(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２または４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこれらの断片と反応する抗体を含む、ビタミンＤ抵抗性くる病の診断剤。
【請求項２】
ビタミンＤ抵抗性くる病が伴性染色体性低リン血症（ＸＬＨ）である、請求項１に記載の診断剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、リン酸代謝、カルシウム代謝、石灰化および／またはビタミンＤ代謝を調節するポリペプチド、同ポリペプチドをコードするＤＮＡ、同ポリペプチドを有効成分とする医薬組成物、および同ポリペプチドを認識する抗体と同抗体を有効成分とする医薬組成物、同抗体を用いた診断方法と診断用組成物に関する。
背景技術
無機リン酸（以下、「リン酸」ということがある。）は、生体のエネルギー代謝、細胞の機能維持に必須であるとともに、カルシウムと協同して石灰化組織の形成に重要な役割を持つ。生体へのリン酸の供給は、主に腸管での吸収に依存し、排泄は腎における尿中排泄と腸管における糞中排泄による。リン酸は、生体内では体液、細胞内液、石灰化組織に流動的に分布している。成人における無機リン酸の吸収量と排泄量はほぼ同等に保たれていることから、リン酸代謝の恒常性を保つ制御機構の存在が示唆されている。リン酸と同様の生体内分布を示し、血中濃度の恒常性を有するカルシウムの代謝調節は、哺乳動物において少なくとも副甲状腺ホルモン、カルシトニン、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３などの調節因子により協調的に行われていることが知られている。
リン酸の代謝調節においては、副甲状腺ホルモンがリン酸排泄を促進すること、あるいは１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が腸管におけるリン酸の吸収を促進することが知られており、カルシウム代謝と密接に関連していることが明らかである。しかしながら、リン酸を主体的に調節する物質はいまだ明らかにされていない。
ところで、リン酸代謝の恒常性が失われ、血中の無機リン酸濃度が低下する疾患としては、原発性副甲状腺機能亢進症、遺伝性の低リン酸血症性くる病、腫瘍性骨軟化症などがあげられる。
原発性副甲状腺機能亢進症は、副甲状腺での副甲状腺ホルモンの過剰産生を特徴とする疾患であり、過剰に産生された副甲状腺ホルモンが腎臓での無機リン酸の再吸収を抑制することにより、リン酸過剰排泄型の低リン酸血症を呈することが知られている。
また、遺伝子疾患に起因する低リン酸血症には、Ｉ型ビタミンＤ依存性くる病、ＩＩ型ビタミンＤ依存性くる病、ビタミンＤ抵抗性くる病などが知られている。Ｉ型ビタミンＤ依存性くる病は、活性化ビタミンＤ合成酵素の遺伝的機能不全が原因で生ずる疾患であり、ＩＩ型ビタミンＤ依存性くる病はビタミンＤ受容体の遺伝的機能不全によるものであり、両者ともにビタミンＤ３の作用が減弱することにより低カルシウム血症とともに低リン酸血症を呈するものである。一方、ビタミンＤ抵抗性くる病は、伴性染色体性のものと常染色体性の低リン酸血症性くる病の少なくとも二種の原因の異なる病態が存在することが知られている。
上記ビタミンＤ抵抗性くる病の両病態では、腎臓からの無機リン酸の漏出を特徴とした低リン酸血症を呈する。近年、伴性染色体性の低リン血症（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉａ：以下「ＸＬＨ」と呼ぶことがある。）患者では、Ｘ染色体上のＰＨＥＸと命名されたエンドペプチダーゼ様蛋白質をコードする遺伝子の変異により誘導されることが明らかにされた。しかし、ＰＨＥＸ蛋白質の機能異常が低リン酸血症を誘導する機序については明らかではない。興味深いことに、低リン酸血症を呈する自然変異マウス（Ｈｙｐ）の遺伝子解析から、このマウスではＰＨＥＸをコードする遺伝子が部分欠損していることが明らかとなった。このマウスを用いた実験により、ＰＨＥＸ欠損マウスの腎機能は正常であることやＨｙｐマウスの体液中に低リン酸血症を誘導する副甲状腺ホルモンとは異なる液性因子が存在することが示されている。常染色体性の低リン酸血症（Ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｈｙｐｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｍｉｃ  ｒｉｃｋｅｔｓ／ｏｓｔｅｏｍａｌａｃｉａ：以下ＡＤＨＲということがある。）に関しては、疾患の責任遺伝子の追求がなされており、連鎖解析により１２ｐ１３の領域に存在することが報告されている。しかし、依然として絞り込まれた領域は広く、多くの遺伝子がそこには含まれており候補遺伝子を特定するには至っていない。
腫瘍性骨軟化症は、腫瘍形成に伴って腎臓からの無機リン酸排泄が増加して低リン酸血症を呈し、腫瘍への放射線照射や腫瘍の除去を行うことで低リン酸血症が消失することを特徴とする疾患である。この疾患においても腎臓でのリン酸の再吸収を抑制することによる低リン酸血症を誘導する因子を腫瘍が産生すると考えられている。
ビタミンＤ抵抗性くる病において想定される原因分子と、腫瘍性骨軟化症において想定される原因分子が同一であるかどうかは確定していないが、両者は明らかにリン酸の尿中排泄を促進する未知のリン酸代謝因子であるという点で一致している。この想定されるリン酸代謝調節因子は、しばしばＰｈｏｓｐｈａｔｏｎｉｎという名称で呼ばれることがある。この未知のリン酸代謝調節因子と、ビタミンＤ抵抗性くる病や腫瘍性骨軟化症との関連性については総説としてもまとめられている（Ｎｅｉｓｏｎ，Ａ．Ｅ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，４７：６３５−６４２，１９９７；Ｄｒｅｚｎｅｒ，Ｍ．Ｋ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．，５７：９−１８，２０００）。
ビタミンＤ抵抗性くる病や腫瘍性骨軟化症におけるもう一つの特徴は、骨の石灰化障害である。この骨の石灰化障害は、低リン酸血症により二次的に生じているとも考えられるが、ビタミンＤ抵抗性くる病のモデルマウスであるＨｙｐマウスの実験では、骨石灰化異常がリン酸濃度に依存せずに生じることが示されており（Ｅｃａｒｏｔ，Ｂ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，７：２１５−２２０，１９９２；Ｘｉａｏ，Ｚ．Ｓ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｅ７００−Ｅ７０８，１９９８）、上述の未知のリン酸代謝調節因子が直接的に骨組織の石灰化を調節している可能性も考えられる。
上述のように、リン酸代謝を調節する未知の因子が存在する可能性が強く示唆される研究データが報告されているが、想定される活性を呈示する実体を分子的に明らかにした例はない。ＷＯ９９／６００１７には、新規ポリペプチドホルモンＰｈｏｓｐｈａｔｏｎｉｎとして新規のポリペプチド配列が開示されているが、Ｐｈｏｓｐｈａｔｏｎｉｎの特徴である低リン酸血症誘導活性は示されていない。これまで明らかにされていない生体由来のリン酸代謝調節因子が存在すると考えられた。
食物より摂取されるビタミンＤ２およびビタミンＤ３、あるいは皮膚で合成されたビタミンＤ３は、主として肝臓に存在するビタミンＤ−２５位水酸化酵素により水酸化を受け、２５−ヒドロキシビタミンＤとなる。その後、腎臓の近位尿細管上皮細胞に存在する２５−ヒドロキシビタミンＤ−１α位水酸化酵素により水酸化を受け、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤとなる。この１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、血清カルシウム、リン濃度を上昇させる生理活性を有するミネラル調節ホルモンであり、副甲状腺ホルモンの分泌抑制、骨吸収促進を担うことなども知られている。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、生体内においてさらに、主に腎臓や小腸に存在する２４位水酸化酵素により水酸化を受け、上述の生理活性を有さない代謝物に変換される。この点において、２４位水酸化酵素は１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの不活性化を担う酵素であると考えられている。一方、２４位水酸化酵素は、２５−ヒドロキシビタミンＤに対しても作用し、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤに変換することが知られている。この２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤには、骨量増加、軟骨分化促進などの生理作用が報告されており、生理活性を有するビタミンＤ代謝物の生成酵素としての一面を有することが示唆されている。
ビタミンＤの活性化に重要な役割を有する１α位水酸化酵素の発現レベルを調節する因子としては、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤなどが知られている。血中カルシウム濃度の低下により分泌が促進されるＰＴＨは、腎臓近位尿細管上皮細胞に存在するＰＴＨ受容体に作用し、細胞内ｃＡＭＰの上昇を介して１α位水酸化酵素遺伝子の転写を促進し、血中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度を上昇させる。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤは腸管からのカルシウム吸収と腎臓でのカルシウム再吸収を促進し、結果として血中カルシウム濃度を上昇させる。他方、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）と結合して１α位水酸化酵素遺伝子やＰＴＨ遺伝子のプロモーター領域に作用して、これらの遺伝子の転写抑制をおこなっていることが報告されている。つまり、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、その活性化因子であるＰＴＨおよび１α位水酸化酵素に対してフィードバック制御を有しており、この機構がカルシウム代謝の恒常性維持において重要な役割を担っている。
近年、血清リン酸濃度の低下が１α位水酸化酵素遺伝子の発現を亢進することが報告されている。リン酸代謝においても、血清リン酸濃度の低下に伴う１α位水酸化酵素遺伝子の発現上昇が血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度を上昇させ、結果として小腸からのリン酸吸収を促進することで血清リン酸濃度を是正するという機構の存在が推察されている。
２４位水酸化酵素遺伝子の発現調節を担う因子としては、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、ＰＴＨ等が挙げられる。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）を介して２４位水酸化酵素遺伝子のプロモーター領域に存在するビタミンＤ受容体応答配列に結合することで転写を促進することが判明している。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、２４位水酸化酵素を活性化して、代謝経路の活性化による１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度の低下を誘導すると考えられている。２４位水酸化酵素遺伝子の発現はＰＴＨにより抑制されることが知られているが、詳細な分子メカニズム明らかではない。
発明の開示
本発明は、血中のリン酸濃度低下を誘導することができる腫瘍由来の新規因子を提供することを目的とする。
腫瘍性骨軟化症で同定される腫瘍は、生理活性を有する分泌因子を放出して、その結果として血中のリン酸濃度が低下すると考えられる。この腫瘍由来因子がリン酸代謝の恒常性を破綻させるということは、▲１▼本来生体で産生されないものが腫瘍特異的に産生されるか、▲２▼正常組織においても産生されるが腫瘍に過剰に産生されるか、あるいは、▲３▼生理的な制御を受けずに腫瘍で産生されることのいずれかを特徴とすると考えられる。
本発明者は、前述のごとく腫瘍由来の低リン酸血症誘導因子が腫瘍性骨軟化症由来の腫瘍において特徴的に産生しているとの推察に基づき、腫瘍において低リン酸血症誘導因子をコードする遺伝子の転写が上昇していること、あるいはその因子のｍＲＮＡの安定性が上昇していることを予想した。そこで、腫瘍性骨軟化症腫瘍患者より治療目的で摘出した腫瘍組織の一部よりＲＮＡを抽出したのち、ファージベクターおよびプラスミドベクターを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製して、腫瘍に特徴的に発現している遺伝子断片のスクリーニングを実行した。スクリーニングは腫瘍に特異的に発現していると考えられるｃＤＮＡ断片を選別する方法と腫瘍由来ｃＤＮＡライブラリーより腎臓近位尿細管上皮細胞株由来のｃＤＮＡプローブと交差しないｃＤＮＡ断片を選別する方法を行った。そして、選択されてきたｃＤＮＡ断片の中で配列の新規性と腫瘍での特徴的な発現が確認できたものをさらに絞込み、低リン酸血症誘導因子をコードすることが期待されるｃＤＮＡ断片を複数得た。これらの配列情報から、それぞれの断片が帰属するＯＲＦを含むｃＤＮＡのクローニングを試み、新規ポリペプチドをコードするＤＮＡを取得した。さらにこの新規ポリペプチドの生物活性を見出すべく鋭意研究を進め、この新規ポリペプチドがリン酸輸送を抑制する活性を有すること、そして動物において低リン酸血症を誘導するとともに骨組織の石灰化を抑制することを明らかにし、本願発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（ａ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、低リン酸血症誘導活性、リン酸輸送抑制活性、石灰化抑制活性若しくは生体内ビタミンＤ代謝調節活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドであって、前記部分配列が、前記アミノ酸配列のうち少なくとも第３４番目〜第２０１番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドであって、前記部分配列が、
（ｉ）前記アミノ酸配列のうち少なくとも第３４番目〜第２０１番目のアミノ酸配列を含み、
（ｉｉ）当該部分配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、
（ｉｉｉ）低リン酸血症誘導活性、リン酸輸送抑制活性、石灰化抑制活性若しくは生体内ビタミンＤ代謝調節活性を有する、
前記ポリペプチド
（２）以下の（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡを含むＤＮＡ。
（ｅ）配列番号１に示される塩基配列のうち第１３３番目〜第８８５番目の塩基配列若しくは配列番号３に示される塩基配列のうち第１番目〜第６８１番目の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｆ）配列番号１若しくは３に示される塩基配列の全部若しくは一部の配列からなるＤＮＡから調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、低リン酸血症誘導活性、リン酸輸送抑制活性、石灰化抑制活性若しくは生体内ビタミンＤ代謝調節活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
ここで、ストリンジェントな条件とは、ナトリウム濃度が７５０ｍＭ以上、好ましくは９００ｍＭ以上であり、温度が４０℃以上、好ましくは４２℃の条件を満たすものをいう。具体的には、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、０．５％ＳＤＳ、５０％Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、４２℃の条件をいう。
（３）前記ＤＮＡを含む組換えベクター。
（４）前記組換えベクターを含む形質転換体。
（５）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）のポリペプチド。
（ａ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２若しくは４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、低リン酸血症誘導活性、リン酸輸送抑制活性、石灰化抑制活性若しくは生体内ビタミンＤ代謝調節活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドであって、前記部分配列が、前記アミノ酸配列のうち少なくとも第３４番目〜第２０１番目のアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドであって、前記部分配列が、
（ｉ）前記アミノ酸配列のうち少なくとも第３４番目〜第２０１番目のアミノ酸配列を含み、
（ｉｉ）当該部分配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、
（ｉｉｉ）低リン酸血症誘導活性、リン酸輸送抑制活性、石灰化抑制活性若しくは生体内ビタミンＤ代謝調節活性を有する、
前記ポリペプチド
前記ポリペプチドには、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ（Ｎ−ビニル−ピロリドン）、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシドとポリエチレンオキシドとのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール及びポリビニルアルコールからなる群から選択される少なくとも１つによって修飾されたものも含まれる。
（６）前記ポリペプチドを有効成分として含む医薬組成物。
上記医薬組成物は、生体のカルシウム代謝、リン酸代謝、石灰化又はビタミンＤ代謝を調節し得るために使用することができる。また、上記医薬組成物は、高リン血症、副甲状腺機能亢進症、腎性骨異栄養症、異所性石灰化、骨粗鬆症及び高ビタミンＤ血症からなる群から選ばれる少なくとも一つに有効である。
（７）前記ポリペプチド又はこれらの部分断片と反応する抗体。
上記抗体は、本発明のポリペプチド又はその部分断片を抗原として動物に免疫する工程を含む方法によって得ることができる。
（８）前記抗体を有効成分として含む医薬組成物。
上記医薬組成物は、生体のカルシウム代謝、リン酸代謝、石灰化又はビタミンＤ代謝を調節することができる。また、骨疾患に有効である。ここで、骨疾患としては、骨粗鬆症、ビタミンＤ抵抗性くる病、腎性骨異栄養症、透析骨症、低石灰化骨症、パジェット病及び腫瘍性骨軟化症からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。
（９）前記抗体を含む、カルシウム代謝異常、リン酸代謝異常、石灰化異常及びビタミンＤ代謝異常のうち少なくとも１つの異常を呈する疾患（例えば腎不全、腎性リン酸漏出症、尿細管性アシドーシス及びファンコニ症候群からなる群から選択される少なくとも１つ）の診断剤。
（１０）前記抗体を含む、骨疾患の診断剤。骨疾患としては、骨粗鬆症、ビタミンＤ抵抗性くる病、腎性骨異栄養症、透析骨症、低石灰化骨症、パジェット病及び腫瘍性骨軟化症からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。
（１１）配列番号１１に示す塩基配列を有するＤＮＡ又はその部分断片を含む、カルシウム代謝異常、リン酸代謝異常、石灰化異常及びビタミンＤ代謝異常のうち少なくとも１つの異常を呈する疾患の診断剤。
部分断片としては、配列番号１１に示す塩基配列のうち第４９８番から第１２９６６番までの配列を有するものが挙げられ、疾患としては、常染色体優性低リン酸血症性くる病が挙げられる。
以下、本発明を詳細に説明する。本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０００−２４５１４４号、２０００−２８７６８４号、２０００−３９１０７７号及び２００１−１２１５２７号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
本明細書において用いる用語につき、以下の通り定義する。
血中１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度低下活性とは、血中の活性型１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度を低下させる方向に働く活性を指す。
低リン酸血症誘導活性とは、血中のリン酸濃度を低下させる方向に働く活性を指す。血中のリン酸濃度は、（ｉ）腸管からの吸収と尿および糞への排泄、並びに（ｉｉ）体内における細胞や骨組織に代表される石灰化組織との出納で規定される。したがって、本明細書でいう低リン酸血症誘導活性は、健全な生体に対して作用させた場合において血中リン酸濃度を低下させる活性を意味しており、必ずしも病的な低リン酸血症を引き起こすことを意味するものではない。単位組織では、腸管におけるリン酸吸収抑制活性、腎臓や腸管におけるリン酸排泄促進活性、あるいは細胞内へのリン酸移行促進活性と同等である場合がある。
また、本発明において、リン酸輸送抑制活性とは、対象細胞に作用してその細胞膜に存在するリン酸輸送担体の活性を抑制することを意味する。主たる対象細胞としては、腎臓尿細管上皮細胞、腸管上皮細胞又は骨芽細胞が考えられる。
さらに、本発明において、石灰化抑制活性とは、骨組織及び軟組織においてカルシウムとリン酸を組成物として含む結晶物を生成又は蓄積する過程を抑制する活性を意味する。
さらに、生体内ビタミンＤ代謝調節活性とは、生体内に存在するビタミンＤおよびそれより体内にて合成される代謝物の絶対量の変化、又は存在比率の変化を調節する効力を指す。これらのビタミンＤおよびその代謝物の生体内における調節は、（ｉ）主に腸管における吸収又は排泄と、（ｉｉ）腎臓での再吸収又は排泄と、（ｉｉｉ）生体内におけるビタミンＤの合成と、（ｉｖ）それに続く水酸化反応とを中心とした代謝的変換により規定される。（ｉｖ）の代謝的変換により生じる主たる代謝物としては、ビタミンＤ−２５−水酸化酵素によりビタミンＤの２５位が水酸化されることにより生じる２５−ヒドロキシビタミンＤ、２５−水酸化ビタミンＤ−２５−１α−水酸化酵素によりヒドロキシビタミンＤの１α位が水酸化されて生じる１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、あるいは、これらの代謝物がさらに２４−水酸化酵素により２４位に水酸基が導入されて生じる２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ又は１α，２４，２５−トリヒドロキシビタミンＤが知られている。ビタミンＤ代謝調節活性は、このようなビタミンＤ代謝物生成に関わる酵素の活性調節、遺伝子発現、又は発現蛋白量の変化を調節する活性として表されることもある。
１．リン酸代謝、カルシウム代謝、石灰化及びビタミンＤ代謝を調節するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（１）ＤＮＡのクローニング
本発明のＤＮＡの一つである配列番号１に示すＤＮＡは、腫瘍性骨軟化症が疑われる患者から摘出した腫瘍の一部より作製したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって得られたものである。
ところで、腫瘍性骨軟化症は、腫瘍の存在に伴い低リン酸血症と骨組織の石灰化不全による骨軟化症を呈する疾患であり、腫瘍を除去するとこれらの症状が消失することを特徴とする。腫瘍抽出物がラットにおいて尿中リン酸排泄を促進すること（Ｐｏｐｖｔｚｅｒ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２９：４１８Ａ，１９８１）や、摘出腫瘍のマウスへの移植実験により低リン酸血症が誘導されること（Ｍｉｙａｕｃｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．６７：４６−５３，１９８８）が報告されているため、腫瘍が全身性の未知の因子を産生し分泌するものと考えられている。
本発明者が使用した腫瘍に関係する症例については、Ｆｕｋｕｍｏｔｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  ２５：３７５−３７７，１９９９に記載されている。この症例は、腫瘍を手術的に摘出したことで、低リン酸血症が顕著に回復した。また、この症例における腫瘍のサイズは径が約１ｃｍ程度と小さいものであった。このような小さな組織より低リン酸血症と全身性の骨軟化症を惹起する活性物質が産生、分泌されていたことが推察されることを考えると、本発明者が調製した腫瘍由来のｃＤＮＡライブラリー中に、このような病態の惹起にかかわる活性物質をコードする遺伝子の少なくとも部分的な断片が他の組織に由来するｃＤＮＡライブラリーと比較して高頻度に含まれていることを予想した。そこで、この腫瘍由来の活性物質をコードする遺伝子の断片配列を同定することを目標として、本腫瘍ｃＤＮＡライブラリーに特異的に多く含まれているｃＤＮＡ断片をディファレンシャルスクリーニング法にて抽出した。
次に、得られたｃＤＮＡ断片の塩基配列を同定し、相互比較を行い、塩基配列の重複をもとに同一遺伝子に由来すると考えられる配列はコンティグを作製して分類した。このようにして得られた塩基配列について、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以下、「ＮＣＢＩ」ということがある。）が提供するデータベースであるＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列と相同性の検索を実施した。このような方法で本腫瘍ｃＤＮＡライブラリーに特異的に多く含まれる塩基配列として、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１５２２番から２７７０番までの配列を得た。この配列はＧｅｎｂａｎｋにアクセッション番号ＡＣ００８０１２で登録されているヒト１２ｐ１３  ＢＡＣ  ＲＰＣＩ１１−３８８Ｆ６の配列の一部と一致した。この登録配列はヒト染色体配列の１２ｐ１３領域の部分配列を示していると考えられるものであった。この登録配列内の推定される遺伝子の位置は塩基配列情報とともに明記されているが、配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１５２２番から２７７０番までの配列、および本発明の配列番号１に示す塩基配列は、推定遺伝子部位として明記されていない。
次に、この配列番号１で示される塩基配列の塩基番号１５２２番から２７７０番までの塩基配列をもとにプローブおよびＰＣＲ用のプライマーを設計して、本腫瘍ｃＤＮＡライブラリーに含まれる連続した塩基配列を単離同定して本発明の配列番号１に示す塩基配列を得た。配列番号１の塩基配列は、本発明の配列番号２に示すアミノ酸配列からなる分泌シグナルを有すると推定されるポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム（以下「ＯＲＦ」ということがある。）を有していた。このポリペプチドのアミノ酸配列はＧｅｎｂａｎｋのアミノ酸配列データベースに登録されていないことから、新規の配列を有するポリペプチドであると考えた。さらに本発明者は、配列番号１に示す塩基配列と配列番号２に示すアミノ酸配列を用いて検索を行い、この分子のマウスオーソログと考えられる配列番号９に示す塩基配列と配列番号１０に示すアミノ酸配列を同定した。後述するように、ヒトのアミノ酸配列に従い作製した組み換え体蛋白質がマウスにおいて活性を示すことから、配列番号２に示すアミノ酸配列と、配列番号１０に示すアミノ酸配列又はマウス全長配列（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０００，２７７（２），４９４−４９８）との比較により、両者で保存されているアミノ酸以外のアミノ酸を置換した蛋白質が本発明のポリペプチドと同等あるいは同種の生物活性を有することが、本発明により容易に推察できるようになった。
（２）塩基配列の決定
上記（１）の通り得られたＤＮＡについて塩基配列の決定を行う。塩基配列の決定はマキサム−ギルバートの化学修飾法、又はＭ１３ファージを用いるジデオキシヌクレオチド鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定機（例えばＰＥＲＫＩＮ−ＥＬＭＥＲ社製３７３Ａ  ＤＮＡシークエンサー等）を用いて配列決定が行われる。
配列番号１に本発明のＤＮＡの塩基配列を、配列番号２に本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を例示するが、このアミノ酸配列からなるポリペプチドが低リン酸血症誘導活性、リン酸輸送抑制活性、石灰化抑制活性又はビタミンＤ代謝調節活性を有する限り、当該アミノ酸配列において１個若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列から１又は数個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２に示されるアミノ酸配列に１又は数個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２で表わされるアミノ酸配列の１又は数個、好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
また、置換の方法としては、アミノ酸の特性をある程度保持したファミリー内での保存的置換を行っても良い。アミノ酸側鎖の特性から一般的に分類されるファミリーは以下のものが挙げられる。
（ｉ）酸性アミノ酸ファミリー：アスパラギン酸、グルタミン酸
（ｉｉ）塩基性アミノ酸ファミリー：リジン、アルギニン、ヒスチジン
（ｉｉｉ）非極性アミノ酸ファミリー：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン
（ｉｖ）非帯電極性アミノ酸ファミリー：グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン
（ｖ）脂肪族ヒドロキシアミノ酸ファミリー：セリン、スレオニン
（ｖｉ）アミド含有アミノ酸ファミリー：アスパラギン、グルタミン
（ｖｉｉ）脂肪族アミノ酸：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン
（Ｖｉｉｉ）芳香族アミノ酸ファミリー：フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
（ｉｘ）疎水性アミノ酸ファミリー：ロイシン、イソロイシン、バリン
（ｘ）小型アミノ酸ファミリー：アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン、グリシン
置換の例として、配列番号２において１７６番目のＡｒｇ及び／又は１７９番目のＡｒｇを、他のアミノ酸、好ましくはＡｌａ、Ｇｌｎ又はＴｒｐに置換して切断が阻害又は抑制されたものが挙げられる。さらに、配列番号２に示すアミノ酸配列において、Ｎ末側、Ｃ末側又は両側のアミノ酸が１０個以上欠失したもの（末端欠失型）も、本発明のポリペプチドに含まれる。末端欠失型の例として、配列番号２においてＣ末側の２０、４０、４５又は５０個のアミノ酸が欠失したもの、及び／又はＮ末側２４又は３３個のアミノ酸が欠失したものが挙げられる。末端欠失型の態様を以下に示す。
0004799801.tif 000002
本発明においては、上記配列番号２に示すアミノ酸配列の部分断片（末端欠失型部分断片）のほか、これらの末端欠失型ポリペプチドにおいて１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加した変異断片も本発明のポリペプチドに含まれる。ここで、上記一覧表において配列番号２に示すアミノ酸の位置番号の後に付した括弧内の数字は、配列番号１に示す塩基配列の塩基の位置番号であり、これらの位置に示す塩基配列からなるＤＮＡ、又はこれらのＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。
本発明において、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも一部に変異を導入するには、該アミノ酸をコードするＤＮＡの塩基配列に変異を導入する手法が採用される。
ＤＮＡに変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法若しくはＧａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知手法又はこれに準ずる方法により行うことができる。例えば、変異オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いた部位特異的突然変異誘発法に基づいて変異を導入するが、変異導入用キット（例えばＭｕｔａｎ−Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、Ｍｕｔａｎ−Ｇ（ＴＡＫＡＲＡ社製）、ＴＡＫＡＲＡ社のＬＡ  ＰＣＲ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓシリーズキットなど）を用いて変異を導入することもできる。
さらに、上記本発明のＤＮＡ（配列番号１、３、５、７、９）から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、低リン血症誘導活性、リン輸送抑制活性、石灰化抑制活性又はビタミンＤ代謝調節活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも、本発明のＤＮＡに含まれる。プローブとは、配列番号１、３、５、７又は９に示す配列の全長又は長さが１７塩基以上の連続する配列（部分配列）に対し相補配列を有するものをいう。
ここで、ストリンジェントな条件とは、ナトリウム濃度が７５０ｍＭ以上、好ましくは９００ｍＭ以上であり、温度が４０℃以上、好ましくは４２℃の条件を満たすものをいう。具体的には、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ、０．５％ＳＤＳ、５０％Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、４２℃の条件をいう。なお、６×ＳＳＣとは、９００ｍＭ  ＮａＣｌ、９０ｍＭクエン酸ナトリウムを意味する。デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）とは、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ポリビニルピロリドン及びＦｉｃｏｌｌ４００を含む溶液であり、５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔは１％ＢＳＡ、１％ポリビニルピロリドン、１％Ｆｉｃｏｌｌ４００の組成からなる（５×Ｄｅｎｈａｒｄｔは５０×Ｄｅｎｈａｒｄｔの１０分の１の濃度を意味する）。
一旦本発明のＤＮＡの塩基配列が決定されると、その後は、化学合成によって、又は決定された当該塩基配列から合成したプライマーを用いたＰＣＲによって、本発明のＤＮＡを得ることができる。
２．本発明のＤＮＡを含む組換えベクター及び形質転換体の作製
（１）組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のＤＮＡを連結（挿入）することにより得ることができる。本発明のＤＮＡを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，ＹＥｐ２４，ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。また、レトロウイルス、アデノウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、あるいはバキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。さらに、ＧＳＴ、Ｈｉｓ−ｔａｇなどが連結された融合プラスミドを用いることもできる。
ベクターに本発明のＤＮＡを挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
本発明のＤＮＡは、そのＤＮＡの機能が発揮されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本発明のＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
（２）形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、エッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属に属する細菌、あるいはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）等の酵母が挙げられる、また、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞等の動物細胞や、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることもできる。
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９、ＨＢ１０１などが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するＴ７プロモーターなどが用いられる。ｔａｃプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピヒア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、又はヒトＦＬ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ若しくはＪｕｒｋａｔ細胞などが用いられる。プロモーターとしてＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、β−アクチンプロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウイルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
３．低リン酸血症誘導活性を有するポリペプチド
これまで腫瘍性骨軟化症における低リン酸血症誘導活性を有する腫瘍産生因子を単離同定する試みがいくつかなされてきた。そして、本発明のポリペプチドは、腫瘍性骨軟化症の腫瘍が産生する新規な分泌因子という特徴を有することが明らかにされた。この低リン酸血症を誘導する因子の推定される生物活性としては、以下の報告がされている。
リン酸の尿中への排泄促進作用：
Ａｓｃｈｉｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  ９１：５６−６０，１９７７、Ｌａｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７：４２１Ａ，１９７９、Ｍｉｙａｕｃｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．６７：４６−５３，１９８８）
腎尿細管上皮細胞のリン酸輸送活性の抑制：
Ｃａｉ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３０：１６４５−１６４９，１９９４、Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｇ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８０：１６２８−１６３４，１９９５、Ｒｏｗｅ，Ｐ．Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  １８：１５９−１６９，１９９６  ２５−ヒドロキシビタミンＤ−１α−ヒドロキシラーゼ活性の抑制：Ｍｉｙａｕｃｈｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．６７：４６−５３，１９８８
特に、腎でのリン酸再吸収を抑制する活性を直接有する未知の分子を「Ｐｈｏｓｐｈａｔｏｎｉｎ」と呼ぶことが提唱されている（Ｅｃｏｎｓ，Ｍ．Ｊ．＆  Ｄｒｅｚｎｅｒ，Ｍ，Ｋ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  ３３０：１６７９−１６８１，１９９４）。このような生物活性を有する未知の因子の存在がＸＬＨにおいても示唆されている。ＸＬＨ患者の臨床所見は、腫瘍性骨軟化症患者と共通して尿中リン酸排泄が亢進した低リン酸血症を特徴とし、骨組織の石灰化不全による骨軟化症やくる病を呈する。ＸＬＨの責任遺伝子はＰＨＥＸというエンドペプチダーゼ様蛋白質をコードしている遺伝子であることが明らかにされている。自然変異マウスであるＨｙｐマウスはＸＬＨと同様の表現形質を呈することが知られていたが、近年このマウスでＰＨＥＸをコードする遺伝子が部分欠失していることが明らかにされ、ＨｙｐマウスはＸＬＨのモデルとして位置付ける妥当性が示された（Ｓｔｒｏｍ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：１６５−１７１，１９９７）。Ｈｙｐマウスにおける低リン酸血症誘導因子が液性因子であることは、Ｈｙｐマウスと正常マウスとの並体癒合実験により明らかにされている（Ｍｅｙｅｒ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．４：４９３−５００，１９８９）。この実験において正常マウスの血中リン酸濃度が低下して、尿中リン酸排泄が増加したことから、Ｈｙｐマウスに存在する体液性の低リン酸血症誘導因子が正常マウスに作用したものと考えられている。これまでのところ、ペプチドの切断活性が推定されるＰＨＥＸとこの未知の低リン酸血症誘導因子との関連性は明らかではないが、ＰＨＥＸが未知の低リン酸血症誘導因子の活性制御の関係や、腫瘍性骨軟化症における低リン酸血症誘導因子とＸＬＨで認められる低リン酸血症誘導因子が同一である可能性についての仮説が提唱されている（Ｄｒｅｚｎｅｒ，Ｍ．Ｋ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  ５７：９−１８，２０００）。この仮説によると、ＰＨＥＸ及び低リン酸血症誘導因子が、正常では同じ細胞で発現しており、ＰＨＥＸが低リン酸血症誘導因子に対して抑制的に働く。ＸＬＨ患者においては、ＰＨＥＸの機能が低下又は消失しているので、低リン酸血症誘導因子の活性が強く現れる。腫瘍性骨軟化症においては、ＰＨＥＸ及び低リン酸血症誘導因子の両方が上昇しているが、結果的に活性型の低リン酸血症誘導因子が量的に正常値より増加すると仮定している。また、この低リン酸血症誘導因子は、腎臓におけるリン酸輸送担体の一つであるＮＰＴ２のリン酸輸送活性に対して抑制的に作用すると仮定している。このような未知の低リン酸血症誘導因子を探索する試みも多くなされているが、これまで分子の同定には至っていない。Ｃａｉらの研究によると、低リン酸血症誘導因子は、分子量が８ｋＤａから２５ｋＤａの間にあると推察されているが（Ｃａｉ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３０：１６４５−１６４９，１９９４）、Ｒｏｗｅらは候補分子として５６ｋＤａと５８ｋＤａの蛋白質を上げている。最近、ＲｏｗｅらはＷＯ９９／６００１７に４３０残基のアミノ酸からなるポリペプチドを腫瘍性骨軟化症の腫瘍由来のリン��代謝調節因子として出願しているが、ここで開示されているポリペプチドは本来存在する蛋白質の部分配列であり、低リン酸血症誘導活性に関連する生物学的活性は開示されていない。最近、ＭＥＰＥという名称でこの特許に開示されていた分子の全長に相当するポリペプチドが報告されたが、やはり低リン酸血症を誘導するような活性については開示されていない（Ｒｏｗｅ，Ｐ．Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６７：５４−６８，２０００）。また、この分子と本発明のポリペプチドの間に配列上、構造上の類似性は認められない。
上述のとおり、低リン酸血症を誘導する活性をもつ生理活性因子の存在が推定されるものの、これまでその実体は明らかにされていなかった。本発明は、そのポリペプチドとしての実体を明らかにし、それをコードする遺伝子配列を明らかにした。そして、以下に記載するように、発明のポリペプチドを生産し、その生産物がリン酸代謝、カルシウム代謝、ビタミンＤ代謝又は石灰化と骨格形成に調節因子として作用し、医薬組成物として有用であることを明らかにした。また、本発明の抗体が治療のみならず臨床検査、診断に有用であることを明らかにした。また、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡが遺伝病の診断やリン酸代謝、カルシウム代謝、骨代謝の多型診断に有用であることを明らかにした。
本発明の低リン酸血症誘導活性を有するポリペプチドは、例えば配列番号１に示す塩基配列の塩基番号１３３番〜８８５番を含む配列を、発現できる形態で適当な宿主細胞に導入して形質転換細胞を調製し、該形質転換細胞に導入したＤＮＡを発現させることによって製造することができる。また、このように産生されたポリペプチドは、宿主が持つ蛋白質修飾機構により切断や糖鎖付加などのポリペプチド鎖の改変を受けることがある。
本発明のポリペプチドは、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、３７℃で４〜４８時間行う。培養期間中、ｐＨは６．０〜８．０に保持する。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なＴ７プロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、ＩＰＴＧ等を培地に添加することができる。また、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、ＩＡＡ等を培地に添加することができる。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜１０日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。培養後、本発明のポリペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより目的のポリペプチドを採取する。また、本発明のポリペプチドが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のポリペプチドを単離精製することができる。
上述のようにＸＬＨにおいてエンドペプチダーゼと考えられるＰＨＥＸが低リン酸血症誘導因子の調節に重要な意義を持つ事を考えると、本発明の配列番号２のアミノ酸配列を持つポリペプチドがさらに修飾、切断されて活性を変化させることも考えられる。本発明において、ＣＨＯ  ｒａｓ−ｃｌｏｎｅ１細胞を宿主として用いて、発明のポリペプチド鎖のＣ末端にＨｉｓを６連続して付与した組み換え体を産生するクローン化した細胞株を作製した。この細胞株は独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２７３、原寄託日  平成１２年８月１１日）。
この細胞株に発明のポリペプチドを生産させ、培養液に分泌されたポリペプチドを調べたところ、図２に示すようにサイズの異なる遺伝子産物がＨｉｓ−ｔａｇを認識する抗体を用いたウエスタンブロッティングで検出された。それぞれのバンドに相当する蛋白質を単離してＮ末端アミノ酸配列を実施したところ、それぞれ配列番号４と配列番号８に示すアミノ酸配列のＮ末側の配列に一致した。前者はシグナル配列が除かれたあとの蛋白質と考えられ、後者は、エンドペプチダーゼ等の酵素により切断されたものと考えられる。
ところで、ＲＸＸＲを認識する蛋白分解酵素の一つとしてｆｕｒｉｎが知られており、実際ｆｕｒｉｎ欠損細胞株で本発明のポリペプチドを発現させたところ断片は検出されなかった。さらに、ｆｕｒｉｎ阻害活性を有する組換え体蛋白α１−ＰＤＸを本発明のポリペプチドと共発現させたところ上清中の切断断片が著しく減少した。
従って、培養の際に、ｆｕｒｉｎ欠損細胞を用いることを含む、またはｆｕｒｉｎ活性を抑制する物質を共存させることを含む、本願ポリペプチドの生産方法も本発明に含まれる。
Ｃａｉらは、腫瘍性骨軟化症の腫瘍由来細胞を培養した培養上清中のリン輸送抑制活性が、透析膜による分画方法で８ｋＤａから２５ｋＤａの分子量範囲にあることを示唆している。本発明の配列番号４のアミノ酸配列を持つポリペプチドが配列番号２の残基番号１７９番のＡｒｇと１８０番のＳｅｒとの間で切断されたポリペプチドに変換されることで、その活性を変化させていることも考えられる。
本発明のポリペプチドは、表２（実施例７）に示すように、低リン酸血症誘導活性の一つの作用様態である腎臓近位尿細管上皮細胞のリン酸輸送活性を抑制する活性を有している。血中に存在する遊離型の無機リン酸の大部分は、腎臓の糸球体で濾過されるが、そのうちの８０〜９０％程度が腎臓の近位尿細管で再吸収される。
この再吸収は、近位尿細管の管腔側に存在するＩＩ型Ｎａ依存性リン酸トランスポーターによるリン酸輸送により行われる。本発明のポリペプチドがリン酸輸送活性を抑制する活性を有するということは、生体においてリン酸の尿中排泄を促進することを意味する。従って、本発明のポリペプチドは、腎臓でのリン酸再吸収の抑制、特に腎臓近位尿細管細胞のリン酸輸送を抑制する活性により低リン酸血症を誘導していると考えられることから、上述のＰｈｏｓｐｈａｔｏｎｉｎと同一物質であることが想定される。
近年、腸管におけるＮａ依存性リン酸トランスポーターが同定され、このトランスポーターは、腎臓に存在するＩＩ型のＮａ依存性リン酸トランスポーターと相同性が高いことから、ＩＩｂ型と命名された。腸管の管腔側にあるこのＩＩｂ型Ｎａ依存性リン酸トランスポーターの抑制も、腎臓のＩＩ型Ｎａ依存性リン酸トランスポーターと同様に本発明のポリペプチドが担当することが考えられる。これも低リン酸血症誘導活性の一つの作用様態と考えられる。
本発明のポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏでの活性は、本発明のポリペプチドを発現する上述の組み換え体細胞をヌードマウスの皮下に移植する実験により評価した。
本試験において移植した細胞は、ヌードマウスの皮下において増殖して腫瘍を形成する。これに伴い細胞が生産し、分泌する本発明のポリペプチドはマウスの体液中に放出されることを特徴としており、当該放出により腫瘍性骨軟化症をモデル化することができる。このモデル実験において、表４（実施例１１）に示すように、本発明のポリペプチドを発現する細胞を移植したマウスは、本発明のＤＮＡを導入していない対照のＣＨＯ細胞を移植して腫瘍を形成させた個体、又は腫瘍を形成していない個体と比較して、明らかな低リン酸血症を呈した。このことから、本発明のポリペプチドは低リン酸血症誘導活性を有していることが明らかとなった。また、リン酸の再吸収率も低下しており、腎臓でのリン酸の再吸収が抑制されていることも明らかとなった。これらのことから、本発明のポリペプチドは、腫瘍性骨軟化症における低リン酸血症誘導因子であると考えられた。
一方、上記モデル実験において、本発明のポリペプチドを産生する組み換え体細胞を移植したマウスでは低カルシウム血症が認められた。従って、本発明のポリペプチドは、低カルシウム血症誘導因子であることも明らかとなった。実施例１６に記載した本発明のポリペプチドを発現するＣＨＯ細胞のヌードマウスへの移植試験において、持続的な血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度の減少が明らかとなった。また、実施例１９、２０に記載したとおり、変異導入ポリペプチドあるいは野生型全長ポリペプチドを正常マウスへ三回投与することで、いずれも血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度を減少させることが明らかとなった。さらに、実施例２４に記載したとおり、本発明のポリペプチドを単回投与後、数時間以内に血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度の減少を認めたことから、この低下活性は本発明のポリペプチドの主な生理作用の一つであると考えられる。
上述のごとく、血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度は、１α位水酸化酵素および２４位水酸化酵素により規定されている。実施例１６に記載したとおり、本発明のポリペプチドの血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度低下作用には、これら代謝酵素の発現変動を伴うことが明らかとなった。さらに、実施例２４に記載したとおり、本発明のポリペプチドを投与後１時間目において、活性型ビタミンＤ合成酵素である１α位水酸化酵素遺伝子転写産物の減少、ならびに代謝酵素である２４位水酸化酵素遺伝子転写産物の亢進を認めた。この発現変動の後に、血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度が低下していくことから、本発明のポリペプチドによる血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度低下作用は、少なくとも１α位水酸化酵素遺伝子の発現抑制および２４位水酸化酵素遺伝子の発現亢進が原因となっていることが示唆された。
一方、実施例１１に記載した本発明のポリペプチドを発現するＣＨＯ細胞のヌードマウスへの長期間移植試験（移植後４４から４６日目）において、１α位水酸化酵素遺伝子の発現は上昇していた。この時点でのマウス血清中ＰＴＨ濃度は、対照群に比し有意に上昇していたことが判明しており、高レベルのＰＴＨ作用による１α位水酸化酵素遺伝子の発現亢進が起こっていたことが推測される。しかし興味深いことに、ＰＴＨ存在下においても、２４位水酸化酵素遺伝子の発現は依然亢進されたままであることから、本発明のポリペプチドによる２４位水酸化酵素遺伝子の発現制御にはＰＴＨの干渉が及んでいないことがわかる。実施例１１に記載したとおり、本マウスは重度の低リン血症およびくる病様所見を示していたにも拘わらず、血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度が上昇しない原因として、本発明のポリペプチドによる持続的な２４位水酸化酵素遺伝子の発現亢進が影響していることが示唆された。
２５−ヒドロキシビタミンＤは、腎臓近位尿細管において再吸収を受けることがＡ．Ｎｙｋｊａｅｒらによって明らかにされている（Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．９６，ｐ５０７−５１５，１９９９）。本明細書に記載はないが、本発明のポリペプチドを発現するＣＨＯ細胞のヌードマウスへの移植試験において、２５−ヒドロキシビタミンＤの血清濃度に著明な変化を認めていない。また、本発明のポリペプチドの作用により、ナトリウム、カリウム、クロライドなどの主要電解質、主要アミノ酸、あるいはグルコースの分画排泄（尿中濃度／血清濃度／ＧＦＲで算出される）に影響を認めなかったことからも、尿細管再吸収機能が障害されていないことを支持する（Ｔ．Ｓｈｉｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ）。従って、本発明のポリペプチドは、２５−ヒドロキシビタミンＤの尿細管における再吸収阻害の結果、血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度低下を引き起こしているのではなく、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの合成経路に特異的に作用していることが示唆された。
腫瘍性骨軟化症において、血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度は著明に低下していることが知られている。また、低リン血症性ビタミンＤ抵抗性くる病（ＸＬＨ）あるいはその病態モデルマウスであるＨｙｐでは、重度の血清リン酸濃度低下にも拘わらず血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度は正常範囲あるいはそのやや下限域である。また、Ｈｙｐマウスの２４位水酸化酵素遺伝子の発現は亢進していることも知られている。これらの低リン血症を呈する病態では、本来、血清リン酸濃度の低下に伴い血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度を上昇させるべく上述の１α位水酸化酵素遺伝子の上昇が引き起こされるはずであるが、その制御システムのいずれかが破綻しており、正常な生理応答ができていないことが病態の原因の少なくとも一つであると考えられている。これらの現象は、実施例１１、１９あるいは２０に記載したマウスでの生理応答と類似しており、本発明のポリペプチドが、上述の病態において、血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度を低下させるべく機能していることが強く示唆される。
本発明のポリペプチドを発現する組み換え体細胞を移植したマウスの骨組織における石灰化の程度は、対照群に比べて著しく低下していることが図５に示すＸ線像より明らかである。胸郭の変形など、骨格形成に対する作用も認められた。  すなわち、本発明のポリペプチドは、骨組織の石灰化の抑制作用、又は骨組織からのカルシウムおよびリン酸の動員を促進する作用を有していると考えられる。この石灰化の低下は、血中のリン酸とカルシウムの両者が著しく減少したため二次的に骨組織の石灰化が抑制されたと考えることもできる。
Ｈｙｐマウスにおいては、腎臓の近位尿細管でのリン酸輸送活性を抑制する因子を骨由来細胞が産生していると考えられている（Ｌａｊｅｕｎｅｓｓｅ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５０：１５３１−１５３８，１９９６）。また、Ｈｙｐマウスの骨芽細胞が石灰化抑制因子を放出していることが報告されている（Ｘｉａｏ，Ｚ．Ｓ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｅ７００−Ｅ７０８，１９９８）。上述のとおり、ＸＬＨと腫瘍性骨軟化症では、低リン酸血症と骨組織の石灰化不全という臨床所見が酷似することと、これらが単一の液性因子により誘導される可能性が高いことを考え合わせると、このＨｙｐマウスの研究で報告されている腎臓のリン酸輸送抑制活性と骨石灰化抑制活性は、同一の因子により引き起こされている可能性がある。また、Ｈｙｐマウスの骨芽細胞は、カルシウムとリン酸が正常域にある状況でも骨形成の異常を呈することが報告されている（Ｅｃａｒｏｔ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．７：２１５−２２０，１９９２）。本発明のポリペプチドは、上記のＨｙｐマウスで想定されている因子と同様の活性を有しており、低リン酸血症誘導活性以外にカルシウムやリン酸代謝を介さずに直接骨組織の石灰化を調節する作用を有していることが考えられる。
本発明を完成させる過程において、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子とともに、実施例３の表１に示すようにデンチンマトリックス蛋白質−１（ＤＭＰ−１）が取得された。この遺伝子は、歯の象牙質にて多く発現し、コードされている蛋白質は象牙質の細胞外基質蛋白質として象牙質の石灰化基質の形成に重要な役割を有していると考えられる。同様にマトリックス細胞外リン酸化蛋白質（ＭＥＰＥ）をコードする遺伝子をＯＳＴ１９０として取得した。この分子の機能の詳細については知られていない。また、同様にオステオポンチンをコードする遺伝子も得られている。ＭＥＰＥ、ＤＭＰ−１、オステオポンチンはＲＧＤモチーフ配列を有するリン酸化蛋白質である点で共通しており、リン酸化されうるセリン、スレオニンに富み、また、酸性アミノ酸であるグルタミン酸やアスパラギン酸の含有率も高く、強度の酸性蛋白質の性質を示すという特微を有する。ＭＥＰＥとＤＭＰ−１の間では、ＡＳＡＲＭ配列と命名された特徴的な酸性領域が保存されており（Ｒｏｗｅ，Ｐ．Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６７：５４−６８，２０００）、両者の生理的あるいは機能的意義の類似性が示唆されている。このような、特徴的な蛋白質の機能の一つとして、石灰化の開始における無機カルシウム塩やリン酸塩との相互作用が考えられている。オステオポンチンの遺伝子発現は骨芽細胞、破骨細胞に加えマクロファージなど幅広く報告されている。一方、ＤＭＰ−１に関しては近年、骨組織での発現、とくに骨細胞での発現が報告されている。ＭＥＰＥの遺伝子発現は骨髄組織での発現やＳａＯＳ−２といった骨肉腫細胞での発現が知られている。このような石灰化組織で認められる酸性マトリックス蛋白質が本発明の過程において本発明のポリペプチドとともに見出されたことは、本発明のポリペプチドが有する作用様式の一面を示していると考えられる。すなわち、本発明のポリペプチドが上記分子に代表される石灰化組織に特徴的な分子の発現を誘導し、協調的に石灰化やカルシウム代謝やリン代謝を調節する可能性や誘導された分子が２次的に、石灰化やカルシウム代謝やリン代謝を調節する可能性が考えられる。また、本発明のポリペプチドが、骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞に直接作用して骨代謝を制御しうることが考えられ、骨粗鬆症に代表される代謝性骨疾患の治療に有効性を示すことが考えられる。
近年、異所性石灰化部位で骨芽細胞様の表現形質をもつ細胞が出現し、骨組織での石灰化過程と同様の機序により石灰化がおこることが示唆されている。従って、本発明のポリペプチドが、このような石灰化細胞の出現や機能を抑制することで、異所性石灰化の治療に有効であることも考えられる。
本発明においては、上記ポリペプチドを修飾することもできる。例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ（Ｎ−ビニル−ピロリドン）、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドのコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコールなどを適宜選択して使用する。修飾方法は、公知の任意の手法を採用することができ、例えば特表平１０−５１０９８０号公報に詳細に開示されている。
４．本発明のポリペプチドに対する抗体
本発明の抗体は、上記本発明のポリペプチドと特異的に反応する。本発明において「抗体」とは、抗原であるポリペプチド又はその断片に結合し得る抗体分子全体またはその断片（例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片）を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明の抗体は、常法に従って調製することができ、例えば、アジュバントとともに抗原で動物を一回あるいは数週間間隔で複数回追加免疫する生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の方法、免疫細胞を分離して適当な培養系で感作させる生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の方法のいずれかの方法によって調製し得る。本発明の抗体を産生し得る免疫細胞としては、例えば脾細胞、扁桃腺細胞、リンパ節細胞などがあげられる。
抗原として使用するポリペプチドは、必ずしも上記の本発明のポリペプチド全体を使用する必要はなく、該ポリペプチドの一部分を抗原として使用してもよい。抗原が短いペプチド、特にアミノ酸２０残基前後の場合は、キーホールリンペットヘモシアニンや牛血清アルブミンのような抗原性の高いキャリアタンパク質と化学修飾などによって結合させて用いるか、あるいは、キャリアタンパク質のかわりに分枝骨格を持つペプチド、例えばリジンコアＭＡＰペプチド（Ｐｏｓｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，１７１９−１７２５，１９８８；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８，６２３−６３０，１９９１；Ｂｒｉａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５６，２５５−２６５，１９９２）と共有結合させて用いる。
アジュバントは、例えば、フロイントの完全、または不完全アジュバントや水酸化アルミニウムゲルなどが用いられる。抗原を投与する動物としては例えばマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウシ、ウマ、モルモット、ハムスターなどが用いられる。
ポリクローナル抗体は、これらの免疫された動物から血液を採取して血清を分離し、硫安沈澱、陰イオン交換クロマトグラフィーまたはプロテインＡ若しくはＧクロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて免疫グロブリンを精製して得られる。上記動物がニワトリの場合は、卵から抗体を精製することもできる。
モノクローナル抗体は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで感作した、あるいは上記動物の免疫細胞を培養可能な親細胞と融合させて作製したハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）細胞の培養上清から、又は同ハイブリドーマ細胞を動物腹腔内接種して得られる腹水から精製して調製することができる。親細胞としては、マウスなどの動物の一般に入手可能な株化細胞を使用することができる。使用する細胞株としては、薬剤選択性を有し、未融合の状態ではＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。例えばＸ６３、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、Ｘ６３．６５３、ＳＰ２／０、Ｙ３、ＳＫＯ−００７、ＧＭ１５００、ＵＣ７２９−６、ＨＭ２．０、ＮＰ４−１細胞などがあげられる。
モノクローナル抗体を作製するための具体的手法は以下の通りである。
前記のようにして作製したポリペプチド又はその断片を抗原として、前記動物に投与する。抗原の動物１匹当たりの投与量は、アジュバントを用いて１〜１００μｇである。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは１〜３週間間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回免疫を行う。そして、最終の免疫日から１〜１０日後、好ましくは１〜４日後に抗体産生細胞を採集する。
ハイブリドーマを得るため、抗体産生細胞と親細胞（ミエローマ細胞）との細胞融合を行う。細胞融合は、血清を含まないＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、５×１０６〜１×１０８個／ｍｌの抗体産生細胞と１×１０６〜２×１０７個／ｍｌのミエローマ細胞とを混合し（抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞比５：１が好ましい）、細胞融合促進剤存在のもとで融合反応を行う。細胞融合促進剤として、平均分子量１０００〜６０００ダルトンのポリエチレングリコール等を使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
次に、細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。細胞懸濁液を例えばウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで適当に希釈後、マイクロタイタープレート上に５×１０５個／ｗｅｌｌ程度まき、各ウエルに選択培地を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、選択培地で培養開始後、１４日前後から生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。増殖してきたハイブリドーマの培養上清中に、本発明のポリペプチドに反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、特に限定されるものではない。例えば、ハイブリドーマとして生育したウエルに含まれる培養上清の一部を採集し、酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等によってスクリーニングすることができる。
また、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで感作した、あるいは上記動物の免疫細胞にＥＢウイルスなどの適当なウイルスを感染させ、得られる不死化抗体産生細胞を培養することにより調製することもできる。
これら細胞工学的手法とは別に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで感作した、あるいは上記動物の免疫細胞から抗体遺伝子をＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）反応によって増幅して取り出し、大腸菌等の微生物に導入して抗体を産生させたり、抗体を融合タンパク質としてファージ表面に発現させるなど、遺伝子工学的手法により得ることもできる。
本発明の抗体を用いて、生体における本発明のポリペプチドを定量する事により、本発明のポリペプチドの各種疾患の病態との係わりを解明する事が出来、さらに同抗体は疾患の診断ひいては治療、且つ本発明のポリペプチドの効率的なアフィニティー精製に資する事が出来る。
本発明のポリペプチドが過度に作用することで、血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの低下を引き起こすことが主たる原因である疾患の存在が想定される。例えば、低リン血症性ビタミンＤ抵抗性くる病（ＸＬＨ）では重度な低リン血症を呈するにも拘わらず、血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度は上昇を認めない。その理由は、ビタミンＤ代謝酵素遺伝子群の異常が想定されているが、この疾患において本発明のポリペプチドの過剰作用が関与している可能性がある。ＸＬＨのマウスモデルであるＨｙｐでは、２４位水酸化酵素遺伝子の発現亢進が報告されており、本発明のポリペプチドの２４位水酸化酵素遺伝子発現亢進作用と一致する。従って、本発明のポリペプチドに対する抗体を投与することで、ビタミンＤ代謝を正常化し、血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度を是正することで本疾患を治療できることが期待される。ＸＬＨの類似の所見を呈する疾患として常染色体優性遺伝性低リン血症くる病（ＡＤＨＲ）がある。我々は本発明のポリペプチドのクローニングに際して、その染色体上の位置より、本ポリペプチドをコードする遺伝子がＡＤＨＲの責任遺伝子であろうと推察していた。最近、ＡＤＨＲの責任遺伝子の解析がなされ、本ポリペプチドをコードする遺伝子のミスセンス変異が原因であることが報告された。我々はさらにこの変異が酵素的切断に対して耐性を与えるものであることを明らかにし、この分子の過剰作用が疾患の原因であることを示した。この疾患に対して、本発明のポリペプチドに対する抗体がその作用を抑制することで疾患治療に有用であることが考えられる。ＡＤＨＲが骨軟化症やミネラル代謝異常、ビタミンＤ代謝異常を呈することから、このような代謝経路が関係する代謝性骨疾患において、本発明のポリペプチドが病因の一つとして作用している疾患の存在が推察され、そのような疾患に対して、本発明のポリペプチドに対する抗体が有効であることが期待できる。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの作用の一つとして、脂肪細胞への分化抑制が知られている。加齢に伴い骨髄中の脂肪細胞が増加することが知られているが、骨髄中に存在する骨芽細胞、脂肪細胞および造血支持細胞の共通の前駆細胞から、脂肪細胞への分化が亢進していると考えられる。この過程において本発明のポリペプチドが過度に作用して、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの局所における濃度を低減している可能性が考えられる。従って、本発明のポリペプチドに対する抗体を用いることで血中あるいは局所の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度を増加させ、脂肪細胞への分化を抑制し、骨形成能や造血能の低下を改善することが期待できる。また、肥満に対しても有効であることが期待される。このような、本発明のポリペプチドが関与する疾患は他にも存在することが考えられる。この様な疾患は、本発明のポリペプチドに対する抗体を組み合わせたＥＬＩＳＡに代表される免疫学的な物質定量法にてスクリーニングすることができる。これにより、本発明のポリペプチドの生理的な正常範囲を設定することができ、またその範囲から逸脱する疾患群を明らかにすることができる。このようにして認められる本発明のポリペプチドの血中濃度が異常高値を示す疾患に対して、本発明のポリペプチドに対する抗体を治療的に使用することが期待できる。
５．医薬組成物
（１）本発明のポリペプチドを含む医薬組成物
本発明のポリペプチドは、血中リン酸濃度の上昇が好ましくない疾患に対して医薬組成物として用いることができる。慢性腎不全においては、腎からのリン酸の排泄量が減少により、血中のリン酸濃度の上昇がおこる。高リン酸血症が腎機能をさらに増悪させるとともに、副甲状腺からの副甲状腺ホルモンの分泌を促進して二次性副甲状腺機能亢進症を引き起こす。本症は、皮膚の掻痒を起こすとともに、腎臓での１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３合成障害による腸管からのＣａ吸収の低下をもたらす。また、血中リン酸の貯留による副甲状腺ホルモンの過分泌状態が、骨組織からのＣａ動員を促進する。この状態が続くと腎性骨異栄養症の様態の一つである線維性骨炎や副甲状腺の過形成を生じる。この状態を回避する好ましい方法の一つが、前述の高リン酸血症の改善であるが、現在の医療では高リン酸血症を十分に制御できていない。本発明のポリペプチドは、排尿機能が残存するまでの慢性腎不全において、腎臓近位尿細管上皮細胞に存在するＩＩ型Ｎａ依存性リン酸トランスポーターを抑制して尿中へのリン酸排泄を促進することで、血中のリン酸を是正する活性を有する（リン酸輸送抑制活性）。また本発明のポリペプチドは腸管に作用して、腎臓と同様にＩＩｂ型Ｎａ依存性リン酸トランスポーターを抑制することでリン酸の体内への吸収も低下させ、血中リン濃度を是正させることができる。
本発明のポリペプチドはまた、カルシウム代謝とリン酸代謝の異常による疾患に対し医薬組成物として用いることができる。カルシウム代謝異常とは、血清カルシウム濃度が臨床上定義されている正常域を逸脱している状態、あるいは、血清カルシウム濃度は正常域であるが、この血清カルシウム濃度を保つために腎臓、腸管、骨組織、副甲状腺の機能が異常に亢進又は低下している状態、あるいは、副甲状腺ホルモン、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３、カルシトニンといった血清カルシウムを調節するホルモンが異常値を示す状態を意味する。また、リン酸代謝異常とは、血清リン酸濃度が臨床上定義されている正常域を逸脱している状態、あるいは、血清リン酸濃度は正常域であるが、腎臓、腸管、骨組織におけるリン酸出納機能が異常に亢進又は低下している状態を意味する。
上述の二次性副甲状腺機能亢進症に伴う腎性骨異栄養症は、臨床においては線維性骨炎のほかに無形成骨やその混合型など多様な形態をとる。これは、二次性副甲状腺機能亢進症に対して、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３又は１α−ヒドロキシビタミンＤ３などが、副甲状腺ホルモンを抑制する目的で一般に用いられている。副甲状腺ホルモン値が十分抑制されない場合は、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３又は１α−ヒドロキシビタミンＤ３の投与の過剰量を投与するパルス療法（以下、「ビタミンＤパルス療法」ということがある。）が行われることがある。血清の副甲状腺ホルモンの正常濃度は６５ｐｇ／ｍｌ以下であるが、この病態において副甲状腺ホルモンの濃度が正常値レベルであるときは、腎性骨異栄養症の一つの様態である無形成骨を生じる。しかも、副甲状腺ホルモン濃度が上昇すると線維性骨炎を生じるといった相反する病態を示す。このような疾患に対する最近の治療指針としては、副甲状腺ホルモン濃度を１３０〜２６０ｐｇ／ｍｌ程度に維持することが提唱されているが、根本的な代謝異常の原因は不明のままである。副甲状腺ホルモンは、血中リン酸濃度の上昇により誘導され、血清カルシウムの上昇により抑制されることが知られている。本発明のポリペプチドは、血中リン酸濃度および血中カルシウム濃度を低下させることから、副甲状腺ホルモンの機能を修飾しうることが推察できる。また、腫瘍性骨軟化症患者において、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が検出限界以下まで低下することが報告されており、本発明のポリペプチドが１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の活性調節に関連していることも推察できる。上述の副甲状腺ホルモンの制御異常や活性異常を伴う腎性骨異栄養症において、本発明のポリペプチドが無形性骨又は線維性骨炎のいずれかに対して臨床上有用な医薬組成物として利用できることが考えられる。従って、腎性骨異栄養症の繊維性骨炎と無形成骨といった相反する病態のいずれかにおいて、本発明のポリペプチドの投与が有用な治療方法を提供することが考えられる。
さらに、本発明のポリペプチドは、異所性石灰化に対し医薬組成物として用いることができる。骨組織以外の組織における石灰化は、生体機能を損なうものである。特に心臓や血管の石灰化による機能不全は生命を脅かすものである。この異所性石灰化の危険因子としては、血中のカルシウムイオンとリン酸イオンの濃度の積（以下、「カルシウム−リン積」ということがある。）が上昇することが挙げられる。上述の二次性副甲状腺機能亢進症の治療において、高リン酸血症の状態に対してビタミンＤパルス療法を行う際に、カルシウム−リン積が上昇して異所性石灰化を起こす場合がある。また、血液透析患者における心血管系の石灰化は重大な問題である。本発明のポリペプチドは、表４に示すように、血清のカルシウム濃度とリン酸濃度を顕著に低下させる活性を有しており、種々の疾患に付随する異所性石灰化に対して有効であることが期待できる。
さらに、本発明のポリペプチドは、代謝性骨疾患に対し医薬組成物として用いることができる。本発明のポリペプチドは、カルシウム代謝、リン酸代謝、石灰化又はビタミンＤ代謝に対して強力な調節活性を有している。カルシウム代謝とリン代謝に関連するホルモンとしては、カルシトニン、副甲状腺ホルモン、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３がある。カルシトニンは血清カルシウムを低下させる活性を有し、副甲状腺ホルモンと１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は、血清カルシウムを上昇させる活性を有している。副甲状腺ホルモンは尿中へのリン酸排泄作用を有しており、カルシトニンにも同様の活性があることが報告されている。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は、腸管からのリン酸の吸収を促進する活性を有する。このように、それぞれのホルモンが血中のカルシウムとリン酸のバランス維持に対して異なる活性を有しているが、カルシトニン及び１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３は骨粗鬆症の治療薬として使用されている。また、副甲状腺ホルモンも骨粗鬆症に対する治療薬として開発中である。
骨代謝には、骨吸収と骨形成という骨組織の異化と同化が相互調節しているという特徴がある。副甲状腺ホルモンを持続的に投与すると骨量を減少させるが、間歇的に作用させることにより骨形成を促進することが知られている。本発明のポリペプチドも、カルシウム代謝とリン酸代謝の調節作用を有していることから、適切な使用方法を選択することで骨粗鬆症をはじめ代謝性骨疾患に対して有効であることが期待できる。
さらに、本発明のポリペプチドは、血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度の上昇が好ましくない疾患又は状態に対して、あるいは、血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤによって誘導される生理応答が好ましくない状態に対して、医薬組成物として用いることができる。
１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤは副甲状腺に対して作用し、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の分泌を抑制する事が知られている。そのため臨床では慢性腎不全における二次性副甲状腺機能亢進症、とりわけ血清中ＰＴＨ濃度が高い症例において、間欠的に高濃度の１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを投与する治療法が確立している。しかしこの治療法の短所として、異所性石灰化を誘発しやすい点が上げられる。血清中リン酸濃度が高い慢性腎不全患者において、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの投与により骨組織以外の組織における好ましくない石灰化がしばしば認められる。本発明のポリペプチドの投与は数時間以内に速やかな血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの低下を促す作用を有することから、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの過剰が原因となる異所性石灰化の治療および予防に有用である。
また、高濃度１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの間欠的投与は過度のＰＴＨ分泌抑制をもたらし、骨の代謝が停止したような所見を呈する無形成骨症を誘発することがある。このような症例に対しても、本発明のポリペプチドの投与により、血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを低下させ、副甲状腺における適切なＰＴＨ分泌を促し、無形性骨からの回復をもたらすことが期待できる。
血管の石灰化においても１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤが石灰化促進因子として関与していることが報告されている。本発明のポリペプチドは血管の石灰化を伴う病態、例えば加齢による動脈硬化、糖尿病性血管症、透析患者による心血管系の石灰化などに対して治療的あるいは予防的に用いることができる。
腸管からのカルシウム吸収は血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤにより促進されることが知られている。本発明のポリペプチドは、血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度を低下させることにより、高カルシウム血症の是正に用いることができる。高カルシウム血症の原因としては、原発性副甲状腺機能亢進症によるＰＴＨの過剰産生、サルコイドーシスや結核などの慢性肉芽腫に伴った高濃度１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ、あるいは悪性腫瘍が産生するＰＴＨｒＰによる骨吸収促進などが挙げられる。１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ過剰だけでなくＰＴＨ又はＰＴＨｒＰが主な原因である高カルシウム血症において、本発明のポリペプチドを投与することにより、血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度を低下させることで高カルシウム血症を改善することが期待できる。特に、サルコイドーシスや結核などの慢性肉芽腫中の活性化マクロファージは１α位水酸化酵素活性を有しており、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を過剰産生する。本発明のポリペプチドにより、この１α位水酸化酵素活性を直接低下させることが期待される。
１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、破骨細胞の分化を促進することが知られており、本発明のポリペプチド投与により骨吸収抑制が期待される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤは強力な破骨細胞分化誘導因子として知られている。破骨細胞による過度な骨吸収は、骨粗鬆症に代表される骨減少疾患を招く。本発明のポリペプチドは、このような骨吸収の促進が認められる疾患において、一過性に血清中１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度を低下させることにより、骨代謝回転を正常に戻すことが期待される。また、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤはｉｎ  ｖｔｒｏで骨芽細胞の分化を抑制することが報告されているが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても骨形成を抑制する因子であることがビタミンＤ受容体欠損マウスの骨移植実験で示唆されている。このような観点からも、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤを低下させうる本発明のポリペプチドは骨量の減少を伴う代謝性骨疾患に対して有用であることが期待できる。また、ビタミンＤ３代謝物の一つである、２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤを投与することにより、骨量の増加を認める報告がなされている。２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤは、２５−ヒドロキシビタミンＤを基質として２４位水酸化酵素が水酸化を行うことで合成される。本発明のポリペプチドは、２４位水酸化酵素遺伝子の発現を有意に亢進させる作用を有しているため、本ペプチドの投与により、血中２４，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度を上昇させ、骨粗鬆症などの骨疾患、あるいは骨格形成異常などに対する骨量の増加を期待することができる。
ＰＴＨは強力な骨吸収促進作用を有することが知られているが、これを間歇投与することで骨代謝回転を刺激することができ、結果的に骨量を増加させる効果を発現させることができる。本発明のポリペプチドの生理活性として、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤの調節作用や血清カルシウム、血清リン酸濃度調節作用、石灰化調節作用を有することが明らかとなっているが、本ポリペプチドを効果的に骨組織に作用させることで骨代謝回転を調節することは可能であると考えられる。従って、骨代謝回転が亢進している閉経後骨粗鬆症や骨代謝回転が低下している退行期骨粗鬆症に対して本ポリペプチドが有用であることが期待できる。このような、本発明のポリペプチドが関与する疾患は他にも存在することが考えられる。この様な疾患は、本発明のポリペプチドに対する抗体を組み合わせたＥＬＩＳＡに代表される免疫学的な物質定量法にてスクリーニングすることができる。
これにより、本発明のポリペプチドの生理的な正常範囲を設定することができ、またその範囲から逸脱する疾患群を明らかにすることができる。このようにして認められる本発明のポリペプチドの血中濃度が異常低値を示す疾患に対して、本発明のポリペプチドを治療的に使用することが期待できる。
（２）本発明の抗体を含む医薬組成物
本発明の抗体は、ビタミンＤ抵抗性くる病や腫瘍性骨軟化症に対し、医薬組成物として用いることができる。上述の抗体の調製方法により本ポリペプチドの中和抗体をポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体として取得することができる。抗体を医薬としてより適正に用いる方法としては、ヒト型抗体やヒト型化抗体を作製することが可能である。腫瘍性骨軟化症における低リン酸血症や骨軟化症の治療又は改善は本発明のポリペプチドの過剰な活性を抑制することで達成できる。本発明のポリペプチドに対する中和抗体を投与することにより腫瘍性骨軟化症の症状改善が期待できる。また、ＸＬＨにおける低リン酸血症誘導因子や石灰化抑制因子が本発明のポリペプチドと同等であると考えられ、ＸＬＨを含むビタミンＤ抵抗性くる病に対する治療薬にもなり得る。
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドが過剰状態に存在するカルシウム代謝又はリン酸代謝異常疾患や代謝性骨疾患に対し、医薬組成物として用いることができる。上述にあるように、慢性腎不全患者や血液透析患者においてはカルシウム代謝やリン酸代謝の恒常性維持機構に異常が生じているが、本発明のポリペプチドが過剰産生や蓄積が原因である可能性がある。本発明のポリペプチドが骨代謝を調節することを示したが、本発明のポリペプチドが過剰に存在することで生じる代謝性骨疾患の存在も考えられる。この場合に本発明のポリペプチドに対する抗体により病態の治療又は改善が期待できる。
本発明の抗体を適用し得る疾患は、骨粗鬆症、ビタミンＤ抵抗性くる病、腎性骨異栄養症、透析骨症、低石灰化骨症、パジェット病、腫瘍性骨軟化症などの少なくとも１種の骨疾患が挙げられる。これらの疾患は、単独であっても、併発したものであっても、上記以外の他の疾病を併発したものであってもよい。
（３）投与プロトコール
本発明のポリペプチド又は抗体を有効成分として含む医薬組成物は、医薬的に許容される担体又は添加物を共に含むものであってもよい。このような担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、本発明の剤形に応じて上記の中から適宜又は組み合わせて選択される。
本発明のポリペプチド又は抗体を骨疾患の予防剤又は治療剤として使用する場合は、使用する対象を特に限定するものではない。
本発明のポリペプチドについては、生体のカルシウム代謝、リン酸代謝、石灰化又はビタミンＤ代謝を調節し得る医薬組成物として使用することができる。
本発明の抗体については、上記のとおり骨粗鬆症、ビタミンＤ抵抗性くる病、腎性骨異栄養症、透析骨症、低石灰化骨症、パジェット病、腫瘍性骨軟化症などの少なくとも１種の骨疾患について治療又は予防を特異目的として用いることができる。これらの疾患は、単独であっても、併発したものであっても、上記以外の他の疾病を併発したものであっても、本発明のポリペプチド又は抗体の使用の対象とすることができる。
本発明のポリペプチド又は抗体を含む予防剤又は治療剤は、ポリペプチドにあっては経口的又は非経口的に、抗体にあっては非経口的に投与することができる。
本発明のポリペプチドを経口的に投与する場合は、それに適用される錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤などの固形製剤、あるいは液剤、シロップ剤などの液体製剤等とすればよい。特に顆粒剤及び散剤は、カプセル剤として単位量投与形態とすることができ、液体製剤の場合は使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよい。
これら剤形のうち経口用固形剤は、通常それらの組成物中に製剤上一般に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤などの添加剤を含有する。また、経口用液体製剤は、通常それらの組成物中に製剤上一般に使用される安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、芳香剤、着色剤などの添加剤を含有する。
本発明のポリペプチド又は抗体を非経口的に投与する場合は、注射剤、坐剤等とすることができる。
注射の場合は、通常単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供され、使用する際に適当な担体、例えば発熱物質不含の滅菌した水で再溶解させる粉体であってもよい。これらの剤形は、通常それらの組成物中に製剤上一般に使用される乳化剤、懸濁剤などの添加剤を含有する。注射手法としては、例えば点滴静脈内注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、皮内注射が挙げられる。また、その投与量は、投与対象の年齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変えることができる。
この場合、本発明のペプチド又は抗体の有効量と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合せとして投与される有効量は、ポリペプチドにあっては、一回につき体重１ｋｇあたり０．０１〜１００μｇ、好ましくは０．５〜２０μｇである。また、抗体にあっては、一回につき体重１ｋｇあたり０．１μｇ〜２ｍｇ、好ましくは１〜５００μｇである。
６．疾患の診断剤
（１）本発明の抗体又はポリペプチド
本発明の抗体は、血中や尿中に存在する本発明のポリペプチドあるいはその代謝物の検出や定量に用い、本発明のポリペプチドと病態の関連性をあきらかにすることができるとともに、関連疾患の診断剤として確立できる。
関連疾患とは、骨疾患またはカルシウム代謝異常、リン酸代謝異常、石灰化異常、及びビタミンＤ代謝異常のうち少なくとも１つの異常を呈する疾患を意味し、例えば骨粗鬆症、ビタミンＤ抵抗性くる病、腎性骨異栄養症、透析骨症、低石灰化骨症、パジェット病、腎不全、腎性リン酸漏出症、尿細管性アシドーシス、ファンコニ症候等が挙げられる。
抗体を用いた結合分子の定量方法は、ラジオイムノアッセイやエンザイムイムノアッセイなどにより一般化している。このような方法を用いて、血中や尿中の本発明のポリペプチドを測定することは、新たな臨床判断の指標となり得る。例えば、くる病患者において、本発明のポリペプチドの血中値が健常人と比較して高値を示す場合には、ＸＬＨ又はＡＤＨＲを強く疑うことができる。また、本発明のポリペプチドの血中濃度の変化により慢性腎不全患者の二次性副甲状腺機能亢進症への進展を予想できる。
腫瘍性骨軟化症については、一般に腫瘍の発見が容易でない場合が多いが、本発明の抗体を用いることで有用な診断方法が確立できる。例えば、くる病や骨軟化症の家族歴がない患者において、血中の本発明のポリペプチド濃度が健常人と比較して著しい高値を示した場合、腫瘍性骨軟化症を疑うことができる。
（２）本発明のＤＮＡ
本発明においては、リン酸代謝異常疾患やカルシウム代謝異常疾患および代謝性骨疾患患者から本発明のＤＮＡ異常を検出することにより、当該疾患の診断と予防を可能にする。
本発明のＤＮＡの塩基配列をＧｅｎｂａｎｋの塩基配列データベース中でサーチすると、３つに断片化した状態で、ヒト１２ｐ１３  ＢＡＣ  ＲＰＣＩ１１−３８８Ｆ６（アクセッション番号ＡＣ００８０１２）の配列と一致する。この断片化は、染色体配列からスプライシングにより本発明のＤＮＡの塩基配列が得られることを示しており、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、少なくとも配列番号１１に示す配列のうち第４９８番から第１２９６６番までの配列又はその一部の断片を含むことが明らかである。この領域内の塩基の置換や挿入や欠失により、本発明のポリペプチドの生物学的および生理的活性の上昇や低下や消失が起こる。本発明のポリペプチドは、リン酸代謝、カルシウム代謝、骨代謝、ビタミンＤ代謝に強力な作用を有することから、この配列番号１１に示す塩基配列又はその一部の領域（例えば第４９８番から第１２９６６番までの配列）において、一部の塩基の置換、挿入、欠失などによる遺伝子多型や変異を明らかにすることにより、リン酸代謝異常やカルシウム代謝異常を含む疾患、あるいは骨代謝異常を呈する疾患、ビタミンＤ代謝異常を呈する疾患の診断、予防が可能となる。
ところで、ＡＤＨＲを有する家系の連鎖解析がなされ、その責任遺伝子が１２ｐ１３に存在することが報告されている（Ｅｃｏｎｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２６５３−２６５７，１９９７）。この報告において、責任遺伝子がマイクロサテライトマーカーＤ１２Ｓ１００とＤ１２Ｓ３９７の１８ｃＭの範囲に存在することが明らかにされている。本発明者は、本発明のＤＮＡが存在する染色体上の位置をこれらと比較して確認したところ、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＡＤＨＲの責任遺伝子が存在する領域と一致した。本発明のポリペプチドの生物活性と遺伝子の染色体上の位置から、本発明のポリペプチドがＡＤＨＲの責任遺伝子によりコードされていると考えられる。このことは、ＡＤＨＲ患者の血液より細胞成分を分離して、これより染色体ＤＮＡを単離して、配列番号１１に示されている領域の塩基配列の変異を見つけることで確定することができる。従って、上記塩基配列領域を有する遺伝子は、常染色体優性低リン酸血症性くる病、伴性染色体性低リン酸血症性くる病、低リン酸血症性骨症、骨粗鬆症等の診断剤として使用される。
本発明者が特定した本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ領域のｅｘｏｎ１とｅｘｏｎ２との間には、ＮＣＢＩのＧｅｎｂａｎｋにアクセッション番号Ｇ１９２５９で登録されているＳＴＳ配列が存在する。このマーカーは本ＤＮＡと遺伝的形質との関連性を調べる上で非常に重要であると考えられる。
本発明は、これまでのカルシウム代謝、リン酸代謝、骨代謝及びビタミンＤ代謝に対する理解に大きな変革をもたらす。慢性腎不全から血液透析期の移行遅延やリン酸代謝とカルシウム代謝関連疾患や代謝性骨疾患に対する新しい治療法と診断方法を提供する。また、既存の治療方法の改善やそれを補助するものとして有用である。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
実施例１  ヒト腫瘍性骨軟化症由来腫瘍ｃＤＮＡライブラリーの作製
液体窒素で凍結させた腫瘍組織を５ｍｌのＩＳＯＧＥＮ（日本国ニッポンジーン）液中で破砕、懸濁させた後、添付文書に従って約０．１３ｍｇのトータルＲＮＡを調製した。このトータルＲＮＡ１．５μｌより、ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡライブラリー作製キット（米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて、添付文書に従いｃＤＮＡを合成した。以下、本ｃＤＮＡをｃＤＮＡ＃２と表記する。このｃＤＮＡ＃２にＥｃｏＲＩアダプターを付加し、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩで消化したλＺＡＰＩＩファージベクター（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）に組み込みんだ後、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄファージパッケージングキット（米国ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用い、添付文書に従い、腫瘍性骨軟化症腫瘍ファージライブラリーを作製した。得られたライブラリーは、独立なクローンを合計で約６０万種類を含んでいた。さらに、上記ファージライブラリーを大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株に感染させた後、１５ｃｍのシャーレ２０枚に蒔き直し、３７℃で１０時間保温することで、プラークを形成させた。このプラークをすべてＳＭバッファーに抽出し、腫瘍性骨軟化症腫瘍ｃＤＮＡファージライブラリーとした。
実施例２  腫瘍ｃＤＮＡのポジティブスクリーニングの実施
概要
腫瘍性骨軟化症の原因遺伝子は、腫瘍の外科的除去において治癒し得ることから、腫瘍において特異的に高発現している可能性が示唆されている。また、これまでの報告では、腫瘍性骨軟化症の腫瘍は中杯葉系、とりわけ間充織細胞由来であることが多い。したがって、正常な中杯葉由来組織中には発現が低く、腫瘍組織中にのみ特異的に高発現している遺伝子群を同定することが必要と考えられる。そこで、以下に示すとおり、ｃＤＮＡサブトラクション法を応用したポジティブスクリーニングを実施した。腫瘍組織由来ｃＤＮＡと、対照として骨組織より単離したｃＤＮＡとをサブトラクションすることで、腫瘍組織中にのみ特異的に高発現し、骨組織中には発現していない遺伝子群を濃縮した。このサブトラクションしたｃＤＮＡ群をプローブに用い、腫瘍ｃＤＮＡファージライブラリーをハイブリダイゼーションすることで、腫瘍特異的発現遺伝子断片を得た。
（１）対照ヒト骨組織ｃＤＮＡの作製
液体窒素で凍結させたヒト骨組織を５ｍｌのＩＳＯＧＥＮ（日本国ニッポンジーン）液中で破砕、懸濁させた後、添付文書に従って約０．０１１ｍｇのトータルＲＮＡを調整した。このトータルＲＮＡ３μｌより、ＳＭＡＲＴ  ｃＤＮＡライブラリー作製キット（米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて、添付文書に従いｃＤＮＡを合成した。このようにして得られたｃＤＮＡを、以下、ｃＤＮＡ＃４と表記する。
（２）腫瘍性骨軟化症腫瘍ｃＤＮＡと対照骨組織ｃＤＮＡのサブトラクション
実施例１で記載したｃＤＮＡ＃２に高発現している遺伝子を濃縮するため、ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ  ｃＤＮＡサブトラクションキット（米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用い添付文書に従って、実施例２（１）で記載したｃＤＮＡ＃４とハイブリダイゼーションさせることにより、ｃＤＮＡ＃２からｃＤＮＡ＃４に含まれている遺伝子断片を差し引いた（サブトラクションした）。その後、差し引かれたｃＤＮＡ＃２は添付文書に従いＰＣＲ増幅され、サブトラクション済みｃＤＮＡ群（Ａ）を得た。
一方、サブトラクションキットの性質上、ハイブリダイゼーションの過程が２回であり、定法に比べ少ないため、両者に共に多く存在する遺伝子は完全にサブトラクションされにくい。そのため、サブトラクション済みｃＤＮＡ群（Ａ）のみをプローブとして、腫瘍性骨軟化症腫瘍ｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイゼーションした場合、完全にサブトラクションできていない遺伝子もポジティブクローンとして得られてしまう。そこで、対照プローブとして実施例２（１）で記載したｃＤＮＡ＃４からｃＤＮＡ＃２を同様の手法で差し引いた後、ＰＣＲ増幅したサブトラクション済みｃＤＮＡ群（Ｂ）を調製した。このサブトラクション済みｃＤＮＡ群（Ｂ）と、先に述べたサブトラクション済みｃＤＮＡ群（Ａ）とをそれぞれ腫瘍ｃＤＮＡライブラリーに対してハイブリダイゼーションし、両者のシグナルを比較することで、腫瘍性骨軟化症腫瘍に特異的に含まれる遺伝子断片を単離する事が可能となる。
（３）腫瘍ｃＤＮＡライブラリーのディファレンシャルハイブリダイゼーション
実施例１に記載した腫瘍性骨軟化症腫瘍ｃＤＮＡファージライブラリーを大腸菌ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株に感染後、１５ｃｍシャーレ一枚あたり３，０００プラークを形成するように蒔き直し、３７℃で８時間保温した。その後、Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）ナイロンフィルターに各２枚ずつプラークを写し取った。転写したナイロンフィルターを添付文書に従ってＤＮＡの固定処理を行い、実施例２（２）で記載したサブトラクション済みｃＤＮＡ（Ａ）およびサブトラクション済みｃＤＮＡ（Ｂ）をそれぞれプローブとしてスクリーニングを実施した。
プローブ標識、ハイブリダイゼーション及びシグナル検出は、Ａｌｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔシステム（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用い、添付文書に従い実施した。プローブには、実施例２（２）で記載したサブトラクション済みｃＤＮＡ（Ａ）およびサブトラクション済みｃＤＮＡ（Ｂ）をそれぞれ１００ｎｇずつ用い、プロトコールに従い蛍光標識した。本プローブをＡｌｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔシステム付属のハイブリダイゼーションバッファー５０ｍｌにそれぞれ加え、同時に８枚のプラークを転写したナイロンフィルター２組をそれぞれプロトコールに従いハイブリダイズ、洗浄した。洗浄後、ナイロンフィルターを発光反応に供し、ＥＣＬフィルム（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に２時間露光し、自動現像機（日本国フジフィルム）にて現像し、結果を解析した。
その結果、サブトラクション済みｃＤＮＡ（Ａ）をプローブに用いた場合に強く露光し、サブトラクション済みｃＤＮＡ（Ｂ）をプローブに用いた場合に露光しない部分に位置する単一のプラークを目視で選択し、シャーレから掻き取り０．５ｍｌのＳＭバッファーに懸濁後、４℃に２時間以上静置することにより、ファージを抽出した。
（４）ポジティブクローンの塩基配列解析
実施例２（３）で得られたポジティブクローンを含んだファージ溶液０．５μｌを鋳型とし、ファージベクター内部配列であるＴ７プライマー（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ）（配列番号２４）およびＴ３プライマー（ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ）（配列番号２５）、ＬＡ−ｔａｑポリメラーゼ（日本国宝酒造社）を用い、９６℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒からなる工程を１サイクルとして３５サイクルのＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルにて電気泳動し、明瞭な単一のバンドが認められたクローンについて、ＰＣＲ増幅断片を鋳型に用いてＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサー（米国ＰＥアプライドシステムズ社）を用いて配列決定した。
一方、明瞭な２本のバンドが認められた場合、相当するバンドのゲル部分より、それぞれＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（独国ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてＰＣＲ産物を抽出し、ＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサーにより配列決定した。
腫瘍性骨軟化症ファージライブラリー３４万１千個のプラークについてディファレンシャルハイブリダイゼーションを行った結果、４５６個のポジティブプラークを確認し、これらすべてを塩基配列決定した。
実施例３  ヒト低リン誘導因子候補遺伝子の絞り込み
実施例２において得られたポジティブクローン４５６個の配列情報について、ＮＣＢＩが提供する塩基配列データベースであるＧｅｎｂａｎｋに登録されている塩基配列に対して相同性検索した。その結果、出現頻度の高い既知遺伝子として表１に記載した遺伝子群が得られた。一方、データベース検索の結果、生物活性の不明な未知遺伝子断片が１００クローン存在した。これら未知遺伝子断片の塩基配列情報について、クローン間での重複を頻度情報として抽出した。その中で最も高頻度に重複した遺伝子として、７クローンが連続して１つのコンティグを形成した配列ＯＳＴ３１１が得られた。このとき得られた塩基配列情報は、配列番号１の塩基番号１５２２から２７７０であった。本遺伝子断片を既存データベースにて検索したところ、ｃＤＮＡ又はＥＳＴとして登録されてはおらず、ゲノム配列にのみ一致した。該当するゲノム配列はＡＣ００８０１２であり、染色体上の１２ｐ１３に位置することがすでに報告されている。しかしながら、得られた配列内には蛋白質をコードする領域（ＯＲＦ）は認められず、３’側非翻訳領域であると予想されたため、腫瘍性骨軟化症腫瘍ｃＤＮＡライブラリーよりｃＤＮＡの全長クローニングを実施した。なお、ＯＲＦの予測には、ＤＮＡＳＩＳ−Ｍａｃ  ｖｅｒｓｉｏｎ３．７のＯＲＦ予測機能を用いた。
0004799801.tif 000003
実施例４  ＯＳＴ３１１の全長クローニング
実施例３で得られたＯＳＴ３１１の配列に基づいて、以下のプライマーを合成し、腫瘍性骨軟化症腫瘍ｃＤＮＡライブラリーのファージ溶液を鋳型として、９６℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒からなる工程を１サイクルとして３５サイクルのＰＣＲを実施した。
0004799801.tif 000004
ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにて電気泳動し、予想されるサイズのＰＣＲ産物の増幅を確認した後、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎカラムＳ−３００ＨＲ（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてＰＣＲ産物を精製した。得られたＰＣＲ産物をＡｌｐｈｏｓ  Ｄｉｒｅｃｔシステム（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用い添付文書に従って蛍光標識し、これをプローブとして、２万クローンの腫瘍性骨軟化症腫瘍ｃＤＮＡライブラリーのプラークハイブリダイゼーションを実施した。
得られた４０個のポジティブクローンを、Ｔ７およびＴ３を用いて、実施例２（４）に記載した要領でＰＣＲ増幅し、得られたＰＣＲ産物の塩基配列を基に、プライマー３１１−Ｌ２９６（配列番号１４、ＧＧＧＧＣＡＴＣＴＡＡＣＡＴＡＡＡＴＧＣ）を合成した。再度、３１１−Ｕ６５（配列番号１２）と３１１−Ｌ３４４（配列番号１３）プライマーで増幅されるＰＣＲ産物をプローブとして、２万クローンの腫瘍性骨軟化症腫瘍ｃＤＮＡライブラリーのプラークハイブリダイゼーションを実施した。ポジティブクローン６２個について、Ｔ７と３１１−Ｌ２９６（配列番号１４）プライマーで増幅したＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、これまで判明した塩基配列と連結した。その結果、配列番号１に示す塩基配列が得られた。この配列番号１の塩基番号１３３に位置する開始コドンからＯＳＴ３１１のＯＲＦが始まることが判明した。さらにＯＲＦの配列を最終的に確定するため、以下のプライマーを合成した。
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上記３１１−Ｆ２（配列番号１６）および３１１−Ｌ６（配列番号２１）プライマーを用い、腫瘍性骨軟化症腫瘍ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（日本国  宝酒造社）を用いて、９６℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、３０秒からなる工程を１サイクルとした３５サイクルのＰＣＲを実施した。
このＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにて電気泳動したところ、約９８０塩基対からなる単一の増幅断片が認められた。そこで、本増幅断片を、上記プライマー（配列番号１５から２１）を用いて塩基配列決定した結果、配列番号１の塩基番号１３３に位置する開始コドンＡＴＧ、および塩基番号８８６に位置する終止コドンＴＡＧに挟まれた、配列番号２に示すポリペプチドをコードするＯＲＦ領域を確定した（配列番号１）。
実施例５  ＯＳＴ３１１の腫瘍性骨軟化症腫瘍特異性
ＯＳＴ３１１の腫瘍特異性を検討するため、腫瘍組織より抽出したｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡおよび対照骨組織より抽出したｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型に、下記に示すＯＳＴ３１１特異的プライマー（配列番号２２及び２３）を用い、９６℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒からなる工程を１サイクルとした３５サイクルのＰＣＲを実施した。なお、両反応液中には終濃度２％となるようＤＭＳＯを添加し、酵素にはＬＡ−ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（日本国宝酒造社）を用いた。また、内部標準としてＧ３ＰＤＨに特異的なプライマー（ＦＷ：ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ（配列番号２６）、ＲＶ：ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ（配列番号２７））によるＰＣＲも同様な条件で実施した。
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図１に示したように、これらのＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにて電気泳動したところ、ＯＳＴ３１１プライマーを用いた場合、腫瘍組織を鋳型にした場合のみ予想されるサイズのＰＣＲ産物が認められた。一方、Ｇ３ＰＤＨプライマーを用いた場合では、腫瘍組織、対照骨組織共に予想されるサイズのＰＣＲ産物が同程度に認められた。この結果から、ＯＳＴ３１１が腫瘍組織特異的に発現していることが確認された。
実施例６  ＯＳＴ３１１安定発現ＣＨＯ細胞の取得
（１）ＯＳＴ３１１発現ベクターの構築
実施例５で示した３１１Ｆ１ＥｃｏＲＩ（配列番号２２）および３１１ＬＨｉｓＮｏｔ（配列番号２３）プライマーを用い、腫瘍性骨軟化症腫瘍ｃＤＮＡライブラリーを鋳型に、９６℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒からなる工程を１サイクルとした３５サイクルのＰＣＲを実施した。なお、応液中には終濃度２％となるようＤＭＳＯを添加し、酵素にはＬＡ−ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（日本国宝酒造社）を用いた。３１１Ｆ１ＥｃｏＲＩプライマーは、Ｋｏｚａｋ配列より上流に位置する、配列番号１の塩基番号１１１よりアニーリングし、３１１ＬＨｉｓＮｏｔプライマーは配列番号１の塩基番号８７１よりアニーリングし、両プライマーを用いたＰＣＲを行うことで、配列番号２に示した全長ポリペプチドをコードする領域を増幅できる。また、３１１ＬＨｉｓＮｏｔプライマー中には、配列番号２のアミノ酸番号２５１番目に続きヒスチジン残基を６個付加した後、終止コドンとなるような塩基配列が含まれている。そのため、翻訳された組換え蛋白質はＣ末端にＨｉｓ６タグ配列を有しており、抗体による組換え体の認識やニッケルレジンによる組換え体精製に有用できる。
ＰＣＲ増幅断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化した後、同様にＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで消化した動物細胞発現用プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１Ｚｅｏ（米国ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）と連結した。得られた組換えベクターを大腸菌ＤＨ５α株に遺伝子導入し、１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地３ｍｌで培養後、ＧＦＸプラスミド精製キット（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてプラスミドの精製を行った。挿入遺伝子の配列を常法に従って決定し、配列番号１の相当部分と一致し、かつ終止コドン直前にＨｉｓ６タグ配列をコードする塩基配列が付加されていることを確認した。
（２）ＯＳＴ３１１安定発現ＣＨＯ細胞の取得
実施例６（１）で作製したＯＳＴ３１１ＯＲＦ部分を挿入したプラスミド約２０μｇを、ベクター内にあるアンピシリン耐性遺伝子を１か所で切断する制限酵素ＦｓｐＩで消化した後、エタノール沈殿させ、１０μｌの超純水に溶解した。その後、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（米国Ｂｉｏ  Ｒａｄ社）を用いて電気穿孔法（エレクトロポレーション）により全量を宿主細胞に導入した。宿主細胞にはＣＨＯ  Ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞（Ｓｈｉｒａｈａｔａ，Ｓ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，５９（２）：３４５−３４７，１９９５）を用いた。７５ｃｍ２培養フラスコ（米国コーニング社）で３７℃、５％ＣＯ２，湿度１００％下、１０％ＦＣＳ入りＭＥＭα培地で培養面積の約９０％を占めるまでＣＨＯ  Ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１を培養した。その後、接着細胞をトリプシン処理することで剥離させ、約１×１０７個の細胞を得た。得られた細胞を０．８ｍｌのＰＢＳに懸濁した後、ＦｓｐＩ消化したプラスミドと混合し、１０分間氷冷した。プラスミドを含んだ細胞を０．４ｃｍ間隔の専用キュベットに移し、電気パルスを０．２５ｋＶ、９７５μＦの設定値でかけた後、キュベットを再度１０分間冷却した。遺伝子導入された細胞を１０％ＦＣＳ入りＭＥＭα培地で２４時間培養した後、終濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなるようゼオシン（米国ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）を加え、さらに１週間培養した。その後、薬剤耐性能を示した細胞をクローン化するため、限界希釈法により０．２細胞／ウェルとなるように９６ウェルプレート（米国コーニング社）に播種し直し、終濃度０．３ｍｇ／ｍｌゼオシン存在下、約３週間培養することで、薬剤耐性株３５クローンを得た。
（３）ＯＳＴ３１１安定発現ＣＨＯ細胞の組換え体産生の確認
薬剤耐性を示した３５クローンについて、その培養上清中の組換え体ＯＳＴ３１１の存在をウエスタンブロッティング法で確認した。
回収した培養上清０．２ｍｌをウルトラフリーＭＣＭ．Ｗ．５，０００カットメンブレンシステム（米国ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いて約４０〜５０μｌに濃縮し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ６．８、５％ＳＤＳ、５０％グリセロール、１００ｍＭ  ＤＴＴを含むサンプルバッファーを１０μｌ添加し、９５℃、５分間加熱した。そして、１０−２０％勾配のポリアクリルアミド電気泳動にて培養上清中の蛋白質を分離した。その後、セミドライブロッティング装置（米国Ｏｗｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、ゲル中の蛋白質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦ膜（米国ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）に転写した。このＰＶＤＦ膜を、ＴＴＢＳバッファー（米国Ｓｉｇｍａ社）中で１／５０００希釈した抗Ｈｉｓ（Ｃ末）抗体（米国ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）とともに室温で１時間インキュベーションした後、ＥＣＬ発光システム（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてフィルムに５分露光し、自動現像機（日本国フジフィルム社）で現像した。その結果、約３２ｋＤａおよび約１０ｋＤａに最も強いシグナルを認めたクローン＃２０を単離した。以下、＃２０細胞を、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈと命名し、独立行政法人産業技術総合研究所、特許微生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１）に寄託した（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２７３）。
実施例７  ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ培養上清によるリン輸送阻害活性の測定
ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈを２２５ｃｍ２培養フラスコ（米国コーニング社）で３７℃、５％ＣＯ２，湿度１００％下、１０％ＦＣＳ入りＭＥＭα培地でフラスコ面積の約８０％を占めるまで増殖させた後、培地を無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ（米国ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）３０ｍｌに置き換え、４８時間後に上清を回収した。浮遊細胞等を除くため上清を１，２００ｇで５分間遠心した後、Ｍｉｎｉｓａｒｔ−ｐｌｕｓ  ０．２２μｍフィルター（独国Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）を用いて濾過した。
この培養上清を用いて、ヒト腎臓近位尿細管細胞株（ＣＬ−８細胞）のリン酸輸送活性に対する作用を検討した。ヒト腎臓近位尿細管細胞株は、１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）を用いて５％ＣＯ２，湿度１００％下３７℃にて培養した。リン輸送活性の測定には、まず４８−ウェルプレート（米国コーニング社）にヒト腎臓近位尿細管細胞株を１０％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で培養した。培養開始から３日目に細胞がプレート底面の全体を覆うようにまで増殖したところで培養液を２００μｌの無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ（米国ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）に置き換え、さらに２０〜２４時間培養した。この状態の細胞を用いて以下のリン酸輸送活性測定実験（実験１と実験２）を実施した。
（１）実験１：
ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ培地を除去して、上述のＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ培地で調製したＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞の培養上清をウェルあたり２００μｌ添加した。このとき対照として、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩを置換しないウェル、および、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈと同様に調製したＣＨＯ−ＯＳＴ１９０Ｈ細胞の培養上清を２００μｌ添加したウェルを、それぞれ３ウェルずつ作製した。上述のＣＨＯ−ＯＳＴ１９０Ｈ細胞は、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞と同様の方法で本発明者がクローン化したＯＳＴ１９０Ｈを発現できる形でＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１に導入して作製した組み換え体細胞である。ＣＨＯ−ＯＳＴ１９０Ｈは、Ｒｏｗｅ，Ｐ．Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６７：５４−６８，２０００で報告されている、ＭＥＰＥと名付けられたポリペプチドと同じポリペプチドのＣ末端に、ＯＳＴ３１１Ｈと同様にＨｉｓ６タグ配列を付与したものを発現する。このサンプル添加後、さらに２６時間ＣＯ２インキュベーター内でインキュベートしたのち、次に示すリン酸輸送活性測定法により、各ウェルの細胞のリン酸輸送活性を測定した。
（２）実験２：
２００μｌのＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩのうち１００μｌを除去した。これにＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞の培養上清１００μｌを添加したウェル、および、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞培養上清を１００μｌ添加したウェルを、それぞれ３ウェルずつ作製して２４時間ＣＯ２インキュベーター内でインキュベートした。その後、以下のリン酸輸送測定法により、各ウェルの細胞のリン酸輸送活性を測定した。
リン酸輸送活性測定法：
培養上清を添加してインキュベーションが終了した細胞をリン酸を含まない緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）で洗浄したのち、同溶液で１０分間室温でインキュベートする。この液を除去し、この緩衝液に放射活性を含むＫＨ２ＰＯ４（ＮＥＮ社）を０．１０５ｍＭとなるように加えたアッセイ溶液を添加して、室温で１０分間インキュベートする。インキュベート終了後、アッセイ溶液を除去して直ちに氷冷しておいた停止溶液（１５０ｍＭ塩化コリン、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１．８ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４）で細胞を３回洗浄する。この洗浄液を除去したのち、０．２Ｎ  ＮａＯＨを８０μｌ添加して室温で１０分間インキュベートし、細胞を溶解させた。この細胞溶解液中の放射活性を測定するために、この溶解液をＲｅａｄｙＣａｐ（Ｂｅｃｋｍａｎ社）に移して５０℃で乾燥させた後、ガラスバイアルに入れてシンチレーションカウンター（Ｗａｌｌａｃ１４１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）で測定した。各アッセイにおけるリン酸輸送活性は、培養上清を添加しなかった対照における取り込みの平均値を１００％として表２に示した。ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞の培養上清は、有意にヒト腎臓近位尿細管上皮細胞のリン酸輸送活性を抑制した。
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実施例８  ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ培養上清からの組換えＯＳＴ３１１の部分精製
実施例７に記載した要領で調製した培養上清を、以下に示す方法で部分精製した。なお、工程１）から４）は４℃クロマトチャンバー内で実施した。
１）ＰｒｏＢｏｎｄニッケルレジン（米国ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）をベッドボリュームが３ｍｌとなるよう使い捨てポリプロピレンカラムに詰め、３０ｍｌのバッファー１（表３）で洗浄、平衡化した。
２）実施例７に記載した要領で調製した培養上清１２０ｍｌを上記ニッケルカラムに自由落下により供し、組換えＯＳＴ３１１を結合させた。
３）表３に示すバッファー２を３０ｍｌ用い、非特異的に吸着しているタンパク質を除去した。
４）表３に示すバッファー３を３ｍｌずつ４回にわけて添加し、組換えＯＳＴ３１１を溶出した。４つの画分を２０μｌずつ、それぞれ原液のまま実施例６（３）に記載した要領でウエスタンブロッティングに供し、抗Ｈｉｓ抗体でＯＳＴ３１１の検出を試みた。
その結果、第２画分に集中して約３２ｋＤａおよび約１０ｋＤａのシグナルが認められた。
５）上記第２画分をＮＡＰ２５およびＮＡＰ１０カラム（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）に供し、溶媒を表３に示すバッファー４に置換した。
６）バッファー４に置換した組換えＯＳＴ３１１を、高速液体クロマトグラフィー（日本国日立製作所）を用い、強陽イオン交換樹脂であるＳＰ−５ＰＷ（日本国トーソー社）に１ｍｌ／分の流速で供し、表３に示すバッファー５を１％／分の勾配で加えることにより溶出し、２ｍｌずつ分取した。図２に示すように、それぞれの溶出画分について、実施例８（５）の要領でウェスタンブロッティングを実施しＯＳＴ３１１の検出を試みたところ、約２８０ｍＭ  ＮａＣｌで約１０ｋＤａのシグナルが分離され、約４００ｍＭ  ＮａＣｌで約３２ｋＤａのシグナルが分離されたことを確認した。対応する画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、銀染色キット（日本国第一化学社）を用いて染色したところ、約１０ｋＤａおよび約３２ｋＤａを含む画分の純度は７０％以上であった。
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実施例９  部分精製した組換えＯＳＴ３１１のＮ末端アミノ酸配列解析
実施例８に記載した方法で得られた、抗Ｈｉｓ抗体で認識される約１０ｋＤａおよび約３２ｋＤａの部分精製画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、セミドライブロッティング装置（米国Ｏｗｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、ゲル中の蛋白質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦ膜（米国ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）に転写した。このＰＶＤＦ膜をＣＢＢ染色することで約１０ｋＤａおよび約３２ｋＤａのバンドを切り出し、プロテインシーケンサＭｏｄｅｌ４９２（米国ＰＥアプライドシステムズ社）を用いてＮ末端アミノ酸配列を決定した。
その結果、約３５ｋＤａのバンドのＮ末端アミノ酸配列は、配列番号２の残基番号２５番目のＴｙｒから始まるＯＳＴ３１１の配列であることが判明し、このことから配列番号２の残基番号１番目のＭｅｔから２４番目のＡｌａまでは分泌シグナル配列として切断されていることが確認された。一方、約１０ｋＤａのバンドのＮ末端アミノ酸配列は、配列番号２の残基番号１８０番目Ｓｅｒから始まるＯＳＴ３１１の配列であることが判明した。この１８０番目Ｓｅｒの直前にＲＲＸＸＲからなるモチーフが存在していることから、組換えＯＳＴ３１１はＣＨＯ細胞由来の何らかのプロテアーゼにより切断を受けていることが判明した。
以上のことから、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞が産生する組換えＯＳＴ３１１は、分泌後、配列番号２において、残基番号２５番目Ｔｙｒから２５１番目Ｉｌｅまでのポリペプチド（配列番号４）、残基番号２５番目Ｔｙｒから１７９番目Ａｒｇまでのポリペプチド（配列番号６）、残基番号１８０番目Ｓｅｒから２５１番目Ｉｌｅまでのポリペプチド（配列番号８）の少なくとも３種類のポリペプチドとして存在していることが判明した。
実施例１０  抗ＯＳＴ３１１部分ペプチドポリクローナル抗体の作製
配列番号２のポリペプチドをＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ６．５．１の計算機能を用いて、疎水性度を予測し、ペプチド抗体作製に適した部位を予測した（図３ＡおよびＢ）。親水性の程度が高く、かつ糖鎖修飾やリン酸化部位となりうる部位以外という観点から、配列番号２の残基番号４８番目Ａｒｇから始まる２０アミノ酸からなるペプチドにＣ末端に合成段階でシステイン残基を人工的に付加した３１１−４８（配列番号２８）および、残基番号１１４番目Ａｒｇから始まる２０アミノ酸からなるペプチドに同様にシステイン残基を付加した３１１−１１４（配列番号２９）を抗原として選択、合成した。なお、両ペプチドのＣ末端に合成段階でシステイン残基を人工的に付加し、キャリア蛋白質（ウシサイログロブリン）との結合に用いた。キャリア蛋白質との結合およびウサギへの免疫は、免疫生物研究所（群馬県藤岡市１０９１番地１号）に委託した（受託番号：１５１５）。
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実施例１１  ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞のヌードマウスへの移植試験
ＯＳＴ３１１が腫瘍性骨軟化症の惹起因子であるかを検証するため、６週齢ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雄）にＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞を移植し、腫瘍を形成させることにより、恒常的に腫瘍から組換えＯＳＴ３１１を分泌するマウス腫瘍性骨軟化症モデルを構築した。実験対照としてＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞と実施例７に記載したＣＨＯ−ＯＳＴ１９０Ｈも同様に移植実験に用いた。
（１）ＣＨＯ細胞移植
ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞とＣＨＯ−ＯＳＴ１９０細胞を培養フラスコからトリプシン処理により分散させ、１×１０８個／ｍｌとなるようＰＢＳに懸濁し、これをヌードマウスの両脇腹に０．１ｍｌずつ皮下注射した（２×１０７個／匹）。また、対照群として、同数個のＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞を同様の方法で皮下注射した。その後、約１か月間、固形食ＣＥ−２（日本国日本クレア社）および水道水を自由摂取させ、５匹ずつプラスチックケージで飼育した。移植して２週間経過した時点での腫瘍形成の認められる割合は、対照群が７５％、ＯＳＴ３１１群が６６．７％であった。
（２）体重変化の比較
ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞を移植してから３１日間の、非腫瘍形成群（ａｖｒ．−で表示されたグラフ）およびＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞腫瘍形成群（ａｖｒ．＋で表示されたグラフ）の平均体重の経時変化を比較した。図４に示すように、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞腫瘍形成群は非腫瘍形成群に比し、体重増加抑制を示し、両群間には明らかに有意差が認められた（２４．１±１．５ｇ  ｖｓ．２６．７±１．０ｇ，ｐ＜０．００１，ｄａｙ３１）。一方、対照ＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞腫瘍形成群と非腫瘍形成群との平均体重において、同様な差は認められなかった（２７．０±１．８ｇ  ｖｓ．２６．７±１．０ｇ，有意差無し，ｄａｙ３１）。
（３）血清リン、カルシウムおよび尿中リン、カルシウムの測定
細胞移植して３０から４０日後、代謝ケージで２４時間飼育し尿を回収後、エーテル麻酔下、心採血または眼窩採血を実施した。末梢血は、マイクロテイナ（米国ベクトンディッキンソン社）により血清分離した。尿は容量測定後、遠心分離により上清を回収した。血清、尿中リン濃度の測定はリン−テストワコー（日本国和光純薬社）を、血清、尿中カルシウム濃度の測定はカルシウム−テストワコー（日本国和光純薬社）を、血清、尿中クレアチニン濃度の測定はＣＲＥ−ＥＮカイノス（日本国カイノス）をそれぞれ用いて実施した。
実験１：
細胞移植後３４日目における、非腫瘍形成群、ＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞腫瘍形成群、ＣＨＯ−ＯＳＴ１９０Ｈ細胞腫瘍形成群、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞腫瘍形成群の血清リン酸濃度を測定した。
実験２：
細胞移植後４４日〜４６日目の腫瘍非形成群とＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞腫瘍形成群での血清および尿中のリン酸濃度、カルシウム濃度、クレアチニン濃度を測定した。腎臓のリン酸およびカルシウム分画排泄は、リン酸又はカルシウムのクリアランスをクレアチニンクリアランスで除して求めた。
測定結果を以下の表４に示す。
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（４）全身骨格のＸ線撮影
ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞移植後、腫瘍形成の認められる個体は、非腫瘍形成個体あるいは対照ＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１移植個体と比し、顕著な体格異常と歩行機能異常を呈したことから、骨格異常が予想された。そこで、対照ＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞移植群、ＣＨＯ−ＯＳＴ１９０Ｈ細胞移植群、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞移植群より、腫瘍形成の認められる個体を無作為に抽出し、Ｘ線撮影装置μＦＸ−１００（日本国フジフィルム社）を用い、添付文書に従ってＸ線撮影を実施した。Ｘ線撮影は、管電圧２５ｋＶ、管電流０．１ｍＡ、照射時間１０秒で行い、専用イメージングプレートに露光し、ＢＡＳ２０００（日本国フジフィルム社）を用いて画像解析を行った。
その結果、図５に示すとおり、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ移植個体において骨組織のＸ線像輝度の減弱が全身に認められ、石灰化の低下が認められた。また胸郭の変形などの骨格異常も認められた。
（５）血清リン、カルシウム濃度およびアルカリホスファターゼ活性の測定
細胞移植して４４日と４６日目に心臓より採血して得た血清を−２０℃で一旦保存した後、一斉に解凍して各血清に含まれるリン濃度、カルシウム濃度を再度測定するとともに、アルカリホスファターゼ活性についても測定した。リン濃度の測定はリン−テストワコー（日本国和光純薬社）を、カルシウム濃度の測定はカルシウム−テストワコー（日本国和光純薬社）を、アルカリフォスファターゼ活性の測定はカルシウムアルカリ性ホスファ  Ｂ−テストワコー（日本国和光純薬社）をそれぞれ用いて実施した。結果を腫瘍非形成群（ｎ＝６）、ＣＨＯ腫瘍形成群（ｎ＝１０）、ＣＨＯ−ＯＳＴ１９０Ｈ細胞腫瘍群（ｎ＝１０）及びＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ腫瘍群（ｎ＝６  ｘ  ２）に分類した。ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ群は４４日目に屠殺した群（ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ−１：ｎ＝６）と４６日目に屠殺した群（ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１−２：ｎ＝６）との２つに分類した。図７に示すように、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ腫瘍群において、血清リン濃度の低下（図７Ａ）、血清カルシウムの低下（図７Ｂ）および血清アルカリホスファターゼ活性の上昇（図７Ｃ）といったいずれも有意な変化が認められた。
（６）腎臓近位尿細管上ナトリウム・リン酸共役輸送担体（ＮａＰｉ−７）の発現
ｉ）近位尿細管上皮細胞冊子縁膜（以下、ＢＢＭと称す）の調製
ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ腫瘍形成個体および非腫瘍形成個体より、ジエチルエーテル麻酔下、腎臓を摘出し中央部を冠状断に二等分した（実験１：ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ腫瘍形成個体６例、非腫瘍形成個体４例、実験２：ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ腫瘍形成個体６例、非腫瘍形成個体２例）。それぞれの個体より摘出した０．５個分の腎臓を用い、Ｋｅｓｓｌｅｒらが報告したプロトコールに従い、ＢＢＭを調製した（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．５０６，ｐｐ．１３６−１５４）。
腎臓を、３ｍｌのホモジナイズバッファー（５０ｍＭマンニトール，２ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５）中でガラス製ホモジナイザーを用い、１，３００ｒｐｍで２分間、破砕懸濁し均質な腎臓抽出液を得た。これに終濃度１０ｍＭとなるようＣａＣｌ２を加え、４℃で１５分間撹拌した後、４，９００ｇで１５分間、４℃で遠心分離した。得られた上清をキムワイプで濾過した後、さらに１６，２００ｇで６０分間、４℃で遠心分離することで、ＢＢＭを多く含む画分を沈殿させた。この沈殿物を５ｍｌのサスペンジョンバッファー（５０ｍＭマンニトール，２ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５）中に分散した後、再度１６，２００ｇで６０分間、４℃で遠心分離した。この操作を２回繰り返した後、０．１ｍｌのサスペンジョンバッファーに溶解した。得られた溶液を定法に従い蛋白質濃度定量を実施したところ、３から４ｍｇ／ｍｌであった。
ｉｉ）ＢＢＭ蛋白質のウェスタンブロッティング
上述の通り、個々のマウスより調製したＢＢＭ蛋白質をそれぞれ１０μｇ／μｌとなるようサスペンジョンバッファーで希釈し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ６．８、５％ＳＤＳ、５０％グリセロール、１００ｍＭ  ＤＴＴを含むサンプルバッファーを２．５μｌ添加し、９５℃、５分間加熱した後、１０−２０％勾配のポリアクリルアミド電気泳動にてＢＢＭ溶液中の蛋白質を分離した。その後、セミドライブロッティング装置（米国Ｏｗｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、ゲル中の蛋白質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ  ＰＶＤＦ膜（米国ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）に転写した。このＰＶＤＦ膜を、ＴＴＢＳバッファー（米国Ｓｉｇｍａ社）中で１／２０００希釈した抗ＮａＰｉ−７ポリクローナル抗体と室温で３時間インキュベーションした。本抗体は、キリンビール株式会社医薬探索研究所内にて、マウスＮａＰｉ−７のＣ末端部位に相当する合成ペプチド（ＬＡＬＰＡＨＨＮＡＴＲＬ）を定法によりウサギに免疫して得られたポリクローナル抗体である。本抗体との反応後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合した抗ウサギＩｇＧ二次抗体（デンマークＤＡＫＯ社）とインキュベーションし、ＥＣＬ発光システム（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いてバンドを検出した。
還元条件下、本抗体により約８０ｋＤａ、約３５ｋＤａおよび約１７０から２００ｋＤａの高分子スメアが確認される（図８）。このバンドパターンは、Ｔａｔｓｕｍｉらが、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２７３，ｐｐ２８５６８−２８５７５，１９９８に報告している事例と一致すること、また、マウスあるいはラットの食事中リン酸摂取量に応じて、これらのバンドが一様に変化することがすでに確認されていることから、ＮａＰｉ−７由来のポリペプチドであることが判明している。図８に示した様に、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ腫瘍形成個体から調製したＢＢＭ蛋白質に含まれるＮａＰｉ−７のシグナルは、前述の断片すべてにおいて（矢印で示したバンド）、非腫瘍形成個体から調製したそれと比べ、顕著に減弱していた。この結果は、独立して実施した実験１および２において、再現された。一方、これらのＢＢＭ蛋白質を１０−２０％勾配のポリアクリルアミド電気泳動にて分離後、ＣＢＢ染色した結果、それぞれのＢＢＭ蛋白質が一様に染色されたことから、ウェスタンブロッティングにおけるシグナルの減弱は、ＮａＰｉ−７に特異的なものであることがわかる（図８）。この事実より、ＯＳＴ３１１蛋白質は腎臓の近位尿細管細胞に作用し、ＮａＰｉ−７の発現量を蛋白質レベルで下方修正することにより、低リン酸血症を惹起していることが推察される。
（７）腎臓および小腸におけるリン酸輸送担体とビタミンＤ代謝酵素のｍＲＮＡの変動解析
ｉ）トータルＲＮＡの調製
細胞移植後４４日〜４６日目に屠殺したマウスより小腸と腎臓を摘出した。腎臓はドライアイスにて急速に冷凍した。凍結した腎臓は−８０℃超低温フリーザー中にて使用時まで凍結保存した。凍結された腎臓１個をＩＳＯＧＥＮ（日本国ニッポンジーン社）５ｍｌに溶解し、添付文書に従ってトータルＲＮＡを調製した。調製したトータルＲＮＡ１５μｇを常法にしたがって、アガロース濃度１％のホルムアルデヒド含有変性ゲルにて電気泳動し、キャピラリートランスファー法によって一夜、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（米国アマシャムファルマシア社）に転写した。転写されたフィルターをストラタリンカー（米国ストラタジーン社）にてＵＶを照射し、転写されたＲＮＡを固定、２ＸＳＳＣで洗浄後、風乾し、使用時まで室温にて保存した。小腸は生理食塩水にて内容物を洗浄除去し、反転させたのち、プレパラートにて小腸上皮を掻き取り液体窒素にて急速に冷凍した。凍結した小腸上皮は−８０℃超低温フリーザー中にて使用時まで凍結保存した。凍結された小腸上皮をＩＳＯＧＥＮ（日本国ニッポンジーン）５ｍｌに溶解し、添付文書に従ってトータルＲＮＡを調製した。調製したトータルＲＮＡ２０μｇを常法にしたがって、アガロース濃度１％のホルムアルデヒド含有変性ゲルにて電気泳動し、キャピラリートランスファー法によって一夜、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（米国アマシャムファルマシア社）に転写した。転写されたフィルターをストラタリンカー（米国ストラタジーン社）にてＵＶを照射し、転写されたＲＮＡを固定、２ＸＳＳＣで洗浄後、風乾し、使用時まで室温にて保存した。
ｉｉ）プローブ用鋳型ＤＮＡの調製
個体番号１のマウスより調製したトータルＲＮＡ５μｇを用いて２０μＬの反応液中（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．３），７５ｍＭ  ＫＣｌ，３ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＤＴＴ，２５ｇ／ｍＬ（ｄＴ）１８，２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ，ＭＭＬＶ逆転写酵素（日本国東洋紡）２００ｕｎｉｔｓ）、３７℃、１時間ｃＤＮＡを合成させた後、７０℃、１５分間処理して酵素を失活させた。合成されたｃＤＮＡは５倍に稀釈し、以下の反応に使用した。
ＧｅｎＢａｎｋ（米国ＮＣＢＩ）に登録されている配列から以下のプライマーを合成し、ＰＣＲ反応に使用した。
マウスＧＡＰＤＨｃＤＮＡ取得用合成プライマー
0004799801.tif 000011
マウスＮｐｔ−１ｃＤＮＡ取得用合成プライマー
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マウスＮａＰｉ−７ｃＤＮＡ取得用合成プライマー
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マウスＮａＰｉ−２ｂ  ｃＤＮＡ取得用合成プライマー
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マウスビタミンＤ１α水酸化酵素ｃＤＮＡ取得用合成プライマー
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マウスビタミンＤ２４水酸化酵素ｃＤＮＡ取得用合成プライマー
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ＴａｋａＬａ  ＬＡ−Ｔａｑ（日本国宝酒造）の添付文書にしたがって反応液を調製し、５０ｍＬ反応液中に上記ｃＤＮＡ１μＬ、及びプライマー各１０ｐｍｏｌを添加し、９４℃で１分保温したのち、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のインキュベートを１サイクルとして４０サイクル増幅し、０．８％アガロースゲル電気泳動にて増幅バンドを分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１社）を用いて目的の断片を回収した。ＧＡＰＤＨに関しては本操作で得られた断片を鋳型としてメガプライムラベリングキット（米国アマシャムファルマシア社）を用いて３２Ｐ標識プローブを調製し、以下のハイブリダイゼーションに使用した。他の遺伝子については取得したＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（米国プロメガ）に組みこみ、大腸菌ＤＨ５αに導入した。Ｔ７（配列番号４２）及びＳＰ６プライマー（配列番号４３）を各１０ｐｍｏｌ添加したＰＣＲ反応液に形質転換大腸菌を添加し、９４℃で１０分保温したのち、９４℃にて３０秒、５５℃にて３０秒、７２℃にて１分を１サイクルとして４０サイクル増幅した。反応液を０．８％アガロースゲル電気泳動にて増幅バンドを分離してジーンクリーンＩＩ（米国Ｂｉｏ１０１）にて目的の断片を抽出した。
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以上の操作によって得られた増幅断片の塩基配列は、ＡＢＩ３７７ＤＮＡシーケンサー（米国ＰＥアプライドシステムズ社）を用いて決定し、それぞれ目的の断片を取得したことを確認した。このようにして得たＤＮＡ断片をメガプライムラベリングキット（米国アマシャムファルマシア）を用いて３２Ｐ標識し、以下のハイブリダイゼーションにおいてプローブとして使用した。
ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションはＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（米国クロンテック社）またはＰｅｒｆｅｃｔｈｙｂハイブリダイゼーション溶液（日本国東洋紡）を用いて、添付文書に従って実施した。ハイブリダイゼーション、洗浄終了後、イメージングプレート（日本国富士フィルム社）に３０分から１夜の間露光し、ＢＡＳ２０００イメージアナライザー（日本国富士フィルム社）にて解析した（図９Ａ〜Ｃ）。併せて目的のバンドのシグナル強度を測定した。それぞれの遺伝子のシグナル強度をＧＡＰＤＨのシグナル強度で補正したのち、非腫瘍形成群（個体番号１〜４）と腫瘍形成群（個体番号５〜１０）の平均値の比を求めた。以下の表５にその値を記す。ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ腫瘍形成に伴い、腎臓のＩ型のリン酸輸送担体（ＮＰＴ−１）は大きく変動しなかったが、腎臓のＩＩ型リン酸輸送担体であるＮａＰｉ−７のｍＲＮＡは顕著に減少した。また、小腸のリン酸輸送担体であるＮａＰｉ−ＩＩｂのｍＲＮＡも顕著な減少が認められた。一方、腎臓のビタミンＤ代謝酵素に関しては、２５−ｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎＤ−１−α−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（１α  ＯＨａｓｅ）と２５−ｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎＤ−２４−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（２４ＯＨａｓｅ）のｍＲＮＡがともに上昇していた。
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（８）血清１，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎＤ濃度の測定
腫瘍移植後４４日目および４６日目に採取したコントロール群マウスの血清とＯＳＴ３１１Ｈ群マウスの血清を各個体より等量づつ採取して、総量０．５ｍｌとして三菱化学ビーシーエルに提出し、血清に含まれる１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの濃度を、臨床検査と同様の方法で測定した。その結果、コントロール群とＯＳＴ３１１群の血清中１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの濃度は、それぞれ２８．０ｐｇ／ｍｌと２３．９ｐｇ／ｍｌであった。上述のとおり、低リン酸血症、低カルシウム血症が認められるにも関わらず、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの濃度が上昇しないことは、明らかにＯＳＴ３１１による作用の結果としてビタミンＤ代謝が影響を受けていることを示すものである。
（９）大腿骨のＸ線撮影
非腫瘍形成マウスとＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１、ＣＨＯ−ＯＳＴ１９０Ｈ、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈを移植したマウスを移植後４４日目から４６日目に屠殺して大腿骨を採取し、４％の中性ホルマリンで３日間固定した。その後、骨周囲の軟組織を除去して、各群より２個体を無作為に抽出して、Ｘ線撮影装置μＦＸ−１００（日本国フジフィルム社）を用いて、管電圧２５ｋＶ、管電流０．１ｍＡ、照射時間５秒でＸ線を照射し、イメージングプレートを露光した。その結果を図１０に示す。ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ群で皮質骨の骨梁骨の減少が認められた。
実施例１２  ＯＳＴ３１１の塩基配列相同性とゲノム領域の解析
配列番号２に示されるアミノ酸配列および配列番号１に示される塩基配列の少なくとも一部を用いて、ＯＳＴ３１１に相当する分子を種を超えて検索することができる。配列番号１の一部の塩基配列を用いてマウスのゲノム配列データベースを検索することでＧｅｎｂａｎｋにアクセッション番号ＡＣ０  １５５３８で登録されているマウス６番染色体の配列中に、ＯＳＴ３１１と相同性の高い配列を見出した。この配列より得られたマウスＯＳＴ３１１の部分ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１０に、ｃＤＮＡの部分配列に相当する塩基配列を配列番号９に示した。ヒトＯＳＴ３１１ポリペプチドとマウスＯＳＴ３１１のポリペプチドとの間におけるアミノ酸の相同性を比較した結果を図６に示す。実施例１１で示したように、ヒトのアミノ酸配列を有するＯＳＴ３１１ポリペプチドは、マウスにおいて明確な生物活性を有していることが明らかとなった。これらのことは図６に示すアミノ酸配列で相同性の低い領域のアミノ酸を置換したり欠失させたり、若しくはアミノ酸を挿入したりしても活性が保持されやすいことを示す。
配列番号１に示す塩基配列をデータベースで一致する領域が認められたヒト１２ｐ１３  ＢＡＣ  ＲＰＣＩ１１−３８８Ｆ６（アクセッション番号ＡＣ００８０１２）と照合して、ＯＳＴ３１１がコードされる領域の配列を同定した。配列番号１１にＯＳＴ３１１の遺伝子近傍の塩基配列を示した。配列番号１１の塩基番号４９８番から５０２番にＴＡＴＡＡボックスがある。配列番号１１の塩基番号１７１３番から本発明者が同定したｃＤＮＡ配列（配列番号１）と一致する配列が出現し、２０５７番まで続く。次に配列番号１に示した塩基配列と一致する部分は、配列番号１１の塩基番号８７３２番から８８３３番までである。ここはｅｘｏｎ２と考えられる。そして最後に現れる配列番号１に示した塩基配列と一致する部分は配列番号１１の塩基番号１０６４４番から始まり、配列番号１１の塩基番号１２９６６番が配列番号１の塩基配列と一致する末尾である。この配列番号１１の塩基番号４９８番から塩基番号１２９６６番までの配列はＯＳＴ３１１をコードする遺伝子の少なくとも一部であると考えられる。また、ｅｘｏｎ１とｅｘｏｎ２との間にはＧｅｎｂａｎｋにアクセッション番号Ｇ１９２５９で登録されているＳＴＳ配列があることが判明した。ＯＳＴ３１１は、１２ｐ１３領域にあるがＥｃｏｎｓ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：２６５３−２６５７，１９９７によると、常染色体性のビタミンＤ抵抗性くる病（ＡＤＨＲ）の責任遺伝子は、連鎖解析の結果、１２ｐ１３のマイクロサテライトマーカーであるＤ１２Ｓ１００とＤ１２Ｓ３９７との間の１８ｃＭ内（特にＤ１２Ｓ３１４とＤ１２Ｓ３９７の間の約１０ｃＭ）に存在することが推定されている。本発明者は、ＯＳＴ３１１の遺伝子と上記マイクロサテライトマーカーの１２番染色体上の物理的位置を調べた。その結果、Ｄ１２Ｓ１００およびＤ１２Ｓ３１４が４６０２〜６１２９ｋｂ、ＯＳＴ３１１が８９５８〜９１２９ｋｂ、Ｄ１２Ｓ３９７が１６２８０〜１６５３７ｋｂという結果を得た。これらの結果と、ＯＳＴ３１１が持つ強力なリン代謝調節活性とを考えると、ＯＳＴ３１１がＡＤＨＲの責任遺伝子であるということが分かった。
実施例１３  ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞のヌードマウスへの短期移植試験
ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞をヌードマウス（６週齢、ＢＡＬＢ／ｃ、雄）の背部皮下に移植し、２日後および６日後における血清リン酸、カルシウム濃度を測定して、組換えＯＳＴ３１１が短期間で与える影響について検討した。実験対照としてＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞を同様に移植実験に用いた。
（１）ＣＨＯ細胞移植
実施例１１の（１）に記載した方法と同様に、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞およびＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞を２×１０７個ずつヌードマウスに皮下移植した（ｎ＝６ずつ）。また、同容量のＰＢＳを同様に皮下移植した（ｎ＝６）。各群６匹毎を、プラスチックケージで飼育し、固形食ＣＥ−２（日本国日本クレア社）および水道水を自由摂取させた。移植して６日間経過した時点において、顕著な腫瘍形成は認められなかった。
（２）細胞移植後２日目における血清リン、カルシウム濃度の測定
細胞移植した翌日、エーテル麻酔下、眼窩採血を実施した。末梢血は、マイクロテイナ（米国ベクトンディッキンソン社）により血清分離した。血清リン濃度の測定はリン−テストワコー（日本国和光純薬社）を、血清カルシウム濃度の測定はカルシウム−テストワコー（日本国和光純薬社）をそれぞれ用いて実施した。図１１Ａに示すように、ＰＢＳ投与群およびＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞移植群に比し、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞移植群は全例において、血清リン酸濃度の有意な低下を認めた。一方、血清カルシウム濃度においては、変化は認められなかった。これらの結果から、ＯＳＴ３１１は投与２日後において、血清リン酸濃度のみを低下させることが明らかとなった。
（３）細胞移植後６日目における血清リン、カルシウム濃度の測定
細胞移植後６日目、エーテル麻酔下、心採血を実施した。上述のごとく、各群の血清リン酸、カルシウム濃度をそれぞれ測定した。図１１Ｂに示すように、移植後２日目と同様、ＰＢＳ投与群およびＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞移植群に比し、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞移植群は全例において血清リン酸濃度の有意な低下を認めた。一方、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞移植群は全例において血清カルシウム濃度の若干の低下を認めた。
実施例１４  組換え体ＯＳＴ３１１の精製
ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞を２２５ｃｍ２培養フラスコ（米国コーニング社）で３７℃、５％ＣＯ２，湿度１００％下、１０％ＦＣＳ入りＭＥＭα培地でフラスコ面積の約８０％を占めるまで増殖させた後、培地を無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ（米国ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ社）５０ｍｌに置き換え、４８時間後に上清を回収した。この要領で得られた、計１，０００ｍｌの培養上清を用いて、以下の方法で組換えＯＳＴ３１１を精製した。
培養上清１０００ｍｌを、１６，２００ｇで１５分間、４℃で遠心分離し、浮遊細胞を除去した後、上清を内径３０ｍｍ×長さ２００ｍｍのガラスカラムにパッキングしたＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（アマシャムファルマシア社、米国）に供し、その素通り画分を金属キレートレジンであるＴａｌｏｎ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社、米国）に吸着させた。非特異的な吸着物を５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．６）および０．３Ｍ  ＮａＣｌからなる洗浄バッファーで除いた後、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．７）および０．２Ｍ  Ｉｍｉｄａｚｏｌｅで溶出した。図１２の右パネルには、抗Ｈｉｓ６抗体（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社、米国）を用いてこの溶出画分を検出したウェスタンブロッティングの結果を示す。この画分には、実施例９に記載したアミノ酸残基１８０番Ｓｅｒから２５１番Ｉｌｅからなる部分ポリペプチド（配列番号８）が含まれている。一方、前述のＳＰ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦに吸着した培養上清中に含まれる蛋白質は、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．７）および０から０．７ＭまでのＮａＣｌ濃度勾配を用いて溶出させた。図１２の左パネルには、抗Ｈｉｓ６抗体（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社、米国）を用いて検出したウェスタンブロッティングの結果を示す。この約０．３Ｍ  ＮａＣｌで溶出される画分には、実施例９に記載したアミノ酸残基２５番Ｔｙｒから２５１番Ｉｌｅからなる部分ポリペプチド（配列番号４）が含まれている。また、図１２の中央パネルは、実施例１０で記載したＯＳＴ３１１部分ペプチド（配列番号２９）を用いて作製したポリクローナル抗体（３１１−１１４）によって検出したウェスタンブロッティングの結果を示す。この約０．４Ｍ  ＮａＣｌの濃度で溶出される画分には、実施例９に記載したアミノ酸残基２５番Ｔｙｒから１７９番Ａｒｇからなる部分ポリペプチド（配列番号６）が含まれている。このようにして、３種類のＯＳＴ３１１部分ペプチド、即ち、配列番号４（以下３１１：２５−２５１と称す）、配列番号６（以下３１１：２５−１７９と称す）、配列番号８（以下３１１：１８０−２５１と称す）を含む画分は精製分離された後、限外分子量１０，０００のＶＩＶＡＳＰＩＮカラム（ザルトリウス社、米国）を用いて濃縮し、１ｍｌの５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．９）および０．１Ｍ  ＮａＣｌからなる溶媒に置換された。
実施例１５  骨非脱灰切片の組織学的検討
実施例１１で作製したＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞移植マウスと腫瘍なしマウスの屠殺時に、右大腿骨と脛骨を、その膝関節で結合した状態で摘出した。そして脛骨骨幹部と大腿骨骨幹部で切断し即座に氷冷しておいた中性ホルマリン中に保存し、非脱灰標本を作製した。以下に非脱灰標本の作製方法を記載する。
骨組織をＶｉｌｌａｎｕｅｖａ  ｂｏｎｅ  ｓｔａｉｎにて３〜７日間前染色を行った。アルコール脱水列で脱水後アセトンで置換し、アセトン・モノマー、モノマーを通した後に樹脂包埋を行った。樹脂は包埋用メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）樹脂を用い、樹脂内に組織が十分に包埋されるように適宜ＭＭＡを追加しながら、約３５℃の恒温器に入れて完全重合させた。ここで用いた包埋用ＭＭＡは、ＭＭＡモノマー（日本国、和光純薬工業社）１００ｍｌに対して、ＭＭＡポリマー（日本国、和光純薬工業社）を４０ｇ加えて完全に溶解させた後、Ｂｅｎｚｏｙｌ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ（日本国、ナカライテスク社）を１ｇの割合で加えて、完全に溶解させたものである。標本は脛骨に対して作製することとし、脛骨の海面骨が観察できるように前額断面でトリミングを行ったのちに硬組織用ミクロトーム（ＲＭ２０６５型スーパーカット、ライカ社製）を用いて厚さ４μｍの前額断面標本を作製した。後染色としてＶｉｌｌａｎｕｅｖａｇｏｌｄｎｅｒ染色を実施した。このようにして得られた標本はキシレン透徹後にクリアシール（日本国、マルトー社）およびワンライト（日本国、マルトー社）を用いて封入した。
標本の顕微鏡観察像を図１３に示す。ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ腫瘍マウスでは対照に比して、成長板幅の増大が認められた。また骨幹端部において、著しい類骨の増大と石灰化領域の減少が認められた。繊維性骨炎の所見は認められず、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ腫瘍マウスより採取した骨は典型的な骨軟化症の所見を呈していた。
実施例１６  ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞移植後早期におけるビタミンＤ代謝の検討
ＯＳＴ３１１のビタミンＤ代謝へ与える影響を検討するため、実施例１３に記載した方法と同様に、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞のヌードマウス（６週齢、ＢＡＬＢ／ｃ、雄）への移植試験を実施した。実験対照として、ＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞を同様に移植した群、及び細胞懸濁液と同用量のＰＢＳを投与した群の２群を設置して比較に用いた。各群は６匹のマウスから構成され、各群毎にマウスをプラスチックケージで飼育し、水道水並びに１．０３％の無機リン酸および１．１８％のカルシウムを含んだ固形食ＣＥ２（日本クレア社、日本国）を自由摂取させた。移植後、１、２、３、６日目における血清１，２５−ヒドロキシビタミンＤ濃度の変動およびビタミンＤ代謝酵素群の発現変化を検討した。
（１）血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度の測定
細胞移植後１、２、３、６日目において、ＰＢＳ投与群、ＣＨＯ−ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞移植群およびＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞移植群のマウスより、エーテル麻酔下、心採血を実施し、マイクロテイナ（ベクトンディッキンソン社、米国）を用いて血清を分離した。各群毎に、個々のマウスより得られた血清を等量ずつ混合し、総量を０．２５ｍｌとして、これらに含まれる１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの濃度を、１，２５（ＯＨ）２Ｄ  ＲＩＡキット「ＴＦＢ」（テイエフビー社、日本国）を用いて測定した。その結果、表６に示すように、ＰＢＳ投与群、ＣＨＯ−ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞移植群に比し、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞移植群において、移植後１日目ですでに１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度の有意な低下を認めた。この低下作用は、移植後２、３、６日目においても認められた。この結果は、腫瘍性骨軟化症における顕著な臨床所見の一つである、血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度の低下と一致している。
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（２）腎臓におけるビタミンＤ代謝酵素遺伝子の発現解析
上述の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３低下作用が、腎臓に発現する２５−ヒドロキシビタミンＤ−１−α−水酸化酵素（１αＯＨａｓｅ）あるいは、２５−ヒドロキシビタミンＤ−２４−水酸化酵素（２４ＯＨａｓｅ）遺伝子の変動に起因するかを検討するため、移植後３日目のＰＢＳ投与群、ＣＨＯ−ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞移植群およびＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞移植群より、それぞれ３または４匹のマウスを無作為に抽出し、腎臓を摘出後、実施例１１（７）に記載した手順に則りトータルＲＮＡを調製し、同記載のプローブを用いてノザンブロッティングを実施した。その結果を図１４に示す。ＰＢＳ投与群、ＣＨＯ−ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞移植群に比し、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞移植群において１αＯＨａｓｅ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルが顕著に減弱していることを認めた。このことは、ＯＳＴ３１１が直接的あるいは間接的に、本遺伝子の発現を抑制することで、血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの生合成を抑制している可能性を示唆している。一方、２４ＯＨａｓｅ遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルは、ＰＢＳ投与群、ＣＨＯ−ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞移植群に比し、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞移植群において有意に亢進していた。このことは、ＯＳＴ３１１が直接的あるいは間接的に、本遺伝子の発現を亢進することで、血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤの不活性化を促進している可能性を示唆している。
実施例１１（８）では、移植後４４、４６日目の血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度は対照群と比し、有意な差が認めらていない。また、１αＯＨａｓｅのｍＲＮＡ発現量が増加傾向にあった点が、本実施例における結果と異なる。その相違を説明する少なくとも一つの可能性として、実施例１７に記載した、血清中副甲状腺ホルモンの影響が考えられる。
実施例１７  ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞移植後早期における血清中副甲状腺ホルモン濃度の検討
実施例１１、１３および１６で記載したＣＨＯ細胞移植後１、２、３、６、４５日目における各マウス血清を等量ずつ混和して０．１５ｍｌとし、Ｒａｔ  ＰＴＨ  ＩＲＭＡキット（日本メジフィジクス社）を用いて添付文書に従い血清副甲状腺ホルモン濃度を測定した。表７に示すように、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１移植群で有意な血清副甲状腺ホルモンの上昇が認められ、その差は移植後４５日目において顕著であった。
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実施例１８  ＣＨＯ産生型組換えＯＳＴ３１１Ｈ全長蛋白質の正常マウスへの投与試験
ＣＨＯ産生型組換えＯＳＴ３１１Ｈ全長蛋白質の正常マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雄、６週齢）への作用を検討するため、実施例１４の（１）で示した精製法により、アミノ酸残基２５番目Ｔｙｒから２５１番目Ｉｌｅ（配列番号４）のＣ末端にヒスチジンタグを付与したポリペプチドを部分精製した。この精製画分を正常マウスの腹腔内へ１回あたり０．１ｍｌずつ投与した。本精製画分中には、ウェスタンブロッティングで得られた蛍光強度から、およそ０．１５〜０．７５μｇの組換えＯＳＴ３１１が含まれると推定される。対照群へは、実施例１４と同様に、溶媒（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液／０．１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ＝７．０）を０．１ｍｌずつ腹腔内に投与した。ＯＳＴ３１１投与群および対照群はそれぞれ５匹のマウスから構成され、各群毎にマウスをプラスチックケージで飼育し、水道水および１．０３％の無機リン酸および１．１８％のカルシウムを含んだ固形食ＣＥ２（日本クレア社、日本国）を自由摂取させた。
［試験１］
試験概略を図１５のＡに示す。第１回目腹腔内投与から数えて５、１０、２３、２８、３３時間後に追加投与をおこない、合計６回の腹腔内投与を実施した。その後、第１回目腹腔内投与から数えて３６、４７、７１時間後にガラス製キャピラリを用いて眼窩より採血し、マイクロテイナ（ベクトンディッキンソン社、米国）を用いて血清を分離した。
得られた血清中のリン酸およびカルシウム濃度を、リン−テストワコーあるいはカルシウム−テストワコー（和光純薬、日本国）を用いて添付文書に従い、決定した。その結果、図１５のＢに示すように、初回投与から３６時間後のＯＳＴ３１１投与群において、有意な血中リン低下作用を認めた（ｔ−ｔｅｓｔ  ＊＊ｐ＜０．００１，＊ｐ＜０．０１）。また、この作用はその後１１時間経過後においても維持された（初回投与から４７時間後）。一方、初回投与７１時間後（最終投与後３８時間後）には、本活性は消失していた。また、いずれの時間においても、血中カルシウム濃度には有意な変化は認められなかった（図１５のＣ）。［試験２］
試験概略を図１６のＡに示す。第１回目腹腔内投与から数えて５、１１時間後に追加投与をおこない、合計３回の腹腔投与を実施した。その後、第１回目腹腔内投与から数えて１３、２４時間後にガラス製キャピラリを用いて眼窩より採血し、マイクロテイナ（ベクトンディッキンソン社、米国）を用いて血清を分離した。得られた血清中のリン酸およびカルシウム濃度をリン−テストワコーおよびカルシウム−テストワコーをそれぞれ用いて添付文書に従い測定した。その結果、図１６のＢに示すように、１３時間後のＯＳＴ３１１投与群において、有意な血清リン酸濃度低下作用を認めた（ｔ−ｔｅｓｔ  ＊＊ｐ＜０．０５，＊ｐ＜０．０１）。また、この作用はその後１１時間経過後においても維持された。また、いずれの時間においても血中カルシウム濃度には有意な変化は認められなかった（図１６のＣ）。
試験１および２の結果から、ＣＨＯ産生型組換えＯＳＴ３１１蛋白質の全長画分が、腹腔内投与により、正常マウスに低リン血症を惹起すること、またその血清リン酸濃度低下作用は初回投与後１３時間後に既に認められること、さらにその活性は投与中止後少なくとも１１時間は持続することが判明した。
実施例１９  ＯＳＴ３１１へのアミノ酸変異導入
実施例９に記載したように、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞により生産される組換えＯＳＴ３１１の一部は産生過程において、アミノ酸残基２５番目Ｔｙｒから１７９番目Ａｒｇまでの配列を有するポリペプチド（配列番号６）およびアミノ酸残基１８０番目Ｓｅｒから２５１番目Ｉｌｅまでの配列を有するポリペプチド（配列番号８）に切断されることが判明している。
この切断は、アミノ酸残基１８０番目Ｓｅｒ直前にあるＲＸＸＲもしくは、ＲＲＸＸＲ配列からなるモチーフを認識するプロテアーゼによる可能性が考えらる。全長型組換え体を生体内に投与した際にも、この切断あるいはそれに類似した分解を受ける可能性が考えられる。そこで、アミノ酸残基１７６番目のＡｒｇおよびアミノ酸残基１７９番目のＡｒｇの両者をＧｌｎに置換しうる配列をコードする変異導入遺伝子ＯＳＴ３１１ＲＱを作製した。
（１）ＯＳＴ３１１／ｐＣＡＧＧＳプラスミドの作製
ＯＳＴ３１１Ｈ／ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドを鋳型として３１１Ｆ１ＥｃｏＲＩ（配列番号２２）及び３１１ＬＮｏｔ（配列番号４４）をプライマーに用い、ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（日本国、宝酒造社）によるＰＣＲを行った。反応は、９４℃、１分保温したのち、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして２５サイクル実施した。反応終了後、ＰＣＲ産物の末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（スイス、ロッシュ社）により平滑化し、フェノールクロロホルム処理によって酵素を失活させた。ＤＮＡをエタノール沈殿させたのち、ポリヌクレオチドキナーゼ（スイス、ロッシュ社）によってＤＮＡ末端のリン酸化を行なった。０．８％アガロースゲル電気泳動によって、目的のＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国、ＢＩＯ１０１社）を用いて回収した。プラスミドベクターｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９９１  Ｄｅｃ  １５；１０８（２）：１９３−９．）をＥｃｏＲＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ断片（スイス、ロッシュ社）を用いて末端の平滑化を行った。続いて牛小腸アルカリフォスファターゼ（日本国、宝酒造社）を用いてＤＮＡ末端の脱リン酸化を行い、０．８％アガロースゲル電気泳動によって目的のＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国、ＢＩＯ１０１社）を用いて回収した。ＤＮＡライゲーションキットバージョン２（日本国、宝酒造社）を用い、添付文書に従って得られたＯＳＴ３１１ｃＤＮＡとｐＣＡＧＧＳプラスミド消化物を結合させた。これを大腸菌ＤＨ５αに導入してクローン化し、目的のプラスミドを取得した。本プラスミドＤＮＡをＯＳＴ３１１ＲＱＨ遺伝子の作製に使用した。
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（２）ＯＳＴ３１１ＲＱＨ遺伝子の作製
以下のプライマーを合成した。
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ＯＳＴ３１１ＭＥ１はＯＳＴ３１１の開始メチオニンを含む部分の順方向プライマー、ＯＳＴ３１１ＨＮｔはＯＳＴ３１１の３’末端に６個のヒスチジンを付加する逆方向プライマー、ＯＳＴ３１１ＲＱＦ及びＯＳＴ３１１ＲＱＲはＯＳＴ３１１ｃＤＮＡのコード領域中５２７番目及び５３６番目のグアニン（配列番号１の６５９番目および６６８番目のグアニンに相当）をそれぞれアデニンに置換することで、アミノ酸番号１７６番目及び１７９番目のアルギニンをグルタミンに置換するための変異導入用の、それぞれ順方向、逆方向プライマーである。ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（米国、プロメガ社）を用い、添付文書に従って２種類の反応液を２０μＬ調製した。一方にはプライマーとしてＯＳＴ３１１ＭＥ１、ＯＳＴ３１１ＲＱＲを終濃度０．２μＭで使用し、鋳型には実施例６の（１）に記載したＯＳＴ３１１発現ベクター１０ｎｇを使用した。９４℃、１分保温したのち、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして２５サイクルＰＣＲ反応を実施した。もう一方にはプライマーとしてＯＳＴ３１１ＲＱＦ、ＯＳＴ３１１ＨＮｔを終濃度０．２μＭで使用し、鋳型にはＯＳＴ３１１／ｐＣＡＧＧＳプラスミド１０ｎｇを使用した。９４℃、１分保温したのち、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして３５サイクルＰＣＲ反応を実施した。上記２種類の反応物をそれぞれ１０倍に希釈し、それぞれ１μＬをＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（日本国、宝酒造社）添付文書に従って調製した反応液５０μＬに添加した。ＬＡ  Ｔａｑポリメラーゼ（日本国、宝酒造社）を用いて、プライマーとしてＯＳＴ３１１  ＭＥ１、ＯＳＴ３１１ＨＮｔを終濃度０．２μＭで使用し、９４℃、１分保温したのち、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして２５サイクルＰＣＲ反応を実施し、さらに７２℃で７分保温した。得られた反応生成物をフェノール／クロロホルム処理し、除蛋白、エタノール沈殿を行った後、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで消化し、２％アガロースゲル電気泳動によって約８００ｂｐのＤＮＡ断片を分離、ジーンクリーンＩＩ（米国、Ｂｉｏ１０１社）を用いて回収した。得られたＤＮＡ断片を、プラスミドｐＥＡＫ８（米国、エッジバイオシステム）に、分子内リボゾームエントリー部位（ＩＲＥＳ）および増強型緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）を連結することにより作製したベクターＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−ｐＥＡＫ８のＥｃｏＲＩ，ＮｏｔＩ部位に挿入することによってＯＳＴ３１１ＲＱＨ／ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ／ｐＥＡＫ８プラスミドを得た。常法に従ってプラスミドＤＮＡを調製、ＡＢＩ３７００蛍光ＤＮＡシークエンサー（米国、ＰＥアプライドシステムズ社）によって塩基配列を決定し、目的のＲ１７６ＱおよびＲ１７９Ｑの変異が導入され、かつ、Ｃ末端にヒスチジンタグをコードしていることを確認した。本遺伝子でコードされるポリペプチドを、以下ＯＳＴ３１１ＲＱＨと称す。
（３）ＣＨＯ安定発現細胞の取得
トランスフェクタム（米国、プロメガ社）を用い、添付文書にしたがって、ＣＨＯ−ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞にＯＳＴ３１１ＲＱＨ／ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ／ｐＥＡＫ８プラスミドを導入した。５μｇ／ｍＬピューロマイシン、１０％ＦＣＳを含むＭＥＭα培地にて薬剤耐性細胞を選択し、ＦＡＣＳ  ｖａｎｔａｇｅ（米国、ベクトンディッキンソン社）によって、ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）の発光強度が強い細胞をソーティングによりクローン化した。クローン化した細胞がコンフルエントになったところで、血清を含まないＤＦ（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）培地に置換し２日後に上清を回収した。回収した上清５０μＬを９６ウエルコンバーチブル濾過装置（米国、ライフテックオリエンタル社）を用いてイモビロンＰフィルター（米国、ミリポア社）に吸着させた。作製したフィルターをＴＢＳ，ＴＴＢＳで洗浄後、ブロックエース（日本国、第一製薬社）で１時間室温にてブロッキングを行った。ブロッキング後、ブロックエースで５，０００倍に稀釈したＨＲＰ標識した抗Ｈｉｓ６モノクローナル抗体（米国、インビトロジェン社）と１時間反応させた。反応後ＴＴＢＳ，ＴＢＳで洗浄し、ＥＣＬ（米国、アマシャムファルマシア社）を用い、添付文書に従ってシグナルの検出を行った。このシグナル強度をもとに高発現クローンＣＨＯ−ＯＳＴ３１１ＲＱＨを選択した。
（４）ＯＳＴ３１１ＲＱＨ  ｐＥＡＫ  ｒａｐｉｄ培養上清の調製
ｐＥＡＫ  ｒａｐｉｄ細胞（米国、エッジバイオシステム）を組織培養用フラスコ（２２５ｃｍ２，米国、コーニング社）２０本に播種した。この細胞にｐＥＡＫシステム添付文書（米国、エッジバイオシステム社）に従い、ＯＳＴ３１１ＲＱＨ／ＩＲＥＳ−ＧＦＰ／ｐＥＡＫ８プラスミド０．４８ｍｇをリン酸カルシウム法にてトランスフェクションした。４時間静置したのち、フラスコ１本あたり５０ｍＬの血清を含まないＭＥＭα培地に置換し後、２日間、３７℃にて培養してその上清を回収した。
（５）組換えＯＳＴ３１１ＲＱＨの発現確認
上述のＣＨＯ−ＯＳＴ３１１ＲＱＨ細胞クローン２種類、及びｐＥＡＫ  ｒａｐｉｄ細胞を用いた一過性発現の培養上清それぞれ１０μＬを実施例６の（３）に記載した要領でウエスタンブロットに供し、培養上清中の組換えＯＳＴ３１１ＲＱＨの存在を検討した。検出抗体には、抗Ｈｉｓ（Ｃ末）抗体（米国、インビトロジェン社）を用いた。その結果、図１７に示すように、いずれの培養上清中においても、実施例６の（３）に記載した約３２ｋＤａのバンドと同位置に存在する強いシグナルを認めた。さらに、いずれの培養上清中においても、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ培養上清中に存在する約１０ｋＤａのシグナルをウェスタンブロッティングでは認めなかった。このことから、Ｒ１７６ＱおよびＲ１７９Ｑの変異を導入することにより、この位置で起こっていると推定されるポリペプチドの切断が阻害あるいは軽減され、その結果アミノ酸番号１８０番目Ｓｅｒから２５１番目Ｉｌｅまでの配列を有するポリペプチド（配列番号８）の存在比が顕著に減少したことが推察される。
実施例２０  組換えＯＳＴ３１１ＲＱＨの正常マウスへの投与試験
実施例１９の（５）で調製した培養上清５００ｍｌより、実施例１４の（１）に記載した方法に準じて、約２．８μｇ／ｍｌの組換えＯＳＴ３１１ＲＱＨ蛋白質を含む精製画分を得た。この精製画分を正常マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雄、６週齢）の腹腔内へ１回あたり０．１ｍｌずつ連続投与し、血清リン酸、カルシウム、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度を測定した。対照群については、溶媒（５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液／０．１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ＝７．０）を０．１ｍｌずつ同様に腹腔内へ投与した。ＯＳＴ３１１ＲＱＨ投与群および対照群はそれぞれ６匹のマウスから構成され、各群毎にマウスをプラスチックケージで飼育し、水道水および１．０３％の無機リン酸および１．１８％のカルシウムを含んだ固形食ＣＥ２（日本クレア社、日本国）を自由摂取させた。
試験プロトコールを図１８のＡに示す。初回投与開始から５、１０、２４、２９、３４時間後に追加投与を実施し、計６回の連続投与とした。途中、初回投与から２４時間後（４回目投与直前）にガラス製キャピラリを用いて眼窩採血を実施し、初回投与から４８時間後にエーテル麻酔下、心採血を行った。
（１）血清リン酸、カルシウム濃度の測定
初回投与後２４時間目および４８時間目の血清より、実施例１４の（３）に記載した方法で血清リン酸を測定した。その結果、図１８のＢに示す通り、いずれの採血時間においてもＯＳＴ３１１ＲＱＨ投与群は有意な低リン血症を示した（ｔ−ｔｅｓｔ  ＊＊ｐ＜０．０１，＊ｐ＜０．０５）。一方、血清カルシウム濃度に有意な変動は認められなかった（図１８のＣ）。
（２）血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度の測定
初回投与後４８時間目において個々のマウスより採取した血清を等量ずつ各群毎に混和し、実施例１６の（１）に記載した方法で、血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ濃度の測定を行った。その結果、対照群が２４４．７ｐｍｏｌ／Ｌを示したのに比し、ＯＳＴ３１１ＲＱＨ投与群は２４．６ｐｍｏｌ／Ｌと顕著な低下を示した。
実施例２１  ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１ＲＱＨ細胞移植試験
実施例１９の（３）で樹立したＯＳＴ３１１ＲＱＨ安定発現細胞ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１ＲＱＨのヌードマウス（７週齢、ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕｄｅ、雄、ｎ＝８）への移植試験を、実施例１３に記載した方法と同様に実施した。対照群としてＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞を同様に移植した（ｎ＝６）。各群毎にマウスをプラスチックケージで飼育し、水道水および１．０３％の無機リン酸および１．１８％のカルシウムを含んだ固形食ＣＥ２（日本クレア社、日本国）を自由摂取させた。
細胞移植後２日目において、ガラス製キャピラリを用いて眼窩採血を実施し、実施例１４の（３）に記載した同様の方法で血清リン酸、カルシウム濃度の測定を行った。図１９のＡに示すとおり、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１ＲＱＨ細胞移植群において有意な血清リン酸の低下を認めた（ｔ−ｔｅｓｔ  ＊ｐ＜０．００１）。一方、血清カルシウム濃度に有意な変化は認められなかった（図１９のＢ）
実施例２２  抗ＯＳＴ３１１部分ペプチドポリクローナル抗体の作製（２）
実施例１０に記載した要領で、さらにＯＳＴ３１１の部分ペプチド４種類を作製した（配列番号４９から５２）。それらを抗原としてウサギに免疫し、得られた抗血清を用いて実施例６の（３）に記載した方法に準じてウェスタンブロッティングを実施し、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞の無血清培養上清中の組換えＯＳＴ３１１Ｈを検出した。抗体反応は、各々のペプチドに対する抗血清をＴＴＢＳで２５０倍希釈した液中で、４℃で一晩振とうさせて行った。洗浄後、これにアルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を結合させた後、アルカリフォスファターゼ発色キット（米国、ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて組換えＯＳＴ３１１を検出した（図２０）。
部分ペプチド
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実施例２３  ＯＳＴ３１１蛋白質検出用ＥＬＩＳＡシステムの構築
（１）抗ＯＳＴ３１１部分ペプチドウサギ抗血清からの抗体精製
Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ  ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃｏｌｕｍｎ（米国、ＢＩＯ−ＲＡＤ社）にｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ（米国、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ社）をスラリーで３ｍｌ充填し、１０ｍｌの０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ３．３）および、２０ｍｌのＰＢＳを用いて洗浄した。実施例１０に記載した２種類および実施例２２に記載した４種類のウサギ抗血清をそれぞれ８００−９００μｌ加え、抗体画分をレジンに吸着させた。カラムを９ｍｌのＰＢＳで洗浄し挟雑物を除去後、０．１Ｍグリシン塩酸バッファー（ｐＨ３．３）を１ｍｌずつ加えることにより、ＩｇＧ溶出画分を得た。溶出に際し、各画分に１０μｌの中和緩衝液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ）を随時加え、溶液を中和した。溶出画分中に含まれる抗体濃度を２８０ｎｍの吸光度を測定することで決定し（吸光係数：１．３４（ｍｇ／ｍｌ）−１・（ｃｍ）−１として算出）、いくつかの画分をまとめＮＡＰ２５カラムを用いて５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム液に置換した。その結果、それぞれのペプチド抗血清より５−１５ｍｇの抗体が得られた（このポリクローナル抗体を、以下それぞれ、３１１−４８抗体、３１１−１１４抗体、３１１−１４８抗体、３１１−１７０抗体、３１１−１８０抗体、３１１−２１０抗体と称す）。
（２）抗ＯＳＴ３１１ＩｇＧのビオチン化
上述６種類の抗ＯＳＴ３１１ペプチドポリクローナル抗体すべてについて５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム液で１ｍｇ／ｍｌに希釈した後、それぞれ１ｍｇの抗体と、１０μｌのジメチルホルムアミドに溶解したＢｉｏｔｉｎ−ＡＣ５−Ｏｓｕ（日本国、同仁化学）溶液（１．８２μｇ／ｍｌ）とを、４℃において２時間、転倒混和した。その後、混合液をＮＡＰ１０カラムに供し、未反応のＢｉｏｔｉｎ−ＡＣ５−Ｏｓｕを除くとともに、溶媒をＰＢＳに置換し、６種類のビオチン化抗ＯＳＴ３１１ペプチドポリクローナル抗体を得た。
（３）抗ＯＳＴペプチドウサギポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法によるＯＳＴ３１１発現細胞培養上清中のＯＳＴ３１１の検出
６種類の固相化用抗ＯＳＴ３１１ペプチドポリクローナル抗体に対して上述の６種類のビオチン化抗体を検出用として組み合わせることで、サンドイッチＥＬＩＳＡシステムを構築し、ＯＳＴ３１１発現細胞培養上清中のＯＳＴ３１１蛋白質の検出を検討した。
上述のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ精製により得られた固相化用抗ＯＳＴ３１１ペプチドポリクローナル抗体６種を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム液で１０μｇ／ｍｌとなるよう希釈し、９６穴ＥＬＩＳＡ用プレートＭａｘｉｓｏｒｐ（米国、Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり５０μｌ加え、３７℃で１時間静置することで、ＩｇＧを固相化した。その後、反応液を除去し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ｉｎ  ＴＢＳ（米国、ＰＩＥＲＣＥ社）を１ウェルあたり５０μｌ加え室温で１０分間ブロッキングした。溶液を除去した後、実施例１９の（５）で記載したＯＳＴ３１１ＲＱＨ  ｐｅａｋ  ｒａｐｉｄ培養上清、または対照としてＭＥＭα培地を１ウェルあたり５０μｌずつ加え、室温で１時間静置することで固相化抗体と結合させた。抗体反応後、ＴＴＢＳで３回洗浄した後、１０％Ｂｌｏｃｋａｃｅ（日本国、大日本製薬社）を含むＴＴＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈した上述のビオチン化抗ＯＳＴ３１１抗体６種（３１１−４８、３１１−１１４、３１１−１４８、３１１−１７０、３１１−１８０、３１１−２１０）をそれぞれ１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で３０分間静置し二次抗体反応をおこなった。各ウェルをＴＴＢＳで３回洗浄した後、１０％Ｂｌｏｃｋａｃｅを含むＴＴＢＳで１０，０００倍に希釈したＨＲＰ標識ストレプトアビジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で３０分間静置してビオチン化抗体と結合させた。各ウェルをＴＴＢＳで３回洗浄した後、ペルオキダーゼ発色基質であるテトラメチルベンジジン（デンマーク、ＤＡＫＯ社）を１ウェルあたり５０μｌ加え、室温で５分間発色させた後、０．５Ｍ硫酸液を１ウェルあたり５０μｌ加えることにより反応を停止させた。測定は９６穴プレート用の吸光度測定装置ＭＴＰ−３００（日本国、コロナ電気社）を用いて行い、４５０ｎｍの吸光度を５７０ｎｍの吸光度で除した値を求めた。対照としてＭＥＭαのみを加えた場合の４５０ｎｍ／５７０ｎｍ値は全て０．０２以下であった。一方、図２１のＡに示すとおり、３１１−４８抗体を固相化し、３１１−１８０抗体で検出する組み合わせ、または、３１１−１８０抗体で固相化し３１１−１４８抗体で検出する組み合わせでは、対照に比し有意に培養上清中のＯＳＴ３１１ＲＱＨを検出することができた。また、例えば３１１−４８抗体を固相化し、３１１−１４８抗体で検出する組み合わせを用いた場合は、両抗体の抗原部位がＯＳＴ３１１蛋白質の実施例９に記載した切断後のＮ末側部分ペプチド（配列番号６）に含まれるため、全長ポリペプチドを検出できるのみならず、そのＮ末部分ポリペプチド断片も検出できると予想される。一方、３１１−２１０抗体を固相化し３１１−１８０抗体で検出すると、全長のみならず実施例９に記載した切断後のＣ末側部分ペプチド（配列番号８）を検出できると予想される。したがって、これらの組み合わせを複合的に用いることにより、生体試料等の検体中のＯＳＴ３１１全長ポリペプチドと部分ポリペプチドの絶対量の測定と存在比の識別が可能となる。
（４）抗ＯＳＴ３１１ペプチドウサギポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法による組換えＯＳＴ３１１蛋白質濃度の定量
上述のＥＬＩＳＡシステムについて、固相化抗体として３１１−４８抗体または３１１−１８０抗体を、検出用抗体として３１１−１４８抗体を用いた組み合わせで、１、０．６７、０．３３、０．１、０．０６７、０．０３３および０．０１μｇ／ｍｌの希釈系列からなる精製組換えＯＳＴ３１１Ｈの検出を検討した。その結果、図２１のＢに示すように、０．１〜１μｇ／ｍｌの範囲内で良好な一次回帰直線が得られたことから（３１１−４８：Ｒ２＝０．９９０，３１１−１８０：Ｒ２＝０．９９６）、少なくともこの濃度範囲における組換えＯＳＴ３１１Ｈを検出可能であることが判明した。
実施例２４  組換えＯＳＴ３１１蛋白質の単回投与による影響の検討
ＣＨＯ産生型組換えＯＳＴ３１１Ｈ全長蛋白質の正常マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雄、６週齢）への短期作用を検討するため、精製した組換えＯＳＴ３１１Ｈ全長蛋白質を尾静脈内へ１匹当たり５．０μｇ／０．１ｍｌずつ単回投与した。対照群へは、溶媒（ＰＢＳ）を０．１ｍｌずつ尾静脈内へ投与した。投与後１、３、８時間目で心採血、解剖を実施し、血清リン酸、カルシウム、ビタミンＤ濃度の測定、腎臓近位尿細管上ナトリウム・リン酸共役輸送体の発現量を解析した。ＯＳＴ３１１投与群および対照群はそれぞれ６匹のマウスから構成され、水道水および１．０３％の無機リン酸および１．１８％のカルシウムを含んだ固形食ＣＥ２（日本クレア社、日本国）を自由摂取させた。
（１）血清リン酸濃度の経時変化
表８に示すとおり、ＯＳＴ３１１蛋白質を単回投与後、１、３時間目における血清リン酸濃度には有意な差は認められなかったのに対し、投与後８時間では有意な低下を認めた。この結果から、ＯＳＴ３１１の作用による血清リン酸濃度の低下には、３から８時間を要することが明らかとなった。一方、すべての時間において血清カルシウム濃度には変化を認めなかった。
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（２）腎臓近位尿細管上ナトリウム・リン酸共役輸送体の発現
実施例１１の（６）に記載した方法に則り、投与後１、３、８時間目における腎臓を各群毎に混合し、近位尿細管冊子縁膜（ＢＢＭ）を調整した。得られたＢＢＭ中のナトリウム・リン酸共役輸送体（ＮａＰｉ７）蛋白質の存在比をウェスタンブロッティング法により解析した。図２２のＡに示すとおり、投与後１、３時間目におけるＮａＰｉ７の発現量は媒体投与群と同等であったのに対し、投与後８時間目におけるＯＳＴ３１１投与群のＮａＰｉ７は、媒体投与群のそれに比し有意に低下していることが明らかとなった。一方、このＮａＰｉ７蛋白質の減少が、ＲＮＡの転写調節を伴ったものかを検討するため、実施例１１の（７）に手順に則り、個々のマウスより摘出した腎臓よりトータルＲＮＡを調整し、同記載のプローブを用いてノザンブロッティングを実施した。その結果、図２２のＢに示すとおり、投与後１、３時間目におけるＮａＰｉ７のｍＲＮＡ量は媒体投与群と同等であったのに対し、投与後８時間目におけるＯＳＴ３１１投与群のＮａＰｉ７は、媒体投与群のそれに比し有意に低下していることが明らかとなった。以上の結果より、組換えＯＳＴ３１１蛋白質の直接又は間接作用による血清リン酸濃度の低下と、腎臓近位尿細管上ナトリウム・リシ酸共役輸送体の下方修正は、両者の変動時間において相関しており、さらにこの蛋白質レベルでの下方修正に寄与する少なくとも一つの要因として、ＮａＰｉ−７のｍＲＮＡ転写レベルでの抑制が起こっていることが明らかとなった。
（３）血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度の経時変化
投与後１、３、８時間目における血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度を、実施例１６の（１）に記載した方法で測定した。図２３に示したとおり、ＯＳＴ３１１投与群において、投与後３時間で既に血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度の有意な低下を認め、８時間目にはさらなる減少を認めた。
（４）ビタミンＤ代謝酵素遺伝子群の発現変化
血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度低下が、腎臓に発現する２５−ヒドロキシビタミンＤ−１−α−水酸化酵素（１αＯＨａｓｅ）、あるいは２５−ヒドロキシビタミンＤ−２４−水酸化酵素（２４ＯＨａｓｅ）遺伝子の変動に起因するかを解明するため、投与後１、３、８時間目における腎臓より、実施例１１（７）に記載した手順に則りトータルＲＮＡを調製し、同記載のプローブを用いてノザンブロッティングを実施した。図２４に示したとおり、投与１時間後において既に１αＯＨａｓｅ遺伝子のｍＲＮＡ量減少および２４ＯＨａｓｅ遺伝子のｍＲＮＡ量増加を認め、その傾向は投与後８時間においてより顕著なものとなることが明らかとなった。図２４において、「ｖｅｈｉｃｌｅ」は２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７）および０．３Ｍ  ＮａＣｌからなる組換えＯＳＴ３１１蛋白質の溶媒を意味する。
これらの結果から、ＯＳＴ３１１は腎臓に発現する２５−ヒドロキシビタミンＤ−１α−水酸化酵素（１αＯＨａｓｅ）あるいは、２５−ヒドロキシビタミンＤ−２４−水酸化酵素（２４ＯＨａｓｅ）遺伝子の発現を調節することで、血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度を低下させることが判明した。
実施例２５  ＯＳＴ３１１Ｃ末欠失体の活性検討
（１）ＯＳＴ３１１Ｃ末欠失体発現系の構築
以下のプライマーを合成した。
0004799801.tif 000026
0004799801.tif 000027
ＯＳＴ３１１Ｒ６９３、ＯＳＴ３１１Ｒ６３３、ＯＳＴ３１１Ｒ６１８、ＯＳＴ３１１Ｒ６０３はＯＳＴ３１１の３’末端からそれぞれ２０、４０、４５、５０アミノ酸残基を欠失させ終止コドンおよびＮｏｔＩ認識配列を導入する逆方向プライマーである。これらの逆方向プライマーと、実施例１９に記載したＯＳＴ３１１の開始メチオニンおよびＥｃｏＲＩ認識配列を含む順方向プライマーＯＳＴ３１１ＭＥ１（配列番号４５）とを終濃度０．２μＭとなるよう組み合わせ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（日本国、宝酒造社）を用い、実施例１９の（２）で記載したＯＳＴ３１１ＲＱＨ／ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ／ｐＥＡＫ８プラスミドＤＮＡ１００ｎｇを鋳型として、９４℃、１分保温した後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分からなる工程を１サイクルとして２５サイクルからなるＰＣＲ反応を実施した。得られた反応生成物をフェノール／クロロホルム処理し、除蛋白、エタノール沈殿を行った後、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで消化し、２％アガロースゲル電気泳動によって各ＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国、Ｂｉｏ１０１）を用いて回収した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで消化したｐＥＡＫ８ベクター（米国、エッジバイオシステム）と連結することによってｐＰＫＯＳＴ３１１−△Ｃ２０、−△Ｃ４０、−△Ｃ４５、−△Ｃ５０プラスミドを得た。定法に従ってプラスミドＤＮＡを調製後、ＡＢＩ３７００蛍光ＤＮＡシークエンサー（米国、ＰＥアプライドバイオシステムズ社）によって塩基配列を決定し、ＯＳＴ３１１ＲＱＨ遺伝子の３’末端から目的通りの塩基対が欠失していることを確認した。
（２）ＣＨＯ安定発現細胞の取得
トランスフェクタム（米国、プロメガ社）を用い、添付文書にしたがって、ＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ１細胞にｐＰＫＯＳＴ３１１−△Ｃ２０、−△Ｃ４０、−△Ｃ４５、−△Ｃ５０プラスミドＤＮＡをそれぞれ導入し、５μｇ／ｍｌピューロマイシン、１０％ＦＳＣを含むＭＥＭα培地にて薬剤耐性を示すＣＨＯ−ＯＳＴ３１１ＲＱ−△Ｃ２０、−△Ｃ４０、−△Ｃ４５、−△Ｃ５０細胞を取得した。これらの細胞をそれぞれ２４穴プレートに蒔き、５μｇ／ｍｌピューロマイシン、１０％ＦＳＣを含むＭＥＭα培地にてコンフルエントになるまで培養した後、無血清ＤＦ（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）培地に置換し３日後、上清を回収した。得られた培養上清を、実施例２２で記載したＯＳＴ３１１特異的ポリクローナル抗体３１１−１４８または３１１−１８０を用いたウェスタンブロッティング法に供し、予想される分子量に相当する位置における目的蛋白質の発現を確認した。
（３）ＯＳＴ３１１Ｃ末欠失体発現ＣＨＯ細胞移植試験
上述の２０、４０、４５および５０残基欠失体を発現するＣＨＯ細胞を、実施例１３に記載した方法と同様にヌードマウス（６週齢、ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕｄｅ、雄、各群６匹ずつ）へ皮下移植した。対照群として全長ＯＳＴ３１１ＲＱＨを発現するＣＨＯ細胞およびＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞をそれぞれ皮下移植した（ｎ＝６）。各群毎にマウスをプラスチックケージで飼育し、水道水および固形食ＣＥ２（日本クレア社、日本国）を自由摂取させた。
細胞移植後３日目において心採血を実施し、実施例２０に記載した同様の方法で血清リン酸、カルシウム濃度および１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度の測定を行った。図２５に示すように、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１ＲＱ−△Ｃ２０、−△Ｃ４０、−△Ｃ４５、−△Ｃ５０細胞移植群のいずれにおいても、全長を発現する細胞移植群と同等の有意な血清リン酸濃度低下を認めた（ｔ−ｔｅｓｔ、＊＊ｐ＜０．００１）。また、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１ＲＱ−△Ｃ４０、−△Ｃ４５、−△Ｃ５０細胞移植群における血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度についても著明な低下を認めた（ＣＨＯ−ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１移植群の平均血清濃度を１００％とした場合、全長：３．１％、△Ｃ４０：９．４％、△Ｃ４５：１０．０％、△Ｃ５０：６８．１％）。これらの結果から、ＯＳＴ３１１蛋白質のＣ末端より少なくとも５０アミノ酸を欠失させても、血清リン濃度低下活性または血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度低下活性は維持されることが明らかとなった。
実施例２６  ＯＳＴ３１１Ｎ末欠失体の活性検討
（１）ＯＳＴ３１１Ｎ末９アミノ酸欠末体発現系の構築
以下のオリゴＤＮＡを合成した。
0004799801.tif 000028
0004799801.tif 000029
ＯＳＴ３１１ＳＧＦＷは、ＯＳＴ３１１の開始メチオニンから配列番号２の２４番目Ａｌａまでのアミノ酸残基で構成されるシグナルペプチド部分をコードする遺伝子配列からなるオリゴＤＮＡであり、その５’末端にＥｃｏＲＩ認識配列を含む。ＯＳＴ３１１ＳＧＲＶはＯＳＴ３１１ＳＧＦＷの相補鎖であり、その５’末端にＥｃｏＲＩ認識配列を含む。また、ＯＳＴ３１１ＳＧＦＷの３’側およびＯＳＴ３１１ＳＧＲＶの５’側には、制限酵素ＳｐｈＩの認識部位が導入してある。このＳｐｈＩ認識部位の導入により、シグナルペプチド配列内の２３番目ＡｒｇがＨｉｓへと置換される。上述のオリゴＤＮＡ同士を定法に従いアニーリングさせることで、両末端部にＥｃｏＲＩ認識配列、およびシグナルペプチド内２３番目アミノ酸残基に相当する位置にＳｐｈＩ認識配列を含み、ＯＳＴ３１１の開始メチオニンから始まる１残基改変されたシグナルペプチドの全長をコードする２本鎖ＤＮＡ断片が得られる。このＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩ消化したｐＥＡＫ８ベクター（米国、エッジバイオシステム）に挿入し、同ベクター内に存在するＥＦ１プロモーターと上述のＤＮＡ断片とが、順方向となっているプラスミドＤＮＡを選択することで、プラスミドｐＰＫＦＧＳＧとした。
次に以下のプライマーを合成した。
0004799801.tif 000030
ＯＳＴ３１１ｄＮ９は、５’末端にＳｐｈＩ認識部位を含み、配列番号２の２４番目Ａｌａ残基の後に同３４番目Ｓｅｒ残基以降のアミノ酸配列が続くように設計された順方向プライマーである。本プライマーと、ＮｏｔＩ認識配列を含み、Ｃ末端部分にヒスチジン残基６個が付加した後、終始コドンとなるよう設計されたプライマーＯＳＴ３１１ＨＮｔ（実施例１９、配列番号４６）を逆方向プライマーとして組み合わせ、実施例１９の（２）で記載したＯＳＴ３１１ＲＱＨ／ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ／ｐＥＡＫ８プラスミドＤＮＡを鋳型として用い、実施例２５（１）に記載した要領でＰＣＲ増幅を実施した。得られたＰＣＲ産物をＳｐｈＩおよびＮｏｔＩで消化した後、同じくＳｐｈＩおよびＮｏｔＩで消化した上述のプラスミドベクターｐＰＫＦＧＳＧに定法に従い挿入した。得られたプラスミドＯＳＴ３１１△Ｎ９−ｐＰＫＦＧＳＧを、ＡＢＩ３７００蛍光ＤＮＡシークエンサー（米国、ＰＥアプライドバイオシステムズ社）を用いて塩基配列を決定したところ、挿入された遺伝子配列は、ＯＳＴ３１１ＲＱＨ遺伝子の開始メチオニンから２４番目Ａｌａまでのシグナルペプチドを含み（ただし、２３番目ＡｒｇはＨｉｓへ置換）、続く２５番目Ｔｙｒから３３番目Ｇｌｙまでの９アミノ酸残基に相当する遺伝子配列のみを欠失し、３４番目Ｓｅｒからヒスチヂンタグを含む終始コドンまでの全配列をコードしていることを確認した。
（２）ＣＨＯ安定発現細胞の取得
トランスフェクタム（米国、プロメガ社）を用い、添付文書にしたがって、ＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ１細胞にＯＳＴ３１１△Ｎ９−ｐＰＫＦＧＳＧプラスミドＤＮＡを導入し、５μｇ／ｍｌピューロマイシン、１０％ＦＳＣを含むＭＥＭα培地にて薬剤耐性を示すＣＨＯ−ＯＳＴ３１１ＲＱ−△Ｎ９細胞を取得した。得られた細胞より実施例２５に記載した要領で培養上清を回収し、実施例２２で記載したＯＳＴ３１１特異的ポリクローナル抗体３１１−１４８、または新たに配列番号２の２３７番目Ｇｌｙより２５１番目Ｉｌｅまでの部分ポリペプチドをウサギに免疫して得られたポリクローナル抗体３１１−２３７を用いたウェスタンブロッティング法により、予想される分子量に相当する位置における目的蛋白質の発現を確認した。このことから、配列番号２における２３番目ＡｒｇをＨｉｓに改変したＯＳＴ３１１シグナルペプチドは適切に機能しＯＳＴ３１１組換え蛋白質を分泌させること、また少なくとも２５番目Ｔｙｒから３３番目Ｇｌｙを欠いても、分泌後、培養上清中にある程度安定に組み換え蛋白質が存在しうることが判明した。
（３）ＯＳＴ３１１Ｎ末９アミノ酸欠失体発現ＣＨＯ細胞移植試験
上述のＣＨＯ−ＯＳＴ３１１ＲＱ−△Ｎ９細胞を、実施例１３に記載した方法と同様にヌードマウス（８週齢、ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕｄｅ、雄、各群６匹ずつ）へ皮下移植した。対照群として全長ＯＳＴ３１１ＲＱＨを発現するＣＨＯ細胞およびＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞をそれぞれ同様に皮下移植した（ｎ＝６）。各群毎にマウスをプラスチックケージで飼育し、水道水および固形食ＣＥ２（日本クレア社、日本国）を自由摂取させた。
細胞移植後４日目において、ガラス製キャピラリーを用いて眼窩採血を実施し、実施例２０に記載した要領で血清中リン酸濃度を測定したところ、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１ＲＱ−△Ｎ９細胞移植群において、全長組換え体発現細胞移植群と同等の有意な血清リン酸濃度低下を認めた（ＣＨＯ−ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１群：６．８５±０．１２ｍｇ／ｄＬ、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１ＲＱＨ群：３．９１±０．２３ｍｇ／ｄＬ（ｐ＜０．００１、対ＣＨＯ−ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１群）、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１ＲＱ−△Ｎ９群：４．３３±０．１５ｍｇ／ｄＬ（ｐ＜０．００１、対ＣＨＯ−ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１群））。この結果から、少なくとも配列番号２の２５番目Ｔｙｒから３３番目Ｇｌｙからなる９アミノ酸残基を欠いてもＯＳＴ３１１の生理活性が損なわれるものではないことが判明した。
実施例２７  大腸菌産生型ＯＳＴ３１１組換え体の検討
（１）ＯＳＴ３１１大腸菌発現ベクターＯＳＴ３１１／ｐＥＴ３ａの構築
以下のプライマーを合成した。
0004799801.tif 000031
実施例１９において作製したＯＳＴ３１１／ｐＣＡＧＧＳプラスミドを鋳型とし、ＯＳＴ３１１Ｎ（配列番号６０）及びＯＳＴ３１１Ｂｍ（配列番号６１）をプライマーとして、ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（米国、プロメガ社）を用いてＰＣＲを行った。反応は、９４℃、１分保温したのち、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして３５サイクル実施した。反応終了後、フェノールクロロホルム処理により酵素を失活させた後、エタノール沈殿によりＤＮＡを回収した。このＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、目的のＯＳＴ３１１ｃＤＮＡ断片を２％アガロースゲル電気泳動で分離したのち、ジーンクリーンＩＩ（米国、ＢＩＯ１０１社）を用いて回収した。一方、プラスミドベクターｐＥＴ３ａ（米国、Ｎｏｖａｇｅｎ社）をＮｄｅＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ断片（スイス、ロッシュ社）を用いて末端の平滑化を行った。さらにこれをＢａｍＨＩで消化した後、目的のプラスミドＤＮＡ断片を０．８％アガロースゲル電気泳動で分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国、ＢＩＯ１０１社）を用いて回収した。この様にして得られたＯＳＴ３１１ｃＤＮＡ断片とプラスミドｐＥＴ３ａ消化物を、ＤＮＡライゲーションキットバージョン２（日本国、宝酒造）を用いて連結した。これを大腸菌ＤＨ５αに導入してクローン化し、プラスミドを抽出した。プラスミドの塩基配列を確認し、ｐＥＴ３ａにＯＳＴ３１１ｃＤＮＡが目的通りに挿入されていることを確認した。これをＯＳＴ３１１／ｐＥＴ３ａとした。
（２）ＯＳＴ３１１大腸菌発現ベクターＯＳＴ３１１／ｐＥＴ２８の構築
以下のプライマーを合成した。
0004799801.tif 000032
ＯＳＴ３１１／ｐＥＴ３ａプラスミドを鋳型とし、ＯＳＴ３１１Ｎｄ（配列番号６２）及びＯＳＴ３１１Ｎｏｔ（配列番号６３）をプライマーとして、ＬＡ  Ｔａｑ（日本国、宝酒造社）を用いてＰＣＲを行った。反応は９４℃で１分保温したのち、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして３５サイクル実施した。反応終了後、フェノールクロロホルム処理により酵素を失活させた。増幅したＤＮＡ断片をエタノール沈殿にて回収した。これをＮｄｅＩとＮｏｔＩで消化したのち、目的のＯＳＴ３１１ｃＤＮＡ断片を２％アガロースゲル電気泳動で分離し、ジーンクリーンＩＩ（米国、ＢＩＯ１０１社）を用いて回収した。一方、プラスミドベクターｐＥＴ２８（米国、Ｎｏｖａｇｅｎ社）をＮｄｅＩとＮｏｔＩで消化し、さらに牛小腸アルカリフォスファターゼ（日本国、宝酒造社）を用いて脱リン酸化を行った。これを０．８％アガロースゲル電気泳動により分離し、目的のプラスミド断片をジーンクリーンＩＩ（米国、ＢＩＯ１０１社）を用いて回収した。このようにして得たＯＳＴ３１１ｃＤＮＡ及びｐＥＴ２８プラスミド消化物をＤＮＡライゲーションキットバージョン２（日本国、宝酒造社）を用いて連結し、大腸菌ＤＨ５αに導入してクローニングし、プラスミドを抽出した。プラスミドの塩基配列を確認し、Ｎ末端側にＨｉｓ−ｔａｇ配列を付加した組換え体ＯＳＴ３１１が発現するようなＯＳＴ３１１ｃＤＮＡがｐＥＴ２８に挿入されていることを確認した。これをＯＳＴ３１１／ｐＥＴ２８とした。このベクターにコードされる組換え体Ｈｉｓ−ＯＳＴ３１１の塩基配列とアミノ酸配列を図２６に示す。
（３）組換え体Ｈｉｓ−ＯＳＴ３１１の大腸菌での発現と調製
プラスミドＯＳＴ３１１／ｐＥＴ２８を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ  ＲＰ（米国、ストラタジーン社）に導入し、形質転換させたクローンを取得した。得られた大腸菌クローンを１０ｍｇのカナマイシン（米国、シグマ社）を含む１００ｍｌのＬＢ培地に植菌し３７℃で終夜培養した。この菌体液を１ＬのＬＢ培地にＡ６００＝０．１となるように接種し、３Ｌ容量の坂口フラスコを用いて３７℃で振とう培養をおこなった。経時的に培養液の吸光度を測定してＡ６００＝０．６〜１．０になったところで、イソプロピル−１−チオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）（日本国、和光純薬）を１ｍＭとなるように加え、４時間後に遠心分離（７７００ｇｘ１５分）により集菌した。集めた菌体を２０ｍｌの１ｍＭ  ＤＴＴを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）中に懸濁し、フレンチプレスを用いて菌体を破砕した。この破砕液を遠心分離（７７００ｇｘ１５分）し、次に、沈殿画分を１５ｍｌの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で懸濁し、ＤＮａｓｅ  Ｉ（スイス国、ロッシュ社）を０．１ｍｇ／ｍＬになるように添加して、４℃で１時間振とうした。その後、遠心分離（２３４００ｇｘ１５分）を行い、沈殿画分をインクルージョンボディとして回収した。得られたインクルージョンボディーを１０ｍｌの０．７５Ｍ尿素および１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に懸濁し、遠心分離（２３４００ｇｘ１５分）により沈殿を回収する洗浄操作を実施した。さらに、この洗浄操作を２回繰り返した。
洗浄したインクルージョンボディを５ｍｌの変性剤溶液（１ｍＭ  ＤＴＴおよび６Ｍ塩酸グアニジンを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８））に懸濁し、３７℃で１時間振とうすることにより可溶化した。不溶物を遠心分離（２３４００ｇｘ１５分）により沈殿として除去した後、６Ｍ塩酸グアニジンを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）で平衡化した。この可溶化サンプルを、Ｎｉ−ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（ドイツ国、ＱＩＡＧＥＮ社）を充填したカラムに供し、６Ｍ塩酸グアニジンを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）で洗浄した。カラムに吸着された蛋白質を５００ｍＭイミダゾール（日本国、ナカライテスク社）および６Ｍ塩酸グアニジンを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）にて溶出させて変性Ｈｉｓ−ＯＳＴ３１１を精製した。精製したサンプルの２８０ｎｍにおける紫外吸光度から濃度を求め、最終濃度が２ｍｇ／ｍｌとなるように６Ｍ塩酸グアニジンを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）を加えて変性Ｈｉｓ−ＯＳＴ３１１溶液を調製した。このサンプルに終濃度が１ｍＭになるように還元剤システインを加え、０．６Ｍ塩酸グアニジン，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）で１００倍希釈し、リフォールディングを開始し、４℃で３日間以上インキュベートした。
このリフォールディング溶液を、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）に対して４℃で透析した。透析液を、限外濾過膜を用いて約１０倍に濃縮し、陽イオン交換カラムＳＰ−５ＰＷ（日本国、東ソー社）を用いてＨＰＬＣにて精製した。蛋白質の溶出には１０％グリセロールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）を用い、０．５Ｍから２ＭまでのＮａＣｌ直線濃度勾配で溶出させた。この溶出パターンを図２７に示す。溶出された２種類の蛋白質ピークのうち、より低い塩濃度で溶出されたピークにＨｉｓ−ＯＳＴ３１１が含まれていることがＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および質量分析からわかった。このようにして約１Ｌの培養菌体から最終精製物であるＨｉｓ−ＯＳＴ３１１を約０．６ｍｇ調製することができた。
（４）ＭＫ−ＯＳＴ３１１発現ベクターｐＥＴ２２ｂ−ＭＫ−ＯＳＴ３１１の構築
以下のプライマーを合成した。
0004799801.tif 000033
上述のＨｉｓ−ＯＳＴ３１１発現プラスミドＯＳＴ３１１／ｐＥＴ２８を鋳型として、ＯＳＴ３１１ＭＫ１（配列番号６４）とＯＳＴ３１１ＭＫ２（配列番号６５）をプライマーとして用いてＰＣＲを行い目的の配列を増幅した。この操作により得られたＯＳＴ３１１ｃＤＮＡは、開始コドン（ＡＴＧ）の後に続く２７塩基が大腸菌型のコドンに変換されている。このＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツ国、ＱＩＡＧＥＮ社）で精製し、制限酵素ＮｄｅＩ（日本国、宝酒造社）とＮｏｔＩ（日本国、宝酒造社）を用い３７℃、１時間消化した。消化物を、アガロース電気泳動で分離後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ドイツ国、ＱＩＡＧＥＮ社）で精製した。このＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｄｅＩとＮｏｔＩで３７℃、１時間消化し、アガロース電気泳動で分離精製したプラスミドベクターｐＥＴ２２ｂ（米国、Ｎｏｖａｇｅｎ社）にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ２（日本国、宝酒造社）を用いて１６℃で１５分間連結した。これを大腸菌ＪＭ１０９（日本国、宝酒造社）に導入してクローン化し、定法に従ってプラスミドを抽出した。得られたプラスミドの塩基配列を決定し、目的通りに取得したＯＳＴ３１１ｃＤＮＡがｐＥＴ２２ｂベクターに挿入されていることを確認した。これをｐＥＴ２２−ＭＫ−ＯＳＴ３１１とした。このベクターにコードされる組換え体ＭＫ−ＯＳＴ３１１の塩基配列とアミノ酸配列を図２６に示す。
（５）ＭＫ−ＯＳＴ３１１の大腸菌での発現と調製
プラスミドｐＥＴ２２−ＭＫ−ＯＳＴ３１１を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ  ＲＰ（米国、ストラタジーン社）に導入し、形質転換させたクローンを取得した。得られた大腸菌クローンを１０ｍｇのアンピシリンを含む１００ｍｌのＬＢ培地に植菌し３７℃で終夜培養した。この菌体液を１ＬのＬＢ培地にＡ６００＝０．１となるように接種し、３Ｌ容量の坂口フラスコを用いて３７℃で振とう培養をおこなった。この菌体液にＩＰＴＧを添加することで組換え体の発現を誘導し、上述のＨｉｓ−ＯＳＴ３１１調製法と同様の方法でインクルージョンボディを調製した。
洗浄したインクルージョンボディを５ｍｌの変性剤溶液（１ｍＭ  ＤＴＴおよび６Ｍ塩酸グアニジンを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８））に懸濁し、３７℃で１時間振とうすることにより可溶化した。これを変成剤溶液で２倍に希釈し、さらに、０．６Ｍ塩酸グアニジンおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）を用いて１００倍に希釈し、リフォールディングを開始し、４℃で３日間以上インキュベートした。酸化剤の添加およびｐＨ７以上の条件下では、蛋白質の沈澱が生じ、リフォールディング効率が著しく低下することが明らかとなった。このリフォールディング溶液を、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）に対して４℃で透析した。限外濾過膜を用いて透析液を約１０倍に濃縮し、陽イオン交換カラムＳＰ−５ＰＷ（日本国、東ソー社）を用いてＨＰＬＣにて精製した。蛋白質の溶出には１０％グリセロールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）を用い、０．５Ｍから２ＭまでのＮａＣｌ直線濃度勾配で溶出させた。図２８に示すように蛋白質の溶出ピークは２種類あり、より低い塩濃度で溶出されたピークにＭＫ−ＯＳＴ３１１が含まれていることが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および質量分析から明らかとなった。約１Ｌのフラスコ培養菌体から最終精製物であるＭＫ−ＯＳＴ３１１を約０．６ｍｇ精製することができた。
（６）ＭＫ−ＯＳＴ３１１のＰＥＧ化
イオン交換カラムで精製した１０ｍｌのＭＫ−ＯＳＴ３１１（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を１０％酢酸を用いてｐＨ４．８に調整した。この溶液に１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）に溶解した分子量２００００の活性化ＰＥＧ（米国、Ｓｈａｒｅｗａｔｅｒ社）２５ｍｇを氷中で撹拌しながら加えた。１５分後に１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）に溶解した１Ｍ水素化シアノほう素ナトリウム（日本国、ナカライテスク社）を最終濃度１５ｍＭになるように加え、さらに４℃で１６時間攪拌した。この反応でＰＥＧ化したＯＳＴ３１１を陽イオン交換カラムＳＰ−５ＰＷ（日本国、東ソー社）を用いてＨＰＬＣにて精製した。蛋白質の溶出には１０％グリセロールを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６）を用い、０．５Ｍから２ＭまでのＮａＣｌ直線濃度勾配で溶出させた。ＰＥＧ化されたＭＫ−ＯＳＴ３１１は、図２９に示すように、ＭＫ−ＯＳＴ３１１よりもさらに低イオン強度側において単一なピークとして溶出された。
（７）Ｈｉｓ−ＯＳＴ３１１組換え体の活性検討
精製Ｈｉｓ−ＯＳＴ３１１組換え体の生物活性を検討するため、実施例２４に記載した要領で組み換え蛋白質を正常マウス（５週齢、ＢＡＬＢ／ｃ、雄、各群６匹）に一匹当たり４．５μｇ／０．１ｍｌずつ尾静脈内単回投与し、９時間後の血清リン酸および１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度を実施例２０に記載した同様の方法で測定した。また陽性対照として、同用量のＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞由来精製組換え体を、また媒体群へは２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．９）および０．３Ｍ  ＮａＣｌからなる溶媒を０．１ｍｌずつ尾静脈内単回投与した。
図３０のＡに示すように、投与から９時間後のＨｉｓ−ＯＳＴ３１１投与群において、媒体投与群と比し有意な血清リン低下作用を認めた。また、その低下程度はＣＨＯ由来組換え体投与群と同等であった。一方、投与から９時間後の血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度についても、図３２に示すようにＨｉｓ−ＯＳＴ３１１投与群において顕著な低下を認めた。
実施例２４の（３）および（４）に記載したように、ＣＨＯ細胞由来のＯＳＴ３１１蛋白質を単回投与して４時間後にすでに有意な血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度低下を認めており、それに先立ち、投与後１時間目において腎臓での２５−ヒドロキシビタミンＤ−１−α−水酸化酵素（１αＯＨａｓｅ）の発現低下および２５ヒドロキシビタミンＤ−２４−水酸化酵素（２４ＯＨａｓｅ）の発現亢進を認めている。そこで、ＢＡＬＢ／ｃマウス（５週齢、雄）へ一匹当たり４．５μｇ／０．１ｍｌずつＨｉｓ−ＯＳＴ３１１を尾静脈内単回投与し、１および４時間後に摘出した腎臓における１αＯＨａｓｅ遺伝子および２４ＯＨａｓｅ遺伝子の発現変化をノザンブロッティング法にて解析した。陽性対照として同用量のＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞由来精製組換え体を、また媒体群へは２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、０．３Ｍ  ＮａＣｌからなる溶媒を０．１ｍｌずつ尾静脈内単回投与した。図３１に示すように、Ｈｉｓ−ＯＳＴ３１１はＣＨＯ由来組換え体と同様に、投与後１時間目ですでに１αＯＨａｓｅ遺伝子の発現低下および２４ＯＨａｓｅ遺伝子の発現亢進を引き起こしており、ＣＨＯ由来組換え体と同等のビタミンＤ代謝酵素遺伝子発現調節活性を有していることが判明した。また、図３２に示すように、血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度変化は、組換え体投与後４時間目で減少傾向を示し、８時間目ではより顕著な低下を認めており、実施例２４の（３）で示したＣＨＯ由来組換え体投与試験で認められた経時変化の様態とほぼ一致していることが判明した。
以上の結果から、大腸菌で産生した組換え体Ｈｉｓ−ＯＳＴ３１１は、少なくとも血清リン低下活性ならびにビタミンＤ代謝調節活性については、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞が産生する分泌型組換え体と同等の生物活性を有していることが判明した。
（８）ＰＥＧ化ＭＫ−ＯＳＴ３１１の活性検討
ＰＥＧ化ＭＫ−ＯＳＴ３１１の生物活性を、実施例２４に記載した要領で正常マウス（５週齢、ＢＡＬＢ／ｃ、雄、各群８匹）一匹当たり５．０μｇ／０．１ｍｌずつ尾静脈内単回投与し、９時間後の血清リン酸濃度を実施例２０に記載した同様の方法で測定した。媒体群へは２０ｍＭ  ＰＢ（ｐＨ６．０）、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１Ｍ  ＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０からなる溶媒を０．１ｍｌずつ尾静脈内単回投与した。投与後８時間目において、ガラス製キャピラリーを用いて眼窩採血を施し、得られた血清中の無機リン酸濃度を測定した。図３０のＢに示したように、ＰＥＧ化ＭＫ−ＯＳＴ３１１投与群において、媒体投与群と比し有意な血清リン低下作用を認めた。この結果から、大腸菌産生型組換え体をＰＥＧ化してもその生物活性は阻害されないことが判明した。
実施例２８  切断部分へのアミノ酸変異導入
実施例９に記載したように、ＯＳＴ３１１は配列番号２のアミノ酸残基１７９番目のＡｒｇと１８０番目のＳｅｒの間で切断を受けることが判明している。一方、実施例１９に記載したようにＯＳＴ３１１のアミノ酸残基１７６番目のＡｒｇおよびアミノ酸残基１７９番目のＡｒｇの両者を同時にＧｌｎに置換することでこの切断が阻害されることが確認されている。これらの事実は、この切断が隣接するＲＸＸＲもしくはＲＲＸＸＲ配列からなるモチーフを認識するプロテアーゼによる可能性を示唆するものである。また、配列番号４に示すポリペプチドからなる全長型組換え体を生体内に投与した際にも、上述の、あるいはそれに類似した切断を受ける可能性が考えられる。そこで、配列番号２のアミノ酸残基１７５番目から１８０番目までの各残基をそれぞれＡｌａ、ＧｌｎあるいはＴｒｐに置換することにより、ＣＨＯ細胞における各変異組換え体の発現分泌パターンにどのような影響を与えるかを検討した。
（１）切断部分変異導入ＯＳＴ３１１遺伝子の作製
以下のプライマーを合成した。
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ｐｙｈ２３ＰＡ１Ｆおよびｐｙｈ２３ＰＡ１Ｒは、ＯＳＴ３１１ｃＤＮＡ（配列番号１）の６５２番目のシトシンをグアニンに置換することで、配列番号２に示すアミノ酸残基１７４番目のＰｒｏをＡｌａに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をＰ１７４Ａと称す。
ｐｙｈ２３ＲＡ１Ｆおよびｐｙｈ２３ＲＡ１Ｒは、ＯＳＴ３１１ｃＤＮＡ（配列番号１）の６５５番目のシトシンをグアニンに、６５６番目のグアニンをシトシンにそれぞれ置換することで、配列番号２に示すアミノ酸残基１７５番目のＡｒｇをＡｌａに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をＲ１７５Ａと称す。
ｐｙｈ２３ＲＡ２Ｆおよびｐｙｈ２３ＲＡ２Ｒは、ＯＳＴ３１１ｃＤＮＡ（配列番号１）の６５８番目のシトシンをグアニンに、６５９番目のグアニンをシトシンにそれぞれ置換することで、配列番号２に示すアミノ酸残基１７６番目のＡｒｇをＡｌａに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下，本変異をＲ１７６Ａと称す。
ｐｙｈ２３ＨＡ１Ｆおよびｐｙｈ２３ＨＡ１Ｒは、ＯＳＴ３１１ｃＤＮＡ（配列番号１）の６６１番目のシトシンをグアニンに、６６２番目のアデニンをシトシンに置換することで、配列番号２に示すアミノ酸残基１７７番目のＨｉｓをＡｌａに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をＨ１７７Ａと称す。
ｐｙｈ２３ＴＡ１Ｆおよびｐｙｈ２３ＴＡ１Ｒは、ＯＳＴ３１１ｃＤＮＡ（配列番号１）の６６４番目のアデニンをグアニンに置換することで、配列番号２に示すアミノ酸残基１７８番目のＴｈｒをＡｌａに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をＴ１７８Ａと称す。
ｐｙｈ２３ＲＡ３Ｆおよびｐｙｈ２３ＲＡ３Ｒは、ＯＳＴ３１１ｃＤＮＡ（配列番号１）の６６７番目のシトシンをグアニンに、６６８番目のグアニンをシトシンにそれぞれ置換することで、配列番号２に示すアミノ酸残基１７９番目のＡｒｇをＡｌａに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をＲ１７９Ａと称す。
ｐｙｈ２３ＳＡ１Ｆおよびｐｙｈ２３ＳＡ１Ｒは、ＯＳＴ３１１ｃＤＮＡ（配列番号１）の６７０番目のアデニンをグアニンに、６７１番目のグアニンをシトシンにそれぞれ置換することで、配列番号２に示すアミノ酸残基１８０番目のＳｅｒをＡｌａに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をＳ１８０Ａと称す。
ｐｙｈ２３ＲＫＱ１Ｆおよびｐｙｈ２３ＲＫＱ１Ｒは、ＯＳＴ３１１ｃＤＮＡ（配列番号１）の６５６番目のグアニンをアデニンに置換することで、配列番号２に示すアミノ酸残基１７５番目のＡｒｇをＧｌｎに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をＲ１７５Ｑと称す。
ｐｙｈ２３ＲＫＱ２Ｆおよびｐｙｈ２３ＲＫＱ２Ｒは、ＯＳＴ３１１ｃＤＮＡ（配列番号１）の６５９番目のグアニンをアデニンに置換することで、配列番号２に示すアミノ酸残基１７６番目のＡｒｇをＧｌｎに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をＲ１７６Ｑと称す。
ｐｙｈ２３ＲＫＱ３Ｆおよびｐｙｈ２３ＲＫＱ３Ｒは、ＯＳＴ３１１ｃＤＮＡ（配列番号１）の６６８番目のグアニンをアデニンに置換することで、配列番号２に示すアミノ酸残基１７９番目のＡｒｇをＧｌｎに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をＲ１７９Ｑと称す。
ｐｙｈ２３ＲＷＦおよびｐｙｈ２３ＲＷＲは、ＯＳＴ３１１ｃＤＮＡ（配列番号１）の６６７番目のシトシンをチミンに置換することで、配列番号２に示すアミノ酸残基１７９番目のＡｒｇをＴｒｐに置換する為の変異導入用の順方向、逆方向のプライマーである。以下、本変異をＲ１７９Ｗと称す。
（１）−１  ＯＳＴ３１１Ｐ１７４ＡＨ遺伝子の作製
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（日本国、宝酒造社）を用い、添付文書に従って２種類の反応液を１００μＬ調製した。一方にはプライマーとしてＯＳＴ３１１ＭＥ１（配列番号４５）、ｐｙｈ２３ＰＡ１Ｆ（配列番号６６）を終濃度０．２μＭで使用し、もう一方にはプライマーとしてｐｙｈ２３ＰＡ１Ｒ（配列番号６７）、ＯＳＴ３１１ＨＮｔ（配列番号４６）を終濃度０．２μＭで使用した。それぞれの反応液に、実施例１９の（１）に記載したＯＳＴ３１１／ｐＣＡＧＧＳプラスミド１０ｎｇを鋳型として加え、９４℃て１分保温したのち、９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして４０サイクルのＰＣＲ反応を実施した。これら２種類の反応液をそれぞれ１０倍に希釈し、それぞれ１μＬをＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（日本国、宝酒造社）添付文書に従って調製した反応液１００μＬに添加した。この溶液にプライマーとしてＯＳＴ３１１ＭＥ１（配列番号４５）、ＯＳＴ３１１ＨＮｔ（配列番号４６）を終濃度０．２μＭとなるよう加え、９４℃で１分保温したのち、９４℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒を１サイクルとして３０サイクルのＰＣＲ反応を実施し、さらに７２℃で７分保温した。得られた反応生成物をジーンクリーンＩＩ（米国、Ｂｉｏ１０１社）を用いて添付の文書に従い回収した。その後ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩで消化し、２％アガロースゲル電気泳動によって約８００ｂｐのＤＮＡ断片を分離、ジーンクリーンＩＩ（米国、Ｂｉｏ１０１社）を用いて回収した。得られたＤＮＡ断片をｐＥＡＫ８ベクター（米国エッジバイオ社）のＥｃｏＲＩ，ＮｏｔＩ部位に挿入することによって、プラスミドＯＳＴ３１１Ｐ１７４ＡＨ−ｐＥＡＫ８を得た。定法に従ってプラスミドＤＮＡを調製し、ＡＢＩ３７００蛍光ＤＮＡシークエンサー（米国、ＰＥアプライドシステムズ社）によって塩基配列を決定し、目的のＰ１７４Ｈの変異が導入されたことを確認した。またＣ末端にヒスチジンタグが付加されてることを確認した。Ｐ１７４Ａの変異が導入された変異遺伝子でコードされるポリペプチドをＯＳＴ３１１Ｐ１７４ＡＨと称す。
（１）−２  ＯＳＴ３１１Ｒ１７５ＡＨ遺伝子の作製
ｐｙｈ２３ＲＡ１Ｆ（配列番号６８）、ｐｙｈ２３ＲＡ１Ｒ（配列番号６９）プライマーを用いて（１）−１と同様の方法にて作製した。
（１）−３  ＯＳＴ３１１Ｒ１７６ＡＨ遺伝子の作製
ｐｙｈ２３ＲＡ２Ｆ（配列番号７０）、ｐｙｈ２３ＲＡ２Ｒ（配列番号７１）プライマーを用いて（１）−１と同様の方法にて作製した。
（１）−４  ＯＳＴ３１１Ｈ１７７ＡＨ遺伝子の作製
ｐｙｈ２３ＨＡ１Ｆ（配列番号７２）、ｐｙｈ２３ＨＡ１Ｒ（配列番号７３）プライマーを用いて（１）−１と同様の方法にて作製した。
（１）−５  ＯＳＴ３１１Ｔ１７８ＡＨ遺伝子の作製
ｐｙｈ２３ＴＡ１Ｆ（配列番号７４）、ｐｙｈ２３ＴＡ１Ｒ（配列番号７５）プライマーを用いて（１）−１と同様の方法にて作製した。
（１）−６  ＯＳＴ３１１Ｒ１７９ＡＨ遺伝子の作製
ｐｙｈ２３ＲＡ３Ｆ（配列番号７６）、ｐｙｈ２３ＲＡ３Ｒ（配列番号７７）プライマーを用いて（１）−１と同様の方法にて作製した。
（１）−７  ＯＳＴ３１１Ｓ１８０ＡＨ遺伝子の作製
ｐｙｈ２３ＳＡ１Ｆ（配列番号７８）、ｐｙｈ２３ＳＡ１Ｒ（配列番号７９）プライマーを用いて（１）−１と同様の方法にて作製した。
（１）−８  ＯＳＴ３１１Ｒ１７５ＱＨ遺伝子の作製
ｐｙｈ２３ＲＫＱ１Ｆ（配列番号８０）、ｐｙｈ２３ＲＫＱ１Ｒ（配列番号８１）プライマーを用いて（１）−１と同様の方法にて作製した。
（１）−９  ＯＳＴ３１１Ｒ１７６ＱＨ遺伝子の作製
ｐｙｈ２３ＲＫＱ２Ｆ（配列番号８２）、ｐｙｈ２３ＲＫＱ２Ｒ（配列番号８３）プライマーを用いて（１）−１と同様の方法にて作製した。
（１）−１０  ＯＳＴ３１１Ｒ１７９ＱＨ遺伝子の作製
ｐｙｈ２３ＲＫＱ３Ｆ（配列番号８４）、ｐｙｈ２３ＲＫＱ３Ｒ（配列番号８５）プライマーを用いて（１）−１と同様の方法にて作製した。
（１）−１１  ＯＳＴ３１１Ｒ１７９ＷＨ遺伝子の作製
ｐｙｈ２３ＲＷＦ（配列番号８６）、ｐｙｈ２３ＲＷＲ（配列番号８７）プライマーを用いて（１）−１と同様の方法にて作製した。
（２）切断部分変異導入ＯＳＴ３１１遺伝子の一過性発現と培養上清の調製
ｐＥＡＫ  ｒａｐｉｄ細胞（米国、エッジバイオシステム）を１２ウェルプレートに播種した。この細胞にｐＥＡＫシステム添付文書（米国、エッジバイオシステム社）に従い、上述の１１種類の変異ＯＳＴ３１１発現プラスミドをリン酸カルシウム法にてトランスフェクションした。４時間静置したのち、１．５ｍｌの血清を含まないＭＥＭα培地に置換し後、２日間、３７℃にて培養してその上清を回収した。
（３）切断部分変異導入ＯＳＴ３１１遺伝子の発現確認
得られた培養上清を、実施例６の（３）に記載した要領でウエスタンブロッティングに供し、培養上清中の切断部分変異導入ＯＳＴ３１１組換え体の存在を検討した。検出抗体には、実施例２２で記載したＯＳＴ３１１特異的ポリクローナル抗体３１１−１４８を用いた。その結果、図３３に示すように、アミノ酸残基１７４番目から１８０番目までの置換体の内、Ｐ１７４Ａ、Ｒ１７５Ａ、Ｒ１７５Ｑ、Ｈ１７７Ａ、Ｔ１７８ＡおよびＳ１８０Ａの変異を導入したＯＳＴ３１１組換え体において、１６ｋＤａ付近に野生型と同様の、配列番号６に示すポリペプチドを含む分解産物を認めたが、Ｒ１７６Ａ、Ｒ１７９Ａ、Ｒ１７６Ｑ、Ｒ１７９ＱあるいはＲ１７９Ｗの変異を導入したＯＳＴ３１１組換え体において、いずれも分解産物を認めないことが明らかとなった。これらの結果から、アミノ酸残基１７９番目Ａｒｇと１８０番目Ｓｅｒとの間で起こる切断には，アミノ酸残基１７６番目Ａｒｇおよび１７９番目Ａｒｇが特に重要な役割を果たすことが示唆された。即ち、両残基を少なくともＡｌａ、ＧｌｎあるいはＴｒｐのいずれのアミノ酸で置換しても、切断が阻害もしくは抑制を受けることから、全長ポリペプチドの産生を促進することが期待される。
実施例２９
実施例６に示すようにＯＳＴ３１１をＣＨＯ細胞やＣＯＳ細胞で発現させた場合に得られる組換え体産物は、実施例９で示したようにＲＸＸＲモチーフの直後である１７９番目のアルギニンと１８０番目のセリンの間で切断されるものが得られる。実施例１８で示したように、ＯＳＴ３１１蛋白質の低リン血症誘導活性はこの部位の切断を受けなかった全長蛋白において保持されていることが明らかとなった。さらに、ＲＸＸＲモチーフがこの切断に関与していることは、実施例１９および実施例２８に示した変異導入試験で明らかである。組換え体ＯＳＴ３１１を効率良く生産取得する上において、この切断を回避することは重要な課題であり、実施例２８で示したＲＸＸＲモチーフに変異を導入することは一つの有効な方法である。ＲＸＸＲモチーフを認識する蛋白分解酵素の一つとして、ｆｕｒｉｎが知られている。この酵素は、トランスゴルジ領域に局在し蛋白質が合成された後、分泌に至る過程においてＲＸＸＲモチーフを認識して蛋白質を切断すると考えられている。
（１）ＯＳＴ３１１切断へのｆｕｒｉｎの関与
ｆｕｒｉｎが欠損しているＬｏＶｏ細胞にＯＳＴ３１１／ｐＣＡＧＧＳプラスミドをトランスフェクタム（米国、プロメガ社）を用いて導入し、４８時間培養したのち、一過性に発現し、培養液中に分泌したＯＳＴ３１１蛋白質をウェスタンブロッティングで３１１−１４８抗体を用いて解析したところ、切断断片は検出されなかった。このことから、ＯＳＴ３１１の生産時に見られる切断にｆｕｒｉｎが関与していることが示唆された。
（２）ＯＳＴ３１１の切断の回避
上記結果より、ｆｕｒｉｎ活性を阻害することが１７９番目のアルギニンと１８０番目のセリンの間で切断されないＯＳＴ３１１の生産性向上に有効であることが想定された。したがって、Ｌｏｖｏ細胞のようなｆｕｒｉｎ活性を持たない宿主でＯＳＴ３１１を発現させること、あるいはｆｕｒｉｎの阻害剤を添加することによりｆｕｒｉｎ活性を抑制した状況でＯＳＴ３１１を発現させることが考えられる。そこで、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞のｆｕｒｉｎ活性を抑制する目的で、α１−アンチトリプシンポートランド（α１−ＰＤＸ）をＢｅｎｊａｎｎｅｔ  Ｓらが報告している方法（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：２６２１０−８，１９９７）に準じて一過性に発現させて培養上清を回収したところ、組換え体産物中の全長体の存在比率が、対照とした非遺伝子導入ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞上清中のものに比べて増加していた。このことから、ｆｕｒｉｎ活性を抑制する物質を外来的あるいは内因的に作用させることでＯＳＴ３１１の全長蛋白の生産効率を上昇させることができると考えられた。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願は、そのまま参考として本明細書に取り入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明により、リン酸代謝、カルシウム代謝および／又は石灰化を調節するポリペプチド、同ポリペプチドをコードするＤＮＡ、同ポリペプチドを有効成分とする医薬組成物、および同ポリペプチドを認識する抗体と同抗体を有効成分とする医薬組成物、同抗体を用いた診断方法と診断用組成物が提供される。
配列表フリーテキスト
配列番号１２：合成ＤＮＡ
配列番号１３：合成ＤＮＡ
配列番号１４：合成ＤＮＡ
配列番号１５：合成ＤＮＡ
配列番号１６：合成ＤＮＡ
配列番号１７：合成ＤＮＡ
配列番号１８：合成ＤＮＡ
配列番号１９：合成ＤＮＡ
配列番号２０：合成ＤＮＡ
配列番号２１：合成ＤＮＡ
配列番号２２：合成ＤＮＡ
配列番号２３：合成ＤＮＡ
配列番号２４：合成ＤＮＡ
配列番号２５：合成ＤＮＡ
配列番号２６：合成ＤＮＡ
配列番号２７：合成ＤＮＡ
配列番号２８：合成ペプチド
配列番号２９：合成ペプチド
配列番号３０：合成ＤＮＡ
配列番号３１：合成ＤＮＡ
配列番号３２：合成ＤＮＡ
配列番号３３：合成ＤＮＡ
配列番号３４：合成ＤＮＡ
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配列番号３８：合成ＤＮＡ
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配列番号４０：合成ＤＮＡ
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配列番号５０：合成ペプチド
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配列番号８５：合成ＤＮＡ
配列番号８６：合成ＤＮＡ
配列番号８７：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＯＳＴ３１１の腫瘍特異性を検討するため、腫瘍組織より抽出したｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡおよび対照骨組織より抽出したｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型に、配列番号２２、２３に示すＯＳＴ３１１特異的プライマーおよび、配列番号２６、２７に示すＧ３ＰＤＨ特異的プライマーを用いてＰＣＲを実施し、その増幅産物をアガロース電気泳動で解析した写真である。
図２は、組換えＯＳＴ３１１を、ニッケルレジンにてアフィニティー精製した後、強陽イオン交換樹脂ＳＰ−５ＰＷで分離精製した溶出画分について、ウェスタンブロッティングを実施しＯＳＴ３１１を検出したことを示す写真である。
図３Ａは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ６．５．１の計算機能を用いて、ペプチド抗体作製に適した部位を予測した結果を示す図である。
図３Ｂは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ６．５．１の計算機能を用いて疎水性度を予測した結果を示す図である。
図４は、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞を移植してから３１日間の、非腫瘍形成群（ａｖｒ．−で表示されたグラフ）およびＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞腫瘍形成群（ａｖｒ．＋で表示されたグラフ）の平均体重の経時変化を示した図である。
図５は、対照ＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞腫瘍形成個体、ＣＨＯ−ＯＳＴ１９０Ｈ細胞腫瘍形成個体、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞腫瘍形成個体をそれぞれＸ線撮影し、全身骨格を示した写真である。
図６は、ヒトＯＳＴ３１１ポリペプチドとマウスＯＳＴ３１１のポリペプチドとの間におけるアミノ酸の相同性を比較した結果を示す図である。
図７は、腫瘍非形成群（ｎ＝６）、ＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１腫瘍形成群（ｎ＝１０）、ＣＨＯ−ＯＳＴ１９０Ｈ腫瘍形成群（ｎ＝１０）、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ腫瘍形成群−１（ｎ＝６）、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ腫瘍形成群−２（ｎ＝６）より４４日目〜４６日目に心採血にて採取した血清中のリン濃度、カルシウム濃度、アルカリホスファターゼ活性を測定した結果を示した図である。
図８は、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ腫瘍形成個体および非腫瘍形成個体より摘出した腎臓から、近位尿細管上皮細胞冊子縁膜を調製し、ナトリウム・リン酸共役輸送担体（ＮａＰｉ−７）の発現量をウェスタンブロッティング法で比較した写真である。
図９Ａは、腫瘍移植後４４日目〜４６日目に屠殺したマウスより採取した腎臓におけるリン酸輸送担体（ＮａＰｉ−７、ＮＰＴ−１）とビタミンＤ代謝酵素（１αＯＨａｓｅ、２４ＯＨａｓｅ）と小腸におけるリン酸輸送担体（ＮａＰｉ−ＩＩｂ）のｍＲＮＡ量の変化をノーザンブロッティングで検出した写真である。
図９Ｂは、腫瘍移植後４４日目〜４６日目に屠殺したマウスより採取した腎臓におけるリン酸輸送担体（ＮａＰｉ−７、ＮＰＴ−１）とビタミンＤ代謝酵素（１αＯＨａｓｅ、２４ＯＨａｓｅ）と小腸におけるリン酸輸送担体（ＮａＰｉ−ＩＩｂ）のｍＲＮＡ量の変化をノーザンブロッティングで検出した写真である。
図９Ｃは、腫瘍移植後４４日目〜４６日目に屠殺したマウスより採取した腎臓におけるリン酸輸送担体（ＮａＰｉ−７、ＮＰＴ−１）とビタミンＤ代謝酵素（１αＯＨａｓｅ、２４ＯＨａｓｅ）と小腸におけるリン酸輸送担体（ＮａＰｉ−ＩＩｂ）のｍＲＮＡ量の変化をノーザンブロッティングで検出した写真である。
図１０は、腫瘍移植後４４日目〜４６日目に屠殺したマウスより採取した大腿骨のＸ線写真である。
図１１Ａは、ＰＢＳ、ＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞およびＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞をヌードマウス（６週齢、ＢＡＬＢ／ｃ、雄）へ移植後、２日目における血清リン酸、カルシウム濃度を比較した図である。
それぞれの値は、平均±標準偏差で表されている。
図１１Ｂは、ＰＢＳ、ＣＨＯ  ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞およびＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞をヌードマウス（６週齢、ＢＡＬＢ／ｃ、雄）へ移植後、６日目における血清リン酸、カルシウム濃度を比較した図である。
それぞれの値は、平均±標準偏差で表されている。
図１２は、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞の培養上清を精製し、溶出画分を抗Ｈｉｓ６抗体および抗ＯＳＴ３１１ペプチド抗体（３１１−１１４）を用いてウェスタンブロッティングした結果を示す写真である。左パネルは３１１：２６−２５１、中央パネルは３１１：２５−１７９、右パネルは３１１：１８０−２５１をそれぞれ検出した図である。ゲル写真上部に「＊」で記した画分を、正常マウスへの単回投与試験に用いた。
図１３は、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞移植マウスおよび腫瘍なしマウスより摘出した脛骨骨幹端部の、非脱灰切片をＶｉｌｌａｎｕｅｖａ  ｇｏｌｄｎｅｒ染色した写真である。
図１４は、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞移植マウスおよび対照マウスより摘出した腎臓における、ビタミンＤ代謝酵素遺伝子産物のノザンブロッティングを示した写真である。
図１５は、Ａは、ＣＨＯ産生型組換えＯＳＴ３１１Ｈ全長蛋白質の正常マウスへの投与試験１について、タイムスケジュールを表した図である。Ｂは、各採血時における血清中リン酸濃度を、Ｃは、同時点での血清カルシウム濃度を表したグラフである。
図１６は、Ａは、ＣＨＯ産生型組換えＯＳＴ３１１Ｈ全長蛋白質の正常マウスへの投与試験２について、タイムスケジュールを表した図である。Ｂは、各採血時における血清中リン酸濃度を、Ｃは、同時点での血清カルシウム濃度を表したグラフである。
図１７は、変異型組換え体ＯＳＴ３１１ＲＱＨを産生するＣＨＯ−ＯＳＴ３１１ＲＱＨ細胞およびＯＳＴ３１１ＲＱＨ／ｐＥＡＫ  ｒａｐｉｄ細胞の培養上清をウェスタンブロッティングに供し、上清中組換え体を検出した写真である。
図１８は、Ａは、変異型組換え体ＯＳＴ３１１ＲＱＨの正常マウスへの投与試験について、タイムスケジュールを表した図である。Ｂは、各採血時における血清中リン酸濃度を、Ｃは、同時点での血清カルシウム濃度を表したグラフである。
図１９は、Ａは、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１ＲＱＨ細胞移植試験の移植後２日目における血清リン酸濃度を示した図である。Ｂは、同試験における血清カルジウム濃度を示した図である。
図２０は、ＣＨＯ−ＯＳＴ３１１Ｈ細胞の無血清培養上清中の組換えＯＳＴ３１１Ｈを抗ＯＳＴ３１１部分ペプチドウサギ抗血清を用いてウェスタンブロッティングにより検出した写真である。
図２１は、Ａは、６種類の抗ＯＳＴ３１１ペプチドポリクローナル抗体を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡを構築し、個々の組み合わせに対する組換えＯＳＴ３１１の検出レベルを示した表である。Ｂは、固相化抗体として３１１−４８抗体または３１１−１８０抗体を、検出用抗体として３１１−１４８抗体を組み合わせたＥＬＩＳＡシステムを用いて、精製組換えＯＳＴ３１１Ｈの濃度とそれぞれに対する測定値の関係をプロットしたグラフである。
図２２は、Ａは、組換えＯＳＴ３１１蛋白質または媒体をマウスに投与後１、３、８時間目における腎臓ＮａＰｉ−７の発現をウェスタンブロッティングで確認した図である。Ｂは、同様の処置をした腎臓のトータルＲＮＡを用い、ＮａＰｉ−７の発現をノザンブロッティングで確認した図である。
図２３は、組換えＯＳＴ３１１蛋白質または媒体をマウスに投与後１、３、８時間目における血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３濃度の推移を表した図である。
図２４は、組換えＯＳＴ３１１蛋白質または媒体をマウスに投与後１、３、８時間目における腎臓のトータルＲＮＡを用いて、２５−ヒドロキシビタミンＤ−１−α−水酸化酵素（１αＯＨａｓｅ）あるいは、２５−ヒドロキシビタミンＤ−２４−水酸化酵素（２４ＯＨａｓｅ）遺伝子の発現をノザンブロッティングで確認した図である。
図２５は、細胞移植後３日目での、ＣＨＯ−ｒａｓ  ｃｌｏｎｅ−１細胞移植群における平均血清リン酸濃度値を１００％とした場合の、各群における平均血清リン酸レベルを表した図である。
図２６は、プラスミドＯＳＴ３１１／ｐＥＴ２８にコードされる組換え体Ｈｉｓ−ＯＳＴ３１１のＤＮＡ塩基配列とアミノ酸配列ならびにプラスミドｐＥＴ２２−ＭＫ−ＯＳＴ３１１にコードされる組換え体ＭＫ−ＯＳＴ３１１のＤＮＡ塩基配列とアミノ酸配列を示した図である。
図２７は、リフォールディング後の組換え体Ｈｉｓ−ＯＳＴ３１１を陽イオン交換カラムＳＰ−５ＰＷ（日本国、東ソー社）を用いてＨＰＬＣ精製した際の溶出パターンを示した図である。
図２８は、リフォールディング後の組換え体ＭＫ−ＯＳＴ３１１を陽イオン交換カラムＳＰ−５ＰＷ（日本国、東ソー社）を用いてＨＰＬＣ精製した際の溶出パターンを示した図である。
図２９は、ＰＥＧ化した組換え体ＭＫ−ＯＳＴ３１１を陽イオン交換カラムＳＰ−５ＰＷ（日本国、東ソー社）を用いてＨＰＬＣ精製した際の溶出パターンを示した図である。
図３０は、大腸菌産生型Ｈｉｓ−ＯＳＴ３１１組換え体（Ａ）またはＰＥＧ化ＭＫ−ＯＳＴ３１１組換え体（Ｂ）を単回投与してから８または９時間後における血清リン酸濃度を表した図である。
図３１は、大腸菌産生型Ｈｉｓ−ＯＳＴ３１１組換え体を単回投与してから１および４時間後での腎臓におけるビタミンＤ代謝酵素遺伝子の発現変化をノザンブロッティング法で解析した結果を表す図である。
図３２は、大腸菌産生型Ｈｉｓ−ＯＳＴ３１１組換え体を単回投与してから１、４および９時間後での血清１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の濃度変化を表す図である。
図３３は、本図はＯＳＴ３１１のアミノ酸１７４〜１８０番目に変異を導入し、その遺伝子をｐＥＡＫ細胞で発現させたときの細胞上清に分泌される変異ＯＳＴ３１１組換え体をウェスタンブロッティングにて検出した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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