(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１(SEQ ID NO.1.)に示す蛋白質分子をコードする単離された核酸。
【請求項２】
核酸分子がＤＮＡ分子である請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
核酸分子がｃＤＮＡ分子である請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
配列番号２に示すヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡである請求項３に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
請求項１〜４の１項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項６】
前記ベクターが、プラスミド、ウイルス又はバクテリオファージである請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
前記プラスミドが、酵母細胞における発現に適合され、かつ前記核酸分子の発現に必要な調節成分を更に含む、請求項６に記載のプラスミド。
【請求項８】
前記プラスミドが、バクテリア細胞における発現に適合され、かつ前記核酸分子の発現に必要な調節成分を更に含む、請求項６に記載のプラスミド。
【請求項９】
前記プラスミドが、哺乳類細胞における発現に適合され、かつ前記核酸分子の発現に必要な調節成分を更に含む、請求項６に記載のプラスミド。
【請求項１０】
請求項１〜４の１項に記載の核酸分子によって形質転換された細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、バクテリア細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、又は昆虫細胞である、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
配列番号１に示す蛋白質分子。
【請求項１３】
その機能が、神経系、筋肉系、前立腺、胃、精巣、卵巣、副腎、乳腺、肝臓、脾臓の細胞を、変性及び／又は細胞死から保護することである請求項１２に記載の蛋白質分子。
【請求項１４】
配列番号１に示す蛋白質分子である免疫原との特異的免疫反応性を有する抗体。
【請求項１５】
その機能が、変性及び／又は細胞死から細胞を保護することである蛋白質分子との特異的免疫反応性を有する抗体であって、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列を含む抗体。
【請求項１６】
請求項１４又は１５の抗体によって免疫細胞化学的に染色した細胞を含む被験者の病理細胞を検出する方法であって、既知の健康な状態を表す細胞と比較した前記細胞における低染色度が、前記細胞の病理変化を示す方法。
【請求項１７】
神経系、筋肉系、前立腺、胃、精巣、卵巣、副腎、乳腺、肝臓、脾臓、肺、気管又は胎盤の細胞を使用する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
被験者から得た試料におけるアルツハイマー症を検査する方法であって、
（ａ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列を含む、（ｂ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子の転写生成物、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列を含む、（ｃ）その蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列を含む蛋白質分子からなる群から選択される少なくとも１つの物質の発現値、又は活性、又は前記発現値及び前記活性の両者を決定すること、並びに前記物質（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの前記発現値、又は前記活性、又は前記発現値及び前記活性の両者を、既知の疾患又は健康な状態を表す対照値と比較し、それによって前記被験者から得た試料におけるアルツハイマー症を検査することを含む、方法。
【請求項１９】
被験者から得た試料におけるアルツハイマー症の進行を検査する方法であって、
（ａ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列を含む、（ｂ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子の転写生成物、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列を含む、（ｃ）その蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列を含む蛋白質分子からなる群から選択される少なくとも１つの物質の発現値、又は活性、又は前記発現値及び前記活性を決定すること、並びに前記物質（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つの前記発現値、又は前記活性、又は前記発現値及び前記活性の両者を、既知の疾患又は健康な状態を表す対照値と比較し、それによって前記被験者から得た試料におけるアルツハイマー症の進行を検査することを含む、方法。
【請求項２０】
前記蛋白質分子の機能が、変性及び／又は細胞死から細胞を保護することである、請求項１８〜１９の１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験者からの試料中の（ｉ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子の転写生成物、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列を含む、又は（ｉｉ）その蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列を含む蛋白質分子の、既知の健康な状態を表す対照値と比較した、発現値又は活性の減少が、前記被験者からの試料におけるアルツハイマー症の存在を示す、請求項１８〜２０の１項に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列を含む、（ｂ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子の転写生成物、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列を含む、（ｃ）その蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列を含む蛋白質分子からなる群から選択される少なくとも１つの物質の活性、又は発現値、又は前記活性及び発現値の両者に影響を及ぼす薬剤の同定方法であって、（ｉ）（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質を含む試料を供給すること、（ｉｉ）前記試料を少なくとも１つの薬剤と接触させること、（ｉｉｉ）接触の前後に前記物質の少なくとも１つの活性、又は発現値、又は前記活性及び発現値の両者を比較することを含む方法。
【請求項２３】
前記蛋白質分子の機能が、変性及び／又は細胞死から細胞を保護することである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
下記（１）の薬剤及び（２）の説明書を含む、アルツハイマー症の診断又は予後のためのキット:
（１）（ａ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列を含む、（ｂ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子の転写生成物、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列を含む、（ｃ）その蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列を含む蛋白質分子を選択的に検出する薬剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤、
（２）（ｉ）被験者からの試料において、（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の発現値、又は活性、又は前記発現値及び前記活性の両者を検出すること；
及び
（ｉｉ）（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の、既知の健康な状態を表す対照値と比較して変化した発現値、若しくは活性、若しくは前記発現値及び前記活性；又は（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の、既知のアルツハイマー症の疾患状態を表す対照値と同様の、又は同一の発現値、若しくは活性、若しくは前記発現値及び前記活性の両者を、アルツハイマー症の診断又は予後の指標としてアルツハイマー症を診断又は予後することにより、
アルツハイマー症を診断し、又は予後することが説明されている説明書。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
細胞死(cell death)は、自然界において２つの異なる形に存在する共通の性質である。壊死(necrosis)は、物理的又は化学的外傷(insult)に起因し、一方、アポトーシス(apoptosis)又はプログラム化された(programmed)細胞死は、内部及び外部刺激に応じた細胞内での自殺(self-destruction)プログラムに起因する。後者のプロセスは、正常な成長及び多細胞生物の維持(maintenance)に必須の細胞死の遺伝子に制御された(gene-directed)形式である。最近の研究は、アポトーシスの制御異常(dysregulation)が、様々な疾患の病因を引き起こし得ることを明確に示している。アポトーシスは、虚血(ischaemia)、例えば、心筋梗塞(myocardial infarction)や発作(stroke)を特徴とする体調において発生することが報告されている。それは、閉塞性黄疸(obstructive jaundice)を含む多くの肝臓病に関連している。毒素及び薬剤による肝臓の損傷もまた、肝細胞中のアポトーシスと関連している。アポトーシスは、数種の腎臓病、即ち、嚢胞腎(polycistic kidney)において、並びにアルコールによって引き起こされる(alcohol-induced)膵炎及び糖尿病のような膵臓病において、重要な現象であることも確認されている。エイズ（ＡＩＤＳ）及びアルツハイマー症やパーキンソン病のような神経変性疾患(neurodegenerative disorders)は、過剰なアポトーシスに関連する病気の中で最も幅広く研究されたグループの典型である。筋萎縮性側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis) 、色素性網膜炎(retinitis pigmentosa)、癲癇(epilepsy)及びアルコール性脳障害(alcoholic brain damage)は、アポトーシスに関連する他の神経病である。
【０００２】
神経病は、人々の間に幅広く蔓延しており、患者の生命のみならず社会にもそれ自体が強い衝撃を与えている。従って、そのような神経病の原因及び根本的な病因(underlying pathogenesis)を明らかにすることが強く求められている。そのような神経病の中で、アルツハイマー症（ＡＤ）は、主要な位置(predominant position)をなしている。１９０７年にババリア人の精神科医、アロイス・アルツハイマー(Alois Alzheimer)によって初めて説明されたアルツハイマー症は、短期間の記憶喪失から始まり、そして認知機能(cognitive functions)の喪失、見当識障害(disorientation)、判断及び推理機能障害、そして最終的には痴呆へ進行する進行性神経機能障害(progressive neurological disorder)である。それは、痴呆の最も一般的なケースである。６５歳以上の人口の５〜１１パーセント及び８５歳以上の人口の約４７パーセントがＡＤを患っていると見積もられている。更に、１９４０年代及び１９５０年代の人口急増(population boom)の間に生まれた成人が、ＡＤが更に流行する年齢に達するので、ＡＤの抑制及び治療は、一層重大な健康管理の問題になるであろう。ＡＤの家族形態(familial forms)は、遺伝的に異質であるが、発症初期には殆どがプレセニリン(presenilin)遺伝子ＰＳＥＮ１及びＰＳＥＮ２における突然変異並びにアミロイド前駆体遺伝子ＡＰＰの突然変異に関連する。ＡＤ患者の大多数は、明らかな遺伝性を有さず、突発性ＡＤに分類される。ＡＤの神経病理学は、多量のニューロン及びシナプスの損失、並びに脳におけるアミロイドプラーク(amyloid plaques)及び神経原線維の絡み合い(neurofibrillary tangles)の形成を特徴とする。アミロイドプラークが、新皮質(neocortex)及び海馬(hippocampus)の全体に亘って均一に(evenly)分布しているが、神経変性は、下位側頭葉(inferior temporal lobes)、内側嗅皮質(entorhinal cortex)、及び海馬において顕著に変性される。前頭葉、頭頂葉、及び後頭葉における同様のニューロンは、厳しい末期ＡＤにおいてでさえ、大部分が変性から保護されている。これらの観察は、ニューロンの特異的集合が、選択的に損傷されやすいことを示している。ＡＤの脳においてニューロンの選択的な損傷の受けやすさを決定する因子は、知られていない。
【０００３】
細胞変性及び細胞死の原因を明らかにすることが、本発明の全般的な目的である。より具体的には、本発明は、神経病、特にアルツハイマー症の原因及び根本的な病因を明らかにすることを目的とする。従って、本発明の目的は、神経病の病因への病識(insight)を提供すること並びに前記疾患、細胞変性及び細胞死の診断及び治療に適した方法及び材料を提供することである。
【０００４】
本発明は、そのアミノ酸配列が、配列番号１(SEQ ID NO.1)に示す配列を含む蛋白質分子並びに配列番号１による蛋白質分子をコードする単離された(isolated)核酸分子を特徴とする。以下、配列番号１の蛋白質分子を、“ＳＥＬＡＤＩＮ-１”と表す。ＳＥＬＡＤＩＮ-１の１つの機能は、変性及び細胞死から細胞を保護することである。特に、神経系、筋肉系、前立腺、胃、精巣、卵巣、副腎、乳腺、肝臓、脾臓、肺、気管又は胎盤の細胞が、変性及び／又は細胞死から保護される。従って、本発明はまた、ＳＥＬＡＤＩＮ-１の所定の一次構造の変形を有することもあるが、その必須の生物学的機能は変化しないままであるＳＥＬＡＤＩＮ-１の機能的変異体(functional variants)も特徴とする。配列番号１に示す蛋白質分子の“変異体”は、例えば、極めて保存的な(conservative)領域において保存的なアミノ酸置換基を有する蛋白質を含む。例えば、イソロイシン(isoleucine)、バリン(valine)及びロイシン(leucine)は、それぞれお互いに置換され得る。アスパラギン酸塩(aspartate)及びグルタミン酸塩(glutamate)は、お互いに置換され得る。グルタミン(glutamine)及びアスパラギン(asparagines)は、お互いに置換され得る。セリン(serine)及びトレオニン(threonine)は、お互いに置換され得る。あまり保存的でない領域中のアミノ酸置換基は、例えば、お互いに置換し得るイソロイシン、バリン及びロイシンを含む。アスパラギン酸及びグルタミン酸は、お互いに置換され得る。グルタミン及びアスパラギンは、お互いに置換され得る。セリンとトレオニンは、お互いに置換され得る。グリシン(Glycine)及びアラニン(alanine)は、お互いに置換され得る。アラニン及びバリンは、お互いに置換され得る。メチオニン(methionine)は、ロイシン、イソロイシン、又はバリンのそれぞれと置換され、又は置換することができる。リシン(lysine)及びアルギニン(arginine)は、お互いに置換され得る。アスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩のうちの１つは、アルギニン又はリシンのうちの１つと置換され、又は置換することができる。ヒスチジン(histidine)は、アルギニン又はリシンと置換され、又は置換することができる。グルタミン及びグルタミン酸塩は、お互いに置換され得る。アスパラギン及びアスパラギン酸塩は、お互いに置換され得る。蛋白質変形の他の例は、グリコシル化(glycosilation)、更に翻訳後変形(posttranslational modifications)を含む。本発明はまた、配列番号１の蛋白質分子のそのような機能的変異体をコードする核酸分子も特徴とする。核酸分子は、ゲノムＤＮＡ分子若しくはｃＤＮＡ分子のようなＤＮＡ分子、又はｍＲＮＡ分子のようなＲＮＡ分子であることができる。特に、前記核酸分子は、配列番号２のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ分子であることができる。本発明はまた、ストリンジェントな(stringent)条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得る単離されたＤＮＡ分子も特徴とする。ストリンジェントな条件としては、（ｉ）６０℃の０．２×ＳＳＣ（標準クエン酸ナトリウム(saline citrate)）及び０．１％ＳＤＳ、及び（ｉｉ）４２℃の５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１０×ダンハート(Denhards' s)溶液、１００μｇ／ｍｌの熱変性サケ精液ＤＮＡが挙げられる。
【０００５】
別の態様において、本発明は、配列番号１に示す蛋白質分子をコードする核酸を含むベクターを特徴とする。それはまた、変性及び／又は細胞死から細胞を保護する機能を有し、その蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む蛋白質分子をコードする核酸分子を含むベクターも特徴とする。好ましい態様において、ウイルス、バクテリオファージ、又はプラスミドは、記載の核酸を含む。特に、バクテリア細胞における発現に適合されたプラスミドは、前記核酸分子、例えば、配列番号１に示す蛋白質分子をコードする核酸分子、及びバクテリア細胞における前記分子の発現に必要な調節成分(regulatory elements)を含む。更なる態様において、本発明は、前記核酸分子、例えば配列番号１に示す蛋白質分子をコードする核酸分子、及び酵母細胞における前記分子の発現に必要な調節成分を含む、酵母細胞における発現に適合されたプラスミドを特徴とする。別の態様において、本発明は、核酸分子、例えば配列番号１に示す蛋白質分子をコードする核酸分子、及び哺乳類細胞における前記分子の発現に必要な調節成分を含む、哺乳類細胞における発現に適合されたプラスミドを特徴とする。
【０００６】
更なる態様において、本発明は、配列番号１に示す蛋白質分子をコードする核酸分子を含む細胞を特徴とする。本発明はまた、変性及び／又は細胞死から細胞を保護する機能を有し、そのアミノ酸配列が配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む蛋白質分子をコードする核酸分子を含む細胞も特徴とする。それはまた、ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子を含む細胞も特徴とする。好ましい態様において、前記細胞は、バクテリア細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、又は昆虫の細胞である。特に、本発明は、配列番号１に示す蛋白質分子をコードする核酸分子、及びバクテリア細胞における前記分子の発現に必要な調節成分を含む、バクテリア細胞における発現に適合されたプラスミドを含むバクテリア細胞を特徴とする。本発明はまた、配列番号１に示す蛋白質分子をコードする核酸分子、及び酵母細胞における前記分子の発現に必要な調節成分を含む、酵母細胞における発現に適合されたプラスミドを含む酵母細胞を特徴とする。それは、配列番号１に示す蛋白質分子をコードする核酸分子、及び哺乳類細胞における前記分子の発現に必要な調節成分を含む、哺乳類細胞における発現に適合されたプラスミドを含む哺乳類細胞を更に特徴とする。
【０００７】
本発明は、配列番号１に示す免疫原、又は変性及び／若しくは細胞死から細胞を保護する機能を有し、その蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む免疫原との特異的反応性を有する抗体を更に特徴とする。別の態様において、本発明は、前記抗体によって免疫細胞化学的に染色した細胞を含む被験者の病理細胞を検出する方法であって、既知の健康な状態を表す対照細胞と比較した前記細胞の低染色度が、前記細胞の病理変化を示す方法を目的とする。本発明は、被験者の脳における病理構造の検出に特に適している−検出方法は、前記抗体によって免疫細胞化学的に染色された前記病理構造を含む。それはまた、筋肉系、前立腺、胃、精巣、卵巣、副腎、乳腺、肝臓、脾臓、肺、気管又は胎盤の病理細胞の検出に特に適している。
【０００８】
別の態様において、本発明は、
（ａ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む、
（ｂ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子の転写生成物、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む、
（ｃ）その蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む蛋白質分子、
（ｄ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子、
（ｅ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子の転写生成物、
（ｆ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子の翻訳生成物、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の値、又は活性、又は前記値及び前記活性の両者に影響を及ぼす分子、
（ｈ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質によって、その値、又はその活性、又はその値及び活性の両者が影響を及ぼされる分子
からなる群から選択される少なくとも１つの物質の値、又は活性、又は前記値及び前記活性の両者を決定すること、
並びに前記物質（ａ）〜（ｈ）の少なくとも１つの前記値、又は前記活性、又は前記値及び前記活性の両者を、既知の疾患又は健康な状態を表す対照値と比較し、それによって前記被験者における疾患、特に神経病を診断又は予後することを含む、被験者における疾患、特に神経病を診断又は予後する方法を特徴とする。
【０００９】
別の態様において、本発明は、
（ａ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む、
（ｂ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子の転写生成物、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む、
（ｃ）その蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む蛋白質分子、
（ｄ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子、
（ｅ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子の転写生成物、
（ｆ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子の翻訳生成物、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の値、又は活性、又は前記値及び前記活性の両者に影響を及ぼす分子、
（ｈ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質によって、その値、又はその活性、又はその値及び活性の両者が影響を及ぼされる分子
からなる群から選択される少なくとも１つの物質の値、又は活性、又は前記値及び前記活性の両者を決定すること、
並びに前記物質（ａ）〜（ｈ）の少なくとも１つの前記値、又は前記活性、又は前記値及び前記活性の両者を、既知の疾患又は健康な状態を表す対照値と比較し、それによって前記被験者における疾患、特に神経病の進行を観察することを含む、被験者における疾患、特に神経病の進行を観察する方法を特徴とする。
【００１０】
更なる態様において、本発明は、
（ａ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む、
（ｂ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子の転写生成物、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む、
（ｃ）その蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む蛋白質分子、
（ｄ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子、
（ｅ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子の転写生成物、
（ｆ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子の翻訳生成物、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の値、又は活性、又は前記値及び前記活性の両者に影響を及ぼす分子、
（ｈ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質によって、その値、又はその活性、又はその値及び活性の両者が影響を及ぼされる分子
からなる群から選択される少なくとも１つの物質の、値、又は活性、又は前記値及び前記活性の両者を決定すること、
並びに前記物質（ａ）〜（ｈ）の少なくとも１つの前記値、又は前記活性、又は前記値及び前記活性の両者を、既知の疾患又は健康な状態を表す対照値と比較し、それによって前記被験者における疾患、特に神経病の治療を評価することを含む、被験者における疾患、特に神経病の治療の評価方法を特徴とする。
【００１１】
更なる態様において、本発明は、
（１）（ａ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む、
（ｂ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子の転写生成物、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む、
（ｃ）その蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む蛋白質分子、
（ｄ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子、
（ｅ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子の転写生成物、
（ｆ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子の翻訳生成物、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の値、又は活性、又は前記値及び前記活性の両者に影響を及ぼす分子、
（ｈ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質によって、その値、又はその活性、又はその値及び活性が影響を及ぼされる分子
を選択的に検出する薬剤からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤、
（２）（ｉ）前記被験者からの試料において、（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の値、又は活性、又は前記値及び前記活性の両者の検出；
及び
（ｉｉ）（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の、既知の健康な状態を表す対照値と比較して変化した(varied)値、若しくは活性、若しくは前記値及び前記活性；
又は（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の、既知の疾患状態を表す対照値と同様の、又は同一の値、若しくは活性、若しくは前記値及び前記活性の両者
が、前記疾患の診断又は予後を示す、前記疾患の診断又は予後
によって前記疾患を診断し、又は予後するための説明書：
を含む疾患の診断又は予後のためのキットを特徴とする。
【００１２】
更なる態様において、そのキットは、前記被験者の治療の成否の観察において使用することができる。それは、病気の進行の観察においても使用することができる。
【００１３】
前述の、病気の診断若しくは予後、又はその進行の観察、又はその治療の評価の方法及びキットの好ましい態様を、ここで詳細に開示する。
【００１４】
好ましい態様において、前記蛋白質分子又はその機能的変異体の機能は、変性及び／又は細胞死から細胞を保護することである。
【００１５】
別の好ましい態様において、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得る前記ＤＮＡ分子は、変性及び／又は細胞死から細胞を保護する機能を有する蛋白質分子をコードする。
【００１６】
好ましい態様において、前記被験者らは、アルツハイマー症及び関連する神経原線維異常(neurofibrillary disorders)、又は細胞変性若しくは細胞死を特徴とする神経変性状態(neurodegenerative states)を患っている。神経病の例としては、パーキンソン病(Parkinson´s disease)、ハンチントン病(Huntington disease)、筋萎縮性側索硬化症(Amyotrophic lateralsclerosis)、又はピック病(Pick´s disease)が更に挙げられる。
【００１７】
前記試料は、脳組織又は筋肉系、前立腺、胃、精巣、卵巣、副腎、乳腺、肝臓、脾臓、肺、気管又は胎盤を含む他の体細胞であることが特に好ましい。その試料は、脳脊髄液及び別の体液であることもできる。
【００１８】
本発明によれば、前記被験者からの試料中の（ｉ）そのアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列若しくはその機能的変異体を含む蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子の転写生成物、又は（ｉｉ）そのアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列若しくはその機能的変異体を含む蛋白質分子の、既知の健康な状態を表す対照値と比較した、値、又は活性、又は前記値及び前記活性の減少は、前記被験者における病理状態の存在を示す。特に、神経変性による影響を激しく受けた前記被験者の脳領域中のＳＥＬＡＤＩＮ−１又はＳＥＬＡＤＩＮ−１転写物の、既知の健康な状態を表す対照値と比較した、値、又は活性、又は前記値及び前記活性の両者の減少は、アルツハイマー症の診断又は予後を示す。下位側頭葉、内側嗅皮質、海馬、及び小脳扁桃(amygdala)内のニューロンは、アルツハイマー症において顕著に変性される。
【００１９】
前記被験者は、そのような被験者が、研究中の疾患、特に神経病に苦しめられていることを示す１つ以上の因子を有することを、予め決定されていることが好ましいこともある。
【００２０】
好ましい態様において、前記被験者は、ヒト、実験動物、例えばラット又はマウス、家畜、又はヒト以外の霊長類、例えばサルであることができる。実験動物は、疾患の動物モデル、例えばアルツハイマー型神経病を有するトランスジェニック(transgenic)マウスであることができる。
【００２１】
好ましい態様において、前記物質の少なくとも１つは、免疫学的検定(immunoassay)、酵素活性検定(enzyme activity assay)及び／又は結合検定(binding assay)を用いて検出される。
【００２２】
好ましい態様において、ＳＥＬＡＤＩＮ−１遺伝子又はその機能的変異体の転写生成物の値の測定は、ＳＥＬＡＤＩＮ−１遺伝子又は前記変異体に特異的なプローブによるノーザンブロット(Northern blots)を用いて、体細胞において行われる。被験者の体細胞から抽出されたＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡからのＳＥＬＡＤＩＮ−１遺伝子に特異的な配列を増幅するために、プライマーの組合せによる定量的(quantitative)ＰＣＲも適用することができる。これらの技術は、当業者に知られている（例えば、ワトソン(Watson)ら、Rekombinierte DNA、第二版、Spektrum Akademischer Verlag GmbH、ハイデルベルグ(Heidelberg)、1993；ワトソン(Watson)ら、Recombinant DNA、第二版、Ｗ．Ｈ．フリーマン・アンド・カンパニー（W.H. Freeman and Company）、1992参照）。
【００２３】
好ましい態様において、配列番号１に示す蛋白質分子又はその機能的変異体若しくはフラグメントの前記値は、免疫学的検定を用いて検出される。これらの検定は、アンチ蛋白質抗体又はアンチ蛋白質抗体に結合する第二抗体のいずれかに結合する酵素的、量子色力学的(chromodynamic)、放射性、又はルミネッセンス標識を用いることにより、前記蛋白質分子とアンチ蛋白質抗体(anti-protein antibody)、例えば、アンチＳＥＬＡＤＩＮ−１抗体との結合量を測定することができる。また、他の高アフィニティーリガンドを使用することもできる。使用され得る免疫学的検定は、例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタン・ブロット及び当業者に既知の他の技術を含む（ハーロー(Harlow)ら、アンチボディズ(Antibodies)、ラボラトリー・マニュアル(A laboratory Manual)、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク参照）。
【００２４】
使用されるべき抗体又はリガンドは、ＳＥＬＡＤＩＮ−１又はその機能的変異体若しくはフラグメントを、好ましくは特異的に検出すべきである。それは、前記試料中に存在する他のいずれの蛋白質とも相互作用しないことが好ましい。
【００２５】
配列番号１の蛋白質分子又はその機能的変異体若しくはフラグメントを認識し得るモノクローナル抗体は、この分野において既知の方法を用いて調製することができる（例えば、コーラ−(Koehler)及びミルスタイン(Milstein)、ネイチャー(Nature) 256、495-497 1975；コズボール（Kozbor）ら、Immunol.Today 4、72、1983；コール(Cole)ら、モノクローナル抗体及び癌治療(Monoclonal antibodies and cancer therapy)、アランＲ.リス社(Alan R.Liss,Inc.)、pp77-96、1985；マークス(Marks)ら、J.Biol.Chem.、16007-16010、1992参照；これらの内容は、本明細書に開示として援用される）。そのようなモノクローナル抗体及びそれらのフラグメントは、組換えＤＮＡ技術の当業者に既知の代替法によって生産することもできる（例えば、サストリー(Sastry)ら、PNAS 86：5728、1989；ワトソン(Watson)ら、Rekombinierte DNA、第二版、Spektrum Akademischer Verlag GmbH、1993；ワトソン(Watson)ら、Recombinant DNA、第二版、W.H.フリーマン・アンド・カンパニー(W.H.Freeman and Company)、1992参照；これらの内容は、本明細書に開示として援用される）。本発明の方法において有用なモノクローナル抗体は、抗体とＳＥＬＡＤＩＮ−１との間に、又は抗体と前記機能的へ変異体若しくはフラグメントとの間に形成された複合体を検出検定(detection assays)において認識することができるようなＳＥＬＡＤＩＮ−１又はその機能的変異体若しくはフラグメントのエピトープ(epitope)を目的としている。“抗体”という語は、ＳＥＬＡＤＩＮ−１と、又はその機能的変異体若しくはフラグメントと特異的に結合するポリクローナル、モノクローナル、キメラ型(chimeric)、組換え型、単一鎖抗体並びにそれらのフラグメントのような当分野において既知の全ての形の抗体を包含する。
【００２６】
抗体又はリガンドは、前記ｇ）及びｈ）を用いる前述の方法及びキットにおいて記載した特異的な分子の検出においても使用することができる。
【００２７】
いずれかの検出検定においてルミネッセンス標識を使用する場合、共焦点光学装置(confocal optical set-up)を用いることが好ましい。
【００２８】
更に好ましい態様において、前記対照値は、研究中の疾患、特にアルツハイマー症のような神経病を患っていない被験者からの試料中の前記（ａ）〜（ｈ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の値、又は活性、又は前記値及び前記活性である。健康な被験者は、前記病気の診断又は予後が行われる被験者と同じ体重、年齢、及び性別であることができる。場合によっては、診断される被験者からの対照値を用いることが好ましいこともある。
【００２９】
好ましい態様において、試料中の前記（ａ）〜（ｈ）の少なくとも１つの値、又は活性、又は前記値及び前記活性の両者を、少なくとも２回、例えば数週間又は数ヶ月間隔で２回測定する。これら２回の値又は活性は、前記疾患の進行を観察するために比較される。長期に亘り、一連の試料を採取することが好ましいこともある。更に好ましい態様において、前記被験者は、１回以上の前記試料採取の前に治療を受ける。
【００３０】
別の態様において、本発明は、
（ａ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む、
（ｂ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子の転写生成物、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む、
（ｃ）その蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む蛋白質分子、
（ｄ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子、
（ｅ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子の転写生成物、
（ｆ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子の翻訳生成物、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の値、又は活性、又は前記値及び前記活性の両者に影響を及ぼす分子、
（ｈ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質によって、その値、又はその活性、又はその値及び活性が影響を及ぼされる分子
からなる群から選択される少なくとも１つの物質の値、又は活性、又は前記値及び前記活性の両者に影響を及ぼす薬剤（類）を、前記被験者に治療に効果的な量で投与することを含む、前記被験者における疾患、特に神経病の治療又は予防の方法を特徴とする。
【００３１】
好ましい態様において、前記蛋白質分子又はその機能的変異体の機能は、変性及び／又は細胞死から細胞を保護することである。
【００３２】
別の好ましい態様において、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得る前記ＤＮＡは、変性及び／又は細胞死から細胞を保護する機能を有する蛋白質分子をコードする。
【００３３】
好ましい態様において、前記被験者は、アルツハイマー症及び関連する神経原線維異常、又は細胞変性若しくは細胞死を特徴とする神経変性状態のような変性状態を患っている。神経病の例としては、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、又はピック病が更に挙げられる。
【００３４】
好ましい態様において、この方法は、前記薬剤（類）の投与のために、それ自体既知の遺伝子治療核酸技術の方法の適用を含む。
【００３５】
遺伝子治療は、数種のアプローチ、即ち、突然変異型(mutated)遺伝子の分子置換、治療効果を有する(therapeutic)蛋白質の合成をもたらす新規遺伝子の付加、及び薬剤による内因性(endogeneous)細胞遺伝子発現の調節を一般に含む。遺伝子伝達技術(Gene-transfer techniques)は詳細に記載され（例えば、ベール(Behr)、Acc.Chem.Res.26、274-278、1993；ムリガン(Mulligan)、サイエンス(Science)260、926-931、1993；これらの内容は、本明細書に開示として援用される）、かつ細胞内へのＤＮＡの機械的微量注入(mechanical microinjection)のような直接的な遺伝子伝達技術並びに（組換え型ウイルス、特にレトロウイルスのような）生物学的ベクター若しくはモデルリポソームを用いる間接的な技術、又はポリカチオンによるＤＮＡの共沈を用いるトランスフェクション(transfection)、化学的手段（溶媒、界面活性剤、ポリマー、酵素）若しくは物理的手段（機械的、浸透性(osmotic)、熱的、電気的衝撃）による細胞膜摂動(pertubation)に基づく技術を含む。出生後の中枢神経系内への遺伝子伝達が詳細に記載されている（例えば、ウォルフ(Wolff)、Current Opinion in Neurobiology、3、743-748、1993参照；これらの内容は、本明細書に開示として援用される）。
【００３６】
好ましい態様において、この方法は、前記被験者の中枢神経系、好ましくは脳へ、ドナー細胞を移植することを含む。前記被験者又はドナー細胞は、好ましくは移植拒絶(graft rejection)を最少化するように治療される。但し、前記ドナー細胞は、前記薬剤（類）をコードする少なくとも１つの遺伝子を導入することによって遺伝的に変更される。前記導入された遺伝子(transgene)は、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターによって輸送されることもある。導入された遺伝子をコードするＤＮＡの非ウイルス性物理的トランスフェクションによって、特に微量注入によって、ドナー細胞内へ遺伝子を導入することができる。エレクトロポレーション(electroporation)、化学媒介(chemically mediated)トランスフェクション、特にリン酸カルシウムトランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション等によって、遺伝子導入を行うことができる。
【００３７】
好ましい態様において、前記薬剤は、前記治療効果を有する蛋白質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するためにインビボで(in vivo)治療され、かつ前記被験者において治療に効果的な量の前記治療効果を有する蛋白質をインビボで発現する対象細胞を前記被験者に導入することを含む工程によって、前記被験者、好ましくはヒトに投与され得る治療効果のある蛋白質である。前記ＤＮＡセグメントは、ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターによって前記細胞内へインビトロで(in vitro)挿入され得る。
【００３８】
好ましい態様において、治療効果を有する核酸又は蛋白質は、細胞、特にニューロンの変性を減少させ、又は防ぎ、かつ脳アミロイド形成を遅らせる。
【００３９】
別の態様において、本発明は、
（ａ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む、
（ｂ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子の転写生成物、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む、
（ｃ）その蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む蛋白質分子、
（ｄ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子、
（ｅ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子の転写生成物、
（ｆ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子の翻訳生成物、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の値、又は活性、又は前記値及び前記活性の両者に影響を及ぼす分子、
（ｈ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質によって、その値、又はその活性、又はその値及び活性が影響を及ぼされる分子
からなる群から選択される少なくとも１つの物質の活性、又は値、又は前記活性及び値の両者に影響を及ぼす薬剤を特徴とする。
【００４０】
好ましくは、前記蛋白質分子又はその変異体の機能は、変性及び／又は細胞死から細胞を保護することである。好ましくは、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得る前記ＤＮＡ分子は、変性及び／又は細胞死から細胞を保護する機能を有する蛋白質をコードする。
【００４１】
別の態様において、本発明は、そのような薬剤を含む医薬を特徴とする。
【００４２】
更に別の態様において、本発明は、
（ａ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む、
（ｂ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子の転写生成物、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む、
（ｃ）その蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む蛋白質分子、
（ｄ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子、
（ｅ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子の転写生成物、
（ｆ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子の翻訳生成物、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の値、又は活性、又は前記値及び前記活性の両者に影響を及ぼす分子、
（ｈ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質によって、その値、又はその活性、又はその値及び活性が影響を及ぼされる分子
からなる群から選択される少なくとも１つの物質の活性、又は値、又は前記活性及び値の両者に影響を及ぼす薬剤であって、疾患、特に神経病の治療又は予防のための薬剤を特徴とする。
【００４３】
好ましい態様において、前記疾患は、細胞変性若しくは細胞死を特徴とする変性状態、又はアルツハイマー症及び関連する神経原線維異常である。神経病の例としては、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ピック病が更に挙げられる。
【００４４】
好ましくは、前記蛋白質分子又はその変異体の機能は、変性及び／又は細胞死から細胞を保護することである。好ましくは、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得る前記ＤＮＡは、変性及び／又は細胞死から細胞を保護する機能を有する蛋白質をコードする。
【００４５】
更なる態様において、本発明は、
（ａ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む、
（ｂ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子の転写生成物、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む、
（ｃ）その蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む蛋白質分子、
（ｄ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子、
（ｅ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子の転写生成物、
（ｆ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子の翻訳生成物、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の値、又は活性、又は前記値及び前記活性の両者に影響を及ぼす分子、
（ｈ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質によって、その値、又はその活性、又はその値及び活性が影響を及ぼされる分子
からなる群から選択される少なくとも１つの物質の活性、又は値、又は前記活性及び値の両者に影響を及ぼす薬剤であって、神経病の治療又は予防のための医薬の調製のための薬剤の使用を特徴とする。
【００４６】
好ましくは、前記蛋白質分子又はその変異体の機能は、変性及び／又は細胞死から細胞を保護することである。好ましくは、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得る前記ＤＮＡは、変性及び／又は細胞死から細胞を保護する機能を有する蛋白質分子をコードする。
【００４７】
好ましい態様において、前記疾患は、アルツハイマー症及び関連する神経原線維異常、又は変性状態、特に細胞変性若しくは細胞死を特徴とする神経変性状態である。神経病の例としては、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、ピック病が更に挙げられる。
【００４８】
更なる態様において、本発明は、
（ａ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む、
（ｂ）蛋白質分子をコードするＤＮＡ分子の転写生成物、但し、前記蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む、
（ｃ）その蛋白質分子のアミノ酸配列が、配列番号１に示す配列又はその機能的変異体を含む蛋白質分子、
（ｄ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子、
（ｅ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子の転写生成物、
（ｆ）ストリンジェントな条件下で、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得るＤＮＡ分子の翻訳生成物、
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の値、又は活性、又は前記値及び前記活性の両者に影響を及ぼす分子、
（ｈ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質によって、その値、又はその活性、又はその値及び活性が影響を及ぼされる分子
からなる群から選択される少なくとも１つの物質の活性、又は値、又は前記活性及び値の両者に影響を及ぼす薬剤の同定のための方法であって、
（ｉ）（ａ）〜（ｆ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質を含む試料を供給すること、
（ｉｉ）前記試料を少なくとも１つの薬剤と接触させること、
（ｉｉｉ）接触の前後に前記物質の少なくとも１つの活性、又は値、又は前記活性及び値の両者を比較すること
を含む方法を特徴とする。
【００４９】
好ましくは、前記蛋白質分子又はその変異体の機能は、変性及び／又は細胞死から細胞を保護することである。好ましくは、配列番号２に記載のｃＤＮＡの相補体とハイブリダイズし得る前記ＤＮＡは、変性及び／又は細胞死から細胞を保護する機能を有する蛋白質分子をコードする。
【００５０】
本発明の他の特徴及び長所は、以下の図面の詳細な説明、実施例及び請求項から明らかであろう。
【００５１】
図１は、アルツハイマー症の脳領域の選択的な損傷の受けやすさを示す。下位側頭葉、内側嗅皮質、海馬、及び小脳扁桃内のニューロンは、アルツハイマー症において顕著に変性される（テリー(Terry)ら、Annals of Neurology、10、184-192、1981）。これらの脳領域は、学習及び記憶機能の処理に顕著に関連する。それに対して、前頭葉、頭頂葉、及び後頭葉内のニューロンは、大部分が変性されず、アルツハイマー症における神経変性過程から保護されている。
【００５２】
図２は、アルツハイマー症患者の脳領域において特異的に発現された遺伝子の同定を開示する。脳領域は、多くのニューロン細胞の損失が生じる脳範囲並びに多数の保護されたニューロンを有する範囲が同定され、かつＲＮＡが抽出された。ｃＤＮＡの合成が、オリゴ−ｄＴプライマーを用いて行われ、次いでランダムプライマー及び（α35Ｓ）−ｄＡＴＰと組み合わせたオリゴ−ｄＴプライマーを用いたＰＣＲを行った。反応物をＤＮＡシーケンシングゲル(sequencing gels)上で分離し、放射能写真撮影(autoradiography)によって視覚化されたＤＮＡバンド及び異なる強度で明るくなったバンドを切り取った。ＤＮＡバンドをＰＣＲによって再び増幅し、大腸菌においてクローン化し、配列を決定した。発現及び機能分析を行った。
【００５３】
図３は、実施例において使用された場合のアルツハイマー症脳組織の細目(specifications)を示す。アルツハイマー症患者及び対照被験者からの脳組織を、死後６時間以内に取り除き、ドライアイス上で直ちに凍結させた。
【００５４】
図４は、アルツハイマー症及び対照被験者からの脳組織中のＳＥＬＡＤＩＮ−１転写物のノーザン・ブロット分析による定量を示す。保護された脳領域、即ち、前頭葉と比較すると、激しい神経変性を受けた脳領域、即ち、通常の脳（ＮＢ１−３）ではなくてアルツハイマー症（ＡＤ１−３）の側頭葉において、転写物の値(transcript levels)は著しく低下した。この疾患は、ＲＮＡの定量導入(equal loading)を調節するために使用される変化しない(unchanged)β−アクチン転写物の値によって示されるように、特異的であった。
【００５５】
図５は、異なるヒト脳領域におけるＳＥＬＡＤＩＮ−１遺伝子の転写値(transcription levels)を示す。ＳＥＬＡＤＩＮ−１遺伝子は、ヒトの脳の全体に亘って発現されることが明らかになった。特に、全ての皮質領域、海馬、小脳扁桃、脊髄及び骨髄では、転写値が高い。アルツハイマー症のサインを全く示さない対照的な(cognitively)正常な対照被験者由来のこの脳において、側頭葉に対する前頭葉の値が変化しないことに注目して下さい。β−アクチン転写物の分析は、導入の対照(loading control)として使用された。
【００５６】
図６は、ヒトの脳組織中のＳＥＬＡＤＩＮ−１の分布を示す。ＲＮＡの比較試料をニトロセルロースフィルター上に滴下し(spotted)、ラベルしたＳＥＬＡＤＩＮ−１遺伝子に特異的なプローブを用いてハイブリダイゼーションによって、ＳＥＬＡＤＩＮ−１転写物を定量した。試験した全ての脳領域において、ＳＥＬＡＤＩＮ−１遺伝子転写物の高い値が観察された。転写物は他の組織においても検出されたが、シグナル強度の大きな変化によって、ＳＥＬＡＤＩＮ−１発現の組織に特異的な制御が示された。
【００５７】
図７は、切片上ハイブリダイゼーション(in situ hybridization)によって分析されたラットの脳皮質、海馬及び基底核(basal nucleus)におけるＳＥＬＡＤＩＮ−１遺伝子の発現を示す。高倍率の染色パターンは、ＳＥＬＡＤＩＮ−１がニューロンにおいて顕著に発現されることを示す。膠細胞(glial cells)とでは、高いハイブリダイゼーションシグナルは観察されなかった。
【００５８】
図８は、ラットの脳の核におけるＳＥＬＡＤＩＮ−１の発現を示す。動眼神経(occulomotor)、室傍核(paraventricular)、赤核及び顔面神経核(red and facial nuclei)において、ＳＥＬＡＤＩＮ−１の強い発現が観察された。更に倍率を上げると、ニューロンとの顕著なハイブリダイゼーションが見られる。膠細胞とでは、高いハイブリダイゼーションシグナルは観察されなかった。
【００５９】
図９は、ラットの脳の海馬及び黒質(substantia nigra)におけるＳＥＬＡＤＩＮ−１の発現を示す。ＳＥＬＡＤＩＮ−１転写物との切片上ハイブリダイゼーションが、感光乳剤放射能写真撮影(photoemulsionautoradiography)によって検出され、この遺伝子のニューロンに特異的な発現が確認された。
【００６０】
図１０は、トランスフェクトされたコス細胞(cos cells)におけるＳＥＬＡＤＩＮ−１−ＥＧＦＰ（強化型(enhanced)緑色蛍光蛋白質）融合の細胞以下の(subcellular)局在化を示す。共焦点顕微鏡写真(confocal micrographs)は、ゴルジ装置(Golgi apparatus)及び内部原形質細網(endoplasmic reticulum)におけるＳＥＬＡＤＩＮ−１の局在化を示すゴルジ特異的染色ＢＯＤＩＰＹ ＴＲセラミドとＳＥＬＡＤＩＮ−１−ＥＧＦＰが同じ場所に局在すること(co-localization)を示す。
【００６１】
図１１は、ＳＥＬＡＤＩＮ−１−ＥＧＦＰ融合が、ＳＥＬＡＤＩＮ−１蛋白質のＮ末端に隣接する被殻の(putative)ミトコンドリアの配列をターゲットにしているにもかかわらず、トランスフェクトされたコス細胞においてミトコンドリアに局在しないことを開示する。共焦点顕微鏡写真は、ＳＥＬＡＤＩＮ−１−ＥＧＦＰ融合及び特異的なミトコンドリア染色ミト・トラッカー赤色(mitochondrial stain Mito Tracker Red)ＣＭ−Ｈ2ＸＲｏｓによって引き起こされる異なる染色パターンを示す。
【００６２】
図１２は、多数の配列の並びに基づくＳＥＬＡＤＩＮ−１蛋白質の構造的特徴及び二次構造の予想(predictions)を開示する。ＳＥＬＡＤＩＮ−１蛋白質は、トランスフェクトされたコス細胞において、又はＥＧＦＰ融合において使用される場合に不活性であることを示す被殻のミトコンドリアの局在シグナルをN末端付近に含む。蛋白質の中央領域には、一群の酸化還元酵素(a family of oxidoreductases)と相同的な配列が含まれ、かつ共有結合のためのＦＡＤ部位が含まれる。蛋白質は、５つのトランスメンブラン(transmenbrane)領域を含むことが予想される。ニューロンにおける発現、ＳＥＬＡＤＩＮ−１蛋白質、アミロイド前駆体蛋白質(APP)並びにプレセニリン(presenillins)PS1及びＰＳ２ゴルジ装置及び内部原形質細網において同じ場所に局在すること、更にトランスメンブランの特徴は、これらの蛋白質の間の機能的関連性を示唆する。ＡＰＰ及びプレセニリンの両者における突然変異が、β−アミロイドの生成の増加を引き起こすことが示された。同様の方法において、ＳＥＬＡＤＩＮ−１蛋白質は、アミロイド前駆体蛋白質の処理及びＡβの生成に影響を与える一般的な生物学的経路に関連することもある。ＳＥＬＡＤＩＮ−１蛋白質をプローブとして用いると、新しいＡＤ薬の目標を表し得る相互作用パートナーを同定することができる。
【００６３】
図１３は、ＳＥＬＡＤＩＮ−１蛋白質の蛋白質配列（配列番号１）を開示する。蛋白質の全長は、５１６個のアミノ酸残基からなる。一文字のアミノ酸コードによって配列を示す。
【００６４】
図１４は、４２４８個のヌクレオチドを含むクローン化ＳＥＬＡＤＩＮ−１ｃＤＮＡ（配列番号２）のヌクレオチド配列を開示する。ＳＥＬＡＤＩＮ−１蛋白質をコードする配列は、１００位から始まり、１６４８位で終了する。
【００６５】
図１５は、４２４８個のヌクレオチドを含むクローン化ＳＥＬＡＤＩＮ−１ｃＤＮＡと４１８６個のヌクレオチドを含むＫＩＡＡ００１８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の比較を開示する。ＫＩＡＡ００１８配列ではＣヌクレオチド（Ｃ／Ｇ塩基対）がないＳＥＬＡＤＩＮ−１配列の１２２８位に大きな違いがある。これにより、ＳＥＬＡＤＩＮ−１配列と比較して、ＫＩＡＡ００１８配列において、 オープン・リーディング・フレーム(open reading frame)におけるフレームシフト(frameshift)が引き起こされる。その結果、ＳＥＬＡＤＩＮ−１翻訳生成物が５１６アミノ酸残基長であるのに対し、ＫＩＡＡ００１８遺伝子の翻訳生成物は３９０アミノ酸長である。フレームシフトにより、長さの違いに加えて、ＫＩＡＡ００１８蛋白質のＣ末端の１４個のアミノ酸とＳＥＬＡＤＩＮ−１ポリペプチドの対応する配列領域（３７７−３９０位）との間の違いが生じる。ＳＥＬＡＤＩＮ−１蛋白質をコードする配列は、１００位のヌクレオチドから始まり、１６４８位で終了する。
【００６６】
図１６は、ＳＥＬＡＤＩＮ−１のアミノ酸配列を示す。死後４時間以内の組織病理診断によって３つの脳中の同じ被験者の下位側頭葉皮質中の確認された神経変性によって選択的に損傷されやすい細胞群において、及び前頭葉又は感覚運動(sensory-motor)皮質において異なって発現される遺伝子を同定するために、示差表示(differential display)を行う（カマー．Ｈ．(Kammer, H)ら、核酸研究(Nucleic acid research)、27、2211、1999より; カマー．Ｈ(Kammer, H)ら、J. Biol. Chem. 273、14538、1998より）。４０個の異なるプライマーの組合せを用いることにより、３６個の異なって発現されたｃＤＮＡのうちの２８個をクローン化し、配列決定した。２つのＡＤ脳領域の間の異なる発現を確認するために、これらのｃＤＮＡを、逆ノーザン・ブロット(reverse Northern blotting)によって更に分析した（ポイラー.G.M-C.(Poirier G.M.-C.)ら、Nucleic Acid Res.、25、913、1997；ファン・ゲルダーR.N.(Van Gelder R. N.)ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、87、1663、1990）。これらのｃＤＮＡのうちの１つの発現は、感覚運動皮質よりも下部側頭葉において顕著に減少した。それ故、ＡＤの脳における選択的な損傷の受けやすさに対するこの転写物の潜在的な重要性を調査した。ｃＤＮＡ配列は、４２４８個のヌクレオチドからなり、５１６個のアミノ酸残基のオープン・リーディング・フレームをコードした。１１６７位のヌクレオチドにシチジン(cytidine)を挿入したため、この配列は、ゲンバンク(GenBank)に寄託されたその相同(homolog)ＫＩＡＡ００１８のより一層短いコード領域とは異なっていた(ノムラ(Nomura)ら、DNA Res. 1、27、1994；ゲンバンク・データベース・アソシエーション(GenBank database accession) HUMRSC390D13643、1、1992；ＤＩＭＨヒューマン(DIMH Human) Q15392、1998)。新しい遺伝子は、ＳＥＬＡＤＩＮ−１と呼ばれている。酸化還元酵素との相同領域を、赤色で強調し、他の種類の“ジミヌト(diminuto)様蛋白質”との相同部を下線で示す。最初の２１個のアミノ酸残基は、被殻のシグナルペプチドを表す。この被殻のカスパゼ(caspase)認識モチーフ“ＬＥＶＤ”は、ＳＥＬＡＤＩＮ−１アミノ酸配列の１２１−１２５位に存在する。カスパゼ３又は６によるＳＥＬＡＤＩＮ−１のインビトロ切断によって、それぞれ約５０、４０、３０、及び２０ｋＤａの４つの異なるＳＥＬＡＤＩＮ−１フラグメントが生成された。二次構造の予想は、少なくとも４つの考えられ得るトランスメンブラン領域を明らかにした。
【００６７】
図１７は、アルツハイマー症（AD）の脳及び正常な対照の脳のノーザン・ブロットを示す。ＳＥＬＡＤＩＮ−１の発現は、前頭葉と比べて下位側頭葉において本質的に低かった。それに対して、正常な対照の脳中のこれら２つの領域の間には、発現の違いはなかった（図１７Ａ、Ｂ）。従って、示差表示及び逆ノーザン・ブロットの両方によって最初に観察された個々のＡＤ脳内の側頭葉と前頭葉の皮質間のＳＥＬＡＤＩＮ−１の発現の違いが、他の３人の患者においてそれぞれ確認された。ＳＥＬＡＤＩＮ−１は、ヒトの脳全体に亘って強く発現され、皮質において、延髄(medulla oblongate)、及び脊髄において、並びに黒質及び海馬において、最も多く発現された（図１７Ｂ）。Ａ．トリゾール試薬(Trizol Reagent)（ギブコ(Gibco)）によって３人の異なるＡＤの脳の前頭葉皮質又は下位側頭葉皮質から抽出された１列当たり１０μｇの全ＲＮＡを、０．８％ホルムアルデヒド−アガロースゲル上で分離し、ハイボンド−Ｎ+−ナイロン膜(Hybond-N+-Nylon Membrane)（アマシャム(Amersham)）上でブロットした。脳１：死後３時間３０分、男性、７２歳。脳２：死後１時間３０分、男性、６２歳。脳３：死後４時間、女性、６３歳。対照の脳：正常な脳、死後１時間１０分、女性、８０歳。多数のヒト脳組織のノーザン・ブロットＩＩ及びＩＩＩにおいてブロットしたもの(blots)を、１−３５０５位のヌクレオチドからのＳｅｌａｄｉｎ−１の32Ｐラベル（32P-labeled）ｃＤＮＡプローブ及びクロンテック(Clontech)製のヒトβ−アクチンの32PラベルｃＤＮＡ対照プローブとハイブリダイズさせた。Ｂ．多数のヒトの脳組織のノーザン・ブロットＩＩ(クロンテック(Clontech) ７７５５−１)及びＩＩＩ（クロンテック(Clontech) ７７５０−１）は、１６人の異なるヒトの脳領域からのポリＡ＋ＲＮＡを、一列当たり２μｇ含んでいた。ブロットしたものを、Ａに記載したものと同じプローブとハイブリダイズさせた。
【００６８】
図１８は、ラットの脳におけるＳｅｌａｄｉｎ−１の発現を示す。パラホルムアルデヒド固定低温部(paraformaldehyde fixed cryostat sections)上での切片上ハイブリダイゼーションを、ハートマン(Hartman)らによって記載されたように行った(ディベロップメンタル・ニューロサイエンス(Developmental Neuroscience) 17、246、1995)。Ｓｅｌａｄｉｎ−１のオープン・リーディング・フレームの６５０ｂｐ及び９００ｂｐフラグメントを、以下のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した：
1s (76-99) 5' GCG CTT ACC GCG CGG CGC CGC ACC 3' (配列番号３)
1as (749-726) 5' GAC CAG GGT ACG GCA TAG AAC AGG 3' (配列番号４)
3s (803-826) 5' AGA AGT ACG TCA AGC TGC GTT TCG 3' (配列番号５)、及び
3as (1749-1726) 5' TTC TCT TTG AAA GTG TGG ATC TAG 3' (配列番号６)
ＰＣＲフラグメントをｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ(Promega)）においてクローン化し、ＥｃｏＲＩによって切断し、ｐブルースクリプト(pBluescript)ＫＳ+においてクローン化した。ＥｃｏＲＩクローン化フラグメントの配向(orientation)をＰＣＲによって分析した。35Ｓラベルアンチセンス及びセンスリボプローブを、製造者の指示に従って、アンビオン・マキシスクリプト・キット(Ambion Maxiscript kit)を用いて、Ｔ３及びＴ７ポリメラーゼによってそれぞれＮｏｔｌ及びＣｌａｌ線形化(linearized)プラスミド上で生成した。ハイブリダイズした断片をＮＴＢ−３写真用乳剤(photographic emulsion)（コダック(Kodak)）に浸漬し、５週間感光させ、メイヤー・ヘマラム(Mayer's hemalum)において対比染色剤着色した(counterstained)。Ａ、Ｄ、Ｇは、乳剤に浸漬した断片の顕微鏡写真を示す。ｐｖｎは、室旁核、ｂｎＭは、マイネルト(Meynert)の基底核、ａｍｙは、小脳扁桃、ｏｃｍｎは、動眼神経核、ｒｎは、赤核、ｆｎは、顔面神経核である。Ｂは、海馬回(hippocampal)領域の暗視野照明の引き伸ばし写真(darkfield illumination blow up)である。ｄｇは、回(gyrus)意味する。Ｃは、皮質層５のｃｌ Ｖの暗視野照明法の引き伸ばし写真である。Ｅ、Ｈは、Ｄ及びＧからの対象領域の高倍率の明視野(brightfield)顕微鏡写真である。Ｆ、Ｉは、銀粒子によって染色した単一のニューロンを示すための、高倍率のＤＩＣ（微分干渉比較(differential interference contrast)）照明(illuminations)である。ラットの脳中では、海馬回領域ＣＡ３において（図１８Ａ、Ｂ）、皮質層５の角錐状ニューロンにおいて（図１８Ａ、Ｃ）、小脳扁桃において（図１８Ａ）、マイネルトの基底核の大形細胞(magnocellular)ニューロンにおいて（図１８Ａ）及び黒質の網状帯において（データは示さず）、ＳＥＬＡＤＩＮ−１の発現が多かった。また、転写物は、室傍核（図１８Ａ）、動眼神経核（図１８Ｄ、Ｅ）、顔面神経核（図１８Ｇ、Ｆ）並びに赤核（図１８Ｄ、Ｅ）においても検出された。
【００６９】
図１９は、ヒトＡＤ（Ａ−Ｄ）及び正常な脳（Ｅ−Ｈ）の切片上ハイブリダイゼーションを示す。埋め込んだ断片 (embedded sections)における切片上ハイブリダイゼーションを、U. Susens, Dev. Neurosci. 19, 410, 1997に記載のように行った。35Ｓラベルリボプローブは、図１８に記載のようにｐブルースクリプトＫＳ+においてクローン化されたＳｅｌａｄｉｎ−１のオープン・リーディング・フレームの最初の６５０個のヌクレオチドから得られた。ハイブリダイズしたスライドを、コダック(Kodak)ＮＴＢ−２乳剤に浸漬し、４時間感光させた。現像後、断片をジェムサ(Giemsa)によって染色した。Ａ、Ｃ、Ｅ及びＧは、暗視野照明を示し、Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈは、対応する明視野照明の顕微鏡写真を示す。明視野写真における銀粒子の鮮明度(visibility)を高めるために、高倍率を示す。Ａ、Ｂは、ＡＤ脳の前頭葉中央部の(midfrontal)皮質におけるＳｅｌａｄｉｎ−１のハイブリダイゼーションパターンを表し、Ｃ、Ｄは、ＡＤ脳の上位側頭葉におけるハイブリダイゼーションパターンを表す。Ｅ、Ｆは、正常な脳の前頭葉中央部の皮質におけるＳｅｌａｄｉｎ−１のハイブリダイゼーションパターンを表す。Ｇ、Ｈは、正常な脳の上位側頭葉におけるハイブリダイゼーションパターンを表す。矢印の先は、銀粒子が充填されたニューロンを示し、矢印は、少量の粒子のみを含むニューロンを示す（Ｄ）。単一のニューロン内でのＳＥＬＡＤＩＮ−１の発現の研究のためのヒトＡＤ及び対照の脳の切片上ハイブリダイゼーションによって、ＡＤ脳における前頭葉皮質におけるニューロンと比較して、ＳＥＬＡＤＩＮ−１ ｍＲＮＡが、側頭葉皮質の残存(remaining)ニューロンにおいて減少したことが示された（図１９、Ａ−Ｄ、矢印）。それに対して、正常な脳では、ＳＥＬＡＤＩＮ−１のニューロンの発現は、前頭葉皮質と側頭葉皮質との間で同じであった（図１９、Ｅ−Ｈ、矢印の先）。これにより、示差表示及びノーザン・ブロット分析からのデータが立証された。ＡＤ脳において前頭葉皮質での値と比較した側頭葉皮質でのＳＥＬＡＤＩＮ−１ ｍＲＮＡの値の減少は、細胞損失だけに起因するのではなく、残存ニューロン内でも減少した。
【００７０】
図２０．被殻の酸化還元酵素としてのＳＥＬＡＤＩＮ−１の機能を分析するために、ヒトＨ４神経膠腫(neuroglioma)細胞を、そのＣ末端において融合させたＳｅｌａｄｉｎ−１によって、ＥＧＦＰ（強化型緑色蛍光蛋白質、クロンテック(Clontech)）へ安定的に(stably)トランスフェクトした。Ａ．２００μＭのＨ2Ｏ2を含むＯｐｔｉＭｅＭ１において、３つのｓｅｌａｄｉｎ−１−ＥＧＦＰクローン及び３つのＥＧＦＰ対照クローンのインキュベーションの１０時間後及び１６時間後、培養皿に付着した残存細胞並びに上清中の細胞を採取し、生存可能な細胞を生存可能でない細胞と区別するために、標準フロー・サイトメトリーの生存率プローブ(standard flow cytometric viability probe)として７−アミノ−アクチノマイシン(actinomycin)Ｄ(7-ADD)によって染色した。死んだ細胞及び損傷された細胞の膜のみが、このＤＮＡ色素に浸透することができ、そして染色することが可能である。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｉｕｒ（ベクトン・ディケンソン(Becton Dickinson)）上で、クローン当たり１０5個の細胞を計測し、生死計測(Live/dead counts)を行った。３回行った２つの実験の平均を示す（±ＳＥＭ）。全てのＳＥＬＡＤＩＮ−１発現クローンは、Ｈ2Ｏ2によって誘発される酸化ストレスに対して、非トランスフェクト又はＥＧＦＰ発現クローンのいずれかよりもはるかに耐性を示した。２００μｍのＨ2Ｏ2による処理の１０時間後に、ほぼ９０％のＳＥＬＡＤＩＮ−１発現細胞及び７５−８０％の対照細胞が生存していた；しかし、２００μｍのＨ2Ｏ2によるインキュベーションの１６時間後には、８０％のＳＥＬＡＤＩＮ−１発現細胞がまだ生存していたのに対し、この時点で、対照細胞は、５２％のみが生存していた。未処理の対照クローンは、同じ時間間隔で最大５％の細胞の死亡を示した。酸化ストレスに更に曝した後のＳＥＬＡＤＩＮ−１発現細胞の生存率の増加が、２つの別々のアプローチによって確認された：１つ目では、細胞培養皿上でのトリパンブルー(trypan blue)染色細胞において生死計測を行い、１０個の無作為に選んだ範囲において位相差顕微鏡(phase-contrast microscopy)で視覚化した。２つ目では、カバーガラス上で成長させ、４％パラホルミアルデヒドで固定した細胞核を、ヘキスト色素３３３４２(Hoechst dye 33342) (モレキュラー・プローブス(Molecular Probes))によって染色し、蛍光顕微鏡によって視覚化した（データは示さず）。これらの測定によって、ＳＥＬＡＤＩＮ−１の発現は、細胞死の誘発に対する抵抗力を与えた。
【００７１】
Ｂ．アポトーシス(apoptotic)細胞死に対する初期マーカーを決定するために、３つのＳＥＬＡＤＩＮ−１−ＥＧＦＰクローン及び３つのＥＧＦＰ対照クローンの細胞溶菌液中のカスパゼ３の活性を、ファーミンゲン(Pharmingen)製カスパゼ３検定キットを用いて測定した。２又は４時間の２００μＭのＨ2Ｏ2によるアポトーシスの誘発後にそれぞれ、細胞を、ＰＢＳ中で簡単に洗浄し、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．５、 １３０ｍＭのＮａＣｌ、１％のトリトン(Triton)−Ｘ−１００、１０ｎＭのＮａＰＰｉ (１ｍｌ当たり２００万個の細胞(2 million cells/ml))に溶解した。９６マルチウェルプレート(96 multiwell plate)において、３７℃で２００μｌのＨＥＰＥＳバッファー中で５μｇのカスパゼ３蛍光遺伝子基質(fluorogenic substrate)Ａｃ−ＤＥＢＤ−ＣＨＯとインキュベートした。カスパゼ切断後、Ａｃ−ＤＥＶＤから遊離させたＡＭＣを、励起波長３８９ｎｍ及び４２０−４６０ｎｍの発光波長スペクトルにおいて分光蛍光計(spectrofluorometer)において測定した。２つの実験を３回行い、ＲＦＵ（相対蛍光単位(relative fluorescence units)）において測定したカスパゼ３活性の平均値を示す（±ＳＥＭ）。２００μＭのＨ2Ｏ2を用いたアポトーシスの誘発の２時間後には、カスパゼ３活性は、ＳＥＬＡＤＩＮ−１−ＥＧＦＰクローン又はＥＧＦＰ−対照クローンのいずれにおいても検出できなかった。しかし、４時間後には、カスパゼ３の活性は、大幅に増加し、３つのＥＧＦＰ−対照クローンでは、３つのＳＥＬＡＤＩＮ−１−ＥＧＦＰクローンと比較して、約２倍高くなったことが観察された。このカスパゼ３活性の増加は、カスパゼ阻害剤Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯによるいずれかの条件において阻害された。
【００７２】
図２１は、ＳＥＬＡＤＩＮ−１の細胞以下の局在化を示す。ＥＧＦＰのＮ末端とＳＥＬＡＤＩＮ−１との融合蛋白質(fusionprotein)を安定して発現する１１４人のヒト神経膠腫細胞(クロンテック(Clontech))を、カバーガラス上で成長させ、４％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳにおいて固定し、又は固定前に２５０ｎｍの赤色蛍光ミトコンドリア染色ミト・トラッカー赤色ＣＭ Ｈ2Ｘｒｏｓ（モレキュラー・プローブ(Molecular Probes)）によって４５分間処理した。固定後、ミト・トラッカーによって予め染色しなかった(prestained)細胞を、０．２％トリトン(Triton)−Ｘ−１００含有PBSにおいて浸透化し(permeablized)、５％の低脂肪乳、０．１％トリトン(Triton)−Ｘ−１００含有ＰＢＳにおいて４℃で一晩阻害した。細胞を、室温で２時間マウスのアンチ蛋白質ジスルフィド異性化酵素に対するモノクローナル抗体(anti-protein disulfide isomerase)(antiPDImAb、ストレスゲン・バイオテクノロジーズ社(StressGen Biotechnologies Corp.))、小胞体(endoplasmic reticulum)に対するマーカーとインキュベートし、洗浄し、アンチマウスＩｇＧ、ＣＹ３ラベル第二抗体（アマシャム(Amersham)）と更に１時間インキュベートした。共焦点走査顕微鏡(confocal laser scanning microscopy)によって細胞を視覚化した。Ａ、Ｄ：緑色蛍光ＳＥＬＡＤＩＮ−１−ＥＧＦＰ融合蛋白質の細胞以下の分布。Ｂ：ａｎｔｉＰＤＩｍＡｂ及び赤色蛍光ＣＹ３ラベル第二抗体による小胞体の染色。Ｃ：Ａ及びＢからのオーバーレイ(overlay)は、黄色蛍光で示したＳＥＬＡＤＩＮ−１とＥＲ−マーカーとの同じ場所での局在化を示す。Ｅ：赤色蛍光ミト・トラッカーＣＭ Ｈ2ＸＲｏｓによるミトコンドリアの染色。Ｆ：Ｄ及びＥのオーバーレイ。これらの同じ場所での局在化を、ミトコンドリアではなく小胞体に主に局在するＳＥＬＡＤＩＮ−１−ＥＧＦＰが、ＳＥＬＡＤＩＮ−１のＮ末端での被殻のミトコンドリア局在化シグナルの存在を意味する(despote)ことが示されたいくつかの細胞以下のオルガネラ(organelles)に対するマーカー及び抗体によって研究する。
【００７３】
新規遺伝子と共に、ＦＡＤ−依存性酸化還元酵素新規遺伝子との相同性を有するＳＥＬＡＤＩＮ−１を同定した。それが、ＡＤ脳中の選択的に損傷を受けやすい領域においてダウンレギュレーションされた(down-regulated)ことが示された。ＡＤ脳断片の切片上ハイブリダイゼーションによって、ｍＲＮＡ値の減少が、影響を受けた領域における神経損失に起因するだけでなく、残存ニューロンのｍＲＮＡ発現の減少も表すことが示された。Ｈ４細胞におけるＳＥＬＡＤＩＮ−１の発現は、酸化ストレスによるアポトーシスに対する抵抗力を与え、更に、アポトーシスが生じた後に、ＳＥＬＡＤＩＮ−１は、被殻のカスパゼ切断部位において切断され、そのため、おそらく不活性化される。これらの結果は、ＳＥＬＡＤＩＮ−１は、酸化ストレスから細胞の構造(machinery)を保護する細胞、特にニューロンの不可欠な要素(integral component)であることを示す。一旦酸化ストレスが圧倒的になると、ＳＥＬＡＤＩＮ−１は、アポトーシスの間のカスパゼの作用のターゲットになる。ＳＥＬＡＤＩＮ−１は、変性及び細胞死から細胞を保護するための治療に効果的な介在(intervention)の高い可能性のある(candidate)遺伝子である。それは特に、Ａβによって誘発される細胞毒(Aβ induced incytotoxicity)からニューロンを保護するための治療に効果的な介在の高い可能性を有する遺伝子である。
【００７４】
【実施例】
実施例１
死後のアルツハイマー症の脳組織
アルツハイマー症の患者及び対照被験者から、死後６時間以内に脳組織を取り除き、ドライアイス上で直ちに凍結させた。平行な断片を組織病理診断の確認及び細胞数計測のために、ホルムアルデヒド中に固定した。多くのニューロン細胞の損失が生じた領域並びに大部分のニューロンが保護された領域を、遺伝子発現の比較のために同定し、ＲＮＡ抽出が行われるまで−８０℃で貯蔵した。
【００７５】
示差表示ＰＣＲによるＳＥＬＡＤＩＮ−１の同定
死後の脳組織からの全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン(Qiagen)）を用いることにより調製した。ＲＮＡ調製物を、ＤＮａｓｅ Ｉ（ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim)）及びＲＮＡｓｉｎ（プロメガ(Promega)）によって３０分間処理し、次いでフェノール抽出を行い、エタノール沈殿させた。１つの塩基固定(base ancor)プライマーＨＴ11Ａ、ＨＴ11Ｃ及びＨＴ11Ｇを有する拡大逆転写酵素(Expand Reverse Transcriptase)（ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim)）を用いることによって、各ＲＮＡ抽出物０．２ｍｇをｃＤＮＡに転写した。以下のＰＣＲ反応において、ランダムプライマーHAP-5 (5'-TGCCGAAGCTTGGAGCTT-3') and HAP3-T (5'TGCCGAAGCTTTGGTCAT-3')と共にＨＴ11Ａを用いることにより、ｃＤＮＡを増幅した。Ｔａｑ−ポリメラーゼ(Taq-polymerase (アンプリタク(AmpliTaq)、パーキン・エルマー社( Perkin Elmer Corp.))、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰ(アマシャム・ファルマシア・バイオテク(Amersham Pharmacia Biotech)並びに(α35S)−ｄＡＴＰ(ＮＥＮライフサイエンスプロダクツ(NEN life science products))を、ザオ(Zhao)らによるＰＣＲプロトコルにおいて使用した。６％のポリアクリルアミド−尿素シーケンシングゲル上でＰＣＲ生成物を分離し、続いて３ｍｍの濾過紙（ワットマン(Whatman)）上で完走させ、そしてＸ線フィルム（デュポン(Dupont)）を１２時間感光させた。
【００７６】
クローニング及びシーケンシング
ゲルから異なるバンドを切り取り、１０分間水中で煮沸し、遠心分離し、そしてエタノール及びグリコゲン／酢酸ナトリウムを用いて上清液からｃＤＮＡを沈殿させ、次いで０．０２５ｍｍのフィルター（タイプＶＳ、ミリポア(Millipore)）によって１時間１０％グリセロールで透析した。非特異的アニーリングのための初期サイクル以外は示差表示ＰＣＲと同じ条件下で行われる再増幅反応の鋳型として、透析物を使用した。得られたＰＣＲ生成物を、アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＱＩＡＥＸＩＩアガロースゲル抽出キット(QIAEXII Agarose Gel Extraction Kit )(キアゲン(Qiagen))によってゲルから精製し、ｐブルースクリプトＫＳ（ストラタジーン(Stratagene) ）のＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位にクローン化した。クローン化したｃＤＮＡフラグメントを、Ｔ３及びＴ７プライマーを用いることにより、ＡＢＩ ３７７ ＤＮＡシーケンサー(ABI 377 DNA sequencer)(パーキン・エルマー社(Perkin Elmer Corp.))によって配列決定した。
【００７７】
ＳＥＬＡＤＩＮ−１ ｃＤＮＡフラグメントの増幅
ＰＣＲ反応のために、ＲＮＡ高適合度Ｔａｑ−ポリメラーゼ(RNA High Fidelity Taq-polymerase)（ベーリンガー・マンハイム(Boehringer Mannheim)）及びＳＥＬＡＤＩＮ−１−特異的プライマーを用いることによりヒトの脳組織から転写したｃＤＮＡを用いることにより、１分間７０℃のアニーリングを４０サイクル行い、ＳＥＬＡＤＩＮ−１ ｃＤＮＡフラグメントを増幅し、７２℃で３分間重合させた。アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲ生成物を分離し、精製し、そしてｐブルースクリプトＫＳ（ストラタジーン(Stratagene) ）のＳｍａ Ｉ制限部位へクローン化した。クローン化したＰＣＲ生成物の配列決定を行い、ヒトの脳のｃＤＮＡライブラリ(library)のスクリーニング及びノーザン・ブロットの精密な分析(probing)の両者のためのプローブとして、制限(restriction)を使用した。
【００７８】
ノーザン・ブロット
製造者の指示に従ってトリゾール試薬（ギブコ ＢＲＬ(Gibco BRL)、ライフテクノロジーズ(Life Technologies)）を用いることにより、死後のヒトの脳からの全ＲＮＡを調製した。１％ホルムアルデヒド含有アガロースゲルにおいて５−１０ｍｇのＲＮＡを分離し、ナイロン膜（ハイボンド−Ｎ+(Hybond-N+)、アマシャム(Amersham)） 上へＲＮＡをブロットした。メガプライムＤＮＡラベリング・キット(Megaprime DNA labelling kit)（アマシャム(Amersham)）を用いることにより生成された(α−32Ｐ)―ｄＣＴＰ(ＮＥＮ)ラベルＳＥＬＡＤＩＮ−１−特異的ｃＤＮＡプローブと膜をハイブリダイズさせた。非常にストリンジェントな条件下で膜を洗浄し、Ｘ線フィルムを１−７２時間感光させた。ＲＮＡの等量導入(equal loading)を制御するために、ヒトのグリセロールアルデヒド−３−リン酸塩脱水素酵素(glycerolaldehyd-3-phosphate dehydrogenase) (GAPDH)の７００ｂｐのｃＤＮＡフラグメントにより、又はｂ−アクチンｃＤＮＡフラグメント（クロンテック(Clontech)）によって同じ膜を精密に分析した。
【００７９】
切片上ハイブリダイゼーション
オープン・リーディング・フレームの初期の２対を表す６５０ｂｐ及び９００ｂｐのいくつかのＳＥＬＡＤＩＮ−１−特異的ｃＤＮＡプローブを、ｐブルースクリプトＫＳ（ストラタジーン(Stratagene) ）においてクローン化し、アンビオン転写キットを用いることにより、35Ｓ−ＣＴＰの存在下で逆転写した。クライオミクロトーム(cryomicrotome)で切り出した大人のラットの脳の１４ｍｍの断片を用いて切片上ハイブリダイゼーションを行い、アミノアルキルシランで処理したスライド上に載せ、室温で５分間、４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ中に固定した。ＰＢＳ中で５分間洗浄した後、１０分間断片をアセチル化し(acetylated)、濃度を上げた一連のエタノールに通し、空気乾燥した。５０％の脱イオンした(deionised)ホルムアミド、１０ｍMのＤＴＴ、２５０ｍｇ／ｍｌのニシン変性精液ＤＮＡ及び２５０ｍｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡにおいて予めハイブリダイゼーションを行った。１０％のデキルトランスルフェート(dextransulphate)を加えた同じバッファー中で２００−５０００ｃｐｍ／ｍｌに希釈したＲＮＡセンス及びアンチセンスプローブとスライドを５０℃で１２時間ハイブリダイズさせた。その後４倍希釈した(4×)ＳＣＣ中での５分間の洗浄をそれぞれ４回行い、スライドを洗浄し、次いで４０ｍｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅＡを含む０．５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡにおいて３０分間インキュベートし、そしてＲＮＡｓｅＡなしで更に３０分間インキュベートした。その後、５０℃で１５分間、２倍希釈した(2×)ＳＣＣ中で２回スライドを洗浄し、徐々に濃度を上げた(graded)エタノールによって乾燥させた。スライドを、コダック・バイオマックスＸ線フィルム(Kodak Biomax x-ray films)に１５分間感光させ、続けてコダックＮＴＢ−３核トラック乳剤(Kodak NTB-3 nuclear track emulsion)に浸漬し、６週間感光させた。コダックＤ１９において現像し、コダック・ユニフィックス(Kodak Unifix)において固定した後、メイヤー・ヘマローンによって対比染色剤着色し、カバーガラスを載せた(coversplipped)。
【００８０】
組織培養におけるＳＥＬＡＤＩＮ−１−ＥＧＦＰ融合蛋白質の組換え型発現
ＳＥＬＡＤＩＮ−１の完全なコード領域を、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１−発現ベクター（クロンテック(Clontech)）のＮ末端へサブクローン化した(subcloned)。製造者の指示に従い、キアゲン(Qiagen)製スーパーフェクト・トランスフェクション試薬(SuperFect transfection reagent)を用いることにより、ＥＧＦＰ又はＳＥＬＡＤＩＮ−１−ＥＧＦＰによってコス−７−細胞をトランスフェクトした。３ｃｍの皿において２日間、細胞を培養した。０．２５ｍＭのＢＯＤＩＰＹ ＴＲセラミド（モレキュラー・プローブ(molecular probes)）によって、ゴルジ装置のために細胞の一部を１時間染色し、その他の部分は、２５０ｎｍのミトコンドリア染色ミト・トラッカー赤色ＣＭ−Ｈ２Ｘｒｏｓによって４５分間処理した。適当なフィルターセットを用いる共焦点レーザー走査顕微鏡によってＳＥＬＡＤＩＮ−１−ＥＧＦＰ融合蛋白質の細胞以下の局在化を分析した。
【図面の簡単な説明】
【図１】アルツハイマー症の脳領域の選択的な損傷の受けやすさを示す。
【図２】アルツハイマー症患者の脳領域において特異的に発現された遺伝子の同定を開示する。
【図３】実施例において使用された場合のアルツハイマー症脳組織の細目を示す。
【図４】アルツハイマー症及び対照被験者からの脳組織中のＳＥＬＡＤＩＮ−１転写物のノーザン・ブロット分析による定量を示す。
【図５】異なるヒト脳領域におけるＳＥＬＡＤＩＮ−１遺伝子の転写値を示す。
【図６】ヒトの脳組織中のＳＥＬＡＤＩＮ−１の分布を示す。
【図７】ヒトの脳組織中のＳＥＬＡＤＩＮ−１の分布を示す。
【図８】切片上ハイブリダイゼーションによって分析されたラットの脳皮質、海馬及び基底核におけるＳＥＬＡＤＩＮ−１遺伝子の発現を示す。
【図９】ラットの脳の核におけるＳＥＬＡＤＩＮ−１の発現を示す。
【図１０】ラットの脳の海馬及び黒質におけるＳＥＬＡＤＩＮ−１の発現を示す。
【図１１】トランスフェクトされたコス細胞におけるＳＥＬＡＤＩＮ−１−ＥＧＦＰ融合の細胞以下の局在化を示す。
【図１２】ＳＥＬＡＤＩＮ−１−ＥＧＦＰ融合が、ＳＥＬＡＤＩＮ−１蛋白質のＮ末端に隣接する被殻のミトコンドリアの配列をターゲットにしているにもかかわらず、トランスフェクトされたコス細胞においてミトコンドリアに局在しないことを開示する。
【図１３】多数の配列の並びに基づくＳＥＬＡＤＩＮ−１蛋白質の構造的特徴及び二次構造の予想を開示する。
【図１４】ＳＥＬＡＤＩＮ−１蛋白質の蛋白質配列（配列番号１）を開示する。
【図１５】４２４８個のヌクレオチドを含むクローン化ＳＥＬＡＤＩＮ−１ｃＤＮＡ（配列番号２）のヌクレオチド配列を開示する。
【図１６】４２４８個のヌクレオチドを含むクローン化ＳＥＬＡＤＩＮ−１ｃＤＮＡ（配列番号２）のヌクレオチド配列を開示する（続き）。
【図１７】４２４８個のヌクレオチドを含むクローン化ＳＥＬＡＤＩＮ−１ｃＤＮＡ（配列番号２）のヌクレオチド配列を開示する（続き）。
【図１８】４２４８個のヌクレオチドを含むクローン化ＳＥＬＡＤＩＮ−１ｃＤＮＡと４１８６個のヌクレオチドを含むＫＩＡＡ００１８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の比較を開示する。
【図１９】４２４８個のヌクレオチドを含むクローン化ＳＥＬＡＤＩＮ−１ｃＤＮＡと４１８６個のヌクレオチドを含むＫＩＡＡ００１８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の比較を開示する（続き）。
【図２０】４２４８個のヌクレオチドを含むクローン化ＳＥＬＡＤＩＮ−１ｃＤＮＡと４１８６個のヌクレオチドを含むＫＩＡＡ００１８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の比較を開示する（続き）。
【図２１】４２４８個のヌクレオチドを含むクローン化ＳＥＬＡＤＩＮ−１ｃＤＮＡと４１８６個のヌクレオチドを含むＫＩＡＡ００１８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の比較を開示する（続き）。
【図２２】４２４８個のヌクレオチドを含むクローン化ＳＥＬＡＤＩＮ−１ｃＤＮＡと４１８６個のヌクレオチドを含むＫＩＡＡ００１８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の比較を開示する（続き）。
【図２３】４２４８個のヌクレオチドを含むクローン化ＳＥＬＡＤＩＮ−１ｃＤＮＡと４１８６個のヌクレオチドを含むＫＩＡＡ００１８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列の比較を開示する（続き）。
【図２４】ＳＥＬＡＤＩＮ−１のアミノ酸配列を示す。
【図２５】アルツハイマー症(AD)の脳及び正常な対照の脳のノーザン・ブロットを示す。
【図２６】アルツハイマー症(AD)の脳及び正常な対照の脳のノーザン・ブロットを示す。
【図２７】ラットの脳におけるＳｅｌａｄｉｎ−１の発現を示す。
【図２８】ヒトＡＤ（Ａ−Ｄ）及び正常な脳（Ｅ−Ｈ）の切片上ハイブリダイゼーションを示す。
【図２９】被殻の酸化還元酵素としてのＳＥＬＡＤＩＮ−１の機能の分析を示す。
【図３０】ＳＥＬＡＤＩＮ−１の細胞以下の局在化を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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