(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
0004820517.tif 000014
［式中、Ｒは独立してＳＯ３−またはＣＨ３であり；スペーサーは−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−であり；ペンタサッカライド残基の電荷は正電荷を有する対イオンにより相殺され；ペンタサッカライド残基中のスルフェート基の総数は４、５または６である］で表される化合物、またはその医薬的に許容され得る塩、または溶媒和物。
【請求項２】
ペンタサッカライド残基が構造：
【化２】
0004820517.tif 000015
で表される請求の範囲第１項に記載の化合物。
【請求項３】
構造：
【化３】
0004820517.tif 000016
で表される請求の範囲第１項に記載の化合物。
【請求項４】
請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の化合物と、医薬的に適当な助剤と、を含む医薬組成物。
【請求項５】
治療に使用するための請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
血栓症または他のトロンビン関連疾患の治療または予防用医薬の製造のための請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は新規な抗血栓性化合物、前記化合物を活性成分として含む医薬組成物及び薬剤を製造するための前記化合物の使用に関する。
【０００２】
セリンプロテアーゼは、血液凝固カスケードにおいて重要な役割を果たす酵素である。重要なセリンプロテアーゼは因子Ｘａであり、これはプロトロンビンのトロンビンへの変換を触媒する。トロンビンは凝固カスケードにおける最終セリンプロテアーゼ酵素である。トロンビンの第１の機能はフィブリノーゲンを分解してフィブリンモノマーを生成することであり、該フィブリンモノマーは架橋して不溶性ゲルを形成する。更に、トロンビンは前記カスケードにおいて因子Ｖ及びＶＩＩＩを活性化することによりそれ自体の生成を調節する。トロンビンは細胞レベルで重要な作用をも有し、血小板凝集、内皮細胞活性化及び繊維芽細胞増殖を引き起こすべく特定受容体に対して作用する。よって、トロンビンは止血及び血栓形成において中心的な調節機能を有する。
【０００３】
最近、セリンプロテアーゼの合成阻害剤の開発において、合成ＮＡＰＡＰ−ペンタサッカライドコンジュゲートが直接抗トロンビン活性及びＡＴＩＩＩ（ここで、ＡＴＩＩＩは抗トロンビンＩＩＩである）媒介抗−Ｘａ活性の両方の二重プロフィールを有する抗血栓剤として報告された（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，９（１４），２０１３−８（１９９９））。報告されている抗血栓剤は興味深い化合物であり得るが、この化合物ではペンタサッカライド残基のスルフェート含量が高いためにＨＩＴ交差活性及びＰＦ４による中和が生ずる（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍ．Ｓｕｐｐｌ，ｐ．３６３，ＰＤ１４８５（１９９７））。
【０００４】
今回、式（Ｉ）を有する化合物が有利で且つ優れた二重プロフィールを有する抗血栓剤であることを知見した。式（Ｉ）を有する化合物は薬理学的に興味深い半減期を有し、１日１回治療を可能とし、ＰＦ４により中和されにくい。更に、出血の恐れも少ない。全体として、式（Ｉ）を有する化合物は魅力的な薬理学特性の組合せを有する。
【０００５】
式（Ｉ）：
【０００６】
【化４】
0004820517.tif 000002
（式中、Ｒは独立してＳＯ３−またはＣＨ３であり、スペーサーは１３〜２５原子長、好ましくは１６〜２２原子長、最も好ましくは１９原子長の柔軟なスペーサーであり、ペンタサッカライド残基の電荷は正電荷を有する対イオンにより相殺され、ペンタサッカライド残基中のスルフェート基の総数は４、５または６である）
を有する化合物、またはその医薬的に許容され得る塩、プロドラッグまたは溶媒和物。
【０００７】
本発明の化合物は、トロンビン媒介疾患及びトロンビン関連疾患を治療及び予防するのに有用である。これらの疾患には、凝固カスケードが活性化されている多数の血栓形成またはプロ血栓形成状態が含まれ、深部静脈血栓症、肺塞栓症、血栓性静脈炎、血栓症または塞栓症からくる動脈閉塞、血管形成術または血栓崩壊中またはその後の動脈再閉塞、動脈損傷または侵襲的心血管処置後の再狭窄、術後静脈血栓症または塞栓症、急性または慢性アテローム性動脈硬化症、卒中、心筋梗塞、ガン及び転移並びに神経変性疾患が例示されるが、これらに限定されない。本発明の化合物は、所要により透析または手術時の体外血液循環中の抗凝固剤としても使用され得る。本発明の化合物はインビトロ抗凝固剤としても使用され得る。
【０００８】
式（Ｉ）を有する化合物は動脈適応症に対する抗血栓剤として特に有用である。
【０００９】
本発明の好ましい化合物としては、ペンタサッカライド残基が下記構造：
【００１０】
【化５】
0004820517.tif 000003
を有する化合物が好ましい。
【００１１】
本発明の化合物の抗血栓活性にとってスペーサーの化学的種類は重要でない。しかしながら、本発明の化合物のスペーサーは柔軟であり、これはスペーサー基が不飽和結合や環状構造のような剛性要素を含まないことを意味する。適当なスペーサーは当業者が容易に設計し得る。好ましいスペーサーは少なくとも１つの−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−要素を含む。より好ましいスペーサーは３個の−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−要素を含む。最も好ましいスペーサーは＊−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）３−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−（ここで、＊で示す末端がペンタサッカライド残基に結合している）である。
【００１２】
式Ｉを有する好ましい化合物は式（Ｉａ）（式中、ｐは１〜５であり、ｎは１〜５であり、ｍは１〜２である）を有する化合物である。最も好ましい化合物は式（Ｉａ）（式中、ｐは３であり、ｎは３であり、ｍは１である）を有する化合物である。
【００１３】
【化６】
0004820517.tif 000004
【００１４】
正電荷を有する対イオンはＨ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋等を意味する。好ましくは、式（Ｉ）を有する化合物はナトリウム塩の形態である。
【００１５】
用語「プロドラッグ」は、アミノ部分のアミノ基が例えばヒドロキシまたはＣ１−６アルコキシカルボニル基で保護されている本発明の化合物を意味する。
【００１６】
本発明の溶媒和物には水和物が含まれる。
【００１７】
遊離塩基の形態で存在し得る本発明の化合物は、医薬的に許容され得る塩の形態の反応混合物から単離され得る。医薬的に許容され得る塩は、式（Ｉ）を有する遊離塩基を有機酸または無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、マレイン酸、マロン酸、メタンスルホン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、アスコルビン酸等）で処理することによっても得られ得る。
【００１８】
本発明の化合物はキラル炭素原子を有し、よって純粋なエナンチオマーとして、エナンチオマー混合物としてまたはジアステレオマーを含む混合物として得られ得る。純粋なエナンチオマーを得る方法は当業界で公知であり、例えば光学活性な酸及びラセミ混合物から得た塩を結晶化したり、キラルカラムを用いてクロマトグラフィーにかけたりする。ジアステレオマーの場合、正相または逆相カラムを使用し得る。
【００１９】
本発明の化合物は、式ＩＩを有するＮＡＰＡＰアナログのカルボキシレート基を活性化した後、アミン基を含むペンタサッカライドスペーサー残基（式ＩＩＩ）を付加し、場合によりアミジン部分を脱保護することにより製造され得る。
【００２０】
【化７】
0004820517.tif 000005
【００２１】
式ＩＩを有する化合物中のカルボキシレート基は混合無水物として、より好ましくは活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド、ペンタフルオロフェノールまたは１−ヒドロキシベンゾトリアゾールのエステル）として活性化され得る。カップリングステップにおいて、式ＩＩ中のベンゾアミジン基を保護していなくても（Ｒ’＝Ｒ”＝Ｈ）、場合によってはカルバメート基、好ましくはアリルオキシカルボニル（Ｒ’及び／またはＲ”はＨ２Ｃ＝ＣＨ−ＣＨ−Ｃ（Ｏ）Ｏ）またはベンジルオキシカルボニル（Ｒ’及び／またはＲ”はＰｈＣＨ２−Ｃ（Ｏ）Ｏ）を用いて保護してもよい。アリルオキシカルボニル保護基及びベンジルオキシカルボニル保護基は比較的穏和な条件下で除去され得る。アリルオキシカルボニル基は弱求核性試薬（例えば、モルホリンまたはマロン酸エステル）の存在下Ｐｄを用いて除去され得る。ベンジルオキシカルボニル基は水素／Ｐｄ（Ｃ）のような条件下で除去され得る。或いは、Ｎ−アルコキシベンズアミジンまたはＮ−ベンジルオキシベンズアミジン（Ｒ’＝Ｈ、Ｒ”＝アルコキシまたはベンジルオキシ）のようなベンズアミジンの合成前駆体を使用し得る。前記の合成前駆体は水素化のような還元条件を用いてベンズアミジンに変換され得る（例えば、Ｆｕｊｉｉ，Ｔら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ，３９，３０１（１９９１）及びＦｕｊｉｉ，Ｔら，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ，４２，１２３１（１９９４））。
【００２２】
好ましいベンズアミジン前駆体は１，２，４−オキサジアゾリン−５−オン（−Ｒ’−Ｒ”−＝−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）である。この前駆体は水素化によりベンズアミジンに変換され得る（Ｂｏｌｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．２５，ｐ．４４７１−４４７４（１９９５））。
【００２３】
式ＩＩを有する化合物は、当業界で公知の各種方法を用いて製造され得る。式ＩＩ（式中、Ｒ’＝Ｒ”＝Ｈ、ｎ＝３、ｍ＝１）を有する化合物の製造方法は欧州特許出願公開第０５１３５４３号明細書に記載されている。式ＩＩ（ここで、アミジンが例えばアリルオキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニル基で保護されている）を有する化合物は、式ＩＶ（ここで、アミジンが例えばアリルオキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニル基で保護されている）を有する化合物からペプチド断片のカップリングのための当業界で公知の方法を用いて製造され得る。式ＩＶを有するカルバメートは、例えば対応のアミジン（式ＩＶ中、Ｒ’＝Ｒ”＝Ｈ）から文献、例えばＷｅｌｌｅｒ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９，３１１９（１９９６）に記載されているように製造され得る。
【００２４】
【化８】
0004820517.tif 000006
【００２５】
式ＩＩを有するＮ−アルコキシベンズアミジン及びＮ−ベンジルオキシベンズアミジン化合物は、（欧州特許出願公開第０５１３５４３号明細書に記載されている）化合物Ｖからこのシアノ化合物をＯ−アルキルヒドロキシルアミンまたはＯ−ベンジルヒドロキシルアミンで処理した後酸性条件下でｔ−ブチルエステルを除去することにより製造され得る。或いは、式ＩＩを有するＮ−アルコキシベンズアミジン及びＮ−ベンジルオキシベンズアミジン化合物は、化合物Ｖのｔ−ブチルエステルを酸性条件下で除去して化合物ＶＩを生成し、その後このシアノ化合物をＯ−アルキルヒドロキシルアミンまたはＯ−ベンジルヒドロキシルアミンと反応させることにより製造され得る。
【００２６】
式ＩＩ（式中、−Ｒ’−Ｒ”−＝−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（１，２，４−オキサジアゾリン−５−オン基））を有する化合物は、式ＩＶ（式中、−Ｒ’−Ｒ”−＝−Ｃ（Ｏ）Ｏ−）を有する化合物からペプチド断片のカップリングのための当業界で公知の方法を用いて製造され得る。
【００２７】
式ＩＩＩを有するアミノ−オリゴサッカライド残基は、例えば欧州特許出願公開第０６４９８５４号明細書に記載されている方法を用いて合成され得る。本発明の化合物のサッカライド残基は、国際特許第９９／２５７２０号パンフレット等に記載されている当業界で公知の方法により製造され得る。
【００２８】
本発明の化合物を製造するための上記方法におけるステップであるペプチドカップリングは、ペプチド断片のカップリング（縮合）のための当業界で公知の方法により、例えばアジド法、混合無水物法、活性化エステル法、または好ましくはカルボジイミド法により、特に触媒・ラセミ化抑制化合物（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及びＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）を付加して実施され得る。「ペプチド、分析、合成、生物学(The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology)」，Ｖｏｌ．３，Ｅ．Ｇｒｏｓｓ及びＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編，ニューヨークに所在のＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８１年）発行及びＢｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．，「ペプチド合成の原理(Principles of peptide synthesis)」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９８４年）発行に概説されている。
【００２９】
合成中、化合物中に存在するアミン官能基はＮ−保護基により保護され得る。ここで、Ｎ−保護基とはα−アミノ基を保護するためにペプチド合成において通常使用されている基、例えばｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フロレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基またはフタロイル（Ｐｈｔｈ）基である。保護基の除去は保護基の種類に応じて各種方法により実施され得る。通常、脱保護は酸性条件下、スカベンジャーの存在下で実施される。アミノ保護基及びその除去は、上掲した「ペプチド、分析、合成、生物学(The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology)」，Ｖｏｌ．３に概説されており、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．及びＷｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．，「有機合成における保護基(Protective groups in organic synthesis)」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９９１年）発行にも記載されている。
【００３０】
本発明の化合物は腸管内または非経口的に投与され得る。前記化合物及びその組成物の正確な用量及びレジメは必ず薬剤の投与をうける各患者の必要性、疾患の程度、必要の程度及び担当医の判断に依存する。通常、非経口投与の場合、吸収により強く依存する他の投与方法に比して用量は少なくてすむ。しかしながら、ヒトに対する１日用量は好ましくは体重１ｋｇあたり０．００１〜１００ｍｇ、より好ましくは体重１ｋｇあたり０．０１〜１０ｍｇである。
【００３１】
本発明の化合物を用いて調製される薬剤は、急性抗凝固治療における補助剤としても使用され得る。この場合、薬剤は前記疾患を治療するのに有用な他の化合物と一緒に投与される。
【００３２】
例えば一般的文献のＧｅｎｎａｒｏら，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０年）発行、特に８部：「薬剤及びその製造(Pharmaceutical Preparations and Their Manufacture)」に記載されているような医薬的に適当な助剤と混合すると、本発明の化合物は固体投与単位（例えば、ピル剤、錠剤）に圧縮され、またはカプセル剤または座剤に加工され得る。医薬的に好適な液体を用いると、本発明の化合物は注射剤として使用されるような溶液、懸濁液または乳濁液の形態で、または鼻スプレーとして使用されるようなスプレーとして適用され得る。
【００３３】
錠剤のような投与単位を製造する場合、慣用されている添加剤、例えば増量剤、着色剤、ポリマー結合剤等が使用される。通常、活性化合物の機能を妨害しない医薬的に許容され得る添加剤が使用され得る。
【００３４】
組成物として投与され得る適当な担体には、ラクトース、スターチ、セルロース誘導体等またはその混合物が含まれ、適当量使用される。
【００３５】
本発明は下記実施例により更に説明する。
【００３６】
実施例１
以下の略号を使用した：
Ａｃ＝アセチル、
Ｂｎ＝ベンジル、
ＤＢＵ＝１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン、
ＤＣＣ＝ジシクロヘキシルカルボジイミド、
ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、
Ｓｕ＝スクシンイミジル、
Ｍｅ＝メチル、
ＴＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート、
ＴＥＡ＝トリエチルアミン、
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸、
Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル。
【００３７】
化合物の番号はスキーム１〜７の化合物を指す。
【００３８】
化合物３
ＤＭＦ（９３０ｍｌ）中に化合物１（５３．６ｇ，１４３．６ミリモル）（Ｒ．Ｒｏｙ；Ｗ．Ｋ．Ｃ．Ｐａｒｋ；Ｑ．Ｗｕ；Ｓ−Ｎ．Ｗａｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，３６（２５），４３７７−８０（１９９５））及び化合物２（２７．９ｇ，８９．３ミリモル）（Ｓ．Ｊ．Ｄａｎｉｓｈｅｆｓｋｙ；Ｍ．Ｐ．ＤｅＮｉｎｎｏ；Ｇ．Ｂ．Ｐｈｉｌｉｐｓ；Ｒ．Ｅ．Ｚｅｌｌｅ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，ＥＮ，４２，１１，２８０９−２８１９（１９８６））を含む溶液を撹拌し、この溶液に５０℃で水素化ナトリウム（６０％分散液７．７ｇ，１９２．２ミリモル）を添加した。１時間後、反応混合物を１２０℃に加熱した。５分間撹拌した後、反応混合物を４０℃に冷却し、水で希釈し、ジクロロメタンで３回抽出した。合わせた有機層を水で洗浄し、真空において濃縮すると、粗な生成物３（５４ｇ）が得られた。
【００３９】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．２３（エーテル１００％）。
【００４０】
化合物４
乾燥トルエン（８００ｍｌ）及び無水酢酸（８００ｍｌ）中に化合物３（８９．３ミリモル）を含む溶液を撹拌し、この溶液に−３０℃で無水酢酸（３４５．０ｍｌ）中に濃硫酸（１６．５ｍｌ）を含む冷却溶液（３６１．５ｍｌ）を滴下した。２時間後、反応混合物をＴＥＡ（２４０ｍｌ）でクエンチし、室温で撹拌した。溶液に５％水性炭酸水素ナトリウムを添加し、水層を酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層を水で２回洗浄し、真空において濃縮した。この手順を繰り返すと、粗な化合物４（５３ｇ）が得られた。
【００４１】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．２９（エーテル１００％）。
【００４２】
化合物５
乾燥トルエン（３７０ｍｌ）中に化合物４（８９．３ミリモル）及びエタンチオール（１１．１ｍｌ，１５０．３ミリモル）を含む溶液を撹拌し、この溶液に０℃でトルエン（１９０ｍｌ）中にＢＦ３−エーテレート（２３．９ｍｌ）を含む溶液を滴下した。室温で１６時間撹拌した後、反応混合物をＴＥＡ及び水性炭酸水素ナトリウムでクエンチし、酢酸エチルで３回抽出した。合わせた有機層を水で洗浄し、真空において濃縮した。粗な生成物をカラムクロマトグラフィー（トルエン／酢酸エチル＝１／１０〜０／１（ｖ／ｖ））により精製すると、化合物５（２１．４ｇ）が得られた。
【００４３】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３１（トルエン／酢酸エチル＝４／６（ｖ／ｖ））。
【００４４】
化合物７
乾燥エーテル／ジクロロメタン（２３２ｍｌ，３／１（ｖ／ｖ））中に供与体５（１５．０ｇ，３０．３ミリモル）及び受容体（２３．０ｇ，３０．３ミリモル）（国際特許第９９／２５７２０号パンフレット）を含む溶液を活性化モレキュラーシーブ４Å（７．６ｇ）の存在下窒素流中で３０分間撹拌した。次いで、反応混合物に、ジオキサン／ジクロロメタン（６９．８ｍｌ，１／１（ｖ／ｖ））中に１，３−ジブロモ−５，５−ジメチルヒダントイン（５．５ｇ，１９．１ミリモル）及びトリフル酸（０．４９ｍｌ，５．６ミリモル）を含む溶液を−２０℃で７５分間かけて滴下した。３０分後、ＴＥＡ（５ｍｌ）を反応混合物に添加し、１０分間撹拌し、次いで濾過した。濾液を１０％水性チオ硫酸ナトリウム及び１０％水性炭酸水素ナトリウムで洗浄し、真空において濃縮した。生成物をカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中０〜５％アセトン）により精製すると、化合物７（１９．６ｇ）が得られた。
【００４５】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１（エーテル／ヘプタン＝８／２（ｖ／ｖ））。
【００４６】
化合物８
乾燥トルエン／無水酢酸（４４２ｍｌ，１／１（ｖ／ｖ））中に化合物７（１９．５ｇ，１６．４ミリモル）を含む溶液を撹拌し、この溶液に−２６℃で無水酢酸（１２０ｍｌ）中に濃酢酸（１１．５ｍｌ）を含む冷却溶液（１３１．５ｍｌ）を滴下した。７５分後、ＴＥＡ（７３．５ｍｌ）を−２０℃で添加した。温度を２０〜３０℃に維持しながら水（３３０ｍｌ）を徐々に添加することにより無水酢酸を分解した。１６時間撹拌した後、混合物を水（８００ｍｌ）に注ぎ、トルエンで２回抽出した。合わせた有機層を水で洗浄し、真空において濃縮した。粗な生成物をカラムクロマトグラフィー（トルエン／酢酸エチル／エタノール＝９６／２／２（ｖ／ｖ／ｖ））により精製すると、化合物８が白色泡状物（１３．２ｇ）として得られた。
【００４７】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．２９（トルエン／エーテル＝９／１（ｖ／ｖ））。
【００４８】
化合物９
３２℃で乾燥トルエン（６６ｍｌ）中に化合物８（１３．２ｇ，１１．７ミリモル）を含む溶液に、モルホリン（４．１ｍｌ，４６．９ミリモル）を添加した。３２℃で４２時間撹拌後、反応混合物を室温に冷却し、４Ｎ水性塩酸（１７．６ｍｌ）を添加した。反応混合物を水で希釈し、酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を水で２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、真空において濃縮すると、粗な化合物９（１２．６ｇ）が得られた。
【００４９】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３２（トルエン／アセトン＝７／３（ｖ／ｖ））。
【００５０】
化合物１２
ジクロロメタン（１１４ｍｌ）中に化合物９（１２．６ｇ，１１．６ミリモル）を含む溶液に、トリクロロアセトニトリル（３．５ｍｌ，３４．９ミリモル）及びＤＢＵ（５２．２μｌ，０．３５ミリモル）を添加した。室温で２時間撹拌した後、反応混合物にジクロロメタン（４５ｍｌ）中に活性化モレキュラーシーブ４Å（２４ｇ）及び受容体１１（８．９ｇ，１３．０ミリモル）を添加した。室温で３０分間撹拌した後、混合物を−２０℃に冷却し、ジクロロメタン（１００ｍｌ）中にトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（４０５μｌ，２．１ミリモル）を含む溶液を滴下した。３０分間撹拌した後、炭酸水素ナトリウムを−２０℃で添加し、反応混合物を濾過した。濾液を水性炭酸水素ナトリウムに注ぎ、ジクロロメタンで３回抽出した。合わせた有機層を水で２回洗浄し、真空において濃縮した。生成物をカラムクロマトグラフィー（１：ＳｉＯ２、エーテル中０〜１０％；２：ＳｉＯ２、トルエン／アセトン＝８５／１５〜８０／２０（ｖ／ｖ）；３：ＲＰ−１８、水／アセトニトリル＝２／８〜０／１０（ｖ／ｖ））により精製すると、純粋な化合物１２（８．９ｇ）が得られた。
【００５１】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３７（トルエン／アセトン＝７／３（ｖ／ｖ））。
【００５２】
化合物１４
ＤＭＦ（３１２ｍｌ）及び水（４５ｍｌ）中に化合物１２（８．９ｇ，５．１ミリモル）及び１０％  Ｐｄ／Ｃ（８．９ｇ）を含む懸濁液を連続水素流中で撹拌した。４．５時間後、Ｐｄ／Ｃ触媒を濾過により除去した。濾液を容量４００ｍｌまで濃縮し、水素流中１０％  Ｐｄ／Ｃ（１．５ｇ）で５．５時間処理した。触媒を濾過により除去した。濾液（９００ｍｌ）に４Ｎ水性水酸化ナトリウム（３２ｍｌ）を添加した。室温で４時間撹拌した後、混合物のｐＨを１Ｎ塩酸を用いて６．６に酸性化し、真空において濃縮した。粗な生成物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムで脱塩し、水で溶離した。適当な分画をプールし、凍結乾燥すると、化合物１４（４．０ｇ）が得られた。
【００５３】
化合物１５
ペンタサッカライド１４（７００ｍｇ，０．６１ミリモル）を水（１３．２ｍｌ）及びＤＭＦ（３．３ｍｌ）に溶解し、Ｎ−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）−スクシンイミド（２２４ｍｇ，０．９０ミリモル）及びＮ−エチルモルホリン（２３３μｌ，１．８３ミリモル）で処理した。１５分間撹拌した後、反応混合物をＲＰ−１８カラムに直接かけ、水／アセトニトリル（１０／０〜７／３）で溶離した。適当な分画をプールし、小容量に濃縮し、Ｄｏｗｅｘ  ５０ＷＸ４−Ｈ＋イオン交換カラムにかけ、水で溶離した。溶離液を真空において濃縮すると、純粋な化合物１５（４８２ｍｇ）が得られた。
【００５４】
化合物１６
ＤＭＦ（４．７ｍｌ）中に化合物１５（４７１ｍｇ，０．３７ミリモル）を含む溶液に三酸化硫黄−ピリジン複合体（１．１ｇ，６．６ミリモル）を添加し、混合物を３０℃で１６時間撹拌した。混合物を室温に冷却し、これを冷却した１０％炭酸水素ナトリウム溶液（１６．７ｍｌ，１９．９ミリモル）に滴下し、室温で１時間撹拌した。混合物を小容量に濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムにかけ、水で溶離した。適当な分画をプールし、小容量に濃縮した後、Ｄｏｗｅｘ  Ｎａ＋  ＨＣＲＷ２カラムにかけ、水で溶離した。溶離液を濃縮し、０．２Ｎ塩酸（８．３ｍｌ）に再溶解し、４℃で１６時間放置した。反応混合物を０．２Ｎ水酸化ナトリウム（８ｍｌ）で中和し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムにかけ、水で溶離して、脱塩した。適当な分画をプールし、真空において濃縮すると、純粋な化合物１６（８４０ｍｇ）が得られた。
【００５５】
化合物１７
ｔｅｒｔ−ブタノール（８５ｍｌ）、水（７９ｍｌ）及び酢酸（数滴）中に化合物１６（０．３７ミリモル）及び１０％  Ｐｄ／Ｃ（８２０ｍｇ）を含む懸濁液を連続水素流中で撹拌した。３時間後、Ｐｄ／Ｃ触媒を濾過により除去し、濾液を濃縮し、凍結乾燥すると、純粋な化合物１７（６７５ｍｇ）が得られた。
【００５６】
４−［［４−［［（１Ｒ）−１−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］メチル］−２−オキソ−２−（１−ピペリジニル）エチル］アミノ］−３−［［（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルフェニル）スルホニル］アミノ］−１，４（Ｓ）−ジオキソブチル］アミノ］−ブタン酸ベンジルエステル塩酸塩（１８）
窒素雰囲気下ＤＭＦ（４０ｍｌ）中に４−［［（１Ｒ）−１−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］メチル］−２−オキソ−２−（１−ピペリジニル）エチル］アミノ］−３−［［（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルフェニル）スルホニル］アミノ］−４−オキソ−（３Ｓ）ブタン酸塩酸塩（２．３８ｇ，３．９６ミリモル）（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，５１，１２０４７−１２０６８（１９９５））及び（４−アミノ酪酸）ベンゼンスルホン酸ベンジル（１．５２ｇ，３．９６ミリモル）（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０５，５２７８−５２８４（１９８３））を含む溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．６８９ｍｌ，３．９６ミリモル）及びテトラメチル−ベンゾトリアゾリルウロニウムテトラフルオロボレート（１．９１ｇ，５．９４ミリモル）を添加した。反応混合物のｐＨをＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを用いて６に維持した。反応混合物を室温で４日間撹拌し、濃縮し、酢酸エチルに溶解し、５％炭酸ナトリウム及び０．１Ｎ塩酸で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮した。残渣を乾燥エタノール（５ｍｌ）に溶解し、乾燥ジイソプロピルエーテルを用いて沈殿し、濾過すると、標記化合物１８（２．４７ｇ）が得られた。
【００５７】
Ｒｆ＝０．３７（酢酸エチル／ピリジン／酢酸／水＝８８／３１／１８／７（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ））、
Ｍａｓｓ（ＥＳＩ＋）＝７７７．４［Ｍ＋Ｈ］＋。
【００５８】
４−［［４−［［（１Ｒ）−１−［［４−（アミノイミノメチル）フェニル］メチル］−２−オキソ−２−（１−ピペリジニル）エチル］アミノ］−３−［［（４−メトキシ−２，３，６−トリメチルフェニル）スルホニル］アミノ］−１，４（Ｓ）−ジオキソブチル］アミノ］−ブタン酸塩酸塩（１９）
メタノール／水（４０ｍｌ，３／１（ｖ／ｖ））中に化合物１８（２．４２ｇ，３．１１ミリモル）及び１０％  Ｐｄ／Ｃ（４００ｍｇ）を含む懸濁液を連続水素流中で撹拌した。８時間後、反応混合物を濾過し、濾液を濃縮し、メタノール／トルエン（１／１０（ｖ／ｖ））で３回共蒸発させた。残渣を乾燥エタノール（５ｍｌ）に溶解し、乾燥ジエチルエーテルを用いて沈殿させ、濾過し、乾燥させた。残渣を水に溶解し、分取ＨＰＬＣ  ＤｅｌｔａＰａｋ  ＲＰ−Ｃ１８カラムに直接かけ、２０％  Ａ／６０％  Ｂ／２０％  Ｃから２０％Ａ／１４％  Ｂ／６６％（Ａ：０．５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ２．１）、Ｂ：水、Ｃ：アセトニトリル／水＝６／４）の勾配溶出系を４０ｍｌ／分の流速で用いて溶離した。収量５９８ｍｇ。
【００５９】
Ｒｔ＝２６．４分（３〜１０分：２０−４３％Ｃ＋２０％Ａ、１０〜５０分：４３−６６％Ｃ＋２０％Ａ；Ａ＝リン酸塩緩衝液（ｐＨ２．１）、Ｂ＝水、Ｃ＝アセトニトリル／水＝６／４（ｖ／ｖ））、分析ＨＰＬＣ  ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ−１８−ＤＢ、
Ｍａｓｓ（ＥＳＩ＋）＝６８７．２［Ｍ＋Ｈ］＋、（ＥＳＩ−）＝６８５．２［Ｍ−Ｈ］。
【００６０】
化合物１７及び化合物１９から化合物２１の製造
ＤＭＦ（８００μｌ）中に化合物１９（４０ｍｇ，５８．３マイクロモル）を含む溶液に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（９．０ｍｇ，７８．１マイクロモル）、ＤＣＣ（１８．５ｍｇ，８９．７マイクロモル）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（８．８ｍｇ，６５．１マイクロモル）を添加した。反応混合物を室温で４０時間撹拌した。反応混合物をジカライトで濾過し、ジカライトをＤＭＦ（２８４μｌ）で４回洗浄した。濾液に０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（１９３６μｌ，ｐＨ７．５）及びペンタサッカライド１７（９４．７ｍｇ，５２．６マイクロモル）を添加した。３０分間撹拌した後、混合物をジカライトで濾過し、濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０カラムにかけ、アセトニトリル／水（１／１（ｖ／ｖ））で溶離した。適当な分画をプールし、濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０カラムクロマトグラフィー（水）により２回脱塩した。適当な分画をプールし、凍結乾燥すると、コンジュケート２１が白色固体（９５．８ｍｇ）として得られた。
【００６１】
Ｍａｓｓ（ＥＳＩ＋）＝２４６９、
ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝８．３分（１５分間：２０−８０％Ｂ；Ａ＝水／アセトニトリル＝８／２（ｖ／ｖ）、Ｂ＝２Ｍ  ＮａＣｌ／アセトニトリル＝８／２（ｖ／ｖ））、分析ＨＰＬＣ  ＭｏｎｏＱ  ＨＲ５。
【００６２】
化合物２２
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍｌ）中に（Ｒ）−Ｎ−Ｂｏｃ（４−シアノフェニル）アラニン（２５．０ｇ，８６．１ミリモル）、ピペリジン（２１．３ｍｌ，２１５．３ミリモル）及びＴＢＴＵ（４１．５ｇ，１２９．２ミリモル）を含む溶液を窒素流中室温で２時間撹拌した。反応混合物を０．２Ｎ塩酸、水、飽和水性炭酸水素ナトリウム及び水で順次洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空において濃縮した。生成物を熱酢酸エチル（３５ｍｌ）に溶解し、ヘプタン（１９０ｍｌ）を用いて沈殿させ、濾過すると、化合物２２（２７．７５ｇ）が得られた。
【００６３】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５８（ヘプタン／酢酸エチル＝３／７（ｖ／ｖ））。
【００６４】
化合物２３
無水エタノール（３０７ｍｌ）中に化合物２２（２５．６ｇ，７１．７ミリモル）、ヒドロキシルアミン塩酸塩（７．１ｇ，１０１．８ミリモル）及びトリエチルアミン（１６．８ｍｌ，１２０．５ミリモル）を含む溶液を８０℃で４時間撹拌した。混合物を室温に冷却すると、結晶が形成した。この結晶を濾別し、エタノール及びエーテルで洗浄し、デシケータ中で乾燥すると、化合物２３（２４．５ｇ）が得られた。
【００６５】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．１５（ヘプタン／酢酸エチル＝３／７（ｖ／ｖ））。
【００６６】
化合物２４
乾燥ピリジン（２４５ｍｌ）中に化合物２３（２４．５ｇ，６２．７ミリモル）及びクロロギ酸エチル（７．２ｍｌ，７５．３ミリモル）を含む溶液を１１５℃で２時間撹拌した。反応混合物を室温に冷却し、水（１２５０ｍｌ）に注ぎ、酢酸エチル（５００ｍｌ）で３回抽出した。合わせた有機抽出物をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空において濃縮すると、化合物２４（２４．３ｇ）が得られた。
【００６７】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．４２（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝９５／５（ｖ／ｖ））。
【００６８】
化合物２５
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１２２ｍｌ）及びＴＦＡ（１２２ｍｌ）中に化合物２４（２４．３ｇ，５８．４ミリモル）を含む溶液を室温で２時間撹拌し、トルエンの存在下真空において濃縮すると、化合物２５（３７．６ｇ）が得られた。
【００６９】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．３５（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝８／２（ｖ／ｖ））。
【００７０】
化合物２６
ＤＭＦ（９５０ｍｌ）及び水（４５０ｍｌ）中にＨ−Ａｓｐ−（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（３９ｇ，２０６．３５ミリモル）、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニルクロリド（６２ｇ，２４９．３ミリモル）及びジイソプロピルアミン（８９ｍｌ，６３５ミリモル）を含む懸濁液を０℃で３時間撹拌した。反応混合物を氷／水（５Ｌ）に注ぎ、ジエチルエーテルで２回洗浄し、４Ｎ水性塩酸（７２ｍｌ）で酸性化し、酢酸エチルで３回抽出した。合わせた酢酸エチル層をＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空において濃縮すると、化合物２６（９７．７ｇ）が得られた。
【００７１】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．６７（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝８／２（ｖ／ｖ））。
【００７２】
化合物２７
乾燥ＤＭＦ（６７０ｍｌ）中に化合物２５（３３．５ｇ）、化合物２６（２４．７ｇ）、ＴＢＴＵ（３６．８ｇ，１１４．６ミリモル）及びジイソプロピルアミン（２７．２ｍｌ，１９４．１ミリモル）を含む溶液を２時間撹拌し、真空において濃縮した。残渣を酢酸エチル（７５０ｍｌ）に溶解し、５％水性炭酸水素ナトリウム（１２５０ｍｌ）及び０．１Ｎ水性塩酸（１２５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空において濃縮すると、化合物２７（３３．８ｇ）が得られた。
【００７３】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．８８（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝８／２（ｖ／ｖ））。
【００７４】
化合物２８
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１７０ｍｌ）及びＴＦＡ（１７０ｍｌ）中に化合物２７（３３．８ｇ，４８．３ミリモル）を含む溶液を室温で２時間撹拌し、トルエンの存在下真空において濃縮すると、化合物２８（３２．３ｇ）が得られた。
【００７５】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．７３（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝８／２（ｖ／ｖ））。
【００７６】
化合物２９
乾燥ＤＭＦ（６２２ｍｌ）中に化合物２８（３２．３ｇ）、Ｈ−ＧＡＢＡ−ＯｔＢｕ・ＨＣｌ（９．５ｇ，４８．４ミリモル）、ＴＢＴＵ（２９．０ｇ，９０．５ミリモル）及びジイソプロピルアミン（２５．２ｍｌ，１７９．８ミリモル）を含む溶液を室温で２時間撹拌し、真空において濃縮した。残渣を酢酸エチル（８４０ｍｌ）に溶解し、５％水性炭酸水素ナトリウム（１４００ｍｌ）及び０．１Ｎ水性塩酸（１４００ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、濾過し、真空において濃縮した。残渣をエタノール（７５ｍｌ）に溶解し、撹拌しながらジイソプロピルエーテル（２９００ｍｌ）にゆっくり添加すると、化合物２９がオフホワイト色結晶（３２．０ｇ）として得られた。
【００７７】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５６（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝９／１（ｖ／ｖ））。
【００７８】
化合物３０
乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍｌ）及びＴＦＡ（１５ｍｌ）中に化合物２９（３．０ｇ，３．８２ミリモル）を含む溶液を室温で２時間撹拌し、トルエンの存在下真空において濃縮した。残渣をシリカゲル上でＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（０〜６％  ＭｅＯＨ）を用いて精製すると、純粋な化合物３０（１．９８ｇ）が得られた。
【００７９】
ＴＬＣ：Ｒｆ＝０．５６（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ＝８／２（ｖ／ｖ））。
【００８０】
化合物３１
ＤＭＦ（４５ｍｌ）中に化合物３０（９００ｍｇ，１．２３ミリモル）、ＴＢＴＵ（３９６ｍｇ，１．２３ミリモル）及びジイソプロピルアミン（２１５μｌ，１．５３ミリモル）を含む溶液を室温で２時間撹拌した。化合物１７（２．０ｇ，１．１１ミリモル）を添加し、４時間撹拌した後混合物を真空において濃縮すると、化合物３１（４．１７ｇ）が得られた。
【００８１】
化合物３１から化合物２１の製造
ｔｅｒｔ−ブチルアルコール（２８ｍｌ）及び水（５６ｍｌ）中に化合物３１（４．１７ｇ）及び１０％  Ｐｄ／Ｃ（２．８ｇ）を含む懸濁液を連続水素流中で一晩撹拌した。Ｐｄ／Ｃ触媒を濾過により除去し、濾液を真空において濃縮した。残渣を水に溶解し、Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにおいて精製した。適当な分画をプールし、濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムクロマトグラフィー（水）により脱塩した。適当な分画をプールし、凍結乾燥すると、コンジュゲート２１が白色固体（１．７４ｇ）として得られた。
【００８２】
【化９】
0004820517.tif 000007
【００８３】
【化１０】
0004820517.tif 000008
【００８４】
【化１１】
0004820517.tif 000009
【００８５】
【化１２】
0004820517.tif 000010
【００８６】
【化１３】
0004820517.tif 000011
【００８７】
【化１４】
0004820517.tif 000012
【００８８】
【化１５】
0004820517.tif 000013
【００８９】
実施例２
本発明の化合物の生物学的活性を以下の試験方法により調べる。
【００９０】
Ｉ．抗−トロンビンアッセイ
トロンビン（因子ＩＩａ）は凝固カスケードにおける因子である。
【００９１】
本発明の化合物の抗−トロンビン活性を、色素産性基質Ｓ−２２３８のトロンビンによる加水分解率を分光光度法により測定することにより調べた。緩衝液系における抗−トロンビン活性のアッセイを使用して試験化合物のＩＣ５０値を調べた。
【００９２】
試験培地：トロメタミン−ＮａＣｌ−ポリエチレングリコール６０００（ＴＮＰ）緩衝液。
【００９３】
参照化合物：Ｉ２５８１（Ｋａｂｉ）。
【００９４】
ビヒクル：ＴＮＰ緩衝液。
【００９５】
悪影響を及ぼさないジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、アセトニトリルまたはｔｅｒｔ−ブチルアルコールを最終反応混合物中２．５％までの濃度で用いて可溶化を助け得る。
【００９６】
方法：
（試薬）
１．トロメタミン−ＮａＣｌ（ＴＮ）緩衝液：この緩衝液の組成は６．０５７ｇ（５０ミリミル）のトロメタミン（Ｔｒｉｓ）、５．８４４ｇ（１００ミリミル）のＮａＣｌ及び１Ｌまでの水である。溶液のｐＨを３７℃でＨＣｌ（１０ミリモル／Ｌ）で７．４に調節する。
２．ＴＮＰ緩衝液：ポリエチレングリコール６０００を３ｇ／Ｌの濃度となるようにＴＮ緩衝液に溶解する。
３．Ｓ−２２３８溶液：Ｓ−２２３８（２５ｍｇ；スウェーデン国に所在のＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）１バイアルを１．２５ｍｇ／ｍｌ（２ミリモル／Ｌ）の濃度となるようにＴＮ緩衝液（２０ｍｌ）に溶解する。
４．トロンビン溶液：ヒトトロンビン（１０００ＮＩＨ単位／バイアル；米国に所在のＥｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓ．Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）を５０ＮＩＨ単位／ｍｌのストック溶液を与えるようにＴＮＰ緩衝液に溶解する。使用直前に、この溶液を３０．２ＮＩＨ単位／ｍｌの濃度となるようにＴＮＰ緩衝液で希釈する。
【００９７】
使用したすべての成分は試薬級である。水性溶液のために超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ品質）を使用する。
【００９８】
（試験及び参照化合物溶液の調製）
試験化合物及び参照化合物を１０−２モル／Ｌのストック濃度となるようにＭｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解する。各濃度を１０−３、１０−４及び１０−５モル／Ｌの濃度となるようにビヒクルで段階的に希釈する。ストック溶液を含めてすべての希釈物をアッセイに使用する（反応混合物中の最終濃度：３×１０−４、１０−４、３×１０−５、１０−５、３×１０−６、１０−６、３×１０−７、１０−７モル／Ｌ）。
【００９９】
（手順）
室温で、試験化合物溶液、参照化合物溶液またはビヒクル０．０７５ｍｌ及び０．０２５ｍｌを微量滴定プレートのウェルにピペットで添加し、前記溶液をそれぞれＴＮＰ緩衝液０．１１５ｍｌ及び０．０１６５ｍｌで希釈する。Ｓ−２２３８溶液のアリコート（０．０３０ｍｌ）を各ウェルに添加し、プレートをインキュベーター（Ａｍｅｒｓｈａｍ）において３７℃で１０分間振盪しながら予熱し、プレインキュベートする。プレインキュベート後、各ウェルにトロンビン溶液０．０３０ｍｌを添加してＳ−２２３８の加水分解を開始する。プレートを３７℃で３０秒間振盪しながらインキュベートする。１分間インキュベート後、各サンプルの４０５ｎｍでの吸光度をキネティック微量滴定プレートリーダー（Ｔｗｉｎｒｅａｄｅｒ  ｐｌｕｓ，Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓ）を用いて９０分間２分毎に測定する。
【０１００】
すべてのデータをデータプロセッシングプログラム（Ｂｉｏｌｉｓｅ）を用いてパーソナルコンピューターに集める。（反応混合物１Ｌあたりのモルで表す）各化合物濃度及びブランクに関して、吸光度を反応時間（分）に対してプロットする。
【０１０１】
応答評価：
各最終濃度について、アッセイプロットから最高吸光度を算出した。ＩＣ５０値（ブランクの最高吸光度を５０％抑制する最終濃度で、μモル／Ｌで表す）をＨａｆｎｅｒら（Ａｒｚｎｅｉｍ−Ｆｏｒｓｃｈ．／Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．，２７（ＩＩ），１８７１−３（１９７７））に従ってロジット変換分析を用いて計算した。
【０１０２】
実施例１の化合物の抗−トロンビン活性ＩＣ５０値は１７ｎＭであった。
【０１０３】
ＩＩ．抗−因子Ｘａアッセイ
活性化因子Ｘ（Ｘａ）は凝固カスケードにおける因子である。本発明の化合物の抗−Ｘａ活性を、色素産性基質Ｓ−２２２２のＸａによる加水分解率を分光光度法により測定することにより調べた。緩衝液系における抗−Ｘａ活性のアッセイを使用して試験化合物のＩＣ５０値を調べた。
【０１０４】
参照化合物：ペンタサッカライドＯｒｇ３１５４０。
【０１０５】
ビヒクル：ＴＮＰ緩衝液。
【０１０６】
悪影響を及ぼさないジメチルスルホキシド、メタノール、エタノール、アセトニトリルまたはｔｅｒｔ−ブチルアルコールを最終反応混合物中１％まで（ＤＭＳＯの場合）及び２．５％まで（他の溶媒の場合）の濃度で用いて可溶化を助け得る。
【０１０７】
方法：
（試薬）
１．トロメタミン−ＮａＣｌ（ＴＮ）緩衝液：この緩衝液の組成は６．１１ｇ（５０．４ミリミル）のトロメタミン（Ｔｒｉｓ）、１０．１７ｇ（１７４ミリミル）のＮａＣｌ、３ｇ／Ｌのポリエチレングリコール６０００及び１Ｌまでの水である。溶液のｐＨを３７℃でＨＣｌ（１０ミリモル／Ｌ）で７．４に調節する。
３．Ｓ−２２２２溶液：Ｓ−２２２２（２５ｍｇ；スウェーデン国に所在のＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）１バイアルを０．３７５ｍｇ／ｍｌ（０．５ミリモル／Ｌ）の濃度となるように水に溶解する。
４．Ｘａ溶液：ウシ因子Ｘヒト（７１ｎＫａｔ／バイアル；Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）をＴＮＰ緩衝液１０ｍｌに溶解した後、０．７５ｎＫａｔ・（１．５Ｕ）／ｍｌの濃度となるようにＴＮＰ緩衝液で希釈する。希釈物は新しく調製しなければならない。
５．ＡＴ−ＩＩＩ溶液：ヒトＡＴ−ＩＩＩ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を１Ｕ／ｍｌの濃度となるように水に溶解した後、溶液を更に０．２５Ｕ／ｍｌの濃度となるように３容量のＴＮＰ緩衝液で希釈する。
６．標準溶液：５．７抗−Ｘａ  Ｕ／ｍｌのＯｒｇ  ３１５４０のストック溶液を０．０５Ｕ／ｍｌまでＴＮＰ緩衝液に希釈する。
６．試験サンプル：各調製物を水に溶解し、０．０５ナノモル／ｍｌの濃度にＴＮＰ緩衝液で希釈する。各調製物につき、９希釈物を作成した（希釈係数１．５）。
【０１０８】
Ｘａ活性の測定：
各試験サンプル（０．０５ｍｌ）を室温で微量滴定プレートのウェルにピペットで添加する。各サンプルにＡＴ−ＩＩＩ溶液（０．０５ｍｌ）を添加し、プレートをＶａｒｉ振盪機を用いて振盪する。ＡＴ−ＩＩＩ溶液を添加してから１０分後Ｘａ溶液のアリコート（０．０５ｍｌ）を各ウェルにピペットで添加し、プレートを再び振盪する。Ｘａ溶液の添加から正確に２分後に、Ｓ−２２２２溶液（０．１ｍｌ）を各ウェルにピペットで添加し、プレートを再び振盪する。すべての添加について、１２チャネルのピペットを使用する。残存量のＸａがＳ−２２２２の加水分解を触媒し、その加水分解率をそれぞれ２及び２２分間室温でインキュベートした後光学的に測定する。各サンプルの吸光度をＲｅａｄｅｒ  Ｍｉｃｒｏｅｌｉｓａ  モデル３１０Ｃ（オランダ国Ｏｓｓに所在のＯｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｋｎｉｋａ）を用いて４０５ｎｍで測定し、吸光度の増加（ΔＯＤ）を算出する。各試験サンプルを２回測定する。１０個のサンプルごとに、ブランク（ＴＮＰ緩衝液０．０５ｍｌ）を含める。
【０１０９】
検量線：
検量サンプルの標準溶液のアリコートから、一連の希釈物を作成する（Ｏｒｇ  ３１５４０サンプルの場合希釈係数１．４）。得られた標準サンプル（約１２個のサンプル）は０．０１〜０．０５抗−ＸａＵ／ｍｌの範囲に含まれていなければならない。各ランで、各標準サンプル０．０５ｍｌを「Ｘａ活性の測定」に記載したように少なくとも３回試験する。最小二乗法を用い、直線をｌｏｇ抗−ＸａＵ／ｍｌ値に対する
ｌｏｇ［平均ΔＯＤ（ブランク）−平均ΔＯＤ（標準サンプル）］／平均ΔＯＤ（標準サンプル）
に当てはめることにより、検量線を作成する。
【０１１０】
応答評価：
各サンプルに関して、平均抗−Ｘａ活性（Ｕ／ｍｌ）を検量線を用いて求める。
【０１１１】
実施例１の化合物の抗−因子Ｘａ活性は１０１２Ｕ／マイクロモルであった。