(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微量分析システム又は合成微粒子の表面への、溶液中の細胞および細胞成分を含む粒子の接着性を防止するための方法において、前記粒子が、少なくとも１つのポリビニルアルコールを含有する溶液中に提供されることを特徴とする、粒子の接着性を防止するための方法。
【請求項２】
前記溶液中のポリビニルアルコールの濃度が０．０１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ポリビニルアルコールが水溶性であることを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が真核細胞および／または原核細胞であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞成分がリポソーム、脂質膜、脂質、タンパク質、ＤＮＡ、核酸、伝達物質、糖、グリカンおよび／または糖タンパク質であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記表面が細胞、細胞膜、細胞成分、被覆されていないかもしくは生体分子で被覆された、ケイ素、シリコーン、有機重合体および／またはガラスから成る表面であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記生体分子が脂質膜、脂質、タンパク質（殊に免疫抗体）、ＤＮＡ、核酸、伝達物質、ビオチン、糖、グリカンおよび／または糖タンパク質であることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記有機重合体がＰＭＭＡ、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、テフロン（登録商標）、ポリアクリル、ナイロン（登録商標）および／またはペルロン（登録商標）であることを特徴とする、請求項６または７記載の方法。
【請求項９】
前記表面が微量分析システムの流路表面を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記表面が合成微粒子の表面を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
−緩衝食塩水、
−イノシトール、
−ポリビニルアルコール
を含有する溶液の使用において、前記ポリビニルアルコールの含量が０．１％（ｗ／ｖ）〜１．１％（ｗ／ｖ）であり、
微量分析システムまたは合成微粒子の表面への、粒子の接着を防止するための使用。
【請求項１２】
前記緩衝食塩水がＰＢＳであることを特徴とする、請求項１１記載の溶液の使用。
【請求項１３】
前記緩衝食塩水および／またはイノシトールの含量が可変的であることを特徴とする、請求項１１または１２記載の使用。
【請求項１４】
前記ポリビニルアルコールの含量が０．３％（ｗ／ｖ）〜０．６％（ｗ／ｖ）であることを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、粒子を含有する溶液に多価アルコールを添加することによる、表面への粒子、特に細胞と細胞成分、の接着性を防止するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
表面への粘着性は細胞の基本的な特性である。これは、例えば、細胞外マトリックスと細胞の相互作用において、遺伝子発現の制御または一般的な細胞機能の制御のための重要な因子であることが明らかになっている。このプロセスは細胞表面におけるタンパク質によって特に影響を与えられる。
【０００３】
しかしながら、細胞のこの特性は細胞培養の調製および細胞あるいは細胞成分の非破壊検査の場合にしばしば大きい問題となる。例えば、調製で使用された補助手段と容器の表面への細胞の粘着性が望ましくない。殊に生物学的な試料の微量分析の技術を問題なく細胞検査に利用することができない。例えば、「ラブ・オン・チップ（Ｌａｂ−ｏｎ−Ｃｈｉｐ）」法の場合のように、流路システムを含むこれらのシステムはしばしばほんの数マイクロメートルの寸法を有するだけである。さらに、これらの微量分析システムの使用される表面材料の選択は、そのつどの製造プロセスあるいは微細構造自体の材料に制約されている。マイクロチャネル分析システムは、例えば、ガラス、ケイ素、シリコーンおよび有機重合体、例えばＰＭＭＡもしくはポリウレタン；つまり細胞の接着性を促進するすべての支持体から製造される。従って表面材料は、最小限の細胞接着性のための必要条件に従って自由に選ぶことはできない。
【０００４】
細胞粘着性／接着性を防止するために、従って微細構造自体の表面が改質される。この目的のために種々の化合物、一般的に疎水性シランおよび親水性重合体（ヒドロゲル）が使用される。
【０００５】
Ｃａｒｌｓｏｎら（（１９９７）：「格子内の白血球のセルフソーティング（Ｓｅｌｆ−Ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｗｈｉｔｅ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  Ｌａｔｔｉｃｅ）」、Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ７９、Ｎｏ．１１、ｐ．２１４９−２１５２）は、公知のコーティングを用いて血球を例えば機械のマイクロフィルターシステムでソーティングすることに成功した。しかしその際、白血球が取り返しのつかないほどに該微細流路の入口に付着したままになった。このことは上記のシステムの場合には望ましいが、同時に、微細流路を細胞の試料の非破壊検査に使用することにおける現在の限界を示している。
【０００６】
Ｌｉらのさらなる研究（「動電学的効果を用いた生物細胞オンチップの輸送、処置、及び反応（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｏｎ−Ｃｈｉｐ  Ｕｓｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｆｆｅｃｔｓ）」、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９７）６９、１５６４−１５６８）は、血球を４０μｍ幅の微細流路の中に入れることができることを明らかにした。しかし細胞はその後試薬で溶解され、そしてそのようにして初めて分析されたのであった。しかしながら、真核性の、特に生きている哺乳動物の細胞の、微細流路からの回収は流路の表面材料の選択に高い要求を課す。
【０００７】
さらなる研究、例えばポリビニルアルコールで小さなガラス板を覆うこと、がこのような表面改質がマウス繊維芽細胞の接着性を最小にすることができることを示した（Ｈｉｓａｄａ，Ｔ．（１９７６）、：「いくつかの重合体に対する培養細胞の接着性（Ｔｈｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｓｏｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）」（日本語）、歯科理工学雑誌１７（３８）、ｐ．９１−１０１））。
【０００８】
同様にポリ（メチルメタクリレート）とポリビニルアルコールからの共重合体粒子が血球に接着せず、そして単球と好中球によって貪食されないことが示されている（Ａｙｈａｎ，Ｈ．およびＥ．Ｐｉｓｋｉｎ（１９９７）：「活性白血球の高分子ミクロスフェアとの相互作用（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）」、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｏｒｇａｎｓ  ２０（１２）、７０４−７０７）。
【０００９】
さらにＫｒｙｌｏｖら（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２１、７６７−７７３、２０００）は、ガラスあるいはポリスチレンへの細胞の粘着性が、その表面が例えばポリビニルアルコールのような親水性重合体（ヒドロゲル）で改質される場合に顕著に減少することを確認した。
【００１０】
しかしながら、すべての上記の研究の場合には、直接の表面コーティングを実施することが必要であり、その際、例えばポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が該表面に固定化されて結合されており、すなわちＰＶＡを用いた支持体の表面コーティングまたは共重合が実施される。コーティングの実施のために、複雑な、特に正確な温度の指定に拘束された、何段階もの、そしてそれによって非常に時間がかかるプロセスが必要である。さらに、特に、ポリスチレンのような重合体から成る表面のコーティングは問題であり、それというのも、この材料がコーティングに必要な１００℃をはるかに超える温度によって損傷を与えられる可能性があるからである。従って、上記方法はただガラス表面を用いた適用にしか満足に使用することができない。
【００１１】
さらに、特に微量分析システムにおける微細構造のわずかでしかない直径のために、満足なコーティングを達成することはしばしば不可能である。従って、例えばほんの数マイクロメートルだけの直径の流路構造の、対応する微細構造の表面全体にわたる重合体あるいは他のコーティング材料の例えば一様な空間的な分布は不可能もしくは不十分にのみ可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
従って本発明の課題は、微量分析システムの表面特性および種類に依存せずにこのシステムで溶液中の粒子、特に細胞と細胞成分、の本質的に非破壊の、そして損失なしの検査を可能にする方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題は、請求項１記載の方法および請求項１２記載の溶液によって解決される。
【００１４】
本発明によれば、上記方法には、粒子、特に細胞あるいは細胞成分、しかしまた、遊離した形で存在しているか、あるいは、例えば、ビーズのような構造体に結合されている、例えばタンパク質およびペプチドを含有する溶液に物質を添加することが含まれる。この本発明による物質によって、表面、特に微量分析システムの表面へのこれらの粒子の粘着の本質的な阻止が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
図１には、０．５％ＰＶＡの存在下での滞留時間ｔに対するマイクロリットル注射器からの懸濁されたＪｕｒｋａｔ細胞の回収率を説明する線図が示されている。
【００１６】
本発明によれば、この物質は、多価アルコール、特にポリビニルアルコール、例えばポリビニルアルコールＶＡ３００００〜７００００および／またはポリグリコール、好ましくはポリエチレングリコールである。驚くべきことに、溶液へのこれら物質の添加は、生きている細胞に関して有毒な作用を示さなかったか、あるいは細胞成分の変化を起こさない。溶液中の多価アルコールの濃度０．０１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）が特に適当である。それどころかポリビニルアルコールの例では、該多価アルコールの接着防止効果が接着防止剤として用いられる公知の物質の接着防止効果をはるかに超えることを示すことができた（表１）。多価アルコールの水溶性および下記のさらなる特性によって、すべての粒子水溶液への普遍的な適用性がもたらされる。
【００１７】
上記物質に対して細胞および／または細胞成分を含有する溶液中での使用を特に可能にする該物質のさらなる重要な特性は、該物質が溶液の生理学的なｐＨ値に対する影響を有していないということである。
【００１８】
例えば蛍光相関分光法、蛍光共鳴エネルギー伝達（Ｆｌｕｏｒｅｓｚｅｎｚｒｅｓｏｎａｎｚ−Ｅｎｅｒｇｉｅｔｒａｎｓｆｅｒ）、蛍光偏光法、蛍光強度分布分析、あるいは、例えば紫外線分光法のような、微量分析システムに応用される多くの分析方法は、光信号の記録および評価に基づいている。従ってそれだけに、上記物質が光学分析に影響を与えないこと、すなわち殊に自己蛍光を示さないか、あるいは溶液の屈折率を変えないことは、この物質の普遍的な適用性のために重要であった。これらの必要条件は、多価アルコール、殊にポリビニルアルコールもしくはポリグリコールによって著しく良好に満たされる。
【００１９】
今回、本発明による方法によって、特に微量分析システムにおける、粒子の本質的に損失なしの検査および粒子の操作、特に分離、が可能になった。これは、例えば、高さ１〜１０００μｍ、特に２〜５００μｍ、殊に４０μｍ、；幅１００〜２０００μｍ、特に２００〜６００μｍおよび長さ１００μｍ〜１０ｃｍ、特に１〜２ｃｍ、の流路を有する微量分析システムが該当しうる。このシステムは特にガラス、ケイ素、シリコーン、有機重合体、あるいは別の適当な材料から成り得る。微量分析システムの特別な実施形態は、例えば顕微鏡分析、光分析および／または電気分析のために、ソーティングのために、分離のために、電気穿孔法のために、粒子、特に細胞の融合および分離のために、検査すべき粒子を操作するために、特に誘電力の発生のための電極を有していてもよい。
【００２０】
従って例えば微量分析システムは、懸濁された粒子（殊に細胞）のソーティングのために微細流路内の誘電分岐器としての電極を含むか、あるいは他の微量分析システムの場合には電極は、細胞融合および／または細胞穿孔法（Ｚｅｌｌｐｏｒａｔｉｏｎ）を実施することができるように配置されており、かつ、他のシステムは、閉じられた微細流路内の２つの電極平面、流路交差点での誘電フィールドケージならびにストップフロー分析ならびに分析された粒子の後続のソーティングの実施のために誘電分岐器として形成された電極を含む。この場合、微細流路システムは、種々の電極システムの組み合わせを含んでいてもよい。
【００２１】
プラスチックもしくはガラスの注射器を用いてしばしば実施される、このようなシステムの中への粒子の注入でさえ、注射器本体への粒子の粘着によって起こされる損失にはもはや至らない。
【００２２】
本発明によれば、添加された物質が生きている細胞にも影響を与えないので、例えば、直接細胞を検査することが可能であり、この検査をベースにしてソートすることが可能であり、そしてさらに効果的に、分離された細胞で細胞培養を新たにつくることが可能である。従って例えば、ある一定の特性、例えば細胞表面上にある一定の種類のレセプターを有する、細胞を効果的にかつ本質的に損失なしで他の細胞から分離しかつ増やすことができる。
【００２３】
本発明による方法は、一般にすべての種類の細胞に、従って真核細胞にも原核細胞にも適している。
【００２４】
表１には、ポリビニルアルコールの存在下での種々の微量分析システムにおける検査および／または操作の後に生きている細胞の割合が示されている。（サイトコン（登録商標）（Ｃｙｔｏｃｏｎ）ソーターチップ（Ｎｏ．１および２）での、サイトコン（登録商標）ポレーターチップ（Ｎｏ．３〜５）、そしてサイトコン（登録商標）ローダーチップ（Ｎｏ．６および７）でのＪｕｒｋａｔ細胞）。
【表１】
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【００２５】
表２には、微量分析システム（サイトコン（登録商標）チップ）での細胞分離後の画分１および２中のＪｕｒｋａｔ細胞および血球の割合がそれぞれ示されている。
【表２】
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【００２６】
本発明による方法は同じく細胞成分に適している。該方法は細胞成分の構造に対する影響を有しておらず、そして変性を起こさない。細胞成分とは、例えば、リポソーム、脂質膜、脂質、タンパク質、ＤＮＡ、核酸、伝達物質、糖、グリカンおよび／または糖タンパク質のことと理解される。つまり原則として、細胞のすべての成分のことであるが、しかし細胞フラグメントのことでもある。
【００２７】
本発明による方法は、該方法が、特にケイ素、シリコーン、ガラスおよび／または有機重合体、例えばＰＭＭＡ、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、テフロン（登録商標）、ポリアクリル、ナイロン（登録商標）および／またはペルロン（登録商標）、から成ることができる微量分析システムの表面への粒子の粘着を防止するという利点の他に、該方法が生体分子、特に細胞、細胞膜、細胞成分、例えば脂質、タンパク質（殊に免疫抗体）、ＤＮＡ、核酸、伝達物質、ビオチン、糖、グリカンおよび／または糖タンパク質相互間あるいはこのような分子で覆われた表面への接着を防止するという可能性も提供する。
【００２８】
表３には、ポリスチレン培養皿への細胞粘着性は種々の物質の存在下で示される。
【表３】
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【００２９】
注釈：
−＝粘着なし
（９）＝非常に低い粘着性
９＝顕著な粘着性
９９＝強い粘着性
９９９＝非常に強い粘着性
ＯＫ＝定量化はないが、比較対照との相違は識別できない。
【００３０】
この場合、本発明の範囲内では表面によっていずれもの表面を意味し、しかし特に流路表面、微量分析システムの貯蔵容器、ホース、注射器、注入モジュールの表面あるいは合成微粒子の表面を意味する。
【００３１】
さらに、微量分析システムでの粒子、特に細胞および細胞成分、の検査に全般的に適している溶液が見いだされた。この溶液は、緩衝食塩水、特にＰＢＳ、および／またはイノシトールならびにポリビニルアルコールを含有する。しかしながら、該溶液に、細胞溶液に関連して知られている他の成分、例えばマグネシウムイオンもしくはカルシウムイオン、を添加することもできる。
【００３２】
緩衝生理食塩水、イノシトール、および／またはＰＶＡの割合は可変的である。該緩衝液は正常浸透圧の、高浸透圧の、もしくは低浸透圧の糖溶液（例えばショ糖あるいはイノシトール）によって可変的な混合比で希釈することができる。前記溶液に対する緩衝生理食塩水の割合は０からほぼ１００％の間で変化させることができ、その際、２０％、５０％もしくはほぼ１００％の割合が特に有利である。
【００３３】
イノシトールは好ましくは、例えば蒸留水中のイノシトールの０．２〜０．５モルの溶液、特に有利に０．３モルの溶液として使用される。この場合、イノシトール溶液と本発明による溶液の割合は、同じく０からほぼ１００％の間で変化させることができる。しかしながら、特に有利であるのは５０％、８０％とほぼ１００％の割合である。
【００３４】
本発明による溶液には、分子量３００００ｇ／ｍｏｌ〜７００００ｇ／ｍｏｌを有するポリビニルアルコールが特に適しており、その際、本発明による溶液中のＰＶＡの量が０．１％の（ｗ／ｖ）〜１．１％（ｗ／ｖ）、特に０．３％（ｗ／ｖ）〜０．６％（ｗ／ｖ）、殊に０．４５％（ｗ／ｖ）〜０．５５％（ｗ／ｖ）である。
【００３５】
本発明による溶液は、粒子の種類と性質に関係なく、特に微量分析システムでの該粒子の検査および操作に使用することができる。
【００３６】
この目的のために、粒子はこの溶液中に直接懸濁することができ、そして微量分析システムに入れることができる。しかしながら、この溶液を粒子懸濁液に添加することも可能である。
【００３７】
例１
溶液のｐＨ値に対するポリビニルアルコールの影響
ＰＢＳ中のポリビニルアルコールの１％の溶液のｐＨ値を測定し、そして７．３１である（生理学的なｐＨ範囲はｐＨ７．２〜７．４である）。
【００３８】
例２
他の添加物との比較での細胞接着性に対するポリビニルアルコールの影響
溶液：
Ｊｕｒｋａｔ細胞（英国、ソールズベリー（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ）の動物細胞培養のヨーロッパ保存機関（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）のクローンＥ６．１）とＵ９３７−細胞（英国、ソールズベリーの動物細胞培養のヨーロッパ保存機関の単球細胞系）をＲＰＭＩ  １６４０培地（カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）のＧＩＢＣＯライフテクノロジーズ社（ＧＩＢＣＯ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でペニシリンおよびストレプトマイシン（ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ）のセロムド／バイオクロム社（Ｓｅｒｏｍｅｄ／Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）と１０％の胎児の子牛の血清（ベルリンのセロムド／バイオクロム社）の各１００ＩＵ／ｍｌの添加下に培養した。この細胞懸濁液３ｍｌごとに遠心分離し、そしてカルシウムおよびマグネシウム不含のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ベルリンのセロムド／バイオクロム社）３００μｌ中に取った。２４ウェル型プレートのウェル（２４ウェル型のポリスチレン培養皿、コーニング・コ−スター社（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏ−ｓｔａｒ）を後記の物質の表１に記載の濃度の添加下にＰＢＳ各５００μｌで満たした。メチルセルロース（２％溶液の１５センチポアズおよび４０００センチポアズの粘度、シュタインハイム（Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ）のシグマ・アルドリッヒ社（ＳＩＧＭＡ  Ａｌｄｒｉｃｈ  ＧｍｂＨ）、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）７０およびフィコール４００（スウェーデン、ウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）のファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、デキストランＴ１０（スウェーデン、ウプサラのファルマシア社）、ポリビニルピロリドン１５および２５（セルバ社（Ｓｅｒｖａ）、ポリエチレングリコール５０００（フルカ社（Ｆｌｕｋａ）ならびにポリビニルアルコール３００００〜７００００（シュタインハイムのシグマ・アルドリッヒ社）を試験した。上記の細胞懸濁液５０μｌを添加した。比較対照として細胞培地５００μｌ（この培地ではこれらの懸濁細胞は粘着しない）中の試料を使用した。
【００３９】
実施：
上記試料を３７℃で３０分間インキュベーションした。接着していない細胞を含む上澄みを取り、そして緩衝液によって置き換えた。粘着性を定性的に評価した（表１参照）。上澄みならウェル中の細胞を、細胞の活力度を検査するためにトリパンブルー溶液（０．２％、シュタインハイムのシグマ・アルドリッヒ社社）で染色した。ポリビニルアルコールのみが両方の細胞系において細胞粘着性に対する著しく顕著な抑制効果を有する。この効果は０．１％（ｗ／ｖ）の濃度ですでに現れる。
【００４０】
結果：
接着防止効果が与えられている多くの物質をポリビニルアルコールと比較して試験した。例えば、非特異的な結合を阻止するためにフローサイトメトリーで知られておりかつ免疫活性の検出（例えばウェスタンブロット法）で使用される牛の血清アルブミン（ＢＳＡ）。さらに、血液試料の密度勾配遠心分離でかあるいは細胞培養技術で使用される種々の親水性重合体を検査した。カルシウムおよびマグネシウム不含の緩衝液中のカドヘリンおよびインテグリン、特異的な細胞−細胞−および細胞−支持体−接着性分子、の影響さえ検査した。これらの分子は相互作用のためにカルシウムを必要とする。ポリビニルアルコールが試料担体への懸濁された細胞の接着性を防止する効果において成果を上げて他の物質を顕著に凌駕することが明らかにされた。
【００４１】
例３
生きている哺乳動物の細胞に関してのポリビニルアルコールの毒性の検査
実施：
マイクロリットル注射器からの細胞の回収への０．５％（ｗ／ｖ）のＰＶＡの使用を検査した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を１ｍｌあたり５．６９×１０５個の細胞の濃度で、０．５％ＰＶＡ（ｗ／ｖ）を含むＰＢＳ中に懸濁した。この懸濁液５μｌを５μｌの注射器（ダイナテック社（Ｄｙｎａｔｅｃｈ））中に吸収した。１μｌごとに直ちにかつ１分ないしは５分後にテラサキプレート（Ｔｅｒａｓａｋｉ−Ｐｌａｔｔｅ）（ウィースバーデン（Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ）のナンク社（ＮＵＮＣ））のウェルの中に移した。細胞を該プレート中でライブ／デッド・ステイン・キット（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ）（オランダ、ライデン（Ｌｅｉｄｅｎ）のモレキュラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））で染色しかつ計数し；その際、同時にそれらの活力度を検査した。回収率を測定した。
【００４２】
結果：
細胞の９０％より多くを−５分後でも−注射器から回収することができた。従って該細胞は付着していなかった。死んだ細胞のパーセンテージは初め、即ち０分で０．８％であり、そして５分後に２．４％に増加しただけだった。
【００４３】
例４
ポリビニルアルコールを含む細胞緩衝液を使用した微量分析システムでの細胞の検査
材料：
微細流路における懸濁された細胞を使用した作業へのポリビニルアルコールの使用をサイトコン（登録商標）３００装置システムを用いて検査した。サイトコン（登録商標）チップはガラスから成り、かつ高さ４０μｍ、幅２００〜６００μｍおよび長さ約１〜２ｃｍの流路を有し、その際、チップの特別な実施形態は流路中に電極を有していてもよい。サイトコン（登録商標）ソーターチップは、例えば、懸濁された粒子（特に細胞）のソーティングのために微細流路中の誘電分岐器としての電極を有し、サイトコン（登録商標）ポレーターチップの場合には電極は、細胞融合および／または細胞穿孔法を実施することができるように配置されており、そして、閉じられた微細流路内の２つの電極平面、流路交差点での誘電フィールドケージならびに誘電分岐器として形成された電極を含むサイトコン（登録商標）ローダーチップの場合には、ストップフロー分析の実施ならびに分析された粒子の後続のソーティングに適当である。
【００４４】
３００００ｇ／ｍｏｌ〜７００００ｇ／ｍｏｌの分子量を有するポリビニルアルコールを使用した。このポリビニルアルコールを緩衝液中に０．５％（ｗ／ｖ）まで溶かし、そして細胞の全ての操作の間、微細流路に存在していた。
【００４５】
実施：
細胞を緩衝液中に懸濁し、そしてサイトコン（登録商標）チップに注入した。懸濁液を流路システム内である一定の流速（「試料」）で送り、そしてチップ出口においてシース流れで加速した。洗い落とされた細胞を数え、そして回収率を初期濃度と注入された試料量から計算した。
【００４６】
結果：
使用する細胞量がたった数百の細胞であり、かつ微細流路での流速が非常に遅かったにもかかわらず（微細流路中の細胞の滞留時間約２分間）、細胞の回収率は非常に高く（表２）、そして約１００％の値を達成可能であった。
【００４７】
例５
血球の分画（赤血球からのリンパ球の分離）
実施：
ヒトの全血とＪｕｒｋａｔ−Ｔリンパ腫細胞とＰＶＡ含有の緩衝液の混合がつくった。この緩衝液はＰＢＳ２０％（ｖ／ｖ）、０．３モルのイノシトール溶液８０％（ｖ／ｖ）とＰＶＡ（３００００〜７００００、シグマ社（Ｓｉｇｍａ））０．５％（ｗ／ｖ）を含んでいた。よく見えるように実験の間、Ｊｕｒｋａｔ細胞を１０μモルのカルセイン−ＡＭ（登録商標）（Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ）（モレキュラー・プローブ社）で標識化した。
【００４８】
血液とリンパ腫細胞を次のとおり希釈した：
上記細胞試料をＪｕｒｋａｔ細胞２．５×１０６個／ｍｌおよび赤血球１．８×１０７個／ｍｌの濃度で混合した。該試料０．３μｌをサイトコン（登録商標）チップ（微量分析システム）に注入した。
【００４９】
この実験に使用するサイトコン（登録商標）チップはガラスから成り、かつ高さ４０μｍ、幅２００〜６００μｍおよび長さ約１〜２ｃｍの流路を有する。さらに、ここで使用する微量分析システムは、細胞のソーティングのために誘電分岐器としてこの場合に配置されている１つもしくはいくつかの微細流路内に電極を有していた。
【００５０】
細胞をそれらの大きさとそれらの誘電特性における相違に基づいてサイトコン（登録商標）微量分析システムのいわゆるスイッチ電極（分岐器）によって電界の周波数８００ｋＨｚおよび振幅、実効値で３〜６Ｖで流速６２〜２４０μｍ／ｓで分離した。これらの条件下で、Ｊｕｒｋａｔ細胞を脇へそらし、そして画分１に集め、その一方で赤血球（ＲＢＣ）は分岐器を通過することができ、そして画分２に集めた。
【００５１】
Ｊｕｒｋａｔ細胞と赤血球（ＲＢＣ）を、濃縮および収率を決定できるように両方の画分で数えた。
【００５２】
結果：
画分１でのＪｕｒｋａｔ細胞に対する濃縮係数は一実験例の場合で１７．５である。この画分でのＪｕｒｋａｔ細胞の収率は、この場合９３％であった（表３）。
【００５３】
全体として（画分１および２）、細胞回収率はほぼ１００％であった。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】Ｊｕｒｋａｔ細胞の回収率を示す線図。
【図１】
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