(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、プロナーゼまたは／およびパパインのタンパク質分解活性を阻害し得るジャガイモジュースであって、前記ジャガイモジュースは、ジャガイモの皮をむき、洗った後、小片に粉砕し、０．２％アスコルビン酸添加下に寒冷紗で濾過したジュースを遠心し、濾紙により濾過し、再度遠心して得られた澄明黄色の上清を０．４５ミクロンフィルターにより濾過して得られるジャガイモジュースを有効成分とする糞便によって生じる炎症を軽減または予防するための組成物。
【請求項２】
糞便によって生じる炎症が腸管、会陰、肛門周囲または人工肛門周囲の炎症であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
【請求項３】
糞便によって生じる炎症を軽減または予防するための組成物を製造するための請求項１または２に記載のジャガイモジュースの使用。
【請求項４】
糞便によって生じる肛門周囲および／または人工肛門周囲の炎症を軽減または予防するための組成物を製造するための請求項１または２に記載のジャガイモジュースの使用。
【請求項５】
糞便によって生じる炎症を軽減または予防するためのオムツを製造するための請求項１または２に記載の組成物の使用。
【請求項６】
請求項１または２に記載の組成物を含んでなる、糞便によって生じる会陰および／または人工肛門周囲の炎症治療用組成物。
【請求項７】
請求項１または２に記載の組成物を含んでなる、糞便によって生じる会陰および／または人工肛門周囲の炎症治療のためのオムツ。
【請求項８】
ヒトを除く哺乳動物を、請求項１または２に記載の組成物による治療に付すことを含む、糞便によって生じる炎症の軽減または予防のための方法。
【請求項９】
請求項１または２に記載の組成物を凍結乾燥して得られる濃縮混合物を含むことを特徴とする糞便によって生じる炎症を軽減または予防するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はタンパク質分解活性を阻害することによる炎症の予防、治療または軽減方法および手段、より詳しくは皮膚または腸管の炎症を予防または軽減する方法および手段に関する。
【０００２】
皮膚（皮膚炎）または腸管（腸炎）の炎症には様々な起源のものがある。第一に、アレルギー反応、（病原性）微生物の感染、化学的または物理的手段による外分泌、およびその他の原因が炎症を引起す。これらの原因事象が直ちにそれを必要とする身体の反応に引き継がれ、その結果、皮膚または腸管がその元の状態に回復しようとして作用と事象の相互作用を引起す。この原因と結果の相互作用において、様々なタンパク質分解酵素の活性が見られる。炎症応答においてサイトカインにより炎症部位に引き寄せられる顆粒球、肥満細胞、マクロファージおよび他の即時型作用物質は、キモトリプシン・プロテアーゼおよびエラスターゼなどのプロテアーゼを含み（そしてそれを分泌し）、それが媒介物質として作用するか、または病原体からまたは周辺の変性した組織から得られるタンパク質を切断し除去する際の手段となる。バクテリアは一次原因作用物質として、または二次的感染に際して、また、他の（病原性）微生物も、それらの目的のために周辺組織を損傷するプロテアーゼを分泌する。宿主と侵入者間のこの戦場において、過剰のタンパク質分解反応は、多くの場合特異プロテアーゼインヒビターにより防御される。プロティナーゼ／プロティナーゼ・インヒビター・システム、例えば、ＰＭＮ−エラスターゼ／アルファ−１−プロティナーゼ・インヒビターおよびカテプシンＧ／アルファ−１−アンチキモトリプシンはよく知られている。
【０００３】
しかし、タンパク質分解酵素それ自体も炎症の原因であり得る。これは特に腸管内に見出される消化酵素の場合にそうである。食餌タンパク質を分解するために、胃、膵臓、および小腸刷子縁は数種のプロテアーゼを分泌する。胃からのペプシンはｐＨ２で最適に作用し、トリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼなどの膵臓および小腸刷子縁酵素はｐＨ７〜８で最適に働く。成人では、小腸の長さが数メートルにも及び、その内容物の通過時間は約３時間である；腸のこの部分では二三種のバクテリアのみがコロニーを造っているが、食物と多様な大量の消化酵素、例えば、リパーゼおよびプロテアーゼなどとの水状混合物で満たされている。しかし、大腸（結腸および盲腸）では、水分含量が著しく減少し、酵素の活性が例えばバクテリアにより中和される。中和され消化された食物とバクテリアの残遺物（糞便）は直腸から体外に出る。結腸が水分含量を有効に低下させ得ず、また、酵素を中和し得ないときにのみ、糞便はなおタンパク質分解活性を含み、それが下痢または糞便失禁に際して、肛門周囲および会陰皮膚に強い刺激となる可能性がある。
【０００４】
取分けヒトの皮膚は、主にケラチンからなる皮膚角質層により保護されてはいるが、他のタンパク質性物質同様に、プロテアーゼのタンパク質分解作用に敏感であり、その結果、液状の小腸内容物が激しい炎症を引起す。
【０００５】
乳児および幼児では、腸が余りよく発達しておらず、特に結腸の機能が成人と異なっている。それが、乳児および幼児糞便の消化酵素が中和されない理由である；糞便の内容物は、結腸を通過したにもかかわらず、小腸の内容物によく似ている。したがって、会陰（肛門周囲）の皮膚炎が成人よりも頻繁に乳児または幼児で見出される。また、胃腸障害をもつ（入院している）乳児と小児はかかる皮膚炎になり易い。かかる皮膚炎または掻痒は、会陰皮膚の掻痒皮膚紅斑、嚢胞、浸潤、浮腫または破壊（擦傷）などにより規定されるが、オムツかぶれ（皮疹）でも見出され、それ自体むしろ緩和なものから重症の形態で現われる。オムツかぶれでの複雑な要因は尿の蓄積であり、そこで尿が糞便のバクテリアによりアンモニアに変わり、それによってｐＨがタンパク質分解酵素にとって都合のよい値に上昇する。皮膚は感染に対し非常に弱いので、（糞便の）タンパク質分解活性に関係したかかる炎症を予防する気配りがなされるべきである。
【０００６】
さらに他の皮膚炎の事例が結腸および／または回腸の切除術を受けた人工肛門の患者に見られる。回腸嚢炎、すなわち、腸炎症が結腸切除後の貯蔵構造物による回腸肛門吻合部の主な合併症であり、臨床症状と貯蔵器（嚢）の炎症により特徴づけられる。周口部（人工肛門周辺）の皮膚炎は、下腹部表面に開口している回腸小孔を備えていて、毎日空にする必要のある人工貯蔵器につながっている患者に見られる。炎症性の腸疾患（ＩＢＤ、例えば、クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）および回腸嚢炎）、および未知病因による炎症において、腸内微生物叢と病原体、これらの微生物から由来するタンパク質分解酵素および内因性（例えば、膵臓または白血球／顆粒球）タンパク質分解酵素の役割、および防御性ムコ糖タンパク質とその下に在る組織の分解に対するそれらの寄与については理解されていない。
【０００７】
取分け、結腸が取除かれているか、あるいはその機能が冒されているか未成熟である場合には、糞便が排泄されたときに、タンパク質分解活性がなお非常に高く、様々な程度の会陰部皮膚炎に至らしめることは明らかである。
【０００８】
言うまでもなく、（激しい）かゆみや、時には上記の炎症の痛みを伴う結果を治癒するために、多くの治療薬および個人的治療用品が開発されている。一般的な抗炎症療法では多くの場合、副腎皮質ステロイドでの治療に頼ろうとするが、これらの薬物では深刻な副作用がしばしば見られる。他の治療法は主に、皮膚に保護層を与える、例えば、亜鉛華などの添加物を含む液体ベースの軟膏を塗付すること、あるいは危険部分を頻繁に清潔にすることに基づいている。特別の個人的治療用品が開発されているが、例えば、会陰部手当て用の特別の湿潤拭き取り布、乳児または患者がひどく汚すにもかかわらず著しく乾燥したままのオムツなどから、回腸小孔または回腸肛門吻合をもつ患者の人工肛門手当て用に特別に設計された製品（人工肛門治療装具）、例えば、粘着性吸収性ディスクおよび人工肛門洗浄液までに及ぶ。
【０００９】
しかし、これら治療のいずれもが、実際に、上記または下記臨床症状の１つ以上を緩和する以上のものではない。
【００１０】
本発明は炎症または掻痒を治療、軽減または予防する方法であって、哺乳動物を、タンパク質分解活性を阻害し得る少なくとも１種のインヒビターによる治療に付すことを特徴とする方法を提供する。好ましくは、本発明は、プロテアーゼを産生または分泌する、例えば、顆粒球、肥満細胞、マクロファージおよび他の炎症過程での作用物質を阻害する方法を提供する。本発明はヒトおよび家畜の医療および介護に適用し得る。
【００１１】
本発明の好適な実施形態は、当該哺乳動物が、例えば、皮膚炎または掻痒にかかっているヒトの場合である。例えば、プロテアーゼ・インヒビターで皮膚炎を治療すると、炎症性掻痒に関与するプロテアーゼのタンパク質分解活性を低下させる。特に、炎症に際して見られる原因と結果の相互作用において、タンパク質分解酵素の活性が高すぎる場合、本発明はタンパク質分解活性を阻害し得る少なくとも１種のインヒビターでの治療によりこの活性（宿主からまたは侵入者のもの）を低下させる方法を提供する。
【００１２】
当該治療は、当該インヒビターを、軟膏、クリーム、ゲル、粉末、または他の適切な形状で炎症部位に塗付することにより行われる。これらの物質は、例えば、インヒビターを含ませた拭き取り布上に、スプレーに、または洗浄液に担持させてもよい。
【００１３】
本発明の好適な実施形態において、治療は、例えば、オムツかぶれのある乳児または幼児に、または下痢または糞便失禁のある小児または成人に、または炎症性大腸症候群の患者に、また、人工肛門患者に見られるようなものであって、すべて主に糞便のタンパク質分解活性の影響を受けている、腸、会陰または人工肛門周辺の炎症に対して提供される。
【００１４】
糞便のタンパク質分解活性治療は、当該インヒビターを、軟膏、クリーム、ゲル、粉末、または他の適切な形状で、会陰または人工肛門周辺の炎症部位に塗付することにより実施することができる。ＩＢＤまたは回腸嚢炎で見られる腸内炎症では、消化管の罹患部分に流し込む、例えば、浣腸液を投与することにより処理するか、あるいは好ましくは、食道と胃を比較的影響なしに通過し得る服用または混合ピルなどの医薬組成物として経口投与してもよい。
【００１５】
これらのインヒビター物質は、例えば、インヒビターを含ませた拭き取り布上に、スプレーに、または洗浄液に担持させてもよい。また、オムツにインヒビターを染み込ませ（オムツの生産に際して、または使用の少し前に）、それによって、オムツかぶれまたは掻痒に対する方法および手段を提供することも可能である。好適な実施形態において、かかるオムツは、使用時に、乳児、幼児、小児または成人の会陰部と接触する少なくともそのオムツの領域（またはその下の部分）を本発明が提供するインヒビターで処理するか、または飽和させる。オムツの場合、当該接触領域は通常会陰部と接触するオムツの表面を含んでなる。
【００１６】
本発明は、炎症傾向にある患者または哺乳動物に、プロテアーゼのタンパク質分解活性を阻害し得るインヒビターを投与することを含んでなる治療方法を提供する。タンパク質分解活性のインヒビターは広く知られている。例えば、酸は膵臓のプロテアーゼによるタンパク質の加水分解に阻害効果を有し、かくして、ｐＨ降下物質は本発明により提供されるインヒビターとして使用することができる。
【００１７】
また、活性炭（かかる製品の一つはノーリットとして知られる）などの吸着性物質はその吸着の性質によりプロテアーゼインヒビターとして作用する。実験の部で、本発明により提供される治療についての幾つかの例を掲げるが、そこでは活性炭、例えば、ノーリット（登録商標）が例えば回腸嚢炎などの炎症を治療するために使用される。
【００１８】
本発明の好適な実施形態において、本発明はプロテアーゼのタンパク質分解活性を阻害し得る方法と手段を提供する。多くのプロテアーゼインヒビターが知られている（例えば、G. Salvesen and H. Nagase, タンパク質分解酵素、実用方法、編集 R.J. Beynon and J.S. Bond In: 実用方法シリーズ。１９８９、参照）。非特異インヒビターが知られているが（すなわち、ヒト血漿α−マクログロブリン）、殆どがプロテアーゼ・クラス間またはサブクラス間を識別する。ペプチドアルデヒドまたはペプチドクロロメチルケトンなどの物質は、それらが模倣するペプチド配列に左右されて、プロテアーゼ（プロティナーゼ）のサブクラスに非常に特異的である。金属キレート形成剤など、その他のものは金属プロティナーゼまたはカルシウム依存性プロティナーゼに対してのみ作用する。クラス特異インヒビターは、セリン・プロティナーゼに対して、システイン・プロティナーゼに対して、アスパラギン酸・プロティナーゼに対してなどに見出されている。これらのプロテアーゼ・インヒビターは生化学調製品に使用するために精製した物質として多くの場合市販入手可能であるが、高価である。
【００１９】
本発明による好適な方法は、インヒビターが植物由来、すなわち、当該インヒビターがプロテアーゼ阻害活性を含んでなる植物産物である場合の方法である。一例として、かかる植物由来の産物は活性炭であり、これは泥炭または木材を焼成することにより得られる。本発明によるさらに好ましい方法は、インヒビターが果実、種子、塊茎または根を生じ得る植物由来のものである場合の方法である。本明細書にて由来とは、例えば、（部分的）精製または単離による由来または必要な遺伝子情報を得て、技術上既知の現今の組換え技術により生産することによる由来を包含する。
【００２０】
植物はしばしばその葉、果実、種子、塊茎または根にもつ強力なプロテアーゼ・インヒビターおよびその混合物の封入により、害虫に対してその葉、果実、種子、塊茎または根を防御する。例えば、コムギまたはダイズなどの穀類または豆類は大豆トリプシン・インヒビター（ＳＢＴＩ）を含んでいるが、これは一般にトリプシンまたはキモトリプシンに対し活性をもつが、他のプロティナーゼクラスに対しては活性をもたない。塊茎および根、例えば、ジャガイモおよびカッサバ、並びにサツマイモ、甜菜およびアメリカヤブニンジンなどは、広範な消化管プロテアーゼ、例えば、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、キモトリプシン、トリプシンおよびエラスターゼなどに対する強力なインヒビターを含んでおり、この広い範囲の故に、本発明によるタンパク質分解活性を含んでなる植物としては塊茎または根由来の産物が好ましい。ジャガイモ塊茎は動物の主要な腸内消化内因性および外因性プロティナーゼすべてに対する種々のインヒビターの取分け豊富な供給源である（Pearce et al., Arch. Biochem. Biophys, 213, 456-462, 1982)。かかるインヒビターは害虫の攻撃に対する塊茎および根などの植物の天然化学的防御メカニズムの一部として存在する抗栄養物として作用する。ジャガイモの場合には、主たるインヒビターはポリペプチド・トリプシン・インヒビター（ＰＴＩ）、ポリペプチド・キモトリプシン・インヒビターＩおよびII（ＰＣＩ−ＩおよびＰＣＩ−II）、キモトリプシンおよびトリプシンに対するインヒビターII、およびカルボキシペプチダーゼ・インヒビターなどであり、これらはすべて他の植物において類似性をもつ。これらは主たる動物の消化プロティナーゼに対して、単独で、また、協力して作用する。
【００２１】
本発明は、炎症または掻痒を軽減または予防する医薬組成物または個人的治療組成物製造のための、タンパク質分解活性を阻害し得るインヒビターまたは植物産物もしくは抽出物の使用を提供する。実験の部において、かかる産物がジャガイモジュースまたは、例えば、凍結乾燥によりそこから誘導されるインヒビターを含んでなる産物についての一例を示す。かかる組成物は患者にインヒビターを塗付し得る軟膏、クリーム、ゲル、粉末、または他の適切な形状からなる。本発明の好適な実施形態において、本発明は、腸内、会陰または人工肛門周辺の炎症または掻痒である炎症または掻痒を軽減または予防する組成物製造のための、タンパク質分解活性を阻害し得るインヒビターまたは植物産物の使用を提供する。かかる組成物は洗浄液の形状であってもよく、食道と胃を通過するカプセルに入れてもよく、また、（調製前の）拭き取り布またはオムツに含ませてもよいが、その場合、該インヒビター（または植物産物）は製造に際してまたは使用寸前に加える。好適な実施形態において、本発明は、例えば、糞便のタンパク質分解活性に反撃する、会陰（肛門周囲）および／または人工肛門周囲治療用の個人または医療治療組成物製造のための、タンパク質分解活性を阻害し得るインヒビターの使用を提供する。
【００２２】
例えば、会陰部炎症は貯蔵器と会陰皮膚をプロテアーゼ・インヒビター含有液またはプロテアーゼ・インヒビター含有の保護軟膏で洗うことにより予防することが可能である。また、汚物を吸着するオムツまたは個人治療用組成物を予めインヒビターで処理することも可能である。
【００２３】
本発明は医薬組成物または個人治療用組成物製造のためのタンパク質分解活性を阻害し得るインヒビターまたは植物産物の使用を提供し、その場合の当該インヒビターまたは産物が植物由来のものであり、好ましくはその場合の当該植物が果実、種子、塊茎または根を生じ得るもの、例えば、ジャガイモ植物である。かかるインヒビター（産物、組成物または混合物）は、上記説明のように、膵臓および顆粒球プロテアーゼの群から選択されるプロテアーゼに対して活性である。本発明の特定の実施形態において、当該インヒビター（組成物または混合物）はパパインおよび／またはプロナーゼを阻害し得るものであり、その広域スペクトルおよび有効性を物語る。
【００２４】
本発明はまた医薬製品または個人治療用製品（例えば、軟膏、粉末、液体）をも提供し、該製品は、例えば、糞便（糞便プロテアーゼ）が原因の炎症または掻痒を、膵臓および刷子縁由来、バクテリア（腸内微生物叢）由来、腸の炎症の場合には、白血球（顆粒球、肥満細胞、マクロファージ）由来のタンパク質分解酵素を阻害することにより予防し得るか、または糞便（糞便プロテアーゼ）が原因の炎症または掻痒を、組織マクロファージ、顆粒球、肥満細胞により産生されるプロテアーゼ（エラスターゼ、カテプシンなど）を阻害することにより治癒し得るか、または皮膚炎症と他の疾患であって、それらの活性が炎症細胞（エフェクター細胞）の浸潤とプロテアーゼの放出に関係するものである炎症と疾患を治癒し得るか、または一般的な掻痒を（治療は多くの場合抗ヒスタミン剤による）、プロテアーゼ・インヒビターを含む軟膏の局所投与が肥満細胞からのヒスタミン放出／食細胞からのプロテアーゼ放出を予防することにより治癒し得る、
プロテアーゼ活性に対するインヒビターを含んでなる医薬製品または個人治療用製品を提供する。
【００２５】
本発明はまたタンパク質分解活性に対するインヒビターを含んでなる肛門周辺および／または人工肛門周辺治療用の個人治療用組成物、洗浄液、湿潤布、粉末、軟膏、またはオムツを提供する。さらに、本発明は本発明による方法に使用するプロテアーゼ・インヒビターを提供する。皮膚保護に対する留意がすでに外科手術時に始まっており、例えば、インヒビター含有の洗浄液などである。インヒビターは人工肛門装具、例えば、粘着性吸収性ディスクなどに、また人工肛門洗浄液および軟膏に取込ませてもよい。
【００２６】
また、本発明は、物質、好ましくは糞便の炎症作用に対するタンパク質分解活性インヒビターの効果を研究する皮膚テスト法を提供する。
【００２７】
本発明をさらに実験の部により説明するが、これは本発明を限定するものではない。
【００２８】
実験の部
成人では、小腸の長さが７メートルあり、その内容物の通過時間は約３時間である；これが大腸に比べて腸のこの部分で僅か２、３種のバクテリアのみがコロニーを造っている理由である。しかし、結腸では大量のバクテリアがコロニーを形成している（１０10〜１０11／グラム）。通過はゆっくりしていて（２４時間）、結腸の主たる機能は水分の吸収である。
【００２９】
最終的に、糞便は固体１部と水分２部からなる。乾燥物質の半分はバクテリアである；残りは大部分が食物線維と落屑上皮細胞と粘液などの宿主由来の物質である。バクテリア醗酵の最も活性な部位は回腸の内容物が盲腸に達する場所である。豊富な栄養物が利用可能であり、水分の割合が高く、微生物叢は増殖に最適な条件をもつ。（ヒト）腸のこの部分についてはデータが僅かしか知られていないが、突然死の犠牲者で測定したｐＨは非常に低い（ｐＨ４.５〜５.５）。
【００３０】
結腸微生物叢は偏性嫌気性バクテリア９９.９％からなる；大腸菌などの嫌気性通性好気性バクテリアは少数群である（約１０4〜１０7バクテリア／グラム糞便）。嫌気性結腸微生物叢は非常に安定であり、種または属のレベルで変更することは、食事を極端に変化したとしても殆ど不可能である（しかし、抗生物質または腸内病原菌による感染は居住する微生物叢を混乱させる）。この現象の原因の一つは、最も重要な栄養物が内因性物質、消化液、粘液などからの誘導物であるということである。消化タンパク質（胆汁酸も）の一部は回腸の遠位部分から再吸収され、残りは結腸で変化を受けるか、消化される。結腸微生物叢はプロテアーゼなどの消化性膵臓酵素の不活化に重要な役割を演じると考えられる。
【００３１】
乳児と幼児では、腸が十分に発達しておらず、特に結腸は成人ほどに機能しない。このことが何故乳児と幼児の糞便中消化酵素が中和されず、および／または再吸収されないかの理由である；その内容物は、結腸を通過したにもかかわらず、高いタンパク質分解活性を含め小腸の内容物によく似ている。
【００３２】
主要な内因性栄養源は恐らく９０％までの炭水化物を含む胃腸粘液からの糖タンパク質である。バクテリア・グリコシダーゼはタンパク質分解による崩壊から糖タンパク質を防御するオリゴ糖の側鎖を分解する。タンパク質コアが炭水化物の保護を欠くと、それは膵臓（およびバクテリア）プロテアーゼによるタンパク質分解に最早抵抗しなくなる。健常の結腸には、粘液の産生と分解の間にバランスがある。
【００３３】
炎症性大腸疾患（ＩＢＤ）：クローン病（ＣＤ）、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）および回腸嚢炎は非常に注目されている。回腸嚢炎はＵＣによる結腸切除後の貯蔵器構造物と回腸肛門吻合の主要な合併症であり、臨床症状と貯臓器（嚢）の炎症により特徴づけられる。ＩＢＤにおける腸内微生物叢の役割が、病原およびその保護ムコ糖タンパク質分解に対する寄与に関し研究された。
【００３４】
腸管内に炎症のある患者は粘膜の完全性喪失を示す。我々はバクテリア・グリコシダーゼとバクテリアおよび宿主由来プロテアーゼの、粘液糖タンパク質分解による潜在的に有害な役割について研究した。したがって、ＩＢＤの患者において、腸内微生物叢の組成およびグリコシダーゼとプロテアーゼの活性を評価した。また、酵素活性を無菌ラットで測定し、微生物叢の影響を確立した。
【００３５】
これらの研究では、活性ＣＤ患者、回腸造瘻患者および嚢をもつ患者の糞便が、高いタンパク質分解活性をもつことを示した。プロテアーゼは肝臓、刷子縁および膵臓からの分泌物として大部分が十二指腸に入る。活性の一部は多分吸収および／または内因性インヒビターの作用のために末端回腸で失われる。健常被験者の糞便では、酵素活性がほんの僅かであるか、またはまったくないと見積もられるが、これは恐らく大部分がバクテリア起源のものである。しかし、ラットなどの無菌動物では大腸全体にわたり高いタンパク質分解活性を示す。活性ＩＢＤ患者、回腸造瘻患者および嚢をもつ患者は高い糞便タンパク質分解活性をもつことが見出された。このことから我々は完全な結腸微生物叢と正常な（ゆっくりとした）移動がこれらの酵素を不活化するために必要であると結論することができる。
【００３６】
ＩＢＤ患者の糞便の高いタンパク質分解活性は粘液の糖タンパク質分解を増大させ、粘膜炎症の維持に役割を演じている可能性がある。この仮説は生体外での実験により確認された。この考えが、会陰皮膚炎を予防するために、回腸肛門吻合（ＩＡＡ）の患者などをプロテアーゼ−インヒビターで治療することを思いつかせた。ＵＣまたは家族性腺腫ポリポーシス（ＦＡＰ）のために手術する患者は結腸切除後の回腸貯蔵器構築対象と考えられる。この小さな貯臓器は肛門と接続する。術後の期間が患者にとってもっとも厳しい時間である。術後間もなくの患者便は水性の粘稠便である。患者は多くの場合（なお）自制しえず、それが会陰皮膚の刺激と掻痒になる（会陰皮膚炎）。会陰皮膚炎の主な原因はプロテアーゼによる表皮（大部分がタンパク質ケラチンから構成される）の分解である。
【００３７】
タンパク質分解活性はこれら患者の糞便で測定し、非常に高いことが判明した。さらに、患者の７５％が中程度から重症の会陰皮膚炎にかかっていた；２５％は何ら刺激の徴候をもたなかった。
【００３８】
材料と方法
タンパク質分解活性／被験者
クローン病（ＣＤ）患者２７人からの糞便サンプルについて検討した。１２人の患者は年齢２７才〜５８才であり、３〜１２年以前に腸の外科手術を受けていた；切除部位は末端回腸、回腸と盲腸、および結腸であった。患者の第二群は手術を受けていなかった；炎症の重要部位は回腸、回腸と結腸、および結腸であった。ＣＤの診断は通常の臨床的、放射医学的および組織病理学的基準により確立した。すべての患者が外来患者であった。
【００３９】
健常ボランティア１２人、年齢２３才〜４８才、を比較のために試験した。
回腸造瘻廃物は通常の回腸造瘻をもつ成人患者（年齢３８〜７１才）５人から入手した。かれらは５年以上前にＣＤまたは消化性大腸炎（ＵＣ）の軽減のために全結腸切除術を受けており、現在は全員健康であった。
【００４０】
嚢をもつ患者１４人（平均年齢２７才）につき検討した。患者はＵＣまたは家族性腺腫ポリポーシスのために回復促進の直腸結腸切除術を受けた。１２人の患者にはＳ嚢を設け、一方、２人の患者にはＷ嚢を創製した。この研究は回復促進の切除術の少なくとも１年後に実施した。回腸嚢炎の診断は、臨床症状、急性非特異炎症の内視鏡像、および炎症性細胞浸潤の組織学的証拠に基づいた。これらの基準を用いると、５人の患者が回腸嚢炎を示し、９人は示さなかった（対象）。
【００４１】
貯臓器構築のために手術した回腸肛門吻合（ＩＡＡ）の患者１３人から糞便サンプルを術後１４日以内に採取した。３１人の健常小児（４ヵ月ないし７才）からの糞便についてタンパク質分解活性を測定した。
【００４２】
タンパク質分解活性／実験室動物
４匹の通常ラット（ウイスター）および４匹の無菌ラット（Ｗａｇ／Ｒｉｊ）からの糞便を検討した。２匹の通常ラットと２匹の無菌ラットからは、腸管の内容物を検討した。
【００４３】
結腸切除したイヌ（純血種ビーグル犬；ハーラン）２０匹からの糞便サンプルを採取した。３匹の回腸造瘻群について検討した。１０匹のイヌには結腸の準全切除術により標準のブルーク（Brooke）回腸造瘻を設けた。５匹のイヌには無弁回腸貯臓器（嚢）を左右同種抗蠕動性吻合により形造った。２週間の回復期後、５匹のイヌを除き、閉塞期間の延長スケジュールを開始した。最大耐久可能閉塞時間は回腸造瘻群では２.５〜３時間、貯臓器群では４〜７時間であった。５匹のイヌには自制回腸造瘻（コック嚢）を設け、カテーテル挿入により２４時間に２〜５回空にした。
【００４４】
タンパク質分解活性／糞便サンプルおよび腸内容物
糞便は排泄から３時間以内に凍結し、−２０℃に保存した。予備試験では保存の少なくとも４ヶ月間、タンパク質分解活性に変化を示さなかった。１ｇのサンプルを２４容量の０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.６）に移し、均一化した（‘ストマッチャー’、ラボ・ブレンダー４００）。粗大粒子をガーゼ濾過によりホモジネートから除いた（アッターモーレン、２層に重ね折り）；これらのサンプルはさらに‘糞便ホモジネート’という。
【００４５】
ラットを殺した直後に、腸全体を取出し、準備した。小腸を同じ長さの４部分に分け、各部分の内容物を０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.２）により注意深く洗った。盲腸と結腸からのサンプルを糞便と同じ方法で処理した。
【００４６】
タンパク質分解活性／マクロファージ
マウス腹腔マクロファージ（ＲＡＷ）を生体外で５％ＦＣＳと４ｍＭグルタミンを含む２００ｍｌのＤＭＥＭ中培養し、２００ＵのＴＮＦαmol培地で刺激した。１８時間後、細胞を収獲、遠心し、２ｍｌの０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.６）に再懸濁した。細胞総数は約３×１０8／ｍｌであった。細胞を繰返し凍結により破壊し、サンプルをプロテアーゼ・アッセイに使用した。
【００４７】
タンパク質分解活性／酵素アッセイ
タンパク質分解活性は糞便ホモジネートを０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.６）に適当に希釈（２５０倍まで）して定量した。ペニシリン（０.１％ｗ／ｖ）を加え、バクテリアの増殖を防止した。より最近の阻害テストでは、ペニシリンを使用しなかった。０.１ｍｌのサンプルをリン酸バッファー中０.１ｍｌの１％（ｗ／ｖ）アゾカゼイン（シグマ）と３７℃で１時間培養した。０.２ｍｌの１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）添加により反応を停止した；室温で１０分後、未水解のアゾカゼイン、バクテリアおよびその他の粒子を１０，０００ｒｐｍ、１０分間の遠心により除去した。次いで、澄明な上清を平底２４穴マイクロプレートの１Ｎ−ＮａＯＨ０.１ｍｌに移した。ブランク・アッセイのために、培養、ＴＣＡ添加後にアゾカゼインを加えた。サンプルの吸光度を４５０ｎｍで測定し、アゾカゼイン溶液から得た標準曲線と比較した。タンパク質分解活性は、乾燥または湿潤サンプル１グラム重量当たり１時間に水解されるアゾカゼインのミリグラムで表した。各希釈サンプルは８０℃、１０分間加熱後の酵素基質水解以外についてテストした。基質とバッファーのインキュベーションにより同時基質水解についてテストした。
【００４８】
Ｎ−スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリド（シグマ）を基質として用い、精製したヒト白血球エラスターゼ（シグマ）およびマウス・マクロファージからのエラスターゼ活性を評価した。０.１ｍｌのサンプルを平底ウエルマイクロタイタープレートの０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.６）中で０.１ｍｌの基質（０.１％ｗ／ｖ）と培養した。３０分または６０分後、３０％酢酸７０μｌ添加により反応を止め、４００ｎｍでの吸光度を測定した。酵素１単位は、３７℃で１分当たりｐ−ニトロアニリド１μｍｏｌを放出する量と定義した。
【００４９】
タンパク質分解活性／ｐＨの影響
タンパク質分解活性に対するｐＨの影響をテストするために、糞便サンプルをクエン酸−リン酸バッファー（０.１Ｍ−Ｎａ2ＨＰＯ4／２Ｈ2Ｏ、０.１Ｍクエン酸／Ｈ2Ｏ）のｐＨを５.２，５.８，６．８および７.６として希釈した。さらに、基質溶液も適切なバッファーで作製した。
【００５０】
無レクチン・ジャガイモタンパク質の調製
粗製または比較的精製されたジャガイモタンパク質をＰＢＳに希釈した。ヒト赤血球（無病）をジャガイモタンパク質に加え（赤血球の最終濃度３％）、１分間注意深く混合し、１５００ｒｐｍで２分間遠心した。上清を再び赤血球と混合した。この操作を５回、赤血球凝集が赤血球凝集試験で見出されるなくなるまで繰返した。明確な赤血球凝集を示したジャガイモタンパク質の最高希釈逆数を赤血球凝集の力価とした。赤血球凝集の力価は、例えば、２５，６００から２５〜１に低下した。凍結乾燥後、無レクチン産物の阻害活性を当初のタンパク質フラクションと比較した。高タンパク質分解活性をもつ糞便サンプルにおいて、また、精製したプロテアーゼ溶液（トリプシン、α−キモトリプシンおよびエラスターゼ、最終濃度１％）においてテストした場合、阻害活性の喪失は見出されなかった。
【００５１】
さらに、無レクチン・ジャガイモタンパク質を、例えば、キトオリゴ−アガロース（生化学）を使用することにより得る。
【００５２】
ジャガイモタンパク質からのレクチンも、タンパク質溶液からそれを除くのではなく、可溶性炭水化物部分、例えば、水解したキチンからのＮ−アセトキトオリゴ糖および胃または腸からの糖タンパク質に結合させることにより不活化する。このレクチンはなお産物中に存在するが、その活性部位は失っている。
タンパク質分解活性／プロテアーゼ・インヒビター
以下のインヒビターを使用した：
−  トラジロール（アプロチニン）（バイエル）希釈せず
−  オボムコイド（）０.１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７.６）中１％（ｗ／ｖ）−  仔ウシ血清（ＦＣＳ）（）希釈せず
−  トリプシン・インヒビターII−大豆から（ＳＴＩ）（Ｔ−９００３；シグマ）リン酸バッファー（ｐＨ７.６）中１％（ｗ／ｖ）
−  ノーリットＡ（上記ＵＳＰ９５１１９１）、Ｂ（テストＥＵＲ、Ａ６９１０）、Ｅ（上記ＵＳＰ９４０２６０）、ＰＲＳＨ、カルボミックス、錠剤
−  プレミアム粉末（ホリスター）
代替法として、“ビントジェス（Bintjes）”からのジャガイモジュース（ＰＪ）を以下のように調製した。皮をむき、洗った後、ジャガイモを小片に粉砕し、０.２％アスコルビン酸添加下に寒冷紗で濾過した。ジュースを２７，５００ＲＣＦ、３０分間４℃で遠心し、濾紙により濾過し、再度遠心した。澄明黄色の上清を０.４５ミクロンフィルターにより濾過し、凍結乾燥した。この粗製産物は無菌であり（血液寒天プレートで照査）、約２５％のタンパク質を含んでいた。ＰＪ粉末１０ｇはジュース２００ｍｌから由来した。
−  “ビントジェス（Bintjes）”からのジャガイモジュース（ＰＪ）を以下のように調製した。皮をむき、洗った後、ジャガイモを小片に粉砕し、０.２％アスコルビン酸添加下に寒冷紗で濾過した。ジュースを２７，５００ＲＣＦ、３０分間４℃で遠心し、濾紙により濾過し、再度遠心した。澄明黄色の上清を０.４５ミクロンフィルターにより濾過し、凍結乾燥した。この粗製産物は無菌であり（血液寒天プレートで照査）、約２５％のタンパク質を含んでいた。ＰＪ粉末１０ｇはジュース２００ｍｌから由来した。
【００５３】
一般に、ジャガイモに存在するプロテアーゼ・インヒビターは、例えば、ジャガイモを粉砕し、デンプンと他の固形物を除き、例えば、そのジュースを凍結乾燥することにより回収し得る。プロテアーゼ・インヒビター調製物の純度は、例えば、遠心分離、ミクロ濾過、限外濾過、ダイアフィルトレーションまたは電気透析により、ジャガイモジュースに存在する非タンパク質性物質および／または低分子量ペプチドおよび／またはアミノ酸を除くことにより、改善することができる。さらに、タンパク質はジャガイモジュース・マトリックスから比較的粗製の形状で選択的に回収することができる。この回収は、例えば、限外濾過、等電沈殿、高分子電解質による（コ）フロキュレーションまたは他のフロキュレーション助剤によるフロキュレーション、他のタンパク質による共沈殿、塩によるタンパク質沈殿（塩析）により、または溶媒の質を変えることにより、例えば、アセトン、メタノール、エタノールまたはイソプロピルアルコールを添加することにより、また、等電点沈殿および熱分画および技術上既知のその他の技法により達成することができる。ジャガイモジュースのプロテアーゼ・インヒビターが比較的熱に安定なので、緩和な熱処理が安定性の低いタンパク質を変性と凝集に導く。凝集したタンパク質は引続き単純な、例えば、遠心分離などの技法により除くことができる。一部のプロテアーゼ−阻害活性は失われるが、残りのプロテアーゼ・インヒビターの純度は上昇する。なおさらに精製することも限外濾過により、またはプロテアーゼ・インヒビターを塩析し、次いで塩および他の不所望成分を限外濾過およびダイアフィルトレーションで除去することにより、可能である。あるいは、数種のプロテアーゼ・インヒビターの単離が、粗製のジャガイモジュース・マトリックスから直接または予備精製後にアフィニティ・クロマトグラフィーに付すことにより可能である。
【００５４】
実験の殆どの場合に、インヒビターを糞便に加え（バッファー中１：２５に希釈）、５〜１５分間混合し、基質に加えた；ＰＪ粉末を未希釈糞便に加え（１：１）、混合後、バッファーで希釈した（１：２５）。各実験において、対照をアッセイした（滅菌した糞便、滅菌したインヒビター、バッファー溶液）。
【００５５】
タンパク質分解活性／精製した酵素
以下の酵素を阻害実験においてテストした：
−  ウシ膵臓トリプシン（セルバ）
−  ウシ膵臓α−キモトリプシン（メルク、シグマ）
−  ウシ膵臓エラスターゼ（シグマ）
−  パパイン（シグマ）
−  プロナーゼ（シグマ）
（カルボキシペプチダーゼとロイシンアミノペプチダーゼをテストしたが、アゾカゼインを水解しなかった）
すべての酵素はバッファー中０.２％（ｗ／ｖ）の濃度で使用した。
【００５６】
タンパク質分解活性／皮膚テスト
皮膚テストは前腕の腹側部で実施した。以下の溶液をテストした：１.高タンパク質分解活性の回腸貯臓器をもつ患者の糞便上清；２．同じ上清であるが、無菌処理；３．０．２５％ＳＴＩ（ｗ／ｖ）；および４．バッファー中０．２５％ＳＴＩ。各溶液２００μｌを皮膚上に折り畳んだ寒冷紗の上に置き、プラスティック粘着性傷パッドで蔽った。総インキュベーション時間は７時間であったが、３時間後および５時間後に、乾燥を防ぐためにバッファー１００μｌを各テストパッチに加えた。
【００５７】
ジャガイモジュースＥｕｒｏ１、Ｅｕｒｏ２、Ｅｕｒｏ３からの産物による糞便タンパク質分解活性の阻害
Ｅｕｒｏ１は粗製のＰＪ粉末であり、Ｅｕｒｏ２と３はより精製したものである。
【００５８】
材料と方法
糞便サンプル
回腸造瘻患者１人、機能良好な嚢を有する患者１人、結腸切除・嚢構築１４日後の患者１人、および４ヵ月の乳児２人からの糞便を使用した。
【００５９】
糞便は乳児のものを除き、希釈せずに使用した。乳児のものはリン酸バッファー（ｐＨ７.６）で１：１に希釈し、１０，０００ｇで１０分間遠心した。
【００６０】
ＥＵＲＯ
ＥＵＲＯはリン酸バッファー（ｐＨ７.６）中、１：５、１：１０、１：２５、１：５０および１：１００の希釈液として使用した。
【００６１】
糞便およびＥＵＲＯを１０分間１：１に混合し、次いで、混合物をリン酸バッファー（ｐＨ７.６）中、１：１２.５に希釈した。
【００６２】
両希釈液において、タンパク質分解活性はアゾカゼインを基質として測定した。
【００６３】
皮膚テスト
テスト溶液５０μｌを満たした１０ｍｍ−１０ｍｍのパッチ・テスト・チャンバー（バン・デル・ベンド）を２人の健常被験者の背中上部皮膚に置き、フィクソムル（Fixomull）ストレッチ自動粘着テープにて固定した；チャンバー間の距離は１５ｍｍであった。４個のテスト・チャンバーを１シリーズとし、頭側から下側へ向けて置き、第二のシリーズは下側から頭側へ向けて置いた。
テスト溶液は以下の組成であった：
Ａ.  エラスターゼ、トリプシンおよびα−キモトリプシン、最終濃度は各酵素１％（酵素混合物）として、回腸造瘻患者からの無菌糞便上清（ＦＳ）に溶解  Ｂ.  ＦＳ
Ｃ.  Ｅｕｒｏ２（最終濃度５％）酵素混合物と共にＦＳに溶解
Ｄ.  ＦＳ中のＥｕｒｏ２
２４時間後、テスト・チャンバーを除き、皮膚を水道水で洗った。１，２，４，６および２４時間後に紅斑および皮膚炎について各部位を調べた。
【００６４】
比較皮膚テストをより精製したジャガイモタンパク質フラクション（ＥＵＲＯ３）について１％の濃度で実施した。５番目のテスト・チャンバーを接触皮膚炎対照Ｅ（蒸留水中ジャガイモタンパク質）として置いた。健常被験者１２人をテストした。
【００６５】
アレルギー・テスト
タイプ４（接触皮膚炎）：皮膚科の患者３１人（ＡＺＲ）を標準のプロトコールに従って比較的精製された（Ｅｕｒｏ３）ジャガイモタンパク質によりテストした。
【００６６】
タイプ１（ＩｇＥ介在）：穿刺テスト：食物アレルギーをもつアレルギー科の患者１０人（ＡＺＲ）をテストした。その結果、患者の１人がジャガイモタンパク質に対し重度のアレルギーをもっていた。
【００６７】
結果
１  糞便中のタンパク質分解活性
健常被験者からの糞便のタンパク質分解活性は低かった。しかし、表１はＣＤ患者、回腸造瘻患者および嚢をもつ患者（回腸嚢炎をもつものともたないもの）が高いタンパク質分解活性をもつことを示す。
【００６８】
【表１】
0004633926.tif 000002
【００６９】
相当する結果が実験室動物の糞便サンプルに見出された。正常なイヌとラットからの糞便は非常に低いタンパク質分解活性を示した。タンパク質分解活性は回腸造瘻排出物において、また閉塞にもかかわらずイヌの無弁の嚢において高いことが判明した；しかし、自制嚢ではタンパク質分解活性に関して完全な正常化を示した（また、他の幾つかのパラメータも同様であったが、ここでは検討しない）。無菌ラットと対照的に、通常動物の結腸では、タンパク質分解活性が著しく低下するが、このことは消化性プロテアーゼの不活化（および／または分解）における結腸微生物叢の役割を示唆する。乳児では、タンパク質分解活性が年齢と共に変わる。健常な乳児と小児の糞便におけるタンパク質分解活性の評価は、乳児（ｎ＝１０、４〜１２ヵ月）では非常に高い活性を示し、小児（ｎ＝９、１〜２才）では低くなるが、なお高い活性を示し、小児（ｎ＝１２、２〜８才）では活性が低くなる。
【００７０】
さらなる実験において、小児３１人の糞便のタンパク質分解活性は年齢と共に低下することが再び判明したが、４ヵ月の小児（ｎ＝４）で１９１ｍｇ水解アゾカゼイン／時間／ｇ糞便、６ヵ月の小児（ｎ＝２）で１０９ｍｇ、８ヵ月の小児（ｎ＝１）で１１８ｍｇ、１１ヵ月の小児（ｎ＝３）で１０５ｍｇ、１６ヵ月の小児（ｎ＝３）で７３ｍｇ、２４ヵ月の小児（ｎ＝６）で３４ｍｇ、３才の小児（ｎ＝５）で２４ｍｇ、５才の小児（ｎ＝３）で３ｍｇ、７才の小児（ｎ＝４）で１４ｍｇであった。
【００７１】
２  タンパク質分解活性の阻害
ｐＨ
図３はタンパク質分解活性のｐＨ依存性が各テストサンプルで似ていることを示す。ｐＨ６.８および７.６で、それぞれｐＨ５.２のときよりも３倍および４倍活性が高かった（両者の比較でｐ＜０.００１）。このことはｐＨ５.２でタンパク質分解活性が７５％阻害されることを意味する。
【００７２】
ＳＴＩ
次の表（表２）はプロテアーゼ・インヒビターによる我々の最初の実験結果を示す。アッセイの条件は異なっていたが、トラジロール、オボムコイドおよびＦＣＳがタンパク質分解活性に影響をもち、その影響はＳＴＩよりも見込みが少ない（か、または競合していた）。１％（ｗ／ｖ）の濃度で、阻害は８０％以上であった。
【００７３】
【表２】
0004633926.tif 000003
【００７４】
数種のノーリットにつき、高タンパク質分解活性の嚢をもつ患者からの糞便により最適吸着性を求めてテストし、術後のＩＡＡ患者を洗浄するための液体におけるプロテアーゼ・インヒビターとして使用するためのものとした。この実験において、プレミアム粉末についてもテストした。表３はプロテアーゼに対しノーリットＰＲＳＨおよびノーリットＥの吸着能力が非常に強いことを示す。
【００７５】
【表３】
0004633926.tif 000004
【００７６】
ノーリットによるタンパク質分解活性の阻害は脱脂乳プレートを用いることによって確認した；寒天中のカゼインがプロテアーゼにより加水分解され、ＴＣＡ処理後に澄明化が見られる。
【００７７】
ノーリットＰＲＳＨにつき、ｐＨ５.２および７.６での異なる濃度でテストした。
【００７８】
【表４】
0004633926.tif 000005
【００７９】
ジャガイモジュース（ＰＪ）
ＰＪを当初調製し、液状物としてテストした；後に凍結乾燥品を調製した。糞便懸濁液中のＰＪ粉末の当初最終濃度は１７％であった。表５はＰＪおよびＰＪ粉末による糞便タンパク質分解活性の阻害を示す。
【００８０】
【表５】
0004633926.tif 000006
【００８１】
バッファー４ｍｌ中１ｇの溶液としてＰＪ（糞便中最終濃度５％）を加熱すると、以下のようにインヒビター能力が低下した：
非加熱ＰＪ：        タンパク質分解活性の阻害６５％
５５℃３０分間：    ６４％
８０℃３０分間：    ４７％
９０℃３０分間：    ２４％
１００℃３０分間：  １４％
精製酵素の活性に対するプロテアーゼ・インヒビターの効果を表６に示す。ＰＪ粉末は数種の膵臓酵素、パパインおよびプロナーゼに対する非常に強力なインヒビターである。
【００８２】
【表６】
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【００８３】
ＰＪ−インヒビターと基質との可能な相互作用は、同じ実験において異なる濃度のアゾカゼインを用いることによりテストした。相互作用は見出せなかった：
【００８４】
【表７】
0004633926.tif 000008
【００８５】
皮膚テスト
パッドと寒冷紗を取除いた後、皮膚を水道水で注意深く洗い、直後に、また１〜１８時間後に判定した。滅菌糞便（２）およびバッファー中のＳＴＩ（４）では反応が見られなかったが、部位１（糞便上清）には中程度の赤味、丘疹および幾つかの嚢が観察し得た。部位３（ＳＴＩを含む糞便上清）は僅かに赤味を示したが、６０分以内に消失した。
【００８６】
ジャガイモジュースまたはそれから由来するインヒビターの効果も生体外と皮膚テストにおいて試験した。その結果を図１〜６に示す。全タンパク質分解活性の９０〜１００％を不活化することが可能であり、ジャガイモジュースまたはそれから由来するインヒビターなど、ジャガイモ抽出物が糞便プロテアーゼを不活化し得るので、これが炎症を予防する。
【００８７】
皮膚テストにおいて、ＰＪおよびその種々の精製フラクションは炎症の治療と予防に使用したとき、非常に効果的であることが示された。回腸造瘻患者からの滅菌糞便上清が皮膚の炎症を起こし、また、タンパク質分解酵素を加えると重度の皮膚炎（赤化、浮腫、小胞、疼痛）を起こす一方で、両事例にジャガイモのジュース・インヒビターを加えると、炎症は見られなかった。例えば、クリームまたはゲルなどの軟膏は、ＰＪインヒビターと混合すると、局所的皮膚炎を阻害または予防し得る。
【００８８】
さらに、アレルギー性または他の不利益となる反応は、ジャガイモのジュース産物両方について観察されなかった。
【００８９】
マクロファージ・プロテアーゼの阻害
マウス・マクロファージによるタンパク質分解性酵素の産生はＴＮＦαによて促進された。精製したジャガイモタンパク質（ＥＵＲＯ３）の添加はエラスターゼ様プロテアーゼの活性を７０％阻害した。
【００９０】
ｍＵでのエラスターゼ活性
マクロファージ（６×１０8細胞）                    ２６.５
マクロファージ（６×１０8細胞）＋ＥＵＲＯ３（１％）  ８.０
これらの結果は（精製した）ヒト白血球エラスターゼがジャガイモ・プロテアーゼ・インヒビターにより低下することを示している。
【００９１】
検討
さらに、これらの実験は腸の炎症および／または結腸または回腸切除の患者、並びに年齢２才までの乳児および幼児が、高い糞便タンパク質分解活性をもつことを示している。これらの酵素は膵臓、刷子縁、微生物および／または細胞（顆粒球、マクロファージ）起源のものである。これらの酵素は防御的な腸粘液層並びに会陰部皮膚を損傷する。
【００９２】
粗製および精製した両方のジャガイモタンパク質（プロテアーゼ・インヒビター）が糞便プロテアーゼ（アゾカゼインを水解する）の活性およびマクロファージ・エラスターゼ（Ｎ−スクシニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−ロイシン−ｐ−ニトロアニリドを水解する）の活性を阻害する。精製した膵臓酵素、トリプシン、キモトリプシンおよびエラスターゼもまたＰＪ（粗製または精製）により阻害される。
【００９３】
皮膚テストにおいて、皮膚炎は滅菌した糞便上清に溶解した精製膵臓プロテアーゼを用いて２４時間以内に生成させた。このテストは微生物学的に安全であるが、胆汁酸などの糞便化合物のさらなる影響については未着手である。皮膚炎はテスト溶液に粗製のまたは精製したジャガイモ・プロテアーゼ・インヒビターを加えることにより、完全に予防された。
【００９４】
糞便上清を再度使用することは恐らく賢明ではない（安全性の理由で）が、３種の精製した酵素混合物は適切な濃度で同じ効果をもつ。アゾカゼインは数種の加水分解酵素により水解される基質であるが、酵素特異基質をテストしてもよい。ＳＴＩは大豆からのインヒビターの一つであり、トリプシンとキモトリプシンを阻害するが、エラスターゼは阻害しない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ジャガイモジュースの産物による糞便タンパク質分解活性の阻害。
機能良好な嚢を有する１患者の糞便を使用した。糞便は希釈せずに使用した。ＥＵＲＯはリン酸バッファー（ｐＨ７.６）に１：５、１：１０、１：２５、１：５０および１：１００に希釈して使用した。糞便とＥＵＲＯを１：１で１０分間混合し、次いでその混合物をリン酸バッファー（ｐＨ７.６）で１：１２.５に希釈した。両希釈液において、タンパク質分解活性つきアゾカゼインを基質として測定した。
【図２】  ジャガイモジュースの産物による糞便タンパク質分解活性の阻害。
回腸造瘻の１患者の糞便を使用した。糞便は希釈せずに使用した。ＥＵＲＯはリン酸バッファー（ｐＨ７.６）に１：５、１：１０、１：２５、１：５０および１：１００に希釈して使用した。糞便とＥＵＲＯを１：１で１０分間混合し、次いでその混合物をリン酸バッファー（ｐＨ７.６）で１：１２.５に希釈した。両希釈液において、活性はアゾカゼインを基質として測定した。
【図３】  ジャガイモジュースの産物による糞便タンパク質分解活性の阻害。
結腸切除１４日後の１患者の糞便を使用した。糞便は希釈せずに使用した。
ＥＵＲＯはリン酸バッファー（ｐＨ７.６）に１：５、１：１０、１：２５、１：５０および１：１００に希釈して使用した。糞便とＥＵＲＯを１：１で１０分間混合し、次いでその混合物をリン酸バッファー（ｐＨ７.６）で１：１２.５に希釈した。両希釈液において、タンパク質分解活性つきアゾカゼインを基質として測定した。
【図４】  ジャガイモジュースの産物による糞便タンパク質分解活性の阻害。
４ヵ月の乳児２人の糞便を使用した。糞便はリン酸バッファー（ｐＨ７.６）に１：１に希釈し、１０，０００ｇで１０分間遠心して使用した。ＥＵＲＯはリン酸バッファー（ｐＨ７.６）に１：５、１：１０、１：２５、１：５０および１：１００に希釈して使用した。糞便とＥＵＲＯを１：１で１０分間混合し、次いでその混合物をリン酸バッファー（ｐＨ７.６）で１：１２.５に希釈した。
両希釈液において、タンパク質分解活性つきアゾカゼインを基質として測定した。
【図５】  ジャガイモジュースの産物による糞便タンパク質分解活性の阻害。
４ヵ月の乳児２人の糞便を使用した。糞便はリン酸バッファー（ｐＨ７.６）に１：１に希釈し、１０，０００ｇで１０分間遠心して使用した。ＥＵＲＯはリン酸バッファー（ｐＨ７.６）に１：５、１：１０、１：２５、１：５０および１：１００に希釈して使用した。糞便とＥＵＲＯを１：１で１０分間混合し、次いでその混合物をリン酸バッファー（ｐＨ７.６）で１：１２.５に希釈した。
両希釈液において、タンパク質分解活性つきアゾカゼインを基質として測定した。
【図６】  テスト溶液５０μｌを満たした１０ｍｍ−１０ｍｍのパッチ・テスト・チャンバー（バン・デル・ベンド）を２人の健常被験者の背中上部皮膚に置き、フィクソムル（Fixomull）ストレッチ自動粘着テープにて固定した；チャンバー間の距離は１５ｍｍであった。４個のテスト・チャンバーを１シリーズとし、頭側から下側へ向けて置き、第二のシリーズは下側から頭側へ向けて置いた。
テスト溶液は以下の組成であった：
Ａ.  エラスターゼ、トリプシンおよびα−キモトリプシン、最終濃度は各酵素１％（酵素混合物）として、回腸造瘻患者からの無菌糞便上清（ＦＳ）に溶解  Ｂ.  ＦＳ
Ｃ.  Ｅｕｒｏ２（最終濃度５％）酵素混合物と共にＦＳに溶解
Ｄ.  ＦＳ中のＥｕｒｏ２
２４時間後、テスト・チャンバーを除き、皮膚を水道水で洗った。１，２，４，６および２４時間後に紅斑および皮膚炎について各部位を調べた。
【図７】  図６記載のパッチ・テストと同じであるあるが、粗製のインヒビター・フラクションをより精製したフラクション（ＥＵＲＯ３）に置換えた。
Ｅ.  蒸留水中のＥＵＲＯ３。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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