(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一のドナーまたは患者からトロンビンを生成するための方法であって、
患者から得た血液製剤から血漿を隔離するステップ、
前記血漿の画分内のプロトロンビンを最終体積中において８％から１８％の範囲の量のエタノールを使用して濃縮するステップ、
０．０１１μＭから０．０４５μＭの範囲の濃度のＣａＣｌ２を使用して前記プロトロンビンをトロンビンに転換するステップ、および
トロンビンから微粒子を濾過するステップを含んでなる方法。
【請求項２】
前記濾過するステップの後に凝固時間を変更するステップをさらに含んでなり、凝固時間の変更がトロンビンを塩類溶液で希釈することで行われる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
血漿を得るために血液製剤を遠心分離することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
生成された自己由来のトロンビンが１５分を超える安定性を有する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
エタノールが最終体積の１３．６％の量だけ使用され、およびＣａＣｌ２が０．０２３μＭの濃度で使用される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
血漿にエタノールとＣａＣｌ２を加えて組成物が形成され、および微粒子の組成物を濾過する前に組成物を撹拌しトロンビンにフィルタを通過させるステップをさらに有してなる、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、概略的には所定ユニットの血漿から十分な安定があり、またトロンビン・リッチな凝固物の溶液と粘着性タンパク質との高速ないし迅速な凝固を６時間を超える間提供する、トロンビン酵素を調製する技術に関するものである。
【０００２】
（背景技術）
フィブリン・シーラントの形成は凝固カスケードの最後のステップに類似しており、トロンビン酵素がフィブリノーゲンを隔離し、フィブリノーゲンは次いでセミ・グリッド（semi-grid）あるいは柔軟性のあるフィブリン・クロットにクロス・リンクされる。フィブリン・クロットは傷サイトに接着され、処理サイトに対する止血剤および治癒特性を提供しつつ、流体漏れに対するバリアを形成し、また組織間の接着が行われる。
【０００３】
現在市販されている本出願人のＣｒｙｏＳｅａｌ（商標）システムは、約１時間以内でドナーの血漿からフィブリノーゲンおよびＸＩＩＩ因子（Factor XIII ）を含み、寒冷沈降され、濃縮された凝固物および接着性タンパク質を産出ないし採取する装置である。ＣｒｙｏＳｅａｌ（商標）システムにより提供される１時間の寒冷沈降反応による産出は、血液銀行において日常的に行われる１日から２日の寒冷沈降反応と比較した場合、ＣｒｙｏＳｅａｌ（商標）の凝固物および接着性タンパク質の産出を患者に接近してまさに手術室ないし術中において行うことができ、これにより処理を何日も前に開始する必要性が回避される。
【０００４】
これらのＣｒｙｏＳｅａｌ（商標）により産出された凝固物および接着性タンパク質は、牛あるいは人のトロンビンと結合されたときには、外科的止血および組織接着に有用な生物学的接着剤を形成する。市販されているトロンビンは、しかしながら、一般的には牛や人の血漿プールを原料とするものであり、依然として患者は陰性ないし負の免疫反応あるいは伝染性の血液派生のウイルスによる汚染及びクルツフェルド−ヤコブ疾患（Crutzfeld-Jacob disease ；ＣＪＤ）あるいはＣＪＤの新しい変種（ＮＶＣＪＤ）の危険性がある。ＣｒｙｏＳｅａｌ（商標）の寒冷沈降の発明の特長は、産出された凝固物および接着性タンパク質が患者自身の血液を原料としており、これらの凝固物および接着性タンパク質が患者の外科的損傷サイトに局所的に適用されたときにおいて、伝染性の血液から派生した疾患による汚染のリスクを解消できることである。
【０００５】
しかしながら、外科的患者に対する最も安全な条件は、トロンビン成分を凝固物および接着性タンパク質成分が産出された同じドナーから産出して、完全に自己由来の生物学的なシーラントあるいは接着剤を形成する２成分の生物学的シーラントを調製することであると長い間考えられていた。
【０００６】
例えば、Ｃｅｄｅｒｈｏｌｍ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＰＣＴ特許（ＷＯ９４／００５６６−１９９４年１月６日）には、その調製方法が、後の分解のためのトロンビン成分の沈降を起こすために血液のイオン強度および血漿のｐＨを調節するものであるトロンビン成分が、同じドナーの血漿を原料とするフィブリノーゲン成分と結合される改良されたフィブリン接着剤が開示されている。これらの工程は非常に時間がかかり、処理時間が１時間未満でなければならない手術室ないし術中において使用するには実用的でない。
【０００７】
３年後の１９７７年において、Ｈｉｒｓｈなど（米国特許第５、６４３、１９２号）には、Ｃｅｄｅｒｈｏｌｍ−Ｗｉｌｌｉａｍｓに続いて、フィブリノーゲン成分およびトロンビン成分が同じドナーの血漿を原料とするものであるフィブリン接着剤を調製する方法が教示されている。このＨｉｒｓｈ特許には、上澄み液を調製するために血漿中のフィブリノーゲンが最初に沈降され、次いで上澄み液中の残査フィブリノーゲンを凝固させる、トロンビンを調製するための方法が開示されており、この方法はＣｅｄｅｒｈｏｌｍ−Ｗｉｌｌｉａｍｓにより教示された方法とは異なるが、トロンビンが４分に対して５秒未満であり、また４７分に対して１０秒未満の凝固速度を提供しなければならない点において、一般的に有用なトロンビンを得ることができない。
【０００８】
これらの凝固速度は、Ｈｉｒｓｈなどのフィブリン接着剤の規定の範囲においては全体の手術を計画できない外科医の要求には不適切である。
【０００９】
外科医は、止血及び組織密封あるいは接着のために高速ないし迅速な凝固時間（＜５秒）を優先的に必要とする。凝固の遅い（＞５秒）生物学的接着剤は、その役目を果たす前に、はみ出しや出血により傷サイトから運ばれてしまう。Ｈｉｒｓｈフィブリン接着剤を利用する外科医は、Ｈｉｒｓｈフィブリン接着剤での処理を意図した止血や組織密封が、凝血時間が５秒より短い４分間のウインド内で起こるようにその手術が行われることを必要とし、６時間にもおよぶ時間帯である手術を通じて迅速な止血および組織接着を優先的に必要とする多くの外科医にとっては、Ｈｉｒｓｈの発明は全体的に実用的ではなくなる。
【００１０】
次の特許が、出願人が知る範囲において本発明の処理に密接な関係があると思われる技術についての特許であり、また関連のある従来技術を開示する出願人の知識の開示義務を免れるためのものである。しかしながら、以下に詳細に説明し、また特にクレームされた本発明の要旨は、これら特許においては単一で教示されるものではなく、またこれら特許の考え得る組合わせから自明なものでないことは明らかである。
【００１１】
米国特許
特許番号                発行日                  発明者
第５，６４８，２６５号  １９９７年７月１５日    Ｅｐｓｔｅｉｎ
第５，５１０，１０２号  １９９６年４月４日      Ｃｏｃｈｒｕｍ
第５，５８５，００７号  １９９６年１２月１７日  Ａｎｔａｎａｖｉｃｈ等
第５，６０５，８８７号  １９９７年２月２５日    Ｐｉｎｅｓ等
第５，６１４，２０４号  １９９７年３月２５日    Ｃｏｃｈｒｕｍ
第５，６３１，０１９号  １９９７年５月２０日    Ｍａｒｘ
第５，６４３，１９２号  １９９７年７月１日      Ｈｉｒｓｈなど
外国特許
特許番号                発行日                  発明者
ＷＯ９４／００５６６    １９９４年１月６日      Cederholm-Willians等
ＥＵ０５９２２４２Ａ１  １９９４年４月１３日    E.R.Squibb & Sons
【００１２】
上記に挙げた従来技術は、これら全てが出願人の知る従来技術の特に検討した目録ではない。これらの検討しない参考文献は、特に以下に説明するように本発明とは明らかに相違するものである。
【００１３】
（発明の開示）
本発明は、長い間必要とされてきた簡単で実用的であり、迅速であるドナー（供与体）の血液から安定した人のトロンビンを調製するための方法であって、非常に長い手術ないし外科手術（例えば、６時間）を通して、同じ血液ユニットから得られ濃縮または質的に向上された凝固物（clotting）と接着性タンパク質（adhesive protein）とを結合し、微生物や可能性のあるＣＤＪまたはＮＶＣＪＤ汚染に患者を晒すことなしに、生物学的シーラントつまり接合剤を形成するために、迅速な凝固ないし凝血（＜５秒）を提供する方法に関するものである。当業分野における従来の研究（Ｈｉｒｓｃｈ等）は、非常に短い４乃至５分の時間の間だけにおいてトロンビンがフィブリノーゲンの迅速な凝固（即ち、５秒未満）を達成するという、最小限の安定性を備えたトロンビンが例示するものであり、広範囲の手術（外科手術）に対して全体的に実用的なものではない。
【００１４】
本発明は、凝固物と接着性タンパク質の正確で反復性ないし再現性があり、迅速または緩慢な重合を起こすことができ、長い手術を通して６時間までの持続時間（継続時間）のある安定なトロンビン酵素（thrombin enzyme）を提供するものである。さらに、全てが単一のドナーを供給源とする凝固物および接着性タンパク質およびトロンビンを使用することで、フィブリンが数千のドナーから貯留された血漿を供給源とすると共にトロンビンが同じ人の血漿の同様な貯留物あるいは牛を由来とするもののいずれかである、市販のフィブリン接着剤を使用することから引き起こされる種々の疾患の危険性が取り除かれる。本発明を使用した安定なトロンビンの製造技術の速度および簡単さは、手術工程の直前ないし手術中においてトロンビンを調製することができ、また長い手術の間を通して迅速な凝固を提供できる。本発明により製造されたトロンビンは、正確でより遅い凝固時間を提供するために塩類溶液ないし食塩水（saline）中で希釈され、これにより４秒未満から２時間以上の所望の時間とすることができる。
【００１５】
本発明の処理は、３つのステップ（工程）から構成され、最初の２つは同時に起こりあるいは行われる。
１．  プロトロンビンの濃度を実質的に高めると同時に、プロトロンビンあるいは長期機能性トロンビンに対する後続の活性化に対して結合、ブロック、干渉、または抑制などをするトロンビノデュリン（Thrombinodulin）や抗トロンビンIIIのような血漿内に自然的に発生する成分を取除きあるいは変性させるためにエタノールを使用することでプロトロンビン中に濃縮ないし質的に向上された画分を調製する。
２．  濃縮されたプロトロンビン溶液にカルシウムイオンを加え、また溶液を短時間撹拌してプロトロンビンを安定で長期型のトロンビンに変換ないし変質させる。
３．  トロンビン溶液をフィルタを通して浸出させ、トロンビンを小さなオリフィスを通してスプレーすることや傷サイト上にトロンビンを薄いチューブで浸出させることを妨害する微粒状物質を取り除く。
【００１６】
（産業上の利用可能性）
本発明の産業上の利用可能性は、以下の本発明の目的の説明を通じて例証する。
【００１７】
従って、本発明の主要な目的は、ドナーの血漿から迅速ないし高速で作用し、安定な自己由来のトロンビンを得るための新規で斬新な装置および方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、多くの関連する外科手術処理より長い保存性（貯蔵寿命）を有する上記の特徴付けされたトロンビンを提供することにある。
本発明の別の目的は、塩類溶液（食塩水）での希釈により、凝固時間を予測可能で任意に長くすることができる上記の特徴付けされたトロンビンを提供することにある。
本発明の別の目的は、前処理工程が簡単である上記の特徴付けされたトロンビンを提供することにある。
本発明の別の目的は、３０分未満の処理時間を有する上記の特徴付けされたトロンビンを生成するための方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、小さなオリフィスつまり穴または開口からスプレーつまり噴霧することができ、あるいは薄いチューブを通して浸出つまり滲み出させることができるトロンビンを提供することにある。
【００１８】
第１の有利な点から見て、本発明の目的は、プロトロンビン濃度を増大しまた同時に汚染タンパク質を除去するためにエタノールにより実質的に濃縮されたプロトロンビン画分から安定な人のトロンビンを生成するための新規で実用的な方法を提供することにある。濃縮されたプロトロンビンに塩化カルシウムを加えることで、プロトロンビンがトロンビンに変換される。同じ単一のドナーの血漿から自己由来の生物学的シーラントのために必要とされる第２の成分を作るため、他の方法によって凝固物（凝固成分）および接着性タンパク質が同時に得られる。
【００１９】
本発明は十分に安定であり、全ての従来技術において例証されたものよりも実質的により安定であり、５秒未満から６時間までの凝固を提供できる。さらに、凝固時間は塩類溶液による希釈により凝固時間を変更できる。
【００２０】
本発明は、さらに、効率的な調製方法を提供するものである。ＣｒｙｏＳｅａｌ（商標）による凝固物および接着性タンパク質の改良された寒冷沈降は、１時間未満を必要とする。この同じ期間フレームにおいては、同じソースのプラズマから自己由来の人のトロンビン成分を最小限の材料および方法で製造できる。生物学的接着剤の両方の生物学的成分は、外科手術のセッティングにおいて容易に結合され、まさに同じドナーつまり患者に投与ないし施され、また結果的に生じる凝固は傷サイトにおいて止血あるいは組織接着を提供する。
【００２１】
本発明はまた、生物学的な接着剤の両方の成分の無菌製造のための方法を提供する。本明細書において説明された改良された無菌製造は、非自己由来の細菌による汚染が本質的にない最終製品を提供する。
上記および他の目的は、添付した図面と組み合わせて以下の詳細な明細書を考慮することで明白となる。
【００２２】
（発明を実施するための最良形態）
図面を参照し、各図を通して同じ構成要素は同じ部品を示しており、参照数字１０は、図１に示された本発明の処理ユニットすなわち処理セットを指している。
【００２３】
すなわち処理セット１０は、トロンビン処理ユニット４０と凝固物および接着性タンパク質処理ユニット６０とに連絡ないし連通した流体受容システム２０を含んでいる。
【００２４】
より詳しくは、流体受容システム２０は管路ないし配管４に連絡ないし連通した入口２を含んでおり、この管路を通って血漿が処理ユニット４０、６０に入る。管路４は、管路４に流体が通過するのを遮断する停止弁６を有している。管路４はＴ型管継手８を通って血漿を分割するために２つの分岐部、つまりトロンビン処理ユニット４０に導かれる第１の分岐路１２と凝固物および接着性タンパク質処理ユニット６０に導かれる第２の分岐路１４との内部に連通している。
【００２５】
入口２に入る血液製剤が血漿であることが好ましいので、全血は最初にフィルタリング（濾過）、遠心分離あるいは血液製剤からより重い赤血球を取り除くために沈降分離する他の手段により処理され、これにより図１の装置において使用される血漿が残留される。トロンビン処理ユニットのために必要な血漿は好ましくは８ｍｌであり、よって濃縮されたトロンビンの最終容積は、凝固物および接着性タンパク質処理ユニット６０からの寒冷沈降された凝固物および接着性タンパク質の典型的な収量（歩留り）に適合ないし匹敵する。図２を参照して、トロンビン貯蔵シリンジつまり注入器（syringe）が無菌の外科手術領域内に導入されるまで無菌状態を提供するため、密封された袋体１６がトロンビン処理ユニット４０の上に置かれている。それ以前において、トロンビン処理ユニットは、柔軟性があり且つ袋体の外部からシリンジのプランジャ（棒状ピストン）の移動を好ましくは許容するように寸法付けされ、密封された袋体内において図２に示されたように動作される。第１の分岐部１２からの流体は管継手１８を越えて多岐管すなわちマニフォルド２２内部を通過する。多岐管２２には、最初は好ましくはガラス製であり１５ｍｌの容積を受容することができる混合シリンジ２６に向けられた弁２４が設けられている。混合シリンジ２６は、矢印Ａの方向に移動されたときには通路である第１の分岐部１２からの血漿を混合シリンジ２６の内部に引き出すプランジャ２８を含んでいる。
【００２６】
図３を参照して、弁２４は混合シリンジ２６とそれぞれ図１に示されたようにＹ型管継手３６を経て多岐管（マニフォルド）２２に作動的に連結されたアンプル３２、３４内の試薬との間でアクセスが得られるように再設定ないし向きを変えられる。アンプル３２または３４のいずれかの内部へのアクセスは、壊れ易いダイヤフラム（隔離板）を破壊するためにアンプルを押圧ないし絞ることで行うことができる。これに代えて、アンプルを受容する取入口３８にダイヤフラムを貫通する中空のスパイクを設けることもできる。いずれの場合でも、アンプル３２、３４の両方の内容物は、図３に示された矢印Ａに沿ってプランジャ２８をさらに後退させることにより混合シリンジ２６内に受容される。第１のアンプル３２には、好ましくは最終容積（final volume）中において１３．６％のＥＴＯＨ濃度を提供するエタノール２ｍｌ．が設けられており、また、第２のアンプル３４には、好ましくは最終容積中において．０２３（０．０２３）μＭの濃度を提供するために１ｍｌ．の塩化カルシウムが設けられている。これに代えて、２つのアンプル３２、３４内に含まれるこれらの試薬は、単一のアンプル内に予め混合されて同時に分配ないし投薬する構成としても良い。本発明の１つの形態において、エタノールを最初に導入し、次いで混合シリンジ２６を撹拌し、さらに塩化カルシウムを導入させることもできるが、両者を同時に血漿に導入することが最適に組み合わされ、続いて短時間の撹拌が行われる。
【００２７】
エタノールと塩化カルシウムが混合シリンジ２６内に導入された場合、弁２４は、混合シリンジ２６が隔離されるように向け直される。内容物は短時間撹拌され、また約２０分間の培養ないし保温がなされる。混合シリンジ２６を押圧して内容物を取り出す前に、弁２４が図４に示されたように向け直され、その後、プランジャ２８は図４においてＢで示された方向に移動される。弁２４がトロンビン分配（調合）シリンジと連絡ないし連通するようにセットされたので、混合シリンジ２６内部の内容物は混合シリンジ２６から分配シリンジ４２に移送される。より詳しくは、多岐管（マニフォルド）２２は、その内部にフィルタ４４が混合シリンジ２６とトロンビン分配シリンジ４２との間の流路内に設けられる凹部を含んでいる。微粒状物質は、分配シリンジ４２にトロンビンが送出される前にフィルタ４４内部に保持される。ここで、流体が分配シリンジ４２に入る際、分配シリンジのプランジャ４６は矢印Ｂと反対の方向に移動する。
【００２８】
図１に戻って、凝固物および接着性タンパク質処理ユニット６０について説明する。トロンビン処理ユニット４０に切り換えられなかった全ての血漿は、凝固物および接着性タンパク質処理ユニット６０の内側チャンバ６２に入る。凝固物および接着性タンパク質処理ユニット６０は、熱交換および回転により操作ないし処理され、血漿から抽出された全ての凝固物および接着性タンパク質は、無菌パウチ６８内に含まれる凝固物および接着性タンパク質分配シリンジ６６による抽出のために袋体すなわち内側チャンバ６２の先端部６４に沈殿ないし堆積される。トロンビンが分配シリンジ４２内に装填ないし入れられ、また凝固物および接着性タンパク質が凝固物および接着性タンパク質分配シリンジ６６内に装填ないし入れられると、２つのシリンジは処理セット１０から切り離され、スプレーあるいは線状および点状の塗布（line and dot application）のために一緒に纏められる。トロンビンを凝固物および接着性タンパク質と混合することで生物学的接着剤が形成される。
【００２９】
両方の分配シリンジは、使用の前に４℃以下で保管される。
【００３０】
図５において、塩化カルシウムの含量が．２３μＭのポイントで一定に保持されている場合において、エタノール濃度によって高速凝固トロンビンの寿命がどのように変化するかを例示したグラフが示されている。ここで、約１３．６％のエタノールにおいて、その寿命が最適化されて少なくとも２４０分に延長される一方、その凝固時間が５秒以下で実質的に一定であることが示されている。８％と１８％の間の範囲は、しかしながら実用性がある。
【００３１】
図６は、トロンビン中の塩化カルシウムの濃度を変える一方、エタノールは１３．６％で一定に保持されている。図示されたように、塩化カルシウムの濃度が２５０ｍＭの塩化カルシウムの．０２３（０．０２３）μＭにおいて、トロンビンの寿命は最適化されて３６０分に延長される一方、凝固時間が５秒以下に維持されている。１２５ｍＭの．０１１（０．０１１）μＭと５００ｍＭの．０４５（０．０４５）μＭの間の範囲は、しかしながら実用性がある。
【００３２】
図７は、トロンビン混合シリンジ２６がガラス対プラスチックから形成されている場合におけるトロンビン処理における差異を反映したものである。図示されたように、凝固速度は５秒以下に近く維持されており、ガラス中では寿命は６０から２４０分である。
【００３３】
図８は、元の血漿と比較してトロンビンの凝固時間を変えるタンパク質を低減するために１３．６％のエタノールと．０２３（０．０２３）μＭの塩化カルシウムを使用した効果を反映したものである。このグラフから明らかなように、主要な妨害（干渉）タンパク質が効率的に取り除かれて、トロンビンの凝固時間が強められるだけでなく、実質的に安定で一定に保持される。
【００３４】
図９には、１３．６％エタノールおよび．０２３（０．０２３）μＭの塩化カルシウムにより処理された、最適化されたトロンビン調整品に対する寿命を関数として測定された凝固時間に関して、図５および図６に示されたことをより詳細に示した図である。
【００３５】
図１０は、濃度１３．６％のエタノールおよび濃度．０２３（０．０２３）μＭの塩化カルシウムで、図９のように最適化されたトロンビン調整品の塩類溶液の効果、寿命を関数として示した図である。トロンビンが塩類溶液により１から１．５に希釈されたとき、凝固時間は２０秒の丁度上から３０秒の丁度下まで拡張され、また１５０分までの寿命を有している。
【００３６】
図１１を参照して、後続での利用のために粒子状物質を取り除く際のフィルタリング（濾過）ステップの有効性を確保するために、混合シリンジ２６内に含まれたトロンビンを略２０分間撹拌した後に内部に存在させることの特長が示されている。変換および活性化のための寿命は、噴霧器のような狭いオリフィスの分配器内でのトロンビンの使用、あるいは薄いチューブを通して絞り出す際におけるトロンビンの使用を最適化するために、フィルタにより十分な量の微粒状物質が取り除かれる。
【００３７】
図１２は、凝固速度と関連した牛の血漿を原料とするトロンビンの活性の従来技術との比較を示したもので、本発明により取り出された自己由来トロンビンは、牛のトロンビンの１００ｉｕ／ｍｌに匹敵ないし同等な凝固速度を提供する。
【００３８】
以上、本発明について説明したが、上記で説明しまた請求の範囲に記載されている本発明の範囲および真の意味を逸脱することなしに多くの構造上の変形および応用を行えることは自明である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  プロトロンビンをトロンビンに処理し、また分類されない（relegated）血漿をプロトロンビンに向け、これから凝固物および接着性タンパク質を抽出する血漿からトロンビンを隔離するための装置の斜視図である。
【図２】  血漿が混合シリンジ内に入れられるトロンビン処理ユニットの断面図である。
【図３】  処理用試薬が血漿をプロトロンビンに、次いでトロンビンに処理するための混合用シリンジに向けられる、図２と類似した説明図である。
【図４】  トロンビンが小さいオリフィスを通してスプレーされ、あるいは薄いチューブを通って浸出されるのを妨害する微粒状物質が最初に濾過された後に分配用シリンジに向けられる図２および図３と類似した説明図である。
【図５】  ＣａＣｌ２が０．０２３μＭで一定に維持されるときに高速凝固トロンビンの寿命に関する最終容積中の種々のＥＴＯＨ濃度の効果を例示した図表である。
【図６】  ＥＴＯＨ濃度が１３．６％で一定に維持されるときに高速凝固トロンビンの寿命に関する最終容積中の種々のＣａＣｌ２濃度の効果を例示した図表である。
【図７】  高速凝固物調製のためにガラスシリンジ内で生じるトロンビンの処理を例示した図表である。
【図８】  ＥＴＯＨ（最終容積中に１３．６％）およびＣａＣｌ２（最終容積中に．０２３μＭ）を混合しおよび微粒状物質をフィルタした後に濃縮トロンビン画分から取り出した汚染タンパク質を説明した図表である。
【図９】  高速凝固のために最適化されたトロンビン調製物の寿命を示した説明である。
【図１０】  遅い凝固のために無菌塩類溶液で１：１５に希釈した最適化されたトロンビン調製物の寿命を示した説明図である。
【図１１】  プロトロンビン画分の濃縮および正確なＥＴＯＨおよびＣａＣｌ２溶液を混合することによる安定なトロンビンへの転換に必要な変換／活性化期間を例示した図表である。
【図１２】  凝固速度に関連させたトロンビン（牛の）濃度（活性度）を例示した図表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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