(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のリゾホスファチジルコリンを測定する方法であって、
該方法は、
（ａ）バシラス属の微生物に由来するモノグリセリドリパーゼを含有する試薬を試料に作用させる工程、および
（ｂ）工程（ａ）で生じたグリセロール−３−ホスホリルコリンを測定する工程、
を含み、
該工程（ｂ）が、
（ｉ）グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼを作用させる工程、
（ii）コリン酸化酵素を作用させる工程、および
（iii）生じた過酸化水素を測定する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
予め試料から脂質を抽出する工程を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が、リゾホスファチジルコリン産生細胞培養液、または体液成分である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
試料中のリゾホスファチジン酸を測定する方法であって、
該方法は、
（ａ）バシラス属の微生物に由来するモノグリセリドリパーゼを含有する試薬を試料に作用させる工程、および
（ｂ）工程（ａ）で生じたグリセロール３−リン酸を測定する工程、
を含む、方法。
【請求項５】
前記工程（ｂ）が、
（ｉ）グリセロール−３−リン酸酸化酵素を作用させる工程、および
（ii）生じた過酸化水素を測定する工程、
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（ｂ）が、
（ｉ）グリセロール−３−リン酸脱水素酵素を、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）または酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）とともに作用させる工程、および
（ii）生成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の量を測定する工程、
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
予め試料から脂質を抽出する工程を含まない、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、リゾホスファチジン酸産生細胞培養液、または体液成分である、請求項４から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
試料中のリゾホスファチジルコリンを測定するためのキットであって、
バシラス属の微生物に由来するモノグリセリドリパーゼを含有する試薬、
グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ、
コリン酸化酵素、および
生じた過酸化水素を測定するための試薬、
を含む、キット。
【請求項１０】
試料中のリゾホスファチジン酸を測定するためのキットであって、バシラス属の微生物に由来するモノグリセリドリパーゼを含有する試薬、
グリセロール−３−リン酸酸化酵素、および
生じた過酸化水素を測定するための試薬、
を含む、キット。
【請求項１１】
さらにグリセロール−３−リン酸脱水素酵素、および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
試料中のリゾホスファチジン酸を測定するためのキットであって、
バシラス属の微生物に由来するモノグリセリドリパーゼを含有する試薬、
グリセロール−３−リン酸脱水素酵素、および
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）または酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、主として臨床検査および生物学的基礎研究の分野で用いられる、リゾリン脂質、特に、リゾホスファチジルコリン（以下、ＬＰＣということがある）またはリゾホスファチジン酸（以下、ＬＰＡということがある）の特異的な測定方法およびそのためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＬＰＣはコリンを含有するリゾリン脂質であり、虚血に陥った心筋組織中に蓄積すること（橋爪裕子他、日薬理誌  114：287-293,(1999)）、粥状動脈硬化の発生に重要な低密度リポタンパク質の酸化変性に伴い、ＬＰＣが増加すること（久米典昭、Molecular Medicine 37(1):22-28,(2000)）などが知られている。また、ＬＰＣは血中においても、多発性骨髄腫患者、卵巣癌患者で高値を示すこと（Sasagawa T.ら、Lipids 34:17-21,(1998)、 Okita M.ら、Int. J. Cancer 71:31-34,(1997)）などが報告されており、新たな診断マーカーとしての可能性が期待されている。
【０００３】
一方、ＬＰＡは脂肪酸を一つ有する最も単純なグリセロリン脂質である。ＬＰＡは、生体内には極微量しか存在しないことから、従来はリン脂質生合成の中間代謝産物として、あるいは細胞膜構成成分としての役割しか持たないと考えられていた。しかしながら、近年、ＬＰＡが様々な生理活性を有することが示され、さらにはＬＰＡ特異的受容体が発見されたことから、生理活性脂質としての役割が注目されている。
【０００４】
これまでに報告されたＬＰＡの代表的な生理活性としては、血小板凝集作用、細胞増殖促進作用、ストレスファイバーの形成、癌細胞の浸潤促進などが挙げられる。
【０００５】
さらに、ＬＰＣと同様に、卵巣癌患者においては健常者に比べて血中ＬＰＡが有意に高いこと（沖田美佐子、岡山県立大学保健福祉学部紀要 1(1): 29-35, (1994)、Xu Y.ら、JAMA. 280(8): 719-723, (1998)、および米国特許第5,994,141号）、ならびに多発性骨髄腫患者においても健常者に比べて血清中のＬＰＡが高いこと（笹川貴代他、栄養−評価と治療 12(4): 303-306, (1995)）が報告されており、新たな腫瘍診断マーカーとしての可能性も期待されている。
【０００６】
このような腫瘍診断マーカーとしての可能性も期待されているＬＰＣまたはＬＰＡの測定法は、かなり煩雑であり、汎用的ではない。一般的なリゾリン脂質の測定法として、例えば、Tokumura A.ら、Am. J. Physiol. 267: C204-210, (1994)が知られているが、この方法は、検体から脂質成分を抽出し、薄層クロマトグラフィーによって他の脂質成分と各リゾリン脂質とを分離、抽出した後、メチル基転移反応を経て得られる脂肪酸メチルエステルを、ガスクロマトグラフィーによって分析する方法であり、実用性に欠けている。
【０００７】
ところで、国際公開特許公報 WO 00/23612には、リゾリン脂質に特異性を有する酵素としてリゾホスホリパーゼ（酵素名リゾホスホリパーゼ（略号ＬＹＰＬ）：旭化成工業株式会社製）を用いる方法が記載されている。しかし、この方法においても、試料からいったん脂質を抽出し、さらにリゾリン脂質を濃縮して、得られたリゾリン脂質を加水分解している。これは、このＬＹＰＬが、厳密にはリゾリン脂質に特異的でないことを示唆している。実際に、本発明者らが行ったＬＰＣ測定では、ＬＹＰＬはジアシル型リン脂質であるホスファチジルコリンを一部分解し、測定することが示された（後記実施例１を参照のこと）。さらに、酵素的サイクリング法を組合せてＬＰＣを測定する方法も知られている（美崎英生他、第126回日本臨床化学会近畿支部例会  32-50、(1986)）が、用いているリゾホスホリパーゼ（ＬＹＰ：東洋醸造株式会社（現旭化成株式会社）製）は、上記ＬＹＰＬと同一の酵素であり、上記と同じ問題を含んでいる。
【０００８】
このように、未だリゾリン脂質に特異的な酵素がなく、依然としてリゾリン脂質の測定は煩雑な方法によらざるを得ない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、試料の前処理を必要とせず、試料中のリゾリン脂質（特に、ＬＰＣおよびＬＰＡ）を特異的に、および簡便かつ正確に測定する方法およびそのためのキットが望まれている。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、リゾリン脂質を分解するがジアシル型のリン脂質をほとんど分解しない酵素を見出し、リゾリン脂質（特に、ＬＰＡ、ＬＰＣ）を特異的にかつ簡便に測定する方法およびそのためのキットを開発し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
本発明は、試料中のリゾリン脂質を測定する方法であって、（ａ）リゾリン脂質を分解するがジアシル型リン脂質を分解しないリゾホスホリパーゼを含有する試薬を試料に作用させる工程、および（ｂ）（ａ）の反応生成物を測定する工程、
を含む方法に関する。
【００１２】
好ましい実施態様においては、前記方法は予め試料から脂質を抽出する工程を含まない。
【００１３】
好ましい実施態様においては、前記リゾホスホリパーゼがバシラス属の微生物に由来するリパーゼである。
【００１４】
好ましい実施態様においては、測定の対象はリゾホスファチジルコリンであり、このリゾホスファチジルコリンの分解によって生じる反応生成物であるグリセロール−３−ホスホリルコリンまたは遊離脂肪酸を測定することにより測定される。
【００１５】
好ましい実施態様においては、前記グリセロール−３−ホスホリルコリンが
（ｉ）グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼを作用させる工程、
（ii）コリン酸化酵素を作用させる工程、および
（iii）生じた過酸化水素を測定する工程、
を含む工程で測定される。
【００１６】
別の好ましい実施態様においては、前記グリセロール−３−ホスホリルコリンが
（ｉ）グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼを作用させる工程、
（ii）グリセロール−３−リン酸酸化酵素を作用させる工程、および
（iii）生じた過酸化水素を測定する工程、
を含む工程で測定される。
【００１７】
好ましい実施態様においては、前記リゾリン脂質がリゾホスファチジン酸であり、測定する（ａ）の反応生成物がグリセロール３−リン酸または遊離脂肪酸である。
【００１８】
好ましい実施態様においては、前記グリセロール−３−リン酸が、
（ｉ）グリセロール−３−リン酸にグリセロール−３−リン酸酸化酵素を作用させる工程、および
（ii）生じた過酸化水素を測定する工程、
を含む工程で測定される。
【００１９】
別の好ましい実施態様においては、前記グリセロール−３−リン酸が、
（ｉ）グリセロール−３−リン酸にグリセロール−３−リン酸脱水素酵素を、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）または酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）とともに作用させる工程、および
（ii）生成する還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の量を測定する工程、
を含む工程で測定される。
【００２０】
本発明は、また、試料中のリゾリン脂質を特異的に測定するためのキットであって、
（ａ）リゾリン脂質を分解するがジアシル型リン脂質を分解しないリゾホスホリパーゼを含有する試薬、および
（ｂ）（ａ）の反応生成物を測定するための試薬、
を含む、キットに関する。
【００２１】
好ましい実施態様においては、前記リゾホスホリパーゼが、バシラス属の微生物に由来するリパーゼである。
【００２２】
好ましい実施態様においては、本発明のキットはリゾホスファチジルコリンを測定するためのキットであり、試薬（ｂ）が、
（ｉ）グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ、
（ii）コリン酸化酵素、および
（iii）生じた過酸化水素を測定するための試薬、
を含む。
【００２３】
好ましい実施態様においては、本発明のキットはリゾホスファチジルコリンを測定するためのキットであり、前記試薬（ｂ）が
（ｉ）グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ、
（ii）グリセロール−３−リン酸酸化酵素、および、
（iii）生じた過酸化水素を測定するための試薬、
を含む。
【００２４】
好ましい実施態様においては、本発明のキットはリゾホスファチジン酸を測定するためのキットであり、前記試薬（ｂ）が、
（ｉ）グリセロール−３−リン酸酸化酵素、および
（ii）生じた過酸化水素を測定するための試薬、
を含む。
【００２５】
さらに好ましい実施態様においては、本発明のキットはリゾホスファチジン酸を測定するためのキットであり、前記試薬（ｂ）が、さらにグリセロール−３−リン酸脱水素酵素、および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を含む。
【００２６】
また、別の実施態様においては、本発明のキットはリゾホスファチジン酸を測定するためのキットであり、前記試薬（ｂ）が、
（ｉ）グリセロール−３−リン酸脱水素酵素、および
（ii）酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）または酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、
を含む。
【００２７】
【発明の実施の形態】
本発明におけるリゾリン脂質の測定法の基本原理は、測定対象物質であるリゾリン脂質に、リゾホスホリパーゼ活性を有する酵素を作用させ、生じた反応生成物を測定することである。
【００２８】
リゾリン脂質がリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）である場合、その測定法の基本原理は、測定対象物質であるＬＰＣに、リゾリン脂質を分解するがジアシル型リン脂質を分解しないリゾホスホリパーゼ（以下、本発明のリゾホスホリパーゼということがある）を作用させ、生じたグリセロール−３−ホスホリルコリン（以下、ＧＰＣということがある）に、さらにグリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ（以下、ＧＰＣＰということがある）を作用させて、生じたコリンまたはグリセロール−３−リン酸（以下、Ｇ−３−Ｐということがある）を、それらの酸化酵素あるいは脱水素酵素を用いて測定することである。
【００２９】
また、リゾリン脂質がリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）である場合、その測定原理は、測定対象物質であるＬＰＡに、本発明のリゾホスホリパーゼを作用させ、生じたＧ−３−Ｐまたは遊離脂肪酸を、それらに特異的な酵素を用いて測定することである。
【００３０】
本明細書において、「リゾホスホリパーゼ」とは、リゾリン脂質を分解するがジアシル型リン脂質を分解しない酵素をいい、「リゾホスホリパーゼを含有する試薬」は、リゾホスホリパーゼを含む組成物をいう。例えば、リゾホスホリパーゼ活性を有する酵素と緩衝液、補酵素、界面活性剤、あるいは酵素の安定化剤または活性化剤などを１または２以上組合せて含む組成物をいう。また、「リゾホスホリパーゼを含有する試薬」は、リゾホスホリパーゼのみを含む場合もある。
【００３１】
リゾホスホリパーゼにより生じたＧＰＣを測定することによりＬＰＣを測定する場合、リゾホスホリパーゼは、必ずしもＬＰＣにのみ特異的である必要はない。すなわち、少なくともＬＰＣを分解してＧＰＣを生じることができれば、他のリゾリン脂質に対して活性を有していてもよい。何故ならば、生じたＧＰＣに、さらにＧＰＣＰを作用させ、生じたコリンに特異的な酸化酵素を用いて測定するのであれば、コリンを含有していない他のリゾリン脂質は測定されないからである。
【００３２】
一方、リゾホスホリパーゼがＬＰＣにのみ特異的な酵素であるか、ＧＰＣＰがＧＰＣにのみ特異的な酵素であれば、Ｇ−３−Ｐをその酸化酵素または脱水素酵素を用いて測定することにより、ＬＰＣを測定することができる。
【００３３】
リゾホスホリパーゼとＧＰＣＰおよびコリン酸化酵素とを組合せて用いる場合、ＬＰＣおよびＬＰＡの反応は、図１に示す通りである。
【００３４】
また、リゾホスホリパーゼにより生じたＧ−３−Ｐを測定することによりＬＰＡ量を測定する場合も、リゾホスホリパーゼは、必ずしもＬＰＡにのみ特異的である必要はない。すなわち、少なくともＬＰＡを分解してＧ−３−Ｐを生じることができれば、他のリゾリン脂質に対して活性を有していてもよい。何故ならば、生じたＧ−３−Ｐに特異的な酸化酵素または脱水素酵素を用いて測定することにより、Ｇ−３−Ｐ以外のリゾリン脂質分解産物が測定されないからである。
【００３５】
さらに具体的に説明すると、本発明に用いられるリゾホスホリパーゼは、ＬＰＡのみでなく、ＬＰＣに対しても作用するが、ＬＰＡの測定に際して問題とならない。なぜなら、試料中のＬＰＣは分解されて、ＧＰＣを生じるが、次いで作用させるグリセロール−３−リン酸酸化酵素（以下、ＧＰＯということがある）またはグリセロール−３−リン酸脱水素酵素（以下、Ｇ３ＰＤＨということがある）がＧ−３−Ｐ特異的であれば、ＧＰＣに作用しないため、ＬＰＣは測定されないからである。リゾホスホリパーゼとＧＰＯとを組合せて用いる場合、ＬＰＡおよびＬＰＣの反応は、図２に示す通りである。
【００３６】
本発明に用いられるリゾホスホリパーゼは、リゾリン脂質を分解するがジアシル型リン脂質を分解しない酵素であれば、特に制限がなく用いられる。好ましい酵素としては、バシラス属の微生物に由来し、本来はモノグリセリドリパーゼとして、旭化成工業株式会社から市販されている酵素名モノグリセリドリパーゼ（略号ＭＧＬＰＬ（ＭＧＬＰということもある））が使用される。
【００３７】
ただし、生じた遊離脂肪酸を測定する場合には、ＬＰＡまたはＬＰＣに対して極めて高い特異性を有するものを用いなければならない。なぜなら、特異性が低ければ、血液などのように多種類のリゾリン脂質を含有している試料を測定する場合に、測定対象以外の他のリゾリン脂質をも検出するからである。このような測定法に用いられるＬＰＡに対して特異性の高いリゾホスホリパーゼ活性を有する酵素として、例えば、ラット脳由来の酵素（Fiona J. ThompsonおよびMike A．Clark, Biochem．J．300:457-461, (1994)）が挙げられる。
【００３８】
Ｇ−３−Ｐの測定法としては、Ｇ−３−Ｐに特異的なＧＰＯを用いて生じた過酸化水素を測定する方法、あるいはＧ−３−Ｐに特異的なＧ３ＰＤＨを用いてＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋から生成するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの量を測定する方法（金井正光編著  臨床検査法提要改訂30版（平成５年発行）560頁）などが挙げられるが、Ｇ−３−Ｐを正確に測定できる方法であればどのような方法でもよい。
【００３９】
ＧＰＯとしては、例えば、ストレプトコッカス属由来、アエロコッカス属由来、ペディオコッカス属由来の酵素が挙げられるが、Ｇ−３−Ｐに特異的なものであれば、本発明に用いられる。
【００４０】
Ｇ３ＰＤＨとしては、例えば、ウサギ筋肉由来のものが挙げられるが、Ｇ−３−Ｐに特異的なものであれば、本発明に用いられる。
【００４１】
また、生じた遊離脂肪酸の測定方法としては、血清中遊離脂肪酸の酵素学的測定法（Shimizu S.ら、Anal. Biochem. 98 341-345, 1979）などが知られているが、遊離脂肪酸を正確に測定できる方法であればどのような方法でもよい。例えば、アシルＣｏＡ合成酵素、ならびにアシルＣｏＡ酸化酵素またはアシルＣｏＡ脱水素酵素を使用して、生じた過酸化水素の量あるいはＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋から生成するＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの量を測定して、遊離脂肪酸量を測定することができる。
【００４２】
さらに、これらの反応によって生じた過酸化水素、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを、既知の高感度測定技術と組み合わせて測定することも可能である。既知の高感度測定技術としては、例えば、酸化酵素によって生じた過酸化水素を蛍光反応または発光反応を用いて測定する方法、酵素的サイクリング反応によって過酸化水素を増幅して測定する方法（美崎英生、検査と技術 27(8): 973-980, (1999)、および登録第1594750号公報）、既存のトリンダー試薬に優るモル吸光係数を有するような高感度発色剤を用いる方法（特開平5-229993号および青山典仁、臨床検査、14(9)：1014-1019、(1997)）などが知られている。
【００４３】
測定の対象となる試料は、何ら限定されるものではなく、ＬＰＡまたはＬＰＣ産生細胞培養液のような基礎研究における試料でもよいし、体液成分のような臨床検査における試料でもよい。体液成分としては、例えば、全血液、血清、血漿、尿、唾液、涙液、腹水、髄液、羊水、膣分泌液などが挙げられる。
【００４４】
本発明のリゾリン脂質の測定キットは、リゾリン脂質を分解するがジアシル型リン脂質を分解しないリゾホスホリパーゼ、および反応生成物を測定するための試薬を含む。
【００４５】
本明細書において、「反応生成物を測定するための試薬」とは、リゾホスホリパーゼを作用させて生じるＧ−３−Ｐ、ＧＰＣ、遊離脂肪酸などを、上記のように直接または間接的に測定する方法に使用する成分単体またはこれを含む組成物をいう。
【００４６】
本明細書において、「生じた過酸化水素を測定するための試薬」とは、酸化酵素の作用によって生じた過酸化水素を、上記のように直接または間接的に測定する方法に使用する成分単体またはこれを含む組成物をいう。この成分としては、発色剤が挙げられ、例えば、トリンダー試薬であるＮ−エチル−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−４−メチルアニリンとカップラーである４−アミノアンチピリンとの組合せ（青山典仁ら、前出を参照のこと）が挙げられる。
【００４７】
通常、本発明のキットは、主反応酵素を含む各物質が適切な濃度となるように処方された試薬キットとして提供される。試薬を含む容器としては、ガラス、プラスチックなどで形成されたバイアル、アンプル、プレート、マイクロプレートなどが挙げられるが、含まれる試薬に影響を及ぼさないものであれば、材質、形態は特に限定されない。その際の試薬形態は、乾燥粉末状、液状など特に制限されるものではなく、酵素の活性化剤、安定化剤、防腐剤などが配合されていてもよい。
【００４８】
また、本発明のキットは、定量的測定はもちろん、定性的測定にも用いられる。定性的測定の形態に適したものとしては、例えば、マイクロプレート、検査紙などの形態と、アンプルまたはバイアルとの組合せもあり得る。
【００４９】
また、試薬キットは、第一反応試薬と第二反応試薬との組み合わせのように、反応液中への添加時期が異なる二種類以上の試薬を適宜組み合わせたものでもよいし、一試薬系でも構わない。１つの容器に収納され、反応時に混合されるようなキットの形態も好ましい。
【００５０】
さらに、測定値に影響を与えるような物質が試料中に含まれる場合、その影響を除去することが、より正確にリゾホスホリパーゼ活性を測定するために好ましい。このような方法として、例えば、試料中のＬＰＡを、生じるＧ−３−Ｐの量によって測定する場合、試料中にもともと存在するＧ−３−Ｐは測定値に影響を与えるので、予め、Ｇ−３−ＰをＧＰＯなどと反応させて除去しておく方法、あるいは、コントロールとしてリゾホスホリパーゼ活性を有する酵素を加えないでＧ−３−Ｐ量を測定し、リゾホスホリパーゼ活性を有する酵素を加えて測定した系から、その測定値を差し引いて、真の活性を求める方法が挙げられる。
【００５１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００５２】
（実施例１：リゾホスホリパーゼの特異性の比較）
リゾホスホリパーゼとして、ビブリオ属微生物由来のＬＹＰＬ（旭化成工業株式会社製）およびバシラス属微生物由来のＭＧＬＰＬ（旭化成工業株式会社製）を用いた。
【００５３】
まず、以下のＬＰＣ測定用試薬を調製した。
試薬Ａ (pH8.0)
トリス  100mmol/L
トリトンＸ-100  0.01%
塩化カルシウム  1mmol/L
N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メチルアニリン  5mmol/L
ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来）  20U/mL
グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ
（グリオクラジウム属由来）  1U/mL
コリンオキシダーゼ（アースロバクター由来）  10U/mL
試薬Ｂ (pH8.0)
トリス  100mmol/L
トリトンＸ-100  0.01%
4-アミノアンチピリン  10mmol/L
リゾホスホリパーゼ（MGLPL）  50U/mL
試薬Ｃ (pH8.0)
トリス  100mmol/L
トリトンＸ-100  0.01%
4-アミノアンチピリン  10mmol/L
リゾホスホリパーゼ（LYPL）  10U/mL
【００５４】
１−オレオイルＬＰＣ、１−オレオイルＬＰＡ、１−パルミトイル−２−リノレオイルＰＣ、およびスフィンゴミエリンを、それぞれ、1.0mmol/Lとなるように、１％の界面活性剤トリトンＸ−１００（商品名）を含む生理食塩水に溶解した。各試料10μLに試薬Ａを300μL加え、３７℃、５分間反応させた。これに試薬Ｂを100μL加え、37℃、５分間反応させた。この37℃、５分間の主波長570nm、副波長700nmにおける反応液の吸光度変化量を測定した。結果を図３に示す。
【００５５】
図３中、１−オレオイルＬＰＣはＬＰＣと、１−オレオイルＬＰＡはＬＰＡと、１−パルミトイル−２−リノレオイルＰＣはＰＣと、およびスフィンゴミエリンはＳＭと略記されている。ＬＹＰＬおよびＭＧＬＰＬはともにリゾリン脂質であるＬＰＣおよびＬＰＡを分解してそれぞれＧＰＣ、Ｇ−３−Ｐを生成する。続いて、ＧＰＣＰがＬＰＣから生じたＧＰＣを分解し、生じたコリンにコリン酸化酵素が作用してＨ２Ｏ２を生成する。一方、ＬＰＡから生じたＧ−３−Ｐは、ＧＰＣＰおよびコリン酸化酵素の基質とならない（図１を参照のこと）。
【００５６】
その結果、ＬＰＣは測定されるがＬＰＡは測定されない。また、ＬＹＰＬおよびＭＧＬＰＬはＳＭに作用しないので、ＳＭは測定されない。従って、ＬＹＰＬとＭＧＬＰＬとはＬＰＣ、ＬＰＡおよびＳＭに対する作用が一致する。しかし、ＬＹＰＬがＰＣに１割程度作用してＧＰＣを生成し、さらにＧＰＣＰが生成したＧＰＣに作用することにより、ＰＣが測定されるのに対し、ＭＧＬＰＬはＰＣに全く作用せず、従って、ＰＣが検出されないという点で異なる。すなわち、ＭＧＬＰＬは、ジアシル型リン脂質を分解しない。ＰＣは血清中でもっとも多く存在するリン脂質であり、ＬＰＣの数十倍存在するといわれているため、その１割が測定されれば、測定値は真のＬＰＣの２倍以上となる。従って、予め脂質を抽出するなどの試料の前処理をせずにＬＰＣ量を正確に測定するためには、ＭＧＬＰＬタイプのように、リゾリン脂質に対して極めて特異性の高いリゾホスホリパーゼが必要となる。
【００５７】
また、このことは、ＬＰＣ測定試薬だけでなく、ＬＰＡ測定試薬についても同様であり、脂質の抽出などの前処理を行わずに正確にリゾリン脂質の測定を行う場合には、ＬＰＡ測定試薬においてもＭＧＬＰＬのようにリゾリン脂質に対して極めて特異性の高いリゾホスホリパーゼが必要となる。
【００５８】
（実施例２：ＬＰＣ検量線の作成）
まず、以下の試薬を調製した。
試薬Ａ (pH8.0)
トリス  100mmol/L
トリトンＸ-100  0.01%
塩化カルシウム  1mmol/L
N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メチルアニリン  3mmol/L
ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来）  10U/mL
グリセロホスホリルコリンホスホジエステラーゼ
（グリオクラジウム属由来） 0.1U/mL
コリンオキシダーゼ（アースロバクター由来）  10U/mL
試薬Ｂ (pH8.0)
トリス  100mmol/L
トリトンＸ-100  0.01%
4-アミノアンチピリン  5mmol/L
リゾホスホリパーゼ（MGLPL）  30U/mL
【００５９】
１−パルミトイルＬＰＣ（合成品）を１％の界面活性剤トリトンＸ−１００（商品名）を含む生理食塩水に溶解し、1.0mmol/LのＬＰＣ溶液を調製した。試料10μLに試薬Ａを300μL加え、37℃、５分間反応させた。これに試薬Ｂを100μL加え、37℃、５分間反応させた。この37℃、５分間の主波長570nm、副波長700nmにおける反応液の吸光度変化量を測定した。結果を図４に示す。
【００６０】
ＬＰＣ濃度と吸光度変化量との間に原点を通る良好な直線関係が得られた。本発明の測定試薬を用いてＬＰＣを測定することが可能である。
【００６１】
（実施例３：従来の方法との相関）
ヒト血清１５検体、管理血清５検体（コンセーラ：日水製薬株式会社、リピッドセーラムＩ：栄研化学株式会社、リピッドセーラムII：栄研化学株式会社、セラクリア−ＬＰ：株式会社アズウェル、ハイレベルチェックリピッド：国際試薬株式会社）の計２０検体を試料とし、実施例２と同様にＬＰＣ量を測定した。
【００６２】
他方、この２０検体の試料から、以下の従来の方法により脂質を抽出し、ＬＰＣの脂肪酸量を分析し、脂肪酸量から全ＬＰＣ量を換算した。
試料0.1mLと、２％ＫＣｌ溶液0.1mL、２Ｎ−ＨＣｌ  0.1mLおよび内部標準として１−ヘプタデカノイルＬＰＣ  7.2μｇとを混合し、さらにクロロホルム：メタノール（２：１）溶液1.5mLを加えて混合した後、1000×ｇで10分間遠心し、下層の1mLを別の容器に分取した。分取した脂質成分を窒素乾固した後、クロロホルム：メタノール（２：１）溶液50μLに再溶解し、シリカゲルＴＬＣプレートの単一レーンに負荷し、クロロホルム：メタノール：アンモニア（６０：３５：８）の混合溶液で室温で展開した。８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸を噴霧して紫外線下、目視にて確認し、プレートからＬＰＣ相当部分をかきとり、別の容器に回収した。回収した容器に三フッ化ホウ素２mLを加え、105℃で30分加温し、メチル基転位反応を行った。その後、蒸留水１mLおよびへキサン２mLを添加し、10秒間激しく攪拌した後、1000×ｇで10分間遠心し、上層の1.2mLを別の容器に分取した。続いて、窒素乾固した後にトルエン40μLに溶解し、ガスクロマトグラフィー用の分析試料とした。
【００６３】
各試料中に含まれる脂肪酸量を測定するために、SUPELCO WAX 10カラム（30m×0.25mm：SUPELCO社製）を装備したＧＣ−１４Ｂ（島津製作所製）ガスクロマトグラフを使用した。オーブンの開始温度は100℃で、１分間保持した後、40℃/分で200℃まで上昇させ、２分間保持した。その後、さらに10℃/分で240℃まで上昇させ、15分間保持した。キャリアガスはヘリウムガスで、試料気化室の温度は250℃、検出器部の温度は250℃であった。
【００６４】
事前に各脂肪酸メチルの保持時間を確認しておき、各脂肪酸メチルに相当するピーク面積から、内部標準である１−ヘプタデカノイルＬＰＣに相当するピーク面積を基準に換算し、パルミチン酸メチル、ステアリン酸メチル、オレイン酸メチル、リノール酸メチル、アラキドン酸メチルおよびドコサヘキサエン酸メチルに相当する各ＬＰＣの総和を、各試料中に含まれるＬＰＣ量とした。
【００６５】
本発明の方法による測定結果と従来の方法による測定結果の相関関係を図５に示す。図５に示すように、相関係数は０．９３５という良好な相関関係が認められた。本発明の方法では、ＬＰＣの測定において、従来の、煩雑な操作を必要とする脂肪酸分析法と同等の測定結果を、簡単にかつ短時間で得ることが可能である。なお、図５において、●はヒト血清、○はコンセーラ、▲はリピッドセーラムＩ、△はリピッドセーラムII、■はセラクリア−ＬＰ、および□はハイレベルチェックリピッドを表す。
【００６６】
（実施例４：ＬＰＡ検量線の作成）
以下の試薬を調製した。
試薬Ａ (pH6.8)
ビス−トリス  100mmol/L
トリトンＸ-100  0.01%
N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メチルアニリン  3mmol/L
ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来）  10U/mL
GPO（ストレプトコッカス属由来）  15U/mL
フラビンアデニンジヌクレオチド  0.05mmol/L
試薬Ｂ (pH6.5)
ビス−トリス  20mmol/L
トリトンＸ-100  0.01%
4-アミノアンチピリン  5mmol/L
リゾホスホリパーゼ（ＭＧＬＰＬ）  20U/mL
【００６７】
1-オレオイルＬＰＡ（合成品）を、界面活性剤トリトンＸ-100（商品名）を1.0％含む生理食塩水に溶解し、0.5mmol/LのＬＰＡ溶液を調製した後、溶解液にて５段階希釈して検量線用試料を作製した。試料10μLに試薬Ａ 300μLを加え、37℃で５分間反応させた。これに試薬Ｂ 100μLを加えてさらに37℃、５分間反応させ、試薬Ｂ添加後５分間の主波長570nm（副波長700nm）における反応液の吸光度変化量を測定した。結果を図６に示す。ＬＰＡ濃度と吸光度変化量との間に良好な直線関係が得られ、これは本測定試薬を用いてＬＰＡを定量することが可能であることを示す。また、0.5mmol/LのＬＰＡを測定した際の反応タイムコースを図７に示した。瞬時に反応は収束し、一定の吸光度を示した。
【００６８】
（実施例５：種々のＬＰＡの高感度発色剤による検出）
高感度発色剤としてトリフェニルメタン誘導体を利用した試薬を調製した。
試薬Ａ (pH6.5)
ビス−トリス  100mmol/L
トリトンＸ-100  0.05%
リゾホスホリパーゼ（ＭＧＬＰＬ）  20U/mL
N,N,N',N',N'',N''-ヘキサ(3-スルホプロピル)-4,4',4''-トリアミノトリフェニルメタン塩（株式会社同人化学研究所製）3mmol/L
試薬Ｂ (pH6.5)
ビス−トリス  100mmol/L
トリトンＸ-100  0.05%
ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来）  30U/mL
GPO（ストレプトコッカス属由来）  15U/mL
フラビンアデニンジヌクレオチド  0.05mmol/L
【００６９】
1-パルミトイルＬＰＡ、1-ステアロイルＬＰＡ、1-オレオイルＬＰＡ、2-オレオイルＬＰＡ、１-パルミトイルＬＰＣ、および1-パルミトイルＬＰＥ（リゾホスファチジルエタノールアミン）を、界面活性剤トリトンＸ-100を1.0％含む生理食塩水に溶解させ、それぞれ2mmol/L相当の試料を調製した。試料4μLに試薬Ａ 300μLを加え、37℃で５分間、加温した後、試薬Ｂ 100μLを加えて37℃、５分間反応させた。この、試薬Ｂ添加後５分間の波長600nmにおける反応液の吸光度変化量を測定した。その結果を図８に示す。ＬＰＡの脂肪酸種および脂肪酸の結合位置に関係なく、本測定法により種々のＬＰＡを測定することが可能であった。また、ＬＰＡ以外の他のリゾリン脂質はほとんど検出されなかった。
【００７０】
（実施例６：酵素的サイクリング法を利用したヒト血清中のＬＰＡ量の測定）
以下に示すような酵素的サイクリング法（美崎英生、検査と技術  27(8)：973-980, (1999)、および登録第1594750号公報を参照のこと）を利用した試薬を調製した。
試薬Ａ (pH7.6)
ビス−トリス  100mmol/L
トリトンＸ-100  0.01%
N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メチルアニリン  3mmol/L
β-NADH  0.05mmol/L
12α-ヒドロキシステロイド脱水素酵素（バチルス属由来）  2U/mL
リゾホスホリパーゼ（ＭＧＬＰＬ）  10U/mL
試薬Ｂ (pH7.6)
ビス−トリス  20mmol/L
トリトンＸ-100  0.01%
ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来）  20U/mL
4-アミノアンチピリン  5mmol/L
GPO（ストレプトコッカス属由来）  50U/mL
G3PDH（ウサギ筋肉由来）  5U/mL
コール酸ナトリウム  1mmol/L
【００７１】
1-オレオイルＬＰＡ 0.1mmol/Lを標準として、ヒト血清を測定した。実施例１と同様の操作にて反応を行い、試薬Ｂ添加後の反応液の吸光度を経時的に主波長570nm（副波長700nm）で測定した。この測定値にはヒト血清中に元来存在するＧ−３−Ｐが反応した結果生じる吸光度が含まれる。そのため、さらに、試薬Ａの代りに、以下に示すリゾホスホリパーゼ活性を有する酵素を含まないＧ−３−Ｐ測定用試薬Ｃを用いて、実施例１と同様の操作にて反応を行い、上記ヒト血清中に存在するＧ−３−Ｐに依存する吸光度を測定し、上記測定値から差し引くことにより、真の測定値を求めた。
【００７２】
試薬Ｃ (pH7.6)
ビス−トリス  100mmol/L
トリトンＸ-100  0.01%
N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メチルアニリン  3mmol/L
β-NADH  0.05mmol/L
12α-ヒドロキシステロイド脱水素酵素（バチルス属由来）  2U/mL
【００７３】
試薬Ａを用いて得られた測定値から、試薬Ｃを用いて得られた測定値を差し引いて補正した反応タイムコースを図９に示す。この結果から、単位時間あたりの吸光度変化量を算出し、同時に測定した１−オレオイルＬＰＡ  0.1mmol/L標準液の単位時間あたりの吸光度変化量から換算したＬＰＡの値を表１に示す。
【００７４】
【表１】
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【００７５】
表１に示すように、ヒト血清のような夾雑物質を含む試料においても、ＬＰＡを簡単に測定できることがわかった。
【００７６】
【発明の効果】
本発明によって、従来法に比べ、脂質の抽出、リゾリン脂質の分離などの煩雑な手段を必要とせず、さらに、試料が体液であっても、脂質の抽出などの前処理を必要とせず、簡便かつ正確にＬＰＣ、ＬＰＡなどのリゾリン脂質を測定することが可能となった。また、本発明の方法は、測定に用いる試料が少量で済み、試料の前処理を必要としないため、汎用型生化学自動分析装置への適用が可能であり、多数の試料を短時間で測定することができる。これらのことから、生化学的基礎研究の分野においても、医学的な臨床検査の分野においても、本発明は極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】リゾホスホリパーゼとＧＰＣＰおよびコリン酸化酵素とを組合せて用いる場合のＬＰＣおよびＬＰＡの反応を示す図である。
【図２】リゾホスホリパーゼとＧＰＯとを組合せて用いる場合のＬＰＡおよびＬＰＣの反応を示す図である。
【図３】 ＬＹＰＬとＭＧＬＰＬとのジアシル型リン脂質に対する反応性の違いを示す図である。
【図４】１−パルミトイルＬＰＣの濃度と吸光度変化量との関係を示すグラフである。
【図５】本発明の方法によるＬＰＣ測定結果と、従来の脂肪酸分析法によるＬＰＣ測定結果の相関関係を示す図である。
【図６】  1-オレオイルＬＰＡの濃度と吸光度変化量との関係を示すグラフである。
【図７】  0.5mmol/LのＬＰＡを測定した際の反応タイムコースを示すグラフである。
【図８】種々のＬＰＡを測定した場合の吸光度変化量を示すグラフである。
【図９】ヒト血清中のＬＰＡの測定における反応タイムコースを示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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