(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の成分：
グアニジニウム塩；
緩衝剤；
還元剤；および
界面活性剤；
を有する水溶液を収容している、血液を採取しそして採取された血液を安定に貯蔵するための容器において、当該容器が負圧を有しそして当該水溶液のｐHが４と7.5の間にある、当該容器。
【請求項２】
グアニジニウム塩がチオシアン酸グアニジニウムおよび塩化グアニジニウムから選択されることを特徴とする請求項１記載の容器。
【請求項３】
グアニジニウム塩の濃度が１〜8.0Mであることを特徴とする請求項１または２記載の容器。
【請求項４】
前記緩衝剤がトリス、HEPES、MOPS、クエン酸緩衝剤およびリン酸緩衝剤から選択されることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の容器。
【請求項５】
前記緩衝剤の濃度が10〜300mMであることを特徴とする請求項１から４のいずれか１項記載の容器。
【請求項６】
前記界面活性剤がトリトン-X-100、NP-40、ポリドカノールおよびトゥイーン20から選択されることを特徴とする請求項１から５のいずれか１項記載の容器。
【請求項７】
前記界面活性剤の濃度が５〜30重量％であることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の容器。
【請求項８】
前記還元剤がジチオトレイトール、β−メルカプトエタノールおよびTCEPから選択されることを特徴とする請求項１から７のいずれか１項記載の容器。
【請求項９】
前記還元剤の濃度が0.1〜10.0重量％であることを特徴とする請求項１から８のいずれか１項記載の容器。
【請求項１０】
次の成分：
4Mチオシアン酸グアニジニウム
45mMトリス／HCl
15％（w/v）トリトン-X-100
0.8％（w/v）DTT
を含み、pHが6.0であることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項記載の容器。
【請求項１１】
採取された血液を含むことを特徴とする請求項１から10のいずれか１項記載の容器。
【請求項１２】
請求項１から10のいずれか１項記載の容器に採取された血液を導入する段階を含む、核酸を安定化するための方法。
【請求項１３】
グアニジニウム塩、緩衝剤、界面活性剤および還元剤を含む溶液の、血液を採取しそして採取された血液を安定に貯蔵するための容器への使用において、当該容器が負圧を有しそして当該水溶液のpHが４と7.5の間にある、当該使用。
【請求項１４】
１から11のいずれか１項記載の容器に全血液を導入することによって得られる安定化した血液試料。
【請求項１５】
人間の血液に由来することを特徴とする、請求項14記載の血液試料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、血液を採取するための容器であって、採取された血液を特に核酸の安定化および分析に使用するための容器に関するものである。
慣用的には採血の間、すでにヘパリン、クエン酸塩またはEDTAなどの抗凝固薬を収容している容器に血液を捕集する。そうすることにより、血液が凝固することが防がれる。こうして得られた血液試料は比較的長時間、適当な温度下で保存される。しかしこの種類の採血は、核酸、たとえば（ｍ）RNAまたはDNAを分析しようとする場合には著しい欠点を有している。このような目的のためには、試料中に含まれている核酸は、すでに採血の瞬間に安定化するのが最も良い。つまり、存在している核酸の分解、およびまたmRNAの新たな合成を防ぐべきである。
【０００２】
試料材料中に含まれている核酸を採血の瞬間から安定的に保存するというこの目標は、次の理由から現在に至るまで実現されていない。
細胞はヌクレアーゼを含んでいる。ヌクレアーゼは核酸基質（RNA、DNA）と接触すると核酸を破壊する酵素である。この作用は、細胞ヌクレアーゼおよび細胞外ヌクレアーゼの作用は、細胞が正常な環境下にある限り通常は生理学的に制御されている。血液の採取は、細胞内に含まれている核酸の多少なりとも強い変化を招く。このとき核酸は細胞内部で、および／または細胞の溶解により外に遊離される。さらに、核酸は多少なりとも強く合成される。まさに血液の長期保存が、細胞の老化と破壊を招くのである。
【０００３】
慣用的な採血法で採取された血液試料の長期保存における別の問題は、試料材料が著しく変化することである。このような細胞の強い溶解などの変化により、核酸分離の標準法がもはや満足できる効率では機能しなくなる恐れがある。
慣用的な採血法においては、試料材料中に含まれている核酸の安定した保存の問題から出発して別の難点が生じる。慣用的な抗凝固薬は、核酸分離時にしばしば十分な効率で分離されず、後続の核酸分析、たとえばPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）による増幅において支障をきたす。ヘパリンは、たとえば一般に知られたPCRの抑制剤である。
【０００４】
最後に、核酸の定量分析において、試料採取から核酸測定に至るまでの全プロセスを標準化された条件のもとでいかに制御できるかという問いが生じる。理想的には、量および品質に関して限定された標準核酸をすでに採取時に試料材料に配合して、試料採取と定量分析の全プロセスを通すべきであろう。これもまた慣用的な採血プロセスでは実現できない。
従来の採血の別の欠点は、感染性の材料を転移する危険である。なぜならば、これまで核酸分離に対しては人手による方法段階が必要だからである。潜在的な感染性の病原菌と接触することは避けられない。
【０００５】
文献には、患者から血液試料を採取した直後にグアニジニウム塩と混ぜる方法が記載されている（EP0818542A1）。この方法では、グアニジニウム塩のより高い安定性を利用するために、グアニジニウム塩は粉末形態で存在する。しかしこの方法は、たとえば塩がまず最初に配合された血液中で溶解しなければならないという重大な欠点がある。溶解過程は、特に温度に依存しており、使用された不透明な試料材料に基づき制御されない。したがって、診断医学上の目的のために相応の生成物を使用することは極めて問題がある。
【０００６】
さらにヌクレアーゼは極めて活発な酵素であり、極端な変性条件のもとでのみ抑制できる。この変性は溶液中のグアニジニウム塩の濃度に依存している。溶液中のグアニジニウム塩の抑制濃度は、引用した方法では最初から与えられていない。したがって、溶解過程において核酸の制御されない分解が生じる。さらにこの方法では還元剤の配合が不要とされるが、特にリボヌクレアーゼの効果的な抑制は保証されていない（例５参照）。
【０００７】
さらに、このようにして作製された試料は、その後のガラス表面での核酸分離には直接使用できない。さらにグアニジニウム塩粉末を使用すると、内部核酸標準を配合できない。このような標準は、プロセス制御および正確な定量化に不可欠である。
本発明の基礎となった技術的問題は、従来技術の欠点を有していない採血のための容器を提供することである。特にこの容器で採取した試料を、他の試料処理段階を実施する必要なく直接慣用の核酸分析プロセスに供給できるようにする。
【０００８】
本発明によりこの問題は、次の成分：
グアニジニウム塩；
緩衝剤；
還元剤；および／または
界面活性剤；
を有する水溶液を収容している、血液を採取するための容器によって解決される。
【０００９】
本発明による容器は、次の利点を有している。１．採取容器が溶液中にすでに核酸安定化物質を含んでいることによって、血液はすでに採取の瞬間に溶解される。２．核酸安定化物質は、試料材料、特にその中に含まれている核酸が溶液と接触した直後に安定化されるように組成されている。３．安定化された試料は、EDTA採取容器またはヘパリン含有採取容器など、これまで慣用のすべての採取プロセスとは異なり、もはや感染性材料としては扱われない。４．核酸安定化物質は、試料材料をそのまま後続の分離プロセスで使用できるように組成されている。５．核酸安定化物質は後続の分離において、PCRの抑制が生じないほど効率的に分離され得る。６．核酸安定化物質に内部標準を配合できる。この内部標準は、試料採取から核酸検出に至るまでのプロセス全体の制御を可能にする。
【００１０】
１番に挙げた採取容器は慣用的な採血容器（小管）からなり、これに所定の容積の核酸安定化物質を入れる。次いで小管に好ましくは所定の負圧を加えて、採取の間、所定の容積の血液だけが流れることができるように保証する。この小管は採血の慣用的な方法で操作することができる。小管内に含まれている溶液は、その好ましい特殊な実施形態において次の反応薬を含んでいる。すなわち、チオシアン酸グアニジニウム、トリトン-X-100、ジチオトレイトールおよび適当な緩衝系、たとえばクエン酸、トリスまたはHepes。上記の組成において、溶液は真空小管と適合性を有している。この溶液は真空小管内で問題なく保存でき、所望の安定化機能を損ねることがない。このプロセス全体が特に血液提供者にとって問題なく、安全に試料採取できる。
【００１１】
グアニジニウム塩、緩衝剤、還元剤および／または界面活性剤を包含している溶液は保存安定であり、供給された採取直後の血液を、同様に保存安定で慣用の核酸分析キット（たとえばロッシュまたはキアーゲン）に直接供給できるような材料に変える。
グアニジニウム塩として、チオシアン酸グアニジニウムおよび塩化グアニジニウムが選択される。
好ましくはグアニジニウム塩の濃度は2.0〜8.0Mである。緩衝剤としてトリスまたはクエン酸塩が選択され、正確なpHは好ましくはHClによって処理される。しかし別の可能な緩衝剤は、HEPES、MOPS、クエン酸緩衝剤およびリン酸緩衝剤、たとえばPBSである。
【００１２】
緩衝剤の濃度は好ましくは10〜300mM、特に10〜100mMである。
界面活性剤としてトリトン-X-100が選択される。その他の可能な界面活性剤は、NP-40、トゥイーン20、ポリドカノール（polydocanol）またはその他の界面活性剤である。
界面活性剤の濃度は好ましくは５〜30％（w/v）、特に10〜20％（w/v）である。
還元剤としてDTTが好ましいが、β−メルカプトエタノール、TCEP（トリ（２−カルボキシエチル）ホスフィン）またはその他の還元剤を使用できる。
【００１３】
還元剤の好ましい濃度は0.1〜10％（w/v）であり、特に好ましくは0.5〜２％（w/v）である。
溶液のpHは好ましくは3.0〜9.0、特に好ましくは4.0〜7.5、さらに特に好ましくは５〜６である。溶液のpHは、特に試料材料を配合した後で5.0〜7.6になるように調整されている。特に好ましくはpHは6.3〜6.9である（例８参照）。特に選択される溶液は、好ましくは4Mチオシアン酸グアニジニウム、45mMトリス／HCl、18％（w/v）、好ましくは15％（w/v）トリトン-X-100、0.8％（w/v）DTTを含み、pHは5.0である。
【００１４】
他の好ましい形態において、血液試料の採取のための容積は負圧を有しており、しかもこの負圧は血管に刺した後であらかじめ規定された容積の血液が容器内に吸引されるように調整できる。相応に真空にした容器は市場で入手できる。
採取された血液を含んだ容器は、直ちにその後の分析に供給でき、あるいはまた比較的長期間（最大数日間）試料の品質を損ねることなく保管することができる。
【００１５】
本発明の方法では、採取直後の血液は直接採血容器内で上記の溶液と接触すると、試料の核酸パターンを変化させ得るすべての過程が直ちに停止される。それゆえ検出された核酸に関して後に求めたデータは、採血の時点での実際の状態を、量および核酸の種類の点で非常に正確に表している。
採取された血液の量は、容器にあらかじめ入れた溶液の0.1〜４倍に相当することが好都合である。溶液は、好ましくは0.5〜5.0mlである。これにより血液添加後のグアニジニウム塩の最終濃度は、1.0〜5M、好ましくは１〜3M、特に好ましくは２〜3Mである（例７）。
【００１６】
本発明による容器は、血液試料を核酸分析に用いることになっている場合に使用すると好都合である。
上記の溶液を上述した採血プロセスの構成部材として使用するだけで、ヌクレアーゼの直接的な不活性化により細胞の即座の溶解および試料の同時安定化が保証される。このようにして得られた血液試料は、驚くべきことに室温またはそれ以上の温度でも数日間にわたって保存できる。さらに、この採血プロセスは、試料採取から核酸分離を経て分析に至るまで、汚染および感染の危険のない操作を保証する。核酸分離の慣用的な方法では従来常に追加的な操作段階（たとえば採取した血液試料を核酸分離のための反応薬に誘導することなど）が必要であるが、これらは追加的な感染リスクを伴っている。
【００１７】
この採血プロセスで得られた試料は、慣用のすべての核酸分離の標準プロセスに適合し得る。これとの関連で特に指摘すべき方法は、ガラス表面における核酸の結合に基づく方法、しかしまた相補的核酸との配列特有の結合および溶剤ベースの抽出法である。
【００１８】
したがって上記の発明は、次の条件を満たすように設計された採血プロセスからなる。１．制御された試料採取と試料材料中に含まれている核酸（DNA、RNA）の同時安定化。２．抗凝固薬の使用を完全に不要にできる試料採取。３．上記の採血プロセスによって得られた試料は、公知のすべての核酸分離プロセスに使用できる。４．この採血プロセスは保存安定である。
さらに驚くべきことに、上記の採血プロセスで得られた試料は容器内で比較的長期間、核酸の変性なしに保存可能である（例２、３、７、８参照）。
以下に、本発明を例に基づいて説明する。
【００１９】
例１．
採血システムは、好ましい実施形態において、次のように構成されることができる（図１参照）。小管を所定の容積の核酸安定化物質で満たし、所定の真空を加え、隔膜で閉じる。隔膜は、慣用の試料採取用具（カニューレ等）と適合し得るように設計されている。この例では、あらかじめ2.2mlの反応薬を入れ、試料採取時に正確に2.2mlの血液が流入するように真空を調整した。流入する血液流に含まれている核酸は、直ちに安定した形態に移行した。
【００２０】
以下の例について一般的な留意事項を述べる。
以下に記載するすべての例において、核酸安定化物質（N-sS）は、別途記載のない限り、次の組成を有している。45mMトリス、5Mチオシアン酸グアニジニウム（GTC）、0.8％（w/v）ジチオトレイトール（DTT）、18％（w/v）トリトン-X-100、pH6.0。
【００２１】
記載されたすべての例において、核酸安定化物質は、別途記載のない限り、試料と１対１で混合した（１容積N-sS＋１容積試料材料）。N-sSの濃度がこれより低いと、たとえば１容積N-sS＋５容積試料とすると、RNAの変性を招く恐れがある。
すべての例について、N-sSを入れた小管内に血液を採取直後に入れて安定化した。
【００２２】
例２．
試料材料とN-sSを混合した後の核酸の安定性、ケイ酸誘導体化された表面を有する試料溶解物からのRNAとDNAの分離
材料と方法
DNAおよびRNA分離のための試料材料は、採取直後、４°Ｃで６日間保存した後および−20°Ｃで１か月間保存した後に使用した。
【００２３】
RNA（図２）の分離のために、高純度RNA分離キット（ベーリンガー・マンハイム、品番1828665）を使用した。同封の注意書きを次のように修正した。2.4ml試料溶解物の容積を、それぞれ600μｌの４部分標本でカラムに適用し、合計2.4mlの溶解物の試料材料を適用した。その他のすべての段階は、同封の注意書き通りに実施した。最後にRNAを100μｌ溶離緩衝剤で溶離した。
【００２４】
DNAを分離するために（図３）、キアアンプ・ブラッド・キット（キアーゲン品番29104）を使用した。同封の注意書きに書かれている標準手順を、幾つかの点で修正した。すなわち、400μｌ試料容積を直接カラムに適用し、キットに含まれている結合反応薬は使用しなかった。25μｌプロテイナーゼ−Ｋ−ストック溶液を配合し、試料を室温下で10分間培養した。その後で、カラムを集合容器内に立て、同封の注意書きに書かれているように遠心分離した。他のすべての段階は、エタノールの使用を除き、同封の注意書きに書かれているとおりに実施した。溶離容積は200μｌであった。
【００２５】
例３．
ストレプトアビジン被覆磁気粒子とビオチン標識オリゴ（dT）を使用した試料溶解物からのmRNAの分離（図４）
材料と方法
容器に20ml試料溶解物を入れた。mRNAを次の方法で分離した。最初に30mlハイブリッド形成緩衝剤（20mMトリス−HCl、300mMNaCl、６nMビオチン標識オリゴ（dT）、pH7.4）を溶解物に加えた。その後で３mgストレプトアビジン磁気粒子（ベーリンガー・マンハイム）を添加した。
【００２６】
試料を混合し、室温下で５分間培養した。磁石を用いて磁気粒子を分離し、その残滓は廃棄した。その後で粒子を洗浄緩衝剤（10mM−トリスHCl、200mMNaCl、１％トリトン-X-100、pH７）で再懸濁して、洗浄緩衝剤１（10mM−トリスHCl、200mMNaCl、pH7.5）で３回洗浄した（洗浄段階：再懸濁、磁気分離、残滓の除去）。最後の洗浄段階の後で残滓を完全に除去し、粒子を20μｌ蒸留水で再懸濁した。試料は５分間70°Ｃに加熱した。磁気粒子を分離し、mRNAを含んでいる残滓をゲル電気泳動によって分析した。
【００２７】
例４．
コメジンスキとサッチ（Chomczynski and Sacchi）（Analytical Biochemistry162、156−159（1987年））による修正規則を用いたDNAとRNAの分離（溶剤抽出に基づく方法）（図５）
材料と方法
２ml試料容積を採血容器から小管に移した。その後で、2M酢酸ナトリウム溶液0.2ml、pH４、２mlフェノール（水飽和）および0.4mlクロロホルム・イソアミルアルコール混合物（49：１）を添加した。各々の溶液を添加した後で、試料をよく混合した。
【００２８】
全溶液を10秒間激しく振り、氷の上で15分間インキュベートした。試料10000ｇを４°Ｃで20分間遠心分離した。遠心分離の後、RNAは水性相、DNAおよびタンパク質は中間相およびフェノール相になった。水性相を容器に移し、１mlイソプロパノールを添加した。RNAを析出させるために、試料を−20°Ｃ下で１時間保存した。４°Ｃ、10000ｇで再度遠心分離した後、RNAはペレット状になった。
【００２９】
これに0.3ml緩衝剤（4Mチオシアン酸グアニジニウム、25mMクエン酸ナトリウム、pH7.0、0.5％サルコシル、0.1M２メルカプトイソプロパノール）を加え、新しい1.5mlエッペンドルフ容器に移し、１容積のイソプロパノールを添加した。−20°Ｃで１時間インキュベートした後、溶液をエッペンドルフ遠心分離機にかけ４℃で10分間遠心分離した。RNAペレットに75％エタノールを加え、遠心分離（スピード・バク）で濃縮し、乾燥させた。さらに処理するために、試料を100μｌの10mMトリス−HCl、pH6.5に溶かした。
【００３０】
例５．
安定化溶液における還元試薬（例：DTT）がRNAの長期安定化に持つ重要性
材料と方法
使用した安定化溶液：40MGTC；13.5％トリトンX100；45mMトリス／HCl；120mMDTT有または無。700μｌ血清を700μｌ安定化溶液と混合した。
【００３１】
２分間培養した後、20μｌMS2-RNA（0.8μｇ／μｌ、ロッシュ）を添加した。試料を40°Ｃで180分間インキュベートし、次いで各400μｌの部分標本をロッシュのハイピュア・トータルRNAキットで処理した。試料はキット結合反応薬を添加せずにコラムに塗布し、指示に従い遠心分離した。次の洗浄段階と50μｌ溶離緩衝剤におけるRNA溶離は指示通りに行った。
分析はアガロースゲルを用いて行った（図６参照）。
結果：安定化溶液に還元試薬を添加しなければ、RNAの長期安定化を達成することはできなかった。
【００３２】
例６．
血清における遊離MS2-RNAの安定性、試料成分によるRNA分解の動態
材料と方法
250μｌ血清を10μｌMS2-RNA（0.8μｇ／μｌ、ロッシュ）を加え、室温下で培養した。RNAを添加した直後、２分ないし50分後に、250μｌ安定化溶液を添加することにより血清中の自然RNA分解を停止した。すべてのバッチは２回測定した。標準として、試料に安定化溶液を添加した後、試料にMS2-RNAのみを加えて平行して処理した。
【００３３】
すべての試料は、ロッシュのハイピュア・バイラルRNA分離キットで平行して処理した。試料はキット結合反応薬を添加せずに１段階でカラムに適用し、指示に従って遠心分離した。次の洗浄段階および50μｌ溶離緩衝剤におけるRNAの溶離は、指示通りに行った。溶離物の20μｌを1.2％天然アガロースゲルで分離し、分析した（図７参照）。
結果：MS2-RNAは血清中では安定でない。血清にRNAを添加してすでに２分後に、RNAは完全に分解された。血清に安定化溶液を１：１の割合で添加することによって、このプロセスを直ちに停止し、安定化溶液を添加した時点（採血）でRNAの安定化を達成できる。
【００３４】
例７．
血清／安定化溶液中のMS2-RNAの安定性：GTC濃度との関係
材料と方法
使用した安定化溶液：３〜5MGTC；13.5％トリトンX100；50mMDTT；42mMトリス／HCl
溶液のpH：約4.0
血清添加後の溶液のpH：約6.7
【００３５】
２ml血清と安定化溶液各2.5mlを混合した。２〜５分間の培養時間の後、90μｌMS2-RNA（0.8μｇ／μｌ、ロッシュ）を添加し、40°Ｃで培養した。規則的な間隔で400μｌ試料を採取し、例５に従いロッシュのハイピュア・トータルRNAキットで処理した。試料を50μｌに溶離し、−20°Ｃで凍結した。RNA完全性を分析するために、溶離物20μｌを1.5％のアガロースゲルに適用した（図８参照）。
【００３６】
試料のPCR分析のために、溶離物10μｌをAMV-RT（ロッシュ）で逆転写し、次いでライトサイクラー上のPCRにより分析した。
0004607323.tif 000002
【００３７】
ライトサイクラー上でアニーリング温度61°Ｃ、検出システムにSYBRグリーンを使用してPCRを行った。
0004607323.tif 000003
【００３８】
結果
40°Ｃにおける３日後のRNA完全性
図８のアガロースゲルは、40°Ｃで３日間培養した後の溶離したMS2-RNAの20μｌを示している。この期間の後、GTC含量に応じて、RNA完全性に明確な差が認められる。これによると血清／安定化溶液中の2M未満の塩分含量は、RNAの完全性にとって有利である。
40°Ｃにおける８日後のRNA増幅の可能性
40°Ｃですでに３日後にRNAの変性開始が確認されたが、すべてのRNA試料は40°Ｃで８日間培養した後に増幅され、明瞭に検出することができた。
PCRの増幅物を完全に２％アガロースゲルに適用した（図９参照）。
【００３９】
例８．
血清／安定化溶液中のMS2-RNAの安定性：安定化溶液を加えた試料のpHとの関係
0004607323.tif 000004
【００４０】
2.0mlの血清と2.5mlの安定化溶液を混合した。90μｌのMS2-RNA（0.8μｇ／μｌ、ロッシュ）の添加後、試料を室温下で培養した。規則的な間隔で500μｌの試料からRNAを採取し、例６に従いロッシュのバイラルRNAキットで処理し、50μｌ溶離緩衝剤に溶離した。溶離物20μｌをアガロースゲルを用いて分析した（図10参照）。
【００４１】
結果
血清／安定化溶液のpHおよびまた安定化溶液のpHおよび緩衝範囲が、RNAの長期間安定化にとって決定的である。pH8.0ではすでに２日後に完全なRNAは検出できなかったのに対し、pH範囲6.6〜7.0では室温下で13日間インキュベートした後も完全なRNAが検出可能であった。しかしpHと並んで、最適に調整されたGTC濃度もRNAの長期安定化にとって重要である（例７も参照）。ここに示す例により、RNAの長期安定化のためには2.2MGTCの安定化した試料中のGTC濃度が2.78より良好であることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１．試料採取容器、N-sS、所定の真空、隔膜で密閉
【図２】  図２．試料採取容器内で異なる期間保存したRNAのゲル分析（１％アガロース）。欄１：試料採取直後の分離（保存なし）。欄２：−20°Ｃで１か月間保存。欄３：４°Ｃで６日間保存。塗布したRNAの量は血液量120μｌに相当した。
【図３】  図３．試料採取容器内で異なる期間保存したDNAのゲル分析（１％アガロース）。欄１：試料採取直後の分離（保存なし）。欄２：−20°Ｃで１か月間保存。欄３：４°Ｃで６日間保存。塗布したDNAの量は血液量10μｌに相当した。
【図４】  図４．10ml血液から溶離したmRNAのゲル分析（１％アガロース）（欄２）。分子重量マーカー（欄１）。mRNAに加えてrRNA帯が見える。帯の鋭い輪郭が核酸の完全性を証明している。
【図５】  図５．120μｌ血液から溶離したRNAのゲル分析（１％アガロース）。
【図６】  図６．DTT有／無で40°Ｃで180分間培養後に分離した血清／安定化溶液（DTT有／無）中のMS2-RNAのゲル分析
欄１：陽性対照：MS2-RNA。欄２：DNAマーカー。欄３、４、５：DTTを加えた安定化溶液によるインキュベーション後のMS2-RNA。欄６、７、８：DTTを加えない安定化溶液でインキュベートした後のMS2-RNA。
【図７】  図７．血清中で０〜50分間インキュベートした後に分離したMS2-RNAのゲル分析
欄10、17：MS2-RNA標準。欄９、16：DNAマーカー。欄７、８：インキュベーション０分。欄５、６：インキュベーション２分。欄３、４：インキュベーション５分。欄１、２：インキュベーション10分。欄11、12：インキュベーション15分。欄13、14：インキュベーション30分。欄15：インキュベーション50分。
【図８】  図８．血清／安定化溶液中で40°Ｃ、３日間インキュベーション後に分離したMS2-RNAのゲル分析。当該RNA試料がインキュベートされた血清添加後の安定化溶液のGTC含量が、対応する欄に記載されている。
欄１：2.70M  GTC。欄２：2.5M  GTC。欄３：2.36M  GTC。欄４：2.20M  GTC。欄５：2.08M  GTC。欄６：1.94M  GTC。欄７：1.80M  GTC。欄８：1.66M  GTC。
【図９】  図９．血清／安定化溶液中で40°Ｃ、１日もしくは８日間インキュベーション後に分離したMS2-RNAのPCR増幅のゲル分析。
欄１：１日後に分離したRNAの増幅。欄２：８日後に分離したRNAの増幅。欄３：DNAマーカー。欄４：MS2-RNA陽性対照：0.8μｇを10μｌRT１に添加：50希釈、１μｌ増幅。
【図１０】  図10．血清／安定化溶液中で室温下、６日間（欄２〜12）または13日間（欄14〜19）インキュベーション後に分離したMS2-RNAのゲル分析。当該欄には血清と安定化溶液との混合後に達成されたpHが示されている。
欄１、13、20：DNAマーカー。欄２：pH8.0。欄３：pH7.7。欄４：pH7.5。欄５：pH7.35。欄６：pH7.18。欄７、14：pH7.07。欄８、15：pH6.94。欄９、16：pH6.8。欄10、17：pH6.72。欄11、18：pH6.68。欄12、19：pH6.7。欄12、19に示されたRNAの安定化溶液は、欄11のRNAと同じpHを有したが、4Mではなく5MGTCを含んだ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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