(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：２に記載されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列またはその相補体を含む単離した核酸。
【請求項２】
該ヌクレオチド配列が配列番号：１に記載の配列または、配列番号：１のヌクレオチド７４〜４４２を含むヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の単離した核酸。
【請求項３】
請求項１に記載の単離した核酸を含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターでトランスフェクトした細胞。
【請求項５】
請求項１に記載の単離した核酸でトランスフェクトした細胞。
【請求項６】
請求項１に記載の単離した核酸を含む非ヒト・トランスジェニック動物。
【請求項７】
配列番号：２に記載されたアミノ酸配列の変異体をコードする単離した核酸であって、該変異体は、アミノ酸８にてＴｈｒからのＡｌａ、アミノ酸９にてＧｌｎからのＧｌｕ、アミノ酸５４にてＭｅｔからのＴｈｒおよびアミノ酸５７にてＩｌｅからのＴｈｒよりなる群から選択されるアミノ酸の置換以外は配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を含む単離した核酸。
【請求項８】
該核酸は配列番号：１に記載されたヌクレオチド配列の変異体を含み、該変異体は、ヌクレオチド９５にてＡからＧ；ヌクレオチド９８にてＣからＧ；ヌクレオチド２３４にてＴからＣ；およびヌクレオチド２４３にてＴからＣよりなる群から選択されるヌクレオチドの置換以外は配列番号：１に記載されたヌクレオチド７４〜４４２を含む、請求項７の単離した核酸。
【請求項９】
請求項７に記載の単離した核酸を含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターでトランスフェクトした細胞。
【請求項１１】
請求項７に記載の単離した核酸でトランスフェクトした細胞。
【請求項１２】
配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を含む単離したポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号：２に記載されたアミノ酸配列の変異体であって、該変異体は、アミノ酸８にてＴｈｒからのＡｌａ、アミノ酸９にてＧｌｎからのＧｌｕ、アミノ酸５４にてＭｅｔからのＴｈｒおよびアミノ酸５７にてＩｌｅからのＴｈｒよりなる群から選択されるアミノ酸の置換以外は配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を含む単離したポリペプチド。
【請求項１４】
ヒトＭｉＲＰ１遺伝子の多型性を検出する方法であって、対象の組織試料から単離されたヒトＭｉＲＰ１遺伝子の配列またはその発現産物をヒトＭｉＲＰ１遺伝子の野生型配列またはその発現産物と比較することを含み、ヒトＭｉＲＰ１遺伝子の野生型配列は配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、組織試料から単離されたヒトＭｉＲＰ１遺伝子の配列またはその発現産物における変異が該組織試料中のヒトＭｉＲＰ１遺伝子における多型性を示すことを特徴とする該方法。
【請求項１５】
ＱＴ延長症候群のリスクの指標となるヒトＭｉＲＰ１遺伝子における多型性を検出する方法であって、対象の組織試料から単離されたヒトＭｉＲＰ１遺伝子の配列またはその発現産物をヒトＭｉＲＰ１遺伝子の野生型配列またはその発現産物と比較することを含み、ヒトＭｉＲＰ１遺伝子の野生型配列は配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、組織試料から単離されたヒトＭｉＲＰ１遺伝子の配列またはその発現産物における変異がＱＴ延長症候群のリスクの指標となる組織試料のヒトＭｉＲＰ１遺伝子における多型性を示し、該変異がアミノ酸８にてＴｈｒからのＡｌａ、アミノ酸９にてＧｌｎからのＧｌｕ、アミノ酸５４にてＭｅｔからのＴｈｒおよびアミノ酸５７にてＩｌｅからのＴｈｒよりなる群から選択されるアミノ酸の置換であることを特徴とする該方法。
【請求項１６】
ＱＴ延長症候群の治療または予防に有用な薬物をスクリーニングする方法であって：
（ａ）野生型ＨＥＲＧおよび配列番号：２に記載されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現する細胞を、電流を測定するための浴液に入れ；
（ｂ）工程（ａ）の細胞における誘導Ｋ＋電流を測定し；
（ｃ）野生型ＨＥＲＧおよび配列番号：２に記載されたアミノ酸配列の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現する細胞を、電流を測定するための浴液に入れ、該変異体はアミノ酸８にてＴｈｒからのＡｌａ、アミノ酸９にてＧｌｎからのＧｌｕ、アミノ酸５４にてＭｅｔからのＴｈｒおよびアミノ酸５７にてＩｌｅからのＴｈｒよりなる群から選択されるアミノ酸の置換以外は配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を含み；
（ｄ）工程（ｃ）の細胞における誘導Ｋ＋電流を測定し；
（ｅ）薬物を工程（ｃ）の浴液に添加し；
（ｆ）工程（ｅ）の細胞における誘導Ｋ＋電流を測定し；ついで、
（ｇ）該薬物が、野生型ＨＥＲＧおよび配列番号：２に記載されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現する細胞において該薬物不存在下で観測される電流と比較して、野生型ＨＥＲＧおよび配列番号：２に記載されたアミノ酸配列の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現する細胞において観測される誘導Ｋ＋電流により近いもしくはより近くない誘導Ｋ＋電流を生じたかどうかを決定し、
ここに、野生型ＨＥＲＧおよび配列番号：２に記載されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現する細胞において観測される誘導Ｋ＋電流により近い誘導Ｋ＋電流を生じた薬物がＱＴ延長症候群の治療または予防に有用であることを特徴とする該方法。
【請求項１７】
工程（ａ）の細胞が野生型ＨＥＲＧおよび配列番号：２に記載されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で共トランスフェクトされ、工程（ｃ）の細胞が野生型ＨＥＲＧおよび配列番号：２に記載されたアミノ酸配列の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸で共トランスフェクトされていることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
（ｉ）工程（ａ）の細胞、（ｉｉ）工程（ｃ）の細胞、または（ｉｉｉ）工程（ａ）および（ｃ）の細胞をＲＮＡでトランスフェクトすることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
薬物が高速遅延整流カリウム電流（ＩＫｒ）に影響する能力を決定する方法であって、
（ａ）野生型ＨＥＲＧおよび配列番号：２に記載されたアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現する細胞を、電流を測定するための浴液に入れ；
（ｂ）工程（ａ）の細胞における第１の誘導Ｋ＋電流を測定するかまたは検出し；
（ｃ）薬物を工程（ａ）の浴液に添加し；
（ｄ）工程（ｃ）の細胞における第２の誘導Ｋ＋電流を測定し；次いで、
（ｅ）工程（ｃ）における薬物の添加が、該第１の誘導Ｋ＋電流を第２の誘導Ｋ＋電流と比較して、ＩＫｒを阻害するか、促進するか、または変化させるかどうかを決定することを特徴とする該方法。
【請求項２０】
薬物が高速遅延整流カリウム電流（ＩＫｒ）に影響する能力を決定する方法であって、
（ａ）野生型ＨＥＲＧおよび配列番号：２に記載されたアミノ酸配列の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を発現する細胞を、電流を測定するための浴液に入れ、該変異体はアミノ酸８にてＴｈｒからのＡｌａ、アミノ酸９にてＧｌｎからのＧｌｕ、アミノ酸５４にてＭｅｔからのＴｈｒおよびアミノ酸５７にてＩｌｅからのＴｈｒよりなる群から選択されるアミノ酸の置換以外は配列番号：２に記載されたアミノ酸配列を含み；
（ｂ）工程（ａ）の細胞における第１の誘導Ｋ＋電流を測定するかまたは検出し；
（ｃ）薬物を工程（ａ）の浴液に添加し；
（ｄ）工程（ｃ）の細胞における第２の誘導Ｋ＋電流を測定し；次いで、
（ｅ）工程（ｃ）における薬物の添加が、該第１の誘導Ｋ＋電流を第２の誘導Ｋ＋電流と比較して、ＩＫｒを阻害するか、促進するか、または変化させるかどうかを決定することを特徴とする該方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、メリーランド州ベセスダのナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルス（National Institute of Health）によって投資された助成金番号ＲＯ１ ＨＬ４６４０１、ＲＯ１ ＧＭ５１８５１およびＰ５０−ＨＬ５２３３８、および米国パブリック・ヘルス・サービス（U.S. Public Health Service）からの助成金番号Ｍ０１ ＲＲ０００６４の下で政府援助によりなされた。連邦政府は本発明において特定の権利を有する可能性がある。
【０００２】
発明の背景
本発明は、イオンチャネルを形成するＭｉｎ−Ｋに関連する遺伝子および遺伝子産物、およびＱＴ延長症候群（ＬＱＴ）を含むイオンチャネル障害の診断方法に指向される。例えば、ＫＣＮＥ２はＨＥＲＧとともにＩＫｒカリウムチャネルを形成し、ＬＱＴと関連する。ＬＱＴは、本発明により、試験されるべき個体のＫＣＮＥ２のＤＮＡ配列を解析し、各ＤＮＡ配列を正常ＫＣＮＥ２の既知のＤＮＡ配列と比較することによって、診断される。また、試験されるべき個体のこれらＭｉｎＫ関連遺伝子は、ＬＱＴを含むイオンチャネル障害をもたらす変異についてスクリーニングすることもできる。ＬＱＴを含むイオンチャネル障害が予測できれば、開業医が現存する医学的療法を用いてこの疾患を予防することも可能となるであろう。本発明は、さらには、ＨＥＲＧおよびＫＣＮＥ２（ＭｉＲＰ１としても知られている）タンパク質が集合して心臓のＩＫｒカリウムチャネルを形成するという知見にも関する。この知識を用いれば、１個の細胞中でこれら２種のタンパク質を同時発現させることができ、そのような形質転換された細胞を用いてＬＱＴの治療または予防に有用であろう薬物をスクリーニングすることもできる。本発明はさらにはＬＱＴの家系で見つけられたヒトＫＣＮＥ２遺伝子中の変異に指向される。
本発明の背景を説明するのに、または実施に関するさらなる詳細な説明を提供するのに、本明細書にて用いる刊行物および他の文献を、出典を明示することにより本明細書の一部とし、便宜上、その各々を添付した引用文献の一覧表に示す。
【０００３】
心臓不整脈が罹患および死亡の一般的原因であり、自然死全体の約１１％を占める（Kannel、１９８７；Willichら、１９８７）。一般に、生命を脅かす心室性不整頻摶の個体の前兆診断および治療は粗末であり、ある場合には、医学的管理が実質的に不整脈および死亡の危険性を増大させる（Cardiac Arrhythmia Suppresion Trial II Investigators、１９９２）。これらの因子が心臓不整脈の危険性のある個体の早期検出を可能とし、不整脈の予防に高い優先性を示す。
【０００４】
遺伝子および後天的因子の両方が心臓不整脈を発病する原因である。ＱＴ延長症候群（ＬＱＴ）は、心室性不整頻摶、特にトルサード・ド・ポアンおよび心室細動より由来の不意の意識喪失、失神、発作および突然死の原因となる遺伝性心臓不整脈である（Ward、１９６４；Romano、１９６５；Schwartzら、１９７５；Mossら、１９９１）。この障害は、一般に、若い、どちらかと言えば、健康な個体で起こる（Ward、１９６４；Romano、１９６５；Schwartzら、１９７５）。ＬＱＴ遺伝子キャリアは、大抵、心電図にてＱＴ間隔の延長、異常な心臓性再分極を明示する（Vincentら、１９９２）。ＬＱＴの臨床的特徴は、一時的な心臓不整脈、特に再分極に関連する心室性不整頻摶などの、不整脈および心室細動における心電図の特徴的な波形特性で命名された、トルサード・ド・ポアンに由来するものである（Schwartzら、１９７５；MossおよびMcDonald、１９７１）。トルサード・ド・ポアンは心室細動、特に致死不整脈に変質する可能性がある。ＬＱＴは一般的な診断疾患ではないが、心室性不整脈は極一般的であり；毎年合衆国で３０００００以上の市民が突然に死亡しており（Kannelら、１９８７；Willichら、１９８７）、多くの場合、その基礎となる機構は異常な心臓の再分極にある。したがって、ＬＱＴは生命を脅かす心臓不整脈を分子レベルで研究する独特な機会を提供するものである。
【０００５】
遺伝性および後天性形態の両方のＬＱＴが定義されている。後天性ＬＱＴおよび二次的不整脈は心臓虚血症、徐脈および低血清中カリウムまたはカルシウム濃度などの代謝性異常に由来させることができる（Zipes、１９８７）。ＬＱＴはまた、抗生物質、抗ヒスタミン薬、汎用性麻酔薬を含む、最も一般的には、抗不整脈薬を含む、特定の医薬を用いる治療に由来させることもできる（Zipes、１９８７）。遺伝的形態のＬＱＴは少なくとも５個の異なる遺伝子が変異したことに由来させることができる。従来の研究においては、ＬＱＴ遺伝子座が染色体１１ｐ１５．５（ＫＶＬＱＴ１またはＬＱＴ１）（Keatingら、１９９１ａ；Keatingら、１９９１ｂ）、７ｑ３５−３６（ＨＥＲＧまたはＬＱＴ２）、３ｐ２１−２４（ＳＣＮ５ＡまたはＬＱＴ３）（Jiangら、１９９４）に地図作成された。これらのうち、遺伝的ＬＱＴの最も一般的な原因がＫＶＬＱＴ１である。本発明者らの研究データはこの遺伝子の変異が５０％より多くの遺伝的ＬＱＴに関与しているとしている。最近になって、第４のＬＱＴ遺伝子座（ＬＱＴ４）が４ｑ２５−２７に地図作成された（Schottら、１９９５）。ＫＣＮＥ１（ＬＱＴ５）もまた、ＱＴ延長症候群に関係している（Splawskiら、１９９７ｂ；Duggalら、１９９８）。これらの遺伝子は心臓作用電位の形成と関連するイオンチャネルをコードする。変異はチャネル機能不全および筋細胞再分極をもたらし得る。心筋でのチャネル発現が局所的に不均一であるため、心臓再分極が異常であると不整脈に関する基体が創製される。ＫＶＬＱＴ１およびＫＣＮＥ１はまた内耳にて発現される（Neyroudら、１９９７；Vetterら、１９９６）。本発明者および第三者らは、これらの遺伝子の各々における同型接合体または異型接合体化合物の変異が難聴および重度の心臓表現型のジャーウェルおよびランゲ−ニールセン（JervellおよびLange-Nielsen）症候群を惹起し得ることを明らかにした（Neyroudら、１９９７；Splawskiら、１９９７ａ；Schultze-Bahrら、１９９７；Tysonら、１９９７）。耳での機能的チャネルの喪失が、難聴に至る、内リンパの生成を破壊するのは明らかである。
【０００６】
ＬＱＴの前兆診断は、現在のところ、心電図におけるＱＴ間隔の長さを基礎としている。ＱＴｃ（心拍数について矯正されたＱＴ；Bazzett、１９２０）が０.４４秒より長いと、伝統的に、罹患している個体と分類される。しかし、大部分のＬＱＴ患者は、心電図を取っていない、若い、どちらかと言えば、健康な個体である。その上、遺伝的研究は、ＱＴｃが感受的でも特異的でもないことを明らかにした（Vincentら、１９９２）。遺伝子キャリアおよびノンキャリアのＱＴｃ間隔のスペクトルは重複しており、そのため分類を誤る。ノンキャリアが長期ＱＴｃ間隔を有することもでき、罹患していると診断され得る。逆に、あるＬＱＴ遺伝子キャリアでは、そのＱＴｃ間隔は０.４４秒以下であるが、不整脈に関する危険性は高い状態にある。ＬＱＴを効果的かつ遺伝子特異的に治療するための正確な前兆診断が重要である。
【０００７】
この障害の常染色体優性形態および常染色体劣性形態が報告されている。常染色体劣性ＬＱＴ（ジャーウェルおよびランゲ−ニールセン症候群としても知られている）は先天的な神経性難聴と関連しており；この形態のＬＱＴが稀に存在する（ジャーウェルおよびランゲ−ニールセン、１９５７）。常染色体優性ＬＱＴ（ロマノ−ワード（Romano-Ward）症候群）はより一般的であり、他の表現型異常性に関連していない（Romanoら、１９６３；Ward、１９６４）。遺伝的ＬＱＴに極めて類似する障害もまた、通常、薬理学的療法の結果として獲得することができる（Schwartzら、１９７５；Zipes、１９８７）。
【０００８】
ＬＴＱに不整脈の機構を暗示するデータがある。以前に、ＬＱＴに関して２つの仮定が提案された（Schwartzら、１９９４）。１の仮定は左側自律神経の優勢が異常な心臓性再分極および不整脈を引き起こすと示唆する。この仮定は右側星状神経節を除去することで、不整脈がイヌで誘発され得るという知見により支持されている。加えて、逸話的証拠によれば、β−アドレナリン作動性ブロッキング剤により、および左側星状神経節摘出術により、数人のＬＱＴ患者が効果的に治療されている（Schwartzら、１９９４）。ＬＱＴの関連する不整脈に関する第２の仮説は、心臓イオンチャネルを調節する、心臓特異的イオンチャネル遺伝子（複数でも可）の変異が筋細胞の再分極の遅れを引き起こすことを示唆する。筋細胞再分極の遅れはＬ−型カルシウムチャネルの反応性を促進し、第２の脱分極をもたらし得る（JanuaryおよびRiddle、１９８９）。これらの第２の脱分極はトルサード・ド・ポアン不整脈で起こりそうな細胞機構である（Suwawicz、１９８９）。この仮定はカルシウムチャネルの薬理学的ブロックがＱＴ延長および再分極関連の不整脈をヒトおよび動物実験で誘発し得るという観察により支持されている（AntzelevitchおよびSicouri、１９９４）。１の形態のＬＱＴが心臓カルシウムチャネル遺伝子を変異させることで得られるという知見が筋細胞性仮定を支持している。
【０００９】
理論上、心臓性ナトリウムチャネル遺伝子の変異はＬＱＴを引き起こす。電位依存性ナトリウムチャネルは心室性筋細胞における速やかな脱分極を媒介し、さらに作用電位が安定期にある間の小さな電流を伝導する（Attwellら、１９７９）。ナトリウムチャネル機能の僅かな異常性（例えば、ナトリウムチャネル不活化の遅れおよびチャネル不活化の電位依存性の変化）は、ＱＴ延長および不整脈に至る、心臓再分極を遅れさせることができる。１９９２年に、Gellensらは心臓ナトリウムチャネル遺伝子、ＳＣＮ５Ａをクローンして特徴付けた（Gellensら、１９９２）。この遺伝子の構造は、２０１６個のアミノ酸のラージタンパク質をコードする、他の、以前に特徴付けられたナトリウムチャネルの構造と同じであった。これらのチャネルタンパク質は４つの同型ドメイン（ＤＩ−ＤＩＶ）を含有し、その各々が６個の推定膜スパンニングセグメント（Ｓ１−Ｓ６）を含有する。最近になって、ＳＣＮ５Ａが染色体３ｐ２１に地図作成されており、それはＬＱＴ３に対する優れた候補遺伝子とされており（Georgeら、１９９５）、この遺伝子はＬＱＴ３と関連することが明らかにされた（Wangら、１９９５ａ）。
【００１０】
１９９４年に、WarmksおよびGanetzkyは新規なヒトｃＤＮＡ、ヒトエーテルａ-ｇｏ-ｇｏ関連遺伝子を同定した（ＨＥＲＧ、WarmkeおよびGanetzky、１９９４）。ＨＥＲＧは、体細胞ハイブリッドパネルをＰＣＲ分析に付すことにより、ヒト染色体７にその起源が突きとめられ（WarmkeおよびGanetzky、１９９４）、ＬＱＴ２の候補とされた。それはカルシウムチャネルと推定アミノ酸配列相同性を有する。ＨＥＲＧを、カルシウム調節カリウムチャネルをコードする、ドロソフィラエーテルａ−ｇｏ−ｇｏ遺伝子（ｅａｇ）との相同性により海馬ｃＤＮＡライブラリーより単離した（Bruggemannら、１９９３）。ＨＥＲＧはｅａｇのヒト相同体ではなく、約５０％のアミノ酸配列相同性を有するにすぎない。
【００１１】
ＬＱＴ１がＫＶＬＱＴ１遺伝子と関連することが見出された（Q.Wangら、１９９６）。ＫＶＬＱＴ１が変異した１６組の家族を同定して特徴付け、１６組の家族すべてにおいて、ＬＱＴ１とＫＬＶＱＴ１の間に明確な関連のあることが明らかにされた。ＫＶＬＱＴ１を染色体１１ｐ１５.５に地図作成し、それをＬＱＴ１の候補遺伝子とした。ＫＶＬＱＴ１はカリウムチャネルの構造的特徴を有するタンパク質をコードし、ノーザンブロット分析により測定されるような遺伝子の発現はＫＶＬＱＴ１が心臓で最も強く発現されることを明らかにした。ＬＱＴを引き起こす１つの遺伝子内欠失および１０種の異なるミスセンス変異がＫＶＬＱＴ１で同定された。これらのデータはＫＶＬＱＴ１が新規な心臓カリウムチャネル遺伝子であると定め、この遺伝子における変異が心室性不整頻摶および突然死に対する罹病性を惹起することを明らかにした。
【００１２】
ＩＫＳチャネルの一成分がｍｉｎＫ、すなわち、単一の推定膜スパニングドメインを有する１３０アミノ酸タンパク質であることは知られていた（Takumiら、１９８８；GoldsteinおよびMiller、１９９１；Hausdorffら、１９９１；Takumiら、１９９１；Buschら、１９９２；WangおよびGoldstein、１９９５；KW Wangら、１９９６）。このタンパク質の大きさおよび構造から、ｍｉｎＫが単独で機能的チャネルを形成することはないようにあった（Attaliら、１９９３；Lesageら、１９９３）。ＫＶＬＱＴ１とｍｉｎＫを集合させ、心臓ＩＫＳカリウムチャネルを形成するという証拠が示されている。このことがSanguinettiら（１９９６ｂ）により公開された。ＩＫＳ機能不全は心臓不整脈の原因の一である。後に（ｍｉｎＫをコードする）ＫＣＮＥ１における変異もまた、ＬＱＴにて起こり得ることが明らかにされた（Splawaskiら、１９９７ｂ）。
ＬＱＴに関わり、ＬＱＴの診断に使用し得る他の遺伝子の同定が所望される。
【００１３】
発明の概要
本発明は、ＭｉｎＫ関連遺伝子、それらのタンパク質産物、カリウムチャネルのごときイオンチャネルを形成するそれらの会合、および心臓不整脈のごときイオンチャネル障害とのそれらの関連性に指向される。
【００１４】
本発明のひとつの局面において、ヒトＫＣＮＥ２、ラットＫＣＮＥ２、ヒトＫＣＮＥ３、マウスＫＣＮＥ３、ヒトＫＣＮＥ４およびマウスＫＣＮＥ４につきＤＮＡおよびタンパク質配列が提供される。あるいは、これらの遺伝子は、それぞれ、ＭｉＲＰ１、ＭｉＲＰ２およびＭｉＲＰ３と呼ばれる。
本発明の第２の局面において、ＩＫｒカリウムイオンチャネルを形成するＨＲＥＧとＫＣＮＥ２との集合が提供される。
【００１５】
本発明の第３の局面において、ＫＣＮＥ２の心臓不整脈との関連性が提供される。これらの２つのタンパク質が集合して該ＩＫｒチャネルを形成するという知見はＬＱＴを治療または予防するのに有用な薬物についてのスクリーニングするアッセイを開発に有用である。卵母細胞のごとき細胞中で両方の遺伝子を同時発現させることによって、その野生型および変異形態の両方において、該ＩＫｒチャネルに影響を有する薬物をスクリーニングすることが可能である。この知見も、ＬＱＴに罹患した対象の早期診断についてのＫＣＮＥ２遺伝子の分析に有用である。
本発明の第４の局面において、ＬＱＴに関連するＫＣＮＥ２における変異を提供する。
【００１６】
本発明の第５の局面において、ＬＱＴに罹患した対象の早期診断のため、該ＫＣＮＥ２遺伝子の分析を提供する。該診断方法は、試験されるべき個体の該ＫＣＮＥ２遺伝子のＤＮＡ配列を解析し、次いで、それを天然、非変異遺伝子のＤＮＡ配列と比較することを特徴とする。第２の具体例において、試験されるべき個体のＫＣＮＥ１遺伝子をＬＱＴを引き起こす変異につきスクリーニングする。ＬＱＴを予測する能力は、医者がベータブロッキング剤のごとき医療治療薬で当該疾患を予防することを可能にする。
本発明の第６の局面において、薬物候補をスクリーニングして、ＬＱＴの治療または予防に有用な薬物を同定する。
【００１７】
本発明の第７の局面において、ＬＱＴおよび他の関連するまたは関連しない障害の治療に有用な薬物をＬＱＴまたはそのような障害を引き起こす危険性につきスクリーニングする。何故ならば、それらはイオンチャネルと相互作用し、それをブロックするであろうからである。
本発明の第８の局面において、当該遺伝子型および薬物反応の薬理遺伝子学を提供する。
【００１８】
図面の簡単な記載
図１Ａ〜１Ｃは、ＭｉＲＰ１が心臓中で発現され、ＭｉｎＫに関連することを示す。図１Ａ：ラットＭｉＲＰ１組織分布。ｒＫＣＮＥ１フラグメント（寄託番号Ｄ８５７９７、３８７ｂｐ）で行われた指示されたラットのナザーンブロット；レーンにつき組織あたり２μｇのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ。図１Ｂ：β−アクチンにつきプローブされたパネルａ中のブロット。図１Ｃ：ラットとヒトとのＭｉＲＰ１およびＭｉｎＫの予測ペプチド配列。推定経膜セグメントに下線を付す；同一残基に薄く影付けする；心臓不整脈に関連する３つのｈＭｉＲＰ１位置に濃く影付けする（Ｑ９、Ｍ５４、Ｉ５７）。ＭｉＲＰ１は、２つのＮ−結合グリコシル化サイト（Ｎ６、Ｎ２９）および２つのタンパク質キナーゼＣ−媒介リン酸化サイト（Ｔ７１、Ｓ７４）につきコンセンサス配列を含有する。ラットとヒトとのＫＣＮＥ１ ｃＤＮＡは、その５’上流配列中にＡＴＧを介在しないインフレーム終止コドンを、および予測した開始メチオニンに対して３位にＡを含有する；ヒトとラットとのＫＣＮＥ１の寄託番号は、それぞれ、ＡＦ０７１００２およびＡＦ０７１００３である。
【００１９】
図２Ａ〜Ｆは、ｒＭｉＲＰ１がイオンチャネルサブユニットであることを示す。ＨＥＲＧ（黒塗り四角）または、ｒＭｉＲＰ１およびＨＥＲＧ（白抜き四角）サブユニットで形成されたチャネルの属性を０．３ｍＭ Ｃａ２＋、１００ｍＭ ＫＣｌ溶液中、実施例に記載するごとく示されたプロトコルにより評価した。図２Ａ：プロトコル１による生電流トレース（挿入図）；目盛線１μＡおよび１秒。図２Ｂ：プロトコル３による生電流トレース（挿入図）；その他は図２Ａとお同じ。図２Ｃ：プロトコル１による定常活性化；矢印部で測定した尾部電流、１０個の卵母細胞の群の平均±ｓ．ｅ．ｍ、ＩＭａｘに対して正規化（４０ｍＶ）。実線はボルツマン関数：１／｛１＋ｅｘｐ［（Ｖ１／２−Ｖ）/Ｖｓ］｝に従う。ここに、Ｖ１／２は半値電位（half maximal voltage）およびＶｓは傾き係数；エラーバーはｓ．ｅ．ｍ．を表す。ＨＥＲＧ、およびｒＭｉＲＰ１＋ＨＥＲＧチャネルにつき、それぞれ、Ｖ１／２は−４６±１および−３７±１ｍＶ、Ｖｓは１１．４±０．２および１１．７±０．１であった。（２Ｃ、挿入図）プロトコル２による種々の電位における活性化速度、３つの卵母細胞の群、６０ｍＶでの速度に正規化。図２Ｄ：プロトコル３によるピーク尾部電流；図２Ｃと同様に当て嵌め；１０個の卵母細胞の群の平均±ｓ．ｅ．ｍ．；ＨＥＲＧ、およびｒＭｉＲＰ１＋ＨＥＲＧチャネルの−１５０ｍＶにてのピークは、それぞれ、−８．８±０．５および−４．９±０．７μＡであった。図２Ｅ：プロトコル４による定常不活性化（挿入図）；８個の卵母細胞の群の平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ピーク（−１４０ｍＶ）に対して正規化。図２Ｆ：プロトコル３による種々の電位における脱活性化速度；電流緩和を８つの卵母細胞の群を用いて、単一指数関数（Ｉ＝Ａｅ−ｔ／τ）で当て嵌めた。；−１２０ｍＶにてのＨＥＲＧおよびｒＭｉＲＰ１＋ＨＥＲＧチャネルは、それぞれ、１．５±０．２および０．２１±０．０１秒、およびＡは７．９±０．４および４．２±０．５μＡであった。
【００２０】
図３Ａ〜３Ｃは、単一のｒＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧチャネル（白抜き四角）が天然ＩＫｒチャネルに対するコンダクタンスにおいて類似するが、ＨＥＲＧチャネル（黒塗り四角）は類似しないことを示す。実施例に示すごとく、プロトコル７により０．３ｍＭ Ｃａ２＋、１００ｍＭ ＫＣｌ溶液中で行われた。図３Ａ：種々の電位における単一チャネル電流；目盛線０．５ｐＡおよび０．２秒。図３Ｂ：脱活性化前に記録されたおよそ３０,０００イベント（１５０推移）のパネルａにおけるパッチから−９０ｍＶにて計算した全点ヒストグラム、Ｐ０は反映していない。図３Ｃ：指示された電位にて保持された細胞付着パッチ（ｎ＝５）における単一ＨＥＲＧまたはｒＭｉＲＰ１＋ＨＥＲＧチャネルについての電流−電位関係；全点ヒストグラムを各電位につき１．３×１０５イベントで構築した、〜４００推移。傾きコンダクタンスは、ＨＥＲＧおよびｒＭｉＲＰ１＋ＨＥＲＧチャネルにつき、それぞれ、１２．９±２．０および８．２±１．４ｐＳであった。０．５ｋＨｚにてフィルターをかけた。
【００２１】
図４Ａ〜４Ｂは、単一ｒＭｉＲＰ１＋ＨＥＲＧチャネルは、ＨＥＲＧチャネルよりも速く脱活性化することを示す。図４Ａ：図３と同様に細胞付着チャネルにおける単一チャネルの脱活性化、目盛線２ｐＡおよび０．７５秒。図４Ｂ：−１００ｍＶにてパネルａ中で行われた５０〜７０の試行のアンサンブル；キャパシタンスト推移をゼロトレース控除によって中性にした。ヒストグラムに単一指数関数（Ｉ＝Ｉ０＋Ｉｅ−ｔ／τ）で当て嵌めた；ＨＥＲＧチャネルにつきτ−１＝３００ｍ秒、Ｉ０＝−８ｐＡ、Ｉ＝−２０ｐＡ、；ｒＭｉＲＰ１およびＨＥＲＧサブユニットを含有するチャネルにつきτ−１＝１３１ｍ秒、Ｉ０＝−１０ｐＡ、Ｉ＝−２４ｐＡ。目盛線１０ｐＡおよび０．５秒。
【００２２】
図５Ａ〜５Ｆは、Ｋ＋によるそれらの調節および脱活性化速度において、ｒＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧチャネル（白抜き四角）は天然ＩＫｒと同様であるが、ＨＥＲＧチャネル（黒塗り四角）は同様でないことを示す。実施例に記載されたプロトコルにより１ｍＭ Ｃａ２＋、４ｍＭ ＫＣｌ溶液中で行われた。図５Ａ：プロトコル６による生電流トレース；目盛線０．１μＡ、１秒。図５Ｂ：活性化パルスの終端（矢印）にての電流−電位関係、７つの卵母細胞の群の平均±ｓ．ｅ．ｍ．；図５Ａにおける実験と同様。図５Ｃ：外部ＫＣｌでの電流増幅の変化；０ｍＶにてパネルａにおいて実験した８つの細胞の群の平均±ｓ．ｅ．ｍ．。実線は該データへの直線当て嵌め；ＨＥＲＧにつき、該関係は傾き＝４６±２および切片＝３７７±６ｎＡ（Ｒ＝０．９９８）を与える；ｒＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧにつき、傾き＝１１．７±０．４および切片＝１５５±２ｎＡ（Ｒ＝０．９９９）。図５Ｄ：プロトコル３による生電流トレース；１秒プレパルスおよび試験パルス持続；目盛線１μＡおよび２５０ｍ秒。図５Ｅ：ピーク（図５Ｄ中の矢印）にての電流−電位関係；５つの卵母細胞の群の平均±ｓ．ｅ．ｍ．；ＨＥＲＧおよびｒＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧチャネルにつき、電流は、それぞれ、−５０ｍＶにて１２００±１００および３００±６０ｎＡであったが、−１２ｍＶにて−２２００±１００および−９００±７０ｎＡであった。図５Ｆ：プロトコル５により評価され、６つの卵母細胞の群の非ブロック電流のフラクションとしてプロットされた、２０ ＫＣｌ中の種々の濃度のＥ−４０３１溶液による定常ブロック；阻害定数は文中で報告される。いずれのチャネル型も初期パルスでのブロックを示さなかった。
【００２３】
図６Ａ〜６Ｂは、ｒＭｉＲＰおよびＨＥＲＧは安定な複合体を形成することを示す。図６Ａ：ｒＭｉＲＰ１−ＨＡ（Ｍ１）、ＨＥＲＧ−ｃｍｙｃ（Ｈ）およびコネキシン４３−ｃｍｙｃ（Ｃ）のＣＯＳ細胞における発現。レーンは全細胞ライゼート（ＴＬ）または抗ｃｍｙｃ抗体で行われた免疫沈降（ＩＰ）を含有する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０〜１６％）および抗−ＨＡ抗体でのウェスターンブロット可視化。細胞を以下のごとくサブユニットで感染させた：レーン１、２：Ｍ１＋Ｈ：レーン３：Ｈ；レーン４：Ｍ１；レーン５：Ｍ１＋Ｃ；バーは３２．７、３０．２および２４ｋＤａをマークする。図６Ｂ：ｒＭｉＲＰ１はイン・ビトロでＭｉｎＫに優先してＨＥＲＧと複合体を形成する。レーンは、ウサギ網状赤血球ライゼートから生じた３５Ｓ−メチオニン標識翻訳産物の抗−ｃｍｙｃ抗体を用いる免疫沈降を含有し、オートラジオグラフィーにより可視化された。反応混合物は、以下のごとく、サブユニット、ｒＭｉＲＰ１（Ｍ１）、ｒＭｉｎＫ（ｍ）およびＨＥＲＧ−ｃｍｙｃ（Ｈ）を含有した：レーン１：Ｍ１＋Ｈ；レーン２：ｍ＋Ｈ；レーン３：Ｍ１＋ｍ＋Ｈ；バー３０．２および２４ｋＤａ。
【００２４】
図７Ａ〜７Ｃは、ｈＭｉＲＰ１およびＨＥＲＧで形成されたチャネル（ＨＥＲＧ単独で形成されたものではない）が二相キネティクスでＥ−４０３１によりブロックされることを示す。示したチャネルサブユニットを発現するＣＨＯ細胞は、−８０ｍＶから＋２０ｍＶまで１秒間、次いで、−４０ｍＶまで２秒間、０．５秒間のサイクル間間隔でステップした。細胞を薬物適用前に４サイクル研究し、１μＭ Ｅ−４０３１（バー）の存在下、−８０ｍＶにて１分間密接に保持し（held closed）、次いで、該薬物の連続的存在下で３０〜７０サイクル研究した。図７Ａ：ＨＥＲＧチャネルを発現する細胞についての最初の２０本の電流トレース；この細胞の第１パルス中の非ブロック電流のフラクションは＝０．９９であった。図７Ｂ：ｈＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧチャネルを発現する細胞についての最初の２０本の電流トレース；この細胞の第１パルス中の非ブロック電流のフラクションは＝０．６４であった。図７Ｃ：パネルａ（ＨＥＲＧチャネル、黒塗り四角、τ＝３８サイクル）およびパネルｂ（ｈＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧチャネル、白抜き四角、τ＝４サイクル）中の細胞についての平衡ブロックへの緩和。
【００２５】
図８Ａ〜８Ｄは、野生型または不整脈関連ｈＭｉＲＰ１サブユニットでのチャネル機能を示す。図８Ａ：１ｍＭ Ｃａ２＋、４ｍＭ ＫＣｌ溶液でプロトコル６によりＣＨＯ細胞中の野生型（ＷＴ）、Ｔ８Ａ、Ｑ９ＥまたはＭ５４Ｔ−ｈＭｉＲＰ１およびＨＥＲＧの生電流トレース、目盛線は、ＷＴにつき１５ｐＡ、およびＴ８Ａ、Ｑ９ＥおよびＭ５４Ｔ−ｈＭｉＲＰ１につき５０ｐＡ、および０．５秒。図８Ｂ：２０ｍＶまで脱分極し（示さず）、次いで、−２０ないし−１２０ｍＶの電位まで再分極することによって誘引された尾部電流、その他は図８Ａと同じ；目盛線は、ＷＴにつき５０ｐＡ、Ｔ８ＡおよびＭ５４Ｔにつき１００ｐＡ、およびＱ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１につき５００ｐＡ、および０．１秒。図８Ｃ：活性化：ＷＴ（白抜き四角）、Ｔ８Ａ（白抜き三角）、Ｑ９Ｅ（黒塗り丸）およびＭ５４Ｔ−ｈＭｉＲＰ１（黒塗り下向き三角）についての等時性Ｐ０曲線；曲線は、１０〜１４個の細胞の群の平均±ｓ．ｅ．ｍ．および図２Ｃと同じように当て嵌める；半値活性化電位および傾き係数を表１に報告する。図８Ｄ：脱活性化：ＷＴ（白抜き四角）、Ｔ８Ａ（白抜き三角）、Ｑ９Ｅ（黒塗り丸）およびＭ５４Ｔ−ｈＭｉＲＰ１（黒塗り下向き三角）についての高速成分、高速および低速速度およびそれらの重みは、生電流トレースを二重指数関数に当て嵌めることによって評価した（表１）。
【００２６】
図９Ａ〜９Ｃは、Ｑ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１がクラリスロマイシン−誘導不整脈および増大した薬物感受性に関連することを示す。示さない限り、１ｍＭ Ｃａ２＋、４ｍＭ ＫＣｌ溶液（実施例）を用いた。図９Ａ：プロトコル６によりＣＨＯ細胞中でＨＥＲＧと共に発現したＱ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１の生電流トレース；目盛線０．１ｐＡおよび０．１秒。図９Ｂ：＋２０ｍＶにての活性化後、クラリスロマイシンの様々な用量での平衡にてのピーク尾部電流増幅の変化；半値ブロッキング濃度は文中、ヒル係数は、ＷＴ（白抜き四角）およびＱ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１（白抜き丸）について、それぞれ、１．７±０．２および１．７±０．１であった。図９Ｃ：パネルａ中での電流−電位関係、０．５ｍＭ クラリスロマイシンの不存在下（黒塗り丸）または存在下（白抜き丸）、６つの細胞の群の平均±ｓ．ｅ．ｍ．。データを図２Ｃのボルツマン関数を用いて当て嵌め、非ブロック電流のフラクションの逆数を積算する；０．５ｍＭ クラリスロマイシンで、野生型についてのＶ１／２は−３０±８ｍＶであり（示さず）、一方Ｑ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１について、それは−２５±５ｍＶであった（示す）；傾き係数は不変であった。１ｍＭ Ｃａ２＋、１ｍＭ ＫＣｌ溶液および０．５ｍＭ クラリスロマイシン中（示さず）、野生型のＶ１／２は−３２±６ｍＶであり、Ｑ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１のそれは−２９±１０ｍＶであった；傾き係数は、これも不変であった。
【００２７】
配列表の簡単な記載
配列番号：１はヒトＫＣＮＥ２のＤＮＡ配列である。配列番号：２はヒトＫＣＮＥ２のタンパク質配列である。配列番号：３はラットＫＣＮＥ２のＤＮＡ配列である。配列番号：４はラットＫＣＮＥ２のタンパク質配列である。配列番号：５はヒトＫＣＮＥ３のＤＮＡ配列である。配列番号：６はヒトＫＣＮＥ３のタンパク質配列である。配列番号：７はマウスＫＣＮＥ３のＤＮＡ配列である。配列番号：８はマウスＫＣＮＥ３のタンパク質配列である。配列番号：９はヒトＫＣＮＥ４のＤＮＡ配列である。配列番号：１０はヒトＣＮＥ４のタンパク質配列である。配列番号：１１はマウスＫＣＮＥ４のＤＮＡ配列である。配列番号：１２はマウスＫＣＮＥ４のタンパク質配列である。配列番号：１３〜１８は変異スクリーニング用の増幅プライマーのＤＮＡ配列である。配列番号：１９はエピトープタッグ化に用いるＨＡ残基のアミノ酸配列である。配列番号：２０はエピトープタッグ化に用いるｃｍｙｃ残基のアミノ酸配列である。
【００２８】
発明の詳細な説明
本発明は、本明細書に記載するごとく、いくつかのＭｉｎＫ関連遺伝子の配列の決定、カリウムチャネルのごときイオン性チャネルを形成するそれらの会合、および心臓不整脈のごときイオンチャネル障害とのそれらの関連性に指向される。本発明は、ＭｉｎＫ関連遺伝子の分子変異体、特に、ＬＱＴの病気素因を引き起こすまたはそれに関連するＫＣＮＥ２にも指向される。また、試験されるべき個体のこれらＭｉｎＫ関連遺伝子は、ＬＱＴを含むイオンチャネル障害をもたらす変異についてスクリーニングすることもできる。ＬＱＴを含むイオンチャネル障害が予測できれば、開業医が現存する医学的療法を用いてこの疾患を予防することも可能となるであろう。本発明は、さらには、ＨＥＲＧおよびＭｉＲＰ１（ＫＣＮＥ２）が集合して心臓のＩＫｒカリウムチャネルを形成するという決定にも指向される。
より詳しくは、本発明はＫＣＮＥ２遺伝子中の変異および、ＬＱＴの診断におけるそれらの使用に関する。本発明は、さらには、ＬＱＴを引き起こすＫＣＮＥ２遺伝子変異体の存在につきヒトをスクリーニングする方法に指向される。今や、ＬＱＴはより早く（すなわち、症状が現われる前）、より決定的に検出し得るので、ＬＱＴを有すると認定された個体はよりよい治療オプションを利用できる。本発明はＬＱＴ１を治療し、予防するのに有用な薬物につきスクリーニングする方法にも指向される。本発明は、さらには、イオンチャネルに不都合な効果につきスリーニングする方法に指向される。最後に、本発明は、遺伝子型を薬物相互作用に相関付けること、すなわち、薬理遺伝子学に指向される。
【００２９】
本発明は、ＭｉｎＫ関連遺伝子、例えば、ＫＣＮＥ２遺伝子をスクリーニングして変異を同定する方法を提供する。かかる方法は、ＭｉｎＫ関連遺伝子、例えば、ＫＣＮＥ２遺伝子の一部を増幅する工程をさらに含んでいてもよく、さらにＫＣＮＥ２遺伝子の一部を増幅するためのプライマーである１セットのポリヌクレオチドを用意する工程を含んでいてもよい。該方法は、ＫＣＮＥ２に関連するＬＱＴのごときイオンチャネル障害の診断または予後のいずれかに使用する変異の同定に有用である。
【００３０】
本発明は、さらには、（ＫＣＮＥ２をコードする）ＫＣＮＥ２もまたＬＱＴに関与していることを示す。ＫＣＮＥ２タンパク質およびＨＥＲＧは集合してＫ＋チャネルを形成する。よって、本発明は、ＫＣＮＥ２遺伝子をスクリーニングして変異を同定する方法を提供する。さらに、かかる方法はＫＣＮＥ２遺伝子の一部を増幅する工程を含んでいてもよく、さらにＫＣＮＥ２遺伝子の一部の増幅を行うためのプライマーである１セットのポリヌクレオチドを用意する工程を含んでいてもよい。該方法は、ＬＱＴの診断またはＬＱＴの予後のいずれかに使用する変異の同定に有用である。
【００３１】
本発明は、薬物候補をスクリーニングして、ＬＱＴのごときイオンチャネル障害の治療または予防に有用な薬物を同定する方法に指向される。卵母細胞、哺乳動物細胞またはトランスジェニック動物（例えば、ノックアウト（knockout）マウス）のごとき細胞中で変異ＨＥＲＧおよび／またはＫＣＮＥ２遺伝子を同時発現させ、次いで、ＩＫｒチャネルに対する薬物候補の影響をアッセイすることによって、ＬＱＴ薬物スクリーニングを行う。該影響を、野生型ＨＥＲＧおよびＫＣＮＥ２遺伝子のＩＫｒチャネル活性と比較する。
最後に、本発明は、薬物との反応に対する遺伝子型の影響を決定する方法に指向される。例えば、該方法は、特定の対立遺伝子の存在をＬＱＴのごときイオンチャネル障害の治療または予防に有用な薬物に対する改善されたまたは不都合な反応と相関付けることが可能である。
【００３２】
ＫＣＮＥ２遺伝子がＬＱＴの発症に関与していることの証明は、異常なＫＣＮＥ２遺伝子産物あるいは異常なレベルの該遺伝子産物を生じさせる配列を罹患した血族メンバーから抽出したＤＮＡ中で見出すことにより得られる。かかるＬＱＴの疑いのある対立遺伝子は多数の血縁者において疾病と共分離するであろう。それらは、一般人の集団中の個体よりもＬＱＴ罹患した非血族個体においてずっと高頻度に存在するであろう。これらの変異は多くの形態であり得る。最も重大な形態は、遺伝子が異常なタンパク質をコードすることとなる、あるいはタンパク質発現を有意に変化させることとなるフレームシフト変異または大規模欠失であろう。あまり重大でない崩壊的変異は、システインへのまたはシステインからの変化、塩基性アミノ酸から酸性アミノ酸への変化またはその逆、疎水性アミノ酸から親水性アミノ酸への変化またはその逆、あるいは２次または３次タンパク質構造に影響する他の変異のごとき、生成タンパク質に有意な影響を与える小規模なイン−フレーム欠失および非保存的塩基対の置換を包含するであろう。サイレント変異または保存的アミノ酸の置換を生じさせる変異は、一般的にはタンパク質機能を崩壊させないと考えられる。
【００３３】
本発明の診断および予後方法によれば、野生型ＫＣＮＥ２遺伝子の変化が検出される。さらに、野生型ＫＣＮＥ２遺伝子を検出し、この遺伝子座の結果としてのＬＱＴの原因の欠如を確認することにより本発明方法を行うことができる。「野生型遺伝子の変化」は、コーディングおよび非コーディング領域における欠失、挿入および点突然変異を包含するすべての形態の変異を含む。欠失は遺伝子全体であってもよく、遺伝子の一部だけであってもよい。点突然変異は停止コドン、フレームシフト変異またはアミノ酸置換を引き起こすものであってもよい。体細胞変異は、特定組織においてのみ生じ、生殖系においては遺伝されないものである。生殖系変異はいすれの体組織においても見ることができ、遺伝される。点突然変異は遺伝子のプロモーターのごとき調節領域において生じることもあり、ｍＲＮＡ発現の消失または減少を導く。また点突然変異は正しいＲＮＡプロセッシングを停止させ、ＫＣＮＥ２遺伝子産物の発現の消失、あるいはｍＲＮＡの安定性または翻訳効率の低下を導く。
【００３４】
有用な診断方法は、後でさらに詳細に説明するが、蛍光イン・サイチュ（in situ）ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、直接ＤＮＡ配列決定、ＰＦＧＥ分析、サザンブロット分析、１本鎖コンホーメーション分析（ＳＳＣＡ）、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ドットブロット分析ならびにＰＣＲ−ＳＳＣＰを包含するが、これらに限らない。
【００３５】
ＫＣＮＥ２遺伝子の変異に関してヒトのいずれの組織を試験することによってもＬＱＴの存在を確認することができる。例えば、生殖系ＫＣＮＥ２変異を遺伝している人はＬＱＴを発症する傾向がある。このことを、その人の身体のいずれの組織から得たＤＮＡを試験することによっても調べることができる。最も簡単には、採血し、血液細胞からＤＮＡを抽出する。さらに、胎児細胞、胎盤細胞または羊水細胞をＫＣＮＥ２の変異について調べることにより出生前診断を行うことができる。野生型ＫＣＮＥ２対立遺伝子の変化は、点突然変異または欠失によるものであっても、本明細書で議論するいずれかの手段により検出することができる。
【００３６】
ＤＮＡ配列の変化を検出するために使用されるいくつかの方法がある。直接ＤＮＡ配列決定は、手動配列決定または自動蛍光配列決定法であり、配列の変化を検出できる。別のアプローチは１本鎖コンホーメーション多型性アッセイ（ＳＳＣＰ）（Orita et al., 1989）である。この方法は、特にＤＮＡフラグメントサイズが２００ｂｐ以上である場合にはすべての配列変化を検出するものではないが、大部分のＤＮＡ配列の変化を検出するように最適化できる。低下した検出感度は不利であるが、ＳＳＣＰを用いた場合の高処理量は研究による変異の検出のための直接配列決定にとり魅力的かつ実行可能な別法である。次いで、ＳＳＣＰゲル上で変化した移動度を有するフラグメントを配列決定して、ＤＮＡ配列変化の正確な性質を調べる。２つの相補的ＤＮＡ鎖間のミスマッチの検出に基づく他のアプローチはクランプされた変性ゲル電気泳動（clamped denaturing gel electrophoresis (CDGE)）（Sheffield et al., 1991）、ヘテロ２本鎖分析（ＨＡ）（White et al., 1992）および化学的ミスマッチ開裂（ＣＭＣ）（Grompe et al., 1989）を包含する。上記方法は大きな欠失、重複または挿入を検出するものではなく、さらに転写またはタンパク質への翻訳に影響する調節的変異を検出するものでもない。タンパク質末端切断アッセイまたは非対称アッセイのごとき、これらのクラスの変異を検出できる他の方法は、特定タイプの変異のみを検出し、ミスセンス変異を検出しないものである。現在利用可能なＤＮＡ配列変化検出方法のレビューはGrompe(1993)の最近のレビューに見られる。変異が知られたものである場合には、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーションのごとき対立遺伝子に特異的な検出アプローチを用いて同じ変異に関して多数の他の試料を迅速にスクリーニングすることができる。かかる方法には、可視的な結果が得られるように金微粒子で標識したプローブを使用できる（Elghanian et al., 1997）。
【００３７】
１種またはそれ以上の制限酵素、好ましくは多種の制限酵素で切断したＤＮＡの一連のサザンブロットを観察することにより、ＤＮＡ配列中の多型性を検出するための迅速な予備分析を行うことができる。各ブロットは一連の正常個体および一連のＬＱＴ症例のものを含む。ハイブリダイズしているフラグメントを示すサザンブロット（ＫＣＮＥ２遺伝子座付近またはこれを含む配列でプローブした場合には対照ＤＮＡとは長さが異なる）は変異の可能性を示す。非常に大きな制限フラグメントを生じる制限酵素を使用した場合には、パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）を用いる。
【００３８】
当該分野においてよく知られた方法を用いてＫＣＮＥ２対立遺伝子を分子クローニングし、次いで対立遺伝子の配列決定を行うことにより点突然変異の検出を行ってもよい。また、例えば、ＰＣＲまたは他の増幅方法を用いて遺伝子またはその遺伝子の一部を増幅してもよく、増幅された遺伝子またはその遺伝子の一部を配列決定してもよい。
【００３９】
可能な対立遺伝子の存在を確認するための、より完全であるが、やはり間接的な試験方法が６つ知られている：１）１本鎖コンホーメーション分析（ＳＳＣＰ）（Orita et al., 1989）；２）変性グラジエントゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Wartell et al., 1990; Shefield et al., 1989）；３）ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Finkelstein et al., 1990; Kinszler et al., 1991）；４）対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯｓ）（Conner et al., 1983）；５）E. coli mutSタンパク質のごとき、ヌクレオチドミスマッチを認識するタンパク質の使用（Modrich, 1991）；ならびに６）対立遺伝子特異的ＰＣＲ（Ruano and Kidd, 1989）。対立遺伝子特異的ＰＣＲに関しては、３’末端において特定のＫＣＮＥ２変異にハイブリダイゼーションするプライマーを使用する。特定の変異が存在しない場合には、増幅産物は観察されない。欧州特許出願公開第０３３２４３５号およびNewton et al., 1989に開示された増幅困難変異系（Amplification Refractory Mutation System(ARMS)）を用いてもよい。クローニング、配列決定および増幅により遺伝子の挿入および欠失を検出することもできる。さらに、遺伝子または周辺マーカー遺伝子用の制限フラグメント長多型性（ＲＦＬＰ）プローブを用いて、対立遺伝子の変化または多型性フラグメント中の挿入を評価することができる。かかる方法は、罹病個体において見出される変異の存在に関して罹病個体の親類をスクリーニングする際に特に有用である。当該分野において知られた挿入および欠失を検出するための他の方法を用いることもできる。
【００４０】
最初の３つの方法（ＳＳＣＰ、ＤＧＧＥおよびＲＮａｓｅ保護アッセイ）において、新たな電気泳動バンドが出現する。ＳＳＣＰは異なって移動するバンドを検出するものである。なぜなら配列の変化は１本鎖の分子内塩基対形成において相違を生じさせるからである。ＲＮａｓｅ保護は、変異ポリヌクレオチドを開裂して２個またはそれ以上の小さなフラグメントにすることを含む。ＤＧＧＥは、変性グラジエントゲルを用いて、野生型配列と比較した場合の変異配列の移動速度の相違を検出する。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドアッセイにおいては、特異的配列を検出するオリゴヌクレオチドを設計し、ハイブリダイゼーションシグナルの存在または不存在を検出することによりアッセイを行う。mutSアッセイにおいては、変異配列および野生型配列間のヘテロ２本鎖中のヌクレオチドミスマッチを含む配列にのみタンパク質が結合する。
【００４１】
本発明によれば、ミスマッチとは、２つの鎖が１００％の相補性を有しない場合にハイブリダイゼーションした核酸２本鎖である。全体的な相同性の欠如は欠失、挿入、逆位または置換による可能性がある。ミスマッチの検出を用いて遺伝子またはそのｍＲＮＡ生成物中の点突然変異を検出することができる。これらの方法は配列決定法よりも感度が低いが、多数の試料について実行することが簡単である。ミスマッチ開裂法の例はＲＮａｓｅ保護法である。本発明の実施に際して、本発明方法は、ヒト野生型ＫＣＮＥ２遺伝子コーディング配列に対して相補的な標的リボプローブの使用を含む。リボプローブおよびヒトから単離されたｍＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかをアニーリング（ハイブリダイゼーション）させ、次いで、２本鎖ＲＮＡ構造中のいくつかのミスマッチを検出できる酵素ＲＮａｓｅＡで消化する。ミスマッチがＲＮａｓｅＡにより検出される場合、それはミスマッチ部位で開裂を引き起こす。よって、アニーリングしたＲＮＡ調合物を電気泳動ゲルマトリックスで分離する場合において、ミスマッチが検出されて、ＲＮａｓｅにより開裂されるならば、リボプローブおよびｍＲＮＡまたはＤＮＡに関して全長２本鎖ＲＮＡよりも小型のＲＮＡ生成物が見られるであろう。リボプローブは全長のｍＲＮＡまたは遺伝子である必要はないが、いずれかのセグメントであってもよい。リボプローブがｍＲＮＡまたは遺伝子のセグメントのみを含む場合、これらのプローブを多種使用して、ミスマッチに関してｍＲＮＡ配列全体をスクリーニングすることが望ましい。
【００４２】
類似のやり方で、酵素的または化学的開裂を用いて、ミスマッチを検出するためにＤＮＡプローブを用いることができる。例えば、Cotton et al., 1988; Shenk et al., 1975; Novak et al., 1986参照。別法として、マッチした２本鎖と比較した場合のミスマッチ２本鎖の電気泳動度の変化によりミスマッチを検出することもできる。例えば、Cariello, 1988参照。リボプローブまたはＤＮＡプローブのいすれかを用い、ハイブリダイゼーションの前にＰＣＲ（下記参照）を用いて、変異を含む可能性のある細胞のｍＲＮＡまたはＤＮＡを増幅することができる。特に、変化が欠失および挿入のごとき大きな転位である場合には、サザンハイブリダイゼーションを用いてＫＣＮＥ２遺伝子のＤＮＡにおける変化を検出することもできる。
【００４３】
ＰＣＲを用いることにより増幅され得るＫＣＮＥ２遺伝子のＤＮＡ配列を、対立遺伝子特異的プローブを用いてスクリーニングしてもよい。これらのプローブは核酸オリゴマーであり、各オリゴマーは既知変異を有する遺伝子配列の領域を含んでいる。例えば、１のオリゴマーは、遺伝子配列の一部に対応した約３０ヌクレオチドの長さであってもよい。かかる一式の対立遺伝子特異的プローブを用いることにより、ＰＣＲ増幅生成物をスクリーニングして、すでに同定されている遺伝子中の変異の存在を同定することができる。例えば、ナイロン膜上で、対立遺伝子特異的プローブと増幅されたＫＣＮＥ２配列とのハイブリダイゼーションを行うことができる。高ストリンンジェンシー条件下での特定プローブとのハイブリダイゼーションは、対立遺伝子特異的プローブの場合と同じ組織中の変異の存在を示す。
【００４４】
新たに開発されたマイクロチップ技術による核酸分析方法も本発明に適用可能である。この方法において、文字通り数千の異なったオリゴヌクレオチドプローブがシリコンチップ上に隊列として構成される。分析すべき核酸を蛍光標識し、チップ上のプローブとハイブリダイゼーションさせる。これらの核酸マイクロチップを用いて核酸−タンパク質相互作用を研究することも可能である。この方法を用いて、分析すべき核酸中の変異の存在を検出でき、あるいは目的遺伝子の発現レベルを測定することができる。該方法は、数千もの多くのプローブを一度に平行処理する方法であり、分析速度を驚くほど速めることができる。この方法を使用したいくつかの論文が公表されている。これらのうちいくつかはHacia et al., 1996; Shoemaker et al., 1996; Chee et al., 1996; Lockhart et al., 1996; DeRisi et al., 1996; Lipshutz et al., 1995である。乳癌遺伝子ＢＲＣＡ１中の変異に関して人々をスクリーニングするためにこの方法がすでに使用されている（Hacia et al., 1996）。この新しい方法はChemical and Engineering Newsのニュース論文（Borman, 1996）にレビューされており、論説の主題であった（Editorial, Nature Genetics, 1996）。Fodor(1997)も参照。
【００４５】
候補遺伝子座における変異に関する最も明確な試験は、患者由来のゲノムＫＣＮＥ２配列を対照集団由来のものと直接比較することである。別法として、例えばＰＣＲによる増幅後にメッセンジャーＲＮＡを配列決定することができ、それにより候補遺伝子のエキソン構造を決定する必要がなくなる。
【００４６】
ＫＣＮＥ２のコーディング領域の外側にある患者由来の変異を、それらの遺伝子付近または遺伝子中のイントロンおよび調節配列のごとき非コーディング配列を調べることにより検出することができる。非コーディング領域中の変異が重要であるという初期の証拠は、対照個体と比較した場合の患者中の異常なサイズあるいは多量のメッセンジャーＲＮＡ分子を明らかにするノーザンブロット実験から得られたものといえる。
【００４７】
当該分野において知られたいずれかの方法を用いてＫＣＮＥ２ ｍＲＮＡ発現の変化を検出することができる。これらの方法はノーザンブロット分析、ＰＣＲ増幅、およびＲＮａｓｅ保護を包含する。減少したｍＲＮＡ発現は野生型遺伝子の変化を示す。野生型遺伝子の変化は、野生型ＫＣＮＥ２タンパク質の変化についてスクリーニングすることによっても検出され得る。例えば、ＫＣＮＥ２と免疫反応するモノクローナル抗体を用いて組織をスクリーニングすることができる。同族抗原の欠如は変異を示す。変異対立遺伝子産物に特異的な抗体を用いて変異遺伝子産物を検出することもできる。当該分野において知られたいずれかの便利なフォーマットを用いてかかる免疫学的アッセイを行うことができる。これらのフォーマットはウェスタンブロット、免疫組織化学的アッセイおよびＥＬＩＳＡアッセイを包含する。変化したＫＣＮＥ２タンパク質を検出するためのいずれかの手段を用いて野生型ＫＣＮＥ２遺伝子の変化を検出することができる。タンパク質結合決定試験のごとき機能アッセイを用いることができる。さらに、ＫＣＮＥ２の生物学的機能を検出するアッセイを使用することもできる。変異したＫＣＮＥ２遺伝子産物を見出すことは、野生型ＫＣＮＥ２遺伝子の変化を示すものである。
【００４８】
変異ＫＣＮＥ２遺伝子または遺伝子産物を、血清、便、尿および痰のごとき他の人体試料において検出することもできる。組織中の変異した遺伝子または遺伝子産物の検出に関して上で述べたのと同じ方法を他の身体試料に適用することができる。かかる身体試料をスクリーニングすることにより、ＬＱＴに関して単純かつ早期の診断を行うことができる。
【００４９】
本発明のプライマーペアーは、ＰＣＲを用いる特定のＫＣＮＥ２対立遺伝子のヌクレオチド配列の決定に有用である。ＫＶＬＱＴ２に関する１本鎖ＤＮＡプライマーのペアーをＫＶＬＱＴ２遺伝子中またはその周辺の配列にアニーリングさせて、当該遺伝子自体のＤＮＡ合成の増幅を開始させることができる。これらのプライマーの完全なセットは遺伝子コーディング配列、すなわちエキソンのすべてのヌクレオチドの合成を可能にする。好ましくは、プライマーのセットはイントロン配列およびエキソン配列の両方の増幅を可能にするものである。対立遺伝子特異的プライマーを用いることもできる。かかるプライマーは特定のＫＣＮＥ２変異対立遺伝子にのみアニーリングし、かくして、変異対立遺伝子が鋳型として存在する場合にのみ生成物を増幅するであろう。
【００５０】
増幅配列のその後のクローニングを容易化するために、プライマーはその５’末端に制限酵素部位配列が付いたものであってもよい。よって、制限酵素部位を形成するに必要なわずかのヌクレオチドを除いて、プライマーのすべてのヌクレオチドはＫＣＮＥ２配列あるいはＫＣＮＥ２に隣接した配列に由来するものである。かかる酵素および部位は当該分野においてよく知られている。当該分野においてよく知られた方法を用いてプライマー自体を合成してもよい。一般的には、市販オリゴヌクレオチド合成装置を用いてプライマーを作成することができる。ＫＣＮＥ２の配列が得られたならば、個々のプライマーの設計は当業者のよく為すところである。本発明は、イントロン／エキソン境界のデータをさらに提供するものであり、そのことによりすべてのエキソン領域を完全に増幅し配列決定するためのプライマーを設計することを可能にする。
【００５１】
本発明により提供される核酸プローブは多くの目的に有用である。それらをゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションに使用することができ、すでに上で述べた点突然変異を検出するためのＲＮａｓｅ保護法に使用することもできる。それらのプローブを用いてＰＣＲ増幅生成物を検出することができる。他の方法を用いてＫＣＮＥ２遺伝子またはｍＲＮＡをのミスマッチを検出するためにそれらのプローブを用いてもよい。
【００５２】
野生型ＫＣＮＥ２遺伝子を有する個体はＬＱＴを有しないことが見出されている。しかしながら、ＫＣＮＥ２遺伝子産物の機能を妨害する変異がＬＱＴの発病に関与している。よって、機能を失った、あるいは機能が変化したタンパク質を生じさせる変化した（あるいは変異した）ＫＣＮＥ２遺伝子の存在は、心臓不整脈の危険性を増大させるＬＱＴを直接引き起こす。ＫＣＮＥ２遺伝子変異を検出するために、生物学的試料を調製し、分析すべき対立遺伝子と野生型対立遺伝子との間の相違に関して分析する。上記のいずれかの方法により変異ＫＣＮＥ２対立遺伝子を先ず同定することができる。次いで、変異対立遺伝子を配列決定して特定の変異対立遺伝子の特定の変異を同定する。別法として、変異した（変化した）タンパク質を同定することにより変異対立遺伝子を先ず同定することができる。次いで、変異対立遺伝子を配列決定して各対立遺伝子に関して特定の変異を同定する。そして、特に、タンパク質の変化した機能を生じさせる変異を本発明の診断および予後方法に使用する。
【００５３】
ＨＥＲＧタンパク質がＭｉＲＰ１（ＫＣＮＥ２）タンパク質と集合することも見出されている。よって、ＫＣＮＥ２遺伝子産物の機能を妨害するＫＣＮＥ２中の変異がＬＱＴの発病に関与している。よって、機能を消失した、あるいは機能が変化したタンパク質を生じさせる変化した（あるいは変異した）ＫＣＮＥ２遺伝子の存在は、心臓不整脈の危険性を増大させるＬＱＴを直接引き起こす。ＫＣＮＥ２遺伝子変異を検出するために、生物学的試料を調製し、分析すべき対立遺伝子と野生型対立遺伝子との間の相違に関して分析する。上記のいずれかの方法により変異ＫＣＮＥ２対立遺伝子を先ず同定することができる。そして慣用的な方法を用いて変異対立遺伝子を配列決定して特定の変異した（変化した）タンパク質の特定の変異を同定する。次いで、変異対立遺伝子を配列決定して各対立遺伝子に関して特定の変異を同定する。そして、特に、タンパク質の変化した機能を生じさせる変異を本発明の診断および予後方法に使用する。
【００５４】
実施例は、現に表されているように、本発明のいくつかの特徴を記載する。該ＫＣＮＥペプチドは、正常イオンチャネル機能に必要とされる明らかになりつつあるスーパファミリーである。ＫＣＮＥ１によりコードされるＭｉｎＫは１２９個のアミノ酸、単一の経膜セグメントを有し、多数の組織中で発現する［Takumi et al., 1988; Swanson, et al., 1993］。ＭｉｎＫの遺伝した変異はＬＱＴＳおよび先天性聾に関連する［Schulze-Bahr et al., 1997; Splawski et al., 1997; Tyson et al., 1997; Duggal et al., 1998］。これらの摂動についての分子ベースが理解されている：心臓および聴覚系の正常機能に重要なＩＫｓチャネルはＭｉｎＫおよびＫｖＬＱＴ１の共集合体であり、ポア形成サブユニットである［Barhanin et al., 1996; Sanguinetti et al., 1996; Vetter et al., 1996］。ＫｖＬＱＴ１のみを含有するチャネルは実験細胞中では機能し得るが、ＩＫｓチャネルは、遅めの活性化および脱活性化キネティクス、大きめの単一チャネルコンダクタンス、クラスＩＩＩ抗不整脈薬への高めの親和性およびもう一つのメッセンジャーに対する高めの感受性を有する［Sanguinetti et al., 1996; Busch et al., 1997; Kaczmarek and Blumenthal, 1997; Sesti and Goldstein, 1998; Yang and Sigworth, 1998］。これらの特性は、ＭｉｎＫおよびＫｖＬＱＴ１サブユニットの深い物理的相関によるものである［Goldstein and Miller, 1991; Wang et al., 1996; Tai et al., 1997; Sesti and Goldstein, 1998; Tai and Goldstein, 1998］。その機能的および臨床的重要性に関わらず、このタイプの混合複合体はＭｉｎＫホモログとして普通でないと考えられ、あるいは、同様の機能を従位的に機能するサブユニットは知られていなかった。
【００５５】
ここに、本発明者らは、染色体位置、ｃＤＮＡ配列および予測産物、野生型挙動およびＫＣＮＥ１（ＭｉｎＫ）の第１の遺伝子ホモログの不整脈関連性を描写する。ＫＣＮＥ２によりコードされるＭｉＲＰ１は１２３個のアミノ酸、単一の予測経膜セグメントを有し、心筋および骨格筋において発現される。ＭｉｎＫ同様に、ＭｉＲＰ１はポア形成サブユニットと共集合して、その機能が天然心臓カリウムチャネルとそれに似た機能属性である安定した複合体を生じる。ＭｉｎＫ／ＫｖＬＱＴ１複合体はＩＫｓチャネルの挙動を再現するが、ＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧ複合体はＩＫｒチャネルの挙動を要約する。ＨＥＲＧサブユニット単独で形成されたチャネルと比較すると、ＭｉＲＰ１を含有するそれらは、変化した電位依存性活性、脱活性化のキネティクス、ユニタリーコンダクタンス、外部Ｋ＋による調節に対する感受性および薬理学を示す。変異形態において、ＭｉＲＰ１は先天性および後天性心臓不整脈に関連する。ＭｉｎＫおよびＭｉＲＰ１は正常心臓イオンチャネル機能に重要であることが明らかにされた。
【００５６】
ＫＣＮＥペプチドを天然細胞中の様々なチャネルアッセンブリーに取り込ませる。ｒＭｉＲＰ１を卵母細胞中の７つの異なるＫ＋チャネルサブユニットと共発現させたとき効果が存在しないことから、機能特異性が推測される。ＭｉｎＫ／ＨＥＲＧアッセンブリーが形成し得る（図６； ［McDonald et al., 1997］）にもかかわらず、イン・ビトロでＭｉｎＫよりもＭｉＲＰ１がＨＥＲＧと優先的に会合することから（図６）、特異的結合が示される。ＩＫｒおよびＩＫｓ以外のチャネルにおけるＫＣＮＥペプチドの役割はほぼ確実のようであるが、ヒトとマウスとのＭｉＲＰ２（ＫＣＮＥ３）およびマウスＭｉＲＰ３（ＫＣＮＥ４）の研究は、それらはＨＥＲＧまたはＫｖＬＱＴ１電流を変化させず、卵母細胞の内在チャネルサブユニットを活性化することもない。
【００５７】
ＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧ複合体は、天然心臓ＩＫｒチャネルのように機能する。ＨＥＲＧサブユニットだけで形成されたチャネルは、作動、コンダクタンス、Ｋ＋による調節、およびメタンスルホンアニリドによるブロックにおいて異なることが知られている［Sanguinetti et al., 1995; Trudeau et al., 1995; Spector et al., 1996; Zou et al., 1997; Ho et al., 1998］および［Shibasaki, 1987; Sanguinetti and Jurkiewicz, 1992; Yang et al., 1994; Veldkamp et al., 1995; Ho et al., 1996; Howarth et al., 1996］。天然ＩＫｒチャネルがＭｉＲＰ１およびＨＥＲＧサブユニットの共集合により形成されるというアイディアは、ここに報告する６つの観察と一致する。
【００５８】
第１に、ＭｉＲＰ１を含有するチャネルの単一チャネルコンダクタンスはＨＥＲＧチャネルのものよりも小さいが、単離したウサギおよびヒトの心臓細胞におけるＩＫｒチャネルのものと同じである［Shibasaiki, 1987; Veldkamp et al., 1995; Zou et al., 1997］。第２に、ネズミとヒトとの心臓筋細胞において、ＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧ複合体はＨＥＲＧサブユニットだけで形成されたチャネルよりも３倍速く脱活性化する［Yang et al., 1994; Sanguinetti et al., 1995; London et al., 1997; Wang et al., 1997］。第３に、ＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧ複合体は、ネズミ心房とモルモット心室との筋細胞におけるＩＫｒチャネル同様に、ＨＥＲＧチャネルよりも外部Ｋ＋による調節に対して感受性が低い［Shibasaki, 1987; Scamps and Carmeliet, 1989; Sanguinetti and Jurkiewicz, 1992; Sanguinetti et al., 1995; Yang and Roden, 1996; Yang et al., 1997］。第４に、ＭｉＲＰ１およびＨＥＲＧサブユニットは、安定な様式で共集合する。第５に、天然ＩＫｒチャネルの保証は、メタンスルホンアニリドクラスＩＩＩ抗不整脈薬によるブロックが２つの相、初期試験パルスで観察される高速相および低速相で進行することである［Carmeliet, 1992］。逆に、ＨＥＲＧチャネルは、明らかなブロックの発展前に活性化の閾に対して正の電位に対して繰返しパルスをかけることを必要とする［Spector et al., 1996］。心筋細胞中の天然ＩＫｒチャネル同様に、ｈＭｉＲＰ１およびＨＥＲＧの集合により形成されたチャネルは、二相Ｅ−４０３１ブロックを示す ―― 混合複合体は初期試験パルスで著しく阻害され、ゆっくりと平衡ブロックに緩和する（図７Ｂ、ｃ）一方、ＨＥＲＧサブユニットだけで形成されたチャネルは繰返し試験パルス後にのみ阻害される（図７Ａ）。最後に、Ｑ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１は、イン・ビトロでＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧチャネルのクラリスロマイシン感受性を増大させる（図９）。クラリスロマイシンは、単離したモルモットとイヌとの心室筋細胞において、ＩＫｒ電流をブロックし、高用量にて、ヒトにおいて、延長したＱＴ間隔およびＴｄＰを誘発することが知られている［Daleau et al., 1995; Antzelevitch et al., 1996; Katapadi et al., 1997］。当該変異体がクラリスロマイシン誘導トルサード・ド・ポアン（ＴｄＰ）およびＶＦに罹患した患者から単離されたことは、天然ＩＫｒチャネルがｈＭｉＲＰ１で形成されるといる論文を支持する。
【００５９】
ｈＫＣＮＥ２は不整脈罹患性遺伝子である。ＭｉＲＰ１の遺伝子における変異は不整脈に罹患しやすくさせるという仮説を支持する分子遺伝子データは、ＬＱＴＳおよび/またはＶＦに関連する３つのミスセンス変異の同定を含む。Ｑ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１は薬物誘導不整脈に罹患した２０人の患者のうち一人に確認された。Ｍ５４Ｔ−ｈＭｉＲＰ１およびＩ５７Ｔ−ｈＭｉＲＰ１はそれぞれ、先天性または散発性不整脈に罹患した２３０人の患者のうち一人から単離された。該仮説を支持する非遺伝子データは、ＩＫｒ機能障害がＬＱＴＳおよび不整脈罹患性を引き起こすことが知られており、ＭｉＲＰ１およびＨＥＲＧが共集合してＩＫｒ様チャネルを形成し、およびＫＣＮＥ２における不整脈関連変異はイン・ビトロで形成されたチャネルに有害な影響を有するという観察を含む。共通の多型性があるという別の説明は誤りが立証されている。
【００６０】
不整脈に関連するＭｉｎＫおよびＭｉＲＰ１変異体は共通の効果を有する。ＭｉｎＫの４つの変異体は先天性ＬＱＴＳに相関している：Ｔ７Ｉ、Ｄ７６Ｎ、Ｓ７４ＬおよびＴＬ５８,５９ＰＰ［Schulze-Bahr et al., 1997; Splawski et al., 1997; Tyson et al., 1997; Duggal et al., 1998］。Ｓ７４Ｌおよび/またはＤ７６Ｌ−ＭｉｎＫでのＩＫｓチャネル形成は、活性化のＶ１／２をより脱分極した電位シフトし、脱活性化を加速し［Splawski et al., 1997; Sesti and Goldstein, 1998］、および、単一チャネルコンダクタンスを減少させる［Sesti and Goldstein, 1998］ことによって、Ｋ＋フラックスを減少させる（および心臓活動電位を延長する）。同様に、該ＱＴ間隔の延長化に関連するＭｉＲＰ１変異体は、活性化の電位依存性を増大し、脱活性化を加速することによってＫ＋電流を低減する。Ｑ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１で形成されたチャネルを通る電流は、薬物ブロックにより感受性なので、クラリスロマイシンに暴露されたとき、野生型と比較してさらに低減する（図９）。
【００６１】
ＭｉＲＰ１、ＭｉｎＫ、ＨＥＲＧおよびＫｖＬＱＴ１における不整脈関連変異は、チャネル機能に同程度の変化を生じる。Ｑ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１は活性化を妨害し、（０ｍＶにて０．５ｍＭ クラリスロマイシンで野生型と対して電流に６０％の低下を生じる）マクロライド抗菌剤に対する感受性を増強する。Ｍ５４Ｔ−ｈＭｉＲＰ１は、野生型の２倍速く脱活性化するＩＫｒチャネルを形成し、τ高速に５４％の低下を示す（表１）。同様に、ＨＥＲＧおよびＫｖＬＱＴ１における機能損失変異は、ピーク電流に５０〜８０％の低下をもたらし［Sanguinetti et al., 1996; Wollnik et al., 1997］、一方、他のＬＱＴＳ関連ＨＥＲＧ変異は、τ高速を４０〜７０％から低下させることによって脱活性化速度を増加させる［Chen et al., 1999］。ＬＱＴＳに関連するＳ７４ＬおよびＤ７６Ｎ−ＭｉｎＫ変異は、４０〜７０％低下した単一チャネルコンダクタンスおよび３３〜７５％高速化した脱活性化速度を有するＩＫｓチャネルを形成する［Sesti aand Goldstein, 1998］。逆に、Ｔ８Ａ−ｈＭｉＲＰ１は、活性化のＶ１／２における８ｍＶの負シフト以外は、低下に関連せず、野生型のように機能した。
【００６２】
心臓活動電位を延長化する医薬での治療中のＴｄＰの発生は予測できない。ＴｄＰは、キニジン［Roden et al., 1986］、ゾタロール［Hohnloser and Woosley, 1994］およびイブチリド［Ellenbogen et al., 1996］を含む種々の抗不整脈薬、抗ヒスタミンテルフェナジン［Woosley, et al., 1993］、消化管運動賦活調整剤シサプリド［Carlsson et al., 1997］およびマクロライド抗菌剤エリスロマイシン［Daleau et al., 1995; Antzelevitch et al., 1996］およびクラリスロマイシン［Kunda et al., 1997; Lee et al., 1998］での治療の認識された危険性である。各場合において、いくつかの場合、ＩＫｒチャネルの阻害によって、該剤は心臓Ｋ＋電流を低減させる。薬物誘導ＴｄＰの危険性にある患者を同定するベースライン特性はＱＴ間隔の先天性延長、低カリウム血症、女性（female gender）および低心拍数を含み、それら各々は、活動電位持続時間を延長化する；この観察は、Roden (1998）が再分極蓄積（repolarization reserve）の概念、すなわち、正常メカニズムによる規律正しい、急速な再分極化に影響する心筋層の過剰能力を発展させることに導いた。ＴｄＰの危険因子はこの蓄積を低減し、より適当なさらなるストレッサーによる不整脈の沈殿物を生成する。
【００６３】
かくして、Ｑ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１を保有する患者におけるベースラインでの延長化されたＱＴ間隔についてのもっともらしいシナリオは、容易には活性化せず、したがって、少ないＫ＋しか通過させずに時機を得て再分極化を達成するチャネルの形成である。低下したＫ＋電流をもたらす３つのさらなる因子が、この患者をＴｄＰおよびＶＦに罹患し易くしたのであろう。第１に、クラリスロマイシンが心臓ＩＫｒチャネルをブロックする；Ｑ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１チャネルは、該薬物に対して３倍感受性が高いので、この効果は該患者においてより顕著であろう。第２に、同時発生の低カリウム血症が、ＩＫｒチャネル活性を低減し、該アクロライド抗菌剤による阻害をさらに増強する。第３に、女性であることが独立危険因子であり、ウサギ心室筋細胞に見られるごとく、おそらくＩＫｒ密度に性差特異性差異によるものであろう［Makker et al., 1993; Drici et al., 1998; Ebert et al., 1998］。本発明者らの結果は、後天性不整脈が変異チャネルサブユニットの遺伝に起因し得るというアイディアを支持し、このサブユニットは、心臓再分極能力を低減するが、誘発的な刺激が心筋層の普通に再分極する能力をさらに低減するまでは充分に耐性である。
【００６４】
定義
本発明は以下の定義および使用の方法を採用し、それらは、適切な場合、ＫＣＮＥ２に言及される。しかしながら、かかる定義および使用の方法はＫＣＮＥ３およびＫＣＮＥ４にも適用可能である。
「ポリヌクレオチドの増幅」とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ライゲーションアンプリフィケーション（すなわちリガーゼ連鎖反応，ＬＣＲ）およびＱ−βレプリカーゼの使用に基く増幅方法のごとき方法を利用する。また、ストランドディスプレースメント増幅（ＳＤＡ）、好熱性ＳＤＡ、および核酸配列に基いた増幅（３ＳＲまたはＮＡＳＢＡ）も有用である。これらの方法は当業者に周知であり、本分野で広く実施されている。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号ならびにInnisら，１９９０年（ＰＣＲについて）；WuおよびWallace，１９８９年（ＬＣＲについて）；米国特許第５，２７０，１８４号および第５，４５５，１６６号ならびにWalkerら，１９９２年（ＳＤＡについて）；Spargoら，１９９６年（好熱性ＳＤＡについて）；Spargoら，１９９６年（好熱性ＳＤＡ）および米国特許第５，４０９，８１８号，Fahyら，１９９１年およびCompton，１９９１年（３ＳＲおよびＮＡＳＢＡについて）を参照。ＰＣＲを行うための試薬およびハードウェアは商業的に入手可能である。ＫＣＮＥ２領域由来の配列を増幅するために有用なプライマーは、好ましくはＫＣＮＥ２領域内の配列またはその中の標的配列に隣接する領域内の配列に相補的であり、および特異的にこれらにハイブリダイズする。増幅によって生じたＫＣＮＥ２配列は直接配列決定できる。別法として、ただしあまり好ましくないが、増幅配列を配列分析前にクローニングしてもよい。酵素的に増幅したゲノムフラグメントの直接クローニングおよび配列分析の方法はScharfら，１９８６年によって開示されている。
【００６５】
「検体ポリヌクレオチド」および「検体鎖」とは、標的配列を含むと推測される１本鎖または２本鎖のポリヌクレオチドをいい、それらは生物学的試料を包含する様々なタイプの試料に存在していてもよい。
「抗体」。本発明はまた、ＫＣＮＥ２ポリペプチドおよびそれらのフラグメントまたはＫＣＮＥ２領域由来のポリヌクレオチド配列に特異的に結合できるポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体およびそれらのフラグメント、ならびにそれらの免疫学的に結合する同等物も提供する。「抗体」なる用語は、均一の分子実体、または抗体生産物のように大多数が異なる分子実体からなる混合物をいうのに共に用いられる。ポリヌクレオチドを、ペプチドシンセサイザーにおいて合成的に調製し、キャリヤー分子（例、キーホール・リンペット・ヘモシアニン）に結合させ、および数ヶ月にわたってウサギに注入できる。ウサギ血清をＫＣＮＥ２ポリペプチドまたはそれらのフラグメントに対する免疫反応性について試験する。タンパク質ポリペプチド、融合タンパク質またはそれらのフラグメントをマウスに注入することにより、モノクローナル抗体を作成できる。モノクローナル抗体はＥＬＩＳＡによってスクリーニングされ、ＫＣＮＥ２ポリペプチドまたはそれらのフラグメントとの特異的な免疫反応性について試験される。［Harlow and Lane, 1988］を参照。これらの抗体はアッセイおよび医薬において有用である。
【００６６】
十分量の目的のポリペプチドが得られれば、それを様々な目的に用いることができる。典型的な使用は、結合について特異的な抗体の生産である。これらの抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよく、当業者に周知のイン・ビトロまたはイン・ビボのどちらの技術で生産されてもよい。ポリクローナル抗体の生産のため、適当な標的免疫系（典型的にはマウスまたはウサギ）を選択する。動物について適当な方法および免疫学者に周知の他のパラメーターによって決定された形式で、実質的に精製された抗原が免疫系に与えられる。注入のための典型的な部位は足蹠中、筋肉内、腹腔内、または皮内である。当然、他の種をマウスまたはウサギに代えてもよい。ついで、目的の特異性のために適合させて、当業者に既知の技術を用いてポリクローナル抗体を精製する。
【００６７】
通常、免疫アッセイにより免疫学的応答を検定する。通常、かかる免疫アッセイは、例えば抗原と同じ細胞および同じ形式で生産された抗原のソースの何らかの精製を含む。様々な免疫アッセイ方法が当業者に周知である。［Harlow and Lane, 1988］または［Goding, 1986］を参照。
【００６８】
典型的には、例えば［Harlow and Lane, 1988］または［Goding, 1986］に記載のごとき標準的方法により、親和性１０−８Ｍ−１、または好ましくは１０−９〜１０−１０Ｍ−１またはそれ以上のモノクローナル抗体が作成される。要するに、適当な動物が選択され、望ましい免疫化プロトコールに従う。適当な期間の後、適当な選択条件下で、かかる動物の脾臓を摘出し、個々の脾臓細胞を溶かし、典型的には、ミエローマ細胞を不死化する。その後、細胞をクローン分離し、抗原の目的の領域に特異的な適当な抗体の生産について各クローンの上清を試験する。
【００６９】
他の適当な技術は、抗原性ポリペプチドへのリンパ球のイン・ビトロ曝露、または別法として、ファージもしくは類似のベクター中の抗体ライブラリーの選択物へのリンパ球のイン・ビトロ曝露を含む。Huseら，１９８９年を参照。本発明のポリペプチドおよび抗体は、修飾して、または修飾せずに使用できる。多くの場合、ポリペプチドおよび抗体を、検出可能なシグナルを与える基質を共有結合的または非共有結合的に結合させることにより標識する。広範な標識および結合技術が知られており、科学文献と特許文献の両方で広く報告されている。適当な標識は放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害剤、蛍光剤、化学ルミネセンス剤、磁性粒子などである。かかる標識の使用を教示する特許には、米国特許第３，８１７，８３７号；第３，８５０，７５２号；第３，９３９，３５０号；第３，９９６，３４５号；第４，２７７，４３７号；第４，２７５，１４９号および第４，３６６，２４１号がある。また、組換え免疫グロブリンを生産することもできる（米国特許第４，８１６，５６７号を参照）。
【００７０】
「結合パートナー」とは、例えば抗原と抗原特異的抗体または酵素とその阻害剤のように、高い特異性でリガンド分子を結合できる分子をいう。通常、特異的結合パートナーは単離条件下で、十分な親和性で検体コピー／相補２重鎖（ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションの場合）に結合して固定しなければならない。特異的結合パートナーは当業者に既知であり、例えば、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、多くの受容体−リガンドの組、および相補的ポリヌクレオチド鎖を含む。相補的ポリヌクレオチド結合パートナーの場合、パートナーは通常少なくとも１５塩基の長さであり、および少なくとも４０塩基の長さであってもよい。１５未満の長さ（例、８塩基）、１５〜４０の間、および４０より多い塩基もまた用いることができることは当業者に理解されよう。ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、または合成ヌクレオチドアナログを含む。さらに、結合パートナーは本明細書に記載のごとく例えば２−ハイブリッド酵母スクリーニングアッセイを用いて同定できる。
【００７１】
「生物学的試料」とは、個体由来の検体ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含むことが推測される組織または流体の試料（特に限定されるものではないが、例えば血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚の表面切片、呼吸器、腸および尿生殖器の管、涙、唾液、血液細胞、腫瘍、器官、組織およびイン・ビトロ細胞培養構成物を含む）をいう。
【００７２】
「コードする」。ポリヌクレオチドが、本来の状態で、または当業者に周知の方法で操作された場合に、転写および／または翻訳されてポリヌクレオチドのｍＲＮＡおよび／もしくはポリペプチドまたはそれらのフラグメントを生産する場合、ポリヌクレオチドはポリペプチドを「コードする」という。アンチセンス鎖はかかる核酸の相補体であり、コーディング配列はそれらから推測できる。
【００７３】
「単離された」または「実質的に純粋な」。「単離された」または「実質的に純粋な」核酸（例、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマー）は、天然では本来のヒト配列またはタンパク質に付随している他の細胞成分（例、リボソーム、ポリメラーゼ、多くの他のヒトゲノム配列およびタンパク質）から実質的に分離されているものである。当該用語は、天然に存在する環境から移動させられた核酸配列またはタンパク質を包含し、および組換えまたはクローン化ＤＮＡ単離物および化学合成アナログまたは異種系により生物学的に合成されたアナログを含む。
【００７４】
「ＫＣＮＥ２対立遺伝子」とは、各々ＫＣＮＥ２遺伝子座の正常な対立遺伝子およびＬＱＴを生じる変種を保有するＫＣＮＥ２対立遺伝子をいう。
【００７５】
「ＫＣＮＥ２遺伝子座」、「ＫＣＮＥ２遺伝子」、「ＫＣＮＥ２核酸」または「ＫＣＮＥ２ポリヌクレオチド」とは、各々正常な組織で発現すると考えられるポリヌクレオチド（それらは全てＫＣＮＥ２領域内である）をいい、その対立遺伝子にはＬＱＴを生じるものがある。ＫＣＮＥ２遺伝子座はコーディング配列、介在配列ならびに転写および／または翻訳を調節する翻訳制御因子を包含することを意図する。ＫＣＮＥ２遺伝子座は当該ＤＮＡ配列の全ての対立性変種を包含することを意図する。「ＫＣＮＥ２」および「ＭｉＲＰ１」なる用語は相互に交換して用いることができる。同様に、ＫＣＮＥ３遺伝子座はコーディング配列、介在配列ならびに転写および/または翻訳を調節する翻訳制御因子を包含することを意図する。該ＫＣＮＥ３遺伝子座は、該ＤＮＡ配列の全ての対立遺伝子変種を包含することを意図する。「ＫＣＮＥ３」および「ＭｉＲＰ２」なる用語は相互に交換して用いることができる。同様に、ＫＣＮＥ４遺伝子座はコーディング配列、介在配列ならびに転写および/または翻訳を調節する翻訳制御因子を包含することを意図する。該ＫＣＮＥ４遺伝子座は、該ＤＮＡ配列の全ての対立遺伝子変種を包含することを意図する。「ＫＣＮＥ４」および「ＭｉＲＰ３」なる用語は相互に交換して用いることができる。
【００７６】
これらの用語は、核酸に適用された場合、ヒトＫＣＮＥ２ポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは変種（例えばタンパク質融合体または欠失体を包含する）をコードする核酸をいう。本発明の核酸は天然のＫＣＮＥ２コード遺伝子または天然のＫＣＮＥ２コード遺伝子と実質的に相同性を有するものあるいはそれらの一部に由来の配列または実質的に類似する配列を有する。
【００７７】
ＫＣＮＥ２の遺伝子または核酸は、各々、ＫＣＮＥ２遺伝子の正常な対立遺伝子（ＫＣＮＥ２ポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えないサイレント対立遺伝子および実質的にその機能に影響を与えないＫＣＮＥ２ポリペプチドのアミノ酸配列変種を導く対立遺伝子を包含する）を包含する。また、これらの用語は、ＫＣＮＥ２ポリペプチドの機能に悪影響を及ぼす１以上の変異を有する対立遺伝子も包含する。変異は、ＫＣＮＥ２ポリペプチドのアミノ酸配列における有害な変化を生じ、ＫＣＮＥ２の機能の部分的または完全な欠失の結果を与える、ＫＣＮＥ２核酸配列における変化であってもよい。あるいは、有効なＫＣＮＥ２の発現の損失またはＫＣＮＥ２ポリペプチドの異常型の生産の結果をあたえる、核酸配列の変化であってもよい。
【００７８】
ＫＣＮＥ２核酸は、配列番号：１（ヒト）または配列番号：３（ラット）に記載されたものであってもよく、上記のような対立遺伝子、または示した配列の１以上の核酸の１以上の付加、挿入、欠失および置換である変化により、示したものとは異なる変種もしくは誘導体であってもよい。ヌクレオチド配列に対する変化がタンパク質レベルでのアミノ酸変化の結果を生じるか否かは遺伝子コードによって決定される。同様の考察および範囲が、本明細書中ＫＣＮＥ２につき記載されるごとく、ヒトＫＣＮＥ３（配列番号：５）、マウスＫＣＮＥ３（配列番号：７）、ヒトＫＣＮＥ４（配列番号：９）およびマウスＫＣＮＥ４（配列番号：１１）にあてはまる。
【００７９】
したがって、本発明の核酸は、配列番号：１および３に記載された配列とは異なる配列を包含し、さらに、これらの図に示したものと同じアミノ酸配列のポリペプチドをコードするであろう。すなわち、本発明の核酸は遺伝子コードの縮重の結果として生じる配列を包含する。一方、コードされたポリペプチドは配列番号：２および４に記載されたアミノ酸配列とは１以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸配列を含んでもよい。本発明は、配列番号：２および４に記載されたアミノ酸配列のアミノ酸配列変種、誘導体または対立形質もまた提供する。
【００８０】
ＫＣＮＥ２遺伝子はまた、各々（ａ）（ｉ）配列番号：１（ヒト）または配列番号：３（ラット）に記載されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の相補鎖に、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし（Ausubelら，１９９２年）、および（ｉｉ）ＫＣＮＥ２に対して機能的に同等の遺伝子産物をコードする、あらゆるＤＮＡ配列、あるいは（ｂ）（ｉ）配列番号：２または配列番号：４に記載されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の相補鎖に、適度なストリンジェント条件のごときあまりストリンジェントではない条件下でハイブリダイズし（Ausubelら，１９９２年）、および（ｉｉ）ＫＣＮＥ２に対して機能的に同等の遺伝子産物をコードする、あらゆるＤＮＡ配列もいう。本発明はまた本明細書に記載の配列の相補鎖である核酸分子も包含する。
【００８１】
本発明のポリヌクレオチド組成物は、当業者に容易に理解されるように、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成型、および混合ポリマー、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を包含し、化学的または生化学的に修飾されていてもよく、非天然または誘導体化ヌクレオチド塩基を含有していてもよい。かかる修飾は、例えば、標識、メチル化、アナログにより天然に生じるヌクレオチドの１以上の置換、非電荷結合（例、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバミデート、等）、電荷結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、等）、未決定の（pendent）分子（例、ポリペプチド）、インターカレーター（例、アクリジン、プソラレン、等）、キレーター、アルキレーター、および修飾結合（例、αアノマー核酸、等）のごときヌクレオチド間修飾を含む。水素結合および他の化学的相互作用を介して目的の配列に結合する能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子もまた包含される。かかる分子は当業者に既知であり、例えばペプチド結合が分子骨格においてリン酸結合に置き換わったものを包含する。
【００８２】
本発明は、ＫＣＮＥ２領域の全部または一部を含む組換え核酸を提供する。組換え構築物は宿主細胞中で自律複製可能であってもよい。別法として、組換え構築物は宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。かかる組換えポリヌクレオチドは、そのオリジンまたは操作の効力により、１）天然では会合するポリヌクレオチドの全部または一部と会合しない；２）天然で結合するもの以外のポリヌクレオチドに結合する；または３）天然に存在しない、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成オリジンのポリヌクレオチドを含有する。本発明の核酸がＲＮＡを包含する場合、示した配列のリファレンスはＲＮＡ同等物と比較してＵによってＴが置き換えられて解釈される。
【００８３】
したがって、他で天然に存在しない配列を含む組換え核酸は本発明によって提供される。野生型の配列を用いても良いが、それは、例えば欠失、置換または挿入によって頻繁に変化する。様々なタイプのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを本発明の核酸の天然のソースとしてスクリーニングできる。またはかかる核酸はゲノムＤＮＡまたはその他の天然のソース中に常在性の配列の増幅により得ることができる。ｃＤＮＡライブラリーの選択は通常目的のタンパク質についてのｍＲＮＡに富んだ組織ソースに対応する。通常ファージライブラリーが好ましいが、他のタイプのライブラリーを用いても良い。ライブラリーのクローンをプレート上に広げ、スクリーニング用の培養基に移し、変成させ、および目的の配列について探索する。
【００８４】
本発明において用いられるＤＮＡ配列は、一般に少なくとも約５コドン（１５ヌクレオチド、より一般的には少なくとも約７〜１５コドン、もっとも好ましくは少なくとも３５コドンを有する。１以上のイントロンが存在しても良い。このヌクレオチドの数は通常、ＫＣＮＥ２コーディング配列およびＫＣＮＥ２コーディング配列に特異的にうまくハイブリダイズするプローブに必要な、ほぼ最小の長さである。本明細書中、特にチップ技術に関して、８ヌクレオチドの低さ、より一般的には８〜１７ヌクレオチドのオリゴマーをプローブとして用いることができる。
【００８５】
核酸操作のための技術は一般的に、例えば、Sambrookら，１９８９年またはAusubalら，１９９２年に記載されている。制限酵素等のような、かかる技術の適用に有用な試薬は当業者に周知であり、New England BioLabs, Boehringer Mannheim, Amersham, Promega, U. S. Biochemicals, New England Nuclearのようなベンダーおよび多数のソースから商業的に入手可能である。本発明の融合タンパク質を生産するために用いられる組換え核酸配列は天然または合成配列から得てもよい。多くの天然の遺伝子配列が、適当なプローブを用い、様々なｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから入手可能である。GenBank, National Institutes of Healthを参照。
【００８６】
本明細書中、ＫＣＮＥ２遺伝子座または領域または対立遺伝子の「一部」とは、少なくとも８ヌクレオチド、または好ましくは約１５ヌクレオチド、またはより好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの最小サイズを有するものとして定義され、および少なくとも約４０ヌクレオチドの最小サイズを有していてもよい。この定義は８〜４０ヌクレオチドの範囲内の全てのサイズおよび４０ヌクレオチド以上の全てもサイズを包含する。したがって、この定義は８、１２、１５、２０、２５、４０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００ヌクレオチドの核酸、またはこれらの値の範囲内のあらゆる数のヌクレオチドを有する核酸（例、９，１０，１１，１６，２３，３０，３８，５０，７２，１２１ヌクレオチド等）、または５００ヌクレオチド以上を有する核酸を含む。本発明は、配列番号：１、３、５、７、９および１１、その相補鎖または機能的に同等の核酸配列由来の少なくとも８ヌクレオチドを有する全ての新規な核酸を包含する。本発明は従来技術において存在する核酸は包含しない。すなわち、本発明は、従来技術に存在する核酸をしない限りにおいて、配列番号：１、３、５、７、９および１１由来の少なくとも８ヌクレオチドを有する全ての核酸を包含する。
【００８７】
「ＫＣＮＥ２タンパク質」または「ＫＣＮＥ２ポリペプチド」とは、ＫＣＮＥ２遺伝子座、それらの変種またはフラグメントによってコードされるタンパク質またはポリペプチドをいう。「ＫＣＮＥ２」および「ＭｉＲＰ１」なる用語は相互に交換して用いられる。同様に、「ＫＣＮＥ３タンパク質」とは、ＫＣＮＥ３遺伝子座、それらの変種またはフラグメントによってコードされるタンパク質またはポリペプチドをいう。「ＫＣＮＥ３」および「ＭｉＲＰ２」なる用語は相互に交換して用いられる。同様に、「ＫＣＮＥ４タンパク質」とは、ＫＣＮＥ３遺伝子座、それらの変種またはフラグメントによってコードされるタンパク質またはポリペプチドをいう。「ＫＣＮＥ４」および「ＭｉＲＰ３」なる用語は相互に交換して用いられる。「ポリペプチド」なる用語はアミノ酸のポリマーおよびその同等物をいい、特定の長さの生産物；したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質をいうものではない。この用語はポリペプチドの修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化等）をいうものではなく、これらは除かれる。この定義に含まれるのは例えば１以上のアミノ酸のアナログ（例えば、非天然のアミノ酸等を包含する）を含有するポリペプチド、置換結合および当業者に既知の他の修飾を有するポリペプチドであり、これらは天然に生じるものと非天然に生じるものの両方を含む。通常、かかるポリペプチドは天然のＫＣＮＥ２配列に対して少なくとも約５０％、好ましくは９０％を超える相同性を有し、さらに好ましくは少なくとも約９５％の同一である。また、高度または低度にストリンジェントな条件下でＫＣＮＥ２コード核酸にハイブリダイズするＤＮＡによってコードされるタンパク質およびＫＣＮＥ２タンパク質に対する抗血清によって回収される密接に関連するポリペプチドまたはタンパク質も含まれる。
【００８８】
ＫＣＮＥ２ポリペプチドは配列番号：２（ヒト）または配列番号：４（ラット）に記載されたものであってもよく、それらは単離および／または精製型であってもよく、天然に会合する物質が無く、または実質的に無いものであってもよい。該ポリペプチドは、原核細胞での発現により生産される場合または合成的に生産される場合、グリコシル化のような本来の翻訳後プロセッシングを欠いていてもよい。別法として、本発明はまたＫＣＮＥ２ポリペプチドの配列変異体、対立形質または誘導体であるポリペプチドも導く。かかるポリペプチドは、１以上のアミノ酸の１以上の付加、置換、欠失または挿入によって、配列番号：２または配列番号：４に記載されたものとは異なるアミノ酸配列を有していてもよい。好ましくは、かかるポリペプチドはＫＣＮＥ２の機能を有する。同様の考察および範囲が、本明細書中ＫＣＮＥ２につき記載されるごとく、ヒトＫＣＮＥ３（配列番号：６）、マウスＫＣＮＥ３（配列番号：８）、ヒトＫＣＮＥ４（配列番号：１０）およびマウスＫＣＮＥ４（配列番号：１２）にあてはまる。
【００８９】
置換変種は典型的にはタンパク質内の１以上の部位において１アミノ酸の他への交換を含み、他の機能や性質を損なうことなく、タンパク質溶解開裂に対する安定性のようなポリペプチドの１以上の性質を調節するために設計されてもよい。アミノ酸置換は残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性に基いてなすことができる。好ましい置換は保存的なもの、すなわち、１アミノ酸が類似の形および電荷のものに置換されたものである。保存的置換は当業者に周知であり典型的には以下のグループ内の置換を含む：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびチロシン、フェニルアラニン。
【００９０】
例えば、抗体の抗原−結合領域または基質分子上の結合部位またはＫＣＮＥ２ポリペプチドと相互作用するタンパク質上の結合部位のような構造との相互作用結合能力を認識可能な程度に損なうことなく、タンパク質構造中の特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換してもよい。タンパク質の生物学的機能活性を定義するのはタンパク質の相互作用能力および性質であるので、タンパク質配列、およびその基礎をなすＤＮＡコーディング配列において特定のアミノ酸置換をなすことができ、それにも関わらず類似の性質のタンパク質が得られる。かかる変化をなすことにおいて、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮してもよい。タンパク質における相互作用的な生物学的機能の供与において疎水性アミノ酸指標の重要性は一般的に当業者に理解される（KyteおよびDoolittle、1982年）。別法として、親水性に基き効果的に類似アミノ酸の置換をなすことができる。タンパク質における相互作用的な生物学的機能の供与において親水性の重要性は一般的に当業者に理解される（米国特許第４，５５４，１０１号）。ポリペプチドの設計における疎水性指標または親水性の使用は米国特許第５，６９１，１９８号においてさらに検討されている。
【００９１】
相同性について比較されるポリペプチド配列の長さは、一般的に少なくとも１６アミノ酸、通常少なくとも約２０残基、より通常では少なくとも約２４残基、典型的には少なくとも約２８残基、および好ましくは約３５残基以上である。
【００９２】
「作動可能に結合された」とは、記載した成分が意図した方法で機能できる関係である並置をいう。例えば、プロモーターがコーディング配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコーディング配列に作動可能に結合されている。
【００９３】
「ペプチド模倣」または「模倣」なる用語は、ＫＣＮＥ２ポリペプチドの必須の生物学的活性を有する物質をいうことを意図する。ペプチド模倣は、タンパク質２次構造の要素を模倣するペプチド含有分子であってもよい（Johnsonら，１９９３年）。ペプチド模倣の背後の基礎となる原理は、抗体と抗原の相互作用、酵素と基質または骨格タンパク質のような分子相互作用を促進するように、タンパク質のペプチド骨格が主にアミノ酸側鎖に向かって存在することである。ペプチド模倣は天然分子と類似の分子相互作用を可能にするように設計される。模倣は全くペプチドでなくてもよいが、天然のＫＣＮＥ２ポリペプチドの必須の生物学的活性は保有する。
【００９４】
「プローブ」。ＬＱＴを罹患し易くするＫＣＮＥ２対立遺伝子に関するポリヌクレオチドの多型性は、ストリンジェント〜中ぐらいのストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、標的配列のポリヌクレオチドと安定なハイブリッドを形成するポリヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによって検出される。プローブが標的配列と完全に相補的であることが推測される場合、高度にストリンジェントな条件が用いられる。ある程度の不一致が予測される場合、例えば、変種が、プローブが完全に相補的でない結果を予期される場合、ハイブリダイゼーションのストリンジェントさを弱めてもよい。非特異的／不定の結合を制御する、すなわちノイズを最小にする条件が選択される（本明細書中、単に「ストリンジェントな」条件を用いるという場合、「高度にストリンジェントな」条件が用いられると読まれることを意図している。）。かかる指示はニュートラルなＤＮＡ多型性と変異を同一視するので、これらの指示はさらにＫＣＮＥ２感受性対立遺伝子の検出を示すためのさらなる分析が必要である。
【００９５】
ＫＣＮＥ２対立遺伝子用のプローブは、ＫＣＮＥ２領域、そのｃＤＮＡ、機能的に同等の配列、またはそれらの相補鎖から得ることができる。プローブは、ＫＣＮＥ２領域の全部または一部にわたり、該領域への特異的ハイブリダイゼーションを可能にする、任意の適当な長さであってよい。標的配列がプローブの配列と同一の配列を含む場合、ハイブリッドはストリンジェントな条件下でも比較的安定なのでプローブは短くてもよい（例、約８〜３０塩基対の範囲内）。ある程度のプローブとの不一致が予測される場合、すなわちプローブが変種領域へハイブリダイズするであろう場合、必要な特異性を有し標的配列にハイブリダイズする、より長いプローブを用いることができる。
【００９６】
プローブは標識またはリポーター分子に結合している単離ポリヌクレオチドを包含し、標準的な方法により、配列類似性を有する他のポリヌクレオチド配列を単離するために用いることができる。プローブを調製および標識する技術については、Sambrookら，１９８９年またはAusubalら，１９９２年を参照。他の類似ポリヌクレオチドは同一性ポリヌクレオチドを用いることにより選択できる。別法として遺伝子コードの重複性の使用により、これらの、または類似のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、合成または選択してもよい。例えば、サイレント変化（それにより様々な制限部位を生じる）により、様々なコドン置換を導入し、または特定の系について発現を最適化できる。変異を導入して、ポリペプチドの性質を修飾し、あるいはポリペプチド分解またはターンオーバー率を変化させることができる。
【００９７】
本発明の合成オリゴヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドを含有するプローブは、天然に発生するかもしくは組換えの１本もしくは２本鎖ポリヌクレオチド、または化学合成から得ることができる。またプローブをニックトランスレーション、クレノウフィルインリアクション、その他の当業者に既知の方法により標識することもできる。
【００９８】
ＫＣＮＥ２をコードするポリヌクレオチド配列由来の、少なくとも約８ヌクレオチド、通常少なくとも約１５ヌクレオチドで、および約９ｋｂ未満、通常約１．０ｋｂ未満を有するポリヌクレオチド配列の部分が、プローブとして好適である。したがって、この定義は８ヌクレオチド〜９０００ヌクレオチドのサイズのプローブを包含する。したがって、この定義は８、１２、１５、２０、２５、４０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００ヌクレオチドのプローブ、またはこれらの値の範囲内のあらゆる数のヌクレオチドを有するプローブ（例、９，１０，１１，１６，２３，３０，３８，５０，７２，１２１ヌクレオチド等）、または５００ヌクレオチド以上を有するプローブを含む。また、当該プローブを用いてＫＣＮＥ２をコードするｍＲＮＡが細胞または組織中に存在するかどうかを決定することもできる。本発明は、配列番号：１、３、５、７、９および１１、その相補鎖または機能的に同等の核酸配列由来の少なくとも８ヌクレオチドを有する全ての新規なプローブを包含する。本発明は従来技術において存在するプローブは包含しない。すなわち、本発明は、従来技術に存在するプローブを包含しない限りにおいて、配列番号：１、３、５、７、９および１１由来の少なくとも８ヌクレオチドを有する全ての核酸を包含する。
【００９９】
類似の考察およびヌクレオチド長をＫＣＮＥ２遺伝子の全部または一部の増幅にも適用できる。したがって、プライマーの定義は８、１２、１５、２０、２５、４０、６０、８０、１００、２００、３００、４００、５００ヌクレオチドのプライマー、またはこれらの値の範囲内のあらゆる数のヌクレオチドを有するプライマー（例、９，１０，１１，１６，２３，３０，３８，５０，７２，１２１ヌクレオチド等）、または５００ヌクレオチド以上もしくは５００〜９０００の間の任意の数のヌクレオチドを有するプローブを包含する。また、当該プライマーを用いてＫＣＮＥ２をコードするｍＲＮＡが細胞または組織中に存在するかどうかを決定することもできる。本発明は、ＫＣＮＥ２遺伝子増幅についてのＫＣＮＥ２遺伝子座、その相補鎖または機能的に等価な核酸配列由来の少なくとも８ヌクレオチドを有する全ての新規なプライマーを包含する。本発明は従来技術において存在するプライマーは包含しない。すなわち、本発明は、従来技術に存在するプライマーを包含しない限りにおいて、少なくとも８ヌクレオチドを有する全ての核酸を包含する。
【０１００】
「タンパク質修飾またはフラグメント」は、本発明により、１次構造配列と実質的に同一であるが、イン・ビボもしくはイン・ビトロの化学的および生化学的修飾を含み、または異常なアミノ酸を取り込んでいるＫＣＮＥ２ポリペプチドまたはそれらのフラグメントを規定する。かかる修飾は、例えばアセチル化、カルボキシル化、ホスホリル化、グリコシル化、ユビキチン化、放射性核種等による標識、および様々な酵素的修飾を包含し、当業者に容易に理解されよう。かかる目的に有用な、様々なポリペプチド標識方法および置換基または標識は当業者に周知であり、３２Ｐのような放射活性アイソトープ、標識抗リガンド（例、抗体）に結合するリガンド、フルオロフォア、化学ルミネッセンス剤、酵素、および標識リガンドについての特異的結合ペアとして使用できる抗リガンドを包含する。標識の選択は、必要な感受性、プライマーとの結合の容易さ、安定性の要求、および利用可能な機器による。ポリペプチド標識方法は当業者に周知である。Sambrookら，１９８９年またはAusubalら，１９９２年を参照。
【０１０１】
実質的に完全長のポリペプチドのほかに、本発明は、ポリペプチドの生化学的に活性なフラグメントを提供する。重要な生化学的活性は、リガンド結合、免疫学的活性およびその他のＫＣＮＥ２ポリペプチドに特有な生化学的活性を包含する。免疫学的活性は、標的免疫系における免疫学的機能、ＫＣＮＥ２タンパク質のエピトープについての拮抗剤または代用抗原として供される結合に関する免疫学的エピトープの分配、の両方を包含する。本明細書で用いられる場合、「エピトープ」とはポリペプチドの抗原決定基をいう。エピトープは、当該エピトープに特有の空間的コンホメーションにおいて３つのアミノ酸を含むことができる。通常、エピトープは、少なくとも５つのかかるアミノ酸、およびより通常では少なくとも８〜１０個のかかるアミノ酸からなる。かかるアミノ酸の空間的コンフォメーションの決定方法は当業者に既知である。
【０１０２】
免疫学的目的のため、タンデム−リピートポリペプチドフラグメントを抗原として用いて、高抗原性タンパク質を生産することができる。別法として、かかるポリペプチドは特異的結合についての高効率拮抗剤として供される。ＫＣＮＥ２ポリペプチドまたはそれらのフラグメントに特異的な抗体生産は下記に記載する。
【０１０３】
本発明はまた、ＫＣＮＥ２ポリペプチドおよびそれらのフラグメントを含有する融合ポリペプチドも提供する。相同ポリペプチドは、２以上のＫＣＮＥ２ポリペプチド配列間、またはＫＣＮＥ２ポリペプチドおよび関連タンパク質間の融合体であってもよい。同様に、誘導タンパク質の性質または活性の組み合わせを示す異種性融合体を構築することができる。例えば、リガンド結合または他のドメインを異なる融合ポリペプチドまたはフラグメント間で「交換」してもよい。かかる相同または異種融合ポリペプチドは、例えば、結合の長さまたは特異性を変化させ得る。融合パートナーは免疫グロブリン、細菌β−ガラクトシダーゼ、ｔｒｐＥ、プロテインＡ、β−ラクタマーゼ、αアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼおよび酵母α接合因子を包含する。Godowskiら，１９８８年を参照。
【０１０４】
融合タンパク質は、典型的には下記のような組換え核酸法、または化学合成のいずれかによってなされる。ポリペプチド合成技術は、例えば、Merrifield（１９６３年）に記載されている。
【０１０５】
「タンパク質精製」とは、ＫＣＮＥ２ポリペプチドまたはそれらを、ＫＣＮＥ２をコードする組換え核酸で形質転換した細胞に由来するような他の生物学的物質から単離する様々な方法をいい、当業者に周知である。例えば、本発明によって与えられる抗体等を用いる免疫親和性クロマトグラフィーによって、かかるポリペプチドを精製できる。様々なタンパク質精製方法が当業者に周知であり、Deutscer，１９９０年およびScopes，１９８２年に記載の方法を包含する。
【０１０６】
「単離」、「実質的に純粋」および「実質的に均一」なる用語は、天然状態では付随している成分から分離されているタンパク質またはポリペプチドをいい、相互に交換して用いるられる。モノマータンパク質は、少なくとも試料の約６０〜７５％が単一のポリペプチド配列を示す場合に、実質的に純粋である。実質的に純粋なタンパク質は、典型的には約６０〜９０％Ｗ／Ｗのタンパク質試料を含み、より通常では約９５％、および好適には約９９％純粋である。タンパク質純度および均一性は、タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続くゲルの染色に基く単一ポリペプチドバンドの可視化のような当業者に周知の多数の方法によって示すことができる。特定の目的のため、より高い分離はＨＰＬＣまたは精製に用いられる当業者に周知のその他の手段の使用によって与えられる。
【０１０７】
ＫＣＮＥ２タンパク質は、天然状態では付随している天然汚染物質から分離された場合、天然の付随成分を実質的に含まない。したがって、化学的に合成したか、または天然でそれを生じる細胞とは異なる細胞系で合成したポリペプチドは、それが天然に会合する成分を実質的に含まない。当業者に周知の精製技術を用いる単離により、タンパク質が天然で会合する成分を実質的に含まないようにできる。
【０１０８】
異種細胞型で発現された場合でも、単離および操作された遺伝配列の発現生産物として生産されたポリペプチドは、本明細書でいう「単離されたポリペプチド」である。合成的に作成した型または異種細胞によって発現された分子は、本質的に単離された分子である。
【０１０９】
「組換え核酸」とは、天然には生じない核酸、または２つの別々に分離された配列フラグメントの人工的な組合わせにより作成された核酸である。この人工的な組合せは、多くの場合、化学合成手段または核酸の単離フラグメントの人工的操作（例、遺伝子工学技術）によってなされる。これは、通常コドンを同一または保存アミノ酸をコードする重複コドンに置き換えるために行い、典型的にはこれと同時に配列認識部位を導入または除去する。別法として、目的の機能を有する複数の核酸フラグメントを一緒にして、目的の機能の組み合わせを生じさせることを行う。
【０１１０】
「制御配列」とは、通常、遺伝子座のコード領域から１００ｋｂ以内の配列をいうが、それらはコード領域から離れていてもよく、遺伝子発現（遺伝子転写、翻訳、スプライシング、メッセンジャーＲＮＡ安定性等を含む）に影響を与える。
【０１１１】
「実質的相同性または類似性」。核酸またはそのフラグメントは、他の核酸（またはその相補鎖）と至適に並置された場合に（適切なヌクレオチドの挿入または欠失を伴って）ヌクレオチド塩基の少なくとも約６０％、通常には少なくとも約７０％、より通常には少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５〜９８％においてヌクレオチド配列同一性が存在すれば、他に対して「実質的に相同」（または「実質的に類似」）である。
【０１１２】
同一性とは、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の度合を意味し、かかる配列の２本の鎖の間の適合の同一性により決定される。同一性は容易に算出し得る。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を測定する数多くの方法があり、「同一性」なる語は当業者によく知られている［Computatioal Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Human Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M., and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991］。２つの配列間の同一性を決定するのに普通用いられる方法は、限定されないが、［Guide to Huge Computers, Martin, J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo, H., and Lipman, D. (1998)］に開示されたものを含む。同一性を決定する好ましい方法は、試験される２つの配列間に最大の適合を与えるように設計される。かかる方法は、コンピュータプログラムに集成される。２つの配列間の同一性を決定するための好ましいコンピュータプログラムは、限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ［Devereux et al. (1984)］、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ［Altschul et al. (1990); Altschul et al. (1997)］を含む。
【０１１３】
あるいは、核酸またはそのフラグメントが別の核酸（またはその相補鎖）に選択的ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合に、鎖またはその相補物に対して実質的相同性（または類似性）が存在する。ハイブリダイゼーションの選択性は、特異性の全体的な欠如よりも実質的に選択的なハイブリダイゼーションが生じる場合に存在する。代表的には、選択的ハイブリダイゼーションは、少なくとも約１４ヌクレオチドにわたる少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも約６５％、より好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性が存在する場合に生じる（Kanehisa, 1984参照）。上記の相同性比較の長さはより長くにわたってもよく、特定の実施態様においてはしばしば少なくとも約９ヌクレオチド、通常には少なくとも約２０ヌクレオチド、より通常には少なくとも約２４ヌクレオチド、代表的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より代表的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６ヌクレオチドまたはそれ以上にわたる。
【０１１４】
当業者には容易に理解されるように、核酸ハイブリダイゼーションは、塩基組成、相補鎖の長さおよびハイブリダイズする核酸間でのヌクレオチド塩基のミスマッチ数に加えて、塩濃度、温度または有機溶媒のような条件によって影響される。ストリンジェントな温度条件は一般に３０℃以上、代表的には３７℃以上、好ましくは４５℃以上の温度を包含する。ストリンジェントな塩条件は通常１０００ｍＭ未満、代表的には５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満である。しかし、いずれかの単一のパラメーターの程度よりも、パラメーターの組合せがずっと重要である。ストリンジェンシー条件は核酸の長さおよび核酸の塩基組成に依存し、当該分野において周知の技術によって決定することができる（例えば、Wetmur and Davidson, 1968参照）。
【０１１５】
プローブ配列はまた、特定の条件下で二重鎖ＤＮＡに特異的にハイブリダイズして、三重鎖または他のより高次のＤＮＡ複合体を形成し得る。そのようなプローブの調製および適切なハイブリダイゼーション条件は当該分野において周知である。
【０１１６】
ポリペプチドに言及する場合、用語「実質的相同性」または「実質的同一性」は、問題のポリペプチドまたはタンパク質が天然のタンパク質全体またはその部分と少なくとも約３０％の同一性、通常には少なくとも約７０％の同一性、より通常には少なくとも約８０％の同一性、好ましくは少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の同一性を示すことを示す。
【０１１７】
ポリペプチドに関して、相同性は、代表的には配列解析ソフトウェアを使用して測定される（例えば、the Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705参照）。タンパク質解析ソフトウェアは、種々の置換、欠失および他の改変に割り当てられた相同性の尺度を使用して類似配列を適合させる。保存的置換は、代表的には、以下の群内での置換を包含する：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【０１１８】
「実質的に類似した機能」は、野生型ＫＣＮＥ２核酸または野生型ＫＣＮＥ２ポリペプチドとの関連で改変された核酸または改変されたタンパク質の機能をいう。改変ポリペプチドは野生型ＫＣＮＥ２ポリペプチドに実質的に相同であり、実質的に同じ機能を有する。改変ポリペプチドは変化したアミノ酸配列を有してもよく、そして／または修飾アミノ酸を含んでもよい。機能の類似性に加えて、改変ポリペプチドは、より長い半減期のような他の有用な特性を有してもよい。改変ポリペプチドの機能（活性）の類似性は、野生型ＫＣＮＥ２ポリペプチドの活性と実質的に同じであってもよい。あるいは、改変ポリペプチドの機能（活性）の類似性は、野生型ＫＣＮＥ２ポリペプチドの活性より高くてもよい。改変ポリペプチドは、従来の技術を使用して合成されるか、または改変核酸によってコードされ、従来の技術を使用して生産される。改変核酸は従来の技術によって調製される。野生型ＫＣＮＥ２遺伝子機能に実質的に類似の機能を有する核酸は、上記の改変タンパク質を生産する。
【０１１９】
ポリペプチドの「フラグメント」、「部分」または「セグメント」は、少なくとも約５〜７個の連続したアミノ酸の、しばしば少なくとも約７〜９個の連続したアミノ酸の、代表的には少なくとも約９〜１３個の連続したアミノ酸の、最も好ましくは少なくとも約２０〜３０個またはそれ以上の連続したアミノ酸の、一続きのアミノ酸残基である。
本発明のポリペプチド（可溶性である場合）を、固相支持体（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、カラム充填材料（例えば、セファロースビーズ）、磁性ビーズ、グラスウール、プラスティック、金属、ポリマーゲル、セルまたは他の基材）に結合させてもよい。そのような支持体は、例えばビーズ、ウェル、ディップスティックまたは膜の形態を取ってもよい。
【０１２０】
「標的領域」とは、増幅および／または検出される核酸の領域をいう。「標的配列」なる語は、プローブまたはプローブが所望の条件下でそれとともに安定なハイブリッド形成する配列をいう。
【０１２１】
本発明の実施には、特に示さない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学および免疫学の従来の技術を用いる（例えば、Maniatis et al., 1982; Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1992; Glover, 1985; Anand, 1992; Guthrie and Fink, 1991参照）。ヒト遺伝子マッピング（ヒト第１染色体のマッピングを含む）のための技術および材料の一般的議論は、例えばWhite and Lalouel, 1988に提供される。
【０１２２】
組換えまたは化学合成核酸の調製：ベクター、形質転換、宿主細胞
多量の本発明のポリヌクレオチドを、適切な宿主細胞中での複製によって生産してもよい。所望のフラグメントをコードする天然または合成ポリヌクレオチドフラグメントを、原核または真核生物細胞中への導入およびその中での複製が可能な組換えポリヌクレオチド構築物（通常はＤＮＡ構築物）に組込む。通常、ポリヌクレオチド構築物は単細胞宿主（例えば、酵母または細菌）中での複製に適切であるが、培養哺乳動物または植物または他の真核生物細胞株への導入（ゲノム内の組み込みを伴うかまたは伴わない）を意図してもよい。本発明の方法によって生産された核酸の精製は、例えば、Sambrook et al., 1989またはAusubel et al., 1992に記載されている。
【０１２３】
本発明のポリヌクレオチドを、例えばBeaucage and Caruthers (1981)に記載のホスホルアミダイト法またはMatteucci and Caruthers (1981)に記載のトリエステル法による化学合成によって生産してもよく、市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機で実施してもよい。相補鎖を合成し、適切な条件下で鎖をアニールさせること、または適切なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を付加することのいずれかによって、化学合成の１本鎖生成物から２本鎖フラグメントを得てもよい。
【０１２４】
原核または真核生物宿主中への導入用に調製したポリヌクレオチド構築物は、宿主によって認識される複製システム（所望のポリペプチドをコードする意図されるポリヌクレオチドフラグメントを含む）を含んでもよく、好ましくはセグメントをコードするポリペプチドに作動可能に連結された転写および翻訳開始調節配列も含む。発現ベクターは、例えば、複製起点または自律複製配列（ＡＲＳ）、発現制御配列、プロモーター、エンハンサーならびに必要なプロセシング情報部位（例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、転写終結配列およびｍＲＮＡ安定化配列）を含んでもよい。そのようなベクターを当該分野で周知の、例えばSambrook et al., 1989またはAusubel et al., 1992に論じられる標準的な組換え技術によって調製してもよい。
【０１２５】
適切なプロモーターおよび他の必要なベクター配列は、宿主中で機能するように選択され、適切であれば、ＫＣＮＥ２遺伝子に天然に結合したものを含んでもよい。細胞株と発現ベクターとの作業可能な組合せの例は、Sambrook et al., 1989またはAusubel et al., 1992に記載されている（Metzger et al., 1988も参照）。多数の有用なベクターが当該分野において公知であり、Stratagene、New England Biolabs、Promega Biotechおよびその他のような販売業者から入手可能である。ｔｒｐ、ｌａｃ、ファージプロモーター、ｔＲＮＡプロモーターおよび解糖系酵素プロモーターのようなプロモーターを原核生物宿主において使用してもよい。有用な酵母プロモーターは、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素（例えば、エノラーゼまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、マルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素およびその他のプロモーター領域を包含する。酵母発現に使用するために適切なベクターおよびプロモーターはさらにHitzeman et al., EP 73,675Aに記載されている。適切な非天然哺乳動物プロモーターは、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター（Fiers et al., 1978）またはマウスモロニー白血病ウイルス、マウス腫瘍ウイルス、トリ肉腫ウイルス、アデノウイルスＩＩ、ウシパピローマウイルスもしくはポリオーマに由来するプロモーターを包含し得る。昆虫プロモーターはバキュロウイルスに由来し得る。さらに、、多コピーの遺伝子を作製するように、構築物を増幅可能遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）に連結してもよい。適切なエンハンサーおよび他の発現制御配列については、Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1982)も参照のこと。例えば、米国特許第5,691,198号；同第5,735,500号；同第5,747,469号；および同第5,436,146号も参照のこと。
【０１２６】
そのような発現ベクターは自律複製してもよいが、それらはまた当該分野において周知の方法によって、宿主細胞のゲノムに挿入されて複製してもよい。
【０１２７】
発現およびクローニングベクターはおそらく、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝子である選択マーカーを含む。この遺伝子の存在によって、インサートを発現する宿主細胞のみの増殖が保証される。代表的な選択遺伝子は、ａ）抗生物質または他の毒性物質（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートなど）に対する耐性を付与する、ｂ）栄養要求欠損を相補する、またはｃ）複合培地からは利用可能でない重要な栄養素を供給する（例えば、バチルス用のＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）タンパク質をコードする。適切な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、異なる宿主に適切なマーカーは当該分野において周知である。
【０１２８】
目的の核酸を含むベクターをイン・ビトロで転写し、生じたＲＮＡを宿主細胞に周知の方法（例えば、注入）（Kubo et al., 1988参照）によって導入することができる。あるいはベクターを宿主細胞に当該分野において周知の方法によって直接導入することができる。方法は細胞性宿主の種類に依存して変動し、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストランまたは他の物質を用いるトランスフェクション；マイクロプロジェクタイルボンバードメント；リポフェクション；感染（ベクターがレトロウイルスゲノムのような感染性因子である場合）；および他の方法を包含する（一般に、Sambrook et al., 1989およびAusubel et al., 1992参照）。当該分野において公知のいずれかの方法（とりわけ、上記の方法を包含する）による宿主細胞中へのポリヌクレオチドの導入は、本明細書において「形質転換」という。上記の核酸が導入された細胞は、その細胞の子孫も包含することを意味する。
【０１２９】
多量の本発明の核酸およびポリペプチドを、ベクターまたは他の発現ビヒクル中のＫＣＮＥ２核酸またはその部分を、適合する原核または真核生物宿主細胞において発現させることによって調製してもよい。最も一般的に使用される原核生物宿主はエシェリキア・コリ（Escherichi coli）であるが、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtlis）またはシュードモナス（Pseudomonas）のような他の原核生物を使用してもよい。
【０１３０】
哺乳動物あるいは他の真核生物宿主細胞（例えば、酵母、糸状菌、植物、昆虫または両生類もしくは鳥類種）も本発明のタンパク質の生産に有用であり得る。培養哺乳動物細胞の増殖自体は周知である（Jakoby and Pastan (eds.) (1979)参照）。一般に使用される哺乳動物宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびＷＩ３８、ＢＨＫ、およびＣＯＳ細胞株であるが、他の細胞株が、例えばより高い発現、所望のグリコシル化パターンまたは他の特徴を提供するために適切であり得ることは当業者によって理解される。一般に使用される昆虫細胞株の例はＳＦ９である。
【０１３１】
クローンは、ベクター構築の様式に依存してマーカーを使用することによって選択される。マーカーは同じかまたは異なるＤＮＡ分子（好ましくは同じＤＮＡ分子）上に存在してもよい。原核生物宿主においては、形質転換体を、例えばアンピシリン、テトラサイクリンまたは他の抗生物質に対する耐性によって選択してもよい。温度感受性に基く特定産物の生産も適切なマーカーとして作用し得る。
【０１３２】
本発明のポリヌクレオチドで形質転換された原核または真核生物細胞は、本発明の核酸およびポリペプチドの生産のみならず、例えばＫＣＮＥ２ポリペプチドの特徴の研究のためにも有用である。
【０１３３】
本明細書中に開示するＫＣＮＥ２遺伝子配列に基くプローブおよびプライマーは、他の種において相同なＫＣＮＥ２遺伝子配列およびタンパク質を同定するために使用される。これらの遺伝子配列およびタンパク質は、それが単離された種についての、本明細書に記載の診断／予後、治療および薬物スクリーニング法において使用される。
【０１３４】
使用法：薬物スクリーニング
本発明は、形質転換された細胞、トランスフェクトされた卵母細胞またはトランスジェニック動物においてＫＣＮＥ２、ＫＣＮＥ３またはＫＣＮＥ４タンパク質を使用することによる化合物のスクリーニングに特に有用である。ＫＣＮＥ２タンパク質のいずれかにおける変異は心臓ＩＫｓカリウムチャネルの機能を変化させる可能性があるので、候補薬物は、それぞれ、正常ＫＣＮＥ２タンパク質および変異ＨＥＲＧタンパク質、または変異ＨＥＲＧおよび変異ＫＣＮＥ２タンパク質のいずれかを含む細胞を使用して、チャネルに対する影響についてスクリーニングされる。薬物を培養細胞に添加するかまたはトランスジェニック動物に投与し、ＩＫｓカリウムチャネルの誘導電流に対する影響を、野生型ＨＥＲＧおよびＫＣＮＥ２を含有する細胞または動物の誘導電流に対して比較する。より正常なレベルまで誘導電流を変化させる薬物候補はＬＱＴの治療または予防に有用である。薬物スクリーニングに用い得る適当な電気生理学的方法は、実施例に記載されている。これらの方法は、卵母細胞または安定に形質転換された細胞に適用し得る。この方法において、ＫＣＮＥ２、ＫＣＮＥ３またはＫＣＮＥ４を含む電位依存性イオンチャネルへの薬物の効果を決定し得る。
【０１３５】
本発明は種々の薬物スクリーニング技術のいずれかにおいてＫＣＮＥ２ポリペプチドまたはその結合フラグメントを使用することによる化合物のスクリーニングに特に有用である。
【０１３６】
そのような試験において用いられるＫＣＮＥ２ポリペプチドまたはフラグメントは、溶液中で遊離しているか、固体支持体に固定されているか、または細胞表面上に保持されているかのいずれかであってもよい。薬物スクリーニング法の１つは、ポリペプチドまたはフラグメントを発現する組換えポリヌクレオチドで安定に形質転換された真核または原核生物宿主細胞を、好ましくは競合的結合アッセイにおいて利用する。そのような細胞（生存または固定形態のいずれか）を、標準的結合アッセイに使用することができる。例えば、ＫＣＮＥ２ポリペプチドまたはフラグメントと試験薬剤との間の複合体の形成について測定してもよく、またはＫＣＮＥ２ポリペプチドまたはフラグメントと既知のリガンドとの間の複合体の形成が試験薬剤によって妨害される程度を検討してもよい。
【０１３７】
従って、本発明は、薬剤をＫＣＮＥ２ポリペプチドまたはそのフラグメントと接触させる工程、および（ｉ）、薬剤とＫＣＮＥ２ポリペプチドまたはフラグメントとの間の複合体の存在、または（ｉｉ）ＫＣＮＥ２ポリペプチドまたはフラグメントとリガンドとの間の複合体の存在について当該分野において周知の方法によってアッセイする工程を包含する薬物のスクリーニング法を提供する。そのような競合的結合アッセイにおいて、ＫＣＮＥ２ポリペプチドまたはフラグメントは代表的には標識されている。遊離のＫＣＮＥ２ポリペプチドまたはフラグメントは、タンパク質：タンパク質複合体中に存在するものから分離され、遊離の（すなわち複合体化されていない）標識の量が、それぞれ試験薬剤のＫＣＮＥ２への結合の尺度、あるいはＫＣＮＥ２：リガンド結合の妨害の尺度となる。遊離ではなく結合ＫＣＮＥ２の量を測定してもよい。ＫＣＮＥ２ではなくリガンドを標識して、試験薬物の存在下または非存在下におけるリガンドのＫＣＮＥ２への結合量を測定することも可能である。
【０１３８】
別の薬物スクリーニング用技術は、ＫＣＮＥ２ポリペプチドに対する適切な結合親和性を有する化合物についての高処理量スクリーニングを提供し、これはGeysen（PCT公開公報WO 84/03564）に詳細に記載されている。簡潔に記載すると、多数の異なる小ペプチド試験化合物を固体基材（例えば、プラスティックピンまたは何らかの他の表面）上で合成する。ペプチド試験化合物をＫＣＮＥ２ポリペプチドと反応させ、洗浄する。次いで、結合したＫＣＮＥ２ポリペプチドを当該分野において周知の方法によって検出する。
【０１３９】
上記の薬物スクリーニング技術において使用するために、精製ＫＣＮＥ２を直接プレート上にコートすることができる。しかし、このポリペプチドに対する非中和抗体を抗体の捕獲のために使用して、ＫＣＮＥ２ポリペプチドを固相上に固定化することができる。
【０１４０】
本発明はまた、ＫＣＮＥ２ポリペプチドまたはそのフラグメントへの結合について、ＫＣＮＥ２ポリペプチドに特異的に結合する能力を有する中和抗体を試験化合物と競合させる競合的薬物スクリーニングアッセイの使用を意図する。この方法において、抗体を使用して、ＫＣＮＥ２ポリペプチドの抗原決定基の１つ以上を共有するいずれかのペプチドの存在を検出することができる。
【０１４１】
上記のスクリーニング法は、ＫＣＮＥ２のみを用いるアッセイに限定されるものではなく、ＫＣＮＥ２−タンパク質複合体の研究にも適用可能である。この複合体の活性に対する薬物の影響を分析する。
【０１４２】
以下のアッセイがこれらの方法に従って薬物候補のスクリーニングに使用できるアッセイの例である。
【０１４３】
変異ＫＣＮＥ２（それ自体または融合タンパク質の一部として）を、野生型ＫＣＮＥ２が結合する野生型タンパク質（それ自体または融合タンパク質の一部として）と混合する。この混合を、薬物の存在下および薬物の非存在下の両方で実施し、変異ＫＣＮＥ２と野生型タンパク質との結合量を測定する。結合量が薬物の不存在下よりも薬物の存在下において多い場合は、この薬物はＫＣＮＥ２における変異から生じるＬＱＴを治療するための薬物候補である。
【０１４４】
野生型ＫＣＮＥ２（それ自体または融合タンパク質の一部として）を、野生型ＫＣＮＥ２が結合する野生型タンパク質（それ自体または融合タンパク質の一部として）と混合する。この混合を、薬物の存在下および薬物の非存在下の両方で実施し、野生型ＫＣＮＥ２と野生型タンパク質との結合量を測定する。結合量が薬物の非存在下よりも薬物の存在下において多い場合は、この薬物はＫＣＮＥ２における変異から生じるＬＱＴを治療するための薬物候補である。
【０１４５】
野生型タンパク質のようにＫＣＮＥ２（それ自体または融合タンパク質の一部として）に結合する変異タンパク質を野生型ＫＣＮＥ２（それ自体または融合タンパク質の一部として）と混合する。この混合を、薬物の存在下および薬物の非存在下の両方で実施し、野生型ＫＣＮＥ２と変異タンパク質との結合量を測定する。結合量が薬物の非存在下よりも薬物の存在下において多い場合は、この薬物はこのタンパク質をコードする遺伝子における変異から生じるＬＱＴを治療するための薬物候補である。
【０１４６】
本発明のＫＣＮＥ２分子（ならびにＫＣＮＥ３およびＫＣＮＥ４分子）、なｒびに本明細書に記載するスクリーニングアッセイによって同定されるＫＣＮＥ２活性（例えば、ＫＣＮＥ２遺伝子発現）に対して刺激性または阻害性効果を有する剤またはモジュレータは、個体に投与して異常ＫＣＮＥ２活性に関連する障害を（予防的または治療的に）処理し得る。そのような処理に関連して、薬理遺伝子学（すなわち、個体の遺伝子型とその個体の外来の化合物もしくは薬物への反応と間の関係の研究）を考慮することができる。治療薬の代謝の差異は薬理学上活性な薬物の用量と血中濃度との間の関係を変えることによって重篤な毒性または治療の失敗をもたらし得る。かくして、医者または臨床医は、
ＫＣＮＥ２分子またはＫＣＮＥ２モジュレータを投与するかどうを決定し、ならびにＫＥＮＥ２分子またはＫＣＮＥ２モジュレータでの治療の用量および/または治療計画を仕立てるのに、関連する薬理遺伝子学研究において得られた知見を適用することを検討することができる。
【０１４７】
薬理遺伝子学は、罹患したヒトにおける変化した薬物特性および異常作用による薬物への反応において臨床学上明らかに遺伝性の変異を扱う。例えば、［Eichelbaum et al., (1996)］および［Linder et al. (1997)］を参照。一般に、２つのタイプの薬理遺伝子学的状態に分類し得る。薬物が体に作用する方法を変化させる単一因子（変化した薬物作用）として遺伝する遺伝子状態または体が薬物に作用する方法を変化させる単一因子（変化した薬物代謝）として遺伝する遺伝子状態。これらの遺伝子状態は稀な遺伝子欠損としてまたは普通に発生する多型性としてのいずれかで発生し得る。例えば、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）はよくある遺伝性酵素病であり、そこでの主たる臨床的合併症は酸化促進薬物（抗マラリア薬、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の消化およびファバビーンの消費後の溶血である。
【０１４８】
遺伝子を同定する一つの薬理遺伝子学的アプローチは、「ゲノムワイドな相関」として知られ、元来、既知の遺伝子関連マーカーからなるヒトゲノムの高解像度マップ（例えば、ヒトゲノム上の６０,０００〜１００,０００個の多型性または可変部位からなる「２対立遺伝子」遺伝子マーカーであり、それらの各々は２つの変異体を有する）に頼る。そのような高解像度マップは、ヒトゲノムにおける何千万もの知られた単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）から作成し得る。本明細書で用いるとき、「ＳＮＰ」はＤＮＡのストレッチ中の単一ヌクレオチド塩基に生じる一般的な変化である。例えば、ＳＮＰはＤＮＡの１０００塩基毎に１回起るであろう。ＳＮＰは疾患プロセスに関与するかもしれないが、大多数が疾患に関連しないであろう。そのようなＳＮＰの発生に基づく遺伝子マップを考えると、個体は、それら個体ゲノムにおける特定パターンのＳＮＰに依存する遺伝子カテゴリーに分類し得る。そのような方法において、そのような遺伝子的に類似する個体の中で共通するであろう特性を考慮して、治療計画を遺伝子的に類似する個体の群に仕立て得る。
【０１４９】
あるいは、「候補遺伝子アプローチ」という方法を用いて、薬物反応を予測する遺伝子を同定し得る。この方法によると、薬物標的をコードする遺伝子が知られていれば（例えば、本発明のＫＣＮＥ２タンパク質またはＫＣＮＥ２レセプター）、その遺伝子の全ての共通する変異体は個体群中でかなり容易に同定し得、該遺伝子の一つのバージョンをもう一つのものに対して有していることが特定の薬物反応に関連しているかどうかを決定し得る。
【０１５０】
例示的な具体例として、薬物代謝酵素の活性は薬物作用の強度および持続性の両方の主要な決定因子である。薬物代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびシトクロムＰ４５０、酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝子多型性の発見は、何人かの患者が期待される薬物効果を得ないか、あるいは、何故誇張された薬物反応を示し、標準および安全用量の薬物の摂取後に重大な毒性を示すのかに関する説明を提供した。これらの多型性は個体群中の２つの発現型において発現する；エクテンシブ・メタボライザー（extensive metabolizer; ＥＭ）およびプアー・メタボライザー（poor metabolizer; ＰＭ）。ＰＭの流行は異なる個体群の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６についての遺伝子コーディングは高度に多型性であり、いくつかの変異あＰＭにおいて同定され、それは全て機能性ＣＹＰ２Ｄ６の不存在をもたらす。ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９のプアー・メタボライザーは、彼らが標準用量を受けたときに、非常にしばしば、誇張された薬物反応を経験する。もし、代謝物が活性治療部位であれば、ＣＹＰ２Ｄ６−形成代謝物モルヒネにより媒介されるコデインの鎮痛効果につき証明されるように、ＰＭは治療的反応を示さない。他方の極端は、標準用量に反応しないいわゆる超高速メタボライザーである。最近、超高速メタボライザーの分子ベースはＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅によるものであると確認された。ＭｉｎＫ関連ペプチドでの類似の解析は遺伝子型と薬物効果とを相関付ける。
【０１５１】
あるいは、「遺伝子発現プロファイリング」という方法を用いて、薬物反応を予想する遺伝子を同定し得る。例えば、薬物（例えば、本発明のＫＣＮＥ２分子またはＫＣＮＥ２モジュレータ）を投与された動物の遺伝子発現は毒性に関係する遺伝子経路が興奮しているかどうかの指示を与える。
【０１５２】
１以上の上記した薬理遺伝子学的アプローチから生じた情報を用いて、個体を予防的または治療的に処理するための適切な用量および治療計画を決定し得る。この知見は、投与または薬物選択に適用する場合、不都合な反応または治療上の失敗を回避し得、かくして、ＫＣＮＥ２分子または、本明細書に記載された例示のスクリーニングアッセイの一つにより同定されたモジュレータのごとき、ＫＣＮＥ２モジュレータで対象を治療するときの治療的もしくは予防的効力を増強する。
【０１５３】
使用法:合理的な薬物設計
合理的薬物設計の目的は、例えば、ポリペプチドのより活性なまたは安定な形態である薬物であって、例えばイン・ビボでポリペプチドの機能を高める、または、それに妨害する薬物を形成するために、目的の生物活性ポリペプチドまたはそれらが相互作用する小分子（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、インヒビター）の構造アナログを製造することである。合理的な薬物デザインに用いるいくつかのアプローチは、三次元構造解析、アラニンスキャン、分子モデリングおよび抗−ｉｄ抗体の使用を含む。これらの技術は当業者によく知られており、各々、出典明示して本明細書の一部とみなされる米国特許第５,８３７,４９２；５,８００,９９８；５,８９１,６２８号に記載されたものを含む。
【０１５４】
かくして、例えば改良されたＫＣＮＥ２ポリペプチド活性または安定性を有する、またはＫＣＮＥ２ポリペプチド活性のインヒビター、アゴニスト、アンタゴニストなどとして作用する薬物を設計することができる。クローン化したＫＣＮＥ２配列の入手可能性により、十分量のＫＣＮＥ２ポリペプチドを、Ｘ線結晶学のような分析研究を行うために利用することができる。加えて、本明細書中に提供されるＫＣＮＥ２タンパク質配列に関する知識は、Ｘ線結晶学に代わる、またはそれに加えるコンピューターモデリング法を用いているものをガイドする。
【０１５５】
本発明のポリペプチドをコンビナトリアルライブラリー技術の結果として開発された化合物をスクリーニングするために使用してもよい。コンビナトリアルライブラリー技術は、ポリペプチドの活性を調節する能力について潜在的な膨大な数の異なる物質を試験する効率的な方法を提供する。そのようなライブラリーおよびその使用は当該分野において公知である。ペプチドライブライーの使用が好ましい（例えば、WO 97/02048参照）。
【０１５６】
簡潔に記載すると、ポリペプチドの活性を調節する物質についてのスクリーニング法は、適切な反応媒質中での１個以上の試験物質のポリペプチドとの接触、処理されたポリペプチドの活性の試験、およびその活性の試験物質（単数または複数）で処理していない匹敵する反応媒質中のポリペプチドの活性との比較を包含し得る。処理ポリペプチドと未処理ポリペプチドとの間の活性の差異が、関連する試験物質（単数または複数）の調節効果の指標となる。
【０１５７】
活性の調節についてのスクリーニングの前にまたはそれとともに、試験物質をポリペプチドと相互作用する能力について、例えば、酵母ツーハイブリッドシステム（例えば、Bartel et al., 1993; Fields and Song, 1989; Chevray and Nathans, 1992; Lee et al., 1995）においてスクリーニングしてもよい。このシステムを、ポリペプチドの活性を調節する実際の能力について物質を試験する前の粗スクリーニングとして使用してもよい。あるいは、スクリーニングを、試験物質をＫＣＮＥ２特異的結合パートナーへの結合についてスクリーニングするために、またはＫＣＮＥ２ポリペプチドの模倣物を見出すために使用し得る。
【０１５８】
ポリペプチド活性を調節するかまたはそれに影響を及ぼす物質の同定の後に、この物質をさらに研究してもよい。さらに、これを調製物（すなわち、製品もしくは処方物）または医薬、医薬組成物もしくは薬物のような組成物中で製造および／または使用してもよい。
【０１５９】
従って、本発明は、種々の態様において、本明細書の開示に従って核酸分子を使用してポリペプチド活性のモジュレーターとして同定された物質のみならず、その物質を含有する医薬組成物、医薬、薬物または他の組成物、その物質を含有するその組成物の投与を包含する方法、例えばＬＱＴの治療（予防的処置を含み得る）のためのその組成物の患者への投与を包含する方法、例えばＬＱＴの治療のための投与用組成物の製造におけるその物質の使用、および医薬上許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体および所望により他の成分とその物質とを混合する工程を包含する医薬組成物の製造方法にも拡張される。
【０１６０】
ポリペプチド機能のモジュレーターとして同定された物質はペプチド性または非ペプチド性であってもよい。非ペプチド「低分子」が、多くのイン・ビトロにおける医薬用途にしばしば好ましい。従って、物質の模倣物（特にペプチドの場合）を医薬用途のために設計してもよい。
【０１６１】
公知の医薬上活性な化合物に対する模倣物の設計は、「リード」化合物に基いた医薬品の開発への公知のアプローチである。活性化合物の合成が困難であるかもしくは高価である場合、または特定の投与方法に不適切である場合（例えば、純粋なペプチドは、消化管中のプロテアーゼによって迅速に分解される傾向があるので経口組成物に不適切な活性薬剤である）に、これが所望され得る。一般に、模倣物の設計、合成および試験は、標的特性について多数の分子をランダムにスクリーニングすることを回避するために使用される。
【０１６２】
所定の標的特性を有する化合物からの模倣物の設計においていくつかの工程が一般にとられる。第１に、標的特性の決定において重大および／または重要な化合物の特定の部分を決定する。ペプチドの場合、これはペプチド中のアミノ酸残基を系統的に変動させることによって（例えば、各残基を順に置換することによって）行うことができる。ペプチドのアラニンスキャンがそのようなペプチドモチーフを精錬するために一般に使用されている。化合物の活性領域を構成するこれらの部分または残基はその「ファルマコフォア」として知られている。
【０１６３】
一旦ファルマコフォアが見出されれば、その構造はその物理的特性（例えば、立体化学、結合、大きさおよび／または電荷）に従って、一連の供給源（例えば、分光技術、Ｘ線回折データおよびＮＭＲ）からのデータを使用してモデリングされる。コンピューター解析、類似性マッピング（これは、原子間の結合ではなく、ファルマコフォアの電荷および／または体積をモデリングする）ならびに他の技術をこのモデリングプロセスにおいて使用することができる。
【０１６４】
このアプローチの変形において、リガンドの三次元構造およびその結合パートナーをモデリングする。リガンドおよび／または結合パートナーが結合に際してコンホメーションを変化させる場合に、これは特に有用であり得、模倣物の設計においてこれを考慮にいれたモデリングが可能となる。
【０１６５】
次いで、ファルマコフォアを模倣する化学基をグラフトできる鋳型分子を選択する。鋳型分子およびそれにグラフトされる化学基は、模倣物の合成が容易になるように簡便に選択することができ、薬理学上許容されそうであり、イン・ビボにおいて分解せず、リード化合物の生物活性を保持している。あるいは、模倣物がペプチドに基く場合、ペプチドを環化させてその剛性を増加させることによって、さらなる安定性を達成することができる。次いで、このアプローチによって見出された模倣物を、それが標的特性を有しているかどうか、またはどの程度それを示すかを見るためにスクリーニングすることができる。次いで、さらなる至適化または改変を実施して、イン・ビボまたは臨床試験用の１個以上の最終模倣物に到達することができる。
【０１６６】
使用法:核酸診断および診断キット
個体をＬＱＴに罹患し易くしているＫＣＮＥ２対立遺伝子の存在を検出するために、血液のような生物試料を調製し、ＫＣＮＥ２感染性対立遺伝子の存在または不在を分析する。ＬＱＴの存在を検出するために、または予後の指標として、生物試料を調製し、ＫＣＮＥ２の変異対立遺伝子の存在または不在を分析する。これらの試験の結果と解釈情報は、試験した個体へ連絡するためにヘルスケアプロバイダーに返す。そのような診断は、診断試験所により行われ得、またはこれとは別に、診断キットを作成し、ヘルスケアプロバイダーまたは自己診断のための民間の個人に販売する。
初めに、スクリーニング法は関連するＫＣＮＥ２配列の増幅を含む。発明のもう一つの好ましい態様においては、スクリーニング法は非ＰＣＲ準拠法を含む。そのようなスクリーニング法は、当該分野で周知の２段階の標識増幅法を含む。ＰＣＲ準拠スクリーニング法も非ＰＣＲ準拠スクリーニング法も、高レベルの感度で標的配列を検出することができる。
【０１６７】
今日使用されている最もポピュラーな方法は、ターゲット増幅である。ここでターゲット核酸配列は、ポリメラーゼを用いて増幅する。ポリメラーゼ駆動増幅を用いる一つの特に好ましい方法は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）である。ポリメラーゼ鎖反応および他のポリメラーゼ駆動増幅アッセイにより、ポリメラーゼ駆動増幅サイクルの使用によるコピー数の百万倍以上の増加を達成することが可能となる。一旦増幅されれば、生じた核酸を配列決定し、ＤＮＡプローブのための基体として用いることができる。
プローブをターゲット配列の存在を検出するために用いる場合、血液または血清のような分析されるべき生物試料を処理して、所望により核酸を抽出することができる。試料核酸は、ターゲット配列の検出を促進するために種々の方法、例えば変性、制限消化、電気泳動またはドットブロッティングで調製することができる。プローブの標的配列とでハイブリッドを形成するために、分析物核酸の標的領域は通常、少なくとも部分的に一本鎖でなければならない。配列が本来一本鎖である場合、変性は必要とされない。しかしながら、配列が二本鎖である場合、配列は好ましくは変性される必要がある。変性は当該分野で公知の種々の方法により行うことができる。
【０１６８】
分析物核酸およびプローブは、プローブ中の標的配列の、分析物中の推定標的配列との安定なハイブリッド形成を促進する条件下でインキュベートする。分析物に結合させるために用いるプローブの領域は、ＫＣＮＥ２の標的領域に完全に相補的であるようにすることができる。それゆえ、偽陽性を防ぐために、高ストリンジェンシー条件が望ましい。しかし、プローブが該ゲノムにユニークな染色体の領域に相補的である場合にのみ、高ストリンジェンシー条件を用いる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度、塩基組成、プローブの長さおよびホルムアミドの濃度を含めた、ハイブリダイゼーション中および洗浄工程中の多くの要因により決定する。これらの要因は、例えばManiatis et al., 1982およびSambrook et al., 1989に概説されている。ある条件下では、三量体、四量体などのような高次のハイブリッドの形成が、ターゲット配列を検出する手段を提供するために所望される可能性がある。
【０１６９】
生じたハイブリッドの検出は、もし存在すれば、通常、標識プローブの使用により成し遂げられる。これとは別に、プローブは標識されなくてもよいが、直接的にまたは間接的に標識したリガンドとの特異的結合により検出することもできる。適当な標識および、プローブとリガンドを標識するための方法は当該分野で公知であり、例えば公知方法（例えばニックトランスレーション、ランダムプライムプライミングまたはキナージング）により取り込まれることができる放射性標識、ビオチン、蛍光基、ケミルミネセンス基（例えばジオキシエタン、特にトリガーされたジオキシエタン）、酵素、抗体、金ナノ粒子などが含まれる。この基本スキームのバリエーションは当該分野で公知であり、外来物質からの検出すべきハイブリッドの分離を促進するバリエーション、および／または標識部分からのシグナルを増幅するバリエーションが含まれる。多くのこれらのバリエーションは、例えばMatthews and Kricka, 1988;Landegren et al., 1988; Mifflin, 1989; U.S.Patent 4,868,105;および、EPO Publication No. 225,807に概説されている。
【０１７０】
前記のように、非ＰＣＲ準拠スクリーニングアッセイが、本発明においても企図される。この方法により、核酸プローブ（または、通常のホスホジエステルを置換しているメチルホスホネートバックボーンのようなアナログ）が低レベルのＤＮＴターゲットにハイブリダイズする。このプローブは、プローブに共有結合している酵素を持ち、該共有結合はハイブリダイゼーションの特異性を妨害しない。この酵素-プローブ-コンジュゲート-標的核酸複合体を、次いで遊離プローブ酵素コンジュゲートから単離することができ、基質を酵素検出のために添加する。酵素活性は、発色または発光出力の変化として観察され、１０３-１０６の感度増加となる。オリゴデオキシヌクレオチド-アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートの調製およびそのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に関する例としては、Jablonski et al. (1986)を参照されたい。
【０１７１】
２段階の標識増幅法が当該分野で公知である。これらのアッセイは、小さいリガンド（ジゴキシゲニン、ビオチンなど）を、ＫＣＮＥ２に特異的に結合することができる核酸プローブに結合させるという原則に基づいて機能する。対立遺伝子特異的プローブも本実施例の範囲内に意図され、例示的な対立遺伝子特異的プローブには、本特許出願の素因変異を包含しているプローブが含まれる。
一例では、核酸プローブに結合させた小リガンドが抗体-酵素コンジュゲートにより特異的に認識される。本実施例の一態様において、ジゴキシゲニンを核酸プローブに結合させる。ハイブリダイゼーションを、ケミルミネセンス基質に代わる抗体-アルカリ性ホスファターゼコンジュゲートにより検出する。本具体例による核酸プローブを標識するための方法に関しては、Martin et al., 1990を参照されたい。第二の例においては、小リガンドが第一リガンドに特異的に複合させることができる第二リガンド-酵素コンジュゲートにより認識される。本例の周知の具体例はビオチン-アビジンタイプの相互作用である。核酸プローブを標識するための方法およびビオチン-アビジン準拠アッセイにおけるその使用に関しては、Rigby et al., 1977およびNguyen et al., 1992を参照されたい。
【０１７２】
本発明の核酸プローブアッセイが、ＫＣＮＥ２を検出することができる核酸プローブのカクテルを用いるということも本発明の範囲内に意図される。つまり、ＫＣＮＥ２の細胞試料中での存在を検出するための一例においては、遺伝子に相補的な１を超えるプローブを用い、および特に、異なるプローブの数は、これとは別に、２、３、または５の異なる核酸プローブ配列である。もう一つの例において、患者におけるＫＣＮＥ２遺伝子配列の変異の存在を検出するために、これらの遺伝子に相補的な１を超えるプローブを使用し、ここでカクテルには、はＫＣＮＥ２に関して改変を有する多くの患者において同定される対立遺伝子特異的変異に対して結合することができるプローブが含まれる。この態様においてはいずれの数のプローブも使用することができ、好ましくは、個体をＬＱＴに罹患し易くしているとみなされる主要遺伝子変異に対応するプローブが含まれる。
【０１７３】
使用法:ペプチド診断および診断キット
ＬＱＴの存在は、野生型ＫＣＮＥ２ポリペプチドの改変に基づいて検出することもできる。そのような変更は、常法に従う配列分析により決定することができる。より好ましくは、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）を用い、ＫＣＮＥ２ペプチドの差、またはその不存在を検出する。抗体を生起させ、かつ精製する方法は当該分野で周知であり、そのような方法のいずれも、本発明中にクレームする調製を達成するために選択することができる。本発明の好ましい態様において、抗体は溶液からはＫＣＮＥ２タンパク質を免疫沈降させ、ならびにウエスタンまたは、ポリアクリルアミドゲルの免疫ブロット上でこれらのタンパク質と反応する。もう一つの好ましい態様において、抗体はパラフィンまたは凍結組織セクションにおいて、免疫細胞化学法を用いてＫＣＮＥ２タンパク質を検出する。
【０１７４】
ＫＣＮＥ２またはその変異を検出するための方法に関する好ましい態様には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射分析アッセイ（ＩＲＭＡ）および、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチアッセイを含む免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）が含まれる。典型的なサンドイッチアッセイは、David et al., in U.S.Patent Nos.4,376,110および4,486,530に記載されており、出典明示して本明細書の一部とみなす。
【０１７５】
使用法:遺伝子治療
本発明により、それぞれ変異ＫＣＮＥ２対立遺伝子を担う細胞に野生型はＫＣＮＥ２機能を供給する方法も提供される。そのような機能を供給することにより、受容細胞の正常な機能化がが可能となる。野生型遺伝子または該遺伝子の部分は、遺伝子が染色体外に留まるようにベクターにて細胞に導入することができる。そのような場合に、遺伝子は、染色体外の場所から細胞により発現される。より好ましいのは、野生型遺伝子またはその部分を、それが細胞中に存在する内在性変異遺伝子と組み換えられるように、変異細胞に導入する場合である。そのような組換えは、遺伝子変異の修正に帰着する二重組換え現象を必要とする。組換えおよび染色体外での維持両方のための遺伝子の導入のためのベクターは当該分野で公知であり、いずれの適当なベクターを用いてもよい。電気泳動、リン酸カルシウム共沈殿およびウイルス形質導入のような、ＤＮＡを細胞に導入するための方法は、当該分野で公知であり、方法の選択は医師の能力内にある。
前に広く論じたように、ＫＣＮＥ２遺伝子またはフラグメントは、適切な場合に、細胞中でのそのような遺伝子の発現生成物の量を増すために、遺伝子治療法において用いることができる。「正常」レベルで変種遺伝子が発現されるが、遺伝子産物が充分には機能的ではない心臓細胞においてすら所定ＬＱＴ遺伝子の発現のレベルを増すのに有用でもあり得る。
【０１７６】
遺伝子治療は、例えばFriedman(1991)またはCulver(1996)により記載されるように、一般に許容される方法に従い行う。患者からの細胞を、まず前記の診断法により、ＫＣＮＥ２ポリペプチドの細胞中での産生を確認するために分析する。発現コントロールエレメントに結合したＫＣＮＥ２遺伝子のコピーを含み、細胞内で複製することができるウイルスまたはプラスミドベクター（次のさらなる説明を参照されたい）を調製する。該ベクターは細胞内で複製することもできる。これとは別に、ベクターは複製欠乏性であってもよく、遺伝子治療で用いるためにヘルパー細胞中で複製される。適当なベクターは、U.S.Patent 5,252,479およびPCT公開出願WO93/07282およびU.S.Patent Nos.5,691.198;5,747,469;5,436,146および5,753,500に開示されるように公知である。ベクターを次いで患者に注射する。感染遺伝子が標的細胞のそれぞれのゲノムに永続的に導入されない場合は、該治療は周期的に繰り返えさなければならないであろう。
【０１７７】
当該分野で公知の遺伝子導入系は、本発明の遺伝子治療法の実施に有用であろう。これらには、ウイルスおよび非ウイルス導入法が含まれる。パポバウイルス（例えばSV40、Madzak et al., 1992)、アデノウイルス(Berkner, 1992; Berkner et al., 1988; Gorziglia and Kapikian, 1992; Quantin et al., 1992;Rosenfeld et al., 1992; Wilkinson and Akrigg, 1992; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Schneider et al., 1998)、ワクシニアウイスル(Moss, 1992; Moss, 1996)、アデノ関連ウイルス(Muzyczka, 1992; Ohi et al., 1990; Russell and Hirata, 1998)、ＨＳＶおよびＥＢＶを含むヘルペスウイルス(Margolskee, 1992; Johonson et al., 1992; Fink et al., 1992; Breakefield and Geller, 1987; Freese et al., 1990; Fink et al., 1996)、レンチウイルス(Naldini et al., 1996)、シンドビスおよびセムリキ・フォレスト・ウイルス(Berglund et al., 1993)およびトリのレトロウイルス(Bandyopadhyay and Temin, 1984; Petropoulos et al, 1992)、ネズミ(Miller, 1992; Miller et al., 1985; Sorge et al., 1984; Mann and Baltimore, 1985; Miller et al., 1988)およびヒト起源(Shimada et al., 1991; Helseth et al., 1990; Page et al., 1990; Buchshacher and Panganiban, 1992)を含む多数のウイルスを遺伝子導入ベクターとして、または遺伝子導入ベクターを修復するための基礎として用いることが出来た。ほとんどのヒト遺伝子治療プロトコルは、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスもまた用いられるが、無能力化したネズミのレトロウイルスに基くものであった。
【０１７８】
当該分野で公知の非ウイルス遺伝子導入法には、リン酸カルシウム共沈殿（Graham and van der Eb, 1973; Pellicer et al., 1980);機械的方法、例えばマイクロインジェクション(Anderson et al., 1980; Gordon et al., 1980; Brinster et al., 1981; Costantini and Lacy, 1981);リポソームを介する膜融合媒介導入(Felgner et al., 1987; Wang and Huang, 1989; Kaneda et al., 1989; Stewart et al., 1992; Nabel et al., 1990; Lim et al., 1991);および直接ＤＮＡ摂取およびレセプター媒介ＤＮＡ導入（Wolff et al., 1990; Wu et al., 1991; Zenke et al., 1990; Wu et al., 1989; Wolff et al., 1991; Wagner et al., 1990; Wagner et al., 1991; Cotten et al., 1990; Curiel et al., 1992; Curiel et al., 1991)のような化学法が含まれる。ウイルス媒介遺伝子導入は、リポソーム送達を用いる直接イン・ビボ遺伝子導入と組み合わせることができ、ウイルスベクターを腫瘍細胞へ指し向け、周りの非分裂細胞には指し向けないことを可能にする。これとは別に、レトロウイルスベクター産生細胞系統を腫瘍に注射することができる（Culver et al., 1992)。次いで、産生細胞の注射により、ベクター粒子の継続的供給源が提供される。この技術は手術不能の脳腫瘍を有するヒトにおける使用で認可されている。
【０１７９】
生物学的および物理的遺伝子導入法を組み合わせるアプローチにおいては、いずれかのサイズのプラスミドＤＮＡを、アデノウイルスヘキソンタンパク質に特異的なポリリジンコンジュゲーテッド抗体と結合させ、生じた複合体をアデノウイルスベクターに結合させる。３分子複合体を次いで使用して、細胞を感染させる。アデノウイルスベクターは、連結されたＤＮＡが損なわれる前に効果的な結合、内部化およびエンドソームの分解を可能にする。アデノウイルス準拠ベクターの送達のための他の方法に関しては、Schneider et al.(1998)およびU.S.Patent Nos.5,691,198;5,747,469;5,436,146および5,753,500を参照されたい。
リポソーム／ＤＮＡ複合体が直接イン・ビボ遺伝子導入を媒介することができることはすでに示されている。標準的なリポソーム調製物においては、遺伝子プロセスは非特異的であるが、局在化されたイン・ビボ摂取および発現が、例えば直接イン・サイチュ投与後の腫瘍沈積物において、報告されている(Nabel, 1992)。
【０１８０】
遺伝子治療の文脈において発現ベクターは、その中にクローン化されたポリヌクレオチドを発現するのに十分な配列を含む構築物を含むことを意味する。ウイルス発現ベクターにおいては、該構築物は、該構築物のパッケージングを支持するのに十分なウイルス配列を含む。ポリヌクレオチドがＫＣＮＥ２をコードする場合、発現によりＫＣＮＥ２が生じる。ポリヌクレオチドがアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムをコードする場合、発現によりアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザイムが生じる。つまりこの文脈においては、発現は、タンパク質産物が合成されることを必要としない。発現ベクターにクローン化されたポリヌクレオチドに加えて、ベクターは真核細胞において機能し得るプロモーターをも含む。クローン化したポリヌクレオチド配列は、このプロモーターの制御下にある。適当な真核プロモーターには、前記のものが含まれる。発現ベクターは前記の選択マーカーおよび他の配列のような配列をも含むことができる。
【０１８１】
ＤＮＡを直接心臓組織にターゲットする遺伝子導入法が好ましい。レセプター媒介遺伝子導入は、例えば、（通常、共有結合閉鎖したスーパーコイル化したプラスミドの形態の）ＤＮＡの、たんぱく質リガンドへのポリリジンを媒介とする結合により成し遂げられる。リガンドは、標的細胞／組織型の細胞表面上の対応するリガンドレセプターの存在に基いて選択する。これらのリガンド-ＤＮＡコンジュゲートは所望により血液に直接注入することができ、レセプター結合および、ＤＮＡ-タンパク質複合体の内部化が起こる標的組織へ指向される。ＤＮＡの細胞内破壊の問題を克服するために、アデノウイルスとの共感染が、エンドソーム機能を壊すために含まれ得る。
治療は次のようである：ＫＣＮＥ２感染性対立遺伝子を担う患者を、その心臓プレカーサー細胞のいくらかまたは全てが機能的に正常なＫＣＮＥ２対立遺伝子の少なくとも一つの追加コピーを受容するように、遺伝子送達ビヒクルを用いて処理する。このステップにおいて、治療した個体は、感染性対立遺伝子の効果が、正常な対立遺伝子の存在により打ち消される程度まで、ＬＱＴのリスクが低下した。
【０１８２】
使用法:ペプチド治療
ＫＣＮＥ２活性を有するペプチドを、変異または欠失ＫＣＮＥ２対立遺伝子を有する細胞に供給することができる。タンパク質は細菌中で、例えば公知の発現ベクターを用いてｃＤＮＡ配列の発現により製造することができる。これとは別に、ＫＣＮＥ２ポリペプチドは、ＫＣＮＥ２産生哺乳類細胞から抽出することができる。加えて、該合成化学法を用いてＫＣＮＥ２タンパク質を合成することができる。そのような方法のいずれも、ＫＣＮＥ２タンパク質を含む本発明の調製物を提供することができる。該調製物は、他のヒトタンパク質とは実質的に異なる。これは微生物中またはイン・ビボでの合成により非常に容易に達成される。
【０１８３】
活性ＫＣＮＥ２分子は、例えばマイクロインジェクションにより、またはリポソームの使用により細胞に導入することができる。これとは別に、いくらかの活性分子が細胞により能動的に、または拡散により取りこまれることができる。ＫＣＮＥ２活性を有する分子の提供により、ＬＱＴの部分的逆転が導かれる。ＫＣＮＥ２活性を有する他の分子（例えばペプチド、薬物または有機化合物）を、そのような逆転をもたらすために使用することもできる。実質上類似する機能を有する修飾ポリペプチドも、ペプチド治療のために用いる。
【０１８４】
使用法:形質転換宿主
治療薬を試験するための動物は、全動物の突然変異誘発後または生殖細胞または接合子の処理後に選択することができる。そのような処理には、通常第二動物種由来の変異ＫＣＮＥ２対立遺伝子の挿入ならびに破壊された相同遺伝子の挿入が含まれる。これとは別に、動物の内在性ＫＣＮＥ２遺伝子を、常法(Capecchi, 1989; Valancius and Smithies, 1991; Hasty et al., 1991; Shinkai et al., 1992; Mombaerts et al., 1992; Philpott et al., 1992; Snouwaert et al., 1992; Donehower et al., 1992)を用いる挿入または欠失変異または他の遺伝子改変により破壊してもよい。試験物質を動物に投与した後に、ＬＱＴの存在を評価しなければならない。試験物質がＬＱＴの出現を予防または抑制する場合、該試験物質はＬＱＴの治療のための候補治療薬である。これらの動物モデルにより、潜在的な治療生成物のための非常に重要な試験ビヒクルが提供される。常法が用いられ、各々、出典明示して本明細書の一部とみなされる米国特許第５,８３７,４９２、５,８００,９９８および５,８９１,６２８号に記載されたものを含む。
【０１８５】
ＬＱＴの前兆診断は、心電図上のＱＴ長期化の同定に依存してきた。不幸にも、心電図は、若く健康な個体においてはめったに行われない。加えて、多くのＬＱＴ遺伝子キャリアは比較的正常なＱＴ間隔を有し、疾患の第一のサインは致命的な心臓不整脈である可能性がある(Vincent et al., 1992)。今回、多くのＬＱＴ遺伝子が同定され、ＬＱＴと関連付けられ、この疾患に関する遺伝子試験を企図することが可能となる。これは継続変異解析およびさらなるＬＱＴ遺伝子の同定を必要とする。より詳細な表現型分析を用いて、ＬＱＴの変異型の間の表現型の違いが発見される可能性がある。これらの違いは診断および治療に有用となる可能性がある。
【０１８６】
ＫＣＮＥ２遺伝子変異とＬＱＴの間の関連性の同定により、ＬＱＴを発症する危険にある人を同定するための、個体の早期前兆スクリーニングが可能となる。そのような個体を同定するために、ＫＣＮＥ２対立遺伝子を、直接に、または対立遺伝子のクローニングの後に変異に関してスクリーニングする。対立遺伝子を、正常対立遺伝子からの核酸配列の違いの存在に関して、以下の方法を含むがそれには限られないいずれかの適当な方法を用いて試験する。：蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、直接ＤＮＡ配列決定、ＰＦＧＥ分析、サザンブロット分析、一本鎖コンホメーション解析（ＳＳＣＰ）、連鎖解析、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ドットブロット分析およびＰＣＲ-ＳＳＣＰ分析。ＤＮＡマイクロチップ法に関する最近開発された方法も有用である。例えば、（１）クローン化した対立遺伝子および正常なＫＣＮＥ２遺伝子両方のヌクレオチド配列または適当なフラグメント（コーディング配列またはゲノム配列）を決定し、および次いで比較するか、または、（２）ＫＣＮＥ２遺伝子または遺伝子フラグメントのＲＮＡの転写産物を、試験される個体からの一本鎖全ゲノムＤＮＡにハイブリダイズさせ、生じたヘテロ二本鎖をリボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅＡ）で処理し、いずれかのミスマッチの位置を検出するために変性ゲル上に流す；かのいずれかである。これらの方法の２つは、以下の方法に従って行うことができる。
【０１８７】
試験すべき個体におけるＫＣＮＥ２遺伝子の対立遺伝子を常法を用いてクローン化する。例えば、血液試料を個体から採取する。この試料中の細胞から単離したゲノムＤＮＡを部分的に約２０ｋｂの平均フラグメントサイズに部分消化する。１８-２１ｋｂの範囲のフラグメントを単離する。生じたフラグメントを適当なベクターに連結する。クローンの配列を次いで決定し、正常なＫＣＮＥ２遺伝子と比較する
これとは別に、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲｓ）を５’領域のためのプライマー対またはＫＣＮＥ２遺伝子のエキソンのためのプライマー対を用いて行う。ＰＣＲを次いで正常ＫＣＮＥ２遺伝子のいずれかの配列に基くプライマー対を用いて行うこともできる。例えば、イントロンの一つのためのプライマー対を調製し、利用することができる。最終的に、ＲＴ-ＰＣＲをｍＲＮＡに関して行うこともできる。次いで、増幅産物を一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）により常法を用いて解析し、いずれかの違いを同定し、次いで、これらを配列決定し、正常な遺伝子配列と比較する。
【０１８８】
個体は、適当なプライマー対を用いて個体のＤＮＡを増幅することにより、および、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いるドット-ブロットハイブリダイゼーションにより増幅された産物を分析することにより、共通のＫＣＮＥ２遺伝子変種を迅速にスクリーニングすることができる。
第二の方法は、正常なＫＣＮＥ２遺伝子と欠損遺伝子の間の違いの検出を支援するためにＲＮａｓｅＡを用いる。この比較は、プローブとしてＫＣＮＥ２遺伝子の小さな（〜５００ｂｐ）制限フラグメントを用いるステップにて行う。まず、ＫＣＮＥ２遺伝子を、遺伝子配列を約５００ｂｐのフラグメントに切断する制限酵素を用いて消化する。これらのフラグメントを電気泳動ゲル上で分離し、ゲルから精製し、個々に、両定位にてＳＰ６ベクター（例えばｐＳＰ６４またはｐＳＰ６５）にクローン化する。ＫＣＮＥ２遺伝子フラグメントのインサートを含むＳＰ６に基くプラスミドを当該分野で周知のＳＰ６転写系を、［α-３２Ｐ］ＧＴＰの存在下で用いてイン・ビトロで転写し、遺伝子の両鎖の放射能標識ＲＮＡ転写産物を生成する。
【０１８９】
個々に、常法を用い、対立遺伝子ＤＮＡを用いてヘテロ二量体を形成するために、これらのＲＮＡ転写産物を使用する。ＫＣＮＥ２フラグメントと個体からのＫＣＮＥ２対立遺伝子サブクローンの間の配列の違いによるＲＮＡ:ＤＮＡヘテロ二本鎖に生じるミスマッチは、ＲＮａｓｅＡを用いて処理すると、ＲＮＡ鎖の開裂を生じる。そのようなミスマッチは、点変異または個体の対立遺伝子の小欠失の結果である可能性がある。ＲＮＡ鎖の開裂により、変性ゲル上でＲＮＡプローブそのものよりも早く移動する２またはそれ以上の小ＲＮＡフラグメントが得られる。
見出されるいずれの違いも、ＫＣＮＥ２遺伝子の分子変種を有する個体および、その結果としてのＱＴ延長症候群の存在を証明する。これらの変種は多くの形態をとることができる。ほとんどのひどい型は、遺伝子に異常なタンパク質をコードさせるフレームシフト変異または大きな欠失であるか、タンパク質の発現を明らかに変更するものである。よりひどくはない切断破壊変異には、生み出されるタンパク質に明らかな影響を有する小さなインフレーム欠失および非保存的塩基対置換、例えばシステイン残基への、またはシステイン残基からの変化、塩基性アミノ酸から酸性アミノ酸への、またはその逆の変化、疎水性から親水性アミノ酸への、またはその逆の変化または、二次または三次タンパク質構造に影響を与える他の変異が含まれる。サイレント変異または保存的アミノ酸置換に帰着する置換がタンパク質の機能を破壊するとは一般には考えられない。
【０１９０】
遺伝子試験により、出生時または出生以前からもＬＱＴの危険にある個体を同定することが可能となる。ＬＱＴの前症状診断により、これらの疾患の予防が可能となる。ベータアドレナリン作動性ブロッキング剤を含む現存している医薬治療法により、該疾患に関連する問題の発症を予防することおよび遅らせることができる。最終的に、本発明は、全自然死の１１％を占める心臓不整脈のような共通の心疾患の原因および治療に関する我々の理解を変える。現存している診断法は、心電図からＱＴ間隔を測定することに焦点を当てている。この方法は、ＱＴ延長症候群の存在の十分迅速な指標ではない。本発明は、該疾患の存在のより迅速な指標である。ＬＱＴの遺伝的試験および改善されたメカニズム理解により、生命を脅かす不整脈の予防のための機会が合理的治療により提供される。例えば、カリウムチャネル開放剤が、ＫＣＮＥ２変異を有する患者において不整脈のリスクを減じることが可能である。これに対してナトリウムチャネルブロッキング剤が、ＳＣＮ５Ａの機能を変更する変異を有する患者のためのより有効な治療法である可能性がある。これらの不整脈はしばしば正常な心臓再分極を伴い、遺伝要因と獲得要因の組み合わせから生じる可能性があるので、最終的にこれらの研究により、一般の不整脈の基礎となるメカニズムに洞察が提供され得る。
【０１９１】
医薬組成物および投与経路
本発明のＫＣＮＥ２ポリペプチド、抗体、ペプチドおよび核酸は、慣用的な医薬配合技術にしたがって調製される医薬組成物に処方できる。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA)を参照のこと。組成物は、有効物質または有効物質の医薬上許容される塩を含有していてもよい。これらの組成物は、１の有効物質に加えて、医薬上許容される賦形剤、担体、バッファー、安定化剤または他の当該分野でよく知られた物質を含んでいてもよい。かかる物質は、非毒性であって、有効成分の効力を妨害しないべきである。担体は、例えば、静脈内、経口、鞘内、神経弓上または非経口などの投与に望ましい調製物の形態に依存して、多種多様な形態をとってもよい。
【０１９２】
経口投与の場合、化合物をカプセル、丸薬、錠剤、ロゼンジ、メルト、粉末、懸濁液またはエマルジョンのような固体または液体調製物に処方することができる。経口投薬形態の組成物を調製するには、経口液体調製物（例えば、懸濁液、エリキシルおよび溶液）の場合、通常の医薬媒体のいくつか、例えば、水、グリコール、油、アルコール、フレーバー剤、保存料、着色料、懸濁化剤などを用いてもよく；経口固体調製物（例えば、粉末、カプセルおよび錠剤）の場合、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などのような担体を用いてもよい。投与が安易なため、錠剤およびカプセルが最も有益な経口投与単位形態を示し、この場合、固体医薬担体が明らかに用いられる。所望ならば、錠剤を標準技術により、糖被覆または腸溶性被覆してもよい。有効物質をカプセルに包んで、血脳関門を通過させるのと同時に、胃腸管を安定に通過させることができる。例えば、ＷＯ９６／１１６９８参照のこと。
【０１９３】
非経口投与の場合、化合物は、医薬担体中に溶解させ、溶液または懸濁液のいずれかとして投与してもよい。適当な担体の例は、水、セーライン、デキストロース溶液、フラクトース溶液、エタノール、または動物性、植物性もしくは合成起源の油である。担体は、また、他の成分、例えば、保存料、懸濁化剤、可溶化剤、バッファーなどを含有していてもよい。化合物が鞘内に投与されるとき、それらはまた、脳脊髄液中に溶解していてもよい。
【０１９４】
有効物質は、好ましくは、治療上有効量で投与される。実際の投与量ならびに投与の速度および時間推移は、治療される状態の性質および重篤度に依存するであろう。治療の規定、例えば、投与量、タイミングなどの決定は、一般的な従業者または専門家の責任内にあり、典型的には、治療されるべき障害、個々の患者の状態、デリバリー部位、投与方法および従業者に既知の他の因子を考慮に入れる。技術およびプロトコールの例は、Remington's Pharmaceutical Sciencesにおいて見出すことができる。
【０１９５】
別法では、ターゲティング療法を用いて、抗体または細胞特異的リガンドのようなターゲティング系の使用によって、ある特定の型の細胞に有効物質をより特異的にデリバリーしてもよい。ターゲティングは、種々の理由、例えば、物質が許容できない毒性である場合、または別法で高すぎる投与量を必要とする場合、または別法で標的細胞に侵入することができない場合に望ましい。
【０１９６】
これらの物質を直接投与する代わりに、それらを標的細胞中、例えば、上記のようなウイルスベクター中または米国特許第５，５５０，０５０号およびＰＣＴ公開公報ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ９４／２５５０３、ＷＯ９５／０１２０３、ＷＯ９６／０２２８６、ＷＯ９６／０２６４６、ＷＯ９６／４０８７１、ＷＯ９６／４０９５９およびＷＯ９７／１２６３５に記載のような、患者における移植のために設計された細胞に基づくデリバリー系において生産できた。ベクターは、治療されるべき特異的細胞を標的とすることができるか、または標的細胞に対してより組織特異的な調節エレメントを含有することができた。細胞に基づくデリバリー系は、患者の体内において所望の標的部位に移植されるように設計されており、有効物質のコーディング配列を含有する。別法では、該物質は、治療されるべき細胞中で生産されるか、または該細胞を標的とする活性化物質による活性形態への変換のための前駆形態で投与できた。例えば、ＥＰ４２５，７３１ＡおよびＷＯ９０／０７９３６を参照のこと。
【０１９７】
本発明の実施は、特に示さない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝子学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニック生物学の常法を用い、それらは当該技術分野の範囲である。例えば、Maniatis et al., 1982; Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1992; Glover, 1985; Anand, 1992; Guthrie and Fink, 1991; Harlow and Lane, 1988; Jakoby and Pastan, 1979; Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al., eds.), Immunochemical Methods In Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds, 1986); Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照のこと。
【０１９８】
多型性解析方法
単一塩基伸長法は、例えば、米国特許第５,８４６,７１０；６,００４,７４４；５,８８８,８１９および５,８５６,０９２号に記載される。簡単には、該方法は、標的配列に相補的なプライマーをハイブリダイズして該プライマーの３’末端を、該標的配列の可能性のある変異の部位のすぐ隣であるがその部位にかからないようにする。すなわち、該プライマーは、５’のすぐ隣の塩基および５’にて終止する標的ポリヌクレオチドの相補体から当該多型性部位までのサブ配列を含む。ハイブリダイゼーションを可能性のある変異の部位を占有するであろう塩基に相補的な１以上の標識ヌクレオチドの存在下で行う。例えば、２対立遺伝子多型性について、２つの異なって標識されたヌクレオチドを用い得る。４対立遺伝子多型性について、４つの異なって標識されたヌクレオチドを用い得る。いくつかの方法において、特定の方法は複数の異なって標識されたヌクレオチドを用い、該ヌクレオチドはジデオキシヌクレオチドである。ハイブリダイゼーションは、該標的配列中の変異の部位を占有する塩基に相補的なヌクレオチドが存在するならば、プライマー伸長を許容する条件下で行う。伸長は標識ヌクレオチドを組み入れ、それによって、標識伸長プライマーを生成する。複数の異なって標識されたヌクレオチドを用い、該標的がヘテロ接合性であれば、複数の異なって標識された伸長プライマーを入手し得る。伸長プライマーが検出され、どの塩基が該標的ポリヌクレオチドにおける変異の部位を占有するかの指示を与える。
【０１９９】
実施例
本発明を以下の実施例でさらに詳細に説明するが、これは説明のために掲げるのであって、断じて本発明を限定する意図のものではない。
当該分野でよく知られている標準的な技術または以下に特記する技術が利用される。
【０２００】
実施例１
分子生物学的方法
遺伝子を修飾されたＭＣＳ（ｐＧＡ１）（ＳｅｓｔｉおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９９８）でｐＢＦ２に連結した後に、全てのｃＲＮＡを合成した。本発明者らは、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０）を用い、ＫＣＮＥ１によってコードされた蛋白質配列でもってＮＣＢＩデータベースをサーチし、有意に相同な遺伝子を見出すことはできなかった。統計学的有意性についての閾値未満の配列の再評価により、短い標的モチーフを運ぶ９つのＥＳＴが同定された。ラットＭｉｎＫにおける標的アミノ酸は、ＩＫｓチャネルゲーティング（Ｔ５９、Ｉ６２、Ｒ６８、Ｓ６９、Ｋ７１、Ｓ７５、Ｄ７７）（Ｔａｋｕｍｉら，１９９１；Ｓｐｌａｗｓｋｉら，１９９７）、イオン選択性（Ｆ５５、Ｔ５９）（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＭｉｌｌｅｒ，１９９１；ＴａｉおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９９８）、単位コンダクタンス（Ｓ７５、Ｄ７７）（ＳｅｓｔｉおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９９８）、ポア閉鎖（Ｙ４７、Ｉ４８、Ｆ５５、Ｇ５６、Ｆ５７）（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＭｉｌｌｅｒ，１９９１；Ｗａｎｇら，１９９６；ＴａｉおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９９８）に影響することが知られている部位および深Ｉｋｓチャネル導電経路において暴露を獲得するもの（Ｆ５５、Ｇ５６、Ｆ５７、Ｔ５９）（Ｗａｎｇら，１９９６；ＴａｉおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９９８）である。ＭｉＲＰ１をコードするラットおよびヒト配列を、まず、逆転写によって心臓ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から単離した。ＭａｒａｔｈｏｎＴＭＤＮＡキットおよびスクリーニングされたランダムおよびオリゴ（ｄＴ）−起点の成人ヒト心臓および成体ラットｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅を行って、完全な配列を決定した。ラットおよびヒトｒＭｉＲＰ１についての３つのｃＤＮＡを単離し、両ストランドについて配列決定した。ＬａｓｅｒＧｅｎｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、ヌクレオチドおよび蛋白質の配列の解析を行った。Ｂｌｏｓｓｕｍアルゴリズムおよびギャップオープニングおよび１５および０．１の伸長ペナルティを備えたＣｌｕｓｔａｌＷ１．６にて整列を行った。ＭｉｎＫについての遺伝子はＫＣＮＥ１と命名されるので、新しい遺伝子には、ゲノムデータベース命名委員会（ＨＵＧＯ／ＧＤＢ）によってＫＣＮＥ２（ＭｉＲＰ１）、ＫＣＮＥ３（ＭｉＲＰ２）およびＫＣＮＥ４（ＭｉＲＰ３）が与えられている。ヒトｒＭｉＲＰ１、ラットＭｉＲＰ１、ヒトＭｉＲＰ２、マウスＭｉＲＰ２およびマウスＭｉＲＰ３についての受託番号は、各々、ＡＦ０７１００２、ＡＦ０７１００３、ＡＦ０７６５３１、ＡＦ０７６５３２、およびＡＦ０７６５３３である。
【０２０１】
ＳＳＣＰ分析。ゲノム試料をＰＣＲによって増幅し、ＳＳＣＴ分析で用いた。３つのプライマー対を突然変異スクリーニングで用いた：
【０２０２】
【化１】
0004643020.tif 000002
【０２０３】
Ｐｅｒｋｉｎ‐Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ９６００サーモサイクラーを用い、１０μｌの最終容量にて、ＰＣＲを５０ｎｇのＤＮＡで行った。ＰＣＲ反応は、４％ホルムアミドおよび１０％グリセロールの最終濃度を有し、鉱油で覆った。増幅条件は、３分間の９４℃，続いての１０秒間の９４℃、２０秒間の５５℃および２０秒間の７２℃の３５サイクル、続いての７２℃における５分間の伸長であった。４０μｌの０．１％ＳＤＳ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび３０μｌの９５％ホルムアミド負荷色素で反応を希釈した。混合物を９４℃にて５−１０分間で変性し、直ちに氷上に置いた。３μｌの各試料を４℃の５％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスアクリルアミド  ４９：１）で、室温の０．５×および１×突然変異検出増強ゲル（ＭＤＥ，ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）で電気泳動に付した。５％ゲルでの電気泳動は、４０Ｗにて２−３時間行い、０．５×および１×ゲルでの電気泳動は、各々、３５０Ｖまたは８００Ｖにて一晩行った。ゲルを３ＭＭ濾紙上で乾燥し、−７０℃にて１８時間フィルムに暴露した。
【０２０４】
ＤＮＡ配列決定。異常および正常ＳＳＣＰバンドをゲルから切り出し、１００μｌのｄｄＨ２Ｏ中で６５℃にて３０分間溶出させた。１０μｌの溶出したＤＮＡを、元のプライマー対を用いる第２の１００μｌ  ＰＣＲ反応で鋳型として用いた。産物を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ１００ミクロコンセントレーター（Ａｍｉｃｏｎ）にて、４００μｌのｄｄＨ２Ｏで３回洗浄した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３７３Ａ  ＤＮＡシーケンサーにて、元のプライマーを用い、ジデオキシ鎖停止法によって、ＤＮＡを両方向に直接的に配列決定した。
【０２０５】
実施例２
電気生理学方法
卵母細胞をＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓから単離し、コラゲナーゼ処理によって脱小胞化し、４６ｎｌ  ｃＲＮＡを翌日注入した。２電極電圧クランプ（Ｏｏｃｙｔｅ  Ｃｌａｍｐ，Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｈａｍｄｅｎ，ＣＴ）およびＩＢＭコンピューターおよび非売品のソフトウェアを用い、０．２ｎｇのラットまたはヒトＭｉＲＰ１  ｃＲＮＡと共にまたはそれなくして１ｎｇのＨＥＲＧ  ｃＲＮＡの注入から２−４日後に、全細胞電流を測定した。特記しない限り、データは４ｋＨｚでサンプリングし、１ｋＨｚで濾過した。生データをリーク修正なしに示す。Ａｘｏｐａｔｃｈ  ２００Ａ増幅器  （Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、Ｑｕａｄｒａ８００コンピューターおよびＡＣＱＵＩＲＥソフトウェア（Ｉｎｓｔｒｕｔｅｃｈ，Ｇｒｅａｔ Ｎｅｃｋ，ＮＹ）を用いて単一チャネル記録を記録し、濾過せずにＶＨＳテープに保存した。ＴＡＣ（Ｉｎｓｔｒｕｔｅｃｈ，Ｇｒｅａｔ Ｎｅｃｋ，ＮＹ）またはＩＧＯＲ（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ Ｏｓｗｅｇｏ，ＯＲ）パッケージを用いる解析に先立ち、４極ベッセルフィルターを通してデータを濾過した。全ての実験は２２℃で行った。
【０２０６】
プロトコル。全ての場合に電圧を−８０ｍＶに保持する。（１）定常状態活性化；１０ｍＶステップにて−８０ないし４０ｍＶの３秒間のプレパルス、−１１０ｍＶへの６秒間のテストパルス；パルス間の間隔５秒。（２）活性化速度；２０ｍＶステップでの０ないし６０ｍＶにおける０．００５−３秒の増加プレパルス持続、−１００ｍＶにおける３秒間のテストパルス；パルス間の間隔５秒。（３）ピーク電流；定常状態脱活性化；脱活性化速度；３０ｍＶへの３秒間のプレパルス、１０ｍＶステップにての−１５０ないし１０ｍＶの５秒間のテストパルス；１秒間の−１２０ｍＶへのパルス；パルス間の間隔５秒。（４）定常状態不活化；２０ｍＶへの３秒間のプレパルス、１０ｍＶステップでの−１２０ないし６０ｍＶの３０ミリ秒間のパルス；２０ｍＶにおける１秒間のテストパルス；パルス間の間隔２秒。（５）Ｅ−４０３１閉鎖；５０サイクルを反復した：３０ｍＶへの３秒間のパルス、−１００ｍＶへの５秒間のテストパルス。（６）等時性およびピーク電流；１０ｍＶのステップでの−８０ないし２０または４０ｍＶへの１または２秒間のパルス、続いての３秒間のパルス間間隔での−４０ｍＶへの２秒のステップ。（７）−８０ないし２０ｍＶの２秒間のパルス、続いての、３秒のパルス間間隔での、１０ｍＶのステップにての−１２０ないし２０ｍＶの電圧への４または６秒のテストパルスによって、単一チャネルを活性化した。
【０２０７】
イオン条件。ＨＥＲＧのみで形成された、またはｒＭｉＲＰ１およびＨＥＲＧの両サブユニットを含有するチャネルの活性化を、プロトコル１および２によって種々Ｃａ２＋濃度で評価した。ブロッキングイオンとしてのＣａ２＋を処理し、本発明者らは、−１００ｍＶにおける０．２９±０．０２ｍＭのＨＥＲＧチャネルに対する見掛けの平衡阻害定数（Ｋｉ）を見出し、これは、他の者（Ｈｏら，１９９８）によって報告されているものと同様の値であり、他方、ｒＭｉＲＰ１を含有するヘテロマーチャネルは、ほぼ３倍低い見掛けのＫｉを有した。かくして、最初の特徴付けは、「低Ｃａ２＋／高Ｋ＋」浴溶液（ｍＭで表す）：９５  ＫＣｌ、５  Ｎａｃｌ、１  ＭｇＣｌ２、０．３  ＣａＣｌ２および１０  ＨＥＰＥＳ、ＮａＯＨにてｐＨ７．６、中で行った。他の実験は、ヒト血漿で見出されるイオン化種のレベルに基づく溶液を用いる（ｍＭで表す）：４  ＫＣｌ、９５  ＮａＣｌ、０．７５  ＭｇＣｌ２、１  ＣａＣｌ２および１０  ＨＥＰＥＳ、ＮａＯＨにてｐＨ７．６。図４でのＫ＋滴定では、ＮａＣｌおよびＫＣｌを等張的に置き換えた。細胞−付着パッチでは、ピペット溶液は以下の通りであった（ｍＭで表す）：１００  ＫＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、０．３  ＣａＣｌ２、１０  ＨＥＰＥＳ  、ＫＯＨにてｐＨ７．５。全細胞では、ピペットは以下のものを含有した（ｍＭで表す）；１００  ＫＣｌ、１  ＭｇＣｌ２、１０  ＨＥＰＥＳ、２  ＥＧＴＡ、ＫＯＨにてｐＨ７．５。
【０２０８】
薬理学。キニジンはＳｉｇｍａから購入し、クラリスロマイシンはAmerican Bioanalytical （Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）から購入した。キニジンおよびＥ−４０３１は、浴溶液に容易に溶解した。ＤＭＳＯ中のクライリスロマイシンの５０ｍＭストックを実験のために浴溶液で希釈した。キニジンおよびクラリスロマイシンは１  ｍＭ  Ｃａ２＋、４ｍＭ  ＫＣｌ溶液を用いるまたは特記した−４０ｍＶにおけるプロトコル１によって実験された。Ｅ−４０３１は、卵母細胞のための１  ｍＭ  Ｃａ２＋、４ｍＭ  ＫＣｌ溶液を用いる−１００ｍＶにおけるプロトコル３、およびＣＨＯ細胞のための−４０ｍＶにおけるプロトコル１によって実験した。ヒル係数は、１／（１＋（［薬物］／Ｋｉ）ｎ）によって決定した。
【０２０９】
実施例３
生化学的方法
ＨＡ残基（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＸ；配列番号：１９）ｃｍｙｃ残基（ＩＳＭＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＸ：配列番号：２０）をコードするヌクレオチドで各々における末端停止コドンを置き換えることによって、ｒＭｉＲＰ１およびＨＥＲＧにエピトークを付した。ＣＯＳ細胞の一過性トランスフェクションはＤＥＡＤ−Ｄｅｔｒａｎ、クロロキノン、ＤＭＳＯストックによるものであった。３０秒間の１０，０００Ｇにおける遠心によって明らかにする前に、トランスフェクトした細胞を緩衝液Ａ（ｍＭで表す）：１５０ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１％ＣＨＡＰＳ、０．２ＰＭＳＦ、２０ＮａＦ、１０Ｎａ３ＶＯ４、５０トリス、ｐＨ７．４および０．７μｇ／ｍｌヘプスタチン中に溶解させた。抗−ｃｍｙｃモノクローナル抗体９Ｅ１０（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）および固定化プロテインＡ／Ｇ（Ｐｉｅｒｃｅ）で免疫沈澱を行った。試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０−１６％）によって分離した。フルオログラフィーのためのホースラディッシュペルオキシダーゼ−ケミネミネセンス結合抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）と共に抗−ＨＡモノクローナル抗体にＣＡ５（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）でウェスタンブロットを行った。Ｓｐｅｅｄｒｅａｄ  Ｌｙｓａｔｅ  ２ＴＭ（Ｎｏｖａｇｅｎ）ウサギ網状細胞溶解物を用いて、ｒＭｉＲＰ１、ｒＭｉｎＫおよびＨＥＲＧ−ｃｍｙｃについてのｃＲＮＡから蛋白質サブユニットを生じさせた。サブユニットを３５Ｓ−メチオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で放射標識し、１．５％ＮＰ−４０を含有する緩衝液Ａ中で希釈した。結合アッセイは、等しい容量の反応混合物を混合し、前記したＩＰに先立って氷上で２時間インキュベートすることによって行った。
【０２１０】
実施例４
ＭｉｎＫに関連する産物をコードする遺伝子の同定およびクローニング
National Center for Biotechnology Information （ＮＣＢＩ）を通じて入手可能なデータベースをＭｉｎＫ−関連配列について評価した。我々のサーチ戦略は、ＩＫｓチャネルゲーティング（Ｔａｋｕｍｉら、１９９９；Ｓｐｌａｗｓｋｙら，１９９７）、イオン選択性（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＭｉｌｌｅｒ，１９９１；ＴａｉおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９９８）、単位コンダクタンス（ＳｅｓｔｉおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９９８）、ポア閉鎖（ＧｏｌｄｓｔｅｉｎおよびＭｉｌｌｅｒ，１９９１；Ｗａｎｇら，１９９６；ＴａｉおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９９１）に影響することが知られているＭｉｎＫ中の部位およびＩｋｓチャネル導電経路において物理的に暴露されたもの（Ｗａｎｇら，１９９６；ＴａｉおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９９８）を標的化した。このようにして、ＭｉｎＫ−関連遺伝子の断片は９つの発現された配列タグ（ＥＳＴ）およびクローン化された３つの新しい遺伝子上で同定された。ＭｉｎＫについての遺伝子は、ＫＣＮＥ１と命名されるので、新しい遺伝子はＫＣＮＥ２、ＫＣＮＥ３およびＫＣＮＥ４と命名され、それらのヌクレオチドおよび予測される蛋白質配列をＮＣＢＩに寄託した。
【０２１１】
実施例５
ｒＭｉＲＰ１はイオンチャネルサブユニットである
ラットｒＭｉＲＰ１（ｒＭｉＲＰ１）をコードするＥＳＴ遺伝子断片はノーザンブロット分析（図１Ａ）によってラット心筋および骨格筋において豊富な単一メッセージを検出したので、心臓ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、複数の同一のｒＭｉＲＰ１クローンを単離した。３６９ｂｐの予測されるオープンリーディングフレームは、２Ｎ−結合グリコシル化部位、単一の膜貫通セグメントおよび２つのプロテインキナーゼＣ−媒介リン酸化部位についてのコンセンサス配列を持つ１２３アミノ酸の蛋白質を予測させる（図１Ｃ）。これは、ｒＭｉＲＰ１は、ＭｉｎＫで見出される同一の単純なタイプＩ膜トポロジー−細胞外アミノ末端、続いての単一の膜にわたるストレッチおよび細胞質カルボキシ末端を有する（Ｂｕｓｃｈら，１９９２；ＤｌｕｍｅｎｔｈａｌおよびＫａｃｚｍａｒｅｋ，１９９４；ＷａｎｇおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９９５）を有する。ＭｉＲＰ１およびＭｉｎＫのラット単離体は２７％のアミノ酸同一性および４５％の相同性を示す（図１Ｃ）。
【０２１２】
ｒＭｉＲＰ１がイオンチャネルサブユニットとして機能できるか否かをテストするために、そのｃＲＮＡ（１−２５ｎｇ）をＸｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ卵母細胞に注入した。ＭｉｎＫについての相補的ＲＮＡは、細胞に内因性であるポア−形成サブニットとのその会合によってこれらの条件下でＫ＋電流を誘導する（ＢｌｕｍｅｎｔｈａｌおよＫａｃｚｍａｒｅｋ，１９９２；ＷａｎｇらおよびＧｏｌｄｓｔｅｉｎ，１９９５：Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉら、１９９６，Ｔａｉら１９９７）。対照的に、２−電極電圧クランプによる測定は、ｒＭｉＲＰ１についてのｃＲＮＡでの注入から１ないし１４日後に電流を明らかとしなかった（ｎ＝４５，示さず）。さらに、ｒＭｉＲＰ１についてのｃＲＮＡは、ＫｖＬＱＴ１、ＫＣＮＱ２、Ｓｈａｋｅｒ、速不活化−除去（Δ６−４６）Ｓｈａｋｅｒ、Ｋｖ１．３、Ｋｖ１．５、Ｋｖ１．６、Ｋｖ２．１のサブユニットの発現によって形成されたチャネルに対して見掛けの効果を有しなかった（ｎ＝１５−３９、示さず）。逆に、ｒＭｉＲＰ１はＨＥＲＧサブユニットで形成されたチャネルの特性に対して有意な効果を有した。
【０２１３】
外向きＫ＋電流に都合がよい正の電圧へ脱分極すると、ＨＥＲＧチャネルが開く。しかしながら、これらのチャネルを通じての正味のイオン移動は、膜の両側のＫ＋濃度が同一である場合（チャネル特徴付けでルーチン的に用いられる非生理学的条件）、脱分極−過分極サイクルにわたって内向きであるので、それらは内側に整流されると記載される。対称１００ｍＭのＫＣｌ溶液（図２）で行い、以下のごとく形成された記録でわかるように、内向き整流は迅速なチャネル不活性化に由来する（Ｓｈｉｂａｓａｋｉ，１９８７；Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉら，１９９５；Ｔｒｕｄｅａｕら，１９９５；Ｓｍｉｔｈら，１９９６；Ｗａｎｇら，１９９７；Ｚｏｕら，１９９７）。
【０２１４】
【数１】
0004643020.tif 000003
【０２１５】
ＨＥＲＧチャネルは脱分極に際して閉じた状態から開いた状態へと活性化される（Ｃ→Ｏ）が、それは迅速に不活性化される（Ｏ→Ｉ）ので、外向きの電流をほとんど通さない。再分極が負の電位に戻るにつれ、チャネルは不活性状態から開いた状態に迅速に回復し（Ｏ←Ｉ）、それは閉じる（Ｃ←Ｏ）までＫ＋電流を通過させる。工程ｇと比較して工程ｃは迅速であるので（転移と呼ばれる脱活性化）、再分極の間に開いた状態で費やされた時間は重要である。これは、脱活性化速度がＫ＋電流の大きさに対してそのような強力な影響を有するのを説明する。低いＣａ２＋濃度は天然のＩＫｒおよびＨＥＲＧチャネルのゲーティング転移を遅らせるので（ＳａｎｇｕｉｎｅｔｔｉおよびＪｕｒｋｉｅｗｉｃｚ，１９９２；Ｈｏら，１９９６）（Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉら，１９９５；Ｈｏら，１９９８）、まず、０．３ｍＭ  Ｃａ２＋、１００ｍＭ  ＫＣｌ溶液を用いてチャネルの機能に対するｒＭｉＲＰ１の影響を調べた。
【０２１６】
膜が種々のテスト電位までステップされた後に閉じた状態を平衡とするチャネルの分率を評価するプロトコルを用い、活性化はｒＭｉＲＰ１によって変更されることが判明した（図２Ａ、図２Ｃ）。ｒＭｉＲＰ１を含有するチャネルは、ＨＥＲＧサブユニットでのみ形成されたチャネルと比較した場合，半最大活性化（Ｖ１／２）を達成するのに、より正の電位、〜９±１ｍＶ（１０卵母細胞についての平均±ｓ．ｅ．ｍ．）を必要とした；対照的に、傾き因子の変化は明らかでなかった（図２Ｃ）。Ｖ１／２におけるこのシフトは、ｒＭｉＲＰ１で形成されたチャネルの活性化のより遅い速度に由来するように見えた（図２Ｃ、ｉｎｓｅｔ，モデル工程）。
【０２１７】
ピーク電流はｒＭｉＲＰ１によっても変化した。保持された脱電極によってチャネルを十分に活性させ、次いで、種々のテスト電位において最大電流を測定するプロトコルを用い、全細胞電流の電流のサイズを評価した（図２Ｂ）。ＨＥＲＧサブユニットで形成されたものと比較して、平均ピーク電流はｒＭｉＲＰ１でのチャネルにつき４０％小さかった（図２Ｄ）。以下に示すごとく、これは、チャネルゲーテイングの変化よりはむしろ変化し単一チャネル電流（すなわち、単位時間当たりの開いたチャネルを通って移動するイオンの数）に主とてして由来した。
【０２１８】
定常状態プロトコル（Ｓｍｉｔｈら，１９９６）を用いて不活性化（工程ｂ）を判断し、ここに、余りに短くて脱活性化がほとんど起こり得ないプレパルスの間に、チャネル不活性化は種々の電圧で平衡に達し；次いで、不活性状態におけるチャネルの分率を、電圧をテスト電位まで段階的に変化させることによって評価する。ＨＥＲＧチャネルの不活性化は、プレパルス電圧が−１００ないし３０ｍＶであるｒＭｉＲＰ１を含有するものと同一であった（図２Ｅ）。電流−電圧の関係は−１００ｍＶよりも負である電位においてのみ異なり、ここに、脱活性化の差は明らかになった。脱活性化からの回復（工程ｃ）は、両チャネルタイプにおいて依然として極端に速かった。
【０２１９】
チャネルの脱活性化（工程ｄ）は、ｒＭｉＲＰ１によって顕著に変化した。脱分極工程によってチャネルが十分に活性化された後、チャネルが閉じた状態へ戻るスピードを種々のテスト電位で評価した。これらのイオン状態下で、ｒＭｉＲＰ１は脱活性化速度の７倍増加を誘導した（図２Ｆ）。かくして、ＨＥＲＧチャネルは、−１００ｍＶまで認識可能に脱活性化されず、ｒＭｉＲＰ１で形成されたチャネルと同一の脱活性化速度を達成するのにより負のステップ５０ｍＶを必要とした。脱活性化は電圧−感受性であったが、ｒＭｉＲＰ１での速度増加は−１００ないし−１５０ｍＶで変化しなかった（示さず）。
【０２２０】
実施例６
ｒＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧおよび天然ＩＫｒチャネルの単位コンダクタンスおよび脱活性化
単一−チャネル分析は、ｒＭｉＲＰ１がピーク全細胞電流を低下させる主なメカニズムを明らかとした（図２Ｄ）。ｒＭｉＲＰ１は、開いたチャネル複合体を通じてほぼ４０％の単位電流の減少を引き起こした（図３Ａ、図３Ｂ）。かくして、すでに記載されているごとく（Ｚｏｕら，１９９７）、単一ＨＥＲＧチャネルは、１２．９±２ｐＸの傾きコンダクタンスを有することが判明した（図３Ｃ）。ｒＭｉＲＰ１を含有するチャネルは８±１ｐＳの値を示した（図３Ｃ）。これは、同一条件下で研究されたウサギ房室節細胞における天然ＩＫｒチャネルで報告された単位コンダクタンス値、８．４ｐＳ（Ｓｈｉｂａｓａｋｉ，１９８７）と同様である。
【０２２１】
チャネルをｒＭｉＲＰ１で形成し、全細胞様式で調べた場合に観察されたチャネル脱活性化の増加した速度（図２Ｆ）は、単一−チャネルレベルでも明らかであった（図４）。単一ＨＥＲＧチャネルは、従前に報告されているごとく（Ｚｏｕら、１９９７）、−１００ｍＶに保持されたパッチにおいて何秒も依然として開いていたが、ｒＭｉＲＰ１で形成されたチャネルは迅速に閉じた（図４Ａ）。５０−７０トレースの全体的平均は、ｒＭｉＲＰ１でのチャネルの形成によって引き起こされた脱活性化の２．３倍加速を強調する（図４Ｄ）。このようにして、ｒＭｉＲＰ１で形成されたチャネルは、再度、天然ＩＫｒチャネルに似ていた。ヒトおよびマウス心室筋細胞において、ＩＫｒチャネルは、ＨＥＲＧまたはネズミエーテルａ‐ｇｏ‐ｇｏ関連遺伝子（ＭＥＲＧ）サブユニット単独で形成されたチャネルよりも２ないし３倍速く脱活性化することが判明した（Ｙａｎｇら，１９９４；Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉら，１９９５；Ｌｅｅｓ−Ｍｉｌｌｅｒら，１９９７；Ｌｏｎｄｏｎら，１９９７）
【０２２２】
実施例７
ｒＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧおよび天然ＩＫｒチャネルの外部Ｋ＋による調節
ヒト血漿におけるものと同様のイオン条件（１ｍＭイオン化Ｃａ２＋、４ｍＭ  ＫＣｌ溶液）を次に使用した。天然ＩＫｒチャネルおよびＨＥＲＧサブユニットのみで形成されたものの１つのホールマークは、脱分極化電圧における電流‐電圧の関係についての負の傾きである；これはチャネルの不活性化に由来する（Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉら，１９９５；Ｓｍｔｉｔｈら，１９９６，Ｓｐｅｃｔｏｒら，１９９６）。予測されるごとく、ｒＭｉＲＰ１は電流／電圧関係の形状に対して有意な効果を有しなかった（図５Ａ、図５Ｂ）。というのは、それはチャネル不活性化を変化させなかったからである（図２Ｅ）。対照的に、外向きＫ＋電流の上方調節は外部Ｋ＋濃度の上昇と関係し、天然ＩＫｒおよびＨＥＲＧチャネル双方のもう１つの顕著な特徴（ＳａｎｇｕｉｎｅｔｔｉおよびＪｕｒｋｉｅｗｉｃｚ，１９９２；Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉら，１９９５）は、ｒＭｉＲＰ１によって修飾された。外部Ｋ＋イオンが１ｍＭから８ｍＭまで変化した場合、ｒＭｉＲＰ１を含有するチャネルはＨＥＲＧチャネルよりも応答が低かった（図５Ｃ）。ネズミ心房細胞またはモルモット心房筋細胞で天然ＩＫｒチャネルを調べると、ｒＭｉＲＰ１でここに観察されたもののように、外部Ｋ＋に対する浅い応答も見出された（Ｓｈｉｂａｓａｋｉ，１９８７；ＳｃａｍｐｓおよびＣａｒｍｅｌｉｅｔ，１９８９；ＳａｎｇｕｉｎｅｔｔｉおよびＪｕｒｋｉｅｗｉｃｚ，１９９２；Ｓａｎｇｕｉｎｅｔｔｉら１９９５；ＹａｎｇおよびＲｏｄｅｎ，１９９６）。血漿−様イオン条件および全細胞モードで調べると、ｒＭｉＲＰ１は、再度、脱活性化の速度を、ＨＥＲＧチャネルについてのτ＝１３０±８ミリ秒から６１±４ミリ秒（平均±ｓ．ｅ．ｍ、プロトコル３、ｎ＝５細胞）へとほぼ２倍増加させることが観察された（図５Ｄ）。
【０２２３】
これらのイオン条件下での、外部Ｋ＋イオンによる活性化、脱活性化および調節に対するｒＭｉＲＰ１の組合せた効果は、ＨＥＲＧサブユニット単独によって形成されたチャネルと比較して、その形状がほとんど変化しない電流／電圧関係を生じた（図５Ｂ）。しかしながら、ｒＭｉＲＰ１でのチャネルを発現する卵母細胞は、ＨＥＲＧチャネルでのものの内向き電流の半分および外向き電流の１／４を通過させた（図５Ｄ、５Ｅ）。
【０２２４】
実施例８
ｒＭｉＲＰ１およびＨＥＲＧサブユニットの安定な会合
エピトープタグで修飾され、哺乳動物組織培養細胞で発現された蛋白質を調べることによって、ｒＭｉＲＰ１およびＨＥＲＧの間のサブユニット相互作用をまず評価した。エピトープは巨視的チャネル活性に対して明らかな効果を有しなかった（示さず）。ＣＯＳ細胞でのｒＭｉＲＰ１−ＨＡの一過性発現、続いての抗−ＨＡ抗体でのウェスタンブロット分析は、成熟蛋白質および少量のそのモノ−および未グリコシル化形態に適した移動距離において、３つの特異的なバンドを明らかとした（図６Ａ、レーン１）；エンドグリコシダーゼＦ処理の結果、最も低い予測質量において、１つの特異的バンドに対するプロフィールが崩壊した（示さず）。
【０２２５】
ＨＥＲＧ−ｃｍｙｃとｒＭｉＲＰ１−ＨＡとの共発現は、抗−ｃｍｙｃモノクローナル抗体での免疫沈殿（ＩＰ）によるｒＭｉＲＰ１−ＨＡの回収を可能とした（図６Ａ、レーン２）。ＨＥＲＧ−ｃｍｙｃが単独で発現された場合（図６Ａ、レーン３）、ｒＭｉＲＰ１−ＨＡが単独で発現された場合（図６Ａ、レーン４）、あるいはチャネル蛋白質コネキシン４３−ｃｍｙｃがｒＭｉＲＰ１−ＨＡと共に発現された場合（図６Ａ、レーン５）、抗−ｃｍｙｃ  ＩＰはシグナルを与えなかったので回収は特異的であることが示された。
【０２２６】
従前に報告されているごとく、ＭｉｎＫおよびＨＥＲＧ−ｃｍｙｃは共に会合する（ＭｃＤｏｎａｌｄら，１９９７）。ＭｉｎＫおよびｒＭｉＲＰ１のＨＥＲＧ−ｃｍｙｃへの結合を比較するために、イン・ビトロで合成された３５Ｓ−標識ＭｉｎＫおよびＭｉＲＰ１サブユニットを用いてアッセイを行った。ｒＭｉＲＰ１およびＨＥＲＧ−ｃｍｙｃ、続いての抗−ｃｍｙｃ  ＩＰのインキュベーションは、オートラジオグラフィー（図６Ｂ、レーン１）によって判断して、ｒＭｉＲＰ１の強力な回復を可能とした。同様に、ｒＭｉｎＫおよびＨＥＲＧ−ｃｍｙｃのインキュベーションは、ｒＭｉｎＫの強力な回復を可能とした（図６Ｂ、レーン２）。ｒＭｉＲＰ１およびｒＭｉｎＫを１：１の比率で混合し、ＨＥＲＧ−ｃｍｙｃと共に５倍モル過剰でインキュベートすると、ｒＭｉｎＫの存在化で観察されたもののように、抗−ｃｍｙｃ−ＩＰはｒＭｉＲＰ１の強力な回復に導き、他方、ｒＭｉｎＫの回復は貧弱であった（図６Ｂ、レーン３）。かくして、ｒＭｉｎＫおよびｒＭｉＲＰ１は、各々、ＨＥＲＧ−ｃｍｙｃと会合することができた。しかしながら、これらのイン・ビトロ条件下では、両ペプチドの存在は、ｒＭｉｎＫとのものに優先して、安定なｒＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧ複合体の形成を有利にした。
【０２２７】
実施例９
ヒトｒＭｉＲＰ１遺伝子、ｈＫＣＮＥ２のクローニングおよび機能
ｒＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧチャネル複合体および天然心臓ＩＫＲチャネルの推定される分子的相関に基づき、本発明者らはヒトＭｉＲＰ１についての遺伝子（ｈＫＣＮＥ２）をクローンして、心臓不整脈を持つ患者における突然変異の存在につきスクリーニングした。多数の同一クローンがヒト心筋ｃＤＮＡライブラリーから単離された。ラットにおけるごとく、心筋および骨格筋において転写体が検出された（示さず）。ヒトｃＤＮＡは、２つのＮ−結合グリコシル化部位、単一の膜貫通セグメントおよび２つのプロテインキナーゼＣ−媒体リン酸化部位を持つ１２３アミノ酸の蛋白質を予測させた。ラットおよびヒトｒＭｉＲＰ１の整列は８２％同一性および９７％相同性を示した（図６ｃ）。
該ｈＫＣＮＥ２遺伝子は染色体２１ｑ２２．１に位置決めされた（受託番号ＡＰ００００５２）。ｈＫＣＮＥ１、ＭｉｎＫをコードする遺伝子は従前にこの部位に位置決めされているので（受託番号ＡＰ００００５３）、これは注目すべきであった。７９ｋｂだけ分離して、該２つの遺伝子を反対方向に整列させる。このオープンリーディングフレームは３４％同一性を有し、双方は単一のエクソンに含まれる（Ｓｐｌａｗｓｋｉら，１９９８）。これは、ＭｉＲＰ１およびＭｉｎＫが遺伝子の複製および発散の進化を通じて関連することを示唆する。
【０２２８】
１ｍＭ  Ｃａ２＋、４ｍＭ  ＫＣｌ溶液を用いてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において一過性発現によって調べられた野生型ヒトＭｉＲＰ１は、ラットＭｉＲＰ１ど同一の効果を有した。ｒＭｉＲＰ１でのチャネルのように、ｈＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧ複合体は、半最大活性化を達成するのにより正の電位への脱分極を必要とし、ＨＥＲＧサブユニット単独によって形成されたチャネルと比較して傾き因子の変化を示さなかった（表１）。ｒＭｉＲＰ１のように、ｈＭｉＲＰ１は定常状態不活性化を変化させなかった（示さず）。ｒＭｉＲＰ１でのそれのように、ｈＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧ複合体はＨＥＲＧチャネルよりも速く脱活性化した（ほぼ３倍）（表１、−１２０ｍＶにおけるτｆ）。最後に、（卵母細胞における）ｈＭｉＲＰ１で形成されたチャネルの単位コンダクタンスはｒＭｉＲＰ１でのチャネルで測定されたのと同一であった（８．０±０．７ｐｓ）（図３ｃに示すごとくｎ＝１１パッチ（示さず））。
【０２２９】
【表１】
0004643020.tif 000004
【０２３０】
活性化速度は１．０ｍＭ  Ｃａ２＋、４ｍＭ  ＫＣｌ溶液中のマクロパッチにて見積もった。電流は図２におけるごとく活性化パラメーターにつき測定し、適合させた；脱活性化については、二重指数関数（Ｉ０＋Ｉｆｅ（‐ｔ／τ）ｆ＋Ｉｓｅ（−ｔ／τ）ｓ）およびプロトコル３を用いた（−１２０ｍＶ）。１ｍＭ  Ｃａ２＋、１ｍＭ  ＫＣｌ溶液中で閉鎖を調べると、野生型ｈＭｉＲＰ１でのチャネルはＶ１／２＝−２０±５ｍＶおよび傾き＝９．２±２を示し、他方、Ｑ９Ｅ−ｈＭｉｒＲＰ１チャネルはＶ１／２＝−１２±５ｍＶおよび傾き＝７．６±１（ｎ＝７−１３細胞）を有した。
【０２３１】
実施例１０
ｈＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧおよび天然ＩＫｒチャネルは二相クラスIIIブロック速度を呈する
クローン化されたＨＥＲＧおよび天然ＩＫｒチャネルの間の基本的な不一致は、Ｅ−１０３１のようなメタンスルホンアニリドクラスIIIに対するそれらの共通点のない応答である。当該剤に暴露された閉じたＨＥＲＧチャネルは、初期テストパルスでほとんど阻害を示さず、反復活性化パルスまたは延長された脱分極にてゆっくりと平衡閉鎖を達成する（Ｓｐｅｃｔｏｒら，１９９６；Ｚｈｏｕら，１９９８）。対照的に、天然ＩＫｒチャネルは、閉鎖の二相−初期テストパルスでの有意な阻害および引き続いてのテストパルスでの平衡ブロックに対する容易な緩和を示す（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，１９９２；Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，１９９３）。
【０２３２】
予測されるごとく、ＣＨＯ細胞で発現され、Ｅ−４０３１中に浴したＨＥＲＧチャネルは、最初のテストパルスに対して最小の阻害を示した（図７Ａ）。顕著に対照的に、ｈＭｉＲＰ１で形成されたチャネルは、天然ＩＫｒチャネルのように、最初のパルスに対して有意に阻害された（図７Ｂ）。１μＭ  Ｅ−４０３１による最初のパルスにおける未ブロック電流の分率は、ＨＥＲＧでは０．９±０．１であり、ＭｉＲＰ１およびＨＥＲＧで形成されたチャネルでは０．６±０．２であった（ｎ＝９細胞）。
【０２３３】
ＣＨＯ細胞中のＨＥＲＧチャネルは、反復パルスでゆっくりと平衡に達し（図７Ｃ；緩和は、２６±９パルスサイクルの時定数（τ）を持つ単一指数関数減衰によって最良に近似された（ｍ＝９細胞））。ｈＭｉＲＰ１でのチャネルのブロックは、最初の速いブロック、続いてのτ＝４±１パルスサイクルでの単一指数関数減衰として最良に記載された（ｎ＝７細胞、図７Ｃ）。かくして、混合されたチャネル複合体は、天然ＩＫｒチャネルで観察された特徴的二相ブロッキング速度を再現した（Ｃｈａｒｍｅｌｉｅｔ，１９９２，Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，１９９３）。
【０２３４】
メタンスルホンアニリドの能力は、細胞型およびイオン条件で広く変化する（ＳｎｙｄｅｒｓおよびＣｈａｕｄｈａｒｙ，１９９６；ＹａｎｇおよびＲｏｄｅｎ，１９９６；Ｙａｎｇら．１９９７）。他の者はＥ−４０３１によるＨＥＲＧチャネルのブロックが、卵母細胞では弱く（Ｋｉ＝５８８ｎＭ）（Ｔｒｕｄｅａｕら，１９９５）、哺乳動物組織培養細胞では強い（Ｋｉ＝７．７ｎＭ）（Ｚｈｏｕら，１９９８）ことを見出している。卵母細胞においては、本発明者らは、ＨＥＲＧチャネルのＤ＝４０３１ブロックが貧弱である（Ｋｉ＝１，２５０±２００ｎＭ）ことを見出し：ｒＭｉＲＰ１およびＨＥＲＧで形成されたチャネルはほぼ３倍より感受性であった（Ｋｉ＝３８０±６０）（図５Ｆ）。ＣＨＯ細胞において、ＨＥＲＧチャネルはＥ＝４０３１によって強力にブロックされ（Ｋｉ＝８．８±０．８ｎＭ）；再度、ｈＭｉＲＰ１で形成されたチャネルは、ほぼ二倍より感受性であった（Ｋｉ＝４．６±０．６ｎＭ）（ｎ＝６細胞）。フェレット心筋細胞中の天然ＩＫｒチャネルはＥ−４０３１に対して感受性であることが判明した（Ｋｉ＝１０．３ｎＭ）（Ｌｉｕら，１９９６）。
【０２３５】
実施例１１
ヒトＭｉＲＰ１における突然変異は不整脈と関連する
ＭｉＲＰ１突然変異体は心臓不整脈を引き起こすという仮説を検定するために、本発明者らは、薬物−誘導不整脈を持つ２０人の患者および遺伝性または散発性不整脈を持つが、それらのＫＶＬＱＴ１、ＨＥＲＧ、ＳＣＮ５Ａ、またはＫＣＮＥ１遺伝子に突然変異を持たない２３０人の患者のパネルをスクリーニングした。また、１，０１０個人の対照集団を評価した。ＳＳＣＰおよびＤＮＡ配列決定による分析は、３つの異常および１つの多形を明らかにした。
Ｑ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１。薬物−誘導不整脈を持つ２０人の患者のうち一人はｈＫＣＮＥ２のヌクレオチド＋２５においてＣからＧへのトランスバージョンを有し、ｈＭｉＲＰ１の推定細胞外ドメインにおいてＱ９からＥへの置換を生じた。この突然変異は１，０１０人の対照個人では同定されなかった。該患者は、高血圧、インスリン非依存性糖尿病および発作の病歴を持つ７６歳のアフリカンアメリカ人女性である。２つのベースライン心電図は、ボーダーライン延長された心拍につき修正したＱＴ間隔を示した（ＱＴｃ＝４６０ミリ秒）。心電図記録は、温和ないし中程度の散在性運動低下を持つ同心性左心室肥大を明らかとしたが、心室拡張は明らかにしなかった。該患者が肺炎で入院が許可され、７用量の静脈内エリスロマイシン（６時間ごとに５００ｍｇ）治療し、次いで、経口クラリスロマイシン（１２時間ごとに５００ｍｇ）にスイッチした。２用量のクラリスロマイシンの後に心電図は５４０ミリ秒のＱＴｃを示した。該患者はＴｄＰおよびＶＦを発症し、細動除去を必要とした。その時点で、彼女は低カリウム血症であり、２．８ｍｅｑ／Ｌの血清ナトリウムレベルであった。
【０２３６】
Ｍ５４Ｔ−ｈＭｉＲＰ１。遺伝性または散発性不整脈を持つ２３０人の患者の一人はヌクレオチド＋１６１においてＴからＣへのトランジションを有し、予測される膜貫通セグメントにおいてＴに代えてのＭ５４の置換を引き起こした。この突然変異は１，０１０人の対照個人では同定されなかった。この患者は健康な３８歳の白人女性である。彼女は投薬を受けていなかった。この個人はジョギングの間にＶＦを有した。彼女の蘇生は細動除去を必要とした。電気生理学的実験および右心室バイオプシーと共に超音波心臓動態診断および心臓カテーテルからの結果は正常であった。引き続いての心電図は、非典型的応答が機能することを示し、ＱＴ間隔は３９０ないし５００ミリ秒の範囲であった。自動内部細動除去器を設置した。
【０２３７】
Ｉ５７Ｔ−ｈＭｉＲＰ１。遺伝性または散発性不整脈を持つ２３０人の患者のうちのもう１人は、＋１７０においてＴからＣへのトランジションを有し、予測された膜貫通セグメントにおいてＩ５７からＴへの置換を引き起こした。この患者は健康な４８歳のヒスパニック女性であり、ＴｄＰまたはＶＦの履歴は有しない。彼女の休止心電図は延長されたＱＴ間隔を示す（ＱＴｃ＝４７０ミリ秒）。彼女は、現在、遺伝的、臨床的および生物物理学的評価を受けている多世代家族のメンバーである。
【０２３８】
Ｔ８Ａ−ｈＭｉＲＰ１。１，２０２人のスクリーニングした個人のうち１８人において、ヌクレオチド＋２２におけるＡからＧへの多形はＭｉＲＰ１の推定細胞外ドメインにおいてＴ８からＡへの変化を生じた。該変化はキニジン誘導不整脈を持つ１人の患者、遺伝性または散発性不整脈を持つ１人の患者および１６人の対照で見出された。
【０２３９】
実施例１２
不整脈−関連ｈＭｉＲＰ１突然変異体はＫ＋フラックスを減少させる
野生型ｈＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧチャネルおよびＱ９Ｅ、Ｍ５４Ｔ、Ｉ５７ＴまたはＴ８Ａ−ｈＭｉＲＰ１で形成されたチャネルを、１ｍＭ  Ｃａ２＋４ｍＭ  ＫＣｌ溶液を用い、ＣＨＯ細胞での一過性発現によって比較した。Ｑ９ｑＥ−ｈＭｉＲＰ１およびＨＥＲＧで形成された突然変異体チャネルは、それらの定常状態不活性化および脱活性化の速度において、野生型サブユニットで形成されたものと同様であった（図８Ｂ、８Ｄ；表１）。しかしながら、この突然変異体はチャネル活性化の電圧依存性を増加させた。かくして、Ｑ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１チャネルは、半最大活性化を達成するのにより正の電位への脱分極を必要とし、野生型と比較して減少した傾き因子を有した（図８、表１）。電圧依存性の増加は与えられた脱分極工程につき開いたチャネルを生じたのは少なく、従って、Ｋ＋フラックスを低下させた。心臓においては、減少したＫ＋電流は相３再分極を遅らせると予測される。これは心臓の活動電位持続を長くし、これは、延長されたＱＴ間隔として表面心電図に反映されている。
【０２４０】
Ｍ５４Ｔ‐ｈＭｉＲＰ１で形成された突然変異体チャネルは、それらの定常状態不活性化において野生型と同等であった（示さず）。しかしながら、この突然変異体は、この場合には、Ｖ１／２を変化させることなく活性化傾き因子を減少させることによって、活性化の電圧−依存性を増加させた（図８Ｃ；表１）。加えて、この突然変異体で形成されたチャネルは、閉鎖のスピードアップされた速度を示し、これらのチャネルは野生型ｈＭｉＲＰ１でのそれよりもほぼ３倍速く、ＨＥＲＧサブユニット単独で形成されたチャネルよりも６−７倍速く脱活性化される（図８Ｄ；表１）。前記したごとく、増加した電圧−依存性の結果、与えられた電圧工程で開いたチャネルは少ない；より速い脱活性化は、突然変異体チャネルが、もしそれらが開いたとしても、野生型よりもより迅速に閉じることを示す。心臓においては、これらの両効果はＫ＋電流を減少させ、心臓の活動電位および心電図で測定したＱＴ間隔を延長する。
また、１５７Ｔ−ｈＭｉＲＰ１はＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧチャネル複合体を通じるＫ＋フラックスを減少し、これは他の場所で詳細に考慮されるであろう（Ｓｐｌａｗｓｋｉら，１９９９）。
【０２４１】
該Ｔ８Ａ−ｈＭｉＲＰ１変異体はスクリーニングした１２６０人の個人のうち１８人から単離された。該変異体を含有するチャネルは野生型ＭｉＲＰ１でのものと同様であったが、それらは、活性化につき減少した電圧−依存性を示し、脱分極に際してより容易に開く（図８Ｂ、８Ｃ、８Ｄ；表１）。該変異体は不整脈を持つ２人の患者、キニジン誘導ＱＴ延長（５００ミリ秒）を持つ１人の患者で見出された。キニジンはＩＫｒチャネルを阻害することが知られているので（Ｒｏｄｅｎら，１９８６）、本発明者らは、野生型またはＴ８Ａ−ｈＭｉＲＰ１で形成されたチャネルの閉鎖を比較した。２つのチャネルタイプのキニジン感受性は有意には異ならず；野生型チャネルは０．７９±０．１８μＭの平衡定数（Ｋｉ）を呈し、他方、Ｔ８Ａ−ｈＭｉＲＰ１チャネルはＫｉ＝０．８４±０．１０μＭを有し、ヒル係数は、各々、１．１±０．０７および１．０±０．０５であった。（ｎ＝９７細胞）。
【０２４２】
実施例１３
Ｑ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１で形成されたチャネルのクラリスロマイシンによる増加した閉鎖
クラリスロマイシン−誘導ＴｄＰおよびＶＦに関連するＱ９Ｅ‐ｈＭｉＲＰ１はＨＥＲＧと合同して、このマクロライド抗生物質による閉鎖に対して増大した感受性を持つチャネルを形成する。野生型ｈＭｉＲＰ１で形成されたチャネルについてのピーク外向き電流の半ブロックに導く用量は、０．７２±０．１８ｍＭであり、これはＨＥＲＧのみで形成されたチャネルで測定されたものと同様である（０．７５±０．３１ｍＭ）。対照的に、Ｑ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１で形成されたチャネルは０．２４±０．０４ｍＭのＫｉを呈した（図９Ａ、９Ｂ）。閉鎖は、活性化に対する閾値に対して正の電圧でのみ観察され、プレパルス電位がより正になるにつれて増大した（図９Ｃ）。これは、開いたチャネルの閉鎖（クラスIII抗不整脈剤によるＩＫｒチャネルの阻害の基礎であると考えられるメカニズム）と合致する（Ｓｐｅｃｔｏｒら，１９９６；Ｗａｎｇら，１９９７）。しかしながら、クラリスロマイシンは、野生型およびＱ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１双方のチャネルにつき、Ｖ１／２においてより正の電位への１０ｍＶシフトを引き起こした（傾き因子に変化はない）（図９Ｃ）。現在、クラリスマイシン阻害のメカニズムは状態依存性として最良に記載される。
【０２４３】
天然ＩＫｒチャネルは、低下した外部Ｋ＋にてクラスIII剤に対して増大する感受性を示すので（ＷａｎｇおよびＲｏｄｅｎ，１９９６）、本発明者らは、浴Ｋ＋濃度が４から１ｍＭに低下すると、クラリスロマイシンブロックを再評価した。溶液の変化はいずれのチャネルの活性に対する効果も有さず（表１）、クラリスロマイシンのブロッキング能力は、野生型ＭｉＲＰ１で形成されたチャネルおよびＱ９Ｅ‐ｈＭｉＲＰ１でのもの双方につき、ほぼ２０％増加した（野生型Ｋｉ＝０．５９±０．１、Ｑ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１につきＫｉ＝０．２０±０．０７ｍＭ、各々、ｎ＝６細胞、示さず）。かくして、Ｑ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１で形成されたチャネルはクラリスロマイシン閉鎖に対してより感受性であり、阻害は電流間低カリウム血症によって強化される。
【０２４４】
実施例１４
ＫＣＮＥ２に対するポリクローナル抗体の創生
ＫＣＮＥ２コーディング配列のセグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいては融合蛋白質として発現される。過剰発現された蛋白質はゲル溶出によって精製され、これを用い、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）によって記載されたものと同様の手法を用いてウサギおよびマウスを免疫化する。この手法は、種々の他の蛋白質に対して抗体を生成することが示されている（例えば、Ｋｒａｅｍｅｒら，１９９３参照）。
【０２４５】
簡単に述べれば、ＫＣＮＥ２コーディング配列のストレッチはプラスミドＰＥＴ５Ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）においては融合蛋白質としてクローン化される。ＩＰＴＧでの誘導の後、予測される分子量を持つ融合蛋白質の過剰発現をＳＤＳ／ＰＡＧＥによって確認する。融合蛋白質は電気溶出によってゲルから精製される。ＫＣＮＥ２融合産物としての蛋白質の同定は、Ｎ−末端における蛋白質配列決定によって確認される。次に、精製された蛋白質をウサギにおいて免疫原として用いる。ウサギをフロイントの完全アジュバント中の１００μｇの蛋白質で免疫し、３週間の間隔で２回ブースター注射し、最初のフロイントの完全アジュバント中１００μｇの免疫原、続いて、ＰＰＳ中の１００μｇの免疫原で行う。抗体含有血清は、しかる後、２週間後に収集する。
【０２４６】
この手法を反復して、ＫＣＮＥ２遺伝子産物の突然変異体形態に対して抗体を生じさせる。野生型ＫＣＮＥ２に対する組合せてこれらの抗体を用いて、種々の組織および生物学的流体中で、突然変異体形態の存在および相対的レベルを検出する。
また、前記手法を用いて、ＫＣＮＥ３、ＫＣＮＥ４に特異的なポリクローナル抗体を生成させる。
【０２４７】
実施例１５
ＫＣＮＥ２に特異的なモノクローナル抗体の創生
以下のプロトコルに従って，モノクローナル交代を生成させる。よく知られているごとく、グルタルアルデヒドまたはＥＤＣを用い、キーホールリンペットヘモシアニンに結合した完全なＫＣＮＥ２またはＫＣＮＥ２ペプチド（野生型または突然変異体）を含む免疫原でマウスを免疫化する。
【０２４８】
該免疫原はアジュバントと混合する。各マウスには１０‐１００μｇの免疫原の４回の注射を与え、４回目の注射の後に、マウスから血液試料を採取して、血清が免疫原に対する抗体を含有するかを判断する。血清力価はＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによって測定する。免疫原に対する抗体の存在を示す血清を持つマウスを、ハイブリドーマ生産につき選択する。
【０２４９】
脾臓を免疫マウスから摘出し、単一の細胞懸濁液を検出する（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ参照）。ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）によって実質的に記載されいてるごとく細胞融合を行う。簡単に述べれば、Ｐ３.６．５.３骨髄腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）によって記載されているごとく、ポリエチレングリコールを用いて、免疫脾臓細胞と融合させる。９６ウエル組織培養プレート中、２×１０５細胞／ウエル密度にて細胞を平板培養する。個々のウエルを増殖につき調べ、野生型または突然変異体ＫＣＮＥ２標的蛋白質を用いるＥＬＩＳＡまたはＲＩＡによって、増殖を持つウエルの上清をＫＣＮＥ２特異的抗体の存在につきテストする。陽性ウエル中の細胞を増殖させ、サブクローンして、モノクローナル性を確立し、確認する。
【０２５０】
所望の特異性を持つクローンを増殖させ、マウスにおける腹水液として、または中空繊維系で増殖させ、特徴付けおよびアッセイ開発のために十分な量の抗体を生産する。
また、前記手法を用いて、ＫＣＮＥ３およびＫＣＮＥ４につき特異的なモノクローナル抗体を生成させる。
【０２５１】
実施例１６
ＫＣＮＥ２についてのサンドイッチアッセイ
モノクローナル抗体をプレート、チューブ、ビードまたは粒子のごとき個体表面上に付着させる。好ましくは、抗体は９０−ウエルのＥＬＩＳＡプレートのウエル表面に付着させる。ＫＣＮＥ２ペプチド／蛋白質（野生型または突然変異体）を含有する１００μｌの試料（例えば、血清、尿、組織サイトゾル）を固相抗体に添加する。試料を室温にて２時間インキュベートする。次に、試料流体をデカントし、固相を緩衝液で洗浄して、未結合物質を除去する。（ＫＣＮＥ２ペプチド／蛋白質上の異なる決定基に対する）第２のモノクローナル抗体１００μＬを固相に加える。この抗体をディテクター分子（例えば１２５Ｉ、酵素、フルオロフォアまたはクロモフォア）で標識し、第２の抗体と共に該固相を室温にて２時間インキュベートする。第２の抗体をデカントし、固相を緩衝液で洗浄して、未結合物質を除去する。
【０２５２】
試料中に存在するＫＣＮＥ２ペプチド／蛋白質量に比例する結合標識の量を定量する。野生型ＫＣＮＥ２に特異的なモノクローナル抗体ならびにＫＣＮＥ２で同定された突然変異の各々に特異的なモノクローナル抗体を用いて別々のアッセイを行う。
また、前記手法を用いて、適当なＫＣＮＥ３またはＫＣＮＥ４抗体を用いてＫＣＮＥ３およびＫＣＮＥ４につきアッセイを行う。
【０２５３】
実施例１７
ＫＣＮＥ  ２Ｋ＋チャネルに影響する薬物をスクリーニングするためのアッセイ
ＫＣＮＥ２は会合して心臓ＩＫｒカリウムチャネルを形成するという知識を持って、今や、このチャネルに対して効果を有するであろう薬物につきスクリーニングするためのアッセイを考案することができる。遺伝子ＫＣＮＥ２を卵母細胞または哺乳動物細胞に共トランスフェクトし、前記したごとく共発現させる。共トランスフェクションは、野生型または特異的に突然変異させたＫＣＮＥ２のいずれかの組合せを用いて行われる。共トランスフェクションで用いる遺伝子の１つは、ＬＱＴを引き起こす突然変異を含む場合、野生型遺伝子のみとの共トランスフェクションと比較し、誘導電流の変化が観察される。薬物候補をトランスフェクトされた細胞の浴溶液に添加し、誘導された電流に対する薬物候補の効果をテストする。それが野生型ＫＣＮＥ２で共トランススフェクトされた細胞で観察された電流に近くなるように誘導電流を変化させる薬物候補はＬＱＴを治療するのに有用である。
【０２５４】
本発明の好ましい具体例の詳細を引用して本発明をこの出願で開示してきたが、本発明の精神および添付の請求の範囲内で修飾は当業者に容易であろうと考えられるごとく、当該開示は限定する意味のものではなく、例示的であることを意図することが理解されるべきである。
【０２５５】
【外１】
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【外２】
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【外３】
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【外４】
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【外５】
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【外６】
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【外７】
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【外８】
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【外９】
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【外１０】
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【外１１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａ〜１Ｃは、ＭｉＲＰ１が心臓中で発現され、ＭｉｎＫに関連することを示す。
【図２】  図２Ａ〜Ｆは、ｒＭｉＲＰ１がイオンチャネルサブユニットであることを示す。
【図３】  図３Ａ〜３Ｃは、単一のｒＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧチャネル（白抜き四角）が天然ＩＫｒチャネルに対するコンダクタンスにおいて類似するが、ＨＥＲＧチャネル（黒塗り四角）は類似しないことを示す。
【図４】  図４Ａ〜４Ｂは、単一ｒＭｉＲＰ１＋ＨＥＲＧチャネルは、ＨＥＲＧチャネルよりも速く脱活性化することを示す。
【図５】  図５Ａ〜５Ｆは、Ｋ＋によるそれらの調節および脱活性化速度において、ｒＭｉＲＰ１／ＨＥＲＧチャネル（白抜き四角）は天然ＩＫｒと同様であるが、ＨＥＲＧチャネル（黒塗り四角）は同様でないことを示す。
【図６】  図６Ａ〜６Ｂは、ｒＭｉＲＰおよびＨＥＲＧは安定な複合体を形成することを示す。
【図７】  図７Ａ〜７Ｃは、ｈＭｉＲＰ１およびＨＥＲＧで形成されたチャネル（ＨＥＲＧ単独で形成されたものではない）が二相キネティクスでＥ−４０３１によりブロックされることを示す。
【図８】  図８Ａ〜８Ｄは、野生型または不整脈関連ｈＭｉＲＰ１サブユニットでのチャネル機能を示す。
【図９】  図９Ａ〜９Ｃは、Ｑ９Ｅ−ｈＭｉＲＰ１がクラリスロマイシン−誘導不整脈および増大した薬物感受性に関連することを示す。
【配列表】
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【図１Ａ−１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ−２Ｆ】
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【図３Ａ−３Ｃ】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図５Ａ−５Ｆ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【図８Ｃ−８Ｄ】
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【図９Ａ−９Ｃ】
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