(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｉｇＡ遺伝子、又は当該遺伝子と９０％の同一性を有し、ＳｉｇＡと同様のシグマ因子としての活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の上流側に隣接する１〜１９８塩基対の領域に、
配列番号２に示す塩基配列における塩基番号１〜１０４７の塩基配列に対して１個又は複数個の塩基が置換、欠失若しくは挿入された塩基配列を含む、塩基長５０００塩基対以内の塩基配列であり、且つｓｉｇＨ遺伝子のプロモーターと同一のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片、及び／又は
枯草菌のｓｐｏＩＩＡオペロンのプロモーター配列若しくは配列番号３で示される塩基配列における塩基番号１〜１１４３の塩基配列に対して１個又は複数個の塩基が置換、欠失若しくは挿入された塩基配列を含む、塩基長５０００塩基対以内の塩基配列であり、且つ当該オペロンのプロモーターと同一のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片、
を挿入して連結させたＤＮＡを、ゲノム上或いはプラスミド上に有する変異バチルス属細菌。
【請求項２】
バチルス属細菌が、枯草菌である請求項１記載の変異バチルス属細菌。
【請求項３】
請求項１又は２記載の変異バチルス属細菌に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物。
【請求項４】
請求項３記載の組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【請求項５】
タンパク質がセルラーゼ、アミラーゼ又はプロテアーゼである請求項４記載の製造方法。
【請求項６】
セルラーゼが配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼ、又は当該アミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつアルカリセルラーゼ活性を有するものである請求項５記載の製造方法。
【請求項７】
アミラーゼが配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるアルカリアミラーゼ、又は当該アミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつアルカリアミラーゼ活性を有するものである請求項５記載の製造方法。
【請求項８】
プロテアーゼが配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼ、又は当該アミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有し、かつアルカリプロテアーゼ活性を有するものである請求項５記載の製造方法。
【請求項９】
ｓｉｇＡ遺伝子、又は当該遺伝子と９０％の同一性を有し、ＳｉｇＡと同様のシグマ因子としての活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の上流側に隣接する１〜１９８塩基対の領域に、
配列番号２に示す塩基配列における塩基番号１〜１０４７の塩基配列に対して１個又は複数個の塩基が置換、欠失若しくは挿入された塩基配列を含む、塩基長５０００塩基対以内の塩基配列であり、且つｓｉｇＨ遺伝子のプロモーターと同一のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片、及び／又は
枯草菌のｓｐｏＩＩＡオペロンのプロモーター配列若しくは配列番号３で示される塩基配列における塩基番号１〜１１４３の塩基配列に対して１個又は複数個の塩基が置換、欠失若しくは挿入された塩基配列を含む、塩基長５０００塩基対以内の塩基配列であり、且つ当該オペロンのプロモーターと同一のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片、
を挿入して連結させたＤＮＡを、バチルス属細菌のゲノム上或いはプラスミド上に有するように構築することを特徴とする変異バチルス属細菌の構築方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる宿主微生物、組換え微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。
【０００３】
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。一方、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、特に最近では、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっており、遺伝子組換えのための宿主微生物の開発が進められている。遺伝子組換え技術を用いた生産菌育種の方法として、遺伝子の発現を調節する転写因子、特にＲＮＡポリメラーゼのシグマ因子を増強する例が知られており、例えば、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）において、栄養増殖期において生育に必須な遺伝子の転写に関与する主要シグマ因子（ハウスキーピングシグマ因子）をコードするｒｐｏＤ遺伝子のコピー数を増加させることによりpyoluteorinや2,4-diacetylphloroglucinol等の抗生物質の生産量を増加させた報告例（例えば、非特許文献１参照）や、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicus）においてハウスキーピングなｓｉｇＡ遺伝子を過剰発現させることによりＬ−リジンの発酵生産量を増加させた報告例（例えば、特許文献１参照）などがある。
【０００４】
しかしながら、これらはいずれも栄養増殖期に於いてハウスキーピングシグマ因子遺伝子の発現を増強するものであった。また、枯草菌（Bacillus subtilis）をはじめとするバチルス属細菌においては、シグマ因子を増強することによって有用物質の生産量を増加させるという報告はこれまでにない。
【特許文献１】国際公開第２００３／０５４１７９号パンフレット
【非特許文献１】J. Bacteriol., 177, 5387, (1995)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、タンパク質又はポリペプチドの生産性向上を可能とする変異バチルス属細菌、また当該変異バチルス属細菌に異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物、更に、当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
バチルス属細菌は、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットとしてプロモーター配列の認識に関与するシグマ因子を複数有している。異なるプロモーターを認識するシグマ因子が、シグマ因子以外の複数サブユニットから成るＲＮＡポリメラーゼコア複合体に結合することによって異なる遺伝子が転写され、これによって、ゲノム上に数千個存在する遺伝子について、状況に応じた遺伝子の発現制御を行っていると考えられている。例えば、バチルス属細菌のうち、枯草菌については１７個のシグマ因子が同定されており、栄養増殖期において生育に必須な遺伝子の転写に関与する主要シグマ因子（ハウスキーピングシグマ因子）であるＳｉｇＡをはじめ、胞子形成過程を制御するシグマ因子ＳｉｇＨ、ＳｉｇＦ、ＳｉｇＥ、ＳｉｇＧ、ＳｉｇＫ、べん毛形成や細胞壁溶解を制御するシグマ因子ＳｉｇＤ、ある種のアミノ酸や糖の代謝を制御するシグマ因子ＳｉｇＬ、環境変化への対応を制御するシグマ因子ＳｉｇＢやＥＣＦシグマと呼ばれるシグマ因子等の存在が知られている（ Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002)）。
【０００７】
これらの中で、胞子形成過程を制御するシグマ因子は、図１に示す様に胞子形成過程の進行に伴って順次発現・活性化されることが知られている。即ち、枯草菌が栄養飢餓状態に陥ると、まずリン酸リレー系と呼ばれる複数のタンパク質間での多段階リン酸伝達系を経て胞子形成開始制御因子であるＳｐｏ０Ａのリン酸化が引き起こされる（Cell, 64, 545, (1991)）。リン酸化Ｓｐｏ０Ａ（Ｓｐｏ０Ａ〜Ｐ）の濃度上昇に伴い、ＳｉｇＨの構造遺伝子（ｓｉｇＨ）の発現を抑制しているリプレッサーＡｂｒＢの誘導が抑制され、結果的にｓｉｇＨの転写がＳｉｇＡ依存的に誘導される（J. Bacteriol., 173, 521, (1991)）。ＳｉｇＨが活性化された後、非対象隔膜形成により枯草菌の細胞質は母細胞側と娘細胞側に分割され、次いで娘細胞側でＳｐｏ０Ａ〜ＰとＳｉｇＨが共役してＳｉｇＦの構造遺伝子（ｓｉｇＦ）を含むオペロン（ｓｐｏIIＡＡ−ｓｐｏIIＡＢ−ｓｉｇＦ）の転写を誘導し（Gene, 101, 113, (1991)）、母細胞側ではＳｐｏ０Ａ〜ＰとＳｉｇＡが共役してＳｉｇＥ前駆体の構造遺伝子（ｓｉｇＥ）を含むオペロン（ｓｐｏIIＧＡ−ｓｉｇＥ）の転写を誘導する（J. Bacteriol., 169, 3329, (1987)）。ＳｉｇＦはアンチ−シグマ因子ＳｐｏIIＡＢ及びアンチ−アンチ−シグマ因子ＳｐｏIIＡＡ、更にＳｐｏIIＡＡの脱リン酸化酵素であるＳｐｏIIＥにより活性化を制御されており（Genes Cells, 1, 881 (1996)）、活性化したＳｉｇＦはシグナル伝達タンパクであるＳｐｏIIＲの構造遺伝子（ｓｐｏIIＲ）の転写を誘導する。娘細胞側から分泌されたＳｐｏIIＲは母細胞側の非対象隔膜に局在するＳｉｇＥ前駆体活性化プロテアーゼであるＳｐｏIIＧＡを活性化し、これによってＳｉｇＥの活性化が起こると考えられている（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92, 2012, (1995)）。
【０００８】
更に娘細胞側ではＳｉｇＦがＳｉｇＧの構造遺伝子（ｓｉｇＧ）の転写を誘導し、母細胞側ではＳｉｇＥがＳｉｇＫの構造遺伝子（ｓｉｇＫ）の転写を誘導するが、娘細胞側でのＳｉｇＧの活性化は母細胞側でのＳｉｇＥの活性化の後に起こり、母細胞側でＳｉｇＫの活性化はこの後に起こる（Mol. Microbiol., 31, 1285, (1999)）。
【０００９】
栄養増殖期には主としてＳｉｇＡがＲＮＡポリメラーゼコア複合体と会合して、ＳｉｇＡが認識するプロモーターを有する遺伝子、またはオペロンの転写を誘導しているが、上記の様な機構により、胞子形成期に入って他のシグマ因子が活性化されると、ＲＮＡポリメラーゼコア複合体と会合するシグマ因子の置換が起こり、ＳｉｇＡと会合するＲＮＡポリメラーゼの量は相対的に低下することが報告されている（J. Bacteriol., 179, 4969, (1999)）。この為、胞子形成期以降、ＳｉｇＡにより認識されるプロモーターからの転写量は相対的に低下するものと考えられる。
【００１０】
斯かる状況の下、本発明者らは、胞子形成期において特異的に認識、発現されるプロモーター配列を、主に栄養増殖期において生育に必須な遺伝子の転写に関与する主要シグマ因子であるＳｉｇＡの遺伝子に連結させることにより、ＳｉｇＡの遺伝子の発現を栄養増殖期後の胞子形成期において増強することができ、当該シグマ因子とＲＮＡポリメラーゼコア複合体との結合量を増加させ、これによって胞子形成期以降の異種タンパク質又はポリペプチドの生産性の向上が図れることを見出した。
【００１１】
すなわち本発明は、ｓｉｇＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列が連結してなるＤＮＡを、ゲノム上或いはプラスミド上に有する変異バチルス属細菌を提供するものである。
【００１２】
また本発明は、当該変異バチルス属細菌に異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物、更に、当該組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造法を提供するものである。
【００１３】
また本発明は、ｓｉｇＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列が連結してなるＤＮＡを、バチルス属細菌のゲノム上或いはプラスミド上に有するように構築することを特徴とする変異バチルス属細菌の構築方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の微生物によれば、該異種タンパク質又はポリペプチドを効率よく生産することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明においてアミノ酸配列及び塩基配列の同一性は、Lipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１６】
本発明の変異バチルス属細菌は、ｓｉｇＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列が連結してなるＤＮＡを、そのゲノム上或いはプラスミド上に有するように構築したものである。
【００１７】
斯かる変異バチルス属細菌を構築するための親微生物としては、胞子形成を行うことを特徴とするバチルス属細菌であれば、その由来は限定されず、野生型のものでも変異を施したものでもよい。中でも本発明において用いられるバチルス属細菌の好ましい例は、全ゲノム情報が明らかにされている、枯草菌（Bacillus subtilis）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・ハロドランス（Bacillus halodulans）などが挙げられ、特に、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から枯草菌が好ましい。
【００１８】
枯草菌のｓｉｇＡ遺伝子とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子をいい、当該遺伝子に相当する遺伝子とは、配列番号１に示されるアミノ酸配列において７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を示す。
【００１９】
斯かるｓｉｇＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に、胞子形成期特異的に認識、転写されるプロモーター配列を連結するが、胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列としては、天然由来のものでも、天然由来を改変したものでも、或いは化学合成したものでも良い。
【００２０】
例えば枯草菌においては、以下（１）〜（６）の何れかの特徴をもつプロモーター配列が挙げられる。
（１）Ｓｐｏ０Ａ〜Ｐ濃度の上昇に伴ってＡｂｒＢによる転写抑制が解除され、且つＳｉｇＡにて認識、転写されるプロモーター配列
（２）ＳｉｇＨにて認識、転写されるプロモーター配列
（３）ＳｉｇＦにて認識、転写されるプロモーター配列
（４）ＳｉｇＥにて認識、転写されるプロモーター配列
（５）ＳｉｇＧにて認識、転写されるプロモーター配列
（６）ＳｉｇＫにて認識、転写されるプロモーター配列
【００２１】
一般に、シグマ因子は転写開始点の上流１０塩基及び３５塩基付近に存在する数塩基の配列を認識して結合するとされており、それぞれ−１０領域、−３５領域と呼ばれている。両領域の配列、両領域間の距離は、シグマ因子毎にそれぞれ共通な特徴を持つことが知られており、コンセンサス配列と呼ばれている。従って、前記（１）〜（６）のプロモーター配列には、（１'）Ｓｐｏ０Ａ〜Ｐ濃度の上昇に伴ってＡｂｒＢによる転写抑制が解除され、且つＳｉｇＡのコンセンサス配列を含む配列、（２'）ＳｉｇＨのコンセンサス配列を含む配列、（３'）ＳｉｇＦのコンセンサス配列を含む配列、（４'）ＳｉｇＥのコンセンサス配列を含む配列、（５'）ＳｉｇＧのコンセンサス配列を含む配列、（６'）ＳｉｇＫのコンセンサス配列を含む配列等が例示できる。
これまでに報告されている枯草菌各シグマ因子のコンセンサス配列を表１に示す。
【００２２】
【表１】
0004820101.tif 000002
【００２３】
（Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002)）
配列中、ＲはＡまたはＧ、ＷはＡまたはＴ、Ｎは任意の塩基をそれぞれ示す。また大文字は保存性が高く、小文字は保存性が低いことを表す。
【００２４】
また、これまでに報告されているＡｂｒＢの認識結合配列は、ＷａＷＷｔｔｔＷＣＡＡａａａａＷ（ＷはＡまたはＴを示す。また大文字は保存性が高く、小文字は保存性が低いことを示す）で表される（J. Bacteriol., 177, 6999, (1995)）。
以上の様に、本発明に於ける胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列とは、前記（１）〜（６）、或いは（１'）〜（６'）の何れかの特徴を有するものである。
【００２５】
（１）または（１'）の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表２に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられ、（２）または（２'）の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表３に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられ、（３）または（３'）の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表４に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられ、（４）または（４'）の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表５に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられ、（５）または（５'）の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表６に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられ、（６）または（６'）の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表７に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられる。
【００２６】
尚、表中の各遺伝子の名称、番号及び機能等は、Nature, 390, 249-256, (1997) で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2003年６月17日更新)された枯草菌ゲノムデーターに基づいて記載している。
【００２７】
【表２】
0004820101.tif 000003
【００２８】
（Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria; biochemistry, physiology, and molecular genetics, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp757, (1993)、J. Bacteriol., 177, 6999, (1995)）
表中、オペロンについては、転写単位の先頭の遺伝子名を示した。
【００２９】
【表３】
0004820101.tif 000004
【００３０】
（Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002)）
表中、オペロンについては、転写単位の先頭の遺伝子名を示した。
【００３１】
【表４】
0004820101.tif 000005
【００３２】
（Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002)）
表中、オペロンについては、転写単位の先頭の遺伝子名を示した。
【００３３】
【表５】
0004820101.tif 000006
【００３４】
（Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002)）
表中、オペロンについては、転写単位の先頭の遺伝子名を示した。
【００３５】
【表６】
0004820101.tif 000007
【００３６】
（Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002)）
表中、オペロンについては、転写単位の先頭の遺伝子名を示した。
【００３７】
【表７】
0004820101.tif 000008
【００３８】
（Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002)）
表中、オペロンについては、転写単位の先頭の遺伝子名を示した。
【００３９】
以上の様に、本発明に於いて用いられる胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列としての好適な例としては、前記（１）〜（６）、或いは（１'）〜（６'）の何れかの特徴をもつプロモーターが挙げられる。一方、枯草菌において、ＳｉｇＥはＲＮＡポリメラーゼに対してＳｉｇＡより高い親和性を示すとの報告例もあることから（J. Bacteriol., 179, 4969, (1999)）、より好適には、ＳｉｇＥが活性化する以前に転写が活性化するプロモーターを利用することが好ましい。より好ましい当該プロモーター配列としては、Ｓｐｏ０Ａ〜Ｐ濃度の上昇に伴ってＡｂｒＢによる転写抑制が解除され、且つＳｉｇＡにより認識、転写されるプロモーター配列（前記（１）又は（１'）に相当）、又はＳｉｇＨにより認識、転写されるプロモーター配列（前記（２）又は（２'）に相当）が挙げられる。
【００４０】
前記（１）又は（１'）の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表１に示した枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーター配列が挙げられ、中でも特に好適な例としては、枯草菌のｓｉｇＨのプロモーター配列が挙げられる。枯草菌のｓｉｇＨのプロモーター配列は、配列番号２に示す塩基配列における塩基番号９８７〜１０２７の塩基配列、好ましくは塩基番号９８７〜１０４７の塩基配列、より好ましくは塩基番号１〜１０４７の塩基配列を含む、塩基長５０００塩基対以内、好ましくは２０００塩基対以内、より好ましくは１０４７塩基対以内の塩基配列であり、且つ当該遺伝子のプロモーターと同一のプロモーター機能を有するものである。
【００４１】
また前記（２）又は（２'）の何れかの特徴を有するプロモーター配列のうち、天然由来のものとしては、表２に示される枯草菌の遺伝子又はオペロンのプロモーターが挙げられ、中でも特に好適な例としては枯草菌のｓｐｏIIＡＡ−ｓｐｏIIＡＢ−ｓｉｇＦオペロン（ｓｐｏIIＡオペロン）のプロモーター配列が挙げられる。枯草菌のｓｐｏIIＡオペロンのプロモーター配列は、配列番号３に示す塩基配列における塩基番号１０８１〜１１１０の塩基配列、好ましくは塩基番号１０８１〜１１１８の塩基配列、より好ましくは塩基番号１〜１１４３の塩基配列を含む、塩基長５０００塩基対以内、好ましくは２０００塩基対以内、より好ましくは１１４３塩基対以内の塩基配列であり、且つ当該遺伝子のプロモーターと同一のプロモーター機能を有するものである。
【００４２】
また、本発明で用いられる胞子形成期特異的に認識、発現されるプロモーター配列としては、表１〜表６記載の枯草菌の各遺伝子或いは各オペロンのプロモーター配列に相当する配列も含まれる。例えば、枯草菌のｓｉｇＨ遺伝子のプロモーター配列に相当する配列としては、配列番号２に示す塩基配列における塩基番号９８７〜１０２７の塩基配列、好ましくは塩基番号９８７〜１０４７の塩基配列、より好ましくは塩基番号１〜１０４７の塩基配列に対して、１個又は複数個の塩基が置換、欠失若しくは挿入された塩基配列を含む、塩基長５０００塩基対以内、好ましくは２０００塩基対以内、より好ましくは１０４７塩基対以内の塩基配列であり、且つ当該遺伝子のプロモーターと同一のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片が挙げられる。
【００４３】
また、ｓｐｏIIＡオペロンのプロモーター配列に相当する配列としては、配列番号３で示される塩基配列における塩基番号１０８１〜１１１０の塩基配列、好ましくは塩基番号１０８１〜１１１８の塩基配列、更に好ましくは塩基番号１〜１１４３の塩基配列に対して、１個又は複数個の塩基が置換、欠失若しくは挿入された塩基配列を含む、塩基長５０００塩基対以内、好ましくは２０００塩基対以内、より好ましくは１１１８塩基対以内の塩基配列であり、且つ当該オペロンのプロモーターと同一のプロモーター機能を有するＤＮＡ断片が挙げられる。
【００４４】
更に、本発明で用いられる胞子形成期における転写に特異的に関与するシグマ因子により認識されるプロモーター配列には、表２又は表３記載の枯草菌の遺伝子又は、枯草菌のオペロンを構成する遺伝子のオーソログ（ortholog）遺伝子のプロモーター配列、好適には、バチルス属細菌由来の当該オーソログ遺伝子のプロモーター配列も含まれる。オーソログ遺伝子は、インターネットで公開されるMicrobial Genome Database（MBGD、http://mbgd.genome.ad.jp/) のCreate/view Orthologous gene tableプログラムを利用することによって見出すことができる。枯草菌ｓｉｇＨ遺伝子のオーソログ遺伝子の例としては、バチルス・ハロドランスのｓｉｇＨ（ＢＨ０１１５）遺伝子や、バチルス・セレウスのＢＣ０１１４遺伝子などが挙げられる。また、枯草菌のｓｐｏIIＡオペロンを構成する各遺伝子のオーソログとしては、バチルス・ハロドランスのｓｉｇＦ（ＢＨ１５３８）遺伝子、ｓｐｏIIＡＢ（ＢＨ１５３７）遺伝子、又ｓｐｏIIＡＡ（ＢＨ１５３６）、バチルス・セレウスのＢＣ４０７２遺伝子、ＢＣ４０７３遺伝子、又ＢＣ４０７４遺伝子などが挙げられる。
【００４５】
斯かる胞子形成期における転写に特異的に関与するシグマ因子により認識されるプロモーター配列は、上記のプロモーター配列を単独で用いる他、複数種を組み合わせて用いることができる。
【００４６】
胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列が枯草菌のｓｉｇＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に結合してなるＤＮＡは、例えば、元来枯草菌ゲノム上に存在するｓｉｇＡ遺伝子の上流に存在するＳｉｇＡ認識プロモーター配列の上流又は下流に、胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含むＤＮＡ断片を挿入することによってゲノム上に構築することができる。尚、胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含むＤＮＡ断片を挿入する部位は、ｓｉｇＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流であればよいが、ｓｉｇＡ構造遺伝子の上流側に隣接する２０００塩基対以内の領域が好ましく、１０００塩基対以内の領域がより好ましく、５００塩基対以内の領域が更に好ましく、１〜１９８塩基対の領域が特に好ましい。但し、胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含むＤＮＡ断片が適切なリボソーム結合部位の配列を含まない場合には、該ＤＮＡ断片をｓｉｇＡ構造遺伝子より１５塩基対以上、上流に挿入することが望ましい。
【００４７】
また、胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列をｓｉｇＡ遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流側に連結したＤＮＡはＰＣＲなどの方法によって構築することも可能である。尚、連結部位からｓｉｇＡ構造遺伝子までの間の、元来枯草菌ゲノム上に存在するｓｉｇＡ遺伝子の上流配列に由来する配列は、０〜２０００塩基対であることが好ましく、０〜１０００塩基対であることがより好ましく、０〜５００塩基対であることが更に好ましく、０〜１９８塩基対であることが特に好ましい。但し、胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含むＤＮＡ断片が適切なリボソーム結合部位の配列を含まない場合には、連結部位からｓｉｇＡ構造遺伝子までの間の、元来枯草菌ゲノム上に存在するｓｉｇＡ遺伝子の上流配列に由来する配列は１５塩基対以上であることが望ましい。本発明変異バチルス属細菌を構築するためには、このようにして構築したＤＮＡを新たに親バチルス属細菌へ導入すれば良い。
【００４８】
例えば胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含むＤＮＡ断片とｓｉｇＡ遺伝子等を含むＤＮＡ断片を連結したＤＮＡ断片をＰＣＲ等の方法により調製し、親バチルス属細菌内で複製可能なプラスミドベクターにクローニングして取り込ませる方法を用いることができる。特に、本発明変異バチルス属細菌を構築するための親バチルス属細菌として枯草菌を用いる場合、複製可能なプラスミドベクターとしてはpUB110（Plasmid, 15, 93, (1986)）、pC194（J. Bacteriol., 150, 815, (1982)）、pTX14-3（Plasmid, 30, 119, (1993)）をはじめとして既に報告のある多数のプラスミドベクターを利用することが可能である。
【００４９】
或いは、胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含むＤＮＡ断片がｓｉｇＡ遺伝子等を含むＤＮＡ断片の上流に連結したＤＮＡ断片を、相同組換え等の方法によってゲノム上に導入することができる。相同組換えを利用してゲノム上にＤＮＡ断片を導入する方法については既にいくつかの報告があり（Mol. Gen. Genet., 223, 268 (1990)等）、それらの方法に従うことによって、本発明の変異バチルス属細菌を得ることができる。
【００５０】
以下、より具体的にＳＯＥ（splicing by overlap extension）−ＰＣＲ法（Gene, 77, 51, (1989)）により調製された胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含むＤＮＡ断片とｓｉｇＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片が連結したＤＮＡ断片を調製し、相同組換えを利用することによりゲノム上に当該ＤＮＡ断片を導入する方法について説明するが、本発明における当該ＤＮＡ断片の導入方法は下記に限定されるものではない。
【００５１】
本発明において、まず１回目のＰＣＲにより胞子形成期において特異的に認識、転写される胞子形成期において特異的に認識、転写されるプロモーター配列を含むＤＮＡ断片と、ハウスキーピングシグマ因子の構造遺伝子断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の３断片を調製するが、この際、例えば、当該プロモーター配列を含むＤＮＡ断片の下流末端にハウスキーピングシグマ因子の構造遺伝子断片の上流側１０〜３０塩基対配列、逆に薬剤耐性マーカー遺伝子断片の上流末端にはハウスキーピングシグマ因子の構造遺伝子断片の下流側１０〜３０塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図２）。
【００５２】
次いで、１回目に調製した３種類のＰＣＲ断片を鋳型とし、当該プロモーター配列を含む断片の上流側プライマーと薬剤耐性マーカー遺伝子断片の下流側プライマーを用いて２回目のＰＣＲを行うことによって、当該プロモーター配列を含む断片の下流末端及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片の上流末端に付加したｓｉｇＡ遺伝子断片配列において、ｓｉｇＡ遺伝子断片とのアニールが生じ、ＰＣＲ増幅の結果、ｓｉｇＡ遺伝子の上流に胞子形成期における転写に特異的に関与するシグマ因子により認識されるプロモーター配列が連結され、且つ薬剤耐性マーカー遺伝子がその下流に連結されたＤＮＡ断片を得ることができる（図２）。
【００５３】
胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列として枯草菌のｓｉｇＨ遺伝子、或いはｓｐｏIIＡオペロンのプロモーターを、薬剤耐性マーカー遺伝子として、クロラムフェニコール耐性遺伝子を用いる場合、例えば表８に示したプライマーセットを用い、Pyrobest ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）などの一般のＰＣＲ用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B. A. White, Humana Press, pp251 (1993)、Gene, 77,61, (1989)等）に示される通常の条件によりＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、所望のＤＮＡ断片を得ることができる。
【００５４】
かくして得られたＤＮＡ断片を、例えば枯草菌ゲノム上に導入する場合、枯草菌細胞内にて複製出来ないプラスミドベクター、例えばｐＭＷ２１９（ニッポンジーン）にクローニングし、コンピテント法等によって細胞内に取り込ませると、プラスミド上のハウスキーピングシグマ因子の遺伝子領域と、ゲノム上のｓｉｇＡ遺伝子領域の間で相同組換えが生じ、薬剤耐性マーカーによる選択によって、胞子形成期に特異的に認識、転写されるプロモーター配列が結合したｓｉｇＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片がプラスミドベクターと共にゲノム上に導入された細胞を分離することができる（図２）。即ち、表３に示したプライマーセットを用いて調製したＤＮＡ断片をｐＭＷ２１９にクローニングしたプラスミドを枯草菌細胞内に取り込ませた場合、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、ｓｉｇＨ遺伝子、或いはｓｐｏIIＡオペロンのプロモーター領域とｓｉｇＡ遺伝子が連結したＤＮＡ断片がゲノム上に導入されていることを、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法などによって確認すればよい。
【００５５】
以上は主に親バチルス属細菌として枯草菌を用いる場合について示したが、他のバチルス属細菌についても同様にして本発明の変異バチルス属細菌を得ることができる。
【００５６】
かくして得られたバチルス属細菌を用いることにより、異種タンパク質又はポリペプチドの生産において、異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子の転写、並びにタンパク生産に関わる種々の遺伝子の転写を行うＳｉｇＡが胞子形成期に発現増強される為、生産性の向上が達成される。
すなわち、ＳｉｇＡによって認識されるプロモーターの下流に目的とするタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を結合させた後、これを本発明により得られた変異バチルス属細菌に導入することによって、栄養増殖期のみならず、胞子形成期に於いても目的のタンパク質又はポリペプチドの生産が継続するため、親バチルス属細菌に比べ、著量の目的タンパク質又はポリペプチドを生産する。
【００５７】
目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子は特に限定されず、洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが含まれる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase) 、転移酵素 (Transferase) 、加水分解酵素 (Hydrolase) 、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素 (Isomerase) 、合成酵素 (Ligase/Synthetase) 等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素の遺伝子が挙げられる。具体的には、多糖加水分解酵素の分類（Biochem. J., 280, 309 (1991)）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、配列番号４又は６で示されるアミノ酸配列からなるバチルス  エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｓ２３７株（FERM BP-7875）又はバチルス  エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−６４株（FERM BP-2886）由来のアルカリセルラーゼや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
【００５８】
また、α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にバチルス属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配列番号１９で示されるアミノ酸配列からなるバチルス  エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｋ３８株（FERM BP-6946）由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。尚、アミノ酸配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。また、プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。より具体的な例として、配列番号２１で示されるアミノ酸配列からなるバチルス  クラウジ（Bacillus clausii）ＫＳＭ−Ｋ１６株(FERM BP-3376)由来のアルカリプロテアーゼや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼが挙げられる。
【００５９】
一方、前述の様に目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子は、その上流に枯草菌ＳｉｇＡなどのハウスキーピングシグマ因子によって認識されるプロモーター配列が結合されている必要があり、更に、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、リボソーム結合部位および開始コドンを含む翻訳開始領域、又、分泌用シグナルペプチド領域が適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開２０００−２１００８１号公報や特開平４−１９０７９３号公報等に記載されているバチルス属細菌、すなわちＫＳＭ−Ｓ２３７株（FERM BP-7875）、ＫＳＭ−６４株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子のハウスキーピングシグマ因子で転写されるプロモーターを含む転写開始制御領域、翻訳開始領域、分泌用シグナルペプチド領域、より具体的には配列番号５で示される塩基配列の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号７で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、また当該塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。
【００６０】
上記の目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むＤＮＡ断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法によって本発明の変異バチルス属細菌に取り込ませることによって、目的タンパク質又はポリペプチドの生産性を向上させることができる。また、当該ＤＮＡ断片に本発明の変異バチルス属細菌ゲノムとの適当な相同領域を結合したＤＮＡ断片を用い、本発明の変異バチルス属細菌ゲノムに直接組み込むことによっても目的タンパク質又はポリペプチドの生産性を向上させることができる。
【００６１】
本発明の変異バチルス属細菌を宿主とした目的タンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。
【００６２】
以上より、胞子形成期におけるｓｉｇＡ遺伝子の転写効率が向上したバチルス属細菌を構築することができ、当該変異バチルス属細菌を組換え生産の宿主細胞として用いれば有用なタンパク質又はポリペプチドを効率的に生産することができる。
【００６３】
以下、実施例を用いて、本発明の変異バチルス属細菌の構築方法と、当該変異バチルス属細菌を宿主として用いたセルラーゼの生産方法について具体的に説明する。
【実施例】
【００６４】
実施例１  胞子形成期に特異的に転写されるプロモーターを有するｓｉｇＡ遺伝子を枯草菌ゲノム上に導入するためのプラスミドの構築
図２に示す方法と同様にして、ｓｉｇＨ遺伝子プロモーター或いはｓｐｏIIＡオペロンプロモーターをｓｉｇＡ構造遺伝子の上流に連結したＤＮＡ断片を、１回交差の相同組換えを利用して枯草菌ゲノム上へ導入する為のプラスミドの構築を行った。即ち、枯草菌１６８株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、表８に示したｓｉｇＡｆとｓｉｇＡｒのプライマーセットを用いてｓｉｇＡ遺伝子を含む１．２ｋｂ断片（Ａ）をＰＣＲにより調製した。同様に表８に示したｓｉｇＨＵｆとｓｉｇＨＵｒ−ｓｉｇＡのプライマーセットを用いてゲノム上のｓｉｇＨ遺伝子の上流に隣接するｓｉｇＨ遺伝子のプロモーターを含む１．０ｋｂ断片（Ｂ）を調製した。同様に表８に示したｓｉｇＦＵｆとｓｉｇＦＵｒ−ｓｉｇＡのプライマーセットを用いてゲノム上のｓｐｏIIＡオペロンの上流に隣接し、ｓｉｇＦ遺伝子の転写を司るｓｐｏIIＡオペロンのプロモーターを含む１．１ｋｂ断片（Ｃ）を調製した。またプラスミドｐＣ１９４（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）を鋳型とし、表８に示したＣｍＦＷとＣｍｒ−ｓｉｇＡのプライマーセットを用いてクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む０．９ｋｂ断片（Ｄ）を調製した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｄ）３断片を混合して鋳型とし、表８に示したｓｉｇＨＵｆとＣｍＦＷのプライマーセットを用いたＳＯＥ-ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ｂ）（Ａ）（Ｄ）の順になる様に結合させ、ｓｉｇＨ遺伝子のプロモーターがｓｉｇＡ構造遺伝子の上流に連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が逆向きに結合した３．１ｋｂのＤＮＡ断片（Ｅ）を得た。同様に（Ａ）（Ｃ）（Ｄ）３断片を混合して鋳型とし、表８に示したｓｉｇＦＵｆとＣｍＦＷのプライマーセットを用いたＳＯＥ−ＰＣＲを行うことによって、３断片を（Ｃ）（Ａ）（Ｄ）の順になる様に結合させ、ｓｐｏIIＡオペロンプロモーターがｓｉｇＡ構造遺伝子の上流に連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が逆向きに結合した３．２ｋｂのＤＮＡ断片（Ｆ）を得た。３．１ｋｂのＤＮＡ断片（Ｅ）と３．２ｋｂのＤＮＡ断片（Ｆ）をそれぞれ枯草菌細胞内では複製できない大腸菌用プラスミドベクターｐＭＷ２１９のＳｍａＩ制限酵素切断点に挿入し、胞子形成期に特異的に転写されるプロモーターを有するｓｉｇＡ遺伝子を枯草菌ゲノム上に導入するためのプラスミドｐＭＷＰＨｓｉｇＡ及びｐＭＷＰＦｓｉｇＡを構築した。
【００６５】
また上記のプライマーのうち、ｓｉｇＡｆ及びｓｉｇＦＵｒ−ｓｉｇＡに代えて、それぞれ表８に示すｓｉｇＡｍｆ及びｓｉｇＦＵｒ−ｓｉｇＡｍを用いて同様の操作を行うことにより、ｐＭＷＰＦｓｉｇＡにおけるｓｉｇＡ遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）が開始コドンとして認識されない（ＡＴＡ）に置換されたｐＭＷＰＦｓｉｇＡｍを構築した。
【００６６】
実施例２  胞子形成期に特異的に転写されるプロモーターを有するｓｉｇＡ遺伝子の枯草菌１６８株ゲノムへの導入  胞子形成期に特異的に転写されるプロモーターを有するｓｉｇＡ遺伝子、又は開始コドン（ＡＴＧ）が（ＡＴＡ）に置換されたｓｉｇＡ遺伝子（ｓｉｇＡｍ）を枯草菌ゲノム上に導入するためのプラスミドｐＭＷＰＨｓｉｇＡ、ｐＭＷＰＦｓｉｇＡ、及びｐＭＷＰＦｓｉｇＡｍを用いてコンピテント法によりそれぞれ枯草菌１６８株の形質転換を行い、クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムを鋳型としてＰＣＲを行うことによって、ゲノム上のｓｉｇＡ遺伝子とプラスミド上のｓｉｇＡ遺伝子又はｓｉｇＡｍの間での相同組換えにより、胞子形成期に特異的に転写されるプロモーターを有するｓｉｇＡ又はｓｉｇＡｍが、１．２ｋｂ断片（Ｄ）と共にゲノム内に挿入されたことを確認し、これらを１６８ＰＨｓｉｇＡ株、１６８ＰＦｓｉｇＡ株、及び１６８ＰＦｓｉｇＡｍ株と命名した。
【００６７】
実施例３  枯草菌変異株のアルカリセルラーゼ分泌生産評価
実施例２にて得られた３種類の枯草菌変異株（１６８ＰＨｓｉｇＡ株、１６８ＰＦｓｉｇＡ株、及び１６８ＰＦｓｉｇＡｍ株）、及び対照として枯草菌１６８株に、バチルス  エスピー（Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｓ２３７株（FERM BP-7875）由来のアルカリセルラーゼ（特開２０００-２１００８１号公報）をコードするＤＮＡ断片（３．１ｋｂ）がシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト）のＢａｍＨＩ制限酵素切断点に挿入された組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を１０ｍＬのＬＢ培地で一夜３７℃で振盪培養を行い、更にこの培養液０．０５ｍＬを５０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃で３日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を求めた。この結果、表９に示した様に、宿主として１６８ＰＨｓｉｇＡ株又は１６８ＰＦｓｉｇＡ株を用いた場合、対照の１６８株（野生型）の場合と比較して高いアルカリセルラーゼの分泌生産が認められた。一方、宿主として１６８ＰＦｓｉｇＡｍを用いた場合のアルカリセルラーゼ分泌量は、対照の１６８株（野生型）と同等であったことから、１６８ＰＨｓｉｇＡ株又は１６８ＰＦｓｉｇＡ株に於ける高生産化が、ゲノム上に新たに付加されたｓｉｇＨ遺伝子或いはｓｐｏIIＡオペロンのプロモーターを持つｓｉｇＡ遺伝子により、ＳｉｇＡが生産されたことによるものと推定された。
【００６８】
【表８】
0004820101.tif 000009
【００６９】
【表９】
0004820101.tif 000010
【００７０】
実施例４  枯草菌変異株のアルカリプロテアーゼ分泌生産評価
実施例３にてアルカリセルラーゼ生産性向上が認められた１６８ＰＨｓｉｇＡ株及び１６８ＰＦｓｉｇＡ株の他のタンパク質又はポリペプチド生産における有効性を確認する為に、以下の様にバチルス属細菌由来のアルカリプロテアーゼ生産性評価を行った。
バチルス  クラウジ（Bacillus clausii）KSM-K16株（FERM BP-3376）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１０に示されるS237pKAPpp-FとKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号２１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ（Appl. Microbiol. Biotechnol., 43, 473, (1995)）をコードする1.3kbのDNA断片（Ｇ）を増幅した。またバチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１０に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237pKAPpp-Rのプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）のプロモーター領域を含む0.6kbのDNA断片（Ｈ）を増幅した。次いで、得られた（Ｇ）（Ｈ）の2断片を混合して鋳型とし、表１０に示されるS237ppp-F2(BamHI)とKAPter-R(BglII)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域の下流にアルカリプロテアーゼ遺伝子が連結した1.8 kbのDNA断片（Ｉ）を得た。得られた1.8 kbのDNA断片（I）をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-BglII制限酵素切断点に挿入し、アルカリプロテアーゼ生産性評価用プラスミドpHYKAP(S237p)を構築した。
構築したプラスミドpHYKAP(S237p)を１６８ＰＨｓｉｇＡ株、１６８ＰＦｓｉｇＡ株、及び対照として枯草菌１６８株にプロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を実施例３と同様の条件にて３日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリプロテアーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリプロテアーゼの量を求めた。この結果、表１１に示した様に、宿主として１６８ＰＨｓｉｇＡ株又は１６８ＰＦｓｉｇＡ株を用いた場合、対照の１６８株（野生型）の場合と比較して高いアルカリプロテアーゼの分泌生産が認められた。
【００７１】
【表１０】
0004820101.tif 000011
【００７２】
【表１１】
0004820101.tif 000012
【００７３】
実施例５  枯草菌変異株のアルカリアミラーゼ分泌生産評価
実施例３及び４にてアルカリセルラーゼ及びアルカリプロテアーゼ生産性向上が認められた１６８ＰＨｓｉｇＡ株及び１６８ＰＦｓｉｇＡ株の他のタンパク質又はポリペプチド生産における有効性を更に確認する為に、以下の様にバチルス属細菌由来のアミラーゼ生産性評価を行った。
バチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株(FERM BP-6946)より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１０に示されるK38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するアルカリアミラーゼ（Appl. Environ. Microbiol., 67, 1744, (2001)）をコードする1.5kbのDNA断片（Ｊ）を増幅した。またバチルス  エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１０に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）のプロモーター領域と分泌シグナル配列をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片（Ｋ）を増幅した。次いで、得られた（Ｊ）（Ｋ）の2断片を混合して鋳型とし、表１０に示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域と分泌シグナル配列をコードする領域の下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した2.1kbのDNA断片（Ｌ）を得た。得られた2.2kbのDNA断片（Ｌ）をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を構築した。
構築したプラスミドpHYK38(S237ps)を１６８ＰＨｓｉｇＡ株、１６８ＰＦｓｉｇＡ株、及び対照として枯草菌１６８株にプロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を実施例３と同様の条件にて５日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアミラーゼの量を求めた。この結果、表１２に示した様に、宿主として１６８ＰＨｓｉｇＡ株又は１６８ＰＦｓｉｇＡ株を用いた場合、対照の１６８株（野生型）の場合と比較して高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められ、上記変異株が種々のタンパク質又はポリペプチド生産において有効であることが示された。
【００７４】
【表１２】
0004820101.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】胞子形成過程における逐次的シグマ因子の活性化を示した模式図である。
【図２】本発明ｓｉｇＡ遺伝子の構築例を示した概念図である。
【図１】
0004820101.tif 000014
【図２】
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【配列表】
0004820101000001.app