(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ステロイド骨格を有する界面活性剤、（ｂ）長鎖脂肪族基を有する硫酸塩又はスルホン酸塩、（ｃ）発色剤、及び（ｄ）栄養成分を含有する培地組成物を、繊維質吸水性シートに担持又は積層させたことを特徴とする大腸菌群用簡易培地。
【請求項２】
成分（ａ）が、コール酸塩、デオキシコール酸塩、タウロコール酸塩、胆汁末、胆汁酸塩、タウロデオキシコール酸塩、アポコール酸塩、グリココール酸塩、グリコデオキシコール酸塩、タウロケノデオキシコール酸塩、タウロデヒドロコール酸塩、タウロリソコール酸塩、及びタウロウルソデオキシコール酸塩から選ばれるものである請求項１記載の簡易培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、接種した際の被検液及び被検液中の微生物の拡散が極めて良好な大腸菌群用簡易培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物の培養方法として、従来一般に行われていた平板塗抹法、混釈法、液体培地法等に代わり、近年、手軽に培養できる簡易培地についての多くの研究がなされている。例えば、（１）防水性基体の上面部に、接着剤層、栄養成分を含む冷水可溶性ゲル化剤粉末層及びカバーシートを順次積層した培養装置（特開昭57-502200号公報）、（２）防水性平板の表面に、冷水可溶性ゲル化剤と微生物培養基の混合物層及び繊維質吸水性シートを順次積層した培養装置（特開平6-181741号公報）、（３）接着剤、ゲル化剤及び菌体栄養成分を含有する培地組成物を、該ゲル化剤の粒径より大きいメッシュを有する繊維状吸水性シートに担持させてなる簡易培地（特開平9-19282号公報）等が報告されている。
【０００３】
しかしながら、このようなシートを用いた簡易培地において、大腸菌群用培地を用いた場合には、培地成分がシート中に固着して、毛細管現象による自動拡散が阻害されるため、接種した被検液及び被検液中の微生物の拡散が悪くなり、発育したコロニーが培地中の一部分に偏り、菌数が計測しにくくなるという問題があった。
【０００４】
また、培地成分には、測定する微生物に対する選択物質が用いられている。例えば、大腸菌群用の培地成分には、選択物質として、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム等の界面活性剤が用いられている。しかしながら、前記のような簡易培地の場合、用いる選択物質によっては、選択性能が弱くなったり、毛細管現象が悪くなるなどの問題があった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、接種した際の被検液及び被検液中の微生物の拡散が極めて良好な簡易培地を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
かかる実情において、本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、特定の２種の界面活性剤を組合わせて用いれば、大腸菌群の選択性能に優れるとともに、毛細管現象も良好で、接種した際の被検液及び被検液中の微生物の拡散が極めて良好な簡易培地が得られることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
すなわち本発明は、（ａ）ステロイド骨格を有する界面活性剤、（ｂ）長鎖脂肪族基を有する硫酸塩又はスルホン酸塩、（ｃ）発色剤、及び（ｄ）栄養成分を含有する培地組成物を、繊維質吸水性シートに担持又は積層させたことを特徴とする大腸菌群用簡易培地を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明において、培地組成物を構成する（ａ）成分のステロイド骨格を有する界面活性剤としては、例えばコール酸塩、デオキシコール酸塩、タウロコール酸塩、胆汁末、胆汁酸塩、タウロデオキシコール酸塩、アポコール酸塩、グリココール酸塩、グリコデオキシコール酸塩、タウロケノデオキシコール酸塩、タウロデヒドロコール酸塩、タウロリソコール酸塩、タウロウルソデオキシコール酸塩等が挙げられ、これらの塩としては、ナトリウムが好ましい。特に、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムが好ましい。
【０００９】
（ｂ）成分の長鎖脂肪族基を有する硫酸塩又はスルホン酸塩としては、炭素数８〜１７の直鎖アルキル基を有するものが好ましく、例えばｎ−ラウリル硫酸ナトリウム、ｎ−テトラデシル硫酸ナトリウム、ｎ−ラウリルスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。特に、ｎ−ラウリル硫酸ナトリウムが好ましい。
【００１０】
（ｃ）成分の発色剤としては、大腸菌群用培地に通常用いられる発色酵素基質で、β−ガラクトシダーゼの基質となる色原体化合物であれば特に制限されないが、例えば５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Magenta-Gal）、５−ブロモ−３−インドリル−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−クロロ−３−インドリル−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−フルオロ−３−インドリル−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、３−インドリル−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ヨード−３−インドリル−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、Ｎ−メチルインドリル−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等が挙げられる。
また、ニュートラルレッド、フェノールレッド、クリスタルバイオレット等の色素を用いることもできる。
【００１１】
（ｄ）成分の栄養成分としては、大腸菌群の生育に適したもので、例えばペプトン、酵母エキス、塩化ナトリウム、硝酸カリウム、ピルビン酸ナトリウム、トリプトファン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、Ｎ−２−アセトアミド−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−アミノエタンスルホン酸等が挙げられる。
【００１２】
また、本発明で用いる繊維質吸水性シートは、接種された被検液が毛細管現象により容易に拡散することが必要であり、例えばレーヨン不織布に代表される合成繊維不織布、コットン不織布に代表される天然繊維不織布等が挙げられる。これらのシートの形状は特に制限されず、正方形、長方形、円形等の何れであってもよい。またその大きさも特に制限されないが、微生物の簡易検出用の場合には長径１〜15cmのものが好ましい。
また、網目の大きさが15〜100メッシュ、特に20〜50メッシュで、厚さが10〜1000μm、特に50〜600μmのものが好ましい。
【００１３】
このような繊維質吸水性シートは防水性平板に載置されているのが好ましく、かかる防水性平板としては、プラスチック、ガラス等の防水性の材質のものであれば何れでもかまわないが、外部からの観察のため透明のものが好ましい。
【００１４】
本発明の簡易培地は、前記成分（ａ）〜（ｄ）を含有する培地成分を、繊維状吸水性シートに担持又は積層することにより製造される。
例えば、前記成分（ａ）〜（ｄ）、並びに（ｅ）水及びアルコールに可溶な接着剤及び（ｆ）水に可溶でアルコールに不溶なゲル化剤を含有する培地成分を、該ゲル化剤より大きいメッシュを有する繊維状吸水性シートに担持させることにより製造することができる。
【００１５】
ここで用いられる（ｅ）成分の接着剤としては、水及びアルコールに可溶なものであることが必要であり、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレンオキサイド等が挙げられ、特にヒドロキシプロピルセルロースが好ましい。
【００１６】
（ｆ）成分のゲル化剤としては、水に可溶でアルコールに不溶であることが必要で、例えばキサンタンガム、ローカストビーンガム、グアーガム、カラギーナン等の天然ゲル化剤、ヒドロキシエチルセルロース等の合成ゲル化物質が挙げられ、特にキサンタンガムが好ましい。かかるゲル化剤は、平均粒径500μm以下、特に0.5〜50μmの粉体を使用するのが好ましい。
【００１７】
具体的には、まず、（ａ）〜（ｆ）の培地成分をアルコールに添加してアルコール懸濁液を調製する。アルコールとしては、例えばエタノール、２−プロパノール等が挙げられる。また、この際、成分（ａ）の濃度は0.001〜1.0重量％、特に0.05〜0.15重量％；成分（ｂ）の濃度は0.001〜1.0重量％、特に0.01〜0.05重量％；成分（ｃ）の濃度は0.01〜10重量％、特に0.05〜0.5重量％；成分（ｄ）の濃度は0.5〜20重量％、特に１〜５重量％になるようにするのが好ましい。
さらに、成分（ｅ）の濃度は、0.01〜0.4重量％、特に0.01〜0.15重量％とするのが好ましく、成分（ｆ）の濃度は0.1〜20重量％、特に２〜６重量％になるようにするのが好ましい。
【００１８】
次いで、このアルコール懸濁液を、防水性平板上に載置した繊維質吸水性シートに注下、噴霧、塗布等によって含浸させる。含浸させるアルコール懸濁液は、上記濃度のものをシート１cm3当り0.5〜２mLとするのが好ましい。その後乾燥してアルコールを蒸発除去することにより、培地成分が担持された繊維質吸水性シートが防水性平板に積層固着されるが、この乾燥に際しては、アルコールの急速な蒸発を抑制しつつ行うのが好ましい。このようにアルコールの急速な蒸発を抑制しつつ乾燥を行うための手段としては特に限定されるものではないが、例えばアルコールの蒸気圧の高い雰囲気中で乾燥を行う、低温で乾燥を行う等の方法が挙げられる。
【００１９】
また、本発明の簡易培地は、例えば前記成分（ａ）〜（ｄ）、並びに（ｅ）水及びアルコールに可溶な接着剤及び（ｆ）水に可溶でアルコールに不溶なゲル化剤を含有する培地成分を、防水性平板の表面の少なくとも一部に被覆し、その被覆表面の少なくとも一部に繊維状吸水性シートを積層させることによっても製造することができる。
すなわち、まず、前記と同様に培地組成物を調製し、これを防水性平板に均一に塗沫した後、乾燥して被覆を形成し、次いで、この被覆表面に繊維状吸水性シートを積層することにより、本発明の簡易培地を得ることができる。
【００２０】
本発明の簡易培地は、汚染及び乾燥を防止するために、その表面をフィルムで覆うか、容器に収納するのが好ましく、特に、防水性平板として容器一体型の防水性容器を用い、これに培地成分を担持させた繊維質吸水性シートを積層固着させるのが好ましい。
【００２１】
このようにして製造された本発明の簡易培地は、エチレンオキサイドガス、γ線、電子線等によって滅菌するのが好ましい。好ましい滅菌方法としては、アルミ包材等、ガスバリヤー性と遮光性を兼ね備えた包材で包装した後、γ線、電子線等の放射線照射を行う方法が挙げられ、特にこの包装の際に簡易培地と共に乾燥剤を封入しておくことが最も好ましい。このような方法で滅菌処理を行うことにより、簡易培地の製造の全行程を無菌状態に管理する必要がなくなり、かつ滅菌後の微生物の混入や光及び湿気による培地の経時変化を抑制することが可能となる。
【００２２】
本発明の簡易培地を用いて微生物を検出するには、当該培地表面に被検液を接種する。そうすると、被検液がメッシュ間の立体的な空洞部の毛細管現象によって容易に拡散し、それに続いて膨潤ゲル化が起こって、被検液中の微生物は捕捉され、自由移動が抑制され、培養によってコロニーが形成される。従って、培地形成面を観察すれば、形成したコロニーが容易に観察できる。試料を定量的に簡易培地へ接種すれば、培養後出現したコロニーを計測することにより、容易に菌数を算定することができる。
【００２３】
なお、菌体液の接種は通常ピペット等により一定量を接種する方法が採用されるが、水分の多い個体へスタンプする方法や試料液へ浸す方法でもよい。また、被検液接種後の培養は、静置して行っても、また輸送期間中に行ってもよい。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２５】
実施例１
（１）培地の作製：
ペプトン15ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、胆汁酸ナトリウム１ｇ、発色酵素基質（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド）0.1ｇ、及びキサンタンガム30ｇを、ヒドロキシプロピルセルロース（HPC）１ｇ及び0.001〜0.1重量％のｎ−ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含有するエタノール溶液1000mLに加え、懸濁液とした。このエタノール懸濁液を１mLずつ繊維質吸水性シート（50φmm）を収納した容器（50φmm）に分注した後、これらが重ならないように、非開放空間内で一夜静置して乾燥した後、蓋をして本発明の簡易培地を作製した。本培地を乾燥剤と共にアルミ包材に密封包装した後、表面線量10〜20kGyのγ線照射を行って滅菌した。
【００２６】
（２）菌株の供試：
供試菌株をトリプトソイブイヨンで24時間前培養したものを、生理食塩水で105〜107倍に希釈して用いた。
【００２７】
比較例１
実施例１において、培地成分として胆汁酸ナトリウムを用いず、0.05〜0.2重量％のｎ−ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いる以外は同様にして、培地を作製した。
【００２８】
試験例１
実施例１及び比較例１で得られた各ＳＤＳ濃度の簡易培地に、各希釈倍率の菌液１mLを接種し、37℃で24時間培養した後、発色及び菌（コロニー）の偏りを目視観察し、拡散不良の有無を評価した。結果を表１及び表２に示す。なお、表１及び表２中、「＋」は菌数が300以上であることを示し、「−」は発育が抑制され、菌が全く生えていないことを示し、「ｗ」は微小コロニーとしてわずかに発育していることを示す。
【００２９】
【表１】
0004666825.tif 000002
【００３０】
【表２】
0004666825.tif 000003
【００３１】
表１及び表２の結果より、胆汁酸塩とＳＤＳを含有する本発明の簡易培地は、いずれも菌液の拡散が良好で、培養後の発色ムラもなかった。また、グラム陽性菌で大腸菌群ではないBacillus subtilis 及び Staphylococcus aureus は、発育が認められず、大腸菌群の選択性能にも優れていた。
これに対し、ＳＤＳを含有せず胆汁酸ナトリウムのみを含有する培地では、拡散不良が起こった。また、胆汁酸ナトリウムを含有せずＳＤＳのみを含有する培地では、拡散不良は生じなかったが、大腸菌群の選択性能が十分ではなかった。
【００３２】
試験例２
実施例１で得られた各ＳＤＳ濃度の簡易培地の中心部に、精製水を１mL接種し、全面に拡散するまでの時間（秒）を測定した。各濃度の簡易培地について、それぞれ４回行なった結果を表３に示す。なお、表３中、精製水が全面に拡散するが、拡散速度が遅いものは「拡散不良なし」として示した。
【００３３】
【表３】
0004666825.tif 000004
【００３４】
表３の結果より、本発明の簡易培地は、精製水の拡散が良好であった。
【００３５】
試験例３
実施例１で得られた本発明の簡易培地について、ＳＤＳを含有しない簡易培地との比較において、大腸菌群の選択性、コロニーの色調及び発育菌数への影響を調べた。結果を表４〜７に示す。なお、培養条件は試験例１と同様である。
【００３６】
【表４】
0004666825.tif 000005
【００３７】
【表５】
0004666825.tif 000006
【００３８】
【表６】
0004666825.tif 000007
【００３９】
【表７】
0004666825.tif 000008
【００４０】
表４〜７の結果より、本発明の簡易培地は、ＳＤＳを含有していても、これにより、大腸菌群の選択性、コロニーの色調及び発育菌数への影響がないことが確認された。
【００４１】
【発明の効果】
本発明の簡易培地は、大腸菌群の選択性能に優れるとともに、毛細管現象も良好で、接種した際の被検液及び被検液中の微生物の拡散が極めて良好である。