(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠中の哺乳類を対象として、体液中のアンジオポエチン−２の濃度を測定し、該測定により得られたアンジオポエチン−２の濃度を健常値と比較することを特徴とする妊娠中毒症の検査方法。
【請求項２】
前記健常値が６ｎｇ／ｍｌ以上である、請求項１に記載の妊娠中毒症の検査方法。
【請求項３】
前記体液が血液である、請求項１又は２に記載の妊娠中毒症の検査方法。
【請求項４】
前記測定が、妊娠２０週以降の哺乳類を対象として行われる請求項１乃至３のいずれか１に記載の妊娠中毒症の検査方法。
【請求項５】
前記測定が、ＥＬＩＳＡ法により行われる、請求項１乃至４のいずれか１に記載の妊娠中毒症の検査方法。
【請求項６】
体液中のアンジオポエチンー２の濃度を測定する試薬を含む、妊娠中毒症検出用試薬。
【請求項７】
請求項６に記載の妊娠中毒症検出用試薬を、妊娠中毒症検出のために使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊娠中毒症の検査方法に関し、より詳細には、妊娠中毒症に現在罹患しているか否か、または将来妊娠中毒症に罹患する可能性があるか否かを、簡便にかつ精度良く知ることのできる妊娠中毒症の検査方法に関する。なお、本発明では、現在妊娠中毒症に罹患している場合と、将来妊娠中毒症に罹患する可能性がある場合と、を総称して「妊娠中毒症罹患性がある」と称し、本発明の「妊娠中毒症の検査方法」は、この妊娠中毒症罹患性について検査するものである。
【背景技術】
【０００２】
妊娠中毒症は、妊娠中に発症する臨床上重要な合併症の一つで、高血圧、蛋白尿、浮腫等を呈し、母体及び／又は新生児に悪影響を与える。
妊娠中毒症罹患性を知る方法は、例えば、母体の脂肪量を評価し、該評価された脂肪量と妊娠中毒症罹患性とを関連付けて行う方法が知られている（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。
特許文献１には、「妊婦の体脂肪率や体重の変化と胎児の成長曲線を関連づけて管理することにより妊娠中毒症の可能性」を知るための妊娠中の定期検診に使用される超音波診断装置が開示されている（即ち、妊娠中毒症に将来罹患する可能性を評価するものである。）。
特許文献２には、「身長、体重等の妊婦の個人データを入力する入力手段と、生体電気インピーダンス法により体水分量と脂肪量とを演算する演算手段と、妊娠週数に応じた基準値を備える基準設定手段と、演算手段による演算結果と基準値とを比較する比較手段と、比較手段の比較結果で妊婦の健康状況を判定する判定手段とを備えた妊婦用健康管理装置」（請求項１）を用い、「判定手段は、妊娠中毒症
の発症を判定すること」（請求項３）により、妊娠中毒症 の発症を判定することが開示されている（即ち、妊娠中毒症に現在罹患していることを評価するものである。）。【０００３】
【特許文献１】特開２００２−６０４号公報（例えば、要約書中の課題）
【特許文献２】特開２００３−３３３５６号公報（例えば、請求項１、請求項３）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、これら特許文献１及び２に開示された発明は、母体の脂肪量から妊娠中毒症罹患性を評価するものであり、これら両者はある程度の関連性は認められるものの、脂肪量が多い母体が妊娠中毒症を必ず発症するものではないし、脂肪量が少ない母体は妊娠中毒症を必ず発症しないというものではなく、妊娠中毒症罹患性を的確に評価する方法はこれまでなかった。【０００５】
そこで、本発明においては、的確に妊娠中毒症罹患性を評価することができる妊娠中毒症の検査方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の妊娠中毒症の検査方法（妊娠中毒症罹患性を評価する方法。即ち、妊娠中毒症に現在罹患していること及び妊娠中毒症に将来罹患する可能性の少なくともどちらかを評価する方法である。）は、妊娠中の哺乳類を対象として、体液中のアンジオポエチン−２の濃度を測定し、該測定により得られたアンジオポエチン−２の濃度を健常値と比較することを特徴とする妊娠中毒症の検査方法（以下、「第１の本方法」という。）である。
また、第１の本方法には、以下（１−１）〜（１−４）の態様が含まれる。
（１−１）前記健常値が６ｎｇ／ｍｌ以上である、上記妊娠中毒症の検査方法。
（１−２）前記体液が血液である、上記妊娠中毒症の検査方法。
（１−３）前記測定が、妊娠２０週以降の哺乳類を対象として行われる、上記妊娠中毒症の検査方法。
（１−４）前記測定が、ＥＬＩＳＡ法により行われる、上記妊娠中毒症の検査方法。【０００７】
そして、本発明の妊娠中毒症の検査方法（妊娠中毒症罹患性を評価する方法。即ち、妊娠中毒症に現在罹患していること及び妊娠中毒症に将来罹患する可能性の少なくともどちらかを評価する方法である。）は、妊娠中の哺乳類を対象として、体液中のアンジオポエチン−２の濃度を測定する測定ステップと、該測定ステップにより得られたアンジオポエチン−２の濃度を健常値と比較する対比ステップと、該対比ステップの結果に基づき、妊娠中毒症の罹患性の有無を判定する判定ステップと、を有する、妊娠中毒症罹患の検出方法（以下、「第２の本方法」という。）である。
また、第２の本方法には、以下（２−１）〜（２−４）の態様が含まれる。
（２−１）前記判定ステップにおいて、前記測定ステップにより得られたアンジオポエチン−２の濃度が健常値よりも低い場合に妊娠中毒症の罹患性ありと判定するものである、上記妊娠中毒症罹患の検出方法。
（２−２）前記体液が血液である、上記妊娠中毒症罹患の検出方法。
（２−３）前記測定ステップが、妊娠２０週以降の哺乳類を対象とする測定ステップである、上記妊娠中毒症罹患の検出方法。
（２−４）前記測定ステップが、ＥＬＩＳＡ法を用いた測定ステップである、上記妊娠中毒症罹患の検出方法。【０００８】
そして、本発明は、妊娠中毒症罹患を検出するために用いられる妊娠中毒症検出用試薬（以下、「本試薬」という。）を提供する。即ち、本試薬は、体液中のアンジオポエチン−２の濃度を測定する試薬を含む、妊娠中毒症検出用試薬である。
なお、本試薬は、妊娠中毒症検出のために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】各被験者の血清試料（正常妊娠群、中毒症群、非妊娠群、分娩後１週間以内群）のアンジオポエチン−２濃度（血清Ａｎｇー２濃度）を示すグラフである。
【図２】正常妊娠群（黒丸）及び中毒症群（白丸）の血清アンジオポエチン−２濃度（血清Ａｎｇー２濃度）と妊娠週数（週）との関係を示すグラフである。
【図３】正常妊娠群の血清アンジオポエチン−２濃度（血清Ａｎｇー２濃度）と平均血圧との関係を示すグラフである。
【図４】中毒症群の血清アンジオポエチン−２濃度（血清Ａｎｇー２濃度）と１日尿蛋白量との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（本発明の妊娠中毒症罹患の検出方法（本方法））
第１の本方法は、妊娠中の哺乳類を対象として、体液中のアンジオポエチン−２の濃度を測定し、該測定により得られたアンジオポエチン−２の濃度を健常値と比較することを特徴とする妊娠中毒症の検査方法である。
第２の本方法は、妊娠中の哺乳類を対象として、体液中のアンジオポエチン−２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎー２）の濃度を測定する測定ステップと、該測定ステップにより得られたアンジオポエチン−２の濃度を健常値と比較する対比ステップと、該対比ステップの結果に基づき、妊娠中毒症の罹患性の有無を判定する判定ステップと、を有する、妊娠中毒症罹患の検出方法である。【００１１】
本方法が対象とする哺乳類は、妊娠中毒症に現在罹患しているか否か又は妊娠中毒症に将来罹患する可能性の有無により体液中のアンジオポエチン−２の濃度に差が生じるものであれば特に制限はないが、例えば、ヒト、ブタ
、ウマ、ウシ 、ヒツジ、ヤギ、イヌ 、ネコ、ウサギ、ハムスター、ラット又はマウス等を例示的に挙げることができる。
体液中のアンジオポエチン−２の濃度測定（測定ステップ）においてアンジオポエチン−２の濃度を測定する体液としては、血液及び尿を例示することができる。好ましくは血液である。なお、血液中のアンジオポエチン−２の濃度は、血清または血漿を測定試料として測定することができる。【００１２】
本方法が対象とする「妊娠中の哺乳類」の妊娠週数は、正常妊娠者と妊娠中毒症患者との間でアンジオポエチン−２濃度に有意な差が生じる期間であれば特に制限されない。妊娠中のヒトの血清（体液）中のアンジオポエチン−２の濃度を測定（測定ステップ）する場合であれば、例えば、始期としては、好ましくは１５週以降であり、より好ましくは２０週以降であり、最も好ましくは２５週以降であり、終期としては、好ましくは４０週以前であり、より好ましくは３８週以前である。
とりわけ２０週以降の早期（例えば、２０週以降２５週以前や、２０週以降３０週以前等）に体液中のアンジオポエチン−２の濃度測定（測定ステップ）を行うことで、妊娠中毒症の罹患を早期に発見したり、妊娠中毒症の将来の罹患可能性を早期に知ることができるので、早期に妊娠中毒症へ対処（例えば、日常生活における注意、指導、医療機関への通院等）することができるようになり重症化予防に役立ち予後の改善をも可能ならしめるものと考えられる。【００１３】
測定（測定ステップ）により得られたアンジオポエチン−２の濃度を比較する健常値（対比ステップにおける健常値）は、妊娠中毒症に現在罹患しておらずかつ妊娠中毒症に将来罹患しない妊娠（腎疾患や本態性高血圧等といった既往歴がないもの）中の体液中のアンジオポエチン−２の濃度とすればよく、例えば、妊娠中毒症に現在罹患しておらずかつ妊娠中毒症に将来罹患しない妊娠中のヒトの血清（体液）中のアンジオポエチン−２の濃度であれば、８．０ｎｇ／ｍｌ〜３０．０ｎｇ／ｍｌ（正常妊娠例）程度である。
なお、妊娠中毒症とは、平成１６年８月９日社団法人日本産科婦人科学会（会長：藤井  信吾）が日産婦誌５６巻９号（平成１６．９）第３〜４頁に発表した「会員へのお知らせ  妊娠高血圧症候群の定義・分類」について」に述べられている。具体的には、妊娠２０週以降、分娩後１２週までに高血圧が見られる場合、または高血圧に蛋白尿を伴う場合のいずれかで、且つこれらの症候が偶発合併症によらないものをいう。通常、妊娠中毒症は、軽症と重症とに分けられ、これら軽症と重症との定義はそれぞれ次の通りである。
１  軽症：
（１）高血圧：血圧が次の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに該当する場合
（ａ）収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上で１６０ｍｍＨｇ未満
（ｂ）拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上で１１０ｍｍＨｇ未満
（２）蛋白尿
原則として２４時間尿を用いた定量法で判定し、３００ｍｇ／日以上で２ｇ／日未満の場合
２  重症：
（１）高血圧：血圧が次の（ｃ）又は（ｄ）のいずれかに該当する場合
（ｃ）収縮期血圧が１６０ｍｍＨｇ以上の場合
（ｄ）拡張期血圧が１１０ｍｍＨｇ以上の場合
（２）蛋白尿
２４時間尿を用いた定量法で判定し、２ｇ／日以上の場合。随時尿を用いる場合は複数回の新鮮尿検査で、連続して３＋（３００ｍｇ／ｄｌ）以上の場合。
また、本発明にいう「妊娠中毒症の検査方法」とは、妊娠中毒症に現在罹患していることを知ることと、妊娠中毒症に将来罹患する可能性を知ること、との少なくともいずれかに用いられるものをいう（両方に用いられるものであって良いことは言うまでもない。）。【００１４】
測定により得られたアンジオポエチン−２の濃度を健常値と比較し（対比ステップ）、その比較結果に基づき、妊娠中毒症の罹患性の有無を判定すること（判定ステップ）は、該比較結果に基づき、妊娠中毒症に（現在）罹患しているか否か又は将来罹患する可能性を判定するものであればいかなるものであってもよく何ら限定されるものではない。例えば、妊娠中毒症に（現在）罹患していることを判定する場合であれば、臨床データ（妊娠中毒症の代表的な臨床データである尿蛋白量等）が妊娠中毒症の罹患を示唆しているときに体液中のアンジオポエチン−２の濃度が妊娠中毒症を示しているときは、妊娠中毒症の（現在）罹患を判定するようなことを例示することができる。そして、妊娠中毒症に将来罹患する可能性を判定する場合であれば、臨床データ（妊娠中毒症の代表的な臨床データである尿蛋白量等）は妊娠中毒症の罹患を示唆していないときに体液中のアンジオポエチン−２の濃度が妊娠中毒症を示しているときは、妊娠中毒症の将来の罹患可能性があることを判定するようなことを例示することができる。
そして、本発明者の研究結果からは、妊娠中毒症に現在罹患しているか又は妊娠中毒症に将来罹患する妊娠中の体液中のアンジオポエチン−２の濃度は、妊娠中毒症に現在罹患しておらずかつ妊娠中毒症に将来罹患しない妊娠中の体液中のアンジオポエチン−２の濃度よりも低かった。このため測定により得られたアンジオポエチン−２の濃度を健常値と比較し（対比ステップ）、その比較結果に基づき、妊娠中毒症の罹患性の有無を判定すること（判定ステップ）においては、測定（測定ステップ）により得られたアンジオポエチン−２の濃度が健常値よりも低い場合に妊娠中毒症に罹患していると判定し又は将来罹患すると判定するものであってもよい。【００１５】
体液中のアンジオポエチン−２の濃度を測定する方法（測定ステップ）は、体液中のアンジオポエチン−２の濃度を測定することができるものであればいかなる方法によって行われてもよく何ら限定されるものではないが、例えば、ＥＬＩＳＡ法（固相酵素免疫測定法）、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法等を用いるようにしてもよい。
とりわけＥＬＩＳＡ法を用いれば、測定キットが市販されていることやその手順等から測定を容易に行うことができ、放射性物質を取り扱う必要がなく、定量的評価が可能であり、そして必要な試料が少量（例えば、血清中のアンジオポエチン−２の濃度を測定する場合、２００マイクロリットル程度）で済む、といった利点がある。【００１６】
（本発明の妊娠中毒症検出用試薬（本試薬））
本試薬は、体液中のアンジオポエチン−２の濃度を測定する試薬を含む、妊娠中毒症検出用試薬である。
体液中のアンジオポエチン−２（Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎー２）の濃度を測定する試薬（複数種類の試薬が組み合わされたものも含む。）としては、該試薬を用いて体液中のアンジオポエチン−２の濃度を測定することができるものであればいかなるものであってもよく何ら限定されるものではないが、前述した本方法の体液中のアンジオポエチン−２の濃度を測定する方法（測定ステップ）に用いられるＥＬＩＳＡ法（固相酵素免疫測定法）、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法等のいずれかを行うための試薬（又はその組合せ）であってもよい。
例えば、ＥＬＩＳＡ法により体液中のアンジオポエチン−２の濃度を測定する場合、本試薬は、マウスモノクローナル抗アンジオポエチンー２抗体、組換え型ヒト由来アンジオポエチン−２、ホースラディシュペルオキシダーゼ標識マウスモノクローナル抗アンジオポエチン−２抗体の試薬を含んでもよい。なお、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社製の商標「Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ｈｕｍａｎＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎー２  ｋｉｔ」はこのような試薬を含み市販されている。
このような本試薬は、それを用いて本方法の測定ステップを行うのに用いられ、それにより本方法に従って妊娠中毒症を検出する（妊娠中毒症に現在罹患しているか又は妊娠中毒症に将来罹患する可能性を評価する）のに供されることができる。
【実施例】
【００１７】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００１８】
（１）対象被験者
以下の実験は、健常妊婦２９名（正常妊娠群（健常群））、妊娠中毒症患者２６名（中毒症群）、健常非妊娠女性２０名（非妊娠群）分娩後１週間以内の女性１１名（妊娠中毒症２例、健常群９例）（分娩後１週間以内群）を対象として行った。なお、これらの被験対象者はいずれも腎疾患や本態性高血圧症の既往歴のない１７〜４１歳の日本人女性である。また、健常妊婦及び妊娠中毒症患者はいずれも妊娠週数２５〜４０週の者を対象とした。
なお、妊婦について、収縮期血圧１４０ｍｍＨｇ以上または拡張期血圧９０ｍｍＨｇ以上で、２４時間蓄尿中の尿蛋白量が３００ｍｇ／日以上である場合を妊娠中毒症として定義し、この定義を満たさない妊婦を健常妊婦とした。【００１９】
（２）血清試料の調製
上記各被験者（正常妊娠群、中毒症群、非妊娠群、分娩後１週間以内群）から各々血液を採取し、常法に従って血清を調製した。なお、妊娠中毒症患者（中毒症群）については、妊娠中毒症発症後すぐに採取した血液を使用した。調製した血清は、使用するまで−８０℃で保存し、使用時に常温下で溶解して用いた。【００２０】
（３）血清アンジオポエチン−２濃度の測定
上記にて調製した各被験者（正常妊娠群、中毒症群、非妊娠群、分娩後１週間以内群）の血清試料について、アンジオポエチン−２の濃度（血清Ａｎｇー２濃度）を測定した。かかる血清Ａｎｇー２濃度の測定は、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社のＥＬＩＳＡキット（商標「Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＨｕｍａｎＡｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎー２  ｋｉｔ」）（以下、「使用キット」という。）を用い、そのマニュアルに従って測定した。【００２１】
なお、上記ＥＬＩＳＡキット（使用キット）は、次の試薬等を含んでいる。
（ａ）「Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ」：アンジオポエチン−２に対するマウスモノクローナル抗体でコーティングされた９６ウエルのポリスチレン製マイクロプレートである。
（ｂ）「Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ」：ホースラディシュペルオキシダーゼと結合した、アンジオポエチン−２に対するマウスモノクローナル抗体を含む試薬である（防腐剤含有）。
（ｃ）「Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎー２  ｓｔａｎｄａｒｄ」：緩衝蛋白質中に、標品である組換え型ヒト由来アンジオポエチン−２を含む試薬（３０ｎｇ／ｍｌ）である（防腐剤含有）。
（ｄ）「Ａｓｓａｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ＲＤ１−７６」：青色色素及び緩衝蛋白質を含む測定用の希釈溶液である（防腐剤含有）。
（ｅ）「Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ  ＤｉｌｕｅｎｔＲＤ５−５」：緩衝蛋白質を含む希釈溶液である（防腐剤含有）。
（ｆ）「Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ」：緩衝化界面活性剤の２５倍濃縮液である（防腐剤含有）。
（ｇ）「Ｃｏｌｏｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａ」：安定化させた過酸化水素である。
（ｈ）「Ｃｏｌｏｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂ」：安定化させたクロモゲン（テトラメチルベンジジン）である。
（ｉ）「Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」：２Ｎの硫酸である。
（ｊ）「Ｐｌａｔｅ  Ｃｏｖｅｒｓ」：プレートカバーである。【００２２】
（３ー１）血清アンジオポエチン−２濃度の測定
下記のステップに従って、血清アンジオポエチン−２濃度（血清Ａｎｇー２濃度）を測定した。
１．「Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ」の各ウエルに、「Ａｓｓａｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ  ＲＤ１−７６」を１００μｌずつ添加する。
２．上記ウエルに、血清試料（正常妊娠群、中毒症群、非妊娠群、分娩後１週間以内群）またはアンジオポエチン−２の標準液を５０μｌずつ添加し、プレートを「Ｐｌａｔｅ  Ｃｏｖｅｒｓ」で覆って、室温で水平に振盪（５００ｒｐｍ±５０ｒｐｍ）しながら２時間反応させる。なお、血清試料は予め「Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ  ＤｉｌｕｅｎｔＲＤ５−５」を用いて５倍に希釈しておいたものを使用する。アンジオポエチン−２の標準液としては、「Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎー２  ｓｔａｎｄａｒｄ」（３０ｎｇ／ｍｌ）を「Ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ  ＤｉｌｕｅｎｔＲＤ５−５」で希釈して調製した、８種の希釈系列（０ｐｇ／ｍｌ、４６．９ｐｇ／ｍｌ、９３．７ｐｇ／ｍｌ、１８７．５ｐｇ／ｍｌ、３７５ｐｇ／ｍｌ、７５０ｐｇ／ｍｌ、１５００ｐｇ／ｍｌ、３０００ｐｇ／ｍｌ）を使用した。
３．反応後、各ウエルから反応液を吸引除去し、洗浄液（４００μｌ／ウエル）で洗浄する。この操作を３回繰り返す。洗浄液は、「Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ」（×２５  濃縮液）を脱イオン水または蒸留水で２５倍希釈したものを使用する。洗浄後、洗浄液を各ウエルから完全に除去して、ペーパータオルで水分を除く。
４．上記の各ウエルに「Ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ−２  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ」を２００μｌ添加し、プレートを「Ｐｌａｔｅ  Ｃｏｖｅｒｓ」で覆って、室温で水平に振盪（５００ｒｐｍ±５０ｒｐｍ）しながら２時間反応させる。
５．反応後、上記３の操作と同様にして、各ウエルを洗浄する。
６．洗浄後、各ウエルに基質溶液を２００μｌ添加し、遮光条件下、室温で３０分間反応させる。なお、基質溶液は、「Ｃｏｌｏｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ａ」と「Ｃｏｌｏｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｂ」とを等量混合したものを用いる（混合後１５分以内に使用する。）。
７  反応後、各ウエルに「Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」を５０μｌ添加する。
８  「Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ」を添加後、３０分以内に各ウエル中の反応液の波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、その値から波長５４０ｎｍまたは５７０ｎｍでの吸光度を控除する。なお、吸光度を測定する吸光度計（測定プレートリーダー）は、ここではＢＩＯ−ＲＡＤ社製の商標「Ｍｏｄｅｌ  ５５０  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ」を用いた。測定条件は、二重波長（Ｄｕａｌ  ｗａｖｅ）（４５０ｎｍ、５７０ｎｍ）、そして撹拌機入り（ｓｈａｋｅｒ  ｏｎ）であった。【００２３】
アンジオポエチン−２の標準液について得られた結果から標準曲線を作成し、これから各被験者の血清試料（正常妊娠群、中毒症群、非妊娠群、分娩後１週間以内群）のアンジオポエチン−２濃度を求めた。なお、各試料は全て２検体ずつ（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）測定し、それぞれの平均値をもとに統計学的解析（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ社製の商標「ＳｔａｔＶｉｅｗ」（ソフトウエア）を用いた。）を行った。アンジオポエチンー２の最小平均検出濃度は８．２９ｎｇ／ｍｌで、アッセイ（ａｓｓａｙ）間、アッセイ内の共同係数偏差はそれぞれ６．９％、１０．４％以下である。【００２４】
（３−２）血清アンジオポエチン−２濃度の測定結果
上記の結果、得られた各被験者の血清試料（正常妊娠群、中毒症群、非妊娠群、分娩後１週間以内群）のアンジオポエチン−２濃度（血清Ａｎｇー２濃度）を図１に示す。図１は、縦軸に血清中のアンジオポエチン−２濃度（単位：ｎｇ／ｍｌ）をとったグラフであり、図１中「Ｎｏｒｍａｌ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ」は正常妊娠群（健常群）を示し、図１中「Ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ」は中毒症群を示し、図１中「Ｐｏｓｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ」は分娩後１週間以内（分娩後１週間以内群）のものを示し、図１中「Ｎｏｎ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ」は非妊娠群を示している。
図１からわかるように、正常妊娠群（Ｎｏｒｍａｌ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）の血清Ａｎｇー２濃度は１８．９±３．２ｎｇ／ｍｌと非妊娠群（Ｎｏｎ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）の血清Ａｎｇー２濃度（２．１±０．２ｎｇ／ｍｌ）に比して顕著に高いのに対し、中毒症群（Ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ）の血清Ａｎｇー２濃度は４．５±０．６ｎｇ／ｍｌと、正常妊娠群（Ｎｏｒｍａｌ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ）の血清Ａｎｇー２濃度（１８．９±３．２ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０００１）に比して著しく低かった。また、分娩後１週間以内群（Ｐｏｓｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）の血清Ａｎｇー２濃度は正常妊娠及び妊娠中毒症の別に関係なく、非妊娠群と同程度に低値であった。【００２５】
（４）血清クレアチニン、クレアチニンクリアランス及び１日尿蛋白量の測定
上記で調製した各被験者（正常妊娠群、中毒症群、非妊娠群、分娩後１週間以内群）の血清試料について、血清クレアチニン及びクレアチニンクリアランスを常法に従って測定した。また、各被験者から１日尿（２４時間蓄尿）を採取し、常法に従って１日蛋白量を測定した。各試料は全て２検体ずつ（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）測定し、それぞれの平均値をもとに統計学的解析（Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ社製の商標「ＳｔａｔＶｉｅｗ」（ソフトウエア）を用いた。）を行った。
なお、血清クレアチニン、クレアチニンクリアランス及び１日尿蛋白量の測定方法については、例えば、Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．，Ｍａｅｓｈｉｍａ，Ｙ．，Ｋｉｔａｙａｍａ，Ｈ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｓ．，Ｔａｋａｚａｗａ，Ｙ．，Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｈ．，Ｙａｍａｓａｋｉ，Ｙ．，Ｍａｋｉｎｏ，Ｈ．：Ｔｕｍｓｔａｔｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｓｔａｇｅ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５３巻：１８３１−１８４０頁，２００４年に従って行えばよい。
結果を表１に示す。全ての値は平均値±標準誤差で示す。クレアチニンクリアランスの単位はｍｌ／分であり、１日尿蛋白量の単位はｇ／日である。【００２６】
【表１】
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【００２７】
表１に示すように、中毒症群の平均血圧は正常妊娠群の平均血圧よりも有意に高値を示した。中毒症群について、腎機能のパラメータである血清クレアチニン及びクレアチニンクリアランスは正常範囲であったが、１日尿蛋白量は約３ｇと高値であった。【００２８】
（５）血清アンジオポエチン−２濃度と臨床パラメータ（妊娠週数、平均血圧、血清クレアチニン、クレアチニンクリアランス、１日尿蛋白量）との相関関係
クラスカルーウォリス法（ＫｒｕｓｋａｌーＷａｌｌｉｃｅ検定）とシェッフェの方法（Ｓｃｈｅｆｆｅの検定）を用い（第１段階でクラスカルーウォリス法を用い、第２段階でシェッフェの方法を用いて解析した。）、表１に示した臨床パラメーター（具体的には、年齢、妊娠期間（妊娠週数）、平均血圧、血清クレアチニン、クレアチニンクリアランス、１日尿蛋白定量）と血清アンジオポエチンー２濃度のグループ内の比較検討を行った。統計学的解析には、Ａｂａｃｕｓ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ社製の商標「ＳｔａｔＶｉｅｗ」（ソフトウエア）を使用し、２群間の相関はスピアマン（Ｓｐｅａｒｍａｎ）の検定を用いて算出した。正常妊娠群（健常群）の血清アンジオポエチンー２濃度に対して、中毒症群の血清アンジオポエチンー２濃度が低いことはｐ＜０．０５をもって統計学的に有意であると判定された。【００２９】
正常妊娠群及び中毒症群における血清アンジオポエチン−２濃度（血清Ａｎｇー２濃度）と妊娠週数（週）との関係を図２に、正常妊娠群における血清Ａｎｇー２濃度と平均血圧との関係を図３に、中毒症群における血清Ａｎｇー２濃度と１日尿蛋白量との関係を図４に、それぞれ示す。
図２は、横軸に妊娠週数（「Ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ  ａｇｅ」、単位：週）をとり、縦軸に血清アンジオポエチン−２濃度（血清Ａｎｇー２濃度、単位：ｎｇ／ｍｌ）をとったグラフであるが、図２からわかるように、正常妊娠群（黒丸：「Ｈｅａｌｔｈｙ  ｐｒｅｇｎａｎｔ」）と中毒症群（白丸：「Ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ」）の血清Ａｎｇー２濃度は、妊娠週数と有意な相関は見られなかったが、妊娠週数がすすむにつれて減少する傾向がみられた。
図３は、横軸に平均血圧（ＭＢＰ、単位：ｍｍＨｇ）をとり、縦軸に血清アンジオポエチン−２濃度（血清Ａｎｇー２濃度、単位：ｎｇ／ｍｌ）をとったグラフであるが、図３からわかるように、平均血圧は、正常妊娠群について、血清Ａｎｇー２濃度と有意な正の相関を示したが（ｒ＝０．４６９、ｐ＝０．００９５）、中毒症群では相関は認められなかった。
図４は、横軸に１日尿蛋白量（ＤＵーＴＰ、単位：ｇ／日）をとり、縦軸に血清アンジオポエチン−２濃度（血清Ａｎｇー２濃度、単位：ｎｇ／ｍｌ）をとったグラフであるが、図４に示すように、１日尿蛋白量は、中毒症群について、血清Ａｎｇー２濃度と有意な負の相関を示した（ｒ＝０．５５、ｐ＝０．０４０１）。なお、中毒症群について、腎機能パラメータ（血清クレアチニン、クレアチニンクリアランス）と血清Ａｎｇー２濃度との間に相関は認められなかった。【００３０】
（６）考察
以上のことから、非妊娠の女性の血清Ａｎｇー２濃度に対して、正常に妊娠している女性の血清Ａｎｇー２濃度（正常妊娠血清Ａｎｇー２濃度）は著明に上昇しているのに対し、妊娠中毒症に罹患している女性の血清Ａｎｇー２濃度は上昇しておらず、正常妊娠血清Ａｎｇー２濃度に比して極めて低値を示すことがわかった。このことから、妊娠女性の血清Ａｎｇー２濃度を測定し、正常妊娠血清Ａｎｇー２濃度（健常値）と対比することによって、妊娠中毒症の罹患の有無を判定することができると考えられる。
また、上記の結果から、血清Ａｎｇー２濃度と尿蛋白量とは有意な負の相関を示し、妊娠中における糸球体濾過障壁の維持にＡｎｇー２が関与していることが示唆される。
また、妊娠中毒症に将来罹患する可能性を判定するには、臨床データ（尿蛋白量や平均血圧等）は妊娠中毒症の罹患を示唆していないときに、血清（体液）中のアンジオポエチン−２の濃度を測定し、正常妊娠血清Ａｎｇー２濃度（健常値）と対比することによって、妊娠中毒症の将来の罹患可能性があることを判定することができると考えられる。【００３１】
以上のように、実施例にて説明した本方法は、妊娠中の哺乳類（ヒト）を対象として、体液（血清）中のアンジオポエチン−２の濃度を測定し、該測定により得られたアンジオポエチン−２の濃度を健常値（健常群の１８．９±３．２ｎｇ／ｍｌ）と比較することを特徴とする妊娠中毒症の検査方法（第１の本方法）である。そして、測定により得られたアンジオポエチン−２の濃度が健常値（健常群の１８．９±３．２ｎｇ／ｍｌ。６ｎｇ／ｍｌ以上。）よりも低い場合（中毒症群の血清アンジオポエチンー２の濃度は、４．５±０．６ｎｇ／ｍｌ）に妊娠中毒症に罹患していると判定し又は将来罹患すると判定する。
また、実施例にて説明した本方法は、妊娠中の哺乳類（ヒト）を対象として、体液（血清）中のアンジオポエチン−２の濃度を測定する測定ステップと、該測定ステップにより得られたアンジオポエチン−２の濃度を健常値（健常群の１８．９±３．２ｎｇ／ｍｌ）と比較する対比ステップと、該対比ステップの結果に基づき、妊娠中毒症の罹患性の有無を判定する判定ステップ（妊娠中毒症に罹患しているか又は将来罹患するか否かを判定する判定ステップ）と、を有する、妊娠中毒症罹患の検出方法（第２の本方法）である。ここでは判定ステップにおいて、測定ステップにより得られたアンジオポエチン−２の濃度が健常値（健常群の１８．９±３．２ｎｇ／ｍｌ）よりも低い場合（中毒症群の血清アンジオポエチンー２の濃度は、４．５±０．６ｎｇ／ｍｌ）に妊娠中毒症に罹患していると判定し又は将来罹患すると判定する。
具体的には、ここでは血清中のアンジオポエチン−２の濃度が８ｎｇ／ｍｌ未満の妊婦のうち約７７％が妊娠中毒症に罹患しており、６ｎｇ／ｍｌ未満の妊婦のうち約８１％が妊娠中毒症に罹患していた。このため例えば、妊婦の血清中のアンジオポエチン−２の濃度を測定し、血清中のアンジオポエチン−２の濃度が８ｎｇ／ｍｌ未満の妊婦は妊娠中毒症に罹患しているか又は将来罹患する可能性が高いものと判定し、血清中のアンジオポエチン−２の濃度が６ｎｇ／ｍｌ未満の妊婦は妊娠中毒症に罹患しているか又は将来罹患する可能性が非常に高いものと判定することもできる。
また、ここでは体液（血清）中のアンジオポエチン−２の濃度測定（測定ステップ）が、妊娠２０週以降の哺乳類（ヒト）を対象とするＥＬＩＳＡ法を用いた測定ステップである。
そして、ここで用いた使用キットのように、体液中のアンジオポエチン−２の濃度を測定する試薬を含むものは、妊娠中毒症検出用試薬として用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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