔＵ３）、パッケージングベクター（ｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ）およびＨＡ蛋白発現プラスミド（ｐＣＡＧＧＳ−ＨＡ）を細胞にコトランスフェクションした結果、２９３Ｔ細胞への遺伝子導入が認められ（図２３）、ＶＳＶ−Ｇを共発現させることなく遺伝子導入が認められることから、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ＨＡ蛋白によるＳＩＶａｇｍをベースとしたシュードタイプレンチウイルスベクターの作製が可能であることが示された。これらシュードタイプベクターの２９３Ｔ細胞を用いた力価は１．３×１０４Ｔ．Ｕ．／ｍｌであった。さらに、このようにして作製したベクターについて遠心による濃縮について検討した結果、ＨＡシュードタイプベクターは遠心により高度の濃縮が可能であることが確認された（図２４）。
［実施例１７］  インフルエンザウイルスおよびセンダイウイルスエンベロープシュードタイプレンチウイルスベクターの調製および性能解析
＜細胞培養＞
２９３Ｔ細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞株）は、１０％非働化仔ウシ血清（ＢＩＯ  ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）高グルコース（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて、３７℃、１０％ＣＯ２で培養した。
＜ベクターの作製＞
２９３Ｔ細胞を６ウェルのプラスチックカルチャープレートへ１ウェルあたり５×１０５個でまき、３７℃、１０％ＣＯ２で４８時間カルチャーした。培養液を１ウェルあたり８００μｌの１％ウシ血清アルブミンを含むＤＭＥＭに置換してトランスフェクションに用いた。１ウェルあたりジーントランスファーベクター（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦ  ＥＧＦＰ／３ＬＴＲΔＵ３）１２００ｎｇ、パッケージングベクター（ｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ）３６０ｎｇ、Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ＨＮ蛋白発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＨＮ、ｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ／ＨＮ、ｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ＋ＨＮおよびＨＡ蛋白発現プラスミド２４０ｎｇをそれぞれ以下の表１１に示す組み合わせで１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に溶解後６μｌのＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を加えて攪拌、１５分間室温で静置した。これに、１００μｌのＯｐｔｉ  ＭＥＭで希釈した４μｌのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を添加して攪拌後さらに室温で１５分間静置し、これを上記の２９３Ｔ細胞に滴下して緩やかに攪拌し、３７℃、１０％ＣＯ２で３時間カルチャーした。１ウェルあたり１ｍｌの１％ウシ血清アルブミンおよび１０μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭを加え、３７℃、１０％ＣＯ２で１６〜２４時間カルチャーした後に、１ウェルあたり２ｍｌの１％ウシ血清アルブミン、５μｇ／ｍｌのトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および５０ｕｎｉｔのノイラミニダーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を含むＤＭＥＭに培地交換し、その２４時間培養後に培養上清を回収、０．４５μｍのフィルターで濾過したものを使用した。
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＜結果＞
ジーントランスファーベクター（ｐＧＬ３Ｃ／ＣＭＶＬ．Ｕ３Ｇ２／ＲＲＥｃ／ｓ／ＣＭＶＦ  ＥＧＦＰ／３ＬＴＲΔＵ３）、パッケージングベクター（ｐＣＡＧＧＳ／ＳＩＶａｇｍ  ｇａｇ−ｔａｔ／ｒｅｖ）、ＨＡ蛋白発現プラスミド（ｐＣＡＧＧＳ−ＨＡ）およびＳｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ＨＮ蛋白発現プラスミド（ｐＣＡＧＧＳ−ＨＮ、ｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ／ＨＮ、ｐＣＡＧＧＳ−ＳＩＶｃｔ＋ＨＮ）を細胞にコトランスフェクションした結果、２９３Ｔ細胞への遺伝子導入が認められた（図２５）。Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓのｂｕｄｄｉｎｇにおけるシアル酸との結合を切断する役割をノイラミニダーゼが担っているため、ＨＡシュードタイプ作製にノイラミニダーゼが必要であった。そこで、Ｓｅｎｄａｉ  ｖｉｒｕｓ  ＨＮ蛋白のノイラミニダーゼ活性を利用する目的で各種ＨＮ発現プラスミドを用いてＨＮ蛋白を共存させたところ、ベクター産生が認められた。この結果から、新規のＨＡ／ＨＮシュードタイプレンチウイルスベクターの作製が可能であることが示された。
産業上の利用の可能性
本発明により、ヘマグルチニン活性を有する膜蛋白質でシュードタイプ化されたレトロウイルスベクターが提供された。本発明のベクターは、遺伝子治療などに好適に用いられる。殊に、気道へのインビボ投与、および造血幹細胞を標的としたエクスビボ投与に有用である。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、センダイウイルスＦ、ＨＮ、またはＦ，ＨＮ蛋白質でシュードタイプ化したマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）を、２９３Ｔ細胞に感染させた結果を示す写真である。ＥＧＦＰを発現するジーントランスファーベクター（ｐＭＳＣＶ  ＥＧＦＰ）を用いてウイルスのパッケージングを行った。パネル上部の「Ｆ」、「ＨＮ」、並びに「Ｆ／ＨＮ」は、それぞれ、パッケージング細胞でセンダイウイルスのＦ、ＨＮ、並びにＦおよびＨＮを発現させて産生させたウイルスを感染させた結果を示す。「ＶＳＶ−Ｇ／Ｎｕｌｌ」の欄は、上段はＶＳＶ−Ｇによりシュードタイプ化したポジティブコントロール、中段および下段はＦ、ＨＮ、およびＶＳＶ−Ｇなどのシュードタイプ化のためのｅｎｖ蛋白を発現させなかった非シュードタイプ化のネガティブコントロールを示す。パネル右の「Ｅｃｏ」および「Ａｍｐｈｏ」は、パッケージング細胞に、それぞれエコトロピックｅｎｖおよびアンフォトロピックｅｎｖを発現させて産生したウイルスを用いた結果を示す。「Ｎｕｌｌ」はレトロウイルスｅｎｖを発現させなかったことを示す。
図２は、センダイウイルスＨＮでシュードタイプ化したアンフォトロピックｅｎｖを持つレトロウイルスのＨＡアッセイの結果を示す写真である。ウイルスの産生のために用いたｐＭＳＣＶ  ＥＧＦＰ、ｐＣｌ−Ａｍｐｈｏ、およびｐＣＡＧＧＳ−ＨＮの量を併記した（図中のＭＳＣＶ：ＡＭＰＨＯ：ＨＮ）。対照のアンフォトロピックｅｎｖを持つレトロウイルス（図中のＡｍｐｈｏ−Ｒｅｔｒｏ）では赤血球凝集は起こらなかったが、センダイウイルスＨＮでシュードタイプ化したレトロウイルス（図中のＨＮ−Ａｍｐｈｏ−Ｒｅｔｒｏ）では凝集反応を起すことが確認された。
図３は、センダイウイルスＨＮ蛋白質でシュードタイプ化したアンフォトロピックｅｎｖを持つＭＳＣＶ（図中ＨＮ−ａｍｐｈｏ）をヒト骨髄細胞に感染させ、フローサイトメーターでＣＤ３４をマーカーに分画してそれぞれの感染細胞（ＧＦＰ発現細胞）の比率を測定した結果を示す図である。図中のａｍｐｈｏはＨＮ蛋白質でシュードタイプ化していない対照である。それぞれのカラムは、ＣＤ３４陰性（ＣＤ３４−）細胞およびＣＤ３４陽性（ＣＤ３４＋）細胞に対するＧＦＰ陽性細胞率を表す。
図４は、構築のベースとなったＳＩＶａｇｍゲノムプラスミド（ａ）および構築したパッケージングベクター（ｂ）、ジーントランスファーベクター（ｃ）、ＶＳＶ−Ｇ供給ベクター（ｄ）の構造模式図である。
図５は、ＳＩＶａｇｍベクターによる２９３Ｔ細胞に対するβガラクトシダーゼ遺伝子導入の結果を示す写真である。上段はベクタープラスミドをトランスフェクションした細胞からとった上清を用いて、２９３Ｔ細胞に対してベクター感染を行い４８時間後にＸ−ｇａｌ染色を行った結果を示す。多くの細胞でβガラクトシダーゼの発現がみられる。下段は無処理対照細胞のＸ−ｇａｌ染色である。
図６は、ＳＩＶａｇｍ  ＳＩＮベクターにより、Ｇ２−Ｍ期で停止状態の２９３Ｔ細胞およびレチノイン酸により分化を誘導したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に対してＥＧＦＰ遺伝子を導入、蛍光顕微鏡で発現を確認した結果を示す写真である。上段：２９３Ｔ×１００、下段：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ×２００
図７は、粒子径を揃えたＦＨＮビロソームおよびＦビロソームのウェスタンブロットの結果を示す写真である。
図８は、不活化センダイウイルス（ＳｅＶ）、ＦＨＮビロソーム、またはＦビロソームと融合させたＳＩＶ（それぞれ図中のＳＩＶ−ＳｅＶ融合、ＳＩＶ−ＦＨＮビロソーム融合、またはＳＩＶ−Ｆビロソーム融合）をＨｅＬａ細胞の培養上清にＭＯＩ＝１０で添加し、１０分、３０分、および１８０分インキュベートして感染させ、その後新鮮な培養液に置換し感染処理開始の４８時間後に感染細胞（ＧＦＰ発現細胞）を観察した結果を示す写真である。ＳＩＶはＶＳＶ−Ｇでシュードタイプ化されているものを用いた。図中のＳＩＶはセンダイウイルスエンベロープを融合させていないネガティブコントロールである。
図９は、ＦＨＮビロソーム、Ｆビロソーム、およびＨＮビロソームのサンプルを電気泳動し、銀染色を行った結果を示す写真である。レーン１：ＳｅＶ（インタクト）、レーン２：ＤＴＴ処理ＳｅＶ、レーン３：トリプシン処理ＳｅＶ、レーン４：ＦＨＮビロソーム、レーン５：Ｆビロソーム、レーン６：ＨＮビロソーム。
図１０は、ＬａｃＺを発現するＳＩＶベクター（ＶＳＶ−Ｇでシュードタイプ化したもの）および、それをさらにビロソームとＦｕｓｉｏｎさせたベクターを２９３Ｔ細胞へ導入し、ＬａｃＺ相対活性を測定した結果を示す図である。アスタリスクはｔ検定によりＳＩＶに対して有意差があることを示す（ｐ＜０．０５）。
図１１は、ＳＩＶ−Ｆ／ＨＮ／Ｍ−ＥＧＦＰ  １０８  Ｔ．Ｕ．を鼻より１００μｌ投与し、３日目の気管の凍結標本の所見を示す写真である。（ｂ）の矢印は気管上皮細胞を示し、ＥＧＦＰの蛍光が認められるが、（ｃ）の無処理マウスでは僅かなバックグラウンドが観察されるに過ぎない。（ａ）は連続切片のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ．Ｅ．）染色を示す。
図１２は、図１１と同じ個体の鼻中隔粘膜の所見を示す写真である（ｂ）。矢印は多列線毛上皮であり、ＥＧＦＰの蛍光が認められる。（ａ）は連続切片のＨ．Ｅ．染色を示す写真である。
図１３は、マウス鼻腔切片におけるシュードタイプレトロウイルスベクターのＥＧＦＰの蛍光の比較を示す写真である。ＶＳＶ−Ｇでシュードタイプ化したＳＩＶ（ＳＩＶ−ＶＳＶ−ＥＧＦＰ）、Ｆ，ＨＮ，Ｍでシュードタイプ化したアンフォトロピックｅｎｖを持つＭＳＣＶ（ＭＳＣＶ−Ｆ／ＨＮ／Ｍ−ＥＧＦＰ）、およびＦ，ＨＮ，Ｍでシュードタイプ化したＶＳＶ−Ｇ  ＳＩＶ（ＳＩＶ−Ｆ／ＨＮ／Ｍ−ＥＧＦＰ）のＥＧＦＰの蛍光像を示す。Ｆ，ＨＮ，Ｍ蛋白を持つＭＳＣＶ−Ｆ／ＨＮ／Ｍ−ＥＧＦおよびＳＩＶ−Ｆ／ＨＮ／Ｍ−ＥＧＦＰにおいて比較的強いシグナルが観察され、特にＳＩＶ−Ｆ／ＨＮ／Ｍ−ＥＧＦＰによるシグナルが高いことが判明した。
図１４は、細胞質側領域置換型ＨＮ発現プラスミドがコードする蛋白質のＳＩＶ細胞質側領域とＨＮ蛋白膜貫通領域（標準字体）の境界部分のアミノ酸配列（配列番号：４０）を示す図である。
図１５は、ＳＩＶ細胞質側領域付加型ＨＮ発現プラスミドがコードする蛋白質の細胞質側領域（下線部）とＨＮ蛋白膜貫通領域（標準字体）の境界部分のアミノ酸配列（配列番号：４１）を示す図である。
図１６は、細胞質側領域欠失型Ｆ発現プラスミドがコードする蛋白質のＦ蛋白膜貫通領域（イタリック）とＦ蛋白細胞質側領域（標準字体）の境界部分のアミノ酸配列（配列番号：４２〜４４）を示す図である。
図１７は、ＳＩＶ細胞質側領域を付加した細胞質側欠失型Ｆ発現プラスミドがコードする蛋白質のＦ蛋白膜貫通領域（下線なしのイタリック）およびＦ蛋白細胞質側領域（標準字体）とＳＩＶ細胞質側領域１１アミノ酸（ＳＩＶｃ１１）（下線）の境界部分のアミノ酸配列（配列番号：４５〜４７）を示す図である。
図１８は、ＳｅＶ  Ｆ／ＨＮシュードタイプＳＩＶベクターの２９３Ｔ細胞における遺伝子導入を示す写真である。
図１９は、ＳｅＶ  Ｆ／ＨＮシュードタイプＳＩＶベクターのＢＥＡＳ−２Ｂ細胞における遺伝子導入を示す写真である。
図２０は、ＳＩＶｃ１１付加型のＳｅＶ  Ｆ／ＨＮシュードタイプＳＩＶベクターの２９３Ｔ細胞における遺伝子導入を示す写真である。
図２１は、ＳｅＶ  Ｆ／ＨＮシュードタイプＳＩＶベクターの濃縮を示す写真である。
図２２は、ＭＳＣＶをベースとしたＳｅＶ  Ｆ／ＨＮシュードタイプレトロウイルスベクターの遺伝子導入を示す写真である。
図２３は、インフルエンザウイルスエンベロープシュードタイプウイルスベクターの遺伝子導入を示す写真である。
図２４は、インフルエンザウイルスエンベロープシュードタイプウイルスベクターの濃縮を示す写真である。
図２５は、インフルエンザウイルスエンベロープおよび各種ＨＮ蛋白質とのシュードタイプウイルスベクターの遺伝子導入を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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