(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号：２により表されるポリヌクレオチド配列、
ｂ）Ｆａｄ２デサチュラーゼ遺伝子の発現を抑制できる３０ヌクレオチドを有する（ａ）のフラグメント、
ｃ）Ｆａｄ２デサチュラーゼ遺伝子の発現を抑制できる５０ヌクレオチドを有する（ａ）のフラグメント、
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のポリヌクレオチド配列と相補的なポリヌクレオチド配列からなる群から選択されるＦａｄ２デサチュラーゼ遺伝子発現を抑制できる配列を含む単離したポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
植物宿主細胞中で機能する異種プロモーターに操作可能に連結された請求項１に記載のポリヌクレオチド配列の少なくとも１つを含む組換えＤＮＡ構築体。
【請求項３】
該ポリヌクレオチド配列が、センス方向にある、請求項２記載の組換えＤＮＡ構築体。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチド配列のいずれか１つを含むＤＮＡ構築体、または請求項２もしくは３に記載の構築体を大豆植物種子において発現させ、ここに、該ポリヌクレオチドまたは該構築体は、該Ｆａｄ２デサチュラーゼ遺伝子を抑制でき、センスまたはアンチセンス方向に位置し；次いで、
該ポリヌクレオチド配列またはイントロンの転写が開始され、該Ｆａｄ２デサチュラーゼ遺伝子の該発現が抑制される条件下で、該種子を増殖させるステップを含み、ここに、該大豆種子は：
（ａ）２６〜８０％のオレイン酸、２．９７〜４９．９２％のリノール酸、および３．３８〜８．８１％のリノレン酸；または
（ｂ）５０〜７５％のオレイン酸、わずか１０〜３０％のリノール酸、およびわずか１〜３％のリノレン酸を含む油性組成物を含むことを特徴とする植物細胞中のデサチュラーゼ遺伝子発現を抑制する方法。
【請求項５】
請求項２もしくは３からの構築体を含む大豆植物種子であって、ここに、該大豆植物種子は：
（ａ）２６〜８０％のオレイン酸、２．９７〜４９．９２％のリノール酸、および３．３８〜８．８１％のリノレン酸；または
（ｂ）５０〜７５％のオレイン酸、わずか１０〜３０％のリノール酸、およびわずか１〜３％のリノレン酸を含む油性組成物を有し、または請求項４の方法により得ることができる大豆植物種子。
【請求項６】
請求項５記載の植物種子を含む植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
導入部分
本出願は、１９９９年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／１５１，２２４号、および１９９９年１２月１７日に出願された米国仮特許出願第６０／１７２，１２８号への優先権を特許請求するものである。
【０００２】
技術分野
本発明は核酸配列および構築体、およびこれらに関する方法を対象とする。
【０００３】
背景
植物油はさまざまな用途において使用される。生合成または天然植物源からの、新規な植物油組成物および／または油組成物を得るための改良された手段が必要とされている。意図する油の使用に応じて、さまざまな異なる脂肪酸組成物が望まれる。
【０００４】
このような油および／または改質された脂肪酸組成物を得るために必要とされる１つの手段は、植物の遺伝子工学によるものである。しかしながら、所望の表現型結果を生み出すことができる適切な核酸配列、このような配列の適切な用途を指示することができる調節領域などを同定することが必要である。
【０００５】
高等植物は、共通の代謝経路（脂肪酸シンターゼ経路）を介して脂肪酸を合成するようである。脂肪酸がグリセロール骨格に結合し、さらなる発芽用のエネルギー源として貯蔵用のトリグリセリドを形成する、増殖中の種子においては、プロプラスチド中にＦＡＳ経路が位置している。最初に行われるステップは、酵素アセチル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ（ＡＴＡ）によって触媒される、アセチル−ＣｏＡおよびＡＣＰからのアセチル−ＡＣＰ（アセチル保有タンパク質）の形成である。アセチル−ＣｏＡから炭素１６および１８個の脂肪酸への伸長は、以下の順序の反応の周期的作用を含む：マロニル−ＡＣＰからの２つの炭素ユニットを縮合させてβ−ケトアシル−ＡＣＰ（β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ）を形成し、ケト機能をアルコールに還元して（β−ケトアシル−ＡＣＰリダクターゼ）、エノイル−ＡＣＰを形成するために脱水させ（β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラーゼ）、最後にエノイル−ＡＣＰを還元して伸長した飽和アシル−ＡＣＰを形成する（エノイル−ＡＣＰリダクターゼ）。β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩはパルミトイル−ＡＣＰ（Ｃ１６：０）までの伸長を触媒し、一方β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩはステアロイル−ＡＣＰ（Ｃ１８：０）への最終的な伸長を触媒する。貯蔵グリセリド中に見られるオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸などの一般的な植物の不飽和脂肪酸は、ステアロイル−ＡＣＰの飽和度低下から誘導されるものであり、可溶性プラスチドΔ−９デサチュラーゼ（「ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ」と呼ばれることも多い）によって触媒される反応においてオレオイル−ＡＣＰ（Ｃ１８：１）を形成する。分子状の酸素には飽和度低下が必要であり、還元されたフェドロキシンがエレクトロン共ドナーとして働く。Δ−１２デサチュラーゼおよびΔ−１５デサチュラーゼが結びついた膜の作用によって、さらなる飽和度低下が順次に行われる。これらの「デサチュラーゼ」は、このようにしてモノまたはポリ不飽和脂肪酸をそれぞれ生み出す。
【０００６】
表現型がＦＡＳとなる核酸配列を得ると、油を生成させるための飽和度低下および／または脂肪酸のグリセロール骨格への取り込みは、当該代謝因子の同定、有用な動的性質を有する酵素源の選択および特徴付け、そのアミノ酸のシークエンシングが可能であるレベルまでの当該のタンパク質の精製（アミノ酸配列データを使用して所望のＤＮＡ配列を探索するためのプローブとして使用することができる核酸配列を得る）、および構築体の調製、結果として生じる植物の形質転換および分析を含めた（これらだけには限られないが）さまざまな障害の影響を受ける。
【０００７】
したがって、さらなる核酸配列標的および脂肪酸組成物を改質するための方法が必要とされる。詳細には、さまざまな範囲の異なる脂肪酸組成物を生成するための構築体および方法が必要とされる。
【０００８】
発明の概要
本発明は一般に、ゲノムデサチュラーゼポリヌクレオチド、詳細には二重結合の脂質アシル部分〔脂質アシル鎖においてカルボキシル末端から数えて１２番目（Δ１２デサチュラーゼまたはｆａｄ２）または１５番目（Δ１５デサチュラーゼまたはｆａｄ３）の炭素位置〕への挿入を触媒する酵素をコードしているゲノムデサチュラーゼポリヌクレオチドを対象とする。さらに本発明は、このようなゲノムポリヌクレオチド配列の単離した非コード領域（特にイントロンおよびプロモーター領域を含むもの）を提供する。Δ１２およびΔ１５デサチュラーゼのプロモーターおよびイントロン配列から誘導される部分的または完全な配列を含む、特異的なオリゴヌクレオチドが提供される。本明細書で開示する配列は大豆植物から得られるが、大豆のデサチュラーゼ配列と相同であるか同一性があるデサチュラーゼゲノムポリヌクレオチド配列のイントロンおよびプロモーター領域から、追加的な配列を誘導することができることが企図される。以下に記載する標準的な方法を使用して、さまざまな植物源（特に油種穀物）から、このような追加的なデサチュラーゼ配列を得ることができる。
【０００９】
植物中の脂肪酸組成物を改質するために使用することができる組換えＤＮＡ構築体を提供すること、Δ１２およびΔ１５デサチュラーゼなどのデサチュラーゼ遺伝子またはタンパク質の転写または転写および翻訳（発現）を改質することも本発明の態様である。本発明は特に、ゲノムクローンのイントロンおよびプロモーター領域から誘導される配列を含むＤＮＡ構築体を対象とし、前記配列はＤＮＡ構築体においてセンスまたはアンチセンス方向にある。次いでこれらのＤＮＡ構築体を使用して宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトし、脂肪酸のレベルが改質された（特にオレイン酸、リノールおよびリノレン酸のレベルが改質された）植物を生成させる。オレイン酸のレベルを増大させリノール酸およびリノレン酸のレベルを低下させるために、Δ１２およびΔ１５デサチュラーゼの遺伝子発現をダウンレギュレートさせるための構築体および方法を提供することが詳細には企図される。油種穀物の種組織中の脂肪酸組成を変化させることが詳細には企図される。
【００１０】
Δ１２およびΔ１５デサチュラーゼポリヌクレオチドの発現によって得られる改質された植物細胞、植物、種子および油も、本発明の一部分であるとみなされる。さらに、それぞれの脂肪酸の特異的相対レベルを有する油組成物を生成することが企図される。１つの好ましい実施形態は少なくとも約８０〜８５％のオレイン酸、わずか約１〜２％のリノレン酸、およびわずか約１〜３％のリノール酸を含み、第２の好ましい実施形態は少なくとも約５０〜７５％のオレイン酸、少なくとも約１０〜３０％のリノレン酸、およびわずか約１〜３％のリノール酸を含む。
発明の詳細な説明
【００１１】
本発明は、ゲノムデサチュラーゼ配列、特に宿主細胞源からのゲノム脂肪酸デサチュラーゼ核酸配列から単離された非コード配列を定める。本発明のデサチュラーゼ配列としては、細胞源から得ることができる蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドなどの源からのアミノ酸をコードする全ての非コード領域など任意の核酸ゲノム配列が挙げられ、それは、植物宿主細胞中、すなわちインビボでの、または植物細胞様環境中、すなわちインビトロでの脂肪酸アシル部分への２重結合の挿入を触媒できる。以下にさらに詳細に記載するように、カルボキシル末端から計数される脂肪酸アシル鎖における炭素１２位（Δ１２デサチュラーゼ）および炭素１５位（Δ１５デサチュラーゼ）に２重結合を付加する酵素をコードする具体的なゲノムポリヌクレオチド配列を提供する。さらに、このようなゲノム配列の特異的な非コード領域をここに提供する。
【００１２】
用語の「非コード」とは、発現された蛋白質の一部または全部をコードしないポリヌクレオチドの配列を言う。非コード方向としては、限定しないが、イントロン類、プロモーター領域および５’不飽和領域が挙げられる。
【００１３】
ここで用いられる用語の「イントロン」とは、発現された蛋白質の一部または全部をコードしないポリヌクレオチドのセグメント、通常はＤＮＡを意味するものとして用語の通常の意味を言う。
【００１４】
ここで用いられる用語の「エキソン」とは、発現された蛋白質の一部または全部をコードするポリヌクレオチドのセグメント、通常はＤＮＡを意味する用語の通常の意味を言う。
【００１５】
したがって、用語の「イントロン」とは、ＲＮＡ分子に転写される遺伝子領域ではあるが、それは、ＲＮＡが蛋白質に転写される前にＲＮＡからスプライシングされるものを言う。ＲＮＡに転写され、引き続き蛋白質に翻訳される遺伝子領域を言う用語の「エキソン」とは対照的である。
【００１６】
配列一覧表および実施例において詳細に記載されるように、ゲノムΔ１２デサチュラーゼ配列およびΔ１５デサチュラーゼ配列およびこのような配列から得られたイントロンおよびプロモーター領域をここに提供する。特に、２種のΔ１２デサチュラーゼゲノムクロ−ンが同定され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３に記載される。単独Δ１５デサチュラーゼゲノムクローンが同定され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に記載される。単独イントロン領域が、Δ１２デサチュラーゼゲノムクローンの各々から得られ、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４が供される。Δ１２デサチュラーゼゲノムクローンの各々からプロモーター領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（塩基対１−１０９４）およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３（塩基対１−１７０４）に含まれる。Δ１５デサチュラーゼは、コード領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、５、６、７、８、２５、２６として記載される）内に７種のイントロンを含んでいた。また、予備的結果は、５’非翻訳領域内に追加イントロンがあることを示唆している。
【００１７】
ここで記載された配列は大豆から得られるが、イントロン領域およびプロモーター領域は、大豆デサチュラーゼ配列に対して相同性があるかまたは同一性を有するデサチュラーゼゲノムポリヌクレオチド配列から得ることができることが考慮されている。特に、配列を、他の植物源および特に油料種子穀物から得ることができる。このようなゲノム配列は標準方法を用いて得ることができるが、その幾つかを以下に記載する。
【００１８】
本発明の配列は、植物における脂肪酸組成物を修飾できるのに使用できる（実施例３および表Ｉを参照）。特に、センスおよびアンチセンス抑制を、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸の広範囲な濃度を獲得するために使用できることが示されている。特に、オレイン酸の濃度が約２６〜８０％の範囲であり得、リノール酸の濃度が約２．９７〜４９．９２％の範囲であり得、リノレン酸の濃度が約３．３８〜８．８１％の範囲であり得ることが示されている。しかし、これらは達成され得る広範囲の単に代表にすぎない。さらに、配列の組合せが追加の脂肪酸組成物を獲得するために使用できることが意図されている。ある一定の組成物が、油の意図的使用に基づいて好まれる。１つの好ましい組成物として、少なくとも約５０〜７５％のオレイン酸、少なくとも約１０〜３０％のリノール酸および約３％以下のリノレン酸が挙げられる。特に好ましい実施形態は、少なくとも約６０〜７０％のオレイン酸、少なくとも約１５〜２０％のリノール酸および約３％以下のリノレン酸が挙げられる。
【００１９】
ここに記載される実施例が、関心のある遺伝子をダウンレギュレートするためにセンスまたはアンチセンス抑制を利用するが、遺伝子発現を変更する他の方法を使用できることが考慮されている。特に、ここに同定された非コード領域に特異的に結合するようにデザインできるＤＮＡ結合蛋白質を用いて、遺伝子発現がダウンレギュレートできるか、またはリボチームがこのような非コード領域を開裂するために利用できることが考慮されている。さらに、以下に記載されているように、当業界によく知られている遺伝子発現のダウンレギュレーションの方法が考慮され、本発明の配列と共に使用できる。
【００２０】
単離ポリヌクレオチド、蛋白質およびポリペプチド
本発明の第１の態様は、単離デサチュラーゼポリヌクレオチドに関する。本発明のポリヌクレオチド配列は、ゲノム核酸配列から得ることができる単離ポリヌクレオチドを含む。
【００２１】
本発明は、配列一覧表に記載される各配列に対してその全長に亘り同一のポリヌクレオチド配列を提供する。該ポリヌクレオチドとしては、例えば限定しないが、転写された非翻訳配列、終結シグナル、リボソーム結合部位、ｍＲＮＡを安定化する配列、イントロン、ポリアデニル化シグナルなどの非コード５’および３’配列などの非コード配列、および追加のアミノ酸をコードする追加のコード配列が挙げられる。例えば、融合ポリペプチドの精製を促進するためにマーカー配列を含むことができる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、構造遺伝子および遺伝子発現を制御する天然関連配列を含んで成るポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２２】
本発明はまた、式：Ｘ−（Ｒ１）ｎ−（Ｒ２）−（Ｒ３）ｎ−Ｙのポリヌクレオチドを含み、式中５’末端におけるＸは、水素であり、３’末端におけるＹは水素または金属であり、Ｒ１およびＲ３は、任意の核酸残基であり、ｎは、１から３０００、好ましくは１から１０００の間の整数であり、Ｒ２は、本発明の核酸配列、特に配列一覧表に記載された群から選ばれた核酸配列、好ましくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜８および２３〜２９である。式中、Ｒ２は、その５’末端残基はＲ１に結合して左側にあり、その３’末端残基はＲ３に結合して右側にあるように配向されている。Ｒが１よりも大きい何れかのＲ基により示される核酸残基の任意の伸長は、ヘテロポリマーまたはホモポリマーの何れか、好ましくはヘテロポリマーであり得る。
【００２３】
さらに発明の好ましい実施形態は、発明のポリヌクレオチドに対し全長に亘り少なくとも５０％、６０％または７０％同一であり、またこのようなポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドである。発明のポリヌクレオチドに対し全長に亘り少なくとも８０％同一の領域を含んで成るポリヌクレオチドおよびそれに相補的なポリヌクレオチドがさらに好ましい。この点で、全長に亘り少なくとも９０％同一のポリヌクレオチドは特に好ましく、少なくとも９５％同一のものはとりわけ好ましい。さらに、少なくとも９７％の同一性を有するものは、大いに好ましく、また少なくとも９８％および９９％の同一性を有するものは、特に大いに好ましく、少なくとも９９％の同一性を有するものは、最も大いに好ましい。
【００２４】
好ましい実施形態は、ゲノムポリヌクレオチド配列から得られ、配列一覧表に記載されるポリヌクレオチドである。
【００２５】
さらに本発明は、上記配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。特に本発明は、上記ポリヌクレオチドに対して緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。ここで用いられる用語「緊縮条件」および「緊縮ハイブリダイゼーション条件」とは、配列間に少なくとも９５％、また好ましくは少なくとも９７％の同一性があれば、一般にハイブリダイゼーションが起こることを意味する。緊縮ハイブリダイゼーション条件の例としては、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸トリナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含んで成る溶液中、４２℃で一晩培養し、次いで約６５℃で０．１ｘＳＳＣ中ハイブリダイゼーション支持体を洗浄するものである。他のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件はよく知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９年）の特に１１章に例示されている。  本発明はまた、前記ポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントを有するプローブを用いて、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、配列一覧表に記載されたポリヌクレオチド配列に関する完全遺伝子を含む適当なライブラリーをスクリーニングにより獲得できるポリヌクレオチド配列から本質的に成るポリヌクレオチドおよび前記ポリヌクレオチド配列の単離を提供する。このようなポリヌクレオチドを獲得するのに有用なフラグメントとしては、例えばここに記載されるプローブおよびプライマーが挙げられる。
【００２６】
本発明のポリヌクレオチドアッセイに関してここに検討されているように、例えば本発明のポリヌクレオチド類は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ用のハイブリダイゼーションプローブとして使用でき、ポリヌクレオチドをコードする完全長ｃＤＮＡ類またはゲノムクローン類を単離し、また配列一覧表に記載されたポリヌクレオチドと高い配列類似性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡまたはゲノムクローン類を単離する。このようなプローブは、一般に少なくとも１５個の塩基を含んで成る。好ましくはこのようなプローブは、少なくとも３０個の塩基を有することになり、少なくとも５０個の塩基を有することができる。特に好ましいプローブ類は、３０個の塩基から５０個までの塩基を有する。
【００２７】
配列一覧表に記載されたポリヌクレオチド配列を含む、または含まれる各遺伝子領域は、配列一覧表で与えられたＤＮＡ配列を用いてスクリーニングにより単離し、オリゴヌクレオチドのプローブを合成し得る。次いで本発明のポリヌクレオチド配列に相補的な配列を有する標識ポリヌクレオチドを用いて、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡをスクリーンし、そのプローブにハイブリダイズするライブラリーのメンバーを同定する。例えば、デサチュラーゼプロモーターとイントロンの配列に一致する合成オリゴヌクレオチドが作製される。特に、ファージベクターにおけるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングは、背景ハイブリダイゼーションレベルがより低いため、このような方法において有用である。
【００２８】
典型的には、核酸プローブの使用から得られるデサチュラーゼ配列は、標的デサチュラーゼ配列とプローブに用いた配列との間に６０〜７０％の配列同一性を示すであろう。しかし、５０〜６０％という小さな配列同一性を有する長配列もまた得られるであろう。核酸プローブは、核酸配列の長断片であり得るか、またはより短いオリゴヌクレオチドプローブでもあり得る。より長い核酸断片をプローブとして使用する場合（約１００ｂｐよりも大）、プローブに用いた配列から２０〜５０％の偏差（すなわち、５０〜８０％の配列相同性）を有する配列を標的サンプルから得るために、低緊縮にてスクリーニングし得る。オリゴヌクレオチドプローブは、デサチュラーゼ酵素をコードする全核酸配列よりかなり短くてもよいが、少なくとも約１０個のヌクレオチドである必要があり、好ましくは少なくとも約１５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２０個のヌクレオチドである。より短い領域を用いる場合は、より長い領域に対比して、より高い程度の配列同一性が望まれる。したがって、他の関連するデサチュラーゼ遺伝子の検出および回収に関して、オリゴヌクレオチドのプローブを設計するためには、保存度の高いアミノ酸配列領域を同定することが望ましい。特に保存度の高い配列を同定できる場合、より短いプローブは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にとり特に有用なことが多い（Ｇｏｕｌｄら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  （１９８９）８６：１９３４−１９３８を参照）。
【００２９】
当業界で十分理解されている「同一性」とは、配列の比較により決定される際の２つ以上のポリペプチド配列間の関係、または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当業界における「同一性」はまた、このような配列鎖の間のマッチにより決定される際の、ポリペプチド配列間またはポリヌクレオチド配列間の配列無関係の程度を意味する。「同一性」は、限定しないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．ら、オックスフォード大学プレス、ニューヨーク（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：ｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．ら、アカデミックプレス、ニューヨーク（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．ら、ヒューマナプレス、ニュージャージー（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、アカデミックプレス（１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊら、ストックトンプレス、ニューヨーク（１９９１）；およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．、およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ，４８：１０７３（１９８８）に記載されたものを含む公知の方法により容易に算出できる。同一性を決定する方法は、試験した配列間で最大に付合するようにデザインされる。さらに、同一性を決定する方法は、公的に入手できるプログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性を決定するのに使用できるコンピュータープログラムは、限定しないが、ＧＣＧ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４）；一揃いの５種類のＢＬＡＳＴプログラム、すなわちヌクレオチド配列照会用にデザインされた３種（ＢＬＡＳＴＮ，ＴＢＬＡＳＮおよびＴＢＬＡＳＴＸ）および蛋白質配列照会用にデザインされた２種（ＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＮ）（Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：７６−８０（１９９４）；Ｂｉｒｒｅｎら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，１：５４３−５５９（１９９７））が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の情報源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ、メリーランド州ベセスダ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））から公的に入手できる。よく知られたＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ演算法もまた、同一性を決定するのに使用できる。
【００３０】
ポリペプチド配列比較用パラメータは、一般に以下のものが挙げられる：
演算法：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）
比較マトリクス：ＨｅｎｔｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｔｉｋｏｆｆからのＢＬＯＳＳＵＭ  ６２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９）１９９２）
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
これらのパラメータと共に使用できるプログラムは、ウィスコン州マジソンの遺伝学コンピューターグループから「ｇａｐ」プログラムとして公的に入手できる。末端ｇａｐにペナルティーの無い上記パラメータは、ペプチド比較用デフォルトパラメータである。
【００３１】
ポリヌクレオチド配列比較用パラメータは以下のものを含む：
演算法：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）
比較マトリクス：マッチ＝＋１０；ミスマッチ＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長レングスペナルティー：３
これらのパラメータと共に使用できるプログラムは、ウィスコン州マジソンの遺伝学コンピューターグループから「ギャップ」プログラムとして公的に入手できる。上記パラメータは、核酸比較用デフォルトパラメータである。
【００３２】
免疫学的スクリーニングに関して、蛋白質に対する抗体は、ウサギまたはマウスに精製蛋白質またはその部分を注射することにより調製できるが、抗体を調製するこのような方法は当業者によりよく知られている。一般的にポリクローナル抗体は遺伝子単離のためにより有用であるが、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の何れをも産生できる。コードされた蛋白質に対する抗体との交差反応により決定される際、ウェスタン分析は、関連蛋白質が所望の植物種の粗製抽出物に存在することを決定するために実施され得る。交差反応性を観察する場合、関連蛋白質をコードする遺伝子は、所望の植物種を示す発現ライブラリーのスクリーニングにより単離される。発現ライブラリーは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９年）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、コールドスプリングハーバーラボラトリー）により記載されているように、ラムダｇｔ１１を含む商品として入手できる種々のベクター類にて構築できる。
【００３３】
植物構築体および使用方法
宿主植物細胞における本発明のデサチュラーゼゲノム配列の転写を方向づけるために、組換えＤＮＡ構築体におけるポリヌクレオチド配列の使用が特に興味深い。発現構築体は、一般に本発明の核酸配列に操作して結合された宿主植物細胞において機能的なプロモーターおよび宿主植物細胞において機能的な転写終結領域を含んで成る。
【００３４】
当業者は、植物細胞において機能的であり、文献に記載されている多くのプロモーター類があることを認識されるであろう。クロロプラストおよびプラスチド特異的プロモーター類、クロロプラストまたはプラスチド機能性プロモーター類およびクロロプラストまたはプラスチド操作可能プロモーター類も考えられる。
【００３５】
１セットのプロモーター類は、たいていの植物器官中に高レベルの発現を生じるＣａＭＶ３５ＳプロモーターまたはＦＭＶ３５Ｓプロモーターなどの構成プロモーター類である。ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＦＭＶ３５Ｓプロモーターの増強形または複製形は、本発明の実施に有用である（Ｏｄｅｌｌら、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３１：８１０−８１２；Ｒｏｇｅｒｓ、米国特許第５，３７８，６１９号）。さらに、葉、幹、根、塊茎、種子、果実など植物の特定の組織において本発明の配列発現をもたらすことが好ましいと思われるが、選ばれたプロモーターは、所望の組織および発生特異性を有する必要がある。
【００３６】
植物種子組織に優先的に発現する転写開始領域からの本発明の核酸配列の発現が特に興味深い。このような種子優先転写開始配列の例としては、植物保存蛋白質遺伝子をコードする配列または油料種子における脂肪酸生合成に関連する遺伝子から誘導された種子優先転写開始配列が挙げられる。このようなプロモーター類の例としては、ナピン（ｎａｐｉｎ）（Ｋｒｉｄｌｅら、Ｓｅｅｄ  Ｓｃｉ．Ｒｅｓ．１：２０９：２１９（１９９１））、ファセオリン、ゼイン、大豆トリプシン阻害剤、ＡＣＰ、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、β−コングリシニン（ｃｏｎｇｌｙｃｉｎｉｎ）の大豆α’サブユニット（Ｃｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３：８５６０−８５６４（１９８６））およびオレオシン（ｏｌｅｏｓｉｎ）などの遺伝子からの５’調節領域が挙げられる。
【００３７】
デサチュラーゼを与える蛋白質の局在化を特定の細胞内区画、例えばミトコンドリア、小胞体、液胞、クロロプラストまたは他のプラスチド区画へと方向付けることは有利である。例えば、本発明の興味のある遺伝子が、発現のためにクロロプラストなどのプラスチドに向けられる場合、構築体はまた、遺伝子をプラスチドに向けさせる配列利用を用いることとなる。このような配列は、ここではクロロプラスト透過ペプチド（ＣＴＰ）またはプラスチド透過ペプチド（ＰＴＰ）と呼ばれる。本様式において、興味のある遺伝子を、プラスチドに直接挿入しない場合、発現構築体はさらに、興味のある遺伝子をプラスチドに向けさせる透過ペプチドをコードする遺伝子を含む。該クロロプラスト透過ペプチドは、興味のある遺伝子から誘導されてもよく、またはＣＴＰを有する非相同性配列から誘導されてもよい。このような透過ペプチドは当業界に知られている。例えば、Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅら、（１９９１）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６；Ｃｌａｒｋら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａら（１９８７）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８；Ｒｏｍｅｒら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１；およびＳｈａｈら、（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４７８−４８１を参照されたし。
【００３８】
意図された利用に依存して、構築体は、全ゲノム核酸配列またはこのような配列の特定の非コード領域またはこのような配列の部分を含み得る。例えば、供されたデサチュラーゼ蛋白質のアンチセンス阻害が望まれる場合、全配列は必要としない。さらに、構築体に用いられたデサチュラーゼ配列をプローブとして用いようとする場合、デサチュラーゼ配列、例えば保存度の高いデナチュラーゼ領域をコードする配列の特定の部分のみを含む構築体を調製することは有利と思われる。
【００３９】
当業者は、宿主細胞内の内因性配列の発現阻害のために、種々の方法があることを認識するであろう。このような方法としては、限定しないが、アンチセンス抑制（Ｓｍｉｔｈら、（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：７２４−７２６）、共抑制（Ｎａｐｏｌｉら、（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２７９−２８９）、リボチーム（ＰＣＴ公報ＷＯ第９７／１０３２８号）、センスおよびアンチセンスの組合せ（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌｅ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３９５９−１３９６４）、プロモーターの沈黙化（Ｐａｒｋら、（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｊ．９（２）：１８３−１９４）、ＤＮＡ結合蛋白質（Ｂｅｅｒｌｉら、（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１４６２８−１４６３３；およびＬｉｕら、（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：９４：５５２５−５５３０）が挙げられる。宿主細胞における内因性配列の抑制法は、一般的に転写または少なくとも抑制される配列の一部の転写および翻訳を使用する。このような配列は、内因性配列の非コード領域と同じくコード化に相同であり得る。
【００４０】
なおその上、転写終結調節領域も、本発明の植物発現構築物内に供し得る。転写終結領域は、デサチュラーゼまたは異なる遺伝資源から誘導される都合のよい転写終結領域、例えば転写開始領域と本来関連する転写終結領域をコードするＤＮＡ配列により供し得る。当業者は、植物細胞において転写を終結できる任意の都合のよい転写終結領域が、本発明の構築体に使用できることを認識されるであろう。
【００４１】
別途に、構築体は、宿主植物細胞プラスミドから直接デサチュラーゼ配列の発現を方向づけるために調製され得る。このような構築体および方法は、当業者に知られており、例えばＳｖａｂら、（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：８５２６−８５３０およびＳｖａｂおよびＭａｌｉｇａ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：９０：９１３−９１７および米国特許第５，６９３，５０７号に一般に記載さている。
【００４２】
発現構築体を含有する組換えＤＮＡ構築体が導入された植物細胞、組織、器官または植物は、形質転換、形質移入されているか、または遺伝導入がなされていると考えられる。遺伝子導入または形質転換された細胞または植物には、細胞または植物の子孫およびこのような遺伝子導入植物を異種交配における親株として使用し、デサチュラーゼ拡散配列の存在から生じる変化した表現型を示す飼育プログラムから生じた子孫も含まれる。
【００４３】
関心のあるＤＮＡ配列としてその発現の増減のために、本発明のデサチュラーゼポリヌクレオチドを有する植物発現構築体または転写構築体は、広範囲の植物、特に食用および産業使用の植物油の生産に係る植物により使用され得る。本質的に温暖気候の油料種子穀物が最も好ましい。興味のある植物としては、限定しないが、セイヨウアブラナ種子（カノーラおよび高エルカ酸変種）、ヒマワリ、ベニバナ、綿花、大豆、ピーナッツ、ココナツおよびヤシ油、およびトウモロコシが挙げられる。組換え構築体を宿主細胞に導入する方法に依って、他のＤＮＡ配列が必要とされ得る。重要なことに、本発明は、双子葉植物種および単子葉植物種に同じく適用され、新規および／または改良された形質変換および調節法に容易に適用し得るであろう。
【００４４】
植物デサチュラーゼプロモーターおよび／または植物中のイントロン構築体の利用が特に興味深く、限定しないが、変更した脂肪酸組成物を有する葉、幹、根、生殖器官、および種子などの植物または植物部分を生産する。デサチュラーゼプロモーターおよび／またはイントロン構築体において特に興味深いのは、宿主細胞内の脂肪酸組成物の修飾のためにセンスまたはアンチセンス方向における、Δ−１２およびΔ−１５デサチュラーゼゲノム配列のプロモーターおよび／またはイントロン配列の利用である。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドは、種々の宿主細胞における利用のための構築体の調製に使用できる。本発明の使用のための宿主としては、限定しないが、植物細胞、細菌細胞、カビ細胞（酵母を含む）、昆虫細胞および哺乳類細胞が挙げられる。
【００４６】
例えば、デナチュラーゼ酵素として単離核酸配列によりコードされた蛋白質の活性および特異性を確認するために、インビトロアッセイについてバキュロウィルス発現系を用いて昆虫細胞培養にて実施できる。このようなバキュロウィルス発現系は当業界に知られており、Ｌｅｅらの米国特許第５，３４８，８８６号により記載されており、その全体が、ここに引用文献として組込まれている。
【００４７】
このような遺伝形質転換植物の獲得における形質転換法は、この発明にとって重要ではなく、現在では植物形質転換の種々の方法が利用できる。さらに、穀物を形質転換するためにより新規な方法が利用できるようになれば、それらもまた、この記載に従って直接適用されてもよい。例えば、アグロバクテリウム感染に本来鋭敏な多くの植物種は、アグロバクテリウムに媒介された形質転換の３成分または２成分ベクター法により首尾よく変換され得る。多くの場合、Ｔ−ＤＮＡによる片側または両側に具体的には左端および右端、さらに具体的に右端隣接した構築体を有することが望ましいであろう。これは特に、構築体がアグロバクテリウム−ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム−リゾゲネスを形質転換の様式として使用する場合に有用であるが、しかし、Ｔ−ＤＮＡ端は形質転換の他の様式での使用を見つけ得る。また、種々の単子葉植物種および双子葉植物種の形質転換を可能にするミクロ注射法、ＤＮＡ粒子衝撃法および電気穿孔法が発展してきた。
【００４８】
通常、ＤＮＡ構築体と共に、宿主における発現にとって必要な調節領域を有し、形質転換細胞の選択に供する構造遺伝子が含まれるであろう。この遺伝子は、細胞毒剤、例えば抗生物質、重金属、毒素に対する抵抗性のために栄養素用急性宿主、ウィルス免疫などにプロトトロピーを供する相補性を提供し得る。宿主に依って、発現構築体またはその成分が導入され、種々の宿主に対して種々の選択条件が用いられる１種または複数のマーカーを使用し得る。
【００４９】
植物細胞の形質転換にアグロバクテリウムが用いられる場合、アグロバクテリウム宿主に存在するＴ−ＤＮＡまたはＴｉ−プラスミドまたはＲｉ−プラスミドとの相同的組換えのために、アグロバクテリウム宿主に導入し得るベクターを使用し得る。組換えのためにＴ−ＤＮＡを含有するＴｉ−プラスミドまたはＲｉ−プラスミドは腕状化してもよいし（えい瘤形成能あり）、または腕状化しなくてもよく（えい瘤形成能なし）、後者は形質転換したアグロバクテリウム宿主中にウィルス遺伝子が存在している限りにおいて許容される。腕状化プラスミドは、正常な植物細胞とえい瘤の混合物を供することができる。
【００５０】
アグロバクテリウムが宿主植物細胞を形質転換する媒体として用いられる幾つかの例において、Ｔ−ＤＮＡ境界領域によって境界づけられている発現構築体または転写構築体は、大腸菌およびアグロバクテリウムを複製できる広範囲宿主ベクターに挿入されることになるが、広範囲ベクターは文献に記載されている。通常使用されるのは、ｐＲＫ２またはその誘導体である。例えば、引用文献としてここに組入れているＤｉｔｔａら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７：７３４７−７３５１）およびＥＰＡ０１２０５１５を参照のこと。他に植物細胞内に発現される配列を、１つは大腸菌内のベクターを安定化し、他方はアグロバクテリウム内のベクターを安定化させる別個の複製配列を含むベクター内へ挿入し得る。例えば、ｐＲｉＨＲＩ（Ｊｏｕａｎｉｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）２０１：３７０−３７４）の複製源を利用し、宿主のアグロバクテリウム細胞内での植物発現ベクターの安定性付与を供するＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｍｍｅｒｆｅｌｔ（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）１４：２６９−２７６）を参照のこと。
【００５１】
発現構築体およびＴ−ＤＮＡと共に、形質転換アグロバクテリウムおよび形質転換植物細胞の選択を可能にする１種または複数のマーカーが含まれるであろう。クロラムフェニコール、カナマイシン、アミノグリコシドＧ４１８、ヒグロマイシンなどの抵抗性など、多数のマーカーが植物細胞と共に使用するために開発された。使用された具体的なマーカーは、本発明にとって本質的ではないが、具体的な宿主および構築様式に依って好ましいマーカーがある。
【００５２】
アグロバクテリウムを用いる植物細胞の形質転換には、外植片を形質転換したアグロバクテリウムと合わせて形質転換に十分な時間培養し、バクテリアを殺菌し、適当な選択的培地において植物細胞を培養し得る。カルスが形成したら、適当な植物ホルモンを用い、知られた方法に従ってシュート形成を促進でき、植物の生殖のために固着培地に移す。その後、植物は増殖して結実し、その種子は反復的生殖を確かにするために、また植物油の単離のために使用され得る。
【００５３】
宿主細胞における不飽和脂肪酸産生を変化させるため本発明に従って第２の発現構築体を使用し得る。例えば、脂肪酸生合成に関与する蛋白質に対するヌクレオチド配列を有する第２の発現構築体とデサチュラーゼ発現構築体とを合わせて宿主細胞へ導入し得る。
【００５４】
複数の発現構築体を含む本発明の植物細胞を得るには幾つかの可能な方法がある。本発明の発現構築体をコードするＤＮＡ配列を有する構築体、およびある酵素をコードする別のＤＮＡ配列を有する少なくとももう１つの構築体を含む植物を生産する任意の手段が本発明に含まれる。例えば、発現構築体は第２の構築体と同時に、双方の構築体を単独の形質転換ベクターに包含することによるか、または各々が所望の遺伝子を発現する別々のベクターを用いることによるかの何れかによって、植物を形質転換するために使用し得る。第２の構築体は、すでにデサチュラーゼ発現構築体により形質転換されている植物内へ導入することができ、または別途に、１つはデサチュラーゼ構築体を発現し、また１つは第２の構築体を発現している形質転換植物を交配して同一植物内にそれらの構築体を共に導入することができる。
【００５５】
本発明を一般的に記述するに当たって、下記の実施例を参照することにより理解がより容易となろうが、これは説明のために入れられているのであって、本発明を限定する意図はない。
【００５６】
実施例
実施例１  デサチュラーゼゲノム配列のクローニング
１Ａ．大豆Δ１２デサチュラーゼ（ｆａｄ２−１）
大豆ｆａｄ２−１Ａ配列は大豆ｆａｄ２−１ｃＤＮＡプローブを用いて大豆ゲノムライブラリーのスクリーニングにより同定された。３種の推定ダイズｆａｄ２−１クローンを同定し、プラーク精製した。３種のダイズｆａｄ２−１クローンのうち２種を、ｐブルースクリプトＩＩＫＳ＋（層遺伝子）に連結し、塩基配列決定した。両クローン（１４−１および１１−１２）は、同一であり、ダイズｆａｄ２−１ｃＤＮＡと厳密にマッチした。全ｆａｄ２−１Ａクローンの配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１で供される。
【００５７】
この完全長クローンを得る前に、ｆａｄ２−１Ａゲノムクローンの一部を、５’非翻訳配列（プライマー１２５０６、５’−ＡＴＡＣＡＡＧＣＣＡＣＴＡＧＧＣＡＴ−３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）からｃＤＮＡ（プライマー１１６９８：５’−ＧＡＴＴＧＧＣＣＡＴＧＣＡＡＴＧＡＧＧＧＡＡＡＡＧＧ−３’、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）内にデザインされたＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。ｆａｄ２−１Ａイントロンを含んだこのＰＣＲ生成物を、ベクターｐＣＲ２．１（インビトロゲン）にクローン化し、塩基配列決定した。ダイズｆａｄ２−１Ａ部分ゲノムクローン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）およびそのイントロン領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を、ＭａｃｖｅｃｔｏｒにおけるＰｕｓｔｅｌｌ比較プログラムを用いて大豆ｃＤＮＡ配列との比較により同定した。イントロン配列は、ＡＴＧ開始コドンの後から始まり、４２０個の塩基長である。
【００５８】
第２のｆａｄ２−１遺伝子科メンバーもまた、同定しクローン化し、ここではｆａｄ２−１Ｂと言う。ダイズｆａｄ２−１Ｂ部分ゲノムクローン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）（プロモーター（１〜１７０４個の塩基対）を含む）；５’ＵＴＲ（１７０５〜１７８２個の塩基対）；イントロン番号１（１７８６〜２１９０個の塩基対）；ｆａｄ２−１Ｂコード化領域（１７８３〜１７８５個および２１９１〜２４６３個の塩基対）の一部およびそのイントロン領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）を、ＭａｃｖｅｃｔｏｒにおけるＰｕｓｔｅｌｌ比較プログラムを用いて大豆ｃＤＮＡ配列との比較により同定した。イントロン配列は、ＡＴＧ開始コドンの後から始まり、４０５個の塩基長である。
【００５９】
１Ｂ．大豆Δ１５デサチュラーゼ（ｆａｄ３）
部分大豆ｆａｄ３ゲノム配列を、プライマー１０６３２、５’−ＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＴＣＧＡＧＡＣＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡＧＣＣＴＡＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）および１０６３３：５’−ＣＡＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＴＣＴＣＴＣＴＡＴＧＣＡＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を用いて大豆ＤＮＡからＰＣＲ増幅した。伸長テンプレートＰＣＲシステム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を製造元説明書に従って使用した。生じたＰＣＲ生成物をベクターｐＣＲ２．１（インビトロゲン）にクローン化し、塩基配列決定した。ダイズｆａｄ３部分ゲノムクローン配列およびイントロン領域を、ＭａｃｖｅｃｔｏｒにおけるＰｕｓｔｅｌｌ比較プログラムを用いて大豆ｆａｄ３ｃＤＮＡ配列との比較により確認した。この同定された部分ゲノム大豆ｆａｄ３配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）から、７種のイントロンが同定された（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（イントロン番号１）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（イントロン番号２）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（イントロン番号３Ａ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（イントロン番号４）、ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：８（イントロン番号５）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５（イントロン番号３Ｂ）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６（イントロン番号３Ｃ）。イントロン番号１は、１９２個の塩基対長であり、２９４位と４８５位との間に位置し、イントロン番号２は、３４８個の塩基対長であり、５７６位と９２３位との間に位置し、イントロン番号３Ａは、１４２個の塩基対長であり、９９１位と１１３２位との間に位置し、イントロン番号３Ｂは、９８個の塩基対長であり、１２２５位と１３２２位との間に位置し、イントロン番号３Ｃは、１１５個の塩基対長であり、１５０９位と１６２３位との間に位置し、イントロン番号４は、１２３１個の塩基対長であり、１７０５位と２９３５位との間に位置し、およびイントロン番号５は、６２６個の塩基対長であり、３０７４位と３６９９位との間に位置する。
【００６０】
実施例２  発現構築体
テンプレートとしてｆａｄ２−１Ａ部分ゲノムクローン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）およびプライマー１２７０１（５’−ＡＣＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡＧＧＴＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＧＴＧＣＣＴＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３））および１２７０２（５’−ＧＣＧＡＧＡＴＣＴＡＴＣＧＡＴＣＴＧＴＧＴＣＡＡＡＧＴＡＴＡＡＡＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４））を用いて、大豆ｆａｄ２−１Ａイントロン配列をＰＣＲにより増幅した。生じた増幅生成物を、ベクターｐＣＲ２．１（インビトロゲン）にクローン化し、塩基配列決定した。次いで、センスおよびアンチセンス方向で、ダイズｆａｄ２−１Ａイントロンを発現カセット、ｐＣＧＮ３８９２にクローン化した。ベクターｐＣＧＮ３８９２は、大豆７ＳプロモーターおよびエンドウＰＢＣＳ３’を含む。次いで双方の遺伝子融合体を、ＦＭＶプロモーターにより調節されたＣＰ４遺伝子を含むベクターｐＣＧＮ９３７２に別個に連結した。生じた発現構築物（ＰＣＧＮ５４６９センスおよびｐＣＧＮ５４７１アンチセンス）を、下記の生物学的方法を用いて大豆の形質転換に用いた。
【００６１】
テンプレートとしてｆａｄ２−１Ｂ部分ゲノムクローン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）およびプライマー１３８８３（５’−ＧＣＧＡＴＣＧＡＴＧＴＡＴＧＡＴＧＣＴＡＡＡＴＴＡＡＡＴＴＧＴＧＣＣＴＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０））および１３８７６（５’−ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＧＴＧＴＣＡＡＡＧＴＡＴＡＡＡＧＡＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１））を用いて、大豆ｆａｄ２−１Ｂイントロン配列をＰＣＲにより増幅した。生じた増幅生成物を、ベクターｐＣＲ２．１（インビトロゲン）にクローン化し、塩基配列決定した。ダイズｆａｄ２−１Ｂイントロンを、プラスミドｐＣＧＮ５４６８（ダイズｆａｄ２−１Ａイントロン（センス）およびエンドウＲＢＣＳ３’に融合された大豆７Ｓプロモーターを含む）またはｐＣＧＮ５４７０（ダイズｆａｄ２−１Ａイントロン（アンチセンス）およびエンドウＲＢＣＳ３’に融合された大豆７Ｓプロモーターを含む）中、それぞれセンスおよびアンチセンス方向で、ダイズｆａｄ２−１Ａイントロンの３’末端に融合した。次いで生じたイントロン組合せ融合体をＦＭＶプロモーターにより調節されたＣＰ４遺伝子を含むベクターｐＣＧＮ９３７２に別々に連結した。生じた発現構築物（ｐＣＧＮ５４８５、ｆａｄ２−１Ａ＆ＢイントロンセンスおよびｐＣＧＮ５４８６、ｆａｄ２−１Ａ＆Ｂイントロンアンチセンス）を、下記の生物学的方法を用いて大豆の形質転換に用いた。
【００６２】
テンプレートとしてｆａｄ３部分ゲノムクローンおよび以下のプライマー：イントロン番号１、プライマー１２５６８：５’−ＧＡＴＣＧＡＴＧＣＣＣＧＧＧＧＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＧＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）および１２５６９：５’−ＣＡＣＧＣＣＴＣＧＡＧＴＧＴＴＣＡＡＴＴＣＡＡＴＣＡＡＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）；イントロン番号２、プライマー１２５１４：５’−ＣＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＴＴＣＡＴＡＣＴＧＧＣＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）および１２５１５：５’−ＣＧＣＡＴＣＧＡＴＴＧＣＡＡＡＡＴＣＣＡＴＣＡＡＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）；イントロン番号４、プライマー１０９２６：５’−ＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＴＣＧＡＧＣＧＴＡＡＡＴＡＧＴＧＧＧＴＧＡＡＣＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）および１０９２７：５’−ＣＡＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＧＴＣＣＡＴＴＴＴＡＧＴＡＣＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）；イントロン番号５、プライマー１０９２８：５’−ＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＴＣＧＡＧＧＣＧＣＧＴＡＣＡＴＴＴＴＡＴＴＧＣＴＴＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）および１０９２９：５’−ＣＡＵＣＡＵＣＡＵＣＡＵＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＡＡＡＴＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）を用いて、大豆ｆａｄ３ゲノムクローンから同定された７種のイントロンのうち４種をＰＣＲにより増幅した。各イントロンに対して生じたＰＣＲ生成物を、ベクターｐＣＲ２．１（インビトロゲン）にクローン化し、塩基配列決定した。イントロン番号１、２、４および５を全て、センスおよびアンチセンス方向で、ｐＣＧＮ３８９２に別個に連結した。ｐＣＧＮ３８９２は、大豆７ＳプロモーターおよびエンドウＲＢＣＳ３’を含む。これらの融合体を、大豆への形質転換のためのＦＭＶプロモーターにより調節されたＣＰ４遺伝子を含むベクターｐＣＧＮ９３７２に連結した。生じた発現構築物（ｐＣＧＮ５４５５、ｆａｄ３イントロン番号４イントロンセンス；ｐＣＧＮ５４５９、ｆａｄ３イントロン番号４イントロンアンチセンス；ｐＣＧＮ５４５６、ｆａｄ３イントロン番号５イントロンセンス；ｐＣＧＮ５４６０、ｆａｄ３イントロン番号５イントロンアンチセンス；ｐＣＧＮ５４６６、ｆａｄ３イントロン番号２イントロンアンチセンス；ｐＣＧＮ５４７３、ｆａｄ３イントロン番号１イントロンアンチセンス）を、下記の生物学的方法を用いて大豆の形質転換に用いた。
【００６３】
ダイズｆａｄ３イントロン番号３Ｃおよび４もまた、ここでｆａｄ３―１Ｂと呼ばれる第２のｆａｄ３遺伝子科メンバーからもＰＣＲ増幅した。以下のプライマー、５’ＣＡＴＧＣＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）および５’ＧＴＴＧＡＴＣＣＡＡＣＣＡＴＡＧＴＣＧ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）を用いて、ダイズｆａｄ３−１Ｂイントロン番号３Ｃおよび４を大豆ＤＮＡからＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ生成物を、ベクターｐＣＲ２．１（インビトロゲン）にクローン化し、塩基配列決定した。ダイズｆａｄ３−１Ｂイントロン番号３Ｃおよび４に関する配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：２８および２９で供される。
【００６４】
実施例３  植物形質転換および分析
Δ１２およびΔ１５デサチュラーゼイントロンのセンスおよびアンチセンス発現に係る発現構築体を含む線状ＤＮＡフラグメントは、ＭｃＣａｂｅら、（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３−９２６の方法により大豆（Ａｓｇｒｏｗ変種Ａ４９２２）へ安定に導入された。形質転換された大豆植物は、グリホサートを含む培地上の選択により同定された。
【００６５】
脂肪酸組成物は、ガスクロマトグラフィーを用いてイントロン発現構築体により形質転換された大豆系の種子から分析された。Ｔ２プールされた種子およびＴ２単独種子油組成物は、非形質転換大豆からの種子と比較して、モノおよびポリ不飽和脂肪酸組成物が、遺伝形質転換大豆系列からの種子油において変化したことを明示している。表１は、説明した構築体を用いて得られた結果の要約を示している。これらのデータは、デサチュラーゼ遺伝子の非コード領域のセンスおよびアンチセンス発現が脂肪酸組成物を変化させることを明らかに示している。このデータはまた、脂肪酸組成物を変える種々の系列を得るためにイントロンが使用できることを示す。所望の相対的脂肪酸組成物に依存してこのような系列から選択することができる。さらに、各イントロンは、各脂肪酸のレベルを様々な程度に変更できることから、イントロンの組合せが、所望の組成物に依存して使用できることが考慮されている。
【００６６】
【表１】
0004744049.tif 000002
0004744049.tif 000003
【００６７】
本明細書に言及されている全ての出版物および特許出願は、本発明に係る当業者の技能レベルを表す。参照のためにここに組入れている全ての出版物および特許出願は、各個別の出版物または特許出願と同程度に具体的に、また個別に参照のために組入れられていることを表す。
【００６８】
前述の発明は、明確な理解の目的上、図解や例によってかなり詳細に記述したが、添付の請求項の範囲内である一定の変更および修飾が実施され得ることは明らかであろう。
【配列表】
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