(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンゴ酢を減圧濃縮後あるいはそのまま蒸留水に対して透析（透析膜３６／３２、分子量１２０００〜１４０００）を行い、透析内液を凍結乾燥する工程、  上記凍結乾燥物をセファクリル  Ｓ−３００ゲルによるゲルロ過クロマトグラフィーを行い、デキストラン換算で１０００以上４００００以下の画分を得て脱塩する工程、  および、その後、弱陰イオン交換クロマトグラフィー、例えばＤＥＡＥ  セファロース  ファースト  フロー陰イオン交換ゲルを充填したカラムクロマトグラフィーに付し、カラム担体容量の少なくとも２倍量の希薄な中性緩衝液で溶出、脱塩した後、凍結乾燥する工程、からなるリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖の製造方法。
【請求項２】
アルファ−１，４−結合の主鎖にアルファ−１，６−結合の分岐構造を有するグルコースを主成分とし、分子量範囲が、デキストラン換算で７０００以上１７０００以下、平均分子量略１００００の、請求項１記載の製造方法によって得られるリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖。
【請求項３】
以下の物性を有することを特徴とする、請求項１記載の製造方法によって得られるリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖。
（ａ）   分子量範囲がデキストラン換算で７０００以上１７０００以下であり、セファクリル  Ｓ−３００によるゲル濾過分析によって平均分子量１００００に主ピークを有すること。
（ｂ）   グルコースを主成分とする多糖であること。
（ｃ）   分子内にアルファ−１，４−結合およびアルファ−１，６−結合を有すること。
【請求項４】
以下の物性を有することを特徴とする、請求項１記載の製造方法によって得られるリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖。
（ａ）   白色ないし淡褐色粉末で、水に溶けやすいこと。
（ｂ）   分子量範囲がデキストラン換算で７０００以上１７０００以下であり、セファクリル  Ｓ−３００によるゲル濾過分析によって平均分子量１００００に主ピークを有すること。
（ｃ）   グルコースを主成分とする多糖であること。
（ｄ）   プロトン−Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＮＭＲ）スペクトルを示し、ＮＭＲによって糖のみからなるシグナルを示すこと。
（ｅ）   透析膜を通過しないこと。
（ｆ）   フェノール硫酸反応およびヨード反応で、夫々陽性を示すこと。
（ｇ）   水溶液中における紫外部吸収極大を示さないこと。
（ｈ）   分子内にアルファ−１，４−結合およびアルファ−１，６−結合を有すること。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の目的】
この発明は、抗腫瘍性多糖に関するものであって、特に青森県特産のリンゴから醸造されたリンゴ酢を原料にして抽出、精製して得られるところの抗腫瘍活性を示す新規な構造からなるリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖を提供しようとするものである。
【０００２】
【従来の技術】
北米バーモント地方の人々が好んで飲用しているバーモント酢、即ち、ティースプーン１杯のリンゴ酢に同じく１杯の蜂蜜を加え、コップ一杯の水で薄めた飲み物は、バーモント地方の人々が長寿を保てる理由の一つと考えられていて、非常に健康に良いものといわれてきているが、その効果を示す生理活性物質の構造的知見ついて、これまでのところ開示されたという情報は全くなく、先の事実からして、全国一のリンゴ生産を誇る特異な地域柄から、その解明は極めて興味深いテーマの一つとなっていた。
【０００３】
現代社会において長寿を全うできる条件としては様々な要因を考慮しなければならいが、その中でも、悪性腫瘍（癌）への罷病率の多寡は、長寿の条件を判断する上で重要な因子となり得ることが既に周知されている。
【０００４】
一方、これまでにも、数多くの宿主仲介性の抗腫瘍性多糖が、穀類や果実等といった種々の材料から見い出されているのも事実であり、例えば、キノコ等から抽出されたβ−（１，３）（１，６）−グルカンは非常に有名であり、更に、各糖残基間のグルコシド結合がアルファ結合をとっている抗腫瘍性多糖のその他の例としは、例えば、昭和６１年特許公開第１８７２２号公報に掲載された発明に見られるように、米糠を原料としたアルファ−（１，６）−グルカンがあり、また、人参三七の根から得られるアルファ−（１，４）−グルカンは、平成１年特許公開第８８６８８号公報の発明として掲載されており、また、平成６年特許公開第２７９２９号公報には、貝類を原料としたグリコーゲン、アルファ−（１，４）（１，６）−グルカンが、分子量１０万以上の抗腫瘍性多糖として掲載されている。
【０００５】
これらのことを類推、勘案した結果、北米バーモント地方の人々の長寿の要因の一つと考えられているリンゴ酢が、何かある種の抗腫瘍性多糖を含んでいるのではないかとの予測をたて、この発明では、リンゴ酢から抗腫瘍性を有する新規な多糖成分を見い出すべく、逸早く、慎重な分析、検討を加えてきたところ、遂に、以下において詳述するとおりの新規な構造からなるりんご酢由来抗腫瘍性多糖と、それを抽出、精製するための新規な製造方法とを完成、実用化することに成功したものである。
【０００６】
【発明の構成】
この発明のリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖は、基本的に以下のとおりの構成を要件とするものである。
即ち  アルファ−１，４−結合の主鎖にアルファ−１，６−結合の分岐構造を有するグルコースを主成分とし、分子量範囲が、デキストラン換算で７０００以上１７０００以下、平均分子量略１００００のリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖である。
【０００７】
上記のとおりの構造を基本とするこの発明のリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖は、物性からその構成を示せば、  (a) 分子量範囲がデキストラン換算で７０００以上１７０００以下であり、セファクリル  Ｓ−３００によるゲル濾過分析によって平均分子量１００００に主ピークを有すること。  (b) グルコースを主成分とする多糖であること。  (c) 分子内にアルファ−１，４−結合およびアルファ−１，６−結合を有すること。以上のとおりの、少なくとも３要素を備えてなることを特徴を有するリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖と言うことができる。
【０００８】
更に具体的には、次のとおりの物性を特徴とするリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖であるとしてその構成を示すことも可能である。
即ち、(a) 白色ないし淡褐色粉末で、水に溶けやすいこと。
(b) 分子量範囲が、デキストラン換算で７０００以上１７０００以下であり、セファクリル  Ｓ−３００によるゲル濾過分析によって平均分子量１００００に主ピークを有していること。  (c) グルコースを主成分とする多糖であること。
(d) プロトン−ＮＭＲ（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スペクトルを示し、ＮＭＲによって糖のみからなるシグナルを示すこと。
(e) 透析膜を通過しないこと。  (f) フェノール硫酸反応で陽性、ヨード反応で陽性を示すこと。  (g) 水溶液中における紫外部吸収極大を示さないこと。  (h) 分子内にアルファ−１，４−結合およびアルファ−１，６−結合を有していること。の８要素を備えてなるリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖である。
【０００９】
【関連する発明】
この発明には、上記したリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖に関連し、以下のとおりの構成からなるリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖の製造方法を包含している。
先ず、リンゴ酢を減圧濃縮後あるいはそのまま蒸留水に対して透析（例えば、三光純薬株式会社、透析膜３６／３２、分子量１２０００〜１４０００等）を行い、透析内液を凍結乾燥する工程。
次いで、上記凍結乾燥物をセファクリル  Ｓ−３００ゲルによるゲルロ過クロマトグラフィーを行い、デキストラン換算で１０００以上４００００以下の画分を得た上、脱塩する工程。
その後において、弱陰イオン交換クロマトグラフィー、例えばＤＥＡＥ  セファロース  ファースト  フロー陰イオン交換ゲル（商品名、ファルマシア社製等）を充填したカラムクロマトグラフィーに付し、カラム担体容量の少なくとも２倍量の希薄な中性緩衝液で溶出脱塩後、凍結乾燥する工程。
以上の工程からなるリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖の製造方法である。
【００１０】
上記透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、弱陰イオン交換クロマトグラフィー等においては、他のゲル濾過担体、イオン交換樹脂、限外濾過膜等を用いて行うことができる。
【００１１】
この発明の方法によって抽出分離精製された抗腫瘍性多糖の性質は、化学分析結果から、次のとおりである。
「平均分子量」
図２のセファクリル  Ｓ−２００ゲル（商品名、ファルマシア社製）濾過クロマトグラフィーによる流出パターンから、標準資料の流出液量に対するそれら分子量の片対数プロットに抗腫瘍性多糖の流出液量を外挿することにより、分子量を推定したところ、リンゴ酢由来抗腫瘍性多糖の平均分子量１００００であることが判明した。
【００１２】
「プロトンＮＭＲ」
この化学分析は、乾燥資料２ミリグラムを９９．８％Ｄ２Ｏに溶解し、１２時間室温で振盪し、重水置換を行い、凍結乾燥した。同様の操作を９９．８％Ｄ２Ｏおよび９９．９５％Ｄ２Ｏにて行い、次に９９．９５％Ｄ２Ｏに溶解し、７０°ＣでＮＭＲを測定した。ＮＭＲの測定には、２７０−ＭＨＺ１Ｈ−ＮＭＲ（ＪＮＭ  ＥＸ−２７０、日本電子製）を使用した。
その結果が、図１のとおりであって、５．３７３ｐｐｍにα−１，４結合に由来するシグナル、４．９６３ｐｐｍにα−１，４，６結合に由来するシグナルを示し、３．４−４．４ｐｐｍに多糖由来と思われるシグナルが捕らえられ、糖のみからなるシグナルを示す。
【００１３】
「化学成分分析値」
糖の組織組成が、次の分析法によってグルコースのみからなることが判明する。
即ち、２規定塩酸で２時間加水分解したものをサンプルとし、ピリジルアミノ化装置（宝酒造株式会社  ＰＡＬＳＴＡＴＩＯＮ  ｍｏｄｅｌ  ４０００）でピリジルアミノ化したものを  ＰＡＬＰＡＫ  ＴｙｐｅＡカラム（４．６×１５０ｍｍ）を用い、溶媒は、０．７Ｍ  カリウム−ホウ酸  緩衝液（ｐＨ９．０）／アセトニトリル（９０／１０，ｖ／ｖ）、流速は、０．３ミリリットル／分、カラム温度は６５℃、検出は蛍光検出器を用い励起波長３１０ｎｍ測定波長３８０ｎｍで、ＨＰＬＣ（Ｈｉｇｈ  ｐｅｆｏｒｍａｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による糖組成分析した結果、図３のリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖のピリジルアミノ化法による糖組成分析による分離パターンが示しているように、リンゴ酢由来抗腫瘍性多糖は、キシロース、グルコース、マンノースおよびガラクトースからなる多糖であり、その殆どがグルコース（９７％）からなる多糖であることが明らかにされた。
以下では、この発明における抗腫瘍性多糖の製造法、および、有効画分の投与法の例を、更に詳しく説明することにする。
【００１４】
【実施例１】
この実施例は、リンゴ酢からの抗腫瘍性多糖の抽出方法の一事例を示すものであり、リンゴ酢５００ミリリットルを１００ミリリットルに減圧濃縮後、蒸留水７０ミリリットルを加えて全量１７０ミリリットルにした後、再び減圧濃縮し、凡そ全量１００ミリリットルにしたものを、蒸留水に対して透析した。
透析内液（粗抗腫瘍性多糖）は、凍結乾燥後、冷蔵保存した。なお、透析内液の乾燥重量は、りんご酢乾燥重量の約７％であった。
【００１５】
【実施例２】
次に、分離、精製例を示すと、粗抗腫瘍性多糖２０ミリグラムを０．１モル塩化ナトリウム水溶液に溶解し、セファクリル  Ｓ−３００ゲル（商品名、ファルマシア社製）、カラム（２．３×１１８ｃｍ）により、溶出液として０．１モルＮａＣｌを用い、流速は、０．５ミリリットル／分で精製した。
各フラクション（５ミリリットル）をフェノール硫酸法で中性糖を測定し、流出パターンを図４に示してある。Ｆ１、Ｆ２およびＦ３の三つの画分に分け、脱塩後，凍結乾燥した。
収量は、Ｆ１が１．６ミリグラム（１２．８％）、Ｆ２が３．８ミリグラム（３０．４％），およびＦ３が７．０ミリグラム（５６．８％）であった。
【００１６】
更に、このＦ３を、ＤＥＡＥ  セファロース  ファースト  フロー陰イオン交換ゲル（商品名、ファルマシア社製）を用いた弱陰イオン交換クロマトグラフィーによって分画精製した。
溶出緩衝液には２０ミリモル／リットル  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）を用い、分離した（図３を参照）。
フェノール硫酸法で中性糖を測定し、３つの画分（ａ・ｂ・ｃ）に分け、透析後、凍結乾燥した。
収量は、ａが３．６ミリグラム（５６％)
、ｂが１．７ミリグラム（２５％）、およびｃ１．２ミリグラム（１９％）であった。図中、ａがりんご酢由来抗腫瘍性多糖である。
【００１７】
【実施例３】
抗腫瘍実験例は、次のとおりである。
６週令メス、平均体重２０グラムのＢＡＬＢ／Ｃ−ＣＲＪマウスに１週間、同系のマウスの腹腔内で継代した癌細胞Ｍｅｔｈ−Ａを、マウス１匹当たり１×１０（５乗）個を腹腔内に移植し、対照群５匹（１群）と試験群（１群）の計２群に分けた。
【００１８】
癌細胞を移植した２日目、４日目、６日目に、試験群には、０．６２５ミリグラムの抗腫瘍性多糖を０．２ミリリットルの生理食塩水に溶解し、腹腔内に投与した。対照群には、同様にして生理食塩水のみを投与した。以後、生存日数を６０日まで観察し、延命効果を次式によって算出した。
延命率（％）＝（試験群の平均生存日数群）／（対照群の平均生存日数）×１００
上記方法によって検定したリンゴ酢由来粗抗腫瘍性多糖の抗腫瘍効果は、下表のとおりであった。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
【実施例４】
続いて、第２の抗腫瘍実験例を示すと、次のとおりである。
６週令メス、平均体重２０グラムのＢＡＬＢ／Ｃ−ＣＲＪマウスに１週間、同系のマウスの腹腔内で継代した癌細胞Ｍｅｔｈ−Ａを、マウス１匹当たり１×１０（５乗）個を腹腔内に移植し、対照群５匹（１群）と試験群（１群）の計２群に分けた。
【００２１】
癌細胞を移植した２日目、４日目、６日目に、試験群には、０．２ミリグラムの抗腫瘍性多糖を０．２ミリリットルの生理食塩水に溶解し、腹腔内に投与した。対照群には、同様にして生理食塩水のみを投与した。以後、生存日数を６０日まで観察し、延命効果を次式によって算出した。
延命率（％）＝（試験群の平均生存日数群）／（対照群の平均生存日数）×１００
上記方法によって検定したリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖の抗腫瘍効果を示すと、下表のとおりでる。
【００２２】
【表２】
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【００２３】
【作用効果】
リンゴ酢由来抗腫瘍性多糖を用いた腫瘍に対する治療法としては、リンゴ酢由来抗腫瘍性多糖を生理食塩水、あるいは各種塩溶液に溶解の後、病巣部に直接注射による投与、静脈投与等が可能である。また、本来生体内に存在する物質と似ているため、毒性は無く、したがって、その病状により、その投与量を広い範囲でコントロールし得る。
【００２４】
この発明において、その抗腫瘍活性を以下の方法によって確認することができる。
即ち、マウスの腹腔内に腫瘍細胞を移植し、このマウスにリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖を生理食塩水に溶解させ、投与することによって腫瘍を治癒することができた。この実験において、治癒されたマウスに副作用は観察されなかったことにから、急性毒性はないものと考えられ、腫瘍に対し大変有望な物質であることを確認することができた。
【００２５】
このような特徴を有する抗腫瘍性多糖としては、キノコ等から抽出されたβ−（１，３）（１，６）−グルカンが有名であるが、この発明におけるリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖は、各糖鎖残基間のグリコシド結合が逆のアルファ結合をとっており、物質的に全く異なるものである。また、抗腫瘍性活性を示す多糖には、この他にも幾つか存在することが報告されており、これら多糖のアルファ−グルカンで抗腫瘍性のあるものも知られているが、それらはアルファ−１，４−結合のみからなるもの（人参三七の根から得られる多糖等）、あるいはアルファ−１，６−結合のみからなるもの（米糠を原料とした多糖等）であって、この発明のリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖とは、その構造および分子量が大きく異なる。
【００２６】
また、アルファ−１，４−結合とアルファ−１，６−結合とを持つグリコーゲン（貝類を原料としたグリコーゲン等）も知られているが、この発明のリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖の分子量が２万以下であるのに対し、それら公知のものは、分子量１０万以上であって全く別の物質である。
【００２７】
叙述の如く、この発明は、通常食されているリンゴ酢から抗腫瘍多糖を抽出し、且つその得られた抗腫瘍多糖の抗腫瘍活性に関する開発、研究を継続し、幾多の試行錯誤を重ねてきた結果、遂にこの発明のリンゴ酢由来抗腫瘍多糖には、強い抗腫瘍性があることを確認することに成功し得たものであり、この固有の特徴は、この発明のリンゴ酢由来抗腫瘍多糖に細胞毒性が見られないことにより、免疫機構、つまり、生体の本来持つべき自己防御機構を活性化して腫瘍細胞に対する抵抗性を高め、その結果、腫瘍細胞の増殖を抑制するのではないかと考えられるものであり、この有効な特徴により、この地域の特産となっているリンゴが、大いにその付加価値を高めた活用を可能として地域産業の発展に寄与できると共に、何よりも人類医学の面で高い評価が得られるものと予想される。
【図面の簡単な説明】
【図１】リンゴ酢由来抗腫瘍多糖のプロトン−ＮＭＲスペクトルである。
【図２】粗抗腫瘍多糖のセファクリル  Ｓ−３００  ゲルによるゲル濾過クロマトグラフィー分離パターンである。
【図３】リンゴ酢由来抗腫瘍性多糖のピリジルアミノ化法による糖組成分析による分離パターンである。
【図４】リンゴ酢由来抗腫瘍多糖のセファクリル  Ｓ−２００  ゲルによるゲル濾過クロマトグラフィー分離パターンである。
【図５】ゲル濾過クロマトグラフィーＦ３画分のＤＥＡＥ  セファロース  ファースト  フロー 弱陰イオン交換樹脂によるイオン交換クロマトグラフィー分離パターンである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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