(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白からなる膵癌用抗癌剤Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅの耐性検査マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵癌用抗癌剤の耐性検査マーカー、膵癌用抗癌剤の補助治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵癌の発生は、年々増加の傾向を辿っており、日本での発生率は１９８５年には１０万人中５．２人まで増加した。そして更に１９９５年には膵癌による死亡数は１０万人中１４．７人となり、男性の癌による死因の第５位、女性の第７位を占めている（厚生統計協会：国民衛生の動向１９９７年）。【０００３】
膵癌は消化器癌のなかでも予後不良の癌として知られている。その理由としては（１）早期発見が困難で、診断時既に進行癌となり切除率が低い、（２）生物学的悪性度が高く、早期に周囲神経叢、腹膜播種や肝転移をきたす、（３）有効な補助療法が確立されていない、などが挙げられる。【０００４】
一方で、局所進行膵癌に対しては拡大リンパ節郭清や門脈合併切除が試みられることで切除率が向上し、膵癌症例の１０〜１５％が外科的切除の対象なった。しかし、その切除によっても生存率が改善するには至っておらず、切除した場合であっても５年生存率は５〜１０％といわれている（下記非特許文献１乃至５参照）。【０００５】
なお近年、膵癌に対し、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅの有効性が報告され（下記非特許文献６参照）、それ以来、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅは膵癌に対する抗癌剤治療の第一選択薬となっている。【０００６】
【非特許文献１】Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｓ，  Ｏｇａｔａ  Ｙ  ａｎｄ  Ｔｓｕｚｕｋｉ  Ｔ、  “Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ａｎｄ  ｐｏｒｔａｌ  ｖｅｉｎ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ”、  Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ、８１巻、１１９０−１１９３頁、１９９４年
【非特許文献２】Ａｌｌｅｍａ  ＪＨ，  Ｒｅｉｎｄｅｒｓ  ＭＥ，  ｖａｎ  Ｇｕｌｉｋ  ＴＭ，  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ  ＤＪ，  ｄｅ  Ｗｉｔ  ＬＴ，  Ｖｅｒｂｅｅｋ  ＰＣＭ  ａｎｄ  Ｇｏｕｍａ  ＤＪ、“Ｐｏｒｔａｌ  ｖｅｉｎ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ｐａｎｃｒｅａｔｏｄｕｏｄｅｎｅｃｔｏｍｙ  ｆｏｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｈｅａｄ”、  Ｂｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ、８１巻、１６４２−１６４６頁、１９９４年
【非特許文献３】Ｎａｋａｏ  Ａ，  Ｈａｒａｄａ  Ａ，  Ｎｏｎａｍｉ  Ｔ，  Ｋａｎｅｋｏ  Ｔ，  Ｉｎｏｕｅ  Ｓ  ａｎｄ  Ｔａｋａｇｉ  Ｈ、“Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｏｒｔａｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｂｙ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｈｅａｄ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ”、Ｓｕｒｇｅｒｙ、１１７巻、５０−５５頁、１９９５年
【非特許文献４】Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＬＥ，  Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ＤＳ  ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎａｎ  ＭＦ、“Ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｐｏｒｔａｌ  ｖｅｉｎ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ”、Ａ  ｃｏｎｔｒａｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ、２２４巻、３４２−３４９頁、１９９６年
【非特許文献５】Ｐｅｄｒａｚｚｏｌｉ  Ｓ，  ＤｉＣａｒｌｏ  Ｖ，  Ｄｉｏｎｉｇｉ  Ｒ，  Ｍｏｓｃａ  Ｆ，  Ｐｅｄｅｒｚｏｌｉ  Ｐ，  Ｐａｓｑｕａｌｉ  Ｃ，  Ｋｌｏｐｐｅｌ  Ｇ，  Ｄｈａｅｎｅ  Ｋ，  Ｍｉｃｈｅｌａｓｓｉ  Ｆ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｌｙｍｐｈａｄｅｎｅｃｔｏｍｙ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ“、Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｖｅｒｓｕｓ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｌｙｍｐｈａｄｅｎｅｃｔｏｍｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐａｎｃｒｅａｔｏｄｕｏｄｅｎｅｃｔｏｍｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ：  ａ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ，  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ，  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｓｔｕｄｙ”、Ｌｙｍｐｈａｄｅｎｅｃｔｏｍｙ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．  Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ、２２８巻、５０８−５１７頁、１９９８年
【非特許文献６】Ｂｕｒｒｉｓ  ＨＡ．  ＩＩＩ，  Ｍｏｏｒｅ  ＭＪ，  Ａｎｄｅｒｓｅｎ  Ｊ，  Ｇｒｅｅｎ  ＭＲ，  Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ  ＭＬ，  Ｍｏｄｉａｎｏ  ＭＲ，  Ｃｒｉｐｐｓ  ＭＣ，  Ｐｏｒｔｅｎｏｙ  ＲＫ，  Ｓｔｏｒｎｉｏｌｏ  ＡＭ，  Ｔａｒａｓｓｏｆｆ  Ｐ，  Ｎｅｌｓｏｎ  Ｒ，  Ｄｏｒｒ  ＦＡ，  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ＣＤ，  Ｖｏｎ  Ｈｏｆｆ  ＤＤ、“Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｅｎｅｆｉｔ  ｗｉｔｈ  ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ  ａｓ  ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｃａｎｃｅｒ:  ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ．”、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ、１５巻、２４０３−２４１３頁、１９９７年。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅの有効性が示されたとはいえ、その奏功率はわずか５．４％程度であり、また腫瘍増大が抑制される率も３９％程度である。また、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅに抵抗性の膵癌患者も多く、投与前にＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅの効果が有るか否かについて現時点で判定することはできない。このため、現時点では最も効果の有る可能性が高い抗癌剤投与を選択する以外に方法はない。また、抗癌剤投与中、その効果が無くなっているか、効果が有るのかの判定も現状では不可能である。【０００８】
なお、抗癌剤の抵抗性を検出するための公知のものとして、ｐ−糖蛋白が報告されているが（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｊ，  Ｘｉａｏ  ＨＱ，  Ｏｂａ  ＢＫ、“Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ−ｃｅｌｌ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ＶＡＤ．”、Ｂｌｏｏｄ、１９８９年、７４巻、９１３−９１７頁、及び、Ｇｅｒｍａｎｎ  ＵＡ，  Ｐａｓｔａｎ  Ｉ，  Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ  ＭＭ、“Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ:  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．”、Ｓｅｍｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１９９３年、４巻、６３−７６頁）、これはＡｄｒｉａｃｉｎに対する抗癌剤の耐性を検査するためのマーカーとなりうるものであって、上記Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅの耐性とは無関係の蛋白である。特にＡｄｒｉａｃｉｎｅの膵癌に対する有用性は報告されておらず、膵癌の第一選択薬として積極的に投与されることは現状殆どない（Ｃｕｌｌｉｎａｎ  Ｓ，  Ｍｏｅｒｔｅｌ  ＣＧ，  Ｗｉｅａｎｄ  ＨＳ  ｅｔ  ａｌ、“Ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｔｒｉａｌ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｍａｌｌｉｎｓｏｎ  ｒｅｇｉｍｅｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ，  ａｎｄ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ．”、Ｃａｎｃｅｒ、１９９０年、６５巻、２２０７−２２１２頁）。【０００９】
そこで本発明は、上記課題を解決し、膵癌に対する抗癌剤の耐性を検査するためのマーカーを提供すること、更にはこれに基づき膵癌の補助治療薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ耐性の膵癌細胞株をその野生株と比較検討したところ、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ耐性の膵癌細胞株にＡｎｎｅｘｉｎ−ＩＩという蛋白（以下「Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白」という。）が強発現していることを発見した。そして更に、このＡｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白に対する抗体を先のＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ耐性の膵癌細胞株に投与し、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅを投与したところ、耐性効果の減弱を認めることができた。すなわち、このＡｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白はＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ耐性株に多く発現しているだけでなく、この蛋白の機能を抑制することで、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅに対する抗癌作用を増強することができることに想到した。【００１１】
そして更に本発明者らは、実際に手術によって切除された膵癌組織に対してもＡｎｎｅｘｉｎ−ＩＩの発現を強発現患者群及び弱発現患者群の２群に分け比較検討したところ、強発現患者群は弱発現患者群に比べ有意にＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ投与後の膵癌の再発が早いことを確認した。これは、強発現患者にはＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅの効果が少なく、弱発現患者にはより積極的にＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅを投与することが重要であることを意味する。これによって予後不良の膵癌患者の延命に寄与することを示すことができることに想到した。【００１２】
また、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅを投与したＡｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ強発現患者に抗Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ抗体を投与することで、抗癌剤Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅの抗癌効果の増強を図ることができる可能性にも想到した。【００１３】
即ち、本発明に係る膵癌用抗癌剤の耐性検査マーカーは、Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白からなることを特徴とする。これにより、膵癌患者に対して、膵癌用抗癌剤に耐性があるか否かを予め調査できる検査マーカーが実現できる。なお、Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩの塩基配列及びＡｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白のアミノ酸配列は、配列表に記載されている。またこの場合において、膵癌用抗癌剤はＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅであることが膵癌用抗癌剤の耐性検査マーカーとしての機能をより確実にする。【００１４】
この膵癌用抗癌剤の耐性検査マーカーは、例えば人体より検体を採取し、その検体中に上記Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩが高発現しているか否かを確認することで利用可能である。Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩの発現の確認については特段に制限はないが、例えば免疫組織染色法やＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇなどを好適に用いることができる。免疫組織染色法としては、例えば（Ｊａｍｂｏｏｒ  Ｋ．Ｖｉｓｈｗａｎａｔｈａ，  Ｙｕｎｇｐｉｎｇ  Ｃｈｉａｎｇ，  Ｋｒｉｓｈｎａｎａｎｄ  Ｄ．Ｋｕｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ，”Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｎｅｘｉｎ  ＩＩ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒｓ．”，  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，  １９９３年、１４巻、２５７５−２５７９頁）等に記載の常法を用いることができ、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇの場合は、例えば（Ｋｏｊｉ  Ｅｍｏｔｏ，  Ｙｕｋｉｓｈｉｇｅ  Ｙａｍａｄａ，  Ｈｉｄｅｔｏｍｏ  Ｓａｗａｄａ，  ｅｔ  ａｌ，”  Ａｎｎｅｘｉｎ  ＩＩ  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”，  Ｃａｎｃｅｒ，  ２００１年、９２巻、１４１９−１４２６頁）等に記載の常法を用いることができる。なおここで「検体」とは、人体より採取した組織を含んでなるものであって、例えば血液、細胞、手術標本（凍結組織、パラフィン包理ブロックを含む）などが挙げられる。【００１５】
また本発明に係る膵癌用抗癌剤の補助治療薬は、抗Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ抗体からなることを特徴とする。これは上述したとおり、Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白に対する抗体を膵癌用抗癌剤ＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅとともにＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ耐性の膵癌細胞株に投与したところ、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅの抗癌作用の増強および膵癌細胞の増殖能の抑制を認めることができたことに基づくものであって、これにより、予後不良の膵癌患者の延命に寄与することを示すことができる。
【発明の効果】
【００１６】
以上により、膵癌に対する抗癌剤の耐性を検査するためのマーカー、更に膵癌の補助治療薬を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について説明する。【００１８】
（膵癌用抗癌剤の耐性検査マーカー）
本発明の一実施形態は、膵癌用抗癌剤の耐性検査マーカーに関する。本実施形態に係る膵癌用抗癌剤の耐性検査マーカーは、Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白からなることを特徴とする。これにより、膵癌患者に対して、膵癌用抗癌剤に耐性があるか否かを予め調査できる。Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩの塩基配列及びＡｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白のアミノ酸配列は、配列表に記載されている。本実施形態において膵癌用抗癌剤とはＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅである。【００１９】
この膵癌用抗癌剤の耐性検査マーカーは、例えば人体より検体を採取し、その検体中に上記Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白が高発現しているか否かを確認することで膵癌用抗癌剤の耐性があるか否かを検査することが可能である。Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白の発現の確認については特段に制限はなく、免疫組織染色法やＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法等を用いることができる。なおここで「検体」とは、人体より採取した組織を含んでなるものであって、例えば血液、細胞、手術標本（凍結組織、パラフィン包理ブロックを含む）などが挙げられる。【００２０】
以上のようにＡｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白をマーカーとすることで、膵癌用抗癌剤の耐性検査マーカーとして利用することができる。この効果については後の実験例にて明らかとなる。【００２１】
（膵癌用抗癌剤の補助治療薬）
本発明の一実施形態は、膵癌用抗癌剤の補助治療薬に関する。本実施形態に係る膵癌用抗癌剤は、抗Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ抗体からなることを特徴とする。これにより、膵癌用抗癌剤の耐性を有する膵癌患者に対しても膵癌用抗癌剤を有効に作用させることができるようになる。なお本実施形態に係る膵癌用抗癌剤はＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅである。【００２２】
またここで抗Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ抗体とは、Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白を抗原とし、このＡｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白のエピトープに特異的に結合することができるものをいう。抗体としてはモノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体は、特段限定はなく常法により製造することができる。【００２３】
膵癌用抗癌剤補助薬の投与は、経静脈的投与が原則であり、点滴静脈注射によって投与することが一般的である。投与の量としては適宜調整可能であるが、抗Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ抗体を２０００ｍｇ／ｍ２程度投与した後、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅを１０００ｍｇ／ｍ２投与する形等が考えられる。【００２４】
これにより、膵癌用抗癌剤の耐性を有する膵癌患者に対しても膵癌用抗癌剤を有効に作用させることができる可能性がある。この効果についても、後述の実験例にて明らかとなる。【００２５】
（実験例）
上記実施形態１に記載のＡｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白を膵癌用抗癌剤の耐性検査マーカーとして使用可能であること、更には抗Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ抗体が膵癌用抗癌剤の補助治療薬として応用できる可能性があることにつき、下記に示す実験により明らかにした。以下説明する。【００２６】
本実験例では、ヒト膵癌細胞株の野生株（ＭＩＡＰａＣａII−ＷＴ）とそのＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ耐性細胞株（ＧＥＭ−ＭＩＡＰａＣａII）との間の蛋白発現の差異を１２％アガロース２次元電気泳動法により解析した。【００２７】
まず各々の細胞を培養し、蛋白抽出、濃度測定を行った後、それぞれ５００μｇの蛋白量を１次元目の電気泳動に用いた。次にｐＨ３〜１０に蛋白が分離された１次元目のゲルを１２％アガロースで作製した平面ゲル上で分子量ごとに分離されるように２次元目の電気泳動を行った。その後、クーマシーブルー染色液にて蛋白染色を行った。図１にこの結果を示す。【００２８】
両者のスポットを比較し耐性株で野生株より強発現しているスポットを見出し、そのスポットのゲルを切り出しエドマン分解法によるアミノ酸Ｎ末端シークエンスを行った結果、質量３６ｋＤａのＡｎｎｅｘｉｎ−ＩＩであることが判明した。この結果を図２に示す。【００２９】
この結果の裏付けを行うために、ＭＩＡＰａＣａII−ＷＴ、ＧＥＭ−ＭＩＡＰａＣａII両細胞株の蛋白を用い、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇを行った。１次抗体としてＲａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ−Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）を用いた。コントロールとしてｇｏａｔ  ａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社）を用いた。【００３０】
培養細胞より蛋白を抽出した後、それぞれ２０μｇの蛋白量をアプライし１０〜２０％グラディエントゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その後ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）に転写し、５％スキムミルクにて非特異的反応をブロッキングした後１：３００に希釈した抗Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ抗体を１次抗体として用いた。２次抗体として１：３０００に希釈したＧｏａｔ−ａｎｔｉＲａｂｂｉｔ−ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＨＲＰ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を使用した。発色液としてＥＣＬ液（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を使用した。【００３１】
Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白が膵癌組織及び細胞株で発現されているとの報告があるが（Ｖｉｓｈｗａｎａｔｈａ  ＪＫら、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｎｅｘｉｎIIｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒｓ．  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １９９３，  １４:  ２５７５−９．）、今回、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ耐性株であるＧＥＭ−ＭＩＡＰａＣａIIでは膵癌細胞株ＭＩＡＰａＣａII−ＷＴよりも１．４４倍のＡｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白が発現しており、発現量に差が生じていることが分かった（図３参照）。【００３２】
次に、Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩのＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ耐性膵癌細胞株の耐性効果を調べる目的でＭＴＴａｓｓａｙ法を行った。９６ｗｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅに０．５ｘ１０４個／１ｗｅｌｌのＧＥＭ−ＭＩＡＰａＣａII細胞を入れ、４８時間３７℃、５％ＣＯ２条件下でインキュベートし、その後１：１０００（２００ｎｇ／ｍｌＩｇＧ）に希釈した抗Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ抗体を培養液に混入し、３時間後１００ｎｇ／ｍｌ濃度のＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅを投与し、同条件下でインキュベートし細胞培養を行い、７２時間後及び９６時間後にＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｉ  ［ＭＴＴ］  （Ｒｏｃｈｅ社）を用いＭＴＴａｓｓａｙを行った。吸光度５９５ｎｍにて測定し、培養細胞に抗Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ抗体を投与した後、１００ｎｇ／ｍｌ濃度のＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅを投与した時、抗体を投与せずＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅを投与した細胞との増殖能を比較したところ増殖細胞数が有意に低下するという結果を得た（ｐ<０．０１）（図４参照）ネガティブコントロールとしてＲａｂｂｉｔ−ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ−ＩｇＧ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｄａｋｏ  Ｊａｐａｎ社）を使用した。【００３３】
上記の結果よりＡｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白はＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ耐性株により多く発現しているというだけでなく、この蛋白に拮抗する抗体を付加する事により膵癌細胞株の増殖能を抑制し、さらにＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅと共に抗体を投与する事で、Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅに対する抗癌作用を増強することが示唆された。即ち、Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白をマーカーとすることで膵癌用抗癌剤に対する耐性の有無を検査することができ、更に抗Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ抗体によりＡｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白の機能を抑制することで、膵癌用抗癌剤の補助治療薬として応用することができる。【００３４】
（症例検討例）
次に、２００１年６月から２００３年１２月までに治癒手術が施行された浸潤性膵管癌の２３症例を対象とし、Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白の発現と耐性との関係について検討を行った。【００３５】
膵癌組織標本を抗Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ抗体を用いて免疫組織学的染色を行い、癌組織に染まる濃淡から弱発現群と強発現群の２群に分けた。なお、全２３症例は放射線、化学療法等の術前補助療法は施行されておらず、術後補助療法としてＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅによる術後化学療法を施行している。【００３６】
免疫染色は１０％ホルマリン固定され、パラフィン包理された組織標本を用い、ストレプトアビジンービオチンペルオキシダーゼ法（Ｄａｋｏ  ＬＳＡＢ２  ｋｉｔ，  Ｄａｋｏ  Ｊａｐａｎ社）にて行った。その際、抗Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ抗体の希釈濃度は１：３００で行った（図５参照）。【００３７】
上記２３例の無再発生存期間とＡｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ免疫染色の２群間をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法にて統計解析を行ったところ、Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ強発現群は弱発現群と比較し有意に再発生存期間が短かった（ｌｏｇｒａｎｋ  ｐ＝０．０３０１）。尚、２群間ではその他の因子（年齢、性別、病期、腫瘍の大きさ、組織型、リンパ節転移の有無、静脈侵襲、リンパ管侵襲）のいずれにおいても有意差は認められなかった。【００３８】
上記の結果により、Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白強発現群がＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅに対する耐性を有していることが確認でき、また弱発現群がＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅに対する耐性を有していないことが確認できた。この結果は、Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白が耐性検査マーカーとして利用可能であることを明確に示しており、更に抗Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ抗体を用いることでＡｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ蛋白の機能を抑制することにより膵癌用抗癌剤として使用可能であることを示唆する。特に膵癌用抗癌剤として使用することにより、予後の不良であった膵癌の治療に寄与することができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ヒト膵癌細胞株の野生株（ＭＩＡＰａＣａII−ＷＴ）とそのＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ耐性細胞株（ＧＥＭ−ＭＩＡＰａＣａII）との間の蛋白発現の差異を１２％アガロース２次元電気泳動法により解析した結果を示す図
【図２】２次元電気泳動法により解析した蛋白のゲルを切り出し、エドマン分解法によるアミノ酸Ｎ末端シークエンスを行ったことを示す図。
【図３】ＧＥＭ−ＭＩＡＰａＣａIIとＭＩＡＰａＣａII−ＷＴのＡｎｎｅｘｉｎ−ＩＩの発現量を示す図。
【図４】ＧＥＭ−ＭＩＡＰａＣａII耐性細胞株に抗Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ抗体を投与後にＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅを投与し、７２時間および９６時間後にＭＴＴａｓｓａｙにて細胞増殖能及び殺細胞効果調べた結果を示す図。＊；ｐ<０．０１
【図５】膵癌組織標本に対して抗Ａｎｎｅｘｉｎ−ＩＩ抗体を用い免疫組織染色を行った場合の図。
【図６】強発現群と弱発現群に対するＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法にて統計解析を行った結果を示す図。
【図１】
0004621923.tif 000002
【図２】
0004621923.tif 000003
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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