(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
その水溶液が、ゾル−ゲル転移温度より低温では流動性のゾル状態となり、ゾル−ゲル転移温度より高温では可逆的にハイドロゲル状態となるハイドロゲル形成性高分子を用い、
ゾル−ゲル転移温度より低温で、流動性のゾル状態とした前記ゲル形成性材料の水溶液と、増殖されたＨＣＶ粒子を包含する細胞とを混合し、
ゾル−ゲル転移温度より高温において、前記混合物をゲル化させた状態で、前記細胞を培養し、
ゾル−ゲル転移温度より低温において該混合物をゾル化させて、前記細胞から放出されたＨＣＶ粒子を回収することを特徴とするＨＣＶ粒子の増殖方法。
【請求項２】
前記放出ＨＣＶ粒子の回収に加えて前記細胞も回収する請求項１に記載のＨＣＶ粒子の増殖方法。
【請求項３】
前記ゾル−ゲル転移温度が、０℃以上３７℃以下の範囲にある請求項１または２に記載のＨＣＶ粒子の増殖方法。
【請求項４】
前記ハイドロゲル形成高分子の水溶液が、ゲル状態では実質的に水不溶性である請求項１〜３のいずれか１項に記載のＨＣＶ粒子の増殖方法。
【請求項５】
その水溶液が、ゾル−ゲル転移温度より低温では流動性のゾル状態となり、ゾル−ゲル転移温度より高温では可逆的にハイドロゲル状態となるハイドロゲル形成性高分子を用い、
ゾル−ゲル転移温度より低温で、流動性のゾル状態とした前記ゲル形成性材料の水溶液と、増殖されたＨＣＶ粒子を包含する細胞とを混合し、
ゾル−ゲル転移温度より高温において、前記混合物をゲル化させた状態で、評価すべき薬剤の存在下で前記細胞を培養し、
ゾル−ゲル転移温度より低温において該混合物をゾル化させて、前記細胞から放出されたＨＣＶ粒子を回収または検出することを特徴とする薬剤の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、増殖されたＣ型肝炎ウイルス（以下「ＨＣＶ」と言う）粒子およびその増殖法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＣＶは、ヒト肝実質細胞を宿主とするウイルスであり、１９８９年にＨＣＶ遺伝子がクローン化された。種々の遺伝子発現系を利用して、各ウイルス抗原の性状が明らかにされた結果、非常に有効な診断系が開発され、Ｃ型肝炎の正確な診断が可能になるとともに、輸血後肝炎の発生がほぼ制圧された。
他方、ＨＣＶを効率よく複製増殖させる培養細胞系は未だ確立されていない。近年、ＨＣＶ遺伝子の自立複製（レプリコン）細胞が作製されたが、ウイルス粒子形成には成功していない。レプリコン細胞を利用することによって、遺伝子複製機構の研究に大きな進展が見られたものの、ＨＣＶの感染、侵入、粒子形成機構などについては依然として不明な点が多い。このため、治療薬、ワクチンの開発研究も充分には進んでいない。動物実験系としては、チンパンジーを用いたＨＣＶ感染モデルが確立されているものの、非常に高価であること、個体差があるため再現性に欠くこと、動物愛護の点からも利用制限が大きいこと、などの問題点がある。
ヒト肝細胞の培養系には、胎児肝細胞、手術切除肝組織等を用いた初代培養細胞、あるいは、原発性肝細胞癌由来の株化細胞が用いられている。しかしながら、前者は入手が容易でない、増殖性が乏しい、などの問題があり、後者は、脱分化が進み本来の肝細胞機能が低下していることが欠点である。肝実質細胞等の上皮性細胞では、細胞を三次元化培養することで、本来の細胞極性が形成され、分化機能を発現するようになることが知られている。ヒト肝細胞もバイオリアクター等の人工肝装置で三次元培養した場合、アルブミン等の肝臓蛋白の産生や薬物代謝機能が亢進することが報告されている（特許文献１）。
【特許文献１】国際公開  ＷＯ  ０１／１４５１７号公報
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は、上記した従来技術の欠点を解消した増殖ＨＣＶ、およびその増殖方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、ＨＣＶの遺伝子複製、ＨＣＶ粒子形成およびＨＣＶ粒子の細胞からの放出を効率よく行うことができる増殖ＨＣＶ、およびその増殖方法を提供することである。
本発明者は鋭意研究の結果、ゾル−ゲル転移温度より低温では流動性のゾル状態となり、ゾル−ゲル転移温度より高温では可逆的にハイドロゲル状態となるハイドロゲル形成性高分子を用いてゲル状態とした系を利用して、ＨＣＶ粒子を包含する細胞を培養することが、上記目的の達成のために極めて効果的なことを見出した。
本発明の培養ＨＣＶ粒子は上記知見に基づくものであり、より詳しくは、濃度勾配下で遠心処理により形成された同一フラクションに、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）−ＲＮＡおよびＨＣＶ−コア蛋白が共に存在することを特徴とするものである。
本発明によれば、更に、その水溶液が、ゾル−ゲル転移温度より低温では流動性のゾル状態となり、ゾル−ゲル転移温度より高温では可逆的にハイドロゲル状態となるハイドロゲル形成性高分子を用い；ゾル−ゲル転移温度より低温で、流動性のゾル状態とした前記ゲル形成性材料の水溶液と、増殖されたＨＣＶ粒子を包含する細胞とを混合し；ゾル−ゲル転移温度より高温において、前記混合物をゲル化させた状態で、前記細胞を培養し（前記細胞からＨＣＶ粒子を放出させ）ゾル−ゲル転移温度より低温において該混合物をゾル化させて、前記細胞から放出されたＨＣＶ粒子を回収または検出することを特徴とするＨＣＶ粒子の増殖方法が提供される。
更に本発明によれば、上記の増殖法で生産されたＨＣＶ粒子を用いた抗ウイルス剤の評価法が提供される。
上述したように本発明によれば、簡便で汎用性の高い組織培養用マトリックスであるＴＧＰ（Ｔｈｅｒｍｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｇｅｌａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒ；本発明に用いるハイドロゲル形成性高分子）を利用して、簡便且つ効率的にＨＣＶを培養することができる。
ＴＧＰゲルは、温度感受性のポリマー素材を使用したマトリックスで、寒天ゲルやゼラチンゲルとは逆に低温（１５℃以下）で水溶液、高温（２５℃以上）でゲル状となる。ゲルの硬さを細胞、組織が自由に生育できる範囲に設定することが容易であるため、細胞等の立体的な培養が可能である。
また、ＴＧＰゲルは、温度を下げることにより、容易に融解するため、細胞等へのダメージを最小限にとどめた形で回収することができる。更にＴＧＰゲルは、人工肝臓装置とは異なり、０．１ｍＬ程度の小スケールから１００ｍＬ以上まで培養スケールを任意に選択することができ、また培養に用いる器具は、通常の細胞培養用のものであり、バイオリアクターなどの特殊な装置を必要としない。このため、ハイスループットの抗ウイルス剤スクリーニングからウイルス粒子の大量調製まで、多様な用途に利用することが可能である。
本発明においては、培養系として、例えば、臨床検査等に用いるマルチウエルプレート（例えば６穴−、１２穴−、２４穴−、９６穴−プレート；通常はプラスチック製）を使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、ＴＧＰで三次元培養したＨＣＶ発現細胞（ＲＣＹＭ１）の位相差顕微鏡写真である（Ａ、ＢおよびＣ）。
図２は、ＴＧＰで三次元培養したＨＣＶ発現細胞（ＲＣＹＭ１）の電子顕微鏡写真である（Ｄ）。
図３は、ＴＧＰで三次元培養したＨＣＶ発現細胞（ＲＣＹＭ１）の電子顕微鏡写真である（Ｅ）。
図４は、培養上清におけるＨＣＶ−ＲＮＡの存在を示すグラフである。
図５は、培養上清におけるＨＣＶコア蛋白質の存在を示すグラフである。
図６は、培養細胞外へ放出されたＨＣＶ粒子の電子顕微鏡写真である（Ａ  １．０４．ｇ／ｍｌ；Ｂ  １．１８ｇ／ｍｌ）。
図７は、金コロイド標識抗ＨＣＶ抗体が結合している５０−６０ｎｍの粒子様構造物を示すＴＥＭ写真（Ａ  抗Ｅ１、Ｅ２抗体）、および陰性コントロール（一次抗体にマウス血清を使用したもの）に対して、金コロイド標識抗ＨＣＶ抗体の結合を試みた場合の状態を示すＴＥＭ写真（Ｂ  正常マウス血清）である。
図８は、ＲＣＹＭ１細胞の培養上澄みのショ糖密度勾配分析の結果を示すグラフ（Ａ、Ｂ、Ｃ）である。
図９は、Ｈｕｈ−７とＲＣＹＭ１細胞が、ＴＧＰ中でスフェロイドを形成している態様の例を示す写真である（Ａ、ａ１）。図９Ｂは、図９Ａの部分（ａ１）の拡大写真である。
図１０は、Ｈｕｈ−７とＲＣＹＭ１細胞が、ＴＧＰ中でスフェロイドを形成している態様の例を示す写真である（Ｂ、ｂ１）。図１０Ｂは、図１０Ａの部分（ｂ１）の拡大写真である。
図１１は、Ｈｕｈ−７とＲＣＹＭ１細胞が、ＴＧＰ中でスフェロイドを形成している態様の例を示す写真である（Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）。
図１２は、ＴＧＰ培養におけるＲＣＹＭ１細胞中のＨＣＶタンパク質の発現と、ウィルス分子の分泌を示す図である（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。
図１３は、ＴＧＰ培養におけるＲＣＹＭ１細胞中のＨＣＶタンパク質の発現と、ウィルス分子の分泌を示す図である（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ）。
図１４は、ＴＧＰ中で増殖されたＲＣＹＭ１細胞の超薄切片の電子顕微鏡写真である（Ａ、Ｂ、Ｃ）。
図１５は、ＴＧＰ培養されたＲＣＹＭ１細胞の超薄切片の免疫電子顕微鏡写真である（Ａ、Ｂ、Ｃ）。
図１６は、ＴＧＰ培養されたＲＣＹＭ１細胞から分泌されたＨＣＶ粒子の感染性、および該感染性の中和を示す図である（Ａ、Ｂ）。
図１７は、ＩＦＮおよびＲＢＶによるＨＣＶ粒子産生の阻害を示す図である（Ａ、Ｂ）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、必要に応じて図面を参照しつつ本発明を更に具体的に説明する。以下の記載において量比を表す「部」および「％」は、特に断らない限り質量基準とする。
（増殖されたＨＣＶ粒子）
本発明の増殖ＨＣＶ粒子は、濃度勾配下で遠心処理により形成された同一フラクションに、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）−ＲＮＡおよびＨＣＶ−コア蛋白が共に存在することが特徴である。本発明において「濃度勾配下で遠心処理により形成された同一フラクション」に「ＨＣＶ−ＲＮＡおよびＨＣＶ−コア蛋白が共に存在する」ことは、後述する実施例１〜３の実験条件下において、容易に確認することができる。
（ＨＣＶ粒子の確認方法）
本発明においては、例えば、以下の方法で、ＨＣＶ粒子の存在を確認することができる。
（１）後述するように、ＨＣＶ包含細胞の培養系における培養上清に、ＰＣＲにより、新たにＨＣＶ遺伝子が形成されたことを確認する。（２）これにより、該上清の下に、「ＨＣＶ」が存在することが推定される。（３）更に、後述する実施例に示すように、同じ密度フラクションに、ＨＣＶ−ＲＮＡと、ＨＣＶ−コアとの双方が存在することを確認する。（４）加えて、この密度フラクションのＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）観察により、ＨＣＶ粒子の存在を確認することもできる。
（金コロイド標識抗体による確認）
本発明のＨＣＶ粒子は、金コロイドで標識した抗ＨＣＶ抗体との抗原抗体反応により、該粒子の存在を確実に検証することができる。このような抗ＨＣＶ抗体との反応は、例えば、後述する「実施例４」の条件下で行うことができる。
（ＨＣＶ増殖方法）
本発明のＨＣＶ増殖方法は、その水溶液が、ゾル−ゲル転移温度より低温では流動性のゾル状態となり、ゾル−ゲル転移温度より高温では可逆的にハイドロゲル状態となるハイドロゲル形成性高分子を用いることが特徴である。より具体的には、本発明においては、該ゾル−ゲル転移温度より低温で、流動性のゾル状態とした前記ゲル形成性材料の水溶液と、増殖されたＨＣＶ粒子を包含する細胞とを混合し；ゾル−ゲル転移温度より高温において、前記混合物をゲル化させた状態で、前記細胞を培養し前記細胞からＨＣＶ粒子を放出させ；ゾル−ゲル転移温度より低温において該混合物をゾル化させて、前記細胞から放出されたＨＣＶ粒子を回収する。
（ＨＣＶ包含細胞）
本発明に用いるべき「ＨＣＶ包含細胞」は、該細胞培養・増殖時に、該細胞内でＨＣＶを包含することが可能である限り、特に制限されない。このＨＣＶ包含細胞としては、例えば、以下のものが使用可能である（このようなＨＣＶを包含することが可能な細胞の詳細については、例えば、文献Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｔ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６；４００８−２１（２００２）．Ａｉｚａｋｉ，Ｈ．ら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３１４；１６−２５（２００３）を参照することができる）。
（ＨＣＶ包含細胞の具体例）
Ｈｕｈ７（Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｔ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６；４００８−２１（２００２）．Ａｉｚａｋｉ，Ｈ．らＶｉｒｏｌｏｇｙ  ３１４；１６−２５（２００３））
（好適なＨＣＶ包含細胞）
ＨＣＶ遺伝子の複製効率の点からは、ＨＣＶ包含細胞としては、Ｈｕｈ７細胞（例えば、ヒューマンサイエンス研究資源バンクより商業的に入手可能）を好適に使用することができる。
（ＨＣＶ増殖方法の一態様）
本発明においては、例えば、以下のようにして、ＨＣＶを増殖することができる。（ＨＣＶ包含細胞へのＨＣＶ遺伝子の導入）
常法により、ＨＣＶ包含細胞（例えば、Ｈｕｈ７細胞）にＨＣＶ遺伝子を導入する（このようなＨＣＶ遺伝子の導入方法についは、例えば文献Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｔ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６：４００８−２１（２００２）を参照することができる）。
（ＨＣＶ包含細胞の培養）
（１）ＨＣＶ包含細胞（例えば、Ｈｕｈ細胞）を、通常の培地（ダルベッコ培地）を用いて、フラスコ培養する。
（２）トリプシン処理（２〜３分）により、増殖細胞をフラスコ壁から剥がして、ダルベッコ培地に再懸濁する。
（３）血球カウンターを用いて細胞をカウントして、濃度（すなわち、一定体積中の細胞の個数）を調整する。
（４）適当な容器（例えば、容積１０ｃｃの試験管）内で、氷上で、ゾル状のハイドロゲル形成性高分子の水溶液（例えば、メビオール株式会社（神奈川県平塚市）から市販されている「メビオール・ジェル」）と、上記懸濁液とを混合して、ピペッティングで均一に懸濁する。
（５）上記懸濁液を、６ウエル−プレートに分注して、３７℃で培養する（５分程度で、細胞を含む懸濁液がゲル状に固まる）。
（６）３７℃に暖めておいたダルベッコ培地を、ゲル上に重層する。
（７）炭酸ガス−インキュベーターで、７〜１０日間インキュベートする。
（８）途中、４日毎に、「３７℃のダルベッコ培地」を交換する（デカンテーションによる）。
（ＨＣＶの回収）
（１）上記した培養後においては、下層にゲル、上層に上清となっている（大きい容器であれば、この容器に、直接に冷却した培地を注入して、ゲル＋上清をまとめて回収しても良い）。この系においては、容器が試験管であり小さいので、下記のように、上清と、ゲルとを別々に回収している。
（２）先ず、上清を回収する。残ったゲルを冷蔵庫にいれてゾル化させ、予め冷却しておいた培地に加えて懸濁する。この懸濁液を、上記の上清と合わせる。
（３）遠心で、細胞／上清を分離する。
（４）上清を、ペレッティングにより濃縮する（すなわち、遠心により固形分を落とす；ただし、必要に応じて、ペレッティングよりマイルドな「限外濾過」によることも可能である）。
（５）上清由来のペレットを懸濁して、濃度勾配下で遠心する。
（６）後述する実施例に示すように、特定密度のフラクションに、ＨＣＶ−ＲＮＡも、コア蛋白も存在する（すなわち、ＨＣＶ粒子があると判断する）。
（７）同じ試料を、必要に応じて、後述する実施例に示すように、ＨＣＶ粒子をＴＥＭ観察により確認する。
（各材料の詳細）
以下、本発明において使用すべき各材料について詳述する。
（ハイドロゲル形成性高分子）
本発明に使用するハイドロゲル形成性高分子は、その水溶液が、ゾル−ゲル転移温度より低い温度でゾル状態、該ゾル−ゲル転移温度より高温でゲル状態となる熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す。
本発明においてハイドロゲルを構成する「ハイドロゲル形成性高分子」とは、架橋（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）構造ないし網目構造を有し、該構造に基づき、その内部に水等の分散液体を保持することによりハイドロゲルを形成可能な性質を有する高分子をいう。又、「ハイドロゲル」とは高分子を含む架橋ないし網目構造と該構造中に支持ないし保持された（分散液体たる）水を少なくとも含むゲルをいう。
架橋ないし網目構造中に保持された「分散液体」は水を主要成分として含む液体である限り、特に制限されない。より具体的に言えば、分散液体は水自身であってもよく、また水溶液および／又は含水液体のいずれであってもよい。この含水液体は、該含水液体の全体１００部に対して、水を８０部以上、更には９０部以上含むことが好ましい。
本発明の目的に反しない限り、上記分散液体は、所定の含量で有機溶媒（例えば、水と相溶性を有するエタノール等の親水性溶媒）あるいは造影剤を含んでいてもよい。
（ゾル−ゲル転移温度）
本発明において「ゾル状態」、「ゲル状態」および「ゾル−ゲル転移温度の定義および測定は、文献（Ｈ．Ｙｏｓｈｉｏｋａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａ３１（１），１１３（１９９４））に記載された定義および方法に基づく。即ち、観測周波数１Ｈｚにおける試料の動的弾性率を低温側から高温側へ徐々に温度を変化（１℃／１分）させて測定し、該試料の貯蔵弾性率（Ｇ´、弾性項）が損失弾性率（Ｇ″、粘性項）を上回る点の温度をゾル−ゲル転移温度とする。一般に、Ｇ″＞Ｇ´の状態がゾルであり、Ｇ″＜Ｇ´の状態がゲルであると定義される。このゾル−ゲル転移温度の測定に際しては、下記の測定条件が好適に使用可能である。
＜動的・損失弾性率の測定条件＞
測定機器（商品名）：ストレス制御式レオメーター  ＡＲ５００、ＴＡインスツルメント社製  試料溶液（ないし分散液）の濃度（ただし「ゾル−ゲル転移温度を有するハイドロゲル形成性高分子」の濃度として）：１０（重量）％  試料溶液の量：約０．８ｇ  測定用セルの形状・寸法：アクリル製平行円盤（直径４．０ｃｍ）、ギャップ６００μｍ  測定周波数：１Ｈｚ  適用ストレス：線形領域内。
本発明においては、細胞ないし培養されたＨＣＶ粒子の熱的損傷を防ぐ点からは、上記ゾル−ゲル転移温度は０℃より高く、３７℃以下であることが好ましく、更には、５℃より高く３５℃以下（特に１０℃以上３３℃以下である）ことが好ましい。
このような好適なゾル−ゲル転移温度を有するハイドロゲル形成性高分子は、後述するような具体的な化合物の中から、上記したスクリーニング方法（ゾル−ゲル転移温度測定法）に従って容易に選択することができる。本発明においてハイドロゲル形成性高分子の水溶液をゲル化させ、ＨＣＶ包含細胞を培養する操作においては、上記したゾル−ゲル転移温度（ａ℃）を、培養時の温度（ｂ℃）と、注入、回収等の操作においてゾル化させための冷却時の温度（ｃ℃）との間に設定することが好ましい。すなわち、上記した３種の温度ａ℃、ｂ℃、およびｃ℃の間には、ｂ＞ａ＞ｃの関係があることが好ましい。より具体的には、（ｂ−ａ）は１〜３６℃、更には２〜３０℃であることが好ましく、また（ａ−ｃ）は１〜３５℃、更には２〜３０℃であることが好ましい。
（ハイドロゲル形成性高分子の水溶液の動作に対する追従性）
本発明においてハイドロゲル形成性高分子の水溶液に基づくハイドロゲルは、その細胞等に対する形態変化への追従性のバランスの点から、より高い周波数に対しては固体的な挙動を示し、他方、より低い周波数に対しては液体的な挙動を示すことが好ましい。より具体的には、該ハイドロゲルの動作に対する追従性は以下の方法で好適に測定することが可能である。
（動作に対する追従性の測定方法）
ハイドロゲル形成性の高分子を含む本発明においてハイドロゲル形成性高分子の水溶液（ハイドロゲルとして１ｍＬ）をゾル状態（ゾル−ゲル転移温度より低い温度）で内径１ｃｍの試験管に入れ、該ハイドロゲル形成性高分子の水溶液のゾル−ゲル転移温度よりも充分高い温度（たとえば該ゾル−ゲル転移温度よりも約１０℃高い温度）とした水浴中で上記試験管を１２時間保持し、該ハイドロゲルをゲル化させる。
次いで、該試験管の上下を逆にした場合に溶液／空気の界面（メニスカス）が溶液の自重で変形するまでの時間（Ｔ）を測定する。ここで１／Ｔ（ｓｅｃ−１）より低い周波数の動作に対して該ハイドロゲルは液体として振舞い、１／Ｔ（ｓｅｃ−１）より高い周波数の動作に対しては、該ハイドロゲルは固体として振舞うことになる。本発明においてハイドロゲルの場合にはＴは１分〜２４時間、好ましくは５分〜１０時間である。
（定常流動粘度）
本発明においてハイドロゲル形成性高分子の水溶液に基づくハイドロゲルのゲル的性質は、定常流動粘度の測定によっても好適に測定可能である。定常流動粘度η（イータ）は、例えばクリープ実験によって測定することができる。クリープ実験では一定のずり応力を試料に与え、ずり歪の時間変化を観測する。一般に粘弾性体のクリープ挙動では、初期にずり速度が時間とともに変化するが、その後ずり速度が一定となる。この時のずり応力とずり速度の比を定常流動粘度ηと定義する。この定常流動粘度は、ニュートン粘度と呼ばれることもある。ただし、ここで定常流動粘度は、ずり応力にほとんど依存しない線形領域内で決定されなければならない。
具体的な測定方法は、測定装置としてストレス制御式粘弾性測定装置（ＡＲ５００、ＴＡインスツルメント社製）を、測定デバイスにアクリル製円盤（直径４ｃｍ）を使用し、試料厚み６００μｍとして少なくとも５分間以上の測定時間クリープ挙動（遅延曲線）を観測する。サンプリング時間は、最初の１００秒間は１秒に１回、その後は１０秒に１回とする。適用するずり応力（ストレス）の決定にあたっては、１０秒間ずり応力を負荷して偏移角度が２×１０−３ｒａｄ以上検出される最低値に設定する。解析には５分以降の少なくとも２０以上の測定値を採用する。本発明においてハイドロゲル形成性高分子の水溶液に基づくハイドロゲルは、３７℃において、ηが５×１０３〜１×１０７Ｐａ・ｓｅｃであることが好ましく、更には８×１０３〜８×１０６Ｐａ・ｓｅｃ、特に１×１０４Ｐａ・ｓｅｃ以上、７×１０６Ｐａ・ｓｅｃ以下であることが好ましい。
上記ηが５×１０３Ｐａ・ｓｅｃ未満では短時間の観測でも流動性が比較的高くなり、細胞の培養系内から移動し易くなる。他方、ηが１×１０７Ｐａ・ｓｅｃを超えると、長時間の観測でもゲルが流動性をほとんど示さなくなる傾向が強まり、細胞の培養系の変形に対するハイドロゲル形成性高分子の水溶液の追従性が不充分となる。また、ηが１×１０７Ｐａ・ｓｅｃを超えるとゲルが脆さを呈する可能性が強まり、わずかの純弾性変形の後、一挙にもろく破壊する脆性破壊が生起しやすい傾向が強まる。
（動的弾性率）
本発明においてハイドロゲル形成性高分子の水溶液に基づくハイドロゲルのゲル的性質は、動的弾性率によっても好適に測定可能である。該ゲルに振幅γ０、振動数をω／２πとする歪みγ（ｔ）＝γ０ｃｏｓωｔ（ｔは時間）を与えた際に、一定応力をσ０、位相差をδとするσ（ｔ）＝σ０ｃｏｓ（ωｔ＋δ）が得られたとする。｜Ｇ｜＝σ０／γ０とすると、動的弾性率Ｇ’（ω）＝｜Ｇ｜ｃｏｓδと、損失弾性率Ｇ”（ω）＝｜Ｇ｜ｓｉｎδとの比（Ｇ”／Ｇ’）が、ゲル的性質を表す指標となる。
本発明においてハイドロゲル形成性高分子の水溶液に基づくハイドロゲルは、ω／２π＝１Ｈｚの歪み（速い動作に対応する）に対しては固体として挙動し、且つ、ω／２π＝１０−４Ｈｚの歪み（遅い動作に対応する）に対しては流体として挙動する。より具体的には、本発明においてハイドロゲル形成性高分子の水溶液に基づくハイドロゲルは、以下の性質を示すことが好ましい（このような弾性率測定の詳細については、例えば、文献：小田良平ら編集、近代工業化学１９、第３５９頁、朝倉書店、１９８５を参照することができる）。
ω／２π＝１Ｈｚ（ゲルが固体として挙動する振動数）の際に、（Ｇ”／Ｇ’）ｓ＝（ｔａｎ  δ）ｓが１未満であることが好ましい（より好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．５以下）。
ω／２π＝１０−４Ｈｚ（ゲルが液体として挙動する振動数）の際に、（Ｇ”／Ｇ’）Ｌ＝（ｔａｎ  δ）Ｌが１以上であることが好ましい（より好ましくは１．５以上、特に好ましくは２以上）。
上記（ｔａｎ  δ）ｓと、（ｔａｎ  δ）Ｌとの比｛（ｔａｎ  δ）ｓ／（ｔａｎ  δ）Ｌ｝が１未満であることが好ましい（より好ましくは０．８以下、特に好ましくは０．５以下）。
＜測定条件＞
ハイドロゲル形成性高分子の水溶液中のハイドロゲル形成性高分子の濃度：約８質量％  温度：３７℃  測定機器：ストレス制御式レオメータ（機種名：ＡＲ５００、ＴＡインスツルメンツ社製）
測定用セルの形状・寸法：ステンレス製平行円盤（直径４．０ｃｍ）、ギャップ６００μｍ  適用ストレス：線形領域内。
（低温での流動性）
本発明においてハイドロゲル形成性高分子の水溶液は低温で細胞培養系へ注入するため、低温で適度な粘性を有することが好ましい。粘性の測定は通常の静的粘性率の測定によって求めることが可能である。
本発明においてハイドロゲル形成性高分子の水溶液は１０℃における粘性率が、０．００５〜１００Ｐａ・ｓｅｃであることが好ましく、更には０．０１〜１０Ｐａ・ｓｅｃ、特に０．１Ｐａ・ｓｅｃ以上、１Ｐａ・ｓｅｃ以下であることが好ましい。
＜測定条件＞
ハイドロゲル形成性高分子の水溶液中のハイドロゲル形成性高分子の濃度：約８質量％  温度：１０℃  測定機器：ストレス制御式レオメータ（機種名：ＡＲ５００、ＴＡインスツルメンツ社製）
測定用セルの形状・寸法：ステンレス製平行円盤（直径４．０ｃｍ）、ギャップ６００μｍ  適用ストレス：線形領域内。
（ハイドロゲル形成性高分子）
上述したような熱可逆的なゾル−ゲル転移を示す（すなわち、ゾル−ゲル転移温度を有する）限り、本発明においてハイドロゲル形成性高分子の水溶液に使用可能なハイドロゲル形成性の高分子は特に制限されない。
その水溶液がゾル−ゲル転移温度を有し、該転移温度より低い温度で可逆的にゾル状態を示す高分子の具体例としては、例えば、ポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとのブロック共重合体等に代表されるポリアルキレンオキサイドブロック共重合体；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等のエーテル化セルロース；キトサン誘導体（Ｋ．Ｒ．Ｈｏｌｍｅら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２４，３８２８（１９９１））等が知られている。
ポリアルキレンオキサイドブロック共重合体として、ポリプロピレンオキサイドの両端にポリエチレンオキサイドが結合したプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−１２７（商品名、ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．製）ゲルが開発されている。このプルロニックＦ−１２７の高濃度水溶液は、約２０℃以上でハイドロゲルとなり、これより低い温度で水溶液となることが知られている。しかしながら、この材料の場合は約２０質量％以上の高濃度でしかゲル状態にはならず、また約２０質量％以上の高濃度でゲル化温度より高温に保持しても、更に水を加えるとゲルが溶解してしまう。また、プルロニックＦ−１２７は分子量が比較的小さく、約２０質量％以上の高度のゲル状態で非常に高い浸透圧を示すのみならず細胞膜を容易に透過するので、細胞の培養に悪影響を及ぼす可能性がある。
一方、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等に代表されるエーテル化セルロースの場合は、通常は、ゾル−ゲル転移温度が高く約４５℃以上である（Ｎ．Ｓａｒｋａｒ，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４，１０７３，１９７９）。これに対して、細胞の培養時の温度は通常３７℃近辺の温度であるため、上記エーテル化セルロースはゾル状態であり、該エーテル化セルロースをハイドロゲル形成性高分子の水溶液として用いることは事実上困難である。
上記したように、その水溶液中がゾル−ゲル転移点を有し、且つ該転移温度より低い温度で可逆的にゾル状態を示す従来の高分子の問題点は、１）ゾル−ゲル転移温度より高温で一旦ゲル化しても、更に水を添加するとゲルが溶解してしまうこと、２）ゾル−ゲル転移温度が細胞の培養時の温度（３７℃近辺）よりも高く、体温ではゾル状態であること、３）ゲル化させるためには、水溶液の高分子濃度を非常に高くする必要があること、等である。
これに対して、本発明者らの検討によれば、好ましくは０℃より高く３７℃以下であるゾル−ゲル転移温度を有するハイドロゲル形成性の高分子（例えば、曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなり、その水溶液がゾル−ゲル転移温度を有し、且つ、ゾル−ゲル転移温度より低い温度で可逆的にゾル状態を示す高分子）を用いてハイドロゲル形成性高分子の水溶液を構成した場合に、上記問題は解決されることが判明している。
（好適なハイドロゲル形成性高分子）
本発明においてハイドロゲル形成性高分子の水溶液として好適に使用可能な疎水結合を利用したハイドロゲル形成性高分子は、曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなることが好ましい。該親水性のブロックは、ゾル−ゲル転移温度より低い温度で該ハイドロゲルが水溶性になるために存在することが好ましく、また曇点を有する複数のブロックは、ハイドロゲルがゾル−ゲル転移温度より高温でゲル状態に変化するために存在することが好ましい。換言すれば、曇点を有するブロックは該曇点より低い温度では水に溶解し、該曇点より高温では水に不溶性に変化するために、曇点より高温で、該ブロックはゲルを形成するための疎水結合を含む架橋点としての役割を果たす。すなわち、疎水性結合に由来する曇点が、上記ハイドロゲルのゾル−ゲル転移温度に対応する。
ただし、該曇点とゾル−ゲル転移温度とは必ずしも一致しなくてもよい。これは、上記した「曇点を有するブロック」の曇点は、一般に、該ブロックと親水性ブロックとの結合によって影響を受けるためである。
本発明に用いるハイドロゲルは、疎水性結合が温度の上昇と共に強くなるのみならず、その変化が温度に対して可逆的であるという性質を利用したものである。１分子内に複数個の架橋点が形成され、安定性に優れたゲルが形成される点からは、ハイドロゲル形成性の高分子が「曇点を有するブロック」を複数個有することが好ましい。
一方、上記ハイドロゲル形成性高分子中の親水性ブロックは、前述したように、該ハイドロゲル形成性高分子がゾル−ゲル転移温度よりも低い温度で水溶性に変化させる機能を有し、上記転移温度より高温で疎水性結合力が増大しすぎて上記ハイドロゲルが凝集沈澱してしまうことを防止しつつ、含水ゲルの状態を形成させる機能を有する。
更に本発明に用いるハイドロゲルは、細胞の培養内で分解、吸収されるものであることが望ましい。すなわち、本発明においてハイドロゲル形成性高分子が細胞の培養内で加水分解反応や酵素反応により分解されて、細胞の培養に無害な低分子量体となって吸収、排泄されることが好ましい。
本発明においてハイドロゲル形成性高分子が曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合してなるものである場合には、曇点を有するブロックと親水性のブロックの少なくともいずれか、好ましくは両方が細胞の培養内で分解、吸収されるものであることが好ましい。
（曇点を有する複数のブロック）
曇点を有するブロックとしては、水に対する溶解度−温度係数が負を示す高分子のブロックであることが好ましく、より具体的には、ポリプロピレンオキサイド、プロピレンオキサイドと他のアルキレンオキサイドとの共重合体、ポリＮ−置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ−置換メタアクリルアミド誘導体、Ｎ−置換アクリルアミド誘導体とＮ−置換メタアクリルアミド誘導体との共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルアルコール部分酢化物を含む群より選ばれる高分子が好ましく使用可能である。
曇点を有するブロックを細胞の培養内で分解、吸収されるものとするには、曇点を有するブロックを疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸から成るポリペプチドとすることが有効である。あるいはポリ乳酸やポリグリコール酸などのポリエステル型生分解性ポリマーを細胞の培養内で分解、吸収される曇点を有するブロックとして利用することもできる。
上記の高分子（曇点を有するブロック）の曇点が４℃より高く４０℃以下であることが、本発明に用いる高分子（曇点を有する複数のブロックと親水性のブロックが結合した化合物）のゾル−ゲル転移温度を０℃より高く３７℃以下とする点から好ましい。
ここで曇点の測定は、例えば、上記の高分子（曇点を有するブロック）の約１質量％の水溶液を冷却して透明な均一溶液とした後、除々に昇温（昇温速度約１℃／ｍｉｎ）して、該溶液がはじめて白濁する点を曇点とすることによって行うことが可能である。
本発明に使用可能なポリＮ−置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ−置換メタアクリルアミド誘導体の具体的な例を以下に列挙する。
ポリ−Ｎ−アクロイルピペリジン；ポリ−Ｎ−ｎ−プロピルメタアクリルアミド；ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド；ポリ−Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド；ポリ−Ｎ−イソプロピルメタアクリルアミド；ポリ−Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド；ポリ−Ｎ−アクリロイルピロリジン；ポリ−Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド；ポリ−Ｎ−シクロプロピルメタアクリルアミド；ポリ−Ｎ−エチルアクリルアミド。
上記の高分子は単独重合体（ホモポリマー）であっても、上記重合体を構成する単量体と他の単量体との共重合体であってもよい。このような共重合体を構成する他の単量体としては、親水性単量体、疎水性単量体のいずれも用いることができる。一般的には、親水性単量体と共重合すると生成物の曇点は上昇し、疎水性単量体と共重合すると生成物の曇点は下降する。従って、これらの共重合すべき単量体を選択することによっても、所望の曇点（例えば４℃より高く４０℃以下の曇点）を有する高分子を得ることができる。
（親水性単量体）
上記親水性単量体としては、Ｎ−ビニルピロリドン、ビニルピリジン、アクリルアミド、メタアクリルアミド、Ｎ−メチルアクリルアミド、ヒドロキシエチルメタアクリレート、ヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルメタアクリレート、ヒドロキシメチルアクリレート、酸性基を有するアクリル酸、メタアクリル酸およびそれらの塩、ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸等、並びに塩基性基を有するＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリート、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（疎水性単量体）
一方、上記疎水性単量体としては、エチルアクリレート、メチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート等のアクリレート誘導体およびメタクリレート誘導体、Ｎ−ｎ−ブチルメタアクリルアミド等のＮ−置換アルキルメタアクリルアミド誘導体、塩化ビニル、アクリロニトリル、スチレン、酢酸ビニル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
（親水性のブロック）
一方、上記した曇点を有するブロックと結合すべき親水性のブロックとしては、具体的には、メチルセルロース、デキストラン、ポリエチレンオキサイド、ポリビニルアルコール、ポリＮ−ビニルピロリドン、ポリビニルピリジン、ポリアクリルアミド、ポリメタアクリルアミド、ポリＮ−メチルアクリルアミド、ポリヒドロキシメチルアクリレート、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニルスルホン酸、ポリスチレンスルホン酸およびそれらの塩；ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ−ジエチルアミノエチルメタクリレート、ポリＮ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドおよびそれらの塩等が挙げられる。
また親水性のブロックは細胞の培養内で分解、代謝、排泄されることが望ましく、アルブミン、ゼラチンなどのたんぱく質、ヒアルロン酸、ヘパリン、キチン、キトサンなどの多糖類などの親水性細胞の培養高分子が好ましく用いられる。
曇点を有するブロックと上記の親水性のブロックとを結合する方法は特に制限されないが、例えば、上記いずれかのブロック中に重合性官能基（例えばアクリロイル基）を導入し、他方のブロックを与える単量体を共重合させることによって行うことができる。また、曇点を有するブロックと上記の親水性のブロックとの結合物は、曇点を有するブロックを与える単量体と、親水性のブロックを与える単量体とのブロック共重合によって得ることも可能である。また、曇点を有するブロックと親水性のブロックとの結合は、予め両者に反応活性な官能基（例えば水酸基、アミノ基、カルボキシル基、イソシアネート基等）を導入し、両者を化学反応により結合させることによって行うこともできる。この際、親水性のブロック中には通常、反応活性な官能基を複数導入する。また、曇点を有するポリプロピレンオキサイドと親水性のブロックとの結合は、例えば、アニオン重合またはカチオン重合で、プロピレンオキサイドと「他の親水性ブロック」を構成するモノマー（例えばエチレンオキサイド）とを繰り返し逐次重合させることで、ポリプロピレンオキサイドと「親水性ブロック」（例えばポリエチレンオキサイド）が結合したブロック共重合体を得ることができる。このようなブロック共重合体は、ポリプロピレンオキサイドの末端に重合性基（例えばアクリロイル基）を導入後、親水性のブロックを構成するモノマーを共重合させることによっても得ることができる。更には、親水性のブロック中に、ポリプロピレンオキサイド末端の官能基（例えば水酸基）と結合反応し得る官能基を導入し、両者を反応させることによっても、本発明に用いる高分子を得ることができる。また、ポリプロピレングリコールの両端にポリエチレングリコールが結合した、プルロニック  Ｆ−１２７（商品名、旭電化工業（株）製）等の材料を連結させることによっても、本発明に用いるハイドロゲル形成性の高分子を得ることができる。
この曇点を有するブロックを含む態様における本発明の高分子は、曇点より低い温度においては、分子内に存在する上記「曇点を有するブロック」が親水性のブロックとともに水溶性であるので、完全に水に溶解し、ゾル状態を示す。しかし、この高分子の水溶液の温度を上記曇点より高温に加温すると、分子内に存在する「曇点を有するブロック」が疎水性となり、疎水的相互作用によって、別個の分子間で会合する。
一方、親水性のブロックは、この時（曇点より高温に加温された際）でも水溶性であるので、本発明の高分子は水中において、曇点を有するブロック間の疎水性会合部を架橋点とした三次元網目構造を持つハイドロゲルを生成する。このハイドロゲルの温度を再び、分子内に存在する「曇点を有するブロック」の曇点より低い温度に冷却すると、該曇点を有するブロックが水溶性となり、疎水性会合による架橋点が解放され、ハイドロゲル構造が消失して、本発明の高分子は、再び完全な水溶液となる。このように、好適な態様における本発明の高分子のゾル−ゲル転移は、分子内に存在する曇点を有するブロックの該曇点における可逆的な親水性、疎水性の変化に基づくものであるので、温度変化に対応して、完全な可逆性を有する。
（ゲルの溶解性）
上述したように水溶液中でゾル−ゲル転移温度を有する高分子を少なくとも含む本発明においてハイドロゲル形成性の高分子は、該ゾル−ゲル転移温度より高温（ｄ℃）で実質的に水不溶性を示し、ゾル−ゲル転移温度より低い温度（ｅ℃）で可逆的に水可溶性を示す。
上記した高い温度（ｄ℃）は、ゾル−ゲル転移温度より１℃以上高い温度であることが好ましく、２℃以上（特に５℃以上）高い温度であることが更に好ましい。また、上記「実質的に水不溶性」とは、上記温度（ｄ℃）において、水１００ｍＬに溶解する上記高分子の量が、５．０ｇ以下（更には０．５ｇ以下、特に０．１ｇ以下）であることが好ましい。
一方、上記した低い温度（ｅ℃）は、ゾル−ゲル転移温度より（絶対値で）１℃以上低い温度であることが好ましく、２℃以上（特に５℃以上）低い温度であることが更に好ましい。また、上記「水可溶性」とは、上記温度（ｅ℃）において、水１００ｍＬに溶解する上記高分子の量が、０．５ｇ以上（更には１．０ｇ以上）であることが好ましい。更に「可逆的に水可溶性を示す」とは、上記ハイドロゲル形成性の高分子の水溶液が、一旦（ゾル−ゲル転移温度より高温において）ゲル化された後においても、ゾル−ゲル転移温度より低い温度においては、上記した水可溶性を示すことをいう。
上記高分子は、その１０％水溶液が５℃で、１０〜３，０００センチポイズ（更には５０〜１，０００センチポイズ）の粘度を示すことが好ましい。このような粘度は、例えば以下のような測定条件下で測定することが好ましい。
粘度計：ストレス制御式レオメータ（機種名：ＡＲ５００、ＴＡインスツルメンツ社製）
ローター直径：６０ｍｍ    ローター形状：平行平板  本発明においてハイドロゲル形成性高分子の水溶液は、上記ゾル−ゲル転移温度より高温でゲル化させた後、多量の水中に浸漬しても、該ゲルは実質的に溶解しない。上記ハイドロゲル形成性高分子の水溶液の上記特性は、例えば、以下のようにして確認することが可能である。
すなわち、本発明においてハイドロゲル形成性の高分子０．１５ｇを、上記ゾル−ゲル転移温度より低い温度（例えば氷冷下）で、蒸留水１．３５ｇに溶解して１０ｗｔ％の水溶液を作製し、該水溶液を径が３５ｍｍのプラスチックシャーレ中に注入し、３７℃に加温することによって、厚さ約１．５ｍｍのゲルを該シャーレ中に形成させた後、該ゲルを含むシャーレ全体の重量（ｆグラム）を測定する。次いで、該ゲルを含むシャーレ全体を２５０ｍｌ中の水中に３７℃で１０時間静置した後、該ゲルを含むシャーレ全体の重量（ｇグラム）を測定して、ゲル表面からの該ゲルの溶解の有無を評価する。この際、本発明においてハイドロゲル形成性の高分子においては、上記ゲルの重量減少率、すなわち（ｆ−ｇ）／ｆが、５．０％以下であることが好ましく、更には１．０％以下（特に０．１％以下）であることが好ましい。
本発明においてハイドロゲル形成性高分子の水溶液は、上記ゾル−ゲル転移温度より高温でゲル化させた後、多量（体積比で、ゲルの０．１〜１００倍程度）の水中に浸漬しても、長期間に亘って該ゲルは溶解することがない。このような本発明に用いる高分子の性質は、例えば、該高分子内に曇点を有するブロックが２個以上（複数個）存在することによって達成される。
これに対して、ポリプロピレンオキサイドの両端にポリエチレンオキサイドが結合してなる前述のプルロニックＦ−１２７を用いて同様のゲルを作成した場合には、数時間の静置で該ゲルは完全に水に溶解することを、本発明者らは見出している。
非ゲル化時の細胞毒性をできる限り低いレベルに抑える点からは、水に対する濃度、すなわち｛（高分子）／（高分子＋水）｝×１００（％）で、２０％以下（更には１５％以下、特に１０％以下）の濃度でゲル化が可能なハイドロゲル形成性の高分子を用いることが好ましい。
本発明に用いられるハイドロゲル形成性高分子の分子量は３万以上３，０００万以下が好ましく、より好ましくは１０万以上１，０００万以下、更に好ましくは５０万以上５００万以下である。
（ＨＣＶ粒子感染性の確認）
本発明においては、後述するように、３Ｄ培養の培養液に分泌されたＨＣＶ粒子が感染性であることは、例えば、ＨＣＶ複製を高度に許容するＨｕｈ−７．５．１細胞に対する該ＨＣＶ粒子の挙動により、確認することができる。抗Ｅ２抗体によって、またはＥ２タンパク質のヒト細胞との結合を妨げる患者血清によって、感染は中和される。後述するように、抗ウイルス薬の評価のためのＴＧＰ−３Ｄ培養システムの有用性を示すこともできる。Ｈｕｈ−７により誘導された３Ｄ培養システムが、感染性のＨＣＶ粒子の産生を与えることを確認できる。このシステムは、天然の宿主細胞環境において、更にＨＣＶ形態形成を研究するための価値あるツールとなり得る。
本発明を、以下の実施例および図面に基づいて具体的に説明する。もっとも本発明の技術的範囲は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０００６】
製造例１
ポリプロピレンオキサイド−ポリエチレンオキサイド共重合体（プロピレンオキサイド／エチレンオキサイド平均重合度約６０／１８０、旭電化工業（株）製：プルロニックＦ−１２７）１０ｇを乾燥クロロホルム３０ｍｌに溶解し、五酸化リン共存下、ヘキサメチレンジイソシアネート０．１３ｇを加え、沸点還流下に６時間反応させた。溶媒を減圧留去後、残さを蒸留水に溶解し、分画分子量３万の限外濾過膜（アミコンＰＭ−３０）を用いて限外濾過を行い、高分子量重合体と低分子量重合体を分画した。得られた水溶液を凍結して、Ｆ−１２７高重合体およびＦ−１２７低重合体を得た。
上記により得たＦ−１２７高重合体（本発明においてハイドロゲル形成性高分子、ＴＧＰ−１）を、氷冷下、８質量％の濃度で蒸留水に溶解した。この水溶液をゆるやかに加温していくと、２１℃から徐々に粘度が上昇し、約２７℃で固化して、ハイドロゲルとなった。このハイドロゲルを冷却すると、２１℃で水溶液に戻った。この変化は、可逆的に繰り返し観測された。一方、上記Ｆ−１２７低重合体を、氷点下８質量％の濃度で蒸留水に溶解したものは、６０℃以上に加熱しても全くゲル化しなかった。
製造例２
トリメチロールプロパン１モルに対し、エチレンオキサイド１６０モルをカチオン重合により付加して、平均分子量約７０００のポリエチレンオキサイドトリオールを得た。
上記により得たポリエチレンオキサイドトリオール１００ｇを蒸留水１０００ｍｌに溶解した後、室温で過マンガン酸カリウム１２ｇを徐々に加えて、そのまま約１時間、酸化反応させた。固形物を濾過により除いた後、生成物をクロロホルムで抽出し、溶媒（クロロホルム）を減圧留去してポリエチレンオキサイドトリカルボキシル体９０ｇを得た。
上記により得たポリエチレンオキサイドトリカルボキシル体１０ｇと、ポリプロピレンオキサイドジアミノ体（プロピレンオキサイド平均重合度約６５、米国ジェファーソンケミカル社製、商品名：ジェファーミンＤ−４０００、曇点：約９℃）１０ｇとを四塩化炭素１０００ｍｌに溶解し、ジシクロヘキシルカルボジイミド１．２ｇを加えた後、沸点還流下に６時間反応させた。反応液を冷却し、固形物を濾過により除いた後、溶媒（四塩化炭素）を減圧留去し、残さを真空乾燥して、複数のポリプロピレンオキサイドとポリエチレンオキサイドとが結合した本発明においてハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−２）を得た。これを氷冷下、５質量％の濃度で蒸留水に溶解し、そのゾル−ゲル転移温度を測定したところ、約１６℃であった。
製造例３
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（イーストマンコダック社製）９６ｇ、Ｎ−アクリロキシスクシンイミド（国産化学（株）製）１７ｇ、およびｎ−ブチルメタクリレート（関東化学（株）製）７ｇをクロロホルム４０００ｍｌに溶解し、窒素置換後、Ｎ，Ｎ’−アゾビスイソブチロニトリル１．５ｇを加え、６０℃で６時間重合させた。反応液を濃縮した後、ジエチルエーテルに再沈（再沈殿）した。濾過により固形物を回収した後、真空乾燥して、７８ｇのポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）を得た。
上記により得たポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）に、過剰のイソプロピルアミンを加えてポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）を得た。このポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）の水溶液の曇点は１９℃であった。
前記のポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−Ｎ−アクリロキシスクシンイミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）１０ｇ、および両末端アミノ化ポリエチレンオキサイド（分子量６，０００、川研ファインケミカル（株）製）５ｇをクロロホルム１０００ｍｌに溶解し、５０℃で３時間反応させた。室温まで冷却した後、イソプロピルアミン１ｇを加え、１時間放置した後、反応液を濃縮し、残渣をジエチルエーテル中に沈澱させた。濾過により固形物を回収した後、真空乾燥して、複数のポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド−コ−ｎ−ブチルメタクリレート）とポリエチレンオキサイドとが結合した本発明においてハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−３）を得た。
このようにして得たＴＧＰ−３を氷冷下、５質量％の濃度で蒸留水に溶解し、そのゾル−ゲル転移温度を測定したところ、約２１℃であった。
製造例４
（滅菌方法）
上記した本発明においてハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−３）の２．０ｇを、ＥＯＧ（エチレンオキサイドガス）滅菌バッグ（ホギメディカル社製、商品名：ハイブリッド滅菌バッグ）に入れ、ＥＯＧ滅菌装置（イージーパック、井内盛栄堂製）でＥＯＧをバッグに充填し、室温にて一昼夜放置した。更に４０℃で半日放置した後、ＥＯＧをバッグから抜き、エアレーションを行った。バッグを真空乾燥器（４０℃）に入れ、時々エアレーションしながら半日放置することにより滅菌した。
この滅菌操作により高分子のゾル−ゲル転移温度が変化しないことを、別途確認した。
製造例５
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド３７ｇと、ｎ−ブチルメタクリレート３ｇと、ポリエチレンオキサイドモノアクリレート（分子量４，０００、日本油脂（株）製：ＰＭＥ−４０００）２８ｇとを、ベンゼン３４０ｍｌに溶解した後、２，２´−アゾビスイソブチロニトリル０．８ｇを加え、６０℃で６時間反応させた。得られた反応生成物にクロロホルム６００ｍｌを加えて溶解し、該溶液をエーテル２０Ｌ（リットル）に滴下して沈澱させた。得られた沈殿を濾過により回収し、該沈澱を約４０℃で２４時間真空乾燥した後、蒸留水６Ｌに再び溶解し、分画分子量１０万のホローファイバー型限外濾過膜（アミコン社製Ｈ１Ｐ１００−４３）を用いて１０℃で２ｌまで濃縮した。該濃縮液に蒸留水４ｌを加えて希釈し、上記希釈操作を再度行った。上記の希釈、限外濾過濃縮操作を更に５回繰り返し、分子量１０万以下のものを除去した。この限外濾過により濾過されなかったもの（限外濾過膜内に残留したもの）を回収して凍結乾燥し、分子量１０万以上の本発明においてハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−４）６０ｇを得た。
上記により得た本発明においてハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−４）１ｇを、９ｇの蒸留水に氷冷下で溶解した。この水溶液のゾル−ゲル転移温度を測定したところ、該ゾル−ゲル転移温度は２５℃であった。
製造例６
製造例３の本発明においてハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−３）を１０質量％の濃度で蒸留水に溶解し、３７℃におけるηを測定したところ、５．８×１０５  Ｐａ・ｓｅｃであった。一方、寒天を２質量％の濃度で蒸留水に９０℃で溶解して、１０℃で１時間ゲル化させた後、３７℃におけるηを測定したところ、そのηは機器の測定限界（１×１０７Ｐａ・ｓｅｃ）を越えていた。
製造例７
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド７１．０ｇおよびｎ−ブチルメタクリレート４．４ｇをエタノール１１１７ｇに溶解した。これにポリエチレングリコールジメタクリレート（ＰＤＥ６０００、日本油脂（株）製）２２．６ｇを水７７３ｇに溶解した水溶液を加え、窒素気流下７０℃に加温した。窒素気流下７０℃を保ちながら、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）０．８ｍＬと１０％過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）水溶液８ｍＬを加え３０分間攪拌反応させた。更にＴＥＭＥＤ０．８ｍＬと１０％ＡＰＳ水溶液８ｍＬを３０分間隔で４回加えて重合反応を完結させた。反応液を１０℃以下に冷却後、１０℃の冷却蒸留水５Ｌを加えて希釈し、分画分子量１０万の限外ろ過膜を用いて１０℃で２Ｌまで濃縮した。
該濃縮液に冷却蒸留水４Ｌを加えて希釈し、上記限外ろ過濃縮操作を再度行った。上記の希釈、限外ろ過濃縮操作を更に５回繰り返し、分子量１０万以下のものを除去した。この限外ろ過によりろ過されなかったもの（限外ろ過膜内に残留したもの）を回収して凍結乾燥し、分子量１０万以上の本発明においてハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−５）７２ｇを得た。
上記により得た本発明においてハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−５）１ｇを、９ｇの蒸留水に氷冷下で溶解した。この水溶液のゾル−ゲル転移温度を測定したところ、該ゾル−ゲル転移温度は２０℃であった。
製造例８
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド４２．０ｇおよびｎ−ブチルメタクリレート４．０ｇをエタノール５９２ｇに溶解した。これにポリエチレングリコールジメタクリレート（ＰＤＥ６０００、日本油脂（株）製）１１．５ｇを水６５．１ｇに溶解した水溶液を加え、窒素気流下７０℃に加温した。窒素気流下７０℃を保ちながら、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）０．４ｍＬと１０％過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）水溶液４ｍＬを加え３０分間攪拌反応させた。更にＴＥＭＥＤ０．４ｍＬと１０％ＡＰＳ水溶液４ｍＬを３０分間隔で４回加えて重合反応を完結させた。反応液を５℃以下に冷却後、５℃の冷却蒸留水５Ｌを加えて希釈し、分画分子量１０万の限外ろ過膜を用いて５℃で２Ｌまで濃縮した。
該濃縮液に冷却蒸留水４Ｌを加えて希釈し、上記限外ろ過濃縮操作を再度行った。上記の希釈、限外ろ過濃縮操作を更に５回繰り返し、分子量１０万以下のものを除去した。この限外ろ過によりろ過されなかったもの（限外ろ過膜内に残留したもの）を回収して凍結乾燥し、分子量１０万以上の本発明においてハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−６）４０ｇを得た。
上記により得た本発明においてハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−６）１ｇを、９ｇの蒸留水に氷冷下で溶解した。この水溶液のゾル−ゲル転移温度を測定したところ、該ゾル−ゲル転移温度は７℃であった。
製造例９
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド４５．５ｇおよびｎ−ブチルメタクリレート０．５６ｇをエタノール５９２ｇに溶解した。これにポリエチレングリコールジメタクリレート（ＰＤＥ６０００、日本油脂（株）製）１１．５ｇを水６５．１ｇに溶解した水溶液を加え、窒素気流下７０℃に加温した。窒素気流下７０℃を保ちながら、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）０．４ｍＬと１０％過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）水溶液４ｍＬを加え３０分間攪拌反応させた。更にＴＥＭＥＤ０．４ｍＬと１０％ＡＰＳ水溶液４ｍＬを３０分間隔で４回加えて重合反応を完結させた。反応液を１０℃以下に冷却後、１０℃の冷却蒸留水５Ｌを加えて希釈し、分画分子量１０万の限外ろ過膜を用いて１０℃で２Ｌまで濃縮した。
該濃縮液に冷却蒸留水４Ｌを加えて希釈し、上記限外ろ過濃縮操作を再度行った。上記の希釈、限外ろ過濃縮操作を更に５回繰り返し、分子量１０万以下のものを除去した。この限外ろ過によりろ過されなかったもの（限外ろ過膜内に残留したもの）を回収して凍結乾燥し、分子量１０万以上の本発明においてハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−７）２２ｇを得た。
上記により得た本発明においてハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−７）１ｇを、９ｇの蒸留水に氷冷下で溶解した。この水溶液のゾル−ゲル転移温度を測定したところ、該ゾル−ゲル転移温度は３７℃であった。
製造例１０
Ｎ−イソプロピルアクリルアミド４４．０ｇおよびｎ−ブチルメタクリレート１．６８ｇをエタノール５９２ｇに溶解した。これにポリエチレングリコールジメタクリレート（ＰＤＥ６０００、日本油脂（株）製）１１．５ｇを水６５．１ｇに溶解した水溶液を加え、窒素気流下７０℃に加温した。窒素気流下７０℃を保ちながら、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）０．４ｍＬと１０％過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）水溶液４ｍＬを加え３０分間攪拌反応させた。更にＴＥＭＥＤ０．４ｍＬと１０％ＡＰＳ水溶液４ｍＬを３０分間隔で４回加えて重合反応を完結させた。反応液を１０℃以下に冷却後、１０℃の冷却蒸留水５Ｌを加えて希釈し、分画分子量１０万の限外ろ過膜を用いて１０℃で２Ｌまで濃縮した。
該濃縮液に冷却蒸留水４Ｌを加えて希釈し、上記限外ろ過濃縮操作を再度行った。上記の希釈、限外ろ過濃縮操作を更に５回繰り返し、分子量１０万以下のものを除去した。この限外ろ過によりろ過されなかったもの（限外ろ過膜内に残留したもの）を回収して凍結乾燥し、分子量１０万以上の本発明においてハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−８）２２ｇを得た。
上記により得た本発明においてハイドロゲル形成性高分子（ＴＧＰ−８）１ｇを、９ｇの蒸留水に氷冷下で溶解した。この水溶液のゾル−ゲル転移温度を測定したところ、該ゾル−ゲル転移温度は２６℃であった。
実施例１
（ＴＧＰ培養細胞培養上清中のＨＣＶ−ＲＮＡの検出）
ダイシストロニックＨＣＶ遺伝子クローン（Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）５’非翻訳領域遺伝子−ネオマイシン耐性遺伝子−脳心筋炎ウイルス５’非翻訳領域遺伝子−ＨＣＶ全蛋白質遺伝子−ＨＣＶ５’非翻訳領域遺伝子からなる）を鋳型としてＲＮＡを合成し、ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ法にてＨｕｈ７細胞へ遺伝子導入した（このようなＨＣＶ遺伝子の導入方法の詳細に関しては、例えば文献Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｔ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７６：４００８−２１（２００２）．を参照することができる）。
ジェネティシン  ０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ４ｇ／Ｌ、ウシ胎児血清２％を含むＡＳＦ１０４培地（ＡＪＩＮＯＭＯＴＯ）で、上記で得た細胞を３週間培養し、薬剤耐性細胞株（ＲＣＹＭ１）を選択した。ＲＣＹＭ１細胞中にＨＣＶゲノムＲＮＡが保持されていることをリアルタイム逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲ法で、ＨＣＶ蛋白質が産生されていることをウエスタンブロット法でそれぞれ確認した。この細胞を５×１０６個までフラスコ内で継代培養した。
ＴＧＰ（製造例３で作製したＴＧＰ）１ｇに培養液（前述）１０ｍＬを加え４℃に冷却したものにフラスコ内で培養した細胞を加え、６  ｗｅｌｌ  プレートに８００μＬ／ｗｅｌｌ毎分注し、３７℃に温めＴＧＰをゲル化した。この細胞を播種したゲルに３７℃に温めた培養液３ｍｌを上層し、３７℃にて１０日間培養した。培養中は４日毎に上層していた培養液を回収し、新しい培養液に交換した。
培養終了後、ゲルを４℃に冷却してゾル化し培養液を添加して希釈し、遠心操作により三次元培養されたＲＣＹＭ１細胞を回収した。培養上清は８０００ｇ、５０ｍｉｎの遠心操作により細胞破砕物等を除いた。この上清を２５，０００ｒｐｍで４ｈｒ遠心した。ペレットをＴＮＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）１ｍｌで溶解し、１０−６０％ショ糖密度勾配遠心で分画した。各画分の比重を測定後、ＴＮＥ緩衝液により三倍に希釈し５０，０００ｒｐｍ、２ｈｒ遠心し、沈殿物を１００μＬのＴＮＥ緩衝液に再度溶解した。この溶液よりＲＮＡを抽出し、各画分中のＨＣＶ−ＲＮＡ量をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法により定量した。コントロールとして、同数のＲＣＹＭ１細胞を１０日間単層培養した培養上清を同様の手法にて解析した。
解析に用いたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲのプライマー及びプローブの塩基配列を以下に示す。
５’−ＧＡＧＴＧＴＣＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＣＡ−３’  ５’−ＣＡＣＴＣＧＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＡＴＣＡ−３’  ５’−（６−ｃａｒｂｏ×ｙｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎｅ）ＣＣＣＧＣＡＡＧＡＣＴＧＣＴＡＧＣＣＧＡＧＴＡＧＴＧＴＴＧＧ（ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ−６−ｃａｒｂｏ×ｙｆｕｏｒｅｓｃｉｎｅ）−３’  ＲＴ−ＰＣＲ反応はＴａｑＭａｎ  ＥＺ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。反応液は全量を５０μＬとし、温度等については以下の反応条件で行った。
６０℃  １ｍｉｎ、５０℃  ６０ｍｉｎ、９５℃  ５ｍｉｎの反応の後、９４℃  １５ｓｅｃ、５５℃  １０ｓｅｃ、６９℃  １ｍｉｎのサイクルを５０サイクル行った。スタンダードＲＮＡはインビトロにて合成したＨＣＶ−ＲＮＡを希釈しスタンダードとして使用した。
その結果を図４に示す。図４中の黒丸（●）はＴＧＰ培養上清、図中の白丸（○）は単層培養上清のＨＣＶ−ＲＮＡ量である。縦軸はＨＣＶ−ＲＮＡ量（１０４  ｃｏｐｉｅｓ／ｆｒａｃｔｉｏｎ）、横軸は各画分の比重（ｇ／ｍｌ）である。図に示すようにＲＣＹＭ１細胞のＴＧＰ培養上清からは比重１．１８ｇ／ｍｌをピークとしてＨＣＶ−ＲＮＡが検出された。この密度はＨＣＶ感染患者血清を用いた研究でＨＣＶ粒子の密度として報告されている値に近く、培養上清中にはＨＣＶ様粒子が存在することが確認された。
実施例２
（ＴＧＰ培養細胞培養上清中のＨＣＶ−コア蛋白質の検出）
Ｃ型肝炎ウイルス全蛋白を発現し、かつ自律的に複製するダイシストロニックＨＣＶゲノムを保持するＨｕｈ７細胞（ＲＣＹＭ１細胞）を５×１０６個までフラスコ内で継代培養した。ＴＧＰに培養液を加え４℃に冷却したものに、フラスコ内で培養した細胞を加え、６ウェル  プレートに８００μＬ／ウェルを分注し、３７℃にあたためＴＧＰをゲル化した。このゲルに培養液３ｍｌを上層し、３７℃にて１０日間培養した。培養中は４日毎に上層していた培養液を回収し、新しい培養液に交換した。培養液は実施例１と同様の物を使用した。
培養終了後、ゲルを４℃に冷却してゾル化し培養液を添加して希釈し、遠心操作により三次元培養されたＲＣＹＭ１細胞を回収した。培養上清は８０００ｇ、５０ｍｉｎの遠心操作により細胞破砕物等を除いた。その上清を２５，０００ｒｐｍで４ｈｒ遠心した。ペレットをＴＮＥ緩衝液１ｍｌで溶解し、１０−６０％ショ糖密度勾配遠心で分画した。各画分の比重を測定後、ＴＮＥ緩衝液により三倍に希釈し５０，０００ｒｐｍ  ２ｈｒ遠心し、沈殿物を１００μＬのＴＮＥ緩衝液に再度溶解した。この溶液をサンプルとして各画分のＨＣＶ−コア蛋白量をＥＬＩＳＡ法により定量した。
コントロールとして、同数のＲＣＹＭ１細胞を１０日間単層培養した培養上清を同様の手法にて解析した。その結果を図５に示す。
図５中の黒丸（●）はＴＧＰ培養上清、図中の白丸（○）は単層培養上清のＨＣＶ−コア蛋白量である。縦軸はＨＣＶ−コア蛋白量（ｆｍｏｌ／ｆｒａｃｔｉｏｎ）を、横軸は各画分の比重（ｇ／ｍｌ）である。図に示すようにＲＣＹＭ１細胞のＴＧＰ培養上清からは比重１．１８ｇ／ｍｌをピークとしてＨＣＶ−コア蛋白が検出された。この密度はＨＣＶ感染患者血清を用いた研究でＨＣＶ粒子の密度として報告されている値に近いものである。また実施例１により同密度にはＨＣＶ−ＲＮＡの存在も確認されており、培養上清中にはＨＣＶ様粒子が存在することが確認された。
実施例３
（ＴＧＰ培養細胞培養上清中のＨＣＶ粒子の検出）
Ｃ型肝炎ウイルス全蛋白を発現し、かつ自律的に複製するダイシストロニックＨＣＶゲノムを保持するＨｕｈ７細胞（ＲＣＹＭ１細胞）を作製した。この細胞を５×１０６個までフラスコ内で継代培養した。ＴＧＰに培養液を加え４℃に冷却したものに、フラスコ内で培養した細胞を加え、６  ウェル  プレートに８００μＬ／ウェルを分注し、３７℃にあたためＴＧＰをゲル化した。このゲルに３７℃に温めた培養液３ｍｌを加えたのち、３７℃にて１０日間培養した。
培養終了後、ゲルを４℃に冷却してゾル化し培養液を添加して希釈し、遠心操作により三次元培養されたＲＣＹＭ１細胞を回収した。培養上清は８０００ｇ、５０ｍｉｎの遠心操作により細胞破砕物等を除いた。その上清を２５，０００ｒｐｍで４ｈｒ遠心した。ペレットをＴＮＥ緩衝液１ｍｌで溶解し、１０−６０％ショ糖密度勾配遠心で分画した。比重１．０４ｇ／ｍｌの画分及びＨＣＶ−ＲＮＡ及びＨＣＶ−コア蛋白のピークであった１．１８ｇ／ｍｌの画分１ｍｌをＴＮＥ緩衝液により三倍に希釈し５０，０００ｒｐｍ、２ｈｒ遠心した。この沈殿物を２０μＬのＴＮＥ緩衝液に再度溶解した。４％酢酸ウランにて染色後、透過型電子顕微鏡にて観察を行った。その結果を図６に示す。１．１８ｇ／ｍｌの分画には直径５０−６０ｎｍで膜構造及び複雑な内部構造をもったウイルス粒子様構造が観察できたのに対し、１．０４ｇ／ｍｌの分画にはこのような構造物は観察されなかった。この粒子様搆造物はＨＣＶ感染血清を用いた研究で粒子として報告されているものと大きさ・密度ともに一致しており、ＨＣＶ粒子であることが確認された。
上記で得た１．１８ｇ／ｍｌ画分（Ａ）及び１．０４ｇ／ｍｌ画分（Ｂ）の電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真を図６に示す。図６に示したように、１．１８ｇ／ｍｌ画分にＨＣＶ粒子が確認された。
実施例４
（ＴＧＰ培養細胞培養上清中のＨＣＶ粒子の免疫染色）
Ｃ型肝炎ウイルス全蛋白を発現し、かつ自律的に複製するダイシストロニックＨＣＶゲノムを維持するＨｕｈ７細胞（ＲＣＹＭ１細胞）を作製した。この細胞を５×１０６個までフラスコ内で継代培養した。ＴＧＰに培養液を加え４℃に冷却したものに、フラスコ内で培養した細胞を加え、６  ウェル  プレートに８００μＬ／ウェルを分注し、３７℃にあたためＴＧＰをゲル化した。このゲルに３７℃に温めた培養液３ｍｌを加えたのち、３７℃にて１０日間培養した。  培養終了後、ゲルを４℃に冷却してゾル化し培養液を添加して希釈し、遠心操作により三次元培養されたＲＣＹＭ１細胞を回収した。培養上清は８０００ｇ、５０ｍｉｎの遠心操作により細胞破砕物等を除いた。その上清を２５，０００ｒｐｍで４ｈｒ遠心した。ペレットをＴＮＥ緩衝液１ｍｌで溶解し、１０−６０％ショ糖密度勾配遠心で分画した。ＨＣＶ−ＲＮＡ及びＨＣＶ−コア蛋白のピークであった比重１．１８ｇ／ｍｌの画分１ｍｌをＴＮＥ緩衝液により三倍に希釈し５０，０００ｒｐｍ、２ｈｒ遠心した。この沈殿物を２０μＬのＴＮＥ緩衝液に再度溶解した。この溶液に対して、一次抗体として抗ＨＣＶエンベロープマウス抗体を、二次抗体として１０ｎｍの金コロイドで標識した抗マウス抗体をそれぞれ反応させ、洗浄後、透過型電子顕微鏡にて観察を行った。その結果を図７Ａ（Ａｎｔｉ−Ｅ１，Ｅ２  Ａｂ）に示す。図７Ａに示したように、５０−６０ｎｍの粒子様構造物に対して抗原抗体反応により金コロイドが結合しているのが観察された。
他方、陰性コントロールとして一次抗体にマウス血清を用いて同様の処理を行った場合には、図７Ｂ（Ｎｏｒｍａｌｍｏｕｓｅ  ｓｅｒｕｍ）に示したような金コロイドの結合した粒子像は観察できなかった。これらの結果より、この粒子様構造物表面にはＨＣＶ構造蛋白であるＥ１，Ｅ２が存在し、ＨＣＶ粒子であることを再確認した。
実施例５
（ラジアルフロー型バイオリアクター（ＲＦＢ））培養で培養されたゲノム長のｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃＨＣＶ−ＲＮＡを担持するＲＣＹＭ１からのＨＣＶ粒子の分泌）
ＦＬＣ４細胞において選択可能なゲノム長のＨＣＶ−ＲＮＡの複製可能なキャパシティを最初に評価した。しかしながら、Ｇ４１８耐性のコロニーは観察されず、ＦＬＣ４細胞がこれらのＨＣＶ−ＲＮＡの複製をサポートしないことが示された。したがって、以降の実験は安定したＨｕｈ−７細胞系（ＲＣＹＭ１）で行われた。そして、Ｃｏｎ１クローンｌ３８９ｎｅｏ／ｃｏｒｅ−３７ＮＫ  ５．１（遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）１ｂ）（Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｔ．，Ｖ．Ｌｏｈｍａｎｎ，Ａ．Ｋａｕｌ，Ｎ．Ｋｒｉｅｇｅｒ，Ｇ．Ｒｉｎｃｋ，Ｇ．Ｒｕｔｔｅｒ，Ｄ．Ｓｔｒａｎｄ，ａｎｄ  Ｒ．Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ．２００２．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：４００８−４０２１）に由来するゲノム長のｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉＲＮＡで、細胞のトランスフェクションによって発現された全長（ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ）のＨＣＶ−ＲＮＡ複製をサポートした。ＲＣＹＭ１細胞中のＨＣＶ−ＲＮＡレベルは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定した約５×１０６コピー／μｇ  トータルＲＮＡであった。ＨＣＶタンパク質の発現と細胞レベル下の局在化は、ウェスタン・ブロッティングおよび免疫蛍光分析によって確認された。３Ｄ  ＲＦＢ培養を展開するために、細胞サスペンジョンを流すことによって、ＲＣＹＭ１細胞は先ずＲＦＢカラムにロードされた、細胞は次いでキャリヤー・ビーズに付着された。細胞は３Ｄマトリックスの範囲内で増殖し、そして、培養液はカラムを通してラジアル方向に循環された。  ＲＦＢ培養システムにおいてＲＣＹＭ１細胞からＨＣＶ粒子が分泌されたかどうか調べるために、培養の５〜１０日後に培養流体が集められ、連続的１０−６０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ショ糖密度勾配遠心分離によって分別された。ＨＣＶ−ＲＮＡおよびコア・タンパク質は、主に１．１５−１．２０ｇ／ｍｌに認められ、１．１８ｇ／ｍｌフラクションで最大となった（図８ＡおよびＢ）。
図８は、ＲＣＹＭ１細胞の培養上澄みのショ糖密度勾配分析の結果を示すグラフである。「材料および方法」において述たように、ＲＦＢ培養されたＲＣＹＭ１（黒円）、単層培養されたＲＣＹＭ１（白四角）およびＲＦＢ培養された５−１５細胞（白三角）から収集された培養メディアが分別された。
図８Ａ：個々のフラクション中のＨＣＶ−ＲＮＡが、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定された。二重測定の平均値は、対応する分数の密度に対してプロットされた。
図８Ｂ：個々のフラクションの中のＨＣＶコア・タンパク質はＥＬＩＳＡによって決定された。二重測定の平均値は、密度に対してプロットされた。
図８Ｃ：ＲＦＢ培養されたＲＣＭ１細胞の培養培養液は、０．２％のＮＰ４０で処理され（白円）、次いでショ糖勾配で遠心分離された。各々の分数は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによってＨＣＶ−ＲＮＡについて検査された。
５−１５細胞を使用した同じ実験（サブゲノム・ＨＣＶレプリコンが複製された）では、ＲＣＹＭ１細胞で観察されたＨＣＶ−ＲＮＡに対応する同様のピークは、検出されなかった。ＲＦＢ培養システムにおける５−１５細胞およびＲＣＹＭ１細胞の両方において、ＨＣＶ−ＲＮＡの実質的な量が１．０３〜１．０７ｇ／ｍｌフラクションに検出された（図８Ａ）。Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎらによる以前の報告（Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ，Ｔ．，Ｖ．Ｌｏｈｍａｎｎ，Ａ．Ｋａｕｌ，Ｎ．Ｋｒｉｅｇｅｒ，Ｇ．Ｒｉｎｃｋ，Ｇ．Ｒｕｔｔｅｒ，Ｄ．Ｓｔｒａｎｄ，ａｎｄ  Ｒ．Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ．２００２．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：４００８−４０２１）と一致して、サブゲノム・レプリコンで細胞から放出されたこれらのＲＮＡは、ウイルス小片と一致しなかった。等価な数のＲＣＹＭ１細胞が単層培養システムで培養されたとき、培養上澄み中にＨＣＶ−ＲＮＡおよびコア・タンパク質の限られた量が検出されたのみであった（図８ＡおよびＢ）。
成熟したＨＣＶウイルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ）は、ヌクレオカプシドと、脂質膜とウイルスエンベロープ・グリコプロテインとから構成される外側エンベロープとを有すると考えられている。培養流体は、脂質を可溶化するためにＮＰ４０で処理されて、次いでショ糖密度勾配遠心分離に供された。１．１８ｇ／ｍｌより、むしろ１．２２ｇ／ｍｌの密度）に集約されたＨＣＶ（図８Ｃ）は、ＨＣＶ粒子の密度が脱エンベロープ化（ｄｅ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｍｅｎｔ）によって、より高い密度にシフトしたことを示す。１．１８のｇ／ｍｌのフラクション（濃縮の後、ネガティブ染色法に供された）の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）は、３０−６０ｎｍの直径および５０ｎｍの主粒径を有する粒子構造を示した。同様の粒子類似の構造は、ＲＣＹＭ１−単層培養の同じ密度フラクションにおいて、またはＲＣＹＭ１−ＲＦＢ培養の１．０７ｇ／ｍｌフラクションにおいては観察されなかった。これらの結果は、ＲＦＢ系では、ＨＣＶ粒子の産生および分泌が、選択可能なｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃなＨＣＶゲノムで可能だったことを示す。
実施例６
熱可逆性ゲル化ポリマー（ＴＧＰ）を使用するＲＣＹＭ１細胞のスフェロイド培養からのＨＣＶ粒子の産生および分泌
実施例１、２と同様にしてＴＧＰに播種されたＲＣＹＭ１細胞は、３日の培養の後にスフェロイドを形成し、約１ｍｍの直径を有する多数のスフェロイドが培養の７−１０日後に観察された。８日間の培養の後、スフェロイドは固定されて、走査型電子顕微鏡（図９Ａおよび図９Ｂ（ａ１））、およびＴＥＭによる超薄切片よって調べられた（図１０Ａ（Ｂ）および図１０Ｂ（ｂ１））。
図９〜１１は、Ｈｕｈ−７とＲＣＹＭ１細胞が、ＴＧＰ中でスフェロイドを形成している態様の例を示す写真である。ＴＧＰ中で８日間培養されたＲＣＹＭ１細胞の走査型電子顕微鏡写真（図９Ａおよび図９Ｂ（ａ１））、および透過型電子顕微鏡写真（図１０Ａ（Ｂ）および図１０Ｂ（ｂ１））を示す。
黒矢印：絨毛様突起、白矢印：胆汁小管様構造。
図１１Ａ〜１１Ｆ（Ｃ−Ｈ）：ＴＧＰ培養（図１１Ａ〜Ｃ（Ｃ−Ｅ））および単層培養（図１１Ｄ〜１１Ｆ（Ｆ−Ｈ））されたＨｕｈ−７細胞におけるｃｏｎｎｅｘｉｎ３２の細胞内局在性。
図１１Ａ（Ｃ）および１１Ｄ（Ｆ）：ｃｏｎｎｅｘｉｎ３２の免疫染色
図１１Ｂ（Ｄ）および１１Ｅ（Ｇ）：位相差顕微鏡
図１１Ｃ（Ｅ）：１１Ａ（Ｃ）および１１Ｂ（Ｄ）のオーバーレイ
核は、ヨウ化プロピジウムで後染色で着色された。
よく発達した絨毛様突起（分極化する上皮の特徴）は、細胞表面で観察された（図９Ａおよび９Ｂ（ａ１））。細胞間のスペース中で、胆汁小管様の構造も観察され、それらはタイトな接合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）を介して接続されるように見えた（図１０Ａ（Ｂ）および１０Ｂ（ｂ１））。この細胞形態は、ＲＦＢ培養において観察されたものに類似しており（Ｇａｒｏｆｆ，Ｈ．，Ｒ．Ｈｅｗｓｏｎ，ａｎｄ  Ｄ．Ｊ．Ｏｐｓｔｅｌｔｅｎ．１９９８．Ｖｉｒｕｓ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｂｕｄｄｉｎｇ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１７１−１１９０．Ｇｒａｋｏｕｉ，Ａ．，Ｄ．Ｗ．ＭｃＣｏｕｒｔ，Ｃ．Ｗｙｃｈｏｗｓｋｉ，Ｓ．Ｍ．Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ，ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｒｉｃｅ．１９９３．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２８３２−２８４３）、成熟した肝臓組織の特徴と良く相関していた。免疫染色により細胞間のギャップ結合の形成において重要な役割を果たすｃｏｎｎｅｘｉｎ３２の観察により、ＴＧＰ培養における細胞接着の表面でｃｏｎｎｅｘｉｎ３２が局所化され（図１１Ａ〜１１Ｃ（Ｃ−Ｅ））、他方、単層培養組織においては、それが細胞質の中に主に分配されることが判明した（図１１Ｄ〜１１Ｆ（Ｆ−Ｈ））。これは、Ｈｕｈ−７細胞が３Ｄ培養系において細胞極性を得たことを示す。
Ｈｕｈ−７細胞中のＨＣＶレプリコンの複製が、ホスト細胞成長に依存することが知られている。ここでは、ＴＧＰ培養系におけるＲＣＹＭ１細胞の成長が、単層培養組織（図１２Ａ）の中の細胞のそれより、有意に（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ）遅いことが見出された。したがって、ＨＣＶタンパク質（図１２Ｂ）の発現と、ＲＣＹＭ１スフェロイドにおけるウイルスＲＮＡコピー数は、単層細胞で観察されるそれらと比較して、見かけ上（ａｐｐｒｅｎｔｌｙ）より低かった。培養上澄みのショ糖密度勾配分析からの結果は、１．１５−１．２０ｇ／ｍｌの密度におけるＨＣＶ−ＲＮＡおよびコア・タンパク質の共沈殿（ｃｏ−ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、および１８ｇ／ｍｌにおけるピークを示した（図１２Ｃ（Ｃ）および１２Ｄ（Ｄ））。この分布は、ＲＦＢ培養において得られたパターンと一致した（図８ＡおよびＢ）。細胞のより遅い成長のため、単層培養と比較して、これらの実験では、より少ない細胞数が３Ｄ培養において使用された点に留意する必要がある。
図１２〜１３は、ＴＧＰ培養におけるＲＣＹＭ１細胞中のＨＣＶタンパク質の発現と、ウィルス分子の分泌を示す図である。
図１２Ａ：ＲＣＹＭ１細胞のＴＧＰ培養（黒円）と単層（白円）の細胞増殖カーブである。細胞は、接種後の０日、３日、６日および９日に採取され、細胞数が決定された。
図１２Ｂ：ＲＣＹＭ１細胞およびコントロールＨｕｈ−７細胞におけるＨＣＶコアとＮＳ５Ａタンパク質のウェスタンブロッティングである。
図１２Ｃおよび１２Ｄ：ＲＣＹＭ１細胞の培養上澄みのショ糖密度勾配分析である。個々のフラクション中のＨＣＶコア・タンパク質（Ｃ）およびウィルスＲＮＡ（Ｄ）は、それぞれ、ＥＬＩＳＡとリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定された。３つの独立した実験からの代表的なデータが示されている。黒円：ＴＧＰ培養のＨＣＶ−ＲＮＡ、白円：単層培養のＨＣＶ−ＲＮＡ；黒三角：ＴＧＰ培養のＨＣＶコア・タンパク質、白三角：単層培養のコア・タンパク質。
図１３Ａ〜１３Ｄ（Ｅ−Ｈ）：ＴＧＰ培養されたＲＣＹＭ１細胞の上澄み中のＨＣＶ粒子の電子顕微鏡写真。
図１３Ａ（Ｅ）：１．１８ｇ／ｍｌ密度フラクションにおけるＨＣＶ粒子のネガティブ染色
図１３Ｄ（Ｈ）に示されるように、球状構造は１．０５ｇ／ｍｌ密度フラクション中に無かった。
図１３Ｂ（Ｆ）：ＨＣＶ粒子の超薄切片。沈殿ＨＣＶ粒子サンプルは、１．１８ｇ／ｍｌフラクションから調製された。
図１３Ｃ（Ｇ）：１．１８ｇ／ｍｌ密度フラクションにおける抗Ｅ２抗体によるＨＣＶ粒子の免疫金ラベリング。金粒子；５ｎｍ、Ｂａｒｓ、５０ｎｍ。
ネガティブ染色法の後の１．１８のｇ／ｍｌのフラクションのＴＥＭ分析は、５０−６０ｎｍの直径およびスパイク様の突起（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ）を有する粒子構造を示した（図１３Ａ（Ｅ））。超薄切片の観察は、約５ｎｍの幅を有する脂質バイレイヤー様の膜構造を示した（図１３Ｂ（Ｆ））。抗Ｅ２抗体を使用した免疫電子顕微鏡観察は、粒子表面におけるＨＣＶエンベロープ・タンパク質を明らかにした（図１３Ｃ（Ｇ））。上澄みの１．０３−１．０５ｇ／ｍｌフラクションにおいてＨＣＶ−ＲＮＡの相当な量が検出された（図１２Ａ）が、これらのフラクションにおいて、ウイルス様の粒子構造は観察されなかった（図１３Ｄ（Ｈ））。これらの結果は、上記で示したＲＦＢ系からの結果に一致した。このように、ウイルス粒子構造における３Ｄ細胞培養系の有効性は、ヒト肝臓由来の細胞を用いるＴＧＰ培養系およびＲＦＢ系において示された。
実施例７
ＲＣＹＭ１細胞のＴＧＰ培養されたスフェロイドにおけるＨＣＶ粒子の超構造（ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ）局在化
次いで、ＥＭ分析超薄切片によって、超構造レベルにおけるＲＣＹＭ１−ＴＧＰ培養において生じたＨＣＶ粒子の細胞内局在化を決定した。短い表面上の突起（直径５０−６０ｎｍ）を有する、膜様の構造を有する球状粒子は、ＥＲの幅広の嚢（図１４Ｂ）におけると同様に、主にＥＲ膜（図１４Ａ）で観察された。
図１４は、ＴＧＰ中で増殖されたＲＣＹＭ１細胞の超薄切片の電子顕微鏡写真である。ＴＧＰ培養されたＲＣＹＭ１細胞中のＨＣＶ粒子。５０−６０ｎｍの直径を有する球状ウイルス様の粒子（矢印）は、ＥＲ膜（図１４ＡおよびＢ）、および細胞質の小嚢において観察された。
小嚢において、これらのウイルス様の粒子は、しばしばアモルファス材料を伴った。以前、清水らは、ＨＣＶに感染したヒトＢ細胞において、形態およびサイズにおいて類似するウイルス様の粒子が観察されたことを報告した（Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｙ．Ｋ．，Ｓ．Ｍ．Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ，Ｍ．Ｋｏｈａｒａ，Ｒ．Ｈ．Ｐｕｒ細胞，ａｎｄ  Ｈ．Ｙｏｓｈｉｋｕｒａ．１９９６．Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃｖｉｒｕｓ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａ細胞ｕｌａｒ  ｖｉｒｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２３：２０５−２０９）。同様の粒子類似の構造は、単層培養におけるＲＣＹＭ１細胞において、またはＴＧＰ培養におけるサブゲノム・レプリコン５−１５細胞においては観察されなかった。
この実験において従来のＴＥＭを使用して観察されたウイルス様の粒子がＨＣＶ粒子であったか否か決定するために、抗コア抗体および抗Ｅ１抗体を用いて免疫電子顕微鏡分析が行われた。ダブルラベリング実験は、ＥＲ膜と協働するウイルス様の粒子が、両方のＨＣＶタンパク質に対して免疫反応性を示し、そして、Ｅ１タンパク質がコア・タンパク質を囲んでいることを示した（図１５Ａ）。本発明者らの知見によれば、ＨＣＶ粒子形成において、ウイルスエンベロープ・タンパク質がコア・タンパク質を囲んでいることを明らかに示す最初の報告である。陰性コントロールとして、サブゲノムＲＮＡを含有する５−１５細胞から調製された薄片はこれらの抗体で染色され、且つ、それらは免疫染色におけるバックグラウンドの無視し得るレベルを示した。
顕微鏡写真の低解像度およびコントラストのため、免疫金電子顕微鏡を用いて細胞内微細構造を視覚化し、抗原性タンパク質局在化を行うことは、一般に難しい。この困難を克服するために、この実験においては、銀増感された免疫金ラベリング法が適用された（図１５Ｂおよび１５Ｃ）。この方法を使用することにより、約２０ｎｍの抗原反応性の免疫金粒子が観察された。
図１５は、ＴＧＰ培養されたＲＣＹＭ１細胞の超薄切片の免疫電子顕微鏡写真である。  図１５Ａ（Ａ）：抗Ｅ１と抗コア・モノクローナル抗体でダブル免疫染色された。コア・タンパク質−特異的な金粒子（１０ｎｍの直径）と、Ｅ１タンパク質−特異的な金粒子（５ｎｍの直径）は、ＥＲ膜の表面でロゼットを形成した。
図１５Ｂ（Ｂ）および１５Ｃ（Ｃ））：抗コア（Ｂ）と抗Ｅ１（Ｃ）抗体による銀増感された免疫金。１．４ｎｍ直径の金粒子とコンジュゲートされた第二の抗体が適用され、次いで銀増感試薬によって粒子が拡大された。矢印は、ウイルス様の粒子が抗コアおよび抗Ｅ１抗体と反応することを示す。
コアおよびＥ１タンパク質の特異的免疫ラベリングは、ＥＲ内、ＥＲ膜上で主に検出された。細胞質の小嚢中、およびＥＲ膜上に観察されたウイルス様の粒子上で、強い免疫陽性反応が検出された。第１抗体として正常マウス血清が使用されたとき、このような免疫ラベリングは観察されなかった。これらの結果は、従来のＴＥＭの超構造観察を確認し、且つＨＣＶ粒子の形成が、ＥＲ膜における推定のコア粒子のバディング（ｂｕｄｄｉｎｇ）によって達成されることを示唆する。
実施例８
ＨＣＶ粒子の伝染力のＥ２グリコプロテインへの依存性
ＴＧＰ系で培養されたＲＣＹＭ１細胞から放出されるＨＣＶ粒子が伝染性であるか否か決定するために、ナイーブなＨｕｈ−７．５．１細胞（ＨＣＶ−陰性のＨｕｈ−７．５（７）に由来する細胞である）が、ＲＣＹＭ１スフェロイドの培養上澄みを接種され、接種の４日後に、ＮＳ５Ａタンパク質について、免疫蛍光染色法によって分析された（図１６Ａ）。
図１６は、ＴＧＰ培養されたＲＣＹＭ１細胞から分泌されたＨＣＶ粒子の感染性、および該感染性の中和を示す図である。
図１６Ａ（Ａ）：ＨＣＶ粒子（上パネル：ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（＋））で感染された、または感染無し（下パネル：ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（−））のＨｕｈ７．５．１細胞が４日間培養され、次いで、抗ＮＳ５Ａ抗体で免疫染色された。核は、ＤＡＰＩで後染色で着色された。
図１６Ｂ（Ｂ）：抗Ｅ２抗体（ＡＰ３３）、ＮＯＢ抗体、または抗ＦＬＡＧ抗体後処理されたＨｕｈ７．５．１細胞は、ＨＣＶ粒子で感染され、４日間インキュベートされた。細胞中のＨＣＶ−ＲＮＡは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定された。三つ組のサンプルにおける平均値が、標準偏差とともに示されている。
約１％のＨｕｈ−７．５．１細胞が、ＮＳ５Ａ陽性であることが観察された。これに対して、ＴＧＰで培養された５−１５細胞から得られた細胞上澄みサンプルを用いて、Ｈｕｈ−７．５．１細胞を接種した際には、ＮＳ５Ａ−陽性細胞は検出されなかった。ウイルスエンベロープ・タンパク質がＨＣＶ粒子による感染を媒介するか否かを更に決定するために、抗Ｅ２抗体、ＮＯＢ抗体の高い力価（１／３５００−１／４０００）を有する患者血清（Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．，Ｄ．Ｒｏｓａ，Ｙ．Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．Ｋａｔａｙａｍａ，Ｈ．Ｈａｒａｄａ，Ｃ．Ｗｙａｔｔ，Ｋ．Ｋｉｙｏｓａｗａ，Ｈ．Ａｉｚａｋｉ，Ｙ．Ｍａｔｓｕｕｒａ，Ｍ．Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｓ．Ａｂｒｉｇｎａｎｉ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍｉｙａｍｕｒａ．１９９８．Ｈｉｇｈ  ｔｉｔｅｒｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｅｎｖｅｌｏｐｅ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ細胞ｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｎａｔｕｒａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２８：１１１７−１１２０）、または抗ＦＬＡＧ抗体（図１６Ｂ）で、ＨＣＶ粒子がプレ・インキュベートされた。細胞内ＨＣＶ−ＲＮＡレベルは、抗Ｅ２抗体、ＮＯＢ３、およびＮＯＢ４の存在下で、それぞれ４３％、２８％および２６％と減少した。感染細胞中のウイルスＲＮＡの減少は、抗ＦＬＡＧ抗体による処理の後で、観察されなかった。上記を総合すると、これらの結果は、ＴＧＰで培養されたＲＣＹＭ１細胞によって生じたＨＣＶ粒子は伝染性であり、ウイルスエンベロープタンパク質が、Ｈｕｈ−７．５．１細胞の感染で重要な役割を果たすことを強く示唆する。
実施例９
ＨＣＶ産生のためのＴＧＰ培養系の潜在的使用法と抗ウイルス剤の評価
Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈらは、ＨＣＶ遺伝子型２ａクローンの完全な複製をサポートする細胞培養系が、抗ウイルス薬の評価に有用であると最近報告した（Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ，Ｂ．Ｄ．，Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ，Ａ．Ｊ．Ｓｙｄｅｒ，Ｂ．Ｗｏｌｋ，Ｔ．Ｌ．Ｔｅｌｌｉｎｇｈｕｉｓｅｎ，Ｃ．Ｃ．Ｌｉｕ，Ｔ．Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｒ．Ｏ．Ｈｙｎｅｓ，Ｄ．Ｒ．Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊ．Ａ．ＭｃＫｅａｔｉｎｇ，ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｒｉｃｅ．２００５．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ細胞ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３０９：６２３−６２６）。しかしながら、現在まで、この完全なＨＣＶ培養系を、最もしばしばＣ型肝炎患者に検出され、且つ治療することが最も難しいものであるところの、遺伝子型１まで拡張されていない。
ここでは、抗ＨＣＶ薬を評価するための、ＲＣＹＭ１細胞のＴＧＰ培養の潜在的有用性を示す（図１７）。
図１７は、ＩＦＮおよびＲＢＶによるＨＣＶ粒子産生の阻害を示す図である。ＴＧＰ培養されたＲＣＹＭ１細胞は、１００ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ−α、または１００μｍのＲＢＶで処理され、次いで細胞中のＨＣＶ−ＲＮＡ（図１７Ａ）、および培地（図１７Ｂ）中のＨＣＶ−ＲＮＡが決定された。個々のサンプルからの培地は、ショ糖勾配遠心分離によって分別され、ＨＣＶ粒子陽性（１．１８ｇ／ｍｌ）および陰性（１．０４ｇ／ｍｌ）フラクションが分析された。三つ組のサンプルにおける平均値および標準偏差が示されている。黒バー：処理無しコントロール、シェードバー：ＩＦＮ−α、白バー；ＲＢＶ．
ＴＧＰ培養されたＲＣＹＭ１細胞スフェロイドにおける細胞内ＨＣＶ−ＲＮＡレベルは、１００ＩＵ／ｍｌのＩＦＮ−αで培養の３日後で、９０％までに低減された（図１７Ｂ）。同様に、１．１８ｇ／ｍｌ上澄みフラクションのＨＣＶ−ＲＮＡコピー数を使って計算された細胞外ＨＣＶ粒子濃度は、ＩＦＮ−α治療によって、８９％になった（図１７Ａ）。更に、ＨＣＶ粒子の産生は、１００μＭのＲＢＶによる治療によって、細胞内ＨＣＶ−ＲＮＡとして、同じ程度（８５％）に阻害された（図１７Ａ）。非処理群の培養上澄みの１．０４ｇ／ｍｌフラクションにおいて検出されたＨＣＶ−ＲＮＡのレベルは１．１８ｇ／ｍｌフラクション中のそれの約１４分の１であり、このレベルは、ＩＦＮ−αまたはＲＢＶの添加で増加した（図１７Ａ）。この増加の基礎をなすメカニズムは知られていないが、ＴＧＰ−ＲＣＹＭ１培養を用いて高度に細胞毒性の薬剤が評価された際に、同様の現象が観察された。したがって、ＩＦＮおよびＲＢＶの緩和な細胞毒効果に起因する細胞死の結果として、ＨＣＶ−ＲＮＡと協働するいくつかの細胞タンパク質が、培養上澄みに放出される可能性がある。
上記を総括すれば、これらの結果は、ＴＧＰ培養に基づくＨＣＶ産生モデルが、ＨＣＶ粒子産生および抗ＨＣＶ薬の阻害作用を評価するために有用であることを証明する。
［配列表］
0004799545.tif 000002
0004799545.tif 000003
【図１Ａ】
0004799545.tif 000004
【図１Ｂ】
0004799545.tif 000005
【図１Ｃ】
0004799545.tif 000006
【図２】
0004799545.tif 000007
【図３】
0004799545.tif 000008
【図４】
0004799545.tif 000009
【図５】
0004799545.tif 000010
【図６Ａ】
0004799545.tif 000011
【図６Ｂ】
0004799545.tif 000012
【図７Ａ】
0004799545.tif 000013
【図７Ｂ】
0004799545.tif 000014
【図８Ａ】
0004799545.tif 000015
【図８Ｂ】
0004799545.tif 000016
【図８Ｃ】
0004799545.tif 000017
【図９Ａ】
0004799545.tif 000018
【図９Ｂ】
0004799545.tif 000019
【図１０Ａ】
0004799545.tif 000020
【図１０Ｂ】
0004799545.tif 000021
【図１１Ａ】
0004799545.tif 000022
【図１１Ｂ】
0004799545.tif 000023
【図１１Ｃ】
0004799545.tif 000024
【図１１Ｄ】
0004799545.tif 000025
【図１１Ｅ】
0004799545.tif 000026
【図１１Ｆ】
0004799545.tif 000027
【図１２Ａ】
0004799545.tif 000028
【図１２Ｂ】
0004799545.tif 000029
【図１２Ｃ】
0004799545.tif 000030
【図１２Ｄ】
0004799545.tif 000031
【図１３Ａ】
0004799545.tif 000032
【図１３Ｂ】
0004799545.tif 000033
【図１３Ｃ】
0004799545.tif 000034
【図１３Ｄ】
0004799545.tif 000035
【図１４Ａ】
0004799545.tif 000036
【図１４Ｂ】
0004799545.tif 000037
【図１４Ｃ】
0004799545.tif 000038
【図１５Ａ】
0004799545.tif 000039
【図１５Ｂ】
0004799545.tif 000040
【図１５Ｃ】
0004799545.tif 000041
【図１６Ａ】
0004799545.tif 000042
【図１６Ｂ】
0004799545.tif 000043
【図１７Ａ】
0004799545.tif 000044
【図１７Ｂ】
0004799545.tif 000045