(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続細胞系の細胞で増殖するように適応した変異ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、前記細胞系がベロ細胞系である変異ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項２】
ベロ細胞系の細胞で増殖するように適応した変異ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）であって、以下の段階：
ａ）ベロ細胞系の細胞を野生型ＭＶＡに感染させること、
ｂ）前記細胞系の感染細胞によって産生されたウイルス粒子を収集すること、
ｃ）前記Ｖｅｒｏ細胞系の新しい細胞を新たに産生されたウイルスに感染させ、前記細胞から産生されたウイルスを収集すること、
を含み、段階ｃ）がウイルス力価の産生量／投入量比が１より大きくなるまで繰り返される方法によって得ることができる、変異ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
【請求項３】
前記細胞系がベロ細胞系ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１である請求項１または２に記載のＭＶＡ。
【請求項４】
Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）（英国ソールズベリー）に受託番号９９１０１４３１として寄託されたＭＶＡ、および／またはベロ細胞において、寄託された株の増殖速度と本質的に同じ速度で増殖するように適応されているが、寄託された株と比較してそのゲノムに少なくとも１つの相違を持っている変異ＭＶＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＭＶＡ。
【請求項５】
Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）（英国ソールズベリー）に受託番号０１０２１４１１として寄託されたＭＶＡ、および／またはベロ細胞において、寄託された株の増殖速度と本質的に同じ速度で増殖するように適応されているが、寄託された株と比較してそのゲノムに少なくとも１つの相違を持っている変異ＭＶＡである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＭＶＡ。
【請求項６】
少なくとも１つの異種核酸配列を含む上記請求項１〜５のいずれか一項に記載のＭＶＡ。
【請求項７】
異種核酸配列が治療用タンパク質および／または抗原決定基をコードする、請求項６に記載のＭＶＡ。
【請求項８】
上記請求項１〜７のいずれか一項に記載のＭＶＡウイルスに感染した宿主細胞。
【請求項９】
上記請求項１〜７のいずれか一項に記載のＭＶＡおよび／または前記ＭＶＡのＤＮＡを含む組成物。
【請求項１０】
ワクチンである請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ヒトを含む動物の生体を免疫処置するための請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
オルトポックス感染に対する免疫処置用の請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ネコをネコ痘感染に対して、マウスをエクトロメリア感染に対して、および／またはラクダをラクダ痘感染に対して免疫処置するための請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
ＭＶＡが非特異的免疫系の活性化剤、抑制剤および／または安定剤である請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
上記請求項１〜７のいずれか一項に記載のＭＶＡおよび／または前記ＭＶＡのＤＮＡをアジュバントとして含む組成物。
【請求項１６】
遺伝子治療において使用するための、請求項６または７に記載の組換えＭＶＡおよび／または前記組換えＭＶＡのＤＮＡを含む組成物。
【請求項１７】
標的細胞に同種および／または異種核酸配列を導入するための、請求項６または７に記載の組換えＭＶＡおよび／または前記組換えＭＶＡのＤＮＡを含む組成物。
【請求項１８】
標的細胞に同種および／または異種核酸配列を導入する方法であって、標的細胞を請求項６または７に記載のＭＶＡおよび／または前記ＭＶＡのＤＮＡにインビトロまたはエクスビボで感染させることを含む方法。
【請求項１９】
上記請求項１〜７のいずれか一項に記載のＭＶＡ株を取得する方法であって、
ａ）ベロ細胞系の細胞を野生型ＭＶＡに感染させること、
ｂ）ウイルスを収集すること、
ｃ）前記ベロ細胞系の新しい細胞を新たに産生されたウイルスに感染させ、前記細胞から産生されたウイルスを収集すること、
を含み、段階ｃ）がウイルス力価の産生量／投入量比が１より大きくなるまで繰り返される方法。
【請求項２０】
野生型ＭＶＡがＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ９４０１２７０７として寄託されたＭＶＡである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
上記請求項１〜７のいずれか一項に記載のＭＶＡのウイルス粒子を製造する方法であって、
ａ）ＭＶＡが複製する細胞系の細胞を適切な条件で培養すること、
ｂ）前記細胞系を前記ＭＶＡに感染させること、および
ｃ）前記細胞によって産生されたウイルス粒子を収集すること、
を含む方法。
【請求項２２】
核酸分子、ペプチドおよび／またはポリペプチドを製造する方法であって、
ａ）宿主細胞を請求項６または７に記載の組換えＭＶＡに感染させること、および
ｂ）感染した宿主細胞を適切な条件で培養すること
を含む方法。
【請求項２３】
上記請求項１〜７のいずれか一項に記載のＭＶＡに反応する疾患または障害を処置または予防するための医薬組成物の製造のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＭＶＡまたは前記ＭＶＡのＤＮＡの使用。
【請求項２４】
ヒトを含む動物の生体を免疫処置するためのワクチンの製造のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＭＶＡまたは前記ＭＶＡのＤＮＡの使用。
【請求項２５】
非特異的免疫系の活性化剤、抑制剤および／または安定剤の製造のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＭＶＡまたは前記ＭＶＡのＤＮＡの使用。
【請求項２６】
アジュバントの製造のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＭＶＡまたは前記ＭＶＡのＤＮＡの使用。
【請求項２７】
非ヒト動物のための、ワクチンとしての請求項１〜７のいずれか一項に記載のＭＶＡまたは前記ＭＶＡのＤＮＡの使用。
【請求項２８】
非ヒト動物のための、アジュバントとしての請求項１〜７のいずれか一項に記載のＭＶＡまたは前記ＭＶＡのＤＮＡの使用。
【請求項２９】
非ヒト動物のための、免疫系の活性化剤、抑制剤および／または安定剤としての請求項１〜７のいずれか一項に記載のＭＶＡまたは前記ＭＶＡのＤＮＡの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ほとんどの哺乳動物（特にヒト）で著しく低下した毒力を示すが、それでもなおワクチンなどの治療薬の製造用として承認された連続細胞系の細胞で増殖する、変異ワクシニアウイルスアンカラ（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ：ＭＶＡ）の新しい株に関する。また本発明は前記適応ＭＶＡ株を製造する方法に関する。本ＭＶＡは、例えば非経口免疫処置にベクター系として、または活性型もしくは不活性型でアジュバントとして、または免疫系の非特異的成分の調節剤として使用することができる。
【０００２】
（発明の背景）
生物は細菌、ウイルス、真菌または寄生虫などの感染因子による攻撃を常に受けている。免疫系は、これらの感染因子およびそれらが産生する毒性分子を破壊し排除することによって、その生物がこれらの因子によって持続感染するのを阻止している。免疫系は特異的部分と非特異的部分とに分割することができるが、両者は密接にクロスリンクしている。非特異的免疫応答は多種多様な異物および感染因子に対する即時的防御を可能にする。これに対して、特異免疫応答は、生物がある物質による攻撃を初めて受けた場合は、誘導期間を経てから生成する。しかし特異的免疫応答の効率は極めてよい。特異的免疫応答は、特定の感染から回復した個体はその特定の感染からは保護されるが、他の感染性疾患には依然として罹りやすいという事実の原因となっている。一般に、同じ感染因子または極めて似た感染因子による２回目の感染では症状がはるかに軽いか、または症状が全く現れない。免疫は長期間持続し、一生持続する場合もある。この免疫記憶は、無害な型または不活性型の感染因子で生物を攻撃して特異的免疫を誘導するという予防接種に利用されている。特異的免疫応答を強化するためにワクチンにはアジュバントが組み込まれることもある。
【０００３】
感染性疾患と免疫に関する知見の多くは痘瘡の研究によってもたらされた。この疾患はオルトポックスウイルス属の一種である痘瘡ウイルスによって引き起される。２世紀近く前に牛痘の予防的接種が開始され、痘瘡に対する免疫処置が行われるようになった。後に免疫処置はワクシニアウイルスで行われた。１９５０年代初頭には、工業国の多くが、ワクシニアウイルスによる予防接種を使って痘瘡を局地的に根絶した。しかし、このワクシニアウイルスによる痘瘡予防接種は、時として、種痘後脳炎、全身性痘疱または接触感染などの重篤な合併症を引き起した。
【０００４】
これらの合併症を示さない新しいワクチンがＡｎｔｏｎ  Ｍａｙｒによって開発された。このポックスワクチンはポックスウイルスの一種、変異ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）からなり、痘瘡に対する非経口予防接種に約１５０，０００例で使用されたが、この予防接種に関係する合併症は何も起こらなかった。免疫不全を持つ小児でさえ重篤な副作用は示さなかった。ＭＶＡは、元のワクシニアウイルスアンカラの突然変異および選択により、ニワトリ胚線維芽細胞培養物における５７５代の継代培養後に得られた。このＭＶＡの安全性はその生物学的、化学的および物理的特徴に表われている。ＭＶＡは分子量が小さく、ゲノム中に６つの欠失を持ち、哺乳類細胞に対して著しく弱毒化されている。すなわちＤＮＡおよびタンパク質は合成されるが、ウイルス粒子は事実上産生されない。Ａｎｔｏｎ  Ｍａｙｒが開発した変異ワクシニアウイルスアンカラはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）（英国ソールズベリー）に受託番号Ｖ９４０１２７０７として寄託された。
【０００５】
痘瘡に対する予防接種は大成功を収めた。１９７９年に国際保健機関は痘瘡の根絶を宣言した。したがって小児の集団予防接種は中止され、予防接種は一部の国の軍人および研究所で働く人々だけに行われている。
【０００６】
痘瘡の根絶ににより、ヒトにおけるポックス感染の主要因はなくなった。しかし一部の非ヒトポックスウイルスは宿主特異性を低下させている。すなわち、一部の非ヒトポックスウイルスは定型宿主（例えば牛痘の場合はウシ）だけでなく、他の動物（例えばラットおよびネコ）でも感染を引き起す。ヒトも同様にこの経路で感染する可能性がある。人口の一部はもはや痘瘡に対する免疫を持たないので、そのような人々にとって動物種のオルトポックス感染は危険でありうる。家畜はヒトにとって主要な感染源である。したがってオルトポックスウイルスに対する家畜の予防接種は重要性を増しつつある。またＭＶＡは遺伝子治療用のベクターとしても、すなわち核酸配列を標的細胞に導入してそこで発現させるためにも重要だろう。
【０００７】
ＭＶＡの対数的再生産には、初代または二次ニワトリ胚線維芽細胞の細胞培養物が必要である。これらの細胞は１０〜１２日間インキュベートした鶏卵から得られる。卵には生物学的多様性があるので、細胞培養系のために得た細胞は細胞レベルでも多様である。また、ニワトリ胚「線維芽細胞培養物」には上皮細胞などの他の細胞タイプが認められる場合も多い。この細胞の多様性はニワトリ胚線維芽細胞で産生されるウイルスの多様性にもつながる。したがって、細胞培養系を規格化し、検証することにより、製造されたＭＶＡが常に高品質であることを保証することは困難である。さらに、インキュベートする卵中に既に存在している微生物またはウイルスによる細胞培養系の汚染を完全に排除することはできない。ＭＶＡをウイルス汚染細胞で増殖させると、ＭＶＡは汚染ウイルスと組換えを起こすかもしれない。そのために新しい予測不可能な特徴を持つＭＶＡが生成するかもしれない。初代または二次ニワトリ胚線維芽細胞は、懸濁培養でのウイルスの大量製造にもあまり適していない。また、ＭＶＡを密度勾配超遠心法によって精製および濃縮すれば有利であろう。しかし、ＭＶＡを初代または二次ニワトリ胚線維芽細胞で培養した場合、そのような精製は困難である。最後に、鶏卵アルブミンに対してアレルギーを起こしたことがある患者の数は増えつつある。インビトロ培養条件はアレルゲン性を著しく低下させるが、アレルギー反応の危険を完全に排除することはできない。
【０００８】
要するにＭＶＡは、初代または二次ニワトリ胚線維芽細胞でしか効率よく増殖させることができず、そのことにより多くの不都合が生じるが、その一方で、ＭＶＡをヒトに安全に応用できることは、ワクチンとしてのＭＶＡの大規模な応用によって証明されているのである。
【０００９】
（発明の目的）
本発明の目的は均質なＭＶＡウイルス粒子の製造条件を提供することである。また前記条件はＭＶＡの簡単かつ大規模な製造が可能なものでなければならない。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
上記の目的および他の目的を達成するために、本発明は、治療薬の製造用として承認された連続細胞系の細胞で増殖するように適応させたＭＶＡ株を提供する。
【００１１】
本発明によれば、ＭＶＡの効率のよい大規模製造が初めて可能になる。連続細胞系の細胞は均質であり、その特徴は安定しているので、これらの細胞系から収集されるＭＶＡも均質であり、その特徴は大いに予測可能である。さらに、微生物による汚染の危険を管理することができ、ＭＶＡをニワトリ胚線維芽細胞で培養した場合に見られるような鶏卵タンパク質によるＭＶＡ製剤の汚染も排除することができる。永久細胞系の取り扱いは便利なので、工業用途には極めて適している。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態では、ＭＶＡを、ワクチン製造用として承認された哺乳類細胞系の細胞で増殖するように適応させる。驚いたことに、ベロ細胞系などの哺乳類細胞系に適応したＭＶＡは、ヒトでも、広範囲にわたる他の哺乳動物でも、依然として低下した毒力を示す。したがって本ＭＶＡは著しく弱毒化されている。すなわち、ＤＮＡおよびタンパク質は合成されるが、ウイルス粒子は事実上産生されないので、病原性は事実上排除されている。したがって本発明のＭＶＡはヒト用および広範囲にわたる哺乳動物用のワクチンとして極めて好適である。したがって本ＭＶＡは獣医学分野にとりわけ適している。
【００１３】
さらに、本発明のＭＶＡ株を取得する方法も提供する。本発明のこの実施形態では、治療物質の製造用として承認された細胞系の細胞を野生型ＭＶＡに感染させる。この感染には高い感染多重度（ＭＯＩ）、すなわち１細胞につき多数のウイルスを使用する。次にウイルスを収集し、同じ細胞系の新しい細胞を新たに産生されたウイルスに感染させる。この工程をＭＶＡが前記細胞系に適応するまで繰り返す（連続継代培養する）。感染後７２時間で適応は達成され、ウイルス力価は投入したウイルス力価と比較して少なくとも１〜９倍、好ましくは１０〜９９倍、より好ましくは１００〜１０6倍、最も好ましくは１０7〜１０10倍上昇する。適応は限られた継代数で達成される。
【００１４】
「増殖するように適応」とは、感染によって産生されるウイルスの量（産生量）が、細胞を感染させるために最初に使用したウイルスの量（投入量）よりも増加することを意味する。この場合、産生量／投入量比は１より大きい。
【００１５】
ＥＣＡＣＣ（英国ソールズベリー）に受託番号９９１０１４３１および／または仮受託番号０１０２１４１１として寄託されたＭＶＡの「誘導株」とは、ベロ細胞において、寄託された株の増殖速度と本質的に同じ速度で増殖するように適応しているが、寄託された株と比較してそのゲノムに少なくとも１つの相違を持っているＭＶＡを意味する。
【００１６】
「免疫系」という用語は基本的に、異物および微生物に対する生物の防御に関与する複合体を表す。免疫系は、いくつかの細胞タイプ（例えばリンパ球および白血球由来の他の細胞）からなる細胞性部分と、ペプチドおよびタンパク質（例えば抗体、補体因子およびサイトカイン類）からなる体液性部分とに分割される。
【００１７】
「免疫応答」という用語は、異物または微生物が生物に侵入したときの免疫系の反応を表す。一般に免疫応答は特異的反応と非特異的反応とに分割されるが、両者は密接にクロスリンクしている。非特異的免疫応答は多種多様な異物および感染因子に対する即時的防御であると考えられる。特異免疫応答は、ある異物に対する生物の極めて効率のよい防御機構であって、前記異物に対して誘導期間後に生じ、前記異物に著しく特異的な防御機構であるとみなすことができる。特異的免疫応答は、特定の感染から回復した個体がその後はその特定の感染から保護されるという現象の原因になっている。
【００１８】
「免疫系の活性化剤」とは、免疫応答を誘発または強化することができる任意の物質を意味する。
【００１９】
「免疫系の抑制剤」とは、免疫応答を軽減または阻害することができる任意の物質を意味する。
【００２０】
「免疫系の安定剤」とは、免疫応答を一定のレベルに保つことができる任意の物質を意味する。
【００２１】
本発明者らは、ベロ細胞系と呼ばれるアフリカミドリザル細胞系（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１）に適応した２つの好ましいＭＶＡ株を提供する。ベロ細胞で１００代継代培養したＭＶＡ株を「Ｖｅｒｏ−ＭＶＡ」と名付け、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（英国ソールズベリー）に受託番号９９１０１４３１として寄託した。ベロ細胞で２００代継代培養した後のＭＶＡ株を「Ｖｅｒｏ−ＭＶＡ−２００」と名付け、ＥＣＡＣＣに仮受託番号０１０２１４１１として寄託した。
【００２２】
上述のようにして得たＭＶＡは、承認された細胞系の細胞を適切な条件で培養し、細胞を当該ＭＶＡに感染させ、その細胞によって産生されたウイルス粒子を収集することによって、さらに増幅される。したがって本ＭＶＡは効率よく、しかも容易に、大量増幅することができる。驚いたことに、本発明のＭＶＡはベロ細胞以外の細胞、例えばＨＬ、ＨＥＰ−２またはヒーラを含むヒト細胞系では、毒力の増加を示さない。
【００２３】
本発明のもう一つの実施形態では、ＭＶＡが、少なくとも１つの異種核酸配列、すなわちＭＶＡゲノム中に本来見いだされない核酸配列を含有する（組換えＭＶＡ）。この異種核酸配列は好ましくは遺伝子であり、より好ましくは免疫タンパク質をコードする遺伝子、最も好ましくはマラリア、狂犬病および／または肝炎に対する免疫を与えるタンパク質をコードする遺伝子である。前記異種核酸配列の発現は、好ましくはワクシニアウイルスプロモーターの転写制御下にあり、より好ましくはＭＶＡ自身のプロモーターの転写制御下にある。本発明のさらに好ましい実施形態では、異種核酸配列を、ＭＶＡゲノムの天然の欠失部位（ＰＣＴ／ＥＰ９６／０２９２６に開示されている）に挿入する。
【００２４】
組換えＭＶＡは、標的細胞にとって同種または異種である核酸配列を標的細胞に導入するために使用される。標的細胞への異種核酸配列の導入は、当該核酸配列によってコードされる異種の核酸、ペプチドおよび／またはポリペプチドおよび／またはタンパク質をインビトロで製造するために使用することができる。この方法には、宿主細胞を組換えＭＶＡに感染させること、感染した宿主細胞を適当な条件で培養すること、そして所望により、前記宿主細胞によって産生されたペプチドおよび／またはタンパク質を単離および／または濃縮することが含まれる。
【００２５】
さらに、同種配列または異種配列の導入はインビトロ遺伝子治療に応用することができ、また好ましくはインビボ遺伝子治療にも応用することができる。インビトロおよびエクスビボ遺伝子治療の場合は、それぞれ、処置しようとする個体から細胞を単離し、その細胞を組換えＭＶＡで形質転換し、その細胞を採取した個体に再導入する。インビボ遺伝子治療の場合は、人体を含む動物の生体に組換えＭＶＡを直接投与する。本発明の好ましい一実施形態では、組換えＭＶＡが抗原または抗原エピトープを発現させる。前記ベクターは、最も好ましくは、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ミコバクテリア、ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、肝炎またはヒト免疫不全ウイルスの抗原決定基を発現させる。
【００２６】
本発明のＭＶＡは、驚くべきことに、依然として著しく弱毒化されているので、本ＭＶＡはヒトを含む広範囲にわたる哺乳動物を免疫処置するのに理想的である。したがって本発明は、ポックス感染（好ましくはオルトポックス感染）に対してヒトを含む動物の生体を免疫処置するためのＭＶＡを含むワクチンも提供する。このワクチンはＭＶＡの他に１または複数の添加物（抗生物質、保存剤または安定剤など）を含んでもよい。本ワクチンは特に獣医学分野で、例えばオルトポックス感染に対して動物を免疫処置するために（例えばネコをネコ痘に対して、マウスをエクトロメリアに対して、またはラクダをラクダ痘に対して免疫処置するために）利用することができる。免疫処置は好ましくは非経口的に行われる。
【００２７】
ワクチン中の抗原決定基の免疫効果は、いわゆるアジュバントの添加によって強化されることが多い。アジュバントは免疫系を非特異的に同時刺激することにより、ワクチンの抗原決定基に対して、より強い特異的免疫反応を引き起す。本発明のもう一つの実施形態では、ワクチンの抗原決定基に対する免疫応答を同時刺激するために、ＭＶＡをアジュバントとして使用する。この場合は、ＭＶＡを不活化することが好ましい。ＭＶＡの不活化は、例えば熱または化学物質によって行うことができる。好ましくは、ＭＶＡをβ−プロピオラクトンによって不活化する。本発明のこの実施形態によれば、不活化したＭＶＡを、数多くの感染性疾患に対するワクチンに、その疾患に対する免疫を増大させる目的で添加することができる。
【００２８】
感染症の場合、個体の免疫系、神経系、ホルモン系および脈管系は密接に連携して働く。これらの相互作用は非特異的免疫系の要素、例えばインターフェロンおよびインターロイキンなどのサイトカインによって調節することができる。ポックスウイルスは免疫系の調節に影響を及ぼすことができる（Ｓｗｉｓｓ  Ｖｅｔ  １１／９９，１３−１７）。したがって本発明のさらなる実施形態では、非特異的（先天性）免疫系の細胞性および体液性要素を調節するために、ＭＶＡ（好ましくは不活化ＭＶＡ）を、ヒトを含む哺乳動物に使用する。好ましくは、ＭＶＡを生体調節剤として使用して、免疫系の機能不全を排除し、身体自身の防御機構を活性化、安定化および／または抑制する。最も好ましくは、ウイルス感染（例えばヘルペスウイルス、Ｂ型またはＣ型肝炎ウイルスによる感染）に備えて、または慢性炎症性疾患に備えて、そして／または腫瘍治療を補助するために、ＭＶＡを生体調節剤として使用する。またＭＶＡは、例えばストレス時または新生児に見られるように感染に対する感受性が高くなっている状況で、免疫系を安定化するためにも使用することができる。活性型ＭＶＡおよび／または好ましくは不活化ＭＶＡは、全身適用（例えば筋肉内適用）および／または局所適用（例えば経粘膜および／または経皮適用）することができる。
【００２９】
要するに、本発明は、一般に野生型ＭＶＡと同じ用途に使用できるが、ニワトリ胚線維芽細胞で野生型ＭＶＡを増幅した場合に起こる問題を生じないＭＶＡを提供する。
【００３０】
（発明の概要）
本発明は、とりわけ以下のものを、単独で、または組合わせて含む。
【００３１】
治療物質の製造用として承認された連続細胞系の細胞で増殖するように適応した変異ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）。
【００３２】
哺乳類細胞系の細胞で増殖するように適応した上記ＭＶＡ。
【００３３】
細胞系がワクチン製造用として承認された細胞系である上記ＭＶＡ。
【００３４】
前記承認された細胞系がベロ細胞系である上記ＭＶＡ。
【００３５】
前記承認された細胞系がベロ細胞系ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１である上記ＭＶＡ。
【００３６】
Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（英国ソールズベリー）に受託番号９９１０１４３１として寄託された上記ＭＶＡおよび／またはその誘導株。
【００３７】
ＥＣＡＣＣ（英国ソールズベリー）に仮受託番号０１０２１４１１として寄託された上記ＭＶＡおよび／またはその誘導株。
【００３８】
少なくとも１つの異種核酸配列を含む上記ＭＶＡ。
【００３９】
例えば治療用タンパク質および／または抗原決定基（マラリア、肝炎および／または狂犬病感染に対する免疫を与えるペプチドなど）をコードする異種核酸配列を含む上記ＭＶＡ。
【００４０】
上記ＭＶＡに感染した宿主細胞。
【００４１】
上記ＭＶＡおよび／または上記ＭＶＡのＤＮＡを含む組成物、好ましくは医薬組成物。
【００４２】
ワクチンである上記医薬組成物。
【００４３】
ヒトを含む動物の生体を免疫処置するための上記ワクチン。
【００４４】
オルトポックス感染に対する免疫処置用の上記ワクチン。
【００４５】
ネコをネコ痘感染に対して、マウスをエクトロメリア感染に対して、および／またはラクダをラクダ痘感染に対して免疫処置するための上記ワクチン。
【００４６】
ＭＶＡが非特異的免疫系の活性化剤、抑制剤および／または安定剤である上記医薬組成物。
【００４７】
上記ＭＶＡおよび／または上記ＭＶＡのＤＮＡをアジュバントとして含む医薬組成物。
【００４８】
上記組換えＭＶＡおよび／または上記組換えＭＶＡのＤＮＡを含む医薬組成物。
【００４９】
遺伝子治療用の上記医薬組成物。
【００５０】
標的細胞に同種および／または異種核酸配列を導入する方法であって、標的細胞を上記ＭＶＡに感染させることを含む方法。
【００５１】
上記ＭＶＡ株を取得する方法であって、ａ）承認された細胞系の細胞を野生型ＭＶＡ（好ましくはＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ９４０１２７０７として寄託されたＭＶＡ）に感染させること、ｂ）ウイルスを収集すること、ｃ）同じ細胞系の新しい細胞を新たに産生されたウイルスに感染させること、および所望により、ｄ）ウイルスが前記細胞系の細胞での増殖に適応するまでｂ）およびｃ）を繰り返すことを含む方法。
【００５２】
上記ＭＶＡのウイルス粒子を製造する方法であって、承認された細胞系の細胞を適切な条件で培養すること、前記細胞系を前記ＭＶＡに感染させること、および前記細胞によって産生されたウイルス粒子を収集することを含む方法。
【００５３】
ＥＣＡＣＣに受託番号９９１０１４３１として寄託されたＭＶＡおよび／またはＥＣＡＣＣに仮受託番号０１０２１４１１として寄託されたＭＶＡまたはそれらウイルス株の誘導株に前記細胞系を感染させる上記方法。
【００５４】
核酸配列、ペプチド、ポリペプチドおよび／またはタンパク質を製造する方法であって、宿主細胞を上記組換えＭＶＡに感染させること、感染した宿主細胞を適切な条件で培養すること、および所望により、前記宿主細胞によって産生された核酸配列、ペプチドおよび／またはタンパク質を単離および／または濃縮することを含む方法。
【００５５】
前記ＭＶＡに反応する疾患または障害を処置または予防するための医薬組成物の製造を目的とする上記ＭＶＡの使用。
【００５６】
ヒトを含む動物の生体を免疫処置するためのワクチンの製造を目的とする上記ＭＶＡの使用。
【００５７】
非特異的免疫系の活性化剤、抑制剤および／または安定剤の製造を目的とする上記ＭＶＡの使用。
【００５８】
アジュバントの製造を目的とする上記の使用。
【００５９】
ワクチンとしての上記ＭＶＡの使用。
【００６０】
アジュバントとしての上記ＭＶＡの使用。
【００６１】
非特異的免疫系の活性化剤、抑制剤および／または安定剤としての上記ＭＶＡの使用。
【００６２】
ヒトを含む動物の生体を免疫処置する方法であって、当該免疫処置を必要とする個体に、治療有効量の上記医薬組成物を投与することを含む方法。
【００６３】
標的細胞に同種および／または異種核酸配列を導入する方法であって、標的細胞を上記ＭＶＡおよび／または上記ＭＶＡのＤＮＡに感染させることを含む方法。
【００６４】
ヒトを含む動物の生体の免疫系を活性化、抑制および／または安定化する方法であって、ヒトを含む動物の生体に上記医薬組成物を投与することを含む方法。
【００６５】
ワクチン中の抗原決定基に対する特異的免疫応答を強化する方法であって、ヒトを含む動物の生体に上記ＭＶＡをアジュバントとして投与することを含む方法。
【００６６】
連続細胞系の細胞で増殖するように適応した変異ワクシニアウイルスアンカラであって、以下の段階：治療物質の製造用として承認された細胞系の細胞を感染させること、前記細胞系によって産生されたウイルス粒子を収集すること、および所望により、前記ＭＶＡが前記細胞内で所望の増殖特性を持つようになるまで上記の工程を繰り返すことを含む方法によって得ることができるもの。
【００６７】
（実施例）
以下の実施例により本発明をさらに詳しく説明する。本発明によって提供される技術の利用可能性を以下の実施例に限定するような解釈を決してしてはならないことは、当業者には十分理解されるだろう。
【００６８】
実施例：ベロ細胞へのＭＶＡの適応および前記ＭＶＡ株の特徴づけ
１．ベロ細胞へのＭＶＡの適応
Ａｎｔｏｎ  Ｍａｙｒによって開発された野生型ＭＶＡ、すなわち変異ワクシニアウイルスアンカラは、ＥＣＡＣＣに受託番号Ｖ９４０１２７０７として寄託されている。このウイルスをベロ細胞で連続継代培養することにより、野生型ＭＶＡをベロ細胞で増殖するように適応させた（表１）。樹立ベロ細胞系の細胞クローンＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−８１（ＷＨＯシードストックＥＣＡＣＣ番号８８０２０４０１）を継代数１４８〜１６５で使用した（ＷＨＯシードロット、マスターおよび分譲バンク）。ＥａｒｌｅのＭＥＭ（ＩＣＮ）（ｐＨ７．４〜７．６）および５％代替血清ＢＭＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）からなる培地で細胞を増殖させた。当業者に知られている技術に従って、細胞を１：２〜１：４に分割することにより、常に同じ分譲バンクの細胞を播種した。培地は１ｍｌあたり約２５０，０００個の細胞を含んだ。細胞を培養管（２ｍｌ）、Ｒｏｕｘ培養皿（１００ｍｌ）およびプラスチック製培養皿（それぞれ６および４０ｍｌ）でそれぞれ増殖させた。一般に細胞は１６〜２４時間後にコンフルエントな単層を形成した。その後、添加剤を含まない純粋なＥａｒｌｅのＭＥＭに、培地を置き換えた。
【００６９】
野生型ＭＶＡの適応には培養管培養系を使用した。継代培養の結果を表１および表２に要約する。ベロ細胞を１０ＭＯＩ（感染多重度）の野生型ＭＶＡ（すなわちベロ細胞１個につき平均して１０個のウイルス粒子）に感染させた。最初に使用した野生型ＭＶＡは、ニワトリ胚線維芽細胞で５７５代にわたって継代培養した後の遺伝子的に均質なプラーク精製ＭＶＡである（ウイルス力価：１０7.75ＫＩＤ50／ｍｌ）。２４時間後に、コンフルエントな単層のベロ細胞の９０％が毒性過程によって破壊された（毒性により５０％、溶解により４０％）。産生されたウイルスを含む培地と細胞片とを細胞の凍結融解後に収集し、この混合物のうち０．２ｍｌを培養管中のベロ細胞の単層に播種した（第２継代）。この処置を２００回繰り返した。第３継代後には、もはや毒性効果は認められなかったが、感染後（ｐ．ｉｎｆ．）４〜６日の期間に細胞の円形化および溶解を特徴とする弱い細胞変性効果（ＣＰＥ）が見られた。ウイルス力価は１０1.0ＫＩＤ50／ｍｌだった。極めて効率は低いもののベロ細胞におけるＭＶＡの増殖が始まったと結論した。第５継代後に、典型的ＣＰＥが観察され、それは感染後４〜５日で完了した。ウイルス力価は第３継代後の１０1.0ＫＩＤ50／ｍｌから第５継代後の１０4.0ＫＩＤ50／ｍｌまで増加した。したがってウイルスはベロ細胞でより効率よく増幅した。継代数５〜１１では、完全なＣＰＥが認められる時期が早くなり、ウイルス力価は継代培養毎に増加した。継代数１１で、１０7.5ＫＩＤ50／ｍｌのプラトーに達した。したがって１１代の継代培養後に、ベロ細胞へのＭＶＡの適応は達成された。さらに３０代の継代培養を行ったところ、結果はどの継代培養でも同じであり、再現性が高かった。すなわち感染後２４時間にはＣＰＥが始まり、感染後３日で全ての細胞が影響を受けた。その時点でベロ細胞の２０％は円形化し、８０％は溶解された。感染後３日でのウイルス力価は常に約１０7.75ＫＩＤ50／ｍｌだった。第１５継代後は、ウイルスを常に感染後２〜３日で収集し、１０ＭＯＩではなく１ＭＯＩだけを細胞の感染に使用した（表２）。その後のさらなる継代培養ではＭＶＡの増殖特性はわずかしか変化しなかった。注目すべきことに、至適ウイルス力価はさらに増加し、第２００継代で１０10ＫＩＤ50／ｍｌに達した。
【００７０】
要するに、ウイルスはベロ細胞で再現性よく指数的に増殖した。この増殖特性は野生型ＭＶＡの特徴とは驚くほど異なっている。したがって、連続継代培養により、ＭＶＡの新しい株が得られた。この新しい株を「Ｖｅｒｏ−ＭＶＡ」と名付け、ベロ細胞における２００代の継代培養後は「Ｖｅｒｏ−ＭＶＡ−２００」と名付けた。
【００７１】
Ｖｅｒｏ−ＭＶＡおよびＶｅｒｏ−ＭＶＡ−２００を大量に培養した。保存のためにＶｅｒｏ−ＭＶＡを遠心分離によって濃縮し、２．５％ポリゲリン（ｐｏｌｙｇｅｌｉｎｅ）に再懸濁し、２ｍｌのバイアル中で凍結乾燥した。凍結乾燥後のウイルス力価は依然として少なくとも１０8.5ＫＩＤ50／ｍｌだった。凍結乾燥したＶｅｒｏ−ＭＶＡおよびＶｅｒｏ−ＭＶＡ−２００を汚染および毒性についてチェックし、＋４℃で保存した。
【００７２】
２．Ｖｅｒｏ−ＭＶＡの生物学的性質の特徴づけ
Ｖｅｒｏ−ＭＶＡ（継代数１００）およびＶｅｒｏ−ＭＶＡ−２００（継代数２００）の生物学的特徴を野生型ＭＶＡの特徴と比較した（表３および表５）。これには当業者に知られている技術を応用した。本発明者らは、ウイルスの宿主域はベロ細胞を除いて変化していないし、ヒトまたは動物に対する毒力も増加していないことを明らかにした。Ｖｅｒｏ−ＭＶＡは依然として非許容宿主細胞での増殖不全（ａｂｏｒｔｉｖｅ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）を特徴とする。
【００７３】
ワクシニアウイルスのエルストリー（Ｅｌｓｔｒｅｅ）株のウイルス粒子と比較したＶｅｒｏ−ＭＶＡのウイルス粒子の主な特徴は、エルストリー株に対して産生させた抗体の交差反応性によって明らかになった。エルストリー株はＷＨＯが痘瘡予防接種用として推奨しているワクシニア株である。エルストリー株に対して産生させたラビットのポリクローナル高度免疫血清をＶｅｒｏ−ＭＶＡに加えた。１００ＫＩＤ50／ｍｌのＶｅｒｏ−ＭＶＡは１：５１２の血清希釈率で完全に中和された。同じ量のワクシニアエルストリー株を中和するには２倍の血清希釈率（１：２５６）が必要だった。したがってＶｅｒｏ−ＭＶＡはワクシニア免疫血清により、依然として効率よく中和することができる。
【００７４】
Ｖｅｒｏ−ＭＶＡ、Ｖｅｒｏ−ＭＶＡ−２００および野生型ＭＶＡを表３、４および５に示す多くの追加試験によって比較した。本発明者らは、ヒトを含む哺乳動物に対するＶｅｒｏ−ＭＶＡおよびＶｅｒｏ−ＭＶＡ−２００の毒力が野生型ＭＶＡと比較して増加していないことを明らかにした。また、Ｖｅｒｏ−ＭＶＡおよびＶｅｒｏ−ＭＶＡ−２００はヒトを含む哺乳動物に対して接触感染性または毒性を示さないこともわかった。驚くべきことにＶｅｒｏ−ＭＶＡの細胞特異性はベロ細胞を除けば野生型ＭＶＡの特異性とほぼ同じだった。すなわち、ヒト細胞系の細胞におけるＶｅｒｏ−ＭＶＡの増幅（表４参照：ＨＬ細胞、ＨＥＰ−２細胞およびヒーラ細胞）は野生型ＭＶＡの増幅とほぼ同じぐらい効率が悪い。したがってヒト細胞とアフリカミドリザルの細胞とは系統学的には密接な近縁関係にあるが、Ｖｅｒｏ−ＭＶＡはヒト細胞で増幅する能力を獲得しなかった。他の試験でも有意な相違は見られなかった。
【００７５】
さらに、野生型ＭＶＡおよびＶｅｒｏ−ＭＶＡ−２００の物理的、化学的および生物学的特徴を比較した（表５）。ニワトリ胚線維芽細胞培養で増殖した野生型ＭＶＡが、アンカラで最初に分離されたポックスウイルスのゲノムと比較して、左逆位末端領域に３つの欠失を持つのに対して、Ｖｅｒｏ−ＭＶＡ−２００は左末端領域中に４つの欠損を持つ。したがって、ベロ細胞における野生型ＭＶＡの継代培養により、新たにもう一つの欠失が起こった。
【００７６】
Ｖｅｒｏ−ＭＶＡを使って家畜をオルトポックス感染に対して免疫処置した。動物の血清を集めて、中和試験を行った。本発明者らは、これらの動物が抗体価の高い抗体を産生することを明らかにした。抗体価は少なくとも１１１日間にわたって安定だった。これらの抗体はプラーク減少試験においてＭＶＡのウイルス粒子をインビトロで中和しうることも明らかになった。要するに、Ｖｅｒｏ−ＭＶＡは家畜およびヒトにおけるオルトポックス感染に対するワクチンとして使用することができる。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
【表２】
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【００７９】
【表３】
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【００８０】
【表４】
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【００８１】
【表５】
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