(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩および（b）該蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドである下式：
【化１−１】
0004799837.tif 000004
〔式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭化水素基またはアシルを示す。〕で表される化合物またはその塩を用いることを特徴とする、該蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法。
【請求項２】
Ｒがヒドロキシメチル、ホルミルまたは４−ヒドロキシフェニルカルバモイルである請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
リガンドが、全trans-レチノール、全trans-レチナールまたは4-ヒドロキシフェニルレチナミドである請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
（a）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有する前記リガンドを、該蛋白質またはその塩に接触させた場合と、（b）該リガンドおよび試験化合物を、該蛋白質またはその塩に接触させた場合における、該リガンドの該蛋白質またはその塩に対する結合量を測定し、比較する、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
（a）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有する前記リガンドを、該蛋白質またはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、（b）該リガンドおよび試験化合物を、該蛋白質またはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、該リガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較する、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩が、該蛋白質またはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質またはその塩である請求項５記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
リガンドが、標識したリガンドである請求項４〜６のいずれか1項に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
（a）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有する前記リガンドを、該蛋白質またはその塩に接触させた場合と、（b）該リガンドおよび試験化合物を、該蛋白質またはその塩に接触させた場合における、該蛋白質またはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、比較する、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
（a）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有する前記リガンドを、該蛋白質またはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、（b）該リガンドおよび試験化合物を、該蛋白質またはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、該蛋白質またはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、比較する、請求項１記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩が、該蛋白質またはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質またはその塩である請求項９記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
（a）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩および（b）該蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドである下式：
【化１−２】
0004799837.tif 000005
〔式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭化水素基またはアシルを示す。〕で表される化合物またはその塩を含有することを特徴とする、該蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（i）GPR30受容体、および（ii）該受容体と、特異的に結合する能力を有するリガンドを用いる医薬のスクリーニング方法およびスクリーニング用キット、該スクリーニング方法またはキットによって得られうる化合物などに関する。詳細には、癌や心疾患などの予防・治療剤などのスクリーニング方法およびスクリーニング用キットなどに関する。
【背景技術】
【０００２】
G protein-coupled receptor（GPCR）は、7回膜貫通型受容体で、ホルモン、神経伝達物質、サイトカインや他の分子のシグナルを細胞膜内へ伝える働きを行っている。GPR30はGPCRの一つで、そのリガンドは報告されていない。ヒトGPR30（hGPR30）(BBRC 228巻, 285-292頁，1996年)関連については、以下のような報告がある。
ヒトさいたい静脈内皮細胞をShear Stressにさらすと、hGPR30の発現量は増加する (BBRC 240巻, 734-741頁，1997年)。心筋由来細胞におけるラットGPR30（rGPR30、GPR41とも呼ばれる）の発現量は、低酸素刺激後に通常の培養に戻すことにより誘導される（J. Biol. Chem. 276巻, 26453-26460頁，2001年）。hGPR30は、エストロジェン・レセプター（ER）が発現している乳癌組織、乳癌由来細胞株および胎盤に発現している（非特許文献１：  Genomics 45巻, 607-617頁，1997年）。乳癌由来細胞MCF7に対して、エストロゲン存在下でプロゲスチン刺激を行うと、GPR30の発現量は増加する（非特許文献２：  Endocrinology 143巻(9)，3376-3384頁，2002年）。性ホルモンは多くの生殖機能の調節を行うことが知られ、例えば、子宮ではプロゲステロンはエストロゲンが誘導する子宮内膜上皮細胞の増殖を阻害する。一方、乳腺でのプロゲステロンの働きはまだ解明されていないことが多い。プロゲスチンは乳癌細胞、正常な乳腺上皮細胞の増殖を阻害する。プロゲスチンによるMCF7細胞の増殖阻害はGPR30の発現量が増加することにより引き起こされることをanti sense RNAを用いた実験により示し、GPR30が乳癌由来細胞の増殖の抑制に関わっている可能性が示された（非特許文献２：  Endocrinology 143巻(9), 3376-3384頁, 2002年）。
4-ヒドロキシフェニルレチナミド（4-HPR）は、核内受容体のRARのアゴニストであること、多種の癌細胞に対しアポトーシスを引き起こすことが報告されている（非特許文献３：  The Journal of Biological Chemistry 271巻(37), 22441-22446頁，1996年）。
【非特許文献１】Genomics 45巻, 607-617頁，1997年)
【非特許文献２】Endocrinology 143巻(9)，3376-3384頁，2002年
【非特許文献３】The Journal of Biological Chemistry 271巻(37), 22441-22446頁，1996年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
安全で優れた癌の予防・治療剤が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者たちは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、4-HPRまたは全trans-レチノール刺激で、GPR30発現CHO細胞の細胞内カルシウムを特異的に上昇させること、さらにはレチノイド類がGPR30のリガンドであることを見出した。4-HPRのアポトーシス促進作用は主にRARbetaの作用であると考えられているが、一方、RARbetaを介さないアポトーシスもあると考えられており、GPR30を介したアポトーシス反応もあり得る。よって、GPR30とレチノイド類とを用いて、癌などに有効な医薬の探索が可能となる。これらの知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、
（１）  （a）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩および（b）該蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを用いることを特徴とする、該蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（２）  リガンドがレチノイドまたはその類縁体である上記（１）記載のスクリーニング方法、
（３）  リガンドが、下式：
【化２】
0004799837.tif 000002
〔式中、Ｒは置換基を有していてもよい炭化水素基またはアシルを示す。〕で表される化合物またはその塩〔以下、化合物（I）と略記することもある〕である上記（１）記載のスクリーニング方法、
（４）  Ｒがヒドロキシメチル、ホルミルまたは４−ヒドロキシフェニルカルバモイルである上記（３）記載のスクリーニング方法、
（５）  リガンドが、全trans-レチノール、全trans-レチナールまたは4-ヒドロキシフェニルレチナミドである上記（１）記載のスクリーニング方法、
（６）  配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表わされるアミノ酸配列である上記（１）記載のスクリーニング方法、
（７）  （a）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（b）該リガンドおよび試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、該リガンドの該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する結合量を測定し比較する、上記（１）記載のスクリーニング方法、
（８）  （a）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、（b）該リガンドおよび試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、該リガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較する、上記（１）記載のスクリーニング方法、
（９）  配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記（８）記載のスクリーニング方法、
（１０）  リガンドが、標識したリガンドである上記（７）〜（９）記載のスクリーニング方法、
（１１）  （a）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合と、（b）該リガンドおよび試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に接触させた場合における、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、比較する、上記（１）記載のスクリーニング方法、
（１２）  （a）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、（b）該リガンドおよび試験化合物を、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を介した細胞刺激活性を測定し、比較する、上記（１）記載のスクリーニング方法、
（１３）  配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩が、該蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩である上記（１２）記載のスクリーニング方法、
（１４）  （a）配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩および（b）該蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンドを含有することを特徴とする、該蛋白質またはその塩と該リガンドとの結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
（１４ａ）  上記（１）記載のスクリーニング方法または上記（１４）記載のスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩、
（１４ｂ）  化合物が、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩とリガンドとの結合を阻害する化合物またはその塩である上記（１４ａ）記載の化合物またはその塩、
（１４ｃ）  アゴニストである上記（１４ｂ）記載の化合物またはその塩、
（１４ｄ）  アンタゴニストである上記（１４ｂ）記載の化合物またはその塩、
（１４ｅ）  上記（１４ｃ）記載の化合物またはその塩を含有してなる癌の予防・治療剤、
（１４ｆ）  上記（１４ｃ）記載の化合物またはその塩を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤、
（１４ｇ）  上記（１４ｄ）記載の化合物またはその塩を含有してなる心疾患の予防・治療剤、
（１４ｈ）  上記（１４ｄ）記載の化合物またはその塩を含有してなる心筋細胞のアポトーシスの予防・治療剤、
（１５）  配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる癌の予防・治療剤、
（１６）  配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤、
（１７）  配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる心疾患の予防・治療剤、
（１８）  配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる心筋細胞のアポトーシスの予防・治療剤、
（１９）  配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩と特異的に結合する能力を有するリガンド、
（２０）  配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進することを特徴とする癌の予防・治療法、
（２１）  配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進することを特徴とする癌細胞のアポトーシス促進法、
（２２）  配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする心疾患の予防・治療法、
（２３）  配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする心筋細胞のアポトーシスの予防・治療法、
（２４）  配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする癌の予防・治療法、
（２５）  配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする癌細胞のアポトーシス促進法、
（２６）  配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする心疾患の予防・治療法、
（２７）  配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に投与することを特徴とする心筋細胞のアポトーシスの予防・治療法、
（２８）  癌の予防・治療剤の製造のための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用、
（２９）  癌細胞のアポトーシス促進剤の製造のための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用、
（３０）  心疾患の予防・治療剤の製造のための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用、
（３１）  心筋細胞のアポトーシスの予防・治療剤の製造のための、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の使用などに関する。
【０００６】
以下、「配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質またはその部分ペプチドもしくはその塩」を「本発明の受容体」または「本発明の蛋白質」と略記する場合がある。さらに、「本発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンド」を「本発明のリガンド」と略記する場合がある。
さらに、本発明は、
（i）標識したＧＴＰγＳの存在下、本発明のリガンドを本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合における、本発明の受容体細胞膜画分へのＧＴＰγＳ結合促進活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ii）細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質の存在下、本発明のリガンドを本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、該細胞の細胞内ｃＡＭＰの産生抑制活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（iii）細胞内ｃＡＭＰ量を増加させる物質の存在下、本発明のリガンドを、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、ＣＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（iv）本発明のリガンドを、標識したアラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、標識したアラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、アラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（v）本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（vi）標識したイノシトールの存在下、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、イノシトール三リン酸産生活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（vii）本発明のリガンドを、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、ＴＲＥ−レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（viii）本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞増殖を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（ix）標識したルビジウムの存在下、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、標識したルビジウムの流出活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（x）本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞外のｐＨ変化を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（xi）ヒスチジン合成遺伝子導入本発明の受容体発現酵母を、ヒスチジン欠乏培地で培養し、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を接触させ、該酵母の生育を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法、
（xii）本発明のリガンドを、本発明の受容体遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体遺伝子ＲＮＡ導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させた場合における、細胞膜電位の変化を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニング方法なども提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットで得られうる化合物またはその塩（好ましくはGPR30アゴニスト）などは、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、卵巣癌、血液腫瘍など）の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤などとして有用である。本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットで得られうる化合物またはその塩（好ましくはGPR30アンタゴニスト）などは、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）の予防・治療剤、心筋細胞のアポトーシスの予防・治療剤などとして有用である。
また、本発明の受容体（例、GPR30など）およびそのリガンド（例、レチノイドおよびその類縁体など）は、癌、心疾患などの予防・治療作用を有する化合物またはその塩のスクリーニングに有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例えば、網膜細胞、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、網膜、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など、または血球系の細胞もしくはその培養細胞（例、MEL，M1，CTLL-2，HT-2，WEHI-3，HL-60，JOSK-1，K562，ML-1，MOLT-3，MOLT-4，MOLT-10，CCRF-CEM，TALL-1，Jurkat，CCRT-HSB-2，KE-37，SKW-3，HUT-78，HUT-102，H9，U937，THP-1，HEL，JK-1，CMK，KO-812，MEG-01など）に由来する蛋白質であってもよく、合成蛋白質であってもよい。
【０００９】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列などがあげられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値＝10；ギャップを許す；マトリクス＝BLOSUM62；フィルタリング＝OFF）にて計算することができる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同質の活性を有する蛋白質などが好ましい。配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列、配列番号：４で表されるアミノ酸配列などが挙げられる。
実質的に同質の活性としては、例えば、リガンド結合活性、シグナル情報伝達作用などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的に同質であることを示す。したがって、リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．５〜２０倍、より好ましくは約０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性やシグナル情報伝達作用などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができるが、例えば、後に記載するリガンドの決定方法やスクリーニング方法に従って測定することができる。
【００１０】
また、本発明の受容体としては、（i）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iii）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（iv）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜１００個程度、好ましくは１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または（v）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質なども用いられる。
本発明の受容体の具体例としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質（ヒトGPR30）、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質（ラットGPR30）、配列番号：３で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質（マウスGPR30）、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質（ヒトGPR30）などが挙げられる。
【００１１】
本発明の受容体の部分ペプチド（以下、本発明の部分ペプチドと称する場合がある）としては、後述の医薬等のスクリーニング方法に用いることのできる部分ペプチドであれば、いかなるものであってもよく、例えば、本発明の蛋白質分子のうち、細胞膜の外に露出している部位であって、実質的に同質のリガンド結合活性などを有するものなどが用いられる。
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質の部分ペプチドとしては、疎水性プロット解析において細胞外領域（親水性（Hydrophilic）部位）であると分析された部分を含むペプチドである。また、疎水性（Hydrophobic）部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個別に含むペプチドも用い得るが、複数のドメインを同時に含む部分のペプチドでもよい。
本発明の部分ペプチドのアミノ酸の数は、本発明の蛋白質の構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、より好ましくは１００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが好ましい。
ここで、「実質的に同質の活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質の活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
また、本発明の部分ペプチドは、（i）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が欠失し、（ii）上記アミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは、１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数個（１〜５個））のアミノ酸が付加し、または（iii）上記アミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは、１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
具体例としては、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列の第５９〜１０２番目、第１６７〜１９８番目、第２０３〜２２４番目または第３１５〜３３８番目のアミノ酸配列を含む部分ペプチドなどが用いられる。
【００１２】
本発明の受容体および本発明の部分ペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。Ｃ末端はカルボキシ（-COOH）、カルボキシレート（-COO-）、アミド（-CONH2）またはエステル（-COOR）であってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ1-6アルキル、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ3-8シクロアルキル、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ6-12アリール、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ1-2アルキルもしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ1-2アルキルなどのＣ7-14アラルキルのほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチルなどが用いられる。
本発明の受容体および本発明の部分ペプチドがＣ末端以外にカルボキシ（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシがアミド化またはエステル化されているものも本発明の受容体および本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の受容体および本発明の部分ペプチドには、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル、アセチルなどのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシルなど）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、-OH、-SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル、アセチルなどのＣ1-6アルカノイルなどのＣ1-6アシルなど）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
【００１３】
本発明の受容体または本発明の部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００１４】
本発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンド（本発明のリガンド）としては、本発明の受容体と特異的に結合するものであれば、何れの物であってもよい。例えば、本発明の受容体との結合の解離定数が１０μＭ以下、好ましくは２μＭ以下、さらに好ましくは１μＭ以下、特に好ましくは２００ｎＭ以下、最も好ましくは１００ｎＭ以下である物などが挙げられる。
本発明のリガンドとしては、例えば、レチノイドまたはその類縁体などが用いられる。レチノイドまたはその類縁体としては、例えば化合物（I）などが挙げられる。
【００１５】
式中、Ｒで示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「炭化水素基」としては、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルなどが挙げられる。炭素数は１〜３０個が好ましい。
「アルキル」としては、例えばＣ1-30アルキル（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、イコシル、ヘニコシル、ドコシル、トリコシル、テトラコシル、ペンタコシル、ヘキサコシル、ヘプタコシル、オクタコシル、ノナコシル、トリアコンチルなど）などが挙げられる。好ましくはＣ9-30アルキルなどである。さらに好ましくはトリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシルなどのＣ13-19アルキルなどである。
「アルケニル」としては、例えばＣ2-30アルケニル（例、ビニル、アリル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−２−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、テトラデセニル、テトラデカジエニル、ペンタデセニル、ペンタデカジエニル、ヘキサデセニル、ヘキサデカジエニル、ヘプタデセニル、ヘプタデカジエニル、ヘプタデカトリエニル、オクタデセニル、オクタデカジエニル、ノナデセニル、ノナデカジエニル、ノナデカトリエニル、ノナデカテトラエニル、イコセニル、イコサジエニル、ヘニコセニル、ドコセニル、トリコセニル、テトラコセニル、ペンタコセニル、ヘキサコセニル、ヘプタコセニル、オクタコセニル、ノナコセニル、トリアコンテニルなど）などが挙げられる。好ましくはＣ13-19アルケニルである。
「アルキニル」としては、例えばＣ2-30アルキニル（例、エチニル、プロパルギル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ヘキシニル、テトラデシニル、ペンタデシニル、ヘキサデシニル、ヘプタデシニル、オクタデシニル、ノナデシニル、イコシニル、ヘニコシニル、ドコシニル、トリコシニル、テトラコシニル、ペンタコシニル、ヘキサコシニル、ヘプタコシニル、オクタコシニル、ノナコシニル、トリアコンチニルなど）などが挙げられる。好ましくはＣ15-17アルキニルである。
「シクロアルキル」としては、例えばＣ3-6シクロアルキル（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなど）などが挙げられる。
【００１６】
本明細書中の「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「置換基」としては、例えばハロゲン原子（例、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素など）、Ｃ1-3アルキレンジオキシ（例、メチレンジオキシ、エチレンジオキシなど）、ニトロ、シアノ、ハロゲン化されていてもよいＣ1-6アルキル（例、メチル、クロロメチル、ジフルオロメチル、トリクロロメチル、トリフルオロメチル、エチル、２−ブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、ペンタフルオロエチル、プロピル、３，３，３−トリフルオロプロピル、イソプロピル、ブチル、４，４，４−トリフルオロブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、５，５，５−トリフルオロペンチル、ヘキシル、６，６，６−トリフルオロヘキシルなど）、Ｃ2-6アルケニル、Ｃ2-6アルキニル、ハロゲン化されていてもよいＣ3-6シクロアルキル（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、４，４−ジクロロシクロヘキシル、２，２，３，３−テトラフルオロシクロペンチル、４−クロロシクロヘキシルなど）、Ｃ6-14アリール（例、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、２−ビフェニリル、３−ビフェニリル、４−ビフェニリル、２−アンスリルなど）、ハロゲン化されていてもよいＣ1-8アルコキシ（例、メトキシ、ジフルオロメトキシ、トリフルオロメトキシ、エトキシ、２，２，２−トリフルオロエトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、４，４，４−トリフルオロブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなど）、ヒドロキシ、Ｃ6-14アリールオキシ（例、フェニルオキシ、１−ナフチルオキシ、２−ナフチルオキシなど）、Ｃ7-16アラルキルオキシ（例、ベンジルオキシ、フェネチルオキシなど）、メルカプト、ハロゲン化されていてもよいＣ1-6アルキルチオ（例、メチルチオ、ジフルオロメチルチオ、トリフルオロメチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、イソプロピルチオ、ブチルチオ、４，４，４−トリフルオロブチルチオ、ペンチルチオ、ヘキシルチオなど）、Ｃ6-14アリールチオ（例、フェニルチオ、１−ナフチルチオ、２−ナフチルチオなど）、Ｃ7-16アラルキルチオ（例、ベンジルチオ、フェネチルチオなど）、アミノ、モノ−Ｃ1-6アルキルアミノ（例、メチルアミノ、エチルアミノなど）、モノ−Ｃ6-14アリールアミノ（例、フェニルアミノ、１−ナフチルアミノ、２−ナフチルアミノなど）、ジ−Ｃ1-6アルキルアミノ（例、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、エチルメチルアミノなど）、ジ−Ｃ6-14アリールアミノ（例、ジフェニルアミノなど）、ホルミル、カルボキシ、Ｃ1-6アルキル−カルボニル（例、アセチル、プロピオニルなど）、Ｃ3-6シクロアルキル−カルボニル（例、シクロプロピルカルボニル、シクロペンチルカルボニル、シクロヘキシルカルボニルなど）、Ｃ1-6アルコキシ−カルボニル（例、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、tert-ブトキシカルボニルなど）、Ｃ6-14アリール−カルボニル（例、ベンゾイル、１−ナフトイル、２−ナフトイルなど）、Ｃ7-16アラルキル−カルボニル（例、フェニルアセチル、３−フェニルプロピオニルなど）、Ｃ6-14アリールオキシ−カルボニル（例、フェノキシカル��ニルなど）、Ｃ7-16アラルキルオキシ−カルボニル（例、ベンジルオキシカルボニル、フェネチルオキシカルボニルなど）、５ないし６員複素環カルボニル（例、ニコチノイル、イソニコチノイル、テノイル、フロイル、モルホリノカルボニル、チオモルホリノカルボニル、ピペラジン−１−イルカルボニル、ピロリジン−１−イルカルボニルなど）、カルバモイル、モノ−Ｃ1-6アルキル−カルバモイル（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイルなど）、ジ−Ｃ1-6アルキル−カルバモイル（例、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイルなど）、Ｃ6-14アリール−カルバモイル（例、フェニルカルバモイル、１−ナフチルカルバモイル、２−ナフチルカルバモイルなど）、５ないし６員複素環カルバモイル（例、２−ピリジルカルバモイル、３−ピリジルカルバモイル、４−ピリジルカルバモイル、２−チエニルカルバモイル、３−チエニルカルバモイルなど）、Ｃ1-6アルキルスルホニル（例、メチルスルホニル、エチルスルホニルなど）、Ｃ6-14アリールスルホニル（例、フェニルスルホニル、１−ナフチルスルホニル、２−ナフチルスルホニルなど）、ホルミルアミノ、Ｃ1-6アルキル−カルボニルアミノ（例、アセチルアミノなど）、Ｃ6-14アリール−カルボニルアミノ（例、ベンゾイルアミノ、ナフトイルアミノなど）、Ｃ1-6アルコキシ−カルボニルアミノ（例、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、プロポキシカルボニルアミノ、ブトキシカルボニルアミノなど）、Ｃ1-6アルキルスルホニルアミノ（例、メチルスルホニルアミノ、エチルスルホニルアミノなど）、Ｃ6-14アリールスルホニルアミノ（例、フェニルスルホニルアミノ、２−ナフチルスルホニルアミノ、１−ナフチルスルホニルアミノなど）、Ｃ1-6アルキル−カルボニルオキシ（例、アセトキシ、プロピオニルオキシなど）、Ｃ6-14アリール−カルボニルオキシ（例、ベンゾイルオキシ、ナフチルカルボニルオキシなど）、Ｃ1-6アルコキシ−カルボニルオキシ（例、メトキシカルボニルオキシ、エトキシカルボニルオキシ、プロポキシカルボニルオキシ、ブトキシカルボニルオキシなど）、モノ−Ｃ1-6アルキル−カルバモイルオキシ（例、メチルカルバモイルオキシ、エチルカルバモイルオキシなど）、ジ−Ｃ1-6アルキル−カルバモイルオキシ（例、ジメチルカルバモイルオキシ、ジエチルカルバモイルオキシなど）、Ｃ6-14アリール−カルバモイルオキシ（例、フェニルカルバモイルオキシ、ナフチルカルバモイルオキシなど）、ニコチノイルオキシ、５ないし７員飽和環状アミノ（例、ピロリジン−１−イル、ピペリジノ、ピペラジン−１−イル、モルホリノ、チオモルホリノ、テトラヒドロアゼピン−１−イルなど）、５ないし１０員芳香族複素環基（例、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、８−キノリル、１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル、１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル、２−ベンゾチアゾリル、２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル、２−ベンゾ［ｂ］フラニル、３−ベンゾ［ｂ］フラニルなど）、スルホなどが���げられる。
該「炭化水素基」は、例えば上記置換基を、置換可能な位置に１ないし５個、好ましくは１ないし３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一または異なっていてもよい。
【００１７】
Ｒで示される「アシル」としては、式：−ＣＯ−Ｒ2、−(Ｃ＝Ｏ)−ＯＲ2、−(Ｃ＝Ｏ)−ＮＲ2Ｒ3、−ＳＯ−Ｒ4、または −ＳＯ2−Ｒ4〔式中、Ｒ2は水素原子、置換基を有していてもよい炭化水素基または置換基を有していてもよい複素環基を、Ｒ3は水素原子またはＣ1-6アルキルを、Ｒ4は置換基を有していてもよい炭化水素基または置換基を有していてもよい複素環基を示す〕で表される基などが挙げられる。好ましくは、式：−ＣＯ−Ｒ2または −(Ｃ＝Ｏ)−ＮＲ2Ｒ3で表される基である。
【００１８】
Ｒ2またはＲ4で示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「炭化水素基」としては、上記Ｒで示される「炭化水素基」などが挙げられる。
Ｒ2またはＲ4で示される「置換基を有していてもよい複素環基」の「複素環基」としては、例えば、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１または２種、１ないし４個のヘテロ原子を含む５ないし１４員（単環、２環または３環式）複素環、好ましくは（i）５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）芳香族複素環、（ii）５ないし１０員非芳香族複素環または（iii）７ないし１０員複素架橋環から任意の１個の水素原子を除いてできる１価基などが挙げられる。
上記「５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）の芳香族複素環」としては、例えば、チオフェン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、ベンゾ［ｂ］フラン、ベンズイミダゾール、ベンズオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンズイソチアゾール、ナフト［２，３−ｂ］チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドール、イソインドール、１Ｈ−インダゾール、プリン、４Ｈ−キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、カルバゾール、β−カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナジン、チアゾール、イソチアゾール、フェノチアジン、イソオキサゾール、フラザン、フェノキサジンなどの芳香族複素環、またはこれらの環（好ましくは単環）が１ないし複数個（好ましくは１または２個）の芳香環（例、ベンゼン環等）と縮合して形成された環などが挙げられる。
上記「５ないし１０員非芳香族複素環」としては、例えば、ピロリジン、イミダゾリン、ピラゾリジン、ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、チオモルホリン、ジオキサゾール、オキサジアゾリン、チアジアゾリン、トリアゾリン、チアジアゾール、ジチアゾールなどが挙げられる。
上記「７ないし１０員複素架橋環」としては、例えば、キヌクリジン、７−アザビシクロ［２.２.１］ヘプタンなどが挙げられる。
【００１９】
該「複素環基」として好ましくは、炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１または２種、好ましくは、１ないし４個のヘテロ原子を含む５ないし１４員（好ましくは５ないし１０員）の（単環または２環式）複素環基である。具体的には、例えば２−チエニル、３−チエニル、２−フリル、３−フリル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、５−キノリル、８−キノリル、１−イソキノリル、３−イソキノリル、４−イソキノリル、５−イソキノリル、ピラジニル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、３−ピロリル、２−イミダゾリル、３−ピリダジニル、３−イソチアゾリル、３−イソオキサゾリル、１−インドリル、２−インドリル、３−インドリル、２−ベンゾチアゾリル、２−ベンゾ［ｂ］チエニル、３−ベンゾ［ｂ］チエニル、２−ベンゾ［ｂ］フラニル、３−ベンゾ［ｂ］フラニルなどの芳香族複素環基、例えば１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル、２−ピラゾリジニル、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、ピペリジノ、２−ピペリジル、３−ピペリジル、４−ピペリジル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、モルホリノ、チオモルホリノなどの非芳香族複素環基などである。
このうち、例えば炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる１ないし３個のヘテロ原子を含む５ないし６員の複素環基等がさらに好ましい。具体的には、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−フリル、３−フリル、ピラジニル、２−ピリミジニル、３−ピロリル、３−ピリダジニル、３−イソチアゾリル、３−イソオキサゾリル、１−ピロリジニル、２−ピロリジニル、３−ピロリジニル、２−イミダゾリニル、４−イミダゾリニル、２−ピラゾリジニル、３−ピラゾリジニル、４−ピラゾリジニル、ピペリジノ、２−ピペリジル、３−ピペリジル、４−ピペリジル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニル、モルホリノ、チオモルホリノなどが挙げられる。
該「置換基を有していてもよい複素環基」の「置換基」としては、例えば上記Ｒ2またはＲ4で示される「置換基を有していてもよい炭化水素基」の「置換基」と同様のものなどが挙げられる。
該「複素環基」は、例えば上記置換基を、置換可能な位置に１ないし５個、好ましくは１ないし３個有していてもよく、置換基数が２個以上の場合、各置換基は同一または異なっていてもよい。
【００２０】
Ｒ3で示される「Ｃ1-6アルキル」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシルなどのＣ1-6アルキルが挙げられる。
【００２１】
Ｒは、好ましくヒドロキシメチル、ホルミル、４−ヒドロキシフェニルカルバモイルなどである。
化合物（I）中、以下の式
【化３】
0004799837.tif 000003
〔式中、Ｒは上記と同意義を示す。〕で表される化合物またはその塩が好ましい。
化合物（I）の好ましい具体例としては、全trans-レチノール、全trans-レチナール、4-ヒドロキシフェニルレチナミドなどが挙げられる。
【００２２】
標識された化合物（I）も、本発明のリガンドに含まれる。
標識物質としては、放射性同位元素（例、〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔32P〕、〔33P〕、〔35S〕など）、蛍光物質（例、フルオレセインなど）、発光物質（例、ルミノールなど）、酵素（例、ペルオキシダーゼなど）、ランタニド元素などがあげられる。中でも、放射性同位元素が好ましい。さらにトリチウムが好ましい。
標識したリガンドとして好ましくは、放射性同位元素で標識された式（I）で表される化合物またはその塩、さらに好ましくは、放射性同位元素で標識された全trans-レチノール、さらに好ましくは、トリチウムで標識された全trans-レチノールなどが挙げられる。
【００２３】
式（I）で表される化合物の塩としては、例えば金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
このうち、薬学的に許容し得る塩が好ましい。例えば、化合物内に酸性官能基を有する場合にはアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩，カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例、カルシウム塩，マグネシウム塩，バリウム塩など）などの無機塩、アンモニウム塩など、また、化合物内に塩基性官能基を有する場合には、例えば臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸など無機酸との塩、または酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などの有機酸との塩が挙げられる。
【００２４】
本発明の受容体および本発明の部分ペプチドは、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から公知のポリペプチドの精製方法によって製造することもできるし、ポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換された形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、ペプチド合成法に準じて製造することもできる。例えば、Genomics、56巻、12-21頁、1999年、Biochim. Biophys. Acta、1446巻、57-70頁、1999年などに記載の方法またはこれに準じた方法により、製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明の受容体または部分ペプチドもしくはそれらの塩の合成には、通常、市販のポリペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするポリペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチド、受容体、部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、ポリペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はポリペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１.５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
【００２５】
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ1-6）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ2−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
【００２６】
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
【００２７】
本発明の受容体または部分ペプチドを得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（ポリペプチド）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたポリペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したポリペプチドとを製造し、この両ポリペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ポリペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の受容体またはその部分ペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明の受容体または部分ペプチドもしくはそれらの塩のエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、受容体またはその部分ペプチドのアミド体と同様にして、所望の受容体またはその部分ペプチドのエステル体を得ることができる。
【００２８】
本発明の受容体または部分ペプチドは、公知のペプチドの合成法に従って、あるいは受容体の部分ペプチドについては、受容体を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明受容体または部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（i）〜（v）に記載された方法があげられる。
（i）M. Bodanszky および M.A. Ondetti、Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966年)
（ii）SchroederおよびLuebke、The Peptide, Academic Press, New York (1965年)
（iii）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、 丸善(株) （1975年）
（iv）矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学IV、 205、(1977年)
（v）矢島治明監修、続医薬品の開発、第14巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて本発明の受容体または部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる受容体または部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００２９】
本発明の受容体または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明の受容体または部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。このうちＤＮＡが好ましく、該ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりtotal RNAまたはmRNA画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction（以下、RT-PCR法と略称する）によって増幅することもできる。
【００３０】
本発明の受容体をコードするＤＮＡとしては、例えば配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する受容体をコードするＤＮＡなどであれば何れのものでもよい。
配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、さらに好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning 2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：１で表わされるアミノ酸配列を含有する受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列を含有する受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：６で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：３で表わされるアミノ酸配列を含有する受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：７で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが、配列番号：４で表わされるアミノ酸配列を含有する受容体をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
【００３１】
本発明の部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、本発明の受容体の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。具体的には、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡ、または配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する受容体をコードするＤＮＡの部分塩基配列を有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
【００３２】
本発明の受容体または部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）は、公知の方法で標識化されていてもよい。標識物質としては、放射性同位元素、蛍光物質（例、フルオレセインなど）、発光物質、酵素、ビオチン、ランタニド元素などがあげられる。
本発明の受容体または部分ペプチドを完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明の受容体または部分ペプチドの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて公知のＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明の受容体または部分ペプチドの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Molecular Cloning 2nd（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
【００３３】
ＤＮＡの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、MutanTM-super Express Km（宝酒造（株））、MutanTM-K（宝酒造（株））等を用いて、ODA-LA PCR法、Gapped duplex法、Kunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された受容体をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明の受容体または部分ペプチドの発現ベクターは、例えば、（a）本発明の受容体または部分ペプチドをコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（b）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウィルス，ワクシニアウィルス，バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ-ＴＫプロモーターなどがあげられる。
【００３４】
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウィルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐrと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏrと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明の受容体のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明の受容体または部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
【００３５】
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ１２・ＤＨ１〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,60巻,160(1968)〕，ＪＭ１０３〔Nucleic Acids Research,9巻,309(1981)〕，ＪＡ２２１〔Journal of Molecular Biology,120巻,517(1978)〕，ＨＢ１０１〔Journal of Molecular Biology,41巻,459(1969)〕，Ｃ６００〔Genetics,39巻,440(1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）ＭＩ１１４〔Gene,24巻,255(1983)〕，２０７−２１〔Journal of Biochemistry,95巻,87(1984)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ-，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Pichia pastoris）ＫＭ７１などが用いられる。
【００３６】
昆虫細胞としては、例えば、ウィルスがＡｃＮＰＶの場合は、ヨトウガの幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウィルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L.ら、In Vivo,13, 213-217,(1977)）などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、Nature,315巻,592(1985)〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７（ＣＯＳ７），Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ-）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69巻,2110(1972)やGene,17巻,107(1982)などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Molecular & General Genetics,168巻,111(1979)などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Methods in Enzymology,194巻,182-187(1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75巻,1929(1978)などに記載の方法に従って行なうことができる。
【００３７】
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Bio/Technology, 6, 47-55(1988)などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．263-267(1995)（秀潤社発行）、Virology,52巻,456(1973)に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、受容体または部分ペプチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Miller， Journal of Experiments in Molecular Genetics,431-433，Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
【００３８】
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Bostian, K. L. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77巻,4505(1980)〕や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Bitter, G. A. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81巻,5330(1984)〕があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace's Insect Medium（Grace, T.C.C., Nature,195,788(1962)）に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Science,122巻,501(1952)〕，ＤＭＥＭ培地〔Virology,8巻,396(1959)〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔The Journal of the American Medical Association 199巻,519(1967)〕，１９９培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73巻,1(1950)〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外などに本発明の受容体または部分ペプチドを生成せしめることができる。
上記培養物から本発明の受容体または部分ペプチドを分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
【００３９】
本発明の受容体または部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、それ公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる受容体または部分ペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適宜組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる受容体または部分ペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する受容体または部分ペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
【００４０】
本発明の受容体と特異的に結合する能力を有するリガンドは、市販されている場合には市販品をそのまま用いることもでき、公知の方法またはこれらに準じた方法に従って抽出または製造することもできる。
【００４１】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体（以下、単に本発明の抗体と称する場合がある）は、本発明の受容体に対する抗体を認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。本発明の受容体に対する抗体としては、受容体のシグナル伝達を不活性化する抗体、受容体のシグナル伝達を活性化する抗体などが挙げられる。
本発明の受容体に対する抗体は、本発明の受容体を抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
（ａ）モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明の受容体は、温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。用いられる温血動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原で免疫された温血動物、例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物の骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化ポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Nature）、256、495 (1975)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどがあげられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などの温血動物の骨髄腫細胞があげられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃で１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、ポリペプチド（蛋白質）抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したポリペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））あるいはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００４２】
（ｂ）モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、公知の方法、例えば、免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原（ポリペプチド抗原）自体、あるいはそれとキャリアー蛋白質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明の受容体に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体に関し、キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
【００４３】
配列番号：１で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質もしくはその部分ペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、該ポリヌクレオチドに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ポリヌクレオチドの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのポリヌクレオチド（アンチセンスポリヌクレオチド）であってもよい。
具体的には、本発明の受容体をコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）（以下、これらのＤＮＡを本発明のＤＮＡと略記する場合がある）に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスＤＮＡ（以下、これらのＤＮＡをアンチセンスＤＮＡと略記する場合がある）が挙げられ、本発明のＤＮＡに相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスＤＮＡであってもよい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などがあげられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、本発明の受容体のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスＤＮＡが好適である。これらのアンチセンスＤＮＡは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
【００４４】
具体的には、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。好ましくは例えば、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７または配列番号：８で表わされる塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのりん酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾りん酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、本発明の受容体遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンスポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいはアミノ酸が決定された蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるポリヌクレオチド（核酸）は、本発明の受容体遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明の受容体関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明の受容体遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明の受容体関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明の受容体関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明の受容体遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とペプチド（蛋白質）との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される指令にあるペプチド（蛋白質）のアミノ酸を通常指している。蛋白質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、蛋白質翻訳終止コドン、蛋白質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域、および３’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、蛋白質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係については、目的核酸が対象領域とハイブリダイズすることができる場合は、その目的核酸は、当該対象領域のポリヌクレオチドに対して「アンチセンス」であるということができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販の蛋白質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、さらにＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
【００４５】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチド（核酸）は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、あるいは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンスヌクレオチドは次のような方針で好ましく設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンスヌクレオチドをより安定なものにする、アンチセンスヌクレオチドの細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、そしてもし毒性があるならアンチセンスヌクレオチドの毒性をより小さなものにする。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えば J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol. 8, pp.247, 1992; Vol. 8, pp.395, 1992; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 などに開示がある。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例えば、ホスホリピド、コレステロールなど）といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端あるいは５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端あるいは５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンスヌクレオチドの阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明の受容体の生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
【００４６】
以下に、（i）本発明の受容体、（ii）本発明の受容体をコードするポリヌクレオチド（本発明のポリヌクレオチド）、（iii）本発明の受容体に対する抗体（本発明の抗体）、（iv）本発明の受容体のアンチセンスポリヌクレオチド（例、本発明のアンチセンスＤＮＡ）、（v）本発明の受容体に特異的に結合する能力を有するリガンド（本発明のリガンド）などの用途を説明する。
〔１〕疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
本発明のリガンドは、癌細胞のアポトーシス促進活性、細胞増殖抑制活性などを有する。
本発明の受容体を用い、または組換え型本発明の受容体の発現系を用いたリガンドレセプターアッセイ系を用いることにより、本発明の受容体と、本発明のリガンドとの結合性を変化させる化合物（例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物など）またはその塩を効率よくスクリーニングすることができる。
該化合物またはその塩には、（i）本発明の受容体を介して細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、微小管結合蛋白質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性など）を有する化合物（アゴニスト）、（ii）上記細胞刺激活性を有しない化合物（アンタゴニスト）、（iii）本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物、（iv）本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合物などが含まれる。
【００４７】
具体的には、（i）本発明の受容体に、本発明のリガンドを接触させた場合と（ii）本発明の受容体に、本発明のリガンドおよび試験化合物を接触させた場合との比較を行なう。比較は、例えば、本発明の受容体に対する本発明のリガンドの結合量、細胞刺激活性などを測定して行う。
本発明のスクリーニング方法としての具体例としては、例えば、
（a）本発明のリガンドを本発明の受容体に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、本発明のリガンドの本発明の受容体に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（b）本発明のリガンドを、本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、本発明のリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（c）本発明の受容体が、本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体である上記（b）記載のスクリーニング方法、
（d）本発明のリガンドが、標識したリガンドである上記（a）〜（c）のスクリーニング方法などのレセプター結合アッセイ系、
【００４８】
（e）本発明のリガンドを本発明の受容体に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、
（f）本発明のリガンドを本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較することを特徴とする、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング方法、および
（g）本発明の受容体が、本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによって細胞膜上に発現した本発明の受容体である上記（f）のスクリーニング方法などの細胞刺激アッセイ系などが挙げられる。
【００４９】
本発明のスクリーニング方法の具体的な説明を以下にする。
本発明の受容体としては、ヒトや温血動物の臓器の膜画分などが好適に用いられる。しかし、特にヒト由来の臓器は入手が極めて困難なことから、スクリーニングに用いられるものとしては、組換え体を用いて大量発現させた本発明の受容体などが適している。
本発明の受容体を製造するには、前述の本発明の受容体の製造方法などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法において、本発明の受容体を含有する細胞あるいは該細胞膜画分などを用いる場合、後述の調製法に従えばよい。
本発明の受容体を含有する細胞を用いる場合、該細胞をグルタルアルデヒド、ホルマリンなどで固定化してもよい。固定化方法はそれ公知の方法に従って行うことができる。
本発明の受容体を含有する細胞としては、本発明の受容体を発現した宿主細胞をいうが、該宿主細胞としては、前述の大腸菌、枯草菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。製造方法は前述と同様である。
膜画分としては、細胞を破砕した後、それ公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、Potter−Elvehjem型ホモジナイザーで細胞を押し潰す方法、ワーリングブレンダーやポリトロン（Kinematica社製）による破砕、超音波による破砕、フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させることによる破砕などがあげられる。細胞膜の分画には、分画遠心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いられる。例えば、細胞破砕液を低速（500rpm〜3000rpm）で短時間（通常、約１分〜１０分）遠心し、上清をさらに高速（15000rpm〜30000rpm）で通常３０分〜２時間遠心し、得られる沈澱を膜画分とする。該膜画分中には、発現した本発明の受容体と細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該本発明の受容体を含有する細胞や膜画分中の本発明の受容体の量は、１細胞当たり１０3〜１０8分子であるのが好ましく、１０5〜１０7分子であるのが好適である。なお、発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性（比活性）が高くなり、高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばかりでなく、同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
【００５０】
前記のレセプター結合アッセイ系や細胞刺激アッセイ系などのスクリーニング方法を実施するためには、例えば、本発明の受容体画分と、本発明のリガンド（例、標識した本発明のリガンド）などが用いられる。本発明の受容体画分としては、天然型の本発明の受容体画分か、またはそれと同等の活性を有する組換え型本発明の受容体画分などが望ましい。ここで、同等の活性とは、同等のリガンド結合活性などを示す。標識したリガンドとしては、例えば、放射性同位元素（例、〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔32P〕、〔33P〕、〔35S〕など）、蛍光物質（例、フルオレセインなど）、発光物質（例、ルミノールなど）、酵素（例、ペルオキシダーゼなど）またはランタニド元素などで標識されたリガンドなどを用いることができる。
具体的には、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物のスクリーニングを行うには、本発明の受容体を含有する細胞または細胞の膜画分を、スクリーニングに適したバッファーに懸濁することによりレセプター標品を調製する。バッファーには、ｐＨ４〜１０（望ましくはｐＨ６〜８）のリン酸バッファー、トリス−塩酸バッファーなどのリガンドと受容体との結合を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。また、非特異的結合を低減させる目的で、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ−８０TM（花王−アトラス社）、ジギトニン、デオキシコレートなどの界面活性剤をバッファーに加えることもできる。さらに、プロテアーゼによる本発明の受容体の分解を抑える目的でＰＭＳＦ、ロイペプチン、Ｅ−６４（ペプチド研究所製）、ペプスタチンなどのプロテアーゼ阻害剤を添加することもできる。０.０１〜１０ｍｌの該レセプター溶液に、一定量（５０００〜５０００００ｃｐｍ）の標識した本発明のリガンドを添加し、同時に１０-10〜１０-7Ｍの試験化合物を共存させる。非特異的結合量（ＮＳＢ）を知るために大過剰の未標識の本発明のリガンドを加えた反応チューブも用意する。反応は０℃〜５０℃、望ましくは４℃〜３７℃で２０分〜２４時間、望ましくは３０分〜３時間行う。反応後、ガラス繊維濾紙等で濾過し、適量の同バッファーで洗浄した後、ガラス繊維濾紙に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターまたはγ−カウンターで計測する。拮抗する物質がない場合のカウント(Ｂ0)から非特異的結合量（ＮＳＢ）を引いたカウント（Ｂ0−ＮＳＢ）を１００％とした時、特異的結合量（Ｂ−ＮＳＢ）が例えば５０％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
さらに、表面プラズモンセンサー技術を利用することによって、本発明の受容体に結合する化合物をスクリーニングすることもできる。
具体的には、ビアコア３０００（ビアコア社）のセンサーチップ表面に、本発明の受容体を固定化後、チップ表面にリン酸緩衝液（ＰＢＳ）などに溶解した試験化合物を流したときの表面プラズモンの変化を測定することにより、本発明の受容体に結合する試験化合物を選択する。例えば、表面プラズモンの変化の測定値が５レゾナンスユニット以上与える試験化合物を本発明の受容体に結合性を有する物質として選択する。
【００５１】
前記の細胞刺激アッセイ系のスクリーニング方法を実施するためには、本発明の受容体を介する細胞刺激活性（例えば、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ｃａ2+遊離、細胞内ｃＡＭＰ生成、細胞内ｃＡＭＰ産生抑制、細胞内ｃＧＭＰ生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、ｃ−ｆｏｓの活性化、ｐＨの低下、ＧＴＰγＳ結合活性、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、微小管結合蛋白質リン酸化酵素（ＭＡＰキナーゼ）の活性化などを促進する活性または抑制する活性など）を、公知の方法または市販の測定用キットを用いて測定することができる。具体的には、まず、本発明の受容体を含有する細胞をマルチウェルプレート等に培養する。スクリーニングを行うにあたっては前もって新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、試験化合物などを添加して一定時間インキュベートした後、細胞を抽出あるいは上清液を回収して、生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。細胞刺激活性の指標とする物質（例えば、アラキドン酸など）の生成が、細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、該分解酵素に対する阻害剤を添加してアッセイを行なってもよい。また、ｃＡＭＰ産生抑制などの活性については、フォルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
細胞刺激活性を測定してスクリーニングを行なうには、適当な本発明の受容体を発現した細胞が必要である。本発明の受容体を発現した細胞としては、前述の本発明の受容体発現細胞株などが望ましい。
試験化合物としては、例えばペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などがあげられる。
【００５２】
上記細胞刺激アッセイ系のスクリーニング方法について、さらに具体的に以下（１）〜（１２）に記載する。
（１）受容体発現細胞が受容体アゴニストによって刺激されると細胞内のG蛋白質が活性化されてGTPが結合する。この現象は受容体発現細胞の膜画分においても観察される。通常、GTPは加水分解されてGDPへと変化するが、このとき反応液中にGTPγSを添加しておくと、GTPγSはGTPと同様にG蛋白質に結合するが、加水分解されずにG蛋白質を含む細胞膜に結合した状態が維持される。標識したGTPγSを用いると細胞膜に残存した標識されたGTPγSを測定することにより、受容体アゴニストの受容体発現細胞刺激活性を測定することができる。
この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
この方法は、本発明の受容体を含む膜画分を用いて行う。本測定法において本発明の受容体膜画分へのGTPγS結合促進活性を示す物質はアゴニストである。
具体的には、標識したGTPγSの存在下、本発明のリガンドを本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体細胞膜画分に接触させた場合における、本発明の受容体細胞膜画分へのGTPγS結合促進活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、本発明のリガンドによる本発明の受容体細胞膜画分へのGTPγS結合促進活性を抑制する活性を示す試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体細胞膜画分に接触させ、本発明の受容体細胞膜画分へのGTPγS結合促進活性を測定することにより、アゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００５３】
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
公知の方法に従って調製した本発明の受容体を含む細胞膜画分を、膜希釈緩衝液（50mM Tris、5mM MgCl2、150mM NaCl、1μM GDP、0.1％ BSA；pH7.4）で希釈する。希釈率は、受容体の発現量により異なる。これをFalcon2053に0.2mlずつ分注し、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を加え、さらに終濃度200pMとなるように[35S]GTPγSを加える。25℃で1時間保温した後、氷冷した洗浄用緩衝液（50mM Tris，5mM MgCl2，150mM NaCl，0.1％ BSA，0.05％ CHAPS；pH7.4）1.5mlを加えて、ガラス繊維ろ紙GF/Fでろ過する。65℃、30分保温して乾燥後、液体シンチレーションカウンターでろ紙上に残った膜画分に結合した[35S]GTPγSの放射活性を測定する。本発明のリガンドのみを加えた実験区の放射活性を100％、本発明のリガンドを加えなかった実験区の放射活性を0％とし、本発明のリガンドによるGTPγS結合促進活性に対する試験化合物の影響を算出する。GTPγS結合促進活性が例えば50％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００５４】
（２）本発明の受容体発現細胞は、本発明のリガンドの刺激により、細胞内cAMPの産生が抑制される。この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、細胞内cAMP量を増加させる物質の存在下、本発明のリガンドを本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、該細胞の細胞内cAMPの産生抑制活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞内cAMP量を増加させる物質としては、例えば、フォルスコリン、カルシトニンなどが用いられる。
本発明の受容体発現細胞内のcAMP産生量は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシなどを免疫して得られた抗cAMP抗体と〔125I〕標識cAMP（ともに市販品）を使用することによるRIA系、または抗cAMP抗体と標識cAMPとを組み合わせたEIA系で測定することができる。また、抗cAMP抗体を、protein Aまたは抗cAMP抗体産生に用いた動物のIgGなどに対する抗体などを使用して固定したシンチラントを含むビーズと〔125I〕標識cAMPとを使用するSPA（Scintillation Proximity Assay）法による定量も可能である（アマシャムファルマシアバイオテク社製のキットを使用する）。
本方法において、本発明のリガンドによる本発明の受容体発現細胞のcAMP産生抑制活性を阻害する活性を示す試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、cAMP産生抑制活性を調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうことができる。
【００５５】
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞（例、CHO細胞などの動物細胞）を24穴プレートに5x104cell/wellで播種し、48時間培養する。細胞を0.2mM 3-イソブチル-メチルキサンチン、0.05％ BSAおよび20mM HEPESを含むハンクスバッファー（pH7.4）で洗浄する（以下、反応用バッファーと略記する）。その後、0.5mlの反応用バッファーを加えて30分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、1μMの本発明のリガンドまたは1μMの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した2μM フォルスコリンを含む0.25mlの反応用バッファーを、細胞に加え、37℃で24分間反応させる。100μlの20％過塩素酸を加えて反応を停止させ、その後氷上で1時間置くことにより細胞内cAMPを抽出する。抽出液中のcAMP量を、cAMP EIAキット（アマシャムファルマシアバイオテク）を用いて測定する。フォルスコリンの刺激によって産生されたcAMP量を100％とし、1μMの本発明のリガンドの添加によって抑制されたcAMP量を0％として、本発明のリガンドによるcAMP産生抑制活性に対する試験化合物の影響を算出する。本発明のリガンドの活性を阻害して、cAMP産生活性が例えば50％以上になる試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００５６】
また、本発明のリガンドの刺激により、細胞内cAMP量が増加する性質を示す本発明の受容体発現細胞を使用する場合、本発明のリガンドを本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、該細胞の細胞内cAMPの産生促進活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
本方法において、本発明のリガンドによる本発明の受容体発現細胞のcAMP産生促進活性を阻害する活性を示す試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させてcAMP産生促進活性を調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうことができる。
cAMP産生促進活性は、上記のスクリーニング法においてフォルスコリンを添加せずに本発明の受容体発現細胞（例、CHO細胞などの動物細胞）に本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加して産生されたcAMPを上記の方法で定量して測定する。
【００５７】
（３）CRE-レポーター遺伝子ベクターを用いて、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
CRE（cAMP response element）を含むDNAを、ベクターのレポーター遺伝子上流に挿入し、CRE-レポーター遺伝子ベクターを得る。CRE-レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞において、cAMPの上昇を伴う刺激は、CREを介したレポーター遺伝子発現と、それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子産物（蛋白質）の産生を誘導する。つまり、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、CRE-レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のcAMP量の変動を検出することができる。
具体的には、細胞内cAMP量を増加させる物質の存在下、本発明のリガンドを、CRE-レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、CRE-レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞内cAMP量を増加させる物質としては、例えば、フォルスコリン、カルシトニンなどが用いられる。
ベクターとしては、例えば、ピッカジーン  ベイシックベクター、ピッカジーン  エンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））などが用いられる。CREを含むDNAを、上記ベクターのレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、CRE-レポーター遺伝子ベクターとする。
本方法において、本発明のリガンドによるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性抑制を回復させる試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させて、フォルスコリン刺激によって上昇した発光量の本発明のリガンドと同様な抑制を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００５８】
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼを利用する例を用いて、このスクリーニング方法の具体例を以下に述べる。
CRE-レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を導入した本発明の受容体発現細胞を、24穴プレートに5x103cell/wellで播種し、48時間培養する。細胞を0.2mM 3-イソブチル-メチルキサンチン、0.05％ BSAおよび20mM HEPESを含むハンクスバッファー（pH7.4）で洗浄する（以下、反応用バッファーと略記する）。その後0.5mlの反応用バッファーを加えて30分間培養器で保温する。反応用バッファーを除き、新たに0.25mlの反応用バッファーを細胞に加えた後、1μMの本発明のリガンドまたは1μMの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した2μM フォルスコリンを含む0.25mlの反応用バッファーを、細胞に加え、37℃で24分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。本発明のリガンド単独を添加した場合と、1μMの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、比較する。
本発明のリガンドは、フォルスコリン刺激に基づくルシフェラーゼによる発光量の増加を抑制する。該抑制を回復させる化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００５９】
レポーター遺伝子として、例えば、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（chloramphenicol acetyltransferase）、β−ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、または市販の測定キットを用いて測定する。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Lumi-Phos 530を用いて、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純薬製FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay KiTを用いて、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Aurora Gal-XEを用いて測定する。
【００６０】
（４）本発明の受容体発現細胞は、本発明のリガンドの刺激により、アラキドン酸代謝物を細胞外に放出する。この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
あらかじめ、標識したアラキドン酸を、本発明の受容体発現細胞に取り込ませておくことによって、アラキドン酸代謝物放出活性を、細胞外に放出された標識されたアラキドン酸代謝物を測定することによって測定することができる。
具体的には、本発明のリガンドを、標識したアラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、標識したアラキドン酸を含有する本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、アラキドン酸代謝物の放出活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、本発明のリガンドによるアラキドン酸代謝物放出活性を阻害する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
また、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、本発明の受容体発現細胞のアラキドン酸代謝物放出活性を公知の方法で調べることによりアゴニスト活性を示す化合物のスクリーニングを行なうこともできる。
【００６１】
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を24穴プレートに5x104cell/wellで播種し、24時間培養後、[3H]アラキドン酸を0.25μCi/wellとなるよう添加し、16時間後、細胞を0.05％ BSAおよび20mM HEPESを含むハンクスバッファー（pH7.4）（以下、反応用バッファーと略記する）で洗浄する。終濃度10μMの本発明のリガンドまたは終濃度10μMの本発明のリガンドおよび試験化合物を含む反応用バッファー 500μlを、各wellに添加する。37℃で60分間インキュベートした後、反応液400μlをシンチレーターに加え、反応液中に遊離した[3H]アラキドン酸代謝物の量をシンチレーションカウンターにより測定する。
反応用バッファー 500μlのみを添加した場合（本発明のリガンド非添加・試験化合物非添加）の遊離[3H]アラキドン酸代謝物の量を0％、10μMの本発明のリガンドを含む反応用バッファーを添加した場合（試験化合物非添加）の遊離[3H]アラキドン酸代謝物の量を100％として、試験化合物を添加した場合の遊離[3H]アラキドン酸代謝物の量を算出する。
アラキドン酸代謝物放出活性が、例えば50％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００６２】
（５）本発明の受容体発現細胞は、本発明のリガンドの刺激により、細胞内のCa濃度が上昇する。この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞内カルシウム濃度上昇活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。測定は公知の方法に従って行う。
本方法において、本発明のリガンドによる細胞内カルシウム濃度の上昇を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみの添加による蛍光強度の上昇を測定することによってアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００６３】
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を、滅菌した顕微鏡用カバーグラス上に播き、2日後、培養液を、4mM Fura-2 AM（同仁化学研究所）を縣濁したHBSSに置換し、室温で2時間30分おく。HBSSで洗浄した後、キュベットにカバーグラスをセットし、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加し、励起波長340nmおよび380nmでの、505nmの蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。
また、FLIPR（モレキュラーデバイス社製）を使って行ってもよい。本発明の受容体発現細胞縣濁液にFluo-3 AM（同仁化学研究所製）を添加し、細胞に取り込ませた後、上清を遠心により数度洗浄後、96穴プレートに細胞を播く。FLIPR装置にセットし、Fura-2の場合と同様に、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加し、蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。
さらに、本発明の受容体発現細胞に、細胞内Caイオンの上昇によって発光するような蛋白質の遺伝子（例、aequorinなど）を共発現させておき、細胞内Caイオン濃度の上昇によって、該遺伝子蛋白質（例、aequorinなど）がCa結合型となり発光することを利用して、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることもできる。
細胞内Caイオンの上昇によって発光するような蛋白質の遺伝子を共発現させた本発明の受容体発現細胞を、96穴プレートに播き、上記と同様に、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加し、蛍光強度の比の上昇を蛍光測定器で測定し、比較する。
本発明のリガンドによる蛍光強度の上昇を、抑制する試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００６４】
（６）受容体を発現する細胞に、受容体アゴニストを添加すると、細胞内イノシトール三リン酸濃度は上昇する。本発明のリガンドの、本発明の受容体発現細胞における細胞内イノシトール三リン酸産生活性を利用することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、標識したイノシトールの存在下、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、イノシトール三リン酸産生活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。測定は公知の方法に従って行う。
本方法において、イノシトール三リン酸産生活性を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、イノシトール三リン酸産生上昇を測定することによってアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００６５】
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を24穴プレートに播き、1日間培養する。その後、myo-[2-3H]inositol（2.5μCi/well）を添加した培地で１日間培養し、細胞を放射活性を有するイノシトールを無添加の培地でよく洗浄する。本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加後、10％過塩素酸を加え、反応を止める。1.5M 水酸化カリウムおよび60mM HEPES溶液で中和し、0.5mlのAG1x8樹脂（Bio-Rad）を詰めたカラムに通し、5mM 四ホウ酸ナトリウム（Na2B4O7）および60mM ギ酸アンモニウムで洗浄した後、1M ギ酸アンモニウムおよび0.1M ギ酸で溶出した放射活性を、液体シンチレーションカウンターで測定する。本発明のリガンドを添加しない場合の放射活性を0％、本発明のリガンドを添加した場合の放射活性を100％とし、試験化合物の、本発明のリガンドと本発明の受容体の結合に対する影響を算出する。
イノシトール三リン酸産生活性が、例えば50％以下になる試験化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００６６】
（７）TRE-レポーター遺伝子ベクターを用いて、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
TRE（TPA response element）を含むDNAを、ベクターのレポーター遺伝子上流に挿入し、TRE-レポーター遺伝子ベクターを得る。TRE-レポーター遺伝子ベクターを導入した本発明の受容体発現細胞において、細胞内カルシウム濃度の上昇を伴う刺激は、TREを介したレポーター遺伝子発現と、それに引き続くレポーター遺伝子の遺伝子産物（蛋白質）の産生を誘導する。つまり、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定することにより、TRE-レポーター遺伝子ベクター導入細胞内のカルシウム量の変動を検出することができる。
具体的には、本発明のリガンドを、TRE-レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、TRE-レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、レポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
ベクターとしては、例えば、ピッカジーン  ベイシックベクター、ピッカジーン  エンハンサーベクター（東洋インキ製造（株））などが用いられる。TREを含むDNAを、上記ベクターのレポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子上流のマルチクローニングサイトに挿入し、TRE-レポーター遺伝子ベクターとする。
本方法において、本発明のリガンドによるレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみをTRE-レポーター遺伝子ベクター導入本発明の受容体発現細胞に接触させ、本発明のリガンドと同様な発光量の増加を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００６７】
レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼを利用する例を用いて、このスクリーニング方法の具体例を以下に述べる。
TRE-レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）を導入した本発明の受容体発現細胞を、24穴プレートに5x103cell/wellで播種し、48時間培養する。細胞を0.05％ BSAおよび20mM HEPESを含むハンクスバッファー（pH7.4）で洗浄した後、10nMの本発明のリガンドまたは10nMの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加し、37℃で60分間反応させる。細胞をピッカジーン用細胞溶解剤（東洋インキ製造（株））で溶かし、溶解液に発光基質（東洋インキ製造（株））を添加する。ルシフェラーゼによる発光は、ルミノメーター、液体シンチレーションカウンターまたはトップカウンターにより測定する。本発明のリガンドを添加した場合と、10nMの本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した場合のルシフェラーゼによる発光量を測定して、比較する。
本発明のリガンドによる細胞内カルシウムの上昇によって、ルシフェラーゼによる発光量が増加する。この増加を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００６８】
レポーター遺伝子として、例えば、アルカリフォスファターゼ、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（chloramphenicol acetyltransferase）、β−ガラクトシダーゼなどの遺伝子を用いてもよい。これらのレポーター遺伝子蛋白質の酵素活性は、公知の方法に従い、または市販の測定キットを用いて測定する。アルカリフォスファターゼ活性は、例えば和光純薬製Lumi-Phos 530を用いて、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ活性は、例えば和光純薬製FAST CAT chrolamphenicol Acetyltransferase Assay Kitを用いて、β−ガラクトシダーゼ活性は、例えば和光純薬製Aurora Gal-XEを用いて測定する。
【００６９】
（８）本発明の受容体発現細胞は、本発明のリガンドの刺激により、MAPキナーゼが活性化され、増殖する。この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞増殖を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本発明の受容体発現細胞の増殖は、例えば、MAPキナーゼ活性、チミジン取り込み活性、細胞数などを測定すればよい。
具体例としては、MAPキナーゼ活性については、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に添加した後、細胞溶解液から抗ＭＡＰキナーゼ抗体を用いた免疫沈降によりＭＡＰキナーゼ分画を得た後、公知の方法、例えば和光純薬製MAP Kinase Assay Kitおよびγ-[32P]-ATPを使用してMAPキナーゼ活性を測定し、比較する。
チミジン取り込み活性については、本発明の受容体発現細胞を24穴プレートに播種し、培養し、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した後、放射活性により標識したチミジン（例、[methyl-3H]-チミジンなど）を加え、その後、細胞を溶解し、細胞内に取り込まれたチミジンの放射活性を、液体シンチレーションカウンターで計数することにより、チミジン取り込み活性を測定し、比較する。
細胞数の測定については、本発明の受容体発現細胞を24穴プレートに播種し、培養し、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を添加した後、MTT（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide）を添加する。細胞内に取り込まれてMTTが変化したMTTホルマザンを、塩酸にて酸性としたイソプロパノール水溶液で細胞を溶解した後、570nmの吸収によって測定し、比較する。
本方法において、本発明の受容体発現細胞の増殖を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、本発明のリガンドと同様な細胞増殖活性を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００７０】
チミジン取り込み活性を利用するスクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を24穴プレートに5000個/ウェル播き、1日間培養する。次に血清を含まない培地で2日間培養し、細胞を飢餓状態にする。本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を、細胞に添加して24時間培養した後、[methyl-3H]-チミジンをウェル当たり0.015MBq添加し、6時間培養する。細胞をPBSで洗った後、メタノールを添加して10分間放置する。次に5％トリクロロ酢酸を添加して15分間放置後、固定された細胞を蒸留水で4回洗う。0.3N水酸化ナトリウム溶液で細胞を溶解し、溶解液中の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定する。
本発明のリガンドを添加した場合の放射活性の増加を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００７１】
（９）本発明の受容体発現細胞は、本発明のリガンドの刺激により、カリウムチャネルが活性化し、細胞内にあるKイオンが、細胞外に流出する。この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
Kイオンと同族元素であるRbイオン（ルビジウムイオン）は、Kイオンと区別無く、カリウムチャネルを通って細胞外に流出する。よって、本発明の受容体発現細胞に、放射活性同位体であるRb（[86Rb]）を取り込ませておいた後、本発明のリガンドの刺激によって流出する86Rbの流れ（流出活性）を測定することにより、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定する。
具体的には、86Rbの存在下、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、86Rbの流出活性を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、本発明のリガンド刺激による86Rbの流出活性の上昇を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、本発明のリガンドと同様な86Ｒｂの流出活性の上昇を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００７２】
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞を24穴プレートに播き、2日間培養する。その後、1mCi/mlの86RbClを含む培地中で2時間保温する。細胞を培地でよく洗浄し、外液中の86RbClを完全に除く。本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を細胞に添加し、30分後外液を回収し、γカウンターで放射活性を測定し、比較する。
本発明のリガンド刺激による86Rbの流出活性の上昇を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００７３】
（１０）本発明の受容体発現細胞が本発明のリガンドに反応し、細胞外のｐＨが変化する。この反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、本発明のリガンドを、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体発現細胞に接触させた場合における、細胞外のｐＨ変化を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
細胞外ｐＨ変化は、例えば、Cytosensor装置（モレキュラーデバイス社）を使用して測定する。
本方法において、本発明のリガンドによる細胞外ｐＨ変化を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体発現細胞に接触させ、本発明のリガンドと同様な細胞外ｐＨ変化を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００７４】
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
本発明の受容体発現細胞をCytosensor装置用のカプセル内で終夜培養し、装置のチャンバーにセットして細胞外ｐＨが安定するまで約2時間、0.1％ BSAを含むRPMI1640培地（モレキュラーデバイス社製）を灌流させる。ｐＨが安定した後、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を含む培地を細胞上に灌流させる。灌流によって生じた培地のｐＨ変化を測定し、比較する。
本発明のリガンドによる細胞外ｐＨ変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００７５】
（１１）酵母（Saccharomyces cerevisiae）のhaploidα-mating Type (MATα) の性フェロモン受容体STe2は、G蛋白質Gpa1と共役しており、性フェロモンα-mating factorに応答してMAPキナーゼを活性化し、これに引き続き、Far1（cell-cycle arrest）および転写活性化因子Ste12が活性化される。Ste12は、種々の蛋白質（例えば、接合に関与するFUS1）の発現を誘導する。一方、制御因子Sst2は上記の過程に抑制的に機能する。この系において、受容体遺伝子を導入した酵母を作製し、受容体アゴニストの刺激により酵母細胞内のシグナル伝達系を活性化し、その結果生じる増殖などを指標として用いる、受容体アゴニストと受容体との反応の測定系の試みが行なわれている（Trends in Biotechnology, 15巻, 487-494頁, 1997年）。上記の受容体遺伝子導入酵母の系を利用して、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
【００７６】
具体例を以下に示す。
MATα酵母のSte2およびGpa1をコードする遺伝子を除去し、代わりに、本発明の受容体遺伝子およびGpa1-Gai2融合蛋白質をコードする遺伝子を導入する。Farをコードする遺伝子を除去してcell-cycle arrestが生じないようにし、また、Sstをコードする遺伝子を除去して本発明のリガンドに対する応答の感度を向上させておく。さらに、FUS1にヒスチジン生合成遺伝子HIS3を結合したFUS1-HIS3遺伝子を導入する。この遺伝子組換え操作は、例えば、Molecular and Cellular Biology, 15巻, 6188-6195頁, 1995年に記載の方法において、ソマトスタチン受容体タイプ2（SSTR2）遺伝子を、本発明の受容体に置き換えて実施することができる。
このように構築された形質変換酵母は、本発明のリガンドに高感度で反応し、その結果、MAPキナーゼの活性化が起き、ヒスチジン生合成酵素が合成されるようになり、ヒスチジン欠乏培地で生育可能になる。
従って、上記の本発明の受容体発現酵母（Ste2遺伝子およびGpa1遺伝子が除去され、本発明の受容体遺伝子およびGpa1-Gai2融合蛋白質コード遺伝子が導入され、Far遺伝子およびSst遺伝子が除去され、FUS1-HIS3遺伝子が導入されたMATα酵母）を、ヒスチジン欠乏培地で培養し、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を接触させ、該酵母の生育を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
本方法において、該酵母の生育を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを上記の本発明の受容体発現酵母に接触させ、本発明のリガンドと同様な酵母の生育を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００７７】
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
上記の本発明の受容体発現酵母を完全合成培地の液体培地で終夜培養し、その後、ヒスチジンを除去した溶解寒天培地に、2x104cell/mlの濃度になるように加える。ついで、9x9cmの角形シャーレに播く。寒天が固化した後、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物をしみこませた滅菌濾紙を寒天表面におき、30℃で3日間培養する。試験化合物の影響は、濾紙の周囲の酵母の生育を、本発明のリガンドのみをしみこませた滅菌濾紙を用いた場合と比較する。また、あらかじめ、ヒスチジンを除去した寒天培地に本発明のリガンドを添加しておき、滅菌濾紙に試験化合物のみをしみこませて酵母を培養し、シャーレ全面での酵母の生育が濾紙の周囲で影響を受けることを観察してもよい。
酵母の生育を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
【００７８】
（１２）本発明の受容体遺伝子RNAをアフリカツメガエル卵母細胞に注入し、本発明のリガンドによって刺激すると細胞カルシウム濃度が上昇して、calcium-activated chloride currentが生じる。これは、膜電位の変化としてとらえることができる（Kイオン濃度勾配に変化がある場合も同様）。本発明のリガンドによって生じる本発明の受容体導入アフリカツメガエル卵母細胞における上記反応を利用して、本発明のリガンドの本発明の受容体発現細胞に対する刺激活性を測定することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングすることができる。
具体的には、本発明のリガンドを、本発明の受容体遺伝子RNA導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を、本発明の受容体遺伝子RNA導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させた場合における、細胞膜電位の変化を測定し、比較することにより、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物をスクリーニングする。
本方法において、細胞膜電位変化を抑制する試験化合物を、拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
一方、試験化合物のみを本発明の受容体遺伝子RNA導入アフリカツメガエル卵母細胞に接触させ、本発明のリガンドと同様な細胞膜電位変化を測定することによりアゴニストのスクリーニングを行なうこともできる。
【００７９】
スクリーニング法の一具体例を以下に述べる。
氷冷して動けなくなった雌のアフリカツメガエルから取り出した、卵母細胞塊を、MBS液（88mM NaCl, 1mM KCl, 0.41mM CaCl2, 0.33mM Ca(NO3)2, 0.82mM MgSO4, 2.4mM NaHCO3, 10mM HEPES； pH7.4）に溶かしたコラーゲナーゼ（0.5mg/ml）で卵塊がほぐれるまで19℃、1〜6時間、150rpmで処理する。外液をMBS液に置換することで3度洗浄し、マイクロマニピュレーターで本発明の受容体遺伝子poly A付加cRNA（50ng/50nl）を卵母細胞にマイクロインジェクションする。
本発明の受容体遺伝子mRNAは、組織や細胞から調製してもよく、プラスミドからin vitroで転写してもよい。本発明の受容体遺伝子mRNAをMBS液中で20℃で3日培養し、これをRinger液を流しているvoltage clamp装置のくぼみに置き、電位固定用ガラス微小電極および電位測定用ガラス微小電極を細胞内に刺入し、（−）極は細胞外に置く。電位が安定したら、本発明のリガンドまたは本発明のリガンドおよび試験化合物を含むRinger液を流して電位変化を記録する。試験化合物の影響は、本発明の受容体遺伝子RNA導入アフリカツメガエル卵母細胞の細胞膜電位変化を、本発明のリガンドのみ含むRinger液を流した場合と比較することによって測定することができる。
細胞膜電位変化を抑制する化合物を拮抗阻害能力のある候補物質として選択することができる。
上記の系において、電位の変化量を増大させると、測定しやすくなるため、各種のG蛋白質遺伝子のpoly A付加RNAを導入してもよい。また、カルシウム存在下で発光を生じるような蛋白質（例、aequorinなど）の遺伝子のpoly A付加RNAを共インジェクションすることにより、膜電位変化ではなく発光量を測定することもできる。
【００８０】
本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、本発明の受容体または本発明の受容体を含有する細胞もしくは細胞の膜画分、および本発明のリガンドを含有する。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、次のものが挙げられる。
１．スクリーニング用試薬
（i）測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution（ギブコ社製）に、0.05％のウシ血清アルブミン（シグマ社製）を加えたもの。
孔径0.45μmのフィルターで濾過滅菌し、4℃で保存するか、または用時調製しても良い。
（ii）本発明の受容体標品
本発明の受容体を発現させたCHO細胞を、12穴プレートに5×105個／穴で継代し、37℃、5％CO2、95％airで2日間培養したもの。
（iii）標識リガンド
〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔32P〕、〔33P〕、〔35S〕などの放射性同位元素で標識した本発明のリガンドを適当な溶媒または緩衝液に溶解したものを、4℃または-20℃にて保存し、用時に測定用緩衝液にて1μMに希釈する。
（iv）リガンド標準液
本発明のリガンドを0.1％ウシ血清アルブミン（シグマ社製）を含むPBSで1mMとなるように溶解し、-20℃で保存する。
【００８１】
２．測定法
（i）12穴組織培養用プレートにて培養した本発明の受容体を発現させた細胞を、測定用緩衝液1mlで2回洗浄した後、490μlの測定用緩衝液を各穴に加える。
（ii）10-3〜10-10Mの試験化合物溶液を5μl加えた後、標識した本発明のリガンドを5μl加え、室温にて1時間反応させる。非特異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに10-3Mの本発明のリガンドを5μl加えておく。
（iii）反応液を除去し、1mlの洗浄用緩衝液で3回洗浄する。細胞に結合した標識された本発明のリガンドを0.2N NaOH-1％SDSで溶解し、4mlの液体シンチレーターA（和光純薬製）と混合する。
（iv）液体シンチレーションカウンター（ベックマン社製）を用いて放射活性を測定し、Percent Maximum Binding（PMB）を次式で求める。
ＰＭＢ＝［（Ｂ−ＮＳＢ）／（Ｂ0−ＮＳＢ）］×１００
ＰＭＢ：Percent Maximum Binding
Ｂ    ：検体を加えた時の値
ＮＳＢ：Non-specific Binding（非特異的結合量）
Ｂ0   ：最大結合量
【００８２】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られうる化合物またはその塩は、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合を変化させる化合物あるいは本発明の受容体の活性を促進または阻害する化合物であり、具体的には、（i）本発明の受容体を介して細胞刺激活性を有する化合物またはその塩（本発明の受容体アゴニスト）、（ii）該刺激活性を有しない化合物（本発明の受容体アンタゴニスト）、（iii）本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物、（iv）本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合物などである。該化合物としては、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
該化合物の塩としては、前記した本発明の受容体の塩と同様のものが用いられる。
【００８３】
上記本発明の受容体アゴニストであるか、またはアンタゴニストであるかの評価方法は、例えば、以下の（i）または（ii）に従えばよい。
（i）前記（a）〜（c）のスクリーニング方法で示されるバインディング・アッセイを行い、本発明のリガンドと本発明の受容体との結合性を変化させる（特に、結合を阻害する）化合物を得た後、該化合物が上記した本発明の受容体を介する細胞刺激活性を有しているか否かを測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の受容体アゴニスト（アゴニスト）であり、該活性を有しない化合物またはその塩は本発明の受容体アンタゴニスト（アンタゴニスト）である。
（ii）(a)試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させ、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定する。細胞刺激活性を有する化合物またはその塩は本発明の受容体アゴニストである。
(b)本発明のリガンドを本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合と、本発明のリガンドおよび試験化合物を本発明の受容体を含有する細胞に接触させた場合における、本発明の受容体を介した細胞刺激活性を測定し、比較する。本発明の受容体を活性化する化合物による細胞刺激活性を減少させ得る化合物またはその塩は本発明の受容体アンタゴニストである。
【００８４】
前述したように、本発明のリガンドは、癌細胞のアポトーシス促進活性、細胞増殖抑制活性などを有する。
従って、本発明の受容体アゴニストは、本発明のリガンドが有する生理活性（例、癌細胞のアポトーシス促進活性など）と同様の作用を有しており、安全で低毒性な医薬、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、卵巣癌、血液腫瘍など）などの予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤などとして有用である。
本発明の受容体アンタゴニストは、本発明のリガンドが有する生理活性（例、虚血再かん流後の心筋細胞のアポトーシスなど）を抑制することができるので、安全で低毒性な医薬、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）などの予防・治療剤、心筋細胞のアポトーシスの予防・治療剤などとして有用である。
本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を促進する化合物は、安全で低毒性な医薬、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、卵巣癌、血液腫瘍など）などの予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤などとして有用である。
本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合力を阻害する化合物は、安全で低毒性な医薬、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）などの予防・治療剤、心筋細胞のアポトーシスの予防・治療剤などとして有用である。
【００８５】
また、本発明は、本発明の受容体をコードする本発明のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法なども提供する。
具体的には、（i）本発明の受容体を産生する能力を有する細胞を培養した場合と（ii）本発明の受容体を産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行い、本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする。
上記スクリーニング方法においては、例えば、（i）と（ii）の場合における、本発明の受容体の遺伝子の発現量（具体的には、本発明の受容体量または本発明の受容体をコードするｍＲＮＡ量など）を測定して、比較する。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明ポリペプチドまたは本発明の受容体を産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適したバッファーに浮遊して調製する。バッファーには、ｐＨ約４〜１０（望ましくは、ｐＨ約６〜８）のリン酸バッファー、ほう酸バッファーなどの、本発明の受容体の活性を阻害しないバッファーであればいずれでもよい。
本発明の受容体を産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明の受容体をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）などが用いられる。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明の受容体を細胞膜上に発現させた形質転換体などが好ましく用いられる。
本発明の受容体の蛋白質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明の抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記ポリペプチドまたは受容体を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
本発明の受容体の遺伝子の発現量は、公知の方法、例えば、ノーザンブロッティングやReverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）、リアルタイムPCR解析システム（ABI社製、TaqMan polymerase chain reaction）などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測定することができる。
例えば、上記（ii）の場合における本発明の受容体の遺伝子の発現を、上記（i）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上促進する試験化合物を本発明の受容体の遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。
例えば、上記（ii）の場合における本発明の受容体の遺伝子の発現を、上記（i）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害する試験化合物を本発明の受容体の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
本発明の受容体の遺伝子の発現を促進（発現量を増加）する化合物またはその塩は、本発明のリガンドと同様に、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、卵巣癌、血液腫瘍など）などの予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤などの医薬として使用できる。
本発明の受容体の遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩は、本発明の受容体に対する本発明のリガンドが有する生理活性を抑制することができるので、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）などの予防・治療剤などとして有用である。
【００８６】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、蛋白質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれた化合物であり、本発明の受容体と本発明のリガンドとの結合性を変化させる化合物、本発明の受容体の活性または機能を促進または阻害する化合物、本発明の受容体の遺伝子の発現を促進または阻害（発現量を増加または減少）する化合物などである。
該化合物の塩としては、前記した本発明の受容体の塩と同様のものが用いられる。
【００８７】
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上記の医薬（予防・治療剤など）として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。
該化合物またはその塩は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、該化合物またはその塩を、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）に対して投与することができる。
【００８８】
該化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はある。
例えば、乳癌患者（体重６０ｋｇ当たり）に、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ経口投与する。非経口的に投与する場合、例えば、該化合物を注射剤の形で乳癌患者（体重６０ｋｇ当たり）に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００８９】
〔２〕本発明の受容体が関与する各種疾病の予防・治療剤
本発明の受容体は、前述したような活性を有する本発明のリガンドへの結合活性などを有する。従って本発明の受容体または本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）に異常があったり、欠損している場合には、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、卵巣癌、血液腫瘍など）などとなる可能性が高い。従って、本発明の受容体または本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）は、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、卵巣癌、血液腫瘍など）などの予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤などの低毒性で安全は医薬として使用することができる。
本発明の受容体または本発明のポリヌクレチドは、例えば、生体内において本発明の受容体が減少あるいは欠損している患者がいる場合に、（イ）本発明のポリヌクレオチドを該患者に投与し、生体内で本発明の受容体を発現させることによって、（ロ）細胞に本発明のポリヌクレオチドを挿入し、本発明の受容体を発現させた後に、該細胞を患者に移植することによって、または（ハ）本発明の受容体を該患者に投与することなどによって、該患者における本発明の受容体の役割を十分に、あるいは正常に発揮させることができる。
本発明のポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤として使用する場合は、該ポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノウィルスアソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは温血動物に投与することができる。本発明のポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明の受容体を上記の予防・治療剤として使用する場合は、少なくとも９０％、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
【００９０】
本発明の受容体は、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、または水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、本発明の受容体を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）などがあげられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例えば、エタノールなど）、ポリアルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０TM、ＨＣＯ−５０など）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。
本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）が挿入されたベクターも上記と同様に製剤化され、通常、非経口的に使用される。
【００９１】
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）に対して投与することができる。
本発明の受容体の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療目的で本発明の受容体を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、一日につき該ポリペプチドを約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１.０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１.０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該受容体の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、乳癌の治療目的で本発明の受容体を注射剤の形で成人（体重６０ｋｇとして）に投与する場合、一日につき該ポリペプチドまたは該受容体を約０.０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０.１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０.１〜１０ｍｇを患部に注射することにより投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【００９２】
〔３〕本発明の受容体の定量
本発明の抗体は、本発明の受容体を特異的に認識することができるので、被検液中の本発明の受容体の定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。
すなわち、本発明は、
（ｉ）本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明の受容体とを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明の受容体の割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明の受容体の定量法、および
（ii）被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明の受容体の定量法を提供する。
上記（ii）の定量法においては、一方の抗体が本発明の受容体のＮ端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明の受容体のＣ端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明の受容体に対するモノクローナル抗体を用いて本発明の受容体の定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のＦ(ａｂ')2、Ｆａｂ'、あるいはＦａｂ画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明の受容体の定量法は、 特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、ポリペプチド量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
【００９３】
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常ポリペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ（１次反応）、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ（２次反応）たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の受容体量を定量することができる。１次反応と２次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
【００９４】
本発明のサンドイッチ法による本発明の受容体の測定法においては、１次反応と２次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明の受容体の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明の受容体のＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原（Ｆ）と、抗体と結合した標識抗原（Ｂ）とを分離し（Ｂ／Ｆ分離）、Ｂ，Ｆいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、Ｂ／Ｆ分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第２抗体などを用いる液相法、および、第１抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第１抗体は可溶性のものを用い第２抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の受容体の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol. 70(Immunochemical Techniques(Part A))、同書 Vol. 73(Immunochemical Techniques(Part B))、同書 Vol. 74(Immunochemical Techniques(Part C))、同書 Vol. 84(Immunochemical Techniques(Part D : Selected Immunoassays))、同書 Vol. 92(Immunochemical Techniques(Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol. 121(Immunochemical Techniques(Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明の受容体を感度良く定量することができる。
【００９５】
さらには、本発明の抗体を用いて本発明の受容体の濃度を定量することによって、本発明の受容体の濃度の増加が検出された場合、例えば、癌、心疾患などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明の受容体の濃度の減少が検出された場合には、例えば、癌、心疾患などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明の受容体を検出するために使用することができる。また、本発明の受容体を精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明の受容体の検出、被検細胞内における本発明の受容体の挙動の分析などのために使用することができる。
【００９６】
〔４〕遺伝子診断薬
本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）は、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトや温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、など）における本発明の受容体をコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
本発明のＤＮＡを用いる上記の遺伝子診断は、例えば、公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Genomics，第5巻,874〜879頁(1989年)、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,第86巻,2766〜2770頁(1989年)）などにより実施することができる。
例えば、本発明の受容体の遺伝子の発現過多が検出された場合は、例えば、癌、心疾患などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。また、本発明の受容体の遺伝子の発現減少が検出された場合は、例えば、癌、心疾患などの疾病である、または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
【００９７】
〔５〕アンチセンスポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）を含有する医薬
本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）に相補的に結合し、該ポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の発現を抑制することができるアンチセンスポリヌクレオチド（例、アンチセンスＤＮＡ）は、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）などの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
例えば、上記アンチセンスＤＮＡを用いる場合、該アンチセンスＤＮＡを単独あるいはレトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノウィルスアソシエーテッドウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って実施することができる。該アンチセンスＤＮＡは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
さらに、該アンチセンスＤＮＡは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
【００９８】
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明の受容体をコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ（例、ｓｉＲＮＡ（small (short) interfering RNA）、ｓｈＲＮＡ（small (short) hairpin RNA）など）、本発明の受容体をコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイムなども、本発明のポリヌクレオチドの発現を抑制することができ、生体内における本発明の受容体または本発明のポリヌクレオチドの機能を抑制することができるので、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）などの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Nature, 411巻, 494頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、TRENDS in Molecular Medicine, 7巻, 221頁, 2001年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明の受容体をコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明の本発明の受容体をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
【００９９】
〔６〕本発明の抗体を含有する医薬
本発明の受容体のシグナル伝達を活性化する本発明の抗体は、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、卵巣癌、血液腫瘍など）の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
本発明の受容体を中和する作用を有する（シグナル伝達を不活性化する）本発明の抗体は、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）などの予防・治療剤、心筋細胞のアポトーシスの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
【０１００】
本発明の抗体を含有する上記医薬は、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトや温血動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なるが、例えば、乳癌患者の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体を１回量として、通常０.０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０.１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０.１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、それ自体または適当な医薬組成物として投与することができる。上記投与に用いられる医薬組成物は、上記またはその塩と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。かかる組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、例えば、経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などがあげられる。かかる組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。例えば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
【０１０１】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤などが用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤などの剤形を包含する。かかる注射剤は、公知の方法に従って、例えば、上記抗体またはその塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製する。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（polyoxyethylene(50mol)adduct of hydrogenated castor oil）〕などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプルに充填される。直腸投与に用いられる坐剤は、上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。かかる投薬単位の剤形としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが例示され、それぞれの投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体が含有されていることが好ましい。
なお前記した各組成物は、上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
【０１０２】
〔７〕ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明の受容体をコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである上記（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターなどを提供する。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ1系統，ＢＤＦ1系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ1系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
【０１０３】
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明の受容体を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明の受容体の機能を抑制するポリペプチドを発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
【０１０４】
本発明の受容体の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、（i）ウィルス（例、シミアンウィルス、サイトメガロウィルス、モロニー白血病ウィルス、ＪＣウィルス、乳癌ウィルス、ポリオウィルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（ii）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性蛋白質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存蛋白質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎蛋白質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウィルスプロモーター、ヒトポリペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするｍＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウィルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
【０１０５】
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明の受容体の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なポリペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
【０１０６】
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明の受容体の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明の受容体の機能亢進症や、本発明の受容体が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明の受容体の増加症状を有することから、本発明の受容体に関連する疾患〔例、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、卵巣癌、血液腫瘍など）、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）など〕に対する予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原科として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラク卜は、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
【０１０７】
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明の受容体の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明の受容体の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明の受容体の機能不活性型不応症における本発明の異常ポリペプチドまたは本発明の異常受容体による正常ポリペプチドまたは受容体の機能阻害（dominant negative作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明の受容体の増加症状を有することから、本発明の受容体の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
（i）組織培養のための細胞源としての使用、
（ii）本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたポリペプチドまたは受容体組織を分析することによる、本発明の受容体により特異的に発現あるいは活性化するポリペプチドまたは受容体との関連性についての解析、
（iii）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（iv）上記（iii）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（v）本発明の変異ポリペプチドまたは受容体を単離精製およびその抗体作製
などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明の受容体の機能不活性型不応症などを含む、本発明の受容体に関連する疾患〔例、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、卵巣癌、血液腫瘍など）、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）など〕の臨床症状を調べることができ、また、本発明の受容体に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどの蛋白質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明の受容体産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明の受容体およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明の受容体の機能不活性型不応症を含む、本発明の受容体に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明の受容体が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
【０１０８】
〔８〕ノックアウト動物
本発明は、本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された上記（１）記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である上記（１）記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（１）記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである上記（４）記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である上記（６）記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである上記（８）記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）上記（７）記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、あるいは該ＤＮＡがコードしている本発明の受容体の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明の受容体の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエクソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
【０１０９】
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエクソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエクソンの機能を破壊するか、あるいはエクソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のEvansとKaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ1マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ1）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ1マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３.５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
【０１１０】
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０6個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（1〜10000 U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常0.001〜0.5％トリプシン／0.1〜5 mM EDTA、好ましくは約0.1％トリプシン／1 mM EDTA）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, Nature 第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin  Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschman ら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明の受容体の細胞生物学的検討において有用である。
【０１１１】
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知の方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明の受容体のヘテロ発現不全個体であり、本発明の受容体のヘテロ発現不全個体同士を交配し、それらの産仔から本発明の受容体のホモ発現不全個体を得ることができる。
【０１１２】
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明の受容体により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明の受容体の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
【０１１３】
本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明の受容体をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明の受容体の発現する組織で、本発明の受容体の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明の受容体の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明の受容体欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、有機酸など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
【０１１４】
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明の受容体の発現を促進し、該ポリペプチドまたは本発明の受容体の活性または機能を促進することができるので、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、卵巣癌、血液腫瘍など）などの予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
また、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明の受容体の発現を阻害し、本発明の受容体の活性または機能を阻害することができるので、例えば、心疾患（例、心筋症、心筋梗塞、心不全、狭心症など）などの予防・治療剤、心筋細胞のアポトーシスの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
【０１１５】
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のスクリーニング方法で得られる化合物またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の乳癌の患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の乳癌の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の心不全の患者においては、一日につき該化合物を約０.１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の心不全の患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療薬の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明の受容体のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明の受容体そのものの体内での産生能力を特異的に促進または阻害（抑制）する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
【０１１６】
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
Ｉ ：イノシン
Ｒ ：アデニン（Ａ）またはグアニン（Ｇ）
Ｙ ：チミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）
Ｍ ：アデニン（Ａ）またはシトシン（Ｃ）
Ｋ ：グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｓ ：グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｗ ：アデニン（Ａ）またはチミン（Ｔ）
Ｂ ：グアニン（Ｇ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｄ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはチミン（Ｔ）
Ｖ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）
Ｎ ：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）もしく
はチミン（Ｔ）または不明もしくは他の塩基
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＢＨＡ          ：ベンズヒドリルアミン
ｐＭＢＨＡ      ：ｐ−メチルベンズヒドリルアミン
Ｔｏｓ          ：ｐ−トルエンスルフォニル
Ｂｚｌ          ：ベンジル
Ｂｏｍ          ：ベンジルオキシメチル
Ｂｏｃ          ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＤＣＭ          ：ジクロロメタン
ＨＯＢｔ        ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＤＣＣ          ：Ｎ,Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＴＦＡ          ：トリフルオロ酢酸
ＤＩＥＡ        ：ジイソプロピルエチルアミン
【０１１７】
Ｇｌｙ又はＧ    ：グリシン
Ａｌａ又はＡ   ：アラニン
Ｖａｌ又はＶ   ：バリン
Ｌｅｕ又はＬ   ：ロイシン
Ｉｌｅ又はＩ   ：イソロイシン
Ｓｅｒ又はＳ ：セリン
Ｔｈｒ又はＴ ：スレオニン
Ｃｙｓ又はＣ ：システイン
Ｍｅｔ又はＭ ：メチオニン
Ｇｌｕ又はＥ ：グルタミン酸
Ａｓｐ又はＤ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ又はＫ ：リジン
Ａｒｇ又はＲ ：アルギニン
Ｈｉｓ又はＨ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ又はＦ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ又はＹ ：チロシン
Ｔｒｐ又はＷ ：トリプトファン
Ｐｒｏ又はＰ ：プロリン
Ａｓｎ又はＮ ：アスパラギン
Ｇｌｎ又はＱ ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｔｙｒ（Ｉ）    ：３−ヨードチロシン
ＤＭＦ          ：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
Ｆｍｏｃ        ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
Ｔｒｔ          ：トリチル
Ｐｂｆ          ：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾ
フラン−５−スルホニル
Ｃｌｔ          ：２−クロロトリチル
Ｂｕt           ：ｔ−ブチル
Ｍｅｔ（Ｏ）    ：メチオニンスルフォキシド
【０１１８】
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ヒトGPR30のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
ラットGPR30のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：３〕
マウスGPR30のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：４〕
ヒトGPR30のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
配列番号：１で表されるアミノ酸配列を有するヒトGPR30をコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
ラットGPR30をコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
マウスGPR30をコードするcDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号：８〕
配列番号：４で表されるアミノ酸配列を有するヒトGPR30をコードするcDNAの塩基配列を示す。
【０１１９】
以下に参考例および実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。
参考例１
ヒトGPR30発現CHO細胞の作製
ヒトGPR30のcDNA（配列番号：５）を公知のPCR法によりクローニングし、pAKKO1.11H発現ベクター（Biochemica et Biophysica Acta 1219 (1994) 251-259）に組み込んだ。プラスミドの構造を、制限酵素処理および配列解析で確認し、正しい構築のものをCHO細胞発現用プラスミドpAK−hGPR30として使用した。
このプラスミドpAK−hGPR30をCHO/dhfr-細胞（American Type Culture Collection）にエレクトロポレーション法で形質導入した。まず、プラスミド pAK−hGPR30を制限酵素Ahd Iで処理した。エレクトロポレーション用のキュベットに、PBS 500μl に懸濁した5 x 106個のCHO/ dhfr- 細胞と、TE buffer 10 μlに溶解したプラスミドDNA 5μgを添加し、5分間氷上で静置後、0.25V、960μFの条件でエレクトロポレーションを行った。5分間氷上で静置後、全量のCHO/ dhfr- 細胞をT75フラスコに播き、10％のウシ胎児血清（BIO WHITTAKER 社）を含む、核酸含有MEMalpha培地（Invitrogen社）中で37℃、5％炭酸ガス中で１日間培養した。該細胞をトリプシン処理により分散させてフラスコから回収し、200個または500個ずつ96 well plateに植え込み、透析済み10％ウシ胎児血清（JRH BIOSCIENCES 社）、50μg/ml gentamicinを含む核酸不含MEMalpha培地（Invitrogen社）中にて37℃、5％炭酸ガス中にて培養を開始した。プラスミドの導入された形質転換CHO細胞は該培地中で生育するが、非導入細胞は次第に死滅していく。培養開始8〜10日後に、96 well plate の一個のwellの中に一個のコロニーが生育してきたwellを選択し、形質転換CHO細胞のコロニーを約48個選んだ。それぞれ選択された細胞からRNAを市販のRNA単離用キットを用いて回収し、以降、公知のTaqMan RT-PCR法によりヒトGPR30を高発現する形質転換CHO細胞19番クローン（以後、ヒトGPR30細胞と略称する）を選別した。
【０１２０】
参考例２
ラットGPR30発現CHO細胞の作製
ラットGPR30は、GPR41としてBiochemical Biophysical Research Communications 234巻、190-193頁、1997年に報告されている。
ラットGPR30レセプターcDNA（配列番号：６）を公知のPCR法によりクローニングし、pAKKO1.11H発現ベクター（Biochemica et Biophysica Acta 1219巻、251-259頁、1994年）に組み込んだ。プラスミドの構造を、制限酵素処理ならびに配列解析で確認し、正しい構築のものをCHO細胞発現用プラスミドpAK-rGPR30として使用した。
このプラスミドpAK−rGPR30を参考例１に記載した方法に従い、CHO/dhfr-細胞（American Type Culture Collection）にエレクトロポレーション法で形質導入し、ラットGPR30を高発現する形質転換CHO細胞6番クローン（以後、ラットGPR30細胞と略称する）を選別した。
【実施例１】
【０１２１】
FLIPRによるヒトGPR30およびラットGPR30アゴニスト活性の測定
上記参考例で得られたヒトGPR30細胞およびラットGPR30細胞を、それぞれ15×104cells/mlとなるように培地（10％ d FBS-DMEM）に懸濁し、FLIPR用96穴プレート(Black plate clear bottom、Coster社)に8連ピペットを用いて各ウェルに200μlずつ植え込み（3.0×104cells/200μl/ウェル）、5％ CO2インキュベーター中にて37℃で一晩培養した後用いた（以後、細胞プレートとする）。H/HBSS（ニッスイハンクス2（日水製薬株式会社）9.8g、炭酸水素ナトリウム 0.35g、HEPES 4.77 g、6 M水酸化ナトリウム溶液でｐＨ７．４に合わせた後、フィルター滅菌処理）20 ml、250 mM Probenecid 200μl、ウシ胎児血清(FBS) 200μlを混合した。また、Fluo 3-AM（同仁化学研究所）2バイアル（50μg）をジメチルスルフォキサイド 40μl、20％ Pluronic acid（Molecular Probes社） 40μlに溶解し、これを上記H/HBSS−Probenecid−FBS に加え、混和後、8連ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ウェル 100μlずつ分注し、5％ CO2インキュベーター中にて37℃で1時間インキュベートした（色素ローディング）。
全trans-レチノール、全-trans-レチナールまたは4-HPR（4-ヒドロキシフェニルレチナミド）を2.5 mM Probenecid、0.1％ CHAPSを含むH/HBSS または 2.5 mM Probenecid、0.1％ CHAPS、0.2％ BSAを含むH/HBSS 150μlに加えて希釈し、FLIPR用96穴プレート(V-Bottomプレート、Coster社)へ移した（以後、サンプルプレートとする）。細胞プレートの色素ローディング終了後、H/HBSSに2.5 mM Probenecidを加えた洗浄バッファーでプレートウォッシャー（Molecular Devices社）を用いて細胞プレートを5回洗浄し、洗浄後100μlの洗浄バッファーを残した。この細胞プレートとサンプルプレートをFLIPRにセットし（FLIPRにより、サンプルプレートから50μlのサンプルが細胞プレートへと移される）、蛍光強度変化を継時的に測定することにより、細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性を測定した。
結果を図１〜図８に示す。
これより、ヒトGPR30細胞およびラットGPR30細胞において、全trans-レチノール、全trans-レチナールおよび4-HPRは、濃度依存的に細胞内カルシウム濃度の上昇を惹起した。
【実施例２】
【０１２２】
FLIPRを用いたヒトGPR30およびラットGPR30アゴニストの探索法
上記参考例で得られたヒトGPR30細胞およびラットGPR30細胞を、それぞれ15×104cells/mlとなるように培地（10％ d FBS-DMEM）に懸濁し、FLIPR用96穴プレート(Black plate clear bottom、Coster社)に8連ピペットを用いて各ウェルに200μlずつ植え込み（3.0×104cells/200μl/ウェル）、5％ CO2インキュベーター中にて37℃で一晩培養した以降のアッセイに用いる（以後、細胞プレートとする）。H/HBSS（ニッスイハンクス2（日水製薬株式会社）9.8g、炭酸水素ナトリウム 0.35g、HEPES 4.77 g、6 M水酸化ナトリウム溶液で pH7.4に合わせた後、フィルター滅菌処理）20 ml、250 mM Probenecid 200μl、ウシ胎児血清(FBS) 200μlを混合する。また、Fluo 3-AM（同仁化学研究所）2バイアル（50μg）をジメチルスルフォキサイド 40μl、20％ Pluronic acid（Molecular Probes社） 40μlに溶解し、これを上記H/HBSS−Probenecid−FBSに加え、混和後、8連ピペットを用いて培養液を除いた細胞プレートに各ウェル 100μlずつ分注し、5％ CO2インキュベーター中にて37℃で1時間インキュベートする（色素ローディング）。
試験化合物を含有する溶液を2.5 mM Probenecid、0.1％ CHAPSを含むH/HBSS または 2.5 mM Probenecid、0.1％ CHAPS、0.2％ BSAを含むH/HBSS 150μlに加えて希釈し、FLIPR用96穴プレート（V-Bottomプレート、Coster社）へ移す（以後、サンプルプレートとする）。細胞プレートの色素ローディング終了後、H/HBSSに2.5 mM Probenecidを加えた洗浄バッファーでプレートウォッシャー（Molecular Devices社）を用いて細胞プレートを5回洗浄し、洗浄後100μlの洗浄バッファーを残す。この細胞プレートとサンプルプレートをFLIPRにセットし（FLIPRにより、サンプルプレートから50μlのサンプルが細胞プレートへと移される）、蛍光強度変化を継時的に測定することにより、細胞内カルシウムイオン濃度上昇活性を測定する。GPR30を発現させないCHO細胞、または、エンドセリン受容体（ETA）、メタスチン受容体（OT7T175）などの受容体を発現させたCHO細胞株を用いて上記と同様の試験を実施し、GPR30発現CHO細胞の細胞内カルシウムイオン濃度を特異的に上昇させる化合物を探索する。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】全trans-レチノールに対するヒトGPR30細胞の蛍光強度の継時的変化を表す。図中、●は全trans-レチノール100μM、▲は全trans-レチノール50μM、■は全trans-レチノール25μM、◆は全trans-レチノール12.5μM、○は全trans-レチノール6.25μM、◇は全trans-レチノール0μMの場合をそれぞれ表す。
【図２】全trans-レチナールに対するヒトGPR30細胞の蛍光強度の継時的変化を表す。図中、●は全trans-レチナール100μM、▲は全trans-レチナール50μM、■は全trans-レチナール25μM、◆は全trans-レチナール12.5μM、○は全trans-レチナール6.25μM、◇は全trans-レチナール0μMの場合をそれぞれ表す。
【図３】4-HPRに対するヒトGPR30細胞の蛍光強度の継時的変化を表す。図中、●は4-HPR 100μM、▲は4-HPR 50μM、■は4-HPR 25μM、◆は4-HPR 12.5μM、○は4-HPR 6.25μM、△は4-HPR 3.125μM、□は4-HPR 1.6125μM、◇は4-HPR 0μMの場合をそれぞれ表す。
【図４】全trans-レチノールに対するラットGPR30細胞の蛍光強度の継時的変化を表す。図中、●は全trans-レチノール100μM、▲は全trans-レチノール50μM、■は全trans-レチノール25μM、◆は全trans-レチノール12.5μM、○は全trans-レチノール6.25μMの場合をそれぞれ表す。
【図５】全trans-レチナールに対するラットGPR30細胞の蛍光強度の継時的変化を表す。図中、●は全trans-レチナール100μM、▲は全trans-レチナール50μM、■は全trans-レチナール25μM、◆は全trans-レチナール12.5μM、◇は全trans-レチナール0μMの場合をそれぞれ表す。
【図６】4-HPRに対するラットGPR30細胞の蛍光強度の継時的変化を表す。図中、●は4-HPR 100μM、▲は4-HPR 50μM、■は4-HPR 25μM、◆は4-HPR 12.5μM、○は4-HPR 6.25μM、◇は4-HPR 0μMの場合をそれぞれ表す。
【図７】種々の濃度の全trans-レチノール、全trans-レチナールおよび4-HPRに対するヒトGPR30細胞の蛍光強度の最高値を表す。図中、◇は全trans-レチノール、■は全trans-レチナール、▲は4-HPRをそれぞれ表す。
【図８】種々の濃度の全trans-レチノール、全trans-レチナールおよび4-HPRに対するラットGPR30細胞の蛍光強度の最高値を表す。図中、◇は全trans-レチノール、■は全trans-レチナール、▲は4-HPRをそれぞれ表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
0004799837.tif 000012
【図８】
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【配列表】
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