(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質工学方法であって、
（ｉ）複数のエントリを含み、各エントリが枠組みタンパク質のアミノ酸残基側鎖の３Ｄ空間における位置および配向の記述に対応するコンピュータデータベースを構築するステップであって、前記枠組みタンパク質は７０以下のアミノ酸を含み、１〜１１のジスルフィド結合を有し、各側鎖の位置および配向がＣα−Ｃβベクトルとして簡略化されるステップと、
（ｉｉ）サンプルタンパク質のある機能に必要な該サンプルタンパク質の２つ以上のアミノ酸残基それぞれの側鎖の３Ｄ空間における位置および配向の記述に対応するクエリを作成するステップであって、各側鎖の位置および配向がＣα−Ｃβベクトルとして簡略化されるステップと、
（ｉｉｉ）該クエリを使ってデータベースを検索し、それによって１つ以上のヒットを同定するステップであって、該ヒットのうち少なくとも１つが、該サンプルタンパク質と構造類似性を有する各枠組みタンパク質に対応するステップとから成る方法。
【請求項２】
Ｃα−Ｃβベクトルは距離行列表示の形式である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒットに対応する前記枠組みタンパク質のアミノ酸配列を、該枠組みタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基をサンプルタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基で置換して改変し、それによって改変枠組みタンパク質を作成するステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基が、サンプルタンパク質の機能領域の少なくとも一部を構成する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記枠組みタンパク質のアミノ酸残基を置換する前記サンプルタンパク質のアミノ酸残基のうちの少なくとも２つが一次配列中で隣接していない請求項４に記載の方法。
【請求項６】
改変された枠組みタンパク質は、サンプルタンパク質よりも安定性が増大している請求項３乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
改変された枠組みタンパク質は、サンプルタンパク質との構造類似性が増大している請求項３乃至６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
改変された枠組みタンパク質は、前記サンプルタンパク質の機能に類似する機能か、またはその機能を阻害する機能を示し得る請求項７に記載の方法。
【請求項９】
サンプルタンパク質はサイトカインである請求項１乃至８のいずれかに記
載の方法。
【請求項１０】
サイトカインは、ＧＨ，ＩＬ−４，ＩＬ−６およびＧ−ＣＳＦからなる群から選択される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｉｉｉ）において、ヒットが前記サンプルタンパク質との構造類似性に従ってランク付けされる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｉｉｉ）の検索は、
（ａ）クリーク検出による前記ヒットの同定
（ｂ）ステップ（ａ）で同定した前記ヒットのフィルタリング
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記枠組みタンパク質が、ＺＤＣ、ＶＩＢ、ＳＣＹおよびＥＲＰから成る群から選択される請求項１乃至１２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、タンパク質工学に適したタンパク質を同定する方法に関する。特に、本発明は、タンパク質を三次構造的外観によって同定するコンピュータデータベース検索法、さらに、そのようにして同定されたタンパク質を１種以上の望ましい特性を有するように改変する方法に関する。本発明は、サイトカイン模倣体などの人工タンパク質に関するが、それに限定されるわけではない。
【０００２】
発明の背景
タンパク質は、生化学反応の酵素触媒作用、核酸の転写および複製の制御、ホルモン調節、シグナルトランスダクションカスケードおよび免疫応答時の抗原識別などの多様な生物学的プロセスに極めて重大なかかわりを有しているために、生命現象の中心となっている。
【０００３】
多くの場合、それらの必要な「機能領域」と称されるタンパク質の１つ以上の構造領域が、ある特定の機能を果たしている。これらの領域は、タンパク質酵素の活性部位、転写因子の核酸結合ドメイン、特定のサイトカインレセプターとの結合に重要なタンパク質サイトカイン領域、または抗原レセプターの抗原結合領域を構成し得る。
【０００４】
タンパク質の機能領域は、通常、その特定の機能を果たすのに必要とされる、すなわち、その機能を果たすのに必須である１個以上のアミノ酸を含んでいる。  多くの場合、それらの必要なアミノ酸残基は、トポグラフィー上では互いに隣接しているが、一次アミノ酸配列に関しては明確に離れている、すなわち、連続していない。さらに、あるタンパク質の機能領域が２つ以上存在する場合、これらの領域もトポグラフィー上では隣接しているが、一次アミノ酸配列に関しては明確に離れている。しかし、ある特定の機能に２つ以上の機能領域が関与している場合には、これらの機能領域は、トポグラフィー上でも十分に離れていることもある。これは、サイトカインの機能領域に関して特に重要な点である。
【０００５】
本明細書に使用する場合、「サイトカイン」は、同種細胞表面レセプターをすると共に、細胞の成長、死滅および分化に関する多様なプロセスの開始、制御および調節に関与する可溶性タンパク質分子を一部として包含する。サイトカインは、典型的には、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−６）、成長および分化因子〔例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびエリトロポエチン（ＥＰＯ）〕ならびに成長ホルモン（ＧＨ）、プロラクチン、ＴＧＦ−β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）およびインスリンなどの他のものによって例示される。これらの分子は、それぞれ、特定のレセプターに結合し、それによって、ある特定の生物学的応答または一連の応答を誘起させ得る。
【０００６】
あるタンパク質のある特定の機能がそのタンパク質の１つ以上の機能領域によるという事実が、あるタンパク質の機能を改変するために機能領域を付加または削除して、そのタンパク質を改変することを目的とする戦略の基礎となっている。
【０００７】
これに関して、多くのサイトカイン−サイトカインレセプター相互作用が多様な生物学的プロセスの調節に極めて重要であるために、サイトカイン模倣体の設計および人工合成が極めて重要な研究分野となっている。したがって、新規な模倣体は、サイトカイン−サイトカインレセプター相互作用に対する生物学的応答を模倣または阻害する重要な新規治療薬になると予想される。
【０００８】
「模倣体」とは、別の分子に類似しているか、もしくは別の分子より強力な生物学的応答を誘起する（「アゴニスト」）か、または他の分子の作用を阻害する（「アンタゴニスト」）分子である。他の分子とは、例えば、サイトカインであってよい。
【０００９】
サイトカインをベースとする模倣体の設計および人工合成に関して、多くの人工模倣体がしばしば遭遇する問題は、それらの模倣体の生物学的半減期が短く、したがって、生体利用率および効力が極めて低いことである。これに関して、システインリッチな小タンパク質が、それらの安定性の故に、模倣体を人工的に合成するためのベースとしてのタンパク質の「足場」として有用であり得ることが提唱された（Ｖｉｔａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，第９２巻，６４０４ページ，１９９５年）。これらのシステインリッチな小タンパク質は、ジスルフィド結合したコアと、タンパク質表面に露出されたアミノ酸側鎖とを含んでいる（Ｎｅｉｌｓｅｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第２６３巻，２９７ページ，１９９６年）。しかし、これらのタンパク質の潜在能力は、典型的な従来技術のタンパク質工学法がループやヘリックスまたはβシートなどの個々の二次構造要素内の隣接アミノ酸群の転移または置換に限られており、かつ、最も適切なジスルフィドリッチな候補を選択するための設計戦略が存在していないために、十分に実現されてはいない。
【００１０】
上記従来法の例としては：アンギオゲニンにＲＮアーゼ活性を付与する（Ｈａｒｐｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  第２８巻，１８７５ページ，１９８９年）か、または、ＲＮアーゼにアンギオゲニン活性を付与する（Ｒａｉｎｅｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２７０巻，１７１８０ページ，１９９５年）ためのＲＮアーゼとアンギオゲニンとの間の二次構造領域の交換；エラスターゼのプロテアーゼインヒビターループをＩＬ−１β骨格に転移させることによるＩＬ−１βへのエラスターゼ阻害活性の挿入（Ｗｏｌｆｓｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３２巻，５３２７ページ，１９９３年）；枯草菌（Ｂａｓｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性プロテアーゼへのサーモリシンの１０アミノ酸カルシウム結合ループの挿入（Ｔｏｍａら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第３０巻，９７ページ，１９９１年）；カリブドトキシンのβシートと置換するための蛇毒由来のβシートの挿入（Ｄｒａｋｏｐｏｌｏｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７１巻，１１９７９ページ，１９９６年）；およびカリブドトキシンのβシートへの炭酸脱水酵素由来のβシートの組込み（Ｐｉｅｒｒｅｔら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，第３５２巻，２１４５ページ，１９９５年）が挙げられる。
【００１１】
タンパク質工学においては、低分子および高分子の３Ｄ（三次元）構造の解明と相まってコンピュータベーステクノロジーの使用が重要度を増している。Ｘ線結晶学およびＮＭＲ技術などにより、３Ｄ分子構造が急速に生成されている。これらの３Ｄ構造は、ＢＲＯＯＫＨＡＶＥＮデータベースなどの一般的にアクセス可能な検索可能データベースに格納することができる。
【００１２】
本明細書の目的に合ったデータベースは、「エントリ」コレクションを含んでおり、各エントリは、枠組みタンパク質（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の３Ｄ構造外観の表示に対応する。枠組みタンパク質とは、単に、実験的解明またはコンピュータモデリングなどの予測手段により３Ｄ構造が存在することがわかっている任意のタンパク質である。枠組みタンパク質は、特定の機能を付与するために構造を改変し得る骨格として有用である。
【００１３】
本明細書において「クエリ（ｑｕｅｒｙ）」とは、目的とする機能を示すタンパク質の３Ｄ構造外観の表示を指す。３Ｄ構造の表示は、「ヒット」を同定する目的でデータベースを検索するのに適した形式である。ヒットとは、検索の実施に用いられる特定のクエリおよびアルゴリズムに従って同定されるエントリである。
【００１４】
３Ｄ構造を、「デカルト空間」ではなく、「距離空間」に位置する原子間の関係の点から表示することによって、データベース検索における重要な進歩が達成された（Ｊａｋｅｓ  ＆  Ｗｉｌｌｅｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ，第４巻，１２ページ，１９８６年；Ｈｏ＆  Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄｅｄ．Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．，第７巻，３ページ，１９９３年）。デカルト空間における位置は３つの座標（ｘ、ｙ、ｚ）によって定義されており、各座標は、それぞれ３つの軸（Ｘ、Ｙ、Ｚ）に沿った位置に対応しており、各軸は他の２つの軸に対して直角に配向されている。
【００１５】
しかし、距離空間における位置は、距離行列の形式で表されると共に、原子間の距離を詳述する原子間距離によって定義されている。したがって、距離行列は座標独立性であり、距離行列間の比較は、デカルト空間を用いた場合に要求されるような特定の基準座標系に制限されずに行うことができる。
【００１６】
原子の配置およびその鏡像が同一の距離行列で記述されることを強調することは重要である。このあいまいさは、二乗平均平方根値（ＲＭＳ）を用いて軽減することができる。
【００１７】
タンパク質の３Ｄ構造に関して、ＭｃＫｉｅら，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３５４−３５５ページ，１９９５年で論じられているように、３Ｄ構造を「Ｃα−Ｃβベクトル」に換算することにより、タンパク質構造を簡素化することができる。Ｃα−Ｃβベクトルは、３Ｄ空間中に位置を占め、その位置は、アミノ酸のα炭素原子とβ炭素原子の間の共有結合の配向によって定義される（Ｌａｕｒｉ  ＆  Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．，第８巻，５１ページ，１９９４年）。タンパク質を構成する（グリシン以外の）２０個の天然構成アミノ酸は、それぞれ、「中心の」α炭素と構成成分側鎖のβ炭素との間の共有結合のためにＣα−Ｃβを有していることが理解されよう。
【００１８】
データベース中のＧｌｙを含むタンパク質に関しては、ＧｌｙをＡｌａに変異させて、データベース検索に要求されるＣα−Ｃβベクトルを生成させることができる。
【００１９】
Ｃα−Ｃβベクトルの有用性は、これらのベクトルが３Ｄ構造を簡素化させることである。したがって、タンパク質のある機能領域のアミノ酸側鎖のみをＣα−Ｃβベクトルマップによって表示するだけでよく、それによって、その特定の機能に直接関与しないタンパク質の実質的な部分が除外される。Ｃα−Ｃβベクトルは、必要とされる基本的な３Ｄ構造情報を構成しているので、データベース検索のためには理想的である。
【００２０】
タンパク質またはその機能領域に対応するＣα−Ｃβベクトルを同定した後、クエリに応答して迅速に検索を実施し得るように、各ベクトルを特徴付けるパラメータをデータベースに記憶させなければならない。Ｃα−Ｃβベクトルの適当な表示には、データベースエントリとしてまたはクエリとして以下のようなオプションが利用可能である。
【００２１】
（Ａ）  距離行列
（Ｂ）  各Ｃα−Ｃβベクトル間に形成された二面角
（Ｃ）  各Ｃα−Ｃβベクトル間に形成された角度α１およびα２
これらの表示についての簡単な説明が、Ｌａｕｒｉ  ＆  Ｂａｒｔｌｅｔｔ，１９９４年（前掲）に提供されており、この文献は以下に文献援用される。データベース検索を成功させる秘訣は速度と効率である。したがって、データベース中のおびただしいエントリの大部分を予備スクリーニングステップで除去する方法を用いるコンピュータ検索アルゴリズムが開発された。
【００２２】
これらのアルゴリズムは、コンピュータ資源を要求しており、したがって、検索は、通常、２つの段階で実行される。
（１）  ヒットを構成しないエントリを除去するためのスクリーニング検索
（２）  １つ以上のヒットを同定するための、クエリと（１）で除去されなかった各エントリとの原子単位での比較
【００２３】
（１）での検索により、エントリを、クエリの幾何属性（Ｌｅｓｋ，Ｃｏｍｍｕｎ．ＡＣＭ，第２２巻，２１９ページ，１９７９年）、原子間距離および原子の種類（Ｊａｋｅｓ  ＆  Ｗｉｌｌｅｔｔ，１９８６年，（前掲））、芳香族性、ハイブリッド形成、結合性、電荷、孤立電子対の電子の位置、または環構造の質量中心（Ｓｈｅｒｉｄａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，第８６巻，８１６５ページ，１９８９年）に基づいてスクリーニングすることができる。このスクリーニング法により、クエリの３Ｄ制約条件を満足する見込みのないエントリが排除されるであろう。
【００２４】
この方法は、迅速ではあるが、エントリをヒットとして登録するためには、エントリが、指定されたどのクエリ成分をも含んでいなければならないことを必要とする。クエリ成分の数が増大するにつれ、ニアミスの数も増大し、ヒットを見つけ出す可能性が減少する。
【００２５】
最近、検索プログラムＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ（Ｈｏ  ＆  Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９３年，（前掲））によって、各ニアミスと各ヒットの相対メリットを査定するさらに有用な検索法が提供された。ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮは、３Ｄ構造特徴における種々の原子および／または結合の座標からなるユーザー定義クエリに対するエントリについて３Ｄデータベースを検索するクリーク検出アルゴリズムを用いる（種々のアルゴリズムが、Ｂｒｉｎｔ  ＆  Ｗｉｌｌｅｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ，第５巻，４９ページ，１９８７年、およびＢｒｉｎｔ  ＆  Ｗｉｌｌｅｔ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．，第２７巻，１５２ページ，１９８７年で検討、比較されている）。ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮは、ヒットとしてユーザー指定の最小数のマッチング原子および／または結合の組合せを含むすべての可能なエントリを同定する。
【００２６】
構造的に関連するタンパク質を同定する手段としての３Ｄデータベース検索の有用性にも拘わらず、この方法は、所望の機能を有するタンパク質の人工合成に関して十分に利用されてはいない。
【００２７】
発明の目的
本発明者らは、３Ｄデータベース検索が１つ以上の所望の構造特徴を有するタンパク質の同定に有用であると共に、そのようなタンパク質が、その後、所望の特性または機能を有するタンパク質を人工合成するための候補「枠組み」であることを確認した。さらに、本発明者らは、タンパク質工学が、ループまたはへリックスなどの二次構造の全要素を組み込むよりも、ある特徴、特性または機能に必要な特定のアミノ酸残基を組み込んで枠組みタンパク質を改変することによって、もっとも良く達成されることを認めた。これは、機能的に重要なアミノ酸がタンパク質中に散らばっており、一次または二次構造の特定の領域に制限されていない場合に特に適している。
【００２８】
したがって、本発明の目的は、新規なタンパク質工学法を提供することである。
発明の要旨
１つの態様において、本発明は以下のステップから成るタンパク質工学法に関する。
【００２９】
（ｉ）  複数のエントリを含み、各エントリが枠組みタンパク質のアミノ酸残基側鎖の３Ｄ空間における位置および配向の記述に対応するコンピュータデータベースを構築するステップであって、各側鎖の位置および配向がＣα−Ｃβベクトルとして簡略化されるステップ
【００３０】
（ｉｉ）  サンプルタンパク質のある機能に必要な該サンプルタンパク質の２つ以上のアミノ酸残基それぞれの側鎖の３Ｄ空間における位置および配向の記述に対応するクエリを作成するステップであって、各側鎖の位置および配向がＣα−Ｃβベクトルとして簡略化されるステップ
【００３１】
（ｉｉｉ）  該クエリを使ってデータベースを検索し、それによって１つ以上のヒットを同定するステップであって、該ヒットのうち少なくとも１つが、該サンプルタンパク質と構造類似性を有する各枠組みタンパク質に対応するステップ
【００３２】
好ましくは、枠組みタンパク質は内部ジスルフィド結合を形成し得る。より好ましくは、枠組みタンパク質は、２〜１１のジスルフィド結合を有し、７０以下のアミノ酸を含むシステインリッチな小タンパク質である。
【００３３】
別の態様において、本発明は以下のステップから成るタンパク質工学法を提供する。
（ｉ）複数のエントリを含み、各エントリが内部ジスルフィド結合を形成し得る枠組みタンパク質のアミノ酸残基の３Ｄ空間における位置および配向の記述に対応するコンピュータデータベースを構築するステップ
【００３４】
（ｉｉ）サンプルタンパク質のある機能に必要な該サンプルタンパク質の２つ以上のアミノ酸残基の３Ｄ空間における位置および配向の記述に対応するクエリを作成するステップ
【００３５】
（ｉｉｉ）該クエリを使ってデータベースを検索し、それによって１つ以上のヒットを同定するステップであって、該ヒットのうち少なくとも１つが、該サンプルタンパク質と構造類似性を有する各枠組みタンパク質に対応するステップ
【００３６】
好ましくは、枠組みタンパク質は、２〜１１のジスルフィド結合を有し、７０以下のアミノ酸を含むシステインリッチな小タンパク質である。
好ましくは、枠組みタンパク質および前記サンプルタンパク質の各アミノ酸側鎖の位置および配向が、Ｃα−Ｃβベクトルとして表される。
【００３７】
上記第１および第２の態様に適用可能な１つの実施態様において、本発明の方法は、ヒットに対応する枠組みタンパク質のアミノ酸配列を、該枠組みタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基をサンプルタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基で置換して改変するステップを含む。
【００３８】
サンプルタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基が、サンプルタンパク質の機能領域の少なくとも一部を構成するのが好ましい。
枠組みタンパク質のアミノ酸残基を置換するサンプルタンパク質のアミノ酸残基のうちの少なくとも２つが一次配列中で隣接していなければなお好ましい。
【００３９】
改変枠組みタンパク質はサンプルタンパク質よりも安定性が増大していることが望ましい。
そのようにして改変された枠組みタンパク質は、サンプルタンパク質との構造類似性が増大しているのが好ましい。
【００４０】
改変された枠組みタンパク質は、サンプルタンパク質の機能に類似する機能か、またはその機能を阻害する機能を示し得るのが有利である。
１つの実施態様において、サンプルタンパク質は、ＧＨ、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびＧ−ＣＳＦからなる群から選択されるサイトカインである。
【００４１】
さらに別の態様において、本発明は、枠組みタンパク質の７０以下のアミノ酸残基および枠組みタンパク質の２〜１１のジスルフィド結合を含むと共に、一次配列中で隣接していない別のタンパク質の機能領域の少なくとも一部を構成する２つ以上のアミノ酸を含む人工タンパク質を提供する。
【００４２】
人工タンパク質は上記の別のタンパク質より高い安定性を有しているのが好ましい。
人工タンパク質が、上記別のタンパク質に類似する機能か、またはそのタンパク質を阻害する機能を示すものであればなお好ましい。
【００４３】
１つの実施態様において、上記別のタンパク質は、ＧＨ、ＩＬ−４、ＩＬ−６およびＧ−ＣＳＦからなる群から選択されるサイトカインである。
１つの特定の実施態様において、人工タンパク質は、ＳＣＹ０１、ＳＣＹ０２、ＳＣＹ０３、ＥＲＰ０１、ＥＲＰ０２、ＥＲＰ０３およびＶＩＢ０１のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００４４】
さらに別の態様において、本発明は、タンパク質構造データベースを検索するためのコンピュータプログラムに関する。
１つの実施態様において、このコンピュータプログラムは、複数のエントリを含み、各エントリが２つ以上のＣα−Ｃβベクトルの距離行列表示に対応する、タンパク質データベースを検索するためのものであり、このプログラムは以下のステップから成る。
【００４５】
（ｉ）  ２つ以上のＣα−Ｃβベクトルの距離行列表示に対応するクエリと各データベースエントリとを比較するステップ
（ｉｉ）  クリーク検出により、クエリと各エントリとの間でマッチした最小数のＣα−Ｃβベクトルによって定義されるヒットを同定するステップ
【００４６】
特に断りのない限り、本明細書および付随する請求の範囲全体を通じて、「含む」および「含んでいる」とは、包括的に用いられており、したがって、記載されている整数または整数群は、他の整数または整数群を除外するものではない。
【００４７】
また、本明細書および特許請求の範囲全体を通して、科学用語は通常の科学的意味を示すが、本文中、いくつかの用語は、当業者による解釈を支援するように定義される。
【００４８】
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明は少なくとも一部が、タンパク質工学によるさらなる改変に適した枠組みタンパク質を同定するためには、エントリのサブジェクトであるサンプルタンパク質の構成アミノ酸側鎖に関して、枠組みタンパク質の構成アミノ酸側鎖の３Ｄ空間における配向に従ってデータベースを検索するのが有利であるという本発明者らの認識に基づいて説明されていることが理解されよう。そのようにして同定された枠組みタンパク質「ヒット」は、トポグラフィーおよび化学などに関してサンプルタンパク質「クエリ」との類似性を適切に共有しており、したがって、さらなる改変に適した候補であると言える。本発明の特定の態様では、改変された枠組みタンパク質が、向上された安定性などの１つ以上の望ましい特性と、場合によって、サンプルタンパク質と類似する機能、またはサンプルタンパク質を阻害する機能とを示し得る。
【００４９】
上記第１および第２の態様の方法に関して、各エントリは、Ｃα−Ｃβベクトルの距離行列表示形式の記述に対応するのが好ましい。
あるいは、Ｃα−Ｃβベクトルは、二面角またはα１およびα２角で表示してもよい。
【００５０】
本明細書に使用する場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、アミノ酸ポリマーに関して交換可能に用いられている。「ペプチド」とは、５０以下のアミノ酸を有するタンパク質である。
【００５１】
本明細書に使用する場合、「枠組みタンパク質」とは、サイズ、溶解度および／または安定性を含む利点を提供する１つ以上の望ましい構造的特徴を示す任意のタンパク質である。この文脈での「安定性」には、タンパク質分解酵素および／もしくは温度変動による分解に対する耐性ならびに／またはカオトロピック剤および／もしくは変性界面活性剤、ｐＨ変化、ｐＨ極値、および／またはレドックス極値および／もしくは変化による変性に対する耐性が含まれる。
【００５２】
枠組みタンパク質は、内部ジスルフィド結合を生成し得る。好ましくは枠組みタンパク質が、７０以下のアミノ酸を含み、かつ２〜１１のジスルフィド結合を有するが、これはシステインリッチな小タンパク質の例である。
【００５３】
各エントリの作成に用いられるアミノ酸は、枠組みタンパク質構成アミノ酸の一部またはすべてを含み得る。
本明細書に使用する場合、「サンプルタンパク質」とは、タンパク質をタンパク質工学用に望ましいものとする１つ以上の目的機能特性を有するタンパク質である。
【００５４】
サンプルタンパク質は、酵素、核酸結合タンパク質、サイトカイン、抗原、レセプター、イオンチャンネル、シャペロニン、または目的とする機能を有する任意のタンパク質であるのが適当である。
【００５５】
１つの実施態様において、サンプルタンパク質は、ＧＨ、ＩＬ−４、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−６およびＥＰＯからなる群から選択されるサイトカインである。
サンプルタンパク質の機能は、特定のレセプターに結合し、それによって生物学的応答を誘起させることを含むのが好ましい。しかし、触媒作用、カチオン（Ｚｎ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋）の結合、イオン（例えば、Ｃｌ−、Ｋ＋、Ｎａ＋）の輸送、脂質の結合、転写調節またはＤＮＡ複製調節の手段としての核酸の結合、タンパク質の折り畳みおよび輸送の支援、ならびにタンパク質が達成する他の機能などの、多様な他の機能も考えられる。
【００５６】
クエリの作成に関して、前記各クエリは、Ｃα−Ｃβベクトルの距離行列表示形式での記述に対応するのが好ましい。しかし、二面角またはα１およびα２角などの他の表示も適当である。
【００５７】
データベースの検索に用いられるコンピュータプログラムは、以下に詳細に説明するようなＶＥＣＴＲＩＸプログラムであるのが好ましい。ＶＥＣＴＲＩＸには、ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮアルゴリズム〔Ｈｏ  ＆  Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９３年，（前掲）（この文献は、本明細書に文献援用される）〕が組み込まれている。ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮプログラムは、ユーザー指定の最小数のユーザー定義クエリマッチング要素の任意の組み合わせを含む構造を同定するために、有機低分子の３Ｄデータベースを検索する。これは、先ず、距離行列を使ってクエリ原子のトポグラフィーを定義し、次いで、その構造の化学的性質を定義する種々のクエリ制約条件を用いてスクリーニングすることによって達成される。この場合も、その構造中の原子のトポグラフィーは、距離行列を用いて表示される。距離の記述がエントリのものとマッチする、データベース中の構造フラグメントは、グラフ理論（Ｇｉｂｂｏｎｓ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｉｃ  Ｇｒａｐｈ  Ｔｈｅｏｒｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，１９８８年）を用いて同定される。
【００５８】
グラフ理論において、グラフとは、辺によって接続されたノード（頂点）からなる構造である。グラフは、すべてのノードが互いに接続されたときに完全に接続される。サブグラフは、大きなグラフの任意のサブセットである。任意のグラフの最大の完全接続サブグラフはクリークと称される。したがって、クエリは、すべての原子間距離が距離行列で測定されるので、完全に接続されたグラフである。次のタスクは、少なくともユーザー定義数のマッチングノードを含むすべてのクリークを検出するために構造データベースを検索することである。
【００５９】
多くのクリーク検出アルゴリズムが存在する。よく知られている手順には、Ｂｏｎｎｅｒ，ＩＢＭ  Ｊ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．，第８巻，２２ページ，１９６４年；Ｇｅｒｈａｒｄｓ  ＆  Ｌｉｎｄｅｎｂｅｒｇ，Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，第２７巻，３４９ページ，１９８１年；およびＢｒｏｎ  ＆  Ｋｅｒｂｏｓｃｈ，Ｃｏｍｍｕ．ＡＣＭ，第１６巻，５７５ページ，１９７３年によるものが含まれる。コンピュータ計算化学者は、データベース中の３Ｄ構造の検索を容易にするために、上記アルゴリズムを適合するかまたは類似の考えを実行した（Ｋｕｎｔｚら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第１６１巻，２６９ページ，１９８２年；ＤｅｓＪａｒｌａｉｓら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，第３１巻，７２２ページ，１９８８年；ＤｅｓＪａｒｌａｉｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，第８７巻，６６４４ページ，１９９０年；Ｃｒａｎｄｅｌｌ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆｒ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．，第２３巻，１８６ページ，１９８３年；Ｂｒｉｎｔ  ＆  Ｗｉｌｌｅｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ，第５巻，４９−５６ページ，１９８７年；Ｋｕｈｌら，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．，第５巻，２４ページ，１９８４年；およびＳｍｅｌｌｉｅら，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｓｃｉ．，第３１巻，３８６ページ，１９９１年）。
【００６０】
コンピュータデータベース検索
ＶＥＣＴＲＩＸ
本発明者らは、Ｈｏ  ＆  Ｍａｒｓｈａｌｌによって、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄｅｄ．Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．，第７巻，３−２２ページ，１９９３年に記載されているようなプログラムＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮのクリーク検出アルゴリズムの変形版であるプログラム「ＶＥＣＴＲＩＸ」を作成した。この検索手順は図式Ａに示されている。Ｈｏ  ＆  Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９３年，（前掲）と比べて変っている主な点には以下が含まれる。
【００６１】
・  クエリおよびデータベースは共にタンパク質である。
・  クエリ要素は、ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮにおけるような個々の原子ではなく、Ｃα−Ｃβベクトルのトポグラフィーを定義する距離行列である。
同様に、データベース構造も、ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮにおけるような原子毎ではなく、Ｃα−Ｃβベクトル距離行列と定義される。
【００６２】
・  ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮにおいては、クエリの原子対は、原子の種類および原子対間の距離がマッチしていれば、データベース中のエントリの原子対とマッチするとみなされ；ＶＥＣＴＲＩＸでは、クエリのＣα−Ｃβベクトル対は、このベクトル対間の４つの距離（Ｃα１−Ｃα２；Ｃα１−Ｃβ２；Ｃβ１−Ｃα２；Ｃβ１−Ｃβ２）がマッチしていれば、データベース中のエントリのＣα−Ｃβベクトル対とマッチするとみなされる。
【００６３】
・  ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮプログラムは、クリーク検出、立体フィルタリングおよびサブセットフィルタリングを一緒に実行し、これら３種の基準を満足するヒットを出力する；設計として、ＶＥＣＴＲＩＸプログラムは、ＭＩＮ＿ＭＡＴＣＨ以上のマッチ数を有するすべてのヒットを出力する。次いで、ＰＯＳＴＶＥＣを用い、それらのヒットを、立体フィルタリング、新規ＭＩＮ＿ＭＡＴＣＨおよびサブセットの考察に基づいてフィルターする；クリーク検出ヒットとフィルタリングプロセスとを分離させることにより、ＶＥＣＴＲＩＸプログラムはよりフレキシブルになる。
【００６４】
本発明者によって書かれたプログラムの概略は、図式Ａに示されている。
ＶＥＣＴＲＩＸプログラムは４種のパラメータを必要とする：（１）ｑｕｅｒｙ．ｆｉｌｅ；（２）ｄａｔａｂａｓｅ．ｆｉｌｅ；（３）ｓｔｅｒｉｃ．ｆｉｌｅおよび（４）ＭＩＮ＿ＭＡＴＣＨ。これらのパラメータを以下に詳細に説明する。
【００６５】
（１）  ｑｕｅｒｙ．ｆｉｌｅ
（例えば、表１におけるような）ｑｕｅｒｙ．ｆｉｌｅは、クエリの定義、各クエリ原子の許容度の定義、およびサブセットの定義を含む。これら３種の定義を以下に説明する。
【００６６】
クエリ定義：  ＶＥＣＴＲＩＸプログラムを実行する前に、特定の標的タンパク質を選択する。標的タンパク質の三次構造は、当業において周知の実験的または理論的手段により決定されている筈である。標的タンパク質の機能性アミノ酸を定義し、それらの機能性残基用のＣα−Ｃβベクトルを抜き出してｑｕｅｒｙ．ｆｉｌｅに入れなければならない。表１は、４つの機能性残基のＣα−Ｃβベクトルの定義を示している。第７、第８および第９列の数字は、それぞれ、ベクトルのｘ、ｙおよびｚ座標を表している。
【００６７】
許容度定義：  許容度は、各原子の配向における許容可能な不確定性を範囲限定する。原子Ａから原子Ｂまでのベクトルの最終許容度は、原子ＡとＢの個々の許容度の合計である。表１において、個々の原子の許容度は、第１０列では０．５Åと定義されており、したがって、２個の原子間の距離の許容度は１．０Åである。
【００６８】
サブセット定義：  原子のリストはＳＵＢＳＥＴにグループ分けすることができる。ｑｕｅｒｙ．ｆｉｌｅは、必要とされる限り多くのＳＵＢＳＥＴの定義を見込んでいる。ＳＵＢＳＥＴ定義は、ＰＯＳＴＶＥＣプログラムにおいて、より関連性の高いヒットを得るためにヒットをフィルターするのに用いられる。表１において、第１ＳＵＢＳＥＴコマンドはサブセット１と定義され、Ｃα−Ｃβベクトル番号１、３および４からなる。第２ＳＵＢＳＥＴコマンドはサブセット２と定義され、Ｃα−Ｃβベクトル番号２からなる。
【００６９】
（２）  ｄａｔａｂａｓｅ．ｆｉｌｅ
ｄａｔａｂａｓｅ．ｆｉｌｅは、データベースを構成するエントリに対応するファイル名のリストを含んでいる。
（３）  ｓｔｅｒｉｃ．ｆｉｌｅ
ｓｔｅｒｉｃ．ｆｉｌｅは、リガンドまたはレセプター空間を表示するグリッド点の座標を含んでいる。レセプターまたはリガンドの３Ｄ構造の利用可能性に基づいて２つの形式の立体フィルタリングが存在する。レセプターの構造が分っており、かつ、クエリがリガンドのレセプター結合アミノ酸側鎖に対応するＣα−Ｃβベクトル由来である場合、ヒットは、例えば、レセプターがサイトカインと結合するとアクセスする３Ｄ空間に該ヒットが侵入するかどうかについて評価しなければならない（レセプターベースフィルタリング）。さらに、リガンドの構造が分っており、かつ、クエリがリガンドのレセプター結合アミノ酸側鎖に対応するＣα−Ｃβベクトル由来である場合、ヒットは、リガンドが占めていない３Ｄ空間に侵入するかどうかについて評価しなければならない（リガンドベースフィルタリング）。このモードは、「ｓｔｅｒｉｃ．ｆｉｌｅ」の第１行で識別される。本発明の立体フィルタリングアルゴリズムの第１ステップは、プログラムＰＲＥＰＡＲＥ＿ＳＴＥＲＩＣ＿ＦＩＬＴＥＲを用いてリガンドまたはレセプターの３Ｄ空間を表示するグリッド点を計算することである。このプログラムは、先ず、ｘ、ｙおよびｚ次元における最大および最小を決定することにより構造の限界を範囲限定する。次いで、限界内の各グリッド点（１Å間隔）に対して、そのグリッド点がレセプターまたはリガンドと立体接触している場合には、ｘｙｚ座標を「ｓｔｅｒｉｃ．ｆｉｌｅ」に出力する。
【００７０】
（４）  ＭＩＮ＿ＭＡＴＣＨ
ＭＩＮ＿ＭＡＴＣＨは、ＶＥＣＴＲＩＸがクリークをヒットとみなす前に要求されるクエリとデータベース中のエントリとの間でマッチする最小数のＣα−Ｃβベクトルを定義する整数である。
【００７１】
適切なパラメータを入力した後、ＶＥＣＴＲＩＸプログラムの最初のステップは、クエリのＣα−Ｃβベクトル距離行列を計算することである（図式Ａ参照）。次いで、各データベースエントリを読出して、枠組みタンパク質のＣα−Ｃβ距離行列を計算する。Ｈｏ  ＆  Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９３年，（前掲）のクリーク検出アルゴリズムを用いて、クエリとデータベースエントリとの間の幾何マッチを同定する。マッチが検出されない場合、別のデータベースファイルを読出して処理する。ヒットが検出された場合には、クリーク検出アルゴリズムがクエリのＣα−ＣβベクトルとマッチするＣα−Ｃβを有するエントリのみを検出するので、いくつかのさらなる処理が必要になる。このアルゴリズムは、立体整合性（ｓｔｅｒｉｃ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）、すなわち、各ヒットが存在していなければならない３Ｄ空間に関して有している構造相補性についてはチェックしない。ＶＥＣＴＲＩＸプログラムは、「ｓｔｅｒｉｃ．ｆｉｌｅ」を用いて、レセプターベースまたはリガンドベースのフィルタリングモードであるかどうかに応じて、レセプター空間すなわち非リガンド空間に侵入するヒット中の原子数を計算する。枠組みタンパク質には、「マッチング」機能性残基を介して標的タンパク質に結合するのに必須ではない部分がある。必須でない部分としては、マッチには存在しない側鎖、マッチした残基または最初のシステイン残基までのＮまたはＣ末端残基が含まれる。残基の必須原子は、主鎖原子（Ｎ、Ｈ、ＣＡ、ＨＡ、Ｃ、Ｏ）およびＣＡ原子に結合している側鎖原子（ＣＢ、１ＨＡおよび２ＨＡ）である。必須残基は、最初のシステインと最後のシステインの間にある。タンパク質中にシステインが全く検出されない場合、必須残基は、最初のマッチ残基と最後のマッチ残基の間にあるとみなされる。ＶＥＣＴＲＩＸプログラムは、必須原子数およびレセプター空間すなわち非リガンド空間に侵入する必須原子数を計数し、出力する。さらに、ＶＥＣＴＲＩＸプログラムは、ｑｕｅｒｙ．ｆｉｌｅに定義されているベクトルの各サブセットについて、サブセット中のマッチしたベクトルの数を計数し、出力する。その結果は、出力ファイルに書き込まれ、次いで、別のデータベースエントリが読出され、このプロセスは、データベースの最後に到達するまで繰り返される。
【００７２】
ＰＯＳＴＶＥＣ
設計により、ＶＥＣＴＲＩＸプログラムは、ＭＩＮ＿ＭＡＴＣＨ以上のマッチ数を有するすべてのヒットを出力する。ＰＯＳＴＶＥＣプログラムは、ＶＥＣＴＲＩＸ後フィルタリング用に書かれている。このフィルタリングは、ｑｕｅｒｙ．ｆｉｌｅに定義されている各ＳＵＢＳＥＴの立体接触、新規マッチ数およびマッチ計数に基づいている。ＰＯＳＴＶＥＣプログラムは、少なくとも３種のパラメータ、すなわち：
【００７３】
ｐｏｓｔｖｅｃ  ｖｅｃｔｒｉｘ＿ｏｕｔ．ｆｉｌｅ  ｍｉｎ＿ｍａｔｃｈ  ｍａｘ＿ｉｎｖａｄｅ＿ｆｒａｃｔｉｏｎ
＜ｓｕｂｓｅｔ１＿ｎｕｍ＞＜ｓｕｂｓｅｔ２＿ｎｕｍ＞．．．＜ｓｕｂｓｅｔＸ＿ｎｕｍ＞
【００７４】
を必要とする。この場合：
・  ｖｅｃｔｒｉｘ＿ｏｕｔ．ｆｉｌｅは、ｖｅｃｔｒｉｘ出力ファイルの名前である。
・  ｍｉｎ＿ｍａｔｃｈは、必要な新規の最小マッチ数を表す。
・  ｍａｘ＿ｉｎｖａｄｅ＿ｆｒａｃｔｉｏｎは、レセプター／非リガンド空間の許容可能な侵入最大部分と定義される。すなわち、ヒットは、侵入部分がｍａｘ＿ｉｎｖａｄｅ＿ｆｒａｃ．より大きい場合、例えば、１０％に対して０．１になると、リジェクトされる。
【００７５】
・  ｓｕｂｓｅｔ１＿ｎｕｍは、サブセット１に必要なマッチ数を表す。
・  ｓｕｂｓｅｔ２＿ｎｕｍは、サブセット２に必要なマッチ数を表す。
・  括弧<>は、任意選択パラメータを示す。すなわち、サブセットパラメータは任意選択であり、サブセットパラメータが定義されていない場合には、サブセットのフィルタリングは存在しない。
【００７６】
ＰＯＳＴＶＥＣの出力は、フィルターされたヒットのｐｄｂファイルである。これらのｐｄｂファイルは、簡単な表示および比較を可能にするクエリファイルと同じ基準座標系にある。
【００７７】
Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩを用いたヒットの検査
ＰＯＳＴＶＥＣから得たヒットを容易に検分することができるように、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩマクロ、ＥＸＡＭＩＮＥ＿ＨＩＴ．ＢＣＬ、が作成された。ＥＸＡＭＩＮＥ＿ＨＩＴ．ＢＣＬを用いる前に、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩの  ．ｐｓｖファイルである、ＥＸＡＭＩＮＥ．ＰＳＶを創製しなければならない。このファイルは、クエリベクトルと同じ基準座標系中にリガンドまたはレセプターを含んでいる。このファイルは、ヒットを表示するためのバックグラウンドとして用いられる。通常、リガンド／レセプターは、薄い色に設定されており、クエリベクトルは濃い線で強調され、Ｃαは赤い色、Ｃβは黄色に彩色されている。Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩでは、ＥＸＡＭＩＮＥ＿ＨＩＴ．ＢＣＬファイルを展開すると、次または前のボタンを介するか、またはヒットのファイル名をクリックすることによりヒットを視覚化する準備ができる。ヒットは、クエリおよびレセプター／リガンドと一緒に表示される。立体接触およびマッチしたベクトルが強調される。
【００７８】
ＶＥＣＴＲＩＸプログラムの代替表示が図式Ｂに示されている。
代案として、他の適当なクリーク検出アルゴリズムが、Ｂｒｉｎｔ  ＆  Ｗｉｌｌｅｔｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ，１９８７年，（前掲）およびＢｒｉｎｔ  ＆  Ｗｉｌｌｅｔｔ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．１９８７年，（前掲）（これらの文献は本明細書に文献援用される）により提供されている。
【００７９】
図式Ｃに略述されている一連の自動化スクリプトを用い、適当な候補を見つけるためにＢＲＯＯＫＨＡＶＥＮデータベースを検索して、システインリッチな小タンパク質のデータベースを毎週更新する。
【００８０】
１つ以上のヒットがクエリに従って上記アルゴリズムによって同定された各エントリに対応しているのが適当である。
ヒットが２つ以上ある場合には、各ヒットを評価し、ランク付けするのが望ましい。ヒットの評価において最も重要な要素は、クエリと比較したときのヒットの「立体整合性」すなわち３Ｄ構造相補性である。この目的に利用可能ないくつかのアルゴリズムが開発された。そのようなアルゴリズムには、ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮプログラムで使用されたアルゴリズム、各ヒットのファンデルワールスとクエリとのオーバーラップを調べるアルゴリズム〔Ａｌｉｎｇｅｒら，１９７２年，（前掲）、（この文献は本明細書に文献援用される）〕または各ヒットおよびクエリに関する共通容量およびエクストラ空間容量を計算するアルゴリズム〔Ｍａｒｓｈａｌｌら，１９７９年，（前掲）（この文献は本明細書に文献援用される）〕が含まれる。
【００８１】
他のアルゴリズムも有用であると考えられる。例えば、重ね合わさせた後のヒットとクエリとの間の単純な距離計算を用いて両者間の３Ｄ空間差を同定することができる。
【００８２】
現在スコアリングに用いられているプロセスの概略が図式Ｄに示されている。これらの手順は、ＰＯＳＴＶＥＣプログラムからの出力データを後処理するものであるが、これらの手順は、最後には、半自動化プロセスを提供するためにＰＯＳＴＶＥＣプログラムに組み込まれるであろう。現在のフィルタリングプロセスでは、ステップ１および２は、人工ヒットのコンフォメーション安定性を評価し、ステップ３は、レセプターとヒットとの適合度の最適化をもたらす。このフィルタリングプロセスは、ヒットとレセプター、例えば、サイトカインとサイトカインレセプターとの予測相互作用の点から見たヒットのスコアリングに関して記述されていることに留意されたい。当業者は、図式Ｄに略述されている原理はどのタンパク質−タンパク質相互作用にも適していることに気付くであろう。例えば、結晶構造が分っていない場合、ヒットがリガンドの立体表面に組み込まれていることを確認するためにスコアリング手順を実行することができる。
【００８３】
また、各ヒットの評価およびランク付けは、当業者が手動で実施し得るが、これは、特に、評価かつランク付けすべきヒットが複数ある場合には、あまり好ましくない方法であると考えられる。
【００８４】
上述に鑑み、本発明の方法がさらなる改変の主題である枠組みタンパク質「ヒット」を提供することが当業者には理解されよう。
本明細書に使用する場合、枠組みタンパク質ヒットは、アミノ酸配列類似性、トポグラフィー類似性および／または化学類似性を有することによって、サンプルタンパク質との「構造類似性」を有している。例えば、枠組みタンパク質「ヒット」は、サイトカインのレセプター結合領域のものと類似の表面トポグラフィーおよび／または化学を有している。枠組みタンパク質アミノ酸をサンプルタンパク質アミノ酸で置換すると、類似度が好ましく増大される。
【００８５】
ヒットとして同定された枠組みタンパク質は、サンプルタンパク質より高い安定性を有している。
本明細書に使用する場合、「安定性」には、タンパク質分解酵素および／もしくは温度変動による分解に対する耐性ならびに／またはカオトロピック剤および／もしくは変性界面活性剤、ｐＨ変化、ｐＨ極値、および／またはレドックス極値および／もしくは変化による変性に対する耐性が含まれる。
【００８６】
本発明の方法のステップ（ｉｉｉ）でクエリの作成に用いられる２つ以上のアミノ酸は、サンプルタンパク質の１つ以上の機能領域の少なくとも一部を構成することが理解されよう。これらのアミノ酸は、ヒットの改変に用いられる少なくとも１つのアミノ酸と同じであっても異なっていてもよい。
【００８７】
１つの実施態様において、ヒットに対応する枠組みタンパク質のアミノ酸配列は、その少なくとも１つのアミノ酸残基をサンプルタンパク質の少なくとも１つのアミノ酸残基で置換して改変する。サンプルタンパク質の少なくとも１個のアミノ酸は、サンプルタンパク質のある機能に要求されるアミノ酸から選択するのが好ましい。この工学プロセスは、所望により、アミノ酸の付加、削除または挿入を含み得る。
【００８８】
先に説明したように、そのような改変の目的は、枠組みタンパク質に特定の特性、特徴または機能を付与することである。本発明の方法は、特定の機能に必須の複数のアミノ酸残基が一次配列に関して連続していないことが多いという事実を考慮に入れている。しかし、これらの「分散」したアミノ酸残基は、１つ以上の機能領域の少なくとも一部を構成し得、各領域は３Ｄ空間の固有の位置および配向を占める。
【００８９】
枠組みタンパク質ヒットの改変は、枠組みタンパク質に、サンプルタンパク質の１つ以上の機能領域を効率的に「転移」させるように実施するのが有利であろう。転移は、サンプルタンパク質の（上記に定義されているような）１つ以上の機能領域由来のアミノ酸残基を枠組みタンパク質のアミノ酸配列に組み込むことにより達成される。そのような改変は、３Ｄ空間に適切に所在かつ配向されている１つ以上の機能領域のアミノ酸残基を組み込んだタンパク質を人工合成するように実施されるであろう。
【００９０】
１つの実施態様において、枠組みタンパク質は、サイトカイン模倣体として機能するように改変される。これに関連して、枠組みタンパク質の改変は、枠組みタンパク質が、（アゴニストの場合におけるように）サンプルタンパク質のものと類似の機能を示し得るように、あるいは、（アンタゴニストの場合におけるように）サンプルタンパク質の機能を阻害するように実施し得る。
【００９１】
しかし、本発明の範囲は、枠組みタンパク質のアミノ酸残基を置換して所望の機能を有するタンパク質を人工的に合成することにまで及ぶ。例えば、酵素を、基質の変換を触媒するように人工合成したり、または、転写因子を、その同種ＤＮＡ配列に結合させ、転写の促進に必要な他の転写因子との複合体を形成するように人工的に合成したりし得る。
【００９２】
サイトカイン模倣体を人工的に合成しようとする場合に、適当な方法は、（ヒットに対応する）枠組みタンパク質のアミノ酸配列を、そのアミノ酸残基をサイトカインの特定のレセプターとの結合に必要なアミノ酸残基から選択されたサイトカインのアミノ酸残基で置換して改変するものである。生物学的応答は、２つ以上のレセプター分子に結合し、それによってレセプター分子を架橋させるサイトカインにより誘起されることが多い。したがって、サイトカインアンタゴニストは、枠組みタンパク質を、一方のレセプター分子には結合するが他方のレセプター分子には結合しないために必要とされる１つの機能領域のアミノ酸残基を含むように改変して人工合成し、アゴニストは、２つのレセプター分子の結合および架橋に共に必要な２つの機能領域のアミノ酸残基を含むように人工合成される。２つのレセプタータンパク質を結合するのに必要な機能領域は、３Ｄ空間においてそれぞれ固有の位置および配向にある。したがって、アゴニストを人工的に合成するには、各機能領域の相対３Ｄ位置および配向がレセプターの結合および架橋を達成し得るようになっていることを必要とする。
【００９３】
サイトカインを特定のレセプターに結合させるのに必要なアミノ酸残基から選択された、前記サイトカインのアミノ酸残基の直接置換に加えて、いくつかの他の設計法を用いることもできる。サンプルタンパク質およびそのレセプターの原子構造が分っている場合、Ｘ−ＳＩＴＥ〔Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１７５，１９９６年；Ｂｏｈｍ，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ．Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．第６巻，６９ページ，１９９２年（これらの文献は本明細書に文献援用される）〕などの新規な設計プログラムを用いて、ヒット中に、活性を変化させる補助結合エピトープの人工合成を誘導し得る。補助結合エピトープは、合成ペプチド化学に用いられる保護基などの追加官能基に接合し得る天然または非天然のアミノ酸であり得る。
【００９４】
ＤｅｌＰｈｉ〔Ｈｏｎｉｇ  ＆  Ｎｉｃｈｏｌｌｓ  Ａ，‘ＤｅｌＰｈｉ’，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９８７年（この文献は、本明細書に文献援用される）〕などの、変異枠組みとサンプルタンパク質との静電的類似性または変異枠組みとサンプルタンパク質レセプターとの静電的相補性を測定するプログラムを用いて、活性に有害であり得る、変異枠組みの非変異領域を決定することができる。
【００９５】
Ｎａｃｃｅｓｓ〔Ｈｕｂｂａｒｄ  ＆  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，‘ＮＡＣＣＥＳＳ’，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ，１９９３年（この文献は本明細書に文献援用される）〕などの、埋もれている表面積を測定するプログラムを用いて、サンプルタンパク質と変異枠組みの埋もれている表面積を分析、比較し得る。
【００９６】
タンパク質中の領域は、無秩序で、Ｘ線またはＮＭＲ構造からは見えないことが多い。サンプルタンパク質の結合領域に残基が見当たらない場合、ホモロジ−モデル化またはループ検索などの方法を用いて原子座標の完全モデルを構築することができる。
【００９７】
どの方法をとるにせよ、枠組みタンパク質のアミノ酸配列の改変には、立体化学および二次構造の整合性の維持を考慮する必要がある。したがって、そのような改変によって枠組みタンパク質中に誘起される構造的効果を予測できることが重要である。これは、Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，第２５３巻，１６４−１７０ページ，１９９１年；Ｌｕｔｈｙら，Ｎａｔｕｒｅ，第３５６巻，８３−８５ページ，１９９２年；およびＬａｓｋｏｗｓｋｉら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．，第２６巻，２８３−９１ページ，１９９３年に記載されているような、当業では周知のアルゴリズムを用いて達成し得る。
【００９８】
改変枠組みタンパク質は、化学合成されるのが好ましい。あるいは、これは、改変枠組みタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を化学合成して達成することもできる。タンパク質および核酸の化学合成に用い得る方法は当業において周知であり、そのような方法の例を以下に提供する。
【００９９】
あるいは、ヒットに対応する枠組みタンパク質のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を試験管内突然変異誘発法により改変して、改変枠組みタンパク質のアミノ酸配列をコードする改変ポリヌクレオチド配列を生成してもよい。Ｃｈａｐｔｅｒ  ８  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ〔Ａｕｓｕｂｅｌら，編；Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，１９９５年（この文献は本明細書に文献援用される）〕に記載されているものなどの適当な試験管内突然変異誘発法は当業において周知である。ファージの表示も企図されており、その方法は当業では周知である。一般的な代表的なファージ表示法は、Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，第２７７巻，３１７ページ，１９９８年（この文献は本明細書に文献援用される）に提供されている。
【０１００】
本発明の１つの実施態様によれば、データベース中の各エントリは、初期にはデカルト座標形式で表示されるが、その後、検索に先だってＣα−Ｃβベクトルの距離行列表示にプロセスされる、７０以下のアミノ酸残基を有するシステインリッチな小タンパク質に対応する。クエリは、サンプルタンパク質のアミノ酸側鎖に対応するＣα−Ｃβの距離行列表示の形式であり、これらのアミノ酸側鎖は、サンプルタンパク質とレセプタータンパク質との高親和性結合に必要である。１つの特定の実施態様において、サンプルタンパク質は、ＧＨ、ＩＬ−４、Ｇ−ＣＳＦおよびＩＬ−６からなる群から選択される。
【０１０１】
サンプルタンパク質がヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、レセプタータンパク質がヒト成長ホルモンレセプター（ｈＧＨＲ）の場合、ｈＧＨのＣα−Ｃβベクトルは、高親和性結合時にｈＧＨＲと接触し、そのような結合に必要とされる、ｈＧＨのアミノ酸側鎖の３Ｄ位置および配向の簡略型である。
【０１０２】
この場合では、ヒットに対応するシステインリッチな小タンパク質はシラトキシンであり、（図１に示されている）そのアミノ酸配列は、この配列を用いて産生されるタンパク質が潜在的にｈＧＨアンタゴニストとして機能し得るように改変されている。その検索プロセスに用いた特定のＣα−Ｃβベクトルは、Ａｓｐ  Ａ１７１；Ｌｙｓ  Ａ１７２；Ｇｌｕ  Ａ１７４；Ｔｈｒ  Ａ１７５；Ｐｈｅ  Ａ１７６；Ａｒｇ  Ａ１７８；  Ｉｌｅ  Ａ１７９；Ｌｙｓ  Ａ４１；Ｌｅｕ  Ａ４５；Ｐｒｏ  Ａ４８；Ｇｌｕ  Ａ５６；Ａｒｇ  Ａ６４；およびＧｌｎ  Ａ６８であった。シラトキシンのアミノ酸配列に組み込まれるｈＧＨの特定のアミノ酸残基は、（上記に示されているような）ｈＧＨとｈＧＨＲとの高親和性結合に必要であり、かつトポグラフィーがシラトキシンの残基とマッチしたものから選択した。シラトキシンのどのアミノ酸を構造整合性に大きな影響を与えることなく置換し得るかは、ＩＮＳＩＧＨＴ  ＩＩモデリングプログラムの助けを借りて決定した。
【０１０３】
可能性のあるｈＧＨアンタゴニストとして設計されたＳＣＹ０１−ＳＣＹ０３ペプチドを、図１に示されている各アミノ酸配列を用いて化学合成した。
別の場合では、ヒットに対応するシステインリッチな小タンパク質はマリーンウォームトキシン（ｍａｒｉｎｅ  ｗｏｒｍ  ｔｏｘｉｎ）（ＶＩＢ）である。このヒットは、以下のｈＧＨアミノ酸残基：Ｌｙｓ  Ａ４１；Ｌｅｕ  Ａ４５；Ｐｒｏ  Ａ４８；Ｇｌｕ  Ａ５６；Ａｒｇ  Ａ６４；Ｇｌｎ  Ａ６８；Ａｓｐ  Ａ１７１；Ｌｙｓ  Ａ１７２；Ｇｌｕ  Ａ１７４；Ｔｈｒ  Ａ１７５；Ｐｈｅ  Ａ１７６；Ａｒｇ  Ａ１７８；Ｉｌｅ  Ａ１７９；Ａｒｇ  Ａ８；Ｌｅｕ  Ａ９；Ａｓｎ  Ａ１２；Ｌｅｕ  Ａ１５；Ａｒｇ  Ａ１６；Ｈｉｓ  Ａ１８；Ａｒｇ  Ａ１９；Ｔｙｒ  Ａ１０３；Ａｓｐ  Ａ１１６；Ｌｅｕ  Ａ１１７；Ｇｌｕ  Ａ１１９；およびＴｈｒ  Ａ１２３を含むクエリを用いたデータベース検索により同定した。
【０１０４】
ヒット（ＶＩＢ）のアミノ酸配列は図２に示されており、ヒット（ＶＩＢ０１）の１つ以上のアミノ酸を改変して人工合成したタンパク質のアミノ酸配列は図２に示されている。ヒットの改変に用いたｈＧＨの特定のアミノ酸残基は、図２に示されているようなｈＧＨのアゴニスト結合機能領域を構成するものから選択した。ｈＧＨとマリーンウォームトキシンとのオーバーラップが図３に示されており、これは、サイトカインアゴニストの機能領域とマッチするヒットを同定するための本発明の方法の能力を強調するのに十分である。
【０１０５】
ｈＧＨアゴニスト領域に従って設計されたペプチドは、候補ｈＧＨアゴニストを構成する。
上記に鑑み、本発明は上記第２の態様によるような人工タンパク質を企図していることが理解されよう。
【０１０６】
１つの実施態様において、人工タンパク質中に存在する別のタンパク質のアミノ酸は、該別のタンパク質の少なくとも１つの機能領域に対応する。
別の実施態様において、人工タンパク質中に存在する別のタンパク質のアミノ酸は、該別のタンパク質の２つの機能領域に対応する。
【０１０７】
この別のタンパク質は、一次配列中で隣接していないアミノ酸を提供するだけでなく、一次配列中で隣接しているアミノ酸も提供し得る。
１つの実施態様において、人工タンパク質は、ＳＣＹ０１、ＳＣＹ０２、ＳＣＹ０３、ＥＲＰ０１、ＥＲＰ０２、ＥＲＰ０３およびＶＩＢ０１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【０１０８】
また、本発明の第１および第２の態様に従って、人工タンパク質のホモログが企図されることも理解されよう。保存性アミノ酸の置換、削除および付加を、アミノ酸配列におけるそのような変化にもかかわらず、タンパク質が特定の機能を保持するように実施し得ることが当業者には理解されよう。そのようなホモログは、本明細書に記載の本発明の範囲内に包含される。
【０１０９】
本発明をさらに詳細に理解するために、当業者は以下の本発明を限定するわけではない実施例を参照されたい。
実施例
実施例１
データベース検索法の概観
本発明者により開発されたコンピュータアプローチであるプログラムＶＥＣＴＲＩＸの概略を図４に示す。第１ステップは小さなシステインリッチなタンパク質のライブラリーの作成である。現在、３７７９を超える実験により導かれた３Ｄ構造を含む３４４のそのようなタンパク質（それぞれが７０未満のアミノ酸残基を有する）がＢＲＯＯＫＨＡＶＥＮデータベースから抽出されている。しかしながら、例えば相同モデリング、スレッディング（threading ）あるいはこの分野では周知の技術により、理論的に導かれた特徴を用いてデータベースを作成するのも可能である。
【０１１０】
それぞれの構造は続いて簡略化してＣα−Ｃβベクトルとされ（ステップａ）、本質的にはエントリデータベースが得られる（ステップｂ）。データベースを検索するために、それぞれのクエリはＣα−Ｃβベクトルの距離行列表示の型とされる（ステップｃ）。しかしながら、２面角（δ）あるいはα１およびα２角などの他の手段によりＣα−Ｃβベクトルを表すことは可能である。Ｃα−Ｃβベクトル対に関するこれらの表示の型の簡単な説明を図５に示す。
【０１１１】
検索アルゴリズムは、クエリＣα−Ｃβベクトルを表す距離行列を各エントリのＣα−Ｃβベクトルを表す距離行列と比較する（ステップｄ）。トポグラフィー類似性の比較を選択した。というのは、Ｃα−Ｃβベクトルはすべてのアミノ酸側鎖（グリシンを除く）に共通であり、本質的に骨格に固定されているからである。そのため、Ｃα−Ｃβベクトルは、アミノ酸側鎖の３Ｄ空間における最初の配向を表し、その配向はおそらく他のタンパク質との相互作用ではそれほど変化しない。側鎖の余分な原子により、そのような相互作用の間におけるある程度の適合が導かれると考えられる。
【０１１２】
その代わりに、より限定されたアプローチは、この分野では周知の適したアルゴリズム（ホルム＆サンダー（Ｈｏｌｍ＆Ｓａｎｄｅｒ）、１９９４年、（前掲）；アレキサンドロフ（Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ）、１９９６年、（前掲）；アレキサンドロフ＆フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）、１９９６年、（前掲）；オレング（Ｏｒｅｎｇ）、１９９４年、（前掲））と共に、α−炭素骨格構造などの二次構造特徴を使用する。
【０１１３】
Ｃα−Ｃβベクトルの分子内での幾何学的関係は、ホー＆マーシャル（Ｈｏ＆Ｍａｒｓｈａｌｌ）、１９９３年、（前掲）のクリーク検出アルゴリズムを用いて比較する。このアルゴリズムはユーザが規定する最小ベクトル成分の数に従いヒットを識別する。しかしながら、これについては当技術分野において周知の他のアルゴリズムもまた有効である。
【０１１４】
ステップｄの結果、１以上のヒットが識別され得る。１つのヒットが得られた場合、ランク付けは必要ない。ヒット数が小さい場合、熟練者であればそれぞれのヒットを個別に評価しランク付けすることが可能であろう（ステップｅ）。しかしながら、ヒット数が大きい場合、そのようなマニュアルによる比較はより困難となり、自動化されたプロセスが必要とされる。
【０１１５】
ヒットを評価しランク付けするのに最も重要な因子は立体的な完全性（integrity ）、すなわち、各ヒットが存在すべき３Ｄ空間に関して有する構造相補性である。例えば、クエリがホルモンのレセプター結合アミノ酸側鎖に対応するＣα−Ｃβベクトルの距離行列表示のタイプである場合、ヒットはサイトカインが結合した時にレセプターがアクセスする３Ｄ空間に侵入するかどうかの観点から評価されなければならない。この目的のために有効ないくつかのアルゴリズムが開発されている。例えば、１９９３のホー＆マーシャルのＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮプログラム（（前掲））は様々なフラッドフィリングアルゴリズムを使用し、レセプターの結晶構造から決定されるレセプターにより占有される３Ｄ空間を規定する。このプログラムは原子チェックルーチンを使用して、ヒットの原子がレセプターの結合「穴」内に存在するかどうか確立する。他のアプローチは、格子点を含む立方体内に分子を配置するステップと、各分子のファンデルワールスオーバーラップをチェックするステップを含む（アリンジャー（Ａｌｌｉｎｇｅｒ）、１９７２年、薬理学と人の未来において、薬理学に関する第５回国際会議の議事録、ｐｐ５７−６３）。関連する方法は、２つの分子の共通体積と過剰空間の体積の計算を含む。（マーシャルら、１９７９年、薬物設計における立体配座パラメータ。活性アナログアプローチ、１１２、２０５）。
【０１１６】
クエリとヒットの間の簡単な距離計算を使用することも可能で、その２つを重ね合わせた後、そのヒットがクエリ構造により占有される空間からはみ出るかどうか認識される。これは、本発明者等が現在構成したアルゴリズムにおいて実行してきたアプローチである。
【０１１７】
ヒットを改変すると、アミノ酸配列変化から生じる劇的な構造効果を予想することができることも需要である。これは部分的には、改変されたヒットのアミノ酸配列とそのクエリが対応するタンパク質（あるいはタンパク質の領域）のアミノ酸配列との同一性の程度を最大にすることにより達成される。さらに、改変されたヒットの立体化学および二次構造妨害の程度は、アミノ酸を基本とするアミノ酸に関するタンパク質立体化学をチェックする標準アルゴリズムを使用して評価することができる。同様に、二次構造予測アルゴリズムを使用して、ヒットのアミノ酸配列改変が二次構造を妨害する可能性を評価することができる。
【０１１８】
最後に、本発明者らは分子表面を用いてクエリとヒットの様々な物理化学的性質を比較しようとしている。電荷、静電位、疎水性、占有、水素結合電位をすべてタンパク質表面にマップし、たんぱく質間で詳細な比較を行った。２つの分子表面の間の類似性の程度を定量するための方法は開発されている。この方法では、グノモン投影により所定の性質の計算された値が球面上に投影される（ダスンジンガー＆ディーン（Ｄａｓｎｚｉｎｇｅｒ＆Ｄｅａｎ）、１９８５年、Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１６  ２１５）。その後、２つのそのような表面は対応する原子の対を用いて重ね合わせることができる。このアルゴリズムはクエリタンパク質をヒットと比較するのに非常に有効であり、そのヒットに対応するタンパク質のアミノ酸残基の細かな調整が可能であり、立体および電気化学相補性が改良される。
【０１１９】
本発明の方法に適用することができるデータベース検索アルゴリズム（例えば、ＶＥＣＴＲＩＸプログラムにより提供されるもの）により、部分的なヒットの識別が可能となるので、熟練者であれば分子モデリングを用いてデータベース検索において見落されたベクトルを模倣するために部分的なヒットに対応するタンパク質表面上の追加の領域の識別をする余地がある。これは、例えば模倣体を人為的に操作する際により高い類似性を達成するために、Ｄ−アミノ酸またはコードされていないアミノ酸の使用を含むことがある。
【０１２０】
以下の実施例では、ＶＥＣＴＲＩＸプログラムを様々なサンプルタンパク質に適用している。
実施例２
高親和性ｈＧＨアンタゴニスト
成長ホルモン（ＧＨ）は多くの成長過程、例えば筋肉、骨および軟骨細胞の成長と分化を調整する下垂体サイトカインである。成長サイトカインレセプター（ＧＨＲ）は３つのドメインからなる。
【０１２１】
（ｉ）ＧＨに結合する細胞外ドメイン
（ｉｉ）経膜ドメイン
（ｉｉｉ）サイトカイン結合時に細胞内信号を導き出すのに関係する細胞質ドメイン
細胞内シグナリングは、各レセプターが単一のＧＨリガンドに逐次結合した後、別個のＧＨＲのニ量体化の結果により起こる。第１のＧＨＲはＧＨの高親和性サイトに結合し、第２のＧＨＲは続いてこの複合体に結合する。このモデルをサポートするものとして、この複合体の結晶構造は、単一のヒトＧＨ分子上の異なるサイトに結合した２つの同一のレセプター分子を示す（ｈＧＨ：デボス（Ｄｅ  Ｖｏｓ）ら、１９９２年、サイエンス２５５  ３０６）。
【０１２２】
ｈＧＨ上の高親和性サイトは凹状で表面積約１２００Å２が埋められるが、ｈＧＨ上の第２の結合サイトでは表面積約９００Å２が埋められる。複合体の安定性に寄与する第３の領域はレセプター−レセプター相互作用により埋められる５００Å２の領域を含む。
【０１２３】
結晶構造により、ｈＧＨの高親和性サイトと低親和性サイトの両方の実際の接触領域は、レセプターとの複合体形成時に埋められることが明らかになっている。
【０１２４】
ｈＧＨのアンタゴニストを開発する際に、本発明者等はｈＧＨの高親和性結合を模倣する分子を設計することを試みた。高親和性結合サイト内のアミノ酸残基の突然変異研究により、若干数のこれらのアミノ酸残基をアラニンに変換すると親和性が著しく減少することが示された（クニングハム＆ウエルズ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ＆Ｗｅｌｌｓ）、１９９３年、２３４  ５５４）。これに関しては、埋められた側鎖を有する３１のアミノ酸残基のうち、ほんの８つ（Ｌｙｓ  Ａ４１；Ｌｙｓ  Ａ４５；Ｐｒｏ  Ａ６１；Ａｒｇ  Ａ６４；Ｌｙｓ  Ａ１７２；Ｔｈｒ  Ａ１７５；Ｐｈｅ  Ａ１７６；Ａｒｇ  Ａ１７８）がアラニンによる置換により起こる結合エネルギーの総変化の約８５％の原因となっていた。さらに５つの残基（Ｐｒｏ  Ａ４８；Ｇｌｕ  Ａ５６；Ｇｌｎ  Ａ６８；Ａｓｐ  Ａ１７１；Ｉｌｅ  Ａ１７９）が本質的には、結合エネルギーの残りの原因であった。
【０１２５】
アンタゴニストの設計において現在使用されているＧＨ残基は、Ａｓｐ  Ａ１７１；Ｌｙｓ  Ａ１７２；Ｇｌｕ  Ａ１７４；Ｔｈｒ  Ａ１７５；Ｐｈｅ  Ａ１７６；Ａｒｇ  Ａ１７８；Ｉｌｅ  Ａ１７９；Ｌｙｓ  Ａ４１；Ｌｅｕ  Ａ４５；Ｐｒｏ  Ａ４８；Ｇｌｕ  Ａ５６；Ａｒｇ  Ａ６４；Ｇｌｎ  Ａ６８である。データベース検索目的のクエリの基本となるのはｈＧＨのこれらのアミノ酸残基である。
【０１２６】
ｈＧＨ高親和性表面の最大７つのベクトルとマッチするヒット枠組みとしてシラトキシン（ｐｄｂ１ｓｃｙ）がリターンされた。ヒット分子の識別後、分子モデリング研究を用いてそのヒットを最適化し、ＳＣＹ０１、ＳＣＹ０２、ＳＣＹ０３の設計を行った。
【０１２７】
例えば、（ＩＮＳＩＧＨＴ  ＩＩを用いる）分子モデリング研究では、シラトキシン系模倣体のＣ末端Ｈｉｓは、レセプターとは相互作用しないので除去できることが示唆された。このことは、Ｈｉｓはペプチド構築中にラセミ化する可能性があるため、標的分子を合成する際に好都合である。図１に示されるように、突然変異枠組みＳＣＹ０１は、７つのマッチするｈＧＨ残基、Ｒ１６７、Ｋ１６８、Ｄ１７１、Ｋ１７２、Ｅ１７４、Ｔ１７５、Ｆ１７６の移入により作成した。同様に、ＳＣＹ０２はｈＧＨ残基、Ｄ１７１、Ｋ１７２、Ｅ１７４、Ｔ１７５、Ｆ１７６、Ｒ１７８、Ｉ１７９の移入により設計した。しかしながら、親和性成熟ｈＧＨ突然変異Ｅ１７４ＳをＳＣＹ００２中に組み入れた。同様に、ＳＣＹ０３は親和性成熟ｈＧＨ突然変異Ｄ１７１ＳおよびＥ１７４Ｓを組み入れた。このように、単一のヒットを基に幾つかの類似体が設計された。この類似体は異なる機能性残基および親和性成熟残基を組み入れた。
【０１２８】
さらに、分子モデリング技術を用いて、新しい枠組みに移されたアミノ酸の機能性を最適化した。ｈＧＨＲの原子構造を使用し、Ｘ−ＳＩＴＥ（ラスコフスキー（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ）ら、１９９６年、（前掲））により、ヒットペプチド内に組み入れることができる官能基に対する結合サイトを予想した。このように、プログラムＸ−ＳＩＴＥ（ラスコフスキー（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ）ら、１９９６年、（前掲））の助けを借りて、新規突然変異および補足官能基を組み入れてＳＣＹ０２およびＳＣＹ０３からＳＣＹ１３を開発した。図１に示されるように、ＳＣＹ１３はＤ１７１Ｙ突然変異、Ｔ１７５Ｄ突然変異およびＦ１７６Ｅ（Ｆｍ）突然変異を有する。さらに、天然シラトキシン配列中のＮ４Ｒ突然変異もまた、Ｘ−ＳＩＴＥ（ラスコフスキー（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ）ら、１９９６年、（前掲））結果を基に組み入れられた。これらの突然変異を組み入れ、静電相互作用を最適化し、モデルとしてのＳＣＹ−ｈＧＨＲ複合体の結合表面積を増加させた。
【０１２９】
分子モデリング研究により、ＳＣＹ０１、ＳＣＹ０２、ＳＣＹ０３では、ｈＧＨＲに結合されると約７００Å２が埋め込まれ、一方ＳＣＹ１３ではｈＧＨＲに結合されると約１０００Å２が埋め込まれる。モデリングプログラムＤｅｌＰｈｉ（ホーニグ、Ｂ＆ニコルス、Ａ（Ｈｏｎｉｇ，Ｂ．＆Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，  Ａ）（１９８７）、「ＤｅｌＰｈｉ」、コンピュータプログラム、コロンビア大学生物化学および分子生物物理学部）を使用してｈＧＨとＳＣＹペプチドの静電位マップを比較すると、ｈＧＨとＳＣＹペプチドの間には良好な相補性があるという結論が得られた。
【０１３０】
シラトキシンペプチドＳＣＹ０１−ＳＣＹ０３およびＳＣＹ−１３（図１）をその後、固相技術（Ｍ．シュノルツァー（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ）ら、１９９２年、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４０  １８０−１９３）を用いて合成し、精製し、酸化させた。質量分析法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびアミノ酸解析（ＡＡＡ）を用いて、生成物のキャラクタリゼーションを十分行った。ＳＣＹ０１およびＳＣＹ０２に関する円偏光二色性により、人工ＳＣＹ分子の二次構造要素を決定した（図６）。スペクトルから天然ＳＣＹ折り畳み（フォールド：ｆold ）と一致する高いらせん量が示された。さらに、ＣＤによりらせん構造は、ＴＦＥなどのらせん安定化剤やグアニジン、ＨＣｌまたは温度などの不安定化剤を添加しても、温度によっても変化しないことが示された。これによりこれらの枠組みの好ましい化学的特性が強調される。
【０１３１】
新しく人為的に操作したＳＣＹ枠組みがクエリとして使用されるＧＨの領域の構造を模倣しているかについて決定するために、ＳＣＹ０１の構造をＮＭＲ分光法により決定した。図７に示されるように、ＧＨ上の官能基およびＳＣＹ０１の人為的に操作された表面との間で配座のオーバーラップ（ＲＭＳ０．４５Å）があることが見出された。このように、標的タンパク質を選択するプロセスを確認し、機能的エピトープを簡略化しＣα−Ｃβベクトルとし、これらをクエリとして使用しこのクエリの形状にマッチする新規枠組みを識別し、新しく枠組みを合成し、キャラクタリゼーションを行い、折り畳む。得られた新しい人工枠組みは、構造的に標的タンパク質の機能的エピトープの構造にマップし、このように設計プロセスが実証される。
【０１３２】
ＳＣＹ０２およびＳＣＹ０３の折り畳みパターンのキャラクタリゼーションを行うために、再びＮＭＲ実験を実行した。しかしながら、今回は、人工ＳＣＹと天然ＳＣＹとの間で二次シフトを比較した（ウィシャート（Ｗｉｓｈａｒｔ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ５  ６７）。予測したように、天然ＳＣＹ分子に比べＣＨαまたはＮＨαシフトにおいてずれはほとんどないかあるいは全くなく、正しい折り畳みおよびジスルフィド結合が示される。
【０１３３】
ＳＣＹ０１についてＢａＦ３細胞系を用いた生物検定により生物学的機能の試験を行った。この細胞は通常、ＧＨに応答する。結果を図８に示す。ＳＣＹ０１について様々な濃度で検定し、０．５ｎｇ／ｍＬのｈＧＨまたはコントロールである５０単位／ｍＬのＩＬ−３に応答するＢａＦ３細胞増殖の阻害能力をチェックした。これらの実験から計算したＫｉは約２００μＭであり、ＩＬ−３誘発増殖に関しては阻害活性は観察されなかった。このようにＳＣＹ０１はＧＨに刺激される増殖に関し阻害活性を示した。この生物学的効果により、ＳＣＹ０１は作用メカニズムに関しさらに調査する対象候補である。
【０１３４】
７２時間までの検定緩衝液中でのインキュベーションの後のさまざまな時間点でのペプチドのＨＰＬＣにより判定すると、ＳＣＹペプチドはｈＧＨ検定緩衝液中で非常に良好な安定性を示した。予備研究では、ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ  ＡＮＤ  ＭＥＨＯＤＳに説明されているように、ＳＣＹ０１を様々なプロテアーゼ（トリプシン、キモトリプシンおよびペプシン）および血清タンパク質に暴露することによりＳＣＹ０１の生体利用効率を評価した。血清安定性試験の結果を表２に示す。酵素安定性試験の結果を表３に示す。ＳＣＹペプチドはそれぞれの場合において２４時間後において安定であることがわかった。一方コントロールペプチドは直ちに消化された。このように、ジスルフィドリッチなタンパク質の好ましい化学的特性が強調される。
【０１３５】
この実施例において、本発明者等はｈＧＨの機能的エピトープを取り上げ、該機能的エピトープを新規ジスルフィドリッチな枠組み上で人為的に操作することに成功した。この枠組みは高分子タンパク質に比べ生体利用効率および生物活性の観点から興味のある化学的特性を有する。
【０１３６】
実施例２に対する実験
ＶＥＣＴＲＩＸ結果
検索したベクトルの数
１５−Ｒ１６７、Ｋ１６８、Ｄ１７１、Ｋ１７２、Ｅ１７４、Ｔ１７５、Ｆ１７６、Ｒ１７８、Ｉ１７９、Ｋ４５、Ｐ４８、Ｅ５６、Ｒ６４、Ｑ６８。
選択した異なる枠組みの数（名称：ｐｄｂコード番号ベクトルマッチ）
シラトキシン：ｐｄｂ１ｓｃｙ（７）
合成
一般的な材料および方法のセクションにおいて説明する通りである。ペプチドのキャラクタリゼーションは、質量分析、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）およびアミノ酸分析（ＡＡＡ）により十分行った。
【０１３７】
折り畳み
ＮＨ４ＨＣＯ３の０．１Ｍ溶液を用いて一晩中室温で攪拌しながらペプチド濃度〜０．３μＭ／ｍｌで純粋な還元ペプチドＳＣＹ０１−０３の折り畳みを行い、ＨＰＬＣおよび質量分析によりモニタした。折り畳まれたペプチドを予備ＨＰＬＣにより単離した。ＳＣＹ０１に対する正確なジスルフィド結合性をＮＭＲによる全構造解析により決定した。１００：１０：１の比率のＧＳＨ：ＧＳＳＧ：ペプチド中酸化および還元グルタチオンを用いる折り畳み方法およびｐＨ７．４のＮａＰＯ４緩衝液中で５ｍＭ  ＧＳＳＧ対０．５ｍＭ  ＧＳＨを用いる公表されている方法を実行し、同様に折り畳まれた材料を得た。純粋ペプチドを折り畳んだ後、全く同じように粗ペプチドを折り畳むことにより等価な収量のペプチドが得られた。ＳＣＹ１３の酸化はＧｌｕに付着したＦｍ基により複雑になった。ｐＨ７．４のＮａＰＯ４緩衝液中、５ｍＭ  ＧＳＳＧ対０．５ｍＭ  ＧＳＨが存在する３０％ＴＦＥ溶液を用いてＳＣＹ１３を酸化した。
【０１３８】
円偏光二色性（ＣＤ）
一般的な材料および方法のセクションにおいて概略を示すようにＣＤを実行した。
ＮＭＲ
ＳＣＹ０１のＮＭＲ構造およびＣＨαとＮＨαの結合性を一般的な材料および方法のセクションにおいて概略を示すように決定した。
【０１３９】
ペプチド安定性試験
検定緩衝液中での安定性
ＳＣＹペプチドはｈＧＨ検定緩衝液（１０％（ｖ／ｖ）の胎児ウシ血清（ＦＢＳ）と１００単位／ｍＬのＩＬ３が追加されたＲＰＭＩ−１６４０媒質）中で非常に良好な安定性を示した。ペプチドを３７℃、緩衝液中１ｍｇ／ｍｌでインキュベートした。サンプルを様々な時間点で取りだし、ＨＰＬＣ分析を行い、７２時間までのペプチド分解速度を求めた。
【０１４０】
血清
静脈穿刺によりへパリンを投与したチューブ中に血液を採集した。血液の遠心分離を５０００ｒｐｍで２０分行い、血清を静かに注いだ。血清を−２０℃で保存した。血清サンプル（９００μｌ）を３７℃でストックペプチド溶液（Ｈ２Ｏ中１ｍｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、要求された時間にアリコート（１００μＬ）を取り出した。５０％  ＣＨ３ＣＨ  ０．１％  ＴＦＡの溶液を添加し血清タンパク質を沈殿させ、１３０００ｒｐｍで５分遠心分離を行った。この溶液のサンプル（１００μＬ）をＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８  ２１８ＴＰ５４  ２５０×４．１ｍｍ  ｉｄ  １％／分  勾配Ｈ２Ｏ／ＣＨ３ＣＨ  ０．１％ＴＦＡ）により分析し、ペプチド消化を検出した。
【０１４１】
酵素安定性試験
トリプシン
ペプチド溶液（ＮＨ４ＨＣＯ３、ｐＨ８．３、０．８７ｍｇ／ｍＬ）にトリプシン（５％  ｗ：ｖ）を添加した。サンプルを３７℃でインキュベートし、０，１，３，１８時間にアリコートを取りだし、上記のようにＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。
【０１４２】
キモトリプシン
ストックペプチド溶液（１００μＬ）に９００μＬのＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８．３）を添加した。５％  ｗ：ｖまでキモトリプシンを添加し３７℃でインキュベートした。０，１，２４時間にアリコートを取りだし、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。
【０１４３】
ペプシン
ストックペプチド溶液（１００μＬ）にＨ２Ｏ（８００μＬ）と０．１Ｍ  ＨＣｌ（１００μＬ）を添加しｐＨ２．２とした。ペプシンを添加し１％ｗ：ｖ溶液とし、３７℃でインキュベートした。０，１，２４時間にアリコートを取りだし、ＲＰ−ＨＰＬＣにより分析した。
【０１４４】
実施例３
成長ホルモン−低親和性サイト
成長ホルモンの低親和性サイトは少なくとも１２の残基を含む。これらの１２の残基のＣα−ＣβベクトルをＶＥＣＴＲＩＸ検索において使用した。１Åの許容度で適合された９つの検索ベクトルがマッチする最も良好なヒットとしてＰｄｂ１ｚｄｃ（ＺＤＣ）がリターンされた。これらの残基はＲ８、Ｌ９、Ｄ１１、Ｎ１２、Ｌ１５、Ｒ１６、Ｒ１９、Ｄ１１６、Ｅ１１９であった。分子モデリング（Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ）を再び用いてヒットを最適化した。Ｒ２９Ｌ（ｈＧＨのＬ９にマッチする）はＺＤＣの折り畳みを妨害するかもしれないことが決定され、この突然変異は組み入れられなかった。さらに、追加の分子モデリング研究により、ＺＤＣはｈＧＨの他の７つの残基にマッチする可能性があることも示唆された。マッチしＺＤＣ０５に組み入れられた残基（１５残基−ヒットとｈＧＨとの間のＲＭＳｄ骨格原子−１．４６オングストローム）はＲ８、Ｄ１１、Ｎ１２、Ｌ１５、Ｒ１６、Ｙ１１１、Ｄ１１２、Ｋ１１５、Ｄ１１６、Ｅ１１８、Ｅ１１９、Ｇ１２０、Ｑ１２２、Ｔ１２３であった。図９に示されるように、突然変異枠組みＺＤＣ０５はｈＧＨにマッチする上記１５残基の移入により作成した。
【０１４５】
実施例３の実験
ＶＥＣＴＲＩＸ結果
検索したベクトルの数
１２−Ｒ８、Ｌ９、Ｄ１１、Ｎ１２、Ｌ１５、Ｒ１６、Ｒ１９、Ｄ１１２、Ｌ１１３、Ｄ１１６、Ｅ１１９、Ｔ１２３。
７以上のベクトルマッチでの異なるマッチの数：２２
７以上のベクトルマッチでの固有の枠組みの数：６
選択された異なる枠組みの数（名称：ｐｄｂコード番号ベクトルマッチ）
タンパク質Ａ人為的操作フラグメント：ｐｄｂ１ｚｄｃ（９）
実施例４
成長ホルモンアゴニストＩ
ｈＧＨのアゴニスト部位は２５残基を含む。これらの２５残基のＣα−ＣβベクトルをＶＥＣＴＲＩＸ検索において使用した。Ｐｄｖ１ｖｉｂ（ＶＩＢ）がマッチした８検索ベクトルにより最も良好なヒットとしてリターンされた。これらの残基はＮ１２、Ｒ１６、Ｒ１９、Ｄ１７１、Ｋ１７２、Ｅ１７４、Ｔ１７５、Ｆ１７６であった。分子モデリングによりＶＩＢはさらにｈＧＨの９残基とマッチすることが決定された。マッチ（１７残基−ヒットとｈＧＨとの間のＲＭＳｄ骨格原子−０．８６オングストローム）し、ＶＩＢ０１に組み入れられた残基は、Ｄ１１、Ｎ１２、Ｒ１６、Ｒ１９、Ｌ２０、Ｈ２１、Ｑ２２、Ｌ２３、Ｆ２５、Ｒ１６７、Ｋ１６８、Ｄ１６９、Ｄ１７１、Ｋ１７２、Ｅ１７４、Ｔ１７５、Ｆ１７６であった。図２に示されるように、突然変異枠組みＶＩＢ０１は上記１７のマッチするｈＧＨ残基の移入により作成した。
【０１４６】
モデリングプログラムＤｅｌｐｈｉ（ホーニグ＆ニコルズ、１９８７、（前掲））を使用してｈＧＨと模倣体の静電位マップを比較すると、ｈＧＨと模倣体との間には良好な相補性が存在するという結果が得られた。
【０１４７】
分子力学力場最小化および分子動力学の助けを借りて、ＶＩＢ０１が模倣ｈＧＨに対し適当な空間配向で突然変異された残基を配置し、本来の折り畳みを保持することが決定された。
【０１４８】
ＶＩＢペプチド（図２）を固相技術（Ｍ．シュノルツァ（Ｓｈｎｏｌｚｅｒ）ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（前掲））を用いて合成し、精製し、酸化した。生成物のキャラクタリゼーションを質量分析、ＨＰＬＣ、ＡＡＡを用いて十分行った。人工ＶＩＢ分子の二次構造要素を図１０に示されるように円偏光二色性によりチェックした。人工ＶＩＢペプチドは非常に安定した構造を有し、水溶液状態ではかなりのらせん特性を示す。これから本来の折り畳みがらせんループまたはらせんモチーフであることが予想される。
【０１４９】
さらに、ＶＥＣＴＲＩＸ検索により、７検索ベクトルがマッチしたヒットとしてペプチドＥＲＰが識別された。これらの残基はＮ１２、Ｌ１５、Ｒ１６、Ｈ１８、Ｒ１９、Ｔ１７５、Ｒ１７８であった。分子モデリングによりＥＲＰはさらにｈＧＨの６残基とマッチすることが決定された。マッチ（１３残基−ヒットとｈＧＨとの間のＲＭＳｄ骨格原子−１．３３オングストローム）し、ＥＲＰ０１に組み入れられた残基は、Ｒ８、Ｄ１１、Ｎ１２、Ｍ１４、Ｌ１５、Ｒ１６、Ｈ１８、Ｒ１９、Ｅ１７４、Ｔ１７５、Ｆ１７６、Ｒ１７８、Ｉ１７９であった。図１１に示されるように、突然変異枠組みＥＲＰ０１は上記１３のマッチするｈＧＨ残基の移入により作成した。
【０１５０】
モデリングプログラムＤｅｌｐｈｉ（ホーニグ＆ニコルズ、１９８７、（前掲））を使用してｈＧＨと模倣体の静電位マップを比較すると、ｈＧＨと模倣体との間には良好な相補性が存在するという結果が得られた。
【０１５１】
分子力学力場最小化および分子動力学の助けを借りて、ＥＲＰ０１が模倣ｈＧＨに対し適当な空間配向で突然変異された残基を配置し、本来の折り畳みを保持することが決定された。
【０１５２】
ＥＲＰ０２はｈＧＨ親和性成熟突然変異Ｅ１７４Ｓ、Ｉ１７９Ｔ、Ｈ１８Ｄを含む点でＥＰＲ０１とは異なる。ＥＲＰ０１およびＥＲＰ０２におけるＧ１４Ｆ突然変異（Ｆ１７６模倣）は２つの主な突然変異、Ｓ６ＧとＮ１１Ｇを必要とした。ＥＲＰ０３ではＧ１４Ｆ突然変異およびこれらの変異に対する必要性を削除されより混乱の少ない配列を与える。
【０１５３】
ＥＲＰペプチド０１−０３（図１１）を固相技術（Ｍ．シュノルツァ（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ）ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、（前掲））を用いて合成し、精製し、酸化した。生成物のキャラクタリゼーションを質量分析、ＨＰＬＣ、ＡＡＡを用いて十分行った。人工ＥＲＰ分子の二次構造要素をＥＲＰ０３に関する円偏光二色性によりチェックした（図１２）。これにより天然ＥＲＰ分子の３らせん束構造と一致する程度の非常に高いアルファらせん特性が示された。
【０１５４】
ＥＲＰ０１およびＥＲＰ０３のＮＭＲを実行し、３つのジスルフィド結合が正しく形成されているかチェックした。予想された通り、天然ＥＲＰ分子からのずれは小さいものにすぎず、ｈＧＨ分子を模倣する突然変異が形成されている（ＥＲＰ０３に対する図１３）。天然ＥＲＰ分子に比べＣＨαまたはＮＨαシフトにおいてずれがほとんどあるいは全くなく、正しい折り畳みおよびジスルフィド結合性が示される。再びジスルフィドリッチペプチド上への本来の折り畳みを維持したままの、新規表面を人為的に操作する可能性が強調される。
【０１５５】
実施例４の実験：ＶＩＢ
ＶＥＣＴＲＩＸ結果
検索したベクトルの数
２５−Ｒ８、Ｌ９、Ｎ１２、Ｌ１５、Ｒ１６、Ｈ１８、Ｒ１９、Ｋ４１、Ｌ４５、Ｐ４５、Ｅ５６、Ｒ６４、Ｑ６８、Ｙ１０３、Ｄ１１６、Ｌ１１７、Ｅ１１９、Ｔ１２３、Ｄ１７１、Ｋ１７２、Ｅ１７４、Ｔ１７５、Ｆ１７６、Ｒ１７８、Ｉ１７９。
【０１５６】
異なるマッチの数
最小５ベクトルマッチで６１２９２
固有枠組みの数
最小７ベクトルで１０、最小８ベクトルで１
選択された異なる枠組みの数（名称：ｐｄｂ  コード：＃ベクトルマッチ）
マリーンウォームトキシン：ｐｄｂ１ｖｉｂ（８）
ペプチド合成
ＶＩＢペプチドの合成を一般的な材料および方法のセクションにおいて説明するように行った。
ＶＩＢペプチドの酸化
還元ＶＩＢペプチドの酸化をＥＲＰペプチドについて概略を示した方法により、３０％ＴＦＥ溶液およびＧＳＳＧ：ＧＳＨ酸化シャトルを用いて行った。
【０１５７】
円偏光二色性
一般的な材料および方法のセクションにおいて概略を示すようにＣＤを実行した。
実施例４の実験：ＥＲＰ分子
ＥＲＰペプチドの合成
一般的な材料および方法のセクションにおいて説明する通りである。
ＥＲＰペプチドの折り畳み
ペプチドを低濃度で冷水中に溶解させ、トリフルオロエタノールを添加して３０％とした。酸化させる前に４℃で２時間冷却し、還元グルタチオンを添加し（１０：１００：１／ＧＳＳＧ：ＧＳＨ：ペプチド）、その後１ＭのＮＨ４Ｈ
【０１５８】
ＣＯ３を添加しｐＨ８．１の０．１Ｍ溶液を得た。酸化ペプチドをＨＰＬＣにより単離した。
円偏光二色性
一般的な材料および方法のセクションにおいて概略を示したようにＣＤを実行した。
【０１５９】
ＥＲＰ０１および０３のＮＭＲ
ＥＲＰ０１およびＥＲＰ０３のＮＭＲ構造およびＣα−ＣβおよびＣα−ＮＨα結合性を、一般的な材料および方法のセクションにおいて概略を示したように決定した。
【０１６０】
実施例５
インターロイキン４（ＩＬ−４）
インターロイキン４は喘息、鼻炎、結膜炎および皮膚炎におけるアレルギー応答メカニズムの基礎となる４つのらせん束サイトカインである。Ｉｇｍ、ＩｇＥ、ＩｇＧを産出するＢ細胞を刺激することにより免疫グロブリンを誘発するのに重要な役割を果たす。ＩＬ−４は主にＩＬ−４アルファレセプターと会合する。このレセプターはほとんど完全な結合親和性の原因である。ＩＬ−４レセプター複合体はその後共通のｙ鎖を起用し、細胞シグナリングへテロダイマーを形成する。
【０１６１】
レセプターα鎖への結合親和性を決定するＩＬ−４の機能性エピトープは、突然変異分析および最近決定されたＩＬ−４およびＩＬ−４Ｒα複合体結晶構造から識別されている（ヘイジ（Ｈａｇｅ）ら、１９９９、Ｃｅｌｌ  ９７  ２７１）。鍵となる結合の発生には主にＩＬ−４のらせんＡおよびＣからの荷電された残基、特にＡｒｇ８８およびＧｌｕ９が関連する。
【０１６２】
ＩＬ−４の結合表面の１３のアミノ酸残基をプログラムＶＥＣＴＲＩＸに対するクエリとして使用した。この場合、検索すべきデータベースはＧＣＮ４の構造を含んでいた。これは３１残基のロイシンジッパーペプチドである。ＧＣＮ４分子はプログラムＶＥＣＴＲＩＸによりヒットとして識別された。ＩＬ−４の８ベクトルとマッチした（ＲＭＳ０．３９Å）。これらの８つのアミノ酸を含むこの分子を人為的に操作、合成すると、ＩＬ−４アゴニストはＫｄ１０６μＭの効能を有すると考えられる（ドミンケス（Ｄｏｍｉｎｑｕｅｓ）ら、１９９９、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６  １５２）．
【０１６３】
１０ベクトルとマッチする他の分子ＺＤＣが見出された。人工枠組みを合成する際に、折り畳み検定する。
ＶＥＣＴＲＩＸ結果
検索したベクトルの数：１３−Ｋ７７、Ｒ８１、Ｋ８４、Ｒ８５、Ｒ８８、Ｎ８９、Ｗ９１、Ｔ１３、Ｅ９、Ｉ５、Ｒ５３、Ｆ８２、Ｋ１２
【０１６４】
７以上での異なるマッチの総数
３９６
固有枠組みの数
３０
選択された異なる枠組みの数（名称：ｐｄｂ  コード：＃ベクトルマッチ）
ＧＣＮ４ペプチド：ｐｄｂ１ｚｔａ（８）
タンパク質Ａフラグメント（人為的操作）：ｐｄｂ１ｚｄｃ（１０）
Ｎ．Ｂ．  Ａｒｇ５３にマッチする検索において選択された分子はない
実施例６
ＣＤ４ＧＰ１２０
ＣＤ４−ＧＰ１２０相互作用は第１の結合事象であり、これによりヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）が細胞内に入ることができる。ＣＤ４の結晶構造は何かの時に周知となっている（ワン（Ｗａｎｇ）ら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８  ４１１）が、ＣＤ４と非常に改変されたＧＰ１２０複合体の構造は１９９８年６月になって解明された（ウォン（Ｋｗｏｎｇ）ら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３、６４８）。ＣＤ４の突然変異分析（フロウリー（Ｆｌｅｕｒｙ）ら、１９９１年、Ｃｅｌｌ  ６６  １０３７）のある時に、ＧＰ１２０への結合に関連する鍵となるアミノ酸は残基４１−４７および鍵となる結合残基Ａｒｇ５９を含むループ（ＣＤＲ１）上に存在することが周知になっている。
【０１６５】
これらの残基のＣα−ＣβベクトルをＶＥＣＴＲＩＸ検索において使用した。２つの分子ＳＣＹおよびＰＴＡ（図１４）が潜在的なマッチとして識別された。上述した設計手順を用いて、どちらの分子の最適化も行った。
【０１６６】
ＳＣＹの生物学的活性はビータ（Ｖｉｔａ）らの研究、１９９８年、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  ４７  ９３と一致する。
実施例６の実験
ＶＥＣＴＲＩＸ結果
検索したベクトルの数
７−Ｋ３５、Ｓ４２、Ｆ４３、Ｒ５９、Ｄ６３、Ｑ４０、Ｌ４４
異なるマッチの総数
４以上のマッチで４０９
固有枠組みの数
１１６
選択された異なる枠組みの数（名称：ｐｄｂ  コード：＃ベクトルマッチ）
サソリ神経毒：ｐｄｂ２ｐｔａ（５）
シラトキシン：ｐｄｂ１ｓｃｙ：（４）
Ａｒｇ５９とのマッチの絶対的な要求を取り除いた場合は、ｓｃｙ分子がｖｅｃｔｒｉｘ検索において選択されるのみである。
【０１６７】
ＰＴＡＣＤ４およびＳＣＹＣＤ４分子の合成
一般的な材料および方法のセクションにおいて説明する通りである。
ＰＴＡＣＤ４分子の酸化
ＰＴＡペプチドを一晩中０．１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３  ｐＨ８．１中で攪拌することにより酸化した。酸化ペプチド（２つの型）をＨＰＬＣにより回収した。両方の折り畳み型について別個に検定した。グルタチオンの存在下、異なる条件でペプチドの酸化を行うと折り畳まれたペプチドが得られなかった。
【０１６８】
ＳＣＹ分子の酸化
ｐＨ７．４のＮａＰＯ４中５ｍＭＧＳＳＧ対０．５ｍＭ  ＧＳＨを用いてＳＣＹ  ＣＤ４分子を酸化した。酸化されたペプチドをＨＰＬＣにより精製した。
バイアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）アッセイ
ＣＭ−５バイアコアチップ上にカップリングしているＮＨＳによりバイアコアチップにＧＰ１２０を結合させる。その後、ＣＤ４をＧＰ１２０表面上を通過させ、結合の程度をオン速度ＫＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎおよびオフ速度ｋＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎの両方により評価する。その後、ＣＤ４は阻害剤リガンドと平衡となり、ＧＰ１２０上を通過する。バイアコアモジュールにより、ＰＴＡまたはＳＣＹリガンドがＣＤ４のチップへの結合を妨害する程度を評価する。
【０１６９】
実施例７
インターロイキン６（ＩＬ−６）
インターロイキン６（ＩＬ−６）は炎症カスケード、神経の発達、骨の代謝、造血細胞の増殖および免疫応答メカニズムにおいて重要な役割を果たすサイトカインである。インターロイキン６はＩＬ−６アルファレセプターおよび共通のレセプターモチーフＧＰ１３０に結合する４らせん束サイトカインである。ＩＬ−６Ｒαサブユニットは細胞内シグナリングにおいて役割を果たさない。これは結合ＧＰ１３０レセプター分子のリガンド依存二量体化により実行される。全レセプター複合体は、２つのユニット、それぞれＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＧＰ−１３０を有するヘキサマーであると考えられる。ＩＬ−６の多面作用効果は、ヘテロ三量体レセプター複合体の複雑な配列により現れると考えられる。ＩＲ−６ＲαおよびＧＰ−１３０の両方に対する相互作用サイトは、レセプター分子とＩＬ−６分子の両方のサイト特異突然変異誘発によりよく研究されている。溶液および結晶の両方の型のＩＬ−６の構造は解明されており、ＧＰ１３０レセプターの結晶構造は最近決定された。
【０１７０】
ＩＬ−６上のＩＬ−６αレセプタ−結合サイト（サイトＩとする）は主にらせんＤの端に局在化されている。２つのその他のサイトＩＩおよびＩＩＩが２つの異なるＧＰ−１３０レセプター分子の結合に関係する。２つのＧＰ１３０結合サイトはＩＬ−６結合サイトに対し反対の分子端の広い領域にわたり広がっている。
【０１７１】
この中で説明したＩＬ−６  ＶＥＣＴＲＩＸ検索はＩＬ−６αレセプター相互作用のみに関係する。ＧＰ１３０レセプター相互作用および多レセプター相互作用には関係しない（しかし、ＶＥＣＴＲＩＸ検索はこれらの２つのサイトＩＩおよびＩＩＩに対しても実行されている）。ヒット枠組みのいずれに対するＩＬ−６残基のモデリングも実行されていない。可能な枠組みの標的の幾つかの例を以下に示す。
【０１７２】
ＶＥＣＴＲＩＸ結果
検索したベクトルの数：２１  サブセット１（サイトＩ）８ベクトル：サブセット２（サイトＩＩおよびＩＩＩ）１３ベクトル。
サイト１に対する８以上のマッチでの異なるマッチの総数
１７９
固有枠組みの数
２９
選択された異なる枠組みの数（名称：ｐｄｂ  コード：＃ベクトルマッチ）
タンパク質Ａフラグメント（人為的操作）：ｐｄｂ１ｚｄｃ：（９）
モロニーネズミ白血病ウイルスフラグメント：Ｐｄｂ１ｍｏｆ：（１０）
シラトキシン：ｐｄｂ１ｓｃｙ：（８）
実施例８
Ｇ−ＣＳＦ
顆粒細胞コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は４らせん束サイトカインおよび成長因子のクラスの一部である。細胞の増殖および分化を促進し、成熟好中球の生成に導くのに関係する。生体内でこれらの好中球を補充する能力により魅力的な薬剤ターゲットとなる。Ｇ−ＣＳＦはＣＳＦレセプターのレセプター二量体化により機能する。レセプター認識に関係する鍵となる残基を識別するために、Ｇ−ＣＳＦ上でアラニン走査突然変異誘発が実行されている。Ｇ−ＣＳＦの結晶構造は１９９３年以降入手可能であり（ヒル（Ｈｉｌｌ）ら、１９９３年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ  ９０  ５１６７）、ＮＭＲ構造は１９９４年以降入手可能である（ツィンク（Ｚｉｎｋ）ら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３  ８４５３）。
【０１７３】
重要なアミノ酸Ｐｈｅ１４５にマッチするベクトルに対する絶対要求を用いてＶＥＣＴＲＩＸ検索を行った。しかしながら、得られたヒットはほとんどなく、おそらくＰｈｅ１４５ベクトルにマッチするあらゆるヒットの制限によるものであろう。この絶対要求の変更とＶＥＣＴＲＩＸ検索の改良により、より多くのヒットが導かれるであろう。
【０１７４】
実施例８の実験
ＶＥＣＴＲＩＸ結果
検索したベクトルの数：１８
異なるマッチの数
３３８
固有枠組みの数
１１５
選択された異なる枠組みの数（名称：ｐｄｂ  コード：＃ベクトルマッチ）
有望なリガンド枠組みに関する選択の前に、更にＶＥＣＴＲＩＸ検索を改良する必要がある。
一般的な材料＆方法
設計
データベース検索およびすべての設計ステップをＲ１００００あるいはＲ１２０００ＳＧＩオクタン（Ｏｃｔａｎｅ）ワークステーション上で実行した。データベース検索はＶＥＣＴＲＩＸを用いて実行した。視覚化およびペプチドの突然変異および改変はそれぞれ、サンディエゴ−Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩのＢｉｏｓｙｍ／ＭＳＩおよびバイオポリマーからのソフトウエアを用いて実行した。分子の静電位特性の分析はサンディエゴ−ＤｅｌＰｈｉのＢｉｏｓｙｍ／ＭＳＩを用いて実行し、一方、表面積計算はＮａｃｃｅｓｓを用いて実行した（ハバード＆トルントン（Ｈｕｂｂａｒｄ＆Ｔｈｏｒｎｔｏｎ）、１９９３年、「ＮＡＣＣＥＳＳ」、コンピュータプログラム、ロンドン大学、生物化学および分子生物学部）。分子力学最小化および分子動力学計算を突然変異させた枠組み上で実行し本来の折り畳みが保持されているかどうか決定した。Ｘ−ＳＩＴＥ（ラスコフスキー（Laskowski ）ら、１９９６年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｐ１７５−２０１）などのプログラムを使用して突然変異させたペプチドに追加の機能を付加した。
【０１７５】
薬品および試薬
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）はアウスペプ（Ａｕｓｐｅｐ）（オーストラリア、メルボルン）から入手した。２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）はリチェリョイ  バイオテクノロジーズ（Ｒｉｃｈｅｌｉｅｕ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（カナダ、ケベック、ヒアシンス通り）から入手した。アセトニトリルはＢＤＨラボラトリーサプライズ（英国、プール）から、ジエチルエーテルはフルカバイオケミカルズ（Ｆｌｕｋａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（メルボルン）から、２−メルカプトエタノールはシグマ（Ｓｉｇｍａ）（セントルイス、Ｍｏ、ＵＳＡ）入手した。トリフルオロエタノールはアルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ、ミルウォーキー、ＷＩ、ＵＳＡ）から入手した。ＨＦはボクゲイセス（Ｂｏｃ  Ｇａｓｅｓ）（ブリスベーン、オーストラリア）から購入した。以下のＮα−Ｂｏｃで保護されたＬ−アミノ酸Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（Ｏｃｈｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎｔｈ）、Ｇｌｕ（ＯＣｈｘ）、Ｈｉｓ（ＤＮＰ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｙｒ（２ＢｒＺ）をノババイオケム（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）（ラホーヤ、ＣＡ、ＵＳＡ）あるいはバヒェム（Ｂａｃｈｅｍ）（スイス）から購入した。ＭＢＨＡポリスチレン樹脂はＰｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（京都、日本）から購入した。
【０１７６】
ＨＰＬＣ方法
モデル６００溶剤送達システム、６００Ｅ制御装置およびモデル４８４検出器を備えたウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）ＨＰＬＣシステムを用いて、分析および予備ＨＰＬＣを実行した。流速１ｍｌ／分の分析用Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８およびＣ４カラム（４．６×２５０ｍｍ  内径）、流速３ｍｌ／分の半−予備カラム（１０×２５０ｍｍ  内径）および流速８ｍｌ／分の予備カラム（２２×２５０ｍｍ  内径）を使用した。０．１％のＴＦＡ水溶液（溶剤Ａ）、９０％水対アセトニトリルの０．０９％のＴＦＡ（溶剤Ｂ）の直線勾配を用いてすべてのペプチドの精製を行った。
【０１７７】
ペプチド合成
改良ＡＢＩ  ４３０Ａペプチド合成器（アレウッドら、１９９７年、（前掲））上で、急速マニュアルＨＢＴＵ  ｉｎ−ｓｉｔｕ中和合成技術（シュノルツァら、１９９２年、（前掲））を用いてペプチドを合成した。０．７９ｍｍｏｌ／ｇ  ＮＨ２置換樹脂を用いて０．２ｍｍｏｌのスケールでＭＢＨＡ樹脂上でペプチド合成を行った。各アミノ酸は、各カップリングに対し２ｍｍｏｌのＡＡ  ０．４８Ｍ  ＨＢＴＵ（４ｍｌ）および１ｍｌ  ＤＩＥＡを１０分間用い、２度カップリングさせた。樹脂の１分ＤＭＦ流洗浄を伴うＴＦＡの２×１分処理によりＢｏｃ基を除去した。
【０１７８】
合成が完了すると、Ｈｉｓ（ＤＮＰ）基が１つの特別な配列中に存在すれば、１０％  ＤＩＥＡ／ＤＭＦ溶液中２０％  メルカプトエタノールを用い３×３０分処理により除去した。ペプチド樹脂の開裂をスカベンジャーとしてＨＦ：ｐ−クレゾール：ｐ−チオクレゾール（９０：８：２）を用いて−５から０℃で２時間行った。Ｔｒｐ（ＣＨＯ）が配列中に存在すると、エタノールアミンによる処理により除去する。ＨＦを真空で除去し、そのペプチドを冷ジエチルエーテル（３×５０ｍｌ）で粉砕し、沈殿したペプチドを収集し、その後０．１％  ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル中に溶解、粗ペプチドを得た。粗ペプチド（〜８０ｍｇロット）をＲＰＨＰＬＣにより精製し、フラクションを収集し、分析ＲＰＨＰＬＣおよびＥＳＭＳにより分析した。精製したペプチドを含むフラクションを一緒にし凍結乾燥した。
【０１７９】
ＡＢＩ  １４０Ｂ溶剤送達システムを備えたＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｓｃｉｅｘ（トロント、カナダ）ＡＰＩ  ＩＩＩ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍａｓｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒイオン噴霧質量分析計を用いて質量スペクトルデータを収集した。生データをプログラムＭａｓｓＳｐｅｃ（パーキンエルマーシエックス（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｓｃｉｅｘ））を用いて分析した。プログラムＭａｃＰｒｏＭａｓｓ（スニルベムリ＆テリーリー（Ｓｕｎｉｌ  Ｖｅｍｕｒｉ  ＆  Ｔｅｒｒｙ  Ｌｅｅ）、シティーオブホープ、デュレート、ＣＡ）を用いて計算質量を求めた。
【０１８０】
紫外線円偏光二色性（ＣＤ）
遠ＵＶ−ＣＤスペクトルを関連する基本ＰＣソフトウエアを備えたＪａｓｃｏ  ７１０  ＣＤ分光計を用いて記録した。ＣＤスペクトルを１残基あたりの平均モル楕円率［θ］ｄｅｇ  ｃｍ２  ｄｍｏｌ−１対０．１ｎｍインクリメントにおける波長のプロットとして示した。マッキントッシュ（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）上のＫａｌｉｄａｇｒａｐｈプログラムを用いてデジタル化したデータをプロットした。定量アミノ酸分析によりすべてのペプチド濃度を決定した。
【０１８１】
１Ｈ  ＮＭＲ分光法
すべてのＮＭＲ実験の記録をＺ−勾配ユニットを備えたＢｒｕｋｅｒ  ＡＲＸ５００分光計上で行った。ペプチド濃度は９５％  Ｈ２Ｏ／５％  Ｄ２Ｏ（Ｔ＝２９３Ｋ）中で約３ｍＭであった。記録されたスペクトルは４００ミリ秒の混合時間でＮＯＥＳＹ（クマール（Ｋｕｍａｒ）ら、１９８０年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．９５  １；ジーナー（Ｊｅｅｎｅｒ）ら、１９７９年、７１  ４５４６）を、８５ミリ秒の混合時間でＴＯＣＳＹ（バックス＆デイビス（Ｂａｘ＆Ｄａｖｉｓ）、１９８５年、６５  ３５５）を含んだ。スペクトルは５５５０Ｈｚにわたり、データポイントは４Ｋ、５１２ＦＩＤ、３２−６４のスキャン、リサイクル遅れ１秒であった。溶媒をＷＡＴＥＲＧＡＴＥ配列を用いて抑制した（ピオット（Ｐｉｏｔｔｏ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ、１９９２年、  ２  ６６１）。スペクトルをＵＸＮＭＲを用いて処理した。フーリエ変換前に両方の次元において、ＦＩＤＳに多項式関数をかけ、９０℃シフトサイン−ベル関数を用いてアポダイズした。５次多項式を用いるベースライン較正を適用し、化学シフト値を外見上０．００ｐｐｍのＤＳＳに対し示した。ウイシャート（Ｗｉｓｈａｒｔ）ら、１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．  ＮＭＲ  ６  １３５のランダムコイルＨ化学シフト値を使用した。ウィスリッチ（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ）ら、１９８６年、タンパク質と核酸のＮＭＲ、ワイリー−インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）ＮＹの方法を用いてスペクトルを割り当てた。
【０１８２】
成長ホルモン増殖検定
安定してヒト成長ホルモンレセプター（ｈＧＨＲ）を発現するＢａＦ−Ｂ０３細胞（プロＢ細胞系）をこの検定で使用する。というのは、０．１ｎｇ／ｍＬ  ｈＧＨ（４．５４ｐＭ）もの低い濃度でＧＨ−特異応答を誘発することができる
【０１８３】
からである。これらの細胞はまたＩＬ３レセプターの内因性発現を示し、培養中に生き残るためにＩＬ３またはＧＭ−ＣＳＦを必要とする。この検定はモスマン（Ｍｏｓｓｍａｎ）、１９８３年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６５  ５５の検定を基本とし、以下の手順を含む。
【０１８４】
（ｉ）３７℃、５％ＣＯ２下で、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清（ＦＢＳ）および１００単位／ｍＬ  ＩＬ３が追加されたＲＰＭＩ−１６４０培地において細胞を培養する。培養物をｍｉｄ−ｌｏｇ成長相に到達させる。
【０１８５】
（ｉｉ）５００×ｇで細胞を遠心分離し、ＰＢＳで洗浄し、培地からＩＬ３を除去する。遠心分離を繰り返し、１ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０と０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ中に再び懸濁させる。細胞を計数し、同じ培地中で８×１０５細胞／ｍＬ濃度まで希釈する。
【０１８６】
（ｉｉｉ）常に攪拌した懸濁液から、５０μＬの細胞を９６ウエルプレートの各ウエルに添加する。
（ｉｖ）０．５％のＦＢＳ培地中で最終濃度が１００ｎＭから１００μＭの範囲となるようにした様々な濃度の試験すべき模倣体のストック溶液を調製する（最終体積は１５０μＬ、そのためストックは必要な最終濃度の３倍必要である）。５０μＬのこれらの溶液を同じ６つの細胞に添加する（すなわち、Ａ１からＡ６までは同じである）。
【０１８７】
（ｖ）最終濃度が０．５ｎｇ／ｍＬとなるようにｈＧＨのストック溶液（３倍）を調製し、１つのプレートの各ウエルに５０ｍＬを添加する。サイトカインを含まない陰性コントロールとして１つの列を含む。
【０１８８】
（ｖｉ）最終濃度が５０単位／ｍＬとなるようにＩＬ−３のストック溶液（３倍）を調製し、もう１つのプレートの各ウエルに５０μＬを添加する。サイトカインを含まない陰性コントロールとして１つの列を含む。
【０１８９】
（ｖｉｉ）穴をあけた加湿箱内で上記インキュベーション条件下、（蒸発速度が不均一にならないように）ふたをせずにプレートをインキュベートする。インキュベーションを２４時間続ける。
【０１９０】
（ｖｉｉｉ）５０μＬの４ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を各ウエルに添加し、さらに３時間インキュベートする。
【０１９１】
（ｉｘ）検定を止めるために、インキュベータから取りだし、１２０μＬのイソプロパノールを添加し、ウエルあたり数秒間あるいは細胞が明らかに溶離されるまで倍散することにより細胞を溶離する。読取前にプレートを暗闇で５分間静置する。
【０１９２】
（ｘ）マイクロプレートリーダー上５９５ｎｍでプレートの読取を行う。得られた値は細胞数に正比例する（ミトコンドリアデヒドロゲナーゼレベルにより測定した通り）。
【０１９３】
結論
これらの研究から、小さなシステインリッチタンパク質を人為的に操作することにより、望ましい生物学的特性、この場合ｈＧＨの生物学的作用を弱める能力を有する生体利用効率の高い安定した模倣体を作成することができることが示された。さらにこの発明にかかるデータベース検索戦略により、興味のある機能を有するサンプルタンパク質と共有する構造の観点から模倣体を人為的に操作するための安定した「枠組み」を識別することができることが示された。そのように識別された枠組みでは、好都合なことにサンプルタンパク質に比べ安定性が増加していた。最後に、本発明の方法により識別された枠組みは、他のアミノ酸配列改変に適しており、サンプルタンパク質の機能を付与したり、それに拮抗する機能を付与したりすることができる。
【０１９４】
そのため、本発明はタンパク質を人為的に操作するための新しい戦略を提供するものであり、その戦略は特に次世代の治療を構成する可能性のある模倣体の人為的操作に適用することができる。
【０１９５】
この発明はこの中で詳細に説明した特別な実施の形態に限定されず、この発明の広い精神および範囲と一致する他の実施の形態も含むことは当業者に理解されるであろう。
【０１９６】
表の簡単な説明
表１は、クエリＣα−Ｃβベクトル、各クエリ原子の許容度およびサブセットを定義するクエリファイルの例。
表２は、ＳＣＹ０１溶液の血清安定性試験の結果。
表３は、ＳＣＹ０１溶液の酵素安定性試験の結果。
【０１９７】
【表１】
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【０１９８】
【表２】
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【０１９９】
【表３】
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【０２００】
【表４】
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【０２０１】
【表５】
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【０２０２】
【表６】
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【０２０３】
【表７】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ｈＧＨ高親和性部位アンタゴニスト枠組みシラトキシン、ｈＧＨアンタゴニストＳＣＹ０１、ＳＣＹ０２、ＳＣＹ０３のアミノ酸配列およびそれらのｈＧＨ配列との整列。ジスルフィド結合はシステインをつなぐ線で示されている。
【図２】  ｈＧＨアゴニスト骨格ＶＩＢ、人工分子ＶＩＢ０１のアミノ酸配列およびｈＧＨ配列とのアラインメント。ジスルフィド結合はシステインをつなぐ線で示されている。
【図３】  αへリックスの極めて高度のオーバーラップを示すｈＧＨ構造とｈＧＨアゴニスト分子ＶＩＢ０１との比較。
【図４】  データベース検索法の図式的概観。
【図５】  １対のＣα−Ｃβベクトルの３種の異なる表示の二次元描写：ｄ＝距離行列の構築に用いられる原子間距離；δ＝二面角；α１およびα２角。
【図６】  温度変化またはへリックス安定剤トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）の添加に対してほとんど構造に変化を示さないＳＣＹ０１の円偏光二色性スペクトル。
【図７】  天然シラトキシン分子と比較して示されている人工ＳＣＹ０１分子の構造。
【図８】  ５０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−３ではなく、０．５ｎｇ／ｍｌ  ｈＧＨへの細胞の増殖応答を阻害することによるＢａＦ３細胞の増殖に及ぼすＳＣＹ０１の生物学的作用。
【図９】  低親和性部位ｈＧＨアンタゴニスト枠組みＺＤＣおよび人工ｈＧＨアンタゴニストＺＤＣ０５のアミノ酸配列ならびにそれらと並置させたｈＧＨ配列。ジスルフィド結合はシステインをつなぐ線で示されている。
【図１０】  ＶＩＢ０１の円偏光二色性スペクトル。
【図１１】  ｈＧＨアゴニスト枠組みＥＲＰ、人工分子ＥＲＰ０１、ＥＲＰ０２、ＥＲＰ０３のアミノ酸配列およびそれらのｈＧＨ配列とのアラインメント。ジスルフィド結合はシステインをつなぐ線で示されている。
【図１２】  温度変化およびへリックス安定剤トリフルオロエタノールの添加に対してほとんど構造の変化を示さないＥＲＰ０３の円偏光二色性スペクトル。
【図１３】  実質的に同一の構造およびジスルフィド結合度を示すＥＲＰ０１およびＥＲＰ０３に関する二次Ｈαシフトの比較。影つき帯域は、天然ＥＲＰ分子の不変残基を示す。−■−＝ＥＲＰ０３  δＨＡ；−◆−＝ＥＲＰδＨＡ。
【図１４】  ＣＤ４枠組みＰＴＡおよびＳＣＹ、人工分子ＰＴＡ  ＣＤ４、ＳＣＹ  ＣＤ４のアミノ酸配列、ならびにそれらのＣＤ４配列とのアラインメント。ジスルフィド結合はシステインをつなぐ線で示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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