(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１試薬及び第２試薬より構成されるアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬であり、試料、第１試薬及び第２試薬を添加した混合液における緩衝剤濃度の３倍以上の濃度であって、かつ使用する温度及び保存する温度における溶解度以下の濃度である緩衝剤を含有する第２試薬、並びに緩衝剤を含有しないか又は混合液における緩衝剤濃度の１０分の１以下の濃度の緩衝剤を含有し、かつ４−ニトロフェニルリン酸又はその塩を含有し、かつｐＨがｐＨ５〜ｐＨ９である第１試薬より構成されることを特徴とするアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬。
【請求項２】
第２試薬のｐＨがｐＨ９〜ｐＨ１１である、請求項１記載のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬。
【請求項３】
第２試薬が、混合液における緩衝剤濃度の５倍以上の濃度であって、かつ使用する温度及び保存する温度における溶解度以下の濃度である緩衝剤を含有する、請求項１又は請求項２記載のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬。
【請求項４】
開封保存時のｐＨの低下を防止し安定化された、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、複数の試薬より構成される試薬群であり、これらの複数の試薬を添加した混合液のｐＨがｐＨ７〜ｐＨ１４の範囲の特定のｐＨである必要がある試薬群に関し、空気中の二酸化炭素の吸収等によるｐＨの変動を抑え、このｐＨの変動が引き起こす内容成分の変性若しくは分解又は効力の低下を防止し、安定化を図るものである。
本発明は、特に、化学分野、医療分野及び臨床検査分野等において有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
試薬及び複数の試薬を添加した混合液は、特定のｐＨの範囲でのみ、その内容成分が安定であったり、効力を有することが多い。
よって、その特定のｐＨの範囲をはずれた場合には、試薬又は混合液の内容成分の変性若しくは分解又は効力の低下が生じ、試薬又は混合液を使用できなくなってしまう。
そのため、そのような試薬又は複数の試薬より構成される試薬群においては、ｐＨがその内容成分が安定であったり又は効力を有するｐＨの範囲の特定のｐＨにある必要があり、実際そのようにｐＨは設定されている。
【０００３】
例えば、臨床検査において肝疾患の診断に重要な血清（血漿）試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性の測定に用いるアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬は、アルカリ性ホスファターゼの至適ｐＨがｐＨ１０であることからｐＨ１０付近にある必要があり、そのように設定されている。このアルカリ性ホスファターゼ活性の測定の原理を下に示した。
【０００４】
【化１】
0004734613.tif 000002
【０００５】
このような試薬又は複数の試薬を添加した混合液のｐＨがｐＨ７〜ｐＨ１４の範囲の特定のｐＨである必要がある試薬又は複数の試薬より構成される試薬群としては、このアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬の他に、やはり臨床検査試薬である、ロイシンアミノペプチダーゼ活性測定試薬、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性測定試薬、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定試薬、乳酸脱水素酵素活性測定試薬、コリンエステラーゼ活性測定試薬、硫酸亜鉛混濁試験測定試薬、チモール混濁試験測定試薬、マグネシウム測定試薬及びカルシウム測定試薬等が知られている。
【０００６】
しかしながら、このような試薬又は複数の試薬より構成される試薬群が空気に触れると、空気中の二酸化炭素（ＣＯ2 ）が試薬中に徐々に溶解し、試薬中にて炭酸（Ｈ2ＣＯ3）となり、試薬のｐＨを徐々に低下させ、これらの試薬を添加した混合液のｐＨも低下してしまい、試薬又は混合液の内容成分の変性若しくは分解又は効力の低下が生じ、試薬又は混合液が使用できなくなってしまう。
【０００７】
臨床検査試薬は、自動分析装置により行われる測定において複数の試薬より構成される試薬群の形態にて使用されることが多く、この測定時には冷温（約２〜１０℃）ではあるものの開封され空気に触れた状態で使用される。
この自動分析装置の試薬保冷庫に置かれた試薬群は、これらの容器に収容された試薬を使いきるまで、１〜２週間以上、長い場合には１カ月程、開封状態のまま空気に触れた状態で使用される。
【０００８】
例えば、この開封状態のまま空気に触れた状態にてアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬を使用すると、空気中の二酸化炭素が徐々に溶解して試薬のｐＨが経時的に低下し、このアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬の混合液（最終反応液）のｐＨもｐＨ１０付近から徐々に低下してしまう。
このため、アルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬の試薬群を開封し使用を開始してから１週間後（２〜１０℃にて使用）に、試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性を測定した場合には、使用開始時に比べて数％低下した測定値が得られてしまう。また、より低温で二酸化炭素が試薬に溶解し易い０〜５℃にて使用した場合には、使用開始１週間後の測定値は１０％以上も低下してしまうものであった。
このように、正確な測定値が得られなくなることは、疾病の診断を誤らせることにもつながる重大な問題であり、その解決が望まれていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように、従来の複数の試薬を添加した混合液のｐＨがｐＨ７〜ｐＨ１４の範囲の特定のｐＨである必要がある試薬群は、開封され空気に触れると、空気中の二酸化炭素が試薬中に徐々に溶解し、試薬のｐＨを徐々に低下させ、これらの試薬を添加した混合液のｐＨも低下してしまい、試薬又は混合液の内容成分の変性若しくは分解又は効力の低下が生じ、試薬又は混合液が使用できなくなってしまうという問題点を有するものであった。
【００１０】
本発明者らは、この従来の複数の試薬を添加した混合液のｐＨがｐＨ７〜ｐＨ１４の範囲の特定のｐＨである必要がある試薬群が有する問題点の解消を目指して鋭意検討を行った結果、試薬群を混合液における緩衝剤濃度の２倍以上の濃度の緩衝剤を含有する高緩衝剤濃度試薬、及び緩衝剤を含有しないか又は混合液における緩衝剤濃度の１０分の１以下の濃度の緩衝剤を含有する低緩衝剤濃度試薬より構成することにより、空気中の二酸化炭素が試薬中に溶解することによる試薬又は混合液のｐＨの低下を抑えることができることを見出し、開封され空気に触れた状態においても、ｐＨの低下による試薬又は混合液の内容成分の変性若しくは分解又は効力の低下が生じることなく、長期間安定に使用することができる試薬群を完成するに至った。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は以下の発明を提供する。
【００１２】
（１）第１試薬及び第２試薬より構成されるアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬であり、試料、第１試薬及び第２試薬を添加した混合液における緩衝剤濃度の３倍以上の濃度であって、かつ使用する温度及び保存する温度における溶解度以下の濃度である緩衝剤を含有する第２試薬、並びに緩衝剤を含有しないか又は混合液における緩衝剤濃度の１０分の１以下の濃度の緩衝剤を含有し、かつ４−ニトロフェニルリン酸又はその塩を含有し、かつｐＨがｐＨ５〜ｐＨ９である第１試薬より構成されることを特徴とするアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬。
（２）第２試薬のｐＨがｐＨ９〜ｐＨ１１である、前記（１）記載のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬。
（３）第２試薬が、混合液における緩衝剤濃度の５倍以上の濃度であって、かつ使用する温度及び保存する温度における溶解度以下の濃度である緩衝剤を含有する、前記（１）又は前記（２）記載のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬。
（４）  開封保存時のｐＨの低下を防止し安定化された、前記（１）〜前記（３）のいずれか１項に記載のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬。
【００１３】
本発明における試薬群は、複数の試薬より構成され、これらの複数の試薬それぞれを添加し調製した混合液又は他の物質にこれらの複数の試薬それぞれを添加し調製した混合液のｐＨが、ｐＨ７〜ｐＨ１４の範囲の特定のｐＨである必要があるものである。
【００１４】
本発明の試薬群は、上記の混合液における緩衝剤の濃度の２倍以上の濃度の緩衝剤を含有する高緩衝剤濃度試薬、及び緩衝剤を含有しないか又は上記の混合液における緩衝剤の濃度の１０分の１以下の濃度の緩衝剤を含有する低緩衝剤濃度試薬より構成される。
【００１５】
一般に、複数の試薬を添加して使用する混合液の緩衝剤の濃度は、その使用目的及び必要とされる緩衝能等を勘案して設定される。例えば、臨床検査試薬においては、まず混合液について測定反応の進行に最適な緩衝剤濃度が緩衝能をふまえて設定され、次にこの混合液の緩衝剤濃度を達成するように試薬群を構成する各試薬の緩衝剤濃度が設定される。
本発明は、このように予め設定されている混合液の緩衝剤の濃度は変えることなく、試薬群を上記の高緩衝剤濃度試薬及び低緩衝剤濃度試薬より構成させることにより、試薬又は混合液のｐＨの低下を抑えることを可能としたものである。
【００１６】
本発明の試薬群において、混合液における緩衝剤の濃度の２倍以上の濃度の緩衝剤を含有する高緩衝剤濃度試薬は、緩衝剤濃度が高く緩衝能が強いため、空気中の二酸化炭素等のｐＨの低下を引き起こす物質が溶解してもｐＨの低下を防ぐことができる。
【００１７】
高緩衝剤濃度試薬とともに試薬群を構成する低緩衝剤濃度試薬は、緩衝剤を含有しないか又は混合液における緩衝剤の濃度の１０分の１以下の濃度の緩衝剤しか含有しないので、高緩衝剤濃度試薬が高濃度の緩衝剤を含有するにもかかわらず、高緩衝剤濃度試薬及び低緩衝剤濃度試薬を添加した混合液の緩衝剤濃度を予め設定されている濃度に保つことができる。
更に、低緩衝剤濃度試薬は緩衝剤を含有しないか又は低濃度であって緩衝能が弱いため、高緩衝剤濃度試薬とは逆にｐＨの低下を引き起こす物質の溶解により容易にｐＨが低下してしまう。この速やかなｐＨの低下により、ｐＨの低下を引き起こす物質の低緩衝剤濃度試薬への更なる溶解は抑制され、結果として低緩衝剤濃度試薬及び高緩衝剤濃度試薬を添加した混合液中のｐＨの低下を引き起こす物質の濃度を低く抑えることができ、混合液のｐＨの低下の抑制に寄与することとなる。
【００１８】
なお、試薬群を構成する全ての試薬において、高濃度の緩衝剤を含有させることによっても、混合液のｐＨの低下を抑制することは可能かと思われる。
しかしながら、この場合は混合液の緩衝剤濃度も高濃度となってしまい、その使用目的に応じて予め設定されている緩衝剤濃度は保てなくなってしまう。
つまり、ｐＨの低下による試薬又は混合液の内容成分の変性若しくは分解又は効力の低下は防止できたとしても、緩衝剤濃度が高すぎるため使用目的に適さないものとなってしまい、実用に適さないものとなってしまう。
【００１９】
これに対して本発明は、試薬又は混合液のｐＨの低下の抑制と混合液に予め設定されている緩衝剤濃度の保持という従来両立が困難であった課題を同時に達成することができるものであり、これは高緩衝剤濃度試薬と低緩衝剤濃度試薬を組み合わせることにより得られる上記作用により初めて可能となったものである。
【００２０】
本発明の高緩衝剤濃度試薬においては、混合液における緩衝剤濃度の２倍以上の濃度の緩衝剤を含有させる必要があるが、ｐＨの低下をより強く抑制できることから混合液における緩衝剤濃度の３倍以上の濃度の緩衝剤を含有させることが好ましく、そして混合液における緩衝剤濃度の５倍以上の濃度の緩衝剤を含有させることが特に好ましい。
【００２１】
但し、試薬群を構成する高緩衝剤濃度試薬及び低緩衝剤濃度試薬を、場合により他の物質を加えて、添加し調製した混合液の緩衝剤濃度を予め設定された濃度とするには、試薬群を構成する高緩衝剤濃度試薬及び低緩衝剤濃度試薬における緩衝剤の濃度は、それぞれの高緩衝剤濃度試薬及び低緩衝剤濃度試薬（他の物質を加えた場合には他の物質も）の添加量に応じて設定することになる。
【００２２】
例えば、試薬群が一つの高緩衝剤濃度試薬及び一つの低緩衝剤濃度試薬の二つの試薬より構成される場合、予め設定された混合液の緩衝剤濃度ＣM 、高緩衝剤濃度試薬の緩衝剤濃度ＣH 並びに添加量ＶH 及び低緩衝剤濃度試薬の緩衝剤濃度ＣL 並びに添加量ＶL の間には下記の式で示される関係が成り立つ。よって、混合液の緩衝剤濃度ＣM が予め規定されている時は、下記の式が成り立つように高緩衝剤濃度試薬の緩衝剤濃度ＣH 並びに添加量ＶH 及び低緩衝剤濃度試薬の緩衝剤濃度ＣL 並びに添加量ＶL をそれぞれ設定すれば良い。また、混合液の緩衝剤濃度ＣM 、高緩衝剤濃度試薬の添加量ＶH 及び低緩衝剤濃度試薬の添加量ＶL が予め規定されている時は、下記の式が成り立つように高緩衝剤濃度試薬の緩衝剤濃度ＣH 及び低緩衝剤濃度試薬の緩衝剤濃度ＣL をそれぞれ設定すれば良い。
【００２３】
【化２】
0004734613.tif 000003
【００２４】
そして、高緩衝剤濃度試薬が含有する緩衝剤の濃度は、使用する温度、保存する温度におけるその緩衝剤の溶解度以下の濃度でないと析出してしまう。
【００２５】
なお、高緩衝剤濃度試薬が含有する緩衝剤濃度が混合液における緩衝剤の濃度の２倍未満であると、緩衝能が弱いためｐＨの低下を引き起こす物質の溶解によるｐＨの低下を有効に防ぐことができない。
【００２６】
また、低緩衝剤濃度試薬が含有する緩衝剤濃度が混合液における緩衝剤の濃度の１０分の１を超えるものであると、その緩衝能によりｐＨの低下を引き起こす物質が溶解した時に速やかにｐＨが低下せず、ｐＨの低下を引き起こす物質の低緩衝剤濃度試薬への更なる溶解は抑制されない。そして、低緩衝剤濃度試薬及び高緩衝剤濃度試薬を添加した混合液の緩衝剤濃度が高濃度となってしまい、予め設定されている緩衝剤濃度が保てなくなってしまう。
【００２７】
本発明の高緩衝剤濃度試薬に含有させる緩衝剤は、特に制限があるものではなく、設定を行うｐＨ及び使用目的等に応じて適宜選択して用いれば良い。なお、一つの高緩衝剤濃度試薬に複数の緩衝剤を含有させて用いても良い。
本発明の低緩衝剤濃度試薬に緩衝剤を含有させる場合も同様であり、特に制限があるものではなく、設定を行うｐＨ及び使用目的等に応じて緩衝剤を適宜選択して用いれば良く、一つの低緩衝剤濃度試薬に複数の緩衝剤を含有させて用いても良い。
【００２８】
そして、本発明の試薬群において、複数の高緩衝剤濃度試薬又は複数の低緩衝剤濃度試薬が含まれる場合には、それぞれの高緩衝剤濃度試薬又は低緩衝剤濃度試薬は、緩衝剤及びその濃度がそれぞれ異なるものであって良い。
【００２９】
本発明において、混合液のｐＨはｐＨ７〜ｐＨ１４の範囲の特定のｐＨである必要があるものなので、本発明の試薬群においてｐＨ維持の役割を有する高緩衝剤濃度試薬におけるｐＨはｐＨ７〜ｐＨ１４の範囲にある必要がある。
【００３０】
低緩衝剤濃度試薬は、本発明の試薬群においてはｐＨ維持の役割を有さないので特にそのｐＨは規定される必要はないが、混合液のｐＨがｐＨ７〜ｐＨ１４の範囲の特定のｐＨである必要があるものなので、強酸性であることは好ましくなくｐＨ３〜ｐＨ１４の範囲にあることが好ましい。
【００３１】
本発明の試薬群は複数の試薬より構成されるものであるが、高緩衝剤濃度試薬及び低緩衝剤濃度試薬の両方の試薬より構成されるものである。
【００３２】
よって、試薬群が二つの試薬より構成されるものである時には、一つは高緩衝剤濃度試薬であり、もう一つは低緩衝剤濃度試薬である。
【００３３】
そして、少なくとも一つの高緩衝剤濃度試薬及び一つの低緩衝剤濃度試薬が含まれていれば、試薬群を構成する他の試薬は高緩衝剤濃度試薬又は低緩衝剤濃度試薬のいずれでも良い。
【００３４】
本発明の試薬群を構成する高緩衝剤濃度試薬及び低緩衝剤濃度試薬に含有させる緩衝剤以外の内容成分及びその濃度は、特に制限があるものではなく使用目的等に応じて適宜選択して含有させれば良い。なお、試薬群を構成する複数の試薬のどの試薬にどの内容成分を含有させるかという内容成分の振り分けも、使用目的及び安定性等を勘案して適宜行えばよい。
【００３５】
また、本発明の試薬群を構成する高緩衝剤濃度試薬及び低緩衝剤濃度試薬を収納する容器についても、特に制限があるものではないので使用目的等に応じて適宜選択して用いればよい。
【００３６】
複数の試薬より構成され、これらの複数の試薬を添加した混合液のｐＨがｐＨ７〜ｐＨ１４の範囲の特定のｐＨである必要がある試薬群としては、例えば、臨床検査試薬であるアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬、ロイシンアミノペプチダーゼ活性測定試薬、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性測定試薬、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定試薬、乳酸脱水素酵素活性測定試薬、コリンエステラーゼ活性測定試薬、硫酸亜鉛混濁試験測定試薬、チモール混濁試験測定試薬、マグネシウム測定試薬及びカルシウム測定試薬等を挙げることができる。
【００３７】
このうち、アルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬、ロイシンアミノペプチダーゼ活性測定試薬、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性測定試薬、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性測定試薬、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定試薬、乳酸脱水素酵素活性測定試薬及びコリンエステラーゼ活性測定試薬は、活性を測定すべき各酵素の至適ｐＨがｐＨ７〜ｐＨ１４の範囲にあるものである。
【００３８】
また、硫酸亜鉛混濁試験測定試薬及びチモール混濁試験測定試薬は、混濁反応の至適ｐＨがｐＨ７〜ｐＨ１４の範囲にあるものである。
【００３９】
そして、マグネシウム測定試薬及びカルシウム測定試薬は、発色反応の至適ｐＨがｐＨ７〜ｐＨ１４の範囲にあるものである。
【００４０】
これらの臨床検査試薬において本発明を実施する場合、試薬群を構成する高濃度緩衝剤試薬及び／又は低濃度緩衝剤試薬に、酵素の基質、共役酵素、補酵素、発色剤、金属イオン若しくはこれを含む金属塩、キレート剤、アルブミンなどのタンパク質、糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤、アジ化ナトリウムなどの防腐剤、試料中に含まれる測定妨害物質の消去剤若しくは影響抑制剤、界面活性剤、賦形剤又は活性化剤等を適宜必要に応じて含有させれば良い。
【００４１】
これらの臨床検査試薬により測定を行う試料としては、例えばヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、大便、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水などの体液若しくは肝臓、胃若しくは脳などの臓器、毛髪、皮膚、爪、筋肉若しくは神経などの組織又は細胞等を挙げることができる。
【００４２】
これらの臨床検査試薬により測定を行う場合、測定は反応速度法（レート法）又は終点法（エンドポイント法）のいずれによるものでも良く、測定ステップは１ステップ法又は２ステップ法等の多ステップ法のいずれでも良く、測定波長は紫外部及び可視部の適当な波長を使用することができ、測定反応の温度は３０℃又は３７℃等測定反応が進行しかつ測定反応に係わる酵素等の反応成分が熱により失活しない範囲内の温度を設定すれば良く、測定反応の開始方法は基質を加えることにより行う方法又は試料を加えることにより行う方法等のいずれの方法でも良く、そして測定の手法は用手法又は自動分析装置などの装置による方法のいずれをも用いることができる。
【００４３】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態の例としてアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬を取り上げて以下に記載するが、本発明はこの記載によって何ら限定されるものではない。
【００４４】
試薬群よりなるアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬は、複数の試薬から構成されるもので有ればいくつの試薬から構成されても良いが、二つの試薬（高緩衝剤濃度試薬及び低緩衝剤濃度試薬）より構成される場合を例にとって以下記載を行う。
【００４５】
このアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬における高緩衝剤濃度試薬として、２−エチルアミノエタノール、ジエタノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール又はＮ−メチル−Ｄ−グルカミン等のｐＨ７〜ｐＨ１４、特にｐＨ１０付近に緩衝能を有する緩衝剤を、試料、第１試薬及び第２試薬を添加した混合液（最終反応液）における緩衝剤濃度の２倍以上の濃度を含有させて調製する。この高緩衝剤濃度試薬においては、混合液における緩衝剤濃度の３倍以上の濃度の緩衝剤を含有させることが好ましく、そして混合液における緩衝剤濃度の５倍以上の濃度の緩衝剤を含有させることが特に好ましい。
【００４６】
また、このアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬における低緩衝剤濃度試薬としては、緩衝剤を含有させないか、又は２−エチルアミノエタノール、ジエタノールアミン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール若しくはＮ−メチル−Ｄ−グルカミン等の緩衝能を有する緩衝剤を、試料、第１試薬及び第２試薬を添加した混合液（最終反応液）における緩衝剤濃度の１０分の１以下の濃度を含有させて調製する。
【００４７】
なお、このアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬において、予め設定された混合液（最終反応液）の緩衝剤濃度ＣM 、高緩衝剤濃度試薬の緩衝剤濃度ＣH 並びに添加量ＶH 、低緩衝剤濃度試薬の緩衝剤濃度ＣL 並びに添加量ＶL 及びアルカリ性ホスファターゼ活性を測定すべき試料の添加量ＶS の間には下記の式で示される関係が成り立つ。よって、混合液の緩衝剤濃度ＣM が予め規定されている時は、下記の式が成り立つように高緩衝剤濃度試薬の緩衝剤濃度ＣH 並びに添加量ＶH 、低緩衝剤濃度試薬の緩衝剤濃度ＣL 並びに添加量ＶL 及び試料の添加量ＶS をそれぞれ設定すれば良い。また、混合液の緩衝剤濃度ＣM 、高緩衝剤濃度試薬の添加量ＶH 、低緩衝剤濃度試薬の添加量ＶL 及び試料の添加量ＶS が予め規定されている時は、下記の式が成り立つように高緩衝剤濃度試薬の緩衝剤濃度ＣH 及び低緩衝剤濃度試薬の緩衝剤濃度ＣL をそれぞれ設定すれば良い。
【００４８】
【化３】
0004734613.tif 000004
【００４９】
アルカリ性ホスファターゼ活性測定方法の日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法〔臨床化学，１９巻，２０９〜２１２頁，１９９０年〕では、混合液（最終反応液）中の緩衝剤（２−エチルアミノエタノール）濃度は１Ｍ（ｍｏｌｅ／Ｌ）に規定されているので、日本臨床化学会勧告法に従う場合には高緩衝剤濃度試薬には２Ｍ以上の緩衝剤（２−エチルアミノエタノール）を含有させ、好ましくは３Ｍ以上を含有させる。また、低緩衝剤濃度試薬には緩衝剤を含有させないか、又は０．１Ｍ以下の緩衝剤（２−エチルアミノエタノール）を含有させる。
例えば、この日本臨床化学会勧告法に従う場合、高緩衝剤濃度試薬と低緩衝剤濃度試薬の添加量の比を１対４とし、低緩衝剤濃度試薬に緩衝剤を含有させない時には、高緩衝剤濃度試薬に含有させる緩衝剤（２−エチルアミノエタノール）の濃度は５Ｍとなる。
【００５０】
そして、アルカリ性ホスファターゼ活性測定方法のドイツ臨床化学会（ＧＳＣＣ）勧告法〔Ｚ．Ｋｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｋｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０巻，２８１〜２９１頁，１９７２年〕及びスカンジナビア臨床化学会（ＳＳＣＣ）勧告法〔Ｓｃｓｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，３３巻，２９１〜３０６頁，１９７４年〕においても、混合液（最終反応液）中の緩衝剤（ジエタノールアミン）濃度は１Ｍに規定されているので、ドイツ臨床化学会勧告法又はスカンジナビア臨床化学会勧告法に従う場合には高緩衝剤濃度試薬には２Ｍ以上の緩衝剤（ジエタノールアミン）を含有させ、好ましくは３Ｍ以上を含有させる。また、低緩衝剤濃度試薬には緩衝剤を含有させないか、又は０．１Ｍ以下の緩衝剤（ジエタノールアミン）を含有させる。
例えば、このドイツ臨床化学会勧告法又はスカンジナビア臨床化学会勧告法に従う場合、高緩衝剤濃度試薬と低緩衝剤濃度試薬の添加量の比を１対４とし、低緩衝剤濃度試薬に緩衝剤を含有させない時には、高緩衝剤濃度試薬に含有させる緩衝剤（ジエタノールアミン）の濃度は５Ｍとなる。
【００５１】
更に、アルカリ性ホスファターゼ活性測定方法の国際臨床化学連合（ＩＦＣＣ）勧告法〔Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１巻，７３１〜７４８頁，１９８３年〕においても、混合液（最終反応液）中の緩衝剤（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）濃度は０．３５Ｍに規定されているので、国際臨床化学連合勧告法に従う場合には高緩衝剤濃度試薬には０．７Ｍ以上の緩衝剤（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）を含有させ、好ましくは１．０５Ｍ以上を含有させる。また、低緩衝剤濃度試薬には緩衝剤を含有させないか、又は０．０３５Ｍ以下の緩衝剤（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）を含有させる。
例えば、この国際臨床化学連合勧告法に従う場合、高緩衝剤濃度試薬と低緩衝剤濃度試薬の添加量の比を１対４とし、低緩衝剤濃度試薬に緩衝剤を含有させない時には、高緩衝剤濃度試薬に含有させる緩衝剤（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）の濃度は１．７５Ｍとなる。
【００５２】
このアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬における高緩衝剤濃度試薬のｐＨは、ｐＨ７〜ｐＨ１４の範囲にあれば良いが、ｐＨ９〜ｐＨ１１の範囲であることが好ましく、ｐＨ１０付近にあることが特に好ましい。
また、低緩衝剤濃度試薬のｐＨは特に規定される必要はないものの、強酸性であることは好ましくないのでｐＨ３〜ｐＨ１４の範囲にあることが好ましい。
【００５３】
本発明におけるアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬において、４−ニトロフェニルリン酸（パラ−ニトロフェニルリン酸）又はフェニルリン酸等のアルカリ性ホスファターゼの基質は、混合液（最終反応液）には１ｍＭ以上、好ましくは４ｍＭ以上含有させる必要がある。この条件が満たされる限り、第１試薬及び／又は第２試薬に４−ニトロフェニルリン酸等のアルカリ性ホスファターゼの基質を含有させる濃度は、特に制限されるものではなく、適宜選択すればよい。
なお、４−ニトロフェニルリン酸等のアルカリ性ホスファターゼの基質は、特に中性付近で安定性が良好であるので、基質はｐＨ５〜ｐＨ９の範囲のｐＨの低緩衝剤濃度試薬に含有させることが特に好ましい。
【００５４】
また、アルカリ性ホスファターゼが十分な活性を示すためにはマグネシウムイオン（Ｍｇ2+）が必要であるので、アルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬における混合液（最終反応液）には０．０１ｍＭ以上、好ましくは０．１ｍＭ以上のマグネシウムイオンを含有させる必要がある。この条件が満たされる限り、第１試薬及び／又は第２試薬にマグネシウムイオンを含有させる濃度は特に制限されるものではなく、適宜選択すればよい。
【００５５】
そして、このアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬の第１試薬及び／又は第２試薬には、亜鉛イオン（Ｚｎ2+）若しくは塩化ナトリウムなどのマグネシウムイオン以外の金属イオン若しくはこれを含む金属塩、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）などのキレート剤、アルブミンなどのタンパク質、糖類若しくは高分子化合物などの安定化剤、アジ化ナトリウムなどの防腐剤、試料中に含まれる測定妨害物質の消去剤若しくは影響抑制剤、界面活性剤、賦形剤又は他の活性化剤等を適宜含有させても良い。
【００５６】
本発明におけるアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬は、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、大便、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水などの体液若しくは肝臓、胃若しくは脳などの臓器、毛髪、皮膚、爪、筋肉若しくは神経などの組織又は細胞等の試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性の測定に用いることができる。
【００５７】
このアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬により測定を行う場合、測定は反応速度法（レート法）又は終点法（エンドポイント法）のいずれによるものでも良く、測定ステップは１ステップ法又は２ステップ法等の多ステップ法のいずれでも良く、測定波長は紫外部及び可視部の適当な波長を使用することができ、測定反応の温度は３０℃又は３７℃等測定反応が進行しかつ測定反応に係わる酵素等が熱により失活しない範囲内の温度を設定すれば良く、測定反応の開始方法は４−ニトロフェニルリン酸などの基質を加えることにより行う方法又は試料を加えることにより行う方法等いずれの方法でも良く、そして測定の手法は用手法又は自動分析装置等の装置による方法のいずれをも用いることができる。
【００５８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例よって限定されるものではない。
【００５９】
〔実施例１〕
（日本臨床化学会勧告法に準拠するアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬）
低緩衝剤濃度試薬からなる第１試薬及び高緩衝剤濃度試薬からなる第２試薬より構成される、日本臨床化学会（ＪＳＣＣ）勧告法に準拠するアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬を調製し、その安定性を検討した。
【００６０】
なお、アルカリ性ホスファターゼ活性測定方法の日本臨床化学会勧告法は、混合液（最終反応液）の緩衝剤及びその濃度を１．０Ｍ２−エチルアミノエタノール、ｐＨをｐＨ９．９０（３０℃）と規定しているものである。
【００６１】
（１）試薬の調製
【００６２】
▲１▼ＪＳＣＣ第１試薬の調製
下記の試薬内容成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、本発明の低緩衝剤濃度試薬からなる第１試薬であるＪＳＣＣ第１試薬を調製した。なお、このＪＳＣＣ第１試薬のｐＨはｐＨ８（２０℃）であった。
【００６３】
0004734613.tif 000005
【００６４】
▲２▼ＪＳＣＣ第２試薬の調製
下記の試薬内容成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、６Ｎ塩酸でｐＨを１０．３（２０℃）に調整して、本発明の高緩衝剤濃度試薬からなる第２試薬であるＪＳＣＣ第２試薬を調製した。
【００６５】
0004734613.tif 000006
【００６６】
▲３▼対照ＪＳＣＣ第１試薬の調製
対照として、下記の試薬内容成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨを１０．３（２０℃）に調整して、従来の日本臨床化学会勧告法準拠試薬の第１試薬である対照ＪＳＣＣ第１試薬を調製した。
【００６７】
0004734613.tif 000007
【００６８】
▲４▼対照ＪＳＣＣ第２試薬の調製
対照として、下記の試薬内容成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨを８．２（２０℃）に調整して、従来の日本臨床化学会勧告法準拠試薬の第２試薬である対照ＪＳＣＣ第２試薬を調製した。
【００６９】
0004734613.tif 000008
【００７０】
（２）安定性検討のための試薬の保存
上記（１）で調製したＪＳＣＣ第１試薬、ＪＳＣＣ第２試薬、対照ＪＳＣＣ第１試薬及び対照ＪＳＣＣ第２試薬を、外形が７９ｍｍ（奥行き、Ｌ）×８８ｍｍ（高さ、Ｈ）×１０〜２４．５ｍｍ（幅、Ｗ）であり上面に１２．５ｍｍ径の口を有する容量が８０ｍＬの長方形のポリエチレン製の容器（日立７１５０形自動分析装置専用容器）の中にそれぞれ６０ｍＬずつ注入し、これらを開封状態のまま温度が２〜８℃に保たれた冷温庫内にて保存した。
なお、この冷温庫内に水を張った容器を置くことにより、水分の蒸発を防止し、試薬の濃縮による検討データへの影響を受けないようにした。
【００７１】
（３）保存した試薬の安定性の測定
保存開始時及び保存１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、６週間後並びに８週間後に、上記（２）で冷温保存したＪＳＣＣ第１試薬及びＪＳＣＣ第２試薬について、また対照としての対照ＪＳＣＣ第１試薬及び対照ＪＳＣＣ第２試薬について、そのｐＨを測定するとともに、これらの試薬を用いてアルカリ性ホスファターゼ活性値が６００国際単位（ＩＵ）／Ｌのヒト血清試料を測定して、試薬の安定性を確認した。
【００７２】
▲１▼ｐＨの測定
ｐＨの測定は、ＪＳＣＣ第１試薬４ｍＬとＪＳＣＣ第２試薬１ｍＬを混合したものを、また対照ＪＳＣＣ第１試薬４ｍＬと対照ＪＳＣＣ第２試薬１ｍＬを混合したものを、それぞれ堀場製作所社製Ｆ−１６型ｐＨメーターを用いて２０℃におけるｐＨを測定した。
【００７３】
▲２▼ヒト血清試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性の測定
ヒト血清試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性の測定は日立製作所社製７１５０形自動分析装置にて行い、ヒト血清試料５μＬに第１試薬としてＪＳＣＣ第１試薬を３００μＬ加え３７℃で５分間反応させた後、第２試薬としてＪＳＣＣ第２試薬を７５μＬ添加し混合液（最終反応液）とし、３７℃で反応を行わせ、第２試薬添加１分３８秒目（３３ポイント）から５分目（５０ポイント）の主波長４０５ｎｍ及び副波長５０５ｎｍにおける吸光度の増加速度よりアルカリ性ホスファターゼ活性値の算出を行った。
【００７４】
また、同様にして、対照ＪＳＣＣ第１試薬を第１試薬とし、そして対照ＪＳＣＣ第２試薬を第２試薬として、ヒト血清試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性の測定を行った。
【００７５】
なお、純水を試料とした時の吸光度の増加速度を試薬盲検値として、測定値より試薬盲検値を差し引いてアルカリ性ホスファターゼ活性値を算出した。
【００７６】
（４）測定結果
保存した試薬のｐＨの測定結果を図１に示した。なお、この図において、横軸は測定に用いた試薬の保存期間を表し、縦軸はｐＨの測定値を表す。
【００７７】
【図１】
【００７８】
この図より、本発明のＪＳＣＣ第１試薬及びＪＳＣＣ第２試薬よりなるアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬においては、冷温における保存８週間後においてもｐＨがほとんど低下していないのに対して、対照ＪＳＣＣ第１試薬及び対照ＪＳＣＣ第２試薬よりなる従来のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬においては、冷温における保存８週間後にｐＨが約０．４５も低下してしまい、アルカリ性ホスファターゼの至適ｐＨを大きく逸脱してしまっていることが分かる。
【００７９】
また、保存した試薬を用いてヒト血清試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性を測定した時の測定結果を図２に示した。この図において、横軸は測定に用いた試薬の保存期間を表し、縦軸はヒト血清試料のアルカリ性ホスファターゼ活性測定値の保存開始時の値を１００％とした時の相対値（残存活性値）を表す。
【００８０】
【図２】
【００８１】
この図より、本発明のＪＳＣＣ第１試薬及びＪＳＣＣ第２試薬よりなるアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬においては、冷温における保存８週間後においてもヒト血清試料のアルカリ性ホスファターゼ活性測定値がほとんど低下していないのに対して、対照ＪＳＣＣ第１試薬及び対照ＪＳＣＣ第２試薬よりなる従来のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬においては、冷温における保存８週間後に約３７％も低下してしまうことが分かる。
【００８２】
これらのことより、高緩衝剤濃度試薬及び低緩衝剤濃度試薬より構成されるアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬は、長期間開封状態で保存してもｐＨの低下を防止することができ、長期間正確な測定値を示すことができ効力の低下を起こさない、安定な試薬群であることが確かめられた。
【００８３】
〔実施例２〕
（ドイツ臨床化学会勧告法に準拠するアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬）低緩衝剤濃度試薬からなる第１試薬及び高緩衝剤濃度試薬からなる第２試薬より構成される、ドイツ臨床化学会（ＧＳＣＣ）勧告法に準拠するアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬を調製し、その安定性を検討した。
【００８４】
なお、アルカリ性ホスファターゼ活性測定方法のドイツ臨床化学会勧告法は、混合液（最終反応液）の緩衝剤及びその濃度を１．０Ｍジエタノールアミン、ｐＨをｐＨ９．８（２５℃）と規定しているものである。
【００８５】
（１）試薬の調製
【００８６】
▲１▼ＧＳＣＣ第１試薬の調製
下記の試薬内容成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、本発明の低緩衝剤濃度試薬からなる第１試薬であるＧＳＣＣ第１試薬を調製した。なお、このＧＳＣＣ第１試薬のｐＨはｐＨ８（２０℃）であった。
【００８７】
0004734613.tif 000009
【００８８】
▲２▼ＧＳＣＣ第２試薬の調製
下記の試薬内容成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、６Ｎ塩酸でｐＨを１０（２０℃）に調整して、本発明の高緩衝剤濃度試薬からなる第２試薬であるＧＳＣＣ第２試薬を調製した。
【００８９】
0004734613.tif 000010
【００９０】
▲３▼対照ＧＳＣＣ第１試薬の調製
対照として、下記の試薬内容成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨを１０（２０℃）に調整して、従来のドイツ臨床化学会勧告法準拠試薬の第１試薬である対照ＧＳＣＣ第１試薬を調製した。
【００９１】
0004734613.tif 000011
【００９２】
▲４▼対照ＧＳＣＣ第２試薬の調製
対照として、下記の試薬内容成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、２Ｎ塩酸でｐＨを８（２０℃）に調整して、従来のドイツ臨床化学会勧告法準拠試薬の第２試薬である対照ＧＳＣＣ第２試薬を調製した。
【００９３】
0004734613.tif 000012
【００９４】
（２）安定性検討のための試薬の保存
上記（１）で調製したＧＳＣＣ第１試薬、ＧＳＣＣ第２試薬、対照ＧＳＣＣ第１試薬及び対照ＧＳＣＣ第２試薬を、外形が７９ｍｍ（奥行き、Ｌ）×８８ｍｍ（高さ、Ｈ）×１０〜２４．５ｍｍ（幅、Ｗ）であり上面に１２．５ｍｍ径の口を有する容量（日立７１５０形自動分析装置専用容器）が８０ｍＬの長方形のポリエチレン製の容器の中にそれぞれ６０ｍＬずつ注入し、これらを開封状態のまま温度が２〜８℃に保たれた冷温庫内にて保存した。
なお、この冷温庫内に水を張った容器を置くことにより、水分の蒸発を防止し、試薬の濃縮による検討データへの影響を受けないようにした。
【００９５】
（３）保存した試薬の安定性の測定
保存開始時及び保存７日後、１４日後、２０日後並びに２８日後に、上記（２）で冷温保存したＧＳＣＣ第１試薬及びＧＳＣＣ第２試薬について、また対照としての対照ＧＳＣＣ第１試薬及び対照ＧＳＣＣ第２試薬について、そのｐＨを測定するとともに、これらの試薬を用いてアルカリ性ホスファターゼ活性値が２００国際単位（ＩＵ）／Ｌのヒト血清試料を測定して、試薬の安定性を確認した。
【００９６】
▲１▼ｐＨの測定
ｐＨの測定は、ＧＳＣＣ第１試薬４ｍＬとＧＳＣＣ第２試薬２ｍＬを混合したものを、また対照ＧＳＣＣ第１試薬４ｍＬと対照ＧＳＣＣ第２試薬１ｍＬを混合したものを、それぞれ堀場製作所社製Ｆ−１６型ｐＨメーターを用いて２０℃におけるｐＨを測定した。
【００９７】
▲２▼ヒト血清試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性の測定
ヒト血清試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性の測定は日立製作所社製７１５０形自動分析装置にて行い、ヒト血清試料５μＬに第１試薬としてＧＳＣＣ第１試薬を２６０μＬ加え３７℃で５分間反応させた後、第２試薬としてＧＳＣＣ第２試薬を１３０μＬ添加し混合液（最終反応液）とし、３７℃で反応を行わせ、第２試薬添加１分３８秒目（３３ポイント）から５分目（５０ポイント）の主波長４０５ｎｍ及び副波長５０５ｎｍにおける吸光度の増加速度よりアルカリ性ホスファターゼ活性値の算出を行った。
【００９８】
また対照として、同じく日立製作所社製７１５０形自動分析装置にて、ヒト血清試料６μＬに第１試薬として対照ＧＳＣＣ第１試薬を３２０μＬ加え３７℃で５分間反応させた後、第２試薬として対照ＧＳＣＣ第２試薬を８０μＬ添加し混合液（最終反応液）とし、３７℃で反応を行わせ、第２試薬添加１分３８秒目（３３ポイント）から５分目（５０ポイント）の主波長４０５ｎｍ及び副波長５０５ｎｍにおける吸光度の増加速度よりアルカリ性ホスファターゼ活性値の算出を行った。
【００９９】
なお、純水を試料とした時の吸光度の増加速度を試薬盲検値として、測定値より試薬盲検値を差し引いてアルカリ性ホスファターゼ活性値を算出した。
【０１００】
（４）測定結果
保存した試薬のｐＨの測定結果を図３に示した。なお、この図において、横軸は測定に用いた試薬の保存期間を表し、縦軸はｐＨの測定値を表す。
【０１０１】
【図３】
【０１０２】
この図より、本発明のＧＳＣＣ第１試薬及びＧＳＣＣ第２試薬よりなるアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬においては、冷温における保存２８日後においてもｐＨがほとんど低下していないのに対して、対照ＧＳＣＣ第１試薬及び対照ＧＳＣＣ第２試薬よりなる従来のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬においては、冷温における保存２８日後にｐＨが約０．１４も低下してしまい、アルカリ性ホスファターゼの至適ｐＨを逸脱してしまっていることが分かる。
【０１０３】
また、保存した試薬を用いてヒト血清試料中のアルカリ性ホスファターゼ活性を測定した時の測定結果を図４に示した。この図において、横軸は測定に用いた試薬の保存期間を表し、縦軸はヒト血清試料のアルカリ性ホスファターゼ活性測定値の保存開始時の値を１００％とした時の相対値（残存活性値）を表す。
【０１０４】
【図４】
【０１０５】
この図より、本発明のＧＳＣＣ第１試薬及びＧＳＣＣ第２試薬よりなるアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬においては、冷温における保存２８日後においてもヒト血清試料のアルカリ性ホスファターゼ活性測定値がほとんど低下していないのに対して、対照ＪＳＣＣ第１試薬及び対照ＪＳＣＣ第２試薬よりなる従来のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬においては、冷温における保存２８日後に約８％も低下してしまうことが分かる。
【０１０６】
これらのことより、高緩衝剤濃度試薬及び低緩衝剤濃度試薬より構成されるアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬は、長期間開封状態で保存してもｐＨの低下を防止することができ、長期間正確な測定値を示すことができ効力の低下を起こさない、安定な試薬群であることが確かめられた。
【０１０７】
【発明の効果】
本発明の、混合液における緩衝剤濃度の２倍以上の濃度の緩衝剤を含有する高緩衝剤濃度試薬、及び緩衝剤を含有しないか又は混合液における緩衝剤濃度の１０分の１以下の濃度の緩衝剤を含有する低緩衝剤濃度試薬より構成される試薬群は、開封状態で空気に触れた状態においてもｐＨの低下を防止することができ、よってｐＨの低下による試薬又は混合液の内容成分の変性若しくは分解又は効力の低下が生じることなく、長期間安定に使用することができるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】日本臨床化学会勧告法に準拠した本発明のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬の冷温保存時のｐＨを示したグラフである。
【図２】日本臨床化学会勧告法に準拠した本発明のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬の冷温保存時の安定性を示したグラフである。
【図３】ドイツ臨床化学会勧告法に準拠した本発明のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬の冷温保存時のｐＨを示したグラフである。
【図４】ドイツ臨床化学会勧告法に準拠した本発明のアルカリ性ホスファターゼ活性測定試薬の冷温保存時の安定性を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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