(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワムシを栄養強化するのに有効な量の、ω−３系高度不飽和脂肪酸、そのエステル、及びそれを含む油脂のうちの少なくとも一つを含有するラビリンチュラ類に属する微生物を含有するワムシ用飼料であって、
前記微生物がビタミンＢ１２で栄養強化されていることを特徴とするワムシ用飼料。
【請求項２】
ワムシを栄養強化するのに有効な量の、ω−３系高度不飽和脂肪酸、そのエステル、及びそれを含む油脂のうちの少なくとも一つを含有するラビリンチュラ類に属する微生物を含有するワムシ用飼料であって、
前記微生物がビタミンＢ１２及びビタミンＥで栄養強化されていることを特徴とするワムシ用飼料。
【請求項３】
ワムシを栄養強化するのに有効な量の、ω−３系高度不飽和脂肪酸、そのエステル、及びそれを含む油脂のうちの少なくとも一つを含有するラビリンチュラ類に属する微生物を含有するワムシ用飼料であって、
ビタミンＢ１２をさらに含有することを特徴とするワムシ用飼料。
【請求項４】
ワムシを栄養強化するのに有効な量の、ω−３系高度不飽和脂肪酸、そのエステル、及びそれを含む油脂のうちの少なくとも一つを含有するラビリンチュラ類に属する微生物を含有するワムシ用飼料であって、
ビタミンＢ１２及びビタミンＥをさらに含有することを特徴とするワムシ用飼料。
【請求項５】
前記ラビリンチュラ類に属する微生物が、スラウストキトリウム科またはラビリンチュラ科に属することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のワムシ用飼料。
【請求項６】
クロレラ及び酵母のうち少なくとも一つをさらに含有することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のワムシ用飼料。
【請求項７】
前記ラビリンチュラ類に属する微生物が、ω−３系高度不飽和脂肪酸で栄養強化されていないことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のワムシ用飼料。
【請求項８】
ワムシを栄養強化するのに有効な量の、ω−３系高度不飽和脂肪酸、そのエステル、及びそれを含む油脂のうちの少なくとも一つを含有し、ビタミンＢ１２で栄養強化されているラビリンチュラ類に属する微生物を飼料として、ワムシを培養する培養方法。
【請求項９】
前記ラビリンチュラ類に属する微生物がω−３系高度不飽和脂肪酸で栄養強化されていないことを特徴とする請求項８に記載の培養方法。
【請求項１０】
前記ラビリンチュラ類に属する微生物が、ω−３系高度不飽和脂肪酸及びビタミンＥの少なくともいずれか一方で栄養強化されていることを特徴とする請求項８または９に記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラビリンチュラ類に属する微生物を含有する動物プランクトン用飼料及びそれを用いた動物プランクトンの培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
魚類及び甲殻類の種苗生産には、初期飼料としてワムシ類、アルテミア、ミジンコ類などの動物プランクトンが必須の餌料となる。近年の魚類栄養学の進歩によりＤＨＡなどのω−３系高度不飽和脂肪酸が海産魚、甲殻類の必須脂肪酸であることが明らかにされ、これら動物プランクトン中のω−３系高度不飽和脂肪酸含量が種苗生産の可否を大きく左右することが示されている。我が国の種苗生産現場においてもω−３系高度不飽和脂肪酸の重要性は広く認識され、動物プランクトンを仔魚に給餌する前にω−３系高度不飽和脂肪酸を用いて栄養強化処理されることが多い。
【０００３】
例えば、ワムシ・ミジンコの場合、通常はナンノクロロプシス、クロレラ、酵母、テトラセルミス、イソクリシスなどの、ＤＨＡを全く含まないか、少量しか含有しない飼料を与えて１〜数日間増殖させる（１次培養）。このとき得られるワムシ・ミジンコは、仔魚や幼生の必須脂肪酸要求を十分満足するだけのＤＨＡを含有していない。したがって、このワムシ・ミジンコの栄養価を改善するために、１次培養後にＤＨＡを豊富に含有する飼料を０．５〜２４時間与えて栄養強化を行う（２次培養）。この２次培養に用いられる飼料としてＤＨＡ強化ユーグレナ、ＤＨＡ強化クロレラ、ＤＨＡエチルエステル、魚油含有マイクロカプセル、魚卵加工物、ＤＨＡ含有藻類などが市販されている。いずれの市販飼料を用いても、０．５〜２４時間の栄養強化処理で相当量のＤＨＡをワムシ・ミジンコに強化できる。
【０００４】
しかし、これらＤＨＡ強化飼料のうち、ほとんどの飼料は２次培養にしか使用できず、もし１次培養に使用すると水質悪化やワムシ・ミジンコの斃死などの問題を引き起こす。１次培養と２次培養の両方に使用できる市販飼料はＤＨＡ強化クロレラのみであるが、ＤＨＡ強化クロレラをワムシの１次培養に使用すると、ワムシ培養水中の細菌数増加、脂質過酸化、奇形発生などの問題が生じることがある。さらにＤＨＡ強化クロレラはクロレラ濃縮液として市販されており、冷蔵輸送・冷蔵保管が不可欠なことから流通経路や流通コストに問題があった。しかし、スプレードライ、凍結乾燥などの方法で乾燥すると極端に餌料価値が低下し、もはやワムシ培養餌料としては使用不可となるため、ＤＨＡ強化クロレラに関しては、流通や保管に有利な乾燥品は実用化されていない。
【０００５】
また、アルテミアの場合、市販の乾燥卵を海水中で孵化・開口させたあとに、ＤＨＡ強化ユーグレナ、ＤＨＡエチルエステル、魚油含有マイクロカプセル、魚卵加工物、ＤＨＡ含有藻類などを原料とするＤＨＡを高濃度に含んだ含有市販飼料を０．５〜２４時間与えて栄養強化を行うが、アルテミアはＤＨＡクロレラを消化できないために、アルテミアの栄養強化には用いられない。
【０００６】
このような状況下で、ω−３系高度不飽和脂肪酸を含有する糸状菌を含んでなる微小飼料生物用飼料が開示された（例えば、特許文献１参照）。
【特許文献１】特許公報第２６６４４５２号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、特許文献１の方法によると、糸状菌を動物プランクトンの飼料にする際には、糸状菌の培養中、培地にω−３系高度不飽和脂肪酸を添加しなければならない。
【０００８】
そこで、本発明は、ω−３系高度不飽和脂肪酸で栄養強化せずに生産できる、ラビリンチュラ類に属する微生物を含有する動物プランクトン用飼料及びそれを用いた動物プランクトンの効率的な培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の動物プランクトン用飼料は、動物プランクトンを栄養強化するのに有効な量の、ω−３系高度不飽和脂肪酸、そのエステル、及びそれを含む油脂のうちの少なくとも一つを含有するラビリンチュラ類に属する微生物を含有する動物プランクトン用飼料であって、前記微生物がビタミンＢ１２及びビタミンＥのうち少なくともいずれか一方で栄養強化されていることを特徴とする。
【００１０】
さらに、本発明の動物プランクトン用飼料は、動物プランクトンを栄養強化するのに有効な量の、ω−３系高度不飽和脂肪酸、そのエステル、及びそれを含む油脂のうちの少なくとも一つを含有するラビリンチュラ類に属する微生物を含有する動物プランクトン用飼料であって、ビタミンＢ１２及びビタミンＥのうち少なくともいずれか一方を含有してもよい。
【００１１】
上記いずれかの動物プランクトン用飼料を与えるのは、ワムシ、アルテミア、又はミジンコであることが好ましい。また、上記いずれかのラビリンチュラ類に属する微生物が、スラウストキトリウム科またはラビリンチュラ科に属することが好ましい。また、上記いずれかの動物プランクトン用飼料は、クロレラ及び酵母のうち少なくとも一つをさらに含有してもよい。また、上記いずれかの動物プランクトン用飼料は、ω−３系高度不飽和脂肪酸で栄養強化されていなくてもよい。
【００１２】
さらに、本発明の培養方法は、ラビリンチュラ類に属する微生物のみを飼料として、動物プランクトンを培養する培養方法である。本培養方法において、前記ラビリンチュラ類に属する微生物がω−３系高度不飽和脂肪酸で栄養強化されていなくてもよいが、前記微生物が、ビタミンＢ１２及びビタミンＥの少なくともいずれか一方で栄養強化されていることが好ましい。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ω−３系高度不飽和脂肪酸で栄養強化せずに生産できる、ラビリンチュラ目に属する微生物を含有する動物プランクトン用飼料及びそれを用いた動物プランクトンの効率的な培養方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、実施例を挙げながら、本発明の実施の形態について詳細に述べる。
【００１５】
まず、本発明の動物プランクトン用飼料は、動物プランクトンを栄養強化するのに有効な量の、ω−３系高度不飽和脂肪酸、そのエステル、及びそれを含む油脂のうちの少なくとも一つを含有するラビリンチュラ類に属する微生物を含む。
【００１６】
ここで、ラビリンチュラ類とは、ラビリンチュラ目に分類されるべき一群の微生物を指す（海洋と生物  ２００１年２３巻１号  ７−１８頁参照）。即ち、現在ラビリンチュラ目に分類されることが明らかになっている微生物と、これら微生物と分子進化的に近縁関係にある微生物とを含む。特に後者に関しては、現在は他の目に分類されているか、分類が明らかでないが、分子進化的にはラビリンチュラ目に分類されるべき微生物も含まれる。例えば、現在ラビリンチュラ目に分類されることが明らかになっている微生物として、ヤブレツボカビ科とラビリンチュラ科とがある。ヤブレツボカビ科には、Japonochytrium属、Labyrinthuloides属の一部、Schizochytrium属の一部、Traustochytrium 属の一部、Ulkenia属が属し、例えば、種としてはJaponochytrium marinum、Labyrinthuloides haliotidis、Schizochytrium aggregatum、Schizochytrium Limacinum、Traustochytrium aggregatum、Traustochytrium aureum、Traustochytrium pachydermum、Traustochytrium striatum、Ulkenia profunda、Ulkenia radiata、Ulkenia visurgensisなどが属する。ラビリンチュラ科には、Aplanochytrium属、Labyrinthula属、Labyrinthuloides 属の一部、Schizochytrium 属の一部、Traustochytrium 属の一部が属し、例えば、種としてはAplanochytrium kerguelense、Labyrinthula sp.、Labyrinthuloides minuta、Schizochytrium minutun、Traustochytrium multirudimentaleなどが属する。分子進化的にはラビリンチュラ目に分類されるべき微生物として、Quahaug Parasite X（Dis.Aquat.Organ., 42, 185-190, 2000）、Diplophrys sp.(ATCC50360)（Dis.Aquat.Organ., 19, 129-136, 1994）、Diplophrys marinaなどがあり、本明細書では、これらを全てラビリンチュラ類と呼ぶ。なお、これらの微生物は、American Culture Collection(ATCC)や独立行政法人製品評価技術基盤機構などの研究機関から容易に入手可能であるが、自然界から取得することも可能である（後述）。
【００１７】
これらラビリンチュラ類に属する微生物は、一般に、動物プランクトンを栄養強化するために有効な量のω−３系高度不飽和脂肪酸を固有に含有する。従って、動物プランクトン飼料として、動物プランクトンを栄養強化するために有効な量のω−３系高度不飽和脂肪酸を含有するラビリンチュラ類に属する微生物を用いる場合、ω−３系高度不飽和脂肪酸で栄養強化しなくても良いが、培養時に、ω−３系高度不飽和脂肪酸を培養液中に添加することにより、さらにω−３系高度不飽和脂肪酸を栄養強化してもよい。ここで、動物プランクトンを栄養強化するために有効な量のω−３系高度不飽和脂肪酸とは、動物プランクトンの培養に際し、増殖や栄養強化を可能にし、２次培養を不要にする量のことである。その適量は動物プランクトンによっても異なるが、乾燥細胞中のＤＨＡ含有率は５％以上であることが好ましく、１０％以上であることがより好ましく、２０％以上であることがさらに好ましい。ω−３系高度不飽和脂肪酸の栄養強化処理により、総脂肪酸中の７０−８０％をＤＨＡが占める微生物を調製することも可能である。なお、ω−３系高度不飽和脂肪酸とは、ω−３の位置に二重結合を有し、３個以上の二重結合を炭素鎖中に有する脂肪酸のことであり、例えば、エイコサテトラエン酸、ＥＰＡ、ドコサペンタエン酸、ＤＨＡ等がある。ラビリンチュラ類に属する微生物は、これらのω−３系高度不飽和脂肪酸を、そのまま含有しても、エステルの形態で含有しても、油脂の形態で含有してもよい。
【００１８】
このような動物プランクトンを栄養強化するために有効な量のω−３系高度不飽和脂肪酸を含有するラビリンチュラ類に属する微生物を、ビタミンＢ１２及びビタミンＥの少なくとも一方で栄養強化する。例えば、ビタミンＢ１２またはビタミンＥを添加した培地中で、上記微生物を培養することにより、ビタミンの栄養強化をすることができる。この際添加するビタミンＢ１２は、コバラミン及びその置換同族体である、シアノコバラミン、ヒドロキソコバラミン、メチルコバラミン、コバマミド等、並びにそれらのエステルを含む。また、ビタミンＥは、トコフェロール類及びトコトリエノール類並びにそれらのエステルを含む。添加形態は、精製した化学分子に限らず、それらを多く含む食品などの抽出物や抽出油などでもよい。
【００１９】
ラビリンチュラ類の栄養強化には、ビタミンＢ１２及びビタミンＥのどちらか一方のみを使用してもよく、両方のみを使用してもよく、また、これらに他の栄養強化物質を加えて使用してもよい。
【００２０】
ラビリンチュラ類をω−３系高度不飽和脂肪酸、ビタミンＢ１２やビタミンＥで栄養強化する際、必要に応じて、乳化剤を適量使用してもよい。乳化剤としては、例えば大豆レシチンやポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどが使用可能であるが、本発明は乳化剤の種類により限定されない。
【００２１】
以上のように、動物プランクトンを栄養強化するために有効な量のω−３系高度不飽和脂肪酸を含有する、ビタミンＢ１２及びビタミンＥの少なくとも一方で栄養強化したラビリンチュラ類に属する微生物を培養して増殖させた後、遠心分離などで集菌し、菌体を凍結乾燥あるいはスプレードライなどにより乾燥することで、目的の乾燥飼料が得られる。
【００２２】
なお、本発明の動物プランクトン用飼料として、その飼料の形態は限定されない。例えば、ビタミンＢ１２及びビタミンＥの少なくとも一方で栄養強化したラビリンチュラ類に属する微生物を生きたまま動物プランクトン用飼料にしてもよいが、上記のような乾燥飼料は、輸送・保存に好都合であり、最も好ましい形態である。
【００２３】
この乾燥飼料は、上記処理した微生物以外に、キャリア、他の栄養強化成分、他の飼料となる物質などを含有しても良いが、上記処理した微生物のみを含有するのが好ましい。
【００２４】
また、ビタミンを飼料中へ添加するには、ラビリンチュラ類に属する微生物をビタミンで栄養強化するほうが好ましいが、栄養強化していないラビリンチュラ類に属する微生物の凍結乾燥飼料に、例えば粉末のような形状のビタミンを混合してもよい。
【００２５】
このようにして作製した動物プランクトン用飼料を、例えばシオミズツボワムシ、Brachionus plicatilis、Brachionus rotundiformisなどのワムシ類、ミジンコ、Artemia franciscanaなどのアルテミア類などの動物プランクトンを培養するために用いるが、対象の動物プランクトンの種類はこれらに限定されない。このようにして、動物プランクトンの培養に対して本発明の飼料を用いることにより、十分な量のω−３系高度不飽和脂肪酸を動物プランクトンに供給することができるため、ω−３系高度不飽和脂肪酸を供給するために行う２次培養を行う必要が無くなる。なお、培養の際の、培地、培養密度、培養様式、培養温度などの培養条件は、特に限定されず、常法に従って培養すればよい。
【００２６】
本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以上に記載された発明の実施の形態及び以下に示す具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００２７】
以下、実施例を挙げ、さらに具体的に本発明を説明する。
【実施例１】
【００２８】
＜ラビリンチュラ類微生物の取得＞
ヤブレツボカビ科Thraustochytrium aureumはＡＴＣＣより入手した(ATCC 28211)。ラビリンチュラ科Labyrinthula sp.は 独立行政法人製品評価技術基盤機構より入手した(IFO 33215)。
【００２９】
ヤブレツボカビ科Ｍ−８株は以下のようにして取得した。まず、石垣島のマングローブ林で採取した海水・落葉を３００ｍｌ三角フラスコに入れ、松花粉（ここでは宮崎市周辺海岸にて採取したものを用いた）を約０．０５ｇ添加した。室温にて１週間放置し、水面の松花粉を含むように海水を採取し、シャーレ中に調製したポテトデキストロース寒天培地上に０．１ｍｌを塗布した。２８℃で５日間培養し、クリーム色でつやのないコロニーをピックアップして新しい寒天培地上に塗布した。３日後、増殖した微生物を顕微鏡下で観察し、ラビリンチュラ類であることを細胞のサイズ、形態から判断してスラント培地に保存した。なお、Ｍ−８株は特許生物寄託センターに寄託済みであり、そこから入手可能である（寄託番号：FERM P-19755）。
【００３０】
＜ビタミンＥまたはビタミンＢ１２強化ラビリンチュラを含む動物プランクトン飼料の生産＞
ヤブレツボカビ科Ｍ−８株、ラビリンチュラ科Thraustochytrium aureum (ATCC 28211)、またはラビリンチュラ科Labyrinthula sp. (IFO 33215)を用い、培地（グルコース３０ｇ、イースト・エキストラクト１０ｇ、を５０％濃度の人工海水１Ｌに溶解し、ｐＨを２〜９に調製したもの）中、２８℃で定常状態になるまで（約７２時間）培養し、遠心分離して菌体を回収した。その後、ＰＢＳで、数回菌体を洗浄した後、凍結乾燥し、動物プランクトン飼料とした。
【００３１】
なお、ラビリンチュラ類微生物をビタミンＢ１２及び／またはビタミンＥで栄養強化する場合は、それぞれビタミンＢ１２（シアノコバラミン）１０μｇ及び／またはビタミンＥ１００ｍｇを上記培地中に加えた培地で培養した。
【実施例２】
【００３２】
＜ビタミンＢ１２含量について、ビタミンＢ１２強化クロレラとＢ１２＋Ｅ強化ラビリンチュラ類微生物との比較＞
市販のビタミンＢ１２強化クロレラ（商品名：生クロレラＶ１２，クロレラ工業（株）製；懸濁液として販売されている）とビタミンＢ１２とビタミンＥで栄養強化したＭ−８のビタミンＢ１２含量を比較した。
【００３３】
＝＝試料の調製＝＝
市販のビタミンＢ１２強化クロレラ懸濁液を、細胞（サンプルＡ）と上澄み（サンプルＢ）に遠心分離した。これらのサンプルと、実施例１と同様に調製した、栄養強化していないＭ−８（以下、Ｍ−８（０）と記す；サンプルＣ）及びビタミンＢ１２とビタミンＥで栄養強化したＭ−８（以下、Ｍ−８（Ｂ１２／Ｅ）と記す；サンプルＤ）中のビタミンＢ１２の含有量を測定した。
【００３４】
＝＝ビタミンＢ１２測定方法＝＝
ビタミンＢ１２含量は、以下のバイオアッセイ法により分析した。
【００３５】
１００ｍｌ三角フラスコに計量した各サンプル２ｇに、水４０ｍｌ、０．５７Ｍ酢酸緩衝液１０ｍｌ、及び０．０５％シアン化カリウム溶液０．４ｍｌを加え、沸騰水浴中で３０分間加熱し、ビタミンＢ１２を抽出した。放冷後、１０％メタリン酸０．６ｍｌを添加し、水を加えて全量１００ｍｌにし、濾過した。濾液２５ｍｌを取り、１Ｍ  ＮａＯＨを用いてｐＨ６．０に調製した後、水を加えて全量５０ｍｌにし、測定値が標準検量線の上にのるように適当に希釈して試験溶液とした。試験溶液０．１ｍｌ、水１．４ｍｌ、ライヒマニＢ１２定量基礎培地１．５ｍｌを試験管に分注し、１２１℃でオートクレーブ滅菌したライヒマニ接種培地でLactobacillus delbrueckii subsp.Lactis(ATCC 7830)を少量接種した。３７℃で２１時間培養後、スペクトロメータで６００ｎｍにおける濁度を測定し、既知濃度のＢ１２溶液を用いてあらかじめ作製した標準検量線を用いて、各サンプル中のビタミンＢ１２含有量を計算した。
【００３６】
＝＝結果＝＝
各サンプル中のビタミンＢ１２含有量を表１に示す。
【表１】
0004813770.tif 000002
【００３７】
サンプルＡ及びサンプルＢのビタミンＢ１２含有量を比較すると、ビタミンＢ１２強化市販クロレラの場合、ビタミンＢ１２全量のうち、７５％が細胞外  （サンプルＢ）に存在し、クロレラ自体（サンプルＡ）が含んでいるのは、２５％にすぎず、量的にも８．９μｇ／１００ｇと、わずかなものであった。それに対し、サンプルＤのＭ−８（Ｂ１２／Ｅ）のビタミンＢ１２含有量は２５０μｇ／１００ｇとなり、サンプルＣのＭ−８（０）と比較すると、約１００倍の取り込みが見られ、量的にも、ビタミンＢ１２強化市販クロレラに比べ、約２８倍の取り込みであった。
【００３８】
このことから、ビタミンＢ１２強化市販クロレラは、ビタミンＢ１２を細胞に取り込ませず、クロレラとは別に添加しているか、取り込ませていたとしても、取り込みはわずかなレベルに過ぎないことが明らかになった。対照的に、ビタミンＢ１２強化Ｍ−８株は多量のビタミンＢ１２を細胞内に取り込んでいることが示された。
【実施例３】
【００３９】
＜Ｂ１２強化ラビリンチュラ類微生物によるワムシ培養＞
＝＝動物プランクトン用飼料の調製＝＝
ラビリンチュラ類は、ヤブレツボカビ科とラビリンチュラ科に大別できる。ここでは、ヤブレツボカビ科の代表として、Ｍ−８株及びThraustochytrium aureum(ATCC28211)を、ラビリンチュラ科の代表として、Labyrinthula sp.を用い、動物プランクトン用飼料を調製して、ワムシの培養を行った。表２に、用いた微生物の種類、及びビタミンＢ１２強化の有無を示す。
【表２】
0004813770.tif 000003
【００４０】
＝＝ワムシ培養方法＝＝
実施例１と同様に調製した上記６種類の動物プランクトン用飼料を用いて、ワムシの培養を行った。人工海水（千寿製薬社、商品名；マリンアートハイ）にＳ型ワムシを５３０個体／ｍＬの濃度で接種し、２８℃で５日間培養し、毎日ワムシの濃度を測定した。なお、一日に一度、表２に記載の飼料を３００ｍｇ／Ｌの濃度で投与した。
【００４１】
＝＝結果＝＝
測定したワムシの濃度を表３に示す。
【表３】
0004813770.tif 000004
【００４２】
いずれの飼料の場合でも、ビタミンＢ１２強化ラビリンチュラ類（サンプルＢ、Ｄ、Ｆ）を用いた時のみワムシが増殖し、ビタミンＢ１２で強化しない微生物（サンプルＡ、Ｃ、Ｅ）ではワムシは増殖しなかった。また、この効果は、ラビリンチュラ目の異なる科に属する微生物で確認されたので、ラビリンチュラ目に属する微生物であれば、広く一般的に、この効果が得られると考えられる。
【実施例４】
【００４３】
＜ワムシの増殖に対する、Ｍ−８（Ｂ１２／Ｅ）と、クロレラ及びパン酵母との比較＞
＝＝培養方法＝＝
実施例１に記載した方法により調製した市販のビタミンＢ１２強化クロレラ（サンプルＡ）、市販のパン酵母（サンプルＢ）、栄養強化していないクロレラ（サンプルＣ）及びＭ−８（Ｂ１２／Ｅ）（サンプルＤ）を用い、ワムシを培養した。なお、ワムシの培養方法は、ワムシの接種濃度が５１０個体／ｍＬの濃度である以外は、実施例３のワムシ培養方法に準じる。
【００４４】
＝＝結果＝＝
測定したワムシの濃度を表４に示す。
【表４】
0004813770.tif 000005
【００４５】
市販のビタミンＢ１２強化クロレラ及び市販のパン酵母に比べ、Ｍ−８（Ｂ１２／Ｅ）を含む動物プランクトン用飼料を用いると、培養５日後のワムシの濃度が約２〜７倍になった。このように、Ｂ１２＋Ｅ強化ラビリンチュラ類微生物は、従来の飼料と比較して、ワムシの増殖に対してかなり優れていることが明らかになった。
【実施例５】
【００４６】
＜Ｍ−８（Ｂ１２／Ｅ）と、クロレラまたは酵母とを併用したワムシの培養＞
＝＝併用培養方法＝＝
実施例１に記載した方法により、Ｍ−８（Ｂ１２／Ｅ）を含む動物プランクトン用飼料を調製した。この飼料に対し、クロレラまたは酵母を添加し、ワムシの併用培養を行った。用いた飼料の組み合わせ及び濃度を表５に示す。
【表５】
0004813770.tif 000006
【００４７】
なお、ワムシの培養方法は、実施例４のワムシ培養方法に準じる。なお今回は、ワムシの密度だけでなく、５日間の培養後、ワムシに含まれる総脂質中のＤＨＡの割合の分析及び細菌密度の測定を行った。
【００４８】
＝＝ＤＨＡの測定方法＝＝
試料１ｇに対し、水１．５ｍｌ及びクロロホルム−メタノール（１：２）溶液６ｍｌを加え、激しく振とうし、脂質を抽出した。遠心分離後、上澄みを回収した。残渣に２ｍｌのクロロホルムを加え、振とうし、遠心した後、上澄みを回収し、先に回収した上澄みと合わせた。０．８８％塩化カリウム溶液で洗浄後、減圧乾固し、総脂質とした。
【００４９】
適量（数ｍｇ分）の脂質にトリコサン酸（２３：０）２ｍｇを加え、１Ｎ水酸化カリウム−９５％エタノール溶液を１５ｍｌ加え、９５℃で１時間、還流加熱した。石油エーテル２０ｍｌで３回洗浄し、回収した水層に６Ｎ塩酸３〜４ｍｌを加え、ジエチルエーテル２０ｍｌで３回抽出し、回収したジエチルエーテルを合わせて、６０ｍｌとした。等量の水で３回洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧乾固した。２００μｌのＤＭＦに溶解し、ガスクロマトグラフィーを用いて、ＤＨＡ量と総脂質量を測定した。
【００５０】
＝＝結果＝＝
測定したワムシの濃度を表６、ワムシに含まれる総脂質中のＤＨＡの割合を表７、培養後の総細菌数を表８に示す。
【表６】
0004813770.tif 000007
【表７】
0004813770.tif 000008
【表８】
0004813770.tif 000009
【００５１】
クロレラとパン酵母の併用（サンプルＡ）に比べ、どちらかをＭ−８（Ｂ１２／Ｅ）を含む動物プランクトン用飼料に変える（サンプルＢ、Ｃ）と、培養５日後のワムシの濃度が２倍以上になった（表６）。このように、他の飼料との併用の場合も、Ｂ１２＋Ｅ強化ラビリンチュラ類微生物の方が、ワムシの増殖により有効であることが示された。
【００５２】
また、表７に示すように、Ｍ−８（Ｂ１２／Ｅ）を含む動物プランクトン用飼料を併用した場合（サンプルＢ、Ｃ）、ＤＨＡがワムシ体内に蓄積しており、ワムシの栄養価も向上した。その結果、ワムシのω−３系高度不飽和脂肪酸栄養強化を行う必要が無くなり、種苗生産の効率化・省力化が可能になった。
【００５３】
さらに、Ｍ−８（Ｂ１２／Ｅ）を含む動物プランクトン用飼料を併用した場合、培養液中に混在している細菌密度も初期密度から大して変化が無く（表８）、培養環境の改善も見られた。