(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスまたはウイルスコアの表面が多価ポリマーでコートされており、該多価ポリマーは複数の反応性基を含み、かつ少なくとも２つの共有結合によってウイルスまたはウイルスコアの表面に共有結合されてポリマーコーティングを形成し、該ポリマーコーティングは、ウイルスまたはウイルスコアがそれが本来正常に結合する部位またはレセプターに結合する能力を妨げることによりウイルスまたはウイルスコアの正常な感染性をマスクする、ポリマーコートされたウイルスまたはウイルスコア。
【請求項２】
ウイルスまたはウイルスコアが治療用遺伝子材料を含む、請求項１記載のポリマーコートされたウイルスまたはウイルスコア。
【請求項３】
ウイルスが、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスを含むパルボウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルスまたはポックスウイルスからなる群から選択される、請求項１または請求項２記載のポリマーコートされたウイルス。
【請求項４】
ウイルスがアデノウイルスである、請求項１または請求項２記載のポリマーコートされたウイルス。
【請求項５】
多価ポリマーが３つ以上の共有結合によってウイルスまたはウイルスコアの表面に共有結合される、請求項１〜４のいずれか１項記載のポリマーコートされたウイルスまたはウイルスコア。
【請求項６】
ポリマーが１以上の反応性基で置換されたバックボーンを有する生物学的不活性な多価ポリマーである、請求項１〜５のいずれか１項記載のポリマーコートされたウイルスまたはウイルスコア。
【請求項７】
反応性基のそれぞれが直接にまたはスペーサー基を介してポリマーバックボーンに結合される、請求項６記載のポリマーコートされたウイルスまたはウイルスコア。
【請求項８】
ポリマーバックボーンが、Ｎ−２−ヒドロキシプロピルメタアクリルアミド（ＨＰＭＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−１−グルタミン（ＨＥＧ）およびエチレングリコール−オリゴペプチド：からなる群から選択されるモノマー単位を含む、請求項６または７記載のポリマーコートされたウイルスまたはウイルスコア。
【請求項９】
ポリマー内での共有結合および／またはポリマーとウイルスもしくはウイルスコアとの間に形成される共有結合が、加水分解的にまたは酵素的に分解可能である、請求項１〜８のいずれか１項記載のポリマーコートされたウイルスまたはウイルスコア。
【請求項１０】
多価ポリマーが架橋され、かつ水性媒体中でハイドロゲルを形成する、請求項１〜９のいずれか１項記載のポリマーコートされたウイルスまたはウイルスコア。
【請求項１１】
生物学的活性物質がポリマーに結合されるか、またはポリマー内に含まれる、請求項１〜１０のいずれか１項記載のポリマーコートされたウイルスまたはウイルスコア。
【請求項１２】
生物学的活性物質が、成長因子もしくはサイトカイン；糖；ホルモン；脂質；リン脂質；脂肪；アポリポプロテイン；細胞接着プロモーター；酵素；毒素；ペプチド；グリコプロテイン；血清タンパク質；ビタミン；ミネラル；および／または抗体認識レセプター：からなる群から選択される１以上である、請求項１１記載のポリマーコートされたウイルスまたはウイルスコア。
【請求項１３】
生物学的活性物質が抗体または抗体フラグメントである、請求項１１記載のポリマーコートされたウイルスまたはウイルスコア。
【請求項１４】
ポリマーがオレイルまたは他の疎水性基を含み、非水性環境内でのウイルスまたはウイルスコアの溶解性並びに分散および安定特性を改変する、請求項１〜１３のいずれか１項記載のポリマーコートされたウイルスまたはウイルスコア。
【請求項１５】
ウイルスがバキュロウイルス粒子である、請求項１４記載のポリマーコートされたウイルスまたはウイルスコア。
【請求項１６】
複数の反応性基を有する多価ポリマーが少なくとも２つの共有結合によってウイルスまたはウイルスコアと共有結合されるように、該ポリマーをウイルスまたはウイルスコアと反応させる工程を含む、請求項１〜１５のいずれか１項記載のポリマーコートされたウイルスの製造方法。
【請求項１７】
ウイルスまたはウイルスコアが治療用遺伝子材料を含む、遺伝子治療において使用するための請求項１〜１５のいずれか１項記載のポリマーコートされたウイルスまたはウイルスコア。
【請求項１８】
ウイルスまたはウイルスコアが治療用遺伝子材料を含む、請求項１〜１５のいずれか１項記載のポリマーコートされたウイルスまたはウイルスコアを含む、遺伝子治療用薬剤。
【請求項１９】
キャリアと一緒になった請求項１〜１５のいずれか１項記載のポリマーコートされたウイルスまたはウイルスコアを含む遺伝子治療用組成物。
【請求項２０】
キャリアが薬学上受容可能な添加剤、希釈剤または賦形剤である、請求項１９記載の遺伝子治療用組成物。
【請求項２１】
オイル汚染物質の処理のための、または農業における病原体への生物学的農薬の送達のための、請求項１〜１５のいずれか１項記載のポリマーコートされたウイルスまたはウイルスコアの使用。
【請求項２２】
ウイルスまたはウイルスコアがそれが本来正常に結合する部位またはレセプターに結合する能力を妨げることによって、ウイルスまたはウイルスコアの正常な感染性をマスクするためにウイルスまたはウイルスコアをコーティングする方法であって、複数の反応性基を有する多価ポリマーをウイルスまたはウイルスコアと反応させて、少なくとも２つの共有結合によってポリマーをウイルスまたはウイルスコアの表面に共有結合させ、それによりポリマーコーティングをそれに形成することを含む方法。
【請求項２３】
ウイルスが治療用遺伝子材料を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ウイルスが、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスを含むパルボウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルスまたはポックスウイルスからなる群から選択される、請求項２２または請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ウイルスがアデノウイルスである、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２６】
ポリマーがターゲットに対する特定のターゲッティング基または部分を含み、ポリマーコートされたウイルスが生物学的ホストにおける特定のレセプターに結合する、請求項２２〜２５のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、微生物（以後、集合的な用語「生物学的エレメント」といい、そこでは、ウイルスは重要なカテゴリーの１つを構成する）の生物学的および／または物理化学的特性を改変する方法に関する。本発明は、本発明に従って、それらの生物学的および／または物理化学的特性についての改変または変更をもたらす様に改変されている、そのような生物学的エレメント、それらの調製のためのプロセス、並びに、農業、石油化学産業、環境科学および医薬を含む種々の分野における種々のバイオテクノロジーストラテジーにおけるそれらの使用にも関する。
【０００２】
背景
ウイルスを含む微生物については、バイオテクノロジーの広範囲の分野にわたる多くの用途が認められている。それらは、医薬、農業、産業上の製造プロセス（特に、石油および醸造産業を含む）、並びにバイオレメディエーション（ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ）に包含される。多くの有用な用途および機能が、そのような生物学的物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）について、特定され、開発されている。しかし、しばしば、それらの活性の開発または増強は、それらの精密な特性によって限定され、理論的に可能であるが実際にはそれらの範囲を超える課題を満足するように、それらの能力を制限する。全く一般的に遭遇されるものであるこの状況においては、その必要とされる目的に対して、より適切な特性を与えるように、ウイルスまたは微生物の特性を再設計することがしばしば望まれる。
よって、例えば、バキュロウイルスをはじめとする生物学的殺虫剤は、不適切な標的特異性および環境中での有害物生存特性を通じて、その有用性が限定される場合があり；硫黄代謝バクテリアは、不適切なパターンの分散および分布を通じて、石油化学産業におけるその有用な用途に限定される場合があり；さらにヒトまたは家畜の遺伝子治療の状況において、治療遺伝子の送達を媒介することが意図されたウイルスは、標的組織における導入遺伝子発現の非効率性を通じたその有用性で限定される。
【０００３】
体細胞の遺伝子治療の分野は、遺伝病（例えば、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、酵素欠損）および加齢または損傷に関連した生理学的悪化（癌、心疾患、成人型糖尿病）から生じる疾病を含む、多くの異なる種類の病気の治療を向上させることを約束するので、近年、主たる興味を引きつけている。しかし、該分野については、１００を超える臨床試験の開始を含めて、急速かつ広範な開発が認められているが、明らかに患者のためになる治療の実例は非常に少ない。１つのアンチセンス技術が、近年、ヒトへの使用について許可されたが、遺伝子治療ストラテジーは未だ本来の見込みを満足しておらず、さらに遠くない未来における日常的な臨床適用についても、何ら承認されそうにない。
治療の効能がないことについての理由は、部分的には、患者の個体群（これらの試験的な治療のために登録されるほとんどの患者は、効果的な治療がわずかな治療の利益を示すことができるとしても、既に完全に病気である）を反映するが、主として、達成される治療遺伝子の発現の、不適切なレベル、持続期間、および分布を反映する。簡単にいうと、洗練された治療ストラテジーの適用の成功は、遺伝子送達および発現のための不適切なベクターによって制限される。
【０００４】
遺伝子治療用途における使用のための、２つの主たるタイプのベクターが今までに探索されており、それらは非ウイルス性（通常、カチオン性リポソームをベースとする）またはウイルス性（通常、レトロウイルス、アデノウイルス、近年ではアデノ随伴ウイルス（ａａｖ）およびレンチウイルス）である。
遺伝子送達は、本質的にはウイルスに必須の唯一の機能であるので、ウイルスは遺伝子送達のためのベクターとして明白な選択肢である。よって、ウイルスについては、現在までの遺伝子治療において、かなりの使用が認められ、臨床試験において使用される大部分のベクターを形成する。その適用の成功を制限する、アデノウイルスの主たる特徴は、その免疫原性である。それらは本物の病原体であって、１００万年にわたって高度に効率的な遺伝子送達ベクターとして進化したものであるが、そのホストも同様に非常に効率的な保護メカニズムを開発してきた。癌患者からの血清および腹水液は、高い希釈率においてさえ、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でウイルス感染を完全に防ぐことができる抗体を含む。アデノウイルスを含む典型的なヒトのプロトコルは、ターゲット細胞の感染の効率が上がらないだけでなく、顕著な炎症応答を導く。
【０００５】
非ウイルス性のシステムは、より良い安全性が記録されており、また大量に生産することがより容易であるが、特異的なトランスフェクション活性およびターゲット組織における遺伝子発現の効率が低いことが主要な問題となっている。
現在入手可能なベクターの、疾病の治療に対する適用の成功に対する、他の主たる制限は、直接的な適用または動脈内投与のいずれかによって、疾病の部位へ直接的にそれらを投与することの必要性である。静脈内注射後に、特定の細胞をターゲットとすることができるベクターはない。カチオン性リピッドシステムは、それらが遭遇する第１の毛細血管ベッド（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｂｅｄ）、肺循環（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ）ベッドを閉塞させ、同時にアデノウイルス／レトロウイルスが急速に肝臓に取り込まれ、（動物実験において）局所的な毒性を媒介する。局所投与が特定の疾病（例えば、気管支上皮嚢胞性繊維症（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ））の治療に適することができるが、他の疾病（特に、臨床上の癌およびアテローム性動脈硬化症）はより広範囲の分布を有しており、静脈内のターゲット化された遺伝子送達は、遺伝子治療を成功させる実現性を包含するのに重要である。
【０００６】
国際公開ＷＯ９８／４４１４３号に開示される、ウイルスの臨床的な使用を容易にするための１つのアプローチは、ウイルスの表面を、ポリ（エチレン−グリコール）（ＰＥＧ）をはじめとするモノ−官能性ポリマー改変することである。これは、血清抗体による感染の中和を、顕著に低減させることを導くことができる。このアプローチは、ターゲット細胞に関しては（アデノウイルスに対するＣＡＲレセプターを介して）、正常のレセプター結合および感染能を維持するが、有用で治療に関連するトロピズムを得るために選択されたレセプターへの、ウイルスのターゲッティングを容易にしないという点で、問題を提供する。
国際公開ＷＯ９８／１９７１０号は、生物学的システムにおける核酸物質の送達のためのキャリアビヒクルとして機能する、核酸物質のカチオン性複合体をコートする多価ポリマーの使用を開示する。しかし、該ポリマーがウイルスまたは他の微生物をコートするのに有用であるという開示も示唆もない。
【０００７】
本発明の目的の１つは、ウイルスまたは微生物をターゲットにすることができ、完全に柔軟なトロピズム、および生物学的または物理学的特性の改変を可能にすることである。
本発明の他の目的および特徴は、後述される、より詳細になされた記載および実施例から明らかとなるであろう。
【０００８】
発明の概要
本発明の１態様は、生物学的エレメントの、生物学的および／または物理化学的特性を改変する方法であって、該方法は、該生物学的エレメントを複数の反応性基を有する多価ポリマーと反応させ、その結果、該生物学的エレメントが該ポリマーに結合され、それにより、該生物学的および／または物理化学的特性を変更または改変するように改変されることを含む該方法を提供する。
生物学的エレメントは、ホストにおける特定の部位またはレセプターを正常にターゲットとし、相互作用するようなウイルスをはじめとする感染性物質であり、本発明は、そのような生物学的エレメントの感染性を改変し、および／または、それをホストにおける新たなまたは異なる部位またはレセプターを再度ターゲットにする方法を提供することができる。そのような再ターゲット化は、生物学的エレメントが治療用遺伝子材料または抗ガン剤を含む、ウイルスベクターをはじめとするベクターである場合に有用な、選択的に再設計された感染性を達成するための可能性を提供することができる。再ターゲット化は、多価ポリマー中に特定のターゲッティング基または部分を導入することにより、そして、改変後、ホストのオリジナルのターゲット部位またはレセプターとのターゲッティングおよび相互作用を阻害するように、生物学的エレメントがポリマーで充分にコートされるのを確実にすることにより行われることができる。
【０００９】
本発明は、非水性媒体における生物学的エレメントの溶解性または分配係数特性を改変する方法も提供することができ、このことは、例えば、油性の媒体における生物学的エレメントの適用と関連して有用であることができるか、または特定のオイル分解（ｏｉｌ  ｄｅｇｒａｄｉｎｇ）微生物のオイル分解活性の効率を向上させるために有用であることができる。これは、いくつかの態様で、適切な疎水性基をポリマー中に導入することによって達成されることができ、さらに、これは、オイル中の遺伝子治療ウイルスベクターの動脈内投与を容易にするのに有用であることもできる。
【００１０】
生物学的エレメントが、アウターエンベロープを有するウイルスであるような場合においては、ウイルスをポリマーと反応させる前の予備的工程は、該エンベロープを取り除くことを含むことができる。
他の態様では、本発明は、生物学的エレメントが複数の反応性基を有するポリマーに結合されることにより改変され、それにより、該生物学的エレメントの生物学的および／または物理化学的特性が改変されることを包含するものとして、認められることもできる。
【００１１】
用語「生物学的エレメント」とは、バクテリア、バクテリオファージ、菌類、胞子（バクテリアまたは菌類から）、ウイルスおよび遺伝情報を含むウイルスコアを意味するものとして、本明細書において使用される。疑義を回避するために、「ウイルスコア」の用語は、ウイルスの外表面エンベロープを除去するように処理されたウイルスを含むものと了解される。
多くの態様においては、ポリマーの生物学的エレメントとの結合は、結果として、ホストの生物学的システムにおける生物学的エレメントの、それが正常に相互作用する他の分子と相互作用する能力の阻害を生じさせるか、または生物学的エレメントが、改変されない状態で正常に結合する、部位または細胞レセプターへ結合する能力の阻害を生じさせる。特定の部位またはレセプターをターゲットとするように改造された、ウイルスをはじめとする生物学的エレメントの場合には、ホストに感染する場合に、既に示されるように、それは、本発明によって、異なるレセプターをターゲットにするか、または異なるターゲットと相互作用するように、そのような生物学的エレメントを再ターゲット化することが可能である。
【００１２】
通常、ポリマーは生物学的エレメントと２以上の結合によって結合されるであろう。生物学的エレメント上のレセプター結合部位を隠すために、少なくとも２つの結合が必要とされることが、概して認められる。
本発明によると、本発明に従ったポリマー改変された生物学的エレメントの調製のための方法がさらに提供され、その方法は生物学的エレメントをポリマーと結合することを含む。本発明は、この方法によって得られるポリマー改変された生物学的エレメントも提供する。
本発明は、遺伝子治療またはＤＮＡワクチン接種処理を行う場合における、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での、治療用遺伝子材料の患者への送達のための、ポリマー改変された生物学的エレメントをさらに提供し、例えば、該ポリマー改変された生物学的エレメントとしては、治療用遺伝子材料を含む本発明に従ったポリマー改変された生物学的エレメントが挙げられる。用語「治療用遺伝子材料」は、本明細書においては、例えば、治療上有用なタンパク質またはＲＮＡの発現により、治療効果を獲得させるために投与される、広範囲の任意の遺伝子材料または核酸を意味するものとして了解されるであろう。
【００１３】
本発明は、農業用用途のための、ウイルス性農薬をはじめとする生物学的農薬の病原体への送達のための、ポリマー改変された生物学的エレメントをさらに提供し、該ポリマー改変された生物学的エレメントは、本発明に従ったポリマー改変された生物学的エレメントであり、該ポリマーは、環境中で、該生物学的エレメントの改変された溶解性、並びに向上された分散および安定性をもたらすように、および／または特定のホストへのターゲット化された相互作用を通じた作用のより大きな選択性を達成するように選択される。
本発明に従って、遺伝子治療の方法も提供され、該方法は、そのような治療を必要としている患者に、治療用遺伝子材料を含む生物学的エレメントを含む、本発明に従ったポリマー改変された生物学的エレメントを投与することを含む。
本発明は、遺伝子治療において使用するための薬剤の製造における、本発明に従ったポリマー改変された生物学的エレメントの使用も提供し、ここで、該ポリマー改変された生物学的エレメントは、治療用遺伝子材料を含む生物学的エレメントを含む。
【００１４】
本発明は、さらに、キャリアと一緒になった、本発明に従ってポリマー改変された生物学的エレメントを含む組成物を提供する。
本発明の態様は、概して、ポリマー改変された生物学的エレメントであって、該ポリマーは２以上の結合によって生物学的エレメントと結合されており、使用される該ポリマーは多価ポリマーであり、すなわち、それは複数の反応性基を含む、前記ポリマー改変された生物学的エレメントを提供する。
本明細書において使用される、用語「反応性基」とは、有意な化学的反応性を示す基、特に、他の分子の補足的な反応性基とのカップリングまたは結合反応に関連する基を意味するものとして理解されるであろう。
【００１５】
本発明において使用されるポリマーは、好ましくは、複数の前記反応性基を含む合成親水性多価ポリマーである。そして、該ポリマーは生物学的に不活性なポリマーである。ポリマーバックボーンは、概して前記反応性基で置換される。これらの反応性基はポリマーバックボーンに、直接に、またはオリゴペプチド結合をはじめとするスペーサー基を介して連結されることができる。そのようなオリゴペプチド結合は、好ましくは、１〜４つの、特に２または４つのペプチド基を含む。好適な結合の例としては、−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−；および−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−が挙げられる。
ポリマーバックボーンは好ましくは、Ｎ−２−ヒドロキシプロピルメタアクリルアミド（ＨＰＭＡ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−１−グルタミン（ＨＥＧ）、またはエチレングリコール−オリゴペプチドをはじめとするモノマー単位をベースとする。バックボーンがエチレングリコール−オリゴペプチドをベースとする場合には、該オリゴペプチド基は好ましくは１〜４つのペプチド基を含む。該オリゴペプチド基は、反応性基によって、任意に上述のスペーサー基を介して、置換されたオリゴペプチド基である。
【００１６】
ポリマーのために好適な反応性基は、生物学的エレメントの表面上に既に存在する、例えば、アミノ基をはじめとする基と反応するであろう基である。例えば、ｐ−ニトロフェノール（ＯＮｐ）エステルまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルが使用されることができる。
本発明における使用のために好適なポリマーの例としては、国際公開ＷＯ９８／１９７１０号に開示されており、さらに、ポリＨＰＭＡ−ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ−ＯＮｐ、ポリＨＰＭＡ−ＧｌｙＰｈｅＬｅｕＧｌｙ−ＮＨＳ、ポリＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐ、ポリＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨＳ、ポリ（ｐＥＧ−オリゴペプチド（−ＯＮｐ））、ポリ（ｐＥＧ−ＧｌｕＬｙｓＧｌｕ（ＯＮｐ））、ｐＨＥＧ−ＯＮｐ、ｐＨＥＧ−ＮＨＳを含む。これらの化合物の調製は、国際公開ＷＯ９８／１９７１０号に開示されている。国際公開ＷＯ９８／１９７１０号に記載された内容は本明細書の一部として参照される。
【００１７】
いくつかの例においては、ポリマーおよび／または、該ポリマーと生物学的エレメントとの間の結合は、任意に、加水分解的にまたは酵素的に分解可能である。加水分解可能性により提供される不安定性は、該不安定性が、生物学的エレメントが保護される時間の調節を可能にするので、望まれる場合がある。よって、ポリマーが組織特異的ターゲッティング基を有して提供される場合には、該ポリマー（または、ポリマーと生物学的エレメントとの間の結合）は、分解し、生物学的エレメントが自由に組織と相互作用するようになる前に、改変された生物学的エレメントがターゲット組織内での好適な位置に到達するのにかかる時間だけの間、該ポリマーが生物学的エレメントを保護するようにデザインされることができる。別法では、ポリマーは、生物学的エレメント放出の最適の速度論を生じさせる速度で分解するようにデザインされることができる。酵素分解可能性によって提供される不安定性は、選択される酵素による切断選択性についてポリマー（または、該ポリマーと生物学的エレメントとの間の結合）がデザインされることを可能にするので、望まれる場合がある。そのような酵素は、ターゲット部位に存在し、改変された生物学的エレメントにターゲット部位で分解が引き起こされる可能性を与えることができ、それにより、ターゲット部位との相互作用のために、生物学的エレメントを放出することができる。酵素は細胞内酵素であることもでき、該酵素は、ターゲット細胞の、選択された細胞コンパートメント内で、改変された生物学的エレメントの分解をもたらし、生物学的エレメントの活性を増強させることができる。別法では、酵素−切断部位は、適切な生物学的活性（例えば、浸潤しているかまたは転移性の、メタロプロテイナーゼを発現している、腫瘍細胞への到着）に応答して、改変された生物学的エレメントの分解を促進するようにデザインされることができる。さらなるバリエーションにおいては、改変された生物学的エレメントを活性化することができる酵素は、好適な時間または部位に投与されることができ、改変された生物学的エレメントに要求される分解、およびそれに引き続いての生物学的エレメントの組織との相互作用を媒介することができる。
【００１８】
少なくともいくつかの態様において、生物学的エレメントを改変するのに使用されるポリマーは、好ましくは、架橋され、その結果ハイドロゲルを形成する。ハイドロゲルは、好ましくは、加水分解的に不安定であるか、または例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ２または９をはじめとする酵素によって分解可能である。これは、生物学的エレメントがハイドロゲル内に固定されるためであり、その結果、生物学的エレメントの放出が制御されることができる。よって、本発明の好ましい特徴の１つに従って、架橋およびハイドロゲル形成を促進するような条件下で（例えば、過剰には存在しないが、高濃度の試薬）、または架橋を促進するようなジアミン類をはじめとする薬剤の存在下で、本発明のプロセスが行われる。改変された生物学的エレメントを含むハイドロゲルの形成は、概して、Ｓｕｂｒ，Ｖ．，Ｄｕｎｃａｎ，Ｒ．ａｎｄ  Ｋｏｐｅｃｅｋ，Ｊ．（１９９０）”Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ  ｆｒｏｍ  ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  ｇｅｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｂｏｎｄｓ”Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ．，１（４）２６１−２７８に記載される化学的アプローチを使用して行われる。
【００１９】
ポリマー上の反応性基の数は、好ましくは、０．５〜１０モル％であり、より好ましくは、１〜６モル％であり、最も好ましくは、２〜５モル％である。
ポリマーと生物学的エレメントとの間の結合の数は、好ましくは３つ以上であり、より好ましくは４つ以上である。結合の数は、例えば、１２または１４であることができる。より多い数の結合を有する利点は、ポリマー改変された生物学的エレメントがより安定であることである。
ポリマーと生物学的エレメントとの間の結合の２以上は、好ましくは、共有結合である。
【００２０】
通常、本発明に従って改変されたウイルスをはじめとする、感染性の生物学的エレメントは、その本来の感染性を完全に失っている。しかし、感染性は、好ましい態様においては、ポリマーに対して生物学的活性物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）を結合することにより、回復されるか、または交換されることができる。生物学的活性物質は、ポリマーが生物学的エレメントと結合される前に、またはその後に、任意に、ポリマーと結合される。好ましくは、ターゲット化剤が複数の反応性基を有する場合には、ターゲット化剤は、カップリング反応を妨害するのを回避するために、ポリマーが生物学的エレメントをコートした後に、ポリマーに結合されるが、他の場合には、生物学的エレメントをコートする前に、ターゲット化剤をポリマーに結合させることが、満足のいくものである場合がある。
生物学的活性物質は、反応性ポリマーを生物学的エレメントに結合するのに使用されるのと同じタイプの反応性基を用いて、導入されることができるか、または異なる化学作用を用いて結合されることができる。後者の状況においては、ヘテロ多官能性反応性ポリマー（例えば、ＯＮｐエステルおよびチオール基を混合して含む）が使用される。
【００２１】
そのような生物学的活性物質は、好ましくは、本発明に従って、ポリマーでコートされた生物学的エレメントの表面上に導入されるかまたは結合させられ、ターゲッティング、組織浸透または薬物動態学を向上させる。生物学的活性物質は、例えば、成長因子またはサイトカイン、糖、ホルモン、脂質、リン脂質、脂肪、アポリポプロテイン、細胞接着プロモーター、酵素、毒素、ペプチド、グリコプロテイン、血清タンパク質、ビタミン、ミネラル、または、例えば、成長因子レセプター、組織特異性抗原、または腫瘍関連抗原をはじめとする、抗体認識レセプターであることができる。いくつかの生物学的活性物質は、混合物を含み、ポリマー改変された生物学的エレメントのそれぞれに結合されることができる。別法では、多目的剤が生物学的活性物質として、直接に、ポリマー改変された生物学的エレメントに結合されることができ、続いて、所望の分子の付着を可能にすることができる。
抗体は、好ましくは、生物学的活性物質として使用され、コートされた生物学的エレメントを異なるターゲット部位へ再ターゲット化し、該異なるターゲット部位は、例えば、種々のレセプター、異なる細胞、細胞外環境および他のタンパク質を含むことができる。広範囲の異なる形態の抗体が使用されることができ、該抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、キメラ抗体、ヒト化（ｈｕｍａｎｉｓｅｄ）抗体、バイスペシフィック（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体、カマリド（ｃａｍａｌｉｄ）抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆｃフラグメントが含まれる。
【００２２】
腫瘍をターゲットにするのに使用するために、好適な生物学的活性物質は、例えば、癌胎児性抗原、またはα−フェトプロテイン、ＨＥＲ−２、プロトオンコジーン、前立腺特異的抗原またはＭＵＣ−１をはじめとする癌関連抗原を認識する抗体が挙げられる。
一般的なリンカーとして機能し、適用の柔軟性を可能にする、生物学的活性物質として使用するのに好適な多目的タンパク質としては、プロテインＧ（これは抗体と結合し、ほとんどの種からの、任意のＩｇＧクラス抗体で表面を改変することを可能にする）、プロテインＡ（これは、プロテインＧと同様の特性を有する）、アビジン（これはビオチンと非常に高い親和性で結合し、表面上にビオチンラベルされた任意のエレメントの導入を可能にする）、ストレプトアビジン（これは、アビジンと同様の特性を有する）、エクストラアビジン（これは、アビジンと同様の特性を有する）、小麦胚芽アグルチニン（これは、糖と結合する）、ヘキサヒスチジン（これは、ニッケルキレートカラム上でゆっくりと精製することを考慮する）、ＧＳＴ（これは、アフィニティークロマトグラフィーによって穏やかに精製することを考慮する）が挙げられる。
【００２３】
生物学的活性物質として使用するのに好適な成長因子またはサイトカインとしては、例えば、脳由来神経栄養因子、毛様体神経栄養因子、ｂ−内皮増殖因子、上皮成長因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞成長因子  酸性（ａＦＧＦ）、繊維芽細胞成長因子  塩基性（ｂＦＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、成長ホルモン放出ホルモン、肝細胞（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ）増殖因子、インスリン様成長因子−Ｉ、インスリン様成長因子−ＩＩ、インターロイキン−１ａ、インターロイキン−１ｂ、インターロイキン２、インターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン１３、ケラチノサイト成長因子、レプチン、肝細胞（Ｌｉｖｅｒ  ｃｅｌｌ）増殖因子、マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージ炎症性タンパク質１ａ、マクロファージ炎症性タンパク質１ｂ、単球走化タンパク質１、２−メトキシエストラジオール、ｂ−神経成長因子、２．５ｓ神経成長因子、７ｓ神経成長因子、ニューロトロピン−３、ニューロトロピン−４、血小板由来増殖因子ＡＡ、血小板由来増殖因子ＡＢ、血小板由来増殖因子ＢＢ、性ホルモン結合グロブリン、ステムセル因子、トランスフォーミング成長因子−β１、トランスフォーミング成長因子−β３、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、血管内皮成長因子、および血管内皮成長因子Ｃが挙げられる。
【００２４】
モノサッカライド、ジサッカライドまたはポリサッカライドの形態で、アミノ誘導体化による導入のための、生物学的活性物質として使用するのに好適な糖としては、例えば、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｌ−フコースおよびラクトースが挙げられる。
生物学的活性物質としての使用に好適なホルモンとしては、例えば、アドレノメデュリン、副腎皮質刺激ホルモン、絨毛性性腺刺激ホルモン、コルチコステロン、エストラジオール、エストリオール、卵胞刺激ホルモン、ガストリン１、グルカゴン、ゴナドトロピン、成長ホルモン、ヒドロコルチゾン、インスリン、レプチン、メラニン細胞刺激ホルモン、メラトニン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、プロゲステロン、セクレチン、トロンボポエチン、チロトロピン、甲状腺刺激ホルモン、およびバソプレッシンが挙げられる。
【００２５】
ポリマーでコートされた生物学的エレメントをターゲット化するか、またはステルス様（ｓｔｅａｌｔｈ−ｌｉｋｅ）特性を提供するための、生物学的活性物質としての使用に好適な脂質、脂肪またはリン脂質としては、例えば、コレステロール、グリセロール、糖脂質、長鎖脂肪酸、特に、例えば、オレイン酸をはじめとする不飽和脂肪酸、血小板活性化因子、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、またはホスファチジルセリンが挙げられる。
生物学的活性物質としての使用に好適な細胞接着プロモーターとしては、例えば、フィブロネクチン、ラミニン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、ポリカチオン、インテグリン、または、インテグリンもしくテトラスパン（ｔｅｔｒａｓｐａｎ）タンパク質に結合するオリゴペプチド配列を挙げることができる。
生物学的活性物質としての使用に好適なアポリポプロテインは、ステルス様特性を提供することもでき、例えば、高密度リポプロテインもしくは低密度リポプロテイン、またはこれらの構成成分を挙げることもできる。
【００２６】
生物学的活性物質としての使用に好適な酵素、例えば、特定の環境を通過する、コートされた生物学的エレメントの移動性を促進させるための酵素としては、細胞外マトリックスを分解することができる酵素（例えば、マトリックスメタロプロテアーゼタイプ１〜１１をはじめとするゼラチナーゼ、またはヒアルロニダーゼ）、核酸を分解することができる酵素（例えば、デオキシリボヌクレアーゼＩ、デオキシリボヌクレアーゼＩＩ、ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼＡ）、タンパク質を分解することができる酵素（例えば、カルボキシペプチダーゼ、プラスミン、カテプシン、エンドプロテイナーゼ、ペプシン、プロテオキナーゼＫ、トロンビン、トリプシン、組織型プラスミノーゲンアクチベーター、またはウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター）、素早い検出を可能にする酵素（例えば、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、ｂ−ガラクトシダーゼ）、または他の有用な酵素、例えば、アミラーゼ、エンドグリコシダーゼ、エンド−ｂ−ガラクトシダーゼ、ガラクトシダーゼ、ヘパリナーゼ、ＨＩＶ逆転写酵素、ｂ−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、インスリンレセプターキナーゼ、リゾチーム、ノイラミニダーゼ、一酸化窒素合成酵素、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼが挙げられる。
生物学的活性物質としての使用に好適な毒素であって、レセプターに結合するか、または細胞膜と相互作用する毒素としては、例えば、コレラトキシンＢサブユニット、クロトキシンＢサブユニット、デンドロトキシン、ヒマ毒Ｂチェーンが挙げられる。
【００２７】
生物学的活性物質としての使用に好適なペプチドとしては、例えば、トランスフェリン、グリーン／ブルー／イエロー蛍光タンパク質、アドレノメデュリン、アミロイドペプチド、アンギオテンシンＩ、アンギオテンシンＩＩ、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ、アトリオペプチン、エンドセリン、フィブリノペプチドＡ、フィブリノペプチドＢ、ガラニン、ガストリン、グルタチオン、ラミニン、ニューロペプチド、Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、インテグリン結合モチーフを含むペプチド、ファージライブラリーを使用して同定されるターゲットペプチド、核に局在する配列を含むペプチド、およびミトコンドリアルホーミング配列を含むペプチドが挙げられる。
生物学的活性物質としての使用に好適な血清タンパク質としては、例えば、アルブミン、補体タンパク質、トランスフェリン、フィブロネクチン、またはプラスミノーゲンが挙げられる。
生物学的活性物質としての使用に好適なビタミンまたはミネラルとしては、例えば、ビタミンＢ１２、ビタミンＢ６または葉酸が挙げられる。
【００２８】
よって、本発明に従った、ポリマー改変された生物学的エレメントは、光度に特定のセットの細胞、例えば腫瘍細胞をターゲットにするように合成されることができることが認められるであろう。しかし、同時に、本発明に従った、ポリマー改変された生物学的エレメントは、概して、中和抗体によって不活性にされないことも見出された。これは、改変された生物学的エレメントがポリマーによって遮蔽されるためと考えられる。ポリマーによる、生物学的エレメントの遮蔽は、向上された有効期間および低ｐＨへの、より良い耐性を含む、他の潜在的な利点を有するものと認められている。そのような生物学的エレメントを精製することは、改変されていない生物学的エレメントの存在下で精製を実行するよりも、よりアグレッシブな技術をつかって精製を行うことができる場合がある。
任意に、ポリマーは、例えば、生物学的環境下での生物学的エレメントの検出を可能にするために、放射性同位元素と結合されることができる。
【００２９】
本発明を実行するのに使用される、バクテリア性の生物学的エレメントとしては、例えば、実験的な遺伝子治療に使用されるバクテリア（例えば、サルモネラ）、生物学的農薬として使用されるバクテリアまたはバキュウロウイルス（例えば、核ポリデドロシス（ｐｏｌｙｄｅｄｒｏｓｉｓ）ウイルス  ＮＰＤ、ノノクルードド（ｎｏｎｏｃｃｌｕｄｅ）ウイルス  ＮＶ、グラニュロシス（ｇｒａｎｕｌｏｓｉｓ）ウイルス、またはバシラススリンギエンシス（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ））、オイルスラッジ／スピルを分解するのに有用なバクテリア株、または遺伝的に改変されたこれらのもの（例えば、ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、ａｎｉｔｒａｔｕｍ、ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ、ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、ｃｏｍａｍｏｎａｓ、ｚａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒまたはｖｉｄｒｉｏ−ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、オイル中の硫黄をＨ２Ｓに還元することができるバクテリア株（例えば、ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｏｂｉｌｉｓ、ｐｅｔｒｏｔｏｇａ  ｍｉｏｔｈｅｒｍａ、ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｎｉｇｒｉｆｉｃａｎｓ、ｄｅｓｕｌｐｈｏｖｉｂｒｉｏ）またはオイルからの硫黄を酸化することができるバクテリア株（例えば、ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ストレインＥＣＲＤ−１）が挙げられる。
【００３０】
原則として、本発明において、任意の公知のウイルスが生物学的エレメントとして使用されることができる。ウイルスは好ましくは、遺伝子工学による組み換えウイルスである。組み換えウイルスは、任意に、トランスジーンを含む。本明細書において使用される用語「トランスジーン」とは、ウイルス本来のものではない核酸を意味するものと理解される。例えば、トランスジーンは、生物学的に機能的なタンパク質もしくはペプチド、アンチセンス分子、またはマーカー分子をコードすることができる。ウイルスはＲＮＡまたはＤＮＡウイルスのいずれかであり、さらに、任意に、次のファミリー（ｆａｍｉｌｙ）およびグループ（ｇｒｏｕｐ）の１つからのものである：Ａｄｅｎｏｖｉｄｉｄａｅ；Ａｌｆａｍｏｖｉｒｕｓｅｓ；Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ；Ａｌｐｈａｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓｅｓ；Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｂａｄｎａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｂｅｔａｃｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓｅｓ；Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｉｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓｅｓ；Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｒｏｍｏｖｉｒｕｓｅｓ；Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｙｍｏｖｉｒｕｓｅｓ；Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ；Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｃａｐｉｌｌｏｖｉｒｕｓグループ；Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓグループ；Ｃａｒｍｏｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｕｓグループ；グループＣａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ；Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｕｓグループ；Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ  ｙｅｌｌｏｗ  ｍｏｔｔｌｅ  ｖｉｒｕｓグループ；Ｃｏｍｏｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｕｓグループ；Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ；ＰＭ２  ｐｈａｇｅグループ；Ｃｏｒｃｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ；グループＣｒｙｐｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ；グループＣｒｙｐｔｏｖｉｒｕｓ；Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｕｓΦ６  ｐｈａｇｅグループ；Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｃｙｔｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｅｓ；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ；グループＣａｒｎａｔｉｏｎ  ｒｉｎｇｓｐｏｔ；Ｄｉａｎｔｈｏｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｕｓグループ；グループＢｒｏａｄ  ｂｅａｎ  ｗｉｌｔ；Ｅｎａｍｏｖｉｒｕｓｅ；Ｆａｂａｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｕｓグループ；Ｆｉｊｉｖｉｒｕｓｅｓ；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｆｕｒｏｖｉｒｕｓグループ；グループＧｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓ；グループ  Ｇｉａｒｄｉａｖｉｒｕｓ；Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ；Ｈｏｒｄｅｉｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｕｓグループ；Ｈｙｂｒｉｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓｅｓ；Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａ；Ｉｄａｅｏｖｉｒｕｓｅｓ；Ｉｌａｒｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｕｓグループ；Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｉｐｏｍｏｖｉｒｕｓｅｓ；Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ；Ｉｒｉｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｌｅｖｉｖｒｉｄａｅ；Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ；Ｌｕｔｅｏｖｉｒｕｓグループ；Ｍａｃｈｌｏｍｏｖｉｒｕｓｅｓ；Ｍａｃｌｕｒａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｍａｒａｆｉｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｕｓグループ；Ｍａｉｚｅ  ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ  ｄｗａｒｆ  ｖｉｒｕｓグループ；ｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｍｏｎｏｇｅｍｉｎｉｖｉｒｕｓｅｓ；Ｇｅ���ｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｎａｎａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｎｅｃｒｏｖｉｒｕｓグループ；Ｎｅｐｏｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｕｓグループ；Ｎｏｄａｖｉｒｉｄａｅ；Ｎｕｃｌｅｏｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｅｓ；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｏｒｙｚａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｏｕｒｍｉａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐａｒｓｎｉｐ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｅｃｋ  ｖｉｒｕｓグループ；Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｉｄａｅ；アデノ随伴ウイルスを含むＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｅａ  ｅｎａｔｉｏｎ  モザイクウイルスグループ；Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｈｙｔｏｒｅｏｖｉｒｕｓｅｓ；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｌａｓｍａｒｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｉｄａｅ；Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓグループ；Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ；Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ；グループＲｈｉｚｉｄｉｏｖｉｒｕｓ；Ｒｙｍｏｖｉｒｕｓｅｓ；Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ；Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ＲＮＡｓ；Ｓａｔｅｌｌｉｖｉｒｕｓｅｓ；Ｓｅｑｕｉｖｉｒｕｓｅｓ；Ｓｅｑｕｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｓｏｂｅｍｏｖｉｒｕｓｅｓ；Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｓｏｂｅｍｏｖｉｒｕｓグループ；ＳＳＶＩ−タイプファージ；Ｔｅｃｔｉｒｉｖｉｄａｅ；Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ；Ｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ；グループＴｏｂａｍｏｖｉｒｕｓ；グループＴｏｂｒａｖｉｒｕｓ；Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ；グループＴｏｍｂｕｓｖｉｒｕｓ；Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓｅｓ；Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ；グループＴｏｒｏｖｉｒｕｓ；Ｔｏｔｉｖｉｒｉｄａｅ；Ｔｙｍｏｖｉｒｕｓｅｓ；グループＴｙｍｏｖｉｒｕｓ；植物ウイルスサテライト；Ｕｍｂｒａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｕｎａｓｓｉｇｎｅｄ  ｐｏｔｙｖｉｒｕｓｅｓ；Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ；Ｕｎａｓｓｉｇｎｅｄ  ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓｅｓ；Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ；Ｖａｒｉｃｏｓａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｗａｉｋａｖｉｒｕｓｅｓ；Ｓｅｑｕｉｖｉｒｉｄａｅ；グループ化されてないウイルス。
【００３１】
本発明における使用のために特に好ましいウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルスまたはポックスウイルスが挙げられる。アビアンアデノウイルスＣＥＬＯをはじめとする非−ヒトアデノウイルスを含む、アデノウイルスが特に好ましい。
【００３２】
生物学的エレメントとしての使用に好適な、生物学的エレメントの構成成分は、例えば、ウイルスのコアまたはプロウイルス（例えば、ポックスウイルスから）によって提供されることができる。ウイルスのコアの例としては、Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｗ．Ｃ．，Ｍ．，Ｋ．，Ｓｋｅｈｅｌ，Ｊ．Ｊ．（１９７２）”Ｔｈｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｃｏｒｅｓ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １１、３５−４６において開示される方法およびこれらの改変法によって調製されるアデノウイルスコアが挙げられる。
【００３３】
生物学的エレメントとしての使用に好適なファージとしては、例えば、次のファミリーの１つからの１つが挙げられる：Ｃｙａｎｏｐｈａｇｅｓ、Ｌａｍｂｄｏｉｄｐｈａｇｅｓ、Ｉｎｏｖｉｒｕｓ、Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｔｙｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｌｅｃｔｒｏｖｉｒｕｓ、Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｓａｔｅｌｌｉｔｅバクテリオファージ、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｔ−ｅｖｅｎファージ。特定のファージの例としては、ＭＶ−Ｌ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ２２、Φ２９、ＳＰ０１、Ｔ４、Ｔ７、ＭＶ−Ｌ２、ＰＭ２、Ｆ１、ＭＶ−Ｌ５１、ΦＸ１７４、Φ６、ＭＳ２、Ｍ１３、Ｑβ、ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ＰＲＤ１）が挙げられる。
【００３４】
生物学的エレメントとしての使用に好適な菌類としては、例えば、担子菌綱ファミリー（担子菌は担子胞子を作成するものであり、Ｇａｓｔｅｒｏｍｙｃｅｔｅｓ、ｈｙｍｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、ｕｒｅｄｉｎｉｏｍｙｃｅｔｅｓ、ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓをはじめとするクラスを含む）、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ、Ｍｅｔａｒｒｈｉｚｉｕｍ、ＥｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａまたはＣｏｅｌｏｍｏｍｙｃｅｓからの１つが挙げられる。生物学的エレメントとしての使用に好適な胞子としては、担子胞子、アクチノミセア（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｒｅ）、アースロバクター（ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ミクロバクテリウム（ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）またはアスパラジーラスフミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）が挙げられる。
生物学的エレメントとしての使用に好適なバクテリアのさらなる例としては、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｅｌｌａ  ｐｏｐｉｌｉａｅ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｐｉｌｉａｅ、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（その亜種、ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ、ｋｕｒｓｔａｋｉおよびＢ．ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）、Ｂ．ｌｅｎｔｉｍｏｒｂｕｓ、Ｂ．ｓｐａｅｒｉｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｍａｌａｃｏｓｏｍｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＸｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ  ｎｅｍａｔｏｐｈｉｌｕｓからなる群から選択される１つが挙げられる。
【００３５】
本発明の方法は、好ましくは７より大きいｐＨで行われる。より好ましくは、本発明の方法はｐＨ７．４〜８．２で行われ、最も好ましくは、約ｐＨ８で行われる。概して、本発明の方法は、より高いｐＨの値でより速いが、ポリマーの加水分解の速度もより速くなる。該方法においては、好適なバッファーが概して使用され、好適なバッファーとしては、リン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩またはＨＥＰＥＳバッファーが挙げられる。プロセスの温度は、好ましくは室温以下であり、より好ましくは、４〜１０℃の範囲である。プロセスでは、好ましくは、混合が行われる。ｐＨＰＭＡ反応性ポリマーを用いて、本発明に従ってウイルスコーティング反応を行う場合には、ポリマーについての好ましい濃度範囲は、２−２０ｍｇ／ｍＬであり、最も好ましい濃度は、概して、５−１０ｍｇ／ｍＬの範囲である。
本発明の組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用、または植物もしくは動物での使用に好適であることができる。該組成物が動物、特に哺乳類における使用のためのものである場合には、キャリアは好ましくは、薬学上受容可能な添加剤、希釈剤または賦形剤である。
【００３６】
図面の簡単な説明
添付される図面において、
図１は、合成ポリマーで表面改変した後の、アデノウイルス粒子上のフリーのアミノ基のフルオレスカミン測定の結果を示す。アデノウイルスの反応性ポリマーとの反応は、ウイルス表面上のフリーのアミノ基の数を減少させる。ここで、ウイルスは、様々な量のｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐと反応され、残っているアミノ基の量が、フルオレスカミンアッセイを用いて決定された（後述の、実施例８参照）。
図２は、ポリマーとアデノウイルスとの間での典型的な反応の分光光度的な測定結果を示す。反応性ポリマーのアデノウイルスとの反応は、遊離の４−ニトロフェノールの生成によって、または反応性エステルの喪失によって、分光光度的にモニターされることができる。ここでは、ｐＨ７．４、７．８、８．０および８．５での反応が、遊離の４−ニトロフェノールの生成（Ａ４１０ｎｍ）によってモニターされ、さらにウイルスを含まないコントロールの場合とそれぞれ比較される。各ペアの上側のライン（接尾辞「ｖ」を有するもの）は、ウイルスの存在下での反応速度を示し、これはウイルスとの反応速度プラス加水分解速度を示し、各ペアの下側のラインは、それぞれのｐＨの値における、単に加水分解だけの速度を記録するものである（後述の、実施例９参照）。
【００３７】
図３は、ポリマーのアデノウイルスとの反応が、ファイバー（ｆｉｂｒｅ）タンパク質の改変をもたらすことを示すウエスタンブロットを示す。さらなる詳細は、実施例１０に示される。このウエスタンブロットは、増加する量のｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで処理されたウイルスをウエスタンブロットすることにより、アデノウイルスファイバータンパク質について測定されるシグナルを比較するものである。ファイバーは、少量のポリマーが使用される場合には正常に移動するが、より多くの量のポリマーは移動の変化をもたらし、ファイバータンパク質についての検出効率の変化をもたらすことができる。このことは、ポリマーによるファイバーの共有結合的な改変を示し、恐らく、架橋していることを示している。
図４は、多価ポリマー、ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐを用いて表面を改変した後での、アデノウイルスの細胞毒性の低減を示す。（Ａ）は、健全に成長している野生型Ａ５４９細胞を示す。（Ｂ）は、顕著な細胞変性を示す、野生型Ａｄ５ウイルスに感染した細胞を示す。（Ｃ）は、モノ−ｐＥＧ化された、野生型のＡｄ５ウイルスで処理された細胞を示し、ｐＥＧ化は細胞変性効果を除去しなかった。（Ｄ）ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで改変された野生型Ａｄ５で処理された細胞を示し、ここでは、細胞が正常に増殖し、細胞変性効果の完全な抑制を示した。
【００３８】
図５は、競合的ＥＬＩＳＡ法を用いて測定される、ポリマーでコートされたアデノウイルスの、低減された抗体結合性を示す。
抗アデノウイルス抗体を含む溶液が、一定範囲のウイルス濃度で、野生型Ａｄ５ウイルスまたはポリマー改変されたＡｄ５ｖウイルスと共にプレインキュベートされた。次いで、残っている抗体が、リガンドとして野生型Ａｄ５を用いて、ＥＬＩＳＡシステムを用いて測定された。溶液が、コートされたウイルスでプレディプリートされる（ｐｒｅ−ｄｅｐｌｅｔｅｄ）場合には、溶液が野生型のウイルスでプレディプリートされる場合よりも、より多くの遊離の抗体を認めることができる。このことは、ポリマーコートの存在による抗体結合の保護を示す。
図６はｐＨＰＭＡでコートされたアデノウイルスのいくつかの物理的特性を示す。野生型Ａｄ５およびポリマーでコートされたＡｄ５は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ；倍率１０００００倍）によって可視化された。サンプルは、２％ホスホタングステン酸、ｐＨ７．０で染色された。ＴＥＭによる観察は、Ａｄ５ＷＴおよびコートされたウイルスの両方についての粒径が、直径で８０ｎｍであることを示した。Ａｄ５ＷＴはｐＨＰＭＡの存在のために、ネガティブに染色されたが、コートされたウイルスはポジティブに染色された。光子相関スペクトロスコピー（ＰＣＳ）による測定は、Ａｄ５ＷＴについての粒子サイズが、ＴＥＭによる測定の８０ｎｍと同じであることを示した。しかし、ｐＨＰＭＡでコートされたウイルスの粒子サイズはＰＣＳによって測定される場合には、Ａｄ５ＷＴのそれよりほぼ２０％大きく、９４ｎｍを示した。さらなる記載は、実施例１３に示される。
【００３９】
図７は、ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐとの反応後の、Ａ５４９細胞における、Ａｄ５−ＧＦＰの感染性の低減を示す。Ａｄ５−ＧＦＰ（改変されていない親ウイルス）は、後述する実施例１３に示されるように、反応性のｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで処理された。Ａ５４９細胞は、４８時間、ウイルスに暴露され、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現のレベルが、蛍光を用いて測定された。ウイルスをｐＨＰＭＡでコーティングすることは、ＧＥＰ発現の顕著な低減を媒介し、ウイルス感染の目立った阻害を反映している。「リガンド」への言及は、ポリマー改変されたウイルスに付着したリガンドにも当てはまる。
図８は、ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐでの反応後での、ヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞におけるＡｄ５−ＧＦＰの感染性の低減を示す。Ａｄ５−ＧＦＰは該明細書中で記載されるように（実施例１４参照）、反応性のｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで処理された。ＨＵＶＥ細胞は、４８時間ウイルスに暴露され、ＧＦＰの発現レベルは蛍光を用いて測定された。ｐＨＰＭＡでウイルスをコーティングすることは、ＧＦＰ発現の顕著な低減を媒介し、ウイルス感染の目立った阻害を反映している。再度、「リガンド」への言及は、ポリマー改変されたウイルスに付着したリガンドにも当てはまる。
【００４０】
図９は、ポリマーでコートされたウイルスを、成長因子ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦを用いて再ターゲット化することによる、Ａ５４９細胞における感染性の回復を示す。Ａｄ５ウイルスはｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐと反応され、次いで、ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦとの反応により再ターゲット化される。次いで、ウイルスはＡ５４９細胞とインキュベートされ、４８時間後に、細胞でのＧＦＰ発現が測定された。ｂＦＧＦはポリマーコーティングによる、取り込みおよび感染阻害の両方を回復させたが、ＶＥＧＦはＧＥＰ発現の弱い回復だけを生じさせた。このことは、相対的に多量のｂＦＧＦレセプターがこれらの細胞上に存在していることを反映し、また少量のＶＥＧＦレセプター存在していることを反映することができる。
図１０は、ポリマーでコートされたウイルスをｂＦＧＦまたはＶＥＧＦで再度ターゲッティングすることによる、Ａ９、Ａ９−２１、Ａ５４９およびヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞での、感染性回復の分析を示す。Ａｄ５ウイルスはｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐと反応され、次いで、ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦとの反応により再度ターゲッティングされた。次いで、ウイルスは細胞とインキュベートされ、４８時間後に、細胞でのＧＦＰの発現が測定された。ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦの存在は、ＨＵＶＥ細胞への感染性を回復させたが、ＶＥＧＦはより効果的であり、おそらく、多量のＶＥＧＦレセプターがこれらの細胞上に発現していたことを反映したものであろう。感染の特異性は、再ターゲット化されたウイルスを用い、好適な抗リガンド抗体（抗−ｂＦＧＦおよび抗−ＶＥＧＦ抗体）を適用して、ＨＵＶＥ細胞の感染を拮抗させることにより示された。Ａ５４９の感染は、過剰のファイバーノブドメインを添加しても拮抗されることができなかったが、しかしながら、このことは、ＣＡＲ結合は、再ターゲット化されたポリマーでコートされたウイルスの感染性における役割を有していないことを示す。
【００４１】
図１１は、ｂＦＧＦで再ターゲット化されたポリマーでコートされたウイルスが使用され、プライマリー卵巣癌「ポリクローナル」株化細胞ＹＳＫ１９に感染させた場合の効果を示す。顕著なレベルの遺伝子発現が達成され、これは改変されていないウイルスを用いるよりも顕著に多かった。感染は、時間の長さを変更して行われ、わずか４時間のインキュベーション後に、両物質は最大の感染レベルに到達したことを認めることができる。
図１２は、Ａｄ５−ＧＦＰまたはｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで改変されたＡｄ５−ＧＦＰ（図中のＥＣ８２として参照される）を用いた、中和抗体の感染阻害効果の評価を示す。Ａ５４９細胞は１０４粒子／細胞のＡｄ５−ＧＦＰ、またはｐＨＰＭＡで改変されたＡｄ５−ＧＦＰ、またはｂＦＧＦで再ターゲット化されたｐＨＰＭＡで改変されたＡｄ５−ＧＦＰ（実施例１５で記載されるように調製された）で、種々の希釈率のウサギ抗−Ａｄ５血清の存在下で、感染された。感染後５日目に、細胞中のＧＦＰ蛍光が測定され、タンパク質濃度が決定された。コートされたウイルスの感染性はｂＦＧＦの添加により回復された。中和は、Ａｄ５−ＧＦＰ単独では９９．２％の低減であったのに対し、再ターゲット化されたコートされたウイルスで２０％までに抑制された。
図１３は、反応性ポリマーの濃度が、ポリマー改変されたアデノウイルスに残っている感染活性におよぼす影響を示す。
【００４２】
調製方法および実施例のより詳細な記載
核酸送達ビヒクルとしての使用のための、ポリマーでコートされたウイルス、および本発明に従って構成された他の生物学的エレメントの調製のための、次の実施例および合成ルートにおけるステージの記載は、本発明のさらなる例示を提供し、さらにこれらのさらなる重要な特徴を開示する。しかし、それらは、如何なる方法においてもこれらを制限するものとして構成されるべきではない。
他に示されない限りは、ポリマーのために示される分子量の値は、重量平均の値を示すことが意図される。実施例においては、ウイルス濃度は、ｍＬあたりのウイルス粒子の数として与えられる。これは、概して、対応する感染単位（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｕｎｉｔ）数より顕著に多い。
第１の実施例（実施例１）においては、調製方法としては、本発明に従って、保護親水性ポリマーコーティングを用いて形成されたアデノウイルスを記載する。
【００４３】
実施例１
Ｎ−２−ヒドロキシプロピルメタアクリルアミド（ＨＰＭＡ）および反応性エステルをベースとした、ポリマー性前駆体によって形成された親水性ポリマーのコーティングを有する、ポリマー改変されたウイルスの調製。
この実施例は、アデノウイルスと、ＨＰＭＡがメタアクリロイル化−オリゴペプチド（グリシン−フェニルアラニン−ロイシン−グリシン）パラ−ニトロフェニルエステルと共重合されてなる、いわゆるポリマー性前駆体とから構成される、コートされたウイルスの形成に関する。
そのようなメタアクリルポリマー性前駆体は、親水性ポリマー物質を提供する。それらは、概して、約２０，０００Ｄａの分子量を有し、活性化されたエステル基（−ＯＮｐ）を有するオリゴペプチド側鎖４−１０モル％を含む。オリゴペプチドはスペーサーとして機能し、サイズを変更することができるが、テトラペプチドＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙは、リソソームのカテプシン酵素（チオールプロテイナーゼ）によって生物分解されるためにデザインされた好ましい１形態を示す。典型的な構造は以下の通りである。
【００４４】
【化１】
0004618958.tif 000002
【００４５】
上述のようなメタアクリルポリマー性前駆体の調製は、概して、ＨＰＭＡを、Ｎ−メタアクリロイル化された関係するペプチドのｐ−ニトロフェニルエステルと共重合する工程を含み、さらに「ポリマー性前駆体」中での、そのように形成されたペプチド側鎖の末端ｐ−ニトロフェノキシ基が、その後の、ウイルスの反応性アミノまたは他の官能基との付加反応のための簡便な脱離基を提供する。Ｎ−メタアクリロイル化されたオリゴペプチドのｐ−ニトロフェニルエステルの合成、およびそのＨＰＭＡとのコポリマーは、文献に、特に、合成ポリマードラッグデリバリー剤に関連する記事または論文に充分に示されており、例えば、Ｐ．Ｒｅｊｍａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ”Ａｍｉｎｏｌｙｓｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ４−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｅｓｔｅｒｓ  ｏｆ  Ｎ−Ｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ”，（１９７７），Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７８，２１５９−２１６８，Ｓｕｂｒ．Ｖ，ｅｔ  ａｌ，”Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｂｏｎｄｓ”，（１９９２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１８，Ｎｏ．２，ｐｐ．１２３−１３２、およびＵｌｂｒｉｃｈ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ，”Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｄｒｕｇ−Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｍｐｏｓｉａ，（１９９６），１０３，ｐｐ．１７７−１９２が挙げられる。また、欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０１８７５４７号も参照、該文献の内容は本明細書の一部として参照される。
【００４６】
反応性ｐ−ニトロフェニルエステルまたは反応性ｐ−ニトロフェノキシ基を有する、側鎖を有する親水性ポリ（ＨＰＭＡ）ポリマーの調製は、特に、国際公開第ＷＯ９８／１９７１０号の実施例３および４に開示される。
さらに、親水性ポリマーを構成するために、Ｎ−メタアクリロイル化オリゴペプチドと共重合されたＨＰＭＡのポリマー前駆体であって、該ポリマー前駆体におけるペプチド側鎖が欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０１８７５４７号に開示されるように調製されるｐ−ニトロフェニルエステル基のかわりに、カルボキシル基で末端を形成するような、前記ポリマー前駆体を使用することも可能である。好適な触媒の存在下において（欧州特許出願公開ＥＰ−Ａ−０１８７５４７号を参照）、カルボキシル基は、コートされるべきウイルス上の１級アミノ基にニトロフェニルエステルの場合のように結合するであろう。しかし、カルボキシル基はウイルス中の反応性アルコール基と結合することができ、エステル基を形成という、さらなる可能性も生じる。その場合には、そのようなエステル基は、酸で触媒される分解または加水分解を通じて、その後に分解されることができる。
【００４７】
アデノウイルス（２５μｇ、８．６×１０１０ウイルス粒子に等しい）が、５０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むリン酸塩で緩衝された生理食塩水（ＰＢＳ）／グリセロール（１０％容量／容量）バッファー、ｐＨ７．４の、１００μＬ中で、６℃でインキュベートされた。反応性エステル基を有する親水性ポリマー（ポリマー性前駆体）が水に溶解され、穏やかに混合しながら前記混合物に添加された（最終濃度２．５ｍｇ／ｍＬ）。溶液は、エステル基と反応することができる、反応性アミン（例えば、Ｔｒｉｓバッファー）をはじめとする求核性基を含まないことが重要である。溶液は、過剰にアルカリ性になることが、活性化されたエステル基の望まれない加水分解を促進するであろうから、過剰にアルカリ性（例えば、ｐＨは８．２より大きくない）になるべきでないことも重要である。ウイルス溶液のｐＨが７．０より低くなることがアデノウイルスの不活性化を開始するので、ウイルス溶液のｐＨが７．０より低くならないことも重要である。
−ＯＮｐエステル基とウイルスの１級アミノ基との間の反応は、エステルの濃度の減少を測定することにより（２７４ｎｍ）または遊離の４−ニトロフェノールの出現をモニターすることによる（４０４−４１０ｎｍ）、分光測定法でモニターされた。１時間後、アミノエタノール（０．１％、容量／容量）が添加され、反応を停止させた。いくつかの場合には、高濃度のウイルスの適用のために、細胞への適用の前に、遊離の４−ニトロフェノールは、ひき続いてろ過または透析により除去された。
【００４８】
任意の反応条件は、ＨＥＰＥＳバッファー、ホウ酸塩溶液または水中で、ｐＨ７．０−８．２、温度４−１０℃、最大ウイルス濃度１０１３粒子／ｍＬでの穏やかな混合（しかし、ボルテックスではない）を含み、架橋を最小化させる。
いくつかの例においては、ｐＨは、反応の間に、水酸化ナトリウムまたはより高いｐＨのバッファーを添加することにより、約ｐＨ８．０まで、徐々に上昇させることができる。これは、１級アミノ基の反応性を促進するが、エステルの加水分解速度も促進させるので、注意深く制御されなければならない。
反応は、ｐＨを８．５に上げて、素早いエステル加水分解を促進させることにより、または好ましくは、例えば、アミノエタノール、アミノプロパノールまたはエチレンジアミンをはじめとする、低分子量の反応性アミンを添加することにより停止させることができる。
そのように形成されたコートされたウイルスは、比較的安定であり、取り扱いやすく、さらにそれらはカラムクロマトグラフィー（例えば、セファロース４Ｂ−ＣＬ）によって、または密度勾配遠心分離法によって精製されることができることも見出された。
【００４９】
上述の実施例において使用される、テトラペプチド−パラニトロフェニルエステルを含む反応性親水性ポリマーの合成は、既に言及されている。反応性親水性コーティングポリマーの注意深い選択が、結果として得られるコートされたウイルスの特性に顕著な影響を及ぼすことができる。例えば、単純なオリゴペプチド−ニトロフェノールエステル反応性側鎖を有するポリマーの使用が、ｐ−ニトロフェノールの遊離を伴った、ウイルスの変化していないアミノ基とのアミノリシス反応を導くが、加水分解成分も有意に存在する。加水分解生成物は、末端アミノ酸での遊離のカルボン酸であり、よって、そのようなコートされたウイルスは、しばしば強力な負の表面電荷を有することが認められる（例えば、−２５ｍＶのゼータ電位）。他の化学作用としては、例えば、パラニトロフェノールの炭酸エステルは、二酸化炭素を遊離して、アミノリシスにおけるのと同じ産物を生じさせるが、加水分解の後にヒドロキシル基を生じさせる。結果として得られる、コートされたウイルスの、測定されたゼータ電位は、概して、非常にゼロに近い。
いくつかの他の反応性親水性ポリマーが、ウイルスの表面コーティングを達成するために使用されることができる。これらは、ポリ−Ｎ５−（２−ヒドロキシエチル）−Ｌ−グルタミン（ｐＨＥＧ）をはじめとする他のポリマーバックボーンをベースにした反応性エステル、またはペンダント反応性エステルを有するオリゴペプチドまたはその他の生物分解可能な配列によって、エンドツーエンド（ｅｎｄ−ｔｏ−ｅｎｄ）で一緒になった、主としてポリ（エチレングリコール）のブロックからなるバックボーンを含む反応性ポリマーを含む。これらの分子の構造の注意深い選択が、それらを特定の酵素による、特定の部位における分解に、または加水分解もしくは酸触媒された加水分解に適合させることができる。これらの物質のいくつかの合成が後の実施例に記載されており、それらは、上述のものと同じプロトコルを用いた、ウイルスの表面の改変に特に有効な薬剤を作成する。アミノ酸スペーサーを有さず、反応性ＯＮｐ炭酸エステルを含む、ポリ−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）（ｐＨＥＧ）をベースにした反応性親水性ポリマー物質は、ｐＨＥＧのクロロホルメートとの反応によって生成されることができ、これは容易に生物分解可能であることが公知である。
【００５０】
ネットで強力な負の表面電荷を有するように形成されたコートされたウイルスは、静脈内投与後に、貪食細胞、とりわけクッパー細胞による素早いスカベンジングにかけられる。ネットで正電荷を有するコートされたウイルスは、毛細血管ベッド、とりわけ、肺循環毛細血管内に蓄積されがちである。よって、延長された血漿中循環を達成するために最も良い表面電荷は、中性またはわずかに負である。
ターゲッティング基または追加の遮蔽分子をはじめとする、他の生物活性分子が、親水性ポリマー前駆体に取り付けられることができることが認識されるであろう。以下の実施例（実施例２）においては、ターゲット化剤であるトランスフェリンは、単にアミノリシスすることによって、またはその炭化水素成分の酸化の後に導入される。
【００５１】
実施例２
アミノリシスを用いた、トランスフェリン−ターゲット化された、コートされたウイルスの構築。
Ｅ１中に、サイトメガロウイルスイミディエート−アーリー（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）プロモーターの制御下で、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子をコードする、Ｅ１−欠損アデノウイルス（２５μｇ、８．６×１０１０ウイルス粒子に等しい）が、５０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファーを含み、ｐＨが７．４、温度６℃である、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／グリセロール（１０％容量／容量）１００μＬ中で、インキュベートされた。反応性親水性ポリマー（実施例１からのものとして、８モル％のＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−４−ニトロフェノールエステルを有するｐＨＰＭＡ）が添加された（最終濃度２．５ｍｇ／ｍＬ）。反応は、ホロトランスフェリン（２０μｇ）の添加前に、１時間行われ、次いで、さらに１時間、反応は継続された。その時点で、アミノエタノール（０．１％容量／容量）の添加により反応が停止され、ウイルスはさらに３０分間そのままにされ、次いで、透析により精製された。
別法として、上述の反応は、温度が６℃に維持され、ｐＨを７．４に維持するようにプログラムされた自動滴定装置（例えば、ＲａｄｉｏｍｅｔｅｒからのｐＨ−Ｓｔａｔ）で行われることができる。
【００５２】
次いで、コートされたウイルスは、２％のウシ胎児血清を含む培地中で、トランスフェリンレセプターポジティブのＫ５６２細胞（１０４細胞／ウエル、９４ウエルプレート中）と共に、最終ウイルス濃度１０８粒子／ウエルでインキュベートされた。７２時間後、細胞はリン酸塩バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．２、トライトンＸ−１００（０．１％容量／容量）含有）中に溶解され、その後、市販のＧａｌａｃｔｏｌｉｇｈｔ（商標）発光アッセイキットを用いた、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子発現の測定を行った。トランスフェリンターゲット化されたコートされたウイルスは、ターゲット化されていないポリマーでコートされたウイルスよりも、顕著により高い遺伝子発現を媒介したことが見出され、そして、このトランスフェクション活性は、拮抗する遊離トランスフェリンを過剰に添加することにより阻害されることができた。しかし、トランスフェリンレセプターネガティブの２９３細胞とインキュベートされる場合には、これらトランスフェリン−ターゲット化された複合体は、トランスフェクション活性を示さなかった。
この、コートされたウイルスを用いる、トランスフェリン−ターゲット化された遺伝子発現のデモンストレーションにもかかわらず、従前においては、コートされたウイルスがエンドソーム／リソソームシステムから出て、細胞質に入ることができるかどうかが不明であったので、この結果はむしろ予期しないものであった。この実施例は、トランスフェリンで媒介される内部移行において、コートされたウイルスの細胞内への導入の後に、該コートされたウイルスの能力が有効に機能することを示す。
【００５３】
実施例３
炭化水素の酸化を用いた、トランスフェリンターゲット化されたコートされたウイルスの構築。
アデノウイルスが、上述の反応性親水性ポリマーでコートされた。しかし、実施例２と異なり、トランスフェリンが使用されず、さらにコーティング反応が２０倍のモル過剰量のジアミノエチレンの添加で停止された。これは、結果として、残っている未反応のＯＮｐエステル基を介して、コートされたウイルスの表面上にアミノ基を導入させた。該アミノ基を有するコートされたウイルスは、セファロース４Ｂ−ＣＬ上でのゲルろ過によって、溶出液として蒸留水を用いて、遊離のジアミンから精製された。
トランスフェリン炭化水素鎖の酸化のために、１０ｍｇのトランスフェリン（０．１３μモル）が、０．４５ｍＬの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０、３０ｍＭ）に溶解され、０℃に冷却された。新たに溶解された過ヨウ素酸ナトリウム（１０ｍｇ／ｍＬの溶液を５０μＬ）が添加され、９０分間、０℃、暗所で反応が行われた。酸化されたトランスフェリンは、プレパックされたＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でゲルろ過で精製され、アルデヒド基の存在が、アニスアルデヒドテストを用いて示された。酸化されたトランスフェリンは、ｐＨ５．０で保たれ、自己反応を防止した。
【００５４】
酸化されたトランスフェリンの、アミノ官能基を有するコートされたウイルスへの架橋のために、ｐＨが７．４に調節され、好適な量の、酸化されたトランスフェリンが、精製されたコートされた複合体に加えられた。混合物は、１−２時間放置され、シッフ塩基タイプの共有結合の形成を可能にした。引き続いて、シッフ塩基は、過剰のシアノボロハイドライドを用いた、最低１時間の還元によって安定化された。最終的に、ウイルスは導入されていないトランスフェリンおよびシアノボロハイドライドから精製され、さらにセファロース４Ｂ−ＣＬまたは等価物上で、ＰＢＳｐＨ７．４を溶出液として、ゲルろ過することにより滅菌された。
生物学的活性は、上述のように示された。
【００５５】
実施例４
ヘテロ２官能性架橋剤を用いた、トランスフェリンターゲット化されたポリマーコートされたアデノウイルスの構築。
この方法は、ＳＨ基を有する、ポリマーでコートされたウイルスの製造、および該ＳＨ基のＳＨ−反応性トランスフェリン分子との結合を含む。
ウイルス調製は、アデノウイルスを許容細胞系内で増殖させることにより生産が行われた。システアミン（２−アミノエタンチオール）がｐＨＰＭＡ−ベースの反応性コーティングポリマーと異なる比率（２〜２５％、反応性エステルと当量）で、ウイルスの添加の前に反応された。この反応は、ｐＨ−Ｓｔａｔ（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ）内で、ｐＨ７．４、１６℃で、次のように行われた。
前駆体型の親水性コーティング物質の好適な量（例えば、８モル％の活性化されたエステル基を有するｐＨＰＭＡ−ベースのコポリマーを４００μｇ／ｍＬ）が水に溶解され、所望の量のシステアミンが添加された。ポリマー前駆体のシステアミンとの反応は、ｐＨを７．４に上昇させることによって開始された。反応は非常に速く、３分後には本質的に完了する。改変されたポリマー前駆体はｐＨ６．０で貯蔵され、望まれない加水分解を防止した。
【００５６】
次いで、等しい容量のアデノウイルスが、改変されたポリマー前駆体に添加された。コーティング物質の、ウイルスのアミノ基との反応はｐＨを７．４に上げることにより開始され、２時間の間続けられた。次いで、未反応のＯＮｐエステル基が過剰量のアミノプロパノールと反応された。
スルフィド−反応性トランスフェリンは次のように調製された。トランスフェリンは、２５ｎｇ／ｍＬで水に溶解された。１−２モル当量の間の、スクシンイミドピリジルジチオプロピオネート（ＳＰＤＰ）が添加された（２５ｍｇ／ｍＬのトランスフェリン１ｍＬに対して、約２０μＬの１０ｍｇ／ｍＬのＳＰＤＰ溶液が使用された）。混合物は１時間室温で放置され、その後、ＰＤ１０カラムを用いたゲルろ過にかけられた。
【００５７】
次いで、スルフィド−反応性ピリジルジチオプロピオネート−トランスフェリン（ＰＤＰ−Ｔｆ）が、スルフィドを有するコートされたウイルス上に反応された。これは、好適な量のＰＤＰ−Ｔｆを、中性条件下で上述のように調製されたコートされたウイルスの溶液に添加することにより行われた。交換反応はオーバーナイトで続けられた。
全ての反応は、脱ガスされた溶液を用いて、酸素が存在しない雰囲気中で行われ、潜在的に凝集物の形成を導く、コーティングポリマーによるジスルフィド結合の形成を防止した。同じ理由で、コーティング物質のスルフィド基を超える過剰なモル数のスルフィド反応性トランスフェリンが使用される。全ての反応の完了後、ウイルスは、セファロース４Ｂ−ＣＬまたは他の好適なマトリックス上での無菌のゲルろ過によって、導入されなかった物質および反応副生成物から精製され、滅菌された。リン酸塩緩衝生理食塩水が溶出液として使用された。生物学的活性は、上述のように示された。
【００５８】
実施例５
ウイルス複合体のｐＥＧ−ＳＨとの反応。
アデノウイルスは、実施例４において示される、反応性エステルおよび遊離のチオール基を有する多価ポリマーを用いてインキュベートされ、表面が改変された。コートされたウイルスは、アルゴン下で、リン酸塩バッファー、ｐＨ７．４（酸素不含）３ｍＬ中のｐＥＧ−ＳＨ１００ｍｇ溶液と混合された。反応は、室温で４時間行われた。製造されたｐＥＧ−含有複合体は、アガロースゲル電気泳動、原子力顕微鏡、および光子相関スペクトロスコピーによって検査された。ジスルフィド結合を介した、ｐＥＧ（５モル％）のグラフティングは、ＤＴＴと反応後、ＵＶ分光法（４１２ｎｍでの吸収）によって確認され、続いて、５，５’−ジチオビス（２−ニトロベンゾイックアシッド）（ＤＴＮＢ）を用いて、放出されたｐＥＧ−ＳＨを定量的に決定した。
【００５９】
実施例６
ポリマーバックボーンが生物分解可能である反応性親水性ポリマーでの、ウイルスのコーティング。
この実施例においては、アデノウイルスは、ペンダント反応性エステルを有する親水性ポリマー、すなわち、ｐＥＧ−ペプチド−ＯＮｐ繰り返しポリマーを用いて表面を改変することにより安定化された。この親水性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）とトリペプチドの交互のブロックから形成され、ポリマーバックボーン中に、タンパク質分解可能性を導入するようにデザインされ、国際公開ＷＯ９８／１９７１０号の実施例１１のパート１１．１および１１．２に開示されるように調製された。
反応性ｐＥＧ−ペプチド−ＯＮｐ繰り返しポリマー（ＤＭＳＯ中に溶解された）は、ＨＥＰＥＳバッファー（５０ｍＭ）（ＰＨ７．４）を含むＰＢＳ／グリセロール（１０％）中のウイルスに添加され、最終濃度を２００μｇ／ｍＬにした。溶液は、遊離のパラニトロフェノールが放出され、徐々に黄色くなった。ウイルスの感染性は、Ａ５４９細胞に対する力価を測定することにより決定され、さらに、該感染性は、ポリマーコーティングの存在により低減されることが認められた。
【００６０】
実施例７
ヒドラジン基で誘導されたポリマーを用いた、アルデヒド基を有する生物学的エレメントの表面の改変。
エンドソームのｐＨで酸不安定でかつレイビル（ｌａｂｉｌｅ）である結合を介した表面コーティングポリマーの付着は、本発明の重要な１態様である。この目的に適する、いくつかの化学的ストラテジーが存在するが、ここではその１つが例示される。
【００６１】
ヒドラジン−改変された親水性ポリマーの合成
（ａ）第１ステージ：ｐＨＰＭＡ−ＯＮｐの、コハク酸ｔ−ブチル−オキシカルボニルヒドラジンとのカップリング
０．２ｇのｐＨＰＭＡ−ＯＮｐが、ｐＨ８．０、ＨＥＰＥＳバッファー中、エチレンジアミンでアミノリシスされた。物質は水中で透析され、コハク酸ｔ−ブチルオキシカルボニルヒドラジン（２０．６４ｍｇ、０．１５６ｍモル）と混合された。溶液のｐＨは、ＨＣｌで５．０に調節された。続いて、水中の３００ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）（１．５６ｍモル）がこの溶液に添加された。反応の間、ｐＨはＨＣｌで５．０に維持された。オーバーナイトで撹拌後、溶液は水で４８時間の間透析された。ポリマーは、凍結乾燥によって集められた。置換の程度は１Ｈ−ＮＭＲによって測定され、４％であった。
（ｂ）第２ステージ：ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）保護基の除去
この改変されたｐＨＰＭＡ誘導体（上述のもの）０．２ｇが１０ｍＬのトリフルオロ酢酸中に溶解された。混合物は１時間の間撹拌され、溶媒は減圧蒸発させられた。残留物は水に溶解され、さらに４８時間透析された。ポリマーは凍結乾燥により集められた。置換の程度は１Ｈ−ＮＭＲによって測定され、３．８％であった。
（ｃ）第３ステージ：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ胞子の、ヒドラジン改変されたｐＨＰＭＡでのグラフト化
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの胞子（５０μｇ）が、ヒドラジン改変されたｐＨＰＭＡ（２００μｇ）と共に、クエン酸塩バッファー、ｐＨ５．０中で、撹拌して、２時間インキュベートされた。胞子上にグラフトされるｐＨＰＭＡの量は、ベネディクト試薬を用いて胞子に随伴するアルデヒド基を測定した後に、算出された。
【００６２】
実施例８
フルオレスカミンアッセイによる、野生型アデノウイルスタイプ５（ｗｔ  Ａｄ５）粒子のｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐ改変の測定。
ｗｔ  Ａｄ５表面タンパク質のアミノ基改変の程度を定量するために、アミノ反応性のフルオレスカミンを用いて、ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐ処理されたアデノウイルスが、改変されていないＡｄ５に対して比較された。
１００μＬのＰＢＳグリセロール（１０％）、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中での２５μｇ（８．６×１０１０）のｗｔ  Ａｄ５粒子が、０−２５０μｇのｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで、氷上で、１時間処理された。この調製物１ｍｇが、３７５μＬのＰＢＳグリセロール（１０％）中で希釈され、１００μｇ／ｍＬのフルオレスカミン含有アセトンで５００μＬにされた。フルオレスカミンでの反応後５分で、クオーツキュベット中、３９２ｅｘ：４８０ｅｍで蛍光が測定された。結果は、未処理のウイルスと比較した、アミノ基の喪失のパーセントで示され、ウイルス上の未反応のフルオレスカミンによるバックグラウンドのシグナルが除かれた（図１）。
【００６３】
実施例９
４−ニトロフェノールの放出による、ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐのｗｔ  Ａｄ５との反応の測定。
ｐＨＭＰＡのアミノ基との反応、または加水分解による反応は、遊離の４−ニトロフェノールを生じさせ、該４−ニトロフェノールは４０４ｎｍまたは４１０ｎｍで測定されることができる。別法では、反応性エステルの喪失が２７４ｎｍでモニターされることができる。
ＰＢＳグリセロール（１０％）および５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４−８．５中での、２５０μｇ／ｍＬのｗｔ  Ａｄ５は、５ｍｇ／ｍＬのｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで処理され、遊離のパラニトロフェノールの生成が、１ｍＬのクオーツキュベット中で、異なるｐＨ値での時間の関数として測定された。反応速度は、バックグラウンドレベルの加水分解を測定するために、ウイルスが存在しない、ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐと比較された（図２）。ウイルスの存在は、顕著により早い反応を誘発し、このことはウイルスとポリマーとの間における、共有結合の形成を示す。反応は、ｐＨ７．８−８．０で最も効率的であり、この場合、アミノリシス：加水分解の比率が最も高い。
【００６４】
実施例１０
ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐによる、ｗｔ  Ａｄ５ファイバー改変のウエスタンブロットによるデモンストレーション。
ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐとの反応後の、ウイルスタンパク質に与えられた移動性の変化を測定するために、コートされたウイルスがＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、抗体（この場合は、抗−ファイバー抗体）を用いて検出するためにニトロセルロースペーパーにトランスファーされた。
２５μｇ（８．６×１０１０）のｗｔ  Ａｄ５粒子が、１００μＬのＰＢＳグリセロール（１０％）および５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中で、０−２５０μｇのｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで、１時間、氷上で処理された。続いて、０．１％のアミノエタノールが添加され、余分のエステル基との反応を完了させた。２μｇ（６．９×１０９）のｗｔ  Ａｄ５粒子は、１２％ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上、２時間、２００Ｖで変性され、分離された。次いで、タンパク質は、４５分間、１０Ｖで、ニトロセルロースにトランスファーされ、電気泳動された。次いで、ニトロセルロースメンブレンは０．１％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳ、５％Ｍａｒｖｅｌ中で、１時間、室温でブロックされ、その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳ中の、１／１０００希釈のモルモット抗Ａｄ５ファイバー抗体で、１時間、プローブ処理された。メンブレンについて、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ＰＢＳで１０分間の洗浄を３回行い、０．１％ＰＢＳ  Ｔｗｅｅｎ中で、１時間、１／１００００希釈の抗モルモットペルオキシダーゼ結合体（ＳＩＧＭＡ）に暴露した。結果（図３）は、充分な濃度のポリマーが使用される場合に、移動性が低減されることを示す。
【００６５】
実施例１１
ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐでの改変による、ｗｔ  Ａｄ５の細胞変性効果の低減。
野生型Ａｄ５は、高効率で、多くのタイプの細胞に感染し、このことは、細胞変性効果（ＣＰＥ）と呼ばれる、細胞の形態の明らかな変化を引き起こす。ｗｔ  Ａｄ５の多価親水性ポリマー、この場合はｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐでの改変は、次のプロトコルによって観察される、ｗｔ  Ａｄ５の細胞変性効果を起こす能力を低減させる。
１００μＬのＰＢＳグリセロール（１０％）および５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４中での、２５μｇ（８．６×１０１０）のｗｔ  Ａｄ５粒子が、氷上で、１時間、０−２５０μｇのｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで処理された。続いて、０．１％アミノエタノールが添加され、余分なエステル基との反応を完結させた。０．２５μｇ（８．６×１０８）のこの調製物は、２ｍＭのグルタミンが添加された１０％ウシ胎児血清ＤＭＥＭの５００μＬ中に希釈され、２４ウエルプレート中の、単層のＡ５４９細胞（１０５）とインキュベートされた。次いで、４８時間後、細胞単層のイメージがデジタルカメラで捕捉された（図４）。ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで処理された８．６×１０８のアデノウイルス粒子は、この濃度が、アデノウイルスが１００％のＣＰＥを生じさせるのに通常必要とされる値の８６０倍であるにも拘わらず、ＣＰＥを引き起こすことができなかったことに注目すべきである。
【００６６】
実施例１２
抗体の、ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐ処理されたアデノウイルスとの相互作用の低減。
アデノウイルスがターゲット細胞に感染する能力は、中和抗体の存在によって低減されることができる。ここで記載される調製物においては、最適とはいえないが、抗体結合の実質的な損失が観察された。
２０ｎｇの、熱処理されたｗｔ  Ａｄ５（５６℃、３０分）が、９６ウエルプレートのＰＢＳグリセロール（１０％）１００μＬに添加され、２時間置かれた。その間に、ｗｔ  Ａｄ５、またはｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐ処理されたｗｔ  Ａｄ５の連続２倍希釈物（最大濃度５μｇ／ｍＬ）が、ＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ中のウサギ抗Ａｄ５血清（１／１０００）で１時間、プレインキュベートされた。次いで、プレインキュベートされた混合物は、ウォッシュ（ＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ×３回、ＰＢＳ×３回）された、ｗｔ  Ａｄ５でコートされた９６ウエルプレートに添加され、２時間の間置かれ、残りの抗体を結合させた。次いで、プレートは再びウォッシュされ（ＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ×３回、ＰＢＳ×３回）、二次抗ウサギペルオキシダーゼ結合体（１／１００００）がＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎに添加され、さらに２時間置かれた。０．１Ｍクエン酸塩バッファー中に溶解されたＯＰＤ試薬の添加により、着色反応が開始され、３０分間置かれ、次いで、反応は４Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の５０μＬで停止され、４９０ｎｍで測定された。結果は、ポリマー改変されたアデノウイルスによる、低減された抗体結合を示す（図５）。
【００６７】
実施例１３
ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐ処理後の、Ａ５４９細胞でレポーター遺伝子を発現するＡｄ５−ＧＦＰの能力の喪失、および電子顕微鏡によるコートされたウイルスのキャラクタリゼーション。
多官能性親水性ポリマー、この場合は、ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐでのアデノウイルスのコーティングは、Ａ５４９細胞中での、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子によって記録される遺伝子発現を妨げた。
ＰＢＳグリセロール（１０％）および５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４の、１００μＬ中での、２５μｇ（８．６×１０１０）のＡｄ５−ＧＦＰ粒子が、０−２５０μｇのｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで、氷上、１時間処理された。続いて、０．１％のアミノエタノールが添加され、余分なエステル基との反応を完了させた。コートされた、およびコートされていないウイルスは、透過型電子顕微鏡を用いて可視化された。コートされていないウイルスとコートされたウイルスとの間の、ホスホタングステン酸に対する親和性の違いが、ポリマー表面コートの存在を示し、コートされたウイルスは、非常にわずかに、より大きい直径を示し、ポリマーの表面コーティングの存在と一致した。ポリマーコーティングの後に、少量の凝集体の存在も示唆され、いくつかのウイルスはダイマーまたはトリマーとして認められた（図６）。１０７−１０９の、この調製物粒子が、９６ウエルプレート中、２ｍＭグルタミンが添加された２％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中の、１０４のＡ５４９細胞に添加された。７２時間後、細胞は０．２％Ｔｒｉｔｏｎ、ｐＨ７．２の１００ｍＭのリン酸カリウムバッファーを用いて溶解され、９６ウエル蛍光計を用いて、蛍光が測定された。結果は、コーティング処理後の、感染活性の完全な喪失を示した（図７）。
【００６８】
実施例１４
ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐ処理後の、ＨＵＶＥ細胞でのレポーター遺伝子を発現する、Ａｄ５−ＧＦＰの能力の喪失。
多官能性親水性ポリマー、この場合は、ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐでのアデノウイルスのコーティングは、ＨＵＶＥ細胞中での、グリーン蛍光タンパク質レポーター遺伝子によって記録される遺伝子発現も妨げた。
ＰＢＳグリセロール（１０％）および５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４の、１００μＬ中での、２５μｇ（８．６×１０１０）のＡｄ５−ＧＦＰ粒子が、０−２５０μｇのｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで、氷上、１時間処理された。その後、０．１％のアミノエタノールが添加され、余分なエステル基との反応を完了させた。１０７−１０９の、この調製物粒子が、９６ウエルプレート中、２ｍＭグルタミンが添加された２％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭ中の、１０４ｃｅｌｌのＨＵＶＥ細胞に添加された。７２時間後、細胞は０．２％Ｔｒｉｔｏｎ、ｐＨ７．２の１００ｍＭのリン酸カリウムバッファーを用いて溶解され、９６ウエル蛍光計を用いて、蛍光が測定された。結果は、コーティング処理後の、感染活性の完全な喪失を示した（図８）。
【００６９】
実施例１５
ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで改変されたウイルスの再ターゲット化後の、Ａ５４９、ＨＵＶＥ、Ａ９、ＳＫＯＶ３およびＹＳＫ１９細胞における、遺伝子発現の回復。
上述のように、アデノウイルスを多官能性親水性ポリマー、この場合、ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐでコーティングすることが、グリーンの蛍光タンパク質レポーター遺伝子により記録される遺伝子発現を妨げる（実施例１３および１４）。図９は、コーティング方法の適用後に観察される、感染活性の完全な喪失が、ターゲット化剤としてのｂＦＧＦの導入により回復されることができることを示す。ｂＦＧＦで再ターゲット化されたポリマーでコートされたアデノウイルスは、改変されていない親のＡｄ５−ＧＦＰに匹敵する遺伝子発現のレベルを示した。これに対して、ＶＥＧＦで再ターゲット化されたコートされたウイルスは、低い活性しか示さず、おそらく、既に示されたように、これらの細胞上には、少数のＶＥＧＦレセプターしか存在していないことを反映しているのであろう。
【００７０】
この特徴を立証するものとして、ＰＢＳ／グリセロール（１０％）および５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４の、１００μＬ中に、２５μｇ（８．６×１０１０）のＡｄ５−ＧＦＰ粒子が、２５０μｇのｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで、氷上、１時間処理された。次いで、１０μｇのｂＦＧＦまたはＶＥＧＦが添加され、さらに１時間置かれた。続いて、０．１％のアミノエタノールが添加され、任意の余分なエステル基との反応を完了させた。Ａ５４９細胞が９６ウエルプレート中に播種され（１０４細胞／ウエル）、サンプルは、フェノールレッドを含まない２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）／ＤＭＥＭ中で、グリーン蛍光タンパク質の遺伝子をコードするＥ１欠損アデノウイルス（ＡｄｇｆｐΔＥ１）、ポリマーでコートされたＡｄｇｆｐΔＥ１（ｐｃ−ＡｄｇｆｐΔＥ１）、ｂＦＧＦ−再ターゲット化ｐｃ−ＡｄｇｆｐΔＥ１（ｂＦＧＦ−ｐｃ−ＡｄｇｆｐΔＥ１）またはＶＥＧＦ−再ターゲット化ｐｃ−ＡｄｇｆｐΔＥ１に感染させられた。感染後（ｐｉ）４８時間に、細胞がｇｆｐ蛍光で評価された。
【００７１】
同じ方法が、ＨＵＶＥ細胞に適用された。図１０は、ＨＵＶＥ細胞を用いて測定される、Ａｄ５−ＧＦＰのポリマーコーティング（ＰＣ）後の、感染性の抑止が、ターゲッティングリガンドとしてのｂＦＧＦの導入によって戻されることができることも示す。これらの細胞においては、ｂＦＧＦでの再ターゲット化は、親のコートされていないウイルス（Ｖ）を用いて観察される感染性よりも、より高い感染性を生じさせる。ＶＥＧＦも、これらの細胞において、効果的な再ターゲット化剤として機能し、ＨＵＶＥ細胞上に発現する高レベルのＶＥＧＦレセプターと一致して、コートされてないウイルスを使用して達成される感染性よりも、さらにより高いレベルの感染性を媒介する。
感染の選択性およびＣＡＲ独立性は、細胞をアデノウイルスファイバーノブドメイン（５０μｇ／ｍＬ；Ａ５４９細胞）またはｂＦＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ；ＨＵＶＥ細胞）とプレインキュベート（１時間、３７℃）することにより、またはウイルスを、ｂＦＧＦに対して（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）もしくはＶＥＧＦに対して（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，ＵＫ）生じるモノクローナル抗体（１００μｇ／ｍＬ）それぞれ単独で、または組み合わせて（ＨＵＶＥ細胞）プレインキュベートすることにより示される。アデノウイルスファイバーノブドメインが、再ターゲット化されたウイルスではなく、正常のウイルスによる感染を阻害する能力は、正常なＣＡＲ−結合が、再ターゲット化されたウイルスの感染において関与していないことを示す。遊離のｂＦＧＦが、再ターゲット化されていないウイルスを用いて、トランスジーン発現を増強させることできないことは、感染を促進するために、リガンドがウイルスに結合されなければならないことを示す。抗−ｂＦＧＦ抗体および抗−ＶＥＧＦ抗体による、ｂＦＧＦおよびＶＥＧＦターゲット化ウイルスをそれぞれ用いた、ＨＵＶＥ細胞の感染阻害は、これらのリガンドがＨＵＶＥ細胞の再ターゲット化された感染の原因であることを示す。
【００７２】
マウスＡ９細胞はＣＡＲを発現せず、正常なアデノウイルス５による感染に対して感染性ではない。これに対して、Ａ９−２１細胞は、ヒト染色体２１の導入により、ヒトＣＡＲを発現するように加工されている。図１０に示されるように、正常なアデノウイルスはＡ９に感染することができないが、Ａ９−２１細胞に感染することができる。これに対して、ｂＦＧＦ再ターゲット化されたポリマーコートされたウイルスは、両方の培養細胞株に効率良く感染する。これは、正常なレセプターが存在していなくても、どのように、アデノウイルスが再ターゲット化され、特定のターゲットに関連するレセプターを介して感染することができるかの明確な例である。
感染は、ｂＦＧＦを用いて再ターゲット化するための同じ方法を用いて、ＳＫＯＶ３ヒト卵巣癌細胞においても回復された。達成された感染のレベルは、改変されていないウイルスに対するものよりも実質的に高かった。感染は、ターゲットリガンドとしての上皮成長因子（ＥＧＦ）並びに、抗体であって、Ｈｅｒ２、Ｍｕｃ−１、並びにｂＦＧＦおよびＥＧＦレセプターの細胞外部分を認識する該抗体を用いても、回復された（データは示さない）。同様に、ポリマーでコートされたアデノウイルスをｂＦＧＦを用いて再ターゲット化することは、長期の培養（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ）のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長された、プライマリー卵巣癌ポリクローナルセル”ライン”ＹＳＫ１９において、図１１によって示されるように、高レベルの遺伝子発現を達成した。これらの細胞において達成される遺伝子発現のレベルは、改変されていないウイルスによって達成されるレベルよりも約４倍高かった。
【００７３】
実施例１６
アミノ末端を有するポリ（ＨＰＭＡ）の合成。
アミノ末端を有するポリ（ＨＰＭＡ）ポリマーが、連鎖移動剤としての２−アミノエタンチオールヒドロクロライド（ＡＥＴ）の存在下で、ＨＰＭＡのラジカル重合によって調製された。ポリマーは、メタノール中、５０℃で、２４時間重合することによって得られた。重合混合物中の試薬の濃度は次の通りである：ＨＰＭＡ  ０．７９Ｍ、開始剤ＡＩＢＮ  ３．３×１０−３Ｍ、ＡＥＴ  ５×１０−３−５×１０−２Ｍ。分子量が２０００〜２００００ｇ／モルの範囲であるポリマーが、２０倍過剰のアセトン−ジエチルエーテル（３：１）中での沈殿によって回収された。ポリマーの分子量は、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２（商標）カラム上のＦＰＬＣによって、移動相としてｐＨ８．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌ含有、０．０５Ｍトリスバッファー中で決定された。末端アミノ基の含有量は、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸を用いた比色アッセイによって測定された。
【００７４】
実施例１７
ポリ〔（ＨＰＭＡ）−ｃｏ−（メタアクリロイル（ＭＡ）−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐ）〕−グラフト−ポリ（ＨＰＭＡ）の合成。
ポリ〔（ＨＰＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐ）〕が無水ＤＭＳＯに溶解され、計算された量のアミノ末端を有するポリ（ＨＰＭＡ）が添加され、活性エステル基の必要とされる部分を改変した。溶液は１２時間、２５℃で撹拌された。ポリマーは、２０倍過剰のアセトン−ジエチルエーテル（容量比３：１）中での沈殿によって単離され、さらに２０％メタノール溶液からアセトン中に再沈殿させた。
残っているｐ−ニトロフェニル活性エステル基の量は、ＤＭＳＯ中で２８０ｎｍのＵＶ吸収を測定することにより決定された。得られたポリマーの特徴（数平均分子量および重量平均分子量の両方）は、オンライン１８アングル光散乱検出器ＷＹＡＴＴを備えたＦＰＬＣにより特定された。
【００７５】
実施例１８
ポリ〔（ＨＰＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐ）〕−グラフト−オレイルアミンの合成。
ポリ〔（ＨＰＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐ）〕が無水ＤＭＳＯに溶解され、計算された量のオレイルアミンが添加され、活性エステル基の必要とされる部分を改変した。溶液は２時間、２５℃で撹拌された。ポリマーは、２０倍過剰のアセトン−ジエチルエーテル（容量比３：１）中での沈殿によって単離され、さらに２０％メタノール溶液からアセトン中に再沈殿させた。
残っているｐ−ニトロフェニル活性エステル基の量は、ＤＭＳＯ中で２８０ｎｍのＵＶ吸収を測定することにより決定された。オレイル基の含有量は、ＤＭＳＯ−ｄ６中の１Ｈ−ＮＭＲにより、オレイル二重結合（５．３ｐｐｍ）のシグナルを用いて評価された。得られたポリマーの特徴（数平均分子量および重量平均分子量の両方）は、ＷＹＡＴＴによる製造される、オンライン１８アングル光散乱検出器を備えたＦＰＬＣにより特定された。
【００７６】
実施例１９
ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐでのワクシニアウイルスの表面改変による、プラークアッセイによる感染性の低減。
ポックスウイルスファミリーの代表的なメンバーとして、ワクシニアウイルスが選択され、ｐＨＰＭＡベースの多価ポリマーを用いた表面の改変を示した。多官能性親水性ポリマーでのワクシニアウイルスの表面改変は、本来の感染活性の低減をモニターすることによって測定されることができる。感染活性は、次のプロトコル（注（Ｎｂ．）、ウイルス粒子の架橋を低減させるために、低濃度（＜２０μｇ／ｍＬ）、および短時間のソニケーションが必要とされることが見出された。）を用いて、ｂＦＧＦの導入によって、野生型のレベルの大きさの１オーダーの範囲内まで、続けて回復されることができる。ＰＢＳおよび５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４の、１００μＬ中の、１０μｇ（〜２．３×１０９）のワクシニアウイルスの粒子が１００μｇのｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで、氷上、１時間処理された。次いで、１０μｇのｂＦＧＦが添加され、さらに１時間置かれた。続いて、０．１％（容量／容量）のアミノエタノールが添加され、余分なエステル基との反応を完了させた。７５％コンフルエントのＨｅＬａ細胞を含む２０ｍｍプレート上での、粒子の連続希釈によって、ウイルス力価が測定された。７２時間後、クリスタルバイオレット染色を行い、プラークがカウントされた。
【００７７】
実施例２０
ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐを用いたレトロウイルスの表面改変。
ＲＮＡを含有し、エンベロープを有するウイルスの表面改変を示すために、ニトロリダクターゼ（ＮＴＲ）遺伝子を発現するレトロウイルス、ｒｖ．ＡＭ１２．ＬＮＣが選択された。ＮＴＲ発現は、株化細胞ＳＫＯＶ３の、プロドラッグ（ＣＢ１９５４）への感受性を、該プロドラッグを活性なバイファンクショナルのアルキレーティング種に転化することにより、増強させるものであり、これは結果として、感染の測定法として毒性が使用されることとなる。ｒｖ．ＡＭ１２．ＬＮＣのｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐでの表面改変は、ＮＴＲ発現レベルを検出可能なレベル以下まで低減させた。しかし、ＮＴＲの発現およびＳＫＯＶ３細胞のＣＢ１９５４への感受性は、次のプロトコルを用いたｂＦＧＦの導入後に、野生型のレベルの５０％以内まで回復された。
ＰＢＳおよび５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４の、１００μＬ中の、濃縮されたレトロウイルス粒子（５×１０６プラーク形成単位、ＰＦＵ）が、１００μｇのｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで、氷上、１時間処理された。次いで、改変されたウイルスを再ターゲット化するために、１０μｇのｂＦＧＦが添加され、さらに１時間置かれた。その後、０．１％（容量／容量）のアミノエタノールが添加され、余分なエステル基との反応を完了させた。５００ｍＬのこの調製物が、２ｍＭグルタミンが添加された１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中に、５ｍＬとなるように希釈され、さらに１０ｃｍのプレート中、ポリブレンの存在下で、１０６のＳＫＯＶ３細胞に添加された。
【００７８】
実施例２１
Ａ５４９細胞においてｂＦＧＦを用いて、再ターゲット化されたポリマーでコートされたアデノウイルスのトランスフェクション活性の、中和抗体による阻害に対する耐性。
既に示されたように、多官能性親水性ポリマー、ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで、アデノウイルスをコートすることは、グリーン蛍光タンパク質レポーター遺伝子により記録されるような、遺伝子発現を阻害する。この例において、Ａ５４９細胞は、種々の希釈のウサギ抗Ａｄ５血清の存在下で、１０４粒子／細胞のＡｄ５−ＧＦＰ、またはｐＨＰＭＡ−改変されたＡｄ５−ＧＦＰ、またはｂＦＧＦ−再ターゲット化されたｐＨＰＭＡ−改変されたＡｄ５−ＧＦＰ（実施例１５に記載されるように調製される）で感染された。感染から５日後に、細胞中のＧＦＰ蛍光が測定され、タンパク質濃度が決定された。コートされたウイルスの感染性は、ｂＦＧＦを添加することにより回復された。中和は、Ａｄ５−ＧＦＰ単独での９９．２％の低減と比較して、再ターゲット化されたコートされたウイルスでは、２０％より少い量の低減であった。
【００７９】
実施例２２
混合されたポピュレーションにおける、レセプターポジティブのターゲット細胞の選択的な感染を達成するためのアデノウイルスの再ターゲット化。
この実施例は、ＶＥＧＦで再ターゲット化された、ｐＨＰＭＡでコートされたアデノウイルスを用いた、混合された細胞ポピュレーションにおける、ターゲット化された感染性を示す。
ＳＵＩＴ２ヒト膵臓癌およびヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞が個別に成長させられ、トリプシン処理され、ＤＭＥＭ／２％ＦＣＳまたはＭ１９９／２０％ＦＣＳ中にそれぞれ、５×１０４細胞／ｍＬの濃度で再懸濁された。細胞は同じメンバーとなるように混合され、３７℃、２時間のリカバリーの後、ウイルスが添加され（１０４粒子／細胞）、さらに１．５時間インキュベートされ、その後、ゼラチンコートされた２４ウエルプレートに播種された。フェーズコントラストおよび蛍光イメージが、感染後（ｐｉ）４８時間で測定された。これらは、改変されていないウイルスは優先的にＳＵＩＴ２細胞に感染するが、ＶＥＧＦ再ターゲット化されたウイルスは選択的にＨＵＶＥ細胞に感染することを示した。
【００８０】
実施例２３
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、ターゲットガン細胞のレセプターに媒介されるトランスフェクションを達成するためのアデノウイルスの再ターゲット化。
３×１０６ＳＵＩＴ２細胞が、ヌードマウス（Ｂａｌｂ／Ｃ、雌、６−８週齢）の腹腔内にインジェクトされた。４８時間後、マウスは１０１０粒子の（Ａ）改変されていないアデノウイルスＡｄｇｆｐΔＥ１；（Ｂ）ポリマーコートされたアデノウイルスｐｃ−ＡｄｇｆｐΔＥ１；もしくは（Ｃ）ｂＦＧＦ−再ターゲット化されたポリマーでコートされたウイルスｂＦＧＦ−ｐｃ−ＡｄｇｆｐΔＥ１が投与されたか、または（Ｄ）マウスは同じルートで、３×１０９粒子のｂＦＧＦ−再ターゲット化されたポリマーでコートされたウイルスｂＦＧＦ−ｐｃ−ＡｄｇｆｐΔＥ１が投与された。さらに、４８時間後、動物は屠殺され、腹腔内からガン細胞が回収された。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ２５顕微鏡を用いて、ＧＦＰ蛍光が写真に撮られ、またフローサイトメトリーによって細胞が分析された。細胞は、ＳＵＩＴ２細胞のネガティブコントロールに対してゲートとされ（ｇａｔｅｄ）、最小蛍光閾値が、０．１％のコントロール細胞を含むものにセットされた。得られたイメージは、（Ａ）７．３％のポジティブ細胞：平均蛍光チャンネル（ＭＦＣ）１２０．５；（Ｂ）０．０６％のポジティブ細胞：ＭＦＣ６．０；（Ｃ）８．６９％のポジティブ細胞：ＭＦＣ９７．０；（Ｄ）２．６１％のポジティブ細胞：ＭＦＣ６４．０；を示した。全体では、これは、改変されていないウイルス（Ａ）およびｂＦＧＦ再ターゲット化されたポリマーでコートされたウイルス（ＣおよびＤ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に感染する能力を有するが、ターゲット化されていないポリマーでコートされたウイルスは該能力を有しないことを示した。
【００８１】
実施例２４
ポリマー濃度量の、コートされたウイルスの感染性に及ぼす影響。
β−ガラクトシダーゼの遺伝子をコードするアデノウイルス５が、２００μｇ／ｍＬから２０ｍｇ／ｍＬまでの範囲の量の、反応性ポリマーｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐと、１時間、室温で反応され、その後、残っている反応性基がアミノリシスされた。次いで、ポリマーでコートされたウイルスは、Ａ５４９細胞を感染させるために使用され、β−ガラクトシダーゼ遺伝子発現のレベルが４８時間後に測定された。図１３は、ポリマー濃度５−１０ｍｇ／ｍＬを用いると、感染の最大阻害が達成され、この濃度は、ポリマーのより低い濃度（２００μｇ／ｍＬ−２ｍｇ／ｍＬ）よりも、２−３ｌｏｇ大きい阻害が達成されたことを示す。ポリマーが、ウイルスの添加の前にアミノリシスされる場合には、感染の阻害は観察されなかった。
【００８２】
実施例２５
オイル中のアデノウイルス配合物および動脈内投与。
ＰＢＳグリセロール（１０％）および５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４の、１００μＬ中の、２５μｇ（８．６×１０１０）のＡｄ５−ＧＦＰ粒子が、オレイル−改変された反応性ｐＨＰＭＡ（５ｍｇ／ｍＬ、１時間；該ポリマーは実施例１８に記載されるように合成された）と反応された。アミノリシス後、未反応の基を除去し、ポリマー改変されたウイルスは凍結乾燥され、リピドール（ポピーシードオイルのヨード化された（ｉｏｄｉｎａｔｅｄ）エステル）に再懸濁された。次いで、オイル懸濁液は、肝内にＶＸ２腫瘍を有するウサギに、肝動脈を介して注入された。配合物の腫瘍内での蓄積および保持が、Ｘ線イメージングによって可視化されることができた。４８時間後、動物は屠殺され、蛍光顕微鏡を用いて、腫瘍内での実際の遺伝子発現が測定された。周囲の組織は有意な遺伝子発現を示さなかった。ＰＢＳグリセロール中のもので、改変されていないアデノウイルスを投与することにより提供されるコントロールも、有意なトランスジーン発現を示さなかった。
【００８３】
実施例２６
バキュロウイルス粒子のｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐでの改変。
無血清改変（ａｄａｐｔｅｄ）ＳＦ９細胞を用いて、Ｃ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅ３９，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ１９９５に記載されるように、振とう培養（撹拌培養が使用されることもできる）方法を用いてバキュロウイルス粒子が増殖された。出芽したビリオン（ＢＶｓ）は、細胞をペレットにする遠心分離により、細胞懸濁液から精製された。ＢＶｓを含む上澄液は、３００ＫＤａのｍｗｃｏメンブレンでの濃縮透析を用いて、濃縮されＨＢＳと置き換えられた。
ＰＢＳおよび５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４の１００μＬ中の、濃縮されたバキュロウイルス粒子（５×１０８粒子／ｍＬ）が、５００μｇのｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで、氷上、２時間処理された。次いで、改変されたウイルスを再ターゲッティングするために、１０−１００μｇのターゲッティングリガンド（ｂＦＧＦ）が添加され、さらに１時間置かれた。その後、０．１％（容量／容量）のアミノエタノールが添加され、余分なエステル基との反応を完了させた。
【００８４】
実施例２７
ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで改変する前の、バキュロウイルスエンベロープの除去、およびバキュロウイルス粒子のｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐでの改変。
精製されたバキュロウイルス粒子が、上述の実施例２６におけるように生産され濃縮された。次いで、精製された粒子は、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  ｘ１００で、１５分間、室温で処理され、バキュロウイルスエンベロープを除去した。
精製され、濃縮された、エンベロープを有しないバキュロウイルス粒子は、次いで、実施例２６に記載されるのと正確に同じ方法を用いてポリマー改変された後に、処理され、再ターゲット化された。
【００８５】
実施例２８
多価親油性ポリマー、ポリ〔（ＨＰＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐ）〕−グラフト−オレイルアミンでの、バキュロウイルスの改変。
実施例２６におけるように、無血清改変（ａｄａｐｔｅｄ）ＳＦ９細胞を用いて、そこで言及された振とう培養法を用いてバキュロウイルス粒子が増殖され、細胞をペレットにする遠心分離により、細胞懸濁液から精製された。次いで、ＢＶｓを含む上澄液は、３００ＫＤａのｍｗｃｏメンブレンでの濃縮透析を用いて、濃縮されＤＭＳＯと置き換えられた。
無水ＤＭＳＯ１００μＬ中の、濃縮されたバキュロウイルス粒子（５×１０８粒子／ｍＬ）が、５００μｇのポリ〔（ＨＰＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐ）〕−グラフト−オレイルアミン（実施例１８参照）で、氷上、２時間処理された。その後、０．１％（容量／容量）のアミノエタノールが添加され、余分なエステル基との反応を完了させた。
この方法において改変されたウイルス粒子は、相分離によって、非水性液体（オイル）中に保持されるべきである。オリーブ、コーン、ひまわりオイルをはじめとするオイルの、そのようなポリマー改変されたウイルス粒子、またはバクテリアもしくは胞子を含む配合物は、スプレーによって植物体表面に適用されることができる。例えば、有害生物の制御に関連して使用される、そのような適用は、乾燥や降雨による除去に対して耐性なので、より長期間フィールド中で持続する。さらに、配合物またはこの種のものは、スタンディング（ｓｔａｎｄｉｎｇ）水に適用されることができるので、例えば、マラリアの幼虫個体群に対する使用のために、バキュロウイルスを広範囲のエリアに渡って容易に分布させることを可能にする。
【００８６】
実施例２９
ポリ〔（ＨＰＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐ）〕−グラフト−オレイルアミンでの、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの改変。
この実施例においては、無水ＤＭＳＯ１００μＬ中の、濃縮されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（５×１０９粒子／ｍＬ）が、１０００μｇのポリ〔（ＨＰＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐ）〕−グラフト−オレイルアミン（実施例１８）で、氷上、４時間処理された。その後、０．１％（容量／容量）のアミノエタノールが添加され、余分なエステル基との反応を完了させた。実施例２８の改変されたバキュロウイルスのように、バクテリア（または、その胞子）は相分離によって、非水性液体（オイル）中に保持されるべきであり、オリーブ、コーン、ひまわりオイルをはじめとするオイルの、ポリマー改変されたバクテリア／胞子を含む配合物は、スプレーによって植物体表面に適用されることができる。繰り返すが、そのような適用は、乾燥や降雨による除去に対して耐性なので、より長期間フィールド中で持続し、さらに、繰り返すが、配合物は、スタンディング水に適用されることができるので、例えば、マラリアの幼虫個体群に対する使用のために、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓを広範囲のエリアに渡って容易に分布させることを可能にする。
【００８７】
実施例３０
ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐでのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．の改変。
オイル分解性の単離されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓがｉｎ  ｖｉｔｒｏでトリプトンソイビーンブロスを用いて、増殖され、オイル分解活性は、０．１％のディーゼルオイルが添加された合成海水中での成長によって選択された。
濃縮されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（５×１０９細胞／ｍＬ）が、ＰＢＳでウォッシュされ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ含有、ｐＨ７．４のＰＢＳに再懸濁された。次いで、細胞は、ゆっくり撹拌されつつ、１０ｍｇ／ｍＬのｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで、氷上、８時間処理された。その後、０．１％（容量／容量）のアミノエタノールが添加され、余分なエステル基との反応を完了させた。
この方法によって改変されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．は、増加した水和層に提供され、それにより、クルードのオイル懸濁液において、より効率的な好気的代謝を可能にする。
【００８８】
実施例３１
（ポリ〔（ＨＰＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐ）〕−グラフト−オレイルアミン）での、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．の改変。
ジエチルアミンが添加された（塩基性を高めるため）、無水ＤＭＳＯ１００μＬ中の、濃縮されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（２×１０８／ｍＬ）が、１００μｇの（ポリ〔（ＨＰＭＡ）−ｃｏ−（ＭＡＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐ）〕−グラフト−オレイルアミン）で、氷上、４時間処理された。次いで、０．１％（容量／容量）のアミノエタノールが添加され、余分なエステル基との反応を完了させた。得られた、ポリマー改変されたバクテリアは、非水性溶媒、とりわけオイルにおける向上された溶解性を示した。この方法により改変されたバクテリアは、概して、クルードオイルスリック中での、より高い保持能を有し、結果として、バイオレメディエーションに対して、向上された特別の活性を生じさせるであろう。
【００８９】
実施例３２
バクテリオファージＭ１３の改変および再ターゲット化。
バクテリオファージＭ１３は、ＬＢ培地中のＥ．Ｃｏｌｉ  ＥＲ２５３７株中で増殖された。ファージは公知の方法で、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓからのプロトコルに記載されるように、ポリ（エチレングリコール）を用いた沈殿により精製され、次いで、透析によって、Ｈｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（ｐＨ７．８）に戻された。次いで、ファージは、２７４ｎｍでの吸収の低下を測定することにより反応をモニターしつつ、ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨＳとの反応により改変された。１時間後、ファージは、ヘルセプチン（ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）（ＨＥＲ２プロト−オンコジーンを認識するモノクローナル抗体）の添加によって再ターゲット化され、ヘルセプチンの、ポリマー改変されたファージ上の余分な反応性エステルとの結合を可能にした。精製後、得られた再ターゲット化されたファージは、ＨＥＲ２−ポジティブ細胞による蓄積を、１００倍を超える増加された速度にすることを示した。
【００９０】
認められるように、本発明は多くの異なる態様を提示し、それは、本明細書において、明白にまたは暗黙のうちに、また、単独でまたは互いに組み合わせて開示される、全ての新規なそして発明である特徴及び態様をその範囲に包含するものである。また、多くの改変が可能であり、特に、本発明の範囲は、例示的な実施例によって、または単に記述的にもしくは説明的な意味で本明細書において使用される用語および表現によって限定されるものとして構成されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、合成ポリマーで表面改変した後の、アデノウイルス粒子上のフリーのアミノ基のフルオレスカミン測定の結果を示すグラフである。
【図２】  図２は、ポリマーとアデノウイルスとの間での典型的な反応の分光光度的な測定結果を示すグラフである。
【図３】  図３は、ポリマーのアデノウイルスとの反応が、ファイバータンパク質の改変をもたらすことを示すウエスタンブロットの結果を示す写真である。
【図４】  図４は、ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐを用いて表面を改変した後での、アデノウイルスの細胞毒性の低減を示す顕微鏡写真である。
【図５】  図５は、競合的ＥＬＩＳＡ法を用いて測定される、ポリマーでコートされたアデノウイルスの、低減された抗体結合性を示すグラフである。
【図６】  図６は、野生型Ａｄ５およびポリマーでコートされたＡｄ５の、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ；倍率１０００００倍）写真である。
【図７】  図７は、ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐとの反応後の、Ａ５４９細胞における、Ａｄ５−ＧＦＰの感染性の低減を示すグラフである。
【図８】  図８は、ｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＯＮｐでの反応後での、ヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞におけるＡｄ５−ＧＦＰの感染性の低減を示すグラフである。
【図９】  図９は、ポリマーでコートされたウイルスを、成長因子ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦを用いて再ターゲット化することによる、Ａ５４９細胞における感染性の回復を示すグラフである。
【図１０】  図１０は、ポリマーでコートされたウイルスをｂＦＧＦまたはＶＥＧＦで再度ターゲッティングすることによる、Ａ９、Ａ９−２１、Ａ５４９およびヒト臍静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞での、感染性回復の分析を示すグラフである。
【図１１】  図１１は、ｂＦＧＦで再ターゲット化されたポリマーでコートされたウイルスが使用され、ＹＳＫ１９に感染させた場合の効果を示すグラフである。
【図１２】  図１２は、Ａｄ５−ＧＦＰまたはｐＨＰＭＡ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＮｐで改変されたＡｄ５−ＧＦＰを用いた、中和抗体の感染阻害効果の評価を示すグラフである。
【図１３】  図１３は、反応性ポリマーの濃度が、ポリマー改変されたアデノウイルスに残っている感染活性におよぼす影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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