(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、アスパラギンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、フェニルアラニン、トリプトファン及びロイシンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸、及びメチオニンを含む安定なＧ−ＣＳＦ凍結乾燥製剤であって、２５℃−３ヶ月長期保存試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上であるか、４０℃−２ヶ月長期保存試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上であるか、５０℃−１ヶ月間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上であるか、６０℃−２週間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上であり、かつ５０℃−１ヶ月間の加速試験後又は６０℃−２週間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦのメチオニン残基酸化体生成率が１％以下である、前記Ｇ−ＣＳＦ凍結乾燥製剤。
【請求項２】
リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸から成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、フェニルアラニン、トリプトファン及びロイシンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸、及びメチオニンを含む請求項１記載のＧ−ＣＳＦ凍結乾燥製剤。
【請求項３】
フェニルアラニン、アルギニン及びメチオニンを含む請求項１記載のＧ−ＣＳＦ凍結乾燥製剤。
【請求項４】
安定化剤として、他のタンパク質を含まない請求項１〜３のいずれかに記載のＧ−ＣＳＦ凍結乾燥製剤。
【請求項５】
マンニトールをさらに含む請求項１〜４のいずれかに記載のＧ−ＣＳＦ凍結乾燥製剤。
【請求項６】
界面活性剤をさらに含む請求項１〜５のいずれかに記載のＧ−ＣＳＦ凍結乾燥製剤。
【請求項７】
界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルである請求項６記載のＧ−ＣＳＦ凍結乾燥製剤。
【請求項８】
界面活性剤がポリソルベート２０及び／又は８０である請求項７記載のＧ−ＣＳＦ凍結乾燥製剤。
【請求項９】
ｐＨが５〜７である請求項１〜８のいずれかに記載のＧ−ＣＳＦ凍結乾燥製剤。
【請求項１０】
ｐＨが５．５〜６．８である請求項９記載のＧ−ＣＳＦ凍結乾燥製剤。
【請求項１１】
ｐＨが６．５である請求項１０記載のＧ−ＣＳＦ凍結乾燥製剤。
【請求項１２】
Ｇ−ＣＳＦがＣＨＯ細胞から産生されたＧ−ＣＳＦである請求項１〜１１のいずれかに記載のＧ−ＣＳＦ凍結乾燥製剤。
【請求項１３】
リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、アスパラギンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、フェニルアラニン、トリプトファン及びロイシンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸、及びメチオニンを、メチオニン残基を有する生理活性タンパク質含有組成物に添加することを特徴とする、該タンパク質のメチオニン残基酸化体生成の抑制方法であって、生理活性タンパク質がＧ-ＣＳＦであり、メチオニン残基を有する生理活性タンパク質含有組成物が凍結乾燥されている、前記方法。
【請求項１４】
安定化剤として他のタンパク質を含まないことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はＧ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）製剤に関し、特に長期保存した後も活性成分の損失が少なく、かつＧ−ＣＳＦのメチオニン残基の酸化体生成率の低い、安定化させたＧ−ＣＳＦ製剤に関する。
背景技術
Ｇ−ＣＳＦは、好中球の前駆細胞に作用し、その増殖ならびに分化成熟を促進する分子量約２万の糖タンパク質である。
本出願人によって、口腔底癌患者の腫瘍細胞から採取した細胞株を培養することにより高純度のヒトＧ−ＣＳＦが精製されて以来、これを契機に、ヒトＧ−ＣＳＦ遺伝子のクローニングに成功し、現在では遺伝子工学的方法によって微生物や動物細胞で組換えヒトＧ−ＣＳＦを大量に生産することが可能になった。また、本願出願人はこの精製したＧ−ＣＳＦの製剤化に成功し、これを感染防御剤として市場に製品を供給している（特許第２１１６５１５号）。
Ｇ−ＣＳＦは極めて微量で使用され、通常成人一人当たり、０．１〜１０００μｇ（好ましくは５〜５００μｇ）のＧ−ＣＳＦを含有する製剤を１〜７回／週の割合で投与する。しかしながら、このＧ−ＣＳＦは例えば注射用アンプル、注射器等の器壁に対し吸着性を示す。また、Ｇ−ＣＳＦは不安定で、外的因子の影響を受けやすく、温度、湿度、酸素、紫外線等に起因して会合、重合あるいは酸化等の物理的、化学的変化を生じ、結果として大きな活性の低下を招く。
そこで安定なＧ−ＣＳＦ製剤を市場に供給するために種々の処方設計がなされている。例えば、（ａ）トレオニン、トリプトファン、リジン、ヒドロキシリジン、ヒスチジン、アルギニン、システイン、シスチン、メチオニンから選ばれる少なくとも１種のアミノ酸；（ｂ）少なくとも１種の含硫還元剤；又は（ｃ）少なくとも１種の酸化防止剤；からなる群から選ばれる少なくとも１種を含む製剤（特許第２５７７７４４号）等が提案されている。また、安定化剤としてポリソルベートなどの界面活性剤を含むＧ−ＣＳＦ製剤がある（特開昭６３−１４６８２６号）。
また、容器への付着を少なくし、化学的変化を押さえるという観点からは、凍結乾燥製剤とすることが有利であり、マルトース、ラフィノース、スクロース、トレハロース又はアミノ糖を含有したＧ−ＣＳＦ凍結乾燥製剤も報告されている（特表平８−５０４７８４号）。
現在市場に供給されている製品には、これら化学的、物理的変化を抑制するために、安定化剤として一般的に使用されているヒト血清アルブミンあるいは精製ゼラチンなどのタンパク質が添加されているものがある。しかしながら、タンパク質を安定化剤として添加することに関しては、ウィルスのコンタミを除去する等のために非常に煩雑な工程を必要とする等の問題があった。
しかしながら、このようなタンパク質を添加しない場合には、Ｇ−ＣＳＦのメチオニン残基の酸化体の生成が多くなり、品質劣化をもたらすというという問題があった。
発明の開示
本発明の目的は、長期の保存にもより安定で、かつＧ−ＣＳＦのメチオニン残基の酸化体生成率の低いＧ−ＣＳＦ製剤を提供することである。
上記目的を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは安定化剤として特定アミノ酸を組み合わせて添加することによって、長期保存後でもＧ−ＣＳＦ残存率が高く、かつＧ−ＣＳＦのメチオニン残基の酸化体生成率の低いＧ−ＣＳＦ製剤となしうることを見いだし本発明を完成した。
すなわち、本発明は、２５℃−３ヶ月長期保存試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上であるか、４０℃−２ヶ月長期保存試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上であるか、５０℃−１ヶ月間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上であるか、６０℃−２週間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上であり、かつ５０℃−１ヶ月間の加速試験後又は６０℃−２週間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦのメチオニン残基酸化体生成率が１％以下である、安定なＧ−ＣＳＦ製剤を提供する。
本発明はさらに、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、アスパラギンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、疎水性アミノ酸から選ばれる一種以上のアミノ酸、及びメチオニンを含む前記のＧ−ＣＳＦ製剤を提供する。
本発明はさらに、疎水性アミノ酸がフェニルアラニン、トリプトファン及びロイシンから選択される前記のＧ−ＣＳＦ製剤を提供する。
本発明はさらに、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸から成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、フェニルアラニン、トリプトファン及びロイシンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸、及びメチオニンを含む前記のＧ−ＣＳＦ製剤を提供する。
本発明はさらに、フェニルアラニン、アルギニン及びメチオニンを含む前記のＧ−ＣＳＦ製剤を提供する。
本発明はさらに、安定化剤として、実質的にタンパク質を含まない前記のＧ−ＣＳＦ製剤を提供する。
本発明はさらに、凍結乾燥製剤である前記のＧ−ＣＳＦ製剤を提供する。
本発明はさらに、マンニトールをさらに含む前記のＧ−ＣＳＦ製剤を提供する。
本発明はさらに、界面活性剤をさらに含む前記のＧ−ＣＳＦ製剤を提供する。  本発明はさらに、界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステルである前記のＧ−ＣＳＦ製剤を提供する。
本発明はさらに、界面活性剤がポリソルベート２０及び／又は８０である前記のＧ−ＣＳＦ製剤を提供する。
本発明はさらに、ｐＨが５〜７である前記のＧ−ＣＳＦ製剤を提供する。
本発明はさらに、ｐＨが５．５〜６．８である前記のＧ−ＣＳＦ製剤を提供する。
本発明はさらに、ｐＨが６．５である前記のＧ−ＣＳＦ製剤を提供する。
本発明はさらに、Ｇ−ＣＳＦがＣＨＯ細胞から産生されたＧ−ＣＳＦである前記のＧ−ＣＳＦ製剤を提供する。
本発明はさらに、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、アスパラギンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、疎水性アミノ酸から選ばれる一種以上のアミノ酸を含み、ｐＨが５〜７であることを特徴とする、２５℃−３ヶ月長期保存試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上であるか、４０℃−２ヶ月長期保存試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上であるか、５０℃−１ヶ月間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上であるか、６０℃−２週間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上である、安定なＧ−ＣＳＦ製剤を提供する。
本発明はさらに、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸から成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、フェニルアラニン、トリプトファン及びロイシンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸を含み、ｐＨが５〜７であることを特徴とする、２５℃−３ヶ月長期保存試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上であるか、４０℃−２ヶ月長期保存試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上であるか、５０℃−１ヶ月間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上であるか、６０℃−２週間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上である、安定なＧ−ＣＳＦ製剤を提供する。
本発明はさらに、ｐＨが６．５である前記いずれかのＧ−ＣＳＦ製剤を提供する。
本発明はさらに、メチオニンを、メチオニン残基を有する生理活性タンパク質含有組成物に添加することを特徴とする、該タンパク質のメチオニン残基酸化体生成の抑制方法を提供する。
本発明はさらに、生理活性タンパク質が、サイトカインまたは生理活性ペプチドである前記の方法を提供する。
本発明はさらに、生理活性タンパク質が、コロニー刺激因子またはＰＴＨである前記の方法を提供する。
本発明はさらに、生理活性タンパク質が、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチンまたはＰＴＨである前記の方法を提供する。
本発明はさらに、安定化剤として他のタンパク質を含まないことを特徴とする前記の方法を提供する。
本発明はさらに、メチオニン残基を有する生理活性タンパク質含有組成物が、凍結乾燥されているかまたは溶液状態であることを特徴とする前記の方法を提供する。
本発明はさらに、メチオニンと他の一種以上のアミノ酸を含む、メチオニン残基を有する生理活性タンパク質含有安定化組成物を提供する。
本発明はさらに、アミノ酸が、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、プロリン、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン及びチロシンから成る群より選ばれる１種または２種以上である、前記メチオニン残基を有する生理活性タンパク質含有安定化組成物を提供する。
本発明はさらに、安定化剤として他のタンパク質を含まないことを特徴とする前記メチオニン残基を有する生理活性タンパク質含有安定化組成物を提供する。発明を実施するための最良の形態
本発明の製剤に使用するＧ−ＣＳＦは高純度に精製されたヒトＧ−ＣＳＦであれば全て使用できる。具体的には、哺乳動物、特にヒトのＧ−ＣＳＦと実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法によって得られたものを含む。遺伝子組換え法によって得られるＧ−ＣＳＦには天然のＧ−ＣＳＦとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列の１または複数を欠失、置換、付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。本発明におけるＧ−ＣＳＦは、いかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したもの、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌などの細菌類；イースト菌；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。好ましくは大腸菌、イースト菌又はＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。最も好ましくはＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。
本発明のＧ−ＣＳＦ製剤には好ましくは安定化剤としてヒト血清アルブミンや精製ゼラチンなどのタンパク質を実質的に含まない。
本発明のＧ−ＣＳＦ製剤は、２５℃−３ヶ月長期保存試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上、好ましくは９５％以上であるか、４０℃−２ヶ月長期保存試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上、好ましくは９５％以上であるか、５０℃−１ヶ月間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上、好ましくは９５％以上であるか、６０℃−２週間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上、好ましくは９５％以上であり、かつ５０℃−１ヶ月間の加速試験後又は６０℃−２週間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦのメチオニン残基酸化体生成率が１％以下、好ましくは検出限界以下であり、従来知られているＧ−ＣＳＦ製剤に比べて極めて安定な製剤である。
本発明のＧ−ＣＳＦ製剤の一例は、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、アスパラギンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸、好ましくはリジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸から成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、疎水性アミノ酸から選ばれる一種以上のアミノ酸、好ましくはフェニルアラニン、トリプトファン及びロイシンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸、及びメチオニンを含むＧ−ＣＳＦ製剤である。
さらに、本発明のＧ−ＣＳＦ製剤の一例としては、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、アスパラギンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸、好ましくはリジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸から成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、疎水性アミノ酸から選ばれる一種以上のアミノ酸、好ましくはフェニルアラニン、トリプトファン及びロイシンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸、及びメチオニンを含み、ｐＨが５〜７であることを特徴とする、２５℃−３ヶ月長期保存試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上であるか、４０℃−２ヶ月長期保存試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上であるか、５０℃−１ヶ月間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上であるか、６０℃−２週間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上であり、かつ５０℃−１ヶ月間の加速試験後又は６０℃−２週間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦのメチオニン残基酸化体生成率が１％以下である、安定なＧ−ＣＳＦ製剤である。
本発明で用いるアミノ酸は、遊離のアミノ酸ならびにそのナトリウム塩、カリウム塩、塩酸塩などの塩を含む。本発明の製剤には、これらのアミノ酸のＤ―、Ｌ−およびＤＬ−体を含み、より好ましいのはＬ−体ならびにその塩である。
本発明の製剤に添加するアミノ酸の添加量は使用するアミノ酸の種類により、後述する試験方法を用いて好ましい範囲を定めることができる。一般には最終投与量として、０．００１〜５０ｍｇ／ｍｌである。例えば、フェニルアラニンでは好ましくは０．１〜２５ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１〜２０ｍｇ／ｍｌであり、アルギニンでは好ましくは０．１〜２５ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１〜２０ｍｇ／ｍｌであり、メチオニンでは好ましくは０．００１〜５ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．０１〜４ｍｇ／ｍｌである。
本発明の製剤には等張化剤として、ポリエチレングリコール；デキストラン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、グルコース、フラクトース、ラクトース、キシロース、マンノース、マルトース、シュークロース、ラフィノースなどの糖類を用いることができる。マンニトールが特に好ましい。マンニトールの添加量は製剤中に１〜１００ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５〜６０ｍｇ／ｍｌである。
本発明の製剤には界面活性剤をさらに含むことができる。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤、例えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリテート、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステアレート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリオキシエチレンソルビタントリステアレート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビットテトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシエチレングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエチレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル；ポリオキシエチエレンノニルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリオキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシエチレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等のＨＬＢ６〜１８を有するもの；陰イオン界面活性剤、例えばセチル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数１０〜１８のアルキル基を有するアルキル硫酸塩；ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム等の、エチレンオキシドの平均付加モル数が２〜４でアルキル基の炭素原子数が１０〜１８であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エステルナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が８〜１８のアルキルスルホコハク酸エステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセロリン脂質；スフィンゴミエリン等のフィンゴリン脂質；炭素原子数１２〜１８の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等を典型的例として挙げることができる。本発明の製剤には、これらの界面活性剤の１種または２種以上を組み合わせて添加することができる。
好ましい界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、特に好ましいのはポリソルベート２０、２１、４０、６０、６５、８０、８１、８５であり、最も好ましいのはポリソルベート２０及び８０である。
本発明のＧ−ＣＳＦ含有製剤に添加する界面活性剤の添加量は、一般にはＧ−ＣＳＦ１重量部に対して０．０００１〜１０重量部であり、好ましくはＧ−ＣＳＦ１重量部に対して０．０１〜５重量部であり、最も好ましくはＧ−ＣＳＦ１重量部に対して０．２〜２重量部である。
本発明のＧ−ＣＳＦ製剤のｐＨは好ましくは５〜７であり、さらに好ましくはｐＨが５．５〜６．８であり、さらに好ましくはｐＨが６〜６．７であり、最も好ましくはｐＨが６．５である。
本発明のＧ−ＣＳＦ製剤には、所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤等を含有してもよい。例えば、含硫還元剤としては、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、並びに炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。また、酸化防止剤としては、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてよい。
本発明のＧ−ＣＳＦ製剤は溶液製剤、凍結乾燥製剤、噴霧乾燥製剤などを含む。最も好ましくは凍結乾燥製剤である。
本発明の製剤は、これらの成分をリン酸緩衝液（好ましくはリン酸一水素ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム系）及び／又はクエン酸緩衝液（好ましくはクエン酸ナトリウムの緩衝液）などの溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製し、あるいはこのようにして調製された溶液製剤を定法により凍結乾燥、又は噴霧乾燥することによって製造できる。
本発明の安定化されたＧ−ＣＳＦ含有製剤は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注なと）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、経口投与も可能である。
本発明のＧ−ＣＳＦ製剤は、通常密封、滅菌されたプラスチックまたはガラス容器中に収納されており、使用時に純水（注射用滅菌水）に溶解して使用する。
本発明の製剤中に含まれるＧ−ＣＳＦの量は、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度、患者の年齢などに応じて決定できるが、一般には最終投与濃度で１〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜８００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５０〜５００μｇ／ｍｌである。
本発明の製剤は、感染症や癌の化学治療において、抗生物質、抗菌剤、抗癌剤などの薬剤を投与する際に同時投与すると、患者の抵抗力、活性などといった免疫応答力に基づいた防御機能を改善することが判明しており、臨床上極めて有用である。従って、本発明の製剤はこれらの薬剤と併用投与することができる。
本発明のＧ−ＣＳＦ製剤は後述の実施例に示すように、２５℃−３ヶ月長期保存試験又は４０℃−２ヶ月長期保存試験を行った後にも、あるいは５０℃−１ヶ月間の加速試験又は６０℃−２週間の加速試験を行った後にも、極めて良好なＧ−ＣＳＦ残存率を示す。また、５０℃−１ヶ月間の加速試験後又は６０℃−２週間の加速試験を行った後にも、Ｇ−ＣＳＦのメチオニン残基酸化体生成率がほとんど観察されなかった。本発明のＧ−ＣＳＦ製剤は２５℃−３ヶ月長期保存試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上、好ましくは９５％以上であるか、４０℃−２ヶ月長期保存試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上、好ましくは９５％以上であるか、５０℃−１ヶ月間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上、好ましくは９５％以上であるか、６０℃−２週間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦ残存率が９０％以上、好ましくは９５％以上であり、かつ５０℃−１ヶ月間の加速試験後又は６０℃−２週間の加速試験後におけるＧ−ＣＳＦのメチオニン残基酸化体生成率が１％以下、好ましくは検出限界以下である。
本発明の製剤では、後述する実施例の結果から、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、アスパラギンから成る群より選ばれる一種以上のアミノ酸と、疎水性アミノ酸から選ばれる一種以上のアミノ酸を添加することにより特に常温における長期保存後のＧ−ＣＳＦ残存率を増加することができ、またメチオニンを添加することにより、Ｇ−ＣＳＦのメチオニン残基酸化体生成率を検出限界以下にすることが観察された。本発明者らは、特定の理論に拘束されるつもりはないが、Ｇ−ＣＳＦのメチオニン残基に代えて、添加されたメチオニンが酸化されることにより、Ｇ−ＣＳＦのメチオニン残基酸化体生成率を低くすると推測した。
さらに本発明によれば、特に、メチオニン残基の酸化体生成に、より影響を受けやすく、微量で生理活性を有する、メチオニン残基を有する生理活性タンパク質の組成物にメチオニンを添加することにより、該生理活性タンパク質のメチオニン残基の酸化体生成を防止することができる。特に、該生理活性タンパク質組成物中に、安定化剤として他のタンパク質を含まない場合、タンパク質組成物が凍結乾燥されている場合、あるいはタンパク質組成物が溶液状態の場合には、タンパク質のメチオニン残基酸化体が生成しやすいことから、メチオニンの添加は有効であると考える。
さらに本発明の組成物に、その他の一種以上のアミノ酸を添加することにより、メチオニン残基の酸化体生成を抑制し、且つ、生理活性タンパク質の分解、凝集等を抑えた、安定化された、メチオニン残基を有する生理活性タンパク質含有組成物を製造することができる。
このとき添加するアミノ酸としては、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、プロリン、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン等が挙げられ、好ましくは、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニンである。
本発明の生理活性タンパク質としては、例えば、
サイトカイン；インターロイキン（ＩＬ−１〜ＩＬ−１３など）、コロニー刺激因子（顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）等）、インターフェロン（ＩＦＮ−α、β、γ等）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β等）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ＬＩＦ（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｆａｃｔｏｒ）、ｏｎｃｏｓｔａｔｉｏｎ  Ｍ（ＯＳＭ）、ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＭＩＦ）、ケモカイン、ＩＬ−８、ＬＤ７８、ＭＣＰ−１など、
生理活性ペプチド；インシュリン、グルカゴン、パラサイロイドホルモン（ＰＴＨ）、ガストリン、セレクチン、コレシストキニン、ガシトリック・インヒビトリー、ポリペプチド、サブスタンスＰ、モチリン、脾ポリペプチド、ニューロテンシン、エンテログルカゴン、ガストリン放出ペプチド、ソマトスタチン−２８、ダイノルフィン、ガラニン、バロニン、パンクレオスタチン、ゼオプシンなど生体酵素；メチオニン残基が活性中心に存在する酵素（例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ等）なと、
または、それらの変異体が挙げられる。
本発明の生理活性タンパク質としては、好ましくは、サイトカインまたは生理活性ペプチドであり、より好ましくは、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチン等のコロニー刺激因子またはＰＴＨを示し、さらに好ましくは、Ｇ−ＣＳＦ、エリスロポエチンまたはＰＴＨを示す。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
実施例
試験方法
バイアルあたりの各原料の添加量が下記の表１及び表２となるように各調剤液を調製し、無菌濾過を行った後、無菌的に各バイアルに１ｍＬずつ正確に充填し、凍結乾燥に供した。凍結乾燥終了後、完全打栓し、Ｇ−ＣＳＦ凍結乾燥製剤を製造した。
【表１】
0004607336.tif 000002
【表２】
0004607336.tif 000003
このように無菌的に調製したＧ−ＣＳＦ含有凍結乾燥製剤を、６０℃の恒温槽内で２週間及び１ヶ月；５０℃の恒温槽内で１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月；４０℃の恒温槽内で２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月；並びに２５℃の恒温槽内で３ヶ月、６ヶ月静置した。
加速品製剤、及び未加速品製剤は、１ｍＬの純水で正確に溶解し、下記の方法の試験試料とした。
バイアル中のＧ−ＣＳＦ含有量（残存率）を下記の方法１に基づき測定した。また、バイアル中のＧ−ＣＳＦメチオニン残基酸化体生成率を下記の方法２に基づき測定した。
方法１
試料は、Ｃ４逆相カラム（４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ、３００オングストローム）を用い、純水、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸を移動相に用いた逆相系高速液体クロマトグラフィー法によりＧ−ＣＳＦ含量を測定した。Ｇ−ＣＳＦとして５μｇ相当量を注入し、アセトニトリルのグラジエントによりＧ−ＣＳＦを溶出させ、２１５ｎｍの波長で分光学的に検出した。
本方法で測定したＧ−ＣＳＦ含量を用い、下記の式に基づき、６０℃−２週間、及び５０℃−１ヶ月間加速後及び６０℃で２週間及び１ヶ月；５０℃で１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月；４０℃で２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月；並びに２５℃で３ヶ月、６ヶ月保存したときのＧ−ＣＳＦ残存率を残存率（％）を算出した。
【式１】
0004607336.tif 000004
方法２
試料は、Ｃ４逆相カラム（４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ、３００オングストローム）を用い、純水、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸を移動相に用いた逆相系高速液体クロマトグラフィー法によりＧ−ＣＳＦ未変化体及び、Ｇ−ＣＳＦ  Ｍｅｔ残基酸化体を測定した。アセトニトリルのグラジエントによりＧ−ＣＳＦを溶出させ、２１５ｎｍの波長で分光学的に検出した。
本方法で測定したＧ−ＣＳＦ未変化体及びＧ−ＣＳＦ  Ｍｅｔ残基酸化体にピーク面積を用い、下記の式に基づき、６０℃−２週間、及び５０℃−１ヶ月間加速後のＧ−ＣＳＦ  Ｍｅｔ残基酸化体生成率（％）を算出した。
【式２】
0004607336.tif 000005
実施例１：各種ｐＨのＧ−ＣＳＦ残存率に及ぼす効果
表１に記載の各種ｐＨで調製した試料１及び試料２を、６０℃−２週、及び５０℃−１ヶ月間加速試験を行った後のＧ−ＣＳＦ残存率を方法１に記載の式により算出した。得られた結果を表３に示す。
【表３】
0004607336.tif 000006
ｐＨ７．４処方に比べて、ｐＨ６．５において、同等あるいはそれ以上の安定性を示した。
実施例２：各種アミノ酸のＧ−ＣＳＦ残存率に及ぼす効果（１）
表１に記載の各種アミノ酸を添加して調製した試料３〜６（Ｇ−ＣＳＦ含量１００μｇ）、並びに試料７〜１０（Ｇ−ＣＳＦ含量２５０μｇ）を、６０℃−２週間、及び５０℃−１ヶ月間加速試験を行った後のＧ−ＣＳＦ残存率を方法１に記載の式により算出した。得られた結果を表４及び表５に示す。
【表４】
0004607336.tif 000007
【表５】
0004607336.tif 000008
いずれのＧ−ＣＳＦ含量においても、アミノ酸無添加処方に比べて、フェニルアラニンを単独添加、あるいはアルギニンを単独添加した製剤では安定性が向上しているが、十分ではない。フェニルアラニンとアルギニンを併用することで安定性の顕著な向上が認められた。
実施例３：各種アミノ酸のＧ−ＣＳＦ残存率に及ぼす効果（２）
表１に記載の各種アミノ酸を添加して調製した試料１１〜２０（アミノ酸１としてフェニルアラニンを、アミノ酸２としてリジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンのいずれかを添加）、並びに試料２１〜３３（アミノ酸１としてアルギニンを、アミノ酸２としてアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、グリシン、セリン、トレオニン、アスパラギン及びグルタミンのいずれかを添加）を、６０℃−２週間、及び５０℃−１ヶ月間加速試験を行った後のＧ−ＣＳＦ残存率を方法１に記載の式により算出した。得られた結果を表６及び表７に示す。
【表６】
0004607336.tif 000009
【表７】
0004607336.tif 000010
フェニルアラニンとリジン、フェニルアラニンとヒスチジン、フェニルアラニンとアルギニン、フェニルアラニンとアスパラギン酸、フェニルアラニンとグルタミン酸、フェニルアラニンとトレオニン、フェニルアラニンとアスパラギンの組み合わせ、並びにアルギニンとロイシン、アルギニンとトリプトファン、アルギニンとフェニルアラニンの組み合わせにおいてそれぞれ顕著な長期保存安定性が観察された。
実施例４：長期保存試験
フェニルアラニン１０ｍｇ、アルギニン１０ｍｇ、メチオニン１ｍｇを含み、Ｇ−ＣＳＦ含量が１００μｇ及び２５０μｇの試料について、６０℃で２週間及び１ヶ月；５０℃で１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月；４０℃で２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月；並びに２５℃で３ヶ月、６ヶ月保存したときのＧ−ＣＳＦ残存率を方法１に記載の式により算出した。得られた結果を表８に示す。
【表８】
0004607336.tif 000011
いずれも優れたＧ−ＣＳＦ残存率を示した。
実施例５：アミノ酸添加のＧ−ＣＳＦ  Ｍｅｔ残基酸化体生成率に及ぼす効果
表２に記載の各量のメチオニンを添加して調製した試料３４〜３６（フェニルアラニンとアルギニンの量は一定でメチオニン添加量がそれぞれ０ｍｇ，０．１ｍｇ、１ｍｇ）を、６０℃−２週間加速試験を行った後に上記方法２で実施したクロマトグラムの１例を図１に、調製直後及び５０℃−１ヶ月加速試験を行った後に上記方法２で実施したクロマトグラムの１例を図２に示す。
メチオニン無添加試料（試料３４）では調製直後並びに５０℃−１ヶ月保存後のいずれにおいてもＧ−ＣＳＦ  Ｍｅｔ残基酸化体の生成が観察されたが、０．１ｍｇ以上のメチオニンの添加により、長期保存後にもＧ−ＣＳＦ  Ｍｅｔ残基酸化体の生成を完全に抑制することができた。
また、Ｇ−ＣＳＦ  Ｍｅｔ残基酸化体生成率を方法２に記載の式により算出した結果を表９に示す。
【表９】
0004607336.tif 000012
このように、０．１ｍｇ以上のメチオニンの添加により、Ｇ−ＣＳＦ  Ｍｅｔ残基酸化体の生成を完全に抑制することができた。
実施例６：パラサイロイドホルモン溶液製剤へのメチオニン添加による、メチオニン残基酸化抑制作用
１〜８４残基を有するパラサイロイドホルモン（以下ＰＴＨと略記）（ＷＯ９０１４４１５に記載の方法で製造）を２００μｇ／ｍＬを含み、バイアル当たりの各原料の添加量が下記の表１０になるよう、試料３７〜試料３９の各調剤液を調整し、無菌濾過を行った後、無菌的に各バイアルに１ｍＬずつ正確に充填し、完全打栓し、ＰＴＨ溶液製剤を製造した。
【表１０】
0004607336.tif 000013
このように無菌的に調整したＰＴＨ含有溶液製剤を、５０℃の恒温槽内に３日間、静置した。
試料は、Ｃ１８逆相カラム（４．６ｍｍｘ２５０ｍｍ、３００オングストローム）を用い、純水、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸を移動相に用いた逆相系高速液体クロマトグラフィー法によりＰＴＨ含量を測定した。ＰＴＨとして、１０μｇ相当量を注入し、アセトニトリルのグラジエントによりＰＴＨを溶出させ、２１５ｎｍの波長で分光学的に検出した。
本試験系では、ＰＴＨ未変化体の直前に、図３に示したとおり、８番目のメチオニン残基が酸化されたＰＴＨ，１８番目のメチオニン残基が酸化されたＰＴＨが検出される。このクロマトグラムに示すとおり、ＰＴＨ中の８番目のメチオニン残基における酸化、および、ＰＴＨ中の１８番目のメチオニン残基における酸化が、製剤中へのメチオニンの添加に伴い抑制可能であることが示されている。  さらに、製剤中へのメチオニンの添加は、メチオニン残基以外の化学分解反応には影響を及ぼしてはいないこともわかる。すなわち、製剤中へのメチオニン添加により、他の化学分解反応には影響を与えず、タンパク質中のメチオニン残基酸化体生成抑制のみを特異的に改善することが可能であることを示している。
産業上の利用分野
本発明のＧ−ＣＳＦ製剤は、長期保存後においてもＧ−ＣＳＦの残存率が極めて高く、またＧ−ＣＳＦのメチオニン残基酸化体生成率をほぼ完全に抑制することのできる安定な製剤である。
【図面の簡単な説明】
図１は、試料３４及び３６を、６０℃−２週間加速試験を行った後に、後述する方法２に記載する方法で実施したクロマトグラムを示す。
図２は、試料３４〜３６を、調製直後及び５０℃−１ヶ月加速試験を行った後に後述する方法２で実施したクロマトグラムを示す。
図３は、パラサイドホルモン溶液製剤を、実施例６で示す方法（５０℃−３日間保存）で実施した、メチオニンの添加によるメチオニン残基酸化抑制作用を示したＨＰＬＣクロマトグラムである。なお、図３中、中央の最も大きいピークがＰＴＨ未変化体であり、Ｍｅｔ−８ピーク、Ｍｅｔ−１８ピークがそれぞれ、８番目のメチオニン残基が酸化されたＰＴＨ，１８番目のメチオニン残基が酸化されたＰＴＨである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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