(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｘ−Ｙ−Ｚのアミノ酸配列
（式中：
−Ｘはアミノ遊離基、若しくはアミノ酸、又は存在せず；
−Ｙは配列番号２のアミノ酸配列であり；
−Ｚは、Ｙの最後の残基の−ＣＯ−基と結合した、アミノ基又は配列番号３に示すプレＳ１領域由来の１〜３０個連続したアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列であるか、あるいは存在しない）、あるいはHBV菌株アルファ１、HBV菌株LSH、ウッドチャックHBV、ヨウモウザルHBV、又はHBVサブタイプad, adr, adw, adyw, ar若しくはayw由来の前記配列Ｘ−Ｙ−Ｚに相当するアミノ酸配列から成る、単離された合成ポリペプチドであって、
Ｎ末端に疎水性部分を有することで化学的に修飾されているポリペプチド、あるいは、上記アミノ酸配列のいずれかの類似体であって、HBV感染に対する阻害活性を有しており、１個の保存的アミノ酸置換がなされている類似体。
【請求項２】
前記疎水性部分がミリスチル基である、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号２のアミノ酸１がミリストイル化されている、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
配列番号４，５，７又は１４のアミノ酸配列から成る、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
配列番号８又は１０のアミノ酸配列から成る、単離されたポリペプチド。
【請求項６】
薬物としての、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド及び医薬として許容される担体を含んで成る医薬組成物。
【請求項８】
HBV感染の阻害のための、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
肝細胞に対するHBV粒子の結合及び／又は内部移行の予防のための、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
HBVによる肝細胞感染のin vitroでの阻害方法であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを用いることを含んで成る方法。
【請求項１１】
HBVの付着及び／又は侵入に関与する肝細胞受容体のin vitroでの同定方法であって、
ａ）肝生検又は肝細胞と請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドとを、肝細胞の表面で発現した受容体に対し前記ポリペプチドを結合させるのに十分な条件で、且つ十分な期間、接触させる段階、
ｂ）受容体に対する前記ポリペプチドの結合を検出する段階；及び
ｃ）前記受容体を同定する段階、
を含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、初期段階でＢ型肝炎の感染を防ぐ新規ポリペプチド及びその誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパドナウイルスは、哺乳類及び鳥類において発見されてきた、小さいエンベロープ型の部分的に二本鎖のＤＮＡウイルスのグループである。ヒトＢ型肝炎ウイルス（HBV）は、このグループのプロトタイプを表しており、ヒトにおいて急性及び慢性の肝炎を引き起こす。HBVによる感染は深刻な健康問題を示し、一年当たり推定１００万人の死をもたらしている。
【０００３】
ヘパドナウイルスの細胞内複製サイクル、特にウイルスＤＮＡの転写、ゲノムＲＮＡのパッケージング及び逆転写並びに共有結合で閉環したHBV−ＤＮＡの細胞内プールの確立は、ある程度詳細に結論付けられている(Nassal et al, 1993; Nassal et al, 1996)。しかしながら、現在まで、HBVに感染可能な細胞系の不在及びin vitroでの感染研究のための一次ヒト肝細胞の制限つきでの利用は、HBV感染の初期段階の理解の進展を容赦なく妨げていた。その結果、様々なHBV受容体候補が結合研究の基礎に対して提案されてきたが(DeMeyer et al, 1997において概説)、それらはどれも侵入過程に関与していることを納得いくように証明することはできなかった。
【０００４】
しかしながら、アヒル及びヒトＢ型肝炎ウイルスのエンベロープタンパク質中の感染に必要な配列を決定する更なる進展が最近になってなされている(Urban et al., 1998, LeSeyec et al., 1998, LeSeyec et al., 1999)。
【０００５】
HBVのウイルスのシェルは、大型（Ｌ）、中型（Ｍ）及び小型（Ｓ）のウイルスエンベロープタンパク質を含む。トリヘパドナウイルスは、Ｌ及びＳタンパク質のみを含んで成る。全ヘパドナウイルスの表面タンパク質は、Ｌタンパク質がＥＲ膜由来脂質二重層においてアンカーとしての役割を果たす完全なＳドメインを含むように、ウイルスＤＮＡの単一のオープンリーディングフレーム内でコードされている。HBVの場合、Ｌ及びＭタンパク質は、プレＳと称される１６３〜１７４アミノ酸の親水性Ｎ末端伸長においてＳタンパク質と異なる。このプレＳ伸長は更に、アミノ末端に対し、プレＳ２（５５アミノ酸）及びプレＳ１（サブタイプawyにおいては１０８アミノ酸）ドメインに分けられる。HBVのサブタイプに依存して、プレＳ１ドメインは多少の配列のバリエーションを示し、そしてサブタイプadrの場合には、追加の１１アミノ酸の挿入部分を有する。
【０００６】
Ｌタンパク質の外部のプレＳ部分において突然変異を有する偽型のHBVの感染性の解析は、感染がHBVのＬタンパク質のプレＳ１ドメイン内の伸長配列に依存することを示した(Le Seyec, 1999)。対照的に、プレＳ２の大部分が感染に不必要であることが判明した(Le Seyec et al, 1998)。このことは、プレＳ１ドメインのアミノ酸３〜７７間の配列が感染段階に関与していることを示唆する。
【０００７】
一次アヒル肝細胞の利用可能性に起因して、関連するアヒルＢ型肝炎ウイルスのモデル系における更なる進展が達成されてきた。この系を用いて、アヒルＢ型肝炎ウイルスのＥ．コリ(E. coli)由来プレＳポリペプチドが、受容体結合に干渉することによって一次アヒル肝細胞のDHBV感染を阻害することが証明された(Urban et al., 1998)。更に、Kuroki等(1994)によって最初に同定されたDHBVプレＳ結合タンパク質であるカルボキシペプチダーゼＤが、トリHBVに共通な受容体成分として機能することが証明された(Urban et al, 1998; Breiner etal, 1998; Urban et al, 2000)。
【０００８】
HBV感染の場合、同程度の知識水準が尚も欠落しており、そしてHBV感染の初期段階に効率的に干渉するペプチド成分についての実験的な証拠もまだない。
【０００９】
本発明者は、HBVのＬタンパク質の、組換え体、Ｅ．コリ由来プレＳポリペプチド及び化学合成されたプレＳペプチドが、HBV感染に干渉しうるか否かについて研究してきた。
【００１０】
彼等は、同時にHBV感染に対して優れた直接的阻害活性を示し、且つHBVに対する免疫保護を誘発させることができる合成ペプチド群を同定した。
【００１１】
これらのポリペプチドは、Ｂ型肝炎ウイルスのサブタイプaywのプレＳ１アミノ酸１〜７８の配列（配列番号１）から設計された。しかしながら、これらのポリペプチドはプレＳ１領域よりも短いが、それらは驚くべきことに、全プレＳ１領域を模倣するより長いポリペプチドより、優れた阻害活性を示す。
【００１２】
本発明の単離された合成ポリペプチド、又はその変異体は、式：
Ｘ−Ｙ−Ｚ      （Ｉ）
（式中：
−Ｘはアミノ酸、例えばメチオニンであるか、又は存在せず；
−Ｙは配列番号２に示すプレＳ１領域のアミノ酸配列２〜４８であるか、あるいはこの配列のＮ末端及び／又はＣ末端が切断された形態であるか、あるいはそれらの変異体であり；
−Ｚは、Ｙの最後の残基の−ＣＯ−基と結合した、配列番号３に示すプレＳ１領域由来の１〜３０個連続したアミノ酸を含んで成るアミノ酸配列であるか、あるいは存在しない）
のアミノ酸配列を有しており、前記ポリペプチドは、疎水性部分を有するように任意に化学的に修飾される。
【００１３】
好ましくは、Ｙが、配列番号２のＣ末端、そして任意にＮ末端を切断した形態であるか、あるいは存在しない場合、Ｚは存在しない。
【００１４】
好ましくは、前記疎水性部分は、少なくとも４個の炭素原子、好ましくは少なくとも６個の炭素原子、更に好ましくは少なくとも８個の炭素原子を有する飽和又は不飽和脂肪酸、例えばミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸又はアラキドン酸のアシルの残り部分に相当し、あるいは前記疎水性部分は、コレステロール基等に相当する。
【００１５】
好ましい態様において、本発明のポリペプチドはミリストイル化されている。更に好ましくは、当該ポリペプチドは配列番号１の２〜４８の全アミノ酸配列を含んで成り、ここで、アミノ酸２（グリシン）はミリスチル基を有している：
Myr-GQNLSTSNPLGFFPDHQLDPAFRANTANPDWDFNPNKDTWPDANKVG (Myr 248, 配列番号７)。
【００１６】
別の態様において、本発明のポリペプチドは、配列番号４、配列番号５又は配列番号７を有している。
【００１７】
用語「変異体」は、ヘパドナウイルス属の異なるウイルス種、菌株又はサブタイプ、例えばHBV菌株アルファ１、HBV菌株ＬＳＨ（チンパンジーで単離されたもの）、ウッドチャックHBV、ヨウモウザルHBV（ＷＭHBV）、又はHBVサブタイプＡＤ、ＡＤＲ、ＡＤＷ、ＡＤＹＷ、ＡＲ及びＡＹＷから成る群から選択される菌株において見られる相同のポリヌクレオチド配列を言及する。
【００１８】
プレＳ１合成ポリペプチドに対するあらゆる類似体が本発明の一部である。類似体は、配列が１００μＭ未満、好ましくは１０μＭ未満、そして好ましくは１μＭ未満のペプチド濃度で、ヒト肝細胞の一次培養物のHBV感染の７０％の阻害を誘発する限り、アミノ酸欠失、アミノ酸置換、例えば他のアミノ酸又はアイソスター（タンパク質のアミノ酸に類似の閉じた構造的且つ空間的類似性を有する修飾アミノ酸）による保存的又は非保存的置換、アミノ酸付加又はアイソスター付加、を包含する。
【００１９】
保存的アミノ酸置換は典型的に、同一クラスのアミノ酸間での置換に関する。これらのクラスは、例えば、未変化の極性側鎖を有するアミノ酸、例えばアスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシン；塩基性側鎖を有するアミノ酸、例えばリジン、アルギニン、及びヒスチジン；酸性側鎖を有するアミノ酸、例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸；並びに非極性側鎖を有するアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、及びシステイン、を含む。
【００２０】
有利なことに、本発明に従うペプチドは、タンパク質分解に耐えるよう修飾される。これは、例えばそれらのＤアミノ酸対応物で曝露された部位のＬアミノ酸を置換することによって達成されうる。
【００２１】
別の態様において、本発明のポリペプチドは、三次元で束縛されるペプチドが設計されるように、短いペプチド性又は非ペプチド性のリンカーを組み込んでいてもよい(Root M.J. et al., 2001)。
【００２２】
本発明のポリペプチドは、当業者に容易に理解される様々な手法によって調製されうる。そのような手法は、更に具体的には固相連続合成及びブロック合成を含む(B. W. Erickson and R. B. Merrifield, 1976)。固相連続法は、既存の自動化されている方法を用い、例えば自動ポリペプチド合成機の使用によって実施されうる。この手法において、αアミノ保護アミノ酸は、樹脂の支持体と結合している。利用される樹脂の支持体は、ポリペプチドの固相調製のために当業界で常用されている任意の適当な樹脂であってもよく、好ましくは最初に導入されたoアミノ保護アミノ酸によるエステル形成のための部位を提供するためにポリオキシエチレンと共重合されているポリスチレンである。本発明者によって適用された、この最適化された方法は、Gausepohl et al, 1989 and 1990に明示的に記載されている。
【００２３】
当該アミノ酸は１つずつ導入される。１つのアミノ酸の導入に相当する各合成サイクルは、脱保護段階、連続洗浄段階、当該アミノ酸の活性化によるカップリング段階、及びその後の洗浄段階、を含む。これらの各段階にはろ過が続く。
【００２４】
カップリングのための反応剤は、ポリペプチド合成のための古典的な反応剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミド、ヒドロキシベンゾトリアゾール、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、及びジフェニルホスホリルアジド、である。
【００２５】
樹脂上でのポリペプチドの合成の後、当該ポリペプチドは、アニソール、エタンジオール又は２−メチルインドールの存在下での強酸、例えばトリフルオロ酢酸による処理によって当該樹脂から分離される。この化合物は、続いて古典的な精製技術によって、例えば高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製される。
【００２６】
本発明のポリペプチドはまた、選択的に保護されるポリペプチドフラグメントをカップリングすることによって得ることができ、このカップリングは溶液中で達成される。
【００２７】
当該ポリペプチドは更に、遺伝子操作技術によっても産生されうる。真核生物の発現系、例えばバキュロウイルス系が特に適している。この手法によると、タンパク質は、異種タンパク質をコードする核酸配列及び核酸配列を制御する核酸配列、例えばプロモーターを含む組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞において発現する。複数の細胞系が、組換えバキュロウイルスの感染に利用可能であり、例えば、American Type Culture Collection (CRL 1711)から入手可能な細胞系SF-9である。
【００２８】
本発明のポリペプチドは、肝細胞に対するHBV粒子の結合及び／又は内部移行の阻止を介して、HBVによるin vitro又はin vivoでの肝細胞の感染を阻害するために使用され得る。
【００２９】
従って、本発明は、HBVによる肝細胞感染のin vitroでの阻害方法であって、上述のポリペプチドを用いることを含んで成る方法、を提供する。
【００３０】
適当な肝細胞には、ヒト一次肝細胞又はHepaRGと称される肝細胞腫由来の細胞系（特許出願番号ＦＲ０１０９０４４に記載）が含まれ、これらは更にHBV感染を受けやすい。
【００３１】
本発明は更に、HBVの付着及び／又は侵入に関与する肝細胞受容体のin vitro及び／又はin vivoでの同定方法並びに／あるいは前記受容体の発現の定量方法であって、上述のペプチドを用いることを含んで成る方法に関する。
【００３２】
特に、前記方法は、
−肝生検又は肝細胞と本発明のポリペプチドとを、肝細胞の表面で発現する受容体に対し前記ポリペプチドを結合させるのに十分な条件で、且つ十分な期間、接触させ、
−受容体に対する前記ポリペプチドの結合を検出し；そして
−前記受容体を同定すること、
から成る段階を含んで成る。
【００３３】
これは、当業者に周知の古典的手法に従い達成されうる。例えば、これは、本発明のポリペプチドの放射性、酵素又は蛍光標識、そしてその後の適切な方法による検出を包含することがある。多数の蛍光材料が公知であり、そして標識として利用され得る。これらは、例えばフルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッドを含む。酵素標識は、注目分子、例えばポリペプチドに対する酵素の複合に存し、そして比色技術、分光学的技術、又は蛍光光度技術のいずれによっても検出されうる。
【００３４】
本発明はまた、本発明に従うポリペプチド、又は前記ポリペプチドのフラグメントに対する抗体に関する。本発明の抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は抗原結合フラグメントFab、Fab'、F(ab')2及びFvであってもよい。それらはまた、免疫複合された、又は標識された抗体であってもよい。
【００３５】
ポリクローナル抗体は、当業者に周知の標準的な方法に従い、本発明のポリペプチドを免疫された動物の血清から得られ得る。当該ポリクローナル血清の特異性は、固相上に固定された式（Ｉ）のポリペプチド、又はそのフラグメントを用いるイムノアフィニティークロマトグラフィーを介して更に増大させられうる。当該抗体は、複合抗体を固定したポリペプチドの形成を可能にするのに十分な時間、固定された免疫ポリペプチドと接触させられる。
【００３６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養の標準的方法に従い得ることができる(Kohler and Milstein, 1975)。
【００３７】
前記抗体は、肝細胞のin vitro又はin vivoでのHBV感染を阻害するのに、あるいはHBV粒子の感染性をex vivoで評価するのに特に有用である。
【００３８】
したがって、本発明は、HBV粒子のex vivoでの感染性を評価するための方法であって、本発明に従う抗体を用いることを含んで成る方法、を提供する。
【００３９】
別の態様において、本発明のポリペプチド又は抗体は薬物として使用され得る。そのような薬物は、HBV感染を阻止又は防ぐのに特に有用であると思われる。
【００４０】
医薬として許容される担体中に、本発明に従うポリペプチド又は抗体のいずれかを含んで成る医薬組成物は本発明の範囲内である。
【００４１】
したがって、本発明は、HBV感染の予防又は処置のための治療的方法であって、本発明のペプチド又は抗体の、それを必要とする患者に対する投与を含んで成る方法、を提供する。
【００４２】
本発明は更に、HBV感染のin vivoでの阻害を目的とする薬物の製造のための本発明のポリペプチド又は抗体の使用に関する。本明細書で使用する場合、用語「処置」は、患者の症状の改善又は安定化を意図する。これは、例えば生物の非感染細胞に対するHBV増殖の予防を含む。
【００４３】
本発明は更に、医薬として許容される担体と一緒に本発明のポリペプチド又は抗体を含んで成る治療組成物を提供する。
【００４４】
別の観点において、本発明は、HBV感染に対するワクチン接種の方法であって、本発明のポリペプチドの、それを必要とする患者に対しての投与を含んで成る方法、を提供する。
【００４５】
したがって、本発明は、医薬として許容される担体中に、本明細書で開示したポリペプチドを含んで成るワクチン組成物を含む。
【００４６】
本出願の文脈において、「ワクチン接種」は、予防的又は治療的ワクチン接種を意図する。「治療的ワクチン接種」は、HBV感染した患者のワクチン接種を意味する。
【００４７】
更なる観点において、本発明は、医薬として許容される支持体中に、本明細書で開示したポリペプチドを含んで成る免疫原性組成物を提供する。
【００４８】
好ましくは、ワクチン方法／組成物又は免疫原性組成物のペプチドは、ミリストイル化される。ミリストイル化は、実際にペプチド抗原に対して誘発された免疫応答を増強させることができる。
【００４９】
本発明のポリペプチドは、免疫原性の特性を増大させるように修飾され得る。そのような増大される免疫原性の特性は、例えば、免疫化後に誘発された抗体の範囲を増大すること、又は種々のウイルス菌株による感染を中和することができる抗体の産生を可能にすること、を言及する。
【００５０】
別の態様において、本発明のポリペプチドは、それらの免疫原性の特性を低下させるように修飾され得る。そのようなポリペプチドは、有害作用を回避し、又は制限しつつ、in vivoでのHBV感染を阻害するための治療的利用において特に有用であろう。
【００５１】
「医薬として許容される担体」は、本発明に従う医薬又はワクチン組成物が調製されうる任意の媒体を言及する。それは、塩溶液、例えばリン酸緩衝塩溶液を含む。通常、希釈剤又は担体が投与形態及び経路、並びに薬務に基づいて選択される。
【００５２】
本発明によると、用語「患者」は、HBVに感染していると思われるあらゆるヒトを意味する。
【００５３】
本発明のポリペプチドは、生体試料中に存在し、且つHBVウイルス粒子のプレＳ１領域のフラグメントに対する抗体との前記ポリペプチドの相互作用の検出を介する、HBV感染のex vivoでの診断に使用され得る。内因性の抗体との前記ポリペプチドの特異的な相互作用は、当業者によって容易に理解される任意の適当な検出法によって検出されうる。
【００５４】
本発明は、このように、HBV感染のex vivoでの診断のための方法であって：
−前記ポリペプチドと、生体試料中に存在し、且つHBVウイルス粒子のプレＳ１領域のフラグメントに対する抗体との間に複合体を形成させるのに十分な条件で、且つ十分な期間、接触させ；
−その存在がHBV感染を示している、前記複合体を検出すること、
から成る段階を含んで成る方法、を提供する。
【００５５】
本発明の診断方法は、HBV感染の開発を予測する方法として有用である。したがって、上記ex vivoでの診断方法の異なる時点での反復は、検出されるHBVウイルス粒子のプレＳ１領域のフラグメントに対する抗体の数の増大又は減少を明らかにすることができる。前記抗体の数の増大は、通常患者の症状の改善を示す。特に、そのような方法は、処置に対する患者の応答の評価を可能にする。
【００５６】
検出は、任意な手段、例えば、当業者によって容易に理解される適切な検出手段と組み合わされる、本発明のポリペプチドの放射性、酵素又は蛍光標識を介して達成されうる。
【００５７】
本発明はまた、プレＳ１遺伝子をコードするHBV抗原に対する検出抗体に関連する診断方法にも関する。そのような抗体は、ex vivoで、サンドイッチ型イムノアッセイ及び競合型イムノアッセイの両方、例えば試料中の抗原が抗体のために標識された免疫原と競合するイムノアッセイによって、本明細書で開示した合成ペプチド性免疫原を用いて生体試料中で検出されうる。
【００５８】
したがって、本発明は更にHBV感染を検出するための方法であって、ヒトから採取した血清に対し定量的イムノアッセイを実施し、その中に存在するプレＳ１領域によってコードされる抗原に対する抗体の量を、上述のHBVペプチド免疫原を利用し、且つ既知のスタンダードと値を比較することで決定すること、を含んで成る方法、に関する。
【００５９】
本発明はまた、HBV感染の存在を検出するための方法であって、ヒトから採取した血清に対し定量的イムノアッセイを実施し、その中に存在するプレＳ１領域によってコードされる抗原の量を、HBVペプチド免疫原に対する上述の抗体を利用し、且つ既知のスタンダードと値を比較することで決定すること、を含んで成る方法、に関する。
【００６０】
本発明に従うペプチド又は抗体のいずれも、患者由来の生体試料に対しイムノアッセイを実施し、その結果、プレＳ１領域によってコードされる抗原に対する抗体、又はプレＳ１領域によってコードされる抗原、の量を評価するために同様に使用され得る。
【００６１】
本発明は、以下の実施例及び添付図面を考慮して更に理解されるだろう。
【実施例】
【００６２】
実施例１：プレＳ１−HBV合成ペプチドによるHBV感染の阻害のための材料と方法
ａ）HBV感染可能な細胞培養の樹立
正常な成人ヒト肝臓の断片は、肝転移のための肝切除を受けている患者から得られた（当該断片は、巨視的に正常な肝臓中の転移から距離を置いて採取した）。この生検材料の利用は、フランス国の法律に従ったものであり、且つフランス国倫理委員会の基準を満たしたものである。肝細胞は、Guguen-Guillouzo及びGuillouzoの手法によって単離され、そして3.5x10-6Mヒドロコルチゾンヘミサクシネート、2mMＬ−グルタミン、1L当たり50mgのゲンタマイシン、5%ジメチルスルホキシド、5%成人ヒト血清、及び5% FCSを添加したＨ培地中で培養された。接種から３日後、細胞を感染させた。
【００６３】
あるいは、いくつかの実験の場合、一次培養物を用いる代わりに、我々は、HepaRGと称され、HBV感染に対して感受性もある、新規肝細胞腫由来の細胞系（特許出願FR 0109044）を利用した。当該感染手法の前に、細胞を分化させ、細胞に肝細胞様の形態を獲得させた（特許出願FR 0109044）。その後細胞を感染させた。
【００６４】
ｂ）細胞培養物のHBV感染
感染性の接種材料として、HepG2クローン2.2.15細胞の５０倍濃縮した培養液を使用し、これは無制限の供給及び一定の品質のためである。
【００６５】
これは前述のように調製した。分化細胞は、5% PEG 8000 (Sigma)を添加した培養液中で１０倍希釈した濃縮済みの感染源と一緒に、既述のように(Gripon et al., 1988 ; Gripon et al., 1993)３７℃で２０時間インキュベートした。コントロールの培養液は、前記感染源の代りに、リン酸緩衝塩溶液(PBS)中で希釈した5% PEG及び25% FCSを用いてインキュベートした。インキュベーション終了後、細胞は前記培養液で３回洗浄され、そして2% DMSO及び5x10-5Mヒドロコルチゾンヘミサクシネートの存在下で維持され、そして指定の時間に採集された。
【００６６】
ｃ）ポリペプチド競合アッセイ
ポリペプチド競合アッセイは、感染源の添加の前に、細胞を解析済みのポリペプチドと一緒に３７℃で３０分間プレインキュベートすることによって実施された。
【００６７】
ｄ）HBV感染阻害の評価
−HBsAgアッセイ
HBsAgは、Bio-Rad Laboratoriesから購入したEILSAキット(Monolisa AgHBs plus)によって前記溶液中で検出された。値はng/ml上清及びコントロールのパーセント（ペプチド無し）で表す。
【００６８】
−ＲＮＡの抽出及び解析
全細胞ＲＮＡは、Total SV RNAキット(Promega, France)で抽出され、1.5%アガロースゲル上で分離され、そして標準的なノーザンブロット法(Sambrook et al., 1989)によって解析された。フィルター上に移動したＲＮＡ量の調整は、メチレンブルー染色後に実施された。ハイブリダイゼーションは、P32標識したHBV DNAを用いて実施された。
【００６９】
実施例２：プレＳ１−HBV合成ポリペプチドによるHBV感染阻害の結果
ａ）HBV感染阻害に対するプレＳ１合成ペプチドのミリストイル化の影響
突然変異実験は既に、プレＳ１領域の一部（アミノ酸（ＡＡ）３−７７）がHBVの感染に必須であることを示している(Le Seyec et al., 1999)。尚、我々も、ＡＡ２であるグリシン残基のミリストイル化がまた、ＡＡ１であるメチオニン残基の除去と関連して重要であることを証明した(Gripon et al., 1995)。従って、我々は、ミリストイル化されたグリシンを有するアミノ酸２−７７を含んで成るペプチドがHBV感染過程に干渉しうると主張してきた。この仮説を評価するために、２つのペプチド：PreS 1-78及びMyr PreS 2-78が合成された。続いて、これらのペプチドは、ヒト肝細胞培養液の感染過程の前及びその間に添加され、感染レベルは感染細胞のHBsAg分泌を測定することによって評価した。図１は、ミリストイル化されてないペプチドが、1μMにおけるHBV感染に対してごくかすかな作用を有しているが、同量のミリストイル化ペプチドがほぼ完全にそれを無効にし、より低量では部分的に阻害であったことを示す。
【００７０】
より高いペプチド濃度(最大100μM）で実施されたほかの実験は、ミリストイル化がHBV感染の阻害に絶対的には必要でないが、約１００倍ほど当該ペプチドの活性を強力に増強することを示す。
【００７１】
ｃ）Ｃ末端側が切断されたプレＳ１合成ペプチドの活性
ヒト肝細胞は、HBVのＬタンパク質のプレＳ１ドメインの一部に相当するミリストイル化された、又はミリストイル化されてないペプチドの存在下でHBV感染された。ペプチド濃度は0.8〜800nMの範囲とした。図２は、ミリストイル化され、切断されたペプチドの阻害活性を示す。ミリストイル化されてないペプチドで得られた結果を表１（後述）に示す。
【００７２】
ペプチドMyr 2-48は最高の阻害活性を示すようである。より大きなペプチドであるMyr 2-68及びMyr 2-78は、800nMでは非常に効果的であるが、それより低い量ではあまり活性がない。より小さなペプチドであるMyr 2-28は、50%の阻害が800nMで観察されるが、概してあまり活性がない。
【００７３】
ある程度の活性が2-48より小さいペプチドでも続くので、Ｎ末端アミノ酸の寄与を評価するために、我々は新規な一連の短いペプチドを産生し、そしてこれらを評価した。結果を図３に示す。この図から、Myr 2-38及びMyr 2-28のペプチドは、それらが8μMでほぼ完全にHBV感染を防ぐので、有意な阻害活性を尚も保持することは明らかである。対照的に、２つのより短いペプチドはもはや活性がなく、そしてより短いものの１つは、不明の理由によりHBV感染を増大させる傾向にある。
【００７４】
プレＳ１ペプチドのミリストイル化及びＣ末端切断の効果はまた、ＲＮＡ解析を通じて研究された。その結果、ミリストイル化された切断型のペプチドが、相当のミリストイル化されてないペプチドと比較した場合に増強された疎外活性を示したこと、及び最高の阻害活性がMyr 2-48で得られることが確認される。
【００７５】
ｃ）プレＳ１相同配列のHBV感染阻害活性
近年発見された霊長類のヘパドナウイルスである、ウォーリーモンキー(Wolly Monkey)Ｂ型肝炎ウイルス(WMHBV)は、チンパンジー及びヒト肝細胞一次培養物についてほぼ完全に感染性を示さなかった。WMHBVのプレS 1-78ポリペプチド配列は、最初のHBV由来ペプチドと６６％の配列同一性を示す。我々は、ヒト細胞のHBV感染に対するWMHBV由来Myr 2-48ペプチド（配列番号１４）の阻害活性を研究してきた。
【００７６】
図４は、WMHBVとHBVに由来する、ミリストイル化された2-48ペプチド（６４％の配列同一性）の競合阻害活性を例示する。この実験は、WHMBV由来のペプチドが、驚くべきことにHBV感染の阻害においてHBV由来ペプチドとほぼ同程度の効率であることをはっきりと示す。この結果は、DHBV感染の強力な阻害剤であるのに、DHBV由来ペプチド[PreS Myr 2-41（配列番号１６）。表１を参照のこと]がHBVウイルスに対して全く活性が無いのと対照的である。
【表１】
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【００７７】
実施例３：プレＳ-HBV合成ポリペプチドによるin vivoでのDHBV感染阻害
アヒルは、DHBV及びアヒルプレＳ Myr2-41(DpreS2-41myr)、サギプレＳ Myr2-44(HepreS2-44myr)、ヒトプレＳ Myr2-68(HupreS2-68myr)、アヒルプレＳ Myr2-21(DpreS2-21myr)又は蒸留水を同時に注射される。感染動物のウイルス血症は、感染後５、９、１５及び２８日目に、ウイルスＤＮＡのドットブロット解析によって評価される。図５に示した結果は、ウイルスＤＮＡが蒸留水で処理されたコントロール動物において検出されたことを証明し、このことは、これらの動物の感染の成功を示唆している。これと反対に、一過性のウイルス血症は、DpreS2-41myr又はDpreS2-21myrのいずれかで処理されたアヒルにおいて、感染後９日目又は１５日目に観察され得る。２８日目に、ウイルスＤＮＡは減少し、又はもはや検出不可能となり、これらのことは、当該動物がウイルスを排除したことを示唆する。この解析は、図６において示したウェスタンブロット解析によって更に支持され、これは、DHBVのLタンパク質がDpreS2-41myr又はDpreS2-21myrのいずれかで処理されたアヒルにおいて感染後３５日目に検出されないことを示している。
【００７８】
これと反対に、ヒトペプチドHupreS2-68myrは、DHBVによるアヒルの感染を遅らせるが、予防しないようである（図５及び６）。
【００７９】
ペプチドDpreS2-21myrが一次アヒル肝細胞のDHBV感染に対してin vitroでの阻害活性を有さないことが示されたので、このペプチドにより観察されるin vivoでの保護は、当該ペプチドの間接作用、すなわちDpreS2-21myrに対する抗体を誘発することを介しての免疫応答の増強によるものであろう。
【００８０】
この実験は、ミリストイル化された合成ペプチドが、Ｂ型肝炎ウイルス感染に対する保護を賦与しうることを例示する。
【表２】
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【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、プレＳ１領域ドメイン（１−７８）に相当する、ミリストイル化された、又はミリストイル化されていないペプチドの存在下で培養されたヒト肝細胞のHBV感染の比較である。感染効率は、感染後１４日目の感染細胞の上清中のHBsAgを測定することによって評価した。値は、コントロール（ペプチド無し）の％として表す。
【図２】図２は、Ｃ末端側が切断されたミリストイル化ペプチドの阻害活性の比較を例示する。ヒト肝細胞は、HBVのＬタンパク質のプレＳ１ドメインの一部に相当する、ミリストイル化された、又はミリストイル化されていないペプチドの存在下でHBVに感染させた。ペプチド濃度は０．８〜８００ｎＭに及ぶ。感染効率は、感染後７日目にHBsAgの分泌を測定することによって評価し、そしてポジティブコントロールの％として表した。
【図３】図３は、Myr 2-48よりも短い、Ｃ末端側が切断されたペプチドの阻害活性の比較である。ペプチド濃度は０．８〜８００ｎＭに及ぶ。感染効率は、感染後８日目にHBsAgの分泌を測定することによって評価し、そしてng/mlで表した。
【図４】図４は、ＷＭHBV及びHBV由来のミリストイル化された２〜４８ペプチドの比較の阻害活性を例示する。HBVによるヒト一次ヒト肝細胞の感染は、ペプチドの存在下で、その濃度を低下させつつ実施した。感染細胞の上清は、感染後１０日目に回収され、そしてHbsAgの存在について解析された。
【図５】図５は、アヒルプレＳ Myr2-41(DpreS2-41myr)、サギプレＳ Myr2-44(HepreS2-44myr)、ヒトプレＳ Myr2-68(HupreS2-68myr)、アヒルプレＳ Myr2-21(DpreS2-21myr)又は蒸留水により、DHBVの感染後５、９、１５及び２８日目に処理されたアヒルの血清中のアヒルHBV（DHBV）のドットブロット解析である。
【図６】図６は、感染後３５日目のアヒルの血清中のDHBVのＬタンパク質のウェスタンブロット解析である。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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