(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガン細胞上に発現し、ガン細胞上のＦａｓに結合して、ガン細胞中のＤＮＡを断片化させ、ガン細胞にアポトーシスを誘導する以下の（ａ）または（ｂ）のガン抑制因子を発現増強することによる、イヌ、ウシ、ブタおよびネコからなる群から選択される哺乳動物に発生した乳ガンの抑制方法。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含有するガン抑制因子。
（ｂ）（ａ）に記載されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含有するガン抑制因子。
【請求項２】
インターロイキン１８をガン細胞に作用させることによる、請求項１に記載の乳ガンの抑制方法。
【請求項３】
インターロイキン１８をガン細胞に作用させることによって前記ガン抑制因子を発現増強させることによる、請求項２に記載の乳ガンの抑制方法。
【請求項４】
インターロイキン１２を同時にガン細胞に作用させることによる、請求項２または３に記載の乳ガンの抑制方法。
【請求項５】
インターロイキン１２を同時にガン細胞に作用させることによって前記ガン抑制因子を発現増強させることによる、請求項４に記載の乳ガンの抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ガン細胞上のガン抑制因子をガン細胞自身に作用させ、生体に発生したガンを縮小させることを目的とした、ガン抑制因子およびガンの抑制方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＦａｓとＦａｓリガンド（以下ＦａｓＬと略記する）の相互作用は、免疫システムの制御、生体組織のホメオスタシスの維持に必要である。ＦａｓＬは活性化された免疫細胞上に存在し、ターゲットであるウイルス感染細胞などにアポトーシスを誘導して死滅させる能力を有する（文献１，２）。免疫細胞上のＦａｓＬはインターロイキン１８（以下ＩＬ１８と略記する）により、その発現が増強されることが知られている（文献３）。また、ＩＬ１８は様々な生理活性において、インターロイキン１２（以下ＩＬ１２と略記する）と相乗作用を示すことが報告されている（文献４）。
【０００３】
元来ＦａｓＬはＴ細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞などリンパ球系の細胞にのみ発現していると考えられていたが、最近、ガン細胞など非リンパ球系の細胞にも発現していることが報告されている（文献５）。
【０００４】
ガン細胞表面上に発現するＦａｓＬは、ガン細胞を攻撃する能力を持つ種々の免疫細胞がガン細胞に接着する際、免疫細胞上のＦａｓに結合して、免疫細胞を殺し、免疫からの攻撃をエスケープすることが知られている（文献６）。従って、ガン細胞表面上のＦａｓＬの存在は、生体での抗腫瘍免疫にとって、不利益になると考えられている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
遺伝子操作技術の進歩により、抗腫瘍作用を有する様々なサイトカインの遺伝子がクローニングされ、ガンに対する治療への応用が試みられている。
【０００６】
しかしながら、免疫からの攻撃をエスケープする作用を有するガン細胞は、サイトカインなどによって生体での抗腫瘍免疫を高めても、ガン抑制効果は期待できない。また、ヒトと同様ペット、特にイヌにも、乳腺腫瘍など多数の腫瘍が知られており、その治療薬および治療方法の開発が求められている。
【０００７】
従って、ガン細胞の免疫からの攻撃のエスケープ作用を解除する方法を見出すことができれば、ヒトをはじめ、動物のガン免疫治療の可能性が開かれることが期待される。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、かかる状況に鑑み、イヌＦａｓＬのｃＤＮＡのクローニングおよびそれを用いたガン細胞の免疫細胞の攻撃からのエスケープ解除を目的とし、創意工夫を成し、イヌのｃＤＮＡからイヌＦａｓＬをコードする遺伝子をクローニングすることに成功し、またイヌＩＬ１８およびイヌＩＬ１２をイヌ乳ガン細胞株に作用させることによって、ガン細胞上のイヌＦａｓＬの発現が増強されることを見出し、更にその発現増強が、ガン細胞自身にアポトーシスを引き起こしてガン細胞を死滅させる現象を見出し、かくして本発明を完成させるに至った。
【０００９】
本発明は、イヌガン抑制因子、ＩＬ１８およびＩＬ１２を用いた、ガン細胞上のガン抑制因子の発現増強方法、およびＩＬ１８およびＩＬ１２を用いて、ガン細胞上のガン抑制因子の発現を増強することによる、イヌ、ウシ、ブタおよびネコからなる群から選択される哺乳動物に発生したガンの抑制方法に関する
【００１０】
すなわち、本発明は、
「ガン細胞上に発現し、ガン細胞上のＦａｓに結合して、ガン細胞中のＤＮＡを断片化させ、ガン細胞にアポトーシスを誘導する以下の（ａ）または（ｂ）のガン抑制因子を発現増強することによる、イヌ、ウシ、ブタおよびネコからなる群から選択される哺乳動物に発生した乳ガンの抑制方法。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含有するガン抑制因子。
（ｂ）（ａ）に記載されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含有するガン抑制因子。」
である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明に用いられるガン抑制因子は、ガン細胞上に発現し、ガン細胞上のＦａｓに結合して、ガン細胞にアポトーシスを誘導するものであり、以下の（ａ）または（ｂ）のものである。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含有するガン抑制因子。
（ｂ）（ａ）に記載されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含有するガン抑制因子。
【００１２】
本発明では、インターロイキン１８をガン細胞に作用させることにより、ガン細胞上のガン抑制因子を発現増強させることができる。このときに、インターロイキン１２を同時にガン細胞に作用させることにより、よりガン抑制因子を発現増強させることができる。
【００１３】
この作用は、ガン細胞が、乳ガン由来である場合に効果がある。インターロイキン１８およびインターロイキン１２の処理は１０５個のガン細胞あたり、それぞれ１ｎｇから１ｍｇ、１ｐｇから１００μｇの量で、１から２４時間処理することで十分な効果が得られる。
【００１４】
ガン細胞表面上に発現しているガン細胞上のＦａｓに結合してガン細胞にアポトーシスを誘導するガン抑制因子を発現増強することにより、哺乳動物の生体に発生したガンを抑制することができる。ガン抑制因子を発現増強させるためには、好ましくは、インターロイキン１８をガン細胞に作用させる。さらに好ましくは、インターロイキン１２を同時にガン細胞に作用させる。インターロイキン１８およびインターロイキン１２の生体に発生したガン細胞への作用方法としては特に限定はないが、好ましくは局所注射投与、手術による直接投与、およびこれら遺伝子の腫瘍内導入などにより、特に効果が期待される。
【００１５】
本発明のガンの抑制方法は哺乳動物がイヌである場合に特に効果があり、その他、ウシ、ブタ、ネコにも適用できる。また、ガン細胞が乳ガン由来である場合に効果がある。
【００１６】
本発明のイヌＦａｓＬをコードするＤＮＡは例えば次のようにして製造することができる。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出した後、ｃＤＮＡを合成し、マウスのＦａｓＬをコードする遺伝子配列を元にしたプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うことにより、イヌＦａｓＬｃＤＮＡをクローニングすることができる。さらに合成したｃＤＮＡよりファージライブラリーを作製し、ＰＣＲによって得られた遺伝子断片とプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、イヌＦａｓＬｃＤＮＡの全長をクローニングすることができる。
【００１７】
イヌの細胞からＲＮＡを得る方法としては、通常の方法、例えば、ポリソームの分離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法などがあげられる。上記イヌ細胞からＲＮＡを抽出する方法としては、グアニジン・チオシアネート処理後ＣｓＣｌ密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネート−塩化セシウム法（文献８）バナジウム複合体を用いてリボヌクレアーゼインヒビター存在下に界面活性剤で処理したのちフェノール抽出を行う方法（文献９），グアニジン・チオシアネート−ホット・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニジン塩酸法、グアニジン・チオシアネート−フェノール・クロロホルム法、グアニジン・チオシアネートで処理したのち塩化リチウムで処理してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を選んで行うことができる。
【００１８】
マイトージェンなどで刺激されたイヌ単核球やリンパ球より通常の方法、例えば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシアネート法、オリゴｄＴセルロースカラム法等によりｍＲＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例えば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献１０），Ｈ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（文献１１）等によりｃＤＮＡを合成する。得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素などを用いるほか１部プライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合成あるいはクローニング用キットを用いるのが便利である。
【００１９】
このｃＤＮＡを鋳型としてマウスやヒトの塩基配列をもとにしたプライマーを用いてＰＣＲを行い、さらに合成したｃＤＮＡをλファージベクターに連結した後、インビトロでλファージのコート蛋白質などと混合することによりパッケージングし、その生成されたファージ粒子を宿主となる大腸菌に感染させる。この際、λファージの感染した大腸菌は溶菌し、１個１個のクローンがプラークとして回収される。このプラークをニトロセルロースなどのフィルターに移し、放射標識したＰＣＲで得た遺伝子をプローブとしたハイブリダイゼーションにより、イヌＦａｓＬｃＤＮＡをクローニングすることができる。
【００２０】
イヌＦａｓＬは、以下の実施例で示すように、イヌ乳ガン細胞に発現し、ＩＬ１８の処理によりその発現が増強され、細胞にアポトーシスを誘導することによって特性化される。ＩＬ１８に加え、ＩＬ１２を処理することによって、さらにその発現が増強される。
【００２１】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。
【００２２】
実施例１
イヌＦａｓＬのクローニング
（１）イヌｃＤＮＡの調製
イヌ末梢血由来リンパ球および種々のイヌ細胞株よりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸（以下ＥＤＴＡと略記する）を含む１０ｍＭ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）（以下ＴＥと略記する）に溶解し、７０℃で５分間処理した後、１Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥを同量加えた。０．５Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリゴｄＴセルロースカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同緩衝液にて洗浄した。さらに０．３Ｍ  ＬｉＣｌを含むＴＥにて洗浄後、０．０１％  ドデシル硫酸ナトリウム（以下ＳＤＳと略記する）を含む２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍｌのミクロ遠心チューブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと０．５μｇのオリゴｄＴプライマー（１２−１８ｍｅｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネート処理滅菌水を加えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベートしたのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭ  ＫＣｌ溶液を２μｌ，２５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 を２μｌ，１０ｍＭ  ｄＮＴＰを１μｌおよび０．１Ｍ  ジチオスレイトール（以下ＤＴＴと略記する）を２μｌそれぞれ加え、４２℃で５分間インキュベートしたのち、２００ユニットのＧｉｂｃｏＢＲＬ社製ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴを１μｌ加え、４２℃でさらに５０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成反応を行った。さらに７０℃で１５分間インキュベートして反応を停止し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃｏｌｉ  ＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間インキュベートした。
【００２３】
（２）イヌＦａｓＬのｃＤＮＡクローニング
ヒトＦａｓＬの塩基配列（文献４）をもとに、
５´ｃｃｔｔｇｇｔａｇｇａｔｔｇｇｇｃｃｔｇｇｇｇａｔｇｔｔｔｃ３´（配列番号：２）
と
５´ａａｇａｃｔｃｔｃａｔｔｃａａｇａｃｃａｔｇｔｔｃｔｃａｇｔ３´（配列番号：３）
の２種類のプライマーをＤＮＡシンセサイザーにて合成した。上記（１）のイヌ末梢血由来リンパ球から得られたｃＤＮＡを０．２ｍｌのマイクロ遠心チューブに２μｌ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、２５ｍＭ  ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ  ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位  Ｅｘ  Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）製）となるように各試薬を加え、全量２０μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマーのアニーリング条件を６０℃、２分、プライマーの伸長条件を７２℃、２分の各条件でＭＪ  ＲＥＳＥＲＣＨ社のＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用い、４０サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動し、約５３０ｂｐのＤＮＡ断片を常法（文献１３）に従って調製した。
【００２４】
このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）のＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２を用いて連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法により調製した。次にこのプラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と同じ条件のＰＣＲによって確認し、蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、挿入したＤＮＡの塩基配列を決定した。このイヌＦａｓＬをコードする配列を配列番号：１に示す。
【００２５】
実施例２
イヌ乳ガン細胞株の樹立
イヌ生体に発生した乳ガン組織を無菌的に切除し、３〜５ｍｍの断片に刻み、ワイヤーメッシュに通した後、０．１％コラゲナーゼ（シグマ社製）と０．００１％デオキシリボヌクレアーゼＩ（シグマ社製）を含むＭＥＭ-Ｈａｎｋｓ培地（大日本製薬（株）製）で、３７℃、２時間懸濁した。懸濁液を１０００ｒｐｍで１５分間遠心後、上清を取り除き、ＥＲＤＦ培地（極東製薬（株）製）で３回洗浄後、１０％牛胎児血清（ギブコ社製、以下ＦＢＳと略記する）を含むＥＲＤＦ培地１０ｍｌで懸濁し、９６穴マイクロプレートに１穴あたり１００μｌづつ添加して、５％ＣＯ2、３７℃の条件で培養した。２日おきに培地交換をし続けたところ、約２週間後、１穴で無限に増殖する不死化細胞株を得た。本イヌ乳ガン細胞株の倍化時間は約２０時間であった。本細胞株をＦＣＢＲ１と名付けた。
【００２６】
実施例３
イヌＩＬ１８の調製
特開2000-78975の配列番号：１の、活性型イヌＩＬ１８タンパクをコードするＤＮＡ断片をｐＧＥＸ−５Ｘ（ファルマシアバイオテク社製）のＢａｍＨＩ切断部位に連結した。これを用いて常法に従い大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレート上に生育するコロニーのうち１５個を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢ培地中で８時間培養し、集めた菌体からプラスミドを抽出、精製後、定法に従い、大腸菌ＢＬ２１を形質転換した。得られた形質転換体のシングルコロニーを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地に植菌した。ＯＤ６００が約０．７になるまで３７℃で培養し、終濃度０．５ｍＭのイソプロピルーβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ファルマシアバイオテク社製）を加えて、さらに１．５時間培養した。培養液１．５ｍｌを１．５ｍｌのマイクロ遠心チューブに取り、１２０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を捨て、１．５ｍｌの１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）に懸濁し、氷上にてハンディーソニックを用いて菌体を破砕した。２００００ｒｐｍで３０分間遠心し、可溶性画分（上清）を得、０．２２μｍのフィルターでろ過滅菌後、イヌＩＬ１８が生産された溶液を得た。この画分をグルタチオンセファロースカラム（ファルマシア社製）にアプライした。その溶出画分をファルマシア社製のＦａｃｔｏｒ Ｘａを用いて切断し、さらに同じカラムにアプライした。カラムに結合しない活性型イヌＩＬ１８タンパクを含む画分を回収した。こうして精製された活性型イヌＩＬ１８タンパクはＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によると、純度が９５％以上であった。また、ワコー社のリムルステストキットを用いた解析によると、このタンパク１ｍｇ中にエンドトキシンは全く検出されなかった。
【００２７】
実施例４
イヌＩＬ１２の調製
特開平11-106350の配列番号：１、１１，２，１２に記載の、イヌＩＬ１２を構成する、Ｐ４０およびＰ３５サブユニットｃＤＮＡを  バキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＡＢ３（ファーミンジェン社製）のプロモーター下流の制限酵素ＸｂａＩおよびＳｍａＩ切断部位にそれぞれ常法に従って連結し、組換えトランスファーベクターを得た。さらにファーミンジェン社のバキュロウイルストランスフェクションキットを用いてその添付マニュアルに従って、組換えバキュロウイルスを作製した。
【００２８】
得られた組換えバキュロウイルスを、ファーミンジェン社のバキュロゴールドＰｒｏｔｅｉｎ−Ｆｒｅｅ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍで７５ｃｍ2のフラスコでコンフルエントまで平面培養したＳｆ２１細胞（Ｓｐｏｎｄｏｐｔｅｒａ  Ｆｌｕｇｉｐｅｒｄａ由来、ファーミンジェン社より入手）に感染させ、４日間培養した後、イヌＩＬ１２が生産された培養上清を得た。培養上清を、スルホプロピル担体（ファルマシアバイオテク社製）を充填したカラムにアプライした後、十分量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：７）でカラムを洗浄した。３５０〜５５０ｍＭのＮａＣｌで溶出した画分を、さらにブルーセファロース担体（ファルマシアバイオテク社製）を充填したカラムにそれぞれアプライし、十分量の２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ：７）でカラムを洗浄後、１．１〜１．２ＭのＮａＣｌで溶出した精製イヌＩＬ１２を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によると、イヌＩＬ１２の純度は、９５％以上であった。
【００２９】
実施例５  イヌガン細胞株におけるＦａｓＬ発現の検出
種々のイヌガン細胞株におけるイヌＦａｓＬの発現を、ＲＴ−ＰＣＲおよびサザンブロッティングによって調べた。
【００３０】
樹立したイヌ乳ガン細胞株ＦＣＢＲ１、イヌ上皮系腫瘍由来細胞株Ａ-７２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５４２）、イヌ骨芽肉腫由来細胞株Ｄ-１７（ＡＴＣＣ ＣＣＬ-１８３）、イヌ胸膜由来細胞株Ｃｆ２Ｔｈ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１４３０）およびイヌ腎由来細胞株ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ-３４）から、実施例１（１）に記載した方法により、ｍＲＮＡを抽出し、０．１μｇの各ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。各イヌ細胞株由来のｃＤＮＡを０．２ｍｌのマイクロ遠心チューブに２μｌづつ取り、実施例１（２）で得られたイヌＦａｓＬの遺伝子配列を元にして合成した、
５´ａｇｃｔｃｔｔｔｃａｔｃｔａｃａｇａａｇｇａｇｃｔｇｇｃｔｇ３´（配列番号：４）
と
５´ｇｃｔｔｇｔａａｃａａｇｇａａｃｃａｔａｔｇｇａｇａｇａａｔ３´（配列番号：５）
の２種のプライマーを各２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2 、２５ｍＭ  ＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌ  ゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、２単位  Ｅｘ  ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造（株）製）となるように各試薬を加え、全量２０μｌとし、ＤＮＡの変性条件を９４℃，３０秒、プライマーのアニーリング条件を６０℃、３０秒、プライマーの伸長条件を７２℃、１分の各条件でＭＪ  ＲＥＳＥＲＣＨ社のＰｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｒを用い、４０サイクル反応させた。これを１％アガロースゲルにて電気泳動後、アマシャム社のＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋に常法に従って転写した。Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋は、５×ＳＳＰＥ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ７．４），５×デンハルト溶液（０．１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン）、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、６５℃で２時間インキュベートし、実施例１（２）で得られた、５４０ｂｐのイヌＦａｓＬｃＤＮＡ断片に宝酒造（株）のＲａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて32Ｐで標識し作製したプローブ１×１０6ｃｐｍ／ｍｌとハイブリダイズした。６５℃で１晩インキュベートした後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋を０．２×ＳＳＣ（３０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中１５分、３回洗浄し、富士写真フィルム（株）の富士イメージングプレートに１２時間露出し、富士写真フィルム（株）のバイオイメージングアナライザーにて解析した。
【００３１】
また、各細胞におけるイヌβアクチンの発現を上記と同様にして解析した。なお、ＲＴ−ＰＣＲ用のプライマーは、
５´ａｔｇｇｃｃｇａｃａａｇｇｔｃｃｔｇａａｇｇａｃ３´（配列番号：６）と
５´ｔａｃａｔｔｇｃｃａｇｇｇａａｇａｇａｔａｇａａ３´（配列番号：７）を用いた。
その結果、イヌβアクチンについては、すべての細胞株で同等の発現が認められたのに対し、イヌＦａｓＬについては、ＦＣＢＲ１に強い発現が認められ、一方、その他のイヌ細胞株においては、弱い発現が認められた。従って、イヌＦａｓＬはイヌ乳ガンに特異的に発現していると推定された。
【００３２】
実施例６  イヌＩＬ１８およびイヌＩＬ１２のイヌ乳ガン細胞株に対するＦａｓＬ発現増強活性の測定
ＦａｓＬを発現している、イヌ乳ガン細胞株ＦＣＢＲ１に対するＩＬ１８およびＩＬ１２のＦａｓＬ発現増強活性を、実施例３および実施例４で調製した精製イヌＩＬ１８およびイヌＩＬ１２を用いて調べた。ＦＣＢＲ１の培養上清に、イヌＩＬ１２（１００ｎｇ／ｍｌ）、イヌＩＬ１８（１μｇ／ｍｌ）およびイヌＩＬ１２（１００ｎｇ／ｍｌ）とイヌＩＬ１８（１μｇ／ｍｌ）をそれぞれ添加し、６時間培養した。培養後、それぞれの細胞から実施例１と同様にしてｍＲＮＡを抽出し、０．１μｇの各ｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。さらに、実施例４と同様にして、イヌＦａｓＬおよびイヌβアクチンのＤＮＡを、ＰＣＲでそれぞれ２５および４０サイクル増幅し、１％アガロースゲルにて電気泳動後、定法に従い、エチジウムブロマイドで染色し、ＵＶ照射下で各ＤＮＡを検出した。その結果、イヌＦａｓＬｍＲＮＡは、イヌＩＬ１８の単独処理により発現増強され、イヌＩＬ１８とイヌＩＬ１２両方の処理により、その発現がさらに増強されていることが判明した。一方、イヌＩＬ１２の単独処理では発現増強が認められなかった。従ってＩＬ１８が、腫瘍細胞上のＦａｓＬの発現を増強する活性を有することが明らかになり、またＩＬ１２がＩＬ１８の本活性において相乗活性を有することが判明した。
【００３３】
実施例７  イヌＩＬ１８およびイヌＩＬ１２のイヌ腫瘍細胞株に対するアポトーシス誘導活性の測定
４８穴の細胞培養プレート（コーニング社製）に１穴あたり、１０5個のＦＣＢＲ１を接着させ、１穴あたり、０．５ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＥＲＤＦ培地を添加した。これに０μｇ、１０μｇ、１００μｇおよび１０００μｇのイヌＩＬ１８をそれぞれ添加し、５％ＣＯ2、３７℃の条件で２４時間培養した。培養後、細胞をトリプシンを用いてプレートから剥離し、ワコー（株）製のアポトーシスラダー検出キットを用いて、その添付マニュアルに従って、各ＤＮＡを抽出した。各々２０μｌのＤＮＡ溶液から４μｌづつを取り、それぞれ１μｌのｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（アポトーシスラダー検出キットに備え付け）を含む６μｌの滅菌蒸留水と混合し、アガロースゲル（アポトーシスラダー検出キットに備え付け）にアプライし、電気泳動した。泳動後のゲルを、１０μｌのＳＹＢＲTM  Ｇｒｅｅｎ Ｉ（ワコー（株）製）を含む１００ｍｌのＴＡＥバッファー中で、３０分間インキュベート後、ＵＶ照射によって各ＤＮＡを検出した。その結果、イヌＩＬ１８で処理されたＦＣＢＲ１のＤＮＡはすべて断片化を起こしていた。一方、イヌＩＬ１８未処理の細胞のＤＮＡにおいては、断片化が認められなかった。従って、イヌＩＬ１８はイヌ乳ガン細胞株ＦＣＢＲ１に作用して、アポトーシスを誘導する活性を有することが明らかになった。
【００３４】
次に、アポトーシス誘導における、イヌＩＬ１８とイヌＩＬ１２の相乗作用について検討した。２４穴の細胞培養プレート（コーニング社製）に１穴あたり、５×１０5個のＦＣＢＲ１を接着させ、１穴あたり、１ｍｌの１０％ＦＢＳを含むＥＲＤＦ培地を添加した。これに１μｇのイヌＩＬ１８、および１μｇのイヌＩＬ１８と１００ｎｇのイヌＩＬ１２をそれぞれ添加し、５％ＣＯ2、３７℃の条件で２４時間培養した。培養後、細胞をプレートから剥離し、生理食塩水で１回洗浄後、ＭＢＬ社製のｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｎｅで１５分間暗所で細胞を染色した。その後、各細胞をベクトンディッキンソン社製のＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ  ＳＥで解析し、アポトーシスを起こした細胞の核酸量を定量した。その結果、アポトーシスを起こした細胞の核酸量は、イヌＩＬ１８およびイヌＩＬ１２未処理細胞のものに比べ、イヌＩＬ１８を単独処理した細胞で約１０％、イヌＩＬ１８とイヌＩＬ１２両方を処理した細胞で約１５％増加していた。これらのことから、ＩＬ１８とＩＬ１２は相乗的に、乳ガン細胞に対してアポトーシスを誘導することが判明した。
【００３５】
実施例８  イヌＩＬ１８によるｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍活性の測定
イヌＩＬ１８のイヌ腫瘍細胞株に対するｉｎ ｖｉｖｏでの直接的抗腫瘍活性の有無を検討した。ＦＣＢＲ１を４週齢のスキットマウス（日本クレア社由来）の背部皮下に移植したところ、腫瘤を形成した４匹の担ガンマウスが作成できた。腫瘍重量を次の式にて算出した。
腫瘍重量＝長径 X 短径2／２
移植から２ヶ月後、腫瘍の大きさが平均３２ｍｍ X １９ｍｍ、腫瘍重量で５．８ｇになったところで、実施例３に記載の１０μｇの精製イヌＩＬ１８を２日間隔で２回、尾静脈より投与した。また同時にコントロールとして生理食塩水を１匹のマウスに投与した。コントロールのマウスの腫瘍重量は投与後さらに増加し、投与後１０日目には１．３倍になった。一方、イヌＩＬ１８を投与したマウスの腫瘍重量は投与後減少し、コントロールを１とした相対腫瘍重量で０．０５から０．１になった。イヌＩＬ１８のこの腫瘍退縮効果は抗マウスインターフェロンγ抗体と抗アシアロＧＭ１抗体の同時投与によって阻害されなかった。イヌＩＬ１８はｉｎ ｖｉｖｏにおいてもイヌ腫瘍細胞に対して抗腫瘍活性を示すことが判明した。
【００３６】
実施例９
イヌＩＬ１８製剤の製造
実施例４で得られた精製イヌＩＬ１８溶液に、注射用生理食塩水、注射用低分子ゼラチン（新田ゼラチン（株））を加えて、ゼラチンの終濃度０．５％に調製した。さらに、ポジダイン（ポール（株））で処理してパイロジェンを除去した後、２５０℃で２時間乾熱滅菌したガラスバイアルに１ｍｌづつ分注した。その後、無菌的に凍結乾燥することによって、１バイアル中に１μｇから１０μｇのイヌＩＬ１８を含むイヌＩＬ１８製剤を得た。このイヌＩＬ１８製剤は、室温条件下で安定であり、また、蒸留水または生理食塩水によって良好に溶解した。
【００３７】
実施例１０  担癌イヌに対するイヌＩＬ１８の抗腫瘍効果
表皮に腫瘤を持つ患犬、計５頭に対してイヌＩＬ１８製剤を局所注射投与した。どの患犬にもさまざまな大きさの腫瘤が複数個存在していた。腫瘤１個につき、１μｇのイヌＩＬ１８を１ー２日間隔で３ー１０回、腫瘍局所に直接、注射投与した。その結果、イヌＩＬ１８製剤を投与した腫瘤の８割が完全に消失し、残りの腫瘤も全て半分以下に縮小した。消失した腫瘍は、以後６ヵ月間観察したが、再発は全くみられなかった。
【００３８】
【発明の効果】
本発明によれば、ガン細胞上のガン抑制因子を発現増強することができる。また、イヌのガン治療に有効なイヌガン抑制因子を提供できる。さらに、ウシ、ブタ、ネコの生体に発生したガンを抑制する方法を提供できる。
【００３９】
参考文献
１．Ｎａｇａｔａ：Ｃｅｌｌ ８８，３５５−３６５（１９９７）．
２．Ｎａｇａｔａら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７，１４４９−１４５５（１９９５）．３．Ｏｋａｍｕｒａら：Ｎａｔｕｒｅ  ３７８，８８−９１（１９９５）．
４．Ｍｉｃａｌｌｅｆら：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６，１６４７−１５１（１９９６）
５．Ｎｉｅｈａｎｓら：Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７，１００７−１０１２（１９９７）．
６．Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら：Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４，１０５７−１０８２（１９９６）．
７．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８，５２９４（１９７９）．
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９．Ｇｕｂｌｅｒら：Ｇｅｎｅ  ２５，２３６−２６９（１９８３）．
１０．Ｏｋａｙａｍａら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１６１，（１９８２）  ＆  ３，２８０，（１９８３）．
【００４０】
【配列表】
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