(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
早期翻訳終結を抑制する化合物の候補化合物のスクリーニング方法であって、
（ｉ）インビトロで化合物を、翻訳細胞抽出物およびポリペプチドをコードする核酸（ここにこのポリペプチドのコード配列は早期終止コドンを含み、該細胞抽出物は哺乳動物細胞抽出物である）とインキュベートする工程；および
（ｉｉ）この核酸から翻訳された完全長ポリペプチドの量を検出する(ここで、該化合物の非存在下で検出される完全長ポリペプチドの量に比べて該化合物の存在下で検出される完全長ポリペプチドの量の増加は、該化合物が早期翻訳終結を抑制することを示す)工程
を含む方法。
【請求項２】
早期翻訳終結を抑制する化合物の候補化合物のスクリーニング方法であって、
（ｉ）化合物を、ポリペプチドをコードする核酸を安定して発現する哺乳動物細胞（ここで、このポリペプチドのコード配列は早期終止コドンを含む）とインキュベートする工程；および
（ｉｉ）この核酸から転写されたmRNAから翻訳された完全長ポリペプチドの量を検出する(ここで、核酸から転写されたmRNAのレベルの変化を伴わない、該化合物の非存在下で検出される完全長ポリペプチドの量に比べて該化合物の存在下で検出される完全長ポリペプチドの量の増加は、該化合物が早期翻訳終結を抑制することを示す)工程
を含む方法。
【請求項３】
該哺乳動物細胞抽出物がウサギ網状赤血球ライセート、またはヒト、マウス、またはラット細胞抽出物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物細胞がヒト細胞である請求項2に記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物細胞が形質転換細胞または一次細胞である請求項2に記載の方法。
【請求項６】
該哺乳動物細胞が２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｋ５６２細胞、または３Ｔ３細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
該完全長ポリペプチドがＥＬＩＳＡ、光放射、比色測定、酵素活性によって、または放射能を用いて検出される、請求項１〜6のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該核酸が異種核酸または内因性遺伝子である請求項１〜7のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該異種核酸がイントロンおよび、コード配列を含む少なくとも２つのエキソンを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該異種核酸がキメラポリペプチドをコードしている、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
該核酸が酵素または免疫グロブリンをコードしている、請求項１〜9のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該ポリペプチドがルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、キナーゼ、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼから選ばれる、請求項１〜9のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
該内因性遺伝子がアルファ−グロビン、ベータ−グロビン、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、ｖＷＦ、ｐ５３、ジストロフィン、ＣＦＴＲ、Ｒｂ、ＭＳＨ１、ＭＳＨ２、ＡＰＣ、Ｗｔ１、ヘキソサミニダーゼＡ、ニューロフィブロミン１、またはニューロフィブロミン２をコードする、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
該インキュベーションおよび検出工程がミクロタイター皿のウェルで行われる、請求項１〜13のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１００から少なくとも６，０００の範囲の複数の候補化合物を互いに並行してスクリーニングし、ミクロタイタープレート形式で工程（ｉ）−（ｉｉ）を連続して繰り返すことをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該インキュベーションおよび検出工程が、自動ピペットステーション、ロボット電機子、およびロボットコントローラーを含む高処理量の統合系で行われる、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、１９９９年１２月１４日提出のＵＳＳＮ ０９／４６１，５０８（これは引用によりその全内容が本明細書中に包含される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
米国政府が後援する調査および開発下でなされた発明に対する権利に関する宣言
適用なし。
【０００３】
発明の背景
鎖の終結変異は、塩基置換またはフレームシフト変異によってセンスコドンが３つの終止コドン（ＵＡＡ、ＵＡＧ、またはＵＧＡ）のうちの１つに変化する変異である。酵母、ヒト遺伝的障害、および免疫グロブリンファミリー遺伝子発現の研究により、そのような鎖終結変異を含むナンセンスＲＮＡ（nonsense RNAs）の翻訳を最小限に抑え、そのＲＮＡ安定性を調節するＲＮＡ監視機構が同定された。この監視機構は「ナンセンス媒介性ｍＲＮＡ崩壊（nonsense-mediated mRNA decay）」（「ＮＭＤ」、例えば Hentze & Kulozik, Cell 96:307-310 (1999); Culbertson, Trends in Genetics 15:74-80 (1999); Li & Wilkinson, Immunity 8:135-141 (1998); および RuizEchevarria et al., TIBS 21-433-438 (1996)）と称される。ＮＭＤは、正常細胞（すなわちＢおよびＴ細胞）および遺伝的変異を伴う細胞（すなわちβ−グロブリン、ＣＦＴＲ、およびジストロフィン中に変異を伴う細胞）の両者において作動する転写後機構である。
【０００４】
ＮＭＤ機構は、正常および早期終止コドンを区別した後、早期終止コドンを伴う多数のＲＮＡを分解に付する。早期終止コドンがＯＲＦの末端近くか、あるいは最後のエキソン内に位置する場合、ＲＮＡはＮＭＤに付されず、その結果トランケートされたポリペプチドが生産されることがある。
【０００５】
多くのヒト疾患は、ナンセンス変異によって引き起こされ、これには例えばｐ５３に関連する癌、網膜芽細胞腫、デュシェンヌ筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、フォンウィルブランド病、サラセミア、神経線維腫症、テイ・サックス病、および血友病がある。ＣＦＴＲ遺伝子内に早期終止コドンを有する培養細胞中、この細胞をアミノグリコシドで処理した場合に、完全長ＣＦＴＲの合成が観察された（例えば Bedwell et al., Nat. Med. 3:1280-1284 (1997); Howard et al., Nat. Med. 2:467-469 (1996)）。さらに、デュシェンヌ筋ジストロフィーに関するマウスモデルでは、硫酸ゲンタマイシンが、ジストロフィン遺伝子内の早期終止コドンでの翻訳終結を抑制することがわかった。これらの抗生物質は早期終止コドンの部位でのミスリーディングおよび別のアミノ酸の挿入を媒介した（例えば Barton-Davis et al., J. Clin Invest. 104:375-381 (1999)）。このように生じたジストロフィンは、ｍｄｘマウスにおいて収縮誘導性損傷に対する保護を提供した。
【０００６】
早期翻訳終結を抑制する化合物は、ナンセンス変異によって生じる多数の疾患に対する有用な処置となろう。したがって、ＮＭＤおよび早期翻訳終結の阻害に関連する薬物の発見に関する高処理量の検定（アッセイ）が望まれる。本発明は、これらの検定、ならびに本明細書から明らかである他の特徴を提供する。
【０００７】
発明の要旨
したがって本出願は、細胞内の早期翻訳終結（premature translation termination）およびナンセンス媒介性ＲＮＡ崩壊を阻害する化合物に関する、高処理量の検定方法を提供する。
【０００８】
一側面では、本発明は、早期翻訳終結およびナンセンス媒介性ｍＲＮＡ崩壊を調節する化合物のインビトロスクリーニング方法であって、（ｉ）インビトロ翻訳細胞抽出物；ポリペプチドをコードする核酸（ここにこのポリペプチドのコード配列は早期終止コドンを含む）；および調節化合物候補を含む翻訳検定物をインキュベートする工程；および（ｉｉ）この核酸から翻訳されたポリペプチドを検出する工程を含む方法を提供する。
【０００９】
一態様では、細胞抽出物は酵母、植物、哺乳類、また両生類由来である。別の態様では、細胞抽出物は真核生物の網状赤血球ライセート、例えばウサギ網状赤血球ライセートである。別の態様では、細胞抽出物は哺乳類の組織培養細胞抽出物、例えばＨｅＬａ細胞Ｓ１００抽出物である。一態様では、この核酸はインビトロで転写されたＲＮＡである。
【００１０】
別の側面では、本発明は、早期翻訳終結およびナンセンス媒介性ｍＲＮＡ崩壊を調節する化合物のインビボスクリーニング方法であって、（ｉ）細胞内でポリペプチドをコードする核酸を発現させる工程（ここにこのポリペプチドのコード配列は早期終止コドンを含む）；（ｉｉ）この細胞を調節化合物候補と接触させる工程；および（ｉｉｉ）この核酸から翻訳されたポリペプチドまたはこの核酸から転写されたＲＮＡを検出する工程を含む方法を提供する。
【００１１】
一態様では、核酸は、ポリペプチドをコードする異種核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含む。別の態様では、このポリペプチドをコードする異種核酸はイントロンおよび、コード配列を含む少なくとも２つのエキソンを含む。別の態様では、早期終止コドンは最後のエキソン内に位置する。別の態様では、異種核酸はキメラポリペプチドをコードする。別の態様では、この核酸は内因性遺伝子、例えば免疫グロブリン、α−グロビン、β−グロビン、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、ｖＷＦ、ｐ５３、ジストロフィン、ＣＦＴＲ、Ｒｂ、ＭＳＨ１、ＭＳＨ２、ＡＰＣ、Ｗｔ１、ヘキソサミニダーゼＡ、ニューロフィブロミン１、またはニューロフィブロミン２である。別の態様では、この細胞を固形支持層（支持体）、例えばビーズ、膜、およびミクロタイタープレートに付着させる。別の態様では、細胞はヒト細胞またはマウス細胞である。別の態様では、この細胞はこの核酸で安定にトランスフェクトされたものである。
【００１２】
一態様では、この核酸は酵素をコードする。別の態様では、この核酸は免疫グロブリンをコードする。別の態様では、この核酸はルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、キナーゼ、クロラムフェニコール トランスフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼをコードする。別の態様では、このポリペプチドは、ＥＬＩＳＡ、光放射、比色測定、酵素活性、または放射能によって検出される。
【００１３】
一態様では、この検定は、ミクロタイター皿、例えば９６ウェルまたは３８４ウェルを有するミクロタイター皿のウェルで行う。別の態様では、ミクロタイタープレート形式中、この方法の工程を並行して繰り返し、ここでは少なくとも約１００から少なくとも約６，０００の範囲の種々の化合物が試験される。別の態様では、この検定は、自動ピペットステーション、ロボット電機子（a robotic armature）、およびロボットコントローラーを含む高処理量の統合系で行われる。
【００１４】
別の側面では、本発明は、翻訳終結およびナンセンス媒介性ｍＲＮＡ崩壊を調節する化合物のスクリーニング用キットであって、ポリペプチドをコードする核酸（ここにこのポリペプチドのコード配列は早期終止コドンを含む）；早期終止コドンでの翻訳終結およびナンセンス媒介性ＲＮＡ崩壊を阻害する化合物のスクリーニング方法を実施するための指示書；およびナンセンス媒介性ＲＮＡ崩壊を阻害するコントロール化合物を含むキットを提供する。
【００１５】
一態様では、コントロール化合物はＧ４１８または硫酸ゲンタマイシンである。
【００１６】
発明の詳しい説明
導入
本発明は、ＮＭＤおよびＲＮＡ内のナンセンス変異によって生じる早期翻訳終結を阻害する化合物をスクリーニングするための高処理量の検定方法を提供する。この検定は細胞翻訳抽出物または転写−翻訳抽出物の混合物および異種性または内因性レポーター核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いてインビトロで行うことができる。この検定はまた、異種性（一時的または安定にトランスフェクトされているもの）または内因性レポーター核酸を有する細胞を用いてインビボで行うこともできる。阻害化合物は、この検定において完全長レポーターＲＮＡまたは完全長レポータータンパク質が生じたか否かを測定することによって検出する。
【００１７】
本発明の検定を用いて同定された阻害化合物を用いて、ナンセンス変異に関連する疾患を処置する。本発明の化合物は、ナンセンスコドンの読み飛ばし（read-through）を可能にし、完全長ポリペプチドを生じさせる。ナンセンス変異に関連する疾患には、例えば血液疾患、例えばサラセミア（α−グロビンおよびβ−グロビン遺伝子）、血友病ＡおよびＢ（因子ＶＩＩＩおよび因子ＩＸ遺伝子）、およびフォンウィルブランド病（ｖＷＦ遺伝子）；ｐ５３関連の癌、例えば肺癌、乳癌、大腸癌、膵癌、食道癌、非ホジキンリンパ腫、および卵巣癌（ｐ５３遺伝子）；結腸直腸癌（ＡＰＣ、ＭＳＨ１およびＭＳＨ２遺伝子）；嚢胞性線維症（ＣＦＴＲ遺伝子）；デュシェンヌ筋ジストロフィー；（ジストロフィー遺伝子）テイ・サックス病（ヘキソサミニダーゼＡ遺伝子）；ウィルムス腫（Ｗｔ１遺伝子）；網膜芽細胞腫（Ｒｂ遺伝子）、神経線維腫症（ＮＦ１およびＮＦ２遺伝子）；腎石（kidney stones）、およびコラーゲン障害が含まれる。
【００１８】
上に記載されるように、一態様では、本検定はインビトロ検定である。このインビトロ検定は翻訳抽出物または転写−翻訳抽出物および、早期終止コドンを有する、レポーターポリペプチドをコードするレポーター核酸分子を用い、ナンセンス媒介性ｍＲＮＡ崩壊および早期翻訳終結の潜在的阻害物質である化合物を試験する。阻害化合物は、この核酸分子から翻訳された完全長ポリペプチドの生産を検出することによって同定される。
【００１９】
レポーター核酸は、本明細書中に記載される任意の方法によってその完全長ポリペプチドがラベル可能であるか、あるいは検出可能である任意のポリペプチドをコードする。一態様では、このポリペプチドは、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、キナーゼ、クロラムフェニコール トランスフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼのような酵素である。別の態様では、このポリペプチドは緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質である。別の態様では、このポリペプチドは、抗体、あるいは放射能ラベルなどによって検出可能である任意のポリペプチドである。終止コドンは、完全長ポリペプチドに関する正しい終止コドンに対してＮ末端側であるポリペプチドの任意の位置であり得る。
【００２０】
このインビトロ反応は翻訳反応または転写−翻訳反応の組み合わせであり得る。翻訳および転写−翻訳に関する細胞抽出物は市販されているか、あるいは当業者に既知の標準的方法を用いて製造できる（例えば Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994); および Jackson & Hunt, Methods in Enzymology 96:50-75 (1983) を参照）。転写−翻訳反応の組み合わせに関して、核酸は、典型的にＤＮＡ分子であり、これはＲＮＡ分子に転写されてから翻訳される。翻訳反応では、この核酸は典型的にＲＮＡであり、インビトロで転写されたＲＮＡまたは内因性ＲＮＡである。例えば細菌ＲＮＡポリメラーゼ、例えばＳＰ６およびＴ７を用いる、インビトロで転写されたＲＮＡの作成方法は、当分野に周知である（例えば Contreras et al., Nuc. Acids Res. 10:6353 (1982) を参照）。翻訳または転写−翻訳反応に適当な細胞抽出物には、酵母、分裂酵母、植物、両生類（例えばアフリカツメガエル）、植物（例えばコムギ胚芽）および哺乳類由来のものが含まれる（例えば Krieg & Melton, Nature 308:203 (1984); Dignam et al., Methods Enzymol. 182:194-203 (1990) を参照）。一態様では、抽出物は網状赤血球ライセート（好ましくはウサギ由来）である。別の態様では、抽出物は培養細胞、好ましくはマウス、ラット、またはヒト細胞由来、例えばＨｅＬａ細胞由来のＳ１００抽出物である（Dignam et al., Nuc. Acids Res. 11:1475-1489 (1983)）。
【００２１】
別の態様では、この検定はインビボの、細胞に基づく検定である。このインビボ検定は細胞、典型的には培養細胞、および、早期終止コドンを含む、レポーターポリペプチドをコードするレポーター核酸分子を用いて、ナンセンス媒介性ｍＲＮＡ崩壊および早期翻訳終結の潜在的阻害物質である化合物を試験する。阻害化合物は、この核酸分子由来の完全長レポーターポリペプチドの生産を検出することによってか、あるいはこのレポーター核酸から転写された完全長レポーターＲＮＡを検出することによって同定される。
【００２２】
このレポーター核酸は任意のポリペプチドをコードし、ここに完全長ポリペプチドは本明細書中に記載の任意の方法によってラベルし、あるいは検出することができる。レポーター核酸は、内因性遺伝子または、この細胞内で安定に、あるいは一時的に発現された異種遺伝子であり得る。さらに、異種性レポーター核酸は、キメラポリペプチド、例えば種々のポリペプチドおよび／または種々の種由来の種々のポリペプチドのキメラ、例えばヒトβ−グロビン由来のエキソンおよびイントロンおよびハエ ルシフェラーゼをコードする配列を含むキメラをコードし得る。一態様では、レポーター核酸は、酵素、例えばルシフェラーゼ、ホスファターゼ、例えばアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、キナーゼ、クロラムフェニコール トランスフェラーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼをコードする異種核酸である。別の態様では、この異種核酸は緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、または免疫グロブリンまたはその断片をコードする。別の態様では、レポーター核酸は内因性遺伝子、例えば免疫グロブリン遺伝子、α−グロビン、β−グロビン、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、ｖＷＦ、ｐ５３、ジストロフィン、ＣＦＴＲ、Ｒｂ、ＭＳＨ１、ＭＳＨ２、ＡＰＣ、Ｗｔ１、ヘキソサミニダーゼＡ、ニューロフィブロミン１、またはニューロフィブロミン２である。別の態様では、このポリペプチドは抗体または放射能ラベルなどによって検出可能な任意のポリペプチドである。
【００２３】
早期終止コドンは、完全長ポリペプチドに関する正しい終止コドンに対してＮ末端側であるポリペプチド中の任意の位置であり得る。レポーターポリペプチドはイントロンを含む可能性があり、いずれか１つのエキソン内に早期終止コドンが位置する。早期終止コドンは天然に存在するものであり得、あるいはインビトロ突然変異誘発技術、例えばＰＣＲ、リンカー挿入、オリゴヌクレオチド媒介性突然変異誘発、およびランダム化学突然変異誘発（インビボおよびインビトロの両方）によって生じさせ得る。
【００２４】
本発明の方法において、任意の適当な真核生物培養細胞、例えば昆虫細胞、酵母細胞、および哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞を用いることができる。細胞は形質転換セルラインまたはプライマリー細胞であり得、接着（付着）性または懸濁物であり得る。一態様では、細胞はハイブリドーマまたはプレＢ細胞または癌細胞である。別の態様では、細胞は２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｋ５６２細胞、または３Ｔ３細胞である。細胞は溶液状態であり得、あるいは固形支持層、例えばビーズまたはプレートにアンカーされた状態であり得る。
【００２５】
好ましくは、インビトロまたはインビボ検定は、ミクロタイタープレートおよび液状ロボット手法、または蛍光抗体またはリガンドを用いる細胞分類（ＦＡＣＳ）を用いる高処理量形式で行われる。インビトロおよびインビボ検定は試験化合物と任意の適切な時間長、すなわち、インビトロ反応に関して約１５、３０、または４５分から１時間まで、１時間、１時間半、２時間、４時間、６時間、１２時間またはそれ以上で１日またはそれ以上まで、ならびにインビボ反応に関して１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間またはそれ以上から１日、２日、３日またはそれ以上までインキュベートすることができる。試験化合物とレポーター反応物のインキュベーションの時間は、当業者が標準的方法論を用いて測定できる。
【００２６】
定義
本明細書中で用いられる以下の用語は、特に記載しない限り、それらに相当する意味を有する。
【００２７】
「核酸から翻訳されたポリペプチドまたは核酸から転写されたＲＮＡを検出する」とは、早期終結および／またはＮＭＤの間接的または直接的影響下であるパラメータ、例えば機能的、物理的および化学的作用を増大または減少させる化合物に関するアッセイを意味する。このような作用は、当業者に既知の任意の手段、例えば分光学的性質（例えば蛍光、吸光度、屈折率）、酵素活性、タンパク質発現、電位感受性色素、放射性同位体流出、誘導可能なマーカー、ＲＮＡ発現のレベル、ｍＲＮＡの適正なスプライシング、リガンド結合アッセイの変化、細胞内の第二メッセンジャー、例えばｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、およびイノシトールトリホスフェート（ＩＰ３）の変化、細胞内カルシウムレベルの変化などによって測定できる。
【００２８】
「阻害物質（inhibitors）」、「抑制因子（suppressors）」および「調節因子（modulators）」は交換可能に用いられ、インビトロおよびインビボアッセイを用いて同定された化合物を用いて早期翻訳終結およびＮＭＤを阻害、抑制、または調節することを意味する。阻害物質は、例えば、早期翻訳終結およびＮＭＤと結合し、これを部分的または全体的にブロックし、崩壊させ、阻害し、遅延させ、不活化し、脱感作するか、あるいは下方調節する化合物である。調節因子には、天然に存在する、および合成のリガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、小化学分子などが含まれる。阻害物質に関するこのようなアッセイは、例えば、インビトロ検定または細胞内で試験核酸を発現させ、推定の調節化合物を適用し、次いで試験核酸のＲＮＡまたはタンパク質レベルに対する機能的作用を測定することを含む。潜在的阻害物質または調節因子で処理されるサンプルまたは検定物は、阻害物質または調節因子を含まないコントロールサンプルと比較して、阻害の程度を試験される。（阻害物質で処理されない）コントロールサンプルは比活性値１００％とされる。コントロールと比較した活性値が少なくとも１１０％、場合により１５０％、２００％、５００％、１００％、２００％、５０００％、１０，０００％またはそれ以上である、すなわち、１と１／２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍またはそれ以上活性が増加した場合に、早期翻訳終結およびＮＭＤの阻害が達成される。阻害は完全長ポリペプチドまたは完全長ＲＮＡのいずれかを検出することによって測定できる。場合により、阻害コントロール反応には、既知の阻害物質、例えばアミノグリコシド抗生物質、例えばＧ４１８を用いることが含まれる。
【００２９】
「抗体」または「免疫グロブリン」は交換可能に用いられ、抗原を特異的に結合し、認識する免疫グロブリン遺伝子由来のフレームワーク領域またはその断片を含むポリペプチドを意味する。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子ならびに種々の免疫グロブリン多様性／連結物／可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はカッパまたはラムダとして分類される。重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、ここにそれぞれ免疫グロブリンのクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥが規定される。
【００３０】
例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位はテトラマーから構成される。各テトラマーは、それぞれ１個の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１個の「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を有する２個の同一ペアから構成される。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に関与する約１００−１１０またはそれ以上のアミノ酸を規定する。用語「可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）」はそれぞれ、これら軽鎖および重鎖を表す。
【００３１】
抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリンとしてか、あるいは、種々のペプチダーゼによる消化によって作成された多数のよく特徴付けされた断片として存在する。したがって、例えばペプシンは抗体をそのヒンジ領域のジスルフィド結合下で消化し、Ｆ(ａｂ)'２を生じる。これはそれぞれ軽鎖がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１と結合しているＦａｂの二量体である。Ｆ(ａｂ)'２は穏やかな条件下で還元され、そのヒンジ領域のジスルフィド結合を崩壊させることができ、これによりＦ(ａｂ)'２二量体はＦａｂ'単量体に変換される。このＦａｂ'単量体は本質的にそのヒンジ領域の部分を有するＦａｂである（Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993) 参照）。種々の抗体断片は、無傷の抗体の消化に関して規定されるが、当業者であれば、このような断片は新たに化学的に合成するか、あるいは組換えＤＮＡ方法論を用いて合成することができることを理解するだろう。これゆえ、本明細書中で用いられる用語「抗体」はまた、完全抗体の修飾によって作成されたか、あるいは組換えＤＮＡ方法論を用いて新たに合成された（例えば単一鎖Ｆｖ）か、あるいはファージディスプレーライブラリー（例えば McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990) を参照）を用いて同定された抗体断片を含む。
【００３２】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造に関して、当分野に既知の任意の技術を用いることができる（例えば Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985) を参照）。単一鎖抗体を製造する技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を本発明のポリペプチドに対する抗体の作成に適用できる。また、トランスジェニックマウス、または他の生物、例えば他の哺乳類を用いて、ヒト化抗体を発現させることができる。別法として、ファージディスプレー技術を用いて、選択された抗原と特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂ断片を同定できる（例えば McCafferty et al., Nature 348:552-554(1990); Marks et al., Biotechnology 10: 779-783 (1992) を参照）。
【００３３】
「キメラ抗体」または「キメラ免疫グロブリン」は、（ａ）定常領域またはその部分が変化し、置換され、あるいは交換され、その抗原結合部位（可変領域）が、異なったクラスまたは変化したクラスの定常領域、エフェクター機能および／または種、または、このキメラ抗体に新規性質を付与する完全に異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などと連結されているか；あるいは（ｂ）異なる抗原特異性または変化した抗原特異性を有する可変領域を用いて、その可変領域またはその部分が変化し、置換され、あるいは交換されている抗体分子である。
【００３４】
「核酸」とは、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを表す。この用語は、基準となる核酸と同様の結合性質を有し、ならびに基準となるヌクレオチドと同様に代謝される、合成の、天然に存在する、ならびに非天然に存在する既知のヌクレオチドアナログまたは修飾されたバックボーン残基または結合を有する核酸を包含する。このようなアナログの例には、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホナート、キラルメチルホスホナート、２−Ｏ−メチル リボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡｓ）が含まれるがこれらに限定されない。
【００３５】
特に記載しない限り、特定の核酸配列はその保存的修飾変異体（例えば縮重コドンの置換）および相補的配列、ならびに明示された配列を内包する。具体的には、縮重コドンの置換は、１またはそれ以上の選択された（か、あるいはすべての）コドンの三番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作成することによって達成することができる（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。用語「核酸」は「遺伝子」、「ｃＤＮＡ」、「ｍＲＮＡ」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」と交換可能に用いられる。
【００３６】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書中で交換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを表す。この用語は、１またはそれ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび非天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用する。
【００３７】
用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに、その天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を表す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝的コードによってコードされるものであり、ならびに後に修飾されたそのようなアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基と結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン（norleucine）、メチオニン スルホキシド、メチオニン メチル スルホニウムを表す。このようなアナログは修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチドバックボーンを有するが、天然に存在するアミノ酸と同一の基本的化学構造を維持している。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学化合物を表す。
【００３８】
本明細書中、アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Biochemical Nomenclature Commision によって推奨される、その一般に既知の三文字記号または１文字記号によって記載することができる。同様にヌクレオチドはその一般に許容される一文字コードによって記載することができる。
【００３９】
「保存的修飾変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。具体的核酸配列に関して、「保存的修飾変異体」とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸であるか、あるいはこの核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列を表す。遺伝コードの縮重のせいで、多数の機能的に同一な核酸が任意の規定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべてアミノ酸アラニンをコードする。したがって、コドンによってアラニンを特定するすべての部分で、そのコドンは、コード化ポリペプチドの変化を伴わずに任意の対応するコドンに変化させることができる。このような核酸変異体は「サイレント変異体」であり、これは保存的修飾変異体の一種である。また、ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列は、その核酸のすべての可能なサイレント変異体を記載している。当業者であれば、核酸中の各コドン（ＡＵＧ（通常、メチオニンに関する唯一のコドン）およびＴＧＧ（通常、トリプトファンに関する唯一のコドン）を除く）を修飾して機能的に同一の分子を生じさせることができることを認識するだろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異体は、記載される各配列中に暗示されている。
【００４０】
アミノ酸配列に関して、当業者であれば、コード化配列中の単一のアミノ酸または少ないパーセンテージのアミノ酸が変化、付加または欠失されている、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加であって、その変化が、アミノ酸の化学的に同様のアミノ酸による置換を生じさせるものが「保存的修飾変異体」であることを認識するだろう。機能的に同様のアミノ酸を提供する保存的置換テーブルは当分野で周知である。このような保存的に修飾された変異体は加えて、多形性変異体、種間相同体、および本発明の対立遺伝子を排除しない。
【００４１】
以下の８群はそれぞれ、相互に保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば Creighton, Proteins (1984) を参照）。
【００４２】
「ラベル」または「検出可能部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出可能な組成物である。例えば有用なラベルには、３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えばＥＬＩＳＡにおいて一般に用いられるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテン、および例えばペプチド内に放射ラベルを包含させることによって検出可能にされ得るタンパク質、あるいはこのペプチドと特異的に反応性である抗体の検出に用いられ得るタンパク質が含まれる。
【００４３】
用語「組換え」とは、例えば細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに対して用いられる場合、その細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種核酸またはタンパク質の導入、または天然核酸またはタンパク質の変化によって修飾されたものであるか、あるいはその細胞がそのように修飾された細胞由来であることを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞内には見られない遺伝子を発現するか、あるいは、別の条件では、異常発現、少量発現されるか、あるいは全く発現されない天然の遺伝子を発現する。
【００４４】
用語「異種（性）（heterologous）」は、核酸の部分に関して用いられる場合、この核酸が、性質上、互いに同じ関係には見出せない２個またはそれ以上の連続物を含むことを示す。例えば、この核酸は典型的には、組換え的に作成され、新規な機能性核酸を作成するように配置された、関連しない遺伝子由来の２個またはそれ以上の配列、例えばあるソース由来のプロモーターおよび別のソース由来のコード化領域を有する。同様に、異種タンパク質とは、性質上、互いに同じ関係には見出せない２個またはそれ以上の連続物を含むタンパク質を表す。
【００４５】
「プロモーター」とは、核酸の転写に関係する核酸制御配列のアレイとして定義される。本明細書中で用いられるプロモーターには、転写開始部位の近くの必要な核酸配列、例えばポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡ因子または開始因子が含まれる。プロモーターはまた、場合により、その近くに、アクチベーターまたはリプレッサー結合部位（群）（例えば ＳＰ１またはＮＦカッパＢ部位）、または遠位のエンハンサーまたはリプレッサー因子（これらは転写開始部位から数千塩基対ほどの位置にあり得る）を含む。「構成性」プロモーターは、ほとんどの環境および発生上の条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターまたは「組織特異的」プロモーターは非構成性プロモーターであり、これは例えば環境的、時間的、組織特異的、または発生上の調節下で活性である。用語「作動可能に連結された」とは、核酸発現制御配列（例えばプロモーター、または転写因子結合部位のアレイ）と第二の核酸配列間の機能性連結を表し、ここに発現制御配列は、第二の配列に対応する核酸の転写に関連する。
【００４６】
「発現ベクター」は、組換え的または合成的に作成された、宿主細胞内で特定の核酸の転写を可能にする一連の特定された核酸因子を有する核酸構築物である。発現ベクターはプラスミド、ウイルス、または核酸断片の部分であり得る。典型的に、発現ベクターは、プロモーターに作動可能に連結された、転写される核酸を含む。
【００４７】
レポーター遺伝子のクローニングおよび発現
Ａ．一般的組換えＤＮＡ法
本発明は組換え遺伝学の分野の通常の技術に依存するものである。本発明において使用する一般的方法を開示している基本的テキストには、Sambrook et al.,. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994) が含まれる。標準的突然変異誘発法を用いて、選択されたレポーター遺伝子または内因性遺伝子内にナンセンス変異を導入することができる。
【００４８】
核酸に関して、サイズはキロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）で与えられる。これらはアガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、配列決定された核酸、または公開されているＤＮＡ配列から見積もられたものである。タンパク質に関して、サイズはキロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で与えられる。タンパク質のサイズは、ゲル電気泳動、配列決定されたタンパク質、導かれたアミノ酸配列、または公開されているタンパク質配列から見積もられる。
【００４９】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22:1859-1862 (1981) によって最初に記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法にしたがい、Van Devanter et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984) に記載のように自動合成装置を用いて化学的に合成できる。オリゴヌクレオチドの精製は、天然アクリルアミドゲル電気泳動またはアニオン交換ＨＰＬＣにより、Pearson & Reanier, J. Chrom. 255:137-149 (1983) に記載のように行う。
【００５０】
クローン化遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、例えば二本鎖鋳型を配列決定するための鎖終結法（Wallace et al., Gene 16:21-26 (1981)）を用いてクローニングした後に確認できる。
【００５１】
Ｂ．ヌクレオチド配列の単離のためのクローニング法
一般に、本発明の異種性レポーター遺伝子をコードする核酸配列はｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡライブラリーからプローブを用いるハイブリダイゼーションによって単離されるか、あるいはオリゴヌクレオチドプライマーを用いる増幅技術を用いて単離される。例えば、レポーター配列は典型的に哺乳類核酸（ゲノムまたはｃＤＮＡ）ライブラリーから、核酸プローブ（この配列は Genebank または他のデータベースまたは公開から得られたものである）を用いるハイブリダイゼーションによってか、あるいはクローン化された相同分子種を用いることによって単離される。ＲＮＡおよびｃＤＮＡを単離するための適当な組織は当業者によって決定される。ゲノムおよびｃＤＮＡライブラリーの作成方法は周知である（例えば Gubler & Hoffman, Gene 25:263-269 (1983); Sambrook et al., 上記; Ausubel et al., 上記を参照）。組換えファージは、Benton & Davis, Science 196:180-182 (1977) に記載のプラークハイブリダイゼーションによって分析される。コロニーハイブリダイゼーションは、Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 72:3961-3965 (1975) に全般に記載されるように行う。
【００５２】
また、プライマーを用いるＰＣＲおよびＬＣＲのような増幅技術を用いて、ＤＮＡまたはＲＮＡ由来のレポーター配列を増幅および単離することができる（例えば Dieffenfach & Dveksler, PCR Primer: A Laboratory Manual (1995); 米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds, 1990) を参照）。これらのプライマーを用いて、例えば完全長配列を増幅するか、あるいは１から数百ヌクレオチドのプローブを増幅し、次いでこれを用いて哺乳類ライブラリーを完全長クローンに関してスクリーニングすることができる。さらに、以下のアミノ酸配列をコードする分解性プライマーを用いて、特定のレポーター遺伝子の配列を増幅することができる。上記のように、このようなプライマーを用いて、完全長配列を単離するか、あるいは例えばライブラリー由来の単離される完全長配列に対して使用できるプローブを単離することができる。また、レポーター遺伝子をコードする核酸は、抗体をプローブとして用いて発現ライブラリーから単離できる。
【００５３】
合成オリゴヌクレオチドを用いて組換えレポーター遺伝子を構築することができる。この方法は、遺伝子のセンスおよびナンセンス両鎖を表す、通常４０−１２０ｂｐ長の一連のオーバーラップするオリゴヌクレオチドを用いて行う。次いでこれらのＤＮＡ断片はアニーリングされ、連結され、クローニングされる。
【００５４】
場合により、レポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼおよびβ−グロビンの組み合わせを含む、キメラタンパク質をコードする核酸を標準的手法にしたがって作成することができる。また、このキメラ遺伝子は異なる種、例えば細菌（例えば大腸菌）、酵母、無脊椎動物、例えばハエおよび線虫、および哺乳類遺伝子（例えばラット、マウス、またはヒト遺伝子）由来の遺伝子またはエキソンの組み合わせであり得る。キメラ遺伝子はある遺伝子由来のエキソンおよびイントロン、および別の遺伝子由来の第二のエキソンを有することがよくある。キメラ遺伝子の作成に関して選択される他の異種タンパク質には、例えば赤色または緑色蛍光タンパク質、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、キナーゼ、クロラムフェニコール トランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルタメート受容体およびロドプシン プレシーケンス（presequence）が含まれる。
【００５５】
Ｃ．原核生物および真核生物における発現
クローン化遺伝子または核酸を発現させるため、典型的にはこの配列を、転写を指揮するプロモーター、場合により転写または翻訳ターミネーター、および場合によりタンパク質をコードする核酸、翻訳開始に関するリボソーム結合部位に関するものを含む発現ベクター内へサブクローニングする。適当な細菌プロモーターは当分野に周知であり、例えば Sambrook et al. および Ausubel et al. に記載されている。細菌発現系は例えば大腸菌、バシラス種およびサルモネラにおいて利用可能である（Palva et al., Gene 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983)）。このような発現系用のキットは市販されている。哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞に関する真核生物発現系は当分野に周知であり、また市販されている。ＲＮＡ発現系、例えばＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる系もまた当業者に周知であり、市販されている。
【００５６】
異種核酸の発現を指揮するのに用いられるプロモーターは、その具体的な適用に依存する。このプロモーターは場合により、異種性転写開始部位から、その天然設定における転写開始部位からとほぼ同じ距離に位置する。しかし、当分野に知られているように、プロモーター機能を喪失することなく、この距離においてはいくつかのバリエーションを適応させることができる。
【００５７】
プロモーターに加えて、発現ベクターは典型的に、宿主細胞内での核酸の発現に関して必要とされるすべてのさらなる因子を含む転写単位または発現カセットを含む。したがって、典型的な発現カセットは、核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターおよび転写物の効率的なポリアデニル化に必要とされるシグナル、リボソーム結合部位、および翻訳終結を含む。カセットのさらなる因子には、エンハンサーおよび、構造遺伝子としてゲノムＤＮＡを用いる場合には、機能的スプライスドナーおよびアクセプター部位を有するイントロンを含む。
【００５８】
プロモーター配列に加えて、発現カセットは、構造遺伝子の下流に、効率的な終結を提供する転写終結領域を含むべきである。この終結領域はプロモーター配列と同一の遺伝子から得てもよく、あるいは別の遺伝子から得てもよい。
【００５９】
遺伝情報の細胞内への輸送に用いられる具体的な発現ベクターは、特に重要ではない。真核および原核生物細胞における発現に関して用いられる任意の慣用的ベクターを用いることができる。標準的細菌発現ベクターには、プラスミド、例えばｐＢＲ３２２に基づくプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、および融合発現系、例えばＧＳＴおよびＬａｃＺが含まれる。またエピトープタグを組換えタンパク質に加え、便利な単離方法を提供できる（例えばｃ−ｍｙｃ）。
【００６０】
真核生物ウイルス由来の調節因子を含む発現ベクターは、典型的に、真核生物発現ベクター、例えばＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、および Epstein-Barr ウイルス由来のベクター中で用いられる。他の例示的真核生物ベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腫瘍ウイルスプロモーター、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞内での発現に有効であることが示される他のプロモーターの指揮下に、タンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。
【００６１】
また、発現ベクター内に典型的に含まれる因子には、大腸菌において機能するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および、真核生物配列の挿入を可能にするプラスミドの必須でない領域における唯一の制限部位が含まれる。選択される具体的な抗生物質耐性は重要ではなく、当分野に既知の多数の任意の耐性遺伝子が適当である。原核生物配列はまた、場合により、必要であれば、真核生物細胞内でのこのＤＮＡの複製を妨害しないように選択される。
【００６２】
標準的トランスフェクション方法を用いて、この核酸を発現する、細菌、哺乳類、酵母または昆虫セルラインを作成する。真核生物および原核生物細胞の形質転換は、標準的技術にしたがって行う（例えば Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)）。
【００６３】
外来のヌクレオチド配列を宿主細胞内へ導入する周知の手法のいずれかを用いることができる。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、プラズマベクター、ウイルスベクターの使用および任意の他の周知の、クローン化ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝物質の宿主細胞内への導入方法が含まれる（例えば Sambrook et al., 上記を参照）。唯一必要なことは、用いられる具体的な遺伝子工学手法が、少なくとも１つの遺伝子を宿主細胞内へ首尾良く導入可能なものであることである。
【００６４】
発現ベクターを細胞内へ導入した後、トランスフェクトされた細胞を、以下に同定される標準的技術を用いてレポーター遺伝子の発現に好ましい条件下で培養する。
【００６５】
異種性レポーター遺伝子に加えて、また、内因性遺伝子をレポーターとして用いることができる。適当な内因性遺伝子、例えばＣＦＴＲ、ジストロフィン、免疫グロブリン、β−グロビン、ｐ５３、網膜芽細胞腫、ニューロフィブロミン（neurofibromin）などを含む細胞を、以下に記載の標準的技術を用いてこの内因性レポーター遺伝子の発現に好ましい条件下で培養する。
【００６６】
細胞培養および選択
組織または血液サンプル由来のセルラインおよび培養細胞を含む、本発明の検定において用いられる細胞の培養は当分野に周知である。Freshney (Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)) およびその引用文献は細胞の培養に関する一般的な指針を提供する。細胞培養に関するさらなる情報は Ausubel および Sambrook 上記に見出せる。細胞培養培地は The Handbook of Microbiological Media (Atlas & Parks, eds., 1993) に記載されている。さらなる情報は商用文献、例えば the Life Science Research Cell Culture Catalogue (1998) (Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, MO)) および例えば the Plant Culture Catalogue and Supplement (1997) (Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, MO)) に見出せる。細胞は、意図される適用および利用可能な装置に応じて、バルクフラスコ中で培養して、これを支持層（例えばミクロタイタープレート）に加えることができ、あるいは支持層（例えばミクロタイタープレートのウェル中）で直接培養することができる。
【００６７】
細胞の選択は意図される適用に基づく。特定細胞における遺伝子の早期翻訳終結の阻害が検定の標的である場合、この特定細胞またはこの細胞の関連する細胞培養形態は典型的に標的である。いくつかの態様では、培養時に、この細胞が入っている容器の支持層に接着する接着細胞が好ましい。接着細胞タイプの多くの例は既知であり、これには上皮細胞および内皮細胞タイプが含まれる。性質上接着性ではない細胞は、支持層を化学的に修飾する（例えば支持層をシランで処理してＯＨ基を提供するか、あるいはアミン試薬で処理してアミン基を提供する）ことによってか、あるいはこの細胞上に細胞表面レセプター分子を発現させ（例えば組換え的に）、支持層に固定された適当なリガンドを提供することによって接着性にすることができることがよくある。一態様では、この細胞は、ハイブリドーマまたはプレＢ細胞である。別の態様では、この細胞は哺乳類またはマウス細胞、例えば２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｋ５６２細胞、または３Ｔ３細胞である。
【００６８】
阻害物質およびハイスループット（高処理量）法
Ａ．阻害物質
早期翻訳終結およびＮＭＤの阻害物質および調節因子として試験する化合物は、いずれかの小さな化学的化合物または生物学的実体（例えば、タンパク質、糖、核酸または脂質）であり得る。典型的に、試験化合物は小化学分子およびペプチドであろう。本質的にいずれかの化合物を、本発明の検定において潜在的な調節因子として使用することができる。該化合物は、水溶液または有機溶液（例えば、メタノール、ＤＭＳＯまたは有機溶媒の混合物）に溶解することができる。該アッセイ（検定）は、該アッセイ工程を自動化し、そしていずれかの便利な供給源からアッセイに化合物を供給することによって（これらは、例えば、ロボットアッセイにおけるミクロタイタープレートのミクロタイターフォーマット中で典型的に平行して行なう）、大きいケミカルライブラリーをスクリーニングするように設計する。。化学的化合物の多数の供給主（例えば、シグマ（St. Louis, MO）、アルドリッチ（St. Louis, MO）、シグマ−アルドリッチ（St. Louis, MO）、フルカ・ケミカバイオケミカアナリティカ（Buchs, スイス）などを含む）が存在することが知られる。
【００６９】
ある実施態様において、ハイスループットスクリーニング法は、多数の潜在的な治療化合物（潜在的な調節因子またはリガンド化合物）を含有するコンビナトリアルケミカルライブラリーまたはコンビナトリアルペプチドライブラリーを含む。次いで、それら「コンビナトリアルケミカルライブラリー」または「リガンドライブラリー」を、本明細書に記載の通り、１つ以上のアッセイにおいてスクリーニングして、望む固有の活性を示すそれらライブラリー要素（ある化学種またはサブクラス）を同定する。そのようにして同定した該化合物は、通常の「リード化合物」として機能したり、またはそれ自身潜在的なもしくは実際の治療として使用することができる。
【００７０】
コンビナトリアルケミカルライブラリーは、化学的な合成もしくは生物学的な合成のいずれかによって、または多数の化学的な「ビルディングブロック」（例えば、試薬）を組み合わせることによって得られる、種々の化学的化合物の集合である。例えば、リニア（linear）コンビナトリアルケミカルライブラリー（例えば、ポリペプチドライブラリー）は、一定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物におけるアミノ酸数）についてのあらゆる可能な方法で、化学的なビルディングブロック（例えば、アミノ酸）の一群を組み合わせることによって得られる。何百万の化学的な化合物を、それら化学的なビルディングブロックをコンビナトリアルに組み合わせることによって製造することができる。
【００７１】
コンビナトリアルケミカルライブラリーの製造およびスクリーニングについては、当該分野の当業者にとってよく知られている。該コンビナトリアルケミカルライブラリーとしては、例えばペプチドライブラリー（例えば、米国特許第5,010,175号、FurkaによるInt. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493 (1991) およびHoughtonらによるNature, 354: 84-88 (1991)を参照）を含むが、これに限定しない。化学的に多様なライブラリーを得るために他の化学をも使用することができる。該化学としては、例えばペプチド（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ91/19735）、コード化されたペプチド（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ93/20242）、ランダムなバイオオリゴマー（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ92/00091）、ベンゾジアゼピン（例えば、米国特許第5,288,514号）、ダイバーソマー（diversomer）（例えば、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド（HobbsらによるProc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913 (1993)）、ビニル性（vinylogous）ポリペプチド（HagiharaらによるJ. Amer. Chem. Soc., 114: 6568 (1992))、グルコースのスカホールドを有する非ペプチド性ペプチド擬態（Hirshmannらによる, J. Amer. Chem. Soc, 114: 9217-9218 (1992)）、小化合物ライブラリーの類似的な有機合成（ChenらによるJ. Amer. Chem. Soc, 116: 2661 (1994)）、オリゴカルバメート（ChoらによるScience 261; 1303 (1993)）、および／またはペプチジルホスホネート（CampbellらによるJ. Org. Chem. 59; 658 (1994)）、核酸ライブラリー（例えば、Ausubel, BergerおよびSambrookによる、上記の全て）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第5,539,083号を参照）、抗体ライブラリー（例えば、VaughnらによるNature Biotechnology, 14 (3): 309-314 (1996)およびPCT/US96/10287）、炭水化物ライブラリー（例えば、Liangらによる、Science, 274, 1520-1522 (1996)および米国特許第5,593,853号を参照）、小有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピンについては、Baum C & EN, 1月18日, 33頁 (1993)；イソプレノイドについては、米国特許第5,569,588号）；チアゾリジノンおよびメタチアゾロンについては、米国特許5,549,974号；ピロリジンについては、米国特許第5,525,735号および5,519,134号；モルホリノ化合物については、米国特許第5,506,337号；ベンゾジアゼピンについては、米国特許第5,228,514号など）を含むが、これらに限定されない。
【００７２】
コンビナトリアルライブラリーの製造装置は、商業的に入手することができる（例えば、３５７ＭＰＳ、３９０ＭＰＳ、Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MAを参照）。加えて、多数のコンビナトリアルライブラリーそのものを商業的に入手することができる（例えば、ComGenex, Princeton, N. J., Tripos, Inc., St. Louis, MO, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MDなどを参照）。
【００７３】
Ｂ．固体状態および溶解性のハイスループットアッセイ
ある実施態様において、本発明はハイスループットフォーマットにおけるインビトロ溶解性アッセイを提供する。別の実施態様において、本発明はハイスループットフォーマットにおける溶解性または固相ベースのインビボアッセイを提供する。ここで、細胞または組織を固相基質と結合させる。場合により、インビトロアッセイは固相アッセイである。
【００７４】
本発明のハイスループットアッセイにおいて、１日で数千の異なる調節因子またはリガンドをスクリーニングすることができる。特に、ミクロタイタープレートの各ウェルを用いて、選んだ潜在的な調節因子に対する別個のアッセイを行なうことができたり、または濃縮時間もしくはインキュベート時間の効果を観察する場合には、毎５〜１０ウェルについて１つの調節因子を試験することができる。従って、１つの標準的なミクロタイタープレートは約１００（例えば、９６）の調節因子をアッセイすることができる。１５３６ウェルプレートを使用する場合には、１つのプレートは約１００〜約１５００の異なる化合物を容易にアッセイすることができる。１日でいくつかの異なるプレートをアッセイすることが可能であり；約６，０００〜２０，０００の異なる化合物についてのアッセイスクリーニングは、本発明の集積システムを用いて可能である。より最近では、試薬操作のためのミクロ流体法（microfluidic approaches）が開発されている。
【００７５】
目的の分子または細胞を、タグまたはタグバインダーの共有結合または非共有結合で固体状態の成分に直接的にまたは間接的に結合させることができる。多数のタグおよびタグバインダーを、文献中によく記載されている公知の分子相互作用に基づいて使用することができる。例えば、タグが天然のバインダー（例えば、ビオチン、プロテインＡまたはプロテインＧ）を有する場合には、適当なタグバインダー（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ネウトラビジン（neutravidin）、免疫グロブリンのＦｃ領域など）と組み合わせて使用することができる。天然の結合基を有する分子（例えば、ビオチン）に対する抗体をも広く利用することができる。適当なタグバインダーについては、例えばSIGMA Immunochemicals 1998 SIGMAカタログ, St. Louis, MOを参照。
【００７６】
同様に、いずれかのハプテン化合物または抗原化合物を適当な抗体と組み合わせて用いて、タグ／タグバインダーの対を得ることができる。何千もの特異的な抗体を商業的に入手することができ、多数の更なる抗体が文献に記載されている。例えば、ある一般的な配置の場合には、タグは１次抗体であり、タグバインダーは１次抗体を認識する２次抗体である。抗体−抗原の相互作用に加えて、受容体−リガンドの相互作用もまた、タグとタグバインダーの対として適当である。例えば、細胞膜受容体の作動薬および拮抗薬（例えば、細胞受容体−リガンドの相互作用（例えば、トランスフェリン、ｃ−キット、ウイルス受容リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン受容体および抗体）、カドヘリン（cadherein）ファミリー、インテグリンファミリーおよびセレクチンファミリーなど）が挙げられる（例えば、PigottおよびPowerによるThe Adhesion Molecule Facts Book I (1993)を参照）。同様に、毒および毒液、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、オピエート、ステロイドなど）、細胞内受容体（これは、様々な小リガンド（例えば、ステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイドおよびビタミン）およびペプチドの効果を媒介する）、薬物、レシチン、糖、核酸（これは、直鎖または環状のポリマー配置である）、多糖類、プロテイン、リン脂質および抗体は全て、様々な細胞受容体と相互作用することができる。
【００７７】
合成ポリマー（例えば、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミドおよびポリアセテート）はまた適当なタグまたはタグバインダーを形成することができる。多数のタグ／タグバインダーの対もまた、本明細書に開示する総説から当該分野の当業者にとって明らかな通り、本明細書に記載のアッセイシステムにおいても有用である。
【００７８】
通常のリンカー（例えば、ペプチド、ポリエーテルなど）もまたタグとして機能することができ、このものはポリペプチド配列（例えば、約５〜２００アミノ酸の間のポリｇｌｙ配列）を含む。それらフレキシブルなリンカーは、当該分野の当業者にとって知られている。例えば、ポリ（エチレングリコール）リンカーは、Sheawater Polymers, Inc. Huntsville, Alabamaから入手することができる。これらのリンカーは、場合によりアミド結合基、スルフヒドリル結合基またはヘテロ官能結合基を有する。
【００７９】
タグバインダーは、現在利用可能ないずれかの様々な方法を用いて固体の基質に固定する。固体の基質は通常、全てまたは一部の基質を表面に化学基を固定させた化学的試薬（このものは、一部のタグバインダーと反応活性である）に曝露させることによって、誘導化されたりまたは官能化される。例えば、長鎖部分との結合に適当な基としては、アミン、ヒドロキシル、チオールおよびカルボキシル基を含む。アミノアルキルシランおよびヒドロキシアルキルシランは、様々な基質（例えば、ガラス表面）を官能化するのに使用することができる。それら固相バイオポリマーアレイの構築は、文献に十分に記載されている。例えば、MerrifieldによるJ. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2254 (1963) (これは、例えばペプチドの固相合成について記載する）；GeysenらによるJ. Immun. Meth. 102: 259-274 (1987)（これは、ピン上での固相成分の製造について記載する）; FrankおよびDoringによる、Tetrahedron 44; 6031-6040 (1988)（これは、セルロースディスク上での様々なペプチド配列の製造について記載する）；FodorらによるScience, 251; 767-777 (1991); SheldonらによるClinical Chemistry, 39 (4): 718-719 (1993); およびKozalらによるNature Medicine 2 (7): 753-759 (1996)（これらは全て、固相基質に固定化させたバイオポリマーのアレイについて記載する）を参照。タグバインダーを固定化する非化学的な方法としては、例えば他の通常の方法（例えば、加熱、ＵＶ放射による橋かけ（cross-linking）など）を含む。
【００８０】
ラベルおよび検出法
検出可能なラベルおよび部分は、１次ラベル（該ラベルは、直接的に検出される要素、または直接的に検出し得る要素を与える要素を含む）、または２次ラベル（ここで、例えば免疫学的なラベル化において一般的である通り、該検出ラベルは、該１次ラベルと結合する）であり得る。ラベルヘの導入方法、ラベル化法およびラベルの検出方法については、PolakおよびVan NoordenによるIntroduction to Immunocytochemistry (2版、1977）およびHandbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, a combined handbook and catalogue Published by Molecular Probes, Inc., Eugene, OR.で知られる。１次および２次のラベルとしては、例えば未検出の要素および検出される要素を含むことができる。
【００８１】
該アッセイにおいて使用される抗体に特有の結合を有意に妨害しない限り、該アッセイで使用されるあるラベルまたは検出基は、本発明の態様にとって重要ではない。該検出基は、検出可能な物理学的性質または化学的性質を有するいずれかの物質であり得る。それら検出可能なラベルについてはイムノアッセイの分野でよく開発されており、通常、それらの方法に有用なほとんどいずれかのラベルを本発明に適用することができる。従って、ラベルは分光分析、光化学、生化学、免疫化学、電気科学、光学もしくは化学の手法によって検出可能ないずれかの組成物である。
【００８２】
本発明において有用な１次ラベルおよび２次ラベルとしては、例えば蛍光色素（例えば、フルオレセインおよびその誘導体（例えば、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびOregon Green (登録商標）、ローダミンおよびその誘導体（例えば、テキサス  レッド、テトラロージミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）など）、ジゴキシゲニン(digoxigenin）、ビオチン、フィコエリトリン(phycoerythrin）、ＡＭＣＡ，ＣｖＤｙｅｓ（登録商標）など）および放射標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐなど）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、分光学的な比色ラベル（例えば、金コロイド、または色ガラスもしくは色プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）のベッド）を含むことができる。
【００８３】
該ラベルは、当該分野でよく知られている方法に従って、検出アッセイの成分に直接的にまたは間接的に結合することができる。非放射性ラベルは、間接的な方法によって結合されることが多い。通常、リガンド分子（例えば、ビオチン）は分子に共有結合させる。次いで、該リガンドを別の分子（例えば、ストレプトアビジン）に結合させる。このものは間接的に検出可能であったり、またはシグナルシステム（例えば、検出可能な酵素、蛍光化合物または化学発光化合物）に共有的に結合させる。上記の通り、広範囲のラベルを使用することができ、ラベルの選択は要求される感度、化合物との結合の容易さ、安定性の要求、利用可能な装置、および処分の準備に依存する。
【００８４】
通常、あるプローブまたはプローブの組み合わせを追跡する検出器は、認識用の試薬ラベルを検出するのに使用する。典型的な検出器としては、例えば分光光度計、光電管およびフォトダイオード、顕微鏡、シンチレーションカウンター、カムコーダー、フィルムなど、並びにそれらの組み合わせを含む。適当な検出器は、例えば当該分野の当業者にとって知られる様々な商業的供給源から広く入手可能である。通常、結合したラベル化した核酸を含む基質の光学的な画像を、続くコンピューター分析でデジタル化する。
【００８５】
好ましいラベルとしては、例えば酵素（例えば、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、キナーゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼ）、オキシダーゼ（oxidotases）（特に、ペルオキシダーゼ）；化学発光（例えば、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）と、分解物として光量子を与える基質）；入手可能なキット（例えば、Molecular Probes, Amersham, Boehringer-Mannheim, and Life Technologies/ Gibco BRL)；着色物（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアルカリホスファターゼと、着色した沈降物を与える基質）；キット（Life Technologies/ Gibco BRLおよびBoehringer-Mannheim製）；ヘミ蛍光分析（例えば、アルカリホスファターゼと、AttoPhos基質（Amersham）または蛍光基質を与える他の基質）；蛍光（例えば、Ｃｙ−５（Amersham）、フルオレセイン、他の蛍光タグおよび蛍光タンパク質（例えば、緑色および赤色の蛍光タンパク質）；検出可能な部分と結合した抗体；および放射能を利用したラベルを含む。ラベル化および検出に関する他の方法は、当該分野の当業者にとって容易に明らかであろう。例えば、表現型の変化（例えば、薬物耐性）を本発明における「ラベル」として使用することができる。
【００８６】
検出可能な２次ラベル化法の好ましい例は、細胞表面分子（例えば、免疫グロブリン）またはチャンネル分子（例えば、ＣＦＴＲ）を認識するラベル抗体を使用する。該抗体は、ＦＡＣＳを用いて検出する。別の実施態様において、抗体についてＥＬＩＳＡアッセイを用いて、本発明のレポーター分子を検出する。
【００８７】
レポーター部分または検出分子として使用することができる好ましい酵素としては、例えばβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色および赤色の蛍光タンパク質、キナーゼ、ペルオキシダーゼ（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）、およびクロラムフェニコールトランスフェラーゼを含む。ルシフェラーゼについての化学発光基質はルシフェリンである。β−ガラクトシダーゼについての化学発光基質のある実施態様は、４−メチルウンベリフェリル（methylumbelliferyl）−β―Ｄ−ガラクトシドである。アルカリホスファターゼ基質の実施態様としては、例えばｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）（これは、分光光度計を用いて検出する）；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）および速い赤色／ナフトールＡＳ−ＴＲホスフェート（これは、視覚的に検出する）；および４−メトキシー４―（３−ホスホノフェニル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２’−アダマンタン］（これは、照度計を用いて検出する）を含む。ホースラディッシュペルオキシダーゼ基質の実施態様としては、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル酸（５ＡＳ）、ｏ−ジアニシジンおよびｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）（これらは、分光光度計を用いて検出する）；および３，３，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）および４−クロロ−１−ナフトール（４Ｃ１Ｎ）（これらは、視覚的に検出する）を含む。他の適当な基質は、当該分野の当業者にとって知られる。酵素−基質反応および生成物の検出は、当該分野の当業者にとって知られる標準的な方法に従って実施され、該酵素イムノアッセイを実施するためのキットを上記の通り入手することができる。
【００８８】
ある実施態様において、早期翻訳終結またはＮＭＤの阻害を、固体支持層に固定化した細胞中のラベルの量を定量することによって測定される。典型的に、細胞のインキュベートの間に試験化合物が存在することにより、試験化合物を含まないコントロールのインキュベーションの場合に対するか、または細胞の種類および培地条件（例えば、レポーター分子の使用）について確立したベースラインと比較して、ラベルの量は増減するであろう。ラベルの検出方法および定量方法は、当該分野の当業者にとってよく知られている。従って、例えばラベルが放射性ラベルである場合には、検出法はシンチレーションカウンターまたは写真フィルム（例えば、オートラジオグラフィー）を含む。ラベルが光学的に検出可能である場合には、典型的な検出器は顕微鏡、カメラ、光電管およびフォトダイオード、並びに広く利用され得る多数の他の検出システムを含む。
【００８９】
ＲＮＡ発現をも、当該分野で知られる技術によって分析することができ、例えば逆転写およびｍＲＮＡの増幅（例えば、ＲＴＱ−ＰＣＲ）、全ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡの単離、ノーザンブロット、ドット（dot）ブロット、インシチューハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼの保護、ＤＮＡマイクロチップアレイの探索（probing）などを挙げられる。ある実施態様において、高密度オリゴヌクレオチド分析法（例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標））を本発明のＲＮＡレポーター分子を同定するのに使用する。例えば、GunthandらによるAIDS Res. Hum. Retroviruses 14; 869-876 (1998); KozalらによるNat. Med.2; 753-759 (1996); MatsonらによるAnal. Biochem. 224: 110-106 (1995)；LockhartらによるNat. Biotechnol. 14; 1675-1680 (1996);GingerasらによるGenome Res. 8: 435-448 (1998); HaciaらによるNucleic Acids Res. 26: 3865-3866 (1998)を参照。
【００９０】
キット
本発明はまた、早期翻訳終結およびＮＭＤの阻害物質をスクリーニングするキットを提供する。それらのキットは、容易に入手可能な物質および試薬から製造することができる。例えば、それらのキットは、インビトロでの翻訳細胞抽出物、ポリペプチドをコード化した核酸（ここで、該ポリペプチドのコード配列は、早期終止コドンを含む）、反応チューブおよび阻害活性を試験するための指示書を含む物質のうちのいずれか１つ以上を含むことができる。広範囲にわたるキットおよび成分を、該キットの予定するユーザーおよび該ユーザーのある要求に応じて、本発明に従って製造することができる。
【００９１】
それら各個別の文献または特許出願が具体的におよび個別に本明細書の一部を構成すると示す通り、本明細書で引用する全ての文献および特許出願は本明細書の一部を構成する。
【００９２】
理解を容易にする目的で、上記の発明を例示および実施例という形でいくらか詳細に記載するが、本発明の精神および本特許請求の範囲を逸脱することなく、ある変化および改変を行なうことができることを、当該分野の当業者は本発明の教示に照らして容易に明らかであろう。
【００９３】
実施例
以下の実施例は、単に例示の目的で示すものであって、限定の目的で示すものではない。当業者は、本質的に同様な結果を得るために、変えたりまたは改変したりすることができる様々なあまり重要でないパラメーターを容易に認識するであろう。
【００９４】
実施例Ｉ：細胞をベースとするアッセイ
１日目午前中に、クローン５５−３１、ｐＭＬＴ５５を用いて安定にトランスフェクトした２９３セルライン（図１を参照）を、１０％胎児ウシ血清を有するＤＭＥＭ培地中の９６ウェルプレートに置いた。各ウェル当たり１００μＬ中に４０，０００細胞で、約８０プレートを培養した。該細胞を３７℃で終夜インキュベートした。
【００９５】
２日目に、試験化合物（ＤＭＳＯ（１００μＬ）の１ｍＭ  ストック溶液の１μＬ；１０μＭの最終濃度）を加えた。コントロールとして、各プレートのカラム１２にＧ４１８（１ｍｇ／ｍＬ）を加えた。該プレートを、３７℃で１２〜１６時間インキュベートした。
【００９６】
３日目に、該細胞にルシフェラーゼ基質を加え、該プレートをTorcon自動化ルシフェラーゼアッセイ読み取り機を用いて９６ウェルプレートについて読み取った（例えば、図３〜４を参照）。ルシフェラーゼ基質は、商業的に入手可能（例えば、Promega）である。
【００９７】
場合により、ある日の早くにプレートし、その日の遅くに化合物を加え、終夜インキュベートし、次いで翌日にルシフェラーゼ活性をアッセイすることによって、１日目および２日目を一緒にすることができる。
【００９８】
実施例ＩＩ．バイオケミカルアッセイ
インビトロで製造したレポーターＲＮＡ（図５の構築物を参照）を、標準的な方法に記載の完全補足したウサギの網状赤血球ライゼート（１５μＬ）（すなわち、JacksonおよびHuntによる、Methods in Enzymology, 96: 50-75 (1983)に記載の方法によって製造）に加えた。インビトロで転写したＲＮＡ（０．５〜１μｇ）を、反応毎に使用した。該反応液を２％のＤＭＳＯ溶液（これは、２０μＭの試験化合物を含有する）（１５μＬ）と混合した。該反応液を加温したインキュベーター中、３０℃で９０分間インキュベートした。ルシフェラーゼ基質を加え、ルシフェラーゼ活性をTorcon自動化読み取り機を用いて読み取った（図６〜７を参照）。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、一時的または安定な一時的感染細胞を用いるアッセイに関する構築物の全体図を示す。終止コドン、遺伝子、およびプロモーターの位置が示されている。
【図２】  図２Ａ−Ｃは、Ｇ４１８媒介性抑制がセルライン特異的ではないことを示す。示されたプラスミドで２４時間、一時的に感染させた細胞を、示された濃度のＧ４１８（パネルＡ、ｐＭＬＴ４９；パネルＢ、ｐＭＬＴ５４；パネルＣ、ｐＭＬＴ５５）に暴露した。ルシフェラーゼ活性は、１２時間暴露後に測定した。
【図３】  図３Ａ−Ｂは、プラスミドｐＭＬＴ５５を用いて安定にトランスフェクトされた２９３細胞の種々のクローンにおけるＧ４１８媒介性抑制を示す（パネルＡ、相対ルシフェラーゼ活性；パネルＢ、倍活性化（fold activation））。記載の独立したクローンを記載の濃度のＧ４１８に暴露した。ルシフェラーゼ活性は１２時間暴露後に測定した。
【図４】  図４は、高処理量形式（９６ウェルプレート）における、安定にトランスフェクトされた２９３セルライン（クローン ＃３１）でのＧ４１８媒介性抑制を示す。９６ウェルプレートのウェル当たり、示された細胞数を培養した。細胞は示された濃度のＧ４１８に暴露した。ルシフェラーゼ活性は、１２時間暴露後に、ロボット９６ウェルプレートリーダーで測定した。また、ゲンタマイシンを用いて、ＮＭＤおよび早期翻訳終結を阻害することができた。
【図５】  図５は、ＲＲＬ（ウサギ網状赤血球ライセート）を用いる生化学的抑制アッセイにおいて使用するための構築物の全体図を示す。終止コドン、遺伝子、ＩＲＥＳ配列、およびプロモ−ター領域の位置が記載されている。
【図６】  図６Ａ−ＤはＲＲＬを用いる生化学的抑制アッセイの性質を示す。示された量のＲＲＬおよびルシフェラーゼＲＮＡ（パネルＡおよびＢ、野生型；パネルＣおよびＤ、終止コドン）の存在下、インビトロ翻訳反応を行った。低レベルのルシフェラーゼ活性はＲＮＡ（パネルＡおよびＣ）およびＲＲＬ（パネルＢおよびＤ）依存性であった。ＷＴおよび終止コドン含有ルシフェラーゼＲＮＡの概略図を示す。ルシフェラーゼ活性は９０分のインキュベーション後に測定した。反応は９６ウェル形式で行った。
【図７】  図７Ａ−Ｂはゲンタマイシンによる抑制が時間依存性であることを示す。インビトロ翻訳アッセイは、ＲＲＬ、ルシフェラーゼＲＮＡ（パネルＡ、ＷＴ；パネルＢ、終止コドン）および示された濃度のゲンタマイシンの存在下で行った。反応物を４５または９０分インキュベートした後、ルシフェラーゼ活性を測定した。ＷＴおよび終止コドンを含むＲＮＡの概略図を示す。この反応は９６または３８４ウェル形式で行った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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