(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染性組換えパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）のゲノムまたはアンチゲノム、ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、および大型ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）を含む単離ＰＩＶであって、そこでＣオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発現を除去するがインタクトＰタンパクの産生を妨げない一つまたは一つより多いヌクレオチド変化が当該ゲノムまたはアンチゲノムへ導入された、前記単離ＰＩＶ。
【請求項２】
該Ｃ  ＯＲＦの発現が一つまたは一つより多い終結コドンの導入により除去された、請求項１の組換えＰＩＶ。
【請求項３】
請求項２の組換えＰＩＶであって、そこで該Ｃ  ＯＲＦ開始コドンが当該ゲノムまたはアンチゲノムの位置１７９５におけるヌクレオチド変化によりトレオニンコドンへ変えられ、二つの終結コドンがヌクレオチド１８１３および１８６９の変更により導入された、前記組換えＰＩＶ。
【請求項４】
請求項１の組換えＰＩＶであって、そこで細胞培養におけるウイルス増殖が、相当する野生型または変異体親ＰＩＶ株の増殖に比べて、５から１０倍またはそれ以上に減衰化された、前記組換えＰＩＶ。
【請求項５】
請求項１の組換えＰＩＶであって、そこで細胞培養におけるウイルス増殖が、相当する野生型または変異体親ＰＩＶ株の増殖に比べて、１０から１００倍またはそれ以上に減衰化された、前記組換えＰＩＶ。
【請求項６】
請求項１の組換えＰＩＶであって、そこで細胞培養におけるウイルス増殖が、相当する野生型または変異体親ＰＩＶ株の増殖に比べて、１００から１，０００倍またはそれ以上に減衰化された、前記組換えＰＩＶ。
【請求項７】
請求項１の組換えＰＩＶであって、そこで該ゲノムまたはアンチゲノムが、ＰＩＶ３ＪＳｃｐ４５内に存在する弱毒化突然変異の少なくとも一つおよび全体までを取込むことによりさらに修飾された、前記組換えＰＩＶ。
【請求項８】
請求項１の組換えＰＩＶであって、そこで該ゲノムまたはアンチゲノムが、ＰＩＶ３Ｌ遺伝子中のＴｙｒ９４２，Ｌｅｕ９９２，および／またはＴｈｒ１５５８；Ｎ遺伝子中のＶａｌ９６および／またはＳｅｒ３８９；Ｃ遺伝子中のＩｌｅ９６；Ｆ遺伝子中のＩｌｅ４２０および／またはＡｌａ４５０；ＨＮ遺伝子中のＶａｌ３８４におけるアミノ酸置換を、および／またはＮ遺伝子に関連した遺伝子開始配列中の位置２３、２４、２８、４５、および／または６２における３’リーダー中のヌクレオチド置換を、指定する弱毒化突然変異の少なくとも一つまたは全部を含む、前記組換えＰＩＶ。
【請求項９】
請求項８の組換えＰＩＶであって、そこで該ゲノムまたはアンチゲノムが、当該突然変異を指定するコドン中の複数のヌクレオチド変化により安定化される少なくとも一つの弱毒化突然変異を含む、前記組換えＰＩＶ。
【請求項１０】
生理的に受容可能な担体中に免疫原的に十分量の請求項１の組換えＰＩＶを含む、ＰＩＶに対して免疫応答を起させる免疫原性組成物。
【請求項１１】
１０３から１０７ＰＦＵの用量で処方される、請求項１０の免疫原性組成物。
【請求項１２】
スプレーまたは液滴により上気道へ投与するために処方される、請求項１０の免疫原性組成物。
【請求項１３】
請求項１０の免疫原性組成物であって、そこで該組換えＰＩＶが、ＨＰＩＶ１，ＨＰＩＶ２およびＨＰＩＶ３から選択される一つまたは一つより多いウイルスに対して免疫応答を起させる、前記組成物。
【請求項１４】
請求項１３の免疫原性組成物であって、そこで該組換えＰＩＶが、ＨＰＩＶ３、およびＨＰＩＶ１またはＨＰＩＶ２のもう一つの別のウイルスに対して免疫応答を起させる、前記組成物。
【請求項１５】
Ｃ  ＯＲＦの部分的または完全欠失、またはＣ  ＯＲＦの発現を除去する一つまたは一つより多いヌクレオチド変化を含む修飾が含まれた当該ＰＩＶゲノムまたはアンチゲノムを含む、請求項１、２または３記載の組換えＰＩＶの製造に使用される単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項１６】
請求項１５の単離ポリヌクレオチド分子であって、そこでＣ  ＯＲＦの発現が、一つまたは一つより多い終結コドンの導入により、または開始コドンにより指定されるアミノ酸を変更する突然変異により除去された、前記ポリヌクレオチド分子。
【請求項１７】
請求項１５の単離ポリヌクレオチド分子であって、そこで該組換え体ゲノムまたはアンチゲノムが、ＰＩＶ３ＪＳｃｐ４５内に存在する一つまたは一つより多い弱毒化突然変異によりさらに修飾された、前記ポリヌクレオチド分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
ヒトパラインフルエンザ３型（ＨＰＩＶ３）は１歳未満の新生児及び小児に於ける重症下気道感染症の主原因の一つである。上記年齢群に於けるウイルス性下気道疾患による入院の主原因として呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）に次ぐものである（Ｃｏｌｌｉｎｓら、ｐ１２０５−１２４３、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ（Ｋｎｉｐｅら、編集）、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版、第１巻．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６；Ｇｒｏｗｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：４１５−４２１、１９９５；Ｍａｒｘら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ，１７６：１４２３−１４２７、１９９７）。本ウイルスによる感染は３歳未満の小児に高い罹病率をもたらす。ＨＰＩＶ１及びＨＰＩＶ２は咽頭気管気管支炎（クルップ）の主要病原菌であり、また重症肺炎及び気管支炎も引き起こすことがある（Ｃｏｌｌｉｎｓら、第３版、“Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ、Ｒ．Ｍ．Ｃｈａｎｏｃｋ、Ｊ．Ｌ．Ｍｅｌｎｉｃｋ，Ｔ．Ｐ．Ｍｏｎａｔｈ，Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ、及びＳ．Ｅ．Ｓｔｒａｕｓ、編集、第１巻、っｐ。１２０５−１２４３、Ｌｉｐｐｉｎｏｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６）。２０年間にわたる長期の研究により、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２及びＨＰＩＶ３がそれぞれ、入院原因の１８％を占める気道疾患による入院の６．０、３．２、及び１１．５％の原因であることがしめされ、それ故に効果的なワクチンが求められている（Ｍｕｒｐｈｙら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  １１、１−１５、１９８８）。パラインフルエンザウイルスはまた、ウイルスを原因とする中耳炎による小児の中耳滲出例に高い割合でも見つかっている（Ｈｅｉｋｋｉｎｅｎら、Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４０：２６０−４、１９９９）。即ち、これらＨＰＩＶ感染に伴う重症下気道疾患及び中耳炎を防ぐことができる、これらウイルスに対するワクチンの製造が求められている。
【０００２】
ＨＰＩＶに対し有効なワクチン治療法の開発には多大な努力が払われてきたがいずれかのＨＰＩＶ株について有効な、あるいはＨＰＩＶ関連疾患を軽減することができる承認されたワクチンの開発は達成されていない。今日注目されているものは、２種類の生ワクチン候補のみである。それら候補の内の１つは、ＨＰＩＶ３に抗原的に関連するウシＰＩＶ（ＢＰＩＶ３）株であり、ＨＰＩＶ３から哺乳動物を防御することが示されている。ＢＰＩＶ３は弱毒化され、遺伝的に安定であり、ヒト乳児及び小児に於いて免疫原性である（Ｋａｒｒｏｎら、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ、１７１：１１０７−１４（１９９５ａ）；Ｋａｒｒｏｎら、Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１７２：１４４５−１４５０、（１９９５ｂ））。第２ＰＩＶ３ワクチン候補、ＪＳ  ｃｐ４５はＨＰＩＶＪ３型のＳ野生型（ｗｔ）株の低温適応型突然変異体である（Ｋａｒｒｏｎら、（１９９５ｂ）、上記；Ｂｅｌｓｈｅら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．１０：２３５−４２（１９８２））。この生の弱毒化された低温継代された（ｃｐ）ＰＩＶ３ワクチン候補は、温度感受性（ｔｓ）、低温適応（ｃａ）及び弱毒化（ａｔｔ）表現形を示し、これらはインビボでのウイルス複製後も安定している。ｃｐ４５ウイルスは実験動物でのヒトＰＩＶ３接種に対し予防的であり、そして血清陰性であるヒト乳児及び小児に於いて弱毒化され、遺伝的に安定であり、そして免疫原性である（Ｈａｌｌら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２２：１７３−１８４（１９９２）；Ｋａｒｒｏｎら、（１９９５ｂ）、上記）。
【０００３】
ＰＩＶワクチン候補の開発を促進するために、組換え体ＤＮＡ技術によりｃＤＮＡより感染性のマイナス鎖型ＲＮＡウイルスを回収することが可能になった（レビューについては、Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ、Ｊ．Ｇｅｎ。Ｖｉｒｏｌ，７７：３８１−８９（１９９６）参照；Ｐａ；ｅｓｅら、Ｐｒｏｃ。Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ。９３：１１３５４−５８，（１９９６））。この関係では、必須ウイルス蛋白質存在下にｃＤＮＡコードアンチゲノムＲＮＡからの感染性呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）、狂犬病ウイルス（ＲａＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、発疹ウイルス（ＭｅＶ）、牛疫ウイルス、シミアンウイルス５（ＳＶ５）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）及びセンダイウイルス（ＳｅＶ）の組換え体による回収が報告されている（例えばそれぞれ全ての目的に関しその全体が参照され、ここに取り込まれているＧａｒｏｉｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：６０８７ー６０９４（１９９５）；Ｌａｗｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：４４７７−８１（１９９５）；Ｒａｄｅｃｋｅら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：５７７３−５７８４（１９９５）；Ｓｃｈｎｅｌｌら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：４１９５−２０３（１９９４）；Ｗｈｅｌａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：８３８８−９２（１９９５）；Ｈｏｆｆｍａｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：４２７２−４２７７（１９９７）；Ｋａｔｏら、Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ  １：５６９−５７９（１９９６）、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４７（１）、１−６（１９９８）；Ｂａｒｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１（１９９７）；国際出願第ＷＯ／９７／０６２７０号；Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：１１５６３−１１５６７（１９９５）；１９９７年７月１５日出願、米国特許出願第０８／８９２，４０３号（公開国際出願第ＷＯ９８／０２５３０号及び１９９７年５月２３日出願、先行米国仮出願第６０／０４７，６３４号、１９９７年５月９日出願第６０／０４６．１４１号及び１９９６年７月１５日出願第６０／０２１．７７３号に対応する）；Ｊｕｈａｓｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（８）５８１４−５８１９（１９９７）；Ｈｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３７；２４９−２６０（１９９７）；Ｂａｒｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１（１９９７）；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４７（２）：２３２−９（１９９８ａ）；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（５）：４４６７−４４７１（１９９８ｂ）；Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５００１−５００９、１９９９；Ｊｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２５１：２０６−２１４（１９９８）；Ｂｕｃｈｏｌｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７３：２５１−２５９（１９９９）；及びＷｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：（４）３４３８−３４４２（１９９９）を参照）。
【０００４】
本発明のより具体的な関係では、感染性の組換え体ＰＩＶ３  ＪＳ株の回収に関して、ｃＤＮＡよりｗｔ表現形を持つＨＰＩＶを製造する方法が最近開発された（例えばＤｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５；３２３−３３２，１９９７；１９９８年５月２２日出願、米国特許出願第０９／０８３，７９３号；１９９７年５月２３日出願、米国仮出願第６０／０４７，５７５号（国際出願第ＷＯ９８／５３０７８号に相当）及び１９９７年９月１９日出願、米国仮出願第６０／０５９，３８５号、いずれも参照されここに取り込まれている、を参照）。更に、これら開示によりｃＤＮＡクローンの遺伝的操作により生物学的突然変異体に於ける表現形の変化の遺伝的基礎、即ちＨＰＩＶ３ｃｐ４５ウイルス内のどの突然変異がｔｓ、ｃａ及びａｔｔ表現形を決定している、そしてどのＢＰＩＶ３の遺伝子がその弱毒化表現形を規定するか特定することが可能にした。更に、これら開示は新規ＰＩＶワクチン候補の構築、及びそれらの弱毒化、免疫原性及び表現形安定性の評価を実現した。
【０００５】
即ち感染性のある野生型組換え体ＰＩＶ３（ｒ）ＰＩＶ３及び複数のｔｓ誘導体がｃＤＮＡより回収されており、逆行性の遺伝子システムを使用して特定の弱毒化突然変異を持ち感染性ウイルスが作られ、そして既存ワクチンウイルスの弱毒化の遺伝的基礎が研究されている。例えば、ｃｐ４５のＬ遺伝子内に見いだされた３種類のアミノ酸置換は単独、又は組合せによりｔｓ及び弱毒化表現形を規定していることが分かっている。ＰＩＶ３ｃｐ４５のその他領域には別のｔｓ及び弱毒化突然変異体が存在する。更に、ＰＩＶ３ｃＤＮＡ回収システムを使い、Ｌ中に３種類全ての弱毒化突然変異を含むＰＩＶ３全長ｃＤＮＡ中にて、ＰＩＶ３ＨＮとＦのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）をＰＩＶ１のそれと置換しキメラＰＩＶ１ワクチン候補が作製されている。このｃＤＮＡ由来の組換え体キメラウイルスはｒＰＩＶ３−１ｃｐ４５Ｌと命名されている（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：１７６２−８、１９９８；Ｔａｏら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：２９５５−２９６１、１９９８；Ｔａｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：１１００−１１０８、１９９９，参照されここに取り込まれている）。ｒＰＩＶ３−１。ｃｐ４５Ｌはハムスターでは弱毒化され、接種されたＰＩＶ１に対し高いレベルの耐性を誘導した。ｒＰＩＶ３−１．ｃｐ４５と命名された組換え体キメラウイルスは、１５種類のｃｐ４５突然変異中１３種類を含む様に、即ちＨＮ及びＦの突然変異を除く形に作製されており、ハムスターの上気道及び下気道内にて強く弱毒化されている（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、印刷中、１９９９）。
【０００６】
各種ＰＩＶ群に対し有効なワクチンの開発に関するこれら数多く進歩にも関わらず、ＰＩＶによる重症の健康上の問題、特に乳児及び小児に於けるＨＰＩＶ３感染による疾患を軽減するための安全且つ効果的なワクチンを作製する更なる手段及び方法に関する明瞭な必要性が依然として当分野には存在している。この関係で残っている要求の中には、様々な臨床条件に於ける使用に適した、好ましく弱毒化された免疫原性を持つ遺伝的に安定なワクチン候補を作製するための更なる手段に関する需要がある。この目的を達するためには、弱毒化突然変異を特定し、組換え体ワクチン株にこれを取り込ませるための既存方法をさらに拡張する必要がある。驚くべきことに、本発明はこの必要性を充足し、以下記載の如く更なる利点も提供する。
【０００７】
発明の概要
本発明は感染性ＰＩＶに限定された所定の構造上及び表現形上の変化を導入する新規手段及び方法を提供する。発明の実施態様の一つでは、動作可能に結合された転写プロモーター、ＰＩＶゲノム又はアンチゲノムをコードするポリヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子、及び転写ターミネーターが提供される。ゲノム及びアンチゲノムは、Ｃ、Ｄ及び／又はＶ遺伝子の１つ、又はそれ以上の発現を低下させる又は除くノックアウト突然変異、又はＣ、Ｄ及び／又はＶのＯＲＦの１つ又はそれ以上の全て、もしくは一部を欠失した突然変異を取り込んでいる。
【０００８】
発明の好適側面では、Ｃ、Ｄ及びＶのＯＲＦの１つ又はそれ以上の発現は、ＰＩＶゲノム又はアンチゲノムを変更しＣのＯＲＦに関して開始コドンをＭからＣに、又は１又はそれより多いストップコドンに変化させる突然変異を取り込むことで低下又は除かれる。あるいは、Ｃ、Ｄ及び／又はＶのＯＲＦの１またはそれ以上が点突然変異の様なその他変異によりその全て又は一部を欠失されることで、対応する蛋白質が部分的又は全体的に機能しなくなるか、又は蛋白質の発現も破壊される。又は、変異を編集部位に起こし、ＲＮＡの編集により得られる蛋白質の編集を阻害し取り除くことできる（Ｋａｔｏら、ＥＭＢＯ  １６：５７８−５８７、１９９７及びＳｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２７：３１４−３２２，１９９７）。
【０００９】
発明の、Ｃ，Ｄ及び／又はＶに突然変異を有する組換え体ＰＩＶは、ワクチン開発に特徴的な極めて望ましい表現形上の特性を有している。組換え体ゲノム又はアンチゲノムの上記変更は、ウイルス及びサブウイルス粒子を生ずる１又はそれより多い所望の表現形を指定する。即ち、ワクチン候補は(i)細胞培養に於ける増殖特性の変化、(ii)哺乳動物宿主に於ける上気道又は下気道での弱毒化、(iii)ウイルスプラークのサイズの変化、(iv)細胞病理学的作用の変化、及び(v)免疫原性の変化として特定される１、またはそれより多い特性を有するものとして作製される。
【００１０】
ここに記載の例示ＰＩＶ組換え体では所望される表現形の変化には、対応する野生型又は突然変異体親株ＰＩＶの増殖に比べインビトロ及び／又は哺乳動物宿主でのウイルス増殖の低下が含まれる。より詳細な観点では、細胞培養でのウイルス増殖はノックアウト又は遺伝子（又はゲノム断片）欠失変異により約５−１０倍低下するだろう。哺乳動物宿主の上気道及び／又は下気道に於けるウイルスの弱毒化は、ワクチン開発を促進するために、好ましくは約１０−１００倍弱められ、時には１００−１，０００倍又はそれ以上弱められる。同時に、発明の組換え体ＰＩＶは哺乳動物宿主の上気道及び下気道の何れについても、ｗｔＰＩＶによる攻撃に対する防衛的免疫反応を促進する免疫原性を有している。
【００１１】
Ｃ、Ｄ及び／又はＶノックアウト変異を持つＰＩＶゲノム又はアンチゲノムは、ヒト又は非ヒト型ＰＩＶ配列でよく、又はその組み換え修飾型でもよい。実施態様の一つでは、ポリヌクレオチド配列は非ヒト型ＰＩＶ配列、例えばウシＰＩＶ（ＢＰＩＶ）由来の遺伝子又は遺伝子断片と組み換え的に結合されたヒトＰＩＶ配列を含むキメラゲノム又はアンチゲノムをコードしている（例えば参照されここに取り込まれている、１９９９年７月９日にＢａｉｌｅｙらより出願された、弱毒化ヒト−ウシキメラパラインフルエンザウイルスワクチン（ＡＴＴＥＮＵＡＴＥＤ  ＨＵＭＡＮ−ＢＯＶＩＮＥ  ＣＨＩＭＥＲＩＣ  ＰＡＲＡＩＮＦＬＵＥＮＺＡ  ＶＩＲＵＳ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ）を発明の名称とする、代理人整理番号１５２８０−３９９０００ＵＳの米国仮出願特許を参照せよ）。更成る例では、ポリヌクレオチドは非ヒト型ＰＩＶと少なくとも１種類のヒト又は非ヒト起源のその他ＰＩＶ由来の配列からなるキメラをコードしている。
【００１２】
別の実施態様では、発明はＣ、Ｄ及び／又はＶコックアウト変異を取り込んでいる組換え体ＰＩＶ（ｒＰＩＶ）ゲノム又はアンチゲノムを含む単離された感染性ＰＩＶ粒子を提供する。単離型感染性ＰＩＶ粒子はウイルス又はサブウイルス粒子であろう。ここに使用される場合、サブウイルス粒子とは、完全ウイルス（例えば完全ゲノム又はアンチゲノム、ヌクレオカプシド及びエンベロープを含み組み立てられたビリオン）には存在している例えば遺伝子断片、遺伝子、蛋白質、又は蛋白質の機能ドメインの様な構造要素を欠いている感染性のＰＩＶ粒子を意味している。即ち、発明のサブウイルス粒子の１例はゲノム又はアンチゲノムとＮ、Ｐ及びＬ遺伝子の産物を含む感染性ヌクレオカプシドである。その他サブウイルス粒子は、他非必須ゲノム的及び構造的要素のなかより非必須遺伝子、ゲノム断片、及び／又は部分的又は完全な遺伝子産物（例えばＦ，ＨＮ、Ｍ又はＣ）を部分的あるいは完全に欠失させるか、又は置換することで作られる。
【００１３】
Ｃ、Ｄ及び／又はＶ欠失、あるいはノックアウト変異を持つ組換え体ＰＩＶに与えられた表現形効果との組合せでは、組換え体ウイルスの弱毒化を増強又は低下させ、そして／又は免疫原活性を変調する追加の突然変異を導入することで、弱毒化及び免疫原性表現形を調節することが望まれることが多い。即ち候補ワクチン株は、少なくとも１種類、そして好ましくは２あるいはそれより多い種類の弱毒化突然変異変異、例えば生物学的に誘導されたＰＩＶ変異体に特定された突然変異、又は組換え体ミニレプリコン、組換え体ウイルスあるいは生物学的に誘導されたウイルスを使用して経験的に特定された変異を取り込むことで、更に弱毒化することができる。この関連にて好適な突然変異型ＰＩＶ株は低温継代（ｃｐ）型、低温適合性（ｃａ）、宿主域制限型（ｈｒ）、小型プラーク型（ｓｐ）及び／又は温度感受性（ｔｓ）突然変異、例えばＪＳ  ＨＰＩＶ３ｃｐ４５突然変異株である。例示の実施態様では、１又はそれより多い弱毒化変異がポリメラーゼＬ蛋白質、例えばＪｓｃｐ４５のＴｙｒ９４２、Ｌｅｕ９９２又はＴｈｒ１５５８に相当する位置に発生している。あるいは、Ｎ蛋白質での弱毒化突然変異は選択され、Ｃ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいは例えばＪＳｃｐ４５の残基Ｖａｌ９６又はＳｅｒ３８９に相当する位置にアミノ酸置換をコードしているノックアウト突然変異体に取り込まれる。別又は追加の突然変異は、例えばＪＳｃｐ４５のＩｌｅ９６に相当する位置のＣ蛋白質中にアミノ酸置換をコードしている。発明のＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト変異の弱毒化調製に適した更に別の突然変異は、Ｆ蛋白質中、例えばＪＳｃｐ４５のＩｌｅ４２０又はＡｌａ４５０に相当する位置に、及びＨＮ蛋白質中、例えばＪＳｃｐ４５の残基Ｖａｌ３８４に相当する位置に見いだされる（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３７４−１３８１、１９９９；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７３：１３７４−１３８１、１９９９，それぞれ参照されここに取り込まれている）。
【００１４】
発明のＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異への取り込みに適した生物学的に誘導されたＰＩＶ変異由来の弱毒化突然変異はまた、例えば３’リーダー配列中の様なＰＩＶゲノム又はアンチゲノムの非コーディング域にも変異を含む。この様な突然変異例では、ＪＳｃｐ４５のヌクレオチド２３、２４、２８又は４５に相当する位置で、組換え体ウイルスの３’リーダー内の位置に編集が加えられている（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３７４−１３８１，１９９９，参照されここに取り込まれている）。 更に別の突然変異例はＮ遺伝子開始配列中に編集が施され、例えばＮ遺伝子開始配列中の、例えばＪＳｃｐ４５のヌクレオチド６２に相当する位置にて１又はそれより多いヌクレオチドが変更されることで編集される。
【００１５】
ＪＳｃｐ４５及びその他の生物学的に誘導されたＰＩＶ突然変異からは弱毒化変異の大型メニューが提供され、それぞれの突然変異はＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異を有する組換え体ＰＩＶに於ける弱毒化レベルの調節を目的として、その他突然変異とそれぞれ組合せることができる。例えば発明の組換え体ＰＩＶｓ内の突然変異体は、１又はそれより多い、好ましくは２又はそれより多いＨＳｃｐ４５の突然変異を含む。ワクチン利用に関し選択された発明の望ましいＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失又はノックアウト突然変異は、広範囲の臨床使用に関し満足行くレベルの弱毒化を達成するために多くの場合少なくとも２、時に３またはそれより多い弱毒化突然変異を持つ。好ましくはＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト変異を有する組換え体ＰＩＶは、変異を特定するコドン中に複数のヌクレオチド置換を持つことで安定化された１又はそれより多い弱毒化突然変異を取り込んでいる。  発明のＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異に採用でき、又は移すことができる追加の突然変異は非ＰＩＶ型の断片化されていないマイナス鎖型ＲＮＡウイルスに特定され、発明のＰＩＶ突然変異体に取り込まれるだろう。これは、参照されここに取り込まれている、発明の名称がクローン化ヌクレオチド配列からの弱毒化マイナス鎖ＲＮＡウイルスワクチンの製造（ＰＲＯＤＣＵＴＩＯＮ  ＯＦ  ＡＴＴＥＮＵＡＴＥＤ  ＮＥＧＡＴＩＶＥ  ＳＴＲＡＮＤＥＤ  ＲＮＡ  ＶＩＲＵＳ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  ＦＲＯＭ  ＣＬＯＮＥＤ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ）である１９９９年４月１３日Ｍｕｒｐｈｙらにより出願された、代理人整理番号１７６３４−０００６００の米国特許出願に記載の如くにして、異種のマイナス鎖ＲＮＡウイルス中に特定された突然変異を、レシピエントのＰＩＶゲノム又はアンチゲノム中の対応する相同部位にマッピングすること、及びレシピエント中の既存配列を突然変異型の遺伝子型に突然変異すること（同一又は保存的突然変異による）で容易に達成される。
【００１６】
上記突然変異に加え、感染性のＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異は望ましくは異種ＰＩＶ又はＰＩＶ様ウイルス、例えばＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、ウシＰＩＶ（ＢＰＩＶ）又は）のマウスＰＩＶ（ＭＰＩＶ）由来の異種のコーディング又は非コーディングヌクレオチド配列を取り込み、キメラゲノム又はアンチゲノムを形成する。例えば、発明の組換え体ＰＩＶは２又はそれより多い野生型又は突然変異型ＰＩＶ株、例えばＨＰＩＶ１やＨＰＩＶ３由来の配列を取り込んでもよい。あるいは発明のＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異はヒト型及び非ヒト型ＰＩＶ由来の配列、例えばＨＰＩＶとＢＰＩＶ由来の配列を取り込んでもよい。好ましくは、”レシピエント”又は”背景”ゲノム又はアンチゲノム中にある、１またはそれより多いヒト型ＰＩＶコーディング及び非コーディングポリヌクレオチドは、異種ＰＩＶ又は非ＰＩＶウイルスに由来する相当配列により、単独又は１又はそれより多い選択された弱毒化点突然変異、例えばｃｐ及び／又はｔｓ突然変異と組合せ置換され、新規の弱毒化ワクチン株を生ずる。単離された感染性ＰＩＶ粒子は、好ましくはヒト型ＰＩＶであり、より好ましくはヒト型ＰＩＶ３（ＨＰＩＶ３）である（例えば参照されここに取り込まれている、１９９９年７月９日にＢａｉｌｅｙらが出願した、代理人整理番号１５２８０−３９９０００ＵＳの、発明の名称、弱毒化ヒト−ウシキメラパラインフルエンザワクチン（ＡＴＴＥＮＵＡＴＥＤ  ＨＵＭＡＮ−ＢＯＶＩＮＥ  ＣＨＭＩＥＲＩＣ  ＰＲＡＲＩＮＦＬＵＥＮＺＡ  ＶＩＲＵＳ）である米国仮出願特許を参照）。
【００１７】
発明の関連する側面では、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＢＰＩＶ又はＭＰＩＶの様な異種ＰＩＶに由来する少なくとも１つの配列と結合したＨＰＩＶ３由来のヌクレオチドを取り込んだ単離された感染性ＰＩＶ粒子が提供される。例えば、ＨＰＩＶ３の全遺伝子は、ＰＩＶ１又はＰＩＶ２のＨＮ及び／又はＦ糖蛋白質遺伝子の様なその他の型のＰＩＶに由来する相当遺伝子によって置き換えることができる。あるいは、選択されたゲノム断片、例えばＨＰＩＶ１又はＨＰＩＶ２のＨＮ又はＦの細胞質テール、膜貫通ドメイン又はエクトドメインで相当するＨＰＩＶ３遺伝子中の対応遺伝子断片を置き換え、例えばＰＩＶ１又はＰＩＶ２のエクトドメインに融合してＰＩＶ３の細胞質テール及び／又は膜貫通ドメインを持つ融合蛋白質の様なキメラ蛋白質をコードする構築体を生ずることができる。あるいはあるＰＩＶに由来する遺伝子又はゲノム断片を異種ＰＩＶ背景内に加え（即ち置換することなく）、得られたクローン内に新規の免疫原性を作り出すことができる。
【００１８】
Ｃ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異を有する組換え体ＰＩＶに加え発明は、それぞれがここに記載の目的の表現形特異的変異を１又はそれより多く取り込んでいる関連ｃＤＮＡクローン、ベクター及び粒子を提供する。これらは選択された組合せで導入され、例えば組換え体ｃＤＮＡゲノム又はアンチゲノムである単離されたポリヌクレオチド内に導入され、ここに記載の方法により発現されることで好適に弱毒化された感染性ウイルス又はサブウイルス粒子を産生する。この工程は、通常の表現形評価と組み合わせて、弱毒化、温度感受性、変更された免疫原性、低温適応性、小型プラークサイズ、宿主域制限性、遺伝的安定性等の所望特性を有するＣ，Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異を提供する。具体的には、弱毒化されているがワクチン接種された哺乳動物宿主に防御的免疫反応を誘導するのに十分な免疫原性を持つワクチン候補が選択される。
【００１９】
発明の別の側面では、Ｃ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異は、例えば生物学的に誘導された突然変異ウイルスより得られた追加の弱毒化突然変異と共に又は無しに、所望の表現形、構造上又は機能上の変化を生じる追加のヌクレオチド変更を有する様に構築される。典型的には、選択されたヌクレオチドの変更は例えば増殖特性、弱毒化、温度感受性、低温適応性、プラークサイズ、宿主域制限、又は免疫原性の様な表現形上の変化を規定するだろう。この関係での構造上の変化には、編集及び特定を容易にすることを目的としたＰＩＶをコードするｃＤＮＡ中への制限部位の導入又は削除が含まれる。
【００２０】
好適実施態様では、Ｃ、Ｄ及び／Ｖ欠失あるいはノックアウト突然変異内のヌクレオチド変更には、遺伝子の部分的又は全体的欠失による追加ウイルス遺伝子の変更又はその発現の低下又は削除（ノックアウト）が含まれる。この関係での突然変異の標的遺伝子には、ヌクレオカプシド蛋白質Ｎ、リン蛋白質Ｐ、大型ポリメラーゼサブユニットＬ、マトリックス蛋白質Ｍ、凝集素−ノイラミダーゼ蛋白質ＨＮ、融合蛋白質Ｆが含まれる。組換え体ウイルスが生存し感染性である範囲に於いて、これら蛋白質のそれぞれを、全体的又は部分的に、単独又はその他所望変更と組合せて選択的に欠失させ、置換し或いは再配置し、新規のＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異を得ることができる。例えば、これら遺伝子の１つまたはそれより多くを、全て或いは部分的に欠失するか、そのその発現を低下もしくは削除して（例えば停止コドンを導入すること、ＲＮＡ編集部位への突然変異により、又はフレームシフト突然変異いより）得られる組換え体クローンの表現形を変更することで、増殖、弱毒化、免疫原性又はその他所望する表現形特性を改良できるだろう。
【００２１】
発明のＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異内の別のヌクレオチド変更には、組換え体ゲノム又はアンチゲノム中の選択遺伝子に関するシス作用型の制御配列の欠失、挿入、付加又は再配置が含まれる。一例では、１つのＰＩＶ遺伝子のシス作用型制御配列が異種制御配列に対応する形で変更され、これが別のＰＩＶ中にある同一遺伝子の相対的シス作用型制御配列、又は別のＰＩＶ遺伝子のシス作用型制御配列になる。例えば、遺伝子末端シグナルは転換又は置換により同一ＰＩＶ株の別遺伝子の遺伝子末端シグナルに変更されるだろう。別の実施態様では、ヌクレオチドの変更は組換え体ゲノム又はアンチゲノム中の翻訳開始部位の挿入、欠失、置換又は再配置であり、例えばある特定の形の蛋白質に関する選択的翻訳開始部位を除く。
【００２２】
更に、Ｃ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウトを、単独又は生物学的に誘導された突然変異ＰＩＶより得た１又はそれより多い弱毒化突然変異と共に有するＰＩＶゲノム又はアンチゲノムに、その他各種の遺伝的変更を作り出すことができる。例えば、非ＰＩＶ供給源由来の遺伝子又はゲノム断片を全て、又は部分的に挿入できるだろう。あるいは、遺伝子の順列を変更するこができ、又はＰＩＶゲノムプロモーターをそのアンチゲノム相当体で置き換えることができる。組換え体ゲノム又はアンチゲノム中に、各種遺伝子間領域やその他領域に特有の制限部位を挿入する様な別種変更或いは追加変更を作り、操作を容易にすることができる。非翻訳遺伝子配列を取り除き、異種配列の挿入能力を高めることができる。
【００２３】
更に別の側面では、組換え体ＰＩＶゲノム又はアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチド又はベクターを変更して、非ＰＩＶ配列、例えばサイトカイン、Ｔヘルパーエピトープ、制限部位マーカー又は目的の宿主に防御免疫反応を惹起することができる微生物（例えばウイルス、細菌又は真菌）の病原性蛋白質をコードさせることができる。この様な実施態様の一つでは、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）由来の遺伝又はゲノム断片、例えばＲＳＶの抗原性蛋白質（例えばＦ又はＧ蛋白質）、免疫原性ドメイン又はエピトープをコードする遺伝子を取り込むＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異が構築される。
【００２４】
発明の関連側面では、Ｃ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異を有する単離された感染性の組換え体ＰＩＶの産生に適した組成体（例えば単離されたポリヌクレオチド及びＰＩＶをコードしているｃＤＮＡを取り込んでいるベクター）及び方法が提供される。発明のこれら側面に含まれるものには、Ｃ、Ｄ及び／又はＶ  ＯＲＦの部分的又は完全な欠失、又はその発現を低下させるか除く１又はそれより多いヌクレオチド変更によって変更されたＰＩＶゲノム又はアンチゲノムを含む分子を取り込んでいる単離されたポリヌクレオチド分子及びこれら分子を取り込んでいるベクターがある。更にＮ、Ｐ、及びＬ蛋白質をコードする１又はそれより多い単離ポリヌクレオチドを含む同一又は別種ベクターも提供される。これら蛋白質はまたゲノム又はアンチゲノムｃＤＮＡより直接発現させることができる。ベクターは細胞又は無細胞溶解物中に好ましく発現、又は共発現され、それにより感染性のＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異体ＰＩＶ粒子又はサブウイルス粒子を産生する。
【００２５】
Ｃ、Ｄ、及び／又はＶ欠失及びノックアウト突然変異体ＰＩＶを産生するための上記方法及び組成体は、感染性ウイルス又はサブウイルス粒子、又はその誘導体を生ずる。感染性ウイルスは認証のＰＩＶウイルス粒子に同等であり、それと同様に感染性である。それは新鮮細胞に直接感染できる。感染性サブウイルス粒子は典型的には、適当な条件の下に感染を開始できるウイルス粒子の亜成分である。例えばゲノム又はアンチゲノムＲＮＡ及びＮ、Ｐ及びＬ蛋白質を含むヌクレオカプシドは、細胞の細胞質内に導入された場合に感染を開始できるサブウイルス粒子の例である。発明内に与えられたサブウイルス粒子には、１又はそれより多い蛋白質、蛋白質断片、又はその他ウイルスコンポーネントを欠くウイルス粒子を含む。
【００２６】
別実施態様では、発明は上記のＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異ＰＩＶゲノム又はアンチゲノムを含む単離されたポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターを含んでいる細胞又は無細胞溶解物、及びＰＩＶのＮ、Ｐ及びＬ蛋白質をコードする１又はそれより多い単離されたポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター（同一又は異種ベクター）を提供する。発現にょり上記ゲノム又はアンチゲノム及びＮ、ＰならびにＬは一つになり感染性のＰＩＶウイルス又はサブウイルス粒子を生ずる。
【００２７】
発明の別実施態様では、Ｃ、Ｄ及び／又はＶノックアウト突然変異を有するＰＩＶゲノム又はアンチゲノムをコードしている単離されたポリヌクレオチド分子を含む発現ベクター、及びＰＩＶのＮ，Ｐ及びＬ蛋白質をコードしている１又はそれより多い単離されたポリヌクレオチド分子を含む発現ベクターを取り込んでいる細胞又は無細胞溶解物発現システム（例えば無細胞溶解体）が提供される。発現により、上記ゲノム又はアンチゲノムとＮ、Ｐ及びＬ蛋白質は一つになり、ウイルス又はサブウイルス粒子の様な感染性ＰＩＶ粒子を生ずる。
【００２８】
発明の組換え体ＰＩＶは、ＰＩＶ感染に対し感受性である宿主に於いて、ＰＩＶに対し所望の免疫反応を生じせしめる各種組成体に有用である。発明の弱毒化Ｃ、Ｄ及び／又はＶ欠失及びノックアウト突然変異は感染した哺乳動物宿主に防御的免疫反応を惹起できるが、同免疫された宿主動物に許容外の重篤な呼吸器疾患症状を引き起さない程度に十分弱毒化されている。弱毒化されたウイルス粒子又はサブウイルス粒子は細胞培養上清に存在し、培養体より単離され、又は部分的あるいは完全に精製されるだろう。ウイルスは凍結乾燥されてもよく、そして必要に応じて保存又は運搬に適したその他各種成分と組み合わせることができる。
【００２９】
発明は更に生理学的に許容されるキャリアー及び／又はアジュバント、及び単離された弱毒化Ｃ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異ＰＩＶ粒子又はサブウイルス粒子を含む新規ワクチンを提供する。 好適実施態様では、弱毒化及び免疫原性の好適バランスを達成するために、ワクチンは少なくとも１つ、そして好ましくは２又はそれより多い上記の追加の突然変異あるいはその他ヌクレオチド変更を有しているＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異ＰＩＶを含む。ワクチンは１０3ないし１０7ＰＦＵ弱毒化ウイルスの用量に処方できる。ワクチンは、単一ＰＩＶ株又は複数のＰＩＶ株に対する免疫反応を惹起する弱毒化されたＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウトウイルスを含むだろう。これに関し、Ｃ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異ＰＩＶ粒子は、ワクチン製剤中にてその他のＰＩＶワクチン株又はＲＳＶの様なその他のウイルス型ワクチンウイルスと組合せることができる。
【００３０】
関連する側面では、発明は個々の免疫系を刺激し、哺乳動物被検体中にＰＩＶに対する免疫反応を惹起するための方法を提供する。方法は免疫学的に十分な量の弱毒化されたＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異ＰＩＶ製剤を生理学的に許容されるキャリアー及び／又はアジュバントに加えることを含む。実施態様の一つでは、免疫学的組成体は少なくとも１つ、そして好ましくは２又はそれより多い上記の所望表現形を指定する弱毒化突然変異あるいはその他のヌクレオチド変更を有しているＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異ＰＩＶを含むワクチンである。ワクチンは１０3ないし１０7ＰＦＵ弱毒化ウイルスの用量に処方できる。ワクチンは、単一ＰＩＶ株又は複数のＰＩＶ株、例えばＨＰＩＶ１及びＨＰＩＶ３に対する、あるいは１又はそれより多いＰＩＶとＲＳＶの様なＰＩＶ外の病原菌に対する免疫反応を惹起する、弱毒化されたＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト変異型ＰＩＶを含むだろう。この関係では、Ｃ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異ＰＩＶは非特異的免疫反応又は複数のＰＩＶあるいは１種類又はそれより多いＰＩＶとＲＳＶの様なＰＩＶ外の病原菌に対する多特異的免疫反応を惹起できる。或いは各種免疫原性を有するＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異ＰＩＶはワクチン混合体中に組み合わせること、又は調整された治療プロトコールの中で別々に投与することができ、１種類のＰＩＶ、複数のＰＩＶ又は１又はそれより多いＰＩＶとＲＳＶの様なＰＩＶ外の病原菌に対しより効果的な防御を惹起できる。好ましくは、免疫原性組成体は上気道に、例えばスプレー、液滴又はエアゾールにより投与される。好ましくは免疫原性組成体は上記気道に、例えばスプレー、液滴、又はスプレーにより投与される。
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は新規ＰＩＶワクチン候補の組合せを得るために、１又はそれより多いＣ、Ｄ及び／又はＶのＯＲＦの発現が誘導されている組換え体ＰＩＶ（ｒＰＩＶ）を提供する。Ｃ、Ｄ及び／又はＶのＯＲＦの発現は、ＰＩＶゲノム又はアンチゲノムを修飾して突然変異を取り込ませ、ＣのＯＲＦの開始コドンのコーディング位置又はＣ、Ｄ及び／又はＶのＯＲＦ中の１又はそれより多い停止コドンを変化させることで低下、又は排除される。Ｃ、Ｄ及び／又はＶの発現、又は対応する蛋白質の発現もしくは機能を破壊して弱毒化したＰＩＶワクチン候補を作製する別の方法には、全体又は部分的にＣ，Ｄ及び／又はＶのコーディング配列の一部又は全てを欠失し、Ｃ、Ｄ及び／又はＶ蛋白質を部分的又は全体的に非機能的にし、あるいはその発現を停止させることが含まれる。
【００３２】
ＨＰＩＶ３はＭｏｎｏｎｅｇａｖｉｒａｌｅｓ目、Ｐａｒａｍｙｘｏｃｉｒｉｄａｅ科に属する新規にＲｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓと命名されたメンバーである。そのゲノムは１５４６２ヌクレオチド（ｎｔ）長の単鎖のマイナス−センスＲＮＡである（Ｇａｌｉｎｓｋｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６５：４９９−５１０、（１９８８）；Ｓｔｏｋｅｓら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２５：９１−１０３（１９９２））。少なくとも８種類の蛋白質がＰＩＶ３によりコードされている：ヌクレオカプシド蛋白質Ｎ、リン蛋白質Ｐ、非構造蛋白質Ｃ、Ｄ蛋白質、マトリックス蛋白質Ｍ、融合蛋白質Ｆ、凝集素−ノリラミニダーゼ蛋白質ＨＮ及び大型ポリメラーゼ蛋白質Ｌ（Ｃｏｌｌｉｎｓら、ｐ１２０５−１２４３、Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ（Ｋｉｎｉｐｅら、編集）、Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、３版、第１巻中、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６）。
【００３３】
Ｍ、ＨＮ及びＦ蛋白質はエンベロープに関連しており、後２者は各ＰＩＶの場合には主要な中和及び防御抗原である表面蛋白質である（Ｃｏｌｌｉｎｓら、”Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”、３版、（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ、Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ、Ｒ．Ｍ、Ｃｈａｎｏｃｋ、Ｊ．Ｌ，Ｍｅｌｎｉｃｋ、Ｔ．Ｐ．Ｍｏｎａｔｈ、Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ及びＳ．Ｅ．Ｓｔｒａｕｓ、編集）、第１巻中、１２０５−１２４３、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６）。ＰＩＶ間の比較可能なＰＩＶ  ＨＮ又はＦ蛋白質環の明瞭な配列の発散は、防御免疫の型特異性の基礎と考えられているな（Ｃｏｌｌｉｎｓら、”Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ”、３版、（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ、Ｐ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ、Ｒ．Ｍ、Ｃｈａｎｏｃｋ、Ｊ．Ｌ，Ｍｅｌｎｉｃｋ、Ｔ．Ｐ．Ｍｏｎａｔｈ、Ｂ．Ｒｏｉｚｍａｎ及びＳ．Ｅ．Ｓｔｒａｕｓ、編集）、第１巻中、１２０５−１２４３、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９６；Ｃｏｏｋら、Ａｍｅｒ  Ｊｏｕｒ  Ｈｙｇ７７：１５０−１５９、１９６３；Ｒａｙら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １６２：７４６−９、１９９０）。
【００３４】
ＨＰＩＶ３遺伝子はそれぞれ単一の蛋白質をコードする単一のｍＲＮＡに転写されるが、ＰｍＲＮＡのみ例外で４種類のＯＲＦ、即ちＰ、Ｃ、Ｄ及びＶを含む（図１）（Ｇａｌｉｎｓｋｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８６：５４３−５５０、１９９２；Ｓｐｒｉｇｇｓら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．６７：２７０５−２７１９、１９８６）。Ｐ及びＣ蛋白質はｍＲＮＡ内の別々の、重複するＯＲＦから翻訳される（図１）。パラミクソウイルスは全てＰ蛋白質をコードするが、Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ及びＭｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ属のみがＣ蛋白質をコードする。個々のウイルスによりＣのＯＲＦから発現される蛋白質の数、及びインビトロ及びインビボでのウイルスの複製に於ける重要性は異なっている。センダイウイルス（ＳｃＶ）はＣ  ＯＲＦより４種類の独立に開始される蛋白質：Ｃ’、Ｃ、Ｙ１及びＹ２を発現するが、それらの翻訳開始部位はｍＲＮＡ中の順番である（Ｃｕｒｒａｎら、Ｅｎｚｙｍｅ  ４４：２４４−９、１９９０；Ｌａｍｂら、ｐ．１８１−２１４、Ｄ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編集）、Ｔｈｅ  Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ中、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１）が、ＨＰＩＶ３及び麻疹ウイルス（ＭＶ）は単一のＣ蛋白質のみを発現する（Ｂｅｌｌｉｎｉら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、５３：９０８−１９、１９８５；Ｓａｎｃｈｅｚら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４７：１７７０８６、１９８５；Ｓｐｒｉｇｇｓら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ、６７：２７０５−２７１９、１９８６）。
【００３５】
４種類全てのＣ由来蛋白質が削除された各種組換え体ＳｅＶはインビトロでは複製できない（Ｋｕｒｏｔａｎｉら、Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．３：１１１−１２４、１９９８）が、個別のＣ蛋白質の削除の影響は複雑である（Ｃａｄｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，  ７０：５０６７−７４、１９９６；Ｆｕｒｒａｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８９：６４７−５６、１９９２；Ｌａｔｏｒｒｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２：５９８４−９３，１９９８）。Ｃ蛋白質のアミノ酸位置１７０にあるフェニルアラニン（Ｆ）をセリン（Ｓ）に変える単一の点突然変異を持つ組換え体ＳｅＶはマウスにおいて弱毒化されたが、培養細胞での複製は障害されなかった（Ｇａｒｃｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３８：４２４−４３１、１９９７；Ｉｔｏｈら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，７８：３２０７−１５、１９９７）。ＳｅＶと好対照に、Ｃマイナス麻疹ウイルス（ＭＶ）はベロ細胞中で効率的に複製したが（Ｒａｄｅｃｋｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１７：４１８−２１、１９９６）、ヒト末梢血細胞では複製の制限を示した、インビボでは若干弱毒化されると考えられた（Ｅｓｃｏｆｆｉｅｒら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７３：１６９５−８、１９９９；Ｖａｌｓａｍａｋｉｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２：７７５４−６１、１９９８）。
【００３６】
Ｐ及びＣのＯＲＦに加えＲＩＶ３のＰｍＲＮＡは更に２つのＯＲＦ、即ちＤ及びＶを有する。ＰＩＶ３Ｄ蛋白質はＰとＤのＯＲＦの融合蛋白質であり、転写編集又はＲＮＡ編集の工程によりＰ遺伝子から発現され、その間にＰｍＲＮＡのＲＮＡ編集部位に２つの非鋳型Ｇ残基が加えられる（図１）（Ｇａｌｉｎｓｋｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８６：５４３−５５０、１９９２；Ｐｅｌｅｔら、Ｅｍｂｏ  Ｊ．１０：４４３−８、１９９１）。ＨＰＩＶ３は唯一Ｄ蛋白質を発現し、それを同一メカニズムにより成す別種パラミクソウイルスである。
【００３７】
Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ属の殆ど全てのメンバー、Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ及びＭｏｒｂｉｉｌｉｖｉｒｕｓはＶ蛋白質を発現する。明らかに発現しないメンバーの一つが完全な形のＶのＯＲＦを欠いているＨＰＩＶ１である（Ｍａｔｕｏｋａら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６５：３４０６−１０、１９９１、参照されここに取り込まれている）。Ｖ  ＯＲＦは極めて保存的であるシステインに富むドメインの存在を特徴とする（Ｃａｔｔａｎｃｏら、Ｃｅｌｌ  ５６：７５９−６４、１９８９；Ｐａｒｋら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６６：７０３３−９、１９９２；Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ  ５４：８９１−９０２、１９８８；Ｖｉｄａｌら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６４：２３９−４６、１９９０，いずれも参照されここに取り込まれている）。Ｖ  ＯＲＦは現在までに配列決定された各ＨＰＩＶ３ウイルスで維持されており、このＯＲＦが発現されており、そしてこのウイルスに関し機能を保持していることが示唆されている（Ｇａｌｉｎｓｋｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５５：４６−６０、１９８６；Ｓｐｒｉｇｇｓら、Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  ６７：２７０５−２７１９、１９８６；Ｓｔｏｋｅｓら、Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ２５：９１−１０３、１９９３）。
【００３８】
ＢＰＩＶ３のＶ蛋白質は１非鋳型Ｇ残基がＲＮＡ編集部位に加えられと発現される（Ｐｅｌｅｔら、Ｅｍｂｏ  Ｊ  １０；４４３−８、１９９１，参照されここに取り込まれている）。しかし、ＨＰＩＶ３の場合２ないし４個の翻訳停止コドンが編集部位とＶ  ＯＲＦとの間に存在しており、そしてＨＰＩＶ３がこのＯＲＦが発現されていない別の例であるか、あるいはそれが別のメカニズムにより発現されているのかについては不明である。一つの可能性は、ＨＰＩＶ３の編集がＰ遺伝子内にある第２の下流側の部位でも起こっていることであるが、これは培養細胞では起こっていないと考えられている（Ｇａｌｉｎｓｋｉら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８６：５４３−５５０、１９９２、それぞれ参照されここに取り込まれている）。あるいは、リボソームがリボソームのフレームシフトによりＶ  ＯＲＦにアクセスできる様に成る可能性もある。これはＭＶのＰ座の状態と比較しうる。ＭＶはＣ、Ｐ及びＶ蛋白質を発現するが、ＰのＯＲＦからＶのＯＲＦへのフレームシフトにより合成される新規のＲ蛋白質も発現する（Ｌｉｓｔｏｎら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６９：６７４２−５０、１９９５、参照されここに取り込まれる）。
【００３９】
ＨＰＩＶ３がそのＶ蛋白質を発現する意味については不明であるが、各種株にてそのＶのＯＲＦが極めてよく保存されていることは、それが実際に発現されていることを示唆する。Ｖ蛋白質の機能はよく分かっていないが、Ｖ−マイナスＭＶ及びＳｅＶ組換え体が回収されており、それはインビボでは効率的に複製するがインビトロでは複製低下を示した（Ｄｅｌｅｎｄａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２８：５５−６２、１９９７；Ｄｅｌｅｎｄａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４２：３２７−３７、１９９８；Ｋａｔｏら、Ｅｍｂｏ  Ｊ．１６：５７８−５８７、１９９７；Ｋａｔｏら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７１：７２６６−７２７２、１９９７；Ｖａｌｓａｍａｋｉｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７２：７７５４−６１、１９９８）。
【００４０】
ＰＩＶのウイルスゲノムもウイルスの複製及び転写に必要とされるプロモーターを含んでいる遺伝子外リダー及びテーラー域を含む。即ち、ＰＩＶ遺伝子地図は３’リーダー−Ｎ−Ｐ／Ｃ／Ｄ／Ｖ−Ｍ−Ｆ−ＨＮ−Ｌ−５’テーラーと表される。転写は３’末端より開始し、遺伝子境界部に認められる短い保存モチーフにより導かれる連続する停止−開始メカニズムにより進められる。各遺伝子の上流端は遺伝子開始（ＧＳ）シグナルを含み、これがそれぞれのｍＲＮＡの開始を支配している。各遺伝子の下流端はポリアデニル化及び終止を支配する遺伝子端部（ＧＥ）モチーフを含む。典型的配列がヒトＰＩＶ３株ＪＳ（ジーンバンク登録番号Ｚ１１５７５、参照されここに取り込まれている）及びワシントン（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）（Ｇａｌｉｎｓｋｉ  Ｍ．Ｓ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ，Ｄ．（編集）、Ｐａｒａｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ、ｐｐ．５３７−５６８、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１、参照されここに取り込まれている）について、及びウシＰＩＶ３株９１０Ｎ（ジーンバンク登録番号Ｄ８０４８７、参照されここに取り込まれている）が記載されている。
【００４１】
ここに使用する場合、”ＰＩＶ遺伝子”は一般的にｍＲＮＡをコードするＰＩＶゲノムの一部を指し、遺伝子開始（ＧＳ）シグナルを持つ上流端に始まり、遺伝子末端（ＧＥ）シグナルを持つ下流末端に終止する。用語ＰＩＶ遺伝子は用語”翻訳オープンリーディングフレーム（読み取り枠）”又はＯＲＦと相互に交換可能である。遺伝子に加え、ＰＩＶのウイルスゲノムは非コーディングの遺伝子間配列及びウイルス複製と転写に必要なプロモーターを持つ遺伝子外のリーダー及びテーラー域を含む。即ち、ＰＩＶの遺伝子地図は３’リーダー−Ｎ−Ｐ／Ｃ／Ｄ／Ｖ−Ｍ−Ｆ−ＨＮ−Ｌ−５’テーラーと表される。転写は３’末端より開始し、遺伝子境界部に認められる短い保存モチーフにより導かれる連続する停止−開始メカニズムにより進められる。発明のＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失変異体を構築するために、１又はそれより多いＰＩＶ遺伝子がその全て又は一部欠失されるだろう。即ち、一つ又はそれより多くのＰＩＶ遺伝子のいずれかのオープンリーディングフレーム及び／又はシス作用型制御配列に部分は完全欠失が作られることを意味する。”ゲノム断片”とは、ＯＲＦ、遺伝子、又は遺伝子外領域あるいはそれらの組合せの一部であろうＰＩＶゲノム由来の何れかの長さの連続ヌクレオチドを意味する。
【００４２】
発明のＣ、Ｄ及び／又はＶ変異体を構築するための別の手段は、ＰＩＶ遺伝子の実質的部分の欠失なしに遺伝子発現を低下又は削除する、”ノックアウト”ウイルスの構築を含む。具体的には、Ｃ、Ｄ及び／又はＶ  ＯＲＦの発現は停止コドンの導入、ＲＮＡ編集部位の突然変異、開始コドンにより特定されうアミノ酸を変える突然変異、又は標的ＯＲＦ中のフレームシフト突然変異により組換え体ＰＩＶゲノム又はアンチゲノムを返納することで好ましく低下、又は除かれる。実施態様の一つでは、突然変異は編集部位内に作られ、編集を妨げそしてそのｍＲＮＡがＲＮＡ編集で作り出される蛋白質の発現を排除することができる（Ｋａｔｏら、ＥＭＢＯ  １６：５７８ー５８７、１９９７及びＳｃｎｎｅｉｄｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２７：３１４−３２２、１９９７、参照されここに取り込まれる）。
【００４３】
発明の別の側面では、ＰＩＶゲノム又はアンチゲノムは突然変異誘導にかけられＣ、Ｄ及び／又はＶのＯＲＦ内に１またはそれより多い停止コドンを作り出す。例の一つでは、メチオニン開始コドンはＣ  ＯＲＦ内にてスレオニンに変化する。別の例では、ゲノム又はアンチゲノム内のヌクレオチド位置（ｎｔ）１７９５（ＴをＣに変える）及びｎｔ１８１３（ＣをＡに変える）の突然変異により２個の停止コドンが導入され、ＣのＯＲＦの位置７及び２６に相当する停止コドンが誘導される。その結果ｒＣ−ＫＯと命名されたノックアウト突然変異体ウイルスができた。発明を例示する他３種類の変異体ウイルスでは、Ｄ及びＶのＯＲＦが単一及び組合せた形で中断されている。ｆＤ−ＫＯと命名された単一型のＤノックアウト突然変異体では、突然変異はＤのＯＲＦの発現を中断する様に導入され、完全長アンチゲノムの２６９２、２６９５及び２６９８のヌクレオチド位置にＣからＡの変化が導入された。これら点突然変異体は推定Ｄ  ＯＲＦ中に連続的に３つの停止コドンを作り出し、その結果３７２アミノ酸長のキメラＤ蛋白質内コドン３０３以後のＤ蛋白質が未成熟に終止する。別の詳細な側面では、完全長アンチゲノムのヌクレオチド位置２８４５（ＡからＴ）及び２８５４（ＣからＴ）に２個の点突然経を導入することで、単一型のＶノックアウト変異体、ｒＶ−ＫＯが作られた。これら突然変異は推定Ｖ  ＯＲＦ内の前方に（位置１７と２０）に停止コドンを作り出した。ｒＤ−ＫＯ及びｒＶ−ＫＯ内の変化はまとめて単一クローンに導入され、組換え体ＤＶノックアウト変異体、ｒＤＶ−ＫＯが作製された。
【００４４】
上記の如くＣ、Ｄ及び／又はＶのＯＲＦ中に１又はそれより多い突然変異を有する発明の組換え体ＰＩＶは、ワクチン開発に関し極めて望ましい表現形特性を有する。ここに記載のＣ、Ｄ及び／又はＶのＯＲＦを全体又は一部欠失し、Ｃ、Ｄ及び／又はＶのＯＦＲの発現を低下又は除く変更は、ウイルス又はサブウイルス粒子を生ずる所望の表現形変化の範囲を規定する。好適実施態様では、Ｃ，Ｄ及び／又はＶの欠失及びノックアウト突然変異体は、対応する野生型又は突然変異型親ＲＳＶ株の増殖に比べ弱化したウイルス増殖を示す。増殖、例えば細胞培養中の増殖は対応する野生型、又は突然変異型親ＲＳＶ株の増殖に比べ、約２倍、より多くは約５倍、そして好ましくは１０倍又はそれ以上低下する（培養気管７日後に測定した場合）。より詳細な側面では、発明の組換え体ＲＳＶは変化したウイルス増殖動態を示す。
【００４５】
Ｃ，Ｄ及び／又はＶの欠失及びノックアウト突然変異を有する組換え体ワクチンウイルスはまたインビボでも弱毒化表現形を好ましく示す。例えばヒトに於けるＰＩＶ複製モデルとして受け入れられている動物モデル、例えばハムスター及びアフリカミドリザル（ＡＧＭｓ）での下気道及び／又は上気道に於ける複製は、対応する野生型又は変異型の親ＰＩＶ株の増殖に比べ約２倍、より多くは約５倍、１０倍、又は２０倍そして好ましくは約１００倍ないし１０００倍以上低下する（例えば感染後３ないし８連続日内の１日又は毎日に測定した場合）。更に、又は上記の弱毒化表現形と結びつけた場合に、Ｃ，Ｄ及び／又はＶの欠失及びノックアウト突然変異を有する組換え体ＰＩＶは、ウイルスプラークのサイズにも、細胞病理効果にも、そして／又は免疫原性にも変化を示すだろう。
【００４６】
発明の組換え体ワクチンウイルスの特に好適な特徴は、それらが上記の如くに弱毒化されながら、それらが感染性であり、そしてワクチン接種された宿主に於いて所望レベルの抗ＰＩＶ免疫反応性を惹起できることである。具体的には、発明の候補ワクチン組換え体は十分免疫原性であり、それらはその後接種されたｗｔウイルスに対する防御免疫反応を惹起する。ここに示す実施例に例示される如く、Ｃ，Ｄ及び／又はＶのノックアウト突然変異体ウイルスに前もって感染すると、ハムスター及びＡＧＭｓにてＨＰＩＶ３に対する明瞭なＨＡＩ抗体反応が誘導され、これら例示の組換え体が防御的であり、従ってワクチン候補として有望であることが示唆されている。発明の別の好適ワクチン組換え体では、免疫活性は有用なワクチン候補を達成できる様に弱毒化のレベルが調整され、典型的には接種ウイルス、例えばｒＪＳ  ＨＰＩＶ３のモデル宿主（ハムスター又はヒト以外の霊長類）の下気道及び／又は上気道に於ける複製は、約５０−１００倍、１００−５００倍、好ましくは約５００−２，０００倍、及び３，０００倍以上低下する（接種後３−８日間に測定した場合）。即ち、発明の組換え体ワクチンウイルスは複製及び増殖を同時に阻害しながら、免疫原性は維持している。
【００４７】
本発明はＣ，Ｄ及び／又はＶの欠失及びノックアウト突然変異を取り込んだ生弱毒化ＲＳＶワクチン候補の開発を提供する。これら組換え体ウイルスは、ｃＤＮＡ中間体とｃＤＮＡベースの回収システムを利用して構築される。ｃＤＮＡより作られた組換え体ウイルスは独立に複製し、あたかもそれらが生物学的由来かの様に継代される。Ｃ，Ｄ及び／又はＶの欠失及びノックアウト突然変異体は更に変更され、特異的な弱毒化突然経に及び各種細胞変異及びヌクレオチド変更を取り込み、所望の構造的又は表現形的効果を生ずる。本発明の補助的側面としてここに記載されていｃＤＮＡから組換え体ＰＩＶを産生するための、そして完全長の変異体及びヌクレオチド変更を作りそして試験するための資料及び方法は、例えばＤｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３３２、１９９７；１９９８年、５月２２日出願の米国特許出願第０９／０８３、７９３号；１９９７年５月２３日出願の米国仮出願第６０／０４７，５７５号（国際出願第ＷＯ９８／５３０７８号に相当）及び１９９７年９月１９日出願の米国仮出願第６０／０５９，３８５号に提供されており、いずれも参照されここに取り込まれている。具体的には、これら書面はＰＩＶを変異誘導し、単離し特徴付けし、弱毒化突然変異株（例えば温度感受性（ｔｓ）、低温継代（ｃＰ）低温適応（Ｃａ），小型プラーク（ｓｐ）及び宿主域制限（ｈｒ）突然変異株）を獲得するるための、そして弱毒化表現形を規定する遺伝的変化を特定するための方法及び操作を記述する。前述の書面はこれら方法と結びつけ、生物学的に誘導された、及び組換え体技術により作製された弱毒化ヒトＰＩＶの、マウス及びヒト以外の霊長類モデル系を含む受け入れられているモデル系に於ける複製、免疫原性、遺伝的安定性及び防御効果を決定するための詳細な手順を記載する。更に、これら書面は一価及び二価のワクチンを含む、ＰＩＶ感染の予防及び治療に適した免疫原性組成体を開発し、そして試験する一般的方法を記載する。必須ＰＩＶ蛋白質と共発現されるＰＩＣゲノム又はアンチゲノムをコードしているｃＤＮＡの構築及び発現により感染性の組換え体ＰＩＶを産生する方法もまた上記取り込まれた書面に記載されており、そこには感染性ＰＩＶウイルスクローンの産生に使用される以下の例示プラスミドの記載が含まれる：ｐ３／７（１３１）（ＡＴＣＣ９７９９０）；ｐ３／７（１３１）（ＡＴＣＣ９７８８９）；及びｐ２１８（１３１）（ＡＴＣＣ９７９９１）；いずれもブダペスト条約に従い、１０８０１ブルバール大学、マナセアス、、バージニア州２０１１０−２２０９、米国にある米国標準株コレクション（Ａｍｅｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）に寄託されており、上記登録番号が付与された。
【００４８】
上記取り込まれた参考資料には、生物学的に誘導されたＰＩＶ変異体中に見いだされた表現形特異的突然変異、例えば低温継代（ｃ）、低温適応（ｃａ）、宿主域制限（ｈｒ）、小型プラーク（ｓｐ）、及び／又は温度感受性（ｔｓ）突然変異体、例えばＪＳＨＰＩＶ３ｃｐ４５変異体株、を取り込む様に変更されている感染性組換え体ＰＩＶを構築し、そして評価する方法も開示されている。これら変異体中に同定された突然変異はＣ，Ｄ、及び／又はＶノックアウト突然変異を有する組換え体ＰＩＶに容易に取り入れることできる。例示実施例では、１又はそれより多い減弱か突然変異がポリメラーゼＬ蛋白質内、例えばＪＳｃｐ４５のＴｙｒ９４２、Ｌｅｕ９９２又はＴｈｒ１５５８に相当する位置に発生している。好ましくは、これら突然変異は、生物学的突然変異体中に同定されたものと同じ同一的又は保存的アミノ酸弛緩により、発明の組換え体ＰＩＶ中に取り込まれる。即ち、ＰＩＶ組換え体はＴｙｒ９４２がＨｉｓに、Ｌｅｕ９９２がＰｈｅに、及び／又はＴｈｒ１５５８がＩｌｅに置換されている突然変異を取り込むだろう。これらアミノ酸の交換に保存的である置換もまた所望突然変異表現形を達成するうえで有益である。
【００４９】
生物学的に誘導されたＰＩＶ突然変異から取り出された突然変異のその他の例にはＪｓｃｐ４５の残基Ｖａｌ９６又はＳｅｒ３８９に対応する位置の特異的突然変異を含む、Ｎ蛋白質中の１又はそれより多い突然変異が含まれる。より詳細には、これら突然変異はＶａｌ９６からＡｌａ、又はＳｅｒ３８９からＡｌａ、又はそれに対し保存的である置換として表される。またＣ蛋白質中のアミノ酸置換、例えばＪＳｃｐ４５のＩｌｅ９６に対応する位置の突然変、好ましくはＩｌｅ９６からＴｈｒへの同一又は保存的置換も、発明の組換え体ＰＩＶに有用である。生物学的に誘導されたＰＩＶ突然変異体より得られる更なる突然変異例は、Ｊｓｃｐ４５の残基Ｉｌｅ４２０又はＡｌａ４５０に対応する位置のＪＳｃｐ４５より得られた突然変異を含むＦ蛋白質中の１又はそれより多い突然変異が含まれ、好ましくはＩｌｅ４２０からＶａｌへ、又はＡｌａ４５０からＴｈｒへの産地間、又はその保存的置換により表される。発明内のその他ＰＩＶ組換え体は、ＪＳｃｐ４５の残基Ｖａｌ３８４に対応する位置の突然変異、好ましくはＶａｌ３８４からＡｌａへの置換により表される突然変異を採用する組換え体により以下例示される様に、ＮＨ蛋白質中の１又はそれより多いアミノ鎖置換を採用している。
【００５０】
発明のこの側面の更に別の例は、ＰＩＶゲノム又はアンチゲノムの非コーディング部分、例えば３’リーダー配列中に１又はそれより多い突然変異を取り込んでいる組換え体ＰＩＶを含む。この様な関係の例示の突然変異は、ＪＳｃｐ４５のヌクレオチド２３、２４、２８又は４５に対応する位置の、組換え体ウイルスの３’リーダー中の位置に作られる。更に追加の例示突然変異は、例えばＮ遺伝子開始配列中の１又はそれより多いヌクレオチド、例えばＪＳｃｐ４５のヌクレオチド６２に対応する位置のヌクレオチドを変更することでＮ遺伝子開始配列中に作り出される。より詳細には、Ｃ，Ｄ及び／又はＶノックアウト変異体は、ヌクレオチド２３にＴからＣへの変化、ヌクレオチド２４にＣからＴへの変化、ヌクレオチド２３にＧからＴへの変化、ヌクレオチド２４にＣからＴへの変化、ヌクレオチド２８にＧからＴへの変化及び／又はヌクレオチド４５にＴからＡに変化を取り込む。遺伝子外配列中の追加の突然変異は、ＪＳのヌクレオチド６２に対応する位置のＮ遺伝子開始配列中にあるＡからＴへの変化により例示される。
【００５１】
Ｃ、Ｄ及び／又はＶノックアウト突然変異中に作ることができるこれら上記例示の突然変異は、−ｒｃｐ４５、ｒｃｐ４５Ｌ，ｒｃｐ４５Ｆ、ｒｃｐ４５Ｍ、れｃｐ４５ＨＮ、ｒｃｐ４５Ｃ、ｒｃｐ４５Ｆ、ｒｃｐ４５３’Ｎ，３’ＮＬ及びｒｃｐ４５  ３’ＮＣＭＦＨＮと命名された組換え体ＰＩＶにより示される様に、上首尾に組換え体ＰＩＶ中に作り出され、回収されている（Ｄｕｒｂｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２３５：３２３−３３２、１９９７；Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ７２：１７６２−８；１９９８年５月２２日に出願の米国特許出願第０９／０８３，７９３号、１９９７年５月２３日出願の米国仮出願特許第６０／０４７，５７５号（国際出願第ＷＯ９８／５３０７８号に相当）及び１９９７年９月１９日出願の米国仮出願６０／０５９，３８５号、それぞれが参照されここに取り込まれている）。
【００５２】
ＪＳｃｐ４５及びその他生物学的に誘導されたＰＩＶ突然変異体からは、弱毒化突然変異の大規模な”メニュー”が提供されており、Ｃ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異を有する組換え体ＰＩＶの弱毒化、免疫原性及び突然変異安定性のレベルを調節することを目的に、それぞれについて他突然変異と組み合わせることができる。この関係に於いて、発明の多くの組換え体ＰＩＶは生物学的に誘導されたＰＩＶ突然変異、例えばＪＳｃｐ４５内に同定されている突然変異の１つ又は組合せを１又はそれより多く、好ましくは２又はそれより多く含むだろう。発明の好適ＰＩＶ組換え体は、ＪＳｃｐ４５内又はその他生物学的に誘導された突然変異ＰＩＶ株中に存在する複数の突然変異の完全相補体を取り込むだろう。好ましくはこれら突然変異体はＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト突然変異を有する組換え体ＰＩＶ中の復帰変異に関し、各突然変異を規定するコドン中に複数のヌクレオチド置換を持つことで安定している。
【００５３】
発明のＣ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウトＰＩＶ突然変異体中に取り込まれる更別の突然変異は、異種ＰＩＶ中又はより関係の通り非断片化マイナス鎖型ＲＮＡウイルス中に特定された、例えば弱毒化突然変異の様な突然変異である。具体的には、あるマイナス鎖ＲＮＡウイルス中に特定された弱毒化及びその他所望突然変異は、例えばコピーされてＣ、Ｄ及び／又はＶ  ＯＲＦ欠失あるいはノックアウト突然変異体中にある対応部位に”移される”。即ち異種のマイナス鎖ＲＮＡウイルス中にある所望突然変異がＰＩＶレシピエントに移される。この作業には、参照されここに取り込まれている、１９９９年４月１３日Ｍｕｒｐｈｙらにより提出された、代理人番号１７６３４−０００６００にて特定されるクローン化配列からの弱毒化マイナス鎖ＲＮＡウイルスワクチンの製造（ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ  ＯＦ  ＡＴＴＥＮＵＡＴＥＤ  ＮＥＧＡＴＩＶＥ  ＳＴＲＡＮＤＥＤ  ＲＮＡ  ＶＩＲＵＳ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  ＦＲＯＭ  ＣＬＯＮＥＤ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ）とダイする米国特許出願に記載の如く、突然変異を異種ウイルス中にマッピングすること、即ち配列アラインメントによりレシピエントＰＩＶ中の対応部位を特定すること、及びＲＳＶレシピエント中の未変性配列を突然変異遺伝子型に突然変異させること（同一又は保存的突然変異による）。この開示が教授するように、異種突然変異ウイルスに同定された変更に保存的に対応する突然変異対処部位に変化をコードする様にレシピエントのゲノム又はアンチゲノムを変更することが好ましい。例えばアミノ酸置換が、対応する野生型配と比較される突然変異ウイルス中の変異部位をマークする場合には、組換え体ウイルス中の対応残基に同様の置換を作らなければならない。好ましくは置換は突然変異ウイルス蛋白質中に存在する置換残基と同一又は保存的なアミノ酸を含むだろう。しかし、突然変異部位の未変性アミノ酸残基を、突然変異蛋白質中の置換残基に関し非保存的に変更することも可能である（例えばその他アミノ酸を利用して野生型残基の機能を破壊するか、又は障害する）。例示突然変異が同定され、発明の組換え体ＰＩＶ内に移されるマイナス鎖ＲＮＡウイルスには特にその他のＰＩＶ（例えばＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、ＢＰＩＶ又はＭＰＩＶ）、ＲＳＶ、センダイウイルス（ＳｅＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、シミアンウイルス５（ＳＶ５）、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）、牛疫ウイルス、イヌジステンバーウイルス（ＣＤＶ）、狂犬病ウイルス（ＲａＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）が含まれる。ＨＰＩＶ３のＬ蛋白質の位置４５６に相当し、従ってフェニルアラニン（又は保存的関連アミノ酸）の置換に転移可能なＲＳＶのＬ蛋白質の位置５２１のフェニルアラニンのアミノ酸置換を含む様々な例示突然変異が開示されているが、これらに限定されない。欠失又は挿入により顕れる突然変異の場合、これらは対応する欠失又は挿入により組換え体ウイルス内に導入できるが、しかし欠失される、又は挿入される蛋白質断片の具体的大きさ及びアミノ酸配列は様々である。
【００５４】
前記取り込みの参考文献にはその他の型の突然変異も開示されており、発明の組換え体ＰＩＶ内に容易に加工でき、増殖、弱毒性、免疫原性、遺伝的安定性を調節し、又はその他の有益な構造上及び／又は表現形上の効果を与えることがでできる。例えば、制限部位マーカーは日常的にＣ、Ｄ及び／又はＶのＯＲＦ欠失あるいはノックアウト変異のアンチゲノム又はゲノムに導入され、ｃＤＮＡ構築及び操作を容易にしている。
【００５５】
キメラヒト−ウシＰＩＶの様なＣ，Ｄ及びＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト突然変異体ＰＩＶワクチンウイルスの産生を可能にする方法及び組成体もまた本発明にて有用である。これら組換え体は、異種遺伝子、ゲノム断片、又はヒト又はウシＰＩＶの単一あるいは複数のヌクレオチドを、部分的又は完全な背景ウシあるいはヒトＰＩＶゲノム又はアンチゲノムと置換、又は付加してヒト−ウシキメラＰＩＶゲノムあるいはアンチゲノムを作製することで作られる（参照されここに取り込まれている、１９９９年７月９日にＢａｉｌｅｙらより出願された、弱毒化ヒト−ウシキメラパラインフルエンザウイルスワクチン（ＡＴＴＥＮＵＡＴＥＤ  ＨＵＭＡＮ−ＢＯＶＩＮＥ  ＣＨＩＭＥＲＩＣ  ＰＡＲＡＩＮＦＬＵＥＮＺＡ  ＶＩＲＵＳ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ）と題する、代理人整理番号１５２８０−３９９０００ＵＳにて特定される米国仮出願特許を参照）。発明の一側面では、ヒト−ウシキメラＰＩＶは、１又はそれより多いヒトＰＩＶに由来する１又はそれより多い異種遺伝子又はゲノム断片と共に部分的又は完全なウシ背景ＰＩＶゲノムあるいはアンチゲノムを取り込む。あるいは、ヒト−ウシキメラＰＩＶは１又はそれより多いウシＰＩＶに由来する異種遺伝子又はゲノム断片と共に部分的又は完全なヒト背景ＰＩＶゲノムあるいはアンチゲノムを取り込む。背景ゲノム又はアンチゲノムへの異種挿入体又は付加に使用されるために選択される遺伝子及びゲノム断片には、Ｎ、Ｐ、Ｃ、Ｄ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ又はＬの野生型又は突然変異型遺伝子あるいは遺伝子断片が含まれる。例示の一実施態様では、ＨＰＩＶ３レシピエントのＮ遺伝子のＯＲＦ又は背景ゲノムがＢＰＩＶ３のＮ遺伝子のＯＲＦにより置き換えられ、その結果親のＢＰＩＶウイルスに類似した、非ヒト霊長類宿主にて宿主域制限表現形を示す感染性組換え体を得た。その他蛋白質も防御免疫反応に寄与でき、従って本発明に於ける使用に関するヒト−ウシＰＩＶキメラウイルスの構築の好適対象ではあるが、異種ヒト又はウシ遺伝子は、１又はそれより多いＰＩＶ防御抗原を、好ましくは１又はそれより多いＨＮ及び／又はＦ糖蛋白質又はその免疫原性ドメインあるいはエピトープをもっぱらコードする。
【００５６】
あるいは、Ｃ、Ｄ及び／又はＶ欠失あるいはノックアウト変異を有するヒト−ウシキメラＰＩＶはＰＩＶ抗原性蛋白質の細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、外部ドメイン、又は免疫原性エピトープをコードする１又はそれより多いゲノム断片を取り込む。これら免疫原性蛋白質、ドメイン及びエピトープは免疫された宿主に於いて新規の免疫反応を作り出す。例えばウシ背景ゲノム又はアンチゲノム内に、ヒトＰＩＶ由来の１又はそれより多い免疫原性遺伝子又はゲノム断片を付加あるいは置換すると、１又はそれより多い特異的ヒトＰＩＶドナー株に対する免疫反応を作り出すことができる組換え体キメラウイルス又はサブウイルス粒子を生じるが、この場合ウシ背景がこれらキメラをワクチン開発の有益な候補とする弱毒化表現形を付与する。
【００５７】
Ｃ、Ｄ及び／又はＶのＯＲＦ内に突然変異を持つヒト−ウシキメラＰＩＶは、部分的ＰＩＶ背景ゲノム又はアンチゲノム内にある対応する遺伝子又はゲノム断片を異種遺伝子又はゲノム断片と置き換えることで構築される。あるいは、異種遺伝子又はゲノム断片は、例えば遺伝子の３’又は５’非コーディング域に、完全な（又はその他遺伝子あるいはゲノム断片が削除された場合には部分的な）ＰＩＶ背景ゲノム又はアンチゲノムと組み合わせた過剰遺伝子又はゲノム断片として付加される。異種遺伝子又はゲノム断片は、部分的又は完全ＰＩＶ背景ゲノム又はアンチゲノム内の遺伝子間位置に付加されるため、背景ゲノム又はアンチゲノム内のオープンリーディングフレームを中断しない。あるいは、異種遺伝子又はゲノム断片は、部分的又は完全ＰＩＶ背景ゲノム又はアンチゲノム内にある、相手遺伝子又はゲノムの野生型遺伝子の順番位置と対応する位置で付加又は置換され、これによりその相手遺伝子又はゲノム断片は置換され又は転置される（例えばプロモーター−末端位置に）。更に別の実施態様では、異種遺伝子又はゲノム断片は、背景ゲノム又はアンチゲノム内の相手遺伝子又はゲノムの野生型遺伝子順番位置に比べ、よりプロモータに接近し、あるいはプロモーターより離れた位置に付加又は置換され、それによりそれぞれ異種遺伝子又はゲノム断片の発現を高め、又は低下する。引用参考文献に開示されたこの様な変更及びその他変更は発明のＣ、Ｄ及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体内に取り込むことができる。
【００５８】
キメラＰＩＶを産するために異種免疫原性蛋白質、ドメイン及びエピトープを導入することは、免疫された宿主に於いて新規免疫反応を作り出すのに特に有用である。異なるＰＩＶのレシピエントゲノム又はアンチゲノム内に、あるドナーＰＩＶ由来の免疫原性遺伝子又はゲノム断片を付加するか置き換えを行うと、ドナーサブグループ又は株、レシピエントサブグループ又は株、あるいはドナーとレシピエントサブグループ又は株両方に対する免疫反応を作り出すことができる。これを達成するために、Ｃ、Ｄ及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト突然変異体ＰＩＶはキメラ蛋白質、例えば別腫ＰＩＶの外部ドメインに融合されたある種のＰＩＶに対し特異的である細胞質テール及び／又は膜貫通ドメインを有する免疫原性糖蛋白質を発現し、例えばヒト−ウシ融合蛋白質、又は２種類のヒトＰＩＶ由来のドメインを取り込んでいる融合蛋白質を提供する様にも構築される。好適実施態様では、Ｃ、Ｄ及び／又はＶのＯＲＦ欠失又はノックアウト突然変異ＰＩＶゲノム又はアンチゲノムはヒトとウシ両方の糖蛋白質ドメイン又は免疫原性エピトープを有する組換え体ウイルス又はサブウイルス粒子内のキメラ糖蛋白質をコードする。例えば、ヒトＰＩＶのＨＮ又はＦ糖蛋白質に由来する糖蛋白質外部ドメインをコードする異種遺伝子断片は、対応するウシＨＮ又はＦ糖蛋白質細胞質及び／又は膜貫通ドメインをコードしているポリヌクレオチド配列（即ちゲノム断片）に連結され、ヒト−ウシキメラＰＩＶゲノム又はアンチゲノムを形成する。
【００５９】
別実施態様では、ワクチン製剤に有用なＣ、Ｄ及び／ＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト突然変異体は通常の方法により変更され、循環中のウイルスの抗原性ドリフトに対応する。典型的には変更はＨＮ及び／又はＦ蛋白質内に行われる。ある種のＰＩＶに由来する全ＨＮ又はＦ遺伝子、あるいは特定のその免疫原性域をコードしているゲノム断片が、別種ＰＩＶ株又はサブグループのレシピエントクローン内にある対応域の置換により、又は遺伝子の１又はそれより多いコピーが付加されることでキメラＰＩＶゲノム又はアンチゲノムｃＤＮＡ内に取り込まれ、複数の抗原系が提示される。変更ＰＩＶクローンより生まれる子孫ウイルスは新興ＰＩＶ株に対するワクチン接種プロトコールに使用することができる。
【００６０】
異種の相手、例えば別のヒト型ＰＩＶ又はウシもしくはマウス型ＰＩＶ配列でヒト型ＰＩＶのコーディング配列又は非コーディング配列（例えばプロモーター、遺伝子終止、遺伝子開始、遺伝子間、あるいはその他シス作動型エレメント）を置換すると、各種に弱毒化され且つその他表現形効果を持つと思われるキメラＰＩＶが得られる。具体的には、ヒトＰＩＶ背景中にウシ又はマウスＰＩＶ遺伝子を置換し導入することで宿主域及びその他所望効果が得られるが、この場合ウシ又はマウス遺伝子はヒト細胞内に於いては、例えば生物学的に相互作用するヒトＰＩＶ配列又は蛋白質（即ちウイルス転写、翻訳、組み立て等に関する置換配列又は蛋白質と通常には協調する配列又は蛋白質）と異種配列又は蛋白質との不適合性故に、あるいはより典型的には細胞蛋白質又は寛容宿主と非寛容宿主間で異なっているその他の細胞環境の側面を持つ宿主域制限により効率的に機能しない。例示実施態様では、ヒトＰＩＶ内への導入に関してウシＰＩＶ配列は、ウシ及びヒトＰＩＶ構造及び機能の既知観点に基づき選択される。
【００６１】
発明の別の側面では、生じるキメラウイルス又はサブウイルス粒子内に弱毒化又はその他所望表現形を指定する１又はそれより多い突然変異を導入することによりキメラゲノム又はアンチゲノムが更に変更されているＣ、Ｄ及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体ＰＩＶが作られる。これら突然変異体は合理的に計画された突然変異誘導計画に従ってデヌボにて作られ、弱毒効果について試験される。あるいは、弱毒化突然変異は既存の生物学的に誘導された変異体ＰＩＶ中に特定され、その後発明のＣ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体ＰＩＶ内に取り込まれる。これら組換え体ＰＩＶは上記の様にワクチン製剤としての使用に適した改良された弱毒化及び免疫原特性をもたらす。この関連では、上記参考文献は部分的ＨＰＩＶ３背景内に置換し組み込まれたＨＰＩＶ１のＨＮ及びＦ遺伝子を有し、更に１又はそれより多いＨＰＩＶ３のＪＳｃｐ４５内に特定された弱毒化突然変異を持つ様に変更されたキメラＰＩＶ組換え体を記載している。この様なキメラ組換え体の一つは、ｃｐ４５のＬ遺伝子内に特定された全ての弱毒化突然変異を取り込んでいる。異種（ＨＰＩＶ１）ＨＮ及びＦ遺伝子を除くｃｐ４５突然変異は全てＨＰＩＶ３−１組換え体内に取り込ませることができ、弱毒化されたキメラワクチン候補を生じることが知られている。
【００６２】
Ｃ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体内への取り込みに適した生物学的に誘導されたＰＩＶの弱毒化突然変異は天然に発生するか、又は周知の突然変異誘導法により野生型ＰＩＶ株内に導入される。例えば不完全弱毒化親ＰＩＶ株は、取り込まれている参考文献に記載の様に細胞培養時ウイルス増殖中の化学的突然変異誘導し、半至適温度で継代してウイルスを選択して増殖制限突然変異を誘導するか、又は細胞培養時に小型プラークを生じる突然変異ウイルスを選択するかすることで作り出すことができる。
【００６３】
”生物学的に誘導されたＰＩＶ”とは、組換え手法により作られていないＰＩＶを意味する。即ち生物学的に誘導されたＰＩＶには、野生型ゲノム配列を有する天然に発生するＰＩＶ、参照の野生型ＰＩＶ配列と異なる対立又は突然変異ゲノムを持つＰＩＶ、例えば弱毒化表現形を指定する突然変異を含むＰＩＶ、を含む全ての天然に発生するＰＩＶが含まれる。同様に、生物学的に誘導されたＰＩＶには、特に人工的な突然変異誘導及び選択法により親ＰＩＶに由来したＰＩＶ突然変異体が含まれる。
【００６４】
上記の如く、十分弱毒化された、生物学的に誘導されたＰＩＶ突然変異の製造は、複数の既知方法により達成できる。この様な方法の一つには、部分的弱毒化ウイルスを漸次温度を下げながら細胞培養で継代にかけることを含む。例えば、部分的に弱毒化された突然変異体は、半至適温度での細胞培養に継代することで作ることができる。即ち、ｃｐ突然変異体又はその他典型的な弱毒化ＰＩＶ株は培養継代によりより低い温度効率的増殖に適応する。この低温継代による突然変異体ＰＩＶの選別は、部分的に弱毒化された親株に比べて誘導株の残存毒性を有意に低下させる。
【００６５】
あるいは、部分的に弱毒化された親ウイルスを化学的突然変異誘導にかけ、生物学的に誘導されたＰＩＶ内に特定の突然変異を導入でき、例えばｔｓ突然変異を誘導し、既にｔｓであるウイルスの場合には追加のｔｓ突然変異は弱毒性を高め、そして／又は弱毒化誘導体のｔｓ表現形を安定化する。ＰＩＶへのｔｓ突然変異の導入法としては、５−フルオロウリジンの様な突然変異剤存在下に、既知方法に従いウイルスを複製させることが含まれる。その他の突然変異誘導法も利用できる。弱毒化はＰＩＶ遺伝子の大部分のｔｓ突然変異より生ずるが、この目的に特に好適な対象はポリメラーゼ（Ｌ）遺伝子に見いだされている。
【００６６】
発明での使用に適した例示弱毒化ＰＩＶでの複製の温度感受性のレベルは、寛容温度に於けるその複製を複数の制限的温度での複製と比較することで決定される。ウイルスの複製が寛容温度に於けるウイルスの複製に比べ１００倍またはそれ以上低下する最低温度はシャットオフ温度と呼ばれている。実験動物及びヒトでは、ＰＩＶの複製及び毒性は共に突然変異のシャットオフ温度に相関している。
【００６７】
ＪＳｃｐ４５ＨＰＩＶ３突然変異体は遺伝的に安定しており、免疫原性は高く、十分に弱毒化されていることが知られている。この生物学的に誘導されたウイルス及びその中に各種単独又は組合せの突然変異を取り込んでいる組換え体ウイルスのヌクレオチド分析からは、各弱毒化の増加レベルは特定のヌクレオチド及びアミノ酸の置換に関係していることが示されている。上記取り込まれている参考文献はまた、突然変異を別々及び各種組合せで感染性ＰＩＶクローンのゲノム又はアンチゲノム中に導入することにより、サイレント型の自然発生突然変異と表現形に関係する変異とを区別する方法についても開示している。親ウイルスと誘導体ウイルスの特徴的表現形を評価することとと結びついているこの工程は、弱毒化、温度感受性、低温適応性、小型プラークサイズ、宿主域制限等の所望特性に関する突然変異を特定する。
【００６８】
こうして特定された突然変異は”メニュー”にまとめられ、次に必要に応じて単独又は組合せの形で導入され、Ｃ，Ｄ及び／又はＶのＯＲＦ欠失又はノックアウト突然変異体の弱毒化、免疫原性、弱毒化表現形の復帰変異に対する遺伝的耐性のレベルが必要に応じ調節される。上記によれば、ｃＤＮＡから感染性ＰＩＶを作り出すことで、Ｃ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体内に特異的な人工的変化を導入することができる。具体的には、感染性の組換え体ＰＩＶは生物学的に誘導された弱毒化ＰＩＶ株の特異的突然変異、例えばｔｓ、ｃａ、ａｔｔ及びその他表現形を指定する突然変異を特定するために利用される。こうして所望突然変異が特定され、組換え体Ｃ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体ＰＩＶワクチン株内に導入される。ｃＤＮＡよりウイルスを作ることができることで、これら突然変異を個別又は各種選択された組合せにより完全長ｃＤＮＡ中に通常に取り込ませること、そして導入突然変異を含む救済型組み換えウイルスの表現形を容易に決定することがること可能になった。
【００６９】
所望表現形、例えばｃｐ又はｔｓ表現形を持った特異的な生物学的に誘導された突然変異を同定し、感染性ＰＩＶクローンに取り込ませることで、発明は同定された突然変異に、又はその近傍内にその他の部位特異的変更を提供する。生物学的に誘導されたＰＩＶの中に作られた最も弱毒化された突然変異が単独のヌクレオチドの変化である場合、組換え体技術によってその他の”部位特異的”突然変異を生物学的に誘導されたＰＩＶ、又は組換え体ＰＩＶに取り込ませることもできる。この場合の部位特異的突然変異には１ないし３、約５−１５まで又はそれより多い変更ヌクレオチド（例えば野生型ＰＩＶ配列、選択された突然変異型ＰＩＶ株、又は突然変異誘導にかけられる親組換え体ＰＩＶクローンと異なる）。あるいは、突然変異はＰＩＶクローン内のその他の関係、例えばシス作動型制御配列又は蛋白質活性部位、結合部位又は免疫原性エピトープ等をコードするヌクレオチド近くに導入できる。部位特異的ＰＩＶ変異体は、一般には所望の弱化表現形を有するが、更に弱化とは関係しないことを特徴とする変更表現形、例えば免疫原性の亢進又は拡大、及び／又は増殖の改善も示す。望ましい部位特異的突然変異体の別の例には、弱化点突然変異を指定するコドン内に追加の安定化ヌクレオチド突然変異を取り込む様に工夫された組換え体ＰＩＶが含まれる。可能な場合には、親変異体又は組換え体ＰＩＶクローン内の弱化アミノ酸変化を指定するコドンに２又はそれより多いヌクレオチド置換を導入し、弱化された表現形からの復帰変異に対する遺伝的耐性を持つ生物学的に誘導された、又は組換え体ＰＩＶを産生する。別の実施態様では、部位特異的ヌクレオチド置換、付加、欠失又は転位を標的ヌクレオチド位置に対し上流（Ｎ末端側）又は下流（Ｃ末端側）に、例えば１ないし３及び１５ヌクレオチド又はそれより５’又は３’側に導入し、例えば既存シス作動性制御エレメントを構築又は除く。
【００７０】
単独、及び複数の点突然変異及び部位特異的突然変異に加え、ここに開示されたＣ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体ＰＩＶへの変化には、欠失又は除去されたＣ、Ｄ及び／又はＶのＯＲＦ又はゲノム断片以外の全遺伝子又はゲノム断片の欠失、挿入、置換又は転位が含まれる。これら突然変異はドナー又はレシピエントゲノム又はアンチゲノム内に、その変化の性質に応じて（即ち少数の塩基の変更は免疫原性エピトープの挿入又は削除し、小さなゲノム断片を変化するが、遺伝子又は大きなゲノム断片が付加、置換、欠失又は転位する場合には塩基の大型ブロックが関係する）少数の塩基（例えば１５−３０塩基から３５−５０塩基又はそれよ以上まで）、ヌクレオチドの大型ブロック（例えば５０−１００，１００−３００，３００−５００，５００−１，０００塩基）あるいはほぼ全遺伝子又は全遺伝子（例えば１，０００−１，５００ヌクレオチド、１，５００−２，５００ヌクレオチド、２，５００−５，０００ヌクレオチド、５，０００−６，５０００ヌクレオチド又はそれ以上）を変更する。
【００７１】
別の側面では、発明は生物学的に誘導されたＰＩＶに由来する組換え体ＰＩＶクローン内に突然変異、例えばｃｐ及びｔｓ突然変異を追加するために、変更が加えられているＰＩＶクローン内に更に同一又は別種の遺伝子が関係する突然変異を提供する。各ＰＩＶ遺伝子は発現レベルに関し選択的に変更できるか、又は全体あるは一部を、単独又はその他所望の変更と組合せて付加、欠失、置換あるいは転位することができ、新規ワクチン特性を示すＣ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体ＰＩＶを産生することができる。即ち、生物学的に誘導されたＰＩＶ変異体から採られた弱化突然変異以外に、あるいはこれと組み合わせて、本発明は感染性ＰＩＶクローンの組換え体技術に基づくＣ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体ＰＩＶの表現形を弱め、あるいは変更するための様々な方法も提供する。感染性クローン内への取り込みに適したキメラゲノム又はアンチゲノム内にあるドナー又はレシピエント遺伝子又はゲノム断片を含む、目的の遺伝子又はゲノム断片をコードする単離されたポリヌクレオチド配列内に各種変更を加えることができる。より具体的には、組換え体ＰＩＶ中に所望の構造的及び表現形的変化を達成するために、発明は親ゲノム又はアンチゲノムに由来する選択されたヌクレオチド、又は複数のヌクレオチドを欠失、置換、導入、あるいは転位する変更の導入を可能とするだけでなく、Ｃ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体ＰＩＶクローン内にある全遺伝子又はゲノム断片を欠失、置換、導入又は転位する突然変異を可能にする。
【００７２】
その結果、選択されたＰＩＶコーディング配列内に停止コドンを導入すること、動作可能に連結されたプロモーターに対するＰＩＶ遺伝子の位置を変更すること、上流開始コドンを導入して発現速度を変化させること、ＧＳ及び／又はＧＥ転写シグナルを変更して（例えば位置の変更、既存配列の変更、又は既存配列を異種配列により置換することにより）表現形を変化させること（例えば増殖、転写に関する温度制限等）及びウイルス複製、選択された遺伝子の転写、又は選択された蛋白質の翻訳の定量的又は定性的変化を指定するその他各種欠失、置換、付加及び転位によって、Ｃ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ又はゲノム断片の欠失又は除去に加えて、選択された遺伝子の発現を単純に変更し、又は除くＣ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体ＰＩＶの変更を提供する。この関係では、増殖に必須ではないＰＩＶ遺伝子は削除できるか、あるいは組換え体ＰＩＶ中に変更され、毒性、病原性、免疫原性及びその他表現形特性に対し所望の効果を生むことができる。
【００７３】
更に例えば増殖、弱毒化、免疫原性、遺伝的安定性を調節し、又はその他有益な構造上及び／又は表現形上の効果を与えるために、単独又は生物学的に誘導された変異体ＰＩＶより得られた１あるいはそれより多くの弱化突然変異と共にヒト−ウシキメラＰＩＶ内に取り込ませるその他の遺伝的変更を、ＰＩＶのゲノム又はアンチゲノム内に作ることができる。これら追加の突然変異は上記に取り込まれている参考文献に開示されており、発明のヒト−ウシキメラＰＩＶに容易に作り出すことができる。例えば制限部位マーカーはヒト−ウシキメラＰＩＶアンチゲノム又はゲノム内に容易に導入され、ｃＤＮＡの構築及び操作を促進する。
【００７４】
発明にはＰＩＶクローン由来の遺伝子又はゲノム断片を取り除くことなく標的とするＣ、Ｄ及び／又はＶのＯＲＦ以外に選択された遺伝子又はゲノム断片の発現を変更又は除く遺伝的変更をＣ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体ＰＩＶに提供する。例えば、これは開始コドンのコーディング枠を変更するか、又は選択されたコーディング配列内に停止コドンを導入する変異を誘導するか、遺伝子の位置を変化させ、あるいは上位置に開始コドンを導入することで発現速度を変化させること、又はＧＳ及び／又はＧＥ転写シグナルを変更して表現形（例えば増殖、転写に関する温度制限等）ことで達成できる。発明のより詳細な側面では、目的のＣ、Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ以外の遺伝子の発現が、その遺伝子又は遺伝子断片を欠失することなく翻訳レベルで除かれる、例えば複数の翻訳停止コドンを翻訳オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内に導入することによって除かれるＣ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体ＰＩＶが提供される。これにより選択された遺伝子が、その遺伝子を欠失することなく翻訳レベルでサイレントである生ウイルスが得られる。別の実施態様では、複数の停止コドンは標的とするＯＲＦ内に導入される。あるいは突然変異がＲＮＡ編集部位に導入されるか、又は開始コドンにより至適されるアミノ酸を変化させる突然変異が導入される。この様な形状のノックアウトウイルスは組織培養に於いてしばしば低い増殖速度と小型のプラークを示す。即ちこれら方法は、主要なウイルス防御抗原の一つではないウイルス遺伝子の発現を除く、更に別の新規弱化突然変異を提供する。この関係では、遺伝子又はゲノム断片を欠失しないで産生されたノックアウトウイルスの表現形は、ここに記した欠失突然変異の誘導によって変更でき、標的蛋白質の合成を回復した修正変変異を効率的に除くことができる。Ｃ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体に関する幾つかのその他遺伝子ノックアウトは、当分野周知の代替計画及び方法を利用し作ることができる（例えばＫｒｅｔｓｈｍｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１６：３０９−３１６，１９９６；Ｒａｄｉｃｌｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１７：４１８−４１２、１９９６；及びＫａｔｏら、ＥＭＢＯＳＳ  Ｊ．１６：１７８−５８７，１９８７；及びＳｃｈｎｅｉｄｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７７：３１４−３２２，１９９６，それぞれ参照され個々に記載されているに記載されている）。
【００７５】
発明のＣ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体ＰＩＶ内への取り込みに適したその他変異には、シス作動型シグナルを目的とする変異があるが、これは例えばＰＩＶミニゲノムの変異分析により特定できる。例えば、リーダー及びテーラー及びフランキング配列の挿入及び欠失分析はウイルスプロモーター及び転写シグナルを特定しＲＮＡ複製又は転写が様々に低下している一連の突然変異を提供する。これらシス作動型シグナルの飽和突然変異誘導（この方法では各位置が順番に各代替ヌクレオチドに変更される）もまたＲＮＡ複製及び転写が低下した（又は増加した）多くの突然変異を特定する。これら突然変異はいずれもここに記したＣ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体ＰＩＶのアンチゲノム又はゲノム中に挿入することができる。完全アンチゲノムｃＤＮＡを使ったトランス作動性蛋白質及びシス作動性ＲＮＡ配列の評価及び操作は、上記参考文献記載のＰＩＶミニゲノムを利用し補助される。
【００７６】
Ｃ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体ＰＩＶ内の追加の突然変異には、ゲノム３’末端をアンチゲノムの相当部分で置換するものが含まれるが、これはＲＮＡ複製及び転写の変化に関連する。例示実施態様の一つでは、防御ＨＮ及び／又はＦ抗原の様な特定ＰＩＶ蛋白質の発現レベルは、天然の配列を合成により作製され効果的な翻訳が得られる様に設計されている配列と置換することで増加きる。この関係では、哺乳動物ウイルスの蛋白質の翻訳レベルでは使用コドンが主要な要素でることが示されている（Ｈａｓｓら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ。６：３１５−３２４、１９９６，参照されここに取り込まれている）。主要な防御抗原であるＰＩＶのＨＮ及びＦ蛋白質をコードするｍＲＮＡで利用されているコドンの検証は、組換え体法により利用されるコドンを改良し、これら遺伝子の発現の改善を達成するだろう。
【００７７】
別の例示実施態様では、選択されたＰＩＶ遺伝子の翻訳開始部位周辺の配列（好ましくは−３位置のヌクレオチドを含む）が単独に、又は上流開始コドンの導入と組み合わせて変更され、翻訳のアップ−又はダウン−レギュレーションを指定することで、ＰＩＶ遺伝子の発現を変化させる。あるいは又、ここに開示されたその他ＰＩＶ変更と組み合わせ、ウイルスの選択された遺伝子の転写ＧＳ又はＧＥシグナルを変化させることでＣ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体ＰＩＶ遺伝子の発現を変化させることができる。別の実施態様では、Ｃ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体に於ける遺伝子発現レベルは転写レベルで変更される。一側面では、ＰＩＶ遺伝子マップの選択された遺伝子の位置はよりプロモターに近い位置、あるいはより遠い位置に変更することができ、これにより遺伝子はそれぞれより効率的又は非効率的に発現される。この側面によれり特定遺伝子の発現を変更し、逆向向きの位置で置換した場合の遺伝子の発現レベルまで低下していることが多い野生型のレベルに比べ、遺伝子発現を２倍、より一般的には４倍、１０倍またはそれ以上まで低下あるいは増加することができる。これら及びその他の位置変更は、例えばＲＮＡ複製に関する選択ウイルス蛋白質の発現の低下による弱化表現形を有する、又は抗原発現の増加といったその他所望特性を有するＰＩＶの新規のＣ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体を生ずる。
【００７８】
発明の感染性Ｃ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体ＰＩＶをここに開示の方法及び組成体により作製することで、免疫原性を高め、野生型ＰＩＶ又は親ＰＩＶに感染した場合に比べ高いレベルの防御を誘導することもできる。例えば、ゲノム又はアンチゲノムをコードしているポリヌクレオチド配列中のヌクレオチドを適切に変化させることで、異種ＰＩＶ株又は型、又はＲＳＶの様なＰＩＶ以外の供給源からの免疫原性エピトープを組換え体クローンに加えることができる。あるいは、発明のＰＩＶ変異体を加工し、免疫原性蛋白質、蛋白質ドメイン、又は所望されるあるいは望ましくない免疫反応と関連する特異的蛋白質の形状を加え、あるいは除くことができる（例えばアミノ酸の挿入、置換又は欠失）。
【００７９】
発明の方法では、追加の遺伝子又はゲノム断片はＣ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体ＰＩＶゲノム又はアンチゲノム内に又は近接して挿入されるだろう。これら遺伝子はレシピエント遺伝子により通常に制御されているか、転写シグナルの独立したセットの制御下にあるだろう。目的の遺伝子には、上記に特定されるＰＩＶ遺伝子だけでなくＰＩＶ以外の遺伝子も含まれる。関心のＰＩＶ以外の遺伝子はサイトカイン（例えばＩＬ−２からＩＬ−１８まで、特にＩＬ−２、ＩＬ−６、及びＩＬ−１２、ＩＬ−１８等）、ガンマ−インターフェロン、及びＴヘルパー細胞エピトープに多い蛋白質をコードする遺伝子が含まれる。これら追加蛋白質は別の蛋白質として、又はＨＮ又はＦの様な既存ＰＶ蛋白質に付随するコピーとして発現することができる。これによりＰＩＶに対する免疫反応を定量的及び定性的に変更し、改善する能力が与えられる。
【００８０】
Ｃ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体内の全ゲノム又はゲノム断片の変化を含む欠失、挿入、置換及びその他の突然変異は極めて安定したワクチン候補を生ずるが、これは免疫抑制状態の個体に特に重要である。これら変化の多くは得られたワクチン株を弱毒化するが、その他は異なるタイプの所望表現形の変化を指定するだろう。例えばアクセサリー（即ち、インビトロ増殖に必須でない）遺伝子は宿主免疫を特異的に干渉する蛋白質をコードする優れた候補である（例えばＫａｔｏら、ＥＭＢＯ．Ｊ。１６：５７８−８７、１９９７、参照されここに取り込まれている）。ワクチンウイルス中のこれら遺伝子の除去には、毒性及び病原性を低下し、そして／又は免疫原性を改善すること期待される。
【００８１】
発明のより詳細な側面では、Ｃ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体はその他病原体、特にＲＳＶの様な気道感染菌の防御抗原に関するベクターとして利用される。例えば組換え体ＰＩＶは、ＲＳＶ由来の防御抗原をコードする配列を取り込み、感染性の弱毒化ワクチンウイルスを産生する様に工夫される。ＲＳＶのｃＤＮＡのクローニング及びその他開示は１９９５年９月２７日提出の米国仮出願第６０／００７，０８３号；１９９６年９月２７日提出の米国特許出願第０８／７２０，１３２号；１９９６年７月１５日提出の米国仮出願第６０／０２１，７７３号；１９９７年５月９日提出の米国仮出願６０／０４６，１４１号；１９９７年５月２３日提出の米国仮出願６０／０４７，６３４号；１９９７年７月２１５日提出の米国特許出願第０８／８９２，４０３号（国際出願第ＷＯ９８／０２５３０号に相当する）；１９９年４月１３日提出のクローンかヌクレオチド配列由来の弱毒化キメラ呼吸系発疹ウイルスウイルスの製造（ＰＲＯＤＣＵＴＩＯＮ  ＯＦ  ＡＴＴＥＮＵＡＴＥＤ  ＣＨＩＭＥＲＩＣ  ＲＥＳＰＩＲＡＴＯＲＹ  ＳＹＮＣＹＴＩＡＬ  ＶＩＲＵＳ  ＶＡＣＣＩＮＥＳ  ＦＲＯＭ  ＣＬＯＮＥＤ  ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ）と題する、代理人整理番号１７６３４−０００６００号により特定される米国特許出願；Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１１５６３−１１５６７、１９９５；Ｂｕｋｒｅｙｅｖら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７０：６６３４−４１，１９９６、Ｊｕｈａｓｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１（８）：５８１４−５８１９、１９９７；Ｄｕｒｂｉｎｒａ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２２−３３２、１９９７；Ｈｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３７：２４９−２６０、１９９７；Ｂａｒｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１２６５−１２７１，１９９７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４７（２）：２３２−９、１９９８ａ；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２（５）；４４６７−４４７１、１９９８ｂ；Ｊｉｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２５１：２０６−２１４、１９９８；及びＷｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：（４）３４３８−３４４３、１９９９、及びＢｕｋｒｅｙｅｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：２３６７−７２，１９９９に提供されており、それぞれが全ての目的に関しその全体が参照されここに取り込まれている）。
【００８２】
発明のこの側面により、少なくとも１種類のＲＳＶ配列を取り込んだＣ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体ＰＩＶが提供される。例えばＨＰＩＶ３の個々の遺伝子はヒトＲＳＶ由来の対応遺伝子により交換される。あるいは選択された異種ゲノム断片、例えばＲＳＶ糖蛋白質の細胞質テール、膜貫通ドメイン又は外部ドメインは相当ゲノム断片、例えばＨＰＩＶ３の同一遺伝子内又はＨＰＩＶ３の別遺伝子内の相当ゲノム断片により置換され、あるいはＨＰＩＶ３ゲノム又はアンチゲノムの非コーディング配列内に加えられキメラＰＩＶ−ＲＳＶ糖蛋白質が作られる。実施態様の一つでは、ヒトＲＳＶのＦ遺伝子由来のゲノム断片は対応するＨＰＩＶ３ゲノム断片を置換し、キメラ蛋白質、例えばＲＳＶの外部ドメインに融合したＰＩＶの細胞質テール及び／又は膜貫通ドメインを持つ融合蛋白質を産生し、新規の弱毒化ウイルスをもたらし、そして／又はＰＩＶ及びＲＳＶ両方に対し免疫原性である多価ワクチンをもたらす。
【００８３】
Ｃ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体に対する上記変更以外にも、ＰＩＶクローン中に別又は追加の変更を加えることができ、各種遺伝子間領域又はその他領域に特有的制限部位（例えばＧとＦ遺伝子間の特異的ＳｔｕＩ部位）を挿入する様な操作を容易にできる。非翻訳遺伝子配列を取り除き、外部配列の挿入能力を増すことができる。
【００８４】
発明の別の側面では、単離された感染性ＰＩＶを産生するための組成体（例えばヒト−ウシキメラＰＩＶをコードするｃＤＮＡを取り込んでいる単離ポリヌクレオチド及びベクター）が提供される。これら組成体及び方法を使用することでＰＩＶゲノム又はアンチゲノム、ヌクレオカプシド（Ｎ）蛋白質、ヌクレオカプシドリン蛋白質（Ｐ）、及び大型（Ｌ）ポリメラーゼ蛋白質より感染性ＰＩＶが作られる。発明の関連側面では、組換え体ＰＩＶに上記の構造上及び表現形上の変化を導入し、感染性の弱毒化ワクチンウイルスを産生する組成体及び方法が提供される。
【００８５】
上記規定の突然変異を感染性のＣ，Ｄ、及び／又はＶのＯＲＦ欠失及びノックアウト変異体クローンに導入することは、各種周知方法により達成できる。ＤＮＡに関する場合”感染性クローン”とは、ｃＤＮＡ又は感染性ウイルまたはサブウイルス粒子のゲノムを生じるために鋳型として機能できるゲノム又はアンチゲノムＲＮＡに転写できる合成又はその他方法による産物を意味する。即ち規定の突然変異は通常の技術により（例えば部位特異的突然変異誘導）ゲノム又はアンチゲノムのｃＤＮＡコピー中に導入することができる。ここに記した如く完全なアンチゲノム又はゲノムｃＤＮＡを組み立てることを目的としたアンチゲノム又はゲノムｃＤＮＡサブ断片の利用には、各領域を別々に操作でき（小型のｃＤＮＡは大型のもの比べ操作し易い）、従って容易に完全なｃＤＮＡに組み立てられれうという利点がある。即ち完全なアンチゲノム又はゲノムｃＤＮＡ、又はそのサブ断片をオリゴヌクレオチド対象の突然変異誘導に関する鋳型として利用することができる。この作業はバイオラッドラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）製のＭｕｔａ−ｇｅｎｅキットの様な単鎖型ファージミド形状の中間体、又はストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）製のカメレオン（Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ）突然変異誘導キットの様に２本鎖型プラスミドを直接鋳型として使用する方法、又は関心の突然変異を含むオリゴヌクレオチド又は鋳型を使うポリメラーゼチェインリアクションを使い作製できる。次に変異型サブ断片は鋳型のアンチゲノム又はゲノムｃＤＮＡに組み立てることができる。その他様々な突然変異誘導法が知られていおり、ＰＩＶアンチゲノム又はゲノムｃＤＮＡ内への所望突然変異の作製に使用できる。突然変異は単一ヌクレオチドの変化から１又はそれより多い遺伝子又はゲノム領域を含む大型のｃＤＮＡ片の交換まで様々である。
【００８６】
即ち、例示の実施態様の一つでは、突然変異はバイオラッド社より入手可能なＭｕｔａ遺伝子ラージミドインビトロ突然変異誘導キットを使用し導入される。簡単に述べると、ＰＩＶゲノム又はアンチゲノムの一部をコードするｃＤＮＡはプラスミドｐＴＺ１８Ｕ内にクローン化され、ＣＪ２３６細胞（ライフテクノロジー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社）の形質転換に用いられる。ファージミド標本はメーカーの指示に従い調整される。オリゴヌクレオチドはゲノム又はアンチゲノムの所望部位に変更ヌクレオチドを導入することによる突然変異誘導に合わせ設計される。次に遺伝的に変更されたゲノム又はアンチゲノム断片を含むプラスミドは増幅され、続いて突然変異断片が完全長ゲノム又はアンチゲノムクローン内に再導入される。
【００８７】
発明はまた１又はそれより多いポリヌクレオチド、例えば１またはそれより多いｃＤＮＡより感染性ヒト−ウシキメラＰＩＶを産生する方法も提供する。本発明によれば、感染性ＰＩＶの形成に必要なウイルス蛋白質との細胞質内又はインビトロ共発現を目的として、ＰＩＶゲノム又はアンチゲノムを含むｃＤＮＡが構築される。”ＰＩＶアンチゲノム”とは子孫ＰＩＶゲノムの合成に関し鋳型として機能する単離されたプラスのセンス型ポリヌクレオチド分子を意味する。好ましくはｃＤＮＡは、転写中、複製中のヌクレオカプシドの生成に必要な蛋白質をコードしている配列、即ちＮ、Ｐ及びＬ蛋白質をコードする配列を相補するプラス−センス転写体とハイブリダイズする可能性を最小にするために、複製中間体ＲＮＡに対応するＰＩＶゲノムのプラス−センス型、又はアンチゲノムとして構築される。
【００８８】
本発明の目的に関し、発明の組換え体ＰＩＶのゲノム又はアンチゲノムは、それにコードされているウイルス粒子又はサブウイルス粒子に感染性を不要するのに必要なこれら遺伝子又はその一部のみを含むことを必要とする。更に、遺伝子又はその一部は、１より多いポリヌクレオチド分子により提供され、即ち遺伝子は別々のヌクレオチド分子の相補等により提供されるか、又はゲノムあるいはアンチゲノムｃＤＮＡから直接発現できる。
【００８９】
組換え体ＰＩＶとは、組換え体発現システムより直接又は間接に誘導されるＰＩＶ又はＰＩＶ様ウイルス又はサブウイルス粒子、又はそれより産生されたウイルス又はサブウイルス粒子より継代されるＰＩＶ又はＰＩＶ様ウイルス又はサブウイルス粒子を意味する。組換え体発現システムは、ＰＩＶ遺伝子発現に制御的役割を持つ少なくとも１つ、又は複数の遺伝的要素、例えばプロモーター、ＰＩＶ  ＲＮＡに転写される構造又はコーディング配列、及び適当な転写開始配列及び終止配列のアッセンブリーを含む作動可能に連結された転写単位を含む、組換え体発現ベクターを利用するだろう。
【００９０】
ｃＤＮＡ発現ゲノム又はアンチゲノムから感染性ＰＩＶを作製するために、ゲノム又はアンチゲノムは（ｉ）ＲＮＡ複製可能なヌクレオカプシドを産生すること、及び（ｉｉ）子孫ヌクレオカプシドにＲＮＡ複製及び転写の両方に関する能力を付与するのに必要とされるＰＩＶ蛋白質と共発現される。
【００９１】
発明の感染性ＰＩＶは、ＰＩＶゲノム又はアンチゲノムＲＮＡをコードする１又はそれより多い単離されたポリヌクレオチド分子を、転写、複製性のヌクレオカプシドを生成するのに必要なウイルス蛋白質をコードする１又はそれより多いポリヌクレオチドと一緒に発現する細胞内又は無細胞共発現することで作られる。感染性ＰＩＶを作るための共発現に有用なウイルス蛋白質には、主要ヌクレオカプシド蛋白質（Ｎ）蛋白質、ヌクレオカプシドリン蛋白質（Ｐ）、大型（Ｌ）ポリメラーゼ蛋白質、融合蛋白質（Ｆ）、凝集素−ノイラミニダーゼ糖蛋白質（ＨＮ）及びマトリックス（Ｍ）蛋白質がある。この関連では、ＰＩＶのＣ、Ｄ及びＶのＯＦＲ産物も有用である。
【００９２】
感染性ＰＩＶを形成するために、必要なウイルス蛋白質との細胞内又はインビトロ共発現を目的として、ＰＩＶゲノム又はアンチゲノムをコードしているｃＤＮＡが構築される。”ＰＩＶアンチゲノム”とは、子孫ＰＩＶゲノムの合成に関する鋳型として使用できる単離されたプラス−センスポリヌクレオチド分子を意味する。好ましくはｃＤＮＡは、転写、複製するヌクレオカプシドを生成するのに必要な蛋白質をコードしている相補配列のプラス−センス転写体とハイブリダイズする可能性を最小にするために、複製中間体のＲＮＡに対応するＰＩＶゲノムのプラス−センス型、又はアンチゲノムとして構築される。
【００９３】
発明の実施態様の幾つかでは、組換え体ＰＩＶ（ｒＰＩＶ）のゲノム又はアンチゲノムはそれによりコードされるウイルス又はサブウイルス粒子に感染性を付与するのに必要な遺伝子又はその一部を含むことだけを必要とする。更に、遺伝子又はその一部は、１又はそれより多いポリヌクレオチド分子により提供され、即ち遺伝子は別々のヌクレオチド分子より相補性等により提供される。別の実施態様では、ＰＩＶゲノム又はアンチゲノムは、ヘルパーウイルス又はプラスミド又はヘルパー細胞株より提供されるウイルス機能が関与しないウイルスの増殖、複製及び感染に必要な全ての機能をコードしている。
【００９４】
”組換え体ＰＩＶ”とは、組換え体発現システムより直接又は間接に誘導されるＰＩＶ又はＰＩＶ様ウイルス又はサブウイルス粒子、又はそれより生じたウイルス又はサブウイルス粒子から継代されたＰＩＶ又はＰＩＶ様ウイルス又はサブウイルス粒子を意味する。組換え体発現システムは、ＰＩＶ遺伝子発現に制御的役割を持つ少なくとも１つ、又は複数の遺伝的要素、例えばプロモーター、ＰＩＶ  ＲＮＡに転写される構造又はコーディング配列、及び適当な転写開始配列及び終止配列のアッセンブリーを含む作動可能に連結された転写単位を含む、組換え体発現ベクターを利用するだろう。
【００９５】
ｃＤＮＡを発現させたＰＩＶのゲノムまたはアンチゲノム(antigenome)から感染性ＰＩＶを生産するために、ゲノムまたはアンチゲノムを、ＰＩＶのＮ、ＰおよびＬタンパク質と共発現させる。ここで、該タンパク質は、（ｉ）ＲＮＡを複製することができるヌクレオキャプシドを生産し、（ｉｉ）後代ヌクレオキャプシドをＲＮＡの複製および転写の両方に適したものにするために、必要なものである。ゲノムヌクレオキャプシドによる転写は、他のＰＩＶタンパク質を提供し、生産性感染を開始させる。あるいは、生産性感染に必要な別のＰＩＶタンパク質を、共発現により補ってもよい。
【００９６】
ＰＩＶのアンチゲノムまたはゲノムと上記ウィルス性タンパク質との合成は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（無細胞）において、例えば、転写と翻訳を組み合わせた反応を用いた後、細胞にトランスフェクトすることにより達成することもできる。あるいは、アンチゲノムまたはゲノムＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成し、ＰＩＶタンパク質を発現させる細胞にトランスフェクトしてもよい。
【００９７】
本発明のある種の態様において、転写・複製するＰＩＶヌクレオキャプシドの作製に必要なタンパク質をコードする配列を、１種またはそれ以上のヘルパーウィルスにより補足する。そのようなヘルパーウィルスは、野生型または突然変異型であることができる。好ましくは、ヘルパーウィルスは、ＰＩＶのｃＤＮＡによりコードされたウィルスと、表現型の面で区別することができる。例えば、ヘルパーウィルスとは免疫学的に反応するが、ＰＩＶのｃＤＮＡによりコードされたウィルスとは反応しないモノクローナル抗体を提供することが望ましい。そのような抗体は、中和抗体であってもよい。いくつかの態様において、組換えウィルスからヘルパーウィルスを分離するために、抗体をアフィニティークロマトグラフィーに用いることができる。そのような抗体の入手を促進するために、ＨＮまたはＦ糖タンパク質遺伝子中などで、ＰＩＶのｃＤＮＡに突然変異を導入して、ヘルパーウィルスからの抗原多様性を提供することができる。
【００９８】
本発明の他の態様において、Ｎ、Ｐ、Ｌおよび他の所望のＰＩＶタンパク質を、１種またはそれ以上の非ウィルス性発現ベクターでコードする。この発現ベクターは、ゲノムまたはアンチゲノムをコードする発現ベクターと同一でも異なっていてもよい。所望により他のタンパク質が含まれていてもよいが、これらはそれぞれ、固有のベクター、またはＮ、Ｐ、Ｌおよび他の所望のＰＩＶタンパク質の１種もしくはそれ以上をコードするベクターによりコードされているか、あるいは、完全ゲノムまたはアンチゲノムである。ゲノムまたはアンチゲノム、およびトランスフェクトしたプラスミドからのタンパク質の発現は、例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターで制御されている各ｃＤＮＡにより達成することができる。ここで、該Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの発現系（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現させるワクシニアウィルスＭＶＡ菌株の組換え体）を用いた、感染、トランスフェクションまたは形質導入により、順次供給される（Ｗｙａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２１０：２０２−２０５（１９９５年）；全体を本明細書中で参考として援用する）。ウィルス性タンパク質、および／またはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼは、ほ乳類の形質転換細胞または予め形成したｍＲＮＡもしくはタンパク質のトランスフェクションにより提供することもできる。
【００９９】
本発明に使用するためのＰＩＶのアンチゲノムは、例えば、クローニングされたｃＤＮＡセグメントの構築、凝集塊中での完全アンチゲノムの表示、ＰＩＶのｍＲＮＡまたはゲノムＲＮＡの逆転写されたコピーのポリメラーゼ連鎖反応など（ＰＣＲ；例えば、米国特許第４６８３１９５号および第４６８３２０２号、ならびにＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．編集，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９０年）に記載されており、それぞれの全体を本明細書中で参考として援用する）により、構成することができる。例えば、最初の構成では、適切なプロモーター（例えば、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター）から伸びるアンチゲノムの左手末端を含有するｃＤＮＡを含むものを作製し、これを、適切な発現ベクター（プラスミド、コスミド、ファージ、またはＤＮＡウィルスベクターなど）中に構築する。ベクターは、突然変異誘発、および／または構築を促進するように設計した固有の制限部位を含有する合成ポリリンカーの挿入により、修飾されていてもよい。調製しやすくするために、Ｎ、Ｐ、Ｌおよび他の所望のＰＩＶタンパク質は、１種またはそれ以上の別個のベクター中に構築することができる。アンチゲノムプラスミドの右手末端は、所望により他の配列（フランキングリボザイムおよびタンデムＴ７転写ターミネーターなど）を含んでいてもよい。該リボザイムは、非ウィルス性ヌクレオチドを１つ含有する３’末端を生じるハンマーヘッド(hammerhead)型（例えば、Ｇｒｏｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５年）、ｓｕｐｒａ）であることができ、あるいは、非ＰＩＶヌクレオチドを含まない３’末端を生じる他のあらゆる適切なリボザイム（デルタ肝炎ウィルスなど）（Ｐｅｒｒｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３５０：４３４−４３６（１９９１年）、全体を本明細書中で参考として援用する）であってもよい。その後、左手末端および右手末端を、共通の制限部位により連結する。
【０１００】
ｃＤＮＡの構成中または構成後に、ＰＩＶのゲノムまたはアンチゲノムにおいて、さまざまな、ヌクレオチドの挿入、欠失および再配列を行うことができる。例えば、所望の特異的ヌクレオチド配列を合成し、従来の制限酵素部位を用いてｃＤＮＡの適切な領域に挿入することができる。あるいは、部位特異的突然変異誘発、アラニンスキャニング、ＰＣＲ突然変異誘発(PCR mutagenesis)のような技術、または当分野で周知の他の技術を用いて、ｃＤＮＡに突然変異を導入することができる。
【０１０１】
ゲノムまたはアンチゲノムをコードするｃＤＮＡを構成するための他の手段は、ｃＤＮＡのサブユニット成分の数を１〜２個まで減少させる改善されたＰＣＲ条件（例えば、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：５６９５−５６９９（１９９４年）に記載されているとおりで、これを本明細書中で参考として援用する）を用いた逆転写ＰＣＲなどである。他の態様において、異なるプロモーター（例えば、Ｔ３、ＳＰ６）または異なるリボザイム（例えば、デルタ肝炎ウィルスのリボザイム）を用いてもよい。異なるＤＮＡベクター（例えばコスミド）を増殖のために用いると、大きなゲノムまたはアンチゲノムへの適応性を高めることができる。
【０１０２】
ゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離されたポリヌクレオチド（例えばｃＤＮＡ）を、トランスフェクション、エレクトロポレーション、機械的挿入、形質導入などにより、適切な宿主細胞に挿入してもよい。該細胞は、生産性ＰＩＶ感染を支持することができるもので、例えば、ＨＥｐ−２、ＦＲｈＬ−ＤＢＳ２、ＬＬＣ−ＭＫ２、ＭＲＣ−５およびベロ細胞である。単離されたポリヌクレオチド配列のトランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム法（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ１４：７２５（１９７８年）；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ７：６０３（１９８１年）；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２：４５６（１９７３年））、エレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１−８４５（１９８２年））、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（編集）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９８７年）、陽イオン脂質媒介トランスフェクション(cationic lipid-mediated transfection)（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｃｕｓ１５：７３−７９（１９９３年））、あるいは、市販のトランスフェクション試薬（例えば、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＣＥ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）などにより、培養細胞に導入することができる（上記の各参考文献の全体を、本明細書中で参考として援用する）。
【０１０３】
上記のように、本発明の態様のいくつかにおいて、Ｎ、Ｐ、Ｌおよび他の所望のＰＩＶタンパク質を、ゲノムまたはアンチゲノムをコードするヘルパーウィルスと表現型の面で区別することができる１種またはそれ以上のヘルパーウィルスでコードする。Ｎ、Ｐ、Ｌおよび他の所望のＰＩＶタンパク質はまた、１種またはそれ以上の発現ベクターでコードされていてもよく、該ベクターは、ゲノムまたはアンチゲノムをコードするベクターと同一または異なるもの、ならびにそのさまざまな組合わせであることができる。所望により他のタンパク質が含まれていてもよいが、これは、固有のベクター、またはＮ、Ｐ、Ｌおよび他の所望のＰＩＶタンパク質の１種もしくはそれ以上をコードするベクターによりコードされているか、あるいは、完全ゲノムまたはアンチゲノムである。
【０１０４】
本発明では、ＰＩＶの感染性クローンを提供することにより、ＰＩＶゲノム（またはアンチゲノム）中に生産される組換えを幅広く変更することができるので、所望の表現型の変化を特徴付ける特定の突然変異を起こすことができる。“感染性クローン”とは、ｃＤＮＡ、または、その合成もしくはその他の生成物であり、感染性ビリオンに直接組み込まれることができるＲＮＡを意味する。該感染性ビリオンは、感染性のウィルス粒子もしくはサブウィルス粒子のゲノムを生産するための鋳型として機能する能力を有するゲノムまたはアンチゲノムＲＮＡに、転写することができる。上記のように、さまざまな従来技術（例えば部位特異的突然変異誘発）により、特定の突然変異をゲノムまたはアンチゲノムのｃＤＮＡコピーに導入することができる。本明細書中に記載するように、完全ゲノムまたはアンチゲノムｃＤＮＡを構築するためにゲノムまたはアンチゲノムｃＤＮＡサブフラグメントを使用すると、各領域を別々に処理することができ（小さなｃＤＮＡ対象物(subjects)は、大きなｃＤＮＡ対象物より取扱いが簡単である）、続いて容易に完全ｃＤＮＡに構築することができるので、有利である。したがって、完全アンチゲノムまたはゲノムｃＤＮＡ、またはその選択サブフラグメントを、オリゴヌクレオチド選択的突然変異誘発の鋳型として用いることができる。これは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）のＭＵＴＡ−ｇｅｎ（登録商標）キットを用いるなどにより一本鎖ファージミド形態の中間体を経るか、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＣｈａｍｅｌｅｏｎ（登録商標）突然変異誘発キットなどの二本鎖プラスミドを鋳型として直接用いる方法か、あるいは、オリゴヌクレオチドプライマーまたは目的の突然変異（単数および複数）を含有する鋳型のいずれかを用いるポリメラーゼ連鎖反応により、行うことができる。その後、変異したサブフラグメントを完全アンチゲノムまたはゲノムｃＤＮＡ中に構築することができる。他のさまざまな突然変異誘発技術が知られており、本発明のＰＩＶのアンチゲノムまたはゲノムｃＤＮＡに目的の突然変異を生産するための使用において、日常的に適合させることができる。
【０１０５】
したがって、一例示的態様において、突然変異の導入は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能なＭＵＴＡ−ｇｅｎ（登録商標）ファージミドｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発キットを用いて行う。手短に述べると、ＰＩＶゲノムまたはアンチゲノムをコードするｃＤＮＡをプラスミドｐＴＺ１８Ｕにクローニングし、ＣＪ２３６細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の形質転換に使用する。ファージミド試料は、製造元が推奨するように調製する。オリゴヌクレオチドは、変更したヌクレオチドをゲノムまたはアンチゲノムの所望の位置に導入することにより突然変異を誘発するように、設計する。その後、遺伝的に変化したゲノムまたはアンチゲノムを含有するプラスミドを増幅する。
【０１０６】
突然変異は多様であることができ、１つのヌクレオチドの変化から、１種もしくはそれ以上の遺伝子またはゲノムセグメントを含有する大きなｃＤＮＡセグメントの導入、欠失または置換に至る。ゲノムセグメントは、構造的および／または機能的ドメイン（例えば、細胞質ドメイン、膜貫通ドメインまたはタンパク質のエクトドメイン）、活性部位（異なるタンパク質との結合または他の生化学的相互作用を媒介する部位など）、エピトープ部位(epitopic site)（例えば、抗体の結合および／または体液性もしくは細胞媒介性免疫応答を刺激する部位）などに対応することができる。この点について有用なゲノムセグメントの範囲は、タンパク質の小さな機能性ドメイン（例えば、エピトープ部位）をコードするゲノムセグメントの場合の約１５〜３５ヌクレオチドから、約５０、７５、１００、２００〜５００、および５００〜１５００またはそれ以上のヌクレオチドに至る。
【０１０７】
特定の突然変異を感染性ＰＩＶに導入する能力は、ＰＩＶの病原性および免疫原性機序の処理など、多くの用途を有する。例えば、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬタンパク質ならびにＣ、ＤおよびＶ  ＯＲＦ生成物を含むＰＩＶタンパク質の機能は、タンパク質の発現レベルを除去または低減する突然変異、またはタンパク質の突然変異体を生じる突然変異を導入することにより、処理することができる。また、プロモーター、遺伝子間領域および転写信号など、さまざまなゲノムＲＮＡの構造的特徴は、本発明の方法および組成物の範囲内で日常的に処理することができる。トランス作用性タンパク質およびシス作用性ＲＮＡ配列の作用は、例えば、ＰＩＶミニゲノム(minigenomes)を用いた並行アッセイに完全アンチゲノムｃＤＮＡを使用することにより（Ｄｉｍｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２７７２−８（１９９３年）、全体を本明細書中で参考として援用する）、容易に決定することができる。該ＰＩＶミニゲノムのレスキュー依存性(rescue-dependent)状態は、抑制性が非常に高いため複製独立型(replicatin-independent)感染性ウィルスを回収することができない突然変異体を特徴付けるのに有用である。
【０１０８】
本発明による組換えＰＩＶ中の遺伝子または遺伝子セグメントのある種の置換、挿入、欠失または再配列、例えば、選択されたタンパク質またはタンパク質領域（例えば、細胞質尾部(cytoplasmic tail)、膜貫通ドメインもしくはエクトドメイン、エピトープ部位もしくは領域、結合部位もしくは領域、活性部位もしくは活性部位を含有する領域など）をコードする遺伝子セグメントの置換は、同一もしくは異なるＰＩＶまたは他の発生源からの存在する“相対(counterpart)”遺伝子または遺伝子セグメントに、構造的もしくは機能的に関連して行う。そのような修飾により、野生型すなわち親世代のＰＩＶまたは他のウィルス菌株に比べて所望の表現型の変化を有する新規の組換え体が得られる。例えば、この型の組換え体は、他のＰＩＶのエクトドメインに縮合した１つのＰＩＶの細胞質尾部および／または膜貫通ドメインを有するキメラタンパク質を発現させることができる。この型の組換え体の他の例は、重複免疫原性領域などの重複タンパク質領域を発現させる。
【０１０９】
本明細書で用いるように、“相対”遺伝子、遺伝子セグメント、タンパク質またはタンパク質領域は、通常、非相同的発生源からのもの（例えば、異なるＰＩＶ遺伝子からのものか、あるいは、異なるＰＩＶ型または菌株中の同一（すなわち相同または対立）遺伝子または遺伝子セグメントを示すもの）である。この状況において選択される代表的な相対物は、総体的な構造的特徴を共有し、例えば、各相対物は、比較できるタンパク質またはタンパク質の構造的ドメイン（細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、エクトドメイン、結合部位もしくは領域、エピトープ部位もしくは領域など）をコードすることができる。相対ドメインおよびそのコード化遺伝子セグメントは、ドメインまたは遺伝子セグメント変異体に共通の生化学的活性により定義される大きさ範囲および配列の多様性を有する種の群がりを包含する。
【０１１０】
相対遺伝子および遺伝子セグメント、ならびに本発明の範囲内の組換えＰＩＶを生産するために本明細書中に開示する他のポリヌクレオチドは、選択したポリヌクレオチド“標準配列”、例えば、他の選択した相対配列と、実質的な配列同一性を共有することが多い。本明細書で用いる“標準配列”は、配列を比較するための基準として用いられる特定配列であり、例えば、全長ｃＤＮＡまたは遺伝子、すなわち完全ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメントである。一般に、標準配列は、少なくとも２０ヌクレオチドの長さであり、少なくとも２５ヌクレオチドの長さであることが多く、しばしば少なくとも５０ヌクレオチドの長さである。２種のポリヌクレオチドは、それぞれ（１）２種のポリヌクレオチドの間の類似する配列（すなわち、完全ポリヌクレオチド配列の一部）を含んでいてもよく、（２）さらに、２種のポリヌクレオチドの間の相違する配列を含んでいてもよい。したがって、２種（またはそれ以上）のポリヌクレオチド配列の比較は、通常、２種のポリヌクレオチド配列を“比較ウィンドウ(window)”にわたり比較して、配列の局所的類似領域を同定および比較することにより実施する。本明細書で用いる“比較ウィンドウ”は、少なくとも２０の接在ヌクレオチド位置の概念的セグメントをさす。ここで、ポリヌクレオチド配列は、少なくとも２０の接在ヌクレオチドの標準配列と比較することができ、比較ウィンドウにおけるのポリヌクレオチド配列部分は、付加または欠失（すなわち間隙）を、２種の配列の最適な整列(alignment)の標準配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０％もしくはそれ未満含んでいてもよい。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適な整列は、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１年）の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０年）の相同性整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８年）の類似法の調査（これらのそれぞれを、参考として援用する）、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩでのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ，本明細書中で参考として援用する）、あるいは検査により実施することができ、さまざまな方法により作製した最良の整列（すなわち、比較ウィンドウにわたる配列類似性の割合（％）がもっとも高くなるもの）を選択する。“配列同一性”という用語は、２種のポリヌクレオチド配列が、比較ウィンドウにわたり同一（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチド基準で）であることを意味する。“配列同一性の割合（％）”という用語は、最適に整列した２種の配列を、比較ウィンドウにわたり比較することにより算出するものである。両配列において同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）がみられる位置数を決定して適合位置数を求め、該適合位置数を比較��ィンドウ中の位置総数（すなわちウィンドウの大きさ）で割り、結果に１００をかけると、配列同一性の割合（％）が得られる。本明細書で用いる“実質的な同一性”という用語は、ポリヌクレオチド配列の特徴を示し、該ポリヌクレオチドは、少なくとも２０ヌクレオチド位置の比較ウィンドウにわたる標準配列（少なくとも２５〜５０ヌクレオチドのウィンドウにわたることが多い）と比較して、少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０〜９５％の配列同一性、より一般的には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。ここで、配列同一性の割合（％）は、標準配列を、欠失または付加を含有していてもよいポリヌクレオチド配列と比較することにより算出し、該欠失または付加の合計は、比較ウィンドウにわたる標準配列の２０％またはそれ未満になる。標準配列は、大きな配列のサブセットであってもよい。
【０１１１】
また、これらのポリヌクレオチド配列の関係に加え、タンパク質および本発明の組換えＰＩＶによりコードされたタンパク質領域は、通常、選択された標準ポリペプチドと保存的関係を有するように、すなわち、実質的な配列同一性または配列類似性を有するように選択される。ポリペプチドで用いたように、“配列同一性”という用語は、ペプチドが、対応位置に同一のアミノ酸を共有することを意味する。“配列類似性”という用語は、ペプチドが、対応位置に同一または類似のアミノ酸（すなわち、保存的置換）を有することを意味する。“実質的な配列同一性”という用語は、２種のペプチド配列が、欠如間隙重量(default gap weights)を用いたＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムなどにより最適に整列している場合、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性またはそれ以上（例えば９９％）の配列同一性を共有すること意味する。“実質的な類似性”という用語は、２種のペプチド配列が、対応する割合（％）の配列類似性を共有することを意味する。同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なっていることが好ましい。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の相互交換能力をさす。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リシン、アルギニンおよびヒスチジンであり；そして、含硫側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。天然に発生するアミノ酸２０種について本明細書で用いる略号は、従来の用法（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ＆Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ編集，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ，１９９１年）、本明細書中で参考として援用する）に従う。従来型アミノ酸２０種、α，α−二置換アミノ酸などの非天然型アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸および他の非従来型アミノ酸の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）も、本発明のポリペプチドに適した成分であることができる。非従来型アミノ酸の例は、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸(carboxyglutamate)、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、ω−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）などである。さらに、糖鎖形成、リン酸化などにより、アミノ酸を修飾してもよい。
【０１１２】
本発明に従ったワクチンウィルス候補を選択するために、周知の方法に従い、生存力、弱毒化および免疫原性の基準を決定する。本発明のワクチンにもっとも望ましいウィルスは、生存力を維持し、安定した弱毒化の表現型を有し、免疫化宿主において複製を示し（低レベルにおいてではあるが）、そして、野生型ウィルスによる感染に起因する重症疾患を防御するのに十分なワクチンにおいて、免疫応答の発現を効果的に誘発しなければならない。本発明の組換えＰＩＶは、生存可能で、これまでのワクチン候補に比べより適切に弱毒化されているだけでなく、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて遺伝学的により安定している・・・防御免疫応答を刺激する能力と、場合によっては、多数の修飾により付与される防御を拡充する（例えば、異なるウィルス菌株または亜群に対する防御、または異なる免疫学的基準（例えば、分泌型免疫グロブリン対血清型免疫グロブリン、細胞性免疫など）による防御を誘導する）能力を保持する。
【０１１３】
本発明の組換えＰＩＶは、周知かつ一般に受け入れられている多様なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏモデルで試験を行うことにより、適切な弱毒化、表現型復帰に対する抵抗性、およびワクチンとして使用するための免疫原性を、確認することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイでは、修飾ウィルス（例えば、何倍も弱毒化した、生物学的に派生した、または組み換えたＰＩＶ）を、例えば、ウィルス複製の温度感受性（すなわち、ｔｓ表現型）、および小さなプラークまたは他の所望の表現型について試験する。修飾ウィルスの試験は、ＰＩＶ感染の動物モデルでさらに行う。さまざまな動物モデルが記載されており、本明細書中で援用するさまざまな参考文献に概説されている。ＰＩＶワクチン候補の弱毒化および免疫原活性を評価するために、げっ歯類およびヒト以外の霊長類を含むＰＩＶモデル系が当分野で幅広く受け入れられており、これにより得られたデータは、ヒトにおけるＰＩＶ感染、弱毒化および免疫原性との相関性が高い。
【０１１４】
先の記載に従い、本発明はまた、ワクチンとして用いるための単離した感染性組換えＰＩＶウィルス組成物を提供する。ワクチンの成分である弱毒ウィルスは、単離された形態で、通常は精製されている。単離されたとは、感染した人の上咽頭のように、野生型ウィルスの発生環境以外の環境にあるＰＩＶをさすものとする。より一般に、単離されたとは、細胞培養液または他の人工的培養液の成分としての弱毒ウィルスを含むものとする。ここで、該培養液は、制御された状態において、該ウィルスを増殖させ、特徴付けることができるものである。例えば、本発明の弱毒ＰＩＶは、感染細胞培養液により生産し、該細胞培養液から分離し、安定剤に加えることができる。
【０１１５】
ワクチンとして用いるために、本発明に従って生産した組換えＰＩＶは、ワクチン製剤に直接用いるか、または、所望により、当分野の技術者に周知の凍結乾燥プロトコルを用いて凍結乾燥することができる。通常、凍結乾燥ウィルスは、約４℃に維持する。凍結乾燥ウィルスは、使用する準備が完了したときに、アジュバントを含むまたは含まない安定化溶液（例えば、食塩液、ＳＰＧ、Ｍｇ++およびＨＥＰＥＳ）中で、さらに以下に記載するように再構成する。
【０１１６】
本発明のＰＩＶワクチンは、免疫原的に有効な量の、本明細書中に記載するように生産したＰＩＶを、活性成分として含有する。修飾ウィルスは、生理学的に許容しうる担体および／またはアジュバントと共に宿主に導入してもよい。有用な担体は当分野で周知のものであり、例えば、水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などを含む。得られる水溶液は、そのままで使用するように包装するか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥製剤は、上記のように、投与する前に滅菌溶液と化合させる。生理学的状態によく似た状態にするために、組成物は、必要に応じて、医薬的に許容しうる補助物質を含有していてもよい。該補助物質は、ｐＨ調節剤および緩衝剤、張度調節剤、湿潤剤などで、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンなどである。許容しうるアジュバントは、当分野で周知の適切な他の多くのアジュバントのうち、不完全フロイントアジュバント、ＭＰＬTM（３−ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ；ＲＩＢＩ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）およびＩＬ−１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を含む。
【０１１７】
本明細書中に記載するＰＩＶ組成物をエアゾール、飛沫、経口、局所または他の経路を介して用いて免疫化すると、宿主の免疫系は、ＰＩＶウィルスタンパク質（例えば、ＦおよびＨＮ糖タンパク質）に特異的な抗体を生産することによりワクチンに反応する。免疫原的に有効な量の、本明細書中に記載するように生産したＰＩＶを用いて、予防接種を行うと、宿主は、少なくとも部分的にまたは完全にＰＩＶ感染に対し免疫性を示すようになるか、または中等度から重度のＰＩＶ感染（特に下気道における）の発症に対し抵抗性を示すようになる。
【０１１８】
ワクチン投与を受ける宿主は、ＰＩＶまたは密接な関連ウィルスにより感染しやすいあらゆるほ乳類であることができ、該宿主は、種痘化菌株の抗原に対し防御的免疫応答を発現する能力を有する。したがって、本発明は、さまざまなヒトおよび動物に用いるためのワクチンを作り出す方法を提供する。
【０１１９】
本発明のＰＩＶを含有するワクチン組成物を、ＰＩＶ感染を起こしやすい、またはＰＩＶ感染のリスクがある宿主に投与すると、宿主自身の免疫応答能力が向上する。そのような量を、“免疫原的に有効な量”と定義する。この使用において、有効な量の範囲内にあるＰＩＶの正確な投与量は、宿主の健康状態および体重、投与方法、製剤の特質などに依存するが、一般に宿主あたりのウィルスは約１０3〜約１０7プラーク形成単位（ＰＦＵ）またはそれ以上であり、より一般的には宿主あたりウィルスは約１０4〜約１０6ＰＦＵである。あらゆる場合において、ワクチン製剤は、重症または致命的なＰＩＶ感染から宿主患者を効果的に防御するのに十分な量の、本発明の修飾ＰＩＶを提供すべきである。
【０１２０】
本発明に従って生成されたＰＩＶは、多数のＰＩＶ血清型または株に対する防御を行うようにその他のＰＩＶ血清型や株のウイルスと一緒に組み合わせることができる。あるいは、多数のＰＩＶ血清型または株に対する防御は、ここに記載のように多数の血清型または株の防御エピトープを一つのウイルス中に組み込むことによって達成できる。通常異なるウイルスが投与される場合、それらは混合物として同時に投与されるが、別々に投与してもかまわない。一つの株による免疫化は同じまたは異なる血清型の異種株に対する防御も与えるかもしれない。
【０１２１】
場合によっては本発明のＰＩＶワクチンと他の因子、とりわけその他の小児ウイルス、に対し防御的応答を誘導するワクチンとを組み合わせることが望ましいかもれない。本発明のもう一つの態様において、ＰＩＶはここに記載するように、感染性のＰＩＶを生成するために使用されるＰＩＶゲノムまたはアンチゲノム中に防御抗原をコードする配列を含有させることによって、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）または麻疹ウイルスなどその他の病原体の防御抗原用のベクターとして用いることができる。
【０１２２】
すべての患者において、組換えＰＩＶワクチンの正確な投与量、および投与時期や投与回数は、患者の健康状態、体重、投与様式、製剤の種類などに基づいて決定される。用量は一般に患者当たり、約１０3から約１０7のプラーク形成単位（ＰＦＵ）以上のウイルスであり、より一般的には患者あたり約１０4から１０6ＰＦＵのウイルスである。いずれにせよ、いろいろある技法の中でも特に補体結合法、プラーク中和法、および／または酸素結合免疫吸着検査法などによって定量される、抗ＰＩＶ免疫反応を効果的に刺激または誘導するのに十分な量の弱毒化ＰＩＶをワクチン製剤は提供しなくてはならない。これに鑑み、個人においては上気道疾病の兆候および症状がモニターされる。チンパンジーへの投与で言えば、ワクチンの弱毒化ウイルスを接種したチンパンジーの上咽頭において、ウイルスの成長は野生型ウイルスの約１０分の１以下のレベルであり、あるいは不完全弱毒化ＰＩＶのレベルと比べて成長は約１０分の１以下である。
【０１２３】
新生児および乳児においては十分な免疫レベルを得るには多数回の投与が必要となるかもしれない。投与は生後１ヶ月以内に開始するべきであり、天然の（野生型）ＰＩＶ感染に対し十分な防御レベルを維持するために必要なだけ、２ヶ月、６ヶ月、１年、あるいは２年などの間隔で小児期を通じて投与されなくてはならない。同様に、たとえば医療関係者、デイケア関係者、家族に幼い子供を持つ人たち、老人、易感染性心肺機能を持つ個人など、とりわけ繰り返しまたは重篤なＰＩＶ感染を受けやすい成人は、防御的免疫反応を確立する、および／または維持するために複数回の免疫化が必要となるかもしれない。誘導免疫性のレベルは分泌抗体および血清抗体を中和する量を測定することによってモニターすることができ、用量の調整とワクチン投与の繰り返し回数は、求める防御レベルを維持するのに必要な量および回数とされる。さらに異なる受容者グループに対しては異なるワクチンウイルスを投与するようにとの指示がなされるかもしれない。たとえば、サイトカインまたはＴ細胞エピトープに富む別のタンパクを発現するように設計されたＰＩＶ株は、乳児よりもむしろ成人にとってとりわけ有用であろう。
【０１２４】
本発明に従って生成されたＰＩＶワクチンはＰＩＶの別のサブグループまたは株の抗原を発現するウイルスと組み合わせて多数のＰＩＶサブグループまたは株に対する防御を達成することができる。あるいはまた、このワクチンウイルスはここに記載のように一つのＰＩＶクローン中に設計された多数のＰＩＶ株あるいはサブグループの防御エピトープを含有することもできる。
【０１２５】
本発明のＰＩＶワクチンは後に個体が野生型ＰＩＶに感染した場合、肺炎、細気管支炎など重篤な下気道疾病に対する防御となる免疫反応の発生をうながす。自然血中ウイルスは、とりわけ上気道においては依然として感染を引き起こす能力を持っているが、ワクチン投与の結果として鼻炎の可能性は大きく減少し、また野生型ワクチンによるその後の感染により抵抗が高められる可能性がある。ワクチン投与後、生体外および生体内での同種（同じサブグループ）の野生型ウイルスを中和することができる宿主発生血清および分泌抗体が検出可能レベル存在する。多くの例において、宿主抗体はまた異なる非ワクチンサブグループの野生型ウイルスを中和する。
【０１２６】
本発明の好ましいＰＩＶワクチン候補はヒトの自然血中の野生型ウイルスと比較すると、毒性が大きく減少している。このウイルスは十分弱毒化しているのでほとんどの免疫個体においては感染の症状は生じない。場合によっては弱毒化ウイルスは依然としてしてワクチンを投与されていない個体に対し播種能力を持っているかもしれない。しかし、その毒性は十分に除かれているので、ワクチンを投与された、あるいは偶棲宿主において重篤な下気道感染が生じることはない。
【０１２７】
ＰＩＶワクチン候補の弱毒化レベルは、たとえば免疫化した宿主の気道に存在するウイルスの量を定量し、それを野生型ＰＩＶあるいは候補ウイルス株として評価された、その他の弱毒化ＰＩＶにより生成された量と比較することによって求めることができる。たとえば、本発明の弱毒化ウイルスはチンパンジーなどの感受性の高い宿主の上気道において、野生型ウイルスの増殖レベルと比較すると、増殖が高度、たとえば１０分の１から１０００分の１、に制限されている。上気道におけるウイルスの増殖に伴う鼻漏の発達をさらに押さえるのに理想的なワクチン候補ウイルスは、上気道および下気道の両方において制限された増殖レベルを示すものである。しかし、本発明の弱毒化ウイルスは、ワクチンを投与された個体において防御を与えるためには、ヒトにおいて十分に感染性を持ち免疫原性でなければならない。感染宿主の鼻咽頭におけるＰＩＶのレベルを定量する方法は文献によりよく知られている。
【０１２８】
本発明のワクチンによって提供される誘導免疫のレベルは分泌抗体および血清抗体を中和する量を測定することによってもモニターすることができる。これらの測定に基づき、所望レベルの防御を維持するのに必要なワクチン用量が調整され、またワクチンの投与が繰り返される。さらにまた別の受容者グループにとっては別のワクチンウイルスも有利であるかもしれない。たとえばＴ細胞エピトープに富む追加タンパクを発現する設計ＰＩＶ株は乳児よりもむしろ成人にとってとりわけ有利であろう。
【０１２９】
さらに本発明の別の態様において、ＰＩＶは気道の一過性遺伝子療法のためのベクターとしても用いられる。この実施態様に従うと、組み換えＰＩＶゲノムまたはアンチゲノムは問題の遺伝子産物をコード化することのできる配列を含有する。問題の遺伝子産物はＰＩＶ発現を制御するものと同一のまたは異なるプロモータの制御下にある。組み換えＰＩＶゲノムまたはアンチゲノムとＮ、Ｐ、Ｌおよび他の所望のＰＩＶタンパク質とを共発現することによって製造され、問題の遺伝子産物をコード化する配列を含有した感染性ＰＩＶが、患者に投与される。投与は通常エアロゾル、ネブライザーまたはその他、治療されている患者の気道に局所投与するものである。組み換えＰＩＶは、所望の遺伝子産物の治療的または予防的レベルを発現するに十分な量投与される。この方法で投与することのできる、代表的な遺伝子産物はたとえばインターロイキン−２、インターロイキン−４、ガンマ−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、およびその他のサイトカイン類、グルコセレブロシダーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、嚢胞性線維症膜内外伝導度調整剤（ＣＦＴＲ）、ヒポキサンチン‐グアニン‐ホスホリボシルトランスフェラーゼ、細胞毒素類、腫瘍抑圧遺伝子類、アンチセンスＲＮＡ類、およびワクチン抗原類などをはじめとする一過性発現に好ましく適している。
【０１３０】
下記の実施例は説明のためのものであり、制限するものではない。これらの実施例は、発現を完全に沈黙させる代表的な突然変異をＣ ＯＲＦへ導入するための組み換えｃＤＮＡシステムの使用を記録するものである。本発明の代表例である、対応するタンパクの発現を沈黙させるために、ＤおよびＶ ＯＲＦに停止コドンを導入することに関与する突然変異もまた構成され評価された。これらの突然変異がウイルスの複製および病理発生におよぼす効果が記録され、それによりＰＩＶに対する生ワクチンを開発する上でこれらの突然変異が有用であることが明らかになった。
【０１３１】
下記に記載する一つの突然変異ウイルス、ｒＣ−ＫＯと呼ぶ、においてＣ開始コドンをメチオニンからトレオニンへ変更し、二つの停止コドンをＣ ＯＲＦのアミノ酸の７番目および２６番目の位置に導入することによって、Ｃタンパクの発現が停止されている。二つ目の突然変異ウイルスにおいて、ｒＣ−ＫＯ突然変異体は、マウスと霊長類モデルの両方を用いて示されているように、生体外および生体内で大きく弱毒化されている。ｒＣ−ＫＯはまた、野生型ＨＰＩＶ３による攻撃に対し十分な防御を与えた。
【０１３２】
ＤおよびＶ ＯＲＦを個々に中断しても、生体外あるいは生体内におけるウイルスの複製に大きな影響は生じなかったが、両方を一緒に中断すると生体内における複製が弱められた。これらの結果からＨＰＩＶ３のＣ、ＤおよびＶタンパクはそれぞれウイルス複製において役割を持っており、例示した突然変異体は組み換えＰＩＶワクチン候補を開発する際の強力なツールとなることが示される。
【０１３３】
実施例１
ＨＰＩＶ３Ｃ、ＤおよびＶ ＯＲＦにおけるノックアウト突然変異の構成
細胞およびウイルス
ヒトＨＥｐ−２およびサルＬＬＣ−ＭＫ２単層細胞培養物を２％のウシ胎児血清、硫酸ゲンタマイシン（５０ｕｇ／ｍＬ）および４ｍＭグルタミンを加えたＯｐｔｉＭＥＭ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中に維持した。バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する修飾したワクシニア菌株アンカラ（ＭＶＡ）組み換えウイルスはＬ．ＷｙａｔｔならびにＢ．Ｍｏｓｓ（Ｗｙａｔｔｅｔａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２１０：２０２２０５、１９９５）両博士から寛大な提供を受けた）。ＰＩＶ３のＪＳ野生型（ｗｔ）株およびその弱毒化ｔｓ誘導体、ＪＳｃｐ４５、は先に記載されているように（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．２２：１７３−１８４、１９９２）ＬＬＣ−ＭＫ２細胞中で増殖した。
ｃＤＮＡ
ＪＳ  ｗｔウイルスの全１５４６２ｎｔアンチゲノム｛ｐ３／７（１３１）２Ｇ｝をコード化する全長ｃＤＮＡクローンは先に記載されている（Ｇｅｎｅｂａｎｋ  受け入れ番号＃Ｚ１１５７５）［Ｄｕｒｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３３２、１９９７、さらに１９９８年５月２２日に出願された米国特許第０９／０８３、７９３号、１９９７年５月２３日に出願された米国暫定特許第６０／０４７、５７５号（国際公告番号ＷＯ９８／５３０７８号に対応）、および１９９７年９月１９日出願された米国暫定特許第６０／０５９号を参照のこと。これらはそれぞれここに援用されている］。このクローンは４つの突然変異ｃＤＮＡ、一つはＣ ＯＲＦの発現が完全に停止されたもの、二つ目と三つめはＤおよびＶ読みとり枠の発現がそれぞれ独立に停止されたもの、そして四つめはＤおよびＶの読みとり枠突然変異が組み合わされたもの（表１、図１）、を構成するためのテンプレートとして用いた。
【０１３４】
ｐ３／７（１３１）２Ｇ（ＰＩＶ３アンチゲノムのｎｔ１２１５−３９０３）のＰｍ１ＩからＢａｍＨＩ断片を多数のクローン化領域中にＰｍ１Ｉ部位を含有するように修飾しておいたプラスミドｐＵＣ１１９｛ｐＵＣ１１９（Ｐｍ１Ｉ−ＢａｍＨＩ）｝内へサブクローン化した。その後特定部位の突然変異誘発をＫｕｎｋｅｌの方法（Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２、１９８７）を用いてｐＵＣ１１９（Ｐｍ１Ｉ−ＢａｍＨＩ）上で行い、下記に説明するＣ、ＤおよびＶ ＯＲＦ中に突然変異を導入した。
【０１３５】
Ｃノックアウト突然変異（ｒＣ−ＫＯ）をコード化するアンチゲノム性ｃＤＮＡの構成
Ｃ ＯＲＦの発現を沈黙させる突然変異を導入するために二つのプライマーを用いた（表１、図１Ｃ参照）。第一の突然変異誘発性のプライマーは、全長アンチゲノムのｎｔ位置１７９５を変更（Ｔ→Ｃ）することにより、Ｃ ＯＲＦ開始コドンをＡＴＧからＡＣＧ（メチオニンからトレオニン）へと変え、ｎｔ位置１８１３を変更（Ｃ→Ａ）することによってＣ ＯＲＦのアミノ酸位置７をセリンから停止コドンへと変えた。第二の突然変異誘発性のプライマーはｎｔ位置１８６９をＣからＡに変更することによってＣ ＯＲＦのアミノ酸位置２６のセリンを停止コドンと置換した。これらＣ ＯＲＦ中に導入された突然変異は、Ｐ ＯＲＦ中では沈黙していた。
Ｄ、ＶおよびＤＶノックアウト突然変異（ｒＤ−ＫＯ、ｒＶ−ＫＯおよびｒＤＶ−ＫＯ）をコードするアンチゲノム性ｃＤＮＡの構成
ＤおよびＶ ＯＲＦの発現を個々に中断する突然変異を導入した。Ｄノックアウトプライマーは全長アンチゲノムのｎｔ位置２６９２、２６９５および２６９８においてＣからＡへの変化を導入した（表１、図１）。これらのポイント突然変異は推定されるＤ  ＯＲＦ中に３つの連続した停止コドンを形成し、それが図１Ｃに示す３７２アミノ酸キメラＤタンパク中のコドン３０３に続きＤタンパク質の早期終了をもたらすのであろう。これらの停止コドンをＰ ＯＲＦ中に同時にコード変化を引き起こすことなくＤ ＯＲＦ中にもっと早い時期に導入することはできなかった。したがって突然変異させたＯＲＦの発現は完全には停止できないが、Ｄ領域のアミノ酸１３１ではなく６２に融合したＰのＮ末端２４１アミノ酸を含有する切断されたＤタンパクを生じるであろう。Ｖノックアウト突然変異誘発性のプライマーは全長アンチゲノムのｎｔ位置２８４５（ＡからＴ）と２８５４（ＣからＴ）に二つのポイント突然変異を導入した（表１）。これらの突然変異は推定されるＶ ＯＲＦ中に停止コドンを早期に生成した（アミノ酸位置１７および２０）。これらの突然変異はＰ  ＯＲＦ中で沈黙していたが、Ｄタンパク中に二つのアミノ酸置換、すなわちＱ３５４ＬとＡ３５７Ｖを導入した。両プライマーは一つの突然変異生成反応中で一緒に用いて複合ＤＶノックアウト突然変異を生成することができた。
【０１３６】
それぞれの全長クローンのＰｍ１ＩからＢａｍＨＩ断片の塩基配列をすべて調べ導入された突然変異の存在を確認し、他の突然変異が偶発的に導入されていないかを確認した。これらの断片をついで、先に記載（Ｄｕｒｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３３２、１９９７）されているように、全長クローンｐ３／７（１３１）２Ｇ中に別々にクローンしてもどし、４つの異なるアンチゲノム性ｃＤＮＡクローンを生成した。
【０１３７】
実施例ＩＩ
組換えＣノックアウト（ｒＣ-ＫＯ）、Ｄノックアウト（ｒＤ-ＫＯ）、Ｖノックアウト（ｒＶ-ＫＯ）、およびＤＶノックアウト（ｒＤＶ-ＫＯ）突然変異体の回収と特性決定
Ｃ、Ｄ、ＶあるいはＤＶノックアウト突然変異のいずれかを持つ、全長アンチゲノム性ｃＤＮＡを６穴プレート（Ｃｏｓｔｅｒ、ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）上で、サポートプラスミド｛ｐＴＭ（Ｎ）、ｐＴＭ（ＰｎｏＣ）およびｐＴＭ（Ｌ）｝と一緒に、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＣＥ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＨＥｐ−２細胞中へ形質移入し、この細胞を先に記載（Ｄｕｒｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３３２、１９９７、さらに１９９８年５月２２日出願の米国特許第０９／０８３、７９３号、１９９７年５月２３日出願の米国特許第６０／０４７、５７５号（国際公告第ＷＯ９８／５３０７８号に対応）、および１９９７年９月１９日出願の米国暫定特許第６０／０５９、３８５号、それぞれここに援用する）のように同時にＭＶＡ−Ｔ７で感染させた。ｐＴＭ（ＰｎｏＣ）はＣ翻訳開始部位がＡＴＧからＡＣＧへと突然変異し、Ｃ ＯＲＦ中の最初のアミノ酸がメチオニンからトレオニンへと変わったことをのぞき、先に記載（同上）のｐＴＭ（Ｐ）プラスミドと全く同一である。３２℃で三日間インキュベートした後トランスフェクション集菌物をＴ２５フラスコ中の新しいＬＬＣ−ＭＫ２細胞単層上で継代培養し、３２℃で五日間インキュベートした（継代培養１とする）。Ｄ、Ｖ、およびＤＶノックアウト継代培養１集菌物に存在するウイルスの量は先に記載（同上）のように、ＰＩＶ３ＨＮ特異性モノクローナル抗体による免疫ペルオキシダーゼ染色により可視化したプラークでＬＬＣ−ＭＫ２単層培養物上でプラークタイトレーションにより求めた。Ｃノックアウトウイルスは生育不良のように見受けられたのでその継代培養１集菌物はさらにＴ７５フラスコ中のＬＬＣ−ＭＫ２細胞単層中で第二の継代培養により増幅した。継代培養２集菌物中に存在するウイルスの量は上記に記載のようにして求めた。
【０１３８】
継代培養１集菌物の上清中に存在するＤ、Ｖ、およびＤＶノックアウトウイルスをついで先に述べたように（Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．  ２２：１７３−１８４、１９９２、ここに援用する）ＬＬＣ−ＭＫ２細胞上で３回プラーク精製した。Ｃノックアウトウイルスは簡単に同定することのできるプラークを形成することができなかったため、プラーク精製により生物学的にクローン化することができなかった。したがってこれはＬＬＣ−ＭＫ２細胞の９６穴プレート（希釈当たり１２穴）上で２倍希釈を用いて最終的に希釈した。プラーク精製の３回目から得た生物学的にクローン化した組換えウイルス、あるいは最終希釈物をついでＬＬＣ−ＭＫ２細胞中で３２℃で増幅し、さらに特性決定をするためのウイルスを製造した。
【０１３９】
回収した組換えウイルスの配列分析
先に記載（Ｄｕｒｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３３２、１９９７）のようにポリエチレングリコール沈殿法により、感染細胞単層から得た清澄培地からウイルスを濃縮した。ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて製造者の推薦する手順に従って精製した。Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用い、推奨プロトコルに従ってＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ生成物がウイルスＲＮＡからのみ派生し、汚染の可能性のあるｃＤＮＡからではないことを確認するために、反応から逆トランスクリプターゼを省いたことをのぞき、全く同一のコントロール反応を行った。プライマーを用いて全長アンチゲノムのヌクレオチド１５９５−３１０４にわたるＰＣＲ断片を作った。この断片には組換えウイルスの全Ｃ、ＤおよびＶ ＯＲＦが含まれている。得られたＰＣＲ生成物をついでサイクルジデオキシリボヌクレオシド配列分析（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いて配列決定した。
【０１４０】
免疫沈降法によるタンパク分析
二つの異なるＣペプチド（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）に対して多価抗原ペプチド（ＭＡＰ）法を用いてウサギの体内で二つのＰＩＶ３  Ｃ特異性抗血清を得た。この二つのペプチドはＣタンパクのアミノ酸領域３０−４４および６０−７４に渡るものであった。各Ｃペプチドの８つのコピーを分岐キャリアコアに乗せてフロイントアジュバントと共にウサギ（ペプチドあたり２匹づつ）に別々に注入した。ウサギには指定ＭＡＰを２週と４週で追加し、４週、８週、および１０週で採血した。各抗血清は高い力価で免疫原として用いたＣペプチドを認識し、放射性免疫沈殿測定法（ＲＩＰＡ）中、ＨＰＩＶ３感染細胞からＣタンパクを析出した。同様にＤおよびＶタンパクに対しても抗血清を作ろうと試みたが、成功しなかった。得られた抗血清はペプチド自身に対しても力価が低く、野生型ウイルスに感染した細胞から製造されたと推定できるＤまたはＶタンパクを検出することができなかった。
【０１４１】
ＬＬＣ−ＭＫ２細胞のＴ２５細胞単層を感染多重度（ＭＯＩ）５で、ｒＣ−ＫＯ、組換えＪＳｗｔ  ウイルス（ｒＪＳ）のいずれかにより感染させ、または膜擬感染させて３２℃でインキュベートした。感染後２４時間で単層をメチオニンフリーのＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で洗浄し、メチオニンフリーのＤＭＥＭ中１０ｕＣｉ／ｕの35Ｓメチオニンの存在下でさらに６時間インキュベートした。細胞を集菌し、３回洗浄し、１ｍｌのＲＩＰＡバッファー｛１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１５０ｍＭ、ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４｝中に再懸濁し、凍結融解して６５００ｘｇで遠心分離した。細胞抽出物を新しいエッペンドルフチューブに移し、両Ｃ抗血清（各５ｕｌ）の混合物を各サンプルに加え２時間の間撹拌を続けながら４℃でインキュベートした。ＨＰＩＶ３のＨＮグリコプロテインを認識する（ｖａｎ  Ｗｙｋｅ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６１：１４７３−１４７７、１９８７）ｍＡｂ４５４／１ｌと１０１／ｌの混合物１０ｕｌを各サンプルに加え、回収したウイルスが実際にＨＰＩＶ３であることを確認した。タンパクＡセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）の１０％の懸濁液２００ｕｌを各サンプルに加えて、４℃で一晩撹拌を続けて免疫複合物を沈殿させた。各サンプルは変性、還元し、４〜１２％のポリアクリルアミドゲル（ＮｕＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）上で製造元の推奨に従って分析した。ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーで分析した。
【０１４２】
ｒＰＩＶ３のマルチサイクル複製法
Ｔ２５フラスコ中のＬＬＣ−ＭＫ２細胞の単層を二つづつｒＣＫＯ、ｒＤＶ−ＫＯ、またはｒＪＳによりＭＯＩ＝０．０１で感染させ、５％ＣＯ2中３２℃でインキュベートした。７日間の間２４時間毎に各フラスコから２５０ｕｌのサンプルを取りだし急速冷凍した。各時点で、等量の新しい培地を戻し入れた。７日間３２℃でインキュベートした９６穴プレート中のＬＬＣ−ＭＫ２細胞単層上で各サンプルの力価を求めた。ウイルスは赤血球吸着により検出し、ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／ｍｌで報告した。
動物実験
ｒＣ−ＫＯ、ｒＤＶ−ＫＯ、ｒＪＳ、ｃｐ４５（ＪＳｗｔウイルスから生物学的に誘導した弱毒化生派生物）またはＲＳウイルス（ＲＳＶ）のいずれかを１０5ＰＦＵ含有するＥＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）０．１ｍｌを１群２１匹の４−６週齢のゴールデンシリアンハムスターに鼻腔内接種した。接種後３、４および５日目に、各群から５匹のハムスター（ＲＳＶを接種されたものを除く）を屠殺し、肺と鼻甲介を回収した。鼻甲介と肺はホモジェナイズし、Ｌ−１５（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中でそれぞれ１０％または２０％ｗ／ｖの懸濁液を調製し、サンプルを急速に冷凍した。サンプル中に存在するウイルスの力価を３２℃で７日間インキュベートしたＬＬＣ−ＭＫ２細胞単層の９６穴プレート上で求めた。ウイルスを赤血球吸着により検出し、平均ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／ｇを５匹のハムスターからなる各群について毎日計算した。各群に残っている６匹のハムスターから接種後０日と２８日目に血清を集めた。各ウイルスに対する血清抗体反応を先に記載した（ｖａｎ  Ｗｙｋｅ  Ｃｏｅｌｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １４３：５６９−５８２、１９８５）赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）アッセイで評価した。各群に残るハムスターは、ＲＳＶで免疫したものも含め、２８日目に生物学的に誘導した１０6ＰＦＵのＰＩＶ３  ＪＳ  ｗｔウイルスで鼻腔内を攻撃した。攻撃後４日目に動物を屠殺し、肺と鼻甲介を回収し上記に記載したように処理した。攻撃サンプル中のウイルスの量は上記に記載のようにして求めた。動物に攻撃を行わないという点を除き、上記に記載のようにしてハムスターにｒＤ−ＫＯおよびｒＶ−ＫＯを投与した実験を別に行った。
【０１４３】
１群４頭のミドリザル（ＡＧＭ）のそれぞれに対し、アカゲザルに対して先に行われた研究（Ｄｕｒｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  １６：１３２４−３０、１９９８）で記載されているように鼻腔内と気管内に１０6ＰＦＵのｒＣ−ＫＯ、ｒＤＶ−ＫＯ、ＪＳｗｔ、またはｃｐ４５のいずれかを接種した。接種後１２日間毎日鼻咽頭ぬぐいサンプルを回収し、気管洗浄サンプルを接種後２、４、６、８および１０日目に回収した。検体を急速冷凍しすべての検体が回収されるまで−７０℃で保存した。サンプル中に存在するウイルスの力価を３２℃で７日間インキュベートした９６穴プレート中のＬＬＣ−ＭＫ２細胞単層上で求めた。ウイルスを赤血球吸着により検出し、平均ｌｏｇ10ＴＣＩＤ50／ｍｌを毎日計算した。各サルから接種後０日と２８日目に血清を集め、様々な突然変異体およびＰＩＶ３野生型（ＪＳ）による実験的感染に対するＰＩＶ３  ＨＡＩ抗体反応を求めた。接種後２８日目にＡＧＭを生物学的に誘導した１０6ＰＦＵのＰＩＶ３野生型ウイルスを含有する１ｍｌの接種物で、鼻腔内と気管内を攻撃した。鼻咽頭ぬぐいサンプルを攻撃後０、１、２、４、６、８、１０、および１２日目に回収し、気管洗浄サンプルを攻撃後２、４、６、８および１０日目に回収した。検体を急速冷凍して保存し上記に記載のように存在するウイルスの力価を求めた。
【０１４４】
組換え突然変異体ｒＣ−ＫＯ、ｒＤ−ＫＯ、ｒＶ−ＫＯおよびｒＤＶ−ＫＯの回収
ＨＰＩＶ３アンチゲノム性ｃＤＮＡを調製し、下記の４つの突然変異ウイルス（表１、図１参照）をコードした：（ｉ）ｒＣ−ＫＯ、ここでＣ ＯＲＦは開始コドンをＭからＴへと変更し、コドン７と２６で翻訳停止を導入するように修飾されている；（ｉｉ）ｒＤ−ＫＯ、ここでは３７２アミノ酸キメラＤタンパク中コドン３０４、３０５および３０６で翻訳停止が導入された；（ｉｉｉ）ｒＶ−ＫＯ、ここではＶ ＯＲＦの位置１７と２０において停止コドンが導入された；そして（ｉｖ）ｒＤＶ−ＫＯ、ここではｉｉとｉｉｉの突然変異が組み合わされた。各突然変異は、Ｖ ＯＲＦ（ｉｉｉ）に導入された二つの停止コドンの場合を除き翻訳的には重なり合うＯＲＦ中で沈黙していたが、上記二つの停止コドンはＤに二つのアミノ酸置換、すなわちＱ３５４ＬとＡ３５７Ｖ、を生じたが、これは回避できなかった。さらにＤ中のストップコドンはＰが変更されてしまうため、ＯＲＦ中に早期に導入することはできなかった。各突然変異は翻訳的に沈黙した制限部位マーカー（表１）と共に導入された。
【０１４５】
【表１】
0004813710.tif 000002
【０１４６】
アンチゲノム性ｃＤＮＡを３つのＰＩＶ３サポートプラスミド｛ｐＴＭ（ＰｎｏＣ）、ｐＴＭ（Ｎ）、ｐＴＭ（Ｌ）｝と共にＨＥｐ−２細胞中に形質移入し、細胞をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するＭＶＡで同時に感染させた。Ｃ、ＤまたはＶ ＯＲＦ中に突然変異を含有するｒＰＩＶ３の回収効率は、ｐ３／７（１３１）２Ｇ、全長ＰＩＶ３アンチゲノムを発現するプラスミドであり、これから組換えＪＳｗｔＰＩＶ３（ｒＪＳ）がこれまでに回収されている（Ｄｕｒｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３５：３２３−３３２、１９９７）を用いて同様に形質移入し感染させたＨＥｐ−２細胞培養物のものと比較した。三日間３２℃でインキュベートした後、形質移入した細胞を回収し、各上清をＴ２５フラスコ中のＬＬＣ−ＭＫ２細胞の新しい単層上に継代培養し、５日間３２℃でインキュベートした（継代培養１）。３２℃で５日たった後、ｒＪＳ、ｒＤ−ＫＯ、ｒＶ−ＫＯ、およびｒＤＶ−ＫＯのＬＬＣ−ＭＫ２細胞単層は３−４＋細胞変性作用（ＣＰＥ）を示した。ｒＣ−ＫＯの対応する継代培養１は、あったとしても最小のＣＰＥを示した。ｒＣ−ＫＯ中のＣＰＥの欠如が突然変異ウイルスの高レベルの増殖制限によるのか、または単にワクチンのきわめて低い初期回収率によるのかが不明瞭であったため、継代培養１は回収され、上清はＴ７５フラスコ中のＬＬＣ−ＭＫ２細胞の新しい単層上に継代培養し、３２℃で７日間インキュベートした（継代培養２）。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞のＴ７５単層は７日間のインキュベートの後、１−２＋ＣＰＥしか示さなかったが、ＨＰＩＶ３の存在は赤血球吸着により確認された。プラーク分離による生物学的クローニングを３回行った後、または最終的希釈後に、各組換え突然変異体をＬＬＣ−ＭＫ２細胞中で２回増幅し、特性決定をさらに行うためのウイルスの懸濁液を生成した。
【０１４７】
回収したウイルスが実際に期待したｒＣ−ＫＯ、ｒＤ−ＫＯ、ｒＶ−ＫＯおよびｒＤＶ−ＫＯ突然変異体であることを確認するために、各クローン化ウイルスをプライマーペアを用いてＨＰＩＶ３アンチゲノムのｎｔ１５９５−３１０４に渡る（これはＣ、ＤおよびＶ ＯＲＦを含有するＰ遺伝子の部分を含む）ＤＮＡの断片を増幅し、ＲＴ−ＰＣＲにより分析した。各ＰＣＲ生成物の生成はＲＴを含んでいるかどうかに依存しており、それぞれがＲＮＡから派生し、汚染ｃＤＮＡからではないことが示された。ｒＣ−ＫＯ、ｒＤ−ＫＯ、ｒＶ−ＫＯおよびｒＤＶ−ＫＯのＰＣＲ生成物をついでマーカーとして導入した制限酵素（表１）で消化し、制限酵素部位の存在を確認した。ヌクレオチド配列決定もまたＲＴ−ＰＣＲ生成物上で行い、導入した突然変異の存在を確認した。導入した突然変異のすべてが、各クローン化組換え体から増幅されたｎｔ１５９５−３１０４に渡るＲＴ−ＰＣＲ断片中に存在することが確認され、その他の偶発的な突然変異はこの断片中には見られなかった。
【０１４８】
Ｃ  ＯＲＦ１が沈黙していることを確認するために、ラジオイムノプレシピテーションアッセイ（ＲＩＰＡ）を行いｒＣ−ＫＯ突然変異ウイルスとｒＪＳｗｔウイルスとを比較した。細胞を感染させ、感染後２４から３０時間35Ｓメチオニンの存在下でインキュベートし、細胞溶解産物を調製した。等量の全タンパクを抗Ｃおよび抗ＨＮ抗体とともにインキュベートし、ついで抗体をタンパクＡセファロースビーズに結合した。ｒＪＳｗｔはＨＮおよびＣタンパクの両方をコード化したが、一方ｒＣ−ＫＯはＣタンパクを発現できなかった（図３）。
【０１４９】
細胞培養物中でのｒＣ−ＫＯおよびｒＤＶ−ＫＯの複製
ＬＬＣ−ＭＫ２細胞単層を２組ｒＣ−ＫＯ、ｒＤＶ−ＫＯまたはｒＪＳでＭＯＩ＝０．０１で感染させ、３２℃で７日間インキュベートした。各培養物の培地を２４時間間隔で採取し、この物質をその後力価測定して細胞培養物中の各ウイルスの複製を評価した。ｒＤＶ−ＫＯの複製は、ウイルス生成速度およびピーク力価（図３）の点、ならびに高温での複製能力（データは示していない）の点で、親ｒＪＳｗｔのものと本質的に見分けがつかなかった。対照的に、ｒＣ−ＫＯウイルスは複製の速度がより遅く、６日目で達したピーク力価はｒＪＳの１００から１０００分の一の低さであった。このようにＣタンパクの発現の欠如は細胞培養物中でのウイルス複製に大きな影響を与えた。
【０１５０】
ハムスターにおけるｒＣ−ＫＯ、ｒＤ−ＫＯ、ｒＶ−ＫＯおよびｒＤＶ−ＫＯの複製
次に突然変異ウイルスとｒＪＳｗｔ親をハムスターの上気道および下気道中でのその複製能力の点で比較した。予備研究によりｒＤ−ＫＯおよびｒＶ−ＫＯウイルスはこのアッセイにおいてｒＪＳウイルスとは見分けがつかないことがわかっていた（データは示していない）ので、これらについてはその後の評価から除外した。第二の実験ではハムスターのグループに対し、一匹あたり１０5ｐｆｕのｒＣ−ＫＯ、ｒＤＶ−ＫＯ、ｒＪＳまたは、生物学的に誘導したワクチン候補株であるｃｐ４５で鼻腔内接種した。試験においては連日、ハムスターの上気道および下気道においてｒＣ−ＫＯの複製は、ｒＪＳと比較し１０００分の一以下に減少し（表２）、ｃｐ４５ワクチン候補ウイルスと同様に弱毒化されていた。ｒＤＶ−ＫＯの複製はハムスターの上気道中では減少しなかったものの、試験した３日間は、連日下気道中では少なくとも２０分の一に減少した（表２）。ｒＣ−ＫＯ、ｒＤＶ−ＫＯ、ｃｐ４５またはｒＪＳで感染させたハムスターはＨＰＩＶ３に対しかなりの抗体反応を示し、ＰＩＶ３攻撃ウイルスの複製を高レベルで制限した（表３）。上気道中でのｒＣ−ＫＯにより提供される防御は不完全ではあったが、それでも大きなものであった。
【０１５１】
【表２】
0004813710.tif 000003
【０１５２】
【表３】
0004813710.tif 000004
【０１５３】
霊長類におけるｒＣ−ＫＯおよびｒＤＶ−ＫＯの複製
ｒＣ−ＫＯおよびｒＤＶ−ＫＯの弱毒化表現型および防御有効性をさらに評価するために、これらの突然変異体を４頭のＡＧＭの群にそれぞれ投与し、その上気道および下気道中での複製をｃｐ４５およびＪＳｗｔのものと比較した。ｒＣ−ＫＯのＡＧＭの上気道中での複製は１００分の一以下に減少したが、ｒＤＶ−ＫＯはこの部位では１０分の一の減少を示した。これら二つのウイルスの上気道中で観察された弱毒化は、ｃｐ４５のものと同等であった（表４）。ｒＣ−ＫＯはＡＧＭの下気道において高度に弱毒化されているものの（１０5倍以上）、ｒＤＶ−ＫＯはこの部位では控えめに（＜１０倍）制限されているにすぎなかった。ＡＧＭのｒＣ−ＫＯへのＨＡＩ応答は、ハムスターと同様、他のウイルスのものより大きく劣っていた（表４）ものの、両ウイルスともＨＰＩＶ３へのＨＡＩ抗体反応を誘導した。免疫したＡＧＭに対し、１０6ＰＦＵの生物学的に誘導したＪＳｗｔウイルスで、２８日めに鼻腔内および気管内の攻撃を行った。ｒＪＳ、ｒＤＶ−ＫＯまたはｃｐ４５ワクチン候補ウイルスを受け取っていた動物はＡＧＭの上気道および下気道中での攻撃ウイルスの複製から完全に守られた。攻撃ウイルスの複製に対し、ｒＣ−ＫＯにより与えられた防御は大きなものではあったが完全ではなかった。攻撃ウイルスのピーク力価はこの群の動物中の上気道および下気道の両方において大きく減少し、ウイルスを上気道および下気道から脱落させる期間は１０日から４日へ、また８日から６日へとそれぞれ短縮された。
【０１５４】
【表４】
0004813710.tif 000005
【０１５５】
上記の開示をまとめると、ここに記載の結果から感染性のＨＰＩＶ３がｃＤＮＡから成功裏に回収され、開始コドンを特定するアミノ酸を変更する、および／または翻訳的停止コドンの導入を行う突然変異を用いた例示した切除法によりＣ、ＤあるいはＶ ＯＲＦの発現がそれぞれ中断された、新規組換えウイルスを構成することができたことを示している。もう一つの例示したウイルスクローンにおいては、ＤおよびＶ ＯＲＦが一緒に中断されていた。これらの例は生体外および生体内においてウイルス複製に対するＨＰＩＶ３のアクセサリーＣ、ＤおよびＶ ＯＲＦの重要性を示しており、ＰＩＶの予防ならび治療のための有用なワクチン候補を提供する。とりわけ、ＡＧＭの上気道および下気道におけるｒＣ−ＫＯの複製レベルはもっとも有望と思われるＰＩＶ３ワクチン候補株であるｃｐ４５を若干下回っているにすぎない。生体内中の複製の低下にもかかわらず、ｒＣ−ＫＯはＨＰＩＶ３攻撃ウイルスの複製を制限するために十分な免疫応答を誘導することができ、この組換え体が有用なワクチン候補の資格をもつことを示したが、ｗｔウイルスの複製制限を高レベルで達成するにはヒトに対し１０7.0ＴＣＩＤほどの比較的高い用量で用いるかまたは複数回の投与を行うことが必要かもしれない。
【０１５６】
組換えＤＮＡ技法を用いてＨＰＩＶ３突然変異体ｃｐ４５中に同定される突然変異はＪＳｗｔ配列中に単体であるいは組み合わせて導入されている（Ｓｋｉａｄｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．７３：１３７４−１３８１、１９９９：１９９８年５月２２日出願の米国特許第０９／０８３、７９３号；１９９７年５月２３日出願の米国暫定特許第６０／０４７，５７５号（国際公告ＷＯ９８／５３０７８号に対応）および１９９７年９月１９日出願の米国暫定特許第６０／５９、３８５号、それぞれここに援用する）。これによりこのワクチン候補の弱毒化、温度感受性（ｔｓ）および／または低温適応フェノタイプに寄与する突然変異体の同定が行える。これらの突然変異体、およびその他ここに開示した組換えＰＩＶの修正物は、Ｃ、Ｄおよび／またはＶ ＯＲＦノックアウト突然変異体を持つ本発明の組み換えＰＩＶの弱毒化レベル、ならびに免疫抗原性、およびその他の所望のフェノタイプ的特性を調整するための有用な補助突然変異体である。
【０１５７】
Ｐ位置内にコードされている可能性のあるその他の二つのタンパクはＶとＤタンパクである。ＨＰＩＶ−１をのぞき、すべてのＲｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓｅｓ、およびＲｕｂｕｌａｖｉｒｕｓｅｓは無傷のＶ ＯＲＦを含有している。Ｖ ＯＲＦのシステインリッチＣ末端部分はＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ中のＰ遺伝子のもっとも保存されているＯＲＦであり、ＨＰＩＶ１とＨＰＩＶ３を除くこれらすべてのウイルス中で発現されているようである。ＨＰＩＶ３はＶ ＯＲＦを含有するが、それがどのようにアクセスされるかについては不明であり、無傷で残っているという事実がそれが使用されていることを示唆している。ＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅのＶシストロンとは異なり、ＤタンパクはヒトおよびウシのＰＩＶ３に対してユニークである。Ｄタンパクは二つの非テンプレートＧ残基をＰ ｍＲＮＡの編集部位に挿入することによってアクセスでき、ＰのＮ−末端２４１アミノ酸がＤ ＯＲＦのＣ末端１３１アミノ酸と融合された融合タンパクを生成する。Ｄタンパクの機能については何も知られておらず、またＤをコードすることのできる編集ｍＲＮＡは検出されている（Ｇａｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８６：５４３−５５０、１９９２）が、ＨＰＩＶ３感染細胞またはビリオン中でＤタンパクはまだ同定されていない。この問題に取り組もうという試みの中で、我々はＤ ＯＲＦによりコード化されている６１のアミノ酸を含有する切断融合タンパクを発現する、３つの連続する停止コドンをＤ ＯＲＦ中に持つ組換えＨＰＩＶ３突然変異体を回収した。ＤまたはＶ ＯＲＦノックアウト突然変異を単体で持つ組換え体はいずれも生体外または生体内において複製を大きく制限することはなかった。しかしこれらの突然変異はそれにも関わらずＰＩＶワクチン候補株の開発にきわめて有用である。これは、ＶおよびＤ ＯＲＦの両方に複数の停止コドンを作り出すために、二組の突然変異を組み合わせることによって、ＶとＤの組み合わせノックアウト突然変異体の回収が成功裏に行われることから明らかである。この突然変異体、ｒＤＶ−ＫＯと呼ぶ、はハムスターの下気道中およびＡＧＭの上気道および下気道中で複製が制限された。Ｐ ＯＲＦは導入された突然変異による影響を受けていないため、我々の観察したフェノタイプはＶならびにＤ活性の欠損を反映していると想定するのが道理であろう。ｒＤＶ−ＫＯの複製は生体内において弱められていたが、細胞培養中での複製は本質的に変化していなかった。これらの結果は、野生型ＨＰＩＶ３のＤおよびＶタンパクは発現されているが、両者の機能は停止されており、それによりｒＤＶ−ＫＯが生体内で弱められたフェノタイプを示すのであるという、納得できる証拠を提供する。これらのタンパクが互いに分子レベルで相互作用を行い生体内での複製に影響を与えているということも考えられる。
【０１５８】
上述の発明は明瞭な理解を行うための説明として詳細に記載したが、制限のためではなく解説のために提示している付属の特許請求の範囲内で、ある種の変更や修正が行えることは当業者にとっては明白であろう。
【０１５９】
微生物預託情報
下記の物質はブダペスト条約の条件のもと、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ２０１１０−２２０９に下記の番号で預託されている。
プラスミド                  受け入れ番号              預託日
ｐ３／７（１３１）        （ＡＴＣＣ９７９９０）    １９９７年４月１８日
ｐ３／７（１３１）２Ｇ    （ＡＴＣＣ９７９８９）    １９９７年４月１８日
ｐ２１８（１３１）        （ＡＴＣＣ９７９９１）    １９９７年４月１８日
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１はＨＰＩＶ３  Ｐ／Ｃ／Ｄ／ＶのＯＲＦの構成を示す（縮尺図ではない）。ＰのｍＲＮＡの３つの読みとり枠はＰ、Ｃ、Ｄにより（＋１，＋２及び＋３）、そしてＶのＯＲＦは長方形で示されている。アミノ酸長が示されている。ＲＮＡ編集部位の位置は縦線にて示されており、その配列モチーフはが示されており、完全なＨＰＩＶの抗原性配列に於けるそのヌクレオチド位置に従い番号がふられている。パネルＡは未編集のＰのｍＲＮＡの配置を詳細に示している。Ｐ及びＣのＯＲＦの翻訳開始部位を含む配列が示されており、完全抗原性配列に従い番号がふられている。ＪＳ野生型クローンの完全抗原性配列に於けるＰ、Ｃ、Ｄ及びＶ  ＯＲＦのヌクレオチド位置は：Ｐは１７８４−３５９５；Ｃ、１７９４−２３９３；Ｄ、２４４２−２９０３；Ｖ、２７９２−３０６６である。ＰｍＲＮＡに対し、ＯＲＦを開始するＡＵＧは８０−８２の位置にある。パネルＢは編集部位に２個の非鋳型挿入体であるＧ残基（ＧＧ）を含むＰｍＲＮＡの編集版の構成を詳細示している。これは読みとり域を変化させ、その結果フレーム＋２内のＰのＯＲＦの上流端はフレーム＋３中のＤのＯＲＦと融合する様になる。得られたキメラ蛋白質は、ＤのＯＦＲによりコードされたＣ−末端側の１３１アミノ酸にＰのＯＲＦによりコードされたＮ−末端側の２４１アミノ酸が融合したものを含む。パネルＣは、パネルＢの編集版ＰｍＲＮＡに例示された、Ｃ、Ｄ及びＶのＯＲＦが中断された突然変異例の位置を示している。導入された停止コドンは四角中に縦線でしめされている。ＣのＯＲＦが変更され、コドン１はＭからＴに、そしてコドン７と２６が停止コドンに変化している。ＤのＯＲＦは変更され、ＤのＣ末端側の１３１アミノ酸にＰのＮ末端側２４１アミノ酸が融合したものを含む３７２アミノ酸長のキメラＤ蛋白質に従って番号を付した場合のコドン３０４、３０５及び３０６に停止コドンが誘導された。ＶのＯＲＦは変更され、コドン１７と２０に停止コドンが導入された。これら後者２例の変異体はＤのＯＲＦのコドン３５４と３５７にアミノ酸置換を生じた（星印）。
【図２】  図２はＣ蛋白質の発現がウイルスｒＣ−ＫＯにて排除されていることを示す放射免疫沈降アッセイを提供する。レーン（ａ）：３５Ｓ−標識細胞溶解物がポリクローナル性Ｃ特異的ウサギ抗血清により免疫沈降された。Ｃ蛋白質に相当する２２ｋＤのバンド（白抜き矢印）はｒＪＳには明瞭に存在するが、レーン（ａ）のｒＣ−ＫＯには認められない。レーン（ｂ）：細胞溶解物はＨＰＩＶ３ＨＮ蛋白質に特異的な２種類のモノクローナル抗体の混合物により免疫沈降した。ＨＮ蛋白質に相当する６４ｋＤのバンド（黒矢印）はいずれのウイルス溶解物中にも存在しており、それらがＨＰＩＶ３を有し同レベルに蛋白質を発現していることが確認された。
【図３】  図３は例示のノックアウト突然変異体ｒＣ−ＫＯ及び親ウイルスであるｒＪＳと比較したｒＤＶ−ＫＯの多数回複製の結果を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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