(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の非標準塩基を含む核酸の増幅を行う方法であって、
ｉｓｏ−Ｃおよびｉｓｏ−Ｇからなるグループより選択される１つ以上の非標準塩基を含むテンプレート核酸を有する、または有すると思われるサンプルに対して、核酸増幅反応を行う工程を含み、
上記核酸増幅反応において、最初に存在していた取り込まれていない非標準塩基の、最初に存在していた取り込まれていない標準塩基に対する比が少なくとも２対１であり、上記テンプレート核酸が上記サンプル中に存在するとき、１つ以上の非標準塩基を特異的に取り込んだ核酸増幅産物が生成される方法。
【請求項２】
少なくとも１つの非標準塩基を含む産物を生成するために核酸を増幅する方法であって、
ｉｓｏ−Ｃおよびｉｓｏ−Ｇからなるグループより選択される１つ以上の非標準塩基を含むテンプレート核酸を有する、または有すると思われるサンプルに対して、核酸増幅反応を行う工程を含み、
上記核酸増幅反応において、最初に存在していた取り込まれていない非標準塩基の、最初に存在していた取り込まれていない標準塩基に対する比が少なくとも２対１であり、上記テンプレート核酸がサンプル中に存在するとき、１つ以上の非標準塩基を特異的に取り込んだ核酸増幅産物が生成される方法。
【請求項３】
上記核酸増幅産物への非標準塩基の取り込み忠実度が少なくとも９３％である請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
上記核酸増幅反応におけるポリメラーゼが、（ｉ）サーマス・アクアチクスのＤＮＡポリメラーゼのＮ末端から２８０個のアミノ酸残基が欠損しているＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｉ）サーマス・フラーブスのＤＮＡポリメラーゼのＮ末端から２７９個のアミノ酸が欠損しているＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｉｉ）ヌクレアーゼ活性が欠損（nuclease-deficient）している、サーマス・アクタチクスのＤＮＡポリメラーゼのアミノ末端欠失変異体、またはこれらの組み合わせである請求項1〜3いずれか一項記載の方法。
【請求項５】
上記核酸増幅反応（nucleic acid amplification reaction）において、取り込まれていない標準塩基が、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵからなるグループより選択され、取り込まれていない非標準塩基が、ｉｓｏ−Ｃおよびｉｓｏ−Ｇからなるグループより選択される、請求項1〜4いずれか一項記載の方法。
【請求項６】
上記核酸増幅産物が存在すれば、上記核酸増幅産物を検出または測定する工程をさらに含む請求項1〜5いずれか一項記載の方法。
【請求項７】
上記の核酸増幅産物を検出または測定する工程が、オリゴヌクレオチドプローブに核酸増幅産物を捕らえる工程を含む請求項6記載の方法。
【請求項８】
上記オリゴヌクレオチドプローブが固体の（solid）支持体に結合されている請求項7記載の方法。
【請求項９】
上記オリゴヌクレオチドプローブが１つ以上の非標準塩基を含む請求項7または8記載の方法。
【請求項１０】
上記の核酸増幅がポリメラーゼ連鎖反応である請求項1〜9いずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
上記核酸増幅反応が直線的（linear）である請求項1〜10いずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
１つ以上の非標準塩基を含む核酸を増幅するためのキットであって、
（ａ）ポリメラーゼ酵素、
（ｂ）ｉｓｏ−Ｃおよびｉｓｏ−Ｇからなるグループより選択される１つ以上の非標準ヌクレオシド三リン酸、および
（ｃ）１つ以上の標準ヌクレオシド三リン酸とを含み、非標準ヌクレオシド三リン酸の標準ヌクレオシド三リン酸に対する比が少なくとも２対１であるキット。
【請求項１３】
さらに、
（ｄ）１つ以上のプライマー、
（ｅ）１つ以上の非標準塩基を含む１つ以上の標的核酸、
（ｆ）１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ、または
（ｇ）１つ以上の分子標識のうち、１つ以上を含む請求項12記載のキット。
【請求項１４】
上記ポリメラーゼ酵素が、（ｉ）サーマス・アクアチクスのＤＮＡポリメラーゼのＮ末端から２８０個のアミノ酸残基が欠損しているＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｉ）サーマス・フラーブスのＤＮＡポリメラーゼのＮ末端から２７９個のアミノ酸が欠損しているＤＮＡポリメラーゼ、（ｉｉｉ）ヌクレアーゼ活性が欠損（nuclease-deficient）している、サーマス・アクタチクスのＤＮＡポリメラーゼのアミノ末端欠失変異体、またはこれらの組み合わせである請求項12または13記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔優先権の主張〕
本出願は、米国仮特許出願第６０／４４０，９２１号に対して優先権を主張するものであり、その全内容は参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
〔発明の分野〕
本発明は、１つ以上の非標準塩基（non-standard bases）を含む核酸の増幅に関するものである。
【０００３】
〔背景〕
全ての生物系（living systems）の遺伝情報の記憶（storage）は、わずか２つの塩基対（Ａ：ＴおよびＧ：Ｃ）の組織的な鎖（organizational string）に由来している。この２つの対暗号（pair code）の単純性は魅力的ではあるが、３つ以上は可能なのかという疑問を呈するものでもある。少なくとも化学的には、追加の塩基対（additional base pair）は考え得る。
【０００４】
ＤＮＡによって表される、規則に基づいた分子認識は、バイオテクノロジーを通じて理想的なことである。バイオテクノロジーにおいては、ＤＮＡの局在化（Pease, A.C.らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5022-6(1994)などを参照されたい）、ナノ構造の組み立て（assembling）（Collins, M.L.らによるNucleic Acids Research 25:2979-2984(1997)などを参照されたい）、「アプタマー（aptamers）」と称される抗体様分子の構築（Prudent, J.R.らによるScience 264:1924-1927(1994)；Hermann, T.and Patel, D.J., Science 287:820-825(2000)などを参照されたい）、および分子構造中の情報を認識する機能の実施などのアプリケーションには、分子に結合する分子が必要とされる。ＤＮＡ化学を拡大して塩基対を追加することは、この強力な分子認識システムの能力を強化するであろう。さらに、塩基対を追加するＤＮＡ化学の拡大により、化学者は、ＤＮＡの基本的要素の数を増加させる新たな方法の開発に向かっている。
【０００５】
新たな塩基対が、複製、転写、翻訳に利用できることを示した最初の実験データは、Bennerと共同研究者らとによって、改変した（shuffled）水素結合スキームを使ってはっきり示された（Piccirilli, J.A.らによるNature 343:33-37(1990)およびSwitzer, C.Y.らによるJ.Am. Chem. Soc. 111:8322-8323(1989)を参照）。
【０００６】
より最近、Romesbergと共同研究者らとは、疎水性相互作用の概念を用いて、水素結合に頼らずに塩基対を生成した。なお、これについては、McMinn, D.L.らによるJ. Am. Chem. Soc. 121:11585-11586(1999)およびTae, E.L.らによるJ. Am. Chem. Soc. 123:7439-7440(2001)に開示されている。上記著者らは、２つのポリメラーゼの特定の混合物を用いて、取り込み後の伸長を実証した。
【０００７】
さらに一歩踏み込み、Yokoyamaと共同研究者らとは、改変した（shuffled）水素結合およびファン・デル・ワールス相互作用の概念を統合させて、非天然の類似物（counterpart)の向かいの、特定のＲＮＡ転写物の部位に、重合させる（polymerize）ことのできる塩基対を開発した。これについては、Ohtsuki, T.らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 98:4922-4925(2001)およびMitsuiらによる、Am. Chem. Soc. 125:5298-5307(2003)に開示されている。
【０００８】
さらに近年、連続した非天然の塩基は、それと対をなす非天然の塩基と特異的に向き合って結合することが実証された。また、他の複製に依存する酵素は、第３の塩基対を効果的に認識するということが実証された。これらについては、Moser, M.J.およびPrudent, J.R.によるNucleic Acids Research 31:5048-53(2003)に開示されている。しかし、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような一般的に使用されている複製システムに、第３の塩基対を配置できるかについては未だ実証されていない。
【０００９】
〔発明の概要〕
本明細書に記載されている一実施形態は、１つ以上の非標準塩基を含む核酸を増幅する方法である。本方法には、１つ以上の非標準塩基を含むテンプレート核酸を有するまたは有すると思われるサンプルに対して、核酸増幅反応を行う工程が含まれる。上記増幅反応中に、テンプレート核酸がサンプル中に存在するとき、１つ以上の非標準塩基を特異的に取り込んだ核酸増幅産物が生成される。ある実施形態においては、増幅反応の忠実度（fidelity）は高く、増幅産物の大部分は、特定回数の増幅サイクル経過後、ユーザが設計した特定部位において非標準塩基を保持している。また、ある実施形態においては、上記反応液に、最初に存在していた非標準ヌクレオシド三リン酸の量は、最初に存在していた標準ヌクレオシド三リン酸の量よりも高く、その比は少なくとも１．５対１、２対１、３対１、または４対１である。
【００１０】
さらに他の実施形態においては、核酸増幅産物への非標準塩基の取り込み忠実度は、少なくとも約９３％、９６％、またはそれより高い。さらに他の実施形態においては、核酸増幅反応に使用されるポリメラーゼは、耐熱性で、エクソヌクレアーゼ活性が欠損している。例えば、Ｋｌｅｎｔａｑ、Ｔｉｎｔａｑ、または両者の組み合わせが挙げられる。ある増幅反応では、取り込まれない塩基は、Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ，またはＵ，ｉＣおよびｉＧである。上記方法のさらなる実施形態においては、上記核酸増幅産物が存在すれば、上記核酸増幅産物を検出または測定する工程、および／または、テンプレート核酸に対して特異的な核酸増幅産物を単離または精製する工程を含んでいてもよい。
【００１１】
別の実施形態は、前記の方法で生成された核酸増幅産物を提供する。さらに別の実施形態は、１つ以上の非標準塩基を有する核酸を増幅するためのキットを提供する。本キットは、以下の成分のいずれか、または全てを含むことができる。上記成分とは、ポリメラーゼ酵素、１つ以上の非標準ヌクレオシド三リン酸、１つ以上の標準ヌクレオシド三リン酸、１つ以上のプライマー、１つ以上の非標準塩基を含む１つ以上の標的核酸、１つ以上のオレゴヌクレオチドプローブ、および／または１つ以上の分子標識（molecular beacon）である。
【００１２】
別の実施形態は、ｉｓｏ‐Ｃのような非標準塩基を１つ以上有する標的核酸の初期量を決定する方法を提供する。本方法は、不安定な非標準塩基を含む、核酸増幅反応の増幅産物を切断する（cleavage）工程と、上記の切断量または切断率に基づいて、初期の標的核酸の数または量を決定する工程とを含む。上記の初期の標的核酸の数または量は、例えば、切断データを標準曲線、すなわちコントロール反応と比較することによって、またはサイクル数やポリメラーゼの忠実度などの反応条件を考慮して計算することによって決定される。本方法は、ある特定の条件下、例えば酸性条件下において、ｉｓｏ‐Ｃのような非標準塩基の不安定性を上昇させる利点があり、その結果として、非標準塩基の部位で核酸の切断が起こる。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、下記工程を含む核酸増幅反応を実施する方法を提供する。
【００１４】
（ａ）１つ以上の非標準塩基からなる標的またはテンプレート核酸を有する、または有すると思われるサンプルに対して、ポリメラーゼが触媒する核酸増幅反応を行う工程。
【００１５】
上記ポリメラーゼは、標的またはテンプレート核酸上の１つ以上の非標準塩基と相補的な部位において、標的またはテンプレート核酸上の１つ以上の非標準塩基に対して特異的な非標準塩基のみを実質的に取り込む。また、上記ポリメラーゼは、標的またはテンプレート核酸上の１つ以上の非標準塩基に対して特異的な非標準塩基に、さらに塩基を付加することができる。さらに、上記反応は、標的またはテンプレート核酸が存在するとき、標的またはテンプレート核酸を複製することができる。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、下記工程を含む核酸増幅反応を実施する方法を提供する。
【００１７】
（ａ）１つ以上の非標準塩基からなる標的またはテンプレート核酸を有する、または有すると思われるサンプルに対して、ポリメラーゼが触媒する核酸増幅反応を行う工程。
【００１８】
（ｉ）上記ポリメラーゼは、標的またはテンプレート核酸上の１つ以上の非標準塩基と相補的な部位において、標的またはテンプレート核酸上の１つ以上の非標準塩基に対して特異的な非標準塩基のみを実質的に取り込む。
【００１９】
（ｉｉ）上記ポリメラーゼは、標的またはテンプレート核酸上の、１つ以上の非標準塩基に対して特異的な非標準塩基に、さらに塩基を付加することができる。
【００２０】
（ｉｉｉ）標的またはテンプレート核酸上の１つ以上の非標準塩基は、ｉｓｏ−Ｃおよびｉｓｏ−Ｇからなるグループから選択される。
【００２１】
（ｉｖ）上記の反応は、標的またはテンプレート核酸が存在するとき、標的またはテンプレート核酸を複製することができる。
【００２２】
前述の実施形態において、上記ポリメラーゼは、相当量の、および／または検出し得る量の不正確な増幅産物を生成することなく、標的またはテンプレート核酸の増幅を２０回以上行うことができる。
【００２３】
上記いずれかの実施形態において、上記ポリメラーゼは、エクソヌクレアーゼ活性が欠損していてもよい。また、上記ポリメラーゼは、ＫｌｅｎＴａｑであってもよい。上記いずれかの実施形態において、上記の標的またはテンプレート核酸はサンプル中に存在し、それらが増幅されてもよい。これらの実施形態およびその他の実施形態において、上記非標準塩基は、ｉｓｏ−Ｃおよびｉｓｏ−Ｇからなっていてもよい。
【００２４】
上記いずれかの実施形態において、６つの塩基記号（base alphabet）が用いられる。これらの実施形態において、上記ポリメラーゼが利用できるヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＵもしくはＴ、ｉｓｏ−Ｃ、並びにｉｓｏ−Ｇからなる。これらの実施形態、およびさらなる実施形態において、上記方法は、標的またはテンプレート核酸の増幅が（ａ）において起こるかどうかを検出する工程をさらに含むことができる。
【００２５】
あらゆる面で、上記実施形態は、その他述べられている実施形態においても適切に用いることができる。
【００２６】
〔詳細な記述〕
図１は、実施例１で使用されている核酸配列を示す。
【００２７】
図２は、塩基の複数の組み合わせを使用して、実施例１に記載の通りに行ったリアルタイムＰＣＲ増幅の結果を示す。
【００２８】
図３は、実施例２に記載のプライマー伸長および融解解析を示す。左側には、テンプレートに対するプライマー３’末端のハイブリダイゼーションが（コントロールではｉＧの後ろで、または実験ではｉＧの前で）終了したダイアグラムを示す。右側は、ｉＧに向き合う塩基が制御されているか（Ｘ＝Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、ｉＣ）、または実験的に決定されている（Ｙ）プライマー伸長産物の融解解析である。全ての反応は、ＴｉＴａｑ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、クエンチャーで修飾したｄｉＧＴＰ、および設計されたｄｉＣＴＰで処理された（Ｒ＝テトラクロロ-フルオレセイン、*＝ダブシル（Dabcyl））。
【００２９】
図４は、実施例３に記載の酸切断解析を示す。
【００３０】
（Ａ）天然ＤＮＡ標的（奇数レーン）および非天然ＤＮＡ標的（偶数レーン）を使用した酸切断生成物
反応生成物をＰＡＧＥで分離し、蛍光イメージングで検出した。レーン１および２には、１０１０コピーの標的投入量（input target）で伸長反応を開始した反応物をロードした。レーン（３−４、５−６、７−８、および９−１０）には、１．５ｘ１０１〜１０１０の間で１０００倍増加させた標的投入量でＰＣＲ反応を開始し、４０サイクル、増幅させた反応物をロードした。スキャンに現れ、切断率の決定に使用したバンドに印をつけている（label）（ＦＬＰ＝全長産物、ＣＰ＝切断生成物）。
【００３１】
（Ｂ）切断解析
１０倍に段階希釈した（a series of 10-fold dilutions）非天然テンプレートを用いて、４０サイクルのＰＣＲを行い、切断生成物の比率を上記のように決定し、投入したコピー数に対してプロットした。
【００３２】
図５は、実施例４で述べられる分子標識解析を示す。テンプレート１（Ａ）またはテンプレート２（Ｂ）と、テンプレート１に対して特異的な分子標識とを含む反応液を使用した増幅解析である。１０２〜１０７までの間で１０倍希釈した各標的を作製し、一連の反応に加えた。４０サイクルのＰＣＲを通して、上記反応を蛍光によってモニターした。
【００３３】
ここで述べるのは、増幅産物に非標準塩基を取り込む核酸の増幅反応または合成を行うための、方法、組成物、およびキットである。一般的に、上記の核酸増幅反応は、特に、非標準塩基を特異的に取り込むという点に関して、忠実度が高く、また誤取り込みされる比率（misincorporation rates）が低い。
【００３４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、分子生物学において最も幅広く使用されている方法であり、増幅、検出、定量、クローニング、遺伝物質のジェノタイピング（genotyping）、核酸のような抗体および／または酵素の選択およびスクリーニング、またタガント分析（taggant analysis）（Clelland, C.T.らによるNature 399,533-4(1999)などを参照）を含むアプリケーション（applications）に用いられている。今まで、ＰＣＲの応用は、プライミング領域（priming region）に、非天然の塩基対を配置させることに限定されていた。したがって、正確な相補体への取り込みに関しては高い忠実度は必要とされていなかった（Moser, M.J.らによるClin. Chem 49,407-414(2003)などを参照）。ＰＣＲ法のような指数関数的な増幅システムのプライミング部位間に、非標準塩基対を付加するのを成功させるためには、新しい塩基は誤取り込みされる比率が低くなければならない。つまり、非標準塩基が高い忠実度で取り込まれる必要がある。実施例では、イソグアノシン:イソシトシン(ｉＧ：ｉＣ)の塩基対のような非標準塩基および塩基対が、伸長、複製、およびＰＣＲによる増幅において、追加の特異的な塩基対として機能できることを実証するデータを示す。
【００３５】
また、本発明にかかる方法、組成物、およびキットは、特定の非標準塩基対を含むその他の特異的な非標準塩基および塩基対の使用が可能であることを想定している。本明細書で述べられている実験は、プライマー伸長融解分析を用いて、６つ全ての三リン酸が等モル量で存在するとき、ｉＧに向き合って取り込まれるヌクレオチドの大部分がｉＣであることを示している。ポリメラーゼの高忠実度もまた確認されており、その結果として、酸切断による部分配列決定によると、ＰＣＲの後に、ｉＣ：ｉＧ塩基対が保持されていた。最後に、ｉＣ：ｉＧを含む分子標識を構築し、適用性を実証するために使用した。上記の追加の塩基対は、「アプタマー」製品、多重診断、および自然発生した核酸の増幅を利用する前述の分野などのような多くのその他のアプリケーションに有用であるだろう。したがって、本発明にかかる方法、キット、および組成物は、上述の用途および本明細書のその他の箇所に述べられているような用途に対応するあらゆる核酸増幅反応に利用できる。
【００３６】
ＰＣＲなどの核酸増幅は、核酸の特定の断片を酵素的に増幅する方法である。上記核酸増幅は、以下の基本工程のサイクルの繰り返しに基づいている。上記基本工程とは、２本鎖核酸を変性させる工程、その後、オリゴヌクレオチドプライマーを上記核酸テンプレートにアニールさせる（anneal)工程、及び核酸ポリメラーゼによってプライマーを伸長させる工程である（Mullisらによるand Saikiらによる、1985；米国特許第４，６８３，１９５号、４，６８３，２０２号、および４，８００，１５９号）。上記核酸増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマーは、上記ＤＮＡの向かい合う鎖にアニールするように設計される。また、上記オリゴヌクレオチドプライマーは、上記核酸ポリメラーゼに触媒される１つのプライマーの伸長産物が、その他のプライマーのテンプレート鎖として供給されるように配置される。上記の増幅の過程において、オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端によって規定される長さがばらばらな核酸断片を指数関数的に増加させることができる。
【００３７】
一般的に、前述の工程は、熱サイクリング反応で達成される。ＤＮＡ増幅で使用される一般的な熱サイクリング反応は、２本鎖の標的ＤＮＡを１本鎖に分離することができる、所定の高い標的変性温度へと初期段階で昇温させることを含む熱サイクリングの温度プロフィールを含む。一般的に、熱サイクル反応の標的変性温度は約９１℃〜９７℃、例えば９４℃〜９６℃であり、この温度で２０秒〜２分間の範囲で反応を行う。その後、反応混合物の温度を、プライマーが１本鎖ＤＮＡにアニールまたはハイブリダイズできる標的アニーリング温度まで下げる。アニーリング温度は、使用されるプライマーおよび標的ＤＮＡによって大きく依存する。一般的に、アニーリング温度は、その適用に依存して５０℃〜７０℃の範囲である。次に、反応混合物の温度を、伸長産物の合成を促進する標的伸長温度にまで上げる。一般的に伸長温度で約２分間維持する。また、上記伸長温度は、上記標的アニーリング温度と上記標的変性温度との間である。これで熱サイクリング反応の１サイクルが完了する。その後、反応混合物の温度を上記標的変性温度まで上昇させることにより、次のサイクルを開始する。一般的には、所望のＤＮＡ量を得るために、上記のサイクルを２０〜４０回繰り返す。当業者には明らかなように、上記の熱サイクル反応に関する上記記載は、例示に過ぎない。したがって、上記温度、時間、サイクル数は熱サイクル反応の特性やアプリケーションに依存して、変更することができる。
【００３８】
一般的に核酸増幅または伸長には、増幅反応を行うための反応成分を含む「マスターミックス」と、１つ以上の異なる配列を持つ標的核酸とを混合する工程、および、この反応混合物を標的核酸の増幅が可能な温度にさらす工程が必要である。
【００３９】
マスターミックス中の反応成分としては、反応混合物のｐＨを調節するバッファー、核酸の合成に必要なエネルギーおよびヌクレオシドを供給する１つ以上の天然ヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、並びにＴまたはＵに対応しており、等濃度で存在することが多い）、核酸合成の開始を促進するためにテンプレートに結合するプライマーまたはプライマー対、並びに合成される相補的な核酸鎖にヌクレオチドを付加するポリメラーゼが含まれる。
【００４０】
本発明にかかる反応のある実施形態では、増幅サイクル数を多くした場合でも、非標準塩基を含む核酸を高忠実度で増幅することができる。これらの実施形態のうち、ある実施形態では、特異的な対に向かい合う非標準塩基の取り込み忠実度または正確性は約７５％となり、９６％以上にもなり得る。したがって、核酸増幅は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０サイクル、またはそれ以上行うことができ、その場合でも、正確な核酸をかなりの量生成することができる。標的特異的な核酸が過半数未満であっても、反応はうまく起こっているが、一般的には、上記増幅反応によって生成された核酸の少なくとも過半数は、標的配列またはその相補配列（complement）を有している。ある実施形態は、核酸増幅産物の５５％以上が標的配列またはその相補配列である核酸増幅反応を提供する。当業者には明らかなように、特異的な核酸産物の比率は、取り込み忠実度や反応サイクル数などの多数の因子に依存し、所望の結果を得るために、または特定の増幅産物を所望量得るために、これらのパラメータを変更することができる。
【００４１】
別の実施形態においては、一度標的が増幅されると、標的配列のみ、または標的配列とその相補配列とを有する特定の増幅産物は、標的配列またはその相補配列を有さない不特定の増幅産物から分離または精製することができる。さらに別の実施形態においては、核酸増幅中または増幅後に存在する特定の増幅産物の量を測定することができる。増幅産物の量は、電気泳動、クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどの分離技術、およびプローブなどの用いる適切な方法を用いて測定することができる。
【００４２】
一実施形態においては、標的に対して特異的な核酸伸長の量は、例えば、実施例に記載されているように、ｉｓｏ−Ｃ塩基を含む核酸鎖の酸切断によって測定することができる。ある実施形態においては、一度核酸増幅反応が完了すると、その結果として得られる増幅産物は酸性状態にさらされる。酸切断に適したｐＨは当業者であれば、決定でき、それは、４、３、２、１、またはそれ未満のｐＨを含んでいるだろう。その後、切断された増幅産物の量または比率を非切断生成物の量と比較して、特定的な増幅産物の比率を決定する。この量または比率が与えられると、サンプル中の標的核酸の初期量または初期数を決定することができる。一般的には、標的核酸の初期量は、切断生成物の比率を、標準曲線または初期の標的量が分かっている１つ以上のコントロール反応に対して比較することによって決定することができる。当業者には明らかなように、反応混合物に対して行われた増幅サイクル数を知ることは有益である。標的核酸の初期量は、増幅の忠実度、サイクル数、および切断された増幅産物の最終的な量または比率に基づいて決定することもできる。
【００４３】
当業者に一般的に理解されているように、「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または、化学骨格によって結合された塩基として一般的に考えられているいかなる配列をも含む。上記化学骨格において、上記塩基は、塩基対を形成する能力や、相補的な化学構造とハイブリダイズする能力を有している。適切な非ヌクレオチドの骨格は、例えば、ポリアミド骨格およびポリモルホリノ骨格を含む。用語「核酸」には、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチド配列、並びにそれらの断片または一部分が含まれる。上記核酸は、天然のソースから分離したり、組み換えにより生成したり、または人工的に合成したりといったあらゆる適切な形態で提供される。また、上記核酸は、１本鎖または２本鎖であり、センス鎖またはアンチセンス鎖を表すことができる。
【００４４】
非標準塩基の取り込み忠実度は、核酸増幅中に伸長に利用できる非標準塩基と標準塩基との比率を変更することで都合よく、上昇させることができることが分かっている。ある実施形態においては、ｉｓｏ−Ｃ、ｉｓｏ−Ｇ、またはこの両方のような、１つ以上の非標準塩基の濃度または量を、標準塩基に対して増加させる。なお、両者は、一般的には、反応混合物中に同量存在する。例えば、１つ以上の遊離および取り込まれていない非標準塩基の濃度または量は、１つ以上の遊離および取り込まれていない標準塩基の濃度または量の５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、またはそれ以上であり、非標準塩基と標準塩基との比は１．５：１、２：１、３：１、４：１、５：１、１０：１、またはそれ以上である。遊離した非標準塩基の比率を増加させることは、増幅反応混合物が、ｉｓｏ−Ｇの向かいに誤取り込みされ得る天然の塩基Ｔを有したり、取り込んだりしているときに、特に好都合であることが分かっている。上記の誤取り込みは、Ｔとミスペア（mispair）を形成するｉＧの少ない互変異性体（tautomeric form）に起因するものであると考えられている。したがって、上記の比率を提供する組成物もまた記載されている。また、非標準塩基の比率は、必要に応じて標準塩基に対して減少させることができる。非標準塩基の取り込みとは、非標準塩基が初期のプライマー配列に存在するというよりもむしろ、プライマーの伸長中に、非標準塩基が増幅産物に付加されることを意味する。
【００４５】
前述の方法に従って生成される、上記増幅された核酸および混合物もまた、ここに記載されている。
【００４６】
第３の塩基対を生成する２つの追加の塩基は、ポリメラーゼ連鎖反応に用いられる。第３の塩基対に対する酵素の忠実度は、分子熱力学融解（molecular thermodynamic melting）、化学切断、および分子標識を用いて実証される。複数の非標準塩基対を含むわずか１５の標的を、４０サイクルで増幅するとき、配列が保存されていることは、実施例で示されている結果によって確認できる。３つの塩基対によって提供される追加の配列空間によって、天然のＤＮＡまたはＲＮＡのみで可能であったよりも高い複雑性および良好な識別を達成できる分子ツールを構築できる。したがって、本発明にかかる方法、キット、および組成物は、３つ、４つ、またはそれ以上の特異的な塩基対を含む核酸を増幅するために用いることができる。
【００４７】
ある実施形態においては、核酸増幅反応溶液のｐＨを、標準塩基のみを含む核酸増幅反応に比べて上昇させる。ＰＣＲ反応での一般的なｐＨは８．３である。したがって、本発明にかかるある方法は、ｐＨが８．５以上の溶液中で実施される。また、ある場合には、上記ｐＨは、９．１といったように９より高い。このようなｐＨは、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ-ｐｒｏｐａｎｅ-ＨＣＩバッファーを用いて達成することができる。ｐＨは、およそ（effectively）９．５まで上昇させることができる。当業者には明らかなように、反応溶液のｐＨは、増幅を妨げたり、または反応溶液中の成分を過度に分解したりするほど高くあってはならない。ある実施形態においては、加熱中の反応溶液の酸性度上昇を防ぐために、ＢＩＳ−ＴＲＩＳ-ｐｒｏｐａｎｅのような、最小化されたΔｐＫａ／ｄｅｇｒｅｅ Ｃを有するバッファーを使用することができる。
【００４８】
本発明のアプリケーション（application）は、４つの標準ヌクレオシド三リン酸より多い塩基をＰＣＲ増幅法に用いることができることを示している。この結果として得られる増幅産物は、初期のテンプレートの非天然の塩基または上記増幅に由来するテンプレートに対応する位置に、初期の非天然の塩基対を含む。ＰＣＲ産物に取り込まれた追加の情報は、診断学、酵素学、分子タギング（molecular tagging）、および追加の非天然情報に基づく残基が有益であるその他分野に適用されるだろう。
【００４９】
ある実施形態においては、チップもしくはウエハ、またはチューブ、錐体、もしくはそれ以外の器具の内面または外面のような単一の固体の支持体（single solid support）である固体の支持体が用いられる。上記の固体の支持体は、安定性、寸法、形状、および表面の滑らかさといった所望の特性の最適な組み合わせが得られるように、適切なあらゆる材料から製造される。好ましい材料は、核酸のハイブリダイゼイションが妨げることはなく、また、核酸の非特異的結合をあまり起こさない材料である。適切な材料には、生物学的もしくは非生物学的な有機材料、または無機材料が含まれる。例えば、マスターアレイ（master array）は、あらゆる適したプラスチックもしくはポリマー、シリコン、ガラス、セラミック、または金属から製造される。また、上記マスターアレイは、固体、樹脂、ゲル、剛性フィルム、または軟性メンブレンといった形状で提供される。適切なポリマーには、例えば、ポリスチレン、ポリ（アルキル）メタクリレート、ポリ（ビニルベンゾフェノン）、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリフッ化ビニリデンなどが含まれる。好ましい材料には、ポリスチレン、ガラス、およびシリコンが含まれる。
【００５０】
また、別種類の固体の支持体を使用することもできる。ある実施形態においては、固体の支持体は、粒子状の支持体である。これらの実施形態においては、オリゴヌクレオチドプローブは粒子に結合する。一般的に、上記粒子は、グループを形成していて、各グループの粒子は、例えば、色、蛍光頻度、密度、大きさ、または形状といった特定の特性を有している。上記特性は、他のグループの粒子との識別または分離に利用することができる。例えばフローサイトメトリー法などの技術を用いることによって、上記粒子は好適に分離することができる。
【００５１】
本発明で考えられているように、上記粒子は、実質的にあらゆる不溶性または固形材料物質から製造することができる。例えば、上記粒子は、シリカゲル、ガラス、ナイロン、樹脂、ＳｅｐｈａｄｅｘＴＭ、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ、セルロース、磁性体、金属（鋼、金、銀、アルミニウム、銅、または合金など）、または金属皮膜された物質、プラスチック物質（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ））など、およびこれらの組み合わせから製造することができる。適したミクロビーズの例は、例えば、米国特許第５,７３６,３３０号、６,０４６,８０７号、および６,０５７,１０７号に記載されている。なお、これら全ては、参照として本明細書に組み入れられる。適した粒子の例は、例えばLuminex Corp., Austin, TXが提供している。
【００５２】
別の例として、上記支持体は、選択的に互いに結合される特有の支持体表面のグループであってもよい。例えば、上記支持体には、特有の光ファイバー、または異なるオリゴヌクレオチドプローブに別々に結合し、その後共に結合してマトリックスのような単一の物を形成する他の支持体が含まれる。
【００５３】
一般的に、上記支持体は（単一の支持体であろうと、粒子状の支持体であろうと）、十分に安定的な方法で、オリゴヌクレオチドプローブを上記支持体の表面に結合、または保持させることができる。これにより、本明細書に述べられている目的を達成することができる。上記の結合には、例えば、支持体とオリゴヌクレオチドプローブとの間における共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合、またはファン・デル・ワールス結合、または正または負に荷電した支持体への吸引（attraction）が含まれる。オリゴヌクレオチドプローブは、直接またはリンカーを介して固体の支持体の表面に結合する。一実施形態においては、オリゴヌクレオチドプローブは、１つ以上の反応性官能基を有する表面、オリゴヌクレオチド、またはその両方を提供または誘導することによって、支持体表面に直接結合させられる。例えば、ＬｕｍｉｎｅｘＴＭ粒子の表面は、例えば、カルボン酸塩、マレイミド、もしくはヒドラジドの機能性、またはアビジンで修飾することができる。また、ガラスの表面は、（シッフ塩基アルデヒドアミンをＤＮＡとカップリングさせるために、）例えば、シランまたはアルデヒドで処理できる。ある実施形態においては、上記支持体または上記支持体上に配置された物質（例えば支持体上のコーティング）は、プローブオリゴヌクレオチド上の反応性官能基と結合しうる反応性官能基を含む。例えば、上記支持体は、オリゴヌクレオチドプローブに結合する部位を提供するために、機能化されていたり（例えば、反応性をもつように機能化された金属またはポリマー表面）、または特定の機能性（例えば、未解明（pending）な官能基を持つポリマー）をもっていたりしてもよい。
【００５４】
別の方法として、オリゴヌクレオチドプローブの架橋によって、上記表面上に当該オリゴヌクレオチドプローブが保持されていてもよい。架橋されるポリヌクレオチドプローブは、架橋部分とプローブ部分とを含み、上記プローブ部分は、上記標的オリゴヌクレオチドの配列にハイブリダイズする配列を含むことが好ましい。
【００５５】
また別の方法として、上記支持体は、ストレプトアビジン、抗体、抗原、酵素、酵素補因子もしくは阻害剤、ホルモン、またはホルモン受容体のような結合剤で、部分的に、または完全に覆われていてもよい。上記結合剤は、一般的に、別の分子または微粒子に対して高い親和性を有する生物学的分子または合成分子である。これらの分子と上記結合剤とは、共有結合または非共有結合により結合する。上記オリゴヌクレオチドプローブは、上記結合剤の相補物（complement）に結合する。上記相補物は、例えば、ビオチン、抗原、抗体、酵素補因子もしくは阻害剤、酵素、ホルモン受容体、またはホルモンである。また、上記オリゴヌクレオチドプローブは、上記結合剤に接触して、上記支持体上に保持される。本明細書において述べられているシステムおよび方法において、その他公知のカップリング技術を容易に適用および使用することができる。
【００５６】
本発明にかかる方法、キット、および組成物は、全ての核酸増幅に適している。なお、これらにおいては、核酸が使用される。多くの商用アプリケーション（application）において、ＤＮＡは２つの状況（context）に関連している。１つ目の状況では、ＤＮＡ様結合は、分子構造中の情報を認識する作業（task）を実行するために用いられる。２つ目の状況では、ＤＮＡは、生物学的サンプル中に存在し、未知量で、時には未知配列を有する解析の標的、すなわち「検体（analyte）」である。２つ目の状況におけるＤＮＡは、１つ目の状況におけるＤＮＡの機能を阻害する（obstruct）可能性がある。したがって、天然のＤＮＡのように振舞う（behave）が、天然ＤＮＡと交差反応しない分子システムは有益である。逆説的には、もし、この新たなシステムが、ここに提示されているシステムのようにＤＮＡに対する構造上の類似性を共有するのであれば、ＤＮＡのために既に開発されている豊富な酵素学および技術をさらに活用することができる。
【００５７】
したがって、ＤＮＡに追加の塩基対を配置する機能には、さまざまな適用可能性がある。Urdeaと共同研究者らは、まず、派生させたＤＮＡ技術を用いて、診断的に利用できることを示した。別の用途として、分子コーディング（molecular coding）への適用が考えられる。分子コーディングでは、多数の技術でＤＮＡが利用されている。コーディングは、診断において、反応生成物を固相へとプローブするために用いられる。これについては、Landegren, U.らによるScience 241:1077-1180(1988)；Oliphant, A.らによるBiotechniques Suppl, 56-58，60-61(2002)；およびChen, J.らによるGenome Research 10:549-57(2000)を参照されたい。コーディングでは、ＤＮＡコンピューティングにおいて、対象物はタガントと称される識別可能なＤＮＡ断片によって標識される。これについてはGibbons, A.らによるCurr. Opin. Biotechnology 8:103-6(1997)を参照されたい。これら全ては、自然発生したＤＮＡに直交する余分な塩基を含んでいることから恩恵を得ている。
【００５８】
また、別の用途は、１本鎖で高度に折りたたまれたＤＮＡおよびＲＮＡ分子であるアプタマーの分野に関するものである。上記アプタマーは、抗体のように、高い親和性と特異性で標的分子に結合することができる。一般的に、アプタマーは、標的結合およびＰＣＲ増幅を複数回行った後に化学的に合成されたオリゴヌクレオチドの広大なライブラリーから抽出される。これについては、Ellington, A.D. and Szostak, J.W., Nature 346:818-822(1990)などを参照されたい。触媒活性のあるアプタマーは、速度増強活性およびターンオーバー活性（turnover activity）を使って分離される。しかし、標準核酸からなるアプタマーは、酵素的な機能に幾分限定されているため、修飾された核酸が探索されている。例えば、Battersby, T.R.らによるJ Am Chem Soc 121、9781-9789(1999)；およびSantoro, S.W.らによるJ Am Chem Soc 122,2433-9(2000)を参照されたい。これについて、さらに詳しく言えば、多数の官能基を用いることができる。慣例的に、１つの機能性がウラシルに加えられる。これは、化学的置換基を追加の塩基に配置することは、通常より早く、反応を停止させるという酵素学的な理由によるものであろう。基本的要素の数を増加させることによって、化学的置換基間の間隔をさらに広げることができる。これにより、ポリメラーゼが全長配列をより処理しやすくなる。
【００５９】
さらに、ＤＮＡは、分子スイッチを形成したり、３次元記憶素子に組み込んだり、高密度の分子認識バイオチップを生み出したり、また既定の構造に組み込んだりできるため、ナノ技術の分野でも利用されるようになっている。複雑なＤＮＡ構造を作り出すための法則、および、より複雑なＤＮＡナノ構造をスクリーニングおよび操作するためのツールが単純であるため、ＤＮＡは、ナノ技術に明らかに追加されている。
【００６０】
ここに示されているｉＣ／ｉＧの取り込み忠実度は、十分、前述の議論した用途に必要とされる範囲内にある。なぜなら、産物に含まれるｉＣ／ｉＧをプローブ（probe）するために用いられるタグ配列（tagging sequence）は、誤取り込みされた天然の配列と交差反応はせず、選択スキーム（selection scheme）は、どのような不適な配列をも排除するためである。示されるデータは、追加の塩基対を用いて新しい技術を生み出すことに関してのみならず、高忠実度の酵素的取り込みおよび特異的酵素認識に依存する新しい生物（organisms）を生み出すことに対しても関心を喚起するものである。拡大した遺伝子アルファベットを利用する必要のある状況をさらによく理解するための追加の研究によって、自然のアルファベットがどのように進化したのかをより理解することができるであろう。
【００６１】
本発明にかかる方法のうち、ある方法では、核酸増幅は、StumpらによるNucleic Acids Research 27(23):4642(1999)で述べられているような直線的な増幅、またはよく知られているＰＣＲ法のような指数関数的なもしくは対数増殖的な（exponential growth）の増幅を達成するために行われる。核酸増幅反応を１つ以上の標的核酸（その全てまたは一部に非標準塩基を含んでいてもよい）を増幅するために、多重化して行うこともできる。
【００６２】
ほとんどの実施形態において、本発明にかかる方法およびキットは、核酸に非標準塩基を適切に取り込むことができるポリメラーゼ酵素を用いる。上記ポリメラーゼ酵素は、非標準塩基が最もよく対を形成する塩基に対して高い特異性をもって、非標準塩基を取り込むことが好ましい。ある実施形態では、上記ポリメラーゼ酵素は、エクソヌクレアーゼ活性を欠損している。適したポリメラーゼの例は、ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼおよびＴｉＴａｑポリメラーゼである。Ｋｌｅｎｔａｑ１ＴＭは、Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８の商品名である。上記Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、サーマス・アクアチクス（Thermus aquaticus）またはサーマス・フラーブス（Thermus flavus）のＤＮＡポリメラーゼと実質的に同一のアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼであるが、サーマス・アクアチクスのＤＮＡポリメラーゼのＮ末端から２８０個のアミノ酸残基またはサーマス・フラーブスのＤＮＡポリメラーゼのＮ末端から２７９個のアミノ酸が欠損している。これについては、米国特許第５，４３６，１４９号で論じられている。Ｋｌｅｎｔａｑ−２７８は、エクソヌクレアーゼ活性が実質的に欠損している。ＴｉＴａｑまたはＴＩＴＡＮＩＵＭＴＭ  Ｔａｑは、ヌクレアーゼ活性が欠損（nuclease-deficient）しており、サーマス・アクタチクスのＤＮＡポリメラーゼのアミノ末端が欠失変異体である。なお、当該Ｔａｑは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入可能である。
【００６３】
ある実施形態においては、ポリメラーゼは、ＴｆｌおよびＴｇｏといったＴａｑではない。なぜなら、これらのポリメラーゼは、本明細書において述べられているように、非標準塩基の取り込み忠実度を高めるために、反応条件を改変すれば用いることができるかもしれないが、非標準塩基に向き合う塩基を誤取り込みすることが実証されたためである。
【００６４】
本明細書で使われている「非標準」または「非天然」の塩基、組み合わせ方式（pairing scheme）、および塩基対は、自然発生するＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵ塩基、並びにＡＴ、ＡＵおよびＧＣの塩基対ではない。一般的に、これらの「非標準」の塩基では、組み合わせ方式は、自然発生した塩基対に見られるのとは異なる水素結合パターンを持つ。ある実施形態においては、本発明にかかるアプリケーションキットおよび方法は、１つの別の非標準塩基のみと特異的に対を形成する（望ましくは高忠実度で対を形成する）非標準塩基を用いる。非標準塩基および非標準塩基対の例は、米国特許第５，４３２，２７２号、第６，００１，９８３号、第６，０３７，１２０号および第６，１４０，４９６号で論じられている。非標準塩基の具体的な例としては、ｉＣ：ｉＧとして共に対を形成するｉｓｏ−Ｃ（ｉＣ）およびｉｓｏ−Ｇ（ｉＧ）が含まれる。非標準塩基の他の例としては、相補体として機能する特定の非標準塩基を特異的に認識するが、水素結合パターン以外の方法で認識する非標準塩基の誘導体が挙げられる。これらは、塩基対を形成するために疎水的な相互作用を用い、特定の塩基対認識（base pairing recognition）のための水素結合に依存しないものを含むが、それに限定されるものではない。
【００６５】
特定の実施形態においては、本発明にかかる方法は、６つの塩基の遺伝暗号、すなわち、４つの標準核酸またはヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴもしくはＵ、並びに２つの非標準塩基ｉＣおよびｉＧを用い、かつポリメラーゼとしてＫｌｅｎＴａｑまたはＴｉＴａｑ酵素を用いて、１つ以上の非標準塩基を含む標的核酸に対して、核酸増幅を行う工程を伴う。これらの実施形態のうち、ある実施形態においては、上記反応は、ＰＣＲ反応であって、２０、２５、３０、またはそれ以上のサイクルで、標的核酸を増幅する。
【００６６】
ポリメラーゼ酵素の忠実度（fidelity）、および特に高い忠実度との用語は、当技術分野に熟達した者にとってよく知られている用語であって、ポリメラーゼが、対応する相補的なヌクレオチドの向かいにヌクレオチドを正確に取り込む能力を述べるために用いられる。すなわち、ポリメラーゼの忠実度が高ければ高いほど、特定の対応するヌクレオチドを正確に取り込む確率が高い。本発明にかかる方法のある実施形態においては、ポリメラーゼ酵素の忠実度は、１５、２０、２５、３０、３５、４０、またはそれ以上のサイクルを行えるほど高いため、配列の大部分は、開始時のテンプレートに由来する最初のヌクレオチド配列を有する。例えば、１サイクル当たり５％、４％、３％、２％、１％、を持つことになる。
【００６７】
ある実施形態においては、ポリメラーゼ酵素によって取り込まれる非標準塩基は、他の非標準塩基であって、自然発生した塩基の１つではない塩基に対して相補的な位置に取り込まれる。ある実施形態においては、第１の非標準塩基は第２の異なる非標準塩基と特異的に対を形成するだけでなく、この逆も正確である。具体的には、第２の非標準塩基は他の非標準塩基とではなく、第１の非標準塩基と特異的に対をなす。ある実施形態においては、非標準塩基は上述のように対を形成するだけでなく、ある特定の塩基組み合わせ方法によってのみ、核酸増幅中に核酸鎖に取り込まれることがある。つまり、それらの非標準塩基は、互換性のある適切な非標準塩基の向かいの位置で、ポリメラーゼによって伸長されている核酸に取り込まれる。例えば、ｉＣは、実質的に、ｉＧの向かい側にのみ取り込まれる。また、その逆も同様である。本明細書に記載されているように、このような取り込み忠実度は、塩基に対して特異的であるのみならず、ポリメラーゼに対しても特異的である。さらに、ポリメラーゼは、一般的に、非標準塩基を取り込む能力を持つだけでなく、テンプレートに特異的な様式で、伸長産物に対して、通り過ぎた非標準塩基（past the non-standard base）に追加の塩基を付加させ続けることができる。言い換えれば、ポリメラーゼは、それまでに非標準塩基を取り込んだいかなる核酸をも伸長することができる。
【００６８】
非標準塩基は、自然発生したプリン、すなわちアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、ピリミジン、シトニン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、またはウラシル（Ｕ）と共に使用することができる。ある実施形態においては、Ｔは反応混合物において使用されず、その代わりに、Ｕと置き換えられる。ＫｌｅｎＴａｑが修飾されたポリメラーゼからは、ＫｌｅｎＴａｑ酵素から得られる取り込み忠実度が得られないと思われるため、ＫｌｅｎＴａｑ酵素の使用は、意外であり、かつ予想外である。ある実施形態においては、ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼは、特定の条件下での核酸増幅過程において、ｉＧの向かいにＴを配置することがあるということが分かっているため、ＵはＴに置き換えることができる。したがって、非標準のｉＧ：ｉＣ塩基対はＡ：Ｔに変換される。意外にも、反応において、ＴをＵで置き換えることで、この問題を克服することができる。それは、ＫｌｅｎＴａｑポリメラーゼは、ｉＧの向かいにＵを配置することがないと思われるからである。したがって、少なくとも３つの塩基対を用いた、特異的でかつ高い忠実度の核酸増幅反応は、ｉＣおよびｉＧと共に、自然発生した塩基、すなわち、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵを利用することで可能となった。
【００６９】
本明細書で述べられる方法には、さらに、１つ以上の標的核酸が存在するときに、核酸増幅を行うことのできる反応混合物に対して核酸増幅反応を行う工程を含むことができる。核酸増幅を行った後、標的核酸の有無を調べたり、その量を測定したりすることができる。核酸産物の検出または定量を促進するために、増幅反応で用いられたプライマー、塩基、または核酸の１つ以上を標識化することができる。増幅産物の検出は、例えば、TyagiらによるNature Biotechnology 14:303(1996)で開示されているように、蛍光成分および／またはクエンチャー成分を使って標識できる標識配列を使用してリアルタイムで行うことができる。標的核酸は、特定の核酸配列を有する、または有すると思われるサンプルから供給または単離される。さらに、既知の配列を有する特定の標的核酸を反応に加えることができる。
【００７０】
増幅反応混合物は、核酸増幅の実施に必要な成分の全部または一部を有することができる。また、それらの成分は、あらゆる適切な順序で添加すればよい。一般的に、核酸増幅に必要な成分には、バッファー、マグネシウムイオン、デオキシリボヌクレオシド３リン酸のような核酸に取り込まれうるヌクレオチド、ポリメラーゼ酵素、および１つ以上のプライマーが含まれる。本発明にかかる方法の実施にあたり、標的核酸は必要でないが、標的核酸の存在下でなければＰＣＲ反応は成功しないことは、当技術分野に熟達した者であれば分かるであろう。
【００７１】
同様に、あらゆる核酸増幅の効率を測定及び／又はコントロール反応と比較することができる。この方法によれば、異なる核酸ポリメラーゼの有効性を検証することができる。
【００７２】
本発明にかかる方法は、様々な厳密な条件の下でも実施可能である。この厳密度（Stringency）に影響を与える様々な要素には、例えば、温度、塩濃度、プローブ／サンプル相同性、核酸の長さ、および洗浄条件などが含まれる。厳密度は、ハイブリダイゼイション温度の上昇に伴って高くなり、他の全ての要素では変化しない。厳密度が高くなるということは、非特異的なハイブリダイゼイションが減少する、つまり、バックグラウンドノイズ（background noise）が減少する。核酸ハイブリダイゼイションの「厳密度が高い条件」および「厳密度が中程度である条件」については、AusubelらのCurr. Prot. Mol. Biol., 1998、Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NYで説明されている。また、厳密度が低い条件を用いることもできる。もちろん、ハイブリダイゼイション条件の厳密度が必要に応じて変更可能であり、核酸鎖間の様々な相補度（complementation）を含めたり、除外したりするために、または、好ましい検出範囲を達成するために、ハイブリダイゼイション条件の厳密度が必要に応じて変更可能であることは、当業者は、十分理解しているであろう。同様に、タンパク質および核酸は、両者間の相互作用を強化または妨害する様々な条件の下で相互作用させることができる。
【００７３】
本発明にかかる方法は、分子タギング（molecular tagging）、ＳＥＬＥＸ、様々な診断用途、およびｓｉＲＮＡのような核酸に基づいた治療法（therapeutics）の産出を含む様々な用途に用いることができる。本方法はまた、非標準塩基およびアプタマーを取り込んだ分岐核酸を製造するために用いることができる。
【００７４】
ある実施形態において、非標準塩基対には、同等の親和性の有無と関係なく、比較的無差別または非優先的な形で自然発生した２つ以上の、つまり３、４、または５つ全ての塩基に結合する塩基のような非特異的、「普遍的」、または「一般的」塩基は含まれない。また、本発明にかかる核酸は、そのような普遍的な塩基を含んでいたり、取り込んでいたりしてもよい。上記の非特異的または普遍的塩基の例としては、２’−デオキシイノシン（イノシン）、３’−ニトロピロール ２’−デオキシヌクレオシド（３’−ニトロピロール）、並びに米国特許第５，４３８，１３１号および第５，６８１，９４７号に開示されているものが含まれる。一般的に、塩基が天然塩基の部分集合のみに対して「普遍的」であるとき、該部分集合は、プリン（アデニンまたはグアニン）またはピリミジン（シトニン、チミン、またはウラシル）のいずれかである。プリンに対して普遍的であると考えられるヌクレオチドの例は、“Ｋ”塩基（Ｎ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリン）として知られている。これについては、BergstromらによるNucleic Acids Research 25:1935(1997)で説明されている。また、ピリミジンの例は、“Ｐ”塩基（６Ｈ、８Ｈ‐３、４‐ジヒドロピリミド[４，５-ｃ][１、２]オキサジン−７−ｏｎｅ）として知られており、Bergstromらによるsupra、および米国特許第６，３１３，２８６で論じられている。その他の適切な普遍的ヌクレオチドには、５−ニトロインドール（５−ニトロインドール  ２’−デオキシヌクレオシド）、４−ニトリインドール（４−ニトロインドール  ２’−デオキシヌクレオシド）、６−ニトロインドール（６−ニトロインドール  ２’−デオキシヌクレオシド）または２’−デオキシネブラリンが含まれる。
【００７５】
標識は、非標準塩基を含む核酸の検出を簡単にすることができる有益な成分であり、ヌクレオチドまたは核酸などのいかなる必要な成分にも取り付けることができる。上記標識は、増幅産物の直接的、近接的、または間接的検出のいずれか、および／または精査（probe）を容易にする。さらに、上記成分の内２つは、２つのオリゴヌクレオチド成分のみを増幅反応に用いるような単一構造（unitary structure）の一部である。ここで使用されている通り、直接検出可能な標識は、直接、または基質（酵素の場合）、光源（蛍光化合物の場合）、もしくは光電子増倍管（放射性または化学発光性化合物の場合）のような物質との相互作用を介して検出することができるシグナルを発生する。
【００７６】
好適な直接標識の例としては、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、３Ｈ、および１４Ｃを取り込んだオリゴヌクレオチドの使用などの、放射性同位体標識が含まれる。オリゴヌクレオチドを直接標識化するひとつの方法としては、エンド標識法がある。エンド標識法においては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’末端へと標識を導入する（Richardson, C.C. The Enzymes, Vol XIV, Nucleic Acids Part A, Ed. Boyer, P.D., Acad. Press, p299(1981)などを参照されたい）。さらに、末端のデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、供給された連続したデオキシリボヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドの３’末端へ付加することができ、またシングルヌクレオチド標識法（single nucleotide labeling）も使用することができる（Bollum, F.J., The Enzymes, Vol. X, Ed. Boyer, P.D. Acad. Press, (1974)；Yousaf, S.I.らによるGene 27:309(1984)；およびWahl, G.M.らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3683-3687(1979)などを参照されたい）。例えば、３２ＰｄｄＡＴＰといった標識化されたｄｄＮＴＰもまた使用可能である。
【００７７】
間接的に検出可能な標識は、それ自体は検出可能なシグナルを発生させないが、間接的に検出可能な標識が付着しているオリゴヌクレオチドを識別するために用いられる。ビオチン、抗体、酵素、フェリチン、抗原、ハプテンなどは、ｄＮＴＰまたはｄｄＮＴＰと結合した時に間接的に検出可能な標識の例を構成する。非放射性の直接標識の好適な例としては、フルオレセイン‐１１‐ｄＵＴＰ（本明細書に参照としてその内容が取り込まれている、Simmonds, A.C.らによるClin Chem 37:1527-1528(1991)を参照）およびジゴキシゲニン-１１ ｄＵＴＰ（本明細書に参照としてその内容が取り込まれている、Muhlegger, K.らによるNucleosides & Nucleotides 8,pp.1161-1163(1989)を参照）が含まれ、これらを標識として使用することができる。さらに、ハプテンで標識化されたオリゴヌクレオチドのような非放射性的に標識されたオリゴヌクレオチドを使用することもできる（Adams, C.W., PCT Patent Appln. WO 91/19729などを参照）。上記のハプテン標識を含む検出スキームには、ハプテンに対する抗体の使用が含まれている。なお、該抗体は標識されている。ビオチンは、特に好適な間接標識であり、ビオチニル化された核酸分子は、標識化または不溶化されたアビジン、ストレプトアビジン、抗ビオチン抗体などを使って検出することができる。また、ビオチニル化された分子は、該分子を不溶性または固定化されたアビジンと接触させることによって、ビオチニル化されていない分子と迅速に分離することができる。
【００７８】
上記の点で、例えばビオチン-１１-ｄＵＴＰは、ｄＵＴＰまたはｄＴＴＰの代わりに使用することができ、またはビオチン-１４-ｄＡＴＰはｄＡＴＰの代わりに使用することができる（本明細書に参照としてその内容が取り込まれているLanger, P.R.らによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6633-6637(1981)を一般例として、参照されたい）。ビオチニル化されたホスホラミダイト（phosphoramidites）もまた使用可能である（Misiura, K.らによるNucleic Acids Research 18:4345-4345(1990)を参照されたい。なお、本明細書に参照としてその内容が取り込まれている。）。上記のホスホラミダイトによって、オリゴヌクレオチドの合成中、その増加していくオリゴヌクレオチド成分に沿った希望する部位に、ホスホラミダイトが正確に取り込まれる。
【００７９】
化学発光物質もまた、間接標識として使用することができる。西洋わさびペルオキシダーゼ（“ＨＲＰ”）やアルカリホスファターゼ（“ＡＰ”）など、核酸に直接架橋させることができる酵素を用いてもよい（Renz, M. およびKurz, C., Nucleic Acids Research １２：３４３５-３４４４（１９６４）を参照されたい。なお、本明細書に参照としてその内容が取り込まれている。）。ＨＲＰの基質であるルミナール、およびＡＰの基質である置換ジオキセタン（substituted dioxetanes）を、化学発光基質として使用することができる。ＨＲＰ標識化プロトコールの典型例としては、Amersham社製（Arlington Heights, Ill., USA）のＥＣＬシステムがある。
【００８０】
直接標識または間接標識の代わりとして、近接標識を用いてもよい。近接標識とは、それと相互作用する別の標識の存在下でのみシグナルを発生する化学成分である。一般的に、近接標識はそれと対応する別の近接標識と組み合わせて使用する。
【００８１】
本発明にかかる方法は自動化に役立つものであることは、当技術分野に熟達する者に理解されるであろう。
【００８２】
本発明にかかるオリゴヌクレオチド、方法、およびキットは、単独で、またはさまざまな組み合わせのいずれかで、本明細書に述べられているいずれかの特徴を作り出すまたは生かすことで実施することができる。さらに、当業者は、本発明は前述の特徴の１つ以上を特に除外する、本発明にかかるオリゴヌクレオチドおよび方法の変種（variation）を含んでいることを理解するだろう。本明細書で使われているように、“a”または“an”は、“１つ”または“１つ以上”を意味する。
【００８３】
本発明は、また、本発明にかかる方法を実施するためのキットを提供する。一実施形態において、上記キットは、本明細書に記載の方法のいずれかを実施するための説明書（instruction）から構成されている。上記説明書は、印刷された紙や、コンピュータで読み込み可能な媒体などの有形媒体を介したあらゆる明確な形態で提供される。また、上記キットは、本方法の実施を容易とするために、１つ以上の試薬、バッファー、ハイブリダイゼイション媒体、ヌクレオチド、標準ヌクレオシド三リン酸、非標準ヌクレオシド三リン酸、核酸、核酸プローブ、プライマー、ヌクレオチド、分子量マーカー、酵素、固体の支持体、データベース、コンピュータプログラム、および／または多穴プレートなどの使い捨て実験器具を含んでいてもよい。本発明にかかるキットに含まれる酵素は、ＤＮＡポリメラーゼなどである。固体の支持体は、ビーズなどを含む。また、分子量標識には、例えば、ビオチンやストレプトアビジンなどが結合した標識が含まれる。上記キットの成分を、必要に応じて同一または別々の容器へ包装することができる。適切なキットの成分の例は、上述または後述の例に記載されている。
【００８４】
〔実施例〕
〔実施例１〕
本実施例は、非標準塩基を含む核酸に対するＰＣＲ増幅の使用例を示す。下記の実施例では、ｉＣはＸで、ｉＧはＹで表される。下記の実施例では、ＪＰ１８４（5'-TCTCTCCTTGCGTCTCTGT-3'）（配列ＩＤ  ＮＯ：１）およびＪＰ１８５（5'-GTGGGTGCGTTCTTTCTTG-3'）（配列ＩＤ  ＮＯ：２）は、各反応で使用するプライマーである。ＪＰ１８３（5'-GTGGGTGCGTTCTTTCTTGCCGYCGGGCYGCGGACAGAGACGCAAGGAGAGA-3'）（配列ＩＤ  ＮＯ：３）およびＳＣＪ２４５（5'-GTGGGTGCGTTCTTTCTTGCTGYCGTGCTGCGGACAGAGACGCAAGGAGAGA-3'）は標的である。ＳＣＪ２４５は、プライミング部位（priming site）間の領域において、２つのＡ：Ｔ塩基対がＧ：Ｃ塩基対に置き換えられている点で、ＪＰ１８３とは異なる。ＳＣＪ０９０（5'-CGACGCXGCCCGXCGGTCG-3'）（配列ＩＤ  ＮＯ：５）およびＳＣＪ２４６（5'-CGACGCXGCACGXCAGTCG-3'）（配列ＩＤ  ＮＯ：６）は、正確な産物をリアルタイムで検出するために使用する、標識化された分子標識である。上記分子標識は、相補的な配列が存在しないとき、ヘアピンを形成することによって機能する。ヘアピン構造では、ＦＡＭシグナルは消失される（quench）。ＰＣＲによって特定の産物が生成され、変性サイクル中に、上記分子標識はアンフォールド（unfold）されると、図１に示されているように上記の２つの種（species）は互いにハイブリダイズする。この形状においては、ＦＡＭ色素は、クエンチャー（quencher）の末端にあり、蛍光シグナルが生成される。ＫｌｅｎＴａｑ１ＴＭポリメラーゼは、ミズーリ州セントルイスのaB Peptides Inc.から入手した。
【００８５】
〔実施例２〕
この実施例における反応条件は後述の通りであり、その結果については図２に記されている。第１に、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｘ、およびＹの取り込みを必要とする標的の増幅において、ＵをＴに置き換える影響について実験した。前記のＪＰ１８３標的は、Ｔを必要としないが、ＳＣＪ２４５はＴを必要とする。したがって、図２の左側で、ＴをもつＪＰ１８３アンプリコン（amplicon）、およびＵをもつＪＰ１８３アンプリコンは、それぞれ上段パネルおよび下段パネルに示されている。Ｔを用いた反応については、先に見られた通りである。Ｇ、Ａ、Ｃ、Ｘ、およびＹ（＠）は、上記分子標識にハイブリダイズする産物を生成するが、Ｔ（*）が添加されるとシグナルは消失する。しかし、下段パネルにおいて、ＴがＵに置き換えられるとき、Ｇ、Ａ、Ｃ、Ｘ、およびＹ（＠）反応と、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｘ、およびＹ（*）反応とは、両者とも、分子標識にハイブリダイズするアンプリコンを生成する。これは、ＵはｉＧと安易に誤って対を形成しないので、ｉＣが適切に取り込まれることを示唆している。右側のパネルは、内部Ａ：Ｔ塩基対を含む標的である。したがって、産物を生成するために全６塩基が必要であるため、Ｇ、Ａ、Ｃ、Ｘ、およびＹ反応のいずれもシグナルを発生させなかった。この反応は、Ａと対を形成する反応において、Ｔを必要とする。Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｘ、およびＹ（*）は、予想通り、誤取り込みのためシグナルを発生させなかった。しかし、Ｇ、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｘ、およびＹ（*）反応は起こる。したがって、このことは、ＵがｉＧ互変異性体（tautomer）との誤った対形成を減少させることができることを示している。
【００８６】
〔実施例３〕
＜プライマー伸長および融解解析（melt analysis）＞
２００ｎＭの５’標識テンプレートＤＮＡオリゴヌクレオチド（5'-TET-T-iC-CGT-iG-CCGTCTCCGTCGTCAGCCGTCA-3'）（配列ＩＤ  ＮＯ：７）は、２倍過剰量の各コントロール、（5'-TGACGGCTGACGACGGAGACGGGACG-3'（配列ＩＤ  ＮＯ：８）、5'-TGACGGCTGACGACGGAGACGGAACG-3'（配列ＩＤ  ＮＯ：９）、5'-TGACGGCTGACGACGGAGACGGTACG‐3'（配列ＩＤ  ＮＯ：１０）、5'-TGACGGCTGACGACGGAGACGGCACG-3'（配列ＩＤ  ＮＯ：１１）、5'-TGACGGCTGACGACGGAGACGG-iC-ACG-3'（配列ＩＤ  ＮＯ：１２）、または試験的ＤＮＡヌクレオチド（5'-TGACGGCTGACGACGGAG-3'（配列ＩＤ  ＮＯ：１３）と組み合わせた（combine）。伸長反応は、１０ｍＭのbis-tris-propane-ＨＣｌｐＨ９．１、４０ｍＭの酢酸カリウム、２ｍＭの塩化マグネシウム、０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、２５μＭのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびｉＣ）、１０μＭのデオキシイソグアノシン三リン酸-ダブシル(ｉＧＴＰ−Ｄａｂｃｙｌ)、および１×ＴｉＴａｑ（Clontech, Palo Alto, CA）を含む１０μＬの反応体積で行った。伸長は、９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、そして６５℃で１分というプロファイルを用いて行った。１０ｍＭのＥＤＴＡを添加して反応を終了させた。６０℃から９０℃での熱融融解解析（thermal melt analysis）は、ｉＣｙｃｌｅｒ（ＢｉｏＲａｄ社、Hercules, CA）上で、６０℃で３０秒、そして６０℃（１サイクルごとに０．５℃ずつ昇温）で１０秒を６０サイクルというプロファイルを用いて行った。
【００８７】
＜非天然塩基の取り込みおよび融解解析＞
プライマー伸長システムを構築し、様々な条件下においてｉＧの向かいに取り込まれる塩基の同一性（identity）を調べた。評価をするパラメータには、ヌクレオシド濃度、緩衝条件（buffering condition）、およびポリメラーゼが含まれていた。該システムにおいて、蛍光クエンチャーで修飾されたｄｉＧＴＰは、フルオロセイン標識からＤＮＡ鎖の向かいに取り込まれた。プライマー伸長の後の熱融解解析によって、上記２つの鎖は分離され、これにより、融解温度（Ｔｍ）が決定される。上記産物のＴｍと、塩基自体が分かっているコントロール構成物（construct）のＴｍとを比較することによって、取り込まれたヌクレオチド鎖（string）、最も重要なことには、非天然塩基の向かいのヌクレオチドを同定する（identify）。非天然三リン酸の天然三リン酸に対する比率を高め、かつ、ＴｉＴａｑ（ヌクレアーゼ欠損であり、サーマス・アクアチクスＤＮＡポリメラーゼのアミノ末端欠失変異体）を用いることにより、ｉＧの向かいへの誤取り込みが大幅に減少することが上記の実験で明らかになった。また、上記の実験によって、チラミジンが、ｉＣＴＰを反応に加えないときに、ｉＧの向かいに取り込まれる主なヌクレオチドであることを示す過去の論文が確証づけられた。これは、互変異性説（図面３）を支持するものである。
【００８８】
〔実施例４〕
＜酸切断解析（acid cleavage analysis）＞
プライマー伸長を、３００ｎＭのＳＣＪ１２４４（5'-Cy3-CCAATGTACGGGGTAAACTCT-3'）（配列ＩＤ  ＮＯ：１４）を、２００ｎＭのＳＣＪ１２４７（5'-GAAGTCCAGCAATCAGAACTATGGCGACTCTCTACCTCCTGCAGGCCCTACCACTTCCCAATAGCTAAGAGTTTACCCCGTACATTGG-3'）（配列ＩＤ  ＮＯ：１５）またはＳＣＪ１２４８（5'-GAAGTCCAGCAATCAGAACTATGGCGACTCTCTACCTCCTGC-iG-GGCCC-iC-ACCACTTCCCAATAGCTAAGAGTTTACCCCGTACATTGG-3'）（配列ＩＤ  ＮＯ：１６）のいずれかと組み合わせて、２５μＬの反応体積で、２５μＭの天然デオキシリボヌクレオシド三リン酸（Ｇ、Ａ、Ｔ、およびＣ）と５０μＭの非天然デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｉＧおよびｉＣ）とを除き、前述と同様のバッファー条件下で行った。伸長は、９５℃で１分、５５℃で１０秒、および７２℃で３０秒というプロファイルで行った。ＰＣＲアンプリコンを、２００ｎＭのＤＮＡオリゴヌクレオチドＳＣＪ１２４４およびＳＣＪ１２４３（5'-GAAGTCCAGCAATCAGAACTATG-3'）（配列ＩＤ  ＮＯ：１７）をプライマーとして使用して生成した。ＳＣＪ１２４７およびＳＣＪ１２４８を１０倍に段階希釈（serial dilution）して、その２．５μＬを、上記伸長で述べた反応混合物１０μｌに使用した。反応は、９５℃で１分、および９５℃で１０分、５５℃で１０秒、７２℃で３０秒というサイクルを４０サイクルというプロファイルに従って行った。
【００８９】
同量の伸長産物と１０ｍＭの氷酢酸とを混合して伸長産物の酸切断を行った。反応液を、９５℃で３０分間インキュベートした。反応容器を開き、９５℃で酸を蒸発させた。２倍量の１００ｍＭの水酸化アンモニウムを添加し、反応液を９５℃で５分間インキュベートした。反応容器を開き、９５℃で塩基を蒸発させた。切断生成物をホルムアミドに再懸濁して、９５℃で１分間加熱した。そして、７Ｍの尿素を含む１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動および蛍光イメージングにより解析した。切断生成物を、ImageQuant software（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、Piscataway, NJ）を使用して定量した。
【００９０】
＜ポリメラーゼの高忠実度の確認＞
次に、ＰＣＲおよび酸切断部分配列決定法（acid cleavage partial sequencing method）を用いて、ポリメラーゼの忠実度を測定した。ｉＣは、酸性条件においては、自然発生した塩基よりも化学変化を起こしやすいことがよく知られている。これについてはVoegel, J.J.およびBenner, S.A.、Helv. Chim. Acta 76:1863-1880(1996)などを参照されたい。低ｐＨ値では、ベータ脱離（beta elimination）の後、核酸塩基の求核置換反応が起こり、その結果、鎖が切断される（Lindahl, T.、Nature 362:709-15(1993)を参照）。核酸塩基がｉＣである部位においては、この速度は、自然発生した塩基の場合の速度よりも速い。上記の情報は、最終アンプリコンで維持されるｉＣの比率をモニターするために利用された。２つの８８ｎｔのテンプレート（１および２）（２つの非標準塩基を含むか含まないのいずれか）が合成された。テンプレート１のｉＣおよびｉＧを、テンプレート２では、それぞれＴおよびＡに変えた。このようにしたのは、このようにしておくことで、誤取り込みが起きた際に、塩基対ｉＣ：ｉＧの解決策となりうることがプライマー伸長実験で示唆されていたからである。全ての反応とも、４０サイクルを行い、また、６つの塩基ヌクレオシド三リン酸混合物、ＴｉＴａｑ、およびＣｙ３で蛍光標識されたフォワードプライマー（forward primer）を含んでいた。主にｉＣを含む部位において鎖を切断するために、産物は酸性条件にさらされ、その後、アルカリ条件にさらされた。ＰＡＧＥを使用して切断生成物を分離し、デンシトメトリで切断率を算出した（図４）。非標準塩基を含む反応については、切断率をテンプレート投入量に対してプロットした。直線の勾配（３．８６）は、各サイクル後に切断される割合の減少であり、ｉＣ：ｉＧ対の忠実度が〜９６％であることを示している。
【００９１】
〔実施例５〕
＜分子標識解析（molecular beacon analysis＞
使用したＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーがＳＣＪ１２４３および（5'-CCAATGTACGGGTAAACTCT-3'）（配列ＩＤ  ＮＯ：１８）であったことを除き、上記酸切断解析の項で記載した通りに、ＰＣＲアンプリコンを生成した。非標準塩基（5'-FAM-GTGCCGGT-iG-GGGCC-iC-GCAGGAGGGGCAC-Dabcyl-3’）（配列ＩＤ  ＮＯ：１９）を含む２重標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドを、２００ｎＭで分子標識として使用した。ＰＣＲ反応のＤＮＡオリゴヌクレオチドテンプレートは、上記と同様、ＳＣＪ１２４７およびＳＣＪ１２４８を１０倍に段階希釈したものとした。段階希釈したテンプレートの２．５マイクロリットルを各反応に添加した。反応は、ＡＢＩ７７００装置（Applied Biosystems社、Foster City, CA）を使用し、９５℃で１分、その後、９５℃で１０秒、６１℃で２０秒、６５℃で１分というサイクルを４０サイクルというプロファイルに従って行った。リアルタイムデータは６１℃で取得した。
【００９２】
＜ＰＣＲ増幅産物の分子標識解析＞
商品として応用できるかを明らかにするために、「分子標識」という著名な方法を使用して、ＰＣＲ増幅中のアンプリコンを含むｉＣ：ｉＧの蓄積を確認した。これについては、Tyagi, S.およびKramer, F.R.によるNature Biotechnology 14:303-308(1996)に開示されている。分子標識は、特定のＤＮＡ配列を検出するためのバイオセンサーである。具体的には、分子標識は、１本鎖ＤＮＡ構造であり、特定の標的にハイブリダイズすると、蛍光強度を変化させる、１対の相互作用する蛍光分子を含んでいる。分子標識は、高い特異性および単一塩基識別能（single base discrimination）でもって結合する。上記の特性は、３つの塩基対から構成されるテンプレートと、２つの塩基対から構成される関連したテンプレートとを識別するためには理想的であると思われる。ＰＣＲの効率を比較するために、６つの塩基ヌクレオシド三リン酸混合物、ＴｉＴａｑ、テンプレート１（非標準塩基を含む標的）に特異的な分子標識、および同一のプライマーセットを含む同じ反応混合物を使用して、上記２つのテンプレートを増幅した。上記実験から放出される蛍光をモニターし、データを用いて直線定量曲線を描いた（図５）。ＰＣＲは、指数関数的な以下の式で表される増幅技術である。
【００９３】
Ｎ＝Ｎ０（ｅ）（Ｋ*ｔ）
（式中、Ｎは分子数を、ｔは時間（ＰＣＲのラウンド）を、Ｋは定数を表す。）
したがって、アンプリコンを完全に１０倍に増やすためには、完全に２倍増幅するとして、〜３．３２の複製サイクルを要する。サイクル閾値に対して、コピー数の対数をプロットすると、各増幅ラウンドで完全に２倍増幅する時の傾きは、〜０．３０１[（２１／０．３０１）＝１０]となる。テンプレート１の上記直線の傾き（傾き＝０．２８±０．０１）は、増幅が不完全であり、１０倍に増加させるために、３．６サイクルが必要であったことを示している。すなわち、効率は約９３％であったことを表している（効率＝ｔｐｅｒｆｅｃｔ／ｔ２＝１／ｔ２＝−ｍ／ｌｏｇ（２）、ここでｍは傾きを表す。）。２つの反応セット（１対２）から放たれるピーク時の蛍光量を比較すると、テンプレート１を使用したとき、３倍の増加が起こったことが分かり、つまり、上記分子標識は、正確な標的に対して特異的であったことを示している。
【００９４】
〔実施例２〜４の考察〕
上記示されたデータは、最も幅広く使用されている分子生物学的な方法、すなわちＰＣＲに対して、新たな塩基対は使用可能であることを示している。上記塩基対（ｉＣ：ｉＧ）を用いた従来の報告は、Ｔとミスペアを形成するｉＧの微量な（minor）互変異性型のために、チラミジンがｉＧの向かいに誤取り込みされるため、ｉＧは実用的ではないことを示唆していた。例えば、Switzer, C.Y.らによるBiochemistry 32:10489-96(1993)などを参照されたい。上記の塩基対をＰＣＲに用いるこれまでの多くの試みは、成功せず、結果として、互変異性体の仮説が打ち立てられた。
【００９５】
ここで報告されるデータから鑑みて、６つの塩基を用いたＰＣＲシステムの有効性は高いと思われる。酸切断部分配列決定および分子標識試験の両者とも、ｉＣとｉＧとの全体的な取り込み効率は〜９６％±３％であることを示している。これらの結果から、これまでの試みは、ｉＧヌクレオチドの互変以外の理由により成功しなかったということを信じざるを得ない。互変以外の理由がより妥当であると考えられるが、その他の理由には、三リン酸の不適切な低濃度；ポリメラーゼの選択；ｉＣ／ｉＧを有する分子の低品質；高いサイクル温度において、反応ｐＨがｉＣが反応ｐＨで過度に不安定であったこと；また、ｉＣを不安定化させていたテンプレートおよびプライマーの精製方法が含まれる。本発明にかかる方法では、核酸増幅の効率を上げるために、どのような組み合わせにも変更可能であり、また、上記パラメータについても、全て変更可能である。上記の結果は、ｉＣ／ｉＧを使用した、拡大した塩基対化学のための強力で再現性のあるシステムが構築されたことを示している。
【００９６】
当業者には明らかなように、あらゆる全ての目的において、特に、明細書を提供する点において、本明細書に記載の全範囲は、あらゆる全ての部分的範囲および部分的範囲の組み合わせをも含んでいる。ここに列挙したあらゆる範囲は、十分記載しているので、容易に理解することができる。また、同じ範囲は、少なくとも２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに等しく分割することができる。限定されていない例として、本明細書に記載の各範囲は、下３分の１、中３分の１、上３分の１というように容易に分割することができる。当業者には明らかなように、「最大で〜まで」、「少なくとも」、「〜より大きい」、「〜より少ない」、「〜より多い」などの全ての言葉は、暗唱された（recited）数字を含み、上述したように、その後、部分的範囲（subrange）に分割できる範囲を指している。同様に、本明細書に開示している全ての比率は、より広範囲の比率の中に含まれる全ての部分的な比率（subratio）を含む。
【００９７】
当技術分野に熟達した者であれば、Markush群のような共通の方法に従って、メンバー（member）がグループ化される場合、本発明は、総括して列挙された全体の群（group）のみならず、群の各メンバーおよび主な群の準群（subgroup）をも含む。したがって、本発明は、全ての目的において、主な群または属（genus）のみならず、１つ以上の群メンバーまたは種（species）が存在しない主な群または属をも含む。本発明はまた、請求項の発明の主な群または属から、群メンバーまたは種のいずれかの１つ以上から除外することを想定している。
【００９８】
本明細中の引用は全て、明確に、参考としてその内容が取り込まれる。
【００９９】
好適な実施形態は図示および記載されているが、本明細書で定義されている幅広い観点からそれることなく、当業者は、常例（ordinary）に従って、変更および修飾することができると理解すべきである。
【０１００】
本発明の応用に関して、以下の文献もまた、本明細書にその内容が取り込まれる。
【０１０１】
Held et al. Nucleic Acids Res. 30(17);3857(2002);
Jurczyk et al., Helveta Chimica Acta 82:1005(1999);
Lutz et al., Nucleic Acids Research 27(13):2792(1999);
Lutz, et al., “Recognition of a Non-Standard Base Pair by Thermostable DNA Polymerases,” Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 8:1149−52(1998).
Michael J. Lutz, et al., “Differential Discrimination of DNA Polymerases for Variants of the Non-Standard Nucleobase Pair Between Xanthosine and 2,4‐Diaminopyrimidine, Two Components of an Expanded Genetic Alphabet, “Nucleic Acids Research 24(7):1308‐13(1996).
Christopher Roberts, et al., “Theoretical and Experimental Study of Isoguanine and Isocytosine: Base Pairing in an Expanded Genetic System,”J. Am. Chem. Soc. 119:4640‐49(1997).
Stephen J. Freeland, et al, “Early Fixation of an Optimal Genetic Code,”Mol. Biol. Evol. 17(4):511‐18(2000).
Eors Szathmary, “What is the Optimum Size for the Genetic Alphabet?,”Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2614‐18(Ａｐｒｉｌ 1992).
Yigin Wu, et al., “Efforts Toward Expansion of the Genetic Alphabet: Optimization of Interbase Hydrophobic Interactions,” J. Am. Chem. Soc.122(32)7612‐32(August 16, 2000）.
Dustin L. McMinn, et al., “Efforts Toward Expansion of the Genetic Alphabet: DNA Polymerase Recognition of a Highly Stable, Self-Pairing Hydrophobic Base,”J. Am. Chem. Soc. 121:11585‐86(1999).
Eunju Lee Tae, et al., “Efforts Toward Expansion of the Genetic AlｐＨaget: Replication of DNA with Three Base Pairs,”J. Am. Chem. Soc. 123:7439‐40(2001).
Yoshinobu Kohara, et al., “DNA Probes on Beads Arrayed in a Capillary, ‘Bead-array,’Exhibited High Hybridization Performance,” Nucleic Acids Research 30(16):1‐7(2002).
Wolfgang Kusser, “Chemically Modified Nucleic Acid Aptamers for in vitro Selections: Evolving Evolution,” Reviews in Molecular Biotechnology 74:27‐38(2000).
Lieven Stuyver, et al., “Line Probe Assay for Rapid Detection of Drug-Selected Mutations in the Human Immunodeficiency Virus Type 1 Reverse Transcriptase Gene,” Antimicrobial Agents and Chemotherapy 41(2):284‐91(Feb. 1997).
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Michael C. Snabes, et al., “Preimplantation Single-Cell Analysis of Multiple Genetic Loci by Whole-Genome Amplification,” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:6181‐85(June 1994).
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、実施例１で使用されている核酸配列を示す図である。
【図２】図２は、塩基の複数の組み合わせを使用して、実施例１に記載の通りにリアルタイムＰＣＲ増幅を行った結果を示す図である。
【図３】図３は、実施例２に記載のプライマー伸長および融解解析を示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、実施例３に記載の酸切断解析における天然ＤＮＡ標的（奇数レーン）および非天然ＤＮＡ標的（偶数レーン）を使用した酸切断生成物を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、実施例３に記載の酸切断解析を示す図である。
【図５】図５は、実施例４に記載の分子標識解析を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【配列表】
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