(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２個以上の、結合されたＧｎＲＨデカペプチド配列であって、
前記２個以上の、結合されたＧｎＲＨデカペプチド配列は、
*ＡＨＷＳＹｋＬＲＰＧＡＨＷＳＹｋＬＲＰＧＣ＃、
ｐＥＨＷＡＹｋＬＲＰＧＱＨＷＡＹｋＬＲＰＧＣ＃、
ｐＥＨＷＳＡｋＬＲＰＧＱＨＷＳＡｋＬＲＰＧＣ＃、
ｐＥＨＷＳＹｋＡＲＰＧＱＨＷＳＹｋＡＲＰＧＣ＃、
ｐＥＨＷＳＹｋＬＡＰＧＱＨＷＳＹｋＬＡＰＧＣ＃、
ｐＥＨＷＳＹｋＬＲＡＧＱＨＷＳＹｋＬＲＡＧＣ＃、または
ｐＥＨＷＳＹｋＬＲＰＡＱＨＷＳＹｋＬＲＰＡＣ＃からなり、
＃はアミドであり、*はアセチルであることを特徴とするペプチド。
【請求項２】
ＧｎＲＨ−ＩとＧｎＲＨ−IIとの間の識別を可能にする免疫応答を可能にすることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
適切な投与量のペプチドによるワクチン接種後において、検出不可能なテストステロンレベルを考慮したことを特徴とする請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
ｐＥＨＷＡＹｋＬＲＰＧＱＨＷＡＹｋＬＲＰＧＣ＃と、
ｐＥＨＷＳＹｋＬＡＰＧＱＨＷＳＹｋＬＡＰＧＣ＃と、
ｐＥＨＷＳＹｋＬＲＰＡＱＨＷＳＹｋＬＲＰＡＣ＃とからなる群から選択され、
＃はアミドであることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項５】
ｐＥＨＷＳＹｋＬＡＰＧＱＨＷＳＹｋＬＡＰＧＣ＃と、
ｐＥＨＷＳＹｋＬＲＰＡＱＨＷＳＹｋＬＲＰＡＣ＃とからなる群から選択され、
＃はアミドであることを特徴とする請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
二量化または多量化されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項７】
担体化合物と複合されることを特徴とする請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
担体化合物はタンパク質であることを特徴とする請求項７に記載のペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを有するワクチン。
【請求項１０】
アジュバントをさらに有することを特徴とする請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
アジュバントは、油中水エマルションの油相または二重油性エマルションであることを特徴とする請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
ブタの免疫去勢のための単回投与に十分な活性を有することを特徴とする請求項９〜１１のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか１項に記載のワクチンによってもたらされるＧｎＲＨ−IIに対する抗体。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを含むＧｎＲＨ−IIに対するワクチン。
【請求項１５】
薬剤として使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項１６】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドを含む前立腺癌治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＧｎＲＨのイソ型に関する。
ＧｎＲＨ−Ｉ（文字通りＧｎＲＨと通常表される。）は、視床下部からの１０個のアミノ酸からなるペプチド（デカペプチド）である。ＧｎＲＨ−Ｉのアミノ酸配列（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：１）は、下記の３文字コードによって、表されることができる。
0004820047.tif 000002
【０００２】
これに対して、ｐＥがピログルタミン酸で、♯がアミドである、１文字コードにおいては、次のように表されることができる。
0004820047.tif 000003
【０００３】
ＧｎＲＨ−Ｉは、下垂体において、生物活性の血中の濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）の放出増加を引起すよう作用し、次には成長期雄動物の精巣の発達、および雄性ステロイドの合成を促す。成長期雌動物においては、卵巣内の濾胞の発達、雌性ステロイドの合成、および排卵のような、卵巣の発達が促される。
【０００４】
ＧｎＲＨ−Ｉは、担体タンパク質と結合した場合には、動物のワクチン接種に用いられ得ることで知られている。このようなワクチン接種は様々な理由で行われるが、これらの理由のすべてはＧｎＲＨ−Ｉ本来の機能に関連する。知られているように、血中のＬＨおよび／またはＦＳＨの急激な低下は、雄の精巣中での雄性ステロイドまたはアンドロゲン、および精子の産生を抑制し、雌の卵巣中での雌性ステロイドまたはプロゲスターゲン、およびエストロゲンの形成、ならびに濾胞成熟を抑制する。このように、血中のアンドロゲン、プロゲスターゲンおよびエストロゲン量の、去勢による精巣または卵巣の除去によって得られるレベルに匹敵する程度までの減少は、ＧｎＲＨ−Ｉに対する効果的な免疫を動物に受けさせることによって達成され得る。その後多くの場合、雄動物においては、精巣は、アンドロゲン（雄性ステロイドホルモン）の合成および精子の形成がないことによって、ゆっくりと成長するか、または全く成長しないようである。雌の動物においては、卵巣の活性は、エストロゲンおよびプロゲスターゲン（雌性ステロイドホルモン）の合成がないことによって、かつ濾胞成熟および排卵の抑制によって弱まるようである。
【０００５】
近年、ＧｎＲＨの第２の型（ＧｎＲＨ−II）が霊長類の脳内に存在すること（Lescheid et al. 138(1997)5618-5629）、およびこの第２ＧｎＲＨ分子に関する遺伝子がヒトゲノムライブラリーからクローン化されたことが報告された（ＧｎＲＨ−II（ＳＥＱＩＤ  Ｎｏ：２））（White et al. PNAS USA 95(1998)305-309）。哺乳類のＧｎＲＨ−Ｉ（ＳＥＱＩＤ  Ｎｏ：１）は、ほとんど脳外で発現されない。この点で少しの例外が知られている。ＧｎＲＨ−Ｉは、月経周期とともに女性の子宮内膜に存在し（Casan et al. Fertil. Steril. 1998, 70, 102-106）、妊娠中にはヒト胎盤で発現する（Kelly et al. DNA cell Biol. 1991, 10, 411-421）。ＧｎＲＨのｍＲＮＡは、ラットの卵巣、精巣、胸腺、胎盤および視床下部において発見された（Oikawa et al., Endocrinology, 1990, 127, 2350-2356）。ＧｎＲＨの発現は、ブタの免疫組織（脾臓、胸腺およびリンパ球）で検出された（Weesner et al., Life Sci, 1997, 61, 1643-1649）。
【０００６】
ＧｎＲＨ−IIは、脳外の多くの組織で発現され、腎臓、骨髄および前立腺において特に高濃度で発見される。脳以外の様々な組織でのＧｎＲＨ−IIの存在は、ＧｎＲＨ−IIが複数の機能を有し得ることを示唆する。さらに、様々な脊椎動物種を通してＧｎＲＨ−IIペプチドの完全保存された構造は、この神経ペプチドが生命維持に必要な生物活性を保有することを示唆する。しかしながら、今日まで、ＧｎＲＨ−IIの機能は、実際に知られていなかった。Ｔリンパ球およびＢリンパ球のような、分類されたリンパ球のいくつかの類型、ならびに肥満細胞は、ＧｎＲＨおよびＧｎＲＨ様ペプチドを産生する。後者の細胞類型の大多数は、腎臓、骨髄および前立腺において存在し、おそらくこれらの組織での数多いＧｎＲＨの発現に寄与している。ＧｎＲＨ−IIは、ＧｎＲＨ−Ｉと比較して、繁殖に関わらないようである。性腺機能が低下した、ＧｎＲＨ−Ｉ遺伝子を欠いたマウスにおいて、ＧｎＲＨ−II産生細胞は通常のマウスと同じ分布で存在するけれども、このことは、これらのマウスに通常の性腺発達を生じさせるには不十分である（Chen et al. FEBS Letters 435 (1998)199-203）。しかしながら、月経周期の黄体期でのマカクは、ＧｎＲＨ−IIの静脈内投与後に、血漿黄体形成ホルモン濃度の著しい上昇を示した一方で、この上昇は、濾胞期中期に生じなかった（
Lescheid et al. Endocrinol. 138(1997)5618-5629）。
【０００７】
本発明は、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）とも呼ばれるゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の型に対する免疫応答を引出すのに適したペプチドを提供するものである。本発明はまた、このようなペプチドに基づく、免疫原性のある組成物およびワクチンと、薬品と、他の調合薬剤とを提供する。本発明はさらに、哺乳動物の繁殖特性または行動特性に影響を与えるためのＧｎＲＨに対する哺乳類免疫方法、およびブタの肉質を向上する方法で、このようなワクチンまたは調合薬剤の使用を提供する。本発明はまた、ＧｎＲＨ−ＩまたはＧｎＲＨ−IIに対して、選択的な免疫原性のある応答を引出すのに適したペプチドを提供する。さらに、本発明は、ＧｎＲＨ−Ｉおよび／またはＧｎＲＨ‐IIに対する抗体、これらの抗体を含む組成物、および医薬組成物における、または前立腺癌治療用薬剤の調製におけるペプチドの使用方法を提供する。
【０００８】
本発明は、以下において、ＧｎＲＨの異なる型を識別可能なペプチド配列を提供することによって、より適切かつ効果的に、ＧｎＲＨの異なる型に対する免疫応答の変異または差異が利用され得るという見識を提供する。さらに特に、本発明は、ＧｎＲＨ−Ｉに対するワクチンの有効性および選択性の向上が達成され得るという見識を提供する。ＧｎＲＨ−Ｉに対する免疫は、ＧｎＲＨ−Ｉを中和させるのに効果的であり、ゴナドトロピンレベルの低減、および性腺ステロイド合成の阻止をもたらす。しかしながら、ＧｎＲＨ−IIの機能に与える、ＧｎＲＨ−Ｉに対する抗体の生理的影響については、全く知られていない。ＧｎＲＨ−IIは主として腎臓内で合成かつ分泌されるので、ＧｎＲＨ−IIと交差反応する、ＧｎＲＨ−Ｉに対する抗体は、腎臓機能に影響を与え得る。腎臓機能におけるＧｎＲＨ−Ｉ免疫の起こり得る副作用を未然に防止するために、免疫去勢ワクチンの抗原応答を特異的にＧｎＲＨ−Ｉに導くこと、および性腺に関わらないＧｎＲＨ−IIの中和が原因で起こり得る有害な副作用を回避することが望ましい。
【０００９】
性行動をしばしば随伴する、種の繁殖能力だけを無効にする必要があるならば、ＧｎＲＨ−Ｉを特異的に中和する免疫去勢ワクチンを目標とすることが好ましい。したがって、ゴナドトロピン放出ホルモンに対する、好ましくはＧｎＲＨ−Ｉに対して選択的な、選択的免疫にすることが望まれる。
【００１０】
獣医薬において、１００％の効果を有するＧｎＲＨ−Ｉに対する免疫は、去勢や卵巣切除などの抜本的な外科的措置による代わりに、簡易にワクチン接種によって、たとえば雌雄のネコやイヌなどの小家畜動物の不妊化、または雄イヌおよび雄ウシの攻撃性処置のために使用され得る。ＧｎＲＨ−Ｉに対する免疫に関して考え得るその他の理由は、イヌ、ネコおよび雌ウシなどの雌動物の発情、ならびに屠殺用に肥育された雄動物の情動不安を防止することである。
【００１１】
ヒトの健康管理において、ＧｎＲＨ−Ｉおよび／またはＧｎＲＨ−IIに対する免疫は、前立腺癌および乳癌の治療に、必要に応じて下垂体癌治療のいくつかの形態にも用いられ得る。前立腺癌の場合、ＧｎＲＨ−IIは前立腺組織において高度に発現するので、ＧｎＲＨ−ＩおよびＧｎＲＨ−IIの両方を中和させることがより望ましい。
【００１２】
ＧｎＲＨ−Ｉに対するワクチンの別の使用は、畜産の分野、とりわけ屠殺用のブタの肥育においてなされる。性成熟した雄ブタの肉は、特有の臭気、いわゆる雄ブタ腐臭（boar taint）または雄ブタ臭（boar odor）を有する。性成熟したブタの精巣において、動物の脂肪組織に蓄積される、多くのＣ１９Δ１６ステロイドが形成される（Patterson, J. Sci. Food Agric. 19, 31-38(1968); Brooks en Pearson, J. Anim. Sci. 62, 632-645(1986); Claus, Zeitschrift.
Tierzuchtg. Zuchtungsbiol. 93, 38-47(1976); Claus, Acta Endocrinol. (
Copenh.) 91, Suppl. 225, 432-483(1979) ）。これらのステロイドは、主として、肉が加熱されたときに不快な尿様の臭気を形成する原因である（Fuchs,
Swedish J. Agric. Res. 1, 233-287(1971); Bonneau, Livest. Prod. Sci. 9, 687-705(1982) ）。この不快な臭気のために、性成熟した雄ブタの肉は一般的に消費に適さず、輸出に不向きである。屠殺される雄ブタの約１０％は屠殺前にすでに性成熟しているので、これは養豚産業に潜在的に多大な損失を負わせている。
【００１３】
これらの損失を抑制かつ防止するために、ほとんどすべての雄の子ブタが、いずれの形態の麻酔なしに一般的に実行される外科的処置によって、幼年時に去勢される。このような去勢の動物に友好的でない側面の他に、去勢は、感染症と、成長阻害と、未処置の動物に比べて、少なくともこの未処置動物が雄ブタ臭を未だ発していない限り劣る、最終的な肉質とをもたらす（Walstra, Livest. Prod. Sci. 1, 187-96(1974) ）。
【００１４】
動物に友好的な代替策は、ＧｎＲＨ−Ｉに対する免疫、いわゆる免疫去勢による、ブタ下垂体内のＧｎＲＨ−Ｉ濃度の減少にある。このＧｎＲＨ−Ｉレベルの減少は、生物活性ＦＳＨおよびＬＨの濃度の減少を導き、次には成長中の動物の精巣発達を抑制し、かつアンドロステロン、テストステロンおよびエストロゲンを含む精巣ステロイドの合成を抑制するだろう。アンドロステロンのレベルが低い、または検出不可能なレベルまで低減されるので、この方法は、屠殺時の雄ブタにおける雄ブタ臭の発生を防止し、かつ去勢手術を不必要にする（Oonk et al., 1995, Livestock production Science 42, 63-71）。
【００１５】
雄ブタ臭に対する好ましいワクチンへの厳格な要件は、ほとんどのブタにおいて精巣の発達が、雄ブタ臭が屠殺時に発生しないような程度まで遅くされること、およびワクチンが動物の精巣発達を低減させない場合に、このことが、うまく免疫去勢されたブタと比べて非常に大きい精巣寸法によって容易に検出され得ることである。
【００１６】
ＧｎＲＨ−Ｉに対するワクチンの抗繁殖力特性に関する既存の文献および先の特許出願において、ワクチン接種の結果は、様々なようである。これらの研究のほとんどにおいては、ほんの一部のワクチン接種を受けた動物がこのワクチン接種に応答しないこと、または、大量のワクチン、複数のワクチン接種もしくは商業上受入れ難いアジュバントが所望の効果を生じさせるために必要とされること、のいずれかが記載されている（Hoskinson et al., 1990, Austr. J. Biotech. 4, 166-170; Falvo et al., (1986) J. Anim. Sci.68:986-994; Clarke et al., 1998, Endocrinology 139, 2007-2014; Adams T.E. and B.M. Adams, Feedlot performance of steers and bulls active immunized against Gonadotropine-Releasing Hormone, J. Anim. Sci. 1992, 70:1691-1698; Brown et al.,
Immunization of sheep against GnRH-I early in life: effects of
reproductive function and hormones in rams, Journal of rep roduction and Fertility (1994) 101, 15-21; Ferro et al., Immunological castration
using a Gonadotropine-releasing Hormone analogue conjugated to PPD, Food and agricultural immunology, 1995, 7, 259-272; U.S.patent 4,608,251;
Int. patent appl. WO 88/05308）。
【００１７】
いくつかの研究はＧｎＲＨ−Ｉに対するワクチンの１００％の有効性を示唆する一方で、このワクチンは多数の動物に試されなかった（Ladd et al. (1994), Development of an antifertility vaccine for pets based on active
immunization against Luteinizing Hormone releasing hormone, Biology of Reproduction 51, 1076-1083; J.G.Manns and S.R.Robbins (1997), Prevention of boar taint with a recombinant based GnRH vaccine, In: Boar taint in entire male pigs, Proceedings of a meeting of the EAAP working group
゛Production and Utilisation of Meat from Entire Male Pigs", EAAP
Publication No.92, 137-140; ）。その他の研究は、個体値が免疫された対照と処置を受けていない対照との間で明らかな相違を示さなかったので、処置された動物の平均値としてこのワクチンの有効性を報告している（Bonneau et al., J. Anim. Sci. 72, 14-20 (1994); Hennesy et al., 1997. Elimination of boar taint: a commercial boar taint vaccine for male pigs. In: Bonneau, M., Lundstrom, K. and Malmfors, B. (Eds.), Boar taint in entire male pigs. Wageningen Pers, Wageningen, EAAP Publication No.92., 141-145）。
【００１８】
このタイプのワクチンを調製する困難性は、耐性現象を原因とする。ホルモンのような自己物質は、異物と認識されない一方で、むしろ免疫システムに容認される。通常、抗体は、自己物質に対して引出されない。ワクチンが効を奏するために、ワクチンは十分に異物でなければならない。免疫システムが容認しない程度にワクチンが異物である場合にのみ、抗体の産生を生じさせるだろう。しかしながら、逆に、抗体はホルモンをなお認識可能でなければならず、したがってワクチンは異物すぎるに越したことはない。
【００１９】
これらの条件が相互に両立し難いようなので、仮に、このような物質が調製され得るとしても、近年まで確実でなかった。ＧｎＲＨ様ペプチドワクチンを産生する１つの試みは、右旋性アミノ酸による、ＧｎＲＨ−Ｉデカペプチド６位におけるグリシンの置換で構成された（D-Tryp; Chaffaux et al., Recueil de
Medicine Veterinaire 161(2), 133-145, 1985）。しかしながら、この修飾されたＧｎＲＨペプチドを含むワクチン製剤が通常のＧｎＲＨ−Ｉデカペプチドよりもさらに好ましく機能しないことが実証された（欧州特許出願第４６４１２４Ａ号）。
【００２０】
近年、我々はＧｎＲＨ−Ｉに対するワクチン接種を受けたすべての個体において、効果的な抗体応答を引出すことが可能であることを決定的に示した（Meloen et al., Vaccine 12, 741-746 (1994)）。これらの実験において、ブタは、古典的類型のＧｎＲＨ−Ｉワクチン（フロイント（Freund）のアジュバント中で担体タンパク質と結合したＧｎＲＨ−Ｉ）から逸脱するＧｎＲＨ−Ｉワクチン、すなわち２個直列状に並ぶ（タンデム）ＧｎＲＨ−Ｉのワクチンによって、２度ワクチン接種を受けた（欧州特許第０４６４１２４号）。この刊行物において、ペプチドは、次の一般式に従った、少なくとも２個直列状に並ぶ（タンデム）ＧｎＲＨ−Ｉ配列（ＳＥＱＩＤ  Ｎｏ：３）を有することを特徴とすると記載されている。
0004820047.tif 000004
【００２１】
この式においてアミノ酸は３文字コードに従って示され、Ｔｒｐ１およびＴｒｐ２は、トリプトファン（Ｔｒｐ）またはホルミル化されたトリプトファン（Ｎ（インドール）−ホルミル−トリプトファン）であり、ｎは、少なくとも１の値を有する番号であり、Ｘは、アミノ酸ＧｌｙとＧｌｕとの間の直接結合またはスペーサー基のいずれかであり、Ｚ１−Ｇｌｘは、ｐＧｌｕ（ピログルタミン酸）または１個以上の追加のアミノ酸を含む尾部を付着したＧｌｕのいずれかであり、Ｇｌｙ−Ｚ２は、Ｇｌｙ−ＮＨ２、または１個以上の追加のアミノ酸を含む尾部を付着したＧｌｙのいずれかである。この一般式において、Ｘはアミノ酸グリシンとグルタミンとの間で直接結合になることができ、すなわちこれらのアミノ酸は中間リンク（標準のペプチド結合を介すること）なしに直接に連結する。タンデムＧｎＲＨ−Ｉワクチンの発明は、これらのＧｎＲＨ−Ｉ配列がスペーサーを介して結合されるペプチドを含む。スペーサー基の性質は、１つ以上のアミノ酸から、相対的に短いまたは長い炭化水素鎖および他の化合物基または分子まで、多様に変化し得る。上記一般式において、Ｚ１−Ｇｌｘは、好ましくはｐＧｌｕ（ピログルタミン酸）を表す一方で、たとえばペプチドと担体タンパク質との結合に使用されるために、１個以上の追加のアミノ酸を含む尾部を付着したＧｌｎも表し得る。上記一般式において、Ｇｌｙ−Ｚ２は、たとえばＧｌｙ−ＮＨ２を表し、またはたとえばペプチドと担体タンパク質との結合に使用されるために、１個以上の追加のアミノ酸を含む尾部を付着したＧｌｙを表す。好ましくは、Ｇｌｙ−Ｚ２は、Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＮＨ２を表し、Ｃ末端システインはペプチドと担体タンパク質との起こり得る結合のために付加される。
【００２２】
国際特許出願第９６／４０７５５号からは、ＧｎＲＨ−Ｉの変異型に適用されたタンデム二量体原理が、いくつかの低刺激性のアジュバント、すなわちＳｐｅｃｏｌおよび二重油性エマルション中で極めて効果的な、かつ少量でも効果的なワクチンを生じさせたことが判る。この場合、ＧｎＲＨ−Ｉ分子の変異型は、右旋性（Ｄ−）アミノ酸、Ｄ−Ｌｙｓによる、デカペプチド６位のアミノ酸、Ｇｌｙの置換で形成され、続いて、その結果生じるペプチドは、二量化され、かつ一般的な担体化合物、オボアルブミンに結合された。したがって、Ｄ−アミノ酸による当初かつ単一のＧｎＲＨ−Ｉデカペプチド６位ＧｌｙのＤ−アミノ酸置換を用いるワクチンが、当初のＧｎＲＨ−Ｉ配列と比べて免疫原性を弱めたのに対して（Chaffaux et al., Recueil de Medicine Veterinaire 161(2), 133-145, 1985）、タンデム二量体ＧｎＲＨ−Ｉワクチンに適用されたＤ−アミノ酸によるこのような置換は、さらに免疫原性のあるＧｎＲＨ−Ｉワクチン製剤を産生することができた。それにもかかわらず、このワクチン接種方法は、完全な効果を目的として、ワクチンの反復投与を必要とした。本質的に１００％効果のある、ＧｎＲＨ−Ｉに対する哺乳類のワクチンの達成を目的とする追加投与の必要性は、既知のペプチドの不都合である。我々は特定の場合に、（Ｄ−Ｌｙｓ６）ＧｎＲＨ−Ｉタンデム二量体（すなわち、Ｄ−Ｌｙｓ６置換による、および置換無しのＧｎＲＨタンデム二量体）の使用は、非常に低いがなお測定可能な量のテストステロンをもたらすことも発見し、これは望ましくなく、かつ（Ｄ−Ｌｙｓ６）ＧｎＲＨ−Ｉタンデム二量体の不都合である。
【００２３】
本発明は、ペプチド配列であって、ワクチンに用いられたときに免疫去勢に効果的なワクチンとなる、タンデムＤ−Ｌｙｓ６ＧｎＲＨ−Ｉの代替物となるペプチド配列を提供する。
【００２４】
本発明の特徴は、タンデムＧｎＲＨ−Ｉ配列中のアミノ酸が変更され得るとともに、その結果置換されたタンデムＧｎＲＨ−Ｉが、免疫去勢に十分な、ＧｎＲＨ−Ｉに対する免疫原性のある応答をなお産生可能である範囲の決定である。したがって、本発明は、量、活性ともに十分競合的な、ＧｎＲＨ−Ｉに対する抗体の産生を生じさせ得るペプチド配列の産生を提供する。本発明は、タンデムペプチド自体に限定されず、類似の識別応答が、単一のデカペプチドの変異で引出されることができ、または、切取られた、もしくは特定のアミノ酸が除去された、または、他の方法によって、たとえば非自然的発生のアミノ酸またはＤ−アミノ酸の追加によって、特にＧｎＲＨ−ＩまたはＧｎＲＨ−IIとの類似度減少をもたらす一方でその免疫原性を高めるこれらの修飾によって、修飾または誘導されたＧｎＲＨ配列で引出されることができる、と理解されるべきである。
【００２５】
本発明のさらなる特徴は、ＧｎＲＨ−Ｉに対する抗体の産生を選択的に生じさせる一方で、ＧｎＲＨ−IIに対してほとんどまたは全く免疫応答を生じさせないペプチド配列を提供することである。このペプチド配列の好適な実施形態は、ＧｎＲＨ−Ｉに対する抗体の産生を選択的に生じさせるだけでなく、免疫去勢に効果的でもあり、その上ＧｎＲＨ−IIに対する免疫応答が減少するか、または存在しないペプチド配列である。
【００２６】
本発明は、タンデムＧｎＲＨ−Ｉペプチド配列中で、様々なアミノ酸が置換されることができ、結果として自己ホルモンとの類似度減少をもたらすと同時に、ＧｎＲＨ−Ｉ結合抗体を引出すペプチドの能力を維持または増大することを見出した。また、ＧｎＲＨ−Ｉペプチド配列中のアミノ酸の正確な置換は、ＧｎＲＨ−Ｉに対する選択的免疫応答、およびＧｎＲＨ−IIに対する免疫応答の減少または不存在をもたらす。
【００２７】
本発明の特徴において、正確に修飾されたタンデムＧｎＲＨ−Ｉペプチド配列は、雄動物の精巣成長を弱める能力だけでなく、テストステロンレベルを、従来の技術で測定不可能な程度まで本質的に低減する能力をも有するワクチンを提供する。
【００２８】
さらに、これらのペプチド配列から調製されたワクチンは、ほとんどの場合において、従来のＤ−Ｌｙｓ６タンデムＧｎＲＨ−Ｉのような、本質的に１００％の活性を達成するために第２の追加免疫を与える必要性を除去した活性を発現する。本発明の用語での１００％の活性または有効性は、単回のワクチン接種後に従来の技術で本質的に検出不可能なテストステロンレベル、と定義される。
【００２９】
本発明の最も顕著な特徴の１つは、これらの代替的ＧｎＲＨワクチンによる抗体がＧｎＲＨ−ＩとＧｎＲＨ−IIとを識別することである。したがって、本発明に従ったペプチドは、ＧｎＲＨ−Ｉに対する活性の増加または維持を表し、同時にＧｎＲＨ−IIに対する免疫応答の減少または不存在が見出される。これは逆の効果を示すペプチドの産生を可能にし、すなわち、これらはＧｎＲＨ−Ｉに対する免疫応答の減少または不存在を表すと同時に、ＧｎＲＨ−IIに対する活性の増加または維持を表す。このようなＧｎＲＨ−IIに特異的な応答は、妊娠を全くまたはほとんど望まない哺乳類の胚の着床抑制を補助するために使用されるだろう。さらに、このようなＧｎＲＨ−IIに特異的な応答を使用して、ＦＳＨレベルが抑制されることができ、全体的な繁殖力の低減に導く。
【００３０】
本発明の１つの特徴は、修飾されたタンデムＧｎＲＨ−Ｉデカペプチド配列を含むペプチドに関連し、これによって適切な投与量のペプチドによるワクチン接種が、本質的に検出不可能なテストステロンレベルを可能にする。
【００３１】
本発明はまた、少なくとも２個以上の、結合された、任意にスペーサーによって結合されたＧｎＲＨ−Ｉデカペプチド配列を含むペプチドに関し、ＧｎＲＨ−ＩとＧｎＲＨ−IIとを効果的に識別し得る免疫原性のある応答を可能にする。
【００３２】
本発明に従ったペプチドは、十分にホルモン様であるが、同時に免疫システムにとって異物であって、このホルモンに対する抗体の産生を生じさせる能力を高める。
【００３３】
本発明の特徴は、個別のタンデムユニットが、ペプチドまたはペプチド組成物と担体化合物タンパク質とを結合する能力を失わずに、免疫原性をさらに高めるように二量化され得ることである。
【００３４】
国際公開公報第９６／４０７５５号に記載された技術と類似した、二量化、およびタンデムと担体との結合に関する技術が用いられることができる。また、ＧｎＲＨ−ＩまたはIIのペプチド配列の一部のみを含むペプチドが本発明で用いられ得ることも想定される。その例は、ノナペプチドおよびウンデカペプチドである。
【００３５】
本発明に従ったペプチドに用いるリンカーは、本願中に記載されたリンカー、ＳＭＣＣリンカーのようなリンカー、または本技術分野において知られている他のリンカーから選択され得る。
【００３６】
これらのリンカーは、２個以上の二量化されたペプチド配列を結合するために使用される。タンデムペプチド配列中のアミノ酸の置換に使用されるアミノ酸は、好ましくはアラニンのような相対的に簡易なアミノ酸である。そのために、好適な実施形態において、異なるアミノ酸はアラニンである。その他のアミノ酸もまた、タンデムデカペプチド配列中のアミノ酸の置換に使用され得る。好ましくは、同類置換のみが行われる。同類置換は、たとえばかさ高のアミノ酸はかさ高のアミノ酸によって、芳香族アミノ酸は芳香族アミノ酸によって置換されるアミノ酸置換である。これらの概念はこれらの当業者に広く知られている。
【００３７】
スペーサーは本発明に従ったペプチドの間に配置され得る。これは多量体を構成可能である。適切なスペーサーは本技術分野において知られている。
【００３８】
本発明の特徴において、本発明に従ったペプチドは（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：４）によって、または次の１文字コードによって与えられた一般式を有する。
0004820047.tif 000005
【００３９】
この一般式において、ＱはＧｌｎを表し、Ｘに先行され、ここでＸはスペーサーを表す。これらのアミノ酸のうちいくつかは、他のアミノ酸と置換された。この式において、置換位置は太字およびアンダーラインで示される。大文字は左旋性アミノ酸を表し、小文字は右旋性アミノ酸を表し、たとえばＫはＬ−Ｌｙｓ、ｋはＤ−Ｌｙｓを表す。続いてこれらの免疫原性のある応答は、担体、一般にはオボアルブミンと結合されるときに決定され、他の担体、たとえばＫＬＨ、ＢＳＡが使用され得る。
【００４０】
ＧｎＲＨ−IIペプチドの配列（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：２）は、これらのアミノ酸うちいずれのアミノ酸が、免疫応答に基づく効果的な識別が２つの配列ＧｎＲＨ−ＩおよびＧｎＲＨ−IIの間でなお可能な方法で置換され得るかを決定することが明らかであろう。
【００４１】
本発明に従ったＧｎＲＨワクチンによって引起された抗体がＧｎＲＨ−ＩとＧｎＲＨ−IIとを識別したかどうかを決定するために、ＧｎＲＨ抗体結合検定法は、ＧｎＲＨ−Ｉタンデム二量体ペプチドまたはそのアラニン置換類似物に対する抗体が、ＧｎＲＨ−IIと結合するか、または結合しないかを決定するために実行された。血清希釈液は、ＧｎＲＨ−Ｉ、ＧｎＲＨ−II、対照ペプチド、またはペプチドなしのいずれかとともにプレインキュベーションされた。次にヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉは、抗体との結合のために、プレインキュベーションされたペプチドと競合するように加えられた。
【００４２】
この手順は、抗体の特異性が追加免疫後に高まるので、追加免疫の前後に採集された血清に関して実行された。
【００４３】
本発明に従ったペプチドがオボアルブミンとの複合体として使用され（ＯＶＡ複合体）、対照と比較されたとき、すべてが若い雄ブタの免疫去勢で有効性を示した。既知のＧ６ｋ−ＧｎＲＨタンデム二量体のＯＶＡ複合体との比較は（表１参照）、本発明に従ったペプチドが、自己ホルモンとの類似性が減少したにもかかわらず同等または類似の有効性を表すことを示した。本発明に従ったペプチドは、ＧｎＲＨ−ＩとＧｎＲＨ−IIとの効果的な識別を可能とする、免疫原性のある応答を提供する。これらのペプチドは、小さい精巣および低いテストステロンレベルを生じさせる。より詳細には、軽い精巣重量および低いテストステロンレベルを示すペプチドは、Ｒ８Ａ、Ｇ１０ＡおよびＳ４Ａである。ＧｎＲＨ−ＩとＧｎＲＨ−IIとの免疫選択性に基づいて好適なペプチドは、Ｓ４ＡおよびｐＥ１Ａである。
【００４４】
好適な実施形態において、ペプチドは、次式からなるグループから選択される。
0004820047.tif 000006
【００４５】
本発明に従ったペプチドにおいて、タンデムユニットの二量化は、たとえばカルボキシ末端またはアミノ末端を介して行われ得る。２つのタンデムユニットは、たとえばジスルフィド架橋またはチオエーテル架橋によって二量化され得る。タンデム配列を二量化するために、２１位のＣｙｓを用いることができ、またはＣｙｓを１位のグルタミン酸の前に合成することができる。ＧｎＲＨタンデムユニットを二量化または多量化するためのその他の方法は、先行技術において発見され得る。もし、２１位のＣｙｓが二量化に関与することによって結合に用いられることができないなら、結合され得るタンデムの別のアミノ酸を同様に使用することができる。二量化または多量化が、担体化合物が複合され得る、利用可能な部位の損失を招く場合、置換するアミノ酸の選択を、適切な側鎖を有するアミノ酸に限定するのは十分可能である。このような置換するアミノ酸は、たとえばＬ−ＬｙｓもしくはＤ−Ｌｙｓ、Ｌ−ＧｌｕもしくはＤ−Ｇｌｕ、または担体化合物に結合可能な側鎖を含む別のアミノ酸になり得る。Ｌ−置換およびＤ−置換は両者ともに同一の効果を有することが検査かつ発見された。
【００４６】
さらに特に、本発明に従ったこのような好適なペプチドの例は、次式に従ったＤ−Ｌｙｓ６タンデムＧｎＲＨ二量体（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：８）である。
0004820047.tif 000007
【００４７】
この本発明の実施形態の例において、タンデム二量体のアミノ酸の１つを別のアミノ酸に置換することが可能である。
【００４８】
アミノ酸置換を含む、その他のペプチド、ペプチド配列、または、単量化、二量化もしくは多量化されたＧｎＲＨタンデムユニットが存在する結合されたペプチド配列もまた、本発明の一部である。
【００４９】
本発明はさらに免疫原性のある形態にされたペプチドを含む組成物を提供する。当業者が知っているように、それ自身免疫原性のない物質の免疫原性のある形態を産生する種々の方法が存在する。１つの可能性は、本発明に従ったペプチドを適切な担体タンパク質に結合することである。適切な担体タンパク質とは、オボアルブミン、ＫＬＨ、またはＢＳＡである。タンデムのペプチドにおいて、システインまたはＣ末端が化学結合に適切に使用され得る。タンデム二量体ペプチドにおいて、結合はまた、（Ｄ−）リシン、（Ｄ−）グルタミン、またはペプチド配列中のアミノ酸を置換する他の修飾されたアミノ酸の、修飾されていない側鎖、または修飾された側鎖によって行われ得る。適切な結合方法および担体タンパク質は当業者によく知られている。
【００５０】
本発明に従えば、オボアルブミンのようなタンパク質とペプチドまたはペプチド組成物との免疫原性のある複合体を含むことを特徴とする好適な組成物が存在する。
【００５１】
本発明に従った組成物はワクチンの形態で使用されることができる。この目的のために、この組成物は投与に適した形態で産生され得る。本発明に従ったワクチンの投与によって、ＧｎＲＨに対する免疫原性のある応答、好ましくはＧｎＲＨ−Ｉに対する免疫原性のある応答が生じる。
【００５２】
したがって、本発明はまた、本発明に従ったワクチンによる哺乳類のワクチン接種を通じて、ＧｎＲＨ−Ｉに対する哺乳類の免疫方法を提供する。好適な実施形態において、本発明は、本発明に従ったワクチンによる、ＧｎＲＨ−Ｉに対する哺乳類の選択的免疫方法を提供する。
【００５３】
もちろん、本発明に従ったワクチン製剤は、少なくとも１つの免疫アジュバントと組合わされることができる。適切な免疫アジュバントは当業者に知られている。本発明に従った好適なアジュバントはＳｐｅｃｏｌまたは二重油性エマルションとすることができる一方、全くまたは低刺激にしか副作用を引出さない他のアジュバントも同様に使用され得る。本発明は、脊椎動物の広範囲、特に哺乳類から選択された個体のＧｎＲＨ−Ｉに対する免疫方法に使用され得る。本発明の好適な実施形態において、ワクチンは単回投与で投与されることができ、２回投与の形態で投与されなければならない現在知られているワクチンと同一の有効性を有する。好ましくは選択的な、ＧｎＲＨ−Ｉに対する免疫は、たとえば、雄雌のネコやイヌのような小家畜動物などの不妊化、または雄イヌおよび雄ウシの攻撃性処置に使用され得る。その他の本発明によるＧｎＲＨ−Ｉに対する免疫の考え得る理由は、イヌ、ネコおよび雌ウシのような雌動物の発情を防止すること、および屠殺用に肥育された雄動物における情動不安を防止または処置することである。ヒトの健康管理において、好ましくはＧｎＲＨ−ＩまたはＧｎＲＨ−IIのいずれかに対して選択的な、ＧｎＲＨに対する免疫は、前立腺癌および乳癌の治療に、必要に応じて下垂体癌治療のいくつかの形態にも使用され得る。
【００５４】
好適な実施形態は、ブタの肉質を向上する方法であって、ブタは、本発明に従ったワクチン製剤によってワクチン接種を受ける。本発明は、以下の実験部において示される。
【００５５】
Ｉ．ブタの免疫去勢
（材料および方法）
材料
アセトニトリル（ＡＣＮ）は、ＨＰＬＣ−Ｓグラジエントグレードであって、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびピペリジンは、ペプチド合成グレードであり、Biosolve（Valkenswaard, NL）からすべて取得された。Ｎ-ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、および２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸（ＨＢＴＵ）は、Richelieu Biotechnologies Inc.（Hamon, Canada）から取得された。ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＢＯＰ）は、
Novabiochem（Laufelfingen, Switserland）から取得された。チオアニソール（ＴＡ）、エタンジチオール（ＥＤＴ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ペンタンおよびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）は、プロアナルシス（pro-
analysis）グレードであり、Merck（Darmstad, Germany）から取得された。ジエチルエーテルは、使用前に活性化した塩基性酸化アルミニウムのカラムで精製された。アミノ酸誘導体および樹脂は、Bachem Feinchemicalien AG（Bubendorf, Switzerland）から取得された。
【００５６】
多重ペプチド合成
Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｍｉｃｒｏｌａｂ  ２２００は、ペプチド合成のために３０ｍｍｏｌの樹脂を含有する洗浄溶媒および試薬を、フィルタを有する４０の個別の４ｍＬカラムを備えたラックに供給するようにプログラムされた。これらのカラムを、真空吸引によって各ステップ後にドレン排出した。この結合サイクルは、二重結合ステップを使用するＦｍｏｃ化学反応に基づいた。
【００５７】
１．ＮＭＰ洗浄（１ｍＬ）
２．３０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＮＭＰ（３分、０．５ｍＬ）
３．３０％（ｖ／ｖ）ピペリジン／ＮＭＰ（１７分、０．５ｍＬ）
４．ＮＭＰ洗浄（５×１ｍＬ）
５．二重結合（２×３０分）
６．ＮＭＰ洗浄（２×１ｍＬ）
【００５８】
結合ステップ：ＮＭＰ中のＦｍｏｃアミノ酸（０．４Ｍ、０．２５ｍＬ）、ＤＭＦ中の（０．４５Ｍ、０．２２ｍＬ）ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ、およびＮＭＰ中のＤＩＥＡ（２Ｍ、０．２ｍＬ）を、反応槽に搬送し、３０〜５０分間反応に置いた。この反応混合物をドレン排出し、結合手順を一度反復した。
【００５９】
最終のアミノ酸を結合した後、Ｆｍｏｃ基を、３０％のピペリジン／ＮＭＰで開裂し、これらのペプチドを、洗浄し、ＮＭＰ／無水酢酸／ＤＩＥＡ（１０／１／０．２）を用いて３０分アセチル化し、再度洗浄し、乾燥した。これらのペプチドを、保護を除去して、１．５ｍＬのＴＦＡ／フェノール／ＴＡ／水／ＥＤＴ（１０／０．７５／０．５／０．５／０．２５）（試薬Ｋ）の混合液中において２時間開裂した。この開裂混合物を濾過し、樹脂を０．５ｍＬのＴＦＡで洗浄し、ペプチドを１３ｍＬのペンタン／ジエチルエーテル（１／１）を加えて沈殿させた。遠心分離の後、この沈殿物を再度ペンタン／ジエチルエーテルによって抽出した。この沈殿物を乾燥し、ＡＣＮ／水（１／１）中において溶解し、凍結乾燥した。この手順は、分子量によって異なる２５〜７０ｍｇのペプチドが得られる。
【００６０】
１文字アミノ酸コードにおける、合成されたペプチドの配列は表１に要約される。
【００６１】
【表１】
0004820047.tif 000008
【００６２】
分析用ＨＰＬＣ
ペプチドの分析のために、２台のウォーターズ（Waters）社ポンプ５１０、ウォーターズ社グラジエントコントローラ６８０、ウォーターズ社ＷＩＳＰ７１２オートインジェクタ、およびウォーターズ社９９１フォトダイオードアレイ検出器からなる、ＬＣ−ＭＳ（電気スプレー）システムを使用した。質量分光計は、陽イオンモードで使用される、Ｍｉｃｔｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  II  ｓｑであった。産生物を、２１５ｎｍで１ｍＬ／ｍｉｎのウォーターズ社Ｄｅｌｔａ  Ｐａｋ  Ｃ１８−１００ａ（３．９×１５０ｍｍ，５ｍｍ）カラムにおいて、３０分で、０．０５％のＴＦＡを有する１０％のＡＣＮ／水から０．０５％のＴＦＡを有する７０％のＡＣＮ／水まで、直線的な勾配で分析した。すべての産生物は、ピーク領域によると４０〜７０％の純度であった。
【００６３】
二量化
粗産生物を、水中２０％のＤＭＳＯ中でこれらの産生物を溶解することで二量化した。そのｐＨは、１％のＮＨ４ＨＣＯ３によって、純粋な溶液を維持する５〜６に調節された。ｐＨの修正は１％の酢酸によってなされた。室温で少なくとも５時間攪拌した後、これらの産生物を精製まで−２０℃で保存した。
【００６４】
調製用ＨＰＬＣ
ペプチド精製を、Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ  Ｃ１８−１００Ａ（１５ｍｍ）材料で満たされた保護カートリッジ（４０×２１０ｍｍまたは２５×２１０ｍｍ）を付加した２つのＰｒｅｐＰａｋカートリッジを有するウォーターズ社ＲＣＭモジュールを備えた、ウォーターズ社Ｐｒｅｐ４０００液体クロマトグラフを使用して実行した。一般に、精製は、分析用ＨＰＬＣと同一の溶離剤を使用して行われたが、０．５％ＡＣＮ／分の勾配速度、および４０または１００ｍＬ／分の流量で行われた。ペプチドを、調製用細胞を有するウォーターズ社４８６分光光度計を使用して２１５〜２３０ｎｍで検出した。これらのペプチドを、凍結乾燥し、純度は少なくとも９０％になるように測定された。
【００６５】
複合体調製
Ｎ−エチル−Ｎ＝（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（“ＥＤＣ”）を介する、ニワトリ卵アルブミン（“ＯＶＡ”）との複合のために、同質量のペプチドおよび担体タンパク質を、ミリＱ水中で個別に溶解し、両溶液をよく混合した。次に、相当質量の１０倍過剰のＥＤＣを、ミリＱ水中で溶解した。続いて、この溶液を連続攪拌の下でペプチド／ＯＶＡの溶液にゆっくりと加えたが、この最終溶液のｐＨは５である。少なくとも６時間ゆっくりと振盪した後、この産生物を、２日間、３００倍過剰のミリＱ水に対して透析（ＭＷカットオフ１０，０００）した。水を１日に２度清新にした。負荷を、複合体および担体タンパク質の比較アミノ酸分析から算定した。アミノ酸分析を、１時間１５０℃での、６Ｎ ＨＣＬを使用するＰｉｃｏ−Ｔａｇワークステーションにおける加水分解、およびイソチオシアン酸フェニルによる誘導体化の後、ウォーターズ社Ｐｉｃｏ−Ｔａｇシステムによって実行した。
【００６６】
このアミノ酸分析によると、この複合体は、担体タンパク質１ｍｇあたり０．３ｍｇ〜０．５ｍｇのペプチドを含有し、例外的に、Ｐ９Ａ−Ｇ６ｋ−ＧｎＲＨタンデム二量体の複合体は、オボアルブミン１ｍｇあたり０．１６ｍｇのペプチドしか含有しなかった。
【００６７】
Ｇ６ｋ−ＧｎＲＨタンデム二量体のＯＶＡ複合体は、Ｇ６ｋ−ＴＤによって略記される。アラニン置換による複合体は、置換される原ＧｎＲＨ配列中のアミノ酸と、その位置と、アラニン置換に関するＡとによって略記される。たとえばｐＥ１Ａ−Ｇ６ｋ−ＧｎＲＨタンデム二量体のＯＶＡ複合体はｐＥ１Ａである。
【００６８】
エマルション調製
薄い鉱油中で２つのデタージェントからなるＳｐｅｃｏｌ（Special Oil
Phase, ＩＤ−ＤＬＯ, Lelystad, The Netherlands）を、油相として使用した（Bokhout et al.,1981）。油中水（ＷＩＯ）エマルションを、攪拌棒を備えたＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ（Janke and Kunkel, Staufen, Germany）を使用して調製した。油相Ｓｐｅｃｏｌ（５容量部）を、２５ｍＬガラス容器に移動し、ミリＱ水中の複合体からなる水相（４容量部）を、エマルションを攪拌しながらゆっくりと加えた。この水相を加えた後、エマルションを同じ回転速度（１５０００ｒｐｍ）で３０秒間攪拌した。エマルションを、安定性を検査するために４℃で夜通し保存し、次の日動物に投与した。
【００６９】
動物
約１０週齢の雄の子ブタを、この実験に関与させた。雑種の子ブタを、半分の小割板で作られた囲いに収容し、任意に飼料および水への通路を与えた。
【００７０】
免疫
これらの小ブタを、不規則に処置に割当て、１つの処置につき６頭または７頭であった。すべての動物に、二量化されたタンデムＧｎＲＨの複合体（すなわち６２μｇペプチド）を含むエマルション、または抗原なしのエマルションを２ｍＬ注射した。注射は、実験開始時（０日）および７週間後（７ｗｐｖ）に首に投与された。最初の免疫から１３週間後（１３ｗｐｖ）、すべての動物を屠殺した。
【００７１】
測定および血液サンプル採取
動物を、０日と、７ｗｐｖおよび１３ｗｐｖとに体重測定した。精巣寸法を、０日と、７週間、１０週間および１３週間後とに、バーニアカリパスで精巣の長さを測定することで決定した。精巣寸法は、両方の精巣の平均で記録された。
【００７２】
血液サンプルを、精巣寸法が測定された同日に、また、最初の免疫から４週間後に、頚静脈の穿刺を介して採取した。血液サンプルは、４℃で夜通し維持され、次の日、血清が遠心分離（１５００ｇ、１５分）によって得られた。血清サンプルを、検査まで−２０℃で保存した。
【００７３】
屠殺後の評価
屠殺後、精巣を除去し、精巣上体を切除し、測量された。精巣重量は両方の精巣の平均で記録された。
【００７４】
ペプチド抗体
免疫に使用されたペプチドに対する抗体をＥＬＩＳＡで測定した。ペプチドを、グルタルジアルデヒド（ＧＤＡ）を使用してマイクロタイタープレートのウェル内で被覆した。ＧＤＡは、室温で４時間０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ５）中で０．２％のＧＤＡをインキュベーションすることによって、ウェルの表面に被覆された。プレートを、１０分間に３回、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８）によって洗浄処理した。３７℃で３時間インキュベーションすることによって、１００ｍＬのリン酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８）中の１μｇのペプチドをウェル毎に被覆した。プレートを、使用されるまで−２０℃で保存した。解凍済みのプレートを、１Ｌの水あたり、８．２ｇのＮａＣｌと、１．１５ｇのＮａ２ＨＰＯ４.２Ｈ２Ｏと、０．２０ｇのＮａＨ２ＰＯ４.２Ｈ２Ｏと、５ｍＬの１０％Ｔｗｅｅｎ  ８０水溶液とを含有するミリＱ水で、１０分間に３回洗浄処理した。
【００７５】
抗ペプチド血清の連続血清希釈液は、２５℃で１時間、被覆されたペプチドと反応することを許された。１０分間３回の洗浄処理の後、ホースラディッシュペルオキシダーゼと結合されたｇｏａｔ−ａｎｔｉ−ｐｉｇ  ＩｇＧ（Dako,
Glastrup, Denmark）を、１時間第２抗体として導入し、ＡＢＴＳ（
Boehringer, Mannheim, Germany）（２０ｍＬのＨ２Ｏ２（３％溶液）に対して１０ｍＬの基質緩衝液中での２５０ｍＬ（２ｇ／１００ｍＬ））を基質として使用した。吸収値は４０５ｎｍで測定された。
【００７６】
ＧｎＲＨ抗体
ＧｎＲＨに対する抗体を、Meloenらの記載のように決定した（Vaccine 12,741-746(1994)）。ブタの抗血清の連続希釈液は、１２５Ｉ−ＧｎＲＨとの結合を許された。力価は、所定の血清希釈液における１２５Ｉ−ＧｎＲＨの結合割合として表される。
【００７７】
テストステロン
血清中のテストステロンレベルを、DPC laboratories（Los Angeles, CA）から購入されたＣｏａｔ−ａ−Ｃｏｕｎｔキットを使用して測定した。
【００７８】
（結果）
精巣寸法および精巣重量
第１免疫から７週間後、免疫去勢効果は、精巣寸法を測定することですでに観察されることができた。３つの処置（Ｒ８Ａ、Ｇ１０ＡおよびＧ６ｋ−ＴＤ）は、追加免疫時に平均精巣寸法の増加（＜１０ｍｍ）をほとんど示さなかった。これらの処置は、屠殺時に７０ｇ以下の精巣重量で成功した。軽い精巣重量の点で効果的だったその他の処置は、ｐＥ１ＡおよびＳ４Ａである一方で、Ｙ５Ａ、Ｌ７ＡおよびＰ９Ａのグループにおいては、それぞれ２頭、１頭および１頭の動物が免疫に反応しなかった（表２）。免疫去勢された動物の個別の精巣重量は７０ｇを超えず、免疫去勢された動物と免疫去勢されなかった動物との間で明らかな相違をもたらした。
【００７９】
【表２】
0004820047.tif 000009
【００８０】
抗体応答
免疫に使用されたペプチドに対する平均抗体力価は表３に示される。Ｈ２ＡおよびＰ９Ａによって処置されたブタの平均抗体力価は、その他の処置のペプチド抗体力価よりも低い。
【００８１】
異なるペプチドに対する個体動物の抗体力価は２〜４の範囲だった。免疫去勢されなかった処置動物の中では、最も低い抗ペプチド力価が示された。Ｈ２ＡおよびＷ３Ａで処置された動物は免疫去勢されなかったけれども、著しい抗ペプチド力価が存在した。
【００８２】
２０００分の１の血清希釈液におけるＧｎＲＨ抗体結合割合は、Ｈ２ＡおよびＷ３Ａのグループにおいて、検出されないか、または低かった。しかしながら、２００分の１の血清希釈液において、抗体は、グループＨ２Ａのすべての動物、およびグループＷ３Ａの３頭の動物の血清中で検出可能だった。
【００８３】
低い平均ＧｎＲＨ抗体力価を有する動物は、免疫去勢されなかった。高い抗体力価は、去勢が成功した動物を常にもたらした。中間の抗体力価を有する動物の精巣重量は１５〜３００ｇと様々だった。
【００８４】
処置毎の平均ＧｎＲＨ抗体力価は、処置毎の精巣重量（中央値）と明らかな関係を示した（表３）。
【００８５】
テストステロン
処置が成功したすべての動物のテストステロンレベルは低く、第２免疫後に低減された。しかしながら、大部分の動物は、早くも最初の免疫から４週間後に、検出不可能なテストステロンレベルを示すことによって去勢効果を示した。これらの動物の精巣重量は、８〜３６ｇと様々だった。
こうして大部分の動物は、単回投与後に効果的に免疫された。
【００８６】
屠殺時のテストステロンレベルはすべての免疫去勢された動物に関して低かったけれども、６５および７０ｇの精巣重量を有する２頭の動物は、それぞれ３．８０および１．１８ｐｍｏｌ／ｍＬの著しい血清テストステロンレベルを有した。
【００８７】
検出不可能なテストステロンと相俟って軽い精巣重量を生じさせたペプチドは、ブタの免疫去勢に関して最も効果的なペプチドとみなされる。これらのペプチドは、Ｓ４Ａ、Ｒ８ＡおよびＧ１０Ａである。
【００８８】
免疫去勢されなかったブタの屠殺時のテストステロンレベルは、０．４６〜４８．９１ｐｍｏｌ／ｍＬと様々だった。
【００８９】
【表３】
0004820047.tif 000010
【００９０】
II．Ｌ−アミノ酸によるＤ−アミノ酸の置換
タンデム二量体の６位、１６位、２７位および３７位におけるＤ−リシン（ｋ）を、Ｌ−リシンによって置換し、その結果生じたペプチドを検査した（表４）。
【００９１】
【表４】
0004820047.tif 000011
Ｌ−リシンによるＤ−リシンの置換はワクチン抗原の有効性を変じない。
【００９２】
III．ＧｎＲＨ−ＩおよびＧｎＲＨ−IIの識別
ＧｎＲＨ抗体結合競合的ラジオイムノアッセイを、Ｇ６ｋ−ＧｎＲＨタンデム（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）二量体ペプチドまたはそのアラニン置換類似物に対する抗体がＧｎＲＨ−IIに結合しているか、ＧｎＲＨ−IIに結合していないかを決定するために実行した。血清希釈液を、ＧｎＲＨ−Ｉ、ＧｎＲＨ−II、対照ペプチド、またはペプチドなしのいずれかとともにプレインキュベーションした。次に、ヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉを、抗体と結合するために、プレインキュベーションされたペプチドと競合するように加えた。
【００９３】
この手順は、抗体の特異性が抗体成熟に起因して追加免疫後に高まり得るので、追加免疫の前後に収集された血清に関して実行された。
【００９４】
（材料および方法）
７ｗｐｖの血清サンプル、および１０ｗｐｖ（追加免疫３週間後）出血による血清サンプルを、０．４％ＢＳＡ（希釈緩衝液）によってＰＢＳ中で１００分の１〜１００００分の１に希釈した。５０μＬの血清希釈液をマイクロウェルプレートに入れ、２５μＬのペプチド溶液（１ウェルあたり希釈緩衝液中、０．２５、２．５または２５ｐｍｏｌのペプチド）を加えた。この混合液を、４℃で２４時間インキュベーションした。次の日２５μＬのヨウ化ＧｎＲＨ（約１３０００ｃｐｍ）を加え、夜通しの保存（４℃）後、結合されていないペプチドを、チャコールによって結合ペプチドと分離した。遠心分離の後、浮遊物を分離、計数し、抗体と結合されたヨウ化ＧｎＲＨの割合を算定した。
【００９５】
（結果）
ヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの抗体結合を、７ｗｐｖで得られたＨ２ＡおよびＷ３Ａ血清を除いたすべての処置の血清に関して実証した。ＧｎＲＨ−Ｉとの競合は、ヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの結合の劇的な減少をもたらし（図１参照）、その反面ＧｎＲＨ−IIによるヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの置換はかなり可変であった。予想されたとおり、どの抗血清も対照ペプチドと結合しなかった。１０ｗｐｖの血清に関して、ほとんどすべての処置の血清において、ヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉは、８０％以上についてＧｎＲＨ−Ｉによって置換された（図２Ａ）。ヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉと結合する抗体に関する、ＧｎＲＨ−IIによる競合は、Ｒ８Ａ、Ｒ９Ａ、Ｇ１０ＡおよびＧ６ｋ−ＴＤの処置のほとんどすべての血清と、Ｙ５ＡおよびＬ７Ａの処置の半分の血清とにおいて、ヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの全体または部分置換を生じさせた（図２Ｂ）。しかしながら、ｐＥ１Ａ、Ｈ２Ａ、Ｗ３ＡおよびＳ４Ａグループの実質的にすべての動物の抗体が、ＧｎＲＨ−IIと完全に結合しておらず、したがってＧｎＲＨ−Ｉに特異的であった。追加免疫前（７ｗｐｖ）血清の置換観察の結果は、１０ｗｐｖ血清と異なった。さらに、すべての処置（低い抗体力価を原因とするＨ２ＡおよびＷ３Ａを除く。）の血清は、ＧｎＲＨ−Ｉによるヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの置換によって決定されたように、ＧｎＲＨ−Ｉを認識した（図３Ａ）。しかしながら、１０ｗｐｖの血清（図２）とは対照的に、ｐＥ１ＡおよびＳ４Ａを含む、すべての処置の血清の大部分は、ＧｎＲＨ−IIを認識した（図３Ｂ）。したがってａＥ１ＡおよびＳ４Ａの７ｗｐｖ血清はＧｎＲＨ−Ｉに特異的ではないけれども、ＧｎＲＨ−IIに特異的でないＧｎＲＨ−Ｉに関する特異性は、追加免疫３週間後（１０ｗｐｖ）に完全に確立される。
【００９６】
追加免疫前の血清によって得られた抗体結合の結果は、１０ｗｐｖの血清と異なった。ｐＥ１ＡおよびＳ４Ａの処置の抗血清を、ＧｎＲＨ−ＩまたはＧｎＲＨ−IIを認識する能力に関して検査した（図３参照）。両ペプチドに関して、７頭のうち６頭の動物からの１０ｗｐｖの血清は、ＧｎＲＨ−IIと結合しなかった。追加免疫前に得られたｐＥ１Ａの血清は、７頭のうち４頭の動物がＧｎＲＨ−IIとの結合を示した。２つの血清はＧｎＲＨ−IIを認識せず、１つの血清はヨウ化ＧｎＲＨとの結合を示さなかった。Ｓ４Ａの追加免疫前血清の結果は、１０ｗｐｖの結果に矛盾している。Ｓ４Ａグループのすべての動物の追加免疫前血清は、ＧｎＲＨ−ＩおよびＧｎＲＨ−IIの両方に類似するヨウ化ＧｎＲＨの結合能力の抑制によって、ＧｎＲＨ−IIを認識した。
【００９７】
IV．ＧｎＲＨタンデム二量体の複合体によるブタの免疫去勢
実験例Ｉに記載されたアラニンスキャンと同様に、ＧｎＲＨタンデムペプチドのアラニン置換ペプチドを合成した（表５）。ペプチドを、二量化し、精製し、かつ前述したＯＶＡと複合した。
【００９８】
【表５】
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【００９９】
グループあたり４頭または５頭のブタを、Ｓｐｅｃｏｌアジュバント中の前記複合体の６２μｇペプチド相当物で免疫した。この複合体の免疫去勢効果は図４に示される。免疫に使用された、ペプチドに対する抗体力価は、ｐＥ１Ａ、Ｈ２ＡおよびＲ８Ａで処置されたブタに関して低く、その反面抗ペプチド抗体が、Ｗ３Ａ、Ｓ４Ａ、Ｙ５ＡおよびＧ１０Ａグループに関して高く評価された。ＧｎＲＨ−Ｉに対する抗体力価は、Ｗ３Ａで処置されたブタの抗体力価を除いて、抗ペプチド抗体力価と一致した。Ｗ３Ａで処置されたブタに関して、高い抗ペプチド抗体をこれらの動物において決定したけれども、ヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉに対する抗体の結合能力が低いことを発見した。
【０１００】
Ｖ．ＧｎＲＨタンデム二量体の抗血清のＧｎＲＨ−ＩとＧｎＲＨ−IIとの識別  ラジオイムノアッセイにおけるヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの抗体結合を、アラニン置換によるＧｎＲＨタンデム二量体のペプチドで処置された、すべての動物の１０ｗｐｖの血清（１００分の１〜１００００分の１に希釈）に関して観察した。ＧｎＲＨ−Ｉとの競合は、ヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの結合の劇的な減少を生じさせた。ほとんどすべての動物の血清において、ヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉは、８０％以上についてＧｎＲＨ−Ｉによって置換された（図５Ａ）。ＧｎＲＨ−IIによるヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの置換は、グループの中でもかなり可変であった。それはＹ５Ａ、Ｌ７Ａ、Ｒ８Ａ、Ｐ９ＡおよびＴＤの処置のほとんどすべての血清において、ヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの全体または部分置換を生じさせ、その反面、残りの処置の多くの血清については、ＧｎＲＨ−IIによるヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの部分置換のみが決定されるか、または全く置換されなかった。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  抗血清とヨウ化ＧｎＲＨのＧｎＲＨ（白丸）、ＧｎＲＨ−II（黒丸）、対照ペプチド（黒角）およびペプチドなし（星印）との結合に関する比較。血清は１０，０００分の１に希釈し、添加するペプチド濃度を上昇させていった（ウェルあたり０．２５，２．５，２５ｐｍｏｌ）。グラフＡ〜Ｃにおいて、ＧｎＲＨ−IIに関して結合能力が増加している血清が示されている。横軸：ペプチド量（ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ）縦軸：結合能力（数／分）
【図２】  棒の各束の下に示された、アラニン置換したＧ６ｋ−ＧｎＲＨタンデム二量体ペプチドによる免疫後の、個別の動物（各棒は１頭の動物を表す。）の血清に関する、ＧｎＲＨ−１（図２Ａ）およびＧｎＲＨ−II（図２Ｂ）によって置換されたヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの割合。追加免疫３週間後（１０ｗｐｖ）に得られた抗血清を、１対１００〜１対１００００に希釈した。置換用のＧｎＲＨ−ＩおよびＧｎＲＨ−IIを、１ｍＬあたり２５０ｐｍｏｌの濃度で加えた。
図２Ａ  横軸：免疫に使用されたペプチド  縦軸：ＧｎＲＨ−Ｉによるヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの置換の割合
図２Ｂ  横軸：免疫に使用されたペプチド  縦軸：ＧｎＲＨ−IIによるヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの置換の割合
【図３】  棒の各束の下に示された、アラニン置換したＧ６ｋ−ＧｎＲＨタンデム二量体ペプチドによる免疫後の、個別の動物（各棒は１頭の動物を示す。）の血清に関する、ＧｎＲＨ−Ｉ（図３Ａ）およびＧｎＲＨ−II（図３Ｂ）によって置換されたヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの割合。抗血清を、追加免疫時に得（７ｗｐｖ）、１対１００〜１対１０，０００に希釈した。置換用のＧｎＲＨ−ＩおよびＧｎＲＨ−IIを、１ｍＬあたり２５０ｐｍｏｌの濃度で加えた。Ｈ２ＡおよびＷ３Ａ血清のデータは、抗体力価が低すぎて置換を測定できなかったため、含まれていない。
図３Ａ  横軸：免疫に使用されたペプチド  縦軸：ＧｎＲＨ−Ｉによるヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの置換の割合
図３Ｂ  横軸：免疫に使用されたペプチド  縦軸：ＧｎＲＨ−IIによるヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの置換の割合
【図４】  オボアルブミンおよびアジュバントとして使用されるＳｐｅｃｏｌに結合されたＧｎＲＨタンデム二量体のペプチド（６２μｇ）で免疫されたブタのいくつかのグループの免疫去勢有効性スコア。最初のペプチドは、ＧｎＲＨタンデム（Ｃｙｓ−ＯＨ）二量体（略記Ｃｙｓ−ＯＨ）であった。このペプチドについて、すべてのアラニンスキャンされたペプチドを免疫に使用した。免疫有効性を４段階で評価した（１＝免疫去勢が生じなかった、２＝少数のブタが免疫去勢された、３＝多数のブタが免疫去勢された、４＝すべてのブタが免疫去勢された）。
【図５】  棒の各束の下に示された、アラニン置換したＧｎＲＨタンデム二量体ペプチドによる免疫後の、個別の動物（各棒は１頭の動物を表す。）の血清に関する、ＧｎＲＨ−１（図５Ａ）およびＧｎＲＨ−II（図５Ｂ）によって置換されたヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの割合。追加免疫３週間後（１０ｗｐｖ）に得られた抗血清を、１対１００〜１対１００００に希釈した。置換用のＧｎＲＨ−ＩおよびＧｎＲＨ−IIを、１ｍＬあたり２５０ｐｍｏｌの濃度で加えた。
図５Ａ  横軸：免疫のために使用されるペプチド  縦軸：ＧｎＲＨ−Ｉによるヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの置換の割合
図５Ｂ  横軸：免疫のために使用されるペプチド  縦軸：ＧｎＲＨ−IIによるヨウ化ＧｎＲＨ−Ｉの置換の割合
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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