(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基部分が、次の式Ｉ：
【化１】
0004814904.tif 000021
（ただし、式Ｉ中、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素である。）
で表される基であるヌクレオシドが組み込まれてなる、光連結性核酸類（ただし、核酸類には、核酸、ペプチド核酸が含まれる）と、
核酸類混合物中に含まれる特定の塩基配列を有する標的核酸類とを、ハイブリッド形成させる工程、
ハイブリッド形成した光連結性核酸類と標的核酸類に、光照射を行って、光連結させる工程、
光連結されていない核酸類を洗浄によって除去する工程、
ハイブリッド形成した光連結性核酸類と標的核酸類に、光照射を行って、光開裂させる工程、
を含む、核酸類混合物中に含まれる特定の塩基配列を有する標的核酸類を、精製する方法。
【請求項２】
光連結されていない核酸類を洗浄によって除去する工程が、相補的二重鎖が解離する洗浄条件で洗浄することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
光連結性核酸類が、標識部位を備えている、請求項１〜２の何れかに記載の方法。
【請求項４】
光連結性核酸類が、担体に固定化されている、請求項１〜２の何れかに記載の方法。
【請求項５】
光連結させる工程の光照射が、３５０〜３８０ｎｍの範囲の波長の光照射によって行われる、請求項１〜４の何れかに記載の方法。
【請求項６】
光開裂させる工程の光照射が、３１０〜３４５ｎｍの範囲の波長の光照射によって行われる、請求項１〜５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
光連結させる工程が、緩衝作用のある塩を含む反応溶液中で行われる、請求項１〜６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
塩基部分が、次の式Ｉ：
【化２】
0004814904.tif 000022
（ただし、式Ｉ中、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素である。）
で表される基であるヌクレオシドが組み込まれてなる、標識部位を備えている、光連結性核酸類（ただし、核酸類には、核酸、ペプチド核酸が含まれる）。
【請求項９】
塩基部分が、次の式Ｉ：
【化３】
0004814904.tif 000023
（ただし、式Ｉ中、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素である。）
で表される基であるヌクレオシドが組み込まれてなる、担体に固定された、光連結性核酸類（ただし、核酸類には、核酸、ペプチド核酸が含まれる）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸類の配列選択的な精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定の塩基配列を備えた核酸類の精製と回収は、遺伝子工学でも重要な基本的な手段のひとつである。特定の塩基配列を備えた核酸類の精製と回収には、その特定の配列と相補的な塩基配列を有する核酸プローブとのハイブリッド形成（ハイブリダイゼーション）が、特定の塩基配列の特異的な認識を可能にする基本的原理として、永らく利用されてきている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００３】
しかし、実際のハイブリッド形成の条件下においては、核酸プローブ分子との会合を、完全な相補鎖としてハイブリッド形成する標的塩基配列の核酸類のみで生じさせることは難しい。すなわち、相補鎖として不完全な非標的塩基配列の核酸類に対しても、一定のミスマッチを含む不完全なハイブリッド形成をしてしまい、核酸プローブ分子との会合が生じることが知られている。このような核酸プローブとの意図しない会合（エラー）は、後の回収段階でノイズ（不純物）として出現する。このようなノイズが出現しないように、検出の特異性を高めようとすれば、不完全なハイブリッド形成を排除することが必要となる。
【０００４】
一方で、ノイズ（不純物）を低減させるためには、不完全なハイブリッド形成ができるだけ生じない条件下で処理を行うことになるが、このような条件下では目的とするハイブリッド形成もまた不安定なものとなって、その結果、標的とする核酸類の回収率が低下してしまう。
【０００５】
しかしながら、ハイブリッド形成による識別は平衡系における熱的安定性の差を利用しているものであって、完全なハイブリッド形成も不完全なハイブリッド形成もその違いは熱的安定性の違いに過ぎない。そのために、両者を区別する適切な条件は目的の塩基配列によって異なり、さらに適切な条件下でもなお、熱的安定性を変化させる条件は両者に均等に作用する。厳密な温度管理を行った実験条件下であっても、この点はかわらない。すなわち、平衡系におけるハイブリッド形成の熱的安定性の差のみを、両者の区別の原理として使用する限りは、温度管理等の条件を厳密に設定した実験条件下であってもなお、精製の純度と回収率のバランスで妥協して、一定のノイズ（不純物）を甘受せざるを得なかった。
【０００６】
さらに、近年では、新規創薬や遺伝子診断のために、一塩基置換した塩基配列を有する核酸類の精製と回収をするための技術が求められている。特に、ＤＮＡの一塩基多型をタイピングする技術には、医療診断の分野での期待が大きい。このために、一塩基の置換を識別できるほどの高い配列選択性と、実用可能な回収率とを両立させた精製と回収の技術が特に求められている。
【０００７】
また、近年では、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）と総称される翻訳を受けないＲＮＡの精製と回収をするための技術が求められている。このｎｃＲＮＡには、サイズが小さいためにマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる一群があり、また、従来はｐｏｌｙＡを有してしばしばスプライシングを受けることから単純にｍＲＮＡとされてきた分子の相当の割合がｍＲＮＡ型ｎｃＲＮＡと呼ばれる一群に属するとも言われている。しかし、これらのＲＮＡは、分子数が少なく多種類が存在していることに加えて、分解を受けやすく短命であるために、ごく短時間で精製と回収を進めなければならない。このために、ごく短時間で処理可能なＲＮＡの配列選択的な精製及び回収の技術が特に求められていた。
【非特許文献１】Lambert, K. N.; Williamson, V. M.  Nucleic Acids Res. 1993, 21, pp775-776.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の目的は、ごく短時間で行うことができ、高い配列選択性と回収率を両立させた、特定の塩基配列を備えた核酸類の精製及び回収の方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的のために、長年にわたって鋭意研究開発を行ってきた光連結技術を用いることを着想した。そして、本発明者らが開発した新規な人工塩基（人工核酸塩基）は、光連結と光開裂が可能であって、これがごく短時間の光照射で可能であることを見出し、この人工塩基（人工核酸塩基）を使用して、核酸類のハイブリッド形成、光連結、及び光開裂を組み合わせて行うことで、上記目的を達成できることを見いだした。
【００１０】
すなわち、新規な人工塩基を使用した光連結を利用し、完全なハイブリッド形成を行った場合にのみ特異的に光連結させ、もはやハイブリッド形成の維持に依存することなく共有結合的に連結された試料核酸類とプローブとを、相補的二重鎖が解離する条件で十分な洗浄を行った後に、光開裂を行うことによって、高い配列選択性と回収率を両立させて、特定の塩基配列を備えた核酸類の精製及び回収を行うことができた。この精製と回収は、新規な人工塩基を光連結し光開裂させることによって、ごく短時間で行うことができるものとなっている。
【００１１】
従って、本発明は次の［１］〜［９］にある。
［１］
塩基部分として、次の式Ｉ：
【００１２】
【化４】
0004814904.tif 000002
【００１３】
（ただし、式Ｉ中、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素である。）
で表される基を有する、光連結性核酸類（ただし、核酸類には、核酸、ペプチド核酸が含まれる）と、
核酸類混合物中に含まれる特定の塩基配列を有する標的核酸類とを、ハイブリッド形成させる工程、
ハイブリッド形成した光連結性核酸類と標的核酸類に、光照射を行って、光連結させる工程、
光連結されていない核酸類を洗浄によって除去する工程、
ハイブリッド形成した光連結性核酸類と標的核酸類に、光照射を行って、光開裂させる工程、
を含む、核酸類混合物中に含まれる特定の塩基配列を有する標的核酸類を、精製する方法。
［２］
光連結されていない核酸類を洗浄によって除去する工程が、相補的二重鎖が解離する洗浄条件で洗浄することによって行われる、［１］に記載の方法。
［３］
光連結性核酸類が、標識部位を備えている、［１］〜［２］の何れかに記載の方法。
［４］
光連結性核酸類が、担体に固定化されている、［１］〜［２］の何れかに記載の方法。
［５］
光連結させる工程の光照射が、３５０〜３８０ｎｍの範囲の波長の光照射によって行われる、［１］〜［４］の何れかに記載の方法。
［６］
光開裂させる工程の光照射が、３１０〜３４５ｎｍの範囲の波長の光照射によって行われる、［１］〜［５］の何れかに記載の方法。
［７］
光連結させる工程が、緩衝作用のある塩を含む反応溶液中で行われる、［１］〜［６］の何れかに記載の方法。
［８］
塩基部分として、次の式Ｉ：
【００１４】
【化５】
0004814904.tif 000003
【００１５】
（ただし、式Ｉ中、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素である。）
で表される基を有し、標識部位を備えている、光連結性核酸類（ただし、核酸類には、核酸、ペプチド核酸が含まれる）。
［９］
塩基部分として、次の式Ｉ：
【００１６】
【化６】
0004814904.tif 000004
【００１７】
（ただし、式Ｉ中、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素である。）
で表される基を有し、担体に固定された、光連結性核酸類（ただし、核酸類には、核酸、ペプチド核酸が含まれる）。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、高い配列選択性と回収率を両立させて、特定の塩基配列を備えた核酸類の精製及び回収を行うことができる。このために、新規創薬や遺伝子診断のために注目されている、一塩基置換した塩基配列を有する核酸類の精製と回収をも可能としている。
【００１９】
さらに、本発明による精製と回収は、人工塩基を光連結し光開裂させることによって、ごく短時間で行うことができるものとなっている。そのために、分解を受けやすく短命なＲＮＡをも対象として、精製と回収を可能としている。
【００２０】
このように、本発明による精製と回収は、高い配列選択性と回収率を両立させ、さらに短時間で行うことができるものとなっているために、特に、分子数が少なく多種類が存在していることに加えて分解を受けやすく短命である非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）に対しても、単離精製の途を拓くものである。特に、いわゆるｐｏｌｙＡを持たないＲＮＡに対しても、本発明による精製と回収は広くて適用できるものとなっており、画期的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明の実施の形態を挙げて、本発明を以下に詳細に説明する。本発明は以下に例示された実施の形態に限定されるものではない。
【００２２】
本発明は、塩基部分として、次の式Ｉ：
【００２３】
【化７】
0004814904.tif 000005
【００２４】
（ただし、式Ｉ中、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素である。）
で表される基を有する、光連結性核酸類（ただし、核酸類には、核酸、ペプチド核酸が含まれる）と、
核酸類混合物中に含まれる特定の塩基配列を有する標的核酸類とを、ハイブリッド形成させる工程、
ハイブリッド形成した光連結性核酸類と標的核酸類に、光照射を行って、光連結させる工程、
光連結されていない核酸類を洗浄によって除去する工程、
ハイブリッド形成した光連結性核酸類と標的核酸類に、光照射を行って、光開裂させる工程、
を含む、核酸類混合物中に含まれる特定の塩基配列を有する標的核酸類を、精製する方法にある。
【００２５】
このような工程によって、本発明による精製と回収は、高い配列選択性と回収率を両立させ、さらに短時間で行うことができるものとなっている。
【００２６】
式Ｉ中のＲａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、さらに好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、又はアルコキシカルボニル基である。アルコキシカルボニル基は、好ましくはＣ２〜Ｃ７、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ６、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ５、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ４、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ３、特に好ましくはＣ２のものを使用することができる。
【００２７】
式Ｉ中のＲ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、又は水素であり、さらに好ましくは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、又はアルコキシカルボニル基である。アルコキシカルボニル基は、好ましくはＣ２〜Ｃ７、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ６、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ５、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ４、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ３、特に好ましくはＣ２のものを使用することができる。
【００２８】
上の式Ｉで表される基は、本発明による新規な人工塩基（人工核酸塩基）である。この基を、塩基部分として有する核酸は、これによって光連結性を備えたものとなる。このような光連結性は、人工核酸塩基を塩基部分として有することによって付与されるので、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）であってもペプチド核酸であっても、このような光連結性の付与が可能である。光連結性核酸類は、通常の核酸の製造方法に準じて製造することができる。
【００２９】
光連結性を付与された核酸類（光連結性核酸類）は、その配列と相補的な配列の核酸類に対して、通常の核酸類と同様に、ハイブリッド形成することができる。すなわち、多数の核酸類の混合物中のうちで、特定の塩基配列を有する核酸類（標的核酸類）とハイブリッド形成することができる。言い換えれば、光連結性核酸類は、特定の塩基配列を有する標的核酸類の塩基配列と相補的な塩基配列の核酸類となるように作製される。
【００３０】
光連結性核酸類が、標的核酸類とハイブリッド形成をする場合に、式Ｉで表される人工塩基と塩基対を形成する位置に配置される塩基の種類は、どのようなものであってもよい。式Ｉで表される人工塩基（Ｋ）と対応する相手方の塩基の位置には、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕのいずれが配置されていても、光連結性核酸類と、標的核酸類とは、良好にハイブリッド形成をすることができる。式Ｉで表される人工塩基は、核酸類の塩基配列の中のいずれの位置に配置されていてもよい。光連結性核酸類と標的核酸類とは、ハイブリッド形成が可能なものであれば、同じ種類の核酸類であってもよく、異なる種類の核酸類であってもよい。
【００３１】
光連結性核酸類が、式Ｉで表される人工塩基を介して光連結可能な相手方の核酸類中の塩基は、ピリミジン環を有する塩基である。すなわち、Ｔ、Ｃ、Ｕを挙げることができる。このようにＵに対して光連結することからも、本発明は、ＲＮＡを標的核酸類として好適に実施可能なものとなっている。実施例においても示すように、本発明に係る光連結は、ハイブリッド形成したときに、式Ｉで表される人工塩基（Ｋ）と対応する相手方の塩基の位置から、相手方の鎖において一塩基だけ３’末端側の位置にある塩基に対して、生じる。
【００３２】
好適な実施の態様において、光連結性核酸類は、標識部位を備えていてもよい。標識部位としては、種々の標識を使用することができ、例えば、ビオチン標識、色素標識（蛍光色素標識を含む）、ＲＩ標識、酵素標識（発色酵素標識を含む）を使用することができる。このような標識部位を備えることによって、標的核酸類とクロスリンクした状態の光連結性核酸類を、容易に単離して回収することができる。
【００３３】
このような標識部分に使用される標識としては、本発明で可能となっている十分な洗浄にも耐えられる標識が好ましい。取り扱いの容易性と強い洗浄条件への耐性から、ビオチン標識又は蛍光色素標識が好ましい。ビオチン標識は、さらにアビジン部分を有する種々の標識を使用して、ビオチン−アビジン結合により検出して、あるいは固定化して、回収することができる。これらの標識部分の付加は、通常の製造方法によって行うことができる。光連結性核酸類は、通常は末端付近に、標識部分を有することが好ましいが、光連結及びハイブリッド形成に望ましくない影響を与えない範囲で、他のいずれの部位に標識部分を有することもできる。
【００３４】
好適な実施の態様において、光連結性核酸類は、担体に固定化されていてもよい。このように担体に固定化された光連結性核酸類を使用すれば、光連結した標的核酸類は担体に固定化されて、容易に単離して回収することができる。担体としては、生化学分野の固相担体として使用されるような種々の材質の材料を使用することができる。例えば、ガラス、多孔質ガラスなどの無機物質類、ポリスチレン（ＰＳ）などの樹脂類、金などの金属類などが挙げられる。好ましいものとして、アデノシン残基を有する固相担体（オリゴアフィニティーサポート（ＯＡＳ）など）、アルデヒド修飾ガラスなどが挙げられる。ガラスプレート、CPG、ポリスチレンビーズなどは好ましい。ＤＮＡチップの基材として使用される通常の材料は、好適に使用可能である。これらの材料は、このような目的に通常使用される種々の形状とすることができ、例えば、ビーズ状、粒子状、円筒状、繊維状、平面基板状とすることができる。
【００３５】
好適な実施の態様において、光連結性核酸類は、担体に直接に結合して固定化されていてもよいが、リンカー部分を介して担体に固定化されていてもよい。リンカー部分としては、核酸類の化学反応に不活性で、５個以上、好ましくは１０個以上の原子を有する、好ましくは直鎖状の分子種であればよい。リンカー部分としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなどの核酸や、ポリエチレングリコール、アルカン類などが好ましい。特にポリエチレングリコールが好ましく、ヘキサ（エチレングリコール）を好適に使用できる。担体に固定化された核酸類を製造する方法としては、核酸類の末端のリン酸基をリンカー部分に結合させて製造することができる。リンカー部分と核酸類を結合させて、次いで担体に結合してもよいし、逆に先に担体とリンカー部分を結合させて、次いでリンカー部分と核酸類とを結合させてもよい。核酸類と結合する位置は、通常は末端のリン酸基を用いるのが好ましいが、これに限定させるものではない。例えば、核酸類の途中の塩基部分の官能基と結合させてもよい。
【００３６】
光連結性核酸類と標的核酸類とをハイブリッド形成させる工程は、ハイブリッド形成に適した通常の条件（温度、ｐＨ、塩濃度、緩衝液等）で行うことができるが、その後に行われる、光照射を行って光連結させる工程と同じ反応溶液中で行うことが作業性の点から好ましい。
【００３７】
ハイブリッド形成した光連結性核酸類と標的核酸類とは、光照射を行うことによって、光連結させることができる。この光連結は、人工塩基部分の光反応によって、光連結性核酸分子と標的核酸類分子との間に、分子間の共有結合が形成されて生じることから、分子間の架橋（クロスリンク）にあたるものである。このようにクロスリンクが形成された分子と分子は、もはや単なる熱的な安定性のみで会合しているのではないので、相補的二重鎖が解離する条件におかれた場合でも、解離することなく結合している。
【００３８】
好適な実施の態様において、光連結させる工程は、緩衝作用のある塩を含む反応溶液中で行われる。緩衝作用のある塩としては、カコジル酸塩、リン酸塩、トリス塩をあげることができるが、本発明においては、特に、蛍光強度の強度増大の観点から、緩衝作用のある塩が、カコジル酸塩であることが好ましい。緩衝作用のある塩の濃度が５〜２５０ｍＭの範囲にあることが好ましく、特に１０〜１００ｍＭの範囲に有ることが好ましい。好適な実施の態様において、反応溶液のｐＨは、好ましくは６．５〜８．０、さらに好ましくは６．５〜７．５、特に好ましくは６．７〜７．３の範囲にある。好適な実施の態様において、反応溶液は、アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属の塩を含むことが好ましい。アルカリ金属及び／又はアルカリ土類金属の塩として、例えば、塩化ナトリウム、及び塩化マグネシウム、好ましくは塩化ナトリウムを挙げることができる。
【００３９】
光連結させる工程の光照射は、一般に３５０〜３８０ｎｍの範囲、好ましくは３６０〜３７０ｎｍの範囲、さらに好ましくは３６６ｎｍの波長を含む光が好ましく、特に好ましくは、３６６ｎｍの単波長のレーザー光である。好適な実施の態様において、光照射による光反応は、１秒から数秒以内、好ましくは１秒以内の反応時間で行われる。ただし、容器及び溶液の光透過性を考慮して、容器を攪拌しながら、さらに時間をかけて光照射を行うこともできる。
【００４０】
光連結させる工程の後に、光連結されていない核酸類を洗浄によって除去する工程が行われる。光反応によってクロスリンクが形成された分子と分子は、もはや単なる熱的な安定性のみで会合しているのではないので、相補的二重鎖が解離する条件におかれた場合でも、解離することなく結合しているために、光連結されていない核酸類を洗浄によって除去する工程が、好ましくは、相補的二重鎖が解離する洗浄条件で洗浄することによって行われる。
【００４１】
相補的二重鎖が解離する洗浄条件としては、一般に知られている相補的二重鎖の解離条件を使用することができる。例えば、温度は、８０〜１００℃、好ましくは９０〜１００℃、特に好ましくは９５〜１００℃の範囲の温度を使用することができる。温度は、共有結合を分解しないならば、沸点の値から達成可能な範囲で高いものであるほうがよい。ｐＨは、共有結合を分解しない範囲で特に制限はないが、共有結合の加水分解をもたらしにくいことから中性付近が好ましい。塩の種類及び塩濃度には、操作に不都合な試料の沈殿が生じない範囲で特に制限はなく、一般には適当な濃度の塩（例えば約０．１Ｍ  ＮａＣｌ）の存在は、相補的二重鎖の解離を促すために好都合である。また、相補的二重鎖の解離を促進するために、変性剤として、例えば、尿素を添加することができる。さらに、相補的二重鎖の解離を促進するために、界面活性剤として、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムを添加することができる。その他、相補的二重鎖の解離に寄与するとして知られる条件を使用することができる。
【００４２】
光連結されていない核酸類を洗浄によって除去する工程を、強い洗浄条件での洗浄によって行うことができることは、本発明の優れた特徴であるが、必ずしも常に強い条件とする必要はなく、予想される不純物（ノイズ）の程度によって、適切な洗浄条件を選択することができる。例えば、塩、界面活性剤、変性剤等を使用することなく、純水を使用して洗浄することもできる。
【００４３】
光連結されていない核酸類を洗浄によって除去する工程の後に、ハイブリッド形成した光連結性核酸類と標的核酸類に、光照射を行って光開裂させる工程を行うことによって、標的核酸類を回収することができる。これによって、最終的に、核酸類混合物中に含まれる特定の塩基配列を有する標的核酸類を、精製して回収することができる。本発明の光連結性核酸類による光連結と光開裂は可逆的なものであるために、このようにして得られた標的核酸類の分子は、もとの核酸類混合物中にあった状態から全く損なわれてはいない。さらに、本発明の光連結性核酸類による光連結と光開裂は可逆的なものであるために、光連結性核酸類の分子もまた、もとの状態から損なわれてはおらず、そのために、本発明によれば、光連結性核酸類は、繰り返して使用することができる。
【００４４】
光開裂させる工程の光照射は、一般に３１０〜３４５ｎｍの範囲、好ましくは３１０〜３４０ｎｍの範囲、さらに好ましくは３１０〜３３０ｎｍの範囲、さらに好ましくは３１０〜３２０ｎｍの範囲、さらに好ましくは３１２ｎｍの波長を含む光が好ましく、特に好ましくは、３１２ｎｍの単波長のレーザー光である。好適な実施の態様において、光照射による光反応は、１秒から数秒以内、好ましくは１秒以内の反応時間で行われる。ただし、容器及び溶液の光透過性を考慮して、容器を攪拌しながら、さらに時間をかけて光照射を行うこともできる。光開裂によって反応溶液中へと遊離した標的核酸類は、公知の方法によって回収することができる。
【００４５】
本発明で使用される光連結性核酸類は、塩基部分として、次の式Ｉ：
【００４６】
【化８】
0004814904.tif 000006
【００４７】
（ただし、式Ｉ中、Ｒａは、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立に、シアノ基、アミド基、カルボキシル基、Ｃ２〜Ｃ７のアルコキシカルボニル基、又は水素である。）
で表される基を有する、光連結性核酸類である。
【００４８】
このような光連結性核酸類には、
次の式ＩＩ：
【００４９】
【化９】
0004814904.tif 000007
【００５０】
（ただし、式ＩＩ中の、Ｒａ、Ｒ１、Ｒ２、式Ｉについて上述した通りである。）
で表されるヌクレオシド（リボヌクレオシド）が組み込まれてなる、核酸が含まれ、
さらに、次の式ＩＩＩ：
【００５１】
【化１０】
0004814904.tif 000008
【００５２】
（ただし、式ＩＩＩ中の、Ｒａ、Ｒ１、Ｒ２、式Ｉについて上述した通りである。）
で表されるヌクレオシド（デオキシリボヌクレオシド）が組み込まれてなる、核酸が含まれる。
【実施例】
【００５３】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５４】
［1.    312 nm光を用いた光クロスリンク体の光開裂反応］
光応答性核酸である3-cyanovinylcarbazole-1’-β-deoxyriboside (CNVK)の構造式を図１に示す。
【００５５】
チミンとの光クロスリンク体であるODN(ACNVK-GT) (20 μM)の水溶液(2 M Urea aq. : CH3CN = 1 : 1)で光開裂反応を行った(total volume: 30 μL)。トランスイルミネーターを用いて312 nm光を室温で、3分間照射した(Scheme 1)。その光反応物のHPLCの分析結果を図２に示す。同様にして、シトシンとの光クロスリンク体であるODN(GCNVK-GC) (20 μM)の水溶液(2 M Urea aq. : CH3CN = 1 : 1)で光開裂反応を行った(total volume: 30μL)。トランスイルミネーターを用いて312 nm光を室温で、3分間照射した(Scheme 2)。その光反応物のHPLCの分析結果を図３に示す。その経時変化を図４に示す。いずれの光開裂反応においても数分単位で効率よく反応が進行することがわかった。
【００５６】
【化１１】
0004814904.tif 000009
【００５７】
【化１２】
0004814904.tif 000010
【００５８】
［2.    312 nm光を用いた光クロスリンク体の光開裂反応 (70 °Cでの加熱)］
ODN(ACNVK-GT) (20 μM)の水溶液で光開裂反応を行った(total volume: 30 μL)。トランスイルミネーターを用いて312 nm光を70 °Cで、30分間照射した(Scheme 3)。その光反応物のHPLCの分析結果を図５に示す。その経時変化を図６に示す。水溶液での光開裂反応を行ったところ、Tをクロスリンク部位に持つクロスリンク体は30分で完全に反応が進行した。
【００５９】
【化１３】
0004814904.tif 000011
【００６０】
［3.    光遺伝子操作法によるDNAの配列選択的精製］
DNAの配列選択的精製の一例の概略を図７に示す。
【００６１】
DNAを配列選択的に精製するために、下記に示す2種類のDNAを1 μmolスケールで合成した。DNA合成した後、ポリスチレンビーズ(PS)を取り出し、アンモニア水を加えて55 °Cで15時間インキュベートし脱保護した。PSをMilliQで5回洗浄してpHを7にした。そして、SpeedVacで1時間かけて乾燥した。
【００６２】
ODN1(CNVK)-PS: 5’-ATGACNVKGCGT-SSS-PS-3’
ODN2(CNVK)-PS: 5’-GTAACNVKTTCC-SSS-PS-3’
【００６３】
Scheme 4に従い、固相を用いたDNAの配列選択的精製を行った。
【００６４】
【化１４】
0004814904.tif 000012
【００６５】
ODN(10)、ODN(15)、ODN(20)、ODN(25)に対してODN1(CNVK)-PS存在下で光照射を行った。反応条件はODN(10)、ODN(15)、ODN(20)、ODN(25)をそれぞれ25 μM、ODN1(CNVK)-PS (32 nmol/mg)を2 mg、カコジル酸バッファー(pH 7.0)を50 mM、NaClを1 Mとしてトータル溶液量を50 μLとした。光照射前の反応溶液をキャピラリーゲル電気泳動(CGE)で分析した(図８(a))。
【００６６】
この反応溶液に対して、0 °CでUV-LEDを用いて366 nm光を15分間(5分間ごとに反応溶液を攪拌)照射した。この反応溶液の上澄み溶液をCGEで分析した(図８(b))。上澄み溶液を取り出した後、超純水で5回洗浄した。得られた固相担体に超純水(50 μL)を加えて、312 nm光を15分間照射して、CGEで分析した(図８(c))。
ODN1(CNVK)-PSを用いた際に目的とするODN(20)を回収することができた。
【００６７】
Scheme 5に従い、固相を用いたDNAの配列選択的精製を行った。
【００６８】
【化１５】
0004814904.tif 000013
【００６９】
ODN(10)、ODN(15)、ODN(20)、ODN(25)に対してODN2(CNVK)-PS存在下で光照射を行った。反応条件はODN(10)、ODN(15)、ODN(20)、ODN(25)をそれぞれ25 μM、ODN2(CNVK)-PS (32 nmol/mg)を2 mg、カコジル酸バッファー(pH 7.0)を50 mM、NaClを1 Mとしてトータル溶液量を50 μLとした。光照射前の反応溶液をCGEで分析した(図９(a))。
【００７０】
この反応溶液に対して、0 °CでUV-LEDを用いて366 nm光を15分間(5分間ごとに反応溶液を攪拌)照射した。この反応溶液の上澄み溶液をCGEで分析した(図９(b))。上澄み溶液を取り出した後、超純水で5回洗浄した。得られた固相担体に超純水(50 μL)を加えて、312 nm光を15分間照射して、CGEで分析した(図９(c))。
ODN2(CNVK)-PSを用いた際に目的とするODN(25)を回収することができた。
【００７１】
［4.    CNVKを含むODNを用いたRNAとの光クロスリンク反応］
CNVKを含むODNを用いて光照射時間1秒での光クロスリンク反応を行った。ODN(ACNVK) (20 μM)とRNA(GU) (20 μM)の光クロスリンク反応を行った(sodium cacodylate 50 mM, NaCl 100 mM, total volume: 30 μL)。UV-LEDを用いて366 nm光を0 °Cで、1秒間照射した(Scheme 6)。その光反応物のHPLCの分析結果を図１０に示す。RNA(GU)を用いて1秒での光クロスリンク反応を行ったところ、収率86%で効率よく反応が進行し、1秒でのRNA光操作が可能であることがわかった。
【００７２】
【化１６】
0004814904.tif 000014
【００７３】
［5.    CNVKを含むODNを用いた8種類の光クロスリンク反応］
CNVKを含むODNを用いて光クロスリンク反応を行った。ODN(ACNVK) (10 μM)とRNA(XU) (X = A, G, C, U, 10 μM)の光クロスリンク反応を行った(sodium cacodylate 50 mM, NaCl 100 mM, total volume: 200 μL)。UV-LEDを用いて366 nm光を0 °Cで、20秒間照射してUPLCを用いて分析した。その結果を図１１(a)に示す。同様にして、Cが光クロスリンク部位となるCNVKを含むODNを用いて光クロスリンク反応を行った。ODN(GCNVK) (10 μM)とRNA(XC) (X = A, G, C, U, 10 μM)の光クロスリンク反応を行った(sodium cacodylate 50 mM, NaCl 100 mM, total volume: 200 μL)。UV-LEDを用いて366 nm光を0 °Cで、20秒間照射してUPLCを用いて分析した。その結果を図１１(b)に示す。これらの結果から、RNAとの光クロスリンク反応はクロスリンク相手がUとCである時に効率よく進行することがわかった。
【００７４】
［6.     312 nm光を用いたRNAとの光クロスリンク体の光開裂反応］
UまたはCが光クロスリンク部位である光クロスリンク体ODN(ACNVK)<>RNA(GU)あるいはODN(GCNVK)<>RNA(GC)を光反応によって調製してHPLCで分取した。そして、得られた光クロスリンク体と質量を測定した。
calcd. for ODN(ACNVK)<>RNA(GU): [(M + H)+] 5675.74, found 5675.25.
calcd. for ODN(GCNVK)<>RNA(GC): [(M + H)+] 5690.75, found 5690.68.
【００７５】
ODN(ACNVK)<>RNA(GU)の水溶液(2 M Urea aq. : CH3CN = 1 : 1)で光開裂反応を行った(total volume: 30 μL)。トランスイルミネーターを用いて312 nm光を室温で、1分間照射した(Scheme 7)。その光反応物のHPLCの分析結果を図１２に示す。同様にして、ODN(GCNVK)<>RNA(GC)の水溶液(2 M Urea aq. : CH3CN = 1 : 1)で光開裂反応を行った(total volume: 30 μL)。トランスイルミネーターを用いて312 nm光を室温で、3分間照射した(Scheme 8)。その光反応物のHPLCの分析結果を図１３に示す。312 nm光を用いて光開裂反応を行ったところ、Uをクロスリンク部位に持つクロスリンク体は1分で完全に反応が進行した。また、312 nm光を用いて光開裂反応を行ったところ、Cをクロスリンク部位に持つクロスリンク体は3分で完全に反応が進行した。
【００７６】
【化１７】
0004814904.tif 000015
【００７７】
【化１８】
0004814904.tif 000016
【００７８】
［7.    ビニルカルバゾールを塩基部位に持つODN の合成］
次のScheme 9 に従い合成を進めた。以下の説明において、化合物に付した番号で化合物を表す場合がある。
【００７９】
【化１９】
0004814904.tif 000017
【００８０】
［3-Iodocarbazole (1) ］
carbazole (2.50 g, 15.0 mmol)のエタノール溶液(500 mL)にNaIO4 (0.80 g, 3.75 mmol)とI2 (1.89 g, 7.45 mmol)を順に加えた後、H2SO4 (1.60 mL, 30.0 mmol)のエタノール溶液(100 mL)を加えて、反応溶液を65 °C で1 時間環流した。TLC (HexH : AcOEt = 4 : 1) で原料の消失を確認し、NaOH (1.4 g) のエタノール溶液(100 mL)を加えて中和した。エタノールを除去した後、反応溶液をクロロホルムで2 回抽出し、水で2 回洗浄した。有機相をNa2SO4 で乾燥し、溶媒を除去した。カラムクロマトグラフィー(HexH : AcOEt = 4 : 1) で精製し、白色粉末として1 (3.06 g, 70%)を得て、白色粉末として3,6-diiodocarbazole (0.47 g, 7.5%)を得た。
1: 1H NMR (DMSO-d6) δ 11.4 (s, 1H), 8.49 (d, 1H, J = 1.7 Hz), 8.14 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.62 (dd, 1H, J = 8.4, 1.7 Hz), 7.48 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.40 (m, 1H), 7.33 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.16 (m, 1H).
3,6-Diiodocarbazole: 1H NMR (DMSO-d6) δ 11.5 (s, 1H), 8.56 (d, 2H, J = 1.7 Hz), 7.65 (dd, 2H, J = 8.5, 1.7 Hz), 7.34 (d, 2H, J = 8.5 Hz). 
【００８１】
［3-Cyanovinylcarbazole (2) ］
Triphenylphosphine (139 mg, 0.53 μmol)のジオキサン溶液(10 mL)にPalladium acetate (40.0 mg, 0.18 μmol)とTriethylamine (0.59 μL, 4.23 mmol)を順に加えて、75°C で5 分間撹拌した。1 (1.03 g, 3.52 mmol)のジオキサン溶液(15 mL)とAcrylonitrile (0.46 μL, 7.04 mmol)を加えて、反応溶液を11.5 時間環流した。TLC (HexH : AcOEt = 4 : 1) で生成物を確認した後、綿ろ過でPalladium 粉末を取り除いた。カラムクロマトグラフィー(HexH : AcOEt = 4 : 1) で精製し、白色粉末として2 (0.14 g, 18%, trans : cis = 97 : 3) を得て、白色粉末として1 (0.37 g, 回収率37%) を回収した。
2: 1H NMR (DMSO-d6) δ 11.6 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 8.11 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.75 (d, 1H, J = 16.7 Hz), 7.69-7.72 (m, 1H), 7.40-7.52 (m, 3H), 7.19-7.24 (m, 1H), 6.36 (d, 1H, J = 16.7 Hz). 
【００８２】
［3-Cyanovinylcarbazole-1’-β-deoxyriboside-3’,5’-di-(p-toluoyl)ester (3) ］
KOH (0.22 g, 3.87 mmol)とTDA-1 (11 mg, 34 μmol)のアセトニトリル溶液(20 mL)に室温で2 (0.26 g, 1.20 mmol)を加えて20 分間撹拌した。反応溶液にChlorosugar (0.53 g, 1.24 mmol)を加えて室温で20 分間撹拌し、TLC (HexH : AcOEt = 4 : 1)で原料の消失を確認した。沈殿物を除去した後、カラムクロマトグラフィー(CHCl3)で精製し、黄色オイルとして3 (0.23 g, 33%)を得た。
3: 1H NMR (CDCl3) δ 8.09 (s, 1H), 8.02 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.98 (d, 2H, J = 8.4 Hz),  7.62-7.65 (m, 1H), 7.62 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.49 (d, 1H, J = 16.5 Hz), 7.25-7.31 (m, 7H), 7.17-7.20 (m, 1H), 6.68 (dd, 1H, J = 9.3, 5.8 Hz), 5.78 (m, 1H), 5.76 (d, 1H, J = 16.5 Hz), 4.91 (dd, 1H, J = 12.4, 2.7 Hz), 4.78 (dd, 1H, J = 12.4, 3.3 Hz), 4.55-4.57 (m, 1H), 3.09-3.20 (m, 1H), 2.45-2.52 (m, 1H), 2.45 (s, 3H), 2.44 (s, 3H), HRMS (MALDI): calcd. for C36H30N2O5Na [(M+ Na)+] 593.2053, found 593.2018. 
【００８３】
［3-Cyanovinylcarbazole-1’-β-deoxyriboside (4) ］
3 (0.22 g, 0.39 mmol)のメタノール溶液(20 mL)に0.5 M methanolic NaOMe (2.3 mL, 1.2 mmol)とクロロホルム(5.0 mL)を加えて、反応溶液を室温で3.5 時間撹拌した。TLC (CHCl3 : MeOH = 9 : 1) で原料の消失を確認した。溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = 9 : 1) で精製し、白色粉末として4 (0.11 g, 81%)を得た。
4: 1H NMR (CDCl3) δ 8.12 (d, 1H, J = 1.7 Hz), 8.06 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 7.59 (d, 1H, J = 9.1 Hz), 7.43-7.57 (m, 4H), 7.26-7.31 (m, 1H), 6.64 (dd, 1H, J = 8.2, 6.9 Hz), 5.87 (d, 1H, J = 16.5 Hz), 4.77-4.82 (m, 1H), 3.95-4.06 (m, 3H), 2.95 (dt, 1H, J = 14.0, 8.2 Hz), 2.30 (ddd, 1H, J = 14.0, 6.9, 3.3 Hz), HRMS (MALDI): calcd. for C20H18N2O3Na [(M+ Na)+] 357.1215, found 357.1265. 
【００８４】
［5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-3-Cyanovinylcarbazole-1’-β-deoxyriboside (5) ］
ピリジン(1.0 mL × 2)で共沸した4 (97 mg, 0.29 mmol)にピリジン(0.5 mL)を加えた。反応溶液に4,4’-dimethoxytritylchloride (118 mg, 0.35 mmol) と4-(dimethylamino)pyridine (7.0 mg, 58 μmol)のピリジン溶液(1.0 mL)を加えて、反応溶液を室温で18 時間撹拌した。TLC (CHCl3 : MeOH = 95 : 5) で生成物を確認した後、ピリジンを除去した。カラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = 98 : 2) で精製し、黄色粉末として5 (113 mg, 61%)を得た。
5: 1H NMR (CDCl3) δ 8.07 (d, 1H, J = 1.7 Hz, 8.02-8.05 (m, 1H), 7.71 (d, 1H, J = 8.5 Hz), 7.62-7.65 (m, 1H), 7.45-7.52 (m, 3H), 7.33-7.37 (m, 4H), 7.25-7.28 (m, 4H), 7.12 (dd, 1H, J = 8.8, 1.7 Hz), 6.81 (dd, 4H, J = 8.8, 1.7 Hz), 6.61 (dd, 1H, J = 8.2, 6.3 Hz), 5.77 (d, 1H, J = 16.7 Hz), 4.80-4.82 (m, 1H), 4.05-4.07 (m, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.56-3.58 (m, 2H), 2.89 (dt, 1H, J = 13.8, 8.2 Hz), 2.23 (ddd, 1H, J = 13.8, 6.3, 2.7 Hz), 1.98 (d, 1H, J = 3.6 Hz), HRMS (MALDI): calcd. for C41H36N2O5Na [(M+ Na)+] 659.2522, found 659.2485. 
【００８５】
［5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-3-Cyanovinylcarbazole-1’-β-deoxyriboside-3’-O-(cyano ethoxy-N,N-diisopropylamino)phosphoramidite (6) ］
アセトニトリル(1.5 mL)で共沸した5 (0.11 g, 0.17 mol)にアセトニトリル(1.5 mL)を加えた。反応溶液に2-cyanoethyl-N,N,N’,N’-tetraisopropylphosphorodiamidite (52 μL, 0.17 mol)と0.45 M tetrazole のアセトニトリル溶液(0.37 mL, 0.17 mol) を加えて、反応溶液を室温で1.0 時間撹拌した。反応溶液を脱酢酸処理した酢酸エチルで2 回抽出し、Sat. NaHCO3 aq. とH2O で洗浄した。有機相をMgSO4 で乾燥し、溶媒を除去した。黄色オイルの粗生成物である6 (0.12 g) をゴムシールボトルにアセトニトリルで移し3 回共沸した後、さらなる精製をせずにDNA 合成に使用した。
【００８６】
［３−シアノビニルカルバゾール−１‘−β−デオキシリボシド (CNVK)を含有するＯＤＮの合成］（Synthesis of ODN containing 3-cyanovinylcarbazole-1’-β-deoxyriboside (CNVK)）
下記に示すCNVK を含むODN を合成した。
ODN(ACNVK): 5’-TGCACNVKCCGT-3’ 
ODN(GCNVK): 5’-TGCGCNVKCCGT-3’ 
ODN(CCNVK): 5’-TGCCCNVKCCGT-3’ 
ODN(TCNVK): 5’-TGCTCNVKCCGT-3’ 
【００８７】
【化２０】
0004814904.tif 000018
【００８８】
次のScheme 10 に従い合成を進めた。
【００８９】
【化２１】
0004814904.tif 000019
【００９０】
［3-Methoxycarbonylvinylcarbazole (7) ］
Palladium acetate (38.0 mg, 0.17 μmol)のDMF 溶液(0.25 mL)に1 (0.50 g, 1.71 mmol)とTributylamine (0.41 μL, 1.71 mmol) とMethyl acrylate (0.38  L, 4.27 mmol)とH2O(1.0 mL)を順に加えて、マイクロウェーブを用いて反応溶液を160 °C で10 分間反応してTLC で反応追跡したところ、1 の消失を確認した。桐山ろ過でPalladium 粉末を取り除いた後、カラムクロマトグラフィー(HexH : AcOEt = 3 : 1) で精製し、白色粉末として7 (0.26 g, 62%)を得た。
7: 1H NMR (CDCl3) δ 8.26 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 8.07 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.89 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 7.61 (dd, 1H, J = 1.7, 8.5 Hz), 7.39-7.44 (m, 3H), 7.23-7.29 (m, 1H), 6.47 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 3.81 (s, 3H). 
【００９１】
［3-Methoxycarbonylcarbazole-1’-β-deoxyriboside-3’,5’-di-(p-toluoyl)ester (8) ］
7 (0.55 g, 2.22 mmol)のアセトニトリル溶液(49 mL)に室温でNaH (92.0 mg, 2.31 mmol)を加えて10 分間撹拌した。反応溶液にChlorosugar (1.14 g, 2.66 mmol) を加えて室温で60 分間撹拌し、TLC (HexH : AcOEt = 4 : 1) で原料の消失を確認した。沈殿物を除去した後、カラムクロマトグラフィー(HexH : AcOEt = 4 : 1) で精製し、白色粉末として8 (0.98 g, 71%)を得た。
【００９２】
［3-Methoxycarbonylcarbazole-1’-β-deoxyriboside (9) ］
8 (0.96 g, 1.59 mmol)のメタノール溶液(46 mL)に0.5 M methanolic NaOMe (9.6 mL, 4.8 mmol)とジクロロメタン(12 mL)を加えて、反応溶液を室温で1 時間撹拌した。TLC (CHCl3 : MeOH = 9 : 1) で原料の消失を確認した。溶媒を除去した後、カラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = 9 : 1) で精製し、白色粉末として9 (0.28 g, 48%)を得た。
9: 1H NMR (CDCl3) δ 8.20 (s, 1H), 8.06 (d, 1H, J = 7.7 Hz), 7.86 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 7.53-7.61 (m, 3H), 7.44 (t, 1H, J = 7.1 Hz), 7.24-7.27 (m, 1H), 6.63 (dd, 1H, J = 8.2, 7.0 Hz), 6.46 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 4.75-4.80 (m, 1H), 3.95-4.04 (m, 3H), 3.81 (s, 1H), 2.95 (dt, 1H, J = 14.0, 8.2 Hz), 2.28 (ddd, 1H, J = 14.0, 7.0, 3.6 Hz). 
【００９３】
［5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-3-methoxycarbonylvinylcarbazole-1’-β-deoxyriboside (10) ］
ピリジン(1.0 mL × 2)で共沸した9 (0.23 g, 0.63 mmol)にピリジン(0.5 mL)を加えた。反応溶液に4,4’-dimethoxytritylchloride (0.26 g, 0.75 mmol) と4-(dimethylamino)pyridine (15.0 mg, 0.13 μmol)のピリジン溶液(2.2 mL)を加えて、反応溶液を室温で16 時間撹拌した。TLC (CHCl3 : MeOH = 95 : 5)で生成物を確認した後、ピリジンを除去した。カラムクロマトグラフィー(CHCl3 : MeOH = 99 : 1) で精製し、黄色粉末として10 (0.21 g, 51%)を得た。
10: 1H NMR (CDCl3) δ 8.17 (s, 1H), 8.02-8.05 (m, 1H), 7.83 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 7.62-7.66 (m, 3H), 7.46-7.49 (m, 2H), 7.34-7.38 (m, 4H), 7.25-7.28 (m, 4H), 7.15 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 6.81 (dd, 4H, J = 8.8, 1.4 Hz), 6.61 (dd, 1H, J = 8.5, 6.3 Hz), 6.40 (d, 1H, J = 15.9 Hz), 4.76-4.80 (m, 1H), 4.05-4.09 (m, 1H), 3.80 (s, 3H), 3.77 (s, 3H), 3.76 (s, 3H), 3.56-3.57 (m, 2H), 2.89 (dt, 1H, J = 14.0, 8.5 Hz), 2.18 (m, 1H), 2.17 (d, 1H, J = 3.8 Hz). 
【００９４】
［5’-O-(4,4’-dimethoxytrityl)-3-methoxycarbonylvinylcarbazole-1’-β-deoxyriboside-3 ’-O-(cyanoethoxy-N,N-diisopropylamino)phosphoramidite (11) ］
アセトニトリル(1.0 mL)で共沸した10 (0.20 g, 0.29 μmol)にアセトニトリル(1.3 mL)を加えた。反応溶液に2-cyanoethyl-N,N,N’,N’-tetraisopropylphosphorodiamidite (92 μL, 0.29 μmol)と0.45 M tetrazole のアセトニトリル溶液(0.65 mL, 0.29 μmol) を加えて、反応溶液を室温で2 時間撹拌した。反応溶液を脱酢酸処理した酢酸エチルで2 回抽出し、Sat. NaHCO3 aq. とH2O で洗浄した。有機相をMgSO4 で乾燥し、溶媒を除去した。黄色オイルの粗生成物である11 (0.25 g) をゴムシールボトルにアセトニトリルで移し3 回共沸した後、さらなる精製をせずにDNA 合成に使用した。
【００９５】
［修飾したＯＤＮの合成］（Synthesis of modified ODN ）
ODN(AX) (5’-TGCAXCCGT-3’, X = 9)とODN(GX) (5’-TGCGXCCGT-3’, X = 9) はABI 3400 DNA 合成機を用いて合成した。それぞれ得られた反応混合物のCPG を二つに分けて、ひとつの反応混合物は0.4 M NaOH in H2O : CH3OH = 1 : 4 を用いて37 °C で17 時間インキュベートして脱保護し、2 M TEAA で中和した後凍結乾燥した。もうひとつの反応混合物は0.05 M K2CO3 in CH3OH を用いて室温で17 時間インキュベートして脱保護し、2 M TEAA で中和した後凍結乾燥した。ODN(AOHVK), ODN(GOHVK), ODN(AOMeVK), ODN(GOMeVK)のDNA を逆相HPLC によって精製した。それぞれのDNA を酵素分解した。単離収率はそれぞれ5, 10, 11, 13%であった。分子量をMALDI-TOF-MS で測定した。
calcd. for ODN(AOHVK), 5’-TGCAOHVKCCGT-3’: [(M+H)+] 2801.93, found 2802.12. 
calcd. for ODN(GOHVK), 5’-TGCGOHVKCCGT-3’: [(M+H) +] 2817.93, found 2818.08. 
calcd. for ODN(AOMeVK), 5’-TGCAOMeVKCCGT-3’: [(M+H) +] 2815.95, found 2816.07. 
calcd. for ODN(GOMeVK), 5’-TGCGOMeVKCCGT-3’: [(M+H) +] 2831.95, found 2831.98. 
【００９６】
下記に示すNH2VK を含むODN を合成した。
ODN(ANH2VK): 5’-TGCANH2VKCCGT-3’ 
ODN(GNH2VK): 5’-TGCGNH2VKCCGT-3’ 
【００９７】
【化２２】
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【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明によれば、高い配列選択性と回収率を両立させて、特定の塩基配列を備えた核酸類の精製及び回収を行うことができる。新規創薬や遺伝子診断のために注目されている、一塩基置換した塩基配列を有する核酸類の精製と回収をも可能としており、産業上有用である。さらに、本発明による精製と回収は、人工塩基を光連結し光開裂させることによって、ごく短時間で行うことができるものとなっている。そのために、分解を受けやすく短命なＲＮＡをも対象として、精製と回収を可能としており、産業上有用である。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は光応答性核酸である3-cyanovinylcarbazole-1’-β-deoxyriboside (CNVK)の構造式を示す図である。
【図２】図２はODN(ACNVK-GT)の光開裂した生成物のＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図３】図３はODN(GCNVK-GC)の光開裂した生成物のＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図４】図４は光クロスリンク体の光開裂の経時変化を示す図である。
【図５】図５はODN(ACNVK-GT) の光開裂した生成物のＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図６】図６は光クロスリンク体の光開裂の経時変化を示す図である。
【図７】図７はDNAの配列選択的精製の一例の概略を表す説明図である。
【図８】図８はDNAの配列選択的精製の結果を示す図である。
【図９】図８はDNAの配列選択的精製の結果を示す図である。
【図１０】図１０は光クロスリンク反応による生成物のＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図１１】図１１は光クロスリンク可能なＲＮＡの塩基を確認した実験結果を示す図である。
【図１２】図１２はODN(ACNVK)<>RNA(GU)の光開裂した生成物のＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図１３】図１３はODN(GCNVK)<>RNA(GC)の光開裂した生成物のＨＰＬＣによる分析結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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