(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルタミン酸含有蛋白素材を水系下に加水分解したもの、及び／又はグルタミン酸含有ア
ミノ酸混合物を、グルタミン酸を５重量％含む培地において３０℃で２日間培養したとき、
グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が７０％以上のγ−アミノ酪酸産生能を有す
るラクトバシルス・カルバタス ＫＭ１４株（寄託番号：FERM P-20497）を用いて発酵する
ことを特徴とするγ−アミノ酪酸豊富な食品の製造法。
【請求項２】
グルタミン酸を５ 重量％ 含む培地において３０℃で２日間培養したときの、グルタミン
酸からγ−アミノ酪酸への変換率が７０％以上であるγ−アミノ酪酸産生菌ラクトバシル
ス・カルバタス ＫＭ１４株（寄託番号：FERM P-20497）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、γ−アミノ酪酸（以下、「GABA」とも云う。）豊富な食品の製造法、及びこれに用いる新規GABA生産乳酸菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
GABAは自然界に広く存在しているアミノ酸であり、血圧降下作用、精神安定作用などの生理機能がある。GABAはグルタミン酸が生物の内在酵素であるグルタミン酸デカルボキシラーゼによって脱炭酸されて生成される。このような反応を利用して生産を高含有させた食品として茶（非特許文献１）、発芽米（特許文献１）、魚醤油などが知られている。また、グルタミン酸を乳酸菌、酵母や麹菌などで変換させたものがある。これらはすべて精製グルタミン酸を添加して製造されたものである。
そして一般に、グルタミン酸もしくはその塩をGABA生成菌や特許文献２に記載のような米糠の酵素や酵母の補酵素を使用し、GABAに変換される。
しかし上記の報告では精製グルタミン酸を原料としてGABAを生産しているに過ぎない。製造コストを考慮すると、精製グルタミン酸を使用しなくとも、高蛋白含有物を分解してGABAを生成させ、一貫して効率よくGABAの豊富な食品を製造する技術が望まれている。
【０００３】
GABAを生成する微生物としては、グルタミン酸デカルボキシラーゼ生産能を有する麹菌（特許文献３）、純白種麹（寄託番号：FERM P-19411）（特許文献４）、テンペ菌（特許文献５）、酵母、乳酸菌などが知られている。
【０００４】
これらの内、乳酸菌に関しては、ラクトバチルス・ブレビス（特許文献６）の他、特許文献７に、GABA高生産能を有する乳酸菌として、ラクトバチルス・ブレビス TY414(寄託番号：FERM P-16910)、ラクトバチルス・デルブルッキィ・ブルガリカス TY393（寄託番号：FERM P-17126）、ラクトバチルス・デルブルッキィ・ブルガリカス IFO13953、ラクトバチルス・ブレビス IFO12005などが開示されている。
また、特許文献８には、キムチから単離されたラクトバチルス・ヒルガルディー K-3株（寄託番号：FERM P-18422）およびそれを使用した食品の製造方法が開示されている。
【０００５】
このようにGABA生成菌を用いてGABAを含む食品を製造する方法が種々知られている。
これらのうちで、オカラを用いるものとしては、特許文献９に、オカラを酵素などで分解した可溶化液、構成アミノ酸としてグルタミン酸を含む蛋白質などからなる培地にGABA生産菌を培養し、GABAを生成させ、これを含む食品素材が開示されている。このGABA生産菌として乳酸菌、酵母、菌、枯草菌(納豆菌）、放射菌、糸状菌、担子菌、連鎖球菌、粘菌類、光合成菌、芽胞菌、藻類(クロレラ）などが列挙されているが、乳酸菌は具体的には実施例においてラクトバチルス・ブレビス IFO12005を開示しているだけである。
また、特許文献１０に、オカラに糖類を加えて乳酸発酵して飲料を製造する方法を開示している。しかし、オカラを酵素分解するわけでもなく、乳酸菌もラクトバシルス・アシドフイルスなど公知の菌を用いており、GABAに関する記載も見られない。
【０００６】
（参考文献）
【特許文献１】特開２０００−３２９２３号公報
【特許文献２】特開２００３−２４５０９３号公報
【特許文献３】特開２００４−１５９６１２号公報
【特許文献４】特開２００５−１３２０５号公報
【特許文献５】ＷＯ０１／０９３６９６号公報
【特許文献６】特開２００３−１８０３８９号公報
【特許文献７】特開２０００−２１００７５号公報
【特許文献８】特開２００３−７０４６２号公報
【特許文献９】特開２００４−３５７６１１号公報
【特許文献１０】特公平３−３７９０４号公報
【非特許文献１】T.Tsushida and T. Murai, Agri.Biol.Chem, 51, 2865-2871 (1987)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明はグルタミン酸のみならずこれを構成アミノ酸として含む蛋白質原材料からGABA豊富な食品を製造することを目的とした。また、本発明は新規GABA生産乳酸菌を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は先ず、グルタミン酸存在下において、効率よくGABAを生産する微生物の分離を行った。そして、食品及び自然界からGABA生産乳酸菌ラクトバシルス・カルバタス（Lactobacillus curvatus）を分離した。
次に、グルタミン酸を含む蛋白素材の一つとして、加熱したオカラに酵素や麹菌を添加して、分解した分解物に前記GABA生産乳酸菌を接種して発酵したところGABAを豊富に含む食品が得られることを見出した。
この際に、グルタミン酸あるいはグルタミン酸を含むペプチド等は添加しなくてもGABAを豊富に含む食品が得られる知見を得た。
そして、ラクトバシルス・カルバタス（Lactobacillus curvatus）のなかでも最もGABA生産能に優れたラクトバシルス・カルバタス（Lactobacillus curvatus）KM14株を見出したのである。
【０００９】
即ち、本発明は、グルタミン酸含有蛋白素材を水系下に加水分解したもの、及び／又はグルタミン酸含有アミノ酸混合物を、γ−アミノ酪酸産生菌ラクトバシルス・カルバタス（Lactobacillus curvatus）を用いて発酵することを特徴とするγ−アミノ酪酸豊富な食品の製造法である。
グルタミン酸含有蛋白素材としてオカラを利用することができる。
加水分解として、酸分解又は酵素分解を利用することができる。
ラクトバシルス・カルバタスとして、グルタミン酸を５重量％含む培地において３０℃で２日間培養したとき、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が５０％以上、好ましくは６０％以上となるものを利用することができる。
ラクトバシルス・カルバタスとして、グルタミン酸を５重量％含む培地において３０℃で２日間培養したときの、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が７０％以上となるラクトバシルス・カルバタス KM14株（寄託番号：FERM P-20497）を利用することがより好ましい。
また、本発明は、グルタミン酸を５重量％含む培地において３０℃で２日間培養したときの、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が５０％以上であるγ−アミノ酪酸産生菌ラクトバシルス・カルバタスである。
ラクトバシルス・カルバタスの菌株は、グルタミン酸を５重量％含む培地において３０℃で２日間培養したときの、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が７０％以上であるγ−アミノ酪酸産生菌ラクトバシルス・カルバタス ＫＭ１４株（寄託番号：FERM P-20497）が好ましい。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によりグルタミン酸を含む蛋白質原材料からGABAの豊富な食品を製造することが可能になったものである。
また、本発明により新規GABA乳酸菌ラクトバシルス・カルバタス KM14株が見出されたものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
まず、グルタミン酸含有蛋白素材を水系下に加水分解したもの、及び／又はグルタミン酸含有アミノ酸混合物を、γ−アミノ酪酸産生菌ラクトバシルス・カルバタス（Lactobacillus curvatus）を用いて発酵することを特徴とするγ−アミノ酪酸豊富な食品の製造法について説明する。
【００１２】
グルタミン酸含有蛋白素材としては、アミノ酸配列中にグルタミン酸残基を含んでいる蛋白素材あるいは遊離アミノ酸中にグルタミン酸を含む蛋白素材も用いることができる。
通常、グルタミン酸を含む食用の蛋白素材であれば特に限定されない。小麦、大豆、コーン、米などの植物蛋白、鳥獣魚介肉などの動物性蛋白も利用することができる。
この内、小麦由来の蛋白素材、例えば小麦グルテンなどはグルタミン酸が豊富で好ましい。この場合、加水分解をアルカリ域で行う必要がある。
また、大豆由来の蛋白素材もグルタミン酸が豊富であり好ましい。大豆由来の蛋白素材としては、大豆、大豆粉、脱脂大豆、豆乳や豆乳粉末、濃縮大豆蛋白、分離大豆蛋白などの他、大豆蛋白質が含まれているオカラなどを利用することができる。
【００１３】
大豆蛋白素材の内、オカラは豆乳や豆腐などの大豆加工食品の製造時に副生されるものであり、その多くは産業廃棄物として処理されているため、その有効利用が模索されている。
オカラ中には蛋白質や糖質などが含まれており、蛋白質が20〜30重量％含まれる。オカラの蛋白質を構成するアミノ酸の内、グルタミン酸の構成比は20重量％を占めており、大豆蛋白素材の中でもオカラに含まれるグルタミン酸含量はより高い。
よって本発明においては、グルタミン酸含有蛋白素材としてオカラを使用することがより好ましい。
【００１４】
本発明は、グルタミン酸含有蛋白素材を水系下に加水分解し、グルタミン酸あるいはグルタミン酸を含むペプチドを生成させることが必要である。本発明に用いる乳酸菌ラクトバシルス・カルバタスによりグルタミン酸をGABAへ変換しやすくするためである。蛋白質のままではラクトバシルス・カルバタスの蛋白質加水分解能が極めて低く、GABAへ変換するのが困難だからである。蛋白質をグルタミン酸やグルタミン酸含有ペプチドにまで加水分解することにより、グルタミン酸をGABAへ変換しやすくすることができる。
【００１５】
グルタミン酸含有蛋白素材は、加水分解の前処理として予め水系下に加熱することで、加水分解を起こしやすくすることができ、加熱殺菌を兼ねることもできる。
加熱を行う場合の温度は特に限定されないが、例えばオカラは通常１００℃〜１６０℃で１分〜６０分行われ、好ましくは１００〜１３０℃で１０〜６０分が適当である。
オカラ中の蛋白質を熱変性させて酵素で加水分解されやすくするだけでなく、オカラ中のセルロース、ヘミセルロースなどを熱水分解して水溶性ヘミセルロースを生成したり、後述するセルラーゼなどのオカラ繊維の加水分解酵素を作用しやすくする効果がある。
【００１６】
蛋白質の加水分解方法は、酸分解や酵素分解により公知の手段を利用することができるが、グルタミン酸をより多く遊離しうる手段がより好ましい。
加水分解に酵素を用いる場合、蛋白質分解酵素が好ましい。動物起源、植物起源、微生物起源などの起源は問わず、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリ性プロテアーゼの何れでもよいが、アルカリプロテアーゼは小麦蛋白（グルテン）、米蛋白（プロラミン）、コーン蛋白（ゼイン）のようにアルカリ域で溶解する蛋白に有効なだけでなく大豆蛋白にも有効であり好ましい。
【００１７】
またエンド型蛋白質分解酵素とエキソ型蛋白質分解酵素を併用するほうがグルタミン酸生成に有効である。エキソ型混在蛋白質分解酵素を用いれば１種類の市販酵素でも有効である。エンド型蛋白質分解酵素としては「スミチームFP」（新日本化学工業社製）が例示され、エキソ型混在蛋白質酵素としては「ウマミザイムG」（天野エンザイム社製）が例示され、これらを混合あるいは単独で使用することができる。エンド型酵素だけではグルタミン酸が遊離しにくい。
【００１８】
グルタミン酸含有蛋白素材が小麦グルテンや分離大豆蛋白のように繊維質を含まないものであればセルラーゼなどの繊維質分解酵素を用いる必要はないが、オカラのように繊維質を含む素材の場合は繊維質を分解する方が、得られる食品を飲食しやすくすることができ有効である。本発明のGABA産生菌が炭素源として資化できる単糖類にまで加水分解できる酵素がより好ましい。
繊維質の分解を促進させるためには、各種エステラーゼ、キシラーゼなどを加えることがより有効である。その他の多糖類加水分解酵素を添加することもできる。
分解条件は使用する酵素によっても異なるため特に限定されないが、通常は20〜70℃で1〜24時間であり、より好ましくは40〜60℃で12時間〜24時間が適当である。また、ｐＨは使用する酵素の作用ｐＨ範囲で行えばよい。
【００１９】
オカラを酵素により加水分解する例をより具体的に説明する。
水100部に対して、10〜30部（ｗ/ｗ比）のオカラを分散、より好ましくは水100部に対して、10〜20部（ｗ/ｗ比）のオカラを分散させ、前述の酵素により加水分解することが適当である。
オカラの割合が多すぎるとオカラが膨潤して操作性が悪くなり、オカラの割合が少なすぎると、例えば約0.5〜1.0部のグルタミン酸しか溶出しないので効率が悪くなる。
本発明のGABA産生菌を用いて発酵することにより前記割合で生成されたグルタミン酸をより効率よくGABAに変換できるものである。
【００２０】
本発明においては、グルタミン酸含有蛋白素材を水系下に加水分解したものの代わりに、グルタミン酸含有アミノ酸混合物を単独或いは該蛋白素材の加水分解物と併用することもできる。
【００２１】
本発明は上記基質をＧＡＢＡ産生菌ラクトバシルス・カルバタスで発酵させることにより、その菌株にもよるが、グルタミン酸をＧＡＢＡへ高度に変換し、ＧＡＢＡを多量に生産することができる。
本発明に用いるGABA産生菌ラクトバシルス・カルバタスは、グルタミン酸をGABAへ変換する能力を有するものであれば用いることができる。
特にグルタミン酸を５重量％含む培地において３０℃で２日間培養したときの、グルタミン酸からγ−アミノ酪酸への変換率が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上のラクトバシルス・カルバタスが適当である。７０％以上の変換率を有する乳酸菌としては、ラクトバシルス・カルバタス KM14株が好ましい。なお、変換率は培養前のグルタミン酸濃度に対する培養後のGABA濃度（％）を算出して求めることができる。
【００２２】
GABA産生菌ラクトバシルス・カルバタスの分離源は、微生物の関与によりGABAが多量に存在する糠床、キムチ、粕漬けなどの漬物やクサヤ漬け汁、なれ寿司などにおいて見出すことができる。菌種の分離は公知の方法によって行うことが出来る。
この分離菌を培養後、グルタミン酸−ブロモクレゾール  グリーンを使用し、グルタミン酸のカルボキシル基がグルタミン酸カルボキシラーゼによって脱炭酸されるときのpHの変化を測定することによりグルタミン酸デカルボキシラーゼ活性を測定することができる（Rice, E.W., C.H. Johnson, M.E. Dunnigan, and D.J. Reasoner (1993) Applied and Environmental Microbiology 59 (12) 4347-4349）。
【００２３】
本発明者の試験によれば、グルタミン酸デカルボキシラーゼ活性が高い乳酸菌類が数種存在した。この活性は乳酸菌の中で一般的にこの活性が高いことが知られており漬物などにも存在するラクトバシルス・ブレビス（NRIC 1032）よりも高いものであった。
この数種の乳酸菌は、菌学的特性や遺伝学的相同性試験の結果、全てラクトバシルス・カルバタスであった。
さらにこの数種の菌を培地にグルタミン酸を加え、変換率を測定したところ、１タイプの菌株がほぼ全てのグルタミン酸をGABAに変換していることが明らかとなった。
そこで、この活性が特に高かった株をγ−アミノ酪酸産生菌「ラクトバシルス・カルバタス  KM14株」として寄託した（寄託番号：FERM P-20497）。
【００２４】
次に、発酵の具体的な実施態様を説明する。
グルタミン酸含有蛋白素材を水系下に加水分解したもの及び/又はグルタミン酸含有アミノ酸混合物は前述のようにグルタミン酸が豊富な素材である。
この素材中のグルタミン酸をラクトバシルス・カルバタスを用いて発酵することによりGABAを生成し、目的のGABAが豊富な食品を得ることができる。
【００２５】
発酵に際しては、炭素源である糖を加えることが好ましい。加える糖としてラクトバシルス・カルバタスが資化できる炭素源であれば特に制限しないが、少糖類が資化しやすく好ましい。例えば、ブドウ糖、ガラクトース、ラクトース、果糖、乳糖、ショ糖、麦芽糖などを用いることができる。
【００２６】
本発明の発酵を行う培養条件は、用いる蛋白素材にもよるが、例えばオカラの場合、１０〜３７℃で１〜７日が好ましい。より好ましくは２０〜３０℃で１〜３日が適当である。
【００２７】
上記の通り発酵されたグルタミン酸含有蛋白素材は、GABA豊富な食品としてそのまま、好ましくは殺菌した後食用に供することができる。
また、発酵後の培養物を公知の方法でろ過、濃縮、活性炭処理などで清澄化することも可能である。この清澄化はろ紙、ろ布などを用いる濾過方法、あるいは遠心分離など公知の手段を利用することができる。
また、発酵後の培養物のpHを調整、あるいは無調整で濃縮することも可能である。濃縮手段は特に限定されず、例えば、エバポレーターなどで加熱温度70〜90℃、蒸発温度40〜60℃により行うことができる。
【００２８】
得られた発酵物は、そのまま各種飲食品用途に用いることができるが、飲食品への添加が許容されている原料、例えば、砂糖、蜂蜜、乳糖、水あめ、各種糖類、糖アルコールなどの甘味料、果汁、又はそのエキス、酸味料、香料、カルシウムなどのミネラル類、各種ビタミン、アミノ酸、多糖類などを加えることもできる。
また、必要に応じて、濾過滅菌、加熱滅菌などによって滅菌することもできる。また炭酸を充填して炭酸飲料にすることもできる。
また、オカラを分解して発酵したものは旨味成分も多いので、味噌、醤油、塩、食酢、香辛料、砂糖などの甘味料を加え、調味料などの食品素材としても利用できる。
【実施例】
【００２９】
以下、実施例により本発明の実施態様を説明する。
［実施例１］
（乳酸菌類の分離）
供試試料は市販の殺菌していない国内産漬物、キムチ、糠漬けなど5種類を用いた。また、炊いた米10gを50mlのイオン交換水に浸漬させ室温で2週間放置後、試料とした。
乳酸菌の分離は試料 1 gを生理食塩水で適宜希釈し、YPD白亜寒天培地(1重量%グルコース、0.5重量%ペプトン、1重量%酵母エキス、0.5重量％炭酸カルシウム、1．5重量％寒天)にて、30℃ または37℃ で平板培養し、生育したコロニーから行った。
【００３０】
（γ−アミノ酪酸(GABA)生産菌の検出）
E.W.Riceらの方法（Rice, E.W., C.H. Johnson, M.E. Dunnigan, and D.J. Reasoner (1993) Applied and Environmental Microbiology 59 (12) 4347-4349）に従って行った。
すなわち、分離された菌を液体培地（1重量%グルコース、0.5重量%ペプトン、1重量%酵母エキス）にて30℃、48時間培養した。この培養液から遠心分離によって菌体を回収した。さらに、この菌体を生理食塩水(NaCl 0.85％ )で洗浄後、表１に示したGAD（Glutamate Decarboxylase）試薬を0.6 mlずつ分注し、攪拌後30℃、72 hr放置した。これを遠心分離で、菌体を除去後、上澄み液の660 nmにおける吸光度を測定した。
GABAは菌体の持っているGADによってグルタミン酸のカルボキシル基から脱炭酸して得られ、その際にカルボキシル基に作用するので、酸性から中性付近へとｐHが変動する。
そこで、培養した菌体を糖を含まないグルタミン酸溶液にいれ、脱炭酸反応によるｐH の変化をブロモクレゾールグリーン溶液で測定した。
【００３１】
（分離菌株）
このGAD測定は、菌体により生成されるGADによりグルタミン酸が脱炭酸されることで、pHが中性付近に移行し、黄色から青色に呈色する反応を利用する。分離の際に、コロニーのタイプや形状などをグループ別にし、その中で、無作為に釣菌した。その得られた15 タイプの株から 4 株に発色が認められ、GABA生産能が認められた。
【００３２】
（表１）GAD試薬組成
────────────────────
L-グルタミン酸                1g
ブロモクレゾール  グリーン    0.05g
塩化ナトリウム               90g
トリトン X-100（商品名）      3ml
蒸留水                     1000ml
────────────────────
【００３３】
（GABA生産菌の菌学的特性）
生理学的同定試験は「乳酸菌実験マニュアル」（内村泰ら：乳酸菌実験マニュアル〜分離から同定まで〜  （株）朝倉書店  (1992))に従った。
すなわち、グラム染色は菌体を火炎固定後、クリスタルバイオレット液で染色し、エタノール・アセトン(2：1)混合液で脱色し、乾燥後1,000倍の倍率で検鏡した。形態及び胞子形成観察はカバーグラスに菌体を風乾、火炎固定後メチレンブルー液で染色し、洗浄後、乾燥し、1,000倍の倍率で検鏡した。
胞子は、染色された細胞内に無色透明の光るものが観察されたとき、胞子ありとした。
カタラーゼ試験は培養した菌体を回収し、3％ 過酸化水素水 1 mlを注ぎ2〜3分観察した。このとき発泡がないものはカタラーゼ陰性、発泡が認められたものはカタラーゼ陽性とした。
運動性試験は0.15％寒天培地を用いて、前培養した供試菌株を白金線に付け穿刺した。30℃ で３日間培養し、穿刺の広がりを肉眼観察した。ガス発生試験は液体培地ダーラム管を入れて、ガス発生の有無を肉眼観察した。生育温度試験は液体培地にて15℃、20℃、40℃、45℃ で３日間培養し、生育の有無を観察した。
【００３４】
（表２）  KM14株の形態学的特性
───────────────
形態観察              短桿
胞子形成              なし
グラム染色            陽性
カタラーゼ            なし
運動性                なし
ガス発生              なし
───────────────
【００３５】
以上の結果より、短桿菌であり、胞子形成がなく、グラム染色が陽性、カタラーゼが陰性、運動性とガス発生がないことより、一般的に広く食品に用いられている乳酸菌のひとつである、ラクトバシルス属の乳酸菌であった。
次に、糖の資化性について、下記に示した18種類の糖を加えた培地(1重量％酵母エキス、0.5重量％ペプトン、1重量％各種糖)での生育を観察した。その結果、表３の通り、リボース、フラクトース、ラクトース、マンノースに発酵性が認められた。しかし、Xyloseに発酵性が認められなかったことよりカルバタスであることが明らかとなり、食品として十分に適する菌種であることがわかった。
【００３６】
（表３）  KM14株の糖の資化性
────────────────────────────────
Arabinose −    Ribose    ＋    Xylose    −    Galactose  ＋
Fructose  ＋    Mannitol  −    Sorbitol  −    Cellobiose −
Maltose   −    Lactose   ＋    Melibiose −    Saccharose −
Trehalose −    Raffinose −    Mannose   ＋    Rhamnose   −
Sucrose   −    Starch    −
────────────────────────────────
（＋；資化性あり、−；資化性なし）
【００３７】
さらに、11SリボソームRNAによる菌種の微生物学的分類を行った。
11SリボソームRNAは菌の属種固有の遺伝的配列である。この配列によって、菌種の属種が推定できる。菌体を培養後、定法に従い、DNAをフェノール−クロロフォルムで抽出後、11sリボソームRNAに存在する特定配列を鋳型としてPCRで増幅した。これをDNAシークエンサーで配列を読み込んだ。このデータをデータベースよりタイプストレインの配列と比較し、相同性を算出した。
11SリボソームRNAの結果より、98％の相同性があった。つまり、KM14株の遺伝配列はタイプストレインのそれと比べて98％同じであることが示された。
また、菌学的特性や遺伝学的相同性試験の結果、4種は同等で、ラクトバシルス・カルバタスであることが確認された。そこで、活性の高かった株をγ−アミノ酪酸産生菌ラクトバシルス・カルバタス KM14株として寄託した（寄託番号：FERM P-20497）。
【００３８】
［実施例２］
（オカラからのGABA生産）
分離大豆蛋白製造工程で副製されるオカラ（不二製油株式会社製）１０ｇに蒸留水100mlを加え、オートクレーブにて１２０℃で20分間の加熱を行った。
加熱したオカラ分散液に5ml滅菌水に溶解した蛋白質分解酵素、スミチームFP（商品名、新日本化学工業株式会社）、ウマミザイムG（商品名、天野エンザイム株式会社）を、それぞれ0.01g加え12〜24時間50℃で加水分解した後、遠心分離にて固液分離を行った。
また、加熱したオカラ分散液に別途塩酸で酸分解したオカラ分解物を調製した。
これらのオカラ分解物に前記の「ラクトバシルス・カルバタス KM14株」を接種し、30℃で48時間培養した。結果を表４に示した。
【００３９】
（表４） オカラ分解物からのGABAの生産                    （単位：ppm）
───────────────────────────────────
条件        固形分濃度（重量％）  培養前グルタミン酸    培養後GABA
───────────────────────────────────
酵素分解          4.9                    1380              1195
酸分解           11.5                    6770              4280
───────────────────────────────────
【００４０】
即ち、10 gのオカラから酵素分解産物で1195 ppm (119.5 mg/100 ml)、酸分解産物で4280 ppm  (428.0 mg/100 ml)のGABAが生産された。培養前グルタミン酸からの培養後GABAへの変換率は酵素分解産物で８７％、酸分解産物で６３％であった。
【００４１】
［実施例３及び比較例］
本発明において見出されたラクトバシルス・カルバタスKM14株のGABA生産能について他の乳酸菌との比較を行った。
（方法）
供試菌株として、ラクトバシルス・カルバタスKM14株、対照としてラクトバシルス・ブレビスNRIC 1032を用いた。
先ず、菌株のGAD（Glutamate decarboxylase）測定は、液体培地（1重量%グルコース、0.5重量%ペプトン、1重量%酵母エキス）にて30℃、48hr培養を行なった。この菌体を生理食塩水にて洗浄し、活性菌体とした。
これをグルタミン酸が１〜５％含む１重量％グルコース、１重量％酵母エキス溶液に接種し、一般的に漬物中でGABAを生産することが知られているラクトバシルス・ブレビスと同様に、30℃で、48時間培養した。その結果を表５に示した。
【００４２】
（表５） グルタミン酸からのGABA生産性の比較              （単位：重量％）
─────────────────────────────────────
菌株        培養前グルタミン酸  培養後グルタミン酸  培養後GABA    変換率
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KM14株              1                  0.1              0.9        90％
2                  0.1              1.5        75％
5                  0.1              3.5        70％
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ブレビス株          1                  0.1              0.6        60％
2                  0.9              1.0        50％
5                  3.2              1.8        36％
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【００４３】
両菌株とも培養前のグルタミン酸濃度を高くするとGABA変換率が低下する傾向となったが、ラクトバシルス・カルバタス KM14株においては、５重量％グルタミン酸を含む培地において、グルタミン酸重量の70重量％ものGABAを生産し、高い変換率を示した。一方、一般的に漬物などでGABA生産菌として知られるラクトバシルス・ブレビス NRIC 1032はGABAの生産性が悪く、変換率は36重量％に過ぎなかった。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明により、乳酸菌ラクトバシルス・カルバタスがGABA生産能に優れることを見出し、特に、最もGABA生産能に優れたラクトバシルス・カルバタス KM14株を見出すことができた。
また、オカラのように従来は副産物として有効利用が少なかった蛋白含有素材を予め酸分解や酵素分解し、GABA生産乳酸菌を接種して発酵するとGABAを豊富に含む食品が得られるものであり、オカラの有効利用が可能となった。
本発明は、オカラだけでなくグルタミン酸を含有する蛋白素材からGABA含有食品の生産が可能になったものであり産業の発達に大いに寄与するものである。