(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体のヒト型結核菌（M. tuberculosis）への曝露と、被験体のウシ型結核菌のカルメット-ゲラン桿菌株（BCG）への曝露とをin vitroで区別するための検査方法であって、被験体由来の細胞集団を配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドMTBN4に応答するCD4 Tリンパ球の存在について検査するステップを含み、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるMTBN4に応答するCD4 Tリンパ球の存在が、該被験体がヒト型結核菌に曝露されたことがあるがヒト型結核菌への曝露なしにBCGに曝露されたことがないことを示すものである、上記方法。
【請求項２】
前記検査で用いる前記ポリペプチドが、ヒト型結核菌複合体の少なくとも1種の他のポリペプチドを含む組成物中に存在し、該少なくとも1種の他のポリペプチドはウシ型結核菌のBCG株の細胞のゲノムによってコードされていない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験体由来の細胞集団をMTBN4に応答するCD4 Tリンパ球の被験体での存在について検査するステップが、該被験体由来のCD4 Tリンパ球を抗原提示細胞（APC）および配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるMTBN4またはその1以上の抗原性セグメントに接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
被験体由来の細胞集団を配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるMTBN4に応答するCD4 Tリンパ球の被験体での存在について検査するステップが、サイトカイン産生について検査することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
測定されるサイトカインがIFNγである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
被験体由来の細胞集団を配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるMTBN4に応答するCD4 Tリンパ球の存在について検査するステップが、以下のステップ:
a. CD4 Tリンパ球を、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるMTBN4またはその1以上の抗原性セグメントの存在下で抗原提示細胞（APC）と接触させるステップであって、該CD4 Tリンパ球は被験体由来の細胞集団に由来するものであり、該APCは該被験体により発現される少なくとも1種の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスII分子を発現する、上記ステップ、および
b. 配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるMTBN4またはその1以上の抗原性セグメントに応答する該CD4 Tリンパ球の能力を測定するステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、結核の分野、特にヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に対する免疫応答を生じさせるためならびにヒト型結核菌にさらされた被験体における感染および疾患を診断するために有用な試薬に関する。
【０００２】
発明の背景
結核感染は、引き続き世界的な健康問題となっている。この状況は、ヒト型結核菌の多剤耐性株の出現および国際的なAIDSの流行により、近年大きく悪化している。従って、ヒト型結核菌に対する効果的なワクチンおよび信頼性の高い診断試薬を作製することがますます重要となってきた。
【０００３】
米国特許出願第08/796,792号は、本明細書中に参考として全て組み込まれる。
【０００４】
発明の概要
本発明は、ヒト型結核菌のゲノム中に有り且つウシ型結核菌（M. bovis）のカルメット-ゲラン桿菌（BCG）株のゲノム中には無いオープンリーディングフレーム（ORF）によりコードされるポリペプチドが、ヒト型結核菌に感染した動物において遅延型過敏症反応を引き出したのに、BCGで感作した動物においては当該反応を引き出さなかった、という本発明者の発見に基づく。したがって、ヒト型結核菌のゲノム中には存在するがBCGのゲノム中には存在しないORFによりコードされるタンパク質は、ヒト型結核菌とBCGとを区別するために、および特に、被験体のヒト型結核菌への曝露とBCGでのワクチン接種とを区別する診断方法（例えばヒト型結核菌特異的抗体およびリンパ球反応性についての皮膚テストならびにin vitroアッセイ等）にとって有用な試薬となる。本発明は、これらのポリペプチド、その機能的セグメント、これらのポリペプチドまたは該機能的セグメントをコードするDNA分子、該DNA分子を含むベクター、該ベクターにより形質転換された細胞、上記ポリペプチド、機能的セグメントもしくはDNA分子のうちの１以上を含む組成物、ならびにこれらを用いた様々な診断的、治療的、および予防的（ワクチン）方法論を特徴とする。
【０００５】
具体的には、本発明は、第１アミノ酸配列または第２アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするDNA配列を含む単離DNA分子を特徴とする。この第１アミノ酸配列は、ポリペプチドMTBN1、MTBN2、MTBN3、MTBN4、MTBN5、MTBN6、MTBN7またはMTBN8のアミノ酸配列（図１に図示）であり得る。また第２アミノ酸配列は、該第１アミノ酸配列が保存的置換されたものと同じ配列である。このポリペプチドは、ヒト型結核菌に特異的な抗原性および免疫原性を有する。また、本発明には、上記DNA分子から単離した一部分も含まれる。該DNA分子の該一部分は、該ポリペプチドの全長ポリペプチドよりも短いセグメントをコードし、このセグメントは、ヒト型結核菌に特異的な抗原性および免疫原性を有する。本発明の他の実施形態は、上記DNA分子と該DNA配列に機能し得る形で連結された転写および翻訳調節配列とを含むベクターである。この調節配列は、該DNA配列によりコードされるポリペプチドまたは機能的セグメントを細胞内で発現させる。本発明は、上記ベクターで形質転換された細胞（例えば真核細胞および原核細胞等）を包含する。
【０００６】
本発明は、上記ベクターのいずれかおよび製薬上許容可能な希釈剤もしくは充填剤を含む組成物を包含する。（例えばDNAワクチンとして使用される）他の組成物は、少なくとも２つ（例えば３、４、５、６、７、８、９、10、12、15または20種）のDNA配列（それぞれヒト型結核菌複合体のポリペプチドまたはその機能的セグメントをコードする）を含むことができ、これらのDNA配列は、該ポリペプチドの各々を脊椎動物の細胞内で発現させる転写および翻訳調節配列に機能し得る形で連結されている。このような組成物において、該DNA配列の少なくとも１つ（例えば２、３、４、５、６、７または８種）は、本発明の上記DNA分子のうちの１つである。コードされるポリペプチドは、好ましくは、ウシ型結核菌のBCG株の細胞のゲノムによってコードされないものである。
【０００７】
また本発明は、第１アミノ酸配列または第２アミノ酸配列を有する単離ポリペプチドを特徴とする。この第１アミノ酸配列は、ポリペプチドMTBN1、MTBN2、MTBN3、MTBN4、MTBN5、MTBN6、MTBN7またはMTBN8（図１に図示）の配列であり得る。また第２アミノ酸配列は、該第１アミノ酸配列が保存的置換されたものと同じ配列である。該ポリペプチドは、ヒト型結核菌に特異的な抗原性および免疫原性を有する。また本発明には、このポリペプチドの単離セグメントも含まれる。該セグメントは、その全長ポリペプチドよりも短く、ヒト型結核菌に特異的な抗原性および免疫原性を有する。他の実施形態は、該ポリペプチドまたは機能的セグメントならびに製薬上許容可能な希釈剤または充填剤を含む組成物である。また本発明の組成物は、ヒト結核菌複合体の少なくとも２つ（例えば３、４、５、６、７、８、９、10、12、15または20種）のポリペプチドまたはその機能的セグメントを含むことができ、この少なくとも２つのポリペプチドのうち少なくとも１つ（例えば２、３、４、５、６、７または８種）のポリペプチドは、本発明の上記ポリペプチドのうちの１つの配列を有するものである。該ポリペプチドは、好ましくは、ウシ型結核菌のBCG株の細胞のゲノムによってコードされないものである。
【０００８】
また本発明は、診断方法も特徴とする。１つの実施形態は、（a）上記ポリペプチド組成物の１つを、ヒト型結核菌に感染したもしくは感染し易いと考えられる被験体に投与すること、および（b）その被験体がヒト型結核菌に感染しているまたは感染し易いことを示す指標として、該組成物に対するその被験体の免疫応答を検出すること、を含む方法である。このような方法の一例は、皮膚テストである。皮膚テストでは、テスト物質（例えばMTBN1〜MTBN8のうちの１以上を含む組成物）を被験体に皮内注射し、そして皮膚の遅延型過敏症反応を検査する。他の実施形態は、（a）被験体に由来するCD4Tリンパ球を含む細胞集団を用意し、（b）該被験体により発現される主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスII分子を発現する抗原提示細胞（APC）を含む細胞集団を用意し、（c）本発明のポリペプチド、機能的セグメント、および/またはポリペプチド組成物のうちの１以上の存在下で（b）のAPCに（a）のCD4リンパ球を接触させ、そして、（d）その被験体がヒト型結核菌に感染しているもしくは感染し易いことを示す指標として、該ポリペプチドに対するCD4リンパ球の反応能力を測定すること、を含む方法である。本発明の他の診断方法は、（a）本発明のポリペプチド、機能的セグメント、またはポリペプチド/機能的セグメント組成物を被験体の体液に接触させ、（b）その被験体がヒト型結核菌に感染しているもしくは感染し易いことを示す指標として、該ポリペプチド、機能的セグメント、またはポリペプチド/機能的セグメント組成物への抗体の結合の存在を検出すること、を含む。
【０００９】
また本発明には、ワクチン接種方法も包含される。これらの方法は、上記ポリペプチド、機能的セグメント、またはDNA組成物のいずれかの被験体への投与を含む。該組成物は、単独でまたは１以上の他の組成物と共に投与することができる。
【００１０】
本明細書中で使用される「単離DNA分子」とは、以下に挙げるもののうち一方または両方のDNAである：そのDNAが由来する生物の天然ゲノム中においてそれがすぐ隣に隣接しているコード配列の一方または両方（すなわち一方は5’側末端にあるもの、他方は3’側末端にあるもの）とすぐ隣に隣接していないもの；あるいはそのDNAが由来する生物において一緒に生じるDNA配列を実質的に含まないもの。この用語は、例えば、ベクター中（例えば自律複製型プラスミドもしくはウイルス中、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中）に組み込まれた組換えDNA、あるいは他のDNA配列から独立した別個の分子（例えばcDNAまたはPCRもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により生成されたゲノム断片）として存在する組換えDNAを含む。また単離DNAとは、更なるヒト型結核菌ポリペプチド配列をコードするハイブリッドDNAの一部である組換えDNAも含む。
【００１１】
「DNA分子」とは、cDNA、ゲノムDNA、および合成（例えば化学合成）DNAを含む。一本鎖の場合、DNA分子は、センス鎖であってもアンチセンス鎖であってもよい。
【００１２】
本発明の「単離ポリペプチド」は、天然に生じる対応物を持たないポリペプチド、または（例えばヒト型結核菌中で）天然においてそれに付随する成分から分離もしくは精製されたポリペプチドである。典型的には、該ポリペプチドは、それに天然において付随しているタンパク質および天然に生じる有機分子が乾燥重量で少なくとも70％除かれている場合、「単離されている」とみなされる。好ましくは本発明のポリペプチドの調製物は、乾燥重量で少なくとも80％、より好ましくは少なくとも90％および最も好ましくは少なくとも99％の本発明のペプチドを含む。化学合成されるポリペプチドは、天然においてそれに付随する成分からもともと分離されているので、合成ポリペプチドは「単離された」ものである。
【００１３】
本発明の単離ポリペプチドは、例えば天然源（例えばヒト型結核菌細菌等）からの抽出、該ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現、または化学合成により得ることができる。それが自然に生じた起源とは異なる細胞系において産生されるポリペプチドは、天然においてそれに付随する成分から分離されるため、「単離された」ものである。単離度または純度は、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法、またはHPLC分析等の任意の適切な方法によって測定することができる。
【００１４】
該ポリペプチドは、本明細書中に開示されるものを改変した第１次アミノ酸配列を含み得る。好ましくは、これらの改変は、保存的アミノ酸置換からなる。保存的置換とは、典型的には、以下に挙げる基内の置換を含む：グリシンおよびアラニン；バリン、イソロイシン、およびロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリンおよびトレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。
【００１５】
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書中において、長さまたは翻訳後修飾（例えばグリコシル化またはリン酸化等）にかかわらず、任意のアミノ酸鎖を述べるために使用される。このように、「ヒト型結核菌ポリペプチド」という用語は、天然に生じる全長ヒト型結核菌タンパク質、および天然に生じる全長ヒト型結核菌タンパク質または天然に生じるタンパク質の特定のドメインもしくは部分に対応する組換えまたは合成により生成されたポリペプチドを含む。またこの用語は、（原核生物細胞における発現に有用な）アミノ末端メチオニンまたはアフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製に有用な任意の短いアミノ酸配列（例えば金属キレートクロマトグラフィーによる精製の場合はポリヒスチジン等）が付加された成熟ヒト型結核菌ポリペプチドを包含する。
【００１６】
本明細書中で使用される「免疫原性」とは、一次免疫応答または記憶免疫応答を活性化することができることを意味する。免疫応答には、CD4+Tリンパ球、CD8+Tリンパ球およびB-リンパ球の応答が含まれる。Tリンパ球の場合、このような応答は、増殖型および/またはサイトカイン（例えばインターロイキン（IL）-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-13、IL-15、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、またはインターフェロン-γ（IFN-γ））-産生型であってもよい。あるいはこれらの応答は、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の産生をもたらすものであっても良い。B-リンパ球反応は、反応するBリンパ球による抗体産生をもたらすものであっても良い。
【００１７】
本明細書中で使用される「抗原性」とは、抗体分子または活性化されたエフェクターT細胞（例えばサイトカイン産生T細胞またはCTL等）上の抗原特異的T細胞受容体（TCR）により認識されることができることを意味する。
【００１８】
このように、「ヒト型結核菌特異的抗原性」を有するポリペプチドは、（a）ヒト型結核菌生物または野生型ヒト型結核菌分子（例えばポリペプチド等）に反応して誘導される抗体によって認識されこれに結合することができるポリペプチド；または（b）適当な抗原提示細胞（APC）によるポリペプチドのプロセッシングおよび適当な主要組織適合遺伝子複合体 (MHC)分子への結合後に、ヒト型結核菌生物または野生型ヒト型結核菌分子（例えばポリペプチド）に反応して誘導されるエフェクターT細胞上のTCRによって認識されこれに結合することができる部分配列を含むポリペプチドである。
【００１９】
本明細書中で使用される、「ヒト型結核菌特異的免疫原性」を有するポリペプチドとは、（a）ヒト型結核菌生物または野生型ヒト型結核菌分子（例えばポリペプチド等）を認識し、これに結合する抗体の産生を誘導することができるポリペプチド；または（b）適当な抗原提示細胞（APC）によるポリペプチドのプロセッシングおよびAPC表面上の適当な主要組織適合遺伝子複合体 (MHC)分子への結合後に、ヒト型結核菌生物または野生型ヒト型結核菌分子（例えばポリペプチド）のAPCによるプロセッシングによって得られてAPC表面上のMHC分子に結合するペプチド断片を認識しこれに結合するTCRを有するT細胞を活性化する部分配列を含むポリペプチドである。免疫原性ポリペプチドに反応して引き起こされる免疫応答は、好ましくは防御的なものである。本明細書中で使用される「防御的」とは、病気の感染もしくは発病の定着（establishment）を予防すること、または被験体の病気の重症度を軽減することを意味する。「予防する」とは、発病を遅らせること、および病気の進行を一部または完全に遮断することを含み得る。
【００２０】
本明細書で使用される「ヒト型結核菌ポリペプチドの機能的セグメント」とは、ヒト型結核菌に特異的な抗原性および免疫原性を有するポリペプチドのセグメントである。
【００２１】
ヒト型結核菌感染またはこのような感染への罹り易さを検査する目的で、ポリペプチド、ポリペプチドの機能的セグメント、またはポリペプチドおよび/または機能的セグメントの混合物が（例えば皮内注射などにより）被験体に投与された場合、「免疫応答を検出する」とは、投与された物質に対する免疫学的反応の兆候（例えば皮内注射部位における皮膚の赤みまたは腫れ）について被験体を検査することを意味する。被験体が投与された物質に対する抗体を有する場合、反応は一般には急速である（例えば１分〜24時間）。一方、被験体の体内の事前に免疫化されたTリンパ球のメモリーもしくは活性化T細胞反応は一般に遅く、24時間後にやっと現れ、24〜96時間で最大になる。
【００２２】
本明細書中において「被験体」とは、ヒト被験体または非ヒト哺乳動物（例えば非ヒト霊長類、ウマ、ウシ科動物、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、ラットまたはマウス等）であってよい。
【００２３】
特に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、この発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。不一致の場合は、定義を含む本明細書が優先する。好適な方法および物質を以下に記載するが、本発明の実施または試験において、本明細書中に記載されるものに類似したまたはこれらと同等な方法および物質を用いることができる。特に断らない限り、これらの物質および方法は単に例示的なものであり、限定的なものではない。本明細書中に記載される全ての出版物、特許出願、特許および他の引用文献は単に例示として挙げたものであり、限定的なものではない。
【００２４】
本発明（例えばヒト型結核菌感染の診断方法等）の他の特徴および利点は、以下の説明、図面および特許請求の範囲から明らかである。
【００２５】
詳細な説明
ヒト型結核菌[Coleら(1998) Nature 393:537-544]のゲノムは、非病原性BCG株には欠失しているオープンリーディングフレーム（ORF）を含む。本明細書中において、これらのORFによりコードされるポリペプチドは「ヒト型結核菌BCG陰性(M.tuberculosis BCG Negative)」ポリペプチド（「MTBN」）と呼ばれ、そのORFは「mtbn」と呼ばれる。本発明は、MTBNポリペプチド（MTBN4）がヒト型結核菌に感染した動物において皮膚反応を引き起こすが、BCGまたはトリ型結核菌（マイコバクテリアの非ヒト型結核菌複合体株）のいずれかに感作させた動物においてはこれを引き起こさない（以下の実施例１参照）、という発見に基づく。これらの発見により、ヒト型結核菌複合体およびBCG以外の両方のマイコバクテリアへの暴露からヒト型結核菌による被験体の感染を区別する診断テストにおいてMTBN（例えばMTBN1〜MTBN8等）を用いることができる、ということを示す。ヒト型結核菌複合体には、ヒト型結核菌、ウシ型結核菌、ネズミ型結核菌およびアフリカ結核菌が含まれる。このように、これらは、ヒト型結核菌にさらされた（したがって潜在的に結核菌を有するまたは有するおそれのある）被験体を、（最も広く用いられている結核菌ワクチンである）BCGでワクチン接種した被験体から区別するために使用することができる。このような区別が可能な診断アッセイは、判別精度の低い診断テストにおいて陽性結果が出た被験体における更なる診断テストおよび/または治療処置により生じる無駄な努力およびそれに伴うコスを大きく低減するであろう大きな進歩を提供するものである。さらに、実施例１の結果は、全ての生存可能なヒト型結核菌生物により発現されるMTBN4が、この生物に感染した被験体において強力な免疫応答を誘導することができ、従ってワクチンとなり得る可能性があることを示す。
【００２６】
本発明のMTBNポリペプチドには、例えば、ヒト型結核菌ゲノムのRD1、RD2およびRD3領域内にコードされるポリペプチドが含まれる[Mahairasら, (1996) J. Bacteriol. 178:1274-1282]。特に関心が持たれるものとして、ヒト型結核菌ゲノムのRD1領域内のORFによりコードされるポリペプチドが挙げられる。しかし、本発明は、RD1、RD2およびRD3領域によりコードされるポリペプチドに限定されず、ヒト型結核菌ゲノムの１以上のメンバーのゲノム中に含まれるがBCGのゲノム中には含まれないORFによりコードされるあらゆるポリペプチドを含む。MTBN1〜MTBN8のアミノ酸配列は図１に、およびmtbn1〜tmbn8のヌクレオチド配列は図２に示す。
【００２７】
本発明は以下に挙げるものを包含する：（a）MTBNポリペプチド（例えばMTBN1〜MTBN8）をコードするmtbn配列（例えばmtbn1〜mtbn8）を含む単離DNA分子ならびに抗原性および免疫原性を有するポリペプチドセグメント（すなわち機能的セグメント等）をコードするこのようなDNA分子の単離部分；（b）MTBNポリペプチド自体（例えばMTBN1〜MTBN8）およびこれらの機能的セグメント；（c）MTBNポリペプチド（例えばMTBN1〜MTBN8）に結合する抗体（このような抗体の抗原結合フラグメント、例えばF(ab’)2、Fab、Fv、および一本鎖Fvフラグメント等を含む）およびその機能的セグメント；（d）mtbn（例えばmtbn1〜mtbn8）配列の１以上を含み且つ発現することができる核酸分子（例えばベクター等）およびDNA分子の一部；（e）このようなベクターにより形質転換された細胞（例えば細菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞等）；（f）MTBN（例えばMTBN1〜MTBN8）ポリペプチド（またはその機能的セグメント）および先に記載したヒト型結核菌ポリペプチド（例えばESAT-6、14kDa抗原、MPT63、19kDa抗原、MPT64、MPT51、MTC28、38kDa抗原、45/47kDa抗原、MPB70、Ag85複合体、MPT53およびKatG等（米国特許出願第08/796,792号も参照されたい））の両方を含む１以上のヒト型結核菌ポリペプチド（またはそのセグメント）をコードするベクターを含む組成物；（g）本発明のポリペプチドおよび先に記載したヒト型結核菌ポリペプチド（上記記載のもの等）の両方を含む１以上のヒト型結核菌ポリペプチド（またはその機能的セグメント）を含む組成物；（h）（c）に記載された抗体のうち１以上を含む組成物；（i）（1）ヒト型結核菌に感染したことまたは感染し易いと考えられる被験体への上記ポリペプチド組成物のいずれかの（例えば皮内注射による）投与、（2）このような被験体に由来するリンパ球（B-リンパ球、CD4 T-リンパ球、およびCD8 T-リンパ球）の、上記ポリペプチド組成物のいずれかに対する反応性についての（例えば細胞増殖、抗体産生、サイトカイン産生またはCTL活性の測定による）in vitroテスト、（3）体液（例えば血液、唾液、血漿、血清、尿または精液、あるいは気管支肺胞洗浄、膣洗浄、または下部消化管洗浄などの洗浄等）の、MTBNポリペプチド（例えばMTBN1〜MTBN8）またはその機能的セグメント、あるいは上記ポリペプチド組成物に対する抗体についてのテスト、（4）（c）に記載した抗体を用いたアッセイにおける、ヒト型結核菌、MTBN（例えばMTBN1〜MTBN8）ポリペプチドまたはその機能的セグメント、あるいは上記ポリペプチド組成物の存在についての体液（例えば上記）のテスト、および（5）MTBNポリペプチド（例えばMTBN1〜MTBN8）をコードする核酸分子（DNAやRNA等）（またはこのような核酸分子の一部）の存在についての、該核酸分子、該核酸分子の一部またはこのような分子の相補体のヌクレオチド配列を有する核酸プローブまたはプライマーを用いた組織（例えば肺や気管支の組織等）または体液（例えば上記）の検査のいずれかを含む診断方法；ならびに（j）（f）、（g）もしくは（h）のいずれかまたはこれらの組成物のうち２つまたは３つの組み合わせを含む組成物の被験体への投与を含むワクチン接種法。
【００２８】
診断に関して、精製MTBNタンパク質、このようなタンパク質の機能的セグメント、またはタンパク質および/もしくは機能的断片の混合物は、ヒト型結核菌による感染を、他の細菌（特に非病原性マイコバクテリア）による感染またはBCGへの（例えばワクチン接種による）暴露から区別するという上記利点を有する。更に、該タンパク質、該タンパク質の機能的セグメント、または該タンパク質および/もしくは機能的セグメントの混合物を含む組成物により、より優れた品質管理が可能となる。これは、「バッチ毎の（batch-to-batch）」の変動性が、結核菌の精製タンパク質誘導体（PPD）等の複合混合物に比較して大幅に削減されるからである。
【００２９】
また、ワクチン接種のための上記ポリペプチドおよび核酸試薬の使用は、特異性および効果の高い免疫化も提供する。非病原性BCGにはない遺伝子によってコードされる病原性ヒト型結核菌ポリペプチドは、病原性の媒介物質となる可能性があるため、これらに対する免疫性は、防御的能力の点で言えば特に効力がある可能性がある。核酸分子を用いてワクチン接種を行う場合、in vivo法および ex vivo法の両方を用いることができる。In vivo法は核酸自体の被験体への投与を含み、ex vivo法は、被験体から細胞（例えば骨髄細胞または線維芽細胞）を得ること、この細胞に該核酸を形質導入すること、好ましくは首尾良く形質導入された細胞を選択もしくは増殖させること、および該形質導入細胞をその被験体に投与することを含む。あるいは、形質導入されて被験体に投与される細胞は、他の被験体に由来するものであってもよい。ワクチン接種および診断の方法については、米国特許出願第08/796,792号（本明細書中に参考として全て組み込まれる）により詳しく記載されている。
【００３０】
以下の実施例は、本発明を例示するためのものであってこれを限定するためのものではない。
【００３１】
実施例１：MPBN4は、ヒト型結核菌に感染したモルモットにおいて特異的な皮膚反応を誘引する
４グループの非近交系雌モルモット（１グループ＝18匹）を用いて、ヒト型結核菌特異的診断試薬としてのMTBN4ポリペプチドの有用性を試験した。これら４つのグループは以下のように処理した。
【００３２】
グループ１の動物には、約100個のヒト型結核菌株H37Rv細胞を用いてエアロゾルにより感染させた。
【００３３】
グループ２の動物には、106個のウシ型結核菌日本BCG生細胞を用いて皮内で感作を行った。
【００３４】
グループ３の動物には、106個のトリ型結核菌生細胞を用いて皮内で感作を行った。
【００３５】
グループ４の動物には、生理食塩水の皮内注射により疑似感作を行った。
【００３６】
感染または感作を行った７週間後、1μgのPPD(各グループから6匹ずつ)、2μgの精製組換えMPT64（各グループから6匹ずつ）、または2μgのMTBN4（各グループから6匹ずつ）を用いて皮内注射を行った。24時間後に、生じた紅斑の直径を測定した。データは紅斑の平均径（mm）で示し、平均偏差を示す（図３）。
【００３７】
どのテスト物質で処理してもグループ４の動物では紅斑は検出されなかったので、このグループについてはデータは示していない。一方、グループ１の動物（黒塗りの棒）は３つのテスト物質全てで有意な反応を示した。グループ２の動物（白抜きの棒）はPPDおよびMPT64に対して有意な反応を示したが、MTBN4に対しては示さなかった。グループ３の動物は、PPDのみに有意な反応を示した（斜線の棒）。
【００３８】
このように、ヒト型結核菌複合体ならびに他のマイコバクテリア株に共通する抗原性/免疫原性分子を含むPPDは、ヒト型結核菌複合体（ヒト型結核菌およびBCG）のマイコバクテリアならびに他の非病原性マイコバクテリウム（トリ型結核菌）で感染させたまたはこれに感作させた動物において反応を誘導した、という意味において、最も小さな差別的結果が得られた。ヒト型結核菌およびBCGの両方によってコードされ、発現されるMPT64は、トリ型結核菌に感染した動物において反応を引き出さなかったが、ヒト型結核菌に感染した動物およびBCGで感作した動物の両方においては反応を引き出した。最後に、MTBN4は、ヒト型結核菌動物のみにおいて反応を誘導した。このようにMTBN4は最も特異的な反応を誘導し、そして最も重要なことに、ヒト型結核菌に感染した動物とBCGに感作させた動物との区別を可能とした。
【００３９】
本発明は現在の好適な実施形態に関して記載したが、本発明の精神を逸脱することなく様々な修正を加えることが可能であることを理解されたい。従って、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ヒト型結核菌ポリペプチドMTBN1〜MTBN8のアミノ酸配列を示したものである。
【図２】  図２は、MTBN1〜MTBN8をコードするコード領域（mtbn1〜mtbn8）のヌクレオチド配列を示したものである。
【図３】  図３は、ヒト型結核菌に感染させた雌モルモットまたはBCGもしくはトリ型結核菌で感作した雌モルモットにおいて、３つの異なるテスト試薬の皮内注射により誘導された遅延型過敏症反応を示す棒グラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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