(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）水２０ないし６０重量％、
（Ｂ）本質的に２５℃で液状の疎水性の油から成る油相３ないし２０重量％、
（Ｃ）乳化剤混合物２０ないし６０重量％−これは本質的に
（ｃ１）エトキシル化ひまし油およびエトキシル化水添ひまし油から選ばれる少なくとも一種の第一の乳化剤および
（ｃ２）１１０μｇ／ｍｌより大きいＮＲＵ50値をもつ少なくとも一種の第二の乳化剤
からなる−
を含むマイクロエマルションであって、
前記乳化剤（ｃ２）は、脂肪酸糖エステルおよびエトキシル化脂肪酸モノグリセリド（当該脂肪酸は１２〜３０個の炭素原子を有する）から選ばれ、且つ、
前記の乳化剤（ｃ１）と乳化剤（ｃ２）の重量比が、１：１ないし６：１である
マイクロエマルション。
【請求項２】
油相（Ｂ）の疎水性の油が植物油、動物油、鉱物油、シリコーン油、炭化水素油、少なくとも８個の炭素原子をもつ液状アルコール、脂肪酸およびポリオールからの油、脂肪酸および一価のＣ１−ないしＣ３０−のアルコールからの油または上記の油の混合物から選ばれることを特徴とする請求項１に記載のマイクロエマルション。
【請求項３】
油相（Ｂ）が室温で固体のワックスを視覚的な透明性を損なう量では含まないことを特徴とする請求項１または２に記載のマイクロエマルション。
【請求項４】
乳化剤（ｃ１）のエトキシル化度が１０ないし１００であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のマイクロエマルション。
【請求項５】
乳化剤（ｃ１）が、水添ＰＥＧ−２５ひまし油、水添ＰＥＧ−３５ひまし油、水添ＰＥＧ−４０ひまし油、水添ＰＥＧ−４５ひまし油、水添ＰＥＧ−５４ひまし油および水添ＰＥＧ−６０ひまし油から選ばれることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のマイクロエマルション。
【請求項６】
乳化剤（ｃ２）が、ココやし脂肪酸蔗糖エステルおよびエトキシ化グリセリルココエートから選ばれることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のマイクロエマルション。
【請求項７】
乳化剤混合物（Ｃ）が、１１０μｇ／ｍｌに等しいか、またはそれより低いＮＲＵ５０値をもつ一種の乳化剤を、含まないかまたはマイクロエマルションの総量に基づいて１０重量％未満の量でしか含まないことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のマイクロエマルション。
【請求項８】
さらに少なくとも一種の毛髪化粧用、皮膚化粧用、皮膚病用および／または医薬用の作用物質を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載のマイクロエマルション。
【請求項９】
作用物質が、多価アルコール、紫外線フィルター、光保護剤、抗酸化剤、ラジカル捕捉剤、ふけとり剤、香料、診断薬、治療薬、ビタミン、脱脂剤、植物エキスおよび薬草エキス、蛋白質加水分解物および絹加水分解物、毛髪光沢剤、毛髪セット用または整髪用の重合体ならびにその組合せから選ばれることを特徴とする請求項８に記載のマイクロエマルション。
【請求項１０】
前記油相（Ｂ）が、植物油、動物油、鉱物油、シリコーン油、炭化水素油、脂肪酸およびポリオールからの油、脂肪酸および一価のＣ１−ないしＣ３０−のアルコールからの油または上記の油の混合物から選ばれる疎水性の油から成ること、ただしこの油相はそれに溶けた親油性の物質を含んでもよく、室温で固体のワックスを含まないか、または５重量％未満の量で含んでもよい、
前記乳化剤混合物（Ｃ）は、乳化剤量に基づいて少なくとも９０重量％が前記乳化剤（ｃ１）および（ｃ２）からなるものであること、
前記乳化剤（ｃ１）が、１０ないし８０のエトキシル化度をもつエトキシル化水添ひまし油から選ばれる少なくとも一種であること
を特徴とする請求項１に記載のマイクロエマルション。
【請求項１１】
透明または半透明の容器に入っていることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載のマイクロエマルション。
【請求項１２】
化粧品、皮膚病薬または医薬品の製造への請求項１〜１１のいずれか１項に記載のマイクロエマルションの使用。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のマイクロエマルションの毛髪処理への使用。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のマイクロエマルションを含むか、またはそれから成る毛髪処理剤を用意し、その毛髪処理剤を毛髪に塗布し、ヘアスタイルを作る毛髪処理法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の対象は、特に皮膚又は毛髪処理用の化粧品、皮膚病薬、または医薬として有用なマイクロエマルションで、好ましくは視覚的に透き通り、透明または少なくとも半透明な製品の形で存在し、水、液状で疎水性の油から成る油相ならびに少なくとも二種の一定の選ばれた乳化剤からなる乳化剤混合物を含むものである。
【背景技術】
【０００２】
マイクロエマルションは、二種の互いに混合できない液体および二つの疎水基を含む少なくとも一種の非イオン性またはイオン性の界面活性剤から成る肉眼で見て均質で、視覚的に透明で、低粘度で、熱力学的に安定な混合物である。両方の互いに溶け合わない成分、例えば水および非極性の炭化水素に一つしか疎水基をもたないイオン性の界面活性剤を添加する場合は、マイクロエマルションの形成にはもう一つの共界面活性剤、大抵短鎖の脂肪族アルコールが必要である。マイクロエマルションにおいては、水、疎水性の相および界面活性剤の相の三成分の混合物が関係する。透過型電子顕微鏡で、マイクロエマルションは超顕微鏡的に強くゆらぐ二方連続(bikontinuierliche)の油−および水−ドメインの構造を有し、その場合、ドメインの大きさは界面活性剤の飽和単分子層の存在において、水の多い相と油の多い相との間の界面張力によって３ないし１００ｎｍの間で安定である。しばしば、マイクロエマルションは固体または半固体であり、「リンギング効果」として知られる挙動を示す。多くの医薬品や化粧品がマイクロエマルションを形成する。マイクロエマルションの一般的な問題は、普通の同じそれ自体問題のない内容物から構成された(マクロ)エマルションと比べて、皮膚との不適合性、特に皮膚および目の刺激に対するより高い危険性にある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
特に刺激性が少なくて肌にやさしい界面活性剤を使用する場合は、不十分な安定性の問題が発生し、濁り、分離または色の変化を起こすか、または製品の望ましい硬度または強度がだんだん低下することがある。したがって、特に皮膚および／または目に適合性があり、十分な長期安定性を有し、望ましい透明性と強度をもち、なおかつ長期間にわたって本質的に損傷を受けないマイクロエマルションを提供するという課題がある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
この課題は、下記の組成のマイクロエマルションによって解決されることがわかった。本発明の対象は、
（Ａ）２０ないし６０重量％、好ましくは３０ないし５５重量％の水、、              （Ｂ）本質的に２５℃で液状の疎水性の油から成る３ないし２０重量％の油相、ただしこの油相はその中に溶けた親油性の物質を含んでもよい、
（Ｃ）（ｃ１）エトキシル化ひまし油およびエトキシル化水添ひまし油から選ばれる少なくとも一種の第一の乳化剤および
（ｃ２）１１０μｇ／ｍｌより大きいＮＲＵ50値をもち、好ましくは４０モルの酸化エチレンでエトキシル化された水添ひまし油のそれより大きいＮＲＵ５０をもつ少なくとも一種の第二の乳化剤
から本質的に成る２０ないし６０重量%の乳化剤混合物
を含む好ましくは視覚的に透き通り、透明または半透明なマイクロエマルションである。
【０００５】
水相（Ａ）
水相中には、水のほかに場合により一種以上の親水性の共溶媒、例えば化粧品に親和性のある一価または多価のアルコールを含んでもよい。適当な一価アルコールは、特に１ないし４個の炭素原子をもつもの、例えばエタノールまたはイソプロパノールである。適切な多価アルコールは、特に２ないし６個の炭素原子をもつもの、例えばエチレングリコールまたはプロピレングリコール、グリセリンさらにまたソルビトールであり、このうちグリセリンが特に好ましい。共溶媒は、好ましくは０ないし１５重量％の量、または１ないし１０重量％の量で添加される。水相中には、さらにそれに溶ける親水性の作用物質および添加剤を含めてもよい。
【０００６】
油相（Ｂ）
油相の含有量は、３ないし２０重量％、好ましくは５ないし１５重量％である。油相は、本質的に室温(２５℃)で液状の成分ならびに場合によりそれに溶かした親油性の作用物質および添加剤から成る。室温で固体のワックスは、含まれないか、または視覚的に透明性を損なわない量、特に５重量％未満、好ましくは１重量％未満の量でだけ含まれる。
【０００７】
液状の油は、例えば植物油、動物油、鉱物油、シリコーン油、炭化水素油、水添ポリオレフィン、少なくとも８個の炭素原子をもつ液状アルコール、特に分枝アルコール、例えばゲルベアルコール、脂肪酸およびポリオールからの油、脂肪酸および一価のＣ１−ないしＣ３０−、好ましくはＣ３−ないしＣ２２−のアルコールからの油または上記の油の混合物である。適切な油は、特にシクロパラフィン、パラフィン油、ポリデセン、鉱物油、イソヘキサデカン、ドデカン、イソエイコサン、液状ポリジメチルシロキサン、シクロテトラシロキサン、シクロペンタシロキサン、フェニルトリメチコン、パルミチン酸イソセチル、ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸イソプロピル、イソステアリン酸オクチル、やし脂肪酸オクチル、パルミチン酸オクチル、ミリスチン酸オクチルドデシル、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、ブチルオクタノール、ヘキシルオクタノール、ブチルデカノール、ヘキシルデカノール、オクチルドデカノールヘキシルデカノール、ヘプタン酸ステアリル、デカン酸イソヘキシル、オクタン酸イソデシル、アジピン酸ジブチル、ジカプリリルエーテル、安息香酸Ｃ１２−１５アルキル、水添ポリイソブテン、スクアラン、スクアレン、天然油、例えばホホバ油、オリーブ油、ひまわり油、大豆油、落花生油、菜種油、アーモンド油、パーム油、ココやし油、ひまし油、小麦胚芽油、ぶどう種油、あざみ油、宵待草油、マカデミアナッツ油、とうもろこし胚芽油、アボカド油などである。
【０００８】
乳化剤相（Ｃ）
乳化剤の含有量は、２０ないし６０重量％、好ましくは３０ないし５０重量％である。乳化剤（ｃ１）の乳化剤（ｃ２）に対する重量比は、好ましくは１：１ないし６：１、特に２：１ないし４：１である。乳化剤相は、本質的に上記の乳化剤型（ｃ１）および（ｃ２）から成る。特に、１１０μｇ／ｍｌ未満のＮＲＵ50値をもつ乳化剤は、含まれないか、または本発明のマイクロエマルションのＮＲＵ50値が１１０μｇ／ｍｌより大きい、好ましくは２００μｇ／ｍｌより大きいか、又は７５０μｇ／ｍｌより大きいように、少量でしか含まれない。特に、１１０μｇ／ｍｌ未満のＮＲＵ50値をもつ乳化剤、例えばエトキシル化脂肪族アルコールまたはエトキシル化脂肪族アルコールりん酸エステルは、含まれないか、または１０重量％未満、５重量％未満または１重量％未満の量でしか含まれない。
【０００９】
マイクロエマルションの製造には、比較的多い乳化剤の量が必要である。高い乳化剤含有量のために、従来のマイクロエマルションは目に対する刺激が高い。ニュートラルレッド取り込み試験（ＮＲＵ試験）として知られるインビトロ試験がマイクロエマルションの目との適合性の特徴付けによく適していること、およびＮＲＵ50値が目に優しいマイクロエマルションの製造に適した乳化剤の確認に適することがわかった。
【００１０】
Ｅ．ボーレンフロイント、Ｊ．Ａ．プエルナーが毒物学会誌２４巻（１９８５）、１１９−１２４頁に記載したＮＲＵ試験は、細胞培養で行われる細胞毒性試験である。上記の論文に使用された動物性のＢａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３線維芽細胞ー細胞培養物の代わりに、ヒトのＨａＣａＴ−ケラチノサイト細胞系の細胞の使用によって、目の刺激力に関するより良い予測が得られる。
【００１１】
本発明に言うＮＲＵ値はＮＲＵ50であり、ヒトのケラチノサイト細胞へのニュートラルテッド色素の吸収を５０％減らす物質または組成物の濃度を表す。ニュートラルレッド（３−アミノ−７−ジメチルアミノ−２−メチル−フェナジン塩酸塩）は、弱陽イオン性の色素であり、容易に外の媒体から健全な細胞の細胞膜を通って細胞系に拡散する。強い有害物質による細胞表面または細胞膜の変化は、色素の吸収および細胞内での色素の停留を減らす。高いＮＲＵ50値は、わづかな細胞障害作用および低い細胞毒性を意味し、検査される物質または組成物のよりよい目との親和性への示唆である。
【００１２】
ひまし油に基づく乳化剤（ｃ１）
この第一の乳化剤は、好ましくは１０ないし５０重量％、特に１５ないし４５重量％の量で含まれる。この第一の乳化剤は、エトキシル化ひまし油およびエトキシル化水添ひまし油から選ばれる。エトキシル化度は、１０ないし１００、特に２０ないし６０であってよい。適切なのは、特にＰＥＧ−ｘひまし油およびＰＥＧ−ｘ水添ひまし油というＩＮＣＩ名をもつ物質であり、ここにｘはエトキシル化度を示し、例えば水添ＰＥＧ−２５ひまし油、水添ＰＥＧ−３５ひまし油、水添ＰＥＧ−４０ひまし油、水添ＰＥＧ−４５ひまし油、水添ＰＥＧ−５４ひまし油または水添ＰＥＧ−６０ひまし油である。
【００１３】
乳化剤（ｃ２）
この第二の乳化剤は、好ましくは３ないし３０重量％、特に５ないし２０重量％の量で含まれる。この第二の乳化剤は、好ましくは脂肪酸糖エステルおよびエトキシル化脂肪酸モノグリセリドから選ばれ、この場合、脂肪酸は好ましくは８ないし３０個、特に１２ないし２２個の炭素原子を有する。脂肪酸糖エステルの糖部分は例えば蔗糖である。脂肪酸糖エステルは、例えばココやし脂肪酸蔗糖エステル、ジラウリン酸蔗糖エステル、ジステアリン酸蔗糖エステル、ラウリン酸蔗糖エステル、ミリスチン酸蔗糖エステル、オレイン酸蔗糖エステル、パルミチン酸蔗糖エステル、リシノ−ル酸蔗糖エステル、ステアリン酸蔗糖エステルのＩＮＣＩ名をもつものである。
【００１４】
エトキシル化脂肪酸モノグリセリドは、例えば一般式ＣｎＨ（２ｎ＋１)−ＣＯ−ＯＣＨＣＨ（−ＯＨ）ＣＨ２（−ＯＣＨ２ＣＨ２−）mＯＨのものであり、ここにｎは好ましくは７ないし２９、特に１１ないし２１の整数であり、ｍはエトキシル化度を示す数で、例えば２ないし１００、特に３ないし４０または５ないし１２である。脂肪酸モノグリセリドは、例えばＰＥＧ−ｘグリセリルココエート、ＰＥＧ−ｘグリセリルイソステアレート、ＰＥＧ−ｘグリセリルラウレート、ＰＥＧ−ｘグリセリルオレエート、ＰＥＧ−ｘグリセリルリシノレート、ＰＥＧ−ｘグリセリルセスキオレエート、ＰＥＧ−ｘグリセリルステアレート、ＰＥＧ−ｘグリセリルタロエートのＩＮＣＩ名をもつものであり、ここにｘはエトキシル化度を示す。
【００１５】
作用物質
好ましい実施態様においては、本発明によるマイクロエマルションはさらに少なくとも一種の作用物質を含み、それは毛髪化粧用、皮膚化粧用、皮膚病用および／または医薬用の作用物質から選ぶことができる。作用物質は、例えば多価アルコール、紫外線濾過剤、光保護剤、抗酸化剤、ラジカル捕捉剤、ふけとり剤、香料、診断薬、治療薬、ビタミン、脱脂剤(rueckfettende Stoffe)、植物エキスおよび薬草エキス、蛋白質加水分解物および絹加水分解物、毛髪光沢剤、毛髪セット用または整髪用の非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性または両性の重合体であり、この場合、重合体は合成または天然起源でもよく、またその組合せでもよい。作用物質の量は、効力および使用目的に応じて、例えば０．００１ないし１０重量％に変化させてもよい。
【００１６】
本発明による製品は、さらに普通の添加成分、例えば保存料、殺菌剤および抗真菌剤、例えば約０．０１ないし１．０重量％の量の２，４，４−トリクロロ−２−ヒドロキシジフェニルエーテル、パラベンまたはメチルクロロイソチアゾリノン、約０．１ないし１．０重量％の量の緩衝剤、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウム、約０．１ないし１．０重量％の量の発色剤、例えばフルオレセインナトリウム塩を含んでもよい。
【００１７】
一つの好ましい実施態様は、
（Ａ）水２０ないし６０重量％、
（Ｂ）植物油、動物油、鉱物油、シリコーン油、炭化水素油、脂肪酸およびポリオールからの油、脂肪酸および一価のＣ１−ないしＣ３０−アルコールからの油、または上記油の混合物から選ばれた２５℃で液状の疎水性の油から成る油相３ないし２０重量％、ただし油相はそれに溶けた親油性の物質を含んでもよいし、また室温で固体のワックスを含まなくてもよいし、５重量％未満含んでもよい、
（Ｃ）乳化剤混合物２０ないし６０重量％−これは乳化剤量に基づき少なくとも９０重量％が、
（ｃ１）１０ないし８０のエトキシル化度をもつエトキシル化水添ひまし油から選ばれる少なくとも一種の第一の乳化剤および
（ｃ２）脂肪酸糖エステルおよびエトキシル化脂肪酸モノグリセリドから選ばれる少なくとも一種の第二の乳化剤である−
を含むマイクロエマルションに関する。
【００１８】
本発明によるマイクロエマルションは、その構造に応じて化粧品、局所皮膚薬または医薬品として、例えば毛髪処理剤、毛髪スタイリング剤、整髪料、皮膚クリーム、皮膚保護クリーム、昼間クリーム、夜間クリーム、皮膚または毛髪用の日焼け止め剤として、あるいは医薬調合品の基剤として使用できる。
【００１９】
使用法
本発明のもう一つの対象は、毛髪の処理法であり、この場合、本発明によるマイクロエマルションを含むか、またはそれから成る毛髪処理剤が用意され、その毛髪処理剤が毛髪の上に塗布されて、ヘアスタイルが作られる。
【００２０】
この使用は、乾いているか、または軽く湿った毛髪に行うことができる。使用量は毛髪の長さや希望の効果に応じて、えんどう豆ないしはしばみの実の大きさでよく、それは好ましくは毛髪への塗布の前に掌の上に擦り込まれる。特別の稠度によって、製品は狙いをつけられ、大きい習熟なしに容易に毛髪にまんべんなく塗ることができる。それは毛髪に状態、定義、構造および支えを与える。毛髪は、快い外観をもち、特にざらざらした感じも油ぎって光る感じもない。この製品は、モダンなスタイリングの創造的なデザインや再デザインに抜群に適している。
【００２１】
本発明の薬剤は、特にその澄度と透明さによって際立っている。したがって、この薬剤は透明または半透明の材料から造った視覚的に好感を与える包装材にも詰められる。容器の材料としては、特にガラスおよび透明または半透明のプラスチック、例えばポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリエチレンテレフタレートが考慮の対象になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
下記の実施例が本発明の対象を詳細に説明するであろう。
［実施例］
ＮＲＵ値の測定は、Ｅ．ボーレンフロイント、Ｊ．Ａ．プエルナーが毒物学会誌２４巻（１９８５）、１１９−１２４頁に記載した標準化された試験法および下記の変更「Ｂａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３線維芽細胞ー細胞培養物の代わりに、ヒトのＨＡＣＡＴ−ケラチノサイト細胞系の細胞の使用および無血清の培地の使用」を伴うドライゼの兎眼刺激試験(ブラントムら１９９７）の代替法についてのＣＯＬＩＰＡ国際確認研究のために作られた標準化された実施規定に基づく。
試験物質から取り出した細胞から得られるニュートラルレッド（３−アミノ−７−ジメチルアミノ−２−メチル−フェナジン塩酸塩）を抽出し、５４０ｎｍで分光光度計で測定する。毒性効果は、正常な無処理の対照細胞に比べて抽出されたニュートラルレッドの量の減少をもたらす。対照細胞に比べて５０％まで抽出され結合されたニュートラルレッドの量の減少をもたらす試験物質の濃度がＮＲＵ50値である。
【００２３】
ＨａＣａＴ細胞は、ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養され、湿度９５％、ＣＯ2５％の大気中で３７℃で２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンで補充される。細胞の保存は、２０％のＦＣＳと１０％のジメチルスルホキシドを含むＤＭＥＭ中でそれぞれ１〜２*１０6細胞／ｍｌの同じ分量で冷凍状態(−１９６℃、液体窒素）で保存される。
【００２４】
ＮＲＵ試験の実施のためには、細胞をまず２４時間増殖培地で培養し、つぎに０．１ｎｇ／ｍｌの上皮細胞成長因子、５μｇ／ｍｌのインシュリン、０．５μｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン、０．１５ｍＭのＣａ++、０．４％ｖ／ｖのウシ下垂体エキス（７．５ｍｇ／ｍｌ）および抗生物質で補充されたメーカー(クロネチクス）からの変性ＭＣＤＢ１５３処方である無血清ケラチノサイト増殖培地（ＫＧＭ）中に試験物質を投入する。
【００２５】
予備実験において、８種の異なった試験物質の濃度でおおよそのＮＲＵ（５０）値を求める。これに基づいて、最終的な測定のために８種の適切な濃度がこのおおよその値の近辺に選ばれる。測定は、同じ濃度で別々のスタートで繰り返される。対照物質としては、５０，２５，１０および１μｇ／ｍｌの濃度のラウリル硫酸ナトリウムが使用される。
【００２６】
くぼみ一つあたり２５０μｌの増殖培地中おおよそ２*１０4個のＨａＣａＴ−細胞を、それぞれ９６のくぼみのあるマイクロタイタープレートの中央の６０のくぼみに入れる。角のくぼみは対照として使い、増殖培地だけを入れる。プレートは、５％ＣＯ2／９５％空気の湿った大気中で３７℃で培養する。培地を除去し、純粋の処理培地または種々の濃度で検査される試験物質または対照物質を含む処理培地に替える。マイクロタイタープレートのレイアウトは下記のとおりである。
【００２７】
【表１】
0004623571.tif 000002
【００２８】
ＢＣ：ブランク対照、２５０μｌの純ＫＧＭ（無血清ケラチノサイト増殖培地を含む）
ＣＣ：対照細胞を含む（陰性対照）
TI１ないしTI８：８種の異なった濃度の試験物質をもつＫＧＭ中に細胞を含む
Ｒ１ないしＲ４：４種の異なった濃度の対照物質（ラウリル硫酸ナトリウム）をもつＫＧＭ中に細胞を含む
【００２９】
２４時間の作用期間ののち、処理培地を５０μｇ／ｍｌのニュートラルレッドを含む保存培地に替える。プレートを改めて３時間恒温器中に置く。そのあと、培地を除き、細胞を固定液(１％ホルムアルデヒド、１％塩化カルシウム）で洗浄し、色素抽出のためにくぼみ一つあたり１００μｌの抽出液（５０％エタノール中１％の氷酢酸）を加える。２０分後、マイクロプレートリーダーで５４０ｎｍでの吸収を測定する。平均値から、かつＢＣくぼみからの零値による補正ののち、試験物質および対象物質について濃度／作用のグラフを描き、そのときの試験濃度に対する陰性対照細胞（ＣＣ）のパーセントで表した生存能力として表わす。陰性対照に対して５０％までニュートラルレッドの吸収を減らす試験物質のそれぞれの濃度を表わすＮＲＵ50値は、濃度／作用の図表の得られたグラフの内挿によって決定する。対照物質であるラウリル硫酸ナトリウムについて得られた値が１０ないし３０μｇ／ｍｌの範囲にある場合、得られた値は受け入れ可能である。
【００３０】
下記に示すＮＲＵ値は、前記の方法で測定したμｇ／ｍｌ単位でのＮＲＵ50値である。本発明による乳化剤：
クレモフォール(登録商標）ＲＨ４１０：ＰＥＧ−４０水添ひまし油；
ＮＲＵ50値＝１８８μｇ／ｍｌ
クレモフォール(登録商標）ＣＯ６０：  ＰＥＧ−６０水添ひまし油；
．                                   ＮＲＵ50値＝２０３μｇ／ｍｌ
セチオール(登録商標）ＨＥ：          ＰＥＧ−７グリセリルココエート；
．                                   ＮＲＵ50値＝２４９μｇ／ｍｌ
テゴソフト(登録商標）ＬＳＥ６５Ｋ：  ココやし脂肪酸蔗糖エステル；
．                                   ＮＲＵ50値＝１９８μｇ／ｍｌ
本発明によらない乳化剤：                                                        オイムルジン(登録商標）０５：        オレス−５；ＮＲＵ＝７．８
オイムルジン(登録商標）Ｂ２：        セテアレス−２０；ＮＲＵ＝５．８
ボルポ(登録商標）２０：              オレス−２０；ＮＲＵ＝６．２
【００３１】
【表２】
0004623571.tif 000003
【００３２】
【表３】
0004623571.tif 000004
【００３３】
【表４】
0004623571.tif 000005
【００３４】
【表５】
0004623571.tif 000006
【００３５】
【表６】
0004623571.tif 000007