(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料中の糖化ヘモグロビンを液体クロマトグラフィーにより測定する糖化ヘモグロビンの測定方法であって、
平均粒径が５μｍ〜２０μｍの範囲にある充填剤が収納されており、内径が３．０〜５．０ｍｍ、長さが１０〜２０ｍｍの範囲にあるカラムに、液体の試料を通過させる工程と、
次に、前記カラムに、溶離液を溶出力を異ならせて１．６ｍｌ／分〜２．５ｍｌ／分の速度で通過させ、ヘモグロビンＡ０及び糖化ヘモグロビンを含む複数種のヘモグロビンを溶出する工程とを備え、前記ヘモグロビンＡ０を溶出する際の溶離液として非イオン性界面活性剤を含有する溶離液を用いることを特徴とする、糖化ヘモグロビンの測定方法。
【請求項２】
前記液体の試料が溶血している血液試料である、請求項１に記載の糖化ヘモグロビンの測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体試料中、例えば血液中の糖化ヘモグロビンの測定方法に関し、より詳細には、液体クロマトグラフィーを用いた糖化ヘモグロビンの測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人の血液中には、様々なヘモグロビンが存在する。成人の血液中のヘモグロビンの約９０％はヘモグロビンＡ０であり、約７％が糖化ヘモグロビンＡ１である。ヘモグロビンのβ鎖に結合した糖の種類により、糖化ヘモグロビンＡ１は、ヘモグロビンＡ１ａ１、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＡ１ｃなどに分隔される。もっとも、糖化ヘモグロビンＡ１の約６０％を占めるのがヘモグロビンＡ１ｃである。
【０００３】
ヘモグロビンＡ１ｃでは、血液中のグルコースがヘモグロビンのβ鎖Ｎ末端に化学的に結合している。ヘモグロビンＡ１ｃのヘモグロビン全体に対する割合は、血糖値に依存するため、ヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンＡ１ｃの割合は、１〜２カ月の期間の患者の血糖値の平均を反映すると言われている。そのため、ヘモグロビンＡ１ｃのヘモグロビン全体に示す割合であるヘモグロビンＡ１ｃ値（％）は、血糖値と異なり一時的な変動を示さないため、糖尿病診断の指標として広く用いられている。
【０００４】
近年、ヘモグロビンＡ１ｃ値は、診察前の必須の検査項目の１つとなっており、より速やかに検査結果の得られることが望まれている。
【０００５】
一般に、ヘモグロビンＡ１ｃ値を測定するにあたっては、液体クロマトグラフィーが用いられている。液体クロマトグラフィーによる検査速度を高めるには、１）カラムの小型化、２）流速を高める方法及び３）充填剤の粒径を小さくする方法などが用いられている。もっとも、流速を高めたり、充填剤の粒径を小さくした場合には、カラム内の圧力が高くなる。そのため、カラムを含む装置の設計に制約が生じる。また、装置の耐圧性能を高めるには、高価な部品を必要とする。そのため、装置のコストが高くなり、高価なカラムは汎用の臨床検査に用いることができない。
【０００６】
液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類の測定を行う場合、下記の特許文献１に記載のように、カチオン交換カラムが用いられ、溶離液の溶出力を変化させることにより、ヘモグロビン類の分離が行われている。通常、溶血した血液試料をカチオン交換液体クロマトグラフィーに供給し溶離液を流して、分離を行うと、ヘモグロビン類は、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＦ、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及びヘモグロビンＡ０の順序で溶出する。
【特許文献１】特公平８−７１９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
前述のように、従来、カラムの小型化、流速の向上あるいは充填剤の粒径を小さくする方法などにより、ヘモグロビン類の測定の高速化が図られていた。しかしながら、高価な装置を必要とすることとなり、これらの高速化手法は、汎用の臨床検査に利用し難かった。また、カラムの小型化を図るにも限界があった。
【０００８】
本発明の目的は、上述した従来技術の現状に鑑み、ヘモグロビンＡ１ｃの測定精度を低下させることなく、測定時間を大幅に短縮することを可能とする糖化ヘモグロビンの測定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る糖化ヘモグロビンの測定方法は、液体試料中の糖化ヘモグロビンを液体クロマトグラフィーにより測定する方法であり、下記の構成を備えることを特徴とする。
【００１０】
すなわち、本発明の測定方法は、平均粒径が５μｍ〜２０μｍの範囲にある充填剤が収納されており、内径が３．０ｍｍ〜５．０ｍｍ、長さが１０ｍｍ〜２０ｍｍの範囲にあるカラムに、液体の試料を通過させる工程と、次に、前記カラムに、溶出力を異ならせて溶離液を１．６ｍｌ／分〜２．５ｍｌ／分の速度で通過させ、ヘモグロビンＡ０及び糖化ヘモグロビンを含む複数種のヘモグロビンを溶出する工程とを備え、前記ヘモグロビンＡ０を溶出する際に溶離液に非イオン性界面活性剤を含有させることを特徴とする。
【００１１】
本発明に係る糖化ヘモグロビンの測定方法でカラムに供給される液体の試料は特に限定されないが、好ましくは、溶血された血液試料が用いられ、それによって、血中の糖化ヘモグロビンであるヘモグロビンＡ１ｃを本発明に従って短時間で高精度に測定することができる。
【００１２】
以下、本発明の詳細を説明する。
【００１３】
液体クロマトグラフィーによる血液中のヘモグロビン類の測定等に際しては、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＦ、不安定型ヘモグロビンＡ１ｃ、安定型ヘモグロビンＡ１ｃ及びヘモグロビンＡ０の順でヘモグロビン類が溶出する。そして、ヘモグロビンＡ０は、ヘモグロビンの大部分を占め、正常人では、ヘモグロビン全体の約９０％を占める。従って、測定を終了するには、ヘモグロビンＡ０をより短時間で溶出させることが重要である。本発明では、上記特定の平均粒径の充填剤が充填されている上記特定の内径及び長さ範囲のカラムを用い、溶離液の流速を１．６ｍｍ／分〜２．５ｍｍ／分とし、ヘモグロビンＡ０を溶出する際の溶離液に非イオン性界面活性剤含有させることにより、各ヘモグロビン類の分離速度を高め、ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能を低下させることなく、大部分を占めるヘモグロビンＡ０の溶出時間を短縮したことに特徴を有する。それによって、ヘモグロビンＡ１ｃの測定精度を低下させることなく、測定時間の大幅な短縮が図られる。
【００１４】
本発明において用いられる充填剤としては、従来より血液中のヘモグロビン類の分離に用いられている様々な充填剤を用いることができる。このような充填剤としては、例えば、ポリマー系、シリカ系などが挙げられる。
【００１５】
上記充填剤の平均粒子系は、５μｍ〜２０μｍの範囲であることが必要である。平均粒径が５μｍ未満では、カラム内の圧力が高くなりすぎる。より好ましくは、平均粒径は６μｍ以上とされ、カラム内圧の上昇をより効果的に抑制することができる。
【００１６】
平均粒径が２０μｍを越えると、ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能が低下するおそれがある。より好ましくは、平均粒径は、１２μｍ以下であり、それによって、ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能をより一層高めることができる。
【００１７】
上記充填剤が充填されるカラムについてはイオン交換液体クロマトグラフィー用の公知のカラムを適宜用いることができる。このようなカラムの材料については特に限定されず、ステンレスなどの金属、ポリエーテルエーテルケトンやポリテトラフルオロエチレンなどの合成樹脂、あるいはガラスなどを挙げることができる。
【００１８】
上記カラムの内径は、３．０ｍｍ〜５．０ｍｍの範囲である。内径が３．０ｍｍ未満では、線速度が高くなりすぎ、カラム内の圧力が上昇しすぎる。内径が５．０ｍｍを越えると、カラム内における拡散が起こりすぎ、ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能が低下する。
【００１９】
カラムの長さは、１０ｍｍ〜２０ｍｍの範囲である。１０ｍｍ未満では、理論段数の低下に伴ってヘモグロビンＡ１ｃの分離性能が低下する。より好ましくは、カラムの長さは１５ｍｍ以上であり、それによって、ヘモグロビンＡ１ｃの分離性能をより一層高めることができる。
【００２０】
カラムの長さが２０ｍｍを越えると、ヘモグロビン画分の溶出に時間がかかり、測定時間の短縮ができなくなる。
【００２１】
また、本発明では、溶離液の溶出力を異ならせてヘモグロビン類を溶出する際の流速については、１．６ｍｌ／分〜２．５ｍｌ／分の範囲とされる。流速が１．６ｍｌ／分未満では、ヘモグロビン画分の溶出に時間がかかり、測定時間が短縮できない。より好ましくは、１．７ｍｌ／分以上とすることにより、測定時間をより一層短縮することができる。
【００２２】
流速が２．５ｍｌ／分を越えると、カラム内の圧力が上昇し、耐圧性に優れたカラムを必要とする。より好ましくは、２．０ｍｌ／分以下とすることが望ましく、それによって、より安価なカラムを用いることができる。
【００２３】
また、本発明では、溶出力を異ならせて溶離液を流して様々なヘモグロビン画分を順次溶出するに際し、ヘモグロビンＡ０を溶出する際の溶離液に非イオン性界面活性剤が含有されている。それによって、疎水性相互作用により充填剤に強固に吸着しているヘモグロビンＡ０を、速やかに溶出することができる。このような非イオン性界面活性剤としては、特に限定されず、公知の任意の非イオン性界面活性剤を用いることができる。このような非イオン性界面活性剤の代表的なものとしては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシポロピレングリコール、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸モノエステル、ショ糖脂肪酸エステル等が挙げられる。中でも、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル系であるポリオキシエチレン（２０）ソルビタンラウレート（Ｔｗｅｎｎ２０）が特に好ましい。
【００２４】
なお、上記非イオン性界面活性剤は、ヘモグロビンＡ０を溶出する際の溶離液に含有されておればよく、ヘモグロビンＡ０を溶出する際の溶離液にのみ非イオン性界面活性剤を添加してもよく、他のヘモグロビン画分を溶出する際の溶離液にも非イオン性界面活性剤を添加していてもよく、添加せずともよい。もっとも、好ましくは、他のＨｂ画分を溶出する際の溶離液に非イオン性界面活性剤を添加すると分離に影響を及ぼす可能性があるため、ヘモグロビンＡ０を溶出する際の溶離液にのみ非イオン性界面活性剤が存在していることが好ましい。
【００２５】
よって、好ましくは、溶離液をカラムに供給するに際し、ヘモグロビンＡ０を溶出する前の段階までは溶離液中に非イオン性界面活性剤を存在させず、ヘモグロビンＡ０を溶出するに際し、非イオン性界面活性剤を溶離液に添加することが望ましい。その場合、溶出力を異ならせるに際し、複数種の溶離液を切り換えて用いてもよく、溶離液をカラムに供給するに際し、供給される溶離液の組成を変更しつつ溶出力を変化させてもよい。
【００２６】
また、ヘモグロビンＡ０を短時間で溶出させるために、特開２００３−１４７１９号公報や特開２００５−１２８０３０号公報に記載のような公知の溶出効率向上方法をさらに併用してもよい。
【００２７】
なお、本発明でカラムに供給される液体の試料としては、患者の糖尿病の指標としてのヘモグロビンＡ１ｃ値を求めるには、溶血された血液試料が用いられる。もっとも、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法は、溶血された血液試料以外の液体の試料中の糖化ヘモグロビンを測定するのに用いられてもよい。
【発明の効果】
【００２８】
本発明に係る糖化ヘモグロビンの測定方法では、上記特定の平均粒径範囲の充填剤が充填されており、内径及び長さが上記特定の範囲の寸法にあるカラムを用い、ヘモグロビン画分の溶出に際しての溶離液の流速を１．６ｍｌ／分〜２．５ｍｌ／分の範囲とし、しかもヘモグロビンＡ０を溶出する際の溶離液に非イオン性界面活性剤が添加されているため、ヘモグロビンＡ１ｃの測定精度を低下させることなく、種々のヘモグロビン画分を速やかに溶出させることができ、さらにヘモグロビン画分の大部分を占めるヘモグロビンＡ０を速やかに溶出させることができる。従って、測定時間の大幅な短縮を図ることができ、ヘモグロビンＡ１ｃ値の測定を速やかに行うことが可能となる。
【００２９】
また、従来の流速を高める方法や、充填剤の平均粒径を小さくする方法で測定速度を高めた場合では、耐圧性に優れたカラムを必要とし、高価な部品を用いなければならなかった。これに対し、本発明では、流速をさほど高める必要はなく、充填剤の平均粒径をさほど小さくする必要もないため、カラムを含む装置のコストを高めることなく、ヘモグロビンＡ１ｃの測定の高速化を図ることが可能となる。よって、汎用的な臨床検査に好適な糖化ヘモグロビンの測定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下、本発明の具体的な実施例及び比較例を挙げることにより、本発明をより詳細に説明する。もっとも、本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。
【００３１】
（１）充填剤の調製
攪拌機付き反応器に、３重量％ポリビニルアルコール（日本合成化学社製）水溶液に、テトラエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）３００ｇ、トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）１００ｇ及び過酸化ベンゾイル１．０ｇの混合物を添加した。混合物を攪拌しながら調粒した後、窒素雰囲気下にて８０℃の温度で１時間重合した。別途、イオン交換基を有する単量体として、２−メタクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（東亜合成化学社製）１００ｇと、ポリエチレングリコールメタクリレート（日本油脂社製、エチレングリコール鎖ｎ＝４）１００ｇをイオン交換水に溶解した。イオン交換水に上記単量体を溶解した該溶液を反応器に添加し、さらに攪拌しつつ窒素雰囲気下で８０℃で２時間重合を行った。得られた重合体含有組成物を水及びアセトンで洗浄し、イオン交換基を有する親水性の被覆重合体粒子を得た。
【００３２】
得られた被覆重合体粒子１０ｇを、溶存オゾンガス濃度１００ｐｐｍのオゾン水３００ｍｌに浸漬し、３０分間攪拌した。攪拌後、遠心分離機（日立製作所製Ｈｉｍａｃ ＣＲ２０Ｇ）を用いて遠心分離し、上澄みを除去した。この操作を２回繰り返し、親水化処理を施し、イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤を得た。
【００３３】
なお、オゾン水は、内径１５ｃｍ×長さ２０ｃｍの円柱形を有する外管内に、パーフルオロアルコキシ樹脂からなる内径０．５ｍｍ×厚さ０．０４ｍｍ×長さ３５０ｃｍの中空管状のオゾンガス透過膜が４００本収容されたオゾン溶解モジュールを含むオゾン水製造システム（積水化学工業社製）を用いて調製した。
【００３４】
上記イオン交換液体クロマトグラフィー用充填剤の作製にあたり、前述したイオン交換基を有する親水性の被覆重合体粒子を得た段階で、レーザー回折式流動分布測定装置を用いて平均粒径を測定した。また、上記被覆重合体粒子の製造に際し、調粒工程の撹拌の回転数を異ならせることにより、平均粒径が異なる以下の３種類の充填剤Ａ〜Ｃを調製した。
【００３５】
充填剤Ａ：平均粒子径９μｍ、ＣＶ値１５％
充填剤Ｂ：平均粒子径３μｍ、ＣＶ値１４％
充填剤Ｃ：平均粒子径２５μｍ、ＣＶ値１２％
（２）カラム
液体クロマトグラフィー用カラムとして、以下の５種類の寸法のカラムＡ〜カラムＨを用意した。
【００３６】
カラムＤ：内径４．６ｍｍ、長さ２０ｍｍ
カラムＥ：内径４．６ｍｍ、長さ９ｍｍ
カラムＦ：内径４．６ｍｍ、長さ３５ｍｍ
カラムＧ：内径２．０ｍｍ、長さ２０ｍｍ
カラムＨ：内径６．０ｍｍ、長さ２０ｍｍ
（３）実験例１
上記充填剤Ａ〜Ｃ及びカラムＤ〜Ｈを組み合わせて得られた下記の表１に示す各カラム装置１〜１５について、Ａ０以外のＨｂ画分を溶出する液を送液ポンプ（島津製作所社製、ＬＣ−１０ＡＳ）を用い、１．７ｍｌ／分の速度で送液した際のカラム内の圧力を測定した。結果を下記の表１に示す。カラム内の圧力が５ＭＰａ以下のものについては、圧力が高くなりすぎないため〇を付し、５ＭＰａを越えるものについては×を付した。
【００３７】
【表１】
0004814204.tif 000002
【００３８】
充填剤ＡとカラムＧの組合せ、充填剤Ｂを充填したすべてのカラムにおいて、圧力が５ＭＰａを超え、圧力基準を満たさなかった。
【００３９】
（４）実験例２
実験例１において〇が付されたカラム装置について、以下の要領でＨｂＡ１ｃを測定し、クロマトグラムを比較した。もっとも、充填剤Ｃを充填したカラムは、ＨｂＡ１ｃピークが溶出しなかったり、溶出しても大きくブロード化したため、ＨｂＡ１ｃ測定値を算出することができなかった。従って、充填剤ＡとカラムＤ，Ｅ，ＦまたはＨを用いてクロマトグラフィーを行った。
【００４０】
ＨｂＡ１ｃの測定： 
グリコＨｂコントロールレベル１（国際試薬社製、参考数値５．８±０．５％）を２００μＬの注射用水で溶解した後、希釈液（０．１％トリトンＸ−１００を含有するリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））で１００倍に希釈したものを調製し、測定試料とした。
測定試料中のヘモグロビンＡ１ｃ量及び非糖化ヘモグロビン量を測定し、ヘモグロビンＡ１ｃと非糖化ヘモグロビンとの合計に対するヘモグロビンＡ１ｃの割合（ヘモグロビンＡ１ｃ値（％））を求めた。
【００４１】
システム：送液ポンプ  ＬＣ−９Ａ（島津製作所社製）
オートサンプラー  ＡＳＵ―４２０（積水化学工業社製）
検出器  ＳＰＤ−６ＡＶ（島津製作所社製）
溶離液：第１液  リン酸緩衝液（ｐＨ５．３）
第２液  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含２５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
※第１液は、それぞれのカラム（充填剤とカラムの組合せ）において、ＨｂＡ１ｃが同一保持時間になるように濃度を調整。
【００４２】
測定時間：５０秒
流速：１．７ｍＬ／分
検出波長：４１５ｎｍ
試料注入量：１０μＬ
【００４３】
結果を図１〜４に示す。なお、表２は、図１〜図４のクロマトグラムを得るのに用いた充填剤ＡとカラムＤ，Ｅ，Ｆ，Ｈの組み合わせを示す。図１〜図４において、１〜５は下記のピークであることを示す。
【００４４】
１：ピーク１  ＨｂＡ１ａ＋ＨｂＡ１ｂ
２：ピーク２  ＨｂＦ
３：ピーク３  不安定型ＨｂＡ１ｃ
４：ピーク４  安定型ＨｂＡ１ｃ
５：ピーク５  ＨｂＡ０
【００４５】
また、表３は、図１〜図４に示したクロマトグラムで求められたＨｂＡ１ｃ測定値を示す。
【００４６】
【表２】
0004814204.tif 000003
【００４７】
【表３】
0004814204.tif 000004
【００４８】
図１〜図４から明らかなように、充填剤ＡとカラムＤの組合せでは、測定時間５０秒で、ＨｂＡ１ｃを分離定量できた。また、ＨｂＡ０も測定時間内に溶出できた。
【００４９】
充填剤ＡとカラムＥの組合せでは、カラムの長さが短すぎるため、ピークがブロード化し、ＨｂＡ１ｃの定量性に問題があった。ＨｂＡ０は測定時間内に溶出できた。
【００５０】
充填剤ＡとカラムＦの組合せでは、ＨｂＡ１ｃ値は基準値内ではあったが、カラムの長さが長すぎるため、ピーク間が圧縮され、ピークの分離に問題があった。また、カラムの長さが長すぎる影響で、測定時間内にＨｂＡ０を完全に溶出することができなかった。
【００５１】
充填剤ＡとカラムＧの組合せでは、カラムの内径が大きすぎるため、ピークがブロード化し、ＨｂＡ１ｃの定量性に問題があった。また、測定時間内にＨｂＡ０を完全に溶出することができなった。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】第２の実験例において、充填剤ＡとカラムＤとを用いた場合のクロマトグラムを示す図である。
【図２】第２の実験例において、充填剤ＡとカラムＥとを用いた場合のクロマトグラムを示す図である。
【図３】第２の実験例において、充填剤ＡとカラムＦとを用いた場合のクロマトグラムを示す図である。
【図４】第２の実験例において、充填剤ＡとカラムＨとを用いた場合のクロマトグラムを示す図である。
【符号の説明】
【００５３】
１…ピーク１（ＨｂＡ１ａ＋ＨｂＡ１ｂ）
２…ピーク２（ＨｂＦ）
３…ピーク３（不安定型ＨｂＡ１ｃ）
４…ピーク４（安定型ＨｂＡ１ｃ）
５…ピーク５（ＨｂＡ０）
【図１】
0004814204.tif 000005
【図２】
0004814204.tif 000006
【図３】
0004814204.tif 000007
【図４】
0004814204.tif 000008