(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
滑膜細胞への目的の核酸のインビトロ送達方法であって、
該目的の核酸および血清型１１、１６、３５または５１のアデノウイルスの線維タンパク質を含む組換えＣ亜群アデノウイルスであって、該Ｃ亜群アデノウイルス由来のカプシドタンパク質が非線維カプシドタンパク質である組換えＣ亜群アデノウイルスを提供する工程、および
該滑膜細胞に該組換えアデノウイルスを感染させる工程
を含む方法。
【請求項２】
前記Ｃ亜群アデノウイルスが血清型５のアデノウイルスである請求項１記載の方法。
【請求項３】
関節リウマチ、強直性脊椎炎または若年性慢性関節炎を治療するための医薬の製造におけるＣ亜群由来の組換えアデノウイルスベクターの使用であって、該組換えアデノウイルスベクターが、血清型１１、１６、３５または５１のアデノウイルスから選択されるＢ亜群のアデノウイルスの線維タンパク質を含むカプシドを含む使用。
【請求項４】
前記Ｃ亜群アデノウイルスが血清型５のアデノウイルスである請求項３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は組換えＤＮＡ技術の分野に属する。より特定すると、本発明は線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞、好ましくは滑膜細胞に核酸を移入するための新しい手段と方法に関する。本発明はさらに、例えば慢性関節リウマチの治療のために、少なくとも線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞、好ましくは滑膜細胞に核酸を移入することによって疾患を治療するための手段と方法に関する。
【０００２】
外来性の遺伝物質を線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞、特に滑膜細胞に効率よく送達することは、達成することが難しい目標であることが証明されてきた。一般に、外来性遺伝物質を細胞に送達する上で非常に効果的な、現在開発されているウイルスベクターでさえも、線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞に外来性遺伝物質を供給することは困難であった。これらの細胞、特に滑膜細胞の形質導入が相対的に非効率的であることは、これらの細胞への核酸移入に基づく治療アプローチの開発の妨げとなってきた。
【０００３】
例えば滑膜細胞への核酸の送達が非効率的であることの結果として、これらの細胞に関わる核酸移入に基づいた治療アプローチは、低い形質導入効率が少なくとも部分的に許容されうる戦略に集中してきた。例えばいわゆる付随的（bystander）効果、すなわち形質導入細胞の付近の非形質導入細胞の機能に影響を及ぼす形質導入細胞における発現、を有するタンパク質をコードする核酸の送達によるものである。付随的効果を有するタンパク質の非制限的な例は、例えばガンシクロビルの存在下で毒性代謝産物の生産を導く単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）発現のような、排出因子（excreted factors）および／または自殺遺伝子の発現である。単純ヘルペスウイルスのＴＫ遺伝子は、比較的毒性の低い抗ウイルス薬、ガンシクロビル（ＧＣＶ）を一リン酸産物へと代謝することができるタンパク質をコードする。その後の哺乳類キナーゼによるリン酸化の結果、おそらくアポトーシスを通して、ＤＮＡ−ポリメラーゼを阻害し細胞を死滅させる、三リン酸化されたヌクレオシド類似体（ＧＣＶ−ＰＰＰ）を生じる（Vincent et al., １９９６）。
【０００４】
付随的効果の使用は、線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞の効率的な形質導入の必要条件を実際にある程度低下させうるが、それにもかかわらず経済的な理由および安全性の理由から、遺伝物質を移入するさらに効率的な方法が依然として望まれる。安全性の局面には、例えばＨＳＶ−ＴＫに基づく細胞死の毒性に対する肝細胞の相対的感受性が含まれる。肝細胞以外の細胞がＨＳＫ−ＴＫによる自殺の標的個体群を形成するときには、肝細胞の形質導入をできるかぎり防がなければならない。例えば核酸送達媒体が送達部位から血流中に漏出し、肝へと移送されることを通して、意図しない肝細胞形質導入が起こりうる。この漏出は、特に使用する核酸送達媒体の量に依存する。すなわち例えば滑膜細胞が標的細胞であるとき、所望するレベルの形質導入を得るためには一定量の核酸送達媒体が必要となる。使用する核酸送達媒体の量が少ないほど、核酸送達媒体の漏出の問題も少なくなる。
【０００５】
線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞への核酸移入が有益である非制限的な例は、慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎および若年性慢性関節炎のような慢性びらん性関節疾患である。これらの疾患における核酸移入のための好ましい標的細胞は滑膜細胞である。しかし、現在の方法ではそのような細胞の形質導入の効率は、所望するレベルにはるかに及ばない。
【０００６】
可動関節の可動関節部においては、骨の末端をおおう関節軟骨の独特の高分子構造によってなめらかな骨の連結が確保されている。関節軟骨は関節腔という腔所内で互いに向かい合って動き、関節腔は滑膜として知られる組織によって裏打ちされている。滑膜は、マクロファージ様のＡ型細胞と線維芽細胞様のＢ型細胞から成り、その下には、解剖学的局在によると、事実上線維性、脂肪性または輪紋状でありうる細胞性滑膜下膜（subsynovium）がまばらに存在する。線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）は、異なる遺伝子発現パターンによって内膜下滑膜中の通常の線維芽細胞と識別できる。ＦＬＳは、高レベルのウリジンジホスホグルコースデヒドロゲナーゼ（ＵＤＰＧＤ）、高レベルの血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）ならびにＣＤ４４（ヒアルロン酸受容体）、フィブロネクチン受容体およびβ3−インテグリンを発現することが示されている。他のソースからの内層線維芽細胞または線維芽細胞はこれらのマーカーを全く発現しないかまたはより低いレベルでしか発現しない（J.C.W.Edwardsによる総説、１９９５；G.S.Firestein, １９９６）。
【０００７】
慢性関節リウマチは、滑膜の大量の過形成および滑膜組織内とその周囲における炎症性細胞（リンパ球、マクロファージおよびマスト細胞）の存在を特徴とする。ＦＬＳとＡ型マクロファージ様細胞の両方が、この疾患の破壊的局面に重要な役割を果たす。Ａ型細胞は、正常内膜および増殖性ＲＡ組織中の細胞の大半を構成する。高度に侵襲性のＦＬＳは、未熟な腫瘍様線維芽細胞に関連する組織学的特徴を通常示す（Qu et al., １９９４；Firestein, １９９６）。これらの滑膜細胞の増殖は、軟骨に侵入して過剰成長し、骨の破壊をもたらすパンヌス組織へと導く（Zvaifler and Firestein, １９９４）。罹患した滑膜の除去は、炎症を低下させ、隣接する構造中で増殖するパンヌスの破壊を防ぐことにより有益である（Thompson et al,. １９７３）。すべての関節部に適しており、むしろ増殖する細胞に特異的な、簡単で非破壊的な局所処置によるこの増殖性パンヌス組織の特異的除去は、ＲＡにとって貴重な治療である（Nakamura et al., １９９７；Cruz−Esteban and Wilke, １９９５）。
【０００８】
遺伝子治療は慢性関節リウマチ（ＲＡ）のための有望な治療方式である。リウマチ様滑膜組織への核酸移入は、炎症または過形成を抑制するメディエイターの生産、または滑膜を特異的に破壊する毒性物質を生じうる。ヒトにおける最初の臨床治験は、炎症を抑えるための、ＩＬ１−ＲＡによる滑膜細胞のエクスビボ（ex-vivo）形質導入に基づくものであった（Evans, １９９６）。
【０００９】
本発明はアデノウイルスベクターの操作の際に為されたものである。それ故、下記の章ではアデノウイルスについて論じる。
【００１０】
アデノウイルス
アデノウイルスは約３６０００塩基対の線状二本鎖ＤＮＡ分子を含む。それには、血清型に依存する正確な長さを持った約９０〜１４０塩基対の同一の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が含まれる。ウイルスの複製起点は正確にゲノム末端のＩＴＲ内にある。転写ユニットは早期領域と後期領域に分けられる。感染直後にＥ１ＡとＥ１Ｂタンパク質が発現され、細胞およびアデノウイルス遺伝子の相互活性化において機能する。早期領域であるＥ２ＡとＥ２Ｂは、アデノウイルスゲノムの複製に必要なタンパク質（ＤＮＡ結合タンパク質、プレ末端（pre-terminal）タンパク質およびポリメラーゼ）をコードする（van der Vliet, １９９５における総説）。早期領域Ｅ４は、多面発現機能、例えばＥ２早期プロモーターの相互活性化、感染の後期におけるウイルスｍＲＮＡの輸送と集積の促進、および主動後期プレｍＲＮＡの核安定性の増大のような機能を有するいくつかの蛋白をコードする（Leppard, １９９７における総説）。早期領域３は、宿主の免疫応答の転形（modulation）に関与するタンパク質をコードする（Wold et al., １９９５）。後期領域は１つの単一プロモーター（主動後期プロモーター）から転写され、ＤＮＡ複製の開始時に活性化される。複雑なスプライシングとポリアデニル化機序が、コアタンパク質、カプシドタンパク質（ペントン、ヘキソン、線維および関連タンパク質）、ウイルスプロテアーゼ、およびカプシドの構築と宿主タンパク質翻訳の停止に必要なタンパク質をコードする１２以上のＲＮＡ種を生じさせる（Imperiale, M. J., Akusjnarvi, G. and Leppard, K. N.（１９９５）アデノウイルス遺伝子発現の転写後制御。「アデノウイルスＩの分子レパートリー」より。ｐ．１３９−１７１．W. Doerfler and P. Bohm(eds), Springer−Verlag Berlin Heidelberg）。
【００１１】
ウイルスと宿主細胞間の相互作用
ウイルスと宿主細胞の相互作用は、主として血清型ＣのウイルスＡｄ２およびＡｄ５に関して検討されてきた。結合は、突出した線維のノブ（knob）領域と細胞受容体との相互作用を通して起こる。Ａｄ２とＡｄ５、そしておそらくより多くのアデノウイルスに対する受容体が、「コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体」またはＣＡＲタンパク質として知られている（Bergelson et al., １９９７）。インターナリゼーションは、ペントンベース中に存在するＲＧＤ配列と細胞インテグリンとの相互作用を通して媒介される（Wickham et al., １９９３）。これはすべての血清型に当てはまるわけではなく、例えば血清型４０と４１は、それらのペントンベース配列中にＲＧＤ配列を含まない（Kidd et al., １９９３）。
【００１２】
線維タンパク質
感染が成功するための最初の段階は、アデノウイルスがその標的細胞に結合するという、線維タンパク質を通して媒介されるプロセスである。線維タンパク質は、ウイルス血清型に依存して異なる長さをもつ（Signas et al., １９８５；Kidd et al., １９９３）三量体構造を有している（Stouten et al., １９９２）。異なる血清型は、構造的に類似したＮおよびＣ末端をもつが、中央幹領域が異なるポリペプチドを有している。Ｎ末端の最初の３０個のアミノ酸が、ペントンベース（Chroboczek et al., １９９５）、特に尾部中の保存されたＦＮＰＶＹＰ領域に線維を固定する（Arnberg et al., １９９７）ことに関与する。Ｃ末端またはノブは、細胞アデノウイルス受容体との初期相互作用の役割を担う。この初期結合後、カプシドペントンベースと細胞表面インテグリンとの間の二次的結合が、被覆小窩中のウイルス粒子のインターナリゼーションとエンドサイトーシスを導く（Morgan et al., １９６９；Svensson and Persson,１９８４；Varga et al., １９９１；Greber et al., １９９３；Wickham et al., １９９３）。インテグリンは、少なくとも１４個のαサブユニットと８個のβサブユニットが同定されている、αβ−ヘテロ二量体である（Hynes, １９９２）。細胞において発現されるインテグリンの配置（array）は複雑で、細胞型と細胞環境によって異なる。ノブは血清型によっていくつかの保存領域を含むが、ノブタンパク質は高い度合の変異性を示し、様々なアデノウイルス受容体が存在することを示唆する。
【００１３】
アデノウイルス血清型
現在、ヒトアデノウイルスの６つの異なる亜群が提示されており、全体で約５０の異なるアデノウイルス血清型を包含する。これらのヒトアデノウイルスに加えて、多くの動物アデノウイルスが同定されている（例えばIshibashi and Yasue, １９８４参照）。血清型は、動物の抗血清（ウマ、ウサギ）による定量的中和によって測定したときの免疫学的差異に基づいて定義される。中和が２つのウイルス間である程度の交叉反応性を示せば、血清型の差異は、Ａ）血球凝集反応阻害に関する交叉反応がないことによって示されるように、血球凝集素が無関係であるかどうか、またはＢ）ＤＮＡの実質的な生物物理的／生化学的相違が存在するかどうか、であると仮定される（Francki et al., １９９１）。最後に同定された血清型（４２〜４９）は、ＨＩＶ感染患者から初めて単離されたものであった（Hierholzer et al., １９８８；Schnurr et al., １９９３）。充分には理解されていない理由から、そのような免疫無防備状態の患者の大部分が、免疫応答性の個人からは一度も単離されたことのないアデノウイルスを放出した（Hierholzer et al., １９８８，１９９２；Khoo et al., １９９５）。
【００１４】
異なるアデノウイルス血清型の中和抗体に対する感受性の相違に加えて、Ａｄ２およびＡｄ５のようなＣ亜群のアデノウイルスは、Ａｄ３やＡｄ７のようなＢ亜群由来のアデノウイルスと比較して、異なる受容体に結合する（Defer et al., １９９０；Gall et al., １９９６）。同様に、Ａｄ３ノブタンパク質をＡｄ５ノブタンパク質と交換することによって、またその逆によって、受容体特異性が変化しうることが明らかにされた（Krasnykh et al., １９９６；Stevenson et al., １９９５，１９９７）。血清型２、４、５および７はすべて、肺上皮および他の呼吸組織に対して天然の併合性（affiliation）をもつ。これに対し、血清型４０と４１は胃腸管に対して天然の併合性をもつ。これらの血清型は、少なくともカプシドタンパク質（ペントンベース、ヘキソン）、細胞結合の役割を担うタンパク質（線維タンパク質）、およびアデノウイルスの複製に関与するタンパク質において異なる。カプシドタンパク質が血清型間で認められる親和性の差をどの程度まで決定するかは不明である。おそらく感染後の機序がアデノウイルスの細胞型特異性を決定するのであろう。血清型Ａ（Ａｄ１２とＡｄ３１）、Ｃ（Ａｄ２とＡｄ５）、Ｄ（Ａｄ９とＡｄ１５）、Ｅ（Ａｄ４）およびＦ（Ａｄ４１）由来のアデノウイルスはすべて、ニトロセルロースに固定したとき、標識した可溶性ＣＡＲ（ｓＣＡＲ）タンパク質に結合しうることが示されている。さらに、高いレベルのＣＡＲを発現するがインテグリンを欠くラモス細胞（Ramos cells）（Roelvink et al., １９９６）への、これらの血清型由来アデノウイルスの結合は、感染の前にウイルスにｓＣＡＲを加えることによって効率よく遮断することができる（Roelvink et al., １９９８）。しかし、これらの亜群の（少なくとも一部の）成員がＣＡＲに結合しうるという事実は、これらのウイルスが種々の細胞型において異なる感染効率をもつことを排除するものではない。例えばＤ亜群血清型は、ＡおよびＣ亜群ウイルスに比べて比較的短い線維シャフト（shaft）を有する。Ｄ亜群ウイルスの親和性は主としてペントンベースのインテグリンへの結合によって決定されると主張されてきた（Roelvink et al., １９９６；Roelvink et al., １９９８）。もうひとつの例は、ヒト線毛気道上皮（ＣＡＥ）の感染に関して１４の異なる血清型を試験し、血清型１７（Ｄ亜群）がＤ亜群の他の成員を含めて他のすべてのウイルスよりも効率的に結合され、インターナリゼーションされることを認めた、１９９８年におけるザブナー（Zabner）らによって提供される。始原胎児ラット細胞におけるＡ〜Ｆ亜群由来の血清型を用いた同様の実験は、ＡおよびＢ亜群由来のアデノウイルスは非効率的であり、Ｄ亜群由来のウイルスが最も効率的であることを示した（Law et al., １９９８）。またこの場合に、１つの亜群内のウイルスが異なる効率を示した。ＣＡＥにおけるＡｄ１７の改善された感染に対する線維結合の重要性が、アーメンタノ（Armentano）ら（ＷＯ  ９８／２２６０９）によって示された。アーメンタノらは、Ａｄ１７由来の線維遺伝子を有した組換えＬａｃＺ  Ａｄ２ウイルスを作製し、キメラウイルスがＡｄ２線維を有するＬａｃＺ  Ａｄ２ウイルスよりも効率的にＣＡＥに感染することを明らかにした。
【００１５】
従って、ＣＡＲに結合する能力を共有するにもかかわらず、線維の長さ、ノブ（knob）配列およびペントンベースのような他のカプシドタンパク質の相違が、アデノウイルスが特定の標的細胞に感染する効率を決定すると考えられる。興味深いことに、Ａｄ５とＡｄ２線維はフィブロネクチンＩＩＩおよびＭＨＣクラス１  α２誘導ペプチドに結合するが、Ａｄ３線維は結合しない。これは、アデノウイルスがＣＡＲ以外の細胞受容体を使用できることを示唆する（Hong et al., １９９７）。血清型４０と４１（Ｆ亜群）はシャフトの長さが異なる２つの線維タンパク質を運搬することが知られている。シャフトが長い４１Ｌ線維はＣＡＲに結合することが示されており、短いシャフトの４１ＳはＣＡＲに結合することができない（Roelvink et al., １９９８）。短い線維に対する受容体は不明である。
【００１６】
アデノウイルス核酸送達ベクター
遺伝子治療において現在使用されている大部分のアデノウイルス核酸送達ベクターは、Ｃ亜群アデノウイルスＡｄ２またはＡｄ５から誘導される。ベクターはＥ１領域に欠失を有しており、そこに新しい遺伝情報を導入することができる。Ｅ１の欠失は組換えウイルス複製に欠損を生じさせる。組換えアデノウイルス、特に血清型５は、動物モデルでの肝、気道上皮および充実性腫瘍（solid tumours）、ならびに免疫欠損マウスにおけるヒト異種移植片へのイン  ビボ（in vivo）での遺伝子の効率的な移入に適することが広汎に証明されている（Bout, １９９６、１９９７；Blaese et al., １９９５）。
【００１７】
アデノウイルスに由来する核酸移入ベクター（アデノウイルスベクター）は、それらを核酸移入のために特に有用なものにする多くの特徴を備えている：
１）アデノウイルスの生物学は充分に特性付けられている、
２）アデノウイルスは重篤なヒトの疾病に結びつかない、
３）アデノウイルスはそのＤＮＡを宿主細胞に導入する上で極めて効率的である、
４）アデノウイルスは広範囲の細胞に感染することができ、広い宿主域をもつ、
５）アデノウイルスは大量に高い力価で生産することができる、
６）そして、アデノウイルスはウイルスゲノムの早期領域１（Ｅ１）の欠失によって複製に欠損をもたらすことができる（Brody and Crystal, １９９４）。
【００１８】
しかし、アデノウイルスベクターの使用に関連したまだ多くの欠点がある：
１）アデノウイルス、特に充分に検討されている血清型であるＡｄ２およびＡｄ５は、通常、それらが導入された宿主による免疫応答を誘発する、
２）現在のところ、ウイルスを特定の細胞および組織に向けることが不可能である、
３）一部の細胞型は、現行の世代のアデノウイルスベクターによっては容易に形質導入されない、
４）血清型Ａｄ２またはＡｄ５は、肝臓以外の器官に付加的な遺伝物質を送達する上で理想的に適しているわけではない。肝臓は、Ａｄ２またはＡｄ５に由来するベクターによって特に良好に形質導入されることができる。血流を通してこれらのベクターを投与すると、肝臓の細胞へのベクターの充分な送達が導かれる。肝細胞以外の細胞型を形質導入する必要がある治療においては、肝細胞によるベクターの取込みを防ぐために肝臓を除外する何らかの手段を講じなければならならい。現在の方法は肝細胞からのベクターの物理的な分離に頼っており、これらの方法の大部分が、手術、バルーン血管形成術、または例えば針を通しての器官内もしくは骨構造への直接注入によって、ベクターおよび／または標的器官を限局することに基づいている。肝臓の除外はまた、実質的に血流から分離された体内の区画（compartment）にベクターを送達し、それによって肝へのベクターの移入を防ぐことを通しても実施されている。これらの方法は主として肝臓へのベクターの大量の送達は避けることができるが、大部分の方法がまだ未完成であり、かなりの漏出があったり、および／または標的組織への浸透特性が低かったりする。一部の場合には、肝細胞へのベクターの不慮の送達が患者に毒性を及ぼすこともある。例えば、ガンシクロビルの投与を通して分裂する癌細胞を死滅させるために、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子を送達することは、同様にかなりの量の肝細胞がそのベクターによって形質導入されるときには、危険を伴わないわけではない。肝細胞へのＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の相当量の送達およびその後の発現は、重大な毒性に結びつく。それ故、肝細胞への形質導入効率が低いという特性を備えた本質的に安全なベクターが別個に必要とされる。
【００１９】
本発明は、線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞、好ましくは滑膜細胞への遺伝物質の導入のための新規手段を提供する。本発明はさらに、肝細胞への核酸の送達を少なくとも部分的に予防するための手段と方法を提供する。本発明はさらに、滑膜細胞に核酸を少なくとも一部は特異的に移入することによって疾患を治療するための手段と方法を提供する。
【００２０】
核酸送達媒体の限界を少なくとも部分的に克服するための材料と方法を提供することが本発明の目的である。
【００２１】
１つの態様では、本発明は、全部または一部がＡｄ５とは異なる血清型に由来する新しいアデノウイルスを提供する。好ましい特性を備えた血清型の特定遺伝子をキメラベクターに結合して、特定適用によりよく適したベクターを生成することができる。好ましい特性とは、特定標的細胞の改善された感染、非標的細胞の低い感染、ウイルスの改善された安定性、抗原提示細胞（ＡＰＣ）への低い取込み、またはＡＰＣへの高い取込み、標的細胞への低い毒性、ヒトもしくは動物における低い中和、ヒトもしくは動物における低いまたは高いＣＴＬ応答、より良好なおよび／もしくは持続的な導入遺伝子の発現、組織内への高い浸透能力、パッケージング細胞系における改善された収率、などを含むがこれらに限定されない。
【００２２】
本発明の１つの態様は、一部のアデノウイルスの低い免疫原性と他のアデノウイルスの特性との組合せを容易にする。そのようなアデノウイルスは、遺伝子治療のアプローチにとって好ましいと考えられる。そのような特性は、特定宿主細胞に対する高い特異性、特定細胞に対する良好な複製機構、特定宿主細胞における高い感染率、非標的細胞における低い感染効率、ＡＰＣ感染の高いまたは低い効率、などであろう。
【００２３】
それ故本発明は、異なる血清型の少なくとも２つのアデノウイルスの有用な特性を有するキメラアデノウイルスを提供しうる。代表的には、遺伝物質を宿主細胞に効率よく移入することができるアデノウイルスを得るためには、前記の非網羅的リストの中から２またはそれ以上の必要条件が求められる。したがって、１つの態様では、本発明は、異なるアデノウイルス血清型由来の異なるアデノウイルス遺伝子を必要な部位に挿入するためのカセットとして使用できるアデノウイルス由来ベクターを提供する。このようにしてキメラアデノウイルスを生産することができるベクターが得られ、もちろんそれによって目的の遺伝子も挿入することができる（例えばもとのアデノウイルスのＥ１部位に）。このようにして、生成されるキメラアデノウイルスを、特定疾患のための遺伝子治療を必要とする特定宿主の必要条件と要求に適合させることができる。このウイルスの生成を可能にするには、一般に、充分な量の安全なキメラアデノウイルスを生産するためのパッケージング細胞が必要であろう。
【００２４】
１つの態様では、本発明は、Ｂ亜群、特に血清型１１、１６、３５および／または５１由来アデノウイルスの線維タンパク質の少なくとも一部を含むアデノウイルスベクターを提供する。該線維タンパク質は、アデノウイルスベクターの天然線維タンパク質であってもよく、または当該アデノウイルスベクターが基づく血清型に由来してもよい。後者の場合には、本発明に従ったアデノウイルスベクターは、少なくとも受容体結合配列を含む、Ｂ亜群アデノウイルスに由来する線維タンパク質の少なくとも一部を示すキメラアデノウイルスである。代表的にはそのようなウイルスは、ベクター（代表的にはプラスミド、コスミドまたはバキュロウイルスベクター）を用いて生成される。そのようなベクターも本発明の対象である。好ましいベクターは、治療する宿主および治療する疾患に特異的に適合するキメラ組換えウイルスを作製するために使用できるベクターである。
【００２５】
本発明はまた、アデノウイルス５型に基づくが、アデノウイルス１６型由来の線維配列の少なくとも一部を有しており、それによってＡｄ１６の線維の一部が宿主細胞の結合にかかわる線維タンパク質の一部を少なくとも含む、キメラアデノウイルスを提供する。
【００２６】
本発明はまた、特定宿主細胞、例えば線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞、好ましくはヒトもしくは動物由来の滑膜細胞を含むがこれらに限定されない宿主細胞において、他の亜群由来のアデノウイルスに比べて改善された感染を示すキメラアデノウイルスベクターを提供する。本発明の一部の重要な特徴は、キメラウイルスを生成するための手段である。代表的には、複製コンピテントアデノウイルスを含むアデノウイルスバッチ（batch）を宿主細胞に投与することは望ましくない。それ故一般に、キメラウイルスをコードするベクター上のアデノウイルスゲノムからいくつかの遺伝子（ただし少なくとも１個）を省くこと、およびキメラアデノウイルスを生産するためにベクターが導入されている細胞のゲノムにこれらの遺伝子を供給することが望ましい。そのような細胞は、通常、パッケージング細胞と呼ばれる。それ故本発明はまた、本発明に従ったアデノウイルスベクター上には存在しないアデノウイルスの生産に必要なすべての要素をトランスで（in trans）含む、本発明に従ったキメラアデノウイルスを生産するためのパッケージング細胞を提供する。代表的にはベクターとパッケージング細胞は、必要な要素をすべて有するが、組換えによって複製コンピテントウイルスを導く共通部分要素を有さないという点で互いに適合していなければならない。それ故本発明はまた、本発明に従ったパッケージング細胞および本発明に従った組換えベクターを含む部品のキットを提供する。それによって、当該細胞と当該ベクターの間で複製コンピテントアデノウイルスの生産をもたらす組換えを導く配列共通部分は、実質的に存在しない。
【００２７】
特定の適用については、例えば治療が腫瘍細胞の根絶を目指すときには、本発明に従ったアデノウイルスベクターは複製コンピテントであってもよく、または特定条件下で、例えば腫瘍細胞のような特定細胞型において複製することができるものでもよい。
【００２８】
より多くの遺伝子、または同じもしくは他の血清型由来のこれらの遺伝子の機能的部分を、対応する天然配列を置換してアデノウイルスベクターに挿入することは、本発明の範囲内である。すなわち、例えば他の血清型の対応する配列を有する線維配列（の機能的部分）の置換は、例えば当該血清型または他の異なる血清型の対応する配列を有するペントンベースまたはヘキソンのような他のカプシド遺伝子（の機能的部分）の置換と組み合わせることができる。該遺伝子に限定されない他の組合せが可能であり、本発明の範囲内であることは当業者には明白である。本発明に従ったキメラアデノウイルスベクターは、少なくとも２つの異なる血清型から作製しうる。これは、標的細胞の改善された感染および／または非標的細胞のより低い感染、ウイルスの改善された安定性、ヒトもしくは動物における低い免疫原性（例えばＡＰＣへの低い取込み、宿主における低い中和および／または低い細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答）、組織内への高い浸透性、導入遺伝子発現のより良好な持続性、などのような好ましい特性を備えたベクターを提供することができる。この態様では、大部分の宿主において中和抗体の不在または低い量の中和抗体の存在によって定義される、より低い免疫原性の血清型由来のカプシド遺伝子、例えばペントンおよび／またはヘキソン遺伝子、を使用することが好ましい。また、標的細胞において改善された結合とインターナリゼーションを示す血清型由来の線維および／またはペントン配列を用いることが好ましい。さらに、標的細胞においてアデノウイルス遺伝子の発現を導く遺伝子が、ウイルスベクターから欠失していることが好ましい。この態様では、すべてのアデノウイルス遺伝子が欠失しているベクターも好ましい。さらに、標的細胞において目的遺伝子を発現へと推進するプロモーターが、細胞型特異的プロモーターであることが好ましい。
【００２９】
ウイルスベクターを厳密に適合させ、任意に所望する特性を備えたキメラウイルスを提供することができるためには、アデノウイルス遺伝子のライブラリーを提供することが好ましく、それによって交換する遺伝子をプラスミドまたはコスミドベースのアデノウイルス構築物上に位置付け、それによって交換する遺伝子または配列を制限部位に隣接させることが好ましい。好ましい遺伝子または配列は、ライブラリーから選択され、ウイルスを産生するために使用するアデノウイルス構築物に挿入されることができる。代表的には、そのような方法は、多くの制限とライゲーション段階およびパッケージング細胞のトランスフェクションを含む。アデノウイルスベクターは１片で、または２もしくはそれ以上の共通部分のある断片としてトランスフェクトすることができ、それによって相同組換えによりウイルスを産生する。例えばアデノウイルスベクターは、例えばＥ１領域における目的遺伝子の挿入または置換のために、ペントンおよび／もしくはヘキソン配列における挿入または置換のために、ならびに線維配列への挿入または置換のために、２またはそれ以上の共通部分のある配列から構築することができる。１つの態様では、本発明は、本発明に従った所望の挿入部位を有する１またはそれ以上のベクターを提供すること、所望する宿主域を有するアデノウイルス血清型に由来する線維タンパク質の少なくとも機能的部分を該ベクターに挿入することおよび／または比較的低い抗原性を有するアデノウイルス血清型に由来するカプシドタンパク質の機能的部分を挿入すること、ならびに該ベクターを本発明に従ったパッケージング細胞にトランスフェクトして、キメラウイルス粒子を産生させることを含む、所望の宿主域や低い抗原性のような１またはそれ以上の所望の特性を有するキメラアデノウイルスを生産するための方法を提供する。もちろん、異なる細胞型から生じる他のウイルス遺伝子の他の組合せも、本明細書中で前に開示したように、挿入することができる。Ｅ１領域における目的遺伝子の挿入または置換に加えて１つだけ非天然配列を有するキメラウイルスも本発明の範囲内である。
【００３０】
代表的に起こるアデノウイルスに対しての免疫原性応答は、宿主による中和抗体の生産である。これが、代表的に、より低い免疫原性の血清型のペントン、ヘキソンおよび／または線維のようなカプシドタンパク質を選択する理由である。
【００３１】
もちろん、異なる血清型由来の完全なタンパク質を有するキメラアデノウイルスを作製することは必ずしも必要ではない。キメラタンパク質を生成することは充分に当該技術の範囲内である。例えば線維タンパク質の場合には、１つの血清型のベースと、別の血清型由来のシャフトおよびノブを有することは充分に可能である。このようにして、ウイルス粒子の会合に役割を担うタンパク質の部分を１つの血清型から生じさせ、それによって完全なウイルス粒子の生産を増強することが可能になる。それ故本発明はまた、ヘキソン、ペントン、線維および／または他のカプシドタンパク質が異なるアデノウイルス血清型から生じるキメラタンパク質である、本発明に従ったキメラアデノウイルスを提供する。野生型カプシド（タンパク質）遺伝子などの全体またはその一部を交換することによってキメラアデノウイルスを作製することに加えて、非アデノウイルス配列、または点突然変異、欠失、挿入などのような突然変異を担うカプシド（タンパク質）遺伝子などを挿入することも本発明の範囲内である。そのようなキメラアデノウイルスは、温度安定性、会合、固定（anchoring）、転嫁感染（redirected infection）、免疫応答の変化などのような好ましい特性に関して、容易にスクリーニングすることができる。やはり他のキメラ組合せも生成することができ、本発明の範囲内である。
【００３２】
遺伝子治療のために一般的に用いられる血清型の組換えアデノウイルスのイン  ビボでの全身送達の際に、ウイルスの９０％以上が肝臓で捕捉されることがマウスとラットにおいて明らかにされた（Herz et al., １９９３；Kass−Eisler et al., １９９４；Huard et al., １９９５）。ヒト肝細胞がアデノウイルス血清型５のベクターによって効率的に形質導入されることも知られている（Castell, J.V., Hernandez, D., Gomez−Foix, A.M., Guillen, I, Donato, T. and Gomez−Lechon, M.J.（１９９７）、アデノウイルスが媒介するヒト肝細胞への遺伝子移入：形質導入細胞の生化学的機能性の分析、Gene Ther.4(5), p455−464）。そのため、Ａｄ２またはＡｄ５ベースのベクターの全身送達によるイン  ビボ遺伝子治療は、望ましくない毒性と標的細胞の形質導入のために使用できるウイルスの減少を導く、肝臓におけるウイルスの効率的な取込みによって著しく妨げられる。それ故、イン  ビボで他の器官に向けることができるアデノウイルス血清型５の宿主細胞域の変更は、本発明の重要な目的である。
【００３３】
組換えアデノウイルス血清型５の転嫁感染を得るために、いくつかのアプローチが検討され、まだいくつかは検討中である。ウィクハム（Wickham）らは、ペントンベースに供給するαvβ3およびαvβ5インテグリンに対して役割を担うと考えられるペントンベース中のＲＧＤ（Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ）モチーフを改変した。このＲＧＤモチーフを、α4β1受容体に特異的な別のペプチドモチーフに置き換えた。このようにして、アデノウイルスを特定標的細胞に向けることが実現された（Wickham et al., １９９５）。クラスニク（Krasnykh）ら（１９９８）は、ノブ中の使用可能なＨＩループを利用した。このループは、Ｘ線結晶学に基づくと、ノブ三量体構造の外側に位置付けられ、それ故ノブにおける分子内相互作用には関与しないと考えられる。ＦＬＡＧをコードする配列をＨＩループに挿入すると、三量体化することができる線維タンパク質を生じ、さらにノブ領域にＦＬＡＧ配列を含むウイルスが作製できることが示された。ＦＬＡＧ含有ノブとＣＡＲとの相互作用は変化しないが、ＨＩループへのリガンドの挿入は感染の標的変更（retargeting）を導くと考えられる。アデノウイルス血清型５の線維とペントンベースにおいて変異を導入することに成功したと報告されているが、ノブの複雑な構造と、ＣＡＲおよび相互作用する正確なアミノ酸についての知識が限られていることから、そのような標的アプローチは労力を要する困難なものとなっている。ＣＡＲおよび特異的細胞受容体に結合する抗体の使用も記述されている（Wickham et al., １９９６；Rogers et al., １９９７）。しかし、このアプローチは、特異的抗体の有用性および遺伝子治療産物の複雑さのために限定される。
【００３４】
前記した限界を克服するために、我々は既存のアデノウイルス線維、ペントンベースタンパク質、ヘキソンタンパク質または他のアデノウイルス血清型に由来する他のカプシドタンパク質を使用した。代替アデノウイルス血清型の構造タンパク質を含むキメラアデノウイルス血清型５のライブラリーを作製することにより、好ましい特性を有する組換えアデノウイルスベクターを速やかにスクリーニングすることができる技術を開発した。
【００３５】
イン  ビボと同様にイン  ビトロ（in vitro）にて特定細胞型に向けられることができ、従って特定の細胞型に対して改変された親和性を有するキメラカプシドを産生するための方法を提供することが、本発明の目的である。アデノウイルスまたはアデノウイルスカプシドを特定細胞型または組織への核酸送達媒体として使用することができる方法および手段を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００３６】
改変された後期遺伝子を有するアデノウイルス血清型５に基づくキメラアデノウイルスの産生について述べる。このために、共に完全なアデノウイルス血清型５のゲノムを含む３つのプラスミドを構築した。これらのプラスミドの１個からアデノウイルス血清型５の線維タンパク質をコードするＤＮＡの部分を取り除き、クローニングを容易にするリンカーＤＮＡ配列に置き換えた。その後このプラスミドを、異なるアデノウイルス血清型に由来した線維タンパク質をコードするＤＮＡの挿入のための鋳型として使用した。異なる血清型に由来したＤＮＡ配列は、（縮重）オリゴヌクレオチドと組み合わせたポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて入手した。アデノウイルス血清型５のゲノム内の前のＥ１位置に、あらゆる目的遺伝子をクローニングすることができる。３個のプラスミドを合わせた１回のトランスフェクション手順によって、組換えキメラアデノウイルスが形成される。あるいはまた、遺伝子のライブラリーから得た配列を、キメラアデノウイルスベクターが１またはそれ以上の断片から構築されるように、クローニングすることができる。例えば１つの構築物は、少なくとも左のＩＴＲおよびウイルスのパッケージングに必要な配列、目的遺伝子のための発現カセットならびに第二構築物と共通部分がある配列を含み、第二構築物は、パッケージング細胞中に存在しない複製およびウイルス形成のために必要なすべての配列ならびに好ましい特性を与える非天然配列を含む。キメラアデノウイルスから成るライブラリーのこの新しい技術は、それ故、イン  ビトロおよびイン  ビボでの遺伝子治療のための改善された組換えアデノウイルスベクターを速やかにスクリーニングすることができる。
【００３７】
イン  ビボ遺伝子治療のためのアデノウイルス５型の使用は、特定の細胞型、例えば線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞、好ましくは滑膜細胞に、効率よく感染することが見掛け上不可能であること、そして特定器官、例えば肝臓や脾臓、の優先的感染によって制限される。特に、このことは慢性関節リウマチ（ＲＡ）の治療に重要性をもつ。例えばアデノウイルスを介した単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼの滑膜細胞への送達は、ＲＡのための可能性のある治療として提案されてきた。しかし、当該遺伝子の効率的な送達が必要とされる。
【００３８】
１つの実施態様では、本発明は、線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞、特に滑膜細胞への核酸送達にとりわけ特に適したアデノウイルスベクターを記載する。この特徴は、関節部に関連する疾患の治療、特に慢性関節リウマチの治療にとって特に重要である。アデノウイルスベクターは、好ましくはＢ亜群アデノウイルスに由来するか、または少なくとも該線維タンパク質の細胞結合部分を含む、Ｂ亜群由来のアデノウイルスの線維タンパク質の機能的部分を含む。
【００３９】
さらなる好ましい実施態様では、アデノウイルスベクターはアデノウイルス５型に基づくキメラベクターであり、少なくともアデノウイルス１６型由来の線維タンパク質の機能的部分を含む。
【００４０】
別の実施態様では、本発明は、全身投与後に肝臓を少なくとも部分的に回避するアデノウイルスベクターまたはキメラアデノウイルスベクターを提供する。好ましくは該アデノウイルスベクターはＢ亜群、特に血清型１６に由来するか、または少なくとも該アデノウイルスに由来した線維タンパク質の細胞結合部分を含む。すべての実施態様において、アデノウイルスベクターおよび／または粒子は所望の特性を有する１つの血清型のみに由来してもよいこと、またはアデノウイルスベクターおよび／または粒子は２もしくはそれ以上のアデノウイルス血清型の配列および／またはそのタンパク質もしくは機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含むことは明白である。
【００４１】
別の態様では、本発明は、キメラアデノウイルス、およびアデノウイルス血清型５とは異なる改変した親和性を有するウイルスを産生するための方法を記載する。例えば、アデノウイルス血清型５に基づくが、天然に存在する何らかのアデノウイル線維を示すウイルスである。このキメラアデノウイルス血清型５は、アデノウイルス血清型５よりも、イン  ビトロおよびイン  ビボでより効率よく、またはより低い効率で特定細胞型に感染することができる。そのような細胞は、内皮細胞、平滑筋細胞、樹状細胞、ニューロン細胞、グリア細胞、滑膜細胞（synovical cell）、肺上皮細胞、造血幹細胞、単核細胞／マクロファージ細胞、腫瘍細胞、骨格筋細胞、中皮細胞、滑膜細胞（synoviocyte）、などを含むがこれらに限定されない。
【００４２】
もうひとつの態様では、本発明は、１またはそれ以上の遺伝子もしくは配列が代替ヒトまたは動物血清型に由来したＤＮＡで置き換えられたアデノウイルス血清型５の別個の部分から成るライブラリーの構築と使用を記載する。全体で完全なアデノウイルスゲノムを網羅するこの構築物のセットは、特定の疾患、患者群さらには一個人のためにあつらえられた独自のキメラアデノウイルスの構築を可能にする。
【００４３】
本発明のすべての態様において、キメラアデノウイルスは、Ｅ１領域における欠失およびプロモーターに連結されているかまたは連結されていない非相同遺伝子の挿入を含んでもいてもよく、または含んでいなくてもよい。さらに、キメラアデノウイルスは、Ｅ３領域における欠失およびプロモーターに連結された非相同遺伝子の挿入を含んでもいてもよく、または含んでいなくてもよい。さらに、キメラアデノウイルスは、Ｅ２および／もしくはＥ４領域における欠失およびプロモーターに連結された非相同遺伝子の挿入を含んでもいてもよく、または含んでいなくてもよい。後者の場合、組換えアデノウイルスを産生するためには、Ｅ２および／またはＥ４を補完する細胞系が必要である。実際に、ウイルスベクターのゲノム内の機能的核酸を取り出して、イン  トランスで供給することができる。従って、極端な状況では、キメラウイルスはそのゲノム中にアデノウイルス遺伝子を全く含まず、定義上、最小アデノウイルスベクターである。この場合、必要なアデノウイルス機能は、安定な細胞系および／またはこれらの遺伝子の一過性発現を用いてイン  トランスで供給される。最小アデノウイルスベクターを作製するための方法はＷＯ９７／００３２６に記載されており、本明細書中に参考文献として組み込まれる。もうひとつの場合には、Ａｄ／ＡＡＶキメラ分子を本発明のアデノウイルスカプシドにパッケージする。Ａｄ／ＡＡＶキメラキメラベクターを作製するための方法はＥＰ  ９７２０４０８５．１に記載されており、本明細書中に参考文献として組み込まれる。原則としていかなる核酸も本発明のアデノウイルスカプシドを備えている。
【００４４】
ひとつの実施態様では、本発明は、線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞、好ましくは滑膜細胞に対して少なくとも組織親和性を含むまたは備えた核酸送達媒体を提供する。別の実施態様では、本発明は、少なくとも肝細胞に対して少なくとも一部減じられた組織親和性を含む、または少なくとも肝細胞に対する親和性を少なくとも欠いている核酸送達媒体を提供する。好ましくは、該核酸送達媒体は、少なくとも線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞、好ましくは滑膜細胞に対する組織親和性を備えており、且つ少なくとも肝細胞に対する組織親和性を少なくとも一部欠いている。本発明の好ましい実施態様では、該核酸送達媒体は、少なくとも線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞、好ましくは滑膜細胞に対する組織親和性を備えており、および／またはＢ亜群アデノウイルス由来の、代表的には血清型１１、１６、３５および／もしくは５１、好ましくはアデノウイルス１６の線維タンパク質を用いて、少なくとも肝細胞に対する組織親和性を少なくとも一部欠いている。本発明の好ましい態様では、該核酸送達媒体は、ウイルスカプシドまたはその機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。好ましくは該ウイルスカプシドは、全体または一部がＢ亜群のアデノウイルス、好ましくはアデノウイルス１６、に由来したウイルスカプシドを含むか、またはＢ亜群のアデノウイルス、好ましくはアデノウイルス１６、に由来のタンパク質またはその機能的部分、誘導体もしくは類似体を含む。本発明の好ましい実施態様では、該ウイルスカプシドは、少なくとも２つの異なるウイルス、好ましくはアデノウイルス、に由来のタンパク質またはその機能的部分、誘導体または類似体を含む。本発明の好ましい実施態様では、該ウイルスの少なくとも１つはＢ亜群のアデノウイルス、好ましくはアデノウイルス１６、である。
【００４５】
本発明の好ましい実施態様では、当該核酸送達媒体はアデノウイルス線維タンパク質またはその一部を含む。該線維タンパク質は好ましくはＢ亜群のアデノウイルス、好ましくはアデノウイルス１６、に由来する。該核酸送達媒体は、他のアデノウイルス由来の他の線維タンパク質またはその一部をさらに含みうる。該核酸送達媒体は他のアデノウイルスタンパク質を含んでいてもよく、または含んでいなくてもよい。核酸は当該線維タンパク質またはその一部に直接結合されていてもよいが、間接的に結合されていてもよい。間接結合の例は、アデノウイルスカプシド内への核酸のパッケージングまたはリポソーム内への核酸のパッケージングを含むがこれらに限定されず、ここにおいて線維蛋白またはその一部はアデノウイルスカプシドに組み込まれているか、またはリポソームに結合されている。線維タンパク質またはその一部への核酸の直接結合は、当該線維タンパク質が複合体の一部ではないとき、または当該線維タンパク質がアデノウイルスカプシドのような複合体の一部であるときに実施しうる。
【００４６】
１つの実施態様では、本発明は、アデノウイルス線維タンパク質を含み、当該線維タンパク質が少なくともＢ亜群アデノウイルス、好ましくはアデノウイルス１６、の組織決定部分を含む核酸送達媒体を提供する。アデノウイルス線維タンパク質は少なくとも３つの機能的ドメインを含む。１つのドメインであるベースは、線維をアデノウイルスカプシドのペントンベースに固定する役割を担う。もうひとつのドメインであるノブは受容体認識の役割を担い、シャフトドメインはベースをノブから分けるスペーサーとして機能する。種々のドメインは他の機能ももちうる。例えば、シャフトはおそらく標的細胞の特異性にも関与する。前記ドメインは各々単独でまたは組み合わせて、線維の部分を定義するために使用してもよい。しかし、各部分はもうひとつの方法でも同定されうる。例えばノブドメインは、受容体結合部分およびシャフト結合部分から成る。ベースドメインは、ペントンベース結合部分およびシャフト結合部分からなる。さらに、シャフトはアミノ酸の反復伸長から成る。これらの反復伸長の各々が部分であってもよいし、または１もしくはそれ以上の他の各部分と組み合わせて線維タンパク質の組織決定部分を形成するために使用してもよい。好ましくは線維タンパク質の該組織決定部分は、少なくとも当該線維タンパク質のノブドメインまたはその機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を含む。
【００４７】
線維タンパク質の組織親和性決定部分は、線維タンパク質の単一部分であってもよいし、または少なくとも１つの線維タンパク質に由来した部分の組合せであってよく、該組織親和性決定部分は、単独でまたはウイルスカプシドとの組合せで、核酸送達媒体が所与の細胞または細胞型に、好ましくは、但し必ずしもそうでなくてもよいが、積極的に形質導入することができる効率を決定する。肝細胞に対する組織親和性とは、肝臓に存在する細胞、好ましくは肝実質細胞（liver parenchyma cells）に対する組織親和性を意味する。
【００４８】
特定組織に対する組織親和性は、当該組織の細胞に形質導入する効率を高めることによって提供されるか、あるいはまた、当該組織の細胞以外の細胞に形質導入する効率を低下させることによって提供されうる。
【００４９】
線維タンパク質は組織親和性を決定する特性を有する。組織親和性に関与する線維タンパク質の最も詳細に記載されている部分は、ノブドメインである。しかし、線維タンパク質のシャフトドメインも組織親和性決定特性を有する。但し、必ずしもアデノウイルスカプシドのすべての組織親和性決定特性が線維タンパク質に組み込まれているわけではない。
【００５０】
本発明の好ましい実施態様では、Ｂ亜群アデノウイルス、代表的にはａｄ１１、１６、３５および／または５１、好ましくはアデノウイルス１６、またはその機能的部分、誘導体および／もしくは類似体に由来する線維タンパク質を、Ｃ亜群、好ましくはアデノウイルス５のアデノウイルス由来の少なくとも１つの非線維カプシドタンパク質と組み合わせる。
【００５１】
本発明の１つの態様では、アデノウイルスに由来する核酸の少なくとも一部を含む核酸送達媒体が提供される。好ましい実施態様では、該アデノウイルス核酸は、少なくともＢ亜群アデノウイルス線維タンパク質の、好ましくはアデノウイルス１６の、組織親和性決定部分を含む線維タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を含む。好ましい態様では、当該アデノウイルスは少なくとも２つの異なるアデノウイルス由来の核酸を含む。好ましい態様では、当該アデノウイルスは、少なくとも２つの異なるアデノウイルス由来の核酸を含み、当該核酸の少なくとも一部は、少なくともＢ亜群アデノウイルス線維タンパク質の、好ましくはアデノウイルス１６の、組織親和性決定部分を含む線維タンパク質をコードする。
【００５２】
本発明の好ましい実施態様では、アデノウイルス核酸は、標的細胞内で複製する当該アデノウイルス核酸の能力が減じられまたは無力にされるように改変する。これは特に、早期領域１のタンパク質をコードする遺伝子を不活性化するまたは欠失させることを通して実現しうる。
【００５３】
もうひとつの好ましい実施態様では、当該アデノウイルス核酸を、当該アデノウイルス核酸によりコードされたアデノウイルスタンパク質に対して免疫応答を行う宿主の免疫系の能力が減じられまたは無力にされるように改変する。これは特に、早期領域２および／または早期領域４のタンパク質をコードする遺伝子の欠失を通して実現しうる。あるいはまた、早期領域３のタンパク質をコードする遺伝子を欠失させたり、別に、早期領域３の遺伝子によってコードされるタンパク質のいくつかの抗免疫系機能を考慮して、何らかの目的のために早期領域３のタンパク質の発現を増強することもできる。またアデノウイルス核酸を、前記したアデノウイルス核酸の２またはそれ以上の改変の組合せによって改変させることもできる。重要な機能をコードする核酸がアデノウイルス核酸から欠失したときには、アデノウイルス核酸、アデノウイルスベクター、媒体またはキメラカプシドを生産することになる細胞において、該重要な機能が補完されなければならないことは明らかである。アデノウイルス核酸はまた、前記した以外の方法によって、例えばカプシドタンパク質またはその部分を、ヒトまたは動物が全く中和抗体を有していない、または低いレベルの中和抗体を有している他の血清型由来のカプシドタンパク質またはその部分と交換することを通して、当該アデノウイルス核酸によりコードされたアデノウイルスタンパク質に対して免疫応答を行う宿主免疫系の能力が減じられまたは無力にされるように改変することができる。もうひとつの例は、カプシドタンパク質をコードする核酸と他の血清型由来のカプシドタンパク質をコードする核酸との交換である。またカプシドタンパク質またはその部分を、個体が免疫応答を惹起することができない、または免疫応答を惹起する能力が低い他のカプシドタンパク質またはその部分と交換することもできる。
【００５４】
アデノウイルス核酸をさらに、または前記した改変の１またはそれ以上の代わりに、ヘキソン、ペントン、線維および／またはタンパク質ＩＸのような、但しそれらに限定されないアデノウイルス後期タンパク質をコードする遺伝子を不活性化するまたは欠失させることによって、改変することができる。
本発明の好ましい実施態様では、アデノウイルスタンパク質をコードするすべての遺伝子を当該アデノウイルス核酸から欠失させ、当該核酸を最小アデノウイルスベクターにする。
【００５５】
本発明のもうひとつの好ましい実施態様では、当該アデノウイルス核酸は、Ａｄ／ＡＡＶキメラベクターであり、少なくともアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の組込み手段は当該アデノウイルス核酸に組み込まれている。
【００５６】
本発明の好ましい実施態様では、本発明に従った、全く同一であるかまたはそうでないベクターまたは核酸は、少なくとも１つの非アデノウイルス核酸をさらに含む。好ましくは、該非アデノウイルス核酸の少なくとも１つは、次のタンパク質またはその機能的部分、誘導体および／もしくは類似体をコードする核酸である。アポリポ蛋白、酸化窒素シンターゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、インターロイキン−３、インターロイキン−１ＲＡ、インターロイキン−１α、アンギオスタチン（angiostatin）もしくはエンドスタチン（endostatin）のような（抗）血管新生タンパク質、抗増殖タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＧＥＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、低酸素症誘発因子（a hypoxia inducible factor）１α（ＨＩＦ−１α）、ＰＡＩ−１、平滑筋細胞抗遊走タンパク質（a smooth muscle cell anti-migration protein）、エリトロポエチン、ＣＤ４０、ＦａｓＬ、インターロイキン−１２、インターロイキン−１０、インターロイキン−４、インターロイキン−１３であり、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ５２、インターロイキン−２、インターロイキン−１、インターロイキン−６、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などに対して分泌される一本鎖抗体、または自己反応性Ｔ細胞上のＴ細胞受容体に対して分泌される一本鎖抗体、免疫応答を抑制する前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）のドミナントネガティブ変異体、例えばインターロイキン−１ＲＡ（受容体拮抗物質）ならびに可溶性インターロイキン１受容体Ｉ（ＩＬ−１ＲＩ）、可溶性インターロイキン１受容体ＩＩ（ｓＩＬ−１ＲＩＩ）、可溶性腫瘍壊死因子受容体Ｉ（ｓＴＮＦＲＩ）およびＩＩ（ｓＴＮＦＲＩＩ）のような可溶性受容体のような炎症促進性サイトカインの拮抗物質、遺伝子Ｂｃｌ３、カクタス（cactus）またはＩκＢα、βもしくはγによってコードされるタンパク質のような成長および／または免疫応答阻害タンパク質、ニワトリ貧血ウイルスのＶＰ３タンパク質のようなアポトーシス誘導タンパク質、またはシトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼおよびリナメラーゼ（linamerase）のような自殺遺伝子によってコードされるタンパク質。１またはそれ以上の当該タンパク質またはその機能的部分、誘導体および／または類似体をコードする核酸を含む本発明に従った遺伝子送達媒体は、罹患した関節部における滑膜細胞および／またはＴ細胞を死滅させるまたは成長を抑制するために使用できる。
【００５７】
もうひとつの態様では、本発明は、線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞、好ましくは滑膜細胞、に対して少なくとも組織親和性を含むまたは備えている核酸送達媒体の生産のための細胞を提供する。もうひとつの態様では、本発明は、肝細胞に対して減じられた組織親和性を含むまたは肝細胞に対する組織親和性を少なくとも部分的に欠いている核酸送達媒体の生産のための細胞を提供する。もうひとつの態様では、本発明は、線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞、好ましくは滑膜細胞、に対して少なくとも組織親和性を含むまたは備えており、肝細胞に対して減じられた組織親和性を含むまたは肝細胞に対する組織親和性を少なくとも部分的に欠いている、核酸送達媒体の生産のための細胞を提供する。本発明の好ましい実施態様では、当該細胞は、アデノウイルス核酸がアデノウイルスカプシド中にパッケージされている、アデノウイルスパッケージング細胞である。本発明のアデノウイルスパッケージング細胞のひとつの態様では、早期領域１によってコードされるタンパク質を除いて、アデノウイルス核酸の複製とパッケージングに必要なすべての機能が、当該アデノウイルス核酸によってコードされるタンパク質および／またはＲＮＡによって提供される。本発明のこの態様において早期領域１がコードするタンパク質は、細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれた遺伝子によってコードされてもよい。本発明の好ましい実施態様では、当該細胞はＰＥＲ．Ｃ６（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）である。一般に、複製とアデノウイルス核酸のアデノウイルスカプシドへのパッケージングに必要な遺伝子産物がアデノウイルス核酸によって提供されないときには、当該パッケージング細胞の一過性トランスフェクションにより、または安定な形質転換を通して、パッケージング細胞によって提供される。しかし、パッケージング細胞によって提供されるアデノウイルス産物はまた、さらに、当該アデノウイルス核酸上に存在する核酸によっても提供されうる。例えば線維タンパク質は、例えば一過性トランスフェクションを通してパッケージング細胞によって提供されてもよいし、またアデノウイルス核酸によってコードされてよい。この特徴は特に、例えば２つの異なるウイルス由来の線維タンパク質の使用を通して、２つの異なる組織親和性を有する線維タンパク質から成るアデノウイルスカプシドを産生するために使用できる。
【００５８】
本発明の核酸送達媒体は、疾患、好ましくは慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎および若年性慢性関節炎のような関節関連疾患の治療に有用である。例えば滑膜細胞における発現が疾患の症状を少なくとも部分的に改善するタンパク質またはその機能的部分、誘導体および／もしくは類似体の非制限的な例は、アポリポ蛋白、酸化窒素シンターゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、インターロイキン−３、インターロイキン−１ＲＡ、インターロイキン−１α、アンギオスタチンもしくはエンドスタチンのような（抗）血管新生タンパク質、抗増殖タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＧＥＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、低酸素症誘発性因子１α（ＨＩＦ−１α）、ＰＡＩ−１、平滑筋細胞抗遊走タンパク質、エリトロポエチン、ＣＤ４０、ＦａｓＬ、インターロイキン−１２、インターロイキン−１０、インターロイキン−４、インターロイキン−１３であり、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ５２、インターロイキン−２、インターロイキン−１、インターロイキン−６、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などに対して分泌される一本鎖抗体、または自己反応性Ｔ細胞上のＴ細胞受容体に対して分泌される一本鎖抗体、免疫応答を抑制する前骨髄球性白血病（ＰＭＬ）のドミナントネガティブ変異体、例えばインターロイキン−１ＲＡ（受容体拮抗物質）ならびに可溶性インターロイキン１受容体Ｉ（ＩＬ−１ＲＩ）、可溶性インターロイキン１受容体ＩＩ（ｓＩＬ−１ＲＩＩ）、可溶性腫瘍壊死因子受容体Ｉ（ｓＴＮＦＲＩ）およびＩＩ（ｓＴＮＦＲＩＩ）ような可溶性受容体のような炎症促進性サイトカインの拮抗物質、遺伝子Ｂｃｌ３、カクタスまたはＩκＢα、βもしくはγによってコードされるタンパク質のような成長および／または免疫応答阻害タンパク質、ニワトリ貧血ウイルスのＶＰ３タンパク質のようなアポトーシス誘導タンパク質、またはシトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼおよびリナメラーゼのような自殺遺伝子によってコードされるタンパク質である。
【００５９】
本発明の核酸送達媒体は、疾患の治療のための薬剤として使用しうる。あるいはまた、本発明の核酸送達媒体は、疾患の治療のための医薬の製造に使用しうる。
【００６０】
ひとつの態様では、本発明は、線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞、好ましくは滑膜細胞、に対する組織親和性を有するまたは備えたアデノウイルスカプシドを提供するものであり、当該カプシドは好ましくは少なくとも２つの異なるアデノウイルス由来のタンパク質を含み、線維タンパク質の少なくとも組織親和性決定部分はＢ亜群アデノウイルス、好ましくはアデノウイルス１６、に由来する。もうひとつの態様では、本発明は、肝細胞に対する組織親和性を減じられているまたは少なくとも部分的に欠いているアデノウイルスカプシドを提供するものであり、当該カプシドは好ましくは少なくとも２つの異なるアデノウイルス由来のタンパク質を含み、線維タンパク質の少なくとも組織親和性決定部分がＢ亜群アデノウイルス、好ましくはアデノウイルス１６、に由来する。
【００６１】
ひとつの実施態様では、本発明は、線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞、好ましくは滑膜細胞、への核酸の送達のための、本発明のアデノウイルスカプシドの使用を含む。もうひとつの実施態様では、本発明は、肝細胞への核酸の送達を少なくとも部分的に防ぐための、本発明のアデノウイルスカプシドの使用を含む。
【００６２】
もうひとつの実施態様では、本発明は、慢性関節リウマチ、または線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞、好ましくは滑膜細胞、への核酸の送達によって治療しうる疾患の治療のためのアデノウイルスを提供する。
【００６３】
さらにもうひとつの実施態様では、本発明は、疾患の治療のための薬剤の一部としてのアデノウイルスカプシドを提供する。さらにもうひとつの実施態様では、本発明は、疾患の治療のための医薬の製造のためのアデノウイルスカプシドを提供する。
【００６４】
本発明のもうひとつの態様では、アデノウイルス５の配列、２１５６２〜３１０９４および３２７９４〜３５９３８を含む構築物、ｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲΔＦｉｂが提供される。
【００６５】
本発明のもうひとつの態様では、アデノウイルス５の配列、２１５６２〜３１０９４および３２７９４〜３５９３８を含み、さらに線維タンパク質をコードするアデノウイルス１６の核酸を含む構築物ｐＢｒ／ＡｄＢａｍＲｆｉｂ１６が提供される。
【００６６】
本発明のさらにもうひとつの態様では、アデノウイルス５の配列、２１５６２〜３１０９４および３２７９４〜３５９３８を含み、さらに線維タンパク質をコードするアデノウイルス１６の核酸を含み、そして当該構築物の非アデノウイルス配列バックボーンにおいて、アデノウイルス５の右側末端反復の近くに唯一の（unique）ＰａｃＩ部位をさらに含む構築物ｐＢｒ／ＡｄＢａｍＲ．ｐａｃ／ｆｉｂ１６が提供される。
【００６７】
本発明のもうひとつの態様では、Ａｄ５配列３５３４〜３１０９４および３２７９４〜３５９３８を含み、線維タンパク質をコードするアデノウイルス１６の核酸をさらに含む構築物ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩｒＩＴＲｆｉｂ１６が提供される。
【００６８】
本発明のもうひとつの態様では、Ａｄ５配列３５３４〜２２４４３および２４０３３〜３１０９４および３２７９４〜３５９３８を含み、線維タンパク質をコードするアデノウイルス１６の核酸をさらに含む構築物ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩｒＩＴＲＤＥ２Ａｆｉｂ１６が提供される。
【００６９】
前記した配列の番号付けにおいて、数字は両端を含む。
【００７０】
本発明の好ましい実施態様では、当該構築物を、線維芽細胞様またはマクロファージ様細胞、好ましくは滑膜細胞、に対して組織親和性を有する核酸送達媒体またはアデノウイルスカプシドの産生のために使用する。
【００７１】
もうひとつの態様では、本発明は、アデノウイルスベクターのライブラリー、または大きな選択範囲の非アデノウイルス核酸を含む、全く同一であるかまたはそうでない核酸送達媒体を提供する。本発明のもうひとつの態様では、カプシドタンパク質をコードするアデノウイルス遺伝子を、少なくとも２つの異なるアデノウイルスに由来したタンパク質から成るアデノウイルスカプシドのライブラリーを産生するために使用し、当該アデノウイルスは好ましくは２つの異なる血清型に由来し、好ましくは１つの血清型がＢ亜群のアデノウイルスである。本発明の特に好ましい実施態様では、アデノウイルスカプシドのライブラリーは、少なくとも２つの異なるアデノウイルス由来のタンパク質を含んで産生され、それにおいて線維タンパク質の少なくとも組織親和性決定部分はＢ亜群のアデノウイルス、好ましくはアデノウイルス１６に由来する。
【００７２】
ひとつの実施態様では、本発明は、少なくとも１つの非アデノウイルス蛋白性分子またはＲＮＡ分子をコードする核酸を含むＢ亜群アデノウイルスカプシドを提供する。好ましくは、当該Ｂ亜群アデノウイルス核酸は、さらにＢ亜群アデノウイルス核酸を含む。より好ましくは、当該Ｂ亜群アデノウイルス核酸は、Ｅ１領域をコードするタンパク質を発現する能力を欠いている。最も好ましくは、当該Ｂ亜群アデノウイルスはアデノウイルス１６である。
【００７３】
もうひとつの態様では、本発明は、少なくとも単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼまたはその機能的部分、誘導体および／もしくは類似体をコードする核酸を含む核酸送達媒体を当該関節部に投与すること、ならびにガンシクロビルまたはその機能的部分、誘導体および／もしくは類似体を当該個体に投与することを含む、個体における関節部から滑膜を少なくとも一部除去するための方法を提供する。好ましくは、当該遺伝子送達媒体は本発明の媒体である。
【００７４】
アデノウイルス１６の線維タンパク質は、好ましくは図７に示す配列の少なくとも一部を含む。しかし、本発明の範囲内で、例えばコドンの縮重を用いることを通して得られる他の配列も使用しうる。あるいはまた、線維配列は、所望する組織親和性決定特性が有意に改変されないかぎり、図７に示す配列と比較してアミノ酸の置換または挿入または欠失を含んでいてもよい。アミノ酸の置換は同じ極性群内でもよく、または同じ極性群の範囲外であってもよい。
【００７５】
形質導入細胞は核酸を備えた細胞である。当該細胞は、核酸をいかなる手段を通して備えられたものであってもよい。同様に、細胞の形質導入を測定することは、当該細胞への核酸の移入を測定することを意味する。当該移入は、細胞に核酸を移入することができるいかなる手段を通して生じたものでもよい。
【００７６】
［実施例］
実施例１：キメラ線維タンパク質を有するアデノウイルス血清型５ベースのウイルスの産生
線維をコードするＤＮＡを欠くアデノウイルス鋳型クローンの産生。アデノウイルス血清型５の線維コーディング配列は、ヌクレオチド３１０４２および３２７８７の間に位置する。線維をコードするアデノウイルス血清型５ＤＮＡを除くために、本発明者らは、構築物ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲで出発した（図１；ＥＣＡＣＣ寄託Ｐ９７０８２１２２）。この構築物から、まず、ＮｄｅＩ部位を除去した。この目的のために、ｐＢｒ３２２プラスミドＤＮＡをＮｄｅＩで消化したのち、クレノウ酵素を用いて突出末端を満たした。ついで、このｐＢｒ３２２プラスミドを再度連結し、ＮｄｅＩで消化し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換した。得られたｐＢＲ／ΔＮｄｅＩプラスミドをＳｃａＩおよびＳａｌＩで消化し、得られた３１９８ｂｐベクター断片をｐＢＲ／Ａｄ．ＢａｍｒＩＴＲに由来する１５３４９ｂｐのＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片に連結し、その結果、よって唯一のＮｄｅＩ部位を含有するプラスミドｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲΔＮｄｅＩが得られた。つぎに、オリゴヌクレオチド「ＮＹ−ｕｐ」と「ＮＹ−ｄｏｗｎ」でＰＣＲを行った（図２）。増幅の間、増幅された線維ＤＮＡのクローニングを容易にするために、ＮｄｅＩおよびＮｓｉＩ両制限部位を導入する。増幅は、各９５℃での４５秒、６０℃での１分間、および７２℃での４５秒間の２５サイクルよりなるものであった。ＰＣＲ反応は、２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドＮＹ−ｕｐおよびＮＹ−ｄｏｗｎ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ2とＰＣＲ緩衝液および１ユニットのエロンゲート（Elongate）熱安定性ポリメラーゼ（ギブコ社(Gibco）、オランダ国(the Netherlands)）を含有するものであった。ＰＣＲ産物の１／１０をアガロースゲルで泳動させると、それは±２２００ｂｐの予測されたＤＮＡ断片が増幅されたことを示した。ジーンクリーン（Geneclean）キット系（バイオ１０１社（Bio101 Inc.））を用いて、このＰＣＲ断片を引き続いて精製した。ついで、構築物ｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍｒＩＴＲΔＮｄｅＩならびにＰＣＲ産物両者を制限酵素ＮｄｅＩおよびＳｂｆＩで消化した。Ｔ４リガーゼ酵素を用いて、ＰＣＲ産物を引き続いてＮｄｅＩおよびＳｂｆＩ部位にクローン化し、かくして、ｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲΔＦｉｂが得られた（図３）。
【００７７】
アデノウイルス血清型由来の線維配列の増幅
代替の血清型に由来する線維タンパク質をコードするＤＮＡの増幅を可能とするために、縮重オリゴヌクレオチドを合成した。この目的で、まず、代替の血清型の線維タンパク質をコードする公知のＤＮＡ配列を整列させて、線維タンパク質の尾部領域ならびにノブ領域両者における保存領域を同定した。６つの亜群全てを代表する１９の異なる血清型のヌクレオチド配列を含んだ整列（aligment）より、（縮重）オリゴヌクレオチドを合成した（表Ｉ参照）。特異的血清型の線維タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するのに使用したオリゴヌクレオチドの組合せを表Ｉに示した。増幅反応（５０μｌ）は、１反応当たり、２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、２５ｐｍｏｌの各オリゴヌクレオチド、標準１×ＰＣＲ緩衝液、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および１ユニットのＰｗｏ熱安定性ポリメラーゼ（ベーリンガー  マンハイム社（Boehringer Mannheim)）を含有した。サイクルのプログラムは２０サイクルを含み、各サイクルは９４℃で３０秒、６０〜６４℃で６０秒、および７２℃で１２０秒からそれぞれなる２０サイクルを含んだ。ＤＮＡ断片が増幅されたことを示すために、ＰＣＲ産物の１／１０をアガロースゲルで泳動した。異なる鋳型はそれぞれについて、２つの独立したＰＣＲ反応を行った。
【００７８】
キメラアデノウイルスＤＮＡ構築物の産生
全ての増幅された線維ＤＮＡならびにベクター（ｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲΔＦｉｂ）をＮｄｅＩおよびＢｓｉＩで消化した。消化したＤＮＡを引き続いてアガロースゲルで泳動させたのち、該ゲルから断片を単離し、ジーンクリーンキット（バイオ１０１社）を用いて精製した。ついで、ＰＣＲ断片をｐＢｒ／ＡｄＢａｍＲΔＦｉｂのＮｄｅＩおよびＮｓｉＩ部位にクローン化し、かくして、ｐＢｒ／ＡｄＢａｍＲＦｉｂＸＸを産生した（ここで、ＸＸは線維ＤＮＡが単離された血清型番号を表す）。ＰＣＲによって産生された挿入断片を配列決定して、正しい増幅を確認した。異なる線維遺伝子の得られた配列を図４に示す。
【００７９】
線維タンパク質についての組換えアデノウイルスキメラの産生
キメラウイルスの効果的な産生を可能とするために、ｐＢｒ／ＡｄＢａｍＲＦｉｂ１６、ｐＢｒ／ＡｄＢａｍＲＦｉｂ２８、ｐＢｒ／ＡｄＢａｍＲＦｉｂ４０−Ｌ構築物由来のＡｖｒＩＩ断片をベクターｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ．ｐａｃ＃８（ＥＣＡＣＣ寄託＃Ｐ９７０８２１２１）にサブクローン化し、このベクターにおける対応する配列を置き換えた。ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ．ｐａｃ＃８はｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲと同一のアデノウイルス挿入断片を有するが、ＩＴＲがベクター配列から分離されることを可能とするｒＩＴＲ近くのＰａｃＩ部位を有する。構築物ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−Ｅｃｏは以下のごとくに産生された。ｐＷＥ．ｐａｃをＣｌａＩで消化し、５プライム突出末端をクレノウ酵素で満たした。ついで、ＤＮＡをＰａｃＩで消化し、アガロースゲルから単離した。ｐＷＥ／ＡｆｌＩＩｒＩＴＲをＥｃｏＲＩで消化し、クレノウ酵素での処理後にＰａｃＩで消化した。アデノウイルス配列を含有する大きな２４ｋｂ断片をアガロースゲルから単離し、ＣｌａＩで消化されて平滑化されたｐＷＥ．ｐａｃベクターに連結した。クロンテック社（Clontech）からのライゲーション発現（ligation express）キットを使用した。ストラタジーン社（Stratagene）からのＸＬ１０−ゴールド（gold）細胞の形質転換後に、予測される構築物を含有するクローンを同定した。ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｌｆＩＩ−Ｅｃｏは、塩基対３５３４〜２７３３６由来のＡｄ５配列を含む。３つの構築物、ＳａｌＩで消化したｐＣｌｉｐｓａｌ−Ｌｕｃ（図５）、ＰａｃＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ＥｃｏならびにＢａｍＨＩおよびＰａｃＩで消化したｐＢｒ／ＡｄＢａｍＲ．ｐａｃ／ｆｉｂＸＸをアデノウイルス生産細胞にトランスフェクションした（ＰＥＲ．Ｃ６，Fallaux et al., １９９８）。図６は、キメラウイルスを産生するのに使用された方法および断片を模式的に示す。ＰａｃＩ含有ベクターにサブクローン化することなくｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲｆｉｂ１２のみが用いられ、従って、ＰａｃＩを用いてベクター配列から遊離されなかったが、右側ＩＴＲに付着させたほぼ１６０ｂｐのベクター配列を残すＣｌａＩで消化した。さらに、ｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲｆｉｂ１２およびｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲｆｉｂ２８は線維配列中に内部ＢａｍＨＩ部位を含有しており、従って、ＢａｍＨＩ部位を近接挟むベクター配列において切断するＳａｌＩで消化された。トランスフェクションのために、２μｇのｐＣＬＩＰｓａｌ−Ｌｕｃ、および４μｇのｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ＥｃｏおよびｐＢｒ／ＡｄＢａｍＲ．ｐａｃ／ｆｉｂＸＸ両者を無血清ＤＭＥＭ中で１００μｌ合計容量まで希釈した。このＤＮＡ懸濁液１００μｌに、無血清培値にて２．５×希釈したリポフェクタミン（ギブコ社）を添加した。室温での３０分後、ＤＮＡ−リポフェクタミン複合体溶液を２．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭに添加し、これを、引き続いてＴ２５ｃｍ2組織培養フラスコに添加した。このフラスコは、１×１０6細胞／フラスコの密度でのトランスフェクション前２４時間に播種されたＰＥＲ．Ｃ６細胞を含有していた。２時間後、２０％胎児仔ウシ（foetal calf）血清を補充した２．５ｍｌのＤＭＥＭの添��によって、ＤＮＡ−リポフェクタミン複合体を含有する培地を一旦希釈した。再び２４時間後に、培地を、１０％胎児仔ウシ血清を補足した新鮮なＤＭＥＭと置き換えた。細胞を６〜８日間培養し、引き続いて採取し、３回凍結／解凍した。室温での３０００ｒｐｍでの５分間の遠心によって、細胞の破片を除去した。上清（１２．５ｍｌ）のうち３〜５ｍｌを用いて、再度ＰＥＲ．Ｃ６細胞を感染させた（Ｔ８０ｃｍ2組織培養フラスコ）。この再感染の結果、５〜６日後に充分な細胞病理学効果（ＣＰＥ）が得られ、そののち、アデノウイルスを前記したように採取した。
【００８０】
キメラアデノウイルスの生産
１０ｍｌの前記粗細胞溶解物を用いて、懸濁液中で増殖する１〜１．５×１０6ＰＥＲ．Ｃ６細胞／ｍｌを含有する１リットルの発酵槽に接種した。接種後３日で、細胞を採取し、室温（ＲＴ）での１７５０ｒｐｍにおける１０分間の遠心によってペレット化した。以下の後続加工プロトコルを用いて、ペレット化した細胞に存在するアデノウイルスを引き続いて抽出し精製した。ペレットを５０ｍｌの１０ｍＭ  ＮａＰＯ4に溶解させ、−２０℃で凍結した。３７℃で解凍した後、５．６ｍｌのデオキシコレート（deoxycholate）（５％重量／容量）を添加した。溶液を混合し、細胞を完全に溶解させるために３７℃で１５分間インキュベートした。溶液を均質化した後、１８７５μｌの１Ｍ  ＭｇＣｌ2および５ｍｌのグリセロールを添加した。３７５μｌのＤＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ）の添加後、溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。ＲＴでの３０分間の１８８０×ｇにおける遠心によって、ブレーキをかけることなく、細胞の破片を除去した。上清は、引き続いて、フレオン（freon）(３×）での抽出によってタンパク質から精製された。清澄化された上清を１Ｍトリス／ＨＣｌ緩衝化塩化セシウムブロック勾配（割合：１．２／１．４ｇｒ／ｍｌ）に加え、１０℃にて２．５時間、２１０００ｒｐｍにおいて遠心した。ウイルスバンドを単離し、そののち、１．３３ｇｒ／ｍｌの塩化セシウムの１Ｍ  トリス／ＨＣｌ緩衝化連続勾配を用いる第２の精製を行った。ついで、１０℃にて、５５０００ｒｐｍにおいて１７時間ウイルスを遠心した。ついで、ウイルスバンドを単離し、スクロース（５０％重量／容量）を最終濃度１％まで添加する。過剰の塩化セシウムは、ＣａＣｌ2（０．９ｍＭ）、ＭｇＣｌ2（０．５ｍＭ）および増大する濃度のスクロース（１、２、５％）を補充した１．５ｌｔｒのＰＢＳに対する透析スライド（スライド−ア−ライザー(Slide-a-lizer)、カットオフ（cut off）１００００ｋＤａ、ピアス社（Pierce）、アメリカ合衆国(USA)）中での透析（ＲＴにて１時間を３回）によって、除去された。透析後、ウイルスをスライド−ア−ライザーから除去し、そののち、ウイルスを−８５℃で貯蔵するために、それを２５および１００μｌの部分に分けた。
【００８１】
１ｍｌ当たりのウイルス粒子の数を決定するために、５０μｌのウイルスバッチを、３００〜６００ｍＭ  ＮａＣｌ勾配を用いるシャブラム（Shabram）ら（１９９７）によって記載されている高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で泳動させた。キメラウイルスのウイルス力価は、Ａｄ５．Ｃｌｉｐ．Ｌｕｃウイルスバッチと同一の範囲であることが判明した（Ａｄ５．Ｃｌｉｐ．Ｌｕｃ：２．２×１０11ｖｐ／ｍｌ；Ａｄ５．Ｌｕｃ−ｆｉｂ１６：３．１×１０12ｖｐ／ｍｌ）。
【００８２】
実施例２
ラットの静脈尾静脈注射（intracenous tail vein injection）後のキメラウイルスの生体分布
Ａｄ５ベースのルシフェラーゼウイルスと比較したキメラアデノウイルスＡｄ５．Ｌｕｃ−ｆｉｂ１６の生体分布を調べるために、ウイルスバッチの各々の１×１０10粒子をＰＢＳで１ｍｌまで希釈し、ウイルスを成体雄Ｗａｇ／Ｒｉｊラットの尾静脈に注射した（３ラット／ウイルス）。ウイルスの投与後４８時間で、ラットを犠牲にし、そののち、肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓および脳を切開した。引き続いて、これらの器官を１ｍｌの溶解緩衝液（ＰＢＳ中に１％トリトンＸ−１００）と混合し、タンパク質溶解物を得るために３０秒間細かに切った。タンパク質溶解物をルシフェラーゼ活性につきテストし、タンパク質濃度を測定した。表ＩＩに示す結果は、アデノウイルス血清型５がほとんど肝臓および脾臓に対して向けられ、他方、Ａｄ５．Ｌｕｃ−ｆｉｂ１６キメラウイルスはそうではないことを示す。この実験は、他の血清型の線維を利用することによって、肝臓によるアデノウイルスの取り込みを回避できることを示す。
【００８３】
実施例３
線維キメラアデノウイルスの生産
１０ｍｌの粗抽出物を用いて、懸濁液中での増殖に特異的に適合した１〜１．５×１０6細胞／ｍｌ  ＰＥＲ．Ｃ６を含有する１リットルの発酵槽に接種するために、もう１つのバッチのＡｄ５．Ｌｕｃ−ｆｉｂ１６が作られた。接種後３日で、室温で１７５０ｒｐｍにて１０分間遠心することによって、細胞を採取しペレット化した。ペレット化された細胞に存在するキメラアデノウイルスを、引き続いて、以下の後続の加工プロトコルを用いて抽出し精製した。ペレットを５０ｍｌの１０ｍＭ  ＮａＰＯ4-に溶解させ、−２０℃で凍結した。３７℃で解凍した後、５．６ｍｌのデオキシコレート（５％重量／容量）を添加し、そののち、溶液を均質化した。細胞を完全に破壊させるために、溶液を引き続いて３７℃で１５分間インキュベートした。溶液を均質化した後、１８７５μｌの（１Ｍ）ＭｇＣｌ2および５ｍｌの１００％グリセロールを添加した。３７５μｌのＤＮａｓｅ（１０ｍｇ／ｍｌ）の添加後、溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。室温での３０分間の１８８０×ｇにおける遠心によって、ブレーキをかけることなく、細胞の破片を除去した。上清を引き続いて１０ｍｌのフレオンを加えることによってタンパク質から精製した。室温でブレーキをかけることなく２０００ｒｐｍにて１５分間遠心すると、３つのバンドが目に見え、そのうち、上方のバンドはアデノウイルスを表す。このバンドは、ピペッティングすることによって単離され、そののち、それにトリス／ＨＣｌ（１Ｍ）緩衝化塩化セシウムブロック勾配（割合：１．２から１．４ｇｒ．／ｍｌまで）を加えた。１０℃にて２．５時間、２１０００ｒｐｍで遠心すると、ウイルスは他の成分とは対照的に、１．４ｇｒ／ｍｌ塩化セシウム溶液に移動しないので、ウイルスは残存するタンパク質および細胞の破片から精製された。ウイルスバンドを単離し、そののち、塩化セシウムの１．３３ｇｒ．／ｍｌのトリス／ＨＣｌ（１Ｍ）緩衝化連続勾配を用いる第２の精製を行う。この勾配の頂部へウイルスを加えた後、ウイルスを１０℃で５５０００ｒｐｍにて１７時間遠心する。引き続いて、ウイルスバンドを単離し、３０μｌのスクロース（５０重量／容量）の添加後、各回が１時間よりなる３回の透析によって過剰塩化セシウムを除去した。透析のために、ウイルスを透析スライド（スライド−ア−ライザー、カットオフ１０，０００ｋＤａ、ピアス社、アメリカ合衆国）に移す。透析に使用した緩衝液は、増加する濃度のスクロース（１〜３回まで；３０ｍｌ、６０ｍｌおよび１５０ｍｌのスクロース（５０％重量／容量）／１．５リットルのＰＢＳ、全て７．５ｍｌの２％（重量／容量）ＣａＭｇＣｌ2を補充）を補充したＰＢＳである。透析後、ウイルスをスライド−ア−ライザーから取り出し、そののち、Ａｄ５．Ｌｕｃ−ｆｉｂ１６ウイルスを−８５℃で保存するために、それを２５ｍｌおよび１００μｌに分けた。
【００８４】
１ミリリットル当たりのウイルス粒子の数を決定するために、５０μｌのウイルスバッチを高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で泳動させる。アデノウイルスをカラムに結合させ（アニオン交換）、そののち、ＮａＣｌ勾配（範囲３００〜６００ｍＭ）を用いてそれを溶出させる。ウイルスピーク下の面積を決定することによって、ウイルス粒子の数を計算することができる。ウイルスバッチに存在する１ｍｌ当たりの感染ユニットの数（ＩＵ）を決定するために、９１１細胞について力価測定を行った。この目的で、１穴当たり１００μｌの合計容量で、列Ｂ、ＤおよびＦにおける９６穴プレートの１穴当たり４×１０4の９１１細胞を播種する。播種後３時間で、細胞をプラスチック支持体に付着させ、そののち、培地を除去した。異なる希釈のウイルス（範囲：１０2倍希釈から２×１０9まで）を含有する２００μｌの容量を、２つ並行して（in duplicate）、細胞に添加した。ＣＰＥについてスクリーニングすることによって、１４日後に依然としてＣＰＥを与える最高のウイルス希釈は、少なくとも１の感染ユニットを含有すると考えられる。ウイルスの計算された量と共にこの観察を用い、これらの穴に存在する容量は、所与のウイルスバッチの１ｍｌ当たりの感染ユニットの数をなす。
【００８５】
実施例４
キメラウイルスは滑膜細胞形質導入における差異を呈する。
【００８６】
ヒト滑膜細胞の感染
実験の最初の組において、５０，０００の滑膜細胞（１個体に由来）を、１穴当たり１ｍｌの容量にて２４穴プレートの各ウェルに播種した。播種後２４時間で、細胞をＰＢＳで洗浄し、そののち、２％ＦＣＳを補足した２００μｌのＤＭＥＭを細胞に添加した。この培地は種々の量のウイルスを含有した（５０、２５０、１２５０、５０００および１００００ｖｐ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ））。ウイルスはＡｄ５．Ｃｌｉｐ．ＬｕｃまたはＡｄ５．Ｌｕｃ−ｆｉｂ１６であった。ウイルスの添加の２時間後、正常培地によって培地を置き換え、かくして、非結合ウイルスを除去する（２つ並行して各感染）。再び４８時間後、細胞を洗浄し、１００μｌの溶解緩衝液の添加によって溶解させ、そののち、ルシフェラーゼ導入遺伝子発現をモニターした。図８において、結果は、滑膜細胞の感染後の１マイクログラムタンパク質当たりのルシフェラーゼ導入遺伝子発現を示す。これらの結果は、コントロールアデノウイルス血清型５と比較して、線維１６キメラアデノウイルスが、導入遺伝子発現に基づいて、有意に良好に滑膜細胞に感染することを示す。コントロールアデノウイルス血清型５に対する線維１６キメラアデノウイルスの倍増加は、使用したＭＯＩに応じて、２．４×（ＭＯＩ  ５０）〜１０５２×（ＭＯＩ  １００００）の範囲であった。同一の実験は、アデノウイルス血清型５および線維１６キメラアデノウイルスの間の導入遺伝子発現において、平均して（ｎ＝４）少なくともファクター１００差異（factor 100 differences）を示した。
【００８７】
実験の第２の組において、等しい数のウイルス粒子を異なる濃度の滑膜細胞に添加した。これらの細胞の感染の効率は滑膜細胞層の密集度（confluency）に依存する可能性があるので、この実験を行った。高度に密集した細胞層はイン  ビボ状況を良好に模倣することができる。この目的で、滑膜細胞を２４穴プレート（２つ並行して）の１穴当たり１２，５００、２５，０００、５０，０００、および１００，０００細胞の濃度で播種した。２４時間後、これらの細胞を２．５×１０8ウイルス粒子を含有する培地で前記したごとくに感染させた。２時間の感染処置（図９参照）の４８時間後に決定されたルシフェラーゼ導入遺伝子発現の結果は、線維１６キメラアデノウイルスがルシフェラーゼの±１０００倍高い発現となり、かくして、細胞が１００％密集である場合は滑膜細胞を感染するのに明らかに良好に適していることを示す。
【００８８】
実験の第３の組において、本発明者らは、ルシフェラーゼ導入遺伝子発現のレベルに対するウイルス接触（exposure）の時間における差異を測定した。線維１６キメラアデノウイルスの結合動力学がアデノウイルス血清型５コントロールウイルスのそれと異なることを示すためにこの実験を行った。この目的で、１５，０００滑膜細胞を１ｍｌの容量にて２４穴プレートに播種した。２４時間後、細胞を５０、５００、または５０００ｖｐ／細胞のＭＯＩにて感染させた（３つ並行して）。感染は２時間または２０時間進行させた。図１０に示される結果は、線維１６キメラアデノウイルスの結合動力学および特徴がコントロールアデノウイルス血清型５のそれとは区別され、線維１６キメラアデノウイルスがコントロールアデノウイルス血清型５ウイルスと比較してかなり効率的に滑膜細胞に感染することを示す。
【００８９】
前記した結果より、線維１６キメラウイルスがアデノウイルス血清型５と比較して滑膜細胞の感染により適していることは明らかである。アデノウイルス血清型５は侵入のためにコクサッキィーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）およびインテグリンαvβ３およびαvβ５を要することが知られているので、本発明者らは、フローサイトメトリーを用いて滑膜細胞におけるこれらの分子の発現をモニターした。この目的で、フローサイトメトリーのために特別に設計したチューブに１×１０5滑膜細胞を移した。細胞をＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで一回洗浄し、しかる後、室温にて１７５０ｒｐｍで５分間の遠心によってペレット化した。引き続いて、１００倍希釈したαvβ３抗体（Ｍａｂ  １９６１、ブランスウィック  ケミ社(Brunswick Chemie)、アムステルダム(Amsterdam)、オランダ王国）１０μｌ、１００倍希釈したαvβ５抗体（抗体（Ｍａｂ  １９７６、ブランスウィック  ケミ社、アムステルダム、オランダ王国）または２０００倍希釈ＣＡＲ抗体（ベルゲルソン(Bergelson)博士、ハーバード医科大学(Harvard Medical School)、ボストン、アメリカ合衆国の寄贈物（Hsu et al., １９８８））を細胞ペレットに添加し、そののち、細胞を暗い環境で４℃にて３０分間インキュベートした。このインキュベーション後、細胞をＰＢＳ／０．５％ＢＳＡで２回洗浄し、再度、室温にて１７５０ｒｐｍにおいて５分間の遠心によってペレット化した。細胞を標識するために、１０μｌのフィコエリスリン（ＰＥ）で標識したラット−抗−マウスＩｇＧ１を細胞ペレットに添加し、細胞を暗い環境で４℃にて３０分間インキュベートした。最後に、細胞をＰＢＳ／０．５％  ＢＳＡで２回洗浄し、フローサイトメーターで分析した。この実験の結果を表IIIに示す。
【００９０】
これらのフローサイトメトリーの結果は、滑膜細胞が検出可能なレベルのＣＡＲを発現しないことを示し、これは、これらの細胞がアデノウイルス血清型５で形質導入するのが困難である理由の少なくとも１つであろう。
【００９１】
滑膜細胞で行った実験についてのコントロールとして、Ａ５４９およびＰＥＲ．Ｃ６細胞を感染した。これらの細胞系はアデノウイルス血清型５によって容易に感染させることができる。滑膜細胞での観察された差異が細胞結合における差異に事実帰せることができるか否か、またはその差異が１感染ユニット比当たりのウイルス粒子の差異によって引き起こされることを調べるために、この実験を行った。この目的で、１０5のＡ５４９細胞を２００μｌの容量にて２４穴プレートに接種した。播種の２時間後、Ａｄ５．Ｌｕｃ−ｆｉｂ１６またはＡｄ５．Ｃｌｉｐ．Ｌｕｃいずれかの異なる量の粒子を含有する培地によって培地を置き換えた（ＭＯＩ＝０、５、１０、２５、１００、５００）。ウイルスの添加の２４時間後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、そののち、１００μｌ溶解緩衝液の各穴への添加によって溶解させ（ＰＢＳ中の１％トリトンＸ−１００）、そののち、導入遺伝子発現（ルシフェラーゼ活性）およびタンパク質濃度を測定した。引き続いて、１μｇタンパク質当たりのルシフェラーゼ活性を計算した。表ＩＶで示されるこれらの結果は、同一量のウイルス粒子を用いた場合、問題となる細胞型で観察された導入遺伝子発現の差異は、ウイルスの結合および／または内部化の差異のためであり、使用したウイルスの量のためではないことを示す。
【００９２】
アデノウイルス血清型５および線維キメラ線維１６を用いて、同様の実験をＰＥＲ．Ｃ６細胞で行った。この目的で、１０5ＰＥＲ．Ｃ６細胞を１００μｌの合計容量にて２４穴プレートに播種した。播種の３時間後、Ａｄ５．Ｃｌｉｐ．ＬｕｃまたはＡｄ５．Ｌｕｃ−ｆｉｂ１６（ＭＯＩ＝１０）いずれかの１０6粒子を含有する培地によって培地を置き換えた。ウイルスの添加の２４時間後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、そののち、１００μｌ溶解緩衝液を付着した細胞に添加した。引き続いて、溶解物を用いて導入遺伝子発現（ルシフェラーゼ活性）およびタンパク質濃度を測定した。表Ｖに示す結果は、再度、線維１６キメラアデノウイルスに好都合の、滑膜細胞で観察された感染効率の差異が、使用したウイルスの量よりもむしろ結合効率に関連する差異であることを示す。
【００９３】
実施例５
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼでのＲＡの処理
材料および方法
組換えアデノウイルスベクター：
この研究で使用したアデノウイルスベクターはＡｄ型５突然変異体のＥ１領域に挿入された組換え遺伝子を含有する。サイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）および主要後期プロモーター（ｍｌｐ）は、ｌａｃＺおよびルシフェラーゼマーカー遺伝子を保有する構築物での遺伝子発現を駆動するために、用いられた。ＴＫ遺伝子を保有するＡｄでの遺伝子発現を駆動するために、Ｍｌｐは用いられた。ウイルス濃度はウイルスの力価測定によって測定した。Ａｄは、複製コンピテント野生型ＡｄまたはＥｌａ組換えを含有しないことを試験された。アデノウイルスベクターＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ｌａｃＺ、ＩＧ．Ａｄ．ｍｌｐ．ｌａｃＺ、ＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ｌｕｃ、ＩＧ．Ａｄ．ｍｌｐ．ｌｕｃならびにＩＧ．Ａｄ．ｍｌｐ−Ｉ．ＴＫおよびその生産は従前に詳細に記載されている（Imler et al.；Vincent et al., １９９６)。
【００９４】
滑膜線維芽細胞培養
ヒト滑膜は、関節置換外科手術時にＡＲＡ−基準１９８７（Arnett et al., １９８８）によって規定されるＲＡを有する患者から得た。滑膜細胞組織は、殺菌リン酸緩衝化生理食塩水にて回収された。脂肪および結合組織を捨て、組織を３７ＥＣにて２時間、０．５ｍｇコラーゲナーゼ／ｍｌと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、７５−ｃｍ2フラスコにおける１０ｍｌのイスコフズ（Iscoves）改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）１７％胎児仔ウシ血清（ＦＣＳ）中に播種した。１週間に２回、培地を新鮮なものとした。接着性滑膜細胞の密集培養を７５−ｃｍ2フラスコ中にて１：２の比率で継代した。室温にて、ＰＢＳに溶解させた１．５ｍｌの０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで細胞をフラスコから脱着させた。
【００９５】
感染：
感染に先立つ日に、レポーター遺伝子実験において２５−ｃｍ2容器当たり１００，０００、またはＴＫ実験において１穴当たり（２４穴プレート）５，０００の密度にて滑膜細胞を平板培養した。細胞を、各々、１０または１ｍｌのＩＭＤＭ  １７％ＦＣＳで培養する。滑膜細胞の感染処置において、ＩＭＤＭ  １７％ＦＣＳ中の改変されたウイルスの適当な用量と培地を置き換えた。
【００９６】
ＬａｃＺイン  ビトロ実験
インキュベーションの２日後、滑膜細胞の数を、陰性コントロールおよび感染（ＭＯＩ）１００のウイルス濃度多重度でインキュベートした試料にてカウントした。残存する試料をＰＢＳで洗浄し、グルタルアルデヒド０．２５％で軽く固定し、ＰＢＳ（２×）で洗浄し、５ｍＭ  Ｋ4Ｆｅ（ＣＮ）6、５ｍＭ  Ｋ3Ｆｅ（ＣＮ）6、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2で０．５ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ染色剤（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−８−Ｄ−ガラクトピラノシド；シグマ  ケミカル社(Sigma Chemical Co.)、セントルイス(St. Louis)、アメリカ合衆国）を含有するＰＢＳ中に浸すこと（immersion）によって染色した。４から６時間後、試料を２回洗浄し、グルタルアルデヒド０．２５％によって反応を停止した。感染細胞のパーセンテージを、少なくとも３００細胞をカウントした（倍率１０×４０）に光学顕微鏡によって評価した。
【００９７】
ルシフェラーゼインビトロ実験
Ａｄ．ｌｕｃとのインキュベーションの３日後、滑膜細胞カウントをｌａｃＺ実験に比較して行った。残存する試料をＰＢＳで洗浄し、軽くトリプシン処理した。２００：１溶解緩衝液を用いて滑膜細胞を溶解させた。２０：１の試料を発光方法（luminonetric method）によって分析した。
【００９８】
ＴＫインビトロ実験
Ａｄ．ＴＫとのインキュベーションの１日後、培地をＩＭＤＭ  ４０％正常ヒト血清（ＮＨＳ）と置き換えた。培養物の半分において、１ｍｌ培地あたり１０μｇのＧＣＶ（９−［１，３−ジヒドレート−２−プロポキシ］メチル］グアニン、ロッシュ  ネダーランド  ビーブイ(Roche Nederland BV)、オランダ王国）を添加した。培地プラスまたはマイナスＧＣＶを第３日に新鮮なものとした。ウイルス感染の５日後に細胞カウントを行った。ＴＫ−付随的死滅実験において、滑膜細胞を含む１つの７５−ｃｍ2フラスコをトリプシン処理し、３つのフラスコに分割した。２つのフラスコを、各々、ＩＧ．Ａｄ．ｍｌｐＩ．ＴＫまたはＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫで感染させた。１日後、感染および非感染細胞を計画（scheme）（図１４参照）に従って混合した。ＩＭＤＭ  ４０％ＮＨＳプラスまたはマイナスＧＣＶと培地を置き換えた。細胞カウントは７日後に行った。
【００９９】
動物および関節内注射
全ての動物プロトコルは医学倫理委員会によって認可され、制度ガイドラインに沿って行った。ＣＩＡに罹った８匹の成体アカゲザル（Macaca mulatta）（Bakker, １９９２）をこれらの実験で用い、Ｄ２封じ込め（D2 containment）下に保持した。取り扱い前に、サルは、８５〜９０％ケタミン［１００：１／ｋｇ、１０ｍｇ／ｍｌ］（エーエスピー  ファルマ  ビーブイ  オウドウォーター社(ASP Pharma BV Oudewater)、オランダ王国）および１０〜１５％ベトランキル（vetranquil）のほぼ１ｍｌの単一筋肉内用量で麻酔された。もし動物がひどい痛みを経験すれば、それに０．０６ｍｇのブルプレノルフィン（Burprenorfine）（テムゲシク−アール(Temgesic-R)、シェアリング−プラフビーブイ社(Shering-Plough BV)、アムステルウェーン(Amstelveen)、オランダ王国）を１日当たり２回与えた。関節内刺穿前に、膝を囲う領域を剃り、ヨウ素ですすいだ。滅菌技術を用いて、各々、ＰＢＳに懸濁させた精製組換えウイルスの１ｍｌまたは０．１ｍｌを、計画に従って、膝または基部に近い指節骨間関節（pip）の関節内空間に注射した。ウイルスの注射後４８時間で開始し、サル７および８は半時間で注入する１０ｍｇ／ｋｇのＧＣＶを１４日間毎日受けた。索内刺穿（intracordial punction）および出血（bleeding）によって動物を殺した。アカゲザル実験の要約については、表ＶＩ参照。
【０１００】
パラメーター：
動物を一般的健康につき毎日モニターし、これは挙動、食欲および糞の整合性（consistency）の記録を含んだ。生化学パラメーターの評価は、ウイルス投与後多数経った日に行った（表ＶＩ参照）。この目的で、動物を前記したごとくに沈静し、体重および直腸温度を測定し、静脈血液試料を収集した［凝固した（clotted）およびエチレンジアミンテトラ酢酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）−処理血液］。血液血清の分析は電解質（Ｎａ、Ｋ、Ｃｌおよび重炭酸塩）；腎臓機能（尿、クレアチニン）および肝臓機能［アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギン−アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＡＴ）、アラニン−アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＡＴ）；乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）および全ビリルビリン］；全タンパク質およびアルブミン；および血液学的パラメーター（赤血球細胞および白血球細胞計数、差分計数、血小板計数、赤血球沈積速度（ＥＳＲ）を含んだ。サル５〜８において、静脈血液を凝固チューブ（clot tubes）に吸い、感染病および免疫学の学部でルーチン的処置に従って、補体固定アッセイによってＡｄに対する抗体の存在につき分析した（ＳＳＤＺ  Delft、オランダ王国）。
【０１０１】
糞、尿および咽頭綿棒を異なるサンプリング日に収集し（表ＶＩ参照）、凍結して保存した。分析は、２９３細胞（野生型および組換えウイルスの増殖）およびｈｅｐ−２細胞（野生型ウイルスの増殖）（Bout et al., １９９４）に関して、抽出物を培養することよりなった。
【０１０２】
大動脈、腋窩リンパ節、膀胱、結腸、十二指腸、心臓、鼡径リンパ節、肺、肝臓、肺門のリンパ節、脾臓、左腎臓、食道、膵臓、甲状腺、骨格筋、骨髄、胸腺、気管、子宮／膣および卵巣または前立腺および精巣の完全な死後剖検および組織病理学的調査を行った。これらの組織の試料を、ルーチン的組織病理学的分析のために１０％リン酸緩衝化ホルマリン中で固定した。
【０１０３】
加えて、サルに１〜５において、腋窩リンパ節、心臓、鼡径リンパ節、肝臓、脾臓、左腎臓、肺、膀胱、食道、骨髄ならびに滑膜注射関節部および非注射コントロール関節部のスナップ凍結（snap-frozen）試料を、ルシフェラーゼアッセイのために採取した（Sawchuk, １９９６）。関節を開き、Ｘ−ｇａｌ染色溶液で着色し（Roessler et al., １９９３；Bout et al., １９９３）、ホルマリン中で、少なくとも７２時間、後固定した。ダイアモンド鋸子を用いて関節を切断し、引き続いて切片をプラスチックに包埋し、６：スライスをミクロトームを用いて切断した。ライデン大学病院（Leiden University Hospital）、オランダ王国の病理学的研究所の標準的手法に従って、スライスをヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【０１０４】
結果
イン  ビトロ
滑膜細胞への遺伝子移入の可能性
異なるレポーター遺伝子および異なるプロモーターを用い、滑膜細胞を改変したＡｄで感染させた。ＭＯＩ  １００のＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ｌａｃＺでの滑膜細胞の感染の２日後、６７％の細胞は、細胞の顕微鏡的に見える青色によって証明されるごとく、Ｘ−ｇａｌに対し陽性であった。滑膜細胞培養において、ＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ｌａｃＺおよびＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ｌｕｃでの感染後双方において、添加したウイルスの量とレポーター遺伝子の遺伝子発現との間で用量依存性関係が観察された（表ＸＩおよび表ＸII参照）。インキュベーション時間を５日に延長すると、滑膜細胞の１００％は青色に染色された。ＣＭＶプロモーターによって駆動されたＡｄ構築物での感染後の遺伝子発現は、ｍｌｐ−プロモーターによって駆動されたＡｄ構築物よりも高い。この差異は、ルシフェラーゼをレポーター遺伝子として用いる（±１０×）よりもｌａｃＺをレポーター遺伝子として用いる（±１００×）方が、より顕著である。ＭＯＩ  １００のＩＧ．Ａｄ．ｍｌｐ．ｌａｃＺでの感染の２日後に、１％未満がｌａｃＺにつき陽性であった。しかしながら、もしルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いると、用量依存性様式での明瞭な遺伝子発現が観察された（表ＸII）。
【０１０５】
滑膜細胞への遺伝子移入の毒性
滑膜細胞につき高用量Ａｄで生じる毒性を評価するために、ウイルスなしで滑膜細胞を培養し、またはＭＯＩ  １００でのＡｄ．ｌａｃＺ、Ａｄ．ｌｕｃもしくはＡｄ．ＴＫと共にインキュベートした。ＭＯＩ  １００での改変されたＡｄに感染後の滑膜細胞の細胞カウントは、非感染培養と比較して有意な差異は示さなかった（表ＶＩＩ）。対試料につきスチューデントｔ−検定ｐ＞０．２。
【０１０６】
細胞死滅の効率
ＩＧ．Ａｄ．ｍｌｐ．ＴＫと共にインキュベートした滑膜細胞を、１０：μｇ／ｍｌ  ＧＣＶと共にまたはそれなくして培養した。ＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫでの滑膜細胞の感染およびＧＣＶでのインキュベーション後に９９パーセントの細胞死滅が観察され、ＩＧ．Ａｄ．ｍｌｐ．ＴＫでの感染は８０％細胞死滅に至った（図１１参照）。２５％形質導入滑膜細胞を７５％非形質導入滑膜細胞と混合した後、付随死滅を評価した。ＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫおよびＩＧ．Ａｄ．ｍｌｐ．ＴＫ実験双方において、広範な細胞死滅が観察された（図１２参照）。
【０１０７】
イン  ビボ：
イン  ビボでの炎症滑膜組織への遺伝子移入の可能性および特異性
８匹の異なるサルの３６関節（１０の膝および２６のｐｉｐ）に、異なる量のＩＧ．Ａｄ．ｌａｃＺ、ＩＧ．Ａｄ．ｌｕｃまたはＩＧ．Ａｄ．ｍｌｐ−Ｉ．ＴＫを注射した。生体分布実験において、ＣＭＶプロモーターを選択して、レポーター遺伝子産物の検出において最大感度を可能とした。
【０１０８】
ＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ｌａｃＺでの感染の２〜３日後に得られた関節および関節周囲の組織の組織学的調査は、滑膜組織被覆腱、骨、関節軟骨および滑膜下脂肪組織と同じく、滑膜絨毛に存在するｌａｃ発現細胞を示した（図１３）。典型的位置および形態学的外観によって証明されるごとく、ｌａｃＺ活性を発現する細胞は滑膜細胞であった。感染細胞のパーセンテージは５〜７０％の範囲であった。ＰＢＳを注射した関節および非注射関節はいずれのｌａｃＺ陽性細胞も示さなかった。関節、骨、脂肪または筋肉組織の感染は観察されなかった。（サル５およびｐｉｐ２サル２において）もし効果的ではないｍｌｐプロモーターを使用したならば、ｌａｃＺ陽性細胞は見いだされなかった。
【０１０９】
イン  ビボでの滑膜細胞への遺伝子移入後の用量応答
サル４および５において、増加する量の改変Ａｄを、サルにおいて連続的ｐｉｐ−関節に注射した。ＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ｌａｃＺを注射したサル４のｐｉｐ−関節において、ｌａｃＺ発現細胞のパーセンテージにおいて、明らかな用量−応答関係が観察された（表ＶＩＩＩ）。ＩＧ．Ａｄ．ｍｌｐ．ｌａｃＺを注射したサル５において、ｌａｃＺ陽性細胞は滑膜で観察されなかった。
【０１１０】
レポーター遺伝子を保有するＡｄの関節内（ｉ．ａ．）投与の毒性
体内分布
該処置の毒性を評価するために、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を保有するＡｄを用いて、ウイルスの体内分布を測定した。発光方法によって測定されたルシフェラーゼ活性は、Ａｄによる器官の感染を示した。サル１〜５は、Ａｄ．ＣＭＶ．ｌｕｃまたはＩＧ．Ａｄ．ｍｌｐ．ｌｕｃを注射し、ウイルス投与の２〜３日後に犠牲にした。滑膜組織の検体を採取した。同一バイオプシーから、組織学的確認が得られて、試料が関連組織を含有するかを判断した。サル４において、試料は主として結合組織を含有し、滑膜組織を含有しなかった。ルシフェラーゼアッセイを用い、前記器官および関節の試料を分析した。非処理サルから得られた試料をコントロールとして用いた。１つの試料（頸）およびわずかに上昇したルシフェラーゼカウント数を有する２つの非ウイルス注射関節を除き、ＩＧ．Ａｄ．ｌｕｃ注射関節のみがルシフェラーゼアッセイで陽性であった（表ＩＸ）。
【０１１１】
ウイルスの放出を評価するために、実験の最初の３日間に排出物を培養した。サル５の糞において（０〜３日）、Ａｄは２９３−およびｈｅｐ−２細胞双方で培養できた。このサルの喉綿棒は第１日において２９３細胞で陽性であった。他のサルの糞において、尿および喉綿棒はＡｄ培養アッセイにおいて陰性であった。
【０１１２】
臨床的挙動
実験の間、サル３および５はひどい関節炎に罹り、登りを困難とし、食欲減退および体重減少に至った。ひどい関節炎に罹った１匹のサルは、４０℃へわずかに体温が上昇した。血液試料についての分析は、関節炎兆候の存在に関連したＣＲＰ、血小板増加症、低アルブミン血症および貧血の増加を示した。ＬＤＨ−レベルの小さな増加が観察された（表Ｘ）。
【０１１３】
組織病理学的分析は、全てのサルにおいて、滑膜炎、中程度の慢性胸膜炎、壊死性皮膚炎、軽い慢性腸炎ならびに鼡径および腋窩リンパ節症を示した。Ａｄのｉ．ａ．投与の処置によって誘導された局所的炎症を分析するために、非注射、生理食塩水−注射およびＡｄ−注射関節をルーチン的組織病理学的分析によって比較した。有意な差異は、滑膜過形成またはリンパ球侵潤において観察されなかった。
【０１１４】
自殺遺伝子ＴＫを保有するＡｄのｉ．ａ．投与の毒性
ＴＫ−実験の間に、サルは、該処置のいずれの毒性も検出することが、念入りに観察された。サルの挙動、臨床的観察、生化学的パラメーターおよび組織病理学的分析は、ＣＩＡのサルで以前に報告されているような異常性を示したに過ぎない。レポーター遺伝子処理群と比較して、自殺遺伝子処理群においてさらなる毒性は見られなかった。組織病理学的分析は、単一肝細胞壊死を有するサル６の肝臓におけるリンパ球および血漿細胞での多病巣中央帯および末梢侵潤を除いて、差を明らかにしなかった。炎症した滑膜組織への自殺遺伝子移入の効果は、該処置の局所的毒性として見ることができた。注射した関節の組織学的分析は、コントロール関節と比較して、滑膜過形成またはリンパ球浸潤の差異を明らかとしなかった。関節周囲は、ＩＧ．Ａｄ．ｍｌｐ−Ｉ．ＴＫ、続いてＧＣＶを注射した膝において１ｃｍ、および非注射膝において１から１．５ｃｍ減少した。関節内注射後の１４から１８日に終了したサル６、７および８において、陰性から陽性への抗体力価の逆転が５〜７日に観察された。ウイルスは排出物から培養した。
【０１１５】
実施例６
組換えアデノウイルスベクターの迅速な無ＲＣＡ（RCA-free）産生のためのプラスミドベースの系
アデノウイルスクローンの構築
１．ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ寄託Ｐ９７０８２１２２）
ＩＴＲ配列の平滑末端クローニングを容易とするために、野生型ヒトアデノウイルス型５（Ａｄ５）ＤＮＡを、過剰のｄＮＴＰｓの存在下にてクレノウ酵素で処理した。クレノウ酵素の不活化およびフェノール／クロロホルム抽出、続いてのエタノール沈殿による精製後、ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化した。このＤＮＡ製造は、以下のごとく製造したｐＢｒ３２２由来のベクターＤＮＡとの連結反応において、さらに精製することなく使用した。ｐＢｒ３２２  ＤＮＡをＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩで消化し、ＴＳＡＰ酵素（ライフテクノロジーズ社(Life Technologies)）での処理によって脱リン酸化し、ＬＭＰアガロースゲル（シープラグー  ジーティージー社(SeaPlaque GTG)）で精製した。コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（ライフテクノロジーズ社）への形質転換およびアンピシリン耐性コロニーの分析後に、Ａｄ５におけるＢａｍＨＩ部位から右側ＩＴＲにわたる挿入断片に対して予測されるごとき消化パターンを示した１つのクローンを選択した。
【０１１６】
右側ＩＴＲにおけるクローニング境界の配列分析は、ＩＴＲの最も３’側のＧ残基が失われたことを明らかとし、ＩＴＲの残りは正しいことが判明した。該失われたＧ残基は複製の間に他のＩＴＲによって補足された。
【０１１７】
２．ｐＢｒ／Ａｄ．Ｓａｌ−ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ寄託Ｐ９７０８２１１９）
ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで消化した。アデノウイルス挿入断片を含むベクター断片をＬＭＰアガロース（シープラクー  ジティージー社）で単離し、ｗｔ  Ａｄ５  ＤＮＡから得られた４．８  ｋｂ  ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片に連結し、ジーンクリーンＩＩキット（Bio 101,Inc.）で精製した。１つのロクーンを選択し、制限酵素分析によってＡｄ５配列の一体性を決定した。クローンｐＢｒ／Ａｄ．Ｓａｌ−ｒＩＴＲは、ｂｐ１６７４６のＳａｌＩ部位からｒＩＴＲまでのおよびｒＩＴＲを含むアデノタイプ５配列を含有する（最も３’側のＧ残基を欠いている）。
【０１１８】
３．ｐＢｒ／Ａｄ．Ｃｌａ−Ｂａｍ（ＥＣＡＣＣ寄託Ｐ９７０８２１１７）
ｗｔアデノ型５ＤＮＡをＣｌａＩおよびＢａｍＨＩで消化し、２０．６ｋｂ断片を電気溶出によってゲルから単離した。ｐＢｒ３２２を同一酵素で消化し、ジーンクリーンによってアガロースゲルから精製した。両断片を連結し、コンピテントＤＨ５αに形質転換した。得られたクローンｐＢｒ／Ａｄ．Ｃｌａ−Ｂａｍを制限酵素消化によって分析し、ｂｐ９１９から２１５６６までのアデノウイルス配列を含む挿入断片を含有することが判明した。
【０１１９】
４．ｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−Ｂａｍ（ＥＣＡＣＣ寄託Ｐ９７０８２１１４）
クローンｐＢｒ／Ａｄ．Ｃｌａ−Ｂａｍを（ｐＢｒ３２２において）ＥｃｏＲＩで直線状にし、ＡｆｌＩＩで部分消化した。６５℃での２０分間のＡｆｌＩＩの加熱不活化の後、断片末端をクレノウ酵素で満たした。ついで、ＤＮＡを、ＰａｃＩ部位を含有する平滑二本鎖オリゴリンカー（５’−ＡＡＴＴＧＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＧＣＴＴＡＡ−３）に連結した。このリンカーは以下の２つのオリゴヌクレオチド：５’−ＡＡＴＴＧＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＧＣ−３’および５’−ＡＡＴＴＧＣＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＣ−３’をアニールし、続いてクレノウ酵素で平滑化することによって作成した。緩衝液を変えるための連結ＤＮＡの沈殿の後、連結物を過剰のＰａｃＩ酵素で消化して、該オリゴのコンカテマーを除去した。ｂｐ３５３４から２１５６６までのＡｄ５配列およびベクター配列を含有する２２０１６ｂｐ部分断片をＬＭＰアガロース（シープラクー  ジーティージー社）で単離し、再度連結し、コンピテントＤＨ５αに形質転換した。ＰａｃＩ部位を含有することが判明し、大きなアデノ断片を保持する１つのクローンを選択し、該５’末端において配列決定して、（喪失した）ＡｆｌＩＩ部位におけるＰａｃＩリンカーの正しい挿入を確認した。
【０１２０】
５．ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｐａｃ＃２（ＥＣＡＣＣ寄託Ｐ９７０８２１２０）およびｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ＃８（ＥＣＡＣＣ寄託Ｐ９７０８２１２１）
クローンｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ中のＡｄ５のＩＴＲ近くへのＰａｃＩ部位の挿入を可能とするために、約１９０ヌクレオチドを、ｐＢｒ３２２バックボーン中のＣｌａＩ部位とＩＴＲ配列の開始点との間を除去した。これは以下のごとくに行った。ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲをＣｌａＩで消化し、種々の長さの時間（２′、５′、１０′および１５′）、ヌクレアーゼＢａｌ３１で処理した。ヌクレオチドの除去に続いて、同一の緩衝液および条件を用い、ｐＢｒ３２２  ＤＮＡにつき別々の反応を行った（また、ＣｌａＩ部位において消化した）。７５℃での１０分間のインキュベーションによってＢａ１３１酵素を不活化し、該ＤＮＡを沈殿させ、小容量のＴＥ緩衝液に再懸濁させた。平滑末端を保証するために、過剰のｄＮＴＰｓの存在下でＤＮＡをさらにＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理した。ＳａｌＩでの（コントロール）ｐＢｒ３２２  ＤＮＡの消化の後、１０′または１５′処理した試料で充分な分解（〜１５０ｂｐ）が観察された。ついで、該１０′または１５′処理したｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ試料を前記平滑末端化ＰａｃＩリンカーに連結した（ｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−Ｂａｍ）。連結物を沈殿によって精製し、過剰のＰａｃＩで消化し、ＬＭＰアガロースゲルでリンカーから分離した。再連結後に、ＤＮＡをコンピテントＤＨ５αに形質転換し、コロニーを分析した。ほぼ所望の長さの欠失を示したクローンを選択し、これらをＴ−トラック配列決定によって分析した（Ｔ７配列決定キット、ファルマシア  バイオテク社(Pharmacia Biotech））。２つのクローンが、ｒＩＴＲのすぐ下流に挿入されたＰａｃＩリンカーを有することが判明した。ＰａｃＩでの消化の後、クローン＃２は２８ｂｐを有し、およびクローン＃８はＩＴＲに付着した２７ｂｐを有する。
【０１２１】
ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ寄託Ｐ９７０８２１１６）
コスミドベクターｐＷＥ１５（クロンテック社(Clontech)）は、より大きなＡｄ５挿入断片をクローン化するために使用された。まず、唯一のＰａｃＩ部位を含有するリンカーをｐＷＥ１５のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ｐＷＥ／ｐａｃを得た。この目的で、そのＥｃｏＲＩ突出末端をもつ以外は、ｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩにつき記載したような二本鎖ＰａｃＩオリゴを使用した。ついで、以下の断片をアガロースゲルからの電気溶出によって単離した。ＰａｃＩで消化したｐＷＥ．ｐａｃ、ＰａｃＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＢｒ／ＡｆｌＩＩ−ＢａｍならびにＢａｍＨＩおよびＰａｃＩで消化したｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ＃２。これらの断片を一緒に連結し、製造業者のプロトコルに従って、λファージパッキング抽出物（ストラタジーン社）を用いてパッキングした。宿主細菌への感染の後に、コロニーをプレート上で増殖させ、完全な挿入断片の存在につき分析した。ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲは、ｂｐ３５３４（ＡｆｌＩＩ部位）から右側ＩＴＲまでおよびそれを含む全てのアデノウイルス型５配列を含有する（最も３’側のＧ残基を欠いている）。
【０１２２】
ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ
ｐＷＥ．ｐａｃをＣｌａＩで消化し、５’突出末端をクレノウ酵素を用いて満たした。ついで、該ＤＮＡをＰａｃＩで消化し、アガロースゲルから単離した。ｐＷＥ／ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲをＥｃｏＲＩで消化し、クレノウ酵素での処理後、ＰａｃＩで消化した。アデノウイルス配列を含有する大きな２４ｋｂ断片をアガロースゲルから単離し、クロンテック社からのＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）キットを用いて、ＣｌａＩで消化し平滑末端化したｐＷＥ．ｐａｃベクターに連結した。ストラタジーン社からの超コンピテント（ultracompetent）ＸＬ１０−ゴールド細胞の形質転換後、予測される挿入断片を含有するクローンを同定した。ｐＷＥ／ＡｆｌＩＩ−ＥｃｏＲＩはｂｐ３５３４〜２７３３６のＡｄ５配列を含有する。
【０１２３】
アダプタープラスミドおよび組換えアデノウイルスの産生
アダプタープラスミドｐＭＬＰＩ．ＴＫの産生
アダプタープラスミドｐＭＬＰＴＫ（特許出願ＥＰ９５２０２２１３）は以下のごとくに改変した。ＳＶ４０ポリＡ配列をプライマーＳＶ４０−１（ＢａｍＨＩ部位を導入する）およびＳＶ４０−２（ＢｇｌＩＩ部位を導入する）で増幅した。この構築物（ｎｔ．２９４５からｎｔ．２７７９まで；Ａｄ５配列ｎｔ．３５１１から３７９４まで）に存在するＡｄ５配列を、プライマーＡｄ５−１（ＢｇｌＩＩ部位を導入する）およびＡｄ５−２で増幅した。
【０１２４】
ＳＶ４０−１：５’−ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＧＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＣ−３’
ＳＶ４０−２：５’−ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣ−３’
Ａｄ５−１：５’−ＧＧＧＡＧＡＴＣＴＧＴＡＣＴＧＡＡＡＴＧＴＧＴＧＧＧＣ−３’
Ａｄ５−２：５’−ＧＧＡＧＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＣＧＧＣＧＴ−３’
【０１２５】
両ＰＣＲ断片をＢｇｌＩＩで消化し、連結した。連結産物をプライマーＳＶ４０−１およびＡｄ５−２で増幅し、ＢａｍＨＩおよびＡｄｌＩＩで消化した。ついで、消化した断片を同一酵素で予め消化したｐＭＬＰ．ＴＫに連結した。ｐＭＬＰＩ．ＴＫと呼ばれる得られた構築物はｎｔ．４５９からｎｔ．３５１０までのアデノウイルスＥ１配列に欠失を含有する。
【０１２６】
ｐＡｄ５／Ｌ４２０．ＨＳＡ、ｐＡｄ５／ＣｌｉｐおよびｐＡｄ５／Ｃ１ｉｐｓａｌの産生
ｐＭＬＰＩ．ＴＫを用いて、特異的プロモーターおよび遺伝子配列よりなる核酸分子を容易に交換することができる新しいベクターを作製した。
【０１２７】
まず、ＰＣＲ産物を、以下のプライマーにて（ＰＣＴ／ＮＬ９６／００１９５に記載された）ｐＺｉｐΔＭｏ＋ＰｙＦ１０１（Ｎ-）鋳型ＤＮＡから産生した。ＬＴＲ−１：５’−ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＡＧＧ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＡＡＣ  ＴＧ−３’およびＬＴＲ−２：５’−ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＧＣＧ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  Ｇ−３’。以下の温度サイクルでの製造業者のプロトコルに従い、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー  マンハイム社(Boehringer Mannheim)）を用いた。９５℃で５′を１回：５５℃で３′；および７２℃で１′、ならびに９５℃での１′、６０℃で１′、７２℃で１′を３０サイクル、続いて１回の７２℃での１０分。ついで、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、ＰｖｕＩＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＭＬＰ１０（Levrero et al., １９９１；Gene 101, １９５−２０２）に連結し、それにより、ベクターｐＬＴＲ１０を得た。このベクターはｂｐ１からｂｐ４５４までのアデノウイルス配列、続いての、突然変異体ポリオーマウイルス（ＰｙＦ１０１）由来のエンハンサーで置き換えられたその野生型エンハンサー配列を有するＭｏ−ＭｕＬＶ  ＬＴＲの一部よりなるプロモーターを含有する。該プロモーター断片をＬ４２０と命名した。配列決定により、ＬＴＲ断片の正しい増幅が確認されたが、ＰＣＲ断片において最も５’側の塩基が失われ、従って、ＰｖｕＩＩ部位は回復されなかった。つぎに、マウスＨＳＡ遺伝子のコーディング領域を挿入した。ｐＬＴＲ１０をＢｓｔＢＩで消化し、続いてクレノウ酵素で処理し、ＮｃｏＩで消化した。ＨＳＡ遺伝子は以下のプライマーを用い、ｐＵＣ１８−ＨＳＡ（Kay et al., １９９０；J.Immunol.145, １９５２−１９５９）でのＰＣＲ増幅によって得た。ＨＳＡ１、５’−ＧＣＧ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＣＧＡ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  Ｃ−３’およびＨＳＡ２、５’−ＧＴＴ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＴＡＧ  ＡＡ−３’。ＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩ部位を用い、２６９ｂｐの増幅された断片をシャトルベクターにサブクローン化した。配列決定により、ＴＡＧ停止コドンに直ぐに続いて過剰のＴＡＧ挿入がある以外は、ＨＳＡ遺伝子の正しいコーディング配列の組込が確認された。ついで、ＴＡＧ重複を含めたＨＳＡ遺伝子のコーディング領域をＮｃｏＩ（付着）−ＳａｌＩ（平滑）断片として切り出し、ｐＬＴＲ１０由来の３．５ｋｂ  ＮｃｏＩ（付着）／ＢｓｔＢＩ（平滑）断片にクローン化し、その結果、ｐＬＴＲ−ＨＳＡ１０を得た。
【０１２８】
最後に、ｐＬＴＲ−ＨＳＡ１０をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そののち、左側ＩＴＲ、パッケージングシグナル、Ｌ４２０プロモーターおよびＨＳＡ遺伝子を含有する断片を、同一酵素で消化したベクターｐＭＬＰＩ．ＴＫに挿入し、それにより、プロモーターおよび遺伝子配列を置き換えた。この結果、プロモーターおよび遺伝子配列の周囲に種々の制限酵素用の便宜な認識部位を含有する新しいアダプタープラスミドｐＡｄ５／Ｌ４２０−ＨＳＡを得た。プロモーター配列を交換するために、ＳｎａＢＩおよびＡｖｒＩＩをＨｐａＩ、ＮｈｅＩ、ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩと組み合わせることができ、他方、後者の部位は、この構築物中の遺伝子を置き換えるために、ＨＳＡコーディング領域由来のＣｌａＩまたはＢａｍＨＩ部位と組み合わせることができる。
【０１２９】
核酸分子の容易な交換を可能とするように設計されたもう１つのアダプタープラスミドは、ｐＡｄ５／Ｌ４２０−ＨＳＡ中のプロモーター、遺伝子およびポリＡ配列をＣＭＶプロモーター、多重クローニング部位、イントロンおよびポリＡシグナルで置き換えることによって作製した。この目的では、ｐＡｄ５／Ｌ４２０−ＨＳＡをＡｖｒＩＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、続いて、クレノウで処理して平滑末端を得た。ｐＢｒ３２２ベクターおよびアデノウイルス配列を有する５．１ｋｂ断片を単離し、ＨｈａＩおよびＡｖｒＩＩで消化し、続いてＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理することによって得られたｐｃＤＮＡ１／ａｍｐ（インビトロゲン社(Invitrogen)）由来の平滑１５７０ｂｐ断片に連結した。このアダプタープラスミドをｐＡｄ５／Ｃｌｉｐと命名した。アデノウイルス断片由来のベクター配列の除去を可能とするために、ｐＡｄ５／ＣｌｉｐをＥｃｏＲＩで部分的に消化し、線状断片を単離した。配列５’ＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣ−３’のオリゴをそれ自体にアニールし、ＳａｌＩ部位およびＥｃｏＲＩ突出を持つリンカーを得た。該リンカーを部分的に消化したｐＡｄ５／Ｃｌｉｐベクターに連結し、ｐＡｄ５／Ｃｌｉｐにおける左側アデノウイルスＩＴＲの２３ｂｐ上流のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたリンカーを有するクローンを選択し、ｐＡｄ５／Ｃｌｉｐｓａｌを得た。
【０１３０】
ｐＡｄ５ＣｌｉｐＬａｃＺ、ｐＡｄ５Ｃｌｉｐ．Ｌｕｃ、ｐＡｄ５Ｃｌｉｐ．ＴＫおよびｐＡｄ５Ｃｌｉｐｓａｌ．Ｌｕｃの産生
アダプタープラスミドｐＡｄ５／Ｃｌｉｐ．ＬａｃＺを以下のごとくに産生した。プライマー
５’ＧＧＧＧＴＧＧＣＣＡＧＧＧＴＡＣＣＴＣＴＡＧＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡおよび
５’ＧＧＧＧＧＧＡＴＣＣＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＡＡＴＣＣ
でのＰＣＲによって、プラスミドｐＭＬＰ．ｎｌｓＬａｃＺ（ＥＰ  ９５−２０２  ２１３）からＥ．ｃｏｌｉ  ＬａｃＺ遺伝子を増幅した。以下の増幅プログラムで、供給業者のプロトコルに従ってＰＣＲ反応をＥｘ  Ｔａｑ（宝酒造株式会社）で行った。９４℃での５分間、１サイクル；９４℃の４５秒間および６０℃の３０秒間および７２℃の２分間、５サイクル；９４℃の４５秒間および６５℃の３０秒間および７２℃の２分間、２５サイクル；７２℃の１０分間；９４℃の４５秒間および６０℃の３０秒間および７２℃の２分間、５サイクル、Ｉサイクル。引き続いて、ＰＣＲ産物をＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化し、消化されたＤＮＡ断片をＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ消化のｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社）に連結し、ｐｃＤＮＡ３．ｎｌｓＬａｃＺを得た。つぎに、プラスミドｐＡｄ５／ＣｌｉｐをＳｐｅＩで消化した。５’部分ＣＭＶプロモーターの一部およびアデノウイルス配列を含有する大きな断片を単離した。プロモーターｐｃＤＮＡ３．ｎｌｓＬａｃＺをＳｐｅＩで消化し、ＣＭＶプロモーターの３’部分およびｌａｃＺ遺伝子を含有する断片を単離した。引き続いて、断片を連結してｐＡｄ／Ｃｌｉｐ．ＬａｃＺを得た。ＣＭＶプロモーターの再構築は制限消化によって確認された。
【０１３１】
アダプタープラスミドｐＡｄ５／Ｃｌｉｐ．Ｌｕｃを以下のごとくに産生した。プラスミドｐＣＭＶ．Ｌｕｃ（ＥＰ  ９５−２０２  ２１３）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化した。ルシフェラーゼ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を単離した。アダプタープラスミドｐＡｄ５／ＣｌｉｐをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、大きな断片を単離した。つぎに、単離されたＤＮＡ断片を連結し、ｐＡｄ５／Ｃｌｉｐ．Ｌｕｃを得た。ベクター断片としてＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化したアダプターｐＣｌｉｐｓａｌを用いる以外は同様にして、アダプターｐＣｌｉｐｓａｌ．Ｌｕｃを産生した。同様に、ｐＣＭＶ．ＴＫ（ＥＰ  ９５−２０２２１３）由来のＴＫ含有ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＣｌｉｐｓａｌに挿入してｐＡｄ５／Ｃｌｉｐ．ＴＫを得た。左側ＩＴＲのすぐ上流のＳａｌＩ部位の存在は、アデノ挿入断片由来のベクター配列の放出を可能とする。これらのベクター配列の除去は、ＰＥＲ．Ｃ６における相同組換えの間のベクター産生の頻度を増強する。
【０１３２】
ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｆｉｂ１６の産生
Ａｄ５／Ａｄ１６キメラ線維を有する組換えアデノウイルスの便宜な産生を可能とするために、本発明者らは、コスミドクローンｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ中のＡｄ５線維の代わりにキメラ線維遺伝子をクローン化した。ｐＢｒ／ＡｄＢａｍＲｐａｃ．ｆｉｂ１６構築物およびｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩ構築物をＢａｍＨＩおよびＰａｃＩで消化して、それをｐＢｒプラスミドから遊離させた。それらをゲルから単離し、アガラーゼ（ベーリンガー社(Boehringer)）を用いることによって清浄した。ｐＷＥ．ｐａｃ構築物をＰａｃＩで消化してそれを線状化し、フェノール／クロロホルムによって清浄した。３点連結反応を用いて、ｐＢｒ／ＡｄＢａｍＲｐａｃ．ｆｉｂ１６構築物およびｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩ構築物のＢａｍＩ部位を一緒に連結し、ｐＷＥ．ｐａｃ構築物をＰａｃＩ部位にて連結する。連結反応ミックスは３つの構築物、Ｔ４リガーゼ、５ｍＭ  ＡＴＰおよびＰＥＧ無しの連結反応緩衝液よりなる。０．１〜１．０μｇの連結されたＤＮＡを含有する１〜４μｌの連結混合物をパッキング抽出物に添加する。別に、１μｌの陽性野生型ラムダＤＮＡコントロールを組みあわせた。チューブを迅速に回転させ、ＲＴで最大２時間インキュベートした。各々に、５００μｌのＳＭ緩衝液（５．８ｇのＮａＣｌ、２．０ｇのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、５０ｍｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍｌの２％（重量／容量）ゼラチンおよび１リットルまでの脱イオン水）および２０μｌのクロロホルムをパッキング混合物に添加して反応を停止させた。チューブを軽く回転させて夾雑物を沈積させた。ファージを含有する上清は今や４℃で１カ月まで保存されることができる。
【０１３３】
ＤＨ５α株およびＶＣＳ２５７株の細菌グリセロールストックをＬＢ寒天プレート上に画線接種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4および０．２％（重量／容量）マルトースを補充した１０ｍｌのＬＢ培地を各細菌株の単一コロニーと共にインキュベートする。最大１．０のＯＤ600に達するまでこれを３７℃で増殖した。ついで、５００×ｇ１０分間で細菌をペレット化した。ペレットを５ｍｌの滅菌１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4に再懸濁し、ほぼ０．５のＯＤ600値に達するまで１０ｍＭ  ＭｇＳＯ4に希釈する。
【０１３４】
陽性野生型ラムダファージコントロールのうち、１０-2および１０-4希釈をＳＭ緩衝液中にて作製した。他の最終パッキング反応のうち、１０-1および１０-2希釈をＳＭ緩衝液中にて作製した。陽性コントロールの１０-4希釈のうち１０μｌを、２００μｌのＶＣＳ２５７宿主細胞（ＯＤ600  ０．５）に添加した。これを３７℃で１５分間インキュベートし、３ｍｌのＬＢ上部寒天（top agar）（ＬＢ培地中０．７％アガロース）（５０℃）を添加し、直ちに予め加温したＬＢ寒天プレート上で延べる（plate）。他の最終パッキング反応の１０-1および１０-2希釈のうち、２５μｌを２５μｌのＤＨ５α宿主細胞（ＯＤ600  ０．５）に添加した。これをＲＴで３０分間インキュベートする。各々、２００μｌのＬＢ培地を添加し、続いて３７℃で１時間インキュベーションした。混合物を短時間回転させ、細菌ペレットを１００μｌのＬＢ培地に再懸濁させ、所要量のアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート上で延ばした。プレートを３７℃で一晩インキュベーションする。結局、コロニーを増殖させ、必要なＤＮＡを制限消化によって試験する。ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲｆｉｂ１６は、Ａｄ５線維に存在するＮｄｅＩ部位から３’側の線維コーディング領域を除き、全てのアデノウイルス型５配列を含有し、これらの配列をＡｄ１６由来の線維配列と置き換え、オープンリーディングフレームを無傷のままとする。
【０１３５】
線維改変を有する組換えウイルスの産生
アダプタープラスミドｐＡｄ５／Ｃｌｉｐ．ＴＫ、ｐＡｄ５／Ｃｌｉｐ．ＬａｃＺまたはｐＡｄ５／Ｃｌｉｐ．ＬｕｃをＳａｌＩで消化して、相同アデノウイルス配列およびベクター由来の左側ＩＴＲを遊離した。ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｄｌＩＩ−ｒＩＴＲｆｉｂ１６をＰａｃＩで消化した。ついで、フェノール／クロロホルム抽出およびＥｔＯＨ沈殿を用いてＤＮＡを精製し、滅菌トランスフェクション上質水に再溶解させた。各構築物の４μｇを、１日前に２．５×１０6細胞で播種してあるＴ２５フラスコにおいてＰＥＲ．Ｃ６細胞にトランスフェクションした。６〜８日後の全ＣＰＥの発生時に、細胞を培地中で採取し、新鮮なＰＥＲ．Ｃ６細胞上にて３ｍｌの３×凍結−解凍細胞溶解物の感染によって増幅した。全ＣＰＥにおいて、細胞を凍結−解凍によって採取し、ウイルスをＰＥＲ．Ｃ６細胞での２回のプラーク精製によって精製した。全ての場合において、プラークは導入遺伝子発現につき陽性であり、生産用のシードストックを産生するために、１つを拾った。
【０１３６】
実施例７
コラーゲン誘導関節炎を罹った非ヒト霊長類における組換えアデノウイルスベクターでの滑膜細胞の感染
酵素β−ガラクトシダーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉ由来のＬａｃＺ遺伝子を担うキメラアデノウイルスによる関節滑膜の形質導入性を、ＲＡについての非ヒト霊長類モデルにおいてイン  ビボでテストした。等容量のフロイントの完全アジュバントに乳化させた合計５ｍｇのウシコラーゲンＩＩ型（１０  ｍｇ／ｍｌ）を、アカゲザル  マカカ  マラタ（Maccaca mulatta）に１０回皮下注射した。該動物は完全破損コラーゲン誘導関節炎（full blown cllagen induced arthritis）（ＣＩＡ）を８週間内に発症した。引き続いて、左側膝に１*１０11ウイルス粒子（ｖｐ）ＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＬａｃＺを関節内注射した。右側膝に１*１０11ｖｐ  ＩＧ．Ａｄ．ＣｌｉｐＬａｃＺ．ｆｉｂ１６を注射した。１ｍｌの希釈液（５％スクロースを補充したＰＢＳ）の全容量にてにてベクターを投与した。侵入の部位は膝蓋骨の中点のすぐ下方の中央であった。膝蓋骨上嚢に向けて直線状に針を導入した。関節包を通過した後、ベクターを関節腔に注射した。そののち、シリンジおよび針を関節から取り出した。注射３日後に、動物を犠牲にした。左側肘に１ｍｌの希釈物のみを注射し、陰性コントロールとして供した。右側肘は未処理のままとした。膝関節および肘を単離し、リン酸緩衝化２％パラホルムアルデヒド／０．２５％グルタルアルデヒド中で３時間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、Ｘ−Ｇａｌ溶液（５ｍＭ  Ｋ4Ｆｅ（ＣＮ）6、５ｍＭ  Ｋ3Ｆｅ（ＣＮ）6、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2および０．５  ｍｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−８−Ｄ−ガラクトプラノシド）中で一晩インキュベートし、ＰＢＳで充分洗浄した。膝関節の過形成滑膜内張（lining）はＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＬａｃＺで染色された。しかしながら、ＩＧ．Ａｄ．Ｃｌｉｐ．ＬａｃＺ．ｆｉｂ１６注射した膝はより強く青色で染色され、これは、Ａｄ１６の線維を担う組換えキメラアデノウイルスが、Ａｄ５の線維を担う組換えアデノウイルスよりも、過形成滑膜をより効果的に感染することを示す。形質導入された組織の詳細な分析により、ＩＧ．Ａｄ．ＣｌｉｐＬａＺ．ｆｉｂ１６処理した関節のパンヌス組織における陽性核の数はＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＬａｃＺ処理関節で見いだされた陽性核の数よりも有意に高いことが確認された。染色された核はパンヌス組織中に数細胞層深いことが判明した。軟骨層の軟骨細胞または希釈物または非注射関節において染色は見いだされなかった。これらの結果は、過形成滑膜が、ＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＬａｃＺベクターと比較して、イン  ビボにてキメラ組換えＩＧ．Ａｄ．Ｃｌｉｐ．ＬａｃＺ．ｆｉｂ１６ベクターでより効果的に形質導入できることを示す。さらに、結果は、軟骨細胞（軟骨再生に必要な良性細胞）ではなく、病気の組織（過形成滑膜）が、好ましくは組換えアデノウイルスベクターによって少なくとも形質導入されたことを示す。
【０１３７】
実施例８
コラーゲン誘導関節炎に罹った非ヒト霊長類における組換えアデノウイルスベクターでの滑膜細胞の用量依存性形質導入
ＬａｃＺ遺伝子を担うキメラアデノウイルスによる関節炎滑膜の形質導入性を、前記したＲＡについての非ヒト霊長類モデルにおいてイン  ビボで用量増大研究で試験した。全容量０．１ｍｌにて近位指節骨間（ｐｉｐ）に関節内投与するＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＬａｃＺまたはＩＧ．Ａｄ．Ｃｌｉｐ．ＬａｃＺ．ｆｉｂ１６の増加させる用量で、ＣＩＡに罹ったサルを処理した。各々、ＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＬａｃＺまたはＩＧ．Ａｄ．ＣｌｉｐＬａｃＺ．ｆｉｂ１６につき、左または右手において、１×１０7から１×１０10ｖｐまでの範囲の増加させるベクター用量を、ｐｉｐ２ないし５に注射した。コントロールとして、０．１ｍｌの希釈物をｐｉｐ１の両手に注射した。第５日に犠牲にした後、手のｐｉｐ関節を２％パラホルムアルデヒド／０．２５％中で固定し、Ｘ−ＧＡＬで染色して前記したごとくにＬａｃＺ発現をモニターした。ＬａｃＺアデノウイルスの注射した用量と滑膜組織中のｌａｃＺ発現細胞の数との間で正の相関が観察された。さらに、ＩＧ．Ａｄ．ＣｌｉｐＬａｃＺ．ｆｉｂ１６ベクター処理関節は、同一ベクター用量でのＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＬａｃＺ処理関節よりも多くのＬａｃＺ陽性細胞を含有し、これは、過形成滑膜は、慢性関節リウマチについての関連するモデルにおいて、ＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＬａｃＺベクターによるよりもキメラ組換えＩＧ．Ａｄ．ＣｌｉｐＬａｃＺ．ｆｉｂ１６ベクターによる方がより効果的に形質導入されることを確認する。注射した関節の顕微鏡観察により、ｌａｃＺ活性を発現する細胞は、典型的位置および形態学的外観によって示されるごとく、滑膜細胞であることが確認された。
【０１３８】
実施例９
ＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＴＫおよびＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＴＫ．ｆｉｂ１６で感染させたＲＡに罹った患者からの病気滑膜の死滅、続いてのイン  ビトロでのガンシクロビルでの処理
ＲＡに罹った患者から滑膜を前記したごとくに単離した。感染の前日に、１０4滑膜細胞を組織培養皿上に延べた。翌日、滑膜細胞を含む８つの皿を、１、１０、１００および１０００ｖｐ／細胞の増加するｍ．ｏ．ｉ．にて、ＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＴＫまたはＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＴＫ．ｆｉｂ１６いずれかで感染させ、または模造物（mock）処理した。感染の４時間後、感染培地を、１０μｇ／ｍｌガンシクロビルを補充したまたは補充しない４０％正常ヒト血清を含有するＩＭＤＭと置き換えた。第０、５、７および１０日に、細胞をカウントした。ＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＴＫ．ｆｉｂ感染細胞はガンシクロビルを含有する培地において、これらの皿中の全細胞数の減少によって決定されるごとく、ＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＴＫ感染細胞よりも、特により低いｍ．ｏ．ｉ．にて、より効果的に死滅された。模造物処理細胞またはガンシクロビルを含まない培地中の感染細胞はいずれも死滅されず、死滅はＡｄ．ＴＫベクターおよびガンシクロビルの組合せによって引き起こされたことを示す。かくして、ＲＡに罹った患者からの過形成滑膜は、プロドラッグのガンシクロビルでの処理と組み合わせたＴＫを発現する組換えＩＧ．Ａｄベクターでの感染に対して感受性である。さらに、ＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＴＫ．ｆｉｂ１６感染後の滑膜細胞の死滅は、ガンシクロビルの存在下でのＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＴＫ感染後の死滅よりもより効果的であった。
【０１３９】
つぎに、処理の付随的効果に向けられた。その目的で、滑膜細胞を前記したごとくに１００のＭ．Ｏ．Ｉ．でＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＴＫで感染させた。翌日、感染細胞をトリプシン処理し、１：４（２５％）または１：２（５０％）の比率にて同一患者からの非感染滑膜細胞と混合した。コントロールとして、非感染（０％）および非混合（１００％）細胞を実験に含ませた。７日後、細胞を、４０％正常ヒト血清および１０μｇ／ｍｌガンシクロビルを補充したＩＭＤＭ中で培養し、１皿当たりの細胞の合計数を決定した。ＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＴＫで感染させた滑膜細胞（１００％）は死滅された。さらに、細胞のあるパーセンテージ（各々、５０％および２５％）のみがＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＴＫで感染された混合細胞集団もまた死滅された。これは、ＴＫ遺伝子を発現する組換えＩＧ．Ａｄベクターで感染されたヒト滑膜細胞が、ＧＣＶ処理後に実質的付随的効果を有することを示す。
【０１４０】
実施例１０
ＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＴＫおよびＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＴＫ．ｆｉｂ１６の関節内注射後の過形成滑膜の死滅、続いてのコラーゲン誘導関節炎に罹った非ヒト霊長類におけるガンシクロビル治療
等容量のフロイント完全アジュバントに乳化させた、合計して、５ｍｇのウシＩＩ型コラーゲン（１０ｍｇ／ｍｌ）でアカゲザルを１０回皮下注射し、ＣＩＡを誘導した。動物は８週間内に完全破損関節炎を発症した。引き続いて、左膝に、合計容量１ｍｌの希釈物にて、１×１０11ｖｐ  ＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＴＫを関節内注射した。右膝に、合計容量１ｍｌの希釈物にて、１×１０11ｖｐ  ＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＴＫ．ｆｉｂ１６を注射した。侵入の部位は膝蓋骨の中点のすぐ下方の中央であった。膝蓋骨上嚢に向けて直線状に針を導入した。関節包を通過した後、物質を膝関節内に注射した。そののち、シリンジおよび針を関節から取り出した。左肘に１ｍｌの希釈物を注射し、陰性コントロールとして供した。２から１５日間、２５ｍｌ滅菌水中のガンシクロビル１０ｍｇ／ｋｇ／日で毎日３０分以内にて、サルを静脈内処理した。第１８日に犠牲にした後、サルの膝および肘を組織病理学的分析のために取り出した。膝の滑膜バイオプシーを液体窒素中でスナップ凍結し、＜−６０℃で保存した。
【０１４１】
アポトーシスの間のゲノムＤＮＡの開裂は、二本鎖の低分子量核ＤＮＡ断片（モノおよびオリゴヌクレオソーム）ならびに高分子量ＤＮＡにおける一本鎖破壊（「ニック」）を生じる。ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ−媒体ｄＵＴＰニック末端標識（TdT-mediated dUTP nick and end labeling））は、アポトーシス誘導ＤＮＡストランド破壊の酵素的イン  サイチュ（in situ）標識の方法である。ＤＮＡにおけるストランド破壊は、酵素的反応において、ＤＮＡ断片の遊離３’−ＯＨ末端を修飾されたヌクレオチドで標識することによって同定することができる。断片化ＤＮＡの遊離３’−ＯＨ末端に対するヌクレオチドの重合を触媒するターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）をポリメラーゼとして使用する。取り込まれたフルオレセイン−１２−ｄＵＴＰは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）と複合体にされたヒツジからの抗−フルオレセイン抗体Ｆａｂ断片によって検出される。該手法は供給業者（プロメガ社(Promega)）によって広く記載されている。基質反応の後に、標識された断片化ゲノムＤＮＡを光学顕微鏡下で可視化した。
【０１４２】
希釈物を注射した肘からの滑膜組織はバックグラウンド組織染色を示し、これは、病気の滑膜でいくらかのアポトーシスが起こったことを示す。陰性コントロール（ＴｄＴ酵素を添加しない）において、染色は検出できなかった。陽性コントロール（ＤＮａｓｅで処理されて、ＴＵＮＥＬアッセイが開始される前にＤＮＡストランド破壊を誘導する試料）は、組織の全ての部分で染色を示した。ＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＴＫ注射関節からの試料は、希釈物処理関節の滑膜組織試料よりも、より染色された細胞を示し、これは、ＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＴＫ−ＧＣＶ治療のためより多くの細胞がアポトーシスに入ったことを示す。最も染色された細胞は、ＩＧ．Ａｄ．ＣＬＩＰ．ＴＫ．ｆｉｂ１６で注射した関節で見いだされた。染色は滑膜および滑膜組織の双方で存在し、これは、該治療が全組織試料を通じて効果的であることを示唆する。これらのデータは、ＴＫ遺伝子を発現するｒｅｃＡｄベクターでの処理、続いてのＧＣＶ処理が、関節炎関節において非外科的滑膜切除を行う可能な方法であることを示す。加えて、これらのデータは、線維１６を含有する組換えアデノウイルスベクターが導入遺伝子を滑膜組織に導入するのに優れていることを示す。
【０１４３】
実施例１１
ＲＡ滑膜細胞に対するＡｄ５．ｌｕｃおよびＡｄ５．ｆｉｂ１６．ｌｕｃの感染の比較
各実験において、１２穴マイクロタイター皿中の１穴当たり合計１５，０００のＲＡ滑膜細胞を播種した。細胞をＡｄ５．ｌｕｃ（バッチｎｒ．ＩＣ０２０−０３２）またはＡｄ５．ｆｉｂ１６．ｌｕｃ（バッチｎｒ．Ｂ２０４−１３０Ｃ）で種々のｍ．ｏ．ｉ．にて感染させ、一晩インキュベートした。７２時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。データを表ＸＩＩＩにまとめる。グラフ表示は図１４にある。
【０１４４】
実施例１２
ＲＡ滑膜細胞に対するＡｄ５．ｌａｃＺおよびＡｄ５．ｆｉｂ１６．ｌａｃＺの感染の比較
各実験において、１２穴マイクロタイター皿中の１穴当たり合計１５，０００滑膜細胞を播種した。細胞をＡｄ５．ｌａｃＺ（バッチｎｒ．Ｂ２６９−１８６）またはＡｄ５．ｆｉｂ１６．ｌａｃＺ（バッチｎｒｓ．Ｂ２０４−１２０ＡおよびＢ２０４−１２０Ｂ）で種々のｍ．ｏ．ｉ．にて感染させ、一晩インキュベートした。７２時間後に、ｌａｃＺ−陽性細胞の％を測定した。データを表ＸＩＶにまとめる。グラフ表示は図１５にある。
【０１４５】
実施例１３
ＲＡ滑膜細胞に対するＡｄ５．ＧＦＰおよびＡｄ５．ｆｉｂ１６．ＧＦＰの感染の比較
各実験において、１２穴マイクロタイター皿中の１穴当たり合計１５，０００ＲＡ滑膜細胞を播種した。細胞をＡｄ５．ＧＦＰ（バッチｎｒ．Ｂ２０４−１０３およびＢ２０４−１３０Ｄ）またはＡｄ５．ｆｉｂ１６．ＧＦＰ（バッチｎｒｓ．Ｂ２０４−１０３およびＩＣ０５４−０２４Ｂ）で種々のｍ．ｏ．ｉ．にて感染させ、一晩インキュベートした。７２時間後に、ＧＦＰ活性を測定した。データを表ＸＶａおよびＸＶｂにまとめる。グラフ表示は図１６ＡおよびＢにある。
【０１４６】
実施例１４
ＲＡ滑膜細胞に対する線維−修飾ウイルスの感染の比較
一連のキメラアデノウイルスを、ＲＡ滑膜細胞に対するその感染性につき試験した。以下のキメラアデノウイルスを生産した。Ａｄ５．ｆｉｂ５、１１、１６、２４、２８、３３、３５、４５および４７、各々はルシフェラーゼ導入遺伝子を担う。各実験において、１２穴マイクロタイター皿中の１穴当たり合計１５，０００のＲＡ滑膜細胞を播種した。細胞を種々のｍ．ｏ．ｉ．にてキメラアデノウイルスで感染させ、一晩インキュベートした。７２時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。データを表ＸＶＩにまとめる。グラフ表示は図１７にある。
【０１４７】
実施例１５
ＲＡ滑膜細胞に対する３つのＢ型線維改変ウイルスの感染の比較
各々がＢ型線維を担う３つのキメラアデノウイルスを、Ａｄ５との比較において、ＲＡ滑膜細胞に対するその感染力につき試験した。以下のキメラアデノウイルスを生産した。Ａｄ５．ｆｉｂ１６、３５および５１、各々はＧＦＰ導入遺伝子を担う。各実験において、１２−穴マイクロタイター皿中の１穴当たり合計５０，０００のＲＡ滑膜細胞を播種した。細胞を種々のｍ．ｏ．ｉ．にてキメラアデノウイルスで感染させ、一晩インキュベートした。７２時間後に、ＧＦＰ活性を測定し、ＧＦＰ−陽性細胞の％を測定した。データを表ＸVIIａおよびｂにまとめる。グラフ表示は図１８ａおよびｂにある。
【０１４８】
実施例１６
ＲＡ滑膜細胞に対する３つのＢ型線維修飾ウイルスの感染の比較
各々がＢ型線維を担う３つのキメラアデノウイルスを、Ａｄ５との比較において、ＲＡ滑膜細胞に対するその感染力につき試験した。以下のキメラアデノウイルスを生産した。Ａｄ５．ｆｉｂ１１、１６および３５、各々はルシフェラーゼ導入遺伝子を担う。各実験において、１２穴マイクロタイター皿中の１穴当たり合計１５，０００のＲＡ滑膜細胞を播種した。細胞を種々のｍ．ｏ．ｉ．にてキメラアデノウイルスで感染させ、一晩インキュベートした。７２時間後に、ルシフェラーゼ活性を測定した。データを表ＸVIIIにまとめる。グラフ表示は図１９にある。
【０１４９】
実施例１７
異なる患者におけるＡｄ５およびＡｄ５．ｆｉｂ１６でのＲＡ滑膜細胞の感染の比較
滑膜細胞は慢性関節リウマチに罹った６人の異なる患者から得た。滑膜細胞は２または２０時間の間にＡｄ５．ｌａｃＺまたはＡｄ５．ｆｉｂ１６．ｌａｃＺで感染させ、４８時間後にｌａｃＺ発現につき染色した。青色細胞の数は顕微鏡下でカウントした。データは表ＸＩＸにまとめ、図２０にプロットする。
【０１５０】
【表１】
0004683727.tif 000002
【０１５１】
【表２】
0004683727.tif 000003
【０１５２】
【表３】
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【０１５３】
【表４】
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【０１５４】
【表５】
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【０１５５】
【表６】
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【０１５６】
【表７】
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【０１５７】
【表８】
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【０１５８】
【表９】
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【０１５９】
【表１０】
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【０１６０】
【表１１】
0004683727.tif 000012
【０１６１】
【表１２】
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【０１６２】
【表１３】
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【０１６３】
【表１４】
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【０１６４】
【表１５ａ】
0004683727.tif 000016
【０１６５】
【表１５ｂ】
0004683727.tif 000017
【０１６６】
【表１６】
0004683727.tif 000018
【０１６７】
【表１７ａ】
0004683727.tif 000019
【０１６８】
【表１７ｂ】
0004683727.tif 000020
【０１６９】
【表１８】
0004683727.tif 000021
【０１７０】
【表１９】
0004683727.tif 000022
【０１７１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ構築物の模式図である。
【図２】  図２は、ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ構築物から線維遺伝子を除くために用いられた方策の模式図である。
【図３】  図３は、構築物ｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲΔｆｉｂの模式図である。
【図４】  図４は、キメラ線維Ａｄ５／１６配列である。
【図５】  図５は、構築物ｐＣｌｉｐｓａｌ−Ｌｕｃの模式図である。
【図６】  図６は、重なる部分のある３つの断片を用いて、キメラアデノウイルスを産生する方法の模式図である。早期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域が指示されている。Ｌ５は、線維コード領域である。
【図７Ａ】  図７Ａは、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて公表されたアデノウイルス１６線維タンパク質をコードする遺伝子を含む配列、および本発明において単離されたアデノウイルス１６変異型由来の線維をコードする遺伝子を含む配列であり、ここでは、線維タンパク質の配列はＮｄｅＩ部位由来である。図７Ａは、ヌクレオチド配列比較の図である。
【図７Ｂ】  図７Ｂは、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて公表されたアデノウイルス１６線維タンパク質をコードする遺伝子を含む配列、および本発明において単離されたアデノウイルス１６の変異型由来の線維をコードする遺伝子を含む配列であり、ここでは、線維タンパク質の配列はＮｄｅＩ部位由来である。図７Ｂは、アミノ酸比較の図である。
【図８】  図８は、異なる量の１細胞当たりのウイルス粒子（ＭＯＩ）および２つの異なるアデノウイルスを用いる滑膜細胞の感染を示す図である。Ａｄ５＝Ａｄ５．Ｃｌｉｐ．Ｌｕｃ。Ａｄ５／１６＝Ａｄ５．Ｌｕｃ−ｆｉｂ１６。２時間感染処置後の４８時間のルシフェラーゼ導入遺伝子発現は、１マイクログラム全細胞溶解産物当たりの相対光ユニット（relative light unit）（＝RLU）として表わされている。エラーバーは平均値の標準誤差（SEM）を表す。
【図９】  図９は、異なる濃度の細胞を用いる滑膜細胞の感染を示す図である。２時間感染処置後の４８時間のルシフェラーゼ導入遺伝子発現は、１マイクログラム全タンパク質当たりの相対光ユニット（＝RLU）として表わされている。エラーバーはＳＥＭを表す。実際のＭＯＩは、細胞濃度で異なり、１細胞当たり２００００ウイルス粒子（細胞密度１２５００）から１細胞当たり２５００ウイルス粒子（細胞密度１０００００）まで変動した。
【図１０】  図１０は、異なるウイルス接触期間（virus expose period）を用いる滑膜細胞の感染を示す図である。２時間または２０時間ウイルス接触（virus exposure）後の４８時間のルシフェラーゼ導入遺伝子発現は、１マイクログラムタンパク質当たりの相対光ユニット（＝RLU）として表わされている。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１１】  図１１は、ＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ＴＫまたはＩＧ．Ａｄ．ｍｌｐ−Ｉ．ＴＫとともにインキュベートされた滑膜細胞を示す図である。
【図１２】  図１２は、０／１００、５０／５０、２５／７５および０／１００の割合でＴＫ感染および非ＴＫ感染滑膜細胞双方を含む培養物にて評価した付随的殺細胞（bystander killing）を示す図である。細胞はＧＣＶとともに、またはＧＣＶなしで培養された。
【図１３Ａ】  図１３Ａは、膝におけるＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ｌａｃＺの関節内注射後３日の、滑膜組織におけるＸ−ｇａｌ発現を示す図である。図１３Ａは顕微鏡図である。
【図１３Ｂ】  図１３Ｂは、膝におけるＩＧ．Ａｄ．ＣＭＶ．ｌａｃＺの関節内注射後３日の、滑膜組織におけるＸ−ｇａｌ発現を示す図である。図１３Ｂは、メイヤーズハマランロサング（Mayers Hamalanlosung）で対比染色された滑膜組織の直接ＬａｃＺ染色を示す図である。
【図１４】  図１４は、ＲＡ滑膜細胞におけるＡｄ５．ｌｕｃおよびＡｄ５．ｆｉｂ１６．ｌｕｃの感染の比較を示す図である。
【図１５】  図１５は、ＲＡ滑膜細胞内にＡｄ５．ｌａｃＺおよびＡｄ５．ｆｉｂ１６．ｌａｃＺを有するｌａｃＺ陽性細胞％を示す図である。
【図１６Ａ】  図１６Ａは、ＲＡ滑膜細胞におけるＡｄ５．ＧＦＰおよびＡｄ５ｆｉｂ１６．ＧＦＰの感染効率を示す図である。
【図１６Ｂ】  図１６Ｂは、Ａｄ５．ＧＦＰかＡｄ５ｆｉｂ１６．ＧＦＰに感染したＲＡ滑膜細胞におけるＧＦＰ生産を示す図である。
【図１７】  図１７は、ＲＡ滑膜細胞における一連のキメラアデノウイルスの感染力を示す図である。
【図１８Ａ】  図１８Ａは、ＲＡ滑膜細胞における３つのＢ型線維変異ウイルスに感染した細胞の％を示す図である。
【図１８Ｂ】  図１８Ｂは、ＲＡ滑膜細胞における３つのＢ型線維変異ウイルスを用いるＧＦＰ生産を示す図である。
【図１９】  図１９は、ＲＡ滑膜細胞における３つのＢ型線維変異アデノウイルスの感染力の比較を示す図である。
【図２０】  図２０は、６人の異なる患者由来のＲＡ滑膜細胞における感染力Ａｄ５．ｌａｃＺ対Ａｄ５．ｆｉｂ１６．ｌａｃ６の比較を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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