(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１で表わされる塩基配列を有するプロモーター領域の制御下にレポーター遺伝子を発現する機能を有するプラスミドＤＮＡ、
（ｂ）ヒトＰＰＡＲγをコードする発現プラスミド、
（ｃ）ヒトＲＸＲαをコードする発現プラスミド、および
（ｄ）ヒトＬＲＨ−１をコードする発現プラスミドで形質転換された形質転換体。
【請求項２】
（１）請求項１記載の形質転換体を被験化合物と接触させる工程、
（２）請求項１記載の形質転換体を被験化合物を含まない溶媒と接触させる工程、および（３）工程（１）及び（２）の各々について、ヒトアディポネクチンプロモーター活性を測定し、工程（１）におけるヒトアディポネクチンプロモーター活性が工程（２）における同活性よりも増強されるとき、該被験化合物をヒトアディポネクチンプロモーター活性を促進する化合物として選択する工程からなる、ヒトアディポネクチンプロモーター活性を促進する化合物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、遺伝子発現用新規レギュレーター塩基配列を含むプロモーターおよびその用途に関する。具体的には、ヒトアディポネクチン遺伝子レギュレーター配列を含むプロモーター領域を含有するＤＮＡ、当該ＤＮＡで形質転換された形質転換体、当該レギュレーター配列を介してアディポネクチンプロモーター活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法などに関する。
従来技術
脂肪組織は、従来脂肪を蓄える受動的な組織であるとされていたが、近年、様々な生理活性因子を活発に生産、分泌する内分泌組織であると捉えられている。脂肪組織を形成する脂肪細胞はアディポサイトカインといわれる種々の生理活性因子を分泌し、全身の糖・脂質代謝制御に重大な役割をはたしていることが近年明らかにされている（Ｎａｔｕｒｅ，４１４巻，２００１年，７９９−８０６頁参照）。アディポネクチンは、ヒト脂肪細胞に最も豊富に発現する遺伝子として、またホルモンとして同定された（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，２２１巻，１９９６年，２８６−２８９頁参照）。アディポネクチンは脂肪細胞特異的に産生、分泌され、血中に豊富に存在する。数多くの研究結果から、アディポネクチンは抗糖尿病、抗動脈硬化、抗肥満作用を有するホルモンであり、代謝疾患の発症、進展に深く関与することが示されている。例えば、血漿アディポネクチン濃度は、虚血性心疾患やインスリン抵抗性糖尿病を有する患者において低下している（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１００巻，１９９９年，２４７３−２４７６頁、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０巻，２０００年，１５９５−１５９９頁参照）。一方、アディポネクチン遺伝子に変異を有する患者において、血漿アディポネクチン濃度の低下は、インスリン抵抗性糖尿病や動脈硬化の発症と相関していた（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５１巻，２００２年，２３２５−２３２８頁参照）。食餌性に惹起された肥満サルにおいて、血漿アディポネクチン濃度は経年的に低下したが、その変化はインスリン抵抗性の悪化と極めてよく相関していた（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５０巻，２００１年，１１２６−１１３３頁参照）。また、アディポネクチン遺伝子を欠損したマウスにおいては、高ショ糖、高脂肪食の負荷により糖尿病が惹起され、動脈に傷害を与えた際の動脈肥厚が著しく亢進していた。それらマウスにアデノウィルスを用いて外来性にアディポネクチン遺伝子を補充すると、病変は著明に改善した（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，８巻，２００２年，７３１−７３７頁、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７７巻，２００２年，３７４８７−３７４９１頁参照）。アポリポタンパク質Ｅを欠損したマウスにおいては、アデノウィルスを用いてアディポネクチン遺伝子を投与すると、動脈硬化の進展が抑制された（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０６巻，２００２年，２７６７−２７７０頁参照）。代謝異常マウスへ組み換えアディポネクチンタンパク質を投与すると、インスリン抵抗性の改善や血糖降下作用が認められた（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７巻，２００１年，９４１−９４６頁、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７巻，２００１年，９４７−９５３頁参照）。これら事実に基づき、低アディポネクチン血症を伴う代謝異常症候群の患者の血漿アディポネクチン濃度を上昇させる治療は、病態の改善に有効であると考えられる。しかしながら、ヒトにおけるアディポネクチンの血漿中濃度は５〜２０μｇ／ｍｌであり（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，２５７巻，１９９９年，７９−８３頁参照）、他の血中ホルモンと比較すると絶対量として極めて高い水準にある。この点を考慮すると、血漿アディポネクチン濃度の低下した患者において、血漿濃度の正常化を目指した組み換えアディポネクチンタンパク質の補充療法は、該タンパク質の持続的高用量投与や、該タンパク質の生体内酵素分解などの防止を含め種々の大きな困難を伴うものと考えられる。
【発明の開示】
生体において、タンパク質の産生は様々な段階で制御されうるが、そのうち最も根源的であるのは遺伝子からメッセンジャーＲＮＡへの転写段階である。疾患関連遺伝子の発現調節を通じてその産物であるタンパク質の量を変化させ、病態改善を図る治療法は、有力な手段のひとつである。転写制御は、メッセンジャーＲＮＡへ転写される塩基配列の近傍に位置するプロモーター領域やエンハンサー領域によりなされ、特に、プロモーター領域内に存在するレギュレーター配列と呼ばれる塩基配列に、転写制御因子として特定のタンパク質が結合することが重要である。それら転写制御因子の中には、低分子量の分子（リガンド）と結合することにより、その作用を発揮する核内受容体と呼ばれる一群のタンパク質が含まれる。例えば、脂肪細胞分化に重要な核内受容体であるＰＰＡＲγ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒγ）は、別の核内受容体ＲＸＲ（Ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と二量体を形成し、遺伝子のプロモーター領域内にあるレギュレーター配列ＰＰＲＥ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）に特異的に結合して転写を調節する。ＰＰＡＲγは、未だ特定されていない内因性のリガンド、あるいはチアゾリジンジオン誘導体のような外来性のリガンドにより活性化される（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７０，３４１−３６７（２００１））。レギュレーター配列ＰＰＲＥは、５’−ＡＧＧＴＣＡ  ｎ  ＡＧＧＴＣＡ−３’に代表される特徴的な塩基配列で構成されているが、ＰＰＲＥを有する遺伝子の種類によりその塩基配列は若干異なっている。ある遺伝子の発現を調節することによってそのタンパク質産生量を変化させ病態改善を図る薬剤を創製するに当たって、遺伝子のプロモーター領域内に存在する、低分子リガンドにより活性が調節される核内受容体のレギュレーター配列を同定することは、効率よく、かつ医薬品候補化合物を見出すために最良のスクリーニング系を構築する上で有用である。従って、ヒトアディポネクチン遺伝子プロモーター領域内に存在する、その転写活性を調節するレギュレーター配列を同定し、当該レギュレーター配列を含むＤＮＡを適当なレポーター遺伝子と連結させ、作出される形質転換体は、アディポネクチン遺伝子の発現促進を通じて作用し得る糖尿病、肥満、高コレステロール血症、高リポ蛋白血症等の代謝異常疾患、高脂血症、動脈硬化症、高血圧、循環器系疾患、過食症等の予防および／または治療薬の有用なスクリーニング系として使用できる。当該形質転換体はさらに、上記疾患が病因になっている種々の症候群（シンドロームＸ、メタボリックシンドローム、マルチプルリスクファクター症候群、インスリン抵抗性症候群、死の四重奏、内臓脂肪症候群等）の予防および／または治療薬の有用なスクリーニング系としても使用できる。しかしながら、現在まで、ヒトアディポネクチン遺伝子の発現調節に関わるレギュレーター配列は同定されておらず、発現促進物質を実質的に有効にスクリーニングできる方法は存在しなかった。
本発明者らは、アディポネクチン遺伝子発現促進物質を探索するスクリーニング法の確立を目指して、鋭意研究を重ねた結果、ヒトアディポネクチン遺伝子５’上流のプロモーター領域内に、アディポネクチン遺伝子に固有のレギュレーター配列ＰＰＲＥとＬＲＨ−ＲＥ（ｌｉｖｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ−１  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）を発見し、同定した。さらに、同定したレギュレーター配列ＰＰＲＥとＬＲＨ−ＲＥが、生理的なヒトアディポネクチンプロモーター活性の調節に機能していることを見出した。本発明者らは、これらの知見に基づき、さらに研究した結果、本発明を完成した。
すなわち本発明は、
１．ヒトアディポネクチンのレギュレーター配列を含むことを特徴とする配列番号１で表される塩基配列を有するプロモーター領域を含むＤＮＡ、
２．ヒトアディポネクチンのレギュレーター配列を含むことを特徴とする配列番号１で表される塩基配列を有するプロモーター領域からなる前記１記載のＤＮＡ、
３．レギュレーター配列が、ＰＰＲＥ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）を含有する配列である前記２記載のＤＮＡ、
４．レギュレーター配列が、ＬＲＨ−ＲＥ（Ｌｉｖｅｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ−１  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）を含有する配列である前記２記載のＤＮＡ、
５．レギュレーター配列が、配列番号２で表される塩基配列である前記２記載のＤＮＡ、
６．レギュレーター配列が、配列番号３で表される塩基配列である前記２記載のＤＮＡ、
７．レギュレーター配列が、配列番号２で表される塩基配列および配列番号３で表される塩基配列の両方を有する塩基配列である前記２記載のＤＮＡ、
８．レギュレーター配列が、配列番号４で表される塩基配列である前記２記載のＤＮＡ、
９．前記２記載のＤＮＡを含む組み換えプラスミドＤＮＡ、
１０．ヒトアディポネクチンのレギュレーター配列を含むプロモーター領域の制御下に構造遺伝子を発現する機能を有することを特徴とする前記９記載の組み換えプラスミドＤＮＡ、
１１．前記９または１０記載の組み換えプラスミドＤＮＡで形質転換された形質転換体、
１２．前記１１記載の形質転換体を用いることを特徴とするヒトアディポネクチンプロモーター活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法、
１３．前記１１記載の形質転換体を用いることを特徴とするシンドロームＸ、メタボリックシンドローム、マルチプルリスクファクター症候群、インスリン抵抗性症候群、死の四重奏、および内臓脂肪症候群から選ばれる症候群の予防および／または治療薬のスクリーニング方法、
１４．症候群の病因である疾患が、糖尿病、肥満、高コレステロール血症、高リポ蛋白血症等の代謝異常疾患、高脂血症、動脈硬化症、高血圧、循環器系疾患、または過食症である前記１３記載のスクリーニング方法、
１５．前記１１記載の形質転換体を用いることを特徴とするヒトアディポネクチンプロモーター活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
１６．前記１１記載の形質転換体を用いることを特徴とするシンドロームＸ、メタボリックシンドローム、マルチプルリスクファクター症候群、インスリン抵抗性症候群、死の四重奏、および内臓脂肪症候群から選ばれる症候群の予防および／または治療薬のスクリーニング用キット、
１７．前記１２記載のスクリーニング方法を用いて得られるヒトアディポネクチンプロモーター活性を促進する化合物またはその塩、
１８．前記１３記載のスクリーニング方法を用いて得られるシンドロームＸ、メタボリックシンドローム、マルチプルリスクファクター症候群、インスリン抵抗性症候群、死の四重奏、および内臓脂肪症候群から選ばれる症候群の予防および／または治療薬、
１９．前記１５記載のスクリーニング用キットを用いて得られるヒトアディポネクチンプロモーター活性を促進する化合物またはその塩、
２０．前記１６記載のスクリーニング用キットを用いて得られるシンドロームＸ、メタボリックシンドローム、マルチプルリスクファクター症候群、インスリン抵抗性症候群、死の四重奏、および内臓脂肪症候群から選ばれる症候群の予防および／または治療薬、
２１．前記１７または１９記載のヒトアディポネクチンプロモーター活性を促進する化合物またはその塩を含有する医薬組成物、および
２２．前記１８または２０記載のシンドロームＸ、メタボリックシンドローム、マルチプルリスクファクター症候群、インスリン抵抗性症候群、死の四重奏、および内臓脂肪症候群から選ばれる症候群の予防および／または治療薬を含有する医薬組成物に関する。
本発明のヒトアディポネクチン遺伝子プロモーター領域内のレギュレーター配列ＰＰＲＥあるいはＬＲＨ−ＲＥを含有するＤＮＡ、またはＰＰＲＥとＬＲＨ−ＲＥの両者を含有するＤＮＡは、当該レギュレーター配列を含み、アディポネクチンプロモーター活性を有するものであればいかなるものであってもよい。具体的には、配列番号１で示される塩基配列、その相補配列またはそれらの一部を含有するものであればいかなるものであってもよい。またヒト由来のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明におけるヒトアディポネクチンプロモーター領域のレギュレーター配列ＰＰＲＥあるいはＬＲＨ−ＲＥのどちらか、またはその両者を含有するプロモーター領域を含む組み換えＤＮＡは、具体的には次のようにして得ることができる。
まず既に報告されているヒトアディポネクチンプロモーター領域（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．Ｒｅｌａｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｏｒｄ．，２４，８６１−８６８（２０００））の塩基配列に対応したプライマーを設計し、ヒト組織由来のゲノムＤＮＡ（例えば、クロンテック社製）を鋳型としたＰＣＲ法により、目的のＤＮＡ断片を増幅する。得られたＤＮＡは大腸菌用のプラスミドなどにクローニングし、塩基配列を決定する。得られたＤＮＡは目的によりそのまま、または制限酵素により消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。さらにプロモーター活性を調べる手段としては、得られたＤＮＡの下流に、転写量の検出可能なレポーター遺伝子を連結する方法が好用される。レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチル転移酵素遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子等が汎用されるが、他のいかなる構造遺伝子であっても、その遺伝子産物が検出可能であれば用いることができる。
上記組み換えプラスミドＤＮＡにより形質転換する宿主としては、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。酵母としては、例えば、サッカロミセス  セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２Ｒ−、ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄなどが挙げられる。昆虫細胞としては、例えば、夜盗蛾Ｓｆ９細胞、蚕ＢｍＮ細胞などが用いられる。動物細胞としては、例えば，サルＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、２９３Ｔ細胞、３Ｔ３−Ｌ１細胞、ヒトＨＥＫ２９３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、白色脂肪細胞、また適当な分化条件により分化誘導された細胞などが用いられる。
酵母を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７５，１９２９（１９７８）に記載の方法を適宜改変して行われる。昆虫細胞を形質転換するには、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），ｖｏｌ．６，４７，（１９８８）などに記載の方法を適宜改変して行うことができる。動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール，２６３（秀潤社より１９９５年に発行）やＶｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．５２，４５６（１９７３）などに記載の方法を適宜改変して行うことができる。
上記形質転換体は、特定の化合物の存在下に培養し、培養物中の遺伝子産物の量を測定し比較することにより、当該化合物によるプロモーター活性の促進能を知ることができる。形質転換体の培養は、それ自体公知の方法で行う。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホルダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７７，４５０５（１９８０））が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが望ましい。培養は通常約２０℃〜３０℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが望ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ナカライ社）などが用いられる。培地のｐＨは約６〜８に調整するのが望ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
本発明のＤＮＡは、ヒトアディポネクチンプロモーター領域のレギュレーター配列ＰＰＲＥあるいはＬＲＨ−ＲＥのどちらか一方、または両者を含有するプロモーター領域を含むＤＮＡであるため、その形質転換体を用いることによって、ヒトアディポネクチンプロモーターの活性を促進する化合物またはその塩をスクリーニングすることができる。以下に当該スクリーニング方法、スクリーニング用キットおよびこれらスクリーニング方法、スクリーニング用キットを用いて得られるヒトアディポネクチンプロモーター活性を促進する化合物またはその塩について具体的に説明する。
（１）ヒトアディポネクチンプロモーターの活性を促進する化合物またはその塩をスクリーニングする方法
本発明のヒトアディポネクチンプロモーター領域のレギュレーター配列ＰＰＲＥあるいはＬＲＨ−ＲＥのどちらか一方、または両者を含有するプロモーター領域を含むＤＮＡ、および当該ＤＮＡで形質転換された形質転換体は、ヒトアディポネクチンプロモーターの活性を促進する化合物またはその塩をスクリーニングするために有用である。
本発明のヒトアディポネクチンプロモーターの活性を促進する化合物またはその塩の決定方法においては、本発明の形質転換体を被験化合物と接触させた場合と本発明のレギュレーター配列を含有しない形質転換体を被験化合物と接触させた場合のポリペプチドの発現量を測定し比較することなどを特徴とする。
被験化合物としては、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物などが挙げられる。これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。発現されるポリペプチドとしては、上記の構造遺伝子（好ましくはレポーター遺伝子）がコードするポリペプチドなどが用いられる。ポリペプチドの発現量の測定方法としては、例えば、Ｂｒａｓｉｅｒ，Ａ．Ｒ．らの方法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｖｏｌ．７，１１１６−１１２２（１９８９））に準じた方法により、ルシフェラーゼ活性を測定することなどが挙げられる。
（２）ヒトアディポネクチンプロモーターの活性を促進する化合物またはその塩をスクリーニングするために用いるスクリーニング用キット
本発明のヒトアディポネクチンプロモーターの活性を促進する化合物またはその塩のスクリーニング用キットは、上述の形質転換体を用いることを特徴とするが、その例として、次のものが挙げられる。
細胞培養用培地：ダルベッコ改変イーグル培地（ナカライ社）に非働化ウシ胎児血清（ＪＲＨバイオサイエンス社）を５％添加したもの。
ヒトアディポネクチンプロモーター活性測定用プラスミド：本発明の、ヒトアディポネクチンプロモーター領域のレギュレーター配列ＰＰＲＥとＬＲＨ−ＲＥ両者を含有するＤＮＡを、ルシフェラーゼ遺伝子を含有するｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社）のマルチクローニング部位に挿入したもの。
核内受容体発現用プラスミド：ヒトＰＰＡＲγ、ヒトＲＸＲα、ヒトＬＲＨ−１の全長ｃＤＮＡを、ヒトｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社）を鋳型としたＰＣＲ法により取得する。取得したｃＤＮＡと哺乳動物細胞用発現プラスミドを同じ制限酵素で処理して連結したものを用いる。
宿主細胞株：ＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓由来細胞株、ＡＴＣＣより入手）
被験化合物：水溶液の状態のものを４℃あるいは−２０℃にて保存し、用時に細胞培養用培地にて５０μＭに希釈する。水に難溶性を示す被験化合物については、ジメチルスルホキシド、エタノール等に溶解する。
（３）スクリーニング法
ＨＥＫ２９３細胞を９６穴マルチプレート（ヌンク社）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養する。遺伝子導入の方法は、Ｌｕらの報告（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，６，５０７−５１５（２０００））中に記載された方法に基いて行う。本発明のヒトアディポネクチンプロモーター活性測定用プラスミドを５０ｎｇ／穴、核内受容体発現用のプラスミドを各々１５ｎｇ／穴、リン酸カルシウム法を用いて細胞に一過性に導入する。遺伝子導入から８時間後に、培養上清の５分の１量の被験化合物希釈液を添加する。さらに３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養し、被験化合物添加から１８時間後にピッカジーンＬＴ（東洋インキ社）を１００μｌ／穴加え、５分間撹拌後、Ｌｍａｘマイクロプレートルミノメーター（モレキュラーデバイス社）で発光活性を測定する。
上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて、ヒトアディポネクチンプロモーター活性を促進する化合物が見出せれば、当該化合物は脂肪組織におけるアディポネクチン産生・分泌を増加し、その結果血漿アディポネクチン濃度を上昇させることから、糖尿病、肥満、高コレステロール血症、高リポ蛋白血症等の代謝異常疾患、高脂血症、動脈硬化症、高血圧、循環器系疾患、過食症等の予防・治療薬として用いることができる。
当該化合物はさらに、上記疾患が病因となっている種々の症候群（シンドロームＸ、メタボリックシンドローム、マルチプルリスクファクター症候群、インスリン抵抗性症候群、死の四重奏、内臓脂肪症候群等）の予防・治療薬としても用いることができる。
上記のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物の非毒性塩としては、例えば、アルカリ金属（カリウム、ナトリウム、リチウム等）の塩、アルカリ土類金属（カルシウム、マグネシウム等）の塩、アンモニウム塩（テトラメチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等）、有機アミン（トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、シクロペンチルアミン、ベンジルアミン、フェネチルアミン、ピペリジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、リジン、アルギニン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン等）の塩、酸付加物塩（無機酸塩（塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩等）、有機酸塩（酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、グルクロン酸塩、グルコン酸塩等）等）が挙げられる。
本発明化合物の非毒性塩には、溶媒和物、または上記本発明化合物のアルカリ（土類）金属塩、アンモニウム塩、有機アミン塩、酸付加物塩の溶媒和物も含まれる。
溶媒和物は非毒性かつ水溶性であることが好ましい。適当な溶媒和物としては、例えば水、アルコール系溶媒（エタノール等）等の溶媒和物が挙げられる。
当該化合物またはその塩を上記の疾患の予防または治療剤として使用する場合は、経口投与のための内服用固形剤、内服用液剤、および非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等として用いられる。
経口投与のための内服用固形剤には、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセル剤には、ハードカプセルおよびソフトカプセルが含まれる。
このような内服用固形剤においては、活性物質はそのままか、または賦形剤（ラクトース、マンニトール、グルコース、微結晶セルロース、デンプン等）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等）、崩壊剤（繊維素グリコール酸カルシウム等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム等）、安定剤、溶解補助剤（グルタミン酸、アスパラギン酸等）等と混合され、常法に従って製剤化して用いられる。また、必要によりコーティング剤（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）で被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる物質のカプセルも包含される。
経口投与のための内服用液剤は、薬剤的に許容される水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等を含む。このような液剤においては、活性物質が、一般的に用いられる希釈剤（精製水、エタノールまたはそれらの混液等）に溶解、懸濁または乳化される。さらにこの液剤は、湿潤剤、懸濁化剤、乳化剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤、緩衝剤等を含有していてもよい。
非経口投与のための注射剤としては、溶液、懸濁液、乳濁液および用時溶剤に溶解または懸濁して用いる固形の注射剤を包含する。注射剤は、活性物質を溶剤に溶解、懸濁または乳化させて用いられる。溶剤として、例えば注射用蒸留水、生理食塩水、植物油、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノールのようなアルコール類等およびそれらの組み合わせが用いられる。さらにこの注射剤は、安定剤、溶解補助剤（グルタミン酸、アスパラギン酸、ポリソルベート８０（登録商標）等）、懸濁化剤、乳化剤、無痛化剤、緩衝剤、保存剤等を含んでいてもよい。これらは最終工程において滅菌するか無菌操作法によって製造される。また無菌の固形剤、例えば凍結乾燥品を製造し、その使用前に無菌化または無菌の注射用蒸留水または他の溶剤に溶解して使用することもできる。
非経口投与のための外用剤の剤形には、例えば、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、湿布剤、貼付剤、リニメント剤、噴霧剤、吸入剤、スプレー剤、エアゾル剤、点眼剤および点鼻剤等が含まれる。これらは活性物質を含み、公知の方法または通常使用されている処方により製造される。
軟膏剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、活性物質を基剤に混和、または溶融させて調製される。軟膏基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、高級脂肪酸または高級脂肪酸エステル（アジピン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、アジピン酸エステル、ミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステル、ステアリン酸エステル、オレイン酸エステル等）、ロウ類（ミツロウ、鯨ロウ、セレシン等）、界面活性剤（ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸エステル等）、高級アルコール（セタノール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール等）、シリコン油（ジメチルポリシロキサン等）、炭化水素類（親水ワセリン、白色ワセリン、精製ラノリン、流動パラフィン等）、グリコール類（エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、マクロゴール等）、植物油（ヒマシ油、オリーブ油、ごま油、テレピン油等）、動物油（ミンク油、卵黄油、スクワラン、スクワレン等）、水、吸収促進剤、かぶれ防止剤から選ばれるもの単独または２種以上を混合して用いられる。さらに、保湿剤、保存剤、安定化剤、抗酸化剤、着香剤等を含んでいてもよい。
ゲル剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、活性物質を基剤に溶融させて製造される。ゲル基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、低級アルコール（エタノール、イソプロピルアルコール等）、ゲル化剤（カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース等）、中和剤（トリエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン等）、界面活性剤（モノステアリン酸ポリエチレングリコール等）、ガム類、水、吸収促進剤、かぶれ防止剤から選ばれるもの単独または２種以上を混合して用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤、着香剤等を含んでいてもよい。
クリーム剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、活性物質を基剤に溶融または乳化させて調製される。クリーム基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、高級脂肪酸エステル、低級アルコール、炭化水素類、多価アルコール（プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等）、高級アルコール（２−ヘキシルデカノール、セタノール等）、乳化剤（ポリオキシエチレンアルキルエーテル類、脂肪酸エステル類等）、水、吸収促進剤、かぶれ防止剤から選ばれるもの単独または２種以上を混合して用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤、着香剤等を含んでいてもよい。
湿布剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、活性物質を基剤に溶融させ、練合物とし支持体上に展延塗布して製造される。湿布基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、増粘剤（ポリアクリル酸、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、デンプン、ゼラチン、メチルセルロース等）、湿潤剤（尿素、グリセリン、プロピレングリコール等）、充填剤（カオリン、酸化亜鉛、タルク、カルシウム、マグネシウム等）、水、溶解補助剤、粘着付与剤、かぶれ防止剤から選ばれるもの単独または２種以上を混合して用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤、着香剤等を含んでいてもよい。
貼付剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、活性物質を基剤に溶融させ、支持体上に展延塗布して製造される。貼付剤用基剤は公知あるいは通常使用されているものから選ばれる。例えば、高分子基剤、油脂、高級脂肪酸、粘着付与剤、かぶれ防止剤から選ばれるもの単独または２種以上を混合して用いられる。さらに、保存剤、抗酸化剤、着香剤等を含んでいてもよい。
リニメント剤は公知または通常使用されている処方により製造される。例えば、活性物質を水、アルコール（エタノール、ポリエチレングリコール等）、高級脂肪酸、グリセリン、セッケン、乳化剤、懸濁化剤等から選ばれるもの単独または２種以上に溶解、懸濁または乳化させて調製される。さらに、保存剤、抗酸化剤、着香剤等を含んでいてもよい。
噴霧剤、吸入剤、スプレー剤および点鼻剤は、一般的に用いられる希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウムのような安定剤と等張性を与えるような緩衝剤、例えば塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のような等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方法は、例えば米国特許第２，８６８，６９１号および同第３，０９５，３５５号に詳しく記載されている。
点鼻剤を投与する際には通常一般に薬剤を含有した溶液および粉末で、専用の点鼻器あるいは噴霧器を用い鼻腔内に定量的にスプレー（噴霧）投与される。
非経口投与のための点眼剤には、点眼液、懸濁型点眼液、乳濁型点眼液、用時溶解型点眼液および眼軟膏が含まれる。
これらの点眼剤は公知の方法に準じて製造される。例えば、活性物質を溶剤に溶解、懸濁または乳化させて用いられる。点眼剤の溶剤としては、例えば、滅菌精製水、生理食塩水、その他の水性溶剤または注射用非水性用剤（例えば、植物油等）等およびそれらの組み合わせが用いられる。点眼剤は、等張化剤（塩化ナトリウム、濃グリセリン等）、緩衝化剤（リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）、界面活性化剤（ポリソルベート８０（商品名）、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等）、安定化剤（クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム等）、防腐剤（塩化ベンザルコニウム、パラベン等）等などを必要に応じて適宜選択して含んでいてもよい。これらは最終工程において滅菌するか、無菌操作法によって製造される。また無菌の固形剤、例えば凍結乾燥品を製造し、その使用前に無菌化または無菌の滅菌精製水または他の溶剤に溶解して使用することもできる。
非経口投与のための吸入剤としては、エアロゾル剤、吸入用粉末剤または吸入用液剤が含まれ、当該吸入用液剤は用時に水または他の適当な媒体に溶解または懸濁させて使用する形態であってもよい。これらの吸入剤は公知の方法に準じて製造される。例えば、吸入用液剤の場合には、防腐剤（塩化ベンザルコニウム、パラベン等）、着色剤、緩衝化剤（リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等）、等張化剤（塩化ナトリウム、濃グリセリン等）、増粘剤（カリボキシビニルポリマー等）、吸収促進剤などを必要に応じて適宜選択して調製される。
吸入用粉末剤の場合には、滑沢剤（ステアリン酸およびその塩等）、結合剤（デンプン、デキストリン等）、賦形剤（乳糖、セルロース等）、着色剤、防腐剤（塩化ベンザルコニウム、パラベン等）、吸収促進剤などを必要に応じて適宜選択して調製される。
吸入用液剤を投与する際には通常噴霧器（アトマイザー、ネブライザー）が使用され、吸入用粉末剤を投与する際には通常粉末薬剤用吸入投与器が使用される。
非経口投与のためその他の組成物としては、活性物質を含み、常法により処方される直腸内投与のための坐剤および腟内投与のためのペッサリー等が含まれる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。当該化合物またはその塩の投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人当たり、一回につき、１ｎｇから１００ｍｇの範囲で一日一回から数回経口投与されるか、または成人一人当たり、一回につき、０．１ｎｇから１０ｍｇの範囲で一日一回から数回非経口投与されるか、または一日１時間から２４時間の範囲で静脈内に持続投与される。
もちろん前記したように、投与量は種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を越えて投与の必要な場合もある。
【図面の簡単な説明】  図１は、ヒトアディポネクチンのプロモーター領域を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
図２は、ヒトアディポネクチンプロモーター／レポータープラスミドＤＮＡおよび各種プロモーター欠失体ＤＮＡの構造を示す。
図３は、恒常的活性化ＰＰＡＲγおよびＲＸＲαによるヒトアディポネクチンプロモーター／レポータープラスミドＤＮＡの転写促進活性を示す。
図４は、ヒトアディポネクチンプロモーター／レポータープラスミドＤＮＡおよび各種プロモーター欠失体ＤＮＡの転写促進活性を示す。
図５は、ＰＰＡＲγ／ＲＸＲ二量体により転写制御される遺伝子群が有するＰＰＲＥの塩基配列の比較を示す。
図６は、ヒトアディポネクチン遺伝子上のＰＰＲＥ配列、およびＰＰＲＥ配列に変異を導入したヒトアディポネクチンプロモーター／レポータープラスミドＤＮＡの構造を示す。
図７は、恒常的活性化ＰＰＡＲγおよびＲＸＲαによる変異プロモーター／レポータープラスミドＤＮＡの転写促進活性を示す。
図８は、ＰＰＡＲγ／ＲＸＲ二量体のヒトアディポネクチンプロモーターのレギュレーター配列ＰＰＲＥへの直接結合（ゲルシフトアッセイ）を示す。
図９は、ＬＲＨ−１により転写制御される遺伝子群が有するＬＲＨ−ＲＥの塩基配列の比較を示す。
図１０は、ヒトアディポネクチン遺伝子上のＬＲＨ−ＲＥ配列、およびＬＲＨ−ＲＥ配列に変異を導入したヒトアディポネクチンプロモーター／レポータープラスミドＤＮＡの構造を示す。
図１１は、ＰＰＡＲγ／ＲＸＲ二量体、またＬＲＨ−１を発現させた際のヒトアディポネクチンプロモーター／レポータープラスミドＤＮＡのピオグリタゾンによる転写促進活性を示す。
図１２は、ＬＲＨ−１のヒトアディポネクチンプロモーターのレギュレーター配列ＬＲＨ−ＲＥへの直接結合（ゲルシフトアッセイ）を示す。
図１３は、分化脂肪細胞におけるヒトアディポネクチンプロモーター／レポータープラスミドＤＮＡのピオグリタゾンによる転写促進活性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：ヒトアディポネクチンプロモーター／レポータープラスミドＤＮＡの構築
ヒトアディポネクチンのプロモーター領域を含むＤＮＡを、高橋らの方法で取得したＤＮＡ断片（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．Ｒｅｌａｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｏｒｄ．，２４，８６１−８６８（２０００））を鋳型としたＰＣＲ法により増幅した。具体的には、ヒトＰ１−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ（ＰＡＣ）ＤＮＡ  ｐｏｏｌｓ（ゲノムシステム社）から、ヒトアディポネクチン遺伝子を含むクローンを得、制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩで消化した。得られた断片のうち２．９ｋｂのＤＮＡ断片は、ヒトアディポネクチン遺伝子の５’上流領域を含んでいた（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．Ｒｅｌａｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｏｒｄ．２４，８６１−８６８（２０００））。当該ＤＮＡ断片を鋳型とし、ヒトアディポネクチン遺伝子の転写開始点を塩基番号１として５’上流側９０８番目から３’下流側１４番目までの塩基配列が増幅されるよう設計したプライマー（５’−ＴＴＴ  ＣＧＧ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＡＧＧ  ＣＣＡ  ＧＡＧ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＴＣ−３’（配列番号５）および５’−ＴＴＴ  ＣＧＧ  ＧＡＧ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＴＧＡ  ＧＡＡ−３’（配列番号６））を用いたＰＣＲ法によりヒトアディポネクチンプロモーター領域を含むＤＮＡ断片を増幅し、塩基配列を決定した。決定した塩基配列を図１に示す。増幅したＤＮＡ断片、およびホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するｐＧＬ３ｂａｓｉｃプラスミド（プロメガ社）をそれぞれ制限酵素ＫｐｎＩとＳａｃＩで消化し、両者を結合した。構造の概略を図２に示す。以降、このヒトアディポネクチンプロモーター／レポータープラスミドをｐ（−９０８）／ＬＵＣと表記する。
実施例２：ヒトアディポネクチンプロモーター／レポータープラスミドＤＮＡの転写促進活性の検定
実施例１で構築したｐ（−９０８）／ＬＵＣが、核内受容体であるＰＰＡＲγ／ＲＸＲの二量体によって活性化されることを、ルシフェラーゼアッセイにより検定した。実施例２では、ヘルペスウィルスタンパク質ＶＰ１６の転写活性化領域と核内受容体ＰＰＡＲγ、およびＲＸＲαを結合させたキメラタンパク質（ＶＰ１６−ＰＰＡＲγ、およびＶＰ１６−ＲＸＲαと表記する。）を細胞内で発現する発現プラスミドＤＮＡを遺伝子導入することにより活性の検定を行った。これらキメラ核内受容体は、それぞれの活性化リガンドに依存せず、応答遺伝子の転写を活性化する能力を有している（Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１６，１０４０−１０４８（２００２））。レポータープラスミドとして、実施例１で構築したｐ（−９０８）／ＬＵＣを、核内受容体発現プラスミドと同時に遺伝子導入した。宿主細胞には、ヒト胎児腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞を用いた。細胞を９６穴マルチプレート（ヌンク社）に播種し、非働化５％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ナカライ社）を用いて３７℃、５％ＣＯ２条件下で一晩培養し、形質転換させた。遺伝子導入の方法は、Ｌｕらの報告（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ６，５０７−５１５（２０００））中に記載された方法に従った。１穴当たり、５０ｎｇのレポータープラスミドｐ（−９０８）／ＬＵＣと２０ｎｇのｂ−ガラクトシダーゼ発現プラスミド、核内受容体発現用のプラスミド各々１５ｎｇを、リン酸カルシウム法を用いて導入した。遺伝子導入から２６時間後にルシフェラーゼ活性、および内部標準用のｂ−ガラクトシダーゼ活性をそれぞれＬｍａｘマイクロプレートルミノメーター、およびＥｍａｘマイクロプレートリーダー（いずれもモレキュラーデバイス社）を用いて測定した。測定結果は、ルシフェラーゼ活性の測定値をβ−ガラクトシダーゼ活性の値で除し、相対活性として表現した。結果を図３に示す。ＶＰ１６−ＰＰＡＲγとＶＰ１６−ＲＸＲαの両者を発現させた細胞において、顕著なルシフェラーゼ活性の上昇が認められた。ＶＰ１６のみ、あるいはＶＰ１６−ＰＰＡＲγ、ＶＰ１６−ＲＸＲαそれぞれ単独の発現によっては、顕著な変化はみられなかった。これらの結果から、用いたヒトアディポネクチンプロモーター領域にＰＰＡＲγ／ＲＸＲ二量体が作用し、転写調節を行うものと考えられた。
実施例３：ヒトアディポネクチンプロモーター領域内のレギュレーター配列（ＰＰＲＥ）の同定
実施例２において認められた転写活性の上昇が、ヒトアディポネクチンプロモーター上のどの領域に依存するのかを特定する目的で、図２下部に示した構造を有するヒトアディポネクチンプロモーター欠失体を作製した。５’末端に制限酵素切断部位を有するプライマーを目的の長さのプロモーターＤＮＡが得られるように設計し、上述のｐ（−９０８）／ＬＵＣを鋳型としてＰＣＲ法により増幅した。増幅したＤＮＡ断片とｐＧＬ３ベーシックプラスミド（ｐＧＬ３  ｂａｓｉｃ  ｐｌａｓｍｉｄ）を制限酵素処理した後、連結して欠失体を構築した。ＨＥＫ２９３細胞において、これら各欠失体をレポーターとして用い、ＶＰ１６−ＰＰＡＲγとＶＰ１６−ＲＸＲαの両発現プラスミドを一過的に発現させ、実施例２で用いたのと同様な方法でルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図４に示す。ヒトアディポネクチンプロモーター領域の、−２８６ｂｐから−２６７ｂｐの配列を欠失することにより、ＶＰ１６−ＰＰＡＲγとＶＰ１６−ＲＸＲα両者の発現によるルシフェラーゼ活性の上昇が消失した。この結果から、ヒトアディポネクチンプロモーター領域の−２８６ｂｐから−２６７ｂｐの間に、ＰＰＡＲγ／ＲＸＲ二量体が作用するレギュレーター配列ＰＰＲＥが存在すると推定された。
図５は、ＰＰＡＲγ／ＲＸＲ二量体により転写制御を受けることが報告されている遺伝子のプロモーター領域に存在するＰＰＲＥの塩基配列を示している（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，８，１２２４−１２３４（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，９１３１−９１３５（２０００）、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，７，１６１−１７１（２００１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４８５７２−４８５７９（２００１））。いずれもダイレクトリピート１（ＤＲ１）と呼ばれる１３塩基からなる類似の構造を有している。ヒトアディポネクチンプロモーター領域の−２８６ｂｐから−２６７ｂｐまでの塩基配列を詳細に調べた結果、報告されているＰＰＲＥと類似した配列が、−２７３ｂｐから−２８５ｂｐまでの間に存在することが明らかとなった（図５、６）。推定された配列が、レギュレーター配列ＰＰＲＥとして機能することを確認する目的で、図６に示すように、推定された配列内に２塩基の変異を導入したレポータープラスミドを作製した。変異の導入は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ストラタジーン社）を用い、添付のプロトコールに従い行った。野生型のＰＰＲＥを有するレポータープラスミドｐ（−９０８）／ＬＵＣと、ＰＰＲＥと推定された配列に変異を導入したレポータープラスミドの転写活性を比較する目的で、ＨＥＫ２９３細胞にＶＰ１６−ＰＰＡＲγとＶＰ１６−ＲＸＲαの両発現プラスミドを一過的に発現させ、実施例２で用いたのと同様な方法でルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図７に示す。ＰＰＲＥと推定された配列に変異を導入したレポータープラスミドを用いた場合、野生型のＰＰＲＥを有するｐ（−９０８）／ＬＵＣでみられるような、ＶＰ１６−ＰＰＡＲγとＶＰ１６−ＲＸＲα両者の発現によるルシフェラーゼ活性の上昇は消失した。この結果から、ＰＰＲＥと推定された配列が、レギュレーター配列として機能し、ヒトアディポネクチンプロモーターのＰＰＡＲγ／ＲＸＲ二量体による転写活性化に必要であると考えられた。
実施例４：ＰＰＡＲγ／ＲＸＲ二量体のレギュレーター配列ＰＰＲＥへの直接結合
ヒトアディポネクチンプロモーター領域の−２８５ｂｐから−２７３ｂｐに同定されたレギュレーター配列ＰＰＲＥに、ＰＰＡＲγ／ＲＸＲ二量体が直接結合することを確認する目的で、ゲルシフトアッセイを行った。ゲルシフトアッセイは文献に記された方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６，４８５７２−４８５７９（２００１））に基づいて行った。結合反応に用いるＰＰＡＲγ、ＲＸＲαタンパク質は、ヒトＰＰＡＲγ、ヒトＲＸＲαを発現する発現プラスミドを鋳型とし、ＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（プロメガ社）を用いて添付のプロトコールに従い、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）系にて合成した。ヒトアディポネクチンプロモーター領域の−２９１ｂｐから−２６７ｂｐまでの塩基配列を有するオリゴＤＮＡ（５’−ＴＧＧ  ＴＴＴＴＧＡ  ＣＴＴＴＴＧ  ＣＣＣ  ＣＡＴ  ＣＴＴ  Ｃ−３’（配列番号７）および５’−ＧＡＡ  ＧＡＴＧＧＧ  ＧＣＡ  ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＡＣＣ  Ａ−３’（配列番号８））をそれぞれ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（アマシャムバイオサイエンス社）とＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）を用いて標識し、二本鎖にしたものを標識プローブとして用いた。塩基配列に付した下線は、ＰＰＲＥを示している。インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）系で合成したタンパク質と標識プローブの結合反応は、２０μｌの溶液中で行った。反応液は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ジチオスレイトール、１０％グリセロールの組成からなり、さらに１μｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）、１μｌの核内受容体を含む合成反応液、２００，０００ｃｐｍの標識プローブを添加し、２０μｌとしたものである。混合後、２５℃で２０分間反応させ、さらに４℃で１５分間静置した。標識プローブと核内受容体の複合体と、複合体を形成していない標識プローブの分離は、４％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により行った。電気泳動は０．５×ＴＢＥバッファー（４５ｍＭ  トリス、４５ｍＭ  ホウ酸、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて２００Ｖの電圧で９０分間行った。泳動後のゲルは乾燥させ、ＢＡＳ２５００システム（富士写真工業）を用いて画像解析した。標識プローブと核内受容体の結合が特異的であることを確認する目的で、競合反応も同時に行った。競合反応は、未標識の野生型ＰＰＲＥを含むオリゴＤＮＡ、あるいはＰＰＲＥに図６に示したのと同様な変異を導入したオリゴＤＮＡを、標識プローブの１０倍、あるいは５０倍のモル濃度で反応液に追加することにより行った。ＰＰＲＥに変異を導入したオリゴＤＮＡの塩基配列は、５’−ＴＧＧ  ＴＴＴＴＧＡ  ＣＴＴ  ＴＴＧ  ｔｔＣ  ＣＡＴ  ＣＴＴ  Ｃ−３’（配列番号９）、および５’−ＧＡＡ  ＧＡＴＧＧａ  ａＣＡ  ＡＡＡ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＡＣＣ  Ａ−３’（配列番号１０）である。変異させた塩基は小文字で示している。塩基配列に付した下線は、ＰＰＲＥを示している。結果を図８に示す。矢印は、標識プローブが分子量の大きなタンパク質と結合することで、ゲル上の移動が遅くなったバンドを指している。ＰＰＡＲγとＲＸＲαの両者を加えて反応させた場合、標識プローブとの複合体のバンド��検出された（レーン４）。競合反応を行うと、未標識の野生型ＰＰＲＥを有するオリゴＤＮＡを過剰量加えた際には、レーン４でみられたバンドが濃度依存的に消失した（レーン５とレーン６）。しかしながら、ＰＰＲＥに変異を導入した未標識オリゴＤＮＡを加えた際には、野生型の場合と比較して、明らかな競合効果の減弱が認められた（レーン７とレーン８）。以上の結果から、ヒトアディポネクチンプロモーター領域に同定したレギュレーター配列ＰＰＲＥに、ＰＰＡＲγ／ＲＸＲ二量体が特異的に結合することが明らかとなった。
実施例５：ヒトアディポネクチンプロモーター領域のレギュレーター配列（ＬＲＨ−ＲＥ）の同定
ヒトアディポネクチンプロモーター領域にＰＰＲＥ以外のレギュレーター配列が存在しないか、その塩基配列を詳細に解析したところ、ＬＲＨ−１（Ｌｉｖｅｒ  Ｒｅｃｅｐｔｅｒ  Ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ−１）と呼ばれる別の核内受容体が結合するレギュレーター配列ＬＲＨ−ＲＥ（ＬＲＨ−１  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）と推定される配列が存在した。図９には、ＬＲＨ−１により転写制御を受けることが報告されている遺伝子のプロモーター領域にあるＬＲＨ−ＲＥの塩基配列を示している（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ６，５０７−５１５（２０００）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，６６６０−６６６５（１９９９）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２４７６７−２４７７３（２００１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，１７７９３−１７７９９（２０００））。ヒトアディポネクチンプロモーター領域に見出された配列は、ラットおよびヒトのＣＹＰ７Ａ１遺伝子のプロモーター領域に存在するＬＲＨ−ＲＥと１塩基しか異なっていなかった。
図１０は、ＬＲＨ−ＲＥと推定される配列の存在する位置を示している。ＬＲＨ−ＲＥと推定される配列は、上述のＰＰＲＥと転写開始点の間の、−２３７ｂｐから−２２９ｂｐまでに位置した。ヒトアディポネクチンプロモーター領域にＬＲＨ−ＲＥと推定される配列が存在したことから、アディポネクチンプロモーターが核内受容体ＬＲＨ−１により転写制御を受ける可能性が考えられた。そこで、ＨＥＫ２９３細胞において、レポータープラスミドとして上述のｐ（−９０８）／ＬＵＣを用い、ＰＰＡＲγ、ＲＸＲα、そしてＬＲＨ−１を発現する発現プラスミドを、実施例２で用いたのと同様な方法で一過性に発現させた。核内受容体を機能させるために、ＰＰＡＲγを活性化する作用の知られているピオグリタゾンを遺伝子導入から８時間後に終濃度が１μＭになるように添加し、その後細胞を１８時間培養した。結果を図１１に示す。ＰＰＡＲγとＲＸＲαの発現により、ルシフェラーゼ活性は２倍上昇した。ピオグリタゾン処理により転写活性はさらに上昇した（レーン２）。一方、ＬＲＨ−１のみを発現させてもルシフェラーゼ活性の上昇はみられなかった（レーン３）。ところがＰＰＡＲγ、ＲＸＲαとＬＲＨ−１を同時に発現させると、ＰＰＡＲγとＲＸＲαのみを発現させた場合と比べて、ルシフェラーゼ活性がさらに２倍上昇した。その効果は、ピオグリタゾン処理の有無に関わらず認められた（レーン２に対してレーン４）。これらの結果から、ＬＲＨ−１は単独では作用を示さないものの、ＰＰＡＲγ／ＲＸＲ二量体によるヒトアディポネクチンプロモーター活性の促進を増強することが明らかとなった。次にＬＲＨ−１による作用が、プロモーター領域のＬＲＨ−ＲＥと推定される配列に依存したものであることを確認する目的で、図１０に示すようにＬＲＨ−ＲＥと推定される配列内に２塩基の変異を導入したレポータープラスミドを作製し、ルシフェラーゼ活性を測定した（図１１）。その結果、ＰＰＡＲγとＲＸＲαのみの発現によるルシフェラーゼ活性の上昇は、野生型ＬＲＨ−ＲＥを有するｐ（−９０８）／ＬＵＣを用いた場合と、ＬＲＨ−ＲＥと推定される配列に変異を導入したレポータープラスミドを用いた場合で差がみられなかった（レーン２に対してレーン６）。一方、ＰＰＡＲγ、ＲＸＲαとＬＲＨ−１を同時に発現させた場合、野生型レポーターを用いた際にみられたＬＲＨ−１による効果（レーン２に対してレーン４）は、変異体レポーターでは消失した（レーン６に対してレーン８）。以上の結果から、本実施例で見出されたＬＲＨ−１の作用は、ヒトアディポネクチンプロモーター領域のＬＲＨ−ＲＥと推定される配列に依存したものであることが明らかとなった。同時に、ＬＲＨ−ＲＥと推定される配列は、レギュレーター配列として機能すると考えられた。
実施例６：ＬＲＨ−１のレギュレーター配列ＬＲＨ−ＲＥへの直接結合
ＬＲＨ−１が、ヒトアディポネクチンプロモーター領域に見出されたレギュレーター配列ＬＲＨ−ＲＥへ直接結合することを確認する目的で、ゲルシフトアッセイを行った。ゲルシフトアッセイは実施例４で用いたのと同様な方法で行った。結合反応に用いたＬＲＨ−１タンパク質は、ヒトＬＲＨ−１を発現する発現プラスミドを鋳型とし、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）系にて合成した。標識プローブには、ヒトアディポネクチンプロモーター領域の−２４５ｂｐから−２２１ｂｐまでの塩基配列を有するオリゴＤＮＡ（５’−ＡＡＴ  ＡＡＧ  ＧＧＴ  ＣＡＡ  ＧＧＣ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  Ｃ−３’（配列番号１１）および５’−ＧＴＧ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＣＴＴ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＴＡＴ  Ｔ−３’（配列番号１２））を用いた。塩基配列に付した下線はＬＲＨ−ＲＥを示している。競合反応は、標識プローブに用いたのと同じオリゴＤＮＡを野生型として、またＬＲＨ−ＲＥに、図１０に示されているのと同様に変異を導入したオリゴＤＮＡ（５’−ＡＡＴ  ＡＡＧ  ＧＧＴ  ＣＡＡ  ｃｃＣ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  Ｃ−３’（配列番号１３）および５’−ＧＴＧ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＧＧｇ  ｇＴＴ  ＧＡＣ  ＣＣＴ  ＴＡＴ  Ｔ−３’（配列番号１４））を変異体として用い、標識プローブの１０倍、あるいは５０倍のモル濃度で反応液に加えた。変異させた塩基は小文字で示している。塩基配列に付した下線は、ＬＲＨ−ＲＥを示している。結果を図１２に示す。インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）系で合成したＬＲＨ−１と野生型ＬＲＨ−ＲＥを含む標識プローブの複合体が矢印で指した位置に検出された（レーン２）。競合反応を行うと、野生型のＬＲＨ−ＲＥを有するオリゴＤＮＡを過剰量加えた場合は、濃度依存的な複合体の消失がみられた（レーン３とレーン４）。一方、変異を導入したＬＲＨ−ＲＥを有するオリゴＤＮＡを加えた場合は、野生型を加えた場合と比較して複合体のバンドの減弱はわずかであった（レーン５とレーン６）。以上の結果から、ヒトアディポネクチンプロモーター領域に同定されたレギュレーター配列ＬＲＨ−ＲＥに、ＬＲＨ−１が特異的に結合することが明らかとなった。
実施例７：同定されたレギュレーター配列ＰＰＲＥとＬＲＨ−ＲＥの脂肪細胞における役割
アディポネクチンプロモーター領域内に同定したレギュレーター配列ＰＰＲＥとＬＲＨ−ＲＥが、脂肪細胞におけるアディポネクチン遺伝子の転写活性化に関与していることを示す目的で以下の実験を実施した。マウス前駆脂肪細胞３Ｔ３−Ｌ１を、タイプＩＶ  コラーゲンでコートした６穴プレート（ベクトン・ディッキンソン社）を用いて培養し、５μｇ／ｍｌインスリン、０．５ｍＭ  イソブチルメチルキサンチン、１μＭ  デキサメタゾンを含む培地で分化誘導した。分化誘導を開始してから６日目の細胞を、形質転換実験に用いた。遺伝子導入には、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００（インビトロジェン社）を使用し、添付のプロトコールにしたがって行った。１穴当たり各々のレポータープラスミドを２μｇ、内部標準用のβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミドを１μｇ使用した。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００とプラスミドをＯＰＴＩ−ＭＥＭ（インビトロジェン社）で希釈し、細胞に添加して３．５時間培養した。その後２０％ウシ胎児血清を含む培地を等量加えて４４時間培養し、ルシフェラーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。ピオグリタゾンは、２０％ウシ胎児血清を含む培地を加える際に終濃度１μＭになるよう添加した。結果を図１３に示す。アディポネクチンプロモーター領域を持たないｐＧＬ３ベーシックプラスミドにより形質転換した場合に比べ、野生型のヒトアディポネクチンプロモーターを有するｐ（−９０８）／ＬＵＣレポーターを用いた際、ルシフェラーゼ活性は１９倍上昇した。１μＭのピオグリタゾンで処理した場合には、処理しない場合と比べてさらに９倍の上昇がみられた。一方、レギュレーター配列ＰＰＲＥに変異を導入したレポーター（図６）を用いた場合には、野生型と比較してルシフェラーゼ活性が著しく低下し、ピオグリタゾン処理による効果も全く認められなかった。また、ＬＲＨ−ＲＥに変異を有するレポーター（図１０）を用いた場合も、野生型の場合と比較してルシフェラーゼ活性の低下がみられた。しかしながら、ピオグリタゾン処理した場合は、処理しない場合に比べてルシフェラーゼ活性が７．５倍上昇し、ピオグリタゾンに対する応答性は保たれていた。以上の結果から、同定されたレギュレーター配列ＰＰＲＥとＬＲＨ−ＲＥが、脂肪細胞におけるアディポネクチンプロモーターの活性化に重大な役割を果たしていることが明らかとなった。同時に、これらレギュレーター配列は、生理的な条件におけるアディポネクチンの遺伝子発現に深く関与しているものと考えられた。
【産業上の利用可能性】  本発明のヒトアディポネクチンプロモーター領域内のレギュレーター配列であるＰＰＲＥ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．Ｒｅｌａｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｏｒｄ．２４，８６１−８６８（２０００））に記載されているヒトアディポネクチン遺伝子の転写開始点を基準として、その５’上流側２７３番目から２８５番目の間に位置する塩基配列、およびＬＲＨ−ＲＥ（上述のＰＰＲＥと同じく５’上流側２２９番目から２３７番目の間に位置する塩基配列）は、核内受容体ＰＰＡＲγ、ＲＸＲ、ＬＲＨ−１が直接結合する配列であり、脂肪細胞におけるアディポネクチンプロモーターの活性化に重大な役割を果たしている。これらレギュレーター配列を含むプロモーター領域を含むＤＮＡと適当なレポーター遺伝子を連結したレポータープラスミドにより形質転換した形質転換体は、生理的なヒトアディポネクチン遺伝子の発現様式に近いものであり、ヒト疾患に対する治療薬剤をスクリーニングする上で極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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