(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化剤としてアセチルトリプトファン又はアセチルトリプトファン誘導体、又はその塩を含む安定したタンパク質製剤であって、タンパク質が造血因子であり、前記アセチルトリプトファン誘導体がアセチルトリプトファンメチルエステル、アセチルトリプトファンエチルエステル、アセチルトリプトファンプロピルエステル、アセチルトリプトファンアミドおよびクロロアセチルトリプトファンからなる群から選択されることを特徴とする前記タンパク質製剤。
【請求項２】
安定化剤がアセチルトリプトファン又はその塩である請求項１記載のタンパク質製剤。
【請求項３】
タンパク質が糖鎖を有することを特徴とする請求項１または２記載のタンパク質製剤。
【請求項４】
タンパク質が遺伝子組換え法により産生されたことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質製剤。
【請求項５】
タンパク質がＣＨＯ細胞で産生されたことを特徴とする請求項４記載のタンパク質製剤。
【請求項６】
タンパク質がエリスロポエチンであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質製剤。
【請求項７】
タンパク質がＧ−ＣＳＦであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質製剤。
【請求項８】
安定化剤として、実質的にタンパク質を含まない請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質製剤。
【請求項９】
凍結乾燥製剤である請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質製剤。
【請求項１０】
溶液製剤である請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質製剤。
【請求項１１】
マンニトールをさらに含む請求項１〜１０のいずれかに記載のタンパク質製剤。
【請求項１２】
界面活性剤をさらに含む請求項１〜１１のいずれかに記載のタンパク質製剤。
【請求項１３】
界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルである請求項１２記載のタンパク質製剤。
【請求項１４】
界面活性剤がポリソルベート２０及び／又は８０である請求項１３記載のタンパク質製剤。
【請求項１５】
ｐＨが４〜８である請求項１〜１４のいずれかに記載のタンパク質製剤。
【請求項１６】
ｐＨが６．０〜７．５である請求項１５記載のタンパク質製剤。
【請求項１７】
メチオニンをさらに含む請求項１〜１６のいずれかに記載のタンパク質製剤。
【請求項１８】
アセチルトリプトファン又はアセチルトリプトファン誘導体、又はその塩の添加量が１〜１００ｍＭである、請求項１〜１７のいずれかに記載のタンパク質製剤。
【請求項１９】
５０℃−１ヶ月間の加速試験後におけるタンパク質残存率が９０％以上であるか、６０℃−２週間の加速試験後におけるタンパク質残存率が９０％以上である、請求項７記載のタンパク質製剤。
【請求項２０】
５０℃−１週間の加速試験後又は６０℃−１週間の加速試験後におけるタンパク質残存率が８５％以上である、請求項６記載のタンパク質製剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はタンパク質製剤に関し、特に長期保存した後も活性成分の損失が少ない、トリプトファン又はトリプトファン誘導体、又はその塩を含有した、安定化したタンパク質製剤に関する。
背景技術
遺伝子組換え技術の発達によって、種々のタンパク質製剤が安定した供給量で提供されるようになった。これらの製剤は安定性を確保するため、凍結乾燥したタンパク質成分粉末とこれを溶解するための水溶性希釈液とを別途包装し、使用時に溶解する形態で提供されるか、あるいは安定性を向上させるための添加剤を加えたタンパク質溶液製剤の形で提供されている。
例えば、好中球の前駆細胞に作用し、その増殖ならびに分化成熟を促進する分子量約２万の糖タンパク質である顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が遺伝子工学的方法によって微生物や動物細胞を用いて組換えヒトＧ−ＣＳＦとして大量に生産することが可能になった。本願出願人はこの精製したＧ−ＣＳＦの製剤化に成功し、これを感染防御剤として市場に製品を供給している（特許第２１１６５１５号）。
Ｇ−ＣＳＦは極めて微量で使用され、通常成人一人当たり、０．１〜１０００μｇ（好ましくは５〜５００μｇ）のＧ−ＣＳＦを含有する製剤を１〜７回／週の割合で投与する。しかしながら、このＧ−ＣＳＦは例えば注射用アンプル、注射器等の器壁に対し吸着性を示す。また、Ｇ−ＣＳＦは不安定で、外的因子の影響を受けやすく、温度、湿度、酸素、紫外線等に起因して会合、重合あるいは酸化等の物理的、化学的変化を生じ、結果として大きな活性の低下を招く。
そこで安定なＧ−ＣＳＦ製剤を市場に供給するために種々の処方設計がなされている。例えば、（ａ）トレオニン、トリプトファン、リジン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン、アルギニン、システイン、シスチン、メチオニンから選ばれる少なくとも１種のアミノ酸；（ｂ）少なくとも１種の含硫還元剤；又は（ｃ）少なくとも１種の酸化防止剤；からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む製剤（特許第２５７７７４４号）等が提案されている。また、安定化剤としてポリソルベートなどの界面活性剤を含むＧ−ＣＳＦ製剤がある（特開昭６３−１４６８２６号）。
さらに、容器への付着を少なくし、化学的変化を押さえるという観点からは、凍結乾燥製剤とすることが有利であり、マルトース、ラフィノース、スクロース、トレハロース又はアミノ糖を含有したＧ−ＣＳＦ凍結乾燥製剤も報告されている（特表平８−５０４７８４号）。
現在市場に供給されている製品には、これら化学的、物理的変化を抑制するために安定化剤としてヒト血清アルブミンあるいは精製ゼラチンなどのタンパク質が使用されているものがある。しかしながら、タンパク質を安定化剤として添加することに関しては、ウィルスのコンタミネーションを除去する等のために非常に煩雑な工程を必要とする等の問題があった。
しかしながら、このようなタンパク質を添加しない場合には、Ｇ−ＣＳＦの会合体の生成が多くなり、品質劣化をもたらすというという問題があった。
また、赤血球系前駆細胞の分化、増殖を促進する酸性糖タンパク質ホルモンであるエリスロポエチン（ＥＰＯ）も、遺伝子工学的方法によって組換えヒトＥＰＯとして大量に生産され、本願出願人はこの精製したＥＰＯの製剤化（凍結乾燥製剤）に成功し、腎性貧血改善剤などとして市場に製品を供給している。
安定なＥＰＯ製剤を市場に供給するための処方設計では、ＥＰＯに見られる化学的変化（加水分解、ジスルフィド交換反応など）あるいは物理的変化（変性、凝集、吸着など）を抑制する必要がある。現在市場に供給されている製品には、これら化学的、物理的変化を抑制するために、安定化剤として一般的に使用されているヒト血清アルブミンあるいは精製ゼラチンなどのタンパク質が添加されているものがある。しかし、タンパク質の添加については上述した問題がある。
安定なＥＰＯ溶液製剤を市場に供給するための処方設計では、ロイシン、トリプトファン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンならびにその塩から選択されるアミノ酸を安定化剤として含むＥＰＯ溶液製剤が提案されている（特願平１１−５２３１４号）。
タンパク質へのアセチルトリプトファンの添加としては、アルブミン、ヒト成長ホルモン、ヒトＢ細胞分化因子（ｈｕｍａｎ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ：ＢＣＤＦ）等で行われている（特公平７−６８１３７号、特開平１０−２６５４０４号、特開平３−２７３２０号）。しかしながら現在までのところ、Ｇ−ＣＳＦやＥＰＯのような造血因子に対してアセチルトリプトファンを添加して安定化させることは知られていない。
本発明の目的は、安定化剤としてタンパク質を含有せず、しかも長期の保存にも安定なタンパク質製剤を提供することである。
発明の開示
上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは安定化剤としてトリプトファン又はトリプトファン誘導体、又はその塩を添加することによって、長期保存後でもタンパク質残存率が高いタンパク質製剤となしうることを見いだし本発明を完成した。
すなわち、本発明は、安定化剤としてトリプトファン又はトリプトファン誘導体、又はその塩を含む安定したタンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、安定化剤がアセチルトリプトファン又はアセチルトリプトファン誘導体、又はその塩である前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、安定化剤がアセチルトリプトファン又はその塩である前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、タンパク質が糖鎖を有することを特徴とする前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、タンパク質が遺伝子組換え法により産生されたことを特徴とする前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、タンパク質がＣＨＯ細胞で産生されたことを特徴とする前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、タンパク質が造血因子であることを特徴とする前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、タンパク質がエリスロポエチンであることを特徴とする前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、タンパク質がＧ−ＣＳＦであることを特徴とする前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、安定化剤として、実質的にタンパク質を含まない前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、凍結乾燥製剤である前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、溶液製剤である前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、マンニトールをさらに含む前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、界面活性剤をさらに含む前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルである前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、界面活性剤がポリソルベート２０及び／又は８０である前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、ｐＨが４〜８である前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、ｐＨが６．０〜７．５である前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、メチオニンをさらに含む前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、トリプトファン又はトリプトファン誘導体、又はその塩の添加量が１〜１００ｍＭである前記タンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、５０℃−１ヶ月間の加速試験後におけるタンパク質残存率が９０％以上であるか、６０℃−２週間の加速試験後におけるタンパク質残存率が９０％以上である、前記Ｇ−ＣＳＦタンパク質製剤を提供する。
本発明はさらに、５０℃−１週間の加速試験後又は６０℃−１週間の加速試験後におけるタンパク質残存率が８５％以上である、前記ＥＰＯタンパク質製剤を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の製剤に使用するタンパク質は、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン等の造血因子、インターフェロン、ＩＬ−１やＩＬ−６等のサイトカイン、モノクローナル抗体、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、レプチン、インシュリン、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）などを含むが、これらに限定されない。タンパク質の中でも、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチン等の造血因子が好ましく、さらに好ましくはＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦである。
本発明の製剤に使用されるタンパク質とは、哺乳動物、特にヒトの生理活性タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法により得られたものを含むが、好ましいのは遺伝子組換え法により得られたものである。遺伝子組換え法によって得られるタンパク質には天然タンパク質とアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列の１又は複数を欠失、置換、付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。さらには、タンパク質はＰＥＧ等により化学修飾されたものも含む。
本発明において有効成分として使用するタンパク質としては、例えば糖鎖を有するタンパク質が挙げられる。糖鎖の由来としては、特に制限はないが、哺乳動物細胞に付加される糖鎖が好ましい。哺乳動物細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来の細胞等があるが、この中でも、ＣＨＯ細胞が最も好ましい。
例えば、本発明のタンパク質製剤に使用するタンパク質がＧ−ＣＳＦである場合には、Ｇ−ＣＳＦは高純度に精製されたＧ−ＣＳＦであれば全て使用できる。本発明におけるＧ−ＣＳＦは、いかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したもの、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌などの細菌類；イースト菌；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。好ましくは大腸菌、イースト菌又はＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。最も好ましくはＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。さらには、ＰＥＧ等により化学修飾されたＧ−ＣＳＦも含む（国際特許出願公開番号ＷＯ９０／１２８７４参照）。
また、本発明のタンパク質製剤に使用するタンパク質がＥＰＯである場合には、ＥＰＯはいかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト尿より種々の方法で抽出し、分離精製したもの、遺伝子工学的手法（例えば特開昭６１−１２２８８号）によりチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来の細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。さらには、ＰＥＧ等により化学修飾されたＥＰＯも含む（国際特許出願公開番号ＷＯ９０／１２８７４参照）。さらに、糖鎖のついていないＥＰＯをＰＥＧ等により化学修飾したものも含む。また、ＥＰＯのアミノ酸配列中のＮ−結合炭水化物鎖結合部位もしくはＯ−結合炭水化物鎖結合部位において、１以上のグリコシル化部位の数を増加させるように改変したＥＰＯ類似体も含む（例えば、特開平８−１５１３９８号、特表平８−５０６０２３号参照）。さらには、糖鎖結合部位の数は変化させずに、シアル酸等の含量を増加させることにより糖鎖の量を増加させたものであってもよい。
本発明のタンパク質製剤には好ましくは安定化剤としてヒト血清アルブミンや精製ゼラチンなどのタンパク質を実質的に含まない。
本発明のタンパク質製剤は、例えば、タンパク質がＧ−ＣＳＦであるときには、５０℃−１ヶ月間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上、好ましくは９５％以上であるか、６０℃−２週間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上、好ましくは９５％以上である。また、本発明のタンパク質製剤は、タンパク質がＥＰＯであるときには、５０℃−１週間の加速試験後又は６０℃−１週間の加速試験におけるＥＰＯ残存率が８５％以上である。従って、従来知られているタンパク質製剤に比べて極めて安定な製剤である。
本発明のタンパク質製剤のｐＨは、好ましくはｐＨ４〜８であり、さらに好ましくはｐＨ６．０〜７．５である。しかしながら、ｐＨは含まれるタンパク質により異なり、これらに限定されるものではない。例えばＧ−ＣＳＦの場合には好ましくはｐＨ５〜７であり、さらに好ましくはｐＨ６．０〜６．７であり、さらに好ましいのはｐＨ６．５である。ＥＰＯの場合には好ましくはｐＨ５〜８であり、さらに好ましくはｐＨ５．５〜ｐＨ７．０である。
本発明のタンパク質製剤に中に含まれるタンパク質の量は、使用するタンパク質、治療すべき疾患の種類、患者の重症度、患者の年齢等に応じて決定できる。一般的には、０．０１μｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１μｇ／ｍｌ以上、さらに好ましくは１０μｇ／ｍｌ以上さらに好ましくは５０μｇ／ｍｌ以上のタンパク質を含む。例えばＥＰＯの場合には、一般には１００〜５０００００ＩＵ／ｍｌ，好ましくは２００〜１０００００ＩＵ／ｍｌ、さらに好ましくは７５０〜７２０００ＩＵ／ｍｌである、また、Ｇ−ＣＳＦの場合には一般には１〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜８００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５０〜５００μｇ／ｍｌである。
本発明で用いるトリプトファン又はトリプトファン誘導体、又はその塩は、遊離のトリプトファン又はトリプトファン誘導体ならびにそれらのナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩などの塩を含む。本発明の製剤に使用するトリプトファン又はトリプトファン誘導体、又はその塩はＤ−、Ｌ−またはＤＬ−体であってよく、より好ましいのはＬ−体である。トリプトファン誘導体には、トリプトファンメチルエステルヒドロクロライド、トリプトファノール、メチルトリプトファン、ベンジロキシトリプトファン、ブロモトリプトファン、フルオロトリプトファン、ヒドロキシトリプトファン、ヒドロキシトリプトファンエチルエステルヒドロクロライド、ヒドロキシトリプトファンハイドレイト、メトキシトリプトファン、アセチルトリプトファン、アセチルトリプトファンエチルエステル、アセチルトリプトファンアミド、オレイルトリプトファンエチルエステル、トリプトファンブチルエステルヒドロクロライド、トリプトファンエチルエステルヒドロクロライド、トリプトファンメチルエステルヒドロクロライド、トリプトファンオクチルエステルヒドロクロライド、トリプトファンアミドヒドロクロライド、フルオロトリプトファン、トリプトファノールオキザレート、アザトリプトファンヒドレート、フルオレニルメトキシカルボニルトリプトファン、カルボベンジロキシトリプトファン、ブトキシカルボニルトリプトファン、メトキシカルボニルトリプトファンメチルエステル、ソリプトファンナフチルアミド、カルボベンジロキシトリプトファン、カルボベンジロキシアラニルトリプトファン、カルボベンジロキシイソロイシルトリプトファン、カルボベンジロキシイソロイシルトリプトファンメチルエステル、カルボベンジロキシメチオニルトリプトファン、カルボベンジロキシメチオニルトリプトファンアミド、カルボベンジロキシノルロイシルトリプトファンメチルエステル、カルボベンジロキシノルバリルトリプトファン、カルボベンジロキシフェニルアラニルトリプトファンアミド、カルボベンジロキシトリプトファンアミド、カルボベンジロキシチロシルトリプトファンアミド、カルボベンジロキシグリシルトリプトファン、カルボベンジロキシグリシルトリプトファンメチルエステル、カルボベンジロキシグリシルトリプトファンアミド、カルボベンジロキシグリシルグリシルトリプトファンメチルエステル、カルボベンジロキシメチオニルトリプトファンメチルエステル、カルボベンジロキシノルバリルトリプトファンメチルエステル、カルボベンジロキシノルバリルトリプトファンアミド、カルボベンジロキシフェニルアラニルトリプトファンメチルエステル、カルボベンジロキシサルコシルトリプトファンメチルエステル、カルボベンジロキシサルコシルトリプトファンアミド、カルボベンジロキシトリプトファンナフチルアミド、カルボベンジロキシトリプトフィルトリプトファンメチルエステル、クロロアセチルトリプトファン、ダンシルトリプトファンクロロヘキシルアンモニウム、グリシルトリプトファン、ホモトリプトファンヒドロクロライド、アラニルトリプトファン、アセチルトリプトファンメチルエステル、カルボベンジロキシトリプトファンニトロフェニルエステル、フリラクリロリルトリプトファンアミド、カルバミルトリプトファン、クロロアセチルトリプトファン、ニトロフェニルスルフェニルトリプトファンジアンモニウム、アセチルトリプトファンプロピリエステル等を含む。本発明ではアセチルトリプトファン及びアセチルトリプトファン誘導体が特に好ましい。アセチルトリプトファン誘導体にはアセチルトリプトファンメチルエステル、アセチルトリプトファンエチルエステル、アセチルトリプトファンプロピルエステル、アセチルトリプトファンアミド、クロロアセチルトリプトファン等がある。
本発明の製剤に添加するトリプトファン又はトリプトファン誘導体、又はその塩の添加量は、使用するタンパク質の種類、タンパク質の濃度、製剤形態（凍結乾燥製剤又は溶液製剤）及び使用する誘導体により異なる。凍結乾燥製剤の場合には、一般に最終投与量として、０．１〜３００ｍＭであり、好ましくは１〜２００ｍＭ、さらに好ましくは１〜１００ｍＭである。溶液製剤の場合には、一般に最終投与量として、０．１〜３０ｍＭであり、好ましくは０．５〜２０ｍＭ、さらに好ましくは０．５〜１０ｍＭである。なお、凍結乾燥製剤の場合、０．１〜３０ｍＭ、好ましくは１〜３０ｍＭ、さらに好ましくは１〜１０ｍＭとすると、安定で且つ再溶解性に優れたタンパク質製剤を提供することができる。
タンパク質とアセチルトリプトファンの重量比は、凍結乾燥製剤の場合には一般に、１：１〜１：１０００である。ＥＰＯの場合は、好ましくは１：１〜１：５００、さらに好ましくは１：２〜１：３００である。Ｇ−ＣＳＦの場合は、好ましくは１：１〜１：５００、さらに好ましくは１：１０〜１：３００である。溶液製剤の場合には、一般に１：１〜１：１０００であるが、ＥＰＯの場合は、好ましくは１：１〜１：５００、より好ましくは１：１０〜１：２５０、さらに好ましくは１：１００〜１：１５０、最も好ましくは１：１２０である。
本発明の製剤にはメチオニンを添加することが好ましい。メチオニンを添加することにより、Ｇ−ＣＳＦのメチオニン残基酸化体生成率を検出限界以下にすることが観察されている（特願平１１−５２３１４号）。本発明者らは、特定の理論に拘束されるつもりはないが、Ｇ−ＣＳＦのメチオニン残基に代えて、添加されたメチオニンが酸化されることにより、Ｇ−ＣＳＦのメチオニン残基酸化体生成率を低くすると推測した。
本発明の製剤には等張化剤として、ポリエチレングリコール；デキストラン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、シュークロース、ラフィノースなどの糖類を用いることができる。マンニトールが特に好ましい。マンニトールの添加量は製剤中に０．１〜１０％、さらに好ましくは０．５〜６％である。
本発明の製剤には界面活性剤をさらに含むことができる。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチエレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のＨＬＢ６〜１８を有するもの；陰イオン界面活性剤、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。本発明の製剤には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。
好ましい界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、特に好ましいのはポリソルベート２０、２１、４０、６０、６５、８０、８１、８５であり、最も好ましいのはポリソルベート２０及び８０である。
本発明のタンパク質製剤に添加する界面活性剤の添加量は、一般には０．０００１〜１０％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは０．００１〜５％であり、さらに好ましくは０．００５〜３％である。本発明のタンパク質製剤には、所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。例えば、含硫還元剤としては、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、並びに炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。また、酸化防止剤としては、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてよい。
本発明のタンパク質製剤は溶液製剤、凍結乾燥製剤、噴霧乾燥製剤などを含む。最も好ましくは凍結乾燥製剤である。
本発明の製剤は、これらの成分をリン酸緩衝液（好ましくはリン酸一水素ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム系）及び／又はクエン酸緩衝液（好ましくはクエン酸ナトリウムの緩衝液）などの溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製し、あるいはこのようにして調製された溶液製剤を定法により凍結乾燥、又は噴霧乾燥することによって製造できる。
本発明の安定化されたタンパク質製剤は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、経口投与も可能である。
本発明のタンパク質製剤は、例えば通常密封、滅菌されたプラスチックまたはガラス容器中に収納されており、使用時に純水（注射用滅菌水）に溶解して使用できる。
本発明のタンパク質製剤は、タンパク質がＧ−ＣＳＦであるときには、後述の実施例に示すように、５０℃−１ヶ月間の加速試験又は６０℃−２週間の加速試験を行った後にも、極めて良好なＧ−ＣＳＦ残存率を示す。本発明のＧ−ＣＳＦ製剤は５０℃−１ヶ月間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上、好ましくは９５％以上であるか、６０℃−２週間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上、好ましくは９５％以上である。
また、本発明のタンパク質製剤は、タンパク質がＥＰＯであるときには、後述の実施例に示すように、アセチルトリプトファンの添加量が極めて少量であっても、５０℃−１週間の加速試験又は６０℃−１週間の加速試験を行った後にもアセチルトリプトファン無添加群に比べて５％以上の極めて良好なＥＰＯ残存率を示した。本発明のＥＰＯ製剤は５０℃−１週間の加速試験後又は６０℃−１週間の加速試験におけるＥＰＯ残存率が８５％以上である。
なお、以下に示す実施例で使用したＧ−ＣＳＦ又はＥＰＯとアセチルトリプトファン添加量との重量比、並びにこれらを用いて行った加速試験後のタンパク質残存率を表１として示す。ここに示す重量比、残存率は本発明の一例を示すものにすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
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本発明のタンパク質製剤がＧ−ＣＳＦ製剤であるときは、感染症や癌の化学治療において、抗生物質、抗菌剤、抗癌剤などの薬剤を投与する際に同時投与すると、患者の抵抗力、活性などといった免疫応答力に基づいた防御機能を改善することが判明しており、臨床上極めて有用である。従って、本発明の製剤はこれらの薬剤と併用投与することができる。
本発明の製剤では、後述する実施例の結果から、トリプトファン又はトリプトファン誘導体を添加することにより特に常温における長期保存後のＧ−ＣＳＦ又はＥＰＯ残存率を増加することができる。
産業上の利用可能性
本発明のタンパク質製剤は、長期保存後においてもタンパク質の残存率が極めて高い、安定な製剤である。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
実施例
（１）Ｇ−ＣＳＦ製剤の試験方法及び測定方法
試験方法
Ｇ−ＣＳＦを含む各調剤液を調製し、無菌濾過を行った後、無菌的に各バイアルに１ｍＬずつ正確に充填し、凍結乾燥に供した。凍結乾燥終了後、完全打栓し、Ｇ−ＣＳＦ凍結乾燥製剤を製造した。尚、使用したＧ−ＣＳＦは組換えＧ−ＣＳＦであり、添加したアミノ酸はいずれも遊離型でＬ−体である。
このように無菌的に調製したＧ−ＣＳＦ含有凍結乾燥製剤を、６０℃の恒温槽内に２週間或いは５０℃の恒温槽内に１ヶ月間静置した。
加速品製剤、及び未加速品製剤は、１ｍＬの純水で溶解し、下記の方法の試験試料とした。
測定方法
試料は、Ｃ４逆相カラム（４．６ｍｍ  ｘ  ２５０ｍｍ、３００オングストローム）を用い、純水、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸を移動相に用いた逆相系高速液体クロマトグラフィー法によりＧ−ＣＳＦ含量を測定した。Ｇ−ＣＳＦとして５μｇ相当量を注入し、アセトニトリルのグラジエントによりＧ−ＣＳＦを溶出させ、２１５ｎｍの波長で分光学的に検出した。
本方法で測定したＧ−ＣＳＦ含量を用い、下記の式に基づき、６０℃２週間、及び５０℃１ヶ月間加速後の残存率（％）を算出した。
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（２）ＥＰＯ製剤の試験方法及び測定方法
試験方法
ＥＰＯを含む各調剤液を調製し、無菌濾過を行った後、無菌的に各バイアルに０．５ｍＬずつ正確に充填し、溶液製剤を調製した。また、このようにして調製された溶液製剤から凍結乾燥製剤を調製した。凍結乾燥終了後、完全打栓し、ＥＰＯ凍結乾燥製剤を製造した。尚、使用したＥＰＯはＣＨＯ細胞から得た組換えＥＰＯであり、添加したアセチルトリプトファンは遊離型でＬ−体である。
このように無菌的に調製したＥＰＯ含有製剤を、５０℃の恒温槽内に１週間或いは６０℃の恒温槽内に１週間静置した。
測定方法
試料は、ＶｙＤＡＣ  ２１４ＴＰ５４カラムを用い、水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸の２液混合グラジェントを移動相に用いた逆相系高速液体クロマトグラフィー法によりＥＰＯ含量を測定した。２１４ｎｍの波長で分光学的に検出した。
実施例１：種々のアミノ酸のＧ−ＣＳＦ残存率に及ぼす効果
以下の処方：
Ｇ−ＣＳＦ  １００μｇ／ｍＬ
アミノ酸              ６０ｍＭ
マンニトール          ２．５％
ポリソルベート２０    ０．０１％
のＧ−ＣＳＦ凍結乾燥製剤を調製し、６０℃の恒温槽内に２週間或いは５０℃の恒温槽内に１ヶ月間静置した後、上述した試験方法で残存率（％）を測定した。得られた結果を表２に示す。
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６０℃の恒温槽内に２週間静置したときにも、５０℃の恒温槽内に１ヶ月間静置したときにも、トリプトファンを添加した製剤が優れた残存率を示した。
実施例２：アセチルトリプトファンの添加量のＧ−ＣＳＦ残存率に及ぼす効果
Ｇ−ＣＳＦを１００μｇ／ｍＬ、メチオニンを６ｍＭ、マンニトールを５％、ポリソルベート２０を０．０１％含み、アセチルトリプトファンの添加量を変化させた試料１−４を測定した結果を以下の表３に示す。なお、アセチルトリプトファンはＮａＯＨ溶液に溶解して使用した。
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アセチルトリプトファン３０ｍＭ，６０ｍＭ，９０ｍＭいずれの添加量においても顕著な残存率を示した。
実施例３：アセチルトリプトファン添加のＥＰＯ残存率に及ぼす効果
ＥＰＯ溶液製剤の調製
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を含み、１０ｍＭリン酸緩衝溶液にてｐＨ７．０に調整した。
さらに、上記溶液製剤から凍結乾燥製剤を調製した。
（１）溶液製剤における残存率
溶液製剤を５０℃−１週間静置した後のＥＰＯ残存率を表４に示す。
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（２）凍結乾燥製剤における残存率
凍結乾燥製剤を６０℃−１週間静置した後のＥＰＯ残存率を表５に示す。
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なお、試料１４，１５，１７は非常に良好な再溶解性を示した。