(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材と、
前記基材に設けられた一つまたは複数の試薬収容部と、
前記複数の試薬収容部のうちの少なくとも一つの試薬収容部の底部に設けられた窪みと、
を備え、
前記試薬収容部全体の容量は１０〜３００μｌの範囲内であり、
前記窪み部分の容量は０．１〜５μｌの範囲内であり、
前記試薬収容部全体の容量に対し、前記窪み部分の容量が１／１０〜１／１００の範囲内であり、
前記試薬収容部の開口径が１〜５０ｍｍの範囲内、前記窪みの開口径が０．１〜５ｍｍの範囲内、かつ試薬収容部の開口径が窪みの開口径の１．５〜５倍であることを特徴とする容器。
【請求項２】
前記試薬収容部の底部の窪みを除いた部分が半球状になっていることを特徴とする請求項１に記載の容器。
【請求項３】
前記窪みの底部が半球状になっていることを特徴とする請求項１または２に記載の容器。
【請求項４】
前記試薬収容部の開口部周囲に凸部を有すること特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の容器。
【請求項５】
前記試薬収容部上にフィルムが張り合わされてなること特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の容器。
【請求項６】
前記基材が、反応部を備えてなることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の容器。
【請求項７】
さらに第二反応部を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試薬を収容、抗原抗体反応による抗原の検出及びＤＮＡの検出、その他化学、生化学、生物反応等に用いられる容器に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、化学反応やＤＮＡ反応、たんぱく質反応などの生化学反応をチップ上にて行うμ−Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ技術やＬａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐ技術が研究され実現して
きており、今まで大型の実験装置や大量の試薬が必要であった反応実験が数ミリ角以下の
チップで少量の試薬で行えるようになってきている。
【０００３】
生化学反応の例としては、酵素反応によるＤＮＡ増幅反応や、既知の配列を有するプローブＤＮＡを用い、ハイブリダイゼーション法により検体ＤＮＡの配列を検出する方法、ＤＮＡの配列決定の中でもＳＮＰ（一塩基多型）の検出法などがある。
ＳＮＰの検出法としては、インベーダー法、タックマンＰＣＲ法をタイピング工程に用いる方法が知られている（特許文献１参照）。
【０００４】
一般的にＤＮＡを用いた検出反応には血液等を採取し抽出したものを用いるが、採取する血液等の試料を少量で済ませるため、検体ＤＮＡの調製法として、酵素反応によるＤＮＡ増幅反応を用いることが多い。
試料中に含まれる微量のＤＮＡを増加させる方法には種々の方法が知られているが、その代表的な方法として、ＰＣＲ増幅反応が知られている。この方法は、試料中の二本鎖ＤＮＡの変性工程（一本鎖に解離）、アニーリング工程（一本鎖ＤＮＡとプライマーを結合）、伸長工程（プライマーからＤＮＡを合成）から構成される３工程を１サイクルとし、このサイクルを繰り返して試料中のＤＮＡを増加させる方法である。変性工程は約９５℃、アニーリング工程は５０〜６０℃、伸長工程は６０〜８０℃で行われる。ＰＣＲ増幅反応はこの熱サイクルを繰り返すことにより行われる。１サイクルに要する時間はせいぜい数分程度であり、このサイクルを繰り返して必要量のＤＮＡを得る。
なお、ＰＣＲ反応の前には前処理として９５℃で数分〜５、６分加熱することもある。
【０００５】
ＳＮＰの検出法の一つであるインベーダー法は、二種類の非蛍光標識オリゴヌクレオチド（アレルプローブ、インベーダープローブ）、一種類の蛍光標識オリゴヌクレオチド（ＦＲＥＴプローブ）及びＤＮＡ構造に特異的なエンドヌクレアーゼ（クリベース）を使用する。アレルプローブは、鋳型ＤＮＡの配列とは無関係な配列（フラップ）を５’側に有し、３’側に鋳型ＤＮＡに特異的な相補配列を有するオリゴヌクレオチドで、その相補配列の５’側末端はＳＮＰ部位となっている。他方、インベーダープローブは、前記ＳＮＰ部位から鋳型ＤＮＡの３’側に相補的に結合するように設計されている。また、ＦＲＥＴプローブは蛍光標識を有するオリゴヌクレオチドで、その５’末端に蛍光標識（レポーター）を有し、その上流にはクエンチャーが結合している。そして、このレポーターから３’側の部位が自己ハイブリゼーションして二本鎖を構成しており、この二本鎖から３’末端側に、アレルプルーブのフラップと相補的な配列である一本鎖の部位を有するものである。また、クリベースは、ヌクレオチドが三重に重なった部位を認識し、三重に重なったヌクレオチドの３’側を切断して遊離させる酵素である。
【０００６】
このインベーダー法においては、まず検査対象の鋳型ＤＮＡとアレルプローブをハイブリゼーションしたときに、ＳＮＰ部位にインベーダープローブの３’末端が侵入する。このため、このＳＮＰ部位で、鋳型ＤＮＡ、アレルプローブ及びインベーダープローブを重ね合わせて三重になる。このＳＮＰ部位の構造をクリベースが認識して、アレルプローブのフラップを切断・遊離させる。次に、アレルプローブ起源の前記遊離フラップはＦＲＥＴプローブとハイブリゼーションする。このハイブリゼーションによって、自己ハイブリゼーションの二本鎖とアレルプローブ起源の前記遊離フラップとの交点で三重となり、クリベースは再びこの構造を認識してＦＲＥＴプローブのレポーターを切断し、クエンチャーから開放される。そして、励起光を照射することにより、切断遊離されたレポーターの蛍光標識が蛍光発色する。仮にＳＮＰ部位の塩基がアレルプローブとマッチしないものであった場合、アレルプローブ起源のフラップは切断・遊離せず、したがって、蛍光発光率が著しく低いから、この蛍光強度の差を検出することによってＳＮＰを検査することができる。なお、励起光としては一般に紫外光又は可視光が利用されている。
また、これらの反応は約６３℃で数十分〜４時間程度インキュベートすることにより行われる。
【０００７】
チップを用いて、これらの反応を行う場合、ＤＮＡの配列を決定する場合などは、スライドガラス上にプローブＤＮＡを固定し、その上でハイブリダイゼーション反応を行う方法が知られている。
また、チップ上に設けたウェルと呼ばれる微小な穴やくぼみが形成され反応場として用いることも知られている。ウェルは、半導体やガラスにエッチングで設けたり、穴のあいた板を積層することで形成されていた。
ウェルを用いる場合、試薬を基板上に固定する必要がなく、またＰＣＲ反応などにも適用できる。
また、これらのウェルは、極微量な試薬を所定の位置に充填後、緩衝液などその他の試薬との混合場として利用できる。
【０００８】
ウェルタイプのものとしては、例えば、基板表面に多数のウェルが設けられている検出用基板が開示されている（特許文献２、３、４参照）。
また、内部に流路を設け、両端に開口部を有する、ＰＣＲ反応用の装置も知られている（特許文献５参照）。
【０００９】
これらはいずれも中の空洞部に試薬を供給するものであるが、酵素や核酸など充填する試薬の量も極微量である。
しかし、微量試薬は輸送過程などで受ける衝撃や傾きにより容易に移動してしまい、混合液組成が予定と異なることが問題となる。
【００１０】
例えば、ウェル状試薬収容部に試薬充填済みチップ上でＰＣＲ反応、酵素を用いるＤＮＡ反応を行う場合、血液や組織から抽出するＤＮＡ量は０．１ｎｇ〜５０ｎｇが適当で有り、ＤＮＡを増幅するためのポリメラーゼなどの酵素や反応に用いる酵素は極微量の充填で十分である。しかし、酵素を試薬と混合して充填できない以上（酵素が失活してしまうため）、酵素と試薬は分けて充填する必要がある。その際には微量の酵素を回収するとその回収は困難なものになるので、数十μｌあるバッファーなどの試薬を回収し微量な酵素が充填されている試薬収容部に移し、混合させることが最も収率を上げる方法となる。
そしてウェル状の試薬収容部内に酵素などの微量試薬を入れておき、その後他の試薬をウェルに注入し、混合する場合、予め収容してある酵素などの微量試薬が移動し、一部後から入れた試薬と接触せずに壁面等に付着して残ってしまい、所望の混合ができないことがある。
このような液残りは、試薬量が多い系では無視できるものであるが、ＤＮＡなどｎｇ単位の試料を用いる場合、試薬もμｌ程度の極微量になり、僅かな液残りが問題となる。
【００１１】
【特許文献１】特開２００２−３００８９４号公報
【特許文献２】ＷＯ２００３／０３１９７２号公報
【特許文献３】特開平０９−９９９３２号公報
【特許文献４】特開２００３−７０４５６号公報
【特許文献５】特許第２７５９０７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、このような事情を考慮してなされたもので、化学、生化学、生物などの分野に用いる容器において、試薬の移動の少ない試薬収容部を備える容器とすることを目的とする。特に酵素などの微量試薬を用いる系において、試薬移動のない容器とすることを目的とする。そして高い液の回収性を目指すものである。また、混合場として用いる場合、確実に所望の組成で混合することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の容器は、基材と、前記基材に設けられた一つまたは複数の試薬収容部と、前記複数の試薬収容部のうちの少なくとも一つの試薬収容部の底部に設けられた窪みと、を備え、前記試薬収容部全体の容量は１０〜３００μｌの範囲内であり、前記窪み部分の容量は０．１〜５μｌの範囲内であり、前記試薬収容部全体の容量に対し、前記窪み部分の容量が１／１０〜１／１００の範囲内であり、前記試薬収容部の開口径が１〜５０ｍｍの範囲内、前記窪みの開口径が０．１〜５ｍｍの範囲内、かつ試薬収容部の開口径が窪みの開口径の１．５〜５倍であることを特徴とする容器である。
【００１７】
また、前記試薬収容部の底部の窪みを除いた部分が半球状になっていてもよい。
【００１８】
また、前記窪みの底部が半球状になっていてもよい。
【００１９】
また、前記試薬収容部の開口部周囲に凸部を有していてもよい。
【００２０】
また、前記試薬収容部上にフィルムが張り合わされていてもよい。
【００２１】
また、前記基材が、反応部を備えていてもよい。
【００２２】
また、さらに第二反応部を有していてもよい。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、試薬を収容する際、試薬収容部底部に窪みを有するため、実験時、運搬時に加わる振動による液の壁面、蓋面への移動がないものとなる。従って、混合場として用いる場合、振動などよる壁面、蓋面での移動した液の液残りがなく所望の液組成で混合することができる。また同様の理由で、収容されている液が微量であっても所望の量の液を回収できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照して説明する。
図１に、本発明の基板の一実施形態を示す図を示す。図１は、略長方形の板状の基板に、試薬を保存するための凹部が複数形成されているチップである。
【００２５】
本発明に用いる基板は、試薬に悪影響を与えないものであればよい。また、反応部を設け反応を行う場合、反応系に悪影響を与えないことが必要である。さらに、反応部を設け、反応部内の反応を基板下方より光学検出する場合は透明性が高い方が好ましい。
このようなものとして、例えば、ＰＣ（ポリカーボネート）、ＰＰ（ポリプロピレン）、シクロオレフィン系ポリマー、メチルペンテン系樹脂、フッ素ポリマー、シリコーン樹脂などを用いることができる。
透明性、耐熱性、耐薬品性や反応系に対する影響などの点からＰＰを用いることが好ましい。
【００２６】
このような合成樹脂を用いて基板を作成すれば、耐熱性、耐薬品性、成形加工性などに優れているため好ましい。さらに、２種類以上の樹脂を接合して用いてもよい。この場合、それぞれの樹脂の特徴を活かして基板を作成することにより、試薬及び試料等の特性に応じた多様な基板とすることが可能となり、用途ごとに使い分けることができる。例えば、基板の上半分と下半分とで材料を分けたりすることも可能となる。また、後述の試薬収容部やＰＣＲ反応部など部分ごとに材料を分けることもできる。
なお、基板の素材としてガラスを用いてもよい。
【００２７】
また、基板のサイズは１０〜１５０ｍｍ×１０〜１５０程度であることが好ましい。この範囲であれば、ハンドリングの点で好ましい。
【００２８】
基板には、底部に窪みを有する試薬収容部を備える。図１に一例を示す。図１において、基板２上に試薬収容部３を８つ備え、そのうちの一つに窪み４を有する。
試薬収容部は、基板がプラスチック、合成樹脂系であれば切削加工、成型加工により形成することができる。ガラスであれば切削加工により形成することができる。また、試薬収容部は複数有することができ、その場合少なくとも一つの試薬収容部が底部に窪みを有するものであればよい。試薬収容部を複数設ける場合、大きさが異なっていても良い。試薬収容部の数は、目的に応じて適宜設定できる。
また、試薬収容部は、予め一つの試薬を入れておき、後から別の試薬を入れ、混合させる混合場として用いることもできる。
【００２９】
試薬収容部の形状は、特に限定はしないが、凹形状（ウェル形状）のものが好ましい。中でも半球状または円筒状で底部が半球状なものが好ましい。半球状であれば試薬を充填する際、試薬の飛び散り、気泡の混入を防げるものとなる。また収容した試薬を取り出す際の取り出し性に優れるものとなる。
窪みを有する試薬収容部の場合、窪みを除いた部分の底部が半球状になっていれば良い。窪みの底部も半球状になっていることが好ましい。微量試薬の液滴は収容されるとき、玉状で供給されるとすると、ちょうど試薬の液滴が半球状の窪みにはまり保持される構造になる。また、試薬の量が窪みの容量より大きい場合でも、半球状であれば試薬の一部が窪みに入り込み保持される。
なお、それ以外にも、開口部が円形または多角形で、断面が三角形状、四角形状、台形形状になっているものでもかまわない。窪みも同様である。
【００３０】
試薬収容部の容量は、１０〜３００μｌの範囲内であることが好ましい。特にＤＮＡを扱う生化学反応では、反応量が微量であり、用いる試薬は高価であることが多い。また、血液から抽出されるＤＮＡは通常０．１ｎｇ〜５０ｎｇ程度であり、ＤＮＡを含む試薬は数百ｎｌ〜数μｌ程度である。そのため、反応に用いる試薬、希釈剤なども多くても数百μｌ程度になり、前述の範囲内であることが好ましい。また試薬の量が数百μｌ以上になる場合、２つに分けて収容してもよい。
なお、窪みを有する試薬収容部も窪みを有さない試薬収容部も前述の範囲内である。
【００３１】
また、試薬収容部の窪み部分の容量が０．１〜５μｌの範囲内であることが好ましい。
このぐらいであれば、例えば、前述のような数十〜数百μｌ程度の試薬を収容する際、液が窪みをきっかけに保持される。
また、前述のように血液から抽出されるＤＮＡは通常０．１ｎｇ〜５０ｎｇ程度であり、ＤＮＡを含む試薬は数百ｎｌ〜数μｌ程度であり、反応に用いる酵素などの試薬も同様に数百ｎｌ〜数μｌ程度である。このように極微量の試薬を収容する場合、ちょうど窪みに固定される状態になる。
【００３２】
試薬収容部全体の容量に対し、窪み部分の容量が１／１０〜１／１００の範囲内であることが好ましい。この範囲内であれば、数十〜数百μｌ程度の試薬を収容する際、窪みをきっかけに窪み周辺に試薬が保持される。
また、数百ｎｌ〜数μｌ程度の極微量の試薬を収容する場合、窪みに極微量の試薬を保持し、後から別の反応試薬を加え、混合場として用いることができる。
【００３３】
前記試薬収容部の開口径が１〜５０ｍｍの範囲内、前記窪みの開口径が０．１〜５ｍｍの範囲内、かつ試薬収容部の開口径が窪みの開口径の１．５〜５倍であることが好ましい。
試薬の量は、数百ｎｌ程度の極微量〜数百μｌ程度であり、また一般的な分注針の径は数十μｍ〜数ｍｍ程度である、そのため、分注適正、目的容量を考慮すると、試薬収容部の開口径が１〜５０ｍｍの範囲内であることが好ましい。
試薬の量が数十〜数百μｌ程度である場合は、窪みの開口径が０．１〜５ｍｍの範囲内であれば、窪みをきっかけに窪み周辺に試薬が保持されるものとなる。また、試薬の量が数百ｎｌ〜数μｌ程度であれば、窪みに極微量の試薬を固定することができる。
また、試薬収容部の開口径が窪みの開口径の１．５〜５倍であれば前述の試薬の保持が効果的になるものである。
【００３４】
また、深さは１〜５０ｍｍの範囲内であることが好ましい。
【００３５】
また、前記試薬収容部は、図６（ｂ）に示すような基板をくりぬいた形状にしてもよいし、図６（ａ）に示すように基板裏面が反応部の形状に沿って基板下方向に凸形状になっていても良い。
【００３６】
また、試薬収容部上に蓋材を設けても良い。蓋材を設けることにより、ごみ、汚染物質などによる汚染を防ぐことができる。
蓋材としてはフィルム状のものを用いることができる。このようなものとしては、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン等のポリオレフィンフィルム、ポリメチルアクリレート、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系フィルム、ポリスチレンフィルム、ポリアセタールフィルム、ポリアミドフィルム、ポリアクリロニトリルフィルム、ポリカーボネートフィルム、シクロオレフィン系フィルム、シリコン樹脂系フィルム、フッ素系樹脂フィルムなどが挙げられる。
また、アルミニウムなどの金属箔や、金属箔と前述の樹脂フィルムの積層フィルムを用いても良い。
【００３７】
これらのフィルム状蓋材は、接着剤を用いて貼り合わせることができる。接着剤としては、耐熱性の硬化性接着剤を用いることができる。
また、ヒートシールにより貼り合わせてもかまわない。ヒートシールであれば、試薬への接着剤の影響を考慮しなくても良いので好ましい。
【００３８】
ヒートシールの条件は、温度１４０℃〜２２０℃、圧力１ｋｇ〜３ｋｇ、時間０．３秒〜２．０の範囲内で、加圧しながら貼り合わせることが好ましい。温度、圧力、時間がこれ以上であると基材が変形を起こしやすくなる。また、これ以下の温度、圧力、時間であるると貼り合わせが困難である。また、温度を上げる場合は、内容物の熱劣化を考慮して時間を短くするとよい。
【００３９】
また、蓋材を設けた場合、試薬の回収は、蓋材の上から注射器のような針状の回収具を用いて、突き刺し、回収しても良い。
【００４０】
なお、蓋材を剥がさずに試薬を回収する場合は、蓋材は剥離する必要がない。
【００４１】
また、開口部周囲に凸部を設けても良い。凸部を設けることにより、蓋材を貼り合わせやすくできる。図２に一例を示す。図２において、基板２上にウェル状の試薬収容部３を８つ備え、そのうちの一つに窪み４を有する。試薬収容部３は開口部周辺に凸部５を有する。
特にヒートシールにより貼り合わせる場合、加熱する部分が、基材全体ではなく、凸部のところだけでよいので、試薬収容部内の試薬への熱的な影響を低減することができる。
【００４２】
このような凸部としては、幅は０．１〜２ｍｍ、好ましくは０．３〜０．７ｍｍの範囲内であることが好ましい。この範囲より小さいと、凸部でヒートシールすることができず、この範囲より大きいと、基材、内容物への影響（ダメージ）が大きくなってしまう。
また、凸部を設けることにより収容部の容量を増やしてもよい。その場合、収容部の強度とヒートシール適性を考慮して、凸部を例えば図８（ｂ）に示すように２段階に形成してもよい。すなわち、強度を出すためにある程度の厚みを持たせた凸部を設け、その上に幅の小さい凸部を設ける２段階構造にすることにより強度とヒートシール適性を両立させてもよい。
【００４３】
また、試薬収容部内に表面処理を施しても良い。ウェル状の試薬収容部内に試薬、検体などの溶液を充填する際、ウェル状の試薬収容部内に表面処理を施しておくと気泡の混入なく溶液を注入できる。また、ウェル状の試薬収容部から溶液を回収する際にも高回収率が期待できる。
【００４４】
なお、表面処理としては、溶液が水系の場合、親水処理を施すことが好ましい。具体的には水との接触角が７０°以下、好ましくは４０°以下がよい。
また、接触角の測定は、公知の接触角計を用いて測定する。また、ウェル内の接触角の測定は困難であるため、同様の表面状態である基板の表面を用いて測定しても良い。
【００４５】
表面処理の方法としては、紫外線照射処理、プラズマ処理、コロナ処理などを用いることができる。
また、処理は大気中で行っても良いが、基板と上部電極の間に処理ガスを流しても良い。処理ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウムなどの不活性ガスが挙げられる。
中でもアルゴンガスを用いたプラズマ処理が好ましい。
【００４６】
また、基板上に反応部を設けても良い。反応部は凹形状（ウェル形状）に形成することができる。図３に一例を示す。図３において、基板２上にウェル状の試薬収容部３を３つ備え、そのうちの一つに窪み４を有する。ウェル状反応部６を２０個備える。
反応部の数は、目的に応じて適宜設定できる。
ウェル状の反応部の開口径は０．１〜５ｍｍの範囲内、深さが０．１〜５ｍｍ範囲内であることが好ましい。前述のようにライフサイエンス分野では、微量試薬を用いることが多く、効率的に反応を行うためには、前記範囲内であることが好ましい。
また、反応部内には予め、反応に必要な試薬を収容していても良い。
【００４７】
ウェル状反応検出部の形状は、特に限定するものではないが、ウェル状反応部の底部が平坦でありウェル開口部から底部まで壁面が傾斜している円錐台形状であることが好ましい。底部が平坦でありウェル開口部から底部まで壁面が傾斜している円錐台形状であれば、下方からの光学的な検出に有利である。例えば反応部内に蛍光物質を下方から紫外線を照射し、同じく下方から蛍光を検出する場合、球状やその他複雑な形状であると、蛍光物質の励起源である紫外線が屈折、散乱して蛍光物質に照射される量が減少してしまう。また生じた蛍光も屈折、散乱し、検出する蛍光強度の低下、誤検出などの原因となってしまう。
なお、それ以外にも、開口部が円形または多角形で、断面が半球形状、Ｕ字形状、三角形状、四角形状になっているものでもかまわない。また、開口部が多角形で断面が台形形状でもかまわない。
【００４８】
また、前記反応部は、図７（ｂ）に示すような基板をくりぬいた形状にしてもよいし、図７（ａ）に示すように基板裏面が反応部の形状に沿って基板下方向に凸形状になっていても良い。
【００４９】
また、反応部上に保護フィルムを設けても良い。保護フィルムを設けることにより、ごみ、汚染物質などによる汚染を防ぐことができる。
保護フィルムとしてはフィルム状のものを用いることができる。このようなものとしては、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン等のポリオレフィンフィルム、ポリメチルアクリレート、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系フィルム、ポリスチレンフィルム、ポリアセタールフィルム、ポリアミドフィルム、ポリアクリロニトリルフィルム、ポリカーボネートフィルム、シクロオレフィン系フィルム、シリコン樹脂系フィルム、フッ素系樹脂フィルムなどが挙げられる。
また、アルミニウムなどの金属箔や、金属箔と前述の樹脂フィルムの積層フィルムを用いても良い。
【００５０】
これらの保護フィルムは、接着剤を用いて貼り合わせることができる。接着剤としては、耐熱性の硬化性接着剤を用いることができる。
また、ヒートシールにより貼り合わせてもかまわない。反応部内に予め試薬を収容しておく場合、ヒートシールであれば、試薬への接着剤の影響を考慮しなくても良いので好ましい。
【００５１】
ヒートシールの条件は、温度１４０℃〜２２０℃、圧力１ｋｇ〜３ｋｇ、時間０．３秒〜２．０の範囲内で、加圧しながら貼り合わせることが好ましい。温度、圧力、時間がこれ以上であると基材が変形を起こしやすくなる。また、これ以下の温度、圧力、時間であるると貼り合わせが困難である。また、温度を上げる場合は、内容物の熱劣化を考慮して時間を短くするとよい。
【００５２】
保護フィルムは使用する前に剥がす必要があるため、易剥離性であることが好ましい。
【００５３】
また、開口部周囲に凸部を設けても良い。凸部を設けることにより、蓋材を貼り合わせやすくできる。特にヒートシールにより貼り合わせる場合、加熱する部分が、基材全体ではなく、凸部のところだけでよいので、反応部内に予め試薬を収容しておく場合、試薬への熱的な影響を低減することができる。
また、剥離する際も、接点が開口部を除いた基材全体ではなく、凸部上だけであるので剥離が容易にできる。
【００５４】
このような凸部としては、幅は０．１〜２ｍｍ、好ましくは０．３〜０．７ｍｍの範囲内であることが好ましい。この範囲より小さいと、凸部でヒートシールすることができず、この範囲より大きいと、基材、内容物への影響（ダメージ）が大きくなってしまう。
また、凸部を設けることにより反応部の容量を増やしてもよい。その場合、反応部の強度とヒートシール適性を考慮して、凸部を２段階に形成してもよい。すなわち、強度を出すためにある程度の厚みを持たせた凸部を設け、その上に幅の小さい凸部を設ける２段階構造にすることにより強度とヒートシール適性を両立させてもよい。
また、凸部同士を凸部と同じ高さで連結させても良い。そのようにすることで、剥離する際に、引っ掛かりがなくスムーズに剥離ができる。
【００５５】
また、試薬収容部内に表面処理を施しても良い。ウェル状の試薬収容部内に試薬、検体などの溶液を充填する際、ウェル状の試薬収容部内に表面処理を施しておくと気泡の混入なく溶液を注入できる。また、ウェル状の試薬収容部から溶液を回収する際にも高回収率が期待できる。さらに、ウェル内で加熱により反応を行う際、液在籍位置が安定し、また蒸発しにくいものとなる。
【００５６】
なお、表面処理としては、溶液が水系の場合、親水処理を施すことが好ましい。具体的には純水との接触角が７０°以下、好ましくは４０°以下がよい。
また、接触角の測定は、公知の接触角計を用いて測定する。また、ウェル内の接触角の測定は困難であるため、同様の表面状態である基板の表面を用いて測定しても良い。
【００５７】
表面処理の方法としては、紫外線照射処理、プラズマ処理、コロナ処理などを用いることができる。
また、処理は大気中で行っても良いが、基板と上部電極の間に処理ガスを流しても良い。処理ガスとしては、窒素、アルゴン、ヘリウムなどの不活性ガスが挙げられる。
中でもアルゴンガスを用いたプラズマ処理が好ましい。
【００５８】
また、反応を２種類以上行う場合、第二反応部を設けても良い。
例えば、反応がＤＮＡの検出反応に用いる場合、第二反応部はＰＣＲ反応部にすることができる。
ＰＣＲ反応部を設けることにより、同一チップ上で検体の調整、ＤＮＡの検出を行うことができる。
ＰＣＲ反応部としては、ウェル状の反応部を設けても良いし、流路を設け流路内で反応を行っても良い。図４に一例を示す。図４において、基板２上にウェル状の試薬収容部３を３つ備え、そのうちの一つに窪み４を有する。ウェル状反応部６を２０個備え。反応部と試薬収容部の間に流路状の第二反応部７を備える。
流路を設ける場合、例えば、両端に開口部を有し、内部に流路を設ける構造が例としてあげられる。開口部直径は５ｃｍ以下程度、開口部深さは０．１ｃｍ〜５ｃｍ程度である。
【００５９】
また開口部は容量を増やすために基材から上部に突出した形状にしてもよい。
内部の流路で反応を行う場合、反応液の蒸発を防ぐために両端の開口部あたりにミネラルオイルなどの蒸発防止剤を加えるてもよい。その場合、開口部の深さを深くすれば、加える蒸発防止剤を増やすことができ、蒸発を確実に防ぐことができる。基板を厚くし、開口部を形成しても良いが、基板の厚みが薄い場合、開口部の一部基板から煙突状にせり出した構造をとり、開口部を深くしても良い。
【００６０】
また、第二反応部上に蓋部を設けても良い。蓋部の材質、形状は特に限定をするものではなく、目的に応じて所望の蓋部を設けることができる。
【００６１】
第二反応部が流路状である場合、具体的には例えば図６に示すような形状であってもよい。
流路状第二反応部は、両端に基材を貫通する貫通孔を設け、基材の裏面に両貫通孔を接続する溝部を設ける。この溝部上に底部形成用フィルムを貼り合わせることにより、流路状反応部を形成する。
この時、溝部の幅、高さはそれぞれ１ｍｍ〜５ｍｍの範囲内であることが好ましい。
【００６２】
前記溝部は両貫通孔を直線で結んでいても良いし、試薬や検査対象の蒸発を防ぐために屈曲した形状であっても良い。
【００６３】
底部形成用フィルムとしてはフィルム状のものを用いることができる。このようなものとしては、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン等のポリオレフィンフィルム、ポリメチルアクリレート、ポリメチルメタクリレート等のアクリル系フィルム、ポリスチレンフィルム、ポリアセタールフィルム、ポリアミドフィルム、ポリアクリロニトリルフィルム、ポリカーボネートフィルム、シクロオレフィン系フィルム、シリコン樹脂系フィルム、フッ素系樹脂フィルムなどが挙げられる。
また、アルミニウムなどの金属箔や、金属箔と前述の樹脂フィルムの積層フィルムを用いても良い。
【００６４】
底部形成用フィルムは接着剤を用いて貼り合わせることができる。また、ヒートシールにより貼り合わせても良い。ヒートシールであれば、反応部内への接着剤の影響を考慮しなくても良いので好ましい。
また、底部形成用フィルムは、一部溝部へ食い込む形状であれば好ましい。基材と底部形成用フィルムの間に隙間が生じず、試薬や検査対象の漏れがないものとなるからである。
【００６５】
また、貫通孔開口部は容量を増やすために基材から上部に突出した形状にしてもよい。
【００６６】
また、開口部にはフタ材を設けてもよい。
【００６７】
また、その他の反応部を設けても良い。
【００６８】
また、ウェル状反応部同士を接続する流路を設けてもよい。図４に一例を示す。図４において、基板２上にウェル状の試薬収容部３を４つ備え、そのうちの一つに窪み４を有する。ウェル状反応部６を２０個備え。試薬収容部同士及び試薬収容部とウェル状反応部が流路８により接続されている。
またウェル状反応部と試薬収容部、ＰＣＲ反応部、その他の反応部を接続する流路を設けてもよい。これら流路を形成することにより、連続した反応を行わせることが可能となる。
【００６９】
また、基板には、変形などを軽減するためにリブを設けてもよい。リブとしては、基板端部の下部及び／又は上部に幅０．１〜３ｍｍ、高さ０．１〜３ｍｍ程度のものを設ければよい。また、置いたときに安定するよう、支持用脚部を設けてもよい。
【００７０】
本発明では、様々な生化学系の反応用のチップとして用いることができ、例えば抗原抗体反応及びＤＮＡ反応の検出などに用いることができる。
抗原抗体反応による抗原検出の場合、例えば、予め各ウェル状反応部内に抗原を含む試料を入れておき、後から検体として抗体を含む試薬を添加し、抗原または抗体のいずれかに標識物質を付けておくことで、反応の有無を検出できる。標識物質としては、蛍光などの発光物質が一般的に用いられる。なおこの場合、基板上に試薬収容部を設けて置き、検体を収容しておいてもよい。
【００７１】
ＤＮＡの検出の場合、例えば、予めウェル状反応部内に核酸プローブを用意しておく。その後、検体ＤＮＡをウェル状反応部に供給し、核酸プローブと検体ＤＮＡのハイブリダイゼーションさ反応により、ＤＮＡの検出を行うことができる。その際、検体ＤＮＡに標識物質を付けておけば、その標識物質の有無を検出することにより検出が可能となる。また、検体ＤＮＡは、血液等から抽出したＤＮＡをＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法などにより調整しておいたものを用いることができる。また、核酸プローブとして配列の異なる核酸を複数用意することで検出物質としての検体ＤＮＡがどのような配列であるかを検出することができる。なおこの場合、基板上に試薬収容部を設けて置き、検出物質を収容しておいてもよい。
【００７２】
また、基板上に遺伝子増幅反応部を設けておき、チップ上で連続して、血液などから抽出したＤＮＡを遺伝子増幅反応により増幅させ、それを検体とし、反応部で核酸プローブとの反応の有無を検出してもよい。具体的には、例えばウェル状試薬収容部に検体として血液などから抽出したＤＮＡを収容しておき、分注動作により、遺伝子増幅反応部へ分注し、遺伝子増幅反応により調製した検体をウェル状の反応部へ分注すればよい。ウェル状試薬収容部から遺伝子増幅反応部、ウェル状反応部へは流路を用いて送液しても良い。
なお、ここでいう遺伝子とはＤＮＡ、ＲＮＡなどのことをいう。また遺伝子増幅反応方法としては前記ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法などがある。
【００７３】
また、一塩基遺伝子多型（ＳＮＰ）の解析にも用いることができる。なお、検体を検出するための試薬は複数あってもよく、検体が蛍光標識されていない場合には、試薬のひとつが標識されていればよい。
【００７４】
また、標識物質は、反応物に特有に作用するものを、反応後に加えることもできる。このようなものとしては、ＤＮＡの検出におけるインターカレーターなどがある。また、ここでいう標識物質とは間接的なものも含む。すなわち、蛍光物質などに結合する物質を標識物質として検体またはプローブ核酸などの検体を検出するための試薬に結合させておき、後から蛍光物質を加えても良い。
【００７５】
また、多段階反応を行ってＳＮＰまたはＤＮＡを検出してもよい。
例えば、インベーダー・アッセイ法（サードウェイブテクノロジーズ，Ｉｎｃ（米国ウィスコンシン州マディソン市）を用いても良い。これによりＳＮＰ解析の具現化を図ることが可能となる。
【００７６】
この場合、検体を検出するための試薬が複数種でもよく、予めウェル状反応部内に少なくとも１種の試薬を入れておき、その後、検体と試薬を同時または順次注入し、反応をおこなっても良い。
【００７７】
また、ウェル状反応部、ＰＣＲ反応部には、反応用液の乾燥を防ぐ目的でミネラルオイルなどの反応用液より比重の軽い不揮発性液体を加えても良い。
また、検体を検出するための試薬はウェル状反応部内に固定してもよいし、固定させずに保持させておくだけでもよい。
【実施例】
【００７８】
＜実施例１＞
図６のウェル形状の検出チップ１を、金型成形により作成する。成形に用いた樹脂は、ポリプロピレン（プライムポリマー社製）を用いて寸法縦２．５ｃｍ×横１２ｃｍの成形品を作成した。
【００７９】
試薬収容部３は開口部直径６ｍｍ、深さ５．２ｍｍで先端が半球状としたもの６つ、窪み４を有し直径６ｍｍ、深さ５．２ｍｍで先端が半球状としたもの２つ形成した。窪み４の開口部直径１．５ｍｍ、深さ０．５ｍｍで先端が半球状とした。
反応部６は直径３ｍｍ、深さ２ｍｍで側面が傾斜し底部が平坦である、断面台形形状とした。底面の直径は１ｍｍとした。なお、基材厚みは１ｍｍでウェル状試薬収容部及びウェル状反応部の底部は基板から下方にはみ出す形状にした。また反応部は２０設けた。
【００８０】
窪みを有する試薬収容部３の容量は３０μｌで、窪み４の容量は０．６μｌである。
【００８１】
第二反応部７であるＰＣＲ反応部は、開口部直径１３ｍｍ、深さ６ｍｍで先端が半球状とした。
【００８２】
なお、基板の端から試薬収容部３、第二反応部７（ＰＣＲ反応部）、反応部６という順に設けた。
【００８３】
次に表面処理として、一対の電極間にＡｒ  １０Ｌ／ｍｉｎ：Ｏ２  ０．５Ｌ／ｍｉｎを供給させ、基材の搬送速度を５０ｍｍ／ｓｅｃで搬送させながら電極間に電圧を印加し、処理を行った。なおこの処理を３回行った。
【００８４】
試薬収容部には、それぞれ
・検体ＤＮＡ１５μｌ（０．１ｎｇ／μｌ）
・ミネラルオイル１２０μｌ
・ＰＣＲｂｕｆｆ及びプライマーミックス及びｄＮＴＰを含むＰＣＲＭｉｘｔｕｒｅ２０μｌ
・２倍希釈ポリメラーゼ０．６μｌ
・インベーダーバッファー及びフレット蛍光試薬及び滅菌水を含むインベーダー試薬３７μｌ
・酵素（クリベース）５μｌ
を収容する。
なお、ポリメラーゼ、酵素（クリベース）は窪みを有する試薬収容部に収容する。ポリメラーゼは０．６μｌであり、ちょうど窪みにはまり保持されている状態である。酵素（クリベース）は窪みには完全に収容されていないが、窪みをきっかけに保持されている状態である。
各反応部には、アレルプローブ（５倍希釈液）０．７５μｌを供給し乾燥状態にした。
また、試薬収容部２つは空けておいた。
【００８５】
次に試薬収容部上に蓋材としてＰＥＴ／アルミ／シーラントフィルムからなる蓋材をヒートシールにより貼り合わせ、反応部上には保護フィルムとしてＰＥＴ／シーラントフィルムからなる保護フィルムをヒートシールにより貼り合わせた。
【００８６】
次に、実験時や運搬時の容器に加わる振動を想定し、振動発生装置（Ｓ/Ｉ社製ＶＯＲＴＥＸ  ＧＥＮＩＥ２）を用いて振動を加えた。振動条件はチップを振動発生装置に真上から押し付け、強度７で３０秒間振動を加えた。
【００８７】
次に、針の内径０．９ｍｍピペット（分注針）を用いてＰＣＲＭｉｘｔｕｒｅ１１μｌを２倍希釈ポリメラーゼ０．６μｌが収容されている窪みを有する試薬収容部に分注し３回ピペッティング（ポンピング）を行い混合した。その後同様のピペットを用いて検体ＤＮＡ８μｌを抽出し、２倍希釈ポリメラーゼが収容されている窪みを有する試薬収容部に分注し３回ピペッティング（ポンピング）を行い混合しＰＣＲ反応液とした。
【００８８】
同様のピペットを用いて混合したＰＣＲ反応液をＰＣＲ反応部に分注した。その後、同様のピペットを用いて２つの開口部にミネラルオイルをそれぞれ７．５μｌづつ供給し、流路内で前記ＰＣＲ試薬をミネラルオイルで挟む状態にした。
【００８９】
次に、ＰＣＲ反応部の流路部を９５℃で５分過熱し、その後９５℃（６０秒）、５８℃（６０秒）、７２℃（６０秒）のサイクルを３０サイクル回し、ＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ反応終了物を得た。
【００９０】
同様のピペットを用いてＰＣＲ反応終了物を、インベーダー試薬が収容されている試薬収容部に全量分注し３回ピペッティング（ポンピング）を行い混合した。その後同様のピペットを用いて酵素（クリベーズ）３μｌを抽出し、インベーダー試薬が収容されている試薬収容部に分注し３回ピペッティング（ポンピング）を行い混合し反応液とした。
【００９１】
得られた反応液を２０の反応部にそれぞれ２μｌづつ、同様のピペットを用いて分注した。その後、蒸発防止のためのミネラルオイルを２０の反応部にそれぞれ４μｌづつ、同様のピペットを用いて分注した。
【００９２】
インベーダー反応・検出は、９５℃５分でＤＮＡを変性させた後、６１℃４０分間インキュベートし、照射し検出した。反応・検出のための装置にはＡＢＩ７３００（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を用いた。
【００９３】
＜比較例１＞
窪みを有する試薬収容部を窪みを有さないものとした以外は実施例１と同様に行った。すなわち、８つの試薬収容部は全て開口部直径６ｍｍ、深さ５．２ｍｍで先端が半球状とし、ポリメラーゼ、酵素（クリベース）を含む６種類の試薬を実施例１と同様に入れた。
【００９４】
インベーダー検出の結果、実施例１のサンプルは、ホモ、ヘテロの検体とも、従来のチューブ内で行う反応と同様の良好な結果が得られた。すなわち反応効率が良かったことが示された。反応効率はPCR産物の量に依存するので、窪みにポリメラーゼがいることで最適の反応液組成で反応が進行したと推測される。
酵素は一般的にグリセロールなどの高沸点、高粘度の溶媒に溶けており、極微量の酵素が、収容部側面や蓋材の上面に付着してしまうと薄く濡れ広がり、通常遠心操作にかけないと底部に溶液を戻すことができない。しかし実施例１では窪みがある試薬収容部を用いることで酵素を含む試薬を強固に安定化させることができ、確実に他の試薬と混合することができるため、上記のような結果が得られたと思われる。また、微量の酵素を確実に回収できたため、所望の組成の反応液を混合することができたと思われる。
【００９５】
比較例１のサンプルは、あまり良好な結果が得られなかった。すなわち実施例１に比べ反応効率が低いことが示された。反応効率が低い原因として、振動を与えたことで、ポリメラーゼ、酵素（クリベース）が中央部から側面から上面に移動してしまい、それぞれ最適なＰＣＲ反応溶液組成、インベーダー反応液組成でなくなってしまったことに起因したと推測される。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】本発明の基板の一例を示す概略図である。
【図２】本発明の基板の一例を示す概略図である。
【図３】本発明の基板の一例を示す概略図である。
【図４】本発明の基板の一例を示す概略図である。
【図５】本発明の基板の一例を示す概略図である。
【図６】本発明の基板の一例を示す概略図である。
【図７】本発明の基板の一例を示す概略図である。
【図８】本発明の基板の一例を示す概略図である。
【図９】本発明の基板の一例を示す概略図である。
【符号の説明】
【００９７】
１      容器（チップ）
２      基板
３      試薬収納部
４      窪み
５      凸部
６      反応部
７      第二反応部（ＰＣＲ反応部（流路タイプ））
７（ａ）せり出し部
７（ｂ）下部フィルム
８      流路
【図１】
0004799187.tif 000002
【図２】
0004799187.tif 000003
【図３】
0004799187.tif 000004
【図４】
0004799187.tif 000005
【図５】
0004799187.tif 000006
【図６】
0004799187.tif 000007
【図７】
0004799187.tif 000008
【図８】
0004799187.tif 000009
【図９】
0004799187.tif 000010