(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも平滑筋細胞および／または内皮細胞に対する組織向性が与えられた遺伝子送達ビヒクルであって、アデノウイルス１１、アデノウイルス１６、アデノウイルス３５およびアデノウイルス５１からなる群より選択される血清型のアデノウイルスのファイバータンパク質を含むキャプシドをコードする核酸を含むＣ亜群由来の血清型の組換えアデノウイルスである遺伝子送達ビヒクルであって、該Ｃ亜群アデノウイルス由来のキャプシドタンパク質が非ファイバーキャプシドタンパク質である遺伝子送達ビヒクル。
【請求項２】
Ｃ亜群由来の血清型がアデノウイルス５である請求項１記載のビヒクル。
【請求項３】
アデノウイルス１６のファイバータンパク質を含むキャプシドをコードする核酸を含む請求項１または２記載のビヒクル。
【請求項４】
前記組換えアデノウイルスが、該アデノウイルス核酸の標的細胞中での複製能力を低減されるかまたは無くすように修飾されたアデノウイルス核酸を含む請求項１〜３のいずれかに記載のビヒクル。
【請求項５】
さらに少なくとも１つの非アデノウイルス核酸を含む請求項１〜４のいずれかに記載のビヒクル。
【請求項６】
少なくとも１つの前記非アデノウイルス核酸が、アポリポタンパク質、酸化窒素シンターゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、インターロイキン−３、インターロイキン−１α、アンギオスタチンなどの（抗）血管新生タンパク質、抗増殖性タンパク質、平滑筋細胞抗遊走タンパク質、血管内皮生長因子（ＶＧＥＦ）、塩基性線維芽細胞生長因子、低酸素症誘導因子１α（ＨＩＦ−１α）またはＰＡＩ−１をコードする遺伝子の群から選択された遺伝子である請求項５記載のビヒクル。
【請求項７】
平滑筋細胞および／または内皮細胞への遺伝子送達方法であって、請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子送達ビヒクルをインビトロにおいて平滑筋細胞および／または内皮細胞へ供給する工程を含む方法。
【請求項８】
アデノウイルス５の配列２１５６２−３１０９４および３２７９４−３５９３８を含み、さらにファイバータンパク質をコードするアデノウイルス１６遺伝子を含む構築物ｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲｆｉｂ１６。
【請求項９】
アデノウイルス５の配列２１５６２−３１０９４および３２７９４−３５９３８を含み、さらにファイバータンパク質をコードするアデノウイルス１６遺伝子を含み、かつさらに該構築物の非アデノウイルス配列骨格中、アデノウイルス５右末端反復配列付近に唯一のＰａｃＩ部位を含む構築物ｐＢｒ／ＡｄＢａｍＲ.ｐａｃ／ｆｉｂ１６。
【請求項１０】
アデノウイルス５配列３５３４−３１０９４および３２７９４−３５９３８を含み、さらにファイバータンパク質をコードするアデノウイルス１６遺伝子を含む構築物ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩｒＩＴＲｆｉｂ１６。
【請求項１１】
アデノウイルス５配列３５３４−２２４４３、２４０３３−３１０９４および３２７９４−３５９３８を含み、さらにファイバータンパク質をコードするアデノウイルス１６遺伝子を含む構築物ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩｒＩＴＲＤＥ２Ａｆｉｂ１６。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は分子遺伝学と医学の分野に関する。具体的には、本発明は遺伝子治療、より具体的にはアデノウイルスを用いる遺伝子治療の分野に関する。
【０００２】
発明の背景
通常、遺伝子治療では、宿主細胞に、その細胞内の遺伝的欠損を矯正する（補う）ため、またはその細胞内の望ましくない機能を抑制するため、またはその宿主細胞を排除するために、遺伝情報が送達される。もちろんその遺伝情報には、その宿主細胞に望ましい機能を与えることも意図され、たとえばその宿主の他の細胞を処置するために分泌タンパク質を供給することなどを意図されうる。
【０００３】
新しい遺伝情報を細胞に導入するために数多くのさまざまな方法が開発されている。インビトロで培養された細胞株に働きうる数多くのさまざまな系があるが、インビボで必要とされる遺伝子導入効率を満たすことができるのは、ウイルスベクター媒介の遺伝子送達法のグループだけのようである。したがって遺伝子治療の目的では、大半の注目が好適なウイルスベクターの開発に向けられている。現在、好適なウイルスベクターを開発するための大半の注目はアデノウイルスに基づくベクターに向けられている。これらのアデノウイルスベクターは外来の遺伝情報をインビボの標的細胞にきわめて効率よく送達できる。さらにまた、大量のアデノウイルスベクターを得ることは、ほとんどのタイプのアデノウイルスベクターにとって、問題ではない。アデノウイルスベクターは比較的簡単に濃縮、精製できる。さらにまた、臨床試験での研究により、患者におけるこれらのベクターの使用に関する価値ある情報が得られている。
【０００４】
遺伝子治療プロトコルで標的細胞への核酸の送達にアデノウイルスベクターを使用する理由はたくさんある。しかし現行のベクターのいくつかの特徴は、特定の適用へのそれらの使用を制限している。たとえば、内皮細胞と平滑筋細胞は現行世代のアデノウイルスベクターでは容易には形質導入されない。心血管領域での適用などの多くの遺伝子治療の適用では、好ましくは、これらのタイプの細胞が遺伝的に改変されるべきである。他方で、一部の適用例では、アデノウイルスベクターのきわめて良好なインビボの送達能力でさえ不充分であり、より高い導入効率が必要とされる。たとえば、標的組織の大半の細胞を形質導入する必要がある場合などがこれにあてはまる。
【０００５】
本発明はアデノウイルスベクターの操作の過程で行なわれた。そこで、以下の項ではアデノウイルスを簡単に概論する。
【０００６】
アデノウイルス
アデノウイルスは約36000塩基対の線状２本鎖DNA分子を含有する。これは約90〜140塩基対の同一な逆方向末端反復配列（ITR）を含有し、その正確な長さは血清型に依存する。ウイルス複製起点はそのITR内のまさにゲノムの末端にある。転写単位は初期領域と後期領域に分割される。感染後間もなくE1Aタンパク質とE1Bタンパク質が発現され、細胞遺伝子とアデノウイルス遺伝子のトランス活性化に機能する。初期領域E2AとE2Bはアデノウイルスゲノムの複製に必要なタンパク質（DNA結合タンパク質、プレ末端タンパク質およびポリメラーゼ）をコードする（1995年のファン  デル  ブリート（van der Vliet）に概説されている）。初期領域E4は、たとえばE2初期プロモーターのトランス活性化、感染の遅発相でウイルスmRNAの輸送と蓄積を促進し、主要後期mRNA前駆体の核安定性を増加させるなどの多面的な機能をもつ数種類のタンパク質をコードする（1997年のレパード（Leppard）に概説されている）。初期領域３は、宿主の免疫応答の調節に関与するタンパク質をコードする（ワード（Wold）ら、1995年）。後期領域は単一のプロモーター（主要後期プロモーター）から転写され、DNA複製の開始に活性化される。複雑なスプライシングおよびポリアデニル化機構により、コアタンパク質、キャプシドタンパク質（ペントン、ヘキソン、ファイバーおよび関連タンパク質）、ウイルスプロテアーゼ、キャプシドの組立と宿主タンパク質翻訳の停止に必要なタンパク質をコードする12を超えるRNA種が生じる（「アデノウイルスの分子的レパートリー  Ｉ（The molecular repertoire of adenoviruses I）」、ダブリュ  ドエルフラー（W.Doerfler）およびピー  ボーン（P.Bohm）編、スプリンガーベルラグ（Springer-Verlag）社、ベルリン・ハイデルベルク）の139〜171頁、インペリアル  エム  ジェー（Imperiale，M.J.）、アクスナルビ  ジー（Akusjnarvi，G.）およびレパード  ケイ  エヌ（Leppard，K.N.）著（1995年）「アデノウイルス遺伝子発現の転写後調節（Post-transcriptional control of adenovirus gene expression）」）。
【０００７】
ウイルスと宿主細胞のあいだの相互作用
ウイルスの宿主細胞との相互作用は主として血清型ＣウイルスAd2とAd5で研究されている。結合は突出したファイバーのノブ領域の細胞レセプターとの相互作用によって起こる。Ad2およびAd5、ならびにおそらくより多くのアデノウイルスのレセプターは「コクサッキーウイルスおよびアデノウイルスレセプター」、すなわちCARタンパク質として知られている（ベルゲルソン（Bergelson）ら、1997年）。インターナリゼーションは、ペントンベース中に存在するRGD配列と細胞インテグリンとの相互作用によって媒介される（ウィックハム（Wickham）ら、1993年）。これはすべての血清型に当てはまるわけではなく、たとえば血清型40と41はそのペントンベース配列中にRGD配列を含有しない（キッド（Kidd）ら、1993年）。
【０００８】
ファイバータンパク質
成功した感染の最初の段階は、標的細胞へのアデノウイルスの結合であり、この過程はファイバータンパク質によって媒介される。ファイバータンパク質は三量体構造を有し（ストウテン（Stouten）ら、1992年）、その長さはウイルス血清型によって異なる（シグナス（Signas）ら、1985年；キッド（Kidd）ら、1993年）。異なる血清型は、ＮおよびＣ末端は構造上類似するが中間のステム領域が異なるポリペプチドをもつ。Ｎ末端の最初の30アミノ酸はペントンベース、とくにテールの保存されたFNPVYP領域（アルンバルグ（Arnberg）ら、1997年）へのファイバーの固定に関与する（クロボクゼック（Chroboczek）ら、1995年）。Ｃ末端、すなわちノブは細胞アデノウイルスレセプターとの初期の相互作用を担う。この初期結合ののち、キャプシドペントンベースと細胞表面インテグリンのあいだの二次的な結合が被覆ピットにおけるウイルス粒子のインターナリゼーションとエンドサイトーシスを引き起こす（モーガン（Morgan）ら、1969年；スヴェンソン（Svensson）およびペルッソン（Persson）、1984年；バルガ（Varga）ら、1991年；グレバー（Greber）ら、1993年；ウィックハム（Wickham）ら、1993年）。インテグリンは少なくとも１４種類のαサブユニットと８種類のβサブユニットが同定されているαβヘテロ二量体である（ハイネス（Hynes）、1992年）。細胞で発現される一連のインテグリンは複雑で、細胞型と細胞環境ごとに変動するだろう。ノブは保存された領域をいくつか含有するが、ノブタンパク質は血清型間で高度の可変性を示すことから、異なるアデノウイルスレセプターの存在が示唆される。
【０００９】
アデノウイルス血清型
現在、ヒトアデノウイルスには、全部で約５０種類のアデノウイルス血清型を包含する６つの異なる亜群が提唱されている。これらのヒトアデノウイルスのほかに、数多くの動物アデノウイルスが同定されている（たとえばイシバシ（Ishibashi）およびヤスエ（Yasue）、1984年参照）。血清型は、動物抗血清（ウマ、ウサギ）での定量的中和によって決定されるその免疫学的弁別性に基づいて定義される。中和が２つのウイルス間で一定程度の交差反応を示す場合は、A）赤血球凝集阻害での交差反応の欠如によって示されるようにそれらの赤血球凝集素が無関係であるか、B）DNA中に実質的な生物物理学的/生化学的相違が存在するならば、血清型の弁別性が想定される（フランキ（Francki）ら、1991年）。最後に同定された血清型（42〜49）はHIV感染患者から初めて単離された（ハイアホルザー（Hierholzer）ら、1988年；シュヌル（Schnurr）ら、1993年）。理由はよくわかっていないが、それらの免疫無防備な患者の大半は、免疫能をもつ各人からは決して単離されなかったアデノウイルスを放出する（ハイアホルザー（Hierholzer）ら、1988年、1992年；クー（Khoo）ら、1995年）。
【００１０】
さまざまなアデノウイルス血清型の中和抗体に対する感受性に関する相違のほかに、Ad2やAd5などのＣ亜群のアデノウイルスは、Ad3やAd7などのＢ亜群に属するアデノウイルスと比べて異なるレセプターに結合する（デファー（Defer）ら、1990年；ガル（Gall）ら、1996年）。また、レセプター特異性はAd3ノブタンパク質をAd5ノブタンパク質と交換することによって改変でき、逆もまた同様であることが立証された（クラスニコ（Krasnykh）ら、1996年；スティブンソン（Stevenson）ら、1995年、1997年）。血清型２、４、５および７はすべて、肺上皮および他の呼吸組織と天然の密接な関係をもつ。これに対し、血清型40と41は胃腸管と天然の密接な関係をもつ。これらの血清型は、少なくともキャプシドタンパク質（ペントン−ベース、ヘキソン）、細胞結合を担うタンパク質（ファイバータンパク質）、アデノウイルス複製に関与するタンパク質が相違する。キャプシドタンパク質が血清型間にみられる向性の相違をどの程度決定するかはわかっていない。感染後の機構がアデノウイルスの細胞型特異性を決定することは充分にありうる。血清型Ａ（Ad12とAd31)、Ｃ（Ad2とAd5)、Ｄ（Ad9とAd15)、Ｅ（Ad4）およびＦ（Ad41）に属するアデノウイルスはすべて、ニトロセルロースに固定した場合、標識された可溶型CAR（sCAR）タンパク質を結合できることが示されている。さらにまた、高レベルのCARを発現させるがインテグリンを欠くラモス（Ramos）細胞（ロエルビンク（Roelvink）ら、1996年）への、これら血清型に属するアデノウイルスの結合は、感染に先立ってsCARをウイルスに添加することによって効率よく遮断できた（ロエルビンク（Roelvink）ら、1998年）。しかし、これらの亜群の（少なくとも一部の）メンバーがCARを結合できるという事実は、これらのウイルスが異なる細胞型で異なる感染効率をもつことを排除するわけではない。たとえばＤ亜群血清型は、Ａ亜群およびＣ亜群のウイルスと比べて比較的短いファイバーシャフトをもつ。Ｄ亜群ウイルスの向性は、大部分はインテグリンへのペントンベースの結合によって決定されると推測されている（ロエルビンク（Roelvink）ら、1996年；ロエルビンク（Roelvink）ら、1998年）。もう一つの例は、1998年に14種類の血清型をヒト繊毛気道上皮（CAE）の感染について調べ、血清型17（Ｄ亜群）が、Ｄ亜群の他のメンバーを含む他のどのウイルスよりも効率よく結合され内在化されることを見出したザブナー（Zabner）らによって提供される。Ａ〜Ｆ亜群に属する血清型を用いた初代胎児ラット細胞における同様の実験は、Ａ亜群とＢ亜群に属するアデノウイルスが無効であり、Ｄ亜群に属するウイルスが最も有効であることを示した（ロー（Law）ら、1998年）。この場合も、１亜群内のウイルスが異なる効率を示した。CAEにおけるAd17の向上した感染性にとってファイバー結合が重要であることは、Ad17由来のファイバー遺伝子をもつ組換えLacZ Ad2ウイルスを作製し、そのキメラウイルスがAd2ファイバーをもつLacZ Ad2ウイルスよりも効率よくCAEに感染することを示したアルメンタノ（Armentano）ら（国際公開第WO98/22609号公報）によって示された。
【００１１】
このように、CARを結合するというそれらに共通の能力にもかかわらず、異なる血清型のファイバーの長さ、ノブ配列および、たとえばペントンベースなどの他のキャプシドタンパク質の相違が、あるアデノウイルスが一定の標的細胞を感染する際の効率を決定しうる。この点で、Ad5ファイバーとAd2ファイバーがフィブロネクチンIIIとMHCクラス1α2由来ペプチドに結合でき、Ad3ファイバーがそれをできないことは興味深い。これは、アデノウイルスがCAR以外の細胞レセプターを使用できることを示唆している（ホング（Hong）ら、1997年）。血清型40と41（Ｆ亜群）は、シャフトの長さが異なる２つのファイバータンパク質を担持することが知られている。長シャフトの41LファイバーはCARを結合することが示されるが、短シャフトの41SはCARを結合できない（ロエルビンク（Roelvink）ら、1998年）。この短いファイバーのレセプターは知られていない。
【００１２】
アデノウイルス遺伝子送達ベクター
遺伝子治療で現在使用されている大半のアデノウイルス遺伝子送達ベクターは、血清型ＣアデノウイルスAd2またはAd5に由来する。これらのベクターはE1領域に欠失をもち、そこに新しい遺伝情報を導入することができる。E1欠失はその組換えウイルスを複製欠損性にする。組換えアデノウイルス、とくに血清型５は、動物モデルと免疫不全マウス中のヒト異種移植片で、肝臓、気道上皮および充実性腫瘍への効率のよいインビボの遺伝子導入に好適であることが広く証明されている（ボウト（Bout）1996年、1997年；ブラエセ（Blaese）ら、1995年）。
【００１３】
アデノウイルス由来の遺伝子導入ベクター（アデノウイルスベクター）は、それらを遺伝子導入にとってとりわけ有用であらしめるいくつかの特徴を有する：
1）アデノウイルスの生物学は詳しく特徴づけられている
2）アデノウイルスはヒトの重大な病理に関係しない
3）このウイルスはきわめて効率よくそのDNAを宿主細胞に導入する
4）このウイルスは多種多様な細胞に感染でき、広い宿主域をもつ
5）このウイルスは高い力価で大量に生産できる
6）このウイルスはそのウイルスゲノムの初期領域１（E1）の欠失によって複製欠損性にできる（ブロディ（Brody）およびクリスタル（Crystal）、1994年）。
【００１４】
しかし、アデノウイルスベクターの使用に伴う欠点が、今なお、いくつかある：
1）アデノウイルス、とりわけ、詳細に研究された血清型Ad2とAd5は、通常、それらが導入された宿主による免疫応答を誘発する
2）特定の細胞と組織に対してウイルスを標的にすることは現在のところできそうにない
3）アデノウイルスの複製とその他の機能は、追加の遺伝物質を提供しようとする細胞にとって常にきわめて適切であるとは限らない
4）血清型Ad2またはAd5は肝臓以外の器官に追加の遺伝物質を送達するのに理想的に適しているわけではない。肝臓はAd2またはAd5に由来するベクターでとりわけうまく形質導入されうる。血流によるそのようなベクターの送達は、肝臓の細胞へのベクターの有意な送達につながる。肝細胞以外の細胞型が形質導入される必要がある治療において、肝細胞によるベクターの取り込みを防ぐために、肝臓除外の手段を適用しなければならない。現行の方法は、肝細胞からのベクターの物理的隔離によっていて、それらの方法の大半は手術、バルーン血管形成術、またはたとえば針による器官への直接的注射によって、ベクターおよび/または標的器官を局在化することによっている。肝臓除外は、血流から本質的に隔離された体内の区画へのベクターの送達によっても実施され、それにより肝臓へのベクターの輸送を防ぐ。これらの方法は肝臓へのベクターの著しい送達を避けることにほとんど成功しているが、これらの方法の大半は粗雑で、まだかなりの漏れがあり、かつ/または不充分な標的組織侵入性をもつ。肝細胞へのベクターの不慮の送達が患者にとって有毒でありうる場合もある。たとえば、のちにガンシクロビルの投与によって分裂中のがん細胞を殺すために、単純ヘルペスウイルス（HSV）チミジンキナーゼ（TK）遺伝子を送達することは、そのベクターによって有意な量の肝細胞も形質導入される場合は、きわめて危険である。HSV-TK遺伝子の肝細胞への有意な送達とそれに続く発現は重度の毒性を伴う。したがって、低下した肝細胞形質導入効率という性質を与えられた本質的に安全なベクターが個別に必要とされている。
【００１５】
表の簡単な説明
表Ｉ：代替アデノウイルス血清型に由来するファイバータンパク質をコードするDNAの増幅に使用したオリゴヌクレオチドと縮重オリゴヌクレオチド。（太字はNdeI制限部位（Ａ〜Ｅ)、NsiI制限部位(１〜６、８)またはPacI制限部位（7）を表す。）
【００１６】
表II：静脈内尾静脈注射後のキメラアデノウイルスの体内分布。各値はルシフェラーゼ活性/μg-総タンパク質を表す。200相対光単位/μg-タンパク質未満の値はすべてバックグランドとみなす。ND＝未決定
【００１７】
表III：内皮細胞と平滑筋細胞の細胞表面でのCARとインテグリンの発現。70％：70％コンフルエンシーの細胞密度でFACS分析のために収集した細胞。100％：100％コンフルエンシーの細胞密度でFACS分析のために収集した細胞。PER.C6細胞は抗体染色の対照として採用した。値はCARまたはインテグリンのいずれか１つをバックグラウンドを超えるレベルで発現させる細胞の百分率を表す。バックグラウンド対照として、HUVECまたはHUVsmcを二次ラット抗マウスIgG1-PE標識抗体のみとインキュベートした。
【００１８】
表IV：A549細胞の感染後の総細胞タンパク質量１μgあたりの導入遺伝子発現（ルシフェラーゼ活性）の測定。
【００１９】
発明の要旨
本発明は遺伝子治療法、化合物および医薬品を提供する。本発明は内皮細胞および/または平滑筋細胞が標的細胞型を形成する遺伝子治療の適用でとりわけ有用である。本発明は少なくとも内皮細胞および/または平滑筋細胞への組織向性を与えられた遺伝子送達ビヒクルに関する。さらに本発明は肝細胞への組織向性が除去された遺伝子送達ビヒクルに関する。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明の目的は、前記したアデノウイルスベクターの制限を克服するための物質と方法を提供することである。広い意味で、本発明は、全部または一部がAd5とは異なる血清型に由来する新しいアデノウイルスを提供する。好ましい特徴をもつ血清型の特定の遺伝子を１つのキメラベクターに組み合わせて、特定の適用に対してより適したベクターを生じさせることができる。好ましい特徴には、特定標的細胞の感染性の向上、非標識細胞の感染性の低下、ウイルス安定性の向上、抗原提示細胞（APC）での取り込みの減少またはAPCでの取り込みの増加、標的細胞に対する毒性の低下、ヒトまたは動物での中和の減少、ヒトまたは動物でのCTL応答の減少または増加、よりよいおよび/または持続的な導入遺伝子発現、組織における進入能の増加、パッケージング細胞株での収量の改善などがあるが、これらに限らない。
【００２１】
本発明の一側面は、一部のアデノウイルスの低い免疫原性と、効率のよい遺伝子治療を可能にする他のアデノウイルスの特徴との組み合わせを容易にする。そのような特徴は、一定の宿主細胞への高い特異性、一定の細胞にとって良好な複製機構、一定の宿主細胞での高い感染率、非標的細胞での低い感染効率、高いまたは低いAPC感染効率などでありうる。このように本発明は、血清型が異なる少なくとも２つのアデノウイルスの有用な性質をもつキメラアデノウイルスを提供しうる。
【００２２】
通例、宿主細胞に遺伝物質を効率よく導入できるアデノウイルスを得るには、前記網羅的でないリストのうちの２つ以上が必要である。したがって本発明は、必要な部位に異なるアデノウイルス血清型由来の異なるアデノウイルス遺伝子を挿入するためのカセットとして使用できるアデノウイルス由来ベクターを提供する。このようにしてキメラアデノウイルスを生成できるベクターを得ることができ、それによってもちろん目的の遺伝子を（たとえば元のアデノウイルスのE1部位に）挿入することもできる。この方法で、産生されるキメラアデノルイスを、一定の障害について遺伝子治療を必要とする一定の宿主の要求と必要に適合させることができる。このウイルスの産生を可能にするには、充分量の安全なキメラアデノウイルスを産生するために、一般に、パッケージング細胞が必要になる。
【００２３】
本発明は、一側面として、Ｂ亜群に属するアデノウイルスのファイバータンパク質の少なくとも１断片を含むアデノウイルスベクターを提供する。該ファイバータンパク質はそのアデノウイルスベクターの天然のファイバータンパク質であってもよいし、そのアデノウイルスベクターの基礎になっている血清型とは異なる血清型に由来してもよい。後者の場合、本発明のアデノウイルスベクターは、Ｂ亜群アデノウイルスに由来するファイバータンパク質の少なくとも１断片、その断片は少なくともレセプター結合配列からなる断片をディスプレーするキメラアデノウイルスである。通例、そのようなウイルスはベクター（通例、プラスミド、コスミドまたはバキュロウイルスベクター）を用いて産生されるだろう。そのようなベクターも本発明の主題である。好ましいベクターは、治療しようとする宿主と治療しようとする障害にとりわけ適したキメラ組換えウイルスを作製するために使用できるベクターである。
【００２４】
本発明は、アデノウイルス５型に基づくが、アデノウイルス16型由来のファイバー配列の少なくとも１断片を有するキメラアデノウイルスであって、そのAd16のファイバーの断片が宿主細胞の結合に関与するファイバータンパク質の断片を含むものをも提供する。また本発明は、特定の宿主細胞、たとえば、ヒトまたは動物起源の内皮細胞や平滑筋細胞など、ただしこれらに限らない宿主細胞で、他の亜群に属するアデノウイルスと比較して改善された感染性を示すキメラアデノウイルスベクターも提供する。本発明の重要な特徴は、キメラウイルスを産生するための手段である。通例、複製コンピテントアデノウイルスを含有するアデノウイルスのバッチを宿主細胞に投与することは望まれない。したがって、一般に、いくつかの遺伝子（ただし少なくとも１つ）を、キメラウイルスをコードするベクター上のアデノウイルスゲノムから除外し、そのベクターにキメラアデノウイルスを産生させる細胞のゲノムにそれらの遺伝子を供給することが望ましい。そのような細胞は通例、パッケージング細胞と呼ばれる。したがって本発明は、アデノウイルスの生産に必要な配列であって本発明のアデノウイルスベクター上に存在しない要素すべてをトランスに含む、本発明キメラアデノウイルス産生用のパッケージング細胞も提供する。通例、ベクターとパッケージング細胞は、それらが必要な要素をすべてもつが、組換えによって複製コンピテントウイルスを生じさせる重複要素はもたないという点で、互いに適合していなければならない。したがって本発明は、本発明のパッケージング細胞と本発明の組換えベクターを含む部品のキットを提供し、該細胞と該ベクターのあいだに複製コンピテントアデノウイルスの産生をもたらす組換えにつながる配列の重複が本質的にないものもある。たとえば腫瘍細胞の根絶を目的とする治療などといった一定の適用のために、本発明のアデノウイルスベクターが複製コンピテントであるか、たとえば腫瘍細胞や腫瘍内皮細胞のような特定の細胞型内で、一定の条件下に複製可能でありうる。
【００２５】
同じまたは他の血清型に由来する、より多くの遺伝子またはそれら遺伝子の機能的部分を本アデノウイルスベクターに挿入して対応する天然配列を置換することは、本発明の範囲に含まれる。したがって、たとえばファイバー配列（の機能的部分）の、他の血清型の対応する配列による置換を、たとえばペントンベースやヘキソンのような他のキャプシド遺伝子（の機能的部分）の、該血清型または他の異なる血清型の対応する配列による置換と組み合わせることができる。前記遺伝子に限らない他の組み合わせも考えられ、それらも本発明の範囲に含まれることは、当業者には理解される。本発明のキメラアデノウイルスベクターは少なくとも２つの異なる血清型に由来しうる。これは、そのベクターに、標的細胞の感染の向上および/または非標的細胞の感染の減少、ウイルスの安定性の向上、ヒトまたは動物での免疫原性の低下（たとえばAPCでの取り込みの減少、宿主での中和の減少および/または細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）応答の減少）、組織浸透性の増加、導入遺伝子発現の持続性の向上などといった好ましい特徴を与える。この点で、大部分の宿主で中和抗体が存在しないかその量が少ないことによって定義される低免疫原性の血清型に由来する、たとえばペントンおよび/またはヘキソン遺伝子などのキャプシド遺伝子を使用することが好ましい。また、標的細胞で改善された結合と内在化を示す血清型に由来するファイバーおよび/またはペントン配列を使用することも好ましい。さらにまた、標的細胞でのアデノウイルス遺伝子の発現をもたらす遺伝子を、ウイルスベクターから欠失させることが好ましい。この点で、すべてのアデノウイルス遺伝子が欠失したベクターも好ましい。さらにまた、標的細胞で発現させようとする目的遺伝子を駆動するプロモーターが細胞型特異プロモーターであることも好ましい。
【００２６】
ウイルスベクターを精密に適合させ、そのキメラウイルスに自由に所望の性質を与えることができるためには、アデノウイルス遺伝子のライブラリーを用意して、交換しようとする遺伝子をプラスミド系またはコスミド系アデノウイルス構築物上に配置し、交換しようとする遺伝子または配列に制限部位を隣接させることが好ましい。好ましい遺伝子または配列をそのライブラリーから選択し、本ウイルスを作製するために使用されるアデノウイルス構築物に挿入することができる。通例、そのような方法は、いくつかの制限および連結段階と、パッケージング細胞のトランスフェクションを含む。アデノウイルスベクターは１部をトランスフェクションするか、２つ以上の重複断片としてトランスフェクションし、相同組換えによってウイルスが生成される。たとえばアデノウイルスベクターは、たとえばE1領域内での目的遺伝子の挿入または置換、ペントンおよび/またはヘキソン配列内での挿入または置換、またはファイバー配列への挿入または置換用の２つ以上の重複配列から組み立てることができる。したがって本発明は、望ましい宿主域や減少した抗原性など、１つ以上の望ましい性質をもつキメラアデノウイルスを生産する方法であって、望ましい挿入部位をもつ１つ以上の本発明ベクターを用意し、所望の宿主域をもつアデノウイルス血清型に由来するファイバータンパク質の少なくとも機能的部分を該ベクターに挿入し、かつ/または、比較的低い抗原性をもつアデノウイルス血清型に由来するキャプシドタンパク質の機能的部分を挿入し、該ベクターを本発明のパッケージング細胞にトランスフェクションし、キメラウイルス粒子を産生させることを含む方法を提供する。もちろん、異なる血清型に由来する他のウイルス遺伝子の他の組み合わせも本明細書で上記開示されるように挿入できる。E1領域での目的遺伝子の挿入または置換に加えて非天然配列を１つだけもつキメラウイルスも本発明の範囲に含まれる。
【００２７】
典型的に起こるアデノウイルスに対する免疫原性応答は、宿主による中和抗体の産生である。通例これが、免疫原性の低い血清型のペントン、ヘキソンおよび/またはファイバーなどのキャプシドタンパク質を選択する理由である。
【００２８】
もちろん、異なる血清型に由来する完全なタンパク質をもつキメラアデノウイルスを作製する必要はないだろう。キメラタンパク質を産生することは充分当技術分野内にあり、たとえばファイバータンパク質の場合、ある血清型のベースをもちもう一つの血清型に由来するシャフトとノブをもつことは明らかに可能である。このようにして、ウイルス粒子の組立を担うタンパク質の部分を、１つの血清型に由来させて、無傷のウイルス粒子の生産を促進させることが可能になる。したがって本発明は、ヘキソン、ペントン、ファイバーおよび/または他のキャプシドタンパク質が異なるアデノウイルス血清型に由来するキメラタンパク質である本発明のキメラアデノウイルスも提供する。野生型キャプシド（タンパク質）遺伝子などの全体またはそれらの一部を交換することによってキメラアデノウイルスを作製することのほかに、温度安定性、組立、固定、指向性が変更された（redirected）感染、変化した免疫反応などといった好ましい特徴について容易にスクリーニングできる非アデノウイルス配列や点突然変異、欠失、挿入などの突然変異を担持するキャプシド（タンパク質）遺伝子などを挿入することも、本発明の範囲に含まれる。ここでも、他のキメラ的組み合わせを産生することができ、それらも本発明の範囲に含まれる。
【００２９】
遺伝子治療用に一般に使用される血清型の組換えアデノウイルスをインビボで全身的に送達すると、ウイルスの90%以上が肝臓で捕捉されることがマウスとラットで立証されている（ヘルツ（Herz）ら、1993年；カス−アイスラー（Kass-Eisler）ら、1994年；ヒュアード（Huard）ら、1995年）。ヒト肝細胞はアデノウイルス血清型５ベクターで効率よく形質導入されることも知られている（キャステル  ジェー  ブイ（Castell,J.V.）、ヘルナンデ  ディー（Hernandez，D.）、ゴメッツ−フォイックス  エー  エム（Gomez-Foix，A.M.）、グイレン  アイ（Guillen，I.）、ドナト  ティ（Donato,T.）およびゴメッツ−レコーン  エムジェー（Gomez-Lechon，M.J.）（1997年）「ヒト肝細胞へのアデノウイルスによる遺伝子導入：形質導入された細胞の生化学的機能の分析（Adenovirus-mediated gene transfer into human hepatocytes：analysis of the biochemical functionality of transduced cells）」、ジーン  セラ（Gene Ther.）4（5）、455〜464頁）。したがって、Ad2またはAd5系ベクターの全身送達によるインビボ遺伝子治療は、肝臓でのウイルスの効率のよい取り込みによって著しく妨害され、望ましくない毒性が生じ、標的細胞の形質導入に利用されうるウイルスが減ることになる。したがって、インビボで他の器官を標的にできるようにアデノウイルス血清型５の宿主細胞域を変更することが、本発明の主な関心事である。
【００３０】
組換えアデノウイルス血清型５の、指向性が変更された（re-directed）感染を達成するために、いくつかの方法が研究されてきた、または今なお研究されている。ウイックハム（Wickham）らは、ペントンベースへのαvβ3およびαvβ5インテグリンの結合を担うと考えられているペントンベース中のRGD（Arg、Gly、Asp）モチーフを改変した。彼らはこのRGDモチーフを、α4βlレセプターに特異的な別のペプチドモチーフで置換した。この方法により、アデノウイルスを特定の標的細胞に誘導することができた（ウイックハム（Wickham）ら、1995年）。クラスニケ（Krasnykh）ら（1998年）はノブ中の利用できるHIループを利用した。このループは、Ｘ線結晶学によれば、ノブ三量体構造の外側にあり、したがってノブにおける分子内相互作用には寄与しないと考えられる。そのHIループへのFLAGコード配列の挿入により、三量体化できるファイバータンパク質が得られ、さらに、ノブ領域にそのFLAG配列を含有するウイルスを作製できることも示された。FLAG含有ノブとCARとの相互作用は変化しないが、HIループへのリガンドの挿入は、感染の標的変更（retargeting）につながりうる。アデノウイルス血清型５ファイバーとペントンベースに変更を導入した成功例は報告されているが、ノブの複雑な構造と、CARとの正確なアミノ酸相互作用に関する限られた知見が、そのような誘導法を面倒かつ困難にしている。CARと特定の細胞レセプターに結合する抗体の使用も記述されている（ウイックハム（Wickham）ら、1996年；ロジャース（Rogers）ら、1997年）。しかしこの方法は、特異抗体の利用可能性と遺伝子治療製品の複雑さにより制限される。
【００３１】
前記の制限を克服するために、我々は他のアデノウイルス血清型に由来する既存のアデノウイルスファイバー、ペントンベースタンパク質、ヘキソンタンパク質または他のキャプシドタンパク質を使用した。代替アデノウイルス血清型の構造タンパク質を含有するキメラアデノウイルス血清型５ライブラリーを作製することにより、我々は好ましい特徴をもつ組換えアデノウイルスベクターの迅速なスクリーニングを可能にする技術を開発した。
【００３２】
インビトロおよびインビボで特定の細胞型を標的にすることができ、したがって一定の細胞型に対して改変された向性をもつキメラキャプシドの作製法を提供することが本発明の目的である。アデノウイルスまたはアデノウイルスキャプシドを特定の細胞型または組織へのタンパク質または核酸送達ビヒクルとして使用できるようにする方法と手段を提供することが本発明のさらなる目的である。
【００３３】
修飾された後期遺伝子をもつアデノウイルス血清型５に基づくキメラアデノウイルスの作製について説明する。そのために、全体として完全なアデノウイルス血清型５ゲノムを含有する３つのプラスミドを構築した。これらのプラスミドの１つから、アデノウイルス血清型５ファイバータンパク質をコードするDNAの一部を除去し、クローニングを容易にするリンカーDNA配列に置換した。つぎに、このプラスミドを、異なるアデノウイルス血清型に由来するファイバータンパク質をコードするDNAを挿入するための鋳型とした。異なる血清型に由来するDNA配列は、ポリメラーゼ連鎖反応技術を（縮重）オリゴヌクレオチドと組み合わせて使用することによって得た。アデノウイルス血清型５のゲノム中のかつてのE1位置に、任意の目的遺伝子をクローニングすることができる。これら３つのプラスミド全部の１回のトランスフェクションにより、組換えキメラアデノウイルスが形成される。あるいは、遺伝子のライブラリーから得られた配列のクローニングは、キメラアデノウイルスベクターが１または２つの断片から構築されるようなものにもできる。たとえば１つの構築物が、少なくとも、ウイルスのパッケージングに必要な配列と左IRT、目的遺伝子用の発現カセット、ならびにパッケージング細胞中に存在しない複製とウイルス形成に必要なすべての配列と好ましい特徴を与える非天然配列とからなる第２構築物と重複する配列を含有する。したがって、キメラアデノウイルスからなるライブラリーのこの新しい技術は、インビトロおよびインビボ遺伝子治療用の改良された組換えアデノウイルスベクターの迅速なスクリーニングを可能にする。
【００３４】
インビボ遺伝子治療にアデノウイルス５型を使用することは、ヒト内皮細胞や平滑筋細胞などの一定の細胞型を感染することができないらしいこと、肝臓や脾臓などの一定の器官の感染が優先されることによって制限される。具体的には、これは再狭窄や肺高血圧症のような心血管疾患の治療に影響する。アデノウイルスによるヒトceNOS（構成性内皮酸化窒素シンターゼ）の送達が、経皮経管冠状動脈形成術（PTCA）後の再狭窄の治療として提案されている。再狭窄は、血管形成術の部位における漸進的動脈リモデリング、細胞外マトリックス形成および内膜過形成を特徴とする（シュワルツ（Schwartz）ら、1993年；カーター（Carter）ら、1994年；シ（Shi）ら、1996年）。NOは、PTCAが誘導する内皮障壁の損傷後に失われることが明示されている血管作動性因子の一つである（リオード  ジョーンズ（Lloyd Jones）およびブロッヒ（Bloch）、1996年）。したがってバルーンによって誘導される損傷後にceNOSのアデノウイルス送達を利用してNOレベルを回復することにより再狭窄が予防されうる（バレネ（Varenne）ら、1998年）。本発明のウイルスまたはキメラウイルスがAd2またはAd5系のウイルスよりも優れるような遺伝子療法の他の適用を非限定的な例としてあげると、血中に分泌されるタンパク質の内皮細胞による産生、高血圧の治療、静脈移植中の狭窄の予防治療、血管新生、心不全、腎性高血圧などがある。
【００３５】
一態様として、本発明は、なかんずく、心血管障害の治療にとって重要な内皮細胞と平滑筋細胞への遺伝子送達にとりわけ適したアデノウイルスベクターを記述する。本アデノウイルスベクターは、好ましくは、Ｂ亜群アデノウイルスに由来するか、少なくとも、Ｂ亜群に属するアデノウイルス由来のファイバータンパク質の、少なくともファイバータンパク質の細胞結合部分を含む機能的部分を含有する。さらに好ましい態様として、本アデノウイルスベクターはアデノウイルス５型に基づくキメラベクターであって、アデノウイルス16型由来のファイバータンパク質の少なくとも機能的部分を含有する。
【００３６】
もう一つの態様として本発明は、全身投与後に肝臓を免れるアデノウイルスベクターまたはキメラアデノウイルスベクターを提供する。好ましくはこれらのアデノウイルスベクターはＡ、Ｂ、ＤまたはＦ亜群、具体的には血清型12、16、28および40に由来するか、該アデノウイルス由来のファイバータンパク質の少なくとも細胞結合部分を含有する。
【００３７】
どの態様でも、本アデノウイルスベクターは望ましい性質をもつ血清型に由来しうる、または本アデノウイルスベクターは１つの血清型に属するアデノウイルスに基づき、かつ、別の血清型の望ましい機能を含む配列を含有し、それらの配列が該血清型内の天然配列を置換しているものと理解すべきである。
【００３８】
もう一つの側面として、本発明は、アデノウイルス血清型５とは異なる改変された向性をもつキメラアデノウイルスとそれらウイルスの作製法を記述する。たとえば、アデノウイルス血清型５に基づくが自然界に存在する任意のアデノウイルスファイバーをディスプレーするウイルス。このキメラアデノウイルス血清型５は一定の細胞型をアデノウイルス血清型５よりもインビトロおよびインビボで高い効率または低い効率で感染できる。そのような細胞には内皮細胞、平滑筋細胞、樹状細胞、ニューロン細胞、グリア細胞、滑液細胞、肺上皮細胞、造血幹細胞、単球/マクロファージ細胞、腫瘍細胞、骨格筋細胞、中皮細胞、滑膜細胞などがあるが、これらに限らない。
【００３９】
もう一つの側面として、本発明は、１つ以上の遺伝子もしくは配列が代替のヒトまたは動物血清型に由来するDNAで置換されているアデノウイルス血清型５の異なる部分からなるライブラリーの構築とその使用を記述する。全体として全アデノウイルスゲノムを包含するこの構築物のセットは、一定の疾患、患者群、さらには１人の個人に特化させた独特なキメラアデノウイルスの構築を可能にする。
【００４０】
本発明のどの側面においても、本キメラアデノウイルスは、E1領域内の欠失と、プロモーターに連結されたまたは連結されていない異種遺伝子の挿入とを、含有してもしなくてもよい。さらにまた、キメラアデノウイルスは、E3領域内の欠失と、プロモーターに連結された異種遺伝子の挿入とを、含有してもしなくてもよい。さらにまた、キメラアデノウイルスは、E2および/またはE4領域内の欠失と、プロモーターに連結された異種遺伝子の挿入とを、含有してもしなくてもよい。後者の場合、組換えアデノウイルスの作製には、E2および/またはE4補完細胞株が必要である。事実、ウイルスベクターのゲノム中のどの遺伝子でも取り出してトランスに供給することができる。したがって極端な場合、キメラウイルスはそれらのゲノム中にどのアデノウイルス遺伝子も含有せず、定義上、最小アデノウイルスベクターである。この場合、すべてのアデノウイルス機能は、安定な細胞株および/またはそれら遺伝子の一過性発現を用いて、トランスに供給される。最小アデノウイルスベクターを産生する方法はWO97/00326に記述されており、ここに参照文献として引用する。別の例では、Ad/AAVキメラ分子が、本発明のアデノウイルスキャプシドにパッケージングされる。Ad/AAVキメラベクターの産生方法はEP97204085.1に記述されており、ここに参照文献として引用する。原則的に、任意の核酸に、本発明のアデノウイルスキャプシドを与えることができる。
【００４１】
一態様として、本発明は、少なくとも平滑筋細胞および/または内皮細胞への組織向性が与えられている遺伝子送達ビヒクルを提供する。もう一つの態様として、本発明は、少なくとも肝細胞への組織向性が除去された遺伝子送達ビヒクルを提供する。好ましくは、該遺伝子送達ビヒクルには、少なくとも平滑筋細胞および/または内皮細胞への組織向性が与えられ、少なくとも肝細胞への組織向性が除去される。本発明の好ましい態様として、該遺伝子送達ビヒクルには、Ｂ亜群アデノウイルス、好ましくはアデノウイルス16由来のファイバータンパク質を用いて、少なくとも平滑筋細胞および/または内皮細胞への組織向性が与えられ、および/または少なくとも肝細胞への組織向性が除去される。本発明の好ましい側面として、該遺伝子送達ビヒクルはウイルスキャプシドを含む。好ましくは、該ウイルスキャプシドは、全部または一部がＢ亜群のアデノウイルス、好ましくはアデノウイルス16に由来するウイルスキャプシドを含むか、またはＢ亜群のアデノウイルス、好ましくはアデノウイルス16由来のタンパク質またはその一部を含む。本発明の好ましい態様として、該ウイルスキャプシドは、少なくとも２つの異なるウイルス、好ましくはアデノウイルスに由来するタンパク質またはその断片を含む。本発明のこの側面の好ましい態様では、該ウイルスの少なくとも１つがＢ亜群のアデノウイルス、好ましくはアデノウイルス16である。
【００４２】
本発明の好ましい態様として、該遺伝子送達ビヒクルはアデノウイルスファイバータンパク質またはその断片を含む。該ファイバータンパク質は、好ましくはＢ亜群のアデノウイルス、好ましくはアデノウイルス16に由来する。該遺伝子送達ビヒクルはさらに、他のアデノウイルスに由来する他のファイバータンパク質またはその断片を含みうる。該遺伝子送達ビヒクルは他のアデノウイルスタンパク質を含んでも含まなくてもよい。核酸はファイバータンパク質またはその断片に直接結合しうるが、間接的に結合してもよい。間接的結合の例には、核酸のアデノウイルスキャプシドへのパッケージングまたは核酸のリポソームへのパッケージングがあり、ファイバータンパク質またはその断片はアデノウイルスキャプシドに組み込まれるかリポソームに結合されるが、これらに限定されない。ファイバータンパク質またはその断片への核酸の直接的結合は、該ファイバータンパク質またはその断片が複合体の一部でない場合、または該ファイバータンパク質またはその断片がアデノウイルスキャプシドなどの複合体の一部である場合に行ないうる。
【００４３】
本発明の一態様として、アデノウイルスファイバータンパク質を含む遺伝子送達ビヒクルであって、そのファイバータンパク質がＢ亜群アデノウイルス、好ましくはアデノウイルス16の組織決定断片を含むものが提供される。アデノウイルスファイバータンパク質は、３つの機能ドメインを含む。１つのドメイン・ベース（base）は、アデノウイルスキャプシドのペントンベースへのファイバーの固定を担っている。もう一つのドメイン・ノブ（knob）はレセプター認識を担っており、一方、シャフト（shaft）ドメインはベースをノブから分離するスペーサーとして機能する。さまざまなドメインは他の機能ももちうる。たとえば、シャフトはおそらく標的細胞特異性にも関与するだろう。前記したドメインのそれぞれは、ファイバーの断片を限定するために使用できる。しかし、断片は別の方法でも同定できる。たとえばノブドメインはレセプター結合断片とシャフト結合断片を含む。ベースドメインはペントンベース結合断片とシャフト結合断片を含む。さらに、シャフトは反復するアミノ酸のストレッチを含む。これらの反復されたストレッチのそれぞれは断片でありうる。
【００４４】
ファイバータンパク質の組織向性決定断片は、ファイバータンパク質の単一の断片であるか、少なくとも１つのファイバータンパク質の断片の組み合わせであることができ、ここに該組織向性決定断片は、単独で、またはウイルスキャプシドと組み合わせて、好ましくはポジティブに、ただし必ずしもその必要はないが、遺伝子送達ビヒクルが所定の細胞または細胞型を形質導入できる効率を決定する。肝細胞への組織向性とは、肝臓に存在する細胞、好ましくは肝実質細胞への組織向性を意味する。
【００４５】
特定組織への組織向性は該組織の細胞が形質導入される効率を増加させることによって与えることができ、あるいは、特定組織への組織向性は、該組織の細胞以外の細胞が形質導入される効率を減少させることによって与えることができる。
【００４６】
ファイバータンパク質は組織向性決定性を有する。組織向性に関与するファイバータンパク質の最も詳しく記述されている断片はノブドメインである。しかし、ファイバータンパク質のシャフトドメインも組織向性決定性をもつ。しかし、アデノウイルスキャプシドの組織向性決定性のすべてが、ファイバータンパク質に組み込まれるわけではない。
【００４７】
本発明の好ましい態様として、Ｂ亜群アデノウイルス、好ましくはアデノウイルス16由来のファイバータンパク質を、Ｃ亜群のアデノウイルス、好ましくはアデノウイルス５に由来する非ファイバーキャプシドタンパク質と組み合わせる。
【００４８】
本発明の一側面として、あるアデノウイルスに由来する核酸を含む遺伝子送達ビヒクルが提供される。本発明の好ましい態様として、該アデノウイルス核酸は、少なくともＢ亜群アデノウイルスファイバータンパク質の、好ましくはアデノウイルス16の組織向性決定断片を含むファイバータンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む。好ましい側面として、該アデノウイルスは、少なくとも２つの異なるアデノウイルスに由来する核酸を含む。好ましい側面として、該アデノウイルスは、少なくとも２つの異なるアデノウイルスに由来する核酸を含み、少なくとも１つの核酸配列は、少なくともＢ亜群アデノウイルスファイバータンパク質の、好ましくはアデノウイルス16の組織向性決定断片を含むファイバータンパク質をコードする。
【００４９】
本発明の好ましい態様として、該アデノウイルス核酸は、標的細胞における該アデノウイルス核酸の複製能力が弱められるか不能になるように修飾される。これは、初期領域１タンパク質をコードする遺伝子を不活化するか欠失させることによって達成できる。
【００５０】
もう一つの好ましい態様として、該アデノウイルス核酸は、該アデノウイルス核酸によってコードされるアデノウイルスタンパク質に対して免疫応答を開始するという宿主免疫系の能力が弱められるか不能になるように修飾される。これは、初期領域２および/または初期領域４のタンパク質をコードする遺伝子の欠失によって達成できる。あるいは、初期領域３タンパク質をコードする遺伝子を欠失させるか、反対に、初期領域３中の遺伝子によってコードされるタンパク質の一部がもつ抗免疫系機能を考慮すると、初期領域３タンパク質の発現をいくつかの目的で強化させうる。また、本アデノウイルス核酸は、前記したアデノウイルス核酸の具体的改変の２つ以上の組み合わせによって改変しうる。必須遺伝子をアデノウイルス核酸から欠失させた場合は、アデノウイルス核酸、アデノウイルスベクター、ビヒクルまたはキメラキャプシドを生産しようとする細胞内で、それらの遺伝子を補完しなければならないことは明らかである。また、アデノウイルス核酸は、前記以外の方法で、たとえばキャプシドタンパク質またはその断片を人間がそれに対する中和抗体をもたないか、低レベルでしかもたない他の血清型に由来するキャプシドタンパク質またはその断片で交換することによって、該アデノウイルス核酸によってコードされるアデノウイルスタンパク質に対して免疫応答を開始するという宿主免疫系の能力が弱められるか不能になるようにも修飾できる。これのもう一つの例は、キャプシドタンパク質をコードする遺伝子の、他の血清型に由来するキャプシドタンパク質をコードする遺伝子との交換である。キャプシドタンパク質またはその断片は、各個体がそれに対する免疫応答を生じさせることができないまたはその能力が低い他のキャプシドタンパク質またはその断片にも交換できる。
【００５１】
アデノウイルス核酸はさらに、または前記した改変の１つ以上に代えて、ヘキソン、ペントン、ファイバーおよび/またはプロテインIXなどのアデノウイルス後期タンパク質をコードする遺伝子を不活化するか欠失させることによって、改変することができるが、これらに限らない。
【００５２】
本発明の好ましい態様として、アデノウイルスタンパク質をコードするすべての遺伝子を該アデノウイルス核酸から欠失させて、該核酸を最小アデノウイルスベクターにする。
【００５３】
本発明のもう一つの好ましい態様では、該アデノウイルス核酸が、少なくともアデノ随伴ウイルス（AAV）の組込み手段が該アデノウイルス核酸に組み込まれているAd/AAVキメラベクターである。
【００５４】
本発明の好ましい態様として、全く同一でもそうでなくてもよい本発明のベクターまたは核酸は、さらに、少なくとも１つの非アデノウイルス遺伝子を含む。好ましくは、該非アデノウイルス遺伝子の少なくとも１つは、アポリポタンパク質、ceNOS、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、インターロイキン−３、インターロイキン−１α、アンギオスタチンなどの（抗）血管新生タンパク質、抗増殖性タンパク質、血管内皮成長因子（VGAF）、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、低酸素症誘導性因子１α（HIF-1α）、PAI-1または平滑筋細胞移動阻害（anti-migration）タンパク質をコードする遺伝子の群から選択される。
【００５５】
もう一つの側面として、本発明は、少なくとも平滑筋細胞および/または内皮細胞への組織向性を与えられた遺伝子送達ビヒクルを生産するための細胞を提供する。もう一つの側面として、本発明は、少なくとも肝細胞への組織向性が除去された遺伝子送達ビヒクルを生産するための細胞を提供する。もう一つの側面として、本発明は、少なくとも平滑筋細胞および/または内皮細胞への組織向性が与えられ、少なくとも肝細胞への組織向性が除去された遺伝子送達ビヒクルを産生するための細胞を提供する。本発明の好ましい態様では、該細胞がアデノウイルスパッケージング細胞であり、そこでアデノウイルス核酸がアデノウイルスキャプシドにパッケージングされる。本発明のアデノウイルスパッケージング細胞の一側面として、アデノウイルス核酸の複製とパッケージングに必要なすべてのタンパク質が、初期領域１によってコードされるタンパク質を除いて、該アデノウイルス核酸に組み込まれた遺伝子によって提供される。本発明のこの側面において、初期領域１がコードするタンパク質は、細胞ゲノムDNAに組み込まれた遺伝子によってコードされうる。本発明の好ましい態様では、該細胞がPER.C6（ECACC受託番号96022940）である。一般に、アデノウイルス核酸の複製とアデノウイルスキャプシドへのパッケージングに必要な遺伝子産物がアデノウイルス核酸によって提供されない場合、それらは、該パッケージング細胞の一過性トランスフェクションか、安定な形質転換により、パッケージング細胞によって提供される。しかし、パッケージング細胞によって提供される遺伝子産物は、該アデノウイルス核酸上に存在する遺伝子によっても提供されうる。たとえばファイバータンパク質はパッケージング細胞によって、たとえば一過性トランスフェクションを介して提供されうるし、アデノウイルス核酸によってもコードされうる。この特徴は、とりわけ、２つの異なるウイルスに由来するファイバータンパク質を含むアデノウイルスキャプシドを作製するために使用できる。
【００５６】
本発明の遺伝子送達ビヒクルは、心血管疾患または内皮細胞もしくは平滑筋細胞への核酸送達によって治療できる疾患の治療に役立つ。後者の非限定的な例は、たとえば癌であって、移入される核酸が抗血管新生タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００５７】
本発明の遺伝子送達ビヒクルは前記疾患治療用の薬剤として使用できる。あるいは、本発明の遺伝子送達ビヒクルは、前記疾患治療用の医薬の製造に使用できる。
【００５８】
一側面として、本発明は、平滑筋細胞および/または内皮細胞への組織向性をもつまたは与えられたアデノウイルスキャプシドであって、該キャプシドが好ましくは少なくとも２つの異なるアデノウイルスに由来するタンパク質を含み、少なくともファイバータンパク質の組織向性決定断片がＢ亜群アデノウイルス、好ましくはアデノウイルス16に由来するものを提供する。もう一つの側面として、本発明は、肝細胞への組織向性が除去されたアデノウイルスキャプシドであって、該キャプシドが好ましくは少なくとも２つの異なるアデノウイルスに由来するタンパク質を含み、少なくともファイバータンパク質の組織向性決定断片がＢ亜群アデノウイルス−好ましくはアデノウイルス16に由来するものを提供する。
【００５９】
一態様として、本発明は、平滑筋細胞および/または内皮細胞に核酸を送達するためのアデノウイルスキャプシドの使用からなる。もう一つの態様として、本発明は、肝細胞への核酸の送達を抑制するためのアデノウイルスキャプシドの使用からなる。本発明のアデノウイルスキャプシドは、心血管疾患または内皮細胞もしくは平滑筋細胞への核酸送達によって治療できる疾患の治療に使用できる。後者の例はたとえば癌であって、移入される核酸が抗血管新生タンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００６０】
本発明のアデノウイルスキャプシドは前記疾患治療用の薬剤として使用できる。あるいは、本発明のアデノウイルスキャプシドは前記疾患治療用の医薬の製造に使用できる。
【００６１】
本発明のもう一つの側面として、アデノウイルス5配列21562-31094および32794-35938を含む構築物pBr/Ad.BamRΔFibが提供される。
【００６２】
本発明のもう一つの側面として、アデノウイルス５配列21562-31094および32794-35938を含み、さらにファイバータンパク質をコードするアデノウイルス16遺伝子を含む構築物pBr/AdBamRfib16が提供される。
【００６３】
本発明のさらにもう一つの側面として、アデノウイルス5配列21562-31094および32794-35938を含み、さらにファイバータンパク質をコードするアデノウイルス16遺伝子を含み、さらにその構築物の非アデノウイルス配列骨格中のアデノウイルス５右末端反復配列付近に唯一のPacI部位を含む構築物pBr/AdBamR.pac/fib16が提供される。
【００６４】
本発明のもう一つの側面として、Ad5配列3534-31094および32794-35938を含み、さらにファイバータンパク質をコードするアデノウイルス16遺伝子を含む構築物pWE/Ad.AflIIrITRfib16が提供される。
【００６５】
本発明のもう一つの側面として、Ad5配列3534-22443および24033-31094および32794-35938を含み、さらにファイバータンパク質をコードするアデノウイルス16遺伝子を含む構築物pWE/Ad.AflIIrITRDE2Afib16が提供される。
【００６６】
前記配列の番号付けでは、数字はそこまで表されるが、それ以降は表されない。
【００６７】
本発明の好ましい態様では、前記構築物が、平滑筋細胞および/または内皮細胞への組織向性をもつ遺伝子送達ビヒクルまたはアデノウイルスキャプシドの作製に使用される。
【００６８】
もう一つの側面として、本発明は、選択された多数の非アデノウイルス核酸を含むアデノウイルスベクターまたは全く同一でもそうでなくてもよい遺伝子送達ビヒクルのライブラリーを提供する。本発明のもう一つの側面として、キャプシドタンパク質をコードするアデノウイルス遺伝子が、少なくとも２つの異なるアデノウイルスに由来するタンパク質を含むアデノウイルスキャプシドのライブラリーを作製するために使用され、該アデノウイルスは好ましくは２つの異なる血清型に由来し、好ましくは１つの血清型がＢ亜群のアデノウイルスである。本発明のとりわけ好ましい態様として、少なくとも２つの異なるアデノウイルスに由来するタンパク質を含むアデノウイルスキャプシドのライブラリーであって、少なくともファイバータンパク質の組織向性決定断片がＢ亜群のアデノウイルス−好ましくはアデノウイルス16に由来するものが作製される。
【００６９】
アデノウイルス16のファイバータンパク質は、好ましくは図9に記載の配列を含む。しかし、本発明の範囲で、コドンの縮重性を用いることにより、類似の配列を得ることができる。あるいは、組織向性決定性が有意に変更されない限り、アミノ酸の置換または挿入または欠失を行なってもよい。そのようなアミノ酸置換は同じ極性グループの範囲内またはその範囲外で行ないうる。
【００７０】
以下に、いくつかの非限定的実施例によって、本発明を例証する。
【００７１】
実施例
実施例１：キメラファイバータンパク質をもつアデノウイルス血清型5系ウイルスの作製
ファイバーをコードするDNAを欠くアデノウイルス鋳型クローンの作製
アデノウイルス血清型５のファイバーコード配列はヌクレオチド31042と32787のあいだに位置する。ファイバーをコードするアデノウイルス血清型5DNAを除去するために、本発明者らは構築物pBr/Ad.Bam-rITR（図１；ECACC受託番号P97082122）から出発した。この構築物から、まず１つのNdeI部位を除去した。そのためにpBr322プラスミドDNAをNdeIで消化したのち、突出末端をクレノウ酵素で補充した。つぎに、このpBr322プラスミドを再連結し、NdeIで消化し、大腸菌DH5αに形質転換した。得られたpBr/ΔNdeIプラスミドをScaIとSalIで消化し、得られた3198bpのベクター断片をpBr/Ad.BamrITR由来の15349bpのScaI-SalI断片に連結することにより、唯一のNdeI部位を含有するプラスミドpBr/Ad.Bam-rITRΔNdeIを得た。つぎに、オリゴヌクレオチド「NY-up」と「NY-down」（図2）を用いてPCRを行なった。増幅されたファイバーDNAのクローニングを容易にするために、増幅中に、NdeIおよびNsiI制限部位の両方が導入された。増幅はそれぞれ94℃で45秒、60℃で１分、72℃で45秒の25サイクルからなった。このPCR反応は、25pmolのオリゴヌクレオチドNY-upまたはNY-down、2mM dNTP、1.5mM MgCl2を含むPCR緩衝液および１単位のエロンゲース熱安定性ポリメラーゼ（ギブコ社（Gibco）、オランダ）を含んだ。そのPCR産物の10分の１をアガロースゲルに流したところ、±2200bpの予想されたDNA断片が増幅されたことが明らかになった。つぎに、このPCR断片をジーンクリーン（Geneclean）キットシステム（バイオ１０１（Bio101）社）を使って精製した。つぎに、構築物pBr/Ad.Bam-rITRΔNdeIと前記PCR産物の両方を制限酵素NdeIとSbfIで消化した。つぎに、T4リガーゼ酵素を使って、そのPCR断片をNdeIおよびSbfI部位にクローニングすることにより、pBr/Ad.BamRΔFib（図３）を作製した。
【００７２】
アデノウイルス血清型からのファイバー配列の増幅
代替血清型由来のファイバータンパク質をコードするDNAの増幅を可能にするために、縮重オリゴヌクレオチドを合成した。そのために、まず、代替血清型のファイバータンパク質をコードする既知のDNA配列をアライメントして、ファイバータンパク質のテール領域とノブ領域の両方で保存された領域を同定した。６つの亜群すべてを代表する19種類の血清型のヌクレオチド配列を含むその整列から、（縮重）オリゴヌクレオチドを合成した（表Ｉ参照）。また表３には、特定の血清型のファイバータンパク質をコードするDNAを増幅するために使用したオリゴヌクレオチドの組み合わせを示す。増幅反応（50μl）は、１反応につき、2mM dNTP、25pmolの各オリゴヌクレオチド、標準１×PCR緩衝液、1.5mM MgCl2および１単位のPwo耐熱性ポリメラーゼ（ベーリンガー  マンハイム（Boehringer Mannheim）社）を含有した。サイクラープログラムは、94℃で30秒、60〜64℃で60秒および72℃で120秒から各々なる20サイクルを含んだ。そのPCR産物の10分の１をアガロースゲルに流して、DNA断片が増幅されたことを証明した。それぞれ異なる鋳型で、２回の独立したPCR反応を行なった。
【００７３】
キメラアデノウイルスDNA構築物の作製
すべての増幅ファイバーDNAとベクター（pBr/Ad.BamRΔFib）をNdeIとNsiIで消化した。つぎに消化したDNAをアガロースゲルに流したのち、各断片をそのゲルから単離し、ジーンクリーン（Geneclean）キット（バイオ１０１（Bio101）社）を使って精製した。つぎにそれらPCR断片をpBr/AdBamRΔFibのNdeIおよびNsiI部位にクローニングすることにより、pBr/AdBamRFibXX（ここにXXはそのファイバーDNAを単離した血清型番号を表す）を作製した。正しい増幅を確認するために、PCRによって生成した挿入物を配列決定した。さまざまなファイバー遺伝子の得られた配列を図４に示す。
【００７４】
ファイバータンパク質に関してキメラな組換えアデノウイルスの作製
キメラウイルスの効率のよい作製を可能にするために、pBr/AdBamRFib16、pBr/AdBamRFib28、pBr/AdBamRFib40-L構築物のAvrII断片をベクターpBr/Ad.Bam-rITR.pac#8（ECACC受託番号#P97082121）にサブクローニングして、このベクター中の対応する配列を置換した。pBr/Ad.Bam-rITR.pac#8は、pBr/Ad.Bam-rITRと同じアデノウイルス挿入物をもつが、そのrITRの近くにPacI部位があり、それがITRをベクター配列から分離することを可能にする。構築物pWE/Ad.AflII-Ecoをつぎのように作製した。pWE.pacをClaIで消化し、その５′突出末端をクレノウ酵素で補充した。つぎにそのDNAをPacIで消化し、アガロースゲルから単離した。pWE/AflIIrITRをEcoRIで消化し、クレノウ酵素で処理したのち、PacIで消化した。アデノウイルス配列を含有する大きい24kb断片をアガロースゲルから単離し、ClaI消化して平滑末端化したpWE.Pacベクターに連結した。クローンテク社（Clontech）の連結発現キット（ligation express kit）を利用した。ストラタジーン社（Stratagene）のXL10-gold細胞を形質転換したのち、予期される構築物を含有するクローンを同定した。pWE/Ad.AlfII-Ecoは塩基対3534−27336のAd5配列を含有する。３つの構築物、すなわちSalIで消化したpClipsal-Luc（図５）、PacIとEcoRIで消化したpWE/Ad.AflII-Eco、およびBamHIとPacIで消化したpBr/AdBamR.pac/fibXXを、アデノウイルス産生細胞（PER.C6、フォールオウス（Fallaux）ら、1998年）にトランスフェクトした。図６は、キメラウイルスの作製に使用した方法と断片の概略図である。pBr/Ad.BamRfib12だけは、PacI含有ベクターにサブクローニングしないで使用したので、PacIではベクター配列から放出されず、右ITRに結合した約160bpのベクター配列を放出するClaIで消化した。さらにまた、pBr/Ad.BamRfib12とpBr/Ad.BamRfib28はそのファイバー配列中に内部BamHI部位を含有するので、BamHI部位に隣接するベクター配列中で切断するSalIで消化した。トランスフェクションのために、２μgのpCLIPsal-Lucおよび４μgのpWE/Ad.AflII-EcoとpBr/AdBamR.pac/fibXXの両方を無血清DMEMに希釈して総体積を100μlにした。このDNA懸濁液に、無血清培地中の2.5倍希釈リポフェクタミン（ギブコ社（Gibco））100μlを加えた。室温で30分後に、そのDNA-リポフェクタミン複合体溶液を2.5mlの無血清DMEMに加え、つぎにそれをT25cm2組織培養フラスコに加えた。このフラスコにはトランスフェクションの24時間前に1×106細胞/フラスコの密度で播種したPER.C6細胞が含まれた。２時間後、そのDNA-リポフェクタミン複合体含有培地を、20％ウシ胎児血清を補足した2.5mLのDMEMを加えることによって１回希釈した。さらに24時間後に、培地を、10％ウシ胎児血清を補足した新しいDMEMに置換した。細胞を６〜８日培養したのち、収集し、３回凍結/融解した。細胞片を、室温、3000rpmで5分間の遠心分離によって除去した。その上清（12.5ml）のうち３〜５mlを使って、PER.C6細胞（T80cm2組織培養フラスコ）を再び感染させた。この再感染は、５〜６日後に完全な細胞変性効果（CPE）をもたらし、そののち、アデノウイルスが前記のように収集される。
【００７５】
ファイバーキメラアデノウイルスの産生
前記の粗製溶解液10mlを、懸濁培養した１〜1.5×106 PER.C6細胞/mlを含む１リットルの発酵槽に接種した。接種の３日後に、細胞を収集し、室温で1750rpmで10分間遠心分離することによってペレット化した。つぎに、ペレット化した細胞中に存在するキメラアデノウイルスを、つぎの後処理法で抽出し、精製した。ペレットを50mlの10mM NaPO4-に溶解し、−20℃で凍結した。37℃で融解したのち、5.6mlのデオキシコレート（５％w/v）を加え、そののち、その溶液をホモジナイズした。つぎに、細胞を完全に破壊するために、その溶液を37℃で15分間インキュベートした。その溶液をホモジナイズしたのち、1875μlの（１M）MgCl2-を加え、５mlの100％グリセロールを加えた。375μlのDNアーゼ（10mg/ml）を添加したのち、その溶液を37℃で30分間インキュベートした。ブレーキをかけずに室温、1880×gで30分間の遠心分離により、細胞片を除去した。つぎに上清を、10mlのフレオンにかけることによってタンパク質から精製した。ブレーキをかけずに室温、2000rpmで15分間の遠心分離を行なうと、３つのバンドが見え、そのうちの上部のバンドはアデノウイルスに相当する。このバンドをピペッティングによって単離したのち、Tris/HCl（１M）緩衝塩化セシウムブロック勾配（範囲：1.2から1.4g/ml）に乗せた。ウイルスは他の構成要素とは対照的に1.4g/ml塩化セシウム溶液には移動しないので、10℃、21000rpmで2.5時間の遠心分離後に、ウイルスが残留タンパク質と細胞片から精製された。そのウイルスバンドを単離したのち、Tris/HCl（１M）で緩衝化した1.33g/ml塩化セシウムの連続勾配を用いる２回目の精製を行なう。この勾配の上部にウイルスをのせたのち、ウイルスを10℃、55000rpmで17時間遠心分離する。つぎに、そのウイルスバンドを分離し、30μlのショ糖（50w/v）を添加したのち、過剰の塩化セシウムをそれぞれ１時間からなる３回の透析によって除去する。透析のために、ウイルスを透析スライドに移す（スライド−エー−ライザー（Slide-a-lizer）、カットオフ10000kDa、米国ピアス社（Pierce））。透析に使用する緩衝液は、濃度の増加するショ糖（１回目から３回目まで：30ml、60mlおよび150mlショ糖（50％（w/v）／1.5リットルPBS、すべて7.5mlの２％（w/v）CaMgCl2を補足）を補足したPBSである。透析後に、ウイルスをスライド−エー−ライザー（slide-a-lizer）から取り出したのち、それを25および100μlずつに等分し、そののち、ウイルスを−85℃で保存する。１mlあたりのウイルス粒子数を決定するために、そのウイルスバッチの50μlを、シャムラム（Shamram）ら（1997年）が記述しているように高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）にかける。ウイルス力価はAd5.Lucウイルスバッチと同じ範囲にあることがわかった（Ad5.Luc：2.2×1011vp/ml；Ad5.LucFib12：1.3×1011vp/ml；Ad5.LucFib16：3.1×1012vp/ml；Ad5.LucFib28：5.4×1010vp/ml；Ad5.LucFib40-L：1.6×1012vp/ml）。
【００７６】
実施例２：ラットの静脈内尾静脈注射後のキメラウイルスの体内分布
ファイバー12、16、28または40-2を保持するキメラアデノウイルスの体内分布を調べるために、作製した各ウイルスバッチ１×1010粒子を１mlのPBSに希釈したのち、そのウイルスをオス成体Wag/Rijラット（3匹/ウイルス）の尾静脈に注射した。対照として、ルシフェラーゼ導入遺伝子を保持するAd5を使用した。ウイルスを投与した48時間後に、ラットを屠殺し、肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓および脳を解剖した。つぎにこれらの器官を１mlの溶解緩衝液（１％トリトンX-100/PBS）と混合し、30秒間細断して、タンパク質溶解液を得た。つぎに、そのタンパク質溶解液を導入遺伝子発現（ルシフェラーゼ活性）の存在について試験し、タンパク質１μgあたりのルシフェラーゼ活性を表すためにタンパク質濃度を決定した。表IIに示す結果は、アデノウイルス血清型５対照とは対照的に、どのファイバーキメラも肝臓または脾臓には特異的に標的されないことを明らかにしている。この実験は、他の血清型のファイバーを利用することにより、肝臓によるアデノウイルスの取り込みを回避することが可能であることを示している。またこれは、肝臓による取り込みがファイバーシャフトの長さとは相関しないか、ファイバーノブのCARへの結合能だけでは決定されないことも示している。使用したファイバーは異なるシャフト長をもち、ファイバー16以外は、CARを結合できるファイバーをもつことが知られている亜群に由来する（ロエルビンク（Roelvink）ら、1998年）。
【００７７】
実施例３：キメラウイルスは内皮および平滑筋細胞形質導入で相違を示す
A）ヒト内皮細胞の感染
ヒト内皮細胞（HUVEC）は既に記述されているように分離し、培養し、特徴づけた（ジャフェ（Jaffe）ら、1973年；ウィンバーグ（Wijnberg）ら、1997年）。簡単に述べると、20mM HEPES、pH7.3（フローラブ社（Flow Labs.）、スコットランド・アーヴィン）、10％（v/v）ヒト血清（地元の血液銀行）、10％（v/v）熱不活性化ウシ新生児血清（NBCS)（ギブコ  ビーアールエル社（GIBCO BRL）、メリーランド州ゲーサースバーグ）、150μg/ml粗製内皮細胞成長因子、5U/mlヘパリン（レオ  ファーマシューティックス製品（Leo Pharmaceutics Products）、オランダ・ウィースプ（Weesp））、ペニシリン（100IU/ml）/ストレプトマイシン（100μg/ml）（ベーリンガー  マンハイム社（Boehringer Mannheim）、ドイツ連邦共和国マンハイム）を補足したM119中、ゼラチン被覆培養皿で、細胞を37℃、５％（v/v）CO2/95％（v/v）大気下に培養した。実験に使用した細胞は継代数１〜３だった。１組目の実験では、40000個のHUVEC細胞（４個体からのプール）を24穴プレートの各ウェルに200μlの総体積で播種した。播種の24時間後に、細胞をPBSで洗浄したのち、２％FCSを補足したDMEM 200μlを細胞に加えた。この培地はさまざまな量のウイルス（MOI=50、250、1000、2500、5000および10000）を含有した。使用したウイルスは対照Ad5のほかに、ファイバーキメラ12、16、28および40-Lだった（各感染３つずつ）。ウイルス添加の２時間後に、培地を通常の培地に置換した。さらに48時間後に、細胞を洗浄し、100μlの溶解緩衝液の添加によって溶解した。図７ａに、HUVEC細胞の感染後の総タンパク質量１マイクログラムあたりの導入遺伝子発現に関する結果を示す。これらの結果は、ファイバーキメラ12と28がHUVEC細胞に感染できないこと、40-LがHUVECに対照Ad5ウイルスと同程度の効率で感染すること、およびファイバーキメラ16が有意によりよくHUVECに感染することを示している。つぎの１組の実験（n=8）では、ファイバー16キメラをAd5.Lucベクターと、１細胞あたり2500ウイルス粒子の各ウイルスによる形質導入後のルシフェラーゼ活性についてHUVECで比較した。これらの実験は、ファイバー16がAd5と比較して平均で8.1倍高いルシフェラーゼ活性（SD±4.6）を与えることを立証した。つぎの実験では、異なるHUVEC細胞濃度を含む24穴プレートのウェルに、等しい数のウイルス粒子を加えた。HUVECはそれらの細胞がコンフルエンシー（confluency）に達した場合にアデノウイルス血清型5によるその感染の効率が下がることが知られているので、この実験を行なった。そのために、HUVECを24穴プレートのウェル１つにつき22500、45000、90000および135000細胞の密度で播種した（３つずつ）。24時間後に、それらの細胞を前記のように、4.5×108ウイルス粒子を含む培地で感染させた。使用したウイルスは、対照アデノウイルス血清型5のほかに、キメラファイバー16であった。感染の48時間後に決定したタンパク質１マイクログラムあたりの導入遺伝子発現量（RLU）の結果（図7b参照）は、HUVEC細胞がインビボでの状況をよりよく模倣する100％のコンフルエンシーの場合でもファイバー16キメラアデノウイルスはHUVEC 細胞を感染させるのにより適していることを示す。ルシフェラーゼマーカー遺伝子は感染された細胞数に関する情報を与えないので、マーカー遺伝子として緑色蛍光タンパク質（GFP）を担持するアデノウイルス血清型５とファイバー16キメラを使って、もう一つの実験を行なった。このタンパク質発現は、形質導入された細胞の百分率と１細胞あたりの蛍光に関する情報を与えるフローサイトメーターで検出できる。この実験では、細胞を１ウェルあたり40000細胞の濃度で播種し、ウイルスに２時間ばく露した。使用したウイルスはAd5.GFP（8.4×1011vp/ml）とAd5.Fib16.GFP（5.1×1011vp/ml）である。細胞を、１細胞あたり500ウイルス粒子のウイルス濃度にばく露した。ウイルスばく露の48時間後に、１細胞あたりのGFP発現を示すパラメーターである中央蛍光値がAd5と比較してファイバー16の方が高いことから、ファイバー16ウイルスは、より高い１細胞あたりの導入遺伝子発現レベルを与えることが、フローサイトメトリーによる分析で立証された（図７ｃ）。このようにこれらの結果は合致しており、ファイバー16キメラウイルスがヒト初代内皮細胞を感染させるのにAd5と比較して、よりよく適していることを立証している。
【００７８】
B）ヒト平滑筋細胞の感染
ECの分離後に平滑筋細胞を分離した（ワインベルグ（Weinberg）ら、1997年）。0.075%（w/v）コラゲナーゼ（ヴォルシングトン  バイオケミカル社（Worthington Biochemical）、米国ニュージャージー州フリーホールド）を含有する培地（ペニシリン/ストレプトマイシンを補足したDMEM）と共に静脈をインキュベーションした。45分後に、剥離した細胞を含む培養培地を静脈から洗い流した。細胞を洗浄し、37℃、５％（v/v）CO2/95％（v/v）大気下に、10％ウシ胎児血清と10％ヒト血清を補足した培養培地中、ゼラチン被覆皿で培養した。実験に使用した細胞は継代数３〜６だった。我々はまず、一群のキメラファイバーウイルスと対照アデノウイルス血清型５のパネルを、ヒト平滑筋細胞の感染に関して試験した。そのために、40000個のヒト臍静脈平滑筋細胞（HUVsmc）を24穴プレートのウェルに200μlの総体積で播種した。播種の24時間後に、細胞をPBSで洗浄し、つぎに２％FCSを補足したDMEM 200μlをその細胞に加えた。この培地はさまざまな量のウイルス（MOI＝50、250、1250、2500および5000)を含んだ。使用したウイルスは対照Ad5のほかに、ファイバーキメラ12、16、28および40-Lだった（各感染３つずつ）。ウイルス添加の２時間後に、培地を通常の培地に置換した。さらに48時間後に、細胞を洗浄し、100μlの溶解緩衝液を添加することによって溶解した。図８ａに、HUVsmc細胞の感染後の総タンパク質１マイクログラムあたりの導入遺伝子発現の結果を示す。これらの結果は、ファイバーキメラ12と28がHUVsmc細胞に感染できないこと、40-LがHUVsmcに対照Ad5ウイルスと同等の効率で感染すること、およびファイバーキメラ16が有意によりよくHUVsmcに感染することを示している。つぎの１組の実験では、伏在静脈、腸骨動脈、左内乳腺動脈（LIMA）および大動脈由来の平滑筋細胞を、ファイバー16キメラとAd5（共にルシフェラーゼをマーカー遺伝子として担持する）による感染について調べた。これらの実験（n=11）は、ファイバー16キメラがAd5と比較して平均で61.4倍高いレベルのルシフェラーゼ活性（SD±54.8）を与えることを明らかにした。使用したアデノウイルスが、さまざまなヒト血管に由来するSMCの感染に関してさまざまな効率をもつという知見ゆえに、高い標準偏差（SD）が得られる。つぎの実験では、異なるHUVsmc細胞濃度コンフルエンシーを含む24穴プレートのウェルに、等しい数のウイルス粒子を加えた。そのために、HUVsmcを24穴プレートのウェル１つにつき10000、20000、40000、60000および80000細胞の密度で播種した（３つずつ）。24時間後に、それらの細胞を前記のように、2×108ウイルス粒子を含む培地で感染させた。使用したウイルスは、対照アデノウイルス血清型５のほかに、キメラファイバー16である。感染の48時間後に決定したタンパク質１マイクログラムあたりの導入遺伝子発現量（RLU）の結果（図８ｂ参照）は、平滑筋細胞がインビボでの状況をよりよく模倣する100％のコンフルエンシーの場合でもファイバー16キメラアデノウイルスは平滑筋細胞を感染させるのにより適していることを示す。ファイバー16キメラとAd5で形質導入されたSMCの数を同定するために、我々はAd5.GFPとAd5Fib16.GFP（EC感染に使用したものと同じバッチ）を使った形質導入実験を行なった。ヒト臍静脈SMCを24穴プレートに１ウェルあたり60000細胞の濃度で接種し、１細胞あたり500または5000ウイルス粒子のAd5.GFPまたはAd5Fib16.GFPに２時間ばく露した。ばく露の48時間後に、細胞を収集し、フローサイトメーターを用いて分析した。5000ウイルス粒子のAd5.GFPによる形質導入後に測定されたGFP発現は、１細胞あたり500ウイルス粒子のファイバー16キメラによる形質導入後のGFP発現に等しいので（図８ｃ）、得られた結果はファイバー16突然変異体が約10倍高いSMCの形質導入を与えることを示す。
【００７９】
C）ファイバー16以外のＢ亜群ファイバー突然変異体
ファイバー16のシャフトとノブはアデノウイルス血清型16に由来し、前述のように、Ｂ亜群に属する赤血球凝集試験、DNA制限パターンおよび中和試験に基づいてＢ亜群ウイルスはさらにＢ1亜群とＢ２亜群に細分されている（ワデル（Wadell）ら、1984年）。Ｂ１亜群のメンバーには血清型３、７、16、21および51が含まれる。Ｂ２亜群のメンバーには11、14、34および35が含まれる。平滑筋細胞の増加した感染がＢ亜群由来のすべてのファイバーのトレード（trade）であるか、１つ以上のＢ亜群ファイバー分子に特有なものであるかを調べるために、我々はファイバー16およびファイバー51（共にＢ１亜群）をファイバー11およびファイバー35（共にＢ２亜群）と比較した。そのために、HUVsmcを１細胞あたりのウイルス粒子の増加量（156、312、625、1250、2500、5000）で感染させた。ファイバー突然変異体はすべてルシフェラーゼマーカー遺伝子を担持する（Ad5Fib11.Luc：1.1×1012vp/ml；Ad5Fib35Luc：1.4×1012vp/ml；Ad5Fib51Luc：1.0×1012vp/ml）。図８ｄに示す測定されたルシフェラーゼ活性によれば、SMCの効率のよい感染は全Ｂ亜群ファイバー分子の一般的トレードではない。明らかにファイバー16とファイバー11は、ファイバー35とファイバー51よりもSMCの感染により適している。それでもなお、試験したすべてのＢ亜群ファイバー突然変異体は、Ad5と比較してSMCをよりよく感染した。
【００８０】
D）器官培養実験
つぎに本発明者らは、ファイバー16キメラまたはAd5を用いたECとSMCの形質導入で観察された相違を、器官培養実験でも証明できるかどうかを確認した。これに関して、我々はつぎの組織に焦点を合わせた：１）ヒト伏在静脈：全臨床的静脈移植術の約80%で使用される静脈
２）ヒト心膜/心外膜：心膜または心外膜細胞の感染後にアデノウイルスによって担持された導入遺伝子から目的のタンパク質を産生する心膜液への組換えアデノウイルスの送達用
３）ヒト冠状動脈：再狭窄を予防するための経皮経管冠状動脈形成術（PTCA）用。冠状動脈のうち、本発明者らは左下行動脈（Left artery descending; LAD）と右冠状動脈（RCA）
に焦点を合わせた。
【００８１】
静脈移植術後のヒト伏在静脈の一部を、約0.5cmの切片にスライスした。つぎに、これらの切片（n＝3）を１mlあたり5×1010ウイルス粒子の200ml中で２時間培養した。ウイルスばく露の２時間後に、それらの切片をPBSで洗浄し、10％CO2培養器中37℃でさらに48時間培養した。つぎに、それらの切片を洗浄し、固定し、LacZ導入遺伝子発現について染色した。ウイルスはAd5.LacZ（2.2×1012vp/ml）、ファイバー16キメラAd5Fib16.LacZ（5.2×1011vp/ml）およびファイバー51キメラAd5Fib51.LacZ（2.1×1012vp/ml）だった。伏在静脈の切片をデジタルカメラで巨視的に写真撮影した。ウイルスばく露の２時間後に伏在静脈切片上で得られたLacZ導入遺伝子発現によれば、ファイバー16およびファイバー51キメラウイルスはどちらもより高い感染を与える。というのは、これらのウイルスを用いると、Ad5.LacZと比較してはるかに多くの青染色が観察されるからである（図８ｅ）。伏在静脈に関して記述したものと同じ実験をヒト心膜およびヒト冠状動脈（RCAとLAD）で行なった。これらの実験の結果（それぞれ図８ｆ、８ｇ、８ｈ）は、初代細胞で行なった実験と共に、ファイバー16および51突然変異体がヒト心血管組織の感染に関してAd5より優れていることを確認するものだった。
【００８２】
E）ヒトECおよびSMCにおけるCARとインテグリンの発現
前述の結果から、ファイバー16由来のシャフトとノブをもつキメラアデノウイルスが内皮細胞と平滑筋細胞を感染させるのによく適していることは明らかである。したがってAd5ウイルス上のファイバータンパク質を変えることにより、本発明者らはAd5には感染しにくい細胞の感染を増加させることができる。Ad5とAd5Fib16の相違は、どちらの細胞型でも有意ではあるものの、平滑筋細胞と比較すると内皮細胞での方が著しくない。これは、レセプター発現の相違を反映しているのかもしれない。たとえばHUVsmcはHUVECよりも顕著に多いαvβ5インテグリンを発現させる（下記参照）。あるいは、この相違はファイバー16のレセプターの発現の相違によるのかもしれない。Ad5.LucFib16は臍静脈平滑筋細胞に、臍静脈内皮細胞より約８倍よく感染するのに対して、Ad5.Lucウイルスの場合は内皮細胞の方が平滑筋細胞よりもよく感染される。Ad5感染がこれらの細胞のレセプター発現と相関するかどうかを調べるために、CARとαvインテグリンの存在をフローサイトメーターで検定した。そのために、1×105個のHUVEC細胞またはHUVsmcをPBS/0.5％BSAで1回洗浄したのち、それらの細胞を室温、1750rpmで５分間の遠心分離によってペレット化した。つぎに、その細胞ペレットに、100倍希釈したαvβ3抗体（Mab 1961、ブランスヴィック  ケミ社（Brunswick chemie）、オランダ・アムステルダム）10μl、100倍希釈したαvβ5抗体（Mab 1976、ブランスヴィック  ケミ社（Brunswick chemie）、オランダ・アムステルダム）または2000倍希釈したCAR抗体（米国ボストンのハーバードメディカルスクールのベルゲルソン（Bergelson）博士の厚意により贈与された（フス（Hsu）ら））を加えたのち、それらの細胞を暗環境下に４℃で30分間インキュベートした。このインキュベーション後に、細胞をPBS/0.5%BSAで2回洗浄し、再び室温、1750rpmで５分間の遠心分離によってペレット化した。それらの細胞を標識するために、フィコエリスリン（PE）で標識した10mlのラット抗マウスIgG1を細胞ペレットに加え、直ちにそれらの細胞を再び暗環境下に４℃で30分間インキュベートした。最後にそれらの細胞をPBS/0.5％BSAで２回洗浄し、フローサイトメーターで分析した。これらの実験の結果を表IIIに示す。これらの結果から、HUVsmcは検出できるレベルのCARを発現させないと結論することができ、これらの細胞がCARレセプターを介して細胞に侵入するアデノウイルスでは形質導入することが困難であることが確認された。
【００８３】
F）ヒトA549細胞の感染
内皮細胞と平滑筋細胞で行なった実験の対照として、さまざまなキメラアデノウイルスの等量のウイルス粒子がアデノウイルスによって容易に感染される細胞株で導入遺伝子発現に有意な相違を示すかどうかを確証するために、A549細胞を感染させた。これは、内皮細胞および平滑筋細胞で観察された感染効率の相違が細胞型特異的であるかどうかを調べるためである。そのために105個のA549細胞を24穴プレートに200μlの体積で播種した。播種の2時間後に、培地を、さまざまな量のファイバーキメラ５、12、16または40-L粒子（MOI＝0、5、10、25、100、500）を含有する培地に置換した。ウイルス添加の24時間後に、細胞をPBSで１回洗浄し、つぎに各ウェルへの溶解緩衝液100μlの添加（PBS中１％トリトンX-100）によってそれらの細胞を溶解したのち、導入遺伝子発現量（ルシフェラーゼ活性）とタンパク質濃度を決定した。つぎに、タンパク質１μgあたりのルシフェラーゼ活性を計算した。表IVに示すそのデータは、Ad5.LucウイルスがA549細胞に最も効率よく感染し、Ad5LucFib16またはAd5LucFib40-Lの感染効率は数倍低いことを立証している。これは、内皮細胞と、とりわけ平滑筋細胞の効率のよい感染が、これらの細胞へのウイルスの結合の相違によるのであって、使用したウイルスの量や品質によるのではないことを意味する。
【００８４】
【表１】
0004683682.tif 000002
【００８５】
【表２】
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【００８６】
【表３】
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【００８７】
【表４】
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【００８８】
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  pBr/Ad.Bam-rITR構築物の概略図である。
【図２】  pBr/Ad.Bam-rITR構築物からファイバー遺伝子を欠失させるために使用した方法の概略図である。
【図３】構築物pBr/Ad.BamRΔFibの概略図である。
【図４Ａ】ファイバーAd5の配列である。
【図４Ｂ】キメラファイバーAd5/12の配列である。
【図４Ｃ】キメラファイバーAd5/16の配列である。
【図４Ｄ】キメラファイバーAd5/28の配列である。
【図４Ｅ】キメラファイバーAd5/40-Lの配列である。
【図５】構築物pC1ipsal-Lucの概略図である。
【図６】３つの重複断片を使ってキメラアデノウイルスを作製する方法の概略図。初期領域（Ｅ）と後期領域（Ｌ）を示す。L5はファイバーコード配列である。
【図７ａ】  A)１細胞につき異なる量のウイルス粒子と異なるファイバーキメラアデノウイルスを用いたHUVEC細胞の感染。ウイルス濃度：10000vp/細胞（＝白い棒）、5000 vp/細胞（＝灰色の棒）、2500vp/細胞（＝黒い棒）、1000vp/細胞（薄い灰色の棒）、250および50vp/細胞はバックグランドを超える検出可能なルシフェラーゼ活性なし。ルシフェラーゼ活性は細胞タンパク質１マイクログラムあたりの相対発光単位（RLU）で表す。
【図７ｂ】  B)異なる濃度の細胞（１ウェルにつき22500、45000、90000または135000細胞を播種）とアデノウイルス血清型５（黒い棒）またはファイバー16キメラアデノウイルス（白い棒）を使ったHUVEC細胞の感染。ルシフェラーゼ活性は細胞タンパク質１マイクログラムあたりの相対発光単位（RLU）で表す。
【図７ｃ】  C)１細胞あたり500ウイルス粒子（黒い棒）または5000ウイルス粒子（灰色の棒）のAd5またはファイバー16キメラウイルス（Fib16）で形質導入したヒト大動脈ECのフローサイトメトリーによる分析。非感染細胞を使用して、バックグラウンドを１％、5.4の中央蛍光値に設定した。フローサイトメーターで観察できる中央蛍光値の最大シフトは9999である。後者は、Ad5とFib16が共に5000vp/細胞でフローサイトメーターの感度スケール外であることを示す。
【図８ａ】  A)１細胞につき異なる量のウイルス粒子と異なるファイバー突然変異型Ad5系アデノウイルスを用いたHUVsmc細胞の感染。ウイルス濃度：5000vp/細胞（＝白い棒）、2500vp/細胞（＝灰色の棒）、1250vp/細胞（＝濃い灰色の棒）、250vp/細胞（＝黒い棒）または50vp/細胞（＝薄い灰色の棒）。ルシフェラーゼ活性は細胞タンパク質１マイクログラムあたりの相対発光単位（RLU）で表す。
【図８ｂ】  B)異なる濃度の細胞（１ウェルにつき10000、20000、40000、60000または80000細胞）とアデノウイルス血清型５（白い棒）またはファイバー16キメラアデノウイルス（黒い棒）を使ったHUVsmc細胞の感染。導入遺伝子の発現が使用した生物発光計の感度域より高いという事実により、キメラファイバー16アデノウイルスによる感染後に頭打ちが観察される。
【図８ｃ】  C)Ad5またはファイバー16突然変異体（Fib16）を使用して500vp/細胞（黒い棒）または5000vp/細胞（灰色の棒）で形質導入したヒト臍静脈SMC。非形質導入細胞を使用して、バックグラウンド中央蛍光値を約１に設定した。フローサイトメーターによって測定されるGFP発現の中央蛍光値を示す。
【図８ｄ】  D)HUVsmcを１細胞につき312（薄い灰色の棒）、625（灰色の棒）、1250（黒い棒）、2500（濃い灰色の棒）、5000（薄い灰色の棒）または10000（白い棒）のウイルス粒子のファイバー11、16、35または51キメラウイルスに感染させた。タンパク質１マイクログラムあたりの相対発光単位（RLU）として表されるルシフェラーゼ導入遺伝子発現を、ウイルスばく露の48時間後に測定した。
【図８ｅ】  E)伏在静脈標本でのLacZ染色像の巨視的写真のスケッチ。核標的LacZ（ntLacZ）は深い青色、白黒印刷では黒または濃い灰色に見える。
【図８ｆ】  F)心膜（pericard）標本でのLacZ染色像の巨視的写真。核標的LacZ（ntLacZ）は深い青色、白黒印刷では黒色に見える。
【図８ｇ】  G)右冠状動脈標本でのLacZ染色像の巨視的写真のスケッチ。核標的LacZ（ntLacZ）は深い青色、白黒印刷では黒く見える。
【図８ｈ】  H)左下行動脈（Left artery descending；LAD）標本でのLacZ染色のスケッチ。核標的LacZ（ntLacZ）は深い青色、白黒印刷では黒色に見える。
【図９Ａ】ジーンバンク（Genbank）に公表されたアデノウイルス16ファイバータンパク質をコードする遺伝子を含む配列と、本発明で分離されたアデノウイルス16変異種のファイバーをコードする遺伝子を含む配列であり、ファイバータンパク質の配列はNdeI部位からである。図９Ａヌクレオチド配列比較。
【図９Ｂ】図９Ｂもヌクレオチド配列比較。
【図９Ｃ】アミノ酸比較。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図８ｄ】
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【図８ｅ】
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【図８ｆ】
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【図８ｇ】
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【図８ｈ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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