(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基の少なくとも一種を官能基とするキチン誘導体を、水酸化カルシウムおよび塩化カルシウムの少なくとも一つを含むカルシウム塩水溶液に溶解し、この溶解液にエポキシ化合物を添加し、その後、さらに、リン酸カルシウム系材料の粉末を添加したものを型に流し込み凍結乾燥する工程、及びこの凍結乾燥した成型物を加熱処理する工程を含むことを特徴とする吸収性生体材料の製造方法。
【請求項２】
前記エポキシ化合物の添加重量がキチン誘導体重量に対して３〜３０質量％であることを特徴とする請求項１記載の吸収性生体材料の製造方法。
【請求項３】
前記リン酸カルシウム系材料の添加重量は、前記エポキシ化合物を添加した溶解液の重量に対して１０〜２００質量％であることを特徴とする請求項１または２記載の吸収性生体材料の製造方法。
【請求項４】
前記加熱処理後、未反応のカルシウム塩及びエポキシ化合物を洗浄除去した後、再度凍結乾燥を行うことを特徴とする請求項１記載の吸収性生体材料の製造方法。
【請求項５】
前記加熱処理温度が１１０℃〜１６０℃であることを特徴とする請求項１記載の吸収性生体材料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、疾患、事故、老齢などにより失われた骨組織および軟骨欠損を修復するために充填使用する吸収性生体材料とその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
吸収性生体材料として、従来、化学架橋剤を用いずに熱架橋したカルボキシメチルキチン(以下CMキチンと略する)の多孔質マトリックス中に、顆粒状のハイドロキシアパタイト、第三リン酸カルシウム（以下ＴＣＰと略する）などのリン酸カルシウム系材料を分散させたものがあった。この吸収性生体材料は、全体としてスポンジのような素材であることから充填する骨欠損部の形状に合わせて、はさみ等によりトリミングし、所定箇所の形状に適合させて詰め込むことが可能であった。したがって、充填箇所から脱落するおそれがなく、本格的な骨形成反応が起こるまでの不安定な期間、CMキチンのマトリックスによりリン酸カルシウム系材料の顆粒が保持された状態で、CMキチンのマトリックス中に存在するポア内に多量の液成分の透過吸収が可能で各種細胞が貯留される環境を提供する。この環境の下、リン酸カルシウム系材料の顆粒が新生骨の起因となり、CMキチンの分解吸収と併行して、ＣＭキチンが新生骨に置換されていくというものであった。
【０００３】
また、最近、学会で発表された比較的新しい生体材料として、カルシウム塩を導入したＣＭキチンをジビニルサルフォンで架橋して得たゲル状物を擬似体液中に浸漬することでその表面にアパタイトを形成することができることが報告されている("Spontaneous Formation of Bonelike Apatite on Carboxymethyl-Chitin Gel in Simulated Body Fluid" Sixth World biomaterials Congress Transaction)。このＣＭキチンについて、具体的な用途は言及されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記従来の吸収性生体材料のうち、前者のものは、リン酸カルシウムの顆粒を保持することで、効率的な新生骨置換を促すことができるものであった一方、機械的強度が低かったため、トリミングや充填の際の取扱いに細心の注意を払わなければならなかった。さらに、生体内環境下で生体内に吸収される速度が比較的速い場合があり、そのようなときに、骨の形成が不活発になる傾向があった。
【０００５】
一方、前記学会で発表された生体材料は、ジビニルサルフォンにより架橋されたＣＭキチンからなるものであり、かかる材料は十分大きな機械的強度と十分遅い生体吸収速度が得られるものではない。
【０００６】
本発明の目的は、上記従来技術の問題を解消し、トリミングの際の強度および生体内環境下での強度を向上させ、また、生体内での吸収速度を十分遅くさせることが可能な吸収性生体材料とその製造方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため本発明の吸収性生体材料は、カルシウムを含み、且つエポキシ化合物により架橋されたキチン誘導体からなることを特徴とする。
【０００８】
この構成によれば、上記カルシウムを含み、エポキシ化合物により架橋されたキチン誘導体が非常に優れた弾性を持ち、トリミングの際或いは生体内環境下での形態保持性を有しているので、術中の取扱いが非常に容易である。また、上記キチン誘導体は生体内吸収速度が十分遅いので、骨の形成を活発にすることができる。加えて、カルシウムイオンが吸収性生体材料内に留まることにより、近傍及び材料内で石灰化を引き起こす核となり、早期の骨修復を促すことができる。その結果、骨修復量を最大限大きくすることが可能である。
【０００９】
また、上記吸収性生体材料の製造方法として、本発明の製造方法は、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基の少なくとも一種を官能基とするキチン誘導体を、水酸化カルシウムおよび塩化カルシウムの少なくとも一つを含むカルシウム塩水溶液に溶解し、この溶解液にエポキシ化合物を添加し、その後、さらに、リン酸カルシウム系材料の粉末を添加したものを型に流し込み凍結乾燥する工程、及びこの凍結乾燥した成型物を加熱処理する工程を含むことを特徴とする。
【００１０】
かかる構成によれば、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基の少なくとも一種を官能基とするキチン誘導体が水溶性であるのでカルシウム塩水溶液中にキチン誘導体を溶解することで容易にカルシウムを導入することができる。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
【００１２】
本発明の吸収性生体材料は、カルシウムを含み、且つエポキシ化合物により架橋されたキチン誘導体からなる。この吸収性生体材料は、スポンジのような素材であることから充填する骨欠損部の形状に合わせて、はさみ等により所望形状にトリミングし、所定箇所に詰め込むことが可能である。
【００１３】
上記キチン誘導体としては、カルボキシメチルキチン、硫酸キチン、リン酸キチン、カルボキシメチル硫酸キチン、カルボキシメチルリン酸キチン等のカルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基の何れか一種類、あるいは二種類以上の官能基を有する水溶性キチン誘導体などがある。
【００１４】
上記エポキシ化合物としては、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル等のエポキシ基を分子内に２ヶ以上導入した化合物などがある。
【００１５】
上記吸収性生体材料は、前述のようにスポンジ状をしているので、骨形成誘導能を有するリン酸カルシウム系材料および／または生理活性物質を担持することができる。これにより、骨形成をより活発にすることができる。なお、生理活性物質とは、細胞表面のレセプターに結合するなどして生化学反応に関与するタンパク質などのことで、骨組織内に存在する未分化な間葉系細胞の骨芽細胞への分化を促進する骨形成タンパク質（ＢＭＰ）やTransforming Growth Factor β(ＴＧＦβ)または、繊維芽細胞増殖塩基性因子(ｂＦＧＦ)やInsulin-like Growth Factor(ＩＧＦ)など間接的に骨形成を誘導する機能性タンパク質などがある。また、生理活性物質として化学合成された（リコンビナント）骨形成因子を用いることも可能である。
【００１６】
かかる吸収性生体材料は次のようにして製造する。すなわち、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基の何れか一種類、あるいは二種類以上の官能基を有するキチン誘導体をカルシウム塩水溶液に溶解し、この溶解液にエポキシ化合物を添加撹拌したものを型に流し込み凍結乾燥する。そして、凍結乾燥した成型物を熱処理する。
【００１７】
上記カルシウム塩としては、水酸化カルシウム、塩化カルシウム等の水溶性のカルシウム塩などを用いることができる。
【００１８】
前記キチン誘導体をカルシウム塩水溶液に溶解した溶解液のキチン誘導体濃度は、２０ｗｔ%以下であることが好ましい。これは、２０ｗｔ%より大きい濃度では水溶液にするのが困難となる場合があるからである。
【００１９】
前記エポキシ化合物の添加量は、キチン誘導体の重量に対して３〜３０%であることが好ましい。エポキシ化合物の添加重量が3％未満では機械的強度向上および生体内での吸収速度を遅くする作用が小さくなる傾向があり、他方３０%を越えると生体が異物反応を起こす可能性があるためである。
【００２０】
また、前記溶解液にエポキシ化合物を添加して撹拌した後、さらに、リン酸カルシウム系材料および/または生理活性物質の粉末を添加してもよい。これらの添加により、骨形成能等の機能を向上させることができる。
【００２１】
前記リン酸カルシウム系材料あるいは生理活性物質の粉末の重量は、前記エポキシ化合物を添加した溶解液の重量に対して、１０％〜２００%であることが好ましい。１０％未満では骨形成能の機能を向上させる作用が小さい傾向があり、他方２００%を越えると、得られる吸収性生体材料が脆くなり、容易に型くずれする可能性があるからである。
【００２２】
さらに、前記加熱処理後、未反応のカルシウム塩及びエポキシ化合物を洗浄除去した後、再度凍結乾燥を行うことが好ましい。これは、残存しているエポキシ化合物のモノマー成分等を洗浄工程で除去し、生体内での異物反応の危険性を低減できるからである。
【００２３】
なお、前記加熱処理温度が１１０℃〜１６０℃であることが好ましい。１１０℃では、架橋に時間がかかり効率的に製造ができない傾向があり、他方、１６０℃以上の加熱処理では、キチン誘導体分子が低分子化し、その結果、埋入初期において、低分子成分の大量溶出に伴う強い炎症反応が引き起こされる恐れがある。
【００２４】
次に、本発明の具体的な実施例と比較例について、並びに、これら実施例品、比較例品を用いた実験例について、そして、実験の結果について説明する。
実施例
以下の順序で本発明の吸収性生体材料(実施例品)を作製した。
▲１▼カルボキシメチル化度７５%のＣＭキチン粉末をCa(OH)2水溶液に溶解し、５ｗｔ%溶解液を調製した。
【００２５】
▲２▼ＣＭキチン添加重量に対して１〜３０ｗｔ%のエポキシ化合物系の化学架橋剤、エチレングリコールポリグリジルエーテル(製品名：デナコール、ナガセ化成工業(株)製)を添加して撹拌した。
【００２６】
▲３▼上記溶解液の重量に対し、等重量または１／５倍重量のα-ＴＣＰ粉末を混入し、スターラーで撹拌した。
【００２７】
また、α-ＴＣＰ粉末を混合しない水溶液も準備した。
▲４▼上記▲３▼の溶解液を金属製、硬質ガラス製あるいはポリプロピレン製の容器中に適量を注入し、超低温保冷庫(−８０℃)で冷凍し、φ４ｍｍ、厚さ２〜３ｍｍの形状に整形した。
▲５▼上記▲４▼の成形物を２４時間凍結乾燥した。
▲６▼上記▲５▼の乾燥物を１１０℃の温度で２時間の真空熱処理を行い、架橋剤の反応を完了させた。
▲７▼上記▲６▼を蒸留水中に浸漬し、残余架橋剤とCa(OH)2を洗浄した。(２４時間、８時間ごとに水を交換する)。
▲８▼再度凍結及び凍結乾燥処理を行った。
比較例
以下の順序で比較例品の吸収性生体材料を作製した。
▲１▼カルボキシメチル化度７５%のCMキチン粉末を蒸留水に溶解し、５ｗｔ%水溶液を調製した。
▲２▼上記▲１▼の水溶液を金属製、硬質ガラス製あるいはポリプロピレン製の容器中に適量を注入し、超低温保冷庫(−８０℃)で冷凍し、φ４ｍｍ、厚さ２〜３ｍｍの形状に成形した。
▲３▼上記▲２▼の成形物を凍結乾燥した。
▲４▼上記▲３▼の乾燥物を１６０℃の温度で２４時間の真空熱処理を行い、熱架橋を施した。
▲５▼上記▲４▼を蒸留水中に浸漬させて洗浄し、再度凍結及び凍結乾燥処理を行った。
【００２８】
これら実施例品と比較例品を用いて以下の要領で実験を行った。
実験例１
所望の形状にトリミングする際の前記吸収性生体材料の強度特性を確認するために乾燥状態における圧縮強度実験を実施した。
圧縮方向の厚みが半分になるまで圧縮し、そのときの応力値を圧縮強度とした。
実験例２
吸収性生体材料を生体組織内に埋入した場合を想定し、材料の強度特性を確認するため含水状態における圧縮強度実験を実施した。
【００２９】
吸収性生体材料を、蒸留水に５分間浸漬した後、水中から取り出して、圧縮方向の厚みが半分になるまで圧縮し、そのときの応力値を圧縮強度とした。
実験例３
カルシウムイオンが吸収性生体材料内に留まることで近傍及び材料内で石灰化を引き起こす核となり、早期の骨修復を促す。そこで、吸収性生体材料中のカルシウムイオン貯留量の指標としてその保持率を以下の手順で求めた。
【００３０】
吸収性生体材料を蒸留水中に２４時間浸漬し、溶出したカルシウムイオン量(A)をICPにて測定した。さらに、浸漬後の吸収性生体材料を水酸化ナトリウム水溶液で溶解させた後、溶解液中のカルシウムイオン量(B)をＩＣＰにて測定した。カルシウムイオンの保持率は以下の式で算出した。
カルシウムイオンの保持率(％)＝ Ａ／(Ａ＋Ｂ) ×１００
実験例４
生体内におけるキチン誘導体の分解性を比較するため、生体内でキチン誘導体を主に分解する酵素であるリゾチームを用いて酵素分解性を確認した。
【００３１】
リゾチームを添加したリン酸緩衝液(ｐＨ：７．４)中に、実施例品及び比較例品の吸収性生体材料を24時間浸漬させ、重量減を測定した。酵素分解性の指標として残存率を浸漬前重量(α)と浸漬後の重量(β)を用いて以下の式で算出した。
【００３２】
キチン誘導体残存率(％)＝  (β/α)×100
実験例５
実施例品、およびα−ＴＣＰ粉末(平均粒径10μm)を混合した実施例品、比較例品を家兎脛骨骨幹部に形成した骨欠損部（動物実験１）、大腿骨関節面（動物実験２）に形成した骨、軟骨欠損部に吸収性生体材料を埋入し、骨の経時的な修復状態を観察した。
【００３３】
α-ＴＣＰを含有しない実施例品、含有した実施例品は、いずれもエポキシ化合物をＣＭキチン重量に対して5重量％添加したものである。また、α-ＴＣＰを含有した実施例品は、α-ＴＣＰをＣＭキチン・エポキシ化合物溶解液の重量に対して等重量分添加したものである。
【００３４】
この動物実験の手順を以下に説明する。
1.全身麻酔下に家兎（ニュージーランドホワイト、生後１２週、オス）の脛骨骨幹部、大腿膝関節面を露出した。
2.脛骨骨幹部の露出箇所、関節面の中央部から大腿骨長軸方向にドリルにて直径４ｍｍ、深さ１０ｍｍの孔を形成した。
ここで、直径を４ｍｍとした理由は、家兎軟骨層の自然治癒限界を超える径４ｍｍというサイズを設定し、実施例品と比較例品の軟骨修復効果を明確に把握するためである。
3.直径４ｍｍ、長さ１０ｍｍに調整した実施例品、α-ＴＣＰ粉末混合の実施例品、比較例品をそれぞれ埋入した。
4.吸収性生体材料の埋入後、関節包および皮膚を縫合した。
なお、孔形成後、吸収性生体材料を埋入せずにそのままの状態で縫合したものを自然治癒（ブランク）例とした。
また、孔形成を行わず、全く処置を行わなかったものを無処置例とした。
実験結果
実験例１〜４の試験の結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
0004683694.tif 000002
【００３６】
表１から明らかなように、乾燥時の強度は実施例品が比較例品よりも高い強度を示し、エポキシ化合物の添加量に関しては、２０ｗｔ％までは添加量が増加するほど高強度を示した。また、α−ＴＣＰの添加量を増やした方がより高い強度を示した。トリミング時の操作性の点ではエポキシ化合物及びα-ＴＣＰの添加量を増やした方が望ましいことが分かる。ただし、エポキシ化合物を２０％以上加えても強度が増加せず、２０〜３０％の間で極値となる傾向がある。
【００３７】
含水時の圧縮強度も乾燥時と同様の傾向を示している。生体内環境下での強度においても、添加量２０ｗｔ％まではエポキシ化合物の添加量を増加させた方が望ましいことがわかった。また、全実施例品について含水時の圧縮強度測定後、圧縮応力を取り除いた際に元の形状に完全に復元することを確認した。この復元力は、吸収性生体材料の埋入時に欠損部位形状に形状適合するのに寄与するものである。
【００３８】
カルシウム保持率とキチン誘導体残存率に関しては、架橋剤を５ｗｔ％まで添加したものは、添加量の増加に応じて率も増加するが、５ｗｔ％を超えると添加量を増加しても率の変化が少なかった。
【００３９】
生体内での吸収性生体材料の吸収速度の指標としての（キチン誘導体）残存率に関しては、熱架橋で架橋された比較例品に比べて、実施例品のすべてが遅い結果であった。
【００４０】
これら実験例１〜４の結果を総合的にみて、エポキシ化合物の添加量としては、２０〜３０ｗｔ％の範囲が特に好ましい。
【００４１】
次に、実験例５の結果を表２〜表４に示す。
これらの表において試料a）実施例品は表１における試料３、試料ｂ）α−ＴＣＰ含有の実施例品は表１における試料８、試料ｃ）比較例品は前述の比較例により得られた表１における試料９、試料ｄ）ブランク（欠損自然治癒例）は骨に孔形成後、吸収性生体材料を埋入せずにそのままの状態で縫合したもの、試料ｅ）無処置例は、孔形成を行わず、全く処置を行わなかったものである。
【００４２】
【表２】
0004683694.tif 000003
【００４３】
【表３】
0004683694.tif 000004
【００４４】
【表４】
0004683694.tif 000005
【００４５】
表２から明らかなように、自然治癒困難と報告されている大きな欠損部において［試料ｄブランク（欠損自然治癒例）を参照］、試料ａ）実施例品および試料ｂ）α−ＴＣＰ含有の実施例品では、試料ｃ）比較例品に比較して極めて早期の段階で新生骨形成を導き、骨性封鎖の状態を達成し、最終的には試料ｅ）無処置例の骨厚みと同等の皮質骨再生が確認された。
【００４６】
また、表３から明らかなように関節面欠損部においても試料ａ）実施例品および試料ｂ）α−ＴＣＰ含有の実施例品では、試料ｃ）比較例品に比較して関節内の海綿骨と軟骨下骨の早期骨形成を導き、表４から明らかなように、同時に硝子軟骨を多く含む軟骨層の再生も確認された。
【００４７】
軟骨組織は、硝子軟骨と繊維性軟骨とが混在したものであり、硝子軟骨を多く含む状態が、より正常な治癒であると言える。
【００４８】
なお、これら表２〜４において試料ｅ）無処置例の値が２、４、８週で若干変化しているのは、家兎の固体差と成長の度合いの違いによるものである。また、表３の第８週で、α−ＴＣＰ含有の実施例品の値が無処置例の値よりも大きくなっているのは、組織の修復過程ではまず過剰気味に組織が形成され、その後、適量に落ち着くことが一般的であり、この８週目の値は過剰気味に組織が形成されている段階のものである。
【００４９】
【発明の効果】
以上のように本発明の吸収性生体材料によれば、カルシウムを含み、エポキシ化合物により架橋されたキチン誘導体が非常に優れた弾性を持ち、トリミングの際或いは生体内環境下での形態保持性を有しているので、術中の取り扱いが非常に容易である。また、上記キチン誘導体は生体内吸収速度が十分遅いので、骨の増殖が活発にすることができる。加えて、カルシウムイオンが吸収性生体材料内に留まることにより、近傍及び材料内で石灰化を引き起こす核となり、早期の骨修復を促すことができる。これらの結果、骨修復量を最大限大きくすることが可能である。
【００５０】
また、上記吸収生体材料の製造方法によれば、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基の少なくとも一種を官能基とするキチン誘導体が水溶性であり、カルシウム塩水溶液に溶解することで、容易にカルシウムを導入することがでる。