(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エフェクター細胞非存在下でのヒトCD20抗原発現細胞培養において該ヒトCD20抗原発現細胞に対してアポトーシスを含む増殖阻害活性を有するマウス由来抗CD20モノクローナル抗体であって、H鎖可変領域アミノ酸配列とL鎖可変領域アミノ酸配列がそれぞれ配列番号２及び８又は配列番号１及び７である前記抗CD20モノクローナル抗体。
【請求項２】
請求項１に記載の抗CD20モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項３】
請求項１記載の抗CD20モノクローナル抗体の可変領域アミノ酸配列とヒトイムノグロブリン定常域アミノ酸配列を融合させたキメラ抗CD20モノクローナル抗体。
【請求項４】
請求項１記載の抗CD20モノクローナル抗体の可変領域CDRのアミノ酸配列とヒトイムノグロブリンのアミノ酸配列を用いてヒト化された抗CD20モノクローナル抗体。
【請求項５】
H鎖可変領域アミノ酸配列とL鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせがそれぞれ配列番号１９及び２３、配列番号１９及び２４、配列番号１９及び２５、配列番号１９及び２６、配列番号２０及び２３、配列番号２０及び２４、配列番号２０及び２５、配列番号２０及び２６、配列番号２１及び２３、配列番号２１及び２４、配列番号２１及び２５、配列番号２１及び２６、配列番号２２及び２３、配列番号２２及び２４、配列番号２２及び２５、又は配列番号２２及び２６である請求項４のヒト化抗CD20モノクローナル抗体。
【請求項６】
ヒト補体またはエフェクター細胞存在下でCD20抗原発現細胞に対して細胞障害性を有する請求項３〜５のいずれか１項に記載の抗CD20モノクローナル抗体。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか１項に記載の抗CD20モノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を組み込んだ哺乳動物細胞。
【請求項８】
CHO細胞である請求項７記載の哺乳動物細胞。
【請求項９】
請求項１及び３〜６のいずれか１項に記載の抗CD20モノクローナル抗体を有効成分とする診断薬。
【請求項１０】
請求項３〜６のいずれか１項に記載の抗CD20モノクローナル抗体を有効成分とする治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトCD20抗原に対するモノクローナル抗体に関し、さらには遺伝子組換によるキメラ抗CD20モノクローナル抗体及びヒト化抗CD20モノクローナル抗体、又はこのいずれかを有効成分とするB細胞性腫瘍または免疫疾患に対する治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
CD20抗原を認識するモノクローナル抗体としては、B1, 2B8（キメラ抗体名はrituximab）、1F5、2H7などが知られている。なかでも、米国IDEC Pharmaceuticals Corporationにより開発されたキメラ抗CD20モノクローナル抗体であるrituximabは低悪性度非ホジキンリンパ腫（NHL）の標準治療薬として確立している他、B細胞が関与する多くの免疫疾患に対して治療効果があることが明らかにされている。例えば、慢性リンパ性白血病などの悪性腫瘍のほかに自己免疫溶血性貧血症、特発性血小板減少症紫斑病などの病原性自己抗体が関与していると考えられる自己免疫疾患、慢性関節リウマチや多発性硬化症といった炎症性疾患に対して効果的とされる(非特許文献１４〜１７)。【０００３】
CD20はBリンパ細胞表面に発現している分子であり、末梢血、脾臓、扁桃、骨髄中の正常B細胞などの他ほとんどの悪性腫瘍B細胞に発現がみられる。この分子は297アミノ酸よりなり、細胞膜を4回貫通しC末端、N末端の両方を細胞内に有し、3回目と4回目膜貫通ドメイン間に糖鎖不含の43アミノ酸残基よりなる唯一の細胞外に露出したループをもつ（非特許文献１、９）。CD20分子は通常４量体として存在し、さらに他のマイナーな成分とヘテロな複合体を形成しているものと考えられている(非特許文献１８)。CD20タンパクは、細胞外への分泌や切断が無いのに加え、抗体結合による細胞内への取り込みがほとんど無いことから、抗体による標的細胞に対する細胞傷害性メカニズムが効果的に働くことが期待できる（非特許文献１〜３）。【０００４】
分子サイズが小さいにも拘わらず、CD20は細胞外における複合体としての発現形態の影響もありエピトープは多様性を有し、それに結合する抗体はさまざまに異なる生物学的応答を介在する。例えば、B細胞レセプターのダウンレギュレーション、MHCクラスII抗原や接着分子の発現増加、hyper-cross-linking下でのCa2+放出活性化、リンパ細胞の機能関連のantigen 1非依存性同型接着の阻害、アポトーシス誘導またはその逆の細胞増殖促進などの活性が大きく異なっている(非特許文献４〜１３)。代表的抗CD20抗体であるrituximab、B1、1F5、2H7においても、その特性及び生物学的機能は異なっており、CD20に結合するモノクローナル抗体というだけではその生物学的性質を特定し得ない。【０００５】
CD20の細胞外ドメインを構成する分子は不溶性である。細胞溶解物由来又は遺伝子組換タンパクとしてのCD20分子は界面活性剤又は強アルカリを用いて可溶化し得るが、このような処理条件下では自然の立体構造を維持することは困難である。このため、抗体を得るための免疫原としてCD20陽性B細胞株が用いられるが、免疫刺激性は弱く成熟した抗体産生細胞クローンを得ることは容易ではない。【０００６】
2005年現在、治療薬として認可されている抗CD20モノクローナル抗体はマウス／ヒトのキメラであるrituximabだけである。異種動物とのキメラ分子は抗原性を有するため治療薬として一般には好まれないが、抗CD20抗体は正常細胞を含む全てのB細胞を標的し除去する性質を有するため抗原性がほとんど無いとされている。しかしながら、数パーセントではあるが治療期間中に中和抗体を誘起する事例が報告されており投与する量や期間によってはさらにその可能性が高まることから、よりヒトに近い配列を有するヒト化抗体またはヒト抗体の開発が望まれる。キメラ抗体のもう一つの不利な点は血中半減期が短いことであり、β半減期は３〜４日に過ぎない。Rituximabの再発低悪性度NHLに対する米国での臨床試験の奏効率は単独投与で50%弱であったことが報告されており、rituximabが効かないかまたは効きの悪い患者が50%以上いることを示している。中悪性度NHLの場合の奏効率はさらに低く30％程度に過ぎない（非特許文献１４）。このため、患者により反応が異なる原因・背景の追究が必要であると同時により優れた効果を有する抗体の開発が望まれる。
【非特許文献１】Leukocyte Fact Book 2nd Edition, Academic Press
【非特許文献２】Stashenko P et al., J Immunol 1980; 125:1678-85
【非特許文献３】Anderson KC et al., Blood 1984; 63:1424-33
【非特許文献４】Shan D et al., Blood 1998; 91:1644-52
【非特許文献５】Flieger D et al., Cell Immunol 2000; 204:55-63
【非特許文献６】Mathas S et al., Cancer Res 2000; 60:7170-6
【非特許文献７】Cardarelli PM et al., Cancer Immunol Immunother 2002; 51:15-24
【非特許文献８】Pedersen IM et al., Blood 2002; 99:1314-9
【非特許文献９】Deans JP et al., Imminol 2002; 107:176-82
【非特許文献１０】Golay JT et al., J Immunol 1992; 149:300-8
【非特許文献１１】Bourger I et al., Eur J Immunol 1993; 23:768-71
【非特許文献１２】White MW et al., J Immunol 1991; 146:846-53
【非特許文献１３】Shan D et al., Cancer Immunol Immnother 2000; 48:673-83
【非特許文献１４】Coiffier B et al., Blood 1998; 92:1927-32
【非特許文献１５】Edward JC et al., Rheumatology (Oxford) 2001; 40:205-11
【非特許文献１６】Zaja F et al., Heamatologica 2002; 87:189-95
【非特許文献１７】Perrotta S et al., Br J Haematol 2002; 116:465-7
【非特許文献１８】Polyak MJ et al., Blood 2002; 99:3256-62
【発明の開示】
【０００７】
本発明の課題は、従来の抗CD20モノクローナル抗体治療薬よりも優れた生物学的機能を有するモノクローナル抗体を提供することである。
【０００８】
本発明者らは、複数のCD20抗原陽性B細胞株、遺伝子工学的にヒトCD20抗原を細胞膜上に発現させた哺乳動物細胞、及びGST（ glutathione S-transferase）タンパクを融合させたヒトCD20タンパクを免疫原として任意に組み合わせて用いることによりヒトCD20抗原に対して特異的に結合するマウス由来抗CD20モノクローナル抗体を得た。このうちいくつかはエフェクター細胞非存在下のin vitro CD20発現細胞培養においてアポトーシスを含む直接的な細胞増殖阻害活性を有していた。また、アポトーシスなどの細胞増殖阻害活性の有無に拘わらず、他の選択されたマウス由来抗CD20モノクローナル抗体も含め、キメラ化により効果的な補体又は抗体依存性の細胞障害性を有した。これらの中から最も望ましい生物学的活性を有すると判断された抗体のアミノ酸配列をヒト化することにより治療薬として使用できる抗CD20モノクローナル抗体が作製された。これにより、本発明は完成された。
【０００９】
本発明は、以下のものを提供する。
（１）エフェクター細胞非存在下でのヒトCD20抗原発現細胞培養において該CD20抗原発現細胞に対してアポトーシスを含む増殖阻害活性を有するマウス由来抗CD20モノクローナル抗体。
（２）H鎖可変領域アミノ酸配列とL鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせがそれぞれ配列番号１及び７、配列番号２及び８、又は配列番号１５及び１７である（１）の抗CD20モノクローナル抗体。
（３）（１）又は（２）の抗CD20モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（４）（２）の抗CD20モノクローナル抗体の可変領域アミノ酸配列とヒトイムノグロブリン定常域アミノ酸配列を融合させたキメラ抗CD20モノクローナル抗体。
（５）（２）の抗CD20モノクローナル抗体の可変領域CDRのアミノ酸配列とヒトイムノグロブリンのアミノ酸配列を用いてヒト化された抗CD20モノクローナル抗体。
（６）H鎖可変領域アミノ酸配列のL鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせがそれぞれ配列番号１９及び２３、配列番号１９及び２４、配列番号１９及び２５、配列番号１９及び２６、配列番号２０及び２３、配列番号２０及び２４、配列番号２０及び２５、配列番号２０及び２６、配列番号２１及び２３、配列番号２１及び２４、配列番号２１及び２５、配列番号２１及び２６、配列番号２２及び２３、配列番号２２及び２４、配列番号２２及び２５、又は配列番号２２及び２６である（５）のヒト化抗CD20モノクローナル抗体。
（７）ヒト補体存在下でCD20抗原発現細胞に対して細胞障害性を有する（４）〜（６）のいずれか１項の抗CD20モノクローナル抗体。
（８）（４）〜（７）のいずれか１項の抗CD20モノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を組み込んだ哺乳動物細胞。
（９）CHO細胞である（８）の哺乳動物細胞。
（１０）H鎖可変領域アミノ酸配列とL鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせがそれぞれ配列番号３及び９、配列番号４及び１０、配列番号５及び１１、配列番号６及び１２、又は配列番号１６及び１８であるマウス由来抗CD20モノクローナル抗体。
（１１）（１０）の抗CD20モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（１２）（１０）の抗CD20モノクローナル抗体の可変領域アミノ酸配列とヒトイムノグロブリン定常域アミノ酸配列を融合させたキメラ抗CD20モノクローナル抗体。
（１３）（１０）の抗CD20モノクローナル抗体の可変領域CDRのアミノ酸配列とヒトイムノグロブリンのアミノ酸配列を用いてヒト化された抗CD20モノクローナル抗体。
（１４）ヒト補体存在下でCD20抗原発現細胞に対して細胞障害性を有する（１２）または（１３）の抗CD20モノクローナル抗体。
（１５）（１２）〜（１４）のいずれか１項の抗CD20モノクローナル抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列を組み込んだ哺乳動物細胞。
（１６）CHO細胞である（１５）の哺乳動物細胞。
（１７）（２）、（４）〜（７）、（１０）及び（１２）〜（１４）のいずれかの抗CD20モノクローナル抗体を有効成分とする診断薬。
（１８）（４）〜（７）及び（１２）〜（１４）のいずれかの抗CD20モノクローナル抗体を有効成分とする治療薬。
【００１０】
なお、これらに規定されるモノクローナル抗体のアミノ酸配列はその二次構造及びその生物学的性質を有意に変更しないかぎり他のアミノ酸で置換しても良く、そうしたアミノ酸配列を置換したモノクローナル抗体もこの本出願の請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】組換抗体発現用ベクターpNOW-Abの構造を示す。
【図２】タンパク発現用ベクターpNOW-Agの構造を示す。
【図３】ヒトCD20遺伝子クローニング用プライマー配列を示す。
【図４】マウス由来抗CD20モノクローナル抗体可変領域H鎖及びL鎖のアミノ酸配列を示す。
【図５】マウス由来抗CD20モノクローナル抗体のアポトーシス試験結果を示す。
【図６】マウス由来抗CD20モノクローナル抗体による細胞増殖阻害試験結果を示す。
【図７】キメラ抗CD20モノクローナル抗体による補体依存性細胞障害性試験結果を示す。
【図８Ａ】ヒト化抗CD20モノクローナル抗体可変領域H鎖及びL鎖のアミノ酸配列、及びそれらに対応する塩基配列を示す。
【図８Ｂ】ヒト化抗CD20モノクローナル抗体可変領域H鎖及びL鎖のアミノ酸配列、及びそれらに対応する塩基配列を示す。
【図９】ヒト化抗CD20モノクローナル抗体による細胞増殖阻害試験結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において、「抗体」という用語は、抗体全般及びそれを構成するH鎖及びL鎖、及びそれらのフラグメントを包含する意味で用いる。【００１３】
本発明は、細胞膜上のヒトCD20抗原に結合し、治療効果を誘導するのに望ましい生物学的活性を有する抗CD20モノクローナル抗体に関する。【００１４】
本発明の第１の態様の抗体は、細胞膜上のヒトCD20抗原に対して特異的に結合するモノクローナル抗体であって、エフェクター細胞の助けを借りることなくヒトCD20抗原発現細胞培養において該ヒトCD20抗原発現細胞に対してアポトーシスを含む増殖阻害活性を有する抗体である。これはオリジナルにはマウス由来抗CD20モノクローナル抗体であり、さらにはこれらをキメラ化又はヒト化した抗CD20モノクローナル抗体をも含む。これらの抗体は、エフェクター細胞の助けを借りることなくin vitroヒトCD20抗原発現細胞培養において該CD20抗原発現細胞に対してアポトーシスを含む直接的な増殖阻害活性を有する。これらのキメラ化又はヒト化した抗CD20モノクローナル抗体は、補体依存性及び／又は抗体依存性の細胞障害性を有する。【００１５】
細胞膜上のCD20抗原への結合性は、SB細胞やRaji細胞などのCD20発現細胞をプレートに付着させ被検体であるモノクローナル抗体を反応させるCell ELISAにより調べることが出来る。しかしながら、それらの細胞のCD20抗原の発現量が充分ではないことから反応性は鋭敏でない。このため、本発明では遺伝子組換によりCD20を多量に発現させたCHO細胞（CD20/CHO細胞）をプレートに付着させ、被検体であるモノクローナル抗体を反応させる方式のCell ELISAが開発された。本発明中の予備試験において、CD20/CHO細胞を用いたCell ELISAはモノクローナル抗体の反応性試験においてSB細胞又はRaji細胞を用いたCell ELISAと同様のパターンを示し、且つ鋭敏であることが確認されている（実施例：CD20/CHO Cell ELISAスクリーニング法の確立、表１を参照）。【００１６】
エフェクター細胞非存在下でのin vitroヒトCD20抗原発現細胞培養における直接的な細胞増殖阻害活性の測定は一般的方法により測定できる（Miyamoto T et al. Avian Dis. Vol 46(1), 10-16)。また、アポトーシス誘導能はフローサイトメトリー（Annexin V/ PI staining）を用いた試験により測定が可能である。【００１７】
第１の態様の抗体の事例には、H鎖可変領域アミノ酸配列とL鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせがそれぞれ配列番号１及び７、配列番号２及び８、又は配列番号１５及び１７で規定されるマウス抗CD20モノクローナル抗体、さらにはこれらをキメラ化又はヒト化した抗CD20モノクローナル抗体が含まれる。これらの抗体は、エフェクター細胞の助けを借りることなくin vitroヒトCD20抗原発現細胞培養において該CD20抗原発現細胞に対してアポトーシスを含む直接的な増殖阻害活性を有する。これらは又補体依存性及び／又は抗体依存性の細胞障害性をも有する。本発明には、マウス由来抗体を産生するハイブリドーマ、及びキメラ抗体又はヒト化抗体のアミノ酸配列に対応する塩基配列を組み込んだ哺乳動物細胞、（実施例ではCHO細胞）も含まれる。【００１８】
キメラ化は、マウス由来モノクローナル抗体のH鎖可変領域アミノ酸配列とヒトイムノグロブリンH鎖定常領域アミノ酸配列、L鎖可変領域アミノ酸配列とヒトイムノグロブリンL鎖定常領域アミノ酸配列を融合させることにより行われ（Ishida T et al. Nippon Rinsho Vol 60, No 3, 439-444）、ヒト化は、マウス由来モノクローナル抗体の可変領域CDRアミノ酸配列とヒトイムノグロブリンのアミノ酸配列を用いてデザインされる。治療薬として好ましいヒト化抗CD20モノクローナル抗体はさまざまにデザインされた抗体の特性を比較することにより選択される（Padlan EA, Mol Immunol Vol 28, No 4/5, 489-498；Wu TT and Kabat EA, Mol Immunol Vol 29, No 9, 1141-1146；Padlan  EA et al., FASEB J Vol 9, 133-139）。【００１９】
キメラ化又はヒト化した抗CD20モノクローナル抗体は、さらに補体依存性細胞障害性(CDC)及びエフェクター細胞存在下で抗体依存性細胞障害性（ADCC）を有する。これらのCDC及びADCCに関する試験方法については一般的に使用されている方法を参照することができる（Manches O et al., Blood 2003; 101(3):949-54; Idusogie EE et al.. J Immunol 2000; 164: 4178-4184）。【００２０】
具体的なヒト化抗CD20モノクローナル抗体の事例は、H鎖可変領域アミノ酸配列とL鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせがそれぞれ配列番号１９及び２３、配列番号１９及び２４、配列番号１９及び２５、配列番号１９及び２６、配列番号２０及び２３、配列番号２０及び２４、配列番号２０及び２５、配列番号２０及び２６、配列番号２１及び２３、配列番号２１及び２４、配列番号２１及び２５、配列番号２１及び２６、配列番号２２及び２３、配列番号２２及び２４、配列番号２２及び２５、又は配列番号２２及び２６で示される。【００２１】
本発明の第２の態様の抗体は、細胞膜上のヒトCD20抗原に対して特異的に結合するマウス由来のモノクローナル抗体であるが、アポトーシスを含む増殖阻害活性を示さないかもしくはその活性がそれほど高くないものである。しかしながら、これらのマウス由来抗体は、キメラ化又はヒト化することによってCDC又はADCC活性を獲得することが可能である。これらの細胞障害性活性も重要な生物学的活性であり、それ故に第２の態様の抗CD20モノクローナル抗体も治療薬としての有望な候補になり得る。【００２２】
第２の態様の抗体の事例には、H鎖可変領域アミノ酸配列とL鎖可変領域アミノ酸配列の組み合わせがそれぞれ配列番号３及び９、配列番号４及び１０、配列番号５及び１１、配列番号６及び１２、又は配列番号１６及び１８であるマウス由来抗CD20モノクローナル抗体、さらにはこれらをキメラ化又はヒト化した抗CD20モノクローナル抗体が含まれる。本発明には、該マウス由来抗体を産生するハイブリドーマ、及び該キメラ抗体及び該ヒト化抗体のアミノ酸配列に対応する塩基配列を組み込んだ哺乳動物細胞、（実施例ではCHO細胞）も含まれる。【００２３】
細胞膜上のCD20抗原への結合性の判定法、増殖阻害、アポトーシス、ADCC、CDCなど各種試験法、及びキメラ又はヒト化抗体の作製法は第１の態様の抗体の場合と同様の方法による。【００２４】
第１の態様及び第２の態様の抗体として記載するキメラ抗CD20モノクローナル抗体又はヒト化抗CD20モノクローナル抗体は、共にB細胞性悪性腫瘍およびB細胞又はB細胞が産生する抗体が関与する免疫疾患に対する治療薬として優れた効果をもつことが期待でき、本発明はキメラ又はヒト化した抗CD20モノクローナル抗体のいずれか、望ましくはヒト化抗CD20モノクローナル抗体を有効成分とする治療薬の開発に供することを目的とする。対象疾患としては、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、慢性関節リウマチ、自己免疫溶血性貧血症、特発性血小板減少症紫斑病、全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、シェーグレン症候群、クローン病、強皮症、多発性硬化症、I型糖尿病などが挙げられる。【００２５】
本発明のマウス由来モノクローナル抗体は以下の方法で作製することができる。【００２６】
感作免疫抗原として、ヒトCD20抗原を発現する細胞株であるSB細胞、Raji細胞又はヒトCD20抗原を発現させたCHO細胞を組み合わせて用いることができる。また、GSTを融合させたヒトCD20タンパク（GST-CD20）を補完的な感作抗原として用いることもある。【００２７】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製は、（１）被免疫動物である動物（マウス）への免疫、（２）免疫された動物からのリンパ球の調製、（３）親細胞の調製、（４）リンパ球と親細胞の細胞融合、（５）スクリーニング、及び（６）クローニングという一連の手続きにより行うことができる（Ailsa M. Campbell (著), 大沢 利昭 (訳) 生化学実験法；モノクローナル抗体、東京化学同人、1989年）。細胞表面のCD20抗原に特異的に結合する抗CD20モノクローナル抗体のクローニングは、CD20/CHO細胞をプレートに固定したCell ELISAに被検体であるモノクローナル抗体を反応させることにより行うことができる。発現ベクターは市販のものでも可であるが、CHO細胞上にCD20抗原を高密度に発現させる必要があることから哺乳動物細胞高発現ベクターpNOW (特許第3582965号公報)を使用してもよい。モノクローナル抗体の選択基準は、陽性コントロールとの比較において同程度以上の反応性を示すものとする。【００２８】
キメラ化及びヒト化抗体の作製は通常の遺伝子組換法に拠ればよい。例えば、発現ベクターは抗体産生用に２セットのマルチクローニングサイトをタンデムに並べ、且つヒトのH鎖及びL鎖の定常域遺伝子が予め組み込まれたpNOW-Abを用いることができる（図１）。
【実施例１】
【００２９】
CD20抗原に対するモノクローナル抗体の作製、キメラ化及びヒト化、さらに得られた抗体の特性に関する試験を、実施例に基づいて説明する。【００３０】
（１）マウス感作用免疫抗原の作製
ヒトCD20全分子をコードする遺伝子に特異的な配列番号１３に記載の５’プライマー及び配列番号１４に記載の３’プライマーを用いてcDNAライブラリーからヒトCD20遺伝子を切り出した（Multiple Choice cDNA human spleen, Origene Technologies, Inc. 6 Taft Court, Suite 100, Rockville, MD 20850）。具体的には図３に記載のプライマーを用いた。CD20遺伝子は哺乳動物細胞用高発現ベクターであるpNOW-Ag（図２）に組み込まれた後、宿主細胞であるCHO細胞にトランスフェクトされた。FACS分析により、細胞表面にCD20分子を高発現している組換CHO細胞（CD20/CHO細胞）を樹立した。なお、FITC標識抗CD20モノクローナル抗体で染色した場合にSB細胞に比べて蛍光強度が5倍以上のものを高発現しているものとした。補完的な免疫原のGST-CD20は、pGEX-4T2ベクターを用いてCD20細胞外ドメインの43アミノ酸のN末にGSTを融合させることにより作製した（G et al. AM , Electrophoresis  Vol 20(2):344-348）。【００３１】
（２）免疫原の調製
SB細胞またはRaji細胞は10％FCS添加RPMI1640培地を用いて培養を行った。CD20/CHO細胞は、G418を800μg/ml添加したCHO-S-SFM II培地（GIBCO、Cat. No. 12052-098）を用いて培養を行った。これらの培養液を遠心分離（1100rpm、5分）した後、細胞にDulbecco's PBS(-)を加えて懸濁させ再度遠心分離した。この洗浄操作をもう一度繰り返し、細胞に生理食塩水を加えて調製した懸濁液（1ml当たりの細胞数は1〜3×107である）を免疫に用いた。GST-CD20が組み込まれたpGEX-4T2はE. coliコンペテントセルに導入された。該コンペテントセルは培養の後溶解され、GST-CD20は溶解細胞から粗精製した後0.1 N苛性ソーダを加えて可溶化された。【００３２】
（３）免疫及び細胞融合
被免疫動物には7〜11週令のBalb/c系雌性マウスを使用した。SB細胞、Raji細胞及びCD20/CHO細胞のうちいずれかの細胞をさまざまな日数間隔で2〜3回繰り返して投与した後、それとは異なった細胞抗原(SB細胞、Raji細胞又はCD20/CHO細胞）を選び最終免疫に使用した。投与した細胞数はいずれもマウス1匹当たり1〜3×107個であった。また、一部のマウスの事例ではGST-CD20を用いて補完的な免疫を行った。最終免疫の3日後にマウスの脾臓細胞を取り出し、RPMI培地中で懸濁した後、PEG-1500の存在下でマウスミエロ−マ(NS-1)との融合反応を行なった（Oi,V.T. et. Herzenberg, 1980, in:Selected Methods in Cellular Immunology；Mishell B et al (Freeman and Co.San Francisco, CA) p.351.)。【００３３】
（４）CD20/CHO Cell ELISAスクリーニング法の確立
SB細胞、Raji細胞、CD20/CHO細胞及びCD20のCHO親株をそれぞれ付着させた96ウェルプレートを用いて、幾つかのマウス由来抗CD20モノクローナル抗体と2B８を反応させた。これらのCell ELISAは抗体濃度に対して同様の傾向を示すことが確認され、抗体間及びコントロールとの相対比較も可能であることが判明した。CD20 CHO細胞ELISAはプレートに付着させた細胞表面の抗原密度が高いことから、被検抗体サンプルが比較的低濃度であっても充分に検出可能なレベルの吸光度を示し、鋭敏な測定系であることが判明した。具体的な測定結果を表１に示す。【００３４】
【表１】
0004813465.tif 000002
【００３５】
（５）Cell ELISAによるスクリーニング
CD20/CHO細胞またはCHO細胞（CD20親株）を付着させた96ウェルプレートを用いてCell ELISAを行い、CD20に特異的に反応する抗体を産生しているウェルを選択した。陽性コントロールには2B8を用い、陰性コントロールにはヒトCD3抗原に対するマウスモノクローナル抗体(BD PharMingen社)を用いた。具体的には、Poly-L-Lysineコート96ウェルプレート（旭テクノグラス、Cat.No.11-023-018）に付着させたCD20/CHO細胞またはCHO細胞（親株）をCell ELISAに用いた。その各ウェルにブロッキング液（0.2%-Gelatine, 0.5%-BSAのPBS溶液）を150μl入れて37℃で1時間静置した。150mM-NaCl, 0.05%-Tween20水溶液を用いてプレートを5回洗浄した後、サンプル（培養上清の希釈液）を各ウェルに100μl入れて1次反応を37℃で1時間行なった。洗浄後、標識抗体の希釈液〔HRP標識抗マウスIgG(H+L) ウサギ抗体（Jackson Lab. Code No. 315-035-003）、またはHRP標識抗マウスIgG(Fcγ) ウサギ抗体（Jackson Lab. Code No. 315-035-008）〕を各ウェルに100μl入れて2次反応を37℃で1時間行なった。1次、2次の反応液の調製には、ブロッキング液と同じものを用いた。洗浄後、発色液（OPD）を各ウェルに100μl入れ30分後に4N-H2SO4を50μl加えて反応を停止し、A492を測定した。結果、2B8と同程度ないし有意に高い反応性を示したウェルを選択した。【００３６】
（６）クローニング
限界希釈法で行った。細胞を96ウェルプレートに撒いて培養後、１コロニーのウェルの培養上清についてCD20/CHO細胞Cell ELISAを行い、特異抗体の産生クローンを選択した。【００３７】
（７）精製抗体の調製
特異抗体の産生クローンを10%FCS添加RPMI1640培地で培養し、細胞密度が5×105/ml前後になった時点で無血清培地ASF-104N（味の素）に培地を交換して培養を行った。その2〜4日後に培養液を遠心分離して培養上清を回収したあと、プロテインＧカラムを用いて精製を行い、溶出されたモノクローナル抗体溶液を150mM-NaClに対して透析した。0.2 μｍのフィルターでろ過滅菌を行ない、試験抗体（抗ヒトCD20マウスモノクローナル抗体）とした。【００３８】
CD20/CHO Cell ELISA法を用いて陽性コントロールに匹敵する結合親和性を有するモノクローナル抗体クローンを選別した。それらの抗体の可変領域について遺伝子配列の決定を行い、その結果としてアミノ酸配列を決定した。代表的な抗体のＨ鎖V領域及びＬ鎖V領域の配列を、配列番号１及び７、配列番号２及び８、配列番号３及び９、配列番号４及び１０、配列番号５及び１１、配列番号６及び１２、配列番号１５及び１７、配列番号１６及び１８に示す（図４）。さらにそれらのクローンについて生物学的特性が調べられた。【００３９】
生物学的特性試験（１）アポトーシス誘導試験
フローサイトメトリー（Annexin V/ PI staining）を用いて試験抗体のアポトーシス誘導能を測定した。陽性コントロールには2B8、陰性コントロールにはヒトCD3に対するマウスモノクローナル抗体(BD PharMingen社)]を用いた。操作手順は次のとおりである。【００４０】
MEBCYTOApoptosis Kit (MBL, Cat.No.4700, Lot.20)を用いて行った。
Raji細胞を遠心後、10% FCS（非動化済）(ICN, Cat.No.2916754, Lot.8005C)を含む新鮮なRPMI1640培地(Sigma, Cat.No.R8758, Lot.44K2416)で懸濁し、12ウェルプレートの各ウェルに5×105細胞/mlの密度で1mlを入れた。各抗体あたり12ウェルを用い、各抗体を終濃度2μg/ml又は4μg/mlになるよう添加した。（３ウェル×２種濃度×２時点、計１２ウェル）【００４１】
培養開始１日後及び２日後に、2×105個程度分の細胞を含む培養液を回収し、遠心後PBSで1回洗浄した。次に85μl Binding bufferを加え懸濁した。さらに、Annexin V-FITC 10μlとPI 5μlを加えてよく混和した後、遮光、室温で15分間反応させた。フローサイトメトリー(FACS Calibur、Becton Dickinson)を用いて測定し、CellQuest（Becton Dickinson）で解析を行った。【００４２】
代表的な８種類のマウス由来抗CD20モノクローナル抗体と陽性コントロール(2B8)、陰性コントロール(抗CD3抗体)の測定結果を図５に示した。一般に2B8のアポトーシスの誘導能は高いとされるが、H鎖可変領域アミノ酸配列とL鎖可変領域がそれぞれ配列番号２及び８のアミノ酸配列を有するクローン(1K1791)はそれとの比較においても際立って高いアポトーシス誘導が観察された。H鎖可変領域アミノ酸配列とL鎖可変領域がそれぞれ配列番号１及び７(1K1422)、又は配列番号１５及び１７(1K0924)のクローンにおいても明らかなアポトーシスによる細胞死が観察された。【００４３】
生物学的特性試験（2）細胞増殖阻害試験
5×104個/mlのRaji細胞懸濁液を10%FCS添加RPMI1640培地で調製して96ウェルプレートに100μl/ウェルずつ入れて培養した。24時間後、抗体濃度がそれぞれ0.01μg/ml, 0.1μg/ml及び1μg/mlになるように各抗体溶液を50μl/ウェル添加して培養を継続した。抗体添加72時間後に発色色素Cell Counting Kit-8(同仁化学  Cat.No.343-07623，Lot. SG076)を10μl/ウェル加え、さらに4時間培養した後で波長492ｎｍにおける吸光度を測定した。図６に代表的な８つのマウス由来抗CD20モノクローナル抗体と陽性コントロール（2B8）の生細胞数測定値を、陰性コントロール（100%）に対する割合として示す。細胞増殖阻害効果は、陰性コントロールとの比較において減少した生細胞数の割合により推定することが可能である。1K0924, 1K1422, 1K1791及び陽性コントロールである2B8において明らかな細胞増殖阻害が観察され、特に1K1791において顕著であった。この傾向は、アポトーシス誘導試験の結果とも一致する。【００４４】
キメラ抗体の作製
それぞれのマウス由来抗体のH鎖およびL鎖の可変領域遺伝子を、ヒトイムノグロブリンH鎖およびL鎖（κ）定常域遺伝子をカセットとして予め有するCHO細胞用高発現ベクターpNOW-Abに組み込んだ。該発現ベクターをCHO細胞にトランスフェクトし、それぞれクローンについて生産性の高いものを選別した。【００４５】
キメラ抗体のCD20抗原に対する結合性試験
作製された８つのキメラ抗CD20モノクローナル抗体はCD20/CHO Cell ELISA法によりヒトCD20抗原に対する反応性が調べられた。陽性コントロールにはrituximab (c2B8)を使用した。試験結果を表２に示す。Cell ELISA測定値(A492)は結合性の強さを反映する。c1K0924及びc1K1422の親和性がコントロールと較べてやや低い傾向にあった以外はほぼ同等またはそれ以上の親和性を示した。【００４６】
【表２】
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【００４７】
キメラ抗体のCDC試験
作製された８つのキメラ抗CD20モノクローナル抗体についてCDC活性が調べられた。陽性コントロールにはrituximab (c2B8)を使用した。 標的細胞にはRC-K8（高知大医学部より入手)を用いた。使用培地としてRHB (基礎培地: RPMI-1640, 添加物: 0.1% BSA、20mM HEPES (pH 7.2)、2mM グルタミン、ペニシリンＧ 100unit/ml、ストレプトマイシン100μg/ml)を調製し用いた。標的細胞は、RHBで洗浄後、106 cells/mlになるように再懸濁した。被験キメラ抗体及びrituximabのそれぞれについて濃度の異なる溶液50μl、市販のヒト補体（Quidel, San Diego, CA、Cat. A113）の4倍希釈溶液50μl、及び106 cells/mlの細胞懸濁液50μlを平底の96穴組織培養用プレート（ブラック）の各ウェルに加えた。その150μl/ウェル中の抗体濃度の設定は、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/mlとした。補体介在性細胞溶解を促進するために37℃、5% CO2の条件で2時間インキュベートした。 50μlのAlamer blue (未希釈, Accumed Internationalの処方、Biosource、Cat. DAL1100 )を添加し、さらに同条件で一晩反応させた。プレートを室温下10分置いて冷却させたあと、蛍光マイクロプレートリーダーを使用して、530nm励起, 590nm測定で蛍光を読み取り、結果は蛍光強度 (RFU)で表示された。CDC活性の割合は次の式で計算された。
%CDC activity = 100×｛RFU（抗体無添加） - RFU（抗体添加)）/｛RFU（抗体無添加） - RFU（Triton X-100添加）｝【００４８】
結果を図７に示す。c1K1712以外は陽性コントロールであるC2B2とほぼ同等またはそれ以上のCDC活性を示した。【００４９】
ヒト化抗体の作製
マウス由来抗CD20モノクローナル抗体1K1791の可変領域CDRをもとにヒト化のデザインを行った。アミノ酸配列から構造解析を行い更にデザイン手法を変えることにより、H鎖及びL鎖それぞれ４種類のヒト化配列が作製された（Padlan EA, Mol Immunol Vol 28, No 4/5, 489-498；Wu TT and Kabat EA, Mol Immunol Vol 29, No 9, 1141-1146；Padlan  EA et al., FASEB J Vol 9, 133-139）。H鎖とL鎖各４種類の全ての組み合わせで抗体が作製された。これらのアミノ酸配列を配列番号１９及び２３、配列番号１９及び２４、配列番号１９及び２５、配列番号１９及び２６、配列番号２０及び２３、配列番号２０及び２４、配列番号２０及び２５、配列番号２０及び２６、配列番号２１及び２３、配列番号２１及び２４、配列番号２１及び２５、配列番号２１及び２６、配列番号２２及び２３、配列番号２２及び２４、配列番号２２及び２５、配列番号２２及び２６に示す（図８A及び図８B）。【００５０】
これらH鎖可変領域４種類とL鎖可変領域４種類のアミノ酸配列は、ヒト遺伝子配列において最も使用頻度の高いDNA(塩基)配列に置換され、さらにこの塩基のいくつかは宿主のCHO細胞への適性を考慮して元のアミノ酸を変えることなく変更された（Kim CH et al.. Gene 1997; 15; 199 (1-2): 293-301）。具体的にアミノ酸配列に対応する塩基配列として、それぞれ配列番号１９に対応して配列番号２７、酸配列番号２０に対応して配列番号２８、配列番号２１に対応して配列番号２９、配列番号２２に対応して配列番号３０、配列番号２３に対応して配列番号３１、配列番号２４に対応して配列番号３２、配列番号２５に対応して配列番号３３、配列番号２６に対応して配列番号３４を用いた（図８A及び図８B）。なお、この塩基配列は、それに対応するアミノ酸配列を変更しないかぎり他の塩基を用いて置換しても良い。【００５１】
H鎖可変領域（塩基配列番号２７〜３０）及びL鎖可変領域（塩基配列番号３１〜３４）の合計８種類の塩基配列は合成された後（宝酒造株式会社）、マルチクローニングサイトをもつ哺乳動物細胞用発現ベクターpNOW-Abに組み込んだ。これらのヒト化された抗体遺伝子が組み込まれた該発現ベクターをCHO細胞にトランスフェクトし、それぞれクローンについて生産性の高いものを選別した。【００５２】
ヒト化抗体の生物学的特性試験      細胞増殖阻害試験
5×104個/mlのRaji細胞懸濁液を10%FCS添加RPMI1640培地で調製して96ウェルプレートに100μl/ウェルずつ入れて培養した。24時間後、抗体濃度が0.5μg/mlになるように各抗体溶液を50μl/ウェル添加して培養を継続した。抗体添加72時間後に発色色素Cell Counting Kit-8(同仁化学  Cat.No.343-07623，Lot. SG076)を10μl/ウェル加え、さらに4時間培養した後で波長492ｎｍにおける吸光度を測定した。図９に1K1791由来の16種類のヒト化抗体のうちの15種類（27クローン）と陽性コントロールであるc2B8(rituximabの別称）の生細胞数測定値を、陰性コントロール（100%）に対する割合として示す。細胞増殖阻害効果は陰性コントロールとの比較において減少した生細胞数の割合により推定することが可能であるが、本試験では全てのクローンについて増殖阻害効果が観察された。【００５３】
なお、本発明の明細書及び図表に記載されるモノクローナル抗体名と配列番号は次のように参照できる。【００５４】
【表３】
0004813465.tif 000004
【００５５】
これらのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、産生する抗体の名称により命名され、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(あて名：郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１ 中央第６)に2006年3月28日にブタペスト条約に基づく国際寄託がなされ、受託番号が次の通り付与されている。1K1422: FERM BP-10587、1K1791: FERM BP-10591、1K1712: FERM BP-10588、1K1402: FERM BP-10586、1K1736: FERM BP-10589、1K1782: FERM BP-10590、1K0924: FERM BP-10584、1K1228: FERM BP-10585。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により治療薬として使用するのに適した生物学的活性を有するモノクローナル抗体が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
0004813465.tif 000013
【図９】
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【配列表】
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