(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
紙の製造方法であって、
ａ）再循環された紙を含んで成る材料からパルプを調製し；
ｂ）酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマーを加水分解できる、クチナーゼ及びカンジダ・アンタルクチカ由来のリパーゼからなる群から選択される脂肪分解酵素により前記パルプを処理し；そして
ｃ）前記処理されたパルプから紙を製造すること；
を含んで成る方法。
【請求項２】
前記クチナーゼが、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）由来のクチナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）由来のクチナーゼが、熱安定性変異体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記クチナーゼが、フサリウム・ソラニ・ピシ（Fusarium solani pisi）由来のクチナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
粘着物の量の減少及び/又はインキ抜きのための請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記紙製造のための酵素の使用量が、酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマー１g当たり0.1〜5000単位/mlのPVAc加水分解活性である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
製紙用パルプ１トン当たり前記酵素の使用量が、
（ｉ）請求項１記載の（ｉ）に従っての100〜100,000単位；又は
（ii）0.1〜100,000mgの酵素タンパク質である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
次の酵素群：プロテアーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、リパーゼ、ヘミセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、及び請求項１に記載のクチナーゼ以外のクチナーゼから選択された少なくとも１つの追加の酵素をさらに使用する請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つのアニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤及び/又は両性イオン性界面活性剤及び/又は分散剤をさらに使用する請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再循環された紙（リサイクル紙）からの紙及び紙製品の製造への一定の脂肪分解酵素の使用に関する。それらの酵素の使用により、故紙に由来する、いわゆる粘着物に関連する問題が軽減される。
【背景技術】
【０００２】
酢酸ビニルを含んで成るポリマーは、産業部門（紙、織物、等）を通して接着剤及び塗布材料として通常使用される。しかしながら、それらの接着剤性のために、それらのポリマーはしばしば、後での加工段階で問題を引き起こす。
例えば、紙産業においては、酢酸ビニルを含んで成るポリマーは、結合剤及び塗布材料として使用される。再循環の間、それらのポリマーは、繊維及び他の物質と一緒に凝集し、紙製品の品質を低める、いわゆる、“粘着物”を形成し、そして機械の有意な停止時間をもたらす。
【０００３】
WO00/34450号、WO01/92502号及びアメリカ特許第5,176,796号は、ピッチ調節のために、紙の製造において一定のリパーゼ及びクチナーゼの使用を報告している。上記アメリカ特許によれば、ピッチは木材の天然の成分であり、そしてトリグリセリドがその主成分である。
WO01/98579号は、紙の再循環の間、粘着物に関する問題の調節のためへのリパーゼ及び/又はエステラーゼの使用を開示する。RESINASE A2X及びNOVO−COR ADLと称するリパーゼが、本明細書における例１〜３に比較目的のために包含される。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、再循環された紙（リサイクル紙）からの紙の製造におけるある種の脂肪分解酵素の使用、及びこの種の脂肪分解酵素を用いての紙の製造方法に関する。それらの種類の脂肪分解酵素は、酢酸ビニルを含んで成るポリマーに対する加水分解活性についての一定の試験により定義される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
粘着物：
Thesaurus of Pulp and Paper Terminology, 1991 (Institute of Paper Science and Technology, Atlanta, USにより編集された)によれば、用語、粘着物とは、再加工の間、紙−機械部分の粘着を引き起こす粘着性の故紙汚染物を表す。そのような汚染物の例として、インキ、タール及びラチックスが言及される。
粘着物の追加の例は、再循環紙製造工程において形成する、繊維の粘着性凝集物、粘着剤、塗膜、結合剤及び他の材料である。従って、粘着物は、再循環紙が使用される紙製造工程に主に関係する。
【０００６】
粘着物は、水不溶性であり、そして紙製造装置の種々の部分上で凝集し、そして付着し、それにより紙品質問題、ペーパーウェブの破壊、及び装置の清浄のための費用のかかる停止時間期間を引き起こす。例えば、粘着物は、紙形成フェルト上に付着し、それにより、形成するペーパーウェブからの水の排水を効果の低いものにし、上記のような問題を再び生ぜしめる。
粘着物は、種々の手段で、例えばサイズ又は比重により区別されて来た。
【０００７】
一次粘着物は、通常いずれの問題も引き起こさないほど小さく、ところが二次粘着物又はマクロ粘着物はより大きく、そして付着する傾向がある。マクロ粘着物は一般的に、微細スクリーン上に保持されるようなサイズのものである。微細スクリーンの例は、50−200, 60−190、又は70−180、又は80−170、又は80−160、又は約80−150μmのスロットを有するそれらのスクリーンである。
【０００８】
高い密度及び低い密度の粘着物は、一定の条件下で、種々のタイプの機械装置により除去できるが、しかし特に、いわゆる中位の範囲の密度の粘着物、すなわち約0.9〜約1.1、又は約0.96〜約1.05、又は約0.98〜約1.02の比重の粘着物に関する問題が存続する。
世界の種々の地域からの粘着物の化学組成は、主に他方の紙製造工程の特徴に依存して、変化することができる。同様に、同じ理由のために、粘着物の組成は、工場から工場に変化することができる。
次の成分が成分の例であり、その１又は複数の成分は典型的には、ヨーロッパ粘着剤、アクリル樹脂、ポリ酢酸ビニル（PVAc）、スチレンブタジエン樹脂（SBR）、ポリエチレン（PE）及びポリプロピレン（PP）に見出される。
【０００９】
本発明においては、酢酸ビニルを含んで成るポリマーに向けられ、粘着物はそのようなポリマーの１つの例である。酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマーは、酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリ（酢酸ビニル）ホモポリマー（PVAc）であり、又はそれは酢酸ビニル及び他のモノマー、例えばエチレン、アクリル酸メチル、ラウリル酸ビニル及びｔ−デカン酸、エテニルエステルを含んで成るコポリマーであり得る。種々のポリマーのブレンド及び混合物（ここで、ポリマーの少なくとも１つは酢酸ビニルを含んで成る）はまた、本明細書に使用されるように、“酢酸ビニルを含んで成るポリマー”の定義に包含される。同じことが、他のポリマーとのみならず、またいずれか他の化合物とのその混合物に関して真実である。
【００１０】
粘着物を調節するための種々の手段、例えば入力する再循環紙の品質の調節、種々の機械的スクリーニング及び遠心分離方法、及び種々の化学物質を用いての分散方法が開発されて来た。また、酵素の使用が提案されている（例えば、上記に言及されるWO01/98579号を参照のこと）。
しかしながら、重度の問題がまだ、存続し、これは、本発明によれば、この目的のためにこれまで記載された酵素よりも卓越した一定の脂肪分解酵素の使用により軽減される。
【００１１】
脂肪分解酵素：
本発明においては、用語“脂肪分解”酵素とは、それらが酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマーを加水分解できる単一の及び特徴的な特性を有する種類の酵素を言及する。
所定の酵素がこの種類の脂肪分解酵素内にあるかどうかを決定するために、次の試験のいずれかを使用することができる：
【００１２】
（ａ）分散されたPVAc基質上での45℃で18時間後、毛管電気泳動による加水分解の程度の決定、ここで前記分散されたPVAc基質はpH6又は８で40mlの緩衝液中に、メタノール中、6％PVAc1.5mlを注入することによって調製され、そして前記PVAcの分子量が約12800である；又は
（ｂ）すべて、酢酸ビニルモノマーを含んで成る次の３種のポリマー調製物の少なくとも１つに対する問題の酵素の加水分解活性の決定：（i）PVAcホモポリマー調製物、（ii）酢酸ビニルエチレンコポリマー調製物、又は（iii）酢酸ビニルtert−デカン酸、エテニルエステルコポリマー調製物。１，２又はすべての３種のそれらの基質に対する加水分解活性は、酵素が本明細書に定義されるような“脂肪分解”酵素であることを示す。
【００１３】
上記試験（ａ）のためには：本明細書における例８に従って決定される加水分解の程度が少なくとも0.1である場合、問題の酵素は、本発明に従っての使用のための加水分解酵素として適切である。約12800のPVAc分子量とは、ゲル透過クロマトグラフィー（GPC）による平均分子量を意味する。この場合、“約12800”とは、10000〜20000の平均分子量を意味する。６又は８の緩衝液pH値は、pH6又はpH8のいずれかであり得る。適切な緩衝液の例は、5mMのHepes緩衝液（pH8）及び5mMのMES（pH6）である。特定の態様においては、加水分解の程度は、少なくとも0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.5, 1.7, 1.8, 1.9又は少なくとも2.0である。
【００１４】
驚くべきことには、比較的低い程度の加水分解は、粘着物の粘着性を低めるために必要とされると思われる。特定の態様においては、加水分解の程度は、10％以下、又は9％以下、又は8％以下、又は7％以下、又は6％以下、又は5％以下、又は4％以下である。さらなる特定の態様においては、加水分解の程度は、上記下限及び上限値に由来するいずれかの範囲内にある。
【００１５】
上記（ｂ）に従っての試験のためには、ポリマー基質が乳化され、そして反応条件、例えばpH、温度及びインキュベーション時間が、問題の酵素の特徴のために選択される。
反応温度の例は、10, 20, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 又は100℃である。
反応pH値の例は、pH2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11又はpH12である。
反応時間の例は、30秒、１分、2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 60, 90, 120又は180分である。
【００１６】
第１の特定の態様においては、酵素は、50mMのNaCl, 0.5mMのKH2PO4, 9％(v/v)のグリセロール及び0.1％（w/v）のアラビアガムから成るエマルジョンにおいて基質としての5％（w/v）のポリ（酢酸ビニル）（PVAc）ホモポリマー調製物による、35℃、pH8での４分間の加水分解活性を有することができる。その特定の態様においては、ポリ（酢酸ビニル）ホモポリマー調製物（また、PVAcホモポリマーと称する）は、46〜50％の範囲の乾燥物質含有率、及び5800〜7200mPa.s の範囲の粘度（Brookfield, 20℃）を有するホモポリマーPVAc分散接着剤である。好ましい基質は、BLUDAN A/S, Vesterlundvej 5-7, DK-2730 Heriev, Denmarkから入手できる製品GLUDANTM 150-6.500である（本明細書における例１に使用される）。この第１の態様においては、加水分解活性は、“PVAc加水分解活性”として言及され得る。
【００１７】
第２の特定の態様においては、酵素は、50mMのNaCl, 0.5mMのKH2PO4, 9％(v/v)のグリセロール及び0.1％（w/v）のアラビアガムから成るエマルジョンにおいて基質としての5％（w/v）の酢酸ビニルエチレンコポリマー調製物による、35℃、pH7での４分間の加水分解活性を有することができる。その特定の態様においては、酢酸ビニルエチレンコポリマーは、56〜60％の範囲の合計固体含有率、及び6000〜7000mPa.s の範囲の粘度（Brookfield, 20℃）を有するPVAcエチレンコポリマー分散接着剤である。好ましい基質は、BLUDAN A/S, Vesterlundvej 5-7, DK-2730 Heriev, Denmarkから入手できる製品GLUDANTM 534-6.500である（本明細書における例２に使用される）。
【００１８】
第３の特定の態様においては、酵素は、50mMのNaCl, 0.5mMのKH2PO4, 9％(v/v)のグリセロール及び0.1％（w/v）のアラビアガムから成るエマルジョンにおいて基質としての5％（w/v）の酢酸ビニル  tert-デカン酸、エテニルエステルコモポリマー調製物による、35℃、pH７での４分間の加水分解活性を有することができる。その特定の態様においては、酢酸ビニル  tert-デカン酸、エテニルエステルコモポリマー調製物は、55±１％の範囲の合計固体含有率、及び1000〜4000mPa.s の範囲の粘度（Brookfield, 23℃）を有する酢酸ビニル−Veovaコポリマー分散接着剤である。好ましい基質は、CHE−NARK ApS, Noerregade 10A, 2. T. V., DK-4600 Koege, Denmarkから入手できる製品NOREMULTM VW1501である（本明細書における例３に使用される）。粘度決定のためには、適切な粘度計は、Brookfield LVF型である。スピンドルNo.3が60rpmの速度で使用される。
【００１９】
それらの条件下で、脂肪分解酵素の加水分解活性（たとえば、PVAc加水分解）は、A280＝0.15に対応する脱イオン水に溶解された脂肪分解酵素200μlを、基質エマルジョン15mlに添加することによって決定され、そして１単位の加水分解活性（例えば、PVAc加水分解活性）が、pH−安定装置により測定されたアセテート１μモルの放出として定義される。A280＝0.15は、問題の酵素についての消衰係数に依存して、約0.10〜0.40mgの酵素タンパク質/mlに対応する。例に使用されるほとんどの酵素に関して、A290＝0.15は、約0.20〜約0.3mgの酵素タンパク質/ml、例えば0.25mgの酵素タンパク質/mlに対応する。特定の態様においては、アッセイ使用される酵素タンパク質の量（15mlの基質エマルジョンに添加される、200μlに含まれる）は、約40〜約60、又は約45〜約55、又は約50μgの酵素タンパク質である。
【００２０】
特定の態様においては、脂肪分解酵素は、0.2単位よりも高い、特に0.4単位又はより特定には0.6単位のPVAc加水分解活性を有することができる。
もう１つの特定の態様においては、脂肪分解酵素は、A280＝0.15を有する脂肪分解酵素溶液1ml当たり、少なくとも0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3.0, 3.2, 3.4, 3.6, 3.8, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0、又は少なくとも13.5単位のPVAc加水分解活性を有する。
【００２１】
さらなる特定の態様においては、脂肪分解酵素は、A280＝0.15を有する酵素溶液1ml当たり、少なくとも0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1又は少なくとも1.2単位の酢酸ビニルエチレンコポリマー基質に対する加水分解活性を有する。
さらなる特定の態様においては、脂肪分解酵素はA280＝0.15を有する酵素溶液1ml当たり、少なくとも0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 又は少なくとも2.1単位の酢酸ビニルtert−デカン酸、エテニルエステルコポリマー基質に対する加水分解活性を有する。
【００２２】
種々の他の態様においては、脂肪分解酵素は、
（iv）LASの存在下で活性的であり（“活性的”とは、反応中への50又は200ppmのLASの添加により、アッセイ（ｉ）−（iii）のいずれかにおける活性（単位/mlで測定される）が、LASの添加を伴なわない対照実験における活性に比較して、少なくとも50％であることを意味する）；さらなる特定の態様においては、活性は、対照に比較して、少なくとも55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 120又は少なくとも130％であり；
【００２３】
（v）LASの存在下で安定性であり（“安定性”とは、50又は200ppmのLASにおいて、pH6又は８及び45℃の温度で１，２又は３時間の酵素（A280＝0.15）のプレインキュベーションの後、アッセイ（ｉ）−（iii）のいずれかを用いての残留活性（単位/mlで測定される）が、対照に比較して、少なくとも55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 120又は少なくとも130％であることを意味する）；
【００２４】
（v）PVAc基質上で、35, 45又は55℃及びpH＝8（5mMのHepes緩衝液を用いる）での20分後、対照よりも高い濁り度を示し、ここで前記基質は、30mlの緩衝液中への、メタノール溶液中、0.15mlの２％（w/v）PVAc（Mw＝113000）の注入により調製され（表４〜６を参照のこと）；
（v）過酸化水素に対して耐性であり、すなわち実質的に同じ濁り度/酵素用量プロフィールが、15ppmの過酸化水素の添加に伴なって及びそれを伴わないで得られ（表９を参照のこと）；そして/又は
（vi）LASに対して耐性であり、すなわち同じ濁り度が、50及び200ppmのLASを伴なって、pH7、45℃での20分後に得られる（表11を参照のこと）。
【００２５】
特定の態様においては、脂肪分解酵素は、十分に定義されており、１つの腫瘍酵素成分のみが存在することを意味する。他においては、用語“十分に定義された”とは、１つの主要脂肪分解酵素成分のみが存在することを意味する。そのような十分に定義され、又は精製され、又は高く精製された脂肪分解酵素は、当業界において知られているようにして、及び/又は問題の特定酵素に関しての出版物に記載されるようにして得られる。適切なサイズ排除カラム上での十分に定義された酵素の分別は、問題の脂肪分解酵素である１つの主要酵素成分のみを表し；又は他方では、問題の脂肪分解酵素である主用脂肪分解酵素成分のみをあらわす。
【００２６】
主要ピークとして得られるピークに関しては、そのピーク領域は、合計ピーク領域/合計脂肪分解ピーク領域の少なくとも50、又は60、又は65、又は70、又は75、又は80、又は85、又は85、又は90、又は92、又は94、又は96、又は少なくとも98％に対応するべきである。
【００２７】
当業者は、適切なサイズ−排除クロマトグラフィーカラムをいかにして選択するかを良く知っている。当業者は、Amersham Biosciences UK Limited, Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire HP7 9NA, UKから入手できるHiLoad 26/60 Superdex 75pgカラム上での調製物の分別により開始する。ピークが明白に分離されない場合、当業者は、異なったカラム（例えば、補正されたカラム粒度及び/又はカラム長さを有する）で行ない、そして/又はサンプル体積を補正することができる。追加の詳細については、本明細書における例11を参照のこと。
【００２８】
さらなる特定の態様においては、脂肪分解酵素は、脱塩され、すなわち低分子量材料、例えば塩を実質的に有さない。ゲル濾過クロマトグラフィーは、適切な脱塩技法である。好ましいカラム材料は、1000以下のMrを有する分子からのMr：5000よりも大きなタンパク質/ペプチドのグループ分離を確保するSephadex G-25である。Mrは相対的分子質量（分子量）を表し、そして単位は、ドルトンである。適切なカラムは、Sephadex G-25Mにより充填される、Amershamから入手できるPD−10カラム、又はNAP5カラムである。その供給者により指図される標準方法が使用され、そして脱塩された水（MilliQ）が平衡化及び溶出のために使用される。
【００２９】
上記のようにして脂肪分解活性を決定するためには、十分には定義され、そして/又は脱塩された脂肪分解酵素調製物が好ましくは使用される。好ましくは、酵素調製物は、十分に定義されており、そして脱塩されている。本明細書における材料及び方法のセクションに記載されるように、脂肪分解活性試験を行なうためには、酵素調製物は、まず、0.15のA280に希釈される。
【００３０】
上記に定義されるような脂肪分解酵素の例は典型的には、酵素命名法（http://www. chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzymeから入手できる）に従っての、又は酵素命名法、1992（Academic Press, San Diego, California, with Supplement 1 (1993), Supplement 2 (1994), Supplement 3 (1995), Supplemento 4 (1997) and Supplement 5 (in Eur. J. Blochem. 1994, 223, 1-5: Eur, J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-6; Eur, J. Biochem. 1997, 250; 1-6, and Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650）からのEC3.1.1 Carboxylic Ester Hydrolasesに分類される酵素（カルボン酸エステル結合を加水分解できる酵素である）間に見出される。脂肪分解酵素、例えばEC3.1.1.3トリグリセロールリパーゼ又はEC3.1.1.74クチナーゼは、活性を有する基質特性を有することができる。
【００３１】
クチナーゼは、菌類に由来することができる。特に、クチナーゼは、ヒューミコラ（Humicola）の株、特にH.インソレンス（H. insolens）、より特定には、H.インソレンス株DSM1800（アメリカ特許第5,827,719号）、又はフサリウム（Fusarium）の株、例えばF．ロセウム  クルモラム（F．roseum culmorum）の株、又は特にF．ソラニ  ピシ（F．solani pisi）（WO90/09446号；WO94/14964号、WO94/03578号）に由来することができる。菌類クチナーゼはまた、リゾクトニア（Rhizoctonia）の株、又はアルテマリア（Altemaria）の株、例えばA．ブラシシコラ（A．brassicicola）(WO94/03578号)に由来することができる。脂肪分解酵素はまた、親クリナーゼ、例えばWO00/34450号又はWO01/92502号に記載されるそれらの変異体でもあり得る。
【００３２】
配列番号１は、ヒューミコラ・インソレンスクチナーゼのアミノ酸配列であり（アメリカ特許第5,827,719号の配列番号２の成熟部分に対応する）、そして配列番号２は、WO94/14964号の図１Dのフラリウム・ソラニ  ピシのアミノ酸配列である。
【００３３】
もう１つの例は、EC3.1.1.3により分類されるようなリパーゼである。より特定には、リパーゼは、シュードモナス（Pseudomonas）、例えばP. プチダ（P. putida）ATCC53552（WO88/09367号；WO89/09263号）、P. セペシア（P．cepecia）(アメリカ特許第4,876,024号)、P．メンドシナ（P．mendocina）(アメリカ特許第5,389,536号)、P．アルカリゲネス（P．alcaligenes）（アメリカ特許第6,313,283号）、P．グラジオリ（P．gladioli）(EP205208号)又はプソイドモナスsp. (アメリカ特許第5,942,431号)に由来する。脂肪分解酵素はまた、親リパーゼ、例えばEP0943678号、アメリカ特許第5,352,594号又はWO94/25578号に記載されるそれらの変異体でもあり得る。
【００３４】
もう１つの例は、カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica）(アメリカ特許第5,273,898号)からのリパーゼB、又はカンジダ・アンタルクチカ（アメリカ特許第5,273,898号）からのリパーゼB、例えばヒポザイマ（Hyphozyma）(アメリカ特許第5,856,163号)からのリパーゼに対して、少なくとも60％、特に65％、より特定には、70％、又は75％、又は80％、又は85％、又は90％、又は92％、又は95％、又は97％、又は少なくとも99％の相同性を有するアミノ酸配列を有する酵素である。このリパーゼは、配列番号３を有する。
【００３５】
もう１つの例は、配列番号１又は２に対して、少なくとも70％、特に75％、又は80％、90％、92％、95％、97％又は少なくとも99％の相同性を有するアミノ酸配列を有する酵素である。
【００３６】
本発明においては、相同性は、第２の配列からの第１の配列の誘導を示す２種の配列間の類似性の程度として決定される。類似性性は、コンピュタープログラムパッケージプログラム、たとえば引用により本明細書に組込まれる、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453において開示されるようなGCGプログラムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）に提供されるコンピュタープログラムGAPにより決定される。
【００３７】
GAPは、ポリペプチド配列比較のために次の設定を用いて使用される：3.0のGAP創造ペナルティー及び0.1のGAP延長ペナルティー。特定の態様においては、相同性は、前記プログラム及び上記に定義される設定を用いて、同一性の程度として決定され、この場合、本発明のためには、“相同性”は、“同一性”及び“相同の”並びに“同一の”により置換され得る。
【００３８】
紙製造工程：
本発明は、ａ）再循環された紙（リサイクル紙）を含んで成る材料からパルプを調製し；ｂ）酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマーを加水分解できる脂肪分解酵素により前記パルプを処理し；そしてｃ）前記処理されたパルプから紙を製造することを含んで成る、紙の製造方法に関する。
【００３９】
本発明に関しては、いずれかのタイプの紙製造工程が適切であり、そして/又はいずれかの紙製造パイプが、それが再循環紙を含んで成る限り、適用され得る。特定の態様においては、パルプの合計量に対する、再循環に基づくパルプの量は、少なくとも２％、又は少なくとも4％、又は少なくとも6％、又は少なくとも8％、又は少なくとも10％、又は少なくとも15、20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90又は少なくとも95％である。さらなる特定の態様においては、パルプの合計量に対する、再循環紙に基づくパルプの量は、25％よりも高くなく、又は30％、又は35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90又は98％より高くない。さらなる特定の態様においては、パルプの合計量に対する、再循環紙に基づくパルプの量は、上記の上限及び下限値に由来するいずれかの区間内にある。乾量は好ましくは、パルプの量を決定するために使用される。
【００４０】
再循環紙に由来しないパルプの部分は、機械的パルプ化、化学的パルプ化、及びそれらのいずれかの混合、例えば化学−機械的パルプ化、熱−機械的パルプ化、化学−熱−機械的パルプ化、等に由来することができる。
【００４１】
二次繊維としても知られている、再循環紙（又は故紙）を含んで成る材料からのパルプの調製に関しては、前記材料が水に混合され、分散され、又は懸濁される。これは、パルプ化として知られている工程である。それにより、インキ及び他の汚染物、例えば接着剤、塗料、等の少なくとも一部が繊維から放される。紙製造パルプはしばしば、再循環紙及び新しい、いわゆる未使用パルプの両者を含んで成る。パルプは、高い（約18％）、中位の（７〜18％）又は低い（7％以下）のコンシステンシーを有することができる。特定の態様においては、本発明の方法及び使用は、高い、中位の又は低いパルプコンシステンシーで操作される。
【００４２】
再循環繊維の源は、当業界において知られている再循環組成の品種又はその混合物、及び再循環繊維と未使用繊維との混合物のいずれかであり得る。再循環繊維組成の主要品種は例えば、MOW（混合された事務用廃棄物）、SOW（分類された事務用廃棄物）、ONP（古い新聞用紙）、WM（廃棄雑誌）及びOCC（古いダンボール容器、等）である。
本発明の方法及び使用への使用のための脂肪分解酵素は、本明細書における“脂肪分解酵素”のセクションに開示される。
【００４３】
用語“パルプの処理”とは基本的に、パルプに問題の酵素を添加することを意味する。処理の条件は、特定の紙製造工程パラメーター又は必要条件、及び問題の酵素の特徴、例えばpH−活性及びpH−安定性範囲、温度活性及び温度安定範囲、加水分解の速度、等に依存して変化することができる。処理条件の例は、本明細書における“加工条件”のセクションに記載されている。特定の態様においては、その条件は、粘着物の量を減じるために、及び/又はインキ抜きを得るために適切である（下記参照のこと）。
処理されたパルプからの紙の製造は、紙又は板紙製品への酵素処理された繊維の形成を含んで成る。
【００４４】
上記段階ａ）〜ｃ）の他に、任意の段階、例えば次の段階の１又は複数の段階が包含され得る：
ｄ）例えば、任意には過酸化物化合物、例えば過酸化水素を含むアルカリ水溶液の存在下で繊維をパルプ化することによるインキ抜き；
ｅ）例えばスクリーニング（粗大及び/又は微細）による汚染物からの繊維の分離；
ｆ）遠心分離清浄；
ｇ）例えば、１又は複数の界面活性剤を用いての浮選；
ｈ）例えば、１又は複数の界面活性剤を用いての洗浄；
ｉ）例えば、１又は複数の界面活性剤を用いての分散；及び/又は
ｊ）必要なら、例えば熱処理段階による酵素の不活性化。
【００４５】
いずれかの数のそれらの追加の段階が包含され得る、そしてその順序は示されるa-b-c-d-e-f-g-h-i のようにある必要はない。特定の態様においては、段階ｄ）及び/又はj)が包含される。本明細書において定義されるような脂肪分解酵素は、好都合には、インキ抜き段階ｄ）においても使用され得る。
【００４６】
酵素は、パルプ化の前、パルプ化段階の間、素材調製段階の間又は前、好ましくはその段階の直前、又は浮選又はインキ抜き段階の後に導入され得る。特定の態様においては、それは紙用機械のヘッドボックスに、又は紙用機械の白水に導入される。
工程は、閉ループ工程であり得る（水の少なくとも１部が再使用され、例えば水の少なくとも10％, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70又は少なくとも80％が再使用される（体積/体積）。
【００４７】
本発明の方法及び使用のさらなる特定の態様においては、酵素は粘着物の調節目的にかなう。粘着物の調節とは、粘着物の量が、酵素により処理されない対照に比較して、低められることを意味する。好ましい態様においては、問題の酵素により処理されたサンプルにおける粘着物の量は、対照に比較して、最大95％、又は90％、又は80％、又は75％、又は70％、又は60％、又は50％、又は40％、又は30％、又は最大20％（w/w）である。WO01/98579号の例１〜６に開示される方法のいずれかが、この決定のために使用され得る。
【００４８】
本発明の方法及び使用のさらなる態様においては、酵素は、インキ抜きの目的にかなう。酵素は、いずれかのプリント方法、例えばオフセット印刷、グラビア印刷及び凸版印刷により製造されるプリントを有する再循環紙をインキ抜きにするために適用され得る。酵素の効果は、得られる紙の白色度又は光沢を改良し、そして/又はそのインキの量を低めることである。これは、例えば日本特許第96014078号に開示されるように、当業界において一般的に知られているようにして測定され得る。
【００４９】
未使用パルプに存在するグリセリドは、粘着物における再循環製紙用パルプからの酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマーと凝集する傾向がある。従って、もう１つの例においては、本発明の方法は、酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマーを加水分解できる脂肪分解酵素、及びグリセリドにおけるエステル結合を加水分解できるリパーゼ、例えばEC3.1.1.3.により分類されるそれらを含んで成ることができる。
【００５０】
従って、本発明の方法及び使用は、広範囲の汚染物、例えばタンパク質汚染物、スターチ含有不純物、トリグリセリド含有不純物、及びヘミセルロース及びペクチンを含む汚染物に対して酵素工程を効果的にするために、酵素の組合せを用いて行なわれ得る。従って、本発明の使用のための脂肪分解酵素は、中でも、プロテアーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、リパーゼ、ヘミセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、クチナーゼ及びペクチナーゼから選択された少なくとも１つの追加の酵素と組み合わされ得る。それらの酵素は、野生型酵素、又は適切な活性を有する、すなわち適切な酵素種類についての次のウェブサイト：http://www. expasy.ch/enzyme/.で示される反応の少なくとも１つを触媒する前記野生型酵素の変異体であり得る。
【００５１】
適切なプロテアーゼの例は、ALCALASE, ESPERASE, SAVINASE, NEUTRASE及びDURAZYMプロテアーゼである。他の好ましいセリン−プロテアーゼは、ノカルジオプシス（Nocardiopsis）、アスペルギラス（Aspergillus）、リゾパス（Rhizopus）、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alcalophilus）、B．セレウス（B．cereus）、B．ナットー（B．natto）、B．バルガタス（B．vulgatus）、B．マイコイド（B．mycoide）からのプロテアーゼ、バチルスからのスブチリシン、特にノカルジオプシスsp. 及びノカルジオプシス・ダソンビレイ（Nocardiopsis dossonvillei）からのプロテアーゼ；例えばWO88/03947号に開示されるそれらの酵素、特にノカルジオプシスsp., NRRL18262及びノカルジオプシス・ダソンビレイ、NRRLは133からのプロテアーゼである。
【００５２】
さらに他の好ましいプロテアーゼは、バチルス・サブチリスの変異体からのセリンプロテアーゼ、例えばWO91/00345号及びEP415298号に開示されるそれらである。適切なアミラーゼの例は、BAN, AQUAZYM, TERMAMYL及びAQUAZYM Ultraアミラーゼである。リパーゼの例は、RESINASE A2Xリパーゼである。ヘミセルラーゼの例は、PULPZYME HCヘミセルラーゼである。エンドグルカナーゼの例は、NOVOZYM613、342及び476酵素製品である。ペクチナーゼの例は、NOVOZYME863酵素製品である。プルラナーゼの例は、PROMOZYMプルラナーゼである。大文字で書かれた酵素は、Novozymes A/S, Krogshoejvej36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmarkから市販されている酵素である。
【００５３】
特に、本発明の方法は、紙に及び/又はその上に存在する酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマーに基づいて使用され得る。より特定には、それは、粘着物に関する問題を減じるために、再循環紙の製紙用パルプにおける、酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマーを加水分解するために使用され得る。他方では、それは、ラベル、例えば郵便及びボトルラベルを除去するために使用され得る。もう1つの例においては、本発明の方法は、紙の再循環の間、粘着物調節のためであり得る。本発明の方法は、撹拌又は機械的撹拌により行なわれ得る。
【００５４】
加工条件：
紙の製造方法、及び本明細書において定義されるような少なくとも１つの脂肪分解酵素の紙製造への使用に関しては、問題の脂肪分解酵素は、上記に記載されるほど純粋である必要はない。第１に、それは十分に定義された酵素調製物である必要はない。第２に、酵素調製物は、脱塩された酵素調製物でなくても良い。
しかしながら、特定の態様においては、酵素調製物は十分に定義されている。これは主に、十分に定義された調製物が、例えばコンシステンシー及び結果の再現性に関して、好都合であるからである。
【００５５】
加工条件は、適用される酵素、反応時間及び与えられる条件の機能であろう。一般的に、酵素は、製紙用パルプに存在する粘着物を調節するのに十分の量で投与される。しかしながら、酵素は、酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマー１g当たり0.1〜5000単位、特に酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマー１g当たり0.5〜1000単位、より特定には酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマー１g当たり１〜500単位の合計量で投与されることが企画され、ここで1単位は、上記に記載されるようにPVAc加水分解活性を言及する。
【００５６】
特定の態様においては、脂肪分解酵素の用量は、製紙用パルプ１トン当たり約100〜約100.000単位である。特定の態様においては、それらの単位は、（ｉ）PVAc加水分解活性；（ii）酢酸ビニルエチレンコポリマーに対する活性；又は（iii）酢酸ビニルtert−デカン酸、エテニルエステルコポリマーに対する活性（本明細書において特定される方法を用いて）を言及する。
【００５７】
好ましい態様においては、単位は、（ｉ）PVAc加水分解活性を言及する。特定の用量範囲（すべて、“約〜から、約〜まで”、及び製紙用パルプ１トン当たりの単位）の追加の例は、次の通りである：200-100.000; 400-100.000; 600-100.000; 800-100.000; 1000-100.000; 1200-100.000; 1500-100.000; 2000-100.000; 100-90.000; 100-80.000; 100-70.000; 100-60.000; 100-50.000; 100-40.000; 100-30.000; 100-20.000; 100-10.000; 及び本明細書に示される上限値及び下限値の組合せ。
【００５８】
他の特定の態様においては、脂肪分解の酵素の用量は、製紙用パルプ１トン当たり、約0.1mg〜約100.000mgの酵素タンパク質である。酵素タンパク質は、本明細書における例11に記載のようにして決定され得る。特定の用量範囲（すべて、“約〜から、約〜まで”、及び製紙用パルプ１トン当たりの単位）の追加の例は、次の例である：0.5-100.000; 1-100.000; 5-100.000; 10-100.000; 20-100.000; 40-100.000; 80-100.000; 100-100.000; 150-100.000; 200-100.000; 500-100.000; 0.1-90.000; 0.1-80.000; 0.1-70.000; 0.1-60.000; 0.1-50.000; 0.1-40.000; 0.1-30.000; 0.1-20.000; 0.1-10.000; 0.1-8.000; 0.1-6.000; 0.1-4.000; 0.1-2.000; 0.1-1.000；及び本明細書に示される上限値及び下限値のいずれかの組合せ。
【００５９】
酵素処理は、約10〜約100℃の温度で行なわれ得る。温度範囲（すべて、“約〜から約〜”）の追加の例は、次の通りである：20-100, 30-100, 35-100, 37-100, 40-100, 50-100, 60-100, 70-100, 10-90, 10-80, 10-70, 10-60及び30-60℃及び本明細書に示される上限値及び下限値のいずれかの組合せ。
【００６０】
酵素処理は、約２〜約12のpHで行なわれ得る。pH範囲（すべて、“約〜から約〜”）の追加の例は次の通りである：3-12, 4-12, 5-12, 6-12, 7-12, 8-12, 9-12, 2-11, 2-10, 2-9, 2-8, 4-10, 5-8及び本明細書に示される上限値及び下限値のいずれかの組合せ。
酵素処理の適切な持続時間は、数秒〜数時間、例えば約30秒〜約42時間、又は約１分〜約24時間、又は約１分〜約18時間、又は約１分〜約12時間、又は約１分〜５時間、又は約１分〜約２時間、又は約１分〜約１時間、又は約１分〜約30分の範囲で存在する。
【００６１】
添加剤：
脂肪分解酵素に対する及びその酵素上の種々の添加剤が、本発明の方法又は使用に使用され得る。例えば、タルク、クレー及び他の無機粒子が粘着物を低い粘性にするために使用され得、そして分散剤、界面活性剤及び溶媒が、粘着物のサイズを低め、そして/又はそれらを分散又は懸濁のまま保持するために使用され得る。
【００６２】
界面活性剤及び/又は分散剤はしばしば、製紙用パルプに存在し、そして/又はそれに添加される。従って、本発明方法は、製紙パルプに通常使用されるアニオン性、非イオン性、カチオン性及び/又は両性イオン性界面活性剤及び/又は分散剤の存在下で行なわれ得る。酢酸ビニルモノマー−を含んで成るポリマーを加水分解できる酵素は、製紙用パルプに従来使用されるか、又は織物の洗浄の間、アニオン性、カチオン性及び/又は両性イオン性界面活性剤及び/又は分散剤の存在下で活性的であり、そして安定性である酵素であり得る。
【００６３】
アニオン性界面活性剤の例は、アルキル、置換されたアルキル又はアリールのカルボキシレート、スルフェート、スルホネート又はホスフェートである。非イオン性界面活性剤の例は、ポリオキシエチレン化合物、例えばアルコールエトキシレート、プロポキシレート又は混合されたエトキシ−プロポキシレート、ポリグリセロール及び他のポリオール、並びに一定のブロック−ポリマーである。
【００６４】
カチオン性界面活性剤の例は、水溶性カチオン性ポリマー、例えば第四アンモニウムスルフェート及び一定のアミン、例えばエピクロロヒドリン/ジメチルアミンポリマー（EPI−DMA）及び架橋されたその溶液、ポリジアリルジメチルアンモニウム塩化物（DADMAC）、DADMAC/アクリルアミドコポリマー、及びイオネンポリマー、例えばアメリカ特許第5,661,662号及び第5,575,993号に開示されるそれらである。両性界面活性剤の例は、ベタイン、グリシネート、アミノプロピオネート、イミノプロピオネート及び種々のイミダゾリン誘導体である。また、アメリカ特許第5,256,252号に開示されるポリマーが使用され得る。
【００６５】
また、本発明によれば、界面活性剤、例えば上記の界面活性剤、例えばそれらのいずれかの組み合わせが、紙製造工程において、本明細書に定義されるような少なくとも１つの脂肪分解酵素と一緒に使用され得、そしてそのような酵素と共に組成物に包含される。そのような組成物における界面活性剤の量は、組成物の約８〜約40％（w/w）である。特定の態様においては、個々の界面活性剤の量は、約10〜約38、又は約12〜約36、又は約14〜約34、又は約16〜約34、又は約18〜約34、又は約20〜約34、又は約22〜約34、又は24〜約34、又は26〜約34、又は約28〜約32％（w/w）である。
【００６６】
もう１つの特定の態様においては、上記範囲の個々は、合計量の界面活性剤を言及する。
組成物は好ましくは、紙の製造のための添加剤である。特定の態様においては、それらは非−構成組成物であり、すなわちそれらはビルダーを含まない。ビルダーの例は、従来、洗剤組成物のために使用される、一定のホスフェート、ゼオライト、等である。
【００６７】
組成物は、次の酵素群から選択された少なくとも１つの追加の酵素を含んで成る：プロテアーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、リパーゼ、ヘミセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、ペクチナーゼ及びクチナーゼ；及びそれらのいずれかの組合せ。
組成物は、例えばアメリカ特許第5,356,800号；第5,780,283号に記載される配合物を用いて安定化され得る。
【００６８】
本発明はまた、次のものにも関する：
（I）クチナーゼにより処理することによって、酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマーを加水分解するための方法；クチナーゼが菌類に由来する上記方法；クチナーゼがヒューミコラ・インソレンス又はフサリウム・ソラニ  ピシに由来する上記方法；シュードモナスに由来するリパーゼにより処理することによって、酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマーを加水分解するための方法；カンジサ・アンタルクチカのリパーゼB（配列番号３）に対して少なくとも60％の相同性を有するアミノ酸配列を有するリパーゼにより処理することによって、酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマーを加水分解するための方法；配列番号１又は２に対して少なくとも70％の相同性を有するアミノ酸配列を有する脂肪分解酵素により処理することによって、酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマーを加水分解するための方法；
【００６９】
（II）50mMのNaCl, 0.5mMのKH2PO4、９％（v/v）グリセロール及び0.1％（w/v）アラビアゴムから成るエマルジョンにおいて基質として酢酸ビニルを含んで成る5％（w/v）ポリマー調製物による35℃、pH8で４分の加水分解活性を有する酵素により、酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマーを処理することより、そのポリマーを加水分解するための方法；及び
【００７０】
（III）紙の製造への酵素の使用、前記酵素は、次のものを有し：
ａ）分散されたPVAc基質上での45℃で18時間後、少なくとも0.1の毛管電気泳動による加水分解の程度、ここで前記分散されたPVAc基質がpH6又は８で40mlの緩衝液中に、メタノール中、6％PVAc1.5mlを注入することによって調製され、そして前記PVAcの分子量が約12800である；及び/又は
【００７１】
ｂ）50mMのNaCl, 0.5mMのKH2PO4、９％（v/v）グリセロール及び0.1％（w/v）アラビアゴムから成るエマルジョンにおいて基質として酢酸ビニルを含んで成る5％（w/v）ポリマー調製物による35℃で４分の加水分解活性、ここで前記ポリマーは、
（i）PVAcホモポリマー調製物であり、そして反応pHは8であり；
（ii）酢酸ビニルエチレンコポリマー調製物であり、そして反応pHは７であり；そして/又は
（iii）酢酸ビニルtert−デカン酸、エテニルエステルコポリマー調製物であり、そして反応pHは7である；
【００７２】
並びに上記（iii）の使用、ここで（ｉ）の条件下での加水分解活性は0.2単位よりも高く、好ましくは0.4単位よりも高く、さらにより好ましくは0.6単位よりも高く；前記酵素は少なくとも0.7単位/mlのPVAc加水分解活性を有し；
（ii）の条件下での加水分解活性は少なくとも0.2単位/mlであり；
（iii）の条件下での加水分解活性は少なくとも0.2単位/mlであり；
【００７３】
ａ）に従っての加水分解の程度の決定に関して、及び段階（ｉ）−（iii）のいずれか１つの段階に従っての加水分解活性に関して、酵素は十分に定義されており；ａ）に従っての加水分解の程度の決定に関して、及び段階（ｉ）−（iii）のいずれか１つの段階に従っての加水分解活性に関して、酵素は脱塩されており；
【００７４】
段階（ｉ）−（iii）のいずれか１つの段階に従っての加水分解活性の決定に関しては、A280＝0.15の酵素溶液200μl、又は酵素タンパク質50μgが、15mlの基質エマルジョンに添加され；粘着物調節及び/又は紙の製造に関しては、再循環紙に基づいて少なくとも部分的に調製され；紙の製造に関しては、酵素用量は、酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマー1g当たり0.1〜5000単位のPVAc加水分解活性であり；製紙用パルプ１トン当たりの酵素用量は、（III）の（ｉ）によれば約100〜約100.000単位であり；
【００７５】
又は（ii）によれば、約0.1〜約100.000mgの酵素タンパク質であり；酵素はLAS及び/又は過酸化水素の存在下で活性的であり、且つ安定性であり；次の酵素群から選択された少なくとも１つの追加の酵素の使用をさらに包含し：プロテアーゼ、アミラーゼ、プルラナーゼ、リパーゼ、ヘミセルラーゼ、エンドグルカナーゼ、ペクチナーゼ及びクチナーゼ；そして/又は少なくとも１つのアニオン性、非イオン性、カチオン性及び/又は両性界面活性剤及び/又は分散剤の使用をさらに含んで成る。
【００７６】
本明細書及び特許請求の範囲に記載される発明は、本明細書に開示される特定の態様は本発明のいくつかの観点を例示しているので、それらの態様により本発明を限定するものではない。いずれかの同等の態様は、本発明の範囲内にある。実際、本明細書に示され、そして記載されるそれらの他に、本発明の種々の修飾が前述の記載から当業者に明らかに成るであろう。そのような修飾はまた、本発明の範囲内にある。抵触の場合、定義を包含する本発明の開示は、調整されるであろう。
【００７７】
種々の文献が本明細書に引用され、その開示は、引例により本明細書に組み込まれる。
材料及び方法：
【００７８】
酵素：
A）アメリカ特許第5,827,719号に従ってのヒューミコラ・インソレンスからのクチナーゼ。
B）A)の熱安定性変異体。
C)WO00/34450号に従ってのA）の熱安定性変異体。
D)WO94/14964号に従ってのフサリウム・ソラニ  ピシからのクチナーゼ。
E)アメリカ特許第5,273,898号に従ってのカンジダ・アンタルクチカからのリパーゼB。
F)アメリカ特許第4,876,024号に従ってのシュードモナス・セパシアからのリパーゼ。
G)アメリカ特許第5,942,431号に従ってのシュードモナスsp. からのリパーゼ。
【００７９】
H)ブタ膵臓からのホスホリパーゼ。
I)NOVOCOR ADLリパーゼ。
J)RESINASE A 2Xリパーゼ。
K)WO00/32758号に従ってのリパーゼ及びホスホリパーゼ活性を有するJ)の変異体。
L)アスペルギラス・ニガーからのフェルラ酸。
NOVOCOR AOL及びRESINASE A 2Xリパーゼは、Novozymes A/S, Krogshoejvej36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmarkから入手できる市販の酵素製品である。
下記表Aに表されるヒューミコラ・インソレンスクチナーゼの変異体は、WO00/34450号及びWO01/92502号に記載のようにして調製され、そして次に記載のようにして脂肪分解活性について試験された。それらの２種の変異体についての試験結果が、B)及びC)として例に示される。
【００８０】
【表１】
0004643125.tif 000002
【００８１】
【表２】
0004643125.tif 000003
【００８２】
試薬/基質：
0.025MのNaOH。
5mMのMES緩衝液、pH6−6.5：
0.98gのMES  ２−［N−モルホリノ］エタンスルホン酸水和物、
0.44gのCaCl2・2H2O、
0.246gのMgSO4・7H2O、
Milli Q水が１Lまで添加される、
pHが弱NaOH又はHClにより調節される。
【００８３】
5mMのHepes緩衝液、pH7−9：
1.19gのHepes（N−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−N’−［２−エタンスルホン酸］）、
0.44gのCaCl2・2H2O、
0.246gのMgSO4・7H2O、
Milli Q水が１Lまで添加される、
pHが弱NaOH又はHClにより調節される。
【００８４】
メタノール溶液中、６％（w/v）ポリ（酢酸ビニル）PVAc：
6gのPVAc、Mw＝12800（GPC）（Aldrich Chemical Company. Inc. カタログ番号43,043-9） が約50℃で約80mlノメタノールに溶解される。冷却する。メタノールが100mlまで添加される。
メタノール溶液中、２％（w/v）ポリ（酢酸ビニル）PVAc：
2gのPVAc、Mw＝113000（Aldrich Chemical Company. Inc. カタログ番号18.948−0）が約50℃で約80mlのメタノールに溶解される。冷却する。メタノールが100mlまで添加される。
LAS（LAS Nansa 1169A, ドデシルベンゼンスルホネートナトリウム塩、Albright & Wilson）。
【００８５】
エマルジョン試薬：
17.9gのNaCl、
0.41gのKH2PH4、
540mlのグリセロール、
6.0gのアラビアガム。
NaCl、 KH2PO4, グリセロール及び400mlのDI水を、強い撹拌下で、アラビアガムが添加される前、混合する。撹拌を、それが完全に溶解されるまで続ける。DI水を１Lまで添加する。
【００８６】
例１〜３についての基質エマルジョン：
15gのPVAｃホモ又はコポリマー（Gludan, Denmark）(それぞれ、例１及び例２−３)、
50mlのエマルジョン試薬、
235mlのDI水。
溶液を、すべての基質が溶解されるまで、約30分間、撹拌する。
【００８７】
装置：
滴定器：Rediometer Titralab (Vit90)。
電極：Onon 8103 Ross−半微小組合せpH電極、ガラス本体。
濁り度測定機：装置を固定する特定のガラス（サンプルセル番号20849-00）を包含する、USEPAフィルター（カタログ30312−00）を備えたHACH濁り度測定機2100AN。
水浴：磁気撹拌器（楕円形の撹拌棒、15mm）を含む水浴。
水浴：温度調節を有する水浴。
【００８８】
フィルター：0.22μmのフィルター（MilliporeによるMillex-GV単一使用フィルター）。
毛管電気泳動：Chemstationソフトウェアを備えたHewlett Packard 3D CE。
Agilent緩衝液：HPCEのためのAgilent塩基性アニオン緩衝液、Part. NO. 5064-8209。
Agilent capillar: Agilent、 融合シリカ、CE ext. 光経路能力、内径50μm、有効長104cm、合計長112.5cm、Part. no. G1600-64232。
張力計：白金Witheimyプレート（寸法、10mm×20mm）溶液の温度調節及び撹拌を備えたKSV Sigma 70 Model 6000。
【実施例】
【００８９】
例１−３．
酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマー調製物を、酵素によるアセテートの開放下で、一定のpHで加水分解する。時間の関数としてのアセテートの塩基による中和によっての開放性を、pH−安定装置滴定により測定する。
【００９０】
滴定器（装置を参照のこと）のスイッチを入れ、水浴を35℃に設定し、そして電極を、通常の検量緩衝液を用いて目盛を定める。15mlの基質エマルジョンを、個々のビーカーに添加し、そして３時間、加熱し、正しい温度を得る（基質は、沈殿を回避するために使用の前、すべての時間で撹拌されるべきである）。pHを、新しく製造され、希釈された水酸化ナトリウム溶液（25mM）により調節する。酵素溶液（脱イオン水中）を、酵素A)〜L）に対応する、高く精製され、そして脱塩された酵素に基づいて調製する。その溶液はA280＝0.15の吸光度に対応し、その200μlを基質エマルジョンに添加し、そして滴定を、25mMの水酸化ナトリウムを用いて開始する。４分後、滴定を停止する。ml/分でのNaOHの平均消費を、２〜４分の間、計算し、そしてこの値を、下記単位計算のために使用する。
【００９１】
１単位の酵素は、所定の条件下での基質の加水分解により、１μモルの滴定できるアセテートの１分当たりの開放する酵素の量として定義される。下記表に示されるような単位/mlは、A280＝0.15の酵素溶液のmlを言及する。
【００９２】
例１．PVAcホモポリマーの加水分解
異なった脂肪分解酵素のPVAcホモポリマー調製物を分解する能力を、上記のようにして測定した。基質エマルジョンへの酵素の添加の前、pHを８に調節した。結果は表３に示される。
【００９３】
【表３】
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【００９４】
例２．酢酸ビニルコポリマーの加水分解
酢酸ビニル及びエチレンから成る酢酸ビニルコポリマー調製物を分解する脂肪分解酵素の能力を、上記のようにして測定した。基質エマルジョンへの酵素の添加の前、pHを７に調節した。結果は表４に示される。
【００９５】
【表４】
0004643125.tif 000005
【００９６】
例３．ラテックス基材の酢酸ビニルコポリマーの加水分解
酢酸ビニル及びtert−デカン酸、エテニルエステルから成る酢酸ビニルコポリマー調製物を分解する脂肪分解酵素の能力を、上記のようにして測定した。基質エマルジョンへの酵素の添加の前、pHを７に調節した。結果は表５に示される。
【００９７】
【表５】
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【００９８】
例４−10．
例４〜10においては、PVAcとして短縮される純粋なポリ（酢酸ビニル）を、基質として使用する。PVAcは水に不溶性であるが、しかしメタノールにはそうではない。メタノールに溶解された少量のPVAcが水中に注入される場合、PVAcは非常に小さな粒子においては、瞬時に沈殿し、そして液体は濁り始める。それらの粒子は、それらの粘着性のために、より大きな粒子に凝集する傾向があり、低められた濁り度をもたらす。酵素が脂肪分解活性（例えば、PVAc加水分解活性）を示す場合、この凝集の妨げられ得る。従って、脂肪分解酵素の効果は、時間の関数としてPVAc分散液の濁り度として直接的に測定される。濁り度は、NTU−単位（比濁法濁り度単位）で測定される。低い数値は、サンプルが透明であることを示し、そして高い数値は、サンプルが濁っている（すなわち、酵素が粘着性を低めるよう作用する）ことを示す。それらの例においては、酵素用量は、ppm（w/w）の酵素タンパク質で与えられる。
【００９９】
例４．PVAcを凝集する能力
撹拌棒及び緩衝液30mlを、グラスに添加する。そのグラスを水浴に置き、そして予定された温度まで調節する。磁気撹拌機の速度を一定に維持する。添加される酵素溶液の体積に対応する緩衝液の量を除去する（体積が一定であることを確保するために）。酸素を添加する。エタノール溶液中、0.15mlの２％（w/v）PVAc（Mw＝113000）を注入し、そしてタイマーを開始する。10秒間の撹拌の後、時間＝０での濁り度を決定する。時間の関数として濁り度を測定する。
それぞれ、35, 45又は55℃、及びpH＝８での10ppmの酵素B)を用いての結果（5mMのHepes緩衝液を用いる）は、それぞれ下記表６〜８に示される。
【０１００】
【表６】
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【０１０１】
【表７】
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【０１０２】
【表８】
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【０１０３】
表９は、5mMのHepes緩衝液を用いて、45℃、pH＝８での２種の脂肪分解酵素についての用量−応答を示す。濁り度は、20分後に測定された。数値は、３回の実験の平均である。
【０１０４】
【表９】
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【０１０５】
表10は、pHに対する脂肪分解酵素の効果を示す（45℃：20分後の濁り度；酵素用量、10ppmの酵素B）。数値は、３回の実験の平均である。
【０１０６】
【表１０】
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【０１０７】
例５．過酸化水素に対する耐性
例４におけるのと同じで組立てを用いた。濁り度は、20分後に測定されるが、しかし15ppmの過酸化水素が、異なった酵素用量レベルの酵素B)に一定レベルで添加された（温度48℃、pH8.5、5mMのHepes緩衝液を用いる）。結果は、下記表11に示される。
【０１０８】
【表１１】
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【０１０９】
もう１つの実験においては、一定の酵素用量レベルの0.5ppmの酵素B)を、種々のレベルの過酸化水素（0−1000ppm）と組合した。結果は、下記表12に示される。
【０１１０】
【表１２】
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【０１１１】
例６．LAS（線状アルキルベンゼンスルホネート）に対する耐性
例４におけるのと同じ組立てを用いた。緩衝液5mMのHepes, pH=７；45℃；濁り度は、20分後に測定された。２種の異なったレベルのLASをアッセイに添加した：50及び200ppm．結果は、下記表13に示される。
【０１１２】
【表１３】
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【０１１３】
例７．酢酸ビニルホモポリマーの加水分解の程度の測定
酢酸ビニルモノマーを含んで成るポリマーの加水分解（脱アセチル化）の程度を、溶液中に開放されるアセテートの検出により測定することができる。低濃度でのアセテートが、毛管電気泳動分析により検出され、そして定量化され得る。
5mMのHepes（pH＝８）40mlを、加熱された水浴上での閉三角フラスコにおいて50℃に加熱する。酵素を、下記表に従っての量で緩衝液中に投与する。次に、メタノール中、6％（w/v） PVAc (Mw=12800)を、下記表に従っての量で緩衝液中に注入する。サンプルを、18時間後に採取し、そして0.22μmのフィルターを通して濾過する。それらのサンプルにおけるアセテートの量を、Agilent緩衝液を用いて、毛管電気泳動により検出し、そしてAgilent capillarを使用する（装置の列挙を参照のとこ）。
【０１１４】
プログラム：温度30℃、電圧−30kV、緩衝液による４分のフラッシュ、50mバールでのサンプルの注入、６秒、50バールでの緩衝液の注入、10秒、20分間の溶出、検出シグナル：350/20nm, 参照シグナル：275/10nm。
アセテート標準曲線：０〜450ppmのアセテートを同時に展開する。アセテートピークを統合し、そしてサンプルにおける量を、標準曲線に比較して決定する。PVAcの加水分解の程度を、最初からのフラスコにおける酢酸ビニルモノマーの正確な量を計算することによって決定する。酢酸ビニルは、86g/モルのMwを有する。
【０１１５】
1.5mlのPVAc溶液の注入を伴なっての実験１〜６に関しては、計算は次の通りである：
（0.0015L＊60gのVAc/L）/（86g/モル＊0.0415L）＝2.522＊10-2モル/L
結果は下記表14に示される。１％の加水分解の程度は、2.522＊10-4モル/L＝15.1mg/L＝15.1ppmのアセテート濃度をもたらすであろう。実験１〜６に関しては、加水分解の程度（％）は、15.1ppmのアセテートに対応する１％の加水分解に対して計算される。実験７−12に関しては、計算は、29.2ppmのアセテートに対応する１％加水分解を与える。
【０１１６】
【表１４】
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【０１１７】
例８．異なったpH及び濃度での酢酸ビニルホモポリマーの加水分解の程度の測定
この例は、正確に例７のようにして行なわれたが、但し異なった条件、すなわち5mMのMES緩衝液を用いて、pH＝６、又は5mMのHepes緩衝液を用いて、pH＝８で、35℃、45℃及び55℃で行なわれる。結果は下記表15に示される。
【０１１８】
【表１５】
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【０１１９】
例９．金属上でのPVAc凝集体の沈着の防止
PVAc凝集体は、フェルトを形成し、フェルトを圧縮し、等のために使用される金属及び疎水性材料のような異なった表面に沈殿し、そしてそれに付着する高い傾向を有する。本明細書に記載される脂肪分解酵素は、PVAc含有溶液に添加される場合、それらの粘着物の形成を妨げるであろう（凝集体はガラス表面に付着しない）。
【０１２０】
200mlの5mMのHepes緩衝液（pH＝８）を、45℃に加熱する。10ppmの酵素Bを、１つのビーカーに添加する。酵素添加を有さないビーカーを同時に、酵素ブランクとして行なう。撹拌を、ガラス被覆された磁石により行なう。金属表面を、その溶液中に浸す。メタノール溶液中、4mlの２％（w/v）PVAc（Mw＝113000）を、前記溶液中に注入する。実験を、10分後に停止する。
金属表面の写真は、図１として添付される。左側の棒は添加された酵素Bを伴なっての実験に関し、そして右側の棒は、添加された酵素を伴なわない対照実験に関する。左側の棒の表面はきれいに見え、ところがPVAc溶液は濁ったままである。対照的に、対照実験（右側の棒）は、金属表面に付着するPVAc凝集体を示し、そして周囲の溶液は透明になる。
【０１２１】
例10．金属表面上でのPVAc沈着の防止
金属表面上での凝集体の沈着は、十分に定義された表面上での質量摂取として定量化される。このためには、Wilhelmyプレートを備えた張力計が適用され得る。張力計は、２分ごとにPVAcの溶液中にプレートを全体的にゆっくりと含浸した後、Wilhelmyプレートの重量上昇を測定するように作動される。10分後の重量が決定される。
【０１２２】
Wilhelmyプレートを、エタノールに含浸し、そしてガスバーナー炎において熱することによって清浄する。きれいなプレートを、張力計電気バランス上に置く。5mMのHepes緩衝液（pH＝8）100mlを、張力計ビーカーにおいて所望する温度（35℃又は45℃）に加熱する。酵素を添加する。
メタノール溶液中、2mlの２％（w/v）PVAc（Mw＝113000）を注入する。Wilhelmyプレートの上下運動を開始する。10分後、プレートの重量を決定する。低い重量摂取は、PVAc沈着の防止を示す。それぞれ35及び45℃の温度が得られる結果は、それぞれ表16及び17に示される。
【０１２３】
【表１６】
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【０１２４】
【表１７】
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【０１２５】
例11．脂肪分解酵素の純度の決定
酵素サンプル中のタンパク質濃度を、PIERCE（PIERCEカタログ番号23225と同一である）からのBCAタンパク質アッセイキットにより決定する。ビシンコニン酸（BCA）のナトリウム塩は、アルカリ環境下で、第一銅イオン（Cu1+）と濃紫色の複合体を形成することができる安定した、水溶解性化合物である。BCA試薬は、アルカリCu2+とタンパク質との反応（ビューレット反応）において生成される第一銅イオンをモニターできるBCAタンパク質アッセイキットの基礎を形成する。この反応から生成される着色物は安定し、そして上昇するタンパク質濃度と比例して上昇する（Smith, P.K., など. (1985), Analytical Biochemistry, Vol. 150, pp. 76-85）。
【０１２６】
BCA使用溶液を、１部の試薬Bと50部の試薬Aとを混合することによって製造する（試薬Aは、PIERCEカタログ番号23223であり、アルカリ炭酸塩緩衝液中、BCA及びタルトレートを含み、試薬Bは、PIERCEカタログ番号23224であり、４％CuSO4・5H2Oを含む）。300mlのサンプルを、3.0mlのBCA使用溶液と共に混合する。37℃で30分後、サンプルを室温に冷却し、そしてA480を、サンプルにおけるタンパク質濃度の測定として読み取る。ウシ血清アルブミン（PIERCEカタログ番号23209）の希釈溶液が、標準としてアッセイに包含される。
【０１２７】
脂肪分解酵素が固体形上に存在する場合、生成物はまず、100mMのH3BO3、10mMの3, 3’−ジメチルグルタル酸、2mMのCaCl2、pH6（緩衝液A）20体積に、5℃で少なくとも15分間、溶解され/懸濁され、そしてこの段階での酵素が懸濁液である場合、その懸濁液は、0.45μmのフィルターを通して濾過され、透明な溶液が得られる。溶液は、この点から、液体脂肪分解酵素として処理される。
脂肪分解酵素が液体である場合、生成物はまず、100体積の緩衝液A＋150mMのNaCl（緩衝液B）に対して、６〜8000DaカットオフSpectraPor透析管（Spectrum Medical Industriesからのカタログ番号132670）において、5℃で少なくとも5時間、透析し、サイズ排除クロマトグラフィーに対して有害である、高い粘度に上昇せしめる配合化学物質を除去する。
【０１２８】
透析された脂肪分解酵素を、沈殿物が透析の間、形成される場合、0.45μmのフィルターを通して濾過する。透析された酵素生成物におけるタンパク質濃度を、上記タンパク質濃度アッセイにより決定し、そして酵素生成物を緩衝液Bにより希釈し、5mg/mlのタンパク質濃度を有する、サイズ排除クロマトグラフィーのためのサンプルを得る。酵素生成物が、透析の後、5mg/ml以下のタンパク質濃度を有する場合、それはそのまま使用される。
【０１２９】
300mlのHiLoad26/60 Superdex75pgカラム（Amersham Pharmacia Biotech）を、緩衝液Bにより平衡化する（流速：1ml/分）。1.0mlの酵素サンプルをカラムに適用し、そしてカラムを緩衝液Bにより、溶出する（流速：1ml/分）。2.0mlの画分を、サンプルがカラムから溶出されるまで、カラムの出口から収集する。収集された画分を、脂肪分解活性について分析する。本明細書に記載される１又は複数のアッセイにおける活性のタンパク質ピークを、脂肪分解酵素ピークとして定義する。脂肪分解酵素ピークの純度を、すべての同定されたピークにおける合計タンパク質量により割り算された、ピークにおけるタンパク質量として計算する。特定の態様においては、純度は、すべての同定された脂肪分解ピークにおける合計タンパク質量により割り算された、ピークにおけるタンパク質を言及する。
【配列表】
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【図１】
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