(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜転位に使用される組成物であって、配列番号２、２３、または２４のアミノ酸配列のみからなる膜転位ペプチド（ＭＴＬＰ）を含有する、組成物。
【請求項２】
ＭＴＬＰが転位される活性薬剤に複合化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＭＴＬＰが転位される活性粒子に複合化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記活性薬剤はウイルスＤＮＡ粒子である請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記ウイルスＤＮＡ粒子はＭＴＬＰでコーティングされたリポソームの形をしている請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物と医薬として許容される担体とを含む医薬製剤。
【請求項７】
経口投与用である請求項６に記載の医薬製剤。
【請求項８】
経口投与により病理学的障害を診断するための製剤の調製における請求項２に記載の組成物の使用であって、前記活性薬剤が診断薬である、前記組成物の使用。
【請求項９】
膜転位に使用される組成物であって、配列番号２、２３、または２４のアミノ酸配列のみからなる膜転位ペプチド（ＭＴＬＰ）のみからなる、組成物。
【請求項１０】
前記ＭＴＬＰはリポソームに複合化されている請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項９又は１０に記載の組成物と医薬として許容される担体とを含む医薬製剤。
【請求項１２】
経口投与用である請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
膜転位に使用される組成物であって、配列番号２、２３、又は２４のアミノ酸配列のみからなる膜転位ペプチド（ＭＴＬＰ）を含み、かつ前記ＭＴＬＰがアミノ酸のＤ−異性体である、組成物。
【請求項１４】
ＭＴＬＰが転位される活性薬剤に複合化されている、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
ＭＴＬＰが転位される活性粒子に複合化されている、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記活性薬剤はウイルスＤＮＡ粒子である請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ウイルスＤＮＡ粒子はＭＴＬＰでコーティングされたリポソームの形をしている請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１３乃至１７のいずれか一項に記載の組成物と医薬として許容される担体とを含む医薬製剤。
【請求項１９】
経口投与用である請求項１８に記載の医薬製剤。
【請求項２０】
経口投与により病理学的障害を診断するための製剤の調製における請求項１４に記載の組成物の使用であって、前記活性薬剤が診断薬である、前記組成物の使用。
【請求項２１】
配列番号２、２３、または２４のアミノ酸配列のみからなるポリペプチド。
【請求項２２】
ＭＴＬＰと活性薬剤の複合体の経口投与により病理学的障害を予防するために使用される請求項２に記載の組成物であって、前記活性薬剤が予防薬である、組成物。
【請求項２３】
ＭＴＬＰと活性薬剤の複合体の経口投与により病理学的障害を治療するために使用される請求項２に記載の組成物であって、前記活性薬剤が治療薬である、組成物。
【請求項２４】
ＭＴＬＰと活性薬剤の複合体の経口投与により病理学的障害を診断するために使用される請求項２に記載の組成物であって、前記活性薬剤が診断薬である、組成物。
【請求項２５】
ＭＴＬＰと活性粒子の複合体の経口投与により病理学的障害を予防するために使用される請求項３に記載の組成物であって、前記活性粒子が予防薬を含有する、組成物。
【請求項２６】
ＭＴＬＰと活性粒子の複合体の経口投与により病理学的障害を治療するために使用される請求項３に記載の組成物であって、前記活性粒子が治療薬を含有する、組成物。
【請求項２７】
ＭＴＬＰと活性粒子の複合体の経口投与により病理学的障害を診断するために使用される請求項３に記載の組成物であって、前記活性粒子が診断薬を含有する、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、本発明と同じ発明者によって出願された１９９９年９月２７日出願の米国仮出願第６０／１５６，２４６号、発明の名称「膜転位ペプチド薬物送達系（Membrane Translocating Peptide Drug Delivery System ）」、の出願日の利益を主張する。該出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（発明の属する技術分野）
本発明は、細胞内への、細胞内区画の内外への、または細胞層を横切っての、医薬として活性な薬剤の取り込みを増強する、ペプチドに関する。より詳細には、本発明は、直接的なまたは医薬として活性な薬剤を装填した粒子からの、細胞内への、細胞内区画の内外への、または細胞層を横切っての、医薬として活性な薬剤の取り込みを増強する、膜転位ペプチド、その断片、モチーフ、誘導体、類似体またはペプチド模倣体に関すると共に、それらをコードするヌクレオチド配列に関する。
【０００３】
（発明の背景）
胃腸管（以下「ＧＩＴ」と称する）の裏当てを形成する上皮組織は、経口投与された医薬として活性な薬剤（以下「活性薬剤」と称する）の吸収に対する主な障壁である。ＧＩＴ上皮を横切る吸収は、細胞による経細胞輸送か、細胞間の傍細胞輸送による。経細胞輸送としては、受容体を媒介とした機構、輸送体を媒介とした機構、チャネルを媒介とした機構、ピノサイトーシスによる機構、エンドシトーシスによる機構、ならびに拡散が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。傍細胞輸送としては、密着結合（タイトジャンクション）を介した移動が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。特に重要なのは、ＧＩＴ上皮を横切った体内への活性薬剤の取り込みを増強するための非侵襲的方法の開発である（Evers, P. Developments in Drug Delivery: Techology and Markets, Financial Times Management Report, 1995 ）。
【０００４】
非侵襲的方法を開発するために、これまではファージディスプレイライブラリを使用して、ＧＩＴ内の特定のＧＩＴ膜受容体、輸送体、ピノサイトーシスまたはエンドシトーシスの標的経路に優先的に結合する特定のペプチド配列（以下「ターゲティングペプチド」と称する）を同定していた。ファージディスプレイライブラリにより選別されたターゲット経路には、ＧＩＴ膜輸送ＨＰＴ１、ｈＰＥＰＴ１、Ｄ２ＨおよびｈＳＩが含まれる。ＨＰＴ１とｈＰＥＰＴ１はジペプチドとトリペプチドを輸送する。Ｄ２Ｈ は中性と塩基性のアミノ酸を輸送する、一連のアミノ酸転位酵素に対する輸送活性化タンパク質である。ｈＳＩは糖代謝に関連し、空腸中の刷子縁タンパク質の９％を構成する。ＨＰＴ１、ｈＰＥＰＴ１、Ｄ２ＨおよびｈＳＩ膜輸送体と相互作用する特定のペプチド配列が、米国特許出願出願番号第０９／０７９，８１９号、第０９／０７９，７２３号および第０９／０７９，６７８号で同定されている（これらはその全体が参照により組み込まれる）。
【０００５】
固有の細胞膜転位特性を有するペプチドを同定するために、これまで非標的経路に基づく分析が使用されてきた。そのような細胞膜転位ペプチドは、細胞膜の脂質と直接相互作用し、細胞膜の脂質に浸透する（Fongら、Drug Development Research 33:64 、1994）。カポジ繊維芽細胞成長因子のシグナル配列の中央の疎水性領域ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１））は膜転位ペプチドであると考えられる。このペプチド（配列番号１）は、細胞内でのタンパク質の機能や細胞内プロセスの研究用に、種々の短いペプチド（＜２５mer ）を脂質二重層を通って生きた細胞内へと送達するために、担体として使用されている（Lin et al. J. Biol. Chem. 271:5305,1996; Liu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11819, 1996;Rojas et al. J. Biol. Chem. 271:27456, 1996; Rojas et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 234:675、1997）。配列番号１を含む４１ｋＤａグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合タンパク質（配列番号１に融合されたＧＳＴ−Ｇｒｂｓ−ＳＨ2）は、ＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞に導入されると共に、上皮成長因子誘導性のＥＧＦＲ−Ｇｒｂ２会合およびＭＡＰキナーゼ活性化を阻害することが示された（Rojas et al. Nature Biotechnology 16:370, 1998）。しかしながら、これらの研究は、活性薬剤が膜転位ペプチドと複合化されるか、活性薬剤が粒子に組み込まれるか粒子が膜転位ペプチドにより修飾されるか（以下「複合化」と称する）した場合に、細胞内へ、細胞内区画の内外へ、および細胞層を横切って活性薬剤を取り込むことを増強するために膜転位ペプチドを使用することには取り組んでいない。
【０００６】
口、鼻、粘膜、局所、経皮、静脈内、筋内、腹腔内、包膜内、ならびに皮下を含むがそれらに限定しない種々の経路で動物に活性薬剤を投与することができるが、経口投与が好ましい経路であるため、細胞膜を横切る活性薬剤の移動を増強する能力は重要である。鼻、粘膜、局所および経皮投与は、粘膜または皮膚を通って循環に入る薬剤の吸収によって左右される。静脈内投与は、高濃度の薬剤の急速な蓄積による有害な影響や、患者の不快感、ならびに注射部位の感染を生じさせることがある。筋内投与は注射部位で痛みを生じさせる可能性がある。皮下投与は、大量投与に適しておらず、刺激性物質にも適していない。経口投与は好ましい経路であるが、多くの活性薬剤がＧＩＴ上皮を横切って効率的に吸収されない。その理由は、ＧＩＴの管腔内で活性薬剤が酵素により分解するか、活性薬剤に対するＧＩＴ上皮の透過性が限定されているか、活性薬剤の分子サイズが大きいか、活性薬剤が親水性であるためである（Fix, JA. J. Pharmac. Sci. 85: 1282, 1996）。経口製剤を開発するためには、活性薬剤を、ＧＩＴの管腔内における酵素による消化から保護し、有効な濃度でＧＩＴの吸収性上皮細胞に提示し、頂点から基底側部の方向に上皮を横切って「移動」させなければならない。
【０００７】
従って、薬剤の経口投与の利点のため、経口摂取された活性薬剤をＧＩＴの管腔内での酵素的分解から保護し、ＧＩＴの裏当てを形成する上皮細胞内へのおよび上皮細胞を横切っての、経口摂取された活性薬剤の吸収を促進する、送達系が必要である。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、完全長ペプチド、その誘導体、断片、モチーフ、類似体またはペプチド模倣体を含む膜転位ペプチド（以下、「ＭＴＬＰ」）またはそれをコードするヌクレオチド配列、ＭＴＬＰが脂質膜を横切って活性薬剤または活性粒子の移動を増強するＭＴＬＰ活性薬剤複合体およびＭＴＬＰ活性粒子複合体を提供することにより、そのような必要を満たす。より詳細には、本発明は、ＭＴＬＰ、ＭＴＬＰ活性薬剤複合体、およびＭＬＴＰ活性粒子複合体を提供する。その場合ＭＴＬＰは、ヒトを含めた動物における、細胞内への、細胞内区画の内外への、および細胞層を横切る、活性薬剤または活性粒子の移動を増強する。ＭＴＬＰ、ＭＴＬＰ活性薬剤複合体およびＭＴＬＰ活性粒子複合体の製造方法および使用方法も包含される。
【０００９】
本発明のＭＴＬＰは、完全長ＭＴＬＰに関連する１又は複数の既知の機能的活性を表すことができる。そのような機能的活性には、膜と相互作用する能力や、上皮細胞（分極・分化したヒトＣａｃｏ−２細胞を含むがこれに限定されない）を横切ってレポーター薬物分子（ｆＭＬＰ）の輸送と競合する能力が含まれるが、それらに限定されるわけではない。機能的活性にはさらに、抗原性（抗ＭＴＬＰ抗体に結合する能力や膜と相互作用するＭＴＬＰと競合する能力を含むがそれらに限定されない）ならびに免疫性（抗体生成を刺激する能力を含むがそれに限定されない）が含まれる。
【００１０】
ＭＴＬＰ活性薬剤複合体を製造する方法には、ＭＴＬＰと活性薬剤の共有結合的結合や、ＭＴＬＰと活性薬剤の非共有結合的結合が含まれるが、それらに限定されるわけではない。ＭＴＬＰ活性粒子複合体を製造する方法には、活性薬剤を、粒子（ナノパーティクル、マイクロパーティクル、カプセル、リポソーム、非ウイルスベクター系およびウイルスベクター系を含むがそれらに限定されない）に組み込む工程を含むがそれに限定されない。ＭＴＬＰは、活性粒子への吸着；活性粒子への非共有結合的結合；および直接またはリンカーを介した、活性粒子、活性粒子を合成するために使用される１または複数のポリマー、該ポリマーを合成するために使用される１または複数のモノマー、および活性粒子を含む他の成分への共有結合的結合；により、活性粒子に対して複合化することができるが、それらに限定されるわけではない。
【００１１】
本発明はまた、ＭＴＬＰをコードするヌクレオチド配列も包含する。ヌクレオチド配列の製造方法には、組換え手段が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【００１２】
ＭＴＬＰ、ＭＴＬＰ活性薬剤複合体およびＭＴＬＰ活性粒子複合体は、単独で使用してもよいし、他の分子（標的経路、核取り込み経路、およびエンドソーム経路に結合する分子、粘膜接着を可能にする分子、脂質膜を横切るか水で充填された孔を通る拡散を容易にする分子、ならびに細胞内輸送を調節または案内する分子を含むがそれらに限定されない）と組み合わせて、または他の分子と共役させて、使用することができる。つまり、異なる機構を同時に使用することによって、活性薬剤のバイオアベイラビリティを増強することができる。
【００１３】
従って、本発明の目的は、完全長ＭＴＬＰを提供することにある。
本発明の別の目的は、完全長ＭＴＬＰの断片、モチーフ、誘導体、類似体およびペプチド模倣体を提供することにある。
本発明の別の目的は、ＭＴＬＰ活性薬剤複合体を含む組成物を提供することにある。
【００１４】
本発明の別の目的は、ＭＴＬＰ活性粒子複合体を含む組成物を提供することにある。
本発明の別の目的は、粒子がマイクロパーティクルであるＭＴＬＰ活性粒子複合体を含む組成物を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、粒子がナノパーティクルであるＭＴＬＰ活性粒子複合体を含む組成物を提供することにある。
本発明の別の目的は、粒子がリポソームであるＭＴＬＰ活性粒子複合体を含む組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明の別の目的は、ウイルス粒子がその表面上でＭＴＬＰを発現するよう修飾された、ウイルスＤＮＡ粒子を含む組成物を提供することにある。
本発明の別の目的は、ウイルス粒子がウイルス生産および精製に続いてＭＬＴＰに複合化された、ウイルスＤＮＡ粒子を含む組成物を提供することにある。
【００１７】
本発明の別の目的は、ウイルス粒子が哺乳類細胞でのウイルス生産および哺乳類細胞からの精製に続いてＭＴＬＰに複合化された、ウイルスＤＮＡ粒子を含む組成物を提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、非ウイルスベース遺伝子送達系がＭＴＬＰに複合化されている、非ウイルスベースの遺伝子送達系を含む組成物を提供することにある。
【００１９】
本発明の別の目的は、脂質膜を横切った活性薬剤の移動を増強することにある。
本発明の別の目的は、細胞内への活性薬剤の取り込みを増強することにある。
本発明の別の目的は、細胞層を横切った活性薬剤の取り込みを増強することにある。
【００２０】
本発明の別の目的は、上皮細胞内への活性薬剤の取り込みを増強することにある。
本発明の別の目的は、上皮細胞層を横切った活性薬剤の取り込みを増強することにある。
【００２１】
本発明の別の目的は、ＧＩＴの裏当てを形成する上皮細胞層を横切って動物の循環に入る活性薬剤の取り込みを増強することにある。
本発明の別の目的は、脂質膜を横切った活性粒子の移動を増強することにある。
【００２２】
本発明の別の目的は、細胞への活性粒子の取り込みを増強することにある。
本発明の別の目的は、細胞層を横切った活性粒子の取り込みを増強することにある。
本発明の別の目的は、上皮細胞への活性粒子の取り込みを増強することにある。
【００２３】
本発明の別の目的は、上皮細胞層を横切った活性粒子の取り込みを増強することにある。
本発明の別の目的は、ＧＩＴの裏当てを形成する上皮細胞層を横切って動物の循環に入る活性粒子の取り込みを増強することにある。
【００２４】
本発明の別の目的は、非ウイルスベース遺伝子送達系による細胞内遺伝子送達を提供することにある。
本発明の別の目的は、非ウイルスベース遺伝子送達系がＭＴＬＰに複合化されている、非ウイルスベース遺伝子送達系による細胞内遺伝子送達を提供することにある。
【００２５】
本発明の別の目的は、完全長ＭＴＬＰの本質的な機能的活性を保持するＭＴＬＰを同定するための、迅速なスクリーニング法を提供することにある。
本発明の別の目的は、ＭＴＬＰの機能的活性を測定するために、細胞ベースのスクリーニング機構を提供することにある。
【００２６】
本発明の別の目的は、ＭＴＬＰの特徴をキャラクタライズするために、細胞ベースのスクリーニング機構を提供することにある。
本発明の別の目的は、活性薬剤は診断薬であり該診断薬の全身濃度が病理学的障害を診断するのに有効であるような一定量のＭＴＬＰ活性薬剤複合体の経口投与により、病理学的障害を診断する方法を提供することにある。
【００２７】
本発明の別の目的は、活性薬剤は予防薬であり該予防薬の全身濃度が病理学的障害を予防するのに有効であるようなＭＴＬＰ活性薬剤複合体の経口投与により、病理学的障害を予防する方法を提供することにある。
【００２８】
本発明の別の目的は、活性薬剤は治療薬であり該治療薬の全身濃度が病理学的障害を治療するのに有効であるようなＭＴＬＰ活性薬剤複合体の経口投与により、病理学的障害を治療する方法を提供することにある。
【００２９】
本発明の別の目的は、活性粒子は診断薬を含み該診断薬の全身濃度が病理学的障害を診断するのに有効であるようなＭＴＬＰ活性粒子複合体の経口投与により、病理学的障害を診断する方法を提供することにある。
【００３０】
本発明の別の目的は、活性粒子が予防薬を含み該予防薬の全身濃度が病理学的障害を予防するのに有効であるようなＭＴＬＰ活性薬剤複合体の経口投与により、病理学的障害を予防する方法を提供することにある。
【００３１】
本発明の別の目的は、活性粒子は治療薬を含み該治療薬の全身濃度が病理学的障害を治療するのに有効であるようなＭＴＬＰ活性薬剤複合体の経口投与により、病理学的障害を治療する方法を提供することである。
【００３２】
本発明の他の目的、特徴および利点は、開示された実施形態についての以下の詳細な説明および特許請求の範囲を概観した後に明白になるだろう。
（発明の詳細な説明）
本発明は、膜を横切る活性薬剤または活性粒子の移動を増強するＭＴＬＰの完全長ペプチド、その誘導体、断片、モチーフ、類似体またはペプチド模倣体（ＭＴＬＰ）を含めた新規な膜転位ペプチドと、それらをコードするヌクレオチド配列と、ＭＴＬＰ活性薬剤複合体と、ＭＴＬＰ活性粒子複合体とに関する。より詳細には、本発明は、新規なＭＴＬＰと、それをコードするヌクレオチド配列と、ＭＴＬＰ活性薬剤複合体と、ＭＴＬＰ活性粒子複合体とに関する。ＭＴＬＰは、ヒトを含めた動物における、細胞内への、細胞内区画内外への、および細胞層を横切るＭＴＬＰ活性薬剤複合体中の活性薬剤の移動、ＭＴＬＰ活性粒子複合体中の活性薬剤の移動、およびＭＴＬＰ活性粒子複合体中の活性粒子の移動を増強する。ＭＴＬＰの製造方法および使用方法も包含される。
【００３３】
本発明は、活性薬剤の全身濃度が病理学的障害の診断、予防または治療に有効であるように一定量のＭＴＬＰ活性薬剤複合体またはＭＴＬＰ活性粒子複合体を動物に投与することによる、病理学的障害の診断、予防、治療を必要とする動物における病理学的障害を診断するか、予防するか、または治療する方法も提供する。
【００３４】
「活性薬剤」は、本明細書で使用する場合、ヒトを始めとする動物で使用することができるすべての診断薬、予防薬または治療薬を包含する。
「活性粒子」とは、本明細書で使用する場合、１又は複数の活性薬剤が装填された粒子のことである。
【００３５】
膜転位ペプチドとは、本明細書で使用する場合、生体膜の脂質と直接相互作用し、生体膜の脂質に浸透するペプチドのことである。
「ＭＴＬＰ」とは、本明細書で使用する場合、完全長膜転位ペプチドまたは完全長ペプチドの１又は複数のモチーフと、完全長ペプチドの１又は複数の機能的活性を表示するその誘導体、断片、モチーフ、類似体および、ペプチド模倣体のことである。
【００３６】
「〜に複合化する」は、本明細書で使用する場合、活性薬剤または活性粒子へのＭＴＬＰの吸着、非共有結合による結合、および非共有結合による結合を包含する。
【００３７】
「ＭＴＬＰ活性薬剤」は、本明細書で使用する場合、活性薬剤に複合化された１又は複数のＭＴＬＰを包含する。
「ＭＴＬＰ活性粒子複合体」は、本明細書で使用する場合、活性粒子に複合化された１又は複数のＭＴＬＰを包含する。
【００３８】
使用される活性薬剤は、診断、予防、または治療すべき病理学的症状、活性薬剤を投与する対象である個体、および投与経路に依存する。活性薬剤には、撮像用薬剤、抗原、抗体、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子、遺伝子訂正ハイブリッドオリゴヌクレオチド、アプタマーオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、リボザイム、シグナル伝達経路阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＤＮＡ変性剤、治療用遺伝子、治療用遺伝子送達系、ならびに米国薬局方や他の既知の薬局方に列挙されているがそれらに限定されない薬物および他の薬剤が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００３９】
薬物には、ペプチド、タンパク質、ホルモン、鎮痛薬、心血管薬、麻酔薬、拮抗薬、キレート化薬、化学療法薬、鎮静薬、抗高血圧薬、抗狭心症薬、片頭痛薬、抗凝固薬、制吐薬、抗腫瘍薬、および抗利尿薬が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００４０】
ホルモンには、インスリン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子調節タンパク質、心房性ナトリウム利尿タンパク質、コロニー刺激因子、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロン、ソマトトロピン、ソマトスタチン、ソマトメジン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ＴＰＡ）、成長ホルモン放出因子ホルモン（ＧＨＲＨ）、オキシトシン、エストラジオール、成長ホルモン、酢酸ロイプロリド、第VIII因子、テストステロンおよびその類似体が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００４１】
鎮痛薬には、フェンタニル、スフェンタニル、ブトルファノール、ブプレノルフィン、レボルファノール、モルフォン（モルヒネ）、ヒドロモルフォン、ヒドロコデイン、オキシモルフォン、メサドン、リドカイン、ブピバカイン、ジクロフェナク、それのナプロクサン、パベリンおよびそれらの類似体が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００４２】
片頭痛薬には、ヘパリン、ヒルジンおよびそれらの類似体が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
抗凝固薬には、スコポラミン、オンダンセトロン、ドンペリドン、エトクロプラミドおよびそれらの類似体が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００４３】
心血管薬、抗高血圧薬および血管拡張薬には、ジルチアゼム、クロニジン、ニフェジピン、ベラパミル、イソソルビド−５−一硝酸塩、有機硝酸塩、ニトログリセリンおよびそれらの類似体が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００４４】
鎮静剤には、ベンゾジアゼピン、フェノチアジンおよびそれらの類似体が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
麻酔性の拮抗薬には、ナルトレキソン、ナロキソンおよびそれらの類似体が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００４５】
キレート化薬には、デフェロキサミンとその類似体が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
抗利尿薬には、デスモプレシン、バソプレシンおよびそれらの類似体が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００４６】
抗腫瘍薬には、５−フルオロウラシル、ブレオマイシン、ビンクリスチン、プロカルバジン、テメゾールアミド、ＣＣＮＵ、６−チオグアニン、オキシ尿素およびそれらの類似体が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００４７】
活性薬剤は、中性または塩の形式で調剤することができる。医薬として許容される塩類には、それらは遊離アミノ基を備えて成る塩；遊離カルボキシル基を備えて成る塩；ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２- エチルアミノエタノール、ヒスチジンおよびプロカインに由来する塩；が含まれるがそれらに限定されるわけではない。活性薬剤は、可溶性、不溶性、浸透性、不浸透性、生分解性または胃停留性のポリマーまたはリポソームを含むがそれらに限定されない医薬として許容される成分から調製された粒子に装填することができる。そのような粒子には、ナノパーティクル、生分解性ナノパーティクル、マイクロパーティクル、生分解性マイクロパーティクル、ナノスフェア、生分解性ナノスフェア、マイクロスフェア、生分解性マイクロスフェア、カプセル、エマルジョン、リポソーム、ミセ
ルおよびウイルスベクター系が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４８】
本発明で使用されるＭＴＬＰには、完全長ペプチド、完全長ペプチドの１又は複数のモチーフおよび完全長ペプチドの１又は複数の機能的活性を表すその誘導体、断片、モチーフ、類似体およびそのペプチド模倣体が含まれる。そのような機能活動には、細胞内への、細胞内区画の内外への、および細胞層を横切る活性薬剤の取り込みの増強や、細胞内への、細胞層を横切る、および細胞内区画の内外への活性薬剤の取り込みの増強における完全長ペプチドとの競争が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４９】
そのようなＭＴＬＰには、アミノ酸配列の全部または一部が表１に示されているのと実質的に同一の一次アミノ酸配列を含むＭＴＬＰが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００５０】
【表１】
0004799790.tif 000002
１５個の残基から成る疎水性ペプチドＺＥｌａｎ０９４（配列番号２）は、１２個の残基から成る疎水性ペプチド配列ＡＡＶＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号１）（Rojas ら、Natural Biotechnology 16:370,1998 ）に関連する。しかしながら、１５個の残基から成るＺＥｌａｎ０９４は、それが３つの追加のアミノ酸残基（N 末端のＫＫＡ）とＣ末端のブロックアミドを有している点で１２個の残基から成る配列番号１と異なる。これらのＮ末端とＣ末端修飾部は、ＭＴＬＰの溶解性とインビボ安定性を増強するようそれぞれ設計される。NH2末端アラニンも、ペプチドのαらせん特性に寄与し得る。
【００５１】
本発明のＭＴＬＰは、ＺＥｌａｎ０９４の全体または断片を含むかまたはＺＥｌａｎ０９４の少なくとも隣接するアミノ酸を有するペプチドを包含する。本発明のＭＴＬＰは、ＺＥｌａｎ０９４の領域と実質的に相同な配列も有する。好ましくは、本発明のＭＴＬＰは、同一サイズの配列に対して、または当該技術分野において周知のコンピュータ相同性プログラムによりアラインメントを行った際に整列された配列と比較した時に、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の同一性を示す。さらに、ＭＴＬＰのコード核酸は、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、または非ストリンジェントな条件下でＺＥｌａｎ０９４のコード配列とハイブリッド形成することができる。
【００５２】
ＭＴＬＰには、ＭＴＬＰと機能的に等価な分子を提供する、特定のアミノ酸残基が付加または削除されたペプチドまたは特定のアミノ酸が同様の性質を有する他のアミノ酸残基で置き換えまたは置換されたペプチドも含まれるが、それらに限定されるわけではない。例えば、アミノ酸残基は、それと同様な極性を有する、機能的等価物として機能しサイレント変異を生じさせる別のアミノ酸残基またはその類似体と置換されてもよい。配列内でのアミノ酸の置換物は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択され得る。無極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正に帯電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負に帯電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸とグルタミン酸が挙げられる。さらに、任意の残基を、溶解度、インビボ安定性、脂質膜との相互作用、または脂質膜を横切る取り込みを増強する天然残基と置き換えてもよい。
【００５３】
さらに、所望であれば、非標準アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を、置換物または付加物としてＭＴＬＰに導入することができる。非標準アミノ酸としては、通常のアミノ酸のＤ−異性体、αアミノイソ酪酸、アミノ酪酸、アミノヘキサン酸、アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルグアニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、Ｐ−アラニン、フルオロ−アミノ酸、ならびに、Ｐ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸およびＮａ−メチルアミノ酸ならびにそのアミノ酸類似体を含むがそれらに限定されない設計者のアミノ酸が含まれるが、それらに限定されるわけではない。任意の残基を、溶解度、インビボ安定性、脂質膜との相互作用、または脂質膜を横切る取り込みを増強する非標準アミノ酸または化学的アミノ酸と置き換えてもよい。
【００５４】
核酸配列、ＭＴＬＰ  ＺＥｌａｎ０９４、Ｆｅｌａｎ０９４、ＺＥｌａｎ０９４Ｒ、１７６〜１９３、２０４Ｎおよび２０４（配列番号２〜２４）のペプチド配列をコードする核酸配列が、表２（配列番号２５〜４７）に与えられる。しかしながら、ヌクレオチドをコードする配列の縮重により、実質的に同じアミノ酸配列をコードする異なるヌクレオチド配列を使用してもよい。すなわち、異なるコドンの置換によって変更されたヌクレオチド配列は、サイレント変異を生じる機能的に等価なアミノ酸をコードすることができる。
【００５５】
ＭＴＬＰは、化学的方法（米国特許第４，２４４，９４６号、第４，３０５，８７２号および第４，３１６，８９１号；Merrifleldら、J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1964；Valeら、Science 213:1394、1981；Marki ら、J. Am. Chem. Soc. 103:3178、1981）；組換えＤＮＡ法（Maniatis、Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 第２版、Cold Spring Harbar Laboratory, Cold Spring Harbor NY, 1990）；当業者に周知のウイルス発現法または他の方法により合成することが可能である。
【００５６】
化学的方法には、固相ペプチド合成が含まれるがこれに限定されない。簡単に説明すると、固相ペプチド合成は、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基を樹脂に結合し、続いてＮ−α保護アミノ酸を付加することから成る。保護基は当該技術分野で周知のいかなるものであってもよい。アミノ酸を成長中のペプチド鎖に付加する前に、先のアミノ酸の保護基は除去される。（Merrifleld J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1964; Vale ら、Science 213: 1394, 1981; Markiら、J. Am. Chem. Soc. 103: 3178, 1981 ）。その後、合成されたペプチドは当該技術分野において周知の方法によって精製される。
【００５７】
【表２】
0004799790.tif 000003
好ましくは固相ペプチド合成は、Applied Biosystems社（ＡＢＩ）によって提供されている「Ｆａｓｔｍｏｃ」合成プロトコルを使用してＡＢＩ社の４３１Ａ型を含むがそれに限定されない自動ペプチド合成装置を使用することにより行われる。このプロトコルは、カップリング剤として２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム六フッ化リン酸塩（ＨＢＴＵ）を使用する（Knorr ら、Tet. Lett. 30:1927, 1989）。合成は、０．２５ｍｍｏｌの市販の４−（２’，４’−ジメトキシフェニル（９−フルオレニル−エトキシカルボニル）−アミノメチル）フェノキシポリスチレン樹脂上で行うことができる（Rink H. Tet. Lett. 28:3787, 1987）の上で行うことができる。Ｆｍｏｃアミノ酸（１ｍｍｏｌ）がＦａｓｔｍｏｃプロトコルに従ってカップリングされる。Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させたＨＢＴＵに関して、溶媒として使用される。側鎖を保護された以下のＦｍｏｃアミノ酸誘導体が使用される：ＦｍｏｃＡｒｇ（Ｐｍｃ）ＯＨ；  ＦｍｏｃＡｓｎ（Ｍｂｈ）ＯＨ；  ＦｍｏｃＡｓｐ（ｔＢｕ）ＯＨ；  ＦｍｏｃＣｙｓ（Ａｃｍ）ＯＨ；  ＦｍｏｃＧｌｕ（ｔＢｕ）ＯＨ；  ＦｍｏｃＧｌｎ（Ｍｂｈ）ＯＨ；  ＦｍｏｃＨｉｓ（Ｔｒ）ＯＨ；  ＦｍｏｃＬｙｓ（Ｂｏｃ）ＯＨ；  ＦｍｏｃＳｅｒ−（ｔＢｕ）ＯＨ；  ＦｍｏｃＴｈｒ（ｔＢｕ）ＯＨ；  ＦｍｏｃＴｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ。（略語：Ａｃｍ：アセトアミドメチル；  Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル；  ｔＢｕ：ｔｅｒｔ−ブチル；  Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシ−カルボニル；  Ｍｂｈ：４，４’−ジメトキシベンズヒドリル；  Ｐｍｃ：２，２，５，７，８−ペンタメチル−クロ−マン−６−スルホニル；  Ｔｒ：５トリチル。）
【００５８】
各合成の終わりに、一定量のペプチドを、紫外線分光法により分析する。乾燥したペプチド樹脂（約３〜１０mg）のサンプルを秤量し、２０％ピペリジンＤＭＡ溶液（１０ｍｌ）を加える。３０分の超音波処理後に、ジベンゾフルベン−ピペリジン付加物（N 末端Ｆｍｏｃ基の開裂により形成）のＵＶ（紫外線）吸光度を、３０１ｎｍにて記録する。ペプチド置換物（ｍｍｏｌ／ｇ）は以下の方程式に従って計算される：
【００５９】
置換物＝Ａ×ｖ×  １０００／７８００×ｗ
式中Ａは３０１ｎｍにおける吸光度であり、ｖは２０％ピペリジンＤＭＡ溶液の体積（ｍｌ）であり、７８００はジベンゾフルベン−ピペリジン付加物の吸光係数（ｍｏｌ／ｄｍ3／ｃｍ）であり、ｗはペプチド樹脂サンプルの質量（ｍｇ）である。N 末端のＦｍｏｃ基を２０％ピペリジンのＤＭＡ溶液の使用により開裂させた後、無水酢酸およびピリジンのＤＭＡ溶液の使用によりアセチル化する。ペプチド樹脂を、ＤＭＡ、ＣＨ2Ｃ12およびジエチルエーテルで入念に洗浄する。
【００６０】
開裂および脱保護（Kingら、Int. J. Peptide Protein Res. 36: 255, 1990）のために使用される方法には、風乾させたペプチド樹脂をエチルメチル−スルフィド（ＥｔＳＭｅ）、エタンジチオール（ＥＤＴ）およびチオアニソール（ＰｈＳＭｅ）で約２０分間処理してから、９５％水性トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加することが含まれるが、これに限定されるわけではない。約５０ｍｌのこれらの試薬を、１グラムのペプチド樹脂当たり、ＴＦＡ：ＥｔＳＭｅ：ＥＤＴ：ＰｈＳｍｅ（１０：０．５：０．５：０．５）の比で使用される。混合物を、Ｎ2雰囲気下で室温にて３時間撹拌し、ろ過し、ＴＦＡ（２×３ｍｌ）で洗浄する。合一した濾液を、真空で蒸発し、黄色／橙色残留物に無水ジエチルエーテルをに加る。生じた白色沈殿をろ過により分離する。合成されたペプチドの精製を、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、サイズカラムクロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、遠心、示差可溶化を含むがそれらに限定されない標準的方法により行う。
【００６１】
ペプチドを発現するための組換えＤＮＡ法は当業者には周知であり、哺乳類系、昆虫系、植物系およびウイルス系を含むがそれらに限定されない生物系における発現が含まれる（Maniatis、T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,  第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1990 ）。例えば、ＭＴＬＰを、ウイルス、ウイルスコートタンパク質、キャプシドタンパク質、またはウイルス表面タンパク質に融合させたウイルスによって発現することができる。さらに、ＭＴＬＰ−ウイルスタンパク質蛋白質複合体は、哺乳類ホストの中で、または対象のウイルスを生産するために使用されるヘルパーウイスルの中で発現することができる。
【００６２】
完全長ペプチドの誘導体、断片、モチーフ、類似体またはペプチド模倣体をコードする遺伝子の生産では、所望の活性がコードされる遺伝子領域内の翻訳停止シグナルにより中断されない同じ翻訳読枠内に、修飾遺伝子が存在することを確実にするよう注意すべきである。
【００６３】
当該技術分野で周知の多くのストラテジー（Maniatis、T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual,  第２版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1990 ）のうち任意のものを用いて、クローニングされたＭＴＬＰ遺伝子配列を修飾することができる。配列は制限酵素により適切な部位で分断し、酵素で修飾し、単離し、インビトロでライゲートすることができる。核酸を、翻訳配列、開始配列および／または終結配列を作成および／または破壊するために、コード領域に変異を作成するかおよび／または新しい制限酵素部位を形成するために、またはインビトロ修飾をさらに促進すべく先在していた制限酵素部位を破壊するために、インビトロまたはインビボで変異させることができる。当該技術分野で任意の周知の突然変異誘発技術を使用してもよく、それには化学的突然変異誘発、インビトロ部位特異的変異誘発（Hutchinson, et al. J. Biol Chem 253: 6551, 1978 ）、ＴＡＢ（商標）リンカー（Amersham Pharmacia、ニュージャージー州ピスカタウェイ所在）、および変異を含むＰＣＲプライマーが含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００６４】
さらに、バクテリオファージM １３またはバクテリオファージＦｄを含むがこれらに限定されないファージディスプレイベクターを修飾して、バクテリオファージのＩＩＩ遺伝子タンパク質生成物またはＶＩＩ遺伝子タンパク質生成物と融合されたＭＴＬＰを発現してもよい。アラニンスキャン位置突然変異、連続ランダム位置スキャン突然変異、および例えば表１に示されるようなそれに由来する配列を含むがそれらに限定されないＭＴＬＰ誘導体をコードする配列のライブラリが、バクテリオファージのＩＩＩ遺伝子タンパク質またはＶＩＩ遺伝子タンパク質のいずれかに対してフレーム内でクローニングされる。その後、ファージディスプレイライブラリをスクリーニングして、活性薬剤または活性粒子を膜を横切って輸送する能力が増強したＭＴＬＰ誘導体を同定することができる。
【００６５】
ＭＴＬＰは、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、パルミトイル化、ミリストリル化、イソプレニル化、リピド化、アルキル化、誘導体化、保護基／ブロック基の付加、タンパク質分解、ならびに抗体または他の細胞リガンドへの結合を含むがそれらに限定されない方法により化学的または生物工学的合成の最中またはその後に修飾され得る。また、ＭＴＬＰは、臭化シアンによる化学的分解、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝合成により、または当該技術分野で既知の他の方法により、修飾される。
【００６６】
ＭＴＬＰの誘導体の形式は、ＭＴＬＰまたはその複数リピートを含めたキメラまたは融合ペプチドであってよく、ペプチド結合を介して異なるペプチドのアミノ酸配列に対して、そのアミノ末端、カルボキシ末端、または内部部位でつながれた、完全長ペプチド配列またはその一部分の少なくとも１つのドメインまたはモチーフから好ましくは成る。キメラペプチドを生産する方法には、異なるペプチドのコード配列にフレーム内でつながれた、ＭＴＬＰコード配列を含む核酸の組換え発現が含まれるが、それに限定されるわけではない。当該技術分野で周知の方法を使用して、所望のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、適切な順で互いにライゲートされ、キメラ産物が発現される。例えば、任意の異種タンパク質をコードする核酸に融合されたＭＴＬＰ核酸の部分を含むモザイク遺伝子が構築され得る。代わりに、キメラＭＴＬＰは、ペプチド合成装置を含むがそれに限定されない技術を用いて合成してもよい。
【００６７】
ＭＴＬＰは、ホモ二機能およびヘテロ二機能の架橋分子の使用を含むがそれらに限定されない方法により、検知可能な標識、吸着促進分子、毒素または固体基質を含むがそれらに限定されない他の分子に対して結合される（Carlssonら、Biochem. J. 173: 723, 1978;  Cumber ら、Methods in Enzymology 112: 207, 1978; Jue ら、Biochem. 17: 5399, 1978; Sunら、Biochem. 13:2334, 1974; Blattlerら、Biochem. 24: 1517, 1985; Liuら、Biochem. 18:690, 1979; YouleとNeville Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5383, 1980; Lerner ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3403. 1981; Jung and Moroi Biochem. Biophys. Acta 761: 162 1983; Caulfield ら、Biochem. 81: 7772, 1984; Staros Biochem. 21: 3950, 1982; Yoshitakeら、Eur. J. Biochem. 101: 395, 1979; Yoshitakeら, J. Biochem. 92: 1413, 1982; Pilch とCzech J. Biol. Chem. 254: 3375, 1979; Novickら, J. Biol. Chem. 262: 8483, 1987; LomantとFairbanks J. Mol. Biol. 104: 243, 1976; HamadaとTsuruo. Anal. Biochem.160: 483, 1987; Hashida ら、J. Applied Biochem. 6:56, 1984; Means and Feeney Bioconjugate Chem. 1:2, 1990 ）。
【００６８】
免疫特異的に免疫原と結合する抗体を生成するために、ＭＴＬＰを免疫源として使用してもよい。そのような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単一鎖Ｆａｂ断片、F （ａｂ’）2断片およびＦａｂ発現ライブラリが含まれるがそれらに限定されない。そのような抗体の使用方法には、局在化、イメージング、診断、治療および処理有効性のモニタリングが含まれるがそれらに限定されない。例えば、ペプチドへ導入されたダンシル基または他のエピトープのようなＭＴＬＰのドメインに特異的な抗体または抗体断片を、ＭＴＬＰの存在を同定するために使用したり、ＭＴＬＰを粒子の表面へ結合させたり、粒子上のＭＴＬＰの量を定量化したり、生物試料中のＭＴＬＰの量を測定したり、細胞または組織試料中のＭＴＬＰを免疫化学的に局在化させたり、インビボ投与後にＭＴＬＰをイメージングしたり、免疫アフィニティカラムクロマトグラフィーによりＭＴＬＰを精製したりするために使用することができる。
【００６９】
当業者に周知の適切なインビボまたはインビトロアッセイにより、ＭＴＬＰの機能的活性を決定することができる。そのようなアッセイには、免疫アッセイ、免疫放射分析アッセイ、免疫拡散アッセイ、および、免疫蛍光アッセイ、ならびにウェスタンブロット分析が含まれるがそれらに限定されない。
【００７０】
ＭＴＬＰは、細胞、細胞内区画または細胞層へ活性薬剤または活性粒子を狙いを定めて向かわせるように機能したり、細胞内への、細胞内区画内外への、および細胞層を横切っての活性薬剤または活性粒子の取り込みを増強するように機能したりする。細胞には、上皮細胞、内皮細胞および中皮細胞、単細胞生物、および植物細胞が含まれるがそれらに限定されない。細胞層には、胃腸管、肺上皮、脳血液関門および血管内皮を含むがそれらに限定されない上皮層、内皮層および中皮層が含まれる。好ましくは、細胞は上皮細胞であり、細胞層は上皮細胞層である。最も好ましくは、細胞はＧＩＴ上皮細胞であり、細胞層はＧＩＴ上皮細胞層である。細胞内区画には、核区画、ミトコンドリア区画、小胞体区画、エンドソーム区画が含まれるがそれらに限定されない。ＭＴＬＰは、細胞内輸送を調節または案内する活性薬剤または活性粒子の取り込みを増強するために、使用することができる。さらに、ＭＴＬＰは、細胞内遺伝子送達を増強するために使用することができる。すなわち、遺伝子またはプラスミドＤＮＡは、カチオン脂質ポリマー系に入れてカプセルにされるか複合化され、カチオン脂質ポリマー系の表面は、ＭＴＬＰまたはターゲティングペプチドで複合化される。別の方法では、プラスミドＤＮＡを凝縮し、凝縮物をカチオン脂質と複合化し、カチオン脂質の表面をＭＴＬＰまたはターゲティングペプチドで複合化する。
【００７１】
ＭＴＬＰを活性薬剤に複合化する（ＭＴＬＰ−活性薬剤複合体）ために使用される方法としては、直接であっても結合部分を介してであってもよいＭＴＬＰと活性薬剤の共有結合による結合、ＭＴＬＰと活性薬剤の非共有結合による結合、ならびに融合タンパク質の生成（この場合ＭＴＬＰは、治療用タンパク質を含むがこれに限定されない活性薬剤に対してフレーム内で融合される）が含まれる。
【００７２】
ＭＴＬＰを活性薬剤を装填した留意に複合化する（ＭＴＬＰ−活性粒子複合体）ために使用される方法としては、活性粒子への吸着；活性粒子への非共有結合による結合；直接であっても結合部分を介してであってもよい、活性粒子、活性粒子の合成に使用される１または複数のポリマー、もしくは該ポリマーの合成に使用される１または複数のモノマーへの共有結合による結合；ならびに、活性粒子を含む任意の他の成分への結合が含まれる。さらに、ＭＴＬＰは、徐放性（制御放出性）の粒子または装置に複合化され得る（Medical Applications of Controlled Release, Langer&Wise （編）、CRC Press, Boca Raton, Florida, 1974; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball （編）, Wiley, New York, 1984; Ranger ら、J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 351, 1989; Howardら、J. Neurosurg. 71: 105, 1989 ）。
【００７３】
ウイルスベースの遺伝子送達系のために使用される方法には、ウイルス粒子の表面上のＭＴＬＰを発現する核酸レベルが修飾されたベクターや、ウイルスベクターに組込まれたＭＴＬＰウイルス融合タンパク質を発現する哺乳類細胞またはヘルパーウイルスが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００７４】
本発明はまた、治療上有効な量のＭＴＬＰ活性粒子複合体またはＭＴＬＰ活性薬剤複合体と、医薬として許容される担体とを含む（Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin ）医薬製剤を提供する。用語「医薬として許容される」は、動物、特にヒトに使用される、国または州政府の規制機関によって承認された担体や、米国薬局方または他の一般に認識されている薬局方に列挙された担体が含まれるが、それらに限定されるわけではない。用語「担体」は、ＭＴＬＰ活性薬剤複合体またはＭＴＬＰ活性粒子複合体と共に投与される希釈液、アジュバント、賦形剤または溶剤のことを指す。そのような医薬担体には、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等のような石油由来、動物由来、野菜由来または合成由来のものを含む、水および油のような無菌の液体であり得る。医薬製剤が経口的に投与されるときは、水が好ましい担体である。食塩水および水性デキストロースならびにグリセリン溶液も、特に注射可能な溶液用の液状担体として使用することができる。適当な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、滑石、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。また製剤は、所望の場合には、少量の湿潤剤、乳化剤、またｐＨ緩衝剤を含んでもよい。これらの組成物には、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、粉剤および徐放製剤が含まれるがそれらに限定されない。製剤は、従来の結合剤とトリグリセリドのような担体を備えた座薬であってもよい。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロースおよび炭酸マグネシウムを含むがそれらに限定されない標準的な担体を含有してもよい。そのような製剤は、活性薬剤を必要とする個体への適切な投与形式を与えるために、適切な量の担体と共に、粒子に装填された治療上有効な量の活性薬剤または活性薬剤を含むだろう。
【００７５】
当該技術分野において周知のいかなる経路を使用してＭＴＬＰ活性薬剤複合体またはＭＴＬＰ活性粒子複合体を投与してもよく、その経路には、経口、経鼻、局所、粘膜、静脈内、腹腔内、皮内、包膜内、筋内、経皮、かつ浸透による経路が含まれるがそれらに限定されるわけではない。好ましくは投与は経口であり、その場合、ＭＴＬＰは、ＧＩＴ上皮細胞への活性薬剤の取り込みと、ＧＩＴ上皮を横切って循環に入る活性薬剤の取り込みを増大する。特定の病状の診断、予防、治療用に投与される、正確な量の活性薬剤は、病理学的障害、病理学的症状の重症度、使用される活性薬剤、および投与経路によって決定される。投与される活性薬剤量および投与スケジュールは、医療従事者により標準的な臨床法を用いて決定される。さらに、活性薬剤投与のための最適範囲の決定を支援するために、インビトロアッセイを任意選択で使用してもよい。
【００７６】
以下の実施例は、本発明の限定を構成することなく、本発明についてさらに詳しく例証する役目を果たすだろう。一方で、本発明の精神および／または特許請求の範囲の範囲から逸脱せずに、当業者には本発明の様々な他の実施形態、改変および均等物が想定されることが明白に理解される。
【００７７】
（実施例１）
ペプチド合成
膜転位ペプチドＺＥｌａｎ０９４、２０４N および２０４と、ターゲティングペプチドＨＡＸ４２、ＰＡＸ２、Ｐ３１およびＳｎｉ３４（米国特許出願出願番号第０９／０７９，８１９号、第０９／０７９，７２３号と第０９／０７９，６７８号）を、ｆｍｏｃ合成プロトコル（Anaspec 社、カリフォルニア州サンホセ所在）を使用して化学合成した。抗ダンシル抗体によるペプチドの検出を可能にするため、各配列のN 末端にダンシル基を付加した（表３）。
【００７８】
【表３】
0004799790.tif 000004
ＺＥｌａｎ０９４（配列番号２）の物性を表４に示す。
表４
ＺＥｌａｎ０９４（配列番号２）の物性
質量（Ｍ＋Ｈ＋）                        １８３８．０３
溶解度                                  １mg／mlの水
外観                                    白色粉末
ＨＰＬＣ純度                            ＞９５％
Kyle-Doolittle  ハイドロパシープロット    図１
【００７９】
（実施例２）
ＭＴＬＰ活性粒子複合体およびターゲティングペプチド活性粒子複合体の調製  活性粒子をコアセルベーション法を使用してポリマーから調製する。好ましくは、粒径は、約５ｎｍ〜７５０μｍの間、より好ましくは約１０ｎｍ〜５００μｍの間、最も好ましくは約５０ｎｍ〜８００ｎｍの間である。ＭＴＬＰまたはターゲティングペプチドは当業者に既知の様々な方法を使用して、粒子に複合化される。
【００８０】
以下はコアセルベート粒子の一般的な調製方法である。
相Ａ  ポリマー剤、表面活性剤、表面安定化剤、表面変性剤、または界面活性剤を水に溶解する（Ａ）。好ましくは、そのような薬剤は、ポリビニルアルコール（以下「ＰＶＡ」）、約５０〜１００％が加水分解された約５００〜５００，０００ｋＤａの分子量範囲のＰＶＡ誘導体である。より好ましくは、該薬剤は、８０〜１００％が加水分解された約１０，０００〜１５０，０００ｋＤａの分子量範囲のＰＶＡである。混合物（Ａ）は、１０〜２０００ｒｐｍ、より好ましくは１００〜６００ｒｐｍで低剪断条件下で撹拌される。溶液のｐＨおよびイオン強度は、塩類、緩衝液、または他の変性剤を用いて変えることが可能である。溶液の粘度は、ポリマー、塩類または他の粘度変性剤を用いて変えることが可能である。
【００８１】
相Ａには、乳化剤、洗剤、可溶化剤、湿潤剤、起泡剤、消泡剤、凝集剤、および解膠剤が含まれ得る。その例としては、ドデカンナトリウム、ドデシルナトリウム−（ラウリル）硫酸塩、ジオクチルナトリウム−スルホサクシネート、セトステアリルアルコール、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムやステアリン酸ナトリウムを始めとするステアリン酸の塩類、ドデシルナトリウム−ベンゼンスルホン酸、コール酸ナトリウムトリエタノールアミンを始めとする陰イオン系界面活性剤；ヘキサデシルトリメチル臭化アンモニウム（セトリミド）、ドデシルヨウ化ピリジニウム、ドデシル塩化ピリジニウムを始めとする陽イオン系界面活性剤；ヘキサオキシエチレンモノヘキサデシルエーテル、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ）、ソルビタンエステル（Ｓｐａｎ）、Ｍａｃｒｏｇｏｌエーテル、Ｐｏｌｏｘａｌｋｏｌ（ポロキサマー）、ＰＶＡ、ＰＶＰ、グリコールおよびグリセリンエステル、脂肪族アルコールポリグリコールエーテル、デキストラン、高級脂肪族アルコールを始めとする非イオン系表面活性剤；Ｎ−ドデシル基アラニン、レシチン、タンパク質、ペプチド、ポリサッカリド、半合成多糖、ステロール含有物質、ならびに水酸化マグネシウムやモンモリロナイト粘土のような細分された固形物、のような両性表面活性剤；が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
【００８２】
相Ｂ  ポリマーを水と混和する有機溶媒に溶解して、有機相（Ｂ）を形成する。好ましくは、有機相は、使用されるポリマーに依存して、０：１００  アセトン：エタノール〜１００：０アセトン：エタノールの比のアセトン−エタノール混合物である。得られる粒子生成物の物理的特性および化学的特性を変えるために、他のポリマー、ペプチド、糖、塩類、天然ポリマー、合成ポリマーまたは他の物質を、有機相（Ｂ）に添加してもよい。
【００８３】
ポリマーは可溶であっても、浸透性であっても、不浸透性であっても、生物分解性であっても、胃停留性であってもよい。ポリマーは天然または合成のポリマーおよびコポリマーの混合物であってもよい。そのようなポリマーには、ポリラクチド、ポリグリコライド、ＤＬ、ＬおよびＤ型のポリ（ラクチドコグリコライド）（ＰＬＧＡ）、コポリシュウ酸エステル、ポリカプロラクトン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリアルキルシアノ−アクリル酸エステル、ポリヒドロキシ酪酸エステル、ポリウレタン、タンパク質、カゼイン、キトサン誘導体、ゼラチン、アラビアゴム、セルロース、多糖、アルギン酸、ポリペプチドおよびその同等物、それらのコポリマー、それらの混合物、それらの対掌体形式、それらの立体異性体、ならびにそれらの任意のＭＴＬＰ共役体が含まれるがそれらに限定されるわけではない。合成ポリマーには、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、セルロースエーテル；セルロースエステル、ニトロセルロース、それらのアクリル酸およびメタクリル酸ならびにエステル、デキストラン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリアルキレン、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレン酸化物、ポリアルキレンテレフタル酸エステル、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルエステル、ポリビニルハロゲン化物、ポリビニルピロリドン、ポリシロキサン、ポリウレタンおよびそれらのコポリマーが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００８４】
相Ｃ
相Ｂを相Ａに入れて連続的な割合で撹拌する。溶媒を、好ましくは外気を超える温度の上昇および／または真空ポンプの使用により、蒸発させる。得られた粒子は、懸濁液（Ｃ）の形をしている。
【００８５】
活性薬剤は、相Ａまたは相Ｂに添加し得る。活性薬剤の装填率は、０〜９０重量％の範囲である。ＭＴＬＰまたはターゲティングペプチドは、相Ｃに添加し得る。ＭＴＬＰおよびターゲティングペプチドの装填率は、０〜９０％の範囲である。
【００８６】
相Ｄ  粒子（Ｄ）を、「ｇ」力での遠心、ろ過、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーまたは電荷分離を含むがそれらに限定されない標準のコロイド分離技術を使用して懸濁液（Ｃ）から分離する。液相を廃棄し、粒子（Ｄ）を、水、塩溶液、緩衝液、または有機溶媒を含むがそれらに限定されない洗浄溶液で再懸濁する。粒子は標準のコロイド分離技術を使用して洗浄溶液から分離し、２回以上洗浄する。ＭＴＬＰまたはターゲティングペプチドを、粒子を洗浄するために使用してもよいし、または代わりに、最終洗浄液中に溶解してもよい。粒子を乾燥する。
【００８７】
ポリマー、ペプチド、糖、塩類、天然および／または生物ポリマー、または他の物質の第２の層を、当該技術分野において周知の任意の適切な方法によって、予備成形された微粒子コアの上に配置してもよい。乾燥させた粒子は、例えば、錠剤化、カプセル化、または噴霧乾燥等によりさらに加工される。形成された粒子の放出プロフィールは、即時から制御または遅延放出まで、使用されるおよび／または所望の製剤に依存して変えられる。
【００８８】
（実施例３）
ウシインスリン装填−ＭＴＬＰコートナノパーティクル−ＭＴＬＰを最終洗浄で添加
速効性のウシインスリン（２８．１ＩＵ／ｍｇ）を、３００ＩＵインスリン／２１０ｍｇナノパーティクルの理論的装填率で、ポリラクチド−コ−グリコライド（ＰＬＧＡ、ベーリンガーインゲルハイム、インディアナ州インディアナポリス）に組み込んだ。ナノパーティクルを、ダンシル化したＺＥｌａｎ０９４（配列番号４８）でコーティングした。
【００８９】
成分                                              量
ＰＬＧＡ  ＲＧ５０４Ｈ（ロット番号２５０５８３）  ２ｇ
アセトン                                          ４５ｍｌ
エタノール                                        ５ｍｌ
ＰＶＡ（５％ｗ／ｖ）                              ４００ｍｌ
（１３〜２３ｋＤａ、９８％加水分解）
ウシインスリン（ロット番号８６ＨＯ６７４）        １００ｍｇ
ＺＥｌａｎ０９４（配列番号４８）                  １０ｍｇ／５０ｍｌ
ｄＨ2Ｏ
【００９０】
調製法：
１．水を沸騰の近くまで加熱し、ＰＶＡを５％ｗ／ｖに添加し、溶液を冷めるまで撹拌した（相Ａ）。
２．アセトンとエタノールを混合し、有機相（相Ｂ）を生成した。
３．ＰＬＧＡをアセトンおよびエタノール（ステップ２）に添加し、撹拌により溶解した（相Ｂ）。
４．ＩＫＡ（商標）反応器を２５℃にセットし、相Ａ（ステップ１）を反応器に添加し、４００ｒｐｍで撹拌した。
５．ウシインスリンを撹拌している相Ａ（ステップ４）に添加した。
６．清潔な管材料と新品の注射を使用して、相Ｂ（ステップ３）をゆっくりと、４０にセットしたペリスタル型ポンプを使用して、撹拌中の溶液（ステップ５）に滴下した。
７．ＩＫＡ（商標）反応器のポートを開放し、４００ｒｐｍで一晩撹拌して懸濁液（相Ｃ）を生成することにより、溶媒を蒸発した。
８．懸濁液である相Ｃ（ステップ７）を、１２，５００〜１５，０００ｒｐｍで２５〜４０分間ＸＬ９０遠心分離機で遠心分離した。
９．  上清を廃棄し、粒子の「ケーキ」を崩壊し、粒子（相Ｄ）を、１２，５００〜１５，０００ｒｐｍで１０〜１５分間４℃でＸＬ９０遠心分離機で遠心分離することにより２００ｍｌのｄＨ2Ｏに入れて２度洗浄した。
１０．上清をデカンテーションで捨て、「ケーキ」を崩壊し、粒子を真空オーブンで乾燥させた。乾いた粒子を粉砕し、包装容器（securitainer）に配置し、分析した。
インスリン装填率は５％であるか、５０ｍｇインスリン／ｇ粒子であった。ＨＰＬＣで決定したインスリン作用強度は５１．４ｍｇ／ｇであった。走査電子顕微鏡によると、直径約３００〜４００ｎｍの適度に球状の粒子を示した。
【００９１】
（実施例４）
ウシインスリン装填−ＭＴＬＰコートナノパーティクル−  ＭＴＬＰを相Ｃに添加
速効性のウシインスリン（２８．１ＩＵ／ｍｇ）を、３００ＩＵインスリン／２１０ｍｇナノパーティクルの理論的装填率で、ＰＬＧＡナノ粒子に組み込んだ。ナノパーティクルを、ダンシル化したＺＥｌａｎ０９４（配列番号４８）でコーティングした。
【００９２】
成分                                              量
ＰＬＧＡ  ＲＧ５０４Ｈ（ロット番号２５０５８３）  ２ｇ
アセトン                                          ４５ｍｌ
エタノール                                        ５ｍｌ
ＰＶＡ（５％ｗ／ｖ）                              ４００ｍｌ
（１３〜１５ｋＤａ、９８％加水分解）
ウシインスリン（ロット番号８６ＨＯ６７４）        １００ｍｇ
ＺＥｌａｎ０９４（配列番号４８）                  １０ｍｇ／５０ｍｌ
ｄＨ2Ｏ
【００９３】
調製法：
実施例３のステップ１〜４を参照。
ステップ５  インスリンとＺＥｌａｎ０９４を、撹拌中のＰＶＡ溶液に添加した。
実施例３のステップ６〜９を参照。
粒子（ステップ９）を粉砕し、包装容器（securitainer）に配置し、分析した。
【００９４】
（実施例５）
ウシインスリン装填−ＭＴＬＰコートナノパーティクル−  ＭＴＬＰを遠心分離１時間前に添加
速効性のウシインスリン（２８．１ＩＵ／ｍｇ）を、３００ＩＵインスリン／２１０ｍｇナノパーティクルの理論的装填率で、ＰＬＧＡナノ粒子に組み込んだ。ナノパーティクルを、ダンシル化したＺＥｌａｎ０９４（配列番号４８）でコーティングした。
【００９５】
成分                                              量
ＰＬＧＡ  ＲＧ５０４Ｈ（ロット番号２５０５８３）  ２ｇ
アセトン                                          ４５ｍｌ
エタノール                                        ５ｍｌ
ＰＶＡ（５％ｗ／ｖ）                              ４００ｍｌ
（１３〜１５ｋＤａ、９８％加水分解）
ウシインスリン（ロット番号８６ＨＯ６７４）        １００ｍｇ
ＺＥｌａｎ０９４（配列番号４８）                  １０ｍｇ／５０ｍｌ
ｄＨ2Ｏ
【００９６】
調製法：
実施例３のステップ１〜７を参照。
ステップ８  ＺＥｌａｎ０９４を、撹拌中の粒子懸濁液に添加した。１時間後、懸濁液を１２，５００〜１４，０００ｒｐｍで２０〜４０分間、４℃で遠心分離した。
実施例３のステップ９〜１０を参照。
【００９７】
（実施例６）
ウシインスリン装填−ＭＴＬＰコートナノパーティクル−ＭＴＬＰ共役ポリマー  速効性のウシインスリン（２８．１ＩＵ／ｍｇ）を、３００ＩＵインスリン／２１０ｍｇナノパーティクルの理論的装填率のＰＬＧＡ−ダンシル化ＺＥｌａｎ０９４（配列番号４８）共役ナノパーティクルに組み込む。
【００９８】
成分
ＰＬＧＡ  ＲＧ５０４Ｈ（ロット番号２５０５８３）
ＲＧ５０４Ｈ−ＺＥｌａｎ０９４（配列番号４８）共役体
アセトン
エタノール
ＰＶＡ（５％ｗ／ｖ）  （１３〜１５ｋＤａ、９８％加水分解）
ウシインスリン
調製法は、ステップ３でＲＧ５０４ＨとＲＧ５０４Ｈ−ＺＥｌａｎ０９４共役体を相Ｂに添加した以外は、実施例３のステップ１〜１０と同じである。
【００９９】
（実施例７）
ウシインスリン装填−ターゲティングペプチドコートトナノパーティクル
速効性のウシインスリン（２８．１ＩＵ／ｍｇ）を、３００ＩＵインスリン／２１０ｍｇナノパーティクルの理論的装填率で、ＰＬＧＡナノ粒子に組み込んだ。ナノパーティクルを、ターゲティングペプチドであるダンシル化ＺＥｌａｎ０１１，０５５，０９１，１０１，１０４，１２８，１２９，１４４（配列番号４９，５１，５０，５２，５６，５５，５４，５３）でコーティングした。
【０１００】
成分                                              量
ＰＬＧＡ  ＲＧ５０４Ｈ（ロット番号２５０５８３）  ２ｇ
アセトン                                          ４５ｍｌ
エタノール                                        ５ｍｌ
ＰＶＡ（５％ｗ／ｖ）                              ４００ｍｌ
（１３〜１５ｋＤａ、９８％加水分解）
ウシインスリン（ロット番号８６ＨＯ６７４）        １００ｍｇ
ＺＥｌａｎ011,055,091,101,104,128,129,144         １０ｍｇ／５０ｍｌ
（配列番号49,51,50,52,56,55,54,53 ）        ｄＨ2Ｏ
【０１０１】
調製法：
実施例３のステップ１〜１０を参照。
インスリン装填率は５％であるか、５０ｍｇインスリン／ｇ粒子であった。
【０１０２】
（実施例８）
動物実験
ＭＴＬＰインスリン粒子複合体（実施例３）およびターゲティングペプチドインスリン粒子複合体（実施例７）からのインビボ経口インスリンバイオアベイラビリティを、開ループラットモデルにて評価した。
【０１０３】
５９匹のウィスターラット（３００〜３５０ｇ）を４時間絶食し、ＭＴＬＰインスリン粒子複合体またはターゲティングペプチドインスリン粒子複合体の投与の１５〜２０分前に、０．５２５ｍｌのケタミン（１００ｍｇ／ｍｌ）＋０．８７５ｍｌのアセプロマジンマレイン酸−ＢＰ（２ｍｇ／ｍｌ）の筋内注射により麻酔した。ラットを、各群が６または７匹の動物を含む９つの群に分けた。１．５ｍｌのＰＢＳに懸濁した約２００ｍｇのＭＴＬＰ−インスリン（３００ＩＵ）粒子複合体を、６匹のラットの各々の幽門の下２〜３ｃｍの位置に十二指腸内注射した（群５）。１．５ｍｌのＰＢＳに懸濁した約２００ｍｇのターゲティングペプチド−インスリン（３００ＩＵ）粒子複合体を、６〜７匹のラットの各々の幽門の下２〜３ｃｍの位置に十二指腸内注射した（群１〜４と群６〜９）。試験群を表５に示す。
【０１０４】
表５
試験群
群番号    ラット番号      ペプチド      ＺＥＬＡＮ番号    配列番号
１        ６              ＨＡＸ４２    ０９１            ５０
２        ７              ＰＡＸ２      １４４            ５３
３        ７              ＰＡＸ２      １２９            ５４
４        ６              Ｐ３１        １０１            ５２
５        ６              ＭＴＬＰ      ０９４            ４８
６        ７              ＰＡＸ２      １２８            ５５
７        ７              ＰＡＸ２      １０４            ５６
８        ７              ＨＡＸ４２    ０１１            ４９
９        ７              ＰＡＸ２      ０５５            ５１
【０１０５】
体血液を、ＺＥｌａｎ０９４−インスリン粒子複合体またはターゲティングペプチド−インスリン粒子複合体の十二指腸内投与後の、０分目、および１５、３０、４５、６０および１２０分目に、各ネズミの尾静脈（０．４ｍｌ）から採取した。各試料中の血中グルコースを、Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（バイエル社；０．１〜３３．３μm ／ｍｏｌ／Ｌ）を使用して測定した。血液を遠心し、血漿を保持した。血漿インスリンを、ＰｈａｄｅｓｅｐｈＲＩＡキット（ファルマシア社、ニュージャージー州ピスカタウェイ所在；３〜２４０μＵ／ｍｌ）を使用して、２連にして分析した。
【０１０６】
図２は、ＺＥｌａｎ０９４−インスリン粒子複合体（群５）およびターゲティングペプチドＺＥｌａｎ０９１−インスリン粒子複合体（群１）、ターゲティングペプチドＺＥｌａｎ１４４−インスリン粒子複合体（群２）、ターゲティングペプチドＺＥｌａｎ１２９−インスリン粒子複合体（群３）、ターゲティングペプチドＺＥｌａｎ１０１−インスリン粒子複合体（群４）、ターゲティングペプチドＺＥｌａｎ１２８−インスリン粒子複合体（群６）、ターゲティングペプチドＺＥｌａｎ０１０４−インスリン粒子複合体（群７）、ターゲティングペプチドＺＥｌａｎ０１１−インスリン粒子複合体（群８）を十二指腸内投与した後の血漿インスリンレベルを示す。図２に示されるように、十二指腸内投与の６０分間に、ＺＥｌａｎ０９４−インスリン粒子複合体はインスリン配達の最も有効な増強を提供し、ＺＥｌａｎ０５５−、１２９−、０９４−、１０１−、１２８−、０９１−、１４４−、および０１１−インスリン粒子複合体がこれに続いた。これらのデータは、ＭＴＬＰインスリン粒子複合体を使用して得られた血漿インスリンレベルがターゲティングペプチドインスリン粒子複合体を使用して得られた血漿インスリンレベルよりも大きいことを示している。
【０１０７】
ＭＴＬＰ−インスリン粒子複合体およびターゲティングペプチドインスリン粒子複合体から送達されたインスリンに生理活性があることを確かめるために、血中グルコースレベルを測定した。十二指腸内投与後２０分間に、図３に示されるように、血中グルコースレベルは約６．０〜９．５ｍｍｏｌ／Ｌから約４．５〜７．０ｍｍｏｌ／Ｌに落ち、少なくとも６０分間はコントロール値（ＰＢＳ）を下回ったままであった。ＭＴＬＰ−インスリン粒子複合体を受取った動物とターゲティングペプチドインスリン粒子複合体を受取った動物の間に、６０分目と１２０分目で血中グルコースレベルに有意な差はなかった。これらのデータは、ダンシル化ＺＥｌａｎ０９４−インスリン粒子複合体およびダンシル化ＺＥｌａｎ０１１、０５５、０９１、１４４、１２９、１０１、１２９、１２８，１０４−インスリン粒子複合体から送達されたインスリンが、生理活性を有していたことを示す。さらに、これらのデータは、ＭＴＬＰ−インスリン粒子複合体から送達されたインスリンが、血中グルコースレベルを有意にかつ長期にわたって減少させたことを示す。
【０１０８】
（実施例９）
ＤＮＡ含有リポソームと、ＤＮＡ含有ＭＴＬＰコートリポソームの調製
ＤＮＡ含有リポソームと、ＤＮＡ含有ＭＴＬＰコートリポソームを、以下のように調製した。
溶液１  １２ｎｍｏｌのリポフェクトアミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社、メリーランド州ロックヴィル所在）、±０．６μｇの硫酸プロタミンを、最終体積７５μｌのｏｐｔｉＭＥＭに溶解して調製した。
【０１０９】
溶液２    １μｇのｐＨＭ６ｌａｃＺ  ＤＮＡ（ベーリンガーマンハイム）を最終体積７５μｌのｏｐｔｉＭＥＭに溶解して調製した。レポータープラスミドｐＨＭ６ｌａｃＺは細菌β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子を含んでいる。
【０１１０】
溶液３  溶液１および溶液２を合一し、複合体を形成できるよう室温で１５分間インキュベートした。
溶液４  ＺＥｌａｎ０９４、２０４Ｎまたは２０４（配列番号２、２３、２４）を、溶液３に加えて最終濃度１００μＭとし、室温で５分間インキュベートした。６００μｌのｏｐｔｉＭＥＭを添加し、溶液を穏やかに混合した。
【０１１１】
ＤＮＡ含有リポソームと、ＤＮＡ含有ＭＴＬＰコートリポソーム複合体を、走査型電子顕微鏡（ＳＣＭ）または透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で分析して複合体リポソームの形成を確認し、ゼータ電位分析により表面電荷特性を確認した。
【０１１２】
（実施例１０）
リポソームからのおよびＭＴＬＰ−リポソームからのＣａｃｏ−２細胞へのＤＮＡの送達
リポソームからの、およびＭＴＬＰ−コートリポソームからのＣａｃｏ−２細胞へのＤＮＡの送達を、細胞上清中の総タンパク質１μｇ当たりのβ−ガラクトシダーゼの発現として計算した。β−ガラクトシダーゼの発現は、ベーリンガーマンハイム社の化学蛍光キットを使用して測定した。タンパク質はピアスマイクロ社のビシンコニニン酸（ＢＣＡ）タンパク質アッセイを使用して測定した。
【０１１３】
Ｃａｃｏ−２細胞は、１ｍｌの培地に１×１０5細胞／ウェルで蒔き、３７℃で５％ＣＯ2中で一晩インキュベートした。細胞を、０．５ｍｌのｏｐｔｉＭＥＭで２回洗浄した。ＺＥｌａｎ０９４、２０４Ｎまたは２０４（配列番号２、２３、２４）（溶液４、実施例９）の各々を、洗浄した細胞を入れた三連ウェル（２５０μｌ／ウェル）に添加し、４時間、３７℃でインキュベートした。４時間後、２×ウシ胎児血清を含む２５０μｌのｏｐｔｉＭＥＭを添加し、細胞をさらに２０時間、３７度でインキュベートした。形質移入の２４時間後、細胞をベーリンガーマンハイム細胞溶解緩衝液で溶解した。溶解液をエッペンドルフ遠心管に入れて１４，０００ｒｐｍで２時間遠心し、上清を集めた。
【０１１４】
表６は、ＤＮＡ送達粒子としてＺＥｌａｎ９４，ＺＥｌａｎ２０４Ｎ，およびＺＥｌａｎ２０４（配列番号２，２３，２４）コートリポソームを使用した、総タンパク質１μｇ当たりの相対βガラクトシダーゼ発現を示す。
【０１１５】
表６
Ｃａｃｏ−２細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの発現
0004799790.tif 000005
【０１１６】
ＭＬＴＰ  ＺＥｌａｎ９４，２０４Ｎコートリポソームは、リポフェクトアミン＋ＤＮＡリポソームおよびリポフェクトアミン＋ＤＮＡ＋プロタミンコントロールリポソームよいも多くのＤＮＡをＣａｃｏ−２細胞に送達した。さらに、β−ガラクトシダーゼ発現に示されるように、ＺＥｌａｎ２O ４Ｎは、核局在化配列（ＮＬＳ）の付加によりＣ末端が修飾されたＺＥｌａｎ０９４誘導体であるが、Ｃａｃｏ−２細胞へのＤＮＡの送達およびＣａｃｏ−２細胞でのＤＮＡの発現の両方を増大するのに最も有効であった。ＭＴＬＰ  ＺＥｌａｎ０９４とその誘導体は、カチオン脂質およびＤＮＡ縮合剤と組み合わさって、細胞への遺伝子の目標付けおよびその後の細胞による遺伝子の取り込みの両方を増強した。
【０１１７】
ＭＴＬＰが活性薬剤および活性粒子の両方の細胞への取り込みを増強するため、ＺＥｌａｎ０９４およびＺＥｌａｎ２０４Ｎを含むがそれらに限定されないＭＴＬＰを、活性薬剤および活性粒子送達系としてのポリマーベース粒子系上およびリポソームベース粒子系上のコーティング剤として使用することができる。さらに、ＭＴＬＰを、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルスおよびワクシニアウイルスを始めとするがそれらに限定されないウイルスベクターベース粒子系上のコーティング剤としても使用することができる。そのようなシステムでは、ウイルスがそれ自体ＭＴＬＰをコードし、ＭＴＬＰをコードするＤＮＡ配列が、１又は複数のウイルスのキャプシドタンパク質をコードするかまたは１又は複数のウイルス表面タンパク質をコードする１又は複数の遺伝子に、フレーム内でクローニングされ得る。代わりに、遺伝子送達のために使用されるウイルスの表面を、哺乳類細胞を含むがそれに限定されない細胞からのウイルス生産および精製後にＭＴＬＰで修飾してもよい。
【０１１８】
（実施例１１）
ＭＴＬＰおよびターゲティングペプチドの、細胞層を横切る基質の輸送に対する影響。
ＭＴＬＰ  ＺＥｌａｎ０９４、ＺＥｌａｎ１７８、ＺＥｌａｎ１８７（配列番号２、５８、５９）およびターゲティングペプチドＺＥｌａｎ０２２（配列番号５７）の、Ｃａｃｏ−２単層を横切るジペプチド14Ｃ−ｇｌｙ−ｓａｒおよびレポーター分子3Ｈ−ｆＭＬＰの輸送に対する影響を測定した。Ｃａｃｏ−２単層を、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−Ｓｎａｐｗｅｌｌ上で成長させた。細胞の生存能を、各実験中にＣａｃｏ−２単層のＴＥＥＲを測定することにより測定した。ＴＥＥＲの有意な降下は測定されなかった。細胞透過性を、各実験中にＣａｃｏ−２単層を横切るマンニトール流束を測定することにより決定した。ＭＴＬＰ  ＺＥｌａｎ０９４の存在下ではマンニトール流束の増加が測定されなかった。
【０１１９】
ＭＴＬＰ  ＺＥｌａｎ０９４、ＺＥｌａｎ１７８、ＺＥｌａｎ１８７（配列番号２、５８、５９）およびターゲティングペプチドＺＥｌａｎ０２２（配列番号５７）の不在化および存在化でのＣａｃｏ−２単層を横切るジペプチド14Ｃ−ｇｌｙ−ｓａｒおよびレポーター分子3Ｈ−ｆＭＬＰの流束を２時間測定し、コールド基質の存在下での透過係数の減小を決定した。
【０１２０】
表７に示されるように、ＭＴＬＰ  ＺＥｌａｎ０９４，１７８，１８７は、レポーター分子3Ｈ−ｆＭＬＰの輸送を阻害したが、ジペプチド14Ｃ−ｇｌｙ−ｓａｒの輸送は阻害しなかった。ターゲティングペプチドＺＥｌａｎ０２２は、レポーター分子3Ｈ−ｆＭＬＰの輸送を阻害した（図４）。分極したＣａｃｏ−２細胞を横切るｆＭＬＰの輸送と競合するＭＴＬＰ  ＺＥｌａｎ０９４，１７８，１８７の能力は、この新規な輸送アッセイが、ＺＥｌａｎ０９４の誘導体、断片、モチーフ、類似体、およびペプチド模倣体や、ＺＥｌａｎ０９４と機能的に類似した有機小分子をスクリーニングして、輸送特性が改良されたＺＥｌａｎ０９４の誘導体、断片、モチーフ、類似体、およびペプチド模倣体や、ＺＥｌａｎ０９４と機能的に類似した有機小分子を同定するために使用することができることを示している。
【０１２１】
【表４】
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さらに、ＭＴＬＰは、レポーター分子3Ｈ−ｆＭＬＰの輸送を阻害したがジペプチド14Ｃ−ｇｌｙ−ｓａｒの輸送は阻害しなかったということは、ｆＭＬＰ輸送に対するＭＴＬＰの影響は、分極した上皮細胞における膜の全体的な乱れによるものではないことを示唆している。さらに、ｆＭＬＰはＧＩＴでの炎症に関して役割を果たすことが知られているため、ＭＴＬＰは、Ｃａｃｏ−２単層を横切るｆＭＬＰの輸送を減少させ、ＧＩＴにおけるｆＭＬＰの化学誘引的な影響を減少させることにより、局所的炎症の予防の際に治療薬としての役割を有しているのかもしれない。
【０１２２】
（実施例１２）
細胞層を横切る分子3Ｈ−ｆＭＬＰの輸送に対するＭＴＬＰの濃度増加の影響  Ｃａｃｏ−２単層を、実施例１１と同様に成長させ、生存能について試験した。Ｃａｃｏ−２単層を横切る3Ｈ−ｆＭＬＰの輸送を、０〜２００μｇ／ｍｌのＭＴＬＰ  ＺＥｌａｎ０９４の存在下で測定した。図５に示されるように、ＭＴＬＰ  ＺＥｌａｎ０９４は、最小濃度（１３μｇ／ｍｌまたは７．１μｌ）でさえ3Ｈ−ｆＭＬＰの輸送を阻害した。これは、ＭＴＬＰ  ＺＥｌａｎ０９４が、上皮細胞層を横切るｆＭＬＰ輸送の、有効な阻害剤であることを示している。
【０１２３】
本発明は本明細書に記述された特定の実施形態によって範囲が制限されることはない。本明細書に記述した改変に加えて、本発明の様々な改変が、上記の説明および添付図面から当業者には明白になるだろう。そのような改変は、特許請求の範囲の範囲内に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＺＥｌａｎ０９４（１５mer ）（配列番号２）のハイドロパシープロットを示す。
【図２】開ループラットモデルにおける、ＺＥｌａｎ０９４−インスリンナノパーティクル複合体およびＨＡＸ４２−、ＰＡＸ２−およびＰ３１−インスリンナノパーティクル複合体からの、インスリンのインビボ送達に続く体血中インスリンレベルを示す。各ポイントは６〜７匹の動物から得た平均値である。
【図３】開ループラットモデルにおける、ＺＥｌａｎ０９４−インスリンナノパーティクル複合体およびＨＡＸ４２−、ＰＡＸ２−およびＰ３１−インスリンナノパーティクル複合体からの、インスリンのインビボ送達に続く体血中グルコースレベルを示す。各ポイントは６〜７匹の動物から得た平均値である。
【図４】ＭＴＬＰ  ＺＥｌａｎ０９４、１７８、１８７およびターゲティングペプチドＺＥｌａｎ０２２の存在下でのＣａｃｏ−２単層を横切るレポーター薬3Ｈ−ｆＭＬＰの輸送を示す。
【図５】ＭＴＬＰ  ＺＥｌａｎ０９４の増加濃度の存在下でのＣａｃｏ−２単層を横切るレポーター薬3Ｈ−ｆＭＬＰの輸送を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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