(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質がタンパク質の結合ドメインに対する阻害剤またはリガンドであるかどうかを決定する方法であって、
ａ）少なくとも１つの触媒ドメインと少なくとも１つの結合ドメインとを含むタンパク質を用いること、
ｂ）前記触媒ドメインに結合し、変換される少なくとも１つのマーカー基質を用いること、
ｃ）前記触媒ドメインと前記結合ドメインとに結合可能な少なくとも１つの基質を用いること、
ｄ）前記タンパク質、前記マーカー基質および前記基質を、前記物質と共にインキュベートすること、および、
ｅ）前記マーカー基質が前記タンパク質によって変換されたかどうかを決定すること、
ｆ）前記物質の非存在下で、工程ａ）〜ｄ）の方法を繰り返すこと、および、
ｇ）前記物質の存在下、および、非存在下におけるインキュベーションの測定値を比較すること、
を含み、ここで前記結合ドメインは触媒ドメインではない、上記方法。
【請求項２】
用いられるタンパク質はコラーゲナーゼであり、用いられる基質はコラーゲンであり、用いられるマーカー基質は（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−（３−［２,４−ジニトロフェニル］−Ｌ−２,３−ジアミノ−プロピオニル）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ2である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規で有利な方法で作用し、かつタンパク質阻害剤である、医療的に価値のある物質の検出方法に関する。
【０００２】
酵素とは、高分子量のタンパク質であり、全ての細胞に存在する。酵素は、生物の膨大な生化学的代謝経路を可能にする生体触媒である。酵素は、いずれの場合もかなり特定の反応に対して特異的である。酵素は、基質と相互作用し、酵素／基質複合体である中間体を形成し、最終的に化学変換を行い、形成された生成物は媒体へ放出される。
【０００３】
簡単な酵素では、基質を取り込むための結合部位はたった一つしかない。より複雑なシステムでは、結合部位Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ等を有する共有結合的または非共有結合的に結合した複数の酵素ドメインで構成され、上記結合部位はいずれの場合においても大概は１つの酵素ドメインに属する。前記結合部位は、順番に、基質の１以上の構造的または化学的な官能基Ｚを認識し、ここでＺは同一であってもよいし（Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３等）、異なっていてもよい（すなわちＹ、Ｘ、Ｗ等）。
【０００４】
それに対応するより複雑な酵素反応は、多数の部分的反応で構成される。従って、ドメインＡは、基質のＺ１グループと相互作用することができる。同様にドメインＢはＺ１またはＺ２と、もしくは１以上のＹ、Ｘ部位等と反応し得る。
【０００５】
タンパク質または酵素の触媒ドメインは、基質を結合させ、化学変換するアミノ酸配列である。タンパク質または酵素の結合ドメインは、可逆的に基質を結合させるアミノ酸配列である。このような酵素システムでは、結合部位に関して、基質の代わりに１以上のリガンドを認識し、結合させることも可能であるが、前記リガンドは、基質のように振舞うこともなく（すなわちリガンドは化学変換されない）、また常に阻害剤のように振舞うこともない。
【０００６】
複雑なタンパク質の阻害剤またはリガンドを検索する場合、通常、触媒ドメインの阻害剤が検出されるが、これは前記阻害剤が基質の化学変換を減少させるためである。マーカー基質の変換が起こらないか、または減少していることによっても、前記阻害剤を指示することができる。結合ドメインに関する阻害剤を見出すことは、実質的により困難である。
【０００７】
従って、本発明の目的は、基質のタンパク質結合ドメインへの結合を減少させるか、または、本質的に妨害するような物質を見出すことである。前記物質は、阻害剤として作用してもよいし、リガンドでもよい。
【０００８】
上記目的は、タンパク質、マーカー基質および基質を、ある物質とともにインキュベートし、前記マーカー基質が前記タンパク質によって変換されたかどうかを決定することによって達成される。
【０００９】
従って、本発明は、物質がタンパク質の阻害剤またはリガンドであるかどうかを決定する方法に関し、当該方法は、
ａ）少なくとも１つの触媒ドメインと少なくとも１つの結合ドメインとを含むタンパク質を用いること、
ｂ）前記触媒ドメインに結合し、変換される少なくとも１つのマーカー基質を用いること、
ｃ）前記触媒ドメインと前記結合ドメインとに結合可能な少なくとも１つの基質を用いること、
ｄ）前記タンパク質、マーカー基質および基質を、物質またはリガンドと共にインキュベートすること、および、
ｅ）前記マーカー基質が前記タンパク質によって変換されたかを決定すること、
を含む。
【００１０】
適切なプローブは、例えば、少なくとも１つの触媒ドメインと少なくとも１つの結合ドメインとを含む酵素である。なお、当該酵素は、１〜８個の触媒ドメインと、１〜８個の結合ドメインとを含んでもよく、好ましくは、どの場合でも１、２、３および４個の触媒ドメインまたは結合ドメインを備えていることである。上記基質は、結合ドメインと触媒ドメインとの両方に結合できる化合物であり、これらは触媒ドメインによって化学変換されるが、結合ドメインによっては化学的に改変されない。上記マーカー基質は、基質とは化学的に異なる化合物であり、触媒ドメインによって化学的に変換され、かつ変換反応のモニタリングが可能なものである。
【００１１】
上記物質は、本質的に、可逆的または非可逆的に上記タンパク質の結合ドメインに結合し、それによって上記基質の上記タンパク質への結合を妨害する。従って上記物質は、上記タンパク質の結合ドメインの阻害剤とみなすこともできる。上記物質は、本質的に、上記タンパク質の触媒ドメインによる上記マーカー基質の化学変換を妨害しない。
【００１２】
適切なタンパク質の例としては、酵素コラーゲナーゼが挙げられ、この酵素は、少なくとも２種の共有結合的に連結した酵素ドメインからなり、そのうち一方はコラーゲンと結合し、他方はタンパク質分解能力を有し、コラーゲン鎖を切断する。このような触媒的なタンパク質分解ドメインは、完全長酵素、すなわち天然に存在する活性な酵素内で共有結合している場合、または、単に組換えによって調製されたタンパク質分解ドメインとして共有結合している場合のいずれにおいても、異なるタイプのマーカー基質を開裂させる能力を有する。
【００１３】
コラーゲナーゼに対する適切なマーカー基質の例としては、蛍光マーカーまたはＵＶマーカーを供給するペプチドが挙げられる。この種の酵素のマーカー基質の例は、（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−（３−［２,４−ジニトロフェニル］−Ｌ−２,３−ジアミノプロピオニル）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ2（Knight, C.G., et al, FEBS Letters （1992） 296, 263-266）；Ｄｎｐ−Ｐｒｏ−β−シクロヘキシル−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｍｅ）−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｎ−Ｍｅ−Ａｂｚ）−ＮＨ2（Bickett D. M., et al., Analytical Biochemistry （1993） 212, 58-64）；Ｍｃａ−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ｇｌｙ−Ｎｖａ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｄｐａ−ＮＨ2（Knaeuper V., et al., JBC （1996） 271/3, 1544-1550）；Ｍｃａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｄｎｐ−ＮＨ2（Nagase H., et al., JBC （1994） 269/33, 20952-20957）；Ｄｎｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−ＮＨ2（Niedzwiecki L, et al., Biochemistry （1992） 31, 12618-12623）（Bickett D. M., et al., Analytical Biochemistry （1993） 212, 58-64; Knight, C.G., et al, FEBS Letters （1992） 296, 263-266; Knaeuper V., et al., JBC （1996） 271/3, 1544-1550; Nagase H., et al., JBC （1994） 269/33, 20952-20957; Niedzwiecki L., et al., Biochemistry （1992） 31, 12618-12623）、または放射標識したペプチドがある。
【００１４】
コラーゲナーゼに対する適切な基質はコラーゲンである。コラーゲンは、プロリンリッチな構造タンパク質（硬性タンパク質）であり、間充組織の細胞間支持物質の主要な構成要素であり、酵素的な攻撃から守る働きがある。左巻きヘリックス構造を有する三本のタンパク質鎖は、右巻きトリプルヘリックス（スーパーヘリックス）にねじられる。１８型コラーゲン（Ｉ型〜XVIII型コラーゲン）が同定されており、これらは構造または機能に従って、筋原線維コラーゲン、筋原線維関連コラーゲン、および非筋原線維関連コラーゲンに分類することができる。
【００１５】
特に適切な基質はII型コラーゲンである。このコラーゲンは、関節の軟骨基質を支えている。変形性関節症やリウマチのようなある種の病気において、関節は破壊され、特に、コラーゲナーゼによるコラーゲンのタンパク質分解による。この種の酵素の阻害剤が知られているが、酵素の触媒ドメインを攻撃するという不利益がある（Weithmann K. U., et al., Inflamm. Res.（1997） 46, 246-252）。前記触媒ドメインは、類似の構造において、多くの酵素の一部を構成しており、結果的に、上記阻害剤は、生命の維持に必要な機能に関する酵素を含む多くの酵素において有害なやり方で作用してしまう（Massova I., et al., The FASEB Journal （1998） 12, 1075- 1095）。本発明の目的は、特定の酵素に対してより高い特異性を有し、医薬として利用可能な、より優れた阻害剤を製造することである。
【００１６】
マーカー基質とII型コラーゲンとを酵素コラーゲナーゼと共にインキュベートし、マーカー基質の変換を測定したところ、驚いたことに、マーカー基質変換が強く阻害されることが見出された。この阻害は、大量のマーカー基質でのみ克服できる。しかしながら、このようなマーカー基質変換の阻害は、コラーゲナーゼの触媒ドメインをII型コラーゲンおよびマーカー基質と一緒にインキュベートするだけでは起こらない。
【００１７】
驚いたことに、本発明の方法において、完全長コラーゲナーゼをマーカー基質、II型コラーゲンおよび上記物質と共にインキュベートすることによって、本質的にマーカー基質変換を阻害させない物質を同定することができる。このような効果は、完全長コラーゲナーゼの代わりにコラーゲナーゼの触媒ドメインのみを用いただけでは起こらない。
【００１８】
これに比べて、従来技術による酵素阻害剤（Weithmann K. U., et al., Inflamm. Res. （1997） 46, 246-252）は、完全長の酵素および触媒ドメインの両方で触媒されたマーカー基質変換の阻害を増加させる。
【００１９】
「少なくとも１つの結合ドメインと少なくとも１つの触媒ドメインとを含むタンパク質」という用語の例としては、マトリキシン（matrixin）のメンバー、酵素ゼラチナーゼ、コラーゲナーゼ−１、好中球コラーゲナーゼまたは１３型のマトリックスメタロプロテイナーゼ（Massova I., et al., the FASEB Journal （1998） 12, 1075-1095）が挙げられる。
【００２０】
本発明の方法において、本発明の物質の検出は、タンパク質によりマーカー基質を速い変換速度で変換させることによって示される。従来技術による阻害剤に比べて、本発明の物質は、酵素ドメインを阻害するのではなく、基質が酵素の結合ドメインへ結合することを妨害する。本発明の物質は、多くのタイプの酵素で見出される酵素ドメインを攻撃しないため、特異性を改善して阻害を起こすことができる。
【００２１】
好ましい方法において、用いられるタンパク質はコラーゲナーゼであり、用いられる基質はII型コラーゲンであり、用いられるマーカー基質は（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−（３−［２,４−ジニトロフェニル］−Ｌ−２,３−ジアミノプロピオニル）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ2である。
【００２２】
さらに本発明は、本発明の方法を実行するための試験キットに関し、当該キットは、
Ａ）少なくとも１つの触媒ドメインと少なくとも１つの結合ドメインとを含むタンパク質、
Ｂ）前記触媒ドメインに結合し、変換されるマーカー基質、および、
Ｃ）前記触媒ドメインと前記結合ドメインとに結合可能な基質、
とを含む。
【００２３】
結合組織疾患の治療のための有効な化合物を見出そうと試みたところ、本発明の方法によって検出された４−（ジフェニルメチレン）−１−［４−（ｐ−フルオロフェニル）−４−フェニル−３−ブテニル］ピペリジンというがメタロプロテイナーゼ類の強い阻害剤であることを見出すに至った。この点において、特に重要なことは、ストロメリシン（マトリックスメタロプロテイナーゼ３）、好中球コラーゲナーゼ（ＭＭＰ−８）およびアグリカナーゼを阻害することであり、なぜならこれらの酵素は軟骨組織の重要な成分であるプロテオグリカンの分解において実質的な役割を有するためである（A. J. Fosang et al. J. Clin. Invest. 98 （1996） 2292-2299）。
【００２４】
また本発明は、活性成分として４−（ジフェニルメチレン）−１−［４−（ｐ−フルオロフェニル）−４−フェニル−３−ブテニル］ピペリジン、および／または、４−（ジフェニルメチレン）−１−［４−（ｐ−フルオロフェニル）−４−フェニル−３−ブテニル］ピペリジンの生理学的に許容される塩、および／または、４−（ジフェニルメチレン）−１−［４−（ｐ−フルオロフェニル）−４−フェニル−３−ブテニル］ピペリジンの立体異性体を、医薬的に適切で、かつ生理学的に許容される担体、添加剤および／または他の活性成分や賦形剤と共に含む医薬に関する。
【００２５】
上記化合物、４−（ジフェニルメチレン）−１−［４−（ｐ−フルオロフェニル）−４−フェニル−３−ブテニル］ピペリジンに加えて、硫酸プロタミン、さらにヘパリンの分解により得られるオリゴ糖および四糖類も、その薬理的特性により、コラーゲナーゼ、メタロプロテイナーゼまたはアグリカナーゼのようなマトリックス分解酵素の活性の増加が経過に含まれる全ての疾患の予防および治療に適切である。上記疾患としては、関節の損傷後または半月板または膝蓋骨の傷害または靭帯断裂後の関節の継続的な固定後の変形性関節症、脊椎症、軟骨融解のような変性関節障害が含まれる。さらに、膠原病、歯周疾患、創傷治癒障害のような結合組織障害、ならびに、炎症、免疫または代謝によって発症する急性および慢性関節炎、関節症、筋肉痛および骨代謝疾患のような運動器官の慢性疾患も含まれる。その上、４−（ジフェニルメチレン）−１−［４−（ｐ−フルオロフェニル）−４−フェニル−３−ブテニル］ピペリジンは、潰瘍形成、アテローム硬化症および狭窄症の治療に適している。加えて、４−（ジフェニルメチレン）−１−［４−（ｐ−フルオロフェニル）−４−フェニル−３−ブテニル］ピペリジンは、炎症、ガン、腫瘍転移の形成、悪液質、食欲低下および敗血症性ショックの治療に適している。
【００２６】
本発明の医薬は、一般的に、経口的または非経口的に投与される。直腸または経皮投与も可能である。
【００２７】
また本発明は、医薬の調製方法に関し、当該方法は、４−（ジフェニルメチレン）−１−［４−（ｐ−フルオロフェニル）−４−フェニル−３−ブテニル］ピペリジンを、医薬的に適切で、かつ生理学的に許容される担体、必要に応じて、さらに適切な活性成分、添加剤または賦形剤と共に、適切な投与形態にすることを含む。
【００２８】
適切な固体状または液状医薬製剤の形態の例としては、顆粒［剤］、粉末、コーティング錠剤、錠剤、（マイクロ）カプセル、座薬、シロップ、エリキシル、懸濁液、乳濁液、ドロップ、または注射用溶液が挙げられ、またさらに、活性成分が遅れて放出される製剤も挙げられ、このような製剤は、担体、崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、滑剤または潤滑剤、着香剤、甘味料および可溶化剤などの一般的な添加物を利用できる。頻繁に用いられる賦形剤としては、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール、およびその他の糖、タルク、乳タンパク質、ゼラチン、スターチ、セルロースおよびその誘導体、動物脂および植物油、例えばタラ肝油、ヒマワリ油、落花生油またはゴマ油、ポリエチレングリコール、および、溶媒、例えば、滅菌水やモノアルコールまたは多価アルコール（例えばグリセロール）など、が挙げられる。
【００２９】
上記医薬製剤は、好ましくは、用量単位で調製および投与され、各単位は、活性成分として、特定の用量の本発明の化合物、４−（ジフェニルメチレン）−１−［４−（ｐ−フルオロフェニル）−４−フェニル−３−ブテニル］−ピペリジンを含む。錠剤、カプセル、コーティング剤または座薬のような固体状の用量単位の場合、前記用量は、約１０００mgまでがよいが、好ましくは約５０〜３００mgであり、アンプル形態中の注射用溶液の場合、約３００mgまでで形成されるが、好ましくは約１０〜１００mgである。体重約７０kgの成人患者を治療する場合、約２０mg〜１０００mg、好ましくは約１００mg〜５００mgの活性成分の一日量が必要とされる。しかしながら、特定の事情によっては、より高いまたはより低い一日量でも適切である。一日量は、それぞれの用量単位の形態で１回の投与またはより少量の用量単位を数回で投与するか、または、特定の間隔で分割した用量を複数回投与するかのいずれかによって投与することができる。
【００３０】
さらに本発明は、本発明の方法による検出によって得られる阻害剤に関する。実施例
上記成分の調製：
成分Ａ）
酵素溶液：
Invitek GmbH（Berlin, Germany）からＭＭＰ−１３の製品（カタログ番号：ＨＭ１３１１００１０）を得て、製造元の説明書にしたがって活性化し、ＴＣＢバッファーで１０μg／１０mlに希釈する。ＴＣＢバッファーは、１０mMのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Germany）を水に溶解し、ＨＣｌでｐＨを７.５に調節することによって調製される。１００mMのＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ（Merck KGaA, Darmstadt, Germany）と、０.０５％Ｂｒｉｉｊ３５溶液、３０％（ｗ／ｖ）（Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Deutschland）を上述の溶液に添加する。
【００３１】
成分Ｂ）
マーカー基質溶液
１０mmol／ｌの（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−（３−［２,４−ジニトロフェニル］−Ｌ−２,３−ジアミノプロピオニル）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ3（Bachem Biochemica GmbH, Heidelberg, Germany）のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Riedel-de Haen AG, Seelze, Germany）溶液を、水で１：４０（ｖ／ｖ）に希釈する。
【００３２】
成分Ｃ）
II型コラーゲン溶液
１０mgのヒトII型コラーゲン（Biocon, Potsdam, Germany）を２４００μlの１０mmol／ｌ酢酸に溶解し（７２時間、４℃で）、次に１３００μlの炭酸水素ナトリウム溶液（２５０mmol／ｌ）ＣａＣｌ2×２Ｈ2Ｏ（Merck KGaA, Darmstadt, Germany）を滴下して加える。
【００３３】
成分Ｄ）
本発明の阻害剤であり、好ましくは水溶液とする。
試験手順
成分Ａ）（２５μl）、Ｂ）（５μl）、Ｃ）（１０μl）およびＤ）（１０μl）を混合し（総量５０μl）、１５分後に市販の分光蛍光計（Spectrafluor plus, Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany）で蛍光を測定する（３３０nmでの励起、３９０nmでの放出）。
【００３４】
酵素と阻害剤とを室温で１５分プレインキュベートする。５μlのマーカー基質溶液、成分Ｂ）（２５μＭ）を加えることによってその反応を開始する。
実施例１Ａにおける蛍光を１００％と設定し、この値を他の実施例の測定値の基準とする。
表１に結果を示す。
【００３５】
【表１】
0004643887.tif 000002
【００３６】
実施例３、５および６は本発明の方法に相当し、新規の阻害剤またはリガンドの検出が可能である。これらは、５００μmol／ｌまでの濃度、好ましくは５０μmol／ｌ以下の濃度で５０〜９９％の蛍光値を生じ、また特に、１nmol／ｌからの濃度、例外的には０.１nmol／ｌまでの濃度で５０〜９９％の値の蛍光を生じることによって区別される。
【００３７】
実施例３：
以下の（Ｉ）で示される本発明の物質、４−（ジフェニルメチレン）−１−［４−（ｐ−フルオロフェニル）−４−フェニル−３−ブテニル］ピペリジンを２００μmol／ｌ用いており、５９％の値が得られる。
【化１】
0004643887.tif 000003
【００３８】
実施例４
この物質から得られた測定値は、４９％以下から減少して０％までであり、他から区別するべきである。従来技術により、２００μmol／ｌのドキシサイクリン（Weithmann K. U., et al., Inflamm. Res. (1997) 46, 246-252）から得られた値は０である。
【００３９】
実施例５
５０μg／５０μlの四糖類、ＧＴ８０２１（Neoparin, lnc., 14274 Wicks Blvd, San Leandro, CA 94577）を用いた。本発明によれば、５０μg／５０μlの四糖類から得られた値は７２％である。
【００４０】
実施例６
６０μg／５０μlの硫酸プロタミン、Ｐ−４０２０（Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Germany）を用いた。本発明によれば、６０μg／５０μlの硫酸プロタミンから得られた値は７３％である。