(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基底前脳コリン作動性ニューロンの損傷または変性の治療用の医薬組成物を製造するためのグリア細胞系由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）の使用。
【請求項２】
該ＧＤＮＦが、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるかまたはその変異体もしくは誘導体である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
該ＧＤＮＦが、［Ｍｅｔ-1］ＧＤＮＦである、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
該誘導体が、水溶性重合体により化学修飾されている、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
該水溶性重合体が、ポリエチレングリコールである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
該医薬組成物が、徐放性医薬組成物である、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
該医薬組成物が、さらに、アルツハイマー病を治療するための第２の治療剤の有効量を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
第２の治療剤が、コリンエステラーゼ阻害物質、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）よりなる群から選ばれる、請求項７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
発明の背景
本発明は、一般に、グリア細胞系由来神経栄養因子（GDNF）タンパク質産物を投与することによる、基底前脳コリン作動性ニューロンの損傷または変性の治療方法に関する。本発明は、特に、アルツハイマー病の治療方法に関する。
神経栄養因子は、神経系または該神経系に神経支配される非神経組織内で見出される天然タンパク質であり、神経および／またはグリア細胞の生存を促進し、それらの表現型分化を維持するよう機能する（Varonら, Ann. Rev. Neuroscience, 1:327, 1979; Thoenenら, Science, 229:238, 1985）。この生理的役割のため、神経栄養因子は、神経損傷から生じる神経細胞の変性および分化機能の喪失の治療に有用である。神経損傷は、（１）損傷部位付近の軸索突起および／または神経細胞体の変性を引き起こす物理的損傷、（２）卒中などの場合に見られる、神経系部分への血流の一時的または永久的な停止（虚血）、（３）癌およびエイズの化学療法剤であるそれぞれシスプラチナムおよびジデオキシシチジン（ddC）などの神経毒に対する意図的または偶然の曝露、（４）糖尿病、腎不全などの慢性代謝疾患、または（５）特定の神経集団の変性から生じるパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）などの神経変性疾患を含む、１以上の神経細胞型の生存および／または適当な機能を損なう状態により生じる。特定の神経栄養因子が、神経損傷の治療に潜在的に有用であるためには、損傷を受けた神経細胞のクラスまたはクラス群が、該因子に応答しなければならず、典型的には、神経栄養因子が異なれば、それが影響を及ぼす神経細胞クラスも全く異なっている。
同定された最初の神経栄養因子は、神経成長因子（NGF）であった。NGFは、ニューロトロフィンと称される栄養因子の確定ファミリーの第１のメンバーであり、現在のところ、ニューロトロフィンには、脳由来神経栄養因子（BDNF）、ニューロトロフィン−３（NT-3）、NT-4/5およびNT-6も含まれる（Thoenen, Trends. Neurosci. 14:165-170, 1991; Lapchakら, Rev. Neurosci., 3:1-10, 1993; Bothwell, Ann. Rev. Neurosci., 18:223-253, 1995）。これらのニューロトロフィンは、trkチロシンキナーゼ受容体（すなわち、trkA、trkB、trkC）のファミリーおよび低親和性p75受容体を介して作用することが公知である（Lapchakら, Rev. Neurosci. 3:1-10, 1993; Bothwell, Ann. Rev. Neurosci., 18:223-253, 1995; Chaoら, TINS 18:321-326, 1995）。中枢神経系（CNS）においては、NGFの受容体であるtrkAの発現は、基底前脳内のコリン作動性ニューロンにほとんど完全に限定されており（Veneroら, Neuroreport 4:959-962, 1993）、該ニューロンは、p75およびtrkBも発現する。コリン作動性ニューロンの変性および／またはジストロフィーはアルツハイマー病の特徴であるため（Hefti, J. Neurobiol. 25:1418-1435, 1994; Olson, Neurochem. Jul. 15:1-3, 1994）、これらのコリン作動性ニューロンは神経学的に特に興味深い。基底前脳コリン作動性ニューロンは、アセチルコリンエステラーゼの組織化学を用いて、あるいはアセチルコリンの合成酵素であるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChAT）に対するまたはp75に対する抗体を用いる免疫組織化学により、形態学的調製物中で容易に同定することができる（Batchelorら, J. Comp. Neurol. 284:187-204, 1989; Kissら, Neurosci. 27:731-748, 1988; Woolfら, Neurosci. 30:143-152, 1989）。
グリア細胞系由来神経栄養因子（GDNF）は、インビトロにおいて中脳ドーパミン作動性ニューロンの生存を促進し該ニューロンの伝達物質表現型を刺激するその効能に基づくアッセイを用いて同定および精製された、最近見出されたタンパク質である（Linら, Science 260:1130-1132, 1993）。GDNFは、神経栄養タンパク質のトランスフォーミング増殖因子（TGF）スーパーファミリーと密接な構造相同性を有するグリコシル化ジスルフィド結合ホモ二量体である（Linら, Science 260:1130-1132, 1993; Krieglsteinら, EMBO J. 14:736-742, 1995; Poulsenら, Neuron 13:1245-1252, 1994）。インビボでは、外因性GDNFでの処理は、黒質ニューロンのドーパミン作動性表現型を刺激し、パーキンソン病の動物モデルにおいて軸索切断またはドーパミン作動性神経毒により誘導された機能的欠損を回復させる（Hudsonら, Brain Res. Bull. 36:425-432, 1995; Beckら, Nature 373:339-341, 1995; Tomacら, Nature 373:335-339, 1995; Hofferら, Neurosci. Lett. 182:107-111, 1994）。GDNFは、初めは、少なくともインビトロにおいてはドーパミン作動性ニューロンに比較的特異的であると考えられていたが、その後の実験から、GDNFは、インビボおよびインビトロの両方で、脳幹および脊髄コリン作動性運動ニューロンに対する神経栄養的効能を有することが判明した（Oppenheimら, Nature 373:344-346, 1995; Zurnら, Neuroreport 6:113-118, 1994; Yanら, Nature 373:341-344, 1995; Hendersonら, Science 266:1062-1064, 1994）。GDNFが、中脳ドーパミン作動性ニューロンおよび体性運動ニューロン以外の神経栄養標的のより大きなスペクトルを有する可能性があることを示す証拠が現れ始めている（YanおよびMatheson, Nature 373:341-344, 1995; Millerら, Soc. Neurosci. Abstr. 20:1300, 1994）。
アルツハイマー病は、最近の記憶の障害、健忘症、情動行動の障害、空間関係または運動技能の操作の困難性により特徴付けられる進行性痴呆である。この疾患は、世界中で発生しており、高い平均余命の人口を有する多数の先進国における晩年の知的障害の全症例の２分の１から３分の２を占める（Selkoe, Neuron, 6:487-498, 1991）。
アルツハイマー病は、痴呆の他の原因が除外された後で、主に臨床症状により診断される。死亡後、アルツハイマー病で見られる脳変性に伴う脳内の多数の特徴的な神経原線維変化および老人斑の観察により、その診断を最終的に確定することができる。神経原線維変化は、変性している神経細胞体および神経突起の内部のねじれた線維の異常なもつれである。これらの線維状沈着物内の主要構造は、ペアードヘリカルフィラメント（PHF）と称される約10nmのねじれたフィラメントの対である。これらのPHFは、主として、修飾されたタウタンパク質の不溶性凝集物よりなるらしい（Selkoe, Neuron, 6:487-498, 1991）。
アルツハイマー病の典型的な老人斑は、いくつかの異常要素（ジストロフィー神経細胞、活性化ミクログリアおよび線維状アストロサイトに囲まれた細胞外アミロイド原線維のコア中心沈着物）を含有する複雑な病変である。これらの斑は、アルツハイマー病、トリソミー21、およびより低い程度ではあるが正常な脳の老化の３つの状態において豊富に見出される。斑のコアのアミロイド線維は、超微細構造的にはPHFと異なっており、細胞外にあり、対になっておらず、約８nmの径を有するが、それは、種々の無関係な全身性アミロイド症における非神経組織内に蓄積するアミロイドフィラメントと酷似している。また、アミロイド沈着は、アルツハイマー病におけるいくつかのまたは多数の脳血管および軟脳膜血管の壁に生じる。アミロイドフィラメントのサブユニット構造は、アミロイドβ−タンパク質（AβP）と称されるペプチドである。AβPペプチドは、生物学的機能が十分には理解されていないβAPPと称されるより大きな695残基の前駆体タンパク質のタンパク質分解断片である。
アルツハイマー病に罹患した脳の免疫細胞化学は、AβPが老人斑の外部に広く分布することを明らかにした。散在性またはプレアミロイド斑と称されるAβPの多数の散在性沈着物があり、該沈着物は、周囲のジストロフィー神経細胞またはグリアをほとんどまたは全く含有しておらず、また、臨床的にはほとんど冒されないと考えられる脳領域（例えば、小脳、線条体および視床）内に見出される。ａ−抗キモトリプシン、補体C1q、C3cおよびC3d因子、血清アミロイドPタンパク質、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどの他のいくつかの異なるタンパク質が、β−アミロイド沈着物と密接かつ特異的に関連している。
アルツハイマー病においては、ある皮質下核の異常と共に、大脳皮質の連合野および記憶野内の選択された細胞の進行性の領域特異的喪失および変性が認められる。ニューロンの喪失は、特に、頭頂および前頭連合野、海馬および扁桃の大きな錐体細胞を冒す。強く冒された海馬の入力は、嗅脳溝内皮質、基底前脳コリン作動性ニューロン、青斑ノルアドレナリン作動性ニューロンからのものである。皮質への主要なコリン作動性投射を発するマイネルトの基底前脳核も、重篤な変性を受ける。
アルツハイマーの患者で見られる行動変化においては、基底前脳コリン作動性ニューロンが重要な役割を果たしていることが、信頼しうる証拠により示されている。コリン作動性機能の喪失は、この疾患における最も初期の変化の１つである。コリン作動性の欠損の程度は、記憶障害の程度と相関し、アセチルコリンエステラーゼ阻害物質によるコリン作動性機能の増強により、著しくはないが有意な症状の改善が得られる。動物においては、海馬および皮質を神経支配するコリン作動性ニューロンの病変は、著しい記憶および認識の障害を引き起こし、この障害は、コリン作動性機能を増強する薬物により逆転される（Hefti, J. Neurobiol. 25:1418-1435, 1994）。
他のモノアミン伝達物質（ノルエピネフリン、セロトニンおよびドーパミン）を産生する他の投射ニューロン、ならびにグルタミン酸、γ−アミノ酪酸（GABA）、ソマトスタチン、神経ペプチドY、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、サブスタンスPおよび他の神経調節物質を産生する皮質ニューロンも、アルツハイマー病において冒される。
専らコリン作動性薬物で治療することにより、アルツハイマー患者の健忘および認識の症状を改善する試みは、ほとんど成功しておらず、多数の副作用を引き起こす。アセチルコリン阻害剤である塩酸タクリン（Cognex▲Ｒ▼）は、アセチルコリンの分解を阻害するものであり、アルツハイマー患者への投与がFDAにより承認されている唯一の薬物である。しかしながら、この薬物による改善も限られたものであり、有意な肝毒性などの多数の不利な副作用を有する。
また、NGFなどのニューロトロフィンによる治療も、アルツハイマー病に対して検討されている。いくつかのニューロトロフィンが、アルツハイマー病の采／脳弓軸索切断モデルにおいて正の効果を与えることが示されている。このモデルでは、内側中隔内のニューロンを采／脳弓の離断により軸索切断すると、コリン作動性ニューロンは、そのp75、trkAおよびChATの発現を、急速に、すなわち２週間以内にダウンレギュレーションする。ついで、それは、萎縮し、ニューロンとして認めることができなくなり、アルツハイマー病と同様の状態になる（Batchelorら, J. Comp. Neurol. 284:187-204, 1989; Gageら, Neuroscience 19:241-255, 1986; Haggら, Brain Res. 505:29-38, 1989; Hefti, J. Neurosci. 6:2155-2162, 1986; Springerら, J. Neurosci. Res. 17:111-118. 1987; Sofroniewら, J. Neurosci. 13:5263-5276, 1993）。このモデルでは、脳室内用量のNGF、BDNFまたはNT-4/5で脳を治療することにより、軸索切断により誘導されるニューロンの萎縮を妨げ、コリン作動性表現型を維持あるいはさらには増強させることができたことが示されている（Haggら, Brain Res. 505:29-38, 1989; Hefti, J. Neurosci. 6:2155-2162, 1986; Knuselら, J. Neurosci. 12:4391-4402. 1992; Koliatsosら, J. Comp. Neurol. 343:247-262, 1994; Koliatsosら, Ann. Neurol. 30:831-840, 1991; Morseら, J. Neurosci. 13:4146-4156, 1993; Veneroら, Neuroscience 59:797-815, 1994; Widmerら, Neuroreport 4:363-366, 1993; Williamsら, Brain Research 498:243-256, 1989; Williamsら, Proc, Nat. Acid. Sci.（USA）83:9231-9235, 1986; Aldersonら, Eur. J. Neurosci. 印刷中: 1995）。軸索切断により誘導されたコリン作動性ジストロフィーの逆転におけるこれらのニューロトロフィンの効能に基づき、アルツハイマー病および他の神経変性障害を治療するために、ニューロトロフィン（特にNGF）の投与が検討されている（Hefti, J. Neurobiol. 25:1418-1435, 1994; Phelpsら, Neurobiol. Aging 10:205-207, 1989; Olson, Neurochem. Jul.25:1-3, 1994）。実際に、そのような効能を調べる小規模な臨床試験が進行中であり、報告され始めている（Olsonら, J. Neural Transm. 4:79-95, 1992; Pettyら, Ann. Aug.36:244-246, 1994を参照されたし）。
NGFは、文献で報告されているもののなかでは、基底前脳ニューロンに対する最も強力な神経栄養因子であり、したがって、アルツハイマー病の潜在的な治療にうってつけの神経栄養因子であると考えられた（Olson, Neurochem. Jul.25:1-3, 1994; Olsonら, J. Neural Transm. 4:79-95, 1992）。NGFは、コリン作動性不全の動物モデルにおいてコリン作動性表現型を維持するばかりでなく、コリン作動性伝達を正常レベルより上昇させる（Haggら, Neurosci. 30:95-103, 1989; Haggら, Brain Res. 505:29-38, 1989; Rylettら, J. Neurosci. 13:3956-3963, 1993; Williamsら, Brain Research 498:243-256, 1989; Lapchak, Exp. Neurol. 124:16-20, 1993）。NGFはまた、正常なコリン作動性ニューロンにおいてさえも、細胞体の肥大およびニューロン周囲の突起の増加（Haggら, Brain Res. 505:29-38, 1989）を含む、そしておそらく異常な軸索結合を含む構造変化を誘導することがある。しかしながら、コリン作動性ニューロン構造の変化、異常な出芽、および異常な神経伝達が、NGF療法における望ましくない副作用となるかもしれない（ButcherおよびWoolf, Neurobiol. Aging 10:557-570, 1989）。末梢性NGFは、炎症痛の主要な寄与因子であり（Woolfら, Neuroscience Sep.62:327-331, 1994）、げっ歯動物におけるNGFの末梢投与は、痛覚過敏を誘導する（Della Setaら, Pharmacol. 49:701-705, 1994; LewinおよびMendell, Trends. Neurosci. Sep.16:353-359, 1993）。
末梢性ニューロパシーに対する全身性投与による、およびアルツハイマー病に対する中枢投与によるNGFの初期ヒト臨床試験において、許容できない副作用が明らかとなった。ヒトにおける低用量のNGFの末梢投与は、重篤な筋肉痛を引き起こす（Pettyら, Ann. Aug.36:244-246, 1994）。NGFを比較的低用量の66μg/日（Olsonら, J. Neural Transm. 4:79-95, 1992）（この用量は、脳重量に基づけば、ラットにおける0.08μg/日の用量に匹敵する（Williams, Exp. Neurol. 113:31-37, 1991））で脳室内注入することにより治療されたアルツハイマー患者は、末梢NGF投与後に生じると報告されている（Pettyら, Ann. Aug.36:244-246, 1994）のと同様の末梢吻筋肉痛および有意な体重減少を経験する。そのような副作用があるため、そのような療法に対するNGFの潜在的に有効な使用は許可されないかもしれない。
また、BDNFは、軸索切断された基底前脳コリン作動性ニューロンに対する活性を有することが公知である（概説としては、HeftiおよびLapchak, Adv. Pharmacol. 24:239-273, 1993; Lapchakら, Exp. Neurol. 124:16-20, 1993を参照されたし）。しかしながら、BDNFは、効力がNGFよりはるかに低く、認識不全の老齢ラットの行動をNGFの場合のようには改善しない（Fischerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8607-8611, 1994）。
本発明にとって一般的に興味深いのは、ピロカルピンで誘導された発作の後で、GDNF mRNAが検出可能となりアップレギュレーションされたというSchmidt-Kastnerら, Mol. Brain Res., 26:325-330, 1994の報告である。本発明にとってさらに興味深いのは、1993年4月1日付け公開のWO93/06116（Linら, Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture）であり、それは、GDNFが神経損傷の治療に有用であると報告しており、神経損傷の原因として、とりわけ、アルツハイマー病を取り上げている。また、Schaarら, Exp. Neurol., 124:368-371, 1993およびSchaarら, Exp. Neurol., 130:387-393, 1994の報告も興味深く、それらによると、基底前脳アストロサイトは、培養条件下で適度のレベルのGDNF ｍRNAを発現したが、GDNFは基底前脳のChAT活性を変化させなかった（後者の知見は、基底前脳コリン作動性ニューロンがGDNFの標的でないことを示唆している）。
このように、アルツハイマー病の治療に有用で、該疾患で見られる進行性の記憶および認識障害を改善する方法および治療用組成物に対する要求が存在し続けている。そのような方法および治療用組成物は、理想的には、重篤な不利な副作用を引き起こすことなく、患者の記憶および認識能力を改善するであろう。
発明の概要
本発明は、グリア細胞系由来神経栄養因子（GDNF）タンパク質産物の治療的に有効な量を投与することによる、基底前脳コリン作動性ニューロンの損傷または変性の治療方法を提供する。本発明の１つの態様においては、GDNFタンパク質産物の治療的に有効な量を投与することによる、アルツハイマー病の治療方法を提供する。そのようなGDNFタンパク質産物は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するGDNF、その変異体および誘導体を含むと意図される。本発明は、GDNFタンパク質産物の投与が、損傷された基底前脳コリン作動性ニューロン（これは、アルツハイマー病との関連性が著しい）の生存および再生を促進するという新規知見に基づく。
本発明においては、GDNFタンパク質産物を、約10μg/kg/日〜100mg/kg/日の用量、好ましくは約１mg/kg/日〜25mg/kg/日の用量、最も好ましくは約５〜20mg/kg/日の用量で投与する。さらに、GDNFタンパク質産物を、アルツハイマー病に対する第２の治療剤の有効量と共に投与することが意図される。そのような第２の治療剤には、コリン作動性アゴニスト、コリンエステラーゼ阻害物質、および他の神経栄養因子が含まれうる。
また、本発明は、基底前脳コリン作動性ニューロンの損傷または変性の治療（アルツハイマー病の治療を含む）用の医薬の製造におけるGDNFタンパク質産物の使用を提供する。
当業者においては、本発明の現在好ましい実施態様を記載する以下の発明の詳細な説明の考慮に基づき、本発明の多数の追加的な態様および利点が明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
図１は、采／脳弓軸索切断後のChATおよびp75陽性ニューロンの数に対する［Met-1］GDNFまたはビヒクルでの処理の効果を示す。
図２は、采／脳弓軸索切断後のChAT陽性ニューロンの数に対する［Met-1］GDNF、BDNF、NGFまたはビヒクルでの処理の効果を示す。
図３は、采／脳弓軸索切断後のChAT酵素活性に対する10μg/日の［Met-1］GDNF、BDNF、NGFまたはビヒクルの効果を示す。
図４は、采／脳弓軸索切断後のp75陽性ニューロンの数に対する［Met-1］GDNF、BDNF、NGFまたはビヒクルでの処理の効果を示す。
図５および６は、采／脳弓軸索切断後の内側（図５）および外側（図６）中隔におけるp75免疫反応性の相対O.D.に対する［Met-1］GDNF、BDNF、NGFまたはビヒクルでの処理の効果を示す。
図７は、采／脳弓軸索切断後の体重に対する［Met-1］GDNF、BDNF、NGFまたはビヒクルでの処理の効果を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、治療的に有効な量のグリア細胞系由来神経栄養因子（GDNF）タンパク質産物を投与することによる、基底前脳コリン作動性ニューロンの損傷または変性の治療方法を提供する。本発明の１つの態様においては、治療的に有効な量のGDNFタンパク質産物を投与することによる、アルツハイマー病の治療方法を提供する。本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するGDNF、その変異体および誘導体を含む生物学的に活性なGDNFタンパク質産物を使用して実施することができる。
本発明は、GDNFに応答することがこれまで確認されていなかったニューロン集団である損傷された基底前脳コリン作動性ニューロンに対して、GDNFタンパク質産物の投与が、正の効果を及ぼすという知見に基づく。本発明は、GDNFタンパク質産物が、ニューロン活性に関与する受容体の発現を維持し、軸索成長の再生応答を可能にし、ニューロンのコリン作動活性に関与する鍵酵素の活性を増強することにより作用することを示す。これらの基底前脳ニューロンの変性は、アルツハイマー病に顕著な特徴であり、これらのニューロンを維持し、および／または、それらの再生を促進する因子は、該疾患の治療（付随する認識および記憶障害の改善を含む）に有効であると予想される。
本発明においては、GDNFタンパク質産物を、約10μg/kg/日〜100mg/kg/日の用量、好ましくは約１mg/kg/日〜25mg/kg/日の用量、最も好ましくは約５〜20mg/kg/日の用量で投与する。さらに、GDNFタンパク質産物を、アルツハイマーに対する第２の治療剤の有効量と共に投与することも意図する。そのような第２の治療剤には、コリン作動性アゴニスト（特に、CNSに特異的であり、末梢筋肉に特異的でないもの）、コリンエステラーゼ阻害物質（例えば、塩酸タクリン）、ニューロトロフィン（例えば、NGF、BDNF、NT-3、NT-4/5、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）または毛様体神経栄養因子（CNTF））、老人アミロイド斑形成の阻害物質、PHF形成の阻害物質、内因性神経栄養因子の合成または産生の誘導物質、および神経栄養因子を分泌（本来的にまたは組換え修飾による）する移植細胞が含まれうる。アルツハイマー病の最も有効な増殖因子療法においては、コリン作動性のものだけでなくすべての易損性ニューロン集団を保護する必要があり、増殖因子を組合せる必要もあると考えられる。上行性ノルアドレナリン作動性ニューロンがNT-3およびNT-4/5に応答するという初期証拠がある。bFGFは、嗅脳溝内皮質のニューロンを、ラットにおいて軸索切断により誘導される変性（アルツハイマー病における嗅脳溝内皮質変性のモデル化病変である）から保護すると報告されている。CNTFは、成体視床皮質ニューロンを、軸索切断後の変性から保護する。
また、本発明は、基底前脳コリン作動性ニューロンの損傷または変性の治療（アルツハイマー病の治療を含む）用の医薬の製造におけるGDNFタンパク質産物の使用を提供する。
本発明で用いる「GDNFタンパク質産物」なる語は、精製された天然、合成または組換えGDNF、生物学的に活性なGDNF変異体（挿入、置換および欠失変異体を含む）、および化学修飾されたその誘導体を含む。また、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトGDNFと実質的に相同なGDNFも含まれる。GDNFタンパク質産物は、その生物学的に活性な形態においては、ホモ二量体またはヘテロ二量体として存在しうる。
本発明で用いる「生物学的に活性」なる語は、GDNFタンパク質産物が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するGDNFと同様の神経栄養特性（neurotrophic properties）を示すが、それと同じ特性の必ずしもすべてを示す必要はなく、必ずしも同程度で示す必要はないことを意味する。関心のある個々の神経栄養特性の選択は、GDNFタンパク質産物を投与する用途に左右される。
本発明で用いる「実質的に相同」なる語は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するGDNFに対する相同性の程度が、好ましくは、70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上または95％以上であることを意味する。例えば、該ラットタンパク質とヒトタンパク質との間の相同性の程度は約93％であり、すべての哺乳動物GDNFが、同様に高い相同性を有するであろう。本発明で記載する相同性の割合（％）は、Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure v.5, p.124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C.（1972）（その開示を、参考として本明細書に組入れることとする）に記載されているとおり、配列の整列を助するために100アミノ酸長中に４個のギャップを導入しうる場合には、比較する配列中の同一のアミノ酸残基であって整列する２種の配列の小さい方に存在するアミノ酸残基の割合（％）として算出される。また、配列番号１のGDNFに対する抗体との交差反応性に基づいて単離しうる任意のGDNFタンパク質産物、あるいは配列番号１のGDNFをコードする遺伝子または遺伝子セグメントとのハイブリダイゼーションにより単離される遺伝子によりコードされるGDNFタンパク質産物が、実質的に相同なものとして含まれる。
本発明のGDNFタンパク質産物は、当業者に公知の任意の手段により単離または製造することができる。本発明で有用なGDNFタンパク質産物の典型的な製造法は、1994年5月23日付け出願の米国特許出願第08/182,183号およびその親出願；WO93/06116として公開されている1992年9月17日付け出願のPCT出願第PCT/US92/07888号（Linら, Syntex-Synergen Neuroscience Joint Venture）；EP610 254として公開されている欧州特許出願第92921022.7号；および本願と同時に出願された共有同時係属米国出願第        号（″Truncated Glial Cell-Line Derived Neurotrophic Factor″、代理人名簿番号第A-357号）（これらのすべての開示を、参考として本明細書に組入れることとする）に記載されている。
天然に存在するGDNFタンパク質産物は、GDNFを分泌または発現する哺乳動物ニューロン細胞調製物または哺乳動物細胞系から単離することができる。例えば、WO93/06116は、B49グリア芽細胞腫細胞の無血清増殖調整培地からGDNFを単離することを記載している。また、GDNFタンパク質産物は、当業者に公知の任意の手段により化学合成することができる。GDNFタンパク質産物は、好ましくは、組換え法により製造する。なぜなら、組換え法は、比較的より大量のタンパク質をより高純度で与えうるからである。組換えGDNFタンパク質産物は、グリコシル化された形およびグリコシル化されていない形を含み、細菌、哺乳動物または昆虫細胞系中で発現されたタンパク質を含む。
一般に、組換え法は、GDNFをコードする遺伝子を単離し、適当なベクターおよび細胞型中へ該遺伝子をクローニングし、必要に応じて所望の変異体をコードさせるために該遺伝子を修飾し、そして該遺伝子を発現させてGDNFタンパク質産物を産生させることを含む。別法として、所望のGDNFタンパク質産物をコードするヌクレオチド配列を、化学合成してもよい。GDNFタンパク質産物は、遺伝暗号の縮重または対立遺伝子変異のためにコドン使用頻度が異なるヌクレオチド配列を用いて発現させてもよいと意図される。WO93/06116は、ラットGDNF遺伝子のｃＤＮＡクローンの単離および配列決定、およびヒトGDNF遺伝子のゲノムＤＮＡクローンの単離、配列決定および発現を記載している。また、WO93/06116は、GDNFタンパク質産物の発現のためのベクター、宿主細胞および培養増殖条件を記載している。大腸菌（E. coli）におけるGDNFタンパク質産物の発現に適した別のベクターは、1991年4月24日付け公開の欧州特許出願第EP0 423 980号（″Stem Cell Factor″）（その開示を、参考として本明細書に組入れることとする）に開示されている。成熟GDNFをコードする遺伝子のＤＮＡ配列およびGDNFのアミノ酸配列は、WO93/06116の図19（配列番号５）に示されている。図19は、GDNFのプレプロ部分の完全なコード配列を示していないが、WO93/06116の図22（配列番号８）には、ヒトプレプロGDNFの最初の50アミノ酸が示されている。
天然に存在するGDNFは、その生物学的に活性な形態においては、ジスルフィド結合で結合した二量体である。細菌系での発現後に単離される物質は、実質的に生物学的に不活性であり、単量体として存在する。生物学的に活性なジスルフィド結合で結合した二量体を得るためには、リフォールディングが必要である。細菌系で発現されたGDNFのリフォールディングおよびナチュレーション（naturation）のための方法は、WO93/06116に記載されている。GDNFの活性を測定するための標準的なインビトロアッセイは、WO93/06116および本願と同時に出願され参考として本明細書に組入れる共有同時係属米国出願第      号（″Truncated Glial Cell-Line Derived Neurotrophic Factor″、代理人名簿番号第A-357号）に記載されている。
Ａ．GDNF変異体
本発明で用いる「GDNF変異体」なる語は、天然に存在するGDNFのアミノ酸配列内の残基と比べて、アミノ酸が欠失している（「欠失変異体」）、挿入されている（「付加変異体」）または置換されている（「置換変異体」）ポリペプチドを含む。そのような変異体は、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のポリペプチドのインビトロ化学合成により製造する。当業者においては、最終的な分子がGDNFの生物学的活性を有する限り、欠失、挿入および置換の多数の組合せを行なうことができると理解されるであろう。
１以上の選択されたアミノ酸残基の置換、挿入または欠失のための突然変異誘発法は、当業者によく知られている（例えば、米国特許第4,518,584号（その開示を、参考として本明細書に組入れることとする））。変異体の構築においては、突然変異部位の位置、および突然変異の性質という２つの主要な変数がある。GDNF変異体を設計する場合、突然変異部位および突然変異の性質の選択は、修飾すべきGDNFの特性に左右されるであろう。突然変異の部位は、例えば、（１）まず同類アミノ酸選択物で置換し、ついで、得られた結果に応じて、よりラジカルな選択物で置換する、（２）標的アミノ酸残基を欠失させる、あるいは（３）その位置する部位の隣にアミノ酸残基を挿入することにより、個別的または連続的に修飾することができる。１〜20個のアミノ酸の同類変化が好ましい。所望のGDNFタンパク質産物のアミノ酸配列が決定されたら、該タンパク質の発現で使用する核酸配列は容易に決定される。また、N末端およびC末端の欠失変異体は、タンパク質分解酵素により得てもよい。
GDNFの欠失変異体の場合、欠失は、一般には約１〜30個の残基、通常は約１〜10個の残基、典型的には約１〜５個の連続した残基に及ぶ。N末端、C末端および内部の配列内欠失が意図される。GDNFの活性を修飾するために、他のTGF-βファミリーメンバーと低い相同性を有する領域内に欠失を導入してもよい。他のTGF-bファミリーの配列と実質的に相同な領域内で欠失させると、GDNFの生物活性をより有意に修飾する可能性が高くなるであろう。連続的欠失の数は、影響を受けるドメイン（例えば、システイン架橋）内のGDNFタンパク質産物の三次構造を維持するよう選択する。欠失変異体の非限定的な具体例には、本願と同時に出願され参考として本明細書に組入れる共有同時係属米国出願第      号（″Truncated Glial Cell-Line Derived Neurotrophic Factor″、代理人名簿番号第A-357号）に記載されているGDNFの１〜40個のN末端アミノ酸を欠くトランケート化GDNFタンパク質産物、またはGDNFのC末端残基を欠く変異体、またはそれらの組合せが含まれる。
GDNFの付加変異体の場合、アミノ酸配列の付加は、典型的には、長さが１残基から100以上の残基を含有するポリペプチドまでの範囲のNおよび／またはC末端の融合体、ならびに内部の単一または複数のアミノ酸残基の配列内付加を含む。内部の付加は、一般には約１〜10残基、より典型的には約１〜５残基、通常は約１〜３アミノ酸残基に及ぶ。N末端付加変異体としては、例えば、［Met-1］GDNFと称されるN末端メチオニル残基を有するGDNF（細菌組換え細胞培養におけるGDNFの直接発現の人工産物）、組換え宿主細胞から成熟GDNFが分泌されるのを促進するためのGDNFのN末端への異種N末端シグナル配列の融合体などが挙げられる。そのようなシグナル配列は、一般には、意図される宿主細胞種から得られ、したがってそれと同種となるであろう。また、付加には、他の神経栄養因子の配列に由来するアミノ酸配列が含まれていてもよい。本発明に従い使用するための好ましいGDNFタンパク質産物は、組換えヒト［Met-1］GDNFである。
GDNFの置換変異体では、GDNFのアミノ酸配列の少なくとも１アミノ酸残基が除去されており、その位置に異なる残基が挿入されている。そのような置換変異体には、種集団における天然に存在するヌクレオチド配列の変化（これは、アミノ酸の変化を引き起こしても引き起こさなくてもよい）により特徴付けられる対立遺伝子変異体が含まれる。置換変異体（例えば、配列番号50を参照されたし）の具体例は、本願と同時に出願され参考として本明細書に組入れる共有同時係属米国出願第      号（″Truncated Glial Cell-Line Derived Neurotrophic Factor″、代理人名簿番号第A-357号）に開示されている。
GDNFアミノ酸配列の特異的な突然変異には、グリコシル化部位（例えば、セリン、トレオニンまたはアスパラギン）に対する修飾が含まれうる。グリコシル化の不存在または部分的なグリコシル化は、任意のアスパラギン-結合グリコシル化認識部位またはO-結合炭水化物の付加により修飾される分子の任意の部位におけるアミノ酸の置換または欠失から生じる。アスパラギン-結合グリコシル化認識部位は、適当な細胞グリコシル化酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、Asn-Xaa-ThrまたはAsn-Xaa-Ser（式中、XaaはPro以外の任意のアミノ酸である）のいずれかである。グリコシル化認識部位の１番目または３番目のアミノ酸位置の一方または両方が種々のアミノ酸で置換されたり欠失したりすると（および／または、２番目の位置のアミノ酸が欠失すると）、修飾されたトリペプチド配列部位でのグリコシル化が生じない。したがって、適当な改変ヌクレオチド配列の発現により、その部位でグリコシル化されていない変異体が得られる。別法として、GDNFのアミノ酸配列は、グリコシル化部位を付加するよう修飾されてもよい。
突然変異誘発のためのGDNFのアミノ酸残基または領域を同定するための１つの方法は、CunninghamおよびWells（Science, 244:1081-1085, 1989）に記載されているとおり、「アラニンスキャニング突然変異誘発（alanine scanning mutagenesis）」と称される。この方法では、標的残基のアミノ酸残基または基を同定し（例えば、Arg、Asp、His、LysおよびGluなどの荷電残基）、それを中性のまたは負に荷電したアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）で置換して、細胞内外におけるそれらのアミノ酸と周囲の水性環境とを相互作用させる。ついで、それらの置換に対して機能的な感受性を示すドメインを、置換部位に追加的または代替的な残基を導入することにより、改良する。このようにして、アミノ酸配列変異を導入するための標的部位を決定し、対応する標的コドンまたは該ＤＮＡ配列の領域上でアラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘発を行ない、発現されたGDNF変異体を、所望の活性と活性の程度との最適な組合せに関してスクリーニングする。
置換突然変異誘発において最も有利な部位としては、種々の種からのGDNFタンパク質中に見出されるアミノ酸が、側鎖の大きさ、電荷および／または疎水性の点で実質的に異なっている部位などが挙げられる。有用な他の部位は、種々の種から得られるGDNF様タンパク質の特定の残基が同一である部位である。そのような位置は、一般には、タンパク質の生物活性に重要である。まず、これらの部位を、比較的に同類的に置換する。そのような同類置換を、表１の「好ましい置換」の項目に示す。そのような置換により生物活性が変化すれば、より実質的な変化（典型的な置換）を導入し、および／または、他の付加または欠失を行なってもよく、得られた産物を活性に関してスクリーニングする。
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アミノ酸配列に対する同類修飾（およびコードする核酸配列に対する対応する修飾）は、天然GDNFと同様の機能的および化学的特性を有するGDNFタンパク質産物を与えると予想される。これに対して、GDNFタンパク質産物の機能的および／または化学的特性の実質的な修飾は、（a）置換領域におけるポリペプチドバックボーンの構造（例えば、シートまたはらせんコンホメーションとしての構造）、（b）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（c）側鎖の大きさの維持、に対するその効果の点で有意に異なる置換を選択することにより達成することができる。天然に存在する残基は、一般的な側鎖の特性に基づき、以下のグループに分類される：
１）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
２）中性親水性：Cys、Ser、Thr；
３）酸性：Asp、Glu；
４）塩基性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；
５）鎖の配向に影響を及ぼす残基：Gly、Pro；および
６）芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非同類置換には、これらのうちの１つのクラスのメンバーを別のクラスのものに交換することが含まれうる。そのような置換残基は、他のTGF-βタンパク質と相同なGDNFタンパク質領域内、または該分子の非相同領域内に導入することができる。
Ｂ．GDNF誘導体
GDNFまたはGDNF変異体の化学修飾された誘導体は、本明細書に開示されている当該分野における技量により製造することができる。誘導体化に最も適した化学的部分には、水溶性重合体が含まれる。水溶性重合体が望ましいのは、水溶性重合体が結合したタンパク質は、水性環境（例えば、生理的環境）中で沈殿しないからである。治療用生成物または組成物の製造のためには、好ましくは、該重合体は医薬上許容されるものである。当業者であれば、該重合体／タンパク質結合体を治療用に使用するか否かの考慮、また、そうであれば所望の用量、循環時間、タンパク質分解に対する抵抗性およびその他の考慮に基づき、所望の重合体の選択が可能であろう。誘導体化の有効性は、誘導体を所望の形態で（すなわち、浸透ポンプにより、あるいはより好ましくは注射または注入により、あるいは、例えば経口、肺または他の運搬経路のためにさらに製剤化することにより）投与し、その有効性を判定することにより確認することができる。
適当な水溶性重合体には、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−1,3−ジオキソラン、ポリ−1,3,6−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモ重合体またはランダム共重合体のいずれか）、およびデキストランまたはポリ（n−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されるものではない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中で安定であるため、製造上有利かもしれない。
該重合体は、任意の分子量のものであってもよく、また、分枝状であっても非分枝状であってもよい。ポリエチレングリコールでは、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造の容易さの点で、約２kDa〜約100kDaである（「約」なる語は、ポリエチレングリコール調製物のうち、ある分子は、示されている分子量より大きく、ある分子は小さいことを示す）。所望の治療プロフィール（例えば、所望の徐放性の持続時間、生物活性に対する存在する効果、取り扱い易さ、抗原性の程度または喪失、および治療用タンパク質または変異体に対するポリエチレングリコールの他の公知の効果）に応じて、他のサイズを用いてもよい。
このように結合するポリマー分子の数は、様々であることが可能であり、当業者であれば、機能に対するその効果を確認することができるであろう。モノ−誘導体化（mono-derivatize）を行なってもよいし、同じまたは異なる化学的部分（例えば、種々の重量のポリエチレングリコールなどの重合体）により、ジ−、トリ−、テトラ−誘導体化あるいは誘導体化のいくつかの組み合わせを行なってもよい。タンパク質（またはペプチド）分子に対する重合体分子の比率は、反応混合物中のそれらの濃度と同様、特に限定されるものではない。一般に、最適な比率（過剰な未反応タンパク質または重合体が存在しないという観点からの反応効率に関して）は、誘導体化の所望の程度（例えば、モノ−、ジ−、トリ−など）、選択した重合体の分子量、該重合体が分枝状か非分枝状か、反応条件などの因子により決定されることとなる。
ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、該タンパク質の機能ドメインまたは抗原ドメインに対する効果を考慮すると、該タンパク質に結合させるべきである。多数の結合方法が当業者に利用可能であり、例えば、参考として本明細書に組入れるEP 0 401 384（G-CSFに対するPEGの結合）を参照されたし。また、Malikら, Exp. Hematol. 20: 1028-1035（1992）（塩化トレシル（tresyl chloride）を用いるGM-CSFのペジル化（pegylation）を報告している）も参照されたし。例えば、ポリエチレングリコールは、反応性基（例えば、遊離アミノまたはカルボキシル基）を介してアミノ酸残基により共有結合させることができる。反応性基は、活性化されたポリエチレングリコール分子が結合しうる基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基には、リシン残基およびＮ末端アミノ酸残基が含まれうる。遊離カルボキシル基を有するものには、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびC末端アミノ酸残基が含まれうる。また、ポリエチレングリコール分子を結合させるための反応性基として、スルフヒドリル基を使用してもよい。治療目的に好ましいのは、アミノ基における結合、例えば、N末端またはリシン基における結合である。受容体結合が望まれる場合には、受容体結合に重要な残基での結合は避けるべきである。
N末端で化学修飾されたタンパク質が特に望ましい場合もある。ポリエチレングリコールを本組成物の例示として用いることにより、種々のポリエチレングリコール分子（分子量、分枝などによる）から、反応混合物中のタンパク質（またはペプチド）分子に対するポリエチレングリコール分子の比率、行なうペジル化反応の型、およびN末端がペジル化された選択したタンパク質の入手方法を選択することができる。N末端がペジル化された調製物の入手方法（すなわち、必要に応じて、他のモノペジル化部分からこの部分を分離すること）は、ペジル化されたタンパク質分子の集団から、N末端がペジル化された物質を精製することにより行なうことができる。選択的なN末端の化学修飾は、ある特定のタンパク質の誘導体化に利用可能な種々のタイプの一級アミノ基の反応性の相違（リシン対該N末端）を利用する還元的アルキル化により達成することができる。適当な反応条件下で、カルボニル基含有重合体による、該タンパク質の実質的に選択的なN末端での誘導体化が達成される。例えば、リシン残基のe−アミノ基と該タンパク質のN末端残基のa−アミノ基との間のpKaの相違を利用できるpHで反応を行なうことにより、該タンパク質のN末端を選択的にペジル化することができる。そのような選択的な誘導体化により、タンパク質に対する水溶性重合体の結合が制御される。すなわち、該重合体との結合は該タンパク質のN末端で優先的に生じ、他の反応性基（例えば、リシン側鎖アミノ基）の有意な修飾は生じない。還元的アルキル化を用いる場合は、該水溶性重合体は、前記のタイプのものであってもよく、該タンパク質に結合するための単一の反応性アルデヒドを有するべきである。単一の反応性アルデヒドを含有するポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドを使用してもよい。
本発明は、少なくとも１つのポリエチレングリコール分子に結合した、原核生物により発現されたGDNF誘導体またはその変異体の使用、ならびにアシルまたはアルキル結合を介して１以上のポリエチレングリコール分子に結合したGDNFまたはその変異体の使用を意図する。
ペジル化は、当該分野で公知の任意のペジル化反応により行なうことができる。例えば、Focus on Growth Factors, 3（2）:4-10（1992）; EP 0 154 316（その開示を、参考として本明細書に組入れることとする）; EP 0 401 384; および本明細書中に引用するペジル化に関する他の刊行物を参照されたし。ペジル化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または類似した反応性の水溶性重合体）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行なうことができる。
アシル化によるペジル化は、一般に、ポリエチレングリコール（PEG）の活性エステル誘導体をGDNFタンパク質または変異体と反応させることを含む。任意の公知のまたは後で見出される反応性PEG分子を使用して、GDNFタンパク質または変異体のペジル化を行なってもよい。好ましい活性化PEGエステルは、N−ヒドロキシスクシンイミド（「NHS」）にエステル化されたPEGである。本発明で用いる「アシル化」は、治療用タンパク質と水溶性重合体（例えば、PEG）との間のアミド、カルバマート、ウレタンなどの型の結合を、限定的でなく包含する意である。Bioconjugate Chem., 5:133-140（1994）を参照されたし。反応条件は、ペジル化の分野で公知のまたは後で開発される任意のものから選択することができるが、修飾すべきGDNFまたは変異体を不活性化する温度、溶媒およびpHの条件は避けるべきである。
アシル化によるペジル化からは、一般に、ポリ−ペジル化GDNFタンパク質または変異体が生じるであろう。好ましくは、該連結結合は、アミドであう。また、好ましくは、得られる産物は、実質的に専ら（例えば、＞95％）モノ、ジ−またはトリ−ペジル化される。しかしながら、ペジル化度がより高いいくつかの種が、用いる特定の反応条件に応じた量で生成するかもしれない。所望により、より精製されたペジル化種を、とりわけ透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動などの標準的な精製法により、該混合物、特に未反応種から分離してもよい。
アルキル化によるペジル化は、一般に、還元剤の存在下、PEGの末端アルデヒド誘導体をGDNFタンパク質または変異体と反応させることを含む。アルキル化によるペジル化からは、ポリ−ペジル化GDNFタンパク質または変異体が生じることもある。さらに、実質的にGDNFタンパク質または変異体のN末端のa−アミノ基においてのみ（すなわち、モノ−ペジル化タンパク質）、ペジル化を有利に行なえるよう反応条件を操作することができる。モノペジル化またはポリペジル化のいずれかの場合には、PEG基を、好ましくは、-CH2-NH-基を介して該タンパク質に結合させる。特に-CH2-基に関しては、この型の結合は、本発明では、「アルキル」結合と称される。
モノペジル化産物を与える還元的アルキル化を介した誘導体化は、誘導体化に利用可能な種々のタイプの一級アミノ基の反応性の相違（リシン対該N末端）を利用する。該反応は、リシン残基のe−アミノ基と該タンパク質のN末端残基のa−アミノ基との間のpKaの相違を利用できるpHで行なう。そのような選択的な誘導体化により、アルデヒドなどの反応性基を含有する水溶性重合体の、タンパク質に対する結合が制御される。すなわち、該重合体との結合は該タンパク質のN末端で優先的に生じ、他の反応性基（例えば、リシン側鎖アミノ基）の有意な修飾は生じない。１つの重要な態様においては、本発明は、モノ重合体／GDNFタンパク質（または変異体）結合体分子（実質的に専ら（すなわち、＞95％）単一の部位において、重合体分子が結合しているGDNFタンパク質または変異体を意味する）の実質的に均一な調製物の使用を意図する。より詳しくは、ポリエチレングリコールを使用する場合、本発明はまた、抗原結合基をおそらく欠いておりポリエチレングリコール分子がGDNFタンパク質または変異体に直接結合しているペジル化GDNFタンパク質または変異体の使用を含む。
したがって、本発明の現在好ましいGDNFタンパク質産物は、１以上のPEG基がアシルまたはアルキル基を介して結合したペジル化GDNFタンパク質または変異体である。前記のとおり、そのような産物は、モノ−ペジル化またはポリ−ペジル化されている（例えば、２〜６個、好ましくは２〜５個のPEG基を含有する）。PEG基は、一般に、アミノ酸のa−またはe−アミノ基において該タンパク質に結合するが、PEG基は、適当な反応条件下でPEG基に結合するようになるのに十分な程度に反応性である該タンパク質に結合している任意のアミノ基に結合することもできると意図される。
アシル化およびアルキル化の両方のアプローチにおいて使用する重合体分子は、前記の水溶性重合体から選択してもよい。選択した重合体は、単一の反応性基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有するよう修飾すべきであり、それにより、好ましくは、本方法で提供されているとおりに重合度が制御される。典型的な反応性PEGアルデヒドは、水溶性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノC1-C10アルコキシまたはアリールオキシ誘導体である（米国特許第5,252,714号を参照されたし）。該重合体は、分枝状であっても非分枝状であってもよい。アシル化反応の場合には、選択した重合体は、単一の反応性エステル基を有するべきである。本還元的アルキル化の場合には、選択した重合体は、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。一般に、水溶性重合体は、天然に存在するグリコシル残基からは選択しない。なぜなら、これらの残基は、通常、哺乳動物組換え発現系により、より簡便に得られるからである。該重合体は、任意の分子量を有していてもよく、また、分枝状であっても非分枝状であってもよい。
本発明で使用するための特に好ましい水溶性重合体は、ポリエチレングリコールである。本発明で用いるポリエチレングリコールは、他のタンパク質の誘導体化に使用されている任意の形態のPEG（例えば、モノ−（C1-C10）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコール）を包含する意である。
一般に、化学誘導体化は、生物学的に活性な物質を活性化重合体分子と反応させるのに使用される適当な任意の条件下で行なうことができる。ペジル化GDNFタンパク質または変異体の製造法は、一般に、（a）GDNFタンパク質または変異体を、該タンパク質が１以上のPEG基に結合するようになる条件下で、ポリエチレングリコール（例えば、PEGの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させ、そして（b）反応産物を得る工程を含む。一般には、アシル化反応の最適な反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて、その場合ごとに決定することとなる。例えば、PEGの比率が高くなるほど、ポリ−ペジル化産物の割合が高くなる。
実質的に均一なモノ重合体／GDNFタンパク質（または変異体）結合分子の集団を得るための還元的アルキル化は、一般に、（a）GDNFタンパク質または変異体を、還元的アルキル化条件下、該GDNFタンパク質または変異体のアミノ末端におけるa−アミノ基の選択的修飾を得るのに適したpHにて、反応性PEG分子と反応させ、そして（b）反応産物を得る工程を含む。
モノ重合体／GDNFタンパク質（または変異体）結合分子の実質的に均一な集団の場合、還元的アルキル化反応条件は、GDNFタンパク質または変異体のN末端に対する水溶性重合体部分の選択的な結合を許容する条件である。そのような反応条件は、一般に、リシンアミノ基とN末端のa−アミノ基とのpKaの相違を与える（pKaは、アミノ基の50％がプロトン化され50％がプロトン化されないpHである）。また、pHは、使用するタンパク質に対する重合体の比率に影響を及ぼす。一般に、pHが低いほど、タンパク質に対してより過剰の重合体が必要となるであろう（すなわち、N末端のa−アミノ基の反応性が低いほど、最適条件を得るためにはより大量の重合体が必要となる）。pHがより高ければ、重合体：タンパク質の比は、それほど大きくする必要はない（すなわち、利用可能な基の反応性が高いほど、重合体分子は少なくてすむ）。本発明の目的のためには、pHは、一般に、３〜９、好ましくは３〜６の範囲内となるであろう。
考慮すべきもう１つの重要な点は、重合体の分子量である。一般に、重合体の分子量が大きいほど、該タンパク質に結合しうる重合体分子は少なくなる。同様に、これらのパラメーターを最適化する場合には、重合体の分枝を考慮すべきである。一般に、分子量が大きくなるほど（あるいは分枝が著しくなるほど）、重合体：タンパク質の比は大きくなる。一般に、本発明で意図されるペジル化反応の場合、好ましい平均分子量は、約２kDa〜約100kDaである。好ましい平均分子量は、約５kDa〜約50kDa、特に好ましくは約12kDa〜約25kDaである。GDNFタンパク質または変異体に対する水溶性重合体の比率は、一般に、１：１から100：１、好ましくは、（ポリペジル化の場合には）１：１から20：１、（モノペジル化の場合には）１：１から５：１の範囲であろう。
前記の条件を用いて還元的アルキル化を行なえば、アミノ末端にa−アミノ基を有する任意のGDNFタンパク質または変異体に対する重合体の選択的結合が得られ、モノ重合体／GDNFタンパク質（または変異体）結合物の実質的に均一な調製物が得られるであろう。本発明で用いる「モノ重合体／GDNFタンパク質（または変異体）結合物」なる語は、GDNFタンパク質またはGDNF変異体タンパク質の１分子に単一の重合体分子が結合してなる組成物を意味する。モノ重合体／GDNFタンパク質（または変異体）結合物は、好ましくは、リシンのアミノ側鎖基上以外のN末端に位置する重合体分子を有するであろう。該調製物は、好ましくは、90％以上のモノ重合体／GDNFタンパク質（または変異体）結合物、より好ましくは、95％以上のモノ重合体／GDNFタンパク質（または変異体）結合物であり、認められうる分子の残りは、未反応である（すなわち、重合体部分を欠くタンパク質である）。
本還元的アルキル化の場合には、還元剤は、水溶液中で安定であるべきであり、好ましくは、還元的アルキル化の初期過程で生じるシッフ塩基のみを還元する能力を有する。好ましい還元剤は、水素化ホウ素ナトリウム、シアノホウ水素化ナトリウム、ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボランおよびピリジンボランから選択してもよい。特に好ましい還元剤は、シアノホウ水素化ナトリウムである。溶媒、反応時間、温度などの他の反応パラメーター、および産物の精製手段は、水溶性重合体によるタンパク質の誘導体化に関する公開されている情報に基づいて、場合ごとに決定することができる（本明細書中で引用している刊行物を参照されたし）。
Ｃ．GDNFタンパク質産物の医薬組成物
GDNFタンパク質産物の医薬組成物は、典型的には、GDNFタンパク質産物の治療的に有効な量を、１以上の医薬上および生理的に許容される製剤化物質との混合物として含む。適当な製剤化物質には、抗酸化剤、保存剤、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、充填剤、増量剤、緩衝剤、運搬用ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または医薬補助剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、適当なビヒクルは、注射用水、生理食塩水または人工CSFであり、これらは、おそらく、非経口投与用組成物中で一般に用いられる他の物質で補足される。中性の緩衝化塩類液、または血清アルブミンと混合された塩類液は、さらに典型的なビヒクルである。
ビヒクル中の主な溶媒は、事実上は水性であっても非水性であってもよい。さらに、該ビヒクルは、pH、浸透圧、粘性、清澄性、色、無菌性、安定性、溶解速度または製剤の臭気を改変したり維持するための他の医薬上許容される賦形剤を含有していてもよい。同様に、該ビヒクルは、GDNFタンパク質産物の放出速度を改変したり維持するための、あるいは血液脳関門を通過することによるGDNFタンパク質産物の吸収または透過を促進するためのさらに他の医薬上許容される賦形剤を含有していてもよい。そのような賦形剤は、単位投与形または複投与形（multi-dose form）のいずれかの非経口投与のための剤形、または埋め込みポンプからの直接的な連続的または一時的な注入のための剤形を製剤化するのに通常および日常的に使用される物質である。
治療用組成物を製剤化したら、それを、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固体または脱水もしくは凍結乾燥された粉末として、無菌バイアル中に保存することができる。そのような製剤は、すぐに使用できる形態で保存することもできるし、あるいは投与前に再構成を要する形態（例えば、凍結乾燥形態）で保存することもできる。
当業者であれば、投与経路および所望の用量に応じて、最適な医薬製剤を決定することができるであろう。例えば、開示を参考として本明細書に組入れるRemington′s Pharmaceutical Sciences, 第18版（1990, Mack Publishing Co., Easton, PA18042）の第1435〜1712頁を参照されたし。該物質は、重合性化合物（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸など）の粒子調製物内またはリポソーム内へ封入されてもよい。また、ヒアルロン酸（hylauronic acid）を使用してもよく、これは、循環の持続化を促進する効果を有するかもしれない。そのような組成物は、本タンパク質および誘導体の物理学的状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響を及ぼしうる。
非経口的徐放製剤、吸入ミスト、経口的に活性な製剤、坐剤などの他の有効な投与形態も意図される。GDNFタンパク質産物の好ましい医薬組成物は、非経口投与用（例えば、脳室内注入または注射用）に製剤化される。そのような非経口投与される治療用組成物は、典型的には、発熱物質を含まない、非経口的に許容される水溶液の形態であり、医薬上許容されるビヒクル中にGDNFタンパク質産物を含む。１つの好ましいビヒクルは、生理食塩水である。
また、GDNFタンパク質産物を含有するある種の製剤を経口投与することも意図される。このようにして投与されるGDNFタンパク質産物はカプセル化してもよいし、固体投与形態の配合で通常使用される担体を使用してまたは使用しないで製剤化してもよい。該カプセルは、生物学的利用能を最大にし前全身分解（pre-systemic degradation）が最小になる胃腸管内部位で該製剤の活性部分を放出するよう設計してもよい。GDNFタンパク質産物の吸収を促進するために、追加的な賦形剤を含有させてもよい。また、希釈剤、香味剤、低融点ロウ、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤および結合剤を使用してもよい。
Ｄ．GDNFタンパク質産物の投与
GDNFタンパク質産物は、皮下、筋肉内、静脈内、経肺的、経皮的、鞘内または脳内に、非経口的に投与することができる。血液脳関門を通過しないタンパク質増殖因子は、脳内に直接投与してもよいし、あるいは、該因子を該関門を通して輸送する他の要素と共に投与してもよい。GDNFタンパク質産物を、脳室内または脳もしくは脊髄くも膜下腔内に投与するのが好ましい。また、GDNFタンパク質産物を、脳実質中に直接的に脳内投与してもよい。生分解性重合体マトリックス中に包埋した神経栄養因子を含有する脳内の徐放性インプラントも、GDNFタンパク質産物を送出することができる。GDNFタンパク質産物は、血液脳関門を通過するよう化学修飾またはパッケージングされた形態で脳外に投与してもよいし、あるいは、GDNFタンパク質産物が該関門を横切り透過するのを促進しうる１以上の物質と共に投与してもよい。例えば、NGFとモノクローナル抗トランスフェリン受容体抗体との結合物は、トランスフェリン受容体に対する結合を介して脳へ輸送されることが示されている。GDNFタンパク質産物の所望の用量を得るためには、反復して毎日またはそれほど頻繁でなく注射することにより投与したり、あるいは、GDNFタンパク質産物を、流出が一定またはプログラム可能な埋め込みポンプ（constant- or programmable-flow implanted pump）から連続的または一時的に注入してもよい。投与頻度は、製剤化されたGDNFタンパク質産物の薬物動態学的パラメーターおよび投与経路に左右されるであろう。
投与方法にかかわらず、比用量は、典型的には、体重または体表面積に基づき計算する。脳に関連した疾患の場合、比用量は、典型的には、体重または体表面積に基づき推定しうる患者のおよその脳重量に基づき計算する。前記製剤のそれぞれを含む治療の場合の適当な用量を決定するのに必要なさらに厳密な計算は、当業者が日常的に行なうものであり、特に、本明細書に開示している用量に関する情報およびアッセイを考慮して、過度な実験なしで当業者が日常的に行なう技量の範囲内のものである。適当な用量は、適当な用量反応データと共に利用されている用量決定のための確立されたアッセイを用いることにより確認してもよい。
前記状態の治療方法に含まれる最終的な投与計画は、薬物の作用を改変する種々の因子（例えば、患者の年齢、状態、体重、性および食事、いずれかの感染の重症度、投与時間ならびに他の臨床的因子）を考慮して、担当医師により決定されることとなる。研究が行われるにつれて、種々の疾患および状態の治療のための適当な用量レベルに関してさらなる情報が現れるであろう。
GDNFの連続的投与または持続的送出が、一定の治療に有利であると考えられる。連続的投与は、機械的手段（例えば、注入ポンプ）を介して行なってもよいが、連続的またはほぼ連続的な他の投与方法を用いてもよいと意図される。例えば、化学的誘導体化により、該タンパク質の徐放性形態が得られることがあり、そのような徐放性形態は、決定された投与計画に基づいて予測可能な量で血流中に連続的に存在させるという効果を有する。したがって、GDNFタンパク質産物は、そのような連続的投与を達成するよう誘導体化されたタンパク質を含む。
また、GDNFタンパク質産物細胞療法（例えば、GDNFタンパク質産物を産生する細胞の脳内移植）も意図される。この実施態様は、生物学的に活性な形態のGDNFタンパク質産物を合成し分泌する能力を有する細胞を患者中に移植することを含むであろう。そのようなGDNFタンパク質産物を産生する細胞は、GDNFタンパク質産物の天然の生産体である細胞（B49グリア芽細胞腫に類似したもの）であってもよいし、あるいは所望のGDNFタンパク質産物をコードする遺伝子（その発現および分泌を促進するのに適したベクター中のもの）での形質転換によりGDNFタンパク質産物を産生する能力が増強されている組換え細胞であってもよい。外来種のGDNFタンパク質産物を投与された患者における潜在的な免疫反応を最小限に抑えるために、GDNFタンパク質産物を産生する天然の細胞がヒト由来であり、ヒトGDNFタンパク質産物を産生することが好ましい。同様に、GDNFタンパク質産物を産生する組換え細胞を、ヒトGDNFタンパク質産物をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換することが好ましい。脳組織の浸潤を避けるために、移植細胞をカプセル化してもよい。GDNFタンパク質産物の放出を許容するが、患者の免疫系による又は周辺組織からの他の有害因子による細胞の破壊を防ぐ生体適合性で半透過性の重合性封入物または膜中に含まれるヒトまたはヒト以外の動物の細胞を、患者に移植してもよい。別法として、GDNFタンパク質産物をエクスビボ（ex vivo）で産生するよう形質転換した患者自身の細胞を、そのようなカプセル化を行なうことなく、患者体内に直接移植することもできるであろう。
また、GDNFタンパク質産物をコードする遺伝子を、核酸構築物または他の適当な運搬ベクターの局所注射により、標的脳細胞内に導入することによるGDNFタンパク質産物のインビボ遺伝子治療も意図される（Hefti, J. Neurobiol. 25:1418-1435, 1994）。例えば、GDNFタンパク質産物をコードする核酸配列を、脳または標的脳細胞内への運搬のために、アデノ随伴ウイルスベクター中に含有させてもよい。その他のウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスおよびパピローマウイルスのベクターが含まれるが、これらに限定されるものではない。また、リポソーム媒介導入、直接注射（裸のＤＮＡ）、受容体媒介導入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿または微粒子衝撃（遺伝子銃）により、物理的な導入を行なってもよい。
生存細胞の膜カプセル化のための方法は、当業者によく知られており、カプセル化された細胞の作製および患者内へのその移植は、過度な実験を行なうことなく達成することができる。例えば、米国特許第4,892,538号、第5,011,472号および第5,106,627号（それらのそれぞれを、参考として本明細書中に特に組入れることとする）を参照されたし。生存細胞をカプセル化するための系は、参考として本明細書中に特に組入れるAebischerらのPCT出願WO91/10425に記載されている。また、AebischerらのPCT出願WO91/10470; Winnら, Exper. Neurol., 113:322-329, 1991; Aebischerら, Exper. Neurol., 111:269-275, 1991; Trescoら, ASAIO, 38:17-23, 1992（それらのそれぞれを、参考として本明細書中に特に組入れることとする）も参照されたし。
本明細書に記載のGDNFタンパク質産物製剤は、獣医学的適用およびヒトに対する適用に用いてもよく、「患者」なる語は限定的なものではないことに注目すべきである。獣医学的適用の場合、用量範囲は、前記と同じになるはずである。
本発明の他の態様および利点は、以下の例示的な実施例の考慮に基づいて理解されるであろう。実施例１は、ラット基底前脳采／脳弓軸索切断モデルにおけるGDNFタンパク質産物またはビヒクルの投与の効果について記載している。実施例２では、ラット基底前脳采／脳弓軸索切断モデルにおいて、NGF、GDNFタンパク質産物とBDNFとの効果を比較している。実施例３は、ラット加齢関連痴呆モデルにおけるGDNFタンパク質産物の効果について記載している。
実施例１
この最初の実験では、GDNFタンパク質産物またはビヒクルでの処理を、ラット采／脳弓軸索切断モデルにおけるp75陽性およびChAT陽性ニューロンの喪失に対するその効果に関して評価した。試験するGDNFタンパク質産物は、組換えヒト［Met-1］GDNFであり、WO93/06116の実施例6Bおよび6Cに一般的に記載されているとおりに大腸菌（E. coli）中で発現させることにより得られた。該タンパク質をリフォールディングし、SDS-PAGEによる評価で95％以上の純度にまで精製した。該タンパク質の生物活性は、本願と同時に出願され参考として本明細書に組入れる共有同時係属米国出願第号（″Truncated Glial Cell-Line Derived Neurotrophic Factor″、代理人名簿番号第A-357号）の実施例４に記載されている標準的なインビトロニューロンアッセイで確認した。PBSのストック溶液中の純粋な［Met-1］GDNFの濃度は、0.3645のO.D.280が［Met-1］GDNFの１mg/mlの濃度に相当するモル吸光により決定した。使用する溶液は、該濃縮物を注入ビヒクル（すなわち、0.1％ラット血清アルブミンを含有するDulbecco′s PBS）中で希釈することにより調製した。
雄のWistarラット（300〜350g、Harlan Sprague-Dawley、Indianapolis, IN）を使用した。各動物は水に自由に近づけるようにし、任意量の修飾実験用食餌（Purina Laboratory Chow 5001, Richmond, IN）が与えられた。それらのラットをイソフルラン気体麻酔剤で麻酔し、立体空間的装置内に配置した（PaxinosおよびWatson, Academic Press, Inc. San Diego, 1986に従い行なった）。各ラットの脳の采／脳弓を、Veneroら, Neuroscience 59:797-815, 1994の方法によりScoutenナイフ（Kopf Instruments, Tujunga, CA）を用いて軸索切断した。
その離断の直後、4.5mmの長さの28ゲージのステンレス鋼カニューレ装置（Plastics One, Roanoke, VA）に、ビヒクルまたは［Met-1］GDNFのいずれかを前充填し、該装置をModel 2002 Alzet浸透注入ポンプ（0.5μl/時間, Alza Corp., Palo Alto, CA）に接続し、ブレグマから0.3mm後方で1.4mm外側の右外側脳室中に配置した。その装置を、シアノアクリレート接着剤及び歯科用アクリル樹脂ならびに１本の頭蓋ねじで頭蓋表面上に固定した。手術の終了時に、該動物の出発体重を測定し、記録した。
４匹のラットを、中脳ドーパミン作動性ニューロンに対するGDNFのインビボ効能に関して既に報告されている（Hofferら, Neurosci. Lett. 182:107-111, 1994; Hudsonら, Brain Res. Bull. 36:425-432, 1995; KearnsおよびGash, Brain Res. 672:104-111, 1995; Strumbergら, Exp. Neurol. 124:401-412, 1995）のに匹敵する用量である10μg/日の［Met-1］GDNFで、連続的な脳室内注入により処理した。４匹の対照ラットにビヒクルを投与し、１mg/mlのアルブミンを非特異的タンパク質として使用した。２週間の処理の後、該動物を、生化学的または形態学的エンドポイント分析のために準備した。
ChAT酵素活性の生化学的分析では、未麻酔ラットをHarvardギロチンで断頭した。右および左海馬および右および左中隔野を、10μg/日の［Met-1］GDNFで処理した動物から解剖し、冷凍した。海馬および中隔組織を、0.2M Tris-HCl（pH7.4）中でホモジナイズ（20×）した。このホモジネート（2.56mg/ml）の２個の５μlアリコートを使用して、SchrierおよびShuster, J. Neurochem. 14:977-985, 1967の方法によりChAT活性を測定した。酵素比活性は、１時間当たり１mgのタンパク質当たり産生されたアセチルコリンのnmolとして表した。アッセイを実施した者は、個々のサンプルが何であるかを知らなかった。
形態学的分析では、該ラットを、ケタミン（25mg/ml）、ロムプン（1.3mg/ml）およびアセプロマジン（0.25mg/ml）の混合物（４ml/kg）の筋肉内注射で麻酔し、秤量し、PBS溶液、ついで４％パラホルムアルデヒドで心臓を通して潅流した。固定および平衡化（30％ショ糖による）の２時間後、連続50μl滑走式ミクロトーム切片を、基底前脳を貫いて切断し、ChATおよびp75に対して免疫組織化学的に染色した。ChAT抗体（MAb305, Chemicon International, Inc., Temecula, CA）およびp75抗体（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を共に、１：1000の希釈度で使用した。ビオチン化された二次抗体およびペルオキシダーゼで標識されたストレプトアビジン（Dako Corp., Carpinteria, CA）を使用して、基質として3,3′−ジアミノベンジジンテトラクロリド（Sigma, St. Louis, MO）用いて両抗体の局在を可視化した。
軸索切断後のニューロン萎縮および表現型ダウンレギュレーションの程度は、中隔および対角帯の吻−尾を横切る領域においては均一であるため、定量分析を簡便にするために、各脳からの唯一の切片を使用した。使用した切片は、軸索切断に対する基底前脳の応答を表す最大ニューロン数の領域（Williamsら, Proc. Nat. Acad. Sci.（USA）83:9231-9235, 1986; Haggら, Brain Res. 505:29-38, 1989; Koliatsosら, J. Comp. Neurol. 343:247-262, 1994）であるPaxinosおよびWatson, Academic Press, Inc. San Diego, 1986の図16または17に対応するものであった。右および左中隔ならびに対角帯内のChAT陽性かつp75陽性の細胞数を、10倍の対物レンズを用いて手動で計数した（Williamsら, Proc. Nat. Acad. Sci.（USA）83:9231-9235, 1986）。その研究者は、治療群が何であるかを知らなかった。右および左、内側および外側中隔、ならびに右および左外側中隔野内の免疫組織化学反応産物の相対光学濃度（O.D.）を、コンピューター支援イメージ分析システム（MCID, Imaging Research, St. Catherine, Ontario, Canada）（Vahlsingら, Brain Research 552:320-329, 1991）を用いて測定した。相対O.D.は、光学密度のおよその尺度となる（Smolen, Neurosciences, P.M. Conn編, pp. 208-229, Academic Press, Inc. San Diego, CA, 1990）。軸索切断および神経栄養因子処理の効果を立証する顕微鏡写真を、Kodak DCS 420デジタルカメラで撮り、Kodak XLS 8600プリンターでプリントした。
組織学的切片の右軸索切断側から得たすべての測定値（正常動物のものを除く）を、対側の未損傷対照側に対する割合（％）として正規化した。２週間にわたる動物の体重の変化を、出発体重に対する割合（％）として表した。生化学的測定値は、対照の未処理組織において測定された値に対する割合（％）として実験群における変化として表した。統計的有意性は、事後分析のためのTukey HSD試験（Systat, SPSS Inc., Chicago, IL）を用いる一方向ANOVAにより決定した。
この最初の実験の結果を図１に示す。その結果は、軸索切断と同側で計数したChAT-またはp75-陽性ニューロンの数の、対側の未損傷対照側で計数した数に対する割合（％）として示されている。ビヒクルで処理された動物に関するデータは黒塗りの棒で示し、［Met-1］GDNFで処理された動物に関するデータは縞状の棒で示す（（*）の記号はp＜0.05であることを示し、（**）の記号はp＜0.01であることを示す）。ビヒクルで処理された動物においては、軸索切断と同側の中隔および対角帯におけるChAT陽性ニューロンの40％およびp75陽性ニューロンの60％の見掛け上の喪失があった。［Met-1］GDNFの注入は、ChAT陽性ニューロンの喪失を正常の60％に制限し、p75陽性ニューロンの喪失を妨げた（すなわち、［Met-1］GDNFは、p75の免疫反応性の発現を、該離断と同側のニューロンの100％で維持した）。さらに、p75陽性の免疫反応性の蓄積が、采／脳弓軸索切断に対して同側かつ近位の［Met-1］GDNFで処理されたラットの外側中隔において観察された。
実施例２
ニューロトロフィンNGFおよびBDNFに対するGDNFタンパク質産物の効能および効力を評価するために、ラット采／脳弓軸索切断モデルに関連した種々のエンドポイントおよび100μg/日〜0.1μg/日の用量範囲の神経栄養因子を用いて、より広範囲の一連の実験を行なった。試験したGDNFタンパク質産物は、組換えヒト［Met-1］GDNFであった。
これらの実験で使用した組換えヒトタンパク質であるGDNFタンパク質産物、BDNFおよびNGFは、大腸菌（E. coli）中で発現させることにより得た。すべてのタンパク質をリフォールディングし、SDS-PAGEによる評価で95％以上の純度にまで精製した。該タンパク質の生物活性は、標準的なインビトロニューロンアッセイで確認した。［Met-1］GDNFの活性は、前記の実施例１で記載したとおりに確認し、一方、NGFおよびBDNFの活性は、それぞれtrkAまたはtrkB受容体を発現する形質転換された線維芽細胞上で評価した。PBSのストック溶液中の純粋な神経栄養因子の濃度は、0.3645のO.D.280が１mg/mlの［Met-1］GDNFに相当し、1.76のO.D.280が１mg/mlのBDNFに相当し、1.57のO.D.280が１mg/mlのNGFに相当するモル吸光により決定した。使用する溶液は、該濃縮物を注入ビヒクル（すなわち、0.1％ラット血清アルブミンを含有するDulbecco′s PBS）中で希釈することにより調製した。インビトロで37℃で１ヵ月までの期間保存された［Met-1］GDNF、BDNFまたはNGFの使用溶液の無菌アリコートにおいて、生物活性の喪失は全く検出されなかった。インビボで２週間注入された後の100μg/mlの［Met-1］GDNF溶液において、生物活性の喪失は全く検出されなかった。
100μg/日〜0.1μg/日の用量範囲の［Met-1］GDNFおよびBDNFをこのモデルで評価して、その２つの神経栄養因子の用量反応曲線を比較した。このモデルにおけるNGFの用量反応曲線は既に報告されているため（Emmettら, Brain Res. 673:199-207, 1995; Williamsら, Brain Research 498:243-256, 1989）、本実験では、NGFの最も有効な用量（すなわち、１μg/日および10μg/日の用量）のみを検討した。対照動物にビヒクルを投与し、該アルブミン（１mg/ml）を非特異的タンパク質として使用した。
これらの実験は、最初の実験で認められたものより、采／脳弓の離断が着実で完全になりニューロンマーカーの喪失が大きくなるよう軸索切断の方法を改変すること以外は、実施例１に記載されている方法により行なった。軸索切断は、以下のとおりに行なった。ブレグマの1.0mm後方かつ1.0mm外側に始まりブレグマの2.0mm外側に伸長する小さなスリットを、頭蓋中に作った。２つの重複したScoutenナイフによる切断により、采／脳弓の完全な軸索切断を達成した。最初の切断では、引っ込められたナイフを、ブレグマの1.0mm後方、2.0mm外側に配置し、硬膜の6.0mm前方に降ろした。第１の切断は、以下の手動工程により行なった：ナイフを中線方向に2.0mm伸ばす；ナイフを4.5mm上げる；ナイフを引っ込め、再び伸ばす；ナイフを4.5mm下げる；ナイフを再び引っ込め伸ばす；ナイフを4.5mm上げる；ナイフを引っ込め、取り出す。第２の重複した切断では、ナイフを180°回転させて、刃を外側に伸ばした。そのナイフを、ブレグマの1.0mm後方かつ1.4mm外側に配置し、硬膜表面の6.0mm前方に降ろした。第２の切断は、以下の手動工程により行なった：ナイフを外側に2.0mm伸ばす；ナイフを4.5mm上げる；ナイフを引っ込め、再び伸ばす；ナイフを4.5mm下げる；ナイフを再び引っ込め、伸ばす；ナイフを4.5mm上げる；ナイフを引っ込め、取り出す。この一連の操作により、采／脳弓の100％の離断（実施動物の視診による判定）、および軸索切断と同側の海馬におけるChAT生化学的活性の90％以上の喪失が得られた。
図２は、軸索切断後のChAT免疫反応性ニューロンの数に基づく［Met-1］GDNF（黒丸）、NGF（白丸）およびBDNF（白ひし形）の用量反応曲線を示す（正常がn=６、0.1μg/日のBDNFがn=4である以外は、すべての用量に関して、サンプルはn=10；）。そのデータは、軸索切断と同側の右側で計数したChAT陽性ニューロンの数の、対側対照側で計数した数に対する割合（％）（平均±SEM）として表されている（（**）の記号は、正常動物に対してp＜0.01であることを示し、（##）の記号は、ビヒクルで処理された動物に対してp＜0.01であることを示す）。ビヒクルで処理された動物（白正方形）では、ニューロンの正常集団（黒丸）のわずか30％が、軸索切断の２週間後にChAT陽性であった。最も有効な用量の［Met-1］GDNFおよびBDNFでの処理は、該ニューロンの60％においてChATの発現を維持し、一方、最も有効な用量のNGFでの処理は、該ニューロンの90％においてChAT発現を維持した。［Met-1］GDNFでは、１μg/日以上の用量で最大効能が得られ、効能は、それより低用量ではビヒクルの対照レベルにまで低下した。BDNFでは、最大効能は、10μg/日で得られ、この効果は、１および0.1μg/日のより低い用量では喪失した。
組織学的検査においては、ビヒクルで処理された動物では、軸索切断の対側と比べて、軸索切断の同側ではChAT陽性ニューロンの明らかな喪失があった。１μg/日の［Met-1］GDNF、１μg/日のNGFおよび10μg/日のBDNFでの処理は、ChAT陽性ニューロンの喪失を有意に減少させ、軸索切断細胞におけるコリン作動性表現型を維持した。［Met-1］GDNFで処理された軸索切断ニューロンのChAT免疫反応性の見掛け上の発現、およびサイズは、正常な未処理動物において、ビヒクルで処理された動物において、および対側対照側で認められるものと同様であった。NGFで処理されたニューロンのChAT免疫反応性の見掛け上の発現およびサイズは、正常動物およびビヒクルで処理された動物のものより大きく、その効果は両側的（bilateral）であった。
内側中隔および対角帯におけるChAT免疫反応性の定量的デンシトメトリーは、これが、軸索切断により誘導されたChATダウンレギュレーションまたは神経栄養維持の有用な指標とならないことを示した。すなわち、バックグラウンド免疫反応性のために、ビヒクルで処理された動物における軸索切断側の密度の見掛け上の減少の検出が不可能であり、それはまた、対側と比べた場合の、いずれかの神経栄養因子の処理による密度の見掛け上の増加を何ら検出しなかった。さらに、ChAT特異的抗体は、軸索切断と同側の外側中隔におけるChAT免疫反応性出芽（sprout）の証拠を示さなかった。
図３は、正常動物の中隔野（黒塗りの棒）における、または軸索切断と対側の左側（一重線影の棒）および軸索切断と同側の右側（二重線影の棒）の軸索切断動物の中隔における、ChAT生化学的比活性に対する神経栄養因子の効果を示す。サンプルのサイズを、各棒の下の括弧内に示す。（（**）の記号は、正常動物に対してp＜0.01であることを示し、（##）の記号は、ビヒクルで処理された動物に対してp＜0.01であることを示し、（#）の記号は、ビヒクルで処理された動物に対してp＜0.05であることを示す）。該離断と同側の右中隔野においてはChAT酵素活性の喪失は全くなかった。10μg/日の［Met-1］GDNF処理により、ChAT活性の軸索切断依存的増強が生じ、正常動物または対側対照側においては、効果は全くなかったが、軸索切断と同側のChAT活性は有意に上昇し、それは、正常動物およびビヒクルで処理された動物で認められるものより40％高かった。NGFでの処理により、左対照中隔および軸索切断と同側の右中隔の両方において、ChAT活性レベルは、正常よりそれぞれ2.2倍および3.1倍高いレベルにまで上昇した。10μg/日のBDNFでの同様の処理は、ChAT酵素活性に何ら影響を及ぼさなかった。
図４は、軸索切断後のp75免疫反応性ニューロンの数に対する［Met-1］GDNF（黒丸）、NGF（白丸）およびBDNF（白ひし形）の効果を示す（正常がn=６、0.1μg/日のBDNFがn=4である以外は、サンプルはn=10）。そのデータは、軸索切断と同側の右側で計数したp75陽性ニューロン数の、対側対照側で計数した数に対する割合（％）（平均±SEM）として表されている。（（**）の記号は、正常動物に対してp＜0.01であることを示し、（##）の記号は、ビヒクルで処理された動物に対してp＜0.01であることを示す）。ビヒクルで処理された動物（白正方形）では、軸索切断の２週間後、正常集団（黒正方形）の40％のみが、p75に対して免疫反応性であった。最も有効な10μg/日の［Met-1］GDNFでの処理は、p75の発現を、基底前脳ニューロンの90％で維持した。［Met-1］GDNFは、二相性の用量反応曲線を有するようであり、100μg/日以上および１μg/日以下の両方の用量では、効能は正常の約60％にまで減少し、一方、0.1μg/日では、効能が喪失した。また、NGFでの処理は、p75の発現を、10μg/日および１μg/日の両方で同様の効能を有する軸索切断ニューロンの90%で維持した。BDNFでの処理は、p75の発現を、10μg/日の用量では該ニューロンの70％で維持したが、１および0.1μg/日のより低い用量では、効能が喪失した。
組織学的検査では、ビヒクルで処理された動物は、軸索切断（右）と同側では、対側の対照（左）側と比べて、p75陽性ニューロンの明らかな喪失を示した。10μg/日の［Met-1］GDNF、１μg/日のNGFおよび10μg/日のBDNFでの処理は、p75陽性ニューロンの喪失を有意に減少させ、軸索切断細胞におけるコリン作動性表現型を維持した。［Met-1］GDNFで処理されたニューロンのサイズおよび外観は、正常ニューロン、ビヒクルで処理されたニューロン、および対側のニューロンと同様であった。p75免疫反応性の見掛け上の発現およびNGFで処理されたニューロンのサイズは、一般には、正常動物およびビヒクルで処理された動物より大きく、その効果は両側的（bilateral）であった。また、NGFでの処理は、p75陽性ニューロン周辺出芽の見掛け上の誘導を、内側中隔の両側で引き起こし、軸索切断された右側でより大きな効果が認められた。ニューロン周辺p75出芽に対するBDNFの影響は、無視しうるものであった。
内側中隔および対角帯におけるニューロン周辺のp75免疫反応性の定量的デンシトメトリーは、軸索切断および神経栄養因子処理の効果の有用な代用マーカーとなった。図５は、軸索切断後の内側中隔におけるp75免疫反応性の相対光学濃度に対する［Met-1］GDNF（黒丸）、NGF（白丸）およびBDNF（白ひし形）の効果を示す（正常がn=６、0.1μg/日のBDNFがn=4である以外は、サンプルはn=10）。そのデータは、MCIDイメージ分析システムを用いて軸索切断と同側の右側で測定した光学濃度の、対側対照側に対する割合（％）（平均±SEM）として表されている。（（**）の記号は、正常動物に対してp＜0.01であることを示し、一方、ビヒクルで処理された動物に対して、（#）の記号はp＜0.05であることを示し、（##）の記号はp＜0.01であることを示す）。相対O.D.の有意な20％の減少が、ビヒクルで処理された動物（白丸）において、軸索切断側で認められた。［Met-1］GDNFで処理された動物では、軸索切断側の相対O.D.は、試験したすべての用量において（0.1μg/日の最低用量においてさえ）、対照より有意に高く、１μg/日の用量で正常レベルに達した。既に報告されているとおり、NGFでの処理は、p75発現を、正常を超えるレベル、すなわち、１μg/日の用量では正常の120％にまで増強し、これは、ビヒクルで処理された動物および正常動物の両方より有意に高かった。また、BDNFでの処理は、ビヒクルで処理された動物より有意に高いp75発現を引き起こしたが、この見掛け上の効力は、0.1μg/日の最低用量で喪失した。。
図６は、軸索切断後の外側中隔におけるp75免疫反応性出芽の相対光学濃度に対する［Met-1］GDNF（黒丸）、NGF（白丸）およびBDNF（白ひし形）の効果を示す（正常がn=６、0.1μg/日のBDNFがn=4である以外は、サンプルはn=10）。そのデータは、MCIDイメージ分析システムを用いて軸索切断と同側の右側で測定した光学濃度の、対側対照側に対する割合（％）（平均±SEM）として表されている。（正常動物に対して（*）の記号はp＜0.05であることを示し、（**）の記号はp＜0.01であることを示し、一方、ビヒクルで処理された動物に対して、（#）の記号はp＜0.05であることを示し、（##）の記号はp＜0.01であることを示す）。ビヒクルで処理された動物（白正方形）においては、正常動物（黒正方形）と比べて、該濃度の変化は全くなかった。［Met-1］GDNFおよびNGFは、光学濃度が対側対照側より２〜2.5倍高いp75陽性線維の有意な蓄積を誘導した。［Met-1］GDNFの最も有効な用量は、10μg/日であった。BDNFでの処理は、対照よりわずかに高い光学濃度を与えるにすぎなかった。
組織学的検査では、ビヒクルで処理された動物は、おそらく軸索切断中隔海馬突起の喪失および逆行性変性に起因する外側中隔の明らかな萎縮を示し、軸索切断と同側の外側中隔におけるp75免疫反応性は、対側と比べて、ほとんどまたは全くなかった。10μg/日の［Met-1］GDNFでの処理は、軸索切断と同側の外側中隔において、外側中隔の全幅にわたり、p75免疫反応性出芽の大きな蓄積を引き起こした。そのようなp75陽性出芽は、正常なラット、ビヒクルで処理されたラット、または対側対照側では認められない。既に報告されているとおり、１μg/日のNGFでの処理は、軸索切断と同側の外側中隔において、外側中隔の全幅にわたり、アセチルコリンエステラーゼ陽性およびp75陽性の出芽の一層大きな蓄積を誘導する。10μg/日のBDNFでの処理は、分布が主に外側中隔の第３中央（the middle third）に限定されるp75免疫反応性のわずかな蓄積を引き起こしたにすぎなかった。神経栄養因子での処理は、軸索切断ニューロンのコリン作動性表現型を維持し、外側中隔における出芽の蓄積を誘導したが、外側中隔の萎縮には影響を及ぼさなかった。外側中隔の面積の定量的測定は、軸索切断と同側の外側中隔の面積に対しては神経栄養因子での処理による効果が全くないこと、すなわち、外側中隔の面積は、すべての処理群において、正常より有意に小さいことを示した。
図７は、動物の体重に対する［Met-1］GDNF（黒丸）、NGF（白丸）およびBDNF（白ひし形）の効果を示す（正常がn=６、0.1μg/日のBDNFがn=4である以外は、サンプルはn=10）。そのデータは、神経栄養因子での処理の２週間後の最終体重の、出発体重に対する割合（％）（平均±SEM）として表されている。（正常動物に対して、（*）はp＜0.05であることを示し、（**）はp＜0.01であることを示し、一方、ビヒクルで処理された動物に対して、（#）はp＜0.05であることを示し、（##）はp＜0.01であることを示す）。正常動物（黒正方形）およびビヒクルで処理された動物（白正方形）は共に、出発体重の20％増加した。［Met-1］GDNFは、100μg/日および10μg/日ではこの体重増加を抑制したが、１μg/日では抑制しなかった。既に報告されているとおり、NGFは、10μg/日および１μg/日の両用量で体重増加を抑制した。しかしながら、BDNFは、有意な体重減少を誘導した。実際のところ、100μg/日のBDNFで処理された動物（n=６）は、処理後７日以内に死亡した。
これらの実験の結果は、中脳ドーパミン作動性および体性運動ニューロンに加えて、基底前脳コリン作動性ニューロンが、GDNFタンパク質産物に応答するCNSのもう１つの異なるニューロン集団であることを示すものである。１μg/日〜100μg/日の用量の外因性GDNFタンパク質産物の注入は、軸索切断された基底前脳ニューロンに対して正の効果を与えるが、これは、p75およびChAT受容体のその発現を、ビヒクル注入後に認められるレベルより有意に高く維持し、外側中隔中への軸索の成長の再生的応答を可能にし、ChAT酵素活性を、正常動物で見出されるより高いレベルにまで、軸索切断依存的に増強することによるものである。GDNFタンパク質産物は、効能においては、NGFおよびBDNFと同様であるが、GDNFタンパク質産物は、処理された軸索切断動物において、独特の表現型を誘導する。ジストロフィー基底前脳コリン作動性ニューロンの維持に対するGDNFタンパク質産物の効能は、それが、アルツハイマー病などのコリン作動性変性疾患に対する潜在的に有用な治療物質であり、GDNFタンパク質産物の独特の特性が、そのような療法において他のニューロトロフィンより優れた点を与えうることを示すものである。
本実験では、GDNFタンパク質産物およびNGFは、軸索切断されたp75陽性ニューロンの数の実質的に100％を維持する点において同様の効能を示し、外側中隔においてp75免疫反応性出芽を誘導する点において同様の効能を示した。しかしながら、NGFの効力は、GDNFタンパク質産物より少なくとも一桁高い。NGFは、１μg/日の用量でp75免疫反応性の発現を100％のニューロンにおいて維持したが、GDNFタンパク質産物は、同じ効果を得るために、10μg/日の用量を要した。また、GDNFタンパク質産物によるChAT陽性ニューロンの維持（60％）は、NGFによるもの（90％）より少なかった。
GDNFタンパク質産物の神経栄養的効能は、ChATおよびp75陽性ニューロンを維持する点で、BDNFのものと同様であったが、GDNFタンパク質は、BDNFより一桁強力であり、外側中隔中へのp75免疫反応性出芽のその誘導および体重増加に対するその効果において、BDNFから明確に分離しうる効能を有していた。采／脳弓軸索切断モデルにおけるGDNFタンパク質産物の有効な用量は、中脳ドーパミン作動性ニューロンに対するGDNFのインビボ効力に関して報告されているもの（Hofferら, Neurosci. Lett. 182:107-111, 1994; Hudsonら, Brain Res. Bull. 36:425-432, 1995; KearnsおよびGash, Brain Res. 672:104-111, 1995; Strumbergら, Exp. Neurol. 124:401-412, 1995）に匹敵する。
本実験では、推定上は正常な未損傷ニューロンにおいて、NGFは、ChATの生化学的活性ならびにChATおよびp75の免疫反応性を正常を超えるレベルにまで刺激した。また、NGFに対する超感受性（super-sensitivity）の軸索切断依存的誘導も認められ、ChAT酵素活性は、その損傷中隔において、一層高いレベルにまで刺激された（対側の未損傷中隔において認められるものより70％高い）。GDNFタンパク質産物は、正常なニューロンにおいてではなく軸索切断されたニューロンにおいてのみ、ChATの生化学的活性を刺激した。一方、BDNFは、軸索切断されたまたは未損傷のいずれのニューロンにおいても、ChATの生化学的活性に対して刺激的効果を全く与えなかった。
軸索切断されたコリン作動性ニューロンに対するGDNFタンパク質産物の効能は、おそらく、受容体に媒介される現象であろう。GDNFタンパク質産物での処理が、対側の対照側に対して、あるいはGDNFタンパク質産物を10μg/日で注入された軸索切断されていない正常動物において、影響を及ぼすことは認められなかったが、采／脳弓の軸索切断が、外因性GDNFに対する基底前脳コリン作動性ニューロンの感受性を誘導することは明らかであり、GDNFタンパク質産物での処理は、p75およびChATの両表現型の喪失を妨げる（すなわち、該表現型の発現を維持する）。このことは、正常な基底前脳ニューロンが、生理的に適当なレベルのGDNF受容体を発現していないこと、および、GDNFタンパク質産物に対する軸索切断により誘導される感受性が、軸索切断により誘導されるGDNF受容体のアップレギュレーションまたは活性化の結果である可能性があることを示唆しているかもしれない。
これらの結果は、ジストロフィーコリン作動性ニューロンに対するGDNFタンパク質産物の効果が、NGFの効果より適度なものであり、GDNFタンパク質産物が、NGFとは異なり、未損傷の正常ニューロンに対して最小限の影響を及ぼすか、全く影響を及ぼさないことを示す。初期の安全性研究では、全身投与の後、ラットはGDNFタンパク質産物に非常によく耐え、高用量においても、痛覚過敏、体重減少などの不利な副作用は全く示されなかった。BDNFは、GDNFタンパク質産物と同様の効能を有するが、それは、GDNFタンパク質産物より効力が一桁低く、ChATの生化学的活性に影響を及ぼさず、重篤な体重減少を引き起こす。
実施例３
GDNFタンパク質産物を、加齢関連痴呆の動物モデルにおいて認識機能を改善するその能力に関して、Fischerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:8607-8611, 1994に従いさらに試験する。簡単に言えば、老齢雌ラット（22〜24月齢）を、空間的な学習および記憶の障害（しばしば、前脳コリン作動性ニューロンの著しい細胞萎縮と関連している）に関して、モリス水迷路作業（Morris water maze task）において選択する。対照は、若い雌ラット（３月齢）である。各ラットに、GDNFタンパク質産物またはビヒクルの脳室内注入を４週間行い、その間、水迷路におけるラットの能力を定期的に試験して、それが空間的記憶を獲得し維持することに関して評価する。また、他のアルツハイマー病モデル（例えば、脳アミロイド症を引き起こしているラット）においても、GDNFタンパク質産物を評価する。
当業者においては、本発明の現在好ましい実施態様についての前記の記載の考慮に基づき、本発明の実施において多数の修飾および変形が見出されると予想される。したがって、本発明の範囲に課されるべき唯一の限定は、添付されている請求の範囲に記載されているものである。
配列表
配列番号１の情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：134アミノ酸残基
（Ｂ）型：アミノ酸
（Ｃ）鎖の数：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ix）配列の特徴
（Ａ）名称／特徴を表す記号：成熟ヒトGDNFの推定アミノ酸配列
（xi）配列：配列番号１：
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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