(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィトグリコーゲンを有効成分として含有することを特徴とする線維芽細胞増殖剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フィトグリコーゲンを有効成分とした新規な線維芽細胞増殖剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フィトグリコーゲンとは、動物の細胞内、特に肝臓や筋肉に多く存在するグリコーゲンと基本構造が同じである植物由来の冷水可溶な貯蔵多糖類であり、α−１，４結合からなるグルコース鎖がα−１，６結合で高度に枝分かれした構造をしている。
そのため、皮膚外用剤において、その構造を活かし保湿剤として配合することが従来より提案されている（特開昭６２−１７８５０５、特開昭６３−２９０８０９）。
しかしながら、フィトグリコーゲンの線維芽細胞増殖効果に関しては未だ何ら報告されていない。
【０００３】
一方、線維芽細胞は、皮膚内の膠原線維、弾力線維、基質を産出し、皮膚の老化と密接な関係を有している。そのため、近年、皮膚外用剤の分野において、線維芽細胞の増殖効果を有する物質を配合し、皮膚の機能そのものを活性化して、皮膚の老化症状の改善を図る試みがなされている。このような物質としては、臓器由来の水溶性蛋白や牛胎盤エキス等が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、臓器由来の水溶性蛋白は、蛋白質であるため、感作性で問題があり、一方、牛胎盤エキスにおいては、牛由来のものであるため、「狂牛病」の問題から安全性で疑問視されおり、安全性に優れた線維芽細胞増殖剤が切望されている。
そこで、本発明の目的は、安全性に優れた線維芽細胞増殖剤を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記の目的を達成すべく安全性に優れた種々の多糖類について鋭意研究を重ねた結果、フィトグリコーゲンに線維芽細胞増殖効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、フィトグリコーゲンを有効成分として含有することを特徴とする線維芽細胞増殖剤、を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。尚、本発明において「％」はすべて「重量％」である。
本発明において「フィトグリコーゲン」とは、前述したとおり、動物の肝臓や筋肉に多く存在するグリコーゲンと基本構造が同じである植物由来の冷水可溶な貯蔵多糖類である。フィトグリコーゲンの供給源としては、植物由来であれば特に限定するものでないが、例えば、トウモロコシ、大麦、米等の種子が挙げられる。その中でも、スイートコーンの種実は他の植物に比較し、フィトグリコーゲンを高濃度含有していることから、供給源として好ましい。
【０００７】
本発明で用いるフィトグリコーゲンの抽出・精製方法は特に制限はなく、任意の方法を採用することができる。一般的な調製方法を示すと、フィトグリコーゲンを含有する植物組織を粉砕等により抽出しやすい状態とした後、植物組織の固形分に対し３〜２０倍量の清水を加え水抽出し、デンプン、蛋白質、その他の不溶物を遠心分離等で除去する。得られた抽出液を加熱処理および／またはトリクロロ酢酸等で処理し蛋白質を除去した後、この処理液にメタノール、エタノール、アセトン等の有機溶剤を添加しフィトグリコーゲンを沈殿させる。尚、沈殿の際の有機溶剤の濃度は、溶剤により異なるが、例えば、メタノールやエタノールのようなアルコールの場合は６０容量％以上、アセトンの場合は５０容量％以上とするのが好ましい。この濃度より低い場合は、フィトグリコーゲンの一部あるいは全部が溶解した状態となるため、収率が低減し好ましくない。次に、回収した沈殿物をメタノール、エタノール、アセトン、ジエチルエーテル等の有機溶剤で洗浄した後、乾燥し粉末状のフィトグリコーゲンを得る。
【０００８】
本発明の線維芽細胞増殖剤は、上述の方法等により得られたフィトグリコーゲンをそのまま用いても良いし、さらに必要に応じ賦形剤等を加配しても良い。
【００１１】
次に、本発明を実施例・試験例に基づき、さらに詳細に説明する。尚、本発明は、これら実施例・試験例に制約されるものではない。
【実施例】
実施例１
新鮮なスイートコーン種実１ｋｇを粉砕機（商品名「ROBOT-COUPE CUTTING MIXER R-551 」、ティー・ケー・食品機械（株）扱い）で粉砕し、この粉砕物に１ｋｇの清水を加え混合後、２００メッシュストレーナーで濾過する。得られた濾液を遠心分離機（商品名「高速冷却遠心機 KR-20000S」、（株）久保田製作所製）で８５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、デンプン、蛋白質、その他の不溶物を除去した。上清を濾紙で濾過後、９５℃で２０分間加熱し、冷却後、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し凝固した蛋白質を除去した。上清を４℃に冷却して、これに５％になるまでトリクロロ酢酸を加え、４℃で一晩放置したのち、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離し沈殿物を除去し、上清を３倍量のメタノールに注加して生じた沈殿物を５０００ｒｐｍで５分間の遠心分離で集め、メタノール、エタノール、ジエチルエーテルで順次洗浄したのち真空乾燥し線維芽細胞増殖剤を得た。
得られた線維芽細胞増殖剤には、乾物中でフィトグリコーゲンを約９５％含有していた。
【００１３】
【試験例】
試験例１（線維芽細胞増殖試験）
＜試験方法＞
Ａ．線維芽細胞増殖剤のウェルへのコート
実施例１で得られた線維芽細胞増殖剤を蒸留水で溶解し、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターで濾過した後、浮遊培養用ウェル（商品名「浮遊培養用９６穴マルチプレート」、住友ベークライト（株）製）に線維芽細胞増殖剤のコート量が固形物として１００μｇ／cm2 となるように添加し、クリーンベンチ内で無菌的に風乾させた。
【００１４】
Ｂ．線維芽細胞の培養
ヒト真皮線維芽細胞（商品名「CryoNHDF-Neo、Strain No.4049」、三光純薬（株）製）を１０％ＦＢＳ（牛胎児血清）含有Ｄ−ＭＥＭ培地で１×１０4 セル／ｍｌとなるように分散し、線維芽細胞増殖剤をコートした各ウェルに１００μｌ添加した。次に、これを、３７℃、５％ＣＯ2 雰囲気下で培養し、３、５、６日目の細胞数を下記のクリスタルバイオレット法により把握した。尚、線維芽細胞増殖剤をコートしていないウェルを用い上記と同様な方法で培養したものを対照とした。
【００１５】
Ｃ．クリスタルバイオレット法
各ウェルに１０容量％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ（−）を添加し、３０分間静置して細胞を固定した後、培地を除去し、ＰＢＳ（−）で１回洗浄した。次に、染色液である０．４ｗ／ｖ％クリスタルバイオレット含有メタノールを各ウェルに５０μｌ添加し、３０分間静置して染色した後、染色液を除去し、蒸留水で洗浄し、２時間程度風乾し、５４５ｎｍにおける吸光度をウェルリーダーＳＫ−６０（（株）サイニクス製）で測定し、６ウェルの平均値を求めたところ、表１の結果が得られた。尚、吸光度０．１当たり約２．５×１０3 の細胞数に相当する。
【００１６】
【表１】
0004762383.tif 000002
【００１７】
表１より、フィトグリコーゲンには線維芽細胞増殖効果を有していることが理解される。
【００２１】
【発明の効果】
以上述べたように本発明において、多糖類であるフィトグリコーゲンに線維芽細胞増殖効果を有することが認められる。これより、安全性に優れた線維芽細胞増殖剤を提供することができる。
【００２２】
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１における線維芽細胞の培養日数と細胞数を把握するクリスタルバイオレット法による吸光度との関係を示したものである。
【図１】
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