(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子と標的物質を含む試料から該標的物質を捕捉するための捕捉分子を結合させるための結合用官能基を基体上に備えた構造体であって、
主鎖の一端に前記基体が結合し、他端に硫黄原子を介して前記結合用官能基が結合した標的物質捕捉用のポリマーと、
主鎖の一端に前記基体が結合し、他端に硫黄原子を介して前記生体分子の前記構造体への吸着を抑制する抑制用官能基が結合した抑制用ポリマーと、
を有し、
前記標的物質捕捉用のポリマーと前記抑制用ポリマーの両方の側鎖にも、前記生体分子の前記構造体への吸着を抑制する抑制用官能基が結合しており、
前記基体上の前記ポリマーの密度は、０．１分子／nm2以上１．０分子／nm2以下の範囲にある
ことを特徴とする捕捉分子を結合させるための結合用官能基を基体上に備えた構造体。
【請求項２】
前記抑制用官能基は、ヒドロキシル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシイソプロピル基、２−ヒドロキシブチル基、スルホニル基、ホスホニル基、アミノ基、メチルアミノ基、エチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、アミド基、メチルアミド基、エチルアミド基、イソプロピルアミド基、ピロリドン基、エチレングリコール基およびその重合体、コリン基、ホスファチジルコリン基のいずれかである請求項１に記載の構造体。
【請求項３】
前記結合用官能基は、カルボキシル基、アルデヒド基、スクシイミド基、マレイミド基、グリシジル基、アミノ基のいずれかである請求項１に記載の構造体。
【請求項４】
前記ポリマーは、ビニル系の高分子化合物からなる請求項１に記載の構造体。
【請求項５】
前記ビニル系の高分子化合物は、側鎖に、ヒドロキシル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシイソプロピル基、２−ヒドロキシブチル基、スルホニル基、ホスホニル基、アミノ基、メチルアミノ基、エチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、アミド基、メチルアミド基、エチルアミド基、イソプロピルアミド基、ピロリドン基、エチレングリコール基およびその重合体、コリン基、ホスファチジルコリン基のいずれかを有するモノマーの重合体である請求項４に記載の構造体。
【請求項６】
前記ポリマーの平均分子量は、５００以上１０００００以下の範囲にある請求項１乃至５のいずれか１項に記載の構造体。
【請求項７】
前記結合用官能基に前記捕捉分子が結合した請求項１乃至６のいずれか１項に記載の構造体。
【請求項８】
生体分子と標的物質を含む試料から該標的物質を捕捉するための捕捉分子を結合させるための結合用官能基を基体上に備えた構造体の製造方法であって、
基体表面を基点とし、前記生体分子の前記構造体への吸着を抑制する抑制用官能基を側鎖に有する不飽和モノマーを重合させて、一端が該基体表面に結合した主鎖を有するポリマーを成長させる工程と、
前記重合で得られたポリマーの主鎖の成長端に、前記結合用官能基と硫黄原子を含有する連鎖移動剤と、前記抑制用官能基と硫黄原子を含有する連鎖移動剤を含有する連鎖移動剤と、を反応させて、
主鎖の一端に前記基体が結合し、他端に硫黄原子を介して前記結合用官能基が結合した標的物質捕捉用のポリマーと、
主鎖の一端に前記基体が結合し、他端に硫黄原子を介して前記生体分子の前記構造体への吸着を抑制する抑制用官能基が結合した抑制用ポリマーと、
を得る工程と、
を有し、
前記基体上の前記ポリマーの密度は、０．１分子／nm2以上１．０分子／nm2以下の範囲にある
ことを特徴とする捕捉分子を結合させるための結合用官能基を基体上に備えた構造体の製造方法。
【請求項９】
光源と、光を検出する検知装置と、検体と検体中の標的物質を捕捉するための捕捉分子とを接触させるための反応領域と、を備え、光学的手法により検体中の標的物質を検出する検出装置であって、前記反応領域内に請求項７に記載の構造体を配したことを特徴とする検体中の標的物質を検出する検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子の非特異吸着を抑制し、標的物質を捕捉する捕捉分子を結合させるための結合用官能基を基体上に備えた構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、検体中の標的物質の検出に、分子間の相互作用が利用されてきた。この相互作用としては、一方の分子が他方の分子を捕捉する２分子間の相互作用がある。このような相互作用としては、例えば、抗原抗体反応、分子とその受容体（レセプター）との結合反応、相補的な核酸間でのハイブリダイゼーション反応、酵素基質結合反応などが知られている。このような相互作用を利用して、検体中の標的物質の検出を行うことができる。例えば、標的物質を捕捉可能な捕捉分子を基体表面上に固定し、標的物質を含む検体をこれに接触させることによって反応を行わせ、基体表面上の捕捉分子に標的物質を捕捉させ、その状態を検出することで、検体中の標的物質の検出を行う方法が一般的である。
【０００３】
基体上に固定した捕捉分子と相互作用する標的物質を定量的に測定するとき、基体表面の性質もしくは固定方法によっては、捕捉分子と相互作用した標的物質以外に、基体表面に非特異的に吸着した生体分子も同時に検出してしまう恐れがある。このことが、微量検出を必要とするセンサでは、最小検出感度を低下させる原因となる。そのため、非特異吸着を抑制しつつ、標的物質のみが検出される手法が必要とされている。
【０００４】
Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．  １９９６，６８，４９０−４９７には、金基体表面に対し、末端をオリゴエチレングリコール修飾したアルカンチオールで自己組織化（ＳＡＭ）膜を形成することが開示されている。さらに、この文献にはＳＡＭ膜上の一部のエチレングリコール末端を活性化してレセプター分子を固定することで、非特異吸着を防止しつつ、標的物質であるリガンド分子のみを検出することが開示されている。
【０００５】
しかし、ＳＡＭ膜は分子間のファンデルワールス力によって形成されるため、基体上に数ｎｍ単位の湾曲や凹凸がある場合、膜が不均一であったり、ＳＡＭが形成されない恐れがある。加えて、安価に製造される基体では多くの場合、図１に示されるように、平面状に形成された膜であっても数ｎｍレベルの凹凸が存在するため、部分的にも前記同様の状態に陥る恐れがある。なお、図１において、１０は基材、１２はアルカンチオール基、１４は標的物質の捕捉分子、１６は標的物質、１８は非特異吸着物質（生体分子）である。そして２９はオリゴエチレングリコールである。
【０００６】
また、特開２００４−２６４０２７号公報にも金基体表面にＳＡＭ膜を作製した構造が開示されている。この公報では、更に、ＳＡＭ膜の末端と反応する官能基と捕捉分子を固定するための官能基とを両端に持つヘテロ二官能基型ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をＳAM膜に反応させ、該PEGを介して捕捉分子を固定することが開示されている。
【０００７】
しかし、アルカンチオールで構成したＳＡＭ膜上に、既に合成されたヘテロ二官能基型ＰＥＧをスペーサーとして機能性分子を固定しようとすれば、ＳＡＭ膜上にＰＥＧを反応させる段階において高分子の立体障害のために隙間が生じる。そのため、図２に示されるように、検体に含まれる小分子（生体分子）がＳＡＭ膜や基体上に吸着する恐れがある。なお、図２において、１０は基材、１２はアルカンチオール基、１４は捕捉分子、１６は標的物質、１８は非特異吸着物質である。そして２０はヘテロ二官能基型ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【０００８】
一方、基板表面への非特異吸着を効果的に防止する技術として、ブラシ状のポリマーをシリコン基体表面に高密度に形成し、タンパク質非特異吸着および細胞接着を防止する技術が知られている。この技術は、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００４，５，２３０８−２３１４に開示されている。この文献には、シリコン表面上で、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(以下、ＭＰＣ)をモノマーとしたブラシ状のポリマーを原子移動ラジカル重合により高密度に形成する点が記載されている。しかし、この文献ではポリマー分子先端に機能性分子を固定するような工夫はなされていない。
【０００９】
また、別に非特異吸着を抑制する方法として特表２００３−５１６５１９号公報に開示されたものがある。特表２００３−５１６５１９号公報には、基体上にグラフト化した官能化ポリマーを塗布すると共に官能化ポリマーに部分的に標的物質捕捉分子を配し、グラフト化した領域により非特異吸着を抑制する手法が開示されている。しかしながらグラフト化した領域の側鎖に非特異吸着を抑制する官能基を配することについては開示されておらず、より十分に非特異吸着を抑制するには改善の余地がある。
【００１０】
上述の通り、生体分子の非特異吸着を防止し、標的物質を基体上の特定の領域に捕らえる各種の手法については、改善の余地のあるのが実状である。本発明は、非特異吸着を効率的に防止し、標的物質を基体上の特定領域で確実に捕捉することで、標的物質を感度良く検出し得る技術を提供するものである。
【特許文献１】特開２００４−２６４０２７号公報
【特許文献２】特表２００３−５１６５１９号公報
【非特許文献１】Anal.Chem. 1996,68,490-497
【非特許文献２】Biomacromolecules 2004,5,2308-2314
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明により提供される生体分子と標的物質を含む試料から該標的物質を捕捉するための捕捉分子を結合させるための結合用官能基を基体上に備えた構造体は、
主鎖の一端に前記基体が結合し、他端に硫黄原子を介して前記結合用官能基が結合した標的物質捕捉用のポリマーと、
主鎖の一端に前記基体が結合し、他端に硫黄原子を介して前記生体分子の前記構造体への吸着を抑制する抑制用官能基が結合した抑制用ポリマーと、
を有し、
前記標的物質捕捉用のポリマーと前記抑制用ポリマーの両方の側鎖にも、前記生体分子の前記構造体への吸着を抑制する抑制用官能基が結合しており、
前記基体上の前記ポリマーの密度は、０．１分子／nm2以上１．０分子／nm2以下の範囲にある
ことを特徴とするものである。
【００１２】
また、本発明により提供される生体分子と標的物質を含む試料から該標的物質を捕捉するための捕捉分子を結合させるための結合用官能基を基体上に備えた構造体の製造方法は、
基体表面を基点とし、前記生体分子の前記構造体への吸着を抑制する抑制用官能基を側鎖に有する不飽和モノマーを重合させて、一端が該基体表面に結合した主鎖を有するポリマーを成長させる工程と、
前記重合で得られたポリマーの主鎖の成長端に、前記結合用官能基と硫黄原子を含有する連鎖移動剤と、前記抑制用官能基と硫黄原子を含有する連鎖移動剤を含有する連鎖移動剤と、を反応させて、
主鎖の一端に前記基体が結合し、他端に硫黄原子を介して前記結合用官能基が結合した標的物質捕捉用のポリマーと、
主鎖の一端に前記基体が結合し、他端に硫黄原子を介して前記生体分子の前記構造体への吸着を抑制する抑制用官能基が結合した抑制用ポリマーと、
を得る工程と、
を有し、
前記基体上の前記ポリマーの密度は、０．１分子／nm2以上１．０分子／nm2以下の範囲にある
ことを特徴とするものである。
【００１３】
また、本発明により提供される検体中の標的物質を検出する検出装置は、光源と、光を検出する検知装置と、検体と検体中の標的物質を捕捉するための捕捉分子とを接触させるための反応領域と、を備え、光学的手法により検体中の標的物質を検出する検出装置であって、前記反応領域内に結合用官能基に標的物質を捕捉する捕捉分子を結合させた本発明の構造体を配したことを特徴とするものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明者らは、基体上に生体分子の非特異吸着防止能を有する高密度なポリマー層を備えた標的物質を捕捉するための基体として好適な構造を見出した。
【００１５】
この構造は、基体に一端を固定したポリマー層の他端、即ち検体側末端に標的物質を捕捉する捕捉分子を結合させるための結合用官能基を部分的に固定し、結合用官能基が固定されていない末端に生体分子の非特異吸着抑制用官能基を固定したものである。更に本発明の構造では、ポリマーの側鎖にも非特異吸着抑制用官能基を結合させている。この構造をとることで、図３に示すようにポリマー末端に固定した非特異吸着抑制用官能基２６及びポリマー側鎖に結合した非特異吸着抑制用官能基２４の双方により非特異吸着分子（生体分子）の吸着が効果的に抑制される。そして、ポリマー末端に固定された結合用官能基２８に固定された標的物質捕捉分子１４により効果的に標的物質１６を捕捉し得る。これにより図３に示されるように表面に数ｎｍ単位の湾曲や凹凸がある基体を用いた場合であっても、生体分子の非特異吸着を抑制しつつ、標的物質を高効率で捕捉し得る。この構造体を標的物質のセンシングに用いると、目的とする標的物質を高感度に検出可能となる。
【００１６】
ここで、図３において、１０は基体、１２はアルカンチオール、２２はポリマー主鎖である。尚、本発明において、基体にポリマーの一端が結合するとは、基体表面に直接ポリマーの一端が結合する場合は勿論、基体上に別の分子や膜が形成され、その上にポリマーの一端が結合する場合も含む。
【００１７】
本発明には以下の各態様が含まれる。
【００１８】
本発明の構造体は、標的物質を捕捉する捕捉分子を結合させるための結合用官能基を基体上に備えた構造体であって、前記基体にはポリマーの一端が結合し、該ポリマーの他端には前記結合用官能基が結合したものと、生体分子の前記構造体への吸着を抑制する抑制用官能基が結合したものと、が存在すると共に、前記ポリマーの側鎖にも前記抑制用官能基が結合していることを特徴とする。抑制用官能基としては、ヒドロキシル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシイソプロピル基、２−ヒドロキシブチル基、スルホニル基、ホスホニル基、アミノ基、メチルアミノ基、エチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、アミド基、メチルアミド基、エチルアミド基、イソプロピルアミド基、ピロリドン基、エチレングリコール基およびその重合体、コリン基、ホスファチジルコリン基のいずれかを用いることができる。結合用官能基としては、カルボキシル基、アルデヒド基、スクシイミド基、マレイミド基、グリシジル基、アミノ基のいずれかを用いることができる。
【００１９】
本発明の構造体は、ポリマーの他端と結合用官能基との間、及びポリマーの他端と抑制用官能基との間、に硫黄原子を含有させることができる。ポリマーとしては、ビニル系の高分子化合物を用いることができる。そして、ビニル系の高分子化合物は、側鎖に、ヒドロキシル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシイソプロピル基、２−ヒドロキシブチル基、スルホニル基、ホスホニル基、アミノ基、メチルアミノ基、エチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、アミド基、メチルアミド基、エチルアミド基、イソプロピルアミド基、ピロリドン基、エチレングリコール基およびその重合体、コリン基、ホスファチジルコリン基のいずれかを有するモノマーの重合体とすることができる。
【００２０】
本発明において基体上のポリマーの密度は、０．１分子／nm2以上１．０分子／nm2以下の範囲とすることができる。また、ポリマーの平均分子量は、５００以上１０００００以下の範囲とすることができる。
【００２１】
また、本発明は結合用官能基に捕捉分子が結合した構造体も包含する。
【００２２】
本発明の構造体の製造方法は、標的物質を捕捉する捕捉分子を結合させるための結合用官能基を基体上に備えた構造体の製造方法であって、基体表面の所定の位置を基点とし、生体分子の前記構造体への吸着を抑制する抑制用官能基を側鎖に有する不飽和モノマーを重合させる工程と、前記重合の末端として、前記結合用官能基と、前記抑制用官能基と、を付加する工程と、を有することを特徴とする。
【００２３】
本発明においては、重合の末端として、結合用官能基と、抑制用官能基とを付加するに際し、硫黄原子を含有する連鎖移動剤を用いることができる。
【００２４】
まず、本発明の標的物質を捕捉する捕捉分子を結合させるための結合用官能基を基体上に備えた構造体の構成について説明する。なお、本発明において、非特異的吸着とは基体表面及びポリマーを含めた本発明の構造体に標的物質を捕捉する捕捉分子と相互作用する生体分子が吸着することをいう。
【００２５】
（基体）
本発明における基体とは、基体表面にポリマーをブラシ状に高密度に形成することが可能なものである。尚、基体の表面に何らかに分子や膜が形成され、その上にポリマーを形成し得るものであっても良い。本発明における基体の材質は、本発明の構造体を形成しうるものであれば、いかなる材質でもよい。好ましくは、アミノ基もしくはチオール基が結合可能である金、銀、銅、白金、アルミニウム等の金属、ＣｄＳ、ＺｎＳ等の半導体、酸化チタン、酸化アルミニウム等の金属酸化物、もしくは、シラノール基が結合可能なガラス、シリコン、酸化チタン、セラミック、もしくは、カルボキシル基が結合可能なセラミック、カーボン等が挙げられる。また、酸素プラズマ処理、ＵＶ処理等により表面を酸化することによりカルボキシル基を提示することが可能なプラスチックでもよい。上記の理由は基体表面へのポリマーの形成方法が深く関与する。ポリマーの形成方法については後に説明する。また、本発明における基体の形状は、平板もしくは粒子、微小構造体などいかなる形状でもよい。
【００２６】
（ポリマー）
本発明の構造体においては、ポリマー分子は、一端が基体表面に固定されている。そして、ポリマーの他端には、捕捉分子を結合させるための結合用官能基が結合したものと、生体分子の非特異吸着を抑制する抑制用官能基が結合したものとが共存する。そしてポリマーの各分子の側鎖には生体分子の非特異吸着を抑制する抑制用官能基を有する。これらのポリマーが基体に固定されていることで、これらのポリマーからなる非特異吸着防止層が形成される。本発明に採用し得るポリマーとしては、ビニル系の高分子化合物を挙げることができる。そして、ビニル系高分子化合物は、側鎖に、ヒドロキシル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシイソプロピル基、２−ヒドロキシブチル基、スルホニル基、ホスホニル基、アミノ基、メチルアミノ基、エチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、アミド基、メチルアミド基、エチルアミド基、イソプロピルアミド基、ピロリドン基、エチレングリコール基およびその重合体、コリン基、ホスファチジルコリン基のいずれかを有するモノマーの重合体を採用することができる。
【００２７】
基体上におけるポリマーの密度は０．１分子／ｎｍ2以上１．０分子／ｎｍ2以下の範囲ある。そのためのポリマー分子一末端の基体への固定には、既に合成されたポリマーを基体表面に接触させて固定させる方法を用いても良いが、好ましくは基体上でポリマーを重合する方法を用いるのが好ましい。この基体上での重合方法としては、リビングラジカル重合が特に好ましい。リビングラジカル重合については後に説明する。なお、かかる重合法によって形成されるポリマー密度は、側鎖によっても異なるが、一般的に小分子のモノマーからなるポリマーの場合、０．５分子／ｎｍ2程度であるが、さらに高密度であってもよい。また、好ましいポリマーの平均分子量は５００以上１０００００以下であり、さらに好ましくは１０００以上１００００以下である。得られる高分子膜の膜厚は５ｎｍ以上であり、さらに好ましくは１０ｎｍ以上１００ｎｍ以下である。
【００２８】
本発明のポリマーは、基体表面の所定の位置を基点とし、生体分子の前記構造体への吸着を抑制する抑制用官能基を側鎖に有する不飽和モノマーを重合させる工程と、重合の末端として、結合用官能基と、抑制用官能基と、を付加する工程と、を経て形成される。
【００２９】
本発明の構造体のポリマーは、基体上に重合により形成することにより、平板上に数ｎｍ程度の凹凸がある場合であっても凹凸に応じて隙間を埋めるようにポリマー層を形成することが可能である。また、基体の形状が粒子や微小構造体の場合、従来の方法では基体表面の微小な空間に対してポリマー層を薄く形成した上に機能性分子を固定することが困難である。しかし、本発明では基体の微小な変化を有する表面形状に沿って高密度のポリマー層を形成することが可能である。
【００３０】
本発明のポリマーは、ポリマー分子の接液側末端（検体側末端）に捕捉分子を結合させるための結合用官能基を有するポリマーと、同じく接液側末端に非特異吸着抑制能を有する官能基が結合されているポリマーとからなる。すなわち、結合用官能基が接液側末端に導入されるポリマー分子と、非特異吸着抑制能を有する官能基が接液側末端に導入されるポリマー分子の両方が得られるように、ポリマーが形成される。また、２種類以上の結合用官能基を固定するため、あるいは２種類以上の非特異吸着抑制能を有する官能基を導入するために、基体上に、２種類、あるいは３種類以上のポリマーが存在しても良い。２種類以上の捕捉分子を固定するときは、それぞれ別々の捕捉分子を固定するための官能基を導入しても良く、同じ官能基を用いて、異なる捕捉分子を固定しても良い。さらに、これら２種類以上のポリマーは各々が複数のモノマーからなるポリマーであっても良い。なお、捕捉分子の固定方法および非特異吸着抑制能を有する官能基の導入方法については後に説明する。
【００３１】
（リビングラジカル重合）
一般的にリビングラジカル重合によれば、合成されるポリマーの分子量分布が小さく、かつ基体上に高密度にポリマー層をグラフト化することができる。よって、非特異吸着抑制能を有する官能基を側鎖に有する不飽和モノマーをリビングラジカル重合すれば、基体上に高密度な非特異吸着抑制層を設けることが可能となる。しかも、基体表面を基点として重合主鎖を成長させて所定の長さ（分子量）を得た後に機能性分子をその接液側末端に導入することで、その活性基をポリマーの立体障害を受けることなく固定することが可能である。リビングラジカル重合法としては、以下の重合のいずれかを利用した方法などを挙げることができる。
（１）有機ハロゲン化物などを開始剤とし、遷移金属錯体を触媒とする原子移動ラジカル重合（Ａｔｏｍ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ＡＴＲＰ）。
（２）ニトロキシド化合物などのラジカル捕捉剤を用いるニトロキシド媒介重合（Ｎｉｔｒｏｘｉｄｅ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ＮＭＰ）。
（３）ジチオカルバメイトなどのラジカル捕捉剤を用いる光イニシエーター重合。
本発明においてはいずれの方法により機能性構造体を製造してもよいが、制御の容易さなどから原子移動ラジカル重合を利用するのが好ましい。
【００３２】
（原子移動ラジカル重合）
リビングラジカル重合が原子移動ラジカル重合の場合、化学式１〜３に示すような有機ハロゲン化物、又は化学式４に示すようなハロゲン化スルホニル化合物を重合開始剤として用いることができる。
【００３３】
【化１】
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【００３４】
原子移動ラジカル重合開始剤が導入された基体を反応溶媒に加えた後、非特異吸着防止層となる不飽和モノマー、遷移金属錯体を添加し、反応系を不活性ガスで置換して原子移動ラジカル重合を行う。これによって、グラフト密度を一定に保持しながら重合を進行させることができる。つまり、重合をリビング的に進行させ、全ての非特異吸着防止層を基体上にほぼ均等に成長させることができる。
【００３５】
反応溶媒としては、特に限定されないが、例えば、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル、ピリジン、水、メタノール、エタノール、プロパノ−ル、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、シクロヘキサノール、メチルセロソルブ、エチルセロソルブ、イソプロピルセロソルブ、ブチルセロソルブ、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノン、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、トリオキサン、テトラヒドロフラン等を使用することができる。これらは単独で使用しても良いし、又は２種以上を併用しても良い。
【００３６】
不活性ガスとして、窒素ガスやアルゴンガスを使用することができる。
【００３７】
使用する遷移金属錯体はハロゲン化金属とリガンドからなる。ハロゲン化金属の金属種としては、原子番号２２番のＴｉから３０番のＺｎまでの遷移金属が好ましく、更に、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕが好ましい。その中でも、塩化第一銅、臭化第一銅が好ましい。
【００３８】
リガンドとしては、ハロゲン化金属に配位可能であれば特に限定されないが、例えば、２，２'−ビピリジル、４，４'−ジ−（ｎ−ヘプチル）−２，２'−ビピリジル、２−（Ｎ−ペンチルイミノメチル）ピリジン、（−）−スパルテイン、トリス（２−ジメチルアミノエチル）アミン、エチレンジアミン、ジメチルグリオキシム、１，４，８，１１−テトラメチル−１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン、１，１０−フェナントロリン、Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ''，Ｎ''−ペンタメチルジエチレントリアミン、ヘキサメチル（２−アミノエチル）アミン等を使用することができる。
【００３９】
遷移金属錯体の添加量は、非特異吸着防止層となる不飽和モノマーに対して、０．００１から１０重量％、好ましくは０．０５から５重量％である。
【００４０】
重合温度は、４０℃から１００℃の範囲であり、好ましくは、５０℃から８０℃の範囲である。
【００４１】
また、重合を行う際、基体に固定されていないフリーな重合開始剤を反応系に添加することが好ましい。フリーな重合開始剤から生成するフリーポリマーは、基体にグラフト化された非特異吸着防止層の分子量及び分子量分布の指標とすることができる。
【００４２】
フリーな重合開始剤としては、基体に固定している原子移動ラジカル重合開始剤と同種のものを選択することが好ましい。つまり、化学式１（Ｘ＝Ｂｒ）の重合開始剤に対して、フリーな重合開始剤は２−ブロモイソ酪酸エチルであることが好ましい。また、化学式２（Ｘ＝Ｂｒ）の重合開始剤に対して、フリーな重合開始剤は２−ブロモプロピオン酸エチルであることが好ましい。
【００４３】
重合終了後、基体をろ過、デカンテーション、沈殿分別、遠心分離等の適切な方法によって分離精製して、非特異吸着防止層がグラフト化された基体を得ることができる。
【００４４】
（ニトロキシド媒介重合）
リビングラジカル重合がニトロキシド媒介重合である場合、化学式５〜７に示すようなニトロキシド化合物を重合開始剤として用いることができる。
【００４５】
【化２】
0004818056.tif 000003
【００４６】
ニトロキシド媒介重合開始剤が導入された基体を反応溶媒に加えた後、非特異吸着抑制層となる不飽和モノマーを添加し、反応系を不活性ガスで置換してニトロキシド媒介重合を行う。これによって、グラフト密度を一定に保持しながら重合を進行させることができる。つまり、重合をリビング的に進行させ、全ての非特異吸着抑制層を基体上にほぼ均等に成長させることができる。
【００４７】
反応溶媒としては特に限定されないが、前記した同様の溶媒を使用することができる。また、それらを単独で使用しても良いし、又は２種以上を併用しても良い。不活性ガスとして、窒素ガスやアルゴンガスを使用することができる。重合温度は、４０℃から１２０℃の範囲であり、好ましくは、５０℃から１００℃の範囲である。重合温度が４０℃未満では、形成される非特異吸着抑制層が低分子量であったり、あるいは重合が進行し難いので好ましくない。また、重合を行う際、基体に固定されていないフリーな重合開始剤を添加することが好ましい。フリーな重合開始剤から生成するフリーポリマーは、基体にグラフト化された非特異吸着抑制層の分子量及び分子量分布の指標とすることができる。フリーな重合開始剤としては、基体に固定しているニトロキシド媒介重合開始剤と同種のものを選択することが好ましい。つまり、化学式５の重合開始剤に対して、フリーな重合開始剤は化学式８に示されるニトロキシド化合物であることが好ましい。
【００４８】
【化３】
0004818056.tif 000004
【００４９】
重合終了後、基体をろ過、デカンテーション、沈殿分別、遠心分離等の適切な方法によって分離精製して、非特異吸着防止層がグラフト化された基体を得ることができる。
【００５０】
（光イニシエーター重合）
リビングラジカル重合が光イニシエーター重合である場合、化学式９に示すようなＮ，Ｎ−ジチオカルバミン系化合物を重合開始剤として用いることができる。
【００５１】
【化４】
0004818056.tif 000005
【００５２】
光イニシエーター重合開始剤が導入された基体を反応溶媒に加えた後、非特異吸着抑制層となる不飽和モノマーを添加し、反応系を不活性ガスで置換して光照射することによって光イニシエーター重合を行う。これによって、グラフト密度を一定に保持しながら重合を進行させることができる。つまり、重合をリビング的に進行させ、全ての非特異吸着抑制層を基体上にほぼ均等に成長させることができる。
【００５３】
反応溶媒としては特に限定されないが、前記した同様の溶媒を使用することができる。また、それらを単独で使用しても良いし、又は２種以上を併用しても良い。
【００５４】
不活性ガスとして、窒素ガスやアルゴンガスを使用することができる。
【００５５】
照射する光の波長は、使用する光イニシエーター重合開始剤の種類によって異なる。化学式９に例示する光イニシエーター重合開始剤を有する基体表面に非特異吸着抑制層をグラフト化する場合、反応系に３００ｎｍから６００ｎｍの波長を示す光を照射することによって光イニシエーター重合が良好に進行する。
【００５６】
重合温度は、副反応を抑制するため、室温あるいはそれ以下の温度であることが好ましい。ただし、同様の効果が得られる範囲においてこの温度領域に限定されるわけではない。
【００５７】
また、重合を行う際、基体に固定されていないフリーな重合開始剤を添加することが好ましい。フリーな重合開始剤から生成するフリーポリマーは、基体にグラフト化された非特異吸着抑制層の分子量及び分子量分布の指標とすることができる。
【００５８】
フリーな重合開始剤としては、基体に固定している光イニシエーター重合開始剤と同種のものを選択することが好ましい。つまり、化学式９の重合開始剤に対して、フリーな重合開始剤は化学式１０に示されるジチオカルバメイト系化合物であることが好ましい。
【００５９】
【化５】
0004818056.tif 000006
【００６０】
重合終了後、基体をろ過、デカンテーション、沈殿分別、遠心分離等の適切な方法によって分離精製して、非特異吸着抑制層がグラフト化された基体を得ることができる。
【００６１】
基体表面に重合開始剤を固定する方法は特に限定されるものではないが、基体が金属であれば、チオール化合物を含む重合開始剤を基体表面に結合するか、又は、前記基体をチオール化合物で前処理した後、続いて重合開始剤を結合する方法が好ましい。
【００６２】
基体が酸化膜を有する金属であれば、シランカップリング剤を含む重合開始剤を結合するか、又は、前記基体をシランカップリング剤で前処理した後、続いて重合開始剤を結合する方法が好ましい。
【００６３】
基体がプラスチックであれば、酸素プラズマ処理、ＵＶ処理等により表面を酸化してカルボキシル基を発現させた後、アミノ化合物を含む重合開始剤を結合するか、又はアミノ化合物で前処理した後、続いて重合開始剤を結合する方法が好ましい。
【００６４】
（連鎖移動剤）
本発明の構造体の有するポリマー層を構成する各ポリマー分子は、その一端が基体に固定されており、基体に固定された側と反対側の接液側の主鎖端部には、捕捉分子を結合させるための結合用官能基または非特異的吸着を抑制する官能基が導入されている。そして接液側末端への捕捉分子の導入は、結合用官能基を主鎖末端に配置し、この官能基に捕捉分子を結合する方法により行う。一方、非特異的吸着を抑制する官能基の接液側末端への導入は、ポリマー主鎖の接液側末端に非特異的吸着を抑制する官能基を配置して進行を停止する方法により行うことができる。これらの導入には、種類の異なる連鎖移動剤を用いたラジカル重合が好適である。
【００６５】
連鎖移動剤とは、一般にラジカル重合反応において、連鎖移動反応により、反応の活性点を移動させる物質であり、重合の末端を所望の官能基に変換したいときに用いられる。本発明における好ましい態様においては、捕捉分子を固定するための官能基、および生体分子の非特異吸着を抑制するための官能基を導入するために、２種類以上の連鎖移動剤がリビングラジカル重合の過程で使用される。連鎖移動剤はチオール化合物であることが好ましい。このことは、本発明の構造体において、ポリマーがラジカル重合によって形成されていることを明確にする。連鎖移動剤として有効なチオール化合物は、炭素鎖が２以上のアルキル鎖の一端にチオール基を有し、他端に所望の官能基を有するものを用いる。機能性分子を固定するための官能基としては、例えば、カルボキシル基、アルデヒド基、スクシイミド基、マレイミド基、グリシジル基、アミノ基を挙げることができる。
【００６６】
一方、非特異吸着を抑制するための官能基としては、例えば、ヒドロキシル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシイソプロピル基、２−ヒドロキシブチル基、スルホニル基、ホスホニル基、アミノ基、メチルアミノ基、エチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、アミド基、メチルアミド基、エチルアミド基、イソプロピルアミド基、ピロリドン基、エチレングリコール基およびその重合体、コリン基、ホスファチジルコリン基を挙げることができる。また、糖などの親水性分子を後に結合させるためのものであってもよい。当然ながら、機能性分子を固定するための官能基と非特異吸着を防止するための官能基の組合せは、異なるものでなければならない。
【００６７】
ここで全てのポリマー分子の接液側末端に対して１種類の連鎖移動剤を用いて捕捉分子を固定するための官能基のみを導入すると、同一捕捉分子内の複数箇所が複数のポリマー末端に対して結合し固定される場合が生じる。そして、捕捉の構造が破壊され活性が低下する場合がある。また、全てのポリマー分子の接液側末端に非特異吸着を抑制するための官能基のみを導入すると、標的物質としての生体物質のセンシング等の機能を構造体に付与することができない。
【００６８】
本発明によれば、後述する捕捉分子が占める面積に対して、捕捉分子を固定する官能基をより少なく導入することが可能となる。より好ましくは、捕捉分子が占める面積に対して前記官能基が一個である。その周辺の末端官能基は非特異吸着を抑制する官能基とする。そのことにより、捕捉分子が一分子につきより少ない個所で結合、好ましくは一点で結合することによって、固定された捕捉分子が本来の活性を発揮することができる。上記のように活性を発揮するために必要な、捕捉分子を固定する官能基の割合は、添加する連鎖移動剤の割合によって決定される。つまり、ポリマー１分子の占有面積（ポリマー密度の逆数、αｎｍ2／分子）と、捕捉分子１分子の占有面積（βｎｍ2／分子）、を把握することが好ましい。そして、ポリマーの接液側末端に占める捕捉分子を固定するための官能基の割合（Ｂ％）を、(式)Ｂ＝α／β×１００（％）となるように添加することが好ましい。すなわち、反応終了時において添加される２種以上の連鎖移動剤のうち、捕捉分子を固定する官能基の割合は、前記式によって決定される。具体的には、捕捉分子を固定する官能基を持つ連鎖移動剤の割合は、添加時における全ての連鎖移動剤のうちの０．１％〜５０％が好ましい。例えば、モル基準で、捕捉分子が分子量約１５０ｋＤの抗体であれば、前記割合は０．１％〜１０％であることがより好ましく、０．３％〜３％であることがさらに好ましい。また、捕捉分子が分子量約２５ｋＤの抗体フラグメントであれば、前記割合は０．５％〜５０％であることがより好ましく、２％〜２０％であることがさらに好ましい。さらに、捕捉分子が分子量約４００程度の小分子（例えばビオチン）であれば、前記割合は１％〜５０％であることがより好ましく、１０％〜５０％であることがさらに好ましい。前記割合が上記各範囲より低い場合は、前記官能基が反応しない、もしくは、捕捉分子が固定されない恐れがある。また、前記割合が上記各範囲より大きい場合は、非特異吸着抑制効果が低くなることが懸念される。
【００６９】
本発明の構造体では、基体上に設けられたポリマー層の接液面（基体表面と反対側の表面）の結合用分子が固定されていない分子末端に、非特異的吸着を抑制する官能基を結合させている。これにより捕捉分子固定後の非特異的吸着を防止するためのブロッキングが不必要となる。
【００７０】
（捕捉分子）
本発明における捕捉分子とは、標的物質と相互作用し、標的物質を選択的（特異的）に捕捉する性質のある分子である。このような分子として具体的には核酸、タンパク質、糖鎖、脂質及びそれらの複合体などが挙げられる。更に具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、遺伝子、染色体、細胞膜、ウイルス、抗原、抗体、抗体フラグメント、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプター、酵素、ペプチド、スフィンゴ糖、スフィンゴ脂質などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましくは生体物質を捕捉、あるいはその構造や特性を変換することができる抗体、抗体フラグメント、あるいは酵素である。
【００７１】
近年のバイオインフォマティクスの発展により、タンパク質のような生体分子の構造と大きさは、そのアミノ酸配列等から想定することができる。そして、グラフト重合されるポリマーの密度を求めておけば、ブラシ状のポリマー分子上に固定されるタンパク質一分子に対して、何分子のポリマーが存在するかが容易にシュミレーションできる。その計算結果に基づいて混合した２種以上の連鎖移動剤をポリマー末端に反応させ、活性基にタンパク質を固定させる。固定したタンパク質はおよそ一点でのみ固定されており、その周辺、つまりタンパク質の下部に位置するポリマーの非結合基は、全て非特異吸着抑制能が高い官能基を使用している。
【００７２】
（捕捉分子の固定）
本発明において捕捉分子を固定する方法は特に限定されるものではないが、好ましくは共有結合をとり得る方法である。
【００７３】
（生体分子の非特異吸着抑制能を有する官能基）
本発明における生体分子の非特異吸着抑制能を有する官能基とは、ポリマーの接液側末端および側鎖の官能基であり、基体表面及び構造体への生体分子の非特異的な吸着を防止または抑制するものであればいかなるものでもよい。具体的には、ヒドロキシル基、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、２−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシプロピル基、２−ヒドロキシイソプロピル基、２−ヒドロキシブチル基、スルホニル基、ホスホニル基、アミノ基、メチルアミノ基、エチルアミノ基、イソプロピルアミノ基、アミド基、メチルアミド基、エチルアミド基、イソプロピルアミド基、ピロリドン基、エチレングリコール基およびその重合体、コリン基、ホスファチジルコリン基を含むものが好ましい。
【００７４】
基体をタンパク質水溶液に接触させたときにタンパク質の非特異吸着が起こる原因の１つとしては以下の事項が考えられる。基体とタンパク質水溶液の接触時にその場に存在する基体中の異分子が水分子間の水素結合を破壊することで、タンパク質が構造を保持できず、分子内部の疎水部を露出した部分が異分子に吸着する。一方、ＰＥＧやＭＰＣはタンパク質の非特異吸着防止能が高い官能基として知られている。これらがタンパク質水溶液に接触したときは水分子間の水素結合を比較的安定に保持し、同時にタンパク質を安定化させる効果があることも知られている。上記内容については、高分子−水界面−水の構造解析からのアプローチ−、高分子、５２巻、１月号（２００３年）に詳細に記載されている。このような観点から、水分子間の水素結合を保持する官能基は、本発明における生体分子の非特異吸着抑制能を有する官能基として使用することができる。
【００７５】
以下に、本発明に関わる検出装置について説明する。
【００７６】
本発明の検出装置は、光源と、光を検出する検知装置と、検体と検体中の標的物質を捕捉するための捕捉分子とを接触させるための反応領域と、を備え、光学的手法により検体中の標的物質を検出する検出装置であって、前記反応領域内に結合用官能基に標的物質を捕捉する捕捉分子を結合させた本発明の構造体を配したことを特徴とするものである。
【００７７】
本発明の検出装置は、基体表面に非特異吸着抑制能を伴うポリマー層を有し、さらにその表面に捕捉分子を配した構造体を、反応領域に配置された装置である。
【００７８】
以下に、本発明に関わる検出方法および標的物質について説明する。
【００７９】
（検出方法）
本発明において捕捉分子に反応する検体中の標的物質における、物理的及び／或いは化学的な量変化を検出する手段としては、光学的にこれらを検出するが好ましい。例えば、蛍光法、電気化学ルミネッセンス法及びプラズモン共鳴法が挙げられる。蛍光法、電気化学ルミネッセンス法を利用する場合は、光量値をもとに標的物質濃度を求めることができるため、定量機能を有する検出機構を簡易なものとすることが可能となる。また、プラズモン共鳴法を用いる場合、反応中の物理的変化を検出することができるため、反応過程の進行状況をも標的物質濃度をもとめるパラメータとすることが可能となる。また、このような物理的変化を測定する場合は、標識が不要であるため、反応領域での反応工程が低減し、検出までに要する時間をより短時間とすることが可能となる。前記プラズモン共鳴法を用いた検出手段としては、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）や、局在プラズモン共鳴法（ＬＰＲ）がある。
【００８０】
（標的物質）
本発明の標的物質は、捕捉分子と反応する物質であればいかなるものでもよい。より好ましくは生体物質である。生体物質としては、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質及びそれらの複合体から選択される生体物質が含まれ、更に詳しくは、核酸、タンパク質、糖鎖、脂質から選択される生体分子を含んでなるものである。更に具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、遺伝子、染色体、細胞膜、ウイルス、抗原、抗体、レクチン、ハプテン、ホルモン、レセプタ、酵素、ペプチド、スフィンゴ糖、スフィンゴ脂質の何れかから選択された物質を含むものであれば、本発明を適用することができる。更には、前記の「生体物質」を産生する細菌や細胞そのものも、本発明が対象とする「生体物質」として標的物質となり得る。
【００８１】
これら標的物質と捕捉分子との相互作用は、本発明の素子により結合前後の物理的／化学的変化量が検出可能であればいかなる相互作用でもよい。好ましくは、「抗原−抗体反応」、「抗原−アプタマー（特定構造を有するＲＮＡ断片）」「リガンド−レセプター相互作用」、「ＤＮＡハイブリダイゼーション」「ＤＮＡ−タンパク質（転写因子等）相互作用」、「レクチン−糖鎖相互作用」等が挙げられる。
【００８２】
本発明の構造体を検体中の標的物質の検出または定量に使用する際の検体には、分析対象としての各種試料や各種試料を必要に応じて前処理して得られた処理物が含まれる。この前処理としては、例えば、生体組織片や血液を検体とする場合において、これらに標的物質が含まれている場合に標的物質を含み、機能性構造体と反応させることが可能な溶液を得るための処理が挙げられる。
【実施例】
【００８３】
実施例１（抗原抗体反応のＳＰＲ検出）
ＳＦ１０製透明ガラス基板（厚さ０．３ｍｍ、１２ｍｍ×１０ｍｍ）上にクロム３ｎｍを蒸着した後、金を４５ｎｍ蒸着する。蒸着の厚みは水晶発振子にてモニターする。金が表面に蒸着された基板をピラニア溶液（硫酸：硝酸＝７：３）中に浸漬し、基板表面の不純物を除去する。
【００８４】
反応用シュレンク管に前記基板を固定し、８−メルカプト−１−オクタノールを加え、緩やかに攪拌し、ＳＡＭを形成する。溶液を取り除いた後、ジクロロメタンで洗浄し、重合開始剤としてエチル２−イソ酪酸ブロミドを加え、基板表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定する。また、フリーの重合開始剤として２−ブロモイソ酪酸エチルを加え、ＣｕＢｒ、２，２'−ビピリジル、メタノールを加える。凍結真空脱気によりシュレンク管内の酸素を除去した後、窒素で反応系内を置換し、ＨＥＭＡ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）モノマーを原子移動ラジカル重合により所定時間反応させる。反応系内にメルカプト酢酸：メルカプトエタノール＝１：１００（モル比）の割合で大量に加えることにより、基板上のグラフトポリマー末端にカルボキシル基とヒドロキシル基が混在した状態とする。以上の操作によって作製された基板の膜厚を分光エリプソメトリー法により測定し、精密重量計で測定が可能な基板の重量とから計算することにより、基板表面のポリマー密度は０.５本／ｎｍ2であることがわかる。さらに、Ｘ線光電子分光法を用いてＳ原子を検出することで連鎖移動剤が導入されていることを確認する。そして、飛行時間型二次イオン質量分析計を用いて、ポリマー末端に結合したメルカプト酢酸とメルカプトエタノールに由来するイオンを検出することで２種類以上のポリマー末端が形成されていることが確認される。ＰＨＥＭＡ層表面を持つ基板を用いて、ＳＰＲ測定を行う。
【００８５】
前記基板表面に水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）、Ｎ-ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）を反応させ、ＰＨＥＭＡ層の末端のカルボキシル基を活性エステル基に変換する。抗ウシ血清アルブミン抗体（以下、Ａｎｔｉ−ＢＳＡ）を溶解したリン酸緩衝溶液を反応させて抗体を固定する。抗体が必要とする面積は、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ２２１（２）：３６１−５（１９９１）によれば、１７．５×１１．５ｎｍである。これを、抗体の固定によって得られるＳＰＲシグナルを重量に換算すると１２ｎｇ／ｍｍ2相当、すなわち１分子／２００ｎｍ2相当である。
【００８６】
続いて、ウシ血清アルブミン（分子量６６０００、以下ＢＳＡ）を溶解したリン酸緩衝溶液を反応させることにより抗原抗体反応を行い、得られるＳＰＲシグナルを重量に換算すると５ｎｇ／ｍｍ2相当、すなわちＢＳＡ１分子／２００ｎｍ2である。またＢＳＡの代わりに、ニワトリ卵白リゾチーム（分子量１５０００、以下ＨＥＬ）溶液を接触させると、ＳＰＲのシグナルがほとんど皆無であるため、非常に高いＳ／Ｎ比で抗原抗体反応を検出することができている。
【００８７】
比較例１（抗原抗体反応のＳＰＲ検出）
実施例１と同様に基板表面の不純物を除去した後、反応用シュレンク管に前記基板を固定し、７−カルボキシ−１−ヘプタンチオールと８−ヒドロキシ−１−オクタンチオールを１：１００の割合で混合して加える。さらにジクロロメタンを加え、緩やかに攪拌し、ＳＡＭを形成する。溶液を取り除いた後、ジクロロメタンで洗浄し、前記基板表面に水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）、Ｎ-ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）を反応させ、ＳＡＭ表面のカルボキシル基を活性エステル基に変換する。Ａｎｔｉ−ＢＳＡを溶解したリン酸緩衝溶液を反応させて抗体を固定する。続いて、ＢＳＡ溶液を反応させることにより抗原抗体反応を行い、得られるＳＰＲシグナルを重量に換算すると２ｎｇ／ｍｍ2相当、すなわちＢＳＡ１分子／５００ｎｍ2である。またＢＳＡの代わりに、ＨＥＬ溶液を接触させると、ＳＰＲのシグナルがほとんど皆無である。
【００８８】
比較例２（抗原抗体反応のＳＰＲ検出）
実施例１と同様に基板表面の不純物を除去した後、反応用シュレンク管に前記基板を固定し、８−アミノ−１−オクタンチオール塩酸塩、ジクロロメタンを加え、緩やかに攪拌し、ＳＡＭを形成する。溶液を取り除いた後、ジクロロメタンで洗浄し、分子量３，４００の末端にスクシンイミド（ＮＨＳ）基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型ポリエチレングリコール（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ，日本油脂社製）溶液を反応させる。ＳＡＭ表面のアミノ基とＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬのＮＨＳ基が反応し、ＭＡＬ基は未反応のまま残るため、ＰＥＧを介してマレイミド基を表面に導入することができる。Ａｎｔｉ−ＢＳＡを溶解したリン酸緩衝溶液を反応させて抗体を固定する。続いて、ＢＳＡ溶液を反応させることにより抗原抗体反応を行い、得られるＳＰＲシグナルを重量に換算すると５ｎｇ／ｍｍ2相当、すなわちＢＳＡ１分子／２００ｎｍ2である。またＢＳＡの代わりに、ＨＥＬ溶液を接触させると、ＳＰＲのシグナルが上昇する。その上昇分を重量に換算すると０．１ｎｇ／ｍｍ2相当、すなわちＨＥＬ１分子／２０００ｎｍ2であり、抗原以外の蛋白が非特異吸着していることが確認される。
【００８９】
比較例３（ＳＰＲにおける非特異吸着防止効果の確認）
実施例１と同様に基板表面の不純物を除去した後、反応用シュレンク管に前記基板を固定し、８−メルカプト−１−オクタノール、ジクロロメタンを加え、緩やかに攪拌し、ＳＡＭを形成する。溶液を取り除いた後、ジクロロメタンで洗浄し、重合開始剤としてエチル２−イソ酪酸ブロミドを加え、基板表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定する。また、フリーの重合開始剤として２−ブロモイソ酪酸エチルを加え、ＣｕＢｒ、２，２'−ビピリジル、メタノールを加える。凍結真空脱気によりシュレンク管内の酸素を除去した後、窒素で反応系内を置換し、ＨＥＭＡ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）モノマーを原子移動ラジカル重合により所定時間反応させる。ＨＥＭＡモノマーをＡＴＲＰにより３時間反応させ、メルカプトエタノールを大量に加えることにより、基板上のグラフトポリマー末端にヒドロキシル基を提示する。実施例１と同様に合成物を確認後、Ａｎｔｉ−ＢＳＡをくわえることにより得られるＳＰＲシグナルは装置の検出下限以下である。さらに、ＢＳＡ抗原を流すことにより得られるＳＰＲシグナルも同様に装置の検出下限以下である。
【００９０】
比較例４（抗原抗体反応のＳＰＲ検出）
実施例１と同様の操作によりＡｎｔｉ−ＢＳＡ抗体の固定までを行う。これに加えて、エタノールアミンを加えることにより、ポリマー表面に未反応のスクシンイミド基が存在する場合にこれを不活性化するためのブロッキングを行う。その後、ＢＳＡ抗原を加えることにより抗原抗体反応を行い、得られるＳＰＲシグナルを重量に換算すると５ｎｇ／ｍｍ2相当である。以上の結果、実施例１と同様の結果が得られたことから、本比較例における非特異的吸着をブロックするためのエタノールアミン添加操作が不必要であることがわかる。
【００９１】
比較例５（抗原抗体反応のＳＰＲ検出、側鎖のないポリマー使用）
実施例１と同様に基板表面の不純物を除去した後、反応用シュレンク管に前記基板を固定し、８−メルカプト−１−オクタノール、ジクロロメタンを加え、緩やかに攪拌してＳＡＭを形成する。溶液を取り除いた後、ジクロロメタンで洗浄し、重合開始剤としてエチル２−イソ酪酸ブロミドを加え、基板表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定する。また、フリーの重合開始剤として２−ブロモイソ酪酸エチルを加え、ＣｕＢｒ、２，２’−ビピリジル、メタノールを加える。凍結真空脱気によりシュレンク管内の酸素を除去した後、窒素で反応系内を置換し、エチレンモノマーを原子移動ラジカル重合により所定時間反応させる。反応系内にメルカプト酢酸：メルカプトエタノール＝１：１００（モル比）の割合で大量に加えることにより、基板上のグラフトポリマー末端にカルボキシル基とヒドロキシル基が混在した状態とする。
【００９２】
前記基板表面に水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）、Ｎ-ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）を反応させ、ＰＨＥＭＡ層の末端のカルボキシル基を活性エステル基に変換する。Ａｎｔｉ−ＢＳＡを溶解したリン酸緩衝溶液を反応させて抗体を固定する。抗体の固定によって得られるＳＰＲシグナルを重量に換算すると、およそ１．２ｎｇ／ｍｍ2相当、すなわち、およそ５×１０3分子／μｍ2相当である。続いて、ＢＳＡ溶液を実施例１と同条件で反応させると、ＳＰＲのシグナルが上昇する。得られるＳＰＲシグナルを重量に換算すると、およそ０．５ｎｇ／ｍｍ2相当、すなわち、およそＢＳＡ５×１０3分子／μｍ2である。このことから、抗原抗体反応を検出していることが確認される。また、ＢＳＡの代わりに、ＨＥＬ溶液を接触させると、ＳＰＲのシグナルが上昇する。その上昇分を重量に換算すると、およそ０．０１ｎｇ／ｍｍ2相当、すなわち、およそＨＥＬ４×１０2分子／μｍ2である。このことから、抗原以外の蛋白が非特異吸着していることが確認される。
【００９３】
実施例２（ＬＰＲ検出用微粒子の作製）
遠沈管に平均粒径４０ｎｍの金微粒子溶液、メルカプトエタノール、水を加え、緩やかに攪拌し、微粒子表面にメルカプトエタノールを吸着させる。ジクロロメタンで３回遠心分離することで反応溶液を除去する。反応用シュレンク管に、表面にＳＡＭを形成した金微粒子を加えた後、重合開始剤としてエチル２−イソ酪酸ブロミドを加え、基板表面に原子移動ラジカル重合開始剤を固定する。また、フリーの重合開始剤として２−ブロモイソ酪酸エチルを加え、ＣｕＢｒ、２，２'−ビピリジル、メタノールを加える。凍結真空脱気によりシュレンク管内の酸素を除去した後、窒素で反応系内を置換し、ＭＰＣモノマーを原子移動ラジカル重合により所定時間反応させる。金微粒子をコアとしてＰＭＰＣ層をコアシェル状に形成する。連鎖移動剤としてメルカプト酢酸：メルカプトエタノール＝１：２０の割合で大量に加えることにより、基板上のグラフトポリマー末端にカルボキシル基とヒドロキシル基が混在した状態とする。溶液を除去し、メタノールで洗浄後、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣ）、Ｎ-ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）、水を加え、ＰＭＰＣ末端のカルボキシル基を活性エステル基に変換された微粒子の懸濁液とする。
【００９４】
実施例３（抗原抗体反応のＬＰＲ検出）
図４にＬＰＲ検出用装置を示す。実施例２で得られたＬＰＲ検出用微粒子（３０）の懸濁液中に表面がアミノ化されたスライドガラス３２を加え、スライドガラス３２の表面に微粒子３０を固定する。洗浄後、さらに抗ＢＳＡ−Ｆａｂフラグメント３４（プロテインデータベースのＸ線回折データより６×６ｎｍと推定）を溶解したリン酸緩衝溶液に反応させる。微粒子表面に残った活性エステル基はエタノールアミンを反応させることで不活性化する。以上の操作により、抗ＢＳＡ−Ｆａｂフラグメント３４が固定化されたＬＰＲ検出用スライドガラスが作製される。ＢＳＡ溶液を反応させることにより抗原抗体反応が行われ、ＬＰＲ検出用装置３８を用いて、反応したＢＳＡ抗原３６を定量することができる。
【００９５】
ＬＰＲ検出用装置３８は、光源４０、分光光度計４２、スライドガラス３２、およびスライドガラス上に固定されたものによって構成される。ＢＳＡ抗原は、光源４０から発せられる光がスライドガラス３２に照射され、スライドガラス３２およびスライドガラス上に固定されたものによって吸収された光を分光光度計４２で測定することにより、検出することができる。また、ＢＳＡ以外の蛋白を接触させてもＬＰＲのシグナルがほとんど皆無であるため、非常に高いＳ／Ｎ比で抗原抗体反応を検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】先行技術に関わる標的物質を捕捉する捕捉分子固定の一例についての模式図である。
【図２】先行技術に関わる標的物質を捕捉する捕捉分子固定の一例についての概略図である。
【図３】本発明に関わる結合用官能基を基体上に備えた構造体の模式図である。
【図４】本発明に関わる局在プラズモン共鳴（ＬＰＲ）検出装置の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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