(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）を用いて、下記式（１）で示される３−ヒドロキシ酪酸と下記式（２）で示される３−ヒドロキシヘキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する方法であって、
炭素数の異なる油脂と脂肪酸とを組み合わせた炭素源を用いることによって、３ＨＨモル分率が１〜４０ｍｏｌ％であり、該モル分率の異なるポリエステルを採取することを特徴とするポリエステルの製造方法。
【化１】
0004643799.tif 000009
【化２】
0004643799.tif 000010
【請求項２】
油脂または脂肪酸の添加量を変えることによって、３ＨＨモル分率を制御する、請求項１記載のポリエステルの製造方法。
【請求項３】
前記油脂がヤシ油、パーム油、パーム核油及びヘキサン酸トリグリセリドからなる群より選択される油脂である請求項１又は２記載のポリエステルの製造方法。
【請求項４】
前記脂肪酸が、炭素数が６〜１０である飽和または不飽和脂肪酸、その脂肪酸エステル及び脂肪酸塩からなる群より選択される脂肪酸である請求項１又は２記載のポリエステルの製造方法。
【請求項５】
前記アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）がアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）より単離されたポリエステル重合酵素遺伝子を含む組換えベクターにより、形質転換された微生物である請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリエステルの製造方法。
【請求項６】
ポリマー含量が３６．６ｗｔ％以上である請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリエステルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は共重合ポリエステルの発酵生産による製造方法に関する。詳しくは、自然環境（土中、河川、海中）の下で、微生物の作用を受けて分解するプラスチック様高分子の製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
現在までに数多くの微生物において、エネルギー貯蔵物質としてポリエステルを菌体内に蓄積することが知られている。その代表例がポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と略す）である。Ｐ（３ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物的に分解されることから、環境にやさしいグリーンプラスチックとして注目されている。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結晶性が高いため、硬くて脆い性質を持っていることから実用的には応用範囲が限られる。この為、この性質の改良を目的とした研究がなされてきた。
【０００３】
その中で、特開昭５７−１５０３９３号公報および特開昭５９−２２０１９２号公報などに３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）とからなる共重合体Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）の製造方法が開示されている。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）はＰ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。これらの公報における共重合体の製造方法は、Ｐ（３ＨＢ）の製造方法と同様に、前段で菌体を増殖させ、後段で窒素またはリンを制限して微生物を培養し、共重合体を製造するものであった。
【０００４】
またＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）については、３ＨＶのモル分率が増えるにつれて柔軟性が変化することから、３ＨＶのモル分率を制御する研究もなされてきた。例えば、特開昭５７−１５０３９３号公報、特開昭６３−２６９９８９号公報ではプロピオン酸を使用し、また特公平７−７９７０５号公報ではプロパン−１−オールを使用し、それらの培地中への添加量を変えることにより３ＨＶのモル分率を制御しており、３ＨＶモル分率が１０〜９０ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）が製造されている。しかしながら、実際のところＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は３ＨＶモル分率を増加させても、それに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルムなどに使用するのに要求される柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取っ手など硬質成形体の分野にしか利用されなかった。
【０００５】
近年、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと略す）との２成分共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）およびその製造方法について研究がなされた。たとえば、特開平５−９３０４９号公報および特開平７−２６５０６５号公報にそれぞれ記載されている。これらの公報のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）共重合体の製造方法は、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）を用いてオレイン酸等の脂肪酸やオリーブオイル等の油脂から発酵生産するものであった。
【０００６】
また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の性質に関する研究もなされている（Ｙ．Ｄｏｉ，Ｓ．Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｈ．Ａｂｅ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２８，４８２２−４８２３（１９９５））。この報告では炭素数が１２個以上の脂肪酸のうちの単一種の脂肪酸を唯一の炭素源としてＡ．ｃａｖｉａｅを培養し、３ＨＨが１１〜１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産している。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨモル分率の増加にしたがって、Ｐ（３ＨＢ）の硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。
【０００７】
また、Ａ．ｃａｖｉａｅのＰＨＡシンターゼ遺伝子をクローニングし、この遺伝子をＰ（３ＨＢ）を９０％以上蓄積するＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓに導入した組換え株を用いて、脂肪酸を炭素源としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する報告がなされた。（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．ｖｏｌ．１７９，Ｎｏ．１５，４８２１−４８３０、特開平１０−１０８６８２号公報）このなかで、オクタン酸ナトリウムを炭素源とすることで、３ＨＨモル分率が１０〜２０ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が生産できると報告している。
【０００８】
このように、本ポリマーを３ＨＨモル分率を広い範囲でコントロールして共重合体を製造することができれば、硬い共重合体から柔らかい共重合体まで発酵生産可能となり、テレビの筐体などのように硬さを要求されるものから糸やフィルムなどのような柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。しかしながら、これらの方法では菌体の生産性が低く、本ポリマーの実用化に向けた生産方法としては適用できない。上述したように、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨモル分率をコントロールして生産することは、幅広い分野へ応用するために必要不可欠である。そこで高い菌体生産性とポリマー含量とを保持し、かつ３ＨＨモル分率をコントロールできる生産方法が求められていた。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記現状に鑑み、３ＨＨモル分率を制御し、様々な３ＨＨモル分率を有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を高い生産性でかつ安定して製造するポリエステルの製造方法を提供することを目的とするものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは様々な検討を行った結果、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）共重合体を蓄積する微生物を、油脂および／または脂肪酸を炭素源とする培地を使用して培養し、高い生産性を保持し、かつ安定して３ＨＨモル分率が異なる共重合体を製造することに成功した。
【００１１】
即ち、本発明は、微生物を用いて、下記式（１）で示される３−ヒドロキシ酪酸と下記式（２）で示される３−ヒドロキシヘキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する方法であって、少なくとも２種の炭素源として、炭素数の異なる油脂の組み合わせ、炭素数の異なる脂肪酸の組み合わせ、又は、炭素数の異なる油脂と脂肪酸との組み合わせのいずれかを用いることによって、３ＨＨモル分率の異なるポリエステルを採取するポリエステルの製造方法である。
【００１２】
【化３】
0004643799.tif 000002
【００１３】
【化４】
0004643799.tif 000003
【００１４】
また、本発明の要旨は、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）共重合体を蓄積する微生物を、少なくとも２種の炭素源として、炭素数の異なる油脂の組み合わせ、炭素数の異なる脂肪酸の組み合わせ、又は、炭素数の異なる油脂と脂肪酸との組み合わせのいずれかを添加した培地で培養することで、３ＨＨモル分率が１〜４０ｍｏｌ％の範囲のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）共重合体を菌体内に蓄積させ、その培養物からポリマーを採取することを特徴とする共重合体ポリエステルの製造方法に関する。以下に、本発明の詳細を説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明のポリエステルの製造方法は、微生物を用いて、上記式（１）で示される３−ヒドロキシ酪酸と上記式（２）で示される３−ヒドロキシヘキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する際に適用される。
上記式（１）で示される３−ヒドロキシ酪酸と上記式（２）で示される３−ヒドロキシヘキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は、例えば、下記一般式（３）に示される。
【００１６】
【化５】
0004643799.tif 000004
【００１７】
式中、ｍ及びｎは、同じか又は異なって、１以上の整数を表す。
本発明のポリエステルの製造方法において、使用する微生物には特に制限なく、菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されているＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属やＡｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属などの細菌類を使用することが出来るが、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）を使用することが好ましい。
【００１８】
また、本発明のポリエステルの製造方法に用いられる微生物は、ポリエステル重合酵素遺伝子を含む組換えベクターにより、形質転換された微生物であることが好ましい。
形質転換体を作製する場合はベクターには、その菌内で自立的に増殖しうるプラスミドベクターを用いることができるが、染色体に組み込まれていても良い。ポリエステル重合遺伝子は構造遺伝子のほかに、プロモーター、ターミネーターなど宿主菌で機能する発現ユニットを有していればよい。
本発明のポリエステルの製造方法において用いられるポリエステル重合遺伝子は、アエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）より単離された遺伝子が好ましく、例えば特開平１０−１０８６８２号公報に記載されている遺伝子断片を用いることができる。
【００１９】
微生物に組換えベクターを導入するには、公知の方法により行うことができる。例えば、カルシウム法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ．Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９．１０７２（１９７４））やエレクトロポレーション法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、１．８．４頁、１９９４年）等を用いることができる。
【００２０】
（ポリエステルの製造方法）
本発明のポリエステルの製造方法においては、微生物を培養する際に、上記のように少なくとも２種の炭素源として、炭素数の異なる油脂の組み合わせ、炭素数の異なる脂肪酸の組み合わせ、又は、炭素数の異なる油脂と脂肪酸との組み合わせのいずれかを用い、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地が使用できる。なお、上記炭素数の異なる油脂とは、油脂を構成する脂肪酸のうち、主要脂肪酸の炭素数が異なる油脂を意味する。
培養温度はその菌の生育可能な温度であればよいが、２０℃から４０℃好ましい。培養時間には特に制限はないが、１〜７日程度で良い。その後、得られた該培養菌体又は培養物からポリエステルを回収すればよい。また、形質転換体を使用する際は、培養中にベクターに存在する耐性遺伝子に対応するカナマイシン、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を添加しても良い。
【００２１】
本発明のポリエステルの製造方法においては、少なくとも２種の炭素源として、炭素数の異なる油脂の組み合わせ、炭素数の異なる脂肪酸の組み合わせ、又は、炭素数の異なる油脂と脂肪酸との組み合わせのいずれかを用いることによって、３ＨＨモル分率の異なるポリエステルを採取する。
【００２２】
炭素源として使用する油脂には特に制限はなく、例えば構成脂肪酸がリノール酸５２％、オレイン酸２１％、パルミチン酸１２％、リノレン酸１１％、ステアリン酸３％である大豆油、構成脂肪酸がオレイン酸５９％、リノール酸２２％、リノレン酸１１％、パルミチン酸４％、ステアリン酸２％であるナタネ油、構成脂肪酸がリノール酸５１％、オレイン酸３５％、パルミチン酸１１％、ステアリン酸２％であるコーン油、構成脂肪酸がオレイン酸７５％、リノール酸１０％、パルミチン酸１０％、ステアリン酸３％、リノレン酸１％であるオリーブ油、構成脂肪酸がパルミチン酸４３％、オレイン酸４１％、リノール酸１０％、ステアリン酸５％、ミリスチン酸１％であるパーム油、構成脂肪酸がラウリン酸４７％、ミリスチン酸１８％、パルミチン酸９％、オレイン酸７％、ステアリン酸３％、リノール酸２％であるヤシ油、構成脂肪酸がラウリン酸４４％、オレイン酸１７％、ミリスチン酸１４％、パルミチン酸３％、リノール酸３％であるパーム核油などの天然物由来の油脂や、炭素数が６以上２０以下の脂肪酸、例えば、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸などから１種以上選択された脂肪酸とグリセロールとから合成したトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドなどがあげられる。天然物由来の油脂では炭素数１２以下の脂肪酸を構成脂肪酸として４０〜５０％含むヤシ油、パーム核油が好ましい。合成したトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドについては、構成脂肪酸はヘキサン酸が好ましい。
【００２３】
本発明のポリエステルの製造方法においては、上記油脂として、ヤシ油、パーム油、パーム核油及びヘキサン酸トリグリセリドからなる群より選択される油脂を用いることが好ましい。
また、上記脂肪酸としてはヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸などの飽和または不飽和脂肪酸、これら脂肪酸のエステルや脂肪酸塩など脂肪酸誘導体が挙げられる。なかでも、炭素数が６〜１０である飽和または不飽和脂肪酸、その脂肪酸エステル及び脂肪酸塩からなる群より選択される脂肪酸が好ましい。
【００２４】
３ＨＨモル分率の高いポリエステルを得るためには、できるだけ炭素数の少ない脂肪酸を含む油脂、脂肪酸を用いることが好ましい。油脂では炭素数が１２以下の脂肪酸を比較的多く含むヤシ油、パーム核油、ヘキサン酸トリグリセリドなどが好ましく、また脂肪酸では、炭素数が６〜１０である飽和または不飽和脂肪酸、その脂肪酸エステル、脂肪酸塩が好ましい。炭素数が６〜１０である飽和または不飽和脂肪酸、その脂肪酸エステル、脂肪酸塩のなかでも、偶数個の炭素数のものがより好ましく、炭素数６のヘキサン酸が特に好ましい。
【００２５】
また、本発明のポリエステルの製造方法においては、炭素源として用いる油脂または脂肪酸の添加量を変えることによって、３ＨＨモル分率を制御することが好ましい。
天然由来の油脂を炭素源とすると、３ＨＨモル分率が１０ｍｏｌ％よりも小さいＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が生産できる。３ＨＨモル分率が１０ｍｏｌ％より大きいＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産するためには、炭素数６〜１０の脂肪酸またはそのトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリドを添加すれば良い。
【００２６】
本発明のポリエステルの製造方法においては、上記のように少なくとも２種の炭素源として、炭素数の異なる油脂の組み合わせ、炭素数の異なる脂肪酸の組み合わせ、又は、炭素数の異なる油脂と脂肪酸との組み合わせのいずれかを用い、上記油脂または脂肪酸の添加量を変えることによって、得られるポリエステルの３ＨＨモル分率を１〜４０ｍｏｌ％の間で制御することができる。
【００２７】
本発明のポリエステルの製造方法において、炭素源である油脂および／または脂肪酸の添加方法としては、特に制限はない。しかし、油脂は一度に大量に添加すると培養液中の溶存酸素濃度を低下させる可能性がある。また脂肪酸は細胞毒性があるため、生育阻害を起こす可能性がある。したがって、これらの添加方法としては、生育阻害を起こさない程度の量を分割して添加する方法や、ペリスタポンプなどを使用し連続添加し、生育阻害を起こさない濃度を維持する方法などが好ましい。分割して添加する場合は、一度に添加する脂肪酸の濃度は１ｗ／ｖ％以下、油脂では５ｗ／ｖ％以下が好ましいが、特に制限されるものではない。また、添加する油脂および脂肪酸の総量は、選択した微生物の生育に影響を与えない程度であれば良く、２０ｗ／ｖ％以下が好ましいが、特に制限されるものではない。油脂と脂肪酸とは別々のラインで添加しても良いが、相溶性がある場合は油脂と脂肪酸とを混合して添加した方が、添加ラインを減らすことができるため好ましい。
【００２８】
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキスなどが挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。
【００２９】
そのほかの有機栄養源としては、アミノ酸、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリンなど、ビタミン、例えばビタミンＢ1 、ビタミンＢ12、ビタミンＣ等が挙げられる。
【００３０】
本発明において、ポリエステルの菌体からの回収は例えば、次のような方法が使用できる。培養終了後、培養液から遠心分離器などを用いて菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄した後、乾燥させる。この乾燥菌体からクロロホルム等の有機溶剤を用いてポリエステルを抽出する。このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液から濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてポリエステルを沈殿させる。濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてポリエステルを回収する。
得られたポリエステルの分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法などにより行う。
【００３１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術範囲を限定するものではない。
【００３２】
（実施例１）
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３株（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ．，Ｙ．Ｄｏｉ．，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４９，３３３−３３６，（１９９８），受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５７８６）（以下Ａｅｄ１３株と略す。）を次のように培養した。前培地の組成は１ｗ／ｖ％Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ＫＨ2 ＰＯ4 、（ｐＨ６．７）とした。ポリエステル生産培地の組成は１．１ｗ／ｖ％Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・１２Ｈ2 Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ＫＨ2 ＰＯ4 、０．６ｗ／ｖ％（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、０．１ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ＦｅＣｌ3 ・６Ｈ2 Ｏ、１ｗ／ｖ％ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2 Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ＮｉＣｌ3 ・６Ｈ2 Ｏ、０．０１ｗ／ｖ％ＣｒＣｌ3 ・６Ｈ2 Ｏを溶かしたもの。）、２ｗ／ｖ％プロエキスＡＰ−１２（播州調味料）、５×１０-6ｗ／ｖ％カナマイシンとした。炭素源は油脂のみとし、パーム油、パーム核油又はヤシ油４ｗ／ｖ％を３回に分けて添加した。
【００３３】
Ａｅｄ１３株のグリセロールストックを前培地に接種して２０時間培養し、６Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤ−５００型）に１．５ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．６から６．８の間でコントロールした。コントロールには５規定の硫酸と水酸化ナトリウムとを使用した。培養は７２時間まで行った。遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄後、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
【００３４】
得られた乾燥菌体約３０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムとを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することで菌体内のポリエステル分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１ｍｌの蒸留水を添加し、攪拌機を用いて激しく撹拌した。静置して二層に分離させた後、下層の有機溶媒層を取り出し、その組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡ  ＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。温度条件は、初発温度１００℃から８℃／分の速度で昇温した。得られた結果を表１に示す。
【００３５】
【表１】
0004643799.tif 000005
【００３６】
この結果から、生産性は、ヤシ油を炭素源とした場合、約２４ｇ／Ｌに向上することがわかった。また生産性が向上すると、特開平１０−１０８６８２号公報に記載の結果とは異なり、３ＨＨモル分率が１０ｍｏｌ％よりも小さくなることがわかった。
【００３７】
（実施例２）
炭素源として１）ヤシ油５ｗ／ｖ％、２）ヤシ油４ｗ／ｖ％とヘキサン酸１ｗ／ｖ％、３）ヤシ油３ｗ／ｖ％とヘキサン酸２ｗ／ｖ％、４）ヤシ油２ｗ／ｖ％とヘキサン酸３ｗ／ｖ％、５）ヤシ油１ｗ／ｖ％とヘキサン酸４ｗ／ｖ％、６）ヤシ油０．５ｗ／ｖ％とヘキサン酸５ｗ／ｖ％と様々に割合を変えて油脂と脂肪酸とを添加した。ヤシ油は接種時にヤシ油を０．５ｗ／ｖ添加し、残りのヤシ油とヘキサン酸とは混合して約１０ｍｌ／ｍｉｎの速度で２４〜６０時間までの間にペリスタポンプで連続添加した。それ以外は実施例１と同様の培地・条件で培養を行い、分析を行った。その結果を表２に示す。
【００３８】
【表２】
0004643799.tif 000006
【００３９】
この結果から、ヘキサン酸の割合が０〜４ｗ／ｖ％に増加するにしたがって、３ＨＨモル分率が８．１〜３２ｍｏｌ％に増加することが分かった。
【００４０】
（実施例３）
炭素源としてヤシ油４ｗ／ｖ％とヘキサン酸トリグリセリド（ＨＴＧ）１ｗ／ｖ％とを用いた。ヤシ油のみの場合は５ｗ／ｖ％添加した。実施例１と同様の培地を使用し、１．８Ｌの生産培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）を用い培養を行った。運転条件は培養温度３０℃、攪拌速度５５０ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨを６．６から６．８の間で５規定の硫酸と水酸化ナトリウムとでコントロールした。接種時にヤシ油を０．５ｗ／ｖ％添加し、残りのヤシ油とＨＴＧとは混合して３等分し、接種後２４、３６、４８時間に添加した。培養は７２時間まで行った。遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄後、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。
実施例１と同様の分析を行った。その結果を表３に示す。
【００４１】
【表３】
0004643799.tif 000007
【００４２】
この結果から、炭素源の一部をＨＴＧに変更すると３ＨＨモル分率が向上することが分かった。
【００４３】
（実施例４）
実施例１と同じ培地、ジャーファーメンターを使用し、同じ運転条件で培養を行った。炭素源はヤシ油４ｗ／ｖ％にヘキサン酸０．５ｗ／ｖ％またはオクタン酸０．５ｗ／ｖ％を混ぜて実施例１と同様に連続添加した。ヤシ油のみの場合は５ｗ／ｖ％添加した。分析結果を表４に示す。
【００４４】
【表４】
0004643799.tif 000008
【００４５】
この結果から、添加する脂肪酸を変えることで、３ＨＨモル分率の異なるポリマーが得られた。
【００４６】
【発明の効果】
本発明により、生分解性ポリマーであるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）共重合体を、物性を大きく変化させる３ＨＨモル分率を１〜４０ｍｏｌ％の範囲で任意に制御して、高い生産性かつ安定して生産することが可能となり、応用範囲の広い本ポリマーを提供できるようになる。