(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素を用いた核酸の合成反応において、生成するピロリン酸の不溶性塩を指標として核酸合成の有無を検出する方法。
【請求項２】
ポリヌクレオチド鎖上の標的領域を増幅し、増幅反応に伴い生成するピロリン酸の不溶性塩を指標として核酸増幅の有無を検出する方法。
【請求項３】
増幅が、以下の工程：
（a）ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の3'末端から当該ポリヌクレオチド鎖の3'末端方向に向かって順に第1の任意配列F1c、第2の任意配列F2c及び第3の任意配列F3cをそれぞれ選択し、標的領域の5'末端から当該ヌクレオチド鎖の5'末端方向に向かって順に第4の任意配列R1、第5の任意配列R2及び第6の任意配列R3をそれぞれ選択し、
（b）前記F2cに対し相補的な配列F2及び該F2の5'側に前記F1cと同一の配列を含むプライマー、前記F3cに対し相補的な配列F3を含むプライマー、前記R2と同一の配列及び該配列の5'側に前記R1に対し相補的な配列R1cを含むプライマー、並びに前記R3と同一の配列を含むプライマーをそれぞれ調製し、
（c）前記ヌクレオチド鎖を鋳型として、鎖置換型ポリメラーゼ、前記プライマー、基質及び緩衝液の存在下でDNA合成反応を行うこと、
により行われるものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
増幅が、以下の工程：
（a）ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の3'末端から当該ポリヌクレオチド鎖の3'未端方向に向かって順に第1の任意配列F1c及び第2の任意配列F2cをそれぞれ選択し、標的領域の5'末端から当該ヌクレオチド鎖の5'末端方向に向かって順に第3の任意配列R1及び第4の任意配列R2をそれぞれ選択し、
（b）前記F2cに対し相補的な配列F2及び該F2の5'側に前記F1cと同一の配列を含むプライマー、並びに前記R2と同一の配列及び該配列の5'側に前記R1に対し相補的な配列R1cを含むプライマーをそれぞれ調製し、
（c）前記ヌクレオチド鎖を増幅用鋳型として、鎖置換型ポリメラーゼ、前記プライマー、基質及び緩衝液の存在下でDNA合成反応を行うこと、
により行われるものである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
融解温度調整剤の存在下でDNA合成反応を行う、請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
融解温度調整剤が、ベタイン、トリメチルアミンN-オキシド、プロリン、ジメチルスルホキシド及びホルムアミドのいずれかである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ピロリン酸の不溶性塩を指標とする検出が、濁度の測定又は沈殿の検出によるものである、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
濁度の測定又は沈殿の検出が、さらに凝集剤を加えて行うものである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
凝集剤が、ポリアクリル酸又はカルボキシメチルデキストランである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ポリヌクレオチド鎖上の標的領域を増幅し、増幅反応に伴い生成するピロリン酸の不溶性塩を経時的に検出することを特徴とする核酸増幅反応のモニタリング方法。
【請求項１１】
増幅が、以下の工程：
（a）ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の3'末端から当該ポリヌクレオチド鎖の3'末端方向に向かって順に第1の任意配列F1c、第2の任意配列F2c及び第3の任意配列F3cをそれぞれ選択し、標的領域の5'末端から当該ヌクレオチド鎖の5'末端方向に向かって順に第4の任意配列R1、第5の任意配列R2及び第6の任意配列R3をそれぞれ選択し、
（b）前記F2cに対し相補的な配列F2及び該F2の5'側に前記F1cと同一の配列を含むプライマー、前記F3cに対し相補的な配列F3を含むプライマー、前記R2と同一の配列及び該配列の5'側に前記R1に対し相補的な配列R1cを含むプライマー、並びに前記R3と同一の配列を含むプライマーをそれぞれ調製し、
（c）前記ヌクレオチド鎖を鋳型として、鎖置換型ポリメラーゼ、前記プライマー、基質及び緩衝液の存在下でDNA合成反応を行うこと、
により行われるものである、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
増幅が、以下の工程：
（a）ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の3'末端から当該ポリヌクレオチド鎖の3'末端方向に向かって順に第1の任意配列F1c及び第2の任意配列F2cをそれぞれ選択し、標的領域の5'末端から当該ヌクレオチド鎖の5'末端方向に向かって順に第3の任意配列R1及び第4の任意配列R2をそれぞれ選択し、
（b）前記F2cに対し相補的な配列F2及び該F2の5'側に前記F1cと同一の配列を含むプライマー、並びに前記R2と同一の配列及び該配列の5'側に前記R1に対し相補的な配列R1cを含むプライマーをそれぞれ調製し、
（c）前記ヌクレオチド鎖を増幅用鋳型として、鎖置換型ポリメラーゼ、前記プライマー、基質及び緩衝液の存在下でDNA合成反応を行うこと、
により行われるものである、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
融解温度調整剤の存在下でDNA合成反応を行う、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
融解温度調整剤が、ベタイン、トリメチルアミンN-オキシド、プロリン、ジメチルスルホキシド及びホルムアミドのいずれかである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ピロリン酸の不溶性塩を指標とする検出が、濁度の測定によるものである、請求項１０〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
濁度の測定が、さらに凝集剤を加えて行うものである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
凝集剤が、ポリアクリル酸又はカルボキシメチルデキストランである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
以下の要素を含む、核酸増幅の有無の検出用又は核酸増幅反応のモニタリング用キット。
（a）ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の3'末端から当該ポリヌクレオチド鎖の3'末端方向に向かって順に第1の任意配列F1c、第2の任意配列F2c及び第3の任意配列F3cをそれぞれ選択し、標的領域の5'末端から当該ヌクレオチド鎖の5'末端方向に向かって順に第4の任意配列R1、第5の任意配列R2及び第6の任意配列R3をそれぞれ選択した場合、前記F2cに対し相補的な配列F2及び該F2の5'側に前記F1cと同一の配列を含むプライマー、前記F3cに対し相補的な配列F3を含むプライマー、前記R2と同一の配列及び該配列の5'側に前記R1に対し相補的な配列R1cを含むプライマー、並びに前記R3と同一の配列を含むプライマー、
（b）鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼ、
（c）要素(b)の基質となるヌクレオチド、
（d）融解温度調整剤、並びに
（e）凝集剤。
【請求項１９】
以下の要素を含む、核酸増幅の有無の検出用又は核酸増幅反応のモニタリング用キット。
（a）ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の3'末端から当該ポリヌクレオチド鎖の3'末端方向に向かって順に第1の任意配列F1c及び第2の任意配列F2cをそれぞれ選択し、標的領域の5'末端から当該ヌクレオチド鎖の5'末端方向に向かって順に第3の任意配列R1及び第4の任意配列R2をそれぞれ選択した場合、前記F2cに対し相補的な配列F2及び該F2の5'側に前記F1cと同一の配列を含むプライマー、並びに前記R2と同一の配列及び該配列の5'側に前記R1に対し相補的な配列R1cを含むプライマー、
（b）鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼ、
（c）要素(b)の基質となるヌクレオチド、
（d）融解温度調整剤、並びに
（e）凝集剤。
【請求項２０】
融解温度調整剤が、ベタイン、トリメチルアミンN-オキシド、プロリン、ジメチルスルホキシド及びホルムアミドのいずれかであり、凝集剤が、ポリアクリル酸又はカルボキシメチルデキストランである、請求項１８又は１９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、核酸増幅の有無を検出する方法に関する。
背景技術
核酸塩基配列の相補性に基づく分析方法は、遺伝的な特徴を直接的に分析することが可能である。そのため、当該分析方法は遺伝的疾患、癌化、微生物の識別等には非常に有力な手段である。また、遺伝子そのものを検出対象とするために、例えば培養のような時間と手間のかかる操作を省略できる場合もある。
しかしながら、試料中に存在する目的の遺伝子量が少ない場合の検出は一般に容易ではなく、標的遺伝子そのものを、あるいは検出シグナル等を増幅することが必要となる。
核酸増幅反応において、増幅の有無を検出する最も一般的な方法は、増幅反応後の溶液をアガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイド等の蛍光インターカレーターを増幅産物に結合させて特異的な蛍光を観察するというものである。他のＤＮＡが混在するおそれがなく、増幅産物の有無のみを知りたい場合には、電気泳動を省略して増幅反応後の溶液に蛍光インターカレーターを加えて蛍光を観察することも可能である。これらの方法は簡便であるが、蛍光を観察するためのＵＶランプと暗室が必要である。
蛍光色素をはじめとする各種標識物質で標識したプライマーやヌクレオチドを用いて増幅反応を行い、増幅産物に取り込まれた標識を観察する方法もあるが、増幅産物に取り込まれなかったフリーの標識プライマー（あるいはヌクレオチド）を分離する操作が必要であり、反応液量が微量である遺伝子増幅反応には適さない。また、標識プライマーやヌクレオチドは高価である。
発明の開示
本発明は、核酸増幅の有無を検出する方法を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、核酸増幅反応に伴い生成する不溶性物質を指標とすることにより、簡便且つ高感度に核酸増幅の有無を検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、酵素を用いた核酸の合成反応において、生成する不溶性物質を指標として核酸合成の有無を検出する方法である。さらに、本発明は、ポリヌクレオチド鎖上の標的領域を増幅し、増幅反応に伴い生成する不溶性物質を指標として核酸増幅の有無を検出する方法である。前記不溶性物質を指標とする検出は、濁度の測定又は沈殿の検出によるものであり得る。濁度の測定又は沈殿の検出は、凝集剤（例えば、ポリアクリル酸、カルボキシメチルデキストラン）を加えて行うものであり得る。
増幅方法としては、以下の工程：
（ａ）ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の３’末端から当該ポリヌクレオチド鎖の３’末端方向に向かって順に第１の任意配列Ｆ１ｃ、第２の任意配列Ｆ２ｃ及び第３の任意配列Ｆ３ｃをそれぞれ選択し、標的領域の５’末端から当該ヌクレオチド鎖の５’末端方向に向かって順に第４の任意配列Ｒ１、第５の任意配列Ｒ２及び第６の任意配列Ｒ３をそれぞれ選択し、
（ｂ）前記Ｆ２ｃに対し相補的な配列Ｆ２及び該Ｆ２の５’側に前記Ｆ１ｃと同一の配列を含むプライマー、前記Ｆ３ｃに対し相補的な配列Ｆ３を含むプライマー、前記Ｒ２と同一の配列及び該配列の５’側に前記Ｒ１に対し相補的な配列Ｒ１ｃを含むプライマー、並びに前記Ｒ３と同一の配列を含むプライマーをそれぞれ調製し、
（ｃ）前記ヌクレオチド鎖を鋳型として、鎖置換型ポリメラーゼ、前記プライマー、基質及び緩衝液の存在下でＤＮＡ合成反応を行うこと、
により行われるものが挙げられる。上記方法をＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）という。
また、上記ＬＡＭＰ法とは別の態様のＬＡＭＰ法、すなわち以下の工程：
（ａ）ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の３’末端から当該ポリヌクレオチド鎖の３’末端方向に向かって順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃをそれぞれ選択し、標的領域の５’末端から当該ヌクレオチド鎖の５’末端方向に向かって順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２をそれぞれ選択し、
（ｂ）前記Ｆ２ｃに対し相補的な配列Ｆ２及び該Ｆ２の５’側に前記Ｆ１ｃと同一の配列を含むプライマー、並びに前記Ｒ２と同一の配列及び該配列の５’側に前記Ｒ１に対し相補的な配列Ｒ１ｃを含むプライマーをそれぞれ調製し、
（ｃ）前記ヌクレオチド鎖を増幅用鋳型として、鎖置換型ポリメラーゼ、前記プライマー、基質及び緩衝液の存在下でＤＮＡ合成反応を行うこと、
により増幅することもできる。
前記工程（ｃ）のＤＮＡ合成反応は、融解温度調製剤（例えば、ベタイン、トリメチルアミンＮ−オキシド、プロリン、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド）の存在下で行われ得る。
さらに、本発明は、ポリヌクレオチド鎖上の標的領域を増幅し、増幅反応に伴い生成する不溶性物質を経時的に検出することを特徴とする核酸増幅反応のモニタリング方法である。増幅は、例えば前記ＬＡＭＰ法により行うことができる。  さらに、本発明は、以下の要素を含む核酸増幅の有無の検出用又は核酸増幅反応のモニタリング用キットである。
（ａ）ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の３’末端から当該ポリヌクレオチド鎖の３’末端方向に向かって順に第１の任意配列Ｆ１ｃ、第２の任意配列Ｆ２ｃ及び第３の任意配列Ｆ３ｃをそれぞれ選択し、標的領域の５’末端から当該ヌクレオチド鎖の５’末端方向に向かって順に第４の任意配列Ｒ１、第５の任意配列Ｒ２及び第６の任意配列Ｒ３をそれぞれ選択した場合、前記Ｆ２ｃに対し相補的な配列Ｆ２及び該Ｆ２の５’側に前記Ｆ１ｃと同一の配列を含むプライマー、前記Ｆ３ｃに対し相補的な配列Ｆ３を含むプライマー、前記Ｒ２と同一の配列及び該配列の５’側に前記Ｒ１に対し相補的な配列Ｒ１ｃを含むプライマー、並びに前記Ｒ３と同一の配列を含むプライマー、
（ｂ）鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼ、
（ｃ）要素（ｂ）の基質となるヌクレオチド、
（ｄ）融解温度調整剤（例えば、ベタイン、トリメチルアミンＮ−オキシド、プロリン、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド）、並びに
（ｅ）凝集剤（例えば、ポリアクリル酸、カルボキシメチルデキストラン）、
さらに、本発明は、以下の要素を含む核酸増幅の有無の検出又は核酸増幅反応のモニタリング用キットである。
（ａ）ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の３’末端から当該ポリヌクレオチド鎖の３’末端方向に向かって順に第１の任意配列Ｆ１ｃ及び第２の任意配列Ｆ２ｃをそれぞれ選択し、標的領域の５’末端から当該ヌクレオチド鎖の５’末端方向に向かって順に第３の任意配列Ｒ１及び第４の任意配列Ｒ２をそれぞれ選択した場合、前記Ｆ２ｃに対し相補的な配列Ｆ２及び該Ｆ２の５’側に前記Ｆ１ｃと同一の配列を含むプライマー、並びに前記Ｒ２と同一の配列及び該配列の５’側に前記Ｒ１に対し相補的な配列Ｒ１ｃを含むプライマー、
（ｂ）鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼ、
（ｃ）要素（ｂ）の基質となるヌクレオチド、
（ｄ）融解温度調整剤（例えば、ベタイン、トリメチルアミンＮ−オキシド、プロリン、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド）、並びに
（ｅ）凝集剤（例えば、ポリアクリル酸、カルボキシメチルデキストラン）
なお、本発明に用いるプライマーを構成する塩基配列の特徴付けのために用いられる同一、あるいは相補的という用語は、いずれも完全に同一、あるいは完全に相補的であることを意味しない。すなわち、ある配列と同一とは、ある配列に対してアニールすることができる塩基配列に対して相補的な配列をも含むことができる。他方、相補的とは、ストリンジェントな条件下でアニールすることができ、相補鎖合成の起点を提供することができる配列を意味する。本発明において、同一とは、塩基配列の相同性が、例えば９０％以上、通常９５％以上、より好ましくは９８％以上であることをいう。また、相補的とは、相補配列と同一の塩基配列を意味する。すなわち、相補配列に対して、塩基配列の相同性が、例えば９０％以上、通常９５％以上、より好ましくは９８％以上であるときに相補的ということができる。なお、相補的な塩基配列は、それが相補鎖合成の起点として機能するときに、その３’末端の少なくとも１塩基が、相補配列に完全に一致することが望ましい。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ポリヌクレオチド鎖上の標的領域を合成又は増幅した後、合成反応又は増幅反応に伴い生成する不溶性物質の存在を検出し、核酸増幅の有無を関連づけることを特徴とするものである。
１．検出対象
本発明の検出対象は、水に不溶性のピロリン酸塩の全てである。ピロリン酸はヌクレオチドが核酸鎖の末端に取り込まれる際に生成する。なお、本明細書中において「ピロリン酸」と「ピロリン酸イオン」とは同義として使用される。ピロリン酸と不溶性の塩を形成する物質のうち、マグネシウムイオンはポリメラーゼに必須であるので、ピロリン酸マグネシウムはこの検出に好適である。ピロリン酸マグネシウム以外のピロリン酸塩を検出対象とする場合は、ピロリン酸と不溶性の塩を形成させるための物質の添加方法に工夫が必要である。すなわち、ポリメラーゼに対して阻害効果を持たないかあるいは阻害効果が弱い物質は、増幅前に予め添加しておくことが可能である。また、ポリメラーゼを強く阻害する物質でも、阻害効果を現さない程度に少量であれば、同様に増幅前に添加しておくことが可能である。ポリメラーゼを強く阻害する物質を多量に添加したい場合は、それを増幅後の反応液に添加することによって同様の検出を行うことができる、このようなピロリン酸マグネシウム以外の検出対象としては、ピロリン酸カルシウム、ピロリン酸バリウム、ピロリン酸鉛等が挙げられる。
本発明においてポリヌクレオチドとは、増幅の対象となる核酸を意味し、一般的にはＤＮＡとＲＮＡの双方を含む。核酸は、一般に生物学的な試料に含まれる。生物学的試料とは、動物、植物又は微生物の組織、細胞、培養物若しくは排泄物、又はそれらの抽出物を意味する。また、生物学的試料には、ウイルスやマイコプラズマのような細胞内寄生体のゲノムＤＮＡ、あるいはＲＮＡが含まれる。また、核酸は、前記生物学的試料に含まれる核酸から誘導されたものであってもよい。たとえば、ｍＲＮＡをもとに合成されたｃＤＮＡや、生物学的試料に由来する核酸をもとに増幅された核酸などが挙げられる。
２．酵素を用いた核酸の合成反応
酵素による核酸の合成反応において、酵素により核酸の末端にヌクレオチドを付加する過程でピロリン酸が生成する場合がある。本発明は、このような核酸の合成反応で生成されたピロリン酸を指標として核酸増幅の有無を検出することができる。
上記酵素としては、以下のものが挙げられる。
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ
Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ
Ｔ４  ＤＮＡ  ポリメラーゼ
逆転写酵素（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）
ＳＰ６  ＲＮＡ  ポリメラーゼ
Ｔ７  ＲＮＡ  ポリメラーゼ
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
Ｐｏｌｙ（Ａ）  ポリメラーゼ
Ｂｓｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ
Ｖｅｎｔ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ
各酵素の反応は、公知の任意の条件で行うことができる（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。
３．増幅反応
本発明の検出対象である不溶性物質がピロリン酸塩であることから、本発明において採用できる増幅反応は、ヌクレオチドが核酸鎖に取り込まれる際にピロリン酸が生成する反応であれば、どのようなものでもかまわない。また、ポリメラーゼも特に限定されるものではない。例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のほか、ＬＡＭＰ法と呼ばれる増幅法、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（特公平７−１１４７１８号公報等）、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法（特許第２６５０１５９号）等を採用することができる。ＰＣＲ法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける核酸の増幅技術として現在最も一般的な方法である。
ＬＡＭＰ法は増幅対象となる塩基配列の末端にループ構造を形成し、そこを起点としてポリメラーゼによる伸長反応が起きると同時に、ループ内の領域にハイブリダイズしたプライマーが、鎖置換反応により核酸鎖を伸長しながら先の伸長反応の産物を１本鎖に解離させていくというものである。生成した１本鎖核酸はその末端に自己相補性領域を持つため、末端にループを形成し新たな伸長反応が始まる。実際のＬＡＭＰ法では等温で進行するため、上に述べた反応は同時に並行して起こる。ＬＡＭＰ法の特徴としては、等温で進行する鎖置換型の反応であることのほかに、増幅産物の量が非常に多いことが挙げられる。これは、ポリメラーゼが失活する原因である熱変性の操作が含まれていないことも一因である。増幅産物の量が多いということは、生成するピロリン酸の量、すなわち不溶性物質の量も多いので、本発明を適用する核酸増幅法としてＬＡＭＰ法は好適である。
（１）ＬＡＭＰ法
まず、ＬＡＭＰ法の概要を示す（図１及び図２）。ＬＡＭＰ法において、まず増幅の対象となる鋳型ポリヌクレオチドを調製する。鋳型ポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）の調製は、化学合成により、あるいは組織又は細胞等の生物学的材料からの公知方法により行うことができる。この場合、増幅の標的領域の両側（標的領域の５’側及び３’側）には、適当な長さの配列（両側配列という）が存在するように鋳型ポリヌクレオチドを調製する（図１Ａ）。両側配列とは、当該標的領域の５’末端からポリヌクレオチド鎖の５’末端までの領域の配列、及び当該標的領域の３’末端からポリヌクレオチド鎖の３’末端までの領域の配列を意味する（図１Ａの両矢印（←→）部分）。両側配列の長さは、標的領域の５’側及び３’側のいずれの領域も、１０〜１０００塩基、好ましくは３０〜５００塩基である。
標的領域及び両側配列を含む鋳型ポリヌクレオチド鎖（図１Ａ）において、両側配列の中から任意に所定の領域を選択する。すなわち、標的領域の３’末端から当該ポリヌクレオチド鎖の３’末端方向に向かって、順に第１の任意配列Ｆ１ｃ、第２の任意配列Ｆ２ｃ及び第３の任意配列Ｆ３ｃをそれぞれ選択する（図１Ｂ）。同様に、標的領域の５’末端から当該ポリヌクレオチド鎖の５’末端方向に向かって、順に第４の任意配列Ｒ１、第５の任意配列Ｒ２及び第６の任意配列Ｒ３をそれぞれ選択する（図１Ｂ）。ここで、前記任意配列Ｆ１ｃと前記任意配列Ｒ１の選択に当たっては、Ｆ１ｃとＲ１との間の距離を０塩基、すなわち、隣接するように選択することや、Ｆ１ｃとＲ１とが一部重複するように選択することも可能である。上記第１〜第６の領域は、それぞれ、調製されたポリヌクレオチド鎖の配列に応じて任意に選択される。選択する個々の領域は、それぞれ、５〜１００塩基が好ましく、１０〜５０塩基がさらに好ましい。この塩基の長さを選択することにより、後述のプライマーがアニールしやすくなる。
また、各任意配列は、ＬＡＭＰ法により得られる増幅産物が分子間アニールではなく、図２ＬのようにＦ１ｃ配列とＦ１配列との間及びＲ１配列とＲ１ｃ配列との間で分子内アニールを優先的に生じ、末端ループ構造を形成するように選択することが好ましい。例えば、分子内アニールを優先的に生じさせるためには、任意配列の選択に当たって、Ｆ１ｃ配列とＦ２ｃ配列との間の距離及びＲ１配列とＲ１ｃ配列との間の距離を考慮することが重要である。具体的には、両者各配列が、０〜５００塩基、好ましくは０〜１００塩基、最も好ましくは１０〜７０塩基の距離を介して存在するように選択することが好ましい。ここで、数値はそれぞれ、Ｆ１ｃ配列及びＦ２ｃ配列自身並びにＲ１配列及びＲ２配列自身を含まない塩基数を示している。
次に、ＦＡプライマーと呼ばれるプライマーを設計及び合成しておいて、これをＦ２ｃにアニールさせる。「ＦＡプライマー」とは、Ｆ２ｃ領域に相補的な配列であるＦ２配列と、Ｆ１ｃと同一の配列（便宜上Ｆ１ｃともいう）とを含むものであって、例えば、Ｆ２の５’側に、Ｆ１ｃ配列の３’末端が連結した構造を有するものが挙げられる（図１Ｃ）。また、「アニール」とは、ヌクレオチド鎖が、ワトソン−クリックのモデルに基づく塩基対結合によって二本鎖構造を形成することをいう。ＦＡプライマーを鋳型ポリヌクレオチド鎖上のＦ２ｃ配列にアニールさせた後は、ＦＡプライマー中のＦ２を起点として、ＤＮＡ鎖合成を開始させる（図１Ｄ）。続いて、Ｆ３ｃに相補的な配列Ｆ３を含むプライマー（以下、Ｆ３プライマーともいう）を鋳型ポリヌクレオチド鎖のＦ３ｃ配列にアニールさせる（図１Ｄ）。そして、アニールさせたＦ３プライマーを起点として、鎖置換型ＤＮＡ合成を行わせる（図１Ｅ）。「鎖置換型ＤＮＡ合成」とは、プライマーを合成起点とする相補鎖合成反応の鋳型に他のポリヌクレオチドがすでにハイブリダイズして２本鎖構造となっているときに、そのポリヌクレオチドを鋳型から分離しながら相補鎖合成が進行する反応をいう。具体的には、ＦＡプライマーによって合成された鎖を、Ｆ３プライマーによって合成された鎖が置換するように合成が進む反応が挙げられる。これは、換言すれば、ＦＡプライマーによって合成された、鋳型ポリヌクレオチド鎖の相補鎖は、Ｆ３プライマーを起点として伸長した鎖によって剥離されるように置換することともいえる。
以上の合成反応によって、以下の（ｉ）及び（ｉｉ）の２種類のヌクレオチド鎖を得ることができる。
（ｉ）鋳型ポリヌクレオチド鎖中の配列「（３’）Ｆ３ｃ−Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ−標的領域−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３（５’）」に対して相補的な配列「（５’）Ｆ３−Ｆ２−Ｆ１−標的領域−Ｒ１ｃ−Ｒ２ｃ−Ｒ３ｃ（３’）」を含むヌクレオチド鎖（図１Ｆ）
（ｉｉ）置換されて一本鎖となった（剥離された）ヌクレオチド鎖、すなわちその５’末端側にＦ１ｃと同一の配列を有する「（５’）Ｆ１ｃ−Ｆ２−Ｆ１−標的領域−Ｒ１ｃ−Ｒ２ｃ−Ｒ３ｃ（３’）」を含むヌクレオチド鎖（図１Ｇ）
ここで、上記（ｉｉ）のヌクレオチド鎖において、Ｆ１とＦ１ｃとは互いに相補的であるため、Ｆ１とＦ１ｃとの間の鎖内水素結合によって両者はハイブリダイズし、ヘアピンループが形成される（図１Ｇ）。そして、ヘアピンループ中にＦ２が含まれる。
次に、上記（ｉｉ）のヌクレオチド鎖のＲ２ｃ配列に、「ＲＡプライマー」と呼ばれるプライマーをアニールさせる。ＲＡプライマーは、Ｒ２配列の５’側に、Ｒ１配列に対して相補的な配列Ｒ１ｃの３’側が連結されている。そして、ＲＡプライマーを合成起点としてＤＮＡ鎖合成を開始させる（図１Ｈ）。ＲＡプライマーを合成起点として合成された伸長ＤＮＡがＦ１とＦ１ｃとの間で形成される相補鎖部分に達すると、図１Ｅに示す置換反応と同様にしてＦ１ｃの配列が当該伸長ＤＮＡによって置換される（図１Ｉ）。続いて鋳型ポリヌクレオチド鎖のＲ３ｃに、該配列に相補的な配列Ｒ３を含むプライマー（以下、Ｒ３プライマーともいう）をアニールさせる（図１Ｉ）。アニールさせたＲ３プライマーを起点として、鎖置換型のＤＮＡ合成を行わせる（図２Ｊ）。以上の合成反応によって、以下の（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の２種類のヌクレオチド鎖が合成される。
（ｉｉｉ）配列「（５’）Ｆ１ｃ−Ｆ２−Ｆ１−標的領域−Ｒ１ｃ−Ｒ２ｃ−Ｒ３ｃ（３’）」に対して相補的なヌクレオチド鎖「（３’）Ｆ１−Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ−標的領域−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３（５’）」（図２Ｋ）
（ｉｖ）最も３’末端側にＦ１を、最も５’末端側にＲ１ｃを有するヌクレオチド鎖「（３’）Ｆ１−Ｆ２ｃ−Ｆ１−標的領域−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ１ｃ（３’）」（図２Ｌ）
なお、上記（ｉｖ）の配列は、３’側に存在する配列Ｆ１とＦ１ｃとの間及び５’側に存在する配列Ｒ１とＲ１ｃとの間の鎖内水素結合によってヘアピンループを形成する（図２Ｌ）。
次に、前記（ｉｖ）ヌクレオチド鎖のうち３’側のヘアピンループ部分のＦ２ｃにＦＡプライマーのＦ２領域をアニールさせる（図２Ｍ）。また、鎖内水素結合によりアニールしているＦ１を合成起点としてＤＮＡ鎖合成を開始させる。図１Ｍにおいて、Ｆ１を起点として合成される伸長鎖は、Ｒ１−Ｒ２−Ｒ１ｃで形成されるヘアピンループを開いて５’末端まで到達する。一方、Ｆ２を起点として反応が進むと、「Ｆ１ｃ−標的領域−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ１ｃ」で構成される鎖に対する相補鎖が合成される。このとき、Ｆ１、及びＦ１を起点として合成された鎖「Ｆ１−標的領域−Ｒ１ｃ−Ｒ２ｃ−Ｒ１」は、上記Ｆ２を起点とする合成によって置換される。これによって、一本鎖突出構造「−標的配列−Ｒ１ｃ−Ｒ２ｃ−Ｒ１」を有する二本鎖ＤＮＡが得られる。かかる一本鎖突出構造部は、一本鎖突出構造部分（「Ｒ１ｃ−Ｒ２ｃ−Ｒ１」）のＲ１ｃとＲ１との間で鎖内水素結合を形成することによってヘアピンループを形成する（図２Ｎ）。この構造物は、鎖内水素結合によりアニールしているＲ１を合成起点としてＤＮＡ鎖合成を開始させる（図２Ｎ）。以上の合成反応によって、以下の（ｖ）及び（ｖｉ）の２種類のヌクレオチド鎖を得る。
（ｖ）配列「（３’）Ｒ１−Ｒ２−Ｒ１ｃ−標的領域−Ｆ１−Ｆ２−Ｆ１ｃ−標的領域−Ｒ１−Ｒ２ｃ−Ｒ１ｃ−標的領域−Ｆ１−Ｆ２ｃ−Ｆ１ｃ−標的領域−Ｒ１−Ｒ２−Ｒ１ｃ（５’）」（図２０）
（ｖｉ）最も３’末端側にＦ１ｃを、最も５’末端側にＲ１を有する配列「（３’）Ｆ１ｃ−Ｆ２−Ｆ１−標的領域−Ｒ１ｃ−Ｒ２ｃ−Ｒ１（３’）」（図２Ｐ）
上記（ｖ）及び（ｖｉ）のヌクレオチド鎖は、いずれも鎖内水素結合によって、（ｖ）についてはＲ２ｃ、並びに（ｖｉ）についてはＦ２及びＲ２ｃをループ部分とするヘアピンループを形成する。上記（ｖ）及び（ｖｉ）の２つの配列においてヘアピンループを形成しているＲ２ｃ部分にはＲＡプライマーがアニールし、該プライマーを起点とするＤＮＡ合成が開始し、標的配列を含むヌクレオチド鎖（（ｖｉ）の配列に対する相補鎖）の合成が進む。この相補鎖は図２Ｌに示す配列と同一であるので、以下、図２Ｌ〜Ｐの反応が繰り返される。一方、図１Ａからの反応も進行し得るので、これらの一連の合成反応が繰り返されて、ポリヌクレオチド鎖の増幅が進行する。
上記の増幅反応においては、ＦＡプライマー、ＲＡプライマー、Ｆ３プライマー及びＲ３プライマーの４種類のプライマーを用いて増幅反応を行うものであるが、Ｆ３プライマー及びＲ３プライマーを使用せずに、ＦＡプライマー及びＲＡプライマーの２種のプライマーのみを使用することによっても、等温下での増幅反応を起こさせることが可能である。なお、その場合には、反応系中にベタイン、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＮＯ）、プロリン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド等の融解温度（Ｔｍ）調整剤を共存させることが好ましい。
（２）反応条件
ＬＡＭＰ法における反応は、緩衝液中にて、鋳型となる１本鎖の核酸に対して、以下の成分を加え、ＦＡ及びＲＡを構成する塩基配列が相補的な塩基配列に対して安定な塩基対結合を形成することができ、かつ酵素活性を維持しうる温度でインキュベートすることにより進行する。インキュベート温度は５０〜７５℃、好ましくは５５〜７０℃であり、インキュベート時間は１分〜１０時間、好ましくは５分〜４時間である。
（ｉ）４種類のオリゴヌクレオチド（ＦＡ、ＲＡ、アウタープライマーＦ３及びアウタープライマーＲ３）
（ｉｉ）鎖置換型の相補鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼ
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼの基質となるヌクレオチド
なお、上記２つの態様のＬＡＭＰ法において使用するＦＡプライマー及びＲＡプライマーをインナープライマー、Ｆ３プライマー及びＲ３プライマーをアウタープライマーともいう。
アウタープライマーからのヌクレオチド鎖合成は、インナープライマーからのヌクレオチド鎖合成よりも後に開始される必要がある。これを達成する方法として、インナープライマーの濃度をアウタープライマーの濃度よりも高く設定する方法などが挙げられる。具体的には、インナープライマーの濃度をアウタープライマーの濃度よりも、２〜５０倍、好ましくは４〜２５倍高く設定することにより実施することができる。
また、上記鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼ（鎖置換型ポリメラーゼともいう）としては、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡績）などが挙げられる。
この反応は、酵素反応に好適なｐＨを与える緩衝剤、酵素の触媒活性の維持やアニールのために必要な塩類、酵素の保護剤、更には必要に応じて融解温度（Ｔｍ）の調整剤等の共存下で行う。緩衝剤としては、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の中性から弱アルカリ性に緩衝作用を持つものが用いられる。ｐＨは使用するＤＮＡポリメラーゼに応じて調整する。塩類としてはＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４等が挙げられ、酵素の活性維持と核酸の融解温度（Ｔｍ）調整のために適宜添加される。酵素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が利用される。更に融解温度（Ｔｍ）の調整剤には、ベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ，−トリメチルグリシン）、トリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＮＯ）、プロリン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミドが利用される。融解温度（Ｔｍ）の調整剤を利用することによって、前記オリゴヌクレオチドのアニールを限られた温度条件の下で調整することができる。特に、ベタイン及びトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＮＯ）は、そのｉｓｏｓｔａｂｉｌｉｚｅ作用によって鎖置換効率の向上にも有効である。ベタインは、反応液中０．２〜３．０Ｍ、好ましくは０．５〜１．５Ｍ程度の添加により、本発明の核酸増幅反応の促進作用を期待できる。これらの融解温度の調整剤は、融解温度を下げる方向に作用するので、塩濃度や反応温度等のその他の反応条件を考慮して、適切なストリンジェンシーと反応性を与える条件を経験的に設定する。
４．検出
本発明の核酸増幅の有無の検出方法においては、反応生成物の不溶性物質を検出の指標とする。さらには、増幅反応に伴い生成する不溶性物質を経時的に検出することにより核酸増幅反応をモニタリングすることが可能である。検出対象である不溶性物質は、増幅反応に用いられたヌクレオチドから生成したピロリン酸と、反応液中の金属イオンとが結合したピロリン酸塩、例えばピロリン酸マグネシウムである。
（１）目視による検出
増幅反応に伴い生成した不溶性物質の最も簡便な検出法は、増幅反応後の反応液の濁りの有無を目視により確認する方法である。次いで簡便な検出法は、増幅反応後の反応液を遠心処理し、沈殿した不溶性物質の有無を目視により確認する方法である。
（２）濁度の検出
反応生成物の吸光度又は散乱光強度を測定して反応液の濁度を求めることにより、その濁度を指標として核酸増幅の有無を検出をすることもできる。吸光度の測定には通常用いられている測定装置を用いることができる。吸光度測定のための波長は適宜設定することができ、３００〜８００ｎｍ、好ましくは主波長３４０〜４００ｎｍ、副波長６００〜８００ｎｍで測定する。散乱光強度の測定には通常用いられている測定装置を用いることができる。
本発明においては、特に吸光度の経時変化を測定することにより、反応時間により核酸増幅反応がどのように推移したか、そのモニタリングをすることができる。
（３）フィルターを用いた検出
反応生成物を有色のフィルターでろ過し、フィルター上の残渣を目視や光の反射率の変化により検出することもできる。
また、ポリアクリル酸、カルボキシメチルデキストラン等の凝集剤を添加することにより、沈殿量を増加させ検出感度を向上させることが可能である。さらに、これらの不溶性物質を着色又は標識することにより、検出を容易にしたり検出感度を向上させることができる。例えば、アシッドオレンジを添加することにより不溶性物質に着色できるので検出が容易になる。
５．核酸増幅の有無の検出用又は核酸増幅反応のモニタリング用キット
上記４の核酸増幅の有無の検出方法又は核酸増幅反応のモニタリング方法は、実施に必要な試薬類を、パッケージングし、キットとして供給することが可能である。より具体的には、以下の構成要素を含むものが挙げられる。
〔キットの構成要素〕
（ａ）  ポリヌクレオチド鎖上の標的領域の３’末端から該ポリヌクレオチド鎖の３’末端方向に向かって順に第１の任意配列Ｆ１ｃ、第２の任意配列Ｆ２ｃ及び第３の任意配列Ｆ３ｃをそれぞれ選択し、標的領域の５’末端からポリ該ヌクレオチド鎖の５’末端方向に向かって順に第４の任意配列Ｒ１、第５の任意配列Ｒ２及び第６の任意配列Ｒ３をそれぞれ選択した場合、前記Ｆ２ｃに対し相補的な配列Ｆ２及び該Ｆ２の５’側に前記Ｆ１ｃと同一の配列を含むプライマー、前記Ｆ３ｃに対し相補的な配列Ｆ３を含むプライマー、前記Ｒ２と同一の配列及び該配列の５’側に前記Ｒ１に対し相補的な配列Ｒ１ｃを含むプライマー並びに前記Ｒ３と同一の配列を含むプライマー、
（ｂ）  鎖置換型の相補鎖合成反応を触媒するポリメラーゼ、
（ｃ）  要素（ｂ）の基質となるヌクレオチド、並びに
（ｄ）  凝集剤（例えば、ポリアクリル酸、カルボキシメチルデキストラン）
上記キットの構成要素は、使用するＬＡＭＰ法の態様に応じて変化し得る。すなわち、必要に応じて、上記構成要素（ａ）から、任意配列Ｆ３ｃに対し相補的な配列Ｆ３を含むプライマー及び任意配列Ｒ３と同一の配列を含むプライマーを省略することが可能である。また、構成要素として、融解温度調整剤（例えば、ベタイン、トリメチルアミンＮ−オキシド、プロリン、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド）を加えることが好ましい。さらに、必要に応じて、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、合成反応生成物の検出のために必要な試薬類が加えられ得る。さらに、本発明の好ましい態様においては、１回の反応に必要な試薬を反応容器に分注した状態で供給することも可能である。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
〔実施例１〕
（１）ＬＡＭＰの反応
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増幅の目的ポリヌクレオチドは、熱変性をしない１×１０４分子のλＤＮＡ（配列番号１）を用いた。
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配列番号１において標的領域、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３に対応する領域は以下の通りである。
標的領域：配列番号１に示す塩基配列の第９２番目のＧのみ
Ｆ１ｃ：配列番号１に示す塩基配列の第６８〜９１番目（２４ｂｐ）
Ｆ２ｃ：配列番号１に示す塩基配列の第２５〜５０番目（２６ｂｐ）
Ｆ３ｃ：配列番号１に示す塩基配列の第１〜２４番目（２４ｂｐ）
Ｒ１：配列番号１に示す塩基配列の第９３〜１１５番目（２３ｂｐ）
Ｒ２：配列番号１に示す塩基配列の第１２９〜１５２番目（２４ｂｐ）
Ｒ３：配列番号１に示す塩基配列の第１５３〜１７２番目（２０ｂｐ）
以下の配列を有するプライマーを反応液中に入れ６５℃で１時間反応させた。プライマー：
１６００ｎＭインナープライマーＦＡ
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１６００ｎＭインナープライマーＲＡ
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４００ｎＭアウタープライマーＦ３
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４００ｎＭアウタープライマーＲ３
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（２）ＬＡＭＰの白色沈殿
ＬＡＭＰ反応終了後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した。遠心後、白色の沈殿物がチューブ（０．２μｌチューブ）の底に生じることを確認することができた（図３右）。なお、図３左のチューブはネガティブコントロール（鋳型なし）である。
（３）ＬＡＭＰ反応物の吸光度測定
測定機器：Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．，Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ２０００
光路長：  １ｃｍ
セル容量：１００μｌ
ＬＡＭＰ反応終了後、Ａ５００ｎｍのときの吸光度を測定した。反応が進んだサンプルでは吸光度の値が１．２１を示したのに対して、反応が進まなかったサンプル（ネガティブコントロール）では０．２５であった。
また、吸収スペクトルを、１ｃｍセルを用いて室温で測定した結果、ＬＡＭＰ反応液はＡ３００ｎｍからＡ６００ｎｍにわたってブロードな吸収スペクトルを示した（図４）。
ｄＮＴＰｓやＤＮＡはこのような長波長領域に吸収を持たないことから、このブロードな吸収は、反応液内に生じた微粒子成分による入射光の散乱に基づくものであると思われる。これを確認するために、反応液を光散乱粒子計で分析した。その結果、平均直径約２μｍの微粒子が生成していることが確認された。
以上より、ＬＡＭＰ反応による核酸増幅の有無を吸光度（濁度）を指標として確認できることが判明した。
〔実施例２〕  沈殿物の解析
ＬＡＭＰ法により得られた白色沈殿がピロリン酸マグネシウムであると仮定し、まず最初にピロリン酸塩であるかを検討した。実施例１で得られた沈殿物に１００μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを加え、６５℃、５分間温めた。遠心後、上清を別のチューブに移し、溶液を中性にするために１００μｌの１Ｎ  ＨＣｌを加えた。この溶液に０．１Ｎ  ＡｇＮＯ３を加えたと同時に白濁した（Ａｇ４Ｐ２Ｏ７の生成）。白色に呈したことから、ピロリン酸塩であることが判明した。
次に、金属がマグネシウムであるかを確かめるために、チタンイエロー試薬を用いて検討した。チタンイエロー試薬はマグネシウム又はホウ素を検出するための試薬であるが、現在の反応系にはホウ素は含まれておらず、検出できるのはマグネシウムだけである。
沈殿物に２０μｌの０．１Ｎ  ＨＣｌを加え溶解後、１μｌの２ｍｇ／ｍｌチタンイエロー試薬を加えた。溶液をアルカリ性にするために２０μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを加えた。この結果、チタンイエロー試薬により赤褐色を呈した沈殿物が確認できた。このことより、白色沈殿物中にマグネシウムが存在していることが判明した。
また、沈殿物をＩＲスペクトル分析に供試した。すなわち、まず実施例１において得られた沈殿物を遠心分離により凝集させた。凝集物を水で３回洗浄後、シリカゲルデシケーター中で１週間乾燥した。得られた乾燥物について、ＫＢｒ法を用い、室温下、６４回の積算によりＩＲスペクトルを測定した。なお、対照として、市販（Ｍｅｒｃｋ社製）のピロリン酸マグネシウム（Ｍｇ２Ｐ２Ｏ７）及びモノリン酸マグネシウム（Ｍｇ３（ＰＯ４）２）を使用した。その結果、図５に示したように、沈殿物のＩＲスペクトルは市販のＭｇ２Ｐ２Ｏ７と一致した。また、有機化合物に特徴的なＣＨ伸縮ピーク（通常、２９００ｃｍ−１；図５中の破線矢印付近）が見られないことから、沈殿物中には有機物は殆ど含まれていないことがわかった。
以上の結果から、白色沈殿はピロリン酸マグネシウムであることが判明した。
〔実施例３〕  マグネシウムイオンとピロリン酸イオンによる沈殿物生成反応
以下の反応液に任意の濃度となるようにＫ４Ｐ２Ｏ７を加え、６５℃で１時間反応させたときの生成した沈殿物を、反応液の吸光度（Ａ  ４４０ｎｍ）を測定することにより調べた。
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結果を図６に示した。図６に示すように、Ｐ２Ｏ７イオン濃度が０．５ｍＭを越えたときに沈殿物が生成することがわかった。Ｐ２Ｏ７イオンが０．５ｍＭ以上生成するためには、ＤＮＡが４μｇ／２５μｌ以上合成される必要がある。ＬＡＭＰは、通常ＤＮＡを２０μｇ／２５μｌ以上合成可能である。一方、ＰＣＲで合成されるＤＮＡ量はＬＡＭＰの１／１００程度なので、通常のＰＣＲではピロリン酸マグネシウムの沈澱は生成されない。今後、ＬＡＭＰのように多量のＤＮＡを合成可能な増幅法が発明された場合にも、この方法は増幅の有無の検出に有用である。
〔実施例４〕  ＬＡＭＰ反応の吸光度による経時的変化（モニタリング）
ＬＡＭＰ反応を石英セル（１ｃｍセル）中で６５℃、１．５時間行った。反応組成液、プライマー等の試料は、実施例１と同様である。この間、経時的にＡ５００ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ネガティブコントロールでは吸光度に変化が見られなかったが、ポジティブコントロールでは６０分をピークとする吸光度の上昇が観察された（図７）。図７において、「○」は反応液を、「●」はネガティブコントロール（鋳型なし）を示す。
同様に、１×１０−２０ｍｏｌのＰＳＡ（前立腺特異抗原）ＤＮＡ（配列番号６）を鋳型として用い、ＬＡＭＰ反応を石英セル中で、６５℃、４０分間行い、経時的にＡ４００ｎｍの吸光度を測定した。
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配列番号６において標的領域、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３に対応する領域は以下の通りである。
標的領域：配列番号６に示す塩基配列の第９１〜１０２番目（１２ｂｐ）
Ｆ１ｃ：配列番号６に示す塩基配列の第６８〜９０番目（２３ｂｐ）
Ｆ２ｃ：配列番号６に示す塩基配列の第２６〜４４番目（１９ｂｐ）
Ｆ３ｃ：配列番号６に示す塩基配列の第１〜１８番目（１８ｂｐ）
Ｒ１：配列番号６に示す塩基配列の第１０３〜１２２番目（２２ｂｐ）
Ｒ２：配列番号６に示す塩基配列の第１３９〜１６１番目（２３ｂｐ）
Ｒ３：配列番号６に示す塩基配列の第１６２〜１７８番目（１７ｂｐ）
以下の配列を有するプライマーを反応液中に入れ６５℃で１時間反応させた。
プライマー：
１６００ｎＭインナープライマーＦＡ
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１６００ｎＭインナープライマーＲＡ
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４００ｎＭアウタープライマーＦ３
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４００ｎＭアウタープライマーＲ３
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その結果、ネガティブコントロールでは、吸光度に変化が見られなかったが、ポジティブコントロールでは約３０分でプラトーに達した（図８）。
以上の結果から、ピロリン酸マグネシウムの白色沈殿を経時的に観察することにより、ＬＡＭＰ反応による核酸増幅反応を経時的にモニタリングできることが判明した。
〔実施例５〕  濁度とＤＮＡ合成量との関係
実施例４と同様に、ＰＳＡ  ＤＮＡを鋳型としたＬＡＭＰ反応を行い、経時的に濁度の測定（Ａ４００ｎｍ）とＤＮＡの定量を行った。なお、ＤＮＡの定量は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ定量キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）により行った。濁度のＤＮＡ量との関係を図９に示した。図９から明らかなように、濁度とＤＮＡ量との間には直線関係が見られ、濁度はＤＮＡ合成量に比例して増加することが示された。
〔実施例６〕  ＬＡＭＰ反応による鋳型ＤＮＡの定量
１０４、１０６、１０８分子のＰＳＡ  ＤＮＡを鋳型として用い、濁度（Ａ４００ｎｍ）をリアルタイムで測定し、濁度が１．０に達するまでの時間（閾時間）を計測した。ＤＮＡ量と閾時間との関係を図１０に示した。図１０から明らかなようにＤＮＡ量と閾時間との間には直線関係が認められた。よって、濁度をリアルタイムで測定し、閾時間を求めることによって、鋳型ＤＮＡの量を定量できることが判明した。
〔実施例７〕  凝集剤を用いた沈殿
ＬＡＭＰ反応溶液に、凝集剤として４００μＭのポリアクリル酸（ＭＷ１００，０００）又は１０ｍＭのカルボキシメチルデキストラン（ＭＷ１０，０００）を添加し、ＬＡＭＰ反応を行った。その結果、凝集剤を添加することによって沈殿物の量が増大した。
〔実施例８〕  不溶性物質の着色
ピロリン酸マグネシウムの白色沈殿を着色することにより、検出を容易にすることができるかを検討した。０．１ｇのピロリン酸マグネシウムに対し、７５０μｌのアシッドオレンジ（終濃度６５μＭ）を添加した。対照としてアシッドオレンジのみの溶液を用意した。室温で４時間撹拌後、上清のアシッドオレンジの吸光度を測定し、対照溶液との吸光度の差からピロリン酸マグネシウムへの着色量を計算した。
その結果、０．１ｇのピロリン酸マグネシウムに対し、５２．８ｎｍｏｌのアシッドオレンジが着色された。これは、この反応系に添加したアシッドオレンジの約半分量がピロリン酸マグネシウムの白色沈殿に吸着したことになる。以上の結果から、ピロリン酸マグネシウムの白色沈殿に色素を吸着させることにより、検出を容易にすることが可能であることが示唆された。また、上記のように上清の色の変化を指標とする検出も可能であることが示された。
配列表フリーテキスト
配列番号１：合成ＤＮＡ
配列番号２：合成ＤＮＡ
配列番号３：合成ＤＮＡ
配列番号４：合成ＤＮＡ
配列番号５：合成ＤＮＡ
配列番号６：合成ＤＮＡ
配列番号７：合成ＤＮＡ
配列番号８：合成ＤＮＡ
配列番号９：合成ＤＮＡ
配列番号１０：合成ＤＮＡ
産業上の利用可能性
本発明により、核酸増幅の有無を検出するための新しい方法が提供される。本発明の方法によれば、増幅反応に伴って生成する不溶性物質を濁度や沈殿の有無により検出することができるので、きわめて簡便に増幅の有無を検出できる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＬＡＭＰ法による増幅方法の概要を示す図である。
図２は、ＬＡＭＰ法による増幅方法の概要を示す図である。
図３は、ＬＡＭＰ法により増幅した結果得られた生成物の白色沈殿を示す写真である。
図４は、ＬＡＭＰ反応液の吸収スペクトルを示す図である。
図５は、白色沈殿物、市販のＭｇ３（ＰＯ４）２、Ｍｇ２Ｐ２Ｏ７の赤外腺吸収スペクトルを示す図である。
図６は、波長４００ｎｍにおける濁度とピロリン酸イオン濃度との関係を示す図である。
図７は、ＬＡＭＰ反応液の波長５００ｎｍにおける濁度の経時変化を示す図である。
図８は、ＬＡＭＰ反応液の波長４００ｎｍにおける濁度の経時変化を示す図である。
図９は、濁度と合成されたＤＮＡ量との関係を示す図である。
図１０は、閾時間と鋳型ＤＮＡ量との関係を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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