(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アフィニティ分離の方法であって、
（ａ）標的分析対象物を含む試料を準備する工程、
（ｂ）固定化タンパク質を含むマトリックスを準備する工程、ここで該固定化タンパク質は、（ｉ）アルカリ性条件下における該タンパク質の安定性を高めそして（ii）該タンパク質が標的分析対象物に結合するのを妨げない、１つ以上の修飾を含み、そしてここでの１つ以上の修飾は、
（１）タンパク質中の１つ以上のＡｓｎ残基の欠失；
（２）タンパク質中の１つ以上のＡｓｎ残基の、Ａｓｎ、Ｇｌｎ及びＣｙｓ以外のアミノ酸による置換；および
（３）それらの組み合わせ
からなる群より選択される、
（ｃ）上記試料および上記マトリックスを接触させる工程、ここで標的分析対象物は固定化タンパク質に結合する、および
（ｄ）上記標的分析対象物を上記マトリックスから単離させる工程
を含む、方法。
【請求項２】
タンパク質中の１つ以上のＡｓｎ残基が、Ａｓｎ、Ｇｌｎ及びＣｙｓ以外のアミノ酸によって置換されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２つ以上のＡｓｎ残基が修飾されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
Ａｓｎ残基すべてが修飾されている、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
タンパク質の三次元構造の表面のＡｓｎ残基が修飾されている、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
Ａｓｎ残基が、リジン、アスパラギン酸及びロイシンから選択されたアミノ酸で置換されている、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法又はタンパク質。
【請求項７】
タンパク質がコンビナトリアルタンパク質である、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
コンビナトリアルタンパク質が、
ａ）アルカリ性条件におけるタンパク質の安定性を高めるための、タンパク質分子中のＡｓｎ残基の修飾工程、ここで前記修飾は請求項１の（１）〜（３）からなる群より選択される、及び
ｂ）タンパク質の結合特性を修飾するための、タンパク質分子のランダム化工程
を含む方法により製造される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程ａ）が工程ｂ）の前に行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ｃ）ランダム化されたタンパク質を、表面ディスプレイライブラリーにおける発現によって選択する工程、をさらに含む請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｃ）がファージディスプレイを用いて行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
コンビナトリアルタンパク質が、免疫グロブリン分子あるいはその断片又は誘導体、ブドウ球菌のタンパク質Ａ（ＳＰＡ）あるいはその断片、ドメイン又は誘導体、又は、ＤＮＡ結合タンパク質あるいはその断片又はドメインに由来する、請求項７乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
コンビナトリアルタンパク質が、ドメインＺ（ＳＰＡのＢドメインの誘導体）又はその誘導体を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質が、アルブミン結合タンパク質（ＡＢＤ）あるいはその断片又は誘導体を含む、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アフィニティ分離及びそれに用いるリガンドに関する。
【０００２】
アフィニティ分離は、一般にアフィニティクロマトグラフィカラム上で起こり、生体分子、特にタンパク質が関与する相互作用の潜在的に高度に特異的な性質を利用する。他の可能な分離方法としては、膜分離、二相抽出、流動床、発泡床（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｂｅｄｓ）及び磁性粒子による分離が挙げられる（Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｒ．  Ｋ．、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、第３版、ＩＳＢＮ  ０−３８７−９４０７２−３）。相互作用としては、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、酵素−基質、レセプター−リガンド（例えばホルモン）、タンパク質−炭水化物及びタンパク質−金属の相互作用が挙げられる。一般に、アフィニティ分離は、酵素とその基質との間、核酸とＤＮＡ結合タンパク質との間、又は抗原と抗体との間のような、タンパク質表面で起こる生物学的に重要な結合相互作用に基づいている。一対の結合相手のいずれか一方を、その結合相手をアッセイ又は精製するために、例えばアフィニティカラム中の不溶性マトリックスへの共有結合によって、固定化することができる。アフィニティ結合分子（特にタンパク質）間の又はアフィニティ結合分子（特にタンパク質）が関与する相互作用の非常に選択的な性質により、それらは、精製／分離技術について理想的なものとなり、そして、多くの用途について、固定化タンパク質リガンドが関与するアフィニティクロマトグラフィは、イオン交換クロマトグラフィ又はゲルろ過クロマトグラフィよりも好ましい。
【０００３】
固体マトリックス上に固定化されている、ある試料中の標的分子に対する特異的結合相手を有するカラムに、その試料を添加する場合、その標的分子は、カラム中に保持され、一方、非標的分子の大部分は、単に通過するであろう。溶液、典型的には次第に低減するｐＨを含む溶液をカラムに加えて、まず最初に非特異的結合分子を洗い流し、最後に標的分子を溶出するために洗い流すことができる。標的分子は、固定化リガンドに対して最も高いアフィニティを有し、カラムから洗い落とされる最後の分子となり、従って、標的分子を最も高い濃度で含むのは最後の画分であり、その最後の画分を、次に、さらなる精製／濃縮工程に用いたり、又は標的分子の存在について直接又は間接にアッセイすることができる。
【０００４】
生化学及び生物工学の分野一般における研究及び医学は、常により純粋な有機及び生物学的分子の試料に対する要求を生み出しており、従って、可能な限り迅速かつ安価に、純度が高い試料を提供することができる戦略に対する要求を生み出してきている。
【０００５】
タンパク質及び他の分子の純粋な試料を得る必要性を満足することと同様に、アフィニティ分離は、試料を標的分子について定量的及び定性的にアッセイすることにおいても重要である。これは、例えば、血液又は尿試料を、代謝不全のような疾患の指標となる分子又は非天然物質、麻薬、ステロイド誘導体等の存在についてアッセイする場合に重要であるかもしれない。
【０００６】
固体アフィニティマトリックスを完備したアフィニティクロマトグラフィカラムは、高価であり得、そして、明らかに、カラムを数回再使用することができること、即ち、標的分子を結合する固定化リガンドの能力の低減により、又は結合特異性の低減により、カラムを廃棄しなければならなくなる前に、多数回の使用を完了できることが望ましい。直接比較できる結果のセットを達成するために、及び別の使用を行う前に非特異的及び特異的結合分子をカラムから排除するために、カラムを洗浄することが必要である。分離媒体及び系を洗浄及び消毒するための認知された標準は、ＮａＯＨ（しばしばＮａＣｌとの組み合わせで用いられる）である。使用される０．１〜１．０ＭのＮａＯＨ溶液は、ウイルス、細菌、核酸、タンパク質、酵母、菌体外毒素、プリオン及び他の夾雑因子を除去することができる。ＮａＯＨ接触時間は、様々であってよく、３０分〜１時間が典型的であり、系からの除去は、簡便なインラインでのｐＨ及び導電率の測定により監視される。
【０００７】
しかし、分離媒体の、これらのむしろ苛酷な消毒条件に耐える能力は、付着したリガンド（結合相手）の官能基、付着の化学、及びアルカリ条件に対する基材マトリックスの安定性に依存する。タンパク質は、ＮａＯＨ洗浄の間に経験されるような極端なｐＨに対して感受性であり、一般的に言って、これは、タンパク質に基づくアフィニティ媒体の有効性に対して不利に影響するであろう。従って、タンパク質に基づくアフィニティ分離は、その良好な特異性のためにイオン交換及びゲルろ過クロマトグラフィよりも有利であるが、これらの他の特異性のより低い技術は、標準的洗浄法によって不利に影響されない。
【０００８】
アルカリ性ｐＨに対するタンパク質の感受性は、主に、アスパラギン残基及びグルタミン残基、特にアスパラギン残基の脱アミド反応のためである。アスパラギンの脱アミド反応は、環状イミド中間体を介して、通常３：１〜４：１の比率でイソアスパルテート及びアスパルテートの形成をもたらす。この反応は、生理学的ｐＨで起こるが、ＮａＯＨ溶液で洗浄されているクロマトグラフィカラムに存在するようなアルカリ性ｐＨでは、はるかに速い。イソアスパルチル形態は、アスパルテートのβ−カルボキシルとＣ−隣接アミノ酸のα−窒素との間の異常なアミド結合によって特徴付けられる。これは、タンパク質骨格中に余分の−ＣＨ２−及び遊離のα−カルボキシル基をもたらす。脱アミド反応の結果としてペプチド骨格の切断が起こり得、タンパク質は、タンパク質全体の構造的変化によって、又は単なる活性又は結合部位のような感受性領域中の小さい変化によって、その活性を失い得る。アスパラギン残基の脱アミド反応の生じ易さは、配列及びコンフォメーションに依存性であり、Ａｓｎ−Ｇｌｙ及びＡｓｎ−Ｓｅｒ部位のＡｓｎ残基は特に攻撃され易い。
【０００９】
それは、アフィニティクロマトグラフィカラムがその中に不溶性支持体上に固定化されたタンパク質を用いて組み立てられている場合、深刻な問題であり、使用と使用との間の必要な洗浄プロセスは、系の効率の低下をもたらす。カラムの絶対的な有用寿命の終わりを早めることと共に、連続的な洗浄が固定化タンパク質の試料からその結合相手を捕捉する能力を低減させる場合、一連の試料中の分析対象物の濃度を測定する使用と使用との間の比較が無意味となる。従って、固定化タンパク質が標準的洗浄方法、特にアルカリ性ｐＨに対してより影響を受け難いアフィニティ分離の方法に対する需要がある。
【００１０】
従って、１つの側面においては、本発明は、アフィニティ分離の方法であって、アフィニティリガンドが固定化タンパク質様リガンドであり、そのタンパク質様リガンドのアスパラギン（Ａｓｎ）残基の１つ以上が修飾されている方法を提供する。
【００１１】
「修飾（された）」という用語は、アスパラギン残基の欠失又はアルカリ感受性がより低いアミノ酸によるアスパラギン残基の置換、あるいは、アスパラギン残基が置換（即ち１以上の基の化学的置換）又は他の化学誘導体化により（例えば保護基によって）修飾されている場合を含む。アルカリ感受性がより低いアミノ酸による１つ以上のアスパラギン残基の置換が好ましい。
【００１２】
「アフィニティ分離」によって、標的分析対象物を含む試料の、その分析対象物に対する特異的結合相手をその上に担持する固体への添加を含む、任意の精製又はアッセイ技術が意味される。重力又は他の手段は、試料が固体を通って又は横切って通過するのを可能にし、分析対象物と固体上に固定化された特異的結合相手との間の相互作用は、その分析対象物が固体上に保持され、一方、試料の残り又は残りのほとんどが系を通過することを意味する。分離は、アフィニティクロマトグラフィカラム上で好都合に行うことができる。固体は、好ましくは、カラム中に、その上部に試料を添加することができ、試料の非標的部分が流出することができるように、配置される。塩溶液のような溶出液又はｐＨ変化を用いて、特異的に結合した分析対象物をはずすことができ、その後、その分析対象物を、制御された方式で多数のアリコート中に集めることができる。
【００１３】
「アフィニティリガンド」は、従ってアフィニティ分離プロセスにおいて使用することができる標的特異的結合相手である。
【００１４】
「分析対象物」は、固定化されたリガンドに特異的に結合することができる、試料中の、タンパク質様又はそれ以外の、あらゆる分子又は分子の断片を指すのに用いられる。
【００１５】
「特異的結合相手」という用語は、分子又は関連する分子の一群を含むことができ、これらの分子のいずれであっても、１つ以上の他の分子に「特異的に」結合することができる。従って、この用語は、任意のある固定化リガンド又は分析対象物が、唯一の結合相手しか有さないことを意味せず、むしろ、結合が、ほとんどの他の分子が同じアフィニティ（親和性）で又は同じストリンジェンシー（厳格性）では結合しないであろう、特に、所定の試料中の他の非標的分子がはるかに低いアフィニティを有するであろう程度まで特異的であることを意味する。アフィニティ分離による精製は、生物学的に特異的な結合相手同士の間の高いアフィニティのために、しばしば数千倍のオーダーである。
【００１６】
固定化タンパク質様リガンドを含むすべてのタイプのアフィニティ分離を、本発明の方法において使用することができ、特定のリガンドとの使用について公知の好適なマトリックス（即ち、固体支持体）は、典型的にはアガロース、ポリアクリルアミド、シリカ、ポリビニルスチレン、デキストラン又は他のポリマーを用いるクロマトグラフィに基いて、当該技術分野で公知である。分離又は固定化プロセスについて当該技術分野で公知の任意の固体支持体を用いることができ、実際、固体支持体へのアフィニティリガンドのような分子の付着のための、当該技術分野で公知の方法のいずれであってもよいのと同じである。タンパク質様リガンドは、通常、シアノゲンブロミド、エピクロロヒドリン、ビソキシラン、ジビニルスルホン、カルボニルジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、トシル／トレシルクロリド、エピクロロヒドリン、カルボジイミド、グルタールアルデヒド、ヒドラジン、オキシランのようなカップリング剤、そしてまたカルボキシル又はチオール活性化マトリックスによって、マトリックスに付着され、ここでもまた、このようなカップリング剤及びカップリングの化学は、当該技術分野において周知であり、文献に広く記載されている（Ｊａｎｓｓｏｎ，  Ｊ．Ｃ．及びＲｙｄｅｎ，  Ｌ．、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、第２版、３７５−４４２頁、ＩＳＢＮ０−４７１−１８６２６−０）。簡単な固定化を可能にするマトリックスの種々の誘導体としては、ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、ＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ及びＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ、並びにエポキシ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が挙げられる。
【００１７】
タンパク質様アフィニティリガンドは、上で定義した「特異的結合相手」として機能することができるタンパク成分を有する分子であってもよい。従って、糖タンパク質又はタンパク質−脂質複合体、あるいは実際、補欠分子団を有するタンパク質を、本発明に従って修飾されたアフィニティリガンドとして用いることができる。しかし、タンパク質分子が好ましい。本明細書において、「タンパク質」という用語は、ポリペプチド又はペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものとして、広く用いる。言い換えれば、本明細書において用いる場合、「タンパク質」は、アミノ酸の鎖から構成されており、この用語は、いかなる特定の構造上の（即ち、三次元構造）又は他の要件を意味しない。
【００１８】
アスパラギンを置き換えるために好適なアミノ酸としては、他の１９種類の標準的な天然アミノ酸のいずれもが含まれるが、システイン及びグルタミンは好ましくないであろう。好ましい置換アミノ酸としては、リジン、アスパラギン酸及びロイシンが挙げられる。当業者に周知の非天然アミノ酸及びアミノ酸誘導体もまた、アスパラギン残基を置き換えるために用いることができよう。固定化されたタンパク質の安定性及びそれゆえ洗浄後のカラムの効率の有意な改良は、たった１個のアスパラギンをアルカリ感受性がより低い残基で置換する場合に観察することができるが、好ましくはアスパラギン残基の２個、３個又はそれを越える数、あるいはすべてでさえも、置換される。
【００１９】
「アルカリ感受性がより低いアミノ酸」は、当該技術分野で公知の技術、方法及び条件を用いて比較した場合、Ａｓｎよりも、アルカリ性条件下で分解を受け難いものである。このような条件としては、例えば、上述のカラム洗浄条件、又は上述の脱アミド反応のようなタンパク質の分解又は安定性を研究するために当該技術分野で用いられる任意の他のアルカリ性条件を挙げることができる。従って、「アルカリ感受性がより低い」アミノ酸は、Ａｓｎ以外の任意のアミノ酸であることができ、より好ましくはＧｌｎ及びＣｙｓでもない他のものである。好都合には、アルカリ感受性は、タンパク質分子中の所定のＡｓｎ残基を置換アミノ酸で置き換えることによって、又はそのＡｓｎ残基を化学的に修飾もしくは誘導体化することによって、そして次に修飾されていないタンパク質とアルカリ性条件（例えばカラム洗浄条件）における安定性を比較することによって、比較することができる。
【００２０】
上述したように、特定のアスパラギン残基の脱アミド化に対する感受性は、タンパク質の構造（Ｃｏｎｆｉｇｒａｔｉｏｎ）に依存し、タンパク質の三次元構造の表面に存在し、従ってアルカリ性条件に特にさらされるそれらの残基を置換することは、特に重要である。最も重要であるのはリガンドの全体的な安定性であり、固定化リガンドとその結合相手との間の相互作用の特異性を維持することが望ましく、従って、置換されるのは、リガンド−分析対象物相互作用に関与しないアスパラギン残基である。
【００２１】
「アスパラギンが修飾された」タンパク質様のアフィニティリガンド(以下、「修飾されたタンパク質」)は、当業者に公知のいずれかの方法により生成することができる。核酸の部位特異的突然変異誘発についての標準技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓによるＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇという題名の実験室マニュアルに記載されている。好ましい技術は、望ましい突然変異を起こすために必要なミスマッチ塩基対を組み込むプライマーがＰＣＲの第一ラウンドにおいて用いられる、ＰＣＲの突然変異誘発を含む。二番目の反応において、一回目の反応に由来する断片を混合し、ポリメラーゼに鎖を充填することができる。得られた二本鎖断片をプラスミドに連結することができ、これを、次に大腸菌を形質転換するのに用いる。タンパク質を、生物学的宿主を用いることなくインビトロで合成することができ、その場合、非天然アミノ酸を導入することができる。
【００２２】
先に示したアフィニティ分離の多くの一般的な使用と同様に、本発明において特に重要なことは、新規で、修飾された又は高められた結合特性を有するリガンドを生成するための特定のタンパク質のランダム化(ランダム突然変異誘発)により生成されたリガンドを用いるアフィニティ分離の使用である。それらのタンパク質をコンビナトリアルタンパク質という。そのような技術は、典型的には、標的タンパク質のランダム突然変異誘発、例えば線状バクテリオファージ表面における、それらの変異体の完全（ｆｕｌｌ）ライブラリーの発現と、それに続く望ましい結合特性を示すタンパク質の選択を含み、その選択は、典型的には、変異体タンパク質と固定化リガンド(結合相手)、即ち、そのタンパク質についての標的分子、例えば標的分析対象物、との間の結合反応に関与する。突然変異誘発はランダムであり、特定コドンによりコードされた結果として得られるアミノ酸は一般的には予め決定されていないが、突然変異が導入されるべき位置は一般的に前もって同定されている。突然変異誘発は、アミノ酸の置換、欠失又は付加(例えば挿入)に関与することができる。
【００２３】
ファージにおける表面ディスプレイのような発現系の使用により、遺伝子型と表現型との間に決定的なつながりが提供される。その特異的結合相互作用に基づいて選択されることができ、観察された結合特性の原因であるタンパク質をコードする核酸も保持する、必要なものが全てそろった単位が存在する。このことは、その結合特性のために選択された有用な量のタンパク質の発現を可能にし、そのような発現は、典型的には形質転換された細菌宿主中において生じる。
【００２４】
従って、固定化されたリガンド［例えば、望ましい標的分子(分析対象物)］に結合する能力により選択されたタンパク質は、アフィニティ分離においてそれ自体が(即ち、アフィニティ−リガンドとして)用いられる。固定化され、試料中の標的分子を精製する又は分析するのに用いられるのは、まず第一に、典型的にはタンパク質を選択するのに用いられたものと同じリガンドである。このように、変異体のライブラリーからのタンパク質は、例えば、カラム中においてマトリックスに固定化されたインシュリンを有するカラムを用いてインシュリンを結合する能力のために選択されることができ、次に、その選択されたタンパク質は、インシュリンの存在について試料を試験するのに用いることができる。
【００２５】
標的分子の存在を試験するのと同様に、本発明のアフィニティ分離方法は、優れた精製方法を提供し、それは良好な純度を有する標的分子の試料を与える。特に、本発明の方法は、分離系を多数回反復した後、例えばカラムの洗浄を伴う多数回の実施の後に、なおまだ純粋な試料を生じる。本発明の方法により生成されたそのような試料は、本発明のさらなる側面を構成する。
【００２６】
前記したランダム化工程及び選択工程の前に、アルカリ感受性がより低いアミノ酸でタンパク質のアスパラギン残基の１つ以上を置換することによりタンパク質が安定化されるならば、アフィニティーカラムを実施と実施との間に洗浄するときに遭遇する高ｐＨのような過酷な条件に耐える能力のゆえに、アフィニティリガンドの有用な寿命は延びる。
【００２７】
従って、本発明のさらなる側面は、ランダム化工程(即ち、「起源」又は「供給源」又は「出発タンパク質」のランダム化によりコンビナトリアルタンパク質を生成するのに用いられる工程)とは別の工程において、タンパク質のアスパラギン残基の１つ以上を修飾することにより(好ましくは、タンパク質のアスパラギン残基の１つ以上をアルカリ感受性のより低いアミノ酸で置換することにより)、アルカリ性条件におけるタンパク質の安定性が高められたコンビナトリアルタンパク質を含む。
【００２８】
そのようなタンパク質を発現する細胞と同様に、そのようなタンパク質をコードする核酸分子は、本発明のさらなる側面を構成する。
【００２９】
ランダム化は、それ自体、アスパラギン残基の置換をもたらし得るが、本発明のこの側面は、安定性を高めるために１つ以上のアスパラギン残基を置換するために特異的に修飾されてもいるタンパク質に関する。タンパク質は、ランダム化の前に又は後に又はランダム化と同時に安定化され得るが、好ましくは、安定化のための修飾は、ランダム化が行われる前に導入される。その安定化がランダム化の前に行われる場合、それは、一回のみ行われること、並びに多くのリガンドに対してランダム化された変異体のライブラリーから選択されることにより行われることを必要とし、異なる結合特性を有するいくつかの安定化タンパク質が得られる。安定化が、特定の結合アフィニティ（親和性）のための選択の後に行われる場合、安定化のための置換の結果としてアフィニティがいくらか喪失する危険がある。
【００３０】
タンパク質分子のコンビナトリアルライブラリーの構築及びその後の、望ましい結合特性を有するタンパク質様リガンドを得るための選択のための技術は、本技術分野において知られている（Ｎｙｇｒｅｎ，  Ｐ．及びＵｈｌｅｎ，  Ｍ．、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９７年、第７巻、４６３−４６９頁）。一般的に、恐らくは温度非感受性又はｐＨ非感受性のような固有の有利な性質を有するタンパク質分子が、足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）として用いられる。その後、異なる結合特性を有する分子のライブラリーを生成するために、コンビナトリアルライブラリーが、そのタンパク質分子のランダムであるが目的とするアミノ酸置換(又は他の突然変異)により構築される。表面残基は、一般的にランダム突然変異誘発のための標的とされる。
【００３１】
適するタンパク質の足場は、単純に線状ペプチドであることができるが、好ましくは、その足場は、より高いアフィニティについての潜在能力を有し、タンパク質分解に対してより低い感受性を有する折りたたまれた三次元構造を有する。初めから足場を設計するよりも、通常は、天然に存在するタンパク質又はドメインを、さらにうまく処理するために選択する。疑問を回避するために、本明細書中での「タンパク質」という用語は、タンパク質分子全体及びそのドメインもしくは断片、ポリペプチド又はペプチドをいうのに用いられることに注意して下さい。
【００３２】
ランダム化タンパク質が線状ファージコートタンパク質との融合タンパク質として表されることとなっている場合、タンパク質の足場の選択は、望ましい宿主有機体、例えば大腸菌において効率よく発現される能力を含むいくつかの要素に依存する。そのタンパク質は又、全体としての三次元構造を失うことなく、その表面に置換(又は挿入又は欠失等)に耐える十分に大きな領域を含むべきである。そのライブラリーが合成により生成されることとなっている場合、小さい全体としてのサイズが予め不可欠である。選択された足場タンパク質が結合機能を有する場合、その相互作用に関与するアミノ酸残基は、ランダム化の標的であり得る。公知の結合特性を高めるために又は新しい特異性を有するリガンドを開発するために、ランダム化が行われ得る。
【００３３】
好適な足場となる分子は、Ｎｙｇｒｅｎら（１９９７年）によって議論されており、それは、拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）配列中に４０以上の残基を有する環状ペプチド、Ｆｖ又は単鎖（ｓｃＦｖ）ドメインを含む免疫グロブリン様足場、５８残基の１ドメインのブドウ球菌のタンパク質Ａ（ＳＰＡ）アナログＺ（Ｚドメインは、ＳＰＡのＢドメインの誘導体である）あるいはＳＰＡの他のドメイン又はアナログのような細菌レセプター、ＤＮＡ結合タンパク質（特に、亜鉛フィンガー及びタンパク質分解酵素阻害剤）を含む。これらの分子すべては、前もって安定化されたタンパク質のコンビナトリアルライブラリーを構築する前に、１つ以上の固有のアスパラギン残基をアルカリ感受性がより低いアミノ酸で置換することにより、安定化され得る。
【００３４】
特に重要であるのは、細菌レセプタードメインＺである（Ｎｏｒｄ，  Ｋ、Ｎｉｌｓｓｏｎ，  Ｊ．、Ｎｉｌｓｓｏｎ，  Ｂ．、Ｕｈｌｅｎ，  Ｍ．及びＮｙｇｒｅｎ，  Ｐ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｅｒｉｎｇ」、１９９５年、第８巻、第６号、６０１−６０８頁）。Ｎｏｒｄらによるこの論文は、ある範囲の足場となる分子に適用できるタンパク質分子の、コンビナトリアルライブラリーの適切な構築方法を記載している。記載された方法は、固相に補助されていて、ランダム化された一本鎖オリゴヌクレオチドの段階的組み立て（ａｓｓｅｍｂｌｙ）に基づく。
【００３５】
形成されたタンパク質ライブラリーからの選択は、ビーズ固定化ライブラリー（ＭｃＢｒｉｄｅ，  Ｊ．  Ｄ．、Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｎ．、Ｄｏｍｉｎｇｏ，  Ｇ．  Ｊ．及びＬｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ，  Ｒ．  Ｊ．、「Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．」、１９９６年、第２５９巻、８１９−８２７頁）、ＤＮＡ結合タンパク質への融合（Ｓｃｈａｔｚ，  Ｐ．  Ｊ．、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、１９９３年、第１１巻、１１３８−１１４３頁）、及び細菌（Ｌｕ，  Ｚ．、Ｍｕｒｒａｙ，  Ｋ．  Ｓ．、Ｖａｎ  Ｃｌｅａｖｅ，Ｖ．、ＬａＶａｌｌｉｅ，  Ｅ．  Ｒ．、Ｓｔａｈｌ，  Ｍ．  Ｌ．及びＭｃＣｏｙ，  Ｊ．  Ｍ．、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、１９９５年、第１３巻、３６６−３７２頁）又はファージ（Ｃｌａｃｋｓｏｎ，  Ｔ．及びＷｅｌｌｓ，  Ｊ．、「ＴＩＢＴＥＣＨ」、１９９４年、第１２巻、１７３−１８３頁）上で、並びに酵母細胞上（Ｂｏｄｅｒ，  Ｅ．  Ｔ．及びＷｉｔｔｒｕｐ，  Ｋ．  Ｄ．、「Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、１９９７年、第１５巻、５５３−５５７頁）及びウイルス系中（Ｅｒｎｓｔ，  Ｗ．、Ｇｒａｂｈｅｒ，  Ｒ．、Ｗｅｇｎｅｒ，  Ｄ．、Ｂｏｒｔｈ，  Ｎ．、Ｇｒａｕｓｓａｕｅｒ，Ａ．及びＫａｔｉｎｇｅｒ，  Ｈ．、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、１９９８年、第２６巻、１７１８−１７２３頁及びＧｒａｂｈｅｒ，  Ｒ．、Ｅｒｎｓｔ，  Ｗ．、Ｄｏｂｌｈｏｆｆ−Ｄｉｅｒ，  Ｏ．、Ｓａｒａ，  Ｍ．及びＫａｔｉｎｇｅｒ，  Ｈ．、「ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、１９９７年、第２２巻、７３０−７３５頁）でディスプレイされた場合を含む、この技術分野において公知の多くの異なる方法によって行うことができる。
【００３６】
国際特許出願公報番号ＷＯ９５／１９３７４は、Ｚ−変異体のコンビナトリアルライブラリーの構築を記載する（特に実施例４を参照されたい）。この出願は、１２頁において、組換えタンパク質の精製におけるＺドメインのアフィニティリガンドとしての利点を、洗浄の間、アフィニティカラムの厳しい環境において比較的安定であるとして、論じている。本発明は、アスパラギン残基の置換により、Ｚドメインがアルカリ性ｐＨに対して安定化され得るというさらなる利益を提供する。本発明により、コンビナトリアルライブラリーを調製する前に、固有のＺドメインを安定化することが提案される。
【００３７】
従って、更なる側面において、本発明は、タンパク質分子のコンビナトリアルライブラリーを調製する方法であって、タンパク質がランダム化される前に、タンパク質のアスパラギン残基の１つ以上を修飾することにより（好ましくはタンパク質のアスパラギン残基の１つ以上の置換により）、当該タンパク質がアルカリ性のｐＨにより低い感受性を示すように変えられている方法を提供する。
【００３８】
本発明のなお更なる側面においては、ファージディスプレイの方法であって、ファージ表面上で発現したタンパク質が、タンパク質の結合特性を修飾するために導入された修飾とは別個の、ある工程において（好ましくはアルカリ感受性がより低い残基での置換により）修飾された１つ以上のアスパラギン残基を有している方法が提供される。
【００３９】
本発明の更なる側面は、安定化されたコンビナトリアルタンパク質を作る方法であって、
ａ）  アルカリ性条件におけるタンパク質の安定性を高めるための、タンパク質分子中のアスパラギン残基の修飾工程、及び
ｂ）  タンパク質の結合特性を修飾するための、タンパク質分子のランダム化工程
を含む方法、を包含する。
【００４０】
工程ａ）における修飾は、好ましくは、アスパラギン残基のアルカリ感受性がより低い他のアミノ酸による置換を含み、工程ａ）は、好ましくは工程ｂ）の前に行う。
【００４１】
ランダム化及び安定化がされているタンパク質分子と同様に、本発明は、安定化された部分とランダム化された部分とを含む融合タンパク質にも関し、そのようなタンパク質は、ある用途において有用である。特に、この技術は、特異的結合特性を有する様々な領域を付着できる安定なフレームワーク（構造）の開発を可能にする。上で論じたランダム化技術により、様々な領域を調製することができ、所望の結合特性を有するタンパク質分子を、例えばファージディスプレイ及びアフィニティクロマトグラフィにより、変異体のライブラリーから選択することができる。このランダム化されたタンパク質は、その後、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で、そのアスパラギン残基の１つ以上を他のアルカリ感受性がより低い残基で置換することにより、アルカリ性条件に対するその安定性を改良するために既にうまく処理されているタンパク質分子と共に、融合タンパク質として発現され得る。
【００４２】
融合タンパク質は、アフィニティクロマトグラフィにおいて、ランダム化された部分によって提供された前もって選択された結合アフィニティと共に、フレームワーク部分によって提供された一般に安定な分子の利益を与えて、固定化リガンドとして使用することができる。そのような系は、重要なタンパク質様の特徴（ペプチドの特徴と対比して）が、安定化部分によって提供されるので、ランダム化及び選択化工程の間、小さなタンパク質分子の使用を可能にすることができる。同様の安定化部分を、様々な異なるランダム化分子と共に使用することができ、その逆もまた同様である。融合ペプチドの安定化フレームワーク部分として機能する好適なタンパク質分子として、アルブミン結合タンパク質（ＡＢＤ）が挙げられ、細菌レセプタードメインＺは、これに関連して、ランダム化に好適な分子である。
【００４３】
従って、本発明は、また、１つ以上の天然のアスパラギン残基が修飾されている（好ましくは、高いｐＨに対して感受性がより低いアミノ酸残基によって置換されている）第一の部分と、その特異的結合特性のために選択されたランダム化されたタンパク質分子である第二の部分を含む融合タンパク質を提供する。
【００４４】
そのようなタンパク質をコードする核酸分子も、そのタンパク質を発現する細胞も、本発明の更なる側面を構成する。
【００４５】
本発明の更なる側面は、アフィニティリガンドのアスパラギン残基の１つ以上を修飾することによる、アフィニティリガンドを安定化する方法を含む（好ましくは、そのアフィニティリガンドは、そのアスパラギン残基の１つ以上をアルカリ性ｐＨに対する感受性がより低いアミノ酸残基で置換することによって安定化される）。
【００４６】
なお更なる側面は、タンパク質のアスパラギン残基の１つ以上の修飾によって安定化されたタンパク質分子の、表面ディスプレイ又はアフィニティクロマトグラフィにおける使用を含む。
【００４７】
「表面ディスプレイ」という用語は、タンパク質の結合特性に基づき、タンパク質分子間の識別を可能にする方法で提供される（ディスプレイされる）分子のライブラリーからのタンパク質の選択に関与する技術を意味する。表面ディスプレイは、典型的には、線状バクテリオファージの表面で行われる（ファージディスプレイ）。しかし、ディスプレイは、細菌、酵母細胞上で、あるいはウイルス系を用いて行うこともできる。当該技術分野で公知又は推奨されているすべての「表面ディスプレイ」を、本発明で使用することができる。
【００４８】
本発明の方法での使用のための好ましいアフィニティリガンドは、アルブミン結合タンパク質（ＡＢＤ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対するアフィニティを有するタンパク質ドメインである。それは、細胞壁に固着した（ａｎｃｈｏｒｅｄ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｇ１４８に由来する細菌レセプタータンパク質に由来する。その具体的用途は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の精製のためのアフィニティリガンドとしてというものである。このタンパク質の野生型配列は、４つのアスパラギン残基を有し、これらの残基の１つのみが置換される場合に、高い安定性が観察される。しかし、好ましくは、すべての４つの残基を、アルカリ感受性がより低い残基で置換する。ＡＢＤの野生型アミノ酸配列は、以下の通りである：
【００４９】
【化１】
0004801258.tif 000002
アスパラギン残基は、ボールド体で示されている。ハイフン（−）は、同じファミリーの他の分子がこの部分に追加のアミノ酸を有することを、わかり易く示すものである。この配列は、図３に示す１９アミノ酸のＮ末端テールを除外している。本文全体を通して、ＡＢＤの具体的アミノ酸は、図３に示した全配列（１９アミノ酸の「テール」を含む）中の位置で同定される。従って、ＡＢＤｗｔの第一のアスパラギン残基を、第２８位置（Ａｓｎ２８）にて安定化することができる。本発明の方法における使用のためのＡＢＤの安定化物は、１９アミノ酸のＮ末端テールの一部又はすべてを含むことができ、あるいはそのようなテールを全く含まなくてもよい。
【００５０】
安定化されたＡＢＤは、上で論じたように、さらにランダム化に供され、例えばＨＳＡに対する修飾された結合特性を有する、及び／又は、何らかの選択の標的に結合することができ、また、ＨＳＡに対する親和性も保持するタンパク質（即ち、コンビナトリアルタンパク質）を作ることができる。ランダム化は、安定化工程で修飾された同じ又は、好ましくは異なる、残基の突然変異誘発を含むことができる。そのようなＡＢＤの誘導体（例えば、ランダム又は特異的突然変異誘発によって作られた突然変異体）もまた、本発明の範囲に包含される。
【００５１】
従って、本発明の更なる側面は、アルブミン結合タンパク質（ＡＢＤ）、あるいはその断片又は誘導体であって、１つ以上の固有のアスパラギン残基が、アルカリ感受性がより低いアミノ酸によって置換されているものである。そのようなタンパク質をコードする核酸分子も、そのタンパク質を発現する細胞も、本発明の更なる側面を構成する。
【００５２】
特に好ましい態様においては、Ａｓｎ２８はロイシンで置換され、Ａｓｎ４２はアスパラギン酸で置換され、Ａｓｎ４５はアスパラギン酸で置換され、そしてＡｓｎ４６はリジンで置換される（本明細書では、ＡＢＤｍｕｔと呼称する）。「ＡＢＤｍｕｔ」は、１９アミノ酸のＮ末端テールの一部又はすべてを含む、あるいはそのようなテールを全く含まないタンパク質を意味するために使用される。典型的には、ＡＢＤｍｕｔが、例えばドメインＺを有する、融合タンパク質の一部であるならば、Ｎ末端テールの一部のみが存在するか、あるいはそのようなテールはないであろう。アスパラギンは、アルカリ感受性が最も強いアミノ酸であり、従って、それを置換するために、他の任意のアミノ酸残基を使用することができ、安定性の向上が期待されるであろう。置換に用いるのに好適なアミノ酸を同定するために、他の種で見出される又は同じ役割を担う他の相同タンパク質の配列を比較することが、役に立ち得る。
【００５３】
他のアフィニティリガンドの安定化に好適な方法においては、ＰＣＲ突然変異誘発により、修飾が導入された。初めに、突然変異を導入するために、ミスマッチプライマーを用いる。次に、一回目のＰＣＲ反応で得られた断片を混合し、ポリメラーゼに鎖を充填させる。修飾を含むＡＢＤの二本鎖の断片を制限酵素で切断し、同じ酵素で制限されたプラスミドに連結する。これを、その後、そのタンパク質の発現系である大腸菌を形質変換するために使用する。
【００５４】
好ましくは、本発明の方法によって精製された（即ち、得られた）アフィニティリガンドは、０．５ＭのＮａＯＨでの２０回の処理の後において、その正常な結合能力の８０％超、好ましくは９５％超を保持する。
【００５５】
本発明は、以下の非制限的な実施例において、更に説明されるであろう。
【００５６】
実施例を通して、ＡＢＤｓｔａｂ及びＡＢＤｍｕｔは、同義的に使用する。
【００５７】
実施例１  クローニング
ＰＣＲ突然変異誘発の鋳型として、ｐＴｒｐＡＢＤＴ１Ｔ２を用いた（Ｋｒａｕｌｉｓ等、１９９６年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、第３７８巻、１９０−１９４頁）。プラスミドは、トリプトファン・プロモーターの制御下、ＡＢＤｗｔの遺伝子をコードする。ＰＣＲ突然変異誘発は２段階で行われる。１回目のＰＣＲで、突然変異を導入し、ＰＣＲの第２ラウンドで、１回目の反応からの断片を混合して、ポリメラーゼに鎖を充填させた（図１）。最初のＰＣＲで用いたプライマーは、
【００５８】
【化２】
0004801258.tif 000003
であった。
【００５９】
二本鎖の断片をＸｂａ  ＩとＰｓｔ  Ｉで切断し、同じ酵素で制限されたｐＴｒｐＡＢＤＴ１Ｔ２に連結した。連結反応混合物を用いてＥ．ｃｏｌｉ、ＲＲＩΔＭ１５株を形質転換した。ＰＣＲにより挿入のサイズを確認した後、配列をサイクル・シーケンシングで確かめた（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。その結果得られたプラスミドを、ｐＴｒｐＡＢＤｍｕｔＴ１Ｔ２と名付けた。
【００６０】
実施例２  発現及び精製
ＡＢＤｍｕｔ及び参照として野生型ＡＢＤをもコードするプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞を、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ）（５ｇ／ｌ）及びカナマイシン一硫酸塩（５０ｍｇ／ｌ）を添加した５００ｍｌのトリプティック・ソイ・ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ）（３０ｇ／ｌ）を含む振動フラスコ中で一晩培養した。ＡＢＤ遺伝子はトリプトファン・プロモーターの制御下にあるので、そのアミノ酸が生育培地中に欠けているときにメッセンジャーＲＮＡの生成が始まる。細胞を、２０時間後、遠心分離（４０００×ｇ、１０分間）によって採集した。細胞を３０ｍｌのＴＳＴ（２５ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）中に再懸濁させた後、それらを超音波処理によって粉砕した。その後、遠心分離工程（約４０，０００×ｇ、２０分間）を行った。上清をろ過（０．４９μｍ）した。可溶性タンパク質を、Ｓｔａｈｌ等（１９８９年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．、第１２４巻、４３−５２頁）により記載されたようにヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）セファロース上のアフィニティクロマトグラフィーで単離した。流出画分中のタンパク質含量を２８０ｎｍにおける吸光度によって測定し、関連のある画分を集めて凍結乾燥した。両方のタンパク質は第一工程精製後で高純度であり、その分子の大きさに従って移動する。
【００６１】
実施例３  ＮａＯＨ処理前後の結合特性
ＡＢＤｗｔ及びＡＢＤｍｕｔの安定性を調べるため、室温で、２４時間の０．５Ｍ  ＮａＯＨ処理前後で、結合特性を調べた。ＡＢＤｗｔ及びＡＢＤｍｕｔの両者を、１ｘＨＢＳ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＰ２０）中に濃度が８００ｎＭになるまで溶解し、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で分析した。非常にアルカリ性の環境にさらした後の活性変化を決定するため、これらのタンパク質を０．５Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。ＮａＯＨ中で２４時間インキュベートした後、試料を、３０ｍＭ酢酸アンモニウムで平衡化されたＮＡＰ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に通した。タンパク質含有試料を凍結乾燥し、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００中で分析するため、１ｘＨＢＳ中に濃度が８００ｎＭになるまで再溶解した。
【００６２】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析
ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００の器械（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）を、リアルタイムアフィニティ分析のために用いた。ＨＳＡ及びＩｇＧを、カルボキシル化されたデキストラン層へのアミン・カップリングにより、ＣＭ５センサー・チップの２つの異なった表面に固定化した。このカップリングは、製造業者の推奨（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）に従って行った。ＩｇＧ表面を対照として用いた。試料を、０．４５μｍフィルターを通して、流速５μｌ／分でランダムな順序で表面に注入した。結果は、明らかに、ＡＢＤｗｔはアルカリ性溶液にさらされている間にＨＳＡに対する親和性を失い、一方、４つのアスパラギン残基を欠いた突然変異体は親和性を保っていることを示す。センサーグラムを図５に示す。
【００６３】
また、まだ活性を保っているタンパク質に対して速度パラメーターの解析を行った。これは、異なる濃度での結合挙動の解析、及びその後のＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ２．１ソフトウエア（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）を用いた結合定数の計算によって行った。用いた濃度は、ＡＢＤｗｔについては４０〜２００ｎＭ、ＡＢＤｍｕｔについては２００〜６００ｍＭで、ＮａＯＨ処理したＡＢＤｍｕｔについては８００〜１２５０ｍＭであった。結果を、以下の表１に示す。
【００６４】
【表１】
0004801258.tif 000004
【００６５】
実施例４  アフィニティマトリックスの製造
安定化したＨＳＡ結合タンパク質のバイオテクノロジーにおける有用性を評価するため、２つのアフィニティクロマトグラフィーマトリックスを製造した。即ち、１つは対照としての突然変異をさせていないタンパク質（ＡＢＤｗｔ）で、もう１つは突然変異させたＡＢＤ（ＡＢＤｍｕｔ）である。用いたマトリックスは、カップリング剤としてカルボジイミド  ＣＭＣ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｗｅｄｅｎ）のついたセファロース  ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）であった。ＡＢＤｗｔ（４．５ｍｇ）とＡＢＤｍｕｔ（８．５ｍｇ）を、別々に９ｍｌの水に溶解させた。３．５ｍｌと５．０ｍｌのゲルを、ＡＢＤｗｔとＡＢＤｍｕｔ溶液にそれぞれ添加した。最後に、０．３８ｇのＣＭＣを溶液に加え、それらを室温で一晩インキュベートした。ゲルを、ＨＲカラム（ｄ＝５ｍｍ、ｈ＝４３ｍｍ）に詰め、マトリックスを不活性にするためには０．５Ｍのエタノールアミン、０．５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ８．３でパルスし、結合していないタンパク質を洗い流すためには０．１Ｍの酢酸ナトリウム、０．５Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ４でパルスした。この後に、カラムはＨＳＡのアフィニティ精製に用いる準備ができた。
【００６６】
実施例５  保持された選択性
突然変異させたタンパク質のＨＳＡに対する選択性が４つのアミノ酸の交換後に保持されているかを調べるため、捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）の実験を行った。一晩生育させたＥ．ｃｏｌｉ細胞の培養物を、超音波処理で壊し、４０，０００×ｇで遠心分離し、０．４５μｍのフィルターでろ過した。Ｅ．ｃｏｌｉライセート（溶解物）の可溶性画分を精製されたＨＳＡと混合し、この混合物をＡＢＤｍｕｔアフィニティカラムにかけた。カラムを洗浄後、結合物を、Ｓｔａｈｌ等（１９８９年、前出）により記載されたように、ｐＨを２．８まで下げることで溶出した。図４に見られるように、ＡＢＤの突然変異体において選択性は保持されている。
【００６７】
実施例６  耐アルカリ性アフィニティカラム
ＡＢＤｗｔカラムとＡＢＤｍｕｔカラムとのアルカリ処理に対する安定性に関しての相違を調べるため、両方のカラムを０．５Ｍの水酸化ナトリウムで繰り返し洗浄した。ＡＫＴＡエクスプロラ（ｅｘｐｌｏｒｅｒ）を用いて、カラムにＨＳＡを充填し、タンパク質をｐＨを下げることで溶出し（Ｓｔａｈｌ等、１９８９年、前出）、最後に両方のカラムを水酸化ナトリウムで洗浄した。このサイクルを１５回繰り返した。総暴露時間は６時間を越えた。用いた流速は６０ｃｍ／時間であり、溶出物を集め、各回毎に分析した。図６には、能力の低下が水酸化ナトリウム暴露時間に対してプロットされている。この図に見られるように、ＡＢＤｗｔは活性をかなり速く失い、一方、突然変異体は実験を通して活性を維持している。これらの結果は、ＢＩＡＣｏｒｅのデータを裏付けており、突然変異体は、クリーニング・イン・プレース（ｃｌｅａｎｉｎｇ−ｉｎ−ｐｌａｃｅ）処理に対し、野生型分子よりもはるかに安定である。
【００６８】
実施例７  Ｚ−ＡＢＤｓｔａｂの製造及び精製
凍結させたＥ．ｃｏｌｉ  ＲＲＩΔＭ１５培地（発現ベクターｐＴＲＰＺＡＢＤｓｔａｂＴ１Ｔ２を宿している）を、５ｇ／ｌ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）と５０ｍｇ／ｌのカナマイシン一硫酸塩（Ｌａｂｋｅｍｉ
Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）でを添加した２０ｍｌのトリプティック・ソイ・ブロス（３０ｇ／ｌ）を接種するために用いた。１０ｍｌの一晩培養物を用いて５００ｍｌの新鮮な培地を接種した。細胞を、３７℃で生育させ、タンパク質の発現を、３−β−インドールアクリル酸（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）を最終濃度が２５ｍｇ／ｍｌとなるまで添加することにより、対数増殖中期（Ａ６００ｎｍ＝１）で誘導した。２４時間後、細胞を、約５０００ｇで１０分間の遠心分離、それに続くＴＳＴ緩衝液（２５ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．５、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０）への再懸濁により採集した。細胞を、超音波処理（Ｖｉｂｒａｃｅｌｌ、Ｓｏｎｉｃｓ  ＆  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｄａｎｂｕｒｙ、ＣＴ、ＵＳＡ）により分解し、３００００ｇ、２０分間で遠心分離した。上清を、０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）でろ過し、ＨＳＡアフィニティクロマトグラフィ（Ｎｙｇｒｅｎ等、１９８８年）にかけた。溶出したタンパク質量を、比吸光度係数、ａ（Ｌ／ｇ＊ｃｍ）を用いて吸光度測定により見積り、関連のある画分を凍結乾燥した。
【００６９】
実施例８  融合タンパク質Ｚ−ＡＢＤｓｔａｂの遺伝子構築
プラスミドｐＴＲＰＺＡＢＤｓｔａｂＴ１Ｔ２を、ｐＴＲＺＡＢＤｍｕｔＴ１Ｔ２から構築した。Ｚドメインをコードする２３３塩基対の遺伝子断片を、ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ消化によりｐＲＩＴ４５（Ｎｉｌｓｓｏｎ等、１９９４年、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第２２４巻、１０３８−１０８）から分離し、ｐＴＲＰＡＢＤｍｕｔＴ１Ｔ２（これは前もって同じ制限エンドヌクレアーゼを用いて切断されている）に連結した。連結反応混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＲＩΔＭ１５株を形質転換した。その結果得られたプラスミドは、融合タンパク質Ｚ−ＡＢＤｓｔａｂをコードする遺伝子を含み、ｐＴＲＰＺＡＢＤｓｔａｂＴ１Ｔ２と名付けられた。
【００７０】
ＡＢＤｓｔａｂ及びＺ−ＡＢＤｓｔａｂ（１９アミノ酸のＮ末端のテールをコードする領域を含む）のＤＮＡ配列は、以下のとおりである。
【００７１】
【化３】
0004801258.tif 000005
【００７２】
実施例９  ＡＢＤｍｕｔドメインの３つの三重突然変異体の遺伝子構築
実施例９と１０は、既に安定化されたＡＢＤ分子上の表面（例えば、ＨＳＡ結合に加わっていない表面）をランダム化させ、それによって選択された任意の標的と結合でき、またＨＳＡへのアフィニティをも保持している分子を作り出すことが可能であることを示す。
【００７３】
ＨＳＡへの結合部位をマッピングするためのアラニン・スキャン実験からの結果を基にして、追加のアラニン置換を含むＡＢＤｍｕｔ（実施例１を参照）ドメインをコードする遺伝子構築体を作製した。これらを、同定されたＨＳＡ結合モチーフ（これは第１及び第２へリックス及びその間のループに位置していた）から離れたドメイン中の位置に導入した。３つの異なるプラスミド遺伝子構築体を、ＰＣＲに基づく突然変異誘発によって組立てたが、各々は３つのアラニン置換を含むＡＢＤｍｕｔタンパク質変異体をコードしている。即ち、
ＡＢＤｍｕｔドメインの２２、２５、２６の位置にアラニン置換を含むｐＴｒｐＡＢＤｍｕｔ２２−２５−２６、
ＡＢＤｍｕｔドメインの２９、３０、３３の位置にアラニン置換を含むｐＴｒｐＡＢＤｍｕｔ２９−３０−３３、及び
ＡＢＤｍｕｔドメインの５４、５７、５８の位置にアラニン置換を含むｐＴｒｐＡＢＤｍｕｔ５４−５７−５８である。ＰＣＲ突然異変誘発のための鋳型として、プラスミドｐＴｒｐＡＢＤｍｕｔＴ１Ｔ２を用いた（実施例１を参照）。そのプラスミドは、トリプトファン・プロモーターの転写制御下にＡＢＤｍｕｔの遺伝子をコードする。２２、２５、２６のアミノ酸のアラニンへの交換は、プライマーＴ１Ｔ２（実施例１を参照）とＬＩＭＡ１２を用いて通常のＰＣＲ突然変異誘発によって行った。
【００７４】
【化４】
0004801258.tif 000006
【００７５】
他の２つの構築体についてのＰＣＲ突然変異誘発を２段階で行った。１回目のＰＣＲ増幅では、突然変異を導入し、２回目のＰＣＲでは、１回目のＰＣＲ増幅からの断片を混合して、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼに補佐された二本鎖ＤＮＡ合成に供し（図１と同じ戦略）、続いて隣接プライマー（ＳＯＨＯ８とＴ１Ｔ２（実施例１を参照））を用いて増幅した。２９、３０及び３３のアミノ酸のアラニン交換のためのＰＣＲに用いたプライマーは、
【００７６】
【化５】
0004801258.tif 000007
であった。５４、５７及び５８のアミノ酸の交換のために、ＬＩＭＡ１５及びＬＩＭＡ１６を用いた。
【００７７】
【化６】
0004801258.tif 000008
【００７８】
プラスミドｐＴｒｐＡＢＤｍｕｔ２２−２５−２６の構築のため、二本鎖ＰＣＲ生成物を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで切断し、他の２つの変異体についてはＸｂａＩとＰｓｔＩを用いた。異なる断片を、同じ酵素で制限されたｐＴｒｐＡＢＤＴ１Ｔ２に連結し、これは、３つの異なったＡＢＤｍｕｔ三重変異体での野生型ＡＢＤドメイン遺伝子の置替えをもたらした。それぞれの混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲＲＩΔＭ１５株を形質転換した。挿入物のサイズを確認した後、配列を、サイクルＤＮＡシーケンシングで制御した（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。その結果得られたプラスミドを、それぞれｐＴｒｐＡＢＤｍｕｔ２２−２５−２６、ｐＴｒｐＡＢＤｍｕｔ２９−３０−３３、及びｐＴｒｐＡＢＤｍｕｔ５４−５７−５８と名付けた。
【００７９】
３つの三重変異体のＤＮＡ配列は以下のとおりである。
【００８０】
【化７】
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【００８１】
実施例１０  ＡＢＤｍｕｔ２２−２５−２６、ＡＢＤｍｕｔ２９−３０−３３及びＡＢＤｍｕｔ５４−５７−５８タンパク質のＨＳＡ結合の分析
ＡＢＤｍｕｔ２２−２５−２６、ＡＢＤｍｕｔ２９−３０−３３、及びＡＢＤｍｕｔ５４−５７−５８タンパク質を、実施例２で記載した通りに製造し、精製した。異なった三重変異体の結合挙動を分析するため、ＢＩ  ｃｏｒｅ  ２０００装置を用いた。ＨＳＡを、カルボキシル化されたデキストラン層へのアミン・カップリングによりＣＭ５センサー・チップのセンサー・チップ表面に固定化した。対照として、ＩｇＧを含むセンサー・チップ表面を用いた。このカップリングは、製造業者の推奨（Ｂｉｏｃｏｒｅ  ＡＢ）に従って行った。３つのタンパク質の試料を０．４５μｍフィルターに通し、流速２０μｌ／分でランダムな順序で表面に注入した。用いた濃度は２００ｎＭで、全ての試料を３回分析した。その結果得られたセンサーグラムは、３つの三重変異体の全てがＨＳＡへの結合能力を保持していることを示す（図７）。これらの結果は、この研究で調べられた９つの位置（２２、２５、２６、２９、３０、３３、５４、５７、５８）が、同時に又は異なった組み合わで、結合、触媒又は基質としての働きのような第２の活性を有する新しいＨＳＡ結合ＡＢＤｗｔ又はＡＢＤｍｕｔドメインを同定するために、部位特異性又はランダム突然変異誘発に供することが可能であるべきことを示す。加えて、残基６２も置換のために用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明によるＰＣＲ突然変異誘発工程の図による説明である。
【図２】  図２は、遺伝子構築のクローニングを示す。
【図３】  図３は、野生型ＡＢＤとその突然変異によるアルカリ耐性変異体のアミノ酸配列である。突然変異による変異体の全配列を、本明細書においては、配列番号１と名付ける。
【図４】  図４は、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％）を示す。レーン１及び２は、それぞれ、精製されたＡＢＤ及びＡＢＤｓｔａｂを示す。第三のレーンは、分子量マーカー（上からそれぞれ９４、６７、４３、４０、２０．２及び１４．４ｋＤａ）を示す。突然変異されたＡＢＤの選択性を確かめるために、大腸菌分解物を、ＨＳＡ（レーン４）でスパイクし、カラムに載せた。レーン５、６及び７は、２、８及び１５回のＮａＯＨでの処理後に溶出された物質を示す。レーン８は、ＨＳＡ対照を示す。
【図５】  図５は、０．５ＭのＮａＯＨでの２４時間の処理の前後における、（Ａ）ＡＢＤｗｔと（Ｂ）ＡＢＤｍｕｔの結合特性を示すＢＩＡＣｏｒｅに由来するセンサーグラムを示す。
【図６】  図６は、０．５ＭのＮａＯＨでの数回の処理後における、２つのアフィニティマトリックス（それぞれＡＢＤｗｔとＡＢＤｍｕｔ）の能力を示すダイアグラムである。
【図７】  図７は、ＡＢＤｍｕｔ及びその３種の異なる三重変異体の結合特性を示す、実施例１０に記載されたＢＩＡＣｏｒｅ実験に由来するセンサーグラムを示す。
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【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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