(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＳＴＡＴ阻害因子−１を発現する細胞を提供し、
（ｂ）該細胞を、サンプル材料を添加したインスリン含有培地で培養し、
（ｃ）該細胞の増殖率を測定し、そして
（ｄ）該細胞の増殖率を指標として、サンプル材料中の血糖降下作用を有する物質を検出する、
ことを包含する、血糖降下作用を有する物質のスクリーニング方法。
【請求項２】
該ＳＴＡＴ阻害因子−１を発現する細胞が、ＳＴＡＴ阻害因子−１を過剰に発現する形質転換体であることを特徴とする、請求項１記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、インスリンの存在下でサンプル材料をＳＴＡＴ阻害因子−１に接触させ、サンプル材料中に含まれる物質によるＳＴＡＴ阻害因子−１の活性阻害を指標として、血糖降下作用を有する物質を検出することを特徴とするスクリーニング方法に関するものである。
従来技術
ＳＴＡＴ（Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）とはサイトカインの刺激で活性化されるシグナル伝達分子であり、ＳＴＡＴ阻害因子−１（ＳＴＡＴ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＳＴＡＴ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ−１）は、ＳＴＡＴによりその発現が誘導され、ＪＡＫキナーゼ（Ｊａｎｕｓ  Ｋｉｎａｓｅ、ＪＡＫ）の活性化を抑制することによって、サイトカインのシグナル伝達を阻害するタンパク質である。ＳＴＡＴ阻害因子−１（“ＳＳＩ−１”、“ＳＯＣＳ−１”、“ＳＩＩＳ−１”などと略されるが、本発明においては、以下、屡々“ＳＳＩ−１”と略す）は本願発明者等によって初めてマウスより単離されたものである（国際公開公報ＷＯ９８／３０６８８号及びＮａｔｕｒｅ  ３８７，９２４−９２９（１９９７））。現在では、ＳＳＩ−１と同じファミリーに属する阻害因子としてＳＳＩ−２やＳＳＩ−３（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３７，７９−８３（１９９７））を含め、８分子が確認されている。又、ヒトのＳＳＩ−１についても、既に本発明者らが単離している（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３７，７９−８３（１９９７））。
ＳＳＩ−１の機能領域は、ＳＳＩ−１変異遺伝子を用いた実験によって決定されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，１３１３０−１３１３４（１９９８））。具体的には、ＪＡＫキナーゼのリン酸化の抑制には、ＳＳＩ−１のＳＨ２領域だけではなく、ＳＨ２領域のＮ末端側の２４アミノ酸（ｐｒｅ−ＳＨ２領域）が必須であること、並びにＳＨ２領域及びｐｒｅ−ＳＨ２領域を介して、ＳＳＩ−１がＪＡＫキナーゼと結合することなどが知られている。更に、本発明者等の行ったＳＳＩ−１ノックアウトマウスを用いた研究によって、ＳＳＩ−１の生体における機能の一部も明らかになっている。ＳＳＩ−１ノックアウトマウスにおいては、リンパ球、心臓、肝臓などのＳＳＩ−１発現臓器で加齢とともにアポトーシスが起こることが判明し、ＳＳＩ−１が細胞の生存、特に炎症と密接な関連があると考えられる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，１５５７５−１５５８２（１９９８））。
細胞内には種々のシグナル伝達経路が存在し、サイトカイン以外にホルモンなどによって生じるシグナル伝達経路も存在する。例えば、インスリンは、細胞増殖、グルコースの取り込み及び代謝、中性脂肪の合成と貯蔵、並びにタンパク合成に関与するホルモンである。インスリンはインスリン特異的な受容体であるインスリン受容体（ＩＲ）を介して種々の生物学的反応を仲介する。インスリン受容体は、自己リン酸化活性を有し、インスリン受容体基質−１（ＩＳＲ−１）のリン酸化に関与することが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２９９１１−２９９１８（１９９７））。リン酸化されたＩＲＳ−１は様々な生物活性を生じる（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４０，Ｓｕｐｐｌ．２：Ｓ２−１７（１９９７）及び  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９，７：２８９−２９３（１９９４））。又、ＩＲの他にＪＡＫキナーゼもインスリン刺激によって活性化されるとの報告があり、ＪＡＫキナーゼのインスリンシグナル伝達への関与も考えられている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３４，２：６５６−６６０及びＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３９，３：８８４−８９３）。
しかしながら、インスリンシグナルの情報伝達経路には未だ不明な点が多く、情報伝達に関与するすべての分子が見出されたわけでもない。インスリン抵抗性の糖尿病（膵臓からのインスリン分泌は正常であるが、末梢組織においてインスリンに対する反応性が低下しているために血糖を取り込む効率が悪く、結果として高インスリン血症や高血糖を呈する糖尿病）の大部分はＩＲの機能欠陥に起因すると考えられているが、その病因は特定されておらず、又、確立された治療方法や治療剤も存在しない。
上記したように、インスリンシグナルの情報伝達経路に関与する分子を明確にし、それら分子の機能を制御することによるインスリン抵抗性の糖尿病の治療剤が望まれていた。本発明の課題は、インスリンシグナルの細胞内情報伝達を阻害する分子であるＳＳＩ−１の阻害剤をスクリーニングする方法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、ＳＳＩ−１ノックアウトマウスが正常なマウスに較べて有意に低血糖であることを知見し、更にＳＳＩ−１ノックアウトマウスから取り出したノックアウト細胞を用いた実験によって、ＳＳＩ−１がインスリンシグナルを阻害する作用を有することを見出した。そして、ＳＳＩ−１の活性阻害によって生じる現象を指標として、血糖降下作用を有する物質を検出する方法を見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
従って、本発明の目的は、インスリン抵抗性の糖尿病の治療薬となる、ＳＳＩ−１の阻害による血糖降下作用を有する物質をスクリーニングする方法を提供することにある。
次に本発明の理解を容易にするために、まず本発明の基本的特徴及び好ましい態様を列挙する。
１．血糖降下作用を有する物質をスクリーニングする方法にして、インスリンの存在下でサンプル材料をＳＴＡＴ阻害因子−１に接触させ、サンプル材料中に含まれる物質による、ＳＴＡＴ阻害因子−１の活性阻害を指標として、血糖降下作用を有する物質を検出することを特徴とするスクリーニング方法。
２．インスリンの存在下でサンプル材料をＳＴＡＴ阻害因子−１を発現する細胞に接触させ、サンプル材料中に含まれる物質による、該細胞が発現するＳＴＡＴ阻害因子−１の活性阻害を指標として、血糖降下作用を有する物質を検出することを特徴とする、前項１記載のスクリーニング方法。
３．（ａ）ＳＴＡＴ阻害因子−１を発現する細胞を提供し、
（ｂ）該細胞を、サンプル材料を添加したインスリン含有培地で培養し、
（ｃ）該細胞の増殖率を測定し、そして
（ｄ）該細胞の増殖率を指標として、サンプル材料中の血糖降下作用を有する物質を検出する、
ことを包含する前項１記載のスクリーニング方法。
４．該ＳＴＡＴ阻害因子−１を発現する細胞が、ＳＴＡＴ阻害因子−１を過剰に発現する形質転換体であることを特徴とする、前項３記載のスクリーニング方法。
本発明の上記及びその他の諸目的、諸特徴ならびに諸利益は、添付の図面を参照しながら行う以下の詳細な説明及び請求の範囲の記載から明らかになる。
発明の詳細な説明
初めに、本発明の基本的特徴を明らかにするために、本発明の完成に至る経緯を追いながら、本発明に包含される技術的特徴について説明する。
本発明の血糖降下作用を有する物質のスクリーニング方法は、ＳＳＩ−１の有するインスリンシグナル阻害効果に基づくものである。
ＳＳＩ−１は：
（１）インスリン受容体とは結合せず、
（２）インスリン受容体のキナーゼ活性を阻害せず、
（３）インスリン受容体に結合しているＪＡＫキナーゼのリン酸化を阻害し、
（４）インスリン受容体によるインスリン受容体基質−１のリン酸化を阻害し、（５）その結果、インスリンシグナルを阻害する。
ＳＳＩ−１は、（５）インスリンシグナルを阻害する。
上記したように、初めに本発明者らは、ＳＳＩ−１ノックアウトマウスの血糖値が低いことを知見し、ＳＳＩ−１がインスリンシグナルの伝達に関与する可能性に着目した。具体的には、ＳＳＩ−１ノックアウトマウスの胎児繊維芽細胞を単離し、インスリン刺激による脂肪細胞への分化を観察した。インスリン刺激によってマウス胎児線維芽細胞の脂肪細胞への分化は促進されることが知られており、ＳＳＩ−１がインスリンシグナルの阻害分子として機能する場合には、ＳＳＩ−１ノックアウトマウスの胎児繊維芽細胞は、正常なマウス胎児線維芽細胞よりもその分化が促進されると考えた。実験結果によって、ＳＳＩ−１ノックアウトマウスの胎児繊維芽細胞は、脂肪細胞への分化が顕著に増大していることが確認された。更にＳＳＩ−１ノックアウトマウスはインスリンに対する感受性が亢進していることも明かとなった。
ＳＳＩ−１は、（４）インスリン受容体によるインスリン受容体基質−１のリン酸化を阻害する。
続いてＳＳＩ−１のインスリンシグナル阻害機構を明らかにする目的で、ＳＳＩ−１を過剰に発現するマウス繊維芽細胞株（ＳＳＩ−１ｃＤＮＡを導入した形質転換体）を用いて、インスリン刺激下におけるインスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）のリン酸化を解析した。その結果、ＳＳＩ−１を過剰に発現するマウス繊維芽細胞株においては、インスリン刺激に対するＩＲＳ−１のリン酸化が阻害されていた。逆にＳＳＩ−１ノックアウトマウスの胎児繊維芽細胞においては、インスリン刺激に対するＩＲＳ−１のリン酸化が持続的であった。これらの結果より、ＳＳＩ−１はＩＲＳ−１のリン酸化を介してインスリンシグナルを調節していることが判明した。
ＳＳＩ−１は、（１）インスリン受容体とは結合せず、（２）インスリン受容体のキナーゼ活性を阻害しない。
ＳＳＩ−１のｃＤＮＡ、インスリンリセプター（ＩＲ）のｃＤＮＡ、ＳＳＩ−１とＩＲのｃＤＮＡをそれぞれ導入した形質転換体におけるＩＲのチロシンリン酸化の程度を検討した。その結果、ＳＳＩ−１とＩＲとの相互作用は確認されず、またＳＳＩ−１はＩＲのキナーゼ活性も阻害しないことが明かとなった。
ＳＳＩ−１は、（３）インスリン受容体に結合しているＪＡＫキナーゼのリン酸化を阻害する。
更に、ＩＲＳ−１のｃＤＮＡ、ＩＲＳ−１とＪＡＫキナーゼ（以下、屡々、“ＪＡＫ”と略す）のｃＤＮＡ、ＩＲＳ−１とＪＡＫとＳＳＩ−１のｃＤＮＡをそれぞれ導入した形質転換体におけるＩＲＳ−１のチロシンリン酸化の程度を検討した。その結果、ＩＲＳ−１とＪＡＫとの相互作用が確認され、ＳＳＩ−１はＪＡＫのリン酸化を阻害していることが判明した。インスリンシグナル伝達経路においてＪＡＫはインスリン受容体に結合しており、インスリン受容体のリン酸化によってリン酸化され、ＪＡＫのリン酸化によってＩＲＳ−１のリン酸化が起こると考えられる。従って、ＳＳＩ−１によるＪＡＫキナーゼの阻害が、ＳＳＩ−１のインスリンシグナル阻害機構の一因であると結論付けられた。
上記の結果から明らかなように、炎症性サイトカインのシグナル拮抗分子としてクローニングされたＳＳＩ−１は、思いがけずインスリンというホルモンにも関連していることが判明した。インスリン抵抗性の糖尿病の原因の１つとして、ＳＳＩ−１による過剰なインスリンシグナルの阻害が考えられる。ＳＳＩ−１を阻害・調節する化合物は、インスリン受容体下のシグナルを直接的に制御できるため、インスリン抵抗性の糖尿病の根本的かつ極めて有用な治療手段となる。
以下、本発明を更に詳細に説明する。
本発明のスクリーニング方法は、インスリンの存在下でサンプル材料をＳＳＩ−１に接触させ、サンプル材料中に含まれる物質による、ＳＳＩ−１の活性阻害を指標として、血糖降下作用を有する物質を検出することを特徴とするスクリーニング方法である。
本発明のスクリーニング方法に用いるＳＳＩ−１は、配列表に示したマウスＳＳＩ−１に限定されるものではなく、本発明者らが単離に成功したヒトＳＳＩ−１を用いることもできる。ヒトＳＳＩ−１については、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３７，７９−８３（１９９７）を参照することができる。
本発明の好ましい態様においては、サンプル材料をＳＳＩ−１を発現する細胞に接触させ、サンプル材料中に含まれる物質による、細胞が発現するＳＳＩ−１の活性阻害を指標として、血糖降下作用を有する物質を検出する。本発明に用いる細胞は、ＳＳＩ−１を発現しており、且つ、内因的あるいは外因的にインスリン受容体を発現した細胞であり、インスリン刺激によって細胞増殖や糖質の取り込みといった生物学的な応答が認められる細胞であれば特に限定はなく、天然の細胞も形質転換体も用いることができる。具体的には、ヒトやマウスの筋肉細胞及び脂肪細胞のように糖を取り込むことのできる細胞や、ＳＳＩ−１遺伝子を導入した形質転換体などが挙げられ、本願の参考例３で製造したような、ＳＳＩ−１を過剰に発現する形質転換体を用いることが好ましい。
ＳＳＩ−１の形質転換体を作成する際に用いることができる細胞株に特に限定はないが、上記したように内因的あるいは外因的にインスリン受容体を発現した細胞であり、インスリン刺激によって細胞増殖や糖質の取り込みといった生物学的な応答が認められる細胞が好ましい。具体的には、マウス繊維芽細胞であるＬ９２９細胞、マウス２９３Ｔ細胞、ラットＬ６細胞、ヒト筋肉細胞、ヒト脂肪細胞などが挙げられ、マウスＬ９２９細胞とマウス２９３Ｔ細胞が好ましい。
ＳＳＩ−１のＤＮＡは、プロモーター、オペレーター、エンハンサーのような転写調節配列、終止配列、ＳＳ１−１遺伝子の発現を制御する調節配列やマーカー遺伝子などを含む、宿主細胞内で発現可能なベクターに組込んで組換え体ＤＮＡとし、宿主細胞に導入することができる。使用するベクターに特に限定はないが、Ｌ９２９細胞や２９３Ｔ細胞を宿主として用いる場合には、ｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドやｐＣＩＢＳＤプラスミドを用いることができる。
宿主細胞に組換え体ＤＮＡを導入するための形質転換技術としては、カルシウム共沈殿法、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクションなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。組換え体ＤＮＡのサイズ、宿主細胞などを考慮して最も適した技術を適宜選択して用いることができる。
本発明のスクリーニング方法に用いられる血糖降下作用を有する物質を包含すると考えられるサンプル材料に特に限定はない。例えば、生体由来の組織や細胞の抽出液、組織や細胞の培養上清、微生物の培養上清、菌体成分や合成化合物を用いることができる。
本発明のスクリーニング方法においては、例えば、細胞増殖率の変化や、糖質の取り込みの変化によってＳＳＩ−１の活性阻害を確認することができる。本発明のより好ましい態様においては、（ａ）ＳＴＡＴ阻害因子−１を発現する細胞を提供し、（ｂ）この細胞を、サンプル材料を添加したインスリン含有培地で培養し、（ｃ）細胞の増殖率を測定し、そして（ｄ）細胞の増殖率を指標として、サンプル材料中の血糖降下作用を有する物質を検出する。ＳＳＩ−１を発現する細胞とＳＳＩ−１を発現しない細胞の間では、インスリン刺激による細胞増殖率が異なるので、インスリン含有培地上で両者を培養した場合、ＳＳＩ−１発現細胞の増殖率は、ＳＳＩ−１非発現細胞の増殖率よりも有意に低い。従って、培地にサンプル材料を添加し、細胞増殖率の変化を見ることによって、ＳＳＩ−１阻害活性を測定することができる。
また、ＳＳＩ−１過剰発現細胞においては、インスリンによる細胞増殖作用が阻害されるだけではなく、インスリンの様々な生物活性が阻害される。従って、筋肉細胞や脂肪細胞などにＳＳＩ−１分子を過剰発現した場合、インスリン依存的な糖の取り込みが抑制されると考えられる。このような条件において、糖の取り込みを回復させる化合物をスクリーニングすることも可能である。
発明を実施するための最良の形態
以下、参考例及び実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
参考例１
ＳＳＩ−１ノックアウトマウスの血糖値の測定
ＢＬ６系マウスを用い、ＳＳＩ−１ノックアウトマウスをＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５，１５５７７−１５５８２（１９９８）に記載の方法と同様に作成し、ＳＳＩ−１ノックアウトマウス（２０例）の血糖値を測定した。同様にして、野生型ＢＬ６系マウス（即ち、正常なマウス）（２０例）の血糖値も測定した。いずれの群においても、採血は午前１０〜１１時に心臓採血により行なった。結果を以下の表１に示す。
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表１より明らかなように、野生型マウスに較べ、ＳＳＩ−１ノックアウトマウスは有意に低血糖であった。
参考例２
ＳＳＩ−１ノックアウトマウスの胎児繊維芽細胞の脂肪細胞への分化
参考例１と同様に作成したＳＳＩ−１ノックアウトマウスから胎児繊維芽細胞を採取し、４８穴プレートを用いて、１０％ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ、ＦＣＳ）、非必須アミノ酸、ペニシリンＧ／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で１００％コンフレントになるまで培養した。その後、さらに４８時間培養を続けた。培地を誘導用メディウム（１０％ＦＣＳ、５μｇ／ｍＬインスリン、０．５ｍＭの３−イソブチル−１−メチルキサンチン、と１μＭのデキサメタゾンを含有するＤＭＥＭ）に置き換え（この日をＤＡＹ０とし）、更に４８時間培養した。次に誘導用メディウムを維持メディウム（１０％ＦＣＳ、５μｇ／ｍＬインスリンを含有するＤＭＥＭ）に置き換え、１日おきにメディウムを交換しながら培養し、６日目（ＤＡＹ６）にオイルレッド−Ｏを用いて細胞を染色し、顕微鏡にて観察した。
正常なマウスの胎児繊維芽細胞についても上記と同様に脂肪細胞へ分化させ、オイルレッド−Ｏを用いて細胞を染色し、顕微鏡にて観察した。
観察の結果、ＳＳＩ−１ノックアウトマウスの胎児繊維芽細胞は、正常なマウスの胎児繊維芽細胞に比べて脂肪細胞への分化が促進されていることが確認された。
参考例３
ＳＳＩ−１強制発現細胞及びノックアウトマウスの胎児繊維芽細胞におけるＩＲＳ−１のリン酸化
配列表の配列番号１に示したＳＳＩ−１  ｃＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩとＰｖｕＩＩで消化し、得られた制限酵素断片をブラントエンド化し、哺乳動物発現ベクターｐＥＦ−ＢＯＳのブラントエンド化したＸｂａＩサイトに挿入した。以下、構築したＳＳＩ−１発現ベクターをｐＥＦ−ＢＯＳ／ＳＳＩ−１とする。
上記で構築したｐＥＦ−ＢＯＳ／ＳＳＩ−１とネオマイシン耐性遺伝子をコードするｐＳＶ２  Ｎｅｏとを２０：１の比率で混ぜ、マウス繊維芽細胞株であるＬ９２９細胞にエレクトロポレーション法で導入した。ネオマイシン耐性を指標とし、形質転換体をＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（米国、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）７５０μｇ／ｍｌを含む培地中で選択した。得られた形質転換体（Ｌ９２９／ＳＳＩ−１）はＳＳＩ−１を過剰に発現する細胞株である。
又、遺伝子を組込んでいないｐＥＦ−ＢＯＳをｐＥＦ−ＢＯＳ／ＳＳＩ−１の代わりに用いて、対照となるネオマイシン耐性のみを発現する形質転換体（Ｌ９２９／Ｎｅｏ）を調製した。
ＳＳＩ−１過剰発現細胞株（Ｌ９２９／ＳＳＩ−１）及び対照となる形質転換体（Ｌ９２９／Ｎｅｏ）を、それぞれ０．２％ＦＣＳ中で１６時間培養した。その後、１０ｎＭインスリンで、０、１０、３０および６０分処理した後、細胞を回収した。回収した細胞について、１％  ＮＰ−４０、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０μＭバナジウム酸ナトリウム、１μｇ／ｍＬルイペプチン、１μｇ／ｍＬペプスタチンＡ、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）および１ｍＭフェニルメチルスルフォニル  フルオライド（ＰＭＳＦ）を含有した２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて細胞溶解液を調製した。得られた細胞溶解液に対して抗ＩＲＳ−１抗体を用いて免疫沈降反応を行ない、免疫複合体を得た。得られた免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開し、抗リン酸化チロシン抗体を用いてウエスタンブロッティングを行なった。
又、抗ＩＲＳ−１抗体を用いたウエスタンブロッティングも行った。
ウエスタンブロッティングの結果を図１に示す。
ノックアウトマウスの胎児繊維芽細胞と野生型マウスの胎児繊維芽細胞（野生型細胞）を用いて、上記と同様にインスリン刺激を与えた細胞のウエスタンブロッティングを行った。但し、２％ＦＣＳをメディウムとして用いて細胞培養を４８時間行い、インスリン刺激は５μｇ／ｍＬインスリンを用いて０、１０、６０および１８０分間細胞を処理することにより行なった。ウエスタンブロッティングの結果を図２に示す。
図１から明らかなように、ＳＳＩ−１過剰発現細胞株（Ｌ９２９／ＳＳＩ−１）では、対照（Ｌ９２９／Ｎｅｏ）と比べ、インスリン刺激に対するＩＲＳ−１のリン酸化が抑制されていた。
一方ＳＳＩ−１ノックアウトマウスの胎児繊維芽細胞（ＳＳＩ−１−／−）では、図２より明らかなように、インスリン刺激に対するＩＲＳ−１のリン酸化が野生型細胞（ＳＳＩ−１＋／＋）に比べて持続的であった。
参考例４
ＳＳＩ−１の作用メカニズムの検討（インスリンリセプター（ＩＲ）との関係）
ｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドにＳＳＩ−１  ｃＤＮＡとＩＲｃＤＮＡをそれぞれ組込み、ｐＥＦ−ＢＯＳ／ＳＳＩ−１とｐＥＦ−ＢＯＳ／ＩＲを得た。得られた組換え体ＤＮＡをカルシウム共沈殿法に基づいて２９３Ｔ細胞に導入し、以下の（ａ）〜（ｃ）のｃＤＮＡを発現する形質転換体を作成した。
（ａ）ＳＳＩ−１、
（ｂ）ＩＲ、及び
（ｃ）ＳＳＩ−１とＩＲ。
又、上記（ｃ）の形質転換体については、インスリンで刺激したものも調製した。
各形質転換体について、形質転換から３６時間後に参考例３と同様に細胞溶解液を調製し、抗ＩＲ抗体を用いて免疫沈降反応を行なった。得られた免疫反応複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開し、抗リン酸化チロシン抗体を用いてウエスタンブロッティングを行い、ＩＲのリン酸化の程度を検討した。
又、免疫沈降を行う前の細胞溶解液と抗ＩＲ抗体を用いて得られた免疫複合体の両方に対して、抗ＳＳＩ−１抗体を用いてウエスタンブロッティングを行ない、ＩＲとＳＳＩ−１の相互作用を検討した。結果を図３に示す。
抗ＩＲ抗体の免疫沈降物に対して抗ＳＳＩ−１抗体を用いたウエスタンブロッティングではＳＳＩ−１に相当するバンドは検出されず、ＳＳＩ−１とＩＲとの相互作用は確認されなかった。抗リン酸化チロシン抗体を用いたウエスタンブロッティングでは、ＩＲのみを発現する形質転換体（ｂ）におけるＩＲ自身のリン酸化が確認され、ＳＳＩ−１とＩＲの両方を発現する形質転換体（ｃ）の場合には、ＩＲは（ｂ）と同様にリン酸化されており、インスリン刺激によってＩＲのリン酸化が増大していた。
上記の図３に示された結果を総合的に検討した結果、ＳＳＩ−１はインスリン受容体とは結合せず、インスリン受容体のキナーゼ活性を抑制しないことが確認された。
参考例５
ＳＳＩ−１の作用メカニズムの検討（ＪＡＫ及びＩＲＳ−１との関係）
ｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドにＩＲＳ−１  ｃＤＮＡ、ＪＡＫ  ｃＤＮＡ、及びＳＳＩ−１  ｃＤＮＡをそれぞれ組込み、ｐＥＦ−ＢＯＳ／ＩＲＳ−１、ｐＥＦ−ＢＯＳ／ＪＡＫ及びｐＥＦ−ＢＯＳ／ＳＳＩ−１を得た。得られた組換え体ＤＮＡをカルシウム共沈殿法に基づいて２９３Ｔ細胞に導入し、以下の（ｄ）〜（ｆ）のｃＤＮＡを発現する形質転換体を作成した。
（ｄ）ＩＲＳ−１、
（ｅ）ＩＲＳ−１とＪＡＫ、及び
（ｆ）ＩＲＳ−１とＪＡＫとＳＳＩ−１。
（尚、ＪＡＫキナーゼにはＪａｋ１やＪａｋ２が知られているが、本発明ではＪａｋ１をＪＡＫキナーゼとして用いた。）
各形質転換体について、参考例３と同様に細胞溶解液を調製し、抗ＩＲＳ−１抗体を用いて免疫沈降反応を行なった。得られた免疫反応複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて展開し、抗リン酸化チロシン抗体を用いてウエスタンブロッティングを行ない、ＩＲＳ−１のリン酸化の程度を測定した。又、抗ＪＡＫ抗体を用いたウエスタンブロッティングも行った。
又、免疫沈降を行う前の細胞溶解液に対して、抗ＳＳＩ−１抗体と抗ＪＡＫ抗体をそれぞれ用いてウエスタンブロッティングを行ない、ＩＲＳ−１とＳＳＩ−１の相互作用を検討した。結果を図４に示す。
抗リン酸化チロシン抗体を用いたウエスタンブロッティングによって、ＩＲＳ−１のみを発現する形質転換体（ｄ）においてはＩＲＳ−１のリン酸化はほとんど起こっていないが、ＩＲＳ−１とＪＡＫを発現する形質転換体（ｅ）においては、ＩＲＳ−１のリン酸化が促進されていることが判明した。更に、ＩＲＳ−１、ＪＡＫ及びＳＳＩ−１の３つを発現する形質転換体（ｆ）においては、形質転換体（ｅ）の場合よりもＩＲＳ−１のリン酸化が抑制されていた。
更に、免疫沈降を行っていない細胞溶解液に対して抗ＳＳＩ−１抗体を用いたウエスタンブロッティングでは、以下の結果が得られた。ＩＲＳ−１とＪＡＫを発現する形質転換体（ｅ）においては、両分子の相互作用が認められたが、そこにＳＳＩ−１が加わった形質転換体（ｆ）の場合には、相互作用は減少することが明らかとなった。
上記の図４に示された結果を総合的に検討した結果、ＳＳＩ−１はインスリン受容体に会合したＪＡＫと結合し、ＪＡＫの活性を抑制することにより、ＩＲＳ−１のリン酸化を抑制することが確認された。
実施例１
血糖降下作用を有する物質のスクリーニング
９６穴のマイクロプレートにインスリン非含有培地（ＤＭＥＭに０．５％ＦＣＳを添加したもの）および種々の濃度のインスリンを含有する培地を加え、そこに３００００細胞／ウエルとなるように参考例３で作成したＳＳＩ−１過剰発現細胞株（Ｌ９２９／ＳＳＩ−１）を植えた。１８時間培養した後、各ウエルにブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を添加し、更に６時間培養した（計２４時間の培養）。次に細胞数を“Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ＢｒｄＵ  Ｋｉｔ”（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いて測定した。インスリン非含有培地での細胞数を１としたときの相対的な細胞増加率を図５に示す。
又、対照となる細胞株（Ｌ９２９／Ｎｅｏ）を用いて、上記と同様にインスリン非含有培地およびインスリン含有培地を用いて細胞培養を行い、２４時間後の細胞増加率を求めた。対照の結果も図５に示す。
両細胞株とも、インスリンの濃度に依存して細胞数が増加したが、ＳＳＩ−１過剰発現細胞株（Ｌ９２９／ＳＳＩ−１）は、対照（Ｌ９２９／Ｎｅｏ）と比べて、細胞の増加率が５０％程度減少した。この結果は、インスリンによって誘導される細胞増殖をＳＳＩ−１が抑制することを示している。従って、この系にサンプル材料を添加し、ＳＳＩ−１過剰発現細胞株（Ｌ９２９／ＳＳＩ−１）の細胞数増加率を指標とすることによって、ＳＳＩ−１の活性を阻害し、血糖降下作用を有する物質をスクリーニングすることができる。
産業上の利用可能性
本発明によれば、インスリン抵抗性の糖尿病の治療薬となる、ＳＳＩ−１を阻害する新たなメカニズムの血糖降下作用を有する物質をスクリーニングする方法が提供される。本発明の方法を用いることにより、インスリンシグナルの情報伝達経路に関与する分子の機能を制御する、インスリン抵抗性の糖尿病の治療剤となる物質のスクリーニングが可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＳＳＩ−１を過剰発現する細胞株（Ｌ９２９／ＳＳＩ−１）と対照（Ｌ９２９／Ｎｅｏ）における、インスリン刺激に対するＩＲＳ−１のリン酸化の程度を表すウエスタンブロッティングの結果である  図中、ＩＰ：α−ＩＲＳ−１は抗ＩＲＳ−１抗体を用いた免疫沈降を意味し、ＷＢ：α−ｐＹは抗リン酸化チロシン抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、ＷＢ：α−ＩＲＳ−１は抗ＩＲＳ−１抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、ｐ−ＩＲＳ−１はリン酸化されたＩＲＳ−１を意味する。
図２は、ＳＳＩ−１ノックアウトマウスの胎児繊維芽細胞株（ＳＳＩ−１−／−）と野生型マウスの胎児繊維芽細胞株（ＳＳＩ−１＋／＋）における、インスリン刺激に対するＩＲＳ−１のリン酸化の程度を表すウエスタンブロッティングの結果である。図中、ＩＰ：α−ＩＲＳ−１は抗ＩＲＳ−１抗体を用いた免疫沈降を意味し、ＷＢ：α−ｐＹは抗リン酸化チロシン抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、ＷＢ：α−ＩＲＳ−１は抗ＩＲＳ−１抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、ｐ−ＩＲＳ−１はリン酸化されたＩＲＳ−１を意味する。
図３は、ＳＳＩ−１を発現する形質転換体（ＳＳＩ−１）、ＩＲを発現する形質転換体（ＩＲ）、ＳＳＩとＩＲを発現する形質転換体（ＳＳＩ−１＋ＩＲ）、及び上記“ＳＳＩ−１＋ＩＲ”をインスリンで刺激したものにおける、ＩＲのリン酸化の程度表すウエスタンブロッティングの結果である。図中、ＩＰ：α−ＩＲは抗インスリン受容体抗体を用いた免疫沈降を意味し、ＷＢ：α−ＳＳＩは抗ＳＳＩ−１抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、ＷＢ：α−ｐＹは抗リン酸化チロシン抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、ＷＢ：α−ＩＲは抗インスリン抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、ｐ−ＩＲはリン酸化されたＩＲを意味する。また、各形質転換体の細胞溶解液（ｌｙｓａｔｅ）について、免疫沈降を行なわずに抗ＳＳＩ−１抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果も示す。
図４は、ＩＲＳ−１を発現する形質転換体（ＩＲＳ−１）、ＩＲＳ−１とＪＡＫキナーゼを発現する形質転換体（ＩＲＳ−１＋Ｊａｋ１）、ＩＲＳ−１とＪＡＫキナーゼとＳＳＩ−１を発現する形質転換体（ＩＲＳ−１＋Ｊａｋ１＋ＳＳＩ−１）における、ＩＲＳ−１のリン酸化の程度及びＩＲＳ−１とＪＡＫとの相互作用を表すウエスタンブロッティングの結果である。図中、ＩＰ：α−ＩＲＳ−１は抗ＩＲＳ−１抗体を用いた免疫沈降を意味し、ＷＢ：α−ｐＹは抗リン酸化チロシン抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、ＷＢ：α−ＩＲＳ−１は抗ＩＲＳ−１抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、ＷＢ：α−Ｊａｋは抗ＪＡＫキナーゼ−１抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、ＷＢ：α−ＳＳＩは抗ＳＳＩ−１抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果であり、ｐ−ＩＲＳ−１はリン酸化されたＩＲＳ−１、ｐ−Ｊａｋ１はリン酸化されたＪａｋ１を意味する。また、各形質転換体の細胞溶解液（ｌｙｓａｔｅ）について、免疫沈降を行なわずに抗ＪＡＫキナーゼ−１抗体及び抗ＳＳＩ−１抗体を用いたウエスタンブロッティングの結果も示す。
図５は、ＳＳＩ−１過剰発現細胞株（Ｌ９２９／ＳＳＩ−１）及び対照（Ｌ９２９／Ｎｅｏ）における、インスリン刺激に対する細胞増殖率の変化を示す。図中、―○―は親細胞の細胞増殖率を示し、―●―はＳＳＩ−１強制発現細胞を示し、横軸は培地中のインスリン濃度（ｎＭ）、縦軸はインスリン非添加培地を用いた際の細胞数を１とした時の相対的な細胞増加率である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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