(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え原生生物の作成方法であって、該原生生物の栄養要求性変異体を作成する作成工程（ａ）と、対応する栄養要求性の相補のための少なくとも１個の遺伝子、及び組み換えタンパク質の生産のために発現されるタンパク質のための少なくとも１個の組み換え遺伝子を含む、組換えＤＮＡで該変異体を形質転換する形質転換工程（ｂ）と、対応する相補原生生物だけを生育することができる最少培地で組換え原生生物を選択する選択工程（ｃ）と、からなることを特徴とする組換え原生生物の作成方法。
【請求項２】
請求項１に記載する作成方法において、該栄養要求性変異体が必須遺伝子をノックアウトすることによって生産されることを特徴とする組換え原生生物の作成方法。
【請求項３】
請求項２に記載する作成方法において、ノックアウトされた遺伝子がトリテルペノイド−サイクラーゼ、デルタ−６−デサチュラーゼまたはデルタ−９−デサチュラーゼであることを特徴とする組換え原生生物の作成方法。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載する作成方法において、該原生生物が原生動物であることを特徴とする組換え原生生物の作成方法。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載する作成方法において、該栄養要求性原生生物変異体を形質転換するための組換えＤＮＡがトリテルペノイド−サイクラーゼ、デルタ−６−デサチュラーゼまたはデルタ−９−デサチュラーゼのための遺伝子を含んでいることを特徴とする組換え原生生物の作成方法。
【請求項６】
組換えＤＮＡが、発現されるタンパク質に対する少なくとも１個の機能的組換え遺伝子をさらに含む、請求項１ないし５のいずれか１項に記載する作成方法。
【請求項７】
組換えタンパク質の作成方法であって、該作成方法が、組換え原生生物の形質転換のための組換えＤＮＡが、発現されるタンパク質に対する少なくとも１個の機能的組換え遺伝子を更に含んでいるところの、請求項１ないし５のいずれか１項に記載する該原生生物を作成する作成工程（ａ）と、該組換え原生生物を培養して、該タンパク質を発現する工程（ｂ）と、該タンパク質を単離する単離工程（ｃ）と、からなることを特徴とする組換えタンパク質の作成方法。
【請求項８】
請求項７に記載する組換えタンパク質の作成方法において、発現されるタンパク質に対する該組換え遺伝子が脊椎動物から単離されることを特徴とする組換えタンパク質の作成方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、陰性選択マーカーを使用しないで遺伝子的に改変された（組換え）原生生物と、かかる改変原生生物によるタンパク質を効率よく作成する作成方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
異種タンパク質発現による組換え（リコンビナント）タンパク質の生産は、天然資源からタンパク質を回収する選択肢の１つである。例えば、医薬品として有用なタンパク質の天然資源は、しばしば非常に限定されていて、精製するのに非常に費用が掛かったり、または単に入手できない場合もある。また、かかる天然資源は、毒性があったりまたは特に感染性を有する物質が混入しているために、非常に問題がある場合もしばしばありうる。他方、現在では、バイオテクノロジーや遺伝子工学は、異種発現によって、一連のタンパク質を満足できる量を経済的にかつ安全に生産して、広範囲に適用することができるようになっている。かかるタンパク質としては、例えば、抗体（診断用、受動免疫用、研究用など）、ホルモン（治療用途のインスリン、エリスロポエチン（EPO）、インターロイキン類など）、酵素（例えば、食品技術、診断、研究用など）、血液因子（血友病処置用など）、ワクチンなどが挙げられる（Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology, ASM Press, Washing DC, Chapter 10: 227-252）（非特許文献１）。
【０００３】
医薬処方用タンパク質、特にヒトタンパク質は、生化学的、生物物理的ならびに機能的性質が天然タンパク質と同一でなければならない。次に、異種遺伝子発現によるかかるタンパク質の組換え産生中においては、細菌とは対照的に、真核細胞中においては、例えば、ジスルフィド架橋形成、前駆タンパク質のタンパク質分解的切断、リン酸化、アセチル化、アシル化、硫酸化、カルボン酸化、ミリスチル化、パルミチル化、特にグリコシル化などのアミノ酸残基修飾などの一連の翻訳後タンパク質修飾が発生することを留意する必要がある。加えて、真核細胞中のタンパク質は、しばしば、シャペロン（chaperones）が関与する複雑な機構によって正確な三次元的構造に導かれる。
【０００４】
これらの修飾は、タンパク質の特定の構造的かつ機能的性質に関して、例えば、タンパク質の酵素活性、特異性（レセプター結合、細胞認識など）、折れ曲がり、溶解性などに関して非常に重要な役割を果たしている（Ashford & Platt 1998, in: Post-translational Processing - A Practical Approach Ed. Higgins & Hames, Oxford University Press, Chapter 4: 135-174； Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington DC, Chapter 7: 145-169）（非特許文献２）。タンパク質がその天然構造から逸脱した改変を受けると、そのタンパク質は不活性化したり、高いアレルギーポテンシャルを持ったりする。
【０００５】
一連の細菌ならびに真核発現システムは組換えタンパク質の生産のためには確立しているけれども、（特に真核タンパク質において）起こりうるタンパク質修飾の全ての領域をカバーし、それで普遍的に使用することができるユニバーサルシステムは存在していない(Castillo 1995, Bioprocess Technology 21: 13-45； Geise et al. 1996, Prot. Expr. Purif. 8: 271-282; Verma et al. 1998 J. Immunological Methods 216: 165-181; Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology ASM Press, Washing DC, Chapter 7: 145-169)（非特許文献３)。しかしながら、また、いくつかの繁用されているシステムが、通常ではない、時には望ましくない翻訳後タンパク質修飾を起こすことは極めて問題である。酵母からの組換え発現タンパク質は、時には、マンノース残基によって非常に強力に修飾される。酵母からのこれらのいわゆる「高マンノース」構造は、約８個ないし５０個のマンノース残基から構成されているので、最大で５個ないし９個のマンノース残基を有する哺乳動物細胞からのマンノースに富む（リッチ）グリコプロテイン構造とは著しく異なっている（Moreman et al. 1994, Glycobiology 4(2): 113-125）（非特許文献４）。これらの酵母に典型的なマンノース構造は強いアレルゲンであるので、これらを治療用途のための組換えグリコプロテインの製造に使用することは非常に問題である（Tuite et al. 1999, in Protein Expression - A Practical Approach, Ed. Higgins & Hames, Oxford University Press, Chapter 3: especially page 76）（非特許文献５）。また、酵母には、ハイブリッドもしくは複雑なグリコプロテイン構造が形成されないので、発現システムとしての使用を更に束縛されている。
【０００６】
最近、植物が組換えタンパク質の産生システムとして論議されることが増えてきていて、その産生システムに使用されているが、哺乳動物に典型的なシアル酸に代わって、グリコプロテイン構造にキシロースを有している（Ashford & Platt)（非特許文献２）。また、植物中に検出されるキシロースおよびα−１，３結合フコースは、アレルギーの危険性を示しているので問題でもある（Jenkins et al. 1996, Nature Biotech. 14: 975-981）（非特許文献６）。
【０００７】
したがって、主に、哺乳動物培養細胞による組換えタンパク質の非常に低価でかつ必要とされている作成方法の代替法として、新規な真核発現システムに対する大きな要請がある。
かかるシステムは下記の要求を充足しているのが理想的である。
（１）選択マーカーおよび調節的ＤＮＡ要素（例えば、転写ならびに翻訳シグナルなど）が入手できること。
（２）発現システムは、できるだけ重要な真核翻訳後タンパク質修飾を有するべきであるが、ヒトに対するアレルゲンを産生しないこと。
（３）組換えタンパク質の生産は、例えば、単純な培地を用いた製造スケール（数千リットルにもなりうる）での細胞または生物の発酵ならびに生産物の単純な後処理などによって処理できるような、できるだけ簡単でかつ経済的であること。
【０００８】
原生生物もしくは原生動物（定義については、Henderson's Dictionary of Biological Terms, 10th Edition 1989, Eleanor Lawrence, Longman Scientific & Technical, England or Margulis et al. (Editors) 1990.  Handbook of Protoctista, Jones & Bartlett, Boston; van den Hoek et al. 1995, Algae - An Introduction to Phycology, Cambridge University Press（非特許文献７）参照）は、酵母、哺乳動物もしくは昆虫の培養細胞のようなすでに確立した真核発現システムに対する発現システムとして興味ある代替法となるかもしれない。これらの生物は、真核細胞の典型的な区分および分化を有している。そのいくつかは、高等真核生物に比較的密接に関連しているが、他方、酵母または細菌とさえ培養と生育において同様であり、大規模に単純な媒体で高細胞密度で比較的簡単に培養することができる。
【０００９】
異種タンパク質を発現するための興味ある原生生物の１つは、繊毛生物テトラヒメナ（Tetrahymena）、特にテトラヒメナ・テルモフィラ（Tetrahymena thermophila）である。テトラヒメナは、高等真核生物に比較的密接に関連していて、それらに典型的な細胞分化を有している、非病原性で単細胞の真核微生物である。テトラヒメナ中での翻訳後タンパク質修飾は、酵母や、その他の真核発現システムに検出されるものよりも、哺乳動物中のそれにより一層類似している。例えば、テトラヒメナには、酵母（「高マンノース」構造）や、植物もしくは下等動物細胞培養物（キシロース残基）とは異なって、強力な抗原性糖鎖は見出されていない（上記を参照）。テトラヒメナは、真正な、完全に分化された真核生物であるけれども、単純な酵母または細菌とその培養ならびに生育特性がより一層類似していて、大規模に比較的低価なスキムミルク培地で容易に培養することができる。最適条件下で、世代時間は約１．５〜３時間であり、非常に高い細胞密度（48 g/L 乾燥重量に相当する2.2 × 107 個/mL）は達成可能である（Kiy and Tiedke 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37: 576-579; Kiy and Tiedke 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 141-146）（非特許文献８）。その結果、テトラヒメナは、大規模組換えタンパク質の発酵製造に対して非常に興味があり、哺乳動物細胞よりもより一層有利である。
【００１０】
発現システムとしてのテトラヒメナの別の有利な側面は、相同ＤＮＡ組換えによる異種遺伝子の組込みがテトラヒメナで可能であることである。これによって、有糸分裂的に安定した形質転換体を発生させることができる。また、標的遺伝子のノックアウトも相同ＤＮＡ組換えによって可能である（Bruns & Cassidy-Hanley in: Methods in Cell Biology, Volume 62, Ed. Asai & Forney, Academic Press (1999) 501-512); Hai et al. in: Methods in Cell Biology, Volume 62, Ed. Asai & Forney, Academic Press (1999) 514-531; Gaertig et al. (1999) Nature Biotech. 17: 462-465; Cassidy-Hanley et al. 1997 Genetics 146: 135-147）（非特許文献９）。これらに加えて、体細胞大核または生殖小核も交互に形質転換できる。大核形質転換の間、安全性もしくは受容問題に関して有利となりうる無菌の形質転換体が得られる。
【００１１】
テトラヒメナの形質転換は、ミクロ注入法、エレクトロポレーション法またはミクロ粒子衝撃法によって行うことができる。このために数多くのベクター、プロモーターなどを入手することができる。形質転換体の選択は、耐性マーカーによって行なわれる。したがって、テトラヒメナは、ｒＤＮＡベクターで有効に形質転換される（Tondravi et al. 1986, PNAS 83:4396; Yu et al. 1989, PNAS 86: 8487-8491）（非特許文献１０）。その他の形質転換実験において、シクロヘキシミドまたはネオマイシン耐性はテトラヒメナにおいて発現された（Yao et al. 1991, PNAS 88:9493-9497; Kahn et al. 1993, PNAS 90: 9295-9299）（非特許文献１１）。これらのマーカー遺伝子に加えて、テトラヒメナは２個の組換えタンパク質（組換え魚寄生虫抗原とニワトリの部分オバルブミン）を有効に発現した（Gaertig et al. (1999, Nature Biotech. 17: 462-465)）（非特許文献１２）。選択は、パクリタクセル（Paclitaxel (Taxol)）で行なった。ガエルテイックら（Gaertig et al.）によって開発されたこのシステムは特許出願中である（WO 00/46381）（特許文献１）。
【００１２】
原生生物または原生動物についての形質転換および異種タンパク質発現の方法は、わずか２、３種について文献に記載されているだけである。また、この発明において、ゾウリムシ（Paramecium）は別の繊毛生物として挙げられている（Boileau et al. 1999, J. Eukaryot. Microbiol. 46: 55-65）（非特許文献１３）。しかしながら、また、組換えタンパク質の形質転換ならびに発現についての種々の実験は、寄生原生動物、例えば、トリパノソーム（Trypanosoma）、レイシュマニア（Leishmania）、プラスモジウム（Plasmodium）などにおいて行なわれた（Beverly 2000, WO 00/58483）（特許文献２）。これらについての論評も記載されている（Kelly, 1997, Adv. in Parasitol., Vol. 39, 227-270）（非特許文献１４）。また、異種タンパク質発現の可能性の１つが、例えば、粘菌Dictyostelium discoideum （Manstein et al. 1995, Gene 162: 129-134, Jung and Williams 1997, Biotechnol. Appl. Biochem. 25: 3-8)（非特許文献１５）において示されているけれども、例えば、クラミドモナス（Chlamydomonas）(Hall et al. 1993, Gene 124: 75-81)（非特許文献１６）、ボルボックス（Volvox）(Schiedlmeier et al. 1994, PNAS 91: 5080-5084)（非特許文献１７）、デイノフラゲラ類（dinoflagellates） (ten Lohuis & Miller 1998, Plant Journal 13: 427-435) （非特許文献１８）およびダイアトーム類（diatoms） (Dunahay et al. 1995, J. Phycol. 31: 1004-1012)（非特許文献１９）などの光合成独立栄養原生生物（ミクロ藻類）にも示されている。しかしながら、ほとんどの場合、耐性マーカーまたは非ヒト選択マーカーが発現された。
【００１３】
したがって、これまでこれらの生物のいずれも組換えタンパク質の大量生産に使用されていない。これらの興味あるシステムならびにその他のおそらく興味あるシステムの多くにとっての大きな問題は、十分に確立した遺伝子工学手法がないことであり、そのうちでも特にベクター、マーカーなどの分子生物学的「ツール」がないことである。
【００１４】
細胞を遺伝子的に慎重に改変することができるためには、選択マーカーが存在することは必要条件である。形質転換した細胞や生物の選択は、一般的には、陰性選択マーカーを介して、一般的には抗生物質（例えば、アンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、ネオマイシンなど）に対する耐性を利用して行われる。これに対して、必須遺伝子を欠失細胞型（この遺伝子産生物の意味で）に導入することによっては稀にしか選択は起こらない（陽性選択もしくは選択相補）。これらには、例えば、酵母中のＬＥＵ−もしくはＵＲＡ３ベース選択システムが含まれる（Glick & Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA, 1998, 2nd Edition, ASM Press, Washington DC, pages 109-169 参照）（非特許文献２０）。しかしながら、上記原生生物のうち未だ余り調べられていない新規生物に対しては、第２の手法は利用することができない。だから、このシステム、特に生産規模での組換えタンパク質の生産に対しては非常に制限されている。
【００１５】
陰性選択は一般的には由々しい欠点を有している。第一に、所望する生産物にとって不必要なＤＮＡを、生産生物に導入しなければならない。これは、生物学的安全性の点で、特に公共が受け入れるかどうかという点で障害となりうる。他方、生物は、選択圧力を維持するために全生産時間中に亘って対応する抗生物質の存在下で培養しなければならない。これは経済的には生産原価を高騰させることになる。抗生物質自体の費用と共に、培地などの生産廃物処理の費用を考慮しなければならないばかりか、得られたタンパク質の後処理もより一層困難になる。しかしながら、経済的な考慮を離れても、環境適応性、生物学的ならびに遺伝子工学的安全性ならびに特に公共の受け入れが非常に問題である。これらに加えて、もし生物を繰り返して形質転換しなければならない場合には、純粋に技術的性質の問題も熟慮しなければならない。もし数種類の抗生物質に対する耐性を同時に発現する数種類の抗生物質が同時に存在する場合には、生物に対して極めて悪影響を及ぼすことになり、予測できない副作用を導くことにもなる。
【００１６】
【特許文献１】
WO 00/46381
【特許文献２】
Beverly 2000, WO 00/58483
【特許文献３】
ドイツ特許出願番号DE 199 57 889 A1
【特許文献４】
ドイツ特許出願番号DE 100 44 468 A1
【特許文献５】
ドイツ特許出願番号DE 199 57 889 A1
【特許文献６】
ドイツ特許出願番号DE 100 44 461 A1
【非特許文献１】
Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology, ASM Press, Washing DC, Chapter 10: 227-252
【非特許文献２】
Ashford & Platt 1998, in: Post-translational Processing - A Practical Approach Ed. Higgins & Hames, Oxford University Press, Chapter 4: 135-174； Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington DC, Chapter 7: 145-169
【非特許文献３】
Castillo 1995, Bioprocess Technology 21: 13-45； Geise et al. 1996, Prot. Expr. Purif. 8: 271-282; Verma et al. 1998 J. Immunological Methods 216: 165-181; Glick & Pasternak 1998, Molecular Biotechnology ASM Press, Washing DC, Chapter 7: 145-169
【非特許文献４】
Moreman et al. 1994, Glycobiology 4(2): 113-125）
【非特許文献５】
Tuite et al. 1999, in Protein Expression - A Practical Approach, Ed. Higgins & Hames, Oxford University Press, Chapter 3: especially page 76
【非特許文献６】
Jenkins et al. 1996, Nature Biotech. 14: 975-981
【非特許文献７】
Henderson's Dictionary of Biological Terms, 10th Edition 1989, Eleanor Lawrence, Longman Scientific & Technical, England or Margulis et al. (Editors) 1990.  Handbook of Protoctista, Jones & Bartlett, Boston; van den Hoek et al. 1995, Algae - An Introduction to Phycology, Cambridge University Press
【非特許文献８】
Kiy and Tiedke 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37: 576-579; Kiy and Tiedke 1992, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 141-146
【非特許文献９】
Bruns & Cassidy-Hanley in: Methods in Cell Biology, Volume 62, Ed. Asai & Forney, Academic Press (1999) 501-512); Hai et al. in: Methods in Cell Biology, Volume 62, Ed. Asai & Forney, Academic Press (1999) 514-531; Gaertig et al. (1999) Nature Biotech. 17: 462-465; Cassidy-Hanley et al. 1997 Genetics 146: 135-147
【非特許文献１０】
Tondravi et al. 1986, PNAS 83:4396; Yu et al. 1989, PNAS 86: 8487-8491
【非特許文献１１】
Yao et al. 1991, PNAS 88:9493-9497; Kahn et al. 1993, PNAS 90: 9295-9299
【非特許文献１２】
Gaertig et al., 1999, Nature Biotech. 17: 462-465
【非特許文献１３】
Boileau et al. 1999, J. Eukaryot. Microbiol. 46: 55-65
【非特許文献１４】
Kelly, 1997, Adv. in Parasitol., Vol. 39, 227-270
【非特許文献１５】
Manstein et al. 1995, Gene 162: 129-134, Jung and Williams 1997, Biotechnol. Appl. Biochem. 25: 3-8
【非特許文献１６】
Hall et al. 1993, Gene 124: 75-81
【非特許文献１７】
Schiedlmeier et al. 1994, PNAS 91: 5080-5084
【非特許文献１８】
ten Lohuis & Miller 1998, Plant Journal 13: 427-435
【非特許文献１９】
Dunahay et al. 1995, J. Phycol. 31: 1004-1012
【非特許文献２０】
Glick & Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA, 1998, 2nd Edition, ASM Press, Washington DC, pages 109-169
【非特許文献２１】
Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Coldspring Harbor, NY
【非特許文献２２】
www.diversa.com や、www. maxygen.comなど
【非特許文献２３】
Nakashima S. et al.：Biochem. J. 317, 29-34 (1996)
【非特許文献２４】
Benson, D.A. et al., Nuc. Acid Res., 28 (10), 15-18 (2000)
【非特許文献２５】
Wuitschick & Karrer, J. Eukaryot. Microbiol. (1999)
【非特許文献２６】
Gaertig et al. (1994) PNAS 91: 4549-4553)
【非特許文献２７】
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, New York
【非特許文献２８】
Gaertig et al. (1994) Nucl. Acids Res. 22: 5391-5398
【非特許文献２９】
Gaertig et al. 1999 Nature Biotech. 17: 462-465
【非特許文献３０】
Gaertig & Kapler (1999)
【非特許文献３１】
Bruns & Cassidy-Hanley, Methods in Cell Biology, Volume 62 (1999) 229-240
【非特許文献３２】
Burns & Cassidy-Hanley: Methods in Cell Biology, Volume 62 (1999) 501-512); Gaertig et al. (1999) Nature Biotech. 17: 462-465;Cassidy-Hanley et al. (1997 Genetics 146: 135-147)
【非特許文献３３】
Sanford et al. (1991) Biotechniques 3:3-16; Bruns & Cassidy-Hanley (1999) Methods in Cell Biology, Volume 62: 501-512
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
先行技術に鑑みて、この発明は、とりわけ組換えタンパク質を効率的に生産することができる遺伝子的に改変した原生生物の陽性選択を行う選択方法を提供することを目的としている。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
この発明の目的は、この発明の特許請求の範囲に記載する発明ばかりではなく、該発明から容易に推測できるまたは結論することができるその他の発明によっても解決することができる。
【００１９】
【発明の実施の形態】
この発明に係る組換え原生生物の生産方法は、原生生物の栄養要求性変異体を作成し、該変異体を対応する栄養要求性の相補のための少なくとも１個の遺伝子を含む組換えＤＮＡで形質転換し、更に相補原生生物だけを生育することができる最少培地で得られた組換え原生生物を選択することによって、驚くほど簡単に行うことができる。特に、恒久的に選択圧力を維持するために、この発明は、抗生物質耐性の選択も、望ましくないおそらく異種の遺伝子が組換え生物中に存在することも最終的には必要としていない。したがって、培養培地に抗生物質を添加することも必要としていない。また、この方法は、問題なく繰り返して同一生物株で使用することができ、その他の望ましくない遺伝子を（過大）発現させることなく、種々の所望の組換え遺伝子でそれを形質転換することができる。
【００２０】
また、この発明の別の態様においては、組換えタンパク質の生産方法は、組換えＤＮＡが、該原生生物の形質転換のために発現されるタンパク質の機能的組換え遺伝子を更に少なくとも１個有している組換え原生生物を上記と同様にして作成することによって行うことができる。次いで、組換え原生生物を培養して、タンパク質を発現単離することができる。
【００２１】
この発明の別の態様は、組換え原生生物であって、その必須遺伝子がノックアウトされて、組換えＤＮＡによる該原生生物の形質転換によって得られる栄養要求性が好ましくは相補されていることを特徴とする組換え原生生物に関するものである。
【００２２】
この発明の好ましい態様は、必須遺伝子をノックアウトすることによって栄養要求性変異体を生産することである。ノックアウトは、対応する遺伝子の完全欠失またはその突然変異によって行うことができる。ここでいう突然変異とは、例えば、個々の塩基対の挿入、欠失、転化または単なる交換を意味するものと理解される。遺伝子の欠失、つまり変異は、当業者にとって公知の方法によって標的生物に対して導入することができた。その中でも、この発明においては、インビトロ突然変異誘発が、例えば、エラ−プローン(error-prone)ＰＣＲや、おそらく臨床方法に従ったり（Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Coldspring Harbor, NY）（非特許文献２１）、またはエクソンシャフリング(exon-shuffling)や、遺伝子部位飽和突然変異誘発（例えば、www.diversa.com や、www. maxygen.comなど）（非特許文献２２）などによって作用する。
【００２３】
この発明において、栄養要求性ノックアウト変異体を産生するための必須遺伝子とは、例えば、脂肪酸、ステロール、アミノ酸の生合成などのための必須代謝性遺伝子であって、その欠如が対応する分子（脂肪酸、ステロール、アミノ酸など）を培養培地に添加することによって補償することができるもの（以下、マーカーとも呼ぶ）を意味するものと理解される。かかる遺伝子を慎重にノックアウトすることによって、細胞は、この代謝経路の産生物に対して栄養要求性となる。このことについては、実施例において、例えば、ステロールおよびアミノ酸生合成に対して記載している。対応する代謝産生物、つまり、コレステロールや脂肪酸を添加することによって、細胞はこのノックアウトを生存させることができる。これらを添加しなければ、細胞は直ぐに死んでしまうことになる。
【００２４】
したがって、この発明において、対応する生物の栄養要求性変異体を生産するために、ノックアウトの適正な標的は、例えば、トリテルペノイド−サイクラーゼ（テトラヒマノール−サイクラーゼと同義）、デルタ−６−デサチュラーゼまたはデルタ−９−デサチュラーゼをコードする遺伝子である。
【００２５】
この発明において、トリテルペノイド−サイクラーゼに対する好ましい遺伝子はドイツ特許出願に記載されている（ドイツ特許出願番号DE 199 57 889 A1）（特許文献３）。この発明において、デルタ−６−デサチュラーゼに対する好ましい遺伝子はドイツ特許出願に記載されている（ドイツ特許出願番号DE 100 44 468 A1）（特許文献４）。また、この発明において、デルタ−９−デサチュラーゼに対する好ましい遺伝子は文献に記載されている（Nakashima S. et al.：Biochem. J. 317, 29-34 (1996)）（非特許文献２３）。更に、対応する配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてaccession no. EMBL D83478として検索することができる。なお、ＧｅｎＢａｎｋについては次の文献を参照するのがよい（Benson, D.A. et al., Nuc. Acid Res., 28 (10), 15-18 (2000)）（非特許文献２４）。その上、これら文献の全ては本明細書の一部として組み込まれているものとする。
【００２６】
この発明による細胞は、ノックアウト遺伝子の再導入による代謝性産生物に対する栄養要求性を必要としている。この場合、栄養要求性は相補することができるといわれている。有効に形質転換された細胞の選択は、最少培地で、つまり、有効でない形質転換がなされた生物が栄養要求性になる代謝性生成物を除外して行うことができる。この発明において、最少培地とは、細胞を生存させることができる必要な構成ブロックを全て含んでいるが（糖などの炭素源、できればアミノ酸などの窒素源、ビタミン、微量元素など）、原発生物が栄養要求性になるための代謝性生産物を含んでいない培地を意味するものと理解される。
【００２７】
栄養要求性を相補するこの遺伝子が、発現される異種タンパク質をコードする遺伝子に結合している場合には、形質転換体は、選択マーカーを添加することなしに、同定することができ、また、有効で安定した発現が選択マーカーの添加に依存せずに、典型的な場合としては、例えば、組換えＥ．ｃｏｌｉにおいて起こる。その他の積極的な効果としては、発現される標的遺伝子に加えて、外来ＤＮＡを細胞に導入する必要がないことである。その上、相同組換えが起こる生物（例えば、テトラヒメナなど）中においては、ＤＮＡはゲノム中にランダムには取り込まれることはなく、特定の位置、つまり、マーカー遺伝子の自然位置に取り込まれる。
【００２８】
しかしながら、当業者にとっては、栄養要求性の相補は対応した異種的またはインビトロで改変された遺伝子によっても発生することは明らかである。
【００２９】
この発明においては、形質転換された原生生物、例えば、原生動物が、上記方法における選択に適している。かかる原生動物としては、例えば、パラメシウム属やテトラヒメナ属などの鞭毛動物、特にテトラヒメナ・テルモフィラが挙げられる。
【００３０】
栄養要求性原生生物突然変異体の形質転換のための組換えＤＮＡは、ベクター、例えば、つまり、あらゆる形の核酸、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、自立複製配列、ファージ、線状もしくは環状の、一重もしくは二重ラセンＤＮＡもしくはＲＮＡ分子であって、標的生物自体において複製することができるかもしくはそのゲノム中に導入できるが、少なくとも標的生物中に機能性配列を含んでいるものであってもよい。
【００３１】
この発明において、機能性配列とは、組換え生物においてもその対応する機能性を充足することができるそのＤＮＡ断片を意味するものと理解される。
【００３２】
この発明において、機能性遺伝子とは、標的生物中で発現することができる遺伝子を意味するものと理解される。したがって、特に、機能性遺伝子は、コード配列に加えて、該コード配列の転写を導く標的生物中において機能的であるプロモーターを含んでいる。この種の機能性タンパク質は、そのうちでも、１個もしくはそれ以上のＴＡＴＡボツクス、ＣＣＡＡＴボックス、ＧＣボックスまたはエンハンサー配列を有していてもよい。それに加えて、機能性遺伝子には、標的生物中において、転写を中断し、ｍＲＮＡのボリアデニル化を導くシグナル配列を含んでいてもよい機能性ターミネーターを含んでいてもよい。また、この機能性遺伝子のコード配列は、標的生物の翻訳に必要な全ての性質（例えば、開始コドン（例えば、ＡＴＧ）、停止コドン（例えば、ＴＧＡ、特にテトラヒメナ内の）、開始前のＡに富む（リッチ）領域（翻訳開始部位）、コザック配列、ボリＡ部位）などを有している。また、この遺伝子は、対応する組換え生物（例えば、テトラヒメナ）に対する特定のコドン用途を有することもできる（Wuitschick & Karrer, J. Eukaryot. Microbiol. (1999)）（非特許文献２５）。
【００３３】
この発明によれば、組換えタンパク質の生産方法において組換え原生生物中で発現されるタンパク質に対する組換え遺伝子は、相同遺伝子でも、異種遺伝子でもよい。異種遺伝子の場合には、その遺伝子は脊椎動物、好ましくはヒトから単離するのが好ましい。この好ましい例としては、ヒトエリスロポエチンが挙げられる。組換えタンパク質、またその組換えタンパク質を含むバイオマスもしくはその１部によって活性免疫化を達成することができるためには、この発明において、組換え原生生物中で発現されるタンパク質に対して好ましい組換え遺伝子は、ヒトまたは動物中に疾患（例えばマラリアなど）を誘発することができる生物からの遺伝子を挙げることができる。
【００３４】
【実施例】
以下の実施例は、この発明を説明するものであるが、この発明を以下の実施例に限定するものではない。
実施例１：生物および培養条件
テトラヒメナ・テルモフィラ（Tetrahymena thermophila）（菌株：Ｂ１８６８ＶＩＩＩ、Ｂ２０８６ＩＩ、Ｂ＊ＶＩ、ＣＵ４２８、ＣＵ４２７、ＣＵ５２２；J. Gaertig, University of Georgia, Athens, GA, USAから入手）を、改良ＳＰＰ培地（２％プロテオスペプトン、０．１％酵母抽出物、０．２％グルコース、０．００３％Ｆｅ−ＥＤＴＡ）（Gaertig et al. (1994) PNAS 91: 4549-4553)）（非特許文献２６）と、スキムミルク培地（２％スキムミルク粉末、０．５％酵母抽出物、１％グルコース、０．００３％Ｆｅ−ＥＤＴＡ）もしくはＭＹＤ（２％スキムミルク粉末、０．１％酵母抽出物、０．２％グルコース、０．００３％Ｆｅ−ＥＤＴＡ）に、抗生物質溶液（１００Ｕ/ｍＬペニシリン、１００μｇ/ｍＬストレプトマイシンおよび０．２５μｇ/ｍＬアンフォテリシンＢ（ＳＰＰＡ培地））を添加して、２５０ｍＬ容アーレンマイヤーフラスコ中で、３０℃で振とう（１５０ｒｐｍ）培養した。
プラスミドとファージはＥ．ｃｏｌｉXL1-Blue、MRF’、TOP10F’もしくはJM109 (Stratagene, Invitrogen, GibcoBRL Life Technologies)で増殖し選択した。細菌の培養は、標準濃度の抗生物質を添加したＬＢ培地もしくはＮＺＹ培地を用いて標準条件下で培養した（Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring, New York)）（非特許文献２７）。
【００３５】
実施例２：トリテルペノイド−サイクラーゼをノックアウトした構成体の作成
ノックアウト構成体を作成するために、プラスミドｐ４Ｔ２−１ΔＨ３からのネオ−カセット（Gaertig et al. (1994) Nucl. Acids Res. 22: 5391-5398）（非特許文献２８）を、トリテルペノイド−サイクラーゼのゲノム配列中に挿入した（ドイツ特許出願番号DE 199 57 889 A1）（特許文献５）。この遺伝子は、テトラヒメナのヒストンＨ４プロモーターと、そのＢＴＵ２遺伝子の３’フランキング配列との制御下にあるネオマイシン耐性遺伝子である。テトラヒメナ中のこの構成体はパロモマイシン耐性を仲介する。プラスミドｐ４Ｔ２−１ΔＨ３はＥｃｏＲＶ/ＳｍａＩで切断され、上記ネオ−カセットを含むほぼ１．４ｋｂフラグメントを、ＥｃｏＲＶで切断したプラスミドｐｇＴＨＣを用いてテトラヒメナのトリテルペノイド−サイクラーゼのゲノム配列中に結合した。これによって、プラスミドｐｇＴＨＣ：：ｎｅｏが作成された（図２参照）。この形質転換中、トリテルペノイド−サイクラーゼに対する遺伝子は、相同組換えによって、この構成体と置換されて、細胞のパロモマイシン耐性が仲介された。
【００３６】
実施例３：発現構成体ｐＢＴＨＣの作成
ベクターｐＢＩＣＨ３（Gaertig et al. 1999 Nature Biotech. 17: 462-465）（非特許文献２９）、（WO 00/45381)（特許文献１）は、テトラヒメナ・テルモフィラＢＴＵ１遺伝子の非コード調節配列によってフランキングされたイチチオフィトラス（Ichthyophthrius）Ｉ抗原（Ｇ１）プレプロテインのコード配列を含んでいる。テトラヒマノール−サイクラーゼ発現構成体ｐＢＴＨＣを作成するために、開始部位にＮｓｉＩ切断部位を有する改変プラスミド（ｐＢＩＣＨ３−Ｎｓｉ）（J. Gaertig, University of Georgia, Athens, GA, USAより提供）を使用した。この目的のために、テトラヒメナのテトラヒマノール−サイクラーゼを、コード配列の開始と停止部位にあるＮｓｉＩとＢａｍＨＩ切断部位にＰＣＲによって挿入した。テトラヒマノール−サイクラーゼの完全ｃＤＮＡ配列（ｐＴＨＣ）を含む単離された単離プラスミドを、テンプレートとしてＰＣＲに使用した。プライマーの配列は下記の通りである。
THC-Nsi-F: 5’-CTCTTTCATACATGCATAAGATACTCATAGGC-3’
（配列番号１）および
THC-Bam-R: 5’- GGCTTGGATCCTCAAATATTTTATTTTTATACAGG-3’
（配列番号２）
上記プライマーを使用して、ＮｓｉＩおよびＢａｍＨＩ切断部位によってフランキングされたテトラヒマノール−サイクラーゼの完全コード配列を含むＰＣＲ生産物が得られた。得られたＰＣＲ生産物とプラスミドｐＢＩＣＨ３Ｎ−Ｎｓｉは、制限酵素ＮｓｉＩとＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲルで精製した後、結合した（図３参照）。そのようにして作成した発現構成体ｐＢＴＨＣは、ＢＴＵ１遺伝子の調節配列中の正確な読み取りフレームに挿入されたトリテルペノイド−サイクラーゼをコードする完全配列を含んでいる。テトラヒメナの形質転換のために、得られた構成体は、制限酵素ＸｂａＩとＳａｌＩで消化して線状化した。
この有効な形質転換中に、ＢＴＵ１遺伝子は、相同組換えによってこの構成体で置換されたので、細胞のパクリタクセル（Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）に対する細胞耐性が仲介された。
【００３７】
実施例４：テトラヒマノール−サイクラーゼ発現構成体ｐＢＴＨＣによるテトラヒメナの大核形質転換
テトラヒメナ・テルモフィラ細胞（ＣＵ５２２）５×１０６個を形質転換に使用した。この細胞を、ＳＰＰＡ培地５０ｍＬ中で、揺とう装置に取り付けた２５０ｍＬ容アーレンマイヤーフラスコを用いて１５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で約３〜５×１０５個/ｍＬの細胞濃度になるまで培養した。その後、５分間遠心分離（１２００ｇ）することによって得られた細胞をペレット化し、その細胞ペレットを１０ｍＭＴｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０ｍＬに再懸濁し、前と同様に遠心分離した。この洗浄工程を繰り返し、細胞濃度３×１０５個/ｍＬの細胞を１０ｍＭＴｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５、抗生物質添加）に再懸濁し、２５０ｍＬ容アーレンマイヤーフラスコに移し、振とうすることなく３０℃で１６〜１０時間培養した（飢餓相）。この飢餓相後、細胞数を再度決定して、上記同様に遠心分離し、細胞を１０ｍＭＴｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いて細胞濃度５×１０6個/ｍＬに調節した。このうちの細胞懸濁液１ｍＬを形質転換に使用した。形質転換は小核衝撃法（下記に説明する）で行った。再生するために、細胞をアーレンマイヤーフラスコのＳＰＰＡ培地に取り、振とうすることなしに３０℃で培養した。３時間培養した後、最終濃度２０μｍのパクリタクセルを添加し、アリコート１００μＬの細胞を９６ウエルマイクロタイタープレートに移した。得られた細胞を湿らせて暗くしたボックス中において３０℃で培養した。２〜３日後、パクリタクセル耐性クローンが同定された。陽性のクローンを２５μｍパクリタクセル添加の新規培地で再培養した。パクリタクセル濃度を増加して（８０μｍまで）培養することによって、完全「フェノタイプ・アソートメント（phenotypic assortment）」に達した（Gaertig & Kapler (1999)）（非特許文献３０）。
【００３８】
クローンの分析のために、ＳＰＰＡ培養液約４ｍＬをパクリタクセルを用いて培養し、ＤＮＡを単離し（Jacek Gaertig et al. (1994) PNAS 91: 4549-4553）（非特許文献３１）、ＤＮＡをＢＴＵ１遺伝子座に組込み、ＰＣＲで増幅した。下記配列を有するＢＴＵ１特異的プライマーは、開始コドンの約５０ｂｐ前および停止コドンの３ｂｐ後にそれぞれあるプライマーとして使用した。
BTU1-5’F (AAAAATAAAAAAGTTTGAAAAAAAACCTTC
（配列番号３）
BTU1-3R’ GTTTAGCTGACCGATTCAGTTC
（配列番号４）
得られたＰＣＲ生産物は、１％アガロースゲル上で制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩまたはＰｓｔＩを用いて切断されるかまたは切断されないかを分析した。完全「フェノタイプ・アソートメント」を、ＢＴＵ１特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによって検査した（Gaertig & Kapler (1999)）（非特許文献３０）。
【００３９】
実施例５：デルタ−６−デサチュラーゼをノックアウトした構成体ｐｇＤＥＳ６：：ｎｅｏの作成
ノックアウト構成体を作成するために、プラスミドｐ４Ｔ２−１ΔＨ３からのネオ−カセット（ドイツ特許出願番号DE 199 57 889 A1）（特許文献５）を、デルタ−６−デサチュラーゼのゲノム配列中に挿入した。この遺伝子は、テトラヒメナのヒストンＨ４プロモーターと、ＢＴＵ２遺伝子の３’フランキング配列との制御下にあるネオマイシン耐性遺伝子である。テトラヒメナ中のこの構成体は、パロモマイシン耐性を仲介する。プラスミドｐ４Ｔ２−１ΔＨ３はＥｃｏＲＶ/ＳｍａＩで切断され、上記ネオ−カセットを含むほぼ１．４ｋｂフラグメントを、ＥｃｏＲＶで切断したプラスミドｐｇＤＥＳ６（ドイツ特許出願番号DE 100 44 461 A1）（特許文献６）を用いてテトラヒメナのデルタ−６−デサチュラーゼ（図５参照）のゲノム配列中に結合した。これによって、プラスミドｐｇＤＥＳ６：：ｎｅｏが作成された。形質転換中、デルタ−６−デサチュラーゼに対する遺伝子は、相同組換えによって、この構成体と置換されて、細胞のパロモマイシン耐性が仲介された。
【００４０】
実施例６：ノックアウトした構成体ｐｇＴＨＣ：：ｎｅｏおよびｐｇＤＥＳ６：：ｎｅｏによるテトラヒメナの小核ならびに大核形質転換
異なる対形成型のテトラヒメナ株（ＣＵ４２８ＶＩＩおよびＢ２０８６ＩＩ）を、別々に、アーレンマイヤーフラスコ中で、ＳＰＰ培地を用いて３０℃で振とう（１５０ｒｐｍ）培養した。細胞密度３〜５×１０５個/ｍＬの細胞を室温で５分間遠心分離した（１２００ｇ）。得られた細胞を１０ｍトリスＭＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０ｍＬで３回洗浄し、最後に１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０ｍＬに再懸濁した後、抗生物質溶液と混合した。その後、混合溶液をアーレンマイヤーフラスコ中で振とうすることなしに３０℃で培養した。約４時間後、両方の培養液中の細胞数を再決定して、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いて細胞密度を３×１０５個/ｍＬに設定した。次に、細胞液を更に１６〜２０時間３０℃で培養した。この飢餓相後、両培養液から同じ数（絶対数）の細胞を２Ｌ容アーレンマイヤーフラスコ中に入れて混合した。得られた細胞を３０℃で培養し（接合開始）、２時間後に接合の効率を決定した。有効な形質転換のためには、約３０％の細胞が対としてこの時点で存在していなければならなかった。
小核形質転換のために、１×１０７個の接合細胞（５×１０５個の対）を、接合後、３時間、３．５時間、４時間および４．５時間経過して、１２００ｇで５分間遠心分離し、得られた細胞ペレットを１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）１ｍＬに再懸濁した。
新規な大核チャージの形質転換のために、細胞を、接合開始後、１１時間して、上記と同様にして遠心分離し、得られた細胞ペレットをトリスＨＣｌに再懸濁した。
【００４１】
形質転換はミクロ粒子衝撃法によって発生した（下記参照）。
テトラヒマノール−サイクラーゼをノックアウトした変異体を培養するために、コレステロール１０μｇ/ｍＬを培地に添加した。
デルタ−６−デサチュラーゼをノックアウトした変異体を培養するために、ボラージュ（Ｂｏｒａｇｅ）オイル（20-25% GLA; SIGMA）２００μｇ/ｍＬを培地に添加した。
パロモマイシン耐性に対する選択によって形質転換された細胞を同定することができた。小核の形質転換中、接合開始１１時間後、パロモマイシン（最終濃度１００μｇ/ｍＬ）を添加した後、アリコート１００μＬずつを９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに分配した。ついで、その細胞を湿ったボックス中３０℃で培養し、２ないし３日後、耐性クローンが同定した。真正の小核形質転換体は、６−メチルプリンに対する耐性によって大核形質転換体と区別できた。大核の形質転換の間、形質転換後約４時間経過して、パロモマイシン（最終濃度１００μｇ/ｍＬ）を添加し、アリコート１００μＬずつを９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに分配した。次いで、その細胞を湿ったボックス中３０℃で培養した。２ないし３日後、耐性クローンを同定した。陽性クローンをパロモマイシン１２０μｇ/ｍＬを添加した新規な培地で再培養した。このように高濃度のパロモマイシンの存在下で細胞を培養することによって、数世代後に完全「フェノタイプ・アソートメント（phenotypic assortment）」に達した（Gaertig & Kapler (1999)）（非特許文献３０）。
得られた小核形質転換体をＢ＊ＶＩ株と交差させることによって、同型接合のノックアウト変異体を作成した（Bruns & Cassidy-Hanley, Methods in Cell Biology, Volume 62 (1999) 229-240）（非特許文献３１）。
【００４２】
実施例７：実施例４：バイオリステイック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換（マイクロ粒子衝撃法）
テトラヒメナ・テルモフィラの形質転換を、文献に記載されているようなバイオリステイック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換によって行った（Burns & Cassidy-Hanley: Methods in Cell Biology, Volume 62 (1999) 501-512); Gaertig et al. (1999) Nature Biotech. 17: 462-465; Cassidy-Hanley et al. (1997 Genetics 146: 135-147)）（非特許文献３２）。バイオリステイックＰＤＳ１０００/Ｈｅパーテイクルデリバリーシステム（Biolistic（登録商標）PDS-1000/He Particle Delivery System (BIO-RAD)）は対応するハンドブックに詳細に記載されている。
形質転換には、金粒子（０．６μｍ；ＢＩＯ−ＲＡＤ）６ｍｇを線状化したプラスミドＤＮＡに装填した（Sanford et al. (1991) Biotechniques 3:3-16; Bruns & Cassidy-Hanley (1999) Methods in Cell Biology, Volume 62: 501-512）（非特許文献３３）。
金粒子の製造：０．６μｍの金粒子（ＢＩＯ−ＲＡＤ）６０ｍｇをエタノール１ｍＬ中に再懸濁した。この目的のために、その粒子を３度それぞれ１〜２分間渦巻き状に激しく混合した。次いで、粒子を１分間遠心分離（１００００ｒｐｍ）し、その上清をピペットで注意深く除去した。得られた金粒子を殺菌水１ｍＬ中に再懸濁し、上記と同様に遠心分離した。この洗浄工程を１度繰り返して、得られた粒子を５０％グリセロール１ｍＬに再懸濁し、そのアリコート１００μＬを２０℃で保存した。
【００４３】
形質転換体の製法：マクロキャリアーホルダー、マクロキャリアーおよびストップスクリーンを１００％エタノール中に数時間保存し、破裂デイスクをイソプロパノールに保存した。次いで、マクロキャリアーをマクロキャリアーホルダー中に挿入した後、空気乾燥した。
金ＤＮＡの粒子への装填：全ての仕事は４℃で行なった。金粒子、作成したベクター、２．５ＭＣａＣｌ２、１Ｍスパーミジン、７０％と１００％エタノールを氷上で冷却した。線状化ベクターＤＮＡ（１μｇ/ ｍＬ）１０μＬを作成した金粒子１００μＬに添加し、１０秒間注意深く渦巻き状に振とうした。次いで、２．５ＭＣａＣｌ２１００μＬをまず添加して、１０秒間渦巻き状に振とうした後、１Ｍスパーミジン４０μＬを添加して１０秒間注意深く渦巻き状に振とうした。更に、７０％エタノール２００μＬを添加した後、得られた粒子を１分間渦巻き状に振とうした後、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離した。得られたペレットを１００％エタノールに再懸濁し、遠心分離した後、１００％エタノール３５μＬに再懸濁した。
上記のように作成した粒子をピペットでマクロキャリアーの中心に注意深く導入した。次いで、形質転換のために、マクロキャリアーを吸湿性のシリカゲルを詰めたボックス中に保存した。
【００４４】
形質転換：製造した細胞（上記参照）１ｍＬを円形フイルターの中心に導入し、１０ｍＭｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を用いてペトリ皿中で湿らせて、バイオリステイックＰＤＳ−１０００/Ｈｅパーテイクルデリバリシステムの形質転換チェンバーの最下層の挿入ストリップ中に導入した。作成した金粒子を用いて、圧力９００ｐｓｉ（４５０ｐｓｉ破裂デイスク２個）、真空度２７インチＨｇで形質転換チェンバー中で形質転換を行なった。次いで、得られた細胞をＳＰＰＡ培地５０ｍＬを入れたアーレンマイヤーフラスコに直ちに移し、振とうすることなく３０℃で培養した。
【００４５】
実施例８：ゲノムテトラヒマノール−サイクラーゼプラスミドｐｇＴＨＣによるテトラヒマノールノツクアウト変異体の再作成−形質転換
形質転換は実施例４と同様にして行った。テトラヒメナ・テルモフィラからのテトラヒマノールノツクアウト変異体（実施例参照）を形質転換に使用した。細胞の培養をコレステロール１０ｍｇ/ｍＬを添加したＳＰＰＡ培地中で行った。ゲノムテトラヒマノール−サイクラーゼ（図１参照）のゲノム断片での形質転換（上記参照）後、細胞をコレステロール無添加のＳＰＰＡ培地に取り、アーレンマイヤーフラスコを用いて振とうせずに３０℃で培養した。３時間後、得られた細胞をアリコート１００μＬずつ９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに移し、得られた細胞を湿らせ暗くしたボックス中で３０℃で培養した。２〜３日後、第１のコレステロール栄養要求性クローンを同定した。約５〜７日後、陽性クローンを新規培地中に再播種した。約２週間細胞を再播種し、個別の細胞を繰り返し単離することによって、完全な「フェノタイプアソートメント」が達成された（Gaertig & Kapler (1999)）（非特許文献３０）。これらのクローンは対照としてパロモマイシンを添加してＳＰＰＡ培地中で培養した。約３〜５日後、培養菌株の全てが死んでいた。得られたクローンは、相同組換えによりネオ遺伝子が損失したことによってパロモマイシン耐性を欠失した。
【００４６】
実施例９：デルタ−６−デサチュラーゼプラスミドｐｇＤＥＳ６によるデルタ−６−デサチュラーゼをノックアウトした変異体の再作成−形質転換
形質転換は実施例４と同様にして行った。形質転換のために、テトラヒメナ・テルモフィラのデルタ−６−デサチュラーゼ・ノツクアウト変異体（実施例５を参照）を使用した。この細胞の培養を、ボラージオイル（20-25% GLA; SIGMA）２００μｇ/ｍＬを添加したＳＰＰＡ培地中で行った。ゲノムデルタ−６−デサチュラーゼフラグメント（図６参照）で形質転換した（上記参照）後、得られた細胞をボラージオイル無添加ＳＰＰＡ培地に取り、アーレンマイヤーフラスコを用いて振とうせずに３０℃で培養した。３時間後、得られた細胞をアリコート１００μＬずつ９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに移し、細胞を湿らせ暗くしたボックス中で３０℃で培養した。約２〜３日後、第１のＧＬＡ栄養要求性クローンを同定した。約５〜７日後、陽性クローンを新規培地中に再播種した。約２週間細胞を再播種して個別の細胞を繰り返し単離することによって、完全な「フェノタイプ・アソートメント」が達成された（Gaertig & Kapler (1999)）（非特許文献３０）。これらのクローンは対照のためにパロモマイシンを添加したＳＰＰＡ培地中で培養した。３〜５日後、培養菌株の全てが死んでいた。得られたクローンは、相同組換えによりネオ遺伝子が損失してパロモマイシン耐性を欠失した。
【００４７】
実施例１０：ネオマイシン遺伝子を結合したプラスミドｐｇＴＨＣによる再作成―形質転換
形質転換は実施例７と同様に行なった。次ぎのようにして構成したベクターを使用した。
テトラヒマノール−サイクラーゼ（ｐｇＴＨＣ）のゲノムフラグメントを制限酵素Ｂｇ１ＩＩで切断した。この酵素は、３’非翻訳領域中の位置４５３７のコードエキソン外のゲノムフラグメントを切断する。両端をスムーズにするためにＴ４ＤＮＡボリメラーゼと一緒に培養した後、ネオマイシンカセットをプラスミド中に結合した。このために、プラスミドｐ４Ｔ２−１ΔＨ３をＥｃｏＲＶ/ＳｍａＩで切断し、上記ネオ−カセットを含んでいるほぼ１．４ｋｂ断片をすでに切断したプラスミドｐｇＴＨＣのテトラヒメナのトリテルペノイド―サイクラーゼの３’非翻訳配列中に結合した。
この構成体（ｐｇＴＨＣ＋ｎｅｏ、図４参照）をテトラヒマノール変異体の形質転換のために使用した。形質転換（上記参照）した後、得られた細胞をコレステロール無添加のＳＰＰＡ培地に取り、アーレンマイヤーフラスコ中で振とうせずに３０℃で培養した。３時間後、パロモマイシンを添加して、得られた細胞をアリコート１００μＬずつ９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに移し、得られた細胞を湿らせ暗くしたボックス中で３０℃で培養した。約２〜３日後、第１のコレステロール栄養要求性であると共に、同時にパロモマイシンに対して耐性を有しているクローンが同定された。得られた陽性クローンを、コレステロールまたはパロモマイシンを添加した新規培地中に再播種した。約２週間細胞を再播種して個別の細胞を繰り返し単離することによって、完全な「フェノタイプアソートメント」が達成された（Gaertig & Kapler (1999)）（非特許文献３０）。これらの細胞は、パロモマイシンを添加した後でさえ良好な生育を示した。
【００４８】
実施例１１：ネオマイシン遺伝子を結合したプラスミドｐｇＤＥＳ６による再作成―形質転換
形質転換は実施例９と同様に行なうことができる。次ぎのようにして構成されたベクターを使用した。
デルタ−６−デサチュラーゼ（ｐｇＤＥＳ６）のゲノムフラグメントを制限酵素ＳｍａＢＩで切断した。この酵素は、５’非翻訳領域中の位置７４７のコードエキソン外のゲノムフラグメントを切断する。プラスミドｐ４Ｔ２−１ΔＨ３をＥｃｏＲＶ/ＳｍａＩで切断し、上記ネオ−カセットを含んでいるほぼ１．４ｋｂ断片を、テトラヒメナのデルタ−６−デサチュラーゼの５’非翻訳配列中のすでに切断したプラスミドｐｇＤＥＳ６に結合した。
この構成体（ｐｇＤＥＳ６＋ｎｅｏ、図７参照）をデルタ−６−デサチュラーゼ変異体の形質転換のために使用した。形質転換（上記参照）した後、得られた細胞をボラージオイル無添加のＳＰＰＡ培地に取り、アーレンマイヤーフラスコ中で振とうせずに３０℃で培養した。３時間後、パロモマイシンを添加して、得られた細胞をアリコート１００μＬずつ９６ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルに移し、得られた細胞を湿らせ暗くしたボックス中で３０℃で培養した。約２〜３日後、第１のコレステロール栄養要求性であると共に、同時にパロモマイシンに対して耐性を有しているクローンが同定された。得られた陽性クローンを、コレステロールまたはパロモマイシンを含んでいる新規培地中に再播種した。約２週間細胞を再播種して個別の細胞を繰り返し単離することによって、完全な「フェノタイプ・アソートメント」が達成された（Gaertig & Kapler (1999)）（非特許文献３０）。これらの細胞は、パロモマイシンを添加した後でさえ良好な生育を示した。
【００４９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】テトラヒマノール遺伝子ｐｇＴＨＣの構造を示す図。
【図２】テトラヒマノールノックアウト構成体ｐｇＴＨＣ：：ｎｅｏの構造を示す図。
【図３】発現構成体ｐｇＢＴＨＣの構造を示す図。
【図４】テトラヒマノール―サイクラーゼ/ネオ構成体ｐｇＴＨＣ＋ｎｅｏの構造を示す図。
【図５】デルタ−６−デサチュラーゼノックアウト構成体ｐｇＤＥＳ６：：ｎｅｏの構造を示す図。
【図６】ゲノムデルタ−６−デサチュラーゼ遺伝子ｐｇＤＥＳ６の構造を示す図。
【図７】ゲノムデルタ−６−デサチュラーゼ/ネオ構成体ｐｇＤＥＳ６＋ｎｅｏの構造を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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