(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体から分離した体液中のリン酸濃度とカルシウム濃度を、測定システムを用いた１回の測定により測定し、測定結果を可視的に表示し、表示された測定結果に基づいて生体内の腎臓機能のコントロール状態を判定する腎臓機能コントロール状態測定方法であって、酵素固定化膜を多孔膜で被履した過酸化水素電極を用いてリン酸濃度を測定する、腎臓機能コントロール状態測定方法。
【請求項２】
各患者についての経時的な測定結果をグラフに表すことを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
カルシウム・リン積値が適正範囲になっているか否かを１つの指標として判定を行なう請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
未処理の体液サンプル中のリン酸濃度を測定するリン酸濃度測定工程と、未処理の体液サンプル中のカルシウム濃度を測定するカルシウム濃度測定工程とを有する請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記未処理の体液サンプルが全血である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
pH及びアルブミン濃度をさらに測定し、カルシウム濃度をこれらに基づいて補正することを含む請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
K濃度、Hct濃度及びIntPTH濃度をさらに測定する請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
リン酸濃度測定工程が、未処理の体液サンプル中に存在するリン酸を、該リン酸が基質と共役する物質である酵素に反応させ、反応により生成又は消費される物質の濃度を電気的又は光学的に測定することにより行われる請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
体内の腎臓機能のコントロール状態の管理の指標であるリン酸濃度と、カルシウム濃度とを一回の試験で測定する自動測定システムであって、体液サンプルを導入するサンプル導入部と、サンプル導入部から導入されたサンプル中のリン酸濃度を測定するリン酸濃度測定手段及びサンプル導入部から導入されたサンプル中のカルシウム濃度を測定するカルシウム濃度測定手段を含む測定部と、該測定部において測定された情報を入力し、リン酸濃度とカルシウム濃度とから体内の腎臓機能のコントロール状態を判定する判定処理部を含む処理手段と、該処理手段に接続された表示手段と、前記処理手段に接続された記憶手段とをさらに具備し、前記処理手段は、前記測定部からの各測定値に基いて各測定対象物の分析値を算出して、各分析値を記憶手段に記憶させると共に、前記各分析値又はそれに基づいて作成されたグラフを前記表示手段に表示させることを特徴とする腎臓機能コントロール状態測定システムであって、酵素固定化膜を多孔膜で被履した過酸化水素電極を用いてリン酸濃度を測定する、腎臓機能コントロール状態測定システム。
【請求項１０】
前記処理手段は、前記各分析値に基いてカルシウム−リン酸濃度積チャートに分析結果をプロットして表示手段に表示させる、請求項９記載のシステム。
【請求項１１】
分析すべき患者に関する患者情報を入力する入力部を備え、前記分析値を対応する患者情報と共に前記記憶手段に記憶させ、同一患者に関する複数回の前記分析結果を、前記カルシウムーリン酸濃度積チャート上に同時に表示できるように処理手段を構成した請求項１０記載のシステム。
【請求項１２】
前記表示手段が、ディスプレイ及び／又はプリンターから成る請求項１０又は１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記カルシウム−リン酸チャートが、横軸をカルシウム濃度とし、縦軸をリン酸濃度としたチャートである請求項１０ないし１２の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１４】
前記測定部は、水素イオン濃度測定手段をさらに具備し、前記カルシウムーリン酸濃度積チャートが、カルシウム濃度を水素イオン濃度でpH7.4の時のカルシウム濃度に補正したチャートである請求項１０ないし１３の何れか１項に記載のシステム。
【請求項１５】
前記測定部は、アルブミン濃度測定手段をさらに具備し、前記カルシウムーリン酸濃度積チャートが、カルシウム濃度をアルブミン濃度で補正したチャートである請求項１０ないし１４の何れか１項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎臓機能コントロール状態測定方法及び測定システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
リン酸は、生体内で各種のリン酸エステルとして糖質代謝に、また高エネルギーリン酸化合物としてエネルギー代謝に必須の物質である。また、核酸、リン脂質、タンパク質、ヌクレオチドなどの構成成分として重要であり、生体にとって必要不可欠な構成要素の一種である。血液中のリン酸は腸管から吸収、骨からの動員、細胞内外の移行、腎からの排泄などの機序によって変動し、臨床診断上有用な測定対象物質である。特に、腎機能に障害のある場合には定期的にモニター、管理の必要な測定項目である。成人の体内総リン量は500〜800gで、そのうち80%以上は骨に分布してカルシウムと結合している。骨以外のリンは大部分が筋肉などの細胞内に存在し、ATPや核酸細胞膜の構成成分および血中のリンは体内総量のわずか0.1%にすぎない。血液中のリンの基準値は2.8〜4.5mg/dlである。5.0mg/dl以上が高リン血症であり、透析患者においては食事療法によりまず改善を行い、さらにリン吸着剤も考慮されている。
【０００３】
一方、カルシウム（Ca）は、生体中に最も多量に含有される無機物質で、その99％以上が骨や歯牙に存在して、骨格の維持およびCaの貯蔵庫の役割をしている。またCaは生体内で、心筋の規律的な収縮、意識の維持、各種のホルモンの分泌、細胞の情報伝達、神経の興奮、血液の凝固など生命活動の根源的で重要な役割に関与する。血液中のカルシウムは、約５０％がタンパク質（主にアルブミン）と結合しており、残りの５０％がイオン化していると言われている。血液中のカルシウムの測定は、Ca恒常性維持の異常発見の手がかりとされる。血液中のカルシウムは透析性と非透析性の形で存在し、その濃度は甲状腺（上皮小体）ホルモン、ビタミンD等によって調節され、正常値は極めて恒定した値を保っている。カルシウムの臨床的意義はカルシウムのみでなく、無機リンやアルカリホスファターゼとの関連に立って考えることが必要である。カルシウム値は副甲状腺機能亢進症、ビタミンD中毒、副腎不全で上昇し、甲状腺機能低下症、ビタミンD欠乏症、腎性くる病、尿毒症で低下する。
【０００４】
血液中のカルシウムの基準値は8.8〜10.9mg/dlである。血液中に含まれるカルシウムは、血液中の総Ca（イオン化Ca48〜55％  蛋白結合形40〜50％、有機酸または無機酸との結合形数％）と赤血球内Caに分けることができ、総CaはPと対応させ副甲状腺機能異常や骨疾患に欠かせない臨床検査である。さらに、イオン化Caは生理機能として神経・筋肉の興奮性、血液凝固機転、細胞膜の透過性、酵素の活性化などに直接関与する重要な因子として極めて微妙な恒常性が維持されている。また内分泌とし副甲状腺機能（PTHとの挙動の対比）、悪性腫瘍として高カルシウム血症惹起のモニター・腎の場合透析治 療のモニター・新生は低カルシウム血症惹起のモニター・麻酔等はカルシウムのホメオステーシス急変のモニターなどに用いられ臨床的に疾患の診断および病態の把握、治療のうえで有用な検査である。イオン化カルシウムの基準値は2.21〜2.52mEq/l  pH＝7.4（37℃にて測定）である。
【０００５】
生体中では、リン酸は腎臓を介して排出される。腎臓機能に障害が起こるとリン酸の排出が出来なくなり、血中のリン酸濃度が上昇する。生体内のリン酸はカルシウムイオン濃度と一定のバランスが保たれており、リン酸濃度が高くなるとカルシウムが骨などから供給され、リン酸濃度を下げようとする働きが生じる。そのような働きが起こると生体に種々の障害が起こることに繋がる。
【０００６】
血液透析療法時における水電解質の変動に関して多くの報告がある。特にNa+、K+、Cl-イオン濃度を測定することは診断上、治療上、重要なことであり、定期的な測定が行なわれている。Na+は細胞外液における中心的な陽イオンである。Cl-とともに、主として、塩化ナトリウム（NaCl）、食塩の形で食事から摂取される。K+は細胞内液中の主要な陽イオンで食事として経口的に摂取されるほか、異化作用が亢進しているときには体内の細胞より遊出してくる。腎不全では、腎という中心的な排泄経路を失っているので体内での蓄積が問題になる。Na+は、体内に蓄積し、その結果、高血圧をきたし、浮腫を発生させる。透析患者における食事療法ではNa+制限が重要であり、透析施行時には体内のNa+バランスを保つために、つまりNa+を除去し、Na+値を低くするのに、体内と透析液側の濃度勾配をつけて除去される。高カリウム血症では心筋の刺激伝導の障害から直接生命に危険が及ぶため、積極的な血清K+の除去がはかられる。ところが急激に血清K+値を低下させると今度は低カリウム血症となり、やはり心筋の刺激伝導障害がおきる。とくに心疾患を合併してジキタリス剤などを用いている患者ではその影響が強くでる。したがって、腎臓機能の低下している透析患者では、血液中のNa+やK+の濃度を厳密にモニターし、治療に反映させることが重要であり、透析導入患者では、定期的な測定、コントロールが行われている。
【０００７】
【特許文献１】特開2002-17354号公報
【特許文献２】特開2003-339384号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、腎臓機能の低下している透析患者にとってコントロールの必要な臨床検査項目を可視的に表示することにより正確な状態把握と治療および患者への指導を可能にする方法及びそのための測定システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、血液中のリン酸濃度とカルシウム濃度を同時に測定することにより、腎臓機能のコントロール状態を管理する分析器において、それらをグラフ上に可視的に表示し、さらに透析患者毎に経時的に表示してそれを治療に反映させることで医療ミス等の事故を改善できることを見出し、本発明を完成したものである。
【００１０】
すなわち、本発明は、生体から分離した体液中のリン酸濃度とカルシウム濃度を、測定システムを用いた１回の測定により測定し、測定結果を可視的に表示し、表示された測定結果に基づいて生体内の腎臓機能のコントロール状態を判定する腎臓機能コントロール状態測定方法であって、酵素固定化膜を多孔膜で被履した過酸化水素電極を用いてリン酸濃度を測定する、腎臓機能コントロール状態測定方法を提供する。また、本発明は、体内の腎臓機能のコントロール状態の管理の指標であるリン酸濃度と、カルシウム濃度とを一回の試験で測定する自動測定システムであって、体液サンプルを導入するサンプル導入部と、サンプル導入部から導入されたサンプル中のリン酸濃度を測定するリン酸濃度測定手段及びサンプル導入部から導入されたサンプル中のカルシウム濃度を測定するカルシウム濃度測定手段を含む測定部と、該測定部において測定された情報を入力し、リン酸濃度とカルシウム濃度とから体内の腎臓機能のコントロール状態を判定する判定処理部を含む処理手段と、該処理手段に接続された表示手段と、前記処理手段に接続された記憶手段とをさらに具備し、前記処理手段は、前記測定部からの各測定値に基いて各測定対象物の分析値を算出して、各分析値を記憶手段に記憶させると共に、前記各分析値又はそれに基づいて作成されたグラフを前記表示手段に表示させることを特徴とする腎臓機能コントロール状態測定システムであって、酵素固定化膜を多孔膜で被履した過酸化水素電極を用いてリン酸濃度を測定する、腎臓機能コントロール状態測定システムを提供する。さらに上記本発明の測定システムにおいて、腎臓機能の低下した透析患者にとって必要な臨床検査項目であるK、HctおよびintPTHも一回の試験で同時に測定し、それらの項目を単独に透析患者毎に経時的に表示してそれを治療に反映させる腎臓機能コントロール状態測定システムを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、１回の測定で腎臓機能のコントロール状態を判定する腎臓機能コントロール状態測定方法及びそのための測定システムが提供された。本発明により、腎臓機能のコントロール状態が簡便、迅速に測定できるので、透析患者の食事療法をはじめ、腎臓病の治療に大いに貢献するものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
上記の通り、本発明の方法では、生体から分離した体液中のリン酸濃度とカルシウム濃度を、１回の測定により測定する。ここで、体液としては、特に限定されず、血液（全血、血清、血漿を包含する）や尿を好ましい例として挙げることができる。体液は、未処理のもの、すなわち、血球分離処理や希釈処理等の前処理が行なわれていないものが簡便で好ましく、特に全血が好ましい。また、「１回の測定」とは、同一のサンプルについて、分割処理等を行なうことなく測定することを意味し、測定システムのサンプル導入部に単一のサンプルを導入すれば、その単一のサンプルについて各測定がなされるという意味である。
【００１３】
腎臓機能のコントロール状態の判定は、リン酸濃度とカルシウム濃度の積を１つの指標として行なうことが好ましい。血清中の濃度で、これらの積が55mg2/dl2以下であることが腎臓機能のコントロール状態が正常であることの１つの指標となる。また、血清中の濃度で、リン酸の濃度が3.5〜5.5 mg/dl、かつ、カルシウム濃度が8.5〜10.5 mg/dlの範囲にあることが腎臓機能のコントロール状態が正常であることの指標となる。したがって、好ましくは、血清中の濃度で、リン酸濃度とカルシウム濃度の積が55mg2/dl2以下、リン酸の濃度が3.5〜5.5 mg/dl、かつ、カルシウム濃度が8.5〜10.5 mg/dlの範囲に入っているか否かを腎臓機能のコントロール状態が正常であるか否かの判断基準にすることができる。なお、全血中の濃度と血清中の濃度は実質的に比例しているので、全血中の濃度から血清中の濃度を算出することは容易である。また、カルシウム濃度は、pH7.4のカルシウム濃度に補正することが好ましい。この補正は、次の式に従って行うことができる。
補正イオン化Ca(mmol/L)＝イオン化Ca(mmol/L) x (1-0.53(7.4-実際のpH))
また、カルシウムイオンは、低アルブミン血症の場合に低値を示すので、アルブミン濃度に基づいて補正することが好ましい。この補正は次の式に従って行うことができる。
補正Ca(mg/dl)＝血清Ca(mg/dl) - 血清アルブミン(g/dl) x 0.9 + 4
このような補正を行なうため、リン酸濃度及びカルシウム濃度に加え、pH及びアルブミン濃度も測定することが好ましい。
【００１４】
さらに、腎臓の機能状態をより的確に判定するために、これらに加え、K濃度、ヘマトクリット(Hct)濃度及び副甲状腺ホルモン(intact PTH)濃度をさらに測定することが好ましい。腎臓機能とこれらの関係及びこれらの適正範囲は周知である。すなわち、K濃度の適正範囲は、３．５〜５．０、Hctの適正範囲は、男性で３９．５〜５１．８、女性で３３．４〜４４．９、intPTHの適正範囲は100〜300 pg/mLである。
【００１５】
測定結果は、後述のようにディスプレイやプリンタ等により可視的に表示され、表示された測定結果に基づいて生体内の腎臓機能のコントロール状態が判定される。好ましくは、各患者についての経時的な測定結果がグラフに表される。
【００１６】
上記した本発明の方法を行なうために用いられる本発明の測定システムは、体液サンプルを導入するサンプル導入部と、サンプル導入部から導入されたサンプル中のリン酸濃度を測定するリン酸濃度測定手段及びサンプル導入部から導入されたサンプル中のカルシウム濃度を測定するカルシウム濃度測定手段を含む測定部と、該測定部において測定された情報を入力し、リン酸濃度とカルシウム濃度とから体内の腎臓機能のコントロール状態を判定する判定処理部を含む処理手段とを有する。また、上記のように、pH及びアルブミン濃度、さらにはK濃度、Hct濃度及びintPTH濃度を測定することが好ましいので、測定部は、これらのそれぞれの測定手段をさらに含むことが好ましい。さらに、測定部には、サンプルの温度制御用のサーミスター(Th)電極、及び参照電極(Ref)を含んでいることが好ましい。
【００１７】
本発明の測定システムは、前記処理手段に接続された表示手段と、前記処理手段に接続された記憶手段とをさらに具備し、前記処理手段は、前記測定部からの各測定値に基いて各測定対象物の分析値を算出して、各分析値を記憶手段に記憶させると共に、前記各分析値又はそれに基づいて作成されたグラフを前記表示手段に表示させる。前記各分析値に基いてカルシウム−リン酸濃度積チャートに分析結果をプロットして表示手段に表示させるものであることが好ましい。また、分析すべき患者に関する患者情報を入力する入力部を備え、前記分析値を対応する患者情報と共に前記記憶手段に記憶させ、同一患者に関する複数回の前記分析結果を、前記カルシウムーリン酸濃度積チャート上に同時に表示できるように処理手段を構成したものであることが好ましい。なお、カルシウムーリン酸濃度積チャートとしては、縦軸および横軸の表示は特に限定するものではないが縦軸をリン酸濃度とし、横軸をカルシウム濃度としたチャートが好ましい。さらに、上記のように、チャートの作成に用いられるカルシウム濃度は、pH7.4の時のカルシウム濃度に補正し、かつ、アルブミン濃度に基づいて補正したものであることが好ましい。また、表示手段としてはディスプレイ及び／又はプリンタが好ましい。さらに管理すべき透析患者はほぼ決まっているために、バーコードやICタグ、磁気カードによる患者IDに基づき管理する機能も備えており、それによって情報を取り込むことにより簡単にデータ一覧表示できる機能を搭載していることが好ましい。
【００１８】
上記した本発明の好ましい測定システムのブロック図を図１に示す。
【００１９】
本発明の好ましい測定システムの測定部は、各測定項目を測定するセンサーを１列に配置すると共に、各センサーのセンサー部が露出する一本のサンプル導入路を設けたものであることが好ましい。図２に測定部の構造の例を模式的に示す。図２中、７０がサンプル導入路であり、７２がセンサー群である。図２中、pHはpHセンサー、KはKセンサー、CaはCaセンサー、Thはサーミスター電極、Refは参照電極、Hct/FSはヘマトクリットセンサー、Ｐはリン酸センサーであり、各センサー又は電極は必要な回路等を含む。これらの各センサーは、サンプル中の各物質又はイオンの濃度に応じて電気的又は光学的信号を生じるものであり、それぞれ公知であるので、公知のセンサーを用いることができる（ただし、体液中のリン酸濃度を電気的信号として測定できるリン酸酵素センサーは、本願発明者が初めて発明したものであり、これを用いることが好ましい。これについては後述する）。簡単に説明すると、pHセンサーとしては、感応ガラスにより隔てた電極内部に銀／塩化銀電極を持つ構造のものを好ましく採用することができる。測定は、図２中のRefを参照電極とする電位差測定によるものが好ましい。K及びCaセンサーとしては、イオン選択性電極(ISE)感応膜により隔てた電極内部に銀／塩化銀電極を持つ構造のものを好ましく採用することができる。測定は、図２中のRefを参照電極とする電位差測定によるものが好ましい。Th電極としては、３７℃環境において一定の抵抗値を示すよう可変抵抗で調整したサーミスター内蔵の電極が好ましい。電極回路は、２端子間の抵抗を測定し、温度変換を行なうものが好ましく、分解能は0.1℃程度が好ましい。Ref電極は、銀／塩化銀電極をセルロースアセテート膜により隔てた電極内部に持つ構造を有するものが好ましい。測定は白金製の液グランドとの電位差測定によるものが好ましい。Hct/FS電極は、電動度測定により、交流印加で抵抗値変化を測定するものが好ましい。
【００２０】
各センサーからの信号は処理手段に伝達され、処理手段で処理されて各分析値が算出され、また、カルシウム−リン酸濃度積チャートが作成され、表示手段に表示され、記憶手段に記憶される。
【００２１】
リン酸センサーに関し、これまでは、体液中のリン酸濃度を電気的信号として取り出すことができるリン酸センサーは知られておらず、本願発明者が初めて提供した。以下、これについて説明する。
【００２２】
本願発明者が別途発明したリン酸測定用酵素センサーの好ましい例を説明する。このリン酸測定用酵素センサーは、過酸化水素電極の電極構造体に特徴がある。この電極構造体は、過酸化水素電極と、該過酸化水素電極を被覆し、リン酸を消費して過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素を固定化した酵素固定化膜と、該酵素固定化膜の外側に配置され、該酵素固定化膜を被覆する多孔膜とを具備する。この構造の１例を図３に模式的に示す。
【００２３】
図３に模式的に示す電極構造体１０は、ガラス管１２の底部を利用して構成されたものであり、ガラス管１２の底部を貫通して、例えば白金から成る過酸化水素電極１４が配置されている。電極１４の先端部１４ａは、ガラス管１２の底部から露出しており、この部分が過酸化水素電極として機能する。過酸化水素電極１４の下部は、溶融後、固化したガラス１６により固着されている。リン酸を消費して過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素を固定化した酵素固定化膜１８が過酸化水素電極の先端部１４ａを被覆している。さらに、多孔膜２０が酵素固定化膜１８の外側に配置され、該酵素固定化膜１８を被覆している。酵素固定化膜１８及び多孔膜２０は、Ｏリング２２によりガラス管１２の底部に固着される。なお、図３は、単純な１例を模式的に示すものであり、要は、過酸化水素電極が、酵素固定化膜及び多孔膜によってこの順序で被覆されていればよい。また、図３は模式図であるので、各部材のサイズの比率も正確に記載しているものではない。
【００２４】
過酸化水素電極自体は周知であり、白金がよく用いられているが、他の金属を採用することも可能である。
【００２５】
酵素固定化膜に固定化する酵素は、リン酸を消費して過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であれば特に限定されるものではなく、ピルビン酸オキシダーゼを好ましい例として挙げることができる。酵素固定化膜は、液体を通すが固定化される酵素のような高分子は通さない、多孔性の半透膜であることが好ましい。このような半透膜は、多孔性の高分子膜から構成することができ、高分子膜を構成する高分子の例としては、酢酸セルロース等のセルロース類、塩化ビニル樹脂、ポリビニルアルコール、ポリカーボネート樹脂、ナイロン、ポリプロピレン、ポリエチレン、テフロン（登録商標）等を挙げることができる。これらの多孔性膜に酵素を固定化する方法自体は周知であり、周知の方法により容易に酵素を半透膜に固定化することができる。下記実施例にも好ましい方法が具体的に記載されている。酵素固定化膜の厚さは、特に限定されないが、通常、１μm〜３０μm程度である。なお、酵素固定化膜は、必ずしも自己支持性の膜である必要はなく、後述する多孔膜を支持体として、その上に樹脂バインダーと酵素の混合物を塗布することなどにより酵素固定化膜を作製してもよい。このような非自己支持性の酵素固定化層も「酵素固定化膜」に包含される。なお、酵素固定化層を形成する樹脂バインダーとしては、この目的に用いられている種々の公知の樹脂バインダーを採用することができ、例えば、スチルバゾリウム化ポリビニルアルコール（PVA-SbQ）、ポリビニルブチラール(PVB)、ポリアリルアミン、ゼラチン、グルタルアルデヒド等を挙げることができる。
【００２６】
前記酵素固定化膜の外側に配置され、該酵素固定化膜を被覆する多孔膜を構成する材料としては、多孔性の膜を形成することができ、必要な機械的強度を有する材料であれば特に限定されず、ポリカーボネート、セルロース混合エステル、ポリテトラフルオロエチレン、ガラス繊維等を例示することができる。多孔膜の孔径は、血球による目詰まりが起きないように、血球のサイズよりも小さいことが好ましく、また、測定の信頼性向上や測定範囲域の拡大の観点から、孔径（直径）は、0.01μｍないし１μｍが好ましく、さらに0.1μｍないし0.6μｍが好ましい。「多孔性」は、スポンジ状のものであってもよいが、測定の信頼性や再現性をより高くする観点から、平膜に円筒状の貫通孔が多数開口したものが好ましい。この場合、貫通孔の密度は、測定の信頼性や再現性をより高くする観点から、107〜109個/cm2程度が好ましく、さらには108〜109個/cm2程度が好ましい。また、多孔膜の厚さは、特に限定されないが、通常、３μｍないし２０μｍ程度、好ましくは、５μｍないし１５μｍ程度である。なお、ポリカーボネートフィルムに、上記の範囲の孔径を有する円筒状の貫通孔が上記の密度に形成された膜が米国Sterlitech社から「Nuclepore」（登録商標）という商品名で市販されており、本発明における多孔膜としては、この市販のNuclepore（登録商標）を1枚から5枚積層して利用することができる。
【００２７】
なお、酵素固定化膜を多孔膜で被覆することにより全血等の体液中のリン酸が、過酸化水素電極により測定可能になる理由は必ずしも明らかではないが、多孔膜によって、基質溶液が保持されると同時に検体中のリン酸の拡散が制限され、酵素には低減された量のリン酸が接触せず、また、血球をはじめとする妨害物質の酵素膜への接触も多孔膜によって防止されるか又はその拡散が制限される結果、全血中のリン酸であっても過酸化水素電極により測定可能になるのではないかと推測される。
【００２８】
なお、過酸化水素電極構造体に用いられる酵素固定化膜は、ピルビン酸オキシダーゼに限定されるものではなく、例えば、酵素固定化膜として、キサンチンオキシダーゼ固定化膜とプリンヌクレオシドホスホリラーゼ固定化膜を積層したもの（キサンチンオキシダーゼ固定化膜を電極側に配置）等も用いることができる。
【００２９】
上記リン酸測定用酵素センサーは、上記した過酸化水素電極構造体を具備する点を特徴としており、他の構成は、公知のリン酸センサーと同様でよい。すなわち、リン酸測定用酵素センサーは、上記本発明の電極構造体と、参照電極と、前記過酸化水素電極と前記参照電極の間に電圧を印加する手段と、前記電極構造体及び前記参照電極を収容するセンサー本体と、該センター本体内に収容される、電解質液とを含む。この構造の１例を図４に模式的に示す。
【００３０】
図４中、１０は上記した本発明の電極構造体であり、２４は参照電極である。センサー本体２６内に電極構造体１０及び参照電極２４が収容されている。センサー本体２６内には、電解質液２８が収容されており（液面が破線で示されている）、過酸化水素電極１４及び参照電極２４は電解質液２８中に浸漬されている。また、電池３０により、過酸化水素電極１４には、参照電極２４に対して正の電圧が印加されている。なお、参照電極としては、Ag/AgCl電極がよく用いられている。また、電解質液としては、食塩を含む緩衝液等を用いることができる。
【００３１】
本発明の方法に用いられるリン酸自動測定装置では、上記したような酵素センサーが、被検試料を導入する被検試料導入流路（図４中の参照番号３１）の一部に配置されている。
【００３２】
使用時には、電極構造体１０の多孔膜を被検試料と接触させる。被検試料は、図４に示す被検試料導入路３１内を矢印で示す方向に流れている。被検試料の一部は、電極構造体の多孔膜を介して酵素固定化膜に至る。酵素固定化膜に接して基質及び必要な補酵素が共存すれば、酵素の触媒作用により、ここで酵素反応が起きる。酵素反応により、被検試料中のリン酸が消費され、過酸化水素が生成する。例えば、酵素がピルビン酸オキシダーゼである場合には、次の反応が起きる。
ピルビン酸＋H2O + O2 + リン酸→アセチルリン酸 + CO2 + H2O2
このように、被検試料中のリン酸が消費されて、それと等モルの過酸化水素が生成する。従って、この時の過酸化水素の生成量は、被検試料中のリン酸濃度に依存して変化し、被検試料中のリン酸濃度が高くなるほど過酸化水素の生成量が増大する。このため、生じた過酸化水素を過酸化水素電極を用いて定量することにより、被検試料中のリン酸濃度を電気的な数値として測定することができる。なお、生成した過酸化水素は、過酸化水素電極上で、次のように分解されて、この際に電流を生じる。
H2O2  →  2H+ + O2 + 2e-
過酸化水素の定量は、過酸化水素電極を流れるこの電流を測定することにより行うことができる。予め既知濃度のリン酸を含む標準試料を複数用いて検量線を作成しておくと、測定された電流値から未知被検試料中のリン酸濃度を知ることができる。
【００３３】
上記リン酸センサーを組み込んだ、自動測定装置のフローチャートの１例を図５に示す。図５中、酵素センサーは３２である。なお、上記の通り、上記した他の項目を測定するセンサーもこの酵素センサー３２と一列に隣接して配置される。３４は三方バルブ、３６は定量シリンジ、３８は送液ポンプ、４０は試薬液、４２は被検試料、４４は電流−電圧転換器、４６はA/Dコンバーター、４８はコンピューター、５０はプリンター、５２は廃液ポンプ、５４は廃液タンクである。
【００３４】
本発明の測定システムは、使用時には、サンプル導入部にサンプル、好ましくは全血を入れ、ポンプを作動させてサンプル導入路を進行させる。サンプル導入路を流れるサンプルは、各センサーのセンサー部と接触しながら進み、最終的には廃棄される。各センサーは、各項目を測定する。この際、必要により酵素基質等の試薬も供される。これは、好ましくは、サンプルをセンサー部に導入する前に、前記酵素センサーによるリン酸の測定に必要な試薬を前記酵素センサーに導入するか又は該試薬とサンプルとの混合物を前記酵素センサーに導入することにより行うことができる。そして、上記の通り、各センサーからの信号は処理手段に伝達され、処理手段で処理されて各分析値が算出され、また、カルシウム−リン酸濃度積チャートおよびカリウム、ヘマトクリットさらにintPTHの経時変化グラフが作成され、表示手段に表示され、記憶手段に記憶される。作成されるカルシウム−リン酸濃度積チャートの例を図６に、各患者についての各分析値の経時変化を示すグラフ（横軸は現在を０とする日数、一点鎖線は正常値の上限及び下限）の例を図７に示す。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の測定システムの好ましい１例のブロック図である。
【図２】本発明の測定システムの好ましい１例の測定部を模式的に示す図である。
【図３】本発明の測定システムに用いられるリン酸測定用酵素センサーの電極の１例を模式的に示す図である。
【図４】本発明の測定システムに用いられるリン酸測定用酵素センサーの一例を模式的に示す図である。
【図５】本発明の測定システムの好ましい１例の構成を示すブロックチャート図である。
【図６】本発明の実施例で作成されたカルシウム−リン酸濃度積チャートの例を示す図である。
【図７】本発明の実施例で作成された各患者についての各分析値の経時変化を示すグラフの例を示す図である。
【符号の説明】
【００３６】
１０  電極構造体
１２  ガラス管
１４  過酸化水素電極
１６  固化したガラス
１８  酵素固定化膜
２０  多孔膜
２２  Ｏリング
２４  参照電極
２６  センサー本体
２８  電解質液
３０  電池
３２  酵素センサー
３４  三方バルブ
３６  定量シリンジ
３８  送液ポンプ
４０  試薬液
４２  被検試料
４４  電流−電圧転換器
４６  A/Dコンバーター
４８  コンピューター
５０  プリンター
５２  廃液ポンプ
５４  廃液タンク
７０  サンプル導入路
７２  測定部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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