(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対応する野生型１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの１，３−プロパンジオールに関するＫｍを超える、１，３−プロパンジオールに関しての増加したＫｍを有する変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼであって、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅから得ることができ、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ中の残基Ｈｉｓ１０５からＬｅｕに対応する変異を含み、そして配列番号２に示す配列を有するアミノ酸配列を含む、変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ。
【請求項２】
配列番号２に示す配列を有する変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼをコードする単離された核酸。
【請求項３】
配列番号１に示す配列を有する、請求項２記載の単離された核酸。
【請求項４】
請求項２記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項４記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，Ａｅｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ，Ｍｕｃｏｒ，Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ，Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓを含む、請求項５記載の宿主細胞。
【請求項７】
工程：ｉ．対応する野生型１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの１，３−プロパンジオールに関するＫｍを超える、１，３−プロパンジオールに関しての増加したＫｍを有する変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを含む微生物を得る工程であって、該変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅから得ることができ、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ中の残基Ｈｉｓ１０５からＬｅｕに対応する変異を含み、そして配列番号２に示す配列を有するアミノ酸配列を含む、変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼであって、該微生物は活性のある１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ活性を発現することができる少なくとも一つの遺伝子を含む工程、および
ｉｉ．上記微生物を炭素基質に接触させる工程
を含む、微生物において１，３−プロパンジオールを生産する方法。
【請求項８】
微生物が、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，Ａｅｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ，Ｍｕｃｏｒ，Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ，Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９２を有する単離された微生物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、１，３−プロパンジオールに関して変更されたＫｍを有する変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼに関する。本発明は、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの変異形態の核酸配列とアミノ酸配列を提供する。本発明は、変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを含む発現ベクターおよび宿主細胞も提供する。
発明の背景
１，３−プロパンジオールは、ポリエステルファイバーの生産およびポリウレタンおよび環式化合物の製造において有力な利用性を有するモノマーである。１，３−プロパンジオールの生産は１９９７年１１月１１日に発行された米国特許第５，６８６，２７６号およびＷＯ９８／２１３４１に開示された。グルコースからの１，３−プロパンジオールの生産のための一つの代表的な経路は以下の一連の工程により達成することができる。グルコースが、解糖経路の酵素による一連の工程において、ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）と３−ホスホグリセルアルデヒド（３−ＰＧ）に変換される。次に、ＤＨＡＰのジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）への加水分解に続く還元によるか、またはＤＨＡＰのグリセロール３−リン酸（Ｇ３Ｐ）への還元に続く加水分解の何れかによりグリセロールが形成される。上記加水分解工程は、それらの基質に関して特異的または非特異的であることが知られている幾多の細胞性ホスファターゼにより触媒され得るか、または上記活性は組換えにより宿主細胞に導入され得る。上記還元工程は、ＮＡＤ+（またはＮＡＤＰ+）にリンクした宿主酵素により触媒され得るかまたは上記活性は組換えにより宿主細胞に導入され得る。注目すべきは、ｄｈａレギュロンが、等式３の可逆反応を触媒するグリセロールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．６）を含むことである。
【０００２】
グリセロール  （反応）  3-HP  ＋  H2O  （等式１）
3-HP＋NADH＋H+  （反応）  1,3-プロパンジオール＋NAD+ (等式２)
グリセロール＋NAD+  （反応）  DHA＋NADH＋H+  （等式３）
グリセロールは中間体３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰ）により１，３−プロパンジオールに変換されることは、上で詳細に記載したとおりである。中間体３−ＨＰは、宿主によりコードされ得るかまたは組換えにより宿主へ導入され得るデヒドロゲナーゼ酵素によりグリセロールから生産される（等式１）。このデヒドロゲナーゼは、グリセロールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．３０）、ジオールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．１．２８）、またはこの形質転換を触媒できるあらゆる他の酵素であり得る。グリセロールデヒドロゲナーゼはｄｈａレギュロンによりコードされる。１，３−プロパンジオールはＮＡＤ+（またはＮＡＤＰ+）リンクした宿主酵素により３−ＨＰ（等式２）から生産されるかまたは上記活性が組換えにより宿主に導入され得る。１，３−プロパンジオールの生産におけるこの最後の反応は、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．１．２０２）または他のアルコールデヒドロゲナーゼにより触媒され得る。
【０００３】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅおよびＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉにおいては、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＢ）、１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ（ｄｈａＴ）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ｄｈａＤ）、およびジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）の機能上リンクした活性をコードする遺伝子は、ｄｈａレギュロンに包含される。ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒとＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ由来のｄｈａレギュロンはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて発現されて、グリセロールを１，３−プロパンジオールに変換することが示された。
【０００４】
当業界において開示された１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの核酸およびアミノ酸の配列は、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ３０９０３（Ｗｉｌｌｉａｒ，１９９４，”Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  １，３−ｐｒｏｐａｎｘｄｉｏｌ  ｐａｔｈｗａｙ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ  ａｎｄ  １，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ”化学工学学位論文、ウイスコンシン−マジソン大学）；Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉのＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０９７７１（Ｄａｎｉｅｌ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  １，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ：ｃｌｏｎｉｎｇ，ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：２１５１−２１５６）；およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍのＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ００６０３４（Ｌｕｅｒｓ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｔｏ  １，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ  ｂｙ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ：ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  １，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５４：３３７−３４５）を含む。
発明の概要
本発明は、野生型Ｅ．ｂｌａｔｔａｅには通常毒性のレベルである少なくとも１０５ｇ／ｌの１，３−プロパンジオールの存在下で生育できるＥ．ｂｌａｔｔａｅの誘導体から単離された、変異体形態の１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（ＰＤＤ）の発見に関する。本発明は、よって、上記変異形態のＰＤＤが、通常は毒性のレベルの１，３−プロパンジオールに対してのＥ．ｂｌａｔｔａｅの耐性に関連するとの発見に一部基づく。本発明は、この変異対ＰＤＤが１，３−プロパンジオールとＮＡＤに関して変更されたＫｍを有するとの発見にも一部基づく。
【０００５】
従って、本発明は、１，３−プロパンジオールに関して野生型ＰＤＤのＫｍを超えるように増加する１，３−プロパンジオールのＫｍを有する変異体ＰＤＤを提供する。一つの態様において、変異体ＰＤＤのＫｍは１，３−プロパンジオールに関しての野生型ＰＤＤのＫの約３倍である。別の態様において、変異体ＰＤＤはＥ．ｂｌａｔｔａｅのＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９２から得ることができる。
【０００６】
本発明のさらに別の態様において、変異体ＰＤＤはＥ．ｂｌａｔｔａｅのＰＤＤにおける残基Ｈｉｓ１０５からＬｅｕに対応する変異を含み、図３に示すとおりである。さらなる態様において、変異体ＰＤＤは配列番号２に示すアミノ酸を含み、そして配列番号１に示す配列を有する核酸によりコードされる。
【０００７】
本発明は、配列番号１に示す配列を有する単離された核酸を含む発現ベクターおよび宿主細胞も提供する。一つの態様において、上記宿主細胞はＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，Ａｅｒｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ，Ｍｕｃｏｒ，Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ，Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓを含む。
【０００８】
さらなる側面において、本発明は、変異体ＰＤＤを含む微生物の使用を含む１，３−プロパンジオールの生産法に関する。
ブダペスト条約下で寄託された微生物の記載
出願人は、特許手続のための微生物の寄託の国際承認に基づくブダペスト条約の権限の下に、以下の生物の寄託を行った。
【０００９】
0004646411.tif 000002
詳細な説明
用語「１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ」または「ＰＤＤ」（当業界では「オキシドレダクターゼ」としても知られる）は、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの１，３−プロパンジオールへの還元を触媒することができる酵素に必須のポリペプチドを意味する。１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼは、例えば、ｄｈａＴ遺伝子によりコードされるポリペプチドを含む。本発明は、限定ではないが、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ，Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ，Ｃ．Ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍを含むあらゆる源からの１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを包含する。
【００１０】
本明細書にて使用されるとおり、用語「変異体（ｍｕｔａｎｔ）」または「変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）」は、微生物の核酸中に生じるあらゆる遺伝子の変化を意味し、そして該微生物の表現型の変化を反映してもしなくてもよい。変異は、単一の塩基対の変化、欠失または挿入を含んでよく；変異は多数の塩基対の変化、欠失または挿入を含んでよく；変異はＤＮＡの大きな領域の変化を含んでもよく、例えば重複または倒置を通してである。変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列は、天然の１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの一つまたは複数のアミノ酸の置換、失または挿入により前駆体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼに由来し得る。遺伝子を修飾するための方法（例えば、部位特異的オリゴヌクレオチド変異導入）は、当業界において記載された。
【００１１】
本明細書にて使用される句「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」は、実施例３に例示された１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ間のアミノ酸の関連性を意味する。本明細書にて論じられる特定の残基は、図３に示すＥ．ｂｌａｔｔａｅのＧＥＢのＰＤＤに指定された番号を引用するアミノ酸残基数を意味する。ＨｉｓからＬｅｕへの変異を図３の残基１０５に示す。図３は、様々な微生物源からの１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを計算法ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて並置することができる。本発明は、図１または２に示されるＥ．ｂｌａｔｔａｅのＰＤＤの変異、またはＡＴＣＣに寄託されて受託番号ＰＴＡ−９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅに限定されないが、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ中の特定の同定された残基に均等な位置のアミノ酸残基を含むＰＤＤｓ全てを包含する。Ｅ．ｂｌａｔｔａｅのＰＤＤ中の残基の特定の残基または部分に相同（即ち、一次構造または三次構造の何れかの位置に対応する）または類似のいずれかであれば、残基は均等である（即ち、化学的にかまたは構造上、結合するか（ｃｏｍｂｉｎｅ）、反応するか（ｒｅａｃｔ）または相互作用する（ｉｎｔｅｒａｃｔ）、同じかまたは類似の機能上の能力を有する）。
【００１２】
一次構造に関する相同性を確立するために、ＰＤＤのアミノ酸配列を、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅのＰＤＤ一次構造（図２に示す）、そして特に配列が公知の全てのＰＤＤｓに対して不変であることが知られている残基のセット（例えば、図３を参照）と、直接比較する。本発明は、変異形態が１，３−プロパンジオールの活性のＫｍを変更することができる限り、１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの全ての源における均等残基の変化を包含する。好ましい態様において、変異形態のＫｍは１，３−プロパンジオールに関して増加する。配列番号１の核酸配列はＰＣＲ技術により得た。そのような技術は、しばしば、偶然にＰＣＲで生じた配列エラーにより特徴付けられる。よって、本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅの１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼおよび１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの他の微生物の源の中の対応する変異を包含する。
【００１３】
用語「Ｋｍ」は酵素の基質に対する親和性を意味する。高いＫｍは低い親和性を反映し；低いＫｍは高い親和性を反映する。
用語「炭素基質」および「炭素源」は、本発明の宿主生物により代謝されることができる炭素源、および特にモノサッカライド、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、そして炭素が一つの基質またはそれらの混合物からなるグループから選択される炭素源を意味する。
【００１４】
用語「宿主細胞」または「宿主生物」は、外来または外因性の遺伝子を受容でき、且つ活性な遺伝子産物を生成するようにそれらの遺伝子を発現させることができる微生物を意味する。
【００１５】
本明細書にて使用されるとおり、「核酸」は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列、およびそれらの断片または部分、およびセンスあるいはアンチセンス鎖を表すかに拘わらず二本鎖または一本鎖であってよいゲノミックまたは合成起原のＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。用語「天然」および「野生型」は、それ自身の制御配列と共に自然界において見いだされる遺伝子を意味する。本明細書にて使用されるとおり、「アミノ酸」はペプチドまたは蛋白質の配列またはその部分を意味する。
【００１６】
用語「発現」は、遺伝子産物の配列をコードする遺伝子からの遺伝子産物への転写および翻訳を意味する。
用語「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」は、細胞の中心的な代謝の一部にない遺伝子をしばしば有する染色体外要素を意味し、そして通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である。そのような要素は、自律複製要素、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、直鎖または環状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、多数のヌクレオチド配列を、プロモーター断片および選択された遺伝子産物に関するＤＮＡを適切な３’非翻訳領域と共に細胞に導入することができる唯一の構築物に、接合させるかまたは組換えた、あらゆる源に由来してよい。「形質転換カセット」は、特定の宿主細胞の形質転換を容易にさせる外来遺伝子に加えて、外来遺伝子を含み且つ要素を有する特定のベクターを意味する。「発現カセット」は、外来宿主中でその遺伝子の増強された発現を可能にする外来遺伝子に加えて、外来遺伝子を含み且つ要素を有する特定のベクターを意味する。
【００１７】
本明細書にて使用される用語「単離された」または「精製された」は、自然界で付随する少なくとも一つの成分から取り出された核酸またはアミノ酸を意味する。
発明の詳細な説明
本発明は、１，３−プロパンジオールに関して増加したＫｍを有することにより特徴付けされる変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（ＰＤＤ）に関する。
【００１８】
Ｉ．ＰＤＤ配列
配列番号１に示すポリヌクレオチド配列は、図３に示すとおり、残基１０５においてＨｉｓからＬｅｕへの変異を有する１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（配列番号２）をコードする。当業者には理解されるとおり、遺伝子コードの縮重のために、様々なポリヌクレオチドが配列番号２をコードし得る。本発明は、そのようなポリヌクレオチド全てを包含する。本発明は、図３に示すとおり、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅの残基Ｈｉｓ  １０５に対応する変異を含むＰＤＤをコードする核酸を包含する。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＰＤＤに関する核酸およびアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ３０９０３にて提供され；Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ由来のＰＤＤはＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０９７７１にて提供され；そしてＣ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍに関してはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０００３４にて提供される。本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅから得ることができる変異ＰＤＤも包含する。
【００１９】
微生物のゲノムから所望の遺伝子を得るための方法は共通であり、そして分子生物学の当業界においてよく知られている。例えば、上記遺伝子の配列が公知ならば、適切なゲノミックライブラリーを制限エンドヌクレアーゼ消化により創製してよく、そして所望の遺伝子配列に相補なプローブを用いて選抜してよい。上記配列が単離されたなら、標準のプライマー指向性増幅方法、例えばポリメラーゼ鎖停止反応（ＰＣＲ）（Ｕ．Ｓ．４，６８３，２０２）を用いて増幅することにより、適切なベクターを用いた形質転換のために適した量のＤＮＡを得てよい。
【００２０】
別法として、適切な細菌の宿主の形質転換のためのコスミッドベクターを用いる方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）にうまくきさいされている。
【００２１】
ＰＤＤ遺伝子内で変異を作成する方法は当業者に知られており、例えば、部位特異的変異導入を含み、手法は１９８８年７月２６日発行の米国特許ＵＳ４７６００２５に記載されている。
【００２２】
ベクターおよび発現カセット
本発明は、変異体ＰＤＤ並びに１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼに関連する他の蛋白質を適切な宿主細胞中にクローン化、形質転換および発現させるるのに適した、様々なベクターおよび形質転換および発現カセットを提供する。適切なベクターは、用いられる細菌に適合性のものであることになる。適切なベクターは、例えば細菌、ウイルス（例えばバクテリオファージＴ７またはＭ１３由来のファージ）、コスミッド、酵母または植物に由来し得る。そのようなベクターを得て、そして使用するためのプロトコルは当業界において知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ−ｖｏｌｕｍｅｓ１，２，３（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，（１９８９））。
【００２３】
典型的には、上記ベクターまたはカセットは、問題の遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択可能なマーカー、および自律複製または染色体組み込みを可能にする配列を含む。適切なベクターは、転写開始制御を収容する遺伝子の５’領域と、転写停止を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含む。両制御領域は、形質転換された宿主細胞に相同な遺伝子に由来することがもっとも好ましいが、そのような制御領域は生産宿主として選択された特定の種にとって本来の遺伝子に由来する必要がないことは認識されるはずである。
【００２４】
開始制御領域またはプロモーターは、所望の宿主細胞におけるＰＤＤの発現を操縦するのに有用であり、多数存在して、当業者により熟知されている。理想的には、これらの遺伝子を操縦することができるあらゆるプロモーターが本発明に適しており、限定ではないが、ＣＹＣ１，ＨＩＳ３，ＧＡＬ１，ＧＡＬ１０，ＡＤＨ１，ＰＧＫ，ＰＨＯ５，ＧＡＰＤＨ，ＡＤＣ１，ＴＲＰ１，ＵＲＡ３，ＬＥＵ２，ＥＮＯ，ＴＰＩ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現に有用）；ＡＯＸ１（Ｐｉｃｈｉａにおける発現に有用）；およびｌａｃ，ｔｒｐ，ＩＰＬ，ＩＰＲ，Ｔ７，ｔａｃおよびｔｒｃ（Ｅ．ｃｏｌｉにける発現に有用）を含む。
【００２５】
停止制御領域は、好ましい宿主にとって本来の様々な遺伝子に由来してもよい。任意には、停止部位は必要なく、しかしながら、もしも含まれていれば最も好ましい。
【００２６】
本酵素の効果的な発現のためには、該酵素をコードするＤＮＡを、発現が適切なメッセンジャーＲＮＡの形成をもたらすように、開始コドンを通して作動可能なように、選択された発現制御領域に連結する。
適切な宿主の形質転換およびＰＤＤの発現
適切なカセットが構築されたなら、それらを使用することにより、適切な宿主細胞を形質転換する。１，３−プロパンジオールの生産に必要な他の蛋白質とは別々かまたは一緒に、変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼを含むカセットを宿主細胞に導入することは、公知の手法、例えば形質転換（例えば、カルシウム透過化細胞、エレクトロポレーションを用いて）または組換えファージウイルスを用いるトランスフェクション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前記）により達成してよい。
【００２７】
宿主細胞
１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼの組換え生産のための適切な宿主細胞は、原核または真核の何れであってもよく、そして活性な酵素を発現する宿主細胞の能力によってのみ制限されることになる。好ましい宿主は、グリセロールまたは１，３−プロパンジオールの生産に有用な典型的な宿主であり、例えば、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ，Ｐｉｃｈｉａ，Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｈａｎｓｅｎｕｌａ，Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ，Ｍｕｃｏｒ，Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ，Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓである。本発明において最も好ましいのは、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種である。
【００２８】
培地および炭素源
本発明における発酵培地は適切な炭素源を含まなければならない。適切な基質は、限定ではないが、モノサッカライド、例えばグルコースおよびフルクトース、オリゴサッカライド、例えばラクトースまたはシュークロース、ポリサッカライド、例えば澱粉またはセルロース、またはそれらの混合物、および継続可能な供給原料からの未精製の混合物、例えばチーズの乳清透過物（ｐｅｒｍｅａｔｅ）、コーンスティープ（ｃｏｒｎｓｔｅｅｐ）リカー、サトウキビ糖蜜、および大麦麦芽を含んでよい。さらに、炭素源は一炭素の基質、例えば二酸化炭素、またはカギとなる生化学中間体への代謝変換が証明されたメタノールであってもよい。
【００２９】
好ましい炭素基質はモノサッカライド、オリゴサッカライド、ポリサッカライド、および一炭素基質である。より好ましいのは、糖、例えばグルコース、フルクトース、シュークロースおよび一炭素基質、例えばメタノールおよび二酸化炭素である。もっとも好ましいのはグルコースである。
【００３０】
適切な炭素源に加えて、発酵培地は、当業者に知られており、培養物の生育およびグリセロール生産に必要な酵素経路の促進に適した、適切なミネラル、塩、共因子、バッファーおよび他の成分を含まねばならない。Ｃｏ（ＩＩ）塩および／またはビタミンＢ12またはその前駆体には、特定の注意を払う。
【００３１】
培養条件：
典型的には、細胞を３０℃において適切な培地中で生育させる。本発明において好ましい生育培地は、一般に市販されている調製培地、例えばＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス、Ｓａｂｏｕｒａｕｄ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ（ＳＤ）ブロスまたは酵母麦芽抽出物（ＹＭ）ブロスである。他に定義されたかまたは合成の生育培地も使用してよく、そして特定の微生物の生育のための適切な培地は、微生物学または発酵科学の当業者に知られている。直接または間接に異化産物抑制を変調することが知られている薬剤、例えば環状アデノシン２’：３’−１リン酸または環状アデノシン２’：５’−１リン酸の使用は、上記反応培地に取り込んでもよい。同様に、グリセロール生産の増強を導く酵素活性を変調することが知られている薬剤（例えば、スルファイト、ビスルファイトおよびアルカリ）の使用は、遺伝子操作と共にかあるいは別に使用してよい。
【００３２】
発酵のための適切なｐＨ範囲はｐＨ５．０からｐＨ９．０であるが、ｐＨ６．０が初期条件の範囲としては好ましい。
本発明を実施する様式および方法は以下の実施例に体する引用により当業者によりさらに完全に理解されるかもしれず、それらの実施例はいかなる様式においても本発明または特許請求の範囲に制限することを意図されない。
実施例
実施例１は配列番号２に示す変異体ＰＤＤに付随する動力学上の変化を記載する。
材料と方法
株−野生型ＡＴＣＣ３３４２９、変異体ＰＤＤのＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９２を含むＥ．ｂｌａｔｔａｅ。
生育−細胞は、複合培地中で、３０Ｃ  ５００ｍｌにおいて２８００ｍｌ発酵バッチ中で２２５ｒｐｍにて撹拌しながら２０時間生育させた。培地は、ＫＨ２ＰＯ４，５．４ｇ／Ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４，１．２ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ，０．４ｇ／Ｌ；酵母抽出物、２．０ｇ／Ｌ；トリプトン、２．０ｇ／Ｌ；およびグリセロール、９．２ｇ／Ｌを水道水中に含む。
抽出物の調製−嫌気条件を避けるために注意しながら細胞を遠心分離により回収した。沈殿物は、５０ｍＭ  ＫＣｌおよび１ｍＭ  ＤＴＴを含む１００ｍｌのＴｒｉｃｉｎｅ  ｐＨ８．２に懸濁した。細胞はフレンチ細胞プレッシャーを通して破壊した。粗抽出物を、２０Ｋ  Ｘ  ｇで２０分間遠心分離してから、１００Ｋ  Ｘ  ｇで１時間遠心分離することにより透明にして、高速上清（ＨＳＳ）画分を生じさせた。
アッセイ−ＰＤＤに関するアッセイはＪｏｈｎｓｏｎ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：２０５０−２０５４に記載されたとおりに実施した。
ＰＤＤの部分精製−ＨＳＳを１６  Ｘ  １００  Ｐｏｒｏｓ  ２０ＨＱカラム上で分離させた。バッファーは、Ａは５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４であり、１００ｕＭ  ＭｎＣｌを含み、そしてＢは５００ｍＭ  ＫＣｌを含むＡＴＣＣバッファーである。カラムを１０ｍｌ／分にて負荷および展開した。勾配は１０ＣＶ洗浄、１０ＣＶにて７０％Ｂまで直線勾配、そして１００％まで１ＣＶであった。活性は勾配の極めて初期の画分において検出された。１ｍＭまで追加のＤＴＴを添加した後に、３３４２９株のプールされたカラム画分をアッセイのために回収されたとおりに使用した。株ＧＥＢ０３１からの活性画分をプールして、ＰＭ３０上で濃縮して、追加の１ｍＭ  ＤＴＴの添加後に濃縮されたとおりに使用した。
株            ＧＤ（Ｕ／ｍｇ）  ＰＤＤ（Ｕ／ｍｇ）    ＧＤ／ＰＤＤ比
３３４２９      ０．６４            ０．２２              ２．９
ＧＥＢ０３１    ０．７９            ０．０８              ９．９
ＰＤＤ動力学−結果を以下に示す。
株            Ｋｍ（ｍＭプロパンジオール）  Ｋｍ（ｕＭ  ＮＡＤ）
３３４２９              ２８                      ５７
実施例２：Ｅ．ｂｌａｔｔａｅからの１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ｄｈａＴ）のクローン化と配列決定
ｄｈａＴ遺伝子を、ＰＣＲにより、Ｅ．ｂｌａｔｔａｅのゲノミックＤＮＡから、鋳型ＤＮＡとしてＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのｄｈａＴ配列に基づく合成プライマー（プライマー１と２）を用いて５’末端にＸｂａＩ部位および３’末端にＢａｍＨＩ部位を取り込んだ。生成物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローン化した。クローン化されたｄｈａＴを次に標準技術により配列決定した。
【００３３】
ＤＮＡ配列決定の結果を配列番号１および配列番号２として与える。
プライマー１
５’ＴＣＴＧＡＴＡＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＡＴＧＣＣＴＧＧＣＧＧＡＡＡＡＴ３’
プライマー２
５’ＧＣＧＣＣＧＴＣＴＡＧＡＡＴＴＡＴＧＡＧＣＴＡＴＣＧＴＡＴＧＴＴＴＧＡＴＴＡＴＣＴＧ３’
当業者には容易に理解されるとおり、ＰＣＲ方法を通して生成された核酸配列は不注意によるエラーを含んでいるかもしれない。本発明は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−９２を有するＥ．ｂｌａｔｔａｅから得ることができるＰＤＤをコードする核酸も包含する。
【００３４】
特許、特許出願、配列および刊行物を含む、本明細書中の全ての文献は、引用により完全に本明細書に編入される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（ＰＤＤ）の核酸配列（配列番号１）を提供する。
【図２】  図２は、変異体１，３−プロパンジオールデヒドロゲナーゼ（ＰＤＤ）のアミノ酸配列（配列番号１）を提供する。
【図３】  図３は、様々な微生物のＰＤＤのアミノ酸アラインメントを提供する。Ｅｂ  ＧＥＢＴはＡＴＣＣに寄託されたＥ．ｂｌａｔｔａｅ変異体ＰＤＤを表し、Ｅｂ  ４２９ＴおよびＥｂ  ９０７Ｔは野生型Ｅ．ｂｌａｔｔａｅ（ＡＴＣＣ加盟番号３３４２９）を表し；ＫｐｎはＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（ＧｅｎＢａｎｋ加盟番号Ｕ３０９０３）であり；ＣｆｕはＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋ加盟番号Ｕ０９７７１）であり、そしてＣｐａｓｔはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋ加盟番号ＡＦ００６０３４）である。
【図１】
0004646411.tif 000003
【図２】
0004646411.tif 000004
【図３】
0004646411.tif 000005