(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウムイオンと、過酸化水素、２価あるいは３価の鉄、２価のマンガン及び１価の銅から選ばれた１又は２以上の酸化還元に関わる物質とを共存させ、肺サーファクタント蛋白質を安定化する方法。
【請求項２】
肺サーファクタント蛋白質の抗原活性を安定化させる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
肺サーファクタント蛋白質が、組換え肺サーファクタント蛋白質Ｄ（ｒＳＰ−Ｄ）である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
カルシウムイオンと、過酸化水素、２価あるいは３価の鉄、２価のマンガン及び１価の銅から選ばれた１又は２以上の酸化還元に関わる物質を併用した安定化された肺サーファクタント蛋白質含有水溶液。
【請求項５】
肺サーファクタント蛋白質の抗原活性を安定化させた、請求項４記載の水溶液。
【請求項６】
肺サーファクタント蛋白質が、組換え肺サーファクタント蛋白質Ｄ（ｒＳＰ−Ｄ）である、請求項４記載の水溶液。
【請求項７】
抗原抗体反応を利用した免疫学的手法によりサンプル中の肺サーファクタント蛋白質を測定するためのキットであって、カルシウムイオンと、過酸化水素、２価あるいは３価の鉄、２価のマンガン及び１価の銅から選ばれた１又は２以上の酸化還元に関わる物質とを併用した安定化された肺サーファクタント蛋白質含有水溶液を肺サーファクタント蛋白質の標準溶液として含有することを特徴とする、肺サーファクタント蛋白質測定用キット。
【請求項８】
肺サーファクタント蛋白質の抗原活性を安定化させた、請求項７記載のキット。
【請求項９】
肺サーファクタント蛋白質が、組換え肺サーファクタント蛋白質Ｄ（ｒＳＰ−Ｄ）である、請求項７記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺サーファクタント蛋白質の安定化法、安定化された肺サーファクタント蛋白質含有溶液、及び安定化された肺サーファクタント蛋白質含有溶液を構成試薬として含有する肺サーファクタント蛋白質測定用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
肺サーファクタント蛋白質は、肺サーファクタントに特異的なアポタンパク質（ＳＰ）であり、現在までに親水性のＳＰ−ＡとＳＰ−Ｄ及び疎水性のＳＰ−ＢとＳＰ−Ｃの４種類が報告されている。その中でも、ＳＰ−Ｄは気道−肺胞系における生体防御機構において重要な役割を果たしていると考えられており、抗原抗体反応を利用した免疫学的手法によりサンプル（血清など）中のＳＰ−Ｄを測定し、特発性間質性肺炎などの肺疾患を診断できることが報告されている（非特許文献１）。【０００３】
上記報告書で報告されている方法は、組換えＤＮＡ手法により取得されるリコンビナントＳＰ−Ｄ（ｒＳＰ−Ｄ）を標準物質として使用しており、このｒＳＰ−Ｄが不安定であるために、カルシウム、バリウム、マグネシウムなどの周期表２族ａ亜族に属する金属イオンを共存させることによってｒＳＰ−Ｄ等の肺サーファクタント蛋白質の安定性が向上することが報告されている（特許文献１）。
【非特許文献１】医学と薬学、３６（４）、８０３−８０８（１９９６）
【特許文献１】特許第３５７３３３０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、確かにカルシウムイオンを共存させることで、肺サーファクタント蛋白質の抗原活性は安定化するものの、長期間の安定性には今なお問題を有していた。すなわち、特許文献１の実施例１〜３に示されているように、カルシウムイオンは６時間程度の比較的短時間の肺サーファクタント蛋白質の安定性に関しては非常に効果を示すものの、１０時間以上、あるいは数日間の中長期的な肺サーファクタント蛋白質の安定性に関しては、カルシウムイオン単独では必ずしも十分でなく、更なる温度に対する安定性の向上が切望されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記問題点を解決すべくランダムスクリーニングを行った結果、肺サーファクタント蛋白質に、カルシウムイオンと酸化還元に関わる物質を共存させるだけで、３７℃の条件下でも４８時間以上抗原活性が失活せずに安定化されることを見い出し、本発明を完成させた。したがって、本発明は以下の通りである。【０００６】
［１］カルシウムイオンと酸化還元に関わる物質とを共存させ、肺サーファクタント蛋白質を安定化する方法。
［２］肺サーファクタント蛋白質の抗原活性を安定化させる、上記［１］記載の方法。
［３］肺サーファクタント蛋白質が、組換え肺サーファクタント蛋白質Ｄ（ｒＳＰ−Ｄ）である、上記［１］記載の方法。
［４］酸化還元に関わる物質が、過酸化水素、２価あるいは３価の鉄、２価のマンガン及び１価の銅から選ばれた１又は２以上のものである、上記［１］記載の方法。【０００７】
［５］カルシウムイオンと酸化還元に関わる物質を併用した安定化された肺サーファクタント蛋白質含有水溶液。
［６］肺サーファクタント蛋白質の抗原活性を安定化させた、上記［５］記載の水溶液。
［７］肺サーファクタント蛋白質が、組換え肺サーファクタント蛋白質Ｄ（ｒＳＰ−Ｄ）である、上記［５］記載の水溶液。
［８］酸化還元に関わる物質が、過酸化水素、２価あるいは３価の鉄、２価のマンガン及び１価の銅から選ばれた１又は２以上のものである、上記［５］記載の水溶液。【０００８】
［９］抗原抗体反応を利用した免疫学的手法によりサンプル中の肺サーファクタント蛋白質を測定するためのキットであって、カルシウムイオンと酸化還元に関わる物質とを併用した安定化された肺サーファクタント蛋白質含有水溶液を肺サーファクタント蛋白質の標準溶液として含有することを特徴とする、肺サーファクタント蛋白質測定用キット。【０００９】
［１０］肺サーファクタント蛋白質の抗原活性を安定化させた、上記［９］記載のキット。
［１１］肺サーファクタント蛋白質が、組換え肺サーファクタント蛋白質Ｄ（ｒＳＰ−Ｄ）である、上記［９］記載のキット。
［１２］酸化還元に関わる物質が、過酸化水素、２価あるいは３価の鉄、２価のマンガン及び１価の銅から選ばれた１又は２以上のものである、上記［９］記載のキット。
【発明の効果】
【００１０】
肺サーファクタント蛋白質（たとえば、ｒＳＰ−Ｄ）を安定化する際、カルシウムイオンと酸化還元に関する物質、具体的には過酸化水素、２価あるいは３価の鉄、２価のマンガン及び／又は１価の銅を共存させるだけで、後述実施例に示すように、肺サーファクタント蛋白質の抗原活性をカルシウムイオン単独の時よりもさらに安定化することができる。【００１１】
このことにより、短期間はもとより、中長期間の常温（２５℃）保管であっても肺サーファクタント蛋白質を失活させることなく保存流通が可能になるとともに、測定時の反応も常温から３７℃で行うことができ、肺サーファクタント蛋白質の免疫学的測定の操作性、汎用性をこれまで以上に向上させることが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明における肺サーファクタント蛋白質には、ＳＰ−Ａ、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｃ及びＳＰ−Ｄのいずれも含まれるが、診断項目として有用性が確認されているＳＰ−Ａ又はＳＰ−Ｄが好ましい。また、本発明においては、肺サーファクタント蛋白質は、生体組織から単離精製されたネイティブの蛋白質であっても、組換えＤＮＡ技術を用いて調製したリコンビナント蛋白質のいずれであっても使用可能である。【００１３】
本発明においては、カルシウムイオンと酸化還元に関わる物質とを共存させることにより、肺サーファクタント蛋白質を安定化することができる。
共存させる酸化還元に関わる物質としては、酸化作用を有する物質及び還元作用を有する物質のいずれでもよいが、過酸化水素、２価あるいは３価の鉄、２価のマンガン及び１価の銅から選ばれた１又は２以上の物質を例示することができ、特に過酸化水素又は２価のマンガンイオンが好適である。【００１４】
酸化還元に関わる物質の使用濃度は、特に制限されるものではないが、肺サーファクタント蛋白質含有水溶液中、過酸化水素等の物質の場合、０．００１〜５％（ｗ／ｖ）、さらに０．０１〜１％（ｗ／ｖ）が好ましい。また、２価あるいは３価の鉄、２価のマンガン、１価の銅などの金属イオンの場合には、０．００１〜１０００ｍＭ、さらに０．０１〜１００ｍＭが好ましい。併用されるカルシウムイオンの使用濃度は、肺サーファクタント蛋白質含有水溶液中、０．００１〜１００ｍＭ、さらに０．０１〜１００ｍＭが好ましい。【００１５】
酸化還元に関わる物質が金属イオンの場合、塩化物、酢酸塩、硝酸塩等の水溶性金属塩を用いるのが好ましい。またカルシウムイオンも、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硝酸カルシウム等の水溶性カルシウム塩を用いるのが好ましい。【００１６】
カルシウムイオンと酸化還元に関わる物質を併用し安定化された肺サーファクタント蛋白質含有水溶液の調製は、水又はＨＥＰＥＳなどの緩衝液にカルシウム塩（例えば、塩化カルシウムなど）と酸化還元に関わる物質（過酸化水素、又はマンガン、鉄もしくは銅の塩（例えば、塩化マンガン、塩化鉄など）を上記濃度になるように溶解後、肺サーファクタント蛋白質を所定量（例えば、１〜２００ｎｇ／ｍＬ）溶解することで実施することができる。なお、溶解する順番は、特に制限されるものではなく、肺サーファクタント蛋白質を先に溶解してもよく、あるいは同時であってもかまわない。【００１７】
このようにして調製した安定化された肺サーファクタント蛋白質含有水溶液は、抗原抗体反応を利用した免疫学的手法によりサンプル中の肺サーファクタント蛋白質を測定するためのキットの肺サーファクタント蛋白質の標準溶液として有用である。このようなキットは、免疫比濁法（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＴＩＡ）、免疫比朧法（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＮＩＡ）、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ｆｌｕｏｒｏ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＦＩＡ）、ラテックス光学測定法（ｌａｔｅｘ  ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＬＰＩＡ）、化学発光測定法（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＣＬＩＡ）、電気化学発光測定法（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＥＣＬＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ｒａｄｉｏ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：ＲＩＡ）など採用したアッセイに適する試薬を適宜含有し、必須の試薬としては、抗肺サーファクタント蛋白質抗体が含まれ、さらに必要に応じて標識抗肺サーファクタント蛋白質抗体、標識第２抗体等が含まれる。そのようなキットとして、ＥＬＩＳＡ法によるＳＰ−Ｄ測定キットを例に挙げ、具体的に説明すれば、たとえば以下のキットを例示することができる。【００１８】
（本発明のキット）
固相化抗ＳＰ−Ｄ抗体試薬
酵素標識化抗ＳＰ−Ｄ抗体試薬
ＳＰ−Ｄ標準抗原溶液（カルシウムイオンとマンガンイオン含有）【００１９】
さらに、上記診断用キットに通常添付されている酵素反応基質液、酵素反応停止液、洗浄液などを添付してもよい。このようなキットの使用法は、例えば、医学と薬学、３６（４），８０４−８０８（１９９６）などに記載の公知の測定方法に準じて行えばよい。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例に基づき、詳細に説明するが、本発明がこれに限定されないことは明らかである。【００２１】
実施例１：３７℃での安定化の検討
緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシウム、１．０％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、０．５％（ｗ／ｖ）トライトンＸ−１００、ｐＨ７．４）に、最終濃度で０．１％（ｗ／ｖ）となるように過酸化水素、１０ｍＭとなるように塩化マンガン、５ｍＭとなるように塩化鉄（ＩＩ）、１ｍＭとなるように塩化鉄（ＩＩＩ）、あるいは１ｍＭとなるように塩化第一銅を添加し、この緩衝液を希釈用緩衝液とした。【００２２】
次に、この希釈用緩衝液にｒＳＰ−Ｄを一定量添加し、３７℃で２４〜４８時間インキュベートし、これをサンプル液とした。なお、対照として過酸化水素、塩化マンガン、塩化鉄（ＩＩ）、塩化鉄（ＩＩＩ）、又は塩化第一銅を添加しない無添加の緩衝液についても同様の処理を行った。【００２３】
インキュベーション後、これらのサンプル液及び対照液をヤマサ醤油株式会社製のＳＰ−Ｄ測定キットを使用して、医学と薬学、３６（４），８０４−８０８（１９９６）に記載の測定法（以下、標準操作法という）に従ってＳＰ−Ｄを測定した。その結果を表１に記す。表１から明らかなように、カルシウムイオンと酸化還元に関わる物質、特に鉄イオンやマンガンイオンを併用することで、ＳＰ−Ｄの抗原活性の安定に有効であることが明らかとなった。【００２４】
【表１】
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【００２５】
実施例２：２５℃での安定化の検討
緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシウム、１．０％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、０．５％（ｗ／ｖ）トライトンＸ−１００、ｐＨ７．４）に、最終濃度で０．１％（ｗ／ｖ）となるように過酸化水素、あるいは１０ｍＭとなるように塩化マンガンを添加し、この緩衝液を希釈用緩衝液とした。【００２６】
次に、この希釈用緩衝液にｒＳＰ−Ｄを一定量添加し、２５℃で３日から５日間インキュベートし、これをサンプル液とした。なお、過酸化水素又は塩化マンガンを添加しない無添加の緩衝液についても同様の処理を行った。【００２７】
インキュベーション後、標準操作法に従って、サンプル液又は対照液中のＳＰ−Ｄを測定した。その結果を表２に記す。表２に示されているように、過酸化水素や塩化マンガン添加サンプルは２５℃、５日間処理後も同等の抗原性を保持することが認められた。一方、無添加のカルシウムイオン単独の場合には、２５℃、５日間処理で２０％以上抗原性の失活が確認された。【００２８】
このように、カルシウムイオンと過酸化水素もしくは塩化マンガンを併用することにより大幅に熱安定性が向上し、２５℃ならば５日間処理しても９０％以上抗原活性が保持できることが明らかとなった。【００２９】
【表２】
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【００３０】
実施例３：塩化カルシウム無しでの添加効果
緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１．０％ウシ血清アルブミン、０．５％トライトンＸ−１００、ｐＨ７．４）に、最終濃度で１０ｍＭになるように塩化カルシウム、５０ｍＭ、１０ｍＭ、１ｍＭとなるように塩化マンガン、１％、０．１％、０．０１％（Ｗ／Ｖ）となるように過酸化水素、あるいは１ｍＭとなるように塩化鉄（ＩＩ）を添加した。この緩衝液を希釈用緩衝液とする。
【００３１】
また、当該希釈用緩衝液にリコンビナントＳＰ−Ｄを一定量添加し、２５℃又は３７℃で表３又は表４に記載の時間インキュベートし、これをサンプル液とした。なお対照として、緩衝液に上記のものを添加しない無添加のものについても同様の処理を行った。【００３２】
このような対照液、サンプル液を用い、ヤマサ醤油株式会社製のＳＰ−Ｄ測定キットを使用して、標準操作法に従ってサンプル液中のＳＰ−Ｄを測定した。
【００３３】
その結果、２５℃（表３）の場合には、マンガンイオン単独でも安定に保持できるものの、３７℃（表４）では、マンガンイオンあるいはカルシウムイオン単独ではＳＰ−Ｄの抗原活性を安定に保持できないことが明らかとなった。【００３４】
【表３】
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【００３５】
【表４】
0004734328.tif 000005
【００３６】
実施例４：塩化カルシウムを含む状態での添加効果
緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシウム、１．０％ウシ血清アルブミン、０．５％トライトンＸ−１００、ｐＨ７．４）に、最終濃度で５０ｍＭ、１０ｍＭ、１ｍＭとなるように塩化マンガン、５ｍＭ、１ｍＭとなるように塩化鉄（ＩＩ）、１ｍＭとなるように塩化鉄（ＩＩＩ）、１ｍＭとなるように塩化第一銅、あるいは１％、０．１％、０．０１％（Ｗ／Ｖ）となるように過酸化水素を添加した。この緩衝液を希釈用緩衝液とする。
【００３７】
また、当該希釈用緩衝液にリコンビナントＳＰ−Ｄを一定量添加し、２５℃又は３７℃で表５及び６に記載の時間インキュベートし、これをサンプル液とした。なお対照として、緩衝液に上記のものを添加しない無添加のもの（塩化カルシウムを含む）についても同様の処理を行った。【００３８】
このような対照液、サンプル液を用い、ヤマサ醤油株式会社製のＳＰ−Ｄ測定キットを使用して、標準操作法に従ってサンプル液中のＳＰ−Ｄを測定した。
【００３９】
その結果、２５℃（表５）の場合、３７℃（表６）の場合、いずれにおいても、カルシウムイオンと併用することで、ＳＰ−Ｄの抗原活性を安定に保持できることが明らかとなった。【００４０】
【表５】
0004734328.tif 000006
【００４１】
【表６】
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