(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端アミノ酸配列
Met−Leu−Ser−Val−Gly−Thr−Thr−Thr−Ile−Gln        (配列番号１)
を含んでなり、サブユニットの分子量が２２ｋＤで、GalNAcに結合特異性がないことを特徴とするマイタケ由来のレクチン。
【請求項２】
ｐＨ９以下で安定で、それ以上で徐々に失活し、ｐＨ１１以上で完全に失活し、また熱に対しては、50℃以下で安定でそれ以上では徐々に失活し、70℃以上では完全に失活する性質を有することを特徴とする請求項１記載のマイタケ由来のレクチン。
【請求項３】
採取したマイタケを冷凍温度で保存した後、解凍し冷蔵温度で放置して得られる浸出液を精製することを特徴とする請求項１記載のマイタケ由来のレクチンの製造方法。
【請求項４】
浸出液をイオン交換体で処理して精製することを特徴とする請求項３記載のマイタケ由来のレクチンの製造方法。
【請求項５】
イオン交換体で処理するにあたり、最初に陰イオン交換体で、次いで陽イオン交換体で処理することを特徴とする請求項４記載のマイタケ由来のレクチンの製造方法。
【請求項６】
冷凍温度が−40℃以下、冷蔵温度が−2℃〜10℃であることを特徴とする請求項３、４または５記載のマイタケ由来のレクチンの製造方法。
【請求項７】
冷凍温度が−70℃以下、冷蔵温度が3℃〜5℃であることを特徴とする請求項３、４または５記載のマイタケ由来のレクチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はマイタケ由来のレクチン及びその簡便、効率的な採取・精製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
レクチンの歴史は、1888年にStillmarkがヒマの実の中に、毒性が強く赤血球凝集活性を持つタンパク質を見つけたのが始まりである。その後1890年にLandsteinerとRaubitschekは、種々の植物種子抽出液が動物の赤血球を動物種によりそれぞれ異なった程度に凝集することを見出した。
【０００３】
これらの結果をヒントに、BoydやRenkonenは、植物種子抽出液の血液型特異的凝集活性を精力的に検索した。これら血液型特異的凝集素は、免疫血清よりも安価に使用できることから、しばしばルーチンな血液型判定に用いられ、また血液特異的免疫抗体や自然抗体とは異なり、単糖乃至オリゴ糖によっても凝集活性が阻止されるという特徴を持っていた。
【０００４】
一部の植物性の赤血球凝集素に関して、それらが極めて特異的に一定の糖構造と結合する事が明らかになったところから、Boydはこれらの赤血球凝集素をレクチン（Lectin）と呼ぶことを提唱した。その後1970年代から、レクチンの細胞生理学的応用につて関心が高まり、植物種子以外の生物材料である細菌、カビ、軟体動物、魚類の血清、哺乳動物の組織からもレクチン様物質が見出される様になった。
【０００５】
生物内でのレクチンの役割について研究対象になってきたのはここ20〜30年であるが、今日レクチンは生物学や医学の研究上非常に貴重な道具として役立っており、その範囲は糖タンパク質や糖ペプチドの分類、確認のみならず、細胞や組織の組織化学、細胞の分化、神経細胞経路の追跡、細菌の種類の決定、骨髄移植時のリンパ球と骨髄の分画など多岐にわたっている。
【０００６】
キノコのレクチンについてはかなりの種類について部分精製の報告はあるが、担子菌キノコの仲間であるマイタケについては、未だ精製法が確立していないし、そのアミノ酸配列も明らかにされていない。この理由としてマイタケはプロテアーゼ活性が強く、その影響によりレクチンの精製を難しくしていると考えられる。即ちプロテアーゼ活性を失活させるには熱、ｐH等物理的処理が考えられるが、同時にレクチン自身が失活すると言う問題がある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
マイタケから、新規なレクチンを採取し、かつ簡便に精製できる手法の開発を課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、最近人工栽培により入手が容易になったマイタケのレクチンに注目し、前記課題を解決すべく検討を行った。
マイタケ由来のレクチンの精製については、Ｋawagishiらが、Sepharose系のアフィニティーカラムを使用した方法が報告されており、（Biochimica et Biophysica Acta 1034(1990) 247〜252頁）実際に追試を試みたが、収量は低く効率的ではなく、またレクチンの性状については必ずしも明確に出来なかった。
【０００９】
また一方、一般にプロテアーゼを取り除く方法としては、カゼインを用いる方法が知られており、実際にレクチン溶液にカゼインを加え、カゼインに吸着したプロテアーゼを除去する方法を試みたが、カゼインの完全な除去が難しく実用的で無いことが分かった。
プロテアーゼ活性を抑え、しかもレクチンの活性には影響なく効率よく採取・精製し、同時にその構造を明らかにすべく鋭意研究の結果本発明を完成した。即ち本発明は
（１）N末端アミノ酸配列
Met-Leu-Ser-Val-Gly-Thr-Thr-Thr-Ile-Gln            (配列番号１)
を含んでなり、サブユニットの分子量が約２２ｋＤであることを特徴とするマイタケ由来のレクチンに関する。
【００１０】
（２）ｐＨ９以下で安定で、それ以上で徐々に失活し、ｐＨ11以上で完全に失活し、また熱に対しては、50℃以下で安定でそれ以上では徐々に失活し、70℃以上では完全に失活する性質を有することを特徴とする(１)記載のマイタケ由来のレクチンに関する。
（３）採取したマイタケを冷凍温度で保存した後、解凍し冷蔵温度で放置して得られる浸出液を精製することを特徴とするマイタケ由来のレクチンの製造方法に関する。
【００１１】
(４)浸出液をイオン交換体で処理して精製することを特徴とする(３)記載のマイタケ由来のレクチンの製造方法に関する。
（５）イオン交換体で処理するにあたり、最初に陰イオン交換体で、次いで陽イオン交換体で処理して精製することを特徴とする(４)記載のマイタケのレクチンの製造方法に関する。
【００１２】
（６）冷凍温度が−40℃以下、冷蔵温度が-2℃〜10℃であることを特徴とする前記（3）、（4）または(5)の方法に関する。
（７）冷凍温度が−70℃以下、冷蔵温度が3℃〜5℃であることを特徴とする前記（3）、（4）または(5)の方法に関する。
以下本発明について詳述する。
【００１３】
本発明におけるマイタケは、マイタケ（Grifola frondosa）、白マイタケ（Grifola albicans）等が挙げられ、主にこれらの子実体を使用する。これらは天然のもの、人工栽培のものいずれも使用できる。
本発明の特徴は収穫されたマイタケをまず冷凍温度で保存し、該冷凍温度で保存したマイタケを解凍してマイタケから浸出する浸出液を利用することにある。
【００１４】
マイタケは、プロテアーゼ活性が非常に強く、従来の抽出方法ではマイタケのレクチンは満足に得られなかったが、本発明の方法により初めて可能となった。
冷凍保存したマイタケの解凍は、通常冷蔵温度に放置して行う。解凍にともない浸出液が出てくるのでこれらを集める。かかる手段により、マイタケの細胞壁を壊すことがないので、プロテアーゼの活性化を抑制する事ができる。従って当然のことながら、解凍したマイタケから浸出液を得るに当たり搾ったり、ホモゲナイズしないのが好ましいことは言うまでもない。
【００１５】
一般に冷凍は凍結点以下の温度をいい、凍結状態で保持する方法を冷凍貯蔵或いは冷凍保存といっている。そして標準的の冷凍保存は−18℃〜−20℃以下と言われている。本発明における冷凍温度もこの温度範囲を指すものとする。
冷蔵は凍結点以上の温度とされ、標準的な食品の貯蔵の温度は−２℃〜10℃と言われ本発明においても此の温度範囲を指すものとする。
【００１６】
冷凍保存の時間が例えば１〜２昼夜と短い場合は、冷凍温度は-18℃〜-20℃でも特に問題ないと考えられるが、適正な保存と冷凍温度と冷蔵温度の差があった方が浸出液が出やすいという観点からすると、−40℃以下更に好ましくは−70℃以下の冷凍温度で保存するのが好適である。
【００１７】
またマイタケに含まれるプロテアーゼの活性化の制御と、作業条件の観点から冷蔵温度は-2℃〜10℃好ましくは３℃〜５℃を選択するのが良い。
解凍は、通常は冷蔵温度で放置して行う。例えば３〜５℃に一晩程度放置する事により行い得る。
【００１８】
以上のようにして得られたマイタケ浸出液中のレクチンの活性を測定しながら次の精製工程を進めるのが好ましく、採取した浸出液のままでは溶血活性が強く溶血因子を失活させるため必要に応じ加熱処理を行う。該処理は５０℃で１５分を基準にして行う。この条件は本発明者等が初めて見出したもので、溶血因子は失活するがレクチンは失活せず、活性の測定が可能となった。
【００１９】
処理条件について温度が若干高ければ、時間を若干短く、また温度が若干低ければ、時間を若干長くといった許容範囲は認められるが、レクチンの活性を維持するためには、５０℃を越えないことが好ましい。
なお、該加熱処理は測定に供する浸出液に限って行っても良い。
【００２０】
本発明の特徴ある方法によって得られた浸出液は、マイタケ由来のレクチンの含量が高く、通常の分画・精製法によって採取することも可能であるが、特にイオン交換体を用いることにより効率よく、適切にマイタケ由来のレクチンを採取することが可能である。
【００２１】
イオン交換体を用いる精製の中でも、最初に陰イオン交換体を用いて、浸出液中に含まれているプロテアーゼ等を吸着除去し、流出液をついで陽イオン交換体で処理して精製することにより、より簡便にマイタケ由来のレクチンを採取する事が出来ることを見出した。
【００２２】
陰イオン交換体としては、弱塩基性のDEAE-Toyopearl、DEAE-Sephadex、DEAE-Celluloseが、陽イオン交換体としては、弱酸性のCM-Toyopearl、CM-Sephadex、CM-Cellulose等が使用できるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００２３】
例えば陰イオン交換体として、DEAE-Toyopearlを用いる場合を例に取って説明すると、予め浸出液をリン酸バッファーで透析した後、該交換体で処理するのが好ましい。
次に流出液を陽イオン交換体であるCM-Toyopearlで処理する場合は、予め酢酸ナトリウムバッファーで透析してのち該交換体カラムで処理するのが好ましい。
【００２４】
以上のようにして得られたマイタケ由来のレクチンは、電気泳動法の一つSDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)により、サブユニットの分子量は約２２ｋD (kiro Dalton)と推定され、Ｎ末端のアミノ酸の残基はプロテインシークエンサーにより以下のように明らかにされた。
【００２５】
Met-Leu-Ser-Val-Gly-Thr-Thr-Thr-Ile-Gln            (配列番号１)
アミノ酸組成は比較的メチオニンや芳香族アミノ酸が多く、サブユニットのアミノ酸の全残基数は１７８と推定され、それから推定されるサブユニットの分子量は２２,７０２であり、SDS-PAGEにより得られる結果と一致する。
【００２６】
なお、サブユニットとは当該分野で一般に認識されているように、一本のペプチド鎖により構成されている部分を称するものである (「基礎生化学実験法」３巻  ３５３頁  阿南  功一他編、丸善(株)発行)。
本発明により得られたマイタケ由来のレクチンは、ｐＨ９まで安定でそれ以上では徐々に失活し、ｐＨ１１で完全に失活する。また、熱に対しては５０℃までは安定でそれ以上では徐々に失活し、７０℃以上では完全に失活した。
【００２７】
また、糖特異性ではPSM(Porcine Stomach mucin「ブタ胃由来のムチン」)に対し阻害がみられ、特異性を示す。
本発明によって得られたマイタケ由来のレクチンは、他のレクチンと同様、生物学、細胞生理学、免疫学等各領域における試薬として利用できるが、更に免疫賦活作用、腫瘍増強抑制作用等が期待され医薬品への応用の可能性がある。
本発明における典型的精製方法の概略を図１に示すと共に以下実施例を記載するが、本発明はこれに限定されるものではなく、レクチンの精製についてはタンパク質、ペプチド類に一般に応用されている方法も適用出来る。
【００２８】
【発明の実施の形態】
(実施例1)
抽出・精製
（１）抽出
人工栽培によるマイタケ（Grifola frondosa）子実体1株を100gずつに分け−80℃の冷凍庫に保存した。保存した子実体を４℃の低温室で一晩放置後、該子実体を搾り浸出液を得た。
浸出液には、マイタケ100gあたり、約60mgの可溶性タンパク質が抽出され、total titerは2.05×106であった。
【００２９】
(２)加熱処理
浸出液中のレクチン活性測定に当たって、そのままでは溶血活性が高く活性を測定することができないので、溶血因子を失活させるため浸出液を５０℃で１５分間熱処理を行った。
【００３０】
(３)レクチンの活性測定
レクチンの活性測定は以下のように行った。
９６穴タイタープレートを用い、試料20μｌをPBS(Phosphate buffered saline)20μlにより連続的に倍数希釈していき、その希釈溶液にウサギ赤血球20μlを加えて軽く振とうして約1時間室温静置後、顕微鏡及び肉眼により血球凝集を観察して測定を行った。血球凝集活性のみられる最大希釈倍率を、そのレクチンの力価（Titer）とした。
【００３１】
尚、活性測定用赤血球は次のように調製した。
▲１▼  ファルコンチューブにウサギ血液１mlとPBS 4.5mlを加えてよく懸濁し、５,000rpm、4℃、５分間遠心分離して赤血球を落とす。
▲２▼  上清を除き、再びPBS 4.5mlを加えてよく懸濁し、5,000rpm、４℃、５分間遠心分離して赤血球を洗浄する。この洗浄操作をあと2回繰り返す。
▲３▼  遠心分離後に赤血球にPBS 4.5mlを加えよく懸濁して、赤血球懸濁液とする。この状態で冷蔵庫に保存すれば約2週間使用できる。
▲４▼  使用時には10倍にPBSで希釈して使用する。
【００３２】
（４）透析
次いで20mMリン酸バッファー(ｐＨ７．２)に対して透析を行い、透析後、４℃、10,000rpm、10分間遠心分離して固形物を取り除いた。
（５）イオン交換体による分画
得られた溶液をバッチ法でDEAE-Toyopearl 650Mに供した。マイタケ由来のレクチンはDEAE-Toyopearl 650Mに吸着されない。非吸着成分の活性がある部分をすべて回収した。収率は90％、比活性1.13×10５ titer/mgで、３倍まで精製された。
【００３３】
（６）透析
以上の様にして得られたマイタケ由来のレクチンを精製するため先ず20mM酢酸バッファー(ｐＨ４.８)に対して透析を行った。
（７）イオン交換体による分画
透析後の溶液をバッチ法でCM-Toyopearl 650M に供した。マイタケ由来のレクチンはCM-Toyopearl 650M に吸着される。非吸着成分を20mM酢酸ナトリウムバッファー(ｐＨ４.８)で洗浄した。その後20mM リン酸バッファー(ｐＨ７.２)に置換した。これは酸性プロテアーゼの影響を考慮して、中性で溶出するために行った。その後樹脂をカラム（3cm×18cm）に詰め直し、0.1MのNaClで洗浄して夾雑タンパク質を除いた後、0.1M〜0.3MのNaClのlinear gradient (各500ml)により溶出し、活性画分を回収した。その収率は86％、比活性4.45×10５ titer/mgで、12倍まで精製したマイタケ由来のレクチンを取得した。
CM- Toyopearl 650M カラムによる溶出パターンのグラフを図２に示す。
また、以上精製過程における比活性の推移等を表１に示す。
【００３４】
【表１】
0004726359.tif 000002
【００３５】
なお、精製、活性測定等に使用した主な試薬は以下のように調製した。
▲１▼ＰＢＳ(ｐＨ７.２)
ＮａＣｌ  ８０ｇ、ＫＣｌ  ２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４  １１ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ２ｇを蒸留水に溶かして１,０００ｍｌとし、ストック用とする。使用時は１０倍希釈する。
▲２▼２０ｍＭリン酸バッファー(ｐＨ７.２)
ＮａＨ２ＰＯ４  １２.０ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ３５.８ｇを蒸留水に溶かし、ｐＨ７.２に１０Ｎ−ＮａＯＨで調整して１０００ｍｌとし、ストック用とする。使用時は１０倍希釈する。
▲３▼２０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー(ｐＨ４.８)
２７.２１６ｇの酢酸ナトリウム・３Ｈ２Ｏを蒸留水で希釈し、ｐＨ４.８に酢酸で調整して１,０００ｍｌとし、ストック用とする。使用時は１０倍希釈する。
【００３６】
（実施例2）
マイタケ由来のレクチンの性質
（１）糖特異性
粗製乃至精製物につき、以下の実験を行った。
▲１▼  レクチン活性は96穴タイタープレートを用い、糖10μlをPBS 10μlにより連続的に倍数希釈していく。
▲２▼  その希釈液に試料（Titer２４のもの）10μlを加えて軽く振とうして約1時間静置する。
▲３▼  ウサギの赤血球20μlを加えて軽く振とうして約1時間室温静置後、顕微鏡及び肉眼により血球凝集を観察して測定を行う。
PSMのみで阻害がみられた。結果は表２に示すとおりである。
【００３７】
【表２】
0004726359.tif 000003
【００３８】
（２）分子量及びサブユニットの挙動
電気泳動法により行った。
マイタケ由来のレクチンは、メルカプトエタノール存在下のSDS-PAGEで、22kDの単一バンドを示した。
マイタケ由来のレクチンのサブユニットの分子量は約22kDと推定される。SDS-PAGEの結果を図３Ａ及び図３Ｂのaに示す。また、マイタケ由来のレクチンはメルカプトエタノール非存在下のSDS-PAGEにおいて複雑な泳動パターンを示した。このSDS-PAGEを図３Ｂのb-eに示す。
【００３９】
この原因は、マイタケ由来のレクチンのシステイン残基のSH基の存在状態によって構造が変化していると考えられる。即ちメルカプトエタノール非存在下のSDS-PAGEでは、その構造変化により泳動速度が異なり、バンドが複数現れたと考えられる。
更にまた、過酸化水素を用いて、マイタケ由来のレクチンのシステイン残基のSH基を酸化し、SDS-PAGEを行った。このSDS-PAGEを図３Ｂのfに示す。大部分が22kDより少し上の付近で１本バンドになった。これはメルカプトエタノール非存在下のSDS-PAGEのモノマーの変形のバンドの位置と重なった。
図３Ｂのa-fのSH基の存在状態の模式図を図４に示す。
【００４０】
（３）ｐＨ安定性
pH安定性の試験は、マイタケ由来のレクチン（Titer２４）を各pＨに放置後、残存活性を測定した。pH9までマイタケ由来のレクチンは安定で、それ以上では徐々に失活し、pH11以上では完全に失活した。そのグラフを図５に示す。
（４）熱安定性
熱安定性の実験では、マイタケ由来のレクチンをTiter２４になる様調整し、各温度に10分間処理後残存活性を測定した。
50℃までマイタケ由来のレクチンは安定で、それ以上では徐々に失活し、70℃以上では完全に失活した。そのグラフを図６に示す。
【００４１】
（５）Ｎ末端アミノ酸配列
マイタケ由来のレクチンを100pmolになるようサンプルを調製し、島津製作所製プロテインシークエンサー、PPSQ-10に供し、Ｎ末端の10の残基を明らかにした。
（６）アミノ酸組成
実施例1で得たマイタケ由来のレクチンを日本電子株式会社製、アミノ酸自動分析計、JLC−500/Vに供した。
モル比は、SDS-PAGEから推定された分子量をもとに、グルタミン酸を基準にして算出した。比較的メチオニンが多く、また芳香族アミノ酸も多いという結果が得られた。
アミノ酸の全残基数は178と推定され、それから推定される分子量は22,702である。
その結果を表３に示す。
【００４２】
【表３】
0004726359.tif 000004
【００４３】
【発明の効果】
本発明によって、マイタケ由来のレクチンを簡便に採取・精製することを可能ならしめた。
【００４４】
【配列表】
0004726359.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】マイタケ由来のレクチンの精製プロトコールを示す図。
【図２】マイタケ由来のレクチンの陽イオン交換クロマトグラフィーによる精製を示す図。
【図３Ａ】マイタケ由来のレクチンの電気泳動を示す図。
【図３Ｂ】マイタケ由来のレクチンの電気泳動を示す図。
【図４】マイタケ由来のレクチンのＳＨ基の存在状態を示す図。
【図５】マイタケ由来のレクチンのｐＨ安定性を示す図。
【図６】マイタケ由来のレクチンの熱安定性を示す図。
【図１】
0004726359.tif 000006
【図２】
0004726359.tif 000007
【図３Ａ】
0004726359.tif 000008
【図３Ｂ】
0004726359.tif 000009
【図４】
0004726359.tif 000010
【図５】
0004726359.tif 000011
【図６】
0004726359.tif 000012