(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エナメル質の表面に、菌と糖とを構成材料の一部とするバイオフィルムを形成し、白斑および／または白濁部を人工的に形成するホワイトスポットの形成方法であって、
エナメル質からなるホワイトスポット形成基材の表面に、コーティング材を積層するコーティング材積層工程と、
前記コーティング材の一部の領域を除去することにより、前記エナメル質の表面の一部が露出したエナメル質露出部を形成する露出部形成工程と、
前記エナメル質露出部において所定の細菌を培養することにより、人工的なバイオフィルムの形成を促すバイオフィルム形成工程と、
前記バイオフィルムの形成を開始した前記ホワイトスポット形成基材を、環境管理することにより、前記エナメル質露出部に白斑および／または白濁部を形成する脱灰工程と、を含むホワイトスポットの形成方法。
【請求項２】
さらに、脱灰工程の後に、
前記コーティング材を前記ホワイトスポット形成基材から除去するコーティング材除去工程、および／または、
前記バイオフィルムを前記ホワイトスポット形成基材から除去するバイオフィルム除去工程、を含むものである請求項１記載のホワイトスポットの形成方法。
【請求項３】
前記環境管理は、人工口腔装置において行なわれるものである請求項１または２記載のホワイトスポットの形成方法。
【請求項４】
前記人工口腔装置は、ｐＨメーターによりｐＨの変化を記録しつつ、温度、時間、及び、酸性度を自動制御するものである請求項３記載のホワイトスポットの形成方法。
【請求項５】
前記コーティング材は、パラフィンワックスである請求項１から４いずれか記載のホワイトスポットの形成方法。
【請求項６】
前記細菌は、ミュータンス菌を含むものである請求項１から５いずれか記載のホワイトスポットの形成方法。
【請求項７】
請求項１から６いずれか記載のホワイトスポットの形成方法により得られた歯科研究材料。
【請求項８】
請求項１から６いずれか記載のホワイトスポットの形成方法により得られたホワイトスポットを、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＱＬＦ）装置および／またはナノインデンターによって評価するホワイトスポットの評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホワイトスポットの形成方法、およびホワイトスポットを有する歯科研究材料に関する。より詳しくは、一様な形状（ｕｎｉｆｏｒｍ）のホワイトスポットを有するスタンダード試料を、短時間に、経済的に、且つ、再現性よく得ることができ、更に、得られる試料のホワイトスポット形成領域の周囲は健全な状態であるホワイトスポットの形成方法、および当該方法によって得られるホワイトスポットを有する歯科研究材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、う蝕の初期段階であるホワイトスポットは、種々のう蝕または脱灰の研究に利用されるばかりでなく、う蝕の発生および進行過程において、様々な研究情報を得るための研究材料として用いられてきた。ホワイトスポットとは、いわゆる初期う蝕の段階に発生する、目視では白斑状または白濁して観察される部位であり、適切な歯科処置、例えばフッ素処理等を施すことにより、再石灰化による健全な歯への回復可能性を有する部位である。
【０００３】
このような研究材料となるホワイトスポットを得る方法としては、これまで、試料のｐＨを低下させて酸性状態とし、更にバッファーを追加して酸性状態を一定期間維持することにより、エナメル質からリン酸とカルシウムを溶解（脱灰）させる方法が採用されてきた。また、この方法においては、脱灰させたくない領域をマニュキュアでコーティングして保護し、マニュキュアにより保護されていない領域（ウィンドウ）を、ホワイトスポットの形成領域としていた。
【０００４】
ところで、脱灰を引き起こす病原因子として、従来からバイオフィルムが注目されている（特許文献１参照）。「バイオフィルム」とは、菌と糖とを構成材料の一部とする、エナメル質の基材（歯）の上に形成される膜状の蓄積物である。バイオフィルムは、通常、う蝕の病原因子として捉えられており、口腔内では、バイオフィルムの直下のエナメル質に、う蝕の初期段階であるホワイトスポットが形成され、やがて、う蝕へと進行していく。
【０００５】
ここで、「バイオフィルム」の形成過程について、図１に基づいて説明する。先ず、バイオフィルムの形成にあたっては、エナメル質１上に、バイオフィルムの構成単位となる菌２が付着する（図１（Ａ））。次に、エナメル質１上において、菌２が増殖し、コロニーが形成される。この菌２で形成されるコロニーに、ショ糖や砂糖等の糖が供給されると、糖は菌２によって分解され、水あめのようなグルカン４に変化する。また、菌２はショ糖や砂糖等の糖の化学変化を起こし、酸を生成する。グルカン４は水に溶けないことから、菌２、その他の菌３、および酸を内部に取り込んで、エナメル質１上にバイオフィルムの形成を始める（図１（Ｃ））。引き続き、菌２によるグルカン４の形成が行なわれることにより、グルカン４は、菌２、その他の菌３、および酸を内部に保護する形で蓄積を続け、やがて、バイオフィルムが完成する（図１（Ｄ））。
【特許文献１】特開２００３−１１６５１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来から用いられている、試料のｐＨを低下させ、酸性状態としてホワイトスポットを得る方法によれば、ホワイトスポットが形成された研究用試料となるまでに、通常、１週間程度の時間が必要であった。また、得られる試料におけるホワイトスポット形成は、マニュキュアで保護した領域にまで及んでしまい、このため、ホワイトスポット形成領域の周囲に健全な歯を残すことには、困難を要していた。更には、得られる試料のホワイトスポット形成状況は、一様な形状（ｕｎｉｆｏｒｍ）とならず、研究にあたってのスタンダード資料を揃えることは、容易なことではなかった。
【０００７】
本発明は、以上のような課題に鑑みてなされたものであり、一様な形状（ｕｎｉｆｏｒｍ）のホワイトスポットを有するスタンダード試料を、短時間に、且つ、再現性よく得ることができ、更に、得られる試料のホワイトスポット形成領域の周囲は健全な状態であるホワイトスポットの形成方法、およびホワイトスポットを有する歯科研究材料を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を解決するため、ホワイトスポットの形成速度および形成一様化（ｕｎｉｆｏｒｍ）に着目して鋭意研究を重ねた。その結果、ホワイトスポット形成領域に、人工的にバイオフィルムを形成させることにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。
【０００９】
（１）  エナメル質の表面に、菌と糖とを構成材料の一部とするバイオフィルムを形成し、白斑および／または白濁部を人工的に形成するホワイトスポットの形成方法であって、エナメル質からなるホワイトスポット形成基材の表面に、コーティング材を積層するコーティング材積層工程と、前記コーティング材の一部の領域を除去することにより、前記エナメル質の表面の一部が露出したエナメル質露出部を形成する露出部形成工程と、前記エナメル質露出部において所定の細菌を培養することにより、人工的なバイオフィルムの形成を促すバイオフィルム形成工程と、前記バイオフィルムの形成を開始した前記ホワイトスポット形成基材を、環境管理することにより、前記エナメル質露出部に白斑および／または白濁部を形成する脱灰工程と、を含むホワイトスポットの形成方法。
【００１０】
（１）のホワイトスポットの形成方法によれば、エナメル質露出部に人工的にバイオフィルムを形成することにより、一様な形状（ｕｎｉｆｏｒｍ）のホワイトスポットを有するスタンダード試料を、短時間に、且つ、再現性よく得ることができる。また、バイオフィルムによれば、直下に形成されるホワイトスポットの形成時間が短いことから、ホワイトスポット形成領域の周囲を健全な状態で保つことが可能となる。更に、（１）のホワイトスポットの形成方法によれば、コーティング材の一部の領域のみを除去し、この領域にホワイトスポットが形成されるため、ホワイトスポットと健全部のコントラストが明瞭となる。このため、ホワイトスポットの評価を容易に行うことが可能となる。また、細菌を一種類のみ用いた場合であっても、ホワイトスポットを形成することが可能であることから、多種多様の試薬、培地等を準備する必要がなく、したがって、経済的にホワイトスポトを形成することが可能である。
【００１１】
（２）  さらに、脱灰工程の後に、前記コーティング材を前記ホワイトスポット形成基材から除去するコーティング材除去工程、および／または、前記バイオフィルムを前記ホワイトスポット形成基材から除去するバイオフィルム除去工程、を含むものである（１）記載のホワイトスポットの形成方法。
【００１２】
（２）のホワイトスポットの形成方法によれば、脱灰工程によりホワイトスポットが形成されたホワイトスポット形成基材から、コーティング材および／またはバイオフィルムを除去することによって、研究等に使用可能なスタンダード試料を容易に得ることができる。
【００１３】
（３）  前記環境管理は、人工口腔装置において行なわれるものである（１）または（２）記載のホワイトスポットの形成方法。
【００１４】
（３）のホワイトスポットの形成方法によれば、人工口腔装置によって環境管理を行なうため、同一条件の環境を容易に再現することが可能となる。したがって、一様な形状（ｕｎｉｆｏｒｍ）のホワイトスポットを有するスタンダード試料を、より確実に得ることが可能となる。
【００１５】
（４）  前記人工口腔装置は、ｐＨメーターによりｐＨの変化を記録しつつ、温度、時間、および、酸性度を自動制御するものである（３）記載のホワイトスポットの形成方法。
【００１６】
（４）のホワイトスポットの形成方法によれば、人工口腔装置によってｐＨの変化を記録しつつ、温度、時間、および、酸性度を自動制御することができる。したがって、同一条件の環境を容易に再現することが可能となるばかりでなく、例えば、睡眠中の口腔内の環境、食事直後の口腔内の環境等を、環境別に実現することが可能となる。これにより、様々な口腔環境における、口腔環境毎の一様な形状（ｕｎｉｆｏｒｍ）のホワイトスポットを有するスタンダード試料を、短時間に、再現性よく得ることができるため、う蝕制御分野の研究開発において、大きな貢献をもたらすことが可能となる。
【００１７】
（５）  前記コーティング材は、パラフィンワックスである（１）から（４）いずれか記載のホワイトスポットの形成方法。
【００１８】
（５）のホワイトスポットの形成方法によれば、コーティング材としてパラフィンワックスを使用することにより、従来から使用されてきたマニュキュア等と比較して、脱灰工程における耐久性をより向上することができる。このため、ホワイトスポット形成領域の周囲が健全な状態のままである試料を、より容易に得ることが可能となる。
【００１９】
（６）  前記細菌は、ミュータンス菌を含むものである（１）から（５）いずれか記載のホワイトスポットの形成方法。
【００２０】
（６）のホワイトスポットの形成方法によれば、バイオフィルム形成工程において培養される細菌として、ミュータンス菌を含むことにより、より容易に脱灰を発生させることが可能となる。したがって、短時間にホワイトスポットを形成することができる。
【００２１】
（７）  （１）から（６）いずれか記載のホワイトスポットの形成方法により得られた歯科研究材料。
【００２２】
（７）の歯科研究材料は、一様な形状（ｕｎｉｆｏｒｍ）のホワイトスポットを有し、更に、得られる試料のホワイトスポット形成領域の周囲は健全な状態である試料である。このため、（７）の歯科研究材料は、研究開発におけるスタンダード試料となりうる。
【００２３】
（８）  （１）から（６）いずれか記載のホワイトスポットの形成方法により得られたホワイトスポットを、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＱＬＦ）装置および／またはナノインデンターによって評価するホワイトスポットの評価方法。
【００２４】
（８）の評価方法に用いられるＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＱＬＦ）装置によれば、ホワイトスポット形成領域の深度（ΔＦ）および面積（ΔＱ）を評価することが可能となる。また、ナノインデンターによれば、ナノスケールの表面の硬度を評価することが可能となる。したがって、（８）の評価方法によれば、ホワイトスポット形成領域の状態を多角的に詳細に検討することが可能となる。また、同時に、健全領域について評価を実施することにより、ホワイトスポットの進行状態について、同一の試料から情報を得ることが可能となる。
【００２５】
（９）  エナメル質の表面に、菌と糖とを構成材料の一部とするバイオフィルムを形成し、当該バイオフィルムによって脱灰が行なわれることにより白斑および／または白濁部が形成された、ホワイトスポットを有する歯科研究材料。
【００２６】
（９）のホワイトスポットを有する歯科研究材料は、従来のバイオフィルムを形成しない状況でホワイトスポットを得る方法で得られた歯科研究材料と比較して、酸でのみ脱灰するのではなく、細菌の出す酵素、化学物質なども再現が可能である点で異なる。このため、（８）の歯科研究材料によれば、口腔内での脱灰のメカニズムをより正確に再現することができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のホワイトスポットの形成方法によれば、短時間に経済的にホワイトスポットを形成することができる。また、一様な形状（ｕｎｉｆｏｒｍ）のホワイトスポットが形成された試料を、再現性よく得ることができる。また、本発明のホワイトスポットの形成方法によれば、ホワイトスポットが形成された部分の周囲は、健全な状態である試料を得ることができる。したがって、本発明によって得られるホワイトスポットが形成された試料は、種々のう蝕、または脱灰の研究に利用可能なばかりでなく、う蝕の発生、および進行過程において、様々な研究情報を得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら説明する。尚、以下、共通する構成要素については、同一符号を付し、その説明を省略若しくは簡略化する。
【００２９】
＜ホワイトスポットの形成方法＞
図２から図７は、本発明の実施形態であるホワイトスポットの形成方法の工程図である。本実施形態においては、コーティング材積層工程（図２）、露出部形成工程（図３）、バイオフィルム形成工程（図４）、脱灰工程（図５）、コーティング材除去工程（図６）、バイオフィルム除去工程（図７）が存在する。以下、それぞれの工程を説明する。
【００３０】
［コーティング材積層工程］
図２は、コーティング材積層工程を示す図である。コーティング材積層工程とは、ホワイトスポット形成基材１０に、コーティング材１１を積層する工程である。
【００３１】
本発明のコーティング材積層工程における積層方法は、特に限定されるものではなく、使用するコーティング材の種類によって、従来公知の方法から適宜選択することができる。例えば、熱により塑性変形するコーティング材を使用する場合には、コーティング材を加熱処理した後に、ホワイトスポット形成基材に圧着処理する方法が挙げられる。また、液体状のコーティング材を使用する場合には、ホワイトスポット形成基材に塗布する方法が挙げられる。
【００３２】
〔ホワイトスポット形成基材〕
本発明に用いられるホワイトスポット形成基材の材料としては、エナメル質からなる材料であれば、特に限定されるものではない。牛歯、人歯等を挙げることができるが、実施条件を同一とするのが容易となる観点から、表面に起伏の少ない基材を選択することが望ましい。
【００３３】
〔ホワイトスポット形成基材の前処理工程〕
本発明の実施に用いられるホワイトスポット形成基材は、事前に、前処理工程を実施することが好ましい。前処理工程とは、ホワイトスポット形成基材の条件を揃える工程である。本発明に用いられるホワイトスポット形成基材の条件を揃えることにより、その他の条件も同一とすれば、より詳細な比較検討を行なうことが可能となる。
【００３４】
前処理工程においては、特に、ホワイトスポット形成基材の形状および／または表面粗さを調整しておくことが好ましい。表面粗さを調整する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、目の大きさの異なる複数種の耐水研磨紙を用いて、順次、小さな目となるよう研磨する方法を挙げることができる。更に、ダイヤモンドペースト等により調整することもできる。
【００３５】
〔コーティング材〕
本発明に用いられるコーティング材は、特に限定されるものではなく、従来公知のコーティング材を用いることも可能である。本発明においては、脱灰工程の環境が酸性となることから、酸性下において十分な耐性を有するものが好ましく、特に、パラフィンワックスシートが好ましい。市販品をそのまま使用することもでき、例えば、ＧＣ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の商品名ＧＣシートワックス等を挙げることができる。
【００３６】
パラフィンワックスシートは、厚みを有することから、エナメル質露出部にバイオフィルムの構成材料となる菌や液体を留めることが可能となる。また、加熱により容易にホワイトスポット形成基材に圧着することが可能であり、更に、切り抜き加工によって容易にエナメル質露出部を形成することができる点から、扱いやすい利点を有する。加えて、ホワイトスポット形成基材に何らの影響を与えることなく剥離することが可能であるため、健全なエナメル質をそのまま残すことができる。
【００３７】
［露出部形成工程］
図３は、露出部形成工程を示す図である。露出部形成工程とは、ホワイトスポット形成基材１０に積層されたコーティング材１１に、露出部形成具１２を用いて、エナメル質露出部１３（図４参照）を形成する工程である。
【００３８】
本発明の露出部形成工程における露出部形成方法としては、特に限定されるものではなく、使用するコーティング材の種類によって、従来公知の方法から適宜選択することができる。例えば、物理的操作によって開窓の作成が可能なコーティング材を使用する場合には、図３に示すように、円筒状等の開窓したい形状・大きさを有する露出部形成具１２をコーティング材に押し付けて、コーティング材をくり抜き切除する方法が挙げられる。また、化学的操作によって開窓が可能なコーティング材を使用する場合には、溶解等の化学的方法により、開窓したいコーティング材の領域を処理する方法が挙げられる。
【００３９】
［バイオフィルム形成工程］
図４は、バイオフィルム形成工程を示す図である。バイオフィルム形成工程とは、露出部形成工程で形成されたエナメル質露出部１３に、バイオフィルム１７の形成を促す工程である。
【００４０】
本発明のバイオフィルム形成工程におけるバイオフィルム形成方法は、特に限定されるものではない。例えば、バイオフィルムを形成することが知られている菌を用いて、当該菌により分解されてグルカンを生成する糖を与える方法を挙げることができる。
【００４１】
〔菌〕
本発明に用いることのできる菌は、特に限定されるものではなく、う蝕の初期段階であるホワイトスポットを形成できるものであればよい。本発明においては、例えば、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属等を挙げることができる。本発明においては、入手容易でう蝕を導き易い点から、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ（ＭＴ８１４８）を用いることが好ましい。
【００４２】
〔菌の事前培養工程〕
本発明においては、バイオフィルム形成工程および後述の脱灰工程で用いられる菌に、事前培養工程を実施することが好ましい。事前培養工程とは、用いる菌を増殖させる工程である。増殖能の優れた菌を用いることにより、短期間にバイオフィルムを形成することが可能となる。
【００４３】
事前培養の方法としては、特に限定されるものではなく、用いる菌の種類によって、従来公知の方法から適宜選択することが可能である。例えば、公知の液体培地によって培養する方法を挙げることができる。
【００４４】
〔唾液によるペリクル作成工程〕
本発明においては、バイオフィルム形成工程の前処理として、唾液によるペリクル作成工程を実施することが好ましい。唾液によるペリクル作成工程とは、露出部形成工程によって形成されたエナメル質露出部に、唾液に含まれるタンパク質由来の薄膜（ペリクル）を形成する工程である。口腔内においては、歯面はペリクルで覆われており、ペリクルは歯面に細菌を結びつける役割（リガンド）を果たしている。前処理としてペリクルを作成することにより、ホワイトスポット形成基材の表面に、細菌が初期付着しやすい状況となる。
【００４５】
唾液によるペリクル作成工程は、特に限定されるものではないが、ホワイトスポット作成条件を同一とする目的で、同一の条件にて実施することが望ましい。例えば、同一の条件で集めた唾液を遠心分離し、上清液をろ過等により精製し、引き続き、得られた精製だ液をエナメル質露出部に注入し、所定の期間安置する方法等を挙げることができる。
【００４６】
［脱灰工程］
図５は、脱灰工程を示す図である。脱灰工程とは、バイオフィルム形成工程でバイオフィルムの形成を開始したホワイトスポット形成基材１０を、環境管理する工程である。
【００４７】
本発明の脱灰工程における、バイオフィルムの形成が始まったホワイトスポット形成基材を環境管理する方法は、特に限定されるものではない。開いた系の中でも、また閉じた系の中でも行なうことが可能であるが、本発明においては、口腔環境と類似した環境下で管理することが好ましい。口腔環境と類似した環境を調整する方法としては、例えば、人工口腔装置を挙げることができる。
【００４８】
〔人工口腔装置〕
本発明のホワイトスポット形成方法において、環境管理に好適に用いられる人工口腔装置（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｍｏｕｔｈ  Ｓｙｓｔｅｍ：ＡＭＳ）について説明する。本発明で好適に用いられる人工口腔装置は、環境管理を行なうことのできるものであれば、特に限定されるものではない。市販の人工口腔装置を使用することも可能である。
【００４９】
図８は、人工口腔装置の例を示す図である。人工口腔装置２０は、内部にホルダー２１を備え、ホルダー２１の上部には、液体の滴下管２２を備える。また、ホルダー２１の内部には、平面ｐＨ電極（図示せず）を備えている。
【００５０】
人工口腔装置２０においては、ホルダー２１の内部に、円形のエナメル質露出部を有するホワイトスポット形成基材２３の複数個を固定する。ホルダー２１の上部に位置する滴下管２２からは、バイオフィルムの構成材料となる菌や糖を含む液体を、再現したい口腔環境に適合するように、連続的または非連続的に滴下する。また、このとき、人工口腔装置２０の内部の温度は、口腔環境にあわせた温度に設定する。
【００５１】
人工口腔装置２０においては、ホルダー２１の内部に備えられた平面ｐＨ電極（図示せず）によって、ｐＨの変化を記録しつつ、温度、滴下時間、酸性度を自動制御する。自動制御にあたっては、ソフトウェアを用いることが可能である。市販のソフトウェアとしては、例えば、プロセスコントローラーＥＰＣ−２０００を挙げることができる。
【００５２】
〔脱灰工程の中断について〕
本発明においては、脱灰工程は連続実施するのみならず、脱灰工程を一時中断し、ホワイトスポット形成基材についてデータの採取等を実施した後に、バイオフィルム形成工程および／または脱灰工程を再度実施することも可能である。これにより、時間経過や環境変化等の履歴を追いつつ、脱灰の程度を確認することができる。
【００５３】
［コーティング材除去工程］
図６は、コーティング材除去工程を示す図である。コーティング材除去工程とは、脱灰工程を経たホワイトスポット形成基材１０から、コーティング材１１を除去する工程である。
【００５４】
本発明のコーティング材除去工程におけるコーティング材の除去方法は、特に限定されるものではなく、使用するコーティング材の種類によって、従来公知の方法から適宜選択することができる。例えば、物理的操作によって剥離可能なコーティング材を使用する場合には、コーティング材に外部から力を加えて、ホワイトスポット形成基材からコーティング材を剥離する方法が挙げられる。また、化学的操作によって除去できるコーティング材を使用する場合には、例えば、溶解等の化学的方法により、コーティング材を除去処理する方法が挙げられる。これらの中では、コーティング材除去工程によってホワイトスポット形成基材が傷つくことがない等、できる限り基材に影響を及ぼさない方法を選択することが望ましい。
【００５５】
［バイオフィルム除去工程］
図７は、バイオフィルム除去工程を示す図である。バイオフィルム除去工程とは、脱灰工程を経たホワイトスポット形成基材１０から、バイオフィルム１７を除去する工程である。
【００５６】
本発明のバイオフィルム除去工程におけるバイオフィルムの除去方法は、特に限定されるものではない。バイオフィルムがホワイトスポット形成基材から除去できる方法であれば、物理的操作によっても、また、化学的操作によってもよい。物理的操作によってバイオフィルムを除去する場合には、例えば、外部から力を加えて、バイオフィルムを破壊する方法を挙げることができる。また、化学的操作によってバイオフィルムを除去する場合には、例えば、バイオフィルムが溶解する溶剤で処理する等の方法を挙げることができる。
【００５７】
＜歯科研究材料＞
本発明の歯科研究材料は、エナメル質の表面に人工的なバイオフィルムが形成され、当該バイオフィルムによって脱灰が行なわれることにより、白斑および／または白濁部が形成されたホワイトスポットを有するものである。本発明の歯科研究材料は、同一の条件下にてホワイトスポットを得ることが可能となるため、一様な形状（ｕｎｉｆｏｒｍ）のホワイトスポットを有する。また、脱灰に要する時間が短時間であることから、得られる試料のホワイトスポット形成領域の周囲は健全な状態である。したがって、本発明の歯科研究材料によれば、試料間における比較検討が容易であり、また、同一試料における健全部とホワイトスポット形成領域との比較検討を容易に実施することが可能となる。
【００５８】
＜ホワイトスポットの評価方法＞
本発明で得られるホワイトスポットの評価方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＱＬＦ）装置および／またはナノインデンターを用いた評価方法を挙げることができる。Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＱＬＦ）装置によれば、ホワイトスポット形成領域の深度（ΔＦ）および面積（ΔＱ）を評価することが可能となり、ナノインデンターによれば、ナノスケールの表面の硬度を評価することが可能となる。これらの評価方法によれば、ホワイトスポット形成領域の状態を多角的に詳細に検討することが可能となり、また、同時に、健全領域について評価を実施することにより、ホワイトスポットの進行状態について、同一の試料から情報を得ることが可能となる。
【実施例】
【００５９】
次に、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００６０】
＜実施例１＞
牛歯のエナメル質を用いて、本発明のホワイトスポットの形成方法を実施した。尚、以下のすべての実験はｎ＝５で、三回繰り返した。
【００６１】
［ホワイトスポット形成基材の準備］
エナメル質からなる材料として、牛の前歯の唇側面を準備し、牛の前歯一本につき、４．０×４．０ｍｍ、厚さ２．０ｍｍの試料を４個ずつ作製した。作製した試料を、＃１０００、＃１２００、＃１５００の３種類の耐水研磨紙を用いて研削し、引き続き、１μｍダイヤモンドペーストを用いて、表面粗さ（Ｒａ値）が約０．５０となるまで研磨を実施し、ホワイトスポット形成基材を得た。
【００６２】
［コーティング材積層工程］
厚さ約１ｍｍのパラフィンワックスシート（商品名：ＧＣシートワックス、医療用具許可番号：１０ＢＺ００１７号、ＧＣ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）の表面を熱して、上記で得られたホワイトスポット形成基材の表面に圧着した。引き続き、ホワイトスポット形成基材の周囲を、ワックススパチュラを用いて焼き付けることにより、パラフィンワックスシートが積層されたホワイトスポット形成基材を得た。
【００６３】
［露出部形成工程］
露出部形成具として、ピペットのチップの先を直径２．５ｍｍとなるように切り取ったものを準備した。準備したピペットを、上記のパラフィンワックスシートが積層されたホワイトスポット形成基材のパラフィンワックスシートの中央部に押し付けて開窓し、直径２．５ｍｍの略円形状のエナメル質露出部が形成されたホワイトスポット形成基材を得た。
【００６４】
［唾液によるペリクルの作成］
同一の条件で集めた唾液を、コンパクト高速冷却遠心機（６５００、株式会社クボタ製）を用いて遠心分離（１５，０００ｒｐｍ）し、上清液を０．２２μｍＣＡフィルターによりろ過した。引き続き、上記で得られたエナメル質露出部を有するホワイトスポット形成基材の上に、ろ液を注入し、３０分間安置することにより、エナメル質露出部の表面に、ペリクルを作製した。
【００６５】
［菌の準備］
細菌として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ（ＭＴ８１４８）を準備し、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）液体培地によって、３７度で約１６時間培養した。引き続き、集菌の後、リン酸緩衝生理食塩水液（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ：ＰＢＳ）によって洗菌した後、同緩衝液（ＰＢＳ）によって、ＯＤ５００＝２となるように再縣濁し、ＭＴ８１４８懸濁液を得た。
【００６６】
［バイオフィルム形成工程］
上記で得られた、エナメル質露出部にペリクルを有するホワイトスポット形成基材を、人工口腔装置（Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｍｏｕｔｈ  Ｓｙｓｔｅｍ：ＡＭＳ）のテフロン（登録商標）製ホルダーの内部に、ユーティリティーワックスを用いて固定した。また、ウォータージャケットの内部を、３７℃に設定した。エナメル質露出部に、上記で得られたＭＴ８１４８懸濁液と、１％のスクロースを含有したハートインフュージョン（ＨＩ）と、ＰＢＳと、を連続的に滴下することにより、人工口腔装置の中で人工バイオフィルムを形成させた。
【００６７】
［脱灰工程］
人工口腔装置（ＡＭＳ）のテフロン（登録商標）製ホルダーの内部に備えられた、平面ｐＨ電極を用いて、ｐＨを連続的に記録しつつ、ＭＴ８１４８懸濁液と、１％のスクロースを含有したハートインフュージョン（ＨＩ）と、ＰＢＳと、を連続的に滴下し続けた。このときの滴下速度は２４μＬ／ｈｒ、懸濁液：ＨＩ：ＰＢＳ＝１：２：１とした。バイオフィルムの形成に伴って、ｐＨが４．０付近まで低下するのを待って、滴下を終了した。このときの滴下時間は、２０時間であった。
【００６８】
［コーティング材除去工程］
人工口腔装置（ＡＭＳ）から試料を取り出し、ＰＢＳにて洗浄した。その後、コーティング材として使用したパラフィンワックスシートを、ホワイトスポット形成基材から剥離した。パラフィンワックスシートの剥離によって、試料には何の影響もないことを確認した。
【００６９】
［バイオフィルム除去工程］
パラフィンワックスシートが剥離された試料を、０．５Ｎ水酸化ナトリウム溶液で処理することにより、基材上に形成されたバイオフィルムの除去を行なった。バイオフィルムが形成されていた領域には、ホワイトスポットが形成されていることを確認した。
【００７０】
［測定・評価］
得られたホワイトスポットを有する試料につき、以下の各種の測定・評価を実施した。
【００７１】
〔脱灰（ホワイトスポット形成）の程度〕
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（商品名：ＱＬＦ−ＴＭ、Ｉｎｓｐｅｃｔｏｒ  Ｄｅｎｔａｌ  Ｃａｒｅ  ＢＶ社製、以下ＱＬＦともいう）装置を用いて、得られたホワイトスポットにつき観察および測定を行なった。ＱＬＦによる写真を図９に示す。また、深度ΔＦ（％）の測定結果を図１０に、面積ΔＱ（％）の測定結果を図１１に示す。
【００７２】
〔ホワイトスポットの断面の観察〕
得られたホワイトスポットの断面につき、電子顕微鏡（ＳＥＭ、商品名：ＪＸＡ−８４０、日本電子株式会社製）による拡大観察を行い、ホワイトスポットの形成状況を確認した。観察にあたっては、先ず、試料を切断し、アルゴンにてエッチング処理を施した。得られたＳＥＭ写真を図１２から図１６に示す。
【００７３】
図１２は、ホワイトスポット断面の全体写真である。図１２に示されるように、ホワイトスポット形成領域（ＷＳＬで図示）は、エナメル質の表面から１０μｍ強の深さの範囲に形成されている。また、ホワイトスポット形成領域（ＷＳＬで図示）の下部には、エナメルプリズムが発生していることが鮮明にうかがえる。
【００７４】
図１３は、ホワイトスポット形成領域（ＷＳＬ）とエナメルプリズムとの境界部分の拡大写真である。図１３に示される写真からは、タンパク質を失って形成される空間が、エナメルプリズムの格子を剥離させつつ進んでいく様子がうかがえる。
【００７５】
図１４および図１５は、剥離されつつあるエナメルプリズムの拡大写真である。図１４に示される写真からは、ホワイトスポット形成の進行により、エナメルプリズムがトンネル様の構造（Ｔｕｎｎｅｌ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）になっている様子がうかがえる。また、図１５に示される写真からは、ホワイトスポット形成の進行により、トンネル様構造の末端に、三角形の空隙が発生している様子がうかがえる。
【００７６】
図１６は、トンネル様の構造（Ｔｕｎｎｅｌ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）となったエナメルプリズムの末端の拡大写真である。図１６に示される写真には、トンネル様構造のエナメルプリズム末端に、菌が到達した様子がうかがえる。
【００７７】
〔表面硬度〕
ナノスケールでの表面の物理的な物性（表面硬度）の変化につき、ナノインデンター（Ｎａｎｏｉｎｄｅｎｔｅｒ、商品名：ＥＮＴ−１１００、株式会社エリオニクス製）を用いて測定を実施した。ホワイトスポット形成領域（ＷＳＬ）の測定結果を図１７に、周囲の健全領域（Ｎｏｒｍａｌ）の測定結果を図１８に示す。図１７および図１８は、横軸にサンプル名、縦軸に強度をプロットしたものである。また、ホワイトスポット形成領域（ＷＳＬ）および周囲の健全領域（Ｎｏｒｍａｌ）の強度の測定結果の平均値を表１に示す。
【表１】
0004820986.tif 000002
【００７８】
＜実施例２＞
実施例１における、ＭＴ８１４８懸濁液と、１％のスクロースを含有したハートインフュージョン（ＨＩ）と、ＰＢＳと、の滴下時間を３０時間に延長した以外は、実施例１と同様の操作によって、ホワイトスポットが形成された試料を得た。
【００７９】
得られた試料の脱灰（ホワイトスポット形成）の程度につき、実施例１と同様に、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＱＬＦ）装置を用いて、観察および測定を行なった。ＱＬＦによる写真を図１９に示す。また、深度ΔＦ（％）の測定結果を図１０に、面積ΔＱ（％）の測定結果を図１１に示す。また、得られた試料の表面硬度につき、実施例１と同様に、ナノインデンターを用いて測定を行なった。結果を図１７、図１８、および表１に示す。
【００８０】
＜実施例３＞
実施例１における、ＭＴ８１４８懸濁液と、１％のスクロースを含有したハートインフュージョン（ＨＩ）と、ＰＢＳと、の滴下時間を４０時間に延長した以外は、実施例１と同様の操作によって、ホワイトスポットが形成された試料を得た。
【００８１】
得られた試料の脱灰（ホワイトスポット形成）の程度につき、実施例１と同様に、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＱＬＦ）装置を用いて、観察および測定を行なった。ＱＬＦによる写真を図２０に示す。また、深度ΔＦ（％）の測定結果を図１０に、面積ΔＱ（％）の測定結果を図１１に示す。また、得られた試料の表面硬度につき、実施例１と同様に、ナノインデンターを用いて測定を行なった。結果を図１７、図１８、および表１に示す。
【００８２】
図９（脱灰工程：２０時間）、図１９（脱灰工程：３０時間）、及び、図２０（脱灰工程：４０時間）の一連の写真に示されるように、脱灰工程が長時間にわたるほど、脱灰が深く、また体積が大きくなる（ΔＦ：深さ、ΔＱ：体積）ことが判る。
【００８３】
図１０に示されるように、脱灰の深度（ΔＦ）は、脱灰工程が長時間にわたるほど大きくなり、より深いホワイトスポットが形成されていることが判る。また、図１１に示されるように、脱灰の面積（ΔＱ）は、脱灰工程が長時間にわたるほど大きくなり、より広い範囲でのホワイトスポットが形成されていることが判る。
【００８４】
図１７、図１８、および表１に示されるように、ホワイトスポット形成領域の表面の強度は、脱灰工程が長時間にわたるほど小さくなり、表面が柔らかくなっていることが判る。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明のホワイトスポットの形成方法によれば、一様な形状（ｕｎｉｆｏｒｍ）のホワイトスポットを有するスタンダードとなる試料を、短時間に、経済的に、且つ、再現性よく得ることができ、更に、得られる試料のホワイトスポット形成領域の周囲は健全な状態となる。したがって、本発明のホワイトスポットの形成方法により得られるスタンダード試料を用いれば、従来よりも効率的に、う蝕の発生および進行過程等における様々な研究を行なうことができることから、本発明は、う蝕制御分野および口腔製品開発に大きな発展をもたらす一助となりうる。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】バイオフィルムの形成工程を示す図である。
【図２】コーティング材積層工程を示す図である。
【図３】露出部形成工程を示す図である。
【図４】バイオフィルム形成工程を示す図である。
【図５】脱灰工程を示す図である。
【図６】コーティング材除去工程を示す図である。
【図７】バイオフィルム除去工程を示す図である。
【図８】人工口腔装置の例を示す図である。
【図９】滴下時間が２０時間の場合のＱＬＦによる写真である。
【図１０】ＱＬＦによるΔＦを示す図である。
【図１１】ＱＬＦによるΔＱを示す図である。
【図１２】ホワイトスポット断面の全体写真である。
【図１３】ホワイトスポット形成領域（ＷＳＬ）とエナメルプリズムとの境界部分の拡大写真である。
【図１４】剥離されつつあるエナメルプリズムの拡大写真である。
【図１５】剥離されつつあるエナメルプリズムの別の拡大写真である。
【図１６】トンネル様の構造となったエナメルプリズムの末端の拡大写真である。
【図１７】ナノインデンメーターによるホワイトスポット形成領域の測定結果を示す図である。
【図１８】ナノインデンメーターによる健全領域の測定結果を示す図である。
【図１９】滴下時間が３０時間の場合のＱＬＦによる写真である。
【図２０】滴下時間が４０時間の場合のＱＬＦによる写真である。
【符号の説明】
【００８７】
１    エナメル質
２    菌
３    その他の菌
４    グルカン
１０  ホワイトスポット形成基材
１１  コーティング材
１２  露出部形成具
１３  エナメル質露出部
１４  菌
１５  糖
１６  グルカン
１７  バイオフィルム
１８  ホワイトスポット
２０  人工口腔装置
２１  ホルダー
２２  滴下管
２３  ホワイトスポット形成基材
【図１】
0004820986.tif 000003
【図２】
0004820986.tif 000004
【図３】
0004820986.tif 000005
【図４】
0004820986.tif 000006
【図５】
0004820986.tif 000007
【図６】
0004820986.tif 000008
【図７】
0004820986.tif 000009
【図８】
0004820986.tif 000010
【図９】
0004820986.tif 000011
【図１０】
0004820986.tif 000012
【図１１】
0004820986.tif 000013
【図１２】
0004820986.tif 000014
【図１３】
0004820986.tif 000015
【図１４】
0004820986.tif 000016
【図１５】
0004820986.tif 000017
【図１６】
0004820986.tif 000018
【図１７】
0004820986.tif 000019
【図１８】
0004820986.tif 000020
【図１９】
0004820986.tif 000021
【図２０】
0004820986.tif 000022