(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を処置するための医薬組成物の調製における、修飾された単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の使用であって、
該修飾がγ１３４．５遺伝子の１コピーのみの変更を含み、該変更により該遺伝子のコピーが活性遺伝子産物を発現することができないものとなる、前記使用。
【請求項２】
前記γ1３４．５遺伝子の変更が、遺伝子のコーディング領域または調節領域内へ１種またはそれ以上のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を挿入することを含む請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記γ1３４．５遺伝子の変更が、遺伝子のコーディング領域または調節領域のすべてまたは一部を削除することを含む請求項２記載の使用。
【請求項４】
前記修飾されたＨＳＶゲノムが、さらにＨＳＶゲノムのウイルス複製に不必要なＵＬ又はＵＳ遺伝子領域における変更を含む請求項１、２、または３記載の使用。
【請求項５】
前記癌が非中枢神経系癌である請求項１、２、または３記載の使用。
【請求項６】
前記癌が中枢神経系癌である請求項１、２、または３記載の使用。
【請求項７】
前記癌が非中枢神経系癌である請求項４記載の使用。
【請求項８】
前記癌が中枢神経系癌である請求項４記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は一般に、腫瘍に対する治療的処置としての、修飾された単純ヘルペスウイルスの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
抗癌剤としてのウイルスの開発は、興味深くはあるが捕まえどころのない戦略となっている。抗癌ウイルス療法の目標は、複製適格性（replication competent）ウイルスと共に低比率の腫瘍細胞を接種した結果、標的腫瘍細胞におけるウイルスの複製、次いで周辺腫瘍細胞の細胞溶解（腫瘍崩壊）と感染を引き起こすことにある。ウイルスによる腫瘍崩壊への鍵は、複製が主として腫瘍細胞において起こり、周辺の正常組織では起こらないようにウイルスを遺伝的修飾することにある。多くの戦略では、腫瘍崩壊のために遺伝子操作されたウイルスの使用に焦点が当てられている。例えば、一つの取り組みにおいては、弱毒化されたレトロウイルスで、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼをコードするように修飾されたものが、分裂中の腫瘍細胞に標的化すべく作出されている［Culver, et al., Science 256:1550-1552 (1992); Ram, et al. Nat. Med. 3:1354-1361 (1997)］。しかしながら、この技術においては腫瘍細胞のわずか１０〜１５％だけしか活発に細胞周期を進めていなかったので、腫瘍細胞のウイルス感染は限られたものであった。別の取り組みにおいて、ｐ５３を欠く腫瘍細胞のみにて複製するように、条件付き複製適格性アデノウイルス（Ｅｌｂ欠失）が設計されたが、わずか５０％の腫瘍細胞しか、非機能性ｐ５３を含まないと推定される［Bischoff, et al., Science 274: 373-376 (1996); Heise, et al. Nat. Med. 3:639-645 (1997); Hollstein, et al., Science 253: 49-53 (1991)］。これらの戦略の成功は、したがって、小さな腫瘍異種移植片のみに実験的に限定されている。
【０００３】
近年、悪性の神経膠腫を処置するための、遺伝子操作された複製適格性ＨＳＶが提案されている［Martuza, et al., Science 252:854-856 (1991)］。抗神経膠腫療法では、増殖性の腫瘍細胞において優先的に複製するようにＨＳＶ−１変異体を構築し、それにより、ヒトでのＨＳＶ脳炎の希少例において観察される、中枢神経系でのウイルスの広汎な散布の危険性が排除されるものである。初期の戦略では、ウイルスＤＮＡ合成に必要とされる酵素（例えば、チミジンキナーゼ、リボヌクレオチドレダクターゼ［Martuza, et al., Science 252:854-856 (1991); Mineta, et al, Cancer Res. 54: 3963-3966 (1994)］）をコードするウイルス遺伝子の欠失に焦点が当てられた。さらに近年の研究では、神経毒性に関わる、新しく同定されたγ1３４．５遺伝子を欠くＨＳＶ変異体の使用に重点がおかれた［Chou, et al., Science 250: 1262-1266 (1990); Chou, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89:3266-3270 (1992); Chou, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 92:10516-10520 (1995); Andreansky, et al. Cancer Res. 57:1502-1509 (1997)］。これまでの結果を組み合わせると、ウイルスの増殖潜在力の低減が安全な頭蓋内ＨＳＶ接種のために必要であるものの、そのウイルスの腫瘍崩壊潜在性の低減に呼応することが示唆された［Advani, et al. Gene Ther. 5: 160-165 (1998)］。頭蓋内接種に対して可能であるよりもさらに強力な抗腫瘍の有効性を有する、遺伝子操作されたＨＳＶの潜在的治療効果は、一般的なヒト腫瘍のモデルにおいて研究されていない。
【０００４】
ＨＳＶは、腫瘍崩壊剤として多くの利点を提供するものである。このウイルスは、多様な癌細胞において良好に複製し、そしてそれが複製する細胞を破壊する。特異的な欠失を導入することによってウイルスを弱毒化することができ、それによって外来遺伝子の挿入および発現への耐容性が付与される［Meignier, et al., J. Infect. Dis. 158:602-614 (1988)］。さらに、多くのＨＳＶウイルス遺伝子の機能が知られている［Shih, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 81:5867-5870 (1984); Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93:113076-11312 (1996)］。しかしながら、ＨＳＶの望ましくない特性に、神経侵襲性（潜伏性を確立する能力）と、潜伏状態からの再活性化に対する能力が包含される。
【０００５】
これまでの研究から、両方のγ1３４．５遺伝子を欠く修飾されたＨＳＶと、神経膠腫異種移植片への電離放射線とによる細胞溶解能の、相互作用的な効果が示されている［Advani, et al. Gene Ther. 5:160-165 (1998)］。γ1３４．５欠損ＨＳＶウイルスの接種と組み合わせられた電離放射線によって、腫瘍異種移植片容量の相乗的減少と、神経膠腫異種移植片におけるウイルス増殖、および腫瘍内分布の増強が引き起こされた。
【０００６】
Ｒ７０２０は、遺伝子操作によって弱毒化されたＨＳＶ株であり、様々な齧歯類、ウサギ、および非ヒト霊長類モデルにおける試験が行われ［Meignier, et al., J. Infect. Dis. 158: 602-614 (1988); Meignier, et al., J. Infect. Dis. 162:313-321 (1990)］、試験をした種のすべてにおいてウイルス感染性が減弱化されたことが示されているものである。この株における注目すべき重要な特性は、これまでに試験した中で最も感受性の高い種においても神経侵襲性がないことである。Ｒ７０２０は、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２感染に対するヒト免疫付与のための候補物質として設計された、修飾されたＨＳＶ株である［Meignier, et al., Infect. Dis. 158:602-614(1988)］。ＨＳＶ感染に対する、生存力が減弱化されたウイルスワクチンとなるように本来作製されたＲ７０２０は、齧歯類および霊長類での研究において安全性および安定性について調べられている［Meignier, et al., J.  Infect. Dis. 158: 602-614 (1988); Meignier, et al., J. Infect. Dis. 162:313-321 (1990)］。Ｒ７０２０の構築については、以前に報告されている［Meignier, et al., J. Infect. Dis. 158: 602-614 (1988); および Roizman, 米国特許第４，８５９，５８７号（引用することによって本明細書に組み入れることとする）］。簡単に説明すると、野生型ＨＳＶ ＤＮＡは、逆方向反復が隣接した独特な二本鎖ＤＮＡ配列の２つの領域からなる［Roizman, et al., Proc Natl. Acad. Sci. (USA) 93:11307-11312 (1996)］。逆方向反復領域は、α０、α４、γ1３４．５、ＯＲＦ ＰおよびＯＲＦ Ｏと命名された５種の遺伝子の２つのコピーを含んでいる。Ｒ７０２０は、その反復の１セットに替えて挿入されたＨＳＶ−２ＤＮＡ断片を含んでおり、したがってγ1３４．５遺伝子の２つのコピーの１つだけを欠くものである。これまでの研究によって、特定の細胞においては、γ1３４．５遺伝子の双方のコピーを欠くウイルスよりも効率よく、Ｒ７０２０が複製することが示されている［Advani, et al. Gene Ther. 5: 160-165 (1998)］。今日までは、Ｒ７０２０はヒトにおいて限定された治験にしか供されていない。
【０００７】
癌療法の失敗の原因の一つは、旧来の細胞毒性および／またはホルモン療法に対する腫瘍細胞の耐性であり、これは、これらの薬剤によって惹起される遺伝的な不安定性と、腫瘍細胞に固有な不安定性とから起こるものである。例えば、ｐ５３遺伝子の欠失または変異は、化学療法および／または放射線によって誘発されるアポトーシスへの腫瘍細胞の感受性を低下させえ［Houldsworth, et al., Oncogene 16:2345-2349 (1998);Aas. et al. Nat. Med. 2: 811-814 (1998); Lowe, et al., Science 266:807-810 (1994);Dalta, et al., Cell Growth Differ. 6:363-370 (1995)］、そしてアンドロゲン受容体における変異は、前立腺癌におけるホルモン耐性をもたらす。また、遺伝子のｂｃ１−２ファミリーの活性化などの「機能の獲得」変異は、種々の細胞毒性療法に対する耐性を増強する。腫瘍細胞本来の遺伝的不安定性に加えて、腫瘍細胞へのＤＮＡ損傷に依存する一般的に用いられる抗癌療法は変異原性であり、そして抗癌処置の結果は、ＤＮＡ損傷剤に対する耐性の選択および進化である。抗腫瘍戦略としてウイルス溶解を使用することの一つの利点は、旧来の薬剤に対する腫瘍耐性をウイルス溶解が克服する潜在性を有することにある。複製適格性ヘルペスによる腫瘍細胞感染の結果、細胞溶解が引き起こされ、また、それ自体には変異原性がないので、ヘルペスを回避するように腫瘍細胞が選択的に進化することは、腫瘍細胞集団内ではより起こり難いのである。
【０００８】
このように、それを必要としている患者において腫瘍成長を遅延および／または低減すべく処置するためのウイルス療法剤と効果的な方法とを、同定および開発することが当該技術分野において希求されている。
【０００９】
【発明の要約】
本発明は、癌を処置するための方法であって、修飾された単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノムを含む単純ヘルペスウイルスの有効量を、処置を必要としている個体に投与する工程を含み、当該修飾が、そのＨＳＶゲノムの逆方向反復領域の修飾を含む方法を提供する。一実施態様において、本発明の方法は、前記ゲノムの逆方向反復領域の修飾が、γ１３４．５遺伝子のコピーの変更を含み、この変更はその遺伝子のコピーを、活性遺伝子産物を発現することができないようにさせるものである、ＨＳＶの使用を包含する。好ましい実施態様において、本発明の方法は、前記γ1３４．５遺伝子の変更が、（ｉ）遺伝子のコーティング領域もしくは調節領域内へ１種もしくはそれ以上のヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を挿入すること、または（ｉｉ）遺伝子のコーティング領域もしくは調節領域のすべてもしくは一部を削除することを含む、ＨＳＶの使用を含んでいる。本発明の方法は、前記修飾されたＨＳＶゲノムが、さらにＨＳＶゲノムの独特な領域における変更を含む、ＨＳＶの使用を包含するものである。
【００１０】
本発明の方法には、中枢神経系の癌のみならず、非中枢神経系の癌の処置を包含する。
【００１１】
【詳細な説明】
本発明は、非中枢神経系腫瘍と、中枢神経系起源の腫瘍を含めた種々の腫瘍を処置するための材料および方法を提供する。処置方法には、遺伝子修飾された単純ヘルペスウイルスで標的腫瘍を感染することを包含し、ここで修飾には、単純ヘルペスウイルスゲノムの内部逆方向反復領域の修飾が含まれる。好ましい実施態様において、単純ヘルペスウイルスゲノムの修飾には、ウイルス遺伝子の内部反復配列の１つのコピーの欠失が含まれ、その領域には、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＯＲＦ Ｏ、ＯＲＦ Ｐおよびγ1３４．５の各々のコピーが含まれている。本発明を実施するのに有用な単純ヘルペスウイルスは、野生型単純ヘルペスウイルスに対して弱毒化されているが、逆方向反復領域のコピーの双方が修飾されている（その領域を、様々な遺伝子の中のいずれか１つの実際の遺伝子産物を発現することができないようにさせる）かまたは欠失しているウイルスよりも複製適格性が強い。本発明を実施するのに有用なウイルスは、ゲノムにさらなる変更を有してもよく、かかる変更には、単純ヘルペスウイルスプロモーターの制御下に非天然タンパク質をコードする配列を発現しうる挿入が包含されえ、これにより次いで、当該技術分野でよく知られた単純ヘルペスウイルス遺伝子のα、βまたはγクラスとして、その配列が調節されることが許容される。［例えば、Fundamental Virology, Second Edition, Field et al. （編集）第33-34章, Raven Press Ltd., New York (1991) （引用することにより本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。］内部反復を欠くウイルスは、必要とあれば、培養でウイルス複製に不必要であることが認められた４７遺伝子の１種またはそれ以上を欠失させることによってさらに弱毒化することができる［Roizman, Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) (1996)］。さらなる毒性を減じるための欠失に好適な遺伝子として挙げられるのが、ＵL１６、ＵL４０、ＵL４１、ＵL５５、ＵL５６、α２２、ＵS４、ＵS８、およびＵS１１遺伝子である。「不必要な」遺伝子のうちの事実上１つの欠失によって、２倍から数ログの範囲の因数で毒性が低減するはずである。加えて、内部逆方向反復を欠くウイルスの候補は、サイトカインやプロドラッグを活性化する酵素の添加によってさらに変更されうる。
【００１２】
本発明を実施するのに有用なヘルペスウイルスは、米国特許第４，８５９，５８７号（引用することにより本明細書に組み入れることとする）および米国特許第５，２８８，６４１号（やはり引用することにより本明細書に組み入れることとする）に記載された方法などの、当該技術分野でよく知られた方法を使用して調製されうる。
【００１３】
以下に示す実施例は、マウスにおける腫瘍サイズを減じるために、ＨＳＶ−１型Ｒ７０２０株単純ヘルペスウイルスを使用することを説明したものである。腫瘍形成性疾患の処置のためのモデルとしてマウスを使用することは、当該技術分野においてよく知られており、広く認められている。実施例１には、ＨＳＶ−１株Ｒ７０２０の構造を記載する。このウイルス株は、本発明を実施するうえで有用な遺伝的に修飾されたウイルスの種類の例証となるものである。実施例２には、マウスにおいて、移植された表皮癌細胞系の腫瘍容量を低減するために、修飾されたＨＳＶ−１を使用することを記載している。
【００１４】
実施例３には、実施例１に記載の表皮癌異種移植片における、ウイルス複製の動態を記載する。実施例４に記載の実験では、残留腫瘍細胞から生じる表皮癌が、ＨＳＶ−１ Ｒ７０２０による感染への感受性を保持していることを確証する。
【００１５】
以下の実施例は例として示すものであり、請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００１６】
［実施例１：ＨＳＶ株Ｒ７０２０の構造］
Ｒ７０２０（１９８５年１２月１０日に寄託、ＡＴＣＣ受託番号 ＶＲ２１２３）の構造には、以前の報告にあるとおり［Meignier, et al., J. Infect. Dis. 158:602-614 (1988)］、親のＨＳＶゲノムのジョイント領域へ挿入された、いくつかの糖タンパク質をコードする遺伝子配列を包含するＨＳＶ−２ ＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ断片を含む挿入が包含されている。Ｒ７０２０構造の詳細な分析によって、下記のとおりMeignier, et al.によって報告されたものとの差異が明らかになった。
【００１７】
第１に、ＨＳＶ−２配列の挿入によっても、親のＨＳＶ−１ ＵL５５遺伝子は完全なままであるが、以前の報告ではＵL５５遺伝子の一部が欠失していることが示されていた。しかしながら、ＵL５５遺伝子には既知の機能がなく、おそらくはウイルスの安全性に影響を及ぼさない。加えて、ＵL５５領域の前にはジョイント領域で３００塩基対の「未知配列」が位置している。以前報告されたような、病原性が含意されているＵL５６領域［Kehm, et al., Virus Res 40: 17-40 (1996)］は、修正された配列に見出されなかった。
【００１８】
第２に、ＵL５６配列はジョイント領域で重複しており、これによっておそらく、予測可能且つ再現可能に生じる欠陥ゲノムがもたらされるのである。欠陥ゲノムは、高多重度で継代するとＨＳＶ−１系統において自発的に生じ、Ｒ７０２０において欠陥ゲノムがより再現性よく頻繁に生じることが知られている。しかしながら、通常どおりの感染物を低重度で継代すると、欠陥ゲノムの蓄積は最小化される。
【００１９】
別の差異では、ＨＳＶ−２配列の本来予測された９６２９塩基対のうちわずか５２２９塩基対しか、Ｒ７０２０に認められなかった。
【００２０】
［実施例２：腫瘍異種移植の容量低減］
実験の第１シリーズにおいて、非機能性ｐ５３を発現する化学療法／放射線耐性の表皮癌細胞系であるＳＱ−２０６細胞、またはホルモン依存性のｐ５３+前立腺癌細胞系であるＰＣ−３細胞を、ヌードマウスの後肢に注射した。ＳＱ−２０ｂは他で報告されているように［Hallahan, et al. Nat. Med. 1:786-791 (1995)］、放射線療法後の患者から単離した表皮癌細胞系である。ＰＣ−３細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手した（Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．番号ＣＲＬ １４３５、Manassas、ＶＡ）。臨床的に明白で、局所的に進行しているヒト癌の相対質量に近似するように、大きな腫瘍異種移植片を使用した。およそ１００ｍｍ3の腫瘍総量を用いて行った初期の研究とは異なり、このシリーズにおける実験はマウス重量の概ね３％に対応する６３０ｍｍ3の初期平均容量を有する腫瘍で実施した［Ram, et al. Nat. Med. 3:1354-1361 (1997)］。
【００２１】
簡単に説明すると、マウス１匹あたり５×１０5細胞数の量のＳＱ−２０ｂ腫瘍細胞を１００μｌの滅菌リン酸緩衝性生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、５乃至６週齡の胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスの右後肢に注射して、２００から１０００ｍｍ3の腫瘍サイズになるまで生育した。マウス後肢モデルは、他で詳説されている［Advani, S.J. et al. Gene Ther. 5, 160-165 (1998)］。以前に報告されたとおり、その主たる利点は侵襲法を頼みにすることなく腫瘍崩壊剤の効果を測定することが許容されることにある。以前に報告されたモデルは、ウイルス感染による処置が開始される時点で１００から６００ｍｍ3までに異種移植片の平均サイズを増加させるように変更して細胞対ウイルスの割合を増加させて、臨床的に関連する状態での腫瘍のサイズに、より一層近似させた。
【００２２】
マウスを２つの処置群：ハミルトンシリンジを用いて（ａ）１０μｌの緩衝性生理食塩水が投与される対照および（ｂ）１０μｌの緩衝液中、２×１０6プラーク形成単位（ｐｆｕ）のＲ７０２０ウイルスが投与されるマウスに無作為に分けた。遺伝子操作されたＲ７０２０ウイルスは、原型ＨＳＶ−１ウイルスであるＨＳＶ−１（Ｆ）に由来する［Meignier, et al.、前出］。Ｒ７０２０は、ＵL２４、ＵL５６、およびα０、α４、γ1３４．５、ＯＲＦＰおよびＯＲＦＯ遺伝子の１つのコピーをコードする逆方向反復の一つのセットを欠いている。ＨＳＶ−１（Ｆ）の内部逆方向反復の欠失領域は、ＨＳＶ−２の糖タンパク質Ｇ、Ｊ、Ｄ、およびＩをコードするＤＮＡ断片によって置換された［Meignier, et al., J. Infect. Dis. 158:602-614 (1988)］。ウイルスは、他で報告されたとおりにベロ細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Manassas、ＶＡ）にて滴定した［Chou, et al., Science 250: 1262-1266 (1990)］。腫瘍総量を隔週、あるいは腫瘍容量が２０００ｍｍ3に達するまで測定した。腫瘍容量は（長さ×幅×高さ）／２の式を使用して計算したが、これは楕円体（δｄ3）／６の式から導かれたものである。動物実験は、シカゴ大学のアニマル・リソース・センターによって認可されたプロトコルにしたがって実施した。画分腫瘍容量は、特定の時点での腫瘍容量を初発容量で割ったものとして定義した（Ｖ／Ｖ0）。腫瘍の容量が２０００ｍｍ3を超えれば、動物を屠殺した。１００μｌのＰＢＳ中、２×１０7細胞数を異種移植片に対して注射したことのみを除き、同様の実験をＰＣ−３を用いて行った。
【００２３】
その結果から、Ｒ７０２０で処理されたＳＱ−２０ｂ異種移植片は、移植から１３日後に消失し始めて感染後４１日で最下点に至り、このとき平均の腫瘍容量低下は、初発腫瘍容量の５分の１に下がることが示唆された。腫瘍異種移植片の７２％（１１例のうちの８例）は第４１日までに初発腫瘍容量の１０％未満にまで消失し、そしてこれら８例のうち７例では８０日より長きにわたってサイズの縮小が持続した。
【００２４】
Ｒ７０２０は、ＰＣ−３前立腺癌異種移植片の腫瘍容量低減においても、やはり有効であった。画分腫瘍容量は、感染後およそ２０乃至３０日で最下点に達した。Ｒ７０２０は、肝癌前立腺癌腫瘍異種移植片の消失惹起にも、同様に有効であった。
【００２５】
［実施例３：ＳＱ−２０８異種移植片におけるウイルス複製の動態］
ＳＱ−２０８異種移植片におけるウイルス複製の動態を評価するために、以下の方法を実施した。ＳＱ２０異種移植片に、２×１０6ｐｆｕのＲ７０２０または緩衝性生理食塩水を注射した。ウイルスを注射したマウスを２群に分けた。一方の群は規定の時間に屠殺した。感染後特定時間に、腫瘍を無菌的に収集し、液体窒素中で素早く凍結して−７０℃にて保存した。腫瘍は１ｍｌの１９９Ｖおよび１ｍｌの無菌スキムミルク中に氷上でポリトロン組織ホモジナイザー（Kinematics、スイス国）を用いて２０秒間ホモジナイズした。ホモジナイズされた溶液はそれぞれ１５秒間づつ３回超音波処理し、ウイルスをベロ細胞にて滴定した。
【００２６】
生理食塩水を注射したマウスにおける腫瘍容量と、ウイルスを注射して同様に処理したマウスの第二群における腫瘍容量について調べた。実施例２に記載の実験と同様に、緩衝性生理食塩水を注射した場合の腫瘍は指数関数的に成長したが、ウイルスを注射した腫瘍は消失していった。ウイルス力価は注射より７日後で、１２４×１０5ｐｆｕ／腫瘍、すなわち腫瘍に注射された量に対してウイルスが６２倍増加するというまでの最高値に達した。かなりの量のウイルス（１０5ｐｆｕを超える）が、感染から３０日後と遅くなってからでも回収された。
【００２７】
［実施例４：Ｒ７０２０の腫瘍崩壊に対する腫瘍細胞の耐性］
ＳＱ−２０ｂ腫瘍細胞がＲ７０２０の腫瘍崩壊効果に対して耐性となる能力を評価するために、以下の実験を行った。
【００２８】
腫瘍は、前記と同様に生育した。腫瘍が２００ｍｍ3を超えるまでに成長したら、第０日に、２×１０6ｐｆｕのＲ７０２０を含む１０μｌの緩衝液を注射した。腫瘍を隔週で測定した。腫瘍が開始時の腫瘍容量（第０日の容量） にまで再度生育したので、無作為化して、２×１０6ｐｆｕのＲ７０２０を含む１０μｌの緩衝液か、またはＨＳＶ−１（Ｆ）の２×１０6ｐｆｕを含む同容量の緩衝液のいずれかを再度注射した。２００ｍｍ3を超える腫瘍を有する動物を、施設ガイドラインにしたがって塗擦した。
【００２９】
その結果、３種の緩衝液が再度注射された腫瘍すべてで、サイズの増大が継続した。画分の腫瘍容量は、Ｒ７０２０またはＨＳＶ−１（Ｆ）のいずれかでの第２回目ウイルス注射後に減少した。腫瘍はＲ７０２０注射の２サイクルを通じて、ウイルスによる腫瘍崩壊に対する感受性を示し続け、実験の開始から少なくとも１２０日間は再発しなかった。ＨＳＶ−１（Ｆ）を再度注射したマウスは、野生型のウイルスを注射した後、２乃至６週で死亡したが、Ｒ７０２０を再度注射したマウスは成長した。このように、予めＲ７０２０で処理された腫瘍の残存細胞から生じたＳＱ−２０ｂ腫瘍は、感染への感受性を維持している。
【００３０】
［実施例５：照射と組み合わせたＲ７０２０処置］
神経膠腫異種移植片についての初期研究によって、弱毒化ＨＳＶの投与と照射の組み合わせの結果、腫瘍細胞破壊の増強と、ウイルス複製の増強とが引き起こされることが示されている［Advani, et al. Gene Ther. 5, 160-165 (1998)］。放射線耐性のＳＱ−２０６細胞系の照射がＲ７０２０の腫瘍崩壊効果を増強するかどうかを調べるために、異種移植片を前記と同様に感染させて、下記のごとき分画照射プロトコルに付した。
【００３１】
異種移植片の照射は、他で報告されたとおりに行った［Advani, et al. Gene Ther. 5, 160-165 (1998)］。簡単に説明すると、腫瘍を保有する後肢をＧＥ ２５０ ｋｖマキシトロンジェネレータを使用して（１９１ ｃＧｙ／分、１５０ ｋＶｐ）電離放射線に曝した。照射は月曜日に４００ｃＧｙ画分にて、Ｒ７０２０での感染後６時間に開始し、火曜日、木曜日、および金曜日に２週間、最高線量３２００ｃＧｙまでを投与した。分画照射は、臨床的に関連するプロトコルにおいて通常用いられる線量で投与された。
【００３２】
その結果、対照の腫瘍に比較して、照射のみでは異種移植片の成長に小幅な遅延が引き起こされることが示唆され、ＳＱ−２０６細胞系の放射線耐性が確認された。実施例２に記載のとおりＲ７０２０で異種移植片を感染した後１３日まで、腫瘍容量の低減は起こらなかったものの、Ｒ７０２０と照射を組み合わせた結果、Ｒ７０２０のみで処理した腫瘍よりも１週間早く、腫瘍容量の消失が起こった。加えて、Ｒ７０２０のみを受けた異種移植片に比して、照射およびＲ７０２０の双方を受けた異種移植片では、かなり早期に腫瘍容量の最下点に至った（２０日 対 ３０日）。
【００３３】
これらの結果から、一般的な癌処置に対して耐性になることの多い実験的ヒト腫瘍の処置におけるＲ７０２０の劇的な抗腫瘍有効性が最初に立証され、そしてＲ７０２０はそれ自体有効な抗腫瘍剤であるが、Ｒ７０２０と照射とを組み合わせると、より迅速且つ完全な腫瘍細胞破壊ももたらされることが示唆される。抗癌療法として弱毒化ＨＳＶと照射とを組み合わせることが、単一の薬剤療法には腫瘍負担が大きすぎるかもしれない場合の臨床状態において特に有用であることがわかる。
【００３４】
前記の例示的な実施例にて示した本発明における多くの修飾および変更が、当業者に想起されると考えられる。したがって、特許請求の範囲に示される限定のみしか、本発明に課されるべきでない。本明細書において引用された参考文献は、参照することによってその全体を本明細書に組み入れることとする。