(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異型ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）血清型１６型のタンパク質をコードする配列を含む合成ポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが配列番号２、配列番号３、および配列番号４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
Ｅ１領域内の欠失及びＥ１領域内の挿入配列を有するアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスワクチンベクターであって、該挿入配列が、
Ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドと、
Ｂ）前記ポリヌクレオチドと機能的に連結されたプロモーターと
を含む発現カセットを含む、ベクター。
【請求項４】
アデノウイルスゲノムが、欠失したＥ３領域も含有している、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
プラスミド部分と発現カセット部分とを含むワクチンプラスミドであって、該発現カセット部分が、
Ａ）請求項１に記載のポリヌクレオチドと、
Ｂ）前記ポリヌクレオチドと機能的に連結されたプロモーターと
を含む、プラスミド。
【請求項６】
前記プラスミド部分がＶ１Ｊｎｓである、請求項５に記載のプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ヒト細胞環境における発現にとってコドン最適化されたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）遺伝子、並びにアデノウイルスベクター及び又はプラスミドベクターを用いた、ワクチンとしてのそれらの使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
パピローマウイルス感染は、ヒト、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、ヘビ、サル、及びウシを含む多様な動物において起こる。パピローマウイルスは上皮細胞に感染し、一般的には、感染部位において良性の上皮腫又は線維上皮腫を誘導する。パピローマウイルスは、種特異的な感染性病原体であり、ヒトパピローマウイルスはヒト以外には感染し得ない。
【０００３】
パピローマウイルスは、小さく（５０〜６０ｎｍ）、エンベロープは有しておらず、最大８個の初期遺伝子及び２個の後期遺伝子をコードする二十面体のＤＮＡウイルスである。ウイルスのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、Ｅ１〜Ｅ７並びにＬ１及びＬ２と名付けられている。なお、「Ｅ」は初期を意味し、「Ｌ」は後期を意味する。Ｌ１及びＬ２は、ウイルスカプシドタンパク質をコードしている。初期遺伝子は、ウイルスの複製及び細胞の形質転換のような機能に関連している。
【０００４】
ヒトにおいて、異なるＨＰＶ型は、良性いぼ（例えば、ＨＰＶ１、２、３型）から高度に侵襲性の性器及び肛門の癌腫（ＨＰＶ１６及び１８型）まで様々な、異なる疾患を引き起こす。現時点において、これらの疾患のための満足のゆく治療法は存在しない。
【０００５】
動物における免疫学的研究は、パピローマウイルス抗原に対する中和抗体の産生が、同種ウイルスによる感染を防止することを示した。しかしながら、ワクチンの開発は、パピローマウイルスのインビトロ培養が困難であることにより妨害されている。
【０００６】
ワクチン投与は、有効な型の疾患予防であり、いくつかの型のウイルス感染に対して成功が示されている。しかしながら、現時点において、有効なＨＰＶワクチンを生成させる試みは、完全には成功していない。
【０００７】
（発明の開示）
本発明は、宿主細胞における効率的な発現のためコドン最適化されたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質をコードするオリゴヌクレオチドに関し、好ましくは、オリゴヌクレオチドはＤＮＡである。１つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、野生型アミノ酸配列を保持しているタンパク質をコードする。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、野生型タンパク質と比較して減少したタンパク質機能を有するが、免疫原性は維持している変異型ＨＰＶタンパク質をコードする。本発明は、そのようにコードされた変異型ＨＰＶタンパク質にも関する。
【０００８】
好ましい実施形態において、タンパク質は、Ｌ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、及びＥ７からなる群より選択される。特に好ましいのは、Ｌ１、Ｌ２、Ｅ２、及びＥ７タンパク質である。
【０００９】
本発明のもう１つの態様は、コドン最適化ＨＰＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドを保持するベクターである。本発明のさらにもう１つの態様は、これらのベクターを含有する宿主細胞である。
【００１０】
好ましい実施形態において、ベクターはアデノウイルスベクターである。特に好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域内の欠失及びＥ１領域内の挿入配列［該挿入配列は、
ａ）Ｌ１、Ｅ１、Ｅ２、及びＥ７タンパク質からなる群より選択されるＨＰＶタンパク質、又はそれらの変異型をコードし、かつヒト宿主細胞における発現にとって最適化されているポリヌクレオチドと、
ｂ）ポリヌクレオチドと機能的に連結されたプロモーターと
を含む発現カセットを含む］を有するアデノウイルスゲノムを含むワクチンベクターである。
【００１１】
本発明により構想されるもう１つの型のベクターは、プラスミド部分とアデノウイルス部分［該アデノウイルス部分は、Ｅ１領域内の欠失及びＥ１領域内の挿入配列を有し、該挿入配列は、
ａ）Ｌ１、Ｅ１、Ｅ２、及びＥ７タンパク質からなる群より選択されるＨＰＶタンパク質をコードし、かつヒト宿主細胞における発現にとってコドン最適化されているポリヌクレオチドと、
ｂ）ポリヌクレオチドと機能的に連結されたプロモーターと
を含む発現カセットを含む］とを含むシャトルプラスミドベクターである。
【００１２】
本発明は、プラスミド部分と発現可能カセット［該発現可能カセットは、
ａ）Ｌ１、Ｅ１、Ｅ２、及びＥ７タンパク質からなる群より選択されるＨＰＶタンパク質をコードし、かつヒト宿主細胞における発現にとってコドン最適化されているポリヌクレオチドと、
ｂ）ポリヌクレオチドと機能的に連結されたプロモーターと
を含む］とを含むプラスミドワクチンベクターにも関する。
【００１３】
本発明は、ヒト宿主へオリゴヌクレオチドを運搬し、コードされたタンパク質の発現を可能にするベクターを含むワクチン組成物にも関する。タンパク質は、免疫応答を誘導するために十分な量で発現させられる。好ましい実施形態において、ベクターは、プラスミドベクター又はアデノウイルスベクターである。
【００１４】
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質、又は野生型タンパク質と比較して減少したタンパク質機能を有するが、免疫原性は維持している変異型ＨＰＶタンパク質をコードする合成ポリヌクレオチド［該ポリヌクレオチド配列は、ヒト宿主細胞における発現にとって最適化されているコドンを含む］を宿主細胞において発現させることを含む、ＨＰＶタンパク質を作成する方法にも関する。
【００１５】
（図面の簡単な説明）
図１は、コドン最適化ＨＰＶ１６  Ｌ１遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）である。
【００１６】
図２は、コドン最適化ＨＰＶ１６  Ｅ１遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２）である。この特定の配列においては、発現したタンパク質のアミノ酸配列を変化させるさらなる変異が存在し、４８２位のグリシン残基がアスパラギン酸に変換され、４３９位のトリプトファン残基がアルギニンとなっている。
【００１７】
図３は、コドン最適化ＨＰＶ１６  Ｅ２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）である。この特定の配列においては、３９位のグルタミン酸残基がアラニンに変化し、７３位のイソロイシン残基もアラニンに変化している。
【００１８】
図４は、コドン最適化ＨＰＶ１６  Ｅ７遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号４）である。この特定の配列においては、２４位のシステイン残基がグリシンに変化し、２６位のグルタミン酸残基がグリシンに変化している。
【００１９】
図５は、コドン最適化ＨＰＶ６ａ  Ｅ７遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）である。
【００２０】
図６は、コドン最適化ＨＰＶ１８  Ｅ７遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号６）である。
【００２１】
図７は、コドン最適化ＨＰＶ６ａ  Ｅ２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号７）である。
【００２２】
図８は、コドン最適化ＨＰＶ１８  Ｅ２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号８）である。
【００２３】
図９は、発現ベクターＶ１Ｊｎｓ内のネイティブ（レーンｄ、ｅ、ｆ）又は合成（ａ、ｂ、ｃ）のＨＰＶ１６  Ｌ１配列により一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のイムノブロット分析の結果を示す。
【００２４】
図１０は、発現ベクターＶ１Ｊｎｓ内のネイティブ又は合成のＨＰＶ１６  Ｅ１配列により一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のイムノブロット分析の結果を示す。レーンａ及びｄはネイティブＨＰＶ１６  Ｅ１配列を含有し、レーンｂ及びｅは合成ＨＰＶ１６  Ｅ１配列を含有し、レーンｃは偽トランスフェクトされた対照である。
【００２５】
図１１は、発現ベクターＶ１Ｊｎｓ内のネイティブ又は合成のＨＰＶ１６  Ｅ２配列により一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のイムノブロット分析の結果を示す。レーンａは偽感染であり、レーンｂはｌａｃＺ対照であり、レーンｃは合成ＨＰＶ１６  Ｅ２単離物＃６を含有し、レーンｄは合成ＨＰＶ１６  Ｅ２単離物＃１１を含有し、レーンｅはネイティブＨＰＶ１６  Ｅ２を有する。
【００２６】
図１２は、発現ベクターＶ１Ｊｎｓ内のネイティブ又は合成のＨＰＶ１６  Ｅ７配列により一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のイムノブロット分析の結果を示す。レーンａは偽感染であり、レーンｂはｌａｃＺ対照であり、レーンｃは合成ＨＰＶ１６  Ｅ７単離物＃２を含有し、レーンｄは合成ＨＰＶ１６  Ｅ７単離物＃４であり、レーンｅはネイティブＨＰＶ１６  Ｅ７である。
【００２７】
図１３は、発現ベクターＶ１Ｊｎｓ内の合成ＨＰＶ６ａ  Ｅ７配列により一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のイムノブロット分析の結果を示す。レーンｂ及びｃは合成ＨＰＶ６ａ  Ｅ７配列を含有し、レーンｄはｌａｃＺ対照を含有し、レーンａは偽トランスフェクトされた対照である。
【００２８】
図１４は、発現ベクターＶ１Ｊｎｓ内の合成ＨＰＶ１８  Ｅ７配列により一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のイムノブロット分析の結果を示す。レーンｂ、ｃ、ｄ、及びｅは合成ＨＰＶ１８  Ｅ７配列を含有し、レーンｆは抗体対照として合成ＨＰＶ１６  Ｅ７を含有し、レーンａは偽トランスフェクトされた対照である。
【００２９】
図１５は、発現ベクターＶ１Ｊｎｓ内の合成ＨＰＶ６ａ  Ｅ２配列により一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のイムノブロット分析の結果を示す。レーンａ及びｂは合成Ｅ２配列を含有し、レーンｃはベータ−ｇａｌ対照であり、レーンｄは偽トランスフェクトされたものである。
【００３０】
図１６は、発現ベクターＶ１Ｊｎｓ内の合成ＨＰＶ１８  Ｅ２配列により一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のイムノブロット分析の結果を示す。レーンａはベータ−ｇａｌ対照であり、レーンｂは偽トランスフェクトされたものであり、レーンｃ及びｄは合成配列を有する。
【００３１】
図１７は、合成ＨＰＶ１６  Ｌ１を生成させるために使用されたオリゴヌクレオチド（配列番号９〜３２）の表である。
【００３２】
図１８は、合成ＨＰＶ１６  Ｅ１を生成させるために使用されたオリゴヌクレオチド（配列番号３３〜６４）の表である。
【００３３】
図１９は、合成ＨＰＶ１６  Ｅ２を生成させるために使用されたオリゴヌクレオチド（配列番号６５〜８４）の表である。
【００３４】
図２０は、合成ＨＰＶ１６  Ｅ７を生成させるために使用されたオリゴヌクレオチド（配列番号８５〜９０）の表である。
【００３５】
図２１は、合成ＨＰＶ６ａ  Ｅ７を生成させるために使用されたオリゴヌクレオチド（配列番号９１〜９６）の表である。
【００３６】
図２２は、合成ＨＰＶ１８  Ｅ７を生成させるために使用されたオリゴヌクレオチド（配列番号９７〜１０２）の表である。
【００３７】
図２３は、合成ＨＰＶ６ａ  Ｅ２を生成させるために使用されたオリゴヌクレオチド（配列番号１０３〜１２６）の表である。
【００３８】
図２４は、合成ＨＰＶ１８  Ｅ２を生成させるために使用されたオリゴヌクレオチド（配列番号１２７〜１５０）の表である。
【００３９】
図２５は、ＪＣＬ−０３１細胞溶解物のウェスタンブロットである。細胞溶解物は、４００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を含有する選択培地中で増殖させたＪＣＬ−０３１細胞から調製された。イムノブロットは、抗ＨＰＶ１６  Ｅ２（ヤギ２４８）抗血清で現像された。分子量マーカーの位置が示されている。
【００４０】
図２６は、ＪＣＬ−０３１細胞により誘導される腫瘍成長からの防御を示す。Ｅ２  ＤＮＡ又は対照ＤＮＡで免疫感作されたマウスに、左鼠径部への皮下注射により、ＪＣＬ−０３１細胞５×１０５個を抗原として接種した。この抗原接種の５日後から、２又は３日間隔で、接種の４週間後まで、全ての動物を観察した。鼠径部の視診、触診、及びカリパスによる腫瘍の直径の測定により、腫瘍を検出し、モニターした。
【００４１】
「プロモーター」という用語は、本明細書において使用されるように、ＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ鎖上の認識部位をさす。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと共に開始複合体を形成して、転写活性を開始させ、駆動する。複合体は、「エンハンサー」と呼ばれる配列を活性化することにより、又は「サイレンサー」と呼ばれる配列を阻害することにより、修飾されうる。
【００４２】
「カセット」という用語は、発現させるべき核酸配列を含有する本発明の配列をさす。カセットは、カセットテープと概念的に類似しており、各カセットはそれ自体の配列を有する。従って、カセットを取り替えることにより、ベクターは異なる配列を発現するであろう。５’及び３’末の制限部位のため、カセットの挿入、除去、又は他のカセットとの交換は容易である。
【００４３】
「ベクター」という用語は、ＤＮＡ断片を宿主生物又は宿主組織へと導入することができる手段をさす。プラスミド、ウイルス（アデノウイルスを含む）、バクテリオファージ、及びコスミドを含む様々な型のベクターが存在する。
【００４４】
「有効な量」という用語は、免疫応答が起こるよう適度なレベルのポリペプチドを産生するために十分なワクチン組成物が導入されることを意味する。当業者は、このレベルが変動しうることを認識する。
【００４５】
「合成」とは、ヒト発現にとって好ましいコドンを含有するようＨＰＶ遺伝子が修飾されていることを意味する。多くの場合、遺伝子によりコードされるアミノ酸は同一のままである。いくつかの実施形態において、合成遺伝子は修飾されたタンパク質をコードしうる。
【００４６】
「ネイティブ」という用語は、遺伝子が、天然に見出されるＤＮＡ配列を含有することを意味する。それは、ウイルス起源の野生型配列である。
【００４７】
（発明の詳細な説明）
様々なＨＰＶタンパク質をコードする合成ＤＮＡ分子が提供される。合成分子のコドンは、好ましい実施形態においてヒト細胞である計画された宿主細胞にとって好ましいコドンを使用するよう設計される。合成分子は、中和抗体及び細胞性免疫を介して、パピローマウイルス感染に対する有効な免疫予防を提供するポリヌクレオチドワクチンとして使用されうる。合成分子は、免疫原性組成物として使用されうる。本発明は、霊長類及びヒトのような哺乳動物を含む脊椎動物へ直接インビボ導入された場合に、動物におけるコードされたタンパク質の発現を誘導するポリヌクレオチドを提供する。
【００４８】
任意の血清型ＨＰＶに由来するＬ１、Ｅ１、Ｅ２、及び／又はＥ７をコードする遺伝子が、本発明に従い修飾されうる。選択されるＨＰＶは、ヒトにおいて病理学的な状態を引き起こすことが既知のものであることが好ましい。この理由から、ＨＰＶ遺伝子は、ＨＰＶ６ａ、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ６８、又はそれらの異型からなる群より選択されることが好ましい。本発明のワクチン製剤は、ＨＰＶ型タンパク質遺伝子（例えば、ＨＰＶ６、１１、１６、及び１８に由来する遺伝子）の混合物を含有していてもよく、かつ／又はタンパク質遺伝子（即ち、Ｌ１、Ｅ１、Ｅ２、及び／又はＥ７）の混合物を含有していてもよい。
【００４９】
コドン最適化
多くのＨＰＶ遺伝子の野生型配列が既知である。本発明に従い、翻訳された配列は同一であるが、Ｌａｔｈｅ，１９８５”アミノ酸配列データより導出された合成オリゴヌクレオチドプローブ：理論的及び実際的な考察（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｄｅｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ：Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ）”Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．１８３：１〜１２（参照により本明細書に組み込まれる）により定義されるような代替コドン使用を有する配列へと、ＨＰＶ遺伝子セグメントを変換した。その方法論は、以下のように要約されうる。
【００５０】
１．適切なオープンリーディングフレームのためのコドンの位置を同定する。
２．観察されるヒト遺伝子による使用頻度と、野生型コドンを比較する。
３．コドンが最も一般に利用されているものでない場合、それをヒト細胞における高発現にとって最適なコドンと交換する。
４．遺伝子セグメント全体が交換されるまで、この手順を反復する。
５．これらのコドン交換により生成した望ましくない配列（例えば、「ＡＴＴＴＡ」配列、イントロンスプライス認識部位の偶発的な作出、不要な制限酵素部位等）について、新たな遺伝子配列を検査し、これらの配列を排除するコドンと置換する。
６．合成遺伝子セグメントを組み立て、改良された発現について試験する。
【００５１】
本発明によると、同一タンパク質配列をコードする代替コドンの使用は、ヒト細胞によるＨＰＶタンパク質の発現に対する制約を除去しうることが見出された。
【００５２】
これらの方法を使用して、様々なパピローマウイルス遺伝子のための以下の合成遺伝子セグメントを作出し、高レベル発現にとって最適化されたコドンから完全に構成される遺伝子を作出した。前記手法は、ＤＮＡワクチンのためのコドン最適化遺伝子を設計するための方法論の要約であるが、同様のワクチン効力又は遺伝子発現増加が、手法のわずかな改変又は配列のわずかな改変によって達成されうることが、当業者には理解される。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態においては、免疫原性は保存しつつ、タンパク質機能を減少させるか又は排除するための改変がなされた（特に、Ｅタンパク質ネイティブタンパク質配列において）。酵素機能を減少させる変異は既知である。ある種の改変は、安全性の限界を拡大すること、及び／又は発現収率を改善することを目的としてなされた。これらの修飾は、選択されたコドンを、哺乳動物細胞においてより高度に発現されるものへと変化させることにより達成された。ＨＰＶ１６  Ｅ１の場合、例えば２個の変異が導入された。ＧＧＣからＧＡＣへの変換によりアミノ酸番号４８２のグリシンをアスパラギン酸に変化させ、ＴＧＧからＣＧＣへの変換により４３９位のトリプトファンをアルギニンに変化させた。
【００５４】
ＨＰＶ１６  Ｅ２については、両コドンをそれぞれＧＣＣに変換することにより、３９位のグルタミン酸をアラニンに変化させ、７３位のイソロイシンをアラニンに変化させた。
【００５５】
ＨＰＶ１６  Ｅ７については、それぞれＴＧＣ及びＧＡＧをいずれもＧＧＣへと改変することにより、２４位のシステインのグリシンへの変換、２６位のグルタミン酸のグリシンへの変換が可能となった。
【００５６】
次いで、コドン最適化遺伝子を、ヒト細胞における効率的なタンパク質発現を提供するよう設計された配列を含む発現カセット中に組み立てる。カセットは、好ましくは、プロモーター及び終結配列のような、それと機能的に連結された関係する転写及び翻訳調節配列と共に、コドン最適化遺伝子を含有する。好ましい実施形態において、プロモーターはイントロンＡ配列を有するサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ−ｉｎｔＡ）であるが、強力な免疫グロブリン又はその他の真核生物遺伝子プロモーターのような多数の他の既知のプロモーターのうちの任意のものが使用されうることを、当業者は認識するであろう。好ましい転写ターミネーターは、ウシ成長ホルモンターミネーターであるが、他の既知の転写ターミネーターも、使用されうる。ＣＭＶｉｎｔＡ−ＢＧＨターミネーターの組み合わせが特に好ましい。
【００５７】
好ましい遺伝子配列の例は、配列番号１〜８に与えられている。
【００５８】
ベクター
本発明によると、少なくとも１個のＨＰＶタンパク質をコードする発現カセットは、次いで、ベクターへ挿入される。ベクターは、好ましくは、プラスミドベクター又はアデノウイルスベクターであるが、プロモーターと連結した直鎖状ＤＮＡ、又はアデノ随伴ウイルスベクターもしくは修飾型ワクシニアウイルスベクターのようなその他のベクターも使用されうる。
【００５９】
選択されたベクターがアデノウイルスである場合、ベクターはいわゆる第１世代アデノウイルスベクターであることが好ましい。これらのアデノウイルスベクターは、非機能性Ｅ１遺伝子領域、好ましくは欠失したアデノウイルスＥ１遺伝子領域を有することを特徴とする。いくつかの実施形態において、発現カセットは、通常はアデノウイルスＥ１遺伝子が位置している位置に挿入される。さらに、これらのベクターは、非機能性又は欠失したＥ３領域を場合により有する。アデノウイルスは、２９３細胞又はＰｅｒＣ．６細胞のようなウイルスＥ１遺伝子を発現する既知の細胞系において繁殖しうる。
【００６０】
アデノウイルスベクターの操作において便利なように、アデノウイルスはシャトルプラスミド形態でありうる。本発明は、プラスミド部分とアデノウイルス部分とを含むシャトルプラスミドベクターにも関する。ここで、アデノウイルス部分は、Ｅ１が欠失しており、場合によりＥ３欠失を有し、そして少なくとも１個のコドン最適化ＨＰＶ遺伝子を含む発現カセットが挿入されているアデノウイルスゲノムを含む。好ましい実施形態において、アデノウイルスベクターが容易に除去され得るよう、プラスミドのアデノウイルス部分の両側には制限部位が存在する。シャトルプラスミドは、原核細胞又は真核細胞において複製されうる。
【００６１】
ＤＮＡ構築物を調製し精製するための標準的な分子生物学の技術により、本発明のアデノウイルス、シャトルプラスミド、及びＤＮＡ免疫原の調製が可能である。
【００６２】
選択されたベクターがプラスミドＤＮＡである場合、ベクターは哺乳動物細胞又は昆虫細胞により認識される１個以上のプロモーターを含有していることが好ましい。好ましい実施形態において、プラスミドは、これに限定されないがＣＭＶプロモーターのような強力なプロモーターを含有するであろう。発現させるべき遺伝子が、そのようなプロモーターと連結されよう。そのようなプラスミドの一例は、記載（Ｊ．Ｓｈｉｖｅｒら，１９９６，ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｍ．Ｌｉｕら編，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｎ．Ｙ．，７７２：１９８〜２０８（参照により本明細書に組み込まれる））されているような哺乳動物発現プラスミドＶ１Ｊｎｓであろう。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態においては、ワクチンプラスミド及びアデノウイルスベクターの両方が、免疫応答を誘導するように脊椎動物へと投与されうる。この場合、２つのベクターは「プライムアンドブースト（ｐｒｉｍｅ  ａｎｄ  ｂｏｏｓｔ）」計画で投与される。例えば、第１の型のベクターが投与され、次いで、予定された量の時間、例えば１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、又はその他の適当な期間の後、第２の型のベクターが投与される。好ましくは、ベクターは、同一のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの組み合わせをコードする発現カセットを保持している。
【００６４】
従って、本発明のもう一つの態様は、
Ａ）Ｌ１、Ｅ１、Ｅ２、及びＥ７タンパク質からなる群より選択されるＨＰＶタンパク質をコードし、かつヒト宿主細胞における発現にとってコドン最適化されているポリヌクレオチドを含む第１のベクターを脊椎動物へ導入すること、
Ｂ）予定された量の時間を経過させること、並びに
Ｃ）Ｅ１領域内の欠失及びＥ１領域内の挿入配列［該挿入配列は、
ｉ）Ｌ１、Ｅ１、Ｅ２、及びＥ７タンパク質からなる群より選択されるＨＰＶタンパク質又はそれらの変異型をコードし、かつヒト宿主細胞における発現にとってコドン最適化されているポリヌクレオチドと、
ｉｉ）ポリヌクレオチドと機能的に連結されたプロモーターと
を含む発現カセットを含む］を有するアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスワクチンベクターを含む第２のベクターを脊椎動物へ導入すること
を含む、脊椎動物におけるヒトパピローマウイルスに対する免疫応答を誘導するための方法である。
【００６５】
一般的には、第１のベクターがプラスミドワクチンベクターであり、第２のベクターがアデノウイルスベクターであることが好ましい。従って、本発明は、
Ａ）プラスミド部分と発現カセット部分［該発現カセットは、
ｉ）Ｌ１、Ｅ１、Ｅ２、及びＥ７タンパク質からなる群より選択されるＨＰＶタンパク質をコードし、ヒト宿主細胞における発現にとってコドン最適化されているポリヌクレオチドと、
ｉｉ）ポリヌクレオチドと機能的に連結されたプロモーターと
を含む］とを含むプラスミドワクチンを脊椎動物へ導入すること、
Ｂ）予定された量の時間を経過させること、並びに
Ｃ）Ｅ１領域内の欠失及びＥ１領域内の挿入配列［該挿入配列は、
ｉ）Ｌ１、Ｅ１、Ｅ２、及びＥ７タンパク質からなる群より選択されるＨＰＶタンパク質、又はそれらの変異型をコードし、かつヒト宿主細胞における発現にとってコドン最適化されているポリヌクレオチドと、
ｉｉ）ポリヌクレオチドと機能的に連結されたプロモーターとを
含む発現カセットを含む］を有するアデノウイルスゲノムを含むアデノウイルスワクチンベクターを脊椎動物へ導入すること
を含む、脊椎動物における免疫応答を誘導する方法に関する。
【００６６】
本発明のさらにもう１つの実施形態においては、コドン最適化遺伝子が「プライム」としてプラスミドベクター又はアデノウイルスベクターにより受容者へと導入され、次いで、コドン最適化遺伝子によりコードされたものと本質的に同一のポリペプチド又はタンパク質を受容者へ導入することにより「ブースト」が達成される。全長タンパク質の断片、特に免疫原性を有し、かつ／又はエピトープを含むものを代用してもよい。
【００６７】
ワクチン受容者へと導入される発現可能ＤＮＡ又は転写されたＲＮＡの量は、部分的には、使用される転写及び翻訳プロモーターの強度、及び発現した遺伝子産物の免疫原性に依存する。一般的には、約１ｎｇ〜１００ｍｇ、好ましくは約１０μｇ〜３００μｇという免疫学的又は予防的に有効な量のプラスミドワクチンベクターが、筋肉組織へと直接投与される。組換えアデノウイルスについての有効量は、粒子約１０６〜１０１２個であり、好ましくは粒子１０７〜１０１１個である。皮下注射、皮内導入、皮膚へのインプレッション（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）、及び腹腔内、静脈内、又は吸入による送達のようなその他の投与様式も企図される。追加（ｂｏｏｓｔｅｒ）ワクチン投与が提供されることも企図される。本発明のワクチンの非経口導入と同時に、又はその後、インターロイキン−１２タンパク質のようなアジュバントを、静脈内、筋肉内、皮下、又はその他の投与手段のような非経口的な手段により投与することも有利である。
【００６８】
本発明のワクチンベクターは、裸の状態であっても、即ちタンパク質、アジュバント、又は受容者の免疫系に影響を与えるその他の物質が付随していなくてもよい。この場合、ワクチンベクターは、これらに限定されないが、無菌生理食塩水又は無菌緩衝生理食塩水のような生理学的に許容される溶液中に存在することが望ましく、又はＤＮＡに、タンパク質又はその他の担体のような、免疫応答を増強することが当分野において既知のアジュバントが付随していてもよい。これらに限定されないが、カルシウムイオンのような、細胞によるＤＮＡ取り込みを補助する物質も有利に使用されうる。これらの物質は、一般的に、本明細書において、トランスフェクション促進試薬、及び薬学的に許容される担体と呼ばれる。微小発射体（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ）にポリヌクレオチドをコーティングするための技術は、当分野において既知であり、本発明に関しても有用である。
【００６９】
以下の実施例は、例示のために提示されるものであり、決して本発明を制限するためのものではない。
【００７０】
（実施例）
実施例１
合成遺伝子の構築
高度に発現される哺乳動物遺伝子において見い出された最も高頻度に使用されるコドンを使用した、アミノ酸配列の逆翻訳により、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｌ１、Ｅ１、Ｅ２、及びＥ７の合成遺伝子配列を生成させた（Ｒ．Ｌａｔｈｅ，１９８５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８３：１〜１２（参照により本明細書に組み込まれる））。制限部位を導入又は除去するため、これらのコドン最適化配列においていくつかの調整を行った。これらの配列に基づくオリゴヌクレオチドを化学合成し（Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ；Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ）、ＰＣＲ増幅により組み立てた（Ｊ．Ｈａａｓ  ｅｔ．ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：３１５〜３２４；及びＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍ．Ｉｎｎｉｓら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０（いずれも、参照により本明細書に組み込まれる））。
【００７１】
全長配列を哺乳動物発現ベクターＶ１Ｊｎｓ（Ｊ．Ｓｈｉｖｅｒ  ｅｔ．ａｌ．１９９６，ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｍ．Ｌｉｕら編，Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｎ．Ｙ．，７７２：１９８〜２０８（参照により本明細書に組み込まれる））へクローニングし、標準的な方法論により配列決定した。実際の配列が予想と異なりアミノ酸置換が生じた場合には、以前に記載されたようなＰＣＲ変異誘発（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍ．Ｉｎｎｉｓら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０，１７７〜１８０頁）により、その配列を修正した。
【００７２】
タンパク質発現は、等量のプラスミドＤＮＡを２９３（形質転換ヒト胎児腎臓）細胞へと一過性トランスフェクトし、ＤＮＡ添加の４８時間後にそれを収集することにより評価した。等しいタンパク質負荷量を提供するため、細胞溶解物を標準化した。分析は、各ＨＰＶタンパク質に対して調製された血清を使用した間接免疫蛍光又はイムノブロット（ウェスタン）分析により実施した（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓａｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９８（参照により本明細書に組み込まれる））。
【００７３】
実施例２
ＨＰＶ１６  Ｌ１の合成
ＨＰＶ１６  Ｌ１をコードする遺伝子は、図１７に列挙された１４個のオリゴマーのアニーリング及び伸長により調製された。５個の別々の伸長反応を実施して、下記実施例３及び４に記載されたものと同様の条件を使用したＰＣＲにより、Ｌ１Ａ、Ｌ１Ｂ、Ｌ１Ｃ、Ｌ１Ｄ、及びＬ１Ｅと名付けられた遺伝子の断片を作出した。
【００７４】
Ｌ１Ａは、オリゴマー配列ＭＮ４Ａ１（配列番号９）、ＭＮ４Ａ２（配列番号１６）、及びＭＮ４Ａ３（配列番号１０）を使用して構築され、オリゴマーＭＮ６０４（配列番号３２）及びＭＮ５９６（配列番号２４）を使用して増幅された。
【００７５】
Ｌ１Ｂは、オリゴマー配列ＭＮ４Ａ４（配列番号１７）、ＭＮ４Ａ５（配列番号１１）、及びＭＮ４Ａ６（配列番号１８）を使用して構築され、オリゴマーＭＮ５９５（配列番号２３）及びＭＮ５９８（配列番号２６）を使用して増幅された。
【００７６】
Ｌ１Ｃは、オリゴマー配列ＭＮ４Ａ７（配列番号１２）及びＭＮ４Ａ８（配列番号１９）を使用して作出され、オリゴマーＭＮ５９７（配列番号２５）及びＭＮ６０２（配列番号３０）を使用して増幅された。
【００７７】
Ｌ１Ｄは、オリゴマー配列ＭＮ４Ａ９（配列番号１３）、ＭＮ４Ａ１０（配列番号２０）、及びＭＮ４Ａ１１（配列番号１４）を使用して作出され、オリゴマーＭＮ５９７（配列番号２５）及びＭＮ６０２（配列番号３０）を使用して増幅された。
【００７８】
Ｌ１Ｅは、オリゴマー配列ＭＮ４Ａ１２（配列番号２１）、ＭＮ４Ａ１３（配列番号１５）、及びＭＮ４Ａ１４（配列番号２２）を使用して作出され、オリゴマーＭＮ６０１（配列番号２９）及びＭＮ６０３（配列番号３１）を使用して増幅された。
【００７９】
ＰＣＲ反応から得られた断片Ｌ１Ａ、Ｌ１Ｂ、Ｌ１Ｃ、Ｌ１Ｄ、及びＬ１Ｅを低融点アガロースでゲル分離し、適切なサイズの産物を切り出し、製造業者の推奨に従いＡｇａｒａｓｅ（登録商標）法（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用して精製した。断片Ｌ１Ａ、Ｌ１Ｂ、及びＬ１Ｃを、オリゴマーＭＮ６０４（配列番号３２）及びＭＮ６００（配列番号２８）を使用した２次ＰＣＲ反応において組み合わせ、Ｌ１Ａ−Ｂ−Ｃを組み立て、Ｌ１Ｄ及びＬ１Ｅを、オリゴマーＭＮ５９９（配列番号２７）及びＭＮ６０３（配列番号３１）を用いた２次ＰＣＲによりＬ１Ｄ−Ｅへと組み立てた。次いで、最終ＰＣＲ反応系列において、オリゴマーＭＮ６０４（配列番号３２）及びＭＮ６０３（配列番号３１）を用いてＬ１Ａ−Ｂ−Ｃ、Ｌ１Ｄ−Ｅを組み合わせる、さらなるＰＣＲ反応により、完全な遺伝子を組み立てた。得られた１．５ｋｂの産物をゲル単離し、ＢｇｌＩＩで消化し、Ｖ１Ｊｎｓへとサブクローニングし、配列決定した。変異が観察された場合には、実施例１に記載のようなＰＣＲ変異誘発によりそれを修正した。正確なＨＰＶ１６  Ｌ１  ＤＮＡ配列、及び実施例１に記載のような一過性トランスフェクションアッセイにおいて使用するためのＶ１Ｊｎｓ内の適切な方向を有するクローンから、ＤＮＡを単離した。
【００８０】
トランスフェクションの結果（ＨＰＶ１６  Ｌ１）
図９は、ネイティブＨＰＶ１６  Ｌ１又はコドン最適化合成ＨＰＶ１６  Ｌ１のいずれかを含有するＶ１Ｊｎｓプラスミドで一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のＨＰＶ１６  Ｌ１イムノブロットの結果を示している。レーンａ、ｂ、及びｃは、合成ＨＰＶ１６  Ｌ１発現構築物を使用して達成された発現レベルである。これらの各レーンには、高レベルの免疫反応性物質が認められ、主要なバンドは、全長ＨＰＶ１６  Ｌ１の予想分子量と一致する、およそ５５ｋＤａに存在する。対照的に、ネイティブＨＰＶ１６  Ｌ１／Ｖ１Ｊｎｓプラスミドでトランスフェクトされた溶解物を含むレーン（レーンｄ、ｅ、及びｆ）には、免疫反応性物質が事実上認められない。全ての細胞溶解物の負荷量は標準化され、等しいＤＮＡ量がトランスフェクションに使用されたため、これらの所見は、合成遺伝子配列が、ネイティブ遺伝子配列と比較して、ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質蓄積レベルを大きく増加させたことを示している。
【００８１】
実施例３
ＨＰＶ１６  Ｅ１の合成
修飾型ＨＰＶ１６  Ｅ１をコードする遺伝子は、図１８に列挙されたオリゴマーを使用して、一連の断片Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ１Ｃ、Ｅ１Ｄ、Ｅ１Ｅ、及びＥ１Ｆから組み立てられた。Ｅ１Ａは、オリゴマーＭＮ６０５（配列番号３３）、ＭＮ６０６（配列番号３４）、及びＭＮ６０７（配列番号３５）の組み立てにより形成され、オリゴマーＭＮ６３６（配列番号６４）及びＭＮ６２４（配列番号５２）を使用して増幅された。
【００８２】
Ｅ１Ｂは、オリゴマーＭＮ６０８（配列番号３６）、ＭＮ６０９（配列番号３７）、及びＭＮ６１０（配列番号３８）の組み立てにより形成され、オリゴマーＭＮ６２３（配列番号５１）及びＭＮ６２６（配列番号５４）を用いて増幅された。
【００８３】
Ｅ１Ｃは、オリゴマーＭＮ６１１（配列番号３９）及びＭＮ６１２（配列番号４０）の組み立てにより形成され、オリゴマーＭＮ６２５（配列番号５３）及びＭＮ６２８（配列番号５６）を用いて増幅された。
【００８４】
Ｅ１Ｄは、オリゴマーＭＮ６１３（配列番号４１）、ＭＮ６１４（配列番号４２）、及びＭＮ６１５（配列番号４３）の組み立てにより形成され、オリゴマーＭＮ６２７（配列番号５５）及びＭＮ６３０（配列番号５８）を用いて増幅された。
【００８５】
Ｅ１Ｅは、オリゴマーＭＮ６１６（配列番号４４）、ＭＮ６１７（配列番号４５）、及びＭＮ６１８（配列番号４６）の組み立てにより形成され、オリゴマーＭＮ６２９（配列番号５７）及びＭＮ６３２（配列番号６０）を用いて増幅された。
【００８６】
Ｅ１Ｆは、オリゴマーＭＮ６１９（配列番号４７）、ＭＮ６２０（配列番号４８）、及びＭＮ６２１（配列番号４９）の組み立てにより形成され、オリゴマーＭＮ６３１（配列番号５９）及びＭＮ６３５（配列番号６３）を用いて増幅された。
【００８７】
前記の方法を使用して、これらのＰＣＲ反応の産物をゲル単離し、２次ＰＣＲにおいて組み合わせて、ＨＰＶ１６  Ｅ１をコードする２ｋｂ遺伝子断片を形成させた。得られたＨＰＶ１６  Ｅ１を前記のようなＶ１Ｊｎｓ発現ベクターに挿入し、実施例１に記載のような一過性トランスフェクションアッセイにおいて利用した。
【００８８】
トランスフェクションの結果（ＨＰＶ１６  Ｅ１）
図１０は、ネイティブＨＰＶ１６  Ｅ１又はコドン最適化合成ＨＰＶ１６  Ｅ１のいずれかを含有するＶ１Ｊｎｓプラスミドで一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のＨＰＶ１６  Ｅ１イムノブロットの結果を示している。レーンｂ及びｅは、コドン最適化ＨＰＶ１６  Ｅ１発現構築物を使用して達成された発現レベルである。高レベルのＨＰＶ１６  Ｅ１特異的免疫染色が認められ、レーンｂ及びｅにおける主要なバンドは、全長ＨＰＶ１６  Ｅ１の予想サイズと一致する、７２ｋＤａに存在する。さらに、偽トランスフェクトされた対照（レーンｃ）には観察されないためＥ１特異的であると考えられる、比較的小さい免疫反応性産物が多数存在する。
【００８９】
ネイティブＨＰＶ１６  Ｅ１／Ｖ１Ｊｎｓ構築物でトランスフェクトされた細胞の溶解物においては、極めて異なる発現プロファイルが観察される。レーンａ及びｄに示されるように、偽トランスフェクション対照には存在しない免疫反応性物質は、極微量しか可視化されない。全ての細胞溶解物の負荷量は標準化され、等しいＤＮＡ量がトランスフェクションに使用されたため、これらの所見は、合成遺伝子配列が、ネイティブ遺伝子配列と比較して、ＨＰＶ１６  Ｅ１タンパク質蓄積レベルを大きく増加させたことを示している。
【００９０】
実施例４
ＨＰＶ１６  Ｅ２の合成
断片ＡＤ。各１５０ｎＭのオリゴヌクレオチド１３８５６−３０７−２Ａ（配列番号６５）、１３８５６−３０７−２Ｂ（配列番号７１）、１３８５６−３０７−２Ｃ（配列番号６６）、及び１３８５６−３０７−２Ｄ（配列番号７２）、各０．５ｍＭのｄＮＴＰ、Ｎａｔｉｖｅバッファー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、並びに１μＬのＮａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含有する反応液５０μｌを、９５℃２分、次いで９５℃４５秒、５５℃４５秒、及び７２℃２．５分を２０サイクルという条件の下で、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）においてインキュベートした。反応液に、最終濃度各４００ｎＭのプライマー１３８５６−３０７−２ＰＡ（配列番号７８）及び１３８５６−３０７−２ＰＤ（配列番号８２）、並びに１μＬのＮａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを添加した。混合物を、９５℃２分、次いで９５℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃２．５分を２５サイクル、インキュベートした。ゲル単離された全長断片ＡＤを、プライマー１３８５６−３０７−２ＰＡ（配列番号７８）及び１３８５６−３０７−２ＰＤ（配列番号８２）を使用して、同条件下で２０サイクル増幅した。
【００９１】
断片ＥＨ。各１５０ｎＭのオリゴヌクレオチド１３８５６−３０７−２Ｅ（配列番号６７）、１３８５６−３０７−２Ｆ（配列番号７３）、１３８５６−３０７−２Ｇ（配列番号６８）、及び１３８５６−３０７−２Ｈ（配列番号７４）、各０．５ｍＭのｄＮＴＰ、Ｎａｔｉｖｅバッファー、並びに１μＬのＮａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する反応液５０μｌを、９５℃２分、次いで９５℃２分、４５秒、５５℃４５秒、及び７２℃２．５分を２０サイクルという条件の下で、インキュベートした。反応液に、最終濃度各４００ｎＭのプライマー１３８５６−３０７−２ＰＥ（配列番号８０）及び１３８５６−３０７−２ＰＨ（配列番号８３）、並びに１μＬのＮａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを添加した。混合物を、９５℃２分、次いで９５℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃２．５分を２５サイクル、インキュベートした。
【００９２】
断片ＩＬ。各１５０ｎＭのオリゴヌクレオチド１３８５６−３０７−２Ｉ（配列番号６９）、１３８５６−３０７−２Ｊ（配列番号７５）、１３８５６−３０７−２Ｋ（配列番号７０）、及び１３８５６−３０７−２Ｌ（配列番号７６）、各０．５ｍＭのｄＮＴＰ、Ｎａｔｉｖｅバッファー、並びに１μＬのＮａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する反応液５０μｌを、９５℃２分、次いで９５℃２分、４５秒、５５℃４５秒、７２℃２．５分を２０サイクルという条件の下で、インキュベートした。反応液に、最終濃度各４００ｎＭのプライマー１３８５６−３０７−２ＰＩ（配列番号８１）及び１３８５６−３０７−２ＰＬ（配列番号８４）、並びに１μＬのＮａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを添加した。混合物を、９５℃２分、次いで９５℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃２．５分を２５サイクル、インキュベートした。
【００９３】
断片ＡＨ。各１．５μｌのＡＤ及びＥＨ  ＰＣＲ産物、各０．５ｍＭのｄＮＴＰ、Ｎａｔｉｖｅバッファー、並びに１μＬのＮａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する反応液５０μｌを、９５℃２分、次いで９５℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃３．５分を２０サイクルという条件の下で、インキュベートした。反応液に、最終濃度各４００ｎＭのプライマー１３８５６−３０７−２ＰＡ（配列番号７８）及び１３８５６−３０７−２ＰＨ（配列番号８３）、並びに１μＬのＮａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを添加した。混合物を、９５℃２分、次いで９５℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃３．５分を２５サイクル、インキュベートした。
【００９４】
断片ＩＭ。１μｌのＩＬ  ＰＣＲ産物、最終濃度各４００ｎＭのオリゴヌクレオチド１３８５６−３０７−２Ｍ（配列番号７７）及び１３８５６−３０７−２ＰＩ（配列番号８１）、各０．５ｍＭのｄＮＴＰ、Ｎａｔｉｖｅバッファー、並びに１μＬのＮａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する反応液５０μｌを、９５℃２分、次いで９５℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃４分を２５サイクルという条件の下で、インキュベートした。
【００９５】
ＡＭ、全長ＨＰＶ１６  Ｅ２の組み立て。各１．５μｌの断片ＡＨ及びＩＭ、各０．５ｍＭのｄＮＴＰ、Ｎａｔｉｖｅバッファー、並びに１μＬのＮａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する反応液５０μｌを、９５℃２分、次いで９５℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃４分を２０サイクルという条件の下で、インキュベートした。反応液に、最終濃度各４００ｎＭのプライマー１３８５６−３０７−２ＰＡ（配列番号７８）及び１３８５６−３０７−２ＰＭ（配列番号７９）、並びに１μＬのＮａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを添加した。混合物を、９５℃２分、次いで９５℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃４分を２５サイクル、インキュベートした。得られた全長断片を１．２％アガロースゲル電気泳動により単離し、ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ；Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）を用いて回収し、評価のため発現ベクターＶ１Ｊｎｓへサブクローニングした。
【００９６】
トランスフェクションの結果（ＨＰＶ１６  Ｅ２）
図１１は、ネイティブＨＰＶ１６  Ｅ２又は合成ＨＰＶ１６  Ｅ２のいずれかを含有するＶ１Ｊｎｓプラスミドで一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のＨＰＶ１６  Ｅ２イムノブロットの結果を示している。レーンｃ及びｄは、コドン最適化ＨＰＶ１６  Ｅ２発現構築物を使用して達成された発現レベルである。偽トランスフェクトされた対照（レーンｃ）には観察されないためＥ２特異的であると考えられる、高レベルのＨＰＶ１６  Ｅ２特異的免疫染色が可視である。
【００９７】
しかしながら、ネイティブＨＰＶ１６  Ｅ２／Ｖ１Ｊｎｓ構築物でトランスフェクトされた細胞の溶解物においては、極めて異なる発現プロファイルが観察される。レーンｅに示されるように、免疫反応性物質は可視化されない。全ての細胞溶解物の負荷量は標準化され、等しいＤＮＡ量がトランスフェクションに使用されたため、これらの所見は、合成遺伝子配列が、ネイティブ遺伝子配列と比較して、ＨＰＶ１６  Ｅ２タンパク質蓄積レベルを大きく増加させたことを示している。
【００９８】
実施例５
ＨＰＶ１６  Ｅ７の合成
ＨＰＶ１６  Ｅ７をコードする遺伝子は、図２０に列挙されたオリゴマーを使用して作成された一連の断片から組み立てられた。
【００９９】
各１５０ｎＭのオリゴヌクレオチド１３８５６−３０７−７Ａ（配列番号８５）、１３８５６−３０７−７Ｂ（配列番号８７）、１３８５６−３０７−７Ｃ（配列番号８６）、及び１３８５６−３０７−７Ｄ（配列番号８８）、各０．５ｍＭのｄＮＴＰ、Ｎａｔｉｖｅバッファー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、並びに１μＬのＮａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含有する反応液５０μｌを、９５℃２分、次いで９５℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃２．５分を２０サイクルという条件の下で、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）においてインキュベートした。反応液に、最終濃度各４００ｎＭのプライマー１３８５６−３０７−７ＰＡ（配列番号８９）及び１３８５６−３０７−７ＰＤ（配列番号９０）、並びに１μＬのＮａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを添加した。混合物を、９５℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃２．５分を２５サイクル、インキュベートした。
【０１００】
得られた全長断片をＴＢＥ中での１．２％アガロースゲル電気泳動（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓａｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９８（参照により本明細書に組み込まれる））により単離し、臭化エチジウムで染色し、ゲルから切り取り、ＧｅｎＥｌｕｔｅカラム（Ｓｕｐｌｅｃｏ；Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）より回収し、水２０μｌに再懸濁させた。２μｌの断片、各０．５μＭのオリゴヌクレオチド１３８５６−３０７−７ＰＡ（配列番号８９）及び１３８５６−３０７−７ＰＤ（配列番号９０）、各０．５ｍＭのｄＮＴＰ、Ｎａｔｉｖｅバッファー、並びにＮａｔｉｖｅ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含有する反応液５１μｌにおいて、配列をさらに増幅した。反応液に、９５℃４５秒、５５℃４５秒、７２℃２．５分を２０サイクル、施した。最終増幅産物を前記のような電気泳動により単離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ；Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）を用いてＤＮＡを回収し、Ｖ１Ｊｎｓへサブクローニングした。
【０１０１】
トランスフェクションの結果（ＨＰＶ１６  Ｅ７）
図１２は、ネイティブＨＰＶ１６  Ｅ７（レーンｅ）又は合成ＨＰＶ１６  Ｅ７（レーンｃ及びｄ）のいずれかを含有するＶ１Ｊｎｓプラスミドで一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のＨＰＶ１６  Ｅ７イムノブロットの結果を示している。合成ＨＰＶ１６  Ｅ７遺伝子細胞溶解物レーンには、ネイティブＨＰＶ１６  Ｅ７遺伝子細胞溶解物（レーンｅ）よりも相当に強く現れている高レベルのＨＰＶ１６  Ｅ７特異的免疫染色が可視である。レーンａ及びｂは、抗体染色がＨＰＶ１６  Ｅ７配列に特異的であることを示す陰性トランスフェクション対照である。全ての細胞溶解物の負荷量は標準化され、等しいＤＮＡ量がトランスフェクションに使用されたため、これらの所見は、合成遺伝子配列が、ネイティブ遺伝子配列と比較して、ＨＰＶ１６  Ｅ２タンパク質蓄積レベルを大きく増加させたことを示している。
【０１０２】
実施例６
ＨＰＶ６ａ及びＨＰＶ１８に由来するＥ７及びＥ２コーディング遺伝子の合成  ＨＰＶ６ａ  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７をコードする遺伝子は、実施例４に記載の方法と同様の方法を使用して構築された。ただし、ＨＰＶ６ａ  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７遺伝子を作出するために使用されたオリゴマーは、それぞれ図２１及び図２２に列挙された配列を含有する。ＨＰＶ６ａ  Ｅ２及びＨＰＶ１８  Ｅ２をコードする合成遺伝子の構築は、それぞれ図２３及び図２４に列挙されたオリゴマー配列を使用して、実施例５において詳述されたのと同様にして実施された。
【０１０３】
トランスフェクションの結果：ＨＰＶ６ａ  Ｅ７及びＨＰＶ１８  Ｅ７
図１３は、合成ＨＰＶ６ａ  Ｅ７（レーンｂ及びｃ）を含有するＶ１Ｊｎｓプラスミドで一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のＨＰＶ６ａ  Ｅ７イムノブロットの結果を示している。全長ＨＰＶ６ａ  Ｅ７について予想される領域に、高レベルのＨＰＶ６ａ  Ｅ７特異的免疫染色が可視である。合成ＨＰＶ６ａ  Ｅ７（レーンｂ、ｃ、ｄ、及びｅ）を含有するＶ１Ｊｎｓプラスミドで一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のＨＰＶ１８  Ｅ７イムノブロット分析による同様なプロファイルが、図１４に見出される。精製されたＨＰＶ１８タンパク質対照（レーンｆ）の位置により示されるような全長ＨＰＶ１８  Ｅ７が見出されるであろう位置に、高レベルのＨＰＶ１８  Ｅ７特異的免疫染色が可視である。陰性対照レーンａには染色される材料が出現せず、そのことは、他のレーンにおける染色がＨＰＶ１８  Ｅ７特異的であることを示している。
【０１０４】
Ｖ１Ｊｎｓ内の合成ＨＰＶ６ａ  Ｅ２をコードする合成遺伝子の発現を、トランスフェクトされた２９３細胞のイムノブロット分析により評価した。それを図１５に示す。レーンａ及びｂは、合成ＨＰＶ６ａ  Ｅ２トランスフェクタントの細胞溶解物であり、レーンｃ及びｄは陰性対照である。ＨＰＶ１８  Ｅ２発現についての類似の実験が、図１６に示されている。レーンｃ及びｄは、合成ＨＰＶ１８  Ｅ２遺伝子を受容したトランスフェクションの細胞溶解物であり、レーンａ及びｂは陰性対照である。これらの図はいずれも、コドン最適化合成遺伝子を哺乳動物細胞において発現させた場合、測定可能なレベルのＥ２産物が蓄積することを示している。
【０１０５】
これらの結果は、合成遺伝子再構築が、ＨＰＶ１６遺伝子に限定されないことを示している。むしろ、他のＨＰＶ型のコドン最適化も、哺乳動物細胞における有意なレベルのＥ７及びＥ２産物の蓄積を可能にする。
【０１０６】
実施例７
ＨＰＶ抗原を発現する複製欠損ＦＧ−Ａｄの構築
出発ベクター
シャトルベクターｐＨＣＭＶＩＢＧＨｐＡ１は、イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含有する発現カセットを有する、Ａｄ５配列のｂｐ１〜ｂｐ３４１及びｂｐ３５３４〜ｂｐ５７９８を含有している。
【０１０７】
アデノウイルス骨格ベクターｐＡｄＥ１−Ｅ３−（ｐＨＶａｄ１とも呼ばれる）は、Ｅ１及びＥ３領域を包含するオリゴヌクレオチドを除く全てのＡｄ５配列を含有している。
【０１０８】
Ａｄ５．ＨＰＶ１６  Ｅ２の構築
１．ヒトＣＭＶプロモーター及びイントロンＡの調節下でＨＰＶ１６  Ｅ２を含有するアデノウイルスシャトルプラスミドｐＡ１−ＣＭＶＩ−ＨＰＶ１６  Ｅ２の構築
ＨＰＶ１６  Ｅ２挿入配列を制限酵素ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩによりｐＶ１ＪＮＳ−ＨＰＶ１６  Ｅ２から切り出し、次いでＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩにより消化されたシャトルベクターｐＨＣＭＶＩＢＧＨｐＡ１へクローニングした。
【０１０９】
２．ＨＰＶ１６  Ｅ２発現カセットを含有するプラスミド型の組換えアデノウイルスベクターｐＡｄ−ＣＭＶＩ−ＨＰＶ１６  Ｅ２を生成させるための相同的組み換え
シャトルプラスミドｐＡ１−ＣＭＶＩ−ＨＰＶ１６  Ｅ２を制限酵素ＢｓｔＺ１７及びＳｇｒＡ１で消化し、次いで直鎖化（ＣｌａＩ消化）されたアデノウイルス骨格プラスミドｐＡｄＥ１−Ｅ３−と共に大腸菌ＢＪ５１８３株へと共形質転換した。コロニーをＰＣＲ分析により確認した。プラスミドの大量作製のため、ベクターをコンピテント大腸菌ＨＢ１０１へと形質転換した。
【０１１０】
３．２９３細胞における組換えアデノウイルスＡｄ．ＣＭＶＩ−ＨＰＶ１６  Ｅ２の生成
ｐＡｄプラスミドを制限酵素ＰａｃＩにより直鎖化し、ＣａＰＯ４法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎキット）を使用して２９３細胞へとトランスフェクトした。１０日後、プラーク１０個を拾い上げ、３５ｍｍプレートにおいて２９３細胞中で増殖させた。アデノウイルスＤＮＡのＰＣＲ分析は、ウイルスがＨＰＶ１６  Ｅ２陽性であることを示した。
【０１１１】
４．大規模な組換えアデノウイルスＡｄ．ＣＭＶＩ−ＨＰＶ１６  Ｅ２の評価
２９３細胞における複数回の増幅により、選択されたクローンを大量に増殖させた。ＨＰＶ１６  Ｅ２の発現も、組換えアデノウイルスを感染させた２９３細胞又はＣＯＳ細胞のＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット分析により確認した。組換えアデノウイルスを、マウス及びアカゲザルにおける評価に使用した。
【０１１２】
処置の方法
ヒトパピローマウイルス感染に対する治療的又は予防的な免疫感作の必要がある対象に、ＨＰＶ  Ｌ１、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、又はＥ７の全部又は一部をコードするＨＰＶ  ＤＮＡ、及びそれらの組み合わせを注射する。注射は、ｉ．ｐ．、皮下、筋肉内、又は皮内でありうる。ＨＰＶ  ＤＮＡは、免疫応答の初回刺激剤（ｐｒｉｍｅｒ）としても使用されうるし、又は免疫応答の追加刺激剤（ｂｏｏｓｔｅｒ）としても使用されうる。ＤＮＡ注射の後、同時、又は前に、ＨＰＶウイルス様粒子（Ｌ１タンパク質のみを含有、又はＬ１及びＬ２タンパク質の両方を含有、又は１個以上のタンパク質の変異型を含有）を含む薬学的組成物、カプソメア、不活化ＨＰＶ、弱毒化ＨＰＶ、ＨＰＶ由来タンパク質を含む組成物、又はそれらの組み合わせを、対象へ注射することもできる。
【０１１３】
実施例８
モデル腫瘍抗原としての合成発現ＨＰＶ  Ｅタンパク質の使用
ＨＰＶ１６  Ｅ２を発現する腫瘍細胞系の生成
合成ＨＰＶ１６  Ｅ２コーディング配列（前記参照）を含有するＮｏｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ制限消化断片を、ネオマイシン耐性マーカーを有し、ＨＣＭＶ極初期プロモーターによるトランスジーンの発現を駆動するＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ消化された発現ベクターｐＢＪ／ｎｅｏ／ＣＣＲ２Ｂと連結させた。得られたプラスミドｐＢＪ−１６Ｅ２を、制限消化、クローニング接合部の配列分析、及び一過性トランスフェクトされたＡ２９３細胞又はＣＴ２６細胞におけるＥ２タンパク質発現誘導能により、特徴決定した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用したＣＴ２６細胞のトランスフェクションにより、安定な細胞系を生成させた。ＢＡＬＢ／ｃマウス結腸癌由来の完全形質転換系、ＣＴ２６細胞は、モデル腫瘍抗原として広範に使用されている（Ｂｒａｔｔａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０：２１４２〜２１４６；Ｆｅａｒｏｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，１９８８  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４８：２９７５〜２９８０（いずれも、参照により本明細書に組み込まれる））。
【０１１４】
４８時間後、細胞をトリプシン処理し、培地で１：１０、１：１００、１：１０００、又は１：１００００に希釈し、１００ｍｍ２プレートに播いた。２４時間後、培地を、４００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を含有する選択培地と交換した。２又は３週間後、よく分離した細胞のコロニーを、クローニングリングを使用して回収し、４８穴プレートに移した。イムノブロット分析によると、１個のクローンがＥ２発現陽性であった。それに、限界希釈により、さらに２回のクローニングを施した。１個のＧ４１８耐性Ｅ２陽性クローン単離物を使用して、細胞系ＪＣＬ−０３１（図２５）を樹立した。
【０１１５】
ＪＣＬ−０３１細胞を皮下注射により（同系）ＢＡＬＢ／ｃマウスへ接種すると、親ＣＴ２６系と類似の動力学で腫瘍が誘導された。回収した腫瘍から培養された細胞は、Ｇ４１８耐性であり、Ｅ２を発現していた。
【０１１６】
Ｖ１Ｊｎｓ：Ｅ２  ＤＮＡを用いた免疫感作によるマウスにおける免疫の誘導  ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＤＮＡ  Ｖ１Ｊｎｓ：１６Ｅ２の筋肉内注射により、複数回、免疫感作した。各用量群から無作為に選択された２匹のマウスからの脾臓をプールし、脾細胞を調製し、マウスインターフェロンガンマＥｌｉｓｐｏｔアッセイ（Ｌａｌｖａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９〜８６５；Ｆｏｒｓｔｈｕｂｅｒ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７１：１７２８〜１７３０；．Ｃｈｕ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１６２３〜１６３１（各々、参照により本明細書に組み込まれる））においてアッセイした。ＨＰＶ１６  Ｅ２の全長をスキャンする３６個の重複する２０アミノ酸残基ペプチド（最終濃度各４μｇ／ｍＬ）の存在下で、脾細胞培養物を３７℃で２４時間インキュベートした。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ｒ４−６Ａ２（Ｐｈａｒｍａｇｉｎ）によりインターフェロンガンマを基質へと捕捉し、ビオチン化ｍＡｂ  ＸＭＧ１．２（Ｐｈａｒｍａｇｉｎ）及びストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ複合体（Ｐｈａｒｍａｇｉｎ）を用いて検出した。結果を下記表Ａに示す。免疫感作されたマウスは、ＨＰＶに対するＣＤ４＋免疫応答を示した（下記表Ａ）。
【０１１７】
Ｅ２  ＤＮＡによる免疫感作は、検出可能な抗Ｅ２抗体応答を誘導しなかった。
【０１１８】
【表１】
0004799789.tif 000002
【０１１９】
抗原としてのＪＣＬ−０３１細胞の接種からの防御
Ｖ１Ｊｎｓ：Ｅ２  ＤＮＡ又は対照ＤＮＡにより免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃマウスに、左鼠径部への皮下注射により、ＪＣＬ−０３１細胞５×１０５個を抗原として接種した。４週間にわたり触診又はカリパス測定により腫瘍増殖をモニターした。図２６は、腫瘍が発生しなかった各用量群の割合を報告している。Ｅ２発現プラスミドで免疫感作された群は、対照群と比較して腫瘍発生から有意に防御された。
【図面の簡単な説明】
【図１】  コドン最適化ＨＰＶ１６  Ｌ１遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）である。
【図２】  コドン最適化ＨＰＶ１６  Ｅ１遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２）である。
【図３】  コドン最適化ＨＰＶ１６  Ｅ２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３）である。
【図４】  コドン最適化ＨＰＶ１６  Ｅ７遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号４）である。
【図５】  コドン最適化ＨＰＶ６ａ  Ｅ７遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号５）である。
【図６】  コドン最適化ＨＰＶ１８  Ｅ７遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号６）である。
【図７】  コドン最適化ＨＰＶ６ａ  Ｅ２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号７）である。
【図８】  コドン最適化ＨＰＶ１８  Ｅ２遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号８）である。
【図９】  発現ベクターＶ１Ｊｎｓ内のネイティブ（レーンｄ、ｅ、ｆ）又は合成（ａ、ｂ、ｃ）のＨＰＶ１６  Ｌ１配列により一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のイムノブロット分析の結果を示す。
【図１０】  発現ベクターＶ１Ｊｎｓ内のネイティブ又は合成のＨＰＶ１６  Ｅ１配列により一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のイムノブロット分析の結果を示す。
【図１１】  発現ベクターＶ１Ｊｎｓ内のネイティブ又は合成のＨＰＶ１６  Ｅ２配列により一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のイムノブロット分析の結果を示す。
【図１２】  発現ベクターＶ１Ｊｎｓ内のネイティブ又は合成のＨＰＶ１６  Ｅ７配列により一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のイムノブロット分析の結果を示す。
【図１３】  発現ベクターＶ１Ｊｎｓ内の合成ＨＰＶ６ａ  Ｅ７配列により一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のイムノブロット分析の結果を示す。
【図１４】  発現ベクターＶ１Ｊｎｓ内の合成ＨＰＶ１８  Ｅ７配列により一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のイムノブロット分析の結果を示す。
【図１５】  発現ベクターＶ１Ｊｎｓ内の合成ＨＰＶ６ａ  Ｅ２配列により一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のイムノブロット分析の結果を示す。
【図１６】  発現ベクターＶ１Ｊｎｓ内の合成ＨＰＶ１８  Ｅ２配列により一過性トランスフェクトされた２９３細胞の溶解物のイムノブロット分析の結果を示す。
【図１７】  合成ＨＰＶ１６  Ｌ１を生成させるために使用されたオリゴヌクレオチド（配列番号９〜３２）の表である。
【図１８】  合成ＨＰＶ１６  Ｅ１を生成させるために使用されたオリゴヌクレオチド（配列番号３３〜６４）の表である。
【図１９】  合成ＨＰＶ１６  Ｅ２を生成させるために使用されたオリゴヌクレオチド（配列番号６５〜８４）の表である。
【図２０】  合成ＨＰＶ１６  Ｅ７を生成させるために使用されたオリゴヌクレオチド（配列番号８５〜９０）の表である。
【図２１】  合成ＨＰＶ６ａ  Ｅ７を生成させるために使用されたオリゴヌクレオチド（配列番号９１〜９６）の表である。
【図２２】  合成ＨＰＶ１８  Ｅ７を生成させるために使用されたオリゴヌクレオチド（配列番号９７〜１０２）の表である。
【図２３】  合成ＨＰＶ６ａ  Ｅ２を生成させるために使用されたオリゴヌクレオチド（配列番号１０３〜１２６）の表である。
【図２４】  合成ＨＰＶ１８  Ｅ２を生成させるために使用されたオリゴヌクレオチド（配列番号１２７〜１５０）の表である。
【配列表】
0004799789.tif 000003
0004799789.tif 000004
0004799789.tif 000005
0004799789.tif 000006
0004799789.tif 000007
0004799789.tif 000008
0004799789.tif 000009
0004799789.tif 000010
0004799789.tif 000011
0004799789.tif 000012
0004799789.tif 000013
0004799789.tif 000014
0004799789.tif 000015
0004799789.tif 000016
0004799789.tif 000017
0004799789.tif 000018
0004799789.tif 000019
0004799789.tif 000020
0004799789.tif 000021
0004799789.tif 000022
0004799789.tif 000023
0004799789.tif 000024
0004799789.tif 000025
0004799789.tif 000026
0004799789.tif 000027
0004799789.tif 000028
0004799789.tif 000029
0004799789.tif 000030
0004799789.tif 000031
0004799789.tif 000032
0004799789.tif 000033
0004799789.tif 000034
0004799789.tif 000035
0004799789.tif 000036
0004799789.tif 000037
0004799789.tif 000038
0004799789.tif 000039
0004799789.tif 000040
0004799789.tif 000041
0004799789.tif 000042
0004799789.tif 000043
0004799789.tif 000044
0004799789.tif 000045
0004799789.tif 000046
0004799789.tif 000047
0004799789.tif 000048
0004799789.tif 000049
0004799789.tif 000050
0004799789.tif 000051
0004799789.tif 000052
0004799789.tif 000053
0004799789.tif 000054
0004799789.tif 000055
0004799789.tif 000056
0004799789.tif 000057
0004799789.tif 000058
0004799789.tif 000059
【図１】
0004799789.tif 000060
【図２】
0004799789.tif 000061
【図３】
0004799789.tif 000062
【図４】
0004799789.tif 000063
【図５】
0004799789.tif 000064
【図６】
0004799789.tif 000065
【図７】
0004799789.tif 000066
【図８】
0004799789.tif 000067
【図９】
0004799789.tif 000068
【図１０】
0004799789.tif 000069
【図１１】
0004799789.tif 000070
【図１２】
0004799789.tif 000071
【図１３】
0004799789.tif 000072
【図１４】
0004799789.tif 000073
【図１５】
0004799789.tif 000074
【図１６】
0004799789.tif 000075
【図１７】
0004799789.tif 000076
0004799789.tif 000077
【図１８】
0004799789.tif 000078
0004799789.tif 000079
0004799789.tif 000080
【図１９】
0004799789.tif 000081
0004799789.tif 000082
【図２０】
0004799789.tif 000083
【図２１】
0004799789.tif 000084
【図２２】
0004799789.tif 000085
【図２３】
0004799789.tif 000086
0004799789.tif 000087
【図２４】
0004799789.tif 000088
0004799789.tif 000089