(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
OmpTプロテアーゼ97番アミノ酸変異体を用いてポリペプチド中の所望する切断部位を切断する方法において、当該ポリペプチド中の所望する切断部位に係るP1位がアルギニン又はリジンであり、P10位からP3位まで又はP3’位からP5’位までのアミノ酸配列中の任意の部位に１つの塩基性アミノ酸又は２つ若しくは３つの塩基性アミノ酸を連続して配し、
OmpTプロテアーゼのＮ末端から97番目のアミノ酸がロイシンの場合は、P1’位がセリン又はアラニンであり、
OmpTプロテアーゼのＮ末端から97番目のアミノ酸がメチオニンの場合は、P1’位がフェニルアラニン、アラニン、セリン、システイン又はチロシンであり、
OmpTプロテアーゼのＮ末端から97番目のアミノ酸がヒスチジンの場合は、P1’位がアラニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン又はアスパラギンである、
ことを特徴とするポリペプチドの切断方法。
【請求項２】
OmpTプロテアーゼ97番アミノ酸変異体により切断されうる切断部位を有する融合タンパク質をコードする遺伝子を有する発現プラスミドにより宿主細胞を形質転換し、当該細胞内において上記遺伝子を発現させ、上記切断部位において上記プロテアーゼで切断されることにより融合タンパク質から目的ペプチドを得ることを含んでなる目的ペプチドの製造方法において、
前記切断部位を介してＣ末端がアルギニン又はリジンである保護ペプチドと融合したＮ末端がアルギニン又はリジン以外である目的ペプチドから構成される融合タンパク質中の当該切断部位に係るP10位からP3位まで又はP3’位からP5’位までのアミノ酸配列中の任意の部位に１つの塩基性アミノ酸又は２つ若しくは３つの塩基性アミノ酸を連続して配し、
OmpTプロテアーゼのＮ末端から97番目のアミノ酸がロイシンの場合は、目的ペプチドのＮ末端がセリン又はアラニンであり、
OmpTプロテアーゼのＮ末端から97番目のアミノ酸がメチオニンの場合は、目的ペプチドのＮ末端がフェニルアラニン、アラニン、セリン、システイン又はチロシンであり、
OmpTプロテアーゼのＮ末端から97番目のアミノ酸がヒスチジンの場合は、目的ペプチドのＮ末端がアラニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン又はアスパラギンである、
ことを特徴とする目的ペプチドの製造方法。
【請求項３】
ポリペプチド中又は融合タンパク質中の所望する切断部位に係るP10位〜P3位の間に２又は３連続して塩基性アミノ酸を配する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ポリペプチド中又は融合タンパク質中の所望する切断部位に係るP5位〜P3位に３連続して塩基性アミノ酸を配する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記塩基性アミノ酸がアルギニン及び／又はリジンである請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
塩基性アミノ酸がアルギニンである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリペプチド中又は融合タンパク質中の所望する切断部位に係るP5位からP1位までのアミノ酸配列がArg-Arg-Arg-Ala-Argである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ポリペプチド中又は融合タンパク質中の所望する切断部位に係るP7位からP1位までのアミノ酸配列がAsp-Ala-Arg-Arg-Arg-Ala-Argである請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記OmpTプロテアーゼ97番アミノ酸変異体をコードする遺伝子を発現する菌体そのものを切断用プロテアーゼとして用いる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記OmpTプロテアーゼ97番アミノ酸変異体をコードする遺伝子と当該プロテアーゼによる切断を所望するポリペプチド又は融合タンパク質をコードする遺伝子とを共発現することからなる請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は大腸菌が有するＯｍｐＴプロテアーゼ又はその変異体を利用して生理活性ペプチド、タンパク質及びそれらの誘導体を融合タンパク質から直接切出す方法に関する。詳細には大腸菌成熟型ＯｍｐＴプロテアーゼを用いる融合タンパク質の切断において、切断部位のＰ３位、Ｐ４位及びＰ５位に塩基性アミノ酸を配することにより当該切断部位のＰ１位とＰ１’位の間のペプチド結合における切断率を上昇させる方法、更に、ＯｍｐＴプロテアーゼのＮ末端から９７番目のアミノ酸を置換してそのＰ１’位に対する基質特異性を改変した変異体を用い、Ｐ１’位のアミノ酸がアルギニン又はリジン以外である場合においても融合タンパク質から生理活性ペプチド、タンパク質及びそれらの誘導体を効率よく遊離、生産する方法に関する。
【背景技術】  大腸菌ＯｍｐＴプロテアーゼは大腸菌外膜画分に存在し、主に塩基性アミノ酸対の間のペプチド結合を選択的に切断するプロテアーゼである。この大腸菌ＯｍｐＴプロテアーゼのアミノ酸配列と相同性を有し且つプロテアーゼ活性を有するあるいは有すると推定されるタンパク質は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ等の腸内細菌にも見出されており、これら一群のタンパク質はｏｍｐｔｉｎ  ｆａｍｉｌｙと称されている。
大腸菌ＯｍｐＴプロテアーゼは分子量約３３５００である。Ｓｕｇｉｍｕｒａ等はＯｍｐＴプロテアーゼについて、基質特異性を調べ、本酵素がアルギニン−アルギニン、リジン−リジン、アルギニン−リジン及びリジン−アルギニンの塩基性アミノ酸対の中央のペプチド結合を特異的に切断する酵素であることを報告している（Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｈａｒａ，Ｔ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５６２５−５６３２，１９８８）。
しかしながら本酵素は全ての塩基性アミノ酸対を切断するわけではなく、むしろその特異性は高い。例えばヒトガンマインターフェロンには塩基性アミノ酸対が１０箇所存在するが、それらのうちで２箇所のみが切断される（Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：３６５０−３６５４，１９８８）。これは基質であるヒトガンマインターフェロンの立体構造や塩基性アミノ酸対周辺の酵素が認識すると思われる部位のアミノ酸配列の影響によると思われる。
本明細書においてはＳｃｈｅｃｈｔｅｒとＢｅｒｇｅｒの表記方法（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ，Ｉ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ，Ａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７：１５７−１６２，１９６７）に従って基質のアミノ酸の位置を表記した。即ち、Ｐｎ…Ｐ２−Ｐ１−Ｐ１’−Ｐ２’…Ｐｎ’においてＰ１位とＰ１’位の間のペプチド結合が切断部位であり、アミノ酸は１文字あるいは３文字表記とし、↓を切断部位とした。
例えば、アミノ酸配列−ロイシン−チロシン−リジン−アルギニン−ヒスチジン−のリジンとアルギニンの間で切断される場合（−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ↓Ａｒｇ−Ｈｉｓ−）、ロイシンがＰ３位、チロシンがＰ２位、リジンがＰ１位、アルギニンがＰ１’位、ヒスチジンがＰ２’位のアミノ酸となる。
更に、切断部位及びその周辺アミノ酸配列にアミノ酸置換を導入して切断を受けなくなった場合又は新たな切断部位が生じる場合においても、特に断りのない限り、もとの配列上の対応するアミノ酸の位置としてこれらを用いることとする。
これまでに塩基性アミノ酸対以外のアミノ酸配列におけるＯｍｐＴプロテアーゼ切断部位も見出されており、ＤｅｋｋｅｒらはＡｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ（Ｐ２−Ｐ１↓Ｐ１’−Ｐ２’）のアミノ酸配列からなるＯｍｐＴプロテアーゼ基質にアミノ酸置換を導入した基質を用いて、ＯｍｐＴプロテアーゼが切断部位のＰ１位のアミノ酸として塩基性アミノ酸であるアルギニン及びリジンに対して高い特異性を示す一方で、Ｐ１’位のアミノ酸に関しては寛容であることを報告している（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：１６９４−１７０１，２００１）。
本発明者らも、尿素存在ポリペプチド変性条件下において本酵素が切断できる融合タンパク質のＰ１’位にアミノ酸置換を導入した融合タンパク質を基質に用いて、Ｐ１’位のアミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、及びプロリン以外のアミノ酸である場合に切断されることを見出している（Ｏｋｕｎｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：１２７−１３４，２００２、特願２０００−６０２８０３）。但し、これらの場合において切断効率はＰ１’位アミノ酸残基がアルギニン又はリジンである場合と比較して低い。
切断部位周辺配列に対する特異性に関してはＰ２位又はＰ２’位に酸性アミノ酸を配した場合に切断を受けなくなることが示されている（Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：１６９４−１７０１，２００１）。
更に、本発明者らはＰ４位又はＰ６位に塩基性アミノ酸であるアルギニン又はリジンを配した場合に切断効率が増加し、逆に酸性アミノ酸であるアスパラギン酸又はグルタミン酸を配した場合にはそれが減少することを報告している（Ｏｋｕｎｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：７７−８４，２００２、特願２０００−６０２８０３）。
その他の切断部位周辺配列に対する特異性に関しては明らかとなっていないがＯｍｐＴプロテアーゼは塩基性の高い抗菌ペプチドであるプロタミンを切断すること（Ｓｔｕｍｐｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：４００２−４００６，１９９８）、プロテアーゼ活性に関わるＯｍｐＴプロテアーゼ菌体外ドメインに酸性アミノ酸が多く存在すること（Ｖａｎｄｅｐｕｔｔｅ−Ｒｕｔｔｅｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：５０３３−５０３９，２００１）からＯｍｐＴプロテアーゼと基質間の相互作用には電荷による作用が重要であろうと推測される。
ＯｍｐＴプロテアーゼの応用面に関して、切断部位に対する特異性の高さ、更には大腸菌外膜に存在しているプロテアーゼであることより、本プロテアーゼは遺伝子組換え技術で作製した融合タンパク質から目的ポリペプチドを遊離させる際にプロセッシング酵素として用いられている。
Ｈａｎｋｅらは大腸菌を用いたコレステロールエステラーゼの分泌生産にあたり、それを大腸菌ヘモリシンＡタンパク質と融合させて菌体外に分泌させた後、外膜に存在しているＯｍｐＴプロテアーゼを作用させて融合タンパク質から活性あるコレステロールエステラーゼを得ることに成功している。彼らは、アルギニン−リジンの配列を持つリンカーを配し、この配列をＯｍｐＴプロテアーゼで切断している。（Ｈａｎｋｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３３：４２−４８，１９９２）。
また、本発明者等はＯｍｐＴプロテアーゼが変性剤に対して抵抗性があることを見出し、この性質を利用することで封入体として発現された融合タンパク質を変性剤の存在下で切断できることを示した。即ち、大腸菌発現系で封入体としてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｖ８プロテアーゼ誘導体融合タンパク質を発現し、それを尿素により可溶化した後、尿素存在下でＯｍｐＴプロテアーゼを働かせ、融合タンパク質からＶ８プロテアーゼ誘導体部分を遊離し、リフォールディングを行ない、酵素活性を有するＶ８プロテアーゼ誘導体を生産することに成功している（Ｙａｂｕｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４：１１８−１２５，１９９５）。
通常、融合タンパク質から目的ポリペプチドあるいは目的タンパク質を遊離させる際には、アミノ酸配列に対する特異性の高い酵素がプロセッシング酵素としてよく用いられている。それらに使われるプロテアーゼには、Ｘａ因子、トロンビン、エンテロキナーゼ等が知られているが、これらの酵素は哺乳類を起源とする酵素であり、その供給量は低く、コストが高いため、融合タンパク質法によるペプチド及びタンパク質の工業的大量処理には適していない。更には目的ポリペプチド、タンパク質を医薬品として用いる際には、酵素に由来するウイルス汚染及び狂牛病の原因因子である変性プリオンタンパク質の汚染についても考慮することが必要である。
ＯｍｐＴプロテアーゼは大腸菌に起源を持つことから、プロセッシング酵素として用いるとき供給量、コスト及び安全性の面において前述の酵素より優れていることは明白である。また、ＯｍｐＴプロテアーゼは封入体中にも存在するため融合タンパク質を封入体として発現させる場合には尿素などの変性剤により融合タンパク質を溶解するだけで作用する。更に、ＯｍｐＴプロテアーゼは大腸菌外膜に存在するため菌体そのものを反応系に添加することによりＯｍｐＴプロテアーゼ反応を行なうことができる（Ｇｒｏｄｂｅｒｇ，Ｊ．ａｎｄ  Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：１２４５−１２５３）。
医薬品製造などの工業的ペプチド生産において大腸菌で生産された融合タンパク質をプロセッシングして目的ポリペプチドを得る際に用いるプロテアーゼの多くは大腸菌由来ではないために精製して使用する必要がある。そのため精製を必要とせず、大腸菌菌体そのもの、外膜画分の添加あるいは封入体溶解のみでＯｍｐＴプロテアーゼをプロセッシングプロテアーゼとして使用することはポリペプチド生産コストの大幅な改善に寄与する。しかし従来大腸菌ＯｍｐＴプロテアーゼを用いた融合タンパク質のプロセッシングにおいて遊離されてくるポリペプチドのＮ末端アミノ酸は一部の例外を除きリジンあるいはアルギニンであるものに限られていた。
ＯｍｐＴプロテアーゼの有用性は大きいが、本発明以前は、ＯｍｐＴプロテアーゼを融合タンパク質の切断酵素として用いる場合、切断部位及びその周辺のアミノ酸配列をどのようにデザインすれば意図する部位で特異的且つ効率的な切断が可能なのかということに関する知見は限られていた。そのため、効率的に切断可能な目的ポリペプチドのＮ末端アミノ酸の種類は限定されていた。従って、得ることのできる目的ポリペプチドの種類が制限されるあるいは、たとえ切断可能であっても効率的な切断が行えないという問題が生じていた。
【特許文献１】特願２０００−６０２８０３
【非特許文献１】Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｎｉｓｈｉｈａｒａ，Ｔ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５６２５−５６３２，１９８８
【非特許文献２】Ｓｕｇｉｍｕｒａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｈｉｇａｓｈｉ，Ｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：３６５０−３６５４，１９８８
【非特許文献３】Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ，Ｉ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ，Ａ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７：１５７−１６２，１９６７
【非特許文献４】Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４０：１６９４−１７０１，２００１
【非特許文献５】Ｏｋｕｎｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：１２７−１３４，２００２
【非特許文献６】Ｏｋｕｎｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：７７−８４，２００２
【非特許文献７】Ｓｔｕｍｐｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：４００２−４００６，１９９８
【非特許文献８】Ｖａｎｄｅｐｕｔｔｅ−Ｒｕｔｔｅｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：５０３３−５０３９，２００１
【非特許文献９】Ｈａｎｋｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３３：４２−４８，１９９２
【非特許文献１０】Ｙａｂｕｔａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４：１１８−１２５，１９９５
【非特許文献１１】Ｇｒｏｄｂｅｒｇ，Ｊ．ａｎｄ  Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：１２４５−１２５３，１９８８
【発明の開示】
本発明においては上記の問題点を克服し、プロセッシング酵素としてＯｍｐＴプロテアーゼ若しくはその変異体を利用してあらゆる種類の目的ポリペプチドを融合タンパク質から効率的且つ特異的に遊離する方法、即ち、目的ポリペプチドのＮ末端アミノ酸をＰ１’位アミノ酸残基として融合タンパク質のＰ１−Ｐ１’の１箇所のみを効率よく切断させることを本発明の課題とする。
上述の課題に対し本発明者らは、ＯｍｐＴプロテアーゼの切断部位及びその周辺アミノ酸配列を更に調べ、新たな切断方法や認識・切断配列を見出せれば、上記のこれらの制限を解決することができ、本酵素が融合タンパク質のプロセッシング酵素として更に有用となると考えた。また、ＯｍｐＴプロテアーゼ自体に部位特異的変異を導入して基質特異性が野生型と異なるＯｍｐＴプロテアーゼ変異体を作製し、これを利用することも可能であると考えた。
そこで本発明者らは、ＯｍｐＴプロテアーゼの基質認識及び切断には切断部位周辺のアミノ酸配列が重要であることから、既知の切断部位を利用し、切断部位及びその周辺アミノ酸配列を検討することにより新たな基質特異性を見い出し、これを融合タンパク質の切断に応用するために鋭意検討を行なった。
本発明において「ＯｍｐＴプロテアーゼ」とは、シグナルペプチドが除かれた後の大腸菌由来の成熟型ＯｍｐＴプロテアーゼ又は当該ＯｍｐＴプロテアーゼ以外のＯｍｐＴプロテアーゼ活性を有するタンパク質（ＯｍｐＴ様プロテアーゼ）を意味する。ＯｍｐＴ様プロテアーゼとしては、（１）Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ、（２）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  Ｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、（３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ及び（４）Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＳｏｐＡ等が挙げられる。
本発明において「ＯｍｐＴプロテアーゼ９７番アミノ酸変異体」とは、上記ＯｍｐＴプロテアーゼの９７番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ９７）を他のアミノ酸で置換したＯｍｐＴプロテアーゼ変異体又は上記ＯｍｐＴ様プロテアーゼのアミノ酸配列中で上記ＯｍｐＴプロテアーゼのＮ末端から９７番目のアミノ酸に相当するアミノ酸を置換した変異体（ＯｍｐＴ様プロテアーゼ９７番相当アミノ酸変異体）を意味する。
ＯｍｐＴプロテアーゼの９７番目のアスパラギン酸を置換する他のアミノ酸としては、例えば、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸又はヒスチジンを挙げることができる。また、ＯｍｐＴ様プロテアーゼ９７番相当アミノ酸変異体としては、上記ＯｍｐＴ様プロテアーゼのうち、（１）Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒについては１１７位（シグナルペプチドを含む全アミノ酸配列におけるＮ末端からのアミノ酸残基の数で示した。
ＯｍｐＴの場合同様にシグナルペプチドを含んだアミノ酸残基数で示すと９７番目アミノ酸は１１７位となる）のアスパラギン酸を、（２）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  Ｅ  ｐｒｏｔｅｉｎについては１３４位のアスパラギン酸を、（３）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＯｍｐＰについては１１７位のアスパラギン酸を、及び（４）Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＳｏｐＡについては１１７位のアスパラギン酸を例えばアラニン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸又はヒスチジンに置換したもの等が挙げられる。
本発明において「目的ペプチド」とは、最終的に得たいペプチドのみならず、融合タンパク質からＯｍｐＴプロテアーゼ等で切断後、更に修飾反応や切断反応を受ける製造中間体（所謂、前駆体ペプチド）をも含む意味で用いられる。
本発明において「保護ペプチド」とは、目的ペプチドとリンカーペプチドを介して融合タンパク質を構成するペプチドであって、リンカーペプチドをも含む意味で用いられる。
本発明において「所望する切断部位」とは、ポリペプチド中の任意の部位、保護ペプチドとリンカーペプチドを介して融合した目的ペプチドからなる融合タンパク質におけるリンカーペプチドのＣ末端と目的ペプチドのＮ末端との間の部位又は当該リンカーペプチド中の任意の部位を意味する。
本発明の主な主題は以下の（１）〜（４）の事項に関する。：
（１）ポリペプチド中の所望する切断部位に係るＰ１位がアルギニン又はリジンであり、Ｐ１’位がアスパラギン酸、グルタミン酸又はプロリン以外であり、Ｐ１０位からＰ３位まで又はＰ３’位からＰ５’位までのアミノ酸配列中の任意の部位に１つの塩基性アミノ酸又は２つ若しくは３つの塩基性アミノ酸を連続して配し（但し、１つの塩基性アミノ酸を配する場合、Ｐ６又はＰ４位を除く）、ＯｍｐＴプロテアーゼを用いて当該ポリペプチド中の所望する切断部位で切断することを特徴とするポリペプチドの切断方法、及び当該切断方法を用いて融合タンパク質から目的ペプチドを得ることを特徴とする目的ペプチドの製造方法、
（２）ＯｍｐＴプロテアーゼ９７番アミノ酸変異体を用いてポリペプチド中の所望の切断部位で切断することを特徴とするポリペプチドの切断方法、及び当該切断方法を用いて融合タンパク質から目的ペプチドを得ることを特徴とする目的ペプチドの製造方法、
（３）ポリペプチド中の所望する切断部位に係るＰ１位がアルギニン又はリジンであり、Ｐ１’位がアルギニン又はリジン以外であり、Ｐ１０位からＰ３位まで又はＰ３’位からＰ５’位までのアミノ酸配列中の任意の部位に１つの塩基性アミノ酸又は２つ若しくは３つの塩基性アミノ酸を連続して配することからなる上記（２）に記載の方法、
（４）ＯｍｐＴプロテアーゼ又はＯｍｐＴプロテアーゼ９７番アミノ酸変異体を用いてポリペプチド中の所望する切断部位で切断することからなるポリペプチドの切断方法であって、当該ポリペプチド中に上記プロテアーゼによる切断を所望しない部位が存在する場合、当該部位に係るＰ３位に酸性アミノ酸を配することにより当該部位における切断を抑制することを特徴とするポリペプチドの切断方法、及び当該切断方法を用いて融合タンパク質から目的ペプチドを得ることを特徴とする目的ペプチドの製造方法。
上記（１）については、ＯｍｐＴプロテアーゼの切断部位の好ましくはＰ１０位からＰ３位（但し、Ｐ６又はＰ４位の１箇所のみを塩基性アミノ酸で置換した場合を除く）、特に好ましくはＰ５位からＰ３位のアミノ酸を塩基性アミノ酸に置換することにより切断率が増加するという新しい知見に基づいている。しかしながら、連続する塩基性アミノ酸の間のペプチド結合をＯｍｐＴが切断しやすいという性質があるためＰ５位からＰ３位に連続する塩基性アミノ酸を配した場合、これらの部位のペプチド結合がＯｍｐＴにより切断されてしまう。
ところが３連続するアルギニンに対するＯｍｐＴの切断率は２連続する場合に比べて減少するという既知の性質を用いて、Ｐ５位からＰ３位に３連続するアルギニンを配した場合にはＰ５位からＰ３位のアルギニンの間での切断を抑えることができた。すなわちこれにより所望の部位での切断（Ｐ１位とＰ１’位のアミノ酸の間での切断）を促進し、所望しない部位での切断（Ｐ５位からＰ３位のアミノ酸の間での切断）を抑制することができた。
以上のことから、切断所望部位のＰ３位、Ｐ４位及びＰ５位に塩基性アミノ酸（好ましくは、アルギニン）を配したアミノ酸配列を所望のポリペプチド中に設計し、当該ポリペプチド中の所望する切断部位のＰ１’位が従来のアルギニン又はリジンの場合のみならず、アスパラギン酸、グルタミン酸又はプロリンを除くその他のアミノ酸の場合にもＯｍｐＴプロテアーゼにより非常に効率的に切断を行なえることを見出した。
更に当該方法は、目的ポリペプチドを含む融合タンパク質を大腸菌宿主で製造させ、大腸菌が本来持っている又は遺伝子工学的に導入したＯｍｐＴプロテアーゼで融合タンパク質から所望する切断部位のＰ１’位からＣ末端側に配されたＮ末端アミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸又はプロリン以外である目的ポリペプチドを切出す場合に特に都合がよい。
また、上記（２）及び（３）については、ＯｍｐＴプロテアーゼのＮ末端から９７番目のアミノ酸を特定のアミノ酸に置換した場合、ＯｍｐＴプロテアーゼでは切断することができない切断部位においても実際に切断できることを見出したことは、目的ペプチドの製造において当該ペプチドのＮ末端アミノ酸の種類を多様に選択できるので非常に有用性が高い。特に、融合タンパク質を用いた目的ペプチドの製法において、融合タンパク質に係るリンカー配列を−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−目的ペプチドと設計し、且つＯｍｐＴプロテアーゼのＮ末端から９７番目のアスパラギン酸を特に好ましくはロイシン、メチオニン又はヒスチジンに置換したプロテアーゼ変異体をプロセッシングプロテアーゼとして利用することにより遊離されてくるポリペプチドのＮ末端アミノ酸がリジンあるいはアルギニンであるもの以外でも効率よく且つ特異的に遊離を可能にすることができる。
本願に係る実施例においては大腸菌由来ＯｍｐＴプロテアーゼの変異体を用いた融合タンパク質の切断を実施したが、ＯｍｐＴプロテアーゼ以外のＯｍｐＴプロテアーゼ活性を有するもの又はそのアミノ酸配列中でＯｍｐＴプロテアーゼのＮ末端から９７番目のアミノ酸に相当するアミノ酸を置換した変異体を用いて融合タンパク質を切断することも十分に可能であると考えられる。
更に、上記（４）については、ポリペプチド又は融合タンパク質中にＯｍｐＴプロテアーゼ及びその変異体による切断を所望しない部位が存在する場合、当該部位に係るＰ３位に酸性アミノ酸を配することにより当該部位における切断を抑制することを見出した。この知見は特に融合タンパク質から目的ペプチドを得る際の融合タンパク質の設計において有用であり、目的ペプチドの製造を非常に効率よく行なうことができる。
更に具体的には本発明は以下の事項に関する。：
（１）ポリペプチド中の所望する切断部位に係るＰ１位がアルギニン又はリジンであり、Ｐ１’位がアスパラギン酸、グルタミン酸又はプロリン以外であり、Ｐ１０位からＰ３位まで又はＰ３’位からＰ５’位までのアミノ酸配列中の任意の部位に１つの塩基性アミノ酸又は２つ若しくは３つの塩基性アミノ酸を連続して配し（但し、１つの塩基性アミノ酸を配する場合、Ｐ６又はＰ４位を除く）、ＯｍｐＴプロテアーゼを用いて当該ポリペプチド中の所望する切断部位で切断することを特徴とするポリペプチドの切断方法。
（２）所望する切断部位を介してＣ末端がアルギニン又はリジンである保護ペプチドと融合したＮ末端がアスパラギン酸、グルタミン酸又はプロリン以外である目的ペプチドからなる融合タンパク質中の当該切断部位に係るＰ１０位からＰ３位まで又はＰ３’位からＰ５’位までのアミノ酸配列中の任意の部位に１つの塩基性アミノ酸又は２つ若しくは３つの塩基性アミノ酸を連続して配し（但し、１つの塩基性アミノ酸を配位する場合、Ｐ６又はＰ４位を除く）、上記切断部位がＯｍｐＴプロテアーゼにより切断されうる切断部位である融合タンパク質をコードする遺伝子を有する発現プラスミドにより宿主細胞を形質転換し、当該細胞内において上記遺伝子を発現させ、上記切断部位において上記プロテアーゼで切断されることにより融合タンパク質から目的ペプチドを得ることを特徴とする目的ペプチドの製造方法。
（３）ポリペプチド中又は融合タンパク質中にＯｍｐＴプロテアーゼによる切断を所望しない部位が存在する場合、当該部位に係るＰ３位に酸性アミノ酸を配することにより当該部位における切断を抑制することからなる上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）ポリペプチド中又は融合タンパク質中の所望する切断部位に係るＰ１０位〜Ｐ３位の間に２又は３連続して塩基性アミノ酸を配することからなる上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）ポリペプチド中又は融合タンパク質中の所望する切断部位に係るＰ５位〜Ｐ３位に３連続して塩基性アミノ酸を配することからなる上記（４）に記載の方法。
（６）塩基性アミノ酸がアルギニン及び／又はリジンである上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）塩基性アミノ酸がアルギニンである上記（６）に記載の方法。
（８）ＯｍｐＴプロテアーゼを用いて、ポリペプチド中の所望する切断部位で切断することからなるポリペプチドの切断方法又は融合タンパク質中の所望する切断部位で切断することからなる目的ペプチドの製造方法であって、当該ポリペプチド中又は当該融合タンパク質中にＯｍｐＴプロテアーゼによる切断を所望しない部位が存在する場合、当該部位に係るＰ３位に酸性アミノ酸を配することにより当該部位における切断を抑制することを特徴とする当該方法。
（９）酸性アミノ酸がアスパラギン酸である上記（３）〜（８）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）ポリペプチド中又は融合タンパク質中の所望する切断部位に係るＰ５位からＰ１位までのアミノ酸配列がＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇである上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法。
（１１）ポリペプチド中又は融合タンパク質中の所望する切断部位に係るＰ７位からＰ１位までのアミノ酸配列がＡｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇである上記（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法。
（１２）ＯｍｐＴプロテアーゼのＮ末端から９７番目のアミノ酸が、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸又はヒスチジンであるＯｍｐＴプロテアーゼ９７番アミノ酸変異体を用いてポリペプチド中の所望の切断部位で切断することを特徴とするポリペプチドの切断方法。
（１３）ポリペプチド中の所望する切断部位に係るＰ１位がアルギニン又はリジンであり、Ｐ１’位がアルギニン又はリジン以外である場合に、ＯｍｐＴプロテアーゼのＮ末端から９７番目のアミノ酸が、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸又はヒスチジンであるＯｍｐＴプロテアーゼ９７番アミノ酸変異体を用いて当該ポリペプチド中の所望の切断部位で切断することを特徴とするポリペプチドの切断方法。
（１４）ポリペプチド中の所望する切断部位に係るＰ１位がアルギニン又はリジンであり、Ｐ１’位がアルギニン又はリジン以外であり、Ｐ１０位からＰ３位まで又はＰ３’位からＰ５’位までのアミノ酸配列中の任意の部位に１つの塩基性アミノ酸又は２つ若しくは３つの塩基性アミノ酸を連続して配し、ＯｍｐＴプロテアーゼのＮ末端から９７番目のアミノ酸が、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸又はヒスチジンであるＯｍｐＴプロテアーゼ９７番アミノ酸変異体を用いて当該ポリペプチド中の所望する切断部位で切断することを特徴とするポリペプチドの切断方法。
（１５）所望する切断部位において、ＯｍｐＴプロテアーゼのＮ末端から９７番目のアミノ酸が、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸又はヒスチジンであるＯｍｐＴプロテアーゼ９７番アミノ酸変異体により切断されうる切断部位を介して保護ペプチドと融合した目的ペプチドからなる融合タンパク質をコードする遺伝子を有する発現プラスミドにより宿主細胞を形質転換し、当該細胞内において上記遺伝子を発現させ、上記切断部位において上記プロテアーゼで切断されることにより融合タンパク質から目的ペプチドを得ることを特徴とする目的ペプチドの製造方法。
（１６）所望する切断部位において、ＯｍｐＴプロテアーゼのＮ末端から９７番目のアミノ酸が、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸又はヒスチジンであるＯｍｐＴプロテアーゼ９７番アミノ酸変異体により切断されうる切断部位を介してＣ末端がアルギニン又はリジンである保護ペプチドと融合したＮ末端がアルギニン又はリジン以外である目的ペプチドからなる融合タンパク質をコードする遺伝子を有する発現プラスミドにより宿主細胞を形質転換し、当該細胞内において上記遺伝子を発現させ、上記切断部位において上記プロテアーゼで切断されることにより融合タンパク質から目的ペプチドを得ることを特徴とする目的ペプチドの製造方法。
（１７）所望する切断部位を介してＣ末端がアルギニン又はリジンである保護ペプチドと融合したＮ末端がアルギニン又はリジン以外である目的ペプチドからなる融合タンパク質中の当該切断部位に係るＰ１０位からＰ３位まで又はＰ３’位からＰ５’位までのアミノ酸配列中の任意の部位に１つの塩基性アミノ酸又は２つ若しくは３つの塩基性アミノ酸を連続して配し、上記切断部位がＯｍｐＴプロテアーゼのＮ末端から９７番目のアミノ酸が、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸又はヒスチジンであるＯｍｐＴプロテアーゼ９７番アミノ酸変異体により切断されうる切断部位である融合タンパク質をコードする遺伝子を有する発現プラスミドにより宿主細胞を形質転換し、当該細胞内において上記遺伝子を発現させ、上記切断部位において上記プロテアーゼで切断されることにより融合タンパク質から目的ペプチドを得ることを特徴とする目的ペプチドの製造方法。
（１８）ポリペプチド中又は融合タンパク質中にＯｍｐＴプロテアーゼ９７番アミノ酸変異体による切断を所望しない部位が存在する場合、当該部位に係るＰ３位に酸性アミノ酸を配することにより当該部位における切断を抑制することからなる上記（１２）〜（１７）のいずれか１項に記載の方法。
（１９）ポリペプチド中又は融合タンパク質中の所望する切断部位に係るＰ１０位〜Ｐ３位の間に２又は３連続して塩基性アミノ酸を配することからなる上記（１２）〜（１８）のいずれか１項に記載の方法。
（２０）ポリペプチド中又は融合タンパク質中の所望する切断部位に係るＰ５位〜Ｐ３位に３連続して塩基性アミノ酸を配することからなる上記（１９）に記載の方法。
（２１）塩基性アミノ酸がアルギニン及び／又はリジンである上記（１４）、（１７）〜（２０）のいずれか１項に記載の方法。
（２２）塩基性アミノ酸がアルギニンである上記（２１）に記載の方法。
（２３）ＯｍｐＴプロテアーゼ９７番アミノ酸変異体を用いて、ポリペプチド中の所望する切断部位で切断することからなるポリペプチドの切断方法又は融合タンパク質中の所望する切断部位で切断することからなる目的ペプチドの製造方法であって、当該ポリペプチド中又は当該融合タンパク質中にＯｍｐＴプロテアーゼ９７番アミノ酸変異体による切断を所望しない部位が存在する場合、当該部位に係るＰ３位に酸性アミノ酸を配することにより当該部位における切断を抑制することを特徴とする当該方法。
（２４）酸性アミノ酸がアスパラギン酸である上記（１８）〜（２３）のいずれか１項に記載の方法。
（２５）ポリペプチド中又は融合タンパク質中の所望する切断部位に係るＰ５位からＰ１位までのアミノ酸配列がＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇである上記（１２）〜（２４）のいずれか１項に記載の方法。
（２６）ポリペプチド中又は融合タンパク質中の所望する切断部位に係るＰ７位からＰ１位までのアミノ酸配列がＡｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇである上記（１２）〜（２４）のいずれか１項に記載の方法。
（２７）ＯｍｐＴプロテアーゼのＮ末端から９７番目のアミノ酸が、ロイシン、メチオニン又はヒスチジンである上記（１２）〜（２６）のいずれか１項に記載の方法。
（２８）ポリペプチド又は融合タンパク質中の所望の切断部位に係るＰ１’位又は目的ペプチドのＮ末端がセリン又はアラニンであり、９７番目のアミノ酸がロイシンであるＯｍｐＴプロテアーゼ９７番アミノ酸変異体を用いる上記（１２）〜（２６）のいずれか１項に記載の方法。
（２９）ポリペプチド又は融合タンパク質中の所望の切断部位に係るＰ１’位又は目的ペプチドのＮ末端がフェニルアラニン、アラニン、セリン、システイン又はチロシンであり、９７番目のアミノ酸がメチオニンであるＯｍｐＴプロテアーゼ９７番アミノ酸変異体を用いる上記（１２）〜（２６）のいずれか１項に記載の方法。
（３０）ポリペプチド又は融合タンパク質中の所望の切断部位に係るＰ１’位又は目的ペプチドのＮ末端がアラニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン又はアスパラギンであり、９７番目のアミノ酸がヒスチジンであるＯｍｐＴプロテアーゼ９７番アミノ酸変異体を用いる上記（１２）〜（２６）のいずれか１項に記載の方法。
（３１）目的ペプチドが２２残基から４５残基のアミノ酸からなるペプチドである上記（２）〜（１１）、（１５）〜（３０）のいずれか１項に記載の方法。
（３２）目的ペプチドが、副腎皮質刺激ホルモン（１−２４）、モチリン又はカルシトニン前駆体である上記（３１）に記載の方法。
（３３）宿主細胞が大腸菌である上記（２）〜（１１）、（１５）〜（３２）のいずれか１項に記載の方法。
（３４）ＯｍｐＴプロテアーゼ又はＯｍｐＴプロテアーゼのＮ末端から９７番目のアミノ酸がアラニン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸又はヒスチジンであるＯｍｐＴプロテアーゼ９７番アミノ酸変異体をコードする遺伝子を発現する菌体そのものを切断用プロテアーゼとして用いることからな上記（１）〜（３３）のいずれか１項に記載の方法。
（３５）ＯｍｐＴプロテアーゼ又はＯｍｐＴプロテアーゼのＮ末端から９７番目のアミノ酸がアラニン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸又はヒスチジンであるＯｍｐＴプロテアーゼ９７番アミノ酸変異体をコードする遺伝子と当該プロテアーゼによる切断を所望するポリペプチド又は融合タンパク質をコードする遺伝子とを共発現することからなる上記（１）〜（３３）のいずれか１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、融合タンパク質ＰＲＲ及びＰＲＸの構造を示す図である。融合タンパク質ＰＲＲのアミノ酸配列の上に各アミノ酸の位置を示し、下の数字はＰＲＲのＮ末端からのアミノ酸配列番号を示す。β−ｇａｌ１１７Ｓ４Ｈは大腸菌のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端から１１７アミノ酸に由来する保護タンパク質、ＧＬＰ−１（７−３７）はヒトグルカゴン様ペプチド−１（７−３７）、Ｌｉｎｋｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅはアミノ酸配列番号１２８番目のグルタミンから１５３番目のアルギニンまでを示す。融合タンパク質ＰＲＲでのＯｍｐＴプロテアーゼ切断部位を（黒三角）で示す。融合タンパク質ＰＲＸはＰＲＲの１４１番目アルギニンをその他の１９種類のアミノ酸に置換した融合タンパク質である。
図２は、融合タンパク質ＰＡｎの構造を示す図である。融合タンパク質ＰＡのアミノ酸配列の上に各アミノ酸の位置を示し、下の数字はＰＡのＮ末端からのアミノ酸配列番号を示す。β−ｇａｌ１１７Ｓ４Ｈは大腸菌のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端から１１７アミノ酸に曲来する保護タンパク質、ＧＬＰ−１（７−３７）はヒトグルカゴン様ペプチド−１（７−３７）、Ｌｉｎｋｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅはアミノ酸配列番号１２８番目のグルタミンから１５３番目のアルギニンまでを示す。融合タンパク質ＰＡでのＯｍｐＴプロテアーゼ切断部位を（黒三角）で示す。融合タンパク質ＰＡｎにおいてアミノ酸置換導入後のアルギニンを斜体太字で示す。ＰＡｎのＯｍｐＴプロテアーゼ切断部位を↓で示す。図中右に融合タンパク質ＰＡの切断率を１００％とした場合の各融合タンパク質の切断率を示す。ａはＡｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０での切断率も含む。ｂはＡｒｇ１４１−Ａｒｇ１４２での切断率も含む。ｃはＡｒｇ１４３Ａｌａ１４４での切断率も含む。
図３は、融合タンパク質ＰＡ１Ａ３’，ＰＡ１’Ａ３’，ＰＡ２３’，ＰＡ３２３’及びＰＡ２’３’の構造を示す図である。融合タンパク質ＰＡ３’のアミノ酸配列の上に各アミノ酸の位置を示し、下の数字はＰＡ３’のＮ末端からのアミノ酸配列番号を示す。β−ｇａｌ１１７Ｓ４Ｈは大腸菌のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端から１１７アミノ酸に由来する保護タンパク質、ＧＬＰ−１（７−３７）はヒトグルカゴン様ペプチド−１（７−３７）、Ｌｉｎｋｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅはアミノ酸配列番号１２８番目のグルタミンから１５３番目のアルギニンまでを示す。アルギニンは太字で示す。融合タンパク質ＰＡ３’でのＯｍｐＴプロテアーゼ切断部位を▽（切断率７３％）、（黒三角）（切断率２２０％）で示す。融合タンパク質ＰＡ１Ａ３’，ＰＡ１’Ａ３’，ＰＡ２３’，ＰＡ３２３’及びＰＡ２’３’においてＰＡ３’にアミノ酸置換導入後のアミノ酸を斜体で示し、ＯｍｐＴプロテアーゼ切断部位を↓で示す。図中右に融合タンパク質ＰＡの切断率を１００％とした場合の各融合タンパク質のＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１（●）とＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４（○）での切断率を示す。ＮＤは検出されなかったことを示す。ａはＡｒｇ１４０−Ａｌａ１４１での切断率を示す。ｂはＡｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０の切断率も含む。ｃはＡｒｇ１４２−Ａｒｇ１４３での切断率も含む。
図４は、融合タンパク質ＰＡ３Ｄ２３’，ＰＡ４Ｄ２３’及びＰＡ５Ｄ２３’の構造を示す図である。融合タンパク質ＰＡ２３’のアミノ酸配列の上に各アミノ酸の位置を示し、下の数字はＰＡ２３’のＮ末端からのアミノ酸配列番号を示す。β−ｇａｌ１１７Ｓ４Ｈは大腸菌のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端から１１７アミノ酸に由来する保護タンパク質、ＧＬＰ−１（７−３７）はヒトグルカゴン様ペプチド−１（７−３７）、Ｌｉｎｋｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅはアミノ酸配列番号１２８番目のグルタミンから１５３番目のアルギニンまでを示す。アルギニンは太字で示す。融合タンパク質ＰＡ２３’での主なＯｍｐＴプロテアーゼ切断部位を（黒三角）で示す。融合タンパク質ＰＡ３Ｄ２３’，ＰＡ４Ｄ２３’及びＰＡ５Ｄ２３’においてＰＡ２３’にアミノ酸置換導入後のアミノ酸を斜体で示し、ＯｍｐＴプロテアーゼ切断部位を↓で示す。図中右に融合タンパク質ＰＡの切断率を１００％とした場合の各融合タンパク質のＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１（●）とＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４（○）での切断率を示す。ＮＤは検出されなかったことを示す。
図５は、融合タンパク質ＰＲＭＴ及びＰＭＴの構造を示す図である。両融合タンパク質のアミノ酸配列上の数字はＮ末端からのアミノ酸配列番号を示す。β−ｇａｌ１１７Ｓ４Ｈは大腸菌のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端から１１７アミノ酸に由来する保護タンパク質、Ｌｉｎｋｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅはＰＲＭＴではアミノ酸配列番号１２８番目のグルタミンから１４０番目のアルギニンまでを、ＰＭＴではアミノ酸配列番号１２８番目のグルタミンから１４３番目のアルギニンまでを示す。融合タンパク質ＰＲＭＴの１４０番目のアルギニンまでのアミノ酸配列は図１に示した構造を有する融合タンパク質ＰＲＲ（特願２０００−６０２８０３参照）のＮ末端から１４０番目のアルギニンまでのアミノ酸配列と一致する。また、融合タンパク質ＰＭＴの１４３番目のアルギニンまでのアミノ酸配列は融合タンパク質ＰＡ２３’（図４）のＮ末端から１４３番目のアルギニンまでのアミノ酸配列と一致する。融合タンパク質ＰＭＴのＯｍｐＴプロテアーゼによる切断部位を●で示し、ＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍによる切断部位を○で示した。ＲＡＲ−ｍｏｔｉｌｉｎはＰＭＴからＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１の切断により遊離するＡｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｍｏｔｉｌｉｎからなるポリペプチド、ＲＲＡＲ−ｍｏｔｉｌｉｎはＰＭＴからＡｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０の切断により遊離するＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｍｏｔｉｌｉｎからなるポリペプチドである。
図６は、融合タンパク質ＰＲＭＴ及びＰＭＴと野生型ＯｍｐＴプロテアーゼ及びＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍの反応（２５℃、１２０分）をＨＰＬＣで解析した結果を示す。
図７は、Ｗ３１１０  Ｍ２５  ＰＭＴ及びＷ３１１０  Ｍ２５  ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｍ発現菌の２Ｌ高密度培養における培養液ＯＤ６６０の経時変化を示す図である。○はＷ３１１０  Ｍ２５  ＰＭＴ、●はＷ３１１０  Ｍ２５  ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｍである。両組換え大腸菌ともにグルコース濃度１．５％、３２℃で培養を開始し、培養開始後約１２時間でグルコースが枯渇した後に２％となるようにグリセロールを添加し、３７℃に培養温度を変え、その後、グリセロールが枯渇するごとに同様に２％となるようにグリセロールを添加し（Ｗ３１１０  Ｍ２５  ＰＭＴ，↑；Ｗ３１１０  Ｍ２５  ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｍ，↓）、Ｗ３１１０  Ｍ２５  ＰＭＴは培養開始後２４時間でＷ３１１０  Ｍ２５  ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｍは２０時間で培養を終了した。
図８は、融合タンパク質ＰＭＴからのＯｍｐＴプロテアーゼ変異体ＯｍｐＴＤ９７Ｍによるモチリン遊離の経時変化を示す。
図９において、Ａは６０分後の反応液をＨＰＬＣで、ＢはＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示す。レーン１，ＰＭＴのみ；２，ＰＭＴ＋Ｄ９７Ｍ；３，モチリン標準品。反応液組成：４Ｍ  尿素，５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０），２ｍＭ  ＥＤＴＡ，ＰＭＴ  ＯＤ６６０＝５０，ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｍ  ＯＤ６６０＝１６；反応温度：２５℃；１２０ｍｉｎ−１で振とう
図１０において、Ａは実施例１、３、５、７、９、１６及び１８で構築した融合タンパク質発現プラスミドの構造を示す。Ｂは実施例１１で構築したＯｍｐＴプロテアーゼ又はＯｍｐＴプロテアーゼ変異体発現プラスミドの構造を示す。
図１１は、融合タンパク質ＰＡＣ及びＰＣＴの構造を示す。各融合タンパク質のアミノ酸配列下の数字はＮ末端からのアミノ酸配列番号を示す。β−ｇａｌ１１７Ｓ４Ｈは大腸菌のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端から１１７アミノ酸に由来する保護タンパク質、Ｌｉｎｋｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅはアミノ酸配列番号１２８番目のグルタミンから１４３番目のアルギニンまでを示す。各融合タンパク質の１４３番目のアルギニンまでのアミノ酸配列は融合タンパク質ＰＡ２３’（図４）のＮ末端から１４３番目のアルギニンまでのアミノ酸配列と一致する。
図１２は、融合タンパク質と野生型ＯｍｐＴプロテアーゼ及びＯｍｐＴプロテアーゼ変異体の反応をＨＰＬＣで解析した結果を示す。ＰＡＣはＤ９７Ｌと１０分間、ＰＣＴはＤ９７Ｈと２時間、２５℃で反応させた。
図１３は、実施例１７で構築したＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍ発現プラスミドの構造を示す。ＭＣＳ，マルチクローニングサイト。
図１４は、実施例１７で作製した融合タンパク質ＰＭＴとＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍを共発現するＷ３１１０  Ｍ２５形質転換大腸菌から得られた封入体を用いた融合タンパク質ＰＭＴからのヒトモチリンの遊離を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果である。Ｍｒ，タンパク質分子量マーカー；レーン１，反応開始後２０分；２，４０分；３，６０分；４，１２０分；５，１８０分；６，２４０分；７，３００分；８，３６０分；９，１４４０分（２４時間）；１０，モチリン標準品。反応液組成：４Ｍ  尿素，５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０），２ｍＭ  ＥＤＴＡ，封入体ＯＤ６６０＝２０；反応温度：２５℃
図１５は、融合タンパク質ＰＭＴ、ＰＭＴ６Ｄ及びＰＭＴ７Ｄの構造を示す図である。融合タンパク質のアミノ酸配列上の数字はＮ末端からのアミノ酸配列番号を示す。β−ｇａｌ１１７Ｓ４Ｈは大腸菌のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端から１１７アミノ酸に由来する保護タンパク質、Ｌｉｎｋｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅはアミノ酸配列番号１２８番目のグルタミンから１４３番目のアルギニンまでを示す。これらの融合タンパク質の１４３番目のアルギニンまでのアミノ酸配列はそれぞれ融合タンパク質ＰＡ２３’、ＰＡ３Ｄ２３’及びＰＡ４Ｄ２３’（図４）のＮ末端から１４３番目のアルギニンまでのアミノ酸配列と一致する。それぞれの融合タンパク質のＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍによる切断部位を矢印で示した。ＡＲ−ｍｏｔｉｌｉｎはＡｒｇ１４１−Ａｌａ１４２の切断により遊離するＡｌａ−Ａｒｇ−ｍｏｔｉｌｉｎからなるポリペプチド、ＲＲＡＲ−ｍｏｔｉｌｉｎはＡｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０の切断により遊離するＡｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｍｏｔｉｌｉｎからなるポリペプチドである。
図１６は、融合タンパク質ＰＭＴとＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍの反応（２５℃、１２０分）をＨＰＬＣで解析した結果を示す。括弧内の数字は融合タンパク質から生成したモチリン濃度を１００とした場合の各副産物濃度を示した。
図１７は、融合タンパク質ＰＭＴ６ＤとＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍの反応（２５℃、１２０分）をＨＰＬＣで解析した結果を示す。括弧内の数字は融合タンパク質から生成したモチリン濃度を１００とした場合の各副産物濃度を示した。
図１８は、融合タンパク質ＰＭＴ７ＤとＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍの反応（２５℃、１２０分）をＨＰＬＣで解析した結果を示す。括弧内の数字は融合タンパク質から生成したモチリン濃度を１００とした場合の各副産物濃度を示した。
【発明を実施するための最良の形態】  以下本発明を詳説する。
ｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＲＲはグルカゴン様ペプチド−１（７−３７）（ＧＬＰ−１（７−３７））を含む融合タンパク質（ＰＲＲ）を発現する発現プラスミドである。
本融合タンパク質の保護タンパク質は大腸菌β−ガラクトシダーゼのＮ末端１１７アミノ酸を含むβ−ｇａｌ１１７Ｓ４Ｈを保護タンパク質とし、アルギニン−アルギニン配列を配した２６アミノ酸よりなるリンカー配列及びＧＬＰ−１（７−３７）より構成されている。大腸菌ＯｍｐＴプロテアーゼはＰＲＲのリンカー配列においてアルギニン−アルギニン配列の中央のペプチド結合を切断し、ＧＬＰ−１（７−３７）を含む４４アミノ酸の目的ポリペプチドを遊離させることを本発明者は既に見出している（Ｏｋｕｎｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：１２７−１３４，２００２）。
次に本発明者は融合タンパク質（ＰＲＲ）を基にＰ１位とＰ１’位がアルギニン、これらの部位以外のＰ１０位からＰ５’位のアミノ酸をすべてアラニンに置換した融合タンパク質であるＰＡを作製した。
更に、この融合タンパク質ＰＡを出発として各部位のアラニンを１箇所ずつアルギニンに置換した融合タンパク質（ＰＡｎ）を作製して、ＯｍｐＴプロテアーゼ切断部位周辺に塩基性アミノ酸であるアルギニンを配することによるＯｍｐＴプロテアーゼ切断への影響を検討した。
その結果、切断部位周辺アミノ酸配列のＰ１０位からＰ３位あるいはＰ３’位からＰ５’位に塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン）が存在する場合（但し、Ｐ６又はＰ４位の１箇所のみを塩基性アミノ酸で置換した場合を除く）、切断率が上昇することを新たに見出した。
一方、Ｐ２位又はＰ２’位がアルギニンの場合は、切断部位として配しているＰ１位とＰ１’位の２つのアルギニンに加えてアルギニンが３連続する配列となるが、この場合には逆に切断率が減少した。即ち、切断部位周辺にアルギニンを存在させることで切断率は上昇するが、アルギニンが３連続した場合には、切断率は減少するということであり、切断部位周辺アミノ酸配列をアルギニンに置換することにより切断率の制御が可能であることが判明した。
更に、Ｐ３’位にアルギニンが存在する融合タンパク質ＰＡ３’（切断部位周辺アミノ酸配列が−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ［Ｐ１］−Ａｒｇ［Ｐ１’］−Ａｌａ−Ａｒｇ［Ｐ３’］−Ａｌａ［Ｐ４’］−Ａｌａ−）において、Ｐ３’位のアルギニンとＰ４’位のアラニンの間での切断も生じていることが判明し、ここにアルギニン−アラニンの間を効率よく切断できる配列が見出された。塩基性アミノ酸が連続して並ぶ配列以外の配列で効率よく基質が切断されたことは、ＯｍｐＴプロテアーゼをプロセッシング酵素として使用する場合に極めて重要であるため、本発明者らは、さらなる検討を実施した。
切断部位周辺にアルギニンを配することにより切断効率が上昇するという知見、更にはアルギニンが３連続する場合にはアルギニン−アルギニン間で切断されにくくなるという知見に基づき、種々のアミノ酸配列を検討したところ、アミノ酸配列−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−において、主たる切断が−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−で生じることを見出した。即ち、３連続する塩基性アミノ酸を配することにより、それ以降に存在する塩基性アミノ酸部位での切断が促進されるという性質があることが明らかとなった。
しかし、上記アミノ酸配列（−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−）では３連続するアルギニン配列中でもなお切断が生じた。これを減少させる目的でＮ末端側上流アミノ酸配列に酸性アミノ酸であるアスパラギン酸を配したアミノ酸配列−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−を作製した。この配列を用いることにより、アルギニン−アラニンの間の切断率が半分に低下したが、３連続するアルギニン配列中の切断を抑えることに成功した。即ち、これらの配列−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−又は−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−においては、ＯｍｐＴプロテアーゼの切断がアルギニン−アラニン間で生じ易いように最適化されているものと考えられる。これらの配列（−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−及びＡｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−）、特に望ましくは、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−を用いることによりＰ１’位がアラニン以外のアミノ酸でも効率よく切断できることが期待された。
以上の結果から、−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−の切断部位のＣ末端側アミノ酸配列に生理活性ペプチドを配することによりＯｍｐＴプロテアーゼで直接融合タンパク質からその生理活性ペプチドを切出すことが可能かどうかを、モチリン（Ｎ末端アミノ酸はフェニルアラニン）を目的ポリペプチドとして検討した。モチリンを目的ポリペプチドとする融合タンパク質ＰＭＴを作製し、ＯｍｐＴプロテアーゼを作用させモチリンの切出しを試みた。
ところが、融合タンパク質ＰＭＴからモチリンを効率よく切出せないことが判明した。この結果より、ＯｍｐＴプロテアーゼの基質特異性としてＰ１’位のアミノ酸に関して寛容ではあることは既知であるが、効率的な切断に利用するには本プロテアーゼ自体に変異を導入しＰ１’位のアミノ酸に対する特異性を高める必要があると考えられた。
すでにＯｍｐＴの結晶構造を解析した論文（Ｖａｎｄｅｐｕｔｔｅ−Ｒｕｔｔｅｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：５０３３−５０３９，２００１）が発表されており、これに関連する論文（Ｋｒａｍｅｒ，ＲＡ．ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  ｌｅｔｔ．５０５：４２６−４３０，２００１）中で基質のＰ１’位のアミノ酸とＯｍｐＴプロテアーゼのＡｓｐ９７（Ｎ末端から９７番目のアスパラギン酸）が相互作用しているのではないかと考察されている。この９７番目のアミノ酸を置換した際に生ずる基質特異性の変化を調べるため、ＯｍｐＴのＡｓｐ９７を２０種類のアミノ酸（アスパラギン酸への同義置換を含む）に置換した変異体に対するプラスミドを作製し、これらをＯｍｐＴ欠損大腸菌ＢＬ２１株に導入してＯｍｐＴプロテアーゼ変異体ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｘ（Ｘは２０種類のアミノ酸に対応）発現大腸菌２０株を調製した。
これらをＯｍｐＴプロテアーゼのＰ１’位基質特異性を調べる目的で調製した図１に示した構造を持つ融合蛋白質ＰＲＸ（Ｘは２０種類のアミノ酸に対応、特願２０００−６０２８０３参照）を基質として作用させ、各々の融合蛋白質の切断を調べた。。その結果、ＯｍｐＴプロテアーゼの９７番目のアスパラギン酸をアラニン、ロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジンに置換したものは、切断率に高低はあるものの、融合蛋白質ＰＲＸを切断する活性を有することが判明した。特に変異体ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｌはセリン、アラニンに、ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｍはフェニルアラニン、アラニン、セリン、システイン及びチロシンに、ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｈはアラニン、バリン、イソロイシン、メチオニン、スレオニン、システイン及びアスパラギンにそれぞれ高い特異性を示すことが明らかとなった。
これより得られた知見を用いてモチリンのＮ末端アミノ酸がフェニルアラニンであることを考慮し、Ｐ１’部位がフェニルアラニンの場合に切断が良好であったＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｍを前述の融合タンパク質ＰＭＴに対して作用させたところ、効率よくモチリンを切出すことが可能となった。即ち、本発明者らはＯｍｐＴプロテアーゼの切断部位周辺の配列を最適化し、更に、ＯｍｐＴプロテアーゼ変異体を利用することにより、これまで所望の位置での切断が困難であった。ＯｍｐＴプロテアーゼによる切断を可能なものとすることに成功した。
更に、この手法が工業的に利用可能であることを検証するために融合タンパク質ＰＭＴ発現大腸菌及びＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｍプロテアーゼ変異体発現大腸菌を高密度培養し、融合タンパク質ＰＭＴ発現大腸菌から調製した封入体を含む反応液にＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｍプロテアーゼ変異体発現大腸菌そのものを直接添加して２５℃、１時間作用させた。この反応液に２０ｍＭ  酢酸（ｐＨ４．０）を添加し、沈殿除去後、上澄液を陽イオン交換及び逆相クロマトグラフィーに供した。これら一連の操作により融合タンパク質ＰＭＴ発現大腸菌培養液１Ｌあたり純度９９．０％以上のモチリンを回収率５２％で１６０ｍｇ生産することができ、十分に工業化可能な水準であることが示された。
更に、このポリペプチド生産系の汎用性を確かめるために目的ポリペプチドとしてヒト副腎皮質刺激ホルモン（１−２４）（Ｎ末端アミノ酸がセリン）及びヒトカルシトニン前駆体（Ｎ末端アミノ酸がシステイン）を配した融合タンパク質を調製し、ＯｍｐＴプロテアーゼ変異体で処理した。その結果いずれの場合においても所望する目的ポリペプチドを得ることができこの系の汎用性の広さを示すことに成功した。
また、融合タンパク質ＰＭＴとＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｍプロテアーゼ変異体を共発現する大腸菌を調製し、この大腸菌を培養して得られた封入体を尿素により溶解しただけで融合タンパク質ＰＭＴからヒトモチリンが遊離可能であることも確認した。
なお、後述の実施例において示されていない具体的な実験操作は特に記載のない限り以下の方法に従った。
（１）発現プラスミドの構築
発現プラスミドの構築は大腸菌ＪＭ１０９を用いて常法に従った。構築された発現プラスミドが目的のプラスミドであることを変異導入のために行なったＰＣＲにより得られたＤＮＡ領域及び合成ＤＮＡによる置換で得られたＤＮＡ領域の塩基配列決定により確認した。なお、実施例１、３、５、７、９、１６、１８で作製したプラスミドの構造を図１０Ａに実施例１１で作製したプラスミドの構造を図１０Ｂに示した。実施例１７で作製したプラスミドは図１３に示した。
（２）ＯｍｐＴプロテアーゼ酵素活性の測定
ＯｍｐＴプロテアーゼ活性はダイノルフィンＡ（ペプチド研究所製）を基質として測定した。
０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）４０μＬに１ｍｇ／ｍＬのダイノルフィンＡ  ５μＬを加えて、これにＯｍｐＴプロテアーゼ活性測定サンプル５μＬを添加して反応を開始した。反応は２５℃で１０分間行ない、１Ｎ  ＨＣｌ  ５μＬを加えて反応を停止した。反応液を１００００×ｇ、３分間遠心分離して上澄液を回収し、２０μＬをＨＰＬＣに供し、分析した。
ＨＰＬＣ分析はＹＭＣ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＲＰカラムを用い、カラム温度４０℃、流速１ｍＬ／ｍｉｎで行った。３分間０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０％アセトニトリルで洗浄した後に、１０分間０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０−１５％アセトニトリルのリニアグラジエントにより溶出を行った。２２０ｎｍの吸収をモニターし、分解産物であるペプチドＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇを検出した。この反応条件下、２５℃１分間でダイノルフィンＡ  １μｍｏｌを切断した時のＯｍｐＴプロテアーゼ活性を１ｕｎｉｔとした。
（３）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
融合タンパク質の切断を検討するために用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動はゲルにテフコ社製の１６％  Ｐｅｐｔｉｄｅ−ＰＡＧＥｍｉｎｉ、泳動バッファーにバイオラッド社製のＴｒｉｃｉｎｅ泳動バッファー、分子量マーカーにテフコ社又はバイオラッド社製のタンパク質分子量マーカーを用いて行った。サンプルに等量の４Ｍ尿素を含む２×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを添加して１００℃、５分間加熱した。１０μＬを電気泳動に供し、テフコ社の指定する泳動条件で電気泳動を行った。泳動後、クマジーブリリアントブルーＲ−２５０を含む染色液で染色した。
（４）封入体の調製
本実施例において、大腸菌で融合タンパク質は封入体として発現され、大腸菌がＯｍｐＴプロテアーゼを発現している場合には得られた封入体を尿素で溶解しただけでＯｍｐＴプロテアーゼによる切断を受ける。そこで切断を避けるために融合タンパク質発現プラスミドでＯｍｐＴプロテアーゼ欠損大腸菌株であるＷ３１１０  Ｍ２５を形質転換して、融合タンパク質を封入体として発現させた。各融合タンパク質を発現するＷ３１１０  Ｍ２５組換え大腸菌を２Ｌ三角フラスコ中でテトラサイクリン１０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地（０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、１％（ｗ／ｖ）トリプトン、０．５％塩化ナトリウム）４００ｍＬを用いて３７℃、１晩、１５０ｒｐｍで旋回培養した。
翌日、４℃、６０００×ｇ、１０分間遠心分離により菌体を回収し、これを超音波処理して菌体破砕した。この菌体破砕液に脱イオン水を加えて３０ｍＬとして、４℃、２５０００×ｇ、１５分間遠心分離し、上清を廃棄して沈殿画分（封入体）を回収した。更に、３０ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に懸濁して４℃、２５０００×ｇ、１５分間遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を３０ｍＬの脱イオン水で懸濁後、４℃、２５０００×ｇ、１５分間遠心分離して沈殿を回収した。これに脱イオン水を添加して１．５  ｍＬとなるようにし、懸濁後４℃、１００００×ｇ、３０分間遠心分離することにより沈殿を得て、再度同操作を繰り返して、ＯＤ６６０＝１００となるように脱イオン水で沈殿を懸濁し、このようにして調製した封入体をＯｍｐＴプロテアーゼ反応の基質として使用した。
（５）ＯｍｐＴプロテアーゼ反応
融合タンパク質を基質としてＯｍｐＴプロテアーゼ反応を次のように行った。１０Ｍ  尿素２０μＬに１Ｍ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）２．５μＬ、及び５０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ２μＬを加え、融合タンパク質封入体（ＯＤ６６０＝１００）１０μＬを添加して、封入体を溶解した。これに水を１０．５μＬ加え、１．４ｕｎｉｔｓ／ｍＬのＯｍｐＴプロテアーゼ５μＬを添加して反応液量５０μＬで反応を開始した。反応温度は２５℃で３０分間行なった。
ＯｍｐＴプロテアーゼと反応して得られたポリペプチドの定量は特に断りのない限り以下の条件でＨＰＬＣにより行った。ＯｍｐＴプロテアーゼ反応液に１５０μＬの６％酢酸、２Ｍ  尿素を添加して反応を停止し、１００００×ｇ、３分間遠心分離して上澄液２０μＬをＹＭＣ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＲＰカラムに供した。ＨＰＬＣはカラム温度４０℃、流速１ｍＬ／ｍｉｎで行った。２０分間０．１％トリフルオロ酢酸を含む３０−５０％アセトニトリルのリニアグラジエントにより溶出を行ない、２１４ｎｍの吸収をモニターしてポリペプチドの定量を行った。
（６）ポリペプチドの質量解析
切断部位を推定するために、ＨＰＬＣで単離したポリペプチドの質量分析をＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ社製ＳＳＱ７１０を用いて行った。
（７）大腸菌外膜画分の調製
宿主をＷ３１１０  Ｍ２５とするＯｍｐＴプロテアーゼ又はＯｍｐＴプロテアーゼ変異体を発現する大腸菌の外膜画分を以下のように調製して実施例１０、１４、１６及び１８でＯｍｐＴプロテアーゼ又はＯｍｐＴプロテアーゼ変異体として融合タンパク質の切断反応に用いた。培養方法は（４）と同様に行い、培養終了後、４℃、６０００×ｇ、１０分間遠心分離により菌体を得た。この菌体を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＴＥ）で懸濁、超音波処理により菌体破砕した。この菌体破砕液を４℃、１０００×ｇ、１０分間遠心分離して沈殿を廃棄して破砕液を回収した。更に、この破砕液を４℃、３６０００×ｇ、４０分間遠心分離して沈殿を回収し、ＴＥで懸濁、再度４℃、３６０００×ｇ、４０分間遠心分離した。得られた沈殿をＯＤ６６０＝１０となるようにＴＥで懸濁した。使用するまで−２０℃で凍結保存した。
【実施例】  以下に実施例を示し、本発明を詳細に説明する。
［実施例１］  融合タンパク質ＰＡｎの調製
ＯｍｐＴプロテアーゼは大腸菌外膜に存在するエンドプロテアーゼである。本酵素の切断において切断部位周辺のアミノ酸配列中の塩基性アミノ酸が非常に大きく影響すると考えられたため、本発明者は本酵素の既知の切断部位を利用し、以下に示す実験を行ない、塩基性アミノ酸の位置と切断率との関係を検討した。
ＯｍｐＴプロテアーゼにより切断される構造を持つ図２に示した融合タンパク質ＰＡ（リンカーペプチドを介した大腸菌のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端１１７アミノ酸に由来する保護タンパク質（β−ｇａｌ１１７Ｓ４Ｈ）とヒトグルカゴン様ペプチド−１（７−３７）（ＧＬＰ−１（７−３７））の融合タンパク質の切断部位のＰ１０位からＰ２位及びＰ２’位からＰ５’位のアラニンをアルギニンに置換することにより、リンカーペプチド内に存在するＯｍｐＴプロテアーゼ切断部位を変換した融合タンパク質ＰＡｎ（図２：ｎは切断部位に対するアミノ酸の位置［Ｐｎ］に対応し、Ｐ１０からＰ２及びＰ２’からＰ５’まで）を作製し、ＯｍｐＴプロテアーゼによる切断について検討することにした。
大腸菌ＯｍｐＴプロテアーゼの認識・切断部位としてアルギニン−アルギニン配列が融合タンパク質のリンカー部分に挿入された融合タンパク質ＰＲＲ（図１）の発現プラスミドであり図１０Ａに示した構造を有するｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＲＲ（特願２０００−６０２８０３参照）をもとにＰＣＲでの部位特異的変異導入及び合成ＤＮＡとの置換により融合タンパク質ＰＡを発現するプラスミドであり図１０Ａに示した構造を有するｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＡを構築した。更に、融合タンパク質ＰＡｎの発現プラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＡｎは図２に示す構造を有する融合タンパク質ＰＡの発現プラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＡにＰＣＲを用いて塩基置換を導入して構築した。構築したプラスミドの構造を図１０Ａに示した。これらの融合タンパク質発現プラスミドでＯｍｐＴプロテアーゼ欠損大腸菌株であるＷ３１１０  Ｍ２５を形質転換して、融合タンパク質を封入体として発現させた。
［実施例２］  ＯｍｐＴプロテアーゼによる融合タンパク質ＰＡｎの切断
ＯｍｐＴプロテアーゼにより切断される構造を持つ図２に示した融合タンパク質ＰＡのＯｍｐＴプロテアーゼ切断部位周辺のアラニンをアルギニンに置換した融合タンパク質ＰＡｎ（図２）を用いて、ＯｍｐＴプロテアーゼによる切断率を検討した。ＰＡｎをｐＨ７．０で特願２０００−６０２８０３に従ってベンザミジンセファロース６Ｂを用いて精製したＯｍｐＴプロテアーゼ標品と反応させた。酵素反応後、ＨＰＬＣにより分析した結果から得られた切断率もあわせて図２に示す。また、質量分析の結果から得られた切断部位も図２に示す。
すべてのＰＡｎはもとのＰＡと同じ部位でＯｍｐＴプロテアーゼによる切断を受け、ＰＡ２，ＰＡ２’及びＰＡ３’はその他の部位でも切断が起こることが示された（図２）。特に、ＰＡ３’はＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１及びＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４の２か所で切断され（切断率はそれぞれ２２０，７３％）、連続する塩基性アミノ酸以外の間（Ａｒｇ１４３−Ａｌａ１４４）で切断されていることがわかった。
また、ＰＡ２とＰＡ２’を除くすべてのＰＡｎにおいて切断率の上昇が認められ、切断部位周辺アミノ酸配列中のＰ１０からＰ３及びＰ３’からＰ５’にアルギニンを配することにより切断率を向上させることができると考えられる。それらのうちでもＰＡ４が最も切断率が高くＰＡの約５倍を示し、Ｐ４位にアルギニンを配することが最も効果的であることがわかった。一方，ＰＡ２及びＰＡ２’では切断率が約１／３にまで減少し、３連続するアルギニン配列になると切断率が低下することがわかった。
［実施例３］  融合タンパク質ＰＡ１Ａ３’、ＰＡ１’Ａ３’の調製
ＯｍｐＴプロテアーゼは連続する塩基性アミノ酸の間を主に切断する酵素であることが知られている。ところが実施例２の結果から融合タンパク質ＰＡ３’が２か所Ａｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１及びＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４で切断されていることがわかり、しかもそのうちの１か所は−Ａｒｇ↓Ａｌａ−の切断であることがわかった。その−Ａｒｇ↓Ａｌａ−での切断率は連続する塩基性アミノ酸の間の切断率と比較すると低いが工業的に利用できる可能性のある切断率へ改善可能であると考えられた。
そこで融合タンパク質ＰＡ３’の２か所の切断部位Ａｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１及びＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４のうちＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１での切断をおさえるためにＡｒｇ１４０又はＡｒｇ１４１をアラニンに置換したアミノ酸配列を有する融合タンパク質ＰＡ１Ａ３’及びＰＡ１’Ａ３’（図３）の調製を行ない、それらのＯｍｐＴプロテアーゼによる切断を検討した。あわせて、これらの融合タンパク質を用いてＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４の切断にＡｒｇ１４０（Ａｒｇ１４３、Ａｌａ１４４をそれぞれＰ１位、Ｐ１’位とするとＰ４位）とＡｒｇ１４１（Ａｒｇ１４３、Ａｌａ１４４をそれぞれＰ１位、Ｐ１’位とするとＰ３位）のいずれが必要であるかについても検討した。
融合タンパク質ＰＡ１Ａ３’及びＰＡ１’Ａ３’の発現プラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＡ１Ａ３’及びｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＡ１’Ａ３’は図３に示す構造を有する融合タンパク質ＰＡ３’の発現プラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＡ３’にＰＣＲを用いて塩基置換を導入して構築した。構築したプラスミドの構造を図１０Ａに示した。これらの融合タンパク質発現プラスミドでＯｍｐＴプロテアーゼ欠損大腸菌株であるＷ３１１０  Ｍ２５を形質転換して、融合タンパク質を封入体として発現させた。
［実施例４］  ＯｍｐＴプロテアーゼによる融合タンパク質ＰＡ１Ａ３’及びＰＡ１’Ａ３’の切断
図３に示した融合タンパク質ＰＡ１Ａ３’及びＰＡ１’Ａ３’のＯｍｐＴプロテアーゼによる切断部位及び切断率を検討した。ＰＡ１Ａ３’及びＰＡ１’Ａ３’をｐＨ７．０で特願２０００−６０２８０３に従ってベンザミジンセファロース６Ｂを用いて精製したＯｍｐＴプロテアーゼ標品を用いて反応させた。酵素反応後、ＨＰＬＣにより分析した結果から得られた切断率、質量分析の結果から得られた切断部位も図３に示す。ＰＡ１Ａ３’及びＰＡ１’Ａ３’はともにＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４で切断されていることがわかった。
しかし、いずれの切断率もＰＡのＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１での切断率に比べて低い値であった。またＰＡ１’Ａ３’ではＡｒｇ１４０−Ａｌａ１４１での切断も確認された。Ａｒｇ１４３−Ａｌａ１４４を切断部位Ｐ１−Ｐ１’と考えた場合、Ａｒｇ１４３−Ａｌａ１４４での切断はＰ３位のアルギニン（ＰＡ１Ａ３’のＡｒｇ１４１）又はＰ４位のアルギニン（ＰＡ１’Ａ３’のＡｒｇ１４０）のいずれかが存在すれば起こるが、Ｐ４位及びＰ３位の両方にアルギニンを配したＰＡ３’の方がＰＡ１Ａ３’及びＰＡ１’Ａ３’よりも切断率が高いことが示唆された。
［実施例５］  融合タンパク質ＰＡ２３’、ＰＡ３２３’及びＰＡ２’３’の調製
実施例４の結果から融合タンパク質ＰＡ１Ａ３’及びＰＡ１’Ａ３’がＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４で切断されており、特にＰＡ１Ａ３’ではＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４のみで切断されたことがわかったが、その切断率は低いものであった。そこで融合タンパク質ＰＡ３’にアミノ酸置換を導入して、−Ａｒｇ↓Ａ１ａ−（Ａｒｇ１４３−Ａｌａ１４４）の切断率を更に上げるようなアミノ酸配列の設計を試みた。実施例２の結果に基づき、−Ａｒｇ↓Ａｌａ−（Ａｒｇ１４３−Ａｌａ１４４）の切断率を上げ、連続する塩基性アミノ酸の間（Ａｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１）の切断率を下げると予想されるアミノ酸配列（２連続するアルギニンを３連続又は４連続するアルギニンにした）を有する融合タンパク質ＰＡ２３’、ＰＡ３２３’及びＰＡ２’３’（図３）の調製を以下のように行ない、それらのＯｍｐＴプロテアーゼによる切断を検討した。
融合タンパク質ＰＡ２３’及びＰＡ２’３’の発現プラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＡ２３’及びｐＧ１１７Ｓ４Ｈｏｍｐ  ＰＡ２’３’は図３に示す構造を有する融合タンパク質ＰＡ３’の発現プラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＡ３’にＰＣＲを用いて塩基置換を導入して構築した。更に、融合タンパク質ＰＡ３２３’の発現プラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＡ３２３’  は図３に示す構造を有する融合タンパク質ＰＡ２３’の発現プラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＡ２３’にＰＣＲを用いて塩基置換を導入して構築した。構築したプラスミドの構造を図１０Ａに示した。これらの融合タンパク質発現プラスミドでＯｍｐＴプロテアーゼ欠損大腸菌株であるＷ３１１０  Ｍ２５を形質転換して、融合タンパク質を封入体として発現させた。
［実施例６］  ＯｍｐＴプロテアーゼによる融合タンパク質ＰＡ２３’、ＰＡ３２３’及びＰＡ２’３’の切断
図３に示した融合タンパク質ＰＡ２３’、ＰＡ３２３’及びＰＡ２’３’のＯｍｐＴプロテアーゼによる切断部位及び切断率を検討した。ＰＡ２３’、ＰＡ３２３’及びＰＡ２’３’をｐＨ７．０で特願２０００−６０２８０３に従ってベンザミジンセファロース６Ｂを用いて精製したＯｍｐＴプロテアーゼ標品を用いて２５℃、３０分間反応させた。酵素反応後、ＨＰＬＣにより分析した結果から得られた切断率、質量分析の結果から得られた切断部位も図３に示す。ＰＡ２３’、ＰＡ３２３’及びＰＡ２’３’はＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４で切断されていることが確認された。ＰＡ２３’のＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４での切断率はＰＡのＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１での切断率の２．９倍の切断率を示した。
Ａｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０及びＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１での切断も見られたがＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４での切断の１３％であった。ＰＡ３２３’のＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４での切断率もＰＡのＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１での切断率の２．９倍の切断率を示したがＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１での切断も見られ、Ａｒｇ１４３−Ａｌａ１４４での切断率の５９％であった。ＰＡ２’３’に関して、Ａｒｇ１４３−Ａｌａ１４４での切断率はＰＡのＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１での切断率の６３％と低く、Ａｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１及びＡｒｇ１４２−Ａｒｇ１４３での切断も確認された。以上のことから、これら３種の融合タンパク質のうちＰＡ２３’が−Ａｒｇ↓Ａｌａ−（Ａｒｇ１４３−Ａｌａ１４４）の切断率を上げて連続する塩基性アミノ酸の間の切断率を下げるための最適な配列を有することが示された。
［実施例７］  融合タンパク質ＰＡ５Ｄ２３’、ＰＡ４Ｄ２３’及びＰＡ３Ｄ２３’の調製
融合タンパク質ＰＡ２３’においてＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４の切断率が非常に高いことが実施例６の結果で示された。しかしながらＡｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０あるいはＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１での切断も確認された。そこで、切断部位近傍に酸性アミノ酸がある場合にその切断がおさえられると考えられることから、Ａｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０あるいはＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１での切断をおさえるためにＡｌａ１３６、Ａｌａ１３７又はＡｌａ１３８をアスパラギン酸に置換した融合タンパク質ＰＡ５Ｄ２３’、ＰＡ４Ｄ２３’及びＰＡ３Ｄ２３’（図４）の調製を以下のように行ない、それらのＯｍｐＴプロテアーゼによる切断を検討した。
融合タンパク質ＰＡ５Ｄ２３’、ＰＡ４Ｄ２３’及びＰＡ３Ｄ２３’の発現プラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＡ５Ｄ２３’、ｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＡ４Ｄ２３’及びｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＡ３Ｄ２３’は図４に示す構造を有する融合タンパク質ＰＡ２３’の発現プラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＡ２３’にＰＣＲを用いて塩基置換を導入して構築した。構築したプラスミドの構造を図１０Ａに示した。これらの融合タンパク質発現プラスミドでＯｍｐＴプロテアーゼ欠損大腸菌株であるＷ３１１０  Ｍ２５を形質転換して、融合タンパク質を封入体として発現させた。
［実施例８］  ＯｍｐＴプロテアーゼによる融合タンパク質ＰＡ５Ｄ２３’、ＰＡ４Ｄ２３’及びＰＡ３Ｄ２３’の切断
図４に示した融合タンパク質ＰＡ５Ｄ２３’、ＰＡ４Ｄ２３’及びＰＡ３Ｄ２３’のＯｍｐＴプロテアーゼによる切断部位及び切断率を検討した。ＰＡ５Ｄ２３’、ＰＡ４Ｄ２３’及びＰＡ３Ｄ２３’をｐＨ７．０で特願２０００−６０２８０３に従ってベンザミジンセファロース６Ｂを用いて精製したＯｍｐＴプロテアーゼ標品を用いて２５℃、３０分間反応させた。酵素反応後、ＨＰＬＣにより分析した結果から得られた切断率、質量分析の結果から得られた切断部位も図４に示す。ＰＡ５Ｄ２３’、ＰＡ４Ｄ２３’及びＰＡ３Ｄ２３’の主な切断部位はＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４であることが確認された。
特にＰＡ４Ｄ２３’のＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４での切断率はＰＡ２３’に比べると低下したがＰＡのＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１での切断率の２倍の切断率を示した。一方ＰＡ２３’で検出されたＡｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０及びＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１での切断は検出されなかった。即ちＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１をＰ１−Ｐ１’と考えた場合にＰ３位にアスパラギン酸を配することによりその切断が抑えられたと考えられる。同様にＡｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０をＰ１−Ｐ１’と考えた場合にＰ２位にアスパラギン酸を配することによりその切断が抑えられたと考えられる。ＰＡ５Ｄ２３’のＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４での切断率もＰＡのＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１での切断率の１．９倍の切断率を示したがＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１での切断も見られた。
ＰＡ３Ｄ２３’に関して、ＰＡ４Ｄ２３’と同様にＡｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０及びＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１での切断は検出されなかった。即ちＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１をＰ１−Ｐ１’と考えた場合にＰ４位にアスパラギン酸を配することによりその切断が抑えられたと考えられる。同様にＡｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０をＰ１−Ｐ１’と考えた場合にＰ３位にアスパラギン酸を配することによりその切断が抑えられたと考えられる。しかしながらＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４での切断率はＰＡのＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１での切断率と同程度でＰＡ４Ｄ２３’よりも低くかった。以上のことから、これら３種の融合タンパク質のうちＰＡ４Ｄ２３’が−Ａｒｇ↓Ａｌａ−（Ａｒｇ１４３−Ａｌａ１４４）での切断率をより高くして連続する塩基性アミノ酸の間の切断を抑えるための最適な配列を有することが示された。
従って、ＯｍｐＴプロテアーゼを用いて保護タンパク質−リンカーペプチド−目的ポリペプチドからなる融合タンパク質よりＮ末端アミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸及びプロリン以外の１７種類のアミノ酸のいずれかである目的ポリペプチドを切出したい場合、−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−のアミノ酸配列のＣ末端に続けてその目的ポリペプチドを配することにより特異的に切出しできる可能性があると考えられる。
［実施例９］  融合タンパク質ＰＲＭＴ及びＰＭＴの調製
実施例６の結果からＯｍｐＴプロテアーゼは図３で示した融合タンパク質ＰＡ２３’における本酵素の切断部位周辺のアミノ酸配列において−Ａｒｇ↓Ａｌａ−を効率よく切断できることが示された。このことから切断部位が−ＡｒｇＸａａ−（Ｘａａは酸性アミノ酸であるアスパラギン酸、グルタミン酸及びプロリン以外の１７アミノ酸）であっても効率よく切断できることが予想された。そこで本発明者は実施例６に用いた融合タンパク質ＰＡ２３’の１４３番目のアルギニンに続けてＮ末端が酸性アミノ酸、プロリン以外のアミノ酸であり、更に、塩基性アミノ酸以外のアミノ酸に置換した場合に本酵素による切断はどうなるのかについて検討した。
まずＯｍｐＴプロテアーゼによりＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１が切断される図１に示した構造を有する融合タンパク質ＰＲＲ（特願２０００−６０２８０３参照）のＮ末端から１４０番目のアルギニンに続けてヒトモチリンを配した融合タンパク質ＰＲＭＴ（図５）を対照として作製した。次に、融合タンパク質ＰＡ２３’（図３及び図４）のＮ末端から１４３番目のアルギニンに続けてヒトモチリンを配した融合タンパク質ＰＭＴ（図５）を作製した。
融合タンパク質ＰＲＭＴの発現プラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＲＭＴとＰＭＴの発現プラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＭＴの構造を図１０Ａに示した。これら２種類の融合タンパク質発現プラスミドでＯｍｐＴプロテアーゼ欠損大腸菌株であるＷ３１１０  Ｍ２５をそれぞれ形質転換し、融合タンパク質生産菌を作製した。得られた菌株を培養後、融合タンパク質ＰＲＭＴ及びＰＭＴを封入体として調製した。
［実施例１０］  ＯｍｐＴプロテアーゼによる融合タンパク質ＰＲＭＴ及びＰＭＴの切断
図５に示した融合タンパク質ＰＲＭＴ及びＰＭＴのＯｍｐＴプロテアーゼによる切断をＷ３１１０  Ｍ２５を宿主としたＯｍｐＴプロテアーゼを発現する大腸菌の膜画分を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥあるいはＨＰＬＣにより検討した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてＯｍｐＴプロテアーゼによる融合タンパク質ＰＭＴの切断を確認できたが、ＰＲＭＴの切断は検出できなかった。ＨＰＬＣによっても融合タンパク質ＰＭＴの切断を確認できたが主にＡｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０あるいはＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１の塩基性アミノ酸対の間での切断であり、Ａｒｇ１４３−Ｐｈｅ１４４でのペプチド切断断片即ちヒトモチリンは質量分析によりごくわずかに検出できたのみである。
このことから切断部位周辺のアミノ酸配列を−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−ｍｏｔｉｌｉｎとしただけではＯｍｐＴプロテアーゼにより主なペプチド切断断片としてヒトモチリンを切出すことができないとわかった。このことから本プロテアーゼの基質特異性としてＰ１’位のアミノ酸に関して寛容ではあるものの効率的な切断に利用するには本プロテアーゼ自体に変異を導入することにより更に、Ｐ１’位のアミノ酸に対する特異性を高める必要があると考えられた。そこでＯｍｐＴプロテアーゼ変異体を作製し、それを用いて融合タンパク質からヒトモチリンを主に切出すことができるかどうかを検討した。
［実施例１１］  ＯｍｐＴプロテアーゼ変異体発現大腸菌の調製
ＯｍｐＴプロテアーゼの結晶構造を解析した論文（Ｖａｎｄｅｐｕｔｔｅ−Ｒｕｔｔｅｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：５０３３−５０３９，２００１）及びこれに関連する論文（Ｋｒａｍｅｒ，ＲＡ．ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳＬｌｅｔｔ．５０５：４２６−４３０，２００１）中で基質のＰ１’位のアミノ酸とＯｍｐＴプロテアーゼのＡｓｐ９７が相互作用しているのではないかと考察されていたため、ＯｍｐＴプロテアーゼのＡｓｐ９７に以下のようにＰＣＲを用いて２０種類のアミノ酸（アスパラギン酸への同義置換を含む）に置換したプラスミドを作製し、これらをＯｍｐＴプロテアーゼ欠損大腸菌ＢＬ２１株に導入してＯｍｐＴプロテアーゼ変異体発現大腸菌２０株を調製した。
ＯｍｐＴプロテアーゼのＡｓｐ９７に変異を導入しやすくし、できるだけＰＣＲで増幅したＤＮＡ領域を少なくするために、図１０Ｂに示した構造を持つＯｍｐＴプロテアーゼ発現プラスミドｐＯｍｐＴＴｃＥ（特願２０００−６０２８０３参照）のＯｍｐＴプロテアーセＳｅｒ９９をコードするＡＧＴをＴＣＴに換えることにより制限酵素部位ＸｂａＩをＰＣＲを用いて導入したＯｍｐＴプロテアーゼ発現プラスミドｐＯｍｐＴＸｂａＩの構築をまず行なった。次にＯｍｐＴプロテアーゼのＡｓｐ９７を２０種類のアミノ酸（アスパラギン酸への同義置換を含む）に置換した変異体ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｘ（Ｘは置換後の２０種類のアミノ酸を示す）を発現するプラスミドｐＯｍｐＴＤ９７ＸはＯｍｐＴプロテアーゼ発現プラスミドｐＯｍｐＴＸｂａＩからＰＣＲを用いた変異導入により構築した。発現プラスミドｐＯｍｐＴＸｂａＩ及びｐＯｍｐＴＤ９７Ｘの構造を図１０Ｂに示した。
得られた２０種類の発現プラスミドｐＯｍｐＴＤ９７ＸをそれぞれＯｍｐＴプロテアーゼ欠損大腸菌ＢＬ２１株に導入してＯｍｐＴプロテアーゼ変異体ＯｍｐＴＤ９７Ｘ発現大腸菌２０株を調製した。これらの大腸菌を試験管によりテトラサイクリン１０μｇ／ｍＬを含むＬＢ液体培地２ｍＬを用いて３７℃でＯＤ６６０＝１程度まで振とう培養後、菌体を遠心分離により回収した。これらに１ｍＬのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）を加えて懸濁後、遠心分離により菌体を回収した。更に、同操作を繰り返して得られた菌体にＯＤ６６０＝２となるようにＴＥを添加して懸濁したものをＯｍｐＴプロテアーゼ変異体ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｘ反応用の菌体懸濁液とした。これらの菌体懸濁液は使用まで−２０℃で凍結保存した。
［実施例１２］  ＯｍｐＴプロテアーゼ変異体発現大腸菌菌体懸濁液中に含まれるＯｍｐＴプロテアーゼ変異体量の確認
ＯｍｐＴプロテアーゼ変異体発現大腸菌菌体懸濁液中に含まれるＯｍｐＴプロテアーゼ変異体量がすべての菌体懸濁液において同量であることを確認するために抗ＯｍｐＴプロテアーゼ抗体を用いてウェスタンブロッティング及び免疫染色を行なった。抗ＯｍｐＴプロテアーゼ抗体は精製ＯｍｐＴプロテアーゼをウサギに免疫感作し、得られた抗血清からＩｇＧ画分を精製し、更に、ここから精製ＯｍｐＴプロテアーゼにアフィニティーのある画分を回収することにより調製した。
１レーンあたりＯＤ６６０＝０．０１に相当する菌体懸濁液を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、電気泳動終了後、ＰＶＤＦ膜を用いてウェスタンブロッティングを行った。調製した転写膜をブロッキング液（５％（ｗ／ｖ）ｓｋｉｍｍｉｌｋ／１ｘ  ＴＢＳＴ＊）に浸漬し、室温で３０分間振とうした。次に抗ＯｍｐＴプロテアーゼ抗体をブロッキング液で１０００倍希釈したものに膜を浸漬し、室温で１００分間振とうした。その後、液を捨て、１ｘ  ＴＢＳＴ＊で５分間、３回洗浄した。更に、ブロッキング液で１０００倍希釈したパーオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ抗体液に膜を浸漬し、室温で４５分間振とうした。
１×ＴＢＳＴ＊で１０分間、４回洗浄後、ＥＣＬキット（アマシャムファルマシア社製）で検出した。宿主であるＯｍｐＴプロテアーゼ欠損大腸菌ＢＬ２１株からはバンドは検出されず、その他の菌体懸濁液からはほぼ同等の強度でバンドが検出されたことからＯｍｐＴプロテアーゼ変異体発現大腸菌菌体懸濁液中に含まれるＯｍｐＴプロテアーゼ変異体量はすべての菌体懸濁液においてほぼ同量であろうと考えられた。（＊１ｘ  ＴＢＳＴ＝１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）
［実施例１３］  ＯｍｐＴプロテアーゼ変異体ＯｍｐＴ  Ｄ９７ＸのＰ１’位基質特異性の検討
ＯｍｐＴプロテアーゼは大腸菌外膜に存在するため反応液中に菌体のまま加えることにより基質と作用させることができる。そのため、ＯｍｐＴプロテアーゼ変異体ＯｍｐＴ  Ｄ９７ＸのＰ１’位基質特異性を調べる目的で図１に示した構造を有する融合蛋白質ＰＲＸ（特願２０００−６０２８０３参照）を基質としてＯｍｐＴプロテアーゼ変異体ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｘとの反応性を次のようにして検討した。１０Ｍ尿素２０μＬに１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）２．５μＬ、及び５０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ２μＬを加え、融合タンパク質封入体（ＯＤ６６０＝１００）５μＬを添加して、封入体を溶解した。
これに水を１０．５μＬ加え、実施例１１で調製したＯｍｐＴプロテアーゼ変異体発現大腸菌菌体懸濁液１０μＬを添加して反応液量５０μＬで反応を開始した。反応は２５℃で６０分間行なった。反応して得られたペプチド断片の定量はＯｍｐＴプロテアーゼ反応時と同じ条件でＨＰＬＣにより行なった。結果を表１に示す。
0004663524.tif 000002
野生型ＯｍｐＴプロテアーゼ（Ｄ９７Ｄ）と融合タンパク質ＰＲＲの反応における切断率を１００％として相対切断率を示した。−は相対切断率が３．０％未満であったことを示す。ＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｖ，Ｄ９７Ｉ，Ｄ９７Ｐ，Ｄ９７Ｗ，Ｄ９７Ｇ，Ｄ９７Ｙ，Ｄ９７Ｋ及びＤ９７Ｒは２０種類いずれの融合タンパク質ＰＲＸとも相対切断率が３．０％未満であった。融合タンパク質ＰＲＬ，ＰＲＰ，ＰＲＷ，ＰＲＧ，ＰＲＱ，ＰＲＤ，ＰＲＥ及びＰＲＨはいずれのＯｍｐＴプロテアーゼ変異体ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｘとも相対切断率が３％未満であった。
この結果、比較的切断率が高く、野生型ＯｍｐＴプロテアーゼとは基質特異性の異なる変異体をいくつか得ることができた。融合タンパク質ＰＲＲ及びＰＲＫに対してはＤ９７Ｄ（野生型）が、ＰＲＳにはＤ９７Ｌが、ＰＲＦとＰＲＹにはＤ９７Ｍが、ＰＲＡ、ＰＲＶ、ＰＲＩ、ＰＲＭ、ＰＲＴ、ＰＲＣ及びＰＲＮにはＤ９７Ｈがそれぞれ最も高い特異性を示すことがわかった。これらのうちでＰＲＦに特異性が高いＤ９７Ｍ変異体を用いて実施例９で調製した融合タンパク質ＰＲＭＴ及びＰＭＴとの反応を行ない、ヒトモチリンを切出せるかどうか検討した。
［実施例１４］  ＯｍｐＴプロテアーゼＤ９７Ｍ変異体による融合タンパク質ＰＭＴからのヒトモチリンの切出し
ＯｍｐＴプロテアーゼＤ９７Ｍ変異体によるヒトモチリン融合タンパク質ＰＲＭＴ及びＰＭＴ（図５）からのヒトモチリンの切出し検討は宿主をＷ３１１０  Ｍ２５とする野生型ＯｍｐＴプロテアーゼ（Ｄ９７Ｄ）及びＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍを発現する大腸菌の外膜画分を用いて行なった。１０Ｍ尿素２０μＬに１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）２．５μＬ、及び５０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ２μＬを加え、融合タンパク質封入体（ＯＤ６６０＝１００）１０μＬを添加して、封入体を溶解した。これに水を１０．５μＬ加え、組換え大腸菌の外膜画分５μＬを添加して反応液量５０μＬで反応を開始した。反応は２５℃で１２０分間行なった。
反応液に１５０μＬの６％酢酸、２Ｍ尿素を添加して反応を停止し、１００００×ｇ、３分間遠心分離して上澄液５０μＬをＹＭＣ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＲＰカラムに供した。ＨＰＬＣはカラム温度４０℃、流速１ｍＬ／ｍｉｎで行った。１５分間０．１％トリフルオロ酢酸を含む２０−２７．５％アセトニトリルのリニアグラジエントにより溶出を行ない、２１４ｎｍの吸収をモニターした。切断部位はポリペプチド断片を単離して質量分析することにより同定した。図６に対照であるＯｍｐＴプロテアーゼＤ９７Ｄ野生型及びＤ９７Ｍ変異体によるヒトモチリン融合タンパク質ＰＲＭＴ及びＰＭＴの切断をＨＰＬＣにより分析した結果を示した。また、表２にそれらの切断部位と切断率を示した。
0004663524.tif 000003
切断率はＤ９７Ｄ野生型でＰＭＴを切断した時のＡｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０での切断率を１００として全て相対切断率で表示した。Ｄ９７Ｄ野生型でＰＲＭＴは切断されず、ＰＭＴを切断した場合にはＡｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０及びＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１での切断が主であった。ところがＤ９７Ｍ変異体を用いたところＰＲＭＴは切断されてモチリンが切り出された。ＰＭＴも切断されてモチリンが遊離されることがわかったが、Ａｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０での切断も確認された。しかし、ＰＭＴから遊離されるモチリンの量はＰＲＭＴよりも３．５倍高かった。この結果はモチリンの切り出しにはＤ９７Ｍ変異体が必要であり、切断部位周辺の配列によりモチリンの切断効率が変化することを示している。
［実施例１５］  モチリンをモデルペプチドとしたＯｍｐＴプロテアーゼ変異体を用いたポリペプチド生産例
ＯｍｐＴプロテアーゼ変異体を用いたポリペプチド生産例としてＷ３１１０Ｍ２５モチリン融合タンパク質ＰＭＴ生産菌（実施例９参照）及びＯｍｐＴプロテアーゼ変異体ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｍ発現菌（Ｗ３１１０  Ｍ２５をｐＯｍｐＴＤ９７Ｍで形質転換して作製）をそれぞれ２Ｌスケールで高密度培養を行ない、Ｗ３１１０  Ｍ２５  ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｍ発現菌菌体を使用してＰＭＴからモチリンを切出し、更に、精製を行なうことによりモチリンを生産した。それらは以下の３ステップからなる。
なお、モチリンの定量は反応液を６％酢酸、２Ｍ尿素により希釈したものを実施例１４に記載したＨＰＬＣ分析法と同じ条件で分析し、ペプチド研究所より購入したヒトモチリンを標準品として用いることにより行なった。また、モチリンの純度は５０分間０．１％トリフルオロ酢酸を含む０−５０％アセトニトリルのリニアグラジエントによる溶出を行なった以外は定量時と同じ条件のＨＰＬＣにより分析した。
（１）Ｗ３１１０  Ｍ２５モチリン融合タンパク質ＰＭＴ生産菌及びＯｍｐＴプロテアーゼ変異体ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｍ発現菌の２Ｌスケール高密度培養
Ｗ３１１０  Ｍ２５モチリン融合タンパク質ＰＭＴ生産菌及びＯｍｐＴプロテアーゼ変異体ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｍ発現菌の２Ｌスケール高密度培養を以下のように行ない、それぞれから封入体及び発現菌体を調製した。ＰＭＴ生産菌及びＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｍ発現菌を５００ｍＬ三角フラスコ中でテトラサイクリン１０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地１００ｍＬを用いて３７℃、１晩旋回培養した。翌日、これを４ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４，４ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４，２．７ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４，０．２ｇ／Ｌ  ＮＨ４  Ｃｌ，１．２ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４，４ｇ／Ｌ酵母エキス，２ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，４０ｍｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，４０ｍｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，１０ｍｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ４・ｎＨ２Ｏ，１０ｍｇ／Ｌ  ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ，４ｍｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，２ｍｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，２ｍｇ／Ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ，１ｍｇ／Ｌ  ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，０．５ｍｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ４，１５ｇ／Ｌグルコース，１０ｍｇ／Ｌテトラサイクリンを含む培地２Ｌの入った攪拌培養器に移して３２℃で培養を開始した。
グルコース枯渇後、２％となるようにグリセロールを添加し、培養温度を３７℃に上げた。その後グリセロールが枯渇するごとに逐次２％となるようにグリセロールを添加し培養を継続した。培養経過は図７に示した。ＰＭＴ生産菌は培養開始後２４時間で終了し、培養液容量は１７００ｍＬであった。マントンゴーリンにより菌体を破砕した後、４℃、６０００×ｇ、１０分間遠心分離により沈殿を得た。この沈殿を２０００ｍＬの脱イオン水で懸濁し、４℃、６０００×ｇ、１０分間遠心分離により沈殿を回収した。更に、得られた沈殿を２０００ｍＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５ｍＭ  ＥＤＴＡ，１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００に懸濁し、４℃、６０００×ｇ、１０分間遠心分離により沈殿を回収した。
この沈殿を２０００ｍＬの脱イオン水に懸濁して４℃、６０００×ｇ、１０分間遠心分離して沈殿を回収した。再度同操作を繰り返して２６ｇの沈殿を得た。これを２６ｍＬの脱イオン水に懸濁して封入体懸濁液（ＯＤ６６０＝２５０，４５ｍＬ）とし使用するまで−２０℃で凍結保存した。ＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｗ３１１０  Ｍ２５  ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｍ発現菌は培養開始後２０時間で培養を終了し、培養液容量は２１００ｍＬであった。培養液を４℃、６０００×ｇ、１０分間遠心分離することにより沈殿を得た。この沈殿を２０００ｍＬのＴＥ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で懸濁し、４℃、６０００×ｇ、１０分間遠心分離により沈殿を回収した。再度同操作を繰り返して３１１ｇの沈殿を回収した。この沈殿を脱イオン水に懸濁して菌体懸濁液（ＯＤ６６０＝３２０，３９０ｍＬ）とし使用するまで−２０℃で凍結保存した。
（２）ＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｗ３１１０  Ｍ２５  ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｍ発現菌による封入体融合タンパク質ＰＭＴの切断
１０Ｍ尿素８ｍＬに１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）１ｍＬ、及び５０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ０．８ｍＬを加え、融合タンパク質封入体ＰＭＴ（ＯＤ６６０＝２５０）４ｍＬを添加して、封入体を溶解した。これに水を５．２ｍＬを加え、（１）で調製したＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｗ３１１０  Ｍ２５  ＯｍｐＴ  Ｄ９７Ｍ発現菌懸濁液（ＯＤ６６０＝３２０）１ｍＬを添加して反応液量２０ｍＬで反応を開始した。反応は２５℃で１２０ｍｉｎ−１で振とうして６０分間行なった。６０分後、反応液１３．５ｍＬ（Ｗ３１１０  Ｍ２５モチリン融合タンパク質ＰＭＴ生産菌培養液１００ｍＬ分の封入体に相当）に４０．５ｍＬの２０ｍＭ酢酸（ｐＨ４．０）を添加して４℃、２５０００×ｇ、１０分間遠心分離により上澄液を得た。これによりほとんどの未反応融合タンパク質、保護ペプチド及び大腸菌由来タンパク質の除去ができた。
この上澄液に２０ｍＭ酢酸（ｐＨ４．０）を加えることにより容量を２００ｍＬとし、これを以下の精製に供した。この上澄液への２０ｍＭ酢酸（ｐＨ４．０）添加によりｐＨを低下させて以下の陽イオン交換クロマトグラフィーに吸着させることができる。なお、図８にモチリン切出しの反応時間を決めるために同条件で１２０分までモチリン遊離の経時変化を観察した結果を示す。また、反応開始後、６０分での融合タンパク質の切断をＨＰＬＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果も合わせて図９のＡ及びＢに示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで示すように、反応開始６０分で融合タンパク質ＰＭＴがほぼ完全に切断されるために遊離するモチリンの増加がほぼ止まった。そのため反応時間を６０分とした。
また、Ａｒｇ１４３−Ｐｈｅ１４４で切断されて生じるヒトモチリンだけでなく、Ａｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０で切断されて生じるポリペプチド（ＲＲＡＲ−ｍｏｔｉｌｉｎ）も検出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ではヒトモチリンよりもＲＲＡＲ−ｍｏｔｉｌｉｎの方がバンドが濃く量的に多く見える（図９のＢ）が、ＨＰＬＣによる分析結果からはヒトモチリンのピークの方がＲＲＡＲ−ｍｏｔｉｌｉｎよりもエリアが大きく量的に多い結果（図９のＡ）となり矛盾が生じた。これはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてＲＲＡＲ−ｍｏｔｉｌｉｎの方がヒトモチリンよりも染色されやすいことが原因であると考えられる。従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果ではバンドの濃さが正しく両者の量比を反映していないものと思われる。
（３）モチリンの精製
２０ｍＭ酢酸（ｐＨ４．０）であらかじめ平衡化したアマシャム・ファルマシア社製ＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（２７ｍＬ，Φ２６ｍｍ  Ｘ  ５０ｍｍ）に上述の上澄液２００ｍＬをアプライした。次に２０ｍＭ酢酸（ｐＨ４．０）及び２０ｍＭ酢酸（ｐＨ４．０），０．１Ｍ  ＮａＣｌをそれぞれ１００ｍＬずつ通液して洗浄を行なった。溶出は２０ｍＭ酢酸（ｐＨ４．０），０．１−０．５Ｍ  ＮａＣｌのリニアグラジエントで２００ｍＬ通液することにより行なった。この陽イオン交換クロマトグラフィーの流速は全て５ｍＬ／ｍｉｎで操作した。溶出画分を５ｍＬずつ分取し、それらのＨＰＬＣ分析結果からフラクションを選択しプールした。これにより融合タンパク質ＰＭＴがＡｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０で切断されて生じるポリペプチドの除去ができた。
このプールを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）であらかじめ平衡化済みのＶｙｄａｃ  ２１４ＴＰＢ１５２０（２４ｍＬ，Φ１０ｍｍ  Ｘ  ３００ｍｍ）に供した。０．１％  ＴＦＡ  １００ｍＬを通液することにより洗浄し、溶出は０．１％  ＴＦＡ，０−３０％アセトニトリルリニアグラジエントで２００ｍＬ通液して行なった。この逆相クロマトグラフィーの流速は全て１．６ｍＬ／ｍｉｎで操作した。溶出画分を４ｍＬずつ分取し、それらのＨＰＬＣ分析結果からフラクションを選択しプールした。本精製の結果を表３に示す。
0004663524.tif 000004
本精製で得られた標品のＨＰＬＣ分析、質量分析及びＮ末端アミノ酸分析の結果はヒトモチリンの示すものと一致した。本精製によりＷ３１１０  Ｍ２５モチリン融合タンパク質ＰＭＴ生産菌培養液１Ｌあたり純度９９．０％以上のヒトモチリンを回収率５２％で１６０ｍｇ得ることが可能であることが示された。
［実施例１６］  ＯｍｐＴプロテアーゼ変異体を用いた融合タンパク質からの生理活性ポリペプチド遊離例
ヒトモチリン以外にＯｍｐＴプロテアーゼ変異体を用いて生理活性ポリペプチドを融合タンパク質から遊離できるかどうかを調べるために図１１に示したヒト副腎皮質刺激ホルモン（１−２４）融合タンパク質ＰＡＣ及びヒトカルシトニン前駆体融合タンパク質ＰＣＴを発現する図１０のＡに示した構造を持つプラスミドを構築し、それらをＷ３１１０  Ｍ２５へ導入した形質転換体から各融合タンパク質を封入体として調製した。それぞれＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７ＬあるいはＤ９７Ｈ発現大腸菌Ｗ３１１０  Ｍ２５の外膜画分と１０分間あるいは２時間、２５℃で反応させた。コントロールとして両融合タンパク質共に野生型ＯｍｐＴプロテアーゼを用いた反応も行った。ＨＰＬＣによる解析結果を図１２に示す。
また、ＨＰＬＣにより各融合タンパク質の切断断片を単離して質量分析も行った。ＨＰＬＣはＹＭＣ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＲＰカラムを用いてカラム温度４０℃、流速１ｍＬ／ｍｉｎで行った。５０分間０．１％トリフルオロ酢酸を含む１０−５０％アセトニトリルのリニアグラジエントにより溶出を行ない、２１４ｎｍの吸収をモニターした。融合タンパク質ＰＡＣは野生型ＯｍｐＴプロテアーゼによりＡｒｇ１４３−Ｓｅｒ１４４で切断されてヒト副腎皮質刺激ホルモン（１−２４）を遊離した。また、Ａｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１でも切断され、ＲＡＲ−ＡＣＴＨを遊離した。図１２には示されていないがＡｒｇ１４３−Ｓｅｒ１４４およびＬｙｓ１５８−Ｌｙｓ１５９で切断されてＡＣＴＨ（１−１５）およびＡＣＴＨ（１６−２４）も生じていた。更に、ＰＡＣはＤ９７ＬによりＡｒｇ１４３−Ｓｅｒ１４４で切断されて、ヒト副腎皮質刺激ホルモン（１−２４）は野生型ＯｍｐＴプロテアーゼの場合の２．９倍遊離した。
他の部位で切断されて生じる副産物は遊離されなかった。融合タンパク質ＰＣＴは野生型ＯｍｐＴプロテアーゼによりＡｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０及びＡｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１で切断され、ＲＲＡＲ−ＣＴ及びＲＡＲ−ＣＴを遊離した。ＰＣＴはＤ９７ＨによりＡｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０、Ａｒｇ１４１−Ａｌａ１４２及びＡｒｇ１４３−Ｃｙｓ１４４で切断されてＲＲＡＲ−ＣＴ、ＡＲ−ＣＴ及びヒトカルシトニン前駆体を遊離した。いずれの融合タンパク質からも目的とする生理活性ポリペプチドが変異型ＯｍｐＴプロテアーゼにより遊離されることが確認された。このことから本実施例で示したリンカーペプチド配列とＯｍｐＴプロテアーゼ変異体を利用した生理活性ポリペプチド生産系は特定の生理活性ポリペプチドに対してのみ利用できるというわけではなく、その汎用性は広いものと考えられる。
［実施例１７］  融合タンパク質ＰＭＴとＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍの共発現
大腸菌で融合タンパク質を封入体として発現し、その宿主大腸菌がＯｍｐＴプロテアーゼを発現している場合には得られた封入体を尿素で溶解しただけでＯｍｐＴプロテアーゼによる切断を受ける。そこでＯｍｐＴプロテアーゼ欠損大腸菌株Ｗ３１１０  Ｍ２５を宿主として融合タンパク質ＰＭＴの発現プラスミドｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＭＴ（実施例９参照）とＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍを発現するプラスミドを共発現した場合にヒトモチリンが封入体溶解により遊離するかどうかを検討した。ＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍを発現するプラスミドｐＯｍｐＴＤ９７ＭはｐＧ１１７Ｓ４ＨｏｍｐＰＭＴと複製起点が同じであるため不和合である。
共発現を可能にするためにｐＭＷ２１８由来のＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍ発現プラスミド（図１３）を以下のように構築した。プラスミドｐＯｍｐＴＤ９７Ｍ（実施例１１参照）を鋳型としてＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を含むプライマーを用いてＰＣＲによりｐＯｍｐＴＤ９７ＭのラクトースプロモーターからｔｒｐＡターミネーターまでを増幅した。得られたＤＮＡ断片をＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化後、ｐＭＷ２１８をＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡ断片に挿入してｐＭＷ２１８由来のＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍ発現プラスミドを作製した。Ｗ３１１０  Ｍ２５モチリン融合タンパク質ＰＭＴ生産菌（実施例９参照）を図１３に示したｐＭＷ２１８由来のＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍ発現プラスミドで形質転換した。
このＷ３１１０  Ｍ２５組換え大腸菌を２Ｌ三角フラスコ中でテトラサイクリン１０ｍｇ／Ｌ及びカナマイシン２０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地４００ｍＬを用いて３７℃、１晩、旋回培養した。封入体の調製はすべて脱イオン水を用いて洗浄した以外は常法に従った。得られた封入体からのヒトモチリンの遊離反応は以下のように行った。１０Ｍ尿素１６０μＬに１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）２０μＬ、及び５０ｍＭ  ＥＤＴＡ  １６μＬを加え、融合タンパク質封入体（ＯＤ６６０＝１００）８０μＬを添加して、封入体を溶解した。これに水を１２４μＬ加えて反応を開始した。
反応は２５℃で行い、反応開始後２０、４０、６０、１２０、１８０、２４０、３００、３６０、１４４０分後にサンプリングしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析に供した（図１４）。分析の結果１４４０分間即ち２４時間反応することにより融合タンパク質ＰＭＴがほぼ完全に分解されることがわかった。このことから実施例１５のようにＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍを発現するプラスミドｐＯｍｐＴＤ９７Ｍの形質転換大腸菌を用いた場合ほど迅速ではないが、反応時間を長くすることにより共発現菌から得られた封入体を溶解しただけでも融合タンパク質ＰＭＴの完全分解が可能であり、ヒトモチリンを遊離できることが示された。
［実施例１８］  融合タンパク質ＰＭＴ、ＰＭＴ６Ｄ、ＰＭＴ７ＤとＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍの反応
実施例１４の結果から融合タンパク質ＰＭＴからＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍによりモチリンが生成することがわかったが、Ａｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０でも切断されて副産物であるＲＲＡＲ−ｍｏｔｉｌｉｎが生成した。一方、実施例８の結果から切断を所望しない部位のＰ３又はＰ４位に酸性アミノ酸であるアスパラギン酸を配することによりその部位での切断を抑えることができることが示された。
そこでモチリン融合タンパク質ＰＭＴのＡｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０は切断を所望しない部位であるため、図１５に示したモチリン融合タンパク質ＰＭＴ６Ｄ、ＰＭＴ７Ｄを発現する図１０Ａに示した構造を持つプラスミドを作製して、これらでＷ３１１０  Ｍ２５大腸菌株を形質転換して、これらの融合タンパク質を封入体として回収し、これらの封入体を用いて、モチリン融合タンパク質濃度４ｍｇ／ｍＬ（ＯＤ６６０はおよそ２０）、４Ｍ尿素、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍ０．５２ｍｇ／ｍＬ（ＯＤ６６０は１）で２５℃、２時間反応した。なお、封入体タンパク質濃度はＨＰＬＣにより以下のように測定した。６％酢酸、２Ｍ尿素に封入体をＯＤ６６０＝１となるように添加して、１００００×ｇ、３分間遠心分離して上澄液５０μＬをＹＭＣ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＲＰカラムに供した。ＨＰＬＣはカラム温度４０℃、流速１ｍＬ／ｍｉｎで行った。
４０分間０．１％トリフルオロ酢酸を含む２０−６０％アセトニトリルのリニアグラジエントにより溶出を行ない、２２０ｎｍの吸収をモニターした。標準品として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて封入体タンパク質濃度を決定した。また、大腸菌の外膜画分中のＯｍｐＴプロテアーゼ変異体Ｄ９７Ｍの懸濁液（ＯＤ６６０＝０．５）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、標準品として精製ＯｍｐＴを用いて、デンシトメーターにより変異体濃度を測定した。反応液をＨＰＬＣにより分析した結果を図１６、１７及び１８に示した。モチリン融合タンパク質ＰＭＴ、ＰＭＴ６Ｄ、ＰＭＴ７Ｄからそれぞれ２８０、２５０、３７０μｇ／ｍＬのモチリンが遊離した。
また、それぞれから遊離したモチリン濃度を１００とした場合の副産物ＡＲ−ｍｏｔｉｌｉｎ（Ａｒｇ１４１−Ａｌａ１４２で切断されて生成）、ＲＲＡＲ−ｍｏｔｉｌｉｎ（Ａｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０で切断されて生成）の濃度を図１６〜図１８に示した。ＰＭＴ（図１６）では副産物がそれぞれ２．８、３３％生成するのに対し、ＰＭＴ６Ｄ（図１７）では３．５、１６％となり、特にＲＲＡＲ−ｍｏｔｉｌｉｎの生成が抑えられた。さらに、ＰＭＴ７Ｄ（図１８）ではＲＲＡＲ−ｍｏｔｉｌｉｎ由来のピークが検出されなかった。これは実施例８の結果に一致するものであり、ＯｍｐＴ変異体酵素を用いた場合にも、切断を所望しない部位のＰ３又はＰ４位に酸性アミノ酸であるアスパラギン酸を配することによりその部位での切断を抑えることができることがわかった。ＰＭＴ７Ｄから最も多くモチリンが遊離した（３７０μｇ／ｍＬ）が、これは副産物が生成しなかった分、モチリン遊離濃度が高くなったものと考えられる。
次に本発明に係る各種融合タンパク質のそれぞれの基本全アミノ酸配列を示す。
融合タンパク質ＰＲＲ（配列番号：１；図１；実施例１〜２、１３）
ＰＲＲに係る配列
0004663524.tif 000005
上記のアミノ酸配列において、下線部はヒトグルカゴン様ペプチド−１（７−３７）（ＧＬＰ−１（７−３７））のアミノ酸配列、２重下線部はＯｍｐＴプロテアーゼ切断部位である塩基性アミノ酸対（Ａｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１）を示す。大腸菌のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端１１７アミノ酸に由来する保護タンパク質（β−ｇａｌ１１７Ｓ４Ｈ）はアミノ酸番号１のメチオニンからアミノ酸番号１２７のアルギニンまでのアミノ酸配列からなる。リンカーペプチドはアミノ酸番号１２８のグルタミンからアミノ酸番号１５３のアルギニンまでのアミノ酸配列からなる。
ＰＡ系融合タンパク質（配列番号：２；図２；実施例１〜２）
ＰＡに係る配列
0004663524.tif 000006
上記のアミノ酸配列において、下線部はヒトグルカゴン様ペプチド−１（７−３７）（ＧＬＰ−１（７−３７））のアミノ酸配列、２重下線部はＯｍｐＴプロテアーゼ切断部位である塩基性アミノ酸対（Ａｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１）を示す。大腸菌のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端１１７アミノ酸に由来する保護タンパク質（β−ｇａｌ１１７Ｓ４Ｈ）はアミノ酸番号１のメチオニンからアミノ酸番号１２７のアルギニンまでのアミノ酸配列からなる。リンカーペプチドはアミノ酸番号１２８のグルタミンからアミノ酸番号１５３のアルギニンまでのアミノ酸配列からなる。
ＰＡ３’系融合タンパク質（配列番号：３；図２〜３；実施例３〜６）
ＰＡ３’に係る配列
0004663524.tif 000007
上記のアミノ酸配列において、下線部はヒトグルカゴン様ペプチド−１（７−３７）（ＧＬＰ−１（７−３７））のアミノ酸配列、２重下線部はＯｍｐＴプロテアーゼ切断部位（Ａｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１及びＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４）を示す。大腸菌のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端１１７アミノ酸に由来する保護タンパク質（β−ｇａｌ１１７Ｓ４Ｈ）はアミノ酸番号１のメチオニンからアミノ酸番号１２７のアルギニンまでのアミノ酸配列からなる。リンカーペプチドはアミノ酸番号１２８のグルタミンからアミノ酸番号１５３のアルギニンまでのアミノ酸配列からなる。
ＰＡ２３’系融合タンパク質（配列番号：４；図３〜４；実施例５〜８）
ＰＡ２３’に係る配列
0004663524.tif 000008
上記のアミノ酸配列において、下線部はヒトグルカゴン様ペプチド−１（７−３７）（ＧＬＰ−１（７−３７））のアミノ酸配列、２重下線部はＯｍｐＴプロテアーゼ切断部位（Ａｒｇ１３９−Ａｒｇ１４０、Ａｒｇ１４０−Ａｒｇ１４１及びＡｒｇ１４３−Ａｌａ１４４）を示す。大腸菌のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端１１７アミノ酸に由来する保護タンパク質（β−ｇａｌ１１７Ｓ４Ｈ）はアミノ酸番号１のメチオニンからアミノ酸番号１２７のアルギニンまでのアミノ酸配列からなる。リンカーペプチドはアミノ酸番号１２８のグルタミンからアミノ酸番号１５３のアルギニンまでのアミノ酸配列からなる。
融合タンパク質ＰＲＭＴ（配列番号：５；図５；実施例９〜１０、１４）
ＰＲＭＴに係る配列
0004663524.tif 000009
上記のアミノ酸配列において、下線部はヒトモチリンのアミノ酸配列、２重下線部は融合タンパク質ＰＲＲのＯｍｐＴプロテアーゼ切断部位Ｐ１位に相当するアルギニン（Ａｒｇ１４０）を示す。大腸菌のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端１１７アミノ酸に由来する保護タンパク質（β−ｇａｌ１１７Ｓ４Ｈ）はアミノ酸番号１のメチオニンからアミノ酸番号１２７のアルギニンまでのアミノ酸配列からなる。リンカーペプチドはアミノ酸番号１２８のグルタミンからアミノ酸番号１４０のアルギニンまでのアミノ酸配列からなる。
融合タンパク質ＰＭＴ（配列番号：６；図５；実施例９〜１０、１４〜１５、１７〜１８）
ＰＭＴに係る配列
0004663524.tif 000010
上記のアミノ酸配列において、下線部はヒトモチリンのアミノ酸配列を示す。大腸菌のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端１１７アミノ酸に由来する保護タンパク質（β−ｇａｌ１１７Ｓ４Ｈ）はアミノ酸番号１のメチオニンからアミノ酸番号１２７のアルギニンまでのアミノ酸配列からなる。リンカーペプチドはアミノ酸番号１２８のグルタミンからアミノ酸番号１４３のアルギニンまでのアミノ酸配列からなる。
融合タンパク質ＰＡＣ（配列番号：７；図１１；実施例１６）
ＰＡＣに係る配列
0004663524.tif 000011
上記のアミノ酸配列において、下線部はヒト副腎皮質刺激ホルモン（１−２４）のアミノ酸配列を示す。大腸菌のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端１１７アミノ酸に由来する保護タンパク質（β−ｇａｌ１１７Ｓ４Ｈ）はアミノ酸番号１のメチオニンからアミノ酸番号１２７のアルギニンまでのアミノ酸配列からなる。リンカーペプチドはアミノ酸番号１２８のグルタミンからアミノ酸番号１４３のアルギニンまでのアミノ酸配列からなる。
融合タンパク質ＰＣＴ（配列番号：８；図１１；実施例１６）
ＰＣＴに係る配列
0004663524.tif 000012
上記のアミノ酸配列において、下線部はヒトカルシトニン前駆体のアミノ酸配列を示す。大腸菌のβ−ガラクトシダーゼのＮ末端１１７アミノ酸に由来する保護タンパク質（β−ｇａｌ１１７Ｓ４Ｈ）はアミノ酸番号１のメチオニンからアミノ酸番号１２７のアルギニンまでのアミノ酸配列からなる。リンカーペプチドはアミノ酸番号１２８のグルタミンからアミノ酸番号１４３のアルギニンまでのアミノ酸配列からなる。
【図１】
0004663524.tif 000013
【図２】
0004663524.tif 000014
【図３】
0004663524.tif 000015
【図４】
0004663524.tif 000016
【図５】
0004663524.tif 000017
【図６】
0004663524.tif 000018
【図７】
0004663524.tif 000019
【図８】
0004663524.tif 000020
【図９】
0004663524.tif 000021
【図１０】
0004663524.tif 000022
【図１１】
0004663524.tif 000023
【図１２】
0004663524.tif 000024
【図１３】
0004663524.tif 000025
【図１４】
0004663524.tif 000026
【図１５】
0004663524.tif 000027
【図１６】
0004663524.tif 000028
【図１７】
0004663524.tif 000029
【図１８】
0004663524.tif 000030
【配列表】
0004663524000001.xml