(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然でグリコシル化され得るアミノ酸位置にアミノ酸置換を含むヒトプラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜３領域をコードする核酸を含み、該置換されたアミノ酸はグリコシル化されていない、血管新生を阻害するための医薬。
【請求項２】
前記アミノ酸置換が、コードされるヒトプラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜３領域のアミノ酸位置２４９、２８９および／または３４６の１つ以上に存在する、請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
前記アミノ酸置換が、コードされるヒトプラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜３領域のアミノ酸位置２８９に存在する、請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
コードされるヒトプラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜３領域のアミノ酸位置２８９において、天然のアスパラギンがグルタミン酸に置換されている、請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
コードされるヒトプラスミノーゲンタンパク質の脱グリコシル化クリングル１〜３領域が配列番号１で示される、請求項３に記載の医薬。
【請求項６】
前記核酸配列を含むベクターを含み、該ベクターは、細胞中に存在する場合、クリングル１〜３領域のタンパク質を発現することができる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は米国立衛生研究所（ＮＩＨ）による助成金番号ＣＡ４５５４８のもとに政府の支援でなされた。米国政府は本発明に一定の権利を有することがある。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は、１９９９年２月１０日に出願された米国仮特許出願番号第６０／１１９，５６２号及び１９９９年４月７日に出願された米国仮特許出願番号第６０／１２８，０６２号の優先権を主張する。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は血管新生を調節する組成物及び方法に関する。更に詳細には、本発明は、癌のような血管新生に関連した疾病を治療するために有用な脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に関する。
【０００４】
［発明の背景］
本明細書で使用するとき、用語「血管新生」は新しい血管が組織又は器官内に生成することを意味する。正常な生理学的条件下では、ヒト又は動物は非常に特定の限定された状況下でしか血管新生を経験しない。例えば、血管新生は通常、創傷治癒、胎児及び胚の発育並びに黄体、子宮内膜及び胎盤の形成で観察される。しかしながら、血管新生は腫瘍の発現、増殖及び転移中のような異常な又は所望されない条件下においても生起する。このタイプの血管新生は非制御血管新生と呼ぶこともできる。
【０００５】
制御及び非制御血管新生は共に同様な態様で進行するものと考えられる。内皮細胞と、基底膜で取り囲まれている周細胞は毛細血管を形成する。血管新生は内皮細胞や白血球によって放出される酵素による基底膜の浸食で開始する。次いで、血管内腔を裏張りしている内皮細胞が基底膜から突き出る。血管新生刺激物質は、内皮細胞が浸食された基底膜から移動するように誘導する。移動中の細胞は親血管から「新芽」を形成し、そしてそこで内皮細胞は有糸分裂をし、そして増殖する。内皮細胞の新芽は互いに合体して毛細血管ループを形成し、新たな血管を創製する。
【０００６】
制御されない永続的な血管新生は多様な疾病状態、腫瘍転移及び内皮細胞による異常な増殖で生起する。制御されない血管新生が存在している多様な病理学的疾病状態は血管新生依存性疾病又は血管新生関連疾病として一緒に分類されてきた。腫瘍の増殖が血管新生依存性であるという仮説はエム．ジュダー・フォークマン（M. Judah Folkman）によって１９７１年に初めて提案された（J. Folkman、「腫瘍性血管新生：治療的意味」、N. Engl. Jour. Med. ２８５：１１８２〜１１８６（１９７１））。この仮定は、最も単純には次のように述べられている：「一度腫瘍「生着(take)」が生起すると、腫瘍細胞集団における全ての増加はその腫瘍に集まる新たな毛細血管の増加によって先行されるにちがいない」。腫瘍「生着」は現在では腫瘍増殖の前血管相を表すものと理解されており、そしてこの相では２，３立方ミリメーター容積を占め且つ２，３百万個の細胞を超えない腫瘍細胞集団が、存在する宿主の微小血管で生存可能である。この相を超えた腫瘍容積の拡大には新たな毛細血管の誘導が必要である。
【０００７】
血管新生を阻害し、腫瘍増殖を阻害し、原発性腫瘍の退行を引き起こし、及び／又は原発性腫瘍の転移を阻害する幾つかの分子が発見されている。これらの分子は抗血管新生作用物質と呼ばれている。これら抗血管新生作用物質の１つはアンギオスタチンと命名されており、そしてこれはプラスミノーゲンタンパク質のフラグメントである。アンギオスタチンは米国特許第５，６３９，７２５号中で初めて記載された。
【０００８】
プラスミノーゲンタンパク質は５個のクリングル領域ドメインとカルボキシ末端領域に位置するセリンプロテアーゼドメインを含んでいる。ヒトプラスミノーゲンのＤＮＡ配列は公表されている。（M.J. Browne等、「ＨｅＬａ細胞における組換えヒトプラスミノーゲン及びアグリコプラスミノーゲンの発現」、Fibrinolysis ５（４）：２５７〜２６０（１９９１））。プラスミノーゲン分子の各クリングル領域は概ね８０個のアミノ酸を含有しておりそして３個のジスルフィド結合を含有している。（K.C. Robbins、「プラスミノーゲン−プラスミン酵素系」、Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Practice、第２版、R.W. Colman等編集、J.B. Lippincott Company、３４０〜３５７頁、１９８７年）。ヒトプラスミノーゲンの各クリングルドメインのおおよそのアミノ酸スパンは次のとおりである：クリングル１は典型的にはＣｙｓ８４〜Ｃｙｓ１６２を包含し、クリングル２は典型的にはＣｙｓ１６６〜Ｃｙｓ２４３を包含し、クリングル３は典型的にはＣｙｓ２５６〜Ｃｙｓ３３３を包含し、クリングル４は典型的にはＣｙｓ３５８〜Ｃｙｓ４３５を包含し、そしてクリングル５は典型的にはＣｙｓ４６２〜Ｃｙｓ５４１を包含している。（F.J. Castellino及びS.G. McCance、「ヒトプラスミノーゲンのクリングルドメイン」、Ciba Found. Symp.、２１２：４６〜６５（１９９７））。各クリングルドメインは概ね２０個のアミノ酸のクリングル間ドメインによって分離されているので、本明細書で定義されているクリングル領域はこれらの隣接クリングル間ドメインの任意の部分を含むことができる。
【０００９】
アンギオスタチンタンパク質は、プラスミノーゲンのこれら５個のクリングル領域のうちの１つ又はそれより多くを含んでいる。アンギオスタチン生成に寄与することが示唆されているプロテアーゼの中には、マクロファージメタロエラスターゼ、メタロプロテイナーゼ（ｍｍｐ）−３、−７及び−９並びにシステインのような遊離スルフヒドリルドナーの存在下でのプラスミンそれ自体がある。（Z. Dong他、「マクロファージ由来のメタロエラスターゼはルイス肺癌におけるアンギオスタチン産生に寄与する」、Cell、８８：８０１〜８１０（１９９７）；H.R. Lijnen、「ストロメライシン−１（ＭＭＰ−３）によるプラスミノーゲンからアンギオスタチン様フラグメントの生成」、Biochemistry、３７：４６９９〜４７０２（１９９８）；B.C. Patterson及びQ.A. Sang、「ヒトマトリライシス（ＭＭＰ−７）及びゲラチナーゼＢ／ＩＶ型コラゲナーゼ（ＭＭＰ−９）のアンギオスタチン変換酵素活性」、J. Biol. Chem. ２７２：２８８２３〜２８８２５（１９９７））（P. Stathakis等、「プラスミンの還元及びタンパク質分解によるアンギオスタチンの生成」、J. Biol. Chem. ２７２：２０６４１〜２０６４５（１９９７）；S. Gately等、「プラスミノーゲンからその血管新生インヒビターアンギオスタチンへの癌介在性変換のメカニズム」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ９４：１０８６８〜１０８７２（１９９７））。
【００１０】
ヒトプラスミノーゲンタンパク質は、そのグリコシル化状態においては、アミノ酸位置Ａｓｎ−２８９にＮ−結合炭水化物鎖を、そしてアミノ酸位置Ｓｅｒ−２４９及びＴｈｒ−３４６にＯ−結合ムチンタイプ炭水化物鎖を含有している。アンギオスタチンタンパク質はプラスミノーゲンタンパク質のフラグメントであるので、アンギオスタチンタンパク質も上記炭水化物鎖を含有している。例えばプラスミンを産生させるｔＰＡやｕＰＡによるプラスミノーゲンのタンパク質分解消化は、プラスミノーゲンの炭水化物含有量で調節されることが知られている。更に、炭水化物鎖はプラスミノーゲンと細胞表面レセプターの結合を調節することが知られている。炭水化物はまた、循環タンパク質の全身における半減期で広い役割を果たすことも知られている。（K. Mori等、「Ｉ型及びＩＩ型組織プラスミノーゲンアクチベーターによる１型及び２型プラスミノーゲンの活性化因子」、J. Biol. Chem. ２７０：３２６１〜３２６７（１９９５）；D.J. Davidson及びF.J. Castellino、「天然及び組換えヒトプラスミノーゲンのウロキナーゼによる活性化並びにリシン結合特性に与えるアスパラギン２８９−結合オリゴ糖の性質の影響」、J. Clin. Invest. ９２：２４９〜２５４（１９９３）；J. Edelberg等、「新生児プラスミノーゲンは改変された細胞表面結合及び活性化動力学を示す」、J. Clin. Invest. ８６：１０７〜１１２（１９９０）；M. Gonzales-Gronow等、「細胞プラスミノーゲン結合部位の更なる特徴分析：プラスミノーゲン２とリポタンパク質ａが同一部位で競合することの証拠」、Biochemistry、２８：２３７４〜２３７７（１９８９）；N. Jenkins等、「グリコシル化権利を取得すること：バイオテクノロジー産業に対する意味」、Nat. Biotechnol. １４：９７５〜９８１（１９９６））。
【００１１】
アンギオスタチン及びその関連クリングルフラグメントがどのようにして内皮細胞の増殖を特異的に阻害するのかということの基礎になっているメカニズムは依然として特徴付けられていない。上記阻害が、増殖中の内皮細胞内で特異的に発現されるレセプターによって介在されるのかどうか、又はアンギオスタチンが内皮細胞によって内在化されそしてそれに続いて細胞の増殖を阻害するのかどうかは依然として明白でない。或いは、アンギオスタチンはインテグリンａvｂ3のような内皮細胞付着レセプターと相互に作用し、インテグリン介在性血管新生を遮断することができる（P.C. Brooks等、「インテグリンアルファｖベータ３アンタゴニストは、血管新生性血管のアポトーシスを誘導することによって腫瘍の退行を促進する」、Cell ７９：１１５７〜１１６４（１９９４））。
【００１２】
アンギオスタチンは血管新生インヒビターとして同定されているが、当該技術分野で求められているものは、高い抗血管新生活性を有しているプラスミノーゲンのクリングル領域フラグメントである。これらの改善されたクリングル領域タンパク質は血管新生介在性疾病、例えば癌の治療並びに他の血管新生プロセス、例えば創傷治癒及び再生の調節に有用であろう。これらのタンパク質は、抗血管新生クリングル領域タンパク質の性質が改善されているため、より少ない用量で投与できるので、癌の治療費用を低下させるであろう。改善された抗血管新生クリングル領域タンパク質の検出、測定及び位置決定用の組成物や方法も当該技術分野で求められている。
【００１３】
［発明の概要］
血管新生を調節しそして所望されない血管新生、特に腫瘍増殖に関連した血管新生を阻害するのに有効な組成物及び方法が本発明で提供される。特に、本発明は、プラスミノーゲンのフラグメントである脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を提供する。クリングル１〜５領域タンパク質の脱グリコシル化がこれらタンパク質の抗血管新生活性を劇的に上昇させるということは本発明の驚くべき発見である。本明細書に記載されている脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質には、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質が１つ又はそれより多くの他のタンパク質と連続している融合タンパク質が含まれることも理解すべきである。好ましい実施態様では、上記融合タンパク質は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質ともう１つの抗血管新生タンパク質を含んでいる。
【００１４】
脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をコードしているヌクレオチド、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をコードしているＤＮＡ配列を含有する発現ベクター、及び脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をコードしているＤＮＡ配列を含有する１つ又はそれより多くの発現ベクターを含有する細胞も本発明に含まれる。
【００１５】
本発明にはまた、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に特異的な抗体、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に特異的な抗体の結合を阻害する抗体、及び脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質レセプターに特異的な抗体も含まれる。これらの抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体でありうる。脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に特異的な抗体は、血管新生によって介在される癌若しくは他の疾病の発症又は再発の診断又は予後判定となる、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の存在及び量を検出するために診断用キットで使用することができる。脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に特異的な抗体はまた、ヒト又は動物を脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に対して受動的に免疫し、そしてそれによって血管新生の阻害を低下させるためにヒト又は動物に投与することもできる。
【００１６】
本発明は、ヒト又は動物において脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質のインビボ濃度を高めることによって、望ましくなく且つ制御されない血管新生によって介在される疾病やプロセスを治療するための方法及び組成物を提供する。脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質のインビボ濃度は、実質的に精製された脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を、血管新生を阻害するのに十分な用量で含んでいる組成物をヒト又は動物に投与することによって高めることができる。更に、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質のインビボ濃度は、ヒト又は動物において、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質又はプラスミノーゲン若しくはプラスミンから脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を放出させる酵素をコードしているヌクレオチドを投与することによって高めることができる。本発明は腫瘍増殖の治療又は抑制に特に有用である。
【００１７】
従って、本発明の目的は、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を含んでいる組成物を提供することである。
【００１８】
本発明のもう１つの目的は、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をコードしているヌクレオチド組成物を提供することである。
【００１９】
本発明のもう１つの目的は、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質のインビボ濃度を高める組成物及び方法を提供することである。
【００２０】
本発明のもう１つの目的は、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に特異的であり且つプラスミノーゲンを認識しない脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の抗体を含んでいる組成物を提供することである。
【００２１】
本発明の目的は、体液中の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に特異的な抗体の存在を検出しそして定量する方法を提供することである。
【００２２】
本発明のもう１つの目的は、癌の検出又は予後判定の方法を提供することである。
【００２３】
本発明のもう１つの目的は、血管新生によって媒介される疾病及びプロセスの治療方法を提供することである。
【００２４】
本発明のもう１つの目的は、癌の増殖を治療又は抑制する組成物を提供することである。
【００２５】
本発明のなおもう１つの目的は、血管新生プロセスの調節のための遺伝子療法に有用な組成物及び方法を提供することである。
【００２６】
これらの目的や他の目的、特徴並びに本発明の利点は、開示した実施態様及び上記請求項に関する以下の詳細な説明を検討した後に明らかになろう。
【００２７】
[詳細な説明]
本発明はプラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜５領域の脱グリコシル化フラグメントを含んでいる。脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を使用する方法並びに脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を検出するための方法及び組成物も本発明に含まれる。
【００２８】
本発明の驚くべき発見は、プラスミノーゲンのクリングル１〜５領域の脱グリコシル化フラグメントがプラスミノーゲンのクリングル１〜５領域のグリコシル化フラグメントより一層劇的に抗血管新生的であるということである。従って、本発明にはクリングル１〜５領域タンパク質の脱グリコシル化フラグメント及びクリングル１〜５領域タンパク質の脱グリコシル化フラグメントを含んでいる組成物が含まれる。１つの実施態様では、組成物は製薬的に許容可能な担体、及び、プラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜５領域の脱グリコシル化フラグメントの天然グリコシル化形態より高い濃度の脱グリコシル化フラグメントを含んでおり、該脱グリコシル化フラグメントは天然グリコシル化形態に結合している１個又はそれより多くの炭水化物部分を欠失しておりそして該脱グリコシル化フラグメントは抗血管新生活性を有している。更なる実施態様では、上記脱グリコシル化フラグメントの量対上記天然グリコシル化形態の量の比率は少なくとも６０：４０、更に好ましくは少なくとも８０：２０、そして最も好ましくは１００：０である。脱グリコシル化フラグメント対天然グリコシル化形態の比率は少なくとも９５：５、９６：４、９７：３、９８：２及び９９：１であってもよい。
【００２９】
本明細書で使用するとき、用語「脱グリコシル化」とは、クリングル１〜５領域タンパク質の天然グリコシル化形態に結合している１個又はそれより多くの炭水化物部分が欠失したタンパク質又はペプチドに言及したものである。「天然グリコシル形態」とは、天然に見られるアミノ酸位置でグリコシル化されているクリングル１〜５領域タンパク質フラグメント又はこのクリングル１〜５領域フラグメントが誘導される、より大きなタンパク質に言及したものである。例えば、ヒトプラスミノーゲンの１つの天然グリコシル化形態はＳｅｒ−２４９、Ａｓｎ−２８９及びＴｈｒ−３４６でグリコシル化されており、そしてそれ故、ヒトプラスミノーゲンのクリングル１〜５領域のフラグメントの天然グリコシル化形態はＳｅｒ−２４９、Ａｓｎ−２８９及び／又はＴｈｒ−３４６でグリコシル化されている。本明細書に記載されているクリングル１〜５領域フラグメントの天然グリコシル化形態は、天然でフラグメントとして存在する必要はなく、そしてより大きなタンパク質の一部として天然に存在することができると理解すべきである。
【００３０】
それ故、「脱グリコシル化プラスミノーゲン」とは、そうでない場合天然でグリコシル化されていることができる（即ち、プラスミノーゲンタンパク質の天然グリコシル化形態ではグリコシル化されている）位置の炭水化物を欠失している任意の種のプラスミノーゲンタンパク質を言う。例えば、本発明にはヒトプラスミノーゲンのアミノ酸位置２８９（Ａｓｎ−２８９）に相当するアミノ酸位置のビシアリル化−ビアンテナリー（biantenary）グリカン、ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸位置２４９（Ｓｅｒ−２４９）に相当するアミノ酸位置のＯ−結合ムチンタイプ炭水化物鎖、及び／又はヒトプラスミノーゲンのアミノ酸位置３４６（Ｔｈｒ−３４６）に相当するアミノ酸位置のＯ−結合ムチンタイプ炭水化物鎖を欠いているプラスミノーゲンタンパク質が含まれる。更に、用語「脱グリコシル化プラスミノーゲン」は、炭水化物鎖がゼロ、１個又は２個であるプラスミノーゲンタンパク質を包含する。本発明の１つの実施態様では、脱グリコシル化プラスミノーゲンはヒトプラスミノーゲンのアミノ酸位置２８９に相当するアミノ酸の任意のＮ−結合炭水化物鎖を欠いている。更なる実施態様では、脱グリコシル化プラスミノーゲンはヒトプラスミノーゲンのアミノ酸位置２８９に相当するアミノ酸の任意の炭水化物部分を欠いている。
【００３１】
更に本明細書で使用するとき、用語「脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質」及び「脱グリコシル化フラグメント」とは、そうでない場合天然でグリコシル化されていることができる（即ち、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の天然グリコシル化形態ではグリコシル化されている）位置に炭水化物を欠失している任意の種のプラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜５領域のフラグメントを言う。例えば、本発明にはヒトプラスミノーゲンのアミノ酸位置２８９に相当するアミノ酸位置のビシアリル化−ビアンテナリーグリカン、ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸位置２４９に相当するアミノ酸位置のＯ−結合ムチンタイプ炭水化物鎖、及び／又はヒトプラスミノーゲンのアミノ酸位置３４６に相当するアミノ酸位置のＯ−結合ムチンタイプ炭水化物鎖を欠いている脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質が含まれる。それ故、用語「脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質」は炭水化物鎖がゼロ、１個又は２個であるクリングル１〜５タンパク質を包含する。本発明の１つの実施態様では、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質はアミノ酸位置２８９のビシアリル化−ビアンテナリーグリカンを欠いている。もう１つの実施態様では、アミノ酸位置２８９の炭水化物鎖はビシアリル化−ビアンテナリーグリカンより小さい。もう１つの実施態様では、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質はヒトプラスミノーゲンのアミノ酸位置２８９に相当するアミノ酸の炭水化物部分を欠いている。
【００３２】
アミノ酸に言及するとき、「に相当する」とは異なるタンパク質又はこれらのフラグメントの同一領域における２個のアミノ酸の比較を示し、上記タンパク質は相同体、オーソログ又はパラログである。相同体は実質的な相同性を有するタンパク質として定義され、ここで「実質的な相同性」は以下で定義される。オーソログは同一でないアミノ酸配列及び類似する機能的特徴を有するタンパク質として定義され、これらタンパク質は異なる種に由来するが、これらの種は共通の先祖起源を有している。パラログは同一でないアミノ酸配列及び類似する機能的特徴を有するタンパク質として定義され、これらタンパク質は同一の種に由来する。本発明において、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３に位置するＡｓｎ−２８９に相当するアミノ酸の例はマウスプラスミノーゲンのクリングル３に位置するアミノ酸であり、そしてこのアミノ酸はこれに結合したＮ−結合炭水化物部分、そして好ましくは、天然で見られるような、これに結合したビシアリル化−ビアンテナリーグリカンを有しうるものである。本発明にはヒト以外の種に由来するプラスミノーゲンのクリングル１〜５領域のフラグメントが含まれると理解すべきである。
【００３３】
本発明のもう１つの実施態様では、クリングル１〜５領域タンパク質はヒトプラスミノーゲンの２８９位に相当する位置に修飾アミノ酸を有しており、そのため該タンパク質の翻訳後修飾中にこの位置に炭水化物部分は付加されない。好ましい実施態様では、上記アミノ酸の置換は保存的置換である。更に好ましい実施態様では、上記アミノ酸の置換はアスパラギンからグルタミン酸への置換である。更になお好ましい実施態様では、クリングル１〜５領域タンパク質は、概ねクリングル１〜３領域に相当する配列番号１に示されるアミノ酸配列を有している。
【００３４】
本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質はインビボ又はインビトロで製造することができる。例えば、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は血清、尿及び腹水を含むがこれらに限定されない体液から単離することができ、又は化学的若しくは生物学的方法（例えば、組換え遺伝子発現、オリゴヌクレオチドの化学的合成、及びプラスミノーゲン又はプラスミンのようなより大きなタンパク質のインビトロ酵素触媒作用）で合成することができる。組換え技術には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するＤＮＡ源からの遺伝子増幅及び逆転写酵素／ＰＣＲを使用するＲＮＡ源からの遺伝子増幅が含まれる。例えば、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は、天然ではグリコシル化可能なアミノ酸位置がグリコシル化されないアミノ酸で置換されている該タンパク質をコードしている遺伝子を発現させることによって組換え的に産生させることができる。この遺伝子は、以下で更に詳細に記載している遺伝子治療方法を使用して個体に投与することができる。クリングル１〜５領域タンパク質は脱グリコシル化プラスミノーゲンと脱グリコシル化プラスミノーゲンを開裂する酵素を個体に投与することによってインビボで作成することもできる。好ましい実施態様では、上記酵素はマクロファージメタロエラスターゼのようなエラスターゼ酵素である。脱グリコシル化クリングル１〜５タンパク質は、脱グリコシル化プラスミノーゲンを特異的に開裂する酵素を投与することによってインビボで作成することもできる。
【００３５】
プラスミノーゲン又はプラスミンのようなより大きなタンパク質から脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を単離するとき、プラスミノーゲン又はプラスミンのどちらかを酵素触媒作用の前に脱グリコシル化するか又は得られたクリングル１〜５領域タンパク質自体を脱グリコシル化することができる。タンパク質の脱グリコシル化方法は当該技術分野の熟練者に良く知られている。しかしながら、エラスターゼによるグリコシル化プラスミノーゲンの酵素触媒作用と比較したとき、エラスターゼによる脱グリコシル化プラスミノーゲンの酵素触媒作用後にクリングル１〜５領域タンパク質の収量が増加することは本発明の驚くべき発見である。それ故、本発明の好ましい実施態様では、クリングル１〜５領域タンパク質は脱グリコシル化プラスミノーゲンのエラスターゼ消化によって単離される。
【００３６】
「クリングル１〜５領域」は、本明細書ではヒトプラスミノーゲンの概ねアミノ酸位置１から概ねアミノ酸位置５４１までに相当する領域として定義されていると理解すべきである。かくして、本発明のクリングル１〜５領域の脱グリコシル化フラグメントはクリングル１領域に先行するＮ−末端配列、クリングル領域１、２、３、４及び５、クリングル間領域並びにこれらの抗血管新生フラグメントを含有することができ、上記領域は天然では連続配列又はそうでないとして見いだされる。脱グリコシル化できるクリングル１〜５領域の抗血管新生フラグメントは米国特許第５，６３９，７２５号及び第５，８３７，６８７号中で更に開示されている。
【００３７】
本発明は任意の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質誘導体を含むように意図されていることも理解すべきである。クリングル１〜５領域タンパク質誘導体には、プラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜５領域のアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。クリングル１〜５領域タンパク質誘導体にはまた、クリングル１〜５領域の抗血管新生フラグメントに相当する配列を有するペプチドも含まれる。「抗血管新生フラグメント」は、アミノ酸配列が、「抗血管新生サブ配列」と称されるクリングル１〜５領域のサブ配列に相当するペプチドであると定義される。「サブ配列」は、より大きな配列内に見られる一連の連続アミノ酸である。サブ配列は一般的に、上記のより大きな配列の概ね少なくとも７０％、更に好ましくは８０％、そして最も好ましくは９０％を構成する。
【００３８】
クリングル１〜５領域タンパク質誘導体にはまた、元の配列又はサブ配列中の１個又はそれより多くのアミノ酸が天然生起のアミノ酸残基又はアミノ酸残基類似体（これは修飾アミノ酸とも称される）で置換されている修飾配列を有しているタンパク質又はペプチドも含まれる。適当なクリングル１〜５領域タンパク質誘導体は、クリングル１〜５領域タンパク質のアミノ酸配列又はクリングル１〜５領域タンパク質の抗血管新生配列と実質的に相同性の修飾配列を有している。
【００３９】
「アミノ酸残基」はタンパク質又はペプチド内で見られる部分であり、そして−ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ−によって表され、Ｒは天然生起アミノ酸の側鎖である。ペプチド内で見られる部分に言及するとき、用語「アミノ酸残基」と「アミノ酸」は相互交換可能的に使用される。「アミノ酸残基類似体」には次式：−ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ−（式中、Ｒは脂肪族基、置換脂肪族芳香族基、ベンジル基、置換ベンジル基、芳香族基又は置換芳香族基であり、そしてＲは天然生起アミノ酸の側鎖に相当しない）を有するＤ型又はＬ型立体配置が含まれる。
【００４０】
本明細書で記載されている脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質配列中のアミノ酸残基の適当な置換には、血管新生脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質誘導体を生じさせる保存的置換が含まれる。保存的置換は、置換するアミノ酸（天然生起又は修飾された）が置換されるアミノ酸と構造的に関連している置換である。「構造的に関連している」アミノ酸は概ね同一の大きさであり、そして側鎖中に同一又は同様な官能基を有している。
【００４１】
１つのグループ内の各アミノ酸が同様な電子及び立体特性を有している天然生起及び修飾アミノ酸のグループを以下で提供する。かくして、保存的置換はアミノ酸を同一グループから得られる別のアミノ酸で置換することによって行うことができる。これらのグループは非限定的であり、そして更なる修飾アミノ酸を各グループに含めることができると理解すべきである。
【００４２】
グループＩにはロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン及び次の側鎖：エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチルの側鎖を有する修飾アミノ酸が含まれる。好ましくは、グループＩにはロイシン、イソロイシン、バリン及びメチオニンが含まれる。
【００４３】
グループＩＩにはグリシン、アラニン、バリン及びエチル側鎖を有する修飾アミノ酸が含まれる。好ましくは、グループＩＩにはグリシン及びアラニンが含まれる。
【００４４】
グループＩＩＩにはフェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、トリプトファン、シクロヘキシルメチル、及び置換ベンジル又はフェニル側鎖を有する修飾アミノ酸残基が含まれる。好ましい置換基には、ハロゲン、メチル、エチル、ニトロ、−ＮＨ2、メトキシ、エトキシ及び−ＣＮのうちの１つ又はそれより多くが含まれる。好ましくは、グループＩＩＩにはフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンが含まれる。
【００４５】
グループＩＶにはグルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸又はアスパラギン酸の置換又は非置換脂肪族、芳香族又はベンジルエステル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、シクロヘキシル、ベンジル又は置換ベンジル）、グルタミン、アスパラギン、−ＣＯ−ＮＨ−アルキル化グルタミン又はアスパラギン（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル及びイソ−プロピル）並びに側鎖−（ＣＨ2）3−ＣＯＯＨを有する修飾アミノ酸、これらのエステル（置換又は非置換脂肪族、芳香族又はベンジルエステル）、これらのアミド及びこれらの置換又は非置換Ｎ−アルキル化アミドが含まれる。好ましくは、グループＩＶにはグルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン酸メチル、アスパラギン酸エチル、アスパラギン酸ベンジル及びグルタミン酸メチル、グルタミン酸エチル及びグルタミン酸ベンジル、グルタミン及びアスパラギンが含まれる。
【００４６】
グループＶにはヒスチジン、リシン、オルニチン、アルギニン、Ｎ−ニトロアルギニン、β−シクロアルギニン、γ−ヒドロキシアルギニン、Ｎ−アミジノシトルリン及び２−アミノ−４−グアニジノブタン酸、リシンの相同体、アルギニンの相同体及びオルニチンの相同体が含まれる。好ましくは、グループＶにはヒスチジン、リシン、アルギニン及びオルニチンが含まれる。アミノ酸の相同体は、側鎖中に１個から約３個までの追加又は削除されたメチレン単位を含んでいる。
【００４７】
グループＶＩにはセリン、トレオニン、システイン、及び−ＯＨ又は−ＳＨで置換されたＣ１〜Ｃ５直鎖又は分岐アルキル側鎖、例えば、−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ又は−ＣＨ2ＣＨＯＨＣＨ3を有する修飾アミノ酸が含まれる。好ましくは、グループＶＩにはセリン、システイン又はトレオニンが含まれる。
【００４８】
本発明のもう１つの態様では、本明細書で記載したアミノ酸配列中のアミノ酸残基に対する適当な置換には、抗血管新生性であるクリングル１〜５領域タンパク質誘導体を生じさせる「過酷な（severe）置換」が含まれる。抗血管新生性クリングル１〜５領域タンパク質誘導体を生じさせる過酷な置換は、高度に保存される位置におけるより高度には保存されない位置においてはるかに一層可能であるように思われる。本発明では、過酷な置換はクリングル間領域とクリングル１に先行するＮ−末端配列においてはるかに一層可能であるように思われる。「過酷な置換」は、置換するアミノ酸（天然生起又は修飾された）が置換されるアミノ酸と比較したとき、顕著に異なるサイズ及び／又は電気的特性を有している置換である。例えば、置換するアミノ酸の側鎖は置換されるアミノ酸の側鎖より顕著に大きい（又は小さい）ことができ、及び／又は置換されるアミノ酸とは顕著に異なる電気的特性を有する官能基を有していることができる。
【００４９】
このタイプの過酷な置換の例には、アラニンに対するフェニルアラニン又はシクロヘキシルメチルグリシンによる置換、グリシンに対するイソロイシンによる置換、対応するＬアミノ酸に対するＤアミノ酸による置換、又はアスパラギン酸に対する−ＮＨ−ＣＨ［（−ＣＨ2）5−ＣＯＯＨ］−ＣＯ−による置換が含まれる。或いは、官能基を側鎖に加えることができるか、側鎖から欠失させることができるか、又は別の官能基と交換することができる。このタイプの過酷な置換の例には、バリン、ロイシン若しくはイソロイシンの脂肪族側鎖に対するアミン若しくはヒドロキシル、カルボン酸の付加、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸の側鎖中のカルボン酸のアミンによる交換、又はリシン若しくはオルニチンの側鎖中のアミン基の欠失が含まれる。なおもう１つの代替法では、置換するアミノ酸の側鎖は置換されるアミノ酸の官能基とは顕著に異なる立体及び電気的特性を有していることができる。このような修飾の例には、グリシンに対するトリプトファン、アスパラギン酸に対するリシン及びセリンの側鎖に対する−（ＣＨ2）4ＣＯＯＨが含まれる。これらの例は限定的であることを意味するものではない。
【００５０】
「実質的な相同性」は、各アミノ酸配列の対応する位置における十分な数のアミノ酸残基が同一であるか又は構造的に関連しており、その結果第１のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドと第２のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドが同様な生物学的活性を示すときに、これら２つのアミノ酸配列間に存在する。一般的に、第１のアミノ酸配列中のアミノ酸の少なくとも３０％、更に好ましくは少なくとも４０％、そして最も好ましくは少なくとも５０％が第２のアミノ酸配列と同一であるか又は構造的に関連しているとき、これらアミノ酸配列間に実質的な配列相同性が存在する。相同性はしばしば、配列分析ソフトウエア、例えば、ＢＬＡＳＴＩＮ又はＢＬＡＳＴＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴで入手可能）を使用して測定される。ＢＬＡＳＴＩＮ（ヌクレオチド配列用）で２つの配列を比較する（例えば、２つの配列を互いに「撃ち合う（Blast)」）ためのデフォールトパラメーターはマッチ報酬＝１、ミスマッチペナルティ＝−２、オープンギャップ＝５及びエクステンションギャップ＝２である。タンパク質配列に対してＢＬＡＳＴＰを使用するとき、デフォールトパラメーターはマッチ報酬＝０、ミスマッチペナルティ＝０、オープンギャップ＝１１及びエクステンションギャップ＝１である。
【００５１】
本発明に関して、プラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜３のクリングル領域モチーフは他の生物学的に活性のタンパク質中に存在していることも知られている。これらのタンパク質にはプロトロンビン、肝細胞増殖因子、散乱因子及びマクロファージ刺激タンパク質が含まれるが、これらに限定されない（T. Yoshimura等、「ヒトマクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ、ＭＳＴ１）のクローニング、配列決定及び発現によって、ＭＳＰはクリングルタンパク質のファミリーのメンバーとして確認され、そしてＭＳＰ遺伝子の位置は第３染色体上に決定される」、J. Biol. Chem.、２６８：１５４６１〜１５４６８、（１９９３））。インビボで抗血管新生活性を有する三次元クリングル様立体配座又はシステインモチーフを有する任意のクリングル１〜５領域タンパク質又はペプチドは本発明の一部であるように意図されている。
【００５２】
本明細書で使用するとき、用語「単離された」とは、その天然状態で通常随伴する構成成分の少なくとも幾つかを実質的に又は本質的に有していない組成物を言うものと理解すべきである。それ故、本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は、通常これらのin situ環境と関連している物質の幾つかを含有していない。典型的には、本発明の単離された脱グリコシル化クリングル領域１〜５タンパク質は、銀染色ゲル上のバンド強度で測定するとき、少なくとも約８０％純粋、通常は少なくとも約９０％純粋、そして好ましくは少なくとも約９５％純粋である。用語「単離された」は、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を含んでいる融合タンパク質を本発明から除外しないものと理解すべきである。本発明は、本明細書に記載したクリングル１〜５領域タンパク質及び他のタンパク質を含んでいる融合タンパク質又はキメラタンパク質を意図している。好ましい実施態様では、融合タンパク質は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質及び他の抗血管新生タンパク質、例えばエンドスタチンタンパク質を含んでおり、該エンドスタチンタンパク質はコラーゲンタンパク質のＣ末端非コラーゲン領域の抗血管新生フラグメントとして定義される。
【００５３】
本明細書に記載した脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は、血管新生が介在するか又は血管新生に係わる疾病又はプロセスを治療するのに有用である。特に、本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は血管新生介在性癌の治療に有用である。本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質はまた、本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に特異的な抗体の産生並びに本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質のレセプター及び化学的模擬物の同定及び単離にも有用である。
【００５４】
脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に加えて、本発明は本明細書に記載したクリングル１〜５領域タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を含んでいる組成物を包含する。本発明の１つの実施態様では、上記ヌクレオチド配列は、ヒトプラスミノーゲンのアミノ酸２８９に相当する位置に修飾アミノ酸を含有するクリングル１〜５領域タンパク質をコードしている。好ましい実施態様では、上記ヌクレオチド配列は配列番号２に示されているとおりである。本発明はまたクリングル１〜５領域タンパク質をコードしているＤＮＡ配列を含有するベクターも含んでおり、該ベクターは、細胞内に存在するとき、クリングル１〜５領域タンパク質を発現することができる。この細胞は１個のベクター又は多数のベクターを含んでいてもよい。本明細書に記載されているヌクレオチド配列は本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を組換え的に産生するのに有用であり、そして遺伝子療法によって血管新生関連疾病及び状態を治療するのに有用である。
【００５５】
更に尚、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を使用して、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質及びこれらのレセプターの抗体を産生させることができる。特に、脱グリコシル化クリングル１〜５領域と特異的に結合するが、グリコシル化プラスミノーゲン又はグリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質とは結合しない抗体を産生させることができる。本明細書で使用するとき、用語「抗体（単数）」及び「抗体（複数）」にはモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、単鎖、二重特異性、サル化及びヒト化抗体、並びにＦａｂ免疫グロブリン発現ライブラリーの産生物を含むＦａｂフラグメントが含まれる。
【００５６】
脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に対する抗血清（又はアゴニスト及びアンタゴニスト）の発生における高い特異性の可能性を高めるために、ジーンバンク（GenBank）、ブルックハーベン・プロテイン（Brookhaven Protein）、スイス−プロット（SWISS-PROT）及びＰＩＲのようなタンパク質配列データベースを使用してタンパク質配列を既知の配列と比較して潜在的な配列相同性を決定することができる。この情報によって、他の分子に対して高度の配列相同性を示す配列の排除が助長される。脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質又はこれらのレセプターと特異的に結合するこれらの抗体は、当該技術分野の通常の技術を有する者に良く知られている診断方法及びキットで使用して、体液又は組織中の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質又はこれらのレセプターを検出又は定量することができる。これらの試験から得られた結果を使用して、癌又は他の血管新生介在性疾病の発症又は再発を診断又は予測することができる。
【００５７】
抗体に言及するとき、句「と特異的に結合する」又は「に特異的な」とは、タンパク質及び他の生物学的物質の異種集団の存在下でペプチドの存在に決定的な結合反応を言う。かくして、指定された免疫アッセイ条件下では、特定の抗体は特定のペプチドと優先的に結合し、そして試料中に存在する他のタンパク質とは顕著な量では結合しない。このような条件下でペプチドと特異的に結合するためには、特定のタンパク質に対する特異性で選択される抗体が必要である。特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために多様な免疫アッセイフォーマットを使用することができる。例えば、固相エリザ（ＥＬＩＳＡ）免疫アッセイを定型的に使用して、タンパク質と特異的に免疫反応性のモノクローナル抗体を選択する。特異的な免疫反応性を決定するために使用できる免疫アッセイフォーマット及び条件の説明については、ハーロー（Harlow）及びレーン（Lane）（１９８８）、「抗体（Antibodies）、実験室マニュアル（A Laboratory Manual）」、コールド・スプリング・ハーバー・パブリケーションズ（Cold Spring Harbor Publications）、ニューヨーク、参照。
【００５８】
検出可能な生物分子又は化学品で標識するとき、上記した脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質、核酸及び抗体は、以下に記載する方法やアッセイを使用するインビボ及びインビトロ診断並びに実験室研究のような目的に有用である。種々のタイプの標識及びこれら標識をポリペプチドや抗体と抱合させる方法は、当該技術分野の熟練者に良く知られている。標識の例には、放射性標識、生物発光標識、蛍光原及び色素原が含まれるが、これらに限定されない。更に尚、本発明は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質抗血清、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質レセプターアゴニスト又は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質レセプターアンタゴニストを包含し、そしてこれらは製薬的に許容可能な賦形剤及び任意に持続性放出化合物又は組成物、例えば生物分解性ポリマー、と組み合わせて以下に記載する治療方法で使用される治療用組成物を形成する。
【００５９】
本発明の方法には、本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の作成、検出及び測定方法、並びに本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を使用する血管新生関連状態及び疾病の治療方法が含まれる。脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は、化学反応によって合成的にか又は発現系と共同した組換え技術によって産生させることができる。これらの脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は動物又はヒト起源であり得る。１つの実施態様では、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は組換え的に産生され、そして配列番号１のアミノ酸配列を有している。
【００６０】
脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質はまた、プラスミノーゲン若しくはプラスミンを酵素的に開裂して抗血管新生活性を有するタンパク質を生成させることによってか又は脱グリコシル化プラスミノーゲンを脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に開裂する内因性酵素の作用を模擬する化合物を使用することによってインビトロ又はインビボで産生させることもできる。脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の産生は、プラスミノーゲン開裂酵素の活性に影響を与える化合物によって調節することもできる。特に、プラスミノーゲンのグリコシル化が、エラスターゼによるプラスミノーゲンの開裂に伴うクリングル１〜５領域タンパク質の収量を低下させるということは本発明の驚くべき発見である。それ故、本発明の１つの実施態様では、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を作成する方法はエラスターゼを使用して脱グリコシル化プラスミノーゲンを開裂することを含んでいる。クリングル１〜５領域タンパク質の生成における本明細書で報告したエラスターゼの役割を所与のものとすると、クリングル３のＮ−結合炭水化物は、クリングル１〜５領域タンパク質の生成に潜在的に寄与する他のプロテイナーゼの反応メカニズムも調節するであろう。
【００６１】
本発明はまた、治療の有効性を決定する目的や癌のような血管新生関連疾病の予後判定及び診断のために体液及び組織中の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を検出する方法も含んでいる。特に、本明細書では循環中のプラスミノーゲンより脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に特異的な抗体の使用方法が提供される。これらの方法は、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をグリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質やグリコシル化プラスミノーゲンから検出しそして識別する手段を提供する。本発明はまた、細胞や組織中の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質結合部位及びレセプターの検出も含んでいる。
【００６２】
脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質及びこれらのレセプターの検出及び測定用キットは本発明の一部分として意図されている。最も高い力価及び特異性を有しそして血漿抽出物、尿、組織及び細胞培養培地中の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を検出することができる抗血清を更に試験して、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の迅速で、信頼でき、感度が良く且つ特異的な測定及び位置決定用キットの容易な使用が確立される。これらのアッセイキットには次の技術；競合及び非競合アッセイ、ラジオイムノアッセイ、生物発光及び化学発光アッセイ、蛍光定量アッセイ、サンドイッチアッセイ、免疫放射線定量アッセイ、ドットブロット法、エリザ法を含む固相酵素アッセイ、尿又は血液の迅速なモニタリング用の抗体被覆片又は測定棒、並びに免疫細胞化学が含まれるが、これらに限定されない。各キットに関しては、アッセイの範囲、感度、精度、信頼性、特異性及び再現性を確立する。アッセイ内及びアッセイ間変動は、置換又は活性の標準曲線に対して２０％、５０％及び８０％のポイントで確立する。
【００６３】
本発明には、関節炎や腫瘍を含むがこれらに限定されない血管新生性疾病及びプロセスを、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の産生を刺激することによって、及び／又は実質的に精製された脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をコードしているヌクレオチド、又は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質アゴニスト若しくはアンタゴニスト及び／又は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質抗血清若しくは脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質抗血清に対する抗血清を患者に投与することによって治療又は予防する方法も含まれる。これらのアンギオスタチン脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質抗血清、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質レセプターアゴニスト若しくはアンタゴニスト、又はこれらの組み合わせは、製薬的に許容可能な賦形剤及び任意に持続性放出マトリックス、例えば生物分解性ポリマーと組み合わせて治療用組成物を形成する。更なる治療方法には、細胞毒性物質と結合した脱グリコシル化クリングル１〜５タンパク質、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質類似体、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質抗血清、又は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質レセプターアゴニスト及びアンタゴニストを投与することが含まれる。
【００６４】
本発明の１つの態様では、個体における血管新生を阻害する方法は、個体において、プラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜５領域のグリコシル化フラグメントのインビボ濃度と比較してプラスミノーゲンタンパク質のクリングル１〜５領域の脱グリコシル化フラグメントのインビボ濃度を高めることを含んでおり、そして上記クリングル１〜５領域タンパク質の脱グリコシル化フラグメントはインビボで抗血管新生活性を有している。脱グリコシル化フラグメントのインビボ濃度は任意の体液又は組織中で高めることができるが、好ましくは血清中で高められる。更なる実施態様では、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は、このような治療を必要としている個体に治療的有効量で投与される。もう１つの実施態様では、プラスミノーゲンのクリングル１〜５領域の脱グリコシル化フラグメントをコードしている遺伝子は、以下で更に詳細に考察する遺伝子治療方法を使用して個体に投与される。好ましくは、上記遺伝子は、クリングル１〜５領域のフラグメントの翻訳後修飾中におけるグリコシル化を防止するアミノ酸置換を含有しており、そして更に好ましくは上記置換はヒトプラスミノーゲンのアミノ酸Ａｓｎ−２８９に相当するアミノ酸における置換である。
【００６５】
脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は、血管新生によって媒介されるか又は血管新生に係わる疾病又はプロセスの治療で有効である。本発明には、有効量の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質、若しくは一緒になって抗血管新生活性を有する脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の組合せ、又は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質アゴニスト及びアンタゴニストで血管新生介在性疾病を治療する方法が含まれる。血管新生介在性疾病には固形腫瘍、白血病のような血液性腫瘍、腫瘍転移、良性腫瘍、（例えば血管腫、聴覚腫、神経線維腫、トラコーマ及び化膿性肉芽腫）、リウマチ様関節炎、乾癬、眼の血管新生性疾病（例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管新生性緑内障、後水晶体線維増殖、ルベオーシス）、オスラー・ウエーバー症候群、心筋血管新生、プラーク血管新生、毛細血管拡張症、血友病関節症、血管線維腫、及び創傷顆粒形成が含まれるが、これらに限定されない。脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は内皮細胞の過剰又は異常刺激による疾病の治療に有用である。これらの疾病には、腸癒着、クローン病、アテローム性動脈硬化症、強皮症及び肥厚性瘢痕、即ちケロイドが含まれるが、これらに限定されない。脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は、胎児着床に必要な血管新生を防止することによる産児制限剤として使用することができる。脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質はまた、ネコひっかき病（Rochele minalia quintosa）及び潰瘍（Helicobacter pylori）のような病因論的結果として血管新生を有している疾病の治療にも有用である。
【００６６】
脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質は疾病治療用の他の組成物や方法と組み合わせて使用することができる。例えば、腫瘍は、今までのように脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質と組み合わせた外科手術、放射線又は化学療法によって治療することができ、そしてその後脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を引き続き患者に投与して、微小転移の休止を延長しそして任意の残存する原発性腫瘍を安定化させ且つその増殖を阻害することができる。
【００６７】
脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を投与する方法に加えて、本発明には受動的抗体治療方法が含まれる。１つの実施態様では、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質抗体は過剰の内因性脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の作用を遮断する。過剰の内因性脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の作用を特異的に遮断すること（内因性グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質に対して）は、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質がグリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質より抗血管新生性であるという本発明における新たな教示を考慮すると、重要である。この処置は、生殖、発生並びに創傷治癒及び組織修復のような血管新生依存性プロセスを調節し、そして異常な排卵、月経及び胎盤形成並びに血管新生を治療する改善された方法を提供する。この方法はまた、転移プロセスに与える脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質除去の影響を試験する有用なツールも提供する。
【００６８】
もう１つの実施態様では、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質抗体のＦａｂ領域に対する抗血清を投与して、内因性脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質抗血清が脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質と結合する能力を遮断することができる。この処置の正味の効果は、内因性で循環中の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質が標的細胞に到達する能力を助長し、そしてそれによって転移拡散を低下させることである。
【００６９】
上記した脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質及びこれらに対する抗体は、当該技術分野の通常の技術を有する者に既知の製剤化方法を使用して、製薬的に許容可能な製剤中に、単離され且つ実質的に精製されたタンパク質及びタンパク質フラグメントとして提供することができる。上記した脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質及びこれらに対する抗体は固体、液体又はエアロゾルであってもよい。固体治療用組成物の例にはピル、クリーム及び埋め込み可能な投与ユニットが含まれる。ピルは経口的に投与することができ、そして治療用クリームは局所的に塗布することができる。埋め込み可能な投与ユニットは局所的に、例えば、腫瘍部位に投与することができるか、又は治療用血管新生調節組成物の全身放出用に、例えば皮下に埋め込むことができる。液体組成物の例には、皮下、静脈内、動脈内注射用に適合させた製剤、並びに局所及び眼内投与用製剤が含まれる。エアロゾル製剤の例には肺に投与するための吸入器用製剤が含まれる。しかしながら一般的に、本発明の製剤は、局所、経皮、腹腔内、頭蓋内、脳血管内、脳内、膣内、子宮内、経口、直腸又は非経口（例えば、静脈内、脊髄内、皮下又は筋肉内）経路を含むがこれらに限定されない任意の経路で投与することができる。
【００７０】
更に、本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質及びこれらに対する抗体は、化合物の持続性放出を可能にする生物分解性ポリマー中に組み入れることができ、これらのポリマーは、医薬送達が望ましい場所、例えば腫瘍部位の近位に埋め込まれるか又は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質若しくは抗体が全身に徐々に放出されるように埋め込まれる。生物分解性ポリマー及びこれらの使用は、例えば、ブレム（Brem）等の「再発性神経膠腫治療用の医薬品ポリマー移植片による間質性化学療法」、J. Neurosurg. ７４：４４１〜４４６（１９９１）中で詳細に記載されている。浸透圧ミニポンプを使用してカニューレから問題の部位に、例えば転移増殖又は当該腫瘍への血管供給体に直接、高濃度の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質及びこれらに対する抗体の制御された送達を提供することができる。
【００７１】
本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質及び抗体の用量は治療される疾病状態又は状況、並びにヒト又は動物の体重や状態及び該化合物の投与経路のような他の臨床因子に依存するであろう。ヒト又は動物を治療するためには、１日当たり概ね０．５ｍｇ／キログラムから１日当たり５００ｍｇ／キログラムの間の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質を投与することができる。特定の動物又はヒトにおける脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の半減期に依存して、該タンパク質は１日当たり数回から１週間に１回の間で投与することができる。本発明はヒト及び獣医学の両用途用の適用を有しているものと理解すべきである。本発明の方法は単回並びに多数回投与を意図しており、一度にか又は長期間に亘るかのどちらかで投与される。
【００７２】
本発明の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質製剤は好都合には単位用量形態で提供することができ、そして慣用の製薬技術で製造することができる。このような技術には、活性成分と製薬的担体（単数又は複数）又は賦形剤（単数又は複数）を一緒に合わせる段階が含まれる。適当な製薬的担体及び賦形剤は当該技術分野の熟練者に知られているが、適当な製薬的賦形剤の例は水である。一般的に、本発明の製剤は活性成分を液体担体若しくは微細分割固体担体又はこれらの両方と、均一に且つ十分に一緒に合わせ、そしてその後、必要な場合、生成物を成形することによって製造される。
【００７３】
非経口投与に適する製剤には、抗酸化剤、緩衝液、制菌剤及び意図される受容者の血液と製剤を等張にする溶質を含有していることができる水性及び非水性の無菌注射溶液；並びに懸濁化剤及び濃厚化剤を含んでいることができる水性及び非水性の無菌懸濁物が含まれる。本発明の製剤は単位用量又は多数回用量容器、例えば密封アンプル又はバイアルで提供することができ、そして使用直前に無菌液体担体、例えば、注射用水を加えることしか必要としないフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵することができる。即時調整の注射溶液や懸濁物は、これまでに記載した種類の無菌散剤、顆粒及び錠剤から製造することができる。
【００７４】
好ましい単位用量製剤は、投与される成分の１日用量若しくは単位、１日のサブドーズ（sub-dose）若しくはこれらの適当な部分を含有するものである。本発明の製剤は、特に上記で言及した成分に加えて、製剤のタイプを考慮して当該技術分野で慣用の他の作用物質を含み得ることが理解されよう。任意に、細胞毒性物質を脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質フラグメントに配合する又はそれらの生物学的に機能的なタンパク質に取り入れるか又はそうでない場合これらタンパク質と組み合わせて、患者に二重療法を提供することができる。
【００７５】
本発明はまた、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をコードしている遺伝子を患者において調節する遺伝子療法も包含する。遺伝子産生物を発現させるためにＤＮＡを細胞に導入又は送達する種々の方法、或いは遺伝子療法と称される方法は「インビボでの哺乳動物体細胞への遺伝子導入」、エヌ．ヤング（N. Yang）、Crit. Rev. Biotechn. １２（４）：３３５〜３５６（１９９２）中に開示されている。遺伝子療法は、エクスビボ又はインビボ療法のどちらかで使用するためにＤＮＡ配列を体細胞又は生殖系細胞中に組み入れることを包含している。遺伝子療法は遺伝子を置換し、正常又は異常な遺伝子機能を増大させ、そして感染性疾病や他の病理学と闘うように機能する。
【００７６】
遺伝子療法で医学的問題を治療する戦略には、欠陥遺伝子を機能的遺伝子で置換するか、又は機能的遺伝子を加えて僅かに機能的な遺伝子の作用を増大させるような治療戦略が含まれる。挿入された遺伝子は疾病又は状態を治療するか又は組織若しくは器官を治療方式に対して一層感受性にすることができる。本発明に関しては、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の遺伝子を細胞のサブセットに入れ、そしてその結果、形質転換された細胞において血管新生の発生を防止することができる。
【００７７】
本発明では、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質ＤＮＡ又は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質調節配列を導入するための多数のプロトコールが予想される。遺伝子治療方法としては、通常脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質と特異的に結合して見いだされるもの以外のプロモーター配列、又は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の産生を増加させる他の配列のトランスフェクションが予想される。このような「遺伝子スイッチ」を使用して、通常は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質（又は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質レセプター）を発現しない細胞内で脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質（又は脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質レセプター）を活性化することができよう。
【００７８】
遺伝子療法のための遺伝子導入方法は３つの広範な範疇：（１）化学的（脂質に基づく担体又は他の非ウイルスベクター）、（２）生物学的（ウイルス由来ベクター及びレセプター取込み）、及び（３）物理的（エレクトロポレーション、直接的遺伝子導入及び粒子衝撃）に属する。遺伝子治療方法論はまた送達部位によって記載することもできる。遺伝子を送達する基本的な方法には、エクスビボ遺伝子導入、インビトロ遺伝子導入及びインビボ遺伝子導入が含まれる。エクスビボ遺伝子導入では、細胞を患者から取り出しそして細胞培養で増殖させる。ＤＮＡは細胞中にトランスフェクションされ、これらのトランスフェクションされた細胞の数を拡大させ、そしてその後患者に再度移植する。本発明は患者から内皮細胞を取り出し、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をコードしているＤＮＡ又はその調節配列をトランスフェクションし、そしてこれらのトランスフェクションされた内皮細胞を患者に再度導入することを包含している。インビトロ遺伝子導入では、培養物中で増殖している形質転換細胞、例えば内皮細胞を患者に導入する。これらの形質転換細胞は、遺伝子療法を受ける患者から取り出されたものではない。インビボ遺伝子導入は、細胞が患者の内部にあるときに患者の細胞内にＤＮＡを導入することに係わっている。これらの方法は、遺伝子を患者に導入するために非感染性ウイルスを使用するか、又はネーキド（naked）ＤＮＡを患者の部位に注射しそしてそれによって或る割合の細胞にＤＮＡを取り込ませてそこで該遺伝子産生物タンパク質を発現させることを含んでいる。本発明においては、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をコードしているＤＮＡを血管を裏張りしている内皮細胞内に導入し、そしてそれによって血管新生を阻害することができる。好ましい実施態様では、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をコードしているＤＮＡを、腫瘍に密接した血管を裏張りしている内皮細胞内に導入する。
【００７９】
遺伝子療法の化学的方法は、細胞膜を横切ってＤＮＡを輸送するために使用される脂質に基づく化合物（必ずしもリポソームではない）に係わることができる。リポフェクチン又はサイトフェクチン、即ち負に荷電したＤＮＡと結合する脂質に基づく陽性イオンは細胞膜を横切ることができるコンプレックスを作り、そして細胞内部にＤＮＡを提供する。リポソーム／ＤＮＡコンプレックスは患者の静脈内に直接注射することができる。リポソーム／ＤＮＡコンプレックスは肝臓で濃縮され、そしてそこでこれらコンプレックスはＤＮＡをマクロファージやクッパー細胞に送達すると考えられている。これらの細胞は長期間生存するので、送達されたＤＮＡは長期間発現する。更に、ベクター又は遺伝子の「ネーキド」ＤＮＡは、治療用ＤＮＡを標的化して送達するために、所望の器官、組織又は腫瘍内に直接注射することができる。他のＤＮＡ担体系は、インビボ遺伝子導入のためにＤＮＡを肝細胞に運ぶアシアロ糖タンパク質／ポリリシン抱合系、及び核に直接運ばれる特異的に操作された小胞コンプレックス中で核タンパク質と結合させたＤＮＡを含んでいる。
【００８０】
遺伝子療法技術で使用される生物学的方法は、レセプターに基づくエンドサイトーシス又はレセプターに基づくファーゴサイトーシスに係わっていることができ、そしてこれらは特定のリガンドを細胞表面レセプターに結合させてエンベロープを形成させ、そして細胞膜を横切ってリガンドを輸送することに係わっている。詳細には、リガンド／遺伝子コンプレックスを創製しそして血流中に注射する。このリガンドのレセプターを有する標的細胞はこのリガンドと特異的に結合しそしてリガンド−ＤＮＡコンプレックスを細胞内に輸送する。更なる生物学的方法はウイルスベクターを使用して遺伝子を細胞内に挿入する。例えば、改変されたレトロウイルスベクターは、遺伝子を末梢及び腫瘍浸潤リンパ球、肝細胞、表皮細胞、筋細胞及び他の体細胞内に導入するためにエクスビボ方法で使用されている。次に、これらの改変された細胞を患者に導入する。
【００８１】
ウイルスベクターはまた、インビボプロトコールを使用して遺伝子を細胞内に挿入するためにも使用されている。外来遺伝子の組織特異的な発現を達成するためには、組織特異的であることが知られているシス作用性調節エレメント又はプロモーターを使用することができる。或いは、組織特異的な発現は、インビボで特定の解剖学的部位へのＤＮＡ又はウイルスベクターのin situ送達を使用して達成することができる。例えば、インビボにおける血管への遺伝子導入は、インビトロで形質導入された内皮細胞を動脈壁上の選択された部位に移植することによって達成されている。周囲の細胞はウイルスによって感染され、そしてそれ故これら細胞も遺伝子産生物を発現した。ウイルスベクターは、例えばカテーテルによってインビボ部位に直接送達することができ、その結果一定の領域だけをウイルスで感染させることができる。レトロウイルスベクターを使用するインビボ遺伝子導入はまた、器官につながっている血管に改変ウイルスを注射することによって哺乳動物組織及び肝臓組織内でも証明されている。
【００８２】
遺伝子療法プロトコールで使用されているウイルスベクターには、レトロウイルス、例えばマウス白血病レトロウイルス、ＲＮＡウイルス、例えばポリオウイルス又はシンドビスウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ワクシニア及び他のＤＮＡウイルスが含まれるが、これらに限定されない。複製欠陥マウスレトロウイルスベクターは最も広範に使用される遺伝子導入ベクターである。遺伝子導入でのレトロウイルスベクターの基本的な利点には、大部分の細胞タイプにおける効率的な感染及び遺伝子発現、標的細胞染色体ＤＮＡへの正確な単一コピーベクター統合並びにレトロウイルスゲノムの操作の容易性が含まれる。アデノウイルスは新規な遺伝子配列をインビボで標的細胞に導入することができる。アデノウイルスに基づくベクターは高レベルで遺伝子産生物タンパク質を発現し、そして、たとえウイルスの力価が低くても、高い感染効率を有している。更に、このウイルスは細胞不含ビリオンとして十分に感染性であるので、発現細胞株を注射する必要はない。アデノウイルスベクターのもう１つの潜在的な利点は、インビボで異種遺伝子の長期間発現を達成できることである。
【００８３】
ＤＮＡを送達する機械的な方法には、ＤＮＡの直接的な注射、例えば生殖又は体細胞内へのＤＮＡの微量注射、空気的に送達されるＤＮＡ被覆粒子、例えば「遺伝子ガン」で使用される金粒子、リン酸カルシウムトランスフェクションのような無機化学的手法及びエレクトロポレーションが含まれる。筋細胞内にプラスミドＤＮＡを注射すると、トランスフェクションされそしてマーカー遺伝子を持続的に発現する細胞が高い割合で得られることが見いだされている。プラスミドのＤＮＡは細胞のゲノムに組み込まれても、または組み込まれなくても良い。トランスフェクションしたＤＮＡが組み込まれないと、突然変異的挿入、欠失、又は細胞若しくはミトコンドリアゲノムにおける改変を懸念しないで長期間、最終的に分化した非増殖性組織における遺伝子産生物タンパク質のトランスフェクションと発現が可能になるであろう。治療用遺伝子を特定の細胞に、必ずしも永久的ではないが、長期間導入することによって、遺伝子疾病の治療又は予防的使用の処置を提供することができる。ＤＮＡを定期的に再度注射して、受容細胞のゲノムに突然変異を生起させることなく、遺伝子産生物値を維持することができよう。外来性ＤＮＡが組み込まれないときには、１個の細胞内で幾つかの異なる外来性ＤＮＡ構築物が存在することができ、そしてこれら構築物は全て種々の遺伝子産生物を発現する。
【００８４】
粒子介在性遺伝子導入方法とエレクトロポレーションは共にインビトロ系でか、又はエクスビボ若しくはインビボ技術と一緒に使用して、ＤＮＡを細胞、組織又は器官内に導入することができる。粒子介在性遺伝子導入に関しては、ＤＮＡ被覆高密度粒子（例えば、金又はタングステン）を加速するために動力を発生する粒子衝撃デバイス又は「遺伝子ガン」が使用される。これらの粒子は標的器官、組織又は細胞に浸透する。エレクトロポレーション介在性遺伝子導入は、ＤＮＡ分子が細胞に浸透できるような方法で膜の透過性を高めるために使用される一定の場強度による短時間の電気インパルスを使用することを含んでいる。
【００８５】
脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質をコードしているＤＮＡを患者内にトランスフェクションする遺伝子療法プロトコールは、脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質ＤＮＡを細胞のゲノム内に、ミニクロモソーム内に組み込むか、又は細胞の細胞質若しくは核質における別個の複製若しくは非複製ＤＮＡ構築物とするかのどちらかによってもよい。脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の発現は長期間継続してよいし、又はＤＮＡを定期的に再度注射して、血清又は細胞、組織若しくは器官内の脱グリコシル化クリングル１〜５領域タンパク質の所望の値を維持することがしてもよい。
【００８６】
本発明は以下の実施例によって更に説明され、そしてこれら実施例はいずれにしても本発明の範囲に対して限定を課すものと解釈してはならない。本明細書の説明を読んだ後に、本発明の精神及び／又は上記請求項の範囲から逸脱することなく、当該技術分野の熟練者に示唆され得る他の種々の実施態様、修正及び等価物の手段を取り得ることを明確に理解すべきである。
【００８７】
実施例１
グリコシル化及び脱グリコシル化クリングル１〜３領域タンパク質の単離
ヒトプラスミノーゲンは、ダブリュ．ジェイ．ブロックウェイ（W.J. Brockway）及びエフ．ジェイ．カステリノ（F.J. Castellino）の「抗線維溶解性アミノ酸の測定及びこれらアミノ酸と種々のプラスミノーゲンとの結合」、Arch. Biochem. Biophys. １５１：１９４〜１９９（１９７２）中に記載されているアフィニティクロマトグラフィーを使用して精製した。ヒト血漿（Children's Hospital血液バンク）１リットルを、２〜３ｍｌ／分の流速度で２００ｍｌのｌｙｓ−セファロース４ｂ（Pharmacia）カラムに適用した。次に、前もって５０ｍＭのトリス ｐＨ７．４で平衡化したカラム（Sigma）を５０ｍＭトリス／１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）５００ｍｌで洗浄した。結合プラスミノーゲンを、５０ｍＭトリス／２００ｍＭ ε−アミノカプロン酸（εＡＣＡ）２００ｍｌで溶出した。この物質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価したとき、９５％以上であった。ヒトプラスミノーゲンは、レクチンアフィニティクロマトグラフィーを使用してグリコシル化プラスミノーゲン（プラスミノーゲン１）及び脱グリコシル化プラスミノーゲン（プラスミノーゲン２）に更に分画した。ヒトプラスミノーゲン（１０ｍｇ）を、５０ｍＭトリス ｐＨ７．４／１ｍＭ ＭｇＣｌ2／１ｍＭ ＣａＣｌ2で平衡化した５ｍｌのｃｏｎＡ ＨｉＴｒａｐカラム（Pharmacia）に適用した。Ｎ−結合炭水化物を欠失しているプラスミノーゲン２はこのカラムと結合しない。カラムを５カラム容量の平衡化用緩衝液で洗浄した後、５０ｍＭトリス ｐＨ７．４／１ｍＭ ＭｇＣｌ2／１ｍＭ ＣａＣｌ2の溶液を使用してプラスミノーゲン１を溶出した。タンパク質濃度は、１．６のＡ0.1%/1cm（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／で入手可能なprotparamツールから計算した）を使用して、分光光度計で２８０ｎｍの波長で測定した。
【００８８】
プラスミノーゲン１及び２を２０ｍＭトリス ｐＨ７．６で透析した。次に、等量のこれらグリコ形態（Ａ２８０ｎｍで測定）を、エム．エス．オーレイリー（M.S. O'Reilly）等の「アンギオスタチンはマウスにおいてヒト原発性腫瘍の休止を誘発しそして維持する」、Nature Medicine ２：６８９〜６９２（１９９６）に記載されているようにして、ブタ膵臓エラスターゼ（ＰＰＥ）で消化した。本質的に、プラスミノーゲンはプラスミノーゲン１ミリグラム当たり０．８単位のＰＰＥ（Calbiochem）によって３７℃で消化された。５時間インキュベートした後、ｌｙｓ−セファロース４ｂカラム（１０ｍｌ）に上記反応混合物を適用し、そして２００ｍＭ εＡＣＡ／５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）５ｍｌでプラスミノーゲンの概ねクリングル１〜３フラグメント及び他のリシン結合フラグメント、例えば、クリングル４を溶出して反応を停止させた。このクリングル１〜３領域タンパク質は、スーパーデックス（Superdex）２００ ＨＲ １０／３０カラム（Pharmacia）でゲルろ過を使用してクリングル４や他のより小さな（＜１２ｋＤａ）フラグメントから分離した。スーパーデックス２００カラムはＰＢＳで平衡化した。クリングル１〜３領域タンパク質濃度は、１．８７のＡ0.1%/1cm値（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／で入手可能なprotparamツールから計算した）を使用して、分光光度計で２８０ｎｍの波長で測定した。
【００８９】
ウシ毛細血管内皮細胞は、エム．エス．オーレイリー等の「アンギオスタチン：ルイス肺癌転移抑制に介在する新規な血管新生インヒビター」、Cell ７９：３１５〜３２８（１９９４）に以前に記載されたようにして取得し、そして１０％の熱不活性化ＢＣＳ、抗生物質及び３ｎｇ／ｍｌの組換えヒトｂＦＧＦ（Scios Nova、カリフォルニア州）を有するＤＭＥＭ中で維持した。細胞をＰＢＳで洗浄し、そしてトリプシンの０．０５％溶液に分散させた。ＤＭＥＭ／１０％ＢＣＳ／１％抗生物質を使用して細胞懸濁物を作成し、そして濃度を２５，０００細胞／ｍｌに調整した。ゼラチン化した２４ウェル培養プレート上に細胞を播き（０．５ｍＬ／ウェル）、そして１０％ＣＯ2中３７℃で２４時間インキュベートした。培地をＤＭＥＭ／５％ＢＣＳ／１％抗生物質０．２５ｍｌと取り替え、そして試験試料を適用した。２０分間インキュベートした後、培地及びｂＦＧＦを各ウェルに添加して、ＤＭＥＭ／５％ＢＣＳ／１％抗生物質／１ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦの最終容量０．５ｍｌを得た。７２時間後、細胞をトリプシン中に分散させ、ヘマテル（Hematell）（Fisher scientific、ペンシルベニア州）中に再度懸濁させ、そしてクールター（Coulter）計数器で計数した。内皮細胞増殖アッセイから得たデータをプロットし、そしてＩＣ50値はシグマプロット（SigmaPlot）を使用して決定した。データ点は全て、クリングル１〜３領域タンパク質の４つの別々の調製物の３重複物として測定した。
【００９０】
実施例２
プラスミノーゲンの脱グリコシル化によってクリングル１〜３領域タンパク質の収量が上昇する
等量のプラスミノーゲン１とプラスミノーゲン２をＰＰＥで消化し、そしてクリングル１〜３領域タンパク質は、プラスミノーゲンのクリングル１〜３領域タンパク質と他のリシン結合フラグメントを精製するためにアフィニティクロマトグラフィー（ｌｙｓ−セファロース）の組合せを使用し、そしてクリングル４からクリングル１〜３領域タンパク質を分離するためにゲルろ過（Superdex200）を使用して、実施例１に記載されているようにして精製した。図２はアフィニティカラムから得られる典型的なクロマトグラムを示し、そしてこれはプラスミノーゲン２と比較して基質としてプラスミノーゲン１を使用したとき、得られる収量が減少していることを証明している。図３は、実施例１に記載されている典型的なゲルろ過実験から得られたクロマトグラムを示す。プラスミノーゲン１から得られるクリングル１〜３領域タンパク質は、このグリコシル化フラグメントから予想されるように、脱グリコシル化クリングル１〜３領域タンパク質（１４．３６分）より僅かに短い保持時間（１３．７７分）を有していることが認められた。プラスミノーゲン２から得られるクリングル１〜３領域タンパク質の収量は、基質としてプラスミノーゲン１を使用したクリングル１〜３領域タンパク質の収量より４〜５倍高かった。グリコシル化クリングル１〜３領域タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥで概ね４０ｋＤａに移動し、そして脱グリコシル化クリングル１〜３領域タンパク質は３８ｋＤａに移動した（データは示していない）。両クリングル１〜３領域タンパク質グリコ体のエドマン分解アミノ末端配列分析によって、Ａｒｇ８７で開始する同一の配列、即ちクリングル１の開始を表すシステイン残基までの１６残基アミノ末端が得られた。
【００９１】
それ故、Ａｓｎ−２８９にＮ−結合炭水化物が存在するとヒトプラスミノーゲンから得られるクリングル１〜３領域タンパク質の生成が調節されることが決定された。炭水化物が存在すると、ＰＰＥを使用してプラスミノーゲン由来のクリングル１〜３領域タンパク質を開裂するとき、クリングル１〜３領域タンパク質の収量は４〜５分の１に低下する。レクチンアフィニティクロマトグラフィーを使用して、グリコシル化プラスミノーゲン（プラスミノーゲン１）と脱グリコシル化プラスミノーゲン（プラスミノーゲン２）を４０：６０の比率で含有している材料から生成されたクリングル１〜３領域タンパク質を分画すると、僅か５〜１０％のグリコシル化クリングル１〜３領域タンパク質しか得られない（データは示していない）ことも測定された。このデータは更に、Ｎ−結合炭水化物がクリングル１〜３領域タンパク質生成に関して負のモジュレーターであることを示した。両クリングル１〜３領域グリコ体は同一のＮ−末端配列を有していたので、炭水化物はタンパク質分解開裂部位に干渉しないことが示された。
【００９２】
グリコシル化クリングル１〜３領域タンパク質はさほど効率的に生成されずそして血管新生のインヒビターとしてさほど効率的でなかったが、Ｎ−結合炭水化物を含有するクリングル１〜３領域タンパク質は脱グリコシル化クリングル１〜３領域タンパク質より長いクリアランス時間を有していると思われる。これは、値は低いが、抗内皮細胞活性の持続を全身的に確保するメカニズムであると思われる。
【００９３】
実施例３
脱グリコシル化クリングル１〜３領域タンパク質は、グリコシル化クリングル１〜３領域タンパク質と比較したとき、高い抗血管新生活性を有している
両クリングル１〜３領域タンパク質グリコ体は、実施例１に記載されているウシ内皮細胞の増殖を阻害する能力についてアッセイした。両クリングル１〜３領域タンパク質グリコ体は内皮細胞の増殖を阻害した。しかしながら、Ｎ−結合炭水化物を含有するグリコシル化クリングル１〜３領域タンパク質は概ね１３μｇ／ｍｌの測定ＩＣ50値を有しており、一方、脱グリコシル化クリングル１〜３領域タンパク質、即ちＮ−結合炭水化物を欠失しているグリコ体は概ね２．４μｇ／ｍｌの測定ＩＣ50値を有している。かくして、脱グリコシル化クリングル１〜３領域タンパク質は内皮細胞増殖のはるかにより効率的なインヒビターであることが明らかになり、そして特に、内皮細胞増殖のインヒビターとして４〜５倍効率的であった。
【００９４】
上記で引用した全ての特許、刊行物及び抄録は本明細書で参照する。上記は本発明の好ましい実施態様とだけ関係しており、そして上記請求項に記載した本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、上記実施態様に多数の修正又は改変を行い得ることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】好ましい脱グリコシル化クリングル１〜３領域タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）及びこれをコードしているヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。
【図２】ｌｙｓ−セファロースを使用したグリコシル化及び脱グリコシル化クリングル１〜３領域タンパク質の精製を示す。
【図３】ゲルろ過クロマトグラフィーを使用したグリコシル化及び脱グリコシル化クリングル１〜３領域タンパク質の精製を示す。
【図４】グリコシル化及び脱グリコシル化クリングル１〜３領域タンパク質による内皮細胞増殖の阻害を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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