(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる２種類の塩基配列からなる２種類のポリヌクレオチド（Ａ）、（Ｂ）を５′末端側のプライマーとして用いてＰＣＲにより転写鋳型を構築する方法において、該２種類のＰＣＲ用プライマーの塩基配列は、該プライマーのいずれか１種類のみで構築されるＤＮＡからの転写が起こらないという条件を満たすものであり、該プライマーの１つはプロモーターの５′末端から少なくともプロモーター機能部位の一部分を含む塩基配列に相補的な配列を有するが、該プロモーターの３′末端側のＲＮＡポリメラーゼ認識部位の少なくとも一部分に相補的な塩基配列をもたない塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ａ）であり、該プライマーの別の１つは該プロモーターの３′末端から少なくともＲＮＡポリメラーゼ認識部位の一部分を含む塩基配列に相補的な塩基配列を有するが、該プロモーターの５′末端側の少なくともプロモーター機能部位に相補的な塩基配列をもたない塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｂ）であり、並びにポリヌクレオチド（Ａ）の３′末端側の塩基配列とポリヌクレオチド（Ｂ）の５′末端側の塩基配列が重複していることを特徴とする転写鋳型の構築方法。
【請求項２】
ポリヌクレオチド（Ｂ）の塩基配列に、さらに続けてＧＡ若しくはＧＡＡ配列を挿入し、その下流に、ｍＲＮＡの翻訳増幅を与える塩基配列と、さらに、翻訳開始コドンＡＴＧ、または目的とする遺伝子のＯＲＦ（翻訳枠）の一部の若しくはＯＲＦを含まないＯＲＦ上流の塩基配列に相補的な塩基配列とを連結した塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いる請求項１に記載の転写鋳型の構築方法。
【請求項３】
ポリヌクレオチドの翻訳部の開始コドンとＯＲＦとの間に、タグまたはエピトープ合成用の塩基配列を組み込むことを特徴とする請求項２に記載の転写鋳型の構築方法。
【請求項４】
無細胞タンパク質合成法に用いる翻訳鋳型分子を作成するための転写鋳型をＰＣＲ法で作成する方法において、該転写鋳型の５′末端側のプライマーとして、配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列表の配列番号３に記載の塩基配列にタバコモザイクウイルス由来のオメガ配列と翻訳開始コドンであるＡＴＧを連結した塩基配列からなるポリヌクレオチド；および配列表の配列番号５に記載の塩基配列に翻訳開始コドンであるＡＴＧと、これに続いて転写目的である遺伝子固有のＯＲＦの５′末端側塩基配列とを連結した塩基配列からなるポリヌクレオチド；とを用い、該転写鋳型の３′末端側のプライマーとして、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることを特徴とする転写鋳型の構築方法。
【請求項５】
転写鋳型をＰＣＲ法で作成するためのプライマーセットであって、５′末端側プライマーとして、プロモーターの５′末端から少なくともプロモーター機能部位の一部分を含む塩基配列に相補的な配列を有するが該プロモーターの３′末端側のＲＮＡポリメラーゼ認識部位の少なくとも一部分に相補的な塩基配列をもたない塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ａ）、該プロモーターの３′末端から少なくともＲＮＡポリメラーゼ認識部位の一部分を含む塩基配列に相補的な塩基配列を有するが該プロモーターの５′末端側の少なくともプロモーター機能部位に相補的な塩基配列をもたない塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｂ）、およびポリヌクレオチド（Ｂ）にアニーリングできる塩基配列に続いて翻訳開始コドンＡＴＧ、または目的とする遺伝子のＯＲＦ（翻訳枠）の一部の若しくはＯＲＦを含まないＯＲＦ上流の塩基配列に相補的な塩基配列を連結してなるポリヌクレオチド（Ｃ）と、３′末端側プライマーとして遺伝子をクローン化したベクターの薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子の転写ターミネーター配列と一部Ｏｒｉを含む間に存在する塩基配列と相補鎖を形成し得る塩基配列を含むポリヌクレオチドと、を含むプライマーセットであって、ここで、ポリヌクレオチド（Ａ）の３′末端側の塩基配列とポリヌクレオチド（Ｂ）の５′末端側の塩基配列が重複していることを特徴とするプライマーセット。
【請求項６】
ポリヌクレオチド（Ｂ）が、プロモーターの３′末端から少なくともＲＮＡポリメラーゼ認識部位の一部分を含む塩基配列に相補的な塩基配列を有するが、該プロモーターの５′末端側の少なくともプロモーター機能部位に相補的な塩基配列をもたない塩基配列に続いて、ＧＡ若しくはＧＡＡ配列を挿入し、その下流にさらにｍＲＮＡの翻訳増幅を与える配列を連結し、さらに、翻訳開始コドンＡＴＧ、または目的とする遺伝子のＯＲＦを含まないＯＲＦ上流の塩基配列に相補的な配列を連結した塩基配列からなるポリヌクレオチドである請求項５に記載のプライマーセット。
【請求項７】
配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列表の配列番号３に記載の塩基配列にタバコモザイクウイルス由来のオメガ配列と翻訳開始コドンであるＡＴＧを連結した塩基配列からなるポリヌクレオチド；および配列表の配列番号５に記載の塩基配列に翻訳開始コドンであるＡＴＧとこれに続いて転写目的である遺伝子固有のＯＲＦの５′末端側塩基配列とを連結した塩基配列からなるポリヌクレオチド；とを５′末端側のプライマーとして含み、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを３′末端側のプライマーとして含み、無細胞 タンパク質合成法に用いる翻訳鋳型分子を構築するための転写鋳型をＰＣＲにより作成するためのプライマーセット。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の構築方法で作成された転写鋳型から転写されたｍＲＮＡを翻訳鋳型として用いる無細胞タンパク質合成法。
【請求項９】
ｍＲＮＡを合成後にゲルろ過により精製する請求項８に記載の無細胞タンパク質合成法。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の構築方法で転写鋳型を作成し、転写用溶液により転写反応を行った後に、無細胞 タンパク質合成用反応溶液を添加して、添加後の反応溶液中の少なくともマグネシウム濃度を翻訳至適濃度に低下し、同時に該反応溶液中の転写基質および転写副生物の濃度を低下し、翻訳反応の持続時間を延長することを特徴とする転写および翻訳連続型希釈方式の無細胞タンパク質合成法。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の構築方法で転写鋳型を作成し、無細胞 タンパク質合成用反応溶液により転写反応を行った後に、希釈溶液を添加して希釈し、当該反応溶液中の少なくともマグネシウム濃度を翻訳至適濃度に低下し、同時に該反応溶液中の転写基質および転写副生物の濃度を低下し、翻訳反応の持続時間を延長することを特徴とする転写および翻訳一体型希釈方式の無細胞タンパク質合成法。
【請求項１２】
反応容器中にｃＤＮＡを添加し、請求項１〜４のいずれか１項に記載の転写鋳型の構築方法を実施して該反応容器中で転写鋳型を作成し、ＲＮＡポリメラーゼと４種類のリボヌクレオシド３リン酸を含む転写用溶液により転写反応を行った後、無細胞 タンパク質合成用反応溶液をさらに添加して、反応溶液中の少なくともマグネシウム濃度を翻訳至適濃度に低下し、翻訳反応を行うことを特徴とする転写および翻訳連続型希釈方式の無細胞タンパク質合成法。
【請求項１３】
反応容器中にｃＤＮＡを添加し、請求項１〜４のいずれか１項に記載の転写鋳型の構築方法を実施して該反応容器中で転写鋳型を作成し、ＲＮＡポリメラーゼと４種類のリボヌクレオシド３リン酸を含む無細胞 タンパク質合成用反応溶液を加えて転写反応を行った後、希釈溶液を添加して希釈し、当該合成溶液中の少なくともマグネシウム濃度を翻訳至適濃度に低下し、翻訳反応を行うことを特徴とする転写および翻訳一体型希釈方式の無細胞タンパク質合成法。
【請求項１４】
マグネシウム濃度を１ｍＭから６ｍＭに低下する請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成法。
【請求項１５】
転写反応を３０℃〜４５℃で実施し、且つ翻訳反応を２０℃〜３０℃で実施することを特徴とする請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成法。
【請求項１６】
コムギ胚芽抽出物を用いることを特徴とする請求項８〜１５のいずれか１項に記載の無細胞タンパク質合成法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、無細胞タンパク質合成システムに用いる翻訳鋳型を遺伝子から合成するための転写鋳型の一般的な設計原理とその構築、およびこの転写鋳型を用いる簡便で高効率なコムギ胚芽無細胞タンパク質合成法に関する。
背景技術
ゲノム計画の完了を間近に控えて、研究課題の中心が遺伝子構造解析から遺伝子機能解析へと急速に展開してきている。細胞内におけるタンパク質は、それが単独で機能しているのではなく、多種多様なタンパク質因子、核酸、低分子種、並びに細胞膜成分等と協調して相互作用することにより機能発現し、さらに該相互作用の総和として生物学的機能が営まれているものと考えられている。
ポストゲノム計画の中心課題の一つは、多種多様なタンパク質因子の複合体の構造と機能の関係を解析することである。ここから得られる成果は、構造生物学や生化学を含む基礎生物学等の研究から、その応用としての医学分野における遺伝子翻訳産物と病因との関係解明、さらには医薬の開発および生産に至る広い分野に極めて重要な知見を提供するものと期待されている。
細胞内で効率良く進行するタンパク質合成反応を生体外で行なう方法として、これまでに例えば細胞内に備わるタンパク質翻訳装置であるリボソーム等を含む成分を生物体から抽出し、この抽出液に翻訳鋳型、基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、並びにその他の有効因子を加えて試験管内でタンパク質を合成する、いわゆる無細胞タンパク質合成法等の研究が盛んに行われてきている（特開平６−９８７９０、特開平６−２２５７８３、特開平７−１９４、特開平９−２９１、特開平７−１４７９９２）。
この無細胞タンパク質合成のための反応系、すなわち無細胞タンパク質合成系に用いるタンパク質合成用の細胞抽出液または生体組織抽出液の調製には、大腸菌、コムギ胚芽、または家兎網状赤血球等が用いられている。無細胞タンパク質合成系は、ペプチド合成速度と翻訳反応の正確性の２点において、生細胞に匹敵する性能を保持し、且つ複雑な化学反応工程や煩雑な細胞培養工程を必要としない利点を有するため、これまでその実用的なシステムの開発がなされてきた。しかし、一般的に生物体の細胞から抽出した細胞抽出液はそのタンパク質合成能が極めて不安定なためにタンパク質合成効率が低く、さらに保存中の細胞抽出液の品質低下も著しかったので、無細胞タンパク質合成系で得られる合成物の量は、放射性同位体標識等によって検出可能な程度の少量であった。そのため、無細胞タンパク質合成系は、実用的なタンパク質の生産方法としては利用できなかった。
従来の効率的な無細胞タンパク質合成法としては、Ｓｐｉｒｉｎらによって開発された連続式無細胞タンパク質合成法〔Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２１７，１２３−１４２〕を挙げることができる。彼らは、目的遺伝子を組み込んだ発現プラスミドを、大腸菌、コムギ胚芽、またはウサギ網状赤血球から調製した細胞抽出液を用いた転写および翻訳共役無細胞タンパク質合成系に添加することにより、タンパク質を効率よく合成できることを示した。なかでも大腸菌抽出液を使用する転写および翻訳共役無細胞タンパク質合成系を用いた連続式無細胞タンパク質合成法では、反応系１ｍｌ当り最大で１ｍｇ前後の産物が得られることを報告している。
しかしながら、大腸菌を用いる無細胞タンパク質合成系は、目的遺伝子を組み込んた発現プラスミドを鋳型として、特に該プラスミドを環状型で用いた場合には高いタンパク質合成能を発揮するものの、直鎖プラスミドやポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（以下、ＰＣＲと省略する）法で構築した直鎖型転写鋳型を用いると、大腸菌抽出液に混入しているＤＮＡ分解酵素の作用により２時間程度の短時間で鋳型ＤＮＡが分解されるため、合成できるタンパク質量は従来のバッチ法と同レベルの反応系１ｍｌ当り数十μｇ程度に低下するという欠点がある。このように従来法で大腸菌、コムギ胚芽、またはウサギ網状赤血球等から調製された無細胞タンパク質合成用の細胞抽出液または組織抽出液には、一群の核酸分解酵素、翻訳阻害タンパク質因子、タンパク質分解酵素等が混入しており、それらの作用によりタンパク質合成反応中に翻訳反応系の失活や不活性化が生じる〔Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８，６５２２−６５３１〕。このため、いずれの細胞抽出液または組織抽出液を用いるタンパク質合成系でも、合成効率が低く、得られるタンパク質量は少なかった。
最近、発明者らは、これらの無細胞タンパク質合成系の欠点を解決する方法、すなわち、▲１▼無細胞タンパク質合成用細胞抽出物製剤および無細胞タンパク質合成法（ＷＯ００／６８４１２号公報）、▲２▼汎用性並びに高効率機能を備えた鋳型分子およびこれを利用する方法（ＷＯ０１／２７２６０号公報）を提供し、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質合成効率を格段に高めることに成功している。発明者らの開発したコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系には核酸分解酵素や翻訳反応阻害因子群が含まれない〔Ｍａｄｉｎ  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９−５６４〕（ＷＯ００／６８４１２号公報）ので、これまで困難であった直鎖ＤＮＡを転写鋳型として用いた効率の高いタンパク質合成の実施が可能となった。
一方、上記高効率コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系に用いる転写鋳型の調製は、従来のＰＣＲ法を利用する鋳型ＤＮＡ構築法により行われている。この方法においてはプライマーとして、ＲＮＡポリメラーゼの認識および結合部位であるベクターのプロモーター部位の全域と、翻訳増幅やｍＲＮＡの安定化に寄与する構造と、これらに続いて目的とする遺伝子のＯＲＦ（翻訳枠）の一部までを含むものを用いていた。このようなプライマーを用いて、目的とする遺伝子からの無細胞タンパク質合成用転写鋳型の構築が試みられてきた。このため、ＰＣＲ法を用いる従来の転写鋳型の構築方法では、目的とする完全長鎖の転写鋳型の他にも、反応中に生じる非特異的なＤＮＡ増幅のために、プロモーター配列を持つ短鎖のＤＮＡ断片が蓄積する。このようなＤＮＡ断片を排除することは困難なので、上記プライマーを用いたＰＣＲ産物を転写鋳型としてＲＮＡ合成を行うと、得られる分子の大半が、非特異的な短鎖ＤＮＡの転写産物である低分子ＲＮＡとなる。これらのＲＮＡ分子の中には５′翻訳開始配列を持つＲＮＡ断片も含まれており、それらがｍＲＮＡとして認識され翻訳される結果、目的遺伝子の翻訳産物以外に多量の低分子の翻訳産物が生じ、それが目的とする翻訳産物の収量と純度の低下を招く原因となっていた。
このように、完全長のプロモーターに相補的な塩基配列を含む５′末端側プライマーを設計し、これを利用して構築した転写鋳型を用いる従来の翻訳鋳型の構築方法には、目的とする遺伝子の転写効率が極めて低く、且つノイズの高い翻訳鋳型を与えるという大きな欠点があった。
さらに、このようにして構築した転写鋳型を用いても、従来のバッチ式コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系を用いての転写および翻訳一体型による効率的なタンパク質合成は、転写反応と翻訳反応における至適マグネシウム濃度が著しく異なることから不可能とされていた。また、転写基質の残存物である４種類のリボヌクレオシド３リン酸（４ＮＴＰｓ）や副生成物のピロリン酸が翻訳反応を強く阻害することも、無細胞タンパク質合成系の効率が低い原因であった。
ゲノムプロジェクトの進行に伴って、今日では多数の遺伝子構造が解明され、さらに数万種類のｃＤＮＡクローンも単離されてきている。２１世紀の基礎科学や応用科学における遺伝子の機能と構造の解析、プロテオーム解析、医薬品の創製等に向けての第一歩として、まずこの膨大な遺伝子から遺伝子産物としてのタンパク質を簡便に効率良く合成する必要がある。そのための要素技術として、▲１▼高い翻訳鋳型活性を保持するｍＲＮＡの設計、▲２▼ｍＲＮＡ合成用の転写鋳型構築技術と、これを用いる簡便な▲３▼無細胞翻訳技術を確立することが待望されている。
発明の開示
本発明の１態様は、無細胞タンパク質合成法に用いる３′末端非翻訳配列を有する翻訳鋳型分子を作成するための転写鋳型をＰＣＲ法で作成するときに使用する３′末端側のプライマーの塩基配列であって、遺伝子をクローン化したベクターの薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子の転写ターミネーター配列と一部Ｏｒｉを含む配列との間に存在する塩基配列と相補鎖を形成し得る塩基配列を含む塩基配列（１）、配列表の配列番号１に記載の塩基配列（２）、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の主用部を含む塩基配列（３）、前記（１）〜（３）のいずれか１の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列、またはこれらの相補的な塩基配列である。
本発明の１態様は、無細胞タンパク質合成法に用いる翻訳鋳型分子を作成するための転写鋳型をＰＣＲ法で作成するときに使用する５′末端側のプライマーの塩基配列であって、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と部分的に相補性を有する塩基配列を含む塩基配列（４）、配列表の配列番号２若しくは配列表の配列番号３に記載の塩基配列（５）、配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含む塩基配列（６）、前記（５）若しくは（６）の塩基配列の主用部を含む塩基配列（７）、前記（４）〜（７）のいずれか１の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列、またはこれらのいずれか１と相補的な塩基配列である。
本発明の１態様は、無細胞タンパク質合成法に用いる翻訳鋳型分子を作成するための転写鋳型をＰＣＲ法で作成するときに使用する５′末端側のプライマーの塩基配列であって、異なる２種類の塩基配列からなる２種類のポリヌクレオチド（Ａ）、（Ｂ）を５′末端側のプライマーとして用いてＰＣＲにより転写鋳型を構築する方法において、該２種類のＰＣＲ用プライマーの塩基配列は、該プライマーのいずれか１種類のみで構築されるＤＮＡからの転写が起こらないという条件を満たすものであり、該プライマーの１つはプロモーターの５′末端から少なくともプロモーター機能部位の一部分を含む塩基配列に相補的な配列を有するが、該プロモーターの３′末端側のＲＮＡポリメラーゼ認識部位の少なくとも一部分に相補的な塩基配列をもたない塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ａ）であり、該プライマーの別の１つは該プロモーターの３′末端から少なくともＲＮＡポリメラーゼ認識部位の一部分を含む塩基配列に相補的な塩基配列を有するが、該プロモーターの５′末端側の少なくともプロモーター機能部位に相補的な塩基配列をもたない塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｂ）であることを特徴とする転写鋳型の構築方法である。
本発明の１態様は、ポリヌクレオチド（Ｂ）の塩基配列に、さらに続けてＧＡ若しくはＧＡＡ配列を挿入し、その下流に、ｍＲＮＡの翻訳増幅を与える塩基配列と、さらに、翻訳開始コドンＡＴＧ、または目的とする遺伝子のＯＲＦ（翻訳枠）の一部の若しくはＯＲＦを含まないＯＲＦ上流の塩基配列に相補的な塩基配列とを連結した塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いる前記の転写鋳型の構築方法である。
本発明の１態様は、ポリヌクレオチドの翻訳部の開始コドンとＯＲＦとの間に、ヒスチジンタグやＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）、ｍｙｂ等のタグまたはエピトープ合成用の塩基配列を組み込むことを特徴とする前記の転写鋳型の構築方法である。
本発明の１態様は、無細胞タンパク質合成法に用いる翻訳鋳型分子を作成するための転写鋳型をＰＣＲ法により作成する方法において、該転写鋳型の５′末端側のプライマーとして、配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列表の配列番号３に記載の塩基配列にタバコモザイクウイルス由来のオメガ配列と翻訳開始コドンであるＡＴＧを連結した塩基配列からなるポリヌクレオチド；および配列表の配列番号５に記載の塩基配列に翻訳開始コドンであるＡＴＧと、これに続いて転写目的である遺伝子固有のＯＲＦの５′末端側塩基配列とを連結した塩基配列からなるポリヌクレオチド；とを用い、該転写鋳型の３′末端側のプライマーとして、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを用いることを特徴とする転写鋳型の構築方法である。
本発明の１態様は、転写鋳型をＰＣＲ法で作成するためのプライマーセットであって、５′末端側プライマーとして、プロモーターの５′末端から少なくともプロモーター機能部位の一部分を含む塩基配列に相補的な配列を有するが、該プロモーターの３′末端側のＲＮＡポリメラーゼ認識部位の少なくとも一部分に相補的な塩基配列をもたない塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ａ）、該プロモーターの３′末端から少なくともＲＮＡポリメラーゼ認識部位の一部分を含む塩基配列に相補的な塩基配列を有するが、該プロモーターの５′末端側の少なくともプロモーター機能部位に相補的な塩基配列をもたない塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｂ）、およびポリヌクレオチド（Ｂ）にアニーリングできる塩基配列に続いて翻訳開始コドンＡＴＧ、または目的とする遺伝子のＯＲＦ（翻訳枠）の一部の若しくはＯＲＦを含まないＯＲＦ上流の塩基配列に相補的な塩基配列を連結してなるポリヌクレオチド（Ｃ）と、３′末端側プライマーとして遺伝子をクローン化したベクターの薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子の転写ターミネーター配列と一部Ｏｒｉを含む間に存在する塩基配列と相補鎖を形成し得る塩基配列を含むポリヌクレオチドと、を含むプライマーセットである。
本発明の１態様は、ポリヌクレオチド（Ｂ）が、プロモーターの３′末端から少なくともＲＮＡポリメラーゼ認識部位の一部分を含む塩基配列に相補的な塩基配列を有するが、該プロモーターの５′末端側の少なくともプロモーター機能部位に相補的な塩基配列をもたない塩基配列に続いて、ＧＡ若しくはＧＡＡ配列を挿入し、その下流にさらにｍＲＮＡの翻訳増幅を与える配列を連結し、さらに、翻訳開始コドンＡＴＧ、または目的とする遺伝子のＯＲＦを含まないＯＲＦ上流（５′末端側）の塩基配列に相補的な配列を連結した塩基配列からなるポリヌクレオチドである前記のプライマーセットである。
本発明の１態様は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；配列表の配列番号３に記載の塩基配列にタバコモザイクウイルス由来のオメガ配列と翻訳開始コドンであるＡＴＧを連結した塩基配列からなるポリヌクレオチド；および配列表の配列番号５に記載の塩基配列に翻訳開始コドンであるＡＴＧとこれに続いて転写目的である遺伝子固有のＯＲＦの５′末端側塩基配列とを連結した塩基配列からなるポリヌクレオチド；とを５′末端側のプライマーとして含み、配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを３′末端側のプライマーとして含み、無細胞タンパク質合成法に用いる翻訳鋳型分子を構築するための転写鋳型をＰＣＲにより作成するためのプライマーセットである。
本発明の１態様は、無細胞タンパク質合成法に用いる高効率ｍＲＮＡ合成用の転写鋳型であって、前記いずれかの構築方法で作成された転写鋳型である。
本発明の１態様は、無細胞タンパク質合成法に用いる高効率ｍＲＮＡ合成用の転写鋳型であって、前記いずれかのプライマーセットを用いてＰＣＲにより合成された転写鋳型である。
本発明の１態様は、前記いずれかの構築方法で作成された転写鋳型または前記いずれかの転写鋳型から転写されたｍＲＮＡを翻訳鋳型として用いる無細胞タンパク質合成法である。
本発明の１態様は、ｍＲＮＡを合成後にゲルろ過により精製する前記の無細胞タンパク質合成法である。
本発明の１態様は、前記いずれかの構築方法で転写鋳型を作成し転写用溶液により転写反応を行った後に、無細胞タンパク質合成用反応溶液を添加して、添加後の反応溶液中の少なくともマグネシウム濃度を翻訳至適濃度に低下し、同時に該反応溶液中の転写基質および転写副生物の濃度を低下し、翻訳反応の持続時間を延長することを特徴とする転写および翻訳連続型希釈方式の無細胞タンパク質合成法である。
本発明の１態様は、前記いずれかの構築方法で転写鋳型を作成し、無細胞タンパク質合成用反応溶液により転写反応を行った後に、希釈溶液を添加して希釈し、当該反応溶液中の少なくともマグネシウム濃度を翻訳至適濃度に低下し、同時に該反応溶液中の転写基質および転写副生物の濃度を低下し、翻訳反応の持続時間を延長することを特徴とする転写および翻訳一体型希釈方式の無細胞タンパク質合成法である。
本発明の１態様は、反応容器中にｃＤＮＡを添加し、前記いずれかの転写鋳型の構築方法を実施して該反応容器中で転写鋳型を作成し、ＲＮＡポリメラーゼと４種類のリボヌクレオシド３リン酸を含む転写用溶液により転写反応を行った後、無細胞タンパク質合成用反応溶液をさらに添加して、反応溶液中の少なくともマグネシウム濃度を翻訳至適濃度に低下し、翻訳反応を行うことを特徴とする転写および翻訳連続型希釈方式の無細胞タンパク質合成法である。
本発明の１態様は、反応容器中にｃＤＮＡを添加し、前記いずれかの転写鋳型の構築方法を実施して該反応容器中で転写鋳型を作成し、ＲＮＡポリメラーゼと４種類のリボヌクレオシド３リン酸を含む無細胞タンパク質合成用反応溶液を加えて転写反応を行った後、希釈溶液を添加して希釈し、当該合成溶液中の少なくともマグネシウム濃度を翻訳至適濃度に低下し、翻訳反応を行うことを特徴とする転写および翻訳一体型希釈方式の無細胞タンパク質合成法である。
本発明の１態様は、マグネシウム濃度を翻訳至適濃度に低下し、マグネシウム濃度を約１ｍＭから約６ｍＭに低下する前記いずれかの無細胞タンパク質合成法である。
本発明の１態様は、転写反応を約３０℃〜約４５℃で実施し、且つ翻訳反応を約２０℃〜約３０℃で実施することを特徴とする前記いずれかの無細胞タンパク質合成法である。
本発明の１態様は、コムギ胚芽抽出物を用いることを特徴とする前記いずれかの無細胞タンパク質合成法である。
発明を実施するための最良の形態
これまでに開発されている無細胞タンパク質合成系のなかでも、コムギ胚芽抽出物を利用したものは、大腸菌抽出物を用いたものに比べて特に核酸分解酵素活性が低く、さらに翻訳活性が安定で且つ高い特性を持っているため〔Ｍａｄｉｎ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９−５６４〕、プラスミドを鋳型とした転写および翻訳一体型方式で高効率のタンパク質合成が可能である（ＷＯ００／６８４１２号公報）。
以下、本発明を、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系および該合成系において機能し得る転写鋳型の設計法と構築法を例として説明するが、本発明の基本原理はここに示した方法に限定されるものではなく、他の微生物や動物細胞由来の細胞抽出物を用いた無細胞タンパク質合成系およびそれに用いる転写鋳型の設計と構築にも応用できる。
（転写鋳型の構築に用いるプライマーの構造）
発明者らは、既に安定化され且つ効率化されたコムギ胚芽抽出液を用いる無細胞タンパク質合成系を用いて、高翻訳鋳型活性に必要なｍＲＮＡの５′および３′末端非翻訳構造を開発し、特許出願している（ＷＯ０１／２７２６０号公報）。特に、長鎖の３′末端非翻訳構造をｍＲＮＡに付加することが無細胞タンパク質合成反応の効率を高めるのに極めて有効であることを明らかにしている。
（１）３′末端側プライマーの構築
翻訳鋳型活性を増強するのに有効であって、且つ出来るだけ短い３′末端非翻訳構造を有するｍＲＮＡの転写鋳型をＰＣＲ法により構築するため、モデル遺伝子としてクラゲのグリーン蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＦＰ）遺伝子を組み込んだプラスミド〔図１の（ａ）参照〕を鋳型としてＰＣＲを実施した。
ＰＣＲ法によるＧＦＰ遺伝子の転写鋳型増幅用の５′末端側プライマーには、
0004762481.tif 000002
の塩基配列からなるポリヌクレオチドを使用した。
３′末端側プライマーは、下記の３種類のプライマー（図１を参照）を使用して比較した。プライマーＩＩＩ（配列表の配列番号１）は、薬剤耐性マーカー遺伝子（図１中ではＡｍｐｒ）の転写ターミネーター配列とＤＮＡ複製開始塩基配列（Ｏｒｉ）との間に存在する塩基配列と相補鎖を形成し得る塩基配列であり、プライマーＩおよびＩＩは参考配列である。
0004762481.tif 000003
検討の結果、プライマーＩＩＩが転写鋳型構築用の３′末端側プライマーとして最適であり、高い翻訳鋳型活性を有するｍＲＮＡを得るための好適な転写鋳型を与え得ることを見出した。
無細胞タンパク質合成法に用いる翻訳鋳型分子の３′末端非翻訳配列の転写鋳型となる塩基配列を、ＰＣＲ法を用いて合成するための３′末端側プライマーとしては、上記配列表の配列番号１に記載の塩基配列からなるプライマーＩＩＩが好ましいものとして挙げることができるが、これに限定されるものではなく、遺伝子をクローン化したベクターの薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子の転写ターミネーター配列とＤＮＡ複製開始塩基配列（Ｏｒｉ）を一部含む配列との間に存在する塩基配列、例えば個々のベクター固有の塩基配列、と相補鎖を形成し得る塩基配列を含む塩基配列からなるプライマーであればよく、特定の塩基配列を有するものではない。例えば、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の主用部を含む塩基配列、これらの塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列、またはこれらの相補的塩基配列からなるプライマーであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリタイズする」とは、例えば、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリタイズシグナルが観察されることを意味し、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（コールドスプリングハーバーラボラトリー，１９８９）等に記載の方法によってこの様な塩基配列を得ることができる。
本発明に係る上記３′末端側プライマーを用いれば、翻訳鋳型活性を増強するのに有効であり且つ出来るだけ短い３′末端非翻訳構造を有するｍＲＮＡの転写鋳型が、ＰＣＲ法で簡便に得られる。ＰＣＲ法で長鎖ＤＮＡを増幅することはその反応の性質上一般的に困難を伴う場合が多く、そのために従来困難であった長鎖非翻訳領域が付加されたｍＲＮＡの転写鋳型をＰＣＲ法で構築することが、本発明により可能となった。
（２）ＰＣＲ法による従来方式の５′末端側プライマーを用いる転写鋳型の設計および構築
モデル遺伝子として、ネズミ肝臓由来の３種類のｃＤＮＡ（それぞれ１８ｋＤａ、２５ｋＤａ、４４ｋＤａのタンパク質をコードするもの）と、ＧＦＰ（２７ｋＤａのタンパク質）をコードするｃＤＮＡを、それぞれプラスミドｐＵＣ１９にクローン化したものを利用した。
１段階目のＰＣＲには５′末端側プライマーとして、タバコモザイクウイルスのオメガ（Ω）配列由来の塩基配列（５′ＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡ３′；配列表の配列番号５）を有する下記プライマー３を使用した。以下に示す塩基配列中で下線部のＡＴＧはＯＲＦの開始コドンであり、Ｘは遺伝子固有のＯＲＦの５′末端側塩基配列を意味する。ここでは遺伝子固有のＯＲＦの５′末端側塩基配列として上記各ｃＤＮＡの５′末端から連続した１９個のヌクレオチドからなる塩基配列を用いたが、Ｘの数は約１３個〜約３０個であればよい。
0004762481.tif 000004
ＰＣＲ用の３′末端側プライマーとしては上記ｍＲＮＡ３転写用のプライマーＩＩＩ（配列表の配列番号１）を用いた。
２段階目のＰＣＲには５′末端側プライマーとして、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター塩基配列の全域に対応する下記プライマー１と、
0004762481.tif 000005
この塩基配列に続いてオメガ配列および遺伝子固有のＯＲＦの５′末端側塩基配列（ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ、１９塩基）を含む以下の配列（プライマー２）を使用した。ここでは遺伝子固有のＯＲＦの５′末端側塩基配列として上記各ｃＤＮＡの５′末端から連続した１９個のヌクレオチドからなる塩基配列を用いたが、Ｘの数は約１３個〜約３０個でよい。
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ＰＣＲ用３′末端側プライマーとしては、上記ｍＲＮＡ３転写用のプライマーＩＩＩ（配列表の配列番号１）の塩基配列を基本としてプロモーター配列上で３塩基ずらして設計し作成した下記のプライマーＩＶ（配列表の配列番号４）を用いた。
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（３）プロモーター配列分断型プライマーを用いる転写鋳型の設計および構築
バックグラウンドの低い転写鋳型の設計および構築には、５′末端側プライマーとして、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列とそれぞれ部分的に相補性を有する２種類の異なる塩基配列からなるプライマーを設計して用いた。該プライマーの一方はプロモーターの５′末端から少なくともプロモーター機能部位の一部分を含む塩基配列に相補的な配列を有するがプロモーターの３′末端側のＲＮＡポリメラーゼ認識部位の少なくとも一部分に相補的な塩基配列をもたない塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ａ）、例えば下記プライマー▲１▼であり、他方はプロモーターの３′末端から少なくともＲＮＡポリメラーゼ認識部位の一部分を含む塩基配列に相補的な塩基配列を有するがプロモーターの５′末端側の少なくともプロモーター機能部位に相補的な塩基配列をもたない塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｂ）、例えば下記プライマー▲２▼である。すなわち、上記２種類のプライマーはそれぞれ、プロモーター塩基配列の別の一部分の塩基配列に相補的な塩基配列を有するプロモーター配列分断型のプライマーである。当該２種類のプロモーター配列分断型プライマーは、これらの両方を用いてＰＣＲにより構築されたＤＮＡからは転写がなされるが、該プライマーのいずれか１種類のみで構築されたＤＮＡからの転写が起こらないという特徴を有する。ここで例示したプロモーター配列分断型プライマー▲１▼および▲２▼はＳＰ６プロモーター配列分断型のプライマーであるが、本発明に係るプロモーター分断型のプライマーはこれらに限らず、様々な種類のプロモーターについて、それらの塩基配列に基づき作成可能である。
0004762481.tif 000008
（下線部はＳＰ６プロモーターの５′末端側との相補配列であるが
、３′末端側との相補配列であるＡＴＡを欠く）。
0004762481.tif 000009
（下線部はＳＰ６プロモーターの３′末端側との相補配列であるが
、５′末端側との相補配列であるＡＴＴＴＡを欠く）
にオメガ配列（７１塩基）とさらにクローン化した遺伝子由来の
ＡＴＧが続いてなる。
プライマー▲３▼：上記プライマー３と同じ。
モデル遺伝子として、３種類のネズミ肝臓由来のｃＤＮＡと、ＧＦＰをコードするｃＤＮＡをそれぞれｐＵＣ１９にクローン化したものを利用した。１段階目のＰＣＲには、５′末端側プライマーとして、オメガ配列由来の塩基配列である５′ＡＣＡＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＡＣＡ３′（配列表の配列番号５）に続いて目的とする遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧから始まる２２塩基のＯＲＦの５′末端部との相補配列を含むプライマー（全長３８塩基）、３′末端側プライマーとしてはｍＲＮＡ３転写用のプライマーＩＩＩ（配列表の配列番号１）を用いた。また、２段階目のＰＣＲには、５′末端側プライマーとしてプライマー▲１▼および▲２▼を、３′末端側プライマーとしては上記プライマーＩＶ（配列表の配列番号４）を用いた（プライマーのモル比は▲１▼：▲２▼：ＩＶ＝１００：１：１００である）。ＰＣＲは、必ずしも２段階に分けて行う必要はなく、全ての工程を１段階で実施しても本発明の本質は何ら変わるものではない。
上記従来方式の５′末端側プライマーを用いて構築した転写鋳型と、上記本発明に係るプロモーター分断型の５′末端側プライマーを用いて構築した転写鋳型とについて、翻訳鋳型の合成効率、および無細胞タンパク質合成の効率を比較したところ、プロモーター分断型プライマーを用いた方がいずれの効率も高かった。
プライマー▲１▼および▲２▼のようなプロモーター配列分断型のプライマーは、転写反応後に目的とするサイズのｍＲＮＡを単離しなくとも、無細胞タンパク質合成系に使用できる、５′末端非翻訳配列を有する翻訳活性の高いｍＲＮＡの翻訳鋳型を、ＰＣＲ法により構築するために有用である。すなわち、プロモーター配列分断型プライマーを用いてＰＣＲ法で得られた転写鋳型から転写したｍＲＮＡには、従来型のプライマーを用いて得たｍＲＮＡに混入する非特異的に生ずる短鎖ｍＲＮＡがほとんど含まれない。非特異的短鎖ｍＲＮＡは無細胞タンパク質合成法において、目的とするタンパク質の強力な合成阻害剤として作用して、合成収量を著しく低下させる原因となるが、本発明に係る翻訳鋳型を使用すれば該短鎖ｍＲＮＡの影響がないため、無細胞タンパク質合成を効率良く行うことができる。また、プロモーター配列分断型プライマーを用いてＰＣＲ法で得られた転写鋳型から転写したｍＲＮＡは、合成後に目的とするサイズのｍＲＮＡを単離することなく無細胞タンパク質合成系に使用できるので、該ｍＲＮＡの合成および該ｍＲＮＡからのタンパク質合成を簡便に行うことができる。
上記無細胞タンパク質合成法に用いる翻訳鋳型分子合成用の転写鋳型となるＤＮＡ塩基配列を構築するための５′末端側ＰＣＲ用プライマーの塩基配列は、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と部分的に相補性を有する塩基配列を含む塩基配列、配列表の配列番号２または配列表の配列番号３に記載の塩基配列、配列表の配列番号３に記載の塩基配列を含む塩基配列、これらの塩基配列の主用部を含む塩基配列、これらの塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズ可能な塩基配列、またはこれらの相補的塩基配列でありうる。
本発明に係る上記５′末端側プライマーを用いれば、バックグラウンドとなる転写産物量が最小限に抑制される転写鋳型がＰＣＲ法により簡便に得られる。上記５′末端側プライマーを用いて転写鋳型を構築するときは、例えば上記５′末端側のＰＣＲ用プライマーの塩基配列である異なる塩基配列からなる２種類のプライマーを使用すればよい。また、３′末端側プライマーとしては、本発明に係る上記３′末端側プライマーを用いるのが好ましい。
ここで、上記２種類の５′末端側プライマーは、いずれか１種類のプライマーのみで構築されるＤＮＡからの転写が起こらないという条件を満たすものであり、該プライマーの１つはプロモーターの５′末端から少なくともプロモーター機能部位の一部分を含む塩基配列に相補的な配列を有するが、プロモーターの３′末端側のＲＮＡポリメラーゼ認識部位の少なくとも一部分に相補的な塩基配列をもたない塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ａ）であり、該プライマーの別の１つはプロモーターの３′末端から少なくともＲＮＡポリメラーゼ認識部位の一部分を含む塩基配列に相補的な塩基配列を有するが、プロモーターの５′末端側の少なくともプロモーター機能部位に相補的な塩基配列をもたない塩基配列からなるポリヌクレオチド（Ｂ）であることが好ましい。
さらに、上記ポリヌクレオチド（Ｂ）は、その塩基配列にさらに続けてＧＡ若しくはＧＡＡ配列が挿入され、その下流にｍＲＮＡの翻訳増幅を与える配列と、さらに、翻訳開始コドンＡＴＧ、または目的とする遺伝子のＯＲＦ（翻訳枠）の一部の若しくはＯＲＦを含まないＯＲＦ上流（５′末端側）の塩基配列に相補的な配列、を連結した塩基配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。ｍＲＮＡの翻訳増幅を与える塩基配列は、例えばタバコモザイクウイルスのオメガ配列やアルファルファモザイクウイルスのリーダー配列由来の塩基配列（ＡＭＶ）、これらを直列に結合させたＡＭＶ−オメガ配列、またはオメガ配列由来の２９塩基オメガ配列等が例示されるが、これらに限らず、翻訳増幅を与え得る塩基配列であればよい。
または、前述の５′末端側プライマーとして、上記ポリヌクレオチド（Ａ）と、上記ポリヌクレオチド（Ｂ）に加えて、ポリヌクレオチド（Ｂ）にアニーリングできる塩基配列に続いて翻訳開始コドンＡＴＧ、または目的とする遺伝子のＯＲＦの一部の若しくはＯＲＦを含まないＯＲＦ上流（５′末端側）の塩基配列に相補的な塩基配列、を連結してなるポリヌクレオチド（Ｃ）を含む３種類のポリヌクレオチドを用いることもできる。目的とする遺伝子のＯＲＦ（翻訳枠）の一部は、該ＯＲＦの５′末端から連続した約１３塩基〜約３０塩基からなる塩基配列である。ここで、ポリヌクレオチド（Ｂ）は、プロモーターの３′末端から少なくともＲＮＡポリメラーゼ認識部位の一部分を含む塩基配列に相補的な塩基配列を有するが、該プロモーターの５′末端側の少なくともプロモーター機能部位に相補的な塩基配列をもたない塩基配列に続いて、ＧＡ若しくはＧＡＡ配列が挿入され、その下流にさらにｍＲＮＡの翻訳増幅を与える配列を連結し、さらに、翻訳開始コドンＡＴＧ、または目的とする遺伝子のＯＲＦの一部の若しくはＯＲＦを含まないＯＲＦ上流（５′末端側）の塩基配列に相補的な配列を連結した塩基配列からなるポリヌクレオチドでもよい。
また、上記５′末端側プライマーの翻訳部の開始コドンとＯＲＦとの間に、ヒスチジンタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、若しくはｍｙｂ等のタグまたはエピトープ合成用の塩基配列を組み込むことができる。このようなプライマーを用いて作成した転写鋳型を用いると、最終的に得られる翻訳産物には上記タグまたはエピトープが、該翻訳産物の精製用若しくはマーカー用等として付加される。
上記２種類のプライマーの組合せ、または上記３種類のプライマーの組合せは、様々な遺伝子についてその転写鋳型を作成するための、汎用性ある５′末端側プライマーとして使用できる。以下、プライマーの組合せをプライマーセットという。さらに、上記プライマーセットに加えて、３′末端側プライマーとして、遺伝子をクローン化したベクターのマーカー遺伝子、例えば薬剤耐性遺伝子等の転写ターミネーター配列と一部Ｏｒｉを含む配列との間に存在する塩基配列と相補鎖を形成し得る塩基配列からなるポリヌクレオチドを組み合わせたプライマーセットは、様々な遺伝子についてその転写鋳型をＰＣＲにより作成するための、汎用性ある有用なプライマーセットとして使用できる。
（転写および翻訳一体型希釈方式タンパク質合成法並びに転写および翻訳連続型希釈方式タンパク質合成法）
上記本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ法で得られる転写鋳型を利用すれば、簡便且つ高効率なタンパク質合成が可能になる。例えば、上記の原理と方法で構築した転写鋳型を用いて合成したｍＲＮＡを翻訳鋳型として用い、タンパク質合成に充分な量のコムギ胚芽抽出液を含む無細胞タンパク質合成用反応溶液に加えて無細胞タンパク質合成を行うと、従来の転写鋳型を用いて合成したｍＲＮＡによるタンパク質合成に比べ、合成反応が長時間持続することができる。該転写鋳型からのｍＲＮＡの合成には、公知の転写反応を利用できる。無細胞タンパク質合成法も、既知の方法に準じて行えばよい〔Ｍａｄｉｎ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９−５６４〕（ＷＯ００／６８４１２号公報）。また、合成したｍＲＮＡをゲルろ過等の方法で精製して用いれば、さらにタンパク質の合成効率を上げることができる。
さらに、本発明に係るプライマーを用いてＰＣＲ法で得られる転写鋳型を、既に報告されている転写および翻訳一体型による無細胞タンパク質合成法（ＷＯ００／６８４１２号公報）と組み合わせてタンパク質合成を行えば、別途転写して作成したｍＲＮＡを無細胞タンパク質合成系に添加する煩雑性が回避できる。該転写鋳型を用いた転写および翻訳一体型コムギ胚芽無細胞タンパク質合成法では、まず転写反応を転写反応に適した条件下で行う。好ましくは転写反応を約３０℃〜約４５℃、より好ましくは約３５℃〜約４０℃、で行なう。その後、反応溶液に適当な希釈溶液を添加することにより翻訳反応に適した条件にした後に、タンパク質合成を行う。翻訳反応の温度は目的とするタンパク質に応じてその翻訳に適した温度が選択されるが、好ましくは約２０℃〜約３０℃である。また、希釈溶液は、翻訳反応に必要なエネルギー源やアミノ酸類等を加えた翻訳反応に適したバッファーであればよく、当該反応溶液中の少なくともマグネシウム濃度が、翻訳至適濃度、好ましくは約１ｍＭ〜約６ｍＭに低減されるように、適当な容量加える。希釈溶液の添加により、同時に当該反応溶液に含まれていた転写基質や転写副生物の濃度を低下させることができる。この結果、タンパク質合成反応の持続時間を延長させることが可能になり、合成効率が向上する。
具体的には、例えば、転写および翻訳一体型希釈方式無細胞タンパク質合成法は、まず容量の４８％容の小麦胚芽抽出液（濃度は、２００Ａ２６０ｎｍ  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を含み次のような終濃度の組成〔１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ）、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、９５ｍＭ  酢酸カリウム、１６ｍＭ  酢酸マグネシウム、２．８５ｍＭ  ジチオスレイトール、０．５ｍｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ、２．５ｍＭ  ＡＴＰ、２．５ｍＭ  ＧＴＰ、２．５ｍＭ  ＵＴＰ、２．５ｍＭ  ＣＴＰ、１５００ユニット／ｍｌのＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、１６ｍＭクレアチンリン酸、１．４８ｍＭ  スペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）、２５μｇ／ｍｌの転写鋳型であるＤＮＡ〕からなる反応溶液を調製して３０℃で３時間、転写反応を行う。その後、反応液を希釈溶液で希釈する。希釈溶液は、例えば、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、９５ｍＭ  酢酸カリウム、０．４ｍＭ  酢酸マグネシウム、２．８５ｍＭ  ジチオスレイトール、０．９４ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭ  クレアチンリン酸、０．３８０ｍＭ  スペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）からなる。この希釈によって、主な成分の濃度は以下の通りとなる。すなわち、小麦胚芽抽出液は原液の８％（原液濃度は、２００Ａ２６０ｎｍ  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、９５ｍＭ  酢酸カリウム、３ｍＭ  酢酸マグネシウム、１．２ｍＭ  ＡＴＰ等である。なお、ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰに関しては、転写反応での消費量が不明なので、希釈後の各濃度は特に計算しない。
上記転写および翻訳一体型希釈方式無細胞タンパク質合成法では、翻訳反応に必要な細胞抽出物であるコムギ胚芽抽出物を、反応溶液中に最初から添加しているため、該抽出物は転写反応時にも存在している。該抽出物は、反応溶液中に最初から添加する必要はなく、ｍＲＮＡ合成後に希釈溶液を加えるとき、終濃度が翻訳反応に適した濃度になるように、希釈溶液と同時にまたは希釈溶液に混合して無細胞タンパク質合成系に添加してもよい。この方法を、ここでは転写および翻訳連続式希釈方式無細胞タンパク質合成法とよぶ。
転写および翻訳一体型または転写および翻訳連続型の希釈方式無細胞タンパク質合成法は、複雑な操作を含まず簡便であり、さらにＰＣＲ法で構築した転写鋳型を直接用いて、無細胞系での効率の高いタンパク質合成を可能にする。また、目的とする遺伝子産物をヒスチジンタグやグルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質として合成すれば、これらに対応するリガンドの固定化物を用いることによって遺伝子産物の精製を効率良く行うことができる。
例えば、図１１に示すように、すべての遺伝子に共通して利用可能な上記本発明に係る汎用性を有するプライマーセット（５′末端側の３種類と３′末端側の１種類）を使用して、一度に多種類のタンパク質を転写および翻訳一体型または転写および翻訳連続型の希釈方式無細胞タンパク質合成法により簡便に且つ効率良く合成することができる。
まず反応容器にｃＤＮＡを加える。このとき、反応容器として例えば９６ウエルタイタープレート等の市販のマルチウエルタイタープレートを用いて各ウエル毎に別種のタンパク質をコードするｃＤＮＡを加えることにより、多種類のタンパク質を一度に合成することができる。このように、マルチウエルタイタープレートの各ウエルに別種のｃＤＮＡを加えたものは、ｃＤＮＡライブラリーとして使用できる。ｃＤＮＡライブラリーは市販のものを用いてもよい。上記ｃＤＮＡライブラリーに上記プライマーセットを添加してＰＣＲを行う。その結果、転写鋳型が形成される。
その後、転写および翻訳一体型希釈方式タンパク質合成法を実施するときは、各反応容器中にＲＮＡポリメラーゼ、４ＮＴＰｓ、コムギ胚芽抽出物等を含む無細胞タンパク質合成用反応溶液（例えば後述の実施例５を参照）を加えて、温度を約３０℃〜約４５℃、好ましくは約３５℃〜約４０℃に保持し、転写反応を所望の時間行う。その後、希釈溶液を添加して、マグネシウム濃度を翻訳反応の至適濃度にまで低減した後、温度を約２０℃〜約３０℃に維持して翻訳反応を行う。その結果、翻訳産物であるタンパク質が得られる。
転写鋳型作成後に転写および翻訳連続型希釈方式タンパク質合成法を実施するときは、各反応容器中にＲＮＡポリメラーゼ、４ＮＴＰｓ等を含む転写用溶液（例えば後述の実施例４を参照）を加えて、温度を約３０℃〜約４５℃、好ましくは約３５℃〜約４０℃に保持し、転写反応を所望の時間行う。その後、コムギ胚芽抽出物等を含む無細胞タンパク質合成用反応溶液（例えば実施例４を参照）加えて、温度を約２０℃〜約３０℃に維持し、翻訳反応を行う。
また、上記のように転写用溶液中で転写反応を所望の時間行った後に、翻訳鋳型が形成された転写反応後の溶液を、予め上記の無細胞タンパク質合成用反応溶液を添加しておいた別の反応容器、例えばマルチウエルタイタープレート中に、該転写反応後の溶液を下層とし、該無細胞タンパク質合成用反応溶液が上層となるように、静かに重層して、無細胞タンパク質合成反応を行うこともできる。この方法では、上層と下層との間に形成された界面で両層の溶液中に含まれている物質の拡散が起こり、徐々に上層と下層が混ざり合う。そのため、連続的に翻訳反応が徐々に進行し、タンパク質合成を長時間に亘って行うことができる。
以上、本発明により、これまで困難であったＰＣＲ法を利用する簡便で効率的な無細胞タンパク質合成が、コムギ胚芽高効率無細胞タンパク質合成系、本発明に係るｍＲＮＡ転写鋳型構築方法、並びに転写および翻訳一体型希釈方式無細胞タンパク質合成法または転写および翻訳連続型希釈方式無細胞タンパク質合成法を利用することによって、初めて可能となった。さらに、プロモーター部位、翻訳増幅構造、およびＯＲＦの一部までを含む従来の一本鎖プライマーを用いて構築した無細胞タンパク質合成用鋳型ＤＮＡを用いると、目的遺伝子の翻訳産物以外に多量の低分子の翻訳産物が生じるので翻訳効率が低かったが、本発明によりこの欠点を解消することができた。上記プロモーター配列分断型プライマーを用いるＰＣＲ法による無細胞タンパク質合成用転写鋳型の構築原理は、コムギ胚芽抽出物を用いる無細胞タンパク質合成系にとどまらず、大腸菌等の他の細胞抽出物を使用する無細胞タンパク質合成系における鋳型設計原理としても利用できる。
本発明によれば、どのようなベクターにクローン化された遺伝子においても、その遺伝子に相補的な配列を有する５′末端側と３′末端側の固有のプライマーを準備すれば、すべての遺伝子に共通して利用可能な汎用性を有する上記プライマーセットを用いて、クローン化された任意の遺伝子に対し、簡便で高効率な無細胞タンパク質合成が可能となる。従って、本発明は、ゲノムプロジェクト完了とともにもたらされる膨大な数の遺伝子の機能解析や構造解析の基盤となる遺伝子産物（タンパク質）の生産に向けた基本的な要素技術を提供するものである。実施例
以下に実施例並びに比較例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１
転写鋳型構築用プライマーの設計と翻訳鋳型活性の高いｍＲＮＡの構築
（ｍＲＮＡの３′末端非翻訳配列合成に着目した転写鋳型構築法）
翻訳鋳型活性を増強するのに有効であり且つ最も短い３′末端非翻訳構造を持つ翻訳効率の高いｍＲＮＡを得るため、ＰＣＲ法を用いて転写鋳型を構築した。  ＰＣＲに用いる鋳型としては、図１の（ａ）に示したコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系用のプラスミドとして開発したｐＥＵ（ＷＯ０１／２７２６０号公報）にクラゲのＧＦＰ遺伝子を常法によりクローン化したものを用いた。このプラスミドの構造は、５′末端側上流にＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列、続いて翻訳開始反応配列であるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のオメガ配列、続いてＧＦＰ遺伝子を連結してあり、３′末端側下流には複製開始点（Ｏｒｉ）、その下流にはマーカー遺伝子としてアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒが組み込まれている〔図１の（ａ）〕。
用いた５′末端側プライマーはＳＰ６プロモーター配列を含むプライマー（５′ＧＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡ３′）であり、３′末端側プライマーは、プライマーＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ（配列表の配列番号１）である〔図１の（ａ）〕。以下にそれらの配列を示す。これらのプライマーは、アマシャム−ファルマシア社に依頼して作成した。
0004762481.tif 000010
上記クラゲＧＦＰ遺伝子を組み込んだｐＥＵを鋳型として、上記プライマーを使用してＰＣＲを以下の条件で行った。
ＰＣＲ用反応溶液
１×        ＥｘＴａｑ  バッファー
２００μＭ  ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオシド３リン酸）
１０ｎＭ    プライマー（５′ＧＣＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡ
Ａ３′）
１０ｎＭ    プライマーＩ、またはＩＩ、またはＩＩＩ
０．０２５Ｕ  ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ
５０ｐｇ／μｌ  鋳型プラスミドＤＮＡ
ＰＣＲの反応条件
９８℃で１分間
↓
（９８℃で１０秒間→６０℃で３０秒間→７２℃で５分間）を３０サイクル
↓
７２℃で４分間
↓
４℃
次に、上記で得られたＰＣＲ産物を転写鋳型として用い、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、下記のように調製した転写用溶液を３７℃で２時間反応させ、転写産物であるｍＲＮＡを得た。
転写用溶液（ｍＲＮＡ溶液）
0004762481.tif 000011
なお、ここで用いた５×バッファーの組成を以下に示す。
0004762481.tif 000012
図１の（ｂ）には上記のように設計し構築した転写鋳型から転写された異なる塩基数の３′末端非翻訳配列を持つｍＲＮＡ分子を模式図で示した。ｍＲＮＡ１はプライマーＩを用いて、ｍＲＮＡ２はプライマーＩＩを用いて、ｍＲＮＡ３はプライマーＩＩＩ（配列表の配列番号１）を用いて構築されたものである。
図中のＣａｐとは、ｍＲＮＡの５′末端に７ｍＧｐｐｐＧを付加して合成したＣａｐ付きＧＦＰｍＲＮＡであり、ｍＲＮＡ２用のプライマーＩＩを用いて構築したため５６１塩基の３′末端非翻訳配列を持つ。また、同図中のＣｉｒｃｕｌａｒとは環状プラスミドを転写鋳型として構築したＧＦＰｍＲＮＡであり、主に１，９００塩基または５，９００塩基からなる２種類の長鎖の３′末端非翻訳配列が含まれる。これらはＷＯ０１／２７２６０号公報に既に開示された方法に従って作成し、それぞれ実験的対照として無細胞タンパク質合成反応に用いた。
上記構築した転写鋳型を用いて得られたｍＲＮＡの翻訳鋳型活性を、バッチ式コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系で３時間の翻訳反応後に調べた。該翻訳反応は、Ｍａｄｉｎらの方法〔Ｍａｄｉｎ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９−５６４〕、およびＷＯ００／６８４１２号公報に記載された方法に従って実施した。また、タンパク質合成は１４Ｃ−ロイシンの取り込みを指標として測定し、縦軸の放射能カウントは、等量の胚芽抽出液量当りで表した。その結果、図１の（ｃ）に示すように、プライマーＩＩＩ（配列表の配列番号１）を用いて構築した鋳型から転写したｍＲＮＡ３（５′末端はオメガ配列、３′末端に１，８９６塩基の非翻訳配列を持つＧＦＰｍＲＮＡ）が高い翻訳効率を示し、その効率は、Ｃａｐ付きｍＲＮＡや、Ｃｉｒｃｕｌａｒプラスミドから転写した長鎖の３′末端非翻訳配列を持つｍＲＮＡに匹敵することが判明した。
すなわち、コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系に用いるｍＲＮＡに３′末端非翻訳配列を付加するための転写鋳型となるＤＮＡ塩基配列の構築には、例えばプライマーＩＩＩ（配列表の配列番号１）の塩基配列のような、遺伝子をクローン化したベクターのアンピシリン耐性遺伝子の転写ターミネーター配列とＯｒｉ間に存在する塩基配列と相補鎖を形成し得る塩基配列をプライマーとして設計して用いる方法が有効であることが明らかになった。
比較例１
転写鋳型構築用プライマーの設計と転写鋳型のＰＣＲによる構築
（従来法による転写鋳型構築法）
５′および３′末端非翻訳構造を有するｍＲＮＡの転写鋳型をＰＣＲ法により得るため、ＰＣＲに用いるプライマーを設計し構築した。
ｍＲＮＡの５′末端非翻訳構造としては、既にＷＯ０１／２７２６０号公報に開示したように、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）由来の塩基配列、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）のオメガ配列、これらを直列に結合させたＡＭＶ−オメガ配列、さらには、オメガ配列を短く削った２９塩基オメガ配列をｍＲＮＡに付加することが、無細胞タンパク質合成反応の効率上昇に極めて有効である。ここでは、これらの５′末端非翻訳構造の中からＴＭＶオメガ配列を５′末端非翻訳配列として選んで用いた。３′末端非翻訳配列としては上記実施例１に示した１，８９６塩基からなる配列を用いた（図１を参照）。
まず、転写鋳型の５′末端配列構築法として繁用されている３種類のプライマーを用いる従来のＰＣＲ法について検討した（図２）。図２の（ａ）にはここで試みたＰＣＲ法の概略について、目的とするタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたプラスミドの構造、５′末端配列構築用の３種類のプライマー（プライマー１、２、３）と３′末端配列構築用のプライマーＩＩＩを模式図で示した。プライマー１、２、および３の塩基配列を以下に示す。プライマー３の塩基配列中、Ｘは目的の遺伝子固有のＯＲＦの５′末端側塩基配列を意味する。プライマーＩＩＩは、実施例１で使用したものと同一である。これらのプライマーは、実施例１と同様の方法で作成した。
0004762481.tif 000013
転写鋳型構築用の鋳型としては、ｐＵＣ１９にｃＤＮＡライブラリーから選んだ遺伝子を組み込んだプラスミドを用いた。プラスミドには、ネズミ肝臓由来の３種類のｃＤＮＡおよびＧＦＰ遺伝子（翻訳産物の分子量は２５ｋＤａ、１８ｋＤａ、４４ｋＤａ、および２７ｋＤａ）をそれぞれ実施例１と同様の方法で組み込んだ。上記プライマーを用いＰＣＲを実施例１と同様に行い、得られたＰＣＲ産物を転写鋳型として実施例１と同様に実験的に転写反応を２時間行い、転写産物を得た。
図２の（ｂ）には、従来のＰＣＲ法で得られる主な増幅産物と非特異的に生ずる短鎖ＤＮＡ副産物を、また（ｃ）には該増幅産物をそのまま転写鋳型として用いて合成される転写産物を模式的に示す。図２の（ｃ）中で、（１）に示すｍＲＮＡは完全長のｍＲＮＡであり完全長の翻訳産物を与えることができ、（２）に示すｍＲＮＡは低分子翻訳産物を与え、（３）に示すｍＲＮＡはオメガ配列を欠くため翻訳鋳型活性はない。転写反応における生化学的特性から考えると、合成されるＲＮＡ分子の大多数は、ＤＮＡ鎖長の短いＰＣＲ産物由来であると予想される。
図３には、上記転写産物について常法によりアガロースゲル電気泳動を行った結果を示す。各レーンは、３種類のｃＤＮＡまたはＧＦＰ遺伝子（翻訳産物の分子量は２５ｋＤａ、１８ｋＤａ、４４ｋＤａ、および２７ｋＤａ）をそれぞれ組み込んだ鋳型プラスミドから作成した転写鋳型を用いて得た転写産物、すなわちｍＲＮＡを示す。また、アステリスクは、完全長の転写産物を示す。図３から分かるように、ＯＲＦが大きい遺伝子ほどその転写効率が低いこと、さらにこの方法で転写される産物の大半は低分子ＲＮＡであることから、ＰＣＲ法によって非特異的に生ずる短鎖ＤＮＡ分子種はプロモーター配列を含んでいる。このことは、上記図２の（ｂ）および（ｃ）に基づく予測とよく一致する結果であった。
次に、上記それぞれの転写産物から目的とするサイズのｍＲＮＡを単離することなく、転写産物を脱塩後にコムギ胚芽無細胞タンパク質合成系に添加して３時間反応させて翻訳産物を得、それを常法に従ってオートラジオグラフィーに付して検出した〔Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０〕〔Ｍａｄｉｎ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９−５６４〕。翻訳反応は、前記〔Ｍａｄｉｎ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９−５６４〕、およびＷＯ００／６８４１２号公報に記載された方法に従って実施した。その結果を図４に示す。図４中にアステリスクで示したように、それぞれのｍＲＮＡ量に対応した少量の翻訳産物が確認できた。翻訳産物の中で、転写産物量の多い１８ｋＤａタンパク質（図３を参照）の合成量が高いものの、大半の翻訳産物が図４中矢印で示したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの低分子領域に分離される低分子であった。このことは、低分子の転写産物中には、５′末端の翻訳開始増強構造であるオメガ配列とＯＲＦの５′末端側の一部とを保持するが、ＯＲＦの３′末端側を欠いたｍＲＮＡの含量が高いことを示す。これらのｍＲＮＡ断片は翻訳開始因子と強い親和性を持つことから、目的タンパク質の強力な合成阻害剤として作用し、合成収量を著しく低下させる原因となる。
実施例２
高効率転写鋳型構築用プライマーの設計とＰＣＲによる高効率転写鋳型の構築
（転写鋳型のＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列に着目した転写鋳型構築法）  比較例１に示した従来法に基づくプライマーの設計方法では、転写反応後に目的とするサイズのｍＲＮＡを単離せずに無細胞タンパク質合成系に使用可能な５′末端非翻訳配列を有する翻訳活性の高いｍＲＮＡの転写鋳型をＰＣＲ法により構築するための有効なプライマーは得られない。そこで、ＲＮＡポリメラーゼの性質を充分に活用する原理、すなわち、ＲＮＡポリメラーゼは完全な塩基配列からなるプロモーター構造を認識するが不完全な塩基配列からなるものを認識しないという事実をに基づいて、この有効なプライマーを設計して作成し、さらに該プライマーを用いた転写鋳型の構築方法を実施した（図５）。
図５の（ａ）にはここで試みたＰＣＲ法に用いた目的とするタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたプラスミドの構造、５′末端配列構築用の３種類のプライマー（プライマー▲１▼、▲２▼、および▲３▼）と３′末端配列構築用のプライマーＩＩＩを模式図で示した。各プライマーの塩基配列を以下に示す。これらのプライマーは、実施例１と同様の方法で作成した。ここで設計したプライマー▲１▼はプロモーターの５′末端から少なくともプロモーター機能部位の一部分を含む塩基配列に相補的な配列を有するが、該プロモーターの３′末端側のＲＮＡポリメラーゼ認識部位の少なくとも一部分に相補的な塩基配列をもたないものであり、プライマー▲２▼は該プロモーターの３′末端から少なくともＲＮＡポリメラーゼ認識部位の一部分を含む塩基配列に相補的な塩基配列を有するが、該プロモーターの５′末端側の少なくともプロモーター機能部位に相補的な塩基配列をもたないものである。すなわち、プライマー▲１▼および▲２▼はプロモーター配列分断型プライマーである。プライマー▲３▼は上記プライマー３と同一であり、プライマーＩＩＩは、実施例１で使用したものと同一である。また、ここではＰＣＲを２段階で行ったため、３′末端側非翻訳配列構築用プライマーとして、さらにプライマーＩＶ（配列表の配列番号４）を合成して使用した。プライマーＩＶは上記プライマーＩＩＩ（配列表の配列番号１）の塩基配列を基本として、プラスミド中で３塩基ずらして設計したもので、下記塩基配列で示される。また、下記のプライマー配列中でＸはプラスミドに組み込んだ遺伝子固有のＯＲＦの５′末端側配列を意味する。
0004762481.tif 000014
これらのプライマーを用いて増幅される主なＰＣＲ産物の模式図を図５の（ｂ）に示した。図５の（ｂ）中の（２）および（３）に示すＤＮＡはＲＮＡポリメラーゼによる認識が極めて低いために、事実上ＲＮＡ合成が行われないことが予測された。また、このように設計されたプライマーを用いて構築される転写鋳型は図５の（ｃ）となることが期待できる。
これらのプライマーを使用して、転写鋳型の構築を行った。まず、転写鋳型構築用の鋳型として、ｐＵＣ１９にｃＤＮＡライブラリーから選んだ遺伝子を組み込んだ比較例１と同じプラスミドを用いた。上記プライマーを使用して２段階のＰＣＲ法により下記の条件で転写鋳型を作成した。ＰＣＲ法には、ポリメラーゼとして宝社製のＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用した。
１段階目のＰＣＲ用混合物（終濃度）
１×            ＥｘＴａｑ  バッファー
２００μＭ      ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオシド３リン酸）
１０ｎＭ        プライマー▲３▼
１０ｎＭ        プライマーＩＩＩ
０．０２５Ｕ    ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ
５０ｐｇ／μｌ  鋳型プラスミドＤＮＡ
２段階目のＰＣＲ用混合物（終濃度）
１×          ＥｘＴａｑ  バッファー
２００μＭ    ｄＮＴＰ
１００ｎＭ    プライマー▲１▼
１００ｎＭ    プライマーＩＶ
１ｎＭ        プライマー▲２▼
０．０２５Ｕ  ＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ
０．０５μｌ  １段階目のＰＣＲ産物
ＰＣＲの反応条件
（１段階目および２段階目のＰＣＲとも同じ条件で実施した。）
９８℃で１分間
↓
（９８℃で１０秒間→６０℃で３０秒間→７２℃で５分間）を３０サイクル
↓
７２℃で４分間
↓
４℃
次に、上記で得られたＰＣＲ産物を転写鋳型として用い、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、下記のように調製した転写用溶液を３７℃で２時間反応させ、転写産物であるｍＲＮＡを得た。
転写用溶液（ｍＲＮＡ溶液）
0004762481.tif 000015
なお、ここで用いた５×バッファーの組成は、実施例１で使用したものと同じである。
図６に、得られた転写産物のアガロースゲル電気泳動による分析結果を示した。低分子転写産物の存在は見られず、各遺伝子からの転写産物として予想される移動度を持ったＲＮＡが合成されていることが確認できた。
これらのｍＲＮＡ標品を脱塩し、翻訳鋳型としてバッチ式コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系に添加してタンパク質合成を行った。合成反応は、〔Ｍａｄｉｎ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９−５６４〕、およびＷＯ００／６８４１２号公報に記載の方法に従い実施した。２６℃で３時間のタンパク質合成反応後のオートラジオグラフィーによる分析結果を図７に示した。
図４と図７を比較すると、転写鋳型により明確な差が認められる。すなわち、本発明に係る方法で設計および構築した転写鋳型を用いた場合、従来法で構築したものに比べ、低分子の翻訳産物の合成は見られず、いずれのタンパク質も効率良く合成されていることが確認できた。
さらに、上記のように設計および構築したプライマーを使用してＰＣＲで得た転写鋳型を用い、無細胞タンパク質合成をＷＯ００／６８４１２号公報に記載の透析膜を用いる透析法に従い２４時間行った。各反応液の１μｌをＳＤＳ−ゲル電気泳動し、タンパク質をクマシーブリリアントブルー染色した。その結果を図８に示す。図中アステリスクはそれぞれの遺伝子から合成されたタンパク質バンドを示す。染色バンドのパターンからいずれのタンパク質も高い効率で合成されたことが確認できた。バンドの染色強度の測定によると、反応液１ｍｌ当り、２５ｋＤａのタンパク質は０．５ｍｇ、１８ｋＤａのタンパク質は３．２ｍｇ、４４ｋＤａのタンパク質は１．２ｍｇ、２７ｋＤａは１．３ｍｇの合成量であった。
実施例３
（ＰＣＲ法により構築した転写鋳型を用いる希釈方式コムギ胚芽無細胞タンパク質合成法）
実施例２の透析膜を利用した連続式無細胞タンパク質合成法は効率が高い反面、操作が煩雑であった。そこでより簡便な方法として、従来のバッチ式無細胞タンパク質合成反応を、低濃度の胚芽抽出液を含む無細胞タンパク質合成用反応溶液中で実施した。
この方法では、従来既知のバッチ方式無細胞タンパク質合成系で使用される組成の反応溶液を使用した〔Ｍａｄｉｎ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，５５９−５６４〕。まず、反応溶液として、容量の４８％容の小麦胚芽抽出液（濃度は、２００Ａ２６０ｎｍ  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を含む次のような終濃度の組成、１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ）、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、９５ｍＭ  酢酸カリウム、２．６５ｍＭ  酢酸マグネシウム、２．８５ｍＭ  ジチオスレイトール、０．５ｍｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭ  クレアチンリン酸、０．３８０ｍＭ  スペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）、６００μｇ／ｍｌのＧＦＰをコードするｍＲＮＡからなる反応溶液を調製した。該ｍＲＮＡは、上記実施例２に記載したプロモーター配列分断型プライマーを用いて実施例２に記載したのと同一の方法でＰＣＲにより得られた転写鋳型から転写されたｍＲＮＡであり、５′末端にオメガ配列を有するがＣＡＰ構造を持たず、１８９６塩基の３′末端非翻訳配列を担持する。上記反応溶液を２６℃で１５分間前保温（プレインキュベーション）した後に、５倍量の希釈溶液〔３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、９５ｍＭ  酢酸カリウム、２．６５ｍＭ  酢酸マグネシウム、２．８５ｍＭ  ジチオスレイトール、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭ  クレアチンリン酸、０．３８０ｍＭ  スペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）〕を添加することによって希釈した（希釈方式）。
なお、タンパク質合成をアミノ酸の取り込みを指標として測定するときは、希釈溶液に１ｍｌ当たり４μＣｉの１４Ｃ−ロイシンを添加したものを用いた。希釈後、再び２６℃でタンパク質合成反応を開始した。その結果を図９の（ａ）に示した。縦軸の放射能カウントは、等量の胚芽抽出液量当りで表した。１４Ｃ−ロイシンのタンパク質への取り込み、すなわちタンパク質合成反応は、従来のバッチ方式（●−●）では１時間で反応が停止したが、本発明に係る希釈方式（○−○）においては、９時間に亘って合成反応が持続し、従来のバッチ方式に比べて約８倍量のタンパク質が合成できた。また、得られたタンパク質をオートラジオグラフィーに付し、その結果を図９の（ｂ）に示した。図中、左側レーンは分子量マーカーを、矢印は合成産物であるＧＦＰを示す。オートラジオグラムでも、希釈方式では９時間に亘って合成反応が持続することが明らかに示された。さらに、その移動度から合成産物が完全長のタンパク質として合成され、反応液中に蓄積していることも明らかになった。
ここに示した希釈方式の無細胞タンパク質合成法は複雑な操作を含まず、ＰＣＲで構築した転写鋳型を用いて高効率の無細胞タンパク質合成を可能にした。
実施例４
（ＰＣＲで構築した転写鋳型を用いる転写および翻訳連続型希釈方式コムギ胚芽無細胞タンパク質合成法）
実施例３の希釈方式コムギ胚芽無細胞タンパク質合成法は翻訳効率が高い反面、別途転写したｍＲＮＡを無細胞タンパク質合成系に添加しなければならないという煩雑性を伴う。そこで、従来の転写系および翻訳系と希釈方式とを組み合わせた、新規な転写および翻訳連続型希釈方式無細胞タンパク質合成法を実施した。
まず、下記に示す転写用溶液を調製した。ここで用いたＰＣＲ産物は、上記実施例２に記載したプロモーター配列分断型プライマー、およびＡｍｐｒとＯｒｉ間に相補性を有する３′側プライマーを用いて実施例２と同様の方法で構築した転写鋳型で、遺伝子としてはＧＦＰを組み込んだものである。この転写用溶液を３７℃で３時間保温してｍＲＮＡを合成した。
転写用溶液（ｍＲＮＡ溶液）
0004762481.tif 000016
なお、上記転写用溶液の組成中ＮＴＰｓの終濃度のみを変えて２．５ｍＭまたは１．５ｍＭとしたものを調製し、それぞれについて転写反応を行った。また、ここで用いた５×バッファーの組成は、実施例１で使用したものと同じである。
得られたｍＲＮＡ溶液は、マグネシウムイオン、ＡＴＰ、ＧＴＰ濃度が翻訳反応の至適濃度より高いため、無細胞タンパク質合成用のコムギ胚芽抽出物を加えるだけではこのまま連続して同一の系内で翻訳反応を行うことができない。そのため、得られたｍＲＮＡ溶液２５μｌに、下記の無細胞タンパク質合成用の反応溶液を添加した。これにより、マグネシウムイオン濃度が翻訳反応の至適濃度、３．１９ｍＭにまで希釈され、タンパク質合成が可能となる。
反応溶液
0004762481.tif 000017
また、この希釈操作によって、翻訳反応を阻害する転写基質の残余成分のリボヌクレオシド３リン酸および副生物のピロリン酸濃度が１／６に低下した。この希釈操作の後に、反応温度は翻訳至適温度である２６℃に設定し、保温を続けた。その結果を図１０に示した。
図１０の（ａ）にはアミノ酸の取り込みにより測定したＧＦＰ合成の結果を示した。ＮＴＰｓ濃度が２．５ｍＭ（中□−□）または３ｍＭ（大□−□）の転写用溶液を用いたとき、９時間に亘って合成反応が持続し、バッチ方式（●−●）に比べて約８倍量のタンパク質が合成できたことを示している。この合成効率は実施例３に示したｍＲＮＡ添加型希釈方式無細胞タンパク質合成系（〇−〇）と同程度である。
さらに図１０の（ｂ）に得られたタンパク質のオートラジオグラムを示した。この図から、転写および翻訳連続型希釈方式では９時間に亘って合成反応が持続していることに加えて、その移動度から合成産物が完全長のタンパク質として合成され、反応液中に蓄積していることも確認できた。転写反応に用いたリボヌクレオチド濃度が２．５ｍＭ（中□−□）のときに、合成されるタンパク質量は最大であった。ＳＤＳ−ゲル電気泳動後にクマシーブリリアントブルーによるタンパク質の染色パターンを得、ＧＦＰの染色バンド強度を測定したところ、反応液１ｍｌ当りのＧＦＰ合成量は０．８２ｍｇであった。
上記のように、プロモーター配列分断型プライマー、およびＡｍｐｒとＯｒｉ間に相補性を有する３′側プライマーを用いて実施例２と同様の方法で構築した転写鋳型を用いることにより、転写および翻訳連続型希釈方式コムギ胚芽無細胞タンパク質合成法が実施でき、効率がよく簡便なタンパク質合成が可能となった。
実施例５
（ＰＣＲ法で構築した転写鋳型を用いる転写および翻訳一体型希釈方式コムギ胚芽無細胞タンパク質合成法）
まず、容量の４８％容の小麦胚芽抽出液（濃度は、２００Ａ２６０ｎｍ  ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を含み次のような終濃度の組成〔１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＮＡｓｉｎ）、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、９５ｍＭ  酢酸カリウム、１６ｍＭ  酢酸マグネシウム、２．８５ｍＭ  ジチオスレイトール、０．５ｍｇ／ｍｌ  クレアチンキナーゼ、２．５ｍＭ  ＡＴＰ、２．５ｍＭ  ＧＴＰ、２．５ｍＭ  ＵＴＰ、２．５ｍＭ  ＣＴＰ、１５００ユニット／ｍｌのＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、１６ｍＭ  クレアチンリン酸、１．４８ｍＭ  スペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）、２５μｇ／ｍｌ  ＤＮＡ〕からなる反応溶液を調製した。ここで用いたＤＮＡは、上記実施例２に記載したプロモーター配列分断型プライマー、およびＡｍｐｒとＯｒｉ間に相補性を有する３′末端側プライマーを用いて実施例２に記載の方法で構築した転写鋳型であり、遺伝子としてはＧＦＰを組み込んだものである。上記反応溶液を３０℃で３時間インキュベーションしてｍＲＮＡを転写した。
この合成溶液中のマグネシウムイオンの濃度、およびＡＴＰとＧＴＰ濃度は翻訳至適濃度のそれらに比べて著しく高いため、転写反応は行われるが、正常なタンパク質合成反応は進行しない。タンパク質合成反応を開始させるため、ｍＲＮＡ合成の後に、上記反応溶液の５倍容の希釈溶液〔３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、９５ｍＭ  酢酸カリウム、０．４ｍＭ  酢酸マグネシウム、２．８５ｍＭ  ジチオスレイトール、０．９４ｍＭ  ＡＴＰ、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、１６ｍＭ  クレアチンリン酸、０．３８０ｍＭ  スペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３ｍＭ）からなり、タンパク質合成をアミノ酸の取り込みを指標として測定する場合には、本溶液１ｍｌに対して、４μＣｉの１４Ｃ−ロイシンを含む〕を添加することによって、マグネシウムイオン濃度を翻訳反応の至適濃度（３．１９ｍＭ）にまで低下した。この方法により、実施例４と同等のタンパク質合成が確認された。
転写および翻訳一体型または転写および翻訳連続型の希釈方式無細胞タンパク質合成法は、複雑な操作を含まず簡便であり、さらにＰＣＲ法により構築した転写鋳型を直接用いてタンパク質の無細胞系での効率の高い合成を可能にした。
産業上の利用可能性
本発明により、汎用性を有し、翻訳鋳型活性が高く、且つ構築が簡単な無細胞タンパク質合成用の転写鋳型の設計および構築が可能になり、さらに該転写鋳型を用いた簡便な無細胞タンパク質合成法が確立された。即ち、▲１▼高翻訳鋳型活性を保持するｍＲＮＡの設計、▲２▼ＰＣＲ技術を基盤として翻訳効率の高いｍＲＮＡを転写するための汎用性があって転写バックグラウンドの抑制等が可能な転写鋳型を遺伝子から構築するためのプライマーの設計、▲３▼構築した無細胞タンパク質合成用転写鋳型を用いる簡便な無細胞タンパク質合成技術、が確立された。
本発明によれば、どのようなベクターにクローン化された遺伝子においても、その遺伝子に相補的な配列を有する５′末端側と３′末端側の２種類の固有のプライマーを準備すれば、すべての遺伝子に共通に利用可能な汎用性プライマー（５′末端側の３種類と３′末端側の１種類）を用いることによって、クローン化された任意の遺伝子に対して、簡便で高効率な無細胞タンパク質が可能となる。ここに説明した発明の成果は、従来の連続式無細胞タンパク質合成法のような複雑な装置や煩雑な操作を必要としない利点をも合わせ持つことから、ゲノムプロジェクト完了とともにもたらされる膨大な数の遺伝子についての機能解析や構造解析の基盤となる遺伝子産物（タンパク質）の生産に向けた基本的な要素技術を提供することになろう。特に、多検体用全自動無細胞タンパク質合成ロボット開発等、無細胞タンパク質合成システムの自動化に向けた要素技術として重要である。従って本発明は、構造生物化学や生化学を含む基礎生物学から、応用としての医薬の開発および生産に至る広い分野に極めて多大に寄与するものである。
配列表フリーテキスト
配列表の配列番号１：ＰＣＲ用プライマーを構築するために設計されたポリヌクレオチド。
配列表の配列番号２：ＰＣＲ用プライマーを構築するために設計されたポリヌクレオチド。
配列表の配列番号３：ＰＣＲ用プライマーを構築するために設計されたポリヌクレオチド。
配列表の配列番号４：ＰＣＲ用プライマーを構築するために設計されたポリヌクレオチド。
配列表の配列番号５：ＰＣＲ用プライマーを構築するためにタバコモザイクウイルスオメガ配列に基づいて設計されたポリヌクレオチド。
【配列表】
0004762481.tif 000018
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【図面の簡単な説明】
図１は、実施例１に於ける３′末端非翻訳配列を有する翻訳鋳型活性が高いｍＲＮＡの転写鋳型をＰＣＲにより得るためのプライマーの設計を示す図である。（ａ）はＯＲＦとしてＧＦＰ遺伝子を組み込んだｐＵＣ１９由来のｐＥＵの構造と、ＰＣＲ法による転写鋳型構築用プライマーを示す。（ｂ）はＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼによる転写産物を示す。（ｃ）はこれらのｍＲＮＡを用いたバッチ式コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質合成を１４Ｃ−ロイシンの取り込みを指標として測定した結果を示す。図中のＣａｐとは、ｍＲＮＡの５′末端に７ｍＧｐｐｐＧを付加して合成したＣａｐ付きｍＲＮＡであり、Ｃｉｒｃｕｌａｒとは環状プラスミドを転写鋳型として構築したｍＲＮＡである。
図２は、比較例１に於ける従来法で設計した５′末端側プライマーを用いる転写鋳型の構築法と、その転写産物、およびその翻訳活性を示す。（ａ）は転写鋳型構築用の鋳型であるプラスミドとＰＣＲ用プライマーの模式図である。（ｂ）は主たるＰＣＲ産物を示す。（ｃ）はＰＣＲ産物として得られた転写鋳型からＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼで転写されると予想されるＲＮＡ分子種を示す模式図である。
図３は、比較例１に於ける従来法で設計した５′末端側プライマーを用いて構築した転写鋳型から得た転写産物のアガロースゲル電気泳動図である。各レーンは、３種類のｃＤＮＡまたはＧＦＰ遺伝子（図中に示すように翻訳産物の分子量は２５ｋＤａ、１８ｋＤａ、４４ｋＤａ、および２７ｋＤａ）をそれぞれ組み込んた鋳型プラスミドから作成した転写鋳型を用いて得たｍＲＮＡを示す。左側レーンは分子量マーカーである。アステリスクは完全長の転写産物を示す。
図４は、比較例１に於ける従来法で設計した５′末端側プライマーにより構築した転写鋳型から得た転写産物を用いて無細胞タンパク質合成を実施後の翻訳産物のオートラジオグラムである。各レーンは、３種類のｃＤＮＡまたはＧＦＰ遺伝子（図中に示すように翻訳産物の分子量は２５ｋＤａ、１８ｋＤａ、４４ｋＤａ、および２７ｋＤａ）をそれぞれ組み込んだ鋳型プラスミドから作成した転写鋳型を用いて得た転写産物から翻訳された翻訳産物を示す。左側レーンは分子量マーカーである。アステリスクは完全長の翻訳産物を、矢印は低分子産物を示す。
図５は、実施例２に於けるＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列分断型プライマーを用いる転写鋳型の構築法と、その転写産物、およびその翻訳活性を示す。（ａ）は転写鋳型構築用の鋳型であるプラスミドとＰＣＲ用プライマーの模式図である。（ｂ）は主たるＰＣＲ産物を示す。（ｃ）はＰＣＲ産物として得られた転写鋳型からＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼで転写されると予想されるＲＮＡ分子種を示す模式図である。
図６は、実施例２に於けるＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列分断型プライマーを用いて構築した転写鋳型から得られた転写産物のアガロースゲル電気泳動図である。各レーンは、３種類のｃＤＮＡまたはＧＦＰ遺伝子（図中に示すように翻訳産物の分子量は２５ｋＤａ、１８ｋＤａ、４４ｋＤａ、および２７ｋＤａ）をそれぞれ組み込んだ鋳型プラスミドから作成した転写鋳型を用いて得たｍＲＮＡを示す。左側レーンは分子量マーカーである。
図７は、実施例２に於けるＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列分断型プライマーを用いて構築した転写鋳型から得られた転写産物を用いて無細胞タンパク質合成を行った後の翻訳産物のオートラジオグラムである。各レーンは、３種類のｃＤＮＡまたはＧＦＰ遺伝子（図中に示すように翻訳産物の分子量は２５ｋＤａ、１８ｋＤａ、４４ｋＤａ、および２７ｋＤａ）をそれぞれ組み込んだ鋳型プラスミドから作成した転写鋳型を用いて得た転写産物から翻訳された翻訳産物を示す。左側レーンは分子量マーカーである。
図８は、実施例２に於けるＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列分断型プライマーを用いて構築した転写鋳型から転写したｍＲＮＡを用いた、透析式コムギ胚芽無細胞タンパク質合成法によるタンパク質合成を示す。各レーンは、３種類のｃＤＮＡまたはＧＦＰ遺伝子（図中に示すように翻訳産物の分子量は２５ｋＤａ、１８ｋＤａ、４４ｋＤａ、および２７ｋＤａ）をそれぞれ組み込んだ鋳型プラスミドから作成した転写鋳型を用いて得た転写産物から翻訳された翻訳産物を示す。左側レーンは分子量マーカーである。アステリスクは各転写産物を示す。
図９は、実施例３に於ける希釈方式コムギ胚芽無細胞タンパク質合成法によるタンパク質合成を示す。（ａ）は従来のバッチ法（●−●）と希釈法（〇−〇）における１４Ｃ−ロイシンのタンパク質への取り込みの経時変化を測定したもので、縦軸の放射能カウントは等量の胚芽抽出液量当りで表した。（ｂ）は得られたタンパク質のオートラジオグラムである。
図１０は、実施例４に於ける転写および翻訳一体型希釈方式コムギ胚芽無細胞タンパク質合成法によるタンパク質合成を示す。（ａ）は１４Ｃ−ロイシンのタンパク質への取り込みの経時変化を測定したものである。図中、小□−□、中□−□、大□−□は、転写反応段階におけるＲＮＡ合成基質濃度を示し、それぞれ１．５ｍＭ、２．５ｍＭ、３．０ｍＭである。●−●は従来のバッチ法、〇−〇はと希釈法を示す。（ｂ）は得られたタンパク質のオートラジオグラムである。
図１１は、ｃＤＮＡライブラリーからのタンパク質ライブラリー作成法の概略を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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