(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、及び芳香環ジオールジオキシゲナーゼをコードする遺伝子を導入した組換え微生物を、下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）：
【化１】
0004744437.tif 000039
〔式中、Ｈ１は置換基を有していてもよい複素環式基であり、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｐ２は置換基を有していてもよいフェニル基であり、Ｃ１は置換基を有してもよい環式炭化水素基（但し、フェニル基を除く）である。ただし、式ＩＩはジフェニルアセチレンではない。〕
で表される化合物、及びアンモニア又はアンモニウム塩を含む培地で温度２０〜４０℃及びｐＨ５〜９で培養して、その培養物又は菌体から、ピコリン酸類（Ｉ’）、（ＩＩ’）又は（ＩＩＩ’）：
【化２】
0004744437.tif 000040
〔式中、Ｈ１、Ａ１、Ｐ２、及びＣ１は前記定義のとおりである。〕
を得ることを含むピコリン酸類の製造方法。
【請求項２】
芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、及び芳香環ジオールジオキシゲナーゼをコードする遺伝子が、ビフェニル分解細菌由来のもの若しくはその変異体又はそれらの分子進化工学的手法による改変体である請求項１記載の方法。
【請求項３】
組換え微生物が組換え大腸菌である請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される化合物が、フラバノン、フラボン、６−ヒドロキシフラバノン、６−ヒドロキシフラボン、７−ヒドロキシフラバノン、２−フェニルキノリン、２−フェニルベンゾキサゾール、ビフェニル、（トランス−）カルコン、３−フェニル−１−インダノン、及び２−フェニルナフタレンからなる群より選択されるものである請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
芳香環ジオキシゲナーゼの大サブユニットが以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとしての機能を有するタンパク質
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の属する技術分野は有機低分子化合物の生触媒工学（biocatalytic engineering）である。具体的には、組換え大腸菌等の組換え微生物を用いた生物変換［バイオコンバージョン（bioconversion）；バイオトランスフォーメーション（biotransformation）とも言う］により、産業上有用な有機低分子化合物（工業原料）を製造しようとするものである。さらに具体的には、本発明は、種々のフェニル基（ベンゼン環）を含む芳香族化合物を原料として用い、そこから、フェニル基（ベンゼン環）がピコリン酸（picolinic acid）基に置換された有機化合物（ピコリン酸類）を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）ＫＦ７０７株は、北九州で単離されたビフェニルやポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）の分解細菌である。この細菌から、ビフェニルの分解酵素遺伝子群が世界で初めて単離されている（Furukawa,K.及びMiyazaki,T., “Cloning of gene cluster encoding biphenyl and chlorobiphenyl degradation in Pseudomonas pseudoalcaligenes.” J. Bacteriol., 166巻, p.392-398, 1986年）。現在では、ビフェニル分解細菌由来のビフェニル分解酵素遺伝子群を用いた研究は、環境浄化関連のニーズから数多くなされており、遺伝子や酵素の構造や機能に関して多くの知見が集積している（たとえば、Furukawa,K., “Engineering dioxygenases for efficient degradation of environmental pollutants,” Curr. Opinion Biotechnol.,11巻,p.244-249.2000年参照）。最初の４反応のビフェニル分解酵素の機能を以下に示す（Suenaga,H.,Goto,M.,及びFurukawa,K., “Emergence of multifunctional oxygenase activities by random priming recombination.” J. Biol. Chem., 276巻, p.22500-22506, 2001年）。
【化１】
0004744437.tif 000002
【０００３】
上記の全遺伝子、すなわち、ｂｐｈＡ（ｂｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４）、ｂｐｈＢ、及びｂｐｈＣ遺伝子を大腸菌に導入し発現させると、その大腸菌は、ビフェニルを代謝してメタ解裂化合物を作ることができるとされている。この環解裂物は有機化学合成の原料としては用途がほとんどない付加価値の低いものである。このメタ解裂化合物はＢｐｈＤにより安息香酸に変換される。【０００４】
すでに、芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子として、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ遺伝子（ｂｐｈＡ）を分子進化工学的手法により改変し、これを導入・発現させた大腸菌又は放線菌を用いて、種々のフェニル基等を含む芳香族化合物からシス（ｃｉｓ）−ジヒドロジオール体を作製した成功例が報告されている（Misawa, N., Shindo, K., Takahashi, H., Suenaga, H., Iguchi, K., Okazaki, H., Harayama, S.,及びFurukawa, K., “Hydroxylation of various molecules including heterocyclic aromatics using recombinant Escherichia coli cells expressing modified biphenyl dioxygenase genes.” Tetrahedron , 58巻, p.9605-9612, 2002年；Shindo, K., Nakamura, R., Chinda, I., Ohnishi, Y. Horinouchi,S., Takahashi, H., Iguchi, K., Harayama, S., Furukawa, K.,及びMisawa, N., “Hydroxylation of ionized aromatics including carboxylic acid or amine using recombinant Streptomyces lividans cells expressing modified biphenyl dioxygenase genes.” Tetrahedron , 59巻, p.1895-1900, 2003年；又は特開２００３−２６９号公報参照）。すなわち、ビフェニルやＰＣＢの分解細菌であるシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株から単離されたビフェニルジオキシゲナーゼにおける大サブユニット（ＢｐｈＡ１）をコードするＤＮＡを、他のビフェニル分解細菌であるブルクホルデリア（Burkholderia）属ＬＢ４００株由来のビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニット（ＢｐｈＡ１）をコードするＤＮＡとの間でＤＮＡシャフリング（DNA shuffling）を行い、基質特異性の幅を広げた遺伝子［ｂｐｈＡ１（２０７２）遺伝子と呼ぶ］が作製されている。このｂｐｈＡ１（２０７２）遺伝子と、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来のビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニット以外の３つの構成要素をコードする遺伝子（ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４遺伝子）とからなる改変ビフェニルジオキシゲナーゼ遺伝子（群）の作製も報告されている。該遺伝子を導入・発現させた大腸菌（一部、放線菌）の形質転換体を用いて、種々のフェニル基等を含む芳香族化合物を変換できるか（基質として認識できるか）どうかの検討がなされており、これまで広範に同種の変換実験が行われてきたにもかかわらず、報告が無かった複素環基とフェニル基を分子内に含む有機低分子化合物（２−フェニルキノリン、２−ベンジルベンゾキサゾール、２−フェニルインドール、２−フェニルピリジン、１−フェニルピラゾール、１−ベンジルイミダゾール、１−ベンジルー４−ピロリドン等）の生物変換が可能であることが見出されている（Misawa, N., Shindo, K., Takahashi, H., Suenaga, H., Iguchi, K., Okazaki, H., Harayama, S.,及びFurukawa, K., “Hydroxylation of various molecules including heterocyclic aromatics using recombinant Escherichia coli cells expressing modified biphenyl dioxygenase genes.” Tetrahedron , 58巻, p.9605-9612, 2002年；Shindo, K., Nakamura, R., Chinda, I., Ohnishi, Y. Horinouchi,S., Takahashi, H., Iguchi, K., Harayama, S., Furukawa, K.,及びMisawa, N., “Hydroxylation of ionized aromatics including carboxylic acid or amine using recombinant Streptomyces lividans cells expressing modified biphenyl dioxygenase genes.” Tetrahedron , 59巻, p.1895-1900, 2003年参照）。すなわち、ＤＮＡシャフリングした改変ビフェニルジオキシゲナーゼ遺伝子［ｂｐｈＡ１（２０７２）ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４；ｂｐｈＡ（２０７２）］を含む大腸菌が、上記有機低分子化合物を変換し、フェニル基���の隣接する位置（置換基が存在する位置を１とした場合、２と３の位置）に位置特異的に２つの水酸基と２つの水素が導入された芳香族−シス（ｃｉｓ）−ジヒドロジオール体を立体選択的に生成できることがわかっている。【０００５】
また本発明者らは、上記のｂｐｈＡ（２０７２）を有する大腸菌により合成された芳香族−シス（ｃｉｓ）−ジヒドロジオール体が、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来の芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）によりジオール体に変換されることを見い出している（特願２００３−５７８６７号（２００３年３月４日出願）参照）。本発明者らはまた、上記のｂｐｈＡ（２０７２）遺伝子とｂｐｈＢ遺伝子を発現する大腸菌が、フラボン、フラバノン、６−ヒドロキシフラボン等のフラボノイドをジオール体に変換できることを見出している（Shindo, K., Kagiyama, Y., Nakamura, R., Hara, A., Ikenaga, H., Furukawa, K.,及びMisawa, N., “Enzymatic synthesis of novel antioxidant flavonoids by Escherichia coli cells expressing modified metabolic genes involved in biphenyl catabolism.” J. Mol. Catalysis B:Enzymatic 23巻, p.9-16, 2003年参照）。【０００６】
一方、分子内にピコリン酸（picolinic acid）を有する化合物（本明細書中「ピコリン酸類」という）（６−置換基−ピリジン−２−カルボン酸）を化学合成により得るのはきわめて煩雑で困難である。また、ピコリン酸類の生物工学的方法による製造法もほとんど知られておらず、わずかに、次の３つの報告が存在するのみである。１つ目の報告は、ビフェニルからピコリン酸類の一種である６−フェニル−ピリジン−２−カルボン酸（6-phenyl-pyridine-2-carboxylic acid）を生成するシュードモナス属（Pseudomonas sp.）を土壌から単離することに成功し、この微生物を用いた６−フェニル−ピリジン−２−カルボン酸の製造法を開示している（特開昭５５−０００３０７公報）。２つ目の報告は、カテコール−２，３−ジオキシゲナーゼ遺伝子を発現した大腸菌を用いて、カテコールや３−メチルカテコール等のカテコールに１つの置換基が付いた化合物をメタ解裂体に変換し、これらを化学処理すること、すなわち、２５％のアンモニア水中で撹拌すること或いはオートクレーブすることにより、ピコリン酸に変換できることを開示している（Asano, Y., Yamamoto, Y., 及びYamada, H., “Catechol 2,3-dioxygenase-catalyzed synthesis of picolinic acids from catechols.” Biosci. Biotech. Biochem. 58巻, p.2054-2056, 1994年）。３つ目の報告は、トルエン分解性のアシネトバクター（Acinetobacter）属細菌を用いて、ジフェニルアセチレンをメタ解裂体に変換し、上記と同様の化学処理をすることにより、６−フェニルアセチレンピコリン酸に変換することを開示している（Spain, J. C., Nishino, S. F., Witholt, B., Tan, L.-S.,及びDuetz, W. A., “Production of 6-phenylacetylene picolinic acid from diphenylacetylene by a toluene-degrading Acinetobacter strain.” Appl. Environ. Microbiol. 69巻, p.4037-4042, 2003年）。ピコリン酸類は医薬・農薬中間体や付加価値化学品として重要性が期待されるものであるにもかかわらず、以上述べてきたように、その製造法に関する情報は非常に少ないのが現状であった。【０００７】
従って、種々のピコリン酸類を調製するための簡便かつ効率的な方法の開発が望まれていた。
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、簡便かつ効率的なピコリン酸類の製造方法を提供することを目的とする。
【０００９】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、芳香環（ビフェニル）ジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４：ＢｐｈＡ）、芳香環（ビフェニル）ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）、及び芳香環（ビフェニル）ジオールジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＣ）をコードする遺伝子を導入し発現させた組換え大腸菌の細胞を、フェニル基（ベンゼン環）を分子内に有する有機低分子化合物の存在下で合成培地内で混合培養すると、メタ解裂化合物ではなく、ピコリン酸類（６−置換基−ピリジン−２−カルボン酸）が生成されることを見出し、本発明を完成させるに至った。なお本発明は、「背景技術」で述べたようなどんな化学処理も必要としないものである。
【００１０】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
【００１１】
（１）下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）：
【化２】
0004744437.tif 000003
〔式中、Ｈ１は置換基を有していてもよい複素環式基であり、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｐ２は置換基を有していてもよいフェニル基であり、Ｃ１は置換基を有してもよい環式炭化水素基（但し、フェニル基を除く）である。ただし、式ＩＩはジフェニルアセチレンではない。〕
で表されるフェニル基を含む芳香族化合物と、芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、及び芳香環ジオールジオキシゲナーゼとを反応させて、ピコリン酸類（Ｉ’）、（ＩＩ’）又は（ＩＩＩ’）：
【化３】
0004744437.tif 000004
〔式中、Ｈ１、Ａ１、Ｐ２、及びＣ１は前記定義のとおりである。〕
を得ることを含むピコリン酸類の製造方法。
【００１２】
上記ピコリン酸類の製造方法において、芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、及び芳香環ジオールジオキシゲナーゼは、ビフェニル分解細菌由来のもの若しくはその変異体又はそれらの分子進化工学的手法による改変体とすることができる。
【００１３】
（２）芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、及び芳香環ジオールジオキシゲナーゼをコードする遺伝子を導入した組換え微生物を、下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）：
【化４】
0004744437.tif 000005
〔式中、Ｈ１は置換基を有していてもよい複素環式基であり、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｐ２は置換基を有していてもよいフェニル基であり、Ｃ１は置換基を有してもよい環式炭化水素基（但し、フェニル基を除く）である。ただし、式ＩＩはジフェニルアセチレンではない。〕
で表される化合物を含む培地で培養して、その培養物又は菌体から、ピコリン酸類（Ｉ’）、（ＩＩ’）又は（ＩＩＩ’）：
【化５】
0004744437.tif 000006
〔式中、Ｈ１、Ａ１、Ｐ２、及びＣ１は前記定義のとおりである。〕
を得ることを含むピコリン酸類の製造方法。
【００１４】
上記ピコリン酸類の製造方法において、芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、及び芳香環ジオールジオキシゲナーゼをコードする遺伝子は、ビフェニル分解細菌由来のもの若しくはその変異体又はそれらの分子進化工学的手法による改変体とすることができる。また、組換え微生物としては、例えば組換え大腸菌が挙げられる。
【００１５】
上記ピコリン酸類の製造方法において、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表される化合物としては、例えば、フラバノン、フラボン、６−ヒドロキシフラバノン、６−ヒドロキシフラボン、７−ヒドロキシフラバノン、２−フェニルキノリン、２−フェニルベンゾキサゾール、ビフェニル、（トランス−）カルコン、３−フェニル−１−インダノン、及び２−フェニルナフタレンが挙げられる。
【００１６】
また、上記ピコリン酸類の製造方法において、芳香環ジオキシゲナーゼの大サブユニットとしては、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質を用いることができる：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとしての機能を有するタンパク質
【００１７】
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとしての機能を有するタンパク質
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列を含み、かつ、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとしての機能を有するタンパク質
（５）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡを含む遺伝子
【００１８】
本発明により、有機化学合成では製造が困難な有機低分子化合物であるピコリン酸類の新規な製造方法が提供される。本発明に係る方法によれば、酵素反応の基質としてフェニル基（ベンゼン環）を分子内に有する有機低分子化合物を用いればよいため、豊富で安価な種々の市販化学合成基質から、医薬品や農薬等の付加価値の高い工業製品原料を製造することができる。また、本発明に係る方法はフェニル基（ベンゼン環）をピコリン酸に変換する方法を提供するものであり、有機化学合成法の１手法を提供するという点で有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明を詳細に説明する。本願は、２００４年３月４日に出願された日本国特許出願第２００４−６１２３８号の優先権を主張するものであり、上記特許出願の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。【００２０】
本発明に係るピコリン酸類の製造方法は、フェニル基（ベンゼン環）を有する有機低分子化合物にビフェニル分解系酵素を作用させることにより、そのフェニル基（ベンゼン環）をピコリン酸に置換することを特徴とするものである。【００２１】
具体的には、ビフェニルジオキシゲナーゼ［ＢｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４：ＢｐｈＡ］、芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ＢｐｈＢ）、及び、芳香環ジオールジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＣ）を、順次作用させて、フェニル基（ベンゼン環）部分がピコリン酸に置換された有機化合物（６−置換基−ピリジン−２−カルボン酸）の製造方法を提供する。ピコリン酸部分を有する有機化合物は、医薬品、農薬を始めとする種々の工業製品の原料として用いることができ、有用である。【００２２】
１．ビフェニル分解系酵素
本発明においては、ビフェニル分解系の最初の３つの酵素、すなわち、芳香環（ビフェニル）ジオキシゲナーゼ（本明細書中「芳香環ジオキシゲナーゼ」ともいう）、芳香環（ビフェニル）−ｃｉｓ−ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（デサチュラーゼ）（本明細書中「芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ」ともいう）、及び、芳香環ジオール（ビフェニルジオール）ジオキシゲナーゼ（本明細書中「芳香環ジオールジオキシゲナーゼ」ともいう）の活性を利用する。本明細書中においては、これらの酵素をまとめてビフェニル分解系酵素という。【００２３】
上記３種類の酵素の元々報告されていた機能を下図に示す（Suenaga,H., Goto,M.,及びFurukawa,K., “Emergence of multifunctional oxygenase activities by random priming recombination.” J. Biol. Chem., 276巻, p.22500-22506, 2001年）。
【化６】
0004744437.tif 000007
【００２４】
これらの酵素は、天然に該酵素を産生する微生物、又は該酵素をコードする遺伝子を導入した微生物から得ることができる。あるいは、該酵素の変異体又は分子進化工学的手法による改変体をコードする遺伝子を導入した微生物から得ることができる。【００２５】
２．ビフェニル系分解酵素をコードする遺伝子
芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子は、ｂｐｈＡ１、ｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３、及びｂｐｈＡ４からなり、芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子はｂｐｈＢからなり、芳香環ジオールジオキシゲナーゼ遺伝子はｂｐｈＣからなる。本明細書でいう芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、及び芳香環ジオールジオキシゲナーゼ遺伝子には、これらの遺伝子を有する微生物に由来するものだけでなく、例えば、それらの自然に若しくは人為的に生じた変異体をコードする遺伝子、又はそれらの遺伝子間でＤＮＡシャフリング等の分子進化工学的手法を施して得られる改変体をコードする遺伝子（改変芳香環ジオキシゲナーゼ、改変芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、及び改変芳香環ジオールジオキシゲナーゼ遺伝子）も含まれる。【００２６】
本発明に用いるＢｐｈ酵素をコードするｂｐｈ遺伝子としては、たとえばシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７由来のものを用いることができる。また、例えばシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株のｂｐｈＡ１とブルクホルデリア属ＬＢ４００株のｂｐｈＡ１間でＤＮＡシャフリングを行い、コードされる酵素の基質特異性を広げたｂｐｈＡ１遺伝子［ｂｐｈＡ１（２０７２）］、又は、シュードモナス・プチダＫＦ７１５株由来のｂｐｈＡ１遺伝子を中央部分に持ち、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株のｂｐｈＡ１遺伝子を両端に持つハイブリッドｂｐｈＡ１遺伝子［ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）］（配列番号１）、及び、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来のｂｐｈＡ２、ｂｐｈＡ３、ｂｐｈＡ４、ｂｐｈＢ、及びｂｐｈＣ遺伝子を用いることができる。ビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニットをコードするｂｐｈＡ１遺伝子としては、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７由来のものよりも変換効率の点で優れた改変ビフェニルジオキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子であるｂｐｈＡ１（２０７２）又は［ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）］を用いるのが好ましい。【００２７】
前者の改変ビフェニルジオキシゲナーゼの大サブユニット［ＢｐｈＡ１（２０７２）］のアミノ酸配列はＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＢ０８５７４８に示されている。また、ＫＦ７０７株の小サブユニット（ＢｐｈＡ２）、フェレドキシン（ＢｐｈＡ３）、及びフェレドキシンレダクターゼ（ＢｐｈＡ４）のアミノ酸配列は、ＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８３６７３に示されている。ＢｐｈＢのアミノ酸配列はＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８３６７３に示されている。なお、その次の反応を触媒する芳香環ジオールジオキシゲナーゼ（ＢｐｈＣ）のアミノ酸配列もＤＤＢＪ／Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｍ８３６７３に示されている。【００２８】
本発明において用いうるｂｐｈＡ１（７１５−７０７）遺伝子（配列番号１）は、シュードモナス・プチダＫＦ７１５株（Hayase,N.,Taira,K. and Furukawa, K., Pseudomonas putida KF715 bphABCD operon encoding biphenyl and polychlorinated biphenyl degradation: Cloning, analysis, and expression in soil bacteria. J. Bacteriol., 172, 1160-1164, 1990）から単離したｂｐｈＡ１配列を中央部分に持ち、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７由来のｂｐｈＡ１配列を両端に持つハイブリッドｂｐｈＡ１遺伝子である。このｂｐｈＡ１（７１５−７０７）遺伝子は、カセットＰＣＲ手法（特開２０００−１２５８７１号公報）でシュードモナス・プチダＫＦ７１５株からｂｐｈＡ１配列を単離し構築されたものであり、酵素反応における変換効率に優れたものである。この遺伝子の塩基配列は配列番号１に、アミノ酸配列は配列番号２に示されている。【００２９】
また、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質が、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとしての機能を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは１若しくは２個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとしての機能とは、芳香環ジオキシゲナーゼ酵素における主要構成タンパク質として、基質認識とその酸素添加反応を担う機能を有することを指す。この機能は、芳香環ジオキシゲナーゼの小サブユニット、フェレドキシン、及びフェレドキシンレダクターゼ遺伝子と共に大腸菌内で共発現させ、基質の生変換実験を行うことによって確認することができる。【００３０】
例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜２個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示されるアミノ酸配列に１〜２個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１〜２個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものも、本発明の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとしての機能を有するタンパク質に含まれる。【００３１】
なお、上記芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットは、後述するピコリン酸類の製造だけではなく、ジヒドロジオール体やジオール体の製造、さらには、芳香族系化合物（例えばビフェニル、ＰＣＢ等）の分解反応においても有用である。【００３２】
このｂｐｈＡ１（７１５−７０７）遺伝子をシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７由来のｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４遺伝子の上流に連結した芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子［ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）Ａ２Ａ３Ａ４］とともに、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来の芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｂｐｈＢ）及び芳香環ジオールジオキシゲナーゼ（ｂｐｈＣ）を組み込んだＪＭ１０９（ｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣ）は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にブタペスト条約の規定下で２００４年２月２日付（原寄託）で国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２１０が付与されている。【００３３】
また、上述したビフェニル分解系酵素をコードする遺伝子としては、部位特異的突然変異誘発法等によって変異が導入され、かつ上記機能又は活性を有する変異体であってもよい。なお、遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）やＭｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製））などを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャフリングやカセットＰＣＲ等の分子進化工学的手法は、例えば、Kurtzman,A.L.,Govindarajan, S., Vahle, K., Jones, J. T., Heinrichs, V., Patten P. A.,Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination: applications to therapeutic proteins.  Curr. Opinion Biotechnol.,12, 361-370, 2001、及び、Okuta, A., Ohnishi, A. and Harayama, S., PCR isolation of catechol 2,3-dioxygenase gene fragments from environmental samples and their assembly into functional genes.  Gene, 212, 221-228, 1998を参照されたい。【００３４】
なお、上記のビフェニル分解系酵素をコードする遺伝子群は通常、ゲノムＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ内において、隣接するかごく近傍に存在しているので、いずれか一つの遺伝子の配列を含むクローン、たとえばコスミドクローン等をコロニーハイブリダイゼーション法等により単離すれば、簡単に他の遺伝子も一緒に単離することができる場合が多い。【００３５】
しかしながら、同様の酵素活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は多数報告され、当業者には周知であるため、本発明はこれらの遺伝子配列を有する組換え微生物から産生される酵素を利用するものに限定されるものではない。【００３６】
３．ビフェニル分解系酵素を産生する微生物
天然に該酵素を産生する微生物としては、例えば、ビフェニルやＰＣＢ（ポリ塩化ビフェニル）等を分解するビフェニル分解細菌、例えば、シュードモナス（Pseudomonas）属、コマモナス（Comamonas）属、ブルクホルデリア（Burkholderia）属、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、ラルストニア（Ralstonia）属等に属する細菌を挙げることができる。これらの属に属する細菌の例としては、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）、ブルクホルテリア（Burkholderia）属ＬＢ４００、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Sphingomonas aromaticivorans）、ロドコッカス・グロベルラス（Rodococcus globerulus）、ラルストニア・オキサラティカ（Ralstonia oxalatica）等を挙げることができる。これらの細菌は、ＡＴＣＣやＤＳＭＺ等のカルチャーコレクションから入手可能である。ただし、本発明で利用可能な微生物は上記のものに限定されず、芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、又は芳香環ジオールジオキシゲナーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子の少なくとも一つを有する微生物であればどのようなものでも利用することができる。【００３７】
芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、又は芳香環ジオールジオキシゲナーゼ遺伝子を有する微生物の一例として、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株（Furukawa,K.及びMiyazaki,T., “Cloning of gene cluster encoding biphenyl and chlorobiphenyl degradation in Pseudomonas pseudoalcaligenes.” J. Bacteriol., 166巻, p.392-398, 1986年）及びブルクホルデリア属ＬＢ４００株（Pseudomonas属に近い）（Erickson,B.D., Mondello,F.J.,Nucleotide sequencing and transcriptional mapping of the genes encoding biphenyl dioxgenase, a multicomponent polychlorinated-biphenyl-degrading enzyme in Pseudomonas strain LB400. J. Bacteriol., 174, 2903-2912, 1992）の解析が行われ、ビフェニル分解系酵素遺伝子が単離されている。シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来の芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子（ｂｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４）を組み込んだ大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＦ６６２２）は、特開２００３−２６９号公報に開示されている。また、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株とブルクホルデリア属ＬＢ４００株由来のｂｐｈＡ１との間でＤＮＡシャフリングを行い分子進化させたｂｐｈＡ１（２０７２）遺伝子を含む芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子［ｂｐｈＡ１（２０７２）Ａ２Ａ３Ａ４］を組み込んだ大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＦ２０７２）は、特開２００３−２６９号公報に開示されている。【００３８】
本発明では、例えば、前項「２．ビフェニル分解系酵素をコードする遺伝子」で説明した改変芳香環（改変ビフェニル）ジオキシゲナーゼ遺伝子［ｂｐｈＡ１（２０７２）Ａ２Ａ３Ａ４］（ｂｐｈＡ（２０７２）と略することがある）又は［ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）Ａ２Ａ３Ａ４］（ｂｐｈＡ（７１５−７０７）と略することがある）、及び、芳香環（ビフェニル）ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ（ｂｐｈＢ）遺伝子、及び芳香環（ビフェニル）ジオールジオキシゲナーゼ（ｂｐｈＣ）遺伝子を導入・発現させた組換え大腸菌及びその組換え大腸菌が産生する酵素を用いることができる。【００３９】
外来遺伝子を大腸菌に導入・発現する方法は常法により行うことができる（例えば、Sambrook,J.,Russell, D. W., "Molecular cloning -A laboratory manual", Third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）。例えば、大腸菌ベクターとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫを用いて、ｂｐｈＡ（２０７２）ＢＣ遺伝子やｂｐｈＡ（７１５−７０７）ＢＣ遺伝子の発現にはｌａｃプロモータを利用することができる。【００４０】
なお、宿主としての微生物は大腸菌に限定されるものではない。たとえば、放線菌であるストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属細菌で、上記遺伝子を導入・発現させることも可能であり、そのような形質転換した組換え微生物も用いることができる（Chun,H.K., Ohnishi,Y., Shindo,K., Misawa,N., Furukawa, K., Horinouchi, S., Biotransformation of flavone and flavanone by Streptomyce lividans cells carrying shuffled biphenyl dioxygenase genes.  J. Mol. Catalysis B: Enzymatic, 21, 113-121, 2003）。【００４１】
４．ビフェニル分解系酵素の単離及び精製
本発明においては、後述する変換反応のために、ビフェニル分解系酵素を産生する微生物から当該酵素を単離及び精製し、それを使用することができる。【００４２】
ビフェニル分解系酵素は、それをコードする遺伝子を保有する前記微生物を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の微生物を培地で培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。【００４３】
細菌等の微生物を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、微生物の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【００４４】
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類、そしてジベンゾフラン、ゲンチジン酸、サリチル酸等の芳香族炭化水素が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、又はその他の含窒素化合物が用いられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。【００４５】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、２０〜４０℃で行う。培養期間中、ｐＨは約５〜９に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００４６】
培養後、目的のビフェニル分解系酵素のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することにより当該タンパク質を抽出する。また、目的タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から目的のタンパク質を単離精製することができる。【００４７】
目的のタンパク質が得られたか否かは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等により確認することができる。さらに、目的タンパク質の理化学的性質又は機能を調べるため、種々の試験を行うことができる。試験項目としては、Ｘ線結晶解析、ＣＤスペクトル解析、ＮＭＲ解析等が挙げられる。【００４８】
５．ピコリン酸類への変換反応
本発明に係るピコリン酸類の製造方法においては、上述のような、芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子、芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子、及び芳香環ジオールジオキシゲナーゼ遺伝子、又はそれらの改変遺伝子を有する微生物が産生する芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、及び芳香環ジオールジオキシゲナーゼを用いて、下記式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）：
【化７】
0004744437.tif 000008
〔式中、Ｈ１は置換基を有していてもよい複素環式基であり、Ａ１は単結合又は置換基を有していてもよい炭素数１〜４のアルキレン基若しくはアルケニレン基であり、Ｐ２は置換基を有していてもよいフェニル基であり、Ｃ１は置換基を有してもよい環式炭化水素基（但し、フェニル基を除く）である。ただし、式ＩＩはジフェニルアセチレンではない。〕
で表されるフェニル基を含む芳香族化合物と、芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、芳香環ジオールジオキシゲナーゼ、及び、メタ開裂化合物ヒドロラーゼとを反応させて、ピコリン酸類（Ｉ’）、（ＩＩ’）又は（ＩＩＩ’）：
【化８】
0004744437.tif 000009
〔式中、Ｈ１、Ａ１、Ｐ２、及びＣ１は前記定義のとおりである。〕
を得る。【００４９】
ここで、「ピコリン酸類」とは、一般的に６−置換基−ピリジン−２−カルボン酸として表すことのできる化合物をいい、ピコリン酸（picolinic acid；ピリジン−２−カルボン酸）の６位に、直接、又はアルキレン基若しくはアルケニレン基を介して複素環式基、フェニル基若しくは環式炭化水素基が結合した構造を持つものである。【００５０】
本明細書でいう「複素環式基」とは、窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子からなる群から選択される１以上の異種原子を環原子として含んでなる単環式又は二環式の環状基であって、置換基により置換されていてもよいものを意味する。「複素環式基」の例としては、Ｃ１−４アルキル基により置換されていてもよい５〜７員の飽和又は不飽和の単環性複素環式基、及びＣ１−４アルキル基により置換されていてもよい９〜１１員の飽和又は不飽和の二環性複素環式基が挙げられる。「複素環式基」を構成する複素環の具体的な例としては、キノリン、インドール、インダノン、ベンゾチアゾール、ベンゾオキサゾール、ピリジン、３−メチルピリジン、ピリミジン、ピロール、ピラゾール、３−メチルピラゾール、イミダゾール、インチアゾール、ベンゾフラン、チオフェン、クロモン（４Ｈ−クロメン−４−オン）、クロマン−４−オン、６−ヒドロキシ−クロマン−４−オン、及びフタルイミド等が挙げられる。【００５１】
アルキレン基は−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１〜４の整数）であって、例えば、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、エチリデン基、イソプロピリデン基、プロピレン基等が挙げられる。【００５２】
アルケニレン基としては、例えば、ビニレン基、１−プロペニレン基、１−ブテニレン基、２−ブテニレン基等が挙げられる。【００５３】
上記複素環式基、アルキレン基及びアルケニレン基は、その基内に−（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｏ−等の構造を含んでいてもよい。さらに、上記複素環式基、アルキレン基及びアルケニレン基は置換基を有していてもよい。置換基としては、炭素数１〜４のアルキル基、アミノ基、ヒドロキシル基、シアノ基等が挙げられる。【００５４】
また、環式炭化水素基としては炭素数５〜１４の飽和又は不飽和の環式炭化水素基が挙げられ、具体的には１−インダノン基、１−ナフチル基、２−ナフチル基、アントラニル基、フェナントレニル基等の芳香族化合物が挙げられる。【００５５】
変換反応の基質として用いられる、フェニル基（ベンゼン環）を分子内に有する有機低分子化合物としては、複素環とベンゼン環がビフェニル結合したもの（例：フラバノン、フラボン、６−ヒドロキシフラバノン、６−ヒドロキシフラボン、７−ヒドロキシフラバノン、２−フェニルキノリン、２−フェニルベンゾキサゾール）だけでなく、複素環とベンゼン環がメチレン基を介して結合したもの（例：２−ベンジルピリジン）や、環化炭化水素基とフェニル環がビフェニル結合したもの（例：ビフェニル、３−フェニル−１−インダノン、１−フェニルナフタレン、２−フェニルナフタレン）や芳香環とフェニル基の間に炭素数３の置換アルケニレン基を有するもの［例：（トランス−）カルコン］が挙げられる。【００５６】
本発明において好適に用いられる基質化合物としては、例えば、以下のような化合物が挙げられる。【００５７】
式（Ｉ）の化合物の具体例：
【化９】
0004744437.tif 000010
【００５８】
式（ＩＩ）の化合物の具体例：
【化１０】
0004744437.tif 000011
【００５９】
式（ＩＩＩ）の化合物の具体例：
【化１１】
0004744437.tif 000012
【００６０】
上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の化合物と、芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、及び芳香環ジオールジオキシゲナーゼとを反応させるか、又はこれらの酵素を産生する微生物とともに培養することにより、下記式（Ｉ’）〜（ＩＩＩ’）に示されるように、フェニル基（ベンゼン環）をピコリン酸に置換できる。
【化１２】
0004744437.tif 000013
〔式中、Ｈ１、Ａ１、Ｐ２、及びＣ１は前記定義のとおりである〕。【００６１】
即ち、本発明の方法により、例えば、式（Ｉ）の具体例として示した７個の化合物からは、以下に示す対応するピコリン酸類［化合物１（フラバノンから）、化合物２（フラボンから）、化合物３（６−ヒドロキシフラバノンから）、化合物４（６−ヒドロキシフラボンから）化合物５（７−ヒドロキシフラバノンから）、化合物６（２−フェニルキノリンから）、化合物７（２−フェニルベンゾキサゾールから）］を得ることができる。これらはすべて新規物質である。
【化１３】
0004744437.tif 000014
また、式（ＩＩ）の具体例として示した２個の化合物からは、以下に示す対応するピコリン酸類［化合物８（ビフェニルから）、化合物９（（トランス−）カルコンから）］を得ることができる。化合物９は新規物質である。
【化１４】
0004744437.tif 000015
【００６２】
上記変換産物９においては、元々の基質（（トランス−）カルコン）が有していたアルケニレン基（１つの炭素間二重結合）が飽和のアルキレン基に変わっている。【００６３】
また、式（ＩＩＩ）の具体例として示した２個の化合物からは以下の対応するピコリン酸類［化合物１０（３−フェニル−１−インダノンから）、化合物１１（２−フェニルナフタレンから）］を得ることができる。これら２つの化合物は新規物質である。
【化１５】
0004744437.tif 000016
【００６４】
上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で表される化合物と、芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、及び、芳香環ジオールジオキシゲナーゼ（又は、これらの酵素を含む破砕微生物、微生物培養液、粗酵素、精製酵素等）との反応、あるいは上記３つの酵素を産生する微生物とともに培養する方法は、通常の酵素反応又は培養方法と同様にして常法により行うことができる。【００６５】
例えば、上記式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）で表される化合物とともに、芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、及び芳香環ジオールジオキシゲナーゼを産生する微生物を培養する方法は以下のようにして行うことができる。【００６６】
微生物を培養する培地としては通常、該微生物が生育し得る培地であれば良く、具体的としては、ＬＢ培地、Ｍ９培地、ＫＢ培地、ＹＭ培地、ＫＹ培地、Ｆ１０１培地、等が例示される。【００６７】
炭素源としては菌体が資化し生育できる炭素化合物であればいずれでも使用可能である。窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源、酵母エキス、ペプトン、肉エキスなどの有機窒素源を使用することができる。これらの他に、必要に応じて、無機塩類、金属塩、ビタミンなどを添加することもできる。ただし、ピコリン酸の窒素源はおそらくアンモニアから来ていることが予想されるので、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源を主要な窒素源として用いるのが望ましい。【００６８】
培養は、通常、温度２０〜４０℃、より好ましくは２５〜３５℃であり、ｐＨは５〜９が好ましい。また、適宜、振盤培養や回転培養としてもよい。【００６９】
培養終了後、培養液を遠心分離機にかけ、上清を回収し、上清液を酢酸エチル等の有機溶媒を用いて抽出する。次いで、抽出液をカラムクロマトグラフィー等で処理することにより目的とするピコリン酸類を得ることができる。
【実施例】
【００７０】
以下、実施例により本発明について具体的に説明する。もっとも、本発明はこれにより限定されるものではない。【００７１】
［実施例１］改変芳香環ジオキシゲナーゼ［ｂｐｈＡ（２０７２）］／芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ／芳香環ジオールオキシゲナーゼ同時発現用プラスミドｐＳＨＦ１０７２の作製
ブルクホルデリア属ＬＢ４００株由来の芳香環（ビフェニル）ジオキシゲナーゼ大サブユニットをコードする遺伝子（ｂｐｈＡ１）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ８６３４８）とシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来の芳香環（ビフェニル）ジオキシゲナーゼの大サブユニットをコードするＤＮＡ（ｂｐｈＡ１）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ８３６７３）を、共通のフランキング配列からなるｂｐｈＡ１プライマーを用いたＰＣＲにより単離した。ｂｐｈＡ１プライマーの塩基配列は以下の通りである：
フォワードプライマー1：5'-CCGAATTCAAGGAGACGTTGAATCATGAGCTCAGC-3'（配列番号３）
リバースプライマー1：5'-TTGAATTCTTCCGGTTGACAGATCT-3'（配列番号４）【００７２】
なお、フォワードプライマー１にはＳａｃＩ部位が、リバースプライマー１にはＢｇｌＩＩ部位があり、両側にさらにＥｃｏＲＩ部位が付与されている（いずれも、アンダーラインで示されている）。ＰＣＲの条件は、９４℃１分、５２℃１．５分、７２℃１分で、２５サイクル行った。【００７３】
単離された上記の２種類のｂｐｈＡ１を混ぜ合わせ、０．１５ユニットのＤｎａｓｅＩ（宝酒造）で１５℃６分間、分解処理した。１０−５０ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルから回収後、混合し、セルフプライミングＰＣＲ、ｂｐｈＡ１プライマーを加えたＰＣＲを行い、ランダムにアミノ酸配列が入れ替わった（ＤＮＡシャフリング）種々のキメラｂｐｈＡ１を含むＰＣＲ産物を得た。なお、ＰＣＲは上記と同じ条件で行い、種々のキメラｂｐｈＡ１を含むＰＣＲ産物は、ＳａｃＩ／ＢｇｌＩＩで二重消化後、アガロースゲルから精製した。【００７４】
シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株のｂｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４−ｂｐｈＢ−ｂｐｈＣ遺伝子群（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ８３６７３）を含む発現プラスミドｐＪＨＦ１８（Hirose, J., Suyama, A., Hayashida, S., Furukawa, K., Gene, 138, 27-33, 1994）を有する大腸菌は、メタ開裂まで反応が進むので、ビフェニルを基質とした場合はメタ開裂産物として、２−ヒドロキシ−６−オキソ−６−フェニルヘキサ−２，４−ジエン酸（2-hydroxy-6-oxo-6-phenylhexa-2,4-dienoic acid）を生成すると考えられている。一般に、メタ開裂産物は黄色を呈するので、４３４ｎｍでモニターすることが可能である。プラスミドｐＪＨＦ１８において、１ヵ所のＭｌｕＩ部位がｂｐｈＡ１内にあるので、ＭｌｕＩで消化し、付着末端を充填した後、再度ライゲーションを行うことにより、ｂｐｈＡ１のみを破壊したプラスミドｐＪＨＦ１８△Ｍ１ｕＩを作製した（T.Kumamaru,H.Suenaga,M.Mitsuoka, T. Watanabe, K. Furukawa, Nature Biotechnology, 16, 663-666, 1998）。【００７５】
次に、ＰＪＨＦ１８△Ｍ１ｕＩをＳａｃＩ／ＢｇｌＩＩで二重消化することにより、△ｂｐｈＡ１遺伝子をのみを含む１．３９ｋｂ断片を除き、代わりに、上記で作製した種々のキメラ体を含むＰＣＲ産物（ＳａｃＩ／ＢｇｌＩＩで二重消化後のもの）を挿入し、種々の改変芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子（改変ｂｐｈＡ１：：ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４遺伝子）とｂｐｈＢｂｐｈＣ遺伝子を含む一連のプラスミド（ｐＳＨＦ１０００シリーズ）を得た。【００７６】
これら一連のプラスミドを有する大腸菌ＸＬ１−Ｂ１ｕｅにビフェニル蒸気を充て、メタ開裂により黄色を呈することができるコロニーを選抜し、以後の実験に用いた。メタ開裂により黄色を呈することができるコロニーにおいては、ＤＮＡシャフリングにより得られた改変ｂｐｈＡ１遺伝子が正常に機能できることを意味している。【００７７】
ビフェニル蒸気により黄色を呈することができた、いくつかの大腸菌形質転換体のうちの１つ（この大腸菌に含まれるプラスミドをｐＳＨＦ１０７２と命名）は、ビフェニルに対するメタ開裂の分解効率が、それぞれの親（ＫＦ７０７及びＬＢ４００）のｂｐｈＡ１遺伝子を持つものより、２倍近く高かっただけでなく、それぞれの親（ＫＦ７０７及びＬＢ４００）のｂｐｈＡ１遺伝子を持つものが分解できないベンゼンやトルエンをもメタ開裂により分解することができた。ただし、この分解効率は、シュードモナス・プチダＦ１の相当遺伝子ｔｏｄＣ１遺伝子を持つものの１／３位であった。【００７８】
上記のプラスミドｐＳＨＦ１０７２由来のシャフリングしたｂｐｈＡ１遺伝子を、ｂｐｈＡ１（２０７２）遺伝子と称する。該ｂｐｈＡ１遺伝子の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０８５７４８に登録されている。また、ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４の塩基配列は前述したように、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ８３６７３に登録されている。【００７９】
なお、既に、このｐＳＨＦ１０７２からｂｐｈＢＣのみを除いて、ｂｐｈＡ１（２０７２）ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４遺伝子を発現するプラスミドｐＫＦ２０７２が作製されており、このプラスミドが導入された大腸菌ＪＭ１０９株を用いた種々の生変換（bioconversion）実験の結果が、前述のMisawa, N., Shindo, K., Takahashi, H., Suenaga, H., Iguchi, K., Okazaki, H., Harayama, S.,及びFurukawa, K., “Hydroxylation of various molecules including heterocyclic aromatics using recombinant Escherichia coli cells expressing modified biphenyl dioxygenase genes.” Tetrahedron , 58巻, p.9605-9612, 2002年及び特開２００３−２６９号公報に開示されている。【００８０】
大腸菌（ｐＫＦ２０７２）は、種々のフェニル基等を含む複素環芳香族化合物を変換し、フェニル基又は複素環芳香族基内の隣接する位置に位置特異的に２つの水酸基と２つの水素が導入された芳香族−シス（ｃｉｓ）−ジヒドロジオール体を立体選択的に生成できることがわかっている。その中でも代表的な反応特異性の例は、複素環芳香族基とフェニル基が単結合（ビフェニル結合）した芳香環化合物を基質とし、産物として、複素環芳香族基−シス−２，３−ジヒドロベンゼンジオール（heteroaromatic group-cis-2,3-dihydrobenezenediol）を合成する立体特異的反応（stereo-specific reaction）である。【００８１】
なお、上記の改変芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子を組み込んだ大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＦ２０７２）は、特開２００３−２６９号公報においてその具体的な作製方法が開示されている。【００８２】
［実施例２］改変芳香環ジオキシゲナーゼ［ｂｐｈＡ（７１５−７０７）］／芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ／芳香環ジオールオキシゲナーゼ同時発現用プラスミドｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣの作製
種々のビフェニル分解菌の持つビフェニルジオキシゲナーゼ大サブユニット（ＢｐｈＡ１）の構造を比較し、それらの間で２箇所の保存性の高いアミノ酸配列が存在することを見いだした。すなわちシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来ＢｐｈＡ１のアミノ酸配列９０−１０１番目に相当するAsp-Lys-Ser-Ile-Lys-Val-Phe-Leu-Asn-Gln-Cys-Arg で表されるアミノ酸配列（保存領域１；配列番号５）と、アミノ酸配列３８６−３９７番目に相当するAsp-Asp-Gly-Glu-Asn-Trp-Val-Glu-Ile-Gln-Lys-Gly で表されるアミノ酸配列（保存領域２；配列番号６）である。【００８３】
ビフェニル分解菌、シュードモナス・グラミニス（Pseudomonas graminis）ＫＦ７０１株、シュードモナス属（Pseudomonas）ＫＦ７０２株、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）ＫＦ７０４株、スフィンゴモナス・ヤノイクヤエ（Sphingomonas yanoikuyae）ＫＦ７０６株、ラルストニア・パウクラ（Ralstonia paucula）ＫＦ７０９株、コマモナス・テストステロニ（Comamonas testosteroni）ＫＦ７１２株、シュードモナス・プチダ（Psudomonas putida）ＫＦ７１５株、シュードモナス・プチダ（Psudomonas putida）ＫＦ７５１株をそれぞれ２ｍｌのＬＢ培地で３７℃、一晩培養し、常法に従いそれぞれのゲノムＤＮＡを抽出した。これらのゲノムＤＮＡを鋳型とし、上記２箇所のＢｐｈＡ１保存領域のアミノ酸配列をコードするプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、それぞれのビフェニルジオキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子ｂｐｈＡ１の保存領域１及び保存領域２に挟まれた領域に相当する約０．９ｋｂの遺伝子（以下Ａ１カセット領域と称す）を増幅した。用いたプライマーは上記アミノ酸配列をコードする複数のコドンのうち複数のビフェニル分解菌において出現頻度の高いコドン配列を組み合わせた混合物として合成した。以下にプライマーの塩基配列を示す：
フォワードプライマー２: 
5’-GACAAGAGCATCAAGGTGTTCCT(A,C,G,T)AACCAGTG(C,T)
CG(A.C.G.T)CA-3’（配列番号７）
リバースプライマー２: 
5’-CCCCTTCTGGATCTCCACCCAGTT(C,T)TC(A,C,G,T)CC(A,G)TCGTC-3’（配列番号８）
配列中カッコ内に示した塩基が複数配列の混合部分である。ＰＣＲの条件は、９４℃１分、６１℃１分、７２℃１分で、３０サイクル行った。【００８４】
次にシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７由来ｂｐｈＡ１遺伝子を鋳型に用い、保存領域１の外側部分及び保存領域２の外側部分、すなわち、アミノ酸配列Ｎ末−９５番目及びアミノ酸配列３９３番目−Ｃ末をそれぞれコードする遺伝子をＰＣＲにより増幅した。用いたプライマーはアミノ酸配列Ｎ末−９５番目部分遺伝子（以下５’ａｒｍと称す）の増幅についてはフォワードプライマー１（実施例１参照）及びリバースプライマー３、アミノ酸配列３９３番目−Ｃ末部分遺伝子（以下３’ａｒｍと称す）についてはフォワードプライマー３及びリバースプライマー１（実施例１参照）を用いた。リバースプライマー３及びフォワードプライマー３の配列を以下に示す：
リバースプライマー３：5’- AACACCTTGATGCTCTTGTC -3’（配列番号９）
フォワードプライマー３：5’- GGGTGGAGATCCAGAAGGGG -3’（配列番号１０）
ＰＣＲの条件は、９４℃１分、６１℃１分、７２℃１分で、３０サイクル行った。【００８５】
次に各Ａ１カセット領域について、５’−ａｒｍ及び３’−ａｒｍを混合し、さらにフォワードプライマー１及びリバースプライマー１を加えてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの条件は、９４℃１分、６１℃１分、７２℃２分で、２５サイクル行った。このＰＣＲ反応においてそれぞれの遺伝子断片は重複部分によりアニーリングし、ｂｐｈＡ１遺伝子の全長に相当する約１．５ｋｂの遺伝子がそれぞれ増幅される。増幅された各遺伝子は５’ａｒｍ−各Ａ１カセット領域−３’ａｒｍという構造を持っており、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来ｂｐｈＡ１遺伝子の保存領域１及び保存領域２に挟まれた部分が各ＫＦ株由来ｂｐｈＡ１遺伝子と入れ替わったハイブリッドｂｐｈＡ１遺伝子である。これらのハイブリッドｂｐｈＡ１遺伝子のそれぞれをシュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株のｂｐｈＡ１Ａ２Ａ３Ａ４−ｂｐｈＢ−ｂｐｈＣ遺伝子群を含む発現プラスミドｐＪＨＦ１８のｂｐｈＡ１遺伝子と入れ替え、種々の改変芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子（ハイブリッドｂｐｈＡ１：：ｂｐｈＡ２Ａ３Ａ４遺伝子）とｂｐｈＢｂｐｈＣ遺伝子を含む種々の発現プラスミド（ｐＢＰＡ７ｘｘ−７０７ＢＣシリーズ）を得た。【００８６】
これら種々のプラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９のコロニーにビフェニル蒸気を充てたところ、すべてのプラスミド保有大腸菌でメタ開裂による黄色を呈し、ハイブリッドｂｐｈＡ１遺伝子が正常に機能していた。次にこれら種々のプラスミド及びｐＳＨＦ１０７２を有する大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと０．２ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ培地で一晩３７℃で培養し、各培養液に種々のビフェニル類似基質を１００μｇ／ｍｌの濃度になるように加え、黄色の呈色により基質の分解の有無を確かめた。基質は、１−フェニルナフタレン、２−フェニルナフタレン、６−ヒドロキシフラバノン、７−ヒドロキシフラバノン、７−ヒドロキシフラボン、及び５，７−ヒドロキシフラボンの６種類について検証した。その結果、ＫＦ７１５株とＫＦ７０７株のハイブリッドｂｐｈＡ１［以下ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）］を有するプラスミドｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣを保有する大腸菌が、１−フェニルナフタレン、２−フェニルナフタレン、６−ヒドロキシフラバノン、及び７−ヒドロキシフラバノンの４種類を分解し、幅広い基質特異性を示した。また、特に１−フェニルナフタレン、２−フェニルナフタレンについてはｐＳＨＦ１０７２を有する大腸菌よりも強い黄色を呈し、強い分解活性を持つことが示された。【００８７】
ｂｐｈＡ１（７１５−７０７）遺伝子の配列を解析したところ、シュードモナス・シュードアルカリゲネスＫＦ７０７株由来ｂｐｈＡ１遺伝子と同じ全長の４５８個のアミノ酸配列をコードしているが、１８２，３２４，３２５番目の３つのアミノ酸残基が異なっており、ＫＦ７０７株由来のものではアスパラギン酸（１８２）、セリン（３２４）、バリン（３２５）残基であるところが、ＢｐｈＡ１（７１５−７０７）では、グルタミン酸（１８２）、スレオニン（３２４）、イソロイシン（３２５）残基となっていた。また、ＢｐｈＡ１（７１５−７０７）のアミノ酸配列は、ＢｐｈＡ１（２０７２）のアミノ酸配列と７ヶ所異なっていた。なお、ＢｐｈＡ１（７１５−７０７）のアミノ酸配列は配列番号２に、塩基配列は配列番号１に示されている。【００８８】
プラスミドｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣを組み込んだ大腸菌ＪＭ１０９（ｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣ）は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）にブタペスト条約の規定下で２００４年２月２日付（原寄託）で国際寄託され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２１０が付与されている。【００８９】
［実施例３］大腸菌形質転換体の作製
大腸菌形質転換体を作製するための手順は以下のとおりである。【００９０】
実施例１、２で作製した改変芳香環ジオキシゲナーゼ、芳香環ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、及び芳香環ジオールオキシゲナーゼ遺伝子を有する組換え大腸菌ＪＭ１０９、すなわち、大腸菌（ｐＳＨＦ１０７２）又は大腸菌（ｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣ）を、１５０μｇ／ｍ１のアンピシリン（Ａｐ）を含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣ１）で対数期前半まで液体培養し、最終濃度が約３０％になるようにグリセロールに懸濁し、−７０〜−８０℃のディープフリーザーに入れることにより、グリセロール保存株とした。また、コントロールとして、ｐＵＣ１１８等のＡｐ耐性のベクターのみを有する大腸菌（ＪＭ１０９株）も同様に培養してグリセロール保存株を作製した。【００９１】
［実施例４］大腸菌形質転換体の基質との共存培養
大腸菌（ｐＳＨＦ１０７２）又は大腸菌（ｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣ）との共存培養による基質のピコリン酸への変換反応を開始するにあたって、まず、実施例３で作製した上記のグリセロール保存株１ｍｌを、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｐ）を含むＬＢ培地１００ｍｌ（５００ｍｌの三角フラスコまたは坂口フラスコを使用）に懸濁し、１２０ｒｐｍ、３０℃で６〜７時間培養した（前培養）。これでＯＤ６００ｎｍが約１になる。次に、前培養液７〜８ｍｌを、１５０μｇ／ｍｌのＡｐ、最終濃度１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、０．４％（ｗ／ｖ）のグルコース、及び、１０ｍｇの基質を含むＭ９培地（Sambrook,J.,Russell,D.W.,“Molecular cloning- a laboratory manual”, Third edition, Cold Spring harbor Laboratory press, 2001）１００ｍｌ（５００ｍｌの三角フラスコまたは坂口フラスコを使用）に入れ、１２０ｒｐｍ、３０℃で２日間培養した（共存培養）。なお、基質は前もって、少量のＤＭＳＯ（１００ｍｇ／ｍｌの濃度）に溶かしたものを培地に加えた。培養２日目に１００ｍｌのメタノールを加え３０分間攪拌することにより生成したピコリン酸類を含む脂質成分を抽出し、８，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を集めた。【００９２】
［実施例５］変換産物のＨＰＬＣ分析
実施例４に従って大腸菌（ｐＳＨＦ１０７２）又は大腸菌（ｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣ）と種々の基質との反応により得られた生成物はＨＰＬＣにより分析した。分析に用いたＨＰＬＣ条件は以下の通りである。検出はｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ ａｒｒａｙ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＨＩＴＡＣＨＩ Ｌ７１００）を用い、２００〜５００ｎｍの吸収を検出した。【００９３】
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｘｔｅｒｒａ ＭＳＣ１８（５μｍ），４．６×１００ｍｍ
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ．
溶媒：Ａ＝５％ＣＨ３ＣＮ，２０ｍＭリン酸、Ｂ＝９５％ＣＨ３ＣＮ，２０ｍＭリン酸
０→３分：Ａ  １００％
３→２０分：Ａ  １００％→Ｂ  １００％（リニアグラジエント）
２０→３０分：Ｂ  １００％
温度：室温【００９４】
〔実施例６〕変換産物の精製・同定
大腸菌（ｐＳＨＦ１０７２）又は大腸菌（ｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣ）と、実施例５で変換が確認された基質の混合培養液１Ｌ（実施例４の１０倍のスケール）に等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを７，０００ｒｐｍにて１０分遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下、約５００ｍｌまで濃縮し、ｐＨ５に調整後、５００ｍｌの酢酸エチルで２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し、生成物含有エキスを得た。エキスをシリカゲル［０．２５ｎｍ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ）］を用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にかけ、変換産物の確認を行った後、シリカゲルカラム［２０×２５０ｍｍ，Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ）］等を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、純品を得た。【００９５】
なお、各基質におけるＴＬＣの展開溶媒は以下の通りである：
フラバノン：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（３：１：０．１）；
フラボン：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（３：１）；
６−ヒドロキシフラバノン：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（６：１：０．１）；
６−ヒドロキシフラボン：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（６：１：０．１）；
７−ヒドロキシフラバノン：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（３：１：０．１）；
２−フェニルキノリン：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（３：１：０．１）；
２−フェニルベンゾキサゾール：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（５：１：０．１）；
ビフェニル：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（４：１：０．１）；
（トランス−）カルコン：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（３：１：０．１）；
３−フェニル−１−インダノン：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（４：１）; 
２−フェニルナフタレン：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（４：１）．【００９６】
また、各基質におけるシリカゲルカラムクロマトグラフィーの展開溶媒は以下の通りである：
フラバノン：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（４：１）；
フラボン：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（４：１：０．１）；
６−ヒドロキシフラバノン：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（３：１：０．１）；
６−ヒドロキシフラボン：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（６：１：０．１）；
７−ヒドロキシフラバノン：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（３：１：０．１）；
２−フェニルキノリン：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（４：１：０．１）；
２−フェニルベンゾキサゾール：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（５：１：０．０５）；
ビフェニル：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（６：１：０．１）；
（トランス−）カルコン：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（３：１：０．１）；
３−フェニル−１−インダノン：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（４：１：０．１）;
２−フェニルナフタレン：ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（５：１：０．１）．【００９７】
（１）フラバノンの変換産物の同定
大腸菌（ｐＳＨＦ１０７２）、及び、大腸菌（ｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣ）によりフラバノン（ｆｌａｖａｎｏｎｅ）の変換実験（各１００ｍｌ）を行い、ＨＰＬＣにより変換率の比較を行ったところ、両組換え大腸菌の変換率は同等であった。そこで、大腸菌（ｐＳＨＦ１０７２）によりフラバノンの変換実験（１Ｌ）を行い、その粗抽出物（４６９ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．４５の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１（２３．８ｍｇ）の純品を得た。化合物１はＦＡＢ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ，ｍａｔｒｉｘ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）でｍ／ｚ２７０に分子イオンピーク（Ｍ＋Ｈ）＋が観測された。さらに高分解能ＦＡＢ−ＭＳを測定した結果、本イオンの精密分子量は２７０．０７８７と計算された。この結果、本イオンの分子式はＣ１５Ｈ１１ＮＯ４（ｃａｌｃｄ  ｆｏｒ  ２７０．０７６７）であり、従って変換化合物の分子式はＣ１５Ｈ１１ＮＯ４と決定された。【００９８】
化合物１をＣＨ２Ｃｌ２中でフェナシルブロマイド、ＴＥＡと反応させるとフェナシルエステルエステルが得られた。従って化合物１にはカルボン酸が存在することが確認された。次に化合物１の１Ｈ−１Ｈ  ＤＱＦ，ＨＭＱＣ，ＨＭＢＣを測定、解析した結果、フラバノンのＡ環、Ｃ環はそのまま残っていることが判明した。この時点で化合物１を構成する元素の残りから考えて、化合物１にはピリジン環が存在することが強く示唆された。これは、Ｊ２’，３’＝７．７Ｈｚ，Ｊ３’，４’＝７．６Ｈｚであることや、ピリジン環を構成していると推定される炭素の１３Ｃ  ＮＭＲケミカルシフト（δＣ１２４．３，δＣ１２４．３，δＣ１３８．７，δＣ１４８．８，δＣ１５７．３）からも確認された。またピリジン環を構成するＣ−２’−Ｃ−３’−Ｃ−４’間で１Ｈ−１Ｈビシナルスピンカップリングが観測されることからカルボン酸がＣ−５’に結合することが確定し、この結果、化合物１を６−（４−オキソ−クロマン−２−イル）−ピリジン−２−カルボン酸（6-(4-oxo-chroman-2-yl)-pyridine-2-carboxylic acid）と同定した。これは新規な化合物であった。その構造とＮＭＲのデータを以下と表１に示す。なお、化学構造式中に書かれた数字は、ＮＭＲの表中の数字と対応しており、同定されたＩＵＰＡＣ名の数字とは対応していない（以後も同様）。【００９９】
【化１６】
0004744437.tif 000017
【０１００】
【表１】
0004744437.tif 000018
【０１０１】
（２）フラボンの変換産物の同定
大腸菌（ｐＳＨＦ１０７２）によりフラボン（ｆｌａｖｏｎｅ）の変換実験（１Ｌ）を行った粗抽出物（５２６ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．３の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物２（２８．０ｍｇ）の純品を得た。化合物２はＦＡＢ−ＭＳでｍ／ｚ２６８に分子イオンピーク（Ｍ＋Ｈ）＋が観測され、１Ｈ，１３Ｃ  ＮＭＲデータから考え合わせてその分子式はＣ１５Ｈ９ＮＯ４と決定された。【０１０２】
次に化合物２の１Ｈ−１Ｈ  ＤＱＦ  ＣＯＳＹ，ＨＭＱＣ，ＨＭＢＣを測定した。化合物２のＮＭＲスペクトルはブロードであり充分な構造情報は得られなかったが、化合物１との比較からも解析することにより、化合物２を６−（４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）−ピリジン−２−カルボン酸（6-(4-oxo-4H-chromen-2-yl)-pyridine-2-carboxylic acid）と同定した。これは新規な化合物であった。その構造とＮＭＲのデータを表２に示す。【０１０３】
【化１７】
0004744437.tif 000019
【０１０４】
【表２】
0004744437.tif 000020
【０１０５】
（３）６−ヒドロキシフラバノンの変換産物の同定
大腸菌（ｐＳＨＦ１０７２）により６−ヒドロキシフラバノン（6-hydroxyflavanone）の変換実験（１Ｌ）を行った粗抽出物（１２４ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２４の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物３（２１．５ｍｇ）の純品を得た。化合物３はＦＡＢ−ＭＳでｍ／ｚ２８６に分子イオンピーク（Ｍ＋Ｈ）＋が観測され、１Ｈ，１３Ｃ  ＮＭＲデータから考え合わせてその分子式はＣ１５Ｈ１１ＮＯ５と決定された。【０１０６】
次に化合物３の１Ｈ−１Ｈ  ＤＱＦ  ＣＯＳＹ，ＨＭＱＣ，ＨＭＢＣを測定した。化合物３のＮＭＲスペクトルはブロードであり充分な構造情報は得られなかったが、化合物１との比較からも解析することにより、化合物３を６−（６−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロマン−２−イル）−ピリジン−２−カルボン酸（6-(6-hydroxy-4-oxo-4H-chroman-2-yl)-pyridine-2-carboxylic acid）と同定した。これは新規な化合物であった。そのＮＭＲのデータを表３に示す。【０１０７】
【化１８】
0004744437.tif 000021
【０１０８】
【表３】
0004744437.tif 000022
【０１０９】
（４）６−ヒドロキシフラボンの変換産物の同定
大腸菌（ｐＳＨＦ１０７２）により６−ヒドロキシフラボン（6-hydroxyflavone）の変換実験（１Ｌ）を行った粗抽出物（１１３ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．３の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物４（３７．０ｍｇ）の純品を得た。化合物４はＦＡＢ−ＭＳ（positive, matrix glycerol）でｍ／ｚ２８４に分子イオンピーク（Ｍ＋Ｈ）＋が観測され、１Ｈ，１３Ｃ  ＮＭＲデータから考え合わせてその分子式はＣ１５Ｈ９ＮＯ５と決定された。【０１１０】
次に化合物４の１Ｈ−１Ｈ  ＤＱＦ  ＣＯＳＹ，ＨＭＱＣ，ＨＭＢＣを測定した。化合物４のＮＭＲスペクトルはブロードであり充分な構造情報は得られなかったが、化合物１との比較からも解析することにより、化合物４を６−（６−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロメン−２−イル）−ピリジン−２−カルボン酸（6-(6-hydroxy-4-oxo-4H-chromen-2-yl)-pyridine-2-carboxylic acid）と同定した。これは新規な化合物であった。そのＮＭＲのデータを表４に示す。【０１１１】
【化１９】
0004744437.tif 000023
【０１１２】
【表４】
0004744437.tif 000024
【０１１３】
（５）７−ヒドロキシフラバノンの変換産物の同定
大腸菌（ｐＳＨＦ１０７２）により７−ヒドロキシフラバノン（7-hydroxyflavanone）の変換実験（１Ｌ）を行った粗抽出物（１１３ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．３の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物５（６８．５ｍｇ）の純品を得た。化合物５はＦＡＢ−ＭＳ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ，ｍａｔｒｉｘ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）でｍ／ｚ２８６に分子イオンピーク（Ｍ＋Ｈ）＋が観測され、１Ｈ，１３Ｃ  ＮＭＲデータから考え合わせてその分子式はＣ１５Ｈ１１ＮＯ５と決定された。【０１１４】
次に化合物５の１Ｈ−１Ｈ  ＤＱＦ  ＣＯＳＹ，ＨＭＱＣ，ＨＭＢＣを測定した。化合物５のＮＭＲスペクトルはブロードであり充分な構造情報は得られなかったが、化合物１との比較からも解析することにより、化合物５を６−（７−ヒドロキシ−４−オキソ−４Ｈ−クロマン−２−イル）−ピリジン−２−カルボン酸（6-(7-hydroxy-4-oxo-4H-chroman-2-yl)-pyridine-2-carboxylic acid）と同定した。これは新規な化合物であった。そのＮＭＲのデータを表５に示す。【０１１５】
【化２０】
0004744437.tif 000025
【０１１６】
【表５】
0004744437.tif 000026
【０１１７】
（６）２−フェニルキノリンの変換産物の同定
大腸菌（ｐＳＨＦ１０７２）、及び、大腸菌（ｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣ）により２−フェニルキノリン（2-phenylquinoline）の変換実験（各１００ｍｌ）を行い、ＨＰＬＣにより変換率の比較を行ったところ、両組換え大腸菌の変換率は同等であった。そこで、大腸菌（ｐＳＨＦ１０７２）により２−フェニルキノリン（2-phenylquinoline）の変換実験（１Ｌ）を行い、その粗抽出物（２１０ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．３の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製後、さらに分取ＨＰＬＣ（カラム：資生堂カプセルパックＳＧ、直径１０ｍｍ×２５０ｍｍ、溶媒：３５％ＭｅＯＨ，０．２％ＴＦＡ）で精製し、化合物６（２１．３ｍｇ）の純品を得た。【０１１８】
化合物６はＦＡＢ−ＭＳでｍ／ｚ２５１に分子イオンピーク（Ｍ＋Ｈ）＋が観測され、１Ｈ，１３Ｃ  ＮＭＲデータから考え合わせてその分子式はＣ１５Ｈ１０Ｎ２Ｏ２と決定された。【０１１９】
次に化合物７の１Ｈ−１Ｈ  ＤＱＦ  ＣＯＳＹ，ＨＭＱＣ，ＨＭＢＣを測定した。これらから得られた情報及び、化合物１との比較からも解析することにより、化合物６を６−キノリン−２−イル−ピリジン−２−カルボン酸（6-quinolin-2-yl-pyridine-2-carboxylic acid）と同定した。これは新規な化合物であった。その構造とＮＭＲのデータを以下と表６に示す。【０１２０】
【化２１】
0004744437.tif 000027
【０１２１】
【表６】
0004744437.tif 000028
【０１２２】
（７）２−フェニル−ベンゾキサゾールの変換産物の同定
大腸菌（ｐＳＨＦ１０７２）により２−フェニルベンゾオキサゾール（2-phenylbenzoxazole）の変換実験（１Ｌ）を行った粗抽出物（７４ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．４の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し精製後、さらに分取ＨＰＬＣ（カラム：資生堂カプセルパックＳＧ、直径１０ｍｍ×２５０ｍｍ、溶媒：５０％ＭｅＯＨ，０．２％ＴＦＡ）で精製し、化合物７（１８．０ｍｇ）の純品を得た。【０１２３】
化合物７はＦＡＢ−ＭＳでｍ／ｚ２４１に分子イオンピーク（Ｍ＋Ｈ）＋が観測され、１Ｈ，１３Ｃ  ＮＭＲデータから考え合わせてその分子式はＣ１３Ｈ８Ｎ２Ｏ３と決定された。【０１２４】
次に化合物７の１Ｈ−１Ｈ  ＤＱＦ  ＣＯＳＹ，ＨＭＱＣ，ＨＭＢＣを測定した。これらから得られた情報及び、化合物１との比較から解析することにより、化合物７を６−ベンゾオキサゾール−２−イル−ピリジン−２−カルボン酸（6-benzooxazol-2-yl-pyridine-2-carboxylic acid）と同定した。これは新規な化合物であった。その構造とＮＭＲのデータを以下と表７に示す。【０１２５】
【化２２】
0004744437.tif 000029
【０１２６】
【表７】
0004744437.tif 000030
【０１２７】
（８）ビフェニルの変換産物の同定
大腸菌（ｐＳＨＦ１０７２）、及び、大腸菌（ｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣ）によりビフェニル(biphenyl)の変換実験（各１００ｍｌ）を行い、ＨＰＬＣにより変換率の比較を行ったところ、変換率は後者の組換え大腸菌の方が１．５倍高効率であった。そこで、大腸菌（ｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣ）によりビフェニル（biphenyl）の変換実験（１Ｌ）を行った粗抽出物（１２１．７ｍｇ）をＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝４：１：０．１）に供したところ、Ｒｆ値０．４の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ＝６：１：０．１）により精製後、さらに分取ＨＰＬＣ（カラム：資生堂カプセルパックＳＧ、直径１０ｍｍ×２５０ｍｍ、溶媒：６０％ＭｅＯＨ，０．２％ＴＦＡ）で精製し、化合物８（７９．２ｍｇ）の純品を得た。【０１２８】
化合物８はＦＡＢ−ＭＳでｍ／ｚ２００に分子イオンピーク（Ｍ＋Ｈ）＋が観測され、１Ｈ，１３Ｃ  ＮＭＲデータから考え合わせてその分子式はＣ１２Ｈ９ＮＯ２と決定された。【０１２９】
次に化合物８の１Ｈ−１Ｈ  ＤＱＦ  ＣＯＳＹ，ＨＭＱＣ，ＨＭＢＣを測定した。これらから得られた情報及び化合物１との比較からも解析することにより、化合物８を６−フェニル−ピリジン−２−カルボン酸（6-phenyl-pyridine-2-carboxylic acid）と同定した。その構造とＮＭＲのデータを以下と表８に示す。本化合物はＣＡＳに登録のある既知物質（特開昭５５−０００３０７公報）であるが、これを作るのに必要な変換酵素遺伝子群を有する組換え微生物を用いた生変換反応による作製は新規な手法である。また、化合物８を作るのに必要な変換酵素やこれをコードする遺伝子は、本発明により初めて明らかにされたものである。【０１３０】
【化２３】
0004744437.tif 000031
【０１３１】
【表８】
0004744437.tif 000032
【０１３２】
（９）（トランス−）カルコンの変換産物の同定
大腸菌（ｐＳＨＦ１０７２）又は大腸菌（ｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣ）によりトランスカルコン（(trans-)chalcone）の変換実験（１Ｌ）を行った粗抽出物（４５６ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．３５の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物９（３０．７ｍｇ）の純品を得た。【０１３３】
化合物９はＦＡＢ−ＭＳでｍ／ｚ２５６に分子イオンピーク（Ｍ＋Ｈ）＋が観測され、１Ｈ，１３Ｃ  ＮＭＲデータから考え合わせてその分子式はＣ１５Ｈ１３ＮＯ３と決定された。【０１３４】
次に化合物９の１Ｈ−１Ｈ  ＤＱＦ  ＣＯＳＹ，ＨＭＱＣ，ＨＭＢＣを測定した。化合物６のＮＭＲスペクトルはブロードであり充分な構造情報は得られなかったが、化合物１との比較から解析することにより、化合物９を６−（３−オキソ−３−フェニル−プロピル）−ピリジン−２−カルボン酸（6-(3-oxo-3-phenyl-propyl)-pyridine-2-carboxylic acid）と同定した。これは新規な化合物であった。その構造とＮＭＲのデータを以下と表９に示す。【０１３５】
【化２４】
0004744437.tif 000033
【０１３６】
【表９】
0004744437.tif 000034
【０１３７】
（１０）３−フェニル−１−インダノンの変換産物の同定
大腸菌（ｐＳＨＦ１０７２）により３-フェニル-１-インダノン（3-phenyl-1-indanone）の変換実験（１Ｌ）を行った粗抽出物（７９ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し精製後、さらに分取ＨＰＬＣ（カラム：資生堂カプセルパックＳＧ、直径１０ｍｍ×２５０ｍｍ、溶媒：５０％ＭｅＯＨ，０．２％ＴＦＡ）で精製し、化合物１０（１０．０ｍｇ）の純品を得た。【０１３８】
化合物１０はＦＡＢ−ＭＳでｍ／ｚ２５３に分子イオンピーク（Ｍ＋Ｈ）＋が観測され、１Ｈ，１３Ｃ  ＮＭＲデータから考え合わせてその分子式はＣ１５Ｈ１１ＮＯ３と決定された。【０１３９】
次に化合物１０の１Ｈ−１Ｈ  ＤＱＦ  ＣＯＳＹ，ＨＭＱＣ，ＨＭＢＣを測定した。これらから得られた情報及び、化合物１との比較から解析することにより、化合物１０を６−（３−オキソ−インダン−１−イル）−ピリジン−２−カルボン酸（6-(3-oxo-indan-1-yl)-pyridine-2-carboxylic acid）と同定した。これは新規な化合物であった。その構造とＮＭＲのデータを以下と表１０に示す。【０１４０】
【化２５】
0004744437.tif 000035
【０１４１】
【表１０】
0004744437.tif 000036
【０１４２】
（１１）２−フェニルナフタレンの変換産物の同定
大腸菌（ｐＳＨＦ１０７２）、及び、大腸菌（ｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣ）により２-フェニルナフタレン（2-phenylnaphthalene）の変換実験（各１００ｍｌ）を行い、ＨＰＬＣにより変換率の比較を行ったところ、変換率は後者の組換え大腸菌の方が１．５倍高効率であった。そこで、大腸菌（ｐＢＰＡ７１５−７０７ＢＣ）により２−フェニルナフタレン（2-phenylnaphthalene）の変換実験（１Ｌ）を行った粗抽出物（１０１ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し精製後、さらに分取ＨＰＬＣ（カラム：資生堂カプセルパックＳＧ、直径１０ｍｍ×２５０ｍｍ、溶媒：７０％ＭｅＯＨ，０．２％ＴＦＡ）で精製し、化合物１１（２０．１ｍｇ）の純品を得た。【０１４３】
化合物１１はＦＡＢ−ＭＳでｍ／ｚ２５０に分子イオンピーク（Ｍ＋Ｈ）＋が観測され、１Ｈ，１３Ｃ  ＮＭＲデータから考え合わせてその分子式はＣ１６Ｈ１１ＮＯ２と決定された。【０１４４】
次に化合物１１の１Ｈ−１Ｈ  ＤＱＦ  ＣＯＳＹ，ＨＭＱＣ，ＨＭＢＣを測定した。これらから得られた情報及び、化合物１との比較から解析することにより、化合物１１を６−ナフタレン−２−イル−ピリジン−２−カルボン酸（6-naphthalene-2-yl-pyridine-2-carboxylic acid）と同定した。これは新規な化合物であった。その構造とＮＭＲのデータを以下と表１１に示す。【０１４５】
【化２６】
0004744437.tif 000037
【０１４６】
【表１１】
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【０１４７】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、その全文を参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用の可能性】
【０１４８】
本発明により、有機化学合成では製造が困難な有機低分子化合物であるピコリン酸類の新規な製造方法が提供される。本発明に係る方法によれば、酵素反応の基質としてフェニル基（ベンゼン環）を分子内に有する有機低分子化合物を用いればよいため、豊富で安価な種々の市販化学合成基質から、医薬品や農薬等の付加価値の高い工業製品原料を製造することができる。また、本発明に係る方法はフェニル基（ベンゼン環）をピコリン酸に変換する方法を提供するものであり、有機化学合成法の１手法を提供するという点で有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１４９】
配列番号１：合成遺伝子
配列番号２：合成タンパク質
配列番号３及び４：合成オリゴヌクレオチド
配列番号５及び６：合成ペプチド
配列番号７及び８：合成オリゴヌクレオチド（ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴを表す）
配列番号９及び１０：合成オリゴヌクレオチド
【配列表】
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