(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロロフレクサス・オーランティアカス（Chloroflexus aurantiacus）に由来し、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を有し、且つ以下の物理化学的性質を有する単離されたタンパク質。
(a) ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるみかけの分子量：約３９ｋＤａ
(b) ｐＨ安定性：ｐＨ５以上で、２５℃、２４時間の加温処理後の残存Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性が８０％以上
(c) 基質特異性：Ｎ−アセチル化もしくはＮ−ホルミル化したメチオニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニンおよびトリプトファンのＬ体およびＤ体に対してＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を示す
【請求項２】
さらに以下の物理化学的性質を有する、請求項１記載のタンパク質。
(d) 熱安定性：７０℃、１時間の加温処理後もＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を有する
(e) 金属イオン依存性：Ｃｏ2+、Ｍｎ2+、Ｍｇ2+、Ｆｅ2+存在下でＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を示す
【請求項３】
７０℃、１時間の加温処理後の残存Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性が少なくとも３０％以上である、請求項１または２記載のタンパク質。
【請求項４】
以下の(a)または(b)のポリペプチドから実質的になる、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を有する単離されたタンパク質。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ７０℃、１時間の加温処理後もＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を有するポリペプチド
【請求項５】
７０℃、１時間の加温処理後の残存Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性が３０％以上である、請求項４記載のタンパク質。
【請求項６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を含む、請求項４または５記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸（但し、配列番号１に示される塩基配列を含む核酸を除く）。
【請求項８】
異種宿主細胞に導入するための請求項７記載の核酸であって、該宿主において使用頻度の低いコドンが使用頻度のより高いコドンに置換された塩基配列からなる核酸。
【請求項９】
宿主が大腸菌である請求項８記載の核酸。
【請求項１０】
配列番号３に示される塩基配列を含む、請求項７〜９のいずれかに記載の核酸。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸が、該核酸を導入する宿主細胞に適合したプロモーターに機能的に連結されてなる発現ベクター。
【請求項１２】
核酸が請求項７〜１０のいずれかに記載のものである、請求項１１記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１または１２記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
【請求項１４】
宿主細胞が大腸菌である請求項１３記載の形質転換体。
【請求項１５】
請求項１３または１４記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からＮ-アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質を採取することを含む、請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質を、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸またはＮ−アシル−Ｌ−アミノ酸に接触させることを含む、ラセミ化されたＮ−アシルアミノ酸の製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質を、Ｄ−またはＬ−アミノアシラーゼの共存下で、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸、Ｎ−アシル−Ｌ−アミノ酸またはその混合物に接触させることを含むＤ−またはＬ−アミノ酸の製造方法。
【請求項１８】
アミノ酸がメチオニン、ロイシン、バリン、フェニルアラニンまたはトリプトファンからなる群より選択される請求項１６または１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学活性なα−アミノ酸の製造に用いることのできる、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ（以下、ＮＡＡＡＲともいう）活性を有する新規タンパク質に関する。さらに、遺伝子工学技術による該ＮＡＡＡＲの製造法、および該ＮＡＡＡＲを用いた光学活性なα−アミノ酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸は構造上光学異性体を形成し得るが、天然に存在し、生命体に利用されるα−アミノ酸のほとんどはＬ体である。しかしながら、Ｄ−アミノ酸も微量ながら生体中に存在する事実も、近年次々と明らかにされており、それらが有する生理活性の有用性から、Ｄ−アミノ酸およびその誘導体も医薬品等の用途に利用されてきている。同一組成であっても、立体構造において鏡像異性体であるＬ−アミノ酸とＤ−アミノ酸とは、生理活性を異にするため、工業的にアミノ酸を利用する際には、その製造工程において、所望の光学活性を有するアミノ酸を取得することが非常に重要である。
【０００３】
アミノ酸の製造方法としては、微生物を培養して産生したアミノ酸を回収する発酵法と、アミノ酸を所定の反応条件において人工的に合成する化学合成法とに大きく二分される。特に、Ｄ−アミノ酸については、現在のところ発酵生産が困難であるため、その製造は化学合成法に頼らざるを得ない。しかしながら、化学合成で生成されるアミノ酸は、光学的にＬ体とＤ体が混在したラセミ状態であることから、ここから光学異性体を分離し、所望の光学活性を有するアミノ酸を抽出する操作がさらに必要となる。この方法としては、Ｎ−アシル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸にＤ−アミノアシラーゼもしくはＬ−アミノアシラーゼを作用せしめて、所望の光学特性を有するアミノ酸を生成させ、これを抽出する方法が公知である。
【０００４】
Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ（ＮＡＡＡＲ）は、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸およびＮ−アシル−Ｌ−アミノ酸をそれぞれ対応する光学異性体に置換する可逆的反応を触媒する。よって、このＮＡＡＡＲをアミノアシラーゼと共にＮ−アシル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸に作用させることで、所望の光学活性なアミノ酸を、アミノアシラーゼ単独で作用させた場合に比して、高い収量で得ることができる。公知のＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質の例としては、例えばアミコラトプシス・エスピー（Amycolatopsis sp.）・ＴＳ−１−６０（以下、単にＴＳ−１−６０という場合がある）由来のもの（特許文献１）、セベキア・ベニハナ（Sebekia benihana）（以下、単にベニハナという場合がある）由来のもの（特許文献２）、デイノコッカス・ラディオデュランス（Deinococcus radiodurans）由来のもの（特許文献３）等が挙げられる。これらは遺伝子配列も決定され（特許文献３によれば、Ｄ．ラディオデュランス由来ＮＡＡＡＲは、ＴＳ−１−６０およびベニハナ由来酵素と、アミノ酸配列でそれぞれ約４６％および４４％の同一性を有する）、形質転換微生物による組換えタンパク質の発現も確認されている。特に、ＴＳ−１−６０由来ＮＡＡＡＲは結晶構造解析までなされ、立体構造が決定されている（非特許文献１）。
【０００５】
通常、同一機能を有する新規酵素を既知酵素のアミノ酸配列情報を手がかりに得ようと思えば、既知配列と相同性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすると予想される新規遺伝子を遺伝子工学的に発現させることで容易に得ることができる。高度にアミノ酸配列が保存されているタンパク質同士であれば、同一の機能を有するオルソログであると考えられるが、ＮＡＡＡＲの場合は、公知ＮＡＡＡＲに対して約４０〜約５０％程度の同一性であれば、そのタンパク質が必ずしもＮＡＡＡＲ活性を有しないことが知られている。例えば、バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）由来ｙｔｆＤ遺伝子産物は、アミノ酸配列で、ＴＳ−１−６０由来ＮＡＡＡＲと約４２％、ベニハナ由来ＮＡＡＲとは約４３％の同一性を有するが、ＮＡＡＡＲ活性がない（特許文献３）。また、これまでＮＡＡＡＲとされてきたＴＳ−１−６０由来酵素の真の機能はｏ−スクシニルベンゾエートシンターゼ（ＯＳＢＳ）であり、基質特異性の甘さからＮ−アシルアミノ酸にも作用してラセミ化反応を起こしているとの仮説が提唱されている（非特許文献２）。本文献によれば、上記ｙｔｆＤ遺伝子産物もまたＯＳＢＳ活性を有しており、ＯＳＢＳ活性を有するすべての酵素がＮＡＡＡＲ活性をも有するわけではないことも記載されている。
即ち、真の生理機能としてＮＡＡＡＲ活性を有するタンパク質はこれまでには知られておらず、したがって、公知のＮＡＡＡＲ活性を有するタンパク質と、アミノ酸配列において約５０％程度もしくはそれより低い同一性を有するタンパク質が、ＮＡＡＡＲ活性を有するか否かは、実際に該タンパク質を調製し、該活性を確認しなければ判断できない。
【０００６】
ところで、タンパク質の分子設計において、安定性の向上は永遠のテーマと言える。各種タンパク質を産業的に利用する際、保存状態あるいは使用条件における該タンパク質の失活は製品品質の低下や生産コスト高といった不利益を生じるため、その利用に際しては該タンパク質の耐久性を高める工夫を余儀なくされる。また、一般に、タンパク質の代表例である各種酵素の触媒活性は高温になるほど高効率であるため、安定性の高いタンパク質の利用はより効率的な条件下での使用を可能にするという利点もある。
【０００７】
タンパク質の安定化を達成する方策の一つに安定化剤の添加がある。保存状態あるいは使用条件においてタンパク質の安定性を向上するために、各種物質を適当量添加することで、より長期にわたりタンパク質の機能を維持しようとするものである。このような化学物質の例としては、糖類、アミノ酸、界面活性剤、ウシ血清アルブミンなどのタンパク質、各種防腐剤など多種多様であるが、どのようなタンパク質も飛躍的に安定性を向上させるような万能な安定化物質は知られておらず、また、これら物質による安定化の度合いにも限度がある。よってタンパク質そのものの性質として安定性に優れていることが好ましい。
【０００８】
近年の遺伝子工学的技術の進歩により、タンパク質をコードする遺伝子に変異を導入することが簡便にできるようになった。アミノ酸残基を置換、欠失、付加することによりタンパク質機能を向上させる工夫が精力的になされており、安定性の向上した変異タンパク質の取得例も多数報告されている。しかしながら、安定性向上という視点では有効な変異が、タンパク質の他の優れた特性を損ねてしまう可能性も少なくない。さらには、遺伝子工学的なタンパク質機能改変は、もとの野生型タンパク質の性能がベースとなるため、元来の安定性が乏しければ目標達成までの道のりも遠くなる。以上のことから、タンパク質を産業的に利用しようとする場合には、仮に遺伝子工学的手法による機能向上を前提とする場合でも、本来の性質として安定性の高いタンパク質を取得することは重要である。
【０００９】
常温もしくはそれより高い温度での長期保存における活性維持率をタンパク質安定性の指標とすることができるが、熱に対する耐性の高いタンパク質は安定性に優れているとみなすのが一般的である。産業上有用な安定性の高いタンパク質をセレクトする際に熱安定性を指標とする方法は定石である。耐熱性タンパク質はすなわち安定性に優れており、産業上においてより有利である。
【００１０】
上記した公知のＮＡＡＡＲ活性を有する種々のタンパク質も、工業的なＤ−アミノ酸生産への応用を考慮した場合、安定性、特に熱安定性の面で十分とはいい難い。
【特許文献１】特開平４−３６５４８２号公報
【特許文献２】特開２００１−３１４１９１公報
【特許文献３】特開２００２−２３８５８１公報
【非特許文献１】Biochemistry (2004) Vol.43, p5716-5727
【非特許文献２】Biochemistry (1999) Vol.38, p4252-4258
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明の目的は、従来公知のアシルアミノ酸ラセマーゼに比して有利な性状を有する、ＮＡＡＡＲ活性を有する新規タンパク質（以下、特にことわらない限り、真の生理機能に関係なくＮＡＡＡＲ活性を有するタンパク質を単にＮＡＡＡＲと称する）、具体的には、熱安定性が向上した耐熱性ＮＡＡＡＲを提供することであり、該ＮＡＡＡＲを用いて、光学活性なアミノ酸、特にＤ−アミノ酸を工業的に生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々検討した結果、クロロフレクサス・オーランティアカス（Chloroflexus aurantiacus）ゲノム中に存在する、ＴＳ−１−６０由来ＮＡＡＡＲと相同性を有する仮想的タンパク質をコードするオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を単離して、該タンパク質を遺伝子工学的に生産することに成功した。そして、該タンパク質がＮＡＡＡＲ活性を有し、かつ公知のＮＡＡＡＲと比して優れた熱安定性を有していることを見出した。さらに、本発明者らは、該タンパク質をＬ−（もしくはＤ−）アミノアシラーゼとの共存下で、基質であるＮ−アシル−Ｄ，Ｌ−アミノ酸に作用せしめることにより、所望の光学活性を有するα−アミノ酸を生成させることに成功して本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
［１］  Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を有し、且つ以下の物理化学的性質を有する単離されたタンパク質。
(a) 熱安定性：７０℃、１時間の加温処理後もＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を有する
(b) 金属イオン依存性：Ｃｏ2+、Ｍｎ2+、Ｍｇ2+、Ｆｅ2+存在下でＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を示す
［２］  ７０℃、１時間の加温処理後の残存Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性が少なくとも３０％以上である、上記［１］記載のタンパク質。
［３］  さらに以下の(c)〜(e)の性質を有する上記［１］または［２］記載のタンパク質。
(c) ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるみかけの分子量：約３９ｋＤａ
(d) ｐＨ安定性：ｐＨ５以上で、２５℃、２４時間の加温処理後の残存Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性が約８０％以上
(e) 基質特異性：Ｎ−アセチル化もしくはＮ−ホルミル化したメチオニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニンおよびトリプトファンのＬ体およびＤ体に対してＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を示す
［４］  以下の(a)または(b)のポリペプチドから実質的になる、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を有する単離されたタンパク質。
(a) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列と６０％以上の同一性、および８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつ７０℃、１時間の加温処理後もＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を有するポリペプチド
［５］  ７０℃、１時間の加温処理後の残存Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性が３０％以上である、上記［４］記載のタンパク質。
［６］  配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１もしくは２以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を含む、上記［４］または［５］記載のタンパク質。
［７］  上記［１］〜［６］のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸（但し、配列番号１に示される塩基配列を含む核酸を除く）。
［８］  異種宿主細胞に導入するための上記［７］記載の核酸であって、該宿主において使用頻度の低いコドンが使用頻度のより高いコドンに置換された塩基配列からなる核酸。［９］  宿主が大腸菌である上記［８］記載の核酸。
［１０］  配列番号３に示される塩基配列を含む、上記［７］〜［９］のいずれかに記載の核酸。
［１１］  上記［１］〜［６］のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸が、該核酸を導入する宿主細胞に適合したプロモーターに機能的に連結されてなる発現ベクター。
［１２］  核酸が上記［７］〜［１０］のいずれかに記載のものである、上記［１１］記載の発現ベクター。
［１３］  上記［１１］または［１２］記載の発現ベクターで宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
［１４］  宿主細胞が大腸菌である上記［１３］記載の形質転換体。
［１５］  上記［１３］または［１４］記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からＮ-アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を有するタンパク質を採取することを含む、上記［１］〜［６］のいずれかに記載のタンパク質の製造方法。
［１６］  上記［１］〜［６］のいずれかに記載のタンパク質を、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸またはＮ−アシル−Ｌ−アミノ酸に接触させることを含む、ラセミ化されたＮ−アシルアミノ酸の製造方法。
［１７］  上記［１］〜［６］のいずれかに記載のタンパク質を、Ｄ−またはＬ−アミノアシラーゼの共存下で、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸、Ｎ−アシル−Ｌ−アミノ酸またはその混合物に接触させることを含むＤ−またはＬ−アミノ酸の製造方法。
［１８］  アミノ酸がメチオニン、ロイシン、バリン、フェニルアラニンまたはトリプトファンからなる群より選択される上記［１６］または［１７］記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明のＮＡＡＡＲは、耐熱性および他の安定性に優れていることから、光学活性を有するα−アミノ酸、特にα−Ｄ−アミノ酸の製造に利用することにより、従来公知のＮＡＡＡＲに比して顕著な生産性の向上をもたらすという有利な効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
ＮＡＡＡＲは、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸およびＮ−アシル−Ｌ−アミノ酸を、それぞれ対応する光学異性体に変換する可逆的反応を触媒するが、本発明のＮＡＡＡＲは、高い熱安定性を示すことにより特徴付けられる。即ち、ＴＳ−１−６０、ベニハナ、Ｄ．ラディオデュランス等に由来する従来公知のＮＡＡＡＲは、いずれも７０℃で３０分間処理するとほぼ完全に失活するのに対し、本発明のＮＡＡＡＲは、７０℃、１時間の加温処理後もＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性を有する。好ましくは、本発明のＮＡＡＡＲは、７０℃、１時間の加温処理後の残存ＮＡＡＡＲ活性（加温処理前の活性を１００％とした相対活性）が３０％以上、より好ましくは５０％以上である。尚、本明細書における熱安定性は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）にタンパク質量にして６ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した状態で上記の加温処理を行い、当該処理前後でＮＡＡＡＲ活性を測定して残存ＮＡＡＡＲ活性を算出することにより、決定することができる。酵素活性測定の条件については後述する。
【００１６】
また、本発明のＮＡＡＡＲは、従来公知のＮＡＡＡＲと同様、Ｃｏ2+存在下で最も高い活性を示すが、Ｍｎ2+、Ｍｇ2+、Ｆｅ2+存在下においても活性を示す。一方で、該酵素はＣｕ2+、Ｂａ2+、Ｚｎ2+存在下では活性を示さない。かかる金属イオン依存性を従来公知のＮＡＡＡＲと比較すると、ＴＳ−１−６０由来ＮＡＡＡＲは、Ｚｎ2+存在下でも比較的高い活性を示す点で本発明のＮＡＡＡＲと相違し、ベニハナ由来ＮＡＡＡＲは、Ｂａ2+、Ｚｎ2+存在下でもある程度の活性を示す点で本発明のＮＡＡＡＲと相違し、Ｄ．ラディオデュランス由来ＮＡＡＡＲは、Ｚｎ2+存在下でもある程度の活性を示す一方、Ｍｎ2+、Ｍｇ2+、Ｆｅ2+存在下での活性が本発明のＮＡＡＡＲに比して低いという点で、本発明のＮＡＡＡＲと相違する。尚、本明細書における金属イオン依存性は、後述の酵素活性測定の条件において、５０ｍＭ 塩化コバルト溶液を同濃度の各種金属イオンの塩溶液に置換して活性を測定し、塩化コバルト溶液を用いたときの酵素活性を１００％とした相対活性で算出することにより、決定することができる。
【００１７】
本発明のＮＡＡＡＲは、そのアミノ酸組成や宿主細胞による糖鎖付加形式の相違などにより、異なる分子量を有してもよいが、好ましくは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるみかけの分子量として、約３９ｋＤａの分子量を有するものが挙げられる。また、アミノ酸組成から計算される理論値でいえば、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＮＡＡＡＲの場合、宿主細胞による糖鎖付加等の修飾を考慮しなければ、約４０．６ｋＤａの分子量を有すると推定される。
【００１８】
本発明のＮＡＡＡＲは、従来公知のＮＡＡＡＲと同様、ｐＨ５以上の広いｐＨ範囲にわたって安定である。即ち、２５℃、２４時間の加温処理後の残存Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性（加温処理前の活性を１００％とした相対活性）が約８０％以上である。尚、本明細書におけるｐＨ安定性は、後述の酵素活性測定の条件において、ＨＥＰＥＳ緩衝液の代わりに酢酸緩衝液（ｐＨ４〜５）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ５〜７）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７〜９）またはグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ９〜１０）を用い、上記加温処理前後でＮＡＡＡＲ活性を測定して残存ＮＡＡＡＲ活性を算出することにより、決定することができる。
【００１９】
本発明のＮＡＡＡＲは、従来公知のＮＡＡＡＲと類似した基質特異性を示す。即ち、Ｎ−アセチル−もしくはＮ−ホルミル−メチオニンに対する活性が最も高いが、Ｎ−アセチル化もしくはＮ−ホルミル化したバリン、ロイシン、フェニルアラニンおよびトリプトファンのＬ体およびＤ体に対しても活性を示す。
【００２０】
本発明のＮＡＡＡＲは、上記の特徴を有する限り特に制限はなく、その由来も限定されない。したがって、天然に存在する生物起源のものの他、自然もしくは人工の突然変異体、あるいは異種（すなわち、外来の）ＮＡＡＡＲ遺伝子を導入して得られる形質転換体由来のものもすべて包含される。好ましくは細菌、より好ましくはクロロフレクサス（Chloroflexus）属に属する細菌、さらに好ましくは、クロロフレクサス・オーランティアカス（Chloroflexus aurantiacus）由来のＮＡＡＡＲが例示される。
【００２１】
本発明の好ましい態様においては、ＮＡＡＡＲは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または該アミノ酸配列と６０％以上の同一性、および８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列（以下、「実質的に同一のアミノ酸配列」という場合がある）を含み、かつ７０℃、１時間の加温処理後もＮＡＡＡＲ活性を有するポリペプチド（以下、「実質的に同一のポリペプチド」という場合がある）から実質的になる、単離されたタンパク質である。
ここで「同一性」並びに「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する、同一アミノ酸残基の割合（％）並びに同一および類似アミノ酸残基の割合（％）をそれぞれ意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ，Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ，Ａｓｐ）、水酸基を含むアミノ酸（Ｓｅｒ，Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ，Ａｌａ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換はタンパク質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990) を参照）。
【００２２】
アミノ酸配列の同一性および／または相同性を決定するためのアルゴリズムとしては、例えば、Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5877 (1993) に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはNBLASTおよびXBLASTプログラム (version 2.0) に組み込まれている（Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997)）］、Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:444-453 (1970) に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のGAPプログラムに組み込まれている］、Myers and Miller, CABIOS, 4: 11-17 (1988) に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはCGC配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム (version 2.0) に組み込まれている］、Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448 (1988) に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはGCGソフトウェアパッケージ中のFASTAプログラムに組み込まれている］等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００２３】
また、ここで「実質的になる」とは、例えば、宿主細胞による糖鎖付加やＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸、あるいは内部アミノ酸残基の側鎖における修飾など、ポリペプチドの有する生理活性、即ち、ＮＡＡＡＲ活性に影響を及ぼさない程度の修飾等がなされたものをも包含する意味で用いられる。より具体的には、Ｃ末端はカルボキシル基、カルボキシレート、アミドまたはエステル（ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチルなどのC1-6アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3-8シクロアルキル基、例えば、フェニル、α-ナフチルなどのC6-12アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル-C1-2アルキル基もしくはα-ナフチルメチルなどのα-ナフチル-C1-2アルキル基などのC7-14アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。さらに、Ｃ末端以外のカルボキシル基がアミド化またはエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが挙げられる。
一方、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基は、保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイルなどのC1-6アシル基など）で保護されていてもよく、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したり、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、-OH、-SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1-6アルカノイル基などのC1-6アシル基など）で保護されていてもよい。あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
【００２４】
また、本発明のＮＡＡＡＲは塩の形態であってもよい。そのような塩としては、例えば、生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
【００２５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｃ．オーランティアカスのゲノム中に存在するＯＲＦにコードされており、既知タンパク質とのアミノ酸配列の相同性から、Ｌ−アラニン−Ｄ，Ｌ−グルタミン酸エピメラーゼ及びエノラーゼスーパーファミリーに属する酵素と推定されているが、該ポリペプチドの実際の機能はおろか、該細菌が該ポリペプチドを実際に産生することもこれまで報告されていない。
【００２６】
配列番号２に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号２に示されるアミノ酸配列と７０％以上の同一性、より好ましくは８０％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性、特に好ましくは９５％以上の同一性、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するものである。
好ましい態様においては、配列番号２に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１もしくは２以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列、例えば、(1)配列番号２に示されるアミノ酸配列中の１もしくは２以上（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(2)配列番号２に示されるアミノ酸配列に１または２以上（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、(3)配列番号２に示されるアミノ酸配列に１または２以上（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、(4)配列番号２に示されるアミノ酸配列中の１または２以上（好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または(5)上記(1)〜(4)の変異が組み合わせれたアミノ酸配列（この場合、変異したアミノ酸の総和が、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜数（２〜５）個）である。
【００２７】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドは、上記の配列番号２に示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、かつ７０℃、１時間の加温処理後も検出可能な程度のＮＡＡＡＲ活性を有する限り、特に制限されないが、好ましくは７０℃、１時間の加温処理後の残存ＮＡＡＡＲ活性が３０％以上、より好ましくは５０％以上のポリペプチドである。ここで、残存ＮＡＡＡＲ活性の定義および該活性の決定方法は、上記と同様である。
【００２８】
本発明のＮＡＡＡＲは、(1)該酵素を産生する組織または細胞を原料として抽出精製する方法、(2)化学的に合成する方法、(3)遺伝子組換え技術によりＮＡＡＡＲを発現するように操作された細胞から精製する方法、または(4)ＮＡＡＡＲをコードする核酸から無細胞転写／翻訳系を用いて生化学的に合成する方法等を適宜用いることによって取得することができる。
【００２９】
天然のＮＡＡＡＲ産生細胞からのＮＡＡＡＲの単離精製は、例えば以下のようにして行うことができる。ＮＡＡＡＲ産生細胞を適当な緩衝液中でホモジナイズし、超音波処理や界面活性剤処理等により細胞抽出液を得、そこから蛋白質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより精製することができる。このような分離技術としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミド電気泳動（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）等の分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー等の特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動等の等電点の差を利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
化学合成によるＮＡＡＡＲの製造は、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列を基にして、配列の全部または一部をペプチド合成機を用いて合成することにより行うことができる。ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。本発明のＮＡＡＡＲを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を含む場合は保護基を脱離することにより、目的とするタンパク質を製造することができる。ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の(1)および(2)に記載された方法に従って行われる。
(1) M. Bodanszkyand M.A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966)
(2) Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, NewYork(1965)
【００３１】
このようにして得られた本発明のＮＡＡＡＲは、公知の精製法により精製単離することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られるＮＡＡＡＲが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆にタンパク質が塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
【００３２】
本発明のＮＡＡＡＲは、好ましくは、該蛋白質をコードする核酸をクローニング（もしくは化学的に合成）し、該核酸を担持する発現ベクターを含む形質転換体の培養物から単離精製することにより製造することができる。
【００３３】
酵素遺伝子のクローニングは、通常、以下の方法により行われる。まず、所望の酵素を産生する細胞または組織より、該酵素を完全または部分精製し、そのＮ末端アミノ酸配列をエドマン法や質量分析などを用いて決定する。また、ペプチドを配列特異的に切断するプロテアーゼや化学物質で該酵素を部分分解して得られるオリゴペプチドのアミノ酸配列を同様にエドマン法や質量分析により決定する。決定された部分アミノ酸配列に対応する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとして用いて、該酵素を産生する細胞または組織より調製されたｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡライブラリーから、コロニー（もしくはプラーク）ハイブリダイゼーション法によって該酵素をコードするＤＮＡをクローニングする。
あるいは、完全または部分精製された酵素の全部または一部を抗原として該酵素に対する抗体を常法にしたがって作製し、該酵素を産生する細胞または組織より調製されたｃＤＮＡまたはゲノミックＤＮＡライブラリーから、抗体スクリーニング法によって該酵素をコードするＤＮＡをクローニングすることもできる。
目的の酵素と酵素学的性質の類似する酵素の遺伝子が公知である場合、例えば、NCBI BLASTのホームページ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）にアクセスし、該公知遺伝子の塩基配列と相同性を有する配列を検索し、ヒットした塩基配列を基にして、上記のようにプローブを作製し、コロニー（もしくはプラーク）ハイブリダイゼーション法によって該酵素をコードするＤＮＡをクローニングすることができる。例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＣ．オーランティアカス由来ＮＡＡＡＲの場合、ＴＳ−１−６０由来ＮＡＡＡＲとアミノ酸レベルで５１％の同一性があるので、ＴＳ−１−６０由来ＮＡＡＡＲ遺伝子の塩基配列とのホモロジー検索により、Ｃ．オーランティアカスゲノム上のＮＡＡＡＲをコードするＯＲＦを見出すことができる。
また、ヒットした塩基配列を基にして、適当なオリゴヌクレオチドをプライマーとして合成し、ＮＡＡＡＲを産生する細胞より調製したゲノムＤＮＡ画分または全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分を鋳型として用い、Polymerase Chain Reaction（以下、「ＰＣＲ法」と略称する）またはReverse Transcriptase-PCR（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって直接増幅することもできる。
上記のようにして得られたＤＮＡの塩基配列は、マキサム・ギルバート法やジデオキシターミネーション法等の公知のシークエンス技術を用いて決定することができる。
【００３４】
本発明のＮＡＡＡＲをコードする核酸は、好ましくは、上記した配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそれと実質的に同一のポリペプチドをコードする核酸である。該核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。
【００３５】
より好ましくは、本発明のＮＡＡＡＲをコードする核酸としては、例えば、配列番号１に示される塩基配列を含む核酸（該核酸がＲＮＡの場合はｔをｕに読み替えるものとする）、あるいは配列番号１に示される塩基配列に相補的な塩基配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ前記した配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと同質の性質、即ち、７０℃、１時間の加温処理後もＮＡＡＡＲ活性を有するという性質を有するポリペプチドをコードする核酸などが挙げられる。
配列番号１に示される塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸としては、例えば、配列番号１に示される塩基配列と６０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸などが用いられる。
【００３６】
本明細書における塩基配列の同一性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Molecular Cloning, 第2版 (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ストリンジェントな条件に従って行うことができる。
【００３７】
ストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム塩濃度が約１９〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９〜約２０ｍＭで、温度が約５０〜約７０℃、好ましくは約６０〜約６５℃の条件等が挙げられる。特に、ナトリウム塩濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
【００３８】
本発明のＮＡＡＡＲをコードするＤＮＡは、上記のようにＣ．オーランティアカスのゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡ（ｃＤＮＡ）より取得することもできるが、化学的にＤＮＡ鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴＤＮＡ短鎖を、ＰＣＲ法を利用して接続することにより、ＮＡＡＡＲの全長をコードするＤＮＡを構築することも可能である。化学合成もしくはＰＣＲ法との組み合わせで全長ＤＮＡを構築することの利点は、該遺伝子を導入する宿主に合わせて使用コドンを遺伝子全長にわたり設計できる点にある。同一のアミノ酸をコードする複数のコドンは均一に使用されるわけではなく、生物種によってその使用頻度が異なる。一般にある生物種において高発現する遺伝子に含まれるコドンは、その生物種において使用頻度の高いコドンを多く含んでおり、逆に発現量の低い遺伝子は使用頻度の低いコドンの存在がボトルネックとなって高発現を妨げている例が少なくない。異種遺伝子の発現に際し、その遺伝子配列を宿主生物において使用頻度の高いコドンに置換することで該異種タンパク質発現量が増大した例はこれまでに多数報告されており、このような使用コドンの改変は異種遺伝子発現量の増大に効果があると期待される。
【００３９】
上記の理由から、本発明のＮＡＡＡＲをコードするＤＮＡは、それが導入される宿主細胞により適したコドン（即ち、該宿主において使用頻度の高いコドン）に改変することが望ましい。各宿主のコドン使用頻度は、該宿主生物のゲノム配列上に存在する全遺伝子における各コドンの使用される割合で定義され、たとえば１０００コドンあたりの使用回数で表される。またコドン使用頻度は、その全ゲノム配列の解明されていない生物にあっては代表的な複数遺伝子の配列から近似的に算出することも可能である。組換えようとする宿主生物におけるコドン使用頻度のデータは、例えば（財）かずさＤＮＡ研究所のホームページ（http://www.kazusa.or.jp）に公開されている遺伝暗号使用頻度データベースを用いることができ、または各生物におけるコドン使用頻度を記した文献を参照してもよく、あるいは使用する宿主生物のコドン使用頻度データを自ら決定してもよい。入手したデータと導入しようとする遺伝子配列を参照し、遺伝子配列に用いられているコドンの中で宿主生物において使用頻度の低いものを、同一のアミノ酸をコードし使用頻度の高いコドンに置換すればよい。
【００４０】
本発明のＮＡＡＡＲをコードするＤＮＡを導入する宿主細胞は、後述するように組換え発現系が確立しているものであれば、特に制限されないが、好ましくは大腸菌、枯草菌などのバクテリア、放線菌、麹菌、酵母といった微生物宿主並びに昆虫細胞、動物細胞、高等植物等が挙げられ、より好ましくは大腸菌（例えば、Ｋ１２株、Ｂ株など）が挙げられる。大腸菌において使用頻度の高いコドンとしては、例えば、Ｋ１２株の場合であれば、ＧｌｙにはＧＧＴまたはＧＧＣ、ＧｌｕにはＧＡＡ、ＡｓｐにはＧＡＴ、ＶａｌにはＧＴＧ、ＡｌａにはＧＣＧ、ＡｒｇにはＣＧＴまたはＣＧＣ、ＳｅｒにはＡＧＣ、ＬｙｓにはＡＡＡ、ＩｌｅにはＡＴＴまたはＡＴＣ、ＴｈｒにはＡＣＣ、ＬｅｕにはＣＴＧ、ＧｌｎにはＣＡＧ、ＰｒｏにはＣＣＧなどが挙げられる。
このように宿主において使用頻度の高いコドンに置換されたＮＡＡＡＲをコードするＤＮＡとして、例えば、Ｃ．オーランティアカス由来のＮＡＡＡＲをコードするＤＮＡを、該ＮＡＡＡＲと同一のアミノ酸配列をコードし、且つ大腸菌Ｋ１２株において使用頻度の高いコドンに置換したＤＮＡ（配列番号３に示される塩基配列）が挙げられる。
【００４１】
本発明はまた、本発明のＮＡＡＡＲをコードするＤＮＡを含む組換えベクターを提供する。本発明の組換えベクターは原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターやウイルスベクター等が包含される。当該組換えベクターは、簡便には当該技術分野において入手可能な公知のクローニングベクターまたは発現ベクターに、上記のＮＡＡＡＲをコードするＤＮＡを適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより調製することができる。また、Ｔａｑポリメラーゼのように増幅末端に一塩基を付加するようなＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅作製した遺伝子断片であれば、ＴＡクローニングによるベクターへの接続も可能である。
【００４２】
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドとして、例えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９など、酵母由来プラスミドとして、例えばｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５など、枯草菌由来プラスミドとして、例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４などが挙げられる。また、ウイルスとして、λファージなどのバクテリオファージや、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等のパポバウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）等のレトロウイルス、アデノウイルス（ＡｄＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニヤウイルス、バキュロウイルスなどの動物および昆虫のウイルスが例示される。
【００４３】
特に、本発明は、目的の宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下にＮＡＡＡＲをコードするＤＮＡが配置されたＮＡＡＡＲ発現ベクターを提供する。使用されるベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で機能して、その下流に配置された遺伝子の転写を制御し得るプロモーター領域（例えば宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌｅｃＡプロモーター等、宿主が枯草菌の場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等、宿主が酵母の場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等、宿主が哺乳動物細胞の場合、ＳＶ４０由来初期プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ由来ロングターミナルリピート、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター）と、該遺伝子の転写終結シグナル、すなわちターミネーター領域を含有し、該プロモーター領域と該ターミネーター領域とが、少なくとも１つの制限酵素認識部位、好ましくは該ベクターをその箇所のみで切断するユニークな制限部位を含む配列を介して連結されたものであれば特に制限はないが、形質転換体選択のための選択マーカー遺伝子（テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する抵抗性を付与する遺伝子、栄養要求性変異を相補する遺伝子等）をさらに含有していることが好ましい。さらに、挿入されるＮＡＡＡＲをコードするＤＮＡが開始コドンおよび終止コドンを含まない場合には、開始コドン（ＡＴＧまたはＧＴＧ）および終止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡ、ＴＡＡ）を、それぞれプロモーター領域の下流およびターミネーター領域の上流に含むベクターが好ましく使用される。
宿主細胞として細菌を用いる場合、一般に発現ベクターは上記のプロモーター領域およびターミネーター領域に加えて、宿主細胞内で自律複製し得る複製可能単位を含む必要がある。また、プロモーター領域は、プロモーターの近傍にオペレーターおよびShine-Dalgarno（ＳＤ）配列を包含する。
宿主として酵母，動物細胞または昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは、エンハンサー配列、ＮＡＡＡＲ ｍＲＮＡの５’側および３’側の非翻訳領域、ポリアデニレーション部位等をさらに含むことが好ましい。
【００４４】
作成した組換えベクターを導入する宿主生物としては、組換え発現系が確立している大腸菌、枯草菌などのバクテリア、放線菌、麹菌、酵母といった微生物宿主並びに昆虫細胞、動物細胞、高等植物等を挙げることができるが、中でもタンパク質発現能力に優れている大腸菌を用いるのが好ましい。組換えプラスミドを導入する方法としてはエレクトロポレーションによる導入のほか、塩化カルシウム等薬品処理によりコンピテント化した宿主であればヒートショックによる導入も可能である。宿主ベクターへの目的組換えプラスミドの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの各種薬剤耐性遺伝子に代表されるマーカーとＮＡＡＡＲ活性とを同時に発現する微生物を検索すればよく、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつＮＡＡＡＲを発現する微生物を選択すればよい。
【００４５】
本発明のＮＡＡＡＲをコードするＤＮＡに適用され得る他のベクター、プロモーター、宿主細胞については、例えば、上記特許文献２および３に記載のものが好ましく例示される。
【００４６】
本発明のＮＡＡＡＲは、上記のようにして調製されるＮＡＡＡＲ発現ベクターを含む形質転換体を培地中で培養し、得られる培養物からＮＡＡＡＲを回収することによって製造することができる。
【００４７】
使用される培地は、宿主細胞（形質転換体）の生育に必要な炭素源，無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えばグルコース，デキストラン，可溶性デンプン，ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類，硝酸塩類，アミノ酸，コーンスチープ・リカー，ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素〔例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化マグネシウム），ビタミン類，抗生物質（例えばテトラサイクリン，ネオマイシン，アンピシリン，カナマイシン等）など〕を含んでいてもよい。
【００４８】
培養は当分野において知られている方法により行われる。下記に宿主細胞に応じて用いられる具体的な培地および培養条件を例示するが、本発明における培養条件はこれらに何ら限定されるものではない。
宿主が細菌，放線菌，酵母，糸状菌等である場合、例えば上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜９である培地である。宿主が大腸菌の場合、好ましい培地としてＬＢ培地，Ｍ９培地［Miller. J., Exp. Mol. Genet, p.431, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)］等が例示される。培養は、必要により通気・攪拌をしながら、通常１４〜４３℃で約３〜７２時間行うことができる。宿主が枯草菌の場合、必要により通気・攪拌をしながら、通常３０〜４０℃で約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母の場合、培地として、例えばBurkholder最少培地 ［Bostian. K.L. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)］が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
宿主が動物細胞の場合、培地として、例えば約５〜２０％のウシ胎仔血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）［Science, 122, 501 (1952)］、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）［Virology, 8, 396 (1959)］、ＲＰＭＩ１６４０培地［J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)］、１９９培地［Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)］ 等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
宿主が昆虫細胞の場合、培地として、例えばウシ胎仔血清を含むGrace’s培地［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8404 (1985)］等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や攪拌を行うこともできる。
【００４９】
ＮＡＡＡＲの精製は、ＮＡＡＡＲ活性の存在する画分に応じて、通常使用される種々の分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。
培養物の培地中に存在するＮＡＡＡＲは、培養物を遠心または濾過して培養上清（濾液）を得、該培養上清から、例えば、塩析、溶媒沈澱、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、等電点電気泳動などの公知の分離方法を適当に選択して行うことにより得ることができる。
【００５０】
一方、細胞質に存在するＮＡＡＡＲは、培養物を遠心または濾過して細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波処理、リゾチーム処理、凍結融解、浸透圧ショック、および／またはトライトン−Ｘ１００等の界面活性剤処理などにより、細胞およびオルガネラ膜を破砕（溶解）した後、遠心分離や濾過などによりデブリスを除去して可溶性画分を得、該可溶性画分を、上記と同様の方法で処理することにより単離精製することができる。
【００５１】
組換えＮＡＡＡＲを迅速且つ簡便に取得する手段として、ＮＡＡＡＲのコード配列のある部分（好ましくはＮまたはＣ末端）に、金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列（例えば、ヒスチジン、アルギニン、リシン等の塩基性アミノ酸からなる配列、好ましくはヒスチジンからなる配列）をコードするＤＮＡ配列を、遺伝子操作により付加して宿主細胞で発現させ、該細胞の培養物のＮＡＡＡＲ活性画分から、該金属イオンキレートを固定化した担体とのアフィニティーによりＮＡＡＡＲを分離回収する方法が好ましく例示される。金属イオンキレートに吸着し得るアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、例えば、ＮＡＡＡＲをコードするＤＮＡをクローニングする過程で、ＮＡＡＡＲのＣ末端アミノ酸配列をコードする塩基配列に該ＤＮＡ配列を連結したハイブリッドプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行ったり、あるいは該ＤＮＡ配列を終止コドンの前に含む発現ベクターにＮＡＡＡＲをコードするＤＮＡをインフレームで挿入することにより、ＮＡＡＡＲコード配列に導入することができる。また、精製に使用される金属イオンキレート吸着体は、遷移金属、例えばコバルト、銅、ニッケル、鉄の二価イオン、あるいは鉄、アルミニウムの三価イオン等、好ましくはコバルトまたはニッケルの二価イオン含有溶液を、リガンド、例えばイミノジ酢酸（ＩＤＡ）基、ニトリロトリ酢酸（ＮＴＡ）基、トリス（カルボキシメチル）エチレンジアミン（ＴＥＤ）基等を付着したマトリックスと接触させて該リガンドに結合させることにより調製される。キレート吸着体のマトリックス部は通常の不溶性担体であれば特に限定されない。
あるいは、タグとしてグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＨＡ、ＦＬＡＧペプチドなどを用いてアフィニティー精製することもできる。
【００５２】
上記精製工程において、必要に応じて膜濃縮、減圧濃縮、活性化剤および安定化剤添加等の処理を行うこともできる。特に本ＮＡＡＡＲは耐熱性に優れているため、他の宿主細胞由来夾雑タンパク質を熱変性せしめ、かつＮＡＡＡＲ活性を保持しうる範囲での加温処理が、大幅なＮＡＡＡＲ純度向上に有効である。これら工程に用いる溶媒としては特に限定されないが、ｐＨ６〜９程度の範囲において緩衝能を有するＫ−リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、ＧＯＯＤの緩衝液等に代表される各種緩衝液が好ましい。
【００５３】
かくして得られるＮＡＡＡＲが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該タンパク質が塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
【００５４】
精製酵素は液状で産業利用に供することも可能であるが、粉末化し、あるいはさらに造粒することもできる。液状酵素の粉末化は定法により凍結乾燥することでなされる。
【００５５】
さらに、本発明のＮＡＡＡＲは、それをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞タンパク質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。本発明のＮＡＡＡＲをコードするＲＮＡは、本発明のＮＡＡＡＲをコードするｃＤＮＡの取得方法において上記した、本発明のＮＡＡＡＲをコードするｍＲＮＡを常法を用いて該ＲＮＡを発現する宿主細胞から精製するか、あるいは、ＮＡＡＡＲをコードするＤＮＡを鋳型とし、ＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写系を用いてｃＲＮＡを調製することによって取得することができる。無細胞タンパク質転写／翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には、大腸菌抽出液はPratt J.M. et al., “Transcription and Tranlation”, Hames B.D. and Higgins S.J. eds., IRL Press, Oxford 179-209 (1984) に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはE.coli S30 extract system (Promega社製) やRTS 500 Rapid Tranlation System (Roche社製) 等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはRabbit Reticulocyte Lysate System (Promega社製) 等、さらにコムギ胚芽由来のものはPROTEIOSTM(TOYOBO社製) 等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばJohnston F.B. et al., Nature, 179: 160-161 (1957) あるいはErickson A.H. et al., Meth. Enzymol., 96: 38-50 (1996) 等に記載の方法を用いることができる。
【００５６】
タンパク質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法 [Pratt, J.M. et al. (1984) 前述] や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞タンパク質合成システム [Spirin A.S. et al., Science, 242: 1162-1164 (1988)]、透析法 (Kigawa et al., 第21回日本分子生物学会, WID6)、あるいは重層法 (PROTEIOSTMWheat germ cell-free protein synthesis core kit取扱説明書: TOYOBO社製) 等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のRNA、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法 (特開2000-333673) 等を用いることができる。
【００５７】
本発明はまた、本発明のＮＡＡＡＲを、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸またはＮ−アシル−Ｌ−アミノ酸に接触させることを含む、ラセミ化されたＮ−アシルアミノ酸の製造方法を提供する。
【００５８】
Ｎ−アシルアミノ酸のラセミ化反応に使用することができる本発明のＮＡＡＡＲは、上記のいずれかの方法により提供される精製酵素だけでなく、その処理物、上記本発明のＮＡＡＡＲ産生細胞（天然のＮＡＡＡＲ産生細胞および上記のようにして製造される形質転換体の両方を包含する）の培養物およびその処理物であってもよい。
【００５９】
例えば、本発明のＮＡＡＡＲの処理物としては、例えば、ＮＡＡＡＲを公知の方法により不溶性の担体に固定化したものが含まれる。一方、本発明のＮＡＡＡＲ産生細胞の培養物としては、該酵素が細胞外に分泌している場合には培養上清が、細胞内発現している場合には、培養菌体を適当な方法により破砕・ろ過もしくは遠心分離等により得られる上清等が挙げられる。さらに該培養物の処理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた上記細胞や、あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕した細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれる。
【００６０】
本発明の方法によってラセミ化され得る基質Ｎ-アシルアミノ酸としては、例えば下記
一般式（Ｉ）に示す化合物を挙げることができる。
【００６１】
一般式
【００６２】
【化１】
0004607061.tif 000002
【００６３】
(式中のＸは置換基を有してもよいカルボン酸由来のアシルを示し、Ｒは置換基を有して
もよい炭素数１から２０のアルキルを示す)
【００６４】
Ｎ-アシル-アミノ酸のアシル基(Ｘ)に関し、アルカノイル、ベンゾイル、アリールアルカノイル等のカルボン酸が挙げられ、これらのアシル基は置換基(ハロゲン、Ｃ１-３アルキル、Ｃ１-３アルコキシ等)を有していてよい。上記アルカノイルの例としてアセチル、ホルミル、クロロアセチル、プロピオニルなどが挙げられ、ベンゾイルの例としてベンゾイル、ｐ-クロロベンゾイルなどが、アリールアルカノイルの例としてフェニルアセチル、フェニルプロピオニルなどが挙げられる。
【００６５】
また、Ｒで表されるアルキルとして直鎖状又は分岐状アルキル、ヒドロキシアルキル、Ｃ１-３アルキルチオ、チオール、フェニル、ヒドロキシフェニルもしくはインドリルで置換されたＣ１-３アルキルおよびアミノ、カルボキシ、グアニジルもしくはイミダゾリルなどで置換されたＣ１-４アルキルなどが挙げられる。
【００６６】
好ましくは、基質Ｎ−アシルアミノ酸として、Ｎ−アシルメチオニン、Ｎ−アシルバリン、Ｎ−アシルロイシン、Ｎ−アシルフェニルアラニン、Ｎ-アシルトリプトファンが適用可能である。これらのＮ−アシルアミノ酸はＬ体であってもＤ体であっても、あるいはそれらの混合物であってもよい。
【００６７】
ラセミ化反応は、本発明のＮＡＡＡＲが反応できる条件であればよく、例えば、反応温度４〜７０℃、好ましくは２０〜６０℃、より好ましくは３０〜５０℃、ｐＨ３〜１１、好ましくはｐＨ５〜１０、基質濃度０．０１〜５０％で行うことができる。基質は反応開始時に一括して添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添加することが望ましい。また、ＮＡＡＡＲが活性を発現するに必要な二価の金属イオン、例えば、Ｃｏ2+、Ｍｎ2+、Ｍｇ2+、Ｆｅ2+を、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、好適には１〜５ｍＭで添加する。
【００６８】
本発明はさらに、本発明のＮＡＡＡＲを、Ｄ−またはＬ−アミノアシラーゼの共存下で、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸、Ｎ−アシル−Ｌ−アミノ酸またはその混合物に接触させることを含むＤ−またはＬ−アミノ酸の製造方法を提供する。本発明のＮＡＡＡＲの形態は、上記ラセミ化法の場合と同様である。
【００６９】
基質となるＮ−アシル−Ｄ−アミノ酸、Ｎ−アシル−Ｌ−アミノ酸またはその混合物溶液を適当な濃度に調製し、ＮＡＡＡＲ、Ｌ−（もしくはＤ−）アミノアシラーゼ、ＮＡＡＡＲが活性を発現するに必要な二価の金属イオンを添加し、適当な温度条件・ｐＨ条件で静置もしくは攪拌する。基質濃度および温度またはｐＨ条件としては、ＮＡＡＡＲおよびアミノアシラーゼが活性を発揮する条件の範囲内であれば特に限定しないが、より好適には基質濃度０．０１％から５０％、ｐＨは５〜１０、温度は３０℃以上で行う。また、添加する二価の金属イオンは、該ＮＡＡＡＲを活性化する働きのあるものであれば特に限定されないが、このような金属イオンの例としてはＣｏ2+、Ｍｎ2+、Ｍｇ2+、Ｆｅ2+が挙げられる。この中でコバルトイオンを利用するのが最も好適である。これら金属イオンを添加する濃度としては、ＮＡＡＡＲとしての機能を発揮するに必要な濃度であれな特に限定しないが、好適には０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、さらに好適には１ｍＭ〜５ｍＭである。
【００７０】
この状態で、添加したアミノアシラーゼがＬ−アミノアシラーゼの場合であれば、まずＮ−アシル−Ｄ−アミノ酸、Ｎ−アシル−Ｌ−アミノ酸のうちＬ体のみがＬ−アミノアシラーゼにより脱アシル化され、目的のＬ−アミノ酸が生成する。ＮＡＡＡＲはＮ−アシルアミノ酸のＬ体をＤ体に変換する反応とＤ体をＬ体に変換する反応の両方を触媒してその比率をほぼ等しくする（ラセミ化）方向に働くが、基質のＬ体が消費されるとラセミ状態が解消されてゆくため、ＮＡＡＡＲの反応としてはよりＤ体→Ｌ体の反応が促進される。このように生成したＮ−アシル−Ｌ−アミノ酸はＬ−アミノアシラーゼにより順次Ｌ−アミノ酸へと分解される。このような原理で、理論的にはすべてのＮ−アシルアミノ酸をＬ−アミノ酸に変換することができる。同様に添加するアミノアシラーゼがＤ−アミノアシラーゼであれば理論的にはすべてのＮ−アシルアミノ酸をＤ−アミノ酸に変換することができる。
【００７１】
本発明による光学活性アミノ酸の製造方法として、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒もしくは水性媒体との２層混合系により行うことができる。
また、反応方法として水溶液中での反応、固定化酵素、固定化酵素膜リアクターなどで実施可能である。本発明により化学的なラセミ化法が不用となり、廃溶媒等の大幅な削減となる事から、環境への負荷低減等工業的なアミノ酸製造において有効である。
【００７２】
基質とするＮ−アシルアミノ酸としては、当該ＮＡＡＡＲが作用しうるものであればよいが、より好適にはＮ−アシルメチオニン、Ｎ−アシルバリン、Ｎ−アシルロイシン、Ｎ−アシルフェニルアラニン、Ｎ-アシルトリプトファンが適用可能である。
【００７３】
本発明において、Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ活性の測定は以下の条件で行う。
＜試薬＞
０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）
５０ｍＭ  Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン（ｐＨ７．５）
６．１ｍｇ／ｍｌ  ４−アミノアンチピリン（第一化学薬品製）溶液
３２．２ｍｇ／ｍｌ    ＴＯＯＳ（同仁化学研究所製）溶液
３００Ｕ／ｍｌ  ペルオキシダーゼ（東洋紡製ＰＥＯ−３０１）溶液
２０Ｕ／ｍｌ  Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（バイオザイム製ＤＯＸ２）溶液
１３００Ｕ／ｍｌ  Ｄ−アミノアシラーゼ（自家調製）溶液
５０ｍＭ  塩化コバルト溶液
上記ＨＥＰＥＳ緩衝液７．５ｍｌ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ溶液２ｍｌ、４−アミノアンチピリン溶液０．１ｍｌ、ＴＯＯＳ溶液０．１ｍｌ、ペルオキシダーゼ溶液０．１ｍｌ、Ｄ−アミノアシラーゼ溶液０．２ｍｌ、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン溶液９．２ｍｌ、塩化コバルト溶液０．８ｍｌを混合して反応試薬とする。
【００７４】
＜測定条件＞
反応試薬２．９ｍｌを３７℃で５分間予備加温する。ＮＡＡＡＲ溶液０．１ｍｌを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、５５５ｎｍの吸光度変化を記録し、その直線領域から１分間あたりの吸光度変化を測定する。盲検はＮＡＡＡＲ溶液の代わりにＮＡＡＡＲを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化を測定する。あらかじめＤ−メチオニン標準液を用いて作成した検量線を元に１分間あたりに生成したＤ−メチオニン量を算出する。上記条件下で１分間に１マイクロモルのＤ−メチオニンを生成するに必要なＮＡＡＡＲ酵素量を１単位として酵素活性を算出する。
【実施例】
【００７５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００７６】
＜実施例１＞
Ｎ−アシルアミノ酸ラセマーゼ遺伝子配列の設計と組換えプラスミドの構築
クロロフレキサス・オーランティアカス由来ＮＡＡＡＲ様タンパク質の配列は、ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴホームページでアミコラトプシス・エスピーＴＳ−１−６０株由来ＮＡＡＡＲタンパク質アミノ酸配列をキーに相同タンパク質の検索を実施した結果得られたHypothetical proteinの配列であり、ＴＳ−１−６０株由来ＮＡＡＡＲとの相同性は５１％である。そのアミノ酸配列を配列番号２に、またそれをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。まず配列番号１の塩基配列から使用されている全コドンをリストアップした。次にかずさＤＮＡ研究所ホームページからエシェリヒア・コリＫ１２株のコドン使用頻度のデータを取得し、前出の塩基配列上の全コドンについて大腸菌における使用頻度を調べた。そして大腸菌での使用頻度の低いコドンを、より使用頻度の高いコドンに変換した。全体的なコドン使用頻度に偏りがないよう調整を実施して最終的に設計した遺伝子塩基配列は配列番号３に示すとおりである。この配列の上流と下流にそれぞれＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩサイトを付加した配列を有する直鎖ＤＮＡを、細胞工学別冊「植物のＰＣＲ実験プロトコール」（ｐ８４−８９，秀潤社刊）に記載の方法で人工的に合成した。このように作製したＤＮＡ分子を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで十分消化し、消化産物は東洋紡製MagExtractor-PCR & Gel Clean Up-を用いて精製することで制限酵素を除いた。得られたＤＮＡ断片は、同様に制限酵素で切断し精製したpBluescriptII KSN+と混合し、混合液と等量のライゲーション試薬（東洋紡製ライゲーション・ハイ）を加えて１６℃、３０分インキュベートすることにより、ライゲーションを実施した。このようにライゲーションした産物は、エシェリヒア・コリＤＨ５α株のコンピテントセル（東洋紡製コンピテント・ハイＤＨ５α）にヒートショックにより形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ寒天培地に生育させた。生育したコロニーを爪楊枝で５ｍｌのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含む）に植菌・３７℃振とう培養し、生育した菌体よりMagExtractor-Plasmid-（東洋紡製）を用いてプラスミドを回収した。回収したプラスミドのｌａｃプロモーター下流の塩基配列を解読し、挿入された断片が配列番号３と同一の配列を有していることを確認して発現プラスミドｐＣＦＮＡＲとした。
【００７７】
＜実施例２＞
形質転換微生物の作製とＮＡＡＡＲの生産
実施例１で得られたプラスミドｐＣＦＮＡＲをエシェリヒア・コリＤＨ５α株に形質転換し、生育したコロニーを５００ｍｌ容坂口フラスコに入った１００ｍｌの種培地（０．５％ポリペプトン、０．２５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、０．５％グルコース、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、ｐＨ７．４）に植菌し、振とう数１８０ｒｐｍで３０℃、１６時間培養し、種培養液とした。得られた種培養液のうち６０ｍｌを２Ｌ容坂口フラスコに入った５００ｍＬの生産培地（２．４％大豆ペプチド、２．４％酵母エキス、１．２５％リン酸１水素２カリウム、０．２３％リン酸２水素１カリウム、０．５％グルコース、０．５％マルトース、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、ｐＨ７．２）に植菌し、振とう数１８０ｒｐｍで３７℃、４８時間培養した。培養終了後、培養液のＮＡＡＡＲ活性を測定したところ１．１Ｕ／ｍｌであった。培養液を５００ｍｌ容遠心管に入れ、高速冷却遠心機（日立製作所製CR21E）を用いて４℃、８０００ｒｐｍで２０分遠心した。遠心後はデカンテーションにより上清を除き、菌体を得た。このように得られた菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、フレンチプレス破砕機を用いて破砕した。菌体破砕液に３％ポリエチレンイミン溶液を対液０．７％添加、マグネットスターラーで室温にて３０分攪拌後、集菌時と同様に遠心し、上清を得た。さらにこの液をマグネットスターラーで攪拌しながら、硫酸アンモニウムを０．４５飽和となるよう添加・溶解し、室温に２０分程度静置した。これを遠心してデカンテーションにより上清を除いて目的タンパク質を含む沈殿を得、この沈殿を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に再溶解した。この塩析・再溶解液を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したＧ−２５セファロース（アマシャム・バイオサイエンス製）を用い、ゲルろ過により脱塩を実施した。さらにこの液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で緩衝化したＤＥＡＥ−セファロースに吸着させ、ＮａＣｌ濃度０〜０．４Ｍのグラジエント溶出を実施し、最後にＧ−２５セファロースによるゲルろ過で脱塩して精製タンパク質を得た。精製ＮＡＡＡＲの比活性（単位タンパク質量あたりのＮＡＡＡＲ活性）を測定したところ、０．６Ｕ／ｍｇであった。
【００７８】
＜実施例３＞
分子量
精製ＮＡＡＡＲのＳＤＳ−ＰＡＧＥをPhastSystem全自動電気泳動装置（アマシャム・バイオサイエンス製）を用いて実施したところ、クマシーブルー染色で単一のバンドとなっており分子量は約３９，０００と推定された。アミノ酸配列から計算上推定される分子量は４０，５９７と見積もられ、これとほぼ一致する結果であった。
【００７９】
＜実施例４＞
熱安定性
本ＮＡＡＡＲを２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）でタンパク質量にして６ｍｇ／ｍｌ（活性にして３．６Ｕ／ｍｌ）の濃度で溶解した溶液をサンプルとした。サンプルは３７℃、４２℃、５０℃、６０℃、７０℃でそれぞれ１時間加温処理し、処理後残存しているＮＡＡＡＲ活性を測定することで温度安定性を求めた。結果を図１に示す。本酵素は６０℃でもほとんど失活がなく、７０℃処理においても処理前に比して５０％程度の活性を維持していた。公知のＮＡＡＡＲは温度安定性としては≦５０℃程度であり、アミコラトプシス属由来ＮＡＡＡＲにおいてマグネシウムイオン添加により熱安定性が向上することが確認されているものの、その条件においても７０℃３０分処理で完全に失活する。公知のＮＡＡＡＲに比して本発明のＮＡＡＡＲは優れた熱安定性を有するものであることが示された。
【００８０】
＜実施例５＞
ｐＨ安定性
ｐＨ４〜１０の範囲でＮＡＡＡＲ溶液を調製し、各ｐＨ条件で２５℃、２４時間インキュベート後の残存活性を調べた。結果を図２に示す。この結果から、安定ｐＨ領域は５以上である。
【００８１】
＜実施例６＞
金属イオン依存性
二価のコバルト、銅、鉄、マンガン、マグネシウム、バリウム、亜鉛それぞれ終濃度２ｍＭ存在下でのＮＡＡＡＲ活性を測定した。結果を表１に示す。公知のＮＡＡＡＲと同様、コバルトイオン存在下において最も高いＮＡＡＡＲ活性を示した。また、鉄、マンガン、マグネシウムの存在下においてもＮＡＡＡＲ活性を示した。一方、銅、バリウム、亜鉛の存在下ではＮＡＡＡＲ活性が検出されなかった。
【００８２】
【表１】
0004607061.tif 000003
【００８３】
＜実施例７＞
基質特異性
基質として、Ｎ−アセチル−Ｌ−メチオニン並びにＮ−アセチル−Ｄ−メチオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−バリン並びにＮ−アセチル−Ｄ−バリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシン並びにＮ−アセチル−Ｄ−ロイシン、Ｎ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン並びにＮ−アセチル−Ｄ−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファン並びにＮ−アセチル−Ｄ−トリプトファンと、同様のＮ−ホルミル−Ｌ−メチオニン並びにＮ−ホルミル−Ｄ−メチオニン、Ｎ−ホルミル−Ｌ−バリン、Ｎ−ホルミル−Ｌ−ロイシン、Ｎ−ホルミル−Ｌ−フェニルアラニン並びにＮ−ホルミル−Ｄ−フェニルアラニン、Ｎ−ホルミル−Ｌ−トリプトファン並びにＮ−ホルミル−Ｄ−トリプトファンについて、基質１％溶液（ｐＨ７．５）１０ｍｌ中に、１ＵのＮＡＡＡＲと１ｍｍｏｌの塩化コバルトを添加し終夜反応させた。ＨＰＬＣ法により光学純度を測定することにより確認した。光学分割カラムはSUMICHIRAL OA-5000（Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.）を用い、２ｍＭ硫酸銅１０％イソプロピルアルコール水溶液を溶離液として、温度５０℃、流速１ｍｌ、検出２５４ｎｍで測定した。結果を表２に示す。公知のＮＡＡＡＲと同様、Ｎ−アセチル−メチオニン並びにＮ−ホルミル−メチオニンに対する活性が最も高いが、Ｎ−アセチル−バリン並びにＮ−ホルミル−バリン、Ｎ−アセチル−ロイシン並びにＮ−ホルミル−ロイシン、Ｎ−アセチル−フェニルアラニン並びにＮ−ホルミル−フェニルアラニン、Ｎ−アセチル−トリプトファン並びにＮ−ホルミル−トリプトファンのＬ体並びにＤ体のアシルアミノ酸に対しても活性を示した。また、フリー体のＬ並びにＤ−アミノ酸には活性を示さなかった。
【００８４】
【表２】
0004607061.tif 000004
【００８５】
＜実施例８＞
ＮＡＡＡＲによるＮ−アシル−アミノ酸のラセミ化反応
１％のＮ−アセチル−Ｌ−メチオニン並びにＮ−アセチル−Ｄ−メチオニン（ｐＨ７．５）にＮＡＡＡＲ１Ｕ、１ｍＭ酢酸コバルトを含む反応液を、４５℃で終夜反応させた。反応液を光学活性カラムによるＨＰＬＣ法により確認した。光学分割カラムはSUMICHIRAL OA-5000（Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.）を用い、２ｍＭ硫酸銅１０％イソプロピルアルコール水溶液を溶離液として、温度５０℃、流速１ｍｌ、検出２５４ｎｍで測定した。光学純度を測定した結果、Ｎ-アセチル-Ｌ-メチオニン並びにＮ−アセチル−Ｄ−メチオニンそれぞれの反応液で、Ｎ−アセチルＤ，Ｌ−メチオニンが確認されその光学純度はほぼ０％ｅｅでラセミ体であった。
【００８６】
＜実施例９＞
ＮＡＡＡＲとＬ−アミノアシラーゼによるＬ−アミノ酸の製造法
２０％Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−バリン（ｐＨ９．０）に、ＮＡＡＡＲ１００Ｕ、Ｌ−アミノアシラーゼ（天野エンザイム社製）１０００Ｕを含む反応液１００ｍｌを、４５℃で終夜反応させた。反応が進行すると生成したＬ−バリンの過飽和分が析出した。析出したＬ−バリンをろ過分離し水洗後乾燥したところ、収率７５％でＬ−バリンを得ることができた。得られたＬ−バリンの光学純度を光学活性カラムによるＨＰＬＣ法により確認した。光学分割カラムはSUMICHIRAL OA-5000（Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.）を用い、２ｍＭ硫酸銅５％イソプロピルアルコール水溶液を溶離液として、温度５０℃、流速１ｍｌ、検出２５４ｎｍで測定した。その結果、生成したＬ−バリンは光学純度がほぼ１００％ｅｅであった。
本発明で得られたＮＡＡＡＲは、工業的Ｌ−アミノ酸製造において収量並びに品質ともに有意であった。
【００８７】
＜実施例１０＞
ＮＡＡＡＲとＤ−アミノアシラーゼによるＤ−アミノ酸の製造法
２０％Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−メチオニン（ｐＨ９．０）に、ＮＡＡＡＲ１００Ｕ、Ｄ−アミノアシラーゼ（天野エンザイム社製）１０００Ｕを含む反応液１００ｍｌを、４５℃で終夜反応させた。反応が進行すると生成したＤ−メチオニンの過飽和分が析出した。析出したＤ−メチオニンをろ過分離し水洗後乾燥したところ、収率７５％でＤ−メチオニンを得ることができた。得られたＤ−メチオニンの光学純度を光学活性カラムによるＨＰＬＣ法により確認した。光学分割カラムはSUMICHIRAL OA-5000（Sumika Chemical Analysis Service, Ltd.）を用い、２ｍＭ硫酸銅５％イソプロピルアルコール水溶液を溶離液として、温度５０℃、流速１ｍｌ、検出２５４ｎｍで測定した。その結果、生成したＤ−メチオニンは光学純度がほぼ１００％ｅｅであった。
本発明で得られたＮＡＡＡＲは、工業的Ｄ−アミノ酸製造において収量並びに品質ともに有意であった。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明により製造した光学活性α−アミノ酸は、食品添加剤や栄養補給剤成分に利用可能であり、また各種医薬品等の製剤の有効成分を製造する中間体としての供給が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】Ｃ．オーランティアカス由来ＮＡＡＡＲと同一のアミノ酸配列からなる大腸菌組換えタンパク質のＮＡＡＡＲ活性における熱安定性を示す図である。縦軸は残存ＮＡＡＡＲ活性（加温処理前の活性を１００としたときの、１時間加温処理後における相対活性；％）、横軸は処理温度（℃）を示す。
【図２】Ｃ．オーランティアカス由来ＮＡＡＡＲと同一のアミノ酸配列からなる大腸菌組換えタンパク質のＮＡＡＡＲ活性におけるｐＨ安定性を示す図である。縦軸は残存ＮＡＡＡＲ活性（加温処理前の活性を１００としたときの２５℃、２４時間加温処理後における相対活性；％）、横軸は反応液ｐＨを示す。
【図１】
0004607061.tif 000005
【図２】
0004607061.tif 000006
【配列表】
0004607061000001.app