(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イムノアッセイ固体支持体であって、該支持体に結合された、少なくとも１つのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗コア抗体、および少なくとも１つの単離されたＨＣＶ  ＮＳ３／４ａエピトープを含み、該ＮＳ３／４ａエピトープが、コンホメーションエピトープであり、そして図４Ａ〜４Ｄに示されるアミノ酸配列、または、該配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し、かつプロテアーゼ活性を有するアミノ酸配列を含む、支持体。
【請求項２】
前記支持体に結合された少なくとも２つのＨＣＶ抗コア抗体を含む、請求項１に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項３】
前記少なくとも１つの抗コア抗体が、ＨＣＶコア抗原のＮ末端領域に対して指向される、請求項１に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項４】
前記少なくとも１つの抗コア抗体が、ＨＣＶ１ポリタンパク質配列に対して番号付された、ＨＣＶのアミノ酸１０〜５３に対して指向される、請求項３に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項５】
前記少なくとも１つの抗コア抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項６】
前記支持体に結合された多エピトープ融合抗原をさらに含む、請求項１に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項７】
前記多エピトープ融合抗原が、図７Ａ〜７Ｆに示されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項８】
イムノアッセイ固体支持体であって、該支持体に結合された、２つのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗コアモノクローナル抗体、および図４Ａ〜４Ｄに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶ  ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープを含む、支持体。
【請求項９】
前記２つの抗コア抗体が、ＨＣＶコア抗原のＮ末端領域に対して指向される、請求項８に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項１０】
前記２つの抗コア抗体が、ＨＣＶ１ポリタンパク質配列に対して番号付けした、ＨＣＶのアミノ酸１０〜５３に対して指向される、請求項９に記載のイムノアッセイ固体支持体。
【請求項１１】
イムノアッセイ固体支持体であって、該支持体に結合された、２つのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗コアモノクローナル抗体、図４Ａ〜４Ｄに示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶ  ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープ、および図７Ａ〜７Ｆに示されるアミノ酸配列を含む多エピトープ融合抗原を含む、支持体。
【請求項１２】
生物学的サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）  請求項１に記載のイムノアッセイ固体支持体を提供する工程；
（ｂ）  生物学的サンプルと該固体支持体を、ＨＣＶ抗原および抗体が、該生物学的サンプル中に存在する場合に、それぞれ、前記少なくとも１つの抗コア抗体および前記ＮＳ３／４ａエピトープに結合可能な条件下で混合する工程；
（ｃ）  以下を、工程（ｂ）由来の固体支持体に、複合体を形成する条件下で加える工程：
（ｉ）  第１の検出可能な標識抗体であって、ここで、該第１の検出可能な標識抗体は、検出可能な標識ＨＣＶ抗コア抗体であり、ここで、該標識抗コア抗体は、該固体支持体に結合した少なくとも１つの抗コア抗体とは異なるＨＣＶコアエピトープに対して指向される、第１の検出可能な標識抗体；
（ｉｉ）  該ＮＳ３／４ａエピトープと反応する生物学的サンプル由来のＨＣＶ抗体と反応する抗原；および
（ｉｉｉ）  （ｉｉ）の抗原と反応する、第２の検出可能な標識抗体；
（ｄ）  もしあれば、該生物学的サンプルにおけるＨＣＶ感染を示すような、該抗体と該抗原との間に形成される複合体を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの抗コア抗体は、前記ＨＣＶコア抗原のＮ末端領域に対して指向され、そして前記検出可能な標識ＨＣＶ抗コア抗体は、該ＨＣＶコア抗原のＣ末端領域に対して指向される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの抗コア抗体は、ＨＣＶ１ポリタンパク質配列に対して番号付けした、ＨＣＶのアミノ酸１０〜５３に対して指向され、そして前記検出可能な標識ＨＣＶ抗コア抗体は、ＨＣＶ１ポリタンパク質配列に対して番号付けした、ＨＣＶのアミノ酸１２０〜１３０に対して指向される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物学的サンプル由来のＨＣＶ抗体と反応する前記抗原が、前記ＨＣＶポリタンパク質のｃ３３ｃ領域由来のエピトープを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｃ３３ｃエピトープが、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）アミノ酸配列と融合され、そして前記第２の検出可能な標識抗体が、該ｈＳＯＤアミノ酸配列と反応する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
生物学的サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）  請求項２に記載のイムノアッセイ固体支持体を提供する工程；
（ｂ）  生物学的サンプルと該固体支持体を、ＨＣＶ抗原および抗体が、該生物学的サンプル中に存在する場合に、それぞれ、前記少なくとも２つの抗コア抗体および前記ＮＳ３／４ａエピトープに結合可能な条件下で混合する工程；
（ｃ）  以下を、工程（ｂ）由来の固体支持体に、複合体を形成する条件下で加える工程：
（ｉ）  第１の検出可能な標識抗体であって、ここで、該第１の検出可能な標識抗体は、検出可能な標識ＨＣＶ抗コア抗体であり、ここで、該標識抗コア抗体は、該固体支持体に結合した少なくとも２つの抗コア抗体とは異なるＨＣＶコアエピトープに対して指向される、第１の検出可能な標識抗体；
（ｉｉ）  ｈＳＯＤアミノ酸配列に融合されたＨＣＶポリタンパク質のｃ３３ｃ領域由来のエピトープ；および
（ｉｉｉ）  該ｈＳＯＤアミノ酸配列と反応する、第２の検出可能な標識抗体；
（ｄ）  もしあれば、該生物学的サンプルにおけるＨＣＶ感染を示すような、該抗体と該抗原との間に形成される複合体を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１８】
生物学的サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）  請求項８に記載のイムノアッセイ固体支持体を提供する工程；
（ｂ）  生物学的サンプルと該固体支持体を、ＨＣＶ抗原および抗体が、該生物学的サンプル中に存在する場合に、それぞれ、前記少なくとも２つの抗コア抗体および前記ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープに結合可能な条件下で混合する工程；
（ｃ）  以下を、工程（ｂ）由来の固体支持体に、複合体を形成する条件下で加える工程：
（ｉ）  第１の検出可能な標識抗体であって、ここで、該第１の検出可能な標識抗体は、検出可能な標識ＨＣＶ抗コア抗体であり、ここで、該標識抗コア抗体は、該固体支持体に結合した少なくとも２つの抗コア抗体とは異なるＨＣＶコアエピトープに対して指向される、第１の検出可能な標識抗体；
（ｉｉ）  ｈＳＯＤアミノ酸配列に融合されたＨＣＶポリタンパク質のｃ３３ｃ領域由来のエピトープ；および
（ｉｉｉ）  該ｈＳＯＤアミノ酸配列と反応する、第２の検出可能な標識抗体；
（ｄ）  もしあれば、該生物学的サンプルにおけるＨＣＶ感染を示すような、該抗体と該抗原との間に形成される複合体を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記少なくとも２つの抗コア抗体は、前記ＨＣＶコア抗原のＮ末端領域に対して指向され、そして前記検出可能な標識ＨＣＶ抗コア抗体は、該ＨＣＶコア抗原のＣ末端領域に対して指向される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも２つの抗コア抗体は、ＨＣＶ１ポリタンパク質配列に対して番号付けした、ＨＣＶのアミノ酸１０〜５３に対して指向され、そして前記検出可能な標識ＨＣＶ抗コア抗体は、該ＨＣＶ１ポリタンパク質配列に対して番号付けした、ＨＣＶのアミノ酸１２０〜１３０に対して指向される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
生物学的サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）  請求項６に記載のイムノアッセイ固体支持体を提供する工程；
（ｂ）  生物学的サンプルと該固体支持体を、ＨＣＶ抗原および抗体が、該生物学的サンプル中に存在する場合に、前記少なくとも１つの抗コア抗体、前記ＮＳ３／４ａエピトープ、および前記多エピトープ融合抗原に結合可能な条件下で混合する工程；
（ｃ）  以下を、工程（ｂ）由来の固体支持体に、複合体を形成する条件下で加える工程：
（ｉ）  第１の検出可能な標識抗体であって、ここで、該第１の検出可能な標識抗体は、検出可能な標識ＨＣＶ抗コア抗体であり、ここで、該標識抗コア抗体は、該固体支持体に結合した少なくとも１つの抗コア抗体とは異なるＨＣＶコアエピトープに対して指向される、第１の検出可能な標識抗体；
（ｉｉ）  第１の抗原および第２の抗原であって、該抗原は、それぞれ、該ＮＳ３／４ａエピトープおよび該多エピトープ融合抗原に反応する生物学的サンプル由来のＨＣＶ抗体と反応する、第１の抗原および第２の抗原；および
（ｉｉｉ）  （ｉｉ）の抗原と反応する、第２の検出可能な標識抗体；
（ｄ）  もしあれば、該生物学的サンプルにおけるＨＣＶ感染を示すような、該抗体と該抗原との間に形成される複合体を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの抗コア抗体は、前記ＨＣＶコア抗原のＮ末端領域に対して指向され、そして該第１の検出可能な標識ＨＣＶ抗コア抗体は、該ＨＣＶコア抗原のＣ末端領域に対して指向される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの抗コア抗体は、ＨＣＶ１ポリタンパク質配列に対して番号付けした、ＨＣＶのアミノ酸１０〜５３に対して指向され、そして前記検出可能な標識ＨＣＶ抗コア抗体は、ＨＣＶ１ポリタンパク質配列に対して番号付けした、ＨＣＶのアミノ酸１２０〜１３０に対して指向される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記生物学的サンプル由来のＨＣＶ抗体と反応する前記第１の抗原が、前記ＨＣＶポリタンパク質のｃ３３ｃ領域由来のエピトープを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｃ３３ｃエピトープが、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）アミノ酸配列と融合され、そして前記第２の検出可能な標識抗体が、該ｈＳＯＤアミノ酸配列と反応する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記生物学的サンプル由来のＨＣＶ抗体と反応する前記第２の抗原が、前記ＨＣＶポリタンパク質のｃ２２領域由来のエピトープを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｃ２２領域由来のエピトープは、前記ＨＣＶ１ポリタンパク質配列に対して番号付けした、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸Ｌｙｓ１０〜Ｓｅｒ９９を含み、該アミノ酸Ｌｙｓ１０〜Ｓｅｒ９９は、Ａｒｇ４７の欠失および４４位でのＴｒｐのＬｅｕへの置換を有し、ここで、該エピトープは、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）アミノ酸配列と融合され、そして前記第２の検出可能な標識抗体は、該ｈＳＯＤアミノ酸配列と反応する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記多エピトープ融合抗原が、図７Ａ〜７Ｆに示されるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
生物学的サンプルにおけるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を検出する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）  請求項１１に記載のイムノアッセイ固体支持体を提供する工程；
（ｂ）  生物学的サンプルと該固体支持体を、ＨＣＶ抗原および抗体が、該生物学的サンプル中に存在する場合に、それぞれ、前記少なくとも２つの抗コア抗体、前記ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープ、および前記多エピトープ融合抗原に結合可能な条件下で混合する工程；
（ｃ）  以下を、工程（ｂ）由来の固体支持体に、複合体を形成する条件下で加える工程：
（ｉ）  第１の検出可能な標識抗体であって、ここで、該第１の検出可能な標識抗体は、検出可能な標識ＨＣＶ抗コア抗体であり、ここで、該標識抗コア抗体は、該固体支持体に結合した少なくとも２つの抗コア抗体とは異なるＨＣＶコアエピトープに対して指向される、第１の検出可能な標識抗体；
（ｉｉ）  ｈＳＯＤアミノ酸配列に融合されたＨＣＶポリタンパク質のｃ３３ｃ領域由来のエピトープ、およびｈＳＯＤアミノ酸配列に融合されたＨＣＶポリタンパク質のｃ２２領域由来のエピトープ；および
（ｉｉｉ）  該ｈＳＯＤアミノ酸配列と反応する、第２の検出可能な標識抗体；
（ｄ）  もしあれば、該生物学的サンプルにおけるＨＣＶ感染を示すような、該抗体と該抗原との間に形成される複合体を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
前記少なくとも２つの抗コア抗体は、前記ＨＣＶコア抗原のＮ末端領域に対して指向され、そして前記検出可能な標識ＨＣＶ抗コア抗体は、該ＨＣＶコア抗原のＣ末端領域に対して指向される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも２つの抗コア抗体は、ＨＣＶ１ポリタンパク質配列に対して番号付けした、ＨＣＶのアミノ酸１０〜５３に対して指向され、そして前記検出可能な標識ＨＣＶ抗コア抗体は、ＨＣＶ１ポリタンパク質配列に対して番号付けした、ＨＣＶのアミノ酸１２０〜１３０に対して指向される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｃ２２領域由来のエピトープは、前記ＨＣＶ１ポリタンパク質配列に対して番号付けした、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸Ｌｙｓ１０〜Ｓｅｒ９９を含み、該アミノ酸Ｌｙｓ１０〜Ｓｅｒ９９は、Ａｒｇ４７の欠失および４４位でのＴｒｐのＬｅｕへの置換を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
免疫診断的検査キットであって、請求項１〜１１のいずれかに１項に記載のイムノアッセイ固体支持体、および免疫診断的検査を行うための指示書を含む、キット。
【請求項３４】
イムノアッセイ固体支持体を作製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）  固体支持体を提供する工程；および
（ｂ）  少なくとも１つのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗コア抗体、および少なくとも１つの単離されたＨＣＶ  ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープを、該支持体に対して結合させる工程、
を包含し、該ＮＳ３／４ａエピトープが、コンホメーションエピトープであり、そして図４Ａ〜４Ｄに示されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項３５】
イムノアッセイ固体支持体を作製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）  固体支持体を提供する工程；および
（ｂ）  ２つのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗コア抗体、および単離されたＨＣＶ  ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープを、該支持体に対して結合させる工程、
を包含し、該ＮＳ３／４ａエピトープが、コンホメーションエピトープであり、そして図４Ａ〜４Ｄに示されるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項３６】
多エピトープ融合抗原の少なくとも１つを、前記支持体に結合させる工程をさらに包含する、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１に記載のイムノアッセイ固体支持体であって、該支持体に結合された、少なくとも１つのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）抗コア抗体、および少なくとも１つの単離されたＨＣＶ  ＮＳ３／４ａエピトープを含み、該ＮＳ３／４ａエピトープが、コンホメーションエピトープであり、そして図４Ａ〜４Ｄに示されるアミノ酸配列を含む、イムノアッセイ固体支持体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般的にウイルスの診断に関連する。特に、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス感染を正確に診断するための抗原／抗体の組み合わせアッセイに関連する。
【０００２】
（発明の背景）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、主に輸血および性的接触を介して感染する、非経口の非Ａ型肝炎、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）の主な原因である。このウイルスは、献血者の０．４〜２．０％に存在する。慢性肝炎は、感染者の約５０％で発症し、そしてこれらの感染した個体のうちおよそ２０％が、肝硬変を発症し、これはしばしば肝細胞癌を引き起こす。従って、この疾患の研究および制御は、医学的に重要である。
【０００３】
ＨＣＶは、ＨｏｕｇｈｔｅｎらによってＮＡＮＢＨの原因として、最初に同定され、そして特徴付けされた。このＨＣＶのウイルスゲノム配列を得るための方法が公知であるのと同様に、この配列も公知である。例えば、国際公開番号ＷＯ８９／０４６６９；同ＷＯ９０／１１０８９；および同ＷＯ９０／１４４３６を参照のこと。ＨＣＶは、９．５ｋｂのポジティブセンス、単鎖ＲＮＡゲノムを有し、Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅファミリーウイルスのメンバーである。系統発生分析に基づいて、少なくとも６つの異なる関連ＨＣＶの遺伝子が、同定されている（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）７４：２３９１〜２３９９）。これらのウイルスは、３０００を超えるアミノ酸残基を有する単一のポリタンパク質をコードする（Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９〜３６９；Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１〜２４５５；Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：１７１１〜１７１５）。ポリタンパク質は、翻訳と同時に、そして翻訳後に、構造タンパク質および非構造（ＮＳ）タンパク質の両方にプロセシングされる。
【０００４】
特に、図１に示されるように、いくつかのタンパク質は、ＨＣＶゲノムによってコードされる。ＨＣＶポリタンパク質の切断生成物の順番および学名は以下である：ＮＨ２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨ。ポリタンパク質の最初の切断は、３つの構造タンパク質（Ｎ末端ヌクレオカプシドタンパク質（「コア」と呼ばれる）ならびに２つのエンベロープ糖タンパク質（「Ｅ１」（Ｅとしても公知）および「Ｅ２」（Ｅ２／ＮＳ１としても公知）））ならびにウイルス酵素を含む非構造（ＮＳ）タンパク質を遊離する、宿主プロテアーゼによって触媒される。ＮＳ領域は、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、およびＮＳ５と呼ばれる。ＮＳ２は、タンパク質分解活性を有する内在性膜タンパク質である。ＮＳ２は、単独でか、またはＮＳ３と組み合わせてのいずれかで、ＮＳ２−ＮＳ３シスル（ｓｉｓｓｌｅ）結合を切断し、これは次にＮＳ３のＮ末端を生じ、セリンプロテアーゼおよびＲＮＡヘリカーゼの両方の活性を含む大きなポリタンパク質を放出する。ＮＳ３プロテアーゼは、残りのポリタンパク質をプロセシングするために役立つ。ポリタンパク質成熟の終了は、ＮＳ３−ＮＳ４ａの連結部での自己触媒的切断（ＮＳ３セリンプロテアーゼによって触媒される）によって開始される。引続くＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３媒介切断は、別のポリペプチドのＮＳ３分子によるポリタンパク質切断連結部の認識に関連するようである。これらの反応において、ＮＳ３は、ＮＳ３補因子（ＮＳ４ａ）、２つのタンパク質（ＮＳ４ｂおよびＮＳ５ａ）、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＳ５ｂ）を遊離する。
【０００５】
ＨＣＶについての免疫学的試薬および診断的試薬として有用なＨＣＶポリタンパク質由来の多数の一般的なポリペプチドならびに特定のポリペプチドが記載されている。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、欧州公開番号３１８，２１６および同３８８，２３２；Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９〜３６２；Ｋｕｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３６２〜３６４；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１〜３８８；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１〜１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３〜３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．、国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８を参照のこと。これらの刊行物は、一般的に、ＨＣＶならびにＨＣＶポリペプチドの免疫学的試薬の製造および使用についての広範な背景を提供する。
【０００６】
ＨＣＶ保有者およびＨＣＶに汚染された血液または血液製剤をスクリーニングおよび同定するための高感度で特異的な方法は、医薬品における重要な進歩を提供する。輸血後肝炎（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ）（ＰＴＨ）は、輸血された患者のおよそ１０％で発症し、そしてＨＣＶは、これらの症例の最大９０％の原因であった。患者の看護についての、ならびに血液および血液製剤によるか、または緊密な個人的接触によるＨＣＶの予防および感染についての、確実な診断手段および予後診断手段が必要とされる。従って、いくつかのアッセイがＨＣＶ感染の血清診断のために開発されてきた。例えば、Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９〜３６２；Ｋｕｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３６２〜３６４；Ｃｈｏｏら、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．（１９９０）４６：４２３〜４４１；Ｅｂｅｌｉｎｇら、Ｌａｎｃｅｔ（１９９０）３３５：９８２〜９８３；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｅｌら、Ｌａｎｃｅｔ（１９９０）３３５：５５８〜５６０；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｅｌら、Ｌａｎｃｅｔ（１９９１）３３７：３１７〜３１９；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．、国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８；Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、国際公開番号ＷＯ９７／４４４６９；ならびにＫａｓｈｉｗａｋｕｍａら、米国特許第５，８７１，９０４号を参照のこと。
【０００７】
血清に基づくいくつかのアッセイで遭遇する重大な問題は、ウイルスの感染と検出との間に有意な間隔（しばしば、８０日間を超える）が存在することである。このアッセイの間隔は、輸血レシピエントに対して重大な危険性を生じ得る。この問題を克服するために、直接ウィルスＲＮＡを検出する核酸に基づく試験（ＮＡＴ）、および抗体応答の代わりにウイルス抗原をアッセイするＨＣＶコア抗原試験が開発された。例えば、Ｋａｓｈｉｗａｋｕｍａら、米国特許第５，８７１，９０４号；Ｂｅｌｄら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ（２０００）４０：５７５〜５７９を参照のこと。
【０００８】
しかし、適切な患者の看護を提供し、そして血液および血液製剤によるか、または密接な個人的接触によるＨＣＶの感染を防ぐための高感度で正確な診断手段および予後診断手段の必要性が残っている。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ＨＣＶセロコンバーション抗体が、代表的に抗コアおよび抗ＮＳ−３（ヘリカーゼ）であるという知見に一部基づいている。従って、本発明は、単一の固体マトリックスを使用してサンプル中に存在するＨＣＶ抗原およびＨＣＶ抗体の両方を検出し得るＨＣＶコア抗原とＮＳ３抗体との組み合わせアッセイを提供する。
【００１０】
従って、１つの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＨＣＶ抗コア抗体およびそれに結合する少なくとも１つの単離されたＨＣＶ  ＮＳ３／４ａエピトープを含むイムノアッセイ固体支持体に関する。この抗体およびＮＳ３／４ａエピトープは、本明細書中に記載される分子のいずれかであり得る。さらに、固体支持体は、図７Ａ〜７Ｆに示されるアミノ酸配列を含む多エピトープ融合抗原のような、本明細書中に記載される多エピトープ融合抗原のいずれかを含み得る。
【００１１】
特定の実施形態において、固体支持体は、それに結合する少なくとも２ゆのＨＣＶ抗コア抗体を含む。さらに、抗コア抗体は、モノクローナル抗体であり得る。さらに、ＮＳ３／４ａエピトープは、コンホメーションエピトープ（例えば、図４Ａ〜４Ｄに示されるアミノ酸配列を含むコンホメーションＮＳ３／４ａエピトープ）であり得る。
【００１２】
別の実施形態において、本発明は、少なくとも２つのＨＣＶ抗コアモノクローナル抗体およびそれに結合する少なくとも１つのＨＣＶ  ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープ（図４〜４Ｄに示されるアミノ酸配列を含む）を含むイムノアッセイ固体支持体に関する。
【００１３】
なおさらなる実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中のＨＣＶ感染を検出する方法に関する。本方法は、以下の工程を包含する：（ａ）上記のようなイムノアッセイ固体支持体を提供する工程；（ｂ）ＨＣＶ抗原およびＨＣＶ抗体（生物学的サンプル中に存在する場合）が、それぞれ少なくとも１つの抗コア抗体およびＮＳ３／４ａエピトープと結合することを可能にする条件下で、生物学的サンプルと固体支持体とを組み合わせる工程；（ｃ）工程（ｂ）からの固体支持体に、複合体が形成する条件下で（ｉ）検出可能に標識した第一の抗体（ここでこの検出可能に標識した第一の抗体は、検出可能に標識されたＨＣＶ抗コア抗体であり、ここでこの標識された抗コア抗体は、固体支持体に結合する少なくとも１つの抗コア抗体とは異なるＨＣＶコアエピトープに対して指向される）；（ｉｉ）ＮＳ３／４ａエピトープと反応性の生物学的サンプル由来のＨＣＶ抗体と反応する抗原；および（ｉｉｉ）検出可能に標識した第二の抗体（ここで、この検出可能に標識された第二の抗体は、（ｉｉ）の抗原と反応性である）を添加する工程；ならびに（ｄ）抗体と抗原（存在する場合）との間に形成された複合体を、生物学的サンプル中のＨＣＶ感染の指標として検出する工程。ＮＳ３／４ａエピトープは、コンホメーションエピトープ（例えば、図４Ａ〜４Ｄに示されるＮＳ３／４ａ配列を有するコンホメーションエピトープ）であり得る。
【００１４】
なお別の実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中のＨＣＶ感染を検出する方法に関する。この方法は以下の工程を包含する：（ａ）上記のようなイムノアッセイ固体支持体（それに結合する少なくとも２つのＨＣＶ抗コア抗体を有する）を提供する工程；（ｂ）ＨＣＶ抗原およびＨＣＶ抗体（生物学的サンプル中に存在する場合）が、それぞれ少なくとも２つの抗コア抗体およびＮＳ３／４ａエピトープと結合することを可能にする条件下で、生物学的サンプルと固体支持体とを組み合わせる工程；（ｃ）工程（ｂ）からの固体支持体に、複合体が形成する条件下で（ｉ）検出可能に標識した第一の抗体（ここでこの検出可能に標識した第一の抗体は、検出可能に標識されたＨＣＶ抗コア抗体であり、ここでこの標識された抗コア抗体は、固体支持体に結合する抗コア抗体とは異なるＨＣＶコアエピトープに対して指向される）；（ｉｉ）ｈＳＯＤアミノ酸配列に融合されたＨＣＶポリタンパク質のｃ３３ｃ領域由来のエピトープ；および（ｉｉｉ）検出可能に標識した第二の抗体（ここで、この検出可能に標識された第二の抗体は、ｈＳＯＤアミノ酸配列と反応性であある）を添加する工程；ならびに（ｄ）抗体と抗原（存在する場合）との間に形成された複合体を、生物学的サンプル中のＨＣＶ感染の指標として検出する工程。ＮＳ３／４ａエピトープは、コンホメーションエピトープ（例えば、図４Ａ〜４Ｄに示されるＮＳ３／４ａ配列を有するコンホメーションエピトープ）であり得る。
【００１５】
上記実施形態のいずれかにおいて、抗コア抗体は、ＨＣＶコア抗原のＮ末端領域に対して（例えば、ＨＣＶ１ポリタンパク質配列に対して番号付けされた、ＨＣＶのアミノ酸１０−５３に対して）指向され得、そして／または検出可能に標識されたＨＣＶ抗コア抗体は、ＨＣＶコア抗原のＣ末端領域（例えば、ＨＣＶ１ポリタンパク質配列に対して番号付けされたＨＣＶのアミノ酸１２０−１３０）に対して指向され得る。さらに、生物学的サンプルからのＨＣＶ抗体と反応する抗原は、ＮＳ３領域（例えば、ＨＣＶポリタンパク質のｃ３３ｃ領域由来のエピトープ）由来であり得、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）アミノ酸配列と融合され得る。この実施形態において、検出可能に標識された第二の抗体は、ｈＳＯＤアミノ酸配列と反応性である。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中のＨＣＶ感染を検出する方法に関する。この方法は以下の工程を包含する：（ａ）２つのＨＣＶ抗コアモノクローナル抗体および図４Ａ〜４Ｄに示されるアミノ酸配列を含むコンホメーションエピトープを含むイムノアッセイ固体支持体を提供する工程；（ｂ）ＨＣＶ抗原およびＨＣＶ抗体（生物学的サンプル中に存在する場合）が、それぞれ少なくとも２つの抗コア抗体およびＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープと結合することを可能にする条件下で、生物学的サンプルと固体支持体とを組み合わせる工程；（ｃ）工程（ｂ）からの固体支持体に、複合体が形成する条件下で（ｉ）検出可能に標識した第一の抗体（ここでこの検出可能に標識した第一の抗体は、検出可能に標識されたＨＣＶ抗コア抗体であり、ここでこの標識された抗コア抗体は、固体支持体に結合する少なくとも２つの抗コア抗体とは異なるＨＣＶコアエピトープに対して指向される）；（ｉｉ）ｈＳＯＤアミノ酸配列に融合されたＨＣＶポリタンパク質のｃ３３ｃ領域由来のエピトープ；および（ｉｉｉ）検出可能に標識した第二の抗体（ここで、この検出可能に標識された第二の抗体は、ｈＳＯＤアミノ酸配列と反応性である）を添加する工程；ならびに（ｄ）抗体と抗原（存在する場合）との間に形成された複合体を、生物学的サンプル中のＨＣＶ感染の指標として検出する工程。
【００１７】
特定の実施形態おいて、少なくとも２つの抗コア抗体は、ＨＣＶコア抗原のＮ末端領域に対して（例えば、ＨＣＶ１ポリタンパク質に対して番号付けされた、ＨＣＶのアミノ酸１０−５３に対して）指向され、そして検出可能に標識されたＨＣＶ抗コア抗体は、ＨＣＶコア抗原のＣ末端領域に対して（例えば、ＨＣＶ１ポリタンパク質配列に対して番号付けされたＨＣＶのアミノ酸１２０−１３０に対して）指向される。
【００１８】
別の実施形態において、本発明は、生物学的サンプル中のＨＣＶ感染を検出する方法に関する。この方法は以下の工程を包含する：（ａ）多エピトープ融合抗原を含むイムノアッセイ固体支持体を提供する工程；（ｂ）ＨＣＶ抗原およびＨＣＶ抗体（生物学的サンプル中に存在する場合）が、少なくとも１つの抗コア抗体、ＮＳ３／４ａエピトープおよび多エピトープ融合抗原と結合することを可能にする条件下で、生物学的サンプルと固体支持体とを組み合わせる工程；（ｃ）工程（ｂ）からの固体支持体に、複合体が形成する条件下で（ｉ）検出可能に標識した第一の抗体（ここでこの検出可能に標識した第一の抗体は、検出可能に標識されたＨＣＶ抗コア抗体であり、ここでこの標識された抗コア抗体は、固体支持体に結合する少なくとも１つの抗コア抗体とは異なるＨＣＶコアエピトープに対して指向される）；（ｉｉ）生物学的サンプル由来のＨＣＶ抗体と反応する第一の抗原および第二の抗原（それぞれ、ＮＳ３／４ａエピトープおよび多エピトープ融合抗原と反応性である）；および（ｉｉｉ）検出可能に標識した第二の抗体（ここで、この検出可能に標識された第二の抗体は、（ｉｉ）の抗原と反応性である）を添加する工程；ならびに（ｄ）抗体と抗原（存在する場合）との間に形成された複合体を、生物学的サンプル中のＨＣＶ感染の指標として検出する工程。
【００１９】
上記のように、抗コア抗体は、ＨＣＶコア抗原のＮ末端領域に対して指向され得、この検出可能に標識された第一のＨＣＶ抗コア抗体は、ＨＣＶコア抗原のＣ末端領域に対して指向され得る。さらに、生物学的サンプル由来のＨＣＶ抗体と反応する第一の抗原は、ＨＣＶポリタンパク質のｃ３３ｃ領域由来のエピトープを含み得、そしてｈＳＯＤアミノ酸配列と融合され得る。この状況において、検出可能に標識された第二の抗体は、ｈＳＯＤアミノ酸配列と反応性である。さらに、生物学的サンプル由来のＨＣＶ抗体と反応する第二の抗原は、ＨＣＶポリタンパク質のｃ２２領域由来のエピトープ（例えば、ＨＣＶ１ポリタンパク質配列に対して番号付けされた、Ａｒｇ４７の欠失および４４位でのＬｅｕのＴｒｐでの置換を有するＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸Ｌｙｓ１０〜Ｓｅｒ９９を含むエピトープ）を含み得る。このエピトープは、ｈＳＯＤアミノ酸配列と融合され得る。その場合、検出可能に標識された第二の抗体は、ｈＳＯＤアミノ酸配列と反応性である。多エピトープ融合抗原は、図７Ａ〜７Ｆに示されるアミノ酸配列を含み得る。
【００２０】
なおさらなる実施形態において、本発明は、生物学的サンプルにおけるＨＣＶ感染を検出する方法に関し、この方法は、以下：（ａ）イムノアッセイ固体支持体を提供する工程であって、この固体支持体は、この固体支持体に結合された、２つのＨＣＶ抗コアモノクローナル抗体、ＨＣＶ  ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープ（図４Ａ〜４Ｄに記載されるアミノ酸配列を含む）、および多重エピトープ融合抗原（図７Ａ〜７Ｆに記載されるアミノ酸配列を含む）を含む、工程；（ｂ）ＨＣＶ抗原および抗体が、生物学的サンプルに存在する場合に、少なくとも２つの抗コア抗体、ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープ、および多重エピトープ融合抗原の各々に結合する条件下で、生物学的サンプルを固体体支持体と合わせる工程；（ｃ）複合体形成条件下で、工程（ｂ）からの固体支持体に、（ｉ）第一の検出可能に標識された抗体（ここで、第一の検出可能に標識された抗体は、検出可能に標識されたＨＣＶ抗コア抗体であり、ここで、この標識された抗コア抗体は、固体支持体に結合された少なくとも２つの抗コア抗体とは異なるＨＣＶコアエピトープに対して指向される）；（ｉｉ）ｈＳＯＤアミノ酸配列に融合されたＨＣＶポリタンパク質のｃ３３ｃ領域由来のエピトープおよびｈＳＯＤアミノ酸配列に融合されたＨＣＶポリタンパク質のｃ２２領域由来のエピトープ；ならびに（ｉｉｉ）第二の検出可能に標識された抗体（ここで、この第二の検出可能に標識された抗体は、このｈＳＯＤアミノ酸配列と反応性である）を添加する工程；（ｄ）（存在する場合、生物学的サンプルにおけるＨＣＶ感染の指標としての）抗体と抗原との間の複合体を検出する工程、を包含する。
【００２１】
この実施形態において、少なくとも２つの抗コア抗体は、ＨＣＶコア抗原のＮ末端領域に対して（例えば、ＨＣＶのアミノ酸１０〜５３（ＨＣＶ１ポリタンパク質に対して番号付けされた）に対して）指向され得、そして検出可能に標識されたＨＣＶ抗コア抗体は、ＨＣＶコア抗原のＣ末端領域に対して（例えば、ＨＣＶのアミノ酸１２０〜１３０（ＨＣＶ１ポリタンパク質に対して番号付けされた）に対して）指向される。さらに、ｃ２２領域由来のエピトープは、ＨＣＶ１ポリタンパク質に対して番号付けされた、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸Ｌｙｓ１０〜Ｓｅｒ９９を含み得、ここで、Ａｒｇ４７が欠失し、そして４４位でＬｕｅがＴｒｐに置換されている。
【００２２】
他の実施形態において、本発明は、免疫診断試験キットに関し、このキットは、上記のイムノアッセイ固体支持体および免疫診断試験を実施するための説明書を含む。
【００２３】
なおさらなる実施形態において、本発明は、イムノアッセイ固体支持体を生成する方法に関し、この方法は、（ａ）固体支持体を提供する工程；および（ｂ）少なくとも１つのＨＣＶ抗コア抗体（例えば、１つまたは２つ以上）、および少なくとも１つの単離されたＨＣＶ  ＮＳ３／４ａエピトープ、ならびに必要に応じて、多重エピトープ融合抗原を、固体支持体に結合する工程を包含する。この抗コア抗体、ＮＳ３／４ａエピトープ、および多重エピトープ融合抗原は、上記の通りである。
【００２４】
さらなる実施形態において、本発明は、多重エピトープ融合抗原に関し、この抗原は、図７Ａ〜７Ｆに記載されるアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性（例えば、９０％以上の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、このアミノ酸配列は、ＨＣＶ感染個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応する。特定の実施形態において、この多重エピトープ融合抗原は、図５Ａ〜５Ｆに示されるアミノ酸配列からなる。
【００２５】
さらなる実施形態において、本発明は、上記の多重エピトープ融合抗原についてのコード配列を含むポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む組換えベクター、この組換えベクターで形質転換された宿主細胞、ならびに、組換え多重エピトープ融合抗原を作製する方法に関し、この方法は、（ａ）上記のような宿主細胞の集団を提供する工程；および（ｂ）この組換えベクター中に存在するコード配列によってコードされる多重エピトープ融合抗原が発現される条件下でこの細胞の集団を培養する工程を包含する。
【００２６】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して、明らかとなる。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されない限り、当該分野の技術の範囲内の、化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の従来の方法を使用する。このような技術は、文献に完全に説明される。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，編）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．、最新添付（ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ））；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）。
【００２８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容がそうではないと明らかに示さない限り、複数の参照をも含むことに注意しなければならない。従って、例えば、「抗原」に対する参照は、２以上の抗原の混合物を含む、など。
【００２９】
以下のアミノ酸の略語は、この明細書を通して使用される：
アラニン：Ａｌａ（Ａ）          アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ）      アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ）        グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ）      グリシン：Ｇｌｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ）        イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ）          リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ）        フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ）          セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
スレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ）        トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ）          バリン：Ｖａｌ（Ｖ）
（Ｉ．定義）
本発明を記載する際に、以下の用語が使用され、そして以下に示されるように定義されることが意図される。
【００３０】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいい。そして生成物の最小長に限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどが、この定義に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方が、この定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾（例えば、グルコシル化、アセチル化、リン酸化など）を含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、タンパク質の所望の活性が維持される限り、ネイティブな配列に対する、改変（例えば、欠失、付加および置換（一般に、性質が保存的である））を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介してのように意図的であり得るか、またはこのタンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーを介するような、偶発的なものであり得る。
【００３１】
ＨＣＶポリペプチドは、上記のように、ＨＣＶポリタンパク質に由来するポリペプチドである。このポリペプチドは、物理的にＨＣＶに由来する必要はなく、合成的にまたは組換え的に生成され得る。さらに、このポリペプチドは、種々のＨＣＶ株および単離物のいずれか（例えば、限定されないが、ＨＣＶの株１、２、３、または４由来の単離物のいずれか）に由来し得る。多くの保存領域および可変領域が、これらの株で既知であり、そして一般に、これらの領域に由来するエピトープのアミノ酸配列は、２つの配列が整列された場合に、高い程度の配列相同性（例えば、３０％より大きい、好ましくは４０％より大きいアミノ酸配列相同性）を有する。従って、例えば、用語「ＮＳ３／４ａ」ポリペプチドは、種々のＨＣＶ株のいずれかに由来するネイティブなＮＳ３／４ａ、ならびに以下にさらに定義されるようなＮＳ３／４ａアナログ、ムテインおよび免疫原性フラグメントをいう。多くのこれらの株の完全な遺伝子型は、公知である。例えば、米国特許第６，１５０，０８７号およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２３８８００ならびにＡＪ２３８７９９を参照のこと。
【００３２】
用語「アナログ」および「ムテイン」は、参照分子の生物学的に活性な誘導体またはこのような誘導体のフラグメント（これらは、本明細書中に記載されるアッセイにおいて免疫反応性のような所望の活性を維持する）をいう。一般に、用語「アナログ」は、改変が免疫原性活性を破壊しない限り、ネイティブ分子に対して、１以上のアミノ酸付加、置換（一般に、性質が保存的である）、および／または欠失を有するネイティブなポリペプチド配列および構造を有する化合物をいう。用語「ムテイン」は、１つ以上のペプチド模倣物（「ペプトイド」）を有するペプチドをいい、例えば、国際公開番号ＷＯ  ９１／０４２８２に記載される。好ましくは、このアナログまたはムテインは、ネイティブな分子と少なくとも同じ免疫活性を有する。ポリペプチドアナログおよびムテインを作製するための方法は、当該分野で公知であり、そして以下にさらに記載される。
【００３３】
特に好ましいアナログは、性質が保存的である置換（すなわち、それらの側鎖が関係するアミノ酸のファミリー内で起こる置換）を含む。具体的に、アミノ酸は、一般的に４つのファミリーに分類される：（１）酸性−−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性−−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）無電荷で極性−−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、しばしば、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、スレオニンのセリンでの単独置換、またはアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸の類似の保存的な置換は、生物学的活性に対して、主要な効果は有さないことが、合理的に予測可能である。例えば、目的のポリペプチドは、分子の所望の機能がインタクトなままである限り、約５〜１０までの保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換、もしくは約１５〜２５までの保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換、あるいは５〜２５の間の任意の整数の保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換を有し得る。当業者は、当該分野で周知の、Ｈｏｐｐ／ＷｏｏｄｓおよびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットを参照することによって、変化を許容し得る目的の分子の領域を容易に決定し得る。
【００３４】
「フラグメント」は、インタクトな全長ポリペプチド配列および構造の一部のみからなるポリペプチドを意図する。このフラグメントは、ネイティブなポリペプチドのＣ末端欠失および／またはＮ末端欠失を含み得る。特定のＨＣＶタンパク質の「免疫原性フラグメント」は、一般に、全長分子の少なくとも約５〜１０連続するアミノ酸残基、好ましくは全長分子の少なくとも約１５〜２５連続するアミノ酸残基、および最も好ましくは全長分子の少なくとも約２０〜５０以上連続するアミノ酸残基（これらは、エピトープを規定する）を含むか、または５個のアミノ酸と全長配列との間の任意の整数の連続するアミノ酸残基を含むが、ただし、問題のフラグメントは、本明細書中に記載されるアッセイにおいて免疫反応性を保持する。例えば、好ましい免疫原性フラグメントとしては、例えば、ポリタンパク質のアミノ酸１０〜４５、１０〜５３、６７〜８８、および１２０〜１３０、エピトープ５−１−１（ウイルスゲノムのＮＳ３領域において）ならびにＨＣＶポリタンパク質のＥ１、Ｅ２、ｃ３３ｃ（ＮＳ３）、ｃ１００（ＮＳ４）、ＮＳ３／４ａおよびＮＳ５領域由来の規定されたエピトープ、ならびにＨＣＶポリタンパク質から同定されるタンパク質の種々のエピトープのいずれかを含むＨＣＶコアのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号ＷＯ  ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ、Ｄ．Ｙ．、国際公開番号ＷＯ  ９４／０１７７８；米国特許第６，１５０，０８７号および同第６，１２１，０２０号を参照のこと。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「エピトープ」は、少なくとも約３〜５、好ましくは約５〜１０または１５、および約１０００アミノ酸以下（またはこの間の任意の整数のアミノ酸）の配列をいい、これは、それ自体によって、またはより大きな配列の一部として、このような配列に応答して産生される抗体に結合する配列を規定する。フラグメントの長さに臨界的な上限は存在せず、このフラグメントは、ほぼ全長のタンパク質配列、またはＨＣＶポリタンパク質由来の２つ以上のエピトープを含む融合タンパク質でさえ含み得る。本発明における使用のためのエピトープは、これが由来する親タンパク質の一部分の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際に、ウイルスゲノムは、一定のフラックスの状態にあり、そして単離物間で比較的高い程度の変異性を示すいくつかの可変ドメインを含む。従って、用語「エピトープ」は、ネイティブな配列に同一な配列、ならびにネイティブな配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般に、性質が保存的である））を包含する。
【００３６】
エピトープを含む所定のポリペプチドの領域は、当該分野で周知の、任意の数のエピトープマッピング技術を使用して、同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、線状エピトープは、例えば、多数のペプチド（これらのペプチドは、タンパク質分子の一部分に対応する）を固体支持体上で同時に合成し、そしてこれらのペプチドを固体支持体になおも付着させつつ、これらのペプチドを抗体を反応させることによって決定され得る。このような技術は、当該分野で公知であり、そして例えば以下に記載される：米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１７８−１８２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５。このような技術を使用して、ＨＣＶの多くのエピトープが同定されている。例えば、Ｃｈｉｅｎら、Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ（１９９４）３２０−３２４頁、およびさらに以下を参照のこと。同様に、コンホメーションエピトープは、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴によって、アミノ酸の空間的立体配座を決定することによって容易に同定される。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（前出）を参照のこと。タンパク質の抗原性領域はまた、標準的な抗原性および疎水性親水性指標プロット（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐから入手可能なＯｍｉｇａ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．０ソフトウェアプログラムを使用して計算されたもの）を使用して、同定され得る。このコンピュータプログラムは、抗原性プロフィールを決定するためのＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法（Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８１）７８：３８２４−３８２８）、および疎水性親水性指標プロットのためのＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術（Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７：１０５−１３２）を使用する。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「コンホメーションエピトープ」とは、全長の天然のタンパク質内の、エピトープをコードするアミノ酸配列にネイティブな構造的特徴を有する、全長タンパク質、またはそのアナログまたはムテインの一部をいう。ネイティブな構造的特徴としては、グリコシル化および三次元構造が挙げられるが、これらに限定されない。エピトープ規定配列の長さは、幅広い変動に供され得る。なぜなら、これらのエピトープは、抗原の三次元形状（例えば、折り畳み）によって形成されると考えられるからである。従って、エピトープを規定するアミノ酸は、比較的少ない数であり得るが、分子の長さに沿って（またはダイマーなどの場合には、異なる分子上にさえ）幅広く分散し得、折り畳みにより正確なエピトープコンホメーションにされる。エピトープを規定する残基間の抗原の部分は、エピトープのコンホメーショナルな構造に重要ではなくてもよい。例えば、これらの介在する配列の欠失または置換は、エピトープのコンホメーションに重要な配列（例えば、ジスルフィド結合に関与するシステイン、グリコシル化部位など）が維持される限り、コンホメーションエピトープに影響しなくてもよい。
【００３８】
ＮＳ３／４ａ領域に存在するコンホメーションエピトープは、上で議論される方法を使用して容易に同定される。さらに、所与のポリペプチドにおけるコンホメーションエピトープの存在または非存在は、抗体（コンホメーションエピトープに対するポリクローナル血清またはモノクローナル血清）を用いて目的の抗原をスクリーニングし、そしてその反応性を線形のエピトープのみ（存在する場合）を保持する変性版の抗原の反応性と比較することによって容易に決定され得る。ポリクローナル抗体を使用するこのようなスクリーニングにおいて、ポリクローナル血清を、最初に変性抗原を用いて吸収し、そして目的の抗原に対する抗体を保持するか否かを観測することが有利であり得る。さらに、ＮＳ３／４ａの場合において、ネイティブなコンホメーションを保存する分子はまた、プロテアーゼ酵素活性そして必要に応じて、ヘリカーゼ酵素活性を有する。このような活性は、以下にさらに記載されるように、酵素アッセイを使用して、検出され得る。
【００３９】
好ましくは、コンホメーションエピトープは、組換え的に産生され、そして、例えば、エピトープの変性なしにその所望の構造的特徴を保存する条件下で抽出可能である細胞において発現される。このような細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞が挙げられる。ＨＣＶポリタンパク質からの組換えコンホメーションエピトープの発現および単離は、例えば、国際公開番号ＷＯ９６／０４３０１、ＷＯ９４／０１７７８、ＷＯ９５／３３０５３、ＷＯ９２／０８７３４に記載される。あるいは、抗原を発現し、そしてさらに、回収の後にタンパク質を再生することが可能である。化学合成によってまた、「ネイティブ」な抗原のコンホメーションエピトープと交差反応するコンホメーショナル抗原ミミトープ（ｍｉｍｉｔｏｐｅ）が提供され得ることがまた理解される。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「多エピトープ融合抗原」または「ＭＥＦＡ」は、複数のＨＣＶ抗原がアミノ酸の単一の連続した鎖の一部であるポリペプチドを意図し、この鎖は、天然に存在しない。ＨＣＶ抗原は、ペプチド結合によって互いに直接的に結合され得るか、または介在するアミノ酸配列によって分離され得る。融合抗原はまた、ＨＣＶポリタンパク質に対して外来性の配列を含み得る。さらに、存在するＨＣＶ配列は、複数のゲノム型由来であり得、そして／またはＨＣＶの単離体であり得る。本発明のイムノアッセイにおける使用のための特定のＭＥＦＡの例は、例えば、国際公開番号ＷＯ９７／４４４６９に詳細に記載され、そして以下にさらに記載される。
【００４１】
「抗体」は、化学的手段または物理的手段によって、目的のポリペプチドに特異的に結合する分子を意図する。従って、ＨＣＶコア抗体は、ＨＣＶコアタンパク質に特異的に結合する分子である。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、ポリクローナル調製物およびモノクローナル調製物の両方、ならびに以下：ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３〜２９９；および米国特許番号第４，８１６，５６７号を参照のこと）；Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ）フラグメント；Ｆｖ分子（非共有結合ヘテロダイマー、例えば、Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６９：２６５９〜２６６２；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１〜４０９６を参照のこと）；単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３を参照のこと）；二量体および三量体の抗体フラグメント構築物；ミニ体（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）（例えば、Ｐａｃｋら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１：１５７９〜１５８４；Ｃｕｍｂｅｒら（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９Ｂ：１２０〜１２６を参照のこと）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６；および１９９４年９月２１日に公開された英国特許公開番号ＧＢ２，２７６，１６９を参照のこと）；ならびに、このような分子から得られる任意の機能性フラグメントから得られる抗体を含み、ここで、このようなフラグメントは、親の抗体分子の免疫学的結合特性を保持する。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、均一な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、抗体の種または供給源に関して限定されず、それが作製される方法によっても限定されることを意図しない。従って、この用語は、マウスハイブリドーマから得た抗体、ならびにマウスハイブリドーマよりもむしろヒトを使用して得たヒトモノクローナル抗体を包含する。例えば、Ｃｏｔｅら、Ｍｏｎｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，１９８５，ｐ．７７を参照のこと。
【００４３】
「組換え体」タンパク質は、所望の活性を有し、そして本明細書中に記載される組換えＤＮＡ技術によって調製されたタンパク質である。一般的に、目的の遺伝子は、以下にさらに記載のように、クローン化され、次いで、形質転換された生物において発現される。宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現してタンパク質を産生する。
【００４４】
「単離された」とは、ポリペプチドをいう場合、示された分子が、その分子が天然に見出される生物全体から分離され、そして別々であるか、または同じ型の他の高分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。ポリヌクレオチドに関して、用語「単離された」は、天然においてそのポリヌクレオチドと通常関連する配列の全てまたは一部を欠いた核酸分子；または天然に存在するが、その配列に関連する異種配列を有する配列；または染色体から解離した分子である。
【００４５】
「等価な抗原決定基」とは、ＨＣＶの異なる亜種または株（例えば、ＨＣＶの株１、２または３）由来の抗原決定基を意味する。より詳細には、エピトープ（例えば、５−１−１）が、公知であり、そしてこのようなエピトープは、株１、２および３の間で変わる。従って、３つの異なる株由来のエピトープ５−１−１は、等価な抗原決定基であり、従って、たとえそれらの配列が同一でないとしても、「コピー」である。一般的に、等価な抗原決定基のアミノ酸配列は、２つの配列が整列された場合、高い程度の配列相同性（例えば、３０％より大きい、好ましくは４０％より大きい、アミノ酸配列相同性）を有する。
【００４６】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド部分または２つのポリペプチド部分の間の類似性の割合をいう。２つのＤＮＡ配列、または２つのポリペプチド配列は、これらの配列が、規定された長さの分子にわたって、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列類似性を示す場合、互いに「実質的に相同」である。本明細書中で使用される場合、実質的に相同はまた、特定のＤＮＡ配列またはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。
【００４７】
一般的に、「同一性」とは、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列それぞれの正確なヌクレオチド−ヌクレオチドの対応またはアミノ酸−アミノ酸の対応をいう。同一性の割合は、それらの配列を整列させ、２つの整列された配列の間の一致の正確な数を数え、短い方の配列の長さによって割り、そして結果に１００を掛けることによる、２つの分子間の配列情報の直接的な比較によって決定され得る。
【００４８】
容易に入手可能なコンピュータプログラム（例えば、ＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、補遺５、３：３５３〜３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（これは、ペプチド分析のために、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９，１９８１の局所的相同性アルゴリズムを適合させる））は、類似性または同一性の分析を助けるために使用され得る。ヌクレオチド配列類似性および同一性を決定するためのプログラム（例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラム（これらもまた、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムに依存する））は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）において入手可能である。これらのプログラムは、製造業者によって推奨され、そして上に参照されるＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに記載されるデフォルトパラメーターを用いて容易に使用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の相同性の割合は、６つのヌクレオチド位置のデフォルトスコアリングテーブルおよびギャップペナルティーを用いてＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して決定され得る。
【００４９】
本発明の状況において類似性の割合を確立する別の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈによる著作権があり、Ｊｏｈｎ  Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ  Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって配給されるプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。この一そろいのパッケージから、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用し得、ここで、デフォルトパラメーターは、スコアリングテーブルのために使用される（例えば、１２のギャップオープンペナルティー、１のギャップ伸長ペナルティー、および６のギャップ）。生成されるデータから、「一致」値が「配列類似性」を反映する。配列間の同一性の割合または類似性の割合を計算するための他の適切なプログラムは、当該分野において一般的に公知であり、例えば、別の整列プログラムは、デフォルトパラメーターとともに使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを使用して用いられ得る：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；マトリクス（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記載（Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ）＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース（Ｄａｔａｂａｓｅ）＝縮重なし、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスにおいて見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００５０】
あるいは、相同性は、相同な領域間に安定な二重鎖を形成する条件下でのポリペプチドのハイブリダイゼーション、続いて、単鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化されたフラグメントのサイズの決定によって決定され得る。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、その特定の系について規定されるように、例えばストリンジェントな条件下で、サザンハイブリダイゼーション実験で同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を規定することは、当該分野の技術の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ上記；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、上記を参照のこと。
【００５１】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コード」する配列は、適切な調節配列の制御下に配置される場合、インビトロまたはインビボで、転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端における翻訳終止コドンによって決定される。転写終結配列は、コード配列の３’側に配置され得る。
【００５２】
「作動可能に連結される」とは、そのように記載される成分が、それらの所望の機能を実行するように構成されるエレメントの配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結される所与のプロモーターは、適切な転写因子などが存在する場合、コード配列の発現をもたらし得る。プロモーターは、コード配列の発現を指示するように機能する限り、コード配列と連続である必要はない。従って、例えば、介在する、翻訳されないが転写される配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得（イントロンが転写され得るように）、プロモーター配列は、なお、コード配列に「作動可能に連結される」とみなされ得る。
【００５３】
「制御エレメント」とは、それが連結するコード配列の発現を助けるポリヌクレオチド配列をいう。この用語は、プロモーター、転写終結配列、上流調節ドメイン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域（５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを含む）、ならびに適切な場合、リーダー配列およびエンハンサー（これらは、集合的に、宿主細胞においてコード配列の転写および翻訳を提供する）を含む。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「プロモーター」は、宿主細胞においてＲＮＡポリメラーゼを結合し得、それに作動可能に連結される下流の（３’方向）コード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明の目的のために、プロモーター配列は、バックグラウンドよりも上の検出可能なレベルで目的の遺伝子の転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列には、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）がある。真核生物プロモーターは、しばしば、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。
【００５５】
制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、ｍＲＮＡにコード配列を転写する場合、細胞においてコード配列の「転写を指示し」、次いで、このｍＲＮＡは、コード配列によってコードされるポリペプチドに翻訳される。
【００５６】
「発現カセット」または「発現構築物」とは、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得るアセンブリをいう。この発現カセットは、上記のような制御エレメント（例えば、目的の配列または遺伝子に（これらの転写を指向するように）作動可能に連結されるプロモーター）を含み、そしてしばしば、同様に、ポリアデニル化配列を含む。本発明の特定の実施形態において、本明細書中に記載される発現カセットは、プラスミド構築物内に含まれ得る。この発現カセットの構成成分に加えて、このプラスミド構築物はまた、１種以上の選択マーカー、このプラスミド構築物が単鎖ＤＮＡとして存在することを可能にするシグナル（例えば、Ｍ１３の複製起点）、少なくとも１ヶ所のマルチクローニングサイト、および「哺乳動物」の複製起点（例えば、ＳＶ４０複製起点またはアデノウイルス複製起点）を含み得る。
【００５７】
本明細書中で使用される「形質転換」とは、挿入のために使用される方法（例えば、直接的な取り込み、トランスフェクション、感染などによる形質転換）に係わらず、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞への挿入をいう。トランスフェクションの特定の方法については、以下をさらに参照のこと。外因性ポリヌクレオチドは、組み込まれていないベクター（例えば、エピソーム）として維持され得るか、または宿主ゲノムに組み込まれ得る。
【００５８】
「宿主細胞」とは、外因性ＤＮＡ配列によって、形質転換された細胞、または形質転換され得る細胞をいう。
【００５９】
「共通の固体支持体」とは、被験体のイムノアッセイにおいて使用されるＨＣＶポリペプチドが、共有結合または疎水性吸着のような非共有結合手段で結合している、単一の固体基質をいう。
【００６０】
「免疫学的反応」とは、目的の抗原が、ＨＣＶに感染した個体由来の生物学的サンプル中に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応することを意味する。
【００６１】
「免疫複合体」とは、抗体が抗原上のエピトープに結合する場合に形成される組み合わせを意図する。
【００６２】
本明細書中で使用される「生物学的サンプル」とは、被験体から単離された組織または流体のサンプルをいい、このサンプルとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、髄液、リンパ液、皮膚のサンプル、以下の外部分泌物（皮膚、気道、腸管、および尿生殖路）、涙、唾液、乳汁、血球、器官、生検材料、ならびにまた培養培地（例えば、組換え細胞、および細胞成分）中での細胞および組織の増殖から得られる馴化培地を含むがこれに限定されないインビトロ細胞培養構築物のサンプル。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、用語「標識」および「検出可能な標識」とは、以下を含むが、これらに限定されない検出可能な分子をいう：放射活性同位元素、蛍光剤、化学ルミネッセンサー（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）、発光団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、発光団、色素、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎｅ）またはハプテン）など。用語「蛍光剤」とは、検出可能な範囲で、蛍光を示し得る物質またはその一部をいう。本発明において使用され得る標識の特定の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ）、Ｔｅｘａｓレッド、ルミノール、ＮＡＤＰＨおよびα−β−ガラクトシラーゼ。
【００６４】
（ＩＩ．発明の実施の形態）
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の式に限定されず、プロセスパラメータ自体は、当然、変化し得ることが理解されなければならない。本明細書中で使用される技術が、本発明の特定の実施形態を記載する目的のみのためであり、限定することを意図しないことも理解されなければならない。
【００６５】
本明細書中に記載される組成物および方法と類似しているかまたは等価の、多数の組成物および方法が、本発明の実施に使用され得るが、好ましい材料および方法は、本明細書中に記載されている。
【００６６】
上記のように、本発明は、初期ＨＣＶ感染を正確に検出するための、新規の診断方法の発見に基づく。この方法は、高度に免疫原性のＨＣＶ抗体およびＨＣＶ抗原の同定および使用に依存し、このＨＣＶ抗体および抗原は、ＨＣＶのセロコンバージョンの初期段階中に存在し、これによって、検出精度を上昇させ、そして誤った結果の発生を減少させる。この方法は、単一のアッセイフォーマットにおいて都合良く実施され得る。
【００６７】
より具体的には、このアッセイは、１種以上のＨＣＶ抗コア抗体（同一のＨＣＶコアエピトープまたは異なるＨＣＶコアエピトープのいずれかに対して指向される）およびＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａ領域由来のエピトープが結合されている固体支持体で実施される。本発明において有用な特定の抗コア抗体の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸１０位〜５３位の間；アミノ酸１０位〜４５位の間；アミノ酸６７位〜８８位の間；アミノ酸１２０位〜１３０位の間に見出されるコア領域におけるエピトープ対して指向されるモノクローナル抗体のような抗体分子、あるいは例えば、以下において同定されたコアエピトープのいずれかに対して指向される抗体：Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．、国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８；ならびに共有に係る、特許になった米国特許出願番号０８／４０３，５９０および同０８／４４４，８１８。
【００６８】
ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａ領域が記載されており、このアミノ酸配列およびこのタンパク質の全体構造は、例えば、Ｙａｏら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９９９年１１月）７：１３５３−１３６３；Ｓａｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７：３３９２−３４０１；およびＢａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｒ．，Ｊ．Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔ．（１９９９）６：１６５−１８１に開示されている。また、Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら、米国特許第５，８４３，７５２号を参照のこと。本発明のイムノアッセイは、天然に存在するＨＣＶ粒子またはその感染産物において見出されるようなコンホメーション中に存在する、ＮＳ３／４ａ領域由来の少なくとも１種類のコンホメーションエピトープを利用し、プロテアーゼ、必要に応じて、ＮＳ３／４ａ遺伝子産物によって通常示されるヘリカーゼ酵素活性および／またはＨＣＶ感染被験体由来の生物学的サンプル中での抗原と抗体との免疫活性の保持、ならびに抗原の変性におけるエピトープ免疫活性の減少によって明らかとなる。例えば、このコンホメーションエピトープは、加熱、極度に酸性または塩基性のｐＨの変化によって、または公知の有機的変性（例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）または適切な界面活性剤）を添加することによって崩壊され得る。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅ．Ｌ．Ｖ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ａｎｇａｌ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、上記のように処理されない産物と比較される変性産物を参照ここと。
【００６９】
プロテアーゼ活性およびヘリカーゼ活性は、当該分野で周知の標準的な酵素アッセイを使用して決定され得る。例えば、プロテアーゼ活性は、当該分野で周知のアッセイの使用により決定され得る。例えば、Ｔａｋｅｓｈｉｔａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）２４７：２４２−２４６；Ｋａｋｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）１２２：７４９−７５５；Ｓａｌｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９８）３７：３３９２−３４０１；Ｃｈｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９８）７２：１０９−１１５；Ｃｅｒｒｅｔａｎｉら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）２６６：１９２−１９７；Ｚｈａｎｇら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９９）２７０：２６８−２７５；Ｋａｋｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９９）８０：７７−８４；Ｆｏｗｌｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｃｒｅｅｎ．（２０００）５：１５２−１５８；およびＫｉｍら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２０００）２８４：４２−４８を参照のこと。プロテアーゼ活性を試験するための特に便利なアッセイは、以下の実施例において記載される。
【００７０】
同様に、ヘリカーゼ活性アッセイは、当該分野で周知であり、そしてＮＳ３／４ａエピトープのヘリカーゼ活性は、例えば、以下を使用して決定され得る：例えば、Ｈｓｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９８）２５３：５９４−５９９に記載されるようなＥＬＩＳＡアッセイ；Ｋｙｏｎｏら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）２５７：１２０−１２６に記載されるようなシンチレーション近接アッセイ系（ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ）；例えば、Ｈｉｃｈａｍら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．（２０００）４６：１８１−１９３およびＫｗｏｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（２０００）２４：９７−１１６に記載されるようなハイスループットスクリーニングアッセイ；ならびに当該分野で公知の他のアッセイ方法。例えば、Ｋｈｕら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．（２００１）７５：２０５−２１４；Ｕｔａｍａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２０００）２７３：３１６−３２４；Ｐａｏｌｉｎｉら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｏｌ．（２０００）８１：１３３５−１３４５；Ｐｒｅｕｇｓｃｈａｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９：５１７４−５１８３；Ｐｒｅｕｇｓｃｈａｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．（１９９８）１９：３５３−３６４；ならびにＨｅｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９：２６１９−２６２５を参照のこと。
【００７１】
抗原の長さは、免疫反応性コンホメーションエピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ）を維持するのに十分である。しばしば、使用される抗原を含むポリペプチドは、ほとんど全長であるが、このポリペプチドはまた、例えば、可溶性を増加させるためか、または分泌を改善するために切断され得る。一般に、ＮＳ３／４ａ中に見出されるコンホメーションエピトープは、細胞中で組換えポリペプチドとして発現され、そしてこのポリペプチドは、以下で詳細に記載されるような所望の形態のエピトープを提供する。
【００７２】
ＮＳ３／４ａポリペプチドに関する代表的なアミノ酸配列は、図３および図４Ａ〜４Ｄに示される。図３の１８２位に存在する太字のアラニンは、別に存在し得る分子の自己触媒を防止するために、この位置において見出されるネイティブなセリンと置換される。図４Ａ〜４Ｄの２位〜６８６位に示されるアミノ酸配列は、ＨＣＶ−１のアミノ酸の１０２７位〜１７１１位に対応する。Ｍｅｔをコードする開始コドン（ＡＴＧ）は、１位として示される。さらに、ＨＣＶ−１の１４２８位（図４のアミノ酸の４０３位）に通常存在するＴｈｒは、Ｐｒｏに変異され、ＨＣＶ−１の１４２９位（図４のアミノ酸の４０４位）に通常存在するＳｅｒは、Ｉｌｅに変異される。しかし、このエピトープが、プロテアーゼ活性および必要に応じてヘリカーゼ活性が保持されるように、そのネイティブコンホメーションを保持または回復する方法を使用して産生される限り、Ｎ末端にＭｅｔを有するか、もしくは有さないネイティブ配列、Ｎ末端にＭｅｔを有するか、もしくは有さない描写アナログ（ｄｉｐｉｃｔｅｄ  ａｎａｌｏｇ）、または他のアナログおよびフラグメントのいずれかは、本発明のアッセイにおいて使用され得る。Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら、米国特許第５，８４３，７５２号およびＺｈａｎｇら、米国特許第５，９９０，２７６号（これらの両方は、ＮＳ３／４ａのアナログを記載する）。
【００７３】
ＮＳ３／４ａのＮＳ３プロテアーゼは、ＨＣＶ−１に対して番号付けされた約１０２７位〜約１２０７位（図４の２位〜１８２位）において見出される。ＮＳ３プロテアーゼの構造および活性部位は、公知である。例えば、Ｄｅ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら、Ａｎｔｉｖｉｒ．Ｔｈｅｒ．（１９９８）３：９９−１０９；Ｋｏｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）４０：６３１−６４０を参照のこと。通常、耐性であるネイティブ配列に対する変化は、分子の活性部位の以外の変化である。特に、図４のアミノ酸１位〜１５５位または２位〜１５５位を保持し、ほとんど置換されないか、または保存的置換のみされることが所望される。１５５を超えて存在するアミノ酸は、より大きな変化に耐性である。さらに、図４に見出されるＮＳ３／４ａ配列のフラグメントが使用される場合、これらのフラグメントは、一般に、Ｎ末端にＭｅｔを有するか、または有さない、少なくともアミノ酸１位〜１５５位または２位〜１５５位、好ましくは、アミノ酸１位〜１７５位または２位〜１７５位、そして最も好ましくは、アミノ酸１位〜１８２位または２位〜１８２位を含む。このヘリカーゼドメインは、ＨＣＶ−１の約１１９３位〜約１６５７位（図４の２０７位〜６３２位）に見出される。従って、ヘリカーゼ活性が所望される場合、この分子の位置は、ほとんど変化しないか、または保存的変化のみされた状態で維持される。当業者は、ＮＳ３／４ａの既知の構造に基づく変化に耐える他の領域を容易に決定し得る。
【００７４】
固体支持体はまた、他の抗原を含み得る。例えば、国際公開番号ＷＯ９７／４４４６９に記載されるような、複数のエピトープ融合抗体（「ＭＥＦＡ」と呼ばれる）を、本発明のアッセイでの使用のために固体支持体に結合し得る。このようなＭＥＦＡは、図１および表１に示される種々のウイルス領域のうち２種以上から誘導される複数のエピトープを含む。特に、図１および表１に示されるように、ＨＣＶポリタンパク質の切断により、ＮＨ２−コア−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨの順序で、少なくとも１０個の異なる産物を産生する。このコアポリペプチドは、ＨＣＶ−１に対して番号付けされた、１位〜１９１位に存在する（ＨＣＶ−１ゲノムに関して、Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５を参照のこと）。このポリペプチドは、さらに、アミノ酸約１位〜約１７３位を含むＨＣＶポリペプチドを産生するように処理される。このエンベロープポリペプチド（Ｅ１およびＥ２）は、それぞれ、約１９２位〜約３８３位および約３８４位〜約７４６位に存在する。Ｐ７ドメインは、約７４７位〜約８０９位に見出される。ＮＳ２は、タンパク質分解活性を有する完全な膜タンパク質であり、そしてこのポリタンパク質の約８１０位〜約１０２６位に見出される。ＮＳ２は、単独か、またはＮＳ３（約１０２７位〜約１６５７位に見出される）と組み合わせてかのいずれかで、ＮＳ２−ＮＳ３単結合（ｓｉｓｓｌｅ  ｂｏｎｄ）を切断し、次に、ＮＳ３  Ｎ末端を生成し、そしてセリンプロテアーゼ活性およびＲＮＡヘリカーゼ活性の両方を含む大きなポリタンパク質を放出する。このＮＳ３プロテアーゼ（約１０２７位〜約１２０７位に見出される）は、残りのポリタンパク質を処理するのに役立つ。ヘリカーゼ活性は、約１１９３位〜約１６５７位に見出される。ポリタンパク質の成熟の完了は、ＮＳ３セリンプロテアーゼにより触媒される、ＮＳ３−ＮＳ４ａ結合の自己触媒による切断より開始される。ＨＣＶポリタンパク質の続くＮＳ−３媒介切断は、別のポリペプチドのＮＳ３分子による、ポリタンパク質の切断部の認識に関与するようである。これらの反応において、ＮＳ３は、ＮＳ３補因子（約１６５８位〜約１７１１位に見出されるＮＳ４ａ）、２個のタンパク質（約１７１２位〜約１９７２位に見出されるＮＳ４ｂ、および約１９７３位〜約２４２０位に見出されるＮＳ５ａ）、ならびにＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（約２４２１位〜約３０１１位に見出されるＮＳ５ｂ）を遊離する。
【００７５】
【表１】
0004834279.tif 000002
＊ＨＣＶ−１に対して番号付けられている。Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２４５１−２４５５を参照のこと。
【００７６】
複数のＨＣＶ抗原は、鎖が天然には存在しないアミノ酸の単一の連続した鎖の一部である。従って、エピトープの線形順序は、エピトープが生じるゲノムにおけるそれらの線形順序とは異なる。本明細書中における使用のためのＭＥＦＡの配列の線形順序は、好ましくは、最適な抗原性のために配置される。好ましくは、これらのエピトープは、１つより多いＨＣＶ株由来であり、従って、１つのアッセイで複数のＨＣＶ株を検出する付加能力を提供する。従って、本明細書中における使用のためのＭＥＦＡは、上記のポリタンパク質由来の様々な免疫原性領域を含み得る。さらに、このポリタンパク質のコア領域におけるフレームシフトから生じるタンパク質（例えば、国際公開番号ＷＯ９９／６３９４１に記載されるようなタンパク質）は、ＭＥＦＡにおいて使用され得る。所望ならば、ＨＣＶポリタンパク質由来の１つ以上のエピトープの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０、またはそれ以上は、融合タンパク質中で生じ得る。
【００７７】
例えば、Ｅ２の超可変領域（例えば、アミノ酸３８４〜４１０または３９０〜４１０にわたる領域）由来のエピトープは、ＭＥＦＡ抗原に含まれ得る。特に有効なＥ２エピトープは、この領域由来のコンセンサス配列（例えば、コンセンサス配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ（これは１型ＨＣＶゲノムのアミノ酸３９０〜４１０のコンセンサス配列を表す））を含むエピトープである。本発明のＭＥＦＡに存在する代表的なＥ２エピトープは、アミノ酸３９０〜４４４にわたるハイブリッドエピトープを含み得る。このようなハイブリッドＥ２エピトープは、ＨＣＶ  Ｅ２のアミノ酸４１１〜４４４のネイティブのアミノ酸配列に融合したアミノ酸３９０〜４１０を表すコンセンサス配列を含み得る。
【００７８】
さらに、抗原は、様々なＨＣＶ株由来であり得る。ＨＣＶの複数のウイルス株が公知であり、そしてこれらの株のいずれか由来のエピトープは、融合タンパク質において使用され得る。生物体の任意の所定の種は、個々の生物体ごとに異なり、さらにウイルスのような所定の生物体は多数の異なる株を有することが周知である。例えば、上で説明されたように、ＨＣＶは、少なくとも６個の遺伝型を含む。これらの遺伝型の各々は、等価な抗原決定基を含む。より詳細には、各株は、ウイルスの全ての株に存在するが、ウイルス株ごとにわずかに異なる多数の抗原決定基を含む。例えば、ＨＣＶは、５−１−１として公知の抗原決定基を含む（図１を参照のこと）。この特定の抗原決定基は、ＨＣＶの３つの異なるウイルス株上で３つの異なる形態で現れる。従って、本発明の好ましい実施形態において、５−１−１の３つ全ての形態は、目的のイムノアッセイにおいて使用される多エピトープ融合抗原上に現れる。同様に、異なるＨＣＶ株のコア領域由来の等価な抗原決定基がまた存在し得る。一般的に、等価な抗原決定基は、アミノ酸配列に関して高度な相同性を有し、この相同性の程度は、整列された場合、一般に３０％以上、好ましくは４０％以上である。本発明の多コピーエピトープはまた、同じエピトープの正確なコピーである複数のコピーを含み得る。
【００７９】
本発明のアッセイと共に使用するための代表的なＭＥＦＡは、国際公開番号ＷＯ９７／４４４６９に記載される。本明細書中で使用するためのさらなる代表的なＭＥＦＡとしては、ＭＥＦＡ１２、ＭＥＦＡ１３、およびＭＥＦＡ１３．１と呼ばれるＭＥＦＡが挙げられる。これらのＭＥＦＡは、単に例示であり、そしてＨＣＶゲノム由来の他のエピトープもまた本発明のアッセイを用いる用途を見出し、そしてこれらまたは他のＭＥＦＡに組み込まれえることが理解されるべきである。
【００８０】
ＭＥＦＡ１２のＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配列を、図７Ａ〜７Ｆに示す。ＭＥＦＡ１２の一般構造式は、図６に示され、そして以下のとおりである：ｈＳＯＤ−Ｅ１（タイプ１）−Ｅ２  ＨＶＲコンセンサス（タイプ１ａ）−Ｅ２  ＨＶＲコンセンサス（タイプ１および２）−ｃ３３ｃショート（タイプ１）−５−１−１（タイプ１）５−１−１（タイプ３）−５−１−１（タイプ２）−ｃ１００（タイプ１）−ＮＳ５（タイプ１）−ＮＳ５（タイプ１）−コア（タイプ１＋２）−コア（タイプ１＋２）。この多コピーエピトープは、ＨＣＶ−１に関して番号付けされた以下のアミノ酸配列を含む（以下に記載されるアミノ酸配列の番号付けは、Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５で提供される番号付けの指示に従い、ここでアミノ酸＃１は、コア領域のコード配列によりコードされる１番目のメチオニンである）：スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ、タンパク質の組換え発現を促進するために使用される）のアミノ酸１〜６９；Ｅ１領域由来のポリタンパク質のアミノ酸３０３〜３２０；ＨＣＶ−１ａ  Ｅ２の超可変領域のコンセンサス配列を表すポリタンパク質のアミノ酸３９０〜４１０；ＨＣＶ−１およびＨＣＶ−２のＥ２超可変領域のコンセンサス配列を表す、領域Ｅ２由来のポリタンパク質のアミノ酸３８４〜４１４；ヘリカーゼを規定するＨＣＶ−１ポリタンパク質のアミノ酸１２１１〜１４５７；５−１−１のアミノ酸１６８９〜１７３５由来のエピトープの３つのコピー（２つはＨＣＶ−１由来であり、１つはＨＣＶ−３由来であり、そして１つはＨＣＶ−２由来であり、これらのコピーは、ＨＣＶの３つの異なるウイルス株由来の等価な抗原決定基である）；ＨＣＶ−１のＨＣＶポリペプチドＣ１００である、ポリタンパク質のアミノ酸１９０１〜１９３６；ＨＣＶ−１のＮＳ５領域由来のエピトープの２つの正確なコピー（この各々はＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２２７８〜２３１３を有する）；およびコア領域由来の３つのエピトープの２つのコピー（１つはＨＣＶ−１由来であり、１つはＨＣＶ−２由来であり、これらのコピーは、ＨＣＶ−１のアミノ酸９〜５３および６４〜８８、ならびにＨＣＶ−２のアミノ酸６７〜８４により表される等価な抗原決定基である）。
【００８１】
表２は、本明細書中の図７Ａ〜７Ｆを参照して、ＭＥＦＡ１２中の様々なエピトープのアミノ酸位置を示す。この表における番号付けは、ＨＣＶ−１に関する。Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１−２４５５を参照のこと。ＭＥＦＡ１３および１３．１はまた、それぞれ、表３および４に示されるような改変を有する、ＭＥＦＡ１２について上で特定された一般式を共有する。
【００８２】
【表２】
0004834279.tif 000003
＊ＳＯＤタンパク質は、検出結合体であるＨＲＰ標識抗ＳＯＤ抗体がＭＥＦＡに結合しないように切断される。コアエピトープは、検出に使用されるＨＣＶコアに対する抗体がＭＥＦＡに結合しないように変異される。
【００８３】
【表３】
0004834279.tif 000004
＊５−１−１エピトープは、ＮＳ３／４ａ組換えタンパク質によって標的化される可能な切断部位（ＣＳまたはＣＡ）を除去することによって改変される。ＣＳまたはＣＡの代わりに、この配列はＰＩに変えられる。さらに、ＳＯＤタンパク質は、検出結合体であるＨＲＰ標識抗ＳＯＤ抗体がＭＥＦＡに結合しないように変異される。コアエピトープは、検出に使用されるＨＣＶに対する抗体がＭＥＦＡに結合しないように変異される。
【００８４】
【表４】
0004834279.tif 000005
＊５−１−１エピトープは、ＮＳ３／４ａ組換えタンパク質によって標的化される可能な切断部位（ＣＳまたはＣＡ）を除去することによって改変される。ＣＳまたはＣＡの代わりに、この配列はＰＩに変えられる。さらに、ＳＯＤタンパク質は、検出結合体であるＨＲＰ標識抗ＳＯＤ抗体がＭＥＦＡに結合しないように変異される。コアエピトープは、検出に使用されるＨＣＶコアに対する抗体がＭＥＦＡに結合しないように変異される。
【００８５】
１つのアッセイ様式において、サンプルは、以下にさらに記載されるように、固体支持体と合わされる。サンプルがＨＣＶに感染している場合、コア抗原およびこの固体支持体上に存在するこれらのエピトープに対するＨＣＶ抗体は、固体支持体成分に結合する。次いで、検出可能に標識された抗コア抗体が、加えられる。この標識された抗コア抗体は、固体支持体に結合する抗コア抗体とは異なるエピトープに対して指向される。この抗コア抗体は、固体支持体上の抗コア抗体により捕捉されるコア抗原に結合する。
【００８６】
生物学的サンプル由来の捕捉されたＨＣＶ抗体（この捕捉されたサンプルのＨＣＶ抗体はＮＳ３／４ａエピトープと反応性である）と反応する抗原もまた加えられる。この抗原は、好ましくは、ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３領域由来のエピトープである。この抗原は、サンプル由来の捕捉されたＨＣＶ抗体に結合する。このようなエピトープを含む多数の抗原が公知であり、これには、ｃ３３ｃおよびｃ１００領域由来の抗原、およびＮＳ３エピトープ（例えば、ｃ２５）を含む融合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。これらおよび他のＮＳ３エピトープは、本発明のアッセイにおいて有用であり、そして当該分野で公知であり、そして例えば、以下に記載されている：Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８；ならびに共有に係る特許になった米国特許出願番号０８／４０３，５９０および同０８／４４４，８１８。
【００８７】
上記の抗原に対する第２の標識された抗体が加えられる。この抗体は、抗原に含まれる任意のエピトープに対して指向され得る。例えば、この抗体は、抗原中に存在するＮＳ３領域に対して指向され得る。あるいは、上記の抗原が融合タンパク質として発現される場合、第２の標識された抗原は、融合パートナーに対して指向され得る。特に、固体支持体がＭＥＦＡを含む場合、さらなる抗原および抗体がアッセイに加えられ得る。これらのアッセイ様式は、以下にさらに説明される。
【００８８】
本発明の代表的なアッセイを図２に示す。この図に示されるように、固体支持体は、２つの抗コアモノクローナル抗体（ｃ１１−３およびＣ１１−７と呼ばれる）を含む。これらの抗体は、アミノ酸１０〜５３（ＨＣＶ１ポリタンパク質配列に関して番号付けした）のコアタンパク質のＮ末端領域に見出されるエピトープに対して指向される。この固体支持体はまた、ＮＳ３／４ａに対するエピトープを含む。生物学的サンプルが、この固体支持体に加えられる。ＨＣＶコア抗原、およびＮＳ３／４ａエピトープに対する抗体（この両方はサンプル中に存在する）は、固体支持体上の捕捉試薬に結合する。
【００８９】
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−標識抗コアモノクローナル抗体ｃ１１−１４（アミノ酸の１２０〜１３０位に見出されるコアのＣ末端領域に対する抗体、ＨＣＶ１ポリタンパク質配列に関して番号付けされている）が、加えられる。ヒトＳＯＤ（ｈＳＯＤ）由来の配列およびｃ３３ｃ領域由来のエピトープを含む融合タンパク質が、この融合タンパク質のＳＯＤ部分に対する第２のＨＲＰ標識抗体と同様に、加えられる。ＳＯＤ−ｃ３３ｃ融合タンパク質は、抗ＮＳ３抗体に結合し、そして抗ＳＯＤ抗体は、次いで、ＳＯＤ−ｃ３３ｃ融合タンパク質に結合する。標識の検出は、ＨＣＶ感染の存在を表す。
【００９０】
本発明の別の代表的なアッセイを図８に示す。抗体アッセイの構成は、ＮＳ３／４ａおよびＭＥＦＡ１２の両方を使用する抗原−抗体−抗原サンドイッチ捕捉アッセイである。固体支持体は、上記の２つの抗コアモノクローナル抗体、ＮＳ３／４ａに対するエピトープ、および代表的なＭＥＦＡであるＭＥＦＡ１２（これは、ヒトＳＯＤの短縮型を含む）を含む。上記のアッセイのように、生物学的サンプルがこの固体支持体に加えられる。ＨＣＶコア抗原、ならびにＮＳ３／４ａエピトープおよびＭＥＦＡのエピトープに対する抗体は、サンプル中に存在し、これは固体支持体上の捕捉試薬に結合する。２つの抗原（１つは、ＮＳ３／４ａに結合するサンプル抗体（上記のような）と反応性であり、そして１つは、ＭＥＦＡ１２に結合するサンプル抗体と反応性である）が添加される。図８において、ＭＥＦＡ１２／サンプル抗体複合体と反応性の抗原は、ＳＯＤ分子とｃ２２ｋｓΔ４７−Ｌ４４Ｗとの間の融合物である。このｃ２２ｋｓ抗原はコア領域由来であり、そしてポリタンパク質のアミノ酸Ｌｙｓ１０〜Ｓｅｒ９９、ならびに通常存在するＡｒｇ４７の欠失、および４４位におけるＬｅｕのＴｒｐでの置換を含む。抗原検出結合体は、上記の第２のＨＲＰ標識モノクローナル抗ＳＯＤ抗体である。
【００９１】
上記の抗原／抗体組み合わせアッセイは、ＨＣＶコア抗原ならびにＮＳ３／４ａおよび／またはコアに対する抗体の両方が、同じアッセイにおいて同じ支持体により検出され得る場合、特に有利である。さらに、上記のように、さらなるＨＣＶエピトープ（例えば、ｃ１００、５−１−１、ＮＳ５抗原に対するＳＯＤ融合タンパク質）、およびポリタンパク質のコア領域におけるフレームシフトから生じるタンパク質（例えば、国際公開番号ＷＯ９９／６３９４１に記載されるようなタンパク質）は、ＨＣＶの他の非構造的エピトープを網羅する組み合わせカクテルにおいて使用され得る。
【００９２】
本発明のさらなる理解のために、より詳細な議論は、本発明のイムノアッセイにおける使用のための抗体の生成、このイムノアッセイにおける使用のためのポリペプチドの生成、およびこのイムノアッセイを実施する方法に関して以下に記載される。
【００９３】
（ＨＣＶイムノアッセイにおける使用のための抗体の生成）
上で説明したように、アッセイは、固体支持体（例えば、１つ以上の抗コア抗体）に結合した種々の抗体、およびＨＣＶ感染がサンプル中に存在する場合に形成される抗原／抗体複合体を検出する種々の抗体を利用する。これらの抗体は、ポリクローナル抗体調製物またはモノクローナル抗体調製物、単一特異的抗血清、ヒト抗体であってもよいし、例えば、ヒト化抗体、変性抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ）フラグメント、Ｆｖフラグメント、単一ドメイン抗体、二量体または三量体の抗体フラグメント構築物、ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、または問題の抗原に結合するそれらの機能的フラグメントのような抗体ハイブリッド抗体またはキメラ抗体であってもよい。
【００９４】
抗体は、当業者に周知の技術、ならびに例えば、米国特許第４，０１１，３０８号；同第４，７２２，８９０号；同第４，０１６，０４３号；同第３，８７６，５０４号；同第３，７７０，３８０号；および同第４，３７２，７４５号に記載される技術を使用して生成される。例えば、ポリクローナル抗体は、適切な動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）を、目的の抗原で免疫することによって生成される。免疫原性を増強するために、抗原は、免疫の前にキャリアに結合され得る。このようなキャリアは、当業者に周知である。免疫は、一般に、生理食塩水中、好ましくは、フロイントの完全アジュバントのようなアジュバント中の抗原を混合または乳化することによって、そして混合物またはエマルジョンを非経口的（一般に、皮下または筋肉内）に注射することによって行なわれる。動物は、一般に、好ましくは、フロイントの不完全アジュバントを使用して、生理食塩水中の抗原の１回以上の注射で、２〜６週後に追加免疫される。抗体はまた、当該分野で公知の方法を使用する、インビトロ免疫によって生成され得る。次いで、ポリクローナル抗血清は、免疫動物から得られる。例えば、抗ＨＣＶポリクローナル抗体の生成については、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号を参照のこと。
【００９５】
モノクローナル抗体は、一般に、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７の方法またはその改変物を使用して調製される。代表的には、マウスまたはラットが、上記のように免疫される。しかし、血清を抽出するために動物を出血させるのではなく、脾臓（および必要に応じていくつかの大きいリンパ節）が取り出され、そして単一の細胞に分離される。所望の場合、脾臓細胞は、抗原でコーティングしたプレートまたはウェルに細胞懸濁液を適用することによって、（非特異的に接着した細胞の除去後に）スクリーニングされ得る。Ｂ細胞（抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現する）はプレートに結合し、そして懸濁液の残りと共に洗い流されない。次いで得られたＢ細胞（または全ての分離した脾臓細胞）は、黒色腫細胞と融合するように誘導されてハイブリドーマを形成し、そして選択的な培地（例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「ＨＡＴ」）で培養される。得られたハイブリドーマは、限界希釈によってプレートされ、そして、免疫抗原に特異的に結合する（そして関連していない抗原に結合しない）抗体の生成についてアッセイされる。次いで、選択されたモノクローナル抗体スクリーニングハイブリドーマは、インビトロ（例えば、組織培養瓶または中空線維反応器中）またはインビボ（例えば、マウスの腹水のような）のいずれかで培養される。
【００９６】
種々の抗ＨＣＶモノクローナル抗体の生成は、例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；共有に係る、特許となった米国特許出願番号０８／４０３，５９０および同０８／４４４，８１８；およびＫａｓｈｉｗａｋｕｍａら、米国特許番号５，８７１，９０４号において記載されている。
【００９７】
上に説明されたように、目的の抗原を認識する能力を保持する抗体フラグメントはまた、目的のイムノアッセイにおいて用途を見出す。インタクトな抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗原結合部位を含む多数の抗体フラグメントが公知である。例えば、機能的な抗体フラグメントは、例えば、ペプシンを使用して、抗体分子から抗原結合を担わない定常領域を切断することによって生成され、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成する。これらのフラグメントは、２つの抗原結合部位を含むが、重鎖の各々から定常領域の一部分を欠く。同様に、所望な場合、Ｆａｂフラグメント（単一の抗原結合部位を含む）が、例えば、パパインでのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の消化によって、生成され得る。機能的フラグメント（重鎖および軽鎖の可変領域のみを含む）は、免疫グロブリン分子の組換え生成または優先的タンパク質分解切断のような標準的な技術を使用して、生成され得る。これらのフラグメントは、Ｆｖとして公知である。例えば、Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：２７０６−２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６を参照のこと。
【００９８】
単鎖Ｆｖ（「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」）ポリペプチドは、ペプチドコードリンカーによって連結されるＶＨコード遺伝子およびＶＬコード遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される共有結合したＶＨ−ＶＬヘテロ二量体である。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３。天然に凝集しているが化学的に分離した、抗体Ｖ領域由来の軽鎖および重鎖ポリペプチドを、抗原結合部位の構造に実質的に類似した三次元構造に折り畳まれるｓＦｖ分子に変換する化学的構造（リンカー）を区別および開発するための多数の方法が記載されている。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号、および同第４，９４６，７７８号を参照のこと。ｓＦｖ分子は、当該分野で記載される方法を使用して生成され得る。例えば、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号、および同第４，９４６，７７８号を参照のこと。設計基準は、一方の鎖のＣ末端と、他方の鎖のＮ末端との間の距離にわたる適切な長さを決定することを包含し、ここで、リンカーは、一般に、コイル化する傾向がないか、または二次構造を形成しない親水性低分子アミノ酸残基から形成される。このような方法は、当該分野で公知である。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号、および同第４，９４６，７７８号を参照のこと。適切なリンカーは、一般に、代替のセットのグリシンおよびセリン残基のポリペプチド鎖を含み、そして可溶性を増強するために、挿入されたグルタミン酸およびリジン残基を含み得る。
【００９９】
「ミニ抗体（ｍｉｎｉ−ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」または「ミニ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）」もまた、本発明を用いる用途が見出される。ミニ抗体は、ヒンジ領域によってｓＦｖから分離された、そのＣ末端にオリゴマー形成ドメインを含むｓＦｖポリペプチド鎖である。Ｐａｃｋら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１：１５７９−１５８４。オリゴマー形成ドメインは、さらなるジスルフィド結合によってさらに安定化され得る自己会合αヘリックス（例えば、ロイシンジッパー）を含む。このオリゴマー形成ドメインは、膜を横切る特定の方向への折り畳みと適合性であるように設計され、この折り畳みは、ポリペプチドの機能的な結合タンパク質へのインビボの折り畳みを容易にすると考えられているプロセスである。一般に、ミニ抗体は、当該分野で周知の方法を使用して生成される。例えば、Ｐａｃｋら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１：１５７９−１５８４；Ｃｕｍｂｅｒら（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９Ｂ：１２０−１２６を参照のこと。
【０１００】
（ＨＣＶイムノアッセイにおける使用のための抗原の生成）
上で説明したように、本発明の分子は、一般に、組換え的に生成される。従って、本発明と共に使用するための、ＨＣＶ抗原をコードするポリヌクレオチドは、分子生物学の標準的な技術を使用して作製され得る。例えば、上記の分子をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え方法を使用して（例えば、この遺伝子を発現する細胞由来のｃＤＮＡおよびゲノムライブラリをスクリーニングすることによって、またはこの遺伝子を含むことが知られているベクターから遺伝子を誘導することによって）得られ得る。さらに、所望の遺伝子は、当該分野（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号）に記載される技術を使用して、ウイルス核酸分子から直接単離され得る。目的の遺伝子はまた、クローン化よりむしろ合成的に生成され得る。これらの分子は、特定の配列について適切なコドンを用いて設計され得る。次いで、完全配列は、標準的な方法により調製される重複オリゴヌクレオチドから構築され、そして完全コード配列に構築される。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９；およびＪａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照のこと。
【０１０１】
従って、特定のヌクレオチド配列は、所望の配列を保有するベクターから得られ得るか、または当該分野で公知の様々なオリゴヌクレオチド合成技術（例えば、適切な場合、部位特異的変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を使用して、完全にもしくは部分的に合成され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、（前出）を参照のこと。特に、所望の配列をコードするヌクレオチド配列を得る１つの方法は、従来の自動化ポリヌクレオチド合成機で生成される重複合成オリゴヌクレオチドの相補的なセットをアニーリングし、続いて適切なＤＮＡリガーゼで連結し、そしてＰＶＲによりこの連結したヌクレオチド配列を増幅することによるものである。例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４０８１〜４０８８を参照のこと。さらに、オリゴヌクレオチド指向型合成（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ５４：７５〜８２）、既存のヌクレオチド領域のオリゴヌクレオチド指向型変異誘発（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３〜３２７、およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４〜１５３６）、およびＴ４ＤＮＡポリメラーゼを使用するギャップオリゴヌクレオチド（ｇａｐｐｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の酵素充填（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｆｉｌｌｉｎｇ−ｉｎ）（Ｑｕｅｅｎら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９〜１００３３）を本発明で使用して、改変されたかもしくは増大された抗原結合能力、および／または減少した免疫原性を有する分子を提供し得る。
【０１０２】
一旦、コード配列が調製または単離されると、このような配列は、任意の適切なベクターまたはレプリコンにクローン化され得る。多数のクローニングベクターが当業者に公知であり、そして適切なクローニングベクターの選択が可能である。適切なベクターとしては、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体または適切なコントロールエレメントと会合した場合に複製し得るウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
次いで、コード配列は、発現のために使用される系に依存して、適切なコントロールエレメントの制御下に置かれる。従って、このコード配列は、プロモータ、リボソーム結合部位（細菌の発現のため）、および必要に応じて、オペレーターの制御下に置かれ、その結果、目的のＤＮＡ配列は、適切な形質転換体によってＲＮＡに転写される。このコード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列（これは後に、翻訳後プロセシングにおいて、宿主によって除去され得る）を含んでも含まなくても良い。例えば、米国特許第４，４３１，７３９号；同第４，４２５，４３７号；同第４，３３８，３９７号を参照のこと。
【０１０４】
制御配列に加えて、宿主細胞の増殖に関連した配列の発現の調節を可能にする調節配列を加えることが所望であり得る。調節配列は、当業者に公知であり、そして例としては、調節化合物を含む、化学的刺激または物理的刺激に対してオンまたはオフにされる遺伝子の発現を引き起こすものが挙げられる。他の型の調節エレメントはまた、ベクター中に存在し得る。例えば、エンハンサーエレメントは、構築物の発現レベルを増加するために本明細書中で使用され得る。例としては、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー（Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：７６１）、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）に由来するエンハンサー／プロモーター（Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：６７７７）およびヒトＣＭＶに由来するエレメント（Ｂｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４１：５２１）（例えば、ＣＭＶイントロンＡ配列に含まれるエレメント（米国特許第５，６８８，６８８））が挙げられる。発現カセットはさらに、適切な宿主細胞において自律的に複製するための複製起点、１つ以上の選択マーカー、１つ以上の制限部位、高いコピー数についての可能性および強力なプロモーターを含む。
【０１０５】
発現ベクターは、特定のコード配列が適切な制御配列と共にベクター中に位置するように構築され、制御配列に対するコード配列の位置および配向は、コード配列が制御配列の「制御」下で転写されるように存在する（すなわち、制御配列のＤＮＡ分子に結合するＲＮＡポリメラーゼは、コード配列を転写する）。目的の分子をコードする配列の改変は、この目的を達成するために所望である。例えば、いくつかの場合において、適切な配向で配列が制御配列に付着するように（すなわち、リーディングフレームを維持するように）配列を改変することが必要であり得る。制御配列および他の調節配列は、ベクターへの挿入の前にコード配列に連結され得る。あるいは、コード配列は、制御配列および適切な制限部位をすでに含む発現ベクターに直接クローニングされ得る。
【０１０６】
上に説明されるように、目的の抗原の変異体またはアナログを生成することが所望であり得る。これは、特にＮＳ３／４ａに当てはまる。そうするための方法は、例えば、Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら、米国特許第５，８４３，７５２号およびＺｈａｎｇら、米国特許５，９９０，２７６号において記載されている。目的のアッセイにおける使用のためのこのＨＣＶタンパク質および他のＨＣＶタンパク質の変異体またはアナログは、配列の挿入によって、そして／または配列内での１つ以上のヌクレオチドの置換によって、目的のポリペプチドをコードする配列の一部を欠失することによって調製され得る。ヌクレオチド配列を改変するための方法（例えば、部位特異的変異誘発など）は、当該分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：４４８；Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒら（１９８７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５：７８６；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８；Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９：６４０９を参照のこと。
【０１０７】
分子は、昆虫系、哺乳動物系、細菌系、ウイルス系および酵母系を含む広範な種々の系において発現され得、これらは全て当該分野で公知である。
【０１０８】
例えば、昆虫細胞発現系（例えば、バキュロウイルス系）は、当業者に公知であり、そして例えば、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）において記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、特に、Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ（「ＭａｘＢａｃ」キット）から市販されている。同様に、細菌および哺乳動物細胞発現系は、当該分野で周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、において記載されている。酵母発現系はまた、当該分野で公知であり、そして例えば、Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂａｒｒら編、１９８９）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎにおいて記載されている。
【０１０９】
上の系を用いる使用のための多数の適切な宿主細胞がまた公知である。例えば、哺乳動物細胞株は、当該分野で公知であり、そして例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、乳児ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、ヒト胚腎細胞、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎（「ＭＤＢＫ」）細胞、およびその他を含むがこれらに限定されない、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株を含む。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．のような細菌宿主において、本発明の構築物を用いる用途を見出す。本発明において有用な酵母宿主としては特に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａが挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターを用いる使用のための昆虫細胞としては特に、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａおよびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉが挙げられる。
【０１１０】
目的のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、当該分野で周知の遺伝子送達技術を使用して、宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれ得るか、または適切な宿主細胞中の安定なエピソームエレメント上に維持され得る。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと。
【０１１１】
選択される発現系および宿主に依存して、分子は、タンパク質が発現される条件下で、上記の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を増殖することによって生成される。次いで、発現されたタンパク質は、宿主細胞から単離され、そして精製される。発現系が、タンパク質を増殖培地中に分泌する場合、生成物は、培地から直接精製され得る。生成物が分泌されない場合、生成物は細胞溶解物から単離され得る。適切な増殖条件および回収方法の選択は、当該分野の技量内である。
【０１１２】
種々のＨＣＶ抗原の組換え生成が記載されている。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．，国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８を参照のこと。
【０１１３】
（免疫診断アッセイ）
一旦生成されると、上記の抗コア抗体およびＮＳ３／４ａ抗原は、本イムノアッセイにおける使用のために適切な固体支持体上に配置される。本発明の目的のための固体支持体は、不溶性マトリクスである任意の物質であり得、そして剛性または半剛性の表面を有し得る。例示的な固体支持体としては、ニトロセルロースのような基材（例えば、膜またはマイクロタイターウェル形態）；ポリ塩化ビニル（例えば、シートまたはマイクロタイターウェル）；ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたはマイクロタイタープレート）；ポリフッ化ビニリデン；ジアゾ化紙；ナイロン膜；活性化ビーズ、磁気応答性樹脂などが挙げられるがこれらに限定されない。特定の支持体としては、プレート、ペレット、ディスク、キャピラリー、中空繊維、針、ピン、固体繊維、セルロースビーズ、孔−ガラスビーズ、シリカゲル、ジビニルベンゼンと必要に応じて架橋したポリスチレンビーズ、グラフトされたコポリ（ｃｏ−ｐｏｌｙ）ビーズ、ポリアクリルアミドビーズ、ラテックスビーズ、Ｎ−Ｎ’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンと必要に応じて架橋したジメチルアクリルアミドビーズ、および疎水性ポリマーでコーティングしたガラス粒子が挙げられる。
【０１１４】
所望される場合、固体支持体に付加される分子は、スチレン部分またはアクリレート部分を作製するために容易に官能基化され得、従って、ポリスチレン、ポリアクリレート、またはポリイミド、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリビニル、ポリジアセチレン、ポリフェニレン−ビニレン、ポリペプチド、多糖類、ポリスルホン、ポリピロール、ポリイミダゾール、ポリチオフェン、ポリエステル、エポキシ、シリカガラス、シリカゲル、シロキサン、ポリホスフェート、ヒドロゲル、アガロース、セルロースなどの他のポリマーへの分子の取り込みを可能にする。
【０１１５】
１つの状況において、固体支持体を、分子が十分に支持体に固定されるような適切な結合条件下で、まずＨＣＶ抗コア抗体およびＮＳ３／４ａエピトープ（本明細書中で集合的に「固相成分」と呼ばれる）、および必要に応じて１つ以上のＭＥＦＡと反応させる。時々、支持体への固定は、より優れた固相結合特性を有するタンパク質への抗原および／または抗体を最初に結合することによって強化され得る。適切なカップリングタンパク質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシニアン、免疫グロブリン分子、チログロブリン、オボアルブミンのような高分子、および当業者に周知の他のタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。支持体に分子を結合させるために使用され得る他の試薬としては、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマーなどが挙げられる。このような分子および抗原にこれらの分子を結合させる方法は、当業者に周知である。例えば、Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，Ｍ．Ａ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：２−１３；Ｈａｓｈｉｄａら（１９８４）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６：５６−６３；ならびにＡｎｊａｎｅｙｕｌｕおよびＳｔａｒｏｓ（１９８７）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３０：１１７−１２４を参照のこと。
【０１１６】
固体支持体を固相成分と反応させた後、任意の非固定固相成分を、洗浄することによって支持体から取り除き、次いで支持体結合成分を、適切な結合条件下で、ＨＣＶ抗体および抗原（本明細書中で集合的に「リガンド分子」と呼ばれる）を含むことが疑われている生物学的サンプルと接触させる。任意の結合していないリガンド分子を除去するために洗浄した後、支持体に結合した抗コア抗体と異なるエピトープに対して指向する第２の抗コア抗体を、適切な結合条件下で添加する。添加される抗コア抗体は、上記のように、検出可能な標識を含み、そして支持体に結合した抗コア抗体と反応したサンプル中に存在し得る任意のコア抗原を結合するように作用する。ＮＳ３／４Ａエピトープと順番に反応したサンプル中に存在する抗体と反応し得る１つ以上の抗原もまた、添加される。上記で説明したように、抗原は、代表的に、ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３領域から誘導され、特に、ＨＣＶのｃ３３ｃ領域から誘導される。これらから誘導されるエピトープの領域の説明に関しては、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ（１９８９）８９：１００１１−１００１５；国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；ならびに、一般に所有された、許可された米国特許出願第０８／４０３，５９０および０８／４４４，８１８を参照のこと。この抗原に対する標識抗体もまた、添加される。従って、抗体は、サンプル中に存在する抗ＮＳ３抗体と反応した抗原に結合する。この目的のために、ｃ３３ｃエピトープは、ｃ３３ｃとヒトスーパーオキシドジスムターゼ（ｈＳＯＤ）との間の融合として好都合に提供され、例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号に記載される方法によって組換え産生され得る。ヒトＳＯＤのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、公知であり、Ｈａｌｌｅｗｅｌｌら、米国特許第５，７１０，０３３号に報告される。従って、ヒトＳＯＤに対する標識抗体は、ＮＳ３／４ａエピトープ、このエピトープと反応するサンプル中の任意の抗体、およびサンプル中のその抗体と順に結合するポリペプチドの間で形成される複合体の存在を検出するために使用され得る。
【０１１７】
ＭＥＦＡが固体支持体上に存在する場合、ＭＥＦＡ上に存在する抗原に結合する生物学的サンプル由来の抗体と反応性である１つ以上のさらなる抗原もまた、アッセイに添加され得る。この状況において特に有用なことは、ＨＣＶのコア領域由来の抗原であり、より詳細には、ＨＣＶポリタンパク質の１１９Ｎ末端コアアミノ酸を含むｃ２２抗原由来であることである。ｃ２２由来の１つの特定の抗原は、ポリタンパク質のアミノ酸Ｌｙｓ１０〜Ｓｅｒ９９ならびに通常存在するＡｒｇ４７の欠失および４４位にＴｒｐの代わりのＬｅｕを含む、ｃ２２ｋｓ  Δ４７−Ｌ４４Ｗである。上記のｃ３３ｃエピトープに関して、この抗原は、ｈＳＯＤおよびヒトＳＯＤに対するその標識抗体との融合として提供され、サンプル中に存在する抗体と、ＮＳ３／４ａエピトープおよび／またはＭＥＦＡとの間に形成される複合体（これらの複合体はまた、ＨＣＶ抗原（例えば、ｃ３３ｃおよびｃ２２）と結合する）の存在を検出するために使用され得る。
【０１１８】
より詳細には、ＥＬＩＳＡ方法を、使用し得、ここで、マイクロタイタープレートのウェルを、固相成分と接触させる。次いで、リガンド分子を含むかまたは含むことが疑われる生物学的サンプルを、コーティングされたウェルに添加する。リガンド−分子の固定化された固相成分への結合を可能にするのに十分なインキュベーション期間の後、プレートを洗浄して、未結合の部分を除去し得、そして、検出可能に標識された２次結合分子（標識抗コア抗体）、ＮＳ３エピトープ含有分子、およびＮＳ３エピトープ含有部分に対する抗体を、添加される。これらの分子を、任意の捕獲サンプル抗原および抗体と反応させ、プレートを洗浄し、そして標識抗体の存在が、当該分野で周知の方法を用いて検出される。
【０１１９】
上記のアッセイ試薬（抗体および抗原を有するイムノアッセイ固体支持体、ならびに捕獲サンプルと反応する抗体および抗原を含む）をまた、適切な指示書および他の必要な試薬と共にキット中に提供して、上記のようにイムノアッセイを実行し得る。このキットはまた、使用する特定のイムノアッセイに依存して、適切な標識ならびに他のパッケージングされた試薬および材料（すなわち、洗浄緩衝液など）を含み得る。標準的なイムノアッセイ（例えば、上記に記載されるもの）を、これらのキットを使用して実行し得る。
【０１２０】
（ＩＩＩ．実験）
以下は、本発明を実行するための特定の実施形態の例である。本実施例は、例示目的のみのために提供され、そして本発明の範囲をいずれにも限定することは意図されない。
【０１２１】
使用した数値（例えば、量、温度など）に関して精度を確実にするための努力がなされたが、いくらかの実験誤差および偏差は、当然許容されるべきである。
【０１２２】
（実施例１）
（ＨＣＶ抗原／抗体の組み合わせイムノアッセイ）
本発明のＨＣＶ抗原／抗体の組み合わせイムノアッセイを、セロコンバージョン検出限界を試験し、そしてこれらの限界を以下のような他の市販で入手されるアッセイに対する限界と比較するために、他のＨＣＶアッセイと比較した。
【０１２３】
（Ａ．材料および方法）
（血液サンプル）市販のヒト血液サンプルのパネルを使用した。このようなパネルは、例えば、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＭＡ（ＢＢＩ）；Ｂｉｏｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ（ＢＣＰ）；およびＮｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ＢｏｃｏＲａｔａｎ，ＦＬ（ＮＡＢＩ）から入手可能である。表５および６に示した日は、血液を被験体から収集した日である。
【０１２４】
（モノクローナル抗体）モノクローナル抗体ｃ１１−３、ｃ１１−７およびｃ１１−１４を、Ｏｒｔｈｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙから入手した。ｃ１１−３およびｃ１１−７抗体は、コアのＮ末端部分（ＨＣＶ１ポリペプチドに対する番号付けでアミノ酸１０〜５３）に対して指向する。ｃ１１−１４モノクローナル抗体は、コアのＣ末端部分（ＨＣＶ１ポリペプチドに対する番号付けでアミノ酸１２０〜１３０）に対して指向する。ｃ１１−１４抗体は、標準的な手順を用いて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合体化されていた。
【０１２５】
モノクローナル抗体５Ａ−３は、ＳＯＤのアミノ酸１〜６５に対して指向された抗ＳＯＤ抗体であり、標準的な技術を使用して作製された。この抗体は、上記のようにＨＲＰに結合体化されていた。
【０１２６】
（Ｂ．抗原）
ｃ３３ｃ抗原（２６６アミノ酸、ＨＣＶ１ポリタンパク質のアミノ酸１１９２〜１４５７）を、５−１−１抗原の合成について記載された方法（Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９−３６２）によって、Ｅ．ｃｏｌｉ中で内部ＳＯＤ融合ポリペプチドとして発現させた。組換え抗原を、Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８９）８９：１００１１−１００１５に記載されるように精製した。ＳＯＤ−ｃ３３ｃの生産手順については、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許第５，３５０，６７１号もまた、参照のこと。
【０１２７】
本アッセイに使用されるＮＳ３／４ａエピトープは、図３に特定される配列を有するコンホメーションエピトープである。
【０１２８】
（Ｃ．イムノアッセイ形式）
Ａｂｂｏｔｔ  ＰＲＩＳＭアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ）は、市販され、そして抗体に基づく検出アッセイである。このアッセイを、製造者らの指示書を用いて実行した。
【０１２９】
ＯＲＴＨＯ  ＨＣＶ  バージョン  ３．０  ＥＬＩＳＡ試験システム（本明細書中、Ｏｒｔｈｏ  ３．０アッセイと称する、Ｏｒｔｈｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）は、抗体に基づく検出アッセイである。このアッセイを、製造者らの指示書を用いて実行した。
【０１３０】
Ｒｏｃｈｅ  Ａｍｐｌｉｃｏｒアッセイ（Ｒｏｃｈｅ，Ｐｌｅａｓａｎｔ，ＣＡ）は、市販のＰＣＲに基づくアッセイである。このアッセイを、製造者らの指示書を用いて実行した。
【０１３１】
Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  ＴＭＡアッセイ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）は、市販の転写媒介増幅アッセイである。このアッセイを、製造者らの指示書を用いて実行した。
【０１３２】
Ｏｒｔｈｏ抗原アッセイ（Ｏｒｔｈｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）は、抗原に基づく検出アッセイである。このアッセイを、製造者らの指示書を用いて実行した。
【０１３３】
本ＨＣＶ抗原／抗体の組み合わせイムノアッセイを、以下のように実行した。１×リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中、各々４ｍｇ／ｍＬの精製モノクローナル抗体Ｃ１１−７とＣ１１−３とを合わせ、そしてウェルを混合した。９０ｎｇのＮＳ３／４ａ組換え抗原を、同じコーティング緩衝液に添加した。この溶液は、コーティング前に３０分間混合した。２００μＬの上記の溶液を、９６ウェル  Ｃｏｓｔａｒ培地結合マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．）へ各ウェルにつき添加した。プレートを、１５〜３０℃で１６〜２４時間インキュベートした。プレートを、ｄＨ２Ｏを用いて２回洗浄し、続いて、３００μＬ／ウェル  後コーティング緩衝液（１％  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ），１×ＰＢＳ）を用いて１時間洗浄し、そして３００μＬ／ウェルの安定緩衝液（１×ＰＢＳ，１％  ＢＳＡ，マンニトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ），ゼラチン）を用いて１時間洗浄した。プレートを吸引し、そして、凍結乾燥機中、４℃で２４時間乾燥させた。プレートを、乾燥剤と一緒に小袋に入れた。
【０１３４】
抗原／抗体の組み合わせイムノアッセイを実行するために、１００μＬの増強溶解緩衝液（１％  Ｎ−ラウリルサルコシン、０．６５Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍｇ／ｍＬ  マウスＩｇＧ試験等級（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１％  スルフヒドリル改変ＢＳＡ（Ｂａｙｅｒ）、０．１％  カゼイン）を、このプレートに添加した。次いで、１００μＬのサンプルを、添加した。これを、振盪器上、４０℃で１時間インキュベートした。プレートを、Ｏｒｔｈｏ  Ｐｌａｔｅ  Ｗａｓｈｅｒ上、１×ＰＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて６回洗浄した。２００μＬの結合溶液（２５０ｎｇ／アッセイ  ＳＯＤ−ｃ３３ｃ抗原を有する１：７５希釈ｃ１１−１４−ＨＲＰ、ならびにＳＯＤ抽出物を含まないＨＣＶ３．０サンプル希釈物中の１：５０００希釈マウス抗ＳＯＤ−ＨＲＰ（ＯＲＴＨＯ  ＨＣＶ  バージョン  ３．０  ＥＬＩＳＡ試験システム（Ｏｒｔｈｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）（全て、添加の３０分前に調製した）。この溶液を、振盪しながら４０℃で４５分間インキュベートした。これを、上記のように６回洗浄し、そして２００μＬの基質溶液（１ＯＰＤ錠剤／１０ｍＬ）を、添加した。ＯＰＤ錠剤は、西洋ワサビペルオキシダーゼ反応の色素発生のためのｏ−フェニレンジアミンジハイドロクロライドおよび過酸化水素を含み、そしてＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販されている。これを、３０分間、１５〜３０℃で暗闇中インキュベートした。この反応を、５０ｍＬ  ４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４の添加によって停止させ、そしてプレートを、コントロールとしての６９０ｎｍでの吸光度に対して、４９２ｎｍで読み取った。
【０１３５】
（Ｄ．結果）
種々のアッセイの結果を、表５および表６に示し、これは示したようにＨＣＶ感染に曝露された血液サンプルで実施した２つの別々の実験を示す。斜線領域は、ウイルスの検出を示す。以下に示されるように、Ｃｈｉｒｏｎの組み合わせ抗原／抗体アッセイは、全てのサンプル中でセロコンバージョンを検出し、一方全ての他の抗体および抗原ベースのアッセイは、少なくとも１つのサンプルにおいてセロコンバージョンを検出することに失敗した。特に、いずれの抗体ベースのアッセイも、少なくとも１８日目までセロコンバージョンを検出しなかった（表５）。表６は、いずれの抗体ベースのアッセイも、ＨＣＶ感染の存在を２２日目で検出しなかったことを示す。さらに、Ｏｒｔｈｏ抗原ベースのアッセイは、８５日目からセロコンバージョンの検出に失敗した。
【０１３６】
従って、上記の結果に基づいて、新規の組み合わせ抗体／抗原アッセイが、他の従来の抗体および抗原ベースのアッセイを用いて得られる偽陰性数を減少させることは明らかである。
【０１３７】
【表５】
0004834279.tif 000006
【０１３８】
【表６】
0004834279.tif 000007
（実施例２）
（ＴｈｒからＰｒｏおよびＳｅｒからＩｌｅへの置換を伴うＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープの産生）
ＮＳ３／４ａのコンホメーションエピトープを以下の通りに得た。このエピトープは、図４Ａ〜４Ｄで指定した配列を有し、ネイティブな配列とは４０３位（ＨＣＶ−１全長配列のアミノ酸１４２８）および４０４位（ＨＣＶ−１全長配列のアミノ酸１４２９）で異なる。特に、ネイティブな配列の１４２８位で通常生じるＴｈｒはＰｒｏへと変異しており、そしてネイティブな配列の１４２９位で生じるＳｅｒは、Ｉｌｅへと変異している。
【０１３９】
特に、用いられる酵母発現ベクターは、上記のｐＢＳ２４．１であった。このイムノアッセイにおいて用いられる代表的なＮＳ３／４ａエピトープをコードするプラスミドｐｄ．ｈｃｖ１ａ．ｎｓ３ｎｓ４ａＰＩを、以下の通りに作製した。二工程手順を用いた。最初に、以下のＤＮＡ片を一緒に連結した：（ａ）５’ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、続いて配列ＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡ、イニシエーターＡＴＧ、およびアミノ酸１０２７で始まりアミノ酸１０４６のＢｇｌＩ部位へと続くＨＣＶ１ａについてのコドンを提供する合成オリゴヌクレオチド；（ｂ）ｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩ由来の６８３ｂｐのＢｇｌＩ−ＣｌａＩ制限フラグメント（アミノ酸１０４６〜１２７４をコードする）；ならびに（ｃ）ＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩで消化し、脱リン酸化し、そしてゲル精製したｐＳＰ７２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ登録番号Ｘ６５３３２）。プラスミドｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩを、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されているバキュロウイルス発現ベクターであるｐＡｃＨＬＴから誘導した。特に、ｐＡｃＨＬＴ  ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩベクターならびに以下のフラグメントを調製した：ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１０２７〜１３３６に対応する９３５ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＡｌｗｎＩ；ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１３３６〜１４１９に対応する２４７ｂｐのＡｌｗｎＩ−ＳａｃＩＩ；ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１４４９〜１５０９に対応する１７５ｂｐのＨｉｎｆＩ−ＢｇｌＩ；ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１５１０〜１７１１に対応する６１９ｂｐのＢｇｌＩ−ＰｓｔＩ＋転写終結コドン。ＨＣＶ−１ゲノムのアミノ酸１４２０〜１４４８に対応し、ＰＩ変異（Ｐｒｏへと変異させたＴｈｒ−１４２８、Ｉｌｅへと変異させたＳｅｒ−１４２９）を含む、合成によって作製した９１ｂｐのＳａｃＩＩ−ＨｉｎｆＩフラグメントを上記の１７５ｂｐのＨｉｎｆＩ−ＢｇｌＩフラグメントおよび６１９ｂｐのＢｇｌＩ−ＰｓｔＩフラグメントと連結し、そしてＳａｃＩＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＧＥＭ−５Ｚｆ（＋）ベクター中にサブクローン化した。ｐＧＥＭ−５Ｚｆ（＋）は、市販のＥ．ｃｏｌｉベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ登録番号Ｘ６５３０８）である。コンピテントなＨＢ  １０１細胞の形質転換、個々のクローンのミニスクリーニング分析および配列確認後、ｐＧＥＭ５．ＰＩクローン２由来の８８５ｂｐのＳａｃＩＩ−ＰｓｔＩフラグメントをゲル精製した。このフラグメントを、上記のＥｃｏＲＩ−ＡｌｗｎＩ  ９３５ｂｐフラグメント、ＡｌｗｎＩ−ＳａｃＩＩ  ２４７ｂｐフラグメントおよびｐＡｃＨＬＴ  ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩベクターと連結した。得られた構築物を、ｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩと命名した。
【０１４０】
上記の連結混合物をＨＢ１０１コンピテント細胞中に形質転換し、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬｕｒｉａ寒天プレートにプレーティングした。個々のクローンのミニプレップ分析によって推定のポジティブを同定し、そのうちの２つを増幅した。ｐＳＰ７２  １ａＨＣのクローン番号１およびクローン番号２についてのプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキットを用いて調製し、そして配列決定した。
【０１４１】
次いで、以下のフラグメントを一緒に連結した：（ａ）ｐＳＰ７２１ａＨＣ  ＃１由来の７６１ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＣｌａＩフラグメント（ｐＳＰ７２．１ａＨＣを、以下を一緒に連結することによって作製した：ＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩで消化したｐＳＰ７２、５’ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を提供する合成オリゴヌクレオチド、続いて配列ＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡ、開始コドンＡＴＧおよびアミノ酸１０２７で始まり、アミノ酸１０４６でのＢｇｌＩＩ部位へと続く、ＨＣＶ１ａについてのコドン、ならびにｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩ由来の６８３ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＣｌａＩ制限フラグメント（アミノ酸１０４６〜１２７４をコードする））；（ｂ）酵母ハイブリッドプロモーターＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨについての１３５３ｂｐのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント；（ｃ）ｐＡｃＨＬＴｎｓ３ｎｓ４ａＰＩ由来の１３２０ｂｐのＣｌａＩ−ＳａｌＩフラグメント（Ｔｈｒ  １４２８がＰｒｏへと変異し、そしてＳｅｒ  １４２９がＩｌｅへと変異したＨＣＶ１ａアミノ酸１０４６〜１７１１をコードする）；ならびに（ｄ）ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化し、脱リン酸化し、そしてゲル精製したｐＢＳ２４．１酵母発現ベクター。連結混合物をコンピテントなＨＢ１０１中へと形質転換し、そして１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬｕｒｉａ寒天プレートにプレーティングした。個々のコロニーのミニプレップ分析によって、予想された３４４６ｂｐのＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ挿入物（ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、イニシエーターコドンＡＴＧおよびアミノ酸１０２７〜１７１１のＨＣＶ１ａ  ＮＳ３／４ａ（図４Ａ〜図４Ｄのアミノ酸１〜６８６として示す）（Ｔｈｒ  １４２８（図４Ａ〜４Ｄのアミノ酸位置４０３）がＰｒｏへと変異し、そしてＳｅｒ  １４２９（図４Ａ〜４Ｄのアミノ酸位置４０４）がＩｌｅへと変異している）から構成される）を有するクローンを同定した。この構築物を、ｐｄ．ＨＣＶ１ａ．ｎｓ３ｎｓ４ａＰＩと命名した（図５を参照のこと）。
【０１４２】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＡＤ３をｐｄ．ＨＣＶ１ａ．ｎｓ３ｎｓ４ａＰＩで形質転換し、そして１つの形質転換体を、培地中のグルコースの枯渇後の発現についてチェックした。組換えタンパク質は、クマシーブルー染色によって検出し、そしてＮＳ３のヘリカーゼドメインに対するポリクローナル抗体を用いて免疫ブロット分析によって確認したところ、酵母において高いレベルで発現された。
【０１４３】
（実施例３）
（ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープの精製）
ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープを以下の通りに精製した。ＮＳ３／４ａエピトープを発現する、上記由来のＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞を、上記の通りに収集した。この細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１μＭペプスタチン、１μＭロイペプチン）中に懸濁し、そして１：１：１の細胞：緩衝液：０．５ｍｍガラスビーズの比でガラスビーズを用いて、Ｄｙｎｏ−Ｍｉｌｌ（Ｗａｂ  Ｗｉｌｌｙ  Ａ．Ｂａｃｈｏｆｏｎ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）またはそれに相当する装置において溶解した。溶解産物を４℃で３０１００×ｇで３０分間遠心分離し、そして不溶タンパク質画分を含むペレットを洗浄緩衝液（６ｍｌ／ｇ出発細胞ペレット重量）に添加し、そして室温で１５分間揺り動かした。洗浄緩衝液は、５０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ８．０）、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．０５％オクチルグルコシド、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１μＭペプスタチン、１μＭロイペプチンからなっていた。細胞破片を、３０１００×ｇで３０分間、４℃での遠心分離によって取り出した。上清を捨て、そしてペレットを保持した。
【０１４４】
タンパク質を、このペレットから以下の通りに抽出した。６ｍｌ／ｇの抽出緩衝液を添加し、そして室温で１５分間揺り動かした。この抽出緩衝液は、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  β−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１μＭペプスタチン、１μＭロイペプチンからなっていた。これを、３０１００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。上清を保持し、そして以下の式を用いて１７．５％になるように硫酸アンモニウムを添加した：上清の容積（ｍｌ）×ｘ％硫酸アンモニウム／（１−ｘ％硫酸アンモニウム）＝上清へと添加される４．１Ｍ飽和硫酸アンモニウムのｍｌ。氷上で攪拌しながら硫酸アンモニウムを滴下し、そして溶液を氷上で１０分間攪拌した。溶液を１７７００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離し、そしてペレットを保持し、そして２℃〜８℃で４８時間まで保存した。
【０１４５】
ペレットを再懸濁し、そしてポリＵカラム（Ｐｏｌｙ  Ｕ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に４℃で以下の通りに流した。ペレットを、ペレットの重量１グラムあたり６ｍｌのポリＵ平衡化緩衝液中に再懸濁した。この平衡化緩衝液は、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ（新たに添加した）、１０％グリセロール、１．２オクチルグルコシドからなっていた。この溶液を４℃で１５分間で揺り動かし、そして３１０００×ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。
【０１４６】
ポリＵカラム（１グラムの出発ペレット重量あたり１ｍｌ樹脂）を調製した。線形流速は６０ｃｍ／時間であり、そしてパッキング流速は６０ｃｍ／時間の１３３％であった。このカラムを平衡化緩衝液で平衡化し、そして再懸濁した硫酸アンモニウムペレットの上清を、この平衡化したカラムにローディングした。このカラムを、平衡化緩衝液でベースラインになるまで洗浄し、そしてタンパク質を、以下のポリＵ溶出緩衝液中で１段階溶出で溶出させた：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ（新たに添加した）、１０％グリセロール、１．２オクチルグルコシド。カラムの溶出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（クマシー染色した）で泳動し、そしてアリコートを凍結して−８０℃で保存した。ＮＳ３／４ａエピトープの存在を、ＮＳ３プロテアーゼドメインに対するポリクローナル抗体および５−１−１エピトープ（ＨＣＶ  ４ａ）に対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットによって確認した。
【０１４７】
さらに、プロテアーゼ酵素活性を、以下の通りにして精製の間、モニタリングした。ＮＳ４Ａペプチド（ＫＫＧＳＶＶＩＶＧＲＩＶＬＳＧＫＰＡＩＩＰＫＫ）およびＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープ含有サンプルを９０μｌの反応緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．０５  ｎ−ドデシルＢ−Ｄ−マルトシド、５ｍＭ  ＤＴＴ）中に希釈し、そして室温で３０分間混合させた。９０μｌの混合物をマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に添加し、そして１０μｌのＨＣＶ基質（ＡｎａＳｐｅｃ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）を添加した。プレートを混合し、そしてＦｌｕｏｓｔａｒプレートリーダーで読み取った。結果を、１分間あたりの相対蛍光単位（ＲＦＵ）で表した。
【０１４８】
これらの方法を用いて、１Ｍ  ＮａＣｌ抽出物の産物は３．７ＲＦＵ／分の活性を含んでおり、硫酸アンモニウム沈澱物は７．５ＲＦＵ／分の活性を有し、そしてポリＵ精製の産物は１８．５ＲＦＵ／分の活性を有していた。
【０１４９】
（実施例４）
（競合研究）
以下の競合研究を、ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープが、他のＨＣＶ抗原と異なる抗体を検出するか否かを評価するために実施した。詳細には、ＮＳ３／４ａ抗原を、以下のようにしてｃ２００抗原と比較した。
【０１５０】
上記のように生成された０．５μｇおよび１．０μｇのＮＳ３／４ａまたはｃ２００（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９２）１５：１９−２５、ＯＲＴＨＯ  ＨＣＶ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０  ＥＬＩＳＡ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙにおいて利用可能）を、総量２２０μｌ（１×ＰＢＳ）で２０μｌのサンプルＰＨＶ９１４−５（感染個体の血液から獲得された初期セロコンバージョンの採血）と混合した。この混合物を、マイクロウェル中で３７℃で１時間インキュベートした。次いでこの混合物を、ＮＳ３／４ａコーティングしたプレートに移し、そして３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、そして以下のようにしてアッセイした。
【０１５１】
１μｇのｃ２００抗原を、総量約２２０μｌ中の１０μｌのサンプルＰＨＶ９１４−５に添加した。この混合物を、マイクロウェル中で３７℃で１時間インキュベートし、そして２００μｌをＮＳ３／４ａコーティングしたプレートに移し（１００ｎｇ／アッセイ）、そして３７℃で１時間インキュベートした。プレートを、１×ＰＢＳ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて５回洗浄した。２００μｌの結合溶液（上記）を添加し、そしてプレートをインキュベートし、そしてアッセイした。ＰＨＶ９１４−５および１×ＰＢＳからなるコントロール（抗原を含まない）もまた上記の通り処理した。
【０１５２】
結果を表７に示す。４列目に示される％阻害結果は、３列目−｛（２列目／３列目）×１００｝として算出する。見られ得る通り、これらのデータは、ＮＳ３４ａが、初期セロコンバージョン抗体により中和され、そしてｃ２００は中和されないことを示す。ＰＨＶ９１４−５  ｃ３３ｃ初期セロコンバージョンパネルのメンバーにおける抗体が、プレート上にコーティングされたＮＳ３４ａと反応する場合、強いシグナルを達成した。ｃ２００抗原は、これらの抗体により中和されなかった。このことは、表７の上パネルに示される。ＮＳ３４ａをＰＨＶ９１４−５サンプルと混合した場合、それは中和され、従って、マイクロプレート上にコーティングされたＮＳ３４ａと反応する抗体は、サンプル中に存在しなかった。これらのデータは、ＮＳ３４ａが、ｃ２００により検出される抗体とは異なるクラスの抗体を検出し得ることを示す。
【０１５３】
【表７】
0004834279.tif 000008
（実施例５）
（ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープの安定性の研究）
アッセイの性能に対するＮＳ３／４ａエピトープの安定性の役割を評価するために、以下の研究を実施して、室温での時間に対するＮＳ３／４ａの免疫反応性を決定した。小アリコートのストックＮＳ３／４ａを、表８に示される間隔で、室温に静置し、次いで凍結させた。全てのバイアルを同時にコーティングし、そして２つの初期ＮＳ３セロコンバージョンパネルに対して試験した。
【０１５４】
表８に見られる通り、ＮＳ３／４ａストックは安定ではなく、そして時間と共に免疫反応性が減少する。さらに、ＮＳ３／４ａのコンホメーションを維持することは、免疫反応性のために必須である。
【０１５５】
さらなる安定性の研究を以下の通り実施した。標準的な手順を用いてＮＳ３／４ａに対して作製された２つのコンホメーションモノクローナル抗体を、抗ＨＣＶ初期セロコンバージョンパネルと置き換えた。ストックＮＳ３／４ａバイアルを、室温にて３、６、および２４時間間隔で保存した。凍結バイアル由来のＮＳ３／４ａを９０ｎｇ／ｍｌでコーティングし、そして上記の手順を用いてアッセイした。結果は、２つのモノクローナル抗体が実際にコンホメーション抗体であり、そしてそれらの反応性は室温でのストックＮＳ３／４ａ抗原の操作に対して感受性であったことを示唆した。ポジティブコントロールのモノクローナル抗体の反応性は変化しなかった。
【０１５６】
【表８】
0004834279.tif 000009
（実施例６）
（変性ＮＳ３／４ａに対するＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープの免疫反応性）
上記のように生成されたＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープの免疫反応性を、ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープ調製物に最終濃度２％でＳＤＳを添加することにより変性させたＮＳ３／４ａと比較した。変性ＮＳ３／４ａおよび立体構造性のＮＳ３／４ａを、上記のようにマイクロタイタープレート上にコーティングした。ｃ２００抗原（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９２）１５：１９−２５、ＯＲＴＨＯ  ＨＣＶ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０  ＥＬＩＳＡ  Ｔｅｓｔ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｏｒｔｈｏ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｒａｒｉｔａｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙにおいて利用可能）もまた、マイクロタイタープレート上にコーティングした。処方物中の還元剤（ＤＴＴ）および界面活性剤（ＳＤＳ）の存在に起因して非立体構造性であると推測されるｃ２００抗原を、比較として用いた。
【０１５７】
免疫反応性を、２つの初期ＨＣＶセロコンバージョンパネルＰＨＶ９０４およびＰＨＶ９１４（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＭＡから市販されているヒト血液サンプル）に対して試験した。これらの結果を表９に示す。これらのデータは、変性または直鎖形態のＮＳ３／４ａ（およびｃ２００）が、ＮＳ３／４ａコンホメーションエピトープと同じくらい早く初期セロコンバージョンパネルを検出しないことを示唆する。
【０１５８】
【表９】
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コンホメーションエピトープの免疫反応性を、標準的な手順を用いて作製されたＮＳ３／４ａに対するモノクローナル抗体を用いても試験した。次いで、これらのモノクローナル抗体を、ＮＳ３／４ａおよび変性ＮＳ３／４ａならびにｃ２００抗原に対して、ＥＬＩＳＡフォーマットにおいて試験した。これらのデータは、抗ＮＳ３／４ａモノクローナル抗体が、表１０に示すセロコンバージョンパネルと同様の様式で、ＮＳ３／４ａおよび変性ＮＳ３／４ａと反応することを示す。この結果はまた、初期ｃ３３ｃセロコンバージョンパネルに対する反応性において類似するモノクローナル抗体が作製され得る場合、ＮＳ３／４ａが本質的に立体構造性であることのさらなる証拠を提供する。
【０１５９】
【表１０】
0004834279.tif 000011
従って、新規のＨＣＶ検出アッセイを開示した。前述のことから、本発明の特定の実施形態が、例示の目的で本明細書中に記載されているが、本発明の意図および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＨＣＶゲノムの模式的表現であり、本発明のアッセイ試薬（タンパク質および抗体）が由来するポリタンパク質の種々の領域を示す。
【図２】  図２は、本発明の代表的な抗体／抗原組合せアッセイの模式図である。
【図３】  図３は、本発明のアッセイにおける使用のための代表的なＮＳ３／４ａコンホメーション抗原のアミノ酸配列を示す。１８２位の太文字のアラニンは、この位置に通常存在するネイティブなセリンに置換される。
【図４】  図４Ａ〜４Ｄは、本発明のアッセイにおける使用のための別の代表的なＮＳ３／４ａコンホメーション抗原のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。図４Ａ〜４Ｄの４０３位および４０４位のアミノ酸は、ＨＣＶ−１のネイティブなアミノ酸配列のＰｒｏのＴｈｒへの置換、およびＩｌｅのＳｅｒへの置換を表す。
【図５】  図５は、ｐｄ．ＨＣＶ１ａ．ｎｓ３ｎｓ４ａＰＩの構築の模式図である。
【図６】  図６は、ＭＥＦＡ  １２の模式的表現である。
【図７】  図７Ａ〜７Ｆは、ＭＥＦＡ  １２のＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を示す。
【図８】  図８は、ＭＥＦＡ  １２を使用する、本発明の代表的なイムノアッセイの模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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