(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を製造する方法であって、以下の工程：
ａ）緑茶抽出物を供給する工程；
ｂ）緑茶抽出物を、２０℃〜６０℃の範囲の温度で、ポリアクリレート、ポリメタクリレートおよびポリアミド樹脂からなる群から選択されるマクロポーラス極性樹脂のクロマトグラフィーに付す工程；
ｃ）２０℃〜６０℃の範囲の温度で、かつ、０．３ｂａｒ〜３ｂａｒの範囲の圧力での、水／イソプロパノール、水／エタノールおよび酢酸エチル／エタノールからなる群から選択される極性溶出溶媒による前記マクロポーラス極性樹脂からのＥＧＣＧを溶出する工程；
ｄ）場合により、工程ｃ）の溶出液を濃縮する工程；
ｅ）場合により、前記マクロポーラス極性樹脂を、残留カテキンの脱着により再生する工程；および
ｆ）場合により、工程ｅ）の脱着したカテキンを濃縮する工程
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ポリアミド樹脂が、Ｐｏｌｙａｍｉｄｅ  １１である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記極性溶出溶媒が、水／イソプロパノールまたは水／エタノールの場合、水７０ｖｏｌ％〜９５ｖｏｌ％、およびイソプロパノールまたはエタノール５ｖｏｌ％〜３０ｖｏｌ％の混合物である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記極性溶出溶媒の流速が、０．５〜２０床容積量／ｈである、請求項１〜３いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
工程ｄ）が、クエン酸、アスコルビン酸またはイソアスコルビン酸を加えることによって行われる、請求項１〜４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
酸が、ＥＧＣＧについて０．１〜２．５％の量で添加される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
工程ｅ）が、純粋有機溶媒、または水１０〜６０ｖｏｌ％および有機溶媒４０〜９０ｖｏｌ％の混合物を用いて行われる、請求項１〜６いずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の製造方法に関する。本発明は、とりわけ、マクロポーラス極性樹脂（macroporous polar resin）での処理を含む、茶カテキンからの分離による、ＥＧＣＧの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
緑茶植物 camellia sinensis の葉は、乾燥重量ベースで３６％までものポリフェノール類を含んでいるが、それらの組成は、気候、季節、種類および成熟度によって変化する。緑茶カテキンは、緑茶ポリフェノール類の主要な組成である。カテキン類の例は、（−）−エピカテキン（ＥＣ）、（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）およびエピカテキンガレート（ＥＣＧ）である。
【０００３】
ＥＧＣＧは、強い抗酸化効果を示すことから、上述のカテキン類の中で最も興味深い化合物である。さらに、ＥＧＣＧは、抗突然変異作用、抗菌効果および血液中のコレステロール濃度にも有益な効果を示すということが証明されている。茶葉に存在する他のカテキンは、ずっと効果が低い。緑茶は、カフェイン、タンパク質、ペクチンおよび／または好ましくないであろう金属イオンのような他の成分も含んでいる。
【０００４】
それゆえ、ＥＧＣＧを、単純で経済的な方法によって、純粋な形で、高い収率で単離することが要求されている。しかしながら、種々の茶カテキン類の構造的な類似性が、個々のカテキンの単離を困難にしている。その上、茶葉中のカテキンには通常、緑茶葉の乾燥重量の４％までの量で存在しているカフェインが付加している。カフェインはカテキンと結び付いており、取り除くのはそう簡単ではないことが知られている。
【０００５】
緑茶抽出物の生産は、この技術分野でよく知られている。米国特許Ｎｏ.５，８７９，７３３は、改善された透明度と色を有する緑茶抽出物の調製を記載している。茶抽出物は、緑茶抽出物を２５℃〜６０℃の範囲の温度で、抽出物に存在する金属カチオンを除去するのに効果的な、所定量の食品品質のカチオン交換樹脂で処理することにより得られる。次に、処理された抽出物を、ナノろ過膜と接触させる。しかしながら、米国特許５，８７９，７３３に記載された方法は茶カテキン混合物からＥＧＣＧを分離するのには適していない。
【０００６】
米国特許Ｎｏ．４，６１３，６７２は、純粋ＥＧＣＧの調製方法について記載しており、その方法は以下の工程を含んでいる：茶葉を温水または４０〜７５％メタノール水溶液、４０〜７５％エタノール水溶液もしくは３０〜８０％アセトン水溶液で抽出する。得られた抽出物をクロロホルムで洗浄し、洗浄した抽出物を有機溶媒に溶解する。有機溶媒を蒸留除去し、濃縮された抽出組成物を、アセトン／テトラヒドロフラン／水（０〜２５：０〜３５：６５〜８５、vol％）を展開液として、逆相分配カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーに付し、これにより、（−）エピカテキン、（−）エピガロカテキン、（−）エピカテキンガレートおよび（−）エピガロカテキンガレートのそれぞれを他から単離する）。米国特許Ｎｏ．４，６１３，６７２に記載された方法は、高価なカラム充填剤の使用のため、技術的段階においてＥＧＣＧの経済的な生産を可能にしていない。その上、米国特許Ｎｏ．４，６１３，６７２に記載された方法は、用いられる溶媒混合物（アセトン／テトラヒドロフラン／クロロホルム）が食品として認可されていないので、食品製品に添加することができるＥＧＣＧの生産を可能にしていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
先行技術は、混合物としてのカテキンの製造方法を記載しているが、成分としての、栄養補助食品および食料品への組み込みのための、純粋な形でのＥＧＣＧの、単純で、安全であり経済的な製造方法が、依然として要求されていた。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
現在、ＥＧＣＧは、マクロポーラス極性樹脂および好ましい極性溶出溶媒を用いる分離を施した場合に、茶カテキン類および／またはカフェインから、改善された選択性をもって単離することができる、ということがわかっている。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下の工程
ａ）緑茶抽出物を供給する工程；
ｂ）緑茶抽出物を、約１０℃〜約８０℃の範囲の温度でマクロポーラス極性樹脂上のクロマトグラフィーに付す工程；
ｃ）約１０℃〜約８０℃の範囲の温度で、かつ、約０．１bar〜５０barの圧力で、マクロポーラス極性樹脂からの極性溶出溶媒によるＥＧＣＧを溶出する工程；
ｄ）場合により、工程ｃ）の溶出液を濃縮する工程；
ｅ）場合により、マクロポーラス極性樹脂を、残留カテキンの脱着により再生する工程；および
ｆ）場合により、工程ｅ）の脱着したカテキンを濃縮する工程
を含む、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）の製造方法を示すものである。
【００１０】
出発物質として用いられる緑茶抽出物の製造は、この技術において公知である。例えば緑茶葉を、典型的には温水または冷水で抽出し、茶カテキン及びカフェインを含有する溶液を得る。この緑茶溶液を、さらに濃縮して、濃縮抽出物溶液か、あるいは乾燥粉末を形成させることができる。この抽出物溶液または乾燥溶液に、食品として認可された酸（例えばクエン酸、アスコルビン酸、イソアスコルビン酸等）のような安定剤を含ませることもできる。
【００１１】
茶抽出物粉末は、例えば Guizhou Highyin Biological Product Co., P.R. China、 または Zhejang Zhongke Plant Technical Co. Ltd., Hangzhou, Zhejang, P. R. Chinaから市販もされている。
【００１２】
ＥＧＣＧの分離は、典型的には緑茶抽出物をマクロポーラス極性樹脂を充填したカラムに付すことにより行う。
【００１３】
ここで用いた「マクロポーラス極性樹脂」は、例えばRoam and Hass, Philadelphia, Pa. から市販されているＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）ＸＡＤ−７のようなポリアクリレート、または例えばToso Hassから市販されているＡＭＢＥＲＣＨＲＯＭ（登録商標）ＣＧ−７１、もしくはMitsubishi Chem. Corp., Philadelphia, Paから市販されているＤＩＡＩＯＮ  ＨＰ  ２ＭＧのようなポリメタクリレート等のアクリル樹脂；あるいはMerck, Darmstadt, Germanyから市販されているポリアミド１１；Fluka, Buchs, Switzerlandから市販されているポリアミド６およびナイロン６，６（それぞれカタログ番号０２３９５および７４７１２）；EMS Chemie, Domat, Switzerlandから市販されているポリアミド１２（Grilamid L25 nature）等のポリアミド類；あるいはSigmaから市販されているポリビニルピロリドンＰ６７５５；あるいは芳香族ポリアミドおよびポリエステルをいう。
【００１４】
樹脂は、好ましくは脱気され、溶出液と平衡に処理される。
【００１５】
本発明の方法は、約１０℃〜約８０℃、好ましくは約４０℃〜６０℃の範囲の温度で行う。温度制御は、例えばカラムを加熱ジャケット等の温度制御された区域に置くことにより実施することができる。
【００１６】
移動相がカラムを通過する際の水圧は、広範囲で変化してもよい。移動相は、約０．１bar〜約５０bar、好ましくは約０．１bar〜２０bar、さらに好ましくは約０．１bar〜約１０barの圧力で、好ましくはポンプでカラム中を通過させる。
【００１７】
移動相は、水と有機溶媒の混合物である極性溶出溶媒を含む。ここで用いられている「有機溶媒」は、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール類、例えばアセトンのようなケトン類、または酢酸エチルのようなエステル類、またはそれらの混合物をいう。エタノールおよびイソプロパノールのような食品等級のアルコール類（food grade alcohol）が好ましい。約７０〜約９５vol％、好ましくは９０vol％の水、および約５〜３０vol％、好ましくは１０vol％の有機溶媒の混合物を含む移動相を用いた場合に、特に良い結果が得られた。移動相を脱気し、例えば窒素またはアルゴンのような不活性雰囲気下に保持することが好都合である。
【００１８】
カラムは、移動相で条件調整をする。カラムを通過する移動相の流速は、広範囲で変化してもよい。流速は、約０．５〜約２０床容積量（bed volume）／時間、好ましくは約０．５〜約２０床容積量／時間、さらに好ましくは約０．８〜５床容積量／時間である（１床容積量は、樹脂１m3当たり溶液または溶媒１m3に相当する）。
【００１９】
固定相と移動相の間で平衡状態に達した後、茶抽出物溶液を移動相に導入する、すなわち、緑茶抽出物をマクロポーラス極性樹脂上のクロマトグラフィーに付す。もし、緑茶抽出粉末を出発物質として用いる場合は、粉末を移動相に溶解する。もし、緑茶抽出物水溶液を用いる場合は、有機溶媒を添加して、抽出物中の有機溶媒に対する水の割合を移動相のそれと合わせる。
【００２０】
本発明において鍵となる部分は、茶抽出物をマクロポーラス極性樹脂で、約１０℃〜約８０℃、約２０℃〜約６０℃、好ましくは約４０℃〜約６０℃の範囲の温度で処理し、そしてＥＧＣＧを極性溶出溶媒で溶出することである。樹脂、溶出液、および温度の３つの特徴の特別な相互作用が、本発明の重要な部分であり、それにより茶カテキンおよび／またはカフェインの混合物からのＥＧＣＧの特異的な分離ができ、すなわち、溶出の後、抽出物あるいは濃縮物中に存在するカテキンの全量から計算して、少なくとも７５％、好ましくは８５％以上、より好ましくは約９０％〜約９７％のＥＧＣＧを含むＥＧＣＧ画分が得られるのである。
【００２１】
マクロポーラス極性樹脂が、カフェイン、ＥＧＣＧ、および残留カテキンを吸着する力は、用いる溶出液および温度に依存し、異なる。カフェインに対する親和性はＥＧＣＧのそれよりも低いので、場合により存在しているカフェインは、最初に溶出し、分離除去することができる。好ましくは、それによってカフェインを純粋な形で回収することもでき、経済的な利点となり得る。ＥＧＣＧが存在する第二画分を単離する。残留している茶カテキンは、ＥＧＣＧのものよりも強い親和性を示すので、残留カテキンを溶解し得る溶媒を用いて樹脂を再生するまで吸着したままである。例えば、残留カテキンは、純粋有機溶媒で溶出すること、または移動相において有機溶媒に対する水の割合を変更することによって溶解することができる。好ましい再生溶媒は、例えば、純粋有機溶媒、または約１０vol％〜約６０vol％の水および約４０vol％〜約９０vol％の有機溶媒の混合物、好ましくは約４０％の水と約６０％の有機溶媒の混合物である。
【００２２】
溶出液中のＥＧＣＧの濃縮は、この技術分野で公知の方法、例えば蒸発によって行なうことができる。ＥＧＣＧ溶出液は、乾燥状態まで蒸発させて、ＥＧＣＧを高純度で含む粉末を得るか、または濃縮して結晶化させることができる。濃縮は、溶出液に食品として認可された酸、例えばクエン酸、アスコルビン酸、イソアスコルビン酸等の安定剤を添加することによって行うことができる。酸は、好ましくはＥＧＣＧに対して約０．１％〜約２．５％の量で添加する。
【００２３】
カフェインを含む前処理画分、および残留カテキンを含む工程ｅ）の画分は、上述したのと同様に濃縮することができる。
【００２４】
この方法は、単一カラムまたは多数のクロマトグラフィーカラムのシステムを用いて行うことができる。この方法は、「模擬移動層クロマトグラフィー」または「アニュラークロマトグラフィー（annular chromatography）」のような技術分野に関する技術を用いても行うことができる。
【００２５】
本発明の方法は、単純で経済的な操作で実施することができるので、収量および取扱いに関して大規模な生産にも応用することができる。
【００２６】
上記により調製したＥＧＣＧは、強力な抗酸化活性を有するので、抗酸化剤として、種々の食料品、化粧品、オイル等に用いることができる。加えて、ＥＧＣＧは、抗突然変異効果、抗菌効果を有し、血液中のコレステロール濃度にも有利な効果を有する。それゆえ、濃縮物または純粋ＥＧＣＧは健康管理製品において有用である。
【００２７】
【実施例】
本発明を、以下の実施例により、より詳しく説明する。
実施例１  ＥＧＣＧの分離
異なるカテキン及びカフェインを含む緑茶抽出物（Guizhou Highyin Biological Products Co., Guiyang, China が、「緑茶抽出物、ポリフェノール少なくとも９５％（Green tea extract, min. 95% of polyphenols）」として製造している）を出発物質として用いた。茶成分の濃度は、ＵＶ吸光度を用いるＨＰＬＣによって測定し、重量％で示した。ＥＧＣＧ、カフェイン、他のカテキンならびに没食子酸の含有量を表１に示した。
【００２８】
【表１】
0004643808.tif 000002
【００２９】
粒子径０．３〜１．２mmのＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）ＸＡＤ−７樹脂３３．５ｌ（２６kg）を、内径１５０mm、長さ２ｍで容積３５．４ｌの実験等級（pilot scale）のカラムに充填した。カラムには、加熱ジャケットを装備した。樹脂は、水を通して洗浄し、水／イソプロパノール（体積比９：１）の混合物で平衡にした。用いた器具および溶媒は、使用の前に脱気して不活性窒素雰囲気下に保った。
【００３０】
充填されたカラムを、サーモスタットで６０℃にした。純粋ＥＧＣＧ１５２．５ｇを含む上記緑茶抽出物（表１）０．４kgを、水／イソプロパノール（体積比９：１）の混合物１．８kg中に溶解し、カラムの上側から流した。ＥＧＣＧを、０．５barの圧力下において、温度６０℃で、水／イソプロパノール（体積比９：１）の混合物で、一定流速５０kg／hでポンプによってカラムから溶出した。初期溶出物１４４kg（前画分）の後、主要ポリフェノール組成物としてＥＧＣＧ１１２ｇを含む主要溶出物１７４kgを回収した。主要溶出物中のＥＧＣＧ濃度は、０．０６４％であった。茶抽出物中のＥＧＣＧ１５２．５ｇから出発した、単離したＥＧＣＧの収率は、７３．５％であった。樹脂を再生するため、残留カテキンを、水／イソプロパノール（体積比４：６）の混合物７８．３kgで溶出して脱着した。次の分離の前に、カラムを、水／イソプロパノール（体積比９：１）の混合物８６kgで、流速１２０kg／hのバックウオッシュモードで調整した。
【００３１】
表２は、ＥＧＣＧの相対百分率で表した、分離効果である。主要溶出物中の茶成分の濃度は、ＵＶ吸光度を用いたＨＰＬＣによって測定し、重量％またはppmで表示した。
【００３２】
【表２】
0004643808.tif 000003
【００３３】
実施例２
実施例１を、表３に示した組成の、Guizhou Highyin Biological Products社の別のロットの「緑茶抽出物、ポリフェノール少なくとも９５％」を用いて繰り返した。
【００３４】
【表３】
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【００３５】
洗浄した実施例１のカラムを、サーモスタットで６０℃にして、分離するのに用いた。純粋ＥＧＣＧ１４０．５ｇを含む、上記の緑茶抽出物（表３）０．４kgを、水／イソプロパノール（体積比９：１）の混合物１．８kgに溶解し、カラム上部に送液した。次に、カラムを実施例１に記載されたように溶出した。初期溶出物２００kg（前画分）の後、主要ポリフェノール成分としてＥＧＣＧ７２．８ｇを含む主要溶出物１１７kgを回収した。主要溶出物中のＥＧＣＧ濃度は、０．０６２％であった。茶抽出物中のＥＧＣＧ１４０．５ｇから出発した、単離したＥＧＣＧの収率は、５１．８％であった。
【００３６】
樹脂を再生するため、残留カテキンを、水／イソプロパノール（体積比４：６）の混合物１００kgで溶出して脱着した。次の分離工程の前に、カラムを、水／イソプロパノール（体積比９：１）の混合物１００kgで、流速１２０kg／hのバックウオッシュモードで調整した。
【００３７】
表４は、ＥＧＣＧの相対百分率で表した、分離効果である。主要溶出物中の茶組成物の濃度は、ＵＶ吸光度を用いたＨＰＬＣによって測定し、ppmで表示した。実施例１と比較して、ＥＧＣＧは、より高い割合で得られた。
【００３８】
【表４】
0004643808.tif 000005
【００３９】
実施例３
実施例２に記載したくり返し運転により準備した吸着／脱着カラムの溶出物９００８kgに、２％クエン酸を添加して安定化して、ＥＧＣＧ量を評価した。溶出物を、４０℃の温度および５５mbarの圧力で、熱交換表面積１．１ｍ2のステンレス製の流下液膜式蒸発機で濃縮した。蒸発ユニットに付した供給溶液のカテキンおよびカフェインの量を、表５に示した。
【００４０】
【表５】
0004643808.tif 000006
【００４１】
蒸発機への供給流量は、再循環流速３００kg／hで、流速１２０kg／h〜１３０kg／hの範囲に制御した。すなわち、蒸留流速は、缶出液除去速度０．５２kg／hで１２３．５kg／hであった。濃縮工程中、第１画分を採取して解析し、続いて第２画分も解析した。ＥＧＣＧ濃縮物のこれら２つの画分は、合計重量６３．５kgであった。
【００４２】
表６は、缶出液中の茶成分の濃度を示したものである。ＥＧＣＧの回収率は９５．９％であった。解析結果は、分離したＥＧＣＧの高い純度は、溶液の濃縮中も維持されていたであろうことを、明白に示している。
【００４３】
ＥＧＣＧは、固形の濃縮溶液から、噴霧乾燥によっても、また結晶化によっても単離することができる。
【００４４】
【表６】
0004643808.tif 000007
【００４５】
実施例４
平均粒径１２０ミクロンを有するＡＭＢＥＲＣＨＲＯＭ（登録商標）ＣＧ−７１ｃ  ４５０mlを、内径２．２cmおよび長さ１０３cmのステンレス製の実験用クロマトグラフィーカラム中に満たした。カラムに加熱ジャケットを装着した。樹脂を洗浄して、水／エタノール混合物（体積比９：１）で平衡にした。
【００４６】
濃縮カテキン粉末Guizhou Highyin Biological Products社の「緑茶抽出物、ポリフェノール少なくとも９５％」（出発物質）２０ｇを、水／エタノール混合物（体積比９：１）２０mlに溶解した。その後、この溶液１４ｇ（ＥＧＣＧ２．９９ｇに相当）をカラム上部に送液した。ＥＧＣＧを、クロマトグラフィーポンプで、２〜３bar下において、６０℃で、水／エタノール混合物（体積比９：１）で、一定流速１６ml／分で溶出した。溶出液を脱気して、使用に先立って窒素雰囲気中に保持した。初期溶出液２．４８l（前画分）の後、流速を２５．５ml／分に変更し、ＥＧＣＧを０．６２７g／lの濃度で含みながら主溶出液５．４０lを、回収した。他のカテキン類およびカフェインに関して、ＨＰＬＣで測定し、そして相対百分率で表した、主画分中のＥＧＣＧの純度は、９７．１３％であった。実験の間、系の中の圧力は、適用した流速に依存して２〜３barであった。表７に、溶出液中および出発物質中の茶成分の濃度を比較しており、すなわち、ＥＧＣＧの相対百分率によって表される分離効果を説明している。出発物質中および主溶出液中における茶成分の濃度は、ＵＶ吸光度を用いるＨＰＬＣで測定し、重量％またはppmで表した。
【００４７】
【表７】
0004643808.tif 000008
【００４８】
実施例５
粒系０．３〜１．２mmを有するＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）ＸＡＤ−７を、内径２．４cmおよび長さ１００cmのガラス製の実験用クロマトグラフィーカラム中に充填した。カラムに加熱ジャケットおよび底に焼結フリットＰ３を装着した。樹脂を、脱イオン水で完全に洗浄し、使用に先立って水／エタノール混合物（体積比９：１）で平衡にした。
【００４９】
濃縮カテキン粉末（Guizhou Highyin Biological Products社の「緑茶抽出物、ポリフェノール少なくとも９５％」）（出発物質）２０ｇを、水／エタノール混合物（体積比９：１）２０mlに溶解した。その後、この溶液１４ｇ（ＥＧＣＧ２．９１ｇに相当）をカラム上部に送液した。ＥＧＣＧを、水／エタノール混合物（体積比９：１）で、一定流速１６．９ml／分で６０℃で、０．５〜１barの圧力で溶出した。溶出液を脱気して、使用に先立って窒素雰囲気中に維持した。初期溶出液２．４８l（前画分）の後、流速を２３．６ml／分に変更し、主溶出液４．９５lを、ＥＧＣＧを０．４７０g／lの濃度で含みながら回収した。他の主要カテキン類およびカフェインに関して、ＨＰＬＣで測定した主画分中のＥＧＣＧの純度は、８６．２２％であった（表８参照）。ＥＧＣＧに基づく収率は、７９．８％であった。実験の間、系の中の圧力は、適用した流速に依存して０．５〜１barであった。
【００５０】
樹脂を再生するため、残留カテキンを、１．３５lの水／エタノール混合物（体積比４：６）で、流速２２．５ml／分での溶出によって脱着した。この画分もまた、さらなる精製、または脱着したカテキンの分離に用いることができる。表８に、溶出液中および出発物質中の茶成分の濃度を比較しており、ＥＧＣＧの相対百分率によって表される分離効果を説明している。出発物質中および主画分中における茶成分の濃度は、ＵＶ吸光度を用いるＨＰＬＣで測定し、重量％またはppmで表した。
【００５１】
【表８】
0004643808.tif 000009
【００５２】
実施例６
実施例５の再生した樹脂を、実施例５に記載した実験カラム中で、水／エタノール混合物（体積比９：１）を樹脂中にポンプで通過させることによって平衡にした。
【００５３】
濃縮カテキン粉末 Guizhou Highyin Biological Products社の「緑茶抽出物、ポリフェノール少なくとも９５％」（出発物質）２０ｇを、水／エタノール混合物（体積比９：１）２０mlに溶解した。その後、この溶液１４ｇ（ＥＧＣＧ３．０４ｇに相当）をカラム上部に送液した。ＥＧＣＧを、水／エタノール混合物（体積比９：１）で、一定流速２２．５ml／分で４０℃で、１〜２barの圧力で溶出した。溶出液を脱気して、使用に先立って窒素雰囲気中に維持した。初期溶出液３．６０l（前画分）の後、流速を２６．３ml／分に変更し、主溶出液４．７３lを回収した。主溶出液中のＥＧＣＧ濃度は、０．２７８g／lだった。他の主要カテキン類およびカフェインに関して、ＨＰＬＣで測定した主画分中のＥＧＣＧの純度は、９３．２％であった。ＥＧＣＧに基づく収率は、４２．８％であった。実験の間、系の中の圧力は、適用した流速に依存して１〜２barであった。
【００５４】
樹脂を再生するため、残留カテキンを、１．９８lの水／エタノール混合物（体積比４：６）で、流速２６．３ml／分での溶出によって脱着した。この画分もまた、さらなる精製、または脱着したカテキンの分離に用いることができる。表９に、溶出液中および出発物質中の茶組成物の濃度を比較しており、すなわちＥＧＣＧの相対百分率によって表される分離効果を説明している。出発物質中および主画分中における茶成分の濃度は、ＵＶ吸光度を用いるＨＰＬＣで測定し、重量％またはppmで表した。
【００５５】
【表９】
0004643808.tif 000010
【００５６】
実施例６の再生した樹脂を、水／イソプロパノールの混合物（体積比９：１）で平衡にした。
【００５７】
濃縮カテキン粉末 Guizhou Highyin Biological Products社の「緑茶抽出物、ポリフェノール少なくとも９５％」２０ｇを、水／イソプロパノール混合物（体積比９：１）２０mlに溶解した。その後、この溶液１４ｇ（ＥＧＣＧ３．２１ｇに相当）をカラム上部に送液し、水／イソプロパノール混合物（体積比９：１）で、一定流速１８ml／分で、カラム温度４０℃で溶出した。溶出液を脱気して、使用に先立って窒素雰囲気中に維持した。初期溶出液１．３５l（前画分）の後、流速を１６．５ml／分に変更し、主溶出液２．０３lを回収した。主溶出液中のＥＧＣＧ濃度は、０．９９８g／lだった。他の主要カテキン類およびカフェインに関して、ＨＰＬＣで測定した主画分中のＥＧＣＧの純度は、８５．７％であった。ＥＧＣＧに基づく収率は、６２．８％であった。実験の間、系の中の圧力は、適用した流速に依存して１〜２barであった。
【００５８】
樹脂を再生するため、残留カテキンを、２．０３lの水／イソプロパノール混合物（体積比４：６）で、流速１６．５ml／分および温度４０℃での溶出によって脱着した。この画分もまた、さらなる精製、または脱着したカテキンの分離に用いることができる。表１０に、溶出液中および出発物質中の茶組成物の濃度を比較しており、すなわちＥＧＣＧの相対百分率によって表される分離効果を説明している。出発物質中および主画分中における茶成分の濃度は、ＵＶ吸光度を用いるＨＰＬＣで測定し、重量％またはppmで表した。
【００５９】
【表１０】
0004643808.tif 000011
【００６０】
実施例６の再生した樹脂を、水／イソプロパノールの混合物（体積比９：１）で平衡にした。
【００６１】
濃縮カテキン粉末 Guizhou Highyin Biological Products社の「緑茶抽出物、ポリフェノール少なくとも９５％」（出発物質）２０ｇを、水／イソプロパノール混合物（体積比９：１）２０mlに溶解した。その後、この溶液１４ｇ（ＥＧＣＧ３．１０ｇに相当）をカラム上部に送液した。ＥＧＣＧを、水／イソプロパノール混合物（体積比９：１）で、一定流速１６．９ml／分で、カラム温度４０℃で溶出した。溶出液を脱気して、使用に先立って窒素雰囲気中に維持した。初期溶出液２．４８l（前画分）の後、流速を２３．６６ml／分に変更し、主溶出液４．９５lを回収した。主溶出液中のＥＧＣＧ濃度は、０．３７０g／lだった。他の主要カテキン類およびカフェインに関して、ＨＰＬＣで測定した主画分中のＥＧＣＧの純度は、８６．６％であった。ＥＧＣＧに基づく収率は、５９．２％であった。実験の間、系の中の圧力は、適用した流速に依存して１〜２barであった。
【００６２】
樹脂を再生するため、残留カテキンを、２．０３lの水／イソプロパノール混合物（体積比４：６）で、流速１６．５ml／分および温度４０℃での溶出によって脱着した。この画分もまた、さらなる精製、または脱着したカテキンの分離に用いることができる。表１１に、溶出液中および出発物質中の茶組成物の濃度を比較しており、すなわちＥＧＣＧの相対百分率によって表される分離効果を説明している。出発物質中および主画分中における茶成分の濃度は、ＵＶ吸光度を用いるＨＰＬＣで測定し、重量％またはppmで表した。
【００６３】
【表１１】
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【００６４】
実施例９  有機溶媒を用いるＰｏｌｉａｍｉｄｅ  １１によるＥＧＣＧの分離
表１２に示したように所定量のカテキン類およびカフェインを含む、市販の緑茶抽出物（Guizhou Highyin Biological Product Co., Guiyang, ChinaのLot#960328「緑茶抽出物、ポリフェノール少なくとも９５％」）を、出発物質として用いた。茶成分の濃度を、ＵＶ吸光度を用いるＨＰＬＣで測定した。
【００６５】
【表１２】
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【００６６】
粒径５〜４０ミクロンの、市販のＰｏｌｙａｍｉｄｅ  １１（カタログNo. 1.07435.0100、Merck社、Darmstadt、ドイツ）を、酢酸エチル３００mlに懸濁し、内径５cmおよび長さ３６cmのカラムに移した。カラムは、加熱ジャケットを装着し、サーモスタッドで４０℃にした。表１２に記載の特徴を有し、純粋ＥＧＣＧ１．１１ｇを含む、出発緑茶抽出物３ｇを酢酸エチル１５３mlに溶解し、カラム上部に送液した。０．３barの圧力下において、酢酸エチル／エタノールグラジエント溶出（酢酸エチル５００ml、酢酸エチル／エタノール（８．５：１．５  vol／vol）１０００ml、酢酸エチル／エタノール（７：３  vol／vol）１０００ml、酢酸エチル／エタノール（１：１  vol／vol）２０００ml）により、主画分５５０mlを得た後、溶媒を蒸発して、ＥＧＣＧ０．８７ｇを含む固形物を、主要カテキン組成物として得た。主溶出液中のＥＧＣＧ濃度は、０．１８６％であった。出発物質中に存在するＥＧＣＧ１．１０６ｇから計算した、分離したＥＧＣＧの収率は７６％であった。
【００６７】
樹脂を再生するため、残留カテキンをエタノール５００mlで脱着した。次の分離の前に、カラムを酢酸エチル５００mlで調整した。
【００６８】
表１３は、分離効果を説明するものである。主溶出液中の茶成分の濃度は、ＵＶ吸光度を用いるＨＰＬＣで測定した。
【００６９】
【表１３】
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【００７０】
実施例１０  水性溶媒混合液を用いたＰｏｌｙａｍｉｄｅ  １１によるＥＧＣＧの分離
カテキンおよびカフェインを表１４に示した量で含む水性緑茶抽出物を、出発物質として用いた。茶成分の濃度は、ＵＶ吸光度を用いるＨＰＬＣで測定し、重量％で示した。
【００７１】
【表１４】
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【００７２】
粒径５〜４０ミクロンの、市販のＰｏｌｙａｍｉｄｅ  １１（カタログNo.1.07435.0100、Merck社、Darmstadt、ドイツ）を、水１００mlに懸濁して、pHを６．５に調製した。この懸濁液を、内径３cmおよび長さ８cmのカラムに移した。純粋ＥＧＣＧ０．０７８ｇを含む上記の緑茶抽出物（表１４）１０mlを、カラム上部に送液した。流速５ml／分での水／エタノールグラジエント溶出（水５００ml、水／エタノール（７：３  vol／vol）６００ml、水／エタノール（６：４  vol／vol）３５０ml、水／エタノール（１：１  vol／vol）５００ml）により、ＥＧＣＧ０．０４６ｇを含む主画分１１０ml（０．０７２ｇ）を得た。主溶出液中のＥＧＣＧ濃度は、０．０６％であった。茶抽出物中のＥＧＣＧ０．０７８ｇから出発した、分離したＥＧＣＧの収率は５９％であった。
【００７３】
樹脂を再生するため、残留カテキンをエタノール５００mlで脱着した。次の分離の前に、カラムを水５００mlで調整した。
【００７４】
表１５は、分離効果を説明するものである。主溶出液中の茶成分の濃度は、ＵＶ吸光度を用いるＨＰＬＣで測定した。
【００７５】
【表１５】
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【００７６】
実施例１１  ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ  ＸＡＤ−７、溶媒系：水／エタノールによるＥＧＣＧの分離
粒径０．３〜１．２mmの平均粒径を有するＡＭＢＥＲＬＩＴＥ  ＸＡＤ−７樹脂４１６mlを、内径２．５cmおよび長さ１００cmの、ガラス製実験クロマトグラフィーカラム（ＥＣＯ２５／９９９Ｍ３Ｖ−Ｋ、Stagroma AG社、Wallisellen、スイス）中に充填した。カラムに加熱ジャケットを装着し、サーモスタッドで６０℃にした。樹脂を洗浄して、水／エタノール混合物（体積比９：１）で平衡にした。
【００７７】
カテキン類およびカフェインを、表１６に示した量で含む、市販の緑茶抽出物（「茶ポリフェノール類ＴＰ−８０（Tea polyphenols TP-80）」、Zhejang Zhongke Plant Technical社、Hangzhou、Zhejang、中華人民共和国）を出発物質として用いた。
茶成分は、ＵＶ吸光度を用いるＨＰＬＣで測定し、重量％で示した。
【００７８】
【表１６】
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【００７９】
純粋ＥＧＣＧ４．５ｇを含む、表１６に示した特徴を有する、出発緑茶抽出物１１．２ｇを、脱イオン水１１２．５mlに溶解し、カラム上部に送液した。カテキン類を、水／エタノール混合物（体積比９：１）で、０．６l／時間の一定流速で、カラム温度６０℃で溶出した。溶出液を脱気して、使用に先立って窒素雰囲気中に維持した。
【００８０】
初期溶出液１．２lの後、溶出液の組成を、水／エタノール体積比８：２に変更した。全量１．５lのこの溶出により、ＥＧＣＧ２．１１５ｇを含む主画分９００mlが得られた。主画分中のＥＧＣＧ濃度は、０．２４５％であった。茶抽出物中のＥＧＣＧ４．５ｇから出発した、分離したＥＧＣＧの収率は、４７％であった。実験の間、系の中の圧力は、０．８〜１．５barで変化した。
【００８１】
樹脂を再生するため、溶出を水／エタノール体積比４：６の混合物で継続し、こうして残留カテキンをエタノールで脱着した。次の分離の前に、カラムを水／エタノール体積比９：１で調整した。
【００８２】
表１７は、分離効果を説明するものである。主画分の残渣（溶媒蒸発）中の茶組成物の濃度は、ＵＶ吸光度を用いるＨＰＬＣで測定し、重量％で示した。
【００８３】
【表１７】
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