(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象となる二本鎖核酸の塩基配列が、参照となる二本鎖核酸の塩基配列と相違性を有しているかを調べる核酸の塩基配列の相違を調べる方法であって、
前記参照となる二本鎖核酸、この二本鎖核酸は蛍光物質である第１のマーカーを備える第１の一本鎖核酸と、蛍光物質であり、前記第１のマーカーに近づくと光学的性質が変化する第２のマーカーを備え、前記第１の一本鎖核酸と相補的な関係にある第２の一本鎖核酸とを有している、と、前記検出対象となる二本鎖核酸、この二本鎖核酸はマーカーを備えない第３の一本鎖核酸と、マーカーを備えない、前記第３の一本鎖核酸と相補的な関係にある第４の一本鎖核酸とを有している、とを含有する検体を用意し、
この検体に対して、前記検出対象となる二本鎖核酸および前記参照となる二本鎖核酸の変性処理を行い、
次いで、この検体に対して、前記変性処理により形成された一本鎖核酸の会合処理を行い、
その後および／またはその際に、前記第２のマーカーが前記第１のマーカーに近づくことに起因して、前記第１のマーカーと前記第２のマーカーとの間で起こる、蛍光共鳴エネルギー移動に基づいて、前記第２のマーカーから、発せられる新たなピーク波長の蛍光を調べることにより、前記検出対象となる二本鎖核酸の塩基配列と、前記参照となる二本鎖核酸の塩基配列との相違性を調べることを特徴とする核酸の塩基配列の相違を調べる方法。
【請求項２】
前記検体では、前記検出対象となる二本鎖核酸の量が、前記参照となる二本鎖核酸の量よりも多い請求項１に記載の核酸の塩基配列の相違を調べる方法。
【請求項３】
前記第２のマーカーから、発せられる新たなピーク波長の蛍光を調べた結果、
前記蛍光の量が、前記検出対象となる二本鎖核酸の塩基配列が前記参照となる二本鎖核酸の塩基配列と相同性を有している場合の前記蛍光の量よりも大きいことを、前記検出対象となる二本鎖核酸の塩基配列と、前記参照となる二本鎖核酸の塩基配列との相違性の指標とする請求項１または２に記載の核酸の塩基配列の相違を調べる方法。
【請求項４】
検出対象となる二本鎖核酸の塩基配列が、参照となる二本鎖核酸の塩基配列と相違性を有しているかを調べる塩基配列の相違を調べる装置であって、
前記参照となる二本鎖核酸、この二本鎖核酸は蛍光物質である第１のマーカーを備える第１の一本鎖核酸と、蛍光物質であり、前記第１のマーカーに近づくと光学的性質が変化する第２のマーカーを備え、前記第１の一本鎖核酸と相補的な関係にある第２の一本鎖核酸とを有している、と、前記検出対象となる二本鎖核酸、この二本鎖核酸はマーカーを備えない第３の一本鎖核酸と、マーカーを備えない、前記第３の一本鎖核酸と相補的な関係にある第４の一本鎖核酸とを有している、とを含有する検体に対して、前記検出対象となる二本鎖核酸および前記参照となる二本鎖核酸の変性処理を行い、次いで、この検体に対して、前記変性処理により形成された一本鎖核酸の会合処理を行う処理部と、
前記検体に光を投射する投射手段と、
前記検体からの前記第１のマーカーに由来する蛍光の光学的性質を検知する第１の検知手段と、
前記検体からの前記第２のマーカーに由来する蛍光の光学的性質を検知する第２の検知手段とを有し、
前記第２のマーカーが前記第１のマーカーに近づくことに起因して、前記第１のマーカーと前記第２のマーカーとの間で起こる、蛍光共鳴エネルギー移動に基づいて、前記第２のマーカーから、発せられる新たなピーク波長の蛍光を前記第２の検知手段により調べ得るように構成され、これにより、前記検出対象となる二本鎖核酸の塩基配列と、前記参照となる二本鎖核酸の塩基配列との相違性が調べられることを特徴とする塩基配列の相違を調べる装置。
【請求項５】
前記検体では、前記検出対象となる二本鎖核酸の量が、前記参照となる二本鎖核酸の量よりも多い請求項４に記載の塩基配列の相違を調べる装置。
【請求項６】
前記第２の検知手段により、前記第２のマーカーから、発せられる新たなピーク波長の蛍光を調べた結果、
前記蛍光の量が、前記検出対象となる二本鎖核酸の塩基配列が前記参照となる二本鎖核酸の塩基配列と相同性を有している場合の前記蛍光の量よりも大きいことを、前記検出対象となる二本鎖核酸の塩基配列と、前記参照となる二本鎖核酸の塩基配列との相違性の指標とする請求項４または５に記載の塩基配列の相違を調べる装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、塩基配列の相違を調べる方法、および塩基配列の相違を調べる装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
がん等のある種の疾病は、体細胞の遺伝子が変異することにより発病することが知られている。したがって、体細胞の遺伝子の変異を調べれば、がん等を診断することが可能である。
このような事情から、現在、遺伝子の変異を好適に検出する方法の開発が、望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、好適に塩基配列の相違を調べることができる塩基配列の相違を調べる方法、および塩基配列の相違を調べる装置を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
このような目的は、下記の本発明により達成される。
【０００５】
（１）  検出対象となる二本鎖核酸の塩基配列が、参照となる二本鎖核酸の塩基配列と相違性を有しているかを調べる核酸の塩基配列の相違を調べる方法であって、
前記参照となる二本鎖核酸、この二本鎖核酸は蛍光物質である第１のマーカーを備える第１の一本鎖核酸と、蛍光物質であり、前記第１のマーカーに近づくと光学的性質が変化する第２のマーカーを備え、前記第１の一本鎖核酸と相補的な関係にある第２の一本鎖核酸とを有している、と、前記検出対象となる二本鎖核酸、この二本鎖核酸はマーカーを備えない第３の一本鎖核酸と、マーカーを備えない、前記第３の一本鎖核酸と相補的な関係にある第４の一本鎖核酸とを有している、とを含有する検体を用意し、
この検体に対して、前記検出対象となる二本鎖核酸および前記参照となる二本鎖核酸の変性処理を行い、
次いで、この検体に対して、前記変性処理により形成された一本鎖核酸の会合処理を行い、
その後および／またはその際に、前記第２のマーカーが前記第１のマーカーに近づくことに起因して、前記第１のマーカーと前記第２のマーカーとの間で起こる、蛍光共鳴エネルギー移動に基づいて、前記第２のマーカーから、発せられる新たなピーク波長の蛍光を調べることにより、前記検出対象となる二本鎖核酸の塩基配列と、前記参照となる二本鎖核酸の塩基配列との相違性を調べることを特徴とする核酸の塩基配列の相違を調べる方法。
【０００９】
（２）  前記検体では、前記検出対象となる二本鎖核酸の量が、前記参照となる二本鎖核酸の量よりも多い上記（１）に記載の核酸の塩基配列の相違を調べる方法。
【００１０】
（３）  前記第２のマーカーから、発せられる新たなピーク波長の蛍光を調べた結果、
前記蛍光の量が、前記検出対象となる二本鎖核酸の塩基配列が前記参照となる二本鎖核酸の塩基配列と相同性を有している場合の前記蛍光の量よりも大きいことを、前記検出対象となる二本鎖核酸の塩基配列と、前記参照となる二本鎖核酸の塩基配列との相違性の指標とする上記（１）または（２）に記載の核酸の塩基配列の相違を調べる方法。
【００１１】
（４）  検出対象となる二本鎖核酸の塩基配列が、参照となる二本鎖核酸の塩基配列と相違性を有しているかを調べる塩基配列の相違を調べる装置であって、
前記参照となる二本鎖核酸、この二本鎖核酸は蛍光物質である第１のマーカーを備える第１の一本鎖核酸と、蛍光物質であり、前記第１のマーカーに近づくと光学的性質が変化する第２のマーカーを備え、前記第１の一本鎖核酸と相補的な関係にある第２の一本鎖核酸とを有している、と、前記検出対象となる二本鎖核酸、この二本鎖核酸はマーカーを備えない第３の一本鎖核酸と、マーカーを備えない、前記第３の一本鎖核酸と相補的な関係にある第４の一本鎖核酸とを有している、とを含有する検体に対して、前記検出対象となる二本鎖核酸および前記参照となる二本鎖核酸の変性処理を行い、次いで、この検体に対して、前記変性処理により形成された一本鎖核酸の会合処理を行う処理部と、
前記検体に光を投射する投射手段と、
前記検体からの前記第１のマーカーに由来する蛍光の光学的性質を検知する第１の検知手段と、
前記検体からの前記第２のマーカーに由来する蛍光の光学的性質を検知する第２の検知手段とを有し、
前記第２のマーカーが前記第１のマーカーに近づくことに起因して、前記第１のマーカーと前記第２のマーカーとの間で起こる、蛍光共鳴エネルギー移動に基づいて、前記第２のマーカーから、発せられる新たなピーク波長の蛍光を前記第２の検知手段により調べ得るように構成され、これにより、前記検出対象となる二本鎖核酸の塩基配列と、前記参照となる二本鎖核酸の塩基配列との相違性が調べられることを特徴とする塩基配列の相違を調べる装置。
【００１２】
（５）  前記検体では、前記検出対象となる二本鎖核酸の量が、前記参照となる二本鎖核酸の量よりも多い上記（４）に記載の塩基配列の相違を調べる装置。
【００１３】
（６）  前記第２の検知手段により、前記第２のマーカーから、発せられる新たなピーク波長の蛍光を調べた結果、
前記蛍光の量が、前記検出対象となる二本鎖核酸の塩基配列が前記参照となる二本鎖核酸の塩基配列と相同性を有している場合の前記蛍光の量よりも大きいことを、前記検出対象となる二本鎖核酸の塩基配列と、前記参照となる二本鎖核酸の塩基配列との相違性の指標とする上記（４）または（５）に記載の塩基配列の相違を調べる装置。
【００１６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を添付図面に示す好適実施形態に基づいて詳細に説明する。
まず始めに、塩基配列の相違を調べる方法の実施形態について説明する。
図１〜３は、本発明の塩基配列の相違を調べる方法の実施形態を説明するための模式的な図である。
【００１７】
本発明は、検出対象となるＤＮＡの塩基配列が、参照となるＤＮＡの塩基配列と相違性を有しているかを調べるものである。例えば、本発明によれば、検出対象となるＤＮＡの塩基配列が、参照となるＤＮＡの塩基配列と同じなのか異なっているのかを、調べることができる。以下、その原理を説明する。
まず、検出対象となるＤＮＡの塩基配列が、参照となるＤＮＡの塩基配列と相違性を有している場合を例に、図３を用いて、一連の流れを説明する。
【００１８】
＜１＞まず、図３（ａ）に示すように、参照となる二本鎖ＤＮＡβと、検出対象となる二本鎖ＤＮＡβｘとを含む検体を用意する。
【００１９】
＜２＞次に、かかる検体中の二本鎖ＤＮＡを変性（ディネイチャー）させる。これにより、二本鎖ＤＮＡの塩基対間の水素結合が切れ、図３（ｂ）に示すように、一本鎖ＤＮＡγ”が形成される。
【００２０】
＜３＞その後、かかる一本鎖ＤＮＡγ”を再会合させる（アニールする）。これにより、相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡ同士がハイブリダイズし、図３（ｃ）に示すように、二本鎖ＤＮＡα”が、形成される。
【００２１】
＜４＞そして、再会合中および／または再会合後に、検体の光学的性質（すなわち二本鎖ＤＮＡα”の光学的性質）を調べることにより、参照となる二本鎖ＤＮＡβと検出対象となる二本鎖ＤＮＡβｘとの塩基配列の相違性を調べることができる。
以下、図３を用いつつ、本発明の実施形態を、詳細に説明する。
【００２２】
＜１＞検体の用意
図３（ａ）に示すように、参照となる二本鎖ＤＮＡβには、例えば、第１の二本鎖ＤＮＡβ１と第２の二本鎖ＤＮＡβ２とを含むものを用意する。
【００２３】
第１の二本鎖ＤＮＡβ１は、互いに相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡａと一本鎖ＤＮＡｂ’とが会合して、構成されている。第２の二本鎖ＤＮＡβ２は、互いに相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡａ’と一本鎖ＤＮＡｂとが会合して、構成されている。
【００２４】
このような二本鎖ＤＮＡβでは、一本鎖ＤＮＡａと一本鎖ＤＮＡａ’とは、例えば同一の塩基配列を有している。また、一本鎖ＤＮＡｂと一本鎖ＤＮＡｂ’とは、例えば同一の塩基配列を有している。一本鎖ＤＮＡａ、ａ’の塩基配列と、一本鎖ＤＮＡｂ、ｂ’の塩基配列とは、互いに相補的なものとなっている。
端的に言えば、第１の二本鎖ＤＮＡβ１の塩基配列と第２の二本鎖ＤＮＡβ２の塩基配列とは、同一となっている。
【００２５】
第１の二本鎖ＤＮＡβ１では、一本鎖ＤＮＡｂ’が、第１のマーカーＭ１を備えている。第２の二本鎖ＤＮＡβ２では、一本鎖ＤＮＡａ’が、第２のマーカーＭ２を備えている。本発明では、第２のマーカーＭ２、および好ましくは第１のマーカーＭ１は、光学的なマーカーとして機能する。また、本発明では、第２のマーカーＭ２は、第１のマーカーＭ１に近づくと光学的性質が変化する性質を有している。さらには、第１のマーカーＭ１は、第２のマーカーＭ２に近づくと光学的性質が変化する性質を有していることが好ましい。
なお、図では、第１のマーカーＭ１は、○印の記号で示し、第２のマーカーＭ２は、●印の記号で示す。また、一本鎖ＤＮＡは、一本の直線で示し、二本鎖ＤＮＡは、接近した２本の平行線で示す。さらには、検出対象となる二本鎖ＤＮＡβｘの塩基配列が参照となる二本鎖ＤＮＡβとの塩基配列と異なっている部分を、×印を付して示す。また、図では、分子間が離間していることは、文字「Ｈ2Ｏ」を配すことにより、模式的に示す。
【００２６】
前述したように、図３に示す例では、検出対象となる二本鎖ＤＮＡβｘの塩基配列は、参照となる二本鎖ＤＮＡβの塩基配列と異なっている。この検出対象となる二本鎖ＤＮＡβｘは、互いに相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡａxと一本鎖ＤＮＡｂxとが会合して、構成されている。
【００２７】
図３（ａ）に参照されるように、各二本鎖ＤＮＡβ１、β２、βｘは、通常、溶媒、担体等で周囲が囲まれているので、二本鎖ＤＮＡβ１、β２、βｘ間は、互いに離間している。換言すれば、変性させる前の二本鎖ＤＮＡβでは、第１のマーカーＭ１と第２のマーカーＭ２とは、離間している。
【００２８】
＜２＞ＤＮＡの変性
同様に、変性して形成された一本鎖ＤＮＡγ”においても、各一本鎖ＤＮＡａ、ａ’、ａx、ｂ、ｂ’、ｂxは、通常、溶媒、担体等で周囲が囲まれているので、一本鎖ＤＮＡａ、ａ’、ａx、ｂ、ｂ’、ｂx間は離間している（図３（ｂ）参照）。したがって、一本鎖ＤＮＡγ”では、第１のマーカーＭ１と第２のマーカーＭ２とは、離間している。
【００２９】
＜３＞ＤＮＡの再会合
その後、一本鎖ＤＮＡγ”を再会合させて二本鎖ＤＮＡα”を形成すると、形成された二本鎖ＤＮＡα”は、図３（ｃ）に参照されるように、５種類のＤＮＡ、すなわち第１の二本鎖ＤＮＡα１と第２の二本鎖ＤＮＡα２と第３の二本鎖ＤＮＡα３と第４の二本鎖ＤＮＡα４と第５の二本鎖ＤＮＡαｘとを含むようになる。
【００３０】
第１の二本鎖ＤＮＡα１は、一本鎖ＤＮＡａ’と一本鎖ＤＮＡｂ’とで構成される。第２の二本鎖ＤＮＡα２は、一本鎖ＤＮＡａ’と一本鎖ＤＮＡｂとで構成される。第３の二本鎖ＤＮＡα３は、一本鎖ＤＮＡａと一本鎖ＤＮＡｂ’とで構成される。第４の二本鎖ＤＮＡα４は、一本鎖ＤＮＡａと一本鎖ＤＮＡｂとで構成される。第５の二本鎖ＤＮＡαｘは、一本鎖ＤＮＡａxと一本鎖ＤＮＡｂxとで構成される。
【００３１】
これら各二本鎖ＤＮＡのうち、第１の二本鎖ＤＮＡα１、第２の二本鎖ＤＮＡα２、第３の二本鎖ＤＮＡα３、および第４の二本鎖ＤＮＡα４は、参照となる二本鎖ＤＮＡβに由来するものである。また、第５の二本鎖ＤＮＡαｘは、検出対象となる二本鎖ＤＮＡβｘに由来するものである。
【００３２】
ここで注目すべきは、一本鎖ＤＮＡａxは一本鎖ＤＮＡａ、ａ’とは異なる塩基配列を有しているので、一本鎖ＤＮＡａxは、一本鎖ＤＮＡｂ、ｂ’とは非相補的であり、一本鎖ＤＮＡｂ、ｂ’とはハイブリダイズしないことである。または、ハイブリダイズしたとしても、その量は、比較的少ない。同様に、一本鎖ＤＮＡｂxは一本鎖ＤＮＡｂ、ｂ’とは異なる塩基配列を有しているので、一本鎖ＤＮＡｂxは、一本鎖ＤＮＡａ、ａ’とは非相補的であり、一本鎖ＤＮＡａ、ａ’とはハイブリダイズしない。または、ハイブリダイズしたとしても、その量は、比較的少ない。
【００３３】
つまり、検出対象となる二本鎖ＤＮＡβｘの塩基配列と参照となる二本鎖ＤＮＡβの塩基配列とが異なっていると、ハイブリダイゼーションは、検出対象となる二本鎖ＤＮＡβｘの構成要素（一本鎖ＤＮＡａx、ｂx）同士、および参照となる二本鎖ＤＮＡβの構成要素（一本鎖ＤＮＡａ、ａ’、ｂ、ｂ’）同士で、もっぱら行われることとなる。したがって、参照となる二本鎖ＤＮＡβがハイブリダイズして得られた二本鎖ＤＮＡα”中の第１の二本鎖ＤＮＡα１、第２の二本鎖ＤＮＡα２、第３の二本鎖ＤＮＡα３、および第４の二本鎖ＤＮＡα４の比率は、図１に示すような参照となる二本鎖ＤＮＡβのみを変性、再会合させた場合に得られる二本鎖ＤＮＡα中の第１の二本鎖ＤＮＡα１、第２の二本鎖ＤＮＡα２、第３の二本鎖ＤＮＡα３、および第４の二本鎖ＤＮＡα４の比率と理論上等価なものとなる。または、これに近いものとなる。
【００３４】
これに対し、図２に示すように、検出対象となる二本鎖ＤＮＡβ３の塩基配列が参照となる二本鎖ＤＮＡβの塩基配列と同じ場合、得られる二本鎖ＤＮＡα’中の第１の二本鎖ＤＮＡα１、第２の二本鎖ＤＮＡα２、第３の二本鎖ＤＮＡα３、および第４の二本鎖ＤＮＡα４の比率は、二本鎖ＤＮＡα（図１参照）中の第１の二本鎖ＤＮＡα１、第２の二本鎖ＤＮＡα２、第３の二本鎖ＤＮＡα３、および第４の二本鎖ＤＮＡα４の比率と異なるものとなる。図２に示すように、検出対象となる二本鎖ＤＮＡβ３の塩基配列が参照となる二本鎖ＤＮＡβの塩基配列と同じ場合、検出対象となる二本鎖ＤＮＡβ３は、一本鎖ＤＮＡａと一本鎖ＤＮＡｂとで構成される。このため、検出対象となる二本鎖ＤＮＡβ３の一本鎖ＤＮＡａは、参照となる二本鎖ＤＮＡβの一本鎖ＤＮＡｂ、ｂ’とハイブリダイズ可能である。同様に、検出対象となる二本鎖ＤＮＡβ３の一本鎖ＤＮＡｂは、参照となる二本鎖ＤＮＡβの一本鎖ＤＮＡａ、ａ’とハイブリダイズ可能である。したがって、図２（ａ）に示すような構成の検体に対して変性、再会合を行うと、図２（ｃ）に示すように、４種類のＤＮＡ、すなわち第１の二本鎖ＤＮＡα１と第２の二本鎖ＤＮＡα２と第３の二本鎖ＤＮＡα３と第４の二本鎖ＤＮＡα４とが形成される。このとき、検出対象となる二本鎖ＤＮＡβ３由来の一本鎖ＤＮＡａ、ｂが、参照となる二本鎖ＤＮＡβ由来の一本鎖ＤＮＡａ、ａ’、ｂ、ｂ’とハイブリダイズしたため、二本鎖ＤＮＡα’中の第１の二本鎖ＤＮＡα１、第２の二本鎖ＤＮＡα２、第３の二本鎖ＤＮＡα３、および第４の二本鎖ＤＮＡα４の比率は、二本鎖ＤＮＡα（図１参照）中の第１の二本鎖ＤＮＡα１、第２の二本鎖ＤＮＡα２、第３の二本鎖ＤＮＡα３、および第４の二本鎖ＤＮＡα４の比率とは、異なる。
【００３５】
例えば、図２（ａ）に示すような検体において、第１の二本鎖ＤＮＡβ１と第２の二本鎖ＤＮＡβ２と検出対象となる二本鎖ＤＮＡβ３との比を１：１：１０とすると、生成される二本鎖ＤＮＡα’では、第１の二本鎖ＤＮＡα１と第２の二本鎖ＤＮＡα２と第３の二本鎖ＤＮＡα３と第４の二本鎖ＤＮＡα４との比は、１：１１：１１：１２１となる。
【００３６】
これに対し、図３（ａ）に示すような検体において、例えば、第１の二本鎖ＤＮＡβ１と第２の二本鎖ＤＮＡβ２と検出対象となる二本鎖ＤＮＡβｘとの比を１：１：１０とすると、生成される二本鎖ＤＮＡα”では、第１の二本鎖ＤＮＡα１と第２の二本鎖ＤＮＡα２と第３の二本鎖ＤＮＡα３と第４の二本鎖ＤＮＡα４と第５の二本鎖ＤＮＡαｘとの比は、１：１：１：１：２０となる。
【００３７】
なお、図１（ａ）に示すような検体において、例えば、第１の二本鎖ＤＮＡβ１と第２の二本鎖ＤＮＡβ２との比を１：１とすると、生成される二本鎖ＤＮＡαでは、第１の二本鎖ＤＮＡα１と第２の二本鎖ＤＮＡα２と第３の二本鎖ＤＮＡα３と第４の二本鎖ＤＮＡα４との比は、１：１：１：１となる。
【００３８】
ここで着目すべきは、二本鎖ＤＮＡα’における第１の二本鎖ＤＮＡα１の相対的な量は、二本鎖ＤＮＡα”における第１の二本鎖ＤＮＡα１の相対的な量よりも小さいことである。換言すれば、二本鎖ＤＮＡα”における第１の二本鎖ＤＮＡα１の相対な量は、二本鎖ＤＮＡα’における第１の二本鎖ＤＮＡα１の相対な量よりも大きい。
【００３９】
そこで、再会合により生成される第１の二本鎖ＤＮＡα１の量（相対的な量）を調べれば、最初に用意した検体中の検出対象となる二本鎖ＤＮＡがβ３であるかβｘであるかが、分かる。すなわち、最初に用意した検体中の検出対象となる二本鎖ＤＮＡの塩基配列が参照となる二本鎖ＤＮＡβと相違性（相同性）を有しているか否かが、分かる。
【００４０】
そして、再会合により生成された第１の二本鎖ＤＮＡα１の量が大きければ、検出対象となる二本鎖ＤＮＡの構成要素は参照となる二本鎖ＤＮＡβの構成要素とハイブリダイズしていないので（または、その量が少ないので）、検出対象となる二本鎖ＤＮＡの塩基配列は、参照となる二本鎖ＤＮＡβの塩基配列と相違していることとなる。
【００４１】
特に、検出対象となる二本鎖ＤＮＡの塩基配列と参照となる二本鎖ＤＮＡβの塩基配列との相違性は、検出対象となる二本鎖ＤＮＡの塩基配列が参照となる二本鎖ＤＮＡβの塩基配列と相同性を有している場合に生成される第１の二本鎖ＤＮＡα１の量（図２参照）と比較すると、好適に調べられる。
【００４２】
このような第１の二本鎖ＤＮＡα１の量は、会合中および／または会合後の検体の光学的性質を調べると、好適に調べることができる。
なお、上記の比はあくまで一例であり、参照となる二本鎖ＤＮＡβの量と検出対象となる二本鎖ＤＮＡβｘ（およびβ３）の量との比は、任意に設定することができる。ただし、より好適に塩基配列の相違を調べる観点からは、検出対象となる二本鎖ＤＮＡβｘの量（モル量）を参照となる二本鎖ＤＮＡβの量よりも多くすることが好ましい。特に、検出対象となる二本鎖ＤＮＡβｘの量を、参照となる二本鎖ＤＮＡβの量（上記の例では第１の二本鎖ＤＮＡβ１の量と第２の二本鎖ＤＮＡβ２の量との合計）よりも、２〜２００倍程度に設定することが、より好ましい。
【００４３】
＜４＞検体の光学的性質の測定
前述したように、第２のマーカーＭ２は、第１のマーカーＭ１に近づくと光学的性質が変化する性質を有している。したがって、第１のマーカーＭ１と第２のマーカーＭ２とが近接すると、つまり、第１の二本鎖ＤＮＡα１が形成されると、検体から、かかる光学的変化に起因する光学的性質が検知されることとなる。当然、この光学的変化の量は、互いに近接した第１のマーカーＭ１と第２のマーカーＭ２との量、すなわち第１の二本鎖ＤＮＡα１の量に対応している。したがって、第２のマーカーＭ２が第１のマーカーＭ１に近づいたことにより検知される光学的性質を測定することにより、検出対象となる二本鎖ＤＮＡの塩基配列が、参照となる二本鎖ＤＮＡβの塩基配列と相違性を有しているかを好適に調べることができる。これにより、検出対象となる二本鎖ＤＮＡが図３に示すような二本鎖ＤＮＡβｘなのか、それとも図２に示すような二本鎖ＤＮＡβ３なのかが、分かる。
【００４４】
このような光学的性質の中でも、検知するのに好ましい光学的性質としては、光スペクトル（特にマーカー由来の光スペクトル）を挙げることができる。スペクトルを検知する測定は、容易に行える。なお、検体からのスペクトルが第１のマーカーＭ１由来のピーク波長と第２のマーカーＭ２由来のピーク波長とを有する場合、両者由来のピーク波長が、好ましくは５０nm以上、より好ましくは１００nm以上異なっていると、前述したような効果を、より効果的に得られるようになる。しかも、これにより、各マーカー由来の光学的性質を、それぞれ独立に検知することが容易となる。
【００４５】
また、このような光学的性質は、マーカー由来の蛍光スペクトルであることが好ましい。換言すれば、第１のマーカーＭ１、第２のマーカーＭ２のうちの少なくとも一方には、蛍光物質を用いることが好ましい。蛍光スペクトルは、通常、バックグラウンドレベルが低い。しかも、蛍光スペクトルは、マーカーの量が比較的少なくても、好適に検出を行うことができる。加えて、蛍光スペクトル測定は、容易である。しかも、蛍光スペクトルは、一般に、その変化を鋭敏に検知できる。
【００４６】
特に、第２のマーカーＭ２および第１のマーカーＭ１には、第２のマーカーＭ２が第１のマーカーＭ１に近づくと第１のマーカーＭ１と第２のマーカーＭ２との間で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：Fluorescence Resonance Energy Transfer）が起こり、第２のマーカーＭ２から、新たなピーク波長の蛍光が発せられるものを用いることが、より好ましい。これにより、検体からは、第１の二本鎖ＤＮＡα１の生成に対応して、蛍光共鳴エネルギー移動に起因する新たな蛍光光が生じるようになる。このため、第１の二本鎖ＤＮＡα１の生成具合およびその量を、より容易かつ高い精度で測定することができる。
【００４７】
このようにして検体の光学的性質を調べる場合、検出対象となる二本鎖ＤＮＡの塩基配列と参照となる二本鎖ＤＮＡβの塩基配列とが相違していることは、第２のマーカーＭ２由来の光の量が、検出対象となる二本鎖ＤＮＡの塩基配列が参照となる二本鎖ＤＮＡβの塩基配列と相同性を有している場合に検体から検知されるマーカーＭ２由来の光の量よりも大きいことを、指標とすることができる。換言すれば、検出対象となる二本鎖ＤＮＡを含む検体に対して再会合工程を行って測定された第２のマーカーＭ２由来の光の量が、図２（ａ）に示すような検体に対して同様の測定を行った場合の第２のマーカーＭ２由来の光の量よりも大きいことを、検出対象となる二本鎖ＤＮＡの塩基配列が、参照となる二本鎖ＤＮＡβの塩基配列と相違性を有することの指標とすることができる。
【００４８】
以上説明したような第１のマーカーＭ１および第２のマーカーＭ２は、ＤＮＡの塩基と結合していてもよいし、ＤＮＡの主鎖（リン酸基と糖とで構成された骨格）と結合していてもよい。
【００４９】
なお、第１のマーカーＭ１が結合したヌクレオチドの塩基と第２のマーカーＭ２が結合したヌクレオチドの塩基とは、一本鎖ＤＮＡａ’と一本鎖ＤＮＡｂ’とがハイブリダイズしたときに、塩基対を構成することが好ましい。これにより、第１の二本鎖ＤＮＡα１が形成されたとき、より好適に第１のマーカーＭ１と第２のマーカーＭ２とが近づくようになる。
【００５０】
このような観点からは、第１のマーカーＭ１が結合したヌクレオチドの塩基と第２のマーカーＭ２が結合したヌクレオチドの塩基とは、互いに相補的であることが好ましい。したがって、例えば第１のマーカーＭ１がアデニンを構成要素とするヌクレオチドに結合している場合には、第２のマーカーＭ２は、チミン（またはウラシル）を構成要素とするヌクレオチドに結合していることが好ましい。また、例えば第１のマーカーＭ１がグアニンを構成要素とするヌクレオチドに結合している場合には、第２のマーカーＭ２は、シトシンを構成要素とするヌクレオチドに結合していることが好ましい。
【００５１】
なお、第１のマーカーＭ１および第２のマーカーＭ２のＤＮＡに結合する部位は、特に限定されないが、ＤＮＡの末端側（３’末端側または５’末端側）であることが好ましい。特に、第１のマーカーＭ１および第２のマーカーＭ２は、ＤＮＡの末端（３’末端または５’末端）のヌクレオチドに結合していることが、より好ましい。これにより、参照となる二本鎖ＤＮＡβの準備、調製が、さらに容易となる。
なお、第１のマーカーＭ１および第２のマーカーＭ２のＤＮＡへの結合は、公知の方法により行うことができる。
【００５２】
このような第１のマーカーＭ１と第２のマーカーＭ２との量比（モル比）、すなわち一本鎖ＤＮＡａ’とｂ’との量比（モル比）は、特に限定されないが、１００：２０〜１００：５００程度とすることが好ましい。これにより、二本鎖ＤＮＡα”中の第１の二本鎖ＤＮＡα１の割合が比較的増大し、第１の二本鎖ＤＮＡα１の生成量を、より容易かつ好適に検知できるようになる。
なお、参照となる二本鎖ＤＮＡβ、および検出対象となる二本鎖ＤＮＡβｘ（またはβ３）の鎖長は、特に限定されないが、例えば、１０〜１０００００bp程度とすることができる。
【００５３】
このような参照となる二本鎖ＤＮＡβ、および検出対象となる二本鎖ＤＮＡβｘ（またはβ３）は、溶媒に溶解していてもよいし（すなわち溶液を構成していてもよいし）、ゲル、ニトロセルロースシート（核酸吸着材料）等の固体に担持されていてもよい。本発明の優れているところは、溶解したＤＮＡはもちろんのこと、固体に担持されたＤＮＡの塩基配列の相違性を調べることが可能なことである。本発明によれば、例えば、ゲル電気泳動を行った後、そのまま電気泳動を行ったゲル内で、ＤＮＡの変性、再会合を行い、さらにそのままゲル中で、塩基配列の相違を、好適に調べることができる。
【００５４】
以上述べた原理を利用した塩基配列の相違の検知は、例えば、以下に述べるような装置を用いると、好適に行うことができる。
以下、本発明の塩基配列の相違を調べる装置の実施形態について、説明する。
【００５５】
以下、ゲル中のＤＮＡから発せられた蛍光光の変化を検知することにより、ＤＮＡの塩基配列の相違を調べる場合を例に、説明を行う。
図４は、塩基配列の相違を調べる装置の実施形態を示す図である。図５（ｉ）は、図４に示す塩基配列の相違を調べる装置に用いられる設置部材を示す斜視図（一部内部透視図）であり、図５（ii）は、図５（ｉ）中のＩ−Ｉ線断面図である。
【００５６】
これらの図に示すように、塩基配列の相違を調べる装置１は、設置部材７と、位置調整手段８と、投射手段２と、集光手段３と、分光手段４と、第１検知手段５と、第２検知手段６と、制御手段９とを有している。
【００５７】
詳しくは、塩基配列の相違を調べる装置１は、ゲルを設置する設置部材７と、ゲルの位置を調整する位置調整手段８と、ゲルに光を投射する投射手段２と、ゲルからの光を集める集光手段３と、ゲルからの光を分離する分光手段４と、分光手段４で分離された光を検知する第１検知手段５と、分光手段４で分離されたもう一方の光を検知する第２検知手段６と、各手段の制御および各手段からの情報を処理する制御手段９とを有している。なお、図４では、設置部材７の記載は省略した。
【００５８】
この塩基配列の相違を調べる装置１は、ゲル１００中のＤＮＡ、マーカーから出射した蛍光光を、２波長同時に、リアルタイムで検知することができる。
以下、塩基配列の相違を調べる装置１を、構成要素ごとに説明する。
本実施形態では、ゲル１００は、設置部材（設置部）７に、設置、取り付けられる。
【００５９】
図５に示すように、設置部材７は、ゲル１００を収納するセル７１と、ゲル１００をセル７１内に固定する固定手段７２とを有している。固定手段７２は、ゲル１００に当接する当て板７２２と、当て板７２２を介してゲル１００を押圧・固定する弾性部材７２１とを有している。
【００６０】
セル７１は、有底箱状をなしており、その内部には、側壁７１２と底板７１３とで画成された内部空間７１１が構成されている。セル７１は、この内部空間７１１に、ゲル１００や固定手段７２を収納することができる。さらには、セル７１は、内部空間７１１に、液体を貯留することができる。これにより、ゲル１００中のＤＮＡに対して、変性、再会合等の処理を施すことができる。このように、本実施形態では、セル７１により、検体に対して処理を行う処理部が構成されている。
図５（ｉ）では、内部空間７１１に収納されるゲル１００、当て板７２２、および弾性部材７２１のうち、ゲル１００、および当て板７２２を、透視して示す。
【００６１】
セル７１では、側壁７１２（のうち少なくとゲル１００が設置される部分）は、例えばガラス等の透明性を有する材料で構成されている。
【００６２】
ゲル１００中の核酸のスペクトルを測定する際には、ゲル１００は、側壁７１２の内周面に密着するように、内部空間７１１内に設置される。そして、このゲル１００には、当て板７２２があてがわれ、この当て板７２２には、例えばゴム板で構成された弾性部材７２１があてがわれる。
【００６３】
図５（ii）に示すように、弾性部材７２１は、例えば横断面形状がＵ字状となるように曲げられ、一端部が当て板７２２に当接し、他端部が当て板７２２と反対側の側壁７１２に当接するように、内部空間７１２内に取り付けられる。このため、弾性部材７２１は、その復元力により当て板７２２と当て板７２２と反対側の側壁７１２とを押圧する。この押圧力により、ゲル１００は、セル７１に、確実に固定される。
【００６４】
加えて、設置部材７では、ゲル１００の押圧面積は、弾性部材７２１とゲル１００との間に介在する当て板７２２により、増大している。このため、設置部材７では、ゲル１００の設置の安定性が増大している。また、設置部材７では、当て板７２２を設けることにより、ゲル１００が、破損から好適に保護されている。
以下、セル７１において、ゲル１００が設置される側を、「正面」という。また、正面と反対側を、「背面」という。
【００６５】
位置調整手段８は、このような設置部材７を、動かすことができる。具体的には、位置調整手段８は、設置部材７を、正面と平行な方向、すなわち正面を基準として上下左右方向（図５（ｉ）の上下左右方向）に、動かすことができる。これにより、位置調整手段８は、投射手段２からの光に対するゲル１００の相対的な位置を、調整することができる。
このように、装置内でゲル１００の位置を調整できるようにすると、モニターを行いたいＤＮＡのバンドを選択することが、容易となる。
【００６６】
このような設置部材７に設置されたゲル１００中のＤＮＡに、投射手段２は、例えばレーザー光を投射することができる。この投射手段２は、例えばレーザー光を発生、出射する光源装置２１と、ゲルへ投射する光の光量（照射強度）を調整するフィルター（光学フィルター）２２とを有している。
【００６７】
本実施形態のように、ゲル１００にレーザー光を投射するようにすると、モニターを行いたいＤＮＡのバンドのみに選択的に光を照射することが、容易となる。
【００６８】
集光手段３は、ゲル１００中のＤＮＡから出射した蛍光光を集光することができる。この集光手段３は、ゲル１００からの光を集めるレンズ（核酸側集光レンズ）３１と、第１検知手段５および第２検知手段６へ入射する光の光量を調整する絞り３２とを有している。
【００６９】
分光手段４は、ゲル１００中のＤＮＡから出射した蛍光光を、波長に応じて分離することができる。この分光手段４は、ダイクロイックミラー４１を有している。このダイクロイックミラー４１は、例えば、所定波長よりも長波長の光を透過し、所定波長よりも短波長の光を反射することができる。この所定値（しきい値）は、特に限定されないが、５３０〜６７０nm程度に設定することが好ましい。
【００７０】
本実施形態のように、ＤＮＡからの光を分離する手段にダイクロイックミラー４１を用いると、簡易な構成かつ省スペースで、しかも好適に、ＤＮＡからの光を分離することができる。
【００７１】
第１検知手段５は、ダイクロイックミラー４１を透過した光を検知することができる。この第１検知手段５は、所定波長（波長域）以外の波長の光をカットする第１フィルター５１と、第１フィルター５１を通過した光を集める第１レンズ（受光側集光レンズ）５２と、入射した光の光量を検知する第１光子計数装置（フォトンカウンター）５３とを有している。
【００７２】
第１光子計数装置５３は、入射した光子数に応じた電気パルスを発生させる第１光子計数素子（フォトンカウンティングヘッド）５３１と、第１光子計数素子５３１で発生したパルスを計数（カウント）する第１パルス計数装置（パルスカウンター）５３２とを有している。これら第１光子計数素子５３１と第１パルス計数装置５３２とは、信号線により、接続されている。
【００７３】
本実施形態のように、ゲル１００からの光の光子数をカウントすることにより光量を検知するようにすると、高い精度で光量を検知することができる。しかも、かかる光量の変化を鋭敏に検知することも容易となる。
【００７４】
第２検知手段６は、ダイクロイックミラー４１で反射した光を検知することができる。この第２検知手段６は、第１検知手段５と同様の構成となっている。具体的には、第２検知手段６は、所定波長（波長域）以外の波長の光をカットする第２フィルター６１と、第２フィルター６１を通過した光を集める第２レンズ（受光側集光レンズ）６２と、入射した光の光量を検知する第２光子計数装置（フォトンカウンター）６３とを有している。
【００７５】
第２光子計数装置６３は、入射した光子数に応じた電気パルスを発生させる第２光子計数素子（フォトンカウンティングヘッド）６３１と、第２光子計数素子６３１で発生したパルスを計数（カウント）する第２パルス計数装置（パルスカウンター）６３２とを有している。これら第２光子計数素子６３１と第２パルス計数装置６３２とは、信号線により、接続されている。
【００７６】
本実施形態のように、ＤＮＡからの光を波長により分離してかかる分離した光を複数の検知手段で検知するようにすると、複数の光成分を、リアルタイムで、より的確に、検知することができるようになる。
【００７７】
以上述べた各手段は、コンピューター９１で構成された制御手段９により、制御される。コンピューター９１には、光源装置２１、絞り３２、第１パルス計数装置５３２、および第２パルス計数装置６３２が、信号線を介して接続されている。コンピューター９１は、これらの部材を、制御することができる。また、コンピューター９１は、第１パルス計数装置５３２および第２パルス計数装置６３２をそれぞれ介して、第１光子計数素子５３１および第２光子計数素子６３１を、制御することができる。
【００７８】
また、コンピューター９１は、第１パルス計数装置５３２および第２パルス計数装置６３２から、パルス数等の情報を、取得することができる。そして、コンピューター９１は、第１パルス計数装置５３２および第２パルス計数装置６３２から送信されてきた情報（１次情報）を、記憶、記録することができる。また、コンピューター９１は、かかる１次情報を演算等して処理し、２次情報に加工することができる。コンピューター９１は、この２次情報も、記憶、記録することができる。
【００７９】
このようなコンピューター９１は、ディスプレイ（表示装置）９１１を備えている。コンピューター９１は、このディスプレイ９１１に、得られた１次情報および２次情報、およびこれらの情報の経時変化等を、表示することができる。
【００８０】
このように、塩基配列の相違を調べる装置１では、コンピューター９１により、検知した情報（検体、マーカーの光学的性質）を処理して２次情報を得る処理手段が構成されている。
【００８１】
以下、塩基配列の相違を調べる装置１の作用を説明する。
【００８２】
例えばコンピューター９１が光源装置２１をオンすると、光源装置２１は、所定波長（例えば後述するλ０）のレーザー光を発生させる。このレーザー光は、光源装置２１から出射し、フィルター２２を通過する。この際に、レーザー光の強度は適度に弱められ、レーザー光は、蛍光測定に、より適したものとなる。
【００８３】
フィルター２２を通過したレーザー光は、図５（ii）に示すように、セル７１の正面に到達する。そして、このレーザー光は、側壁７１２を透過し、例えば、ゲル１００内に形成されたＤＮＡバンド（検体）に入射する。
【００８４】
ゲル１００中のＤＮＡにレーザー光が当たると、第１のマーカーＭ１および／または第２のマーカーＭ２が、かかるレーザー光を吸収して、励起する。これら励起した第１のマーカーＭ１および第２のマーカーＭ２は、その後、基底状態に戻る。この際に、第１のマーカーＭ１や第２のマーカーＭ２からは、蛍光光が発せられる。
【００８５】
ゲル中のＤＮＡから発せられた蛍光光の一部は、レンズ３１に入射し、集光されつつ、絞り３２を通過する。この絞り３２により、集光された蛍光光の光量が、調整される。
【００８６】
絞り３２を通過した蛍光光は、ダイクロイックミラー４１に入射する。そして、入射した蛍光光のうち、長波長の光はダイクロイックミラー４１を透過し、短波長の光はダイクロイックミラー４１で反射する。
【００８７】
ダイクロイックミラー４１を透過した光は、第１フィルター５１を通過する。この際、第１フィルター５１で、検知を行う波長域（例えば後述するλ２）以外の光は、除去される。第１フィルター５１を通過した光は、第１レンズ５２を通過し、集光されつつ、第１光子計数素子５３１に入射する。第１光子計数素子５３１は、入射した光の光子数に応じて、電気的パルスを発生させる。かかるパルスは、第１パルス計数装置５３２に伝達される。そして、第１パルス計数装置５３２は、かかるパルスの数をカウントし、かかるパルス数またはこれを微分した値を、情報として、コンピューター９１に送信する。
【００８８】
同様にして、ダイクロイックミラー４１で反射した光は、第２検知手段６で検知される。ダイクロイックミラー４１で反射した光は、第２フィルター６１を通過する。この際、第２フィルター６１で、検知を行う波長域（例えば後述するλ１）以外の光は、除去される。第２フィルター６１を通過した光は、第２レンズ６２を通過し、集光されつつ、第２光子計数素子６３１に入射する。第２光子計数素子６３１は、入射した光の光子数に応じて、電気的パルスを発生させる。かかるパルスは、第２パルス計数装置６３２に伝達される。そして、第２パルス計数装置６３２は、かかるパルスの数をカウントし、かかるパルス数またはこれを微分した値を、情報として、コンピューター９１に送信する。
【００８９】
このようにして第１パルス計数装置５３２および第２パルス計数装置６３２から送信されてきた情報（例えばパルス数、単位時間あたりのパルス数など）を、コンピューター９１は、１次情報として、逐次、記憶、記録する。
【００９０】
また、コンピューター９１は、かかる１次情報に基づいて、２次情報を求める。例えば、コンピューター９１は、第１パルス計数装置５３２から送られてきたパルス数（あるいは単位時間あたりのパルス数）と第１パルス計数装置５３２から送られてきたパルス数（単位時間あたりのパルス数）との比を、逐次求める。コンピューター９１は、得られた２次情報を、逐次、記憶、記録する。
【００９１】
その後、コンピューター９１は、取得した１次情報、２次情報、およびこれらの経時変化等を、ディスプレイ９１１に表示する。例えば、コンピューター９１は、第１光子計数装置５３で検知された光子数、第２光子計数装置６３で検知された光子数、両者の光子数の比、これらの値の経時変化等を、グラフ、数値等として、ディスプレイ９１１に、表示する。
【００９２】
使用者（塩基配列の相違を調べる人）は、このディスプレイ９１１の表示を見て、塩基配列の相違を調べることができる。第１光子計数装置５３で検知された光子数は、ゲル１００中のＤＮＡ（マーカー）が発した所定波長（例えば後述するλ２）の蛍光光の強度と対応（比例）している。また、第２光子計数装置６３で検知された光子数は、ゲル１００中のＤＮＡ（マーカー）が発した所定波長（例えば後述するλ１）の蛍光光の強度と対応（比例）している。同様に、第１光子計数装置５３で検知された光子数と第２光子計数装置６３で検知された光子数との比は、ＤＮＡが発した波長λ１の蛍光光の強度と波長λ２の蛍光光の強度との比に対応（比例）している。したがって、ディスプレイ９１１に表示された蛍光光の強度、および強度比を見れば、使用者は、核酸、マーカーから発せられた蛍光光の強度等が分かる。ゆえに、使用者は、塩基配列の相違を調べることができる。
【００９３】
このように、検知する波長を固定してかかる波長の光の強度変化を検知することにより、核酸からのスペクトルの変化を検知するようにすると、リアルタイムのモニターを、簡単な装置の構成で、容易に行うことができるようになる。
【００９４】
図７〜図９に示すように、検体の光学的性質（光の強度）の経時的変化を知ることができる。
【００９５】
以下、塩基配列の相違を調べる装置１の使用方法を、説明する。
以下の説明は、互いに近づくと蛍光共鳴エネルギー移動を引き起こす物質を第１のマーカーＭ１および第２のマーカーＭ２に用いた場合を例に、説明する。
【００９６】
具体的な説明に入る前に、蛍光共鳴エネルギー移動を引き起こす物質を第１のマーカーＭ１および第２のマーカーＭ２に用いた場合に観測される現象を、まず説明する。
なお、以下の説明で用いる波長λは、例えばピーク波長を指す。また、話を簡略化するため、ＤＮＡの拡散、希釈等の要因は、無視して説明する。
【００９７】
例えば、下記のような性質を有する第１のマーカーＭ１および第２のマーカーＭ２を用意する。
【００９８】
▲１▼第１のマーカーＭ１と第２のマーカーＭ２とが互いに離間しているときに、すなわち蛍光共鳴エネルギー移動が起きないときに、所定波長λ０の光を第１のマーカーＭ１および第２のマーカーＭ２に照射すると、
→第１のマーカーＭ１は、所定波長λ１（例えばλ０＜λ１）の蛍光光を発する。
→第２のマーカーＭ２は、特段蛍光光を発しない。
【００９９】
▲２▼第１のマーカーＭ１と第２のマーカーＭ２とが互いに近接したときに、すなわち蛍光共鳴エネルギー移動が起きるときに、所定波長λ０の光を第１のマーカーＭ１および第２のマーカーＭ２に照射すると、
→第１のマーカーＭ１は、特段蛍光光を発しない。これは、蛍光共鳴エネルギー移動が起きて、第１のマーカーＭ１が吸収した光エネルギーが、第２のマーカーＭ２に移動するからである。
→蛍光共鳴エネルギー移動により、第２のマーカーＭ２は、所定波長λ２（例えばλ１＜λ２）の蛍光光を発する。
【０１００】
このような現象を引き起こす物質としては、下記のようなものが挙げられる。
第１のマーカーＭ１（ドナー）：ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート：Fluorescein Isothiocyanate）、５−カルボキシフルオレセイン（5-carboxyfluorescein）、テルビウム、ＩＡＥＤＡＮＳ（5-(iodoacetamideothyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid）、ＭＩＡＮＳ（2-(4'-maleimidylamilino)naphthalene-6-sulfonic acid）、ＥＤＡＮＳ（5-[(2-aminoethyl)amino]naphthalene-1-sulfonic acid）、ＤＡＣＭ（N-(7-dimethylamino-4-methylcoumarinyl)-maleimide）、ＮＢＤ（7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl）、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）、ＢＦＰ（Blue Fluorescent Protein）、ＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）など。
第２のマーカーＭ２（アクセプター）：Ｃｙ５（商品名）、ローダミン、テトラメチルローダミン（tetramethylrhodamine）、５−カルボキシテトラメチルローダミン（5-carboxytetramethylrhodamine）、ＤＡＢＭＩ（4-dimethylaminophenylazophenyl-4'-maleimide）、ＤＡＢＣＹＬ（4-(4-dimethylaminophenylazo)benzoic acid）、ＦＩＴＣ、ＧＦＰ（Green Fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）など。
【０１０１】
このような物質を第１のマーカーＭ１および第２のマーカーＭ２として用いると、図１（ａ）、図２（ａ）、および図３（ａ）に参照されるように、参照となる二本鎖ＤＮＡβでは、第１のマーカーＭ１と第２のマーカーＭ２とは離間しているので、検体からは、もっぱら波長λ１の蛍光光が発せられることとなる。
【０１０２】
次いで、検体中の二本鎖ＤＮＡを変性させて一本鎖ＤＮＡγ、γ’、γ”を生成させた場合も、図１（ｂ）、図２（ｂ）、および図３（ｂ）に参照されるように、一本鎖ＤＮＡγ、γ’、γ”では第１のマーカーＭ１と第２のマーカーＭ２とは離間しているので、一本鎖ＤＮＡγ、γ’、γ”からは、もっぱら波長λ１の蛍光光が発せられることとなる。
【０１０３】
その後、この一本鎖ＤＮＡγ、γ’、γ”を再会合させると、図１（ｃ）、図２（ｃ）、および図３（ｃ）に参照されるように、ハイブリダイズして生成される二本鎖ＤＮＡα、α'、α"では、一部のＤＮＡ（第１の二本鎖ＤＮＡα１）で、第１のマーカーＭ１と第２のマーカーＭ２とが互いに近接する。このため、二本鎖ＤＮＡα、α'、α"（すなわち検体）からは、波長λ２の蛍光光が発せられることとなる。
【０１０４】
ここで、図３に示すように、検出対象となる二本鎖ＤＮＡがβｘの場合、すなわち、検出対象となる二本鎖ＤＮＡの塩基配列が、参照となる二本鎖ＤＮＡβの塩基配列と異なっている場合、第１の二本鎖ＤＮＡα１が比較的多量に生成されるので、波長λ２の蛍光光（第２のマーカーＭ２由来の蛍光光）の光量Ｂが比較的多く増大する。すなわち、検出対象となる二本鎖ＤＮＡの塩基配列が参照となる二本鎖ＤＮＡβの塩基配列と異なっている場合、ハイブリダイゼーション完了後の波長λ２の蛍光光の光量Ｂは、比較的高い。
【０１０５】
また、ハイブリダイズして生成される二本鎖ＤＮＡα、α'、α"の一部（第３の二本鎖ＤＮＡα３）では、第１のマーカーＭ１は、第２のマーカーＭ２と離間したままとなる。このため、二本鎖ＤＮＡα、α'、α"からは、波長λ２の蛍光光に加えて、波長λ１の蛍光光も発せられることとなる。
【０１０６】
ここで、図３に示すように、検出対象となる二本鎖ＤＮＡがβｘの場合、第１の二本鎖ＤＮＡα１が比較的多量に生成された分、第３の二本鎖ＤＮＡα３の生成量が少なくなる。このため、二本鎖ＤＮＡα”からの波長λ１の蛍光光（第１のマーカーＭ１由来の蛍光光）の光量Ａは、二本鎖ＤＮＡα’（図２参照）からの波長λ１の蛍光光の光量Ａに比べ、低くなる傾向を示す。すなわち、検出対象となる二本鎖ＤＮＡの塩基配列が参照となる二本鎖ＤＮＡβの塩基配列と異なっている場合、ハイブリダイゼーション完了後の波長λ１の蛍光光の光量Ａは、検出対象となる二本鎖ＤＮＡの塩基配列が参照となる二本鎖ＤＮＡβの塩基配列と同じ場合に比べて、若干低い。
【０１０７】
よって、検出対象となる二本鎖ＤＮＡがβｘの場合、光量Ｂ／光量Ａ（波長λ２の蛍光光の光量の波長λ１の蛍光光の光量による商）は、かなり高くなる。
なお、第２の二本鎖ＤＮＡα２、第４の二本鎖ＤＮＡα４、および第５の二本鎖ＤＮＡαｘは、特段蛍光光を発しない。
【０１０８】
このような測定を好適に行う観点からは、波長λ０と波長λ１とは、特に限定されないが、１０nm以上異なっていることが好ましい。また、前述したように、波長λ１と波長λ２とは、５０nm以上異なっていることが好ましく、１００nm以上異なっていることがより好ましい。なお、照射光の波長λ０は、特に限定されないが、３５０〜５５０nm程度とすることが好ましい。また、第１のマーカーＭ１には、特に限定されないが、波長λ１として、４００〜６００nm程度の蛍光を発するものを選択することが好ましい。さらには、第２のマーカーＭ２には、特に限定されないが、波長λ２として、５００〜７５０nm程度の蛍光を発するものを選択することが好ましい。
【０１０９】
同様の観点からは、波長λ０における第１のマーカーＭ１のモル吸光計数ｃ１は、特に限定されないが、５０００〜１００００００程度であることが好ましい。これにより、第１のマーカーＭ１は、比較的低濃度でも、好適に蛍光光を発することができるようになる。また、波長λ０における第２のマーカーＭ２のモル吸光計数ｃ２は、特に限定されないが、５〜１０００００程度であることが好ましい。これにより、第１のマーカーＭ１に、照射光（励起光）が、より好適に到達するようになる。さらには、ｃ２／ｃ１は、特に限定されないが、１／２〜１／１０００程度であることが好ましい。このように、ｃ１とｃ２とが好ましくは２倍〜１０００倍程度異なるようにすると、第１のマーカーＭ１は、より好適に励起することができるようになる。
【０１１０】
このような測定は、塩基配列の相違を調べる装置１を用いて、例えば以下のようにして、行える。
【０１１１】
・まず、参照となる二本鎖ＤＮＡβと検出対象となる二本鎖ＤＮＡとを含有する溶液を用意する。このときの二本鎖ＤＮＡβ１の濃度は、泳動を行うサンプル量によっても若干異なるが、０．１〜１００μＭ程度とすることが好ましい。同様に、二本鎖ＤＮＡβ２の濃度は、泳動を行うサンプル量によっても若干異なるが、０．１〜１００μＭ程度とすることが好ましい。また、検出対象となる二本鎖ＤＮＡの濃度は、泳動を行うサンプル量によっても若干異なるが、１〜１０００μＭ程度とすることが好ましい。
【０１１２】
・次に、この溶液に対して、例えばポリアクリルアミド、アガロース等を用いて、ゲル電気泳動を行う。これにより、参照となる二本鎖ＤＮＡβと検出対象となる二本鎖ＤＮＡとで構成されたバンド（泳動バンド）を有するゲル１００が得られる。
【０１１３】
なお、ゲルの組成、泳動条件等によっても若干異なるが、第１のマーカーＭ１の分子量と第２のマーカーＭ２の分子量との差を、好ましくは１５００以内、より好ましくは５００以内にすると、二本鎖ＤＮＡβ１のバンドと二本鎖ＤＮＡβ２のバンドとが分離してしまうことを、好適に防止できる。
【０１１４】
・電気泳動終了後、ゲル１００を設置部材７に取り付ける。この前に、ゲル１００の洗浄を行ってもよい。
【０１１５】
・次に、必要に応じて、使用者は、コンピューター９１を操作して、ゲル１００の位置を調整する。使用者は、参照となる二本鎖ＤＮＡβと検出対象となる二本鎖ＤＮＡとで構成されたバンドが投射手段２から投射されたレーザー光の光路上に位置するように、ゲル１００の位置を調整する。
使用者がコンピューター９１を操作すると、コンピューター９１は、使用者の操作に対応して、位置調整手段８を駆動する。これにより、セル７１が動く。前述したようにゲル１００はセル７１に固定されているので、ゲル１００は、セル７１と一体となって移動する。
【０１１６】
・次に、必要に応じて、コンピューター９１は、良好な測定が行えるように、光源装置２１や絞り３２を駆動して、第１光子計数素子５３１や第２光子計数素子６３１への入射光の光量を、調整する。
【０１１７】
・次に、使用者は、例えば変性液をセル７１内に注いで、ゲル１００中のＤＮＡを変性させる。
前述したように、ゲル１００は、セル７１の内部空間７１１内に設置されるので、変性液を内部空間７１内に入れると、ゲル１００は、変性液と接触する。これに対応して、ゲル１００中の二本鎖ＤＮＡも、変性液と接触する。その結果、参照となる二本鎖ＤＮＡβおよび検出対象となる二本鎖ＤＮＡは変性し、一本鎖ＤＮＡγ”（またはγ’）が生成される。
【０１１８】
このような変性液としては、例えば、アルカリ溶液、尿素等の変性剤を含有する溶液などが挙げられる。変性液にアルカリ水溶液を用いる場合、そのpHは、特に限定されないが、８〜１２程度とすることが好ましい。
【０１１９】
なお、二本鎖ＤＮＡと変性液との接触時間は、特に限定されないが、３０〜１８０分程度に設定することが好ましい。これにより、迅速かつ確実に二本鎖ＤＮＡβを変性させることができる。また、変性液の温度は、特に限定されないが、１５〜９０℃程度とすることが好ましい。これにより、二本鎖ＤＮＡβの変性を効率よく行え、かつ、ゲル１００の劣化を好適に防止できる。
【０１２０】
このとき、使用者は、ＤＮＡからの蛍光光の変化を、例えばディスプレイ９１１でモニターするとよい。ＤＮＡからの蛍光光は、ＤＮＡの状態を推測する上で、良い判断材料となる。
このように、変性液を用いてＤＮＡを変性させると、簡易にＤＮＡを変性させることができる。
【０１２１】
・次に、使用者は、例えばセル７１内の変性液を会合液に取り替えて、一本鎖ＤＮＡγ”（またはγ’）を再会合させる。
前記と同様の原理から、会合液を内部空間７１１内に入れると、ゲル１００中の一本鎖ＤＮＡγは、会合液と接触する。その結果、一本鎖ＤＮＡγはハイブリダイズし、二本鎖ＤＮＡα”（またはα’）が生成される。
【０１２２】
このような会合液としては、例えば、弱アルカリ性〜酸性のpHを有する緩衝液等が挙げられる。この場合の会合液のpHは、特に限定されないが、６〜８程度とすることが好ましい。また、緩衝液を会合液に用いる場合、緩衝液中の緩衝剤の濃度は、特に限定されないが、５mM〜１Ｍ程度とすることが好ましい。これにより、一本鎖ＤＮＡγ"（またはγ'）のハイブリダイゼーションをより好適に行うことができる。
【０１２３】
なお、会合液の温度は、特に限定されないが、５〜６０℃程度とすることが好ましい。これにより、一本鎖ＤＮＡγ"（またはγ'）のハイブリダイゼーションを円滑かつ効率よく行え、かつ、ゲル１００の劣化を、好適に防止できる。また、前工程の変性液の温度と本工程の会合液の温度との差は、特に限定されないが、６０℃以内とすることが好ましい。
このように、会合液を用いると、ゲルの浸漬液を交換するだけで、簡易かつ好適にＤＮＡの再会合を行うことができる。
【０１２４】
・会合液をセル７１内に入れた後、使用者は、波長λ１の光量Ａ、波長λ２の光量Ｂ、これらの比等の変化を、ディスプレイ９１１を見て適宜チェックすると良い。これにより、使用者は、塩基配列の相違を調べることはもちろんのこと、一本鎖ＤＮＡγのハイブリダイゼーションの進行状態をも、モニターすることができる。
【０１２５】
・その結果、波長λ１の光量、波長λ２の光量、これらの比等の変化が収まったら（ほぼ終了したら）、二本鎖ＤＮＡα”（またはα’）がほぼ完全に生成されたといえるので、使用者は、ＤＮＡの再会合工程を終了することができる。
【０１２６】
使用者は、ディスプレイ９１１を見てこのときの波長λ１の光量Ａ、波長λ２の光量Ｂ、これらの比等調べれば、より高い精度で、塩基配列の相違を調べることができる。
【０１２７】
前述したように、波長λ２の蛍光光の光量Ｂ、および光量Ｂ／光量Ａが比較的高ければ、検出対象となる二本鎖ＤＮＡの塩基配列は、参照となる二本鎖ＤＮＡβの塩基配列と相違性を有していると言える。すなわち、検出対象となる二本鎖ＤＮＡは、図３に示すような二本鎖ＤＮＡβｘであると言える。一方、波長λ２の蛍光光の光量Ｂ、および光量Ｂ／光量Ａが比較的低ければ、検出対象となる二本鎖ＤＮＡの塩基配列は、参照となる二本鎖ＤＮＡβの塩基配列と相同性を有していると言える。すなわち、検出対象となる二本鎖ＤＮＡは、図２に示すような二本鎖ＤＮＡβ３であると言える。
【０１２８】
なお、検体に照射するレーザー光は、連続光でもよいし、パルス光でもよい。すなわち、核酸には、光を、連続的に照射してもよいし、間欠的に照射してもよい。ただし、パルス光を照射すると、蛍光マーカー等の退色を防ぐことができるという利点が得られる。
【０１２９】
また、ゲル１００への光の照射強度は、特に限定されないが、０．０５〜５０mJ/sec程度とすることが好ましい。これにより、測定をより好適に行えるようになる。さらには、本実施形態のようにゲル１００へレーザー光を照射する場合、そのスポット径は、特に限定されないが、０．１〜３mm程度とすることが好ましい。これにより、測定を行いたいＤＮＡで構成されたバンドに、より選択的に光を照射することが可能となる。
【０１３０】
以下、本発明の塩基配列の相違を調べる装置の他の実施形態について説明する。
本実施形態の塩基配列の相違を調べる装置については、前述した塩基配列の相違を調べる装置１と相違する事項について重点的に説明し、共通する事項については、説明を省略する。
【０１３１】
図６は、塩基配列の相違を調べる装置１’の設置部材、およびその近傍の部材を示す側面図である。
図４および図６に示すように、塩基配列の相違を調べる装置１’は、設置部材７’と、ゲルの温度を調整する温度調整手段９５と、位置調整手段８と、投射手段２と、集光手段３と、分光手段４と、第１検知手段５と、第２検知手段６と、制御手段９とを有している。なお、図４では、設置部材７’および温度調整手段９５の記載は省略した。
【０１３２】
この塩基配列の相違を調べる装置１’は、設置部材７’に設置されたゲル１００の温度を調整しつつ、ゲル１００中のＤＮＡから出射した蛍光光を、検知することができる。換言すれば、塩基配列の相違を調べる装置１’は、ゲル１００中のＤＮＡから出射した蛍光光をモニターする機能に加えて、ゲル１００中のＤＮＡに変性、再会合を行わせる機能を備えている。
【０１３３】
このゲル１００の温度は、温度調整手段９５で、調整される。このように、本実施形態では、温度調整手段９５により、検体に対して処理を行う処理部が構成されている。本実施形態では、温度調整手段９５を、設置部材７’の背面側（レーザー光が入射する側と反対側）に設けた。図６に示すように、温度調整手段９６は、ゲル１００を加熱する加熱手段９７と、ゲル１００を冷却する冷却手段９８と、加熱手段９７および冷却手段９８とゲル１００との間で熱伝達を行う伝熱ブロック９６と、ゲル１００の温度を検知する温度感知手段９９とを有している。
【０１３４】
加熱手段９７は、発熱し、ゲル１００を加熱する面ヒーター９７１と、コンピューター９１からの信号に基づき、面ヒーター９７１を駆動、制御するドライバー９７２とを有している。
【０１３５】
冷却手段９８は、ゲル１００等からの熱を放熱して、ゲル１００を冷却する冷却器９８１と、冷却器９８１を駆動するドライバー９７２とを有している。冷却器９８１は、ゲル１００等からの熱を放熱するヒートシンク９８２と、ヒートシンク９８２での放熱を促進するファン９８３とを有している。ヒートシンク９８２は、例えば、金属（アルミニウム等）などの熱伝導性の物質で構成されている。このヒートシンク９８２は、例えば薄板が多数立設されたような構成の放熱部９８６を有している。この放熱部９８６では、表面積、すなわちヒートシンク９８２と空気との接触面積が増大しており、熱が効率よく、大気に放出されるようになっている。このような放熱を、ファン９８３は、促進することができる。ファン９８３は、風を発生させる羽根９８３と、羽根９８３を回転させるモーター９８８とを有している。ファン９８３が稼動する場合には、ヒートシンク９８２に埋設されたモーター９８８が回転し、この駆動力が羽根９８３に伝達される。その結果、羽根９８３が回転し、風が生じる。そして、この風により、放熱部９８６での放熱が、促進される。
【０１３６】
ヒートシンク９８２の放熱部９８６と反対側の面には、前述した面ヒーター８７１が、ヒートシンク９８２に密着するように設けられている。さらには、温度調整手段９６では、この面ヒーター９７１に密着するように、伝熱ブロック９６が設けられている。
【０１３７】
伝熱ブロック９６は、面ヒーター９７１で発生した熱を、ゲル１００に伝達し、また、ゲル１００の熱をヒートシンク９８２に伝達することができる。この伝熱ブロック９６は、例えば、金属（アルミニウム等）などの熱伝導性の物質で構成されている。
【０１３８】
このような伝熱ブロック９６を介して、温度感知手段９９は、ゲル１００の温度を検知することができる。温度感知手段９９は、ゲル１００の温度を検知する温度センサー９９１と、温度センサーからのアナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄコンバーター９９２とを有している。この温度感知手段９９では、温度センサー９９１は、伝熱ブロック９６に埋設されるように、設置されている。このため、温度センサー９９１は、伝熱ブロック９６の温度を直接検知することができる。これにより、伝熱ブロック９６の温度はゲル１００の温度とほぼ対応しているので、温度センサー９９１は、ゲルの温度を検知することができる。
【０１３９】
伝熱ブロック９６の面ヒーター８７１と反対側の面には、ゲル１００を支持、固定する設置部材７’が設置される。設置部材７’は、一対の支持板７３、７４を有している。これら支持板７３、７４は、例えば図示しない取り付け具（留め金等）により、伝熱ブロック９６に取り付けられる。そして、これら支持板７３、７４がゲル１００を挟持することにより、ゲル１００が、設置、固定される。
【０１４０】
このような設置部材７’では、正面側の支持板（伝熱ブロック９６と反対側の支持板）、すなわち支持板７４（のうち少なくとゲル１００が設置される部分）は、例えばガラス等の透明性を有する材料で構成されている。また、背面側の支持板（伝熱ブロック９６側の支持板）、すなわち支持板７３は、例えばガラス、金属等で構成されている。
【０１４１】
位置調整手段８は、このような設置部材７’および温度調整手段９５を、一体的に動かすことができる。具体的には、位置調整手段８は、設置部材７’および温度調整手段９５を、ゲル１００と平行な方向、すなわちゲル１００を基準として上下左右方向（図６の上下および紙面の表裏方向）に、動かすことができる。これにより、位置調整手段８は、投射手段２からの光に対するゲル１００の相対的な位置を、調整することができる。
【０１４２】
以上述べた温度調整手段９５は、コンピューター９１で構成された制御手段９により、制御される。温度調整手段９５が有するドライバー９７２、ドライバー９８４、およびＡ／Ｄコンバーター９９２は、信号線を介して、コンピューター９１に接続されている。コンピューター９１は、ドライバー９７２およびドライバー９８４を介して、面ヒーター９７１およびファン９８３を制御することができる。また、コンピューター９１は、Ａ／Ｄコンバーター９９２を介して、温度センサー９９１から、ゲル１００の温度情報を、取得することができる。そして、コンピューター９１は、かかる情報を、記憶、記録することができる。また、コンピューター９１は、ディスプレイ９１１に、ゲル１００の温度、およびその経時変化等を、表示することができる。
【０１４３】
以下、塩基配列の相違を調べる装置１’がゲル１００の温度を調整する際の作用を、説明する。
まず、使用者は、設定したいゲル１００の温度、すなわち設定温度を、コンピューター９１に入力する。また、コンピューター９１は、温度センサー９９１から、ゲル１００の温度情報を取得する。
【０１４４】
ゲル１００の温度が設定温度よりも低い場合には、コンピューター９１は、面ヒーター９７１を駆動し、発熱させる。面ヒーター９７１で発生した熱は、伝熱ブロック９６および支持板７３を介して、ゲル１００に伝達される。これにより、ゲル１００の温度が上昇する。その後、ゲル１００の温度が設定温度に近づいたら、コンピューター９１は、面ヒーター９７１の出力を弱める。そして、ゲル１００の温度が設定温度に到達したら、コンピューター９１は、面ヒーター９７をオフする。
【０１４５】
また、ゲル１００の温度が設定温度よりも高い場合には、コンピューター９１は、ファン９８３を駆動し、ヒートシンク９８２による放熱を促進させる。ゲル１００の熱は、支持板７３および面ヒーター９７１を介して、ヒートシンク９８２に伝達される。そして、この熱は、放熱部９８６から、発散される。このとき、ファン９８３が回転していると、羽根９８３から放熱部９８６に風が送られてくる。この風により、放熱部９８６では、放熱が促進される。その結果、ゲル１００からヒートシンク９８２への熱移動も促進され、ゲル１００の温度が、効率よく低下する。その後、ゲル１００の温度が設定温度に近づいたら、コンピューター９１は、ファン９８３をオフする。
【０１４６】
以下、塩基配列の相違を調べる装置１’の使用方法を、説明する。
・まず、前記と同様に、二本鎖ＤＮＡを含有する溶液に対して、ゲル電気泳動を行う。
【０１４７】
・電気泳動終了後、ゲル１００を設置部材７’に取り付ける。
このとき、必要に応じて、ゲル１００の位置を調整、装置の各部材の調整等を行ってもよい（塩基配列の相違を調べる装置１の使用方法の説明参照）。
【０１４８】
・次に、使用者は、コンピューター９１を操作して、設定温度を、二本鎖ＤＮＡが変性する温度に設定する。また、必要に応じて、使用者は、ゲル１００の加熱時間を設定する。
この操作により、塩基配列の相違を調べる装置１’は、ゲル１００の加熱を行う。これにより、ゲル１００の温度が上がる。その結果、ゲル１００中の参照となる二本鎖ＤＮＡβおよび検出対象となる二本鎖ＤＮＡとが変性し、一本鎖ＤＮＡγ"（またはγ'）が生成される。
【０１４９】
なお、設定温度（最高温度）は、特に限定されないが、６０〜９０℃程度とすることが好ましい。また、ゲル１００の温度が６０℃を超えている時間は、特に限定されないが、３０秒〜３０分程度とすることが好ましい。これにより、二本鎖ＤＮＡβの変性を効率よく行える。
このように、加熱によりＤＮＡを変性させると、迅速にＤＮＡを変性させることができ、工程に要する時間を短縮できる。
【０１５０】
・次に、塩基配列の相違を調べる装置１’は、加熱時間が終了したら、面ヒーター９７１をオフする。あるいは、使用者は、コンピューター９１を操作して、一本鎖ＤＮＡγが再会合する温度に、設定温度を変更する。
この操作により、塩基配列の相違を調べる装置１’は、ゲル１００の冷却を行う。これにより、ゲル１００の温度が下がる。その結果、一本鎖ＤＮＡγ"（またはγ'）がハイブリダイズし、二本鎖ＤＮＡα"（またはα'）が生成される。
このように、ＤＮＡを冷却する方法は、簡易にＤＮＡの再会合を行うことができ、装置の自動化に有利である。
【０１５１】
・ゲル１００の冷却を開始した後、使用者は、波長λ１の光量Ａ、波長λ２の光量Ｂ、これらの比、ゲルの温度等の変化を、ディスプレイ９１１を見て適宜チェックするとよい。これにより、使用者は、塩基配列の相違を調べることはもちろんのこと、一本鎖ＤＮＡγのハイブリダイゼーションの進行状態をも、モニターすることができる。
【０１５２】
以上述べた塩基配列の相違を調べる装置１’によれば、核酸の変性、再会合を行わせるための試薬を特段用意しなくても、核酸の変性、再会合を行うことができ、便利である。しかも、核酸の加熱、冷却は、塩基配列の相違を調べる装置１’が行ってくれるので、使用者の作業の手間が軽減される。加えて、コンピューター９１が光量の経時変化に加えて、温度の経時変化も記憶できるので、温度変化と蛍光光の光量の変化との相関を把握しやすくなる。
【０１５３】
以上、本発明の実施形態を説明したが、本発明は、これに限定されるものではない。
例えば、ＤＮＡに照射する光は、レーザー光でなくてもよい。
例えば、設置部材の背面側から、ＤＮＡに光を照射するようにしてもよい。
例えば、溶液中のＤＮＡからの光をモニターするようにしてもよい。
例えば、ＤＮＡの吸光、透過光をモニターするようにしてもよい。
【０１５４】
例えば、分光手段には、ダイクロイックプリズム、プリズム、回折格子等を用いてもよい。
例えば、検知手段には、フォトダイオード、フォトトランジスタ等を用いてもよい。
例えば、冷却手段には、ペルチェ素子等を用いてもよい。
【０１５５】
なお、以上述べた説明では、ＤＮＡを核酸の代表として説明したが、本発明では、例えば、ＲＮＡ、合成オリゴヌクレオチド等、ＤＮＡ以外の核酸の塩基配列の相違を調べることができる。
【０１５６】
なお、上記実施形態では、第１のマーカーを備える一本鎖核酸と第２のマーカーを備える一本鎖核酸とは別々の二本鎖核酸を構成していたが、例えば下記に示すように、第１のマーカーを備える一本鎖核酸と第２のマーカーを備える一本鎖核酸とが会合して構成された核酸を、参照となる二本鎖核酸として用いてもよい。
ａ’  ●━━━━━━━━━
ｂ’  ○━━━━━━━━━
※この記載は、一本鎖核酸ａ’（第２の核酸）と一本鎖核酸ｂ’（第１の核酸）とが会合して、参照となる二本鎖核酸が構成されている例を示したものである。
【０１５７】
上記実施形態では、二本鎖の核酸を用いて塩基配列の相違を調べたが、一本鎖の核酸を用いて塩基配列の相違を調べてもよい。
【０１５８】
【実施例】
まず、アマシャムファルマシアバイオテク株式会社に、６０merの一本鎖ＤＮＡａ、ａ’、ａx、ｂ、ｂ’およびｂxの合成を依頼し、これらのＤＮＡを購入した。
【０１５９】
一本鎖ＤＮＡａと一本鎖ＤＮＡｂとは、相補的な塩基配列を有している。一本鎖ＤＮＡｂ’は、一本鎖ＤＮＡｂのｄＡＴＰのアデニンのアミノ基に、第１のマーカーＭ１としてＦＩＴＣ（分子量＝３９０、波長４９４nm（λ０）におけるモル吸光係数ｃ１＝７７０００）を、結合させたものである。また、一本鎖ＤＮＡａ’は、一本鎖ＤＮＡａの５’末端のリン酸基に、第２のマーカーＭ１としてＣｙ５（アマシャムファルマシアバイオテク株式会社製、分子量＝９７５、波長４９４nm（λ０）におけるモル吸光係数ｃ２＝２５０００）を、結合させたものである。
【０１６０】
また、一本鎖ＤＮＡａxと一本鎖ＤＮＡｂxとは、相補的な塩基配列を有している。この一本鎖ＤＮＡａxの塩基配列は、十数塩基に１塩基の割合で、一本鎖ＤＮＡａの塩基配列と、相違している（変異している）。同様に、一本鎖ＤＮＡｂxの塩基配列は、十数塩基に１塩基の割合で、一本鎖ＤＮＡｂの塩基配列と、相違している（変異している）。
【０１６１】
次に、一本鎖ＤＮＡａと一本鎖ＤＮＡｂ’との間、および一本鎖ＤＮＡａ’と一本鎖ＤＮＡｂとの間でアニーリングを行い、第１の二本鎖ＤＮＡβ１および第２の二本鎖ＤＮＡβ２を、それぞれ得た。また、一本鎖ＤＮＡａxと一本鎖ＤＮＡｂxとの間でアニーリングを行い、検出対象となる二本鎖ＤＮＡβｘを得た。さらには、一本鎖ＤＮＡａと一本鎖ＤＮＡｂとの間でアニーリングを行い、検出対象となる二本鎖ＤＮＡβ３を得た。
【０１６２】
これらのＤＮＡを基に、下記の３種類のＤＮＡ水溶液を調製した。
サンプル１：第１の二本鎖ＤＮＡβ１  １０μＭ、第２の二本鎖ＤＮＡβ２  １０μＭ
サンプル２：第１の二本鎖ＤＮＡβ１  １０μＭ、第２の二本鎖ＤＮＡβ２  １０μＭ、検出対象となる二本鎖ＤＮＡβ３  ５０μＭ
サンプル３：第１の二本鎖ＤＮＡβ１  １０μＭ、第２の二本鎖ＤＮＡβ２  １０μＭ、検出対象となる二本鎖ＤＮＡβｘ  ５０μＭ、以上。
【０１６３】
次に、これらのサンプル１μＬを用いて、１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った（ゲル組成  ＝  ２９：１アクリルアミド／メチレンビスアクリルアミド２０％溶液  ３．３mL、ＴＥＭＥＤ５mL、１０％ＡＲＳ  ５０μＬ、５×ＴＢＥ  ２mL、ＤＷ  ４．６mL）。
【０１６４】
電気泳動後、各ゲルを、純水で洗浄した。
次に、これらのゲルを、図５に示すような設置部材に、それぞれ設置、固定した。また、これらの設置部材のセルに、ゲルが浸漬するように、緩衝液（トリス１０．８ｇ、ホウ酸５．５ｇ、ＥＤＴＡ０．７ｇ／１Ｌ）を入れた。
【０１６５】
次に、これらの設置部材を、図４に示すような塩基配列の相違を調べる装置に、それぞれ取り付けた。なお、本実施例で用いた塩基配列の相違を調べる装置のダイクロイックミラーには、波長６００nmを超える光を透過し、この波長以下の光を反射する性質のものを用いた。
【０１６６】
次に、これらのゲルのバンド（検体）に、波長４９４nm（λ０）のレーザー光（照射強度＝１．１１mJ/sec、スポット径＝０．７mm）をパルス照射（３０sec毎に１sec照射）した。
【０１６７】
そして、ゲル中のＤＮＡバンドから発せられた蛍光光から、５３０nm（λ１）の蛍光光の強度Ａ、および６７０nm（λ２）の蛍光光の強度Ｂを、それぞれ測定した（単位cps: count per second）。さらには、測定中、コンピューターで、Ｂ／Ａを、リアルタイムに算出した。
【０１６８】
測定開始から１０分後、セル中の液を、変性液（NaOH２．０ｇ、NaCl３．５ｇ、ポリエチレングリコール１０．０ｇ／１００mL、温度２５℃）に取り替え、さらに測定を続行した。
【０１６９】
測定開始から１時間１０分後、セル中の変性液を、会合液（NaCl１１．７ｇ、ポリエチレングリコール２０．０ｇ、０．５Ｍリン酸緩衝液（pH７．８）４０mL、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ２mL、ホルムアルデヒド１００mL／２００mL、温度２５℃）に取り替え、さらに測定を続行した。
サンプル１の測定結果を図７に、サンプル２の測定結果を図８に、サンプル３の測定結果を図９に、それぞれ示す。
【０１７０】
ＦＩＴＣは、Ｃｙ５と近接していない場合、波長４９４nm（λ０）の光を照射すると、波長約５３０nm（λ１）の蛍光光を発する性質を有している。一方、Ｃｙ５は、ＦＩＴＣと近接していない場合、波長４９４nm（λ０）の光を照射しても、特段蛍光光を発しない。また、ＦＩＴＣとＣｙ５とが近接すると、蛍光共鳴エネルギー移動が起こり、ＦＩＴＣが吸収した光エネルギーは、Ｃｙ５に移動する。その結果、Ｃｙ５は、約６７０nm（λ２）の蛍光光を発する。また、ＦＩＴＣは、波長約５３０nm（λ１）の蛍光光を発しなくなる。
【０１７１】
図７、８および９に示すように、ゲルに変性液を接触させると、５３０nm（λ１）の蛍光光強度Ａおよび６７０nm（λ２）の蛍光光強度Ｂは、減少し、その後傾きはゼロに近づいた。また、Ｂ／Ａは、変性中、ほぼ一定であった。なお、蛍光光強度Ａおよび蛍光光強度Ｂが減少したのは、ゲル内でのＤＮＡの拡散によるものである。
【０１７２】
図７、８に示すように、サンプル１、２のゲルに会合液を接触させると、蛍光光強度Ａは、上昇し、その後、ほぼ一定の値に落ち着いた。同様に、蛍光光強度Ｂも、上昇し、その後、ほぼ一定の値に落ち着いた。これらの結果に対応して、Ｂ／Ａも、上昇し、その後、ほぼ一定の値に落ち着いた。
【０１７３】
図９に示すように、サンプル３のゲルに会合液を接触させると、蛍光光強度Ａは、上昇し、その後、ほぼ一定の傾きで減少した。同様に、蛍光光強度Ｂも、上昇し、その後、ほぼ一定の傾きで減少した。また、Ｂ／Ａは、会合液を接触直後大きく上昇し、その後、ほぼ一定の傾きで増加した。Ｂ／Ａの傾きが一定となった時期は、蛍光光強度Ａおよび蛍光光強度Ｂの傾きがほぼ一定となった時期に対応している。
【０１７４】
ここで着目すべきは、蛍光光強度Ａ、蛍光光強度Ｂ、およびＢ／Ａが上昇して安定した（またはおよそ安定した）後のこれらの値である。
例えば、サンプル１の２時間３０分後の蛍光光強度Ｂと、サンプル２の２時間後の蛍光光強度Ｂと、サンプル３の２時間３０分後の蛍光光強度Ｂとを比較してみと、サンプル１の蛍光光強度Ｂは２８００００cpsであり、サンプル２の蛍光光強度Ｂは１２００００cpsであり、サンプル３の蛍光光強度Ｂは３５００００cpsである。
【０１７５】
この結果から分かるように、サンプル３の蛍光光強度Ｂは、サンプル２の蛍光光強度Ｂよりもはるかに大きい。これは、サンプル３中に存在する互いに近接するＣｙ５およびＦＩＴＣの量が、サンプル２中に存在する互いに近接するＣｙ５およびＦＩＴＣの量よりも、はるかに多いことを意味する。したがって、サンプル３では、検出対象となるＤＮＡが参照となるＤＮＡとハイブリダイズしている量が、サンプル２に比して、はるかに少ないことが分かる。これは、サンプル３中の検出対象となるＤＮＡの塩基配列が参照となるＤＮＡの塩基配列と相違していることと対応している。
【０１７６】
同様に、サンプル１の２時間３０分後のＢ／Ａと、サンプル２の２時間後のＢ／Ａと、サンプル３の２時間３０分後のＢ／Ａとを比較してみと、サンプル１のＢ／Ａは０．９であり、サンプル２のＢ／Ａは０．２５であり、サンプル３のＢ／Ａは１．１である。サンプル３のＢ／Ａは、サンプル２のＢ／Ａよりもはるかに大きい。この値は、前述した結論をさらに強く支持している。
【０１７７】
また、サンプル１の２時間３０分後の蛍光光強度Ａと、サンプル２の２時間後の蛍光光強度Ａと、サンプル３の２時間３０分後の蛍光光強度Ａとを比較してみると、サンプル１の蛍光光強度Ａは３０００００cpsであり、サンプル２の蛍光光強度Ｂは５３００００cpsであり、サンプル３の蛍光光強度Ｂは３５００００cpsである。サンプル３の蛍光光強度Ａは、サンプル２の蛍光光強度Ａよりも小さい。これは、サンプル３では、Ｃｙ５に近接していないＦＩＴＣの量が、サンプル２よりも少ないことを意味している。かかる点からも、サンプル３では、検出対象となるＤＮＡが参照となるＤＮＡとハイブリダイズしている量が、サンプル２に比して、少ないことが伺える。
【０１７８】
以上の結果から、本実施例では、検出対象となるＤＮＡの塩基配列が参照となるＤＮＡの塩基配列と十数塩基に１塩基程度しか異なっていない場合でも、両者の塩基配列が相違していることを、高い精度で検出できたと言える。
【０１７９】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、高い精度、感度で、塩基配列の相違を調べることができる。しかも、本発明によれば、塩基配列の相違を、簡単な操作で簡易に調べることができる。
【０１８０】
したがって、本発明を用いれば、体細胞の遺伝子の変異等を、より容易かつ高い信頼性で発見することができるようになる。ゆえに、本発明は、がん等の疾病の診断などに有力である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の塩基配列の相違を調べる方法、および塩基配列の相違を調べる方法の実施形態を説明するための模式的な図である。
【図２】本発明の塩基配列の相違を調べる方法、および塩基配列の相違を調べる方法の実施形態を説明するための模式的な図である。
【図３】本発明の塩基配列の相違を調べる方法、および塩基配列の相違を調べる方法の実施形態を説明するための模式的な図である。
【図４】本発明の塩基配列の相違を調べる装置の実施形態を示す図である。
【図５】図５（ｉ）は、図４に示す塩基配列の相違を調べる装置に用いられるゲルの設置部材を示す斜視図（一部内部透視図）であり、図５（ii）は、図５（ｉ）中のＩ−Ｉ線断面図である。
【図６】本発明の他の実施形態において、図４に示す塩基配列の相違を調べる装置に用いられるゲルの設置部材、およびその近傍に設置される部材を示す側面図である。
【図７】実施例において、ＤＮＡの変性、再会合を行い、その際の５３０nmの蛍光光の強度Ａ、６７０nmの蛍光光の強度Ｂ、およびＢ／Ａの経時変化を示したグラフである。
【図８】実施例において、ＤＮＡの変性、再会合を行い、その際の５３０nmの蛍光光の強度Ａ、６７０nmの蛍光光の強度Ｂ、およびＢ／Ａの経時変化を示したグラフである。
【図９】実施例において、ＤＮＡの変性、再会合を行い、その際の５３０nmの蛍光光の強度Ａ、６７０nmの蛍光光の強度Ｂ、およびＢ／Ａの経時変化を示したグラフである。
【符号の説明】
β                      参照となる二本鎖ＤＮＡ
β１                  第１の二本鎖ＤＮＡ
β２                  第２の二本鎖ＤＮＡ
ａ、ａ’、ｂ、ｂ’  一本鎖ＤＮＡ
Ｍ１              第１のマーカー
Ｍ２              第２のマーカー
β３                    検出対象となる二本鎖ＤＮＡ
βｘ                    検出対象となる二本鎖ＤＮＡ
ａx、ｂx            一本鎖ＤＮＡ
γ、γ’、γ"            一本鎖ＤＮＡ
α、α’、α"            二本鎖ＤＮＡ
α１                  第１の二本鎖ＤＮＡ
α２                  第２の二本鎖ＤＮＡ
α３                  第３の二本鎖ＤＮＡ
α４                  第４の二本鎖ＤＮＡ
αｘ                  第５の二本鎖ＤＮＡ
１、１’        塩基配列の相違を調べる装置
２            投射手段
２１        光源装置
２２        フィルター
３            集光手段
３１        レンズ
３２        絞り
４            分光手段
４１        ダイクロイックミラー
５            第１検知手段
５１        第１フィルター
５２        第１レンズ
５３        第１光子計数装置
５３１    第１光子計数素子
５３２    第１パルス計数装置
６            第２検知手段
６１        第２フィルター
６２        第２レンズ
６３        第２光子計数装置
６３１    第２光子計数素子
６３２    第２パルス計数装置
７、７’      設置部材
７１        セル（処理部）
７１１    内部空間
７１２    側壁
７１３    底板
７２        固定手段
７２１    当て板
７２２    弾性部材
７３、７４  支持板
８            位置調整手段
９            制御手段
９１        コンピューター
９１１    ディスプレイ
９５          温度調整手段（処理部）
９６        伝熱ブロック
９７        加熱手段
９７１    面ヒーター
９７２    ドライバー
９８        冷却手段
９８１    冷却器
９８２  ヒートシンク
９８３  ファン
９８６  放熱部
９８７  モーター
９８８  羽根
９８４    ドライバー
９９        温度感知手段
９９１    温度センサー
９９２    Ａ／Ｄコンバーター
１００          ゲル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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