(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する方法。
【請求項２】
心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア含有量に基づいて、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する請求項1に記載の方法。
【請求項３】
心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する請求項1に記載の方法。
【請求項４】
心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び膜電位に基づいて、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する請求項1に記載の方法。
【請求項５】
ミトコンドリア指示薬を用いて心筋細胞含有細胞混合物を標識し、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位を測定することを特徴とする請求項1〜4に記載の方法。
【請求項６】
心筋細胞含有細胞混合物が、全心臓構成細胞混合物又は心筋細胞分化可能細胞由来細胞混合物である請求項1〜5に記載の方法。
【請求項７】
心筋細胞分化可能細胞が、幹細胞、前駆細胞及び卵細胞からなる群から選択される請求項6に記載の方法。
【請求項８】
ミトコンドリア指示薬を用いて心筋細胞含有細胞混合物を標識した後、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位を測定する前に、ミトコンドリア指示薬の非存在下にて標識した細胞を培養する工程を更に含む請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
ミトコンドリア指示薬が、以下の化合物からなる群から選択される請求項5〜8のいずれか1項に記載の方法。
A1372
【化１】
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D273
【化２】
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D288
【化３】
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D308
【化４】
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D378
【化５】
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D426
【化６】
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D632
【化７】
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D633
【化８】
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D22421
【化９】
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D23806
【化１０】
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L6868
【化１１】
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M7502
【化１２】
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M7510
【化１３】
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M7511
【化１４】
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M7512
【化１５】
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M7513
【化１６】
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M7514
【化１７】
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M22422
【化１８】
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M22423
【化１９】
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M22425
【化２０】
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M22426
【化２１】
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R302
【化２２】
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R634
【化２３】
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R648
【化２４】
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R14060
【化２５】
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R22420
【化２６】
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T639
【化２７】
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T668
【化２８】
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T669
【化２９】
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及びT3168
【化３０】
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【請求項１０】
ミトコンドリア指示薬がM7512、T3168、T668又はR302である請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
心筋細胞含有細胞混合物から、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を濃縮する方法であって：
（1）心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬を用いて標識する工程；並びに
（2）細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて心筋細胞を選択する工程；
を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１２】
心筋細胞含有細胞混合物が、全心臓構成細胞混合物又は心筋細胞分化可能細胞由来細胞混合物である請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
心筋細胞分化可能細胞が、幹細胞、前駆細胞及び卵細胞からなる群から選択される請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記（1）の工程の後、（2）の工程の前に、ミトコンドリア指示薬の非存在下にて標識した細胞を培養する工程を更に含む請求項11〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
ミトコンドリア指示薬が、A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669及びT3168からなる群から選択される請求項11〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
ミトコンドリア指示薬がM7512、T3168、T668又はR302である請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を製造する方法であって：
（1）心筋細胞分化可能細胞から、心筋細胞を分化・誘導し、心筋細胞含有細胞混合物を調製する工程；
（2）心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬を用いて標識する工程；並びに
（3）細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて心筋細胞を選択する工程；
を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項１８】
心筋細胞分化可能細胞が、幹細胞、前駆細胞及び卵細胞からなる群から選択される請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記（2）の工程の後、（3）の工程の前に、ミトコンドリア指示薬の非存在下にて標識した細胞を培養する工程を更に含む請求項17又は18に記載の方法。
【請求項２０】
ミトコンドリア指示薬が、A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669及びT3168からなる群から選択される請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２１】
ミトコンドリア指示薬がM7512、T3168、T668又はR302である請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
心筋細胞含有細胞混合物中における心筋細胞比率を評価する方法であって：
（1）心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬を用いて標識する工程；並びに
（2）細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて、非心筋細胞に対する心筋細胞の比率を計測する工程；
を含むことを特徴とする前記方法。
【請求項２３】
心筋細胞含有細胞混合物が、全心臓構成細胞混合物又は心筋細胞分化可能細胞由来分化細胞混合物である請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
心筋細胞分化可能細胞が、幹細胞、前駆細胞及び卵細胞からなる群から選択される請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
ミトコンドリア指示薬が、A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669及びT3168からなる群から選択される請求項22〜24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２６】
ミトコンドリア指示薬がM7512、T3168、T668又はR302である請求項25に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全心臓構成細胞群もしくは、幹細胞に由来する細胞群からの心筋細胞の選択方法と、その方法を利用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
成体における心筋細胞は増殖活性を喪失しており、重症な心筋梗塞、心筋症などの疾患では心臓移植に頼らざるを得ない。しかし、現状では心臓のドナー不足の問題を克服するには至っておらず、心臓移植以外の治療方法を見出すことが急務である。これに対して、心筋細胞を体外で作製し、心筋細胞の補充に充てることは、心臓移植に頼らなくてはならない患者を救済する最も有望な方法と予想されている。【０００３】
心筋細胞の作製方法は、胚性幹細胞を分化させて用いる方法、並びに生体内に存在することが示唆されている幹細胞（体性幹細胞）を取り出し、分化を誘導する方法などが検討されている。しかし、幹細胞の性質として、心筋細胞以外の細胞を副産物として産生してしまうという問題点や、未分化な細胞を残存させる性質を有するといった問題点が存在するために、これまでは、分化・誘導を行った細胞集団をそのまま治療に用いることは出来ないとされていた。そのため、ヒトにおいて実用可能にするためには、分化・誘導を行った細胞集団から心筋細胞を選び出すことが必須である。【０００４】
現在、心筋細胞を精製する方法としては、あらかじめ幹細胞のゲノムに何らかのマーカー遺伝子の導入を行う方法以外に有効な方法は報告されていない（FASEB J. 2000; 14: 2540-2548）。しかしながら、ゲノムを改変することは、それ自体に倫理的な問題を持つ上、細胞ガン化率の変化等、予測不可能な重大リスクを伴うため、ヒトにおける実用化のためには大きな問題をはらんでいる。【０００５】
心臓において、酸素消費量が主要な組織に比べて高いこと、及び心臓におけるミトコンドリアの含有量が比較的多いことは、知られている（Am J Physiol 1985; 248: R415-421）。また、心筋細胞が細胞分化・成熟すると、分裂能を著しく消失することは広く知られている。しかしながら、上述したような心筋細胞の性質を応用して心筋細胞を選びだそうとする試みは従来の技術分野においては全く知られていない。さらには、ミトコンドリアの膜電位に着目して心筋細胞ミトコンドリアの膜電位と他の細胞ミトコンドリアの膜電位を直接比較検討した例は無く、ミトコンドリアの膜電位を指標として心筋細胞の選択を検討した例は報告されていない。
【非特許文献１】FASEB J. 2000; 14: 2540-2548
【非特許文献２】Am J Physiol 1985;248:R415-421
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、従来は直接的には心筋細胞を選び出すこととは結びついていなかった心筋細胞の諸性質を用いて、全心臓構成細胞混合物や心筋細胞分化可能細胞由来細胞混合物から、遺伝子の改変を伴わずに心筋細胞を選び出す方法を開発することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、心筋細胞が、他の全ての細胞と比較して相対的にミトコンドリア含有量が多いという性質及び心筋細胞ミトコンドリアが他の全ての細胞ミトコンドリアと比較してその膜電位が高いという性質に基づいて、上述した課題を解決することに成功し、ミトコンドリア特異的標識試薬を用いて心筋細胞含有細胞混合物を標識し、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又はミトコンドリア膜電位を測定することにより、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに、心筋細胞を選択するという、画期的な方法を確立した。【０００８】
具体的には、本発明の第一の態様において、心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する方法を提供する。【０００９】
すなわち、本発明の方法の第一の態様において、
心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア含有量に基づいて、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する方法；
心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する方法；または
心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び膜電位に基づいて、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する方法；
を提供する。【００１０】
本発明の方法の当該態様は、ミトコンドリア指示薬を用いて心筋細胞含有細胞混合物を標識し、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位を測定することを特徴とする。【００１１】
ここで、心筋細胞含有細胞混合物は、全心臓構成細胞混合物又は心筋細胞分化可能細胞由来細胞混合物であることを特徴とする。【００１２】
また、筋細胞分化可能細胞は、幹細胞、前駆細胞及び卵細胞からなる群から選択されることを特徴とする。【００１３】
本発明の当該態様においては、ミトコンドリア指示薬を用いて心筋細胞含有細胞混合物を標識した後、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位を測定する前に、ミトコンドリア指示薬の非存在下にて標識した細胞を培養する工程を更に含んでもよい。【００１４】
さらに、本発明の当該態様において使用されるミトコンドリア指示薬が、A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669及びT3168からなる群から選択されることを特徴とし、この態様においては、M7512、T3168、T668又はR302であることが好ましい。【００１５】
本発明の第二の態様において、心筋細胞含有細胞混合物から、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を濃縮する方法であって：
（1）心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬を用いて標識する工程；並びに
（2）細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて心筋細胞を選択する工程；
を含むことを特徴とする前記方法を提供する。【００１６】
本発明の第二の態様において、心筋細胞含有細胞混合物は、全心臓構成細胞混合物又は心筋細胞分化可能細胞由来細胞混合物であることを特徴とする。【００１７】
また、心筋細胞分化可能細胞は、幹細胞、前駆細胞及び卵細胞からなる群から選択されることを特徴とする。【００１８】
本発明の第二の態様において、前記（1）の工程の後、（2）の工程の前に、ミトコンドリア指示薬の非存在下にて標識した細胞を培養する工程を更に含んでもよい。【００１９】
さらに、本発明の当該態様において使用されるミトコンドリア指示薬は、A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669及びT3168からなる群から選択されることを特徴とし、この態様においては、M7512、T3168、T668又はR302であることが好ましい。【００２０】
本発明の第三の態様において、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を製造する方法であって：
（1）心筋細胞分化可能細胞から、心筋細胞を分化・誘導し、心筋細胞含有細胞混合物を調製する工程；
（2）心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬を用いて標識する工程；並びに
（3）細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて心筋細胞を選択する工程；
を含むことを特徴とする前記方法を提供する。【００２１】
本発明の方法の第三の態様において、心筋細胞分化可能細胞は、幹細胞、前駆細胞及び卵細胞からなる群から選択されることを特徴とする。【００２２】
また、前記（2）の工程の後、（3）の工程の前に、ミトコンドリア指示薬の非存在下にて標識した細胞を培養する工程を更に含んでもよい。【００２３】
さらに、本発明の当該態様において使用されるミトコンドリア指示薬は、A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669及びT3168からなる群から選択されることを特徴とし、この態様においては、M7512、T3168、T668又はR302であることが好ましい。【００２４】
本発明の第四の態様において、心筋細胞含有細胞混合物中における心筋細胞比率を評価する方法であって：
（1）心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬を用いて標識する工程；並びに
（2）細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて、非心筋細胞に対する心筋細胞の比率を計測する工程；
を含むことを特徴とする前記方法を提供する。【００２５】
本発明の方法の第四の態様において、心筋細胞含有細胞混合物は、全心臓構成細胞混合物又は心筋細胞分化可能細胞由来分化細胞混合物であることを特徴とする。【００２６】
また、心筋細胞分化可能細胞が、幹細胞、前駆細胞及び卵細胞からなる群から選択されることを特徴とする。【００２７】
さらに、本発明の当該態様において使用されるミトコンドリア指示薬は、A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669及びT3168からなる群から選択されることを特徴とし、この態様においては、M7512、T3168、T668又はR302であることが好ましい。【００２８】
以上のことから、本発明は、一態様において、心筋細胞含有細胞混合物から、細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を選択する方法を提供することに関する。【００２９】
細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位の測定は、ミトコンドリア指示薬を用いて心筋細胞含有細胞混合物を標識することにより、行うことができる。【００３０】
ここで「心筋細胞含有細胞混合物」という場合、心筋細胞とそれ以外の細胞とからなる全ての細胞混合物を意味する。例えば、全心臓構成細胞混合物又は心筋細胞分化可能細胞由来細胞混合物を、その例としてあげることができる。全心臓構成細胞混合物とは、同種若しくは異種の心臓組織から種々の酵素処理の結果として得られる、心筋細胞、内皮細胞、間質細胞、平滑筋細胞、等の細胞からなる混合物のことをいう。また、心筋細胞分化可能細胞由来細胞混合物とは、心筋細胞分化可能細胞（例えば、胚性幹細胞や体性幹細胞等の幹細胞、前駆細胞、及び受精卵細胞や体細胞クローン等の卵細胞）を、当該細胞から心筋細胞を分化させる条件下にて培養した結果得られる、心筋細胞、非心筋細胞、未分化細胞、神経細胞、上皮細胞等の細胞からなる混合物のことをいう。更に、ES細胞から心筋細胞を分化・誘導した場合も含まれる。【００３１】
細胞のミトコンドリア含有量及びミトコンドリア膜電位は、ミトコンドリア指示薬を用いて細胞内のミトコンドリアを標識することにより、定量化することができる。しかしながら、ミトコンドリア含有量及びミトコンドリア膜電位を反映するミトコンドリア指示薬由来シグナルの絶対値は、解析に用いる心筋細胞の成熟度により、また標識試薬の種類、暴露時間などの暴露条件により変化する。そのため、本発明において重要なのは、ミトコンドリア指示薬由来シグナル量の絶対値ではなく、心筋細胞と非心筋細胞との間におけるミトコンドリア指示薬由来シグナル量の相対関係である。そして、本発明においては、相対的に高い蛍光強度を示す細胞を、心筋細胞として選択することができる。実際に使用を予定している心筋細胞含有細胞混合物の試料を用いて予備的実験を行い、目的に合致した心筋細胞集団の規定条件（即ち、ミトコンドリア含有量及び／又はミトコンドリア膜電位の程度と心筋細胞との関係）の適正化を行う。具体的には、予備的実験において、ミトコンドリア含有量及び／又はミトコンドリア膜電位を指標として、選択すべき細胞のミトコンドリア指示薬由来シグナル量の範囲を区分けし、相対的に高いミトコンドリア含有量及び及びミトコンドリア膜電位を示す細胞を回収するように設定する。【００３２】
本発明において、「ミトコンドリア指示薬」とは、生細胞中のミトコンドリアを特異的に標識できてその存在量を測定しうる物質、生細胞中のミトコンドリアを特異的に標識できてミトコンドリア膜電位を測定しうる物質、又は生細胞中のミトコンドリアを特異的に標識できてその存在量とミトコンドリア膜電位の両方を測定しうる物質であれば、どのような物質であってもよい。例えば、（1）蛍光を有し、ミトコンドリア構造物質（例えば、タンパク質、脂質、糖鎖、核酸又はこれらの代謝産物等）と結合する物質、（2）蛍光を有し、ミトコンドリアの膜電位によってミトコンドリア内に選択的に取り込まれる物質、（3）ミトコンドリア構造物質の作用により蛍光を発する物質に変換される物質、又は（4）ミトコンドリア構造物質の作用によりミトコンドリア外に拡散できなくなる物質などが例としてあげられる。【００３３】
本発明においては、ミトコンドリア指示薬の具体例として、A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、S7563、T639、T668、T669又はT3168等（化合物製品番号：いずれもMolecular Probe社から入手可能）を使用することができ、より好ましくは、M7514、M7510、M7511、M7512、M7513、M22425、M22426、T668、R302、又はT3168を、最も好ましくはT668、R302、M7514又はT3168を使用することができるが、これらのものに限定されない。上記に例示した本発明において使用できるミトコンドリア指示薬は、それぞれ次の構造を有している。【００３４】
【化１】
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【００３５】
【化２】
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【００３６】
【化３】
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【００３７】
【化４】
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【００３８】
【化５】
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【００３９】
【化６】
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【００４０】
【化７】
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【００４１】
【化８】
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【００４２】
【化９】
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【００４３】
【化１０】
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【００４４】
【化１１】
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【００４５】
【化１２】
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【００４６】
【化１３】
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【００４７】
【化１４】
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【００４９】
【化１６】
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【００５０】
【化１７】
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【００５１】
【化１８】
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【００５２】
【化１９】
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【００５３】
【化２０】
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【００５４】
【化２１】
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【００５５】
【化２２】
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【００５６】
【化２３】
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【００５７】
【化２４】
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【００５８】
【化２５】
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【００５９】
【化２６】
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【００６０】
【化２７】
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【００６１】
【化２８】
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【００６２】
【化２９】
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【００６３】
【化３０】
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【００６４】
更に、ミトコンドリア指示薬として、S7563、S7567及びS7585（化合物製品番号：Molecular Probe社から入手可能）も用いることができる。【００６５】
これらのミトコンドリア指示薬は、それぞれの物質に特有の励起波長を有し、特有の波長を有する蛍光を発光することが知られている。例えば、M7514の場合には、490 nmの励起波長を受けて516 nmの蛍光を発光し、また、T3168の場合には、535 nmの励起波長を受けて590 nmの蛍光を発光することが知られている。【００６６】
前述したとおり、心筋細胞は、他の細胞と比較して細胞内のミトコンドリア含有量が多く、またミトコンドリア膜電位が高いため、ミトコンドリア指示薬を用いて心筋細胞含有細胞混合物を標識すると、心筋細胞は他の細胞と比較して、より強い蛍光強度を示す。本発明においては、まず、標識した心筋細胞含有細胞混合物の各細胞内におけるミトコンドリア含有量及び／又はミトコンドリア膜電位を測定する。次により強い標識強度を示す細胞を心筋細胞として規定した上で、測定したミトコンドリア含有量及び／又はミトコンドリア膜電位に基づいて、相対的高ミトコンドリア含有細胞集団、相対的に高い膜電位を有するミトコンドリアを含有する細胞集団、又は相対的高ミトコンドリア含有細胞であって且つ相対的に高い膜電位を有するミトコンドリア含有細胞である集団である心筋細胞を分離する。【００６７】
例えば上述した蛍光発光性のミトコンドリア指示薬を用いて心筋細胞含有細胞混合物を標識する場合、セルソーターを使用して、心筋細胞（ミトコンドリア含有量が相対的に多く、且つ相対的に高い膜電位を有するミトコンドリアを含有するため、相対的により強い蛍光強度を示す）を、心筋細胞以外の細胞（ミトコンドリア含有量が相対的に少ない、又は相対的に低い膜電位を有するミトコンドリアを含有するため、ミトコンドリア指示薬による標識に基づく蛍光強度も相対的に弱い）から区別し、その結果心筋細胞を、生きたままで、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに、選択することができる。本発明において使用するセルソーターは、蛍光標識された細胞を生きたまま分取できるものであればどのようなものであってもよく、具体的な装置としては、例えば蛍光細胞分取機（Fluorescent Activated Cell Sorter；FACS（登録商標））（BD, Franklin Lakes, NJ USA）を使用することができるが、これ以外の装置（Beckman社、Coulter社、Cytomation社など）を使用してもよい。【００６８】
心筋細胞の選択は、心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬により標識した直後に行ってもよい。しかしながら、心筋細胞含有細胞混合物からより確実に心筋細胞を選択することを望む場合には、ミトコンドリア指示薬で標識した後、ミトコンドリア指示薬の非存在下にてさらに培養を行い、その後心筋細胞を選択してもよい。ミトコンドリア指示薬で標識した後、ミトコンドリア指示薬の非存在下でさらに培養を行うと、細胞が分裂するにつれて、1細胞あたりに含まれるミトコンドリア指示薬含有量は減少する。従って、増殖性の細胞では培養時間が長くなればなるほど、細胞内のミトコンドリア指示薬含有量が減少し蛍光強度が低下する。その一方で心筋細胞は分裂能を失っているか又は非常に低下しているため、培養時間が長くなっても、1細胞あたりのミトコンドリア指示薬含有量が他の細胞ほど減少せず、相対的に強い蛍光強度を維持することができる。従って、心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬を用いて標識した後、ミトコンドリア指示薬の非存在下にてさらに一定期間、具体的には数日間、培養することにより、心筋細胞とそれ以外の細胞との間での標識強度の差が拡大し、より確実に心筋細胞を選択することができる。【００６９】
また、本発明は、第二の態様において、心筋細胞含有細胞混合物から、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を濃縮する方法であって、（1）心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬を用いて標識する工程；及び（2）細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて心筋細胞を選択する工程；を含むことを特徴とする方法もまた、提供する。【００７０】
この態様において、心筋細胞含有細胞混合物は、全心臓構成細胞混合物又は心筋細胞分化可能細胞由来細胞混合物のいずれかである。ここで全心臓構成細胞混合物は、心筋細胞と非心筋細胞との混合物であり、そのままの状態で心臓移植を行うと、非心筋細胞の存在により、レシピエントの心臓において重篤な副作用を引き起こす危険性が存在する。そのため、より安全・確実にレシピエントに対する心筋細胞の移植を行うため、移植前に、心筋細胞含有細胞混合物における心筋細胞の比率をできるだけ高くしておく、即ち濃縮しておくことが好ましい。また、心筋細胞分化可能細胞としては、例えば、幹細胞、前駆細胞または卵細胞を使用することができる。【００７１】
この方法において、より確実に心筋細胞を濃縮するためには、前記（1）の工程の後、（2）の工程の前に、ミトコンドリア指示薬の非存在下にて標識した細胞を培養する工程をさらに行ってもよい。この工程により、他の細胞の蛍光強度を低下させて心筋細胞内の相対的な蛍光強度を強めることができ、より確実に心筋細胞を濃縮することができる。【００７２】
この態様においても、ミトコンドリア指示薬としては、前述した通り、A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669またはT3168を使用することができ、好ましくは、ミトコンドリア指示薬がM7512、T3168、T668又はR302を使用する。【００７３】
また、本発明は、第三の態様において、心筋細胞含有細胞混合物から、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を製造する方法であって、（1）心筋細胞分化可能細胞から、心筋細胞を分化・誘導し、心筋細胞含有細胞混合物を調製する工程；（2）心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬を用いて標識する工程；及び（3）細胞の相対的ミトコンドリア含有量及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて心筋細胞を選択する工程；を含むことを特徴とする方法もまた、提供する。【００７４】
この態様において、心筋細胞含有細胞混合物は、全心臓構成細胞混合物又は心筋細胞分化可能細胞由来細胞混合物のいずれかである。ここで全心臓構成細胞混合物は、心筋細胞と非心筋細胞との混合物であり、そのままの状態で心臓移植を行うと、非心筋細胞の存在により、レシピエントの心臓において重篤な副作用を引き起こす危険性が存在する。そのため、より安全・確実にレシピエントに対する心筋細胞の移植を行うため、移植に際しては、心筋細胞含有細胞混合物における心筋細胞の比率をできるだけ高くした調製物を提供することが好ましい。また、心筋細胞分化可能細胞としては、例えば、幹細胞、前駆細胞または卵細胞を使用することができる。【００７５】
この方法においては、より確実に心筋細胞を製造するために、前記（1）の工程の後、（2）の工程の前に、ミトコンドリア指示薬の非存在下にて標識した細胞を培養する工程をさらに行ってもよい。【００７６】
この態様においても、ミトコンドリア指示薬としては、前述した通り、A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669またはT3168を使用することができ、好ましくは、ミトコンドリア指示薬がM7512、T3168、T668又はR302を使用する。【００７７】
心筋細胞を分化・誘導する方法として、より未分化で多彩な分化能を有している多能性幹細胞（pluripotent stem cells）から分化・誘導する方法が、すでに当該技術分野においていくつか開発されている。多能性幹細胞とは、試験管内培養により未分化状態を保ったまま、ほぼ永続的又は長期間の細胞増殖が可能であり、正常な核（染色体）型を呈し、適当な条件下において三胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）すべての系譜の細胞に分化する能力をもった細胞と定義される。現在、多能性幹細胞としては、初期胚より単離される胚性幹細胞（embryonic stem cells：ES細胞）、胎児期の始原生殖細胞から単離される胚性生殖細胞（embryonic germ cells：EG細胞）、そして成体骨髄から単離される成人型多能性幹細胞（multipotent adult progenitor cells：MAPC）の3種が最もよく知られている。【００７８】
例えば、多能性幹細胞のうちの胚性幹細胞から心筋細胞を分化・誘導する方法は、浮遊凝集培養法、ハンギングドロップ培養法、フィーダー細胞との共培養法、旋回培養法、軟寒天培養法、マイクロキャリア培養法等を挙げることができる。【００７９】
例えば浮遊凝集培養法の場合、単一細胞状態（酵素消化等を施すことで細胞同士の接着がない個々の細胞が液相中で分散した状態）とした胚性幹細胞を、培地に数百細胞／mLの細胞密度になるように懸濁し、白血病阻害因子（leukemia inhibitory factor：LIF）等の分化抑制因子を存在させずに浮遊培養を行うと、ES細胞同士が接着、凝集し、胚様体（embryoid body：EB）とよばれる初期胚類似の構造体を形成し、その後、EBを浮遊状態もしくは接着状態で培養することにより、自律拍動性を有した心筋細胞に分化・誘導できることが知られている。【００８０】
また例えば、ハンギングドロップ培養法の場合、培養皿のふたに、20μlの培養液からなる液滴を作製し、この液滴中に細胞数百個を含ませ、この培養皿のふたを培養皿に被せて静置することにより、細胞が液滴の底面、即ち液滴の先端部分において細胞塊を形成し、この細胞塊を自律拍動性を有した心筋細胞に分化・誘導できることが知られている。【００８１】
また例えば、フィーダー細胞との共培養法を用いる場合、間葉系細胞の性質を有した細胞、好ましくはST2細胞、OP9細胞、PA6細胞等の骨髄ストローマ細胞様の形質を有する細胞を高密度培養、マイトマイシンC処理、又は放射線照射等の方法によりフィーダー化し、その上に、培地に単一細胞状態のES細胞を播種後、培養することにより、自律拍動性を有した心筋細胞に分化・誘導できることが知られている。【００８２】
また、本発明は、第四の態様において、心筋細胞含有細胞混合物中における心筋細胞比率を評価する方法であって、（1）心筋細胞含有細胞混合物をミトコンドリア指示薬を用いて標識する工程；並びに（2）細胞の相対的ミトコンドリア含有量に基づいて、非心筋細胞に対する心筋細胞の比率を計測する工程及び／又は細胞の相対的ミトコンドリア膜電位に基づいて心筋細胞を選択する工程；を含むことを特徴とする方法もまた、提供する。【００８３】
この態様において、心筋細胞含有細胞混合物は、全心臓構成細胞混合物又は心筋細胞分化可能細胞由来細胞混合物のいずれかである。ここで全心臓構成細胞混合物は、心筋細胞と非心筋細胞との混合物であり、そのままの状態で心臓移植を行うと、非心筋細胞の存在により、レシピエントの心臓において重篤な副作用を引き起こす危険性が存在する。そのため、より安全・確実にレシピエントに対する心筋細胞の移植を行うため、移植前に、心筋細胞含有細胞混合物における心筋細胞の比率をできるだけ高くしておく、即ち濃縮しておくことが好ましい。また、心筋細胞分化可能細胞としては、例えば、幹細胞、前駆細胞または卵細胞を使用することができる。【００８４】
この態様においても、ミトコンドリア指示薬としては、前述した通り、A1372、D273、D288、D308、D378、D426、D632、D633、D22421、D23806、L6868、M7502、M7510、M7511、M7512、M7513、M7514、M22422、M22423、M22425、M22426、R302、R634、R648、R14060、R22420、T639、T668、T669またはT3168を使用することができ、好ましくは、ミトコンドリア指示薬がM7512、T3168、T668又はR302を使用する。【００８５】
心筋細胞の移植に関連する分野においては、心筋細胞を分化・誘導する方法としていくつかの方法が公知であり、また将来的にも心筋細胞を分化・誘導する方法は多数開発されることが予想される。しかしながら、上述したとおり、心臓への移植細胞中に非心筋細胞が混在していると、心臓移植に際してレシピエントの心臓において重篤な副作用を引き起こす危険性が存在する。この方法によって、心臓への移植が予定されている心筋細胞調製物中の心筋細胞の比率を、移植前に評価することによって、移植に用いられる心筋細胞調製物の確実性を事前に評価することができる。【００８６】
当該技術分野においては、心筋細胞の精製方法として、例えば、フローサイトメーターや磁気ビーズ、パンニング法等の抗原−抗体反応に準じた方法（Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition（Acad. Press, 1993）；Antibody Engineering: A Practical Approach（IRL Press at Oxford University Press, 1996）；元となるES細胞等の多能性幹細胞の遺伝子に前もって人為的な修飾を加え、薬剤耐性もしくは異所性蛋白質の発現能を付与することにより、心筋細胞としての形質を有する細胞を回収する方法；及び精製度は低いが他の方法と組み合わせて用いることが容易なショ糖、パーコール等の担体を用いた密度勾配遠心による細胞分画法（Circ Res. 2002 20;91:501-508））等が、具体例として知られている。
【発明の効果】
【００８７】
本発明の方法により、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに、心筋細胞含有細胞混合物から心筋細胞を選択することができる。また、本発明の方法により、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに、心筋細胞含有細胞混合物中の心筋細胞を濃縮すること、そして心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を製造することもまた、可能である。さらに、種々の方法により調製された心筋細胞含有細胞混合物中における心筋細胞比率を評価することも可能である。【００８８】
本発明において記載するこれらの方法により、心筋細胞含有細胞混合物中の心筋細胞の比率を向上させることができ、レシピエントの心臓に移植した際に非心筋細胞の存在により発生するおそれのある種々の副作用を低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】図1は、新生仔ラット心臓から抽出した全心臓構成細胞混合物のミトコンドリア指示薬M7512による標識像を示す。
【図２】図2は、マウス胚性幹細胞由来の心筋細胞分化可能細胞由来細胞混合物に対するミトコンドリア指示薬M7512による標識像を示す。
【図３】図3は、新生仔ラット心臓から抽出した全心臓構成細胞混合物をミトコンドリア指示薬M7512にて標識し、各細胞の蛍光量を個々に検出した場合の細胞集団の分布を示す。
【図４】図4は、マウス胚性幹細胞由来の心筋細胞分化可能細胞由来細胞混合物を、ミトコンドリア指示薬、M7512にて標識し、各細胞の蛍光量を個々に検出した場合の細胞集団の分布を示す。
【図５】図5は、図3に示した全心臓構成細胞混合物の、心筋細胞マーカーに対する抗体、抗サルコメアα-アクチニン抗体による標識像を示す。
【図６】図6は、図4に示した心筋細胞分化可能細胞由来細胞混合物の、心筋細胞マーカーに対する抗体、抗サルコメアα-アクチニン抗体による標識像を示す。
【図７】図7は、新生仔ラット心臓から抽出した全心臓構成細胞混合物に対してミトコンドリア指示薬、T3168による標識を行い、各細胞の蛍光量を個々に検出し分布解析と細胞分取を行った集団の、心筋細胞マーカーに対する抗体、抗サルコメアα-アクチニン抗体による標識像を示す。
【図８−１】図8は新生仔ラット全心臓細胞に対してT668による標識を行い、蛍光量を個々に検出し分布解析と細胞分取を行った集団解析の結果並びに、各細胞群の心筋細胞マーカーに対する抗体、抗サルコメアα-アクチニン抗体による標識像を示す。ここで、図8-1は、新生仔ラット胎仔心臓由来の細胞集団が、T668蛍光強度によって3つの細胞集団に分離されたことを示す図である。
【図８−２】図8-2は、T668に由来する蛍光シグナルが最も強かった細胞群の殆ど全ての細胞が心筋細胞であり、中蛍光細胞集団の殆ど全てが、心筋細胞でないことを示す図である。
【図８−３】図8-3は、R302でも、T668と同様に細胞を得ることができることを示す図である。
【図９−１】図9は、ミトコンドリア指示薬T668によるラット胎仔全心臓構成細胞の細胞集団解析と、分取細胞のアクチニンに対する免疫染色を示す。ここで、図9-1は、胎生13日のラット胎仔心臓由来の細胞集団が、T668蛍光強度によって3つの細胞集団に分離されたことを示す図である。
【図９−２】図9-2は、T668に由来する蛍光シグナルが最も強かった細胞群の殆ど全ての細胞が心筋細胞であり、中蛍光細胞集団の殆ど全てが、心筋細胞でないことを示す図である。
【図１０−１】図10は、ミトコンドリア指示薬T668による胎仔全細胞の染色と心筋細胞の精製を示す。ここで、図10-1は、胎生9日のラット胎仔由来の細胞集団では、蛍光強度による細胞集団では主に1つの細胞集団が観測されることを示す図である。
【図１０−２】図10-2は、心筋細胞マーカーであるアクチニンで免疫染色を行ったところ、T668では粗95％以上が心筋細胞であることが判明したことを示す図である。
【図１１】図11は、ミトコンドリア指示薬T668による生後8日から胎生11日までのラット全心臓構成細胞の染色と細胞集団解析
【図１２】図12は、ミトコンドリア指示薬T668によるマウス胚性幹細胞由来多種細胞群の染色と分取した細胞集団のアクチニンに対する免疫染色。
【発明の実施の形態】
【００９０】
（1）心筋細胞含有細胞混合物の調製
先ず、心筋細胞含有細胞混合物を、全心臓構成細胞混合物、又は幹細胞由来細胞混合物として得る。
【００９１】
全心臓構成細胞混合物は、まず中絶胎児又は新生仔の心臓から心室を単離し、これをハサミで細断した後、コラゲナーゼなどの酵素で処理することにより細胞間結合を除去して細胞を分散させることにより、調製することができる。
【００９２】
幹細胞由来細胞混合物は、胚性幹細胞や体性幹細胞などの幹細胞を、ハンギングドロップ培養法（Bader A, et al., Differentiation, 2001 68: p.31-43）により、心筋細胞を分化・誘導させることにより、調製することができる。幹細胞由来細胞混合物を使用する場合には、分化・誘導した細胞混合物に対して、心筋細胞の分化・成熟度を高める処理（例えばall-trans レチノイン酸の添加）を行うことが望ましい。
【００９３】
（2）細胞のミトコンドリア指示薬による標識
本発明においては、好ましいミトコンドリア指示薬として、蛍光発光性のM7512、T3168、T668又はR302（全てMolecular Probe社製）を使用する。全心臓構成細胞混合物、又は幹細胞由来細胞混合物に対して、M7512、T3168、T668又はR302を、培養液中に添加しインキュベーションすることにより、細胞をM7512、T3168、T668又はR302にて標識する。
【００９４】
細胞をミトコンドリア指示薬で標識後、さらに数日間培養を行うことにより、心筋細胞の標識シグナル量と他の細胞の標識シグナル量との差をさらに増幅できる。
【００９５】
（3）心筋細胞の選択
M7512、T3168、T668又はR302により標識した全心臓構成細胞混合物、又は幹細胞由来細胞混合物について、セルソーターを使用して各細胞内におけるミトコンドリア含有量を測定し、相対的に高いミトコンドリア含有量を有する細胞集団を心筋細胞として分離する。M7512、T3168、T668又はR302を用いて心筋細胞を選択するために望ましいセルソーターとして、蛍光細胞分取機（Fluorescent Activated Cell Sorter；FACS（登録商標））（BD, Franklin Lakes, NJ USA）を使用する。
【００９６】
（4）心筋細胞の確認
上述した方法により、標識強度が強い細胞を分取し、その細胞を培養する。その後、心筋細胞を他の細胞から識別できる他の方法を用いて、選択後の心筋細胞の含有量・含有率を算出し、本発明の効果を確認する。本発明においては、心筋細胞を他の細胞から識別できる他の方法として、心筋細胞特異的マーカー（例えば、ミオシン重鎖／軽鎖やサルコメアα-アクチニン、トロポニンI、ANP、GATA-4、Nkx2.5、MEF-2c）に対する抗体により検出する方法を使用することができる。本発明においてはそれらのうち、抗サルコメアα-アクチニン抗体（anti-Sarcomeric α-Actrinin Antibody）により標識する方法を使用する。
【実施例】
【００９７】
本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。しかしながら、以下の実施例は、本発明の例示であって、本発明を限定することを意図するものではない。【００９８】
実施例1：新生仔ラット心臓から抽出した全心臓構成細胞混合物のミトコンドリア指示薬による標識
この実施例は、本発明の方法が、全心臓構成細胞混合物中の心筋細胞を検出するために使用可能かどうかを確認するために行った。【００９９】
生後1〜3日目の新生仔ラットをエーテル麻酔し、頸椎脱臼により犠死せしめた後、心臓を摘出した。心室を単離し、血清無添加D-MEM（High-glucose）培地（Invitrogen社）中、0.025％（w/v）のコラゲナーゼ（Warthington Biomedical Corporation社製）存在下にて単離した心室を消化することによって、細胞を分散させ、全心臓構成細胞混合物を得た。【０１００】
培養液を、牛胎仔血清（JRH Bioscience社）を終濃度10％で混合したD-MEM（High-glucose）培地（Invitrogen社）に置換した。このようにして調製した培養細胞に対して、ミトコンドリア指示薬M7512（Molecular Probe社製）を終濃度100 nMとなるように培養液中に添加し、37℃にて10分間インキュベートした。その後培地を用いて4回洗浄した後、さらに37℃にて24時間培養した。【０１０１】
このようにして標識した細胞を、蛍光顕微鏡により観察した。結果を図1に示す。【０１０２】
図1では、心筋細胞においてはM7512による蛍光が明瞭に観察され、心筋細胞が多量のミトコンドリアを細胞内に含有していることが示されるが、枠で囲った非心筋細胞においては、わずかなミトコンドリアしか含有されていないことが示された。【０１０３】
実施例2：マウス胚性幹細胞由来細胞混合物に対するミトコンドリア指示薬による標識
この実施例は、本発明の方法が、幹細胞由来細胞混合物中の心筋細胞を検出するために使用可能かどうかを確認するために行った。【０１０４】
未分化マウス胚性幹細胞に対して、ハンギングドロップ培養法（Bader A, et al., Differentiation, 2001 68: p.31-43）を用いて、心筋細胞の分化・誘導をおこなった。具体的には、培養皿のふたに、20μlの培養液からなる液滴を作製し、この液滴中に細胞数百個を含ませ、この培養皿のふたを培養皿に被せて静置することにより、細胞を液滴の底面、即ち液滴の先端部分において細胞塊を形成させ心筋細胞を分化・誘導させる方法である。心筋細胞の分化・誘導に際しては、培養液として、牛胎仔血清（EQUITECH-BIO社）を終濃度10％で混合したα-MEM培地（SIGMA社）を使用した。【０１０５】
分化・誘導後14日目に、培養容器内にて、自律拍動性の細胞を含有する細胞隗が生成されたことを確認し、さらに心筋細胞の分化・成熟度を高めるため、all trans-レチノイン酸を終濃度10-8 Mとなるように培養液中に添加した。【０１０６】
分化・誘導21日目に自律拍動性の細胞を含有する細胞隗を分散し、個々の細胞に分散した。このようにして調製した細胞混合物を、実施例1と同様の条件でM7512により標識し、M7512の除去後さらに接着培養を5日間継続した後、培養条件下で形成された自律拍動性の細胞を含有する細胞塊を、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図2に示す。【０１０７】
図2では、細胞塊の1回の拍動周期（即ち、弛緩期1-収縮期-弛緩期2）にわたって、細胞塊の位相差像（上段）ならびに蛍光像（下段）を示している。この結果、全ての自律拍動性の心筋細胞が他の細胞に比較してM7512で強く標識されていることがわかった。即ち、自律拍動性の細胞塊では、M7512による蛍光が明瞭に見えるのに対して、自律拍動性の細胞塊周辺に存在する細胞においては、M7512による蛍光がほとんど見られないことが示された。【０１０８】
実施例3：ミトコンドリア指示薬で標識した全心臓構成細胞混合物の細胞分布の解析
この実施例は、実施例1の全心臓構成細胞混合物中に心筋細胞がどの程度存在するかを明らかにすることを目的として行った。【０１０９】
まず、全心臓構成細胞混合物を、実施例1に記載した方法により調製し、M7512にて標識した。この標識済み全心臓構成細胞混合物を、FACS（登録商標）（BD, Franklin Lakes, NJ USA）による細胞集団存在分布解析に供した。結果を図3に示す。【０１１０】
図3において、横軸のFSC-Aは、細胞の大きさを示す指標である。図示したように、全心臓構成細胞混合物は、相対的に蛍光強度が強いP5領域に存在する細胞と、相対的に蛍光強度が弱いP6領域に分けることができる。そして、本実施例においては、P5領域に存在する細胞を心筋細胞として分取し、P6領域に存在する細胞を心筋細胞以外の細胞として分取し、培養を行った。【０１１１】
実施例4：ミトコンドリア指示薬で標識したマウス胚性幹細胞由来細胞混合物の細胞分布の解析。【０１１２】
この実施例は、実施例2のマウス胚性幹細胞由来細胞混合物中に心筋細胞がどの程度存在するかを明らかにすることを目的として行った。【０１１３】
まず、マウス胚性幹細胞由来細胞混合物を、実施例2に記載した方法により調製し、M7512にて標識した。この標識済みマウス胚性幹細胞由来細胞混合物中を、FACS（登録商標）（BD, Franklin Lakes, NJ USA）による細胞集団存在分布解析に供した。結果を図4に示す。【０１１４】
図4において、横軸のFSC-Aは、細胞の大きさを示す指標である。図示したように、マウス胚性幹細胞由来細胞混合物は、相対的に蛍光強度が強いP2領域に存在する細胞と、相対的に蛍光強度が弱いそれ以外の領域に存在する細胞とに分けることができる。そして、本実施例においては、P2領域に存在する細胞を心筋細胞として分取し、培養を行った。【０１１５】
実施例5：全心臓構成細胞混合物から選択した細胞の、心筋細胞マーカーによる標識
この実施例は、全心臓構成細胞混合物中に存在した心筋細胞が、実施例3の方法によりどの程度濃縮されたかを明らかにすることを目的として行った。【０１１６】
実施例3に記載した方法にて分取したP5領域及びP6領域に属する細胞集団を、培養液として、牛胎仔血清（EQUITECH-BIO社）を終濃度10％で混合したα-MEM培地（SIGMA社）中で12時間培養した後、パラフォルムアルデヒドにより固定した。【０１１７】
次いで、固定した細胞を、心筋細胞マーカーであるマウス抗サルコメアα-アクチニン抗体（シグマ社）を用いて標識し、緑色蛍光物質で標識したヤギ抗マウス抗体（Molecular Probes社）を用いて、細胞に結合したマウス抗サルコメアα-アクチニン抗体を可視化した。結果を図5に示す。図5では、全心臓構成細胞混合物での結果を上段に、実施例3でP5領域から採取した細胞についての結果を中段に、そして実施例3でP6領域から採取した細胞についての結果を下段に、それぞれ示した。【０１１８】
その結果、本発明の方法により選択する前の細胞混合物中には、抗サルコメアα-アクチニン抗体により認識される心筋細胞とそれ以外の細胞とが混在しており、全細胞中の心筋細胞の比率は30％であった。これに対して、P5領域から採取した細胞は、99％以上が心筋細胞であることが示された。また、P6領域から採取した細胞の中にも心筋細胞がわずかながら残存していたが、本発明の方法による選択を行う前と同等の心筋細胞比率でしかなかった。【０１１９】
これにより、本発明の方法を用いて、全心臓構成細胞混合物から、高純度で心筋細胞を選択し、濃縮することができることが明らかになった。【０１２０】
実施例6：マウス胚性幹細胞由来細胞混合物から選択した細胞の、心筋細胞マーカーによる標識
この実施例は、マウス胚性幹細胞由来細胞混合物中に存在した心筋細胞が、実施例4の方法によりどの程度濃縮されたかを明らかにすることを目的に行った。【０１２１】
実施例4に記載した方法にて分取したP2領域に属する細胞集団及びそれ以外の領域に属する細胞集団を、培養液として、牛胎仔血清（EQUITECH-BIO社）を終濃度10％で混合したα-MEM培地（SIGMA社）中で12時間培養した後、パラフォルムアルデヒドにより固定した。【０１２２】
次いで、固定した細胞を、心筋細胞マーカーであるマウス抗サルコメアα-アクチニン抗体（シグマ社）を用いて標識し、緑色蛍光物質で標識したヤギ抗マウス抗体（Molecular Probes社）を用いて、細胞に結合したマウス抗サルコメアα-アクチニン抗体を可視化した。結果を図6に示す。図6では、マウス胚性幹細胞由来細胞混合物での結果を上段に、実施例4でP2領域から採取した細胞についての結果を下段に、それぞれ示した。【０１２３】
その結果、本発明の方法により選択する前の細胞混合物中には、抗サルコメアα-アクチニン抗体により認識される心筋細胞とそれ以外の細胞とが混在しており、全細胞中の心筋細胞の比率は10％であった。これに対して、M7512で標識した場合の蛍光強度が強かったP2領域から採取した細胞は、80％以上が心筋細胞であることが示された。【０１２４】
これにより、本発明の方法を用いて、マウス胚性幹細胞由来細胞混合物からも、高純度で心筋細胞を選択し、濃縮することができることが明らかになった。【０１２５】
実施例7：ミトコンドリア指示薬T3168による標識
本実施例は、ミトコンドリア指示薬T3168によって標識を行った場合にも、M7512で得られた結果と同様の結果が得られることを確認するために行った。【０１２６】
ミトコンドリア指示薬としてT3168（Molecular Probe社製）を使用する以外は、実施例1に記載した方法と同一の方法により、ミトコンドリア指示薬により標識した新生仔ラット心臓から抽出した全心臓構成細胞混合物を調製した。【０１２７】
このようにして調製した標識された全心臓構成細胞混合物について、実施例3に記載した方法と同一の方法によりFACSにより細胞分布を解析し、そして相対的に強い蛍光強度を示す細胞を心筋細胞として選択・採取した。このようにして得られた細胞を、実施例5に記載する方法と同一の方法により、培養した後パラフォルムアルデヒドにより固定し、マウス抗サルコメアα-アクチニン抗体（シグマ社）を用いて標識した。結果を図7に示す。【０１２８】
その結果、本発明の方法により選択する前の細胞混合物中には、抗サルコメアα-アクチニン抗体により認識される心筋細胞とそれ以外の細胞とが混在しており、全細胞中の心筋細胞の比率は30％であった。これに対して、相対的に強い蛍光強度を示す細胞は、95％以上が心筋細胞であることが示された。【０１２９】
これにより、本発明の方法を用いて、ミトコンドリア指示薬としてT3168を使用した場合でも、全心臓構成細胞混合物から、高純度で心筋細胞を選択し、濃縮することができることが明らかになった。【０１３０】
実施例8：ミトコンドリア指示薬T668による新生仔ラット全心臓構成細胞の染色と心筋細胞の精製
新生仔ラット胎仔心臓を0.025％（w/v）コラゲナーゼ（シグマ）とトリプシン（GIBCO）で処理し、細胞集団を回収した。細胞が分散された培養液に対し、終濃度1μMのミトコンドリア指示薬T668（Molecular Probe社製）を用いて37℃にて15分間暴露し、3回洗浄した後、直ちにFACS解析を行った。その結果、T668蛍光強度によって3つの細胞集団に分離された（図8-1）。蛍光シグナルが最も強い高蛍光細胞集団と中蛍光強度細胞集団をそれぞれ分取し培養した。【０１３１】
次いで、培養細胞に対してアクチニンに対する免疫染色を行い、心筋細胞を同定した（図8-2）。この結果、T668に由来する蛍光シグナルが最も強かった細胞群の殆ど全ての細胞が心筋細胞であり、中蛍光細胞集団の殆ど全てが、心筋細胞でないことが分かった。同様にR302（Molecular Probe社製）でも解析を行い、同様の結果を得た（図8-3）。【０１３２】
実施例9：ミトコンドリア指示薬T668とM7514による新生仔ラット全心臓構成細胞の染色と単位ミトコンドリア当たりの膜電位の比較解析。【０１３３】
実施例8と同様の材料および方法を用いて細胞集団を採取した。そして、心筋細胞をミトコンドリア特異的に染色する膜電位非依存性ミトコンドリア指示薬M7514（Molecular Probe社製）と、心筋細胞をミトコンドリア特異的に染色する膜電位依存性ミトコンドリア指示薬T668で染色を行った。この後直ちにFACS解析を行った。T668による蛍光とM7514による蛍光は波長が異なるため、別々に検出することが可能である。T668蛍光を指標として三つの細胞集団を検出した。実施例8に示した解析から、最も高い蛍光を示す高蛍光細胞集団は、心筋細胞群であり、中蛍光細胞集団は非心筋細胞であることが分かっている。【０１３４】
次にT668由来の蛍光強度をM7514由来の蛍光強度で割った比率で個々の細胞群を分別した。T668のシグナルに基づいて心筋細胞と同定された細胞群では、M7514に対するT668の蛍光強度比として例えば150％を採用した場合、150％以上の細胞が全体の90％であったのに対し、T668でのシグナルに基づいて非心筋細胞と同定された細胞では、M7514に対するT668蛍光強度比150％以上は全体の13％でしかなかった。この差の意味するところは、心筋細胞では、非心筋細胞に比べて、ミトコンドリアの含有量のみならず、ミトコンドリア当たりの膜電位も高いことを示している。【０１３５】
実施例10：ミトコンドリア指示薬T668によるラット胎仔全心臓構成細胞の染色と心筋細胞の精製
胎生13日のラット胎仔心臓をコラゲナーゼとトリプシンで処理し、細胞集団を回収した。細胞が分散された培養液に対し、終濃度1μMのミトコンドリア指示薬T668をもちいて37℃にて15分間暴露し、3回洗浄した後、直ちにFACS解析を行った。T668蛍光強度によって3つの細胞集団に分離された（図9-1）。蛍光シグナルが最も強い高蛍光細胞集団と中蛍光細胞集団をそれぞれ分取し培養した。【０１３６】
培養細胞に対してアクチニンに対する免疫染色を行い、心筋細胞を同定した。この結果、T668に由来する蛍光シグナルが最も強かった細胞群の殆ど全ての細胞が心筋細胞であり、中蛍光細胞集団の殆ど全てが、心筋細胞でないことが分かった（図9-2）。【０１３７】
実施例11：ミトコンドリア指示薬T668とM7512による胎仔全細胞の染色と心筋細胞の精製
胎生9日のラット胎仔をコラゲナーゼとトリプシンで処理し、細胞集団を回収した。細胞が分散された培養液に対し、終濃度1μMのミトコンドリア指示薬T668を用いて37℃にて15分間暴露し、3回洗浄した後、直ちにFACS解析を行った。蛍光強度による細胞集団では主に1つの細胞集団が観測され、発生後期の全心臓サンプルを用いた解析から心筋細胞として検出が予測される高蛍光強度領域に明確な細胞集団は見出されなかった（図10-1）。しかし、主細胞集団に比べて高蛍光をしめす細胞が僅かな割合で存在したため、これを高蛍光細胞集団として分離回収した。【０１３８】
この細胞を培養し、心筋細胞マーカーであるアクチニンで免疫染色を行ったところ、T668では粗95％以上が心筋細胞であることが判明した（図10-2）。胎生9日の胎仔（初期胚）では、心筋細胞も極めて未熟であるため、ミトコンドリアの量的変化は十分に起こっていないものと考えられている。この結果は、そのような時期においてもミトコンドリア膜電位という指標を用いることにより、心筋細胞を効率的に選択することができることを示している。【０１３９】
実施例12：ミトコンドリア指示薬T668による生後8日から胎生11日までのラット全心臓構成細胞の染色とFACS解析
生後8日から胎生11日までのラット心臓をコラゲナーゼとトリプシンで処理し、細胞集団を回収した。細胞が分散された培養液に対し、終濃度1μMのミトコンドリア指示薬T668を用いて37℃にて15分間暴露し、3回洗浄した後、直ちにFACS解析を行った。T668蛍光強度によって細胞集団は分離された。最も蛍光強度の強い高蛍光心筋細胞集団は、発生の進行に合わせて量が増え、細胞群に明確に分離されてゆくことが分かる（図11）。この結果、本明細書が提供する方法を用いることによって、心筋細胞の成熟度を推測することが可能であること示された。【０１４０】
実施例13：ミトコンドリア指示薬T668によるマウス胚性幹細胞由来多種細胞群の染色と心筋細胞の精製
実施例2と同様の方法を用いて、ES細胞を心筋細胞を含む細胞群に分化させた。この多種細胞塊をコラゲナーゼとトリプシンで処理し、バラバラの細胞を得た。細胞が分散された培養液に対し、終濃度1μMのミトコンドリア指示薬T668を用いて37℃にて15分間暴露し、3回洗浄した後、直ちにFACS解析を行った。蛍光強度による細胞集団では主に1つの細胞集団が観測され、発生後期の全心臓サンプルを用いた解析から心筋細胞として検出が予測される高蛍光強度領域に明確な細胞集団は見出されなかった（図12）。しかし、主細胞集団に比べて高蛍光をしめす細胞が存在したため、これを高蛍光細胞集団として分離回収した。【０１４１】
この細胞を大量に培養し、心筋細胞マーカーであるアクチニンで免疫染色を行ったところ、98％以上が心筋細胞であることが判明した。逆に主細胞集団を回収し、培養、免疫染色を行ったところ、殆どが心筋細胞ではなかった。【０１４２】
実施例14：ミトコンドリア指示薬S7563による新生仔ラット全心臓構成細胞の染色と心筋細胞の精製
新生仔ラット胎仔心臓をコラゲナーゼとトリプシンで処理し、細胞集団を回収した。細胞が分散された培養液に対し、終濃度1μMのミトコンドリア指示薬S7563を用いて37℃にて15分間暴露し、3回洗浄した後、直ちにFACS解析を行った。S7563蛍光強度によって3つの細胞集団に分離された。蛍光シグナルが最も強い細胞集団を分取し培養した。【０１４３】
培養細胞に対してアクチニンに対する免疫染色を行い、心筋細胞を同定した。この結果、S7563に由来する蛍光シグナルが最も強かった高蛍光細胞集団の殆ど全ての細胞が心筋細胞であり、中蛍光細胞集団の殆ど全てが、心筋細胞ではないことが分かった。
【産業上の利用可能性】
【０１４４】
本発明の方法により、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに、心筋細胞含有細胞混合物から心筋細胞を選択することができる。また、本発明の方法により、心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに、心筋細胞含有細胞混合物中の心筋細胞を濃縮すること、そして心筋細胞の遺伝子改変を伴わずに心筋細胞を製造することもまた、可能である。さらに、種々の方法により調製された心筋細胞含有細胞混合物中における心筋細胞比率を評価することも可能である。【０１４５】
本発明において記載するこれらの方法により、心筋細胞含有細胞混合物中の心筋細胞の比率を向上させることができ、レシピエントの心臓に移植した際に非心筋細胞の存在により発生するおそれのある種々の副作用を低減することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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