(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガスが供給され、かつその雰囲気の温度、湿度及びガス濃度が調節される密閉空間と、
この密閉空間に設置され、培養液が溜められる培養液槽と、
前記密閉空間に設置され、前記培養液が供給されて細胞又は組織を培養する培養チャンバと、
前記密閉空間に設置されて外部と遮断され、前記培養チャンバと前記培養液槽とをチューブで連結して構成され、前記培養液槽の培養液を前記培養チャンバに連続的、間欠的又は周期的のうちの一つ、又はこれらの組合せの何れかを用いて循環させる培養回路と、
前記培養チャンバ内の培養液中に前記細胞又は前記組織を浮遊状態又は非浮遊状態で保持する保持手段と、
前記培養液槽と前記培養チャンバとの間の前記培養回路に設置され、前記密閉空間内に供給されている前記ガスを前記チューブに流れる前記培養液に吸収させる気体吸収部と、
前記培養チャンバの外側に備えられ、前記培養チャンバの外側から前記培養チャンバに対して圧力を加えることにより、前記培養チャンバ内の培養液中で培養されている前記細胞又は前記組織に対して作用させ、その圧力として、前記細胞又は前記組織に連続して変化する圧力、間欠して変化する圧力又は周期的に変化する圧力の何れかの圧力の一つ又はこれらの２以上の組合せからなる圧力を加えるとともに、前記細胞又は前記組織に加えられている前記圧力を検出して付与すべき圧力との誤差を求めて前記圧力の補正を行う加圧手段と、
を備えることを特徴とする細胞又は組織の培養装置。
【請求項２】
前記保持手段は、前記細胞又は前記組織の成長により前記保持手段をその細胞又は組織に吸収されることを特徴とする請求項１記載の細胞又は組織の培養装置。
【請求項３】
前記保持手段は、ハイドロジェルであることを特徴とする請求項１記載の細胞又は組織の培養装置。
【請求項４】
前記培養液は、各種アミノ酸、糖類、塩類又はタンパク質の１又は２以上を含んで構成されることを特徴とする請求項１記載の細胞又は組織の培養装置。
【請求項５】
少なくとも前記培養チャンバを含み前記密閉空間から分離可能な培養ユニットを構成したことを特徴とする請求項１記載の細胞又は組織の培養装置。
【請求項６】
前記密閉空間に供給される前記ガスは、窒素、酸素又は二酸化炭素等のガスであることを特徴とする請求項１記載の細胞又は組織の培養装置。
【請求項７】
前記培養回路に前記培養液を供給する培養液供給手段を備え、この培養液供給手段は、
前記培養回路に取り付けられた送液チャンバと、
この送液チャンバに取り込まれた前記培養液を加圧して送り出す送液装置と、
を備える構成としたことを特徴とする請求項１記載の細胞又は組織の培養装置。
【請求項８】
前記密閉空間は、前記温度条件を設定する加熱手段を備えて所望の温度に維持、制御されることを特徴とする請求項１記載の細胞又は組織の培養装置。
【請求項９】
前記密閉空間は、湿度条件を設定する加湿手段を備えて所望の湿度に維持、制御されることを特徴とする請求項１記載の細胞又は組織の培養装置。
【請求項１０】
前記培養チャンバに超音波等の音波を付与する音波発生装置を備えたことを特徴とする請求項１記載の細胞又は組織の培養装置。
【請求項１１】
前記密閉空間内のガス濃度を制御する制御手段を備えたことを特徴とする請求項１記載の細胞又は組織の培養装置。
【請求項１２】
前記細胞又は前記組織に加える前記圧力は、培養される前記細胞又は前記組織が対応する生体の部位に応じて設定されたことを特徴とする請求項１記載の細胞又は組織の培養装置。
【請求項１３】
前記加圧手段から前記細胞又は前記組織に加えられる前記圧力は、断続状態、一定時間毎の連続した繰り返し、一定時間毎に増減させることを特徴とする請求項１記載の細胞又は組織の培養装置。
【請求項１４】
前記培養回路は、前記加圧手段による前記培養チャンバ内の前記培養液の圧力上昇を緩衝する圧力緩衝手段を備えたことを特徴とする請求項１記載の細胞又は組織の培養装置。
【請求項１５】
前記培養チャンバに受圧膜を介在させて圧力チャンバを取り付け、この圧力チャンバに水圧、油圧又は空気圧を作用させ、前記培養チャンバ内の前記細胞又は前記組織に圧力を加えるようにしたことを特徴とする請求項１記載の細胞又は組織の培養装置。
【請求項１６】
前記圧力緩衝手段は圧力逃し弁で構成され、この圧力逃し弁は、前記培養チャンバ内の前記培養液の圧力が所定圧力を越えるとき、開くことにより、前記培養チャンバ内の前記培養液を前記培養回路に流して前記培養液の圧力を降下させることを特徴とする請求項１４記載の細胞又は組織の培養装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞組織工学や遺伝子治療等の応用であるティッシュ・エンジニアリングに用いられる細胞又は組織の培養装置に係り、人体の欠損組織の修復等に必要な細胞や組織の体外培養に用いられる細胞又は組織の培養装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体の欠損箇所や異常箇所の修復には次のような方法がある。その第１は、欠損箇所や異常箇所の修復手段として、プラスチック、金属、セラミック等の生体以外の材料で代用する方法である。代用品としては骨用のセラミック、ステンレススチール、関節用のポリエチレン樹脂、血管用のビニール樹脂等がある。第２は、他の動物、他の部位等の生体材料を代用する方法がある。この代用品には例えば、皮膚等がある。また、第３は、他人の臓器を移植する方法である。
【０００３】
第１の方法では、プラスチック、金属、セラミック等の生体以外の材料の摩耗、消耗によって定期的に交換の必要が生じたり、摩耗等により分離した物質が生体に対して悪影響を与えることがある。また、合成樹脂の血管では、血管が長期間の使用により、内部が詰まってくるという事例も報告されている。第３の方法では、移植すべき臓器の提供者がいなければ実施は不可能であるし、実施した場合でも臓器間の拒否反応の問題が残る。
【０００４】
このため、実用化の期待がかかる修復方法は、生体細胞をその体内又は体外で細胞又は組織を培養して得られた細胞や組織を欠陥部位の修復にあてるという方法である。現在の研究では、皮膚、軟骨、骨、血管、肝臓、膵臓等多くの組織にその可能性があることが報告されている。生体の細胞から患者の体内、体外で細胞又は組織を培養し、その培養によって得られた細胞や組織を欠損部分の修復にあてれば、体内で再生不可能な組織の再生ができ、しかも、修復に用いた組織は患者自身の遺伝子を持った組織であるから拒否反応はなく、また、例えば合成樹脂等のように生体材料以外の化学物質が生体に悪影響を与えるということもない。理想的な治療が可能になる。
【０００５】
ところで、従来、この種の技術として特開平９−３１３１６６号「細胞培養装置」が提案されている。この技術では、培養毎に各部品を分解して洗浄、滅菌を行った後、再度装置を組み立てなければならず、滅菌後に細菌に汚染されるおそれがある。汚染を防ぐために装置を組み立ててから、オートクレーブ（１２１°Ｃ絶対圧２気圧）等の滅菌処理を行うことは可能であるが、ポンプや圧力センサは多くの電子部品や特殊な樹脂、オイルを含んでいるから、汚染防止上、用いることができない。そのため、ポンプや圧力センサはその一部を分解して培養液の通路部分のみを取り出して薬品による滅菌を行い、他の部品はオートクレーブにより滅菌を行い、その後、ポンプや圧力センサと装置を組み立てることになるため、手間がかかるとともに雑菌汚染の危険性が高い。また、インキュベータ（培養庫）を用いて培養することは、ポンプや制御装置が温度、湿度により悪影響を受け易く、容積に限りがあるインキュベータに全ての装置を収容することができない。このため、インキュベータの貫通穴に配管や電源、制御用の電線を通すため、インキュベータと外気とを連結した状態で装置を組み上げなければならない。また、培養液の回路全体に圧力をかけるため、ポンプや配管等の部品を含め、全体を耐圧構造にしなければならないが、高い圧力（例えば１ＭＰａ以上）の設定は非常に難しく、高圧力を与えようとすると、全体を高耐圧構造としなければならず、コストアップが問題となる。
【０００６】
また、従来、物理的刺激として圧力を加えながら生体組織を培養する研究はハーバードメディカルスクールの水野秀一博士他から報告されている〔Materials Science and Engineering C6 (1998)301-306〕。この研究によれば、図２６に示すように培養装置が構成されており、この培養装置における各要素とその機能について説明すると、ポンプ４００は、培養液４０２を循環させる役割と、培養チャンバ４０４の内部を加圧して細胞４０６又は組織に静水圧を与える役割を果たし、例えば、液体クロマト用のポンプが用いられ、一定流量を流すための制御装置が内蔵されている。
【０００７】
バックプレッシャレギュレータ４０８は、細胞４０６又は組織に与えようとする圧力以上になると弁４１０を開いて圧力を逃がし、培養チャンバ４０４内部の圧力を一定に保つ。細胞４０６に与えようとする圧力に応じて、バックプレッシャレギュレータ４０８を選択して取り付ける。
【０００８】
培養チャンバ４０４は細胞４０６又は組織を培養する空間を構成し、この培養チャンバ４０４にはコラーゲンで形成されたスポンジからなる足場４１２に細胞４０６又は組織を植え付けたものを収容する。細胞４０６又は組織は、コラーゲンのスポンジからなる足場４１２で増殖する。
【０００９】
圧力センサ４１４は、培養チャンバ４０４内の圧力を検知し、圧力モニタ４１６は圧力センサ４１４の検出圧力を表示する。ポンプ４００は、この検出圧力によって制御され、その検出圧力が過大となった場合、ポンプ４００の運転を停止する。
【００１０】
培養液槽４１８は、培養する細胞４０６又は組織に適する培養液４０２を溜め、この培養液４０２は、例えば、アミノ酸類、糖類、塩類等からなる。培養液槽４１８は、閉塞栓４２０に貫通させた通気チューブ４２２を通して外気に通じ、通気フィルタ４２４は外気による汚染を防止する。
【００１１】
この培養装置は、密閉空間であるインキュベータに収容される。このインキュベータは、快適な培養雰囲気を形成する空間であって、細胞、組織に最適な温度、湿度及びガス濃度（酸素、炭酸ガス）に維持されている。そして、培養液４０２はポンプ４００によって回路４２６内に満たされて循環する。酸素、炭酸ガスは通気フィルタ４２４を通過して培養液４０２に溶け込み、培養液４０２は適度な酸素濃度、炭酸ガス濃度に保たれる。ポンプ４００を運転すると、次第に培養チャンバ４０４の中の圧力が上昇し、バックプレッシャレギュレータ４０８の設定圧力以上になると、バックプレッシャレギュレータ４０８の弁４１０が開いて培養液４０２を排出し、培養液４０２が排出した分だけ、培養液４０２の圧力が低下するため、弁４１０が閉じる。このような動作の繰り返しにより、一定圧力が維持され、同時に、一定量の培養液４０２の循環が繰り返される。細胞４０６又は組織はこのような圧力刺激を受けながら増殖する。
【００１２】
この培養装置では一定圧力を維持できるものの、圧力の昇降を繰り返すことができない。圧力上昇はポンプ４００によるため、圧力の上昇速度がポンプ４００の能力により決まり、培養液４０２の循環量を増すと、上昇速度が速くなり、その循環量を少なく設定すると、圧力上昇が緩慢になる。このため、圧力サイクルを連続的に繰り返す場合、圧力を下降させるには、図２７のように、バックプレッシャレギュレータ４０８に並列にバイパス弁４２８とオリフィス弁（ニードル弁）４３０を備えたバイパス路４３２を設置する方法がある。この方法では、降圧が可能になるものの、１周期に要する時間が長くなると同時に、繰り返し周期の設定と培養液４０２の循環量を独立させることができず、また、オリフィス弁４３０の調節が微妙となり、圧力低下の割合が不安定になるという欠点がある。
【００１３】
そして、培養の実施の度に各部品を分解して洗浄、滅菌を行った後、装置を組み立てなければならないため、滅菌後に細菌汚染のおそれがある。汚染防止のため、組み立てた装置をオートクレーブ（１２１°Ｃ絶対圧２気圧）等の滅菌処理を施すことが考えられるが、ポンプや圧力センサは多くの電子部品や特殊な樹脂、オイルが含まれているために不可能である。このため、現状では、ポンプや圧力センサは一部を分解して培養液の通路部分のみを取り出し、薬品による滅菌を行い、他の部分はオートクレーブにより滅菌を行った後、ポンプや圧力センサと装置を組み立てなければならず、手間がかかり、雑菌汚染のおそれも高い。
【００１４】
培養液への酸素、炭酸ガスの取り込みはフィルタを通しているが、周囲の雰囲気から直接行っているため、汚染のおそれもある。また、この培養装置は、インキュベータに収容されるが、ポンプユニットや圧力モニタは温度、湿度により悪影響を受け易く、インキュベータにポンプユニットや圧力モニタを収容することは容積的に困難である。このため、インキュベータの貫通穴に配管用のチューブや電源、制御用の電線を通してその内部と外部とを連結することにより、装置を組み上げなければならない。
【００１５】
また、圧力の設定は設定圧力に応じたバックプレッシャレギュレータを選択して組み込むため、圧力の設定を変えるには、バックプレッシャレギュレータを取り替えなければならないため、手間がかかるとともに雑菌汚染の危険性も高い。
【００１６】
圧力サイクルを変更する場合、図２７に示す培養装置は、低圧側の設定をすることができず、オリフィス弁４３０である程度の圧力調整が可能であるとしても、設定された圧力がポンプ４００の循環流量で変化する。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
このように、従来の生体の細胞又は組織の培養では、インキュベータ（培養庫）内の温度、湿度、二酸化炭素濃度、酸素濃度を最適な条件に設定し、その中で細胞を培養している。このようなインキュベータによる培養では、シャーレの上での平面的（２次元的）培養であり、３次元的な培養の試みが成されている。しかも、このような培養においては、外気に晒された培養液や細胞又は組織が細菌に汚染され易く、安定的な培養が難しい。
【００１８】
しかも、生体の細胞は常に物理的刺激下にあり、それらの刺激は細胞の代謝機能の制御、細胞分裂サイクル、生物刺激の濃度勾配や分散等に間接的に影響を与えているが、それを安定的に実現することが難しく、物理的刺激の量、変化、周期等の設定や変更は非常に困難であった。そして、培養にあたっては微妙な圧力設定や調整が必要となり、培養担当者の熟練を要する。
【００１９】
このため、従来の生体細胞の体外培養は、修復すべき部位の大きさに成長させるのに時間がかかり、汚染等により正常な培養が損なわれることがあった。
【００２０】
そこで、本発明は、汚染の防止とともに効率的な体外培養を実現した細胞又は組織の培養装置を提供することを課題とする。
【００２１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、生体を模倣した環境等、任意に制御される環境下に培養位置（培養チャンバ２０）を設置するとともに、前記培養位置に細胞（５）又は組織を保持しながら培養液（３）を供給し、理想的な環境下にある前記培養位置で前記細胞又は前記組織を培養することで、汚染防止を図るとともに、前記細胞又は前記組織の効率的な体外培養を実現したものである。
【００２２】
上記目的を達成するため、本発明の細胞又は組織の培養装置は、ガスが供給され、かつその雰囲気の温度、湿度及びガス濃度が調節される密閉空間（２）と、この密閉空間に設置され、培養液（３）が溜められる培養液槽（９、４９、培養液バッグ４８）と、前記密閉空間に設置され、前記培養液が供給されて細胞又は組織を培養する培養チャンバ（２０）と、前記密閉空間に設置されて外部と遮断され、前記培養チャンバと前記培養液槽とをチューブ（５０Ａ〜５０Ｅ）で連結して構成され、前記培養液槽の培養液を前記培養チャンバに連続的、間欠的又は周期的のうちの一つ、又はこれらの組合せの何れかを用いて循環させる培養回路（培養回路ユニット４）と、前記培養チャンバ内の培養液中に前記細胞又は前記組織を浮遊状態又は非浮遊状態で保持する保持手段（足場７）と、前記培養液槽と前記培養チャンバとの間の前記培養回路に設置され、前記密閉空間内に供給されている前記ガスを前記チューブに流れる前記培養液に吸収させる気体吸収部（気体吸収装置１０）と、前記培養チャンバの外側に備えられ、前記培養チャンバの外側から前記培養チャンバに対して圧力を加えることにより、前記培養チャンバ内の培養液中で培養されている前記細胞又は前記組織に対して作用させ、その圧力として、前記細胞又は前記組織に連続して変化する圧力、間欠して変化する圧力又は周期的に変化する圧力の何れかの圧力の一つ又はこれらの２以上の組合せからなる圧力を加えるとともに、前記細胞又は前記組織に加えられている前記圧力を検出して付与すべき圧力との誤差を求めて前記圧力の補正を行う加圧手段（圧力印加装置１６）とを備えることを特徴とする。
【００２３】
即ち、欠損した生体の一部等の修復に必要な組織は、その生体の細胞や組織を用いることが理想的である。これを実現するためには、生体から採取した細胞や組織を用いてそれを体外培養することである。この体外培養で重要なことは、汚染防止と、生体と同等の培養環境、即ち、生体を模倣した環境を人工的に実現することである。そこで、人工的に形成した環境に培養位置を設定し、この培養位置に細胞又は組織を保持し、培養液を供給することにより、細胞又は組織の体外培養を実現している。ここで、環境とは、細胞又は組織によって形成される生体を基準とし、その生命を健康的に維持するに必要な体内、体外の刺激を含む生存条件を示す。また、培養液は、細胞又は組織の生命を維持するとともに生育に必要な栄養源を含む。この場合、培養液の供給は、細胞又は組織に静水圧と流れという物理的刺激を与え、細胞又は組織が代謝機能、分裂サイクル、生物刺激の濃度勾配や分散に影響を受け、その培養が促進され、その結果、体内組織に近く、また、体内組織と融合し易い細胞又は組織を培養することが可能となる。
【００２４】
上記目的を達成するためには、本発明の細胞又は組織の培養装置において、前記保持手段は、前記細胞又は前記組織の成長により前記保持手段をその細胞又は組織に吸収されることを特徴とする。
【００２５】
培養位置の設定や環境設定については、既に述べた通りである。培養位置に設定された細胞又は組織に対し、培養回路を通して培養液を連続的又は断続的に供給する。外界と分離又は遮断された培養回路を通して培養液を供給することにより、培養液の供給形態を連続的又は断続的に行うことができると同時に、汚染防止を図ることができる。培養液の供給形態についても、生体の環境に対応して制御することで、生体を模倣することができ、効率的に細胞又は組織の培養を行うことができる。そして、培養中に細胞又は組織には所望の圧力を作用させて物理的刺激を加えており、その圧力の形態は、連続、間欠又は周期的な変化とすることにより、生体を模倣し、培養される細胞又は組織に必要な柔軟性や耐久性等の生体に必要な物理的、機械的な強度を付与することができる。これは、修復すべき生体の部位に対応した理想的かつ実用的な細胞又は組織、即ち、体内組織に近く、体内組織と融合し易い細胞又は組織の培養に寄与することになる。
【００２６】
このような構成によれば、培養すべき細胞又は組織が培養チャンバに収容され、外気と遮断されて必要な培養液が供給される。外気と遮断された細胞又は組織は、菌体等の汚染から防護され、その結果、品質の良い組織に成長する。また、細胞又は組織には、培養液による静水圧と流れによる物理的刺激に加え、加圧手段によって所望の圧力が付与される。この結果、細胞の代謝機能、分裂サイクル、生物刺激の濃度勾配や分散に影響を受け、細胞又は組織の培養が促進される。また、細胞又は組織への培養液の供給は、間欠的又は連続的に行うことができるので、バリエーションのある物理的刺激によって培養の促進が図られる。この場合、常に新しい培養液の供給や培養液を繰り返し循環させる供給の何れか一方又は双方を含むものである。循環させる形態では、培養液を節約できるが、一方向的な供給の場合には培養液の濃度変化を防止できる点で有利であろう。
【００２７】
上記目的を達成するためには、前記保持手段は、ハイドロジェルである構成としてもよい。即ち、保持手段として細胞又は組織を培養液中に浮遊状態で保持させるハイドロジェルを用いれば、細胞又は組織の成長によりその細胞又は組織に養分として吸収される。ハイドロジェルは、培養すべき細胞又は組織を包み込んで浮遊状態に保持し、培養が完了した時点でそのハイドロジェルから細胞や組織を取り出すことが可能である。
【００２８】
上記目的を達成するためには、前記培養液は、各種アミノ酸、糖類、塩類又はタンパク質の１又は２以上を含んで構成してもよい。培養液の選択は、効率的な培養や品質の良い細胞又は組織を形成する上で主要な要素であり、培養すべき細胞又は組織に応じたものとして、例えば、各種アミノ酸、糖類、塩類又はタンパク質の１つ又はこれらから選択された２以上の物質又は全てを含んで構成したものを用いれば、効率的な培養や品質の良い細胞又は組織が形成される。
【００２９】
上記目的を達成するためには、少なくとも前記培養チャンバを含み前記密閉空間から分離可能な培養ユニット（培養回路ユニット４）を構成してもよい。即ち、培養する細胞又は組織を収容する培養チャンバを備える培養ユニットは、培養装置本体と独立して分離、着脱可能とすることにより、外気と分離された培養ユニットとともに細胞又は組織を移動させることができ、移動中に菌体等による汚染から細胞又は組織を防護することができる。
【００３０】
上記目的を達成するためには、前記密閉空間に供給される前記ガスは、窒素、酸素又は二酸化炭素等のガスとしてもよい。即ち、細胞又は組織を培養すべき環境は生体に対応した環境が望ましいことから、その一例として、窒素、酸素又は二酸化炭素等のガスの供給、温度又は湿度の設定等の生体環境を設定し、所望の状態に制御すればよい。
【００３１】
上記目的を達成するためには、前記培養回路に前記培養液を供給する培養液供給手段（培養液供給装置６）を備え、この培養液供給手段は、前記培養回路に取り付けられた送液チャンバ（１２８）と、この送液チャンバに取り込まれた前記培養液を加圧して送り出す送液装置（１２）とを備える構成としてもよい。即ち、培養液供給手段は、培養回路に培養液を供給又は循環させる手段であって、その形態は各種のものが想定できるが、例えば、送液チャンバを設け、この送液チャンバに取り込んだ培養液を加圧して送り出す送液装置で構成すれば、加圧量を制御することで所望の送液量を設定することができる。
【００３２】
上記目的を達成するためには、前記密閉空間は、前記温度条件を設定する加熱手段（温度調節装置３４）を備えて所望の温度に維持、制御される構成としてもよく、また、前記密閉空間は、湿度条件を設定する加湿手段（湿度調節装置３２）を備えて所望の湿度に維持、制御される構成としてもよい。即ち、培養回路が収容される密閉空間の温度及び湿度を制御し、生体環境に合致する培養空間を形成することができる。
【００３３】
上記目的を達成するためには、前記培養チャンバに超音波等の音波を付与する音波発生装置（１１４）を備えた構成としてもよい。即ち、生体は外界からの音響的刺激を受けており、音波発生装置を併用することにより、生体環境を音響的に模倣することができる。また、培養チャンバに培養すべき細胞又は組織を注入する際に、超音波を併用して効率的かつ信頼性の高い注入を行うことができる。
【００３４】
上記目的を達成するためには、前記密閉空間内のガス濃度を制御する制御手段（制御装置４０）を備える構成としてもよい。即ち、密閉空間に供給されるガス濃度を制御手段によって制御することにより、生体環境を模倣することができ、細胞又は組織の培養促進を図ることができる。
【００３５】
上記目的を達成するためには、前記細胞又は前記組織に加える前記圧力は、培養される前記細胞又は前記組織が対応する生体の部位に応じて設定する。即ち、細胞又は組織を生体の部位に応じて培養することができる。
【００３６】
上記目的を達成するためには、前記加圧手段から前記細胞又は前記組織に加えられる前記圧力は、断続状態、一定時間毎の連続した繰り返し、一定時間毎に増減させる構成としてもよい。即ち、圧力パターンはあらゆる形態を想定することができ、その選択により効率的に細胞又は組織の培養を行うことができる。
【００３７】
上記目的を達成するためには、前記培養回路は、前記加圧手段による前記培養チャンバ内の前記培養液の圧力上昇を緩衝する圧力緩衝手段（圧力緩衝装置１８）を備えた構成としてもよい。即ち、培養回路の圧力調整を圧力緩衝手段で行えば、生体環境に近い物理的刺激を実現することができ、細胞又は組織の培養の促進を図ることができる。
【００３８】
上記目的を達成するためには、前記培養チャンバに受圧膜（６４）を介在させて圧力チャンバ（６０）を取り付け、この圧力チャンバに水圧、油圧又は空気圧を作用させ、前記培養チャンバ内の前記細胞又は前記組織に圧力を加える構成としてもよい。即ち、受圧膜を設置したことにより、培養チャンバに収容されている細胞又は組織に対し、外気と遮断した状態で加圧刺激を与えることができるとともに、生体環境を模倣した刺激等、所望の加圧刺激を実現できる。
【００３９】
上記目的を達成するためには、前記圧力緩衝手段は圧力逃し弁（２６）で構成され、この圧力逃し弁は、前記培養チャンバ内の前記培養液の圧力が所定圧力を越えるとき、開くことにより、前記培養チャンバ内の前記培養液を前記培養回路に流して前記培養液の圧力を降下させる構成としてもよい。即ち、培養液に加えられる圧力を緩衝することは、理想的な加圧刺激を細胞又は組織に付与するために極めて重要であり、その一手段として、圧力逃し弁を用いて培養液の圧力が圧力逃し弁に任意に設定される一定圧力を越えるとき、圧力逃し弁を開いて培養液の圧力を降下させれば、培養液を汚染させることなく、理想的な圧力状態に制御することができる。
【００４０】
【発明の実施の形態】
図１は、本発明の細胞又は組織の培養装置の第１の実施形態を示している。
【００４１】
細胞又は組織の培養装置１はその培養空間として密閉空間２を備えており、この密閉空間２には、培養すべき細胞又は組織に培養液３を供給する培養回路として培養回路ユニット４が設置されている。この培養回路ユニット４は、装置本体側と分離、着脱可能に設定することができる。この培養回路ユニット４は、培養液槽９、培養液供給装置６、培養加圧装置８、気体吸収装置１０及び弁１１を備えているとともに分岐路１３を備えており、この分岐路１３には弁１５が設けられている。培養液３は、培養しようとする細胞や組織に養分を与えるキャリアであって、必須アミノ酸や各種アミノ酸とグルコース（糖類）を含んだ液体であり、培養しようとする細胞や組織に応じてＮａ+ 、Ｃａ++等の無機質が追加されたり、血清等のタンパク質を含む場合もある。また、これらの装置は、フッ素樹脂、ＰＥＥＫ、高耐熱グレードポリプロピレン、シリコーン、ステンレススチール等の十分な耐熱性を持ち、生体に影響を与えるような物質の溶出のない樹脂材料を用いて構成することにより、構成部品での汚染を防止することができる。
【００４２】
弁１１、１５は、ピンチバルブ等で構成することができ、培養回路ユニット４は、弁１５を閉じ弁１１を開くことで閉ループ回路、弁１５を開き弁１１を閉じることで全開ループ回路、弁１１、１５を共に開くことで一部開ループ回路となる。また、培養回路ユニット４は、部分的に設置した気体吸収装置１０に代えて、二点鎖線で示す気体吸収部４１と、実線で示す耐圧部４３とを備えても良く、気体吸収部４１は密閉空間２に充満させたガスを培養液３に吸収させる部分、耐圧部４３は培養液３の加圧部分に対応して信頼性のある送液を確保して液漏れを防止する部分である。気体吸収部４１には、例えば、ＣＯ2 、Ｏ2 ガス等のガスを透過し易いエラストマ材料等で形成されたチューブを用いることができる。
【００４３】
培養液槽９は、密閉空間２に収容されて細胞又は組織の培養に必要な培養液３を溜める手段である。また、培養液供給装置６は培養回路ユニット４に培養液３を供給する手段であって、培養回路ユニット４に挿入された送液装置１２を駆動装置１４によって駆動し、所定量の培養液３を培養回路ユニット４に供給する。培養加圧装置８は、培養すべき細胞５（図３）又は組織に加圧する手段であって、圧力印加装置１６及び圧力緩衝装置１８を備えている。圧力印加装置１６は、培養回路ユニット４の培養チャンバ２０に圧力容器２２を取り付け、駆動装置２４によって任意の圧力を培養チャンバ２０に作用させる。培養チャンバ２０にはコラーゲン等から成形された足場に培養すべき細胞又は組織が植え付けられて収容され、外界から隔離される。
【００４４】
圧力緩衝装置１８は、培養加圧装置８で加圧される培養液３の圧力を緩衝する手段であって、所定値を越える培養液３の圧力に対し、培養回路ユニット４に挿入された圧力逃し弁２６を駆動装置２８で駆動して最大圧を設定し、その最大圧を越える培養液３の圧力が作用したとき、培養液３を逃がすことにより圧力を緩衝する。また、圧力容器２２には、培養加圧装置８に併設された加圧用液体注入装置３０から加圧用液体が注入される。
【００４５】
また、この培養装置１には湿度調節装置３２、温度調節装置３４及びガス混合・濃度調節装置３６が設置されており、雰囲気の湿度、温度及びガス混合・濃度が調節される。また、操作装置３８は管理者によって所望の調整操作を行うためのものであって、制御装置４０は培養液供給装置６、培養加圧装置８、加圧用液体注入装置３０、湿度調節装置３２、温度調節装置３４及びガス混合・濃度調節装置３６等の各種装置を操作装置３８からの操作入力や制御プログラムによって制御する手段である。
【００４６】
次に、この装置を用いた細胞又は組織の培養について説明すると、培養準備として、制御装置４０に対して操作装置３８等の操作によって培養条件等の必要事項を入力する。この場合、必要事項は、培養液３にどのような圧力を設定するかであり、その設定形態は、最大圧力、最小圧力、その昇圧又は減圧等の圧力傾斜、加圧周期、培養液３の流量、培養温度、培養時間等である。また、培養回路ユニット４は、弁１１、１５の開閉を切り換えることにより、閉ループとするか、開ループとするかを選択する。
【００４７】
次に、培養チャンバ２０の中にコラーゲンのスポンジ等の足場７（図３）を設置し、この足場に培養すべき細胞５（図３）又は組織を植え付ける。コラーゲンのスポンジは、培養チャンバ２０内でコラーゲン液を凍結乾燥することによって形成しても良い。
【００４８】
次に、培養液槽９に規定量の培養液３を入れ、密閉空間２を閉鎖した後、運転スイッチを投入し、培養運転の準備（自動運転）により、加圧用液体注入装置３０から圧力容器２２側に加圧用液体が供給される。
【００４９】
培養液供給装置６が駆動されると、送液装置１２を通じて培養液３が培養チャンバ２０側に流れ、培養すべき細胞又は組織に培養液３が供給される。この培養液３の供給形態は、連続、間欠的、周期的又はこれらの組合せの何れかが選択される。
【００５０】
また、培養液３で満たされた培養チャンバ２０には、足場によって保持された細胞又は組織が収容されており、この細胞又は組織には圧力容器２２から圧力が加えられる。この圧力は、培養準備で設定された圧力パターンによる。
【００５１】
そして、培養液３に加えられる圧力が設定圧力を越えた場合には、圧力逃し弁２６を通して培養液３が耐圧部４３から流出し、圧力調整が行われる。
【００５２】
このような動作を所定の培養時間中繰り返すことにより、細胞又は組織が培養チャンバ２０内で所望の大きさに成長する。足場にコラーゲンのスポンジを用いている場合には、培養される細胞又は組織がそのコラーゲンを吸収し、足場は自然に消失する。
【００５３】
また、ハイドロジェルを保持手段に用いた場合には、そのハイドロジェル内に細胞又は組織が浮遊状態で収容されて保持されている。
【００５４】
また、弁１５を閉じ、弁１１を開いて培養回路ユニット４を閉ループ化した場合には、培養液３は、培養回路ユニット４内を循環し、培養すべき細胞又は組織側には培養液３が供給される。また、弁１１を閉じ、弁１５を開いて培養回路ユニット４を開ループ化した場合には、培養液３は、分岐路１３側に流れ、加圧用液体注入装置３０側、即ち、加圧水槽６８（図２）側に流れ、培養すべき細胞又は組織側には常に新鮮な培養液３を供給することができる。
【００５５】
そして、培養中、培養回路ユニット４の気体吸収装置１０又は気体吸収部４１には、通流する培養液３に密閉空間２内から窒素、酸素、二酸化炭素等のガスが吸収され、生体と同様のガス交換に必要なガスが細胞又は組織に培養液３を通じて供給される。
【００５６】
このように、細胞又は組織には、生体を模倣した培養環境が設定されて体外培養を、菌体等に汚染されることなく、効率的に行うことができる。即ち、細胞又は組織は、培養チャンバ２０内で培養液３の静水圧と流れによる物理的刺激が加えられるので、代謝機能、分裂サイクル、生物刺激の濃度勾配や分散に影響を受け、培養が促進される。また、細胞又は組織は、圧力印加装置１６による加圧及びその加圧形態に応じて物理的刺激を受ける。この結果、細胞又は組織の培養が促進され、体内の組織に近い、また、体内組織と融合し易い組織を培養することができる。また、耐圧部４３を部分的に設定することにより、耐圧構造に要するコストを低減することができる。
【００５７】
次に、図２は培養装置１の具体的な実施形態を示し、図３は培養装置１の培養回路ユニット４の一部、培養液供給装置６、培養加圧装置８の圧力印加装置１６及び圧力緩衝装置１８を拡大して示している。培養装置１は、図４に示すように、培養回路ユニット４が着脱される構成である。
【００５８】
この培養装置１は、密閉可能な培養庫４２を備えており、ドア２７０（図１４）の開閉がドアスイッチ４４によって検出される。この培養庫４２には、培養液３を供給する培養回路ユニット４が収容される。この培養回路ユニット４は、培養チャンバ２０、送液装置１２、圧力逃し弁２６を介して培養液３を溜める培養液槽としての培養液バッグ４８をチューブ５０Ａ、５０Ｂ、５０Ｃ、５０Ｄ、５０Ｅで連結した着脱可能なチューブユニットである。チューブ５０Ａ、５０Ｄ、５０Ｅは、気体吸収部４１（図１）であって、培養庫４２内のガスを吸収可能なエラストマ材料等で構成された通気チューブで構成され、また、チューブ５０Ｂ、５０Ｃは耐圧部４３（図１）であって、培養液３の圧力に耐える耐圧チューブで構成される。そして、チューブ５０Ｅには、チューブ５０Ｅを屈曲させて培養回路ユニット４内のガスを吸収するガス吸収部５２が形成されている。
【００５９】
培養液バッグ４８は培養庫４２の壁面に重量検知手段としての検知スイッチ５４を備えるフック５６を以て支持されており、培養液バッグ４８内の培養液３の容量がその重量により検知スイッチ５４によって検知される。この検知スイッチ５４が培養液バッグ４８の所定重量の減少を検知したとき、制御装置４０を通して表示手段（表示装置２３２）や電話等を通じてその異常を告知する。ガス吸収部５２と送液装置１２との間のチューブ５０Ａ、５０Ｅには培養液排出部５８が分岐して設けられ、チェック用バルブ５９によって開閉される。このチェック用バルブ５９は、培養回路ユニット４内の培養液３を採取するための手段であって、培養液排出部５８から採取された培養液３は、その変性状態、即ち菌体等の物質によって汚染されているか否か、ｐＨ、濃度、生成物、酸素濃度、二酸化炭素濃度等の検査に供することができる。
【００６０】
培養すべき細胞５はコラーゲン等で形成された足場７に着床させ、足場７とともに培養チャンバ２０に収容される。この培養チャンバ２０は培養容器６１によって構成され、培養容器６１は、圧力チャンバ６０に複数のボルト６２等の固定手段によって取外し可能に取り付けられており、インジェクションポート６３が設けられている。このインジェクションポート６３は、培養チャンバ２０内に設置した足場７に培養すべき細胞５を外部から注射器等によって着床させるために用いる。培養チャンバ２０の固定には例えばクランパのような他の固定手段を用いても良い。圧力チャンバ６０及び培養容器６１はＯリング等のシール材によって封止される。培養チャンバ２０の圧力チャンバ６０側の面部が受圧膜６４で閉塞されて密閉空間を形成しており、この受圧膜６４を介して培養チャンバ２０に圧力チャンバ６０内の加圧水６５が接している。
【００６１】
圧力チャンバ６０には給水管路６６を通して加圧水（液）槽６８が連結されており、給水管路６６には流水センサ７０、ポンプ８０、バイパス弁８２及び封止弁８４が設けられ、バイパス弁８２には中間にオリフィス８６を持つバイパス管路８８が設けられている。即ち、バイパス弁８２及び封止弁８４を開いてポンプ８０を駆動することにより、加圧水６５を加圧水槽６８から圧力チャンバ６０内に充填することができる。加圧水槽６８の加圧水位は水位センサ９６によって検出されるので、その水位に応じて給水バルブ９２を開閉することにより、加圧水槽６８に加圧水６５を給水管路９４を通じて補充するので、加圧水槽６８の水位を常に最適水位に保持することができる。また、加圧水槽６８の給水管路６６には排水管路９８が分岐されており、細胞５の培養終了時、排水バルブ１００を開いて加圧水６５が排水される。
【００６２】
また、圧力チャンバ６０には加圧水槽６８側に向かう回収管路１０２が設けられ、この回収管路１０２には封止弁１０４及び循環ポンプ１０６が設けられている。回収管路１０２の先端部は加圧水槽６８内の加圧水６５中に浸漬している。即ち、封止弁８４を開きかつバイパス弁８２を閉じて循環ポンプ１０６を駆動すると、圧力チャンバ６０内が減圧されて、圧力チャンバ６０や各管路６６、１０２等の内壁に付着している気泡等を加圧水槽６８側に排出することができる。また、この圧力チャンバ６０の加圧水６５は、ポンプ８０、１０６の同時駆動により加圧水槽６８から給水管路６６を通して圧力チャンバ６０に供給しつつ回収管路１０２を通して加圧水槽６８に戻し、加圧水槽６８との間で循環させることも可能である。
【００６３】
圧力チャンバ６０の壁面部にはヒータ１０８、温度センサ１１０、圧力センサ１１２及び音波発生装置１１４が設けられており、収容されている加圧水６５の加熱と、その温度又は圧力が検出されるとともに、圧力チャンバ６０には、必要に応じて音波発生装置１１４から超音波等の音波を加えることができる。
【００６４】
そして、圧力チャンバ６０には加圧手段として加圧ピストン１１６が進退自在に設けられ、加圧ピストン１１６は圧力チャンバ６０の壁面部に突出させた支持筒部１１７によって支持され、支持筒部１１７と加圧ピストン１１６との間には封止手段であるＯリング１１９によって封止されている。この加圧ピストン１１６には加圧用スプリング１１８を介して加圧駆動手段としてアクチュエータ１２０及びモータ１２２が取り付けられている。モータ１２２は例えば、ステッピングモータで構成され、このモータ１２２の回転がアクチュエータ１２０によって進退動に変換されて加圧用スプリング１１８に加えられ、加圧ピストン１１６の進退に応じて圧力チャンバ６０内の圧力を増減させることができ、加圧ピストン１１６の進入時、高圧、加圧ピストン１１６の後退時、低圧を生じさせ、その圧力変化が受圧膜６４を通して足場７上の細胞５に加圧刺激を与える。また、加圧ピストン１１６の位置は位置センサ１２３によって検出されており、その検出データは加圧ピストン１１６の進退の制御、即ち、加圧刺激の制御に用いられる。
【００６５】
この場合、圧力チャンバ６０には加圧水６５が充填されており、加圧ピストン１１６から加えられる圧力は、加圧水６５を通じて受圧膜６４に全面的に作用し、その圧力が受圧膜６４から培養液３を通して細胞５や組織に均等に静水圧を作用させることができ、ストレイン（変位）も同様に均等に作用させることができる。しかも、加圧ピストン１１６の移動量の制御で圧力変化量のダイナミックレンジを大きくでき、小さい値から大きな値まできめ細かい制御が可能である。そして、加圧ピストン１１６の移動は位置センサ１２３によって検出されて制御装置４０によって監視され、その移動量が限界位置に到達した場合には、培養装置１の異常として制御装置４０から警報出力が発せられ、制御装置４０に接続されている表示手段（図５の表示装置２３２等）に警告表示を行い、又は、電話等の通信回線を通じて管理者に告知することができる。
【００６６】
また、培養チャンバ２０に連続的又は間欠的に培養液３を送る送液装置１２は、出入側に送出側逆流防止弁１２４、吸引側逆流防止弁１２６を有する送液チャンバ１２８を備え、培養庫４２にネジ１３０によって取外し可能に取り付けられている。送液チャンバ１２８には送液ピストン１３２が進退自在に取り付けられ、この送液ピストン１３２の中途部には殺菌液溜１３４が設けられるとともに、加圧用スプリング１３６が取り付けられている。送液ピストン１３２と送液チャンバ１２８の本体部との間には封止手段であるＯリング１３３、１３５が設けられている。殺菌液溜１３４には、殺菌剤、消毒液又はペニシリン等の抗生物質が充填され、外部からの菌体や異物の侵入を阻止している。加圧用スプリング１３６は、防護筒１３７内に収容されている。
【００６７】
送液ピストン１３２の後端部には駆動手段としてアクチュエータ１３８及びモータ１４０が取り付けられている。モータ１４０は例えば、ステッピングモータで構成され、このモータ１４０の回転がアクチュエータ１３８によって進退動に変換されて加圧用スプリング１３６に加えられ、送液ピストン１３２の進退に応じて送液チャンバ１２８内の圧力が増減し、その圧力変化が各逆流防止弁１２４、１２６の弁体１４２、１４４に加えられる。送液ピストン１３２が送液チャンバ１２８から引き出されると、送液ピストン１３２の引出し分だけ送液チャンバ１２８内が負圧になって弁体１４２はスプリング１４３の復元力によって引き下げられて送出側逆流防止弁１２４が閉じるとともに、弁体１４４がスプリング１４５の加圧力に逆らって引き上げられて吸引側逆流防止弁１２６が開くことにより、送液チャンバ１２８内に培養液３が吸い込まれる。また、送液ピストン１３２が送液チャンバ１２８内に進入すると、送液チャンバ１２８内が加圧されて弁体１４４が下降して吸引側逆流防止弁１２６が閉じ、弁体１４２が上昇して送出側逆流防止弁１２４が開くので、送液チャンバ１２８内の培養液３が培養チャンバ２０側に送り出される。
【００６８】
また、培養液３の圧力緩衝装置１８は圧力逃し弁２６を備えており、圧力逃し弁２６は培養庫４２にネジ１４６によって取外し可能に取り付けられている。この圧力逃し弁２６は、弁室１４８に進退して開閉可能な弁体１５０が取り付けられ、この弁体１５０のプランジャ１５２の中途部には殺菌液溜１５３が設けられている。プランジャ１５２と弁室１４８の本体部との間には封止手段であるＯリング１５５、１５７が設けられている。殺菌液溜１５３には、殺菌剤、消毒液又はペニシリン等の抗生物質が充填され、外部からの菌体や異物の侵入を阻止している。また、弁体１５０のプランジャ１５２の後端部には緩衝スプリング１５４を介して駆動手段としてのアクチュエータ１５６及びモータ１５８が取り付けられている。モータ１５８は例えば、ステッピングモータで構成され、このモータ１５８の回転がアクチュエータ１５６によって進退動に変換されて緩衝スプリング１５４に加えられ、弁体１５０を開く動作圧は緩衝スプリング１５４の圧縮度に応じて調整される。即ち、緩衝スプリング１５４の圧縮度が高いとき、弁体１５０を開くために必要な培養液３からの圧力が高くなり、また、緩衝スプリング１５４の圧縮度が低いとき、弁体１５０を開くために必要な培養液３からの圧力が低くなる。このような圧力緩衝装置１８を設けるのは、培養チャンバ２０の培養液３に加えられる加圧力を培養回路ユニット４側で緩衝するためである。
【００６９】
この圧力逃し弁２６の弁室１４８と培養液バッグ４８とを連結するチューブ５０Ｄにはピンチバルブ１６２とともに吸引チューブ１６４が分岐して設けられ、この吸引チューブ１６４にはピンチバルブ１６６、逆流防止弁１６８及び培養液溜１７０が設けられており、培養液溜１７０は吸引チューブ１６５を通じて回収管路１０２に連結されている。ピンチバルブ１６２はチューブ５０Ｄを開閉し、また、ピンチバルブ１６６は吸引チューブ１６４の開閉に用いられる。逆流防止弁１６８は、弁体１６９をスプリング１７１の加圧力によって閉止させており、培養液３の圧力がスプリング１７１の加圧力を越えるとき、培養液３が吸引チューブ１６４を通して培養液溜１７０側に流れる。ピンチバルブ１６６は逆流防止弁１６８とは無関係にその操作によって吸引チューブ１６４を閉止でき、その閉止によって培養液３の通流を阻止することができる。また、ピンチバルブ１６６が開いているとき、培養液溜１７０は密閉容器であるから、封止弁１０４を閉じ、循環ポンプ１０６を駆動すると、培養液溜１７０内が減圧されるので、スプリング１７１の加圧力に対抗して弁体１６９を移動させ、逆流防止弁１６８を開くことができ、このとき、培養液３を培養液溜１７０側に引き込むことができる。
【００７０】
また、培養庫４２にはガス混合・濃度調節装置３６としてＮ2 ガスボンベ１７２、Ｏ2 ガスボンベ１７４、ＣＯ2 ガスボンベ１７６がそれぞれ管路１７８、１８０、１８２を通して連結され、各管路１７８、１８０、１８２にはガス開閉バルブ１８４、１８６、１８８、流量調節弁１９０、１９２、１９４、フローメータ１９６、１９８、２００、圧力調整器２０２、２０４、２０６及びバルブ２０８、２１０、２１２が設置されている。即ち、ガス開閉バルブ１８４〜１８８を選択的に開閉することにより、Ｎ2 、Ｏ2 又はＣＯ2 の１又は２以上が供給されて混合される。
【００７１】
また、培養庫４２には加湿手段である湿度調節装置３２として加湿用水２１４を溜める加湿用水受皿２１６及び攪拌用ファン２１８が設置されるとともに、加熱手段である温度調節装置３４として気体加熱用ヒータ２２０、庫内温度センサ２２２及び攪拌用ファン２１８が設置されている。攪拌用ファン２１８は、ファンモータ２２４によって駆動される。
【００７２】
なお、培養装置１の異常発生時、警告を発することを言及しているが、管理者が必要な処置を行うまで、異常の種別に関係なく培養中の細胞５や組織を保存するため、制御装置４０は、培養庫４２内の保温制御、ガス濃度の制御、送液運転を継続する。このような継続運転は、所定の培養時間が到来しても、また、正常に運転が終了した場合にも、培養庫４２内の保温制御、ガス濃度の制御、送液運転を同様に継続させる。
【００７３】
次に、図５は、操作装置３８及び制御装置４０の構成例を示している。操作装置３８及び制御装置４０は、パーソナルコンピュータ等で構成された主制御装置２３０を備えている。主制御装置２３０にはディスプレイ、液晶等の表示装置２３２、ハードディスク、光ディスク、フロッピィディスク、ＩＣカード等の外部記憶装置２３４、キーボードの入力装置２３６が接続されている。入力装置２３６は、操作装置３８の一部又は全部を構成する。
【００７４】
主制御装置２３０には、温度検出回路２３８を通じて温度センサ１１０の検出出力、温度検出回路２４０を通じて庫内温度センサ２２２の検出出力、圧力検出回路２４２を通じて圧力センサ１１２の検出出力、位置センサ１２３の検出出力及び検知スイッチ５４の検知出力が加えられ、モータ１２２の駆動出力が駆動回路２４４、モータ１４０の駆動出力が駆動回路２４６、モータ１５８の駆動出力が駆動回路２４８、ヒータ１０８の駆動出力が駆動回路２５０、バルブ１８４、１８６及びバルブ１８８の駆動出力が駆動回路２５２、ファンモータ２２４の駆動出力が駆動回路２５４、ヒータ２２０の駆動出力が駆動回路２５６から得られるとともに、音波発生装置１１４の駆動出力が得られる。
【００７５】
次に、本発明に係る細胞又は組織の培養について、図６に示す動作フローチャートを参照して説明する。
【００７６】
ステップＳ１は初期設定モードである。この初期設定モードは、培養回路ユニット４の装着後に、圧力チャンバ６０内に加圧水６５を満たし、培養回路ユニット４内に培養液３を満たす工程と、設定入力された圧力値に相当する培養加圧装置８の圧力印加装置１６、圧力緩衝装置１８の動作量をサンプリングして記憶保持する工程を含む。培養回路ユニット４及び受圧膜６４を構成する材質の伸び率が異なり、かつ圧力チャンバ６０内に残留する気泡等によって設定圧力を得るための動作量が異なる。そこで、初期設定モードでは、これらの設定値を修正する。
【００７７】
培養回路ユニット４が装着されると、ガス混合・濃度調節装置３６、湿度調節装置３２及び温度調節装置３４を動作させ、培養庫４２の内部にガスを充填するとともに適湿及び適温に制御する。そして、給水バルブ９２を開いて加圧水槽６８に上水等からなる加圧水６５を設定水位まで補充し、バイパス弁８２、封止弁８４、１０４を開き、ポンプ８０を動作させて圧力チャンバ６０内に加圧水６５を供給する。圧力チャンバ６０への加圧水６５の供給量は流水センサ７０で検出され、所定量の加圧水６５が検出されたとき、ポンプ８０を停止し、循環ポンプ１０６による循環動作に切り換える。
【００７８】
循環動作では、バイパス弁８２を閉じてバイパス管路８８への流路に切り換える。このとき、オリフィス８６によって加圧水６５の通流量が制限され、循環ポンプ１０６の吸引力によって圧力チャンバ６０内が負圧となり、圧力チャンバ６０内に残留する気泡が加圧水槽６８側に排出される。このとき、ピンチバルブ１６２を閉じ、ピンチバルブ１６６を開いて、循環ポンプ１０６によって生じる負圧により培養液バッグ４８内の培養液３をチューブ５０Ｅ、５０Ａ、５０Ｂを通して培養チャンバ２０に充填する。循環ポンプ１０６を所定時間動作させて培養液３を培養チャンバ２０に充填させた後、ピンチバルブ１６６を閉じ、ピンチバルブ１６２とバイパス弁８２を開き、循環流による負圧を解除し、かつ循環ポンプ１０６を停止させる。続いて封止弁８４、１０４を閉じた後、ヒータ１０８により圧力チャンバ６０内の加圧水６５を加熱し、その温度を温度センサ１１０で検出することにより、温度制御を開始する。
【００７９】
次に、圧力緩衝装置１８のモータ１５８を動作させ、圧力逃し弁２６を閉じ、チューブ５０Ｃを一定圧で閉塞させる。モータ１２２を動作させて予め設定した最大圧力Ｐｍａｘが検出されるまで圧力印加装置１６を動作させる。最大圧力Ｐｍａｘが検出されたとき、モータ１２２のパルスカウントを主制御装置２３０のメモリに記憶する。次に、圧力緩衝装置１８のモータ１５８を現在の圧力値が低下するまで回転させ、この圧力値を最大圧力Ｐｍａｘの位置としてモータ１５８のパルスカウントを主制御装置２３０のメモリに記憶する。
【００８０】
次に、圧力印加装置１６のモータ１２２を予め設定した最小圧力Ｐｍｉｎが検出されるまで回転させる。最小圧力Ｐｍｉｎが検出されたとき、モータ１２２のパルスカウントを主制御装置２３０のメモリに記憶する。次に、圧力緩衝装置１８のモータ１５８を回転させ、最小圧力Ｐｍｉｎより減少を開始する位置にてモータ１５８を停止し、そのとき、このモータ１５８のパルスカウント値を主制御装置２３０のメモリに記憶する。
【００８１】
次に、この初期設定モードの後、ステップＳ２に移行し、圧力可変培養モードか否かを判定する。即ち、圧力を周期的に変更して培養を行うか否かが判定され、圧力可変を行うときはステップＳ３の圧力可変培養モードに移行し、また、一定圧力で培養するときはステップＳ７の固定圧力培養モードに移行する。
【００８２】
ステップＳ３の圧力可変培養モードでは、周期Ｔ毎に加圧、圧力保持、減圧、圧力保持を繰り返して培養チャンバ２０の細胞５を加圧刺激し、かつ培養液３の送液を行う。
【００８３】
ステップＳ４では、圧力印加装置１６、圧力緩衝装置１８の動作による圧力とＰｍａｘ、Ｐｍｉｎとの誤差が所定値以上か否かが判定される。所定値以上の誤差が生じたとき、ステップＳ５に移行して最大圧力Ｐｍａｘ、最小圧力Ｐｍｉｎの各値と一致する圧力印加装置１６、圧力緩衝装置１８の移動量をサンプリングして主制御装置２３０のメモリの記憶値を修正する。
【００８４】
次に、ステップＳ６では、所定の培養時間ｔが経過するまでステップＳ３〜ステップＳ６を繰り返し、所定の培養時間ｔが経過したとき、培養終了とし、ステップＳ１１に移行する。
【００８５】
また、ステップＳ７の固定圧力培養モードでは一定の圧力によって細胞５又は組織を刺激し、かつ培養液３の送液を行う。即ち、ステップＳ８では圧力印加装置１６、圧力緩衝装置１８の動作による圧力と設定圧力Ｐｓとの誤差が所定値以上か否かが判定される。所定値以上の誤差が生じたとき、ステップＳ９に移行して設定圧力Ｐｓと一致する圧力印加装置１６、圧力緩衝装置１８の移動量をサンプリングして主制御装置２３０のメモリの記憶値を修正する。そして、ステップＳ１０では、所定の培養時間ｔが経過したとき、培養終了とし、ステップＳ１１に移行する。
【００８６】
次に、ステップＳ１１では生体細胞保存運転モードを実行する。細胞５又は組織の培養が完了、即ち、組織が生成されても、移植のための移送を開始するまでの間、その細胞５ないし組織を健全に保存する必要がある。生体細胞保存運転モードでは、細胞５を所定温度に維持しつつ、培養液３を供給して生体細胞を健全な状態に保持する。
【００８７】
次に、ステップＳ１２では生体細胞を移植か否か、即ち、細胞５からなる組織の移植のために運転停止命令が入力されたか否かを判定し、運転停止命令により培養液３の循環と温度制御を停止する。培養回路ユニット４を脱離させ、細胞５ないし組織は培養回路ユニット４とともに移送される。
【００８８】
次に、図７、図８及び図９は、初期設定モードにおける設定入力動作を示し、符号ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅは、分割して記載したフローチャートの結合子であって、符号ａ〜ｅの一致は結合部である。
【００８９】
ステップＳ２１では培養チャンバ２０を周期的な加圧下での培養か、又は一定圧力下での培養かを入力する。ステップＳ２２において、圧力を周期的に可変させるとき、ステップＳ２４に移行して「圧力可変」を表示する。また、一定圧力下で培養を行うとき、ステップＳ２３に移行して「圧力一定」を表示する。
【００９０】
ステップＳ２５では、圧力を可変させる周期Ｔを入力する。ステップＳ２６では入力された周期Ｔが実行可能な範囲内であるか否かを判定し、実行範囲外のときはステップＳ２７に移行して「周期Ｔの再入力」を表示して告知し、ステップＳ２５に移行して再入力を行う。実行範囲内であれば、ステップＳ２８に移行して設定した「周期Ｔ」の表示と、主制御装置２３０のメモリへの記憶が行われる。
【００９１】
ステップＳ２９では最大圧力Ｐｍａｘの保持時間ｔ1 を入力する。ステップＳ３０では入力された時間ｔ1 が周期Ｔの動作範囲内にあるか否かを判定する。動作範囲外であればステップＳ３１に移行して「ｔ1 の再入力」の表示により告知し、ステップＳ２９に移行して再入力を行う。動作範囲内であればステップＳ３２に移行して「最大圧保持時間ｔ1 」の表示と主制御装置２３０のメモリへの記憶が行われる。
【００９２】
ステップＳ３３では最小圧力Ｐｍｉｎの保持時間ｔ2 を入力する。ステップＳ３４では入力された時間ｔ2 が周期Ｔの動作範囲内にあるか否かを判定する。動作範囲外であればステップＳ３５に移行し「ｔ2 の再入力」を表示し、ステップＳ３３に移行して再入力を行う。動作範囲内であればステップＳ３６に移行して「最小圧保持時間ｔ2 」の表示と、主制御装置２３０のメモリへの記憶を行う。
【００９３】
ステップＳ３７では入力された周期Ｔと時間（ｔ1 ＋ｔ2 ）の差時間を２分して加圧、減圧時間ｔ3 を演算する。ステップＳ３８では時間ｔ3 が動作範囲内にあるか否かを判定する。動作範囲外にあるとき、周期Ｔ、時間ｔ1 、ｔ2 の値が適切なものでないと判断し、ステップＳ２５に戻る。時間ｔ3 が動作範囲内にあるとき、演算された時間ｔ3 を主制御装置２３０のメモリに格納し、ステップＳ３９において「加圧、減圧時間ｔ3 」を表示する。ステップＳ４０では加圧、減圧時に緩急の変化を付けるか否かの入力を行う。ステップＳ４１において緩急を付けるときにはステップＳ４２に移行し、緩急を付けないときはステップＳ４６に移行する。ステップＳ４２では加圧、減圧時に緩急を付けるための変化量の入力が行われる。ステップＳ４３では入力された変化量が動作可能か否かを判定する。動作不能のときはステップＳ４４に移行し「加圧、減圧変化量の再入力」を表示してステップＳ４２に移行して再入力を行う。また、動作可能であればステップＳ４５に移行して「加圧、減圧量」の表示と、主制御装置２３０のメモリへの記憶とを行う。このとき、圧力変位のシュミレーション画面を表示させても良い。
【００９４】
ステップＳ４６では最小圧力Ｐｍｉｎを入力する。ステップＳ４７では圧力印加装置１６が実行可能な範囲内にあるか否かを判定する。実行範囲外であればステップＳ４８に移行し「最小圧力Ｐｍｉｎの再入力」を表示し、ステップＳ４６で再入力が行われる。また、実行範囲内であればステップＳ４９に移行し「最小圧力Ｐｍｉｎ」の表示と、主制御装置２３０のメモリへの記憶を行う。
【００９５】
ステップＳ５０では最大圧力Ｐｍａｘを入力し、ステップＳ５１では圧力印加装置１６が実行可能な範囲内にあるか否かを判定する。実行範囲外であればステップＳ５２に移行し「最大圧力Ｐｍａｘの再入力」を表示し、ステップＳ５０で再入力が行われる。また、実行範囲内であればステップＳ５３に移行し「最大圧力Ｐｍａｘ」の表示と、主制御装置２３０のメモリへの記憶を行う。
【００９６】
ステップＳ５４では圧力チャンバ６０の制御温度ｃｔが入力される。ステップＳ５５では実行可能な範囲内にあるか否かが判定される。実行範囲外であればステップＳ５６に移行し「温度ｃｔの再入力」を表示し、ステップＳ５４で再入力を行う。また、実行範囲内であればステップＳ５７に移行し「温度ｃｔ」の表示と主制御装置２３０のメモリへの記憶を行う。
【００９７】
ステップＳ５８では培養回路ユニット４の培養液３の循環流量ｆを入力する。ステップＳ５９では実行可能な範囲内にあるか否かが判定される。実行範囲外であればステップＳ６０に移行し、「循環流量ｆの再入力」を表示して告知し、ステップＳ５８で再入力を行う。また、実行範囲内であればステップＳ６１に移行し「循環流量ｆ」の表示と、主制御装置２３０のメモリへの記憶を行う。
【００９８】
ステップＳ６２では運転時間の入力を行う。ステップＳ６３では「運転時間」の表示と、主制御装置２３０のメモリへの記憶を行う。
【００９９】
ここで、圧力印加装置１６における加圧ピストン１１６と細胞５或いは組織に加えられる圧力との関係を説明すると、加圧ピストン１１６の断面積をＡ（cm2 ）、圧力をＰ（kg／cm2 ）、力をＦ（kgf ）とすると、力Ｆは、Ｆ＝Ｐ×Ａとなり、加圧用スプリング１１８のバネ定数をＫ（ kgf／mm）、そのバネ収縮量をＬ2 （mm）とすると、力Ｆは、Ｆ＝Ｋ×Ｌ2 であるから、
0004607432.tif 000002
となる。即ち、加圧ピストン１１６が移動するとき、加圧用スプリング１１８の弾性力が加圧ピストン１１６に作用し、加圧ピストン１１６は圧力チャンバ６０内の加圧水６５を圧縮する。圧縮されることにより圧力チャンバ６０内は圧力が上昇し、圧力センサ１１２でその圧力が検出される。この加圧ピストン１１６の変位、即ち、移動量（mm）と圧力Ｐ（kg／cm2 ）との関係は、例えば、図１０のようになる。図１０において、Ｌ1 はモータ１２２による移動量、Ｌ2 は加圧用スプリング１１８の収縮量、Ｌ3 は加圧用スプリング１１８を用いない場合の加圧ピストン１１６の移動量、Ｌ4 は混入している空気の収縮による加圧ピストン１１６の移動量、Ｌ5 は水の収縮による加圧ピストン１１６の移動量、Ｌ6 は培養チャンバ２０及び圧力チャンバ６０の容器の変形による加圧ピストン１１６の移動量を示している。Ｌ3 はＬ4 、Ｌ5 、Ｌ6 の総和であり、Ｌ1 はＬ2 、Ｌ3 の総和を表している。この圧力印加装置１６による加圧ピストン１１６の移動量と、圧力センサ１１２の圧力値の関係を主制御装置２３０のメモリに格納する。
【０１００】
空気の収縮による加圧ピストン１１６の移動量を説明すると、空気の容積（１気圧時）をＶ（cm3 ）、空気の容積（加圧時）をＶa （cm3 ）とし、１×Ｖ＝（Ｐa ＋１）×Ｖa ＝一定とすると、空気の容積Ｖa は、Ｖa ＝Ｖ／（Ｐa ＋１）となり、空気の収縮による加圧ピストン１１６の移動量Ｌ4 （mm）は、
0004607432.tif 000003
となる。
【０１０１】
また、水及び培養液３の圧縮による加圧ピストン１１６の移動量は以下のようになる。即ち、水及び培養液３の体積をＷ（cm3 ）、水の圧縮率（４０°Ｃ）を０．４４×１０-5（ cm2／kg）とすると、水及び培養液３の圧縮量ΔＷ（cm3 ）は、ΔＷ＝０．４４×１０-5×Ｐ×Ｗとなり、水及び培養液３の圧縮による加圧ピストン１１６の移動量Ｌ5 （mm）は、
0004607432.tif 000004
となる。ここで、圧力容器２２及び培養容器６１の変形によるみかけの収縮率をＣt とすると、収縮量ΔＷt は、ΔＷt ＝Ｗ×Ｃt であるから、容器の変形による加圧ピストン１１６の移動量Ｌ6 は、
0004607432.tif 000005
となる。したがって、加圧ピストン１１６の総移動量は式（１）、（２）、（３）及び（４）を加算した値Ｌ1 となる。
【０１０２】
また、圧力緩衝装置１８側では、緩衝スプリング１５４に加える圧力を減らしていくと、培養チャンバ２０内の圧力が、圧力逃し弁２６にかかる圧力に打ち勝ち、圧力逃し弁２６が開き、培養液３が圧力逃し弁２６を通過し、培養チャンバ２０側の圧力が低下する。緩衝スプリング１５４の加圧力と培養液３側の圧力が釣り合ったところで落ち着く。圧力緩衝装置１８の圧力逃し弁２６に加えられる力を説明すると、圧力逃し弁２６による閉塞面積をＢ（cm2 ）、圧力をＰ（kg／cm2 ）、圧力Ｐと釣り合う力をＦ（kgf ）とすると、Ｆ＝Ｐ×Ｂとなり、緩衝スプリング１５４のバネ定数をＫ（ kgf／mm）、緩衝スプリング１５４の縮み量をｍ（mm）とすると、釣り合う力ＦはＦ＝Ｋ×ｍとなり、緩衝スプリング１５４の縮み量ｍはｍ＝Ｐ×Ｂ／Ｋによって表される。図１１は、圧力逃し弁２６側に加える圧力、即ち、アクチュエータ１５６側の移動量（緩衝スプリング１５４の縮み量）と圧力逃し弁２６に作用する圧力、即ち、調整圧力との関係を示す。図１１において、ｍ1 は単一の緩衝スプリング１５４を用いた場合、ｍ2 は緩衝スプリング１５４に異なる２つのスプリングを用いた場合を示している。
【０１０３】
送液装置１２の容積が小さいため、培養液３の収縮や容器の変形、気体の収縮等はほとんど無視することができる。そのため、送液ピストン１３２の送液量Ｖ（ml）は送液ピストン１３２の断面積Ｃ（cm2 ）、移動量ｌ（cm）とすると、Ｖ＝Ｃ×ｌであるので、移動量ｌはｌ＝Ｖ／Ｃとなり、送液量に応じて移動量が決定する。送液装置１２の送液ピストン１３２の移動量が多い場合は、送液ピストン１３２の移動後すぐに元の位置に戻すが、培養液３の移動量が少ない場合は戻さず、次の送液動作のときはその位置からさらに送液ピストン１３２を移動させ、移動不可能な位置まで移動したら元の位置に戻す。このとき、設定の降下圧力の許容値より高くなった場合は運転前に記憶した圧力逃し弁２６のアクチュエータ１５６の移動量と圧力の関係のデータをこの値を元に補正する必要がある。
【０１０４】
次に、図１２は、図６のステップＳ３で実行される圧力可変培養モードの実行形態を表している。即ち、図１２は、培養チャンバ２０に印加される圧力状態と加圧タイミングを表すタイミングチャートであって、（ａ）は培養チャンバ２０の圧力推移、（ｂ）は圧力緩衝装置１８の動作タイミング、（ｃ）は圧力印加装置１６の加圧タイミング、（ｄ）は培養液供給装置６の送液タイミングを示している。
【０１０５】
培養チャンバ２０は周期Ｔで最大圧力Ｐｍａｘと最小圧力Ｐｍｉｎの間で加圧、減圧が繰り返される。ｔ1 は最大圧力Ｐｍａｘを保持する時間であり、ｔ2 は最小圧力Ｐｍｉｎを保持する時間である。また、ｔ3 は加圧、減圧時の動作時間である。これら最大圧力Ｐｍａｘ、最小圧力Ｐｍｉｎ、時間ｔ1 、ｔ2 、ｔ3 は生体内の外部培養させる部位に応じて任意に変更することができる。また、培養すべき細胞５における生体の年齢、性別、身長、体重、生体内の部位等のデータによって適切な数値を選択して加圧、減圧を行うこともできる。
【０１０６】
圧力緩衝装置１８は加圧を開始する前に時間ｔ5 で最大速力にて最大圧力Ｐｍａｘを得られる位置まで動作させてチューブ５０Ｃを閉塞する。その後、ｔ4 の遅延時間を経て圧力印加装置１６の動作を開始し、時間ｔ3 に相当する速度で最小圧力Ｐｍｉｎから最大圧力Ｐｍａｘまで加圧を行う。
【０１０７】
最大圧力Ｐｍａｘの時間ｔ1 で保持した後、圧力印加装置１６が再び動作し、時間ｔ3 に相当する速度で最大圧力Ｐｍａｘから最小圧力Ｐｍｉｎまで減圧を開始する。圧力印加装置１６が動作してから時間ｔ6 だけ遅延して圧力緩衝装置１８が時間ｔ7 だけ動作して、チューブ５０Ｃの閉塞力を解除する。
【０１０８】
また、圧力制御を開始したとき、圧力０付近から最大圧力Ｐｍａｘまで増加させる。このとき、圧力緩衝装置１８は最大速度で閉塞位置まで移動し、時間ｔ9 経過後に圧力印加装置１６を動作させ、時間ｔ3 に相当する速度で最大圧力Ｐｍａｘに到達するまでの時間ｔ8 の間加圧を行う。
【０１０９】
最小圧力Ｐｍｉｎに保持されてから時間ｔ11の経過後に培養液供給装置６が時間ｔ12だけ動作して培養液３を培養チャンバ２０に送出する。時間ｔ12を変更することにより送液量を任意に設定することができる。送液後、時間ｔ13だけ経過後に時間ｔ12とほぼ等しい時間ｔ14の間、送液ピストン１３２を後退させる。なお、この例では最小圧力Ｐｍｉｎの保持時間ｔ2 で送液を行ったが、最大圧力Ｐｍａｘの保持時間ｔ1 又は加圧、減圧時間ｔ3 で送液を行っても良い。
【０１１０】
次に、図１３は、図６のステップＳ３で実行される圧力可変培養モードの他の実行形態を表している。即ち、図１３は、培養チャンバ２０に印加される圧力状態と加圧タイミングを表すタイミングチャートであって、（ａ）は培養チャンバ２０の圧力推移、（ｂ）は圧力緩衝装置１８の動作タイミング、（ｃ）は圧力印加装置１６の加圧タイミング、（ｄ）は培養液供給装置６の送液タイミング、即ち、培養チャンバ２０に印加する圧力パターンの変形例を示す。
【０１１１】
この例では、加圧、減圧時間ｔ3 に、加圧速度、減圧速度を２次関数的に変動させて緩急を付けた圧力印加パターンを送出させたものであり、圧力変動に緩急を付けることにより、例えば歩行時の膝の軟骨にかかる圧力パターンを再現することができる。この場合、圧力印加装置１６は時間ｔ15、ｔ16、ｔ17に示されるように動作速度が変更され、時間ｔ3 において加圧力に緩急が加えられる。その他の動作は、図１２の動作と同様であるので、その説明を省略する。
【０１１２】
次に、図１４ないし図２１は、本発明の細胞又は組織の培養装置の第２の実施形態を示し、図１４は培養装置の正面側配置、図１５は培養装置の側面側配置、図１６は培養装置の要部、図１７は培養回路ユニット４、図１８は培養回路ユニット４を除いた培養装置の要部、図１９は圧力印加装置１６、図２０は培養液供給装置６、図２１は圧力緩衝装置１８を示している。第１の実施形態と同一部分には同一符号を付してある。
【０１１３】
この培養装置は単一のハウジング２６０を以て構成され、ハウジング２６０は培養室２６２、機械室２６４及び制御・電源室２６６に区画されている。培養室２６２の内部には培養庫４２が収容されており、培養庫４２内の構成は第１の実施形態と同様であるが、異なる点は、培養液供給装置６、圧力印加装置１６及び圧力緩衝装置１８等が単一の処理部２６８で構成されている。
【０１１４】
培養室２６２及び機械室２６４には独立して開閉されるドア２７０、２７２が設けられ、機械室２６４には培養液供給装置６、圧力印加装置１６及び圧力緩衝装置１８の機構部分とともに加圧水槽６８等が収容されており、各アクチュエータ１２０、１３８、１５６は、図１５に示すように、共通の取付板２６９で機械室２６４の背面側に支持されている。機械室２６４の壁面には、給水口２７４、排水口２７６が設けられている。制御・電源室２６６には制御装置４０及び電源装置が収容されており、その前面パネル側に表示装置２３２とともに電源スイッチ２７８が設置されている。
【０１１５】
次に、図１６に示すように、培養室２６２には培養庫４２が収容されており、培養庫４２には培養回路ユニット４及び処理部２６８が収容されている。処理部２６８には、図１７及び図１８に示すように、培養回路ユニット４側の処理ユニット２８０が着脱可能に構成されている。
【０１１６】
次に、図１９は、培養チャンバ２０を構成する培養容器６１、圧力容器２２を含む圧力印加装置１６を示している。この場合、圧力印加装置１６のアクチュエータ１２０は、ハウジング２８２にボールスクリュ２８４を取り付け、このボールスクリュ２８４の後端部にモータ１２２をカップリングジョイント２８６で結合したものである。ボールスクリュ２８４には回転によって前後動する移動ベッド２８８が設けられ、この移動ベッド２８８とボールスクリュ２８４の前端部側に設けられた支持フランジ２９０との間に重合させた２つの加圧用スプリング１１８Ａ、１１８Ｂが設置されている。即ち、加圧用スプリング１１８Ａ、１１８Ｂは、ボールスクリュ２８４の回転に応じて移動する移動べッド２８８により圧縮状態が変化し、各加圧用スプリング１１８Ａ、１１８Ｂの弾性特性が加圧ピストン１１６側に作用する。ボールスクリュ２８４に代えてベルトやカム等でアクチュエータ１２０を構成しても良い。
【０１１７】
次に、図２０は、培養液供給装置６を示している。アクチュエータ１３８は、ハウジング２９１にボールスクリュ２９２を取り付け、このボールスクリュ２９２の後端部にモータ１４０をカップリングジョイント２９４で結合したものである。ボールスクリュ２９２には回転によって前後動する移動ベッド２９６が設けられ、この移動ベッド２９６に取り付けられたピストン押板２９８の前面部には送液ピストン１３２の後端部が接触している。即ち、モータ１４０によるボールスクリュ２９２の回転に応じて移動する移動べッド２９６が前進することにより、加圧用スプリング１３６が圧縮されると、送液ピストン１３２が前進し、移動べッド２９６が後進することにより、加圧用スプリング１３６の圧縮が解かれ、加圧用スプリング１３６の復帰力によって送液ピストン１３２が後退する。送液ピストン１３２の進退によって培養液３を送り出すことができる。
【０１１８】
次に、図２１は、圧力緩衝装置１８を示している。アクチュエータ１５６は、ハウジング３００にボールスクリュ３０２を取り付け、このボールスクリュ３０２の後端部にモータ１５８をカップリングジョイント３０４で結合したものである。ボールスクリュ３０２には回転によって前後動する移動ベッド３０６が設けられ、この移動ベッド３０６には重合させた緩衝スプリング１５４Ａ、１５４Ｂを介してプランジャ押板３０８が取り付けられ、このプランジャ押板３０８の前面部には圧力逃し弁２６のプランジャ１５２の後端部が接触している。即ち、モータ１５８によるボールスクリュ３０２の回転に応じて移動する移動べッド３０６が前進することにより、緩衝スプリング１５４Ａ、１５４Ｂとともにプランジャ押板３０８を前進させ、緩衝スプリング１５４Ａ、１５４Ｂの圧縮状態が変化する。即ち、弁体１５０が圧縮状態にある緩衝スプリング１５４Ａ、１５４Ｂを介して押し付けられ、圧力逃し弁２６が閉塞状態に保持される。この保持状態は、ボールスクリュ３０２の回転と、それに伴う緩衝スプリング１５４Ａ、１５４Ｂの圧縮状態によって変化する。
【０１１９】
次に、図２２は、培養液供給装置６の変形例を示している。図２、図３及び図１４に示す培養液供給装置６では、送液ピストン１３２に加圧用スプリング１３６を設置したが、加圧用スプリング１３６を除き、アクチュエータ１３８のボールスクリュ２９２で移動する移動ベッド２９６に連結シャフト３１０を取り付け、この連結シャフト３１０の先端に送液ピストン１３２の後端部を固定ピン３１２等の固定手段を以て連結するようにしても良い。このように構成しても、ボールスクリュ２９２の正逆転によって送液ピストン１３２を進退させることができる。
【０１２０】
次に、図２３は、本発明の細胞又は組織の培養装置の第３の実施形態を示している。この実施形態では、圧力印加装置１６の圧力容器２２で形成される圧力チャンバ６０の内部に図示しないコンプレッサから矢印Ｐｒで示すように、加圧空気を圧力調整器３１４、昇圧バルブ３１６及びニードルバルブ３１８を備えた管路６７を通して作用させ、圧力チャンバ６０内の加圧空気をニードルバルブ３２０及び降圧バルブ３２２を備えた回収管路１０２を通して排出させ、チューブ５０Ｄ側に弁１１（図１）又はピンチバルブ１６２（図２）に代えて、アクチュエータ３２１の回転によって開閉されるバルブ３２３を設けても良い。バルブ３２３を間欠的に閉塞させる動作と、加圧空気を作用させて受圧膜６４を加圧する動作とを併用することにより、細胞５に加圧刺激を加えることができる。この場合、加圧刺激に変化を付与するには、昇圧バルブ３１６及び降圧バルブ３２２の開閉制御によって行うことができる。このような空気を用いた場合には、低圧では単位移動量あたりの圧力変化量を小さく、また、高圧では単位移動量あたりの圧力変化量を大きくできるとともに、細胞又は組織に圧力を印加する際、モータやアクチュエータ等から発生する不要な振動の吸収が可能となり、細胞又は組織に対する加圧刺激の精度を高めることができる。
【０１２１】
次に、図２４及び図２５は、本発明の細胞又は組織の培養装置の第４の実施形態を示している。培養すべき細胞５はコラーゲン等から成形された足場７に移植されており、足場７毎に培養チャンバ２０に格納される。培養チャンバ２０には培養液３が培養液槽４９から培養回路ユニット４を通して供給される。培養回路ユニット４は、閉回路を構成しており、この培養回路ユニット４には、送液装置１２としてのポンプ３２４、圧力センサ３２６及び圧力緩衝装置１８が設けられている。圧力センサ３２６の検出圧力は圧力制御器３２８に加えられ、その検出圧力に応じた制御出力が圧力制御器３２８からポンプ３２４に加えられている。
即ち、培養液３の圧力Ｐが一定に制御されている。
【０１２２】
また、圧力緩衝装置１８は、培養回路ユニット４の一部に挿入された圧力逃し弁２６の弁体１５０のプランジャ１５２に緩衝スプリング１５４を介在してアクチュエータ１５６を取り付け、このアクチュエータ１５６にモータ１５８を連結したものである。モータ１５８の回転、即ち、正転、逆転、停止及び回転速度が制御装置４０によって制御される。即ち、モータ１５８の回転がボールスクリュ３０２に伝達され、ボールスクリュ３０２の回転によって移動ベッド３０６がその回転方向に応じて前後に移動する。この移動は、緩衝スプリング１５４を介して弁体１５０のプランジャ１５２に伝達されるので、弁体１５０の閉止力が移動ベッド３０６の位置及び緩衝スプリング１５４の圧縮力によって設定される。ポンプ３２４による培養液３の圧力が弁体１５０の閉止力に打ち勝つとき、弁体１５０が開かれ、圧力逃し弁２６を培養液３が通過する。
【０１２３】
そして、培養液槽４９には、酸素又は二酸化炭素等のガスを取り入れる空気管路３３０が設けられ、空気管路３３０には雑菌、異物等の侵入を防止するフィルタ３３２が設けられている。即ち、空気管路３３０から取り入れられた酸素又は二酸化炭素は培養液３とともに培養チャンバ２０の細胞５に伝達される。
【０１２４】
このような構成によれば、ポンプ３２４を駆動することにより、培養液３が培養回路ユニット４に供給されて培養チャンバ２０に通流し、細胞５に必要な養分と酸素又は二酸化炭素等のガスを供給する。圧力緩衝装置１８を駆動することにより培養回路ユニット４が閉塞され、ポンプ３２４から培養液３に加えられる圧力によって培養チャンバ２０内の圧力が上昇する。圧力緩衝装置１８の緩衝力、即ち、弁体１５０の閉止力の調整によって、ポンプ３２４から加えられた圧力と平衡する任意の圧力値を得ることができる。
【０１２５】
図２５はこの加圧動作を示している。圧力緩衝装置１８を周期的に動作させることにより、最大圧力Ｐｍａｘと最小圧力Ｐｍｉｎを交互に細胞５に付与することができる。即ち、細胞５には最大圧力Ｐｍａｘが時間ｔ1 、最小圧力Ｐｍｉｎが時間ｔ2 、また、昇圧時間ｔ3 及び降圧時間ｔ3 が設定され、生体と同様に培養液３の圧力循環が得られ、生体と同等の成長環境が実現される。そして、圧力緩衝装置１８の動作速度を制御することにより、時間ｔ1 、ｔ2 、ｔ3 を任意に調整でき、培養する細胞５の特性や生体部位に応じた最適状態を実現することができる。
【０１２６】
【発明の効果】
以上説明したように、本発明によれば、次の効果が得られる。
ａ  生体内環境を模倣した環境下で汚染されることなく効率良く培養することができ、体内組織に近い、しかも、体内組織と融合し易い細胞又は組織を培養することができる。
ｂ  生体の細胞又は組織を特定の培養位置に保持し、生体を模倣した環境下に設定して培養液を連続的又は断続的に供給し、連続、間欠又は周期的に変化する圧力を加えることにより、修復すべき生体の部位に対応した理想的かつ実用的な組織、即ち、体内組織に近く、体内組織と融合し易い組織の培養を実現することができる。
ｃ  培養すべき細胞又は組織を培養液中に浮遊又は非浮遊の状態で保持し、極めて安定した状態で効率的な培養を行うことができる。
ｄ  細胞又は組織を培養液中に浮遊状態でハイドロジェル、又は足場によって保持するので、細胞又は組織の培養を促進することができる。
ｅ  培養液を培養すべき細胞又は組織に応じた、例えば、各種アミノ酸、糖類、塩類又はタンパク質の１つ又はこれらから選択された２以上の物質又は全てを含んで構成したものを用いるので、効率的な培養や品質の良い細胞又は組織を培養することができる。
ｆ  培養環境を生体の部位の生理的条件、又はこの生理的条件に加えて年齢、身長、体重、性別、その他の生体毎の固有情報に応じて設定するので、体内組織と融合し易い細胞又は組織を培養することができる。
ｇ  窒素、酸素又は二酸化炭素等のガスの供給及び制御、温度又は湿度の設定及び制御により生体環境を設定するので、生体に近い環境制御を実現でき、体内組織に近い、しかも、体内組織と融合し易い細胞又は組織の培養に寄与することができる。
ｈ  修復すべき生体の部位に対応して圧力を加えることにより、理想的かつ実用的な細胞又は組織を形成することができる。
ｉ  圧力のパターンを連続、間欠又は周期的に変化する形態とし、それを選択し、又は組み合わせることにより、理想的な物理的刺激を実現することができ、細胞の代謝機能や分裂サイクル、生物刺激の濃度勾配や分散に影響を与え、培養の促進を図ることができる。
ｊ  培養回路は、培養すべき細胞又は組織を培養チャンバに収容して外気と遮断された細胞又は組織に必要な培養液を供給するので、外気と遮断された細胞又は組織は、菌体等の汚染から防護され、その結果、品質の良い組織を培養することができる。また、細胞又は組織は、培養液による静水圧と流れによる物理的刺激に加え、加圧手段によって所望の圧力が付与されるので、細胞の代謝機能、分裂サイクル、生物刺激の濃度勾配や分散に影響を受け、細胞又は組織の培養を促進することができる。また、細胞又は組織への培養液の供給形態は培養液供給手段によって任意に設定され、間欠的又は連続的に供給することができるので、バリエーションのある物理的刺激によって培養の促進を図ることができる。
ｋ  加圧手段又は培養液供給手段は、任意に制御することができ、コンピュータ等の制御手段を用いることにより、フィードバック制御やフィードフォワード制御等の各種のプログラム制御を行うことにより、生体環境を模倣するとともに、所望の環境を設定でき、効率の良い培養を行うことができる。
ｌ  圧力の加え方、即ち、圧力パターンは培養すべき細胞又は組織に対応して設定することにより、より効率的な培養を行うことができる。
ｍ  圧力パターンはあらゆる形態に設定でき、その選択及び組合せを以て効率的に細胞又は組織の培養を行うことができる。
ｎ  培養した細胞又は組織を収容する培養チャンバを備える培養ユニットは、培養装置本体と独立して分離、着脱可能であるので、外気と分離された培養ユニットとともに細胞又は組織を移動させることができ、移動中に菌体等による汚染から細胞又は組織を防護でき、生体の修復等の信頼性を高めることができる。
ｏ  培養空間である密閉空間が外気と遮断されることにより、所望のガスの供給による培養環境の設定が可能になるとともに、外気による汚染から細胞又は組織を防護することができる。
ｐ  密閉空間に収容される培養回路に窒素、酸素又は二酸化炭素等のガスを供給するとともに、培養回路に気体吸収部を備えることにより、ガスを細胞又は組織に付与することができ、ガスの供給及び制御によって生体環境を模倣することができる。
ｑ  密閉空間によって形成される培養空間に窒素、酸素又は二酸化炭素等のガスを充填させることにより、生体環境を模倣し、所望の培養空間を形成することができる。
ｒ  培養回路に必要な培養液を供給又は循環させるための培養液槽を備え、しかも、外気と遮断された密閉空間内に培養液槽を設置するので、培養液の汚染防止を図ることができる。
ｓ  受圧膜の設置により、培養チャンバに収容されている細胞又は組織に対し、外気と遮断した状態で加圧刺激を与えることができるとともに、生体環境を模倣した刺激等、所望の加圧刺激を実現できる。
ｔ  培養回路の一部を加圧した場合、その圧力調整を圧力緩衝手段で行えば、生体環境に近い物理的刺激を実現することができ、細胞又は組織の培養の促進を図ることができる。
ｕ  圧力の形成手段として、水圧、油圧又は空気圧の何れを用いても所望の加圧刺激を実現でき、生体環境を精度良く模倣することができる。
ｖ  培養液供給手段を送液チャンバに取り込んだ培養液を加圧して送り出す送液装置で構成すれば、培養回路に効率良く培養液を供給又は循環させることができ、この加圧量を制御することで所望の送液量を設定できる。
ｗ  培養液に加えられる圧力を緩衝するので、理想的な加圧刺激を細胞又は組織に付与することができ、例えば、圧力逃し弁を用いて、培養液の圧力を圧力逃し弁の制御により、圧力逃し弁を開いて培養液の圧力を降下させれば、培養液を汚染させることなく、理想的な圧力状態に制御することができる。
ｘ  培養回路が収容される密閉空間の温度及び湿度を制御し、生体環境に合致する培養空間を形成することができる。
ｙ  生体は外界からの音響的刺激を受けており、音波発生装置を併用することにより、生体環境を音響的に模倣することができ、しかも、培養チャンバに培養すべき細胞又は組織を注入する際に、超音波を併用して効率的かつ、信頼性の高い注入を行うこともできる。
ｚ  密閉空間に供給されるガス濃度を制御手段によって制御することにより、生体環境を模倣することができ、細胞又は組織の培養促進に寄与することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の細胞又は組織の培養装置の第１の実施形態を示すブロック図である。
【図２】細胞又は組織の培養装置を示す図である。
【図３】培養装置の培養回路ユニットの一部、培養液供給装置、圧力印加装置及び圧力緩衝装置を拡大して示した図である。
【図４】培養装置と培養回路ユニットとの分離状態を示す図である。
【図５】制御装置を示すブロック図である。
【図６】細胞又は組織の培養を示すフローチャートである。
【図７】細胞又は組織の培養における初期設定を示すフローチャートである。
【図８】細胞又は組織の培養における初期設定を示すフローチャートである。
【図９】細胞又は組織の培養における初期設定を示すフローチャートである。
【図１０】圧力印加装置における加圧ピストンの変位、移動量に対する圧力チャンバ内の圧力を示す図である。
【図１１】圧力逃し弁におけるアクチュエータの変位に対する弁の調整圧力を示す図である。
【図１２】圧力可変培養モードの実行形態を示すタイミングチャートである。
【図１３】圧力可変培養モードの他の実行形態を示すタイミングチャートである。
【図１４】本発明の細胞又は組織の培養装置の第２の実施形態を示す図である。
【図１５】図１４の培養装置の側面側を示す図である。
【図１６】培養装置本体の部分及び培養回路ユニットを示す図である。
【図１７】培養装置本体から分離した培養回路ユニットを示す図である。
【図１８】培養回路ユニットを外した培養装置本体の部分を示す部分断面図である。
【図１９】培養回路ユニットにおける圧力印加装置を示す部分断面図である。
【図２０】培養回路ユニットにおける培養液供給装置を示す部分断面図である。
【図２１】培養回路ユニットにおける圧力緩衝装置を示す部分断面図である。
【図２２】培養回路ユニットにおける培養液供給装置の他の構成例を示す部分断面図である。
【図２３】本発明の細胞又は組織の培養装置の第３の実施形態を示す図である。
【図２４】本発明の細胞又は組織の培養装置の第４の実施形態を示す図である。
【図２５】加圧制御を示す図である。
【図２６】従来の細胞又は組織の培養を示す図である。
【図２７】従来の他の細胞又は組織の培養を示す図である。
【符号の説明】
１  培養装置
２  密閉空間
３  培養液
４  培養回路ユニット（培養回路、培養ユニット）
５  細胞
６  培養液供給装置（培養液供給手段）
７  足場（保持手段）
８  培養加圧装置
９  培養液槽
１０  気体吸収装置（気体吸収部）
１２  送液装置
１６  圧力印加装置（加圧手段）
１８  圧力緩衝装置（圧力緩衝手段）
２０  培養チャンバ（培養位置）
２６  圧力逃し弁
３２  湿度調節装置（加湿手段）
３４  温度調節装置（加熱手段）
４０  制御装置（制御手段）
４２  培養庫
４８  培養液バッグ（培養液槽）
４９  培養液槽
５０Ａ〜５０Ｅ  チューブ
６０  圧力チャンバ
６４  受圧膜
１１４  音波発生装置
１２８  送液チャンバ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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