(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来アルカリホスファターゼを含有する水溶液にコール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸またはこれらの塩を添加することを特徴とするヒト由来アルカリホスファターゼの安定化方法。
【請求項２】
ヒト由来アルカリホスファターゼが形質転換動物細胞より得られるヒト由来肝型アルカリホスファターゼであることを特徴とする請求項１記載の安定化方法。
【請求項３】
ヒト由来アルカリホスファターゼがヒト由来アルカリホスファターゼと抗原、抗体、アビジン、ハプテン、ペプチド、又は核酸との結合物からなるヒト由来肝型アルカリホスファターゼ誘導体である、請求項１に記載の安定化方法。
【請求項４】
ヒト由来アルカリホスファターゼを含有する水溶液におけるコール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、またはグリコケノデオキシコール酸の濃度が０．２ｍＭ〜１０ｍＭであることを特徴とする請求項１記載の安定化方法。
【請求項５】
ヒト由来アルカリホスファターゼを含有する水溶液がコール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸またはこれらの塩を含有してなることを特徴とするヒト由来アルカリホスファターゼの安定化水溶液。
【請求項６】
コール酸、タウロコール酸、デオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、またはこれらの塩からなるヒト由来アルカリホスファターゼの安定化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、精度管理用試料、酵素免疫測定法に基づく検査試薬に用いられるアルカリホスファターゼまたはその誘導体の水溶液の安定化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）は、植物、動物、および微生物などに存在することが知られている酵素である。臨床検査においては、血清中の酵素活性が測定され、種々の病態を反映することが知られている。また、動物由来、とりわけ牛小腸ＡＬＰは、その分子活性が高いことから、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）の標識酵素として汎用されている。
【０００３】
したがって、ＡＬＰ含有組成物は、検体検査時にはＡＬＰ酵素活性測定の際のコントロールまたは標準物質として、また、ＥＩＡにおいてＡＬＰを標識酵素として用いる免疫試薬としても有用である。
アルカリホスファターゼ水溶液の安定化に関して、アルカリホスファターゼに可逆的な結合活性を有するリン酸、リン酸エステルおよびこれらの塩などを添加する報告がある（特開平８−１６８３７７号）が、これらの化合物は、該酵素の基質または生成物でもあるため、保存中に添加物自体が分解されたり、酵素活性測定に及ぼす影響が懸念される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、冷蔵（２〜８度）で長期間、また、３７℃付近の温度でも最低１ヶ月は活性の変動のないアルカリホスファターゼ、またはその誘導体を含む水溶液の安定化方法を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、コール酸、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸などの胆汁酸または抱合胆汁酸をＡＬＰまたはその誘導体の水溶液に添加することによって、劇的にその安定性が増すことを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明に関して、以下具体的に説明する。本発明において、安定化剤として用いられる胆汁酸としては、ケノデオキシコールコール酸、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、コール酸およびこれら胆汁酸塩、またはこれら胆汁酸のグリシン抱合体、タウリン抱合体および塩が挙げられる。これら胆汁酸類の好適な濃度としては０．１〜２０ｍＭ、特に好ましくは０．２〜１０ｍＭである。
【０００７】
また、本発明に用いられるアルカリホスファターゼについては、その用途が合致すれば特に限定されない。例えば、動物起源としては、牛腎臓、ブタ腎臓、ニワトリ小腸などが、微生物起源としては、大腸菌由来のものが市販されている。また、ＨｅＬａ細胞や羊膜細胞などの株化細胞の培養物から取得することもできる。さらに、近年の遺伝子工学技術の発展により、ヒト由来ＡＬＰ蛋白質をコードする遺伝子も明らかになっており、これらの遺伝子を組み込んだ形質転換体細胞からも取得できる。例えば、肝型ＡＬＰが形質転換動物細胞より取得、精製され旭化成（株）より市販されている（旭化成（株）診断用酵素カタログ）。
【０００８】
また、この際、形質転換体細胞としては、ヒト細胞のみでなく、チャイニーズハムスター由来ＣＨＯ細胞等のヒト以外の動物細胞や大腸菌、酵母、カビなどの微生物を用いることもできる。さらに、ＡＬＰのアミノ酸配列の一部が削除または置換され、他のアミノ酸残基またはアミノ酸配列が付加されているＡＬＰ誘導体をコードする遺伝子を用いた形質転換体を用いることもできる。これら生産された酵素は、市販されたもの以外は、カラムクロマトグラフィ法等の公知の精製法を組み合わせ、実用レベルまで純度を高めて本目的に使用すればよい。また、上記のＡＬＰに抗原、抗体、アビジン、ペプチドなどを結合して用いることもできる。
【０００９】
本発明におけるこれらの酵素添加量は、特に限定されないが、９〜６５００Ｕ／Ｌ、特に好ましくは４５〜１３００Ｕ／Ｌである。
これらの化合物は、例えば、トリスやＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳなどの緩衝能を有する水性媒体を用いて中性付近のｐＨ、具体的にはｐＨ５．５〜８．５の範囲になるように調整すればよい。また、雑菌による汚染を防ぐため、適宜防腐剤等を添加することもできる。防腐剤の例としては、ゲンタマイシン、カナマイシン、アンピシリン等の抗生物質、ホウ酸、プロクリン(ProClin)などの静菌剤などが挙げられる。
【００１０】
以下、本発明を実施例に基づいて説明する。
【実施例１】
０．０１％ＢＳＡ、１０μＭ塩化亜鉛、０．０５％アジ化ナトリウム、５００Ｕ／Ｌのアルカリホスファターゼ（旭化成（株）、製品ナンバーＴ−７３）を含有する４０ｍＭＢＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液に各種添加剤を加えて、３７℃の活性推移を追った。表１に示したとおり、添加物無添加の２３日目の残存活性が６７．４％であるのに対し、各種胆汁酸類を２．５ないし５ｍＭ加えたものは、８６．５％以上の残存活性を示した。
【００１１】
【表１】
0004761337.tif 000002
【００１２】
【実施例２】
０．０５％ＢＳＡ、１０μＭ塩化亜鉛、０．０５％アジ化ナトリウム、５００Ｕ／Ｌのアルカリホスファターゼ（旭化成（株）、製品ナンバーＴ−７３）を含有する４０ｍＭＢＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液に、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム（Ｎａ・ＧＣＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸ナトリウム（Ｎａ・ＣＤＣＡ）の濃度をそれぞれ３水準設定して加え、２５℃、および３７℃保存における活性の推移を調べた。表２に示したとおり、２５℃では少なくとも１ヶ月間は活性の低下が全く認められず、また、３７℃においても、Ｎａ・ＧＣＤＣＡが１ｍＭ、Ｎａ・ＣＤＣＡでは２．５ｍＭ以上で、やはり１ヶ月活性の低下は認められなかった。
【００１３】
【表２】
0004761337.tif 000003
【００１４】
【実施例３】
０．１％ＢＳＡ、１０μＭ塩化亜鉛、０．０５％アジ化ナトリウム、５００Ｕ／Ｌのアルカリホスファターゼ（旭化成（株）、製品ナンバーＴ−７３）を含有する４０ｍＭＢＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液に、グリコケノデオキシコール酸ナトリウム（Ｎａ・ＧＣＤＣＡ）を２ｍＭになるように加え、５℃、１０℃、―２０℃保存における安定性を調べた。表３に示すように、５℃、１０℃の冷蔵保存で９ヶ月まで全く活性が低下していない。また、−２０℃の凍結保存でも同様活性低下が認められなかった。
【００１５】
【表３】
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【００１６】
【発明の効果】
本発明によるアルカリホスファタ−ゼ水溶液は、冷蔵で少なくとも９ヶ月、また、３７℃においては１ヶ月活性の低下が全く認められず、極めて安定性に富む組成とすることができたものである。