(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
０超過２０モル％までのポリエチレングリコール誘導体化両親媒性小胞形成脂質を含んでなる非電荷リポソームを含んでなり、このリポソームが４０〜２００ｎｍの範囲で選択される平均粒径を有し、かつ、水溶性コルチコステロイドを含んでなる、炎症性疾患の炎症領域治療のための非経口投与用医薬組成物。
【請求項２】
０超過２０モル％までのポリエチレングリコール誘導体化両親媒性小胞形成脂質と０超過１０モル％までの負電荷小胞形成脂質とを含んでなる負電荷リポソームを含んでなり、このリポソームが４０〜２００ｎｍの範囲で選択される平均粒径を有し、かつ、水溶性コルチコステロイドを含んでなる、炎症性疾患の炎症領域治療のための非経口投与用医薬組成物。
【請求項３】
コルチコステロイドが、抗炎症性疾患の全身治療に通常用いられるコルチコステロイドからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記コルチコステロイドが、プレドニソロン、デキサメタゾンおよびメチルプレドニソロンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
コルチコステロイドが、局所用に通常用いられるコルチコステロイドからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項６】
前記コルチコステロイドが、ブデソニド、フルニソリドおよびプロピオン酸フルチカゾンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
慢性関節リウマチの炎症領域治療のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
多発性硬化症の炎症領域治療のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は２０モル％までのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体化両親媒性小胞形成脂質と所望により１０モル％以下の負電荷小胞形成脂質とを含んでなる非電荷小胞形成脂質からなるリポソームを含んでなり、このリポソームが約４０〜２００ｎｍの範囲で選択される平均粒径を有し、かつ、コルチコステロイドを含有する、炎症性疾患の部位特異的治療のための非経口投与用の、特には静脈投与用の医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症組織および領域の部位特異的治療を目的とした、ＰＥＧ含有リポソームを基にした組成物の静脈投与はすでに欧州特許ＥＰ０６６２８２０に開示されている。ＰＥＧ−リポソームなどの非電荷のまたはやや負電荷の小胞形成脂質を含む、長時間循環する小型リポソームは、静脈投与後、全身循環を超えない量で何時間も循環可能であり、それゆえに理論的には炎症領域に共通した血管浸透性の高い部位における管外遊出を介して比較的多量の抗炎症剤を送達することができることが周知である。このようなリポソームは、炎症性疾患、例えば慢性の自己免疫疾患であって、間接の炎症と進行性の軟骨破壊を引き起こす慢性関節リウマチの治療において、特に着目されるものである。いくつかのタイプの抗リウマチ薬が使用できるが、重度の持続性滑膜炎や急性憎悪の治療は、高用量の糖質コルチコイドを含む静脈注射を数回用いる必要がある場合がある。全身用コルチコステロイドは疾病の症状を抑えることはできるが、副作用により使用は制限される。これに加え、糖質コルチコイドは、血漿半減期が短いこと、および目的の作用部位に治療上有効な薬剤濃度に到達させるのに高用量を何度も繰り返し投与する必要があるなど、好ましくない薬物動態挙動を欠点として有する。糖質コルチコイドの（局所）効力を高め、全身性の副作用をなくすために罹患間接へのステロイドの間接内注射がよく用いられるが、この投与法は患者にとっては不快であり、複数の小間接が罹患している際には実施できない。また、間接の無痛破壊の著しい発生率は、糖質コルチコイドの間接内注射の繰り返しに関連している可能性がある。欧州特許ＥＰ−０６６２８２０−Ｂによれば、ＰＥＧ含有リポソームに封入するための好ましい化合物は、プレドニソン、メチルプレドニソロン、パラメタゾン、１１-フルドロコルチゾール、トリアムシノロン、ベータメタゾンおよびデキサメタゾンなどのステロイド系抗炎症化合物である。挙げられたこれらのステロイドは全身投与されるステロイド群に属するものである。実施例１２はこの特許における糖質コルチコイド含有ＰＥＧ−リポソームの例に過ぎず、二プロピオン酸ベクロメタゾン含有ＰＥＧ−リポソームの製造に関するものである。しかし、in vivoにおけるデータは全く示されていない。欧州特許ＥＰ−０６６２８２０の開示のデキサメタゾン含有ＰＥＧ−リポソームの製造およびin vivo実験的関節炎モデルにおけるその静脈投与に関しては、本発明者らは欧州特許ＥＰ−０６６２８２０に教示されるような有用な作用は全く認めることができなかったとしている。糖質コルチコイドを含有する懸濁液と同じ糖質コルチコイドが封入されているＰＥＧ−リポソームの間の薬物動態プロフィールに違いは見られなかった。
【０００３】
糖質コルチコイドは多くの場合で炎症性疾患の治療に最も効果的な薬剤であるので、非経口投与後に局所活性の増強および延長のために炎症領域または組織において有効量の糖質コルチコイドをより効果的に送達できるリポソーム組成物を提供する必要がある。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の一つの目的は、２０モル％までのポリエチレングリコール誘導体化両親媒性小胞形成脂質と所望により１０モル％以下の負電荷小胞形成脂質とを含んでなる非電荷小胞形成脂質からなるリポソームを含んでなり、このリポソームが約４０〜２００ｎｍの範囲で選択される平均粒径を有し、かつ、水溶性コルチコステロイドを含有する、炎症性疾患の部位特異的治療のための非経口投与用医薬組成物を提供することである。
【０００５】
本発明のさらなる目的は、２０モル％までのポリエチレングリコール誘導体化両親媒性小胞形成脂質と所望により１０モル％以下の負電荷小胞形成脂質とを含んでなる非電荷小胞形成脂質からなるリポソームを含んでなり、このリポソームが約４０〜２００ｎｍの範囲で選択される平均粒径を有し、かつ、コルチコステロイドを含有し、このコルチコステロイドが水溶型で薬剤に用いられることを特徴とする医薬組成物の、非経口投与後の炎症組織または領域の部位特異的治療に有効な薬剤の製造のための使用を提供することである。
【発明の具体的説明】
【０００６】
今般、２０モル％までのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体化両親媒性小胞形成脂質と所望により１０モル％以下の負電荷小胞形成脂質とを含んでなる非電荷小胞形成脂質からなる長時間循環リポソーム（このリポソームは約４０〜２００ｎｍの範囲で選択される平均粒径を有する）に水溶型のコルチコステロイドを配合することにより、同じコルチコステロイド化合物を含有する水溶液の１回の静脈注射の場合と比べて、このリポソームを含んでなる医薬組成物の１回の静脈投与後の炎症組織におけるコルチコステロイドの局在性の上昇および保持の向上が達成できることが分かった。
【０００７】
本発明の長時間循環リポソームは循環半減期が少なくとも６時間である。なお、循環半減期とは対数リポソームクリアランスプロフィールの第二の直線期における、初期濃度、すなわちｔ＝０の際の推定血漿濃度の５０％に達する時間と定義される。
【０００８】
リポソームの粒径は重要な特徴であり、このことは平均粒径＞５００ｎｍのＰＥＧ−リポソームにおけるリン酸プレドニソロン二ナトリウムなどの水溶性コルチコステロイドを投与しても、ラットアジュバント関節炎モデルの脚の炎症をそれほど軽減しなかったという事実により証明される。
【０００９】
本発明の水溶性コルチコステロイドは、１５〜２５℃の温度で水または生理学的値に緩衝させた水、例えばｐＨ＞６．０で評価した場合に≦１０の中に１（ｗ／ｖ）溶解する化合物である。
【００１０】
本発明に従って有利に使用できる水溶性コルチコステロイドとしては、遊離水酸基を有するコルチコステロイドから調製されたアルカリ金属塩およびアンモニウム塩；（Ｃ２〜Ｃ１３）脂肪族飽和および不飽和ジカルボン酸などの有機酸；ならびにリン酸および硫酸などの無機酸がある。また、コルチコステロイドの酸付加塩も長時間循環ＰＥＧ−リポソームに封入するのに有利でありうる。コルチコステロイド分子の１を超える基が塩の形成に利用可能であれば、一塩および二塩が有用である。アルカリ金属塩としてはカリウムおよびナトリウム塩が好ましい。また、その他コルチコステロイドの正電荷または負電荷誘導体も使用できる。水溶性コルチコステロイドの具体例としては、リン酸ベタメタゾンナトリウム、リン酸デソニドナトリウム、リン酸デキサメタゾンナトリウム、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウム、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、リン酸メチルプレドニソロンナトリウム、コハク酸メチルプレドニソロンナトリウム、リン酸プレドニソロンナトリウム、コハク酸プレドニソロンナトリウム、塩酸プレドニソラメート、リン酸プレドニソン、リン酸トリアムシノロンアセトニド二ナトリウムおよびリン酸トリアムシノロンアセトニド二カリウムが挙げられる。
【００１１】
上記コルチコステロイドは通常、抗炎症性疾病および疾患の全身治療に用いられる。本発明者らによって特定の小さな平均粒径を有するＰＥＧリポソーム中で水溶型のコルチコステロイドを用いることで、全身投与により関節炎部位に対する薬剤の効果的なターゲッティングが起こることが証明されたことから、本発明は様々な理由で通常局所用に用いられているコルチコステロイドに有利に適用することができる。このようなコルチコステロイドとしては例えば、二プロピオン酸アルクロメタゾン、アムシノニド、一プロピオン酸ベクロメタゾン、１７−吉草酸ベタメタゾン、シクロメタゾン、プロピオン酸クロベタゾール、酪酸クロベタゾン、プロピオン酸デプロドン、デソニド、デソキシメタゾン、酢酸デキサメタゾン、吉草酸ジフルコルトロン、二酢酸ジフルラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドネート、ピバル酸フルメタゾン、フルニソリド、酢酸フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、ピバル酸フルオコルトロン、酢酸フルオルメトロン酢酸フルプレドニデン、ハルシノニド、ハロメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、メドリゾン、酢酸メチルプレドニソロン、フロ酸モメタゾン、酢酸パラメタゾン、プレドニカルベート、酢酸プレドニソロン、プレドニリデン、リメキソロン、吉草酸チキソコルトール、およびトリアムシノロンヘキサアセトニドが挙げられる。局所コルチコステロイドはこれらの薬剤が全身循環に利用できるようになるやいなや迅速で効率的なクリアランスを受けるものであり、特に注目されるものである。その例としてはブデソニド、フルニソリドおよびプロピオン酸フルチカゾンがある。部位特異的薬剤送達を達成し、それにより全身治療に伴う副作用を回避し、迅速なクリアランスなど、コルチコステロイドに固有の問題を克服するために上記の局所用ステロイドの水溶形態を製造し、これを本発明のＰＥＧリポソームへ封入することにより、今般、かかるコルチコステロイドを全身投与することが可能である。この点でリン酸ブデソニドは大いに注目される塩であることが分かった。
【００１２】
本発明のリポソームは、従来のリポソームおよび例えば欧州特許ＥＰ０６６２８２０に開示されているようなＰＥＧ−リポソームの製造に用いられる方法に従って製造することができる。極力高い封入を達成するには水相にコルチコステロイドを溶解させることによる有効成分のリポソームへの受動導入で十分であるが、他の方法も使用できる。リポソームの形成に用いられる脂質成分はリン脂質、スフィンゴ脂質、およびステロールなどの種々の小胞形成脂質から選択すればよい。これらの基本化合物を例えばスフィンゴミエリンおよびエルゴステロールで置き換える（全置換または部分置換）することもできる。リポソーム中へ水溶性コルチコステロイドを効果的に封入し、リポソームからの薬剤の漏出を避けるには、特に飽和した硬質のアセチル鎖を有するリン脂質化合物が有用であることが分かっている。
【００１３】
本発明のＰＥＧリポソーム含有水溶性コルチコステロイドの１回の注射後に見られる有益な作用は、種々の濃度の非封入水溶性コルチコステロイドの１回の注射の後、また繰り返し注射した後に得られた結果と比べて極めて好ましいものである。非封入水溶性コルチコステロイドの投与は封入コルチコステロイドよりもはるかに効果が低く、遊離型と封入型のコルチコステロイドの総量を考えれば、７日間連続注射した場合でも遊離型コルチコステロイドは常に少なくとも５〜１０倍効果が低かったことが容易に分かる。これらの効果は２種の異なる動物モデル、すなわちラットアジュバント関節炎モデルおよびマウスコラーゲン誘導性関節炎モデルで認められたものである。これらの好ましい効果は用量に依存した全ての関節炎関連症状の完全かつ長期的な緩和であろう。これに加え、マウスモデルでは、処置後１週間、炎症が再発した時点で軟骨の腐蝕の軽減が見られた。
【００１４】
実験的自己免疫脳脊髄炎では超高用量のメチルプレドニソロンが多発性硬化症の治療で用いられる１０ｍｇ／ｋｇの「標準」用量よりもＴ細胞のアポトーシスの誘導に効果が高いことが示されていることから、プレドニソロンを含有する長時間循環リポソーム製剤がin situでＴ細胞のアポトーシスの誘導におけるメチルプレドニソロンのパルス療法よりも優れているかどうかを調べた。１０ｍｇ／ｋｇのリン酸プレドニソロンリポソームはin situで速やかにＴ細胞のアポトーシスを増大させ、Ｔ細胞およびマクロファージの浸潤が少なくなることで、養子移植実験的自己免疫脳脊髄炎（ＡＴ−ＥＡＥ）の罹患活性の緩和がもたらされることが認められた。これらのリポソームは血液脳関門での混乱を伴って管外遊出して炎症組織に集積することができるので、リン酸プレドニソロンリポソームは、より高用量が必要でより顕著な全身性副作用を引き起こすメチルプレドニソロンの代替治療薬となりうる。これらの知見は多発性硬化症などの中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性自己免疫疾患の治療に関わりを持つ可能性がある。
【００１５】
驚くことに小型で硬質のＰＥＧ含有リポソームはそれらの内容物を放出しにくいことが知られているが、本発明のＰＥＧ−リポソームは水溶性コルチコステロイドを目的の作用部位に効果的に送達して炎症を完全に抑えることができた。
【実施例】
【００１６】
以下、実施例により本発明をさらに説明する。
実施例１
リン酸プレドニソロン含有ＰＥＧ−リポソームの製造
７５０ｍｇのジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）(Lipoid Ludwigshafen)、２５０．８ｍｇのコレステロール(Sigma Aldrich)および２６７．６ｍｇのＰＥＧ−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）(Avanti Polar Lipids)を秤量し、１００ｍＬ丸底フラスコで混合した。これらの脂質を約３０ｍＬのエタノールに溶解した。その後、Ｒｏｔａｖａｐｏｒにて真空下４０℃で１時間、蒸発乾固させた後、１時間窒素ガスでフラッシした。
【００１７】
１２００ｍｇのリン酸プレドニソロン二ナトリウム(OPE Nieuwegein)を秤量し、１２ｍＬの滅菌ＰＢＳに溶解した。この溶液を乾燥脂質フィルムに加え、その脂質フィルムの完全な水和を図るため、ガラスビーズの存在下で１時間振盪した。
【００１８】
このリポソーム懸濁液を押出成形機（Aventin、最大量１５ｍＬ）に移し、窒素ガスを用い、それぞれ２００と１００ｎｍ、それぞれ１００と５０ｎｍ、およびそれぞれ５０と５０ｎｍの孔径を有する、一方がもう一方の上に置かれた２ポアフィルターで６回、加圧下で押し出した。次にこのリポソーム懸濁液を透析コンパートメント(Slide-A-Lyzer, 10.000MWCO)で１リットルの滅菌ＰＢＳに対して２４時間２回透析した。
【００１９】
リポソームの平均粒径は光散乱(Malverm Zeta-sizer)によって測定したところ９３．１±１．２ｎｍであることが分かり、多分散指数は０．０９５±０．０２４であった。リン酸プレドニソロンの封入効率はＨＰＬＣ法によって測定したところ３〜４％の間であることが分かった。リポソーム懸濁液は４℃の窒素雰囲気下で保存したところ約２ヶ月間安定であることが分かった。
【００２０】
実施例２
他の水溶性コルチコステロイド含有ＰＥＧ−リポソームの製造
リン酸プレドニソロン二ナトリウムの代わりにそれぞれリン酸デキサメタゾン二ナトリウム(OPG Nieuwegein)、リン酸ベタメタゾン二ナトリウム(Sigma-Aldrich)または２１−リン酸ブデソニド(Syncom, Groningen, the Netherlands)を用いたこと以外は実施例１を繰り返した。
【００２１】
実施例３
ラットアジュバント関節炎モデルにおける治療効果の評価
ルイスラットの尾の基部にフロイントの不完全アジュバント中の熱不活化結核菌(Mycobacterium tuberculosis)を皮下感作させた。感作して９〜１２日後に脚の炎症が始まり、約２０日後に最大重度に達し、その後徐々に消散した。
【００２２】
脚の炎症の重篤度を一脚につき最大スコア４で視覚的に評価し、疾病により引き起こされた体重減少を測定するすることでこの疾病の評価を行った。これらの変数に対する、実施例１に従って製造したリン酸プレドニソロンリポソームの治療効力を同用量の非封入薬剤と比較した。ラットは平均スコア＞６の際（疾病誘導後１４または１５日目）に処置した。
【００２３】
ラット５個体中４個体において、１０ｍｇ／ｋｇリン酸プレドニソロンリポソーム一回投与で処置した後３日以内に炎症プロセスの完全緩和が見られた（平均スコア０．１±０．１、ＰＢＳ処理ラットの１１．８±１．９と比較）。非封入リン酸プレドニソロンは疾病の経過を有意に変化させなかった（ｐ＞０．０５、Kruskall-Wallis検定、ノン−パラメトリック）。これに対し、１ｍｇ／ｋｇリン酸プレドニソロンリポソームも効果的であった（ｐ＜０．０５、Kruskall-Wallis検定、ノン−パラメトリック）。体重減少については１０ｍｇ／ｋｇリン酸プレドニソロンリポソームのみが有意な効果を有していた（ｐ＜０．０５、片側ANOVA検定）。これらのラットは８日後に最初の体重に回復した。他の処置群は進行性の体重減少を受け続けた。
【００２４】
非封入リン酸プレドニソロンの一回注射に効果は見られなかったことから、７日間毎日１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇを注射することとした。両方の治療計画とも平均６．５±０．５６（１４日目）から１５日目から２１日目までの平均値５．０前後まで炎症スコアが低くなった（毎日生理食塩水で処置した対照は２０日目に最大１０．６±１．３に達した）。しかし、１４日目における１０ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇリン酸プレドニソロンリポソームの一回注射は２０日目までにアジュバント関節炎（ＡＡ）症状を消失させた。空のリポソームによる対照処置では疾病の進行に変化はなかった（ｐ＞０．０５）。
【００２５】
また、実施例２のリポソーム組成物もアジュバント関節炎モデルで試験した。リン酸デキサメタゾンリポソームはリン酸プレドニソロンリポソームまたはリン酸ベタメタゾンリポソームよりも効果が高いことが分かった。２ｍｇ／ｋｇ量は１０ｍｇ／ｋｇリン酸プレドニソロンリポソームと同様の効果であった。２ｍｇ／ｋｇリン酸ベタメタゾンリポソームは２ｍｇ／ｋｇリン酸プレドニソロンリポソームよりも効果が高かいことが分かったが、２ｍｇ／ｋｇリン酸デキサメタゾンリポソームとは対照的に、完全な回復は得られなかった。２１−リン酸ブデソニド（１ｍｇ／ｋｇ）はリン酸デキサメタゾンリポソームと比べて、少なくとも同等に有効な疾病抑制をもたらした。
【００２６】
実施例４
ＡＴ−ＥＡＥにおける治療効力の評価
雌ルイスマウスに１０７ＭＢＰ特異的Ｔ細胞の静脈注射により養子移植実験的自己免疫脳脊髄炎（ＡＴ−ＥＡＥ）を誘導した。実施例１に従って製造した１０ｍｇ／ｋｇリン酸プレドニソロン含有リポソームを犠牲にする４２時間および１８時間前に静脈注射した。もう一方の群には灌流１８時間および６時間前に５０ｍｇ／ｋｇメチルプレドニソロンを静脈注射した。対照ラットには同じ時点で空のリポソームおよび／または生理食塩水を施した。脊髄のＴ細胞またはマクロファージはパラフィン包埋組織にて免疫組織化学的に検出し、アポトーシスはＴＵＮＥＬアッセイにより、また、形態学的基準により評価した。統計分析には分類したデータに関するスチューデントのｔ検定を用いた。脊髄組織におけるＴ細胞のアポトーシス率はリン酸プレドニソロンリポソームによって有意に増大した（３９．４±６．８％、ｐ＜０．０００１に対して対照群では１６．１±４．３％、データは全て平均値±標準偏差で示される）。内部対照としてのメチルプレドニソロンは３０．８±８．０％という率でのＴ細胞アポトーシスをもたらす（対照に対してｐ＜０．０１）。アポトーシスが増大する結果としてＴ細胞の浸潤はリン酸プレドニソロンリポソームによって明らかに低下した（４５±１２Ｔ細胞／ｍｍ２）。なおこれは対照に対して（１１５±５１Ｔ細胞／ｍｍ２、ｐ＜０．０５）、およびメチルプレドニソロンに対して（９６±１９Ｔ細胞／ｍｍ２、ｐ＜０．０５）統計学的に有意であった。炎症のもう１つの局面としてのマクロファージの浸潤は対照（７８±３７マクロファージ／ｍｍ２、ｐ＜０．０５）と比較して、およびメチルプレドニソロン（６６±２５マクロファージ／ｍｍ２、ｐ＜０．０５）と比較して、リン酸プレドニソロンリポソーム（３１±１３マクロファージ／ｍｍ２）によって有意に低下した。迅速機構の検討を目的に養子移植モデルを選択した場合でも、４２時間内にリン酸プレドニソロンリポソームの治療効果が見られ、対照（３．２±０．３、ｐ＜０．０１）に比べて臨床スコア２．８±０．２に達し、これはメチルプレドニソロン（リン酸プレドニソロンリポソームに対して３．２±０．３、ｐ＜０．０５）よりも優れていた。