(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
0004643906.tif 000027
（式中、ＮおよびＮ′は、互いに相補的な天然に存在する、または天然に存在しないヌクレオチドであり、ヌクレオチド鎖(Ｎ′)yは、標的遺伝子またはそれに対応するＲＮＡに対して相補的な非コーディング鎖であり、
ｘおよびｙは、互いに独立して、２１〜１００であり、
ｎは、独立して、４〜２０であり、
ｍは、独立して、０〜２０であり、
ｐは、独立して、０〜１０であり、
ＷおよびＺは、３′５′または２′５′インターヌクレオシド結合を介して結合した天然に存在する、または天然に存在しないヌクレオチドであり、
Ｌｉは、２つのヌクレオチド鎖を共有結合させるリンカーであり、
少なくとも２つの残基ＺまたはＷは、２′５′インターヌクレオシド結合を介して結合され、一本鎖形態で存在する）
で示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
ｘおよびｙが互いに独立して２１〜４５である、請求項１に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
ｘおよびｙが互いに独立して２１〜２５である、請求項２に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
ｎが４〜１０である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌク
レオチド。
【請求項５】
ｎが４〜６である、請求項４に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
ｍが０〜１０である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
ｍが０〜６である、請求項６に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
ｍが０である、請求項７に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
ｘとｙとが等しく、そしてｎが４〜６である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
ｐが０〜５である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
ｐが０である、請求項１０に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
相同標的ＲＮＡが、以下の配列パターン：
５′−(Ｕ)v−(Ｎ)z−(Ｕ)w
５′−(Ｕ)v−(Ｎ)z−ＵＸ
５′−ＵＸ−(Ｎ)z−ＵＸ、および、
５′−(Ｕ)v−(Ｎ)z
（式中、ｖは独立して２〜２０であり、ｗは独立して２〜２０であり、ｚは独立して１５〜２５であり、Ｕはウリジンであり、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＵであり、ＸはＡ、ＧまたはＣである）
のいずれか１つを有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
ｖが２〜１０である、請求項１２に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
ｖが２〜６である、請求項１２または１３に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
ｗが２〜１０である、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
ｗが２〜６である、請求項１５に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
ｚが１６〜２３である、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
ｚが１９〜２１である、請求項１７に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
Ｚがアデノシンまたは３′−デオキシアデノシンである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
１またはそれ以上の天然ホスホジエステル結合が、ヌクレアーゼ分解に対して安定な非天然のインターヌクレオチド結合で置換された、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の
式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
１またはそれ以上の天然ホスホジエステル結合が、ホスホロチオエート結合で置換された、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
複数の天然ホスホジエステル結合が、ホスホロチオエート結合で置換され、この改変は末端および内部ピリミジンヌクレオチドに位置する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
ＬｉがヌクレオチドＮである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
Ｌｉが非ヌクレオチドリンカーである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
初めに標的遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドを調製し、このオリゴヌクレオチドを細胞に導入し、この細胞をインキュベートし、次に、コントロール細胞中の対応するｍＲＮＡまたは対応する遺伝子産物の量を比較測定することにより、標的遺伝子の遺伝子発現の阻害を測定する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の１またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを用いてインビトロの細胞での標的遺伝子の遺伝子発現を抑制する方法。
【請求項２６】
２′５′−オリゴアデニレートシンターゼが、コントロール細胞に比べて低く発現されるか、または不完全である、請求項２５に記載の、細胞での標的遺伝子の遺伝子発現を抑制する方法。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、ならびに、医薬を製造または処方するための添加剤および／またはキャリアーを含む医薬。
【請求項２８】
腫瘍治療で使用するための、請求項２７に記載の医薬。
【請求項２９】
感染症の治療または予防で使用するための、請求項２７に記載の医薬。
【請求項３０】
ウイルス性疾患の治療または予防で使用するための、請求項２７に記載の医薬。
【請求項３１】
炎症または喘息の治療で使用するための、請求項２７に記載の医薬。
【請求項３２】
心臓血管性疾患または代謝性疾患の治療で使用するための、請求項２７に記載の医薬。
【請求項３３】
新規の治療用標的遺伝子を同定または確認するための、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項３４】
作物保護研究において、新規の標的遺伝子を同定または確認するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項３５】
初めに、オリゴヌクレオチドを溶液中または固相で、連続カップリングまたはブロックでのカップリングにより調製し、調製後に単離および精製することを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを調製する方法。
【請求項３６】
請求項３５に記載のオリゴヌクレオチド誘導体を調製し、さらなる添加剤および／またはキャリアーと混合する、医薬を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも部分的に二本鎖であり、少なくとも１つの３′末端に２′５′−結合オリゴヌクレオチド残基を有する新規のオリゴヌクレオチド誘導体、および、遺伝子発現の特異的阻害に関するそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
合成核酸を用いて遺伝子発現を阻害することがますます重要になりつつある。これら合成核酸（オリゴヌクレオチド）の典型的な代表例としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡ酵素および外部ガイド配列（ＥＧＳ）がある。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、ワトソン−クリック塩基対を介して相補メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）に結合し、その対応するタンパク質への翻訳を阻害する短い一本鎖核酸誘導体のことである。ほとんどの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞性リボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）によりサポートされるメカニズムに従った作用を示し、多数の研究でこれに関する証拠が示されている。全ての細胞に存在するＲＮアーゼＨは、二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを認識し、１つのホスホジエステル結合、またはほとんどの場合において２以上のホスホジエステル結合を加水分解することにより、前記オリゴヌクレオチドに相補的なｍＲＮＡを切断する。ＲＮアーゼＨの活性化が起こるようにオリゴヌクレオチドを改変する方法が知られており、例えば、Uhlmann（2000）Curr．Opin
．Drug Discov．Dev．3，203-213に説明されている。合成リボザイムは、その配列中にこのヌクレアーゼ活性を有する。最も一般的なタイプのリボザイムは、「ハンマーヘッド型」リボザイムであり、これは、天然に存在するリボザイムから誘導されたコンセンサス配列ＧＡＡＡＣがＲＮアーゼ部分を形成し、フランキング配列がアンチセンスオリゴヌクレオチド部分を形成する。しかしながら、天然に存在するリボザイムモチーフから誘導されていないが、インビトロでの選択で発見されたＤＮＡ酵素が、同様に作用する。ＥＧＳは、細胞性ＲＮアーゼＰを活性化し、適切なフランキング配列を介して標的ｍＲＮＡに結合し、特異的ｍＲＮＡ分解を誘導する合成ＲＮＡ類似体である。上述した全てのオリゴヌクレオチド誘導体は、ＲＮＡ結合部分が一本鎖であり、標的ｍＲＮＡとの相互作用により配列特異的な方法で遺伝子発現を阻害するように用いられる。
【０００３】
また、転写因子の結合領域を模倣した「デコイ」（decoy）オリゴマーを用いて特定の
タンパク質と相互作用することによって遺伝子発現を阻害することも可能である。デコイ物質を用いた処理により、配列特異的な方法で特定のタンパク質、特に転写因子を妨害し、それにより転写活性化を妨げることが可能になる。
【０００４】
最後に、ＤＮＡレベルで作用するオリゴヌクレオチド誘導体がある。このオリゴヌクレオチド誘導体としては、三重鎖形成オリゴヌクレオチド（アンチジーンオリゴヌクレオチド）が挙げられる。「アンチジーンオリゴヌクレオチド」は、フーグスティーン型塩基対を介してＤＮＡ二重らせんの主溝（large groove）で結合して三重らせんを形成し、それにより遺伝子転写の配列特異的阻害を起こす。細胞内で作用するオリゴヌクレオチド誘導体の他のグループであるキメラプラストは、特異的遺伝子の補正に用いられる。
【０００５】
合成オリゴヌクレオチドを用いる遺伝子発現の阻害に関する共通の問題は、有効な配列を同定するために、標的核酸の様々な領域に対する相当数のオリゴヌクレオチドを常に分析する必要があることである。その上、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば、非効率的または不完全にしか遺伝子発現を阻害できない。その上、配列非特異的な副作用が観察されており、これは、約５塩基の長さの比較的短い部分配列でもＲＮアーゼＨを活性化するという事実により引き起こされるのかもしれない。これは例えば、「Woolf et a
l．(1992）．Proc．Natl．Acad．Sci U．S．A．89．7305-7309」で示される。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドとタンパク質との相互作用により生じる副作用も存在する。
【０００６】
近年、遺伝子発現の抑制に二本鎖ＲＮＡを使用することが説明されている。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）とは、特定の細胞および生物においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスに従ったｍＲＮＡの配列特異的分解を誘導するシグナルである。ＲＮＡｉ現象は、多数の異なる生物、例えば、C．elegans、ハエ、菌類、植物およびマウス胚などで観察されている。ＲＮＡｉは、植物で発見された転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）と非常に類似しているか、または同一であると考えられている。５００塩基対（ｂｐ）を超過する長さのｄｓＲＮＡ（そのセンス鎖配列は阻害しようとする標的ｍＲＮＡと同一である）を単に注射することにより、対応するＤＮＡ配列を有する標的遺伝子の発現を特異的に阻害することができる。これは、非相同遺伝子の発現を損なわず、標的遺伝子の塩基配列は改変されない。ＲＮＡｉは、ｄｓＲＮＡがまず比較的小さい断片に分解され、続いてその断片が標的ｍＲＮＡの配列特異的分解に用いられると推測される転写後プロセスである。二本鎖ヌクレアーゼ活性に加えて、ＡＴＰ依存性ヘリカーゼ活性も議論されている。しかしながら、このプロセスの詳細なメカニズムはわかっていない。植物における研究によれば、約２５個のヌクレオチド長の小さいｄｓＲＮＡ断片がＲＮＡｉの「活性種」を代表しており、この断片が標的ＲＮＡの配列特異的な認識を細胞性リボヌクレアーゼに移すことが示されている。
【０００７】
ｄｓＲＮＡにより遺伝子発現を抑制する効率は、前記ｄｓＲＮＡの断片長が減少するほど徹底的に低下する。従って、４００〜５４０ｂｐのｄｓＲＮＡは非常に効果的に遺伝子発現を阻害するが、一方で、２００〜３００ｂｐのｄｓＲＮＡはそれほど効率的ではなく、５０〜１００ｂｐのｄｓＲＮＡは少しも効果がないことが見出された。ごく最近、結局のところ、長さが２６〜８１ｂｐの小さいｄｓＲＮＡ断片がＲＮＡｉ様プロセスを生じさせることができることが見出された。しかしながら、観察された阻害は、長いｄｓＲＮＡ断片の場合よりも実質的に弱いようである。７１７ｂｐのｄｓＲＮＡにより生じる阻害が、長さが２００ｂｐ未満のｄｓＲＮＡによる阻害よりも非常に顕著であった。２６ｂｐのｄｓＲＮＡの活性は、８１ｂｐのｄｓＲＮＡよりも約２５０倍低かった。その上、異なる２７ｂｐのｄｓＲＮＡが全く不活性であったことから、阻害は配列依存性であった。
【０００８】
Elbashir et al．Nature（2001）411，494によれば、２１個のヌクレオチドを含む二本鎖ＲＮＡによる細胞培養中での遺伝子発現阻害が説明されている。対応するｄｓＲＮＡ分子は、両方の鎖の３′末端に、ウラシルまたはチミン塩基のいずれかを有する２つの３′５′−結合ヌクレオチドのオーバーハングを有する。著者等はまた、２′５′−オリゴアデニレート活性化リボヌクレアーゼプロセスにより、標的ＲＮＡの内因性の配列非特異的分解が生じることを特筆している。しかしながら、阻害がうまくいくかどうかは用いられる細胞系に強く依存するという明らかな不利益がある。
【０００９】
これまでに、主に長さが１００ｂｐを超えるｄｓＲＮＡを用いて遺伝子発現を効率的に阻害していた。この比較的長いｄｓＲＮＡは、対応するＤＮＡからの適切な転写系を介したインビトロまたはインビボ転写によってのみ利用可能である。長いｄｓＲＮＡを用いるＲＮＡｉのその他の制限は、C．elegans、ゼブラフィッシュ、植物、特定のタイプの菌類、ショウジョウバエ、マウスの卵母細胞および胚のような特定の生物でのみｄｓＲＮＡによる配列特異的阻害が可能であり、一方で、ほとんどの動物細胞は、ｄｓＲＮＡで処理するとアポトーシスを起こすということである。長いｄｓＲＮＡでも、配列相同性が７０〜９０％である場合は遺伝子発現を阻害する。この理由のために、高い配列相同性を有する遺伝子ファミリーの場合、複数の完全に相同ではない遺伝子の発現を同時に阻害することにより、表現型の誤訳（misinterpretation）を起こすことが可能である。
【００１０】
ｄｓＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡウイルスを用いた細胞の処理は、一般的に、アポトーシスプロセス、または、２′５′−オリゴアデニレート−シンターゼ活性の誘導によるｍＲＮＡの配列非特異的分解を生じさせる。感染した細胞は、ウイルスのｄｓＲＮＡに反応して、異常な２′５′−ホスホジエステル−インターヌクレオシド結合を有する三量体または四量体アデニレート（２′５′−Ａ）を合成する。２′５′−Ａは、その５′末端で細胞性キナーゼによりリン酸化され、続いてＲＮアーゼＬと呼ばれるヌクレアーゼを活性化する。また、２′５′−Ａを化学合成し、細胞に導入することもできる（Torrence et al．(1994）Curr．Med．Chem1，176-191）。しかしながら、合成２′５′−Ａは、それらが５′−リン酸または５′−三リン酸型に変換された場合にのみＲＮアーゼＬを活性化する。続いて、５′−ｐ−２′５′−Ａ（ｐは、リン酸、二リン酸または三リン酸）により活性化されたＲＮアーゼＬは、配列非特異的な方法で細胞の全てのＲＮＡを分解する。加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドと５′−ｐ−２′５′−Ａ残基との結合体により、遺伝子発現を配列特異的に阻害することが可能であることが示された。しかしながら、この目的に関して、２′５′−Ａ残基の５′末端は、オリゴヌクレオチドに結合するのではなく、リン酸または三リン酸として存在することが必須である（Torrence et al．(1993）Proc．Natl．Acad．Sci．U. S. A．90，1300-4）。その上、標的ＲＮＡが認識するオリゴヌクレオチド部分（アンチセンス部分）は、一本鎖形態でなければならない。上述した理由のために、結果として遊離の５′−リン酸または三リン酸機能を有さない２′５′−Ａ残基をそれらの３′末端に有するオリゴヌクレオチドは、これまで、遺伝子発現の阻害剤として説明されていない。一本鎖の５′−リン酸化５′−ｐ−２′５′−Ａアンチセンスオリゴヌクレオチド結合体による遺伝子発現の阻害は、アンチセンス原理のバリエーションであり、それゆえに、アンチセンス−オリゴヌクレオチドアプローチの制限にもさらされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
近年、新しい遺伝子の機能研究（機能ゲノミクス）のためのツールとして、オリゴヌクレオチドがますます用いられつつある。未知の機能を有するタンパク質をコードする新しい遺伝子の遺伝子発現を配列特異的に阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの使用は、一般的に、配列が異なる多種多様なオリゴヌクレオチドを分析しなければならないためにより困難になり、これは、特にハイスループットプロセスにおいて不利である。
【００１２】
それゆえに、本発明の目的は、通常の方法および薬剤の上述の制限を回避する、顕著に改善された遺伝子発現の阻害が可能な新規の化学修飾されたオリゴヌクレオチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明によれば、この目的は、少なくとも部分的に二本鎖であり、少なくとも１つの３′末端に２′５′−結合オリゴヌクレオチド残基を有する新規のオリゴヌクレオチド誘導体によって達成される。新規のオリゴヌクレオチド誘導体の配列は、１つの鎖において、ＲＮＡ配列（その翻訳が阻害され得る）に相補的であり、他方の鎖において、阻害され得るＲＮＡに対応する。従って、ＲＮＡ二本鎖は、遺伝子（その発現が阻害され得る）の塩基配列に対応し、ここで、デオキシリボヌクレオチドが対応するリボヌクレオチドで置換され、チミジンがウリジンで置換される。
【００１４】
従って、本発明は、式Ｉで示される二本鎖核酸誘導体を提供する。
【化１】
0004643906.tif 000002
式中、ＮおよびＮ′は、少なくとも部分的に互いに相補的な天然に存在する、または天然に存在しないヌクレオチドであり、少なくとも１つのヌクレオチド鎖(Ｎ)xまたは(Ｎ′)yは、標的遺伝子またはそれに対応するＲＮＡに対して相補的または部分的に相補的であり、
ｘおよびｙは、互いに独立して、１０〜１００、好ましくは１５〜４５、特に好ましくは１６〜２５であり、
ｎは、０〜２０、好ましくは２〜１０、特に好ましくは３〜６であり、
ｍは、０〜２０、好ましくは２〜１０、特に好ましくは３〜６であり、
ｐは、０〜２０、好ましくは０〜５であり、
ＷおよびＺは、３′５′または２′５′インターヌクレオシド結合を介して結合した天然に存在する、または天然に存在しないヌクレオチドであり、
Ｌｉは、２つのヌクレオチド鎖を共有結合させるリンカーであり、
少なくとも２つの残基ＺまたはＷは、２′５′インターヌクレオシド結合を介して結合され、一本鎖形態で存在し、ｍおよびｎは同時に０ではない。
【００１５】
好ましくは、相同標的ＲＮＡが以下の配列パターンである式Ｉで示されるオリゴヌクレオチドである：
５′−(Ｕ)v−(Ｎ)z−(Ｕ)w
５′−(Ｕ)v−(Ｎ)z−ＵＸ
５′−ＵＸ−(Ｎ)z−ＵＸ、および、
５′−(Ｕ)v−(Ｎ)z
式中、ｖおよびｗは、互いに独立して、２〜２０、好ましくは２〜１０、特に好ましくは２〜６であり、
ｚは１５〜２５、好ましくは１６〜２３、特に好ましくは１９〜２１であり、
Ｕはウリジンであり、ＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＵであり、ＸはＡ、ＧまたはＣであり、好ましくはＡである。
【００１６】
発現が阻害され得る遺伝子が、例えば、以下のＤＮＡ配列：
５′−ＴＴＴＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＴＧ（配列番号１）
または、以下のＲＮＡ配列：
５′−ＵＵＵＵＧＡＡＧＣＧＡＡＧＧＵＵＧＵＧＧＡＵＣＵＧ（配列番号２）
を含む場合、標的ＲＮＡは、以下の配列パターン：
５′−（Ｕ）v−（Ｎ）z−ＵＸ
（式中、ｖは４であり、ｚは１９であり、ＸはＧである）を有する。
【００１７】
その上、好ましくは、１またはそれ以上のホスホジエステル結合が、例えばホスホロチオエート結合またはＮ３′，Ｐ５′−ホスホロアミデート結合で置換された式Ｉで示されるオリゴヌクレオチドである。特に好ましくは、１またはそれ以上のホスホジエステル結合がホスホロチオエート残基で置換された式Ｉで示されるオリゴヌクレオチドである。特に、いくつかのピリミジンヌクレオチドが配列中で互いに連続する場合、ホスホロチオエート残基は、好ましくは、３′末端、５′末端ならびに内部ピリミジンヌクレオチドＣおよびＵに導入される。ホスホロチオエート残基は、上部または下部の鎖に、好ましくは両方の鎖に導入することができる。
【００１８】
本発明の特定の実施形態は、遺伝子発現を抑制するための、２またはそれ以上の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド誘導体の混合物の使用を含む。この場合におけるオリゴヌクレオチド誘導体は、ＲＮＡの異なる領域に対して、または、異なる遺伝子のＲＮＡに対して向けられていてもよい。
【００１９】
驚くべきことに、少なくとも１つの末端に２′５′−結合オリゴアデニレート残基を有する部分的に二本鎖の核酸が、３′５′−結合ヌクレオチドのみを含む二本鎖ＲＮＡよりもかなり強く遺伝子発現を阻害することが見出された。また、２′５′−結合オリゴアデニレート残基を有する二本鎖ＲＮＡ断片は、２′５′−結合オリゴアデニレート残基を有する対応する一本鎖よりも活性であった。通常は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびセンスオリゴヌクレオチドは互いの作用を相殺するので、これは驚くべきことである。その他の驚くべきことは、２′５′−結合オリゴアデニレート残基は、その活性を示すために、５′−リン酸または５′−三リン酸残基を有する遊離末端を有さなくてもよいことである。また、２′５′−結合オリゴアデニレート残基が、５′機能を介して３′５′−結合ＲＮＡに直接結合できることは全く驚きである。驚くべきことに、コーディング鎖中の２′５′−Ａ残基は、２′５′−Ａ残基が非コーディング鎖中に存在する間は二本鎖の活性に対して非常にわずかなプラス効果しか有さなかった。驚くべきことに、下部の鎖に４〜６塩基のオーバーハングした末端を有する二本鎖ＲＮＡは、２つのオーバーハングした塩基しか有さないものよりずっと活性である。一般的に、活性な配列を得るために複数の配列（例えば１０〜１００）を分析しなければならないアンチセンスオリゴヌクレオチドとは対照的に、驚くべきことに、全ての分析された式Ｉで示される二本鎖オリゴヌクレオチドは、それらが対応する遺伝子配列に相同である場合、阻害活性であった。驚くべきことに、２′５′−結合オリゴヌクレオチドとの内因性の非特異性は、ともに観察されなかった。これまでに、二本鎖ＲＮＡを介した２′５′−活性阻害は常に、非特異的、すなわち配列非依存性な効果と関連づけられてきた（Bass，Nature（2001）411，428）。
【００２０】
塩基対を形成しない２つの２′５′−(Ａ)4−オリゴヌクレオチドの混合物は、二本鎖
分子よりも効果が低い。その上、式Ｉで示される化合物は、それらの配列が標的ＲＮＡに完全に相同ではない場合、効果が低いか、または効果がない。
【００２１】
驚くべきことに、本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ヒトの初期細胞において阻害の配列特異的な効果も有していた。我々が知る限り、ヒトの初期細胞中の二本鎖オリゴヌクレオチドによる遺伝子発現の阻害は、これまで観察されていない。これに関して、二本鎖ＲＮＡの１つの鎖のみがオーバーハングした末端を有していなければならないということは、同様に意外であった。
【００２２】
本発明に係る式Ｉで示されるオリゴヌクレオチドは、わずかな量の異常な２′５′−オリゴアデニレートシンターゼしか発現しない細胞、または２′５′−オリゴアデニレートシンターゼを全く発現しない細胞において遺伝子発現を抑制することに用いることもできる。２１個のヌクレオチドを有する記載されたｄｓＲＮＡ分子は（Elbashir et al．Nature（2001）411,494）、このような特性を有さない。
【００２３】
その上また、２′５′−オリゴアデニレートシンターゼの欠陥または異常を有する患者を治療するために式Ｉで示されるオリゴヌクレオチドを用いることも可能である。例えばＣＦＳ（慢性疲労症候群）の患者を治療することもできる。
【００２４】
特定の標的の遺伝子発現を抑制するのに用いられる二本鎖核酸の配列は、対応する遺伝子配列に基づき選択される。前記遺伝子の配列は、配列解析により、または、遺伝子データベースから得られる。本明細書で説明され得る例は、二本鎖核酸によるルシフェラーゼ（ホタル）の阻害である。この遺伝子の登録番号はＵ４７２９８である。ホタルルシフェ
ラーゼのコーディング領域は、１６５３個のヌクレオチドを含む。以下の４つの領域を、二本鎖核酸による阻害に関する標的配列として特に選択することができる。
【００２５】
【化２】
0004643906.tif 000003
【００２６】
従って、これら領域に対応する二本鎖ＲＮＡは以下の配列を有する。
【化３】
0004643906.tif 000004
【００２７】
それらから得られた本発明に係る二本鎖核酸は、例えば、以下に列挙された配列を有し
、少なくとも１つの鎖において、２またはそれ以上のヌクレオチド（本明細書においては小文字で示される）が、２′５′インターヌクレオシド結合を介して結合されることを特徴とする。オーバーハングした末端は、標的ＲＮＡに相補的でなくてもよい。数字はＲＮＡ上の領域を示し，ｕｐは、上部の（コーディング）鎖を意味し、ｌｏは、下部の（非コーディング）鎖を意味する。好ましくは、２′５′−結合アデニレート残基である。式Ｉにおいてｐが０の場合、２つの鎖は、水素結合を介してのみ共に結合される。
【００２８】
【化４】
0004643906.tif 000005
【００２９】
しかしながら、該オリゴヌクレオチドはまた、例えば、下部の鎖に６個のオーバーハングしたヌクレオチドを有してもよく、これらは部分的または完全に２′５′−結合である。
【００３０】
【化５】
0004643906.tif 000006
【００３１】
二本鎖オリゴヌクレオチドの鎖の構造の例を以下に示す：
【化６】
0004643906.tif 000007
【００３２】
生物活性を試験するために、以下のオリゴヌクレオチドを調製し、必要に応じて二本鎖にハイブリダイズさせ、分析混合物におけるルシフェラーゼ活性の阻害について試験することができる。
【００３３】
【化７】
0004643906.tif 000008
【００３４】
他の種の細胞、特にヒトの初期細胞において本発明のオリゴヌクレオチドが遺伝子発現を抑制することに用いることもできることを示すために、本発明の化合物を、例えば、ヒト遺伝子またはそれに対応するＲＮＡに対して向けることができ、ヒト細胞（ＨＵＶＥＣ、ヒト臍帯静脈内皮細胞）で分析することができる。これに関して、遺伝子データベースからのＥｄｇ−１のＤＮＡ（登録番号Ｍ３１２１０）を、例えば、対応する二本鎖ＲＮＡに転写することができ、以下の２つの領域（１７５および７２５）を、適切なオリゴヌクレオチドを合成するために選択することができる。
【００３５】
Ｅｄｇ−１ＲＮＡ：
【化８】
0004643906.tif 000009
【００３６】
対応するオリゴヌクレオチドの可能な構造の例を以下に示す：
【化９】
0004643906.tif 000010
【００３７】
数字はＥｄｇ−１のＲＮＡ上の領域を示し、ｕｐは、上部の（コーディング）鎖を意味し、ｌｏは、下部の（非コーディング）鎖を意味する。ミスマッチコントロールは、完全に対になった二本鎖を形成するが、５個のヌクレオチドがｅｄｇ−１のＲＮＡとは異なる（ミスマッチとして下線で示した）。ＦＩＴＣは、市販の蛍光マーカーである。
【００３８】
その上、改善されたヌクレアーゼ安定性と増加した阻害活性を有し、上記のｅｄｇ−１配列から誘導されたｅｄｇ−１に対して向けられた以下のオリゴヌクレオチドが調製された。
【００３９】
【化１０】
0004643906.tif 000011
【００４０】
本発明の他の実施形態は、２′５′−結合のオーバーハングした残基を１つの鎖、好ましくは非コーディング鎖のみに有し、２つの鎖が１またはそれ以上の共有結合で共に結合された二本鎖オリゴヌクレオチドを用いる。この共有結合の可能な例は、(Ｌｉ)p型のリ
ンカーである。
【化１１】
0004643906.tif 000012
【００４１】
例えば、２つの核酸鎖は、複数のヌクレオチド残基、好ましくは４〜５個のヌクレオチド残基を介して共に結合することができる（ＬｉはＮ、好ましくはチミジンであり、ｐは４〜２０、好ましくは４または５である）。
【化１２】
0004643906.tif 000013
【００４２】
塩基が失われた（abasic）リンカーの場合において、分子は、例えば、以下の式を有する：
【化１３】
0004643906.tif 000014
【００４３】
しかしながら、２つの鎖はまた、非ヌクレオチド残基を介して共に結合されてもよい。適切な非ヌクレオチドリンカーの例としては、１またはそれ以上のオリゴエチレングリコールリン酸残基、好ましくはトリ−およびヘキサエチレングリコールリン酸残基が挙げられる。その他のリンカーの例としては、アルカンジオールリン酸、好ましくはプロパン−１,３−ジオールリン酸、ブタン−１,４−ジオールリン酸、および、ドデシル−１,１２−ジオールリン酸が挙げられる。さらなるリンカーの例としては、一般的に、３′−Ｏ、５′−Ｏ−で結合した塩基が失われた（abasic）１′,２′−ジデオキシリボースユニットが挙げられる。合成に必要なリンカー試薬は、大抵は市販されている（例えば、スペーサー９、スペーサー１８、スペーサーＣ３、スペーサーＣ１２、ｄスペーサー（塩基が失われた）、Glen Research，Sterling，VAより）。リンカーはまた、例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドの細胞の摂取を増す、生物学的利用能を増す、ヌクレアーゼ安定性を増す、または、生物活性を増すことができる官能基を取り込むことも可能である。その上、例えば蛍光マーカーまたはビオチンマーカーを標識するための基をリンカーに取り込ませることも可能である。
【００４４】
２つの鎖を結合させるためのリンカーのその他の例としては、ジスルフィド架橋（−Ｓ−Ｓ−）またはピロチオリン酸架橋（−（Ｏ3）−Ｐ−Ｓ−Ｓ−Ｐ（Ｏ3）−）が挙げられる。
あるいは、親油性もしくはイオンの相互作用を介して、または、水素結合を介して、非共有結合により二本鎖を共に結合させることができる。
【００４５】
ルシフェラーゼ発現の阻害の特異性は、標的ＲＮＡに完全に相同ではなく、例えば２または４個の塩基のミスマッチを有する二本鎖コントロールオリゴヌクレオチドに基づき調べられた。その他のコントロールオリゴヌクレオチドは、オーバーハングした末端に応じて変化させる。
【００４６】
【化１４】
0004643906.tif 000015
【００４７】
例えば、ホスホロチオエート（星印）または２′Ｏ−メチルリボヌクレオチド（下線）のいずれかの改変を上部もしくは下部の鎖または両方の鎖に有する以下のオリゴヌクレオチドが調製された。
【化１５】
0004643906.tif 000016
【００４８】
本発明に係る式Ｉで示される核酸誘導体は、オリゴヌクレオチドから合成される。例えば、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドアデノシンホスフェート、グアノシンホスフェート、イノシンホスフェート、シチジンホスフェート、ウリジンホスフェート、および、チミジンホスフェートから完全に合成することができる。好ましくは、リボヌクレオチドから合成されたオリゴヌクレオチド、「オリゴリボヌクレオチド」である。本発明の他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、１またはそれ以上の修飾、例えば化学修飾を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、複数の同一および／または異なる修飾を有してもよい。
【００４９】
化学修飾の例は当業者既知であり、例えば、以下で説明されている：E．Uhlmann and A．Peyman，Chemical Reviews 90（1990）543  and“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques，S．Agrawal，Ed，Humana Press，Totowa，USA 1993，J．Hunziker and C．Leumann‘Nucleic Acid Analogs：Synthesis and Properties’in Modern Synthetic Methods（Ed．Beat Ernst and C．Leumann）Verlag Helvetica Chimica Acata，Basle，p.331−417，RP lyer et al．Curr  Opin Mol Therap（1999）1：344−358；S．Verma and F．Eckstein，Annu Rev Biochem（1998）67：99−134；JW Engels and E．Uhlmann：Chemistry of oligonucleotides．In：Pharmaceutical aspects of oligonucleotides．Couvreur P，Malvy C（Eds
），Taylor & Francis，London,（2000）：35−78。
【００５０】
オリゴヌクレオチドの化学修飾としては、例えば、以下が挙げられる：
ａ）例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ＮＲ1Ｒ1′ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、（Ｃ1〜Ｃ21）−Ｏ−アルキルホスフェート、［（Ｃ6〜Ｃ12）アリール−（Ｃ1〜Ｃ21）−Ｏ−アルキル］ホスフェート、（Ｃ1〜Ｃ8）アルキルホス
ホネートおよび／または（Ｃ6〜Ｃ12）アリールホスホネート架橋で、リン酸ジエステル
架橋を、完全または部分的に置換すること、ここで、
Ｒ1およびＲ1′は、互いに独立して、水素、（Ｃ1〜Ｃ18）アルキル、（Ｃ6〜Ｃ20）アリール、（Ｃ6〜Ｃ14）アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）アルキル、好ましくは水素、（Ｃ1〜Ｃ8
）アルキルおよび／またはメトキシエチル、特に好ましくは水素、（Ｃ1〜Ｃ4）アルキルおよび／またはメトキシエチルであり、または、
Ｒ1およびＲ1′は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、５〜６員環複素環（Ｏ、Ｓ、Ｎからなる群より選択された他のヘテロ原子をさらに含んでもよい）を形成する；
【００５１】
ｂ）完全または部分的に３′−および／または５′−リン酸ジエステル架橋を「デホスホ」架橋（例えば、Uhlmann，E．And Peyman，A．In“Methods in Molecular Biology”
，Vol．20，“Protocols for Oligonucleotides and Analogs”，S．Agrawal，Ed.，Humana Press，Totowa 1993，Chapter16，355ffで説明された）、例えば、ホルムアセタール、３′−チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム，メチレンジメチルヒドラゾ，ジメチレンスルホンおよび／またはシリル基で置換すること；
【００５２】
ｃ）部分的に糖リン酸主鎖を、例えば「モルホリノ」オリゴマーで置換すること（例えば、E.P．Stirchak et al.，Nucleic Acids Res．17（1989）6129、および、J．Summerton and D．Weller，Antisense and Nucleic Acid Drug Dev．7（1997）187−195 で説明された）、および／または、ポリアミド核酸（「ＰＮＡｓ」）で置換すること（例えば、P.E．Nielsen et al.，Bioconj．Chem．5（1994）3 で説明された）、および／または、ホスホモノエステル核酸（「ＰＨＯＮＡｓ」）で置換すること（例えば、Peyman et al.，Angew．Chem．Int．Ed．Engl．35（1996）2632−2638 で説明された）；
【００５３】
ｄ）例えば、β−Ｄ−２′−デオキシリボース、α−Ｄ−２′−デオキシリボース、Ｌ−２′−デオキシリボース、２′−Ｆ−２′−デオキシリボース、２′−Ｆ−２′−デオキシアラビノフラノース、２′−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルリボース、２′−Ｏ−（Ｃ2
〜Ｃ6）アルケニルリボース、２′−［Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ6）ア
ルキル］リボース、２′−ＮＨ2−２′−デオキシリボース、β−Ｄ−キシロフラノース
、β−Ｄ−アラビノフラノース、α−アラビノフラノース、２,４−ジデオキシ−β−Ｄ
−エリスロヘキソピラノース、立体構造的に制限された糖類似体（例えばＬＮＡなど）（Locked Nucleic Acids；Singh et al.，Chem．Commun．4（1998）455；Singh et al．Chem．Commun．12（1998）1247）、および、炭素環（例えば、Froehler，J．Am．Chem．Soc．114（1992）8320 で説明された）、および／または、開鎖した糖類似体（例えば、Vandendriessche  et  al.，Tetrahedron 49（1993）7223 で説明された）、および／または、ビシクロ糖類似体（例えば、M．Tarkov et al.，Helv．Chim．Acta 76（1993）481 
で説明された）で、部分的にβ−Ｄ−リボース単位を置換すること。２′−修飾オリゴヌクレオチド類似体は、Manoharan，Biochim．Biophys．Acta（1999）117 で詳細に説明さ
れ、立体構造的に制限されたオリゴヌクレオチド類似体は、Herdewijn，Biochim．Biopyhs．Acta（1999）167 で詳細に説明される；
【００５４】
ｅ）天然ヌクレオシド塩基を修飾し、それぞれ完全または部分的に、例えば、５−（ヒ
ドロキシメチル）ウラシル、５−アミノウラシル、プソイドウラシル、プソイドイソシトシン、ジヒドロウラシル、５−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルウラシル、５−（Ｃ2〜Ｃ6）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ2〜Ｃ6）アルキニルウラシル、５−（Ｃ1〜Ｃ6）アルキルシトシン、５−（Ｃ2〜Ｃ6）アルケニル−シトシン、５−（Ｃ2〜Ｃ6）アルキニルシトシン、５−フルオロウラシル、５−フルオロシトシン、５−クロロウラシル、５−クロロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ブロモシトシン、または、７−デアザ−７−置換プリンで置換すること。
【００５５】
複素環式の塩基修飾は、例えば、Herdewijn，Antisense & Nucl．Acid Drug  Dev．（2000）２９７に説明される。
その上、オリゴヌクレオチドの化学修飾は、オリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドの特性（例えばヌクレアーゼ安定性、標的配列に対する親和性、薬物動態学）に有利な影響を与える、および／または、改変オリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションの際に結合および／または架橋により前記標的配列に作用する１またはそれ以上の分子と結合することを含む（オリゴヌクレオチド結合体）。それらの例としては、ポリリジン、インターカレーター（例えばピレン、アクリジン、フェナジン、フェナントリジン）、蛍光性化合物（例えばフルオレセイン）、クロスリンカー（例えばソラレン、アジドプロフラビン）、親油性分子（例えば（Ｃ12〜Ｃ20）アルキル）、脂質（例えば１，２−ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール）、ステロイド（例えばコレステロールまたはテストステロン）、ビタミン（例えばビタミンＥ）、ポリ−またはオリゴエチレングリコール、（Ｃ12〜Ｃ18）アルキルリン酸ジエステル、および／または、−Ｏ−ＣＨ2−
ＣＨ（ＯＨ）−Ｏ−（Ｃ12〜Ｃ18）アルキルとの結合体である。このような分子は、５′および／または３′末端で、および／または、配列内で、例えば核酸塩基で結合させることができる。当業者既知のオリゴヌクレオチド結合体の例は、Manoharan（2001）Conjugated Oligonucleotideｓ in Antisense technology．In：Crooke（Editor）Antisense technology．Marcel Dekker．New York 中で説明される。
【００５６】
化学修飾の特定の実施形態は、オリゴヌクレオチドと、ａ）親油性分子、例えば（Ｃ12〜Ｃ20）アルキル、ｂ）ステロイド、例えばコレステロールおよび／またはテストステロン、ｃ）ポリ−および／またはオリゴエチレングリコール、ｄ）ビタミンＥ，ｅ）インターカレーター、例えばピレン、ｆ）（Ｃ14〜Ｃ18）アルキルリン酸ジエステル、および／または、ｇ）−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−Ｏ−（Ｃ12〜Ｃ16）アルキルとの結合に関す
る。
【００５７】
化学修飾の他の特定の実施形態は、アリールエステル結合体として、例えばＦＤＡ結合体としてＨＭＲ９９／Ｌ０４５で説明されたオリゴヌクレオチドの誘導体化に関し、該誘導体化は、前記オリゴヌクレオチドの細胞の摂取に有用である。
【００５８】
前記オリゴヌクレオチド誘導体を調製する方法は当業者既知であり、例えば、Uhlmann
，E．& Peyman，A.，Chem．Rev．90（1990）543、および／または、M．Manoharan in“Antisense Research and Applications”，Crooke and Lebleu，Eds.，CRC Press，Boca Raton，1993，chapter17，p.303ff、および／またはＥＰ−Ａ０５５２７６６に説明される。二本鎖は、例えば、前記２つの一本鎖の溶液を加熱し、続いて希釈緩衝液中で冷却することにより２つの一本鎖をハイブリダイゼーションさせて調製することができる。原則として、遺伝子合成に関して説明された方法を二本鎖調製に用いることができる（Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments（Editors：Gassen and Lang）Verlag Chemie，Weinheim（1982））。
【００５９】
本発明のさらに特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、その３′および／または５′末端で、３′−３′および／または５′−５′転位を有していてもよい。このタ
イプの化学修飾は当業者既知であり、例えば、M．Koga  et al.，J．Org．Chem．56（1991）3757 に説明される。
【００６０】
２′５′でオーバーハングした残基は、例えば、アデノシン、３′−デオキシアデノシン（コルディセピン）、イノシン、８−ブロモアデノシン、８−メチルアデノシン、およびその他の８−置換アデノシン誘導体を含み得る。リボース残基はまた、３′−Ｏ−メチルアデノシンとして誘導体化することができる。２′５′−オーバーハング部分におけるインターヌクレオシド結合は、好ましくはホスホジエステル結合、および、ホスホロチオエート結合である。２′５′−アデニレートの一般的な誘導体、ならびに、それらの合成およびＲＮアーゼＬ活性化は、文献（Ｐｌａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．７８，５５）に説明される。
【００６１】
さらに本発明は、オリゴヌクレオチドを調製する方法を提供する。説明されたオリゴヌクレオチドを様々な既知の化学法を用いて調製することができ、例えば、Eckstein，F．
（1991）“Oligonucleotides and Analogues，A Practical Approach”，IRL Press，Oxford に説明されたように調製することができる。必要に応じて1またはそれ以上の酵素的な工程を含む方法でオリゴヌクレオチドを調製することもできる。
【００６２】
その上、本発明は、特定の標的遺伝子の発現を調節するため、および、完全にまたは部分的に抑制するため、例えば、完全にまたは部分的に翻訳を抑制するための、オリゴヌクレオチドの使用を提供する。その上、本発明は、わずかな量の異常な２′５′−オリゴアデニレートシンターゼしか有さない細胞、または、２′５′−オリゴアデニレートシンターゼを全く有さない細胞において、発現を調節するため、および、完全にまたは部分的に抑制するための、前記オリゴヌクレオチドの使用に関する。
【００６３】
その上、本発明は、医薬としての前記オリゴヌクレオチドの使用、または、医薬製造のための前記オリゴヌクレオチドの使用を提供する。特に、特定の遺伝子の発現または過剰発現を伴う病気の予防および／または治療に適した医薬において前記オリゴヌクレオチドを使用することが可能である。
【００６４】
本発明は、特定の遺伝子が原因であるか、または特定の遺伝子が過剰発現することにより関与する病気の治療のための、前記オリゴヌクレオチドまたは前記オリゴヌクレオチドを含む医薬の使用をさらに提供する。
【００６５】
本発明の医薬は、例えば、ウイルス例えば、ＣＭＶ、ＨＩＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、肝炎Ｂ、肝炎Ｃウイルス、またはパピローマウイルスにより引き起こされる疾患の治療のための治療に用いることができる。本発明の医薬は、例えばポリオウイルス、ＶＳＶまたはインフルエンザウイルスのようなＲＮＡウイルスの治療、また特に、例えばレオウイルスのような二本鎖ＲＮＡウイルスの治療に特に適している。
【００６６】
本発明の医薬はまた、例えばガン治療に適している。この場合において、例えば、ガンの発達または成長の原因となる標的に対して向けられたオリゴヌクレオチド配列を用いることが可能である。このような標的の例としては、以下が挙げられる：
１）核の腫瘍性タンパク質、例えば、ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｆｏｓ／ｊｕｎ、ＰＣＮＡ、ｐ１２０など、
２）細胞質／膜結合型腫瘍性タンパク質、例えば、ＥＪ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ｒｒｇ、ｂｃｌ−２、ｃｄｃ−２、ｃ−ｒａｆ−１、ｃ−ｍｏｓ、ｃ−ｓｒｃ、ｃ−ａｂｌ、ｃ−ｅｔｓなど、
３）細胞性受容体、例えば、ＥＧＦ受容体、Ｈｅｒ−２、ｃ−ｅｒｂＡ、ＶＥＧＦ受容体（ＫＤＲ−１）、レチノイド受容体、タンパク質キナーゼ調節サブユニット、ｃ−ｆｍ
ｓ、Ｔｉｅ−２、ｃ−ｒａｆ−１キナーゼ，ＰＫＣ−α、タンパク質キナーゼＡ（Ｒ１α）など、
４）サイトカイン、成長因子、細胞外基質、例えば、ＣＳＦ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ミエロブラスチン（ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｉｎ）、フィブロネクチンなど、
５）腫瘍抑制遺伝子の阻害剤、例えばＭＤＭ−２など。
【００６７】
本発明の医薬は、例えば、インテグリンまたは細胞−細胞付着受容体により、例えばＶＬＡ−４、ＶＬＡ−２、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭまたはＥＬＡＭにより影響を受ける疾患の治療にさらに適している。
【００６８】
本発明の医薬はまた、例えば再狭窄の予防に適している。この点について、例えば、増殖または遊走を引き起こす標的に対して向けられたオリゴヌクレオチド配列を用いることが可能である。このような標的の例としては、以下が挙げられる：
１）核のトランスアクチベータータンパク質およびサイクリン、例えば、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｆｏｓ／ｊｕｎ、サイクリンおよびｃｄｃ２キナーゼなど、
２）マイトジェンまたは成長因子、例えば、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦおよびＴＧＦ−βなど、
３）細胞性受容体、例えば、ｂＦＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体、および、ＰＤＧＦ受容体など。
【００６９】
本発明は、さらに、アデノシンＡ１受容体、アデノシンＡ３受容体、ブラジキニン受容体またはＩＬ−１３の発現を適切なオリゴヌクレオチドを用いて阻害することによる喘息の治療のためのオリゴヌクレオチドに関する。
【００７０】
本発明はまた、例えば、β１−アドレナリン受容体またはＥＤＧファミリーからのタンパク質（例えばＥｄｇ−１など）の発現を阻害することにより、例えば心疾患を治療するためのオリゴヌクレオチドに関する。
本発明はまた、例えばＰＴＰ−１Ｂの発現を阻害することにより、例えば糖尿病を治療するためのオリゴヌクレオチドに関する。
【００７１】
該医薬は、例えば、経口的に投与可能な医薬品の形態で、例えば、錠剤、コーティング錠剤、ハードもしくはソフトゼラチンカプセル、溶液、乳濁液または懸濁液の形態で用いることができる。これらはまた、例えば坐剤の形態で直腸に投与することができ、または、例えば注射液の形態で非経口的に投与することができる。医薬品は、治療上不活性な有機および無機キャリアー中に前記化合物を加工することにより製造することができる。錠剤、コーティング錠剤およびハードゼラチンカプセルのためのこのようなキャリアーの例としては、ラクトース、コーンスターチまたはそれらの誘導体、タルクおよびステアリン酸またはそれらの塩がある。溶液の調製に適したキャリアーは、水、ポリオール、スクロース、転化糖およびグルコースである。注射液に適したキャリアーは、水、アルコール、ポリオール、グリセロールおよび植物油である。坐剤に適したキャリアーは、植物油および硬化油、ワックス、油脂および半固体ポリオールである。該医薬品はまた、保存剤、溶媒，安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、香味剤、浸透圧を調製するための塩、緩衝剤、コーティング剤、抗酸化剤、および、必要に応じて、その他の治療上活性な物質を含んでもよい。
【００７２】
好ましい投与形態は、局所投与であり、例えば、カテーテルを用いた、または、吸入、注射もしくは注入による局所投与、および経口投与である。注射については、オリゴヌクレオチド誘導体は、溶液中に、好ましくは生理学的に許容できる緩衝液（例えば、ハンク
ス液またはリンガー液）中に処方される。しかしながら、オリゴヌクレオチドを固形状に処方して、使用前に溶解または懸濁してもよい。全身投与に好ましい投与量は、約０.０
１mg／kg〜約５０mg／kg体重・１日である。
その上本発明は、オリゴヌクレオチドおよび／または生理学的に許容されるそれらの塩、加えて製薬上適切なキャリアーおよび／または添加剤を含む医薬品に関する。
【００７３】
オリゴヌクレオチドおよび／または生理学的に許容されるそれらの塩は、そのものを医薬として、互いを含む混合物で、または、局所的、経皮、非経口または経腸の適用が可能であり、活性成分として活性な用量の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、それに加えて一般的な製薬上適切なキャリアーおよび添加剤を含む医薬品の形態で、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトに投与することができる。製剤は、通常、約０.１〜９０質量％の
治療上活性な化合物を含む。例えば、乾癬または白斑のような皮膚疾患の治療に関しては、例えば軟膏、ローションもしくはチンキ、乳濁液、または懸濁液の形態での局所適用が好ましい。
【００７４】
該医薬品は、製薬上不活性な無機および／または有機キャリアーを用いて、それ自体既知の方法で製造される（例えばRemingtons Pharmaceutical Sciences，Mack Publ．Co.，Easton，PA.）。丸剤、錠剤、コーティング錠剤およびハードゼラチンカプセルの製造に
関しては、例えばラクトース、コーンスターチおよび／またはそれらの誘導体、タルク、ステアリン酸および／またはそれらの塩などが用いることができる。ソフトゼラチンカプセルおよび／または坐剤のためのキャリアーの例は、油脂、ワックス、半固体および液体ポリオール、天然油および／または硬化油などである。液剤および／またはシロップ調製に適したキャリアーの例は、水、スクロース、転化糖、グルコース、ポリオールなどである。注射液の調製に適したキャリアーは、水、アルコール、グリセロール、ポリオール、植物油などである。マイクロカプセル、インプラントおよび／またはロッドに適したキャリアーは、グリコール酸と乳酸との混合ポリマーである。当業者既知のリポソーム製剤（N．Weiner，Drug Develop  Ind Pharm 15（1989）1523；“Liposome Dermatics，Springer Verlag 1992）、例えばＨＶＪリポソーム（Hayashi，Gene Therapy 3（1996）878）もまた適切である。皮膚への投与もまた、例えばイオノフォア法および／または電気穿孔法を用いて可能である。加えて、リポフェクチン、およびその他のキャリアーシステム，例えば遺伝子治療で用いられるキャリアーシステムを用いることができる。特に適切なシステムは、優れた効率でオリゴヌクレオチドを真核細胞に導入するのに用いることができるシステムである。
【００７５】
活性物質およびキャリアーに加えて、医薬品はまた、添加剤、例えば、充填剤、増量剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、湿潤剤、安定剤、乳化剤、保存剤、甘味料、着色剤、香味剤、または芳香剤、増粘剤、希釈剤、緩衝物質、さらに、溶媒および／または可溶化剤および／または持続性を達成するための物質、さらに、浸透圧を調製するための塩、コーティング剤および／または抗酸化剤を含ませることができる。これらはまた、２またはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドおよび／またはそれらの生理学的に許容される塩も含ませることができ、さらにその上、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに加えて、１またはそれ以上のその他の治療上活性な物質を含ませることができる。
【００７６】
用量は広い範囲で変えることができ、個々のケースにおいて、個々の状況に応じて調節するべきである。
【実施例】
【００７７】
１．式Ｉで示されるオリゴヌクレオチドの合成
ａ）３′ａａａａａＵＧＵＣＵＡＣＧＵＧＵＡＵＡＧＣＵＣＣＡＣ（小文字で示された塩基は２′５′インターヌクレオシド結合を有する）
ＡＢＩ３９４ＤＮＡまたは Expediteシンセサイザー（Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany）で合成を行った。製造元が推奨する合成サイクルを用いたが、ただしリボヌクレオシド−２′−Ｏ−ホスホロアミデートに関しては、縮合工程を２倍行い（カップリング時間はそれぞれ４００秒であった）、ヨウ素酸化工程の長さを３０秒に増やした。用いられた固相は、糖の２′または３′位で５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−６−ベンゾイルアデノシン（ＮＳＳ−６１０１−１０Ａ，Chemgenes，Waltham，MA）を結合させた１０００Åに調整された多孔質ガラス（ＣＰＧ）支持体である。トリクロロ酢酸で開裂させて５′−Ｏ−ジメトキシトリチル基を除去した後、５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−６−ベンゾイル−３′−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン−２′−Ｏ−ホスホロアミデート（ＡＮＰ−５６８１，Chemgenes）で４回縮合することにより、２′５′−結合オリゴヌクレオチド部分を合成した。これに続いて、対応する５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルヌクレオシド−３′−Ｏ−ホスホロアミデート（ＡＮＰ−５６７１〜ＡＮＰ−５６８０，Chemgenes）で繰り返し縮合することにより、３′５′−結合オリゴヌクレオチド部分を合成した。支持体からオリゴマーを分離し、リン酸基およびアミノ保護基を脱保護するために、ＣＰＧ支持体を、７５０μｌの濃アンモニア／エタノール（３：１、ｖ：ｖ）で３０℃で２４時間振盪しながらインキュベートした。上清を支持体から分離し、次に、支持体を１５０μｌの濃アンモニア／エタノール（３：１、ｖ：ｖ）で２回以上洗浄した。合わせた上清を減圧下で濃縮し、シリル保護基を除去するために、残留物を１２００μｌのトリエチルアミン×３ＨＦ（非常に毒性）中で振盪しながら３０℃で２４時間インキュベートした。これに続いて、７００μｌのｎ−ブタノールを加え、ドライアイス上で３０分間混合物を冷却し、遠心分離した。ペレットをブタノールで２回以上洗浄した。加えて、塩化ナトリウム沈殿を、次に行った。ゲル電気泳動において１１６1 ＯＤ（２６０）の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 ８２５６.０，実測値 ８２５６.８）。
【００７８】
ｂ）３′ａａａａＡＵＡＵＵＡＣＵＵＧＣＡＣＵＵＡＡＣＧＡＧ
実施例１のａ）と同様にして合成を行い、５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−６−ベンゾイル−３′−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン−２′−Ｏ−ホスホロアミデート（ＡＮＰ−５６８１，Chemgenes）で３回縮合することにより２′５′−結合
オリゴヌクレオチド部分を合成した。ゲル電気泳動において１１２ ＯＤ（２６０）の唯
一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 ７９５８.９，実測値 ７９５８.６）。
【００７９】
ｃ）３′ａａａａＣＣＡＵＵＵＣＡＡＣＡＡＧＧＵＡＡＡＡＡＡ
実施例１のｂ）と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において１１７ ＯＤ（２６
０）の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 
８０１２.０，実測値 ８０１１.８）。
【００８０】
ｄ）３′ａａａａＣＵＵＣＧＣＵＵＣＣＡＡＣＡＣＣＵＡＧＡＣ
実施例１のｂ）と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において１１７ ＯＤ（２６
０）の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 
７８６８.８，実測値 ７８６８.６）。
【００８１】
ｅ）３′ａａａａａａＣＵＵＣＧＣＵＵＣＣＡＡＣＡＣＣＵＡＧＡＣ
実施例１のａ）と同様にして合成を行い、５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−６−ベ
ンゾイル−３′−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン−２′−Ｏ−ホスホロアミデート（ＡＮＰ−５６８１，Chemgenes）で５回縮合することにより２′５′−結合
オリゴヌクレオチド部分を合成した。ゲル電気泳動において１１２ ＯＤ（２６０）の唯
一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 8527.2，実測値 8527.5）。
【００８２】
ｆ）３′ｔｅｇ−ＡＡＣＵＵＣＧＣＵＵＣＣＡＡＣＡＣＣＵＡＧＡＣ（ここでｔｅｇは、トリエチレングリコールリン酸残基である）
実施例１のａ）と同様にして、トリエチレングリコールスクシネート誘導体化ＣＧＰ支持体を用い、５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−６−ベンゾイル−３′−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン−２′−Ｏ−ホスホロアミデート（ＡＮＰ−５６８１，Chemgenes）と縮合することにより、配列に従って２′５′−結合オリゴヌクレオチド部分を調製して合成を行った。３′−末端アデノシンの２′位にトリエチレングリコールリン酸残基を含む８３ ＯＤ（２６０）の粗生成物が得られた。生成物をＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 ７４２２.５，実測値 ７４２２.６）。
【００８３】
ｇ）５′ＧＡＡＧＣＧＡＡＧＧＵＵＧＵＧＧＡＵＣＵＧａａａａ
実施例１のｂ）と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において１０８ ＯＤ（２６
０）の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 
８１４９.０，実測値 ８１４８.９）。
【００８４】
ｈ）５′−ＧＧＵＡＡＡＧＵＵＧＵＵＣＣＡＵＵＵＵＵＵａａａａ
実施例１のｂ）と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において１１２ ＯＤ（２６
０）の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 
７９３０.７，実測値 ７９３０.７）。
【００８５】
ｉ）５′−ＧＡＡＧＣＧＡＡＧＧＵＵＧＵＧＧＡＵＣＵＧ
３′５′−インターヌクレオチド結合を導入したことを除いては、実施例１のａ）と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において８２ ＯＤ（２６０）の唯一の主要なバン
ドを示す粗生成物が得られた。生成物をＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 ６８３２.２，実測値 ６
８３１.８）。
【００８６】
ｊ）３′ａａａａＣ*Ｕ*Ｕ*ＣＧＣ*Ｕ*ＵＣ*ＣＡＡ*ＣＡＣ*Ｃ*ＵＡＧＡ*Ｇ
実施例１のｂ）と同様にして合成を行った。特定の酸化工程においてヨード液ではなくBeaucage試薬（ＲＮ−１５３５，Chemgenes，Waltham，MA）を用いることによって、ホスホロチオエート残基を導入した。ゲル電気泳動において１１２ ＯＤ（２６０）の唯一の
主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 ８０２９.４，実測値 ８０３１.２）。
【００８７】
ｋ）３′−ａ*ａ*ａａ−Ｃ*Ｕ*Ｕ*ＣＧＣ*Ｕ*ＵＣ*ＣＡＡ*ＣＡＣ*Ｃ*ＵＡＧＡ*Ｃ
実施例１のｊ）と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において１２８ ＯＤ（２６
０）の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 
８０６１.６，実測値 ８０６２.８）。
【００８８】
ｌ）３′−Ａ*Ｕ*ｕａ−Ｃ*Ｕ*Ｕ*ＣＧＣ*Ｕ*ＵＣ*ＣＡＡ*ＣＡＣ*Ｃ*ＵＡＧＡ*Ｃ（ｕとａとの間に唯一の２′５′−インターヌクレオチド結合を含む）
実施例１のｋ）と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において９６ ＯＤ（２６０
）の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 ８
０１５.５，実測値 ８０１７.８）。
【００８９】
ｍ）３′ａａａａ−ＣＵＵＣＧＣＵＵＣＣＡＡＣＡＣＣＵＡＧＡＣ（小文字で示された塩基は２′５′−インターヌクレオシド結合を有し、下線で示されたヌクレオチドは２′−Ｏ−メチルリボヌクレオシドである）
実施例１のａ）と同様にして合成を行った。下線で示されたヌクレオチドの場合は、５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−メチル−リボヌクレオシド−３′−Ｏ−ホスホロアミデート（ＡＮＰ−５７５１〜ＡＮＰ−５７５８，Chemgenes）を縮合した。ゲル電気泳動において９９ ＯＤ（２６０）の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 ８１６３.４.６，実測値 ８１６５.１）。
【００９０】
ｎ）３′ａ*ａ*ａａ−Ｃ*Ｕ*Ｕ*ＣＧＣ*Ｕ*ＵＣ*ＣＡＡ*ＣＡＣ*Ｃ*ＵＡＧＡ*Ｃ
実施例１のｍ）と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において１２７ ＯＤ（２６
０）の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 
８３５６.１．実測値 ８３５７.２）。
【００９１】
ｏ）３′−ａａａａＵＡＧＵＡＧＧＡＣＣＵＣＵＵＧＵＡＧＡＡＡ（ｅｄｇ−１−１７５＿ｌｏ）
実施例１のｂ）と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において１３４ ＯＤ（２６
０）の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 
８０３７.９，実測値 ８０３８.９）。
【００９２】
ｐ）３′−ａａａａＧＧＵＵＣＣＧＧＵＣＧＧＣＧＵＣＧＡＧＡＣ（ｅｄｇ−１−７２５＿ｌｏ）
実施例１のｂ）と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において１３４ ＯＤ（２６
０）の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 
８０７５.９，実測値 ８０７６.９）。
【００９３】
ｑ）３′−ａａａａＧＧＵＧＣＣＵＧＵＣＵＧＣＧＧＣＧＡＣＡＣ（ｅｄｇ−１−ｍｍ＿ｌｏ）
実施例１のｂ）と同様にして合成を行った。ゲル電気泳動において１０９ ＯＤ（２６
０）の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 
８０３５.９，実測値 ８０３７.０）。
【００９４】
ｒ）５′ＡＵＣＡＵＣＣＵＧＧＡＧＡＡＣＡＵＣＵＵＵ（ｅｄｇ−１−１７５−ｕｐ）
３′５′−インターヌクレオチド結合を導入したことを除いては、実施例１のａ）と同様にして合成を行った。用いられた固相は、糖の２′または３′位に５′−Ｏ−ジメトキシトリチルウリジン（ＮＳＳ−６１０４−１０Ｕ，Chemgenes，Waltham，MA）を結合させた１０００Åに調整された多孔質ガラス（ＣＰＧ）支持体であった。ゲル電気泳動におい
て１１０ ＯＤ（２６０）の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をＨ
ＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 ６６１８.０，実測値 ６６１８.５）。
【００９５】
ｓ）５′ＡＵＣＡＵＣＣＵＧＧＡＧＡＡＣＡＵＣＵＵＵ−ＦＩＴＣ（ｅｄｇ−１−１７５＿ｕｐ−ＦＩＴＣ）
３′５′−インターヌクレオチド結合を導入したことを除いては、実施例１のａ）と同様にして合成を行った。用いられた固相は、保護されたフルオレセイン誘導体（ＮＳＳ−９７５０５−Ａ１ＣＬ，Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含む５００Åに調整された多孔質ガラス（ＣＰＧ）支持体であった。ゲル電気泳動において７９ ＯＤ（
２６０）の唯一の主要なバンドを示す粗生成物が得られた。生成物をＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）でさらに特徴付けた（計算値 ７４２８.７，実測値 ７４３２.３）。
【００９６】
２．ＳＬ−３細胞におけるルシフェラーゼ発現の阻害
生物活性に関して試験するために、以下のオリゴヌクレオチドを、必要に応じてハイブリダイズにより二本鎖にして調製し、以下の分析混合物中でルシフェラーゼ活性の阻害に関して試験した。
【００９７】
【化１６】
0004643906.tif 000017
【００９８】
分析混合物１、２、５、６、１２および１３は、二本鎖形態ではないＲＮＡを含む。その一方で、分析混合物３、４、７、８、９、１０および１１の中のオリゴヌクレオチドは、二本鎖として対をなしている。二本鎖７、９および１１は、両方の鎖において、オーバーハングした２′５′−結合オリゴヌクレオチド残基を有する。オリゴリボヌクレオチドｌｕｃ−１１０８＿ｌｏは、その３′末端に２つだけオーバーハングした２′５′−結合ヌクレオチドおよびトリエチレングリコールリン酸残基（ｔｅｇ）を含む。分析混合物８および１０の二本鎖は、２′５′−結合オーバーハングを有する鎖を１つだけ有する。
【００９９】
トランスフェクション：実験の前の日に、２×１０6細胞／mlを６ウェルプレートにプ
レーティングした。希釈緩衝液中で２つの鎖を熱し、その後それらを冷却することによりオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ二本鎖を得て、１００μｌのＳＦ ９００II ＳＦＭ（ＳＦ−９００無血清昆虫用培地II；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ １０９０２−０９６）で処理した。トランスフェクションのために、１０μｌのリポフェクチン（１mg／ml；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を１００μｌのＳＦ ９００II ＳＦＭと混合し、室温で１５分間インキュ
ベートした。これに続いて、リポフェクチンミックスと核酸とを共にピペッティングし、室温で１５〜４５分間インキュベートした。その間に、細胞を、３mlの無血清培地と８００μｌのＳＦ ９００II ＳＦＭとで洗浄し、核酸／リポフェクチン混合物を連続的に細胞に加え、続いて、２５℃で一晩インキュベートした。次の日、１mlの培地および血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ １０１２２−１６６；最終濃度２％）を加える。
【０１００】
デュアル−ルシフェラーゼレポーター（ＤＬＲ；プロメガＥ１９６０）アッセイシステム：
【化１７】
0004643906.tif 000018
【０１０１】
プロメガ社のＤＬＲアッセイは、１つのサンプルから、異なる核酸配列を有するホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を逐次的に測定することができる。測定しようとする式Ｉで示されるオリゴヌクレオチドは、ホタルルシフェラーゼに対して向けられた。従って、ウミシイタケルシフェラーゼ活性ではなくホタルルシフェラーゼ活性だけが阻害されるはずである。従って、阻害作用に加えて、特異性も試験され得る。
【０１０２】
ウェルプレート中での細胞の受動的な溶解を、初めに培地を除去し、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ １４２００−０６７））で細胞を洗浄することにより行った。培地を吸引により完全に除去し、続いて、ＰＬＢ（受動的な溶解緩衝液、水で１：５に希釈；５００μｌのＰＬＢ（１×）が６ウェルプレートの１つのウェルに導入された）をそれに加えた。これに続いて、室温で振盪しながら１５分間インキュベートした。
【０１０３】
１０mlのルシフェラーゼ分析緩衝液II（ＬＡＢ1 II）にルシフェラーゼ分析基質（ＬＡＳ）を再懸濁することにより、ルシフェラーゼ分析試薬ＩＩ（ＬＡＲ II）を調製した。
Ｓｔｏｐ＆ＧＩｏ試薬の調製は、乾燥Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ基質を含むボトルに２００μｌのＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ基質（溶液）を加え、ボルテクサーを用いて１０秒間溶液を混合することによりなされた。１×Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ溶液を作製するために、２０μｌの５０×Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ基質と、１mlのＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ緩衝液を合わせる。これは、１０回の分析に十分である。
【０１０４】
ＤＬＲ−アッセイ：１００μｌのＬＡＲ IIを２０μｌの細胞溶解物と共にウェルに導
入し、２〜３秒間上下にピペッティングすることにより混合した。ホタルルシフェラーゼ活性のルミノメトリック（luminometric）測定の後、１００μｌのＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ試薬を加え、溶液を混合し、続いて、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。Fluoroskan Ascent FL ルミノメーター（Thermo Labsystems，Frankfurt，Germany）を用いて発光を測定した。
【０１０５】
【表１】
0004643906.tif 000019
【０１０６】
二本鎖オリゴヌクレオチド（３、４、７〜１０）は、対応する一本鎖分子（１、２、５、６、１２および１３）に比べて実質的に相当な程度ホタルルシフェラーゼ活性を阻害した（ただし、下部の鎖に２つだけオーバーハングしたヌクレオチドを有する二本鎖（分析混合物１１）を除く）。上部の鎖におけるオーバーハングした２′５′−(Ａ)4残基は、下部の鎖に２′５′−(Ａ)4残基を有する限り、二本鎖の活性において、全く効果を有しないか、または非常にわずかな陽性の効果しか有しなかった（３ｖｓ．４、および、７ｖｓ．８を参照）。下部の鎖における２′５′−(Ａ)4残基は、２′５′−(Ａ)2残基と比べて、顕著に改善された二本鎖の作用を引き起こした（７および８ｖｓ．１１）．５）を参照）。非相補的な塩基のために二本鎖を形成できなかった２つの一本鎖２′５′−（Ａ）4オリゴヌクレオチドの混合物（１２および１３）は、相補的な塩基とオーバーハングした２′５′−アデニレート残基とを有する二本鎖よりもかなり活性が低かった。
【０１０７】
同様に、式Ｉで示される以下の改変オリゴヌクレオチドを分析混合物１４〜１８中で分析した。
【化１８】
0004643906.tif 000020
【０１０８】
【表２】
0004643906.tif 000021
【０１０９】
下部の鎖における特定の位置へのホスホロチオエート残基の導入（分析混合物１４）、または、下部および上部の鎖における特定の位置へのホスホロチオエート残基の導入（分析混合物１６）は、本発明のオリゴヌクレオチドの顕著に改善された作用が得られたが、一方で、下部の鎖全体または上部の鎖全体における２′−Ｏ−メチル残基の導入（分析混合物１５および１７）は、活性の強い減少が起こった。驚くべきことに、分析混合物１６の小さいオリゴヌクレオチドが、ホタルルシフェラーゼの発現を、非常に長い二本鎖ＲＮＡ（約１１００ｂｐ）と同等に阻害した。一本鎖（分析混合物１８）も同様に不活性であった。
【０１１０】
３．ヒト初期臍帯細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるｅｄｑ−１発現の阻害
本発明のオリゴヌクレオチドがヒトの初期細胞において遺伝子発現を抑制することに用いることができることを示すために、前記オリゴヌクレオチドはまた、ヒト遺伝子または対応するＲＮＡに対して向け、ヒト細胞（ＨＵＶＥＣ、ヒト臍帯静脈内皮細胞）で試験さ
れた。
適切なオリゴヌクレオチドを合成した。
【０１１１】
【化１９】
0004643906.tif 000022
【０１１２】
分析混合物１４〜１６の二本鎖オリゴヌクレオチドは、１つの鎖（非コーディング）のみに２′５′−結合オーバーハングした残基を有する。この特徴はまた、本発明の特定の実施形態である。
【０１１３】
細胞（ＨＵＶＥＣ）および細胞摂取の検出
トランスフェクション：実際のトランスフェクションの２４時間前に、初期ＨＵＶＥＣ（Jafee et al.，1973，J．Clin．Invest52，pp.2745 に従って単離された第二世代）を
密度２.５×１０5細胞／ウェルでラットのコラーゲン−Ｉ（Biocoat，＃354400，Becton Dickinson）で被覆した６ウェルプレートにプレーティングした。特定のオリゴヌクレオ
チドの等モル量の鎖とそれと対の鎖（それぞれの場合、滅菌ろ過したＰＢＳ（ｐＨ７.４
，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ ＃１４２００−０６７）中の１mM）を混合し、９５℃で５分間インキュベートし、続いて室温まで冷却し、４℃で５分間インキュベートすることによりハイブリダイズさせた。トランスフェクションのために、６μｌのリポフェクチン（１mg／ml；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，＃１８２９２−０１１）を２００μｌの血清非含有Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ１培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，３１９８５−０４７）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。パラレル反応において、１０μＭ（→最終濃度０.１μＭ）または１００μＭ（→最終濃度１μＭ）のハイブリダイズしたオリゴヌクレオチド溶液（ＰＢＳ中、ｐＨ７.４）を無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ１培地で１：１０の割合に希釈し、同量のプレインキュベートしたリポフェクチン溶液と混合した。室温で１５分間インキュベートした後、前記混合物の量を無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ１培地で２mlに増やし、回収された細胞をＰＢＳで１回洗浄し、続いて、前記混合物を、３７℃で、５％ＣＯ2および湿度９５％で４時間インキュベートした。その後、回収された細胞を再びＰＢＳで洗浄し、続いて、血清含有ＥＧＭ培地（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ，＃ＣＣ−３０２４＋ＥＧＭサプリメント＃ＣＣ−３１２４）で被覆し、さらに２４または４８時間インキュベートした。蛍光標識したオリゴヌクレオチドを用いた摂取の研究の場合において、細胞を４時間インキュベートし、次に、５％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中、ｐＨ７.４）で固定し、倒立蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ１３５Ｍ）で、その２００倍の倍率で冷却したＣＣＤカメラ（ＯＲＣＡ−１，Ｂｆｉ  ｏｐｔｉｌａｓ）を用いて、ＦＩＴＣフィルターを通して励起させて（励起：４９０nm，放出：５１０nm）直接撮影し、ＡＱＭ２０００ソフトウェア（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ）で処理した。
【０１１４】
ウェスタンブロット分析：回収された細胞をＰＢＳで１回洗浄することにより、細胞を溶解させ、続いて、２００μｌ／ウェルの２×Laemmli緩衝液（Bio-Rad ＃１６１−０７
３７）でそれを被覆した。室温で５分間インキュベートした後、セルスクレーパー（Becton Dickinson，＃３０８５）を用いて細胞溶解物を回収し、断続的な１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，Laemmli et al.，1970，Bio-Rad-Criterion-System ＃３４５−００１４）の前に、９５℃で５分間加熱し、４５μｌのこの溶液を各スロットに適用した。ゲルを１×トリス／グリシン／ＳＤＳ緩衝液（Bio-Rad ＃１６１−０７３２）で泳動した。免疫ブロットのために、Bio-Rad クライテリオンウェスタンブロット装置（＃１７０−４０７０）で、１×トリス／グリシン緩衝液（Bio-Rad ＃１６１−０７３２，＋１０％メタノール）中で、ゲルをニトロセルロース（ＮＣ）メンブレン（Amersham ＃ＲＰＮ２０２０Ｄ）にトランスファーした。次に、５％粉乳（“Blotto”，Bio-Rad ＃１７０−６４０４）および０.１％Tween２０（Bio-Rad ＃１７０−６５３１）を含む１×ＴＢＳ緩衝液（Bio-Rad ＃１７０−６４３５）を用いて、ＮＣメンブレンを室温で１時間飽和させた。Blotto 非含有ＴＢＳ−Tween（ＴＢＳＴ）緩衝液でメンブレンを３回洗浄した後、TBST-Blotto での１：５０希釈液中の抗ｈＥＤＧ−１一次抗体（ＥＤＧ−１特異的ペプチド配列ＣＫＡＨＲＳＳＶＳＤＹＶＮＹＤで免疫化し、ＫＬＨとカップリングし、上述のペプチド配列に対する親和性で精製することによって得られたポリクローナルウサギ血清）で、メンブレンを４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体（アルカリホスファターゼをカップリングした抗ウサギ、Dianova ＃１１１−０５５−０４５）をTBST-Blottoでの１：２０００希釈液で室温で１時間インキュベートした。さらなる洗浄工程の後（上記参照）、ＥＣＦ（「増強された化学蛍光」）検出反応（Amersham ＃ＲＰＮ５７８５）を行い、ポリエチレンのラップ（clingfilm）で被覆したＮＣメンブレンを１mlのＥＣＦ基質（Amersham Pharmacia ＃ＲＰＮ５７８５）で室温で５分間インキュベートし、続いて、Fluor-Imager 595 スキャナー（Amersham Pharmacia）を用いて検出した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Amersham Pharmacia）を用いてシグナルを定量し、ＮＣメンブレンを１回脱色し（Alpha Diagnostic Kit ＃９０１００）、上述の方法に従ってβ−チューブリン特異的一次抗体（親和性で精製されたウサギ抗体、Santa Cruz ＃ｓｃ−９１０４）をインキュベートした後得られたβ−チューブリンシグナルに標準化した。
【０１１５】
【表３】
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【０１１６】
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドで初期ＨＵＶＥＣ細胞を処理することにより、Ｅｄｇ−１発現の用量依存性の阻害が生じた。分析混合物１４および１５においてｅｄｇ−１特異的オリゴヌクレオチドで処理した後、チューブリンレベルではなくｅｄｇ−１タンパク質レベルだけが減少したことから、阻害は、標的遺伝子特異的であることが証明された。また、分析混合物１４および１５のｅｄｇ−１相同オリゴヌクレオチドのみがｅｄｇ−１発現を阻害したが、一方で、５個のヌクレオチドがｅｄｇ−１配列とは異なる分析混合物１６の二本鎖核酸はｅｄｇ−１発現を阻害しなかったことから、阻害は、用いられたオリゴヌクレオチドに関して配列特異的であることが証明された。
我々は、これがヒトの初期細胞における二本鎖ＲＮＡによる遺伝子発現の配列特異的阻害を説明した最初の実験であると考える。
【０１１７】
ＨＵＶＥＣ細胞における細胞の摂取を分析混合物１７の蛍光標識された二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて調べた。分析混合物１７を４時間インキュベートした後、蛍光顕微鏡を用いて良好な細胞の摂取が検出された。摂取された二本鎖オリゴヌクレオチドは、主に細胞質に存在していたが、その一方で、一本鎖ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドは、同じ条件下で主に核で見出された。
【０１１８】
４．ホスホロチオエート改変オリゴマーを用いたヒト初期臍帯細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるＥｄｇ−１発現の阻害
ヒト細胞（ＨＵＶＥＣ、ヒト臍帯静脈内皮細胞）におけるＥｄｇ−１の遺伝子発現を阻害するために、実施例３で説明したように特定の位置をホスホロチオエートで改変したオリゴリボヌクレオチド類似体を初期のヒト細胞に用いた。
【０１１９】
【化２０】
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【０１２０】
分析混合物１８〜２０の二本鎖オリゴリボヌクレオチドは、１つの鎖（非コーディング）のみに、２′５′−結合オーバーハングした残基を有する（特定のインターヌクレオチド結合のみがホスホロチオエートで改変された）。この特徴は、同様に本発明の特定の実施形態である。
【０１２１】
【表４】
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【０１２２】
この実験は、供与量をより多様に変化させて繰り返された。
【表５】
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【０１２３】
本発明の化学修飾された二本鎖オリゴヌクレオチドで初期ＨＵＶＥＣ細胞を処理することにより、ｅｄｇ−１発現の用量依存性の阻害が生じた。ｅｄｇ−１特異的オリゴヌクレオチドで処理した後、分析混合物１８および１９において、チューブリンレベルではなくＥｄｇ−１タンパク質レベルだけが減少したことから、前記阻害は標的遺伝子特異的であることが証明された。また、分析混合物１８および１９のｅｄｇ−１相同オリゴヌクレオチドだけがｅｄｇ−１発現を阻害したが、その一方で、５個のヌクレオチドがｅｄｇ−１配列とは異なる分析混合物２０の二本鎖核酸はｅｄｇ−１発現を阻害しなかったことから、阻害は、用いられたオリゴヌクレオチドに関して配列特異的であることが証明された。
【配列表】
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