(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細長い、可撓性圧力管の連通通路に沿って流体的に結合された駆動バルブ内に含まれるシステム流体中にトラップされた気体をパージする方法であって、前記連通通路の一端は、前記システム流体を提供するシステム流体リザーバと流体連通し、一方、前記連通通路の反対端は、分注オリフィスと流体連通し、前記方法は、
前記システム流体を前記駆動バルブを通して、前記圧力管の前記一端および前記分注オリフィスの間の前記連通通路内へと流すことによって、前記駆動バルブおよび前記連通通路が乾燥状態から流体状態へと変換されること、
前記システム流体が前記駆動バルブを通って前記システム流体リザーバから前記分注オリフィスへと流れることを阻止する閉鎖状態と、前記システム流体が前記連通通路を通って流れることを可能にする開放状態との間で、それぞれ所定の期間だけ少なくとも２つの異なる離散周波数において前記駆動バルブを急速に駆動することによって、前記駆動バルブおよび対応する連通通路内のトラップされた気体を前記分注オリフィスを通してパージし吐出すること
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
前記システム流体を実質的に一定のバックプレッシャで加圧することによって、実質的に一定の圧力ヘッドを前記駆動バルブにおいて提供することをさらに含む方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、
前記駆動バルブを前記それぞれの離散周波数において前記それぞれの所定の期間、前記急速に駆動することは、設定された回数、実行される方法。
【請求項４】
請求項２に記載の方法であって、
前記駆動バルブを前記急速に駆動することは、複数の設定された離散周波数において前記駆動周波数を変化させることによって実行され、前記離散周波数のうちの一つにおけるそれぞれの駆動はそれぞれ所定の期間である方法。
【請求項５】
請求項２に記載の方法であって、
前記複数の離散周波数は、約１Ｈｚから約１７５０Ｈｚの範囲にある方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、
前記複数の離散周波数は、約１０Ｈｚから約４２０Ｈｚの範囲にある方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法であって、
それぞれの離散周波数において前記それぞれの所定の期間、それぞれの回数、前記分注バルブを駆動することをさらに含む方法。
【請求項８】
請求項４に記載の方法であって、
前記駆動周波数を前記変化させることは、前記離散周波数において前記駆動周波数を徐々に増加させるランプ状周波数スイープによって実行される方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、
前記駆動周波数を前記徐々に増加させることは、約１０Ｈｚから約４２０Ｈｚの範囲において実行される方法。
【請求項１０】
請求項４に記載の方法であって、
前記駆動周波数を前記変化させることは、前記離散周波数において前記駆動周波数を徐々に減少させるランプ状周波数スイープによって実行される方法。
【請求項１１】
請求項２に記載の方法であって、
前記バックプレッシャは、約２．０ｐｓｉから約１５．０ｐｓｉの範囲にある方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、
前記バックプレッシャは約８．０ｐｓｉである方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、
前記システム流体を加圧することは、実質的に一定のバックプレッシャを前記システム流体リザーバにおいて加圧気体で形成する方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、
前記システム流体を前記加圧することは、前記システム流体が前記連通通路内に流れ込む前に実行される方法。
【請求項１５】
非接触液体分注システムの対応する細長い可撓性圧力管のそれぞれの連通通路に沿って流体的に結合された複数の駆動バルブ内に含まれるシステム流体からトラップされた気体を同時にパージする方法であって、それぞれの前記圧力管の一端は、前記システム流体を提供するシステム流体リザーバと流体連通し、一方、その他端はそれぞれの分注オリフィスと流体連通し、前記方法は、
（ａ）それぞれの各圧力管の一端およびその各分注オリフィスの間のそれぞれの連通通路内に前記システム流体を同時に流すことによって、それぞれの駆動バルブおよびそれぞれの前記連通通路が乾燥状態から流体状態へと変換されること、
（ｂ）前記システム流体が前記駆動バルブを通って前記システム流体リザーバから前記各分注オリフィスへと流れることを阻止する各閉鎖状態と、前記システム流体が前記連通通路を通って流れることを可能にする各開放状態との間で、各所定の期間、離散周波数においてそれぞれの駆動バルブを同時に急速に駆動することによって、それぞれの各駆動バルブおよびそれぞれの各連通通路内に含まれるトラップされた気体が前記各分注オリフィスを通してパージされ、吐出されるようにすること
を含む方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
前記システム流体リザーバ内の前記システム流体を加圧気体で加圧することによって、実質的に一定圧力ヘッドをそれぞれの駆動バルブにおいて形成すること
をさらに含む方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、
前記各所定の期間、それぞれの駆動バルブを前記同時に急速に駆動することは、それぞれ、所定の回数、実行される方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法であって、
前記同時に急速にそれぞれの駆動バルブを駆動することは、複数の設定された離散周波数において前記駆動周波数を変化させることによって実行され、前記離散周波数のうちの一つにおけるそれぞれの駆動はそれぞれ所定の期間である方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、
前記複数の離散周波数は、約１０Ｈｚから約４２０Ｈｚの範囲にある方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法であって、
それぞれの離散周波数において前記それぞれの所定の期間、それぞれの回数、前記分注バルブを駆動することをさらに含む方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、
前記駆動周波数を前記変化させることは、前記離散周波数において前記駆動周波数を徐々に増加させるランプ状周波数スイープによって実行される方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、
前記駆動周波数を前記徐々に増加させることは、約１０Ｈｚから約４２０Ｈｚの範囲において実行される方法。
【請求項２３】
請求項１８に記載の方法であって、
前記駆動周波数を前記変化させることは、前記離散周波数において前記駆動周波数を徐々に減少させるランプ状周波数スイープによって実行される方法。
【請求項２４】
請求項１６に記載の方法であって、
前記システム流体を前記加圧することは、約２．０ｐｓｉから約１５．０ｐｓｉの範囲の前記加圧気体を供給することによって実行される方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、
前記システム流体を前記加圧することは、約８．０ｐｓｉの範囲の前記加圧気体を供給することによって実行される方法。
【請求項２６】
請求項２４に記載の方法であって、
気体が溶け込むことを抑制し、実質的に前記システム流体に溶解しない加圧気体を選択することをさらに含む方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、
前記加圧気体を選択することは、ヘリウムを選択することを含む方法。
【請求項２８】
請求項１５に記載の方法であって、
（ｃ）実質的に同じ期間、前記閉鎖状態から前記開放状態へと、かつ前記閉鎖状態へと戻してそれぞれの前記駆動バルブを駆動することによって、前記各圧力管のそれぞれの分注オリフィスからシステム流体をそれぞれ分注すること、
（ｄ）それぞれの分注オリフィスから分注された前記システム流体の容量を測定すること、
（ｅ）前記測定された容量の平均分散を計算すること、
（ｆ）前記平均分散から所定のパーセンテージより多く変化するシステム流体の測定された容量を有するそれぞれの圧力管について、イベント（ｂ）を繰り返すこと
をさらに含む方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、
それぞれの圧力管についての前記各分注容量が前記平均分散から前記所定のパーセンテージより多く変化しないようになるまで、イベント（ｃ）〜（ｆ）を繰り返すこと
をさらに含む方法。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法であって、
前記所定のパーセンテージは、約３％から約７％の範囲にある方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、
前記所定のパーセンテージは、約５％の範囲にある方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、発明者Johnsonら、２００２年１月２５日出願の「METHODS FOR HIGH-PERFORMANCE, LOW-VOLUME DISPENSING」と題された米国仮特許出願第６０／３５１，８５８号（弁護士整理番号ＩＮＶＤＰ００４Ｐ）に基づく35 U.S.C. §119のもとの優先権を主張し、この仮特許出願は、その全体が全ての目的のためにここで参照によって援用される。
【０００２】
本発明は、液体ハンドリングの方法および装置に関し、より具体的には非接触、高パフォーマンス、比較的低容量の液体分注の方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００３】
生命科学、特にゲノム解析およびプロテオーム解析は、生物工学および製薬産業界によってなされなければならない反応および分析の数を飛躍的に増加させてきている。推定３０００万回のテストが、典型的な製薬会社の化合物ライブラリをターゲット受容体に対してスクリーニングするためには必要とされる。この典型的な数のテストは、情報がヒトゲノムのシーケンスから集められるにつれて劇的に増加する。これらの増加するスループットの要求を経済的に実現可能なかたちで満足するためには、テストの小型化が不可避である。
【０００４】
技術的な進歩によって、さまざまなタイプの分析を行うためのマイクロスケールにおける化学／生化学反応の実証および使用が可能にしている。このように小さなスケールにおけるこれら反応を実現することは、従来のアプローチによっては釣り合わないような経済学をもたらす。容量が小さくなったことにより、コストは大きさにしたがって削減されるが、従来の液体ハンドリングデバイスは必要とされる容量では機能しない。パラレルインプリメンテーションは、スクリーニングのための高密度プレートおよびタンパク質の質量分析のための高密度ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦプレートの使用によって示されるように、より多くの優位性を提供する。律速するハードウェアは、注目化合物のためのロバストでスケーラブルな低容量液体トランスファー技術である。大きくなる要求とともに、複数の試薬のサブマイクロリットルの容量（すなわちナノリットルからマイクロリットル）を操作するのに適した液体ハンドリングデバイスの開発が望まれる。
【０００５】
液体試薬ハンドリングを行う最近のシステムは、しばしば「ピックアンドプレース」手法を採用し、ここでソースプレートからのサンプル、通常はマイクロリッタのプレートが取り上げられ、ターゲットプレートとして知られる他のリザーバに置かれる。この手法は、プレートを反復試験に使うためにしばしば適用され、ここでソースおよびターゲットプレート間のスケールの縮小が効果的に実現される。典型的には適切な容量がソースプレートから吸引され、複数のターゲットプレート上のターゲットサイトに置かれる。この構成において、縮小されたサンプル容量およびサンプル間隔がより高い縮小化のために必要である。これら液体ハンドリングシステムは、大きくは２つの液体分注タイプにカテゴライズされえる。すなわち接触液体分注装置および非接触液体分注装置である。
【０００６】
接触液体ハンドリングのこのような一つのタイプは、キャピラリー接触分注であり、ここで液体試薬の液体トランスファーのためには物理的接触が必要である。例として、薄い細長いピンツールを用いて、その先がソースプレート内の液体試薬サンプル中に浸され、それからターゲットプレートのターゲットサイトにおいて液体試薬サンプルをその上に垂らすために基板表面と物理的に接触するよう動かされる。キャピラリー動作を通じて、液体のある程度の量がチップに付着し、それから接触することでターゲットサイトにトランスファーされる。
【０００７】
しかしこのアプローチは、本質的に体積計測の点では不正確であり、これはピンツール表面に付着する液体の量がサイクル毎にばらつきえるからである。さらに液滴の「ウィッキング」のために、ピコリットルオーダーの比較的小さい分注量は、乾いた表面上に供給されるときスケールダウンされた高スループットスクリーニングアセイのために要求される充分な正確さをもっては反復的に得られない。さらに吐出量を推測するために、いくつかの物理特性およびパラメータが考慮されなければならない。これらには、ごく少ない例を挙げるだけで、液体試薬の表面張力、液体表面の液体状態、試薬液体の基板表面への親和性、試薬液体のピンツール表面への親和性、吐出接触の運動量、および基板表面上の生物化学的コーティングの塗布が含まれる。このキャピラリー接触分注手法に付随する他の問題は、ツールチップおよびターゲットサイトの不用意なクロスコンタミネーションに対して弱いことで、これは複数の試薬を扱い、ターゲットサイト密度が高いときに特にそうである。さらに壊れやすい生物化学コーティングは、しばしばテストサイトの表面上に用いられ、これは付着接触のあいだにピンツールのチップによって容易に破損しえる。
【０００８】
非接触タイプ液体分注システムについては、液体分注は、分注装置およびターゲットとされた基板表面の間の物理的接触なしに行われる。典型的にはこれらシステムは、容積式ポンプ、シリンジベース液体ハンドラ、圧電ディスペンサおよびソレノイドベースのディスペンサを含み、これらの技術のそれぞれはそれらの長所および短所を持つ。例えば圧電ベースのシステムは、ピコリットルのオーダーでの低容量液体ハンドリングのタスクを正確な吐出で行うことができる。さらにこれら装置は、テストサイトアレイ密度を増やすことができる位置の正確な動き制御プラットフォームと共に用いられる。
【０００９】
このアプローチは、ピコリットルオーダーで低容量の試薬吐出を正確にできるが、これらシステムに付随する一つの問題は、圧電ヘッドのディスペンスオリフィスに直接、流体的に結合された専用の、つまり固定されたサンプルリザーバが必要なことである。しかしこの非接触技術の応用は、サブマイクロリットルの容量の複数の試薬が必要なときは労働集約的である。さらにピコリットルレベルでの体積の正確さは、部分的には小さいディスペンスオリフィス直径に依存するもので、この小さい直径はしばしば詰まりやすい。またこれらシステムのスケーラビリティは悪くなるが、これはオリフィスの小さい直径のためにパルス当たりの容量ディスペンスが制限されるからである。
【００１０】
一方で非接触液体分注のためのソレノイドベースのアクチュエーションは、圧電ベースの液体ディスペンサシステムに比べてずっと融通が利き、スケーラビリティがある。液体試薬サンプルをシステムのフローパスまたは連通通路（例えばチューブの）に引き込む従来の吸引手法を用いると、比較的大きな容量または反復した小さい容量がソレノイドによって高い精度でディスペンスされる。
【００１１】
しかしこれらの設計に付随する一つの問題は、ソレノイドベースのアクチュエータは、ディスペンスフローパスと同一ライン上に配置されなければならないことである。したがって、分注アクチュエータの要素を通して引き込まれた試薬サンプルのフローは、よくない静摩擦を引き起こしえる。結果的には、分注アクチュエータの寿命を本来よりも短くさせると共に、容量吐出の不正確さが生じることになる。
【００１２】
この問題に対応するために、他の相溶性システム流体（典型的には濾過されたイオン除去水）が吸引された液体試薬の上流で加えられ、試薬が分注アクチュエータに接触することを防ぐ。この２流体吐出のアプローチは、広い範囲の反復で容量をディスペンスするのにうまくいくことが証明されてきている。しかしサンプル・試薬およびシステム流体の間の液体境界における分散または希釈効果のために、大きなオーバフィル容量が必要とされる。これは、ソレノイドの反復的アクチュエーションが流体境界における撹拌を増す、反復液体分注には特に当てはまる。図１（ディスペンスされた試薬サンプルの測定された濃度対ディスペンス回数を示す）のチャートに示されるように、容量測定の正確さは一定のままであるが、液体試薬サンプルの測定された濃度は、５０回から６０回の吐出の後、大きく低下する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、液体サンプル・試薬濃度の低下をきたさず、マイクロリットルからナノリットルの容量測定の正確さを持った反復的で低容量、非接触な液体分注を提供するスケーラブルで非接触の液体ハンドリングシステムおよび方法が望まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、反復した精密で低容量の液体を非接触液体分注装置の分注オリフィスから分注する装置および方法を提供する。分注装置の細長い連通通路は、システム流体リザーバと流体連通する一端および分注オリフィスにおいて終端する反対端内部壁によって規定される。システム流体は、システム流体リザーバから分注オリフィスへと実質的に連続的に伸びる連通通路内に入れられる。気体流体が連通通路の断面寸法の横断面にわたって実質的に連続的に伸びるように、比較的小さい容量の気体流体（gaseous fluid）が分注オリフィスを通して吸引され、連通通路内に導かれる。その後、吸引された気体流体の比較的小さい容量が、連通通路の内部壁と、連通通路に含まれるシステム流体および分注液体の間の液体境界との間に完全に閉じ込められた微細な単体のエアギャップを形成するように、分注液体は、分注オリフィスを通して吸引され、連通通路内に導かれる。このエアギャップは、液体境界におけるそれらの間の分散および希釈を実質的に阻止する。分注を行うために、所定のパルス幅を持つ急速な圧力パルスが、微細なエアギャップから上流でシステム流体に印加され、微細エアギャップの実質的な流体圧縮なしに、圧力パルスが微細エアギャップを移動し、分注液体へと伝わるようにする。これにより分注オリフィスから液体を分注することの実質的に正確で比較的低容量の非接触液体分注が可能になる。
【００１５】
したがって、より小さい容量のインライン気体を吸引することは、約５．０マイクロリットルより大きい場合には不可能な、容量計測分注の正確さおよび再現性を大きく改善することがわかった。連通通路の横断断面寸法にわたって伸びる約２５０ナノリットルから約２．０マイクロリットルの範囲の単一の連続エアギャップを適用することで、正確で低容量の非接触液体分注がこれら非接触液体分注装置から吐出され、一方で、境界における液体の充分な分離を維持することによってシステム流体による分散および希釈を最小化する。
【００１６】
これら離散エアギャップは、与えられた直径について約１０マイクロリットルより大きいエアギャップとは異なり、本質的に実質的に非圧縮性流体として振る舞う。圧力パルスが連通通路をつたって伝搬していくとき（後述のようにバックプレッシャおよび分注アクチュエータの開放および閉鎖から発生する）、圧力パルスは、この離散エアギャップ境界を、コンプライアンスによる大きなエネルギー損失なく伝わっていくことができる。これにより、ピコリットルからマイクロリットルの反復した正確で低容量の非接触液体分注のために、分注オリフィスにわたり圧力パルスをよりうまく制御できる。
【００１７】
ある具体的な実施形態において、システム流体は、実質的に一定のバックプレッシャの気体で加圧される。よって、システム流体リザーバから下流で、エアギャップよりは上流の連通通路と流体連通する急速な駆動分注バルブは、流体フローを発生させるために駆動されえる。バックプレッシャはある構成では、約２．０ｐｓｉから約１５．０ｐｓｉの範囲にあり、好ましくは約８．０ｐｓｉである。加圧気体は、ガスが溶け込むことを抑制する、システム流体に実質的に不溶性であるものから選択されえる。そのような気体の一つはヘリウムである。
【００１８】
エアギャップは好ましくは、分注オリフィス内へと、連通通路に流体的に結合された計測分析吸引装置を通して計量される。このような装置の一つは、計量分析シリンジである。分注液体はまた、連通通路内でこの吸引装置を通して計測され、分注バルブから約１．０から約３．０インチより大きいエアギャップを維持する。
【００１９】
本発明の他の局面において、駆動バルブ中に含まれるシステム流体内にトラップされた気体がパージされ、これら非接触液体ハンドリングシステムの分注オリフィスを通して吐出される。システム流体は、最初は駆動バルブを通して流され、圧力管の一端および分注オリフィスの間の連通通路内に入ることによって、駆動バルブおよび連通通路が乾燥状態から流体状態へ変換される。前記システム流体が前記駆動バルブを通って前記システム流体リザーバから前記分注オリフィスへと流れることを阻止する閉鎖状態と、前記システム流体が前記連通通路を通って流れることを可能にする開放状態との間で、駆動バルブを急速に駆動することによって、駆動バルブおよび対応する連通通路内にトラップされた気体は、パージされ分注オリフィスから吐出されえる。
【００２０】
各離散周波数における駆動バルブの急速駆動は、好ましくは各所定の期間だけ、所定の回数行われる。さらに駆動バルブの急速駆動は好ましくは駆動周波数を複数の所定の離散周波数において変動されることによって実行される。離散周波数のうちの一つにおけるそれぞれの駆動は、各所定の期間、各所定の回数、行われる。ある例では、複数の離散周波数は、約１Ｈｚから約１７５０Ｈｚの範囲にあり、一方、他の例では、複数の離散周波数は、約１０Ｈｚから約４２０Ｈｚの範囲にある。
【００２１】
駆動周波数を変化させることは、離散周波数において駆動周波数を徐々に増加させるランプ状周波数スイープによって実行されえる。あるいは、駆動周波数を変化させることは、離散周波数において駆動周波数を徐々に減少させるランプ状周波数スイープによって実行されえる。
【００２２】
マルチチャネル液体ハンドリング装置において、パージング手法も適用可能である。システム流体は、それぞれ各圧力管の一端および各分注オリフィスの間のそれぞれ各連通通路に流れ込みえ、それによりそれぞれの駆動バルブおよびそれぞれの連通通路は乾燥状態から流体状態（hydraulic state）に変換される。その後、それぞれのチャネルについての対応する駆動バルブは、各閉鎖状態および各開放状態の間で急速に駆動されえる。それぞれの駆動は、離散駆動周波数において各所定の期間、実行され、それぞれの各駆動バルブおよびそれぞれの各連通通路内に含まれるトラップされた気体はパージされ各分注オリフィスを通して吐出される。
【００２３】
このマルチチャネル構成において、駆動バルブのそれぞれは、実質的に同じ期間、駆動されえ、それぞれシステム流体を、各圧力管のそれぞれの分注オリフィスから分注する。それぞれのチャネルからの各分注された容量が測定されえる。測定された容量の平均分散（mean variance）を計算すること、および特定のチャネルから分注された実際の測定された容量を平均分散と比較することによって、パージルーチンが成功したかを決定できる。これは測定された容量が平均分散から所定のパーセンテージより多く変化したかによって決定される。この所定のパーセンテージは、約３％から約７％の範囲であり、より好ましくは約５％である。所定のパーセンテージを超えられ場合、ルーチンは繰り返される。
【００２４】
本発明のさらに他の局面において、任意のハードウェア構成（例えばチューブ長、オリフィス直径、チップ設計など）、試薬溶液特性および環境条件に適用しえるこれら低容量の非接触液体分注システムからの分注出力を推定するための万能の較正手法が開発された。この同じ較正手法は、ハードウェア構成または溶液特性にかかわりなく、所望の容量（約０．０５０μＬから５０μＬの範囲）を分注するようこれら非接触液体分注システムを較正または微調整するために適用されえる。すなわち較正手法は変数のどれにも依存しないが、結果（実際の分注容量）は上述の変数に依存する。
【００２５】
したがって、この較正手法は、それぞれのハードウェア構成について、かつその特定のハードウェア構成から分注されるそれぞれの試薬液体について実行されなければならない。簡単には、この較正手法においては、前記選択された範囲の容量の液体の前記最小容量に相関する低いベースパルス幅より小さい第１パルス幅のあいだ前記分注バルブが正確に駆動される。さらに前記選択された範囲の容量の液体の前記最大容量に相関する上側シーリングパルス幅より大きい第２パルス幅のあいだ前記分注バルブが正確に駆動される。さらに少なくとも３つの異なる、間隔の空いた中間パルス幅のあいだ前記分注バルブは正確に駆動される。前記第１容量、前記第２容量、および前記少なくとも３つの中間容量が正確に測定される。簡単には、重量計測および分光写真法が好ましいが、任意の正確な容量測定法が応用されえる。
【００２６】
これら測定された容量、および対応するパルス幅を用いて、較正点を通してオリフィスから分注された液体容量を分注バルブの各パルス幅に相関付ける較正プロファイルが構築される。曲線近似法を用いて、残りの較正プロファイルが内挿される。さらに較正プロファイルを応用して、液体分注のための１つ以上のターゲットにされた容量に相関付けるパルス幅が外挿されえる。
【００２７】
本発明の他の局面において、正確で低容量の液体ハンドリングシステムの連通通路に流体的に結合された比較的小さい直径の分注オリフィスを通して液体を分注する液体フローパフォーマンスを評価するためのフローセンサが含まれる。このセンサは、前記分注オリフィスから液体を分注する前に、前記液体ハンドリングシステムの前記分注オリフィスから下流おいて実質的に水平に伸びる光学パスに沿って前記分注オリフィスの一方の側から外側の位置から光ビームを放射するビーム放射器を含む。このセンサは、前記分注オリフィスの反対側から外側の位置から、前記光学パスに沿って前記光ビームを連続的に検出する受光器を含む。一般に充分なだけ前記分注液体を前記連通通路を通して流すことによって、少なくとも１つの液滴の分注液体を前記分注オリフィスから、前記光ビームの前記光学パスを横切って吐出するとき、液滴が検出されるか、または検出されない。もし前記液滴が検出されれば、センサは、前記分注オリフィスを通しての前記分注流体のフロー状態を示し、もし前記液滴が検出されなければ、前記分注オリフィスを通しての前記分注流体の非フロー状態を示す。
【００２８】
液滴がビームの中を通過するとき、受光された光ビームは、受光器による強度が低減される。よってセンサは、光ビームの検出において、変化または停止を検出する。
【００２９】
放射デバイスは、光ビームを放射するレーザダイオードによって提供されえる。受光要素はそれから、ダイオードによって放射された波長を検出する。受光要素の感度は調節可能であり、それにより液滴が受光要素にとってより「見やすい」ようにされる。これは、受光要素によって受光される光ビームの強度を弱めることによって実行されえる。ディフューザが強度を弱めるために利用されえる。
【００３０】
他の実施形態において、センサは、比較的小さい直径の複数の分注オリフィスが実質的に直線のアレイ中にアラインされた、マルチチャネル液体分注システムにおいて応用されえる。この構成において、センサは、前記分注オリフィスから液体を分注する前に、前記液体ハンドリングシステムの前記分注オリフィスから下流おいて実質的に水平に伸びる光学パスに沿って前記分注オリフィスの一方の側から外側の位置から光ビームを放射する光ビームの放射器を含む。このセンサは、前記分注オリフィスの反対側から外側の位置から、前記光学パスに沿って前記光ビームを連続的に検出する受光器を含む。一般に充分なだけ前記分注液体を前記連通通路を通して流すことによって、少なくとも１つの液滴の分注液体を前記分注オリフィスから、前記光ビームの前記光学パスを横切って吐出するとき、液滴が検出されるか、または検出されない。もし前記液滴が検出されれば、センサは、前記分注オリフィスを通しての前記分注流体のフロー状態を示し、もし前記液滴が検出されなければ、前記分注オリフィスを通しての前記分注流体の非フロー状態を示す。このシーケンスは、それぞれの残りの分注オリフィスのそれぞれについて分注オリフィスの全体のアレイについての動作フロー状態を評価するためにシーケンシャルに反復されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】インライン気体ギャップの適用なしで非接触液体分注システムを利用した１００ｎｌ試薬分注のシーケンス（試薬濃度で測定）のパフォーマンスを示すチャートである。
【図２】本発明によって構築されたインラインエアギャップを組み込んだ非接触液体分注システムの概略図である。
【図３】本発明によって構築されたインラインエアギャップを組み込んだマルチチャネル非接触液体分注システムの概略図である。
【図４】図３の代替の概略図である。
【図５】本発明によってインライン気体ギャップの適用ありで非接触液体分注システムを利用した１００ｎｌ試薬分注のシーケンス（試薬濃度で測定）のパフォーマンスを示すチャートである。
【図６】本発明と組み合わせて利用されたＸ−Ｙ−Ｚ「ピックアンドプレース」メカニズムの上透視図である。
【図７】本発明による「パージ」ルーチンにおける利用されるある具体的なセットの周波数のテーブルである。
【図８】本発明によって構築され、ノズルアレイにマウントされたオリフィス詰まり検出アセンブリの断面における拡大された一部の底部平面図である。
【図９】図８のオリフィス詰まり検出アセンブリの断面における一部側面の正面図である。
【図１０】本発明の較正手法によって構築された０．１マイクロリットルから１．０マイクロリットルの範囲の容量を分注する較正プロファイルのグラフである。
【図１１】図１０の較正プロファイルを構築するために選択された測定された較正点のある具体的なセットのテーブルである。
【図１２】開放バルブ時間（すなわちパルス幅）と相関付けての分注バルブを通しての過渡および定常フローを示す非線形分注プロファイルのグラフである。
【図１３】図１４〜１８の較正プロファイルを構築するために選択された測定された較正点を含む分注容量の３つの具体的な範囲に関連するデータのテーブルである。
【図１４】本発明の較正手法によって構築された１．０マイクロリットルから１０．０マイクロリットルの範囲の容量を分注する較正プロファイルのグラフである。
【図１５】本発明の較正手法によって構築された１０．０マイクロリットルから４０．０マイクロリットルの範囲の容量を分注する較正プロファイルのグラフである。
【図１６】図１０、１４および１５の較正プロファイルのための３レンジ複合較正プロファイルのグラフである。
【図１７】図１０および１４の較正プロファイルのための２レンジ複合較正プロファイルのグラフである。
【図１８】図１４および１５の較正プロファイルのための２レンジ複合較正プロファイルのグラフである。
【図１９】下側および上側ベースパルス幅の間の中間測定較正点を選択するためのデータを含む分注容量の３つの具体的な範囲に関連するデータのテーブルである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明の構成は、他の目的および優位性の特徴を持ち、これらは添付図面と併せて、本発明を実施するベストモードの以下の説明および添付の特許請求の範囲から明らかだろう。
【００３３】
本発明は、いくつかの具体的な実施形態を参照して記載されるが、この記載は本発明を例示的に示すものであって、本発明を限定するように解釈されるべきではない。本発明についてのさまざまな改変は、特許請求の範囲によって規定される本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、当業者によって好ましい実施形態に対して行われえる。よりよい理解のためにさまざまな図を通して同様の要素は同様の参照番号によって示される。
【００３４】
図２を参照して、大きく２０で示される非接触液体ハンドリング方法およびシステムが提供され、これは、ターゲットまたは宛先基板表面２１上に正確な低容量、液体分注が可能である。広くは、ある具体的な実施形態において、液体ハンドリングシステム２０は、圧力サブシステム２２、流体吸引（fluid aspiration）（入力）サブシステム２３、流体分注（fluid dispensing）（出力）サブシステム２５および流体切替サブシステム２６を含む。より具体的には、液体ハンドリングシステム２０の圧力サブシステム２２は、流体圧力ライン２８および３０を介して、液体吸引（入力）サブシステム２３の液体吸引源３１、および液体分注（出力）サブシステム２５の液体分注源３２に独立して流体的に結合された加圧されたシステム流体リザーバ２７を含む。さらにこれらソース３１、３２は、細長い流体連通通路（fluid communication passageway）３３を介して分注オリフィス３５に流体連通を提供する液体切替サブシステム２６に独立して流体的に結合される。ある構成においては、このオリフィス３５は、それからの流体吸引および分注の両方を可能にする分注ノズル３６の遠端に位置する。
【００３５】
さらに図２および図３に最もよく示されるように、システム２０の流体フローパスは、切替サブシステム２６の切替バルブ３７を介して、吸引源３１による第１流体パスＡと、分注源３２による第２流体パスとの間で選択的に切替可能である。よって、第１流体パスＡは、システム流体リザーバ２７から分注オリフィス３５へ吸引源３１を通して伸び、流体を連通通路へ吸引し、一方、第２流体パスＢは、システム流体リザーバ２７から分注オリフィス３５へ分注源３２を通して伸び、流体を連通通路から分注する。実質的に第１流体パスＡは、分注オリフィスへの流体入力の測定を制御し、一方、第２流体パスＢは、分注オリフィスからの流体の測定を制御する。
【００３６】
他のソレノイドベースの非接触流体ハンドリングシステムと同様、後でより詳細に記載されるように、ノズル３６およびオリフィス３５は、ターゲットにされた分注液体（例えば液体試薬サンプル）を連通通路３３へ試薬／サンプル源またはソースプレート３８から吸引し、また液体試薬サンプルをそれから吸引する。しかし現在の技術とは異なり、本発明は、液体境界におけるシステム流体４０による分散または希釈効果によるサンプルの濃度の低下なしに、ナノリットルオーダーの反復した正確な低容量、非接触液体分注を可能にする。
【００３７】
こんどは図２を参照して、これは、その中の液体試薬サンプルを吸引する前に、エアギャップ４１を分注オリフィス３５を介して連通通路内に吸引することによって達成される。このエアギャップは、含まれるシステム流体４０の遠位端が、液体試薬サンプルスラグ４２の近位端と接触するのを完全に分離するために、連通通路の断面の全体にわたって連続的に伸びていなければならない。このトラップされたエアギャップ４１の完全性は、任意の吸引および分注操作のあいだ、２つの対向する流体の間で維持されるので、液体試薬サンプル４２およびシステム流体４０の間の境界における分散または希釈効果は、実質的に除去される。すなわちエアギャップ４１は、実質的にそのままの状態で保持され、エアギャップが連通通路３３に沿って往復運動するときも分割されない。
【００３８】
図１の上述のチャートを図５のチャートと比較すると、ソレノイドベースの液体ハンドリングシステムをインラインエアギャップなしで応用すること、同じソレノイドベースの液体ハンドリングシステムをインラインエアギャップありで応用することは、それぞれ反復して（すなわち約３５０分注）１００ナノリットルの量の液体を吐出することになるが、これらにより濃度の安定性のパフォーマンス利点が明らかに示される。簡単には、これらチャートは、分注された液体試薬（相対フローレスンスユニット（Relative Florescence Units、ＲＦＵ））の測定された濃度対分注回数を示す。図１のチャートでは、液体サンプル分注の測定された濃度は、液体境界におけるシステム液体の分散または希釈効果のために、５０回〜６０回の連続分注の後、大きく低下する。これと比較して、エアギャップ４１を含ませて液体を分離することは、分注回数にわたって濃度低下を大きく減らす（図５）。
【００３９】
しかし正確で非接触の液体分注を繰り返し、ナノリットルからマイクロリットルの範囲で実質的に低容量で行うためには、液体を分離するエアギャップの量が大きすぎてもパフォーマンスを低下させることがわかっている。例えば、２μＬのエアギャップは、１μＬのレプリケート分注（replicate dispenses）のために用いられえるが、１００ｎＬの分注には大きすぎる。システム流体および試薬流体の間でボリュームが大きすぎるエアギャップが吸引されるとき、インラインの気体（エアギャップ）の圧縮が液体分注プロシージャ中に起こりえる。このエアギャップ４１の圧縮は、それがエアギャップ４１を移動するとき、予測不能に圧力パルスの効率に影響を与える。実際には、可変圧力降下が、ノズルオリフィスではなく、エアギャップ／液体境界において起こる。したがって、そのようなシステム中の追加のコンプライアンスによる、分注オリフィスにわたる圧力パルスの大きさを再現し制御することは困難である。したがって低容量、非接触、ナノリットルレンジまで小さい液体分注のために要求された正確性および再現性は、エアギャップが０．０５〜５μＬの範囲にあるときだけ達成されえる。例として、このような圧縮は、０．０２０”〜０．０３５”の内径直径の連通通路で１０．０マイクロリットル以上の吸引されたエアギャップ容量について観測されている。エアギャップは、圧縮されてそれから膨張するスプリングのように圧力パルスに対して反応する。
【００４０】
本発明のある局面によれば、インライン気体のより小さい容量を吸引することは、５．０マイクロリットルより多い容量では不可能な、体積測定分注の正確さおよび再現性を大きく改善することがわかっている。約２５０ナノリットルから２．０マイクロリットルの範囲の単一の連続エアギャップを、連通通路の断面寸法全体にわたってカバーするように提供することによって、正確な低容量、非接触、液体分注が、これら非接触、液体分注装置から提供されえ、一方で、システム流体による分散および希釈を最小化するために境界における液体の充分な分離を維持できる。
【００４１】
高速写真を用いて、これらの離散エアギャップは、与えられた直径について約１０マイクロリットルより大きいエアギャップとは異なり、実質的に非圧縮性の流体として実質的にふるまうことが観測されている。したがって圧力パルスが連通通路に沿って伝搬するとき（後述するようにバックプレッシャおよび分注アクチュエータの開放および閉鎖から発生する）、圧力パルスは、コンプライアンスによる大きなエネルギー損失なしにこの離散エアギャップ境界を移動しえる。これにより、ピコリットルからマイクロリットルの範囲における反復的な正確で低容量の非接触液体分注のための、ノズル３６において分注オリフィスにわたっての圧力パルスの制御をより充分に行える。
【００４２】
図３および４に戻って参照し、図６に示されるように、非接触、液体ハンドリングシステム２０がより詳細に説明される。好ましい形態において、液体ハンドリングシステム２０は、同時に多数の試薬分注を多数ノズル３６から分注できるマルチプルマルチチャネル液体分注装置によって提供される。２００２年９月６日に出願された米国特許出願第１０／２３７，９１６号の主題であるUNIVERSAL NON-CONTACT LIQUID HANDLING PERIPHERAL APPARATUS（その全体が全ての目的のためにここで参照によって援用される）と同様に、遠隔流体モジュール４３は、流体吸引（入力）サブシステム２３、流体分注（出力）サブシステム２５および流体切替サブシステム２６を収めるように含まれる。圧力サブシステム２２は、流体モジュール４３のディジタル圧力レギュレータ４６に結合された１／８”の圧力ライン４５を有する加圧システム流体リザーバ２７を含む。さらに圧力レギュレータ４６は、好ましくは約５０ｐｓｉの最大圧力を有する圧力源（不図示）に流体的に結合される。ディジタル圧力レギュレータによって制御される好ましいバックプレッシャは、約２ｐｓｉから約１５ｐｓｉであり、より好ましくは約８ｐｓｉの範囲に保持される。しかし選択されたバックプレッシャは、後述のように、分注アクチュエータのパラメータ、分注オリフィス直径およびノズル設計（オリフィスにおいてバックプレッシャを作る）、分注される液体の量、および液体サンプルおよびシステム流体の粘性を含むいくつかのファクタに依存する。したがって動作中、一定のバックプレッシャが、第１流体パスＡおよび第２流体パスＢの両方において維持される。ノズルオリフィス３５から液体試薬の液滴を射出するために必要な圧力パルスを作るのは、分注アクチュエータ３２（例えばソレノイド分注バルブ）の駆動と相まって、この一定のバックプレッシャである。
【００４３】
簡単には、分注バルブ３２における圧力ヘッドは、システム流体リザーバ２７においてシステム流体（好ましくは濾過された非イオン化水）に働くシステム圧力気体によって作られる。好ましくは圧力気体は、システム流体中の気体バブルを除去し、気体が溶け込むこと（in-gassing）を抑圧し、システム流体に不溶性であるよう選択される。システム流体への気体の溶け込みは、バブルまたはマイクロバブルの形成につながり、急速なソレノイド駆動によって引き起こされる分注パフォーマンスの低下につながる。システム流体中のマイクロバブルは、エアギャップとは異なり、システムの圧力低下のために分注パフォーマンスを悪化させる。マイクロバブルは制御不能であり、連通パス内に意図的に導入されるのではなく、一方、エアギャップは正確に制御され意図的である。例えば圧力パルスが連通通路３３を通って伝搬するとき、これらマイクロバブルの累積効果は、分注オリフィス３５にわたる圧力降下を逆に低下させるコンプライアンスを増す。圧力気体の溶け出し（out-gassing）の潜在的な落とし穴は、エアが、以前に駆動準備されたソレノイド内でトラップされえることである。トラップされたエアは、それから、ソレノイドが、それが完全に駆動準備されたときよりも、より多くの分量を分注する状況を作る。ソレノイドは開放し、システム流体がバルブを通過するようにする。これはソレノイド内でトラップされたエアを圧縮する。システム流体は、こんどは、ソレノイドバルブ内にトラップされた圧縮されたエアを変位させる。バルブが閉じると、トラップされたエアは膨張し、エアギャップを圧縮するシステム流体をバルブから出る向きに押す。
【００４４】
特に有利なこのような圧力気体にはヘリウムがあり、ここで水溶性加圧システム流体（aqueous pressurized system fluid）を用いる。この不活性気体は、システム流体内のエア（窒素）気体バブルを排気し、追加のバブルの形成を抑圧する。水溶性溶液へのヘリウムの溶解度は、また、空気、窒素またはアルゴンのそれよりも小さい。したがって、ヘリウムの使用は、非脱ガス、水溶性システム流体の使用を可能にする。
【００４５】
ついでながら濾過された非イオン化水は、システム流体として選ばれる最も典型的で良性の液体である。しかし応用例に応じて、その液体の表面張力がシステム流体およびサンプル試薬の間にエアギャップを形成できる限り、他の流体および水溶性試薬も代わりに用いられえることが理解されよう。
【００４６】
１／１６”ＩＤ  ＰＦＡ圧力ライン３０を用いて、第２流体パスＢは、システム流体を８本の独立したチャネルに分配する８つのポートマニフォールドデバイス４７（図３）に流体的に結合される。もちろんより多い、または少ない対応するチャネルが用いられえる。こんどはマニフォールドデバイス４７のそれぞれは、圧力ライン４８を介して対応するソレノイド分注バルブ３２に流体的に結合され、これはこんどはハイブリッドバルブマニフォールド４９にこんどは流体的に結合され、このマニフォールド４９は流体を切替バルブ３７に流す。前述のように好ましくはソレノイドベースであるこれら分注バルブは、約６．９（１０）3Ｎ／ｍ2（１ｐｓｉ）から約１３８（１０）3Ｎ／ｍ2（２０ｐｓｉ）の範囲の圧力を用いた、約２００μｓから約１０秒の範囲の持続期間を持つ計測された圧力パルスを伝達する。好ましくは、これら分注バルブ３２は、ドロップオンデマンド印刷のために設計された従来のインクジェット型の印刷バルブまたはポンプによって提供される。例えば、コネティカット州、エセックスのLee Companyは、ソレノイドベースのインクジェットバルブ（モデルNo. INKX0502600AB）を製造し、これは本発明と共に用いるのに適する。
【００４７】
図３に最もよく示されるように、それぞれのソレノイド分注バルブ３２の出力は、直接に複数のパス、ハイブリッドバルブマニフォールド４９にマウントされる。内部切替バルブ３７は、流体吸引システムおよび流体分注システムの間で切り替えるとき、正確な位置付けを実現するために好ましくはロータリシアフェースバルブによって提供される。この切替サブシステムは、２０００年１０月１１日に出願され「HYBRID VALVE APPARATUS AND METHOD FOR LIQUID HANDLING」と題された米国特許出願第０９／６８９，５４８号の主題であり、その全体が全ての目的のためにここで参照によって援用される。簡単には、ロータリシアフェースバルブ／ハイブリッドマニフォールドを通して、選択されたソレノイド分注バルブが選択されたノズル３６に流体的に結合されえる。
【００４８】
第１流体パスＡについては、１／６”ＩＤ  ＰＦＡ圧力ライン２８がシステム流体リザーバ２７から吸引源３１に伸び、これは好ましくは、単一のモータドライブによって駆動される８チャネルシリンジドライブである。このマルチチャネルシリンジドライブは、システム流体を８つの独立したチャネルに同時に分配し吸引する。シリンジベースのポンプまたはダイヤフラムポンプのようなこの外部分析測定装置は、少なくとも２５０ナノリットルから約２．０マイクロリットルの範囲の少量の流体をそれぞれ関連付けられた圧力ライン５０内に対応する分注オリフィス３５を通して正確に測定して吸引することが可能である。これら吸引デバイスの典型的なものは、カリフォルニア州、サンタロザのInnovadyne Technologies, Inc.によって提供されるモデル# 2009Dである。ソレノイド分注バルブ３２と同様に、それぞれの分析的シリンジベースドライブ３１の出力は、ハイブリッド切替バルブ３７の関連付けられた入力にそれぞれ２２ゲージＦＥＰ圧力ライン４４を介して流体的に結合される。
【００４９】
ハイブリッドバルブ３７から対応するノズル３６への出力ライン５０は、それぞれの独立チャネルの対応する連通通路３３を提供する。それぞれのラインは好ましくは、サンプル試薬の対応する連通通路への吸引のためにサンプルソース上への、またはその高パフォーマンス低容量分注のために宛先基板表面またはマイクロタイタープレートの上への関連付けられたノズル３６の正確な位置付けを可能にするために、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）（例えばＰＦＡ／ＦＥＰ）の圧力チュービングによって提供される。
【００５０】
こんどは図３および６を参照して、ユニバーサル非接触液体ハンドリング周辺装置２０は、ユニットとして総体的にノズル３６の正確な位置付けを操作するためのベース５２および自動化された動き制御要素５３を有する「ピックアンドプレース」メカニズム５１を内蔵する。簡単には動き制御要素５３は好ましくは、従来の３軸Ｘ−Ｙ−Ｚデカルト座標系、および精密トラックまたはレールハードウェアを用い、ノズルをＸ軸およびＹ軸に沿って（すなわち、マイクロタイタープレート２１のターゲットになったテストサイト５４の鉛直上に）、かつＺ軸に沿って位置付ける。ある具体的な構成において、分注ヘッドは、マイクロタイタープレート２１のウェルまたはテストサイト５４の間隔に合う距離によって分注端が等しい間隔で離された、リニアアレイ中でアラインされた８つの分注ノズル３６を提供する。Ｘ軸およびＹ軸方向において移動できる他のプレート要素の上にＺ軸方向に移動できる１つの位置付け要素を有し、それぞれのノズルがソースプレート上で操作され、ターゲットにされたサンプルリザーバへ位置決め操作されえる他の従来の位置決めメカニズムも応用されえる。
【００５１】
さらに操作インタフェース要素５５は、全てのサブシステム（例えば流体モジュール４３および「ピックアンドプレース」メカニズム５１）のスタンドアローンまたはリモート操作を提供する。より具体的には、インタフェース要素５５は、流体制御および動き制御要素を操作し統合する。このシャーシ中に組み込まれるのは、器具を操作するのに必要なプリント回路基板、コネクタ、およびファームウェアの全てである。ソフトウェアは、インタフェース要素とは独立してホストコンピュータ上に常駐しえる。
【００５２】
ハイブリッドバルブ装置および非接触液体分注周辺装置は、印刷アレイに適合され、ここで隣接するテストサイト５４間の距離、つまりテストサイトピッチは、約１ミクロン（μｍ）から約１０，０００ミクロン（μｍ）の範囲にある。よって本発明は、化学または生化学サンプルまたは試薬を、リザーバウェル５６（例えば９６または３８４ウェルを持つ従来のマイクロタイタープレート）のアレイを有するサンプルソースプレート３８からより高密度のテストサイト５４（例えば１５３６ウェルマイクロタイタープレート）へ転送するのに、または遺伝子発現または他のスクリーニング実験を行うのに用いられるチップベースの生物センサ（通常、「マイクロアレイ」と呼ばれる）の製造に特に適する。ソースプレートは、サンプル分析プロトコルにおいて一般に用いられ、典型的には、流体分注がその中で行われる均一に間隔が空けられたくぼみつまりウェル（すなわちテストサイト５４）を規定するプラスチックプレートによって提供される。これら商業的に入手可能な長方形のプレートはさらに、図６に示されるプレート２１のような業界標準の９６マイクロウェルプレートを提供する１２マイクロウェルの８列を含む。他の従来のサイズは、３８４マイクロウェルを提供する２４マイクロウェルの１６列を含む。
【００５３】
ＴＥＦＬＯＮ（ＰＦＡ／ＦＥＰ）圧力ライン５０に戻って、これらの細長い、化学的に不活性なラインは、単にそれぞれの流体連通通路３３をハイブリッドバルブ排出口およびそれぞれのノズルオリフィス３５の間に設ける以上の機能を果たすように選択される。例えば、気体が溶け込むことをさらに低減させるために、ラインは、生物的流体、およびＤＭＳＯ、ＴＨＦ、アルコール、アルデヒド、ケトン、ハロゲン化炭化水素、脂肪族炭化水素、生命科学および診療分野で用いられる酸および塩基のような、ふつう用いられる溶媒に実質的に化学的に不活性なように選択されえる。これら圧力ラインはまた、Ｘ−Ｙ−Ｚ「ピックアンドプレース」メカニズム５１（図６）にマウントされるノズル３６のＸ−Ｙ−Ｚ位置付けを可能にするよう充分に可撓性がある。さらにソレノイドアクチュエータ３２がノズル３６に相対的に離れて配置されることによって、分注システムの設計において柔軟性が向上する。すなわち、圧力ライン５０の全体の長さを選択するとき、連通通路の内部直径と共にいくつかのファクタが考慮される。
【００５４】
後述するように圧力ライン５０の長さは、連通通路３３の総和容量を決定する一つのファクタではあるが、連通通路の断面寸法の横断面にわたってエアギャップ４１の完全性（ばらばらにならないこと）を維持するために、インラインエアギャップ４１をソレノイド分注アクチュエータ３２よりも充分に下流に配置することが望ましいことがわかった。システム流体リザーバ２７におけるバックプレッシャに依存して、エアギャップ４１がソレノイド分注アクチュエータ３２にあまりに近く位置すると、圧力パルスから連通通路３３に沿って伝搬する初期のショックまたは衝撃は、エアギャップを分割させるのに充分かもしれない。エアギャップ４１の容量が非常に小さい（すなわち約２５０ナノリットルから約２．０マイクロリットル）ので、この境界において対向する液体の希釈および分散は、任意の分割と共に起こりやすい。
【００５５】
したがって、連通通路３３内に吸引された液体試薬サンプルのターゲットにされた累積容量に加えて充分な量だけ圧力ライン５０を長くすることによって、エアギャップ４１は、分注アクチュエータ３２から充分に下流に配置されえ、それにより連通通路３３中のシステム流体容量４０は、部分的に分離され、エアギャップ４１に対する圧力パルスの衝撃を緩和する。さらに、連通通路３３中に圧力パルスが初めて入り、可撓性のある圧力ラインが動いてしなると、圧力ライン５０の可撓性そのものが、圧力パルスの初期衝撃を動き吸収を通じて緩衝するのを手伝うと信じられている。例として、約０．０２０”〜０．０３５”ＩＤの範囲の内部直径、約２ｐｓｉから約１５ｐｓｉの範囲のバックプレッシャ、および約２５０ナノリットルから約２．０マイクロリットルのエアギャップ４１を有する可撓性圧力ラインについては、エアギャップ４１は好ましくは、約１．０インチから約３．０インチの範囲で連通通路の入り口から下流に位置する。
【００５６】
圧力ライン５０および対応する流体ハンドリング要素を選択するときの他の考慮する点は、連通通路３３内を往復運動するときの、細かいエアギャップ４１の完全性を維持することである。これは主として、連通通路３３内で相対的に滑らかな壁の遷移を提供することによって提供される。このような滑らかな遷移は、連通通路を通して移動するときに、エアギャップ４１の分割を避けるために非常に重要である。これは、圧力ライン５０およびノズル３６の間のような任意の要素の境界において特に当てはまる。大きな直径から小さな直径への階段状の遷移や、内部壁からの突起のような急な遷移は、それが通過するときにエアギャップの完全性に影響を与ええる。したがって全ての遷移、特に要素の境界を滑らかにするために、要素の特性を一致させるために大きな努力が払われる。ステンレススチールプローブの電気化学的研磨およびノズルを流体ラインに接続するステンレススチールチューブの面取りのような工程は、階段状遷移によって引き起こされる分散効果を最小にしえる。全ての流体ラインおよびチャネルの寸法を制御することは、パフォーマンスを向上させ、不正確さを抑制するのに役立つ。
【００５７】
流体分注に影響を与える他のファクタには、いくつかを挙げると、連通通路の内部直径、ノズル設計（例えばまっすぐまたは角度が付けられた通路）およびオリフィス直径によって作られるバックプレッシャ、液体試薬流体の粘性が含まれる。示されるようにさらに他の考慮される点としては、圧力ライン５０の長さはターゲットにされた分注の応用例に応じて調整されえる。一般に本発明によれば、これら非接触流体分注システム２０のために分注される流体の量がより少ないほど、圧力ラインに要求される長さは短くなり、一方、低容量流体分注の容量が大きくなるほど、要求される長さは長くなり、単に連通通路の容量を考慮するだけではなくなる。
【００５８】
例として、液体分注の量が少ないとき（例えば５０ｎｌ）、圧力ラインの長さは好ましくは、これらの微小な量の液滴をきれいに射出する必要があるノズル３５にわたって必要とされる圧力降下を維持するために低く抑えられなければならない。これは部分的には、適切なパフォーマンスを確実にするためにソレノイド分注バルブ３２が最適なバックプレッシャ範囲内で動作する必要があることによる。バックプレッシャがあまりに低いと、ノズルオリフィスから液滴がきれいに射出されるのに充分ではなく、一方、バックプレッシャがあまりに高いと、バルブの適切な動作を損ねる（例えばバルブの開放がまったく損なわれる）。このカテゴリーのたいていのソレノイド分注バルブ３２についての最適なバックプレッシャの範囲は、４ｐｓｉから約１５ｐｓｉである。
【００５９】
しかしより小さい分注量を実現するためには、より小さいパルス幅が必要とされ、その結果、全体には低い圧力になる。あまりに長い圧力ラインは、オリフィス３５にわたって低すぎる圧力降下を引き起こすが、これはそのような降下が圧力ラインの長さの関数だからである。すなわち、圧力ラインの長さが長いほど、内部壁および流体間の摩擦によって引き起こされる圧力損失の増分による圧力降下は大きくなる。システム内のコンプライアンスを低減するために後述されるパージルーチンにおいて、ソレノイドバルブ３５および連通通路３３内のトラップされたエアおよびデッドボリューム（dead volume）は、好ましくはパージされるが、圧力ラインの壁と流体の摩擦による圧力損失は依然として存在する。オリフィスにわたってのあまりに小さい圧力降下は、同じパルス幅および流体リザーババックプレッシャが与えられたとき、射出容量を低下させる。その結果、残留サンプル流体は、後に続く射出のあいだ、ある特定の射出が、分注容量を非常に大きくさせつつ、この蓄積したものを射出された液滴内で運び出すまで、オリフィス３５において蓄積する。これはもちろん体積測定の不正確さおよびばらつきにつながる。より長い圧力ラインの長さについて比較すると、低容量分注のより大きい量は、液滴のきれいな射出のために必要とされる圧力降下を達成するためにバックプレッシャまたはパルス幅を調節することによって正確に吐出される。
【００６０】
本発明のこの局面の例として、約５０ｎｌの流体分注を実現するために、バックプレッシャが定格で約８ｐｓｉのとき、内部直径約０．０２８インチ定格を有する圧力ラインの長さは、約２．０インチから約１２インチの範囲になければならない。他の例として、約２００ｎｌの流体分注を実現するために、同じシステムプレッシャを用いるとき、圧力ライン５０の長さは、約２．０インチから約１１８インチ（３メートル）の範囲になければならない。同じ量の流体を吐出するためには、一般に、チューブの長さが長くなると、より短いチューブ長と比較して、パルス幅またはバックプレッシャは増加されなければならない。これは、流体の粘性が変化しないと仮定している。
【００６１】
ノズルからの反復分注の累積容量に付随的には依存する（後述）連通通路内に吸引される所定の容量に依存して、圧力ライン５０の長さおよびその内径が決定されえる。ノズルオリフィス３５およびソレノイドベースのアクチュエータ３２（図２）の間の、約５．０インチから約１２０．０インチの、約０．０２０インチＩＤから約０．０３５インチＩＤのチューブで長いチューブのリモート分注を用いると、２５ナノリットルから７０マイクロリットルの容量が、５％未満の相対標準偏差（ＲＳＤ）の分注パフォーマンスで分注されえる。例として、本発明による流体間の細かなエアギャップの吸引方法を、０．０２８”定格内部直径を有する流体連通ライン５０に応用することによって、それぞれ実質的に等しい濃度を有する（図１（細かいエアギャップなしのシステム応用例）を図５（エアギャップありのシステム応用例）と比較）約２０００から約４４，０００の２５ナノリットル容量の分注が実現できる。スケーラビリティを示すために、このアプローチはまた、約１から約２５の４０マイクロリットルの容量の分注もできる。他の例では、単一の５００μｌ吸引容量を用いて、約４８００の１００ナノリットル分注から約４８０の１マイクロリットル分注が、実質的に等しい濃度で得られ、そのときのＲＳＤは５％未満である。バラツキはシステムによるものを含み、ここでチューブの直径は０．０１０”ＩＤから０．０４０”ＩＤで、チューブの長さは１２０”より長く、ＲＳＤは１０％未満である。
【００６２】
本発明の手法の応用例がこれからさらに完全に記載される。図２を参照して、微細エアギャップ４１が連通通路に吸引される前に、それぞれの連通ライン５０内のシステム流体４０は、どの水分状態（例えば乾いた、部分的に乾いた、または濡れた水分状態）にシステムがあるかにかかわらず、対応する分注オリフィス３５の末端へ移動されなければならない。システム流体リザーバのバックプレッシャを適用すると、これはソレノイド分注バルブ３２（第２流体パスＢ）またはシリンジベース吸引アクチュエータ３１（第１流体パスＡ）、またはその両方を通して実行されえる。
【００６３】
第２流体パスＢについて、切替バルブ３７は、ソレノイド分注バルブ３２および対応する連通通路３３の間で流体連通が可能になるよう向きが設定される。ソレノイド分注バルブ３２はそれから、連通通路および対応するソレノイド分注バルブ３２の間の流体連通を阻止または閉鎖する閉鎖状態から、連通通路および対応するソレノイド分注バルブ３２の間の流体連通を可能にするまたは開放する開放状態へと動作されえる。加圧されたシステム流体リザーバ２７の一定のバックプレッシャが、ソレノイドを通して連通通路３３にそれが流れるためにそれからシステム流体に印加される。これはシステム流体が、対応する分注オリフィス３５から実質的に一定かつバブルが発生しないように分注されるまで行われる。トラップされた気体パージルーチンがそれから適用され、これは後で詳述される。
【００６４】
同様に第１流体パスＡについて、切替バルブ３７は、シリンジベース吸引アクチュエータ３１および対応する連通通路３３の間の流体連通を可能にするよう向きが設定される。シリンジドライブ内の３方向バルブは、連通通路およびシステム流体リザーバ間の流体連通を可能にするよう開放されえる。再び、システム流体リザーバ２７の一定のバックプレッシャまたはシリンジドライブの始動動作（priming action）が印加され、システム流体は実質的に一定でバブルなしでシステムから出るまで、ハイブリッドバルブおよび対応する連通通路３３のチャネルを通して流される。
【００６５】
いったんシステム流体が満足のいく状態でそれぞれの分注オリフィス３５の末端まで移動し、トラップされた気体がそれらのそれぞれの連通通路およびソレノイド分注バルブ３２からパージされると、後述するように、ノズル３６は、「ピックアンドプレース」メカニズム５１を介して、それぞれの試薬サンプルの吸引の前に、ソースプレート３８のそれぞれのウェルの上に垂直に配置されえる。ハイブリッドバルブ３７が流体吸引が可能なように配置されると、それぞれの対応する精密分析シリンジドライブ３１は、ユニットとして分注オリフィス３５を介して連通通路３３に入るエアを正確に測定するよう動作される。本発明によれば、この分離容量は、約１５０ｎｌから約５μｌの範囲であり、より好ましくは約２５０ｎｌから約２μｌである。
【００６６】
上述のようなユニバーサル非接触液体ハンドリング周辺装置２０のようなＸ−Ｙ−Ｚ「ピックアンドプレース」メカニズム５１を応用すれば、それぞれのノズル３６は、ターゲットにされたサンプルリザーバに移動されえる。その後、対応する精密分析シリンジドライブ３１を駆動することで、試薬流体サンプルの単一の連続スラグが連通通路内に引き込まれる。好ましくは微細エアギャップ４１が関連付けられたチューブの連通通路３３内に保持され、ハイブリッドバルブ３７内には引き込まれない。エアギャップ４１はハイブリッドバルブ３７より上流に位置されえるが、エアギャップをハイブリッドバルブ３７より下流に保持し、単に対応する圧力ライン５０を長くすることによってソレノイド分注バルブからの下流距離を最小に維持するのが好ましい。上述のように、ラインの長さおよびＩＤは、連通通路内に吸引されるべき所定の容量の関数として選択される。
【００６７】
ハイブリッドバルブ３７は、それぞれの連通通路３３を、対応する分析シリンジドライブ３１との連通から、流体モジュール上に離れて位置する対応するソレノイド分注バルブ３２へ切り替えるよう作動される。上述の手法を応用し、「ピックアンドプレース」メカニズムが５１であるなら、ノズル３６は、それらの宛先テストサイト５４の上に再配置される。ソレノイドベースのアクチュエータ３２は、パルス幅（すなわちバルブが開いている時間の長さ）を制御することによって、対応するノズルオリフィスから射出される液滴の容量を決定するために閉鎖状態から開放状態への間で正確に駆動される。上述のように、また後述の較正手法を用いて、オリフィスから射出される液体試薬の容量に対応するパルス幅は、多くのファクタの関数であり、それらには、液体試薬サンプルの粘性、ライン５０の長さ、ラインのＩＤ、システム流体リザーバのバックプレッシャ、ノズル設計の関数であるノズルオリフィスにわたる結果として生じるバックプレッシャが含まれる。例えば、３０％グリセリン／水のような溶液を有効に分注するためには、ヘキサンのような粘性のより少ない溶液の分注を実行するのに比較して、より高いバックプレッシャが必要とされ、より長いパルス幅が必要とされ、かつより遅い吸引速度が用いられなければならない。蛍光ラベリング（fluorescent labeling）または重量測定の使用を通してさまざまな流体を経験的に較正することができるので、所定の較正からのオフセットとして用いるための器具によって参照されえる化合物のクラスのマトリクス（a matrix of compound classes）を開発することが可能になる。
【００６８】
本発明の他の局面によれば、システム流体が最初にアクチュエータおよび連通通路を通して流され、乾いたエアが満たされた状態から濡れた液体が満たされた状態へと変わるときに、ソレノイドベースのアクチュエータ３２内にトラップされたエアをパージする方法が開発された。上述のように、このようなトラップされた気体をパージすることは、低容量の正確で非接触液体分注のためには必要不可欠である。ソレノイドそのものの中にあるそれぞれのトラップされたエアバブルまたはマイクロバブル、および連通通路３３の壁に付着したバブルは、連通通路全体にわたって横断するように伸びる微細エアギャップ４１に比較して、連通通路に沿って伝搬する圧力パルスを微小に緩衝する（micro-dampen）。しかしシステム中のこのコンプライアンスの集合的影響は、大きなシステム圧力ロスにつながり、容量測定上の正確さを低減させえるノズルオリフィス３５にわたっての非有効な圧力降下に結果としてつながる。またバブルのスプリングのような圧縮および伸長は、不正確な分注を引き起こす。
【００６９】
反復された固定パルスのソレノイド駆動を用いて、最終的にはノズルオリフィスからパージされる、圧力ライン５０の分注アクチュエータおよび対応する連通通路３３内にトラップされた気体を移動させるための「ブザー」ルーチンが開発された。速い駆動を用いて、高い周波数で分注バルブを開いたり閉じたりすることで、システム流体のバックプレッシャと併せて、このルーチンは有効にバブルつまりソレノイドバルブにトラップされたエアをパージする、つまり追い出す。１Ｈｚから約１７００Ｈｚの範囲の比較的、高い周波数の駆動が用いられるので、コーディングされたファームウェアがしたがってこのルーチンを実行するのに必要とされる。より好ましくは約１０Ｈｚから約４２０Ｈｚの周波数範囲が用いられる。
【００７０】
トラップされたバブルを完全にパージすることを確実にするためにソレノイド駆動周波数を変化させることが特に有効であることがわかった。ソレノイド内でトラップされた気体の量に依存して、ソレノイド内の気体を移動させるには異なる周波数で駆動することが効果的である。パージされたソレノイドの結果として低減されたコンプライアンスは、複数のソレノイドのシステムのパフォーマンスに大きな影響を持ち、分注の正確さおよび複数チャネルのシステムの安定性を大幅に改善する。例えば、１から２５の離散した周波数帯が、約１０Ｈｚから約４２０Ｈｚのランダムな周波数レンジにおいて適用されえる。他の具体的な実施形態において、図７のテーブル１に示されるように、固定されたパルスのランプ状周波数の増分は、約１Ｈｚから約４２０Ｈｚまでの１から１５の離散した、等間隔の周波数群をスイープする。よって、ある種の吐出パターンもより有効であるかもしれないが、有効であるとわかったのは、これら異なる離散周波数帯群である。例として、１つのルーチンは、より密度の高い周波数間隔をより高いまたは低い周波数において持つランプ状周波数減少スイープを含みえる。簡単には、図７のテーブル１の第４カラム内の実際の駆動周波数は、より高いｎＢｕｚｚＣｏｕｎｔレートにおいてはリニアではなく、これはそれぞれの駆動コマンドの実行に約２００μｓかかるからである。比較的低い周波数において、これは大きなファクタではないが、より高い反復ではファクタとなる。
【００７１】
このユニバーサル非接触液体ハンドリング周辺装置のような複数チャネルシステムにおいて、上述のような連通通路３３の同時パージングは、それに結合された対応するソレノイド分注バルブ３２の同時駆動を通じて起こりえる。しかし全てのソレノイド分注バルブおよびその関連付けられた連通通路が等しく、同じ速度でパージされるわけではない。したがって、この「ブザー」ルーチンの完了の後、全ての圧力ライン内のパージの質を決定するための手法が開発された。
【００７２】
これは、それぞれの対応するソレノイド分注バルブを通して圧力パルスを発生することによって実行され、これらのそれぞれは実質的に同じパルス幅を有する。本質的には、実質的に等しい量のシステム流体を、それぞれの圧力ラインとは独立にそれぞれ分注するための試みがなされる。それぞれの各ノズルオリフィスからの液体分注は、分注された容量を決定するために集められる。重量測定的、分光光度的、または光学的方法によるもののような従来の測定手法が用いられえる。例えばほぼ８ｐｓｉのバックプレッシャを適用し、２８，０００μｓのパルス幅を発生するようソレノイド分注バルブ３２を動作させれば、典型的には約１０００ナノリットルのシステム流体を生むはずである。
【００７３】
分注された液体のこれらの測定された容量を用いれば、平均分散（mean variance）が計算される。所定の数値よりも大きい量だけ平均分散を超える測定された容量を有する流体量を吐出した圧力ライン５０の任意のものについては、トラップされた気体がソレノイドアクチュエータおよび／または連通通路内にまだ残っているかもしれない。よってこの連続したコンプライアンスは、このように測定された、平均分散からの差の原因である。ある具体的な実施形態において、所定の数値は、計算された平均分散からの約３％から約７％の差の範囲にあり、より好ましくは約５％である。分散は、全てのチップについての分注の平均と比較したときの、単一のチップについての平均の百分率の差であり、ここで以下のように書ける。
【００７４】
%Variance＝（（チップ平均-全てのチップの平均)/全てのチップの平均）＊１００
【００７５】
これらの差に対応するために、これらの特定のラインまたはラインのセット全体についてパージルーチンが繰り返され、分注シーケンスおよび容量測定が繰り返される。実際、この全体のプロシージャは、それぞれのラインが、平均分散から所定の数値内で異なる流体量を吐出するまで繰り返される。いったんこの分散が仕様の中に収まると、全ての圧力ライン５０およびそれらの関連付けられたソレノイド分注バルブは、トラップされたバブルを適切にパージされ、流体的にそのままに保たれる。
【００７６】
さらに本発明の他の局面において、それぞれの各ノズル３６内の分注オリフィス３５を通しての流れ、または流れの欠如をモニタするための装置および手法が開発された。ノズルまたは分注オリフィス３５は、好ましくは約５０ミクロンから約２５０ミクロンの範囲にあり比較的小さいので、詰まった分注オリフィスは、これら低容量分注システムにおいて潜在的に問題である。よって大きくは７０で示される詰まり検出センサアセンブリがオリフィス３５の「詰まり」を検出するために利用される。図９および１０において最もよく見られるように、センサアセンブリ７０は、ノズル３６のチップにマウントされ、これらノズルは、「ピックアンドプレース」メカニズム５１の自動化された動き制御要素５３によって搬送される。好ましくはセンサアセンブリは、光学ビームを放射する光学ビーム発光器要素７１、およびその光学ビームを検出する受光要素７２を有する光学的「スルービーム」センサによって提供される。しかし代替の光学デバイスによる変化形も用いられえる。
【００７７】
分注オリフィス３５から下流にセンサアセンブリ７０の要素を配置しアラインすることによって、分注オリフィス３５から分注された液体の任意の流れは、光学発光器要素７１から受光要素７２への光ビームの伝達を阻害する。したがってノズルオリフィス３５から分注された液体の適切な射出は、光ビームの透過を阻害し、これは分注オリフィスの完全性が損なわれておらず、かつ適切な動作が開始されえることを示す。さらにこれら低容量液体分注システムは典型的には、液体の連続的な流れとは対照的に、液体の微細液滴を分注オリフィス３５から射出するので、光ビームの連続的受光が途絶えるのはミリ秒のオーダーである。いったん液滴が通過すると、光ビームは受光要素７２によって再び受光され検出される。例として、約５０ナノリットルの液体分注の通過について、ほぼ８ｐｓｉのシステム流体バックプレッシャを適用すれば、ビームの中断はわずか約２〜３ミリ秒のオーダーである。
【００７８】
対照的に、もしそれぞれのノズルオリフィス３５が完全に詰まっているとすると、ビームの中断は起こらず、これは潜在的な問題を意味する。より洗練された動作において、より大きな容量がノズルオリフィス３５から分注されるべき場合、部分的に詰まったオリフィスも検出されえる。例えば既知の液体の所定の分注容量、および既知のハードウェアおよびパラメータ（例えばシステム流体バックプレッシャ、オリフィス直径、出口速度など）について、ビームを遮断するのに必要とされる時間が求められえるか、または推定されえる。しかしもしビームの遮断が既知の、または推定された期間よりも大幅に小さい期間であるなら、遮断が起こっていないにしても、部分的に詰まったオリフィスが検出されえる。
【００７９】
ある構成において、それぞれのノズル３６は、それぞれのノズルオリフィス３５に対応する専用のセンサを含む。このような構成は、もちろんかなり費用がかかるだろう。他の実施形態においては図１０に示されるように、センサアセンブリ７０のセンサ要素７１、７２は、好ましくは一直線上に、長手方向にノズル３６と共に配置されることによって、一つのセンサしか必要ではない。この構成において、光学発光器要素７１は、ノズルアレイの一端から外側へ配置され、一方、受光要素７２は、このアレイのもう一端から外側へ配置される。よって光学発光器は、アレイ全体（例えば６〜１２個）のノズルオリフィス３５にわたって光パルスを放射でき、それによりオリフィスの任意の一つからの一滴の液体の射出も受光要素７２による光ビームの検出を阻む。
【００８０】
このアプローチにおいて、対応するオリフィス３５を通しての流れまたは流れの欠如を検出するときは、それぞれの各チャネルはもちろん独立にモニタされなければならない。吐出および検出シーケンスは任意の順序でよく、また、センサハードウェアおよび関連付けられたソフトウェア／ファームウェアコード、データ獲得、故障決定、アルゴリズム、および獲得されたデータに応答する復旧プロトコルを用いて、任意の詰まり、または部分的詰まりの検出が決定され、制御され、かつ動作されえる。
【００８１】
光学センサアセンブリ７０の光学発光器要素７１は、好ましくはレーザダイオードなどによって提供される。光学受光要素７２は、もちろんそのダイオードによって放射される波長範囲の光を検出するように選択される。例えば、レーザダイオードは、安全な波長であることから便利であり、安価な要素を用いる可視長範囲の光を送信するよう選択されえる。この応用例に適した一つのそのような光学的センサは、日本の名古屋のＳＵＮＸによって製造されるＳｕｎ−Ｘ光学センサ（モデルＮｏ．ＦＸ−Ｄ１）である。
【００８２】
ノズルを横切って伝送される光ビームの検出を促進するために、ダイオードによって放射される光ビームの強度を弱めることが必要になるかもしれない。受光要素によって受け取られる放射光があまりに強いと、特に液滴が実質的に透明なときには、ビームが実質的に液滴を透過してしまい、検出と間違ってしまう。光の強度を低下させることは、実効的には、検出感度を全体的に増すことにつながり、その結果、射出された液滴が受光要素にとってはより「見やすく」なる。
【００８３】
受光要素７２によって検出される光ビームの強度を低下させるのに適用されるある手法は、受光要素の面の前に拡散器またはフィルタ７３を配置することである。これは、受光要素７２の面を覆うこと、および受光要素へと通る光伝達量を低減する小さい開口７４を提供することによって達成される。好ましくは、開口は、直径が約０．００５インチから約０．０３０インチの範囲にあり、より好ましくは、直径が約０．０２０インチである。受光要素によって受け取られる光強度を弱める他の構成には、光フィルタがある。
【００８４】
センサアセンブリ７０は、ノズル３６の分注オリフィス３５に対して、動き制御ユニット５３にマウントされることを可能にするブラケット７５ａ、７５ｂ（図１０）のペアを含む。これらのマウンティングブラケット７５ａ、７５ｂは、光ビームの送信および受信のために対応する光学要素７１、７２を互いに内側に向かい合わせるよう構成される。ある構成において、光発光器要素７１の発光面および受光要素７２の受光面は、好ましくは約０．２５インチから約２．０インチの範囲で対応する末端ノズルオリフィス３５から下流に配置され、より好ましくは約０．７５インチそれから下流である。さらにそれぞれの要素面は、好ましくは、ノズルオリフィス３５のアレイの長手方向軸に沿って一直線上に配置されるが、水平には対応する末端ノズルオリフィスから外側へ約０．２５インチから約２．０インチ間隔が空けられ、より好ましくは約０．７５インチである。これらブラケット７５ａ、７５ｂは、また、センサ要素の位置の微調整を可能にする調整を提供しえる。
【００８５】
本発明の他の局面において、本発明の分注方法が応用される前に、これら低容量、非接触、液滴分注システム２０から分注される容量を較正するための方法が提供される。上述のようにこれらシステムは、連通通路および最終的には分注オリフィス３５を通して流体フローを発生するのに、加圧された流体および微小分注（ソレノイド）バルブに依存する。従来のシリンジベースのポンプ手法とは異なり、システム構成、試薬流体特性および環境条件は、後述するように大きくフロー出力およびシステムから分注される容量に影響を与える。例えば従来のシリンジポンプ手法は、シリンジを満たし、空にするために機械的ドライブを用いる。一般に流体の特性、システム設計および環境条件にかかわらず、これらシステムのシリンジに注入され、それから分注される流体の容量は、シリンジドライブが動くように命令されるステップの数に直接に比例する。
【００８６】
定期的に、シリンジドライブは、これら機械的ポンプの正確さおよび精密さを評価するために較正されえる。正確さを改善するためにこれらのステップ化されたドライブを調整するのは不可能であり、その代わり、ドライブは、正確さを達成するために、理論的ステップ数ではない異なる数のステップを移動するよう命令されなければならない。例えばこれは次の方程式によって決定されえる。
【００８７】
容量（ステップ）=（望ましい容量）（フルストローク当たりの総ステップ数／シリンジ容量）（例えば７５０容量（ステップ）＝２５０μＬ（１５０００ステップ／５００μＬ）＝７５００ステップ）
【００８８】
ソレノイドベースの分注バルブ３２に適用される技術は、容量型シリンジポンプのそれとは非常に異なる。上述のように液体分注システム２０のソレノイド分注バルブ３２および加圧されたシステム流体リザーバ２７は、異なる容量の液体試薬サンプルを宛先サイトに吐出するために、分注バルブを閉鎖状態から開放状態へさまざまな期間のあいだ駆動することによって液体分注を実行するために協働する。分注バルブから分注される液体の容量は、バルブが開放状態を維持される時間の長さに比例する。これらシステムからの分注容量は、よって、以下を含むいくつかのファクタに依存する。すなわちバルブが開放されている時間、システム流体のバックプレッシャ、分注オリフィスの直径、および微小分注バルブおよびチップ（tip）の間の距離（すなわち流体と圧力ラインの壁との間の摩擦）が含まれる。したがって関連する多くの変数によって、バルブが開放されている期間に基づいて数学的に分注容量が計算されるが、これはこのような高精度低容量液体分注器具については非常に手間がかかり困難である。
【００８９】
したがってそれぞれのハードウェア構成（例えばチューブ長、オリフィス直径、チップ設計など）、試薬溶液特性および環境条件について適用されえるこれら低容量、非接触、液体分注システム２０のための分注出力を推定するために万能の較正手法が開発された。この同じ較正手法は、ハードウェア構成または溶液特性にかかわりなく、所望の容量（約０．０５０μＬから５０μＬの範囲）を分注するようこれら非接触液体分注システムを較正または微調整するために適用されえる。よってこの較正手法の実現は、バルブ開放時間、システム流体バックプレッシャ、オリフィス直径またはチューブ長などのこれら変数パラメータに依存しないが、これら測定された量から生成される較正プロファイルは、このような上述のパラメータに依存する。すなわち較正手法は変数のどれにも依存しないが、結果（実際の分注容量）は上述の変数に依存する。
【００９０】
したがって、この較正手法は、それぞれのハードウェア構成について、かつその特定のハードウェア構成から分注されるそれぞれの試薬液体について実行されなければならない。簡単には、同じハードウェア構成で液体試薬サンプルがこれら複数のチャネル液体分注システムのそれぞれのオリフィスから分注されるとき、この較正手法は、システマチックに実行されえ、それからそれぞれのチャネルについて平均が取られる。しかし他の場合には、チャネルが異なるハードウェア構成を有する場合、および異なる分注容量の異なる液体試薬サンプルが分注される場合、この較正手法は、それぞれの個別チャネルについて実行されえる。温度のような他の環境ファクタもまた、較正プロファイルに影響を与えうる。適切なパフォーマンスを確実にするために、較正は器具が用いられる場所において実行されるのが望ましい。
【００９１】
本発明の較正手法によれば、較正プロファイルは、分注容量をパルス幅（すなわちソレノイドバルブ３２の開放時間）の関数としてグラフを描くことによって生成されるべきである。この例は、分注容量（例えばナノリットル）対パルス幅（例えばマイクロ秒）を示す図１１のテーブルＩＩと併せて図１０の較正プロファイルである。約０．１マイクロリットルから約１マイクロリットルの範囲の分注容量について、１０個の較正点が選択され、較正プロファイルを生成する。しかしより少ない較正点またはより多い較正点を用いることもできる。現実性を無視すれば、点が多いほど、生成される較正プロファイルの正確さは増す。典型的には、分注されるべき容量のターゲット範囲が特定の分注セッションまたはプロシージャについて決定されると、較正点は、少なくとも低いベースパルス幅より低く、高いシーリングパルス幅より上であるように選択されなければならない。図１１のテーブルＩＩは、例として、０．１００マイクロリットルから１．００マイクロリットルの範囲を挟む３，６００マイクロ秒の低いベースパルス幅および３０，０００マイクロ秒の高いシーリングパルス幅を示す。それから以下にある手法が例示されるように、いくつかの中間点も液体分注のターゲットにされた容量範囲内から選択されなければならない。経験および教育された推定を通じて以外では、低いベース幅より小さい、および容量のターゲットとされた範囲のための高いシーリングのパルス幅よりも大きい液体容量を分注するのに必要とされるパルス幅は推定される。
【００９２】
図１０および１１の例において、約５１インチの長さの圧力ライン、約０．９９７７７３５ｇ／ｍＬ、約８．００ｐｓｉｇのバックプレッシャ、および雰囲気温度約２３℃について、３６００マイクロ秒のパルス幅が選択されることによって０．１マイクロリットルの低いベース容量範囲より低い試薬液体の容量が分注された。３６００マイクロ秒のパルス幅を液体分注システム２０の動作インタフェース要素５５に入力することは、本質的にソレノイドバルブをこの期間だけ開放することになる。ついでながら上述のこれらソレノイド分注バルブは、わずか約３００マイクロ秒の小さい期間だけ開放するよう正確に駆動されえる。２４ボルトのスパイク電圧における最小スパイク駆動時間は、これらのバルブについて２５０マイクロ秒であるが、２００マイクロ秒の駆動は、２０マイクロ秒の水晶クロック周波数と組み合わせることによって得られる。
【００９３】
分注された容量は集められ、それから実際の分注された容量を決定するために測定される。簡単には、後で詳述されるように、２つの低容量測定手法が本発明と関連して適用される。一つの低容量測定手法は、分注された流体の重量を測定すること（すなわち重量測定法）を伴い、もう一つは低分注容量の相対蛍光ユニットを測定すること（分光写真法）を伴う。吸光度、蛍光、および質量分光のような使用可能な多くの検出方法が存在する。異なる検出手法は、広い範囲の化学的性質が較正されるようにする。検出手法によらず、単一のパルス幅における複数の反復パルスが供給され、平均の分注容量を測定する。このような平均化は、それぞれの個別の分注からの精密さにおけるバラツキによって引き起こされる正確さの誤差を少なくする。さらに上述のような同一のハードウェア構成を有する複数のチャネル応用例については、チャネルの数だけ平均されてシステマチックな較正が行われえる。
【００９４】
いったん平均分注容量が測定され計算されると（初期パルス幅３６００マイクロ秒については約０．０９７マイクロリットルである）、較正プロファイルに沿った較正点がプロットされえる。本質的に、測定された吐出容量は、開放バルブ時間（すなわちパルス幅）と相関が取られる。より多くの点に適用することによって、図１１のテーブルＩＩに示されるように、図１０の較正プロファイルは、この特定のハードウェア構成について０．１マイクロリットルから約１マイクロリットルの容量範囲について生成されえる。いったんこれが確定されると、このターゲット容量分注範囲内の任意の分注容量は、内挿法によって約−５％から約＋５％の範囲において正確に求められる。さらに必要なソフトウェア／ファームウェアコード、データ獲得、故障決定、アルゴリズムおよび獲得されたデータに応答する反復プロトコルを含む操作インタフェース要素５５を通して、分注容量は自動化されえる。
【００９５】
バルブ開放（すなわちパルス幅）が（２００マイクロ秒＝０．２ミリ秒）マイクロ秒の範囲（すなわち１×１０-6秒）で制御される、ソレノイド分注バルブ３２の応用を通じた非常に低い容量範囲の低容量、非接触液体分注については、較正点の選択が非常に重要である。一般にはソレノイド分注バルブ３２を通したフローが始まる点において、フロー速度は、最大フローに達するまで増加する。この範囲において、バルブを通した試薬フローの変化率（すなわち加速）は増加であり、フローはよって定常状態ではない。いったん最大速度が得られると、フローは実質的に変化せず、ここでフローの変化率（すなわち加速）は実質的にゼロである。よって分注プロファイルはリニアになる。
【００９６】
これは図１２の分注プロファイルグラフにおいてよりはっきりと例示され、これはフロー（ナノリットル／ミリ秒）対パルス幅（マイクロ秒）を相関させている。分注プロファイルグラフを見ると、この場合、変曲領域または点が、約８，０００マイクロ秒から約１０，０００マイクロ秒の間のどこかでフローが実質的に定常になるところに見える、図１０の較正プロファイルを見るよりも、もっと直感的かもしれない。経験からすれば、最大フロー速度は、典型的にはほぼ０．５マイクロリットルに近い分注容量において幅広いハードウェア構成、溶液特性および雰囲気条件について起こる。
【００９７】
最大フロー速度に達するまでの非線形、非定常状態、完全に発達し（fully developed）、層状の性質のために、プロファイルをとるのがより困難なのはこの過渡領域である。したがって、較正点の多くは、この（非定常状態、完全に発達した層状の）領域の中で確立されなければならない。よって較正プロファイル（図１０および１２）を構築するとき、より多い個数のパルス幅の選択が、この領域内で割り当てられなければならない。対照的に、フローが実質的に定常である、分注プロファイルのよりリニアな領域においては、較正プロファイルを内挿するために決定されるためには較正点はより少ししか必要とされない。しかし過渡フローの考慮は、非常に低容量の分注（約０．１０マイクロリットルから約１．００マイクロリットル）で非常に短いパルス幅（約３，０００マイクロ秒から約１０，０００マイクロ秒の範囲）においてはより不可避であることが理解されよう。対照的に、ターゲット分注容量は、フロー速度が最大速度であるときに生じ、このような過渡フローは流体がもはや加速していないので考慮される必要はない。
【００９８】
ターゲット吐出容量が、実質的に広い容量にわたるとき（例えば約０．１マイクロリットルから約５０．０マイクロリットル）、較正プロファイルは離散した狭く規定される容量範囲（すなわち異なる容量範囲にわたる、または互いに重なり合う３つ以上較正プロファイル）に分割されえる。その後、これらプロファイルは、一つの複合較正プロファイルに統合されえる。例えば図１３のテーブルＩＩＩにおいて、容量範囲は、３つの異なる容量範囲に分割されている。すなわち０．１マイクロリットルから１．０マイクロリットル、１．０マイクロリットルから１０．０マイクロリットル、および１０．０マイクロリットルから４０．０マイクロリットルである。
【００９９】
上述較正手法を適用して、較正プロファイルは、それぞれの異なる容量範囲について構築された。０．１マイクロリットルから１．０マイクロリットルの範囲の第１容量範囲は、その測定されたデータがより詳細に図１３のテーブルＩＩＩに記載され、結果として生じる較正プロファイルは図１０に示される。同様に１．０マイクロリットルから１０．０マイクロリットルの範囲の第２容量範囲は、結果として生じる較正プロファイルは図１４に示され、一方、１０．０マイクロリットルから４０．０マイクロリットルの範囲の第３容量範囲は、結果として生じる図１５の較正プロファイルを生む。ターゲット容量分注範囲に依存して、これら較正プロファイルは、より広い較正プロファイルを生むために結合されえる。図１６〜１８はしたがって、３レンジおよび２レンジ較正プロファイルを生み、このデータは、自動化動作のためのソフトウェアインタフェースに入力されえる。インタフェースはグラフィカルである必要はないことが理解されよう。さらにプロファイルは結合されえるが、ソフトウェアおよびファームウェアは、最終の較正テーブル内で多くのデータ点（この例では１０個の点が例示され、１μＬおよび１０μＬにおいて較正範囲が重複することを示すように与えられる）をサポートするよう適合されえる。
【０１００】
前述のように、これら較正プロファイルを作成するために選択された初期パルス幅は、較正された範囲についての最低ターゲット容量より少ない容量を吐出する低いベースパルス幅、および較正された範囲についての最高ターゲット容量より多い容量を吐出する最上シーリングパルス幅を用いて推定される。これは図１３のテーブルＩＩＩの第２容量範囲において例示され、ここで低いベースパルス幅および関連付けられた分注容量は、第１容量範囲（すなわち０．１マイクロリットルから１．０マイクロリットル）の上側のシーリングパルス幅および関連付けられた分注容量と重複する。同様に第２容量範囲の上側シーリングパルス幅および関連付けられた分注容量は、第３容量範囲（すなわち１０．０マイクロリットルから４０．０マイクロリットル）の低いベースパルス幅および関連付けられた分注容量と重複する。特に１．０マイクロリットルから１０．０マイクロリットルの範囲の第２容量範囲において、２３，７００マイクロ秒の低いベースパルス幅が選択され、約０．８４１マイクロリットルの分注容量を得た。上側ベース端において、２００，０００マイクロ秒のパルス幅が選択されると、約１１．７７２マイクロリットルの分注容量が得られた。
【０１０１】
この較正プロファイルについての中間パルスを決定するある手法においては、低いベースパルス幅が上側シーリングパルス幅に分割され、ベースパルス幅からシーリングパルス幅への複数のものを計算する。この係数（quotient）のログがそれから計算されることによって、較正プロファイルの中間部で用いられるパルス幅を計算するのに用いられる乗数が決定される。
【０１０２】
後述のように、およびそのデータがテーブルＩＩＩのものに対応する図１９のテーブルＩＶにおいて例示されるように、第２容量範囲の係数は、以下のように決定される。
【０１０３】
２００，０００μｓ／２３，７００μｓ＝８．４３８８１９
【０１０４】
したがって、
乗数＝係数1/ (較正点の個数)乗数＝１．２６７４１９
【０１０５】
乗数１．２６７４１９はそれから計算されて、中間パルス幅を決定する。例えば、２３，７００μｓ×１．２６７４１９＝３０，０３８μｓであり、一方、３０，０３８μｓ×１．２６７４１９＝３８，０７１μｓなどとなる。
【０１０６】
較正プロファイルのパルス幅を決定するこの曲線近似手法を用いると、較正は多くの範囲および多くの較正点について求められえる。この曲線近似手法は、いくつかの理由で優れている。第１に、この手法は、ターゲットの分注容量を挟むパルス幅において推測するのではなく、較正範囲内で用いられるパルス幅を計算できる柔軟性を提供する。推測の場合、正しいものが決定されるまで、それぞれの較正の反復を実行する必要が生じる。第２に、パルス幅に比較しての分注容量は、対数的に増加するように見える。したがって低いベースパルス幅を、それから後続のパルス幅を選択することは、ベースパルス幅からのリニアな変位ではなく、対数的変位であり、較正プロファイルがソフトウェアにおいて用いられて分注パルスを選択するとき、改善された正確さを生む。最後に、この手法は、後続のパルス幅群に間隔を置き、それによってカーブのより低い端部においてより多くの点が存在し、カーブのより上の端部においてより少ない点が存在する（例えば図１９のテーブルＩＶの「パルス範囲」カラムを参照）ようにする。点１および２の時間差は９５６μｓであり、点２および３の時間差は１２１０μｓであり、点３および４の時間差は１５３２μｓであり、全ての後続のパルス群の間の差はより期間が長くなるよう増加している。
【０１０７】
簡単には、図１９のテーブルＩＶの「期間パルス」のカラムについて、分注器は単一のマイクロ秒の解像度で分注する能力を持たない。水晶つまりクロック周波数は２０マイクロ秒に設定されている。器具は、３６００マイクロ秒において分注するコマンドを受け取る。ファームウェアはそれからこの時間を期間に変換する。（３６００μｓ／（２０μｓ／期間））＝１８０期間である。分注はそれから、２０マイクロ秒を１８０期間だけ分注する。もし分注時間が２０または設定されたクロック周波数によって割り切れないなら、ファームウェアは、分注期間の数を小さい整数に丸める。４５５６マイクロ秒の計算されたパルス幅は、２２７．８期間に変換され、それから２２８期間つまり４５６０マイクロ秒に丸められる。
【０１０８】
上述のように、分注オリフィス３５からの分注された容量の実際の測定は、重量計算または分光写真計算のいずれかを用いて決定されえる。これら２つの方法は以下に簡単に説明される。
【０１０９】
重量測定計算について、この手法は、分注された流体の重量を計測することを伴う（すなわち重量計測法）。それぞれのパルスの後に吐出された流体の質量を測定することによって、吐出された流体容量は簡単に計算され、それぞれのソレノイドバルブの開放時間と相関がとられる。典型的には単一のパルス幅の複数のパルスがコンテナに吐出される。コンテナおよび分注された液体は重さが量られ、いったんコンテナの重さが除かれると分注された液体の重さが決定される。複数のパルスが較正手法で用いられる理由は、それぞれの個別の分注からの精密さのバラツキによって引き起こされる正確さの任意の誤差を減らすためである。他の手法は、それぞれのチャネルについてのハードウェア構成が実質的に同様である場合、それぞれのソレノイド分注バルブを同一のパルス幅で同時に駆動することであり、それから測定された分注容量をそれぞれのチャネルについて平均する。このようにして、個別の較正とは対照的にシステマチックな較正が実行されえる。
【０１１０】
それぞれのパルスで吐出された流体の容量は、以下の方程式によって決定される。
【数１】
0004621777.tif 000002
【０１１１】
上述のように、これら較正プロファイルを作成するのに用いられるパルス幅は、較正された範囲についての最低ターゲット容量より少ない容量を吐出する低いベースパルス幅、および較正された範囲において最高ターゲット容量より多い容量を吐出する最上シーリングパルス幅を用いて計算が開始される。低いベースパルスはそれから上側シーリングパルスに分割されて複数のベースパルスからシーリングパルスまでを計算する。この係数の対数がそれから計算され、較正プロファイルの中間部で用いられるパルスを決定する。較正プロファイルのパルスを決定するこの手法を用いて、較正は、多くの範囲および多くの較正点について求められる。異なるパルス幅がそれぞれの較正点について用いられ、それにより全ての最終容量の合計質量が同じ程度になるようにされる。このようにしてスケールは、いつも同程度の質量を測定する。しかし統計的に多いパルスを較正のために維持するために、それぞれの較正点は好ましくは最小でも１０個のパルスを適用する。
【０１１２】
分光写真法容量計算（または蛍光較正法）については、この手法は液体分注がいくつかの異なるパルス幅（すなわちバルブ開放期間）において、最適な蛍光が可能なマイクロプレート内で起こるときに用いられる。この方法において用いられるプレートは、暗い背景のために通常、ブラックプレートである。それぞれのウェル内での蛍光を測定し、その蛍光を標準カーブと比較することによって容量が計算されえる。いったん容量が既知になると、それから容量およびパルス幅の関係がグラフ上にプロットされえる。単一のパルスにおける複数のパルスがマイクロタイタープレートの単一のウェルに吐出され、合計蛍光が蛍光プレートリーダにおいて測定される。複数のパルス幅が較正手法で用いられる理由は、それぞれの個別の分注からの精密さのバラツキによって引き起こされる正確さの任意の誤差を減らすためである。重量計測部におけるテーブルは、分注器を１００から１，０００ｎＬ、１，０００から１０，０００ｎＬ、および１０，０００から４０，０００ｎＬの３つの異なる容量範囲において較正するのに用いられるパルスを以下に示す。
【０１１３】
蛍光法で較正するためのイベントのシーケンスは、以下のような概略である。
【０１１４】
・ブラックマイクロプレート内に分注する
・マイクロプレートに希釈剤を加える
・プレートを１分震盪する
・プレートを読む
・蛍光標準カーブから容量を計算し、以下を計算する
【０１１５】
○容量吐出計算
・較正プレートおよび分注プレートＲＦＵ（相対蛍光ユニット）データをＥｘｃｅｌにエクスポートする
・較正プレートについての線形回帰の傾きを計算する
・分注プレート上のＲＦＵデータを濃度に変換する
・それぞれのウェルに吐出された染料の容量を計算する
【０１１６】
○吐出された染料の濃度
○  ｙ＝Ｍｘ＋ｂ（線形回帰の傾き）
【０１１７】
○容量計算−２つの方法
【０１１８】
○V1 = (C2V2)/C1  もしV2 >> V1なら以下を使う
・C2 = 線形回帰から得られた値
・C1 = ストック溶液濃度（〜500,000 nmol/L）
・V2 = 加えられた希釈剤の容量
○100μL = 100,000 nL
○100μＬに加えられた500 nL  〜０．５％の誤差
【０１１９】
○C1V1=C2V2  もしV2 〜V1なら以下を使う
・C1V1 = C2(V1+Vdil)
・C1V1 = C2V1 + C2Vdil
・C1V1-C2V1 = C2Vdil
・V1(C1-C2) = C2Vdil
・V1 =(C2Vdil)/(C1-C2)
・C2 = 線形回帰から得られた値
・C1 = ストック溶液濃度（〜500,000 nmol/L）
・Vdil = ウェルに吐出された希釈剤の容量
【０１２０】
再び、これら較正プロファイルを作成するために用いられるパルス幅は、較正された範囲についての最低ターゲット容量より少ない容量を吐出する低いベースパルス幅、および較正された範囲において最高ターゲット容量より多い容量を吐出する最上シーリングパルス幅を用いて計算が開始される。低いベースパルスはそれから上側シーリングパルスに分割されて複数のベースパルスからシーリングパルスまでを計算する。この係数の対数がそれから計算され、較正プロファイルの中間部で用いられるパルスを決定する。較正プロファイルのパルスを決定するこの手法を用いて、較正は、多くの範囲および多くの較正点について求められる。異なるパルス幅がそれぞれの較正点について用いられ、それにより全ての最終容量の合計質量が同じ程度になるようにされる。このようにしてスケールは、いつも同程度の質量を測定する。これは較正のための蛍光法へ較正が遷移するとき、さらに重要になる。蛍光マイクロプレートリーダは、分析スケールよりもずっと狭いリニアな範囲を有する。しかし統計的に多いパルスを較正のために維持するために、それぞれの較正点は好ましくは最小でも１０個のパルスを適用する。
【０１２１】
本発明のいくつかの実施形態しか詳細には説明されていないが、本発明は多くの他の具体的な形態において本発明の精神または範囲から逸脱することなく実施可能であることが理解されよう。
【図１】
0004621777.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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