(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１５に記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質。
【請求項２】
配列番号７２に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載のタンパク質を認識する抗体。
【請求項４】
配列番号７２に記載されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号１５に記載されるヌクレオチド配列もしくはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５記載のポリヌクレオチドを含む，肝癌を診断する為の組成物。
【請求項７】
請求項４または５に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項８】
請求項７記載のベクターを含む細胞。
【請求項９】
請求項４または５に記載のポリヌクレオチドの発現量を測定することを特徴とする肝癌の存在を検出するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、癌に関連する遺伝子、この遺伝子によりコードされるタンパク質、およびこのタンパク質を認識する抗体に関する。本発明の遺伝子、タンパク質および抗体は、癌の診断および治療、ならびに癌の治療薬の開発において用いることができる。
【背景技術】  これまでに、細胞の癌化と関連してその発現量が変化する遺伝子や、癌のマーカーとなりうる抗原が多数見いだされており、多くの研究が行われている。しかし、特定の癌を特異的に検出または治療することは依然として困難である。したがって、当該技術分野においては、癌の診断および治療に用いることができる、さらに別の癌関連遺伝子およびタンパク質を同定することが求められている。
本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある：ＥＰ１０３３４０１；ＵＳ２００２０２２２４８；ＵＳ２００２０４２０９６；ＵＳ２００２０８１５０；ＵＳ６３３７１９５；ＵＳ６３６２３２１；ＷＯ９７３８０９８；ＷＯ９９２０７６４；ＷＯ９９２９７２９；ＷＯ０００６６９８；ＷＯ００１２７０２；ＷＯ００３４４７７；ＷＯ００３６１０７；ＷＯ００３７６４３；ＷＯ００５５１７４；ＷＯ００５５３２０；ＷＯ００５５３５１；ＷＯ００５５６３３；ＷＯ００５８４７３；ＷＯ００７３５０９；ＷＯ０１００８２８；ＷＯ０１０９３１７；ＷＯ０１２１６５３；ＷＯ０１２２９２０；ＷＯ０１５１５１３；ＷＯ０１５１６２８；ＷＯ０１５４７３３；ＷＯ０１５５９５５；ＷＯ０１５７０５８；ＷＯ０１５９１１１；ＷＯ０１６０８６０；ＷＯ０１６４８３５；ＷＯ０１６４８８６；ＷＯ０１６６７１９；ＷＯ０１７０９７６；ＷＯ０１７３０２７；ＷＯ０１７５１７７；ＷＯ０１７７１６８；ＷＯ０１９２５７８；ＷＯ０１９４６２９；ＷＯ０２００６７７；ＷＯ０２００８８９；ＷＯ０２００９３９；ＷＯ０２０４５１４；ＷＯ０２１０２１７；ＷＯ０２１２２８０；ＷＯ０２２０５９８；ＷＯ０２２９０８６；ＷＯ０２２９１０３；ＷＯ０２５８５３４；ＷＯ０２６０３１７；ＷＯ０２６４７９７。
本発明は、癌の診断および治療剤として用いることができる遺伝子およびタンパク質を提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明者らは、癌組織において特定の遺伝子の発現が亢進していることを見いだし、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントを提供する。
１つの観点においては、本発明は、配列番号１、２、２８、２９、３０、３１、３２、５１、５２、６０および６１のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子、および該遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントを提供する。好ましくは、該遺伝子は、配列番号１、２、２８、２９、３０、３１および３２のいずれかに記載されるヌクレオチド配列、より好ましくは配列番号１または２に記載されるヌクレオチド配列を有する。
これらのタンパク質やフラグメントは肺癌の診断または治療のための組成物として有用である。
別の観点においては、本発明は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、５３、５４および５５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子、および該遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメント提供する。好ましくは、該遺伝子は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、２２、２３、２４、２５および２６のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する。
これらのタンパク質やフラグメントは胃癌の診断または治療のための組成物として有用である。
別の観点においては、本発明は、配列番号３、７、２０、２１、４６、４７、４８、４９および５０のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子、および該遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントを提供する。好ましくは、該遺伝子は、配列番号３、７、２０、２１、４６、４９および５０のいずれかに記載されるヌクレオチド配列、より好ましくは配列番号３、７、２０および２１のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する。
これらのタンパク質やフラグメントは大腸癌の診断または治療のための組成物として有用である。
別の観点においては、本発明は、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、４３、４４、４５、５６、５７、５８、５９、６２、６３、６４および６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子、および該遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントを提供する。好ましくは、該遺伝子は、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、４５、５６、５７、５８、６４および６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列、より好ましくは、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、６４および６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する。
これらのタンパク質やフラグメントは肝癌の診断または治療のための組成物として有用である。
好ましくは、本発明の組成物において、該遺伝子は、配列番号１、９、１０、１４、２０、２２、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３２、３８、３９、４０、４４、５１、５２、５３、５４および５８のいずれかに記載されるヌクレオチド配列、より好ましくは、配列番号１、９、１０、１４、２０、２２、２４、２５および２６のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する。
また好ましくは、本発明の組成物において、該遺伝子は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２３、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３７、４１、４２、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、５６、５７、５９、６０、６１、６２および６３のいずれかに記載されるヌクレオチド配列、より好ましくは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２１および２３のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する。
別の観点においては、本発明は、上述の遺伝子またはそのフラグメントを発現する細胞またはベクターを提供する。これらの細胞やベクターは、本発明のタンパク質の製造、該タンパク質に対する抗体の製造、癌の診断・治療などに有用である。
また別の観点においては、本発明は、配列番号６６−１２３に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのフラグメントを提供する。これらのタンパク質またはそのフラグメントは、抗体の製造の際の抗原として、または癌の診断・治療に有用である。
さらに別の観点においては、本発明は、上述のタンパク質またはそのフラグメントを認識する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。本発明はまた、このような抗体を産生する細胞を提供する。
さらに別の観点においては、本発明は、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列もしくはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいはこれらのポリヌクレオチドに高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを提供する。
さらに、本発明は、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチド配列もしくはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいは、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも１２ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを提供する。
これらのポリヌクレオチドは、癌の診断、タンパク質の製造、プライマー、遺伝子発現阻害の為のアンチセンス・ｓｉＲＮＡなどに有用である。
さらに別の観点においては、本発明は、抗癌活性を有する化合物を同定する方法であって、培養ヒト細胞を試験化合物と接触させ、そして前記細胞において配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現量の変化を引き起こす化合物を抗癌活性を有する化合物として同定する、の各工程を含む方法を提供する。
さらに別の観点においては、本発明は、Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法を提供する。好ましくは、癌は、肺癌、肝癌、または膵癌である。本発明の方法においては、好ましくは、細胞外に分泌されたＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質が検出される。また好ましくは、本発明の方法はＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を認識する抗体を用いて行われる。好ましくは、本発明の方法においては、血液中、血清中、または血漿中のＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質、あるいは細胞から分離したＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質が検出される。
別の態様においては、本発明は、以下の工程：
（ａ）  被験者から試料を採取する工程；
（ｂ）  採取された試料に含まれるＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を検出する工程
を含む癌の診断方法を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１の発現解析の結果を示す。
図２は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２の発現解析の結果を示す。
図３は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２の発現解析の結果を示す。
図４は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３の発現解析の結果を示す。
図５は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４の発現解析の結果を示す。
図６は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５の発現解析の結果を示す。
図７は、癌関連遺伝子ＴＥＧ６の発現解析の結果を示す。
図８は、癌関連遺伝子ＴＥＧ６の発現解析の結果を示す。
図９は、癌関連遺伝子ＴＥＧ７の発現解析の結果を示す。
図１０は、癌関連遺伝子ＴＥＧ８の発現解析の結果を示す。
図１１は、癌関連遺伝子ＴＥＧ９の発現解析の結果を示す。
図１２は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１０の発現解析の結果を示す。
図１３は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１１の発現解析の結果を示す。
図１４は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１２の発現解析の結果を示す。
図１５は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１３の発現解析の結果を示す。
図１６は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１４の発現解析の結果を示す。
図１７は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１５の発現解析の結果を示す。
図１８は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１６の発現解析の結果を示す。
図１９は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１７の発現解析の結果を示す。
図２０は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１８の発現解析の結果を示す。
図２１は、癌関連遺伝子ＴＥＧ１９の発現解析の結果を示す。
図２２は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２０の発現解析の結果を示す。
図２３は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２１の発現解析の結果を示す。
図２４は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２２の発現解析の結果を示す。
図２５は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２３の発現解析の結果を示す。
図２６は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２４の発現解析の結果を示す。
図２７は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２５の発現解析の結果を示す。
図２８は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２６の発現解析の結果を示す。
図２９は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２７の発現解析の結果を示す。
図３０は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２８の発現解析の結果を示す。
図３１は、癌関連遺伝子ＴＥＧ２９の発現解析の結果を示す。
図３２は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３０の発現解析の結果を示す。
図３３は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３１の発現解析の結果を示す。
図３４は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３２の発現解析の結果を示す。
図３５は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３３の発現解析の結果を示す。
図３６は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３４の発現解析の結果を示す。
図３７は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３５の発現解析の結果を示す。
図３８は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３６の発現解析の結果を示す。
図３９は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３７の発現解析の結果を示す。
図４０は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３８の発現解析の結果を示す。
図４１は、癌関連遺伝子ＴＥＧ３９の発現解析の結果を示す。
図４２は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４０の発現解析の結果を示す。
図４３は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４１の発現解析の結果を示す。
図４４は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４２の発現解析の結果を示す。
図４５は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４３の発現解析の結果を示す。
図４６は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４４の発現解析の結果を示す。
図４７は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４５の発現解析の結果を示す。
図４８は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４６の発現解析の結果を示す。
図４９は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４７の発現解析の結果を示す。
図５０は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４８の発現解析の結果を示す。
図５１は、癌関連遺伝子ＴＥＧ４９の発現解析の結果を示す。
図５２は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５０の発現解析の結果を示す。
図５３は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５１の発現解析の結果を示す。
図５４は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５２の発現解析の結果を示す。
図５５は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５３の発現解析の結果を示す。
図５６は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５４の発現解析の結果を示す。
図５７は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５５の発現解析の結果を示す。
図５８は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５６の発現解析の結果を示す。
図５９は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５７の発現解析の結果を示す。
図６０は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５８の発現解析の結果を示す。
図６１は、癌関連遺伝子ＴＥＧ５９の発現解析の結果を示す。
図６２は、癌関連遺伝子ＴＥＧ６０の発現解析の結果を示す。
図６３は、癌関連遺伝子ＴＥＧ６１の発現解析の結果を示す。
図６４は、癌関連遺伝子ＴＥＧ６２の発現解析の結果を示す。
図６５は、癌関連遺伝子ＴＥＧ６３の発現解析の結果を示す。
図６６は、癌関連遺伝子ＴＥＧ６４の発現解析の結果を示す。
図６７は、新規遺伝子Ｋ＃１の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
図６８は、新規遺伝子Ｋ＃１とＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＸＭ＿０６７３６９とのアライメントを示す。
図６９は、新規遺伝子Ｋ＃１のアミノ酸配列モチーフの解析結果を示す。
図７０は、新規遺伝子Ｋ＃２（クローン１１）の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
図７１は、新規遺伝子Ｋ＃２（クローン１８）の塩基配列およびアミノ酸配列を示す。
図７２は、新規遺伝子Ｋ＃２（クローン１１）と、ヒトＬＩＮ−２８、線虫ＬＩＮ−２８、アフリカツメガエルＬＩＮ−２８、ショウジョウバエＬＩＮ−２８およびマウスＬＩＮ−２８のアミノ酸配列の比較を示す。
図７３は、Ｃ２０ｏｒｆ１０２遺伝子の肺扁平上皮癌における発現を示す。
図７４は、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を用いる、各種癌細胞株およびその培養上清におけるＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質分子の検出を示す。
図７５は、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を用いる、肺腺癌組織におけるＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質の発現解析の結果を示す。
図７６は、抗ｈＮｏｔｕｍ抗体を用いる、各種癌細胞株およびその培養上清におけるｈＮｏｔｕｍタンパク質分子の検出を示す。
図７７は、抗ｈＮｏｔｕｍ抗体を用いる、肝癌組織におけるｈＮｏｔｕｍタンパク質の発現解析の結果を示す。
図７８は、抗Ｋ＃２抗体を用いる、Ｋ＃２強制発現細胞株および各種癌細胞株におけるＫ＃２タンパク質分子の検出を示す。
図７９は、抗Ｋ＃２抗体を用いる、肝癌組織におけるＫ＃２タンパク質の発現解析の結果を示す。
図８０は、抗ＫＩＡＡ１３５９抗体を用いる、ＫＩＡＡ１３５９強制発現細胞株および各種癌細胞株におけるＫＩＡＡ１３５９タンパク質分子の検出を示す。
図８１は、抗ＫＩＡＡ１３５９抗体を用いる、胃癌組織におけるＫＩＡＡ１３５９タンパク質の発現解析の結果を示す。
図８２は、抗ＰＥＧ１０／ＯＲＦ２抗体を用いる、ＰＥＧ１０強制発現細胞株および各種癌細胞株におけるＰＥＧ１０タンパク質分子の検出を示す。
図８３は、抗ＰＥＧ１０／ＯＲＦ２抗体を用いる、肝細胞癌組織におけるＰＥＧ１０タンパク質の発現解析の結果を示す。
図８４は、抗ＤＵＳＰ９抗体を用いる、ＤＵＳＰ９強制発現細胞株および各種癌細胞株におけるＤＵＳＰ９タンパク質分子の検出を示す。
図８５は、抗ＤＵＳＰ９抗体を用いる、肝細胞癌組織におけるＤＵＳＰ９タンパク質の発現解析の結果を示す。
図８６は、抗ＣｙｓｔａｔｉｎＳＮ抗体を用いる、大腸癌組織におけるＣｙｓｔａｔｉｎＳＮタンパク質の発現解析の結果を示す。
図８７は、抗ＳＦＲＰ４抗体を用いる、胃癌組織におけるＳＦＲＰ４タンパク質の発現解析の結果を示す。
図８８は、抗ＳＦＲＰ４抗体を用いる、ＳＦＲＰ４を強制発現させたＣＯＳ７細胞の培養上清おけるＳＦＲＰ４タンパク質の検出を示す。
発明の詳細な説明
本発明は、癌組織において特定の遺伝子の発現が亢進している遺伝子、およびこの遺伝子によりコードされるタンパク質を利用する、癌の診断および治療のための組成物を提供する。
蛋白質
第１の観点においては、本発明は、配列番号１−６５に記載される癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントを提供する。好ましくは、本発明の組成物は、配列番号６６−１２３に記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのフラグメントを含む。
本発明のタンパク質またはそのフラグメントは、癌の診断・治療や、抗体作製の際の抗原として有用である。
本発明の組成物においては、タンパク質またはそのフラグメントは、所望の免疫原性を有する限り、上述の配列から、１または数個のアミノ酸残基が欠失、置換または付加された変異体であってもよい。このような変異体は、好ましくは、上述のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、好ましくは９０％またはそれ以上、より好ましくは９５％またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
アミノ酸配列の同一性は、比較すべき２つの配列において、同一である残基の数を残基の総数で割り、１００を乗ずることにより表される。標準的なパラメータを用いて配列の同一性を決定するためのいくつかのコンピュータプログラム、例えば、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２），ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）、およびスミス−ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ）（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７）が利用可能である。
あるアミノ酸配列に対する１または複数個のアミノ酸残基の欠失、付加および／または他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸およびアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
当業者であれば公知の方法、例えば、部位特異的変異誘発法（Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ，ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ  Ｗ，ａｎｄ  Ｆｒｉｔｚ  ＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８２，４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、アミノ酸に適宜変異を導入することにより、該タンパク質と同等なタンパク質を調製することが可能である。
本発明のタンパク質は、後述するタンパク質を産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点または糖鎖の有無や形態などが異なり得る。例えば、本発明のタンパク質を原核細胞、例えば大腸菌で発現させた場合、本来のタンパク質のアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加される。本発明のタンパク質はこのようなタンパク質も包含する。
本発明のタンパク質は、当業者に公知の方法により、組み換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することが可能である。組み換えタンパク質であれば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のタンパク質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、本発明のタンパク質をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えタンパク質として宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えタンパク質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。融合タンパク質の精製後、必要に応じて融合タンパク質のうち、目的のタンパク質以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。
天然のタンパク質であれば、当業者に周知の方法、例えば、本発明のタンパク質を発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述する本発明のタンパク質に結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明は、また、本発明のタンパク質のフラグメント（部分ペプチド）を包含する。本発明のフラグメントは、例えば、本発明のタンパク質に対する抗体の作製、本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニングや、本発明のタンパク質の促進剤や阻害剤のスクリーニングに利用し得る。また、本発明のタンパク質のアンタゴニストや競合阻害剤になり得る。
本発明のフラグメントは、免疫原とする場合には、少なくとも７アミノ酸以上、好ましくは８アミノ酸以上、さらに好ましくは９アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。本発明のタンパク質の競合阻害剤として用いる場合には、少なくとも１００アミノ酸以上、好ましくは２００アミノ酸以上、さらに好ましくは３００アミノ酸以上のアミノ酸配列を含む。
本発明のフラグメントは、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明のタンパク質を適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによってもよい。
本発明は、また、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターは、宿主細胞内において本発明のＤＮＡを保持させたり、本発明のタンパク質を発現させるために有用である。
ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有していることが好ましい。
ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。
本発明のタンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（ファルマシア社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ  ｓｙｓｔｅｍ」（キアゲン社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
また、ベクターには、タンパク質分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、本発明のタンパク質を製造するためのベクターとしては、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ  ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ」（ギブコＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩＰｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ」（インビトロゲン社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製起点を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点としては、また、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明のタンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。タンパク質製造のための産生系は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ  Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することによりタンパク質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、ｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物または植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物または植物の体内でタンパク質を産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ  Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から、目的のタンパク質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入したバキュロウイルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のタンパク質を得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望のタンパク質を得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ  Ｋ．−Ｃ．Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
これにより得られた本発明のタンパク質は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｄａｎｉｅｌ  Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたタンパク質も包含する。
なお、タンパク質を精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
後述の実施例において示されるように、配列番号１−６５に示される癌関連遺伝子の遺伝子配列（表１を参照）を元にＰＣＲプライマーを設計し、ヒトの正常および癌組織から得たｃＤＮＡを用いて、定量ＰＣＲによりヒト組織における癌関連遺伝子の発現量の定量化を行ったところ、本発明の癌関連遺伝子は特定のヒト癌組織においてその発現が亢進されていることが見いだされた。
配列番号１、２、２８、２９、３０、３１、３２、５１、５２、６０および６１に記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子は、肺癌においてその発現が亢進していることが見いだされた。すなわち、配列番号１、２、２８、２９、３０、３１、３２、５１、５２、６０および６１に記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントは、肺癌の診断または治療において有用である。好ましくは、該遺伝子は、配列番号１、２、２８、２９、３０、３１および３２のいずれかに記載されるヌクレオチド配列、より好ましくは配列番号１または２に記載されるヌクレオチド配列を有する。
配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、５３、５４および５５に記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子は、胃癌においてその発現が亢進していることが見いだされた。すなわち、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、５３、５４および５５に記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントは、胃癌の診断または治療において有用である。好ましくは、該遺伝子は、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、２２、２３、２４、２５および２６のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する。
配列番号３、７、２０、２１、４６、４７、４８、４９および５０に記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子は、大腸癌においてその発現が亢進していることが見いだされた。すなわち、配列番号３、７、２０、２１、４６、４７、４８、４９および５０に記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントは、大腸癌の診断または治療において有用である。好ましくは、該遺伝子は、配列番号３、７、２０、２１、４６、４９および５０のいずれかに記載されるヌクレオチド配列、より好ましくは配列番号３、７、２０および２１のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する。
配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、４３、４４、４５、５６、５７、５８、５９、６２、６３、６４および６５に記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子は、肝癌においてその発現が亢進していることが見いだされた。すなわち、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、４３、４４、４５、５６、５７、５８、５９、６２、６３、６４および６５に記載されるヌクレオチド配列を有する遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントは、肝癌の診断または治療において有用である。好ましくは、該遺伝子は、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、４５、５６、５７、５８、６４および６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列、より好ましくは、配列番号１４、１５、１６、１７、１８、１９、６４および６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する。
配列番号１−６５に記載される癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントを含む本発明の組成物は、癌に対するワクチンとして用いることができる。上述のタンパク質またはその免疫原性フラグメントを、適当なアジュバントとともに、あるいは他の適当なポリペプチドとの融合タンパク質として、対象となるヒトまたはその他の動物に投与することにより、そのヒトまたは動物の体内で免疫応答を生じさせることができる。あるいは、本発明の組成物は、上述の癌関連遺伝子またはそのフラグメントを発現する細胞の形で投与してもよい。
また、本発明の組成物は、被検者が配列番号１−６５に記載される癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体を有するか否かを測定することにより、特定の癌に罹患しているか否かを診断するために用いることができる。
抗体
別の観点においては、本発明は、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有する癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントを認識する抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。さらに、該抗体またはその結合フラグメントを含む、癌を診断または治療するための組成物を提供する。本発明の抗体は、好ましくは、配列番号６６−１２３で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質またはそのフラグメントを認識することができる。本発明はまた、このような抗体を産生する細胞を提供する。
認識するとは、抗体が、特定の条件下において、上述の癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質またはそのフラグメントに対して、他のポリペプチドに結合するより高い親和性をもって結合することを意味する。
本発明の抗体には、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびに抗原決定基に特異的に結合する能力を保持している抗体およびＴ−細胞レセプターフラグメント等の、抗体の変種および誘導体が含まれる。
又、本発明の抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、等を適宜用いることができる。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするＤＮＡをヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡをヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，１９９３，５３，８５１−８５６．）。
また、ヒト抗体の取得方法も知られている。例えば、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８参照）。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ９３／１２２２７，ＷＯ９２／０３９１８，ＷＯ９４／０２６０２，ＷＯ９４／２５５８５，ＷＯ９６／３４０９６，ＷＯ９６／３３７３５参照）。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／２０７９１，ＷＯ９３／０６２１３，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９３／１９１７２，ＷＯ９５／０１４３８，ＷＯ９５／１５３８８を参考にすることができる。
また、抗体は抗原に結合することができれば、抗体断片（フラグメント）等の低分子化抗体や抗体の修飾物などであってもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｄｉａｂｏｄｙなどを挙げることができる。このような抗体断片を得るには、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。又、抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質などを結合することも可能であり、特に放射性標識抗体は有用である。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
又、本発明においては、細胞傷害活性を増強する目的などで、糖鎖を改変した抗体などを用いることも可能である。抗体の糖鎖改変技術は既に知られている（例えば、ＷＯ００／６１７３９、ＷＯ０２／３１１４０など）。
又、本発明においては、２種以上の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体も含まれる。通常このような分子は２個の抗原を結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体）、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類の）抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。多特異性抗体は全長からなる抗体、またはそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二特異性抗体）であり得る。
当分野において多特異性抗体の製造法は公知である。全長の二特異性抗体の産生は、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の共発現を含むものである（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖はランダムに取り合わされるので、共発現を行う得られた複数のハイブリドーマ（クワドローマ）は、各々異なる抗体分子を発現するハイブリドーマの混合物であり、このうち正しい二特異性抗体を産生するものを選択する必要がある。選択はアフィニティークロマトグラフィー等の方法により行うことができる。また、別な方法では所望の結合特異性を有する抗体の可変領域を免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合する。該定常ドメイン配列は、好ましくは免疫グロブリンの重鎖の定常領域の内、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の一部を少なくとも含むものである。好ましくは、さらに軽鎖との結合に必要な重鎖のＣＨ１領域が含まれる。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、および、所望により免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡをそれぞれ別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に形質転換する。別々の発現ベクターに各遺伝子を挿入することにより、それぞれの鎖の存在割合が同じでない方が、得られる抗体の収量が上がる場合に、各鎖の発現割合の調節が可能となり都合が良いが、当然ながら、複数の鎖をコードする遺伝子を一つのベクターに挿入して用いることも可能である。
好ましい態様においては、第一の結合特性を有する重鎖がハイブリッド免疫グロブリンの一方の腕として存在し、別の結合特性の重鎖−軽鎖複合体がもう一方の腕として存在する二重特異性抗体が望ましい。このように一方の腕のみに軽鎖を存在させることにより、二重特異性抗体の他の免疫グロブリンからの分離を容易に行うことができる。該分離方法については、ＷＯ９４／０４６９０参照。二特異性抗体の作成方法については、さらに、Ｓｕｒｅｓｈら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０（１９８６））の方法を参照することができる。組換細胞培養物から得られる最終産物中のホモダイマーを減らしヘテロダイマーの割合を増加させる方法として、抗体の定常ドメインのＣＨ３を含み、一方の抗体分子において、他方の分子と結合する表面の１若しくは複数の小さな側鎖のアミノ酸を大きな側鎖のアミノ酸（例えば、チロシンやトリプトファン）に変え、他方の抗体分子の対応する部分の大きさ側鎖のアミノ酸を小さなもの（例えば、アラニンやスレオニン）に変えて第一の抗体分子の大きな側鎖に対応する空洞を設ける方法も知られている（ＷＯ９６／２７０１１）。
二重特異性抗体には、例えば、一方の抗体がアビジンに結合され、他方がビオチン等に結合されたようなヘテロ共役抗体が含まれる（米国特許第４，６７６，９８０号；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／００３７３；ＥＰ０３０８９）。このようなヘテロ共役抗体の作成に利用される架橋剤は周知であり、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号にもそのような例が記載されている。
また、抗体断片より二特異性抗体を製造する方法も報告されている。例えば、化学結合を利用して製造することができる。例えば、まずＦ（ａｂ’）２断片を作成し、同一分子内でのジフルフィド形成を防ぐため断片をジチオール錯化剤アルサニルナトリウムの存在化で還元する。次にＦ（ａｂ’）２断片をチオニトロ安息香酸塩（ＴＮＢ）誘導体に変換する。メルカプトエチルアミンを用いて一方のＦ（ａｂ’）２−ＴＮＢ誘導体をＦａｂ’−チオールに再還元した後、Ｆ（ａｂ’）２−ＴＮＢ誘導体およびＦａｂ’−チオールを等量混合し二特異性抗体を製造する。
組換細胞培養物から直接、二重特異性抗体を製造し、単離する方法も種々、報告されている。例えば、ロイシンジッパーを利用した二重特異性抗体の製造方法が報告されている（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２））。まず、ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質のロイシンジッパーペプチドを、遺伝子融合により異なる抗体のＦａｂ’部分に連結させ、ホモダイマーの抗体をヒンジ領域においてモノマーを形成するように還元し、抗体ヘテロダイマーとなるように再酸化する。また、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を、これら２つのドメイン間での対形成できない位に短いリンカーを介して連結し、相補的な別のＶＬおよびＶＨドメンと対を形成させ、それにより２つの抗原結合部位を形成させる方法もある（Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３））。また、一本鎖Ｆｖ（ｓＦＶ）を用いたダイマーについても報告されている（Ｇｒｕｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５３６８（１９９４））。さらに、二重特異性ではなく三重特異性の抗体についても報告されている（Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１））。
本発明における「抗体」にはこれらの抗体も包含される。
本発明の抗体および抗体フラグメントは、任意の適当な方法、例えば、インビボ、培養細胞、インビトロ翻訳反応、および組換えＤＮＡ発現系により製造することができる。
モノクローナル抗体およびハイブリドーマを製造する手法は当該技術分野においてよく知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，”Ｍｏｎｏｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，１９８４；Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３５：１−２１，１９８０）。上述の癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質またはフラグメントを免疫原として用いて、抗体を生成することが知られている任意の動物（マウス、ウサギ等）に皮下または腹膜内注射することにより免疫することができる。免疫に際してアジュバントを用いてもよく、そのようなアジュバントは当該技術分野においてよく知られている。
ポリクローナル抗体は、免疫した動物から抗体を含有する抗血清を単離し、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、またはラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、所望の特異性を有する抗体の存在についてスクリーニングすることにより得ることができる。
モノクローナル抗体は、免疫した動物から脾臓細胞を切除し、ミエローマ細胞と融合させ、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を作製することにより得ることができる。ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、またはラジオイムノアッセイ等の当該技術分野においてよく知られる方法を用いて、目的とするタンパク質またはそのフラグメントを認識する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する。所望の抗体を分泌するハイブリドーマをクローニングし、適切な条件下で培養し、分泌された抗体を回収し、当該技術分野においてよく知られる方法、例えばイオン交換カラム、アフィニティークロマトグラフィー等を用いて精製することができる。あるいは、ゼノマウス株を用いてヒト型モノクローナル抗体を製造してもよい（Ｇｒｅｅｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３，１９９９；Ｗｅｌｌｓ，Ｅｅｋ，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ２０００  Ａｕｇ；７（８）：Ｒ１８５−６を参照）。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用な方法（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）により容易に単離、配列決定できる。ハイブリドーマ細胞はこのようなＤＮＡの好ましい出発材料である。一度単離したならば、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または形質転換されなければ免疫グロブリンを産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞へ組換え、組換え宿主細胞からモノクローナル抗体を産生させる。また別の態様として、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０））により記載された技術を用いて製造された抗体ファージライブラリーより抗体、または抗体断片は単離することができる。
上述の抗体は、検出可能なように標識することができる。標識としては、放射性同位体、アフィニティー標識（例えばビオチン、アビジン等）、酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光標識（例えばＦＩＴＣまたはローダミン等）、常磁性原子等が挙げられる。そのような標識を行う方法は当該技術分野においてよく知られている。上述の抗体は、固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例には、プラスチック、アガロース、セファロース、ポリアクリルアミドおよびラテックスビーズ等が含まれる。抗体をそのような固体支持体に結合させる技術は当該技術分野においてよく知られている。
後述の実施例において記載されるように、本発明の癌関連遺伝子は、特定の癌組織において亢進された発現を示すため、本発明の抗体は、癌診断マーカーとして有用である。本発明の抗体を、ウエスタンブロット法、ＥＬＩＳＡ法、組織染色法などの手法において用いて、組織または細胞における、癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を検出することができる。被験者の組織に由来する試料（例えば、生検サンプル、血液サンプル等）と本発明の組成物とを免疫複合体が形成されるような条件下で接触させ、該試料に抗体が結合するか否かを判定することにより、該試料中の癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質の存在または量を判定することができ、このことにより癌の診断、癌の進行または治癒のモニタリング、および予後の予測を行うことができる。本発明の診断用組成物は、試料中で上述の癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質の存在を検出するためのキットとして提供することができる。このようなキットは、上述の抗体に加えて、洗浄試薬および結合した抗体の存在を検出しうる試薬、例えば、標識第２抗体、標識された抗体と反応しうる発色団、酵素、または抗体結合試薬、ならびに使用の指針を含むことができる。
さらに、本発明の癌関連遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体は、特定の癌細胞に対する特異性を有するため、癌の治療剤として、あるいは、薬剤を癌組織に特異的にターゲティングさせるミサイル療法において用いることができる。好ましくは、本発明の組成物は、肺癌、胃癌、大腸癌および肝癌の診断および治療において用いられる。
本発明の治療剤は、当該技術分野においてよく知られる薬学的に許容しうる担体とともに、混合、溶解、顆粒化、錠剤化、乳化、カプセル封入、凍結乾燥等により、製剤化することができる。
経口投与用には、本発明の治療剤を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、錠剤、丸薬、糖衣剤、軟カプセル、硬カプセル、溶液、懸濁液、乳剤、ゲル、シロップ、スラリー等の剤形に製剤化することができる。
非経口投与用には、本発明の治療剤を、薬学的に許容しうる溶媒、賦形剤、結合剤、安定化剤、分散剤等とともに、注射用溶液、懸濁液、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、吸入剤、座剤等の剤形に製剤化することができる。注射用の処方においては、本発明の治療剤を水性溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理的食塩緩衝液等の生理学的に適合性の緩衝液中に溶解することができる。さらに、組成物は、油性または水性のベヒクル中で、懸濁液、溶液、または乳濁液等の形状をとることができる。あるいは、治療剤を粉体の形態で製造し、使用前に滅菌水等を用いて水溶液または懸濁液を調製してもよい。吸入による投与用には、本発明の治療剤を粉末化し、ラクトースまたはデンプン等の適当な基剤とともに粉末混合物とすることができる。座剤処方は、本発明の治療剤をカカオバター等の慣用の坐剤基剤と混合することにより製造することができる。さらに、本発明の治療剤は、ポリマーマトリクス等に封入して、持続放出用製剤として処方することができる。
投与量および投与回数は、剤形および投与経路、ならびに患者の症状、年齢、体重によって異なるが、一般に、本発明の治療剤は、１日あたり体重１ｋｇあたり、約０．００１ｍｇから１０００ｍｇの範囲、好ましくは約０．０１ｍｇから１０ｍｇの範囲となるよう、１日に１回から数回投与することができる。
治療剤は通常非経口投与経路で、例えば注射剤（皮下注、静注、筋注、腹腔内注など）、経皮、経粘膜、経鼻、経肺などで投与されるが、特に限定されず、経口投与でもよい。
ポリヌクレオチド
さらに別の観点においては、本発明は、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列もしくはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいはこれらのポリヌクレオチドに高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを提供する。
さらに、本発明は、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチド配列もしくはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいは、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる少なくとも１２ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。
これらのポリヌクレオチドは、癌の診断、タンパク質の製造、プライマー、遺伝子発現阻害の為のアンチセンス・ｓｉＲＮＡなどに有用である。癌は、好ましくは、肺癌、胃癌、大腸癌および肝癌から選択される。
配列番号１−６５に示される本発明の癌関連遺伝子は、後述の実施例において示されるように、特定のヒト癌組織においてその発現が亢進されている。したがって、本発明の組成物は、癌関連遺伝子の発現をサイレンシングするためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｓｉＲＮＡ等の薬剤として、および癌関連遺伝子を検出するためのプローブまたはプライマーとして用いることができる。又、本発明のタンパク質を製造する際に用いることも可能である。
本発明の組成物に含まれるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらの混合物、あるいはＰＮＡ等の誘導体であってもよい。これらのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合、塩基および／または糖において化学的に修飾されていてもよく、５’末端および／または３’末端に修飾基を有していてもよい。ヌクレオシド間結合の修飾の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール等が挙げられる。塩基修飾の例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、および５−（カルボキシヒドロキシエチル）ウラシル等が挙げられる。糖修飾の例としては、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロ修飾等が挙げられる。また、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロースおよびヘキソース等の糖を用いてもよい。
本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列もしくはこれに相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、あるいはこれらのポリヌクレオチドに高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドである。高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なポリヌクレオチドは、通常、高い同一性を有する。ここで、高い同一性とは、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列と７０％以上の同一性を有し、好ましくは、８０％以上の同一性、さらに好ましくは９０％以上の同一性を有することを言う。
塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，１９９３）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０）。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
さらに、本発明は、配列番号６６−１２３に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは本発明のタンパク質を製造する際に用いることができ、又、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列またはその相補的な配列を有するポリヌクレオチドが癌細胞で高発現していることから、それらのポリヌクレオチドを検出して癌の診断を行う際のプローブとして用いること等が可能である。
又、本発明の組成物は、これを導入した細胞内で所望のアンチセンス、リボザイム、ｓｉＲＮＡを生成させることができる核酸構築物として提供してもよい。
本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをアンチセンス、リボザイム、ｓｉＲＮＡなどとして用いる場合、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは少なくとも１２ヌクレオチド以上の鎖長を有していることが好ましく、さらに好ましくは１２−５０ヌクレオチドであり、特に好ましくは１２−２５ヌクレオチドである。これらのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、所望のアンチセンス、リボザイムまたはｓｉＲＮＡの活性を有する限り、上述したヌクレオチド配列から、１または数個の塩基が欠失、置換または付加された変異体であってもよい。このような変異体は、好ましくは、上述のヌクレオチド配列と、少なくとも７０％、好ましくは９０％またはそれ以上、より好ましくは９５％またはそれ以上の同一性を有するヌクレオチド配列を有する。あるいは、このようなポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。
ハイブリダイゼーションとの用語は、ＤＮＡまたはこれに対応するＲＮＡが、溶液中でまたは固体支持体上で、別のＤＮＡまたはＲＮＡ分子と水素結合相互作用により結合することを意味する。このような相互作用の強さは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変化させることにより評価することができる。所望の特異性および選択性によって、種々のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を用いることができ、ストリンジェンシーは、塩濃度または変性剤の濃度を変化させることにより調節することができる。そのようなストリンジェンシーの調節方法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”、第２版．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅｄｓ．、１９８９）に記載されている。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、５０％ホルムアミドの存在下で、７００ｍＭのＮａＣｌ中４２℃、またはこれと同等の条件をいう。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．８、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理サケ精子ＤＮＡ、および５Ｘデンハルト溶液中で４２℃で一夜のハイブリダイゼーション；２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄；および０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで４５℃での洗浄である。
本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、当業者に公知の方法で製造することが可能である。例えば、当該技術分野において知られるプロトコルを用いて、市販のＤＮＡ合成機（例えば３９４合成器、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で合成することができる。あるいは、本明細書に開示される配列情報に基づいて、適当なテンプレートとプライマーとを組み合わせて用いて、当該技術分野においてよく知られるＰＣＲ増幅技術により製造することができる。
さらに、本発明のポリペプチドを発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、本発明のポリヌクレオチドの配列の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えば、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に記載の方法により調製してもよいし、市販のＤＮＡライブラリーを用いてもよい。また、本発明のポリペプチドを発現している細胞よりＲＮＡを調製し、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１）に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを増幅させることにより調製することも可能である。
また、得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたｃＤＮＡをプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムＤＮＡを単離することも可能である。
より具体的には、例えば、まず本発明のタンパク質を発現する細胞、組織（例えば、肺癌細胞、大腸癌細胞、肝癌細胞、胃癌細胞）などから、ｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社）等を用いて行うこともできる。また、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）に従い、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うことができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を調製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
また、本発明のＤＮＡにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８１）９，ｒ４３−７４）。また、本発明のＤＮＡは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なＤＮＡフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）および／または終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ、またはＴＡＧ）の挿入等が挙げられる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、試料中において癌関連遺伝子を検出するための核酸プローブとして用いることができる。本発明のプローブは、配列番号１−６５に記載される塩基配列またはこれと相補的な塩基配列の少なくとも１２塩基、２０、３０、５０または１００塩基またはそれ以上の連続する塩基配列を有し、癌関連遺伝子の特定の領域に特異的にハイブリダイズするよう選択される。組織、血液等の資料からＤＮＡを抽出するか、またはｍＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し、これをハイブリダイゼーションが生じるような条件下でプローブと接触させ、試料に結合したプローブの存在または量を検出することにより、試料中における癌関連遺伝子またはその転写産物の存在または量または変異を検出することができる。
プローブは、固体支持体上に固定化してもよい。そのような固体支持体の例としては、限定されないが、プラスチック、アガロース、セファロース、ポリアクリルアミド、ラテックスビーズおよびニトロセルロース等が含まれる。プローブをそのような固体支持体に結合させる技術は当該技術分野においてよく知られている。プローブは、標準的な標識技術、例えば放射性標識、酵素標識（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、蛍光標識、ビオチン−アビジン標識、化学発光等を用いて標識することにより可視化することができる。すなわち、本発明の組成物は、試料中の癌関連遺伝子またはその転写産物の存在を検出するためのキットとして提供することができる。このようなキットは、上述のプローブに加えて、洗浄試薬、結合したプローブの存在を検出することができる試薬、ならびに使用の指針を含むことができる。
あるいは、本発明の診断用組成物は、配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を増幅することができる１組のプライマーを含んでいてもよい。このようなプライマーを用いて、適当なｃＤＮＡライブラリをテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により目的とする配列を増幅した後、ハイブリダイゼーションまたは塩基配列決定などの手法によりＰＣＲ産物を分析し、試料中の癌関連遺伝子またはその転写産物の存在または量または変異を検出することができる。このようなＰＣＲ手法は当該技術分野においてよく知られており、例えば、”ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９９０に記載されている。
プライマーとして用いるためには、本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、配列番号１−６５のいずれかに示される塩基配列、またはこれと相補的な塩基配列中の連続する少なくとも１２塩基、好ましくは１２−５０塩基、より好ましくは１２−２０塩基の配列を有する。
本発明のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、癌関連遺伝子によりコードされるｍＲＮＡに結合しその発現を阻害するアンチセンス分子、またはｍＲＮＡを切断するリボザイムまたはｓｉＲＮＡとして用いて、癌関連遺伝子をサイレンシングすることができる。アンチセンス、リボザイムおよびｓｉＲＮＡ技術を用いて遺伝子発現を制御する方法は当該技術分野においてよく知られている。例えば、本発明の組成物を適当な担体とともに投与してもよく、あるいは、アンチセンス、リボザイムまたはｓｉＲＮＡをコードするベクターを投与してインビボでこれらの発現を誘導してもよい。
”リボザイム”との用語は、ｍＲＮＡを切断する触媒活性を有する核酸分子を表す。リボザイムは、一般に、エンドヌクレアーゼ、リガーゼまたはポリメラーゼ活性を示す。種々のタイプのトランス作用性リボザイム、例えばハンマーヘッドおよびヘアピンタイプのリボザイムが知られている。
”アンチセンス”とは、ゲノムＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、その転写および／または翻訳を阻害することによりそのタンパク質の発現を阻害する、核酸分子またはその誘導体を表す。結合は一般的な塩基対相補性によるものでもよく、または、例えば、ＤＮＡデュープレックスへの結合の場合には、二重ヘリックスの主溝における特異的相互作用によるものでもよい。アンチセンス核酸の標的部位としては、ｍＲＮＡの５’末端、例えばＡＵＧ開始コドンまでおよびこれを含む５’非翻訳配列が好ましいが、ｍＲＮＡの３’非翻訳配列またはコーディング領域の配列もｍＲＮＡの翻訳の阻害に有効であることが知られている。
ｓｉＲＮＡとは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を行うことができる二本鎖核酸を意味する（例えば、Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８を参照）。ｓｉＲＮＡは、配列特異的にｍＲＮＡを分解し、このことにより遺伝子の発現を抑制することができる。ｓｉＲＮＡは、典型的には、標的とする配列に相補的な配列を含む２０−２５塩基対の長さの二本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡ分子は、化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドを含んでいてもよい。
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質を製造する際に用いることも可能である。
スクリーニング
さらに別の観点においては、本発明は、抗癌活性を有する化合物を同定する方法を提供する。この方法は、培養ヒト細胞を試験化合物と接触させ、そして前記細胞において配列番号１−６５のいずれかに記載されるヌクレオチド配列を含む遺伝子の発現量の変化を引き起こす化合物を抗癌活性を有する化合物として同定する工程を含む。
試験化合物としては、天然または合成の任意の化合物を用いることができ、コンビナトリアルライブラリを用いてもよい。細胞における癌関連遺伝子の発現量は、例えば、上述した定量的ＰＣＲ法により簡便に測定することができるが、当該技術分野において知られる他のいずれの方法を用いてもよい。
検査方法
本発明は、本発明の遺伝子またはタンパク質の発現量を測定する工程を含む、癌の検査方法を提供する。以下に検査方法の具体的な態様を記載するが、本発明の検査方法は、それらの方法に限定されるものではない。
本発明の検査方法の１つの態様としては、まず、被検者からＲＮＡ試料を調製する。次いで、該ＲＮＡ試料に含まれる本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの量を測定する。次いで、測定されたＲＮＡの量を対照と比較する。別の態様としては、まず、被検者からｃＤＮＡ試料を調製する。次いで、該ｃＤＮＡ試料に含まれる本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡの量を測定する。次いで、測定されたｃＤＮＡの量を対照と比較する。
これらのような方法としては、当業者らに周知の方法、例えばノーザンブロッティング法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法等を挙げることができる。
ＤＮＡアレイ法においては、被検者から調製したＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡ試料を調製し、本発明のオリゴヌクレオチドが固定された基板と接触させ、該ｃＤＮＡ試料と該基板に固定されたヌクレオチドプローブとのハイブリダイズの強度を検出することにより、該ｃＤＮＡ試料に含まれる本発明の遺伝子の発現量を測定する。次いで、測定された本発明の遺伝子の発現量を対照と比較する。
被検者からのｃＤＮＡ試料の調製は、当業者に周知の方法で行うことができる。ｃＤＮＡ試料の調製の好ましい態様においては、まず被検者の細胞あるいは組織（例えば、肺、大腸、胃、肝臓、など）から全ＲＮＡの抽出を行う。全ＲＮＡの抽出は、当業者にとって周知の方法、例えば次のようにして行うことができる。全ＲＮＡ抽出には純度の高い全ＲＮＡが調製できる方法であれば、既存の方法およびキット等を用いることが可能である。例えばＡｍｂｉｏｎ社“ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ”を用い前処理を行った後、ニッポンジーン社”Ｉｓｏｇｅｎ”を用いて全ＲＮＡの抽出を行う。具体的方法にはそれらの添付プロトコールに従えばよい。
次いで、抽出した全ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡの合成を行い、ｃＤＮＡ試料を調製する。全ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成は、当業者に周知の方法で実施することができる。調製したｃＤＮＡ試料には、必要に応じて、検出のための標識を施す。標識物質としては、検出可能なものであれば特に制限はなく、例えば、蛍光物質、放射性元素等を挙げることができる。標識は、当業者によって一般的に行われる方法（Ｌ  Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｌａｓｅｒ−ｃａｐｔｕｒｅｄａｄｊａｃｅｎｔ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１９９９，１１７−１２２）で実施することができる。
ヌクレオチドプローブと該ｃＤＮＡとのハイブリダイズの強度の検出は、ｃＤＮＡ試料を標識した物質の種類に応じて当業者においては適宜行うことができる。例えば、ｃＤＮＡが蛍光物質によって標識された場合、スキャナーによって蛍光シグナルを読み取ることによって検出することができる。
本発明の検査方法の別の態様としては、まず、被検者の細胞あるいは組織からタンパク質試料を調製する。次いで、該タンパク質試料に含まれる本発明のタンパク質の量を測定する。次いで、測定されたタンパク質の量を対照と比較する。
このような方法としては、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、並びに本発明の抗体を用いた、ウェスタンブロッティング法、ドットブロッティング法、免疫沈降法、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、および免疫蛍光法を例示することができる。又、本発明の遺伝子の発現量の測定のかわりに、本発明のタンパク質の発現量を測定することによっても、癌の診断を行うことが可能である。
上記の方法において、対照と比較して、本発明の遺伝子またはタンパク質の発現量が有意に上昇していた場合、被検者は、癌を発症している、もしくは発症する可能性が高いと判定される。
本発明はまた、癌の検査方法に用いるための検査薬を提供する。このような検査薬としては、本発明のオリゴヌクレオチドを含む検査薬（オリゴヌクレオチドプローブが固定された基板を含む）、本発明の抗体を含む検査薬が挙げられる。上記抗体は、検査に用いることが可能な抗体であれば、特に制限はない。抗体は必要に応じて標識される。
上記の検査薬においては、有効成分であるオリゴヌクレオチドや抗体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（ＢＳＡやゼラチンなど）、保存剤等が必要に応じて混合されていてもよい。
Ｃ２０ｏｒｆ１０２の検出
別の観点においては、本発明は、Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を検出することを特徴とする癌の診断方法を提供する。本発明の方法は、Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を検出することを特徴とする。Ｃ２０ｏｒｆ１０２はＮ末端に分泌シグナルを有する分泌タンパク質であり、そのアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子配列およびアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＮＭ ０８０６０７（配列番号２および６６）に開示されている。本発明において、Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質とは、全長タンパク質およびその断片の両方を含むことを意味する。断片とは、Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質の任意の領域を含むポリペプチドであり、天然のＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質の機能を有していなくてもよい。Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質の分泌シグナルは配列番号６６のアミノ酸配列において１−２４番目（Ｐｓｏｒｔ予測：ｈｔｔｐ：／／ｐｓｏｒｔ．ｎｉｂｂ．ａｃ．ｊｐ／）が相当する。
本発明においては、癌細胞、特に肺癌、肝癌（例えば、中分化型肝癌）、膵癌において、非常に高頻度でＣ２０ｏｒｆ１０２がタンパク質レベルで発現亢進していることが見いだされた。また、Ｃ２０ｏｒｆ１０２に特異的なモノクローナル抗体を用いることにより、免疫組織診断が可能であることが示された。
本発明で検出するＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質はヒトＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質が好ましいが、それに限定されず、イヌＣ２０ｏｒｆ１０２、ネコＣ２０ｏｒｆ１０２、マウスＣ２０ｏｒｆ１０２、ハムスターＣ２０ｏｒｆ１０２などいかなるＣ２０ｏｒｆ１０２でもよい。
本発明において検出されるＣ２０ｏｒｆ１０２は分泌前のＣ２０ｏｒｆ１０２でもよいが、分泌後のＣ２０ｏｒｆ１０２が好ましい。Ｃ２０ｏｒｆ１０２はＮ末端に分泌シグナルを有する分泌タンパク質であり、細胞内で産生された後に細胞外に分泌される。分泌後のＣ２０ｏｒｆ１０２とは、細胞外に存在するＣ２０ｏｒｆ１０２のことをいう。
本発明において検出とは、定量的または非定量的な検出を含み、例えば、非定量的な検出としては、単にＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質が存在するか否かの測定、Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定、Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定などを挙げることができ、定量的な検出としては、Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質の濃度の測定、Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質の量の測定などを挙げることができる。
被検試料としては、Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されないが、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、細胞、細胞破砕物、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿などを挙げることができるが、好ましいのは血液、血清、または血漿である。又、生物の体から採取された細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。
診断される癌は、特に制限されず如何なる癌でもよいが、具体的には、肝癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、乳癌、腎癌、脳腫瘍、子宮癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫などを挙げることができる。好ましいものは肺癌、肝癌、膵癌である。
肝癌は、低分化型肝癌、中分化型肝癌、高分化型肝癌などに分類され、本発明による検出は如何なる肝癌でもよいが、中分化形肝癌の検出が好ましい。
肺癌は、さらに肺腺癌、肺扁平上皮癌、肺小細胞癌、肺大細胞癌などに分類され、本発明による検出は如何なる肺癌でもよいが、肺腺癌の検出が好ましい。
本発明においては、被験試料中にＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質が検出された場合、陰性コントロールまたは健常者と比較して被験試料中に検出されるＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質の量が多いと判断される場合に、被験者が癌であるまたは癌になる可能性が高いと判定される。
本発明の診断方法の好ましい態様としては、細胞から遊離し、血中に存在するＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を検出することを特徴とする診断方法を挙げることができる。特に好ましくは、血中に存在するＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質またはその断片を検出する。
被検試料に含まれるＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質の検出方法は特に限定されないが、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。
抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を用いた一般的な検出方法としては、例えば、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体とＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を結合させた後に洗浄して、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を介して支持体に結合したＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を検出することにより、被検試料中のＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。
本発明において抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を固定するために用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）や、バイオセンサーチップなどを用いることができる。抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。
抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体とＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜室温にて１時間〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質と抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。
本発明のＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質検出方法においては、Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を含まない陰性コントロール試料やＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果、Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を定量的に検出することも可能である。
抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を介して支持体に結合したＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質の検出の好ましい態様として、標識物質で標識された抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を用いる方法を挙げることができる。例えば、支持体に固定された抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。
抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ（３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉなど）、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。
具体的には、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を支持体に固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡ、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などを挙げることができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。
本発明のＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質検出方法の特に好ましい態様として、ビオチンで標識された抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体およびアビジンを用いる方法を挙げることができる。
具体的には、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ビオチン標識抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、アビジンに結合している酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を検出する。
本発明のＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質検出方法の他の態様として、Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を特異的に認識する一次抗体を一種類以上、および該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。
例えば、支持体に固定された一種類以上の抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を、一次抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体および該一次抗体を特異的に認識する一種類以上の二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。
本発明のＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質の検出方法の他の態様としては、凝集反応を利用した検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を感作した担体を用いてＣ２０ｏｒｆ１０２を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料と混合し、一定時間攪拌する。試料中に抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりＣ２０ｏｒｆ１０２を検出することができる。また、凝集による濁度を分光光度計等により測定することによっても検出することが可能である。
本発明のＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質の検出方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（アマーシャムバイオサイエンス社製）等のバイオセンサーを用いることによりＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質と抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体の結合を検出することが可能である。具体的には、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体に結合するＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を共鳴シグナルの変化として検出することができる。
本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。
本発明は、癌の診断のための被検試料中のＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を検出するための診断薬またはキットの提供をも目的とするが、該診断薬またはキットは少なくとも抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を含む。該診断薬またはキットがＥＬＩＳＡ法等のＥＩＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬またはキットがラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該キットは、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。
抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体の作製
本発明で用いられる抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体はＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質に特異的に結合すればよく、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
又、支持体に固定される抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体と標識物質で標識される抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体はＣ２０ｏｒｆ１０２分子の同じエピトープを認識してもよいが異なるエピトープを認識することが好ましく、部位は特に制限されない。
本発明で使用される抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、Ｃ２０ｏｒｆ１０２を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるＣ２０ｏｒｆ１０２を、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ ０８０６０７に開示されたＣ２０ｏｒｆ１０２遺伝子／アミノ酸配列を発現することによって得る。すなわち、Ｃ２０ｏｒｆ１０２をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を公知の方法で精製する。また、天然のＣ２０ｏｒｆ１０２を精製して用いることもできる。
次に、この精製Ｃ２０ｏｒｆ１０２タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、Ｃ２０ｏｒｆ１０２の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトＣ２０ｏｒｆ１０２のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、Ｃ２０ｏｒｆ１０２遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで得ることもでき、さらに天然のＣ２０ｏｒｆ１０２をタンパク質分解酵素により分解することによっても得ることができる。部分ペプチドとして用いるＣ２０ｏｒｆ１０２の部分および大きさは限られない。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したＰＥＧ溶液（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識第２次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣ２０ｏｒｆ１０２に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、Ｃ２０ｏｒｆ１０２への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＣ２０ｏｒｆ１０２を投与して抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＣ２０ｏｒｆ１０２に対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９４／２５５８５号公報、ＷＯ９３／１２２２７号公報、ＷＯ９２／０３９１８号公報、ＷＯ９４／０２６０２号公報参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。具体的には、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を産生するハイブリドーマから、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。
目的とする抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。
本発明で使用される抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ９４／１１５２３号公報参照）。
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
本発明では、上記抗体のほかに、人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。
ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ１２５０２３号公報、ＷＯ９６／０２５７６号公報参照）。
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域
（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲおよびＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。
キメラ抗体およびヒト化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず、Ｃ２０ｏｒｆ１０２に結合する限り、抗体の断片またはその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆  Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部または所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。
抗体の修飾物として、標識物質等の各種分子と結合した抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体はＣ２０ｏｒｆ１０２分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がＣ２０ｏｒｆ１０２を認識し、他方の抗原結合部位が標識物質等を認識してもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１α（ＨＥＦ１α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）により、また、ＨＥＦ１αプロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃｚプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃｚプロモーターを使用する場合はＷａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はＢｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞または原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。
本発明の癌関連遺伝子
本発明において同定された癌関連遺伝子の名称、発現が亢進している癌組織、ならびにこれらの遺伝子の配列およびコードされるタンパク質の配列を示す配列番号の一覧を表１に示す。
0004643450.tif 000002
0004643450.tif 000003
ＴＥＧ１（配列番号２；配列番号６６）は、Ｃ２０ｏｒｆ１０２をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＡ２０６７６３（参照配列ＮＭ＿０８０６０７）である。この遺伝子は、肺癌、中分化型肝癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ２（配列番号３；配列番号６７）は、ＥＳＴ（ＡＳＣＬ２）をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＩ３９３９３０である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、膵癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ３（配列番号４）は、ＥＳＴ（ＥＰＳＴ１ｉｓｏｆｏｒｍ）をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＢＥ６４５４８０である。この遺伝子は、胃癌、中分化型肝癌、大腸癌、肺癌、膵癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ４（配列番号５）は、ＥＳＴをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＡ４４７３１７である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ５（配列番号６）は、ＥＳＴをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＩ２１７３７５である。この遺伝子は、胃癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ６（配列番号７；配列番号６８）は、ＯＫ／ＳＷ−ＣＬ３０をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＩ２１７３７５である。この遺伝子は、肺癌、胃癌、大腸癌、中分化型肝癌、で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ７（配列番号８）は、ＤＫＦＺｐ６８６Ｌ１５３３をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＢＧ４９２３５９である。この遺伝子は、肺癌、胃癌、大腸癌、中・低分化型肝癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ８（配列番号１０；配列番号６９）は、ＥＳＴ（Ｇｅｎｅ＃３０）をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＢＦ８２５７０３である。この遺伝子は、胃癌、低分化型肝癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ９（配列番号１１；配列番号７０）は、ＢＣ０１２３１７をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＬ３８９９８１．１である。この遺伝子は、胃癌、低分化型肝癌、膵癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ１０（配列番号１２）は、ＥＳＴ２４２８８１をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＢＧ２８５８３７である。この遺伝子は、胃癌、中・低分化型肝癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ１１（配列番号１３；配列番号７１）は、ＦＬＪ１１０４１をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＩ３４３４６７である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、中分化型肝癌、肺癌、膵癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ１２（配列番号１５；配列番号７２）は、ＥＳＴをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＢＦ０５７０７３である。後述の実施例に記載されるように、本発明においてこの遺伝子の全長配列が明らかになった。この遺伝子は、肝癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ１３（配列番号１６）は、ＥＳＴをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＨ６６６５８である。この遺伝子は、肝癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ１４（配列番号１７；配列番号７３）は、ＡＳＰＭをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿０１８１２３．１である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肝癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ１５（配列番号１８；配列番号７４）は、Ｓｐ５をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＩ３８０２０７である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肝癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ１６（配列番号１９）は、ＩＭＡＧＥ：２９７４０３をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＦ３３９８１３．１である。この遺伝子は、肝癌、肺癌、膵癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ１７（配列番号２０；配列番号７５）は、ＤＫＦＺｐ４３４ｋ２４３５をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＬ１３６８５５．１（参照配列ＮＭ＿０３２２５６）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ１８（配列番号２２；配列番号７６）は、ＣＢＲＣ７ＴＭ ２４９をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＩ６９４４１３である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、中・低分化型肝癌、膵癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ１９（配列番号１；配列番号７７）は、ＶＬＧＲ１をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＦ０５５０８４．１（参照配列ＮＭ＿０３２１１９）である。この遺伝子は、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ２０（配列番号９；配列番号７８）は、Ｃ２０ｏｒｆ５４をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＡ９０３８６２（参照配列ＮＭ＿０３３４０９）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ２１（配列番号１４；配列番号７９）は、ＲＨＢＧをコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿０２０４０７．１（参照配列ＮＭ＿０２０４０７）である。この遺伝子は、肝癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ２２（配列番号２１；配列番号８０）は、ＣＯＰＧ２をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＢ０４７８４７．１（参照配列ＮＭ＿０１２１３３）である。この遺伝子は、大腸癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ２３（配列番号６４、６５；配列番号８１、８２）は、ＥＳＴをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＬ０３９８８４である。後述の実施例に記載されるように、本発明において、この遺伝子の全長配列が明らかになった。この遺伝子は、低分化型肝癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ２４（配列番号２３；配列番号８３）は、ＢＥ６７０５８４をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＢＥ６７０５８４である。この遺伝子は、胃癌、肺癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ２５（配列番号２４；配列番号８４）は、ＧＲＰ４９をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＬ５２４５２０（参照配列ＮＭ＿００３６６７）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、中分化型肝癌、肺癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ２６（配列番号２５；配列番号８５）は、ＭＵＣ１７をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＫ０２６４０４．１である。この遺伝子は、胃癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ２７（配列番号２６；配列番号８６）は、ＥＰＨＢ２をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＦ０２５３０４．１（参照配列ＮＭ＿００４４４２）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が大腸癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ２８（配列番号２７；配列番号８７）は、ＧＰＣＲ４１（ＦＬＪ１１８５６）をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＫ０２１９１８．１（参照配列ＮＭ＿０２４５３１）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、大腸癌転移組織（肝臓）、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ２９（配列番号２８；配列番号８８）は、ＨＳ６ＳＴ２をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＩ７６７７５６である。この遺伝子は、肺癌、大腸癌、低分化型肝癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が肺癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ３０（配列番号２９；配列番号８９）は、ＰＣＤＨＢ２をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿０１８９３６．１（参照配列ＮＭ＿０１８９３６）である。この遺伝子は、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が肺癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ３１（配列番号３０；配列番号９０）は、ＷＦＤＣ３（Ｃ２０ｏｒｆ１６７）をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＬ０５０３４８である。この遺伝子は、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が肺癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ３２（配列番号３１；配列番号９１）は、Ｃ２０ｏｒｆ４２をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿０１７６７１．１（参照配列ＮＭ＿０１７６７１）である。この遺伝子は、肺癌、胃癌、大腸癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が肺癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ３３（配列番号３２；配列番号９２）は、ＰＩＧＲをコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿００２６４４．１（参照配列ＮＭ＿００２６４４）である。この遺伝子は、肺癌、大腸癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が肺癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ３４（配列番号３３；配列番号９３）は、２ＦＥ２Ｌ３をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿００４２８９．３（参照配列ＮＭ＿００４２８９）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、大腸癌転移組織（肝臓）、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ３５（配列番号３４；配列番号９４）は、ＴＲＡＧ３をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿００４９０９．１（参照配列ＮＭ＿００４９０９）である。この遺伝子は、胃癌、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ３６（配列番号３５；配列番号９５）は、ＴＲＩＭ３１をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿００７０２８である。この遺伝子は、胃癌、膵癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ３７（配列番号３６；配列番号９６）は、ＫＩＡＡ１３５９をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＢ０３７７８０である。この遺伝子は、胃癌、肺癌、大腸癌、膵癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ３８（配列番号３７；配列番号９７）は、ｕｂｉｑｕｔｉｎＤをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿００６３９８である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、中・低分化型肝癌、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ３９（配列番号３８；配列番号９８）は、Ｈｅｐｈａｅｓｔｉｎをコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿０１４７９９．１（参照配列ＮＭ＿０１４７９９）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌転移組織（肝臓）、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ４０（配列番号３９；配列番号９９）は、ＫＩＡＡ０１５２をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＢＣ０００３７１．１（参照配列ＮＭ＿０１４７３０）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、グリア芽腫、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ４１（配列番号４０；配列番号１００）は、ＫＩＡＡ０７０３をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿０１４８６１．１（参照配列ＮＭ＿０１４８６１）である。この遺伝子は、胃癌、肺癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ４２（配列番号４１；配列番号１０１）は、ＭＥＳＴ／ＰＥＧ１をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿００２４０２．１（参照配列ＮＭ＿００２４０２）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ４３（配列番号４２；配列番号１０２）は、ＫＩＡＡ１１９９をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＢ０３３０２５．１である。この遺伝子は、胃癌、肺癌、大腸癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ４４（配列番号４３；配列番号１０３）は、ＥＬＯＶＬ２をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＢＦ５０８６３９（参照配列ＮＭ＿０１７７７０）である。この遺伝子は、肝癌、グリア芽細胞腫、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。
ＴＥＧ４５（配列番号４４；配列番号１０４）は、ＲＯＢＯ１をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＢＦ０５９１５９（参照配列ＮＭ＿１３３６３１）である。この遺伝子は、肝癌、グリア芽細胞腫、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。
ＴＥＧ４６（配列番号４５；配列番号１０５）は、ＦＬＪ１０５０４ＭＩＳＡＴＯをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＢＣ００２５３５．１（参照配列ＮＭ＿０１８１１６）である。この遺伝子は、肝癌、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が肝癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ４７（配列番号４６；配列番号１０６）は、ｃｙｓｔａｔｉｎＳＮをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿００１８９８．１（参照配列ＮＭ＿００１８９８）である。この遺伝子は、大腸癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が大腸癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ４８（配列番号４７；配列番号１０７）は、ＬＯＣ１１６２３８をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＢＥ３２８８５０（参照配列ＮＭ＿１３８４６３）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、低分化型肝癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。
ＴＥＧ４９（配列番号４８；配列番号１０８）は、ＭＲＰＬ５０をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＢＧ０２８２１３（参照配列ＮＭ＿０１９０５１）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、中・低分化型肝癌、グリア芽腫、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。
ＴＥＧ５０（配列番号４９；配列番号１０９）は、ＴＯＰ１ｍｔをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＷ５９２６０４（参照配列ＮＭ＿０５２９６３）である。この遺伝子は、大腸癌、低分化型肝癌、大腸癌転移組織（肝臓）、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が大腸癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ５１（配列番号５０；配列番号１１０）は、ＦＫＳＧ１４をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＢＣ００５４００．１（参照配列ＮＭ＿０２２１４５）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が大腸癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ５２（配列番号５１；配列番号１１１）は、ＣＤＨ３をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿００１７９３．１（参照配列ＮＭ＿００１７９３）である。この遺伝子は、肺癌、胃癌、大腸癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。
ＴＥＧ５３（配列番号５２；配列番号１１２）は、ＮＲＰ２をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮ９０７７７（参照配列ＮＭ＿００３８７２）である。この遺伝子は、肺癌、グリア芽腫、大腸癌転移組織（肝臓）、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。
ＴＥＧ５４（配列番号５３；配列番号１１３）は、ＣＬＤＮ３をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＢＥ７９１２５１（参照配列ＮＭ＿００１３０６）である。この遺伝子は、胃癌、肺癌、大腸癌、大腸癌転移組織（肝臓）で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ５５（配列番号５４；配列番号１１４）は、ＣＬＤＮ４をコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿００１３０５．１（参照配列ＮＭ＿００１３０５）である。この遺伝子は、胃癌、肺癌、大腸癌、大腸癌転移組織（肝臓）、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ５６（配列番号５５；配列番号１１５）は、ｓｆｒｐ４をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＷ０８９４１５（参照配列ＮＭ＿００３０１４）である。この遺伝子は、肺癌、胃癌、グリア芽腫、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が胃癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ５７（配列番号５６；配列番号１１６）は、ＡＳＰＳＣＲ１をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿０２４０８３．１（参照配列ＮＭ＿０２４０８３）である。この遺伝子は、肝癌、肺癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が肝癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ５８（配列番号５７；配列番号１１７）は、ＧＡＧＥＣ１をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿０７００３．１（参照配列ＮＭ＿００７００３）である。この遺伝子は、肝癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が肝癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ５９（配列番号５８；配列番号１１８）は、ＲＨＡＭＭをコードする。この遺伝子によりコードされるタンパク質は膜タンパク質である。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿０１２４８５．１（参照配列ＮＭ＿０１２４８４）である。この遺伝子は、胃癌、大腸癌、肝癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。この遺伝子の発現が肝癌と関連していることは知られていない。
ＴＥＧ６０（配列番号５９；配列番号１１９）は、ＰＥＧ１０をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＢＥ８５８１８０（参照配列ＮＭ＿０１５０６８）である。この遺伝子は、肝癌、肺癌、肝芽腫で発現が亢進していることが見いだされた。
ＴＥＧ６１（配列番号６０；配列番号１２０）は、ＰＡＥＰをコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿００２５７１．１（参照配列ＮＭ＿００２５７１）である。この遺伝子は、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。
ＴＥＧ６２（配列番号６１；配列番号１２１）は、ＭＧＣ１０９８１をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＢＣ００４３９７．１（参照配列ＮＭ＿０３２６５４）である。この遺伝子は、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。
ＴＥＧ６３（配列番号６２；配列番号１２２）は、ＤＵＳＰ９をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＮＭ＿００１３９５．１（参照配列ＮＭ＿００１３９５）である。この遺伝子は、肝癌で発現が亢進していることが見いだされた。
ＴＥＧ６４（配列番号６３；配列番号１２３）は、ＫＩＡＡ１０８９をコードする。この遺伝子のＧｅｎＢａｎｋ受託番号はＡＢ０２９０１２．１である。この遺伝子は、肝癌、肺癌、膵癌で発現が亢進していることが見いだされた。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００３−２９０７０４号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】  以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
［実施例１］
ヒト癌組織において発現が亢進する遺伝子の同定
ヒトの各種癌組織（肺腺癌、胃癌、大腸癌、肝細胞癌、脳腫瘍）において正常組織に比べ発現が亢進する遺伝子の同定を行うために、ヒト各種癌摘出組織におけるｍＲＮＡの発現解析をＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ｇｅｎｅ  ＣｈｉｐＴＭ  ＨＧ−１３３Ａ，Ｂ  Ｔａｒｇｅｔ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）を用いて実施した。
１．１．  ヒト肺腺癌において発現が亢進する遺伝子の同定
ヒト肺腺癌においてヒト正常肺組織に比べ発現が亢進する遺伝子を同定するために、下記のようにしてｍＲＮＡの発現解析を実施した。
すなわち、初めに各種分化度・ステージを含む１２例の肺腺癌摘出組織の癌部位、および１例の正常肺より、ＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社）を用いて添付の方法に従い全ＲＮＡを調製した。続いて、肺腺癌ならびに正常肺におけるｍＲＮＡの発現をＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ，Ｂ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）を用いて解析した。すなわち、癌部位に関しては１２例分より調製した全ＲＮＡをそれぞれ等量ずつ混合したもの５μｇを、また対照として１例の正常肺より調製した全ＲＮＡ５μｇを試料として用い、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社）に準じて遺伝子発現解析を行った。それぞれの解析における全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、各遺伝子の発現量は相対値とした。
１．２．  ヒト胃癌において発現が亢進する遺伝子の同定
ヒト胃癌においてヒト正常胃組織に比べ発現が亢進する遺伝子を同定するために、上記と同様の方法によりｍＲＮＡの発現解析を実施した。
すなわち、３例の胃癌摘出組織、および１例の正常胃より上記と同様に全ＲＮＡを調製し、癌部位に関しては３例分の全ＲＮＡをそれぞれ等量ずつ混合したもの５μｇを、また対照として１例分の正常胃より調製した５μｇの全ＲＮＡを試料として用い、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ，Ｂ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）を用いてｍＲＮＡの発現を解析した。それぞれの解析における全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、各遺伝子の発現量は相対値とした。
１．３．  ヒト大腸癌において発現が亢進する遺伝子の同定
ヒト大腸癌においてヒト正常大腸組織に比べ発現が亢進する遺伝子の同定を上記と同様に実施した。
すなわち、３例の大腸癌摘出組織の癌部位および１例の正常大腸組織より上記と同様に全ＲＮＡを調製し、癌部位に関しては３例分の全ＲＮＡをそれぞれ等量ずつ混合したもの５μｇを、また対照として１例分の正常胃より調製した５μｇの全ＲＮＡを試料として用い、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ，Ｂ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）を用いてｍＲＮＡの発現を解析した。それぞれの解析における全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、各遺伝子の発現量は相対値とした。
１．４．  ヒト肝細胞癌において発現が亢進する遺伝子の同定
ヒト肝細胞癌においてヒト正常肝臓に比べ発現が亢進する遺伝子の同定を上記と同様に実施した。
すなわち、３例のＣ型肝炎ウイルス感染型の中分化型肝細胞癌、３例のＣ型肝炎ウイルス感染型の低分化型肝細胞癌部位および１例の正常肝臓組織より上記と同様に全ＲＮＡを調製し、各種分化度の異なる癌部位に関しては各３例分の全ＲＮＡを等量ずつ混合したもの５μｇを、また対照として１例分の正常肝臓より調製した５μｇの全ＲＮＡを試料として用い、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ，Ｂ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）を用いてｍＲＮＡの発現を解析した。それぞれの解析における全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、各遺伝子の発現量は相対値とした。
１．５．  ヒトグリア芽腫において発現が亢進する遺伝子の同定
ヒトグリア芽腫においてヒト正常脳組織に比べ発現が亢進する遺伝子の同定を上記と同様に実施した。
すなわち、５例のグリア芽腫摘出組織の癌部位および１例の正常脳組織より上記と同様に全ＲＮＡを調製し、癌部位に関しては５例分の全ＲＮＡをそれぞれ等量ずつ混合したもの５μｇを、また対照として１例分の正常脳組織より調製した５μｇの全ＲＮＡを試料として用い、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭ  ＨＧ−Ｕ１３３Ａ，Ｂ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）を用いてｍＲＮＡの発現を解析した。それぞれの解析における全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、各遺伝子の発現量は相対値とした。
以上の解析の結果、表２に示す遺伝子がそれぞれ対応する正常組織に比べｍＲＮＡの発現が亢進していることが明らかとなった。
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特にＴＥＧ１−ＴＥＧ１８に関しては今までにいかなる癌細胞においてもその発現亢進が明らかになっておらず、今回の解析によりある種の癌において発現が亢進することが示された。また、ＴＥＧ１９−ＴＥＧ６０の各遺伝子に関しては、今までに報告されていた癌種以外に、今回新たな癌種で発現が亢進することが明らかとなった。
１．６．  各種癌組織において発現が亢進する遺伝子の同定
ＴＥＧ１−ＴＥＧ６４の各遺伝子の、それぞれの癌種における発現解析を、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭＨＧ−Ｕ１３３Ａ，Ｂ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）、およびＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭＨＧ−Ｕ１３３ｐｌｕｓ２（Ａｆｆｙｍｅｔｒｙｘ社製）を用いて実施した。すなわち、肺小細胞肺癌１０例、肺扁平上皮癌５例、肺腺癌５例、大腸癌７例、大腸癌肝転移組織８例、腎癌２例、および膵癌４例の各検体を個々に上項と同様に全ＲＮＡを調製した。そして、その全ＲＮＡ５μｇを、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭＨＧ−Ｕ１３３Ａ，Ｂを用いてｍＲＮＡの発現解析を実施した。肺小細胞癌、大腸癌および大腸癌肝転移組織の一部についてはＵ−１３３Ａチップのみの解析である。それぞれの解析における全遺伝子の発現スコアの平均値を１００とし、各遺伝子の発現量は相対値とした。また、小細胞癌２２例、および膵癌２７例は、ＧｅｎｅＣｈｉｐＴＭＨＧ−Ｕ１３３ｐｌｕｓ２を用いて、同様に解析を実施した。
その結果、表３および４に示すように、ＴＥＧ１−ＴＥＧ６４の各遺伝子が各癌種においても発現亢進していることが明らかとなった。
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［実施例２］
ＲＴ−ＰＣＲを用いた発現亢進頻度の確認
上記のＧｅｎｅ  ｃｈｉｐ解析では各種摘出癌組織より調製したＲＮＡをまとめて解析した点、ならびにＧｅｎｅ  ｃｈｉｐ解析の結果を確認するために、個々の癌サンプルならびに非癌部の正常組織における各遺伝子のｍＲＮＡの発現量をＲＴ−ＰＣＲ法により解析し、発現亢進の程度、ならびに発現亢進頻度を検討した。
２．１．各種癌組織からの一本鎖ｃＤＮＡの調製
各種ヒト癌組織、ならびに正常組織より以下のようにしてＰＣＲの際の鋳型ＤＮＡとして用いる一本鎖ｃＤＮＡを調製した。
すなわち、肺腺癌に関しては肺腺癌組織１２例ならびに正常肺組織４例より、ヒト大腸癌に関しては１０例のヒト大腸癌組織ならびに同摘出組織中の非癌部の正常大腸組織より、ヒト胃癌に関しては１２例のヒト胃癌摘出組織、ならびに同摘出組織中の非癌部の正常胃組織より、ならびにヒト肝癌に関しては９例のヒト摘出肝癌組織ならびに同摘出組織中の非癌部よりそれぞれ全ＲＮＡを上記と同様の方法を用いて調製した後、全ＲＮＡより逆転写酵素ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。このようにして調製した一本鎖ｃＤＮＡは後述のＰＣＲの際に鋳型ＤＮＡとして用いた。
２．２．ＲＴ−ＰＣＲを用いた発現解析
続いて、表２に示す各遺伝子に関してＲＴ−ＰＣＲ法によりｍＲＮＡの発現量を解析した。すなわち、２５μＬのＰＣＲ反応液は、５００ｍＭ  ＫＣｌ，１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１％  Ｇｅｌａｔｉｎ、各１．２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ）、１μＬの一本鎖ｃＤＮＡ、５ｐｍｏｌｅずつの各遺伝子に特異的なセンスプライマー、アンチセンスプライマーのセット、０．７５μＬのＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ（１０００倍希釈溶液，宝酒造社製）、０．２５μＬのｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（ＦＧ  Ｐｌｕｔｈｅｒｏ，Ｒａｐｉｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９３  ２１：４８５０−４８５１．）を含むように調製した後、初めに９４℃で３分間一次変性を行い、９４℃で１５秒、５７℃で１５秒、７２℃で３０秒からなるサイクルを３０回行なった。各遺伝子のＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーは表５に示すものをそれぞれデザインし解析に用いた。
また、個々のＲＮＡ中のヒトβ−アクチン遺伝子発現量もヒトβ−アクチンに特異的なセンスプライマー（配列番号２５２：ＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＣＡＣＴＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣ）ならびにアンチセンスプライマー（配列番号２５３：ＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＧ）を用い上記と同様に解析を行った。
0004643450.tif 000011
0004643450.tif 000012
ＰＣＲ法により増幅された産物は１．０％アガロースゲル電気泳動後、エチジウムブロマイド染色にて確認を行う、またはｉＣｙｃｌｅｒＱリアルタイムＰＣＲ解析システム（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）によりｍＲＮＡ量を定量した。
ＴＥＧ１の発現解析
肺腺癌組織１２例および正常肺組織４例より調製したＲＮＡを用い、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ１遺伝子のｍＲＮＡは正常肺組織での発現は認められなかったのに対し、解析した１２例の肺腺癌組織の内１０例で明らかにＴＥＧ１遺伝子の高発現が確認された（図１）。
同様にして、正常肺５例と肺扁平上皮癌９例の定量的ＰＣＲ解析を実施した。ＰＣＲの結果、ＴＥＧ１遺伝子のｍＲＮＡは正常肺組織での発現は認められなかったのに対し、解析した９例の肺扁平上皮癌組織の内３例でＴＥＧ１遺伝子の発現亢進が確認された（図７３）。
ＴＥＧ２の発現解析
５例の大腸癌組織および同一サンプルの非癌部である正常大腸組織より調製したＲＮＡ、ならびに１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ２遺伝子のｍＲＮＡは解析した大腸癌においては５例中３例において、また胃癌においては１１例中全てで明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図２、３）。
ＴＥＧ３の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ３遺伝子のｍＲＮＡは解析した胃癌においては１１例中９例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図４）。
ＴＥＧ４の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ４遺伝子のｍＲＮＡは解析した胃癌においては１１例中７例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図５）。
ＴＥＧ５の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ５遺伝子のｍＲＮＡは解析した胃癌においては１１例中７例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図６）。
ＴＥＧ６の発現解析
９例の大腸癌組織および同一サンプルの非癌部である正常大腸組織より調製したＲＮＡ、ならびに１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ６遺伝子のｍＲＮＡは解析した大腸癌においては９例中３例で明らかに癌部において発現の亢進が確認され、また胃癌においては解析した全ての正常胃においては全く発現が認められなかったのに対し、２例で非常に強いｍＲＮＡの発現が確認された（図７、８）。
ＴＥＧ７の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ７遺伝子のｍＲＮＡは解析した胃癌においては１１例中６例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図９）。
ＴＥＧ８の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ８遺伝子のｍＲＮＡは解析した正常胃においてはほとんど発現が認められないのに対し、胃癌においては１１例中１例で顕著なｍＲＮＡの発現が確認された（図１０）。
ＴＥＧ９の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ９遺伝子のｍＲＮＡは解析した胃癌においては１１例中６例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図１１）。
ＴＥＧ１０の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ１０遺伝子のｍＲＮＡは解析した胃癌においては１１例中１０例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図１２）。
ＴＥＧ１１の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ１１遺伝子のｍＲＮＡは解析した胃癌においては１１例中１０例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図１３）。
ＴＥＧ１２の発現解析
９例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ１２遺伝子のｍＲＮＡは解析した肝癌９例中６例で明らかに癌部において発現の亢進が確認され、特に中分化型肝癌（＃２１、２９、３２）および低分化型肝癌（＃２２、１１１、１１５）において顕著な発現亢進が認められた（図１４）。
ＴＥＧ１３の発現解析
９例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ１３遺伝子のｍＲＮＡは解析した肝癌９例中４例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図１５）。
ＴＥＧ１４の発現解析
９例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ１４遺伝子のｍＲＮＡは解析した肝癌９例全てで癌部において顕著な発現の亢進が確認された（図１６）。
ＴＥＧ１５の発現解析
９例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ１５遺伝子のｍＲＮＡは解析した肝癌９例中６例で癌部において顕著な発現の亢進が確認された（図１７）。
ＴＥＧ１６の発現解析
９例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ１６遺伝子のｍＲＮＡは解析した肝癌９例中５例で癌部において顕著な発現の亢進が確認された（図１８）。
ＴＥＧ１７の発現解析
１０例の大腸癌組織および同一サンプルの非癌部である正常大腸組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ１７遺伝子のｍＲＮＡは解析した１０例全てにおいて癌部での発現亢進が確認され、特に５例において明らかに高発現していた（図１９）。
ＴＥＧ１８の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ１８遺伝子のｍＲＮＡは解析した胃癌においては１１例中７例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図２０）。
ＴＥＧ１９の発現解析
肺腺癌組織１２例および正常肺組織４例より調製したＲＮＡを用い、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ１９遺伝子のｍＲＮＡは正常肺組織での発現は認められなかったのに対し、解析した１２例の肺腺癌組織の内３例で明らかに発現が亢進することが確認された（図２１）。
ＴＥＧ２０の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ２０遺伝子のｍＲＮＡは解析した胃癌においては１１例中６例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図２２）。
ＴＥＧ２１の発現解析
９例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ２１遺伝子のｍＲＮＡは解析した肝癌９例中５例で明らかに癌部において発現の亢進が確認され、特に中分化型肝癌（＃２１、２７、２９、３２）において顕著な発現亢進が認められた（図２３）。
ＴＥＧ２２の発現解析
６例の大腸癌組織および同一サンプルの非癌部である正常大腸組織より調製したＲＮＡを用い、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ２２遺伝子のｍＲＮＡは解析した６例中３例で癌部での発現亢進が確認された（図２４）。
ＴＥＧ２３の発現解析
９例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ２３遺伝子のｍＲＮＡは解析した肝癌９例中６例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図２５）。
ＴＥＧ２４の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ２４遺伝子のｍＲＮＡは解析した胃癌においては１１例中５例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図２６）。
ＴＥＧ２５の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ２５遺伝子のｍＲＮＡは解析した胃癌においては１１例中７例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図２７）。
ＴＥＧ２６の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ２６遺伝子のｍＲＮＡは解析した胃癌においては１１例中４例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図２８）。
ＴＥＧ２７の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ２７遺伝子のｍＲＮＡは解析した胃癌においては１１例中８例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図２９）。
ＴＥＧ２８の発現解析
８例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ２８遺伝子のｍＲＮＡは解析した胃癌においては８例中５例で明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図３０）。
ＴＥＧ２９の発現解析
肺腺癌組織８例および正常肺組織４例より調製したＲＮＡを用い、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ２９遺伝子のｍＲＮＡは正常肺組織での発現は認められなかったのに対し、解析した８例の肺腺癌組織の内７例で明らかに発現が亢進することが確認された（図３１）。
ＴＥＧ３０の発現解析
肺腺癌組織１２例および正常肺組織４例より調製したＲＮＡを用い、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ３０遺伝子のｍＲＮＡは正常肺組織での発現はほとんど認められなかったのに対し、解析した１２例の肺腺癌組織の内１１例でｍＲＮＡの発現が確認され、さらにそれらの内４例で正常肺に比べ明らかに発現が亢進することが確認された（図３２）。
ＴＥＧ３１の発現解析
肺腺癌組織１２例および正常肺組織４例より調製したＲＮＡを用い、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ３１遺伝子のｍＲＮＡは正常肺組織での発現はほとんど認められなかったのに対し、解析した１２例の肺腺癌組織の内７例で明らかに発現が亢進することが確認された（図３３）。
ＴＥＧ３２の発現解析
肺腺癌組織１２例および正常肺組織４例より調製したＲＮＡを用い、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ３２遺伝子のｍＲＮＡは正常肺組織での発現に比べ、解析した１２例の肺腺癌組織の内４例で明らかに明らかに発現が亢進することが確認された（図３４）。
ＴＥＧ３３の発現解析
上記と同様に肺腺癌組織１２例および正常肺組織４例より調製したＲＮＡを用い、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ３３遺伝子のｍＲＮＡは正常肺組織での発現は認められなかったのに対し、解析した１２例の肺腺癌組織の内９例でｍＲＮＡの発現が確認され、特に４例において極めて高いｍＲＮＡの発現が確認された（図３５）。
ＴＥＧ３４の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ３４遺伝子のｍＲＮＡは解析した１１例中８例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図３６）。
ＴＥＧ３５の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ３５遺伝子のｍＲＮＡは解析した１１例中７例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図３７）。
ＴＥＧ３６の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ３６遺伝子のｍＲＮＡは解析した１１例中８例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図３８）。
ＴＥＧ３７の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ３７遺伝子のｍＲＮＡは解析した１１例中７例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図３９）。
ＴＥＧ３８の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ３８遺伝子のｍＲＮＡは解析した１１例中８例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図４０）。
ＴＥＧ３９の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ３９遺伝子のｍＲＮＡは解析した全体的に癌部での発現が高い傾向が認められ、特に１１例中６例で癌部において発現の亢進が確認された（図４１）。
ＴＥＧ４０の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ４０遺伝子のｍＲＮＡは解析した１１例中４例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図４２）。
ＴＥＧ４１の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ４１遺伝子のｍＲＮＡは解析した１１例中４例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図４３）。
ＴＥＧ４２の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ４２遺伝子のｍＲＮＡは正常胃においては全体的に発現が低いのに対し、解析した１１例中６例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図４４）。
ＴＥＧ４３の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ４３遺伝子のｍＲＮＡは正常胃ではほとんどｍＲＮＡの発現が認められなかったのに対し、癌部においては解析した１１例中９例でｍＲＮＡの発現が確認された（図４５）。
ＴＥＧ４４の発現解析
９例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ４４遺伝子のｍＲＮＡは解析した肝癌９例中５例で癌部において明らかに発現の亢進が確認された（図４６）。
ＴＥＧ４５の発現解析
１１例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ４５遺伝子のｍＲＮＡは解析した肝癌１１例中７例で癌部において明らかに発現の亢進が確認された（図４７）。
ＴＥＧ４６の発現解析
９例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ４６遺伝子のｍＲＮＡは解析した肝癌９例全てにおいて癌部での発現の方が高い値を示し、特に６例で癌部において顕著な発現の亢進が確認された（図４８）。
ＴＥＧ４７の発現解析
１０例の大腸癌組織および同一サンプルの非癌部である正常大腸組織より調製したＲＮＡを用い、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ４７遺伝子のｍＲＮＡは解析した１０例中８例のサンプルにおいて正常大腸組織に比較し、明らかに癌部での発現亢進が認められた（図４９）。
ＴＥＧ４８の発現解析
１０例の大腸癌組織および同一サンプルの非癌部である正常大腸組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ４８遺伝子のｍＲＮＡは解析した１０例中９例において癌部での発現亢進が確認された（図５０）。
ＴＥＧ４９の発現解析
６例の大腸癌組織および同一サンプルの非癌部である正常大腸組織より調製したＲＮＡを用い、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ４９遺伝子のｍＲＮＡは解析した６例中３例において非癌部に比べ癌部において発現が亢進していることが確認された（図５１）。
ＴＥＧ５０の発現解析
６例の大腸癌組織および同一サンプルの非癌部である正常大腸組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、解析した６例全ての正常大腸組織ではＴＥＧ５０由来のバンドの増幅は認められなかったのに対し、癌部では６例中４例においてバンドの増幅が認められ、癌部において発現が亢進することが確認された（図５２）。
ＴＥＧ５１の発現解析
６例の大腸癌組織および同一サンプルの非癌部である正常大腸組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ５１遺伝子のｍＲＮＡはいずれの正常大腸組織でもＰＣＲによる増幅が認められなかったのに対し、解析した６例の大腸癌組織の内５例でＴＥＧ５１遺伝子の明らかな増幅が確認されたことより、大腸癌において発現が亢進していることが確認された（図５３）。
ＴＥＧ５２の発現解析
肺腺癌組織１２例および正常肺組織４例より調製したＲＮＡを用い、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ５２遺伝子のｍＲＮＡは正常肺組織に比べ解析した１２例中７例で明らかに肺癌において発現が亢進することが確認された（図５４）。
ＴＥＧ５３の発現解析
肺腺癌組織８例および正常肺組織４例より調製したＲＮＡを用い、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ５３遺伝子のｍＲＮＡは正常肺組織での発現は認められなかったのに対し、解析した８例の肺腺癌組織の全てで発現の亢進が確認された（図５５）。
ＴＥＧ５４の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ５４遺伝子のｍＲＮＡは正常胃においては解析した１１例中９例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図５６）。
ＴＥＧ５５の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ５５遺伝子のｍＲＮＡは解析した１１例中６例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図５７）。
ＴＥＧ５６の発現解析
１１例の胃癌組織および同一サンプルの非癌部である正常胃組織より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ５６遺伝子のｍＲＮＡは正常胃においては全体的に発現が低いのに対し、解析した１１例中９例において明らかに癌部において発現の亢進が確認された（図５８）。
ＴＥＧ５７の発現解析
９例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ５７遺伝子のｍＲＮＡは解析した肝癌９例中５例で癌部において明らかに発現の亢進が確認された（図５９）。
ＴＥＧ５８の発現解析
９例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ５８遺伝子のｍＲＮＡは解析した肝癌９例中５例で癌部において明らかに発現の亢進が確認された（図６０）。
ＴＥＧ５９の発現解析
９例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ５９遺伝子のｍＲＮＡは解析した非癌部９例においては発現量が全体的に少ないのに対し、解析した肝癌９例全てで癌部において明らかに発現の亢進が確認された（図６１）。
ＴＥＧ６０の発現解析
９例の肝芽腫組織および２例の正常肝臓より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ６０遺伝子のｍＲＮＡは解析した正常肝臓においてはほとんど発現が認められないのに対し、解析した肝芽腫９例の内８例において明らかに発現の亢進が確認された（図６２）。
ＴＥＧ６１の発現解析
肺腺癌組織１２例および正常肺組織４例より調製したＲＮＡを用い、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
その結果、ＴＥＧ６１遺伝子のｍＲＮＡは正常肺組織での発現は認められなかったのに対し、解析した１２例の肺腺癌組織の内３例でＰＡＥＰ遺伝子の高発現が確認された（図６３）。
ＴＥＧ６２の発現解析
肺腺癌組織１２例および正常肺組織４例より調製したＲＮＡを用い、定量的ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ６２遺伝子のｍＲＮＡは正常肺組織での発現に比べ、解析した１２例の肺腺癌組織の内８例で明らかに発現が亢進することが確認された（図６４）。
ＴＥＧ６３の発現解析
９例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ６３遺伝子のｍＲＮＡは解析した非癌部９例においては発現がほとんど認められないのに対し、解析した肝癌９例中８例で明らかに発現の亢進が確認された（図６５）。
ＴＥＧ６４の発現解析
９例の肝癌組織および同一サンプルの非癌部より調製したＲＮＡを用い、ＲＴ−ＰＣＲ法により遺伝子発現比較を行った。
ＰＣＲの結果、ＴＥＧ６４遺伝子のｍＲＮＡは解析した肝癌９例中８例で癌部において明らかに発現の亢進が確認された（図６６）。
以上の結果より、これらの遺伝子、または蛋白の現量量を測定することで癌の診断に用いられることが明らかになった。
［実施例３］
肝癌発現遺伝子ＴＥＧ１２の全長ｃＤＮＡの単離、同定
上記のＧｅｎｅ  ｃｈｉｐ解析ならびにＲＴ−ＰＣＲ解析の結果、肝癌において発現が亢進することが明らかになったＴＥＧ１２のｃＤＮＡ配列を明らかにするために、ｃＤＮＡの単離、同定を試みた。
すなわち、Ｇｅｎｅ  ｃｈｉｐ解析の際にプローブ配列の由来となったＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ；ＢＦ０５７０７３：配列番号２５４）の近傍に存在するＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ；ＢＵ８４４３７３）をＧｅｎＢａｎｋより抽出し各ＥＳＴにハイブリダイズするプライマーをデザインしＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅を行った。ＰＣＲはヒト肝癌細胞株であるＨｅｐ３Ｂ、ＨｕＨ６、ＨｅｐＧ２より調製したＲＮＡを等量ずつ用い作製した一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、各５ｐｍｏｌｅのＰＣＲプライマーＬＳ５５７（ＡＴＣＣＧＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＧＣＣＡＡＧＴＣ：配列番号２５５）ならびにＬＳ５８９（ＧＧＧＡＴＴＣＡＣＡＴＴＡＣＣＡＣＧＧＣＡＧＴＧＣ：配列番号２５６）を用い実施した。なお、ＰＣＲはＬＡ−ＰＣＲキット（宝酒造社製）を用い、９４℃で３０秒、６３℃で３０秒、そして７２℃で５分からなるサイクルを３５サイクル実施した結果、約２０００ｂｐのバンドが増幅された。ＰＣＲ増幅産物をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入した後、増幅遺伝子の塩基配列を定法により解析した結果、元々のＥＳＴ（ＢＦ０５７０７３）のＤＮＡ配列より５’側の上流領域の配列を含む遺伝子であることが明らかになった。なお、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ配列は配列番号２５７に示す。
続いて、ＢＦ０５７０７３の近傍にあると考えられる別のＥＳＴ配列（ＢＵ８５９３８６）と上記により単離・同定された遺伝子の配列を元にデザインしたＰＣＲプライマーを用いＰＣＲを実施した。ＰＣＲプライマーとしては各５ｐｍｏｌｅのＬＳ８５８（ＡＴＧＧＣＴＴＣＧＴＴＣＣＣＣＧＡＧＡＣＣＧＡＴＴＣ：配列番号２５８）ならびにＬＳ８５９（ＧＡＡＧＡＣＧＡＧＧＡＴＴＣＧＡＴＴＧＴＴＧＣＣＡＡＡＧＴＣＣＡＣＣ：配列番号２５９）を用い、９５℃で３０秒、６８℃で３分のサイクルからなる反応を３５サイクル行った以外は上記と同様の条件にて実施した結果、約２，５００ｂｐのバンドが増幅された。ＰＣＲ増幅産物は上記と同様にｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターに挿入した後、塩基配列の同定を行った結果、さらに５’−側の配列を含むことが明らかになった。なお、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ配列は配列番号２６０に示す。
以上のＰＣＲ法により得られた２つの増幅産物の配列を基に全長３，４０１ｂｐからなる新規ｃＤＮＡを同定し、一つのオープン・リーディング・フレームが見出された（図６７）。その塩基配列を配列番号１５に、また塩基配列から類推されるアミノ酸配列を配列番号７２に示した。今回単離・同定された配列を基にＢｌａｓｔ検索を実施した結果、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＸＭ＿０６７３６９（配列番号２６３）と相同性を示すことが明らかになったものの、一部配列が異なっている領域が認められた（図６８）。以上の結果より肝癌細胞において特異的に発現が亢進する新規遺伝子を単離・同定し、Ｋ＃１と命名した。
今回単離した塩基配列より類推されるアミノ酸配列を元に既知蛋白との相同性検索を行った結果、ヒトＴＲＩＭ３α（Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｍｏｔｉｆ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ３、ＧｅｎＢａｎｋ  番号ＮＭ＿００６４５８）と２８．６％の相同性を、ヒトＴＲＩＭ２と２７．５％の相同性をそれぞれ示した。ＴＲＩＭファミリーは現在までに３７種が報告されており、いくつかの特徴的なモチーフをもつことが知られている（Ｒｅｙｍｏｎｄ  Ａ．，ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（２００１）２０．２１４０−２１５１）。そこで、Ｋ＃１のアミノ酸配列を基にモチーフ解析を行った結果、アミノ酸配列の相同性と同様にＴＲＩＭ３ならびにＴＲＩＭ２と比較的類似したモチーフ構造を持つことが明らかになり、実際にＴＲＩＭ３αとは図６９に示すように特徴的なモチーフが保存されていた。しかしながら、既知のＴＲＩＭファミリーには完全にＫ＃１の示すモチーフ構造と同一の構造を示す分子は存在していないことより、今回単離・同定したＫ＃１はＴＲＩＭ２およびＴＲＩＭ３に比較的類似した新規ＴＲＩＭ分子であることが強く示唆された。また、今回単離したＫ＃１と同様にＴＲＩＭ３と同様の構造を示すラットＢＥＲＰは、細胞内に局在し、ミオシンＶ等と共役し蛋白の細胞内輸送に関与すること、あるいは神経突起の伸展に関与することが示唆されている（Ｅｌ−Ｈｕｓｓｅｉｎｉ，Ａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２６７、９０６−９１１、２０００、Ｅｌ−Ｈｕｓｓｅｉｎｉ，Ａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４、１９７７１−１９７７７、１９９９）。以上のことより、今回同定したＫ＃１蛋白はＴＲＩＭファミリーに属し、さらにラットＢＥＲＰと同様に細胞内の蛋白輸送などに関与することで細胞の形態形成や増殖などに関与する可能性が考えられ、肝癌等の発現が亢進する病態において重要な役割を示すこと、ならびに医薬品のターゲット分子としての可能性が考えられた。
［実施例４］
４−１．  肝癌発現遺伝子（ＴＥＧ２３）の全長ｃＤＮＡの単離、同定
上記のＧｅｎｅ  ｃｈｉｐ解析ならびにＲＴ−ＰＣＲ解析の結果、肝癌において発現が亢進することが明らかになったＴＥＧ２３の全長ｃＤＮＡ配列を明らかにするために、ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）法を用いｃＤＮＡの単離、同定を試みた。
すなわち、Ｇｅｎｅ  ｃｈｉｐ解析の際のプローブ配列（２２９３４９＿ａｔ＿ｕ１３３Ｂ）より５’−側の配列を同定するためにＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて５’−ＲＡＣＥ解析を実施した。初めに、プローブの由来となったヒトＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ０３９８８４：配列番号２６１）の配列を元に設計したプライマーＬＳ９００（配列番号２６２：ＧＧＧＴＴＣＡＣＴＴＴＧＧＴＣＴＣＴＡＧＴＡＣＧＧ）を用い、肝癌細胞株ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ６、ならびにＨｅｐ３Ｂより調製した全ＲＮＡをそれぞれ等量ずつ混合した１０００ｎｇの全ＲＮＡよりキット添付の方法に従い一本鎖ｃＤＮＡを合成した。続いて、合成した一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより５’−側の配列を含むｃＤＮＡを増幅した。すなわち、１．２５μＬの一本鎖ｃＤＮＡ、５ｐｍｏｌｅのＬＳ９００をＰＣＲプライマーとして用い、キット添付の方法に従いＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは初めに９４℃で１分間編成を行った後、９８℃で１０秒、６８℃で３分のサイクルからなる反応を３５サイクル、そして７２℃で５分間インキュベートした。約５，０００ｂｐのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に挿入し、常法により大腸菌ＤＨ５α（東洋紡社製）を形質転換後、得られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製した。プラスミドＤＮＡ中の挿入遺伝子の塩基配列を解析した結果、二種類の塩基配列持つｃｌｏｎｅ−１１とｃｌｏｎｅ−１８を得た。それぞれの配列の３’側にヒトＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＬ０３９８８４）の配列を付加したものを配列番号６４と配列番号６５に示す。今回単離された二種類のクローンいずれにおいてもそれぞれ２５０アミノ酸（ｃｌｏｎｅ−１１）、または２１０アミノ酸（ｃｌｏｎｅ−１８）をコードするオープン・リーディング・フレームを持つことが明らかになった（図７０、７１）。なお、ｃｌｏｎｅ−１１より類推されるアミノ酸配列を配列番号８１に、ｃｌｏｎｅ−１８より類推されるアミノ酸配列を配列番号８２に示す。今回得られた二種のクローンにおいて類推されるアミノ酸配列を比較すると、ｃｌｏｎｅ−１１はｃｌｏｎｅ−１８よりＮ末側に４０アミノ酸長いことより、今回単離された二種のクローンは５’−側の使用しているエクソンの異なるスプライシング・バリアントである可能性が予測された。以上の結果より肝癌細胞において発現が亢進する新規遺伝子を単離・同定し、Ｋ＃２と命名した。
Ｋ＃２（ｃｌｏｎｅ−１１）のアミノ酸配列を基にＢｌａｓｔ検索を実施し、類縁の蛋白を同定した結果、ヒトＬＩＮ−２８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿０２４６７４）（配列番号２６４）と７１．８％の相同性、線虫ＬＩＮ−２８とは（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿０５９８８０）（配列番号２６５）と３３．１％の相同性を示すことが明らかになった。ＬＩＮ−２８ホモログは線虫やショウジョウバエに加えマウス、ヒトといった高等生物においても保存されている蛋白であることより（Ｍｏｓｓ，Ｅ．Ｇ．ら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２５８、４３２−４４２、２００３）、ヒトＬＩＮ−２８、線虫ＬＩＮ−２８に加え、さらにアフリカツメガエルＬＩＮ−２８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＦ５２１０９８）（配列番号２６６）、ショウジョウバエＬＩＮ−２８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＡＦ５２１０９６）（配列番号２６７）、マウスＬＩＮ−２８（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．ＮＭ＿１４５８３３）（配列番号２６８）を加え、それぞれのアミノ酸配列を比較したところ、いずれにおいてもコールド・ショック・ドメインおよびＺｎフィンガー・ドメインを保持することが明らかとなったことより（図７２）、今回単離・同定したＫ＃２は新たなヒトＬＩＮ−２８ホモログである可能性が強く示唆された。なお、ＬＩＮ−２８はｍＲＮＡに結合しｍＲＮＡからの翻訳やｍＲＮＡの安定性に関与することで、発生期の細胞運命の制御に関わるタンパク質であることが明らかになっている（Ｍｏｓｓ，Ｅ．Ｇ．ら、Ｃｅｌｌ、８８、６３７−６４６、１９９７）。以上のことより、Ｋ＃２蛋白もＬＩＮ−２８と同様の機能を有する可能性が考えられ、ヒト発生期の制御、あるいは癌細胞の発生、増殖、あるいは肝炎ウイルス等のウイルスの複製等に関与することが予測された。
４−２．  抗Ｋ＃２抗体の作製
抗Ｋ＃２抗体を用いた癌の検出が可能かどうかを明らかにするために、抗Ｋ＃２抗体の作製を行った。
Ｋ＃２の免疫用抗原としてＫ＃２（ｃｌｏｎｅ−１８）のアミノ酸の部分配列（１−２１０ａａ）をＧＳＴ融合タンパク質として、組み換え体の調製を実施した。すなわち、Ｋ＃２  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅ−１８を鋳型とし、プライマーＦ（配列番号２７８）、およびプライマーＲ（配列番号２７９）を用いＰＣＲ法にてＫ＃２（１−２１０ａａ）をコードする遺伝子を増幅し、続いてｐＧＥＭ−Ｔｅベクター（プロメガ社製）への挿入を行った。塩基配列を定法にて確認した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩを用いて切断した遺伝子断片をｐＤＥＳＴ１５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入し、発現ベクターｐＤＥＳＴ１５−Ｋ＃２を構築した。
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続いて、発現ベクターｐＤＥＳＴ１５−Ｋ＃２を上項と同様にＧＳＴ結合型抗原タンパク質（ｋ＃２（１−２１０ａａ））を上項と同様に調製し、Ｋ＃２ポリクローナル抗体の作製のため、ｋ＃２（１−２１０ａａ）−ＧＳＴ融合タンパク質を免疫したウサギ抗血清の調製を実施した。すなわち、ニュージーランドホワイト種ウサギ（１０週齢雌、日本クレア社製）にＰＢＳ懸濁したＫ＃２＿ＧＳＴ融合タンパク質１００μｇ／０．５ｍＬ／匹をフロイント完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ社）０．５ｍＬと混合してエマルジョンにしたものを皮下注射により投与して初回免疫を行った。以後２週間間隔で、ＰＢＳに懸濁したＫ＃２＿ＧＳＴ融合タンパク質１００μｇ／０．５ｍＬ／匹をフロイント不完全アジュバント０．５ｍＬと混合してエマルジョンにしたものを、皮下注射により投与して合計４回免疫を実施した。免疫前、３回、そして４回目免疫後に採血を実施し、Ｋ＃２＿ＧＳＴ融合タンパク質に対する抗体価上昇をＥＬＩＳＡ法で確認した。抗体価の上昇を確認した後、全採血を行い、Ｋ＃２免疫ウサギ抗血清を得た。これを抗Ｋ＃２ポリクローナル抗体とした。
４−３．  抗Ｋ＃２ポリクローナル抗体を用いたＫ＃２タンパク質分子の検出
上記により調製したＫ＃２免疫ウサギ抗血清の反応性を確認するために、Ｋ＃２強制発現細胞株ならびに各種癌細胞株の細胞ライゼートを用いＫ＃２の検出を行った。
Ｋ＃２発現用動物細胞発現ベクターは前述のＫ＃２をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１に挿入し、Ｋ＃２遺伝子発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｋ＃２とした。そして、１μｇの発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−Ｋ＃２を２ｘ１０５個ＨＥＫ２９３細胞にＦｕＧｅｎｅ６試薬（ロシュダイダイアグノスティック社製）を用いて導入し、Ｋ＃２を一過性発現させた。発現ベクター導入３日後の細胞を回収し、培養細胞をＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（ｐＨ８．０））にて可溶化することで細胞ライゼートを調製した。それぞれ３ｍｇタンパク質相当量のライゼートをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに供し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離した後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ（アマシャムバイオサイエンス社製）に転写した。そして一次抗体として抗Ｋ＃２ポリクローナル抗体（抗血清５０００倍希釈）を使用し、二次抗体にＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ジャクソン社製）を用い、ＥＣＬプラス（アマシャムバイオサイエンス社製）による検出を行ったところ、Ｋ＃２と考えられるバンドが検出された。
同時に各種癌細胞株の細胞ライゼートに関して同様にウエスタンブロット解析を行った。その結果、ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３の解析結果と一致し、ｍＲＮＡ発現スコアが高い細胞株においてのみ分子量約２７ｋＤａの全長のＫ＃２と考えられるバンドを検出することに成功した（図７８）。なお、Ｌｉ−７細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞に関してＧｅｎｅＣｈｉｐデータはない。
４．４  抗Ｋ＃２ポリクローナル抗体を用いた肝癌組織におけるＫ＃２のタンパク質の発現解析
Ｋ＃２癌の組織抽出物を用いて抗Ｋ＃２ポリクローナル抗体によるウエスタンブロット解析を実施した。ヒト組織抽出物調製は、組織片にＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（ｐＨ８．０））を添加して超音波破砕後、遠心して上清画分を回収して行った。各々の抽出サンプルについて蛋白質濃度をブラッドフォード法で定量し、４ｍｇ／ｍＬとなるように調製した後、ＳＤＳ−サンプルバッファーと等量混合し、９５℃で５分間加熱処理を行った。１５％ポリアクリルアミドゲルを調製して抽出物サンプルを１０ｍｇずつアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
上記と同様に、抗Ｋ＃２ポリクローナル抗体によるウエスタンブロット解析を実施したところ、特異的なＫ＃２付近のバンドが、癌部特異的に検出された（図７９）。
以上の結果により、ＴＥＧ２３：Ｋ＃２分子は癌部特異的にタンパク質レベルにおいても発現が亢進し、かつ、癌細胞株において分泌されていることが明らかになったことにより、抗Ｋ＃２抗体を用いた癌組織、および血清を用いた診断における有用性が示された。
［実施例５］
抗ＴＥＧ１：Ｃ２０ｏｒｆ１０２モノクローナル抗体の作製
抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体を用いた癌の検出が可能かどうかを明らかにするために、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２モノクローナル抗体の作製を行った。
５−１．  Ｃ２０ｏｒｆ１０２  ｃＤＮＡの単離
Ｃ２０ｏｒｆ１０２の発現を行うために、まずＣ２０ｏｒｆ１０２のｃＤＮＡを以下のようにして単離した。肺腺癌組織より前述の方法に従い一本鎖ｃＤＮＡを調製し、それを鋳型としてＥｃｏＲＩまたはＸｈｏＩの制限酵素サイトのついたプライマーＦ（配列番号：２６９）とＲ（配列番号：２７０）を用いてＰＣＲ法にて、Ｃ２０ｏｒｆ１０２予測配列と一致する約６１５ｂｐ付近のバンドの検出に成功した。ＰＣＲ用酵素および試薬には、アドバンテージＨＦポリメラーゼミックス（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＨＦ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ；クロンテック社製）およびアドバンテージＨＦ  ＰＣＲバッファー（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＨＦ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）、２００μＭデオキシヌクレオチド三リン酸、０．２μＭプライマーを用い、ｃＤＮＡ  １μＬを鋳型にしたＰＣＲ（９４℃３０秒、６８℃３０秒、７２℃３分、３５サイクル）を行った。ＰＣＲ法で得られた特異的増幅断片はＤＮＡライゲーションキット（タカラ社製）を用いてｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（プロメガ社製）に挿入し、塩基配列を定法により確認したところ、単離したｃＤＮＡがＣ２０ｏｒｆ１０２に相当することが明らかとなった。なお、プライマーＦはＣ２０ｏｒｆ１０２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿０８０６０７）の５’−端にハイブリダイズするように、そしてＲは３’−端にハイブリダイズするようにデザインした。
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５−２．  Ｃ２０ｏｒｆ１０２の免疫用抗原の調製
ＰＣＲ産物を組み込んだｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクターはコンピテント細胞ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）へ形質転換し、５−ブロモ−４−クロロ−３−β−インドリルーガラクトピラノシド（５−Ｂｒｏｍｏ−４−Ｃｈｌｏｒｏ−３−Ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；Ｘ−ｇａｌ）を用いたカラーセレクションを行い、ＰＣＲ産物が組み込まれたベクターのみを選出した。形質転換は、コンピテント細胞に１０μＬのライゲーション反応産物を加え、３０分間氷冷後に、４２℃のヒートショック４５秒、続けて２分間氷冷して形質転換を起こさせた。さらに、抗生物質耐性遺伝子の発現を行うために抗生剤を含まないＬＢ培地を９００μＬ加え、３７℃で３０分間穏やかに撹拌した。遠心で菌体を回収し、２０ｍｇ／ｍＬのＸ−ｇａｌを２０μＬ散布させた、アンピシリンを含むＬＢプレートに菌体をまき込み、３７℃で１６時間培養した。プレート上で生育したコロニーのうち、発色をしていないコロニー（ＰＣＲ産物がベクターに組み込まれていることが予想されるもの）を５個選択し、最終濃度が１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地で３７℃、１６時間激しく撹拌し、菌体を増殖させた。増殖した菌体の一部から、フェノール／クロロホルム抽出によってプラスミドＤＮＡを回収し、ＥｃｏＲ  Ｉ（８Ｕ／μＬ）を０．５μＬ、１０×Ｈ  バッファーを２μＬ、蒸留水を７．５μＬ加え、３７℃で１時間消化を行った。０．８％のアガロースゲルを用いた電気泳動で消化物のサイズが目的のＰＣＲ産物のサイズと同一であることを確認した。Ｃ２０ｏｒｆ１０２の遺伝子が組み込まれたと考えられるプラスミドＤＮＡの回収はカンタムプレップ  プラスミド  ミニプレップキット（ＱｕａｎｔｕｍＰｒｅｐ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔ（バイオラッド社製）を用いて行った。溶出は蒸留水で行った。塩基配列を定法にて確認した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩを用いて切断した遺伝子断片を、大腸菌タンパク質発現用ベクターであるｐＥＴ４１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入に組み換えた。ｐＥＴ４１に組み込まれた遺伝子は、ＧＳＴ融合タンパク質として翻訳される。
ｐＥＴ４１を制限酵素（ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ）で消化し、電気泳動を行い、キアクイック  ゲル抽出キットで精製を行った。ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙによって増幅したＣ２０ｏｒｆ１０２の配列をもつフラグメントはＤＮＡライゲーションキットを用いてｐＥＴ４１に組み込みを行った。
ｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙから精製を行ったＣ２０ｏｒｆ１０２フラグメント４μＬに、ライゲーションバッファー５μＬおよびｐＥＴ４１を１μＬ加え、１６℃で３０分間保温した。
ライゲーション反応の終了したプラスミドＤＮＡはＸＬ−１  Ｂｌｕｅへ形質転換を行い、カナマイシンを含むＬＢ培地で１６時間振盪を行い、菌体を増殖させた。増殖させた大腸菌から、カンタムプレップ  プラスミド  ミニプレップキットを用いて、プラスミドの精製を行った。ｐＥＴ４１へのＣ２０ｏｒｆ１０２の挿入を確認するために、ｐＥＴがもつ配列に対するプライマー（配列番号２７１および２７２）でシーケンスを行った。
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ｐＥＴ４１ベクターに組み込まれたＣ２０ｏｒｆ１０２を、Ｔ７プロモーターを持つコンピテント細胞ＢＬ２１  Ｃｏｄｏｎ  ＰＬＵＳ  ＲＩＬ（ノバジェン社製）に形質転換させた。
形質転換は、以下の手順で行った。１００μＬのＢＬ２１  Ｃｏｄｏｎ  ＰＬＵＳ  ＲＩＬにｐＥＴ−Ｃ２０ｏｒｆ１０２−ＦＬを１μｇ／μＬ濃度で１μＬ加え５分間氷冷した。その後、４２℃の恒温層に２０秒間漬け、ヒートショックを与えた。さらに２分間氷冷した後、９００μＬの抗生剤無添加のＬＢを加え、３７℃で１０分間インキュベートした後に、遠心（１０００×ｇ、５分）を行った。上清を廃棄した後コンピテント細胞を再懸濁させ、カナマイシンを含んだＬＢプレートにまきこんで３７℃で１６時間、選択培養を行った。
大腸菌を用いて発現させたＣ２０ｏｒｆ１０２のＧＳＴ融合タンパク質の精製はＧＳＴとグルタチオンの結合を利用したアフィニティ精製で行った。まず、培養液を６０００×ｇ、４℃で１０分間遠心することで大腸菌の菌体を回収した。菌体溶解バッファー（５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩，ｐＨ８．０）を加え、氷上で超音波処理を行った。その後、最終濃度が１％になるようにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を添加し、１３４００×ｇ、４℃で４５分間遠心を行って上清を回収した。この上清にグルタチオンセファロース（アマシャムバイオサイエンス社製）を５００μＬ加え、４℃で１時間転倒混和を行い、ＧＳＴ−Ｃ２０ｏｒｆ１０２融合蛋白質を吸着させた。
遠心（３０００×ｇ、４℃、５分）でグルタチオンセファロースを回収し、１０ｍＬのＰＢＳ−Ｔ（０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＰＢＳ）で洗浄後、溶出バッファー（５０ｍＭ還元型グルタチオン、２００ｍＭ塩化ナトリウム１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）を加えて４℃で１時間転倒混和し、ＧＳＴ融合タンパク質を溶出させた。遠心（３０００×ｇ、４℃、５分）によってグルタチオンセファロースを除去し、ＧＳＴ融合Ｃ２０ｏｒｆ１０２精製蛋白質を得た。ＰＤ−１０カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）でＰＢＳ溶液とし、ブラッドフォード法によってタンパク質濃度を定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度を検定し、免疫に必要なタンパク質の量および純度を満たしていることを確認し、このタンパク質を以下に示すモノクローナル抗体作製のための免疫原とした。
５−３．  Ｃ２０ｏｒｆ１０２モノクローナル抗体の作製
ヒトＣ２０ｏｒｆ１０２の完全長蛋白質のＧＳＴ−融合発現物（大腸菌発現物）精製品を免疫原とした。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ雌６週齢）に５０μｇ／匹で３回免疫した後、血清中の抗体価を検定した。抗体価検定法として、免疫原０．５μｇ／ｗｅｌｌを固相化したＥＬＩＳＡ用プレートに、予めＧＳＴ蛋白質で抗ＧＳＴ抗体のノイズを吸収させた免疫マウス血清の希釈列を反応させ、ＨＲＰ標識抗マウス抗体の反応を経て、基質添加後に得られた発色について４５０ｎｍの吸光度を測定する方法（免疫抗原固相ＥＬＩＳＡ法）を使用した。
抗体価亢進を認めたマウスに２５μｇ／匹を最終免疫し、７２時間後に脾臓細胞を採取し、骨髄腫細胞（Ｐ３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１）と細胞融合（Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ：Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５（１９７５））を行った。ＨＡＴ選択培地で培養を行うことにより、ハイブリドーマを得た。ハイブリドーマの培養上清を予めＧＳＴ蛋白質で吸収させた後に免疫抗原固相ＥＬＩＳＡを行い、Ｃ２０ｏｒｆ１０２現物）に対して反応するものを一次選抜した。免疫抗原ＥＬＩＳＡ陽性のバイブリドーマについては、ＣＯＳ７細胞にＣ２０ｏｒｆ１０２を強制発現させた細胞株のタンパク質抽出液を用いたウエスタン・ブロッティングにおいて特異性を検定した。陽性のものについて限界希釈法にてクローニングを行い、モノクローナル抗体産生株を樹立した。抗体産生ハイブリドーマをＢＡＬＢ／ｃマウスに接種することによってマウス腹水を得た。腹水中のモノクローナル抗体を硫安塩析法で精製し、精製抗体を調製した。以上により、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２抗体Ｈ９６１５を作製した。
［実施例６］
抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２モノクローナル抗体を用いたＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質分子の検出
上記により調製した抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２モノクローナル抗体Ｈ９６１５の反応性を確認するために、Ｃ２０ｏｒｆ１０２強制発現細胞株ならびに各種癌細胞株の細胞ライゼートを用いＣ２０ｏｒｆ１０２の検出を行った。
初めに、Ｃ２０ｏｒｆ１０２強制発現ＣＯＳ７細胞を用いウエスタンブロット解析により抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２モノクローナル抗体Ｈ９６１５の反応性を確認した。動物細胞発現ベクターは前述のＣ２０ｏｒｆ１０２をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ４Ｍｙｓ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入したＣ２０ｏｒｆ１０２遺伝子発現ベクターを使用した。すなわち、１μｇの発現ベクターを５ｘ１０４個のＣＯＳ７細胞にＦｕＧｅｎｅ６試薬（ロシュダイダイアグノスティック社製）を用いて導入し、Ｃ２０ｏｒｆ１０２を一過性発現させた。発現ベクター導入３日後の細胞を回収し、培養細胞をＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（ｐＨ８．０））にて可溶化することで細胞ライゼートを調製した。それぞれ１０μｇタンパク質相当量のライゼートをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに供し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離した後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ（アマシャムバイオサイエンス社製）に転写した。そして抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２モノクローナル抗体Ｈ９６１５（１μｇ／ｍＬ）を使用し、二次抗体にＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン社製）を用い、ＥＣＬプラス（アマシャムバイオサイエンス社製）による検出を行ったところ、理論分子量２２．５ｋＤａ付近に特異的なＣ２０ｏｒｆ１０２と考えられるバンドが検出された。
同時に、各種癌細胞株の細胞ライゼートに関して同様にウエスタンブロット解析を行った。その結果、ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３の解析結果と一致し、ｍＲＮＡ発現スコアが高い細胞株においてのみ分子量約２２．５ｋＤａの全長のＣ２０ｏｒｆ１０２と考えられるバンドを検出することに成功した（図７４）。
さらに、Ｃ２０ｏｒｆ１０２遺伝子が予測配列として分泌シグナルを有することから、Ｃ２０ｏｒｆ１０２を発現する癌細胞株において分泌型のＣ２０ｏｒｆ１０２が培養上清中に検出できるか確認したところ、Ｃ２０ｏｒｆ１０２を高発現する癌細胞株の培養上清中にも強制発現細胞の培養上清と同じ分子量のバンドが抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２モノクローナル抗体により検出された（図７４）。
以上の結果より、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２モノクローナル抗体Ｈ９６１５はＣ２０ｏｒｆ１０２を特異的に検出できること、ならびにＧｅｎｅＣｈｉｐ解析によるｍＲＮＡ発現の程度とＣ２０ｏｒｆ１０２タンパク質の発現の程度が一致することが明らかとなった。さらに、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２モノクローナル抗体を用いた検討からＣ２０ｏｒｆ１０２発現細胞の培養上清中に分泌型のＣ２０ｏｒｆ１０２が存在することが明らかとなったことより、分泌型Ｃ２０ｏｒｆ１０２を検出することで癌細胞の有無を判断できる可能性が強く示唆された。
［実施例７］
抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２モノクローナル抗体を用いた肺腺癌組織におけるＣ２０ｏｒｆ１０２のタンパク質の発現解析
肺腺癌の組織抽出物を用いて抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２モノクローナル抗体Ｈ９６１５によるウエスタンブロット解析を実施した。ヒト組織抽出物調製は、組織片にＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（ｐＨ８．０））を添加して超音波破砕後、遠心して上清画分を回収して行った。各々の抽出サンプルについて蛋白質濃度をブラッドフォード法で定量し、４ｍｇ／ｍＬとなるように調製した後、ＳＤＳ−サンプルバッファーと等量混合し、９５℃で５分間加熱処理を行った。１５％ポリアクリルアミドゲルを調製して抽出物サンプルを１０μｇずつアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。上記と同様に、抗Ｃ２０ｏｒｆ１０２モノクローナル抗体Ｈ９６１５によるウエスタンブロット解析を実施したところ、特異的な約２２．５ｋＤａ付近のバンドが、癌部特異的に検出された（図７５）。
以上の結果により、ＴＥＧ１：Ｃ２０ｏｒｆ１０２分子は癌部特異的にタンパク質レベルにおいても発現が亢進し、かつ、癌細胞株において分泌されていることが明らかになったことにより、モノクローナル抗体を用いた癌組織、および血清を用いた診断における有用性が示された。
［実施例８］
抗ＯＫ／ＳＷ−ＣＬ．．３０抗体の作製
ＴＥＧ６：ＯＫ／ＳＷ−ＣＬ．．３０に関して、抗ＯＫ／ＳＷ−ＣＬ．．３０抗体を用いた癌の検出が可能かどうかを明らかにするために、抗ＯＫ／ＳＷ−ＣＬ．．３０抗体の作製を行った。
８−１．  ｈＮｏｔｕｍ  ｃＤＮＡの単離
公共データベース（ＵＣＳＣおよびＧｅｎＢａｎｋ）の検索によって、ＯＫ／ＳＷ−ＣＬ．．３０のｃＤＮＡ配列は部分配列であり、実際にはＯＫ／ＳＷ−ＣＬ．．３０配列をすべて含み、かつ、さらなる５‘領域を含んだ仮想タンパク質ＬＯＣ１４７１１１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿１７８４９３：配列番号２７３−２７４）が全長ＯＲＦ遺伝子である可能性が見出された。その配列はシグナル配列を含み、かつ、ハエＮｏｔｕｍ（ＮＭ＿１６８６４２）と相同性４２．７％示すことから、新規遺伝子としてｈＮｏｔｕｍと命名し、以下の解析を実施した。まずｈＮｏｔｕｍのｃＤＮＡを以下のようにして単離した。ＨｅｐＧ２細胞より前述の方法に従い一本鎖ｃＤＮＡを調製し、それを鋳型としてプライマーＷＴ１６４（配列番号２７５）とＬＳ７４６（配列番号２７６）を用いてＰＣＲ法にて、ｈＮｏｔｕｍ予測配列と一致する約１．５ｋｂｐ付近のバンドの検出に成功した。ＰＣＲ法はＫＯＤ  ｐｌｕｓキット（ＴＯＹＯＢＯ社製）のプロトコールに準じて調整した反応液に反応液総量の５％に相当するＤＭＳＯを加え、初めに９５℃で２分間一次変性を行い、９４℃で１５秒、６８℃で９０秒からなるサイクルを３５回行なった。ＰＣＲ法で得られた特異的増幅断片をＴＯＰＯクローニング法によりｐＥＮＴＲ（インビトロジェン社製）に挿入し、塩基配列を定法により確認したところ、単離したｃＤＮＡがｈＮｏｔｕｍであることが明らかとなった。
なお、プライマーＷＴ１６４はｈＮｏｔｕｍ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿１７８４９３）の５’−端にハイブリダイズするように、そしてＬＳ７４６は３’−端にハイブリダイズするようにデザインした。
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８−２．  ｈＮｏｔｕｍの免疫用抗原の調製
ｈＮｏｔｕｍの免疫用抗原としてアミノ酸の部分配列（１４３ａａ−４９６ａａ）をＧＳＴ−結合型タンパク質として、組み換え体の調製を実施した。すなわち、上記のｈＮｏｔｕｍ  ｃＤＮＡを鋳型とし、ＬＳ６９５プライマー（配列番号２７７）、およびＬＳ７４６（配列番号２７６）を用いＰＣＲ法にてｈＮｏｔｕｍ（１４３ａａ−４９６ａａ）をコードする遺伝子を増幅し、続いてｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（プロメガ社製）への挿入を行った。塩基配列を定法にて確認した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩを用いて切断した遺伝子断片をｐＥＴ４１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入し、発現ベクターを構築した。
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ＧＳＴ融合抗原タンパク質（ｈＮｏｒｔｕｍ  １４３ａａ−４９６ａａを含む）の調製、およびマウス免疫によるモノクローナル抗体の作製は上項と同様に実施した。その結果、ｈＮｏｔｕｍモノクローナル抗体Ｈ９５４１を作製した。
［実施例９］
抗ｈＮｏｔｕｍ抗体を用いたｈＮｏｔｕｍタンパク質分子の検出
作製したモノクローナル抗体の反応性を確認するために、ｈＮｏｔｕｍ強制発現細胞株ならびに各種癌細胞株の細胞ライゼートを用いｈＮｏｔｕｍの検出を行った。コントロールには上記で使用した抗原部位１４３ａａ−４９６ａａをｐｃＤＮＡ４に挿入したベクターを使用した。予測分子量は３９．９ｋＤａである。ウエスタンブロット解析は上項と同様に実施し、一次抗体であるＨ９５４１は終濃度１００μｇ／ｍＬで実施した。
その結果、図７６に示すとおり３７ｋＤａマーカー位置付近にｈＮｏｔｕｍ（１４３ａａ−４９６ａａ）と考えられる特異的なバンドが検出された。
続いて、各種癌細胞株の細胞ライゼートに関して同様にウエスタンブロット解析を行った。その結果、ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３の解析結果と一致し、ｍＲＮＡ発現スコアが高い細胞株においてのみ分子量約５５ｋＤａの全長のｈＮｏｔｕｍと考えられるバンドを検出することに成功した（図７６）。
さらに、ｈＮｏｔｕｍ遺伝子が予測配列として分泌シグナルを有することから、ｈＮｏｔｕｍを発現する癌細胞株において分泌型のｈＮｏｔｕｍが培養上清中に検出できるか確認したところ、ｈＮｏｔｕｍを高発現する癌細胞株の培養上清中にも強制発現細胞の培養上清と同じ分子量のバンドが抗ｈＮｏｔｕｍ抗体により検出された（図７６）。
以上の結果より、ｈＮｏｔｕｍモノクローナル抗体Ｈ９５４１はｈＮｏｔｕｍを特異的に検出できること、ならびにＧｅｎｅＣｈｉｐ解析によるｍＲＮＡ発現の程度とｈＮｏｔｕｍタンパク質の発現の程度が一致することが明らかとなった。さらに、抗ｈＮｏｔｕｍ抗体を用いた検討からｈＮｏｔｕｍ発現細胞の培養上清中に分泌型のｈＮｏｔｕｍが存在することが明らかとなったことより、分泌型ｈＮｏｔｕｍを検出することで癌細胞の有無を判断できる可能性が強く示唆された。
［実施例１０］
ｈＮｏｔｕｍ抗体を用いた肝癌組織におけるｈＮｏｔｕｍのタンパク質の発現解析
肝癌の組織抽出物を用いて抗ｈＮｏｔｕｍ抗体によるウエスタンブロット解析を実施した。上記と同様に、ｈＮｏｔｕｍ抗体によるウエスタンブロット解析を実施したところ、特異的なｈＮｏｔｕｍ付近のバンドが、癌部特異的に検出され、（図７７）。３検体調査し、２検体において陽性であった。、また、検体２６に関しては、同一患者より得た２ヶ所の肝細胞癌組織（Ｓ２、Ｓ５）のうち、一箇所の組織でｈＮｏｒｔｕｍが陽性であった。
以上の結果により、ＴＥＧ６：ｈＮｏｔｕｍ（ＯＫ／ＳＷ−ＣＬ．．３０）分子は癌部特異的にタンパク質レベルにおいても発現が亢進し、かつ、癌細胞株において分泌されていることが明らかになったことにより、モノクローナル抗体を用いた癌組織、および血清を用いた診断における有用性が示された。
［実施例１１］
１１−１．  抗ＫＩＡＡ１３５９抗体の作製
ＴＥＧ３７：ＫＩＡＡ１３５９について、抗ＫＩＡＡ１３５９抗体を用いた癌の検出が可能かどうかを明らかにするために、抗ＫＩＡＡ１３５９抗体の作製を行った。すなわち、ＫＩＡＡ１３５９の免疫用抗原としてアミノ酸の部分配列（７６ａａから８８ａａ）をペプチドタンパク質として、常法によりペプチド配列合成を実施した。ペプチドＮ末端にＣ：システイン残基を付加し、Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）にコンジュゲーションし免疫原とした。そしてモノクローナル抗体は上項と同様に実施した。そしてモノクローナル抗体Ａ８４０９Ａの単離に成功した。
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１１−２．  ＫＩＡＡ１３５９ｃＤＮＡの単離
ＫＩＡＡ１３５９の発現を行うために、まずＫＩＡＡ１３５９のｃＤＮＡを以下のようにして単離した。ＫＩＡＡ１３５９発現細胞であるＭＫＮ７４細胞より前述の方法に従い一本鎖ｃＤＮＡを調製し、それを鋳型としてプライマーＦ（配列番号２８１）とＲ（配列番号２８２）を用いてＰＣＲ法にて、ＫＩＡＡ１３５９の予測配列と一致する約１．６ｋｂｐ付近のバンドの検出に成功した。ＰＣＲ法はＡｄｖａｎｖｔｅｄｅ  ＨＦ２キット（クロンテック社製）のプロトコールに準じて反応液を調製し、初めに９５℃で１分間一次変性を行い、９４℃で１５秒、６３℃で３０秒、６８℃で２分からなるサイクルを３５回行なった後、最後の伸長反応を６８℃で６分間からなる条件で実施した。ＰＣＲ法で得られた特異的増幅断片をＴＡクローニング法によりｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（プロメガ社製）に挿入し、塩基配列を定法により確認したところ、単離したｃＤＮＡがＫＩＡＡ１３５９であることが明らかとなった。そして、このｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入し、ＫＩＡＡ１３５９遺伝子発現ベクターとした。なお、プライマーＦはＫＩＡＡ１３５９遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿１５２６７３）の５’−端にハイブリダイズするように、そしてＲは３’−端にハイブリダイズするようにデザインした。
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１１−３．  抗ＫＩＡＡ１３５９抗体Ａ８４０９Ａを用いたＫＩＡＡ１３５９タンパク質分子の検出
上記により作製した抗ＫＩＡＡ１３５９抗体Ａ８４０９Ａの反応性を確認するために、ＫＩＡＡ１３５９強制発現細胞株ならびに各種癌細胞株の細胞ライゼートを用いＫＩＡＡ１３５９の検出を行った。
コントロールとして、ＫＩＡＡ１３５９を強制発現させたＣＯＳ７ライゼートを用い、各種癌細胞株の細胞ライゼートに関して同様にウエスタンブロット解析を行った。Ａ８４０９Ａ抗体濃度は１００μｇ／ｍＬで使用した。その結果、ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３の解析スコアの高い、Ｃａｐａｎ１において、コントロールの強制発現ＫＡＩＩ１３５９と同等な約１００ｋＤａのＫＡＩＩ１３５９分子と考えられるバンドの検出に成功した（図８０）。
１１−４．  抗ＫＩＡＡ１３５９抗体Ａ８４０９Ａを用いた胃癌組織におけるＫＩＡＡ１３５９のタンパク質の発現解析
胃癌の組織抽出物を用いて抗ＫＩＡＡ１３５９抗体Ａ８４０９Ａによるウエスタンブロット解析を実施した。ヒト組織抽出物調製は、組織片にＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（ｐＨ８．０））を添加して超音波破砕後、遠心して上清画分を回収して行った。各々の抽出サンプルについて蛋白質濃度をブラッドフォード法で定量し、４ｍｇ／ｍＬとなるように調製した後、ＳＤＳ−サンプルバッファーと等量混合し、９５℃で５分間加熱処理を行った。１０％ポリアクリルアミドゲルを調製して抽出物サンプルを１０ｍｇずつアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
上記と同様に、抗ＫＩＡＡ１３５９抗体Ａ８４０９Ａによるウエスタンブロット解析を実施したところ、特異的な１００ｋＤａ付近のバンドが、癌部特異的に検出された（図８１）。
以上の結果により、ＴＥＧ３７：ＫＩＡＡ１３５９分子は癌部特異的にタンパク質レベルにおいても発現が亢進し、かつ、癌細胞株において発現亢進していることが明らかになったことにより、モノクローナル抗体を用いた癌組織、および血清を用いた診断における有用性が示された。
［実施例１２］
１２−１．  抗ＰＥＧ１０抗体の作製
ＴＥＧ６０：ＰＥＧ１０は通常のコドンユーセージにより翻訳するＯＲＦ１と、ＯＲＦ１の終止コドン領域でフレームシフトが起こり、新たに翻訳されるＯＲＦ２の存在が、Ｓｈｉｇｅｍｏｔｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２９，４０７９−４０８８，２００１のマウスＰＥＧ１０の報告、あるいはＯｎｏら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，７３，２３２−２３７，２００１のヒトＰＥＧ１０のゲノム配列からの予測により、示唆されているが、実験的にヒトＰＥＧ１０のＯＲＦ２存在を証明した報告は見つかっていない。そのため、我々はＯＲＦ２部分のフレームシフトが実際に起こっているのかどうか、また、その新たに翻訳された領域が癌組織で存在するどうかを証明するため、予測したＯＲＦ２アミノ酸配列をもとに抗ＰＥＧ１０／ＯＲＦ２モノクローナル抗体を作製し、証明することを試みた。
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１２−２．  ＰＥＧ１０ｃＤＮＡの単離
ＰＥＧ１０の発現を行うために、まずＰＥＧ１０のｃＤＮＡを以下のようにして単離した。ヒト胎児肝組織より前述の方法に従い一本鎖ｃＤＮＡを調製し、それを鋳型としてプライマーＦ１（配列番号２８４）とＲ１（配列番号２８５）を用いてＰＣＲ法にて、ＰＥＧ１０予測配列と一致する約２２００ｋｂｐ付近のバンドの検出に成功した。ＰＣＲ法はＡｄｖａｎｔａｇｅ２  ｃＤＮＡ  ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）のプロトコールに準じて反応液を調製し、初めに９４℃で１分間一次変性を行い、９４℃で３０秒、６８℃で３分からなるサイクルを３５回行なった後、最後の伸長反応を６８℃で１０分間からなる条件で実施した。ＰＣＲ法で得られた特異的増幅断片をＴＡクローニング法によりｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ（プロメガ社製）に挿入し、塩基配列を定法により確認したところ、単離したｃＤＮＡがＰＥＧ１０であることが明らかとなった。
なお、プライマーＦ１はＰＥＧ１０遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０４９８３４）の５’−端にハイブリダイズするように、そしてＲ１は３’−端にハイブリダイズするようにデザインした。
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１２−３．  ＰＥＧ１０／ＯＲＦ２の免疫用抗原の調製およびモノクローナル抗体の作製
ＰＥＧ１０／ＯＲＦ２の免疫用抗原としてアミノ酸の部分配列（ＯＲＦ２／５１ａａ−２５１ａａ）をＧＳＴ−結合型タンパク質として、組み換え体の調製を実施した。
すなわち、上記のＰＥＧ１０ｃＤＮＡを鋳型とし、Ｆ２プライマー（配列番号２８６）、およびＲ２プライマー（配列番号２８７）を用いＰＣＲ法にてＰＥＧ１０（ＯＲＦ２／５１ａａ−２５１ａａ）をコードする遺伝子を増幅し、続いてｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（プロメガ社製）への挿入を行った。塩基配列を定法にて確認した後、制限酵素ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩを用いて切断した遺伝子断片をｐＥＴ４１ｃベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入し、発現ベクターｐＥＴｃ＿ＰＥＧ１０＿ＯＲＦ２を構築した。
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続いて、発現ベクターｐＥＴｃ＿ＰＥＧ１０＿ＯＲＦ２を上項と同様にＧＳＴ結合型ＰＥＧ１０＿ＯＲＦ２タンパク質として調製、マウス免疫によるモノクローナル抗体の作製を実施した。そしてＰＥＧ１０＿ＯＲＦ２に対するモノクローナル抗体Ｈ４１２８を作製した。
１２−４．  抗ＰＥＧ１０／ＯＲＦ２抗体を用いたＰＥＧ１０タンパク質分子の検出
上記により調製した抗ＰＥＧ１０／ＯＲＦ２抗体Ｈ４１２８の反応性を確認するために、ＰＥＧ１０強制発現細胞株ならびに各種癌細胞株の細胞ライゼートを用いＰＥＧ１０の検出を行った。
初めに、ＰＥＧ１０強制発現ＣＯＳ７細胞を用いウエスタンブロット解析により抗ＰＥＧ１０／ＯＲＦ２抗体Ｂ００００Ａの反応性を確認した。動物細胞発現ベクターは前述のＰＥＧ１０全長をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ４ＨｉｓＭａｘＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入したＰＥＧ１０遺伝子発現ベクターｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ＿ＰＥＧ１０＿Ｆｕｌｌを使用した。ＰＥＧ１０のＮ末端にＸｐｒｅｓｓタグ配列が挿入されたコンストラクトとなっている。すなわち、１μｇの発現ベクターｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ＿ＰＥＧ１０＿Ｆｕｌｌ、もしくは陰性対照としてｐｃＤＮＡ４（Ｍｏｃｋ）を５ｘ１０４個のＣＯＳ７細胞とＨｅｐ３Ｂ細胞にＦｕＧｅｎｅ６試薬（ロシュダイダイアグノスティック社製）を用いて導入し、ＰＥＧ１０を一過性発現させた。発現ベクター導入３日後の細胞を回収し、培養細胞をＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（ｐＨ８．０））にて可溶化することで細胞ライゼートを調製した。それぞれ５ｍｇタンパク質相当量のライゼートをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに供し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離した後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ（アマシャムバイオサイエンス社製）に転写した。そして一次抗体として抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体（５０００倍希釈）（インビトロジェン社製）もしくはＰＥＧ１０／ＯＲＦ２抗体Ｈ４１２８（２μｇ／ｍＬ）を使用し、二次抗体にＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、ＥＣＬプラス（アマシャムバイオサイエンス社製）による検出を行ったところ、Ｍｏｃｋの陰性コントロールに対し、Ｈ４１２８抗体により、ＰＥＧ１０と考えられる８３ｋＤａ、５０ｋＤａ付近のバンドが得意的に検出された（図８２）。また、Ｎ末に標識されたＸｐｒｅｓｓタグ抗体においても同様に約８３ｋＤａ付近のバンドは特異的に検出されている。その約８３ｋＤａ付近のものはＯＲＦ１以降フレームシフトを起こし、ＯＲＦ２の融合した全長サイズでなはないかと考察している。また、抗原としたＯＲＦ２部分のアミノ酸配列は通常のフレームでは翻訳されないことから、ヒトＰＥＧ１０においてフレームシフトが行われていることが、抗ＰＥＧ１０／ＯＲＦ２抗体Ｈ４１２８を用いることにより明らかとなった。
１２−５．  抗ＰＥＧ１０抗体Ｈ４１２８を用いた肝細胞癌組織におけるＰＥＧ１０のタンパク質の発現解析
肝細胞癌および肝芽種の組織抽出物を用いて抗ＰＥＧ１０抗体によるウエスタンブロット解析を実施した。ヒト組織抽出物調製は、組織片にＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（ｐＨ８．０））を添加して超音波破砕後、遠心して上清画分を回収して行った。各々の抽出サンプルについて蛋白質濃度をブラッドフォード法で定量し、４ｍｇ／ｍＬとなるように調製した後、ＳＤＳ−サンプルバッファーと等量混合し、９５℃で５分間加熱処理を行った。１２％ポリアクリルアミドゲルを調製して抽出物サンプルを１０ｍｇずつアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
上記と同様に、抗ＰＥＧ１０抗体Ｈ４１２８によるウエスタンブロット解析を実施したところ、特異的な８３ｋＤａ付近のバンドと５０ｋＤａ付近のバンドが、癌部特異的に検出された（図８３）。このことにより強制発現させたＰＥＧ１０のみならず、肝細胞癌、肝芽種組織においてもＰＥＧ１０／ＯＲＦ２が存在することが明らかとなった。
以上の結果により、ＴＥＧ６０：ＰＥＧ１０分子は癌部特異的にタンパク質レベルにおいても発現が亢進していることが明らかになったことにより、モノクローナル抗体を用いた癌組織、および血清を用いた診断における有用性が示された。
［実施例１３］
１３−１．  ＤＵＳＰ９の免疫用抗原の調製およびモノクローナル抗体の作製
ＴＥＧ６３：ＤＵＳＰ９に関して、モノクローナル抗体を用いた癌の検出が可能かどうかを明らかにするために、抗ＤＵＳＰ９抗体の作製を行った。
ＤＵＳＰ９の免疫用抗原としてＤＵＳＰ９全長配列をＧＳＴ融合タンパク質として、組み換え体の調製を実施した。すなわち、ＨｅｐＧ２ｃＤＮＡを鋳型とし、Ｌｓ７７２プライマー（配列番号２８８）、およびＬｓ７７３プライマー（配列番号２８９）を用いＰＣＲ法にてＤＵＳＰ９（３８５ａａ）をコードする遺伝子を増幅し、続いてｐＧＥＭ−Ｔｅベクター（プロメガ社製）への挿入を行った。塩基配列を定法にて確認した後、制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断した遺伝子断片をｐＥＴ４１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入し、発現ベクターｐＥＴ４１ａ−ＤＵＳＰ９を構築した。
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続いて、発現ベクターｐＥＴ４１ａ−ＤＵＳＰ９を用いて上項と同様にＧＳＴ融合ＤＵＳＰ９（１−３８５ａａ）タンパク質の調製を行い、マウス免疫によるモノクローナル抗体の作製を実施した。そして、抗ＤＵＳＰ９抗体＃８９０１を作製した。
１３−２．  抗ＤＵＳＰ９抗体を用いたＤＵＳＰ９タンパク質分子の検出
上記により調製した抗ＤＵＳＰ９抗体＃８９０１の反応性を確認するために、ＤＵＳＰ９強制発現細胞株ならびに各種癌細胞株の細胞ライゼートを用いＤＵＳＰ９の検出を行った。
初めに、ＤＵＳＰ９強制発現ＣＯＳ７細胞を用いウエスタンブロット解析により抗ＤＵＳＰ９抗体＃８９０１の反応性を確認した。動物細胞発現ベクターは前述のＤＵＳＰ９をコードするｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ４Ｍｙｓ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入したＤＵＳＰ９遺伝子発現ベクターｐｃＤＮＡ４−ＤＵＳＰ９を使用した。すなわち、１μｇの発現ベクターｐｃＤＮＡ４−ＤＵＳＰ９を５ｘ１０４個のＣＯＳ７細胞にＦｕＧｅｎｅ６試薬（ロシュダイダイアグノスティック社製）を用いて導入し、ＤＵＳＰ９を一過性発現させた。発現ベクター導入３日後の細胞を回収し、培養細胞をＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（ｐＨ８．０））にて可溶化することで細胞ライゼートを調製した。その３ｍｇタンパク質相当量のライゼートをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに供し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離した後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ（アマシャムバイオサイエンス社製）に転写した。そして一次抗体としてＤＵＳＰ９抗体（１μｇ／ｍＬ）を使用し、二次抗体にＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（ジャクソン社製）を用い、ＥＣＬプラス（アマシャムバイオサイエンス社製）による検出を行ったところ、約４２ｋＤａ付近にＤＵＳＰ９と考えられるバンドが検出された。
同時に各種癌細胞株の細胞ライゼートに関して同様にウエスタンブロット解析を行った。その結果、ＧｅｎｅＣｈｉｐＵ１３３の解析結果と一致し、ｍＲＮＡ発現スコアが高い細胞株においてのみ分子量約４２ｋＤａの全長ＤＵＳＰ９と考えられるバンドを特異的に検出することに成功した（図８４）。
１３−３．  抗ＤＵＳＰ９抗体を用いた肝細胞癌組織におけるＤＵＳＰ９のタンパク質の発現解析
肝細胞癌の組織抽出物を用いて抗ＤＵＳＰ９抗体＃８９０１によるウエスタンブロット解析を実施した。ヒト組織抽出物調製は、組織片にＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭトリスヒドロキシアミノメタン塩酸塩（ｐＨ８．０））を添加して超音波破砕後、遠心して上清画分を回収して行った。各々の抽出サンプルについて蛋白質濃度をブラッドフォード法で定量し、４ｍｇ／ｍＬとなるように調製した後、ＳＤＳ−サンプルバッファーと等量混合し、９５℃で５分間加熱処理を行った。１２％ポリアクリルアミドゲルを調製して抽出物サンプルを１０ｍｇずつアプライし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
上記と同様に、抗ＤＵＳＰ９抗体＃８９０１によるウエスタンブロット解析を実施したところ、特異的な４２ｋＤａ付近のバンドが、癌部特異的に検出された（図８５）。特に低分化型肝細胞癌において３例中３例にて検出された。
以上の結果により、ＴＥＧ６３：ＤＵＳＰ９分子は癌部位において遺伝子発現亢進のみならず、タンパク質レベルにおいても癌部および癌細胞株において、発現亢進していることがモノクローナル抗体を用いることにおいて証明された。このことにより、モノクローナル抗体を用いた癌組織、および血清を用いた診断における有用性が示された。
［実施例１４］
１４−１．  抗ＣｙｓｔａｔｉｎＳＮ抗体の作製
ＴＥＧ４７：ＣｙｓｔａｔｉｎＳＮに関して、抗ＣｙｓｔａｔｉｎＳＮ抗体を用いた癌の検出が可能かどうかを明らかにするために、抗ＣｙｓｔａｔｉｎＳＮ抗体の作製を行った。
すなわち、ＣｙｓｔａｔｉｎＳＮの免疫用抗原としてアミノ酸の部分配列（６０ａａから７５ａａ）をペプチドタンパク質として（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｎｏ．：ＮＭ＿００１８９８参照）、常法によりペプチド配列合成を実施した。ペプチドＮ末端にＣ：システイン残基を付加し、Ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）にコンジュゲーションし免疫原とした。そしてモノクローナル抗体は上項と同様に作製した。そしてモノクローナル抗体の単離に成功した。
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１４−２．  抗ＣｙｓｔａｔｉｎＳＮ抗体を用いた大腸癌組織におけるＣｙｓｔａｔｉｎＳＮのタンパク質の発現解析
大腸癌の組織抽出物を用いて抗ＣｙｓｔａｔｉｎＳＮ抗体によるウエスタンブロット解析を実施した。ヒト組織抽出物調製およびウエスタンブロット解析は上項と同様に実施した。抗ＣｙｓｔａｔｉｎＳＮ抗体（４μｇ／ｍＬ）によるウエスタンブロット解析を実施したところ、特異的な１５ｋＤａ付近のバンドが、癌部特異的に検出された（図８６）。ＣｙｓｔａｔｉｎＳＮの予測分子量が約１６ｋＤａであることから、癌部において特異的にＣｙｓｔａｔｉｎＳＮが発現亢進していることが明らかとなった。
以上の結果により、ＴＥＧ４７：ＣｙｓｔａｔｉｎＳＮ分子は癌部特異的にタンパク質レベルにおいて発現亢進していることが明らかになったことにより、モノクローナル抗体を用いた癌組織、および血清を用いた診断における有用性が示された。
［実施例１５］
抗ＳＦＲＰ４抗体の作製
ＴＥＧ５６：ＳＦＲＰ４に関して、抗ＳＦＲＰ４抗体を用いた癌の検出が可能かどうかを明らかにするために、抗ＳＦＲＰ４抗体の作製を行った。
１５−１．  ＳＦＲＰ４ｃＤＮＡの単離
ＳＦＲＰ４の発現を行うために、まずＳＦＲＰ４のｃＤＮＡを以下のようにして単離した。胃癌組織より前述の方法に従い一本鎖ｃＤＮＡを調製し、それを鋳型としてＥｃｏＲＩまたはＸｈｏＩの制限酵素サイトのついたプライマーＧＣ８９８（配列番号２９１）とＧＣ８９９（配列番号２９２）を用いてＰＣＲ法にて、目的サイズと一致する約１０００ｂｐ付近のバンドの検出に成功した。ＰＣＲ用酵素および試薬には、アドバンテージＨＦポリメラーゼミックス（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＨＦ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ；クロンテック社製）およびアドバンテージＨＦ  ＰＣＲバッファー（Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＨＦ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ）、２００μＭデオキシヌクレオチド三リン酸、０．２μＭプライマーを用い、ｃＤＮＡ  １μＬを鋳型にしたＰＣＲ（９４℃３０秒、６８℃３０秒、７２℃３分、３５サイクル）を行った。ＰＣＲ法で得られた特異的増幅断片はＤＮＡライゲーションキット（タカラ社製）を用いてｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（プロメガ社製）に挿入し、塩基配列を定法により確認したところ、単離したｃＤＮＡがＳＦＲＰ４に相当することが明らかとなった。
なお、プライマーＧＣ８９８はＳＦＲ４＿ＯＲＦ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿００３０１４）の５’−端にハイブリダイズするように、そしてＧＣ８９９は３’−端にハイブリダイズするようにデザインした。
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１５−２．  ＳＦＲＰ４の免疫用抗原の調製
ＳＦＲＰ４の免疫用抗原として上記の全長ＳＦＲＰ４配列をＧＳＴ−結合型タンパク質として、組み換え体の調製を実施した。すなわち、上記のｐＧＥＭ−Ｔに挿入されたＳＦＲＰ４配列を、制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩを用いて切断し、そしてｐＥＴ４１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入し、発現ベクターＧＳＴ−ＳＦＲＰ４を構築した。
ＧＳＴ融合抗原タンパク質の調製、およびマウス免疫によるモノクローナル抗体の作製は上項と同様に実施した。その結果、抗ＳＦＲＰ４モノクローナル抗体Ａ７１１３を作製した。
１５−３．  抗ＳＦＲＰ４抗体を用いた胃組織におけるＳＦＲＰ４のタンパク質の発現解析
胃癌の組織抽出物を用いて抗ＳＦＲＰ４抗体によるウエスタンブロット解析を実施した。上項と同様に、抗ＳＦＲＰ４抗体Ａ７１１３（４０μｇ／ｍＬ）によるウエスタンブロット解析を実施したところ、癌部において特異的な約５０ｋＤａ付近のバンドが検出された（図８７）。
同時に上記でクローニングしたＳＦＲＰ４配列を挿入した発現ベクターＳＦＲＰ４＿ｐｃＤＮＡ４Ｈｉｓ−Ｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＣＯＳ７細胞に強制発現させ、その細胞ライゼートに対する抗Ｍｙｃ抗体（５千倍希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるウエスタンブロット解析を実施したところ、臨床検体で検出されたものと同一サイズのバンドが検出された（図８８）。そのため、臨床検体で抗ＳＦＲＰ４モノクローナル抗体により検出された５０ｋＤａのバンドはＳＦＲＰ４であると考えられ、モノクローナル抗体によりＳＦＲＰ４が癌部での亢進が特異的に検出されたことが明らかとなった。さらに、ＳＦＲＰ４を強制発現させたＣＯＳ７細胞の培養上清の解析を試みたところ、シグナル配列を持つＳＦＲＰ４が培養上清に分泌することが明らかとなった（図８８）。
以上の結果により、ＴＥＧ５６：ＳＦＲＰ４分子は癌部特異的にタンパク質レベルにおいても発現が亢進し、かつ、癌細胞において分泌されていることが示唆されたことにより、モノクローナル抗体を用いた癌組織、および血清を用いた診断における有用性が示された。
産業上の利用性
本発明の遺伝子、タンパク質および抗体は、癌の診断および治療、ならびに癌の治療薬の開発において用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【配列表】
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