(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小流体分析装置内で試料を処理する方法であって、
a)  充填材料を捕捉するのに適した捕捉区域を有する主要通路を提供し、
b)  所定の溶媒組成を有する溶液中に調製された試薬処理された充填材料のスラリーを提供し、
c)  前記捕捉区域を装填し、前記試薬処理された充填材料の充填床を形成するように、該捕捉区域に接続された流動通路を通して、該捕捉区域中への該試薬処理された充填材料の流動を生じさせ、
d)  前記試薬処理された充填材料の試薬が該試料を処理するように、分析物を含有する試料を前記充填床を通して流動させ、それによって、前記捕捉区域から排出される試料が、変更された分析物組成を有する、
各工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
微小流体分析装置内で試料を処理する方法であって、
a)  充填材料を捕捉するのに適した捕捉区域を有する主要通路を提供し、
b)  所定の溶媒組成を有する溶液中に調製された試薬処理された充填材料のスラリーを提供し、
c)  前記捕捉区域を装填し、前記試薬処理された充填材料の充填床を形成するように、該捕捉区域に接続された流動通路を通して、該捕捉区域中への該試薬処理された充填材料の流動を生じさせ、
d)  前記試薬処理された充填材料の試薬が該試料を処理するように、分析物を含有する試料を前記充填床を通して流動させ、それによって、前記捕捉区域から排出される試料が、変更された分析物組成を有し、
e)  前記充填材料の凝集および前記充填床の安定化を行うように、前記溶媒の組成を調節する、
各工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
工程b)が、多孔質ビーズから構成される充填材料を提供することを特徴とする請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記多孔質ビーズが、約0.7から約10.0μｍまでの範囲の直径を有するように選択されることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記多孔質ビーズが、約1.5から約4.0μｍまでの範囲の直径を有するように選択されることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項６】
前記溶媒がアセトニトリルであり、工程e)が、前記充填床を安定化するようにその濃度レベルを約50％未満に調節する工程を含むことを特徴とする請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
前記溶媒がアセトニトリルであり、工程e)が、前記充填床を安定化するようにその濃度レベルを約30％未満に調節する工程を含むことを特徴とする請求項４または５記載の方法。
【請求項８】
前記充填床を不安定化するように前記濃度レベルを50％より高く調節し、前記捕捉区域を未装填状態にするように、工程c)の前記流動を逆流させる各工程を含むことを特徴とする請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
前記捕捉区域を再度充填するように工程c)を繰り返し、前記充填床を再度安定化するように前記濃度レベルを再調節する各工程を含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
工程c)の前に、凝集を防ぐように、前記充填材料に中性界面活性剤を加え、
工程c)の後に、該中性界面活性剤を除去して、凝集を促進させる、
各工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
工程c)の後に、前記充填床を安定化するように、重合剤を前記流動通路中に導入し、該重合剤を重合させる、
各工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１２】
工程d)が、流体力を加えて、前記充填材料の流動を生じさせる工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記充填材料が少なくともいくつかの荷電された粒子を含み、工程d)が、電圧を加えて、該充填材料の流動を生じさせる工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記充填材料が、磁場の影響を受けやすい粒子を少なくともいくつか含み、工程d)が、該充填材料の流動を生じさせる磁場を加える工程を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記充填材料の直接の見通し線進入を防ぎ、それによって、均一な充填を促進するように、前記流動通路と前記捕捉区域との間の接続点に屈曲構造体を提供する工程を含むことを特徴とする請求項１から１４いずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
微小流体分析装置内にビーズベースの試薬を捕捉する方法であって、
a)  ビーズベースの充填材料を捕捉するのに適した捕捉区域を有する主要通路を提供し、
b)  所定の溶媒組成を有する溶液中に調製された、試薬処理されたビーズのスラリーを提供し、
c)  前記捕捉区域に装填し、前記ビーズの充填床を形成するように、該捕捉区域に接続された流動通路を通る該捕捉区域中への前記ビーズの流動を生じさせ、
d)  前記充填材料の凝集および前記充填床の安定化を行うように、前記溶媒の組成を調節する、
各工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
微小流体分析装置において、
a)  上側表面を有する実質的に平面の基板、
b)  該上側表面に形成された少なくとも１つの主要通路であって、第１と第２の端部および使用されている流動の所定の方向を有する主要通路、
c)  前記平らな基板の上方に配置され、前記通路を上から閉鎖するカバープレート、
d)  前記主要通路を横切って、該通路の前記第１と第２の端部の間に形成された第１の堰であって、使用時に、少なくともある程度の流動が、該第１の堰を越えて流れることのできる少なくとも１つの流動間隙を提供し、このとき、一般に該流動間隙よりも大きい構成粒子を有する充填材料を捕捉している第１の堰、
e)  前記平面の基板の上側表面に形成された少なくとも１つの副通路を含み、該副通路が、前記第１の堰より上流の位置において第１の端部で前記主要通路に、第２の端部でリザーバに接続されており、該副通路が前記主要通路よりも高い流れ抵抗を与え、前記リザーバが前記充填材料を含有することを特徴とする微小流体分析装置。
【請求項１８】
前記副通路の接続された第１の端部より上流に位置する第２の堰をさらに含み、前記第１と第２の堰がそれらの間にチャンバを形成し、該第２の堰が、使用時に、少なくともある程度の流動が該第２の堰を越えて流れることのできる少なくとも１つの流動間隙を提供し、このとき、前記チャンバ内に前記充填材料を捕捉していることを特徴とする請求項１７記載の微小流体分析装置。
【請求項１９】
前記主要通路への各々の副通路の接続部に、一方の側に曲げられた屈曲構造体が設けられ、それによって、使用時に、充填材料が前記チャンバ中に吹き付けられ、均一な充填を促進させることを特徴とする請求項１８記載の微小流体分析装置。
【請求項２０】
前記屈曲構造体が、少なくともある程度、前記副通路から前記チャンバ中への充填材料の直接の見通し線進入を妨害し、該屈曲構造体の一方の側にチャンバ口部を形成することを特徴とする請求項１９記載の微小流体分析装置。
【請求項２１】
前記流動間隙が、前記カバープレートと前記堰の頂部との間にほぼ均一な間隙を含むことを特徴とする請求項１７から１８いずれか１項記載の微小流体分析装置。
【請求項２２】
前記流動間隙が、前記堰内の複数の実質的に垂直な間隙を含むことを特徴とする請求項１７から１８いずれか１項記載の微小流体分析装置。
【請求項２３】
前記装置が１つの微小流体チップ上に完全に形成されていることを特徴とする請求項１７から２２いずれか１項記載の微小流体分析装置。
【請求項２４】
請求項１７記載の微小流体分析装置内に充填反応床を形成する方法において、非導電性基板を提供し、前記主要通路の第２の端部および充填材料を含有する前記リザーバに比較的高い電圧を加え、前記主要通路の第１の端部に比較的低い電圧を加えることにより界面動電流れを生じさせ、それによって、充填材料が該リザーバから該主要通路中に流動し、前記第１の堰に対して捕捉される各工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記リザーバに比較的低い電圧を加えながら、前記主要通路の第１と第２の端部に比較的高い電圧を加えることにより、充填材料が該主要通路から除去されることを特徴とする請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
請求項１７記載の微小流体分析装置内に充填反応床を形成する方法において、前記主要通路の第２の端部および充填材料を含有する前記リザーバに比較的高い圧力を加え、該主要通路の第１の端部に比較的低い圧力を加えることにより圧力駆動流れを生じさせ、したがって、充填材料が、該リザーバから該主要通路中に流動し、前記第１の堰に対して捕捉される工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２７】
前記リザーバに比較的低い圧力を加えながら、前記主要通路の第１と第２の端部に比較的高い圧力を加えることにより、充填材料が該主要通路から除去されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
請求項１７記載の微小流体分析装置内のチャンバを充填する方法において、非導電性基板を提供し、充填材料を含有する前記リザーバに比較的高い電圧を加え、前記主要通路の第１と第２の端部に比較的低い電圧を加えることにより界面動電流れを生じさせ、それによって、充填材料が該リザーバから該チャンバ中に流動し、前記第１と第２の堰により捕捉される各工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
充填材料が、前記界面動電流れを逆にすることにより前記チャンバから除去されることを特徴とする請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
請求項１７記載の微小流体分析装置内のチャンバを充填する方法において、充填材料を含有する前記リザーバに比較的高い圧力を加え、第１と第２の前記主要リザーバに比較的低い圧力を加えることにより圧力駆動流れを生じさせ、それによって、充填材料が、該充填材料リザーバから前記チャンバ中に流動し、前記第１と第２の堰により捕捉される工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３１】
充填材料が、前記圧力駆動流れを逆にすることにより前記チャンバから除去されることを特徴とする請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
請求項３１記載の微小流体分析装置内のチャンバを充填する方法において、磁性充填材料を提供し、前記チャンバ内に磁力を提供することにより、磁気駆動流れを生じさせ、それによって、前記充填材料が該チャンバに進入し、前記第１と第２の堰により捕捉される工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
充填材料が、前記チャンバ内の前記磁力を逆にすることにより、該チャンバから除去されてもよいことを特徴とする請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記充填材料が多孔質ビーズから構成されることを特徴とする請求項２４から３３いずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
前記ビーズがほぼ球状であることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記ビーズが最初に緩衝液中に懸濁されていることを特徴とする請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記緩衝液が、水と混和性の有機溶媒であることを特徴とする請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記有機溶媒が、50％までの濃度レベルのアセトニトリルであることを特徴とする請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記試料が、固相抽出を受けることを特徴とする請求項１から１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項４０】
前記試料が、キャピラリー電気クロマトグラフィーを受けることを特徴とする請求項１から１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項４１】
前記試料が、ビーズベースの試薬を用いた免疫測定を受けることを特徴とする請求項１から１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項４２】
前記試薬処理された充填材量が、酵素の固定化されたビーズからなることを特徴とする請求項１から１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項４３】
微小流体分析装置において、
a)  上側表面を有する実質的に平面の基板、
b)  該上側表面に形成された少なくとも１つの主要通路であって、第１と第２の端部および使用されている流動の所定の方向を有する主要通路、
c)  前記平らな基板の上方に配置され、前記通路を上から閉鎖するカバープレート、
d)  前記主要通路を横切って、該通路の前記第１と第２の端部の間に形成された第１の堰であって、使用時に、少なくともある程度の流動が、該第１の堰を越えて流れることのできる少なくとも１つの流動間隙を提供し、このとき、一般に該流動間隙よりも大きい構成粒子を有する充填材料を捕捉している第１の堰、
e)  前記充填材料の凝集および該充填材料の充填床の安定化を行うように、使用時に溶媒の組成を調節する手段を有することを特徴とする微小流体分析装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、広く、微小流体分析装置に関し、より詳しくは、小型化レベルで液相分析を行うためのマイクロ全分析装置（μ−ＴＡＳ）に関する。
【０００２】
発明の背景
マイクロ全分析装置（μ−ＴＡＳ）の分野における最近の進歩により、１つのマイクロチップで小型化レベルで化学反応、分離および検出を行う装置がもたらされた［例えば、Harrison,D.J.; Fluri,K.; Seiler,K.; Fan,Z.; Effenhauser,C.S.; and Manz,A., Science 1993, 261, 895-897. Harrison,D.J.; and van den Berg,E.; Eds., Micro Total Analysis Systems '98, Proceedings of the μ-TAS '98 Workshop (Kluwer:Dordrecht, 1998). Coyler,C.L.; Tang,T.; Chiem,N.; and Harrison,D.J., Electrophoresis 1997, 18, 1733-1741参照］。
【０００３】
殆どの従来技術の微小流体デバイスは、従来の開放管流動設計および溶液相試薬に基づくものである。これらのデバイスの機能性は増大し続けているが、これらの従来技術において現在欠けている重要な特徴の１つは、固定化試薬または固定相を有する充填材料を導入するための、オンチップ充填反応床を効果的に組み込む能力である。ある従来技術の設計において充填反応床を用いる試みがいくつか行われたが、今までのところ、充填材料（微細ビーズのような）を複雑な微小流体マニホールドの部分に充填するのが難しいために、微小流体デバイス内にこれらの試薬供給ビヒクルを効果的に利用することが妨げられていた（充填の難しさは、この分野の専門家によりよく認識されている。例えば、Ericson,C.; Holm,J.; Ericson,T.; and Hjertenk,S., Analytical Chemistry参照）。
【０００４】
ある従来技術の例において、ビーズ捕捉フリットを有する充填床クロマトグラフィーデバイスが、シリコン基板内に製造された［Ocvirk,G., Verpoorte,E., Manz,A., Grasserbauer,M., and Widmer,H.M. Analytical Methods and Instrumentation 1995, 2, 74-82］。しかしながら、この従来技術の設計における充填材料は、容易に充填したり、交換したりできず、したがって、その実用性は限られていた。
【０００５】
何人かの著者が、従来のキャピラリー内に充填材料を保持するためのフリットを再現できるように製造することに関連する困難を記載してきた［Boughtflower,R.J.; Underwood,T.; Paterson,C.J. Chromatographia 1995, 40, 329-335. Van den Bosch,S.E.; Heemstra,S.; Kraak,J.C.; Poppe,H.J. Vhromatogr. A 1996, 755, 165-177. Colon,L.A.; Reynolds,K.J.; Alicea-Maldonado,R.; Fermier,A.M. Electrophoresis 1997, 18, 2162-2174. Majors,R.E. LC-GC 1998, 16, 96-110］。従来の装置に用いられたフリットは、時間と労力のかかる方法を用いて調製されるものであり、最も一般的に用いられていた方法は、水性ケイ酸ナトリウムにより湿らされた、純粋なシリカゲルの使用を含む。フリットは、最初に、シリカおよび水性ケイ酸ナトリウムから製造されたペースト中にキャピラリー端部を叩いて入れることにより製造される。次いで、形成されたシリカの栓を加熱して、フリットを製造する。現在の構成方法は、使用できるフリットを高い歩留まりで製造していない。
【０００６】
さらに、従来技術の構成方法により製造されたフリットを用いると、望ましくない気泡が形成されることが多い［Altria,K.D.; Smith,N.W.; and Turnbull,C.H., Chromatographia, 46 (1997) 664. Majors,R.E., LC-GC, 16(1998) 96］。気泡により、カラム内に不連続が生じ、溶液の流動が妨げられ、最終的に、分離が妨げられる。これらの気泡は、ビーズ捕捉フリットから開放キャピラリー中に移動することにより生じる電気浸透流（ＥＯＦ）速度の変化から生じると考えられている。より高い電圧で増大することが観察されている、気泡の形成により、キャピラリーを横切るように引加できる電圧の量が制限され、それによって、カラムの長さ、分離効率、および分析速度が制限されてしまう。
【０００７】
従来技術の制限を克服した、機能的なオンチップ充填反応床設計を開発することにより、微小流体ツールボックスの範囲が著しく向上し、そのようなデバイスの用途数が増えるであろう。
【０００８】
発明の要約
一般に、本発明は、小型化レベルで充填材料（例えば、ビーズ）を効果的に交換できる、１つ以上の堰構造体を用いたオンチップ床設計を提供する。本発明は、微小流体分析装置の機能を新規の用途に拡張する。例えば、本発明により形成された充填反応床は、以下詳細に説明するように、オンチップ固相抽出（ＳＰＥ）およびオンチップキャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）を可能にする。この設計はさらに、例えば、集積充填床免疫または酵素リアクタを含むように拡張できる。
【０００９】
第１の態様において、本発明は、微小流体分析装置内で試料を処理する方法であって、
a)  充填材料を捕捉するのに適した捕捉区域を有する主要通路を提供し、
b)  所定の溶媒組成を有する溶液中に調製された、試薬処理された充填材料のスラリーを提供し、
c)  捕捉区域に装填し、充填材料の充填床を形成するように、捕捉区域に接続された流動通路を通して、捕捉区域中への充填材料の流動を誘発させ、
d)  分析物を含有する試料を充填床に通して流動させ、それによって、捕捉区域を出る試料が、変更された分析物組成を有するようになる、
各工程を含む方法を提供する。
【００１０】
ある実施の形態において、本発明はさらに、
e)  充填材料の凝集および充填床の安定化を行うように、溶媒の組成を調節する、
工程を含む。
【００１１】
別の実施の形態において、工程b)が、多孔質ビーズを含む充填材料を提供する工程を含む。
【００１２】
別の実施の形態において、前記多孔質ビーズは、約0.7から約10.0μｍまでの範囲の直径を有するように選択される。
【００１３】
さらに別の実施の形態において、前記多孔質ビーズは、約1.5から約4.0μｍまでの範囲の直径を有するように選択される。
【００１４】
別の実施の形態において、前記溶媒がアセトニトリルであり、工程e)が、充填床を安定化させるために、濃度レベルを約50％未満に調節する工程を含む。
【００１５】
別の実施の形態において、前記溶媒がアセトニトリルであり、工程e)が、充填床を安定化させるために、濃度レベルを約30％未満に調節する工程を含む。
【００１６】
別の実施の形態において、前記方法はさらに、充填床を不安定にさせるために、濃度レベルを50％より高く調節し、前記充填区域を未装填状態にするように、工程c)において流動を逆流させる各工程を含む。
【００１７】
別の実施の形態において、前記方法はさらに、前記充填区域に再装填するように、工程c)を繰り返し、充填床を再度安定化するために、濃度レベルを再調節する各工程を含む。
【００１８】
さらに別の実施の形態において、前記方法はさらに、
工程c)の前に、凝集を防ぐように、前記充填材料に中性界面活性剤を加え、
工程c)の後に、凝集を促進させるように、この中性界面活性剤を除去する各工程を含む。
【００１９】
別の実施の形態において、前記方法はさらに、
工程c)の後に、充填床を安定化するように、重合剤を流動通路に導入し、この重合剤を重合させる各工程を含む。
【００２０】
さらに別の実施の形態において、工程d)は、前記充填材料の流動を誘発する流体力を加える工程を含む。
【００２１】
別の実施の形態において、前記充填材料は少なくともいくつかの荷電粒子を含み、工程d)が、前記充填材料の流動を誘発する電場を加える工程を含む。
【００２２】
別の実施の形態において、前記充填材料は、磁場の影響を受けやすい粒子を少なくともいくつか含み、工程d)が、前記充填材料の流動を誘発する磁場を加える工程を含む。
【００２３】
別の実施の形態において、前記方法はさらに、前記充填材料の直接の見通し線(line-of-sight)進入を防ぎ、それによって、均一な充填を促進するように、前記流動通路と前記捕捉区域との間に接続点に屈曲構造体を提供する工程を含む。
【００２４】
別の態様において、本発明は、微小流体分析装置内にビーズベースの試薬を捕捉する方法であって、
a)  ビーズベースの充填材料を捕捉するのに適した捕捉区域を有する主要通路を提供し、
b)  所定の溶媒組成を有する溶液中に調製された、試薬処理されたビーズのスラリーを提供し、
c)  前記捕捉区域に装填し、前記ビーズの充填床を形成するように、前記捕捉区域に接続された流動通路を通して、充填区域中へのビーズの流動を誘発させ、
d)  前記充填材料の凝集および充填床の安定化を行うように、前記溶媒の組成を調節する、
各工程を含む方法を提供する。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、微小流体分析装置において、
a)  上側表面を有する実質的に平面の基板、
b)  この上側表面に形成された少なくとも１つの主要通路であって、第１と第２の端部および使用される所定の流動方向を有する主要通路、
c)  前記平面の基板上に配置されたカバープレートであって、その上から前記通路を閉鎖するカバープレート、
d)  前記主要通路を横切り、該通路の第１と第２の端部の間に形成された第１の堰であって、流動間隙よりもほぼ大きい成分粒子を有する充填材料を捕捉しながら、使用中に、少なくともいくつかの流動を第１の堰を通過して流動させる少なくとも１つの流動間隙を提供する堰、
を含む装置を提供する。
【００２６】
ある実施の形態において、前記装置はさらに、前記平面の基板の上側表面中に形成された少なくとも１つの副通路を含み、この副通路が、第１の端部で、前記第１の堰より上流の位置で前記主要通路に、第２の端部で、リザーバに接続され、この副通路が前記主要通路よりも高い流動抵抗を与える。
【００２７】
別の実施の形態において、前記装置はさらに、前記副通路の接続された第１の端部より上流に位置する第２の堰を含み、第１と第２の堰がそれらの間にチャンバを形成し、この第２の堰が、チャンバ内に前記充填材料を捕捉しながら、使用中に、少なくともある程度の流動を第２の堰を通過するように流動させる少なくとも１つの流動間隙を提供する。
【００２８】
別の実施の形態において、前記主要通路への各々副通路の接続部には、１つの側部に曲げられた湾曲構造体が設けられ、それによって、使用中に、充填材料が前記チャンバ中に吹き付けられて、均一な充填が促進される。
【００２９】
別の実施の形態において、前記湾曲構造体が、前記副通路から前記チャンバ中への充填材料の直接の見通し線進入を少なくともある程度妨害し、湾曲構造体の一方の側に対してチャンバ口部を形成する。
【００３０】
別の実施の形態において、前記流動間隙が、前記カバープレートと前記堰の頂部との間にほぼ均一な間隙を含む。
【００３１】
さらに別の実施の形態において、前記流動間隙は、前記堰内の複数の実質的に垂直な間隙を含む。
【００３２】
別の実施の形態において、前記装置は、１つの微小流動チップ上に完全に形成される。
【００３３】
別の実施の形態において、本発明は、非導電性基板を提供し、主要通路の第２の端部および充填材料を含有するリザーバに、比較的高い電圧を加え、主要通路の第１の端部に比較的低い電圧を加えることにより界面動電流動を行わせる各工程を含み、したがって、充填材料がリザーバから主要通路中に流動し、第１の堰で捕捉される方法を提供する。
【００３４】
ある実施の形態において、前記充填材料は、前記リザーバに比較的低い電圧を加えながら、前記主要通路の第１と第２の端部に比較的高い電圧を加えることにより、主要通路から除去される。
【００３５】
別の態様において、本発明は、主要通路の第２の端部および充填材料を含有するリザーバに比較的高い圧力を加え、主要通路の第１の端部に比較的低い圧力を加えることにより、圧力駆動流れを生じさせる各工程を含み、したがって、充填材料がリザーバから主要通路中に流動し、第１の堰により捕捉される方法を提供する。
【００３６】
ある実施の形態において、充填材料は、前記リザーバに比較的低い圧力を加えながら、前記主要通路の第１と第２の端部に比較的高い圧力を加えることにより、主要通路から除去される。
【００３７】
別の実施の形態において、前記方法は、本発明は、非導電性基板を提供し、充填材料を含有するリザーバに比較的高い電圧を加え、主要通路の第１と第２の端部に比較的低い電圧を加えることにより界面動電流れを生じさせる各工程を含み、したがって、充填材料がリザーバからチャンバ中に流動し、第１と第２の堰で捕捉される方法を提供する。
【００３８】
別の実施の形態において、充填材料は、前記界面動電流動を逆流させることによりチャンバから除去される。
【００３９】
別の態様において、本発明は、微小流体分析装置内のチャンバを充填する方法であって、充填材料を含有するリザーバに比較的高い圧力を加え、第１と第２の主要リザーバに比較的低い圧力を加えることにより、圧力駆動流れを生じさせる工程を含み、それによって、充填材料が、充填材料リザーバから、チャンバ中に流動し、第１と第２の堰により捕捉される方法を提供する。
【００４０】
別の実施の形態において、充填材料は、圧力駆動流れを逆流させることにより、チャンバから除去されてもよい。
【００４１】
別の実施の形態において、前記方法は、磁性を帯びた充填材料を提供し、チャンバ内に磁力を加えることにより磁気駆動流れを生じさせる工程を含み、それによって、充填材料がチャンバ内に進入し、第１と第２の堰により捕捉される。
【００４２】
別の実施の形態において、充填材料は、チャンバ内の磁力を逆にすることにより、チャンバから除去されてもよい。
【００４３】
上述した実施の形態のいずれにおいても、充填材料は、多孔質ビーズから構成されてもよい。
【００４４】
別の実施の形態において、前記ビーズは、ほぼ回転楕円体であってもよい。
【００４５】
別の実施の形態において、前記ビーズは、最初に緩衝液中に懸濁されている。
【００４６】
別の実施の形態において、前記緩衝液は、水混和性有機溶媒である。
【００４７】
別の実施の形態において、前記有機溶媒は、50％までの濃度レベルを有するアセトニトリルである。
【００４８】
本発明をより理解するために、例として、本発明の好ましい実施の形態を示す、添付の図面を参照する。
【００４９】
発明の詳細な説明
先に説明したように、本発明は、微小流体分析装置の用途の数を著しく増やす機能的オンチップ充填反応床を提供するために、オンチップの充填材料（ビーズのような）を捕捉し、捕捉区域を効果的に充填し、取り出せる都合のよい装置および方法を提供するように設計されている。
【００５０】
本発明により促進されるそのような拡張された用途の１つは、固相抽出（ＳＰＥ）によるオンチップ試料の予備濃縮である。微小流体分析において、ＳＰＥは、検出限界の問題を克服すること、または潜在的な干渉を除去することを要求されることが多い。これまで、マイクロチップ内の予備濃縮は、「等電点電気泳動法」を使用した試料スタッキングにより行われてきた［Jacobson,S.C. and Ramsey,M. Electrohporesis 1995, 16, 481-486］。都合よくは、試料スタッキングとは異なり、ＳＰＥは、特定の分析物に関して選択性に作製でき、緩衝液濃度の精密な制御を必要としない。ＳＰＥに関して、予備濃縮の量は予備濃縮時間により制限され、このために、試料スタッキングよりも融通性がある。分析物のＳＰＥは、分析物の予備濃縮に関してだけでなく、他の不純物の除去または溶媒条件の変更に関しても、有益となる。ＳＰＥの微小流体デバイスとの組合せが行われてきたが［Figeys,D. and Aebersold,R. Anal.Chem. 1998, 70, 3721-3727］、これらの従来技術のデバイスにおけるＳＰＥ部材は、チップの外部のキャピラリーまたは同様なカートリッジ内に作製され、したがって、より複雑かつより高価な装置となっていた。本発明は、オンチップＳＰＥ部材を促進することにより、この従来技術の制限を克服するように設計されている。
【００５１】
本発明により実現されたように、集積オンチップＳＰＥ部材は、製造が非常に容易であり、チップに結合する死空間が小さい必要がなく、従来技術において必要とされたオフチップ操作から生じる試料の取扱い損失や汚染問題が除かれる。本発明により促進される、チップ上へのＳＰＥのごく普通の組込みにより、オンチップ検出限界に関する問題が減少し、集積できる試料の調製段階の範囲が改善されると期待される。
【００５２】
本発明により促進される拡張された別の用途は、オンチップキャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）である。ＣＥＣは、液体クロマトグラフィーおよびキャピラリー電気泳動の両方の分離能を組み合わせたという事実のために、最近著しい注目を浴びるようになってきた。これまで、デバイス内にクロマトグラフィー材料を充填することに関連する難点は、従来技術の開放通路法に行われてきた以前のクロマトグラフィーに関する労力に最も集中していた［Manz.A.,Miyahara,Y.Miura,J.,Watanabe,Y.Miyagi and H.Sato,K.,Sens.Actuators 1990,B1,249-255; Jacobson,S.C.,Hergenroder,R.Koutny,L.B.and Ramsey.J.M.Anal.Chem.1994,66,2369-2373; Kutter,J.P.,Jacobson,S.C.,Matsubara,N. and Ramsey,J.M.Anal.Chem.1998,70,3291-3297; He,B.Tait,N. and Regnier,F.Anal.Chem.1998,70,3790-3797］。従来技術において、2μｍ以下の通路幅を有する開放通路法のデバイスは、開放カラム中の移動相の移動を改善する必要があり、閉塞および検出のための短い路長のような他の事項を実際に検討する必要が生じた。また、再現性およびそのような構造体における固定相の費用に関する問題もあった。
【００５３】
本発明者により実現されたように、本発明によるオンチップ充填床クロマトグラフィーには、低移動相質量移動を提供する利点があり、様々な固定相が利用できるようになった。この場合、オフチップで調製された固定相を使用すると、チップを被覆する必要がなくなり、固定相の調製を最適化できるという利点が得られる。
【００５４】
本発明により促進される拡張されたさらに別の用途は、オンチップのビーズに基づいた免疫測定法および酵素に基づく測定法を提供することにある。これらの用途が以下にさらに説明される。
【００５５】
実施例
実施例により本発明を説明するために、本発明者は、ここに記載する一連の実験を行った。
【００５６】
チップの設計
図１Ａおよび１Ｂは、これらの実験に用いられた微小流体デバイス10を示している。デバイス10は、基板８の頂面に形成された主要通路11を含み、主要通路11は、これも基板８に形成されたチャンバ４により仕切られている。チャンバ４により仕切られた主要通路11の２つの分岐は、さらに主要リザーバ１および２と称される。チャンバ４は、狭い副通路５により充填材料リザーバ３に接続されている。充填材料リザーバおよび狭い副通路５もまた、基板８に形成されている。図１Ｂは、走査電子顕微鏡（マサチューセッツ州、ピーボディーのJeol X-Vision JSM6301FXV）により得られたチャンバ４の拡大画像を示している。チャンバ４は、主要通路11の比較的狭い部分に、主要通路11を横切って形成された２つの堰６，７を提供することにより形成されている（図１Ａ）。図１Ｂから分かるように、堰６，７は、主要通路11の深さほどは高くなく、したがって、以下に説明するように、ある程度の流体が６，７を越えて流れることができる。このデバイス10は、公知の化学エッチング法を用いて、Alberta Microelectronic Corporation（アルバータ州、エドモントン）によりコーニング0211ガラスに作製された［Fan,Z.H.; Harrison,D.J.Anal.Chem.1994,66,177-184］。この基板材料は非導電性であるが、界面動電力以外が用いられる場合（以下に詳述するように）、基板材料は、半導体または導体であってもよいことに留意されたい。デバイス10を形成するために、２つのフォトマスクが必要であった：第１のフォトマスクを用いて、堰６，７の頂部を約1μｍの深さまでエッチングした；第２のフォトマスクを用いて、通路５，11を約10μｍの深さまでエッチングした。
【００５７】
図２Ａは、通路11（主要リザーバ１，２）の深さほど高くはない堰６，７の断面図を示しており、したがって、基板の頂部に配置され、それによって、チャンバ４、通路５，11およびリザーバ１，２，３を閉じているカバープレート９（図１Ａにも図１Ｂにも示されていない）と堰６，７の頂部との間に小さな流動間隙14，15が設けられる。図２Ａに示されているように、ビーズ12は、一般に、流動間隙14，15よりも大きく、したがって、チャンバ４から逃れられない。
【００５８】
図２Ｂおよび２Ｃは、堰６’がより小さい流動インピーダンスを与えるように、実質的に垂直Ｖ字型刻み目６”が設けられている、堰６’の代わりの実施の形態の、それぞれ、側面図および端部図を示している。垂直Ｖ字型刻み目６”は、ビーズがそれらを通って流動できないほど十分に狭いべきである（すなわち、最小のビーズの直径よりも少なくとも約10％小さいべきである）。
【００５９】
溶液および試薬
これらの実験に様々な溶液および試薬を用いた。使用前に、アセトニトリル（オンタリオ州、トロントのＢＤＨ社）を、0.45μｍのナイロン−６，６フィルタ（イリノイ州、ディアフィールドのAltech社）に通して濾過した。そうでなければ、アセトニトリルを受け取ったまま用い、電解質は加えなかった。また、超純水（オンタリオ州、ミシソーガのMillipore Canada社）中に、50ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ7.0）および酢酸アンモニウム（ｐＨ8.5）の緩衝液を調製した。アセトニトリルおよび緩衝液の１：１（ｖ／ｖ）混合物を調製した。0.10ｍＭの４，４−ジフルオロ１，３，５，７，８ペンタメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３（オレゴン州、ユージーンのMolecular Probes社）の原液を、ＨＰＬＣ級のメタノール（ニュージャージー州、フェアローンのFisher社）中に調製した。フルオレセイン二ナトリウム塩（シグマ社）の1ｍＭの原液をリン酸緩衝液中に調製した。次いで、両方の原液を、50ｍＭのリン酸緩衝液および50ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液中で希釈して、1.0ｍＭの溶液を得て、次いで、これらを1.0ｎＭまで希釈した。この1.0ｎＭ溶液は、予備濃縮および電気クロマトグラフィーのための試料として用いた。使用前に、全ての水溶液（緩衝液および試料）を、酢酸セルロースシリンジフィルタ（0.2μｍの細孔サイズ）（ニューヨーク州、ロチェスターのNalgene社）に通して濾過した。
【００６０】
充填材料
これらの実験に用いたある適切な充填材料は、逆相クロマトグラフィー固定樹脂を含んだ。この樹脂は、走査電子顕微鏡により測定したように、粒子の直径が1.5から4.0μｍまでの範囲に及ぶ多孔質Ｃ−１８樹脂であるSpherisorb  ＯＤＳ１（英国、フリント州のPhase Separations社）であった（ＯＤＳビーズ１２）。約0.003ｇ／ｍｌのＯＤＳ１のスラリーをアセトニトリル中に調製した。このスラリーを用いて、充填材料リザーバ３に供給し、その後、チャンバ４を充填した。
【００６１】
ある溶媒および添加剤の組合せが、充填材料が充填されたチャンバ内に留まるのに役立つことが分かった。例えば、ＯＤＳビーズをアセトニトリル中に導入する場合、それらは容易に流動するが、一方で、その後、水性またはほぼ水性の溶媒に切り換えると、ビーズが凝集し、チャンバ内に捕捉されるようになる。ＯＤＳビーズに関して、充填床を不安定化する点まで観察される凝集を乱さずに、30％までのアセトニトリルが水溶液中に存在できた。50％までアセトニトリルが存在すると、凝集がわずかに損失し、充填床がわずかに不安定化された。別の例として、タンパク質Ｇまたはタンパク質Ａが被覆されたビーズは水溶液中で凝集体を形成した。このために、それらビーズを捕捉区域中に導入することが難しくなった。しかしながら、Ｔｗｅｅｎ２０またはＢｒｉｊ３５（両方とも登録商標）のような中性界面活性剤を添加すると、そのような凝集が防がれ、前記ビーズを導入できた。逆に、界面活性剤をその後水性溶媒から除去すると、凝集が生じ、捕捉された床の安定性が向上した。以下の傾向が観察された：非極性または部分的に非極性のビーズ相（例えば、ＯＤＳおよびタンパク質被覆ビーズ）を使用する場合、溶媒の表面張力を、有機溶媒または界面活性剤のような有機添加剤を添加することにより、水または緩衝水の表面張力よりも低下させると、凝集する傾向が減少した。反対に、より小さい表面張力を有する材料を水溶液から減少させるまたは除去すると、ビーズを床上の適所に固定する傾向が上昇し、これらデバイス内のビーズ捕捉を向上させるための「溶媒固定」法が形成された。メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド、炭酸プロピレン等のような、水と混和性のある、アセトニトリル以外の有機溶媒をこれらの目的のために使用してもよい。ビーズ上または試料中に存在するかもしれないタンパク質と相溶性である限り、中性界面活性剤の代わりに、荷電された界面活性剤を用いてもよい。
【００６２】
磁気充填に関して用いられる磁気ビーズが、Ａｂｅｂａｗ−タンパク質「Ａ」被覆ビーズ：スチレンおよびジビニルベンゼンからなるコポリマーマトリクス（カリフォルニア州、Prozyme）内に分散された36-40％の磁鉄鉱の組成を含んでもよい。また、ｍＲＮＡの単離のために、Ｇｕｉｆｅｎｇ−ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）25被覆ビーズを用いてもよい。これらビーズは、ビーズ全体に亘り磁気材料（Ｆｅ2Ｏ3およびＦｅ3Ｏ4）が均一に分散している。ビーズは、前記磁気材料（ノルウェー国、オスロのDynal社）を収容するポリスチレンにより被覆されている。
【００６３】
器具の使用
本発明の実験を実施する際に、様々な器具を用いた。これらの器具およびその操作は当業者によく知られているので、短い記載のみが与えられ、それら器具は図面に示されていない。
【００６４】
オンチップでのビーズの充填および全ての液体の取扱いに必要な電気泳動電圧を制御するのに用いた電源およびリレー装置は、以前に記載されていた［Fluri,K.,Fitzpatrick,G.,Chiem,N. and Harrison,D.J.Anal.Chem.1996,68,4285-4290］。ＬａｂＶＩＥＷプログラム（テキサス州、オースチンのNational Instruments社）は、電圧装置のコンピュータ制御のため、およびデータ獲得のために書かれた。
【００６５】
この実験に用いたレーザ誘発蛍光検出装置は、4.0ｍＷで動作する、488ｎｍ領域のアルゴンイオンレーザ（カリフォルニア州、サンホセのUniphase社）、および関連する集束光学素子から構成されていた［Manz.A.,Miyahara,Y.,Miura,J.,Watanabe,Y.,Miyagi,H. and Sato,K.Sens.Actuators 1990,B1,249-255］（カリフォルニア州、アービンのMelles Griot社）。ＢＯＤＩＰＹ試料（上述した）から発せられた蛍光を、25倍、0.35ＮＡの顕微鏡対物レンズ（ドイツ国、Leitz Wetzlar社）により集めた。画像をＳＯＮＹ  ＣＣＤ−ＩＲＩＳカメラにより観察した。あるいは、チャンバ４と充填材料リザーバ３との間の狭い通路５をモニタできるように位置した検出器として、530ｎｍの発光フィルタおよび光電子増倍管（ＰＭＴ）（ニュージャージー州、ブリッジウォーターのHamamatsu、Ｒ１４７７）を用いた。チャンバ４に隣接した主要通路11の部分からデータを採集した。堰６は、ちょうど視野から外れていた。ＰＭＴは530Ｖでバイアスされており、一方で、ＰＭＴ信号は、増幅され、フィルタリングされ（25Hz Butterworth）、50Ｈｚの周波数でサンプリングされた。
【００６６】
緩衝液、アセトニトリル、および緩衝液とアセトニトリルの両方における1.0ｎＭのＢＯＤＩＰＹの蛍光を、島津ＲＦ−５３０１ＰＣ蛍光分光光度計を用いて測定した。
【００６７】
上述した様々な器具に関して、特定のモデルおよび製造業者が与えられているが、当業者には、どのような適切な機能的同等物を用いてもよいことが理解されよう。
【００６８】
チップの操作
図１Ａおよび１Ｂを再度参照する。充填材料リザーバ３からチャンバ４中に至る狭い副通路５を用いて、界面動電ポンプ輸送を用いて、固定相の充填材料をチャンバ４中に向けた［Yan,C.,米国特許第5,453,163号,1995; Knox,J.H. and Grant,I.H.Chromatographia 1991,32,317-328］。上述したように、基板８は非導電性であり、これにより、界面動電ポンプ輸送法を用いて、ビーズ12を充填することができる。
【００６９】
デバイス10は、使用前に、どのような水溶液によっても状態調節されていなかった。チャンバ４，通路５，11、およびリザーバ１，２，３には、最初に、アセトニトリルを満たした。充填材料リザーバ３中のアセトニトリルを、ＯＤＳ／アセトニトリルスラリー（上述の）と置換し、次いで、主要リザーバ１および２をアースしながら、充填材料リザーバ３に正の高電圧を加えることにより、チャンバ４にＯＤＳビーズ12（図２）を充填した。充填材料リザーバ３に加えられた電圧は、チャンバ４の充填を行うために、約５分間に亘り200Ｖから800Ｖまで上昇させた。
【００７０】
チャンバ４が一旦充填されたら、段階勾配を実施して、水溶液を主要通路11に、ＯＤＳビーズをチャンバ４内に導入した。リザーバ１および２中には、アセトニトリルおよび緩衝液の１：１（ｖ／ｖ）混合物を配置した。アセトニトリルにより、充填材料リザーバ３内のスラリーを置換した。次いで、主要リザーバ１に電圧を加え、200Ｖから800Ｖまで上昇させた。このとき、充填材料リザーバ３は400Ｖにバイアスされ、主要リザーバ２はアースされていた。800Ｖでの２から５分後、リザーバ１および２中のアセトニトリル／緩衝液の混合物を緩衝液と置換し、同じ電圧プログラムを繰り返した。チャンバ４を目視でモニタして、アセトニトリルが緩衝液により完全に置換されたこと、並びに充填材料（ビーズ12）がこの過程中にシフトしたり、除去たりしなかったことを確認した（アセトニトリルが排出されたときに、ビーズ12が塊状になるのが分かり、水／アセトニトリルの界面での屈折率変化が明らかに見えた）。行った実験が、以下に詳細に説明されている。
【００７１】
実験結果および議論
実験を行うために、図２Ａに示したように、チャンバ４に充填材料（ビーズ12）を充填する必要があった。
【００７２】
図１Ａおよび１Ｂに示した狭い副通路５は、チャンバ４に充填材料（ビーズ12）を供給するために、約30μｍ幅に作製した。次いで、試料を、リザーバ２（入口通路）から、チャンバ４を横切って、主要リザーバ１（出口通路）に向かって供給できた。チャンバ４の容積は330ｐｌであり、一方で、出口通路および入口通路の容積は、それぞれ、1.5×10-7ｌおよび4.1×10-8ｌであった。主要通路11は、堰６，７があるにもかかわらず、狭い通路５（30μｍ）の幅と比較して比較的広い幅（580μｍ、堰で300μｍまで狭くなる）を考慮して、副通路５よりもずっと小さい流れ抵抗を有した。デバイス10内の相対的流れ抵抗は、試料の装填および溶離の最中の狭いビーズ導入副通路５中への流動よりもむしろ、主要リザーバ１および２の間の流動を促進するために、これら通路５，11に関する幅寸法を選択することにより操作した。
【００７３】
逆相ＯＤＳビーズ12（前述の）を、タンパク質、ペプチドおよびトリプシン消化物のクロマトグラフィー［Seifar,R.M.; Kok,W.T.,; Kraak,J.C.; and Poppe,H.Chromatographia,1997,46,131-136.Yan,.; Dadoo,R.; Zhao,H.; Zare,R.N.; and Rakestraw,D.J.,Anal.Chem.1995,67,2026-2029］、並びにＳＰＥおよびＣＥＣの他の用途［Nielsen,R.G.; Riggin,R.M.; Rickard,E.C.J.Chromatogr.1989,480,393-401.Hancock,W.S.; Chloupek,R.C.; Kirkland,J.J.; Snyder,L.R.J.Chromatogr.A 1994,686,31-43］に関する拡張使用のために、ＳＰＥデバイスに用いた。従来のキャピラリーの界面動電充填は以前に記載されており［Yan,C.;米国特許第5,453,163号,1995.Knox,J.H.; Grant,I.H.Chromatographia 1991,32,317-328.］、本発明者はその方法を本発明に適応した。
【００７４】
先に手短に説明したように、充填方法は、主要リザーバ１および２をアースしながら、充填材料リザーバ３に正の電圧（200-800Ｖに上昇）を加える工程を含んだ。加えられた電圧により、ＥＯＦがビーズ通路を下流に流動し、ビーズを空洞中に運んだ。クロマトグラフィービーズ12を懸濁させ、それらが凝集し、狭い副通路５を塞ぐのを防ぐために、有機溶媒が必要であった。研究により、アセトニトリルが満たされたキャピラリーは、実質的な電気浸透流動を示すことが分かった［Wright,P.B.; Lister,A.S.; Dorsey,J.G.Anal.Chem.1997,69,3251-3259.Lister,A.S.; Dorsey,J.G.; Burton,D.E.J.High Resol.Chromatogr.1997,20,523-528.Schwer,C.; Kenndler,E.Anal.Chem.1991,63,1801-1807.Salimi-Moosavi,H.; Cassidy,R.M.Anal.Chem.1995,67,1067-1073］。
【００７５】
図３Ａに示したように、充填の初期段階で、チャンバ４に進入するビーズ12は、チャンバ４の両側の堰６，７に接触した。先に説明したように、堰６，７の頂部からカバープレート９の底部までの距離（約1.0μｍ）は、ＯＤＳビーズ12の個々の粒子の直径（約1.5-4.0μｍ）より小さいので、ビーズ12は堰６，７を越えることができない。
【００７６】
図３Ｂに示したように、チャンバ４は、クロマトグラフィー材料により完全に満たされるまで、充填され続けた。前述したように、充填材料を保持するための再現可能にフリットを製造することに関連する難点はよく知られている。重要なことに、本発明に使用される堰の設計は、この問題を回避し、ビーズの界面動電充填により、観察できるほどの空隙なく、チャンバ中に亘りビーズを均一に分布させた。実際に、堰構造体を使用すると、カラムのフリット製造の必要が最終的になくなるであろう。
【００７７】
本発明の堰の設計により、ビーズを満たしたときに、２つの堰により形成された捕捉区域に亘り、堰で気泡を形成させずに、20,000から80,000Ｖ／ｃｍほど高い範囲の電場を加えることができる。これらの堰を有するデバイスに行った分離では、少なくとも15,000Ｖ／ｃｍほど高い電場を用いることができる。堰を横切って消散されたパワーは、気泡を形成することなく、3-7Ｗ／ｍほど高くても差し支えない。これとは対照的に、従来のカラムに形成されたフリットは、せいぜい、0.6Ｗ／ｍより大きいパワー消散で気泡を形成することが報告されてきており、気泡を形成しないことが報告されている、150-600Ｖ／ｃｍの範囲の電場がせいぜいである。
【００７８】
外部キャピラリーをチップに結合させ、外部クロマトグラフィーキャピラリー内に充填されたビーズの捕捉要素として堰を使用することが可能である。これは、Bigs等（N.H.Bings,C.Wang,C.D.Skinner,C.L.Colyer,P.Thibeault,D.J.Harrison,Anal.Chem.71(1999)3292-3296）により記載されたように、小さい死空間結合を用いて行うことができる。このようにして、チップベースの堰が、外部キャピラリー内に通常形成されるフリットを置き換えることができ、より高い電場を使用でき、速度および分離効率が改善される。
【００７９】
（主要リザーバ１および２を真空に引くことにより、空洞を充填することもできるが、これは、試料装填および溶離のために界面動電流動が用いられる場合には、それほど都合よくないことに留意されたい。）
ある理由のために、ビーズ12が望ましいほどは詰まった状態に充填されなかった場合（図２および３Ｂに示すように）、それらは、単に電圧を逆にすることによりチャンバ４から除去され、次いで、充填方法を繰り返した。一旦水溶液がチャンバ４に導入されたら、逆相ビーズ12は、凝集する傾向にあり、除去するのがより難しかったことに留意されたい。しかしながら、その後の除去は、ＥＯＦまたは真空、もしくはそれら２つの組合せのいずれかを用いて、その水溶液をアセトニトリルでフラッシュすることにより行った。都合よくは、ビーズ12をチャンバ４から効果的に除去する能力により、使用済みクロマトグラフィービーズを回復させることができる、またはより効力のある材料を代用できる。
【００８０】
重要なことには、チャンバの入口に屈曲構造体13を利用した設計（図１Ｂおよび３Ａ）により、充填において最も好ましい結果が得られ、チャンバ４を充填し、電圧または真空の除去または変更後にもそのままにすることができる。それらの図面から分かるように、副通路５は、堰６，７に対して非対称様式でチャンバ入口４Ａを介してチャンバ４に接続している。また、屈曲構造体13は、好ましくは、副通路５からチャンバ４への充填材料の直接の見通し線進入を妨げる。むしろ、屈曲構造体13は、充填材料を、チャンバ入口４Ａを介して、チャンバ４に間接的に進入させる。
【００８１】
先に説明したように、充填段階中、充填材料リザーバ３は、リザーバ１および２をアースした状態で、正のバイアスが加えられている。屈曲構造体13により、電場線が、空洞中への湾曲した通路にしたがうと考えられる。その結果、クロマトグラフィービーズ12が電場線にしたがってチャンバ口４Ａ中に入るときに、まるで降雪機からのように「吹き付けられ」（図３Ａ）て、均一に充填されるようである。
【００８２】
充填方法の最中に、チャンバ４は、屈曲構造体13の始めの部分までしか充填されなかった（図３Ｂ参照）。一旦充填されると、ビーズは、狭い副通路５の側部を下流に流れ、中央部を上流に流れて（充填材料リザーバ３に向かって）、閉じた電気泳動装置において生じる溶媒の逆流を模倣するのが観察された［Shaw,D.J. Introductio to Colloid and Surface Chemistry,3rd ed. Butterworths: London,1980］。そのような閉じた系において、ＥＯＦは、チャンバの端部に到達するまで、壁に沿って向けられ、そこで、圧力により、溶液が方向を逆転し、ビーズ導入通路の中央を逆流する。
【００８３】
図示した屈曲構造体の重要な面は、捕捉区域中への非対称進入であり、これにより、充填が良好になる。対称入口は、進入しているビーズが両方の堰に等しく進むことができ、これにより、充填が不均一になったり、難しくなったりする傾向にある。非対称構造体により、ビーズは、最初に、捕捉区域の一方の端部に優先的に充填され、次いで、その位置から一方向に蓄積することができる。屈曲構造体の重要な役割は、充填床の使用中に、捕捉区域からの直線流出を防ぐことにある。
【００８４】
入口に非対称がなく構築されたチャンバは、非対称進入設計ほど良好に充填されると観察されなかった。これらの場合、充填材料は、入口から最も遠い角部を充填する傾向にあったが、追加の材料がチャンバに進入することがない様子であった。対称設計のために、この型のチャンバは、ある程度まで充填された後に、溶媒の逆流を示すと考えられる。すなわち、ある程度充填されたチャンバは、閉じたすなわち制限された系に似ているようである。そのような出来事は、対称チャンバのビーズによる充填を不可能にするであろうし、Shawにより説明されたように、以前に観察された挙動と一貫性がある。そのような挙動は、ある場合には対称構造体を満たすが、他の場合にはそれほど容易に満たせない能力の理由を説明しているであろう。これとは対照的に、入口を保護している屈曲構造体13の有無にかかわらず、非対称設計は、狭いビーズ導入通路５中への直接の逆流を経験することが少ないようである。
【００８５】
固相抽出（ＳＰＥ）オンチップ
先に説明したように、本発明により、微小流体分析装置の用途を拡張することができる。そのような拡張の１つは、直接オンチップでのＳＰＥを容易にすることである。予備濃縮は、微小流体デバイスの感度を向上させるのに使用できる価値のある手段である。分析物を予備濃縮するためにマイクロチップ上に構成した充填ＳＰＥ床の能力を測定するために、本発明者は、50ｍＭのリン酸緩衝液からのＢＯＤＩＰＹ試薬の1.0ｎＭ溶液を濃縮した。使用した溶液条件は、ＨＰＬＣ−ＣＥ装置においてタンパク質およびペプチド分析に関して用いたものと同様であった［Bushy,M.M.; Jorgenson,J.W.Anal.Chem.1990,62,978-984.Castagnola,M.; Cassiano,L.; Rabino,R.;Rossetti,D.V.J.Chromatogr.1991,562,51-58.］。ＢＯＤＩＰＹ試薬は、緩衝水溶液中に希釈した場合、ＯＤＳ材料に関して高い親和性を示し、優れた蛍光物質である。ＢＯＤＩＰＹ試薬の予備濃縮および溶離は四段階で行った：ＳＰＥ床の緩衝液による平衡；試料の導入；緩衝液のフラッシュ；および分析物の溶離。
【００８６】
充填床をリン酸緩衝液により濯いだ後、1.0ｎＭのＢＯＤＩＰＹ溶液を主要リザーバ１内に配置し、主要リザーバ２をアースした状態で、＋200Ｖを２分間に亘り加えた。ＥＯＦ（0.2ｍｍ／秒、1.2×10-9ｌ／秒）がリザーバ２に向かって流動し、装填段階中に、ＢＯＤＩＰＹをＳＰＥ床上に運んだ。
【００８７】
図４Ａに示したように、吸収されたＢＯＤＩＰＹの蛍光は、初めに、ビーズ12の最初の数層のみに生じた（図の上部近く）。図４Ｂは、1.5分後のＳＰＥ床を示しており、合計で1.4×10-16モルのＢＯＤＩＰＹ試薬がその床に充填された（染料が完全に捕捉されたとする）。ＢＯＤＩＰＹについて、ＯＤＳ材料へのその高い親和性のために、試料の漏出は観察されなかった。実際に、目視での観察により、２分間に亘る1.0ｎＭのＢＯＤＩＰＹ溶液の濃縮後、5％のみのＳＰＥ床の物理的容積が用いられ、330ｐｌの床の容量は、約2.8×10-15モルの分析物であったことを示唆している。
【００８８】
床上（チャンバ４内）の通路11内に残留する試料を洗浄するために、装填後に、緩衝液洗浄段階を用いた。次いで、リザーバ１および２中の溶液をアセトニトリルと交換し、最初の装填段階と同じ方向に移動する溶媒により染料を溶離させた（または溶離段階中の潜在的勾配の逆転により、元の試料リザーバに向かって戻るように向けられた）。両方の工程はうまく機能したが、我々の試験にとっては、後者がより都合よい。図５は、床平衡後の、1.0ｎＭのＢＯＤＩＰＹ試料に関する３段階予備濃縮実験を図示している。90秒の装填段階は、図１Ａに示したように位置する検出器を蛍光が通過したときの信号の増加を示した。この後に、60秒の濯ぎ段階を行った。次いで、アセトニトリルを用いて、装填されたのとは反対の方向に床からＢＯＤＩＰＹ試薬を溶離して、検出器の再位置決めの必要をなくした。ＢＯＤＩＰＹ試薬は、90秒の予備濃縮段階後の比較的狭い３秒の帯域内に溶離され、元の試料と比較して、数倍の濃度上昇を示した。ＢＯＤＩＰＹ（1.0ｎＭ）試薬の蛍光は、緩衝液とアセトニトリルの両方の中で試験し、いずれの溶媒についても、強度に著しい差を示さなかった。予備濃度因子（Ｐ．Ｆ．）は、方程式(1)を用いて推測できる：
【数１】
0004799792.tif 000002
ここで、Ｖiは分析物含有緩衝液の容積であり、Ｖfは分析物含有アクリロニトリルの容積である。Ｖiは、予備濃縮時間（ｔpre、秒）と濃縮されている試料の電気浸透流（ｆbuff、ｌ／秒）との積であり、一方で、Ｖfは、溶離された分析物のピーク幅（ｔelute、秒）と溶離溶媒の流量（ｆelute、ｌ／秒）との積である。この場合、分析物は、少なくとも100倍だけ予備濃縮された。十分な濃縮後、ＢＯＤＩＰＹは、ＳＰＥ床上に容易に目視により観察される。
【００８９】
異なる試料の装填時間を用いて、予備濃縮の量を増加させた。実験において、120-532秒に及ぶ予備濃縮時間を研究し、80-500の予備濃縮因子を生じた。予備濃縮時間に対してプロットされたピーク区域（rds  3-11％）は、研究した条件に亘り、線形の関係を生じた（r2＝0.9993）。
【００９０】
キャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）オンチップ
先に説明したように、本発明により促進される別の用途は、オンチップのキャピラリー電気クロマトグラフィー（ＣＥＣ）である。緩衝液で平衡にされたオクタデシルシランビーズ12が充填されたチャンバ４に、逆相モードのＣＥＣを行った。チップ設計内にインジェクタがないために、試料は、50ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ8.5中のクロマトグラフィー床の前方に装填した（上記「溶液および試薬」を参照のこと）。両方の化合物は、装填およびフラッシュ段階において分析物信号がないことにより示されたように、これらの条件下で完全に保持された。装填段階は、試料を導入し、床の前方に保持された分析物を濃縮するように機能した［Swartz,M.E.; Merion,M.; J.Chromatogr,1993,632,209-213］。図６は、30％のアセトニトリル／70％の50ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液の移動相組成物による、ＢＯＤＩＰＹおよびフルオレセインのＣＥＣ分離に含まれる３つの段階を示している。一旦混合移動相が床に到達したら、両方の化合物は、クロマトグラフィーを経験し始め、床から溶離される。それら化合物は、200μｍ未満のクロマトグラフィー床上で20秒未満で、完全に溶離され、分離されて、フルオレセインのピークに関して2μｍのプレート高さ（Ｎ＝100プレートまたは50000プレート／ｍ）を生じた。これらの条件下において、フルオレセインは、ＢＯＤＩＰＹより先に溶離される。ピークは、標準物の保持時間を混合物のものと比較することにより同定された。ｐＨ8.5では、フルオレセインは実効（−２）電荷を有し、一方で、ＢＯＤＩＰＹは中性である。通常のＣＥＣ分離において、フルオレセインの電気泳動移動度は、ＥＯＦに対抗し、ＢＯＤＩＰＹをフルオレセインよりも先に溶離させるであろう。この場合、２つの成分の溶離順序は逆になり、分析物と固定相との間の相互作用を示す。より疎水性の強いＢＯＤＩＰＹは、フルオレセインよりも高い、クロマトグラフィー材料に関する親和性を有し、ＢＯＤＩＰＹをより長く保持し、遅く溶離させる。
【００９１】
最後に、図７Ａ−７Ｄは、異なる濃度のアセトニトリルの移動相を用いた、ＢＯＤＩＰＹとフルオレセインとのＣＥＣ分離を示している。アセトニトリルの濃度が上昇すると、移動相の極性が低下し、ＢＯＤＩＰＹが溶離するのに必要な時間が減少するのが観察された。フルオレセインの溶離時間は変化せず、低い％のアセトニトリルを除いて、クロマトグラフィー保持がほとんどまたは全くないことを示している。アセトニトリル濃度を減少させると、基線解像度(baseline resolution)が得られるが、より広い帯域の広がりに導かれる。
【００９２】
これらの結果は、チップ上の開放管ＣＥＣについて報告されたものに匹敵する［Jacobson,S.C.,Hergenroder,R.,Koutny,L.B.,Ramsey,J.M.Anal.Chem.1994,66,2369-2373.Kutter,J.P.;Jacobson,S.C.;Matsubara,N.; Ramsey,J.M.Anal.Chem.1998,70,3291-3297.He,B.,Tait,N.,Regnier,F.Anal.Chem.1998,70,3790-3797.］。
【００９３】
ビーズベースの試薬を用いた免疫測定
ビーズ上の免疫測定、または免疫吸着測定は、ビーズの表面上への抗体または抗原いずれかの配置を含む。抗原を含有する溶液がビーズを通過するときに、抗原は抗体に特異的に結合する。このようにして、抗体に関する抗原の特異性を用いて、抗原を溶液中の他の種から分離する。その後、抗体または抗原がビーズから溶離され、複合体または遊離抗体のいずれかとして検出されるように、溶液の条件が変更される。チップ上の免疫吸着測定の開発は、消費される試薬の量が少ないために、魅力的である。それに加え、マイクロタイタプレートまたはイムノビーズが充填されたシリンジに行われる従来の方法と比較して、マイクロチップは、非常に速い分析時間を示す。オンチップの免疫吸着測定はまた、オンチップの液相免疫測定よりも低い濃度検出限界を与え、ビーズベースのオンチップ免疫測定の開発が重要になる。
【００９４】
特異的酵素が結合したビーズは、２つの堰により形成されたチャンバ中に充填される。通路の壁の表面積とは対照的に、ビーズの表面積は大きいので、ビーズを使用するのが好ましい。表面積が大きくなると、容量が大きくなり、分析物の捕捉もより効率的になる。前記堰は、充填される免疫測定ビーズのための明確なチャンバを形成する。本発明者により、酵素のテオフィリンに関するチップ上のビーズベースの免疫測定が示された。実験において、タンパク質Ａにより被覆された磁気ビーズがチップのチャンバ内に充填される。その後、抗体（抗テオフィリン）が、1ｍＭのトリシン緩衝液  ｐＨ8.0中の床に流される。抗テオフィリンが充填床を流動するときに、抗体はタンパク質Ａに結合する。抗テオフィリンを、床が抗体で飽和されていることを確実にするために、数分間に亘り床を通過させた。次いで、緩衝液洗浄段階を用いて、チャンバおよび通路から、残留する未結合抗体を除去した。抗テオフィリンに結合する床に流動させることにより、蛍光ラベルされたテオフィリン（キットから希釈された）により床を飽和させた。床が飽和された点は、床の下の蛍光をモニタし、漏出曲線（図１１）が平坦状態に達した点を測定することにより求めた。漏出後、緩衝液フラッシュ段階を用いて、デバイスからテオフィリン溶液を洗浄した。次いで、遊離タンパク質またはテオフィリン／抗体の複合体のいずれかとして、床からテオフィリンを溶離させるために、カオトロピック剤を加える。カオトロピック剤は、様々な種類のものであって差し支えないが、この実施例においては、90％のアセトン／10％のトリシン緩衝液の混合物を用いた。一旦カオトロピック剤が充填床に到達したら、テオフィリンは、比較的狭い帯域で溶離する（図１２）。
【００９５】
通常は、これらの条件下で競合測定が行われるが、直接測定は、免疫測定床として機能する、堰により形成されたチャンバの能力を示す。
【００９６】
酵素反応床
ビーズのような固体支持体に酵素を固定化する方法がいくつか開発されてきた。一旦固定化されたら、酵素ビーズを床中に充填して、溶液がそこを通って流されるときに、化学反応を起こすことができる。通常は、基質を含有する溶液が床に流される。この基質が酵素と接触するときに、酵素は基質と反応して、生成物を生成する。固定化された酵素と基質との反応から生じた生成物は、後に、検出方法または他の合成プロセスに使用できる。この実施例では、多孔質シリカビーズ（5μｍの直径）上に固定化された酵素の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とキサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）の使用を説明する。これらの結果は、酵素は、ビーズ上に一旦固定化されたら、堰デバイス中に捕捉／充填することができ、そこで、まだ活性であり、酵素反応床として使用できることを示している。
【００９７】
ＸＯＤおよびＨＲＰを、グルタルアルデヒド（シグマ社）と架橋させることにより、３−アミノプロピルトリエトキシシランによりシラン化されたＮｕｃｌｅｏｓｉｌ  １０００−５シリカビーズ（ドイツ国、Machrey-Nagel）上に固定化した。ガラスビーズ上への酵素の固定化は、以前に記載されており、当業者に知られている。全ての研究は、1ＭのＮａＯＨによりｐＨ９に調節された50ｍＭのホウ酸を用いて行った。
【００９８】
ＨＲＰおよびＸＯＤの固定化を行って、２つの重要事項を示した。第１は、堰デバイス内に酵素の固定化されたビーズを充填する能力であり、第２は、酵素がまだ活性であり、一旦充填されたら反応に触媒作用を及ぼすのに用いられることを示すことにあった。これらの本質の各々を示すために、堰デバイスを用いて、化学発光反応を行った。
【００９９】
固定化された酵素を充填する能力により、ある分析物について異なる検出方法を使用することができる。例えば、少量の分析物しか利用できない場合、またはそうでなければ標識付け反応を実施するのが難しい場合、非常に感度の高い測定のために、ルミノール化学発光（ＣＬ）反応を使用できる。ＣＬ反応は、光源を必要とせず、検出スキームを単純にするという点で独特である。ＨＲＰにより触媒作用が及ぼされる化学発光反応が以下に示されている。
【０１００】
【化１】
0004799792.tif 000003
ＨＲＰが固定化されたビーズを堰デバイス中に充填し、反応のための試薬を含有する溶液を床に流した。固定化されたＨＲＰは、Ｈ2Ｏ2（100Ｍ）およびルミノール（10ｍＭ）の溶液を、固定化されたＨＲＰを含有するビーズが充填された床に流したときに、化学発光反応に触媒作用を及ぼすことが分かった。この反応により生じた光は、酵素床の下流で検出された。
【０１０１】
しかしながら、連続試行の各々において、ＣＬ反応から生じた光は、以前の施行（図１１）よりも低かったことが分かった。これはおそらく、連続試行により、酵素の活性が減少したことにより生じたのであろう。これらの結果は、堰デバイス内のＯＤＳビーズの交換について論じられたように、使い尽くされたビーズを新たなものと交換する方法の利点を証拠付けている。
【０１０２】
代わりの実施の形態
本発明による設計の２つの堰の実施の形態をこれまで説明してきたが、他の実施の形態も可能である。例えば、オンチップリアクタビーズを形成するために、１つの堰の設計を実施することもできる（すなわち、主要通路11内の上流に位置する第２の堰６を有さない）。具体的には、主要通路を横切って形成された下流堰７を提供し、下流方向にのみ圧力を加える（すなわち、主要リザーバ２および副通路３から主要リザーバ１に）ことにより、下流堰７に対して充填が行えることが分かる。しかしながら、１つの堰の設計により、ＳＰＥまたはＣＥＣに用いたときの分離効率を減少させる、充填床にでこぼこの前縁が形成されるかもしれないことに留意されたい。さらに、小さなビーズの長い床に関連する高い背圧により、充填の長さが約4-6ｍｍに制限された。マイクロチップの高圧勘合を用いれば、高圧ポンピングが可能になり、いくぶん長い長さが可能になるであろう。
【０１０３】
１つの堰の設計を用いた充填床を形成するために、他の種類の力を用いてもよい。例えば、下流方向のみに向けられた（すなわち、主要リザーバ２および充填材料リザーバ３から、主要リザーバ１に）、界面動電力を用いて、制限された程度の充填（数ミリメートルの長さまで）を行うことができた。
【０１０４】
堰の数を変更することに加えて、図８Ａ−８Ｃの本発明の代わりの実施の形態に示したように、チャンバに１つより多い入口または出口を設けることもできる。
【０１０５】
図８Ａにおいて、チャンバ４が２つの堰６，７の間に形成されている。２つの副通路５ａ，５ｂが、チャンバ４への入口または出口として働くように設けられている。図示したように、副通路５ａ，５ｂは、チャンバの充填を良好に促進するように、互いに対してずれていてもよい。ビーズを、捕捉区域の他端から捨てるためにフラッシュで排出できるように、またはフラッシング剤を代わりのリザーバから供給できるように、第２の副通路が加えられる。後者の設計により、使用済みビーズが、新しいビーズ流を汚染するのを防ぐ、および／または試料溶液および試料廃物溶液が、フラッシュ中に捕捉区域中に向けられるのを防ぐことができる。
【０１０６】
図８Ｂに示すように、この設計における副通路は、副通路５ｂがビーズをフラッシュできるように、または捕捉区域からフラッシュにより排出されているビーズが、例えば、充填材料リザーバ３中への代わりに、廃物リザーバ（図示せず）中に向けられるように、１つ以上に随意的な分岐５ｃを有してもよい。
【０１０７】
別の実施の形態が図８Ｃに示されている。ここでは、ビーズを通過させずに流体が流動できるように、第３の副通路５ｄのチャンバ４への入口近くに、副通路堰16が設けられている。この「堰を備えた」副通路５ｄは、例えば、特に、チャンバ４の長さ（堰６，７の間で測定された）が4-6ｍｍよりも大きい場合、ビーズの装填中にチャンバ４内に強まる圧力を解放するために、使用してもよい。
【０１０８】
図８Ａ−８Ｃに示した３つの実施の形態全てにおいて、チャンバ４中への副通路の入口は、「見通し線」流動を副通路からチャンバ４中に、またはその逆に向けるのを防ぐために、前述したように、屈曲または類似の形状を含むように改良されてもよい。前述したように、この入口の改良は、充填を補助するためにビーズを捕捉区域中に吹き付けるように働き、かつ後の使用中にビーズがチャンバ４から排出される傾向を減少するように働く。
【０１０９】
図８Ａ−８Ｃに示したように、１つより多い副通路によるビーズの装填は、界面動電装填を使用した場合に、これらの副通路中への流動を防ぐように追加の副通路にも電圧を加えなければならないことを除いて、１つの副通路および２つの堰を有する設計に関するものと同じ様式で行われる。ビーズの除去中に、捕捉区域すなわちチャンバ４からビーズを吐き出させるために、第２の副通路（例えば、図８Ａの副通路５ｂ）に電圧を加えてもよく、１つの副通路の設計に用いたものであるが、追加の副通路における電圧降下に関して調節されたもののような電圧が加えられる。認識されるように、フラッシュ段階中の流動方向は、加える電圧の極性により制御できる。
【０１１０】
ビーズを装填するために圧力駆動流れを使用する場合、装填中に追加の副通路に背圧を加えなければならない、そうでなければ、追加の副通路に取り付けられたリザーバを一時的に密閉してもよい。チャンバ４からビーズをフラッシングする場合、１つ以上の副通路からビーズをフラッシュするように、ビーズ供給通路５ａに圧力を加えてもよい。
【０１１１】
多数の副通路の設計および界面動電力を使用してＳＰＥまたはＣＥＣを行う場合、捕捉区域における１つの副通路について説明したのと実質的に同じ様式で、捕捉区域からと、副通路中への試料またはビーズの漏れを防ぐように、追加の副通路に電圧を加えてもよい。圧力駆動ポンピングを使用する場合、副通路は、副通路中への流動を除去するように加えられる十分に正の圧力を有してもよく、そうでなければ、それぞれの副通路に取り付けられたリザーバを一時的に密閉しても差し支えない。
【０１１２】
ポリマーによる充填ＯＤＳビーズの固定化
界面動電、磁気または圧力の充填技法を用いてクロマトグラフィー床にビーズを充填した後、これらの充填技法の内の１つを用いて、ビーズ導入通路の適当な部分にビーズを充填した。次いで、リザーバ内の過剰なビーズを除去した。次いで、約40ｍｌのモノマー混合物を、ビーズリザーバ中にピペットにより入れ、ビーズに向かって、ビーズ導入通路に沿った圧力または界面動電流により配送した。この段階中、ビーズ導入通路内のある領域における屈折率の変化を用いて、モノマー溶液の位置をモニタし、モノマーが充填ビーズ床に到達する十分前に、流動を停止した。
【０１１３】
一般的なモノマー溶液は以下のように調製する：10重量％のＨ2Ｏ、40重量％の１，４−ブタンジオールおよび50重量％の１−プロパノールを含んだ３成分溶媒混合物800ｍｌを収容したバイアルに、２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、2重量％）およびエチレンジメタクリレート（ＥＤＭＡ）の混合物200ｍｌを加えた（C.Peters et al.,Anal.Chem.1997,69,3646-3649）。次いで、モノマー溶液を15分間に亘りＮ2でパージして、溶解酸素を除去した。他の重合性モノマー溶液を用いてもよい。
【０１１４】
次いで、このデバイスを24-48時間に亘り60℃でオーブン内に保持した。デバイスをオーブンから取り出して、室温まで冷ました。このとき、全てのリザーバは、蒸発を防ぐために蓋がされていた。あるいは、ＡＩＢＮまたは他の開始剤による光開始重合を用いて、デバイスを長期間に亘り加熱する必要なく、モノマー溶液を重合させてもよい。重合後、デバイスをアセトニトリルで濯ぎ、次いで、緩衝液で濯いだ。ビーズ床を不安定にせずに、そのようなデバイスに、100％までのアセトニトリルの移動相組成物を使用できた。
【０１１５】
寸法の指標
本発明により設計した微小流体デバイスの様々な寸法の理論的制限は知られていないが、本発明者は、以下に論じる実際的な目的に関するいくつかの一般的な指標を採用した。
【０１１６】
捕捉区域の長さは、約10μｍから約200ｃｍまでのいずれに及んでもよいと考えられる（必要であれば、１つのデバイスウェハーの範囲内にそのような長さを含められるようにするために、螺旋状または曲がりくねった通路を使用することにより）。必要とされる捕捉区域の長さは、用途に依存し、充填および排出を行うために加えられる力によっても制限される。例えば、オンチップのＣＥＣには、比較的長い捕捉区域が必要であり、好ましい上限は、約5ｃｍである。
【０１１７】
捕捉区域、試料通路および廃物通路の深さに関しては、実際的な範囲は、約400μｍから約0.25μｍまでであると推測される。より好ましくは、その上限は約100μｍであるべきであり、下限は、最低の実際的な深さよりも約10％大きいべきである。
【０１１８】
また、詰まる傾向を減少させるために、ビーズ配送通路およびビーズ廃物通路（副通路５，５ａ−５ｄ）は、好ましくは、ビーズの直径よりも、少なくとも約３倍深く、少なくとも３倍広いべきである。
【０１１９】
副通路５，５ａ−５ｄの最大寸法もまた、必要とされる相対的な流れ抵抗（すなわち、使用中の副通路の逆流を最小にするように、副通路対主要通路および堰の流れ抵抗）に依存する。一般的に言えば、副通路の流れ抵抗は、逆流問題を最小にするために、堰の流れ抵抗よりも高いべきである。
【０１２０】
添付の表は、圧力駆動流れを用いた、流動通路深さ、堰深さおよび副通路長さの関数としての、捕捉区域から出る容積流量への通路寸法および堰寸法の計算された影響についての情報を与える。
【０１２１】
以下の表において、通路Ｗと称されるのは、図１Ａの要素１であり；通路Ｃと称されるのは、図１Ａの要素５であり；通路Ｃ’と称されるのは、図１Ａの要素３である。
【０１２２】
【表１】
0004799792.tif 000004
容積流量は、矩形通路断面に関しするナビエ・ストークスの方程式および通路形状の影響のペリー(Perry)の表の値を用いて推測した。半分の幅ａおよび半分の深さｂを有する通路の流れ抵抗が方程式２により与えられる：
【数２】
0004799792.tif 000005
ここで、ΔＰは長さＬの通路部分に沿った圧力降下であり、Ｕは平均線形流速であり、ｈは粘度であり、Ｎは断面比ｂ／ａ（ｂ＜ａ）に依存する形態要因である。要因Ｎは、圧力駆動された放物線流動に関するナビエ・ストークスの方程式に対する解から推測してもよく、Chemical Enginner's Handbook,（3rd edition, 1950）387頁にペリーにより表にされていた。デバイス設計における目的は、表における副通路Ｃの抵抗を、堰および後の流動通路Ｗの抵抗よりも高くすることにあり、したがって、堰を横切る流動が好ましい。流動要素が直列にある場合、各々の部分に関して方程式１の右側により与えられる流れ抵抗を、連続電気インピーダンスの抵抗を加えられるような様式で加えられる。流体要素が平行にある場合、平行の電気抵抗について行われるように、全インピーダンスの逆数を得るために、それらの流れ抵抗の逆数を加えることができる。通路または複数の通路の組合せを通る容積流量Ｑは、方程式３により与えられる。
【０１２３】
【数３】
0004799792.tif 000006
ここで、Ｒｆは、上述した全ての通路部分に関して、互いに組み合わせられる、方程式１の右側により定義される流体流れの抵抗である。堰を横切る容積流量Ｑｗ対副通路中への容積流量Ｑｃに対する比ｒ（ｒ＝Ｑｗ／Ｑｃ）は、堰を横切って流れる溶液の比率（Ｑｗ％＝１／（１＋ｒ））が高いことを確実にするのに大きいべきである。このことは、表に示したいくつかの計算を広い主要通路と比較して長く狭い副通路を用いることにより、他の通路の深さに対する堰の深さを上昇させることにより、主要通路に対する副通路の深さを減少させることにより行うことができる。
【０１２４】
【表２】
0004799792.tif 000007
【表３】
0004799792.tif 000008
一体化分析方法
上述した本発明の様々な特徴は、より複雑な微小流体設計に使用されるであろうことが認識される。
【０１２５】
図９は、各々が異なる機能を有する、いくつかの捕捉区域が組み込まれた、一般に20により示される、多数の堰および多数の副通路の設計を示している。
【０１２６】
例として、堰６ａおよび６ｂの間に形成された第１の捕捉区域25において、特定のタンパク質に対する抗体が装填されたビーズが、副通路24により導入される（副通路26を通って排出される）。細胞溶解産物または血清試料もしくは他のタンパク質源が、試料リザーバ（図示せず）から供給され、試料入口21および入口通路38を介してチップに装填される（試料は、試料出口22から除去され、溶離液入口23も、入口通路に設けられる）。次いで、試料は、捕捉区域25内の抗体ビーズ床に流れ込み、特定のタンパク質を単離し、一方で、流出液は廃物出口27に向けられる。
【０１２７】
次いで、アセトニトリルと水の混合物のようなカオトロピック溶離剤が導入されて（溶離液入口23）、カラムからタンパク質を溶離させ、これを、次の捕捉区域30（堰６ｃおよび６ｄの間に形成された）に配送し、そこで、この区域30中に装填された（副通路29，31を介して）ビーズ上に固定化されたプロテアーゼ酵素により消化される。流出液は、この段階で、廃物出口32に向けられるであろう。十分な反応時間後、緩衝液が配送され（溶離液入口28、緩衝液流し28ａ、床25からの廃物）、床からのタンパク質消化物を次の捕捉区域35（堰６ｅおよび６ｆの間に形成された）中にフラッシュし、流出液は廃物出口39に送られる。
【０１２８】
第３の捕捉区域35は、固相抽出材料（副通路34，36を介して充填され、除去される）を含有し、区域35内の床上に消化ペプチドを濃縮できる。次いで、メタノール／水性混合物またはアセトニトリル／水性混合物のような溶離溶媒が導入されて（溶離液入口33、緩衝液流し33ａ）、濃縮されたタンパク質消化物を最終分析のためにチップ上の別に位置に送る（出口通路37、廃物39、または採集40）。
【０１２９】
充填床チップからエレクトロスプレー質量分析器へのインターフェース
本発明による充填床流動通路は、図１０に示したように、エレクトロスプレーカプラ41を介して、質量分析器にインターフェースで連結してもよい。充填床４は、質量分析器内にエレクトロスプレーにより導入する前に、タンパク質の酵素消化、特定の化学物質またはタンパク質のアフィニティー精製および予備濃縮、固相抽出の濃度強化、またはキャピラリー電気クロマトグラフィー分離、もしくはこれらや他の段階の任意の組合せを行ってもよい。チップからエレクトロスプレーへのインターフェースは、連結領域で、100ｎｌ未満の死空間、好ましくは、1ｎｌ未満、最も好ましくは、100ｐｌ未満の死空間を提供する任意の方法を用いて行ってもよい。Wang等、またはKargerにより記載されている方法のような方法を用いて、そのインターフェースを形成することができる［Bings,N.H.;Wang,,C.;Skinner,C.D.;Colyer,C.L.;Thibeault,P.;Harrison,D.J.Anal.Chem.71(1999)3292-3296.Zhang,B.;Liu,H.;Karger,B.L.;Foret,F.Anal.Chem 71(1999)3258-3264］。
【０１３０】
本発明を様々な実施の形態を参照して説明してきたが、請求項に記載された本発明の忠実な精神および範囲から逸脱せずに、明白な変更を行ったり、同等物で置き換えてもよいことが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】  本発明による微小流動デバイスの平面図
【図１Ｂ】  充填材料（ビーズのような）が捕捉されているチャンバの拡大斜視図
【図２Ａ】  チャンバ中に充填され、カバープレートにより保持されている充填材料（ビーズ）と共に、図１Ｂの線Ａ−Ａでとられたチャンバを示す断面図
【図２Ｂ】  本発明による堰の別の実施の形態の側面図
【図２Ｃ】  図２の端部図
【図３Ａ】  図１Ｂおよび２Ａに示したチャンバ中に充填されている充填材料（ビーズ）の初期段階の概略図
【図３Ｂ】  充填材料（ビーズ）が完全に充填された後の図３Ａのチャンバの概略図
【図４Ａ】  頂部近くの堰／ビーズ界面で1.0ｎＭのＢＯＤＩＰＹ溶液の予備濃縮の初期段階を示す概略図
【図４Ｂ】  頂部近くの堰／ビーズ界面で1.0ｎＭのＢＯＤＩＰＹ溶液の予備濃縮の後期段階を示す概略図
【図５】  装填中の第１の1.0ｎＭのＢＯＤＩＰＹ試料、その後の緩衝液によるフラッシュ、およびアセトニトリル（ＡＣＮ）による溶離中の予備濃縮されたＢＯＤＩＰＹの蛍光を示す、蛍光強度対時間のプロットを示すグラフ
【図６】  装填、フラッシュおよび溶離を含む分離の異なる段階を示す、ＢＯＤＩＰＹおよびフルオレセインの電気クロマトグラムを示すグラフ
【図７】  特に、(A)30％、(B)22％、(C)15％および(D)10％での、移動相中の異なる濃度のアセトニトリルによるＢＯＤＩＰＹおよびフルオレセインの電気クロマトグラムを示すグラフ
【図８】  本発明による微小流体デバイスの代わりの実施の形態の平面図
【図９】  多数の充填チャンバを有する、本発明による微小流体デバイスの平面図
【図１０】  質量分析計と共に用いられている、本発明による微小流体デバイスの斜視図
【図１１】  充填床を飽和しているときの、テオフィリンの蛍光強度対時間をプロットしているグラフ
【図１２】  比較的狭い帯域にある充填床から溶離されているテオフィリンを示すグラフ
【図１３】  ＣＬ反応から発せられたより低い光となる各々の連続試行を示すグラフ
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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