(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SV40ウイルス、JCウイルス又はBKウイルスのVP1キャプシド蛋白質であるウイルスタンパク質と、SV40ウイルス、JCウイルス若しくはBKウイルスのVP2キャプシド蛋白質又は粒子形成促進活性を有するそのＮ−末端側部分である粒子形成促進因子とから構成される、均一なサイズのウイルス粒子様構造体。
【請求項２】
SV40ウイルス、JCウイルス又はBKウイルスのVP1キャプシド蛋白質であるウイルスタンパク質と、SV40ウイルス、JCウイルス若しくはBKウイルスのVP2キャプシド蛋白質又は粒子形成促進活性を有するそのＮ−末端側部分である粒子形成促進因子とから構成され、被封入物質を収容した、均一なサイズのウイルス粒子様構造体。
【請求項３】
前記SV40ウイルスのVP1キャプシド蛋白質が、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するか、或いは配列番号：２に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の欠失、付加又は他のアミノ酸による置換を有する蛋白質である、請求項１又は２に記載のウイルス素粒子様構造体。
【請求項４】
前記置換が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における、49位のGlu、51位のGlu、160位のGlu、163位のGlu、216位のSer、217位のLys、219位のGlu、332位のGlu、333位のGlu及び348位のAspの内の少なくとも１個のアミノ酸の置換である、請求項３に記載のウイルス様粒子構造体。
【請求項５】
前記SV40ウイルスのキャプシド蛋白質VP2が、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するか、或いは配列番号：１に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の欠失、付加又は他のアミノ酸による置換により修飾されており、且つ粒子形成促進活性を維持している蛋白質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のウイルス素粒子様構造体。
【請求項６】
前記SV40ウイルスのVP2キャプシド蛋白質、又は粒子形成促進活性を有するそのＮ−末端側部分が、配列番号：１の示すアミノ酸配列、又はその少なくとも１−272位のアミノ酸を含Ｎ−末端側部分である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のウイルス素粒子様構造体。
【請求項７】
前記SV40ウイルスのVP2キャプシド蛋白質の粒子形成促進活性を有するＮ−末端側部分が、配列番号：１に示すアミノ酸配列中の、少なくとも273位〜307位のVP1結合領域のアミノ酸配列を含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載のウイルス素粒子様構造体。
【請求項８】
前記被封入因子が生理活性物質または非生理活性物質またはそれらの混合物である、請求項２〜７のいずれか１項に記載のウイルス粒子構造体。
【請求項９】
前記非生理活性物質が低分子物質あるいは高分子物質あるいはそれら混合物である、請求項８に記載のウイルス粒子構造体。
【請求項１０】
前記生理活性物質が、核酸、蛋白質、又は低分子物質である、請求項９に記載のウイルス様粒子構造体。
【請求項１１】
SV40ウイルス、JCウイルス又はBKウイルスのVP1キャプシド蛋白質であるウイルスタンパク質を、pH5〜pH10及び室温にて、130mM〜500mM 一価の陽イオン及び２μM〜50mMの二価陽イオンの存在下で、且つSV40ウイルス、JCウイルス若しくはBKウイルスのVP2キャプシド蛋白質又は粒子形成促進活性を有するそのＮ−末端側部分である粒子形成促進因子の存在下でインキュベートすることを特徴とする、ウイルスタンパク質と粒子形成促進因子から構成される均一なサイズのウイルス粒子集団の形成方法。
【請求項１２】
SV40ウイルス、JCウイルス又はBKウイルスのVP1キャプシド蛋白質であるウイルスタンパク質及び被封入物質を、pH5〜pH10及び室温にて、130mM〜500mMの一価の陽イオン及び2μM〜50mMの二価の陽イオンの存在下で、且つSV40ウイルス、JCウイルス若しくはBKウイルスのキャプシド蛋白質VP2又は粒子形成促進活性を有するそのＮ−末端側部分である粒子型性促進因子の存在下でインキュベートすることを特徴とする、被封入物質とそれをとり巻くウイルスタンパク質及び粒子形成促進因子から構成される均一なサイズのウイルス粒子様構造体の形成方法。
【請求項１３】
前記一価の陽イオンがナトリウムイオンである、請求項11又は12に記載の方法。
【請求項１４】
前記二価の陽イオンがカルシウムイオンである、請求項11〜13のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記一価の陽イオンの濃度が150mMであり、そして前記二価陽イオンの濃度が2mMである、請求項11〜14のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記SV40ウイルスのVP1キャプシド蛋白質が、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するか、或いは配列番号：２に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の欠失、付加又は他のアミノ酸による置換を有する蛋白質である、請求項12〜15のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記置換が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における、49位のGlu、51位のGlu、160位のGlu、163位のGlu、216位のSer、217位のLys、219位のGlu、332位のGlu、333位のGlu及び348位のAspの内の少なくとも１個のアミノ酸の置換である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記SV40ウイルスのキャプシド蛋白質VP2が、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するか、或いは配列番号：２に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の欠失、付加又は他のアミノ酸による置換により修飾されており、且つ粒子形成促進活性を維持している蛋白質である、請求項11〜17のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記SV40ウイルスのVP2キャプシド蛋白質、又は粒子形成促進活性を有するそのＮ−末端側部分が、配列番号：１の示すアミノ酸配列、又はその少なくとも１−272位のアミノ酸を含Ｎ−末端側部分である、請求項11〜17のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記SV40ウイルスのVP2キャプシド蛋白質の粒子形成促進活性を有するＮ−末端側部分が、配列番号：１に示すアミノ酸配列中の、少なくとも273位〜307位のVP1結合領域のアミノ酸配列を含んでなる、請求項11〜17のいずれか１項に記載のウイルス素粒子様構造体。
【請求項２１】
前記被封入因子が生理活性物質または非生理活性物質またはそれらの混合物である、請求項12〜20のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記非生理活性物質が低分子物質あるいは高分子物質あるいはそれら混合物である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記生理活性物質が、核酸、蛋白質、又は低分子物質である、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
SV40ウイルス、JCウイルス又はBKウイルスのVP1キャプシド蛋白質であるウイルス蛋白質と、当該ウイルス蛋白質についての結合領域を含んでなり且つ生理活性物質が連結された、SV40ウイルス、JCウイルス若しくはBKウイルスのキャプシドVP2蛋白質又は粒子形成促進活性を有するそのＮ−末端側部分とを、宿主細胞中で共発現させることを特徴とする、ウイルス蛋白質から構成されるウイルス様粒子に生理活性物質を導入する方法。
【請求項２５】
前記SV40ウイルスのVP1キャプシド蛋白質が、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するか、或いは配列番号：２に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の欠失、付加又は他のアミノ酸による置換を有する蛋白質である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記置換が、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における、49位のGlu、51位のGlu、160位のGlu、163位のGlu、216位のSer、217位のLys、219位のGlu、332位のGlu、333位のGlu及び348位のAspの内の少なくとも１個のアミノ酸の置換である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記SV40ウイルスのキャプシド蛋白質VP2が、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するか、或いは配列番号：２に示すアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の欠失、付加又は他のアミノ酸による置換により修飾されており、且つ粒子形成促進活性を維持している蛋白質である、請求項24又は25に記載の方法。
【請求項２８】
前記SV40ウイルスのVP2キャプシド蛋白質の粒子形成促進活性を有するＮ−末端側部分が、配列番号：１に示すアミノ酸配列中の、少なくとも273位〜307位のVP1結合領域のアミノ酸配列を含んでなる、請求項24〜26のいずれか１項に記載のウイルス素粒子様構造体。
【請求項２９】
請求項８又は10に記載のウイルス粒子構造体を有効成分とする、生理活性物質を細胞に導入するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明はウルスタンパク質を用いたウイルス粒子様構造体、及びその形成方法に関する。このウイルス粒子様構造体はその中に他の物質を収容できるので、ドラッグデリバリー、遺伝子治療におけるキャリアーなどとして有望である。
【背景技術】  従来のウイルス粒子様構造体の形成は、細胞内で形成させたウイルス様粒子を回収することにより作成していた。
またこのウイルス様粒子を細胞より精製し、それから粒子構成単位（例えばＳＶ４０ウイルスではＶＰ１五量体）に一旦解離させ、試験管内で再びウイルス様粒子を再構成させる方法もある。
従来の再構成方法は高塩濃度の非生理的な条件で行われるが、粒子内部に取り込ませる生理活性物質が失活したりあるいは溶媒に難溶であったりするなどの問題があり、この条件は生理活性物質を粒子内に取り込ませるには適切ではない。またこの方法を用いても均一なサイズのウイルス様粒子を効率よく再構成させることが困難であった。
【発明の開示】
本発明では試験管内でウイルス粒子様構造体を再構成する際、生理的条件下でかつ効率的に均一なサイズの粒子形成を行うことができるための方法を提供しようとするものである。
本発明はまた、宿主細胞内でウイルス粒子様構造体を形成する方法を提供する。
本発明は試験管内において生理的条件下で効率的にサイズが均一なウイルス様粒子形成を行うために、天然のウイルス粒子中に見られるタンパク質を再構成環境に加えることで、目的を達成した。
従って、本発明は、ウイルスタンパク質と粒子形成促進因子とから構成される、均一なサイズのウイルス粒子様構造体を提供する。本発明はまた、ウイルスタンパク質と粒子形成促進因子とから構成され、被封入物質を収容した、均一なサイズのウイルス粒子様構造体を提供する。
本発明はまた、ウイルスタンパク質を、ｐＨ５〜ｐＨ１０．０及び室温にて、１３０ｍＭ〜５００ｍＭ一価の陽イオン及び２μＭ〜５０ｍＭの二価陽イオンの存在下で、且つ粒子形成促進因子の存在下でインキュベートすることを特徴とする、ウイルスタンパク質と粒子形成促進因子から構成される均一なサイズのウイルス粒子集団の形成方法；並びにウイルスタンパク質及び被封入物質を、ｐＨ５〜ｐＨ１０及び室温にて、１３０ｍＭ〜５００ｍＭの一価の陽イオン及び２μＭ〜５０ｍＭの二価の陽イオンの存在下で、且つ粒子型性促進因子の存在下でインキュベートすることを特徴とする、被封入物質とそれをとり巻くウイルスタンパク質及び粒子形成促進因子から構成される均一なサイズのウイルス粒子様構造体の形成方法を提供する。
本発明は更に、ウイルス蛋白質と、当該ウイルス蛋白質についての結合領域を含んでなり且つ生理活性物質が連結されたキャプシド蛋白質ＶＰ２又はその部分とを、宿主細胞中で共発現させることを特徴とする、ウイルス蛋白質とキャプシド蛋白質ＶＰ２又はその部分とから構成されるウイルス様粒子に生理活性物質を導入する方法を提供する。
本発明はまた、表面が負に帯電した高分子を封入したウイルス蛋白質とから構成されるウイルス粒子集団の製造方法において、ウイルス蛋白質と、当該ウイルスキャプシド蛋白質３６０部に対して０．０１〜１００部（重量比）の高分子とを混合し、一価の金属塩および２価の金属塩を含む水溶液に対して透析する、ことを特徴とする方法を提供する。
上記負に帯電した高分子は、好ましくは、ＤＮＡ、各種ＲＮＡ、合成核酸様構造体である。上記ウイルス粒子集団の製造方法において、ウイルス蛋白質と、当該ウイルスキャプシド蛋白質３６０部に対して加える負に帯電した高分子の重量比は好ましくは０．２以上である。
ウイルス粒子様構造体を構成する前記ウイルス蛋白質は、好ましくは、ＳＶ４０ウイルス、ＪＣウイルス又はＢＫウイルスのＶＰ１キャプシド蛋白質である。
前記ＳＶ４０ウイルスの蛋白質として、ＶＰ１キャプシド蛋白質又はその変異体が挙げられる。前記ＶＰ１キャプシド蛋白質の変異体は、例えば、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するＶＰ１キャプシド蛋白質において、１〜数個のアミノ酸の欠失、付加又は他のアミノ酸による置換を有する蛋白質が例示される。具体的な置換としては、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における、４９位のＧｌｕ、５１位のＧｌｕ、１６０位のＧｌｕ、１６３位のＧｌｕ、２１６位のＳｅｒ、２１７位のＬｙｓ、２１９位のＧｌｕ、３３２位のＧｌｕ、３３３位のＧｌｕ及び３４８位のＡｓｐの内の少なくとも１個のアミノ酸の置換が例示される。
ウイルス粒子様構造体を構成する前記粒子形成促進因子は、好ましくは、ウイルス粒子カプシド蛋白質、当該蛋白質の粒子形成促進活性を有するＮ−末端領域、又は当該蛋白質において１〜複数のアミノ酸が付加、欠失及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されており、且つ粒子形成促進活性を維持している蛋白質である。前記ウイルス粒子キャプシド蛋白質は、好ましくは、ＳＶ４０ウイルス、ＪＣウイルス又はＢＫウイルスのキャプシド蛋白質ＶＰ２である。より具体的な例では、前記ウイルス粒子キャプシド蛋白質は、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するＳＶ４０ウイルスのキャプシド蛋白質ＶＰ２である。
本発明のウイルス様構造体を生体外、たとえば試験管内で形成させる場合、好ましくは、前記ウイルス粒子キャプシド蛋白質は、配列番号：１に示すアミノ酸配列中の、少なくとも１位〜２７２位のアミノ酸配列を含んで成るか、あるいは少なくとも１位〜５８位、５９位〜１１８位、１１９位〜１５２位、又は１５３位〜２７２位のアミノ酸配列を含んでなる、ＳＶ４０ウイルスのキャプシド蛋白質ＶＰ２の部分である。
本発明のウイルス用構造体を、宿主細胞内で形成させる場合、好ましくは、前記ウイルス粒子キャプシド蛋白質は、配列番号：１に示すアミノ酸配列中の、少なくとも２７３位〜３０７位のＶＰ１結合領域のアミノ酸配列を含んでなる、ＳＶ４０ウイルスのキャプシド蛋白質ＶＰ２の部分であり、これには好ましくは所望の導入されるべき生理活性物質、非生理活性物質またはそれらの混合物が連結されている。
前記非生理活性物質は、例えば低分子物質あるいは高分子物質あるいはそれら混合物である。
前記被封入因子は、典型的には、生理活性物質であり、例えば、核酸、蛋白質、又は低分子物質である。
本発明のウイルス粒子様構造体を形成する前記一価の陽イオンは、好ましくは、ナトリウムイオンであり、塩化ナトリウムとして使用される。また、本発明のウイルス粒子様構造体を形成する前記二価の陽イオンは、好ましくは、カルシウムイオンであり、塩化カルシウムとして使用される。前記一価の陽イオンの濃度は、例えば１５０ｍＭであり、そして前記二価陽イオンの濃度は、例えば２ｍＭである。
本発明はまた、生理活性分子を含んで成る前記のウイルス構造体を有効成分とする、生理活性物質を細胞に導入するための組成物に関する。
【図面の簡単な説明】  図１は、粒子形成促進因子の存在下での本発明の方法により形成したウイルス粒子様構造体の電子顕微鏡写真を示す。
図２は、粒子形成促進因子の非存在下で、ウイルス蛋白質を生理的条件下で処理した場合の、電子顕微鏡写真を示す。
図３は、ウイルス蛋白質ＶＰ１と粒子形成促進因子ＶＰ２との比率を変えた場合の、ウイルス粒子様構造体の形成の状態を示す、電子顕微鏡写真を示す。
図４は、Ｃ−末端側を欠失させた粒子形成促進因子ＶＰ２を用いて生成させたウイルス粒子様構造体の電子顕微鏡写真を示す。
図５は、Ｃ−末端側に点変異を導入した粒子形成促進因子ＶＰ２を用いて生成させたウイルス粒子様構造体の電子顕微鏡写真を示す。
図６は、ｐＨ８〜１０の非生理的条件下でインキュベーションを行なった場合、粒子形成促進因子の非存在下でも、均一な球形のウイルス粒子様構造体が形成されることを示す、電子顕微鏡写真を示す。
図７は、実施例２において調製したウイルス粒子を蔗糖密度遠心分離により分画し、サザンブロッティングにより検出した結果を示す図である。
図８は、実施例３において、ｐＥＧの存在下でＶＰ１−ＶＰ２タンパク質から構成されたウイルス様粒子をショ糖密度勾配遠沈で分画した後のｐＥＧ  ＤＮＡの分布、及び抗ＶＰ１抗体で検出されたタンパク質の分布を示す。
図９は、実施例３において、ウイルス様粒子を介してＣＯＳ−１細胞に導入されたｐＥＧが当該細胞で発現され蛍光タンパク質が産生されたことを示す。
図１０は、実施例４の結果を示し、粒子形成促進因子としてのＶＰ２タンパク質の部分と粒子形成との関係を示す。
図１１は、実施例５の結果を示し、ＶＰ１からのウイルス様構造体への取り込みのために必要なＶＰ２の部分を示す。
図１２は、実施例６の結果を示し、所定の条件下でＶＰ１から形成されるウイルス様構造体にＤＮＡが取り込まれることを示す。
図１３は、実施例６において得られた生成物の電子顕微鏡観察の結果を示す。
図１４は、実施例７において、予めＲｎａｓｅ処理を施したｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、Ｒｎａｓｅ処理を施さないｔｏｔａｌ  ＲＮＡと精製したＶＰ１タンパク質を混合し、この混合液をｐＨ５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液に室温で１６時間透析をすることで再構成を行った。再構成を行った後、電子顕微鏡を用いて置換した溶媒中のＶＰ１五量体の集合化様式を観察した。図はＲＮａｓｅ処理を施したものをＲＮａｓｅ＋、ＲＮａｓｅ処理を施さないものをＲＮａｓｅ−として表している。この図から球状ウイルス様粒子の形成はＲＮＡの存在によって起きていることが示唆された。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明においてウイルスタンパク質粒子を形成するためのタンパク質源として使用しうるウイルスは、その主要構造タンパク質または粒子外殻構成タンパク質から粒子を形成しうるものであれば特に限定されない。例えば、主要構造タンパク質として、シミアンウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎｖｉｒｕｓ  ４０；ＳＶ４０）、ヒトポリオーマウイルスであるＪＣ、ＢＫウイルス、等ががあげられる。ＳＶ４０のＶＰ１が特に好ましい。粒子外殻形成タンパク質としては、例えばカプシドタンパク質ＶＰ１（ＳＶ４０、ヒトポリオーマウイルスであるＪＣウイルス、ＢＫウイルス、などがあげられる。
ＳＶ４０のＶＰ１としては、生来のＶＰ１でもよく、またその変異体であってもよい。変異体としては、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するＶＰ１キャプシド蛋白質において、１〜数個のアミノ酸の欠失、付加又は他のアミノ酸による置換を有する蛋白質が例示され、具体的な置換の例として、配列番号：２に記載のアミノ酸配列における、４９位のＧｌｕ、５１位のＧｌｕ、１６０位のＧｌｕ、１６３位のＧｌｕ、２１６位のＳｅｒ、２１７位のＬｙｓ、２１９位のＧｌｕ、３３２位のＧｌｕ、３３３位のＧｌｕ及び３４８位のＡｓｐの内の少なくとも１個のアミノ酸の置換が例示できる。
１つの態様において、本発明は１６０位のＧｌｕが他のアミノ酸により置換されており、野性型に比べて硬い（ｒｉｇｉｄ）又は安定なウイルス様タンパク質粒子を形成することができるタンパク質（変異体Ａ；ｍｔＡ）を提供する。好ましくは、上記のＧｌｕは、Ｇｌｎにより置換される。
他の態様において、本発明は１６３位のＧｌｕが他のアミノ酸により置換されており、野性型に比べて硬い（ｒｉｇｉｄ）又は安定なウイルス様タンパク質粒子を形成するタンパク質（変異体Ｂ；ｍｔＢ）を提供する。好ましくは、上記ＧｌｕはＧｌｎにより置換される。
他の態様において、本発明は、３４８位のＡｓｐが他のアミノ酸により置換されており、野性型に比べて硬い又は安定なウイルス様タンパク質粒子を形成するタンパク質（変異体Ｃ；ｍｔＣ）を提供する。上記Ａｓｐは好ましくはＡｓｎにより置換される。
他の態様において、本発明は、１６０位のＧｌｕ及び１６３位のＧｌｕが他のアミノ酸により置換されており、野性型に比べて硬い（ｒｉｇｉｄ）ウイルス様タンパク質粒子を形成するタンパク質（変異体Ｄ；ｍｔＤ）を提供する。上記のＧｌｕは好ましくはＧｌｎにより置換される。
他の態様において、本発明は、１６０位のＧｌｕ、１６３位のＧｌｕ及び３４８位のＡｓｐが他のアミノ酸により置換されており、野性型に比べて硬い（ｒｉｇｉｄ）又は安定なウイルス様タンパク質粒子を形成するタンパク質（変異体Ｅ；ｍｔＥ）を提供する。上記のＧｌｕは好ましくはＧｌｎにより置換され、そしてＡｓｐは好ましくはＡｓｎにより置換される。
他の態様において、本発明は、３３２位のＧｌｕ、３３３位のＧｌｕ及び３４８位のＡｓｐが他のアミノ酸により置換されており、棒状のウイルス様タンパク質粒子を高頻度に形成することができるタンパク質（変異体Ｆ；ｍｔＦ）を提供する。上記のＧｌｕは好ましくはＧｌｎにより置換され、そしてＡｓｐは好ましくはＡｓｎにより置換される。
他の態様において、本発明は、４９位のＧｌｕ及び５１位のＧｌｕが他のアミノ酸により置換されており、野性型に比べて硬い（ｒｉｇｉｄ）又は安定なウイルス様タンパク質粒子を形成するタンパク質（変異体Ｇ；ｍｔＧ）を提供する。上記Ｇｌｕは好ましくはＧｌｎにより置換される。
他の態様において、本発明は、４９位のＧｌｕ、５１位のＧｌｕ、１６０位のＧｌｕ、１６３位のＧｌｕ、２１６位のＳｅｒ、２１７位のＬｙｓ、２１９位のＧｌｕ、３３２位のＧｌｕ、３３３位のＧｌｕ及び３４８位のＡｓｐが他のアミノ酸により置換されており、野性型に比べてウイルス様タンパク質粒子を形成しにくくなっているタンパク質（変異体Ｈ；ｍｔＨ）を提供する。上記のＧｌｕは好ましくはＧｌｎにより置換され、Ａｓｐは好ましくはＡｓｎにより置換され、Ｓｅｒは好ましくはＡｌａにより置換され、そしてＬｙｓは好ましくはＡｌａにより置換される。
なお、上記の変異体の調製方法は特開２００２−３６０２６６に詳細に記載されている。
本発明においては、ｐＨ５〜１０の条件下で、粒子形成促進因子を使用することが必要である。粒子形成促進因子としては、例えば、ウイルス粒子内タンパク質が好ましい。例えば、ウイルス粒子内タンパク質として、ＳＶ４０ウイルス、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、などのキャプシドタンパク質ＶＰ２又はそのＮ−末端側部分、あるいはヒストンタンパク質などがあげられる。特に好ましいウイルス粒子内タンパク質はＳＶ４０のＶＰ２又はそのＮ−末端側部分である。ＳＶ４０のＶＰ２のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。本発明の粒子形成促進因子としてＳＶ４０のＶＰ２又はその部分を用いて生体外でウイルス様構造体を形成させる場合、配列番号：１に記載のアミノ酸配列中、少なくとも、第１位のアミノ酸から第５８位のアミノ酸までのアミノ酸配列、第５９位のアミノ酸から第１１８位までのアミノ酸配列、及び１１９位から１５２位のアミノ酸配列、及び第１５３位から２７２位のアミノ酸配列を含めばよい。
Ｓｖ４０ウイルスのキャプシド蛋白質ＶＰ２を用いて、ウイルス様構造体を細胞内で形成させる場合、このキャプシド蛋白質は、配列番号：１に示すアミノ酸配列中の、少なくとも２７３位〜３０７位のＶＰ１結合領域のアミノ酸配列を含んでいればよい。
本発明のウイルス粒子内蛋白質はまた、例えば配列番号：１に示すアミノ酸配列又はそのＮ−末端配列において、１〜数個のアミノ酸残基が付加、欠失、及び／又は他のアミノ酸による置換によって修飾されており、且つ粒子形成促進因子活性を維持しているものであってもよい。修飾されるアミノ酸残基の数はたとえば１〜２０個、例えば１〜１５個、あるいは１〜数個である。
本願発明の方法によりウイルス粒子を形成する際の、粒子の外殻を構成するウイルスタンパク質の濃度は、５０ｎｇ／μＬ〜５００ｎｇ／μＬ、好ましくは７０ｎｇ〜２００ｎｇであり、粒子形成促進因子としてのタンパク質の濃度は、１ｎｇ／μＬ〜１μｇ／μＬ、好ましくは１０ｎｇ／μＬ〜１００ｎｇ／μＬである。また、ウイルス粒子に被封入物質を封入する場合の被封入物質の濃度は、その物質の種類により異なるが、０．１ｎｇ／μＬ〜１０μｇ／μＬ、好ましくは１０ｎｇ／μＬ〜１μｇ／μＬである。
本発明によれば、上記のウイルスタンパク質を、（１）ｐＨ５〜ｐＨ１０のｐＨ範囲、及び（２）室温にて、（３）１３０ｍＭ〜５００ｍＭ  一価の陽イオン、（４）２μＭ〜５０ｍＭの二価陽イオン、及び（５）粒子形成促進因子の存在下でインキュベートすることにより、球状の均一なサイズの粒子を形成することができる。一価の陽イオンとしてはナトリウムイオン、例えば塩化ナトリウムが好ましく、ナトリウムイオンの濃度は、好ましくは１４０ｍＭ〜１６０ｍＭであり、特に１５０ｍＭが好ましい。
二価陽イオンとしては、カルシウムイオン、カドミウムイオン、マンガンイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオンなどが使用できるがカルシウムイオンが特に好ましく、例えば塩化カルシウムとして使用される。カルシウムイオンの濃度は、好ましくは１．７５ｍＭ〜２．２５ｍＭであり、とくに２ｍＭが好ましい。
なお、ｐＨ８〜ｐＨ１０の範囲で、室温にて、１３０〜１７０ｍＭの塩化ナトリウム、１．５ｍＭ〜２．５ｍＭの二価陽イオンの存在下でインキュベートする場合、粒子形成促進因子を添加しなくても、球状の均一なサイズのウイルス粒子様構造体を形成せしめることが出来る。
本発明の、被封入物質を封入したウイルス粒子の形成方法においては、上記のウイルス粒子形成方法において、インキュベーションの際に被封入物質を共存させればよい。被封入物質としては特に限定されないが、例えば核酸、即ちＤＮＡ又はＲＮＡ、特にＤＮＡ、タンパク質又はペプチド、各種の低分子物質、例えば医薬活性物質、などが挙げられる。
このようにして作製した、生理活性分子を含んで成る前記のウイルス構造体は、その生理活性物質を細胞に導入するために使用することが出来る。これにより、ドラッグデリバリー、遺伝子治療などのための、生理活性物質の生細胞への導入、例えば、遺伝子導入、遺伝子治療、特定遺伝子発現及び機能抑制を用いた再生医療などへの応用、標識物質などを含むウィルス様粒子を用いた組織及び臓器特異的又は病巣特異的な標識方法などに応用できる。
【実施例】  次に、実施例により、本発明を更に具体的に説明する。
実施例１． ウイルス粒子の調製
（１）ウイルスタンパク質（ＶＰ１）五量体の調製
１０ｃｍ径の組織培養用ディッシュ５０枚にＳｆ９細胞を１×１０７個づつ蒔き、ＳＶ４０のウイルスタンパク質（ＶＰ１）を発現する組換えパキュロウイルスを、ｍ．ｏ．ｉ．（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；重複感染度）５〜１０で感染させた。
感染７２時間後に、細胞を、スクレイパーを用いて培地ごと回収した後、冷却したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）により２回洗浄した。回収した細胞に、氷冷したソニケーション用緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９），１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ），２ｍＭ  ＰＭＳＦ）を１０ｍＬ加え、ＴＡＩＴＥＣ社のＶＰ−１５Ｓ（ソニケーター）を用いて、ＤＵＴＹＣＹＣＬＥ  ５０％、出力５の条件で、氷冷しながら１０分間超音波破砕した。次に、細胞破砕液を１４，０００ｇ，４℃にて２０分間遠心し、その上清を回収した。
ＳＷ４１Ｔｉ用Ｏｐｅｎ  Ｔｏｐ  Ｕｌｔｒａｃｌｅａｒ  Ｔｕｂｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ）に４種類の密度の異なる塩化セシウム溶液（５０％、４０％、３０％、２０％（ｗ／ｖ））を密度の高いほうから順番に１．５ｍｌづつ静かに重層し、その上に、上記の細胞破砕液５ｍＬを重層し、ＳＷ４１Ｔｉローター（ＢＥＣＫＭＡＮ）で３０，０００ｒｐｍ、４℃にて２．５時間遠心した。遠心後、密度勾配の中程に白く形成されるＳＶ４０ウイルスのウイルス様粒子（Ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｃ；ＶＬＰ）の層を回収した。回収した溶液を、ＳＷ５５Ｔｉ用Ｏｐｅｎ  Ｔｏｐ  Ｕｌｔｒａｌｅａｒ  Ｔｕｂｅ（ＢＥＣＫＭＡＮ）に移し、３７％（ｗ／ｖ）塩化セシウム溶液を、容量チューブの先端から約５ｍｍに達するまで添加し、これをＳＷ５５Ｔｉローター（ＢＥＣＫＭＡＮ）で５０，０００ｒｐｍ、４℃にて２０時間遠心し、再度形成されたＶＬＰ層を回収した。
得られた精製ウイルス様タンパク質の溶液に、１／１００量の１０％（ｖ／ｖ）界面活性剤ＮＰ−４０を添加し（最終濃度０．１％）、２０Ｍｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９），０．１％ＮＰ−４０の透析溶液中で４℃にて２４時間透析を行い、塩化セシウムを除去した。透析後、１５，０００ｇ，４℃にて１０分間遠心し、その上清を回収した。
次に、０．２５Ｍエチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）と１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）とを、各々の終濃度が２５ｍＭ  ＥＧＴＡ及び３０ｍＭ  ＤＴＴとなるようにウイルス様粒子溶液に添加し、３７℃にて１時間インキュベートすることにより、ウイルス様粒子をＶＰ１の五量体へと解離させた。インキュベートの後、１５，０００ｇ，４℃にて１０分間遠心し、得られた上清をゲル濾過クロマトグラフィーにかけて、ＶＰ１の五量体の精製を行った。このクロマトグラフィーは、ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇカラム（Ｐｈａｅｍａｃｉａ）を用い、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＥＧＴＡ，５ｍＭ  ＤＴＴ，４℃の条件下で行った。
得られたフラクションのそれぞれの１部分を取ってＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動にかけ、分子量約２０ＯｋＤａに検出されたＶＰ１五量体とし、このタンパク質を含むフラクションを、ＶＰ１五量体の含有フラクションして、液体窒素により凍結した後−８０℃で保存した。
（２）ＳＶ４０−ＶＰ２タンパク質の調製
アミノ末端にヒスチジン配列およびＦＬＡＧ配列を挿入したＳＶ４０−ＶＰ２遺伝子をｐＥＴ−１４ｂベクターに組込み大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した。形質転換した大腸菌を２５０ｍｌのＬＢ培地に接種し、３７℃でしんとう培養した。培養液が、対数増殖期（濁度；Ｏ．Ｄ．値０．３（波長６６０ｎｍ））で１ｍＭ  ＩＰＴＧでタンパク質の誘導発現を行った。誘導発現４時間後に、大腸菌を遠心して回収した後、冷却したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）により２回洗浄した。回収した大腸菌に、氷冷した結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９），１０％グリセロール，５００ｍＭ  ＫＣｌ，０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％  ＮＰ−４０，０．５ｍＭ  ＤＴＴ，１０ｍＭイミダゾール）を４０ｍｌ加え、ＴＡＩＴＥＣ社のＶＰ−１５Ｓ（ソニケーター）を用いて、ＤＵＴＹ  ＣＹＣＬＥ  ５０％、出力５の条件で、氷冷しながら１０分間超音波破砕した。次に、細胞破砕液を１４，０００ｇ、４℃にて２０分間遠心し、その上清を回収した。
回収した上清を、予め結合緩衝液で平衡化しておいた５００μＬのＨｉｓレジン（Ｑｉａｇｅｎ社）と混ぜ４℃、１時間ローターでゆっくりと回転させることで攪拌した。攪拌した溶液を遠心し、レジンをペレットにし上清を除いた。このレジンにウォッシュ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９），１０％グリセロール，５００ｍＭ  ＫＣｌ，０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％  ＮＰ−４０，０．５ｍＭ  ＤＴＴ，２０ｍＭイミダゾール）を１０ｍＬ加え、攪拌した。攪拌した溶液を再び遠心し、上清を注意深く除いた。この洗浄操作を３回繰り返した。最後にこのレジンに、エリューション緩衝液（（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９），１０％グリセロール，５００ｍＭ  ＫＣｌ，０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．１％  ＮＰ−４０，０．５ｍＭ  ＤＴＴ，１Ｍイミダゾール）を５００μＬ加え、攪拌した。攪拌した溶液を遠心し、上清を注意深く回収した。この操作を二回繰り返すことで、計１ｍｌのＳＶ４０−ＶＰ２タンパク質を得た。
（３）生理的条件下でのウイルス粒子の試験管内再構成
調製したＳＶ４０−ＶＰ１タンパク質五量体とＳＶ４０−ＶＰ２タンパク質を用いて生理的条件下でのウイルス粒子の試験管内再構成を行った。即ち、ｐＨ５〜７の場合、例えば、ＶＰ１五量体タンパク質８２．５ｎｇ／μＬ，１５０μＬに、ＶＰ２タンパク質８００ｎｇ／μＬ，３．４μｌを加えて、４℃で３０分間インキュベーションし、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２の溶液で透析法を用いて透析することで再構成を行った。即ち、ＶＰ１タンパク質とＶＰ２タンパク質のｍｏｌ比が３６０：８４になるように加えた。ウイルス様粒子の検出は、電子顕微鏡観察を用いて行った。結果を図１に示す。
（４）生理的条件下でのＶＰ１五量体の集合化様式の検討
精製したＶＰ１五量体タンパク質を含む溶液を、透析により生理的条件の溶媒に置換し、その集合化様式を調べた。粒子形成が観察された（３）の結果とは異なり、生理的条件下でのｐＨ５．０〜７．０の場合、ＶＰ１五量体のみではウイルス粒子様構造体の形成は殆ど見られなかった。ＶＰ１、例えば２７０ｎｇ／μＬ濃度のＶＰ１五量体１５０μＬを、室温で、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２でｐＨが４、または５、または６、または７の溶液で透析した。透析開始１６時間後にこの溶液を回収し、電子顕微鏡下で観察して、各条件下で見られるＶＰ１五量体の集合化様式を観察した。結果を図２に示す。
（５）生理的条件下においてＶＰ１五量体にＶＰ２タンパク質を比率を変えて加えた場合の集合化様式
精製したＶＰ１五量体タンパク質に分子量比でＶＰ１タンパク質：ＶＰ２タンパク質＝３６０：１０．５、３６０：２１、３６０：４２、３６０：８４となるようにタンパク質溶液を混合した。その溶液をｐＨ５．０の生理的条件の溶媒に透析法を用いて室温で置換した。置換した溶媒を電子顕微鏡観察することでＶＰ２タンパク質の濃度が変化した時に見られる集合化の様式を観察した。
例えば、２７０ｎｇ／μＬ濃度のＶＰ１五量体１５０μＬと１．１μｇ／μＬ濃度のＶＰ２タンパク質を１．１μＬ、２．２μＬ、４．４μＬ、８．８μＬとなるようにそれぞれタンパク質溶液を混合した。その溶液を４℃、３０ｍｉｎインキュベーションして、ｐＨ５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２の溶液で１６時間、室温で透析した。この溶液を回収し、電子顕微鏡下での観察に供し、ＶＰ２タンパク質の濃度変化に伴うＶＰ１五量体の集合化の様式を観察した。結果を図３に示す。幾つかの実験区ではこのｐＨ条件下で特徴的な桿状構造体が見られるがそれと同時に球状のウイルス様粒子が形成されているのがわかる。
（６）カルボキシル末端を欠失したΔＣ１３  ＶＰ２タンパク質、ΔＣ４０  ＶＰ２タンパク質、ΔＣ８０  ＶＰ２タンパク質を加えた場合のＶＰ１五量体の集合化様式
精製したＶＰ１五量体タンパク質と精製したΔＣ４０  ＶＰ２タンパク質（分子量約３４ＫＤａ）、ΔＣ８０  ＶＰ２タンパク質（分子量約３０ＫＤａ）を分子量比でＶＰ１：カルボキシル末端欠失ＶＰ２＝３６０：８４の比で混ぜ、４℃で３０ｍｉｎインキュベーションした。この混合液をｐＨ５．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２の溶液で室温にて透析した。
例えば、７５．７ｎｇ／μＬ濃度のＶＰ１、１５０μＬに７６３ｎｇ／μＬ濃度のΔＣ４０  ＶＰ２を２．６μＬ、又は７５８ｎｇ／μＬ濃度のΔＣ８０ＶＰ２を２．３μＬを加ええ、３０ｍｉｎ、４℃でインキュベーションした。この混合液を上記の溶
液を用いて室温で１６時間透析したのち、この混合液を回収、電子顕微鏡下での観察に供して、カルボキシル末端を欠失したＶＰ２タンパク質を加えた場合のＶＰ１五量体の集合化の様式を観察した。結果を図４に示す。共にＶＰ２アミノ酸配列を一部欠損しているのにも関わらず、ウイルス様粒子形成を誘起することができることがわかる。
（７）点変異を導入したＶＰ２タンパク質を加えた場合のＶＰ１五量体集合化の観察
ＶＰ１五量体タンパク質と各種の点変異を導入したＶＰ２タンパク質、２８３位から２８５位のＰｒｏ，Ｇｌｙ，ＧｌｙがＡｒｇ，Ｇｌｕ，Ａｒｇに変異したもの（以下ＰＧＰ→ＲＥＲ）、２７６位のＰｈｅと２７７位のＩｌｅがＧｌｕに変異したもの（以下ＦＩ→ＥＥ）、あるいはＡｌａに変異したもの（以下ＦＩ→ＡＡ）、２９６位のＬｅｕと３００位のＬｅｕがＡｌａに変異したもの（以下ＬＰＬＬＬ→ＡＰＬＬＡ）等の各種ＶＰ２タンパク質を分子量比で、ＶＰ１：点変異体ＶＰ２＝３６０：８４の比で混合し、４℃で３０ｍｉｎ静置し、その後、室温でｐＨ５．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２の溶液に透析した。
例えば８２．５ｎｇ／μＬ濃度のＶＰ１  １５０μＬに９８４ｎｇ／μＬ濃度のＰＧＰ→ＲＥＲ  ＶＰ２を２．７μＬ、又は１．１８μｇ／μＬ濃度のＦＩ→ＥＥ  ＶＰ２を２．３μＬ、又は７７９ｎｇ／μＬ濃度のＬＲＬＬＬ→ＡＲＬＬＡ  ＶＰ２を３．５μＬ、又は１．１３μｇ／μＬ濃度のＦＩ→ＡＡ  ＶＰ２を２．４μＬを加え、３０ｍｉｎ、４℃で静置し、この混合液を上記の条件で透析した。透析開始１６時間後にこの混合液を回収し、電子顕微鏡下での観察に供して、点変異を導入したＶＰ２タンパク質を加えた場合のＶＰ１五量体集合化の様式を確認した。結果を図５に示す。いずれの場合もＶＰ２の点変異導入によってウイルス様粒子の形成効果が阻害されることはなかった。
（８）ｐＨ８．０〜ｐＨ１０．０のｐＨ条件下でのＶＰ１五量体集合化の観察
精製したＶＰ１五量体タンパク質を含む溶液を、ｐＨ８．０〜ｐＨ１０．０の条件で透析し、その集合化様式を調べた。粒子形成促進因子が必要なｐＨ５．０〜ｐＨ７．０の条件とは異なり、生理的条件下でのｐＨ８．０〜１０．０の場合、ＶＰ１五量体のみでもウイルス様粒子形成が観察された。例えば２７０ｎｇ／μＬ濃度のＶＰ１五量体１５０μＬを、室温で、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２でｐＨが８、または９、または１０の溶液で透析した。透析開始１６時間後にこの溶液を回収し、電子顕微鏡下で観察して、各条件下で見られるＶＰ１五量体の集合化様式を観察した。結果を図７に示す。
実施例２．ＤＮＡを取り込んだウイルス様粒子の形成
実施例１を反復した。ただし、生理的条件下でのウイルス様粒子の試験管内再構成の工程（３）において、３０００ｂｐのプラスミドを共存させる事により、ウイルス様粒子へのＤＮＡ取り込みを行った、形成されたウイルス様粒子をショ糖密度勾配遠心分離にかけて分画、サザンブロッティング法により、ＤＮＡの検出を行った。図７に示すとおり、ウイルス様粒子中にＤＮＡが取り込まれた。
調製したＳＶ４０−ＶＰ１タンパク質五量体とＳＶ４０−ＶＰ２タンパク質を用いて生理的条件下でのウイルス様粒子の試験管内再構成を行った。その際に、ＤＮＡを加えた。即ち、ｐＨ５．０〜７．０の場合、例えば、ＶＰ１五量体タンパク質７５．７ｎｇ／μＬ、１５０μＬに、ＶＰ２タンパク質８００ｎｇ／μＬ、２．８μＬを加え、さらに３０００塩基対の環状二本鎖プラスミドＤＮＡ（ｐＧ５ｖｅｃｔｏｒ）５．７ｎｇ／μｌ、２１μＬを加えた。その混合溶液を４℃で３０分間インキュベーションし、１５０ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ２の溶液で透析法を用いて透析することで再構成を行った。
再構成をしたウイルス様粒子の画分に加えたＤＮＡが検出されることを確認するために、ショ糖密度勾配遠心を行った。遠心したサンプルを分画し、その画分をプロテアーゼ処理することでＶＰ１タンパク質を分解した。そのサンプルをアガロース電気泳動で分離し、サザンブロッティング法を行うことで、ＤＮＡがウイルス様粒子の画分に検出できることを確認した。通常は８、９及び１０番の画分がウイルス様粒子を含むが、図７で示す通り、ＤＮＡが８，９，１０番に検出できたことでウイルス様粒子の中にＤＮＡが包含できていることを確認した。
実施例３． ＤＮＡを取り込んだウイルス様粒子を用いての細胞への遺伝子導入
実施例２を反復した。但し、プラスミドとして、哺乳類真核細胞内で蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現できるｐＥＧを用いた。ｐＥＧプラスミドＤＮＡを含むウイルス様粒子の形成はショ糖密度勾配遠沈により行い、ウイルス様粒子を含む画分にＤＮＡが含まれることを確認した。即ち、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ７．２）の溶媒中、ｐＥＧプラスミドの存在下で、ＶＰ１  ＶＰ２タンパク質を用いてウイルス様粒子を再構成し、ショ糖密度勾配遠沈でプラスミドＤＮＡを含むウイルス様粒子を分画した。
ウイルス様粒子は抗ＶＰ１抗体（α−ＶＰ１）を用いたＷｅｓｔｅｒｎブロット法で、ｐＥＧはＳｏｕｔｈｅｒｎプロット法で検出した。結果を図８に示す。図上の数字はフラクションの番号を示し、最初が密度勾配のトップ（Ｔｏｐ）最後がボトム（Ｂｏｔｔｏｍ）であり、Ｐは遠沈した際にチューブ底にペレットとして沈澱したものを示す。このＤＮＡは、ＤＮＡ分解酵素Ｄｎａｓｅ  Ｉによる処理に耐性であるため、ＶＰ１−ＶＰ２タンパク質の殻に含まれていることが示唆された。
上記ウイルス様粒子を用いて、ｐＥＧ  ＤＮＡをＣＯＳ−１細胞に導入した。即ち、ＣＯＳ−１細胞を、直径６ｃｍのディッシュに６．６５×１０４細胞の量でまき、一晩培養した。細胞が剥がれないように培養液を除き、上記のプラスミドＤＮＡを含むウイルス様粒子約１００μＬを細胞に加えた。３７℃にて２時間インキュベーションした後、その際細胞が乾かないように１５分間おきに培養液に細胞をなじませた。培養後、培養液１．５ｍＬを細胞に加え、３７℃にて４８時間培養した。この後、細胞のＧＦＰタンパク質の発現を蛍光顕微鏡で確認し、細胞へのプラスミドＤＮＡの導入を確認した。結果を図９に示す。ｐＥＧによりコードされる蛍光タンパク質の発現が多くの細胞に見られ、（図９において、白く不定形に見えるものが蛍光タンパク質を発現した細胞）ＤＮＡを含むウイルス粒子により高効率の遺伝子導入が確認された。
実施例４． 細胞外でのＶＰ１蛋白質のウイルス様構造体の形成に関与する粒子形成促進因子としてのＶＰ２の部分の特定
ＳＶ４０のＶＰ１蛋白質からのウイルス様構造体の形成に必要な、粒子形成促進因子としてのＳＶ４０のキャプシド蛋白質ＶＰ２の領域を特定するため、図１０に示す、ＶＰ２蛋白質（全長アミノ酸配列は、配列番号：１に示す通り）の種々の領域０．４４μＭとＳＶ４０のＶＰ１蛋白質２．２μＭとを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む溶液（ｐＨ５．０）中でインキュベートし、生成物を電子顕微鏡で観察した。結果を図１０に示す。図中、「Ｖ」は５量体の均一なウイルス様構造体が形成されたことを示し、「Ｔｉ」は微小形粒子を示し、「（−）」は粒子が形成されなかったことを示し、「Ｔｕ」は、チューブ状の構造体が形成されたことを示す。
図１０の結果から明らかな通り、ＳＶ４０のキャプシド蛋白質ＶＰ２が粒子形成促進因子として機能するためには、配列番号：１のアミノ酸配列中の、少なくとも１位〜５８位のアミノ酸配列及び１１９位〜２７２位のアミノ酸配列が必要である。
実施例５． 細胞内で、ウイルス様構造体にＶＰ２を取り込む場合に必要なＶＰ２の領域の決定
ＳＶ４０のＶＰ２またはＶＰ３タンパク質（ＶＰ３はＶＰ２のＣ末端と共通な配列である）を昆虫細胞内でＶＰ１と共発現させると、形成されるＶＬＰの内部にＶＰ２、ＶＰ３が包含されることが報告されている。これをこの現象を利用して、ＶＰ１から構成されるウイルス様構造体に生理活性物質を封入する可能性を確かめるため、ＶＰ２もしくはＶＰ３又はその種々の断片にＧＦＰを融合させ、この融合タンパク質とＶＰ１とを共発現させることにより、当該融合タンパク質がウイルス様構造体に包含されるか検討した。
実験方法
融合タンパク質としては、ＶＰ２タンパク質、ＶＰ３タンパク質（ＶＰ２タンパク質の部分）、及びＶＰ１結合領域（ＶＰ２の２７３位−３０７位）を含むＶＰ２タンパク質（ＶＰ３タンパク質）の４種類のＣ末端断片（合計６種類のタンパク質）につき、夫々のＮ−末端又はＣ−末端にＧＦＣを融合させたもの（合計１２種類の融合タンパク質）を用いた。これら１２種類の融合タンパク質の構造の概略を図１１に示す。これらの融合タンパク質を発現させるバキュロウイルスを作製し、当該融合タンパク質を発現させる場居路ウイルスと、ＶＰ１を発現させるバキュロウイルスとを昆虫細胞に共感染させた。
８４時間後に細胞をスクレイパーで回収した後、氷冷したＰＢＳ（−）で細胞を洗浄した。細胞の破砕は超音波破砕により行った。１０ｃｍ径のディッシュ一枚当たり５００μｌのソニケーションバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．９）、１％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ（ＤＯＣ）、２ｍＭ  ｐｈｅｎｙｌ  ｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、１μｇ／ｍｌ  ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、ａｎｔｉｐａｉｎ、ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）を加え、超音波破砕装置を用いて氷冷しながら溶液が透明になるまで行った。超音波破砕後１５，０００ｘｇ、４℃で１０分間遠心し、その上清を細胞溶解液とした。細胞溶解液の一部を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、抗ＶＰ１ポリクローナル抗体と抗ＧＦＰモノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ製）でウエスタンブロッティングを行いＶＰ１タンパク質及びＧＦＰ融合タンパク質の発現を確認した。
調製した細胞溶解液を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．９）とあわせて２０μｌとし、５×４１ｍｍ  ｏｐｅｎ  ｔｏｐ  ｔｕｂｅ（Ｂｅｋｍａｎ社製）内にあらかじめ形成させておいた２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．９）に溶解させた２０％−４０％（ｗ／ｖ）ショ糖密度勾配溶液０．６ｍｌ上に静かに重層した。専用のアダプターを用いてチューブをＳＷ５５Ｔｉローター内に固定し、５０，０００ｒｐｍ、４℃で１時間遠心を行った。遠心後、チューブの上端より５５μｌずつ溶液を分画し、１２フラクション目は残ったサンプルに２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．９）を加え５５μｌとしチューブの底を洗うようにして回収した。各々の画分の１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、抗ＶＰ１ポリクローナル抗体と抗ＧＦＰモノクローナル抗体（Ｒｏｃｈｅ製）でウエスタンブロッティングを行った。昆虫細胞内でＶＬＰが形成されれば、７−１０番目のフラクションにＶＰ１タンパク質のピークが検出される。ＧＦＰ融合タンパク質のピークがＶＬＰのピークと同様に７−１０番目のフラクションに検出されたものは、形成されたＶＬＰ中に包含されていることが示唆される。これによって融合タンパク質のウイルス様構造体への包含を検討した。
結果を図１１に示す。
この結果から明らかな通り、少なくともＶＰ１結合領域を含むＶＰ２タンパク質の断片のＣ−末端側にＧＦＰを融合させた場合、ＶＰ１から形成されるウイルス様構造体は融合タンパク質を取り込むことができた。
この結果は、ＧＦＰに代えて目的とする生理活性物質をＶＬ２またはＶｓｏｎｏＰ１結合領域を含む断片に連結すれば、その生理活性物質をウイルス様構造体中に取り込むことができることを示唆している。
実施例６． 生体外での、ウイルス様構造体へのＤＮＡの取り込み
ＳＶ４０のＶＰ１タンパク質とＤＮＡとを、ＶＰ１：ＤＮＡ＝６００：０〜１の重量比で混合し、３０分間、氷上で冷却した後、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む溶液（ｐＨ５）に対して、室温にて１６時間透析した。この透析物の一部は、電子顕微鏡観察のため、及びタンパク質の定量（ｉｎｐｕｔタンパク質）のために使用し、他の一部はシュークロースクッションを用いる遠心分離にかけ、粒状物及びＤＮＡを回収した。この回収物を用いて、（１）タンパク質の定量（粒子を形成したタンパク質の量）、（２）プロナーゼＫによりタンパク質を分解下後のＤＮＡの量（ｉｎｐｕｔＤＮＡの量）、及び（３）ＤＮａｓｅによる封入されていないＤＮＡの分解除去及びプロナーゼＫによるタンパク質分解の後に残ったＤＮＡ（粒子中に封入されていたＤＡＮ）の量を測定した。
結果を図１２及び図１３に示す。図１２から明らかな通り、ＶＰ１タンパク質６００重量部に対してＤＮＡの量が０．２重量部以上である場合にＤＮＡがＶＰ１ウイルス様構造体に取り込まれた。
実施例７． ＲＮＡを取り込んだウイルス様粒子の形成
精製したＶＰ１五量体タンパク質にＲＮＡを混合した。この混合液を生理的条件の溶媒に透析法を用いて室温で置換した。電子顕微鏡を用いて置換した溶媒中のＶＰ１五量体の集合化様式を観察した。
例えば、５００ｎｇ／μｌ濃度のＶＰ１五量体２０μｌと９３８．７ｎｇ／μｌ濃度のｔｏｔａｌ  ＲＮＡ０．７９μｌを混合し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ溶液で、メスアップすることで体積を１００μｌとした。その溶液を４℃、３０ｍｉｎインキュベーションして、ｐＨ５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２の溶液に１６時間、室温で透析することで置換した。この溶液を回収し、電子顕微鏡を用いて、置換した溶媒中のＶＰ１五量体の集合化様式を観察した。結果を図１４に示す。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの添加によって球状のウイルス様粒子が形成されているのが分かる。
【産業上の利用可能性】  高濃度のＳＶ４０のＶＰ１五量体を生理的条件下において静置しても、粒子を形成させることはできない。例えば、ｐＨ５〜７、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む溶液中でＶＰ１五量体を約８０ｎｇ／μＬ濃度で静置すると、チューブ状構造体または不定形の凝集体しか形成しない。一方、同じ条件でＶＰ２タンパク質約１５−２０ｎｇ／μＬの濃度で加えることにより、効率よく均一なサイズの粒子が形成できる。また高ｐＨ条件下、ｐＨ８．０〜１０．０ではＶＰ２タンパク質無しでも均一なサイズのウイルス様粒子を形成することが観察された。つまり低塩濃度、ｐＨ５からｐＨ１０の間での生理的条件下で、ウイルス粒子様構造体の作製ができるようになった。
【図１】
0004734608.tif 000002
【図２】
0004734608.tif 000003
【図３】
0004734608.tif 000004
【図４】
0004734608.tif 000005
【図５】
0004734608.tif 000006
【図６】
0004734608.tif 000007
【図７】
0004734608.tif 000008
【図８】
0004734608.tif 000009
【図９】
0004734608.tif 000010
【図１０】
0004734608.tif 000011
【図１１】
0004734608.tif 000012
【図１２】
0004734608.tif 000013
【図１３】
0004734608.tif 000014
【図１４】
0004734608.tif 000015
【配列表】
0004734608000001.xml