(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における癌を診断するのを支援するための方法であって、以下の工程：
該被験体から得た生物学的サンプルにおいて、機能的な野生型Ｆｕｓ１産物（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＦ０５５４７９）の発現を評価する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記サンプルが組織サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組織サンプルが、脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、血液細胞、膵臓、結腸、胃、子宮頸部、乳房、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、頭頸部、食道、口腔組織、骨髄および血液組織からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記評価する工程が、野生型Ｆｕｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＦ０５５４７９）をコードする核酸を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記検出する工程が、前記核酸を増幅する工程を包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記検出する工程が、核酸ハイブリダイゼーションを包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記検出する工程が、配列決定する工程を包含する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記評価する工程が、野生型Ｆｕｓ１ポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＦ０５５４７９）を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＥＬＩＳＡをさらに包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
免疫組織化学をさらに包含する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記評価する工程が、野生型または変異体のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションを包含し、そして該オリゴヌクレオチドが、チップまたはウエハ上にアレイ状に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
正常サンプルにおける野生型Ｆｕｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＦ０５５４７９）の発現を比較する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記比較する工程が、野生型Ｆｕｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＦ０５５４７９）の発現のレベルを評価する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
腫瘍細胞の増殖を抑制するための組成物であって、
（ａ）野生型Ｆｕｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＦ０５５４７９）をコードする核酸；および
（ｂ）該腫瘍細胞において活性なプロモーター、
を含む発現カセットを含有する、組成物。
【請求項１５】
前記腫瘍細胞が、脳腫瘍、肺腫瘍、肝臓腫瘍、脾臓腫瘍、腎臓腫瘍、リンパ節腫瘍、小腸腫瘍、血液細胞腫瘍、膵臓腫瘍、結腸腫瘍、胃腫瘍、子宮頸部腫瘍、乳房腫瘍、子宮内膜腫瘍、前立腺腫瘍、精巣腫瘍、卵巣腫瘍、皮膚腫瘍、頭頸部の腫瘍、食道腫瘍、口腔組織腫瘍、ならびに骨髄腫瘍からなる群より選択される腫瘍由来である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記核酸がウイルスベクターに含まれている、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記核酸がリポソームに含まれている、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
腫瘍細胞の表現型を変更するための組成物であって、
（ａ）野生型Ｆｕｓ１（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＦ０５５４７９）をコードする核酸；および
（ｂ）該腫瘍細胞において活性な、プロモーター、
を含む発現カセットを含有する、組成物。
【請求項２１】
前記表現型が、増殖、移動、接触阻害、軟寒天増殖、細胞周期、浸潤性、腫瘍形成、および転移可能性からなる群より選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記プロモーターがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
癌に罹患している被験体において癌を阻害するための組成物であって、
（ａ）野生型Ｆｕｓ１ポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＦ０５５４７９）をコードする核酸；および
（ｂ）該被験体の腫瘍細胞において活性なプロモーター、
を含む発現カセット
を含み、該ポリペプチドの発現が該癌を阻害することを特徴とする、組成物。
【請求項２４】
前記被験体がヒトである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記癌が、脳癌、肺癌、肝臓癌、脾臓癌、腎臓癌、リンパ節癌、小腸癌、血液細胞癌、膵臓癌、結腸癌、胃癌、子宮頸部癌、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、皮膚癌、頭頸部の癌、食道癌、口腔組織癌、ならびに骨髄癌からなる群より選択される、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記発現カセットが、ウイルスベクターに含まれている、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記発現カセットがリポソームに含まれている、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３０】
前記発現カセットが、ポリＡ配列をさらに含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３１】
前記ポリＡ配列がウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記発現カセットが、腫瘍内に、腫瘍脈管構造内に、腫瘍に局在させて、腫瘍に局所的に、または全身に投与されることを特徴とする、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３３】
前記被験体に化学療法剤と組合わせて投与されることを特徴とする、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３４】
前記化学療法剤が、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲンレセプター結合因子、タキソール、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター、トランスプラチナ、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサートを含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記被験体に放射線と組合わせて投与されることを特徴とする、請求項２３に記載の組成物。
【請求項３６】
前記放射線が、癌の部位に局所的に送達されることを特徴とする、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記放射線が全身放射線である、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
前記放射線が、γ線、Ｘ線、加速されたプロトン、マイクロ波放射線、ＵＶ放射線、または腫瘍細胞に指向された放射性同位体の送達を含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
前記被験体に第２の抗癌遺伝子と組合わせて投与されることを特徴とする、請求項２３に記載の組成物。
【請求項４０】
前記第２の抗癌遺伝子が、腫瘍サプレッサーである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記第２の抗癌遺伝子が、アポトーシスのインヒビターである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４２】
前記第２の抗癌遺伝子が、癌遺伝子アンチセンス構築物である、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４３】
癌を有する被験体を処置するための組成物であって、
野生型Ｆｕｓ１ポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＦ０５５４７９）
を含む、組成物。
【請求項４４】
前記癌が、脳癌、肺癌、肝臓癌、脾臓癌、腎臓癌、リンパ節癌、小腸癌、血液細胞癌、膵臓癌、結腸癌、胃癌、子宮頸部癌、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、皮膚癌、頭頸部の癌、食道癌、口腔組織癌、ならびに骨髄癌からなる群より選択される、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ポリペプチドがリポソーム内に含まれる、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
前記リポソームが、Ｎ−（１−［２，３−ジオレオイルオキシ］プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）およびコレステロールから構成される、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記被験体がヒトである、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４８】
抗腫瘍活性について候補物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ｉ）機能的な野生型Ｆｕｓ１ポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＦ０５５４７９）を欠く細胞を提供する工程；
（ｉｉ）該細胞を、該候補物質と接触させる工程；および
（ｉｉｉ）該細胞に対する該候補物質の影響を決定する工程、
を包含し、ここで、該決定する工程は、該候補物質の存在下または非存在下での該細胞の野生型Ｆｕｓ１ポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＦ０５５４７９）の発現を比較する工程を包含する、方法。
【請求項４９】
前記細胞が腫瘍細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記決定する工程が、前記候補物質の存在下での前記細胞の１つ以上の特徴を、該候補物質の非存在下での類似の細胞の同じ１つ以上の特徴と比較する工程をさらに包含する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記特徴が、ホスファターゼ活性、増殖、転移、接触阻害、軟寒天増殖、細胞周期調節、腫瘍形成、腫瘍進行、転移および／または組織浸潤である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記候補物質が、化学療法剤または放射線治療剤である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記候補物質が、低分子ライブラリーから選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
抗腫瘍活性について候補物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ｉ）細胞を提供する工程；
（ｉｉ）該細胞を、該候補物質と接触させる工程；および
（ｉｉｉ）野生型Ｆｕｓ１ポリペプチド（ＧｅｎＢａｎｋ番号：ＡＦ０５５４７９）の発現に対する、該候補物質の影響を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項５５】
前記発現カセットが脂質ビヒクルまたはリポソームに含まれている、請求項２０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本出願は、米国仮出願番号６０／２１７，１１２号（２０００年７月１０日出願）の利益を主張する。
【０００２】
合衆国政府は、Ｐ５０−ＣＡ７０９０７に基づき本発明における権利を有する。
【０００３】
（Ｉ．発明の分野）
本発明は、一般に、分子生物学および腫瘍学の分野に関連する。
【０００４】
（ＩＩ．関連技術）
癌は、複数の因子の発生の結果である。変異は、細胞増殖が増大することを生じるプロトオンゴジーンにおいて生じ得る。変異はまた、その正常な機能が細胞増殖を調節することである腫瘍サプレッサーで生じ得る。ＤＮＡ修復酵素における変異は、増殖する前に損傷を修復するこの細胞の能力を損なう。腫瘍サプレッサー遺伝子は、その非存在（欠損または不活化）が癌に至り得る、正常な遺伝子である。腫瘍サプレッサー遺伝子は、細胞増殖および細胞分裂を緩和するタンパク質をコードする。癌は、両方の対立遺伝子に変異が存在する場合に生じる。
【０００５】
腫瘍サプレッサー遺伝子（ＴＳＧ）は、ヒトの肺癌および他の癌の病原において主要な役割を果たす。肺癌細胞は、複数の公知の優性および劣性の癌遺伝子における変異および欠失を保有する（Ｓｅｋｉｄｏら，１９９８，Ｖｉｒｍａｎｉら，１９９８）。公知のＴＳＧ（例えば、Ｒｂ，ｐ５３，および推定ＴＳＧ）が、染色体領域、３ｐ、５ｑ、６ｐ、８ｐ、９ｐおよび１１ｐならびに他の部位に見出された（Ｓｅｋｉｄｏら，１９９８，Ｇａｚｄａｒら，１９９４，Ｍｉｎｎａ，１９９４）。新たな肺腫瘍および腫瘍細胞の細胞遺伝学的研究および対立遺伝子型決定研究は、複数の部位で腫瘍細胞対立遺伝子欠損を示し、これは、１つ以上のこのようなＴＳＧの存在を示唆する（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８、Ｖｉｒｍａｎｉら、１９９８、Ｇａｚｄａｒら、１９９４、Ｍｉｎｎａら、１９９７）。しかし、第三染色体のショートアーム（３ｐ）における、細胞遺伝学的変化および対立遺伝子の欠損は、約９０％の小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および５０％を超える非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）において最も頻繁に関与することが示された（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８、Ｇａｚｄａｒら、１９９４、Ｍｉｎｎａら、１９９７、Ｄａｌｙら、１９９３）。ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣは、肺腫瘍の２つの処置群であり、そして、４つの組織学的型から構成される。扁平上皮細胞細胞癌腫、腺癌、および大細胞癌は、ＮＳＣＬＣ群に入る。小細胞肺癌は、ＳＣＬＣ群に入る。約７５％の肺腫瘍がＮＳＣＬＣである。転移は、ＳＣＬＣの場合よりＮＳＣＬＣの方がより遅い。ＳＣＬＣは、固形腫瘍のうち最も転移性のものの１つである（Ｍａｂｒｙら，１９９８）。さらに、類似の３ｐの変化は、肺に加え、いくつかの他の癌において見出された（例えば、腎臓（Ｂｅｒｎｕｅｓら、１９９８、Ｚｂａｒら、１９８７）、胸部（Ｇａｚｄａｒら、１９９８、Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８）、頭頸部（Ｂｕｃｈｈａｇｅｎら、１９９６）、膵臓（Ｇｏｒｕｎｏｖａら、１９９８）、腎臓（Ｈｕｇｈｓｏｎら、１９９８）、口腔（Ｕｚａｗａら、１９９８）、および子宮頸管癌（Ｋｅｒｓｅｍａｅｋｅｒｓら、１９９８））。さらに、肺癌におけるホモ接合性欠失で規定されるようなＴＳＧの群は、４５０ｋｂ領域で３ｐ２ｌ．３において位置付けられ、そして単離された（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８、Ｍｉｎｎａら、１９９７、Ｈｕｎｇら、１９９５、Ｓｅｋｉｄｏら、１９９６、Ｗｉｓｔｕｂａら、１９９９）。肺癌新生物形成前の研究は、３ｐ２ｌの対立遺伝子欠損が、肺癌においてこれまで検出された最も初期の遺伝的異常であり、過形成損傷を生じることを示す；これは、１以上の３ｐ−劣性癌遺伝子が、多くのヒトの癌（肺癌を含む）の分子病原論において「ゲートキーパー」として機能することを示し、ここで、これは、全ての場合の５０％を超えて関与する可能性がある（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８、Ｍｉｎｎａら、１９９７、Ｈｕｎｇら、１９９５、Ｓｅｋｉｄｏら、１９９６、Ｗｉｓｔｕｂａら、１９９９、Ｋｏｈｎｏら、１９９９、ら、１９９９、Ｗｉｓｔｕｂａら、１９９９）。
【０００６】
最近、ヒト染色体バンド３ｐ２ｌ．３は、いくつかのＳＣＬＣ株およびＮＳＣＬＣ株において重複したホモ接合性欠損を被ることが示された；ＴＳＧの候補が、いくつかのヒト癌においてこの重要な領域に位置付けられ、さらにＴＳＧ領域を規定した（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８、Ｍｉｎｎａら、１９９７、Ｈｕｎｇら、１９９５、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、１９９７）。この証拠は、この３ｐ２ｌの重要な領域における遺伝子が、肺癌細胞，腎臓癌細胞、および乳癌細胞においてテロメラーゼ媒介細胞不死性経路の調節に関与することを示す（Ｓｈａｙ、１９９７、Ｓｈａｙ、１９９８）。３ｐ欠失が、喫煙する患者の肺腫瘍組織においてより頻繁に生じることがまた示された。さらに、３ｐ２ｌ．３における、発癌性ベンゾ［ａ］ピレンジオールエポキシドに対する感受性の増大は、肺癌の危険性の増大に関連し、３ｐ２１．３が肺癌における発癌物質の分子標的であることを示唆した（Ｗｕら、１９９８）。それらの研究に関わらず、これらの遺伝子の機能をさらに同定し、これらの癌との関連性を実証する必要性が依然存在する。
【０００７】
（発明の要旨）
３ｐ２ｌ．３における腫瘍サプレッサー遺伝子は、現在開示されている：Ｇｅｎｅ２６（ＣＡＣＮＡ２Ｄ２）（Ｇａｏら、２０００）、ＰＬ６、Ｂｅｔａ＊（ＢＬＵ）、ＬＵＣＡ−１（ＨＹＡＬｌ）、ＬＵＣＡ−２（ＨＹＡＬ２）、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１）、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１（ＮＰＲＬ２）、およびＳＥＭ  Ａ３。腫瘍増殖および腫瘍進行の抑制、アポトーシスの誘導、細胞周期動力学の変更、およびテロメラーゼ活性抑制における個々の３ｐの遺伝子の機能は、インビトロおよびインビボにおける３ｐの遺伝子のリポソーム媒介移入および組換えアデノウイルスベクター媒介移入によって特徴付けられた。これはまた、Ｂｅｔａ＊遺伝子の最初の開示である。
【０００８】
従って、３ｐ２ｌ．３の染色体位置を有する腫瘍サプレッサーを使用する方法を提供することが本発明の目的である。腫瘍サプレッサー、Ｂｅｔａ＊を提供することがまた、目的である。さらに、これらの腫瘍サプレッサーが挿入され得る組換えアデノウイルスを構築する方法を提供することが目的の方法である。
【０００９】
本発明の実施形態は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドである。配列番号１の配列を有する核酸がまた提供される。配列番号２のアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドがさらに提供される。別の実施形態は、配列番号１の１５の連続した塩基対またはこれの相補体を含む１５〜約１００塩基対の核酸である。さらなる実施形態は、配列番号１の約２０、２５、３０、４０、５０または１００の連続した塩基対、またはこれの相補体を含む。
【００１０】
本発明の別の実施形態は、配列番号２の１０と約５０との間の連続した残基を有する単離されたペプチドである。さらに、このペプチドは、配列番号２の１５、２０、２５、または３０の連続した残基を含み得る。本願において、「約」は、±２アミノ酸の以内であるとして定義される。
【００１１】
なお別の実施形態は、配列番号２を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットであり、ここで、このポリペプチドは真核生物細胞において作動可能なプロモーターの制御下にある。別の実施形態において、この発現カセットのプロモーターは、コード配列に対して異種である。このプロモーターは、組織特異的かつ誘導的なプロモーターであり得る。別の実施形態において、発現カセットは、ウイルスベクターに含まれ得る。このウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターであり得る。さらなる実施形態において、この発現カセットはポリアデニル化シグナルを含み得る。
【００１２】
別の実施形態は、配列番号２の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含む細胞であり、ここで、このポリヌクレオチドは、真核生物細胞において作動可能なプロモーターの制御下に存在し、このプロモーターは、このポリヌクレオチドに対して異種である。
【００１３】
本発明のなお別の実施形態は、配列番号２の配列を含むポリペプチドまたはこれの免疫学的フラグメントに免疫学的に結合するモノクローナル抗体である。検出可能な標識を有するモノクローナル抗体がまた、提供される。この標識は、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識、および酵素であり得る。本発明の別の実施形態は、配列番号２を含むポリペプチドまたはこれの免疫学的フラグメントを含むポリペプチドに免疫学的に結合するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞である。さらなる実施形態は、ポリクローナル抗血清であり、この抗血清の抗体は、配列番号２を含むポリペプチドまたはこれの免疫学的フラグメントに免疫学的に結合する。
【００１４】
なお別の実施形態は、配列番号１を含むＤＮＡセグメントまたはこの相補体に、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離されかつ精製された核酸である。さらなる実施形態において、この核酸は、約１５、１７、２０または２５の塩基長である。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、組換えアデノウイルスを構築する方法であって、この方法は、以下を包含する：（ａ）シャトルベクターを提供する工程であって、このシャトルベクターは、アデノウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、プロモーターおよびポリＡ配列を含む発現カセット、このプロモーターの制御下にある導入遺伝子、およびこのＩＴＲ−プロモーター−導入遺伝子−ポリＡセグメントの５’末端および３’末端の独特の制限部位を含む、工程；（ｂ）この制限酵素部位で切断する工程；（ｃ）Ｅ１領域およびＥ３領域全体を欠くアデノウイルスベクターにこの放出されたセグメントを連結し、この得られたベクターで細菌性宿主細胞を形質転換する工程；（ｄ）この細菌性宿主細胞からベクターを得て、そしてこのベクターを消化してＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスゲノムを放出する工程；および  （ｅ）このアデノウイルスゲノムをＥ１発現宿主細胞中にトランスフェクトする工程。さらなる実施形態において，この導入遺伝子は
Ｇｅｎｅ２６、ＰＬ６、Ｂｅｔａ＊、ＬＵＣＡ−１、ＬＵＣＡ−２、１２３Ｆ２、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、またはＳＥＭ  Ａ３である。別の実施形態において、このプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであり得、そしてこのポリＡ配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列であり得る。
【００１６】
本発明のなお別の実施形態は、組換えアデノウイルスを構築するための方法であって、この工程は、以下を含む：（ａ）シャトルベクターを提供する工程であって、このシャトルベクターは、アデノウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、プロモーターおよびポリＡシグナル配列を含む発現カセット、このプロモーターの制御下にある導入遺伝子、テトラサイクリン耐性−ｏｆｆ応答エレメントおよびこのＩＲＴ−プロモーター−導入遺伝子−ポリＡセグメントの５’末端および３’末端の独特の制限部位を含む、工程；（ｂ）この制限酵素部位で切断する工程；（ｃ）テトラサイクリン耐性−ｏｆｆトランス活性化因子遺伝子を含み、Ｅ１領域およびＥ３領域全体を欠くアデノウイルスベクターにこの放出されたセグメントを連結し、この得られたベクターで細菌性宿主細胞を形質転換する工程；（ｄ）この細菌性宿主細胞からベクターを得て、そしてこのベクターを消化してＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスゲノムを放出する工程；および（ｅ）このアデノウイルスゲノムをＥ１発現宿主細胞中にトランスフェクトする工程。さらなる実施形態において，この導入遺伝子は、Ｇｅｎｅ２６、ＰＬ６、Ｂｅｔａ＊、ＬＵＣＡ−１、ＬＵＣＡ−２、１２３Ｆ２、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、またはＳＥＭ  Ａ３である。別の実施形態において、このプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであり得、そしてこのポリＡ配列  は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列であり得る。
【００１７】
なお別の実施形態において、シャトルベクターがまた提供され、このシャトルベクターは、アデノウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、プロモーターおよびポリＡ配列を含む発現カセット、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ応答エレメントおよびこのＩＴＲ−プロモーター−ポリＡセグメントの５’末端および３’末端の独特の制限部位を含む。本発明の別の実施形態において、このプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターであり、そしてこのポリＡ配列はウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列である。上記のセグメント中の複数目的のクローニング部位がまた提供され、この部位は、上記のプロモーターと上記のポリＡ配列との間に位置付けられる。
【００１８】
なお別の実施形態は、テトラサイクリン耐性ｏｆｆ活性化因子遺伝子を含み、そしてＥ１領域およびＥ３領域の全体を欠くアデノウイルスベクターである。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、被験体における癌を診断する方法であって、以下の工程を包含する：（ｉ）この被験体から生物学的サンプルを得る工程；および（ｉｉ）サンプル中の機能的な、Ｇｅｎｅ２６産物、ＰＬ６産物、Ｂｅｔａ＊産物、ＬＵＣＡ−ｌ産物、ＬＵＣＡ−２産物、１２３Ｆ２産物、Ｆｕｓｌ産物、１０１Ｆ６産物、Ｇｅｎｅ２１産物、またはＳＥＭ  Ａ３産物の発現を評価する工程。さらなる実施形態において、このサンプルは、組織サンプルである。この組織サンプルは、脳組織、肺組織、肝臓組織、脾臓組織、腎臓組織、リンパ節、小腸組織、血液細胞組織、膵臓組織、結腸組織、胃組織、子宮頸部組織、胸部組織、子宮内膜組織、前立腺組織、精巣組織、卵巣組織、皮膚組織、頭頸部組織、食道組織、口腔組織、骨髄組織または血液組織であり得る。別の実施形態において、この評価する工程は、Ｇｅｎｅ２６、ＰＬ６、Ｂｅｔａ＊、ＬＵＣＡ−１、ＬＵＣＡ−２、１２３Ｆ２、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、またはＳＥＭ  Ａ３をコードする核酸を検出する工程を包含する。検出する工程は、この核酸の増幅、核酸ハイブリダイゼーション、または配列決定を含み得る。別の実施形態において、この評価する工程は、Ｇｅｎｅ２６ポリペプチド、ＰＬ６ポリペプチド、Ｂｅｔａ＊ポリペプチド、ＬＵＣＡ−１ポリペプチド、ＬＵＣＡ−２ポリペプチド、１２３Ｆ２ポリペプチド、Ｆｕｓ１ポリペプチド、１０１Ｆ６ポリペプチド、Ｇｅｎｅ２１ポリペプチド、またはＳＥＭ  Ａ３ポリペプチドを検出する工程を含む。Ｇｅｎｅ２６ポリペプチド、ＰＬ６ポリペプチド、Ｂｅｔａ＊ポリペプチド、ＬＵＣＡ−１ポリペプチド、ＬＵＣＡ−２ポリペプチド、１２３Ｆ２ポリペプチド、Ｆｕｓ１ポリペプチド、１０１Ｆ６ポリペプチド、Ｇｅｎｅ２１ポリペプチド、またはＳＥＭ  Ａ３ポリペプチドを検出する工程は、ＥＬＩＳＡまたは免疫組織化学を含み得る。なお別の実施形態において、この評価する工程は、野生型オリゴヌクレオチドまたは変異型オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを含み、このオリゴヌクレオチドはチップまたはウエハ上に配置される。本発明の別の実施形態において、Ｇｅｎｅ２６、ＰＬ６、Ｂｅｔａ＊、ＬＵＣＡ−１、ＬＵＣＡ−２、１２３Ｆ２、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、またはＳＥＭ  Ａ３の発現は、正常組織中の、Ｇｅｎｅ２６、ＰＬ６、Ｂｅｔａ＊、ＬＵＣＡ−１、ＬＵＣＡ−２、１２３Ｆ２、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、またはＳＥＭ  Ａ３の発現と比較される。別の実施形態において、この比較は、Ｇｅｎｅ２６、ＰＬ６、Ｂｅｔａ＊、ＬＵＣＡ−１、ＬＵＣＡ−２、１２３Ｆ２、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、またはＳＥＭ  Ａ３の発現のレベルを評価する工程を包含する。
【００２０】
別の実施形態は、Ｇｅｎｅ２６、ＰＬ６、Ｂｅｔａ＊、ＬＵＣＡ−１、ＬＵＣＡ−２、１２３Ｆ２、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、またはＳＥＭ  Ａ３の機能的な対立遺伝子の１つまたは両方を欠失した非ヒトトランスジェニック動物である。類似の非ヒトトランスジェニック動物と比較して、Ｇｅｎｅ２６、ＰＬ６、Ｂｅｔａ＊、ＬＵＣＡ−１、ＬＵＣＡ−２、１２３Ｆ２、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、またはＳＥＭ  Ａ３を過剰発現する非ヒトトランスジェニック動物が提供される。さらなる実施形態は、ゲノムが、誘導的プロモーターの制御下にある、Ｇｅｎｅ２６、ＰＬ６、Ｂｅｔａ＊、ＬＵＣＡ−１、ＬＵＣＡ−２、１２３Ｆ２、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、またはＳＥＭ  Ａ３を含む発現カセットを含む、非ヒトトランスジェニック動物である。
【００２１】
本発明の実施形態は、腫瘍細胞の増殖を抑制する方法であって、この方法は、以下の工程を包含する：この細胞を発現カセットに接触させる工程であって、この発現カセットは、以下：（ａ）Ｇｅｎｅ２６、ＰＬ６、Ｂｅｔａ＊、ＬＵＣＡ−１、ＬＵＣＡ−２、１２３Ｆ２、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、またはＳＥＭ  Ａ３をコードする核酸；および（ｂ）この腫瘍細胞で活性であるプロモーターを、この腫瘍細胞によるこの核酸の取り込みを可能にする条件下で含む工程。別の実施形態において、この腫瘍細胞は、以下に由来する：脳腫瘍、肺腫瘍、肝臓腫瘍、脾臓腫瘍、腎臓腫瘍、リンパ節腫瘍、小腸腫瘍、血球腫瘍、膵臓腫瘍、結腸腫瘍、胃腫瘍、子宮頸部腫瘍、乳房腫瘍、子宮内膜腫瘍、前立腺腫瘍、精巣腫瘍、卵巣腫瘍、皮膚腫瘍、頭頸部腫瘍、食道腫瘍、口腔組織腫瘍、または骨髄腫瘍。さらなる実施形態において、この核酸は、ウイルスベクターに含まれる。このウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、およびヘルぺスウイルスベクターであり得る。なお別の実施形態において、この核酸は、リポソームに含まれる。
【００２２】
本発明の別の実施形態は、腫瘍細胞の表現型を変更する工程であって、この方法は、以下の工程を包含する：この細胞を発現カセットに接触させる工程であって、この発現カセットは、以下：（ａ）Ｇｅｎｅ２６、ＰＬ６、Ｂｅｔａ＊、ＬＵＣＡ−１、ＬＵＣＡ−２、１２３Ｆ２、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、またはＳＥＭ  Ａ３をコードする核酸；および（ｂ）この腫瘍細胞で活性であるプロモーターを、この腫瘍細胞によるこの核酸の取り込みを可能にする条件下で含む工程。別の実施形態において、この表現型は、以下からなる群より選択される：増殖、移動、接触、阻害、軟寒天増殖、細胞周期、浸潤性、腫瘍形成、および転移性潜在能力。なお別の実施形態において、このプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。
【００２３】
別の実施形態は、癌に苦しむ被験体中の癌を阻害する方法であって、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）Ｇｅｎｅ２６ポリペプチド、ＰＬ６ポリペプチド、Ｂｅｔａ＊ポリペプチド、ＬＵＣＡ−１ポリペプチド、ＬＵＣＡ−２ポリペプチド、１２３Ｆ２ポリペプチド、Ｆｕｓ１ポリペプチド、１０１Ｆ６ポリペプチド、Ｇｅｎｅ２１ポリペプチド、またはＳＥＭ  Ａ３ポリペプチドをコードする核酸；および（ｂ）この被験体の腫瘍細胞で活性なプロモーターを含む発現カセットを被験体に投与する工程であって、これによってこのポリペプチドの発現が癌を阻害する、工程。さらなる実施形態において、この被験体は、ヒトである。他の実施形態において、この核酸は、Ｇｅｎｅ２６、ＰＬ６、Ｂｅｔａ＊、ＬＵＣＡ−１、ＬＵＣＡ−２、１２３Ｆ２、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、またはＳＥＭ  Ａ３をコードする。別の実施形態において、この癌は、以下からなる群より選択される：脳癌、肺癌、肝臓癌、脾臓癌、腎臓癌、リンパ節癌、小腸癌、血球癌、膵臓癌、結腸癌、胃癌、子宮頸部癌、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、皮膚癌、頭頸部癌、食道癌、口腔組織癌、および骨髄癌。なお別の実施形態において、この発現カセットは、ウイルスベクターに含まれる。このウイルスベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ならびにヘルペスウイルスベクターであり得る。別の実施形態において、この発現カセットは、リポソームに含まれる。別の実施形態において、この発現カセットは、ポリＡ配列をさらに含む。このポリＡ配列は、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ配列であり得る。さらなる実施形態において、この発現カセットが、腫瘍内、腫瘍脈管構造内、腫瘍に対する局部、腫瘍の領域に、または全身的に投与される。
【００２４】
この被験体に化学療法剤を投与することがまた、癌を阻害する方法において提供される。別の実施形態において、この化学療法は、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イフォファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ  １６）、タモキシフェン、ラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）、エストロゲンレセプター結合試薬、タキソール、ゲムシタビエン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター（ｆｒｎｅｓｙｌ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、トランスプラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎ）、ビンブラスチンおよびメトトレキサート。被験体に放射線を与える工程がまた、提供される。別の実施形態において、この放射線は、癌部位に対して局所的に送達されるか、または全身照射である。この放射線は、γ線、Ｘ線、加速したプロトン、マイクロ波放射、ＵＶ放射、または、腫瘍細胞に対する指向された放射性同位体の送達を含み得る。なお別の実施形態において、第二の抗癌遺伝子が、被験体に投与され得る。この第二の抗癌遺伝子は腫瘍サプレッサーであり得る。この第二の抗癌遺伝子は、アポトーシスのインヒビターであり得る。別の実施形態において、この第二の抗癌遺伝子は、癌遺伝子アンチセンス構築物であり得る。
【００２５】
本発明の実施形態は、癌を有する被験体を処置する方法であって、この方法は、以下の工程を包含する：Ｇｅｎｅ２６ポリペプチド、ＰＬ６ポリペプチド、Ｂｅｔａ＊ポリペプチド、ＬＵＣＡ−１ポリペプチド、ＬＵＣＡ−２ポリペプチド、１２３Ｆ２ポリペプチド、Ｆｕｓｉポリペプチド、１０１Ｆ６ポリペプチド、Ｇｅｎｅ２１ポリペプチド、ＳＥＭ  Ａ３ポリペプチドを被験体に投与する工程。別の実施形態において、この癌は、以下からなる群より選択される：脳癌、肺癌、肝臓癌、脾臓癌、腎臓癌、リンパ節癌、小腸癌、血球癌、膵臓癌、結腸癌、胃癌、子宮頸部癌、乳癌、子宮内膜癌、前立腺癌、精巣癌、卵巣癌、皮膚癌、頭頸部癌、食道癌、口腔組織癌、および骨髄癌。さらなる実施形態において、このポリペプチドは、リポソームに含まれる。このリポソームは、Ｎ−（１−［２，３−ジオレオイルオキシ］プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＡＰ）およびコレステロールからなり得る。別の実施形態において、この被験体は、ヒトである。
【００２６】
本発明の別の実施形態は、抗腫瘍活性のために候補物質をスクリーニングする方法であって、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）機能的な、Ｇｅｎｅ２６ポリペプチド、ＰＬ６ポリペプチド、Ｂｅｔａ＊  ＬＵＣＡ−１ポリペプチド、ＬＵＣＡ−２ポリペプチド、１２３Ｆ２ポリペプチド、Ｆｕｓｉポリペプチド、１０１Ｆ’６ポリペプチド、Ｇｅｎｅ２１ポリペプチド、またはＳＥＭ  Ａ３ポリペプチドを欠く細胞を提供する工程；（ｉｉ）この細胞を、この候補物質と接触させる工程；および（ｉｉｉ）この細胞におけるこの候補物質の効果を決定する工程。別の実施形態において、この細胞は、腫瘍細胞である。別の実施形態において、この決定する工程は、候補物質の存在下にあるこの細胞の１以上の特徴を、この候補物質の非存在下にある類似の細胞の同じ１以上の特徴と比較する工程を包含し得る。さらなる実施形態において、この特徴は、以下からな群より選択される：Ｇｅｎｅ２６、ＰＬ６、Ｂｅｔａ＊、ＬＵＣＡ−１、ＬＵＣＡ−２、１２３Ｆ２、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、ＳＥＭ  Ａ３の発現、ホスファターゼ活性、増殖、転移、接触阻害、軟寒天増殖、細胞周期調節、腫瘍形成、腫瘍進行、転移、および組織浸潤。別の実施形態において、この候補物質は、化学療法剤または放射線療法剤である。低分子ライブラリーから選択される候補物質がまた、提供される。さらなる実施形態において、この細胞は、インビトロまたはインビボで接触される。
【００２７】
本発明の実施形態は、抗腫瘍活性について候補物質をスクリーニングする方法であって、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）細胞を提供する工程；（ｉｉ）この細胞を、この候補物質と接触させる工程；および（ｉｉｉ）Ｇｅｎｅ２６ポリペプチド、ＰＬ６ポリペプチド、Ｂｅｔａ＊ポリペプチド、ＬＵＣＡ−１ポリペプチド、ＬＵＣＡ−２ポリペプチド、１２３Ｆ２ポリペプチド、Ｆｕｓ１ポリペプチド、１０１Ｆ６ポリペプチド、Ｇｅｎｅ２１ポリペプチド、またはＳＥＭ  Ａ３ポリペプチドの発現における、この候補物質の効果を決定する工程。
【００２８】
別の実施形態は、宿主細胞中にＢｅｔａ＊ポリペプチドを生成する方法であって、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）この宿主細胞中で活性なプロモーターに作動可能に連結したＢｅｔａ＊をコードする核酸を含む発現カセットを提供する工程；（ｂ）この発現カセットをこの宿主細胞に移入する工程；および（ｃ）このＢｅｔａ＊ポリペプチドの発現を可能にする条件下でこの宿主細胞を培養する工程。
【００２９】
本発明のなお別の実施形態は、被験体の癌を診断する方法であって、この方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）この被験体から生物学的サンプルを得る工程；および（ｉｉ）Ｇｅｎｅ２６、ＰＬ６、Ｂｅｔａ＊、ＬＵＣＡ−ｌ、ＬＵＣＡ−２、１２３Ｆ２、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、またはＳＥＭ  Ａ３のプロモーター領域の過剰メチル化を検出する工程。
【００３０】
本発明の他の、目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。しかし、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、例示としてのみ与えられることが理解されるべきである。なぜならば、本発明の精神および範囲内の種々の変化および改変は、この詳細な説明から当業者にとって明らかとなるからである。
【００３１】
（配列の要約）
配列番号１＝Ｂｅｔａ＊（ＢＬＵ）ヌクレオチド配列
配列番号２＝Ｂｅｔａ＊（ＢＬＵ）アミノ酸配列
（発明の詳細な説明）
腫瘍サプレッサー遺伝子（ＴＳＧ）は、ヒト肺癌および他の癌の病因において主要な役割を果たす。肺癌細胞は、複数の公知の優性および劣性の癌遺伝子における変異および欠失を有する（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８、Ｖｉｒｍａｎｉら、１９９８）。肺癌において変化されていることが見出されている他のＴＳＧは、ｐ５３、ｐ１６、Ｒｂ、およびＦＨＩＴ−１（Ｍａｂｒｙら、１９９８）である。公知のＴＳＧ（例えば、Ｒｂ、ｐ５３など）は、染色体領域３ｐ、５ｑ、６ｐ、８ｐ、９ｐおよび１１ｐ、ならびに他の部位に見出されている（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８、Ｇａｚｄａｒら、１９９４、Ｍｉｎｎａら、１９９４）。新鮮な肺腫瘍および腫瘍細胞の細胞遺伝子学研究および対立遺伝子型決定研究は、複数の部位での腫瘍細胞対立遺伝子欠損を示し、これは、１以上のこのようなＴＳＧの存在を示唆する（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８、Ｖｉｒｍａｎｉら、１９９８、Ｇａｚｄａｒら、１９９４、Ｍｉｎｎａら、１９９７）。これらの遺伝子座は、喫煙者の肺癌に対する素因を理解するにおいて重要である（Ｍａｂｒｙら、１９９８）。ヘテロ接合性の損失（ＬＯＨ）は、他の固形腫瘍と同様に、肺癌において一般的である。肺癌においてヘテロ接合性の損失を受ける染色体遺伝子座のいくつかは、以下である：９ｐ２１−ｐ２２、１３ｑ１４、１７ｐ１３．１、３ｐ１２−ｐ１４、３ｐ２１、３ｐ２５、５ｑ２１、１１ｑ１２−ｑ２４および２２ｑ。肺癌に対する脆弱性は、複数の遺伝子座で生じる遺伝的差異に起因し得る。これらの遺伝子は、タバコの発癌物質の代謝において役割を果たし得る。第３染色体のショートアーム（３ｐ）上の細胞遺伝的変化および対立遺伝子の損失は、最も頻繁には、小細胞肺癌（ＳＣＬＳ）の約９０％において、および５０％を超える非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）において関与することが示されている（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８、Ｇａｚｄａｒら、１９９４、Ｍｉｎｎａら、１９９７、Ｄａｌｙら、１９９３）。さらに、より小さい３ｐの変化は、いくつかの他の癌（例えば、腎（Ｂｅｒｎｕｅｓら、１９９８、Ｚｂａｒら、１９８７）、胸部（Ｇａｚｄａｒ，１９９８、Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８）、頭頸部（Ｂｕｃｈｈａｇｅｎら、１９９６）、膵臓（Ｇｏｒｕｎｏｖａら、１９９８）、腎臓（Ｈｕｇｈｓｏｎら、１９９８）、口腔（Ｕｚａｗａら、１９９８）、および子宮頸癌（Ｋｅｒｓｅｍａｅｋｅｒら、１９９８、Ｗｉｓｔｕｂａら、１９９７））において確認されている。
【００３２】
近年、ヒト染色体帯３ｐ２１．３が、いくつかのＳＣＬＣ株およびＮＳＣＬＣ株において重複するホモ接合性欠失を受けることが示された。ＴＳＧの候補は、いくつかのヒトの癌において、この重要な領域に位置付けられ、これは、さらにＴＳＧ領域を規定する（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８、Ｍｉｎｎａら、１９９７、Ｗｉｓｔｕｂａら、１９９９、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、１９９７）。この証拠は、この３ｐ２１の重要な領域における遺伝子が、肺癌細胞、腎癌細胞および乳癌細胞におけるテロメラーゼ媒介性の細胞不死化経路の調節に関与することを示す（Ｓｈａｙ、１９９７、Ｓｈａｙ、１９９８）。細胞ハイブリッドおよび微小核体第３染色体移入研究は、ヒト肺癌細胞株、腎癌細胞株および卵巣癌細胞株において悪性を抑制するヒトの第３染色体遺伝子の能力を実証している（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８、Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９４）。３ｐ欠失が、喫煙患者の肺腫瘍組織においてより頻繁に生じることも示されている。さらに、３ｐ２１．３での発癌物質ベンゾ［ａ］ピレンジオールエポキシドに対する感受性の上昇が、肺癌の危険性の増加に関連付けられ、これは、３ｐ２１．３が、肺癌における発癌物質の分子標的であり得ることを示唆する（Ｗｕら、１９９８）。
【００３３】
本発明は、肺癌に関与する遺伝子座を同定する。肺癌におけるホモ接合性欠失によって定義されるような、ＴＳＧのグループ（Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、ＰＬ６、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、１２３Ｆ２、Ｂｅｔａ＊およびＳＥＭ  Ａ３）は、３ｐ２１．３において４５０ｋｂ領域中に位置付けられそして単離されている（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８、Ｍｉｎｎａら、１９９７、Ｈｕｎｇら、１９９７、Ｓｅｋｉｄｏら、１９９６、Ｗｉｓｔｕｂａら、１９９９）。肺癌新生物発生前の研究は、３ｐ２１対立遺伝子欠損が、これまでに検出された中で、肺癌において最も早期の遺伝子異常であることを示す。１以上の３ｐ劣性癌遺伝子は、多くのヒトの癌（肺癌を含む）の分子性病因における「ゲートキーパー」として機能し、おそらく、全症例の５０％を超えて関与している（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８、Ｍｉｎｎａら、１９９７、Ｈｕｎｇら、１９９７、Ｓｅｋｉｄｏら、１９９６、Ｗｉｓｔｕｂａら、１９９９、Ｋｏｈｎｏら、１９９９、Ｗｉｓｔｕｂａら、１９９９）（図３）。
【００３４】
（１）３ｐ２１．３において４５０ｋｂ領域中に位置付けられた３ｐ遺伝子が、肺癌におけるホモ接合性欠失によって規定され；（２）３ｐ２１対立遺伝子欠損が、肺癌および他の腫瘍において検出された最も早期の遺伝子異常のうちの１つであり；（３）これらの３ｐ遺伝子のヘテロ接合性の欠損、ホモ接合性欠失および異常が、肺癌を含む多くのヒトの癌の病因に関連し（おそらく、前症例の５０％を超えて関与している）；そして（４）複数の３ｐ遺伝子が、腫瘍サプレッサー遺伝子として機能するか、またはこの３ｐ２１．３領域が腫瘍サプレッサー領域として機能するので、これらの３ｐ遺伝子の遺伝的／細胞遺伝的な状態および機能に基づいて開発された技術および分子ツールは、種々のヒトの癌の早期検出、診断、およびモニタリング、ならびに予防および治療的試行のために極めて価値がある。
【００３５】
（Ｉ．腫瘍サプレッサー遺伝子領域としての３ｐ遺伝子の機能）
腫瘍サプレッサー遺伝子として遺伝子の機能を規定するための基準の１つは、それらの遺伝子の不活性化によって特徴付けられる腫瘍表現型が、これらの遺伝子の野生型対立遺伝子の置換によってレスキューされ得ることを実証することである。頻繁なヘテロ接合性の欠損（ＬＯＨ）、ホモ接合性欠失、またはいくつかの場合において、遺伝子の異常な転写物および変異が、発癌物質の標的であり、そしてその遺伝子の機能の欠損が、ヒトの癌を導く場合、野生型遺伝子でのそれらの異常な遺伝子の置換が、Ｒｂまたはｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子によって示される腫瘍抑制と同様の腫瘍抑制（インビトロでの腫瘍細胞増殖の阻害、腫瘍形成能および腫瘍増殖の抑制、ならびにインビボでの腫瘍細胞の浸潤および転移の阻害を含む）を生じる（Ｐｅｌｌｅｇａｔａら、１９９６、Ｐｏｌｙａら、１９９６、Ｗａｎｇら、１９９６）。
【００３６】
腫瘍サプレッサー遺伝子としての３ｐ遺伝子の同定は、複数の部位での腫瘍細胞対立遺伝子欠損およびこれらの領域におけるホモ接合性欠失を示す、新鮮な腫瘍および腫瘍細胞株の細胞遺伝学的研究および対立遺伝子型決定研究に基づいた。これらの３ｐ遺伝子のいくつかは、現在利用可能なデータベース中のいくつかの公知の遺伝子に対して、ＤＮＡおよびその推定アミノ酸配列における種々の程度の相同性を共有するが；癌の病因および腫瘍形成能におけるこれらの３ｐ遺伝子または３ｐ２１．３領域の機能は、以前は未知であった。細胞ハイブリッドおよび微小核体第３染色体移入研究は、ヒト肺癌細胞株、腎癌細胞株および卵巣癌細胞株、ならびにマウスＡ９線維肉腫細胞において悪性を抑制する、ヒトの第３染色体遺伝子の能力を実証しているが、Ａ５４９ヒト肺癌細胞への第３染色体全体の導入に関連する１例のみが、報告されているだけである（Ｍｉｎｎａら、１９９７、Ｓａｎｃｈｅｚら、１９９４、Ｋｉｌｌａｒｙら、１９９２、Ｋｉｌｌａｒｙら、１９９５、Ｓａｔｏｈら、１９９３）。
【００３７】
本発明において、腫瘍増殖および腫瘍進行の抑制、アポトーシスの誘導、細胞周期運動の改変、ならびにテロメラーゼ活性の抑制における個々の３ｐ遺伝子の機能が、インビトロおよびインビボでの３ｐ遺伝子のリポソーム媒介移入および組換えアデノウイルスベクター媒介移入によって初めて特徴付けられ、そして腫瘍サプレッサー領域としての３ｐ遺伝子の機能の概念が、この重要な３ｐ２１．３領域における複数の３ｐ遺伝子に関与する腫瘍サプレッサー活性に基づいて初めて展開された。これらの３ｐ腫瘍サプレッサーの知見は、関連する癌を処置するための新しい治療剤の開発を可能にする。
【００３８】
アデノウイルスベクターは、インビトロおよびインビボでの最も効率的な遺伝子送達系であることが見出されている（Ａｄａｍｓら、１９９６、Ｆａｎｇら、１９９９）。組換えアデノウイルスベクターは、基本研究の遺伝子移入および臨床適用のために広範に使用されている（Ｒｏｔｈら、１９９８、Ｒｏｔｈ、１９９８、Ｃｈｅｎｇａｌｖａｌａら、１９９１）。しかし、アデノウイルスＤＮＡのインビトロ操作は、その大きいゲノムサイズおよび限定された固有かつ有用な制限部位（これらが、組換えアデノウイルスベクターの構築を、比較的時間のかかる労力を要するものにする）に起因して、非常に困難である。このような組換えアデノウイルスを構築するための以下の２つの従来の方法が、よく実証されている：インビトロ連結法（Ｂｅｒｋｎｅｒ，１９９８）およびインビボ相同組換え法（Ｂｅｔｔら、１９９４）。インビトロ連結法は、導入遺伝子をプラスミドベクターにサブクローニングして、ウイルスゲノムの左末端および哺乳動物遺伝子発現カセットを含むセグメントを構築する第１の工程からなり、次いで、組換えベクターが、ウイルスゲノムへのそのセグメントのインビトロ連結によって生成され、次いで、再構築された組換えウイルス分子を許容性の２９３細胞にトランスフェクトする。ＨｉｒｏｙｕｋｉおよびＫａｙは、インビトロ連結法を開示する（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉら、１９９８）。もう一方の方法は、重複するフラグメントを有する２つのプラスミドを使用して、２９３細胞における相同組換えによる相同組換えによって組換えウイルスを生成する。これらの方法についての主要な制限は、非組換えウイルスのバックグラウンドの生成、インビボ相同組換えの低い頻度、および純粋な組換えベクターを単離するための繰り返しのプラークスクリーニングである。２９３細胞において同時トランスフェクトされた２つのプラスミドの相同組換え（Ｂｅｔｔら、１９９４）、酵母細胞中の感染性酵母人工染色体（ＹＡＣ）におけるアデノウイルスゲノムの標的化された改変（Ｋｅｔｎｅｒら、１９９４）、コスミドパッケージング細菌におけるコスミドアデノウイルスベクター（Ｆｕら、１９９７）、およびｒｅｃＡ＋細菌株におけるプラスミド（Ｃｈａｒｔｉｅｒら、１９９６、Ｈｅら、１９９８）に基づく、組換えアデノウイルスベクターの構築のためのいくつかの代替手段が存在する。これらの方法は、より効率的であるが、より複雑であり、さらなる酵母宿主または特別な細菌株の使用を必要とし、これらの宿主における相同組換えの低い効率およびｒｅｃＡ＋細菌株によって保持されるプラスミド中の組換えアデノウイルスゲノムの不安定性に直面する。
【００３９】
比較すると、現在のＡｄ−ＲＡＰ系は、遺伝子治療のための組換えアデノウイルスベクターの構築について、非常に簡単であり、効率的であり、そして迅速である。これらの系は、通常の分子生物学的試薬および通常使用される細胞株を使用する、簡単なインビトロ連結を必要とする。得られた組換えアデノウイルスゲノム含有プラスミドは、容易にスクリーニングされ得、かつ安定である。その後の、許容性の２９３細胞への、リポソーム（ＤＯＴＡＰ）によって媒介される直線化した組換えアデノウイルスＤＮＡのトランスフェクションは、非常に効率的であり、そして組換えアデノウイルスの均質な集団が、迅速に生成され得る。
【００４０】
組換えアデノウイルスベクターＡｄ−３ｐを使用して、任意の他の利用可能な遺伝子送達系および遺伝子送達技術よりもはるかに高い効率で、インビトロおよびインビボによって３ｐ遺伝子を送達し得る。アデノウイルスベクターによって媒介される種々の細胞型における形質導入の高い効率および導入遺伝子の高レベルの発現に起因して、Ａｄ−３ｐベクターは、インビトロおよびインビボでこれらの腫瘍細胞サプレッサー遺伝子の生物学的機能および機構を研究するための効果的なツールとして使用され得る。Ａｄ−３ｐは、Ａｄ−３ｐベクターまたはプロタミン−Ａｄ−３ｐ複合体の静脈内注射または腫瘍内注射のいずれかによって、種々の腫瘍（肺、結腸、乳房、胃、子宮頸部、ならびに頭頸部、前立腺、および膵臓）における腫瘍形成能、腫瘍抑制、および転移プロセスの制限を限定するために使用され得る。
【００４１】
多くの場合、いくつかの遺伝子（例えば、Ｂａｋ、Ｂａｘ、ＦａｓＬ）の発現は、宿主２９３細胞に対して高度に毒性であり、これは、上記のいずれかの方法および手順による、このような遺伝子を保有する組換えアデノウイルスの構築および生成を極めて困難なものにし、そして時折、不可能なものにする。現在のＡｄ−ＲＡＰ−ＴｅｔＲ−Ｏｆｆ系は、このような組換えアデノウイルスベクターを首尾よく構築および生成するために使用され得る。アデノウイルスベクターにおける導入遺伝子の発現は、細胞培養培地へのテトラサイクリンの添加によって停止され得、宿主細胞に対する遺伝子の毒性効果は、回避され得、そして組換えアデノウイルスは、通常どおり、２９３細胞において生成される。いくつかの他の系（例えば、二成分アデノウイルスベクター系（Ｋａｇａｗａら、１９９９））が、このような組換えアデノウイルスベクターを首尾よく構築するために開発されている。しかし、一方のウイルスベクター中の導入遺伝子の発現が、もう一方のウイルスベクターのトランス活性化因子遺伝子の発現に依存し、つまり、２つのアデノウイルスベクターが、インビトロおよびインビボで導入遺伝子発現に必要とされ、これは、次いで、インビボでのこのような系の適用を制限してきた。比較すると、Ａｄ−ＴｅｔＲ−Ｏｆｆベクター系において、トランス活性化因子ＴｅｔＲ−Ｏｆｆ遺伝子およびＴｅｔＲ−Ｏｆｆ応答エレメント（ＴＲＥ）が、同じアデノウイルスベクターに共存し、そして従って、導入遺伝子の発現が、テトラサイクリンインデューサーの非存在下および存在下で１つのベクターにおいて開始または停止され得る。さらに、導入遺伝子は、ＴＲＥ調節プロモーターの制御下にあるので、導入遺伝子の発現のレベルは、インビトロおよびインビボでのテトラサイクリン投与によって効率的に調節される。まとめると、Ａｄ−ＲＡＰ−Ｔｅｔ−Ｏｆｆ系のこれらの新規な特徴は、この系を、細胞傷害性遺伝子を保持する組換えアデノウイルスベクターの迅速かつ首尾よい構築および生成のための有用な新しいツールにする。
【００４２】
３ｐ領域のヘテロ接合性欠失またはホモ接合性欠失のいずれかを含む肺癌細胞株への、リポソーム媒介またはアデノウイルス媒介の一過性のトランスフェクションによる、個々の野生型３ｐ２１．３遺伝子の導入は、ヌードマウスにおいて、腫瘍細胞増殖を制限し、アポトーシスを誘導し、そして細胞周期運動を改変し、腫瘍増殖および腫瘍進行を抑制した。種々のレベルの細胞増殖の阻害、アポトーシスの誘導、および細胞周期運動の改変が、Ａｄ−Ｆｕｓ１、Ａｄ１０１Ｆ６およびＡｄ−Ｇｅｎｅ２１形質導入ヒト肺癌細胞Ｈ１２９９、Ａ５４９およびＨ４６０（これらは、３ｐ遺伝子を欠失しているか、または異常な３ｐ遺伝子を有する）において観察された。しかし、Ａｄ−Ｆｕｓ１、Ａｄ１０１Ｆ６およびＡｄ−Ｇｅｎｅ２１形質導入正常ＨＢＥＣ細胞およびＨ３５８細胞（これらは、野生型３ｐ遺伝子を含む）においては、細胞増殖に対する有意な阻害効果は観察されなかった。従って、観察された細胞増殖阻害は、これらの遺伝子の通常の細胞傷害性に起因しなかった。これらのＡｄ−３ｐトランスフェクト体における３ｐ遺伝子の過剰発現は、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって確かめられた。腫瘍増殖は、ヌードマウスにおけるＨ１２９９およびＡ５４９異種移植片中のＡｄ−１０１Ｆ６、Ａｄ−Ｆｕｓ１およびＡｄ−Ｇｅｎｅ２１ベクターの腫瘍内注射を介する、１０１Ｆ６、Ｆｕｓ１およびＧｅｎｅ２１の過剰発現によって、有意に抑制された。さらに、肺転移性腫瘍増殖もまた、実験的Ａ５４９転移を保有するヌードマウスにおけるプロタミン−複合体化Ａｄ−１０１Ｆ６、Ａｄ−Ｆｕｓ１およびＡｄ−Ｇｅｎｅ２１の全身注射によって、有意に阻害された。まとめると、これらの結果は、複数の３ｐ遺伝子が、腫瘍サプレッサー遺伝子としてかまたは腫瘍サプレッサー領域として、インビトロおよびインビボで機能すること、およびこれらの新しく同定され特徴付けられた３ｐ腫瘍サプレッサー遺伝子またはこの３ｐ腫瘍サプレッサー領域が、リポソーム−３ｐ複合体、３ｐ遺伝子を含む組換えアデノウイルスベクター、および本発明において開発された局所的または全身的遺伝子送達系のような、分子ツールを使用して、癌遺伝子治療のために使用され得ることを示す。肺癌および他の癌における野生型３ｐ２１．３遺伝子およびそれらの変異形態の同定および機能的特徴付けは、肺癌および他の腫瘍のための治療の開発における重要な段階を提供する。
【００４３】
（Ａ．３ｐ２１．３の背景）
肺癌におけるホモ接合性欠失によって定義されるような、ＴＳＧのグループは、３ｐ２１．３において４５０ｋｂ領域中に位置付けられそして単離されている（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８、Ｍｉｎｎａら、１９９７、Ｈｕｎｇら、１９９５、Ｓｅｋｉｄｏら、１９９６、Ｗｉｓｔｕｂａら、１９９９）。肺癌新生物発生前の研究は、３ｐ２１対立遺伝子欠損が、これまでに検出された中で、肺癌において最も早期の遺伝子異常であることを示し、これは、過形成病変を生じる。１以上の３ｐ劣性癌遺伝子は、多くのヒトの癌（肺癌を含む）の分子性病因における「ゲートキーパー」として機能し、おそらく、全症例の５０％を超えて関与している（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８、Ｍｉｎｎａら、１９９７、Ｈｕｎｇら、１９９５、Ｓｅｋｉｄｏら、１９９６、Ｗｉｓｔｕｂａら、１９９９、Ｋｏｈｎｏら、１９９９、Ｗｉｓｔｕｂａら、１９９９）。
【００４４】
近年、ヒト染色体帯３ｐ２１．３が、いくつかのＳＣＬＣ株およびＮＳＣＬＣ株において重複するホモ接合性欠失を受けることが示された。ＴＳＧの候補は、いくつかのヒトの癌において、この重要な領域に位置付けられ、これは、さらにＴＳＧ領域を規定する（Ｓｅｋｉｄｏら、１９９８、Ｍｉｎｎａら、１９９７、Ｗｉｓｔｕｂａら、１９９９、Ｋｏｈｎｏら、１９９９、Ｗｉｓｔｕｂａら、１９９９、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、１９９７）。この３ｐ２１の重要な領域における遺伝子は、肺癌細胞、腎癌細胞および乳癌細胞におけるテロメラーゼ媒介性の細胞不死化経路の調節に関与する（Ｓｈａｙ、１９９７、Ｓｈａｙ、１９９８）。３ｐ欠失が、喫煙患者の肺腫瘍組織においてより頻繁に生じることも示されている。さらに、３ｐ２１．３での発癌物質ベンゾ［ａ］ピレンジオールエポキシドに対する感受性の上昇が、肺癌の危険性の増加に関連付けられ、これは、３ｐ２１．３が、肺癌における発癌物質の分子標的であり得ることを示唆する（Ｗｕら、１９９８）。
【００４５】
（Ｂ．３ｐ２１．３タンパク質）
Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、およびＳＥＭ  Ａ３分子全体に加えて、本発明はまた、これらのポリペプチドのフラグメントに関し、これらのフラグメントは、腫瘍抑制活性を維持してもしなくてもよい。各タンパク質の全長は、Ｆｕｓ１＝１６１アミノ酸、１０１Ｆ６＝２２２アミノ酸、Ｇｅｎｅ２１＝２０３アミノ酸、Ｇｅｎｅ２６＝１２０５アミノ酸、Ｂｅｔａ＊＝４４０アミノ酸、Ｌｕｃａ１＝４３５アミノ酸、Ｌｕｃａ２＝４７３アミノ酸、ＰＬ６＝３５１アミノ酸、１２３Ｆ２＝４３１アミノ酸、およびＳＥＭ  Ａ３＝７４９アミノ酸である。その分子のＮ末端を含むフラグメントは、コード領域内の翻訳終止部位の遺伝子操作によって生成され得る（以下に議論する）。あるいは、プロテアーゼとして公知のタンパク質分解酵素でのＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、およびＳＥＭ  Ａ３分子の処理は、種々のＮ末端フラグメント、Ｃ末端フラグメントおよび内部フラグメントを生成する。フラグメントの例としては、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上のアミノ酸長のＢｅｔａ＊配列の連続する残基が挙げられ得る。これらのフラグメントは、公知の方法（例えば、沈殿（例えば、硫酸アンモニウム）、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（免疫アフィニティークロマトグラフィーを含む）または種々のサイズ分離（沈降、ゲル電気泳動、ゲル濾過））に従って精製され得る。
【００４６】
（１．３ｐ．２１．３タンパク質の精製）
Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、およびＳＥＭ  Ａ３またはそれらの改変体を精製することが望ましくあり得る。タンパク質精製技術は、当業者に周知である。これらの技術は、１つのレベルでの、ポリペプチド画分および非ポリペプチド画分への細胞環境の粗分画を含む。他のタンパク質からポリペプチドを分離して、目的のポリペプチドは、部分精製または完全精製（または均質なまでの精製）を達成するために、クロマトグラフィー技術および電気泳動技術を使用してさらに精製され得る。純粋なペプチドの調製に特に適切な分析方法としては、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー；ドデシル硫酸ナトリウム／ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）；等電点電気泳動である。ペプチドを精製する特に有効な方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）またはＨＰＬＣである。
【００４７】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量するための種々の方法は、本開示を考慮して当業者に公知である。これらには、例えば、活性画分の比活性の決定、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析により画分内のポリペプチドの量の評価が挙げられる。
【００４８】
タンパク質精製における使用に適切な種々の技術が、当業者に周知である。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などを用いる沈殿、または熱変性とその後の遠心分離；クロマトグラフィー工程（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィー）；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにこのような技術および他の技術の組み合わせが挙げられる。当該分野で一般に知られるように、種々の精製工程を実施する順序が変更され得るか、または特定の工程が省略され得、そしてこれらは、実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製のための適切な方法をなお生じると考えられる。
【００４９】
ＳＤＳ／ＰＡＧＥの異なる条件によって、ポリペプチドの移動が（時には有意に）変動し得ることが公知である（Ｃａｐａｌｄｉら、１９７７）。従って、異なる電気泳動条件下では、精製または部分精製された発現産物の見かけの分子量が変動し得ることが理解される。
【００５０】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、並外れたピーク分解能を有する非常に迅速な分離によって特徴付けられる。これは、非常に微細な粒子および高い圧力の使用を使用して、十分な流速を維持することによって達成される。分離は、約数分またはせいぜい１時間で完了され得る。さらに、非常に少ない容量のサンプルのみが必要とされるだけである。なぜなら、ボイド容量がベッド容量の非常に少ない割合であるほどに、粒子は、非常に小さくかつ密集されているからである。また、サンプルの濃度は、低くあり得る。なぜなら、バンドは、サンプルの非常にわずかな希釈物が存在するほどに狭いからである。
【００５１】
ゲルクロマトグラフィーまたは分子篩クロマトグラフィーは、分子サイズに基づく特別のタイプの分配クロマトグラフィーである。ゲルクロマトグラフィーを支持する理論は、そのカラム（これは、小さな孔を含む不活性物質の小さな粒子で調製される）が、より小さな分子からより大きな分子を、それらが孔の中または周辺を通り抜ける際に、それらのサイズに依存して分離することである。粒子が作製される材料がこれらの分子を吸着しない限り、流れの速度を決定する唯一の因子は、そのサイズである。従って、形状が比較的一定である限り、分子は、減少サイズ様式でカラムから溶出される。ゲルクロマトグラフィーは、異なるサイズの分子を分離することについて卓越している。なぜなら、分離は、ｐＨ、イオン強度、温度などのような全ての他の因子に依存しないからである。また、実質的に吸着は存在せず、ゾーンの広がりも小さく、そして溶出容積は、単純に分子量に関連する。
【００５２】
アフィニティークロマトグラフィーは、単離されるべき物質とそれが特異的に結合し得る分子との間の特異的な親和性に依存するクロマトグラフィー手順である。これは、レセプター−リガンド型の相互作用である。カラム材料は、不溶性マトリクスに結合パートナーの１つを共有結合カップリングさせることにより合成される。次いで、カラム材料は、溶液から物質を特異的に吸着させ得る。溶出は、結合が生じない条件に、条件を変える（ｐＨ、イオン強度、温度などを変更する）ことによって生じる。
【００５３】
マトリクスは、それ自体で有意な程度で分子を吸着せず、かつ広範囲の化学的、物理的および熱安定性を有する物質であるべきである。そのリガンドは、その結合特性に影響しないようにカップリングされるべきである。そのリガンドはまた、比較的強固な結合を提供するべきである。サンプルまたはリガンドを破壊することなく物質を溶出することが可能であるべきである。アフィニティークロマトグラフィーの最も一般的な形態の１つは、免疫アフィニティークロマトグラフィーである。本発明に従う使用に適切な抗体の生成を、以下に議論する。
【００５４】
本発明はまた、本発明の種々の実施形態における使用のための、より小さいＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、およびＳＥＭ  Ａ３関連ペプチドを記載する。これらの比較的小さいサイズに起因して、本発明のペプチドは、従来の技術に従って、溶液中または固体支持体上で合成され得る。種々の自動合成機が、市販されており、公知のプロトコルに従って使用され得る。例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，（１９８４）；Ｔａｍら、（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、（１９８６）；ならびにＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７９）（これらの各々は、参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。本明細書中に記載の選択された領域に対応する、短いペプチド配列、または重複ペプチドのライブラリー（通常約６アミノ酸から約３５〜５０アミノ酸まで）は、容易に合成され得、次いで、反応性のペプチドを同定するために設計されたスクリーニングアッセイにおいてスクリーニングされ得る。あるいは、組換えＤＮＡ技術を使用し得る。ここでは、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列が、発現ベクターに挿入され、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、そして発現に適切な条件下で培養される。
【００５５】
本発明はまた、抗体の産生に関連する動物の免疫のための抗原としての、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、およびＳＥＭ  Ａ３のタンパク質またはペプチドの使用を提供する。生体特異的（ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ）または多価組成物あるいはワクチンが生成される。これらの組成物の調製において使用される方法は、当業者に知られており、そして動物への投与に適切（すなわち、薬学的に受容可能）であることが想定される。
【００５６】
（２．Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、およびＳＥＭ  Ａ３の改変体）
これらのポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、置換改変体、挿入改変体または欠失改変体であり得る。欠失変異体は、機能または免疫学的活性に必須でない、ネイティブタンパク質の１以上の残基を欠失する。別の一般的なタイプの欠失改変体は、分泌シグナル配列またはタンパク質が細胞の特定の部分に結合するのを指向するシグナル配列を欠失する欠失改変体である。挿入変異体は、代表的に、ポリペプチドの非末端点での物質の付加を包含する。これには、免疫反応性エピトープの挿入または単なる一残基の挿入が挙げられ得る。末端付加は、融合タンパク質と呼ばれる。
【００５７】
置換改変体は、代表的には、タンパク質内の１以上の部位でのあるアミノ酸の別のアミノ酸での交換を含み、そしてこれは、ポリペプチドの１以上の特性（例えば、タンパク質分解性切断に対する安定性）を、他の機能または特性の損失を伴うことなく調節するように設計され得る。この種の置換は、好ましくは、保存的であり、すなわち、あるアミノ酸が、類似の形状および電荷のアミノ酸と置換される。保存的置換は、当業者に周知であり、そしてこれらには、以下の変化が含まれる：アラニンからセリン；アルギニンからリジン；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジン；アスパラギン酸からグルタミン酸；システインからセリン；グルタミンからアスパラギン；グルタミン酸からアスパラギン酸；グリシンからプロリン；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミン；イソロイシンからロイシンまたはバリン；ロイシンからバリンまたはイソロイシン；リジンからアルギニン；メチオニンからロイシンまたはイソロイシン；フェニルアラニンからチロシン、ロイシンまたはメチオニン；セリンからスレオニン；スレオニンからセリン；トリプトファンからチロシン；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニン；およびバリンからイソロイシンまたはロイシン。
【００５８】
以下は、等価的またはさらには改善された第２世代の分子を作製するためのタンパク質のアミノ酸変化に基づく議論である。例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位のような構造との相互作用結合能力の顕著な損失を伴うことなく、特定のアミノ酸が、他のアミノ酸で置換され得る。タンパク質の生物学的機能を規定するのはタンパク質の相互作用性の能力および性質であるので、特定のアミノ酸の置換は、タンパク質配列およびその基本となるＤＮＡコード配列において作製され、そしてそれにも拘らず、同様の特性を有するタンパク質を獲得し得る。従って、以下に議論されるように、それらの生物学的有用性または活性の顕著な損失を伴うことなく、種々の変化が、遺伝子のＤＮＡ配列において作製され得ることが、本発明者よって意図される。表１は、特定のアミノ酸をコードするコドンを示す。
【００５９】
アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。種々の前述の特性を考慮する例示的置換は、当業者に周知であり、そしてこれらには、以下が挙げられる：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン。
【００６０】
（Ｃ．核酸）
Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、およびＳＥＭ  Ａ３は、４５０ｋｂの重要な領域における、３ｐ２１．３の染色体位置で見出される。これらは、３ｐ２１．３において以下の順序で見出される：Ｇｅｎｅ２６、ＰＬ６、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｂｅｔａ＊、１２３Ｆ２、Ｆｕｓ１、Ｌｕｃａ２、Ｌｕｃａ１、およびＳＥＭ  Ａ３。各々の長さは、Ｆｕｓ１＝１６９６核酸、１０１Ｆ６＝１１１７核酸、Ｇｅｎｅ２１＝１６９６核酸、Ｇｅｎｅ２６＝５４８２核酸、Ｂｅｔａ＊＝１７４６核酸、Ｌｕｃａ１＝２５６５核酸、Ｌｕｃａ２＝１７８３核酸、ＰＬ６＝１８６０核酸、１２３Ｆ２＝１５０２核酸、およびＳＥＭ  Ａ３＝２９１９核酸である（図５）。
【００６１】
さらに、本発明は本明細書中に開示される特定の核酸に限定されないことが明らかでであるはずである。以下に議論されるように、「Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３遺伝子」は、種々の異なる塩基を含み得、そしてなお、本明細書中に開示された遺伝子と機能的に識別不能な（いくつかの場合において構造的に識別不能な）対応するポリペプチドを生成する。
【００６２】
本発明に従う核酸は、本明細書中に開示される、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、およびＳＥＭ  Ａ３の遺伝子全体、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、およびＳＥＭ  Ａ３のドメイン、またはＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、およびＳＥＭ  Ａ３の配列の任意の他のフラグメントをコードし得る。核酸は、ゲノムＤＮＡに由来し得る（すなわち、特定の生物のゲノムから直接的にクローニングされ得る）。しかし、他の実施形態において、この核酸は、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含む。
【００６３】
用語「ｃＤＮＡ」は、テンプレートとしてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を使用して調製されるＤＮＡをいうことが意図される。ゲノムＤＮＡあるいはゲノムのテンプレート、プロセシングされていないＲＮＡテンプレート、または部分的にプロセシングされたＲＮＡテンプレートから重合されるＤＮＡに対して、ｃＤＮＡを使用する利点は、ｃＤＮＡは、対応するタンパク質のコード配列を主に含むということである。非コード領域が最適な発現に必要とされる場合、またはイントロンのような非コード領域がアンチセンス手法で標的化される場合のように、全長ゲノム配列または部分ゲノム配列が好ましい場合はあり得る。
【００６４】
所定の種由来の所定のＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３が、わずかに異なる核酸配列を有するが、それでもなお同じタンパク質をコードする天然の改変体（表１）によって表され得ることがまた意図される。
【００６５】
本願において使用される場合、用語「配列番号１の核酸配列を有するポリヌクレオチド」は、全ての細胞性核酸を含まない単離された核酸分子をいう。機能的に等価なコドンは、同じアミノ酸をコードするコドン（例えば、アルギニンまたはセリンについての６つのコドン（表１））であり、そして生物学的に等価なアミノ酸をコードするコドンもまたいう。
【００６６】
【表１】
0004813746.tif 000002
本発明のＤＮＡセグメントは、上記のように、生物学的に機能的に等価なＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、およびＳＥＭ  Ａ３のタンパク質およびペプチドをコードするものを含む。このような配列は、核酸配列およびそれによりコードされるタンパク質内に天然に存在することが公知である、コドン縮重およびアミノ酸の機能的等価性の結果として生じ得る。あるいは、機能的に等価なタンパク質またはペプチドは、組換えＤＮＡ技術の適用を介して作製され得、ここで、タンパク質構造における変化は、交換されるアミノ酸の特性の考慮に基づいて、操作され得る。ヒトによって設計された変化は、以下に記載のように、部位指向型変異誘発技術の適用を介して導入され得るか、またはランダムに導入されそして所望の機能について後にスクリーニングされ得る。
【００６７】
（Ｄ．ハイブリダイゼーション）
当然、本発明はまた、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、およびＳＥＭ  Ａ３をコードする配列に相補的であるかまたは本質的に相補的であるＤＮＡセグメントを包含する。「相補的」である核酸配列は、標準的なワトソン−クリック相補性規則に従って塩基対形成し得る核酸配列である。本明細書中で使用される場合、用語「相補的（な）」は、上に示されるヌクレオチド比較によって評価され得るように規定されるような、または本明細書中に記載されるような比較的にストリンジェントな条件下で上述の核酸セグメントにハイブリダイズし得るような、実質的に相補的である核酸配列を意味する。このような配列は、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、およびＳＥＭ  Ａ３のタンパク質全体、またはそれらの機能的もしくは非機能的なフラグメントをコードし得る。
【００６８】
あるいは、ハイブリダイズするセグメントは、より短いオリゴヌクレオチドであり得る。１７塩基長の配列は、ヒトゲノム中に一度のみ生じるはずであり、従って、固有の標的配列を特定するのに十分である。より短いオリゴマーがインビボでの接近性を作製および増加するのにより容易であるが、多数の他の要因が、ハイブリダイゼーションの特異性を決定することに関与している。オリゴヌクレオチドのその相補的な標的に対する結合親和性および配列特異性の両方は、長さの増加と共に増加する。他のオリゴヌクレオチドも意図されるが、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれより大きい塩基対の例示的なオリゴヌクレオチドが使用されることが意図される。２５０、５００、または１０００塩基およびそれより大きいものをコードするより長いポリヌクレオチドも同様に意図される。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、サザンブロットおよびノーザンブロット、インサイチュ組織ハイブリダイゼーションにおけるプローブとして、そして増幅反応におけるプライマーとしての用途が見出される。
【００６９】
従って、本発明のヌクレオチド配列は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの相補的なストレッチと二重鎖分子を選択的に形成するこれらの能力について、またはサンプル由来のＤＮＡまたはＲＮＡの増幅のためのプライマーを提供するために、使用され得る。想定される適用に依存して、標的配列についてのプローブまたはプライマーの種々の程度の選択性を達成するために、種々のハイブリダイゼーション条件を使用することが所望される。
【００７０】
特定の適用（例えば、部位指向型変異誘発によるアミノ酸の置換）において、より低いストリンジェンシー条件が必要とされることが理解される。これらの条件下で、プローブおよび標的鎖の配列が完全に相補的でなくても、ハイブリダイゼーションは生じ得るが、１つ以上の位置において不一致である。条件は、塩濃度を増加させそして温度を低下させることによって、よりストリンジェントでない条件となり得る。例えば、培地ストリンジェンシー条件は、約３７℃〜約５５℃の温度で約０．１〜０．２５Ｍ  ＮａＣｌによって提供され得るが、低ストリンジェンシー条件は、約２０℃〜約５５℃の範囲の温度で約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍ  塩によって提供され得る。従って、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作され得、従って、一般的に所望の結果に依存して選択される方法である。
【００７１】
他の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、例えば、約２０℃〜約３７℃の間の温度で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ジチオスレイトールの条件下で達成され得る。利用される他のハイブリダイゼーション条件は、約４０℃〜約７２℃の範囲の温度で、約１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含み得る。ホルムアミドおよびＳＤＳはまた、ハイブリダイゼーション条件を変更するために使用され得る。
【００７２】
（Ｅ．プライマーおよびプローブ）
本明細書中で定義される場合、用語プライマーは、テンプレート依存性のプロセスにおいて新生核酸の合成を開始し得る任意の核酸を包含することを意味する。代表的に、プライマーは、１０〜２０塩基対長のオリゴヌクレオチドであるが、より長い配列が使用され得る。プライマーは、二本鎖形態または一本鎖形態で提供され得るが、一本鎖形態が好ましい。プローブは異なって定義されるが、これらはプライマーとして作用し得る。プローブは（おそらくプライミングし得る間に）、標的ＤＮＡまたはＲＮＡに結合するように設計され、そして増幅プロセスにおいて使用される必要はない。
【００７３】
他の実施形態において、プローブまたはプライマーは、放射性種（３２Ｐ、１４Ｃ、３５Ｓ、３Ｈ、または他の標識）、発蛍光団（ローダミン、フルオレセイン）または化学発光（ルシフェラーゼ）で標識される。
【００７４】
本発明のプローブおよびプライマーを使用する１つの方法は、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、およびＳＥＭ  Ａ３に関連する遺伝子、またはより詳細には、他の種由来のＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、およびＳＥＭ  Ａ３のオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）についての検索における方法である。通常、標的ＤＮＡは、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーであるが、スクリーニングは、ＲＮＡ分子の分析を含み得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー、およびプローブの領域を変化させることによって、種々の程度の相同性が発見され得る。
【００７５】
特定の実施形態において、ハイブリダイゼーションを決定するための適切な手段（例えば、標識）と組み合わせて、本発明の規定の配列の核酸を使用することは、有利である。蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素学的リガンドまたは他のリガンド（例えば、アビジン／ビオチン）（これらは、検出され得る）を含む、広範な種々の適切な指示手段が、当該分野で公知である。他の実施形態において、放射性試薬または他の環境的に望ましくない試薬の代わりに、蛍光標識、またはウレアーゼ、アルカリホスファターゼもしくはペルオキシダーゼのような酵素タグを使用することが所望であり得る。酵素タグの場合、相補的な核酸を含有するサンプルとの特異的なハイブリダイゼーションを同定するための、可視検出可能であるかまたは分光光度的に検出可能である検出手段を提供するために使用され得る比色指示基質が、公知である。
【００７６】
本発明のプローブおよびプライマーを活用する別の方法は、部位指向型変異誘発または部位特異的変異誘発における方法である。部位特異的変異誘発は、基礎をなすＤＮＡの特異的変異誘発を介する、個々のペプチド、または生物学的に機能的な等価なタンパク質もしくはペプチドの調製において有用な技術である。この技術はさらに、１つ以上のヌクレオチド配列変化をＤＮＡに導入することによって、前述の１つ以上の考慮を組み込んで、配列改変体を迅速に調製および試験する能力を提供する。部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用を介する変異体の生成を可能にし、妨害されている欠失結合部の両側で安定な二重鎖を形成するのに十分なサイズかつ十分な配列複雑性のプライマー配列を提供する。代表的に、配列の結合部の両側の約５〜１０残基が変更された、約１７〜２５ヌクレオチド長のプライマーが好ましい。
【００７７】
一般に、本明細書中で記載されるプローブまたはプライマーは、溶液ハイブリダイゼーションにおいて、ＰＣＲＴＭにおいて、対応する遺伝子の発現の検出のために、ならびに固相を使用する実施形態において、試薬として有用であることが想定される。代表的な固相ハイブリダイゼーション方法は、米国特許第５，８４３，６６３号、同第５，９００，４８１号、および同第５，９１９，６２６号において開示されている。本発明の実施において使用され得るハイブリダイゼーションの他の方法は、米国特許第５，８４９，４８１号、同第５，８４９，４８６号、および同第５，８５１，７７２号において開示されている。明細書中の本節において同定されるこれらおよび他の参考文献の関連部分は、参考として本明細書中に援用される。
【００７８】
（Ｆ．テンプレート依存性増幅方法）
多数のテンプレート依存性プロセスが、所定のテンプレートサンプル中に存在するマーカー配列を増幅するために利用可能である。最も知られた増幅方法の１つは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号、ならびにＩｎｎｉｓら、１９９０（これらの各々は、その全体が参考として本明細書中に援用される）において詳細に記載される、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＣＲＴＭと称される）である。他の増幅方法は、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑｂｅｔａレプリカーゼ、等温増幅、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、捕捉部分または検出部分を有するプライマーを使用するＰＣＲＴＭ様テンプレート依存性合成ならびにＰＣＲＴＭ様酵素依存性合成、転写ベースの増幅システム（ＴＡＳ）、一本鎖および二本鎖ＤＮＡの循環的（ｃｙｌｉｃａｌ）合成、「ＲＡＣＥ」、片側ＰＣＲＴＭ、ならびに２オリゴヌクレオチド増幅である。
【００７９】
手短に言うと、ＰＣＲＴＭにおいて、マーカー配列の反対側の相補鎖上の領域に相補的である２つのプライマー配列が調製される。過剰のデオキシヌクレオシドトリホスフェートが、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）と共に反応混合物に添加される。マーカー配列がサンプル中に存在する場合、プライマーはマーカーに結合し、そしてポリメラーゼは、ヌクレオチドの付加によって、プライマーをマーカー配列に沿って伸長させる。反応混合物の温度を上昇および低下させることによって、伸長したプライマーは、マーカーから解離して反応産物を形成し、過剰のプライマーは、マーカーおよび反応産物に結合し、そしてプロセスが繰り返される。
【００８０】
逆転写酵素ＰＣＲＴＭ増幅手順は、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために行なわれ得る。ＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写する方法は周知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９において記載される。逆転写のための代替的な方法は、耐熱性のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを利用する。これらの方法は、１９９０年１２月２１に出願されたＷＯ９０／０７６４１において記載される。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は、当該分野で周知である。
【００８１】
（Ｇ．ベクター）
用語「ベクター」は、核酸配列が細胞（ここで、核酸配列が複製され得る）への導入のために挿入され得る、キャリア核酸分子をいうために使用される。核酸配列は、「外因性」であり得、これは、核酸配列が、ベクターが導入される細胞に対して外来であること、またはこの配列が細胞中の配列に対して相同であるが、この配列が通常見出されない宿主細胞の核酸中の位置に存在することを意味する。ベクターとしては、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、および植物ウイルス）、および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）が挙げられる。当業者は、標準的な組換え技術を介してベクターを構築するように十分に備えており、これらの技術は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８８およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９９４（両方とも参考として本明細書中に援用される）において記載される。
【００８２】
用語「発現カセット」は、転写され得る遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする核酸配列を含むベクターをいう。いくつかの場合において、ＲＮＡ分子は、次いで、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに翻訳される。他の場合において、これらの配列は、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの生成の際に、翻訳されない。発現ベクターは、種々の「制御配列」を含み得、これは、特定の宿主生物における作動可能に連結したコード配列の転写およびおそらく翻訳に必要な核酸配列をいう。転写および翻訳を管理する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能も同様に果たす核酸配列を含み得、そして以下に記載される。
【００８３】
（Ｈ．プロモーターおよびエンハンサー）
「プロモーター」は、転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。これは、調節タンパク質および分子が、例えば、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子に結合し得る遺伝子エレメントを含み得る。成句「作動可能に位置する」、「作動可能に連結した」、「制御下」、および「転写制御下」は、プロモーターが、核酸配列に関して、その配列の転写開始および／または発現を制御するために、正確な機能的位置および／または配向であることを意味する。プロモーターは、「エンハンサー」と組み合わせて使用されてもよいし使用されなくてもよく、エンハンサーは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列をいう。
【００８４】
プロモーターは、コードセグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって獲得され得るように、遺伝子または配列に天然に関連するものであり得る。このようなプロモーターは、「内因性」として称され得る。同様に、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する核酸配列と天然に関連し得るものであり得る。あるいは、特定の利点は、組換えプロモーターまたは異種プロモーター（これらは、その天然の環境において核酸配列と通常関連しないプロモーターをいう）の制御下にコード核酸セグメントを位置付けることによって得られる。組換えエンハンサーまたは異種エンハンサーはまた、その天然の環境において核酸配列と通常関連しないエンハンサーをいう。このようなプロモーターまたはエンハンサーとしては、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、および任意の他の原核生物細胞、ウイルス細胞、または真核生物細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に存在」しないプロモーターまたはエンハンサー（すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメントおよび／または発現を変更する変異を含む）が挙げられ得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列合成的に生成することに加えて、配列は、本明細書中に開示される組成物と組み合わせて、ＰＣＲＴＭを含む、組換えクローニング技術および／または核酸増幅技術を使用して生成され得る（米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号（各々が参考として本明細書中に援用される）を参照のこと）。このようなプロモーターは、レポーター遺伝子としての使用のためにβ−ガラクトシダーゼ発現を駆動するために使用され得る。さらに、ミトコンドリア、クロロプラストなどのような非核細胞小器官中で配列の転写および／または発現を指向する制御配列もまた同様に使用され得ることが意図される。
【００８５】
もちろん、発現のために選択された細胞型、細胞小器官、および生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効率的に指向するプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用することが重要である。分子生物学の当業者は、一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、および細胞型の組み合わせの使用を知っている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）（参考として本明細書中に援用される）を参照のこと）。使用されるプロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、そして／または導入されたＤＮＡセグメントの高レベルの発現を指向する適切な条件下で有用であり得る（組換えタンパク質および／またはペプチドの大規模生成における利点のような）。プロモーターは、異種であってもよいし内因性であってもよい。
【００８６】
表２は、遺伝子の発現を調節するために、本発明の文脈中で使用され得るいくつかのエレメント／プロモーターを列挙する。この列挙は、発現の促進に関与する全てのあり得るエレメントを網羅することを意図するのではなく、単にそれらの例示的な列挙である。表３は、誘導性エレメントの例を提供し、これらは、特定の刺激に応答して活性化され得る核酸配列の領域である。
【００８７】
【表２】
0004813746.tif 000003
0004813746.tif 000004
0004813746.tif 000005
【００８８】
【表３】
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組織特異的プロモーターまたは組織特異的エレメントの同定、ならびにこれらの活性を特徴付けるアッセイは、当業者に周知である。このような領域の例としては、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子（Ｎｏｍｏｔｏら、１９９９）、ソマトスタチンレセプター２遺伝子（Ｋｒａｕｓら、１９９８）、マウス精巣上体レチノイン酸結合遺伝子（Ｌａｒｅｙｒｅら、１９９９）、ヒトＣＤ４（Ｚｈａｏ−Ｅｍｏｎｅｔら、１９９８）、マウスα２（ＸＩ）コラーゲン（Ｔｓｕｍａｋｉら、１９９８）、Ｄ１Ａドーパミンレセプター遺伝子（Ｌｅｅら、１９９７）、インスリン様増殖因子ＩＩ（Ｗｕら、１９９７）、ヒト血小板内皮細胞接着分子−１（Ａｌｍｅｎｄｒｏら、１９９６）が挙げられる。
【００８９】
（Ｉ．開始シグナル）
特定の開始シグナルはまた、コード配列の効率的な翻訳のために必要とされ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接する配列を含む。外因性の翻訳制御シグナル（ＡＴＧ開始コドンを含む）が、さらに提供される必要があり得る。当業者は、容易にこのことを決定し得、そして必要なシグナルを提供し得る。開始コドンは、完全な挿入物の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームと「インフレーム」でなければならないことが周知である。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成のいずれかであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントを含むことによって高められ得る。
【００９０】
（Ｊ．スプライシング部位）
ほとんどの転写された真核生物ＲＮＡ分子は、第１の転写物からイントロンを除去するためにＲＮＡスプライシングを起こす。ゲノムの真核生物配列を含むベクターは、タンパク質発現のための転写物の適切なプロセシングを確実にするための、ドナースプライシング部位および／またはアクセプタースプライシング部位を必要とし得る。（Ｃｈａｎｄｌｅｒら、１９９７（参考として本明細書中に援用される）を参照のこと。）
（Ｋ．ポリアデニル化シグナル）
発現において、転写物の適切なポリアデニル化を行なうためのポリアデニル化シグナルが代表的に含まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の首尾良い実施に重要はないと考えられ、そして／または任意のこのような配列が使用され得る。特定の実施形態は、簡便でありそして／もしくは種々の標的細胞において十分に機能することが公知のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよび／またはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。転写終止部位もまた、発現カセットのエレメントとして意図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強するように、そして／またはカセットから他の配列への読み過ごし（ｒｅａｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ）を最小にするように機能し得る。
【００９１】
（Ｌ．複製の起点）
宿主細胞においてベクターを増殖するために、ベクターは、複製部位の１つ以上の起点（しばしば「ｏｒｉ」と称される）を含み得、これは、複製が開始される特定の核酸配列である。あるいは、宿主細胞が酵母である場合、自律的複製配列（ＡＲＳ）が使用され得る。
【００９２】
（Ｍ．検出マーカーおよびスクリーニングマーカー）
本発明の特定の実施形態において、細胞は、本発明の核酸構築物を含み、細胞は、発現ベクター中にマーカーを含むことによって、インビトロまたはインビボで同定され得る。このようなマーカーは、細胞に同定可能な変化を付与し、発現ベクターを含む細胞の簡単な同定を可能にする。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するマーカーである。陽性選択マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするマーカーであるが、陰性選択マーカーは、その存在がその選択を止めさせるマーカーである。陽性選択マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。選択マーカーおよびスクリーニングマーカーの例は、当業者に周知である。
【００９３】
（Ｎ．宿主細胞）
異種核酸配列を発現させる状況において、「宿主細胞」は、原核生物細胞または真核生物細胞をいい、そしてこれは、ベクターを複製し得るそして／またはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現し得る任意の形質転換可能な生物を含む。宿主細胞は、ベクターのレシピエントとして使用され得、そしてそのように使用されてきた。宿主細胞は、「トランスフェクト」されてもよいし「形質転換」されてもよく、これは、異種核酸が宿主細胞に移入されるかまたは導入されるプロセスをいう。形質転換された細胞は、最初の被験体細胞およびその子孫を含む。
【００９４】
宿主細胞は、所望の結果が、ベクターの複製であるかまたはベクターにコードされた核酸配列の一部または全ての発現であるかに依存して、原核生物細胞または真核生物細胞から誘導され得る。多数の細胞株および培養物が、宿主細胞としての使用のために利用可能であり、そしてこれらは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（これは、生きている培養物および遺伝物質についての保管所として機能する組織である（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ））から獲得され得る。適切な宿主は、ベクター骨格および所望の結果に基づいて、当業者によって決定され得る。例えば、プラスミドまたはコスミドは、多数のベクターの複製のための原核生物宿主細胞に導入され得る。ベクターの複製および／または発現のための宿主細胞として使用される細菌細胞としては、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、およびＫＣ８、ならびにＳＵＲＥ（登録商標）コンピテント細胞およびＳＯＬＯＰＡＣＫＴＭＧｏｌｄ細胞（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標），Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）のような多数の市販の細菌宿主が挙げられる。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２のような細菌細胞は、ファージウイルスのための宿主細胞として使用され得る。
【００９５】
ベクターの複製および／または発現のための真核生物宿主細胞の例としては、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、Ｃｏｓ、ＣＨＯ、Ｓａｏｓ、およびＰＣ１２が挙げられる。種々の細胞型および生物由来の多数の宿主細胞が利用可能であり、そして当業者に公知である。同様に、ウイルスベクターは、真核生物宿主細胞または原核生物宿主細胞（特に、ベクターの複製または発現に許容的な宿主細胞）のいずれかと組み合わせて使用され得る。
【００９６】
いくつかのベクターは、原核生物細胞および真核生物細胞の両方において複製および／または発現されるのを可能にする制御配列を使用し得る。当業者はさらに、上記宿主細胞全てを維持しそしてベクターの複製を可能にするためにこれらをインキュベートする条件を理解する。ベクターの大規模生成、ならびにベクターによってコードされた核酸およびこれらの同族のポリペプチド、タンパク質、またはペプチドの生成を可能にする技術および条件もまた、理解されそして公知である。
【００９７】
（Ｏ．発現系）
上で議論された組成物の少なくとも一部または全てを含む多数の系が存在する。原核生物および／または真核生物に基づく系が、核酸配列、またはこれらの同族のポリペプチド、タンパク質およびペプチドを生成するために、本発明を用いる使用のために利用され得る。多数のこのような系が、市販されておりそして広範に利用可能である。
【００９８】
昆虫細胞系／バキュロウイルス系は、米国特許第５，８７１，９８６号、同第４，８７９，２３６号（共に参考として本明細書中に援用される）において記載されるように、異種核酸セグメントの高レベルのタンパク質発現を生成し得、そしてこれらは、例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）からのＭＡＸＢＡＣ（登録商標）２．０およびＣＬＯＮＴＥＣＨ（登録商標）からのＢＡＣＰＡＣＫＴＭバキュロウイルス発現系の名称で購入され得る。
【００９９】
発現系の他の例としては、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（登録商標）のＣＯＭＰＬＥＴＥ  ＣＯＮＴＲＯＬＴＭ誘導性哺乳動物発現系（これは、合成エクジソン誘導性レセプターを含む）、またはそのｐＥＴ発現系（Ｅ．ｃｏｌｉ発現系）が挙げられる。誘導性発現系の別の例は、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）から入手可能であり、これは、Ｔ−ＲＥＸＴＭ（テトラサイクリン調節発現）系（全長ＣＭＶプロモーターを使用する誘導性哺乳動物発現系）を保有する。ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）はまた、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ発現系（これは、メチロトローフの酵母Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａにおける組換えタンパク質の高レベル生成のために設計される）と呼ばれる酵母発現系を提供する。当業者は、核酸配列またはその同族のポリペプチド、タンパク質またはペプチドを生成するための、ベクター（例えば、発現構築物）を発現する方法を知っている。
【０１００】
（Ｐ．発現ベクターの送達）
発現ベクターを細胞に導入し得る多くの方法が存在する。本発明の特定の実施形態において、この発現構築物は、ウイルスまたはウイルスゲノム由来の操作された構築物を含む。特定のウイルスが、レセプター媒介エンドサイトーシスを介して細胞に進入して、宿主細胞ゲノムに入りそしてウイルス遺伝子を安定かつ効率的に発現する能力によって、それらのウイルスは、外来遺伝子を哺乳動物細胞に移入するための魅力的な候補物となる（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６：Ｔｅｍｉｎ，１９８６）。遺伝子ベクターとして用いた最初のウイルスは、パポーバウイルス（シミアンウイルス４０、ウシ乳頭しゅウイルス、およびポリオーマ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６）、およびアデノウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６）を含めたＤＮＡウイルスであった。これらは、外来ＤＮＡ配列については比較的低い能力を有し、そして限定された宿主スペクトルを有する。さらに、許容性細胞におけるその腫瘍形成性能力および細胞変性効果によって安全性の懸念が生じる。それらのウイルスは、外来の遺伝物質を８ｋｂまでしか受け入れられないが、種々の細胞株および実験動物に容易に導入され得る（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６）。
【０１０１】
インビボ送達のための方法の１つとして、アデノウイルス発現ベクターの使用が挙げられる。「アデノウイルス発現ベクター」とは、（ａ）構築物のパッケージングを支持するため、そして（ｂ）そのなかにクローニングされているアンチセンスポリヌクレオチドを発現するために十分なアデノウイルス配列を含む構築物を包含することを意味する。この文脈では、発現には遺伝子産物が合成されることを必要としない。
【０１０２】
（１．アデノウイルス発現ベクター）
この発現ベクターは、遺伝子操作型のアデノウイルスを含む。アデノウイルス（３６ｋｂ、直線状、二本鎖ＤＮＡウイルス）の遺伝的組織の知識によれば、アデノウイルスＤＮＡの大きい断片の、７ｋｂまでの外来配列による置換が可能である（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ，１９９２）。レトロウイルスと対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体組み換えを生じない。なぜならアデノウイルスＤＮＡは、潜在的な遺伝毒性なしにエピソーム様式で複製し得るからである。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、そしてゲノム再配列は大規模な増幅後に検出されていない。アデノウイルスは、細胞周期段階にかかわらず、実質的に全ての上皮細胞に感染し得る。
【０１０３】
１つの系（システム）では、組み換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同組み換えから生成される。２つのプロウイルスベクターの間の可能性のある組み換えに起因して、野生型アデノウイルスは、このプロセスから生成され得る。従って、個々のプラークから単一クローンのウイルスを単離し、そしてそのゲノム構造を試験することが重要である。
【０１０４】
現在のアデノウイルスベクター（複製欠損である）の生成および増殖は、特有のヘルパー細胞株（２９３と名付けられた）に依存する。この細胞株は、Ａｄ５  ＤＮＡフラグメントによってヒト胚性腎細胞からトランスフォームされ、そしてＥ１タンパク質を構成的に発現する（Ｇｒａｈａｍら、１９７７）。
【０１０５】
ヘルパー細胞株は、ヒト胚性腎細胞、筋細胞、造血細胞、または他のヒト胚性間葉細胞または上皮細胞のようなヒト細胞に由来し得る。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスを許容する他の哺乳動物種の細胞に由来し得る。このような細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞または他のサル胚性間葉細胞または上皮細胞が挙げられる。上記のように、好ましいヘルパー細胞株は２９３である。
【０１０６】
アデノウイルスベクターが複製欠損であるか、または少なくとも条件付で欠損であるという要件以外、アデノウイルスベクターの性質は、本発明の首尾よい実施のために重要であるとは考えられない。このアデノウイルスは、４２の異なる既知の血清型またはサブグループＡ〜Ｆのいずれかであり得る。サブグループＣの５型アデノウイルスは、本発明の使用のための条件付き複製欠損アデノウイルスベクターを得るための好ましい出発物質である。この理由は５型アデノウイルスがヒトアデノウイルスであり、それについて多量の生化学的情報および遺伝子情報が既知であるからであり、そしてこれはベクターとしてアデノウイルスを使用するほとんどの構築物について伝統的に用いられてきた。
【０１０７】
アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現研究（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）およびワクチン開発（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ，１９９２；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ，１９９１）において使用されてきた。最近、動物研究によって、組換えアデノウイルスが遺伝子治療に使用され得ることが示唆された（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０；Ｒｉｃｈら、１９９３）。異なる組織への組換えアデノウイルスの投与における研究としては、以下が挙げられる：気管点滴注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３）、末梢静脈注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ，１９９３）、および脳への定位的な接種（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅら、１９９３）。
【０１０８】
（２．レトロウイルス発現ベクター）
レトロウイルスは、逆転写プロセスによって感染細胞においてそれらのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する能力で特徴付けられる、一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。次いで、生じたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞の染色体に安定に組込まれ、そしてウイルスタンパク質の合成を指向する。この組み込みは、レシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列の保持を生じる。このレトロウイルスゲノムは、３つの遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）を含有し、これらはそれぞれ、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をコードする。ｇａｇ遺伝子の上流に見出される配列は、ビリオンへのゲノムのパッケージングについてのシグナルを含む。２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列が、このウイルスゲノムの５’末端および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、そしてまた、宿主細胞ゲノムにおける組み込みに必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。
【０１０９】
レトロウイルスベクターを構築するために、目的の遺伝子をコードする核酸が、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入されて、複製欠損であるウイルスを産生する。ビリオンを産生するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら、１９８３）。ｃＤＮＡを含む組換えプラスミドが、レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と共に（例えば、リン酸カルシウム沈降により）この細胞株に導入される場合、このパッケージング配列は、この組換えプラスミドのＲＮＡ転写物がウイルス粒子にパッケージングされるのを可能にし、次いでこのウイルス粒子が培養培地中に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔａｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎら、１９８３）。次いで、この組換えレトロウイルスを含む培地は、回収され、必要に応じて濃縮され、そして遺伝子移入に使用される。レトロウイルスベクターは、広範な種々の細胞型に感染し得る。しかし、組み込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５）。
【０１１０】
（３．他のウイルスベクター）
他のウイルスベクターが、本発明における発現構築物として使用され得る。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｃｏｕｐａｒら，１９８８）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｓｋａ，１９８４）およびヘルペスウイルスのようなウイルス由来のベクターが使用され得る。これらは、種々の哺乳動物細胞についていくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｃｏｕｐａｒら，１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら，１９９０）。
【０１１１】
センスまたはアンチセンスの遺伝子構築物の発現をもたらすため、この発現構築物を細胞に送達しなければならない。この送達は、細胞株を形質転換（トランスフォーム）するための実験手順においてのように、インビトロで、または特定の疾患状態の処置においてのようにインビボもしくはエキソビボで達成され得る。送達の１つの機構は、ウイルス感染を介しており、ここで発現構築物は、感染性ウイルス粒子にキャプシド形成される。
【０１１２】
（４．発現構築物の移入のための非ウイルス方法）
培養された哺乳動物細胞への発現構築物の移入のためのいくつかの非ウイルス方法がまた本発明によって意図される。これらとしては、リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ、１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｇｏｐａｌ、１９８５）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）、直接マイクロインジェンクション（ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５）、ＤＮＡ充填化リポソーム（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９）およびリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞超音波処理（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）、高速微粒子銃を使用する遺伝子ボンバードメント（Ｙａｎｇら、１９９０）、およびレセプター媒介トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ、１９８７；ＷｕおよびＷｕ、１９８８）が挙げられる。これらの技術のいくつかは、インビボまたはエキソビボでの使用に首尾よく適用され得る。
【０１１３】
一旦、発現構築物が細胞に送達されれば、目的の遺伝子をコードする核酸は、異なる部位に配置されそして発現され得る。特定の実施形態において、この遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組み込まれ得る。この組み込みは、相同組み換え（遺伝子置換）を介した同系の位置および方向であり得るか、または無作為の非特異的位置に組み込まれ得る（遺伝子増大）。なおさらなる実施形態において、核酸は、ＤＮＡの別々のエピソームセグメントとして細胞中に安定に維持され得る。このような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞の周期と独立してまたは同調して維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物がどのように細胞に送達されるか、そしてこの核酸が細胞のどこに保持されるかは、使用される発現構築物のタイプに依存する。
【０１１４】
本発明のなお別の実施形態において、その発現構築物は、単に、裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドからなり得る。その構築物の移入は、細胞膜を物理的または化学的に透過性にする上記の任意の方法によって行われ得る。これは、特に、インビトロでの移入に適用可能であるが、インビボでの使用にも適用され得る。Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９８４）は、リン酸カルシウム沈降物の形態で、成体および新生仔マウスの肝臓および脾臓へとポリオーマウイルスＤＮＡを首尾良く注入し、活性なウイルス複製および急性の感染を実証した。ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＮｅｓｈｉｆ（１９８６）はまた、リン酸カルシウム沈降したプラスミドの直接腹腔内注入が、トランスフェクトした遺伝子の発現をもたらしたことを実証した。これによって、目的の遺伝子をコードするＤＮＡがまた、インビボで同様の様式で移入されて遺伝子産物を発現し得ることが予想される。
【０１１５】
なお別の実施形態において、裸のＤＮＡ発現構築物の細胞への移入は、微粒子銃（ボンバードメント）を含み得る。この方法は、ＤＮＡで被覆された微量子銃（マイクロプロジェクタイル）を高速に加速する能力に依存し、それらが細胞を死滅させずに細胞膜を貫通し、そして細胞に侵入することを可能にする（Ｋｌｅｉｎら、１９８７）。小粒子を加速するためのいくつかのデバイスが開発されている。１つのこのようなデバイスは、電流を生成するための高電圧放電に依存し、これは、次いで推進力を提供する（Ｙａｎｇら、１９９０）。使用される微粒子銃は、タングステンまたは金ビーズのような生物学的に不活性な物質からなっている。
【０１１６】
ラットおよびマウスの肝臓、皮膚、および筋肉組織を含む選択された器官は、インビボでボンバードされている（Ｙａｎｇら、１９９０；Ｚｅｌｅｎｉｎら、１９９１）。銃と標的器官との間のなんらかの介在組織を排除するため（すなわち、エキソビボ処置）、この方法には、組織または細胞の外科的曝露を必要とし得る。再度、特定の遺伝子をコードするＤＮＡは、この方法を介して送達され得、そして本発明によってなお組み込まれ得る。
【０１１７】
本発明のさらなる実施形態において、その発現構築物は、リポソームに捕捉され得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒体によって特徴づけられる小胞構造である。多層リポソームは、水性媒体によって分離された多数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁された場合に自発的に形成する。その脂質成分は、閉鎖された構造を形成する前に、自己再配置を経て、そして水および溶解した溶質を脂質二重層の間に捕捉する（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ，１９９１）。リポフェクタミンＤＮＡ複合体もまた意図される。
【０１１８】
リポソーム媒介核酸送達およびインビトロでの外来ＤＮＡの発現は非常に成功している。Ｗｏｎｇら（１９８０）は、培養ニワトリ胚、ＨｅＬａ細胞、および肝癌細胞において、外来ＤＮＡのリポソーム媒介送達および発現の可能性を実証した。Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、静脈内注射後のラットにおいて首尾よいリポソーム媒介遺伝子移入を達成した。
【０１１９】
本発明の特定の実施例において、そのリポソームは、センダイウイルス（ＨＶＪ）と複合体化され得る。これは、細胞膜との融合を容易にすること、およびリポソームカプセル化ＤＮＡの細胞への侵入を促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａら、１９８９）。他の実施形態において、そのリポソームは、核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合体化され得るか、または組み合わせて利用され得る（Ｋａｔｏら、１９９１）。なおさらなる実施形態において、そのリポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と複合体化され得るか、または組み合わせて利用され得る。このような発現構築物がインビトロおよびインビボにおいて核酸の移入および発現において首尾よく使用されたという点で、それらは本発明に適用可能である。細菌のプロモーターがＤＮＡ構築物中で利用される場合、それはまた、適切な細菌ポリメラーゼをリポソーム内に含めることが所望される。
【０１２０】
特定の遺伝子をコードする核酸を細胞に送達するために利用され得る他の発現構築物は、レセプター媒介送達ビヒクルである。これらは、ほとんど全ての真核生物細胞におけるレセプター媒介エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込みを利用する。種々のレセプターの細胞型特異的分布のために、その送達は、高度に特異的であり得る（ＷｕおよびＷｕ、１９９３）。
【０１２１】
レセプター媒介遺伝子標的化ビヒクルは、一般的に以下の２つの成分からなる：細胞レセプター特異的リガンドおよびＤＮＡ結合剤。いくつかのリガンドが、レセプター媒介遺伝子移入のために使用されている。最も広汎に特徴づけられているリガンドは、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）（ＷｕおよびＷｕ、１９８７）およびトランスフェリン（Ｗａｇｎｅｒら、１９９０）である。最近、ＡＳＯＲと同じレセプターを認識する合成ネオ糖タンパク質が、遺伝子送達ビヒクルとして使用されており（Ｆｅｒｋｏｌら、１９９３；Ｐｅｒａｌｅｓら、１９９４）、そして上皮増殖因子（ＥＧＦ）はまた、扁平上皮癌細胞に対して遺伝子を送達するために用いられている（Ｍｙｅｒｓ，ＥＰＯ  ０２７３０８５）。
【０１２２】
他の実施形態において、送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含み得る。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、ラクトシル−セラミド、ガラクトース−末端アシアロガングリオシド（リポソームに組み込まれた）を使用し、そして肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みの増大を観察した。従って、特定の遺伝子をコードする核酸はまた、リポソームを伴うかまたは当該分野もなわない多数のレセプター−リガンド系によって、肺細胞、上皮細胞または腫瘍細胞のような細胞型に特異的に送達され得ることが可能である。例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、ＥＧＦレセプターの上方制御（アップレギュレーション）を示す多くの腫瘍細胞において遺伝子をコードする核酸の媒介送達のためのレセプターとして用いられ得る。マンノースは、肝臓細胞上のマンノースレセプターを標的化するために使用され得る。また、ＣＤ５（ＣＬＬ）、ＣＤ２２（リンパ腫）、ＣＤ２５（Ｔ細胞白血病）およびＭＡＡ（黒色腫）に対する抗体は、同様に、標的化部分として使用され得る。
【０１２３】
特定の実施形態において、遺伝子移入は、エキソビボ条件下でさらに容易に実施され得る。エキソビボ遺伝子治療とは、動物からの細胞の単離、インビトロでのこの細胞への核酸の送達、次いで動物へのこの改変した細胞の戻しをいう。これは、動物からの組織／器官の外科的取り出し、または細胞および組織の初代培養を包含し得る。
【０１２４】
初代哺乳動物細胞培養物は、種々の方法において調製され得る。細胞がインビトロでかつ発現構築物と接触していながら生存しているためには、その細胞が、酸素と二酸化炭素と栄養素と正確な比率で接触して維持されるが、微生物の汚染からは保護されていることを確実にすることが必要である。細胞培養技術は、十分に文献に報告されており、そして本明細書において参考文献として開示されている（Ｆｒｅｓｈｎｅｒ，１９９２）。
【０１２５】
前記の１つの実施形態は、タンパク質の産生のための細胞を不死化するために遺伝子移入の使用を包含する。目的のタンパク質の遺伝子は、上記のように適切な宿主細胞に移入され得、その後、適切な条件下で細胞培養される。実質的に任意のポリペプチドについてのその遺伝子は、このようにして利用され得る。組換え発現ベクターおよびその中に含まれる要素の生成は、上記で議論した。あるいは、産生されるべきタンパク質は、問題の細胞によって通常合成される内因性のタンパク質であり得る。
【０１２６】
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＶｅｒｏおよびＨｅＬａ細胞およびチャイニーズハムスター卵巣の細胞株、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、ＮＩＨ３Ｔ３、ＲＩＮ、およびＭＤＣＫ細胞である。さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の様式でその遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能に重要であり得る。異なる宿主細胞は、翻訳後プロセシングおよびタンパク質の修飾のための特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系は、発現される外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。
【０１２７】
多数の選択系が使用され得、それらには、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、またはａｐｒｔ−細胞における、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。また、抗代謝物抵抗性は、以下に対する選択性を基礎として使用され得る：抵抗性を付与するｄｈｆｒ；ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ；アミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ；およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏ。
【０１２８】
動物細胞は、以下の２つの態様でインビトロで増殖され得る：培養のバルクを通じて懸濁液中において増殖する非足場依存性細胞として、またはそれらの増殖のための固相基質への付着を必要とする足場依存性細胞（すなわち、細胞増殖の単層型）として。
【０１２９】
（Ｑ．抗体）
本発明の抗体は、免疫沈降による抗原の単離に有用である。免疫沈降は、複合混合物からの標的抗原成分の分離を含み、そして少量のタンパク質の識別または単離のために用いられる。膜タンパク質の単離のため、細胞を界面活性剤ミセルに溶解しなければならない。胆汁塩のような他の因子が酸性のｐＨかまたは二価カチオンの存在下で沈殿するので、非イオン性塩が好ましい。抗体およびその用途を以下にさらに考察する。
【０１３０】
別の局面において、本発明は、本発明のＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、もしくはＳＥＭ  Ａ３分子と免疫反応性である抗体、またはその任意の部分を意図する。抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。１つの実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。抗体を調製および特徴付けるための手段は当該分野で周知である（例えば、ＨｏｗｅｌｌおよびＬａｎｅ，１９８８を参照のこと）。
【０１３１】
要するに、ポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドを含む免疫原を用いて動物を免疫すること、およびその免疫された動物から抗血清を収集することによって調製される。広範な動物種が、抗血清の生成のために用いられ得る。代表的には、抗−抗血清の生成のために用いた動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、またはウマを含む非ヒト動物である。ウサギの比較的大量の血液のおかげで、ウサギはポリクローナル抗体の生成のために好ましい選択である。
【０１３２】
抗原のアイソフォームに特異的な抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方）は、当業者に一般に公知であるように、従来の免疫技術を用いて調製され得る。本発明の化合物の抗原性エピトープを含む組成物は、１つ以上の実験動物（例えば、ウサギまたはマウス）を免疫するために用いられ得る。次いで、これらの動物は本発明の化合物に対して特異的な抗体を生成するように進行する。ポリクローナル抗血清は、抗体生成のための時間経過後、単にこの動物を放血して全血から血清サンプルを調製することによって、入手され得る。
【０１３３】
本発明のモノクローナル抗体は、標準的な免疫化学手順（例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット方法）において、および免疫組織化学手順（例えば、組織染色）において、ならびに異なる種の特定のＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３に関連する抗原性エピトープに特異的な抗体を利用し得る他の手順において、有用な用途を見出すことが提唱される。さらに、異なる種の特定のＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３に特異的なモノクローナル抗体が、他の有用な用途において利用され得ることが提唱される。
【０１３４】
一般に、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方とも、種々の実施形態において用いられ得る。例えば、これらの抗体は、他のＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３をコードするｃＤＮＡまたは遺伝子を得るための抗体クローニングプロトコールにおいて使用され得る。それらの抗体はまた、細胞または動物におけるＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３が関連するペプチドの効果を分析するための阻害試験において用いられ得る。抗−Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３の抗体はまた、種々の細胞事象の間、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３の分布を分析するための免疫学的局在決定試験において、例えば、細胞周期における異なる時点でのＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、およびＳＥＭ  Ａ３のポリペプチドの細胞特異的または組織特異的な分布を決定するために有用である。このような抗体の特に有用な用途は、例えば、抗体親和性カラムを用いて、ネイティブまたは組み換えのＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３を精製することである。このような免疫学的技術の全ての操作は、本開示に照らして当業者に公知である。
【０１３５】
抗体を調製および特徴付けるための手段が当該分野で周知である（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，１９８８（本明細書において参考として援用されている）を参照のこと）。モノクローナル抗体調製のさらに具体的な例は、以下の実施例に記載している。
【０１３６】
当該分野で周知のように、所定の組成物はその免疫原性において変化し得る。従って、キャリアに対してペプチドまたはポリペプチド免疫原を結合することによって達成され得るように、宿主免疫系をブーストすることがしばしば必要である。例示的かつ好ましいキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。他のアルブミン（例えば、オボアルブミン、マウス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミン）もまた、キャリアとして使用され得る。キャリアタンパク質にポリペプチドを結合体化させるための手段は、当該分野において周知であり、そしてこれには、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｃｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ）、カルボジイミド、およびビス−ビアゾ化ベンジジン（ｂｉｓ−ｂｉａｚｏｔｉｚｅｄ  ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）が挙げられる。
【０１３７】
また当該分野において周知のように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、免疫応答の非特異的刺激物質（アジュバントとして公知）を使用することによって増強され得る。例示的かつ好ましいアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（殺傷されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含有する、免疫応答の非特異的刺激物質）、不完全フロイントアジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。
【０１３８】
ポリクローナル抗体の産生において使用される免疫原組成物の量は、免疫原および免疫に使用される動物の性質に応じて変動する。種々の経路を使用して、免疫原を投与し得る（皮下、筋内、皮内、静脈内、および腹腔内）。ポリクローナル抗体の産生は、免疫後の種々の時点で、免疫された動物の血液をサンプリングすることによってモニターされ得る。第２のブースター注射もまた、与えられ得る。追加免疫（ブースト）および力価測定のプロセスを、適切な力価が達成されるまで繰り返す。所望されるレベルの免疫原性が獲得された場合に、この免疫された動物を採血し得、そして血清を単離および保存し得、そして／または、この動物を使用して、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成し得る。
【０１３９】
ｍＡｂは、米国特許第４，１９６，２６５号（これは、本明細書中で参考として援用される）に例示される技術のような、周知技術の使用を通して容易に調製され得る。代表的に、この技術は、選択された免疫原組成物（例えば、精製されたまたは部分的に精製された、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、あるいは高レベルのＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３を発現する細胞）を用いて適切な動物を免疫することを含む。免疫する組成物は、抗体産生細胞を刺激するのに有効な様式で投与される。マウスおよびラットのような齧歯類は好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジ、およびカエルの細胞の使用もまた可能である。ラットの使用は、特定の利点を与え得る（Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６）が、マウスが好ましい。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、最も慣用的に使用され、そして一般により高率で安定な融合物を与えるので最も好ましい。
【０１４０】
免疫後に、抗体を産生する潜在能を有する体細胞（詳細には、Ｂリンパ球（Ｂ細胞））が、ｍＡｂ産生プロトコルにおける使用のために選択される。これらの細胞は、生検された脾臓、扁桃、もしくはリンパ節から、または末梢血サンプルから獲得され得る。脾臓細胞および末梢血細胞が好ましい。前者は、脾臓細胞が分裂形質芽球段階にある抗体産生細胞の豊富な供給源であるからであり、後者は、末梢血が容易に利用可能であるからである。しばしば、一団の動物が免疫され、そして最高の抗体力価を有する動物の脾臓が取り出され、そして注射器でこの脾臓をホモジネートすることによって脾臓リンパ球が得られる。代表的に、免疫したマウス由来の脾臓は、約５×１０７〜２×１０８のリンパ球を含む。
【０１４１】
次いで、免疫した動物由来の抗体産生Ｂリンパ球は、不死化骨髄腫細胞の細胞（一般的には、免疫された動物と同じ種の細胞）と融合される。ハイブリドーマ産生融合手順における使用に適切な骨髄腫細胞株は、好ましくは非抗体産生であり、高い融合効率を有し、そして、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地中でその細胞株を増殖し得なくさせる酵素欠損を有する。
【０１４２】
当業者に公知のように、多くの骨髄腫細胞のうちの任意の細胞が使用され得る（Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６；Ｃａｍｐｂｅｌｌ、１９８４）。例えば、免疫した動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳｌ／１．Ａｇ  ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７、およびＳ１９４／５ＸＸ０  Ｂｕｌが使用され得；ラットについて、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ１．２．３、ＩＲ９８３Ｆ、４Ｂ２１０が使用され得；そしてＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、およびＵＣ７２９−６はすべて、細胞融合に関連して有用である。
【０１４３】
抗体産生脾臓細胞または抗体産生リンパ節細胞、および骨髄腫細胞のハイブリッドを生成するための方法は、通常、細胞膜の融合を促進する因子（化学的または電気的）の存在下で、２：１の比率で体細胞を骨髄腫細胞と混合する工程を包含するが、この比率はそれぞれ約２０：１〜約１：１まで変動し得る。センダイウイルスを使用する融合方法は、記載されており（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ；１９７５；１９７６）、そしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ）を使用する融合方法は、Ｇｅｆｔｅｒら（１９７７）に記載されている。電気的に誘導された融合方法の使用もまた適切である（Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６）。
【０１４４】
融合手順は通常、低い頻度（約１×１０−６〜１×１０−８）で生存可能なハイブリッドを生成する。しかし、これは問題を提起しない。なぜなら、生存可能な融合ハイブリッドは、選択培地中で培養することによって、親の非融合細胞（特に、通常は無限に分裂しつづける、非融合骨髄腫細胞）から識別されるからである。選択培地は、一般に、組織培養培地中でのヌクレオチドのデノボ合成をブロックする薬剤を含む培地である。例示的かつ好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキサート、およびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジンの両方のデノボ合成をブロックし、一方、アザセリンは、プリン合成のみをブロックする。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、ヌクレオチドの供給源としてヒポキサンチンおよびチミジンを倍地に補充する（ＨＡＴ培地）。アザセリンが使用される場合、ヒポキサンチンを培地に補充する。
【０１４５】
好ましい選択培地は、ＨＡＴである。ヌクレオチドサルベージ経路を機能し得る細胞のみが、ＨＡＴ培地中で生存し得る。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の重要な酵素（例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を欠損し、そしてそれらは生存し得ない。Ｂ細胞はこの経路を機能し得るが、それらは培養中で限られた寿命を有し、そして一般に約２週間以内に死滅する。従って、選択培地中で生存し得る唯一の細胞は、骨髄腫細胞およびＢ細胞から形成されたハイブリッドである。
【０１４６】
この培養は、特定のハイブリドーマが選択されるハイブリドーマの集団を提供する。代表的に、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレート中での単一クローン希釈によって細胞を培養し、次いで所望の反応性について個々のクローンの上清を試験すること（約２〜３週間後）によって、実施される。このアッセイは、高感度で、単純で、そして迅速であるべきである（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫検定法、細胞傷害性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイ（ｄｏｔ  ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）など）。
【０１４７】
次いで、選択されたハイブリドーマを段階希釈し、そして個々の抗体産生細胞株にクローン化する。次いで、このクローンは無限に増殖されて、ｍＡｂを提供し得る。細胞株は、２つの基本的様式でｍＡｂ産生のために利用され得る。ハイブリドーマのサンプルは、もともとの融合物のために体細胞および骨髄腫細胞を提供するために使用された型の組織適合性動物に注射（しばしば、腹膜腔内へ）され得る。この注射された動物は、融合された細胞ハイブリッドによって産生される特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発症する。次いで、この動物の体液（例えば、血清または腹水）を穿刺により採取して、高濃度でｍＡｂを提供し得る。個々の細胞株はまた、インビトロで培養され得る。ここで、ｍＡｂは培養培地中に自然に分泌され、ここからｍＡｂは高濃度で容易に獲得され得る。いずれの方法によって産生されたｍＡｂも、所望であれば、濾過、遠心分離および種々のクロマトグラフィー方法（例えば、ＨＰＬＣまたはアフィニティークロマトグラフィー）を使用して、さらに精製され得る。
【０１４８】
（Ｒ．  Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３に関わる癌を診断すること）
Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２およびＳＥＭ  Ａ３、ならびにそれらの対応する遺伝子は、癌の診断指標または予後指標として使用され得る。より詳細には、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２およびＳＥＭ  Ａ３に関連する、点変異、欠失、挿入、または調節の混乱（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）は、癌を引き起こし得るかまたは癌の発達を促進し得、原発部位において腫瘍の進行を引き起こすかまたは促進し得、そして／または転移を引き起こすかまたは促進し得る。Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２およびＳＥＭ  Ａ３の発現によって影響され得る悪性疾患に関連する他の現象としては、新脈管形成および組織侵襲が挙げられる。
【０１４９】
（１．遺伝子診断）
本発明の１つの実施形態は、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３の発現における変動を検出するための方法を包含する。これは、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、もしくはＳＥＭ  Ａ３のレベルを決定する工程、または発現される産物における特定の変化を決定する工程を包含し得る。明らかに、この種類のアッセイは、関連する癌の診断において重要性を有する。このような癌としては、脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、血球、膵臓、結腸、胃、子宮頸部、乳房、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、頭頸部、食道、口組織、骨髄および血液組織の癌が挙げられ得る。
【０１５０】
生物学的サンプルは、任意の組織または流体であり得る。種々の実施形態は、脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、血球、膵臓、結腸、胃、子宮頸部、乳房、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、頭頸部、食道、口組織、骨髄および血液組織の細胞を含む。他の実施形態は、末梢血液、リンパ液、腹水、漿液、胸水、痰、脳脊髄液、涙液、糞便または尿のような流体サンプルを含む。
【０１５１】
使用される核酸は、標準的な方法論（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）に従って、生物学的サンプルに含まれる細胞から単離される。核酸は、ゲノムＤＮＡまたは分画された細胞ＲＮＡもしくは全細胞ＲＮＡであり得る。ＲＮＡが使用される場合には、このＲＮＡを相補ＤＮＡに転換することが、所望であり得る。１つの実施形態においては、このＲＮＡは、全細胞ＲＮＡであり；別の実施形態では、ＲＮＡは、ポリＡ  ＲＮＡである。通常、核酸は、増幅される。
【０１５２】
形式に依存して、目的の特異的核酸は、増幅を使用して直接的に、または増幅に続いて第２の公知の核酸を用いてサンプル中で同定される。次に、同定された産物が検出される。特定の適用においては、この検出は、可視的な手段（例えば、ゲルのエチジウムブロミド染色）によって実施され得る。あるいは、この検出は、化学発光によるか、放射性標識または蛍光標識の放射性シンチグラフィーによるか、あるいは電子的化または熱的なインパルスシグナルを使用するシステム（Ａｆｆｙｍａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｂｅｌｌｕｓ，１９９４）によってさえの、産物の間接的な同定を包含し得る。
【０１５３】
検出に続いて、所定の患者において見られる結果を、正常な患者およびＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３関連の病理を有する患者の統計的に有意な参照群と、比較し得る。この様式で、検出されるＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３の量または種類と、種々の臨床状態とを相関付けることが可能である。
【０１５４】
遺伝子の変更は、欠失、挿入、点変異および重複を含む。点変異は、終止コドン、フレームシフト変異またはアミノ酸置換を生じる。体細胞変異は、非生殖系列組織において生じる変異である。生殖系列組織は、任意の組織において生じ、そして遺伝する。コード領域内および外側の変異はまた、ともに、遺伝子の転写を変えるか、または不安定化するか、またはそうでなければ転写物（ｍＲＮＡ）もしくはタンパク質のいずれかのプロセシングを変えることによって、産生されるＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３の量に影響し得る。
【０１５５】
種々の異なるアッセイがこれに関して意図され、これには、限定しないが、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、直接的ＤＮＡ配列決定、ＰＦＧＥ分析、サザンまたはノーザンブロッティング、一本鎖コンフォメーション分析（ＳＳＣＡ）、ＲＮＡｓｅ保護アッセイ、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ドットブロット分析、変性勾配ゲル電気泳動、ＲＦＬＰおよびＰＣＲＴＭ−ＳＳＣＰが挙げられる。
【０１５６】
（２．サザン／ノーザンブロッティング）
ブロッティング技術は、当業者に周知である。サザンブロッティングは、標的としてＤＮＡの使用に関し、一方、ノーザンブロッティングは、標的としてＲＮＡの使用に関する。それぞれが、異なる型の情報を提供するが、多くの局面において、ｃＤＮＡブロッティングは、ブロッティングまたはＲＮＡ種に類似する。
【０１５７】
簡単に述べると、適切なマトリクス（しばしば、ニトロセルロースのフィルター）に固定されたＤＮＡ種またはＲＮＡ種を標的化するためにプローブが使用される。異なる種は、分析を促進するために空間的に分離されるべきである。これは、しばしば、核酸種のゲル電気泳動、続くフィルター上での「ブロッティング」によって達成される。
【０１５８】
引き続いて、ブロットされた標的が、変性および再ハイブリダイゼーションを促進する条件下でプローブ（通常、標識される）とともにインキュベートされる。プローブが標的との塩基対を形成するように設計されるので、プローブは、再生条件下で標的配列の部分に結合する。次いで、結合していないプローブは、除去され、そして検出が上記のように達成される。
【０１５９】
（３．分離方法）
通常、１つの段階でまたは別の段階で、特異的な増幅が行われたか否かを決定するために、テンプレートおよび過剰なプライマーから増幅産物を分離することが所望される。１つの実施形態において、増幅産物を標準的な方法を用いて、アガロース、アガロースアクリルアミド、またはポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照のこと。
【０１６０】
あるいは、クロマトグラフィー技術を使用して、分離を達成し得る。本発明において用いられ得る、多くの種類のクロマトグラフィーが存在する：吸着、分配、イオン交換、およびモレキュラーシーブ、ならびにカラムクロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、およびガスクロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーを用いるための多くの専門的技術（Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ、１９８２）。
【０１６１】
（４．検出方法）
マーカー配列の増幅を確認するために、産物を、可視化し得る。代表的な可視化方法の１つは、臭化エチジウムを用いたゲルの染色およびＵＶ光下の可視化を含む。あるいは、増幅産物が、放射線標識ヌクレオチドまたは蛍光定量的に標識されたヌクレオチドを用いて完全に標識されれば、増幅産物は、分離後、Ｘ線フィルムに曝露されるか、または適切な刺激スペクトルの下で可視化され得る。
【０１６２】
（５．キット構成要素）
Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３およびその改変体を検出および配列決定するのに必要な全ての基本的な物質および試薬を、キットの中に一緒に組合せ得る。これは、一般に、事前選択プライマーおよびプローブを含む。核酸を増幅するのに適切な酵素もまた含まれ得、これは増幅のために必要な反応混合物を提供するための種々のポリメラーゼ（ＲＴ、Ｔａｑ  ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭなど）、デオキシヌクレオチド、および緩衝液を含む。このようなキットは、一般的に、適切な手段で、それぞれの個々の試薬および酵素ならびにそれぞれのプライマーまたはプローブに対して異なる容器を含む。
【０１６３】
（６．ＲＴ−ＰＣＲＴＭ（相対的定量的））
ｃＤＮＡへのＲＮＡの逆転写（ＲＴ）およびそれに続く相対的な定量ＰＣＲＴＭ（ＲＴ−ＰＣＲＴＭ）を使用して、患者から単離された特定のｍＲＮＡ種の相対的な濃度を測定し得る。特定のｍＲＮＡ種の濃度が変化することを決定することによって、この特定のｍＲＮＡ種をコードする遺伝子が、示差的に発現されることが示される。
【０１６４】
ＰＣＲＴＭにおいて、ある試薬が限界になるまで、増幅される標的ＤＮＡの分子数は、反応のサイクル毎にほぼ２倍に増加する。その後、サイクル間で増幅される標的の増加がなくなるまで、増幅速度は、次第に減少する。サイクル数をＸ軸に、そして増幅される標的ＤＮＡの濃度のｌｏｇをＹ軸にして、グラフをプロットすると、このプロットした点を繋ぐことによって、特徴的な形の曲線が形成される。１回目のサイクルによる開始時では、この曲線の傾きは、正でありかつ一定である。これは、この曲線の直線部分といわれる。ある試薬が限界になった後、この曲線の傾きは、減少し始めそして最終的に０になる。この時点で、増幅された標的ＤＮＡの濃度は、ある固定値に漸近する。これは、この曲線のプラトー部分といわれる。
【０１６５】
このＰＣＲＴＭ増幅の直線部分における標的ＤＮＡの濃度は、反応を開始する前の標的の開始濃度に、正比例する。同じサイクル数を完了しそして直線範囲にあるＰＣＲＴＭ反応において、標的ＤＮＡの増幅産物の濃度を決定することによって、元のＤＮＡ混合物中の特定の標的配列の相対的な濃度を決定することが可能である。これらのＤＮＡ混合物が、異なる組織または細胞から単離されたＲＮＡから合成されたｃＤＮＡである場合、この標的配列が由来する特定のｍＲＮＡの相対的な存在量が、それぞれの組織または細胞について決定され得る。このＰＣＲＴＭ産物の濃度と相対的なｍＲＮＡの存在量との正比例は、このＰＣＲＴＭ反応の直線範囲にのみ当てはまる。
【０１６６】
曲線のプラトー部分における標的ＤＮＡの最終濃度は、反応混合物中の試薬の利用能によって決定され、そして標的ＤＮＡの元の濃度に非依存的である。従って、ｍＲＮＡ種の相対的な存在量が、ＲＮＡ集団の収集物についてＲＴ−ＰＣＲＴＭによって決定され得る前に、満たされなければならない第１の条件は、このＰＣＲＴＭ反応がこのＰＣＲＴＭ反応曲線の直線部分にあるときに、増幅されたＰＣＲＴＭ産物の濃度がサンプリングされなければならないというということである。
【０１６７】
特定のｍＲＮＡ種の相対的な存在量を首尾よく決定するためのＲＴ−ＰＣＲＴＭ実験について満たされなければならない第２の条件は、増幅可能なｃＤＮＡの相対的な濃度が、ある独立した標準に対して正規化されなければならないということである。ＲＴ−ＰＣＲＴＭ実験の目標は、サンプル中の全ｍＲＮＡ種の平均存在量に対する、特定のｍＲＮＡ種の存在量を決定することである。以下に記載の実験において、β−アクチン、アスパラギンシンテターゼおよびリポコルチンＩＩのｍＲＮＡを、外部標準および内部標準として使用し、これらに対して、他のｍＲＮＡの相対的な存在量を比較する。
【０１６８】
競合的ＰＣＲＴＭについてのほとんどのプロトコルは、標的とほぼ同量の内部ＰＣＲＴＭ標準を利用する。これらのストラテジーは、ＰＣＲＴＭ増幅産物がＰＣＲＴＭの直線期にサンプリングされる場合に、効果的である。反応がプラトー期に近づいている時に産物をサンプリングする場合、低量の産物が比較的過度に現われる。多くの異なるＲＮＡサンプルについて行われる相対的な存在量の比較（例えば、示差的発現についてＲＮＡサンプルを試験する場合）は、ＲＮＡの相対的な存在量において差異を生じるよう歪められ、その存在量は、実際に存在するよりも少なく現われる。これは、内部標準が標的よりもはるかに豊富に存在する場合には、重要な問題ではない。内部標準が標的よりも豊富に存在する場合、直接的な直線比較が、ＲＮＡサンプル間でなされ得る。
【０１６９】
上記の議論は、臨床的に由来する物質についてのＲＴ−ＰＣＲＴＭアッセイについての理論的考察を記載する。臨床サンプルに固有の問題は、それらの量が可変的である（正規化に問題を生じる）こと、そしてそれらの質が可変的である（信頼できる内部コントロール（好ましくは、標的よりも大きいサイズの）の同時増幅を必要とする）ことである。これらの両方の問題は、ＲＴ−ＰＣＲＴＭが、内部標準を用いる相対的な定量ＲＴ−ＰＣＲＴＭとして行われ、この内部標準が、標的ｃＤＮＡフラグメントよりも大きい、増幅可能なｃＤＮＡフラグメントであり、そしてこの内部標準をコードするｍＲＮＡの存在量が、標的をコードするｍＲＮＡよりもほぼ５〜１００倍高い場合に、克服される。このアッセイは、それぞれのｍＲＮＡ種の絶対的存在量ではなく、相対的な存在量を測定する。
【０１７０】
他の研究は、外部標準プロトコルを用いる、より通常の相対的な定量ＲＴ−ＰＣＲＴＭアッセイを使用して行われ得る。これらのアッセイは、増幅曲線の直線部分におけるＰＣＲＴＭ産物をサンプリングする。サンプリングに最適なＰＣＲＴＭサイクル数は、各標的ｃＤＮＡフラグメントについて経験的に決定されなければならない。さらに、種々の組織サンプルから単離された各ＲＮＡ集団の逆転写酵素産物は、等濃度の増幅可能なｃＤＮＡに対して注意深く正規化されなければならない。この考慮は非常に重要である。なぜなら、このアッセイは、絶対的なｍＲＮＡの存在量を測定するからである。絶対的なｍＲＮＡの存在量は、正規化されたサンプルのみにおける、示差的な遺伝子発現の尺度として使用され得る。増幅曲線の直線範囲の経験的な決定およびｃＤＮＡ調製物の正規化は、退屈な時間のかかるプロセスであるが、このＲＴ−ＰＣＲＴＭアッセイの結果は、内部標準を用いる相対的な定量ＲＴ−ＰＣＲＴＭアッセイからの結果よりも優れたものであり得る。
【０１７１】
この利点についての１つの理由は、内部標準／競合因子を用いないので、全ての試薬が、増幅曲線の直線範囲において、単一のＰＣＲＴＭ産物に変換され得、従って、これが、アッセイの感度を増加するということである。別の理由は、１つのＰＣＲＴＭ産物のみを用いるので、電気泳動ゲル上での産物の提示または他の提示方法の複雑性が低下し、バックグラウンドが少なくなり、より容易に理解されることである。
【０１７２】
なお他の研究は、「リアルタイム」ＲＴ−ＰＣＲＴＭ（Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９９３）を使用して実行され得る。これらのアッセイは、ＰＣＲＴＭ産物が、固定された数のサイクルの後に蓄積するＰＣＲＴＭ産物の量を検出する代わりに、それらが蓄積する時、そのＰＣＲＴＭ産物を検出する。それぞれのＰＣＲＴＭサイクルの後に、蛍光検出する方法が必要とされる。蛍光シグナルは、サイクル数に対してプロットされる。サイクル数は、閾値サイクル（ＣＴ）として表現される。最初の蛍光は、プロットのベースラインを規定し、そして蓄積されたＰＣＲＴＭ産物は、ベースラインの上の蛍光の増加によって示される。サンプル中の標的の量の定量は、開始コピー数を決定するために、ＣＴを測定し、検量線と比較することによって決定される。
【０１７３】
「リアルタイム」ＲＴ−ＰＣＲＴＭ（Ｈｉｇｕｃｈｉら、１９９３）は、終点よりもむしろ、ＰＣＲＴＭの対数期の間に決定されるので、標的の量のより正確な定量を提供する。ＣＴ値の使用によって、より大きな動的範囲が可能になるので、これはまたより高いスループットを可能にする。それぞれのサンプルの希釈は、もはや必要ではない。
【０１７４】
（７．免疫診断）
本発明の抗体は、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティングのような技術によって、健康な組織および疾患状態の組織のＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３の量を特徴付ける際に使用され得る。これは、悪性疾患の存在または非存在についてあるいはさらなる癌の指標としてのスクリーンを提供し得る。
【０１７５】
本発明の抗体の使用が、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、考慮される。例えば、抗Ｆｕｓ１抗体、抗１０１Ｆ６抗体、抗Ｇｅｎｅ２１抗体、抗Ｇｅｎｅ２６抗体、抗Ｂｅｔａ＊抗体、抗Ｌｕｃａ１抗体、抗Ｌｕｃａ２抗体、抗ＰＬ６抗体、抗１２３Ｆ２抗体、または抗ＳＥＭ  Ａ３抗体は、選択された表面（好ましくは、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルのようなタンパク質親和性を示す表面）に固定される。不完全に吸着された材料を除くために洗浄された後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、または粉ミルクの溶液のような試験抗血清に関して抗原的に中性であることが公知の非特異的タンパク質でアッセイプレートウェルを結合またはコーティングすることが望ましい。これは、固定表面の非特異的吸着部位の遮断を可能にし、従って、表面への抗原の非特異的結合によって引き起こされるバックグラウンドを減少する。
【０１７６】
ウェルへ抗体を結合し、バックグラウンドを減少させるために非反応性物質でコーティングし、そして非結合物質を洗浄により除去した後に、固定表面を、免疫複合体（抗原／抗体）形成を導く様式で、試験されるサンプルと接触させる。
【０１７７】
試験サンプルと結合抗体との間の特異的な免疫複合体の形成、引き続く洗浄に続いて、免疫複合体形成の存在および量さえも、これを、一次抗体とは異なるＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２、またはＳＥＭ  Ａ３に対する特異性を有する二次抗体に供することによって決定され得る。適切な条件は、好ましくは、サンプルを希釈剤（例えば、ＢＳＡ、ウシガンマグロブリン（ＢＧＧ）ならびにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎ（登録商標））で希釈することを含む。これらの加えられる薬剤はまた、非特異的バックグラウンドの減少を助ける傾向がある。次いで、層状の抗血清を、約２〜約４時間、好ましくは約２５℃〜約２７℃のオーダーの温度でインキュベートし得る。インキュベーションに続いて、抗血清接触表面を、非免疫複合材料を除去するために洗浄する。好ましい洗浄手順は、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）またはホウ酸塩緩衝液のような溶液で洗浄することを含む。
【０１７８】
検出手段を提供するために、二次抗体は、好ましくは、適切な色素原性基質を用いるインキュベーションの際に色の発色を生成する関連酵素を有する。従って、例えば、免疫複合体形成の発生を支持する時間の間および条件下（例えば、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）のようなＰＢＳ含有溶液中、室温での２時間のインキュベーション）でのウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼまたは（西洋ワサビ）ペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧとの二次抗体結合表面の接触およびインキュベーションが望まれる。
【０１７９】
二次酵素タグ化抗体を用いるインキュベーションの後、そして未結合材料を除去するための洗浄に続いて、標識の量は、酵素標識のようなペルオキシダーゼの場合において、尿素およびブロモクレゾールパープルまたは２，２’−アジノ（ａｚｉｎｏ）−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）およびＨ２Ｏ２のような色素原性基質とのインキュベーションによって定量される。次いで、定量は、色生成の程度を測定すること（例えば、可視スペクトル分光光度計を使用すること）によって達成される。
【０１８０】
先の形式は、サンプルをアッセイプレートに最初に結合することによって変更され得る。次いで、一次抗体が、このアッセイプレートとともにインキュベートされ、続いて、一次抗体に対する特異性を有する標識された二次抗体を使用して結合した一次抗体を検出する。
【０１８１】
本発明の抗体組成物は、免疫ブロット分析またはウェスタンブロット分析において大きな用途を見出す。抗体は、固体支持マトリクス（例えば、ニトロセルロース、ナイロンまたはその組み合わせ）上に固定されたタンパク質の同定のための高親和性の一次試薬として使用され得る。免疫沈降、続くゲル電気泳動とともに、これらは、抗原の検出に使用される二次試薬が有害なバックグラウンドを引き起こす抗原を検出する際に使用するための単一工程試薬として使用され得る。ウェスタンブロットとともに使用される免疫学に基づいた検出法は、これに関して特定の使用であると考慮される、毒素部分に対する酵素タグ化二次抗体、放射線標識二次抗体または蛍光タグ化二次抗体を含む。
【０１８２】
（８．他のマーカーとの腫瘍サプレッサーの組み合わせ）
腫瘍は、特に腫瘍進行の進んだ段階において、不均一であることが周知である（Ｍｏｒｔｏｎら、１９９３；ＦｉｄｌｅｒおよびＨａｒｔ、１９８２；Ｎｏｗｅｌｌ、１９８２；Ｅｌｄｅｒら、１９８９；Ｂｙｓｔｒｙｎら、１９８５）。原発性腫瘍または転移内の腫瘍細胞は全て、同じマーカー遺伝子を発現し得るが、特定のｍＲＮＡの発現レベルは、かなり異なる（Ｅｌｄｅｒら、１９８９）。特定の例において、一連の不均質なマーカーの整列を処理し得る検出システムを使用することが必要である。
【０１８３】
従って、本発明は、マーカーとして種々の腫瘍サプレッサーを例示するが、癌の存在または非存在に相関する任意のマーカーが、腫瘍の検出および処置の効力を改善するために、これらのマーカーと組み合わせて使用され得る。本明細書中で使用される場合、マーカーは、その産生または産生の欠如が癌細胞の特徴である任意のタンパク質分子（または対応する遺伝子）である。所定の分析において使用されるマーカーの特定のセットに依存して、統計学的分析は異なる。例えば、特定の組み合わせのマーカーが、黒色腫または乳癌に非常に特異的である場合、陽性結果の特形学的有意性は高い。しかし、このような特異性は、感受性を犠牲にして達成される。すなわち、陰性の結果は、黒色腫または乳癌の存在下でさえ生じ得る。同様に、異なる組み合わせは、非常に敏感であり得る。すなわち、陰性になることはほとんどないが、低い特異性を有する。
【０１８４】
新規マーカーが同定されると、異なる民族集団もしくは性別、異なる地理的分布、異なる疾患段階、異なる程度の特異性または異なる程度の感受性で最適な機能を示す異なる組み合わせが、開発され得る。疾患の進行に対する治療レジメンの効果に対して特に敏感なマーカーの組み合わせもまた、開発され得る。患者は、手術、遺伝子治療、高熱、免疫療法、サイトカイン治療、遺伝子治療、放射線療法または化学療法の後に、特定の治療が有効であるか否か決定するためにモニターされ得る。
【０１８５】
黒色腫のための特に有用なマーカーの組み合わせの１つは、チロシナーゼおよびＭＡＧＥファミリーのメンバー（特にＭＡＧＥ−１またはＭＡＧＥ−３）である。ヒトチロシナーゼは、ヒトの皮膚および眼の褐色または黒色の色素の群である、メラニンの産生を調節する、必須の酵素である（Ｎｏｒｄｌｕｎｄら、１９８９；Ｈｏｏｎら、１９９３）。より詳細には、チロシナーゼは、チロシンのＤｏｐａへの変換およびＤｏｐａのドーパキノンへの変換を触媒する。
【０１８６】
これらおよび他のマーカーと組み合わせて使用され得る、多くの他のマーカーが存在する。例えば、ｂ−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｂ−ＨＣＧ）。ｂ−ＨＣＧは、妊婦の胎盤の栄養膜細胞によって産生され、そして、初期段階での妊娠の維持に必須である（Ｐｉｅｒｃｅら、１９８１；Ｔａｌｍａｄｇｅら、１９８４）。ｂ−ＨＣＧは、栄養膜または生殖系列起源の腫瘍（例えば、絨毛癌または精巣癌腫細胞）によって産生されることが公知である（Ｍａｄｅｒｓｂａｃｈｅｒら、１９９４；Ｃｏｌｅら、１９８３）。ｂ−ＨＣＧの異所的発現もまた、種々の非生殖腺の腫瘍（例えば、乳癌、肺癌、胃癌、結腸癌および膵臓癌など）において、多くの異なるイムノアッセイによって検出されている（ＭｃＭａｎｕｓら、１９７６；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら、１９９４；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、１９８９；Ｍａｒｃｉｌｌａｃら、１９９２；Ａｌｆｔｈａｎら、１９９２）。これらの腫瘍におけるｂ−ＨＣＧ産生の機能は、未だ未知であるが、癌細胞によるが、非生殖腺起源の正常細胞にはよらないｂ−ＨＣＧの隔世遺伝的発現は、ｂ−ＨＣＧが、黒色腫および乳癌の検出において潜在的に優れたマーカーであることを示唆する（Ｈｏｏｎら、１９９６；Ｓａｒａｎｔｏｕら、１９９７）。
【０１８７】
マーカーの別の例示的な例は、グリコシルトランスフェラーゼｂ−１、４−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（ＧａｌＮＡｃ）である。ＧａｌＮＡｃは、それぞれ、ＧＭ２およびＧＤ２を生成するための、ｂ１（ｒ）４結合によるＮ−アセチルガラクトサミンの、ガングリオシドＧＭ３およびＧＤ３の両方への転移を触媒する（Ｎａｇａｔａら、１９９２；Ｆｕｒｕｋａｗａら、１９９３）。これはまた、Ｎ−アセチルガラクトサミンの他の炭水化物分子（例えば、ムチン）への転移も触媒する。ガングリオシドは、細胞分化、接着および悪性形質転換において重要な役割を果たす、シアル酸含有グリコスフィンゴリピドである。黒色腫において、ガングリオシドＧＭ２およびＧＤ２の発現は、しばしば、非常に高いレベルに増強され、そして転移腫瘍を含む腫瘍進行に関連する（Ｈｏｏｎら、１９８９；Ａｎｄｏら、１９８７；Ｃａｒｕｂｉａら、１９８４；Ｔｓｕｃｈｉｄａら、１９８７ａ）。ガングリオシドはまた、黒色腫、腎臓癌腫、肺癌腫、乳癌腫の細胞において発現される。ガングリオシドＧＭ２およびＧＤ２は、ヒトにおいて免疫原性であり、そして特定の免疫療法（例えば、ヒトモノクローナル抗体または癌ワクチン）のための標的として使用され得る（Ｔｓｕｃｈｉｄａら、１９８７ｂ；Ｉｒｉｅ、１９８５）。
【０１８８】
ＧａｌＮＡｃ  ｍＲＮＡは、ＧＭ２およびＧＤ２の発現マーカーとして使用され得、そして結果的に、黒色腫または乳癌細胞のいずれかのマーカーとして使用され得る。ＧａｌＮＡｃは、一般に、正常なリンパ球、上皮細胞、メラノサイト、結合組織またはリンパ節の細胞においては発現されない。検出されるとしても、非常に低レベルである。前立腺特異的抗原は、前立腺癌に十分特徴付けられたマーカーである（Ｇｏｍｅｌｌａら、１９９７）。白血病についてのｂｒｃ／ａｂｌ遺伝子は、ＨＯＪ−１と組み合わせて有用であることが意図される、さらに十分に特徴付けられたマーカーである。
【０１８９】
本発明によって意図される他のマーカーとしては、細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）標的が挙げられる。ＭＡＧＥ−３は、黒色腫細胞および乳癌細胞において同定されたマーカーである。ＭＡＧＥ−３は、多くの黒色腫および他の腫瘍において発現され、そして（ＣＴＬ）標的である（Ｇａｕｇｌｅｒら、１９９４）。ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−６、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐは、ＭＡＧＥ遺伝子ファミリーの他のメンバーである。ＭＡＧＥ−１遺伝子の配列は、ＭＡＧＥ−３と７３％の同一性を示し、そしてＣＴＬによっても認識される抗原を発現する（Ｇａｕｇｌｅｒら、１９９４）。ＭＡＲＴ−１は、別の潜在的なＣＴＬ標的であり（Ｒｏｂｂｉｎｓら、１９９４）、そしてまた、本発明において含まれ得る。
【０１９０】
ＭＵＣ１８は、黒色腫細胞の同定において有用である、別のマーカーである（Ｌｅｈｍａｎら、１９８９；Ｌｅｈｍａｎら、１９８７）。ＭＵＣ１８は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである、細胞表面糖タンパク質であり、そして神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）に対して配列相同性を有する。他のムチンファミリーのメンバーとしては、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３およびＭＵＣ４が挙げられる。これらは、特定の腫瘍細胞株で高レベルで発現されることが見出され（Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈら、１９９４）、そしてまた、本発明の新規ＨＯＪ−１マーカーと組み合わせてマーカーとして使用され得る。
【０１９１】
黒色腫転移の発生に関連する接着分子の免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバー（Ｄｅｎｔｏｎら、１９９２）は、本発明において使用され得る。例としては、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、ＮＣＡＭ、ＶＣＡＭ−１およびＥＬＡＭが挙げられる。別の実施形態としては、癌腫細胞関連分子および他の転位性疾患に関連する分子（例えば、癌胎児抗原（ＣＥＡ；ＬｉｎおよびＧｕｉｄｏｔｔｉ、１９８９））が挙げられる。
【０１９２】
他の癌腫または皮膚癌に関連するタンパク質およびその対応する核酸もまた、本発明において使用され得る。好ましい例としては、黒色腫抗原ｇｐ７５（Ｖｉｊａｙａｓａｒｄａｈｉら、１９９０）、ヒトサイトケラチン２０、高分子量黒色腫抗原（Ｎａｔａｌｉら、１９８７）およびサイトケラチン１９（Ｋ１９）（Ｄａｔｔａら、１９９４）が挙げられる。本明細書中で有用であり得る他のマーカーとしては、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）のインヒビターが挙げられる。例えば、ＣＤＫ４は、細胞周期のＧ１期を通じて進行を調節する。ＣＤＫ４の活性は、活性化サブユニット（Ｄ型サイクリン）および阻害サブユニットによって制御され、ｐ１６ＩＮＫ４は、ＣＤＫ４に特異的に結合して阻害するタンパク質として、生化学的に特徴付けられている（Ｓｅｒｒａｎｏら、１９９３；Ｓｅｒｒａｎｏら、１９９５）。他のＣＤＫ阻害タンパク質としてはまた、ｐ１６、ｐ２１ＷＡＦ１およびｐ２７ＫＩＰ１が挙げられる。この列挙は、本発明において使用され得る潜在的なマーカーの型および数について、網羅的であることを意図せず、例示のみである。
【０１９３】
メラニン合成経路に関する他のタンパク質およびその対応する核酸は、マーカーとして使用され得る（例えば、チロシナーゼ関連タンパク質１および２、ならびにｐＭｅｌ１７遺伝子ファミリーのメンバー）（Ｋｗｏｎら、１９９３）。
【０１９４】
本発明の好ましい実施形態は、癌細胞の検出のための、多くの異なる組み合わせのマーカーを含む。細胞中の新生物を示す任意のマーカーが、本発明において含まれ得る。
【０１９５】
（Ｓ．トランスジェニック動物／ノックアウト動物）
本発明の１つの実施形態において、機能的なＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３ポリペプチドあるいはこれらの改変体をコードする機能的導入遺伝子を含むトランスジェニック動物が、作製される。Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３導入遺伝子を発現するトランスジェニック動物、このような動物に由来する組換え細胞株およびトランスジェニック胚は、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３の機能を誘導または抑制する薬剤を、スクリーニングおよび同定するための方法において有用であり得る。本発明のトランスジェニック動物はまた、癌のような指標を研究するためのモデルとして使用され得る。
【０１９６】
本発明の１つの実施形態において、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３導入遺伝子を非ヒト宿主に導入して、ヒトまたはマウスのＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３遺伝子を発現するトランスジェニック動物を作製する。このトランスジェニック動物は、導入遺伝子の発現を可能にする様式でゲノムに導入遺伝子を組み込むことにより作製される。トランスジェニック動物を作製する方法は、一般に、Ｗａｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｐｐｅ（米国特許第４，８７３，１９１号；本明細書中に参考として援用される）、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９８５；本明細書中にその全体が参考として援用される）、および「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（ｅｄｓ．，Ｈｏｇａｎ，Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，Ｃｏｓｔａｎｔｉｍｉ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４；本明細書中にその全体が参考として援用される）に記載される。
【０１９７】
導入遺伝子と内因性遺伝子との間での相同組換えにより内因性Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３を置き換えることが望ましい；またはこの内因性遺伝子を、「ノックアウト」動物の作出において欠失により除去し得る。代表的には、ゲノム配列に隣接するＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３遺伝子は、マイクロインジェクションにより受精卵へと移入される。マイクロインジェクションを受けた卵は、宿主雌性動物に移植され、そして導入遺伝子の発現について子孫がスクリーニングされる。トランスジェニック動物は、受精卵から作製され得、これらとしては、爬虫類、両生類、鳥類、哺乳動物および魚類が挙げられるが、これらに限定されない動物から作製され得る。特定の好ましい実施形態において、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３を過剰発現するか、または変異形態のポリペプチドを発現するトランスジェニックマウスが作製される。あるいは、ノックアウトマウスにＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３が存在しないことにより、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３タンパク質の喪失がインビボで細胞に与える影響の研究が可能になる。ノックアウトマウスはまた、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３関連の癌の発生についてのモデルを提供する。
【０１９８】
上記のように、トランスジェニック動物およびこのような動物に由来する細胞株は、特定の試験実験における用途を見出し得る。これに関して、野生型または変異体のＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３を発現し得るトランスジェニック動物および細胞株は、試験物質に曝され得る。これらの試験物質は、野生型Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３発現を増強する能力／および／またはＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３の発現もしくは機能を機能させるかもしくは損なう能力についてスクリーニングされ得る。
【０１９９】
本明細書中で言及されるプロモーター配列は、β−ガラクトシダーゼ発現を駆動するために使用され得る。トランスジェニックマウスにおけるβ−ガラクトシダーゼレポーター構築物の使用は、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３の発現を調節する因子を同定するために使用され得る。
【０２００】
（Ｔ．Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３を使用する癌を処置するための方法）
別の実施形態において、本発明はまた、癌の処置を包含する。本発明に従って処置され得る癌の型は、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３の関与によるのみで制限される。関与によって、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３が変異されることも異常であることさえも必要とせず、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３の過剰発現が、細胞内の他の病変を実際に克服し得る。従って、広範な種々の癌細胞が、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３治療を使用して処置され得、これらには、脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、小腸、血液細胞、膵臓、結腸、胃、子宮頸部、胸部、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、頭頸部、食道、口腔組織、骨髄および血液組織が挙げられる。
【０２０１】
多くの状況下で、癌細胞は、殺傷されることも、正常な細胞死または「アポトーシス」を受けるよう誘導されることも必要ではない。むしろ、意味のある処置を達成するために、必要なことは、腫瘍増殖をある程度に遅くさせることである。腫瘍増殖は、部分的または完全にブロックされてもよいが、いくらかの腫瘍退行が達成されてもよい。腫瘍負荷の「寛解」および「減少」のような臨床用語はまた、それらの通常の用語法を考慮して意図される。
【０２０２】
（１．遺伝子ベースの治療）
本発明者らによって意図される治療実施形態の１つは、いくつかの癌の腫瘍形成に関連する事象への分子レベルでの介入である。詳細には、本発明者らは、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３を癌細胞に提供し得る発現カセットを、それらの癌細胞に提供することを意図する。発現ベクターおよびそれに使用される遺伝子エレメントの長期にわたる考察が、参考としてこの節において援用される。特に好ましい発現ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルスベクターである。リポソームにカプセル化した発現ベクターもまた、好ましい。
【０２０３】
種々の経路が、種々の腫瘍型について意図される。経路についての以下の節は、可能な経路の広範なリストを含む。実質的に任意の腫瘍について、全身送達が意図される。これは、微視的な癌または転移性の癌を攻撃するために特に重要であることを示す。別々の腫瘍塊が同定され得る場合、種々の直接的、局所的および領域的なアプローチが採用され得る。例えば、腫瘍に、発現ベクターを直接注射し得る。腫瘍床は、切除前、切除中または切除後に処置され得る。切除後は、一般に、手術後に設置されたカテーテルによってベクターを送達する。腫瘍の血管系を利用して、支持する動脈または動脈に注射することによって腫瘍内にベクターを導入し得る。より遠位な血液供給経路もまた、利用され得る。
【０２０４】
異なる実施形態において、エキソビボ遺伝子治療が意図される。このアプローチは、骨髄に関連する癌の処置に特に適切であるが、これらに限定されない。エキソビボの実施形態において、患者由来の細胞を取り出し、そして少なくともいくらかの時間体外で維持する。この期間の間、治療が送達され、その後、細胞を患者に再導入し；望ましくは、サンプル中の任意の腫瘍細胞は、殺傷されている。
【０２０５】
（２．タンパク質治療）
別の治療アプローチは、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３のポリペプチド、活性フラグメント、合成ペプチド、模倣物またはそれらの他のアナログを被験体に提供することである。タンパク質は、組換え発現手段によって生成され得るか、また十分に小さい場合、自動ペプチド合成機によって生成され得る。処方物は、投与経路および目的に基づいて選択され得、これらには、リポソーム処方物および古典的な薬学的調製物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０６】
（３．免疫療法、従来の化学療法または放射線療法との組み合わせ治療）
ＤＮＡ損傷剤に対して耐性のある腫瘍細胞は、臨床腫瘍学における主要な問題を提示する。現在の癌研究の１つの目標は、化学療法および放射線療法の効力を改善する方法を見出すことである。１つの方法は、このような従来の治療法を遺伝子治療と組み合わせることによる。例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳ−ｔｋ）遺伝子は、レトロウイルスベクター系によって脳腫瘍に送達された場合、抗ウイルス剤ガンシクロビルに対する感受性を首尾よく誘導した（Ｃｕｌｖｅｒら、１９９２）。本発明の状況下で、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３置換療法は、化学療法または放射線療法の介入と組み合わせて同様に使用され得ることが意図される。上記のように、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３遺伝子治療と免疫療法とを組み合わせることもまた効果的であることが示され得る。
【０２０７】
本発明の方法および組成物を使用して、細胞を殺傷するため、細胞増殖を阻害するため、転移を阻害するため、脈管形成を阻害するため、あるいは腫瘍細胞の悪性表現型を逆転または減少するために、一般に、「標的」細胞にＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３発現構築物および少なくとも１つの他の薬剤を接触させる。これらの組成物は、細胞の増殖を殺傷または阻害するのに効果的な組み合わせの量で提供される。このプロセスは、細胞に、発現構築物およびこれらの薬剤または因子を同時に接触させることを包含し得る。これは、細胞に、両方の薬剤を含む単一の組成物または薬理学的処方物を接触させることによってか、または細胞に、２つの別々の組成物または処方物（ここで、一方の組成物が、発現構築物を含み、そして他方が、薬剤を含む）を接触させることによって達成され得る。
【０２０８】
あるいは、遺伝子治療処置は、数分から数週間の範囲の間隔で、他の薬剤処置に先行または後続し得る。他の薬剤および発現構築物を細胞に別々に適用する実施形態において、一般に、その薬剤および発現構築物が、細胞に対して有利な組み合わせの効果をなお発揮し得るように、各送達の時点間で有意な期間が経過しないことを確保する。このような例において、互いに約１２〜２４時間内、より好ましくは、互いに約６〜１２時間以内に、その両方の様式を細胞に接触させることが意図され、約１２時間のみの遅延時間が、最も好ましい。いくつかの状況において、処置期間を有意に延長することが望ましくあり得るが、その場合、それぞれの投与間で、数日（２、３、４、５、６または７日）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８週間）経過させる。
【０２０９】
Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３あるいは他の薬剤のいずれかの１回以上の投与が望ましいこともまた、想定される。以下に例示するような種々の組み合わせが使用され、ここでは、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３が「Ａ」であり、そして他の薬剤が「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ。
他の組み合わせが、意図される。また、細胞殺傷を達成するために、両方の薬剤が、細胞を殺傷するのに効果的な組み合わせの量で細胞に送達される。
【０２１０】
組み合わせ治療における使用に適切な薬剤または因子は、細胞に適用された場合にＤＮＡ損傷を誘導する任意の化学化合物または治療方法である。このような薬剤および因子としては、ＤＮＡ損傷を誘導する放射線および波動（例えば、γ−照射、Ｘ線、加速プロトン、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出など）が挙げられる。「化学療法剤」としても記載される、種々の化学化合物は、ＤＮＡ損傷を誘導するよう機能し、これら全ては、本明細書中に開示される組み合わせの処置方法における使用に意図される。使用されることが意図される化学療法剤としては、例えば、以下が挙げられる：シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イホスファミド、メルファラン、クロランブシル、ブルスファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、エストロゲンレセプター結合因子、タキソール、ゲンタマイシン、ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター、トランスプラチン（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセート、ならびに過酸化水素。本発明はまた、１以上のＤＮＡ損傷剤（放射線ベースまたは実際の化合物のいずれでも）の組み合わせの使用（例えば、シスプラチンとのＸ線の使用またはエトポシドとｎシスプラチンの使用）を包含する。特定の実施形態において、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３発現構築物と組み合わせたシスプラチンの使用は、この化合物として特に好ましい。
【０２１１】
本発明に従う癌の処置において、腫瘍細胞に、発現構築物に加えて、薬剤を接触させる。これは、局在化した腫瘍部位に放射線（例えば、Ｘ線、加速プロトン、ＵＶ光、γ線、またはマイクロ波でさえ）を照射することによって達成され得る。あるいは、腫瘍細胞に、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル、エトポシド、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、より好ましくは、シスプラチンのような化合物を含む治療有効量の薬学的組成物を被験体に投与することによって、薬剤を接触させ得る。上記のように、薬剤は、それをＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３発現構築物と組み合わせることによって、組み合わせ治療組成物またはキットとして調製および使用され得る。
【０２１２】
核酸（特に、ＤＮＡ）を直接架橋する薬剤は、ＤＮＡ損傷を促進することが想定され、これは、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３との相乗的な抗腫瘍性の組み合わせを導く。シスプラチンのような薬剤および他のＤＮＡアルキル化剤が、使用され得る。シスプラチンは、癌を処置するために広範に使用されており、その有効用量は、計３つの過程で３週間毎に５日間、２０ｍｇ／ｍ２の臨床的適用において使用される。シスプラチンは、経口的には吸収されず、従って、静脈内、皮下、腫瘍内または腹腔内の注射を介して送達されるべきである。
【０２１３】
ＤＮＡを損傷する薬剤としてはまた、ＤＮＡ複製、有糸分裂および染色体分離に干渉する化合物が挙げられる。このような化学療法化合物としては、アドリアマイシン（ドキソルビシンとしても公知）、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシンなどが挙げられる。これらの化合物は、新生物の処置のための臨床設定において広範に使用され、アドリアマイシンについては２１日間隔で２５〜７５ｍｇ／ｍ２の範囲の用量で静脈内にボーラス注射を介して投与され、エトポシドについては３５〜５０ｍｇ／ｍ２で静脈内またはその２倍の静脈内用量を経口的に投与される。
【０２１４】
核酸の前駆体およびサブユニットの合成および忠実度を破壊する薬剤もまた、ＤＮＡ損傷を導く。そのような多くの核酸前駆体が、開発されている。広範な試験を受けそして容易に利用可能な薬剤が、特に有用である。それ自体で、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のような薬剤は、新生物組織によって優先的に使用され、このことが、この薬剤を、新生物細胞に標的化するために特に有用なものとする。非常に毒性であるが、５−ＦＵは、広範なキャリア中で適用可能あり、３〜１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量での局所的ではあるが静脈内投与で通常使用される。
【０２１５】
ＤＮＡ損傷を引き起こし、そして広範に使用されている他の因子としては、γ線、Ｘ線、加速プロトン、として一般的に公知のもの、および／または腫瘍細胞への放射性同位体の直接送達が挙げられる。ＤＮＡ損傷因子の他の形態（例えば、マイクロ波およびＵＶ照射）も意図される。ほぼおそらく、これらの因子の全ては、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の構築および維持に対して、広範なＤＮＡ損傷をもたらす。Ｘ線についての投与量範囲は、長期期間（３〜４週間）についての５０〜２００レントゲンの日量から、２０００〜６０００レントゲンの単回用量にまでわたる。放射性同位体についての投与量範囲は、広範に変化し、そしてその同位体の半減期、放出される照射の強度およびタイプ、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【０２１６】
当業者は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、第３３章（特に、６２４〜６５２頁）に従う。投薬におけるいくつかのバリエーションは、処置される被験体の状態に依存して必然的に生じる。いずれにしろ、投与を担う人は、個々の被験体についての適切な用量を決定する。さらに、ヒト投与については、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓに要求される、滅菌基準、発熱基準、一般的な安全基準および純度基準を満たすべきである。
【０２１７】
本発明者らは、３ｐ２１．３に関連する癌を有する患者へのＦｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３発現構築物の局所的送達が、この臨床疾患を相殺するための治療効果的な遺伝子を送達するための非常に有効な方法であることを提唱する。同様に、化学療法または放射線療法は、被験体の身体の特定の罹患した領域に指向され得る。あるいは、発現構築物および／または薬剤の全身送達は、特定の状況下（例えば、広範な転移が生じている場合）で適切であり得る。
【０２１８】
Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３標的化治療と化学療法および放射線治療との組み合わせに加えて、他の遺伝子治療との組み合わせが有益であることもまた考えられる。例えば、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３およびｐ５３変異またはｐ１６変異を同時に標的化することにより、改良された抗癌処置を行い得る。おそらく、任意の他の腫瘍関連遺伝子（例えば、ｐ２１、Ｒｂ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＢＣＲＡ２、ｐ１６、ＦＨＩＴ、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＢＲＣＡ１、ＶＨＬ、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｍｓ、ｊｕｎ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ｂｃｌおよびａｂｌ）は、この様式で標的化され得る。
【０２１９】
前記の治療のいずれも、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３関連障害を処置する際にそれら自体で有用であると証明され得ることもまた示されるべきである。この点に関して、化学療法および非Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１、Ｇｅｎｅ２６、Ｂｅｔａ＊、Ｌｕｃａ１、Ｌｕｃａ２、ＰＬ６、１２３Ｆ２またはＳＥＭ  Ａ３の遺伝子療法の組み合わせへの言及はまた、これらのアプローチが別々に用いられ得ることを考慮して解釈されるべきである。
【０２２０】
（４．患者に投与するための処方および経路）
臨床適用が企図される場合、薬学的組成物（発現ベクター、ウイルスストック、タンパク質、抗体および薬物）を意図された適用に適切な形態で調製することが必要である。一般的に、これは、本質的に発熱物質、およびヒトまたは動物に有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを必要とする。
【０２２１】
一般的に、送達ベクターを安定にし、かつ標的細胞による取り込みを可能にする、適切な塩および緩衝液を用いることが望ましい。緩衝液はまた、組換え細胞が患者に導入される場合に用いられる。本発明の水性組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性培地に溶解または分散された、細胞に対して有効量のベクターを含む。このような組成物はまた、接種材料としても好ましい。句「薬学的にまたは薬理学的に受容可能な」とは、動物またはヒトに投与される場合、有害反応、アレルギー反応または他の都合の悪い反応を生じない分子実体および組成物をいう。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意のおよび全ての、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤および等張剤および吸収遅延剤などを包含する。薬学的に活性な物質のための、このような媒体および薬剤の使用は、当該分野において周知である。少しでも従来の媒体または薬剤が、本発明のベクターまたは細胞と不適合である場合を除いて、治療的組成物中でのその使用が企図される。補助的な活性成分もまた、組成物中に組込まれ得る。
【０２２２】
本発明の活性組成物は、古典的な薬学的調製物を包含し得る。本発明に従うこれらの組成物の投与は、その標的組織がその経路を介して利用可能な限り、任意の一般的な経路を介する。この経路としては、経口、鼻、口腔、直腸、腟内または局所が挙げられる。あるいは、正常注射（ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ）、皮内注射、皮下注射、筋内注射、腹腔内注射または静脈内注射によって投与され得る。このような組成物は、標準的には、薬学的に受容可能な組成物として投与される。処方の際に、溶液は投薬処方に適合した様式、および治療的に有効であるような量で投与される。
【０２２３】
（実施例）
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、従って、その実施のために好ましい形態を構成するとみなされ得ることが、当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、多数の変化が、開示される特定の実施形態においてなされ得、なお本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られ得ることを認識すべきである。より詳細には、化学的および生理学的の両方で関連した特定の試薬が、本明細書中に記載される試薬と置換され得るが、同じかまたは類似の結果が得られることは、明らかである。当業者に明らかな、全てのこのような類似の置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって規定されるような本発明の精神、範囲および概念の中にあるとみなされる。
【０２２４】
（実施例１．３ｐ２１．３クリティカル領域における３ｐ遺伝子の同定および３ｐ遺伝子のｃＤＮＡの単離）
３ｐ腫瘍サプレッサー領域を、適合した腫瘍／正常組織対におけるＬＯＨ領域を調査し、かつホモ接合欠失の異常な例を試験するために設計された対立形質によって同定した（図４）。肺癌において対立遺伝子欠失を示す、最も頻繁に関与した領域を３ｐ２１．３領域にマッピングした。さらに、複数の重複したホモ接合欠失は、ＳＣＬＣ株Ｈ７４０およびＳＣＬＣ株Ｈ１４５０における３ｐ２１．３染色体領域において見出され、これにより３ｐ２１．３領域における約７５０ｋｂに隣接する腫瘍サプレッサー遺伝子に調査が絞られた。９つの遺伝子（Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、ＮＰＲＬ２（Ｇｅｎｅ２１）、ＣＡＣＮＡ２Ｄ２（Ｇｅｎｅ２６）、ＨＹＡＬ１（Ｌｕｃａ１）、ＨＹＡＬ２（Ｌｕｃａ２）、ＰＬ６、１２３Ｆ２およびＢｅｔａ＊）は、分裂されるか、または３ｐ２１．３領域において見出される約３５ｋｂのホモ接合欠失に直接隣接していた。ＳＥＭ  Ａ３もまた、３ｐ２１．３領域に存在する。これらの遺伝子のｃＤＮＡは、単離およびクローン化され、そしてこれらの遺伝子における変異を、種々の腫瘍ならびに一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）およびＤＮＡ配列決定分析による腫瘍細胞株において決定した（表４）。ｃＤＮＡクローンの一部は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて公知の遺伝子に対して約５０％のアミノ酸相同性を示し、いくらかは、ＧｅｎＢａｎｋにおいてランダム配列タグ化部位に対する完全なＤＮＡ配列の相同性が実証され、そして、１つの遺伝子、Ｂｅｔａ＊は、以前は未知であった（表４）。
【０２２５】
（表４．１２５ｋｂの３ｐ２１．３クリティカル領域において同定された遺伝子およびそれらのｃＤＮＡ配列決定および変異分析の状態）
【０２２６】
【表４】
0004813746.tif 000008
＊他の公知の遺伝子に対する、予測されるアミノ酸配列の相同性としては、以下が挙げられる：ＣＡＣＮＡ２Ｄ２（Ｇｅｎｅ２６）、電位型Ｃａ２＋チャネルα２δ調節サブユニット；ＮＰＲＬ２（Ｇｅｎｅ２１）、窒素パーミアーゼ制御因子；１２３Ｆ２、Ｒａｓ結合タンパク質のＭａｘｐ１／Ｎｏｒｅｌホモログ；ＨＹＡＬ２（ＬＵＣＡ−２）およびＨＹＡＬ１  （ＬＵＣＡ−１）、ヒアルロニダーゼのファミリー。
＊＊アミノ酸配列を変更した変異のみが示される。さらに、１つより多くの腫瘍において見出され、かつアミノ酸配列を変更しなかった多型は、示されない。
【０２２７】
（実施例２．３ｐ遺伝子の組換えアデノウイルスベクターの構築）
アデノウイルスベクターは、インビトロ、動物モデル、臨床前調査、およびヒト臨床遺伝子治療試行において、遺伝子送達のために広く使用されている。形質導入の高い有効性および種々の細胞型におけるアデノウイルスベクターによって媒介される導入遺伝子の高レベルの発現のために、３ｐ遺伝子を発現する組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ−３ｐｓ）は、機能的な野生型３ｐ遺伝子を、３ｐまたは３ｐ遺伝子の異常性を伴う腫瘍または腫瘍細胞株に導入するための有効なツールとなる。
【０２２８】
３ｐ２１遺伝子の組換えアデノウイルスベクターとしては、Ｇｅｎｅ２１、Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２６、１２３Ｆ２Ｓ、Ｌｕｃａ１、およびＢｅｔａ＊が挙げられ、このアデノウイルスベクターは、本発明者らが近年開発したライゲーション媒介プラスミド−アデノウイルスベクター構築系、ｐＡｄ−ＲＡＰおよびｐＡｄ−ＲＡＰ−Ｓｈｕｔｔｌｅを使用して、構築された。本発明者らは、この系を使用して、首尾良くかつ迅速に、３ｐ２１．３領域における１０個全ての遺伝子について組換えアデノウイルスベクターおよび多数の他の組換えベクターを構築した。組換えＡｄ−３ｐｓは、インビトロで標的細胞を直接感染させることによって、およびインビボでベクターの静脈内注射または局所注射によって、効果的に３ｐ遺伝子を種々の細胞型に送達し、そしてこれら種々の細胞型において３ｐ遺伝子を発現し得る。染色体３ｐにおける腫瘍サプレッサー３ｐ２１．３遺伝子の相対的なゲノム位置、および３ｐ遺伝子の組み換えアデノウイルスベクターの構造は、概略的に実証される（図５）。
【０２２９】
本発明者らは、ｐＡｄ−ＲＡＰおよびｐＡｄ−ＲＡＰ−Ｓｈｕｔｔｌｅと命名した、新規のライゲーション媒介プラスミド−アデノウイルスベクター構築系を開発した。この系を使用して、細菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて組換えアデノウイルス含有プラスミドを迅速に構築し得、次いで、首尾良く、哺乳動物宿主２９３細胞において同種アデノウイルスを産生し得る（図１）。この系において、導入遺伝子（Ｘ）を、まず、プラスミドシャトルベクター（ｐＡｄ−ＲＡＰ−Ｓｈｕｔｔｌｅ）中に配置する。このベクターは、アデノウイルス逆方向反復末端（ＩＲＴ）配列、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリ（Ａ）シグナル配列の発現カセット、ならびに、ＩＲＴ−ＣＭＶ複数クローニング部位ＢＧＨ配列の５’末端および３’末端において、それぞれ、２つの特有な制限部位ＢｓｔＢＩおよびＣｌａＩを含む。次いで、ＩＲＴ−ＣＭＶ−Ｘ−ＢＧＨを含むＢｓｔＢＩ／ＣｌａＩ放出ＤＮＡフラグメントをアデノウイルスプラスミドスベクター（ｐＡｄ−ＲＡＰ）に挿入する。このベクターは、ＢｓｔＢＩ部位およびＣｌａＩ部位を用いたインビトロでのライゲーションにより、完全なＥ１およびＥ３欠失アデノウイルス５型ゲノムおよび３つの特有な制限部位（ＰａｃＩ、ＢｓｔＢＩおよびＣｌａＩ）を含む。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉへの形質転換の後、９０％の形質転換体が正確な挿入を有する。最終的に、得られたプラスミドのＰａｃＩ／ＢｓｔＢＩ消化によって、３ｐ遺伝子を含む全体のアデノウイルスゲノムの放出が可能になる。次いで、組換えＡｄ−Ｘ  ＤＮＡを２９３細胞にトランスフェクトし、組換えＡｄ−Ｘの同種集団を得る。他のプロモーター、ポリＡ配列および制限部位を使用し得る。この系を使用して、２〜４週間以内に組換えアデノウイルスを迅速に構築し得る。比較した場合、哺乳動物細胞において同種組換えを使用するような従来の方法は、通常、３〜１２ヶ月かかる。
【０２３０】
宿主２９３細胞における導入遺伝子の可能な細胞傷害性に起因して、特定の組換えアデノウイルスを産生するのに失敗した場合、図２に実証されるような、テトラサイクリンの存在下で導入遺伝子発現を遮断し得るテトラサイクリン調節エレメント（ＴＲＥ）を用いる、ｐＡｄ−ＲＡＰ−ＴｅｔＲ−ＯｆｆおよびｐＡｄ−ＲＡＰ−ＴＲＥ−ＣＭＶ−Ｓｈｕｔｔｌｅと命名した類似システムが開発されており、このようなベクターの産生のために使用され得る。
【０２３１】
Ａｄ−ＣＭＶ−ＧＦＰ（Ａｄ−ＧＦＰ）およびＡｄ−ＣＭＶ−ＬａｃＺベクターを、ウイルスベクターによる形質導入の有効性をモニタリングするため、そして非特異的導入遺伝子発現コントロールとして使用した。Ａｄ−Ｅ１−（Ａｄ−ＥＶ）（空のＥ１ベクター）を、陰性コントロールとして使用する。ウイルスタイターを、光学密度測定およびプラークアッセイの両方によって決定した。野生型ウイルスによるウイルス調製物の潜在的な汚染を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析によってモニタリングした。ウイルスベクターにおける３ｐ遺伝子の配列を、自動化ＤＮＡ配列決定によって確認した。得られたＡｄ−３ｐｓを、それぞれ、Ａｄ−１０１Ｆ６、Ａｄ−Ｇｅｎｅ２６、Ａｄ−Ｇｅｎｅ２１、Ａｄ−Ｆｕｓ１、Ａｄ−ＰＬ６、Ａｄ−Ｌｕｃａ１、Ａｄ−Ｌｕｃａ２、Ａｄ−１２３Ｆ２Ｓ、Ａｄ−Ｂｅｔａ＊、およびＡｄ−ＳＥＭ  Ａ３と命名した。
【０２３２】
（実施例３．ＰＡＤ３ｐｓの調製）
プロタミン−アデノウイルス（ＰＡＤ）複合体の調製ならびにインビトロおよびインビボでのＰＡＤによる形質導入の有効性の増大が報告されている（Ｃｌａｒｋら、１９９９、Ｌａｎｕｔｉら、１９９９）。プロタミン−アデノウイルス複合体を、１×１０１０ウイルス粒子を５０μｇの硫酸プロタミン（１０ｍｇ／ｍｌ）と単純に混合することによって調製した。この複合体を１０分間室温でインキュベートして、次いでこの複合体化アデノウイルスを、指定のインビトロまたはインビボ実験のために、適切な容量のＰＢＳ中に希釈した。
【０２３３】
（実施例４．ＬＤＣ３ｐｓおよびＬＰＤ３ｐｓの調製）
リポソーム（ＤＯＴＡＰ：コレステロール）（ＬＤＣ）、プラスミドＤＮＡおよびＬＤＣ−３ｐ  ＤＮＡ複合体（ＬＤＣ３ｐｓ）をＴｅｍｐｌｅｔｅｎら（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら、１９９７）によって記載されるように調製した。ＬＤＣ３ｐｓを、１匹のマウスに対する静脈注射用に８０ｎｍｏｌのリポソーム：１００μｌの全容量において５％  Ｄｅｘｔｒａｌ水（Ｄ５Ｗ）中の５０μｇのＤＮＡとして処方した。リポソーム（ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）：プロタミン：ＤＮＡ（ＬＰＤ）をＨｕｎｇ（ｌｉら、１９９８）の方法に基づいて調製した。
【０２３４】
（実施例５．腫瘍細胞増殖に対する３ｐ遺伝子の過剰発現の影響）
新規な腫瘍サプレッサー遺伝子の生物学的機能を研究するために、野生型遺伝子発現プラスミドによって過渡的にまたは安定にトランスフェクトされた腫瘍細胞株において、実験を通常通りに行った。Ａｄ−３ｐベクターは、インビトロおよびインビボでの３ｐ遺伝子送達に関するプラスミドに対して、いくつかの利点を提供し得る。１）形質導入の高い有効性（＞８０％）および高レベルの３ｐ遺伝子発現は、標的細胞に対するウイルス粒子の感染多重度（ＭＯＩ）を単純に調節することによって、細胞型の広いスペクトルにおいて容易に達成され得る。従って、Ａｄ−３ｐｓを使用して、個々の領域または全領域として３ｐ遺伝子の有効性を評価し得る；２）Ａｄ−３ｐｓ形質導入を、腫瘍細胞に直接適用して、安定に形質導入されたコロニーの選択なしに動物において腫瘍形成能に対するそれらの影響を研究し得、これによって、コロニー選択プロセスに関連した問題および得られた細胞コロニーにおいて生じる未知のエフェクターまたは因子を回避し得る；そして、３）Ａｄ−３ｐｓを直接使用して、個々のＡｄ−３ｐベクターまたは組み合わせたＡｄ−３ｐベクターを用いて動物に静脈内注射または腫瘍内注射することによってインビボでの腫瘍サプレッサー遺伝子領域としての３ｐ遺伝子の役割を評価し得る。
【０２３５】
これらの新規に単離された３ｐ遺伝子の生物学的機能は、インビトロおよびインビボの両方で、リポソーム媒介遺伝子移入および組換えアデノウイルスベクター媒介遺伝子移入によって、本発明において特徴付けられる。ヒト肺癌細胞株（Ｈ１２９９、Ｈ３５８、Ｈ４６０およびＡ５４９）は、様々な状態の染色体３ｐまたは個々の３ｐ遺伝子および正常なヒト気管支上皮細胞（ＨＢＥＣ）株を伴い、これらを、細胞増殖阻止、増幅、アポトーシスおよびインビトロでの細胞周期動力学に対する３ｐ遺伝子の効果、ならびに動物モデルにおける一次腫瘍および転移性腫瘍の増殖に対する効果を評価するために使用した。
【０２３６】
３ｐ遺伝子がインビトロで腫瘍サプレッサーとして機能するという仮説を試験するために、本発明者らは、種々のヒト非小細胞肺癌細胞、ならびにリポソーム媒介３ｐ遺伝子移入もしくはアデノウイルスベクター媒介３ｐ遺伝子移入により様々な状態の３ｐ染色体構造または遺伝子および遺伝子産物（表５）を有する正常ヒト気管支上皮細胞株（ＨＢＥＣ）において、細胞増殖に対する３ｐ遺伝子の過剰発現の効果を研究するために、一連の実験を行った。これらの株の１つは、Ｈ１２９９（ｐ５３の内部ホモ接合欠失を含むＮＳＣＬＣ細胞株）であり、３ｐ対立遺伝子のＬＯＨを有する染色体３の正常なコピーを有さず、非常に高レベルのテロメラーゼ発現および活性を有する。Ａ５４９は、異常な３ｐ対立遺伝子を有する野生型ｐ５３を含む肺癌細胞株であり；Ｈ３５８は、２つの３ｐ対立遺伝子を有する野生型ｐ５３を含む肺癌細胞株であり；そして、Ｈ４６０は、３ｐ２１．３領域のｎｏｅ対立遺伝子欠失を有する野生型ｐ５３を含む肺癌細胞株である（表５）。正常なＨＢＥＣまたは繊維芽細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）をまた使用して、３ｐ遺伝子およびＡｄ−３ｐの一般的な細胞傷害性を評価し得る。２９３細胞株をアデノウイルスベクターの構築、増幅および滴定に使用し得る。細胞を、１０％ＦＢＳを有する４．５ｇ／ｌのグルコースを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＤＭＥＭ）中に維持した。
【０２３７】
（表５．ヒト肺癌細胞株および正常ＨＢＥＣ＊における３ｐ遺伝子の状態）
【０２３８】
【表５】
0004813746.tif 000009
＊略語：ＨＢＥＣ、ヒト気管支内皮細胞、ＮＳＣＬ、非小細胞肺癌、ＬＯＨ、ホモ接合欠損、ＷＴ、野生型。
【０２３９】
本発明において開発されたＡｄ−３ｐベクター、プロタミン−Ａｄ−３ｐ複合体（ＰＡＤ３ｐ）またはリポソーム（ＤＯＴＡＰ）−３ｐプラスミドＤＮＡ  複合体（ＬＰＤ３ｐ）を使用して、効率的に３ｐ遺伝子を、インビトロでの直接形質導入によって腫瘍細胞に、およびインビボでの全身投与によって原発性腫瘍部位および遠位の肺腫瘍部位または他の転位性腫瘍部位に送達し得る。ヒト肺癌Ｈ１２９９およびＡ５４９ならびに他の癌の自発性または実験的な肺転位性モデルを使用して、腫瘍進行に対する３ｐ遺伝子の効果、ならびにＰＡＤ３ｐまたはＬＰＤ３ｐ複合体の静脈内注射を介してマウスの肺転移性腫瘍の全身処置による転位を研究し得る。
【０２４０】
Ｈ１２９９細胞におけるリポソーム媒介３ｐ遺伝子移入の実験において、９個の遺伝子からの６個の遺伝子（Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、Ｌｕｃａ１、１２３Ｆ２Ｓ、Ｂｅｔａ＊、およびＧｅｎｅ２１）が、非トランスフェクトおよび空のＣＭＶベクターでトランスフェクトされたコントロールと比較して、トランスフェクションの４８時間後に、Ｈ１２９９形質転換体において細胞増殖阻害の様々な程度（２０〜６５％）を実証した。３つの他の遺伝子（Ｇｅｎｅ２６、ＰＬ６およびＬｕｃａ２）は、同じ実験条件下でＨ１２９９細胞増殖に対して有意な効果を示さなかった（表６）。Ｈ１２９９細胞増殖に対するＦｕｓ１、Ｂｅｔａ＊、１２３Ｆ２ＳおよびＧｅｎｅ２１の観察された阻害効果は、同じ実験条件下で、高度に細胞傷害性の遺伝子Ｂａｋの阻害効果と比較可能であった（表６）。３つの他の遺伝子（Ｇｅｎｅ２６、ＰＬ６およびＬｕｃａ２）は、同じ実験条件下でＨ１２９９細胞増殖に対する有意な効果を示さなかった。アポトーシス誘導の変化した程度（１０〜４０％）、および変更した細胞周期動力学（Ｇ０、Ｇ１およびＳ相で細胞集団の変化）を、ＴＵＮＥＬ反応およびＰＩ染色を用いるＦＡＣＳ分析によって遺伝子Ｆｕｓ１、１０１Ｆ６、１２３Ｆ２Ｓ、ＬｕｃａおよびＢｅｔａ＊を含むプラスミドでトランスフェクトしたＨ１２９９細胞において観察した。
【０２４１】
（表６．Ｈ１２９９細胞に対するＤＯＴＡＰ媒介３ｐ遺伝子発現の効果（４８時間））
【０２４２】
【表６】
0004813746.tif 000010
１空のプラスミドトランスフェクト細胞のものに対する、３ｐ遺伝子発現プラスミドＤＮＡトランスフェクト細胞におけるコロニー形成アッセイからのデータ。ＮＤ、未決定；ＳＴＤＥＶ、反復実験の平均からの標準偏差。
【０２４３】
腫瘍細胞増殖に対する３ｐ遺伝子の効果を、種々の肺癌細胞株および正常なＨＢＥＣ株における組換えアデノウイルスベクター媒介３ｐ遺伝子移入によってさらに特徴付けた。腫瘍細胞増殖に対する１０１Ｆ６、Ｆｕｓ１およびＧｅｎｅ２１過剰発現の観察された阻害効果の特異性、ならびに過剰に発現された３ｐ遺伝子の潜在的な細胞傷害性を試験するために、本発明者らは、Ａｄ−３ｐ形質導入された野生型３ｐ含有Ｈ３５８細胞および正常なＨＢＥＣ細胞における細胞増幅に対するこれらの３ｐ遺伝子の影響を分析した（図６）。各株における細胞を、ウイルス粒子／細胞（ｖｐ／ｃ）において種々の感染多重度（ＭＯＩ）で投与されたＡｄ−１０１Ｆ６、Ａｄ−ｆｕｓ１、およびＡｄ−Ｇｅｎｅ２１ベクターによってインビトロで形質導入した；ＰＢＳで処理した細胞をモック（ｍｏｃｋ）として、空ベクターＡｄ−ＥＶをネガティブとして、Ａｄ−ＬａｃＺを非特異的として、そしてＡｄ−ｐ５３を陽性コントロールとして、それぞれ使用した。非形質導入コントロール細胞と比較した場合、種々のＭＯＩで、Ａｄ−３ｐ形質転換ＨＢＥＣにおいて１０％未満の細胞生存度損失、およびＨ３５８細胞において２０％未満の細胞生存度損失が観察された。類似の損失もまた、Ａｄ−ＥＶ形質導入細胞およびＡｄ−ＬａｃＺ形質導入細胞において観察され、形質導入後の時間経路の全体を通じて、Ａｄ−ｐ５３形質導入細胞においてわずかに高い損失が観察され、全般的な細胞傷害性がこれらの３ｐ遺伝子の過剰発現に関連していないことが示唆される。形質導入の効率を、蛍光顕微鏡下でＡｄ−ＧＦＰ形質導入細胞集団におけるＧＦＰ発現細胞を試験することによって決定した。
【０２４４】
アデノウイルスベクターの形質導入の効率は、各細胞株に適用された最も高いＭＯＩにおいて８０％よりも高かった。細胞増殖を、それぞれ、形質導入後１日、３日および５日での細胞生存度を決定することによって分析した。細胞生存度は、Ａｄ−１０１Ｆ６、Ａｄ−Ｆｕｓ１およびＡｄ−Ｇｅｎｅ２１を形質導入した、Ａ５４９細胞およびＨ４６０細胞において有意に減少し、これらは３ｐ領域においてＬＯＨを阻害するが、３ｐ領域およびｐ５３のホモ接合欠失を含む野生型ｐ５３およびＨ１２９９細胞を含む（図６）。全ての場合において、形質導入細胞の生存度を、非形質導入（ＰＢＳ処置）コントロール細胞（この生存度は１００％に設定された）の生存度と比較した。
【０２４５】
これらのＡｄ−３ｐ形質転換体における３ｐ遺伝子の過剰発現を、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって評価し、そしてβアクチンＤＮＡについてのヒト全ＲＮＡ、プライマーおよびＴａｑＭａｎプローブの既知の濃度を、標準としておよび内部コントロールとして使用した（図７）。３ｐ遺伝子のＴａｑＭａｎプローブおよびプライマーを、Ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｒｅｓｓソフトウエア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して設計した。ヒトゲノムＤＮＡまたは全ＲＮＡを、テンプレート標準として使用し、そしてヒトβアクチンまたはグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ＴａｑＭａｎプローブおよびプライマーをコントロールとして使用した。全ＲＮＡを、ＴＲＩＺＯＬを使用して、Ａｄ−３ｐ形質導入腫瘍細胞または腫瘍試料から単離した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲ産物の定量化を行い、そしてＴａｑＭａｎ  Ｇｏｌｄ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ，  ａｎ  ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍおよび備え付けのソフトウエアを使用して分析した。これらの結果は、これらの３ｐ遺伝子の過剰発現がインビトロで腫瘍細胞増殖を阻害し得ることを示している。
【０２４６】
（実施例６．腫瘍細胞増殖および増幅に対する３ｐ遺伝子の影響）
３ｐまたは３ｐ遺伝子の異常性を有する種々の肺癌細胞の増殖特性が、野生型３ｐ遺伝子の導入によって変更され得るか否かを試験するために、指定した形質導入後時間間隔における種々のＭＯＩでのＡｄ−３ｐ形質導入腫瘍細胞における細胞生存度を、以前に記載されたような（Ｈｅら、１９９８）、ＸＴＴ染色によってアッセイし、非形質導入細胞およびＡｄ−ＥＶ−、Ａｄ−ＧＦＰ−またはＡｄ−ＬａｃＺ形質導入細胞を、コントロールとして使用した。各実験を、二連または三連に与えられた各処置によって、少なくとも３回繰返した。Ａｄ−３ｐ形質導入細胞の増幅を、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の細胞内への取り込みについて免疫蛍光酵素結合イムノソルベント検定法によって分析した。Ａｄ−３ｐ形質導入した正常なＨＢＥＣを使用して、インビトロでの３ｐ遺伝子およびＡｄ−３ｐの可能な一般の細胞傷害性を評価した。Ａｄ−３ｐ形質導入細胞における３ｐ遺伝子の転写および発現を、抗３ｐタンパク質ポリクローナル抗体を用いた逆転写酵素連鎖反応またはノーザンブロットおよびウエスタンブロット分析によって試験した。
【０２４７】
（実施例７．Ａｄ−３ｐ形質導入細胞における３ｐ遺伝子の発現のウエスタンブロット分析）
Ａｄ−３ｐ形質導入細胞における３ｐ遺伝子電子の発現を、推定３ｐアミノ酸配列から誘導されたポリペプチドに対するポリクローナル抗体、または３ｐ融合タンパク質におけるＦＬＡＧタグのｃ−ｍｙｃに対するモノクローナル抗体を使用するウエスタンブロットによって分析した。６０ｍｍディッシュ（１〜５×１０６／ウェル）において増殖した細胞を、Ａｄ−３ｐを用いて処理し、そしてＰＢＳ単独をコントロールとして使用した。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。各レーンを、約６０μｇ細胞溶解物タンパク質で充填し、１００Ｖで１〜２時間電気泳動した。次いで、タンパク質をゲルからＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬＴＭ膜に移した。膜をブロッキング溶液（３％乾燥乳、ＰＢＳ中の０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で、室温で１時間ブロックした。次いで、膜を、ウサギ抗ヒト３ｐペプチドまたは、抗ｍｙｃまたはＦＬＡＧモノクローナル抗体の１：１０００の希釈液と共にインキュベートし、そして、マウス抗βアクチンモノクローナル抗体の１：１０００の希釈液と共にインキュベートした。免疫複合体を、ＥＣＬＴＭ  キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して、二次ＨＲＰ標識化ウサギ抗マウスＩｇＧ、またはヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて検出した。
【０２４８】
（実施例８．Ａｄ−３ｐ形質導入腫瘍細胞における３ｐ遺伝子によるアポトーシスの誘導）
外因性３ｐ遺伝子のアポトーシス誘導能およびＡｄ−３ｐ形質導入Ｈ１２９９、Ａ５４９、Ｈ４６０、Ｈ３５８およびＨＢＥＣ細胞における細胞周期プロセスに対するそれらの効果を、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）反応を使用したＦＡＣＳによって分析した（図８）。アポトーシスの誘導を、Ａｄ−３ｐ形質導入Ｈ１２９９（図８Ａ）、Ａ５４９（図８Ｂ）およびＨ４６０（図８Ｃ）細胞において検出したが、Ｈ３５８（図８Ｄ）およびＨＢＥＣ（図８Ｅ）細胞においては検出されなかった。細胞の１５〜２０％、４０〜６５％および７５％より多くが、それぞれ、形質導入Ｈ１２９９、Ａ５４９およびＨ４６０細胞においてＡｄ−１０１Ｆ６、Ａｄ−Ｆｕｓ１およびＡｄ−Ｇｅｎｅ２１を用いての形質導入後５日で死んだのに対して、それぞれ、ＰＢＳ単独で処理され、そしてＡｄ−ＥＶベクターで形質導入された細胞のわずか約７％および１０％が、同じ期間でＴＵＮＥＬ陽性であった。Ａｄ−３ｐ形質導入細胞におけるアポトーシスの誘導レベルは、形質導入後の時間と共に増加し、そして細胞の生存度と相関した（図６）。３ｐ遺伝子による腫瘍細胞増幅の阻害は、アポトーシスの誘導を介して直接または間接的に媒介される。
【０２４９】
（実施例９．アポトーシスの誘導および細胞周期動力学Ａｄ−３ｐ形質導入細胞の変更）
腫瘍サプレッサー遺伝子による腫瘍細胞成長および増殖の阻害は、一般的に、アポトーシスの誘導および細胞周期プロセスの変更によって特徴付けられる。従って、３ｐ遺伝子誘導アポトーシスおよび細胞周期動力学を、フルオレセインソチオシアネート標識化ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いる末端デオキシトランスフェラーゼデオキシウリジルトリホスフェート（ｄＵＴＰ）ニック末端標識化（ＴＵＮＥＬ）反応を使用するフローサイトメトリおよびヨウ化プロピジウム染色によってそれぞれ分析した。簡潔には、細胞（１×１０６／ウェル）を６つのウェルプレートに播種し、そして、Ａｐ−３ｐ構築物を用いて形質導入し；未処理の細胞、Ａｄ−ＥＶ形質導入細胞、Ａｄ−ＧＦＰ形質導入細胞またはＡｄ−ＬａｃＺ形質導入細胞を、コントロールとして使用した。細胞を設計した形質導入後の設定した時間に収集し、次いで、前記のように、ＤＮＡ断片化およびアポトーシスについてＴＵＮＥＬ反応により、ならびにＤＮＡ含有量および細胞周期状態についてフローサイトメトリを使用するヨウ化プロピジウム染色によってそれぞれ、分析した。Ａｄ−１０１Ｆ６、Ａｄ−Ｆｕｓ１およびＡｄ−Ｇｅｎｅ２１形質導入細胞における細胞周期プロフィールは、形質導入後３日目での非形質導入およびＡｄ−ＥＶ形質導入コントロールにおけるものと比較して、後期Ｇ２期およびＳ期段階でのこれらの遺伝子の過剰発現によって有意に影響を受けるようであった（図９）。
【０２５０】
（実施例１０．インビボでの３ｐ遺伝子の過剰発現による腫瘍増殖の抑制）
３ｐ遺伝子（１０１Ｆ６、Ｆｕｓ１、およびＧｅｎｅ２１）の腫瘍サプレッサー機能を、ヌードマウスのＡ５４９皮下腫瘍にこれらのＡｄ−３ｐベクターを直接的に腫瘍内注入することにより、インビボで評価した（図１０）。腫瘍の増殖を最初の注入から最後の注入後２０日目まで記録した。Ａｄ−１０１Ｆ６、Ａｄ−Ｆｕｓ１、およびＡｄ−Ｇｅｎｅ２１で処理したマウス中の全ての腫瘍の増殖は、腫瘍と比較して有意に抑制されたことが示された。
【０２５１】
（実施例１１．インビボでの腫瘍形成および腫瘍増殖に対する３ｐ遺伝子の発現の効果）
腫瘍形成研究のために、Ｈ１２９９細胞またはＡ５４９細胞を、モックコントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、陰性コントロールとしてＡｄ−ＥＶ、および非特異的コントロールとしてＡｄ−ＬａｃＺを用いた適切なＭＯＩで、Ａｄ−３ｐを用いてインビトロで形質導入した。形質導入した細胞を、それぞれ、形質導入後２４時間および４８時間で収集した。細胞の生存性を、トリパンブルー排除染色により決定した。次いで、生存細胞（１×１０７）を、６〜８週齢の雌ヌードマウスの右側腹部に皮下注入した。マウスにおける腫瘍形成を、週に２または３回、３ヶ月間まで観察した。腫瘍の寸法を２または３日毎に測定した。
【０２５２】
腫瘍増殖に対する３ｐ遺伝子の効果を研究するために、Ｈ１２９９細胞またはＡ５４９細胞を用いて、ヌードマウスにおいて皮下腫瘍を構築した。簡潔にいうと、１×１０７細胞を、６〜８週齢の雌ヌードマウスの右側腹部に注入した。腫瘍が直径５〜１０ｍｍに達したとき（注入後約２週間）、この動物に、Ａｄ−３ｐベクターおよびコントロールベクターを、それぞれ１０〜１２日以内に４〜５回、単位腫瘍あたり総用量３〜５×１０１０ｐｆｕで腫瘍内注入した。腫瘍の大きさを、上記のようにして測定および算出した。この実験の最後に、この動物を殺傷し、そして腫瘍を切り出し、病理学的および免疫組織化学的分析のために処理した。
【０２５３】
（実施例１２．インビボでのプロタミン−アデノウイルス複合体媒介の３ｐ遺伝子の移入による肺転移性腫瘍増殖の阻害）
本発明者らは、インビトロでのアデノウイルス媒介性遺伝子移入の有効性の増強のため、およびプロタミン／アデノウイルス複合体の静脈内注入によるインビボでの組換えアデノウイルスの肺および他の器官への全身送達のために、新規のプロタミン／アデノウイルス複合体を開発した。プロタミン（Ｐｒｏｔｅｍｉｎｅ）−Ａｄ−３ｐ複合体（ＰＡＤ３ｐ）を用いて、ヌードマウスのＡ５４９実験用肺転移モデルにおける肺転移性腫瘍増殖に対する３ｐ遺伝子の過剰発現の効果を研究した（図１１）。転移性腫瘍増殖は、ＰＡｄ−１０１Ｆ６処理マウス、ＰＡｄ−Ｆｕｓ１処理マウス、およびＰＡｄ−Ｇｅｎｅ２１処理マウスにおいて、コントロール群におけるこれらと比較して有意に阻害された。これらのデータは、Ａｄ−３ｐ処理皮下腫瘍から獲得された結果と一致する。従って、３ｐ遺伝子は、インビボでの腫瘍増殖の抑制および腫瘍進行の阻害において役割を果たす。
【０２５４】
（実施例１３．インビボでのＬＰＤ３ｐ媒介またはＰＡＤ３ｐ媒介の３ｐ遺伝子移入による転移性腫瘍増殖に対する３ｐ遺伝子の効果）
Ｈ１２９９細胞またはＡ５４９細胞の実験用肺転移モデルを用いて、ＰＡＤ３ｐまたはＬＰＤ３ｐのいずれかの複合体の静脈内注入を通じた肺転移性腫瘍の全身性処置による、腫瘍の進行および転移に対する３ｐ遺伝子の効果を研究した。２００μｌ  ＰＢＳ中のＡ５４９細胞（１〜２×１０６）を用いてヌードマウスを、そしてＨ１２９９細胞（１〜２×１０６）を用いてＳＣＩＤマウスを、それぞれ微量（ｉｎｔｒａ  ｖｅｎｉａｌｌｙ）接種した。実験用転移性腫瘍コロニーは、接種後７〜１０日目に形成された。ＰＡＤ３ｐ複合体およびコントロール複合体を、２日毎に３回、各々２〜５×１０１０ウイルス粒子／２００〜５００μｇプロタミンの用量（単位動物当たり総容量２００μｌ）で静脈内注入により動物に投与した。あるいは、ＬＰＤ３ｐを、１日毎に６回、各々１２０ｎｍリポソーム：６μｇプロタミン：５０μｇＤＮＡの用量（単位動物当たり総容量２００μｌ）で静脈内注入により適用した。動物を、最後の注入後２週間で殺傷した。肺転移性腫瘍を、インディアンインク（Ｌｉら、１９９８）を用いて染色し、肺の表面上の腫瘍コロニーを、解剖顕微鏡の下で計数し、次いで肺組織を、さらなる病理学的および免疫組織化学的分析のために切り出した。
【０２５５】
（実施例１４．テロメラーゼ活性および細胞不死の分析）
細胞不死に関連する酵素テロメラーゼの活性化は、ヒト癌の発症における重要な工程を構成し得る。肺癌細胞におけるテロメラーゼのほぼ普遍的に調節されない発現、およびテロメラーゼ抑制調節経路における３ｐ遺伝子の関与についての証拠に起因して、野生型３ｐ２１．３遺伝子の導入により与えられる腫瘍細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈおよびｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の変化が、Ａｄ−３ｐ形質導入体における抑制されたテロメラーゼ活性に関係するか否かを研究することが重要である。テロメラーゼ活性をアッセイするために、形質導入されていない細胞およびＡｄ−３ｐで形質導入された細胞ならびにコントロールベクターで形質導入された細胞（１０５）を、以前に記載された通りに収集および調製した（Ｗｕら、１９９８）。およそ１０３、１０２、または１０１個の細胞に相当する細胞抽出物を、各々のテロメラーゼアッセイに使用した。１０〜１００個程度の肺癌細胞におけるテロメラーゼ活性を検出し得る、標準的なテロメア反復増幅プロトコル手順を、記載されるように改変して実施した（Ｐｅｌｌｅｇａｔａら、１９９６、Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉら、１９９８、Ｋａｇａｗａら、１９９９）。
【０２５６】
（実施例１５．肺癌および乳癌ならびに悪性表現型の抑制における１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）（３３９））
（Ｉ．１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１）遺伝子の特徴付け）
１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）遺伝子が、肺癌および乳癌において変異しているか否かを決定するために、本発明者らは、ゲノムＤＮＡに対する一本鎖コンホメーション多型アッセイを使用して、ＲＡＳＳＦ１Ａアイソフォームの広範な変異分析を実施した。本発明者らは、以前に、７７の肺癌細胞株サンプルにおいてＲＡＳＳＦ１Ｃ変異を見出せなかった（３４６）。参照としてＲＡＳＳＦ１Ａ配列を使用することにより、本発明者らは、以下に挙げるいくつかの多型を見出した：コドン２１（ＡＡＧからＣＡＧ）、ＬｙｓからＧｌｎ；コドン２８（ＣＧＴからＣＧＡ）、アミノ酸変化なし；コドン４９（ＧＧＣからＧＧＴ）、アミノ酸変化なし；コドン５３（ＣＧＣからＴＧＣ）、ＡｒｇからＣｙｓ；コドン１２９（ＧＡＣからＧＡＧ）、ＡｓｐからＧｌｕ；コドン１３３（ＧＣＴからＴＣＴ）、ＡｌａからＳｅｒ；およびコドン３２５（ＴＡＴからＴＧＴ）、ＴｙｒからＣｙｓ。１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１）遺伝子を、図１２に示す。
【０２５７】
（ＩＩ．肺癌細胞株および乳癌細胞株におけるＲＡＳＳＦＩＡおよびＲＡＳＳＦ１Ｃの発現）
１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１）は、肺、乳房、頭頸部、腎臓、ならびに子宮頸部の腫瘍の増殖の間の対立遺伝子の欠失によりしばしば影響を受ける領域内に位置する（３４１〜３４５）。本発明者らは、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）およびＲＡＳＳＦ１Ｃが肺癌細胞株および乳癌細胞株において発現されるか否かを調査した。本発明者らは、アイソフォーム特異的ＲＴ−ＰＣＲを用いて、肺腫瘍細胞株および乳房腫瘍細胞株ならびに正常な肺上皮培養物および正常な乳房上皮培養物における１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）およびＲＡＳＳＦ１Ｃの発現を試験した（図１３）。
【０２５８】
アイソフォーム特異的ＲＴ−ＰＣＲアッセイを、ＲＡＳＳＦ１ＡおよびＲＡＳＳＦ１Ｃの発現の分析のために使用した。ＲＡＳＳＦ１Ｃに対するプライマーは、Ｎｏｘ３（５’−ＣＴＧＣＡＧＣＣＡＡＧＡＧＧＡＣＴＣＧＧ−３’）およびＲ１８２であり、ＲＡＳＳＦ１Ａに対するプライマーは、ＰＫＣＤＦまたはＮＦ（５’−ＴＧＣＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＧＣＣＡＣ−３’）のいずれかおよびＲ１８２であった（図１２Ｃ）。総ＲＮＡを、５％ウシ胎仔血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（完全培地）中で増殖された、以前に記載された肺癌細胞株および乳癌細胞株から、Ｔｒｉｚｏｌ抽出により単離した。４μｇの総ＲＮＡを、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｋｉｔを使用して逆転写した。全てのｃＤＮＡ調製物を、ＲＡＳＳＦ１Ａ転写物の第１エキソンのすぐ上流の転写されないゲノム配列を増幅する能力について試験した。この配列由来の産物を生成する任意のｃＤＮＡを、ゲノムＤＮＡが混入しているという理由で廃棄した。
【０２５９】
本発明者らはまた、５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＤＮＡのメチル化を阻害する薬物）に曝露した後のＲＡＳＳＦ１Ａの発現を評価した。本発明者らは、ＲＡＳＳＦ１Ａを発現しないＮＳＣＬＣ株ＮＣＩ−Ｈ１５７のサブコンフルーエントカルチャーを、０．５ｐＭ  ５−アザ−２’−デオキシシチジンに４８時間曝露し、その後、総ＲＮＡを単離し、そしてＲＡＳＳＦ１Ａ、ＲＡＳＳＦ１Ｃ、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対してＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＧＡＰＤＨ転写物のＲＴ−ＰＣＲを正方向プライマーＧＡＰＤＨ−Ｃ（５’−ＣＡＴＧＡＣＡＡＣＴＴＴＧＧＴＡＴＣＧＴＧ−３’）および逆方向プライマーＧＡＰＤＨ−Ｄ（５’−ＧＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＡＧＡ−３’）を使用して実施した。ＲＴＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により分離し、そしてエチジウムブロミドを用いて染色した後に可視化した。
【０２６０】
１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）は、正常な肺上皮培養物（ＮＨＢＥおよびＳＡＢ培養物）、正常な乳房上皮培養物において発現された（図１３、Ｃ）が、３２個のＳＣＬＣ株のうちの３２個（１００％）、２６のＮＳＣＬＣ細胞株のうちの１７個（６５％）、および２５個（６０％）の乳癌細胞株のうちの１５個（６０％）においては発現されなかった。代表的なデータを図１３に示す。対照的に、ＲＡＳＳＦ１Ｃは、試験したほぼ全ての肺癌細胞株および乳癌細胞株において発現された（１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１）遺伝子座を含む既知のホモ接合性欠失を有するいくつかの肺癌細胞株および乳癌細胞株を除く）。切除した肺腺癌において１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）は、５つの癌のうちの２つでしか発現されず、ＲＡＳＳＦ１Ｃは、全ての癌において発現された（図１３Ｃ）。
【０２６１】
１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）についてのＲＴ−ＰＣＲ分析の間、本発明者らは、ＲＡＳＳＦ１Ａを発現する腫瘍およびＮＨＢＥ培養物における２つの狭い間隔のバンドにしばしば注目した（図１３）。本発明者らは、これらのＲＴ−ＰＣＲ産物を配列決定し、そして大きい方のバンドが１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）に対応し、小さい方の産物が異なる転写物ＲＡＳＳＦ１Ｆ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２８６２１７）を示すことを見出した。この転写物は、エキソン１Ｃが除かれており、ＤＡＧ結合ドメイン内で終了する９２アミノ酸の推定短縮ペプチドをコードするｍＲＮＡを産生する（図１２Ｄ）。ほぼ全てのサンプルにおいて、ＲＡＳＳＦ１Ｆは、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）が発現される場合に発現される。しかし、いくつかの乳癌および正常な乳房上皮培養物において（図１３）、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）は、ＲＡＳＳＦ１Ｆの発現を伴わずに発現される。
【０２６２】
（ＩＩＩ．１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）プロモーター領域のメチル化状態）
腫瘍における異常なプロモーターのメチル化は、ヒトの癌においていくつかの腫瘍サプレッサー遺伝子の遺伝子発現の欠失を引き起こすことが見出されている（３４８）。肺癌における１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）発現の欠失が、プロモーターの過剰なメチル化の結果であるか否かを評価するために、本発明者らは、８つの肺癌細胞株由来の亜硫酸ナトリウム改変ＤＮＡを配列決定することにより、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）の５’領域（推定１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）転写開始部位の−８００〜＋６００ｂｐ）におけるＣｐＧメチル化状態を決定した。
【０２６３】
推定ＲＡＳＳＦ１ＡおよびＲＡＳＳＦ１Ｃのプロモーター領域のメチル化状態を、メチル化特異的ＰＣＲにより決定した。ＲＡＳＳＦ１Ａを発現しない肺癌細胞株（ＮＣＩ株Ｈ１２９９、Ｈ１１８４、Ｈ１３０４、Ｈ８４１、Ｈ２１０８、およびＨ１２８）またはＲＡＳＳＦ１Ａを発現する肺癌細胞株（Ｈ１７９２およびＨ２００９）由来のゲノムＤＮＡを、亜硫酸ナトリウム処理により改変した（３５２、３５３）。亜硫酸塩処理は、シトシン塩基をウラシル塩基に変換するが、メチルシトシン塩基に対する影響はない。ＰＣＲ増幅後のＰＣＲフラグメントの配列決定により、メチル化により改変されたプロモーター領域における特異的なＣｐＧジヌクレオチドが同定される（３５２、３５４、３５５）。ＰＣＲプライマーを、ＲＡＳＳＦ１Ａ（コスミドＬｕｃａｌ２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ００２４８１ヌクレオチド１７７３０−１８３７０）およびＲＡＳＳＦ１Ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＣ００２４８１ヌクレオチド２１０２２−２１１５２および２１１９４−２１３３２）の推定プロモーター領域中のゲノム配列を増幅するよう設計した。得られたＰＣＲフラグメントを、自動化された蛍光に基づくＤＮＡ配列決定により配列決定し、メチル化状態を決定した。
【０２６４】
ＲＡＳＳＦ１Ａを発現しない肺癌細胞株におけるＣｐＧメチル化についてのデータを用いて、ＲＡＳＳＦ１Ａ  ５’プロモーター領域に対するメチル化特異的ＰＣＲ（３５２）プライマーを設計した。メチル化形態を検出するためのプライマーは、５’−ＧＧＧＴＴＴＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧＣＧ−３’（正方向）および５’−ＧＣＴＡＡＣＡＡＡＣＧＣＧＡＡＣＣＧ−３’（逆方向）であり、そして非メチル化形態を検出するためのプライマーは、５’−ＧＧＴＴＴＴＧＴＧＡＧＡＧＴＧＴＧＴＴＴＡＧ−３’（正方向）および５’−ＣＡＣＴＡＡＣＡＡＡＣＡＣＡＡＡＣＣＡＡＡＣ−３’（逆方向）であった。各プライマーセットは、１６９塩基対（ｂｐ）産物を生成した。メチル化特異的ＰＣＲサイクル条件は、９５℃にて１５分間のインキュベーション１回、続いて、９４℃にて３０秒間の変性、アニーリング温度（メチル化特異的プライマーについては６４℃、そして非メチル化特異的プライマーについては５９℃）にて５０秒間、７２℃にて３０秒間の伸長のサイクルを４０回、そして７２℃にて１０分間の最終伸長から構成される。ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル中で分離した。製造業者の指示に従い、ＣｐＧ（ＳｓｓＩ）メチラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）によりインビトロでメチル化したリンパ球ＤＮＡを、陽性コントロールとして使用した。水のブランクを、陰性コントロールとして使用した。
【０２６５】
１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）を発現しない６つ全ての肺癌細胞株は、推定プロモーター領域におけるほぼ全てのＣｐＧジヌクレオチド部位のメチル化を示した。１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）を発現した２つの肺癌細胞株は、これらのＣｐＧ部位でメチル化されなかったか、または限定されたメチル化を示したかのいずれかであった。対照的に、これらの８つの細胞株の推定ＲＡＳＳＦ１Ｃプロモーター領域のＣｐＧにおいて、メチル化は見出されなかった。
【０２６６】
プロモーターの過剰なメチル化が、肺癌細胞株における１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）の発現の欠失に寄与することを確認するために、本発明者らは、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）発現に対する５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＤＮＡメチラーゼを阻害する薬物）の効果を評価した。本発明者らは、ＲＡＳＳＦ１Ａを発現しないＮＳＣＬＣ株ＮＣＩ−Ｈ１５７を、５−アザ−２’−デオキシシチジンに曝露し、そしてこの細胞株による１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）の再発現を見出したが、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨまたはＲＡＳＳＦ１Ｃの発現における変化はほとんどなかったか、または全くなかった（図１４）。
【０２６７】
（ＩＶ．肺癌および乳癌における１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）のプロモーター領域のメチル化特異的ＰＣＲ分析）
原発性の肺癌および乳癌におけるＲＡＳＳＥ１Ａのプロモーター領域のメチル化状態を決定するために、本発明者らは、メチル化特異的ＰＣＲ分析を使用した。多くの原発性の切除されたＮＳＣＬＣ由来のゲノムＤＮＡ、同一の患者から切除されたが癌に関与していない一対の肺組織、原発性の切除された乳癌、および肺癌細胞株ならびに乳癌細胞株の大パネルを、亜硫酸水素ナトリウムで処理し、そして１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）のプロモーター領域におけるメチル化ＣｐＧジヌクレオチドおよび非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドの存在について試験した（図１５）。原発性の切除されたＮＳＣＬＣおよび非腫瘍対サンプルは全て、非メチル化プロモーター配列を含んだ。このことは、これらの切除された腫瘍が顕微解剖されず、間質細胞が混入していたことが理由であると考えられた。しかし、１０７個の原発性ＮＳＣＬＣのうちの３２個（３０％）、４７個のＳＣＬＣ株のうちの４７個（１００％）、および３９個の原発性乳癌のうちの１９個（４９％）が、メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ対立遺伝子を示した（図１５；表７）。対照的に、１０４個の切除された非悪性肺組織の対において、メチル化対立遺伝子は検出されなかった（図１５；表７）。
【０２６８】
（表７．肺癌および乳癌におけるＲＡＳＳＦ１Ａ  ＣｐＵ島−メチル化対立遺伝子の検出のための、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応アッセイの頻度）
【０２６９】
【表７】
0004813746.tif 000011
＊ＮＳＣＬＣ＝非小細胞肺癌；ＳＣＬＣ小細胞肺癌。
【０２７０】
本発明者らは、肺癌細胞株および乳癌細胞株のパネルにおいて、高頻度のメチル化１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）対立遺伝子を見出した（表７）。肺癌細胞株および乳癌細胞株は、正常細胞が混入していない癌細胞の本質的なクローン集団を表わす。本発明者らは、メチル化１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）対立遺伝子および非メチル化１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）対立遺伝子の頻度を表にした（表８）。肺癌株および乳癌株は、しばしば、平均的な腫瘍の集団よりも臨床的により攻撃的な病巣に由来する（３４９〜３５１）が、本発明者らの以前の研究（３５０、３５１）は、癌細胞株が、それらの由来となった培養されていない癌標本において見出される遺伝子的変更を保持し続けることを示した。メチル化対立遺伝子のみの存在は、両方の親の対立遺伝子のメチル化またはメチル化対立遺伝子の保持のいずれか、および非メチル化３ｐ対立遺伝子の喪失と一致する。全てのＳＣＬＣ細胞株は、ホモ接合性の欠失が理由で、メチル化対立遺伝子のみを有するか、または１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）を完全に欠失した。このことは、ＳＣＬＣにおいて、ほぼ普遍的である３ｐ２１．３対立遺伝子の欠失と一致する（３４１、３５０、および３５６）。ＮＳＣＬＣ細胞株のうち、２７個のうちの１３個（４８％）（表８）は、メチル化１２３Ｆ２（ＲＡＳＳ１Ａ）対立遺伝子のみを有し、そして２７個のうちの１０個（３７％）は、非メチル化対立遺伝子のみを有した。このことは、この腫瘍細胞型におけるより低い割合の３ｐ２１．３対立遺伝子の喪失と一致する（３４１）。同様に、乳癌細胞株の２２個のサンプルのうちの１０個（４５％）（表８）は、メチル化対立遺伝子のみを有し、そして２２個のうちの７個（３２％）は、非メチル化対立遺伝子のみを有した。再度、このことは、乳癌において見出された３ｐ２１．３対立遺伝子の欠失の割合と一致する（３５１）。予測した通り、３ｐ２１．３領域に関与するホモ接合性欠失を有することが以前に示された２つの腫瘍株は、メチル化および非メチル化の両方の対立遺伝子に対して陰性である（表８）（３４６、３４７）。
【０２７１】
（表８．９７個の肺癌細胞株および乳癌細胞株＊におけるメチル化および非メチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ対立遺伝子の存在）
【０２７２】
【表８】
0004813746.tif 000012
＊ＳＣＬＣ＝小細胞肺癌  〜  ＮＳＣＬＣ＝非小細胞肺癌；ＢＣＣＬ＝乳癌細胞株。
†メチル化および非メチル化の両方の対立遺伝子を欠失したメチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応遺伝子型を有する２つの腫瘍細胞株（ＳＣＬＣ株ＮＣＩＨ７４０および乳癌株１１ＣＣ  １５００）は、染色体領域３ｐ２１．３におけるＲＡＳＳＦＩ遺伝子座を含むホモ接合性欠失を有することが知られていた。
【０２７３】
６１個の肺癌細胞株および乳癌細胞株のサブセットについて、本発明者らは、発現分析およびメチル化分析の両方を実施し、そしてメチル化ＲＡＳＳＦ１Ａ対立遺伝子の存在と１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）発現の欠失との間に統計的に有意な関係（Ｐ＜０．００１、Ｆｉｓｈｅｒの直接確率法）を見出した。１２個のサンプルにおいて、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）は、メチル化対立遺伝子の非存在下で発現され；４４個のサンプルにおいて、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）は、メチル化対立遺伝子の存在下で発現されず；４個のサンプルにおいて、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）は、メチル化対立遺伝子の非存在下で発現されず；そして１個のサンプル（乳癌細胞株）において、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）は、メチル化対立遺伝子および非メチル化対立遺伝子の両方の存在下で発現された。これらのデータは、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）のメチル化と１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）発現の欠失との重要な関係を示す。
【０２７４】
次に、本発明者らは、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）プロモーターのメチル化と原発性ＮＳＣＬＣを有する患者における臨床的知見との間に任意の関係が存在するか否かを評価した。本発明者らは、１０７個の切除されたＮＳＣＬＣにおいて、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）のメチル化と、年齢、性別、腫瘍−結節−転移（ＴＮＭ）病理段階、または腫瘍組織学との間に統計的に有意な関係を見出さなかった。さらに、本発明者らは、３９個の原発性の切除された乳癌において、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）のメチル化と、年齢、ＴＮＭ病理段階、腫瘍組織学、エストロゲン、もしくはプロゲステロンレセプター状態、またはＨＥＲ２／Ｎｅｕの発現との間に統計的に有意な関係を見出さなかった。
【０２７５】
肺癌患者の間の生存率は、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）のメチル化状態により異なった（Ｐ＝０．０４６）（図１６）。また、一変量分析によって、治療的外科切除を試みて処置されたＮＳＣＬＣを有するこの１０７人の患者の群において、腫瘍（Ｔ１、Ｔ２、およびＴ３）、リンパ節段階（Ｎ１およびＮ２）、および報告された体重減少は、反生存性の統計的に有意な予測因子であった。喫煙歴の差異（はい／いいえ、または１年に４０箱のカットオフでの年間箱数）も処置の差異（全ての患者は葉切除または肺切除の外科的切除を受け、そして５人のみ以前に放射線療法または化学療法を受けた）も、いずれも反生存性を説明しなかった。多変量分析は、小さなサンプルの大きさでの使用に制限されるので、本発明者らは、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）のメチル化および主要な一変量因子（腫瘍、リンパ節段階、および体重喪失）の使用により、Ｃｏｘ比例的障害回帰分析（Ｃｏｘ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  ｈａｚａｒｄｓ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）のメチル化は、生存の非依存的な予後因子であることが見出されなかった。しかし、この結果は、少数であることに起因し得る。なぜなら、リンパ節段階（公知の予後因子）さえもまた、もはやこの分析において非依存性因子でなかったからである。
【０２７６】
（Ｖ．腫瘍細胞表現型に対する１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）の外因性発現の効果）
本発明者らは、腫瘍細胞表現型に対するＲＡＳＳＦ１Ａの効果を３つの方法により試験した。本発明者らは、増殖の尺度として足場依存性のコロニー形成を、そして悪性潜在性の尺度として足場非依存性のコロニー形成を使用した。本発明者らはまた、インビボでの腫瘍形成を直接的に評価した。
【０２７７】
ＲＡＳＳＦ１Ａを発現するＮＳＣＬＣ  ＮＣＩ−Ｈ  １２９９クローンのインビトロでの増殖の特徴を、足場依存性増殖および足場非依存性（軟寒天）増殖について試験した。非選択培地における増殖の４８時間後、一過的にトランスフェクトしたＮＳＣＬＣ  ＮＣＩ−Ｈ  １２９９細胞をトリプシンを用いて取り外し、そして８００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含む完全培地中に希釈（通常は、１０〜２５倍）し、そして新鮮な１００ｍｍディッシュにプレートした。培地を週に二度交換した。１４日後、培地を除き、プレートをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、そしてコロニーを１％メチレンブルーを含有する５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノールで染色した。足場非依存性の軟寒天増殖アッセイについて、１０００個のＲＡＳＳＦＩＡ発現細胞を懸濁し、そして６００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を補充した０．３３％Ｎｏｂｌｅ寒天（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む完全培地にプレートし、そして０．５０％寒天ベースを含む完全培地の上に重層した。２１日後、直径０．２ｍｍよりも大きいコロニーを計数した。
【０２７８】
レトロウイルス感染細胞について、足場非依存性増殖アッセイを以下の通り実施した：各々の感染由来の１０００個の生存可能な選択された細胞を、０．５０％寒天ベースの上に０．３３％軟寒天を含むＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）（１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を含む）にプレートした。２１日後、直径０．２ｍｍよりも大きいコロニーを計数した。
【０２７９】
本発明者らはまた、インビボでヌードマウスにおいて増殖するＲＡＳＳＦ１Ａ感染細胞の能力を試験した。雄ＢＡＬＢ／ｃヌード（ｎｕ／ｎｕ）３〜６週齢マウスを、セシウム源からの３５０ｃＧｙへの５分間の曝露によって、５匹の動物の群における実験の０日目に照射した。次の日、１０７個の生存可能な親のベクターコントロールまたはＲＡＳＳＦ１Ａレトロウイルスを感染させたＮＳＣＬＣ  ＮＣＩ−Ｈ１２９９腫瘍細胞を含む０．２ｍＬの滅菌ＰＢＳを用いて、各マウスに、側腹部で皮下注入した。マウスを、腫瘍の大きさについて２〜３日毎にモニタリングし；一旦、腫瘍が１５００ｍｍ３より大きくなった場合、そのマウスを殺傷した。
【０２８０】
本発明者らは、最初に、ＲＡＳＳＦ１Ａ  ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１＋（選択マーカーを含む発現ベクター）中にクローニングし、そして内因性の１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）発現を欠くＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞をトランスフェクトした。１４〜２１日間の選択後、本発明者らは、足場依存性アッセイおよび足場非依存性アッセイの両方において、ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞のコロニー形成を決定した。ＮＣＩ−Ｈ  １２９９細胞における１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）の発現は、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター単独でトランスフェクトした細胞と比較して、足場依存性コロニー形成における４０％〜６０％の減少および足場非依存性コロニー形成におけるおよそ９０％の減少を引き起こした（図１７Ａ）。ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞は、遺伝子内ｐ５３ホモ接合性欠失を有するので（３４）、野生型ｐ５３の一過的な発現は、増殖阻害についての陽性コントロールとして機能し得る。実際、ＮＣＩ−Ｈ  １２９９細胞における野生型ｐ５３の発現は、足場依存性アッセイおよび足場非依存性アッセイにおけるコロニー形成において、それぞれ８０％および９５％の減少を引き起こした（図１７Ａ）。１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）でトランスフェクトしたＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞のいくつかのコロニーを選択培地中で単離し、そしてノーザンブロット分析により１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）を発現することを見出した（図１７Ｂ）。これらのコロニーはインビトロで十分に増殖したが、各々は、ベクターでトランスフェクトしたコントロールクローンと比較して、足場非依存性コロニー形成をおよそ９０％減少した（図１７Ｃ）。
【０２８１】
ｐｃＤＮＡ３．１＋ベクターが増殖抑制効果を媒介する可能性を排除するために、本発明者らは、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）またはＲＡＳＳＦ１Ｃを含むレトロウイルス発現ベクターを用いてＮＣＩ−Ｈ  １２９９細胞を感染させ、そして足場非依存性の様式で増殖するこれらの細胞の能力を試験した。１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）を発現する細胞は、空のレトロウイルスベクターまたはＲＡＳＳＦ１Ｃを含むレトロウイルスベクターを用いて感染させた細胞と比較して、軟寒天コロニーを形成する能力における顕著な減少を有した（図１７Ｄ）。このレトロウイルスベクターを発現する細胞は、プレートした１００００個の細胞当たり３２００個のコロニーを形成した。１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）発現細胞は、ベクターコントロールコロニーの１９％のみを形成したが、ＲＡＳＳＦ１Ｃは、ベクターコントロールの１０８％を形成した。ＲＡＳＳＦ１Ａ感染細胞およびＲＡＳＳＦ１Ｃ感染細胞はインビトロで十分に増殖し、そして毒性またはアポトーシスの徴候を示さなかった。
【０２８２】
最後に、本発明者らは、レトロウイルス感染ＮＣＩＨ１２９９細胞の、ヌードマウスにおいて腫瘍を形成する能力を試験した。ベクターでトランスフェクトした細胞（親細胞）は、迅速に腫瘍を形成した（図１７Ｅ）．対照的に、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）レトロウイルスベクターで感染し、そして１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１Ａ）タンパク質を発現する細胞は、インビボでずっと低い腫瘍形成性を有した（図１７Ｅ）。
【０２８３】
（実施例１６．ヒト染色体３ｐ２１．３ホモ接合性欠失領域におけるいくつかの遺伝子は、インビトロおよびインビボで腫瘍サプレッサー活性を示す）
（Ｉ．腫瘍細胞増殖に対する、３ｐ遺伝子の強制的発現の効果）
３ｐ遺伝子の１つ以上が、インビトロで腫瘍サプレッサーとして機能するという仮説を試験するために、本発明者らは、いくつかの型のＡｄ−３ｐ形質導入されたヒトＮＳＣＬＣ細胞および正常ＨＢＥＣ株における細胞増殖に対する、３ｐ２１．３遺伝子の発現の効果を研究するために、一連の実験を行った。各株における細胞を、ｖｐ／ｃの単位の種々のＭＯＩで、Ａｄ−１０１Ｆ６、Ａｄ−ＦＵＳ１、Ａｄ−ＮＰＲＬ２、Ａｄ−ＢＬＵ、Ａｄ−ＲＡＳＳＦ１、Ａｄ−ＨＹＡＬ２およびＡｄ−ＨＹＡＬ１ベクターによってインビトロで形質導入した；細胞を、偽コントロール、陰性コントロール、非特異的コントロール、または陽性コントロールとして、それぞれＰＢＳ、Ａｄ−ＥＶ、Ａｄ−ＬａｃＺ、またはＡｄ−ｐ５３で処理した。形質導入効率を、蛍光顕微鏡下でＡｄ−ＧＦＰ形質導入細胞集団中のＧＦＰ−発現細胞を試験することによって決定し、そして各細胞株に適用した最も高いＭＯＩで、８０％より高いことを見出した。
【０２８４】
細胞増殖を、ＸＴＴアッセイを使用して分析して、形質導入の１、２、３、および５日後に残ってる生存細胞の数を決定した｛５日目については、最も高いＭＯＩ（それぞれ、Ａ５４９について５０００ｖｐ／ｃ、Ｈ１２９９について１０００ｖｐ／ｃ、Ｈ４６０について５０００ｖｐ／ｃ、Ｈ３５８について２５００ｖｐ／ｃ、およびＨＢＥについて１０００ｖｐ／ｃ）についてのデータのみ示す｝（図１９）。全ての場合において、形質導入した細胞の生存度を、形質導入していない（ＰＢＳ処理）コントロール細胞の生存度（これらの生存度を１００％に設定した）と比較した。図２２において見られ得るように、細胞の生存度は、Ａｄ−１０１Ｆ６−、Ａｄ−Ｆｕｓ１−、およびＡｄ−ＮＰＲＬ２形質導入したＡ５４９およびＨ４６０細胞において有意に減少し、これらは、複数の３ｐ２１．３マーカーに対するホモ接合性を示し、そして野生型のｐ５３、およびＨ１２９９細胞を含む（これらは、３ｐ２１．３ホモ接合性を示すが、ｐ５３のホモ接合性欠失もまた有する）。細胞生存度の緩やかな減少は、Ａｄ−ＲＡＳＳＦ１Ｃ形質導入したＨ１２９９細胞において示される。しかし、Ａｄ−ＨＹＡＬ１、Ａｄ−ＨＹＡＬ２、Ａｄ−ＢＬＵ、Ａｄ−ＥＶまたはＡｄ−ＬａｃＺで形質導入されたこれらの細胞のいずれにおいても、増殖に対する有意な効果は観察されなかった。これらの結果は、いくつかの野生型３ｐ２１．３遺伝子の外因的発現が、３ｐ欠乏性腫瘍細胞の増殖を阻害し得るか、またはこれらの３ｐ２１．３遺伝子のインビトロでの腫瘍サプレッサー機能を回復し得ることを示唆する。
【０２８５】
腫瘍細胞増殖に対して観察された阻害効果の特異性を明らかにし、そして正常細胞上で外因的に発現された３ｐ２１．３遺伝子の潜在的な細胞傷害性を試験するために、本発明者らは、３ｐ２１．３ヘテロ接合性Ｈ３５８細胞および正常ＨＢＥＣにおける細胞増殖に対する、これらの３ｐ２１．３遺伝子の効果を分析した（図１９）。図１９に示されるように、最も高いＭＯＩですべてのＡｄ−３ｐ遺伝子で形質導入されたＨＢＥＣは、１０％未満の細胞生存度の損失を有するが、同じベクターで形質導入されたＨ３５８細胞は、形質導入されていないコントロール細胞と比較した場合、２０％未満の細胞生存度の損失を有した。細胞数の同様のレベルの損失を、Ａｄ−ＥＶおよびＡｄ−ＬａｃＺで形質導入したＨ３５８細胞およびＨＢＥＣ細胞において観察した。ｐ５３を欠失するＨ３５８細胞は、Ａｄ−ｐ５３コントロールで形質導入される場合に、細胞生存度が減少した。これらの結果は、Ａｄ−ＬａｃＺ、Ａｄ−ＨＹＡＬ２、Ａｄ−ＨＹＡＬ１、Ａｄ−ＲＡＳＳＦ１、およびＡｄ−ＢＬＵを用いる効果の欠如と関連し、３ｐ欠乏性腫瘍細胞における３ｐ２１．３遺伝子、ＦＵＳ１、ＮＰＲＬ２、１０１Ｆ６の腫瘍抑制機能の特異性を実証し、そして全般的な細胞傷害性はこれらの野生型３ｐ２１．３遺伝子の外因的発現と関連しないことを示す。
【０２８６】
Ａｄ−３ｐトランスフェクト体における３ｐ２１．３遺伝子の発現を、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって確認し、そして既知濃度のヒト総ＲＮＡおよびプライマーならびにβ−アクチンＤＮＡおよびＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡのためのＴａｑＭａｎプローブを、それぞれ、標準および内部コントロールとして使用した（図２０）。ＦＵＳ１（図２０Ａ）、１０１Ｆ６（図２０Ｂ）、ＮＰＲＬ２（図２０Ｃ）、およびＨＹＡＬ１（図２０Ｄ）の転写を、これらの３ｐ２１．３遺伝子の増大した発現レベルと、形質導入されたＨ１２９９細胞における対応するＡｄ−３ｐベクターの増大したＭＯＩとの間の関連性を示すことによって定量的に実証した。他の３ｐ２１．３遺伝子（ＨＹＡＬ２、ＨＹＡＬ１、ＢＬＵ、およびＲＡＳＳＦ１）の転写もまた、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって検出した。ＦＵＳ１タンパク質および１０１Ｆ６タンパク質の発現もまた、その推定アミノ酸配列由来のオリゴペプチドに対して惹起された利用可能なポリクローナル抗体を使用して、ウエスタンブロット分析によって検出した。
【０２８７】
（ＩＩ．Ａｄ−３ｐ形質導入した腫瘍細胞中の３ｐ遺伝子による、アポトーシスの誘導）
Ａｄ−３ｐ形質導入したＨ１２９９、Ａ５４９、Ｈ４６０、Ｈ３５８、およびＨＢＥＣ細胞においてアポトーシスを誘導する、外因的に発現された３ｐ２１．３遺伝子の能力を、ＴＵＮＥＬ反応を使用して、ＦＡＣＳによって分析した（図２１）。アポトーシスの誘導を、Ａｄ−１０１Ｆ６−、Ａｄ−ＦＵＳ１−、およびＡｄ−ＮＰＲＬ２形質導入したＡ５４９（図２１Ａ）、Ｈ１２９９（図２１Ｂ）、およびＨ４６０（図２１Ｃ）細胞において検出したが、Ｈ３５８（図２１Ｄ）およびＨＢＥＣ（図２１Ｅ）細胞においては検出されなかった。アポトーシス細胞集団は、形質導入の持続時間の増加に伴って増加した；形質導入されたＨ１２９９、Ａ５４９、およびＨ４６０細胞において、それぞれ、Ａｄ−１０１Ｆ６、Ａｄ−ＦＵＳ１、およびＡｄ−ＮＰＲＬ２で形質導入した５日後に、細胞の１５〜２０％、４０〜６５％、および７５％より多くがアポトーシス細胞であったが、一方、ＰＢＳ単独で処理した細胞およびＡｄ−ＥＶベクターで形質導入した細胞のうち、それぞれ７％および１０％のみが、同じ時間間隔の後でＴＵＮＥＬ陽性であった。Ａｄ１０１Ｆ６、Ａｄ−ＦＵＳ１、およびＡｄ−ＮＰＲＬ２によるアポトーシス誘導レベルは、ｐ５３遺伝子を欠失するＨ１２９９細胞株（図２１Ｂ）においてよりも、野生型ｐ５３を有するＡ５４９およびＨ４６０細胞株（図２１Ａおよび２１Ｃ）において、２０〜５０％より有意に現れた。Ａ５４９細胞およびＨ４６０細胞におけるアポトーシスのレベルは、ｐ５３欠乏性のＨ１２９９細胞およびＨ３５８細胞におけるＡｄ−ｐ５３によって誘導されるレベルに匹敵した（図２１Ｂおよび２１Ｄ）。しかし、Ａｄ−ＢＬＵ、Ａｄ−ＲＡＳＳＦ１、Ａｄ−ＨＹＡＬ２、およびＡｄ−ＨＹＡＬ１によって形質導入された腫瘍細胞株のいずれにおいても、アポトーシスの有意な誘導は観察されなかった（図２１）。これらのＡｄ−３ｐベクターによって形質導入された細胞におけるアポトーシスのレベルおよび誘導時間は、同じベクターで処理した細胞における細胞増殖阻害のレベルおよび誘導時間と十分に関連し（図１９）、これは、３ｐ２１．３遺伝子による腫瘍細胞増殖の抑制が、アポトーシス誘導の機構を直接的または間接的に介して媒介されることを示唆する。
【０２８８】
（ＩＩＩ．Ａｄ−３ｐベクターの腫瘍内注射による腫瘍増殖の抑制）
インビトロで観察されたこれらの３ｐ２１．３遺伝子の腫瘍細胞増殖に対する阻害効果が、インビボでの腫瘍増殖に対しても実証され得るか否かを決定するために、本発明者らは、コントロールとしてＰＢＳおよびＡｄ−ＥＶ、Ａｄ−ＬａｃＺ、およびＡｄ−ｐ５３ベクターと共に、ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＡ５４９またはＨ１２９９腫瘍異種移植片に、Ａｄ−３ｐ２１．３遺伝子ベクターを直接腫瘍内注射することによって、腫瘍増殖の抑制における３ｐ２１．３遺伝子の効力を評価した（図２２）。腫瘍の増殖を、最初の注射から最後の注射の２０日後まで記録した。腫瘍容積を、各群における処置の開始時の容積に対して、処置後の腫瘍容積の増加のパーセンテージを算出することによって正規化した。Ａ５４９（図２２Ａ）およびＨ１２９９（図２２Ｂ）腫瘍モデルの両方において、Ａｄ−１０１Ｆ６、Ａｄ−ＦＵＳ１、またはＡｄ−ＮＰＲＬ２で処置した腫瘍の全ては、Ａｄ−ＬａｃＺまたはＡｄ−ＥＶコントロールで処置したマウス群と比較して、有意な増殖の抑制を示した（Ｐ＜０．００１）が、Ａｄ−ＢＬＵ、Ａｄ−ＲＡＳＳＦ１、およびＡｄ−ＨＹＡＬ１−処置した腫瘍においては、有意な効果は観察されなかった。Ａｄ−ＨＹＡＬ２で処置したＡ５４９  Ｈ１２９９腫瘍ではなくＨ１２９９  Ａ５４９腫瘍異種移植片は、処置の終点でのみ有意な減少を示した（Ｐ＝０．０３６）。さらに、Ａｄ−ｐ５３ベクターで処置した腫瘍よりも有意に強力な腫瘍増殖阻害が、Ａｄ−１０１Ｆ６およびＡｄ−ＮＰＲＬ２ベクターで処置したＡ５４９腫瘍において示された（図２２Ａ）。
【０２８９】
（ＩＶ．プロタミン−アデノウイルス複合体−媒介３ｐ２１．３遺伝子移入による、実験的な肺転移の発生の阻害）
全身的転移を抑制する際の３ｐ２１．３遺伝子の潜在能力をさらに探索するために、インビボでの組換えアデノウイルスの全身的送達を増大するための、プロタミン／アデノウイルス複合体（Ｐ−Ａｄと名付ける）を使用する新規な処方物を開発した。実験的なＡ５４９転移性ヒト肺癌モデルを使用して、ｎｕ／ｎｕマウスにおける肺転移の発生に対する３ｐ２１．３遺伝子移入の効果を研究した（図２３）。アデノウイルス３ｐ２１．３遺伝子ベクターをプロタミンと複合体化し、そして静脈内注射を介して送達した。Ａ５４９転移の発生は有意に阻害され、そしてＡ５４９を接種したマウス由来の肺表面上の転移性腫瘍コロニーの形成は、コントロール処置群における形成と比較して、Ｐ−Ａｄ−１０１Ｆ６、Ｐ−Ａｄ−ＦＵＳ１、Ｐ−Ａｄ−ＮＰＲＬ２、Ｐ−Ａｄ−ＢＬＵまたはＰ−Ａｄ−ＨＹＡＬ２で処置した動物において８０％より多く減少した（図２３Ａ）。しかし、Ｐ−Ａｄ−ＨＹＡＬ１およびＰ−Ａｄ−ＲＡＳＳＦ１Ｐ−Ａｄ−ＢＬＵで処置した動物においては、転移性コロニー形成の有意な減少は観察されなかった。これらのデータは、Ａｄ−３ｐで処置した皮下腫瘍から得られた結果と一致しており、腫瘍増殖の抑制およびインビボでの腫瘍の進行の阻害における、これらの３ｐ２１．３遺伝子の役割をさらに支持する。
【０２９０】
（実施例１７．３ｐ２１．３ホモ接合性欠失領域から単離された候補腫瘍サプレッサー遺伝子ＦＵＳ１の過剰発現は、Ｇ１停止および肺癌細胞の増殖の阻害を導く）
小肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の両方における染色体アーム３ｐの１つの対立遺伝子の非常に頻繁な損失は、この染色体領域における腫瘍サプレッサー遺伝子（ＴＳＧ）の存在についての強力な証拠を提供する（３６３；３６４；３６７；３７１；３７２）。単離された対立遺伝子損失を示す複数の異なる３ｐ領域を、詳細な対立形質決定（ａｌｌｅｌｏｔｙｐｉｎｇ）研究によって同定し、これにより３ｐ上に位置するいくつかの異なるＴＳＧが存在することを示唆される（３６１；３６２；３７２）。肺癌細胞株および乳癌細胞株におけるネスト化したホモ接合性欠失は、３ｐ２１．３において見出され、ＴＳＧ候補としての２５の新しい遺伝子の同定、注釈付け（ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ）および評価を含む本発明者らの検索の焦点を、６３０ｋｂの領域にあてた（３５７；３６５；３６６；３６８；３６９；３７０）。乳癌の欠失は、この領域をさらに１２０ｋｂにまで狭め、そして９つのＴＳＧ候補（ＣＡＣＮＡ２Ｄ２，ＰＬ６，１０６Ｆ６，ＮＰＲＬ２／ｇ２１，ＢＬＵ，ＲＡＳＳＦ１，ＦＵＳ１，ＨＹＡＬ２，ＨＹＡＬ１）を、この領域内またはこの領域の境界に位置付けた（３６９）。これらの候補ＴＳＧの１つ、ＦＵＳ１（ＡＦ０５５４７９）（既知遺伝子のいずれとも相同性を示さない）は、肺癌においてほんのわずかの変異しか有さないこと、そして通常は肺癌におけるｍＲＮＡレベルで発現されることが見出された（３６６）。いくつかのＮＳＣＬＣ（ＮＣＩ−Ｈ３２２およびＮＣＩ−Ｈ１３３４）は、同じ非センスの変異を示し、この変異は、異常なｍＲＮＡのスプライシングから生じる。この異常な形態は、ＦＵＳ１エキソン２の３’末端で２８ｂｐのｍＲＮＡを欠失し、野生型における１１０アミノ酸と比較して、８２アミノ酸の短縮された推定タンパク質を生じる（図２４）。肺癌細胞株ＤＮＡについて以前に行われてた本発明者らの変異分析を確認するために、本発明者らは、一次非培養肺癌中のＦＵＳ１における他の変異を探索した。一本鎖構造多型（ＳＳＣＰ）分析を、４０の一次非培養肺癌のゲノムＤＮＡ（９のＳＣＬＣおよび３１のＮＳＣＬＣ）を使用して行った（図２４）（３６０）。変異は検出されなかったが、本発明者らは、イントロン２において１つのヌクレオチド多型を見出し、これはＦＵＳ１のアミノ酸配列を変更しなかった。
【０２９１】
次に、本発明者らは、ＴＳＧの不活化を導く後成的機構として、ＣｐＧ島プロモーター領域のメチル化を考えた。実際、このような腫瘍後天性プロモーター領域のメチル化は、ＦＵＳ１のすぐ動原体側（ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ）に存在するＲＡＳＳＦＩＡ  ｍＲＮＡアイソフォームを生じることが見出された（３５４；３５８）。しかし、ＦＵＳ１  ｍＲＮＡは、このようなＣｐＧのメチル化を起こす大部分の肺癌において発現され、ＦＵＳ１の不活化の方法について見込みがない（３６６）。さらに、ＦＵＳ１のＣｐＧ島を含む５’推定プロモーター領域を、６つの肺癌由来の亜硫酸水素ナトリウム処理した（３５５）ＤＮＡを使用して配列決定し、本発明者らは、ＦＵＳ１タンパク質の発現を検出せず（以下を参照のこと）、そしてＣｐＧメチル化を見出さなかった。
【０２９２】
この遺伝子が肺癌の病因に関与する別の機構として、ＦＵＳ１の単独機能不全（ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）または発現の減少の可能性を考えた（３５６；３５９；３７３）。本発明者らは、最初に、抗Ｆｕｓ１抗ペプチド抗体（これは、外因的に発現されるＦｕｓ１を容易に検出する）を使用して肺癌細胞株のパネルのウエスタンブロット分析を行ったが（図２５）、肺癌においていずれの内因的ＦＵＳ１発現も検出され得なかった（ネガティブなデータの例として与えら得るＨ１２９９  ＮＳＣＬＣについては、図２５）。この検出の欠如は、種々の要因（抗体の品質を含む）に起因し得る。それにもかかわらず、ＦＵＳ１タンパク質発現の欠如または低レベルのＦＵＳ１タンパク質発現が肺癌の病因に関与する場合、本発明者らは、Ｆｕｓ１の内因的導入および発現が悪性の表現型を抑制し得ると結論付けた。コロニー形成アッセイを、ＦＵＳ１発現ベクターのトランスフェクション後に行った。本発明者らは、ＰＣＲによってＣ末端ＦＬＡＧタグ化ＦＵＳ１構築物を作製し、そしてこれを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ）に連結した。空のベクター、ならびに野生型ＦＵＳ１、ＦＬＡＧ−タグ化ＦＵＳ１、および８２ａａの変異ＦＵＳ１を含む発現ベクターを、ＮＳＣＬＣ  ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞（これは、３ｐ２１．３  ６３０ｋｂ領域についての対立遺伝子を喪失し、そして検出可能なＦＵＳ１タンパク質を発現しない（図２５））、およびＮＳＣＬＣ  ＮＣＩ−Ｈ３２２細胞（これは、ＦＵＳ１  １の内因性のホモ接合性の非センス短縮変異の発現を含み、そしてまた、検出可能なＦＵＳ１タンパク質を発現しない）にトランスフェクトした。Ｈ１２９９細胞中のＦＵＳ１構築物の、一過性のトランスフェクション後の発現を、抗Ｆｌａｇ抗体および抗Ｎ末端ＦＵＳ１抗体を使用して、ウエスタンブロット分析によって確認した（図２５）。肺癌コロニー形成に対する、ｎｅｏ耐性遺伝子でのＦＵＳ１のトランスフェクションの効果を試験した。ＦＵＳ１トランスフェクションにおけるＧ４１８耐性コロニーの数は、空のベクターでのトランスフェクションと比較して、劇的に減少した（図２５）。対照的に、変異ＦＵＳ１トランスフェクト体において形成したコロニーの数は、わずかに減少したのみであり、これにより、この肺癌に関連した変異ＦＵＳ１が、機能的に不活性であったことが示唆される（図２５）。
【０２９３】
Ｈ１２９９細胞中でエクジソン誘導性哺乳動物発現系を発生させて、ＦＵＳ１の過剰発現が腫瘍細胞増殖を阻害し得ることを確認した。この系において、ＦＵＳ１の発現を、Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ  Ａの存在下で誘導する。調節可能なホルモンレセプターベクターｐＶｇＲＸＲのみを有するＨ１２９９親ＥＣＲ９細胞を、さらなるコントロールとして役立てた。Ｈ１２９９  ＥＣＲ９細胞を、ｐＩＮＤｓｐ１−ＦＵＳ１−ＦＬＡＧ（ｎｅｏ）でトランスフェクトし、Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ  Ａの存在または非存在下でＧ４１８を用いて選択し、そしてＧ４１８耐性コロニーの数を比較した。ＦＵＳ１誘導条件下で発現が誘導された、細胞中に形成されたコロニーの数は、非誘導条件下での細胞中でのコロニーの数と比較して、平均７５±８％減少した。これは、ＦＵＳ１の増殖阻害活性の別の確認（ｃｏｎｆｉｒｍｉｎｇ  ａｔｉｏｎ）を提供する。２０の安定なＧ４１８耐性コロニーを、非誘導条件下で単離し、そしてＦＵＳ１−ＦＬＡＧの誘導可能な発現を試験した。その中で、６つのコロニーが、ある程度のＦＵＳ１誘導を示し、そして２つの安定なコロニーを選択し（Ｃｌ．１３およびＣｌ．１６）、このコロニーにおいて、ＦＵＳ１−Ｆｌａｇの発現は、Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ  Ａによって明らかに誘導性であった（図２６）。しかし、両方の細胞株は、非誘導条件においてある程度のＦＵＳ１を発現した。これはＦＵＳ１発現の調節が漏出性であることを示す。
【０２９４】
ＭＴＴアッセイによって、誘導条件および非誘導条件における細胞増殖速度を試験した。Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ  Ａは、親細胞株であるＨ１２９９  ＥＣＲ  ９細胞の増殖に対しては何の効果も有さないが、Ｃｌ．１３細胞およびＣｌ．１６細胞の増殖は、Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ  Ａの存在下で阻害された（図２６）。Ｆｕｓ１の発現の誘導および腫瘍細胞増殖の阻害は、Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ  Ａの用量に依存するようであり、この両方は、Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ  Ａの濃度の増加と共に増加する（図２６）。Ｆｕｓ１誘導の場合、この腫瘍細胞の倍加時間もまた、両方のクローンにおいて増加した（それぞれ、Ｃｌ．１３については、２２時間から４６時間、そしてＣｌ．１６については、２１時間から４５時間）。これらの結果はまた、Ｆｕｓ１の過剰発現が、インビトロでのＨ１２９９肺癌細胞の増殖を抑制することを示した。
【０２９５】
ＴＵＮＥＬアッセイによって、誘導条件下でのＨ１２９９細胞におけるアポトーシスの増加は観察されなかった。しかし、細胞がＰｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ  Ａによって誘導されて４８時間にわたってＦｕｓ１を発現し、そしてＦＡＣＳ分析によって蛍光発色セルソーター（ＦＡＣＳ）分析（詳細には、図２６の説明文を参照のこと）によって分析した場合、本発明者らは以下を見出した：親Ｈ１２９９−ＥＣＲ９細胞が、細胞周期パラメーターの変化を有さないこと（Ｇ１  ５１％、Ｓ  １８％、Ｇ２／Ｍ  ３１％（非誘導）およびＧ１  ５０％、Ｓ  １８％、Ｇ２／Ｍ  ３２％（誘導））；一方、Ｆｕｓ１誘導クローンは、Ｇ１停止を示した（Ｈ１２９９クローン１３は、Ｇ１  ５０％、Ｓ  １７％、Ｇ２／Ｍ  ３３％（非誘導）、およびＧ１  ６５％、Ｓ  １０％、Ｇ２／Ｍ  ２５％（誘導）を示し；そしてＨ１２９９クローン１６は、Ｇ１  ５６％、Ｓ  １６％、Ｇ２／Ｍ  ２８％（非誘導）およびＧ１  ６５％、Ｓ  １２％、Ｇ２／Ｍ  ２３％（誘導）を示した）。Ｇ１％における増加は有意であった（Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）。これらの細胞周期分析の結果は、Ｈ１２９９細胞におけるＦＵＳ１の過剰発現がＧ１停止および細胞周期動力学の変更に関連することを示すことを示唆する。
【０２９６】
肺癌細胞株は、検出可能な内因的レベルのＦｕｓ１タンパク質を発現せず、そして過剰発現によるＦｕｓ１の内因的導入は、インビトロで肺癌細胞の増殖を阻害した。この増殖阻害は、この領域について対立遺伝子を喪失した肺癌株およびＦＵＳ１のホモ接合性の短縮変異を有する別の株において見られた。さらに、本発明者らは、この短縮Ｆｕｓ１タンパク質が、腫瘍増殖抑制活性を喪失していたことを見出した。急性トランスフェクション研究に加えて、本発明者らは、Ｆｕｓ１誘導系を確立し、そして腫瘍増殖阻害がＦｕｓ１タンパク質の発現レベルに相関したことを示した。さらに、同じ発現調節系を使用する細胞周期分析は、細胞増殖の阻害についての機構が、Ｇ１停止に関連し、そしてアポトーシスの誘導には関連しなかったことを示した。最後に、本発明者らは、ＦＵＳ１の体細胞性変異が、原発性肺癌においては珍しい（０／４０）ことを確認し、これは、以前の研究（３／７９の肺癌が、ＦＵＳ１遺伝子における変更を有することを示す（２つの非センス変異および１つの欠失））と一致している。実際に、本発明者らがこの６００ｋｂの３ｐ２１．３領域において詳細に研究した２５の候補遺伝子のうち２２のいずれかにおける変異の頻度は、この遺伝子座での高頻度のＬＯＨと比較して、低い。この低い変異の頻度を説明する１つの可能性は、ＦＵＳ１の発現の喪失、または腫瘍プロモーターの後天性メチル化による３ｐ２１．３遺伝子の他の喪失である。同じ３ｐ２１．３欠失領域から単離されたＲＡＳＳＦ１Ａ  ｍＲＮＡアイソフォームの発現およびＦＵＳ１の１５．５ｋｂ動原体性は、この遺伝子についての後天性ＣｐＧ島プロモーターＤＮＡのメチル化によって、多くの肺癌において阻止された（３５４；３５８）。ＲＡＳＳＦ１Ａの置換は、インビトロおよびインビボでの腫瘍細胞増殖を阻害し、これは、ＲＡＳＳＦ１Ａが、この遺伝子座における別の候補腫瘍サプレッサーであることを示す。しかし、本発明者らは、ＦＵＳ１  ｍＲＮＡ発現の損失（３６６）または肺癌におけるＦＵＳ１についての５’領域のＣｐＧメチル化を見出さなかったので、ＦＵＳ１遺伝子についての不活化機構として腫瘍後天性プロモーターのメチル化を除外した。ＦＵＳ１は、単独機能不全腫瘍サプレッサー遺伝子として作用し得る（３５６）。本発明者らの実験は、ＦＵＳ１の過剰発現が、Ｈ１２９９におけるＧ１停止を引き起こすことを示した。いくつかのシグナルまたは環境的なキュー（ｃｕｅ）は、正常細胞においてＦｕｓ１の発現を誘導し、そしてＧ１停止を導き得るが、悪性細胞における３ｐ対立遺伝子の損失およびＦＵＳ１のいくつかの他の変更は、肺腫瘍におけるＦＵＳ１の単独機能不全および／または発現の損失を導き得、そして細胞周期の停止から脱出し得る。
【０２９７】
本明細書中に開示されそして特許請求される全ての組成物および／または方法は、本開示を鑑みて、過度の実験なく作製および実施され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される組成物および／または方法、ならびにこの方法の工程または工程の順序において、変更が適用され得ることが当業者に明らかである。より詳細には、化学的および生理学的の両方で関連する特定の因子が、本明細書中に記載の因子の代わりに使用され得、その上、同じかまたは同様の結果が達成され得ることが明らかである。当業者に明白な全てのこのような類似の置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲および概念に含まれるとみなされる。
【０２９８】
（参考文献）
以下の参考文献は、これらが本明細書中の記載に対する例示的な手順的または補足となる他の詳細を提供する程度まで、本明細書中で詳細に参考として援用される：
【０２９９】
【表９】
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以下の図面は、本明細書の一部を形成し、そして本発明の特定の局面をさらに実証することが意図される。本発明はまた、本明細書中に示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１つ以上を参照することによって、より良好に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ｐＡｄ−ＲＡＰシステムおよびｐＡｄ−ＲＡＰ−シャトルシステムを用いた、組換えアデノウイルスの構築スキームおよび産生スキーム。
【図２】  ｐＡｄ−ＲＡＰ−Ｔｅｔ−ＯｆｆおよびｐＡｄ−ＲＡＰ−ＴＲＥ−ＣＭＶ−シャトルを用いた、組換えアデノウイルスの構築スキーム。ＴｅｔＲ−Ｏｆｆ＝テトラサイクリン耐性−ｏｆｆトランスアクチベータ−遺伝子、ＴＲＥ＝ＴｅｔＲ−Ｏｆｆ応答エレメント。
【図３】  初代非小細胞肺癌と関連する気道上皮の新生物形成前病変において見出される、遺伝子変化のタイミング。
【図４】  ヒト肺癌細胞株および腫瘍由来のＤＮＡにおける３ｐ領域の相互型決定（ａｌｌｅｌｏｔｙｐｉｎｇ）。黒い楕円＝ヘテロ接合性の損失；白い楕円＝対立遺伝子の維持；および斜線を引いた楕円＝ホモ接合性欠失。
【図５】  ヒト染色体３ｐにおける３ｐ２１腫瘍抑制領域の位置および３ｐ遺伝子の組換えアデノウイルスベクターの構造のスキーム。個々の３ｐ遺伝子のサイズおよびそれらの対応するアミノ酸残基、ならびに活性な腫瘍抑制（ＴＳ）領域および３ｐ中の既知のＴＳＧもまた、示す。
【図６】  Ａｄ−３ｐ形質導入肺癌細胞および正常ヒト気管支上皮細胞における腫瘍細胞増殖に対する３ｐ遺伝子過剰発現の影響。ＭＯＩは、ウイルス粒子／細胞（ｖｐ／ｃ）として表す。
【図７】  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＨ１２９９細胞におけるアデノウイルス媒介３ｐ遺伝子発現の定量。ＭＯＩは、ウイルス粒子／細胞（ｖｐ／ｃ）として表す。
【図８】  Ａｄ−３ｐで形質導入された肺癌細胞および正常ＨＢＥＣにおける３ｐ遺伝子過剰発現によるアポトーシスの誘導。アポトーシスを、ＴＵＮＥＬ反応を用いてＦＡＣＳによって分析した。
【図９】  Ａｄ−３ｐで形質導入されたヒト肺癌細胞Ａ５４９およびＨ１２９９における細胞周期動態に対する、３ｐ遺伝子過剰発現の影響。
【図１０】  ヌードマウスにおけるＡｄ−３ｐベクターの腫瘍内注射による、Ａ５４９腫瘍増殖に対する、３ｐ遺伝子過剰発現の影響。
【図１１】  ヌードマウスにおけるプロタミン−Ａｄ−３ｐベクター複合体の全身注射による、Ａ５４９肺転移性腫瘍増殖に対する、３ｐ遺伝子過剰発現の影響。
【図１２】  ＲＡＳＳＦ１座位、転写物、およびタンパク質ドメイン（ｄｏｍａｌｎ）のマップ。Ａ）ＲＡＳＳＦ１ＡおよびＲＡＳＳＦ１Ｃの推定プロモーター領域（二方向の矢印によって示される位置）におけるＣｐＧアイランドの位置を有する、ＲＡＳＳＦ１座位のエキソン−イントロン構造。ＲＡＳＳＦ１Ａ転写物は、ＣｐＧアイランド内に位置する最も動原体性のプロモーター領域から生じると推定され、そしてエキソン１Ａで開始する。ＲＡＳＳＥｉＦもまた、このプロモーターで開始するが、エキソンｉＣを失っている。ＲＡＳＳＦ１Ｃの転写物は、ＲＡＳＳＦ１Ａのプロモーター領域から約２キロベースである最もテロメアのプロモーター領域で開始し、そしてエキソン１で開始する。四角は、エキソンを示し；線は、イントロンを示す。Ｂ）ＲＡＳＳＦ１Ａ転写物および推定タンパク質配列ドメインの模式図。アイソフォーム特異的逆転写（ＲＴ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析に使用した種々のプライマー（ＰＫＣＤＦ、ＮＦ、Ｒ１８２、およびＲ２９２）の位置を示す。目盛りの印は、エキソンの境界を同定する。潜在的なａｒｃ相同性３（５Ｈ３）結合領域、推定ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）結合ドメイン、ＰＥＳＴ配列、Ｒａｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎドメイン、および毛細管拡張性運動失調−変異（ＡＴＭ）リン酸化部位を標識する。Ｃ）ＲＡＳＳＦ１Ｃ転写物および推定タンパク質配列ドメインの模式図。アイソフォーム特異的ＲＴ−ＰＣＲ分析に使用した種々のプライマー（ＮＯＸ３、Ｒ１８２、およびＲ２９２）の位置を、示す。Ｄ）ＲＡＳＳＦＩＦ転写物および推定タンパク質配列ドメインの模式図。
【図１３】  肺癌細胞株（Ａ）、胸部癌株（Ｂ）、ならびに切除した肺腫瘍および正常ヒト肺および胸部上皮培養物（Ｃ）のサンプリングにおける、アイソフォーム特異的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって検出された、ＲＡＳＳＦ１ＡおよびＲＡＳＳＦ１ＣのメッセンジャーＲＮＡレベル。全てのＲＴ−ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲル上で分離し、そしてエチジウムブロマイドを用いた染色によって同定した。矢印は、転写物の位置を示す。Ａ）試験した肺癌株：レーン１−１１１５７；レーン２＝１１３５８；レーン３＝１１７２７；レーン４＝１１７４０；レーン５＝１１７４８；レーン６＝１１８３８；レーン７＝１１１１８４；レーン８＝１１１２９９；レーン９＝１１１３０４；レーン１０＝１１１４３７；レーン１１＝１１１４５０；レーン１２＝１１１７７０；レーン１３＝１１１７９２；レーン１４＝１１１９６３；レーン１５＝１１１９９３；レーン１６＝１１２００９；レーン１７＝１１２０７７；レーン１８＝１１２１０８；レーン１９＝１１ＨＣＣ４４；およびレーン２０＝ＨＣＣ７８。Ｂ）試験した胸部癌株：レーン１＝１１ＣＣ３８；レーン２＝１１ＣＣ１１８７；レーン３＝ＨＴＢ１９；レーン４＝ＨＴＢ２Ｏ；レーン５＝ＨＴＢ２２；レーン６＝１１ＴＢ２３；レーン７＝１１ＴＢ２４；レーン８＝１１ＴＢ２５；レーン９＝１１ＴＢ２６；レーン１０＝１１ＴＢ２７；レーン１１＝ＨＴＢ１２Ｉ；レーン１２＝ＨＴＢ１２９；レーン１３＝ＨＴＢ１３Ｏ；レーン１４＝ＨＴＢＩ３１；レーン１５＝ＨＴＢ１３２；レーン１６＝Ｈ’Ｉ’Ｂ１３３；レーン１７＝１１ＣＣ１３９５；レーン１８＝１１ＣＣ１４２８；レーン１９＝１１ＣＣ１５６９；レーン２０＝１１ＣＣ１８０６；およびレーン２１＝１１ＣＣ２１５７。Ｃ）切除した肺腺癌サンプル（ＡＤＣ１〜５）および正常小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）の培養物、正常ヒト気管支上皮（ＮＨＢＥ）培養物、および正常ヒト胸部上皮（ＮＨＢＲＥ）培養物。
【図１４】  ５−アザ−２’−デオキシシチジン（ＳＡｚａ−ＣｄＲ）を用いた肺癌細胞の処理後の、ＲＡＳＳＦ１Ａの発現。ＲＡＳＳＦ１Ｃを発現するがＲＡＳＳＦ１Ａは発現しないＮＣＩ−１１１５７（非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）細胞株）を、０．５ｐ．Ｍ  ＳＡｚａ−ＣｄＲの存在下（＋のレーン）および非存在下（−のレーン）で４８時間増殖させた。総ＲＮＡを単離し、相補鎖ＤＮＡを調製し、そしてアイソフォーム特異的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＲＡＳＳＦ１Ｃ、およびコントロールとしてのグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）について実行した。
【図１５】  切除された原発性非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）およびそれに伴なう正常肺組織（上部パネル）、小細胞肺癌腫（ＳＣＬＣ）細胞株（中央のパネル）、および原発性胸部癌（下部のパネル）における、メチル化されたＲＡＳＳＦ１Ａ  ５、ＣｐＧ配列の検出のための、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）。代表的なサンプルを示す。切除されたＮＳＣＬＣについて、Ｕ＝非メチル化配列に特異的なプライマーを用いた結果；Ｍ＝メチル化配列に特異的なプライマーを用いた結果。ＮＬ＝正常肺組織；Ｔ＝腫瘍；Ｐ＝末梢血リンパ球ＤＮＡ（これは、メチル化されていないかまたはインビトロでメチル化されている（ＩＶＭＤ））を用いた結果；ならびに、１１２０＝水のブランクを用いた陰性コントロール。ＳＣＬＣについて、各レーンは、異なる細胞株由来のメチル化配列についてのＰＣＲ結果を示す。レーン２０は、陰性コントロールである。乳癌について、各レーンは、異なるサンプル由来のメチル化配列についてのＰＣＲ結果を示す。ＰＣＲ産物は、２％アガロースゲル上で分離し、そしてバンドを、エチジウムブロマイドを用いた染色後に検出した。
【図１６】  ＲＡＳＳＦ１Ａメチル化状態に基づいて非小細胞肺癌腫が切除された１０７人の患者（３２人はメチル化され、７５人はメチル化されていなかった）についてのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線。メチル化されていないＲＡＳＳＦ１Ａ対立遺伝子を有する患者について、症例数＝７５、検閲＝３９、および事象＝３６、全体の生存平均は、５２ヶ月であり（９５％の信頼区間（ＣＩ）＝４４〜５９）、全体の生存中央値は、４９ヶ月であった（９５％のＣＩ＝４４〜５９）；メチル化されたＲＡＳＳＦ１Ａ対立遺伝子を有する患者について、症例数＝３２、検閲＝９、および事象＝２３、全体の生存平均は、３７ヶ月であり（９５％のＣＩ＝２７〜４６）、全体の生存中央値は、２８ヶ月であった（９５％のＣＩ＝９〜４７）。ＲＡＳＳＦ１Ａメチル化の生存分布の一様性について統計的なｌｏｇ−ｒａｎｋ検定は、３．９７であった（ｄｆ  １、Ｐ＝０．０４６３）。各群について危険性のある患者は以下のようであった：ＲＡＳＳＦ１Ａ非メチル化−１２ヶ月（ｎ＝６３）、３６ヶ月（ｎ＝３４）、および６０ヶ月（ｎ＝１６）；ＲＡＳＳＦ１Ａメチル化−１２ヶ月（ｎ＝２４）、３６ヶ月（ｎ＝１３）、および６０ヶ月（ｎ＝５）。
【図１７】  非小細胞肺癌腫（ＮＳＣＬＣ）細胞株ＮＣＩ−１１１２９９のインビトロ増殖およびインビボ増殖に対する、ＲＡＳＳＦ１Ａの影響。Ａ）ｉｏｏ空のベクター（ｐｃＤＮＡ３．１＋）または野生型ｐ５３もしくはＲＡＳＳＦ１Ａを含むｐｅＤＮＡ３．１＋発現ベクターを用いたＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞のトランスフェクション後の、足場依存性コロニー形成および足場非依存性コロニー形成。足場依存的増殖の分析のために、非選択増殖培地中で２日間の後、トランスフェクトしたＮＣＩ−１１１２９９細胞を、選択培地を用いて１００−ｍｍ２ディッシュに希釈した。トランスフェクトした細胞を、８００ｐ．ｇ／ｍＬのＧ４１８を含む液体培地（足場依存的アッセイのために）または軟寒天（足場非依存的アッセイのために）中に配置した。コロニーを、１４日後に足場依存的実験においてメチレンブルーを用いて染色した。結果は、液体培地における８〜１２回の実験および３回の軟寒天実験の平均を示す。標準偏差を示すか、または標準偏差は２％未満である。黒色のバー、足場依存的増殖（９５％の信頼区間［ＣＩ］＝０〜３６（ｗｔ（野生型）ｐ５３について）および５２〜６０（ＲＡＳＳＦ１Ａについて））；白色のバー、足場非依存的増殖（９５％のＣＩ＝０〜６（ｗｔ（野生型）ｐ５３について）および０〜３９（ＲＡＳＳＦ１Ａについて））。Ｂ）ｐｃＤＮＡ３．１＋ベクターまたはＲＡＳＳＦ１Ａ相補鎖ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含むｐｃＤＮＡ３．１＋でトランスフェクトしたＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞の安定クローンにおけるＲＡＳＳＦ１Ａ発現のノーザンブロット分析。ベクターコントロール（ベクター）および種々のＲＡＳＳＦ１ＡメッセンジャーＲＮＡレベルを有する４つの別個のクローンを示す。これらのクローンのうちのいくつかを、Ｄに示す足場非依存的増殖アッセイに使用した。リボソームＲＮＡのエチジウムブロマイド染色を、充填コントロールとして示す。アイソフォーム特異的プライマーを用いた逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応によって、クローンがまたＲＡＳＳＦ１Ａアイソフォームを発現することを確認した。Ｃ）ｐｃＤＮＡ３．１＋ベクターまたはＲＡＳＳＦ１Ａ  ｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ３．１＋でトランスフェクトしたＮＣＩ−１１１２９９細胞の安定クローンにおける、軟寒天（足場非依存的）コロニー形成。平均および標準偏差を示す。ＲＡＳＳＦ１Ａを発現するクローンの各々について、９５％のＣＩ＝０〜４（Ｆ１Ａ．４）、２〜１６（Ｆ１Ａ．５）、および３〜１４（Ｆ１Ａ．１９）。Ｄ）ＮＣＩ１１１２９９細胞を、ベクターコントロールまたはＲＡＳＳＦ１ＡもしくはＲＡＳＳＦ１Ｃ  ｃＤＮＡのいずれかを含むｐＢＡＢＥｐｕｒｏレトロウイルス発現ベクターを用いて感染させた。感染細胞（１プレート当たり１０，０００細胞）を、０．３３％  寒天中に懸濁し、そして懸濁物を、０．５％  寒天ベース上に層にした。直径が０．２ｍｍより大きいコロニーを、２１日後に計数した。下の右のパネルは、ＲＡＳＳＦ１グルタチオンＳトランスフェラーゼ融合タンパク質に対するウサギ抗体を用いて展開した代表的なウエスタンブロットを示し、ＲＡＳＳＦ１タンパク質の発現を確認する。Ｃ＝ＲＡＳＳＦ１Ａ  ｃＤＮＡを含むｐｅＤＮＡ３．１＋を用いたＮＣＩ−１１１２９９細胞の一過性トランスフェクションによって生成される陽性コントロール；Ｖ＝レトロウイルスベクターコントロールを用いたＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞の感染（陽性コントロールからのはみ出しに注意すること；１Ａ＝ＲＡＳＳＦ１Ａを含むレトロウイルスベクターを用いたＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞の感染；および１Ｃ＝ＲＡＳＳＦ１Ｃを含むレトロウイルスベクターを用いたＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞の感染）。Ｅ）ＮＣＩ−１１１２９９細胞のインビボ増殖に対するＲＡＳＳＦ１Ａの影響。ＲＡＳＳＦ１Ａを発現する約１０７個の生存可能なＮＣＩ−Ｈ  １２９９細胞を、各々注射前に５回照射したＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）ヌードマウスの脇腹に注射した。腫瘍サイズを、時間を追ってモニターし、そしてサイズは、立方ミリメートルで示す。ベクターをトランスフェクトしたＮＣＩ−Ｈ  １２９９細胞の注射を与えた２０匹より多くのマウスにおける腫瘍増殖の平均容積を示す（Ｈ１２９９親）。ＲＡＳＳＦ１Ａ感染させたＮＣＩ−Ｈ  １２９９細胞の注射を与えたマウスは、測定可能な腫瘍を増殖しなかった。
【図１８】  ヒト染色体３ｐにおける推定３ｐ２１．３腫瘍抑制領域の位置および３ｐ２１．３遺伝子の組換えアデノウイルスベクターの構造の模式図。個々の３ｐ２１．３遺伝子のサイズおよびｃＤＮＡのコード配列から推定される対応するアミノ酸残基、ならびに活性な腫瘍抑制（ＴＳ）領域および３ｐ中の既知のＴＳＧを示す。３ｐ２１．３遺伝子がＣＭＶプロモーターによって駆動され、複製不能５型アデノウイルス（Ａｄ５）ゲノムのＥ１欠失領域中のＢＧＨポリＡシグナル配列で尾の部分を形成する哺乳動物発現カセットを挿入することによって、３ｐ２１．３遺伝子の組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ−３ｐ）を構築した。Ｅ１欠失（ΔＥ１）およびＥ３欠失（ΔＥ３）の相対的な位置、Ａｄ５ゲノム中の反転反復末端（ＩＲＴ）配列を示す。
【図１９】  Ａｄ−３ｐ形質導入ヒト肺癌細胞および正常気管支上皮細胞における腫瘍細胞増殖に対する、３ｐ２１．３遺伝子の外因性発現の影響。細胞を、３ｐ２１．３遺伝子（１０１Ｆ６、ＮＰＲＬ２、ＢＬＵ、ＲＡＳＳＦ１Ｃ  ＦＵＳ１、ＨＹＡＬ２、およびＨＹＡＬ１）のアデノウイルスベクター、コントロール遺伝子（ＬａｃＺおよびｐ５３）のアデノウイルスベクター、および空ベクター（Ａｄ−ＥＶ）を用いて、最も高いＭＯＩ（ｖｐ／ｃ）（それぞれ、Ａ５４９について５０００、Ｈ１２９９について１０００、Ｈ４６０について５０００、Ｈ３５８について２５００、およびＨＢＥについて１０００）で形質導入し、ＰＢＳ単独を、ｍｏｃｋコントロールとして使用した。細胞の生存度を、ＰＢＳ処理コントロール細胞（１００％）に対する、生存可能なアデノウイルスベクター形質導入細胞のパーセンテージとして表す。誤差のバーは、少なくとも３回の個々の実験における平均の標準偏差を表す。処理は、各実験について４連で与えた。ベクター処理細胞とＡｄ−ＥＶ−処理細胞、Ａｄ−ＬａｃＺ−処理細胞、またはＰＢＳ−処理コントロールとの間の細胞生存度における差異の有意性を、両側スチューデントのｔ検定によって分析した。Ｐ＜０．０５を、有意であるとした。Ａｄ−ＥＶ形質導入細胞およびＡｄ−ＬａｃＺ形質導入細胞  対  ＰＢＳ処理コントロールとの間の細胞生存度の差異は、有意ではなかった（異なる時点および細胞株から、Ｐ＝０．２５〜Ｐ＝０．９５）。同じＭＯＩにおけるＡｄ−１０１Ｆ６形質導入細胞、Ａｄ−Ｆｕｓ１形質導入細胞、およびＡｄ−ＮＰＲＬ２形質導入細胞  対  Ａｄ−ＥＶ形質導入細胞、Ａｄ−ＬａｃＺ形質導入細胞、またはＰＢＳ処理コントロールとの間の細胞生存度の差異は、形質導入の３日後および５日後の両方においてＡ５４９細胞、Ｈ１２９９細胞、およびＨ４６０細胞において有意であった（Ｐ≦０．０００１〜Ｐ≦０．００５）が、形質導入の３日後および５日後の両方において、それぞれ、Ｈ３５８細胞株およびＨＢＥＣ細胞株において有意ではなかった（Ｐ≧０．１０〜Ｐ≧０．９５、異なる時点および細胞株より）。細胞生存度に対するＡｄ−ＢＬＵ、Ａｄ−ＨＹＡＬ２、およびＡｄ−ＨＹＡＬ１の影響は、Ａｄ−ＥＶおよびＡｄ−ＬａｃＺの影響と比較して、全細胞において有意ではなかった（Ｐ＞０．４５）。
【図２０】  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＨ１２９９細胞におけるアデノウイルス媒介３ｐ２１．３遺伝子発現の定量。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを実行し、そしてＰＣＲプロフィールを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステムおよび装備されたソフトウエア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって作製した。既知濃度のβ−アクチンＤＮＡを、標準として使用した。Ｈ１２９９細胞を、それぞれ、１ｐｆｕ／細胞、５ｐｆｕ／細胞、および１０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩ（矢印で示す）で４８時間、３ｐ２１．３遺伝子のアデノウイルスベクター（ＦＵＳ１（Ａ）、１０１Ｆ６（Ｂ）、ＮＰＲＬ２（Ｃ）、およびＨＹＡＬ１（Ｄ））によって形質導入した。
【図２１】  Ａｄ−３ｐ形質導入ヒトＮＳＣＬＣ細胞および正常ＨＢＥＣにおける３ｐ２１．３遺伝子の外因性発現による、アポトーシスの誘導。アポトーシスを、ＦＩＴＣ標識ｄＵＴＰを用いたＴＵＮＥＬ反応を使用してＦＡＣＳによって分析した。細胞を、それぞれ、Ａ５４９（Ａ）について５０００のＭＯＩ（ｖｐ／ｃ）、Ｈ１２９９（Ｂ）について１０００のＭＯＩ（ｖｐ／ｃ）、Ｈ４６０（Ｃ）について５０００のＭＯＩ（ｖｐ／ｃ）、Ｈ３５８（Ｄ）について２５００のＭＯＩ（ｖｐ／ｃ）、およびＨＢＥＣ（Ｅ）について１０００のＭＯＩ（ｖｐ／ｃ）で３ｐ２１．３遺伝子のアデノウイルスベクターを用いて形質導入し、そしてＰＢＳ、Ａｄ−ＥＶ、およびｐ５３をコントロールとして使用した。形質導入後に示された日に、細胞を収集し、そしてアポトーシスについて分析した。アポトーシスの割合は、総細胞集団中のＦＩＴＣ標識細胞のパーセンテージとして表す。誤差のバーは、３連の処理物での２または３回の反復した実験および各実験についてのＴＵＮＥＬ反応における平均の標準偏差を表す。ベクター処理細胞とＡｄ−ＥＶ処理細胞、Ａｄ−ＬａｃＺ処理細胞、またはＰＢＳ処理コントロールとの間のアポトーシスにおける差異の有意性を、両側スチューデントのｔ検定によって分析した。Ｐ＜０．０５を、有意であるとした。Ａｄ−ＥＶ形質導入細胞およびＡｄ−ＬａｃＺ形質導入細胞によって誘導されたアポトーシス  対  ＰＢＳ処理コントロールによって誘導されたアポトーシスとの間の差異は、有意ではなかった（Ｐ＝０．９２５〜Ｐ＝０．６７５、異なる時点および細胞株より）。Ａｄ−１０１Ｆ６形質導入細胞、Ａｄ−ＦＵＳ１形質導入細胞、およびＡｄ−ＮＰＲＬ２形質導入細胞において誘導されたアポトーシスとＡｄ−ＥＶ処理細胞、Ａｄ−ＬａｃＺ処理細胞、またはＰＢＳ処理コントロールにおいて誘導されたアポトーシスとの間の差異は、形質導入の３日後および５日後の両方においてＡ５４９細胞およびＨ４６０細胞で有意であり（Ｐ＜０．０００１〜Ｐ＜０．００５）、そして形質導入の５日後におけるＨ１２９９細胞においてＡｄ−ＥＶ処理細胞およびＰＢＳ処理細胞に対して有意であった（Ｐ＜０．０２）が、それぞれ、形質導入の３日後および５日後の両方の全時点で、Ｈ３５８細胞株およびＨＢＥＣ細胞株は有意ではなかった（Ｐ≧０．８５〜Ｐ≧０．９５）。Ａｄ−ｐ５３形質導入Ｈ３５８細胞におけるアポトーシスの誘導は、全ての他の実験と比較して、全時点で有意であった（Ｐ＜０．０００１）。Ａｄ−ＢＬＵ、Ａｄ−ＨＹＡＬ２、およびＡｄ−ＨＹＡＬｙａｌｌを用いて処理された細胞におけるアポトーシスの誘導は、ＰＢＳ、Ａｄ−ＥＶ、またはＡｄ−ＬａｃＺで処理したものと比較して、全細胞株および全時点において有意ではなかった（Ｐ＞０．８５）。
【図２２】  ｎｕ／ｎｕマウスにおけるヒト肺癌Ａ５４９（Ａ）およびＨ１２９９（Ｂ）皮下腫瘍の増殖に対する、３ｐ２１．３遺伝子アデノウイルスベクターの腫瘍内投与の影響。腫瘍の直径が腫瘍接種の約２週間後に５〜１０ｍｍに達したときに、この腫瘍に、個々の３ｐ２１．３遺伝子（１０１Ｆ６、ＮＰＲＬ２、ＢＬＵ、ＲＡＳＳＦ１ＣＦＵＳ１、ＨＡＹＬ２、およびＨＹＡＬ１）アデノウイルスベクターまたはコントロールベクターＡｄ−ＥＶ、ＬａｃＺおよびｐ５３を用いて、それぞれ、５×１０１０ｖｐ／腫瘍の用量（各々、２００μｌのＰＢＳ、１週間に３回）を注射した。ＰＢＳ単独をｍｏｃｋコントロールとして使用した。結果を、各処理群について５〜１０匹のマウスにおける平均値±ＳＤとして報告する。腫瘍容積を、各群において、処理開始の腫瘍サイズに対する、処理後の腫瘍サイズの増加のパーセンテージによって正規化する。これらの実験からの平均腫瘍容積±ＳＥを示す。ＡＮＯＶＡを実行して、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａソフトウェア（ＳｔａｔＳｏｆｔ  Ｉｎｃ．）を用いて各処理群間の統計的有意性を決定し、Ｐ≦０．０５を有意とみなした。Ａｄ−１０１Ｆ６処理マウス、Ａｄ−ＦＵＳ１処理マウス、Ａｄ−ＮＰＲＬ２処理マウス  対  Ａｄ−ＥＶ処理コントロールマウスおよびＡｄ−ＬａｃＺ処理コントロールマウスとの間の腫瘍容積における差異は、Ａ５４９腫瘍モデルおよびＨ１２９９腫瘍モデルの両方において統計的に有意であり（Ｐ＜０．０００１）、そしてＡｄ−ＨＹＡＬ２処理マウスにおける差異はＡ５４９において有意であった（Ｐ＝０．０２４）が、最後の注射から５日後のＨ１２９９腫瘍モデルにおいて有意ではなく（Ｐ＜０．０００１）、Ａｄ−ＨＹＡＬ１処理、Ａｄ−ＨＹＡＬ２処理、Ａｄ−ＲＡＳＳＦ１Ｃ処理、およびＡｄ−ＢＬＵ処理は有意ではなかった（Ａ５４９腫瘍モデルおよびＨ１２９９腫瘍モデルの両方とも、Ｐ＞０．０５）。
【図２３Ａ】  ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＡ５４９の実験的肺転移の発生に対する、プロタミン−Ａｓ−３ｐ複合体の全身投与の影響。Ａ．、Ｐ−Ａｄ−３ｐ２１．３遺伝子を用いて処理したマウスにおける相対的な転移性腫瘍。全ての動物に、各動物につき２００μｌの総容量の、３×１０１０ウイルス粒子および３００μｇプロタミンの各用量で、２日おきに３回、種々のプロタミン−アデノウイルスベクター複合体を静脈内注射し、そしてＰＢＳ単独を、ｍｏｃｋコントロールとして使用した。各処理群は、５〜１０匹の動物からなった。肺を、最後の注射の２週間後に収集し、そして肺表面上の転移性コロニーを、どれが処理群であるかを認識しないままで計数した。転移の発生は、ＰＢＳ処理群において形成された転移性コロニー（１００％とする）に対する、プロタミン−アデノウイルス複合体処理群において形成された転移性コロニーのパーセンテージとして表す。誤差のバーは、標準誤差（ＳＥ）を表す。ノンパラメトリックなｔ検定（Ｗａｌｄ−Ｗｏｌｆｏｗｉｔｚ  Ｒｕｎｓ  Ｔｅｓｔ）を実行して、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａソフトウェア（ＳｔａｔＳｏｆｔ  Ｉｎｃ．）を用いて各処置群間の統計的有意性を決定し、Ｐ≦０．０５を有意とみなした。転移発生の有意な阻害が、ＰＢＳ、Ｐ−Ａｄ−ＥＶ、またはＰ−Ａｄ−ＬａｃＺで処理したマウスと比較して、それぞれ、Ｐ−Ａｄ−１０１Ｆ６（Ｐ＝０．００２）、Ｐ−Ａｄ−ＮＰＲＬ２（Ｐ＝０．００１）、Ｐ−Ａｄ−ＢＬＵ（Ｐ＝０．０１８）、Ｐ−Ａｄ−ＦＵＳ１（Ｐ＝０．００２）、およびＰ−Ａｄ−ＨＹＡＬ２（Ｐ＝０．０１４）を用いて処理したマウスにおいて観察されたが、Ｐ−Ａｄ−ＢＬＵ（Ｐ＝０．８１８）またはＰ−Ａｄ−ＨＹＡＬ１（Ｐ＝０．９０４）を用いて処理したマウスにおいて有意な阻害はなかった。
【図２３Ｂ】  ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＡ５４９の実験的肺転移の発生に対する、プロタミン−Ａｓ−３ｐ複合体の全身投与の影響。Ｂ．、転移について墨汁で染色した代表的な肺の写真。転移性コロニーは、肺表面上の白色の点として示される。
【図２４】  （ａ）ＮＳＣＬＣ  ｃＤＮＡ  ＨＣＣ５１５（野生型ＦＵＮ１）およびＨ３２２（ＦＵＳ１の小さいｃＤＮＡ変異形態）のＲＴ−ＰＣＲ分析。（ｂ）野生型ＦＵＳ１および変異体異常スプライシング形態のゲノム構造。一番上の線は、コスミドクローンＬＵＣＡ＃１３（＃Ｚ８４４９２）由来のゲノムＤＮＡおよび表示されるヌクレオチド配列番号である。矢じり形は、ＳＳＣＰ分析のプライマーを示す。四角は、１１０アミノ酸のＦＵＳ１野生型形態および８２アミノ酸のＦＵＳ１異常スプライシング形態についての、オープンリーディングフレーム（黒）および非翻訳領域（白）を有するｃＤＮＡを表す。ＦＵＳ１についての配列およびＦＵＳ１異常についての配列の最初の８０アミノ酸が同じであることに注意すること。ＰＣＲ−ＳＳＣＰ分析のために３つのプライマーセットを、全長ＦＵＳ１オープンリーディングフレームをカバーするように設計した。使用したプライマーは、以下であった：
Ｓ１：ＧＴＴＡＴＧＧＴＡＧＴＧＣＧＧＡＣＴＧおよび
ＡＳ１：ＧＧＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＧＣＣＣＴＴＡＣ；
Ｓ２：ＧＡＣＣＴＧＴＧＡＣＡＴＴＴＧＣＣＧＴＧおよび
ＡＳ２：ＣＡＡＣＡＧＡＴＣＣＣＡＴＣＴＧＧＧＴＣ：ならびに
Ｓ３：ＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＣＣＴＴＡＣＡ：および
ＡＳ３：ＴＣＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＣＡＧ。
【図２５】  （ａ．）肺癌細胞におけるＦＵＳ１の内因性発現および一過性発現のウエスタンブロット。トランスフェクションを、ＤＭＲＩＥ  Ｃ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて製造業者らの指示書に従って実行した。ＮＳＣＬＣ  Ｈ１２９９  （２×１０５細胞）を、トランスフェクションの２４時間前に３．５ｃｍディッシュにプレートし、２μｇのプラスミドおよび４μｌのＤＭＲＩＥ  Ｃを各トランスフェクションに使用した。全プラスミドを、ＰＣＲ構築後に再び配列決定し、そして種々のＦＵＳ１オープンリーディングフレームの配列を検証した。２×１０４細胞から、サンプル緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２％ＳＤＳ、１０％  β−メルカプトエタノール、２０％  グリセロール、０．０３％  ＰＢＰ）を用いて１０μｌの溶解物を作製し、１２．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動し、続いてニトロセルロース膜に転写した。ＰＢＳ中の５％  ドライミルクおよび０．２％  Ｔｗｅｅｎを用いたブロッキング後、この膜をウサギポリクローナル抗体と共に１時間室温でインキュベートした。抗ＦＵＳ１抗体（血清の１：３００希釈）を、ヒトＦＵＳ１タンパク質配列のアミノ酸１〜１５に対するペプチドを用いてウサギ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｃ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ）を免疫することによって作製した。抗ＦＬＡＧ抗体Ｍ２は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのものであった。ペルオキシダーゼ標識抗ウサギＩｇＧ抗体または抗マウスＩｇＧ抗体を用いたインキュベーション後に、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ化学発光基質（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いてこの膜を現像した。ＦＬＡＧタグ化ＦＵＳ１の計算分子量は１５ｋｄであり、両方の抗体によって認識されたバンドのサイズは、計算したサイズよりもわずかに大きかった。予想したとおり、変異体ＦＵＳ１（８２アミノ酸であることが予想された）は、野生型ＦＵＳ１（１１０アミノ酸）よりもわずかに小さい。（ｂ．）Ｈ１２９９  ＮＳＣＬＣ細胞におけるコロニー形成アッセイの結果。トランスフェクション後、Ｈ１２９９細胞を、トリプシン処理し、再びプレートに播き、そしてＧ４１８（６００μｇ／ｍｌ）を補充した培地（ＲＰＭＩ  １６４０  ５％ウシ胎仔血清）中で２〜３週間培養し、そしてエタノール／ＰＢＳ（５０／５０％）中のメチレンブルーを用いた染色後に、Ｇ４１８耐性コロニーの数を計数した。ＦＵＳ１およびＦＵＳＩ−ＦＬＡＧを用いたトランスフェクション後、コロニー形成は劇的に抑制されたが、８２アミノ酸異常ＦＵＳ１構築物はほとんど抑制しなかったことに注意すること。Ｈ１２９９について、２以上の実験の２〜４プレートの平均の、平均値および標準偏差は、以下のようであった：ベクターコントロールｐｃＤＮＡ３．１、１００±１８％（１００％＝２４８コロニー）、ＦＵＳ１−ＦＬＡＧ  １６±１０％、ＦＵＳ１  ２３±１１％、ＦＵＳ１変異体  ７７±１１％。ＦＵＳ１トランスフェクト細胞およびＦＵＳ１−ＦＬＡＧトランスフェクト細胞のコロニー数は、ベクターコントロールと比較して有意に減少した（Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定）。Ｈ３２２細胞は、ベクターコントロール（１００％）と比較して、ＦＵＳ１−ＦＬＡＧトランスフェクションによって４０±３４％のコロニー形成を有した（Ｐ＜０．０５）。
【図２６】  （ａ．）ＮＣＩ−Ｈ１２９９安定トランスフェクトクローンにおける、Ｐｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ  Ａの制御下のエクジソン発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によるＦＵＳ１タンパク質の誘導。本発明者らは、調節可能なホルモンレセプターベクターであるｐＶｇＲＸＲをＨ１２９９にトランスフェクトし、そして２０個のＺｅｏｃｉｎ（ｐＶｇＲＸＲの選択マーカー）耐性コロニーを得た。これらの安定なｐＶｇＲＸＲトランスフェクト体を、ｐＩＮＤ−ＬａｃＺでのトランスフェクト後に、β−ｇａｌ活性についてスクリーニングした。これらのコロニーから、本発明者らは、β−ｇａｌ活性がＨ１２９９細胞中でＰｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ  Ａによって特異的に調節された親細胞として、クローンＥＣＲ  ９を選択した。本発明者らは、ＦＵＳＩ−ＦＬＡＧを含む発現ベクター（ｐＩＮＤｓｐｌ−ＦＵＳ１−ＦＬＡＧ）を作製し、そしてこれをＥＣＲ９にトランスフェクトした。ウエスタン分析。各細胞株からの１０μｇの総細胞溶解タンパク質および抗ＦＵＳ１抗体を、分析に使用した。誘導に使用したＰｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ  Ａの濃度（μＭ）を、ブロットの上に示す。ＥＣＲ９は、調節ベクター単独でトランスフェクトしたＨ１２９９親細胞株である。；クローン１３および１６は、調節可能なＦＵＳ１ベクターを含むＨ１２９９クローンを表す。（ｂ．）ＮＳＣＬＣ  Ｈ１２９９ＥＣＲ  ９（コントロール）、（ｃ．）Ｈ１２９９ＦＵＳ１  クローン１３、および（ｄ．）Ｈ１２９９ＦＵＳ１  クローン１６のインビトロ増殖を、ＭＴＴアッセイによって測定した。細胞（１０４）を、５％  ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）の１ｍｌでプレートし、２４ウェルプレートでＰｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ  Ａ（０日目に添加した）の存在下（１．５μＭ）または非存在において培養し、そしてウェルを、表示される日にＭＴＴアッセイのために回収した。ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ）（５００μｇ／ｍｌ）を、培養物に添加し、３７℃で２時間インキュベートし、細胞内ホルマザン結晶を、０．０１Ｎ  ＨＣｌを含むイソプロパノールを用いて可溶化し、この溶液の５６０ｎｍにおける吸光度を、分光計を用いて測定した。ＯＤ  ５６０は、０〜１．２の範囲で細胞数に直接比例する。データ点は、各データ点のＳＤ（約５％、記号内に含まれる）と共に、３ウェルの平均を表す。ＦＵＳ１で誘導可能なＨ１２９９クローンの細胞周期分布分析について、ＥＲＣ  ９細胞（クローン１３およびクローン１６）（２×１０５）を、１０ｃｍディッシュにプレートし、そしてＰｏｎａｓｔｅｒｏｎｅ  Ａの存在下（５μＭ）または非存在下で２日間培養した。細胞を収集し、５０％  エタノール／ＰＢＳで固定し、５ｍｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅを用いて処理し、ヨウ化プロピジウムを用いて染色し、そしてＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ装置（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によってＤＮＡ含量について分析した。ＦＡＣＳ分析を３回の独立した実験で実行し、これらは類似の結果であった。ＦＵＳ１誘導条件下で、Ｇ１細胞の％は、コントロールと比較して有意（Ｐ＜０．０５）に増加した。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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