(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューロメジンU（NMU）遺伝子およびApoE遺伝子を両方ともホモ欠損していることを特徴とする、高コレステロール血症の非ヒト疾患モデル動物。
【請求項２】
普通食で高コレステロール血症を発症する、請求項1に記載の高コレステロール血症の非ヒト疾患モデル動物。
【請求項３】
動物がマウスである、請求項1または2に記載の高コレステロール血症の非ヒト疾患モデル動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高コレステロール血症の疾患モデル動物を提供することに関する。より具体的には、高コレステロール血症の疾患モデルマウスを提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
現代の成人病として、高コレステロール血症およびそれに起因する動脈硬化症は、重要な疾患の一つとされている。血清総コレステロール値の調節機構として、低密度リポタンパク質受容体（LDLR）が主要な働きをしていることが知られている。HMG-CoA還元阻害薬であるスタチンは、LDL受容体の発現を調節することにより、血清総コレステロール値を低下させ、動脈硬化症の発症・進展を抑制することが知られている。スタチンは、このような作用により、世界の公衆衛生分野において多大な貢献をしている。
【０００３】
このような血清総コレステロールを低下させる化合物は、高コレステロール血症の治療ならびに動脈硬化症の予防に非常に有用であるが、その様な化合物をスクリーニングするためのモデル動物は、現在までのところ、十分に開発がなされているとは言えない状況である。
【０００４】
例えば、動脈硬化症のモデル動物については、家族性高コレステロール血症のモデル動物として、低密度リポタンパク質受容体（LDLR）遺伝子のノックアウトマウスが作出された（非特許文献1）。このモデルマウスにおいては、高コレステロール食を与えた場合には1500〜2000 mg/dlの血清総コレステロール値を示し、顕著な動脈硬化症を発症することが知られていたものの、普通食を与えた場合にはわずか230 mg/dlの血清総コレステロール値を示すにすぎなかった（非特許文献1）。
【０００５】
ApoE遺伝子のノックアウトマウスでは、普通食を与えた場合に450〜700 mg/dlの血清総コレステロール値を示し、LDLRノックアウトマウスよりは顕著な高コレステロール血症および動脈硬化症が認められたが（非特許文献2）、マウスはコレステロールエステル転送タンパク質(CETP)を持たないため、コレステロールを転送するメインのリポタンパク質がLDLではなくHDLであり、動脈硬化症を発症しにくいという問題点が存在していた。
【０００６】
さらに、高コレステロール血症および動脈硬化症のモデル動物を得ることを目的として、LRLR遺伝子とApoE遺伝子とを両方とも欠損するLRLR／ApoEダブルノックアウトマウスが作出されたが、この場合にも普通食を与えた場合に450〜700 mg/dlの血清総コレステロール値を示すにすぎず、ApoEノックアウトマウスと同等の高コレステロール血症を示すにすぎなかった（非特許文献3）。
【０００７】
一方、ニューロメジンU（NMU）は、ブタの脊髄から単離された神経ペプチドであり主として消化管と下垂体に存在することが知られている。この物質は、平滑筋の収縮、血圧、摂食行動などに関わっていると考えられている物質である（非特許文献4）。
【０００８】
このNMU遺伝子を欠失させたNMUノックアウトマウスでは、過食、肥満、高インスリン血症がみられる他、加齢とともに高血糖や高脂血症の症状を呈するようになることが報告されている（非特許文献5）。
【０００９】
これらの疾患モデル動物は、いずれも高コレステロール食を与えた場合には顕著な血清総コレステロール値を示し、また顕著な動脈硬化症の症状を示すものの、普通食を与えた場合には、予期されたほどの高い血清総コレステロール値を示すことがなく、当該技術分野においては、普通食を与えた場合にも非常に高い総コレステロール値を示す動物モデルを開発することが急務とされている。
【非特許文献１】Ishibashi S, et al., J. Clin. Invest. 92:883-893, 1993
【非特許文献２】Plump AS, et al., Cell 71:343-353, 1992
【非特許文献３】Ishibashi S, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4431-4435, 1994
【非特許文献４】Kojima M, et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 276:435-438, 2000
【非特許文献５】Hanada R, et al., Nat. Med. 2004 10:1067-73, 2004
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、従来のモデル動物では得られなかった顕著な高コレステロール血症を呈する新しい疾患モデル動物を提供することを課題とする。より具体的には、高コレステロール食を処方しなくても、普通食のみで高コレステロール血症を呈する疾患モデル糖物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の発明者らは、ニューロメジンU（NMU）遺伝子およびApoE遺伝子を両方とも欠損していることを特徴とする動物を作出したところ、顕著な高コレステロール血症を発症することを見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、ニューロメジンU（NMU）遺伝子およびApoE遺伝子を両方とも欠損していることを特徴とする、高コレステロール血症の疾患モデル動物を提供することにより、上述した課題を解決できることを示した。
【発明の効果】
【００１２】
本発明においては、上述したニューロメジンU（NMU）遺伝子およびApoE遺伝子を両方とも欠損している動物を提供することにより、普通食で高コレステロール血症および動脈硬化症を発症する、疾患モデル動物を作出することができた。
【発明の実施の形態】
【００１３】
本発明は、本発明は、ニューロメジンU（NMU）遺伝子およびApoE遺伝子を両方とも欠損していることを特徴とする、高コレステロール血症の疾患モデル動物を提供する。ニューロメジンU（NMU）遺伝子およびApoE遺伝子を両方とも欠損している動物は、まずNMU遺伝子を欠損している動物およびApoE遺伝子を欠損している動物をそれぞれ作出し、これらの動物を交配することにより作出することができる。
【００１４】
特定の遺伝子を欠失する動物は、一般的な遺伝子ノックアウト動物の作出方法（Joyner AL, Scarnes WC, Nature 338:153-156, 1989）を用いて作出することができる。そして、このような一般的な方法で作出された遺伝子ノックアウト動物は、標的とする遺伝子の対立遺伝子を両方とも欠損することを特徴とする。したがって、NMU遺伝子を欠損している動物は、染色体上のNMU遺伝子の対立遺伝子を両方とも欠失していることを特徴とし、そしてApoE遺伝子を欠損している動物は染色体上のApoE遺伝子の対立遺伝子を両方とも欠失していることを特徴とする。動物におけるNMU遺伝子およびApoE遺伝子の有無は、動物由来の細胞（例えばマウスの場合には尾の先端切除片由来の細胞）からDNAを抽出し、それを鋳型として、NMU遺伝子に関しては欠失したアレルの検出にはフォワードプライマーとしてaatgggcccg actaatttgg cacatggtca ccat（SEQ ID NO: 1）およびリバースプライマーとしてcagggtagtg gaggaagtga aaccacatcg（SEQ ID NO: 2）を用い、ワイルドタイプのアレルの検出には、フォワードプライマーとしてcccggcactt cgcccaatag cagccagtcc（SEQ ID NO:3)およびリバースプライマーとしてacctaagtta agtttctagt accactcacc（SEQ ID NO:4)を用いた。ApoE遺伝子に関してはフォワードプライマーとしてtagccgaggg agagccg（SEQ ID NO: 5）およびリバースプライマーとして欠失したアレルの検出にはgacttgggag ctctgcagc（SEQ ID NO: 6）、ワイルドタイプのアレルの検出にはgccgccccga ctgcatct（SEQ ID NO: 7）を用いて、それぞれPCR法を行って増幅の有無を調べることにより確認した。
【００１５】
これらのNMU遺伝子を欠損している動物（NMU-/-）とApoE遺伝子を欠損している動物（ApoE-/-）とを交配すると、F1ハイブリッド個体はすべて〔NMU+/-：ApoE+/-〕の遺伝子型をもつ個体となる。F1ハイブリッド個体同士を交配すると、25％の確率で〔NMU-/-：ApoE-/-〕の遺伝子型をもつ、NMU遺伝子およびApoE遺伝子の両方ともを欠損するNMU／ApoEダブルノックアウト動物が生まれる。この〔NMU-/-：ApoE-/-〕の遺伝子型を有するNMU／ApoEダブルノックアウト動物同士を交配することにより、NMU／ApoEダブルノックアウト動物を維持する。
【００１６】
本発明のNMU／ApoEダブルノックアウト動物の動物種は、実験モデル動物として一般的に利用されている動物種であって、遺伝子ノックアウト技術を利用することができる動物種であればどのような動物種であってもよく、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、などが好ましい。
【００１７】
このNMU／ApoEダブルノックアウト動物は、普通食を与え、自由飲水、25℃の条件下で飼育する。このように飼育された動物の血清コレステロール値は、当該技術分野において酵素法と呼ばれる血中コレステロール値の定量法を用いて測定する。この酵素法は、エステル型コレステロールを加水分解して遊離型コレステロールと脂肪酸を生成するコレステロールエステラーゼ、および遊離型コレステロールから過酸化水素とΔ4-コレステノンを生成するコレステロールオキシダーゼを使用する方法であり、この2種類の酵素の働きにより初期エステル型コレステロール濃度に依存して生成される過酸化水素を酸化剤として、ペルオキシダーゼの存在下で発色基質を酸化することにより、初期エステル型コレステロール濃度を定量することができる方法である。
【００１８】
本発明においては、血中に存在する、VLDL、LDL、HDLのすべてのコレステロールを定量することができる酵素法用キットを使用することが好ましい。このようなキットとしては、デタミナーL TCII、デタミナーTC-555（いずれも協和メデックス）やアクアオートカイノスT-CHO試薬（株式会社カイノス）などを使用することができる。
【００１９】
血清総コレステロール値を定量する場合には、血清サンプルをそのまま使用するが、VLDL、LDL、およびHDLの各成分を定量する場合には、血清サンプルをまず各成分に分画し、それぞれの画分について上記酵素法による定量を行う。VLDL、LDL、およびHDLの各成分を分画するためには、血清中のリポタンパク質を分析可能なゲル濾過カラムを用いてHPLCなどを使用することができる。このようなゲル濾過カラムとしては、TSKgel LipopropakXL、TSKgel Lipopropak（いずれも東ソー）などを使用することができる。
【００２０】
以下の実施例において、本発明を更に具体的に説明する。
【実施例】
【００２１】
実施例1：ニューロメジンU（NMU）遺伝子およびApoE遺伝子をともに欠損するマウスの作出
本実施例においては、ニューロメジンU（NMU）ノックアウトマウスとApoEノックアウトマウスとを交配することにより、NMU遺伝子およびApoE遺伝子をともに欠損するマウス（以下、「NMU／ApoEダブルノックアウトマウス」または「〔NMU-/-：ApoE-/-〕」という）を作出した。
【００２２】
NMUノックアウトマウスは、久留米大学の児島将康教授の研究室で作出されたものの譲渡を受けた（Hanada R, et al., Nat. Med., 2004 10: 1067-73）。このマウスは、また、アポEノックアウトマウスC57BL/6J-Apoetm1Uncは、Jackson Laboratory（Bar Harbor, Maine, USA）より購入した。これらのマウスは、25℃、水および餌の自由摂取、無菌の条件下で、国立循環器病センターの実験動物指針に基づいて飼育した。
【００２３】
NMUノックアウトマウスのオスおよびアポEノックアウトマウスのメスを交配して得られたF1マウス〔NMU+/-：ApoE+/-〕どうしをさらに交配することにより、1/16の確率で生じる「NMU／ApoEダブルノックアウトマウス」〔NMU-/-：ApoE-/-〕を得た。このマウスがNMU-/-：ApoE-/-ダブルノックアウトマウスであることは、マウスの尾の先端サンプルを採取し、このサンプルから得られる核酸について、NMU遺伝子に関しては、欠失アレルの検出にフォワードプライマーaatgggcccg actaatttgg cacatggtca ccat（SEQ ID NO: 1）およびリバースプライマーとしてcagggtagtg gaggaagtga aaccacatcg（SEQ ID NO: 2）を用い、ワイルドタイプのアレルの検出には、フォワードプライマーとしてcccggcactt cgcccaatag cagccagtcc（SEQ ID NO:3)およびリバースプライマーとしてacctaagtta agtttctagt accactcacc（SEQ ID NO:4)を用いたPCRを行った。また、ApoE遺伝子に関してはフォワードプライマーとしてtagccgaggg agagccg（SEQ ID NO: 5）およびリバースプライマーとして欠失したアレルの検出にはgacttgggag ctctgcagc（SEQ ID NO: 6）、ワイルドタイプのアレルの検出にはgccgccccga ctgcatct（SEQ ID NO: 7）を用いて、それぞれPCR法を行って増幅の有無を調べることにより、遺伝子の欠損を確認した。
【００２４】
このようにして得られた〔NMU-/-：ApoE-/-〕マウスは、〔NMU-/-：ApoE-/-〕マウスどうしを交配させることにより維持し、また以下の実験に使用した。
実施例2：血清総コレステロール値の対比
本実施例においては、普通食を摂食させた場合の、種々の遺伝子欠損マウスにおける血清総コレステロール値を対比した。
【００２５】
12匹の12週齢のオスの〔NMU-/-：ApoE-/-〕マウスの尾静脈から血液を採血し、これを遠心分離して血清を得た。このサンプルを実験群とした。一方、対照群として、同じ週齢のオスのApoEノックアウトマウス、ニューロメジンUノックアウトマウス、LDL受容体ノックアウトマウス、ApoE／LDL受容体ダブルノックアウトマウスからも、同様にして採血し、これを遠心分離して血清を得た。血清総コレステロール値は、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとを使用する酵素法の試薬、デタミナーLTC特注（協和メデックス）を使用して、製品に付属する指示に従って測定した。
【００２６】
それぞれのマウスの血清総コレステロール値の結果を、以下の表1および図1に示す。この図1において、「ApoE／NMU」：ApoE／ニューロメジンUダブルノックアウトマウス（すなわち、〔NMU-/-：ApoE-/-〕）、「ApoE」：ApoEノックアウトマウス、「NMU」：ニューロメジンUノックアウトマウス、「LDLR」：LDL受容体ノックアウトマウス、「ApoE／LDLR」：ApoE／LDL受容体ダブルノックアウトマウスからそれぞれ得られた結果を示す。結果は、平均±標準偏差（mg/dl）で示す。これらのデータの統計解析の結果、〔NMU-/-：ApoE-/-〕マウスでは、他のマウスと比較して、顕著に血清総コレステロール値が高く、普通食を与えた場合でも顕著な高コレステロール血症を発症することが明らかになった。
【００２７】
実施例3：VLDL値の対比
血清中のコレステロールのうち、VLDL、LDL、HDL分画のどの分画が上昇しているのかを調べることにより、リポタンパク質代謝の状態を知ることができる。そこで、本実施例においてはまず、普通食を摂食させた場合の、種々の遺伝子欠損マウスにおける血清VLDL値を対比した。
【００２８】
実施例2と同様に、12匹の12週齢のオスの実験群のマウスおよび5匹の同週齢のオスの対照群のマウスから、血清50μlずつを採取し、カラムとしてTSKgel LipopropaxXL（東ソー）を使用したHPLCにより、血清中のコレステロールをVLDL、LDL、HDLの各画分に分画した。本実施例においては、得られたVLDLを、実施例2と同様に、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとを使用する酵素法の試薬、デタミナーL TC特注（協和メデックス）を使用して、製品に付属する指示に従って定量した。
【００２９】
それぞれのマウスのVLDL-コレステロール値の結果を、表1および図2に示す。この図2は、ApoE／NMU、ApoE、NMU、LDLR、ApoE／LDLRの各マウス（マウスの略語は実施例2に記載したとおりである）からそれぞれ得られた結果である。データは、平均±標準偏差（mg/dl）で示す。これらのデータの統計解析の結果、〔NMU-/-：ApoE-/-〕マウスでは、他のマウスと比較して、顕著に血清VLDL値が高いことが明らかになった。
【００３０】
実施例4：LDL-コレステロール値の対比
本実施例においては、続いて、普通食を摂食させた場合の、種々の遺伝子欠損マウスにおける血清LDL値を対比した。
【００３１】
実施例3において得られた血清中LDL画分を、実施例2と同様に、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとを使用する酵素法の試薬、デタミナーL TC特注（協和メデックス）を使用して、製品に付属する指示に従って定量した。
【００３２】
それぞれのマウスのLDL-コレステロール値の結果を、表1および図3に示す。この図3は、ApoE／NMU、ApoE、NMU、LDLR、ApoE／LDLRの各マウス（マウスの略語は実施例2に記載したとおりである）からそれぞれ得られた結果である。データは、平均±標準偏差で示す（mg/dl）。これらのデータの統計解析の結果、〔NMU-/-：ApoE-/-〕マウスでは、他のマウスと比較して、顕著に血清LDL-コレステロール値が高いことが明らかになった。
【００３３】
実施例5： HDL-コレステロール値の対比
本実施例においては、続いて、普通食を摂食させた場合の、種々の遺伝子欠損マウスにおける血清HDL値を対比した。
【００３４】
実施例3において得られた血清中HDL画分を、実施例2と同様に、コレステロールエステラーゼとコレステロールオキシダーゼとを使用する酵素法の試薬、デタミナーL TC特注（協和メデックス）を使用して、製品に付属する指示に従って定量した。
【００３５】
それぞれのマウスのHDL-コレステロール値の結果を、表1および図4に示す。この図4は、ApoE／NMU、ApoE、NMU、LDLR、ApoE／LDLRの各マウス（マウスの略語は実施例に記載したとおりである）からそれぞれ得られた結果である。データは、平均±標準偏差（mg/dl）で示す。これらのデータの統計解析の結果、〔NMU-/-：ApoE-/-〕マウスでは、他のマウスと比較して、血清HDL-コレステロール値が低いことが明らかになった。
【００３６】
この血清LDL-コレステロール値のデータと血清HDL-コレステロール値のデータとを組み合わせて考慮すると、〔NMU-/-：ApoE-/-〕マウスで血清総コレステロール値が顕著に高くなったのは、いわゆる悪玉コレステロールと呼ばれるLDLおよびVLDLが増加することによっているのであり、その一方でいわゆる善玉コレステロールと呼ばれるHDLは増加しないことから、この〔NMU-/-：ApoE-/-〕マウスが、高コレステロール食を処方しなくても、普通食を与える環境下で、高コレステロール血症を発症しやすい体内環境が作られていることが明らかになった。
【００３７】
【表１】
0004734523.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００３８】
ニューロメジンU（NMU）遺伝子およびApoE遺伝子を両方とも欠損している本発明のNMU／ApoEダブルノックアウトマウスは、普通食で高コレステロール血症を発症することから、高コレステロール血症の疾患モデル動物として、高コレステロール血症のための治療薬あるいは予防薬を開発するために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図1は、実験で使用した各マウスの血清総コレステロール値の結果を示す図である。
【図２】図2は、実験で使用した各マウスのVLDL-コレステロール値の結果を示す図である。
【図３】図3は、実験で使用した各マウスのLDL-コレステロール値の結果を示す図である。
【図４】図4は、実験で使用した各マウスのHDL-コレステロール値の結果を示す図である。
【図１】
0004734523.tif 000003
【図２】
0004734523.tif 000004
【図３】
0004734523.tif 000005
【図４】
0004734523.tif 000006
【配列表】
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