(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むＤＮＡ；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ；
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ＩＬ−１受容体ファミリーメンバーに結合し、かつ、ＩＬ−６産生を誘導する、前記ポリペプチド、をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ；及び
（ｄ）（ａ）−（ｃ）に定義されたＤＮＡに、遺伝子暗号の結果、縮重しているＤＮＡであって、ＩＬ−１受容体ファミリーメンバーに結合し、かつ、ＩＬ−６産生を誘導するポリペプチドをコードする前記ＤＮＡ
からなる群から選択されるＤＮＡ。
【請求項２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド残基１１２〜５８５のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むＤＮＡ。
【請求項３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ。
【請求項４】
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；及び
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２のアミノ酸配列に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、ＩＬ−１受容体ファミリーメンバーに結合し、かつ、ＩＬ−６産生を誘導する、前記ポリペプチド
からなる群から選択されるポリペプチド。
【請求項５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡによりコードされるポリペプチドを含む、ポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。
【請求項８】
請求項７に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
ポリペプチドを産生する方法であって、請求項８に記載の宿主細胞をポリペプチドの発現を引き起こす条件下で培養することを含んでなる前記方法。
【請求項１０】
請求項４〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドと免疫反応する抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、新規の精製及び単離されたＩＬ−１エータ（η）ポリペプチドとそのフラグメント、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そのようなポリペプチドの組換え型の産生方法、これらポリペプチドに対して産生された抗体、これらポリペプチドから誘導される断片化ペプチド、及びそれらの使用に関する。
【０００２】
先行技術の記載
インターロイキン−１（ＩＬ−１）は、大きなサイトカイン群のメンバーであり、その主要機能は免疫及び炎症性の反応を仲介することである。いくつかの既知のＩＬ−１ファミリーメンバーがあるが、それにはＩＬ−１アルファ（ＩＬ−１α）、ＩＬ−１ベータ（ＩＬ−１β）、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ＩＬ−１デルタ（ＩＬ−１δ）、ＩＬ−１イプシロン（ＩＬ−１ε）、ＩＬ−１ゼータ（ＩＬ−１ζ）及びＩＬ−１８（かつてはＩＧＩＦとして知られ、ＩＬ−１ガンマとも知られている）が含まれる。マクロファージにより分泌されるＩＬ−１は、実際は大部分のＩＬ−１βといくらかのＩＬ−１αの混合物である（Abbas et al., 1994）。ＩＬ−１αとＩＬ−１βは、はじめはシグナル配列を欠く３３ｋＤの前駆体として産生され、タンパク分解の開裂によりさらにプロセシングを受けて、それぞれ約１７ｋＤの分泌される活性形態を産生する。さらに、ＩＬ−１αの３３ｋＤ前駆体も活性である。このＩＬ−１の両形態は第２染色体上に位置する２つの異なる遺伝子の産物である。この２つの形態は互いに３０％未満相同でしかないが、それらは同一の受容体に結合し、類似の活性を有する。
【０００３】
ＩＬ−１の生物学的に不活性な形態である、ＩＬ−１ｒａは、構造的にはＩＬ−１に相同であり、同一の受容体に結合する。さらに、ＩＬ−１ｒａは、細胞外領域への効率的な分泌を可能にするシグナル配列とともに産生され、その領域でＩＬ−１と競争的に競合する（Abbas et al., 1994）。
【０００４】
ＩＬ−１ファミリーのリガンドは、Ｉｇスーパーファミリーのメンバーである、２種のＩＬ−１受容体のファミリーに結合する。ＩＬ−１受容体には８０ｋＤａのＩ型受容体（ＩＬ−１ＲＩ）と６８ｋＤａのＩＩ型受容体（ＩＬ−１ＲＩＩ）が含まれる。ＩＬ−１リガンドはまた、ＩＬ−１ＲＩＩの可溶性タンパク分解フラグメント（ｓＩＬ−１ＲＩＩ）にも結合し得る（Colotta et al., 1993）。
【０００５】
ＩＬ−１の主たる起源は活性化マクロファージ又は単核食細胞である。ＩＬ−１を産生する他の細胞には、上皮及び内皮の細胞が含まれる（Abbas et al., 1994）。マクロファージからのＩＬ−１分泌が起こるのは、マクロファージがグラム陰性細菌に遭遇して捕食した後である。そのような細菌は、内毒素としても知られるリポ多糖類（ＬＰＳ）分子を細菌の細胞壁に含有する。ＬＰＳ分子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及びＩＬ−１を産生するようにマクロファージを刺激する活性成分である。この場合、ＩＬ−１はＬＰＳとＴＮＦ産生に反応して産生される。低濃度では、ＬＰＳはマクロファージを刺激し、そして、細菌感染を排除するのに必要とされるＢ細胞と他の宿主の応答を活性化するが、高濃度では、ＬＰＳは重篤な組織障害、ショック、さらには死まで引き起こし得る。
【０００６】
ＩＬ−１の生物学的機能には、血管内皮細胞及び白血球の活性化、局所性の組織破壊、及び発熱が含まれる（Janeway et al., 1996）。低レベルでは、ＩＬ−１はマクロファージ及び血管内皮細胞を刺激し、ＩＬ−６を産生させ、血管内皮細胞の表面上の分子をアップレギュレートして白血球吸着を増加させ、単核食細胞と他の細胞を刺激することによって炎症性白血球を間接的に活性化して、そして、炎症性白血球を活性化するある種のサイトカインを産生する。さらに、ＩＬ−１はプロスタグランジン、酸化窒素シンテターゼ、及びメタロプロテイナーゼの誘導のような他の炎症反応にも関わる。これらのＩＬ−１の機能は低レベルの微生物感染時にはきわめて重要である。しかしながら、微生物感染が急上昇すると、ＩＬ−１は、発熱を誘発し、単核食細胞を刺激してＩＬ−１及びＩＬ−６を産生させ、肝細胞からの血清タンパク質の産生を高め、そして凝固系を活性化することによって全身的に作用する。さらに、ＩＬ−１は出血性の腫瘍壊死を引き起こさず、骨髄幹細胞の分裂を抑制しない。そしてＩＬ−１は、高濃度ではヒトに対して致死的である。
【０００７】
ＥＰ  ０８７９８８９Ａ２は、ＩＬ−１ファミリーの代表メンバーの多数の使用について論じる。この刊行物では、ＩＬ−１デルタのポリペプチドが、慢性及び急性の炎症、関節炎、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶、移植片対宿主病、感染症、卒中、虚血、急性呼吸疾患症候群、再狭窄、脳損傷、ＡＩＤＳ、骨疾患、癌、動脈硬化症及びアルツハイマー病を含む、様々な疾患の治療に使用し得ることが開示されている。ＩＬ−１ファミリーメンバーが治療に使用され得る他の疾患は、炎症性腸疾患、多発性骨髄腫、多発性硬化症、喘息、アレルギー、骨粗鬆症、膵炎、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、心筋梗塞及び鬱血性心不全を含む心臓病、ライム病、歯周病、腐敗症、熱射病、糸球体腎炎、変形性関節症、肉芽腫形成、早期分娩、及びブドウ膜炎である。
【０００８】
ＩＬ−１の重要な機能を前提とすれば、ＩＬ−１リガンド及びＩＬ−１受容体ファミリーの追加メンバーについて当技術分野ではニーズが存在する。さらに、タンパク質の研究と免疫系に対する継続した関心に照らし、（本発明のヒトＩＬ−１イータのような）新規タンパク質及びその阻害剤の発見、同定及び役割は現代の分子生物学及び生化学の最先端にある。知識が増大しているにもかかわらず、細胞及び免疫の応答に関わるタンパク質の同一性及び機能については当技術分野で依然としてニーズが存在する。
【０００９】
発明の概要
本発明は、「ＩＬ−１エータ」と呼ばれる新規なＩＬ−１ファミリーリガンドについての単離ポリヌクレオチドとそのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを提供することによって、上記の当技術分野の様々なニーズを充足することに役立つ。このように、１つの側面では、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＤＮＡ配列を含んでなる、単離された新規のＩＬ−１エータのポリヌクレオチド分子と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチド分子、並びにこれらの配列に相補的なポリヌクレオチド分子に関する。
【００１０】
一本鎖と二本鎖の両方のＲＮＡ及びＤＮＡポリヌクレオチド分子、並びにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の全部又は一部を含んでなる変性した、二本鎖ＤＮＡ及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチド分子が本発明に含まれる。さらに含まれるのは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を含んでなるポリヌクレオチド分子の in vitro 突然変異誘発により誘導される、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の配列を含んでなるポリヌクレオチド分子から縮重している、並びに本発明のＤＮＡの対立遺伝子（ａｌｌｅｌｉｃ）変異体である、単離ポリヌクレオチド分子である。本発明はまた、上記ポリヌクレオチド分子の発現を指令する組換えベクターとこれらベクターにより形質転換されたか又はトランスフェクトされた宿主細胞を含む。
【００１１】
さらに、本発明は、上記のポリヌクレオチドを使用して、ＩＬ−１ファミリーのリガンド及び受容体に関連した活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを同定する方法を含む。このように、ＩＬ−１イータのポリヌクレオチドは、ＩＬ−１エータタンパク質をコードすることによりＩＬ−１エータ受容体を同定するために使用され得る。
【００１２】
さらに、上記のポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドが関連しているヒト染色体を同定するために使用し得る。このように、ＩＬ−１エータのポリヌクレオチドは、ヒトの第２染色体を同定するために使用し得る。従って、上記のポリヌクレオチドはまた、ヒトの第２染色体上の遺伝子地図を作成すること；ある種の疾患、症候群、又はヒト第２染色体に関連した他のヒトの病態に関連した遺伝子を同定すること；及び細胞のシグナル伝達と免疫系を研究することにも使用し得る。
【００１３】
本発明はまた、本発明の遺伝子によりコードされるそれぞれのポリヌクレオチドの発現を阻害するために、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリヌクレオチドに由来するセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することを含む。
【００１４】
本発明はまた、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の可溶性ポリペプチド分子を含む、上記ポリヌクレオチド分子によりコードされるＩＬ−１エータの単離されたポリペプチド又はフラグメントを含む。さらに本発明は、上記ポリペプチドの産生についての方法であって、発現を促進する条件の下で宿主細胞を培養し、そして、培養培地からこのポリペプチドを回収することを含む、前記方法を含む。特に、細菌、酵母、植物、昆虫及び動物細胞における上記ポリペプチドの発現が本発明には含まれる。
【００１５】
一般に、本発明のポリペプチドは、免疫調節、細胞増殖、細胞死、細胞移動（ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）、細胞−細胞相互作用、及び炎症反応のような細胞プロセスを研究するために使用し得る。さらに、上記のポリペプチドは、ＩＬ−１エータのリガンドに結合するタンパク質を同定するために使用し得る。
【００１６】
さらに、本発明には、上記ポリペプチドを利用してポリペプチドの反対構造分子（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）に関連した活性のある潜在的な阻害剤をスクリーニングするアッセイ、及びポリペプチドの反対構造分子が媒介する疾患の治療のための治療剤として上記ポリペプチドを使用する方法が含まれる。さらに、その阻害剤（例えば、阻害剤として作用する設計された受容体）の設計において上記ポリペプチドを使用する方法も本発明の一側面である。
【００１７】
さらに本発明に含まれるのは、サンプルのポリヌクレオチド及び／又はタンパク質の同定に役立つ電子データベースの検索における使用のための、ＩＬ−１エータのポリヌクレオチド配列、そのポリペプチド又はそのフラグメントの予測されるアミノ酸配列、又はそのポリペプチド及びそのフラグメントの予測されるアミノ酸配列の組み合わせの使用である。
【００１８】
上記ポリペプチドに結合する単離されたポリクローナル又はモノクローナルの抗体、さらに本発明のポリペプチドを精製するのに役立つ上記抗体の使用も本発明に含まれる。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明に含まれるポリヌクレオチド分子には、以下のヌクレオチド配列が含まれる：
名称：ＩＬ−１エータ
【００２０】
【化１】
0004623342.tif 000002
【００２１】
本発明のヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列には以下が含まれる：
名称：ＩＬ−１エータ（ポリペプチド）
【００２２】
【化２】
0004623342.tif 000003
【００２３】
本発明のＩＬ−１エータポリヌクレオチドの発見は、各ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクター、並びにこの発現ベクターでトランスフェクトされるか又は形質転換される宿主細胞の構築を可能にする。本発明はまた、生物学的に活性なＩＬ−１エータポリペプチドとそのフラグメントの単離及び精製を可能にする。さらにもう１つの態様では、本発明のポリペプチド又はそのオリゴヌクレオチドは、関連した活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを同定するためのプローブとして使用され得る。このように、ＩＬ−１エータは、ＩＬ−１エータファミリーリガンドに関連した活性を同定するために使用し得る。さらにＩＬ−１エータのポリヌクレオチド又はそのオリゴヌクレオチドはヒトの第２染色体を同定するために使用し得る。同様に、上記のポリヌクレオチド又はそのオリゴヌクレオチドはヒト第２染色体上の遺伝子地図を作成すること、及びある種の疾患、症候群、又はヒト第２染色体に関連した他のヒトの病態に関連した遺伝子を同定することに使用し得る。このように、ＩＬ−１エータのポリヌクレオチド又はそのオリゴヌクレオチドは、緑内障、外胚葉性異形成、インスリン依存型糖尿病、皺肌皮膚症候群、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、及び脛骨筋ジストロフィーを同定するために使用し得る。最後に、上記ポリヌクレオチドに由来する一本鎖のセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＩＬ−１エータによりコードされるポリヌクレオチドの発現を阻害するために使用され得る。
【００２４】
ＩＬ−１エータとその可溶性フラグメントは、血管内皮細胞及びリンパ球の活性化を活性化する及び／又は阻害する、局所性の組織破壊と発熱の誘発（Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔａｌ．，１９９６）を誘導する及び／又は阻害すること、ＩＬ−６を産生するマクロファージ及び血管内皮細胞を阻害する及び／又は刺激すること、プロスタグランジン、酸化窒素シンテターゼ及びメタロプロテイナーゼの誘導を誘発する及び／又は阻害すること、及び血管内皮細胞の表面にある分子のアップレギュレーションをアップレギュレートする及び／又は阻害することのために使用され得る。さらに、上記のポリペプチドとその断片化ペプチドはまた、転写因子のＮＦ−κＢ及びＡＰ−１、ＭＡＰキナーゼのＪＮＫ及びｐ３８、ＣＯＸ−２、ｉＮＯＳのような炎症メディエーターの誘導とこれらの分子により刺激されるあらゆる活性を誘発する及び／又は阻害するためにも使用され得る。
【００２５】
さらに、上記のポリペプチドとその断片化ペプチドは、分子量マーカーとして、及びペプチド断片化の対照として使用し得て、本発明には、これらの試薬を含んでなるキットが含まれる。最後に、上記のポリペプチドとそのフラグメントは抗体を産生するために使用し得て、本発明には、ＩＬ−１エータポリペプチドを精製するための上記抗体の使用が含まれる。
【００２６】
ポリヌクレオチド分子
特定の態様では、本発明は、混在する内因性物質がないある種の単離されたヌクレオチド配列に関する。「ヌクレオチド配列」は、分離したフラグメントの形態であるか又はより大きなポリヌクレオチド構築体の成分としてのポリヌクレオチド分子を意味する。ポリヌクレオチド分子は、少なくとも１回は実質的に純粋な形態で、及び（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) に概説されるような）標準的な生化学方法によりその成分ヌクレオチド配列の同定、操作及び回収を可能にする量又は濃度において単離されたＤＮＡ又はＲＮＡから誘導された。そのような配列は、好ましくは、典型的には真核生物の遺伝子に存在する内部の非翻訳配列、又はイントロンにより中断されていないオープンリーディングフレームの形態で提供及び／又は構築される。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’又は３’にも存在し得るが、ここではそれはコーディング領域の操作又は発現に干渉しない。好ましくは、本発明のＤＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１１２〜５８５を含む。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチドには、一本鎖と二本鎖の両方の形態であるＤＮＡ、並びにそのＲＮＡ相補体が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成したＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。ゲノムＤＮＡは、慣用技術、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のｃＤＮＡ、又はその好適なフラグメントをプローブとして使用することによって単離され得る。
【００２８】
本発明のＤＮＡ分子には、完全長の遺伝子、並びにそのポリヌクレオチド及びフラグメントが含まれる。完全長の遺伝子はＮ末端のシグナルペプチドを包含し得る。他の態様には、可溶性の形態をコードする（例えばタンパク質の細胞外ドメインをシグナルペプチドと一緒か又は一緒でなくコードする）ＤＮＡが含まれる。
【００２９】
本発明のポリヌクレオチドは、選好的には、ヒトの供給源から導かれるが、本発明には非ヒト種から導かれるものも含まれる。
本発明に含まれるのは、実施例１において記載されるような単離されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡクローンである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１１２〜５８５によりコードされるポリペプチドをＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示す。この配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のＩＬ−１エータをＩＬ−１ファミリーのメンバーとして同定する。
【００３０】
１つより多くのコドンが同一のアミノ酸をコードする、既知の遺伝暗号の縮重性により、ＤＮＡはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示すものから変化し得て、それでもＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。そのような変異ＤＮＡは、（例えばＰＣＲ増幅の間に起こる）サイレント突然変異から生じ得るか、又は天然（ｎａｔｉｖｅ）配列の意図的な突然変異誘発の産物であり得る。
【００３１】
このように、本発明は、
（ａ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ；
（ｂ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１１２〜５８５を含んでなるＤＮＡ；
（ｃ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡに中程度のストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズし得て、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ；（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＤＮＡに高度のストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズし得る相補体であり、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ；及び（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）に定義されるＤＮＡに遺伝暗号の結果として縮重であり、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ：から選択される単離ＤＮＡを提供する。生物学的に活性である、例えばＩＬ−１受容体に結合する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチドフラグメントをコードするＤＮＡも本発明に含まれる。当然ながら、そのようなＤＮＡ配列によりコードされるポリペプチドも本発明に含まれる。
【００３２】
本明細書で使用されるように、中程度のストリンジェンシーの条件は、例えばＤＮＡの長さに基づいて、当業者により容易に決定され得る。基本的な条件は Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Vol. 1, pp. I. 101-104, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)に説明されていて、５Ｘ  ＳＳＣ，０．５％  ＳＤＳ，１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）のニトロセルロースフィルター前洗浄溶液、約５０％ホルムアミド、６Ｘ  ＳＳＣ、約４２℃のハイブリダイゼーション条件（又はスターク溶液のような他の同様なハイブリダイゼーション溶液／約５０％ホルムアミド、約４２℃）、及び約６０℃，０．５Ｘ  ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用を包含する。高度のストリンジェンシーの条件も、例えばＤＮＡの長さに基づいて、当業者により容易に決定され得る。一般に、そのような条件は上記のようなハイブリダイゼーション条件として定義され、約６８℃，０．２Ｘ  ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳでの洗浄である。当業者は、この温度と洗浄溶液の塩濃度がプローブの長さのような要因により必要に応じて調整し得ることを理解されよう。
【００３３】
また本発明に含まれるのは、ポリペプチドフラグメントをコードするＤＮＡと、以下に説明するような、不活性化Ｎ−グリコシル化部位、不活性化プロテアーゼプロセシング部位、又は保存的なアミノ酸置換を含んでなるポリペプチドをコードするＤＮＡである。
【００３４】
もう１つの態様では、本発明のポリヌクレオチド分子にはまた、天然ＤＮＡに少なくとも８０％同一であるポリヌクレオチドが含まれる。さらに考慮されるのは、ポリヌクレオチドが天然ポリヌクレオチドに少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、又は少なくとも９９．９％同一である分子を包含する態様である。
【００３５】
同一性比率は、視察と数学的計算により決定し得る。あるいは、２種のポリヌクレオチド配列の同一性比率は、Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12: 387, 1984）に記載され、ウィスコンシン大学遺伝学コンピュータグループ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータプログラム、バージョン６．０を使用して配列情報を比較することによって決定し得る。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルト変数には以下が含まれる：（１）ヌクレオチドについての単一比較マトリックス（同一について１、非同一について０の値を含有する）と、Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979 に記載のような Gribskov and Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986 の加重比較マトリックス；（２）各ギャップにつき３．０のペナルティと各ギャップの各記号につきさらに０．１０のペナルティ；及び（３）末端ギャップについてはペナルティなし。配列比較のために当業者に使用される他のプログラムも使用し得る。
【００３６】
本発明はポリペプチドの産生に有用な単離されたポリヌクレオチドを提供する。そのようなポリペプチドは、数多くの慣用技術のいずれかによって製造し得る。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ、又はその所望されるフラグメントは、そのポリペプチド又はフラグメントの製造のために発現ベクターへサブクローン化され得る。このＤＮＡは、有利には、適切なリーダー又はシグナルペプチドをコードするＤＮＡに融合される。あるいは、所望されるフラグメントが既知の技術を使用して、化学的に合成され得る。ＤＮＡフラグメントはまた、完全長のクローン化ＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化により産生され、アガロースゲル上の電気泳動により単離され得る。必要ならば、５’又は３’末端を所望されるように再構築するオリゴヌクレオチドが、制限酵素消化により産生されるＤＮＡフラグメントへ連結され得る。そのようなオリゴヌクレオチドは、所望のコーディング配列の上流に制限エンドヌクレアーゼ開裂部位をさらに含有し、開始コドン（ＡＴＧ）をコーディング配列のＮ末端に位置づける場合もある。
【００３７】
周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法も、所望のタンパク質フラグメントをコードするＤＮＡを単離して増幅するために適用し得る。ＤＮＡフラグメントの所望される末端を規定するオリゴヌクレオチドが５’及び３’のプライマーとして利用される。さらに、オリゴヌクレオチドは、増幅されたＤＮＡフラグメントの発現ベクターへの挿入を促進するために、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有し得る。ＰＣＲ技術は Saiki et al., Science 239: 487 (1988); Recombinant DNA Methodology, Wu et al., eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989), pp. 189-196；及び PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds., Academic Press, Inc. (1990) に説明される。
【００３８】
ポリペプチドとそのフラグメント
本発明はポリペプチドとそのフラグメントを様々な形態で含むが、それには、天然に存在するものか又は組換えＤＮＡ技術が関わる方法のような様々な技術により産生されるものが含まれる。そのような形態には、限定しないが、誘導体、変異体、及びオリゴマー、並びに融合タンパク質又はそれらのフラグメントが含まれる。
【００３９】
本発明のポリペプチドには、上記に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされる完全長のタンパク質が含まれる。ＩＬ−１エータの特に好ましいポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む。
【００４０】
本発明のポリペプチドは分泌され得て、従って、可溶性であり得る。可溶性ポリペプチドは、それが発現される細胞から分泌され得る。一般に、可溶性ポリペプチドは、所望のポリペプチドを発現する無傷の（ｉｎｔａｃｔ）細胞を培地から、例えば遠心分離により分離し、所望のポリペプチドの存在について培地（上澄液）をアッセイすることによって同定され（非可溶性の膜結合型の対合物から区別され）得る。ポリペプチドの培地における存在は、このポリペプチドが細胞から分泌され、従って、このタンパク質の可溶形態であることを示す。
【００４１】
１つの態様では、可溶性のポリペプチドとそのフラグメントは、細胞外ドメインの全部又は一部を含むが、細胞膜上にポリペプチドの保持を引き起こし得る膜貫通領域を欠く。可溶性ポリペプチドは、ポリペプチドが産生される細胞から分泌される限り、細胞質ドメイン、又はその一部を包含し得る。
【００４２】
一般に、可溶形態の使用はある種の応用にとって有利である。可溶性ポリペプチドは細胞から分泌されるので、組換え宿主細胞からのポリペプチドの精製が促進される。さらに、一般に、可溶性ポリペプチドは、静脈内投与により適している。
【００４３】
本発明はまた、所望の生物学的活性を保持する細胞外ドメインのポリペプチド及びフラグメントを提供する。特定の態様は、天然のコグネイト、基質、又は対構造（「結合パートナー」）に結合する能力を保持するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のポリペプチドフラグメントに関する。そのようなフラグメントは、上記のように、可溶性ポリペプチドであり得る。もう１つの態様では、ポリペプチド及びフラグメントには、有利にも、上記のようなＩＬ−１リガンド及びＩＬ−１受容体ファミリーに保存された領域が含まれる。
【００４４】
さらに本明細書に提供されるのは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の配列の少なくとも２０個、又は少なくとも３０個の連続したアミノ酸を含んでなるポリペプチドフラグメントである。ポリペプチドフラグメントはまた抗体を産生するときの免疫原として利用され得る。
【００４５】
天然に存在する変異体、並びにポリペプチド及びフラグメントの誘導される変異体も本明細書に提供される。
変異体は、少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を示し得る。さらに考慮されるのは、ポリペプチド又はフラグメントが好ましいポリペプチド又はそのフラグメントに対して少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、又は少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む態様である。同一性比率は、視察と数学的計算により決定し得る。あるいは、２種のタンパク質配列の同一性比率は、Needleman and Wunsch (J. Mol. Bio. 48: 443, 1973）のアルゴリズムに基づき、ウィスコンシン大学遺伝学コンピュータグループ（ＵＷＧＣＧ）から入手可能なＧＡＰコンピュータプログラムを使用して配列情報を比較することによって決定し得る。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルト変数には以下が含まれる：（１）Henikoff and Henikoff (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915, 1992) により記載されるスコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップウェート；（３）４のギャップ長ウェート及び（３）末端ギャップについてはペナルティなし。配列比較のために当業者に使用される他のプログラムも使用し得る。
【００４６】
本発明の変異体には、例えば、選択的ｍＲＮＡスプライシング反応か又はタンパク分解的な開裂から生じるものが含まれる。選択的なｍＲＮＡのスプライシングは、例えば、天然に存在するタンパク質の可溶形態のような、先端が切れているが生物学的には活性なタンパク質を産出する。タンパク分解に帰せられる変異には、タンパク質から１つ又はそれより多くの末端アミノ酸（一般には１〜５個の末端アミノ酸）がタンパク分解的に除去されることにより、様々な宿主細胞の型において発現時にＮ又はＣ末端が異なることが含まれる。アミノ酸配列における違いが遺伝的多型性（タンパク質を産生する個体間の対立遺伝変異）に帰せられるタンパク質も本明細書で考慮される。
【００４７】
本発明の範囲内にある追加の変異体には、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基、等のような他の化学的成分と共有性又は集合性のコンジュゲートを形成することによってその誘導体を創出するように修飾され得るポリペプチドも含まれる。共有性の誘導体は、ポリペプチドのアミノ酸側鎖上の官能基かＮ末端又はＣ末端に化学的成分を連結することによって製造され得る。それに結合した診断用（検出し得る）又は治療用の薬剤を含んでなるコンジュゲートも、以下に詳しく論じるように、本明細書で考慮される。
【００４８】
他の誘導体には、Ｎ末端又はＣ末端融合のような組換え培地における合成による、ポリペプチドの他のタンパク質又はポリペプチドとの共有又は集合性のコンジュゲートが含まれる。融合タンパク質の例はオリゴマーとともに以下に論じる。さらに、融合タンパク質は精製及び同定を促進するために加えられるペプチドを含む。そのようなペプチドには、例えば、ポリ−Ｈｉｓ、又は米国特許第５，０１１，９１２号及び Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988 に記載の抗原性同定ペプチドが含まれる。そのようなペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド、Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓである。これはきわめて抗原性であり、特定のモノクローナル抗体により可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現される組換えタンパク質の迅速アッセイと簡略な精製を可能にする。４Ｅ１１と称されるマウスのハイブリドーマは、参照により本明細書に援用される米国特許第５，０１１，９１２号に記載のようなある種の２価金属カチオンの存在下でＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドと結合する。４Ｅ１１ハイブリドーマ細胞系は、受け入れ番号ＨＢ  ９２５９の下でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに保管されている。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体はイーストマン・コダック社、科学造影システム部門、ニューヘーヴン、コネティカットから入手可能である。
【００４９】
本明細書で提供される変異ポリペプチドのなかには、天然の生物学的活性を保持する天然のポリペプチドの変異体、又はそれらの実質的な均等物がある。１つの例は、天然の形態と本質的に同じ結合親和性で結合する変異体である。結合親和性は、例えば米国特許第５，５１２，４５７号と以下に示されるような慣用法によって測定され得る。
【００５０】
変異体には、天然の形態と実質的に相同であるが、１つ又はそれより多くの欠失、挿入又は置換のために天然の形態のものとは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。特定の態様には、限定しないが、天然配列と比較して、アミノ酸残基の１〜１０個の欠失、挿入又は置換を含むポリペプチドが含まれる。
【００５１】
あるアミノ酸は、例えば、類似の物理化学的特徴を有する残基により置換され得る。そのような保守的な置換の例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａを互いに置換するように、ある脂肪族残基を他の脂肪族残基に置換すること；ＬｙｓとＡｒｇ、ＧｌｕとＡｓｐ、又はＧｌｎとＡｓｎの間のように、ある極性基を他の極性基に置換すること；あるいは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒを互いに置換するように、ある芳香族残基を他の芳香族残基に置換することが含まれる。他の保守的な置換（例えば類似した疎水性の特徴を有する残基全体を置換すること）もよく知られている。
【００５２】
同様に、本発明のＤＮＡには、１つ又はそれ以上の欠失、挿入又は置換のために天然のＤＮＡとは異なるが、生物学的に活性なポリペプチドをコードする変異体が含まれる。
【００５３】
さらに本発明には、会合した天然パターンのグリコシル化を有するか又は有さない本発明のポリペプチドが含まれる。酵母又は哺乳動物の発現系（例、ＣＯＳ−１又はＣＯＳ−７細胞）において発現されるポリペプチドは、発現系の選択により、分子量及びグリコシル化パターンにおいて、天然のポリペプチドに類似しているか又はそれとは有意に異なることがあり得る。大腸菌（E. coli）のような細菌発現系における本発明のポリペプチドの発現は非グリコシル化の分子を提供する。さらに、ある調製物では、多数の異なるグリコシル化をしたタンパク質の種が含まれる場合がある。グリコシル基は、慣用方法、特にグリコペプチダーゼを利用する方法により除去し得る。一般に、本発明のグリコシル化ポリペプチドはモル過剰量のグリコペプチダーゼ（ベーリンガーマンハイム）とともにインキュベートされ得る。
【００５４】
対応して、アミノ酸残基又は配列の様々な付加若しくは置換、又は、末端若しくは内部の残基又は配列の欠失をコードする同様のＤＮＡ構築体も本発明に含まれる。例えば、ポリペプチドの細胞外ドメインにあるＮ−グリコシル化部位は、グリコシル化を妨げ、哺乳動物及び酵母の発現系において炭水化物が減少した類似体の発現を可能にするように、修飾され得る。真核生物のポリペプチドにおけるＮ−グリコシル化部位はＡｓｎ−Ｘ−Ｙなるアミノ酸の三つ組によって特徴づけられ、ここでＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であり、ＹはＳｅｒ又はＴｈｒである。この三つ組をコードするヌクレオチド配列に対する適切な置換、付加又は欠失は、Ａｓｎ側鎖における炭水化物残基の結合の防止をもたらす。例えば、Ａｓｎを別のアミノ酸に置換するように選択した単一ヌクレオチドの変更は、Ｎ−グリコシル化部位を不活性化するのに十分である。あるいは、Ｓｅｒ又はＴｈｒをＡｌａのような別のアミノ酸に置換し得る。タンパク質内のＮ−グリコシル化部位を不活性化するための既知の方法には、参照により本明細書に援用される、米国特許第５，０７１，９７２号及びＥＰ２７６，８４６号に記載のものが含まれる。
【００５５】
変異体のもう１つの例では、生物学的活性に必須ではないＣｙｓ残基をコードするヌクレオチドを、Ｃｙｓ残基を欠失させるか又は他のアミノ酸で置換させるように変化させ、折りたたみ又は再生のときに不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成を防止することが可能である。
【００５６】
他の変異体は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母の系における発現を高めるために、隣接する二塩基性アミノ酸残基を修飾することによって製造される。ＥＰ２１２，９１４号は、タンパク質内のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活性化するための部位特異的突然変異誘発の使用を開示する。ＫＥＸ２プロテアーゼのプロセシング部位は、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、及びＬｙｓ−Ａｒｇ対を、これらの隣接塩基性残基の出現を消去するように変化させる残基の欠失、付加又は置換により不活性化される。Ｌｙｓ−Ｌｙｓ対はＫＥＸ２開裂に対してほとんど影響されないので、Ａｒｇ−Ｌｙｓ又はＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの変換は、保守的で、ＫＥＸ２部位を不活性化するのに好ましいアプローチを代表する。
【００５７】
本発明に含まれるのは、ＩＬ−１エータポリペプチドを含有するオリゴマー又は融合タンパク質である。そのようなオリゴマーは、二量体、三量体、又はより高次のオリゴマーを含む、共有結合しているか又は非共有結合している多量体の形態であり得る。上記のように、好ましいポリペプチドは可溶性であり、従って、これらのオリゴマーは可溶性ポリペプチドを含む場合がある。本発明の１つの側面では、オリゴマーはポリペプチド成分の結合能力を維持し、それに対し２価、３価等の結合部位を提供する。
【００５８】
本発明の１つの態様は、ポリペプチドに融合したペプチド成分間の共有又は非共有の相互作用により連結した多数のポリペプチドを含んでなるオリゴマーに関する。そのようなペプチドはペプチドリンカー（スペーサー）、又はオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであり得る。以下により詳しく説明するように、ポリペプチドに付いてそのオリゴマー化を促進し得るペプチドには、ロイシンジッパーと、抗体から由来したある種のペプチドがある。
【００５９】
１つの選択肢として、オリゴマーは、免疫グロブリンに由来するポリペプチドを使用して製造される。抗体由来ポリペプチドの様々な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合したある異種ポリペプチドを含んでなる融合タンパク質の調製は、例えば Ashkenazi et al. (PNAS USA 88: 10535, 1991)；Byrn et al. (Nature 344: 677, 1990); 及び Hollenbaugh and Aruffo ("Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", in Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10. 19. 1-10. 19. 11, 1992) により説明される。
【００６０】
本発明の１つの態様は、本発明のポリペプチドを抗体由来のＦｃポリペプチドに融合することによって創出した２種の融合タンパク質を含んでなるダイマーに関する。本発明のポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を好適な発現ベクターへ挿入する。組換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞において、ポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質が発現され、そして抗体分子のように会合し、このとき鎖間のジスルフィド結合がＦｃ部分間で形成され、２価の分子を産生する。
【００６１】
「Ｆｃポリペプチド」という用語には、本明細書で使用するように、Ｆｃ領域のＣＨドメインのいずれか又は全部を含んでなる、抗体のＦｃ領域を構成するポリペプチドの天然及びムテインの形態が含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有するそのようなポリペプチドの短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）も含まれる。好ましいポリペプチドはヒトＩｇＧ１抗体から誘導されるＦｃポリペプチドを含む。
【００６２】
参照により本明細書に援用される、ＰＣＴ出願ＷＯ９３／１０１５１号に記載の１つの好適なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＮ末端ヒンジ部からＦｃ領域の天然のＣ末端までわたる単鎖ポリペプチドである。もう１つの有用なＦｃポリペプチドは、参照により本明細書に援用される米国特許第５，４５７，０３５号及び Baum et al., (EMBO J. 13: 3992-4001, 1994) に記載されたＦｃムテインである。このムテインのアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａへ変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕへ変化し、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａへ変化していることを除くと、ＷＯ９３／１０１５１号に示される天然のＦｃ配列のそれと同一である。ムテインはＦｃ受容体に対して減少した親和性を示す。
【００６３】
Ｆｃ部分を含んでなる上記の融合タンパク質（及びそれから形成されるオリゴマー）は、プロテインＡ又はプロテインＧのカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にする利点を提供する。
【００６４】
他の態様では、本発明のポリペプチドは、抗体重鎖又は軽鎖の可変部について置換され得る。融合タンパク質が抗体の重鎖と軽鎖の両方でつくられる場合、４つまでものポリペプチド細胞外領域と同数のオリゴマーを形成することが可能である。
【００６５】
あるいは、オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を有するか又は有さない，多数のポリペプチドを含んでなる融合タンパク質である。好適なペプチドリンカーには、参照により本明細書に援用される、米国特許第４，７５１，１８０号及び４，９３５，２３３号に記載のものがある。所望のペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列が、好適な慣用法を使用して、本発明のＤＮＡ配列の間に、同一の読み枠で挿入され得る。例えば、リンカーをコードする化学合成されたオリゴヌクレオチドが、上記の配列の間に連結され得る。特定の態様では、融合タンパク質は、ペプチドリンカーにより分離された、２〜４個の本発明の可溶性ポリペプチドを含む。
【００６６】
本発明のオリゴマーを製造するもう１つの方法は、ロイシンジッパーの使用に関わる。ロイシンジッパードメインはそれが見出されるタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において最初に同定され（Landschulz et al., Science 240: 1759, 1988）、以来、多種多様なタンパク質に見出されてきた。既知のロイシンジッパーのなかには天然に存在するペプチドと、二量体化又は三量体化するその誘導体がある。
【００６７】
ジッパードメイン（本明細書ではオリゴマー化、又はオリゴマー形成ドメインとも言われる）は、反復する７個のリピートを含み、それにはしばしば、他のアミノ酸に分断された４又は５個のロイシン残基がある。ジッパードメインの例は酵母転写因子のＧＣＮ４とラット肝臓に見出される熱安定性のＤＮＡ結合タンパク質に見出されるものである（C/EBP; Landschulz et al., Science 243: 1681, 1989）。２種の核内形質転換タンパク質である、ｆｏｓ及びｊｕｎも、マウスの癌原遺伝子、ｃ−ｍｙｃの遺伝子産物と同じように、ジッパードメインを示す（Landschulz et al., Science 240: 1759, 1988）。核内癌遺伝子、ｆｏｓ及びｊｕｎの産物は、ヘテロ二量体を選好的に形成するジッパードメインを含む（O'Shea et al., Science 245: 646, 1989; Turner and Tjian, Science 243: 1689, 1989）。ジッパードメインはこれらタンパク質の生物学的活性（ＤＮＡとの結合）に必要である。
【００６８】
パラミクソウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、及び多くのレトロウイルスを含む、いくつかの異なるウイルスの融合原性（fusogenic）タンパク質もジッパードメインを保有する（Buckland and Wild, Nature 338: 547, 1989; Britton, Nature 353: 394, 1991; Delwart and Mosialos, AIDS Research and Human Retroviruses 6: 703, 1990）。この融合原性ウイルスタンパク質のジッパードメインはこのタンパク質の膜貫通領域の近くにあり、ジッパードメインが融合原性タンパク質のオリゴマー構造に貢献し得ると示唆されている。融合原性ウイルスタンパク質のオリゴマー化は、融合孔の形成に関与する（Spruce et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88: 3523, 1991）。ジッパードメインはまた、熱ショック転写因子のオリゴマー化にもある役割を担うと最近報告されている（Rabindran et al., Science 259: 230, 1993）。
【００６９】
ジッパードメインは、短く平行に巻いたコイルのように折りたたまれる（O'Shea et al., Science 254: 539; 1991）。この平行巻きコイルの全体構成は十分特徴づけられていて、Crick (Acta Crystallogr. 6: 689, 1953) により提唱されるように、「ノブから穴へ」（knobs-into-holes）パッキングである。ジッパードメインにより形成される二量体は、McLachlan and Stewart (J. Mol. Biol. 98: 293; 1975) の命名によれば、（ａｂｃｄｅｆｇ）nと表記される７個のリピートにより安定化される。ここで、残基ａ及びｄは一般に疎水性の残基（ｄはロイシンである）であり、これらはヘリックスの同一面に整列する。ｇとｅの位置には通常反対電荷の残基が現れる。このように、２つのらせんジッパードメインから形成される平行巻きコイルにおいては、第一ヘリックスの疎水性側鎖により形成される「ノブ」が、第二ヘリックスの側鎖間に形成される「穴」へパックされる。
【００７０】
位置ｄ（しばしばロイシン）にある残基は大きな疎水性の安定化エネルギーに貢献し、オリゴマー形成にとって重要である（Krystek et al., Int. J. Peptide Res. 38: 229, 1991）。Lovejoy et al. (Science 259: 1288, 1993) は、らせんが上下行する三本鎖αヘリックスの束構造の合成を最近報告した。彼らの研究から、疎水性の安定化エネルギーがらせんモノマーからの巻きコイル形成の主たる推進力を提供することが確かめられた。上記の研究は、巻きコイルの化学量論と幾何学に静電的な相互作用が貢献することも示している。ロイシンジッパーの構造に関するさらなる議論については Harbury et al. (Science 262: 1401, 26 November 1993) に見出される。
【００７１】
可溶性オリゴマータンパク質に適したロイシンジッパードメインの例はＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８号に記載され、肺界面活性タンパク質Ｄ（ＳＰＤ）から誘導されるロイシンジッパーについては、参照により本明細書に援用される Hoppe et al. (FEBS Letters 344: 191, 1994) に記載されている。異種タンパク質の安定な三量体化を可能にする、それが融合する修飾されたロイシンジッパーの使用が Fanslow et al. (Semin. Immunol. 6: 267-278, 1994) に説明されている。ロイシンジッパーペプチドが融合した可溶性ポリペプチドを含んでなる組換え融合タンパク質が好適な宿主細胞で発現され、形成される可溶性オリゴマーが培養上澄液から回収される。
【００７２】
ある種のロイシンジッパー部分は選好的に三量体を形成する。１つの例は、そのまま参照により本明細書に援用される、Hoppe et al. (FEBS Letters 344: 191, 1994) と米国特許第５，７１６，８０５号に記載のような肺界面活性タンパク質Ｄ（ＰＳＤ）から誘導されるロイシンジッパーである。この肺ＳＰＤ誘導化ロイシンジッパーペプチドは、アミノ酸配列、Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｈｉｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｇｌｎ  Ｔｙｒを含む。
【００７３】
三量体化を促進するもう１つのロイシンジッパーの例は、米国特許第５，７１６，８０５号に記載のようなアミノ酸配列、Ａｒｇ  Ｍｅｔ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ｈｉｓ  Ｉｌｅ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｇｌｕ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｇｌｕ  Ａｒｇを含んでなるペプチドである。１つの別の態様では、Ｎ末端にＡｓｐ残基が加えられ、もう１つの態様では、ペプチドはＮ末端のＡｒｇ残基を欠く。
【００７４】
オリゴマー化を促進する特性を保持する、前記ジッパーペプチドのフラグメントも利用し得る。そのようなフラグメントの例には、限定しないが、上記のアミノ酸配列に表されるＮ末端又はＣ末端の残基の１又は２個を欠くペプチドが含まれる。ロイシンジッパーは、天然に存在するロイシンジッパーペプチドから、例えば天然のアミノ酸配列における保守的な置換により誘導され得るが、ここでオリゴマー化を促進するペプチドの活性は保持される。
【００７５】
天然に存在する三量体タンパク質から誘導される他のペプチドも三量体オリゴマーの製造に利用され得る。あるいは、オリゴマー化を促進する合成ペプチドが利用される場合がある。特定の態様では、ロイシンジッパー部分にあるロイシン残基がイソロイシン残基に置換される。イソロイシンを含んでなるそのようなペプチドはイソロイシンジッパーと言われる場合があるが、本明細書で利用されるように、「ロイシンジッパー」の用語に含まれる。
【００７６】
ポリペプチドとそのフラグメントの産生
本発明のポリペプチドとそのフラグメントの発現、単離及び精製は、限定しないが以下を含む、好適な技術により達成され得る：
本発明はまた、ＤＮＡを含有する組換えクローニング及び発現ベクター、並びにこの組換えベクターを含有する宿主細胞を提供する。ＤＮＡを含んでなる発現ベクターは、このＤＮＡによりコードされる本発明のポリペプチド及びフラグメントを製造するために使用され得る。ポリペプチドを製造する方法は、ポリペプチドをコードする組換え発現ベクターで形質転換された細胞を、ポリペプチドの発現を促進する条件下で培養し、次いで発現されたポリペプチドをこの培養物から回収することを含む。当業者には、発現されたポリペプチドを精製する方法が利用される宿主細胞の型のような要因により、及びこのポリペプチドが膜結合性であるか、又は宿主細胞から分泌される可溶形態であるかにより変わり得ることがわかるだろう。
【００７７】
任意の好適な発現系を利用し得る。ベクターには、本発明のポリペプチド又はフラグメントをコードするＤＮＡ、それと機能可能的に連結した（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）、哺乳動物、細菌、ウイルス又は昆虫の遺伝子に由来するような、好適な転写又は翻訳の調節ヌクレオチド配列が含まれる。調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、及び転写及び翻訳の開始及び終了を制御する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、調節配列が機能的にこのＤＮＡ配列に関わるとき、機能可能的に連結する。このように、プロモーターヌクレオチド配列は、プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を制御する場合、ＤＮＡに機能可能的にＤＮＡに連結する。一般に、所望の宿主細胞において複製する能力を与える複製起点、及び形質転換体が同定される選択遺伝子が、発現ベクターへ取り込まれる。
【００７８】
さらに、適切な（天然又は異種の）シグナルペプチドをコードする配列が発現ベクターへ取り込まれ得る。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列は、このＤＮＡがはじめに転写され、ｍＲＮＡがシグナルペプチドを含んでなる融合タンパク質へ翻訳されるように、本発明のポリヌクレオチド配列に対してインフレームで融合され得る。意図される宿主細胞において機能的であるシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外分泌を促進する。シグナルペプチドは、その細胞からのポリペプチドの分泌時に、ポリペプチドから開裂される。
【００７９】
当業者は、シグナルペプチドの開裂される位置がコンピュータプログラムにより予測されるものとは異なる場合があり、組換えポリペプチドを発現することに利用される宿主細胞の型のような要因により変化し得ることも理解されよう。タンパク調製物には、１つより多くの部位でのシグナルペプチドの開裂から生じる、異なるＮ末端アミノ酸を有するタンパク質分子の混合物が含まれ得る。
【００８０】
ポリペプチドの発現に適した宿主細胞には、原核生物、酵母又は高等な真核細胞が含まれる。宿主細胞としての使用に概して好ましいのは哺乳動物又は昆虫の細胞である。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞の宿主との使用に適したクローニング及び発現のベクターは、例えば、Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, (1985) に記載されている。無細胞翻訳系も、本明細書に開示されるＤＮＡ構築体から誘導されるＲＮＡを使用してポリペプチドを産生するために利用され得る。
【００８１】
原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性の生物が含まれる。形質転換に適した原核性の宿主には、例えば、大腸菌（E. coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）及びシュードモナス（Pseudomonas）、ストレプトマイセス（Streptomyces）及びスタフィロコッカス（Staphylococcus）属内の様々な他の種が含まれる。大腸菌     のような原核性の宿主細胞では、原核宿主細胞における組換えポリペプチドの発現を促進するためにＮ末端メチオニン残基をポリペプチドが含む場合がある。このＮ末端Ｍｅｔは、発現される組換えポリペプチドから開裂され得る。
【００８２】
原核宿主細胞において使用される発現ベクターは、概して１つ又はそれより多くの表現型の選択マーカー遺伝子を含む。表現型の選択マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を与えるか又は自己栄養要求性を供給するタンパク質をコードする遺伝子である。原核宿主細胞に有用な発現ベクターの例には、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）のような市販のプラスミドから誘導されるものが含まれる。ｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を含有し、従って、形質転換された細胞を同定するための簡便な手段を提供する。好適なプロモーターとＤＮＡ配列がｐＢＲ３２２ベクターへ挿入される。他の市販ベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（ファルマシアファインケミカルズ、ウプサラ、スウェーデン）及びｐＧＥＭ１（プロメガバイオテク、マジソン、ＷＩ，ＵＳＡ）が含まれる。
【００８３】
組換え原核宿主細胞の発現ベクターに通常使用されるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Chang et al., Nature 275: 615, 1978；及び Goeddel et al., Nature 281: 544, 1979）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8: 4057, 1980；及びＥＰ−Ａ−３６７７６）及びｔａｃプロモーター（Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 412, 1982）が含まれる。特に有用な原核宿主細胞の発現系は、ファージλＰLプロモーターとｃＩ８５７ｔｓ易熱性リプレッサー配列を利用する。λＰLプロモーターの誘導体を取り込むアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能なプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株のＪＭＢ９，ＡＴＣＣ  ３７０９２に存在）及びｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１，ＡＴＣＣ  ５３０８２に存在）が含まれる。
【００８４】
あるいは、ポリペプチドは、好ましくは Saccharomyces 属（例えば、S. cerevisiae）からの酵母宿主細胞において発現され得る。Pichia 又は Kluyveromyces のような他の酵母の属も利用され得る。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミド由来の複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化の配列、転写終止の配列、及び選択マーカー遺伝子をしばしば含有する。酵母ベクターに適したプロモーター配列には、とりわけ、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980）、あるいはエノラーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのような他の解糖系酵素（Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968；及び Holland et al., Biochem. 17: 4900, 1978）のプロモーターが含まれる。酵母での発現の使用に適した他のベクター及びプロモーターは、Hitzeman, ＥＰＡ−７３，６５７にさらに記載される。もう１つの選択肢は、Russel et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) 及び Beier et al. (Nature 300: 724, 1982) により記載された、グルコースで抑制されるＡＤＨ２プロモーターである。酵母と大腸菌の両方で複製し得るシャトルベクターは、大腸菌における選択及び複製のためのｐＢＲ３２２由来ＤＮＡ配列（Ａｍｐr遺伝子及び複製起点）を上記の酵母ベクターへ挿入することによって構築され得る。
【００８５】
酵母α因子のリーダー配列はポリペプチドの分泌を指令するために利用し得る。α因子リーダー配列は、しばしばプロモーター配列と構造遺伝子配列の間に挿入される。例えば、Kurjan et al., Cell 30: 933, 1982 及び Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330, 1984 を参照のこと。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適した他のリーダー配列は当業者に知られている。リーダー配列は、１つ又はそれより多くの制限部位を含有するようにその３’末端の近くで修飾され得る。このことにより、リーダー配列の構造遺伝子への融合が促進される。
【００８６】
酵母の形質転換プロトコールは当業者に知られている。そのようなプロトコールの１つは Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929, 1978 に記載されている。Hinnen et al. のプロトコールは選択培地においてＴｒｐ+形質転換体について選択するが、ここで選択培地は０．６７％酵母窒素塩基、０．５％カサミノ酸、２％グルコース、アデニン１０ｍｇ／ｍｌ及びウラシル２０ｍｇ／ｍｌを含む。
【００８７】
ＡＤＨ２プロモーター配列を含有するベクターにより形質転換された酵母宿主細胞は、「リッチ」培地において発現を誘導するために増殖され得る。リッチ培地の例は、１％酵母抽出物、２％ペプトン及び、アデニン８０ｍｇ／ｍｌ及びウラシル８０ｍｇ／ｍｌで補充した１％グルコースを含むものである。グルコースが培地から消費され尽くすと、ＡＤＨ２プロモーターの脱抑制が起こる。
【００８８】
哺乳動物又は昆虫の宿主細胞培養系も組換えポリペプチドを発現するために利用され得る。昆虫細胞における異種タンパクの産生用のバキュロウイルス系については Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988) により概説されている。確立された哺乳動物起源の細胞系も利用し得る。好適な哺乳動物宿主細胞系の例には、ＣＯＳ−７サル腎臓細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Gluzman et al., Cell 23: 175, 1981）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、及びＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞系、さらに McMahan et al. (EMBO J. 10: 28121, 1991) により記載されたアフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）から誘導されるＣＶ１／ＥＢＮＡが含まれる。
【００８９】
ＤＮＡを哺乳動物細胞へ導入するための確立された方法は Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, pp. 15-69 に記載されている。リポフェクタミン（Lipofectamine）脂質試薬（ギブコ／ＢＲＬ）又はリポフェクタミン−プラス（Lipofectamine-Plus）脂質試薬のような市販の試薬を使用するさらなるプロトコールを使用して、細胞をトランスフェクトすることができる（Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1987）。さらに、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd. ed. Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) に記載のような慣用法を使用して哺乳動物細胞をトランスフェクトするためにエレクトロポレーションを使用し得る。安定な形質転換体の選択は、例えば、細胞毒性薬に対する耐性のような当技術分野で知られている方法を使用して実施し得る。Kaufman et al., Meth. in Enzymology 185: 487-511, 1990 は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性のような、いくつかの選択スキームを説明する。ＤＨＦＲ選択に適した宿主株はＣＨＯ株のＤＸ−Ｂ１１であり得るが、これはＤＨＦＲを欠いている（Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, 1980）。ＤＨＦＲのｃＤＮＡを発現するプラスミドをＤＸ−Ｂ１１株へ導入することが可能であり、このプラスミドを含有する細胞だけが適切な選択培地において増殖し得る。発現ベクターへ取り込み得る他の選択マーカーの例には、Ｇ４１８やハイグロマイシンＢのような抗生物質への耐性を与えるｃＤＮＡが含まれる。このベクターを宿す細胞がこれらの化合物に対する耐性に基づいて選択され得る。
【００９０】
哺乳動物宿主細胞の発現ベクターについての転写及び翻訳の制御配列はウイルスゲノムから切り出し得る。通常使用されるプロモーター配列及びエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、及びヒトサイトメガロウイルスから誘導される。ＳＶ４０ウイルスゲノムから誘導されるＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、及びポリアデニル化の部位が、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現についての他の遺伝子要素を提供するために利用され得る。ウイルスの初期及び後期プロモーターが特に有用であるのは、ウイルス複製起点を含有するフラグメントとして、いずれもウイルスゲノムから容易に得られるからである（Fiers et al., Nature 273: 113, 1978; Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990）。より小さいか又はより大きいＳＶ４０フラグメントも、ＳＶ４０ウイルス複製起点部位中に位置づけられるＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位へ広がる約２５０ｂｐの配列が含まれる限り、使用され得る。
【００９１】
哺乳動物発現ベクター由来の異種遺伝子の発現を向上することが示されているさらなる制御配列には、ＣＨＯ細胞に由来する発現増強配列要素（ＥＡＳＥ）（Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, pp. 529-534 及びＰＣＴ出願ＷＯ９７／２５４２０号）、及び３裂リーダー（ＴＰＬ）、及びアデノウイルス２由来のＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Gingeras et al., J. Biol. Chem. 257: 13475-13491, 1982）のような配列が含まれる。ウイルス起源の内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）配列は、ジシストロン性（dicistronic）ｍＲＮＡが効率的に翻訳されることを可能にする（Oh and Sarnow, Current Opinion in Genetics and Development 3: 295-300, 1993; Ramesh et al., Polynucleotides Research 24: 2697-2700, 1996）。選択マーカーの遺伝子（例、ＤＨＦＲ）が後続するジシストロンｍＲＮＡの一部としての異種ｃＤＮＡの発現は、宿主のトランスフェクション効率と異種ｃＤＮＡの発現を向上させることが示されている（Kaufman, Meth. in Enzymology, 1990）。ジシストロンｍＲＮＡを利用する代表的な発現ベクターは、Mosser et al., Biotechniques 22: 150-161, 1997 に記載のｐＴＲ−ＤＣ／ＧＦＰと Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, pp. 529-534 に記載のｐ２Ａ５Ｉである。
【００９２】
有用な高発現ベクターである、ｐＣＡＶＮＯＴが、Mosley et al., Cell 59: 335-348, 1989 に記載されている。哺乳動物宿主細胞における使用についての他の発現ベクターは、Okayama and Berg（Mol. Cell. Biol. 3: 280, 1983）により開示されるように構築され得る。Ｃ１２７マウス乳房上皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの安定な高レベル発現に有用な系は、実質的に Cosman et al. (Mol. Immunol. 23: 935, 1986) に記載のように構築され得る。Cosman et al., Nature 312: 768, 1984 に記載の有用な高発現ベクターである、ＰＭＬＳＶ  Ｎ１／Ｎ４は、ＡＴＣＣ  ３９８９０として保管されている。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターが、参照により本明細書に援用される、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６及びＷＯ９１／１８９８２号に記載されている。さらにもう１つの選択肢では、ベクターはレトロウイルスから誘導され得る。
【００９３】
もう１つの有用な発現ベクターである、ｐＦＬＡＧ（登録商標）も使用し得る。ｐＦＬＡＧ（登録商標）技術は低分子量（１ｋＤ）で、親水性のｐＦＬＡＧ（登録商標）マーカーペプチドを、ｐＦＬＡＧ（登録商標）発現ベクターにより発現される組換えウイルスのＮ末端に融合させることに集中している。
【００９４】
利用され得るシグナルペプチドに関して述べると、天然のシグナルペプチドは、所望されるならば、異種のシグナルペプチド又はリーダー配列により置換され得る。シグナルペプチド又はリーダーの選択は、組換えポリペプチドが産生される宿主細胞の型のような要因に依存する場合がある。例示すると、哺乳動物宿主細胞において機能的である異種シグナルペプチドの例には、米国特許第４，９６５，１９５号に記載のインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Cosman et al., Nature 312: 768, 1984 に記載のインターロイキン−２受容体のシグナルペプチド；ＥＰ３６７，５６６に記載のインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載のＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；及びＥＰ４６０，８４６に記載のＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドが含まれる。
【００９５】
本発明には、ポリペプチドとそのフラグメントを単離して精製する方法が含まれる。
本発明に含まれる「単離された」ポリペプチド又はそのフラグメントは、それ（ら）が天然において見出され得る環境と同一な環境には存在しないペプチド又はフラグメントである。本発明に含まれる「精製された」ポリペプチド又はフラグメントは、例えば、上記のもののような組換え発現系の精製産物又は天然に存在する細胞及び／又は組織のような非組換え源からの精製産物のように、他のタンパク質又はポリペプチドと本質的に会合していない。
【００９６】
１つの好ましい態様では、組換えポリペプチド又はフラグメントの精製は、本発明のポリペプチド又はフラグメントの精製に役立つ、他のポリペプチドへの本発明のポリペプチド又はフラグメントの融合を使用して達成し得る。そのような融合パートナーにはポリ−Ｈｉｓ又は上記の他の抗原同定ペプチド、並びにすでに記載したＦｃ部分が含まれ得る。
【００９７】
宿主細胞の型に関しては、当業者に知られているように、組換えポリペプチド又はフラグメントを精製する方法は、利用される宿主細胞の型や、組換えポリペプチド又はフラグメントが培地へ分泌されるか否かといった要因により変化し得る。
【００９８】
一般に、組換えポリペプチド又はフラグメントは、分泌されなければ宿主細胞から、又は可溶性で分泌されれば培地又は上清から単離され得て、１回又はそれより多くの濃縮、塩析、イオン交換、疎水相互作用、アフィニティー精製、又はサイズ排除クロマトグラフィーの工程が続く。上記の工程を達成する特定の方法に関しては、市販のタンパク濃縮膜、例えば、アミコン又はミリポアペリコンの超濾過ユニットを使用して、最初に培地を濃縮してもよい。濃縮工程に続き、濃縮物がゲル濾過媒体のような精製マトリックスへ適用され得る。あるいは、アニオン交換樹脂、例えば、ペンダントなジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックス又は基質を利用し得る。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、又はタンパク精製に通常利用される他のタイプのものであり得る。あるいは、カチオン交換工程を利用し得る。好適なカチオン交換物には、スルホプロピル又はカルボキシメチル基を含有する様々な不溶性マトリックスが含まれる。さらに、クロマト濃縮工程を利用し得る。あるいは、疎水性相互作用のクロマトグラフィー工程を利用し得る。好適なマトリックスは樹脂に結合したフェニル又はオクチル部分である。さらに、組換えタンパク質と選択的に結合するマトリックスを用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用し得る。そのように利用される樹脂の例は、レクチンカラム、色素カラム、及び金属キレートカラムである。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンダントなメチル、オクチル、オクチルデシル又はその他の脂肪族の基を有するシリカゲル又はポリマー樹脂）を利用する１回又はそれより多くの逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を利用して、さらにポリペプチドを精製することが可能である。様々に組み合わされる、上記精製工程の一部又は全部はよく知られていて、単離されて精製される組換えタンパク質を提供するために利用され得る。
【００９９】
また、本発明のポリペプチドに対して産生されるモノクローナル抗体のような、本発明のポリペプチド結合タンパク質を含んでなるアフィニティーカラムを利用して、発現されるポリペプチドをアフィニティー精製することも可能である。これらのポリペプチドは、慣用技術、例えば、高い塩濃度の緩衝液で溶出した後に使用のために低塩濃度の緩衝液へ透析すること、又はｐＨや利用されるアフィニティーマトリックスに応じて他の成分を変えることを使用してアフィニティーカラムから取り出し得るか、又は本発明から導かれるポリペプチドのような、天然に存在するアフィニティー部分の基質を使用して競合的に取り出し得る。
【０１００】
本発明のこの側面では、本発明のポリペプチドと相互作用し得る本発明の抗ポリペプチド抗体、又は他のタンパク質のようなポリペプチド結合タンパク質は、カラムクロマトグラフィーマトリックス、又は本発明のポリペプチドをその表面上に発現する細胞を同定、単離、又は精製するのに適した類似の基質のような固相支持体へ結合し得る。本発明のポリペプチド結合タンパク質の固相接触表面への吸着は、任意の手段により達成し得る。例えば、磁気マイクロスフェアをこのポリペプチド結合タンパク質でコートして、インキュベーション容器において磁場を介して固定し得る。細胞混合物の懸濁液を、そのようなポリペプチド結合タンパク質をその上に有する固相と接触させる。本発明のポリペプチドをその表面に有する細胞は固定されたポリペプチド結合タンパク質に結合し、結合しない細胞は洗浄除去される。このアフィニティー結合法は、そのようなポリペプチド発現細胞を溶液から精製、スクリーニング、又は分離するのに有用である。ポジティブ選択された細胞を固相から遊離させる方法は当技術分野で知られていて、例えば、酵素の使用が含まれる。そのような酵素は、好ましくは、細胞に対して無毒で非障害性であり、好ましくは細胞表面結合パートナーを開裂することに向けられる。
【０１０１】
あるいは、本発明のポリペプチド発現細胞を含有すると思われる細胞の混合物を、先ず本発明のビオチニル化ポリペプチド結合タンパク質とともにインキュベートしてもよい。インキュベーション時間は、典型的には、本発明のポリペプチドへの十分な結合を確保するために少なくとも１時間の間である。次いで、生成した混合物を、アビジン被覆ビーズで詰めたカラムへ通し、それによりアビジンに対するビオチンの高親和性によりポリペプチド結合細胞のビーズに対する結合が提供される。アビジン被覆ビーズの使用が当技術分野で知られている。Berenson et al. J. Cell Biochem., 10D: 239 (1986) を参照のこと。結合しない物質の洗浄と結合した細胞の遊離は、慣用法を使用して実施される。
【０１０２】
所望される純度の程度は、タンパク質の意図される使用に依存する。ポリペプチドが例えば in vivo 投与される場合は、比較的高い程度の純度が所望される。そのような場合、ポリペプチドは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析時に他のタンパク質に対応するタンパク質のバンドが検出されないように精製される。関連分野の当業者により認識されるように、グリコシル化の違い、翻訳後プロセシングの違い、等により、そのポリペプチドに対応する多数のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥで視覚化される場合がある。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析で単一タンパク質のバンドにより示されるように、実質的な均一性にまで精製される。タンパク質のバンドは、銀染色、クマッシーブルー染色、又は（タンパク質が放射標識されれば）オートラジオグラフィーにより視覚化され得る。
【０１０３】
本発明の精製されたポリペプチド（タンパク質、ポリペプチド、フラグメント、変異体、オリゴマー、及び他の形態を含む）は、従来の結合アッセイのような適切なアッセイにおいて、結合パートナーへ結合する能力について試験され得る。例示すると、ポリペプチドは検出試薬（例、放射核種、発色素、発色又は蛍光反応を触媒する酵素、等）で標識され得る。標識されたポリペプチドを、結合パートナーを発現する細胞に接触させる。次いで、細胞を洗浄して非結合性の標識ポリペプチドを除去し、細胞に結合した標識の存在を、標識の性質により選択された、好適な技術により決定する。
【０１０４】
結合アッセイ法の１例は以下のようなものである。結合パートナーのｃＤＮＡを含有する組換え発現ベクターが、当技術分野でよく知られた方法を使用して構築される。この組換え発現ベクターでＣＶ１−ＥＢＮＡ−１細胞／１０ｃｍ2ディッシュをトランスフェクトする。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４７８）は、ＣＭＶの極初期エンハンサー／プロモーターから推進されて、ＥＢＶ核抗原−１を構成的に発現する。ＣＶ１−ＥＢＮＡ−１は McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991) に記載のように、アフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）から誘導された。
【０１０５】
トランスフェクトされた細胞を２４時間培養し、次いで各ディッシュの細胞を２４穴プレートへ分割する。さらに４８時間培養した後で、トランスフェクトした細胞（約４ｘ１０4細胞／ウェル）をＢＭ−ＮＦＤＭで洗浄する。これは、脱脂乾燥乳５０ｍｇ／ｍｌが加えられた結合培地（２５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、２ｍｇ／ｍｌのアジ化ナトリウム、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．２を含有するＲＰＭＩ  １６４０）である。次いで、例えば上記のようにつくった様々な濃度の可溶性ポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質とともに、細胞を３７℃で１時間インキュベートする。次いで細胞を洗浄し、一定飽和濃度の125Ｉ−マウス抗ヒトＩｇＧとともに、３７℃で１時間ゆっくり振盪させながら、結合培地においてインキュベートする。しっかり洗浄した後で、トリプシン処理により細胞を遊離させる。
【０１０６】
上記に利用されるマウス抗ヒトＩｇＧはヒトＩｇＧのＦｃ領域に抗して向けられ、ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社、ウェストグローブ、ＰＡから入手可能である。標準的なクロラミンＴ法を使用して抗体を放射ヨード化する。この抗体は、細胞に結合したポリペプチド／Ｆｃタンパク質のＦｃ部分へ結合する。すべてのアッセイにおいて、非特異的な125Ｉ−抗体の結合をＦｃ融合タンパク質／Ｆｃの不在下、並びにＦｃ融合タンパク質と２００倍モル過剰の非標識マウス抗−ヒトＩｇＧ抗体の存在下でアッセイする。
【０１０７】
細胞に結合した125Ｉ−抗体をパッカード・オートガンマカウンターにて定量する。アフィニティー計算結果（Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51: 660, 1949）を、Ｍｉｃｒｏｖａｘコンピュータで実行されるＲＳ／１（ＢＢＮソフトウェア、ボストン、ＭＡ）で算出する。
【０１０８】
もう１つの好適な結合アッセイの形式は競合結合アッセイである。例示すると、変異体の生物学的活性は、結合パートナーへ結合することについて天然のタンパク質と競合する変異体の能力についてアッセイすることによって決定され得る。
【０１０９】
競合結合アッセイは慣用された方法によって実施され得る。競合結合アッセイに利用され得る試薬には本発明の放射標識ポリペプチドと結合パートナー（内因性又は組換え）を発現する無傷の細胞が含まれる。例えば、細胞表面ＩＬ−１エータ受容体への結合について、可溶性のＩＬ−１エータ変異体と競合させるために、放射標識した可溶性ＩＬ−１エータフラグメントを使用し得る。無傷の細胞の代わりに、（固相表面での）プロテインＡ又はプロテインＧの相互作用を介して固相に結合した可溶性の結合パートナー／Ｆｃ融合タンパク質をＦｃ部分に置換することが可能である。プロテインＡ又はプロテインＧを含有するクロマトグラフィーカラムにはファルマシア・バイオテク社、ピスカタウェイ、ＮＪから入手可能なものが含まれる。
【０１１０】
もう１つの競合結合アッセイの形式は、可溶性ＩＬ−１エータ受容体／Ｆｃ融合タンパク質のような放射標識可溶性結合パートナーと、結合パートナーを発現する無傷の細胞を利用する。競合的オートラジオグラフィープレート結合アッセイにより定性的な結果を得ることが可能であるのに対し、スキャッチャードプロット（Scatchard, Ann. N. Y. Acad. Sci. 51: 660, 1949）は、定量的な結果を産生するのに利用され得る。
【０１１１】
本発明のＩＬ−１エータポリペプチドはまた、本発明のＩＬ−１エータポリペプチドの活性化を阻害する化合物及び小分子（アンタゴニスト）についてのスクリーニングアッセイとしても利用され得る．このように、本発明のポリペプチドは、例えば、細胞、無細胞調製物、化学ライブラリー、及び天然産物の混合物からアンタゴニストを同定するために使用され得る。アンタゴニストは、天然であるか又は修飾されたＩＬ−１エータポリペプチドの基質、リガンド、酵素、受容体、等であり得るか、又はＩＬ−１エータポリペプチドの構造又は機能上の模擬体であり得る。アンタゴニストは、さらに、小分子、ペプチド、抗体、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。
【０１１２】
ＩＬ−１エータポリペプチドに拮抗する（ａｎｔａｇｏｎｉｃ）化合物を同定する方法の１つの態様は、ＩＬ−１エータポリペプチドに反応する細胞に候補化合物を接触させ、結合、又は機能性の反応の促進又は阻害を観察することである。次いで、候補化合物と接触した細胞の活性を接触しなかった同一の細胞とＩＬ−１エータポリペプチド活性について比較し得て、ＩＬ−１エータポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストが同定され得る。本発明のなおさらなる態様は、ＩＬ−１エータポリペプチドを発現する細胞と候補化合物を接触させ、ＩＬ−１エータ産生を測定することによって、ＩＬ−１エータの合成又は分泌を阻害する化合物を同定する方法を提供する。ＩＬ−１エータ産生の測定は、存在するタンパク質（例、ＥＬＩＳＡ）又はタンパク質の活性の量を測定することのような数多くのよく知られた方法により達成され得る。
【０１１３】
ＩＬ−１エータポリペプチド又はオリゴヌクレオチドの使用
本発明のポリヌクレオチドの使用には、ポリヌクレオチドフラグメント又はオリゴヌクレオチドのプローブ又はプライマーとしての使用がある。そのようなフラグメントは、少なくとも約１７個の連続したＤＮＡ配列のヌクレオチドを含む。他の態様では、ＤＮＡフラグメントは、少なくとも３０個、又は少なくとも６０個の連続したＤＮＡ配列のヌクレオチドを含む。
【０１１４】
他の哺乳動物種由来のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の相同体が本明細書で考慮されるので、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１のヒトＤＮＡ配列に基づいたプローブは、慣用された種間ハイブリダイゼーション技術を使用して、他の哺乳動物種から誘導されるｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。
【０１１５】
上記に示したアミノ酸配列と組み合わせた遺伝暗号に関する知識を使用して、縮重したオリゴヌクレオチドのセットが製造され得る。そのようなオリゴヌクレオチドは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマー使用され、それによりＤＮＡフラグメントが単離されて増幅される。
【０１１６】
オリゴヌクレオチドを含む、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のＩＬ−１エータのポリヌクレオチドの全部又は一部が、ヒト第２染色体、並びにＩＬ−１リガンドファミリーメンバーのＤＮＡを含有する、その特定の座を同定するために周知の技術を使用して、当業者により使用され得る。有用な技術には、限定しないが、放射線ハイブリッドマッピング（高解像能）、染色体スプレッドへの in situ ハイブリダイゼーション（中解像能）、及び個々の染色体を含有するハイブリッド細胞系へのサザンブロットハイブリダイゼーション（低解像能）のような様々な周知の技術におけるプローブとして、オリゴヌクレオチドを含む配列又は部分を使用することが含まれる。
【０１１７】
例えば、染色体は放射線ハイブリダイゼーションによりマップされ得るが、これにはＰＣＲと、ホワイトヘッド研究所／ゲノム研究ＭＩＴセンターのＧｅｎｅｂｒｉｄｇｅ４パネルの９３放射線ハイブリッド（http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human#STS#releases/july97/rhmap/genebridge4.html）を使用することが含まれる。ＰＣＲプライマーは所期の遺伝子のなかに存在し、ヒトゲノムＤＮＡ由来の産物を増幅するが、ハムスターのゲノムＤＮＡは増幅しない。ＰＣＲの結果は、インターネット（http://www-seq.wi.mit.edu）上のホワイトヘッド／ＭＩＴ放射線マッピング部位へ提示されるデータベクターへ変換される。このデータが記録され、放射線ハイブリッドマップ上の既知の配列タグ部位（ＳＴＳ）マーカーに対して染色体の帰属及び配置が提供される。以下のウェブサイトは放射線ハイブリッドマッピングについての追加情報を提供する：http://www-genome.wi.mit.edu/ftp/distribution/human#STS#releases/july97/07-97.INTRO.html。
【０１１８】
ＤＮＡのＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１は、ヒト第２染色体の２ｑ１１−１２領域に対する放射線ハイブリダイゼーションによりマップされた。ヒト第２染色体は、限定しないが、緑内障、外胚葉性異形成、インスリン依存型糖尿病、皺肌皮膚症候群、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、及び脛骨筋ジストロフィーを含む特定の疾患に関連している。このように、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリヌクレオチド又はそのフラグメントは、第２染色体への遺伝子マッピングに関連した異常を分析する既知の技術を使用して、当業者により使用され得る。このことにより、このマーカーが再配置されるか又は欠失している病態を区別することを可能にする。さらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド又はそのフラグメントは、位置不明の他の遺伝子をマップするために位置マーカーとして使用され得る。
【０１１９】
このＤＮＡは、本発明のポリヌクレオチドに対応する遺伝子の欠陥、又は不十分な量により（直接又は間接的に）仲介される障害への治療を開発することにおいて使用され得る。天然の（ｎａｔｉｖｅ）ヌクレオチド配列の本明細書における開示は、欠陥遺伝子の検出、及び正常遺伝子でのその置換を可能にする。欠陥遺伝子は、in vitro 診断アッセイにおいて、及び本明細書に開示される天然ヌクレオチドを、この遺伝子における欠陥を収容することが疑われる個人から導かれる遺伝子のそれと比較することにより検出され得る。
【０１２０】
他の有用なポリヌクレオチドのフラグメントには、ターゲットｍＲＮＡ（センス）又はＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合し得る一本鎖ポリヌクレオチド配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含んでなる、アンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドが含まれる。本発明によるアンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）のフラグメントを含む。そのようなフラグメントは、概して少なくとも約１４個のヌクレオチド、好ましくは約１４〜約３０個のヌクレオチドを含む。あるタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づいて、アンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドを誘導する能力は、例えば、Stein and Cohen (Cancer Res. 48: 2659, 1988) 及び van der Krol et al. (BioTechniques 6: 958, 1988) に記載されている。
【０１２１】
アンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドがターゲットのポリヌクレオチド配列へ結合すると、様々な手段の１つによりタンパク質の発現を阻止するか又は阻害する二重鎖の形成をもたらすが、その手段には、ＲＮアーゼＨによるｍＲＮＡの分解増強、スプライシングの阻害、転写又は翻訳の早期終止、又は他の手段が含まれる。このように、アンチセンスオリゴヌクレオチドはタンパク質の発現を阻止するために使用され得る。アンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドは、修飾された糖−ホスホジエステル骨格（又は、ＷＯ９１／０６６２９号に記載されるような他の糖連結）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、ここでそのような糖連結は内因性ヌクレアーゼに対して耐性である。そのような耐性のある糖連結を有するオリゴヌクレオチドは in vivo で安定である（即ち、酵素分解に抵抗し得る）が、ターゲットのヌクレオチド配列に結合し得る配列特異性を保持する。
【０１２２】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、ＷＯ９０／１０４４８号に記載されるような有機成分、及びポリ−（Ｌ−リジン）のような、ターゲットポリヌクレオチド配列に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める他の成分に共有的に連結するオリゴヌクレオチドが含まれる。なおさらに、エリプチシンのようなインターカレート剤、及びアルキル化剤又は金属複合体もセンス又はアンチセンスのオリゴヌクレオチドに付着し得て、ターゲットヌクレオチド配列に対するアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を変化させる。
【０１２３】
アンチセンス又はセンスのオリゴヌクレオチドは、例えば、リポフェクション、ＣａＰＯ4仲介性ＤＮＡトランスフェクション、エレクトロポレーション、又はエプシュタイン−バーウイルスのような遺伝子導入ベクターを使用することを含む任意の遺伝子導入法により、ターゲットポリヌクレオチド配列を含有する細胞へ導入し得る。
【０１２４】
センス又はアンチセンスのオリゴヌクレオチドはまた、ターゲットヌクレオチド配列を含有する細胞へ、ＷＯ９１／０４７５３号に記載のようなリガンド結合分子とのコンジュゲートの形成によっても導入され得る。好適なリガンド結合分子には、限定しないが、細胞表面受容体、増殖因子、他のサイトカイン、又は細胞表面受容体に結合する他のリガンドが含まれる。好ましくは、リガンド結合分子のコンジュゲーションは、その対応する分子又は受容体へ結合するか、又はセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートしたバージョンの細胞へのエントリーを阻止する、リガンド結合分子の能力に実質的には干渉しない。
【０１２５】
あるいは、センス又はアンチセンスのオリゴヌクレオチドは、ＷＯ９０／１０４４８号に記載のように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成によりターゲットポリヌクレオチド配列を含有する細胞へ導入され得る。このセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは、内因性リパーゼにより細胞内部で解離される。
【０１２６】
ＩＬ−１エータポリヌクレオチド及び断片化ポリペプチドの使用
本発明のポリペプチドのそれぞれは、タンパク精製試薬としての使用を見出す。このポリペプチドは固形支持材料へ結合され、アフィニティークロマトグラフィーにより結合パートナータンパク質を精製するために使用され得る。特定の態様では、（結合パートナータンパク質に結合し得る、本明細書に記載の任意の形態における）ポリペプチドは、慣用法により固形支持体へ結合される。１例として、タンパク質のアミノ酸側鎖上で官能基と反応する、官能基を含有するクロマトグラフィーカラムを利用し得る（ファルマシアバイオテク社、ピスカタウェイ、ＮＪ）。１つの選択肢では、（上記のような）ポリペプチド／Ｆｃタンパク質が、プロテインＡ−又はプロテインＧ−含有クロマトグラフィーカラムへＦｃ部分との相互作用を介して結合される。
【０１２７】
本発明のポリペプチドはまた、細胞表面で結合パートナーを発現する細胞を精製するか又は同定することにおいて使用を見出す。ポリペプチドは、カラムクロマトグラフィーマトリックス又は同様の好適な基質のような固相へ結合される。例えば、磁気マイクロスフェアをこのポリペプチドでコートして、インキュベーション容器において磁場を介して固定し得る。結合パートナー発現細胞を含有する細胞混合物の懸濁液を、ポリペプチドをその上に有する固相と接触させる。結合パートナーをその細胞表面で発現する細胞は固定されたポリペプチドに結合し、結合しない細胞は洗浄除去される。
【０１２８】
あるいは、ポリペプチドは検出可能な成分にコンジュゲートされ、次いで細胞とインキュベートして、結合パートナーの発現について試験され得る。インキュベーションの後で、非結合の標識物質を除去し、検出可能な成分の細胞上での存在又は不在を決定する。
【０１２９】
さらなる選択肢では、結合パートナーを発現する細胞を含有することが疑われる細胞の混合物をビオチニル化ポリペプチドとともにインキュベートする。インキュベーション時間は、典型的には、十分な結合を確保するために少なくとも１時間の間である。次いで、得られた混合物を、アビジン被覆ビーズで詰めたカラムへ通し、それによりアビジンに対するビオチンの高親和性により所望の細胞のビーズへの結合が提供される。アビジン被覆ビーズを使用する方法が知られている（Berenson et al. J. Cell. Biochem., 10D: 239, 1986 を参照のこと）。結合しない材料を除去するための洗浄と、結合した細胞の遊離は、慣用法を使用して実施される。
【０１３０】
ポリペプチドはまた、結合パートナータンパク質の結合活性をその結合親和性に関して測定することにおいて使用を見出す。このように、ポリペプチドは、例えば、様々な条件下でタンパク質の貯蔵寿命及び安定性をモニターするために、「品質保証」試験を実施する人々により利用され得る。例えば、ポリペプチドは、様々な温度で保管されたか又は様々な細胞型で産生された結合パートナータンパク質の生物学的活性を測定する結合親和性試験において利用され得る。このタンパク質はまた、結合パートナータンパク質の修飾（例、化学修飾、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）、突然変異、等）の後で生物学的活性が保持されているかどうかを判定するためにも使用され得る。修飾された結合パートナータンパク質の結合親和性を非修飾結合パートナータンパク質のそれと比較して、結合パートナーの生物学的活性に対するこの修飾の有害な影響を検出する。このように、結合パートナータンパク質の生物学的活性は、例えばそれが研究試験において使用される前に確かめることができる。
【０１３１】
ポリペプチドは、結合パートナーを担う細胞へそれに結合した剤を運搬するための担体としても使用を見出す。このように、ポリペプチドは、診断用又は治療用の剤をin vitro 又は in vivo の方法においてそのような細胞（又は結合パートナーを細胞表面に発現することが判明している他の細胞型）へ運搬するために使用され得る。
【０１３２】
ポリペプチドへ結合しうる検出可能な（診断用）及び治療用の剤には、限定しないが、毒素、他の細胞毒性剤、薬物、放射性核種、発色素、発色又は蛍光反応を触媒する酵素、等が含まれ、特定の剤が意図される適用に応じて選択される。毒素には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、緑膿菌の外毒素Ａ、リボソーム不活性化タンパク質、トリコテセンのようなマイコトキシン、及びそれらの誘導体及びフラグメント（例、一本鎖）がある。診断使用に適した放射性核種には、限定しないが、123Ｉ、131Ｉ、99mＴｃ、111Ｉｎ、及び76Ｂｒが含まれる。治療使用に適した放射性核種の例は、131Ｉ、211Ａｔ、77Ｂｒ、186Ｒｅ、212Ｐｂ、212Ｂｉ、109Ｐｄ、64Ｃｕ、及び67Ｃｕである。
【０１３３】
そのような剤は、好適な任意の慣用法によりポリペプチドへ付けることができる。ポリペプチドは、所望の剤上の官能基と反応して例えば共有結合を形成し得る官能基をアミノ酸側鎖上に含む。あるいは、このタンパク質又は剤は、所望される反応性の官能基を産生するか又は結合させるように誘導化し得る。誘導化は、様々な分子をタンパク質へ結合させることに利用される二機能性カップリング試薬（ピアスケミカル社、ロックフォード、イリノイ）のうちの１つの結合を含みうる。タンパク質を放射標識するための数多くの技術が知られている。例えば、好適な二機能性キレート剤を使用することによって、放射性核種金属をポリペプチドへ付け得る。
【０１３４】
以上のように、ポリペプチドと好適な診断又は治療薬を含んでなる（好ましくは共有結合した）コンジュゲートが調製される。コンジュゲートは、特定の応用に適した量において投与されるか、又は他のやり方で利用される。
【０１３５】
本発明のポリペプチドは、このポリペプチドの欠損、又は不十分な量により（直接的又は間接的に）仲介される障害についての治療薬を開発することに使用され得る。さらに、本発明のポリペプチドは、このポリペプチドの過剰から（直接的又は間接的に）生じる障害についての治療を開発することに使用され得る。本発明のポリペプチドはそのような障害に罹患した哺乳動物へ投与され得る。
【０１３６】
本発明のポリペプチドはまた、in vitro 又は in vivo の方法において、結合パートナーの生物学的活性を阻害することにおいても利用され得る。例えば、内因性ＩＬ−１エータのその細胞表面受容体への結合を阻害するために、精製されたＩＬ−１エータポリペプチドが使用され得る。
【０１３７】
本発明のポリペプチドは結合パートナー仲介性の障害を治療するために哺乳動物へ投与され得る。そのような結合パートナー仲介性の障害には、結合パートナーにより（直接的又は観察的に）引き起こされるか又は増悪される病態が含まれる。
【０１３８】
本発明の組成物は、天然タンパク質、変異体、誘導体、オリゴマー、及び生物学的に活性なフラグメントのような、本明細書に記載の任意の形態でポリペプチドを含有し得る。特定の態様では、組成物は本発明の可溶性ポリペプチド、又は可溶性ポリペプチドを含んでなるオリゴマーを含む。
【０１３９】
本発明のポリペプチドの有効量を、生理学的に許容される希釈剤、担体、又は賦形剤のような他の成分と組み合わせて含んでなる組成物が本明細書に提供される。ポリペプチドは、薬剤的に有用な組成物を製造するために使用される既知の方法により製剤化され得る。それらは、単一の有効成分としてか、又はある適応症に適した他の既知の有効成分とともにのいずれかで、薬剤的に許容される希釈剤（例、生理食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩緩衝化溶液）、保存剤（例、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、乳化剤、可溶化剤、アジュバント及び／又は担体との混合物において結合され得る。薬剤組成物に適した製剤には、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. 1980, Mack Publishing Company, Easton, PA に記載のものが含まれる。
【０１４０】
さらに、そのような組成物はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合し得るか、又はポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストラン等のポリマー化合物へ取り込まれ得るか、又はリポソーム、ミクロエマルジョン、ミセル、単層又は多層の小胞、赤血球ゴースト、又はスフェロプラストへ取込まれ得る。そのような組成物は、物理状態、溶解性、安定性、in vivo 放出速度、及び in vivo クリアランスに影響を及ぼすので、意図される応用により選択される。
【０１４１】
本発明の組成物は、適切なやり方、例えば、局所的、非経口的、又は吸入により投与され得る。「非経口」という用語には、注射（例えば、皮下、静脈内、又は筋肉内経路による）、さらに局在化した投与（例、疾患又は損傷の部位で）が含まれる。インプラントからの持続放出も考慮される。当業者は、適切な投与量が、治療される障害の性質、患者の体重、年齢及び一般状態、さらに投与経路のような要因に依存して変化することを認識されよう。初回投与は動物試験により決定され得て、ヒトへ投与する投与量のスケーリングは当技術分野で受け入れられた方法によりなされる。
【０１４２】
生理学的に許容される製剤においてポリヌクレオチドを含んでなる組成物も考慮される。例えば、ＤＮＡは注射用に製剤化され得る。
本発明のポリペプチドのもう１つの使用は、ＩＬ−１エータのその結合パートナーとの相互作用からか、又はこれらの相互作用を阻害することから生じる、様々な細胞型に対する生物学的影響を研究するための研究ツールとしての使用である。ポリペプチドはまた、ＩＬ−１エータ、結合パートナー、又はそれらの相互作用を検出するための in vitro アッセイにおいても利用され得る。
【０１４３】
本発明のもう１つの態様は、細胞シグナル伝達を研究するために本発明のポリペプチドを使用することに関する。ＩＬ−１ファミリーリガンドは、細胞のシグナル伝達、血管内皮細胞及びリンパ球の活性化、炎症性サイトカイン、急性期タンパク質、造血、発熱、骨再吸収、プロスタグランジン、メタロプロテイナーゼ、及び吸着分子の誘導を包含する、感染防御と免疫炎症反応において中心的な役割を担う。既知のＩＬ−１ファミリーメンバーの数が増加するにつれて、好適な分類法は、ポリペプチドの構造並びに機能（活性化と調節の特性）を比較することに基づいたものになる。このように、ＩＬ−１エータは、他のＩＬ−１ファミリーリガンド（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、及びＩＬ−１８）と同じように、上記の機能の多くに関わり、炎症反応を促進し、従って、おそらくは、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、及び乾癬のような免疫及び／又は自己免疫性の疾患の発症及び維持に関わる可能性がある。そうであれば、本発明のポリペプチドの発現及び／又は活性化における変化は、限定しないが、細胞特異的な反応及び増殖の活性化又は阻害を含む、多数の細胞プロセスに甚大な影響を及ぼす可能性がある。クローン化したＩＬ−１エータ、又はその機能的に不活性な突然変異体の発現は、特定のシグナル伝達反応を仲介することにおいて特定のタンパク質が果たしている役割を同定するために使用され得る。
【０１４４】
ＩＬ−１仲介性の細胞シグナル伝達には、しばしば分子の活性化カスケードが関わり、その間は、標的基質をリン酸化する細胞内キナーゼを特異的に活性化することによって、受容体がリガンド−受容体仲介性シグナルを伝達する。これらの基質はそれ自身がリン酸化の後に活性化されるキナーゼであり得る。あるいは、それらは、リン酸化に続くタンパク質−タンパク質相互作用により下流のシグナル伝達を促進するアダプター分子であり得る。基質分子の性質にかかわらず、発現される機能的に活性なＩＬ−１エータのバージョンとその結合パートナーは、どんな基質が本発明のポリペプチドにより認識されて活性化され得るのかを同定するために使用され得る。そうであれば、これらの新規ポリペプチドは、シグナル伝達経路に関わる新規な分子を同定するための試薬として使用され得る。
【０１４５】
抗体
本発明のポリペプチドと免疫応答する抗体も本明細書に提供される。そのような抗体は、（非特異的な結合とは反対に）抗体の抗原結合部位を介してポリペプチドと特異的に結合する。このように、上記に示したようなポリペプチド、フラグメント、変異体、融合タンパク質等は、それらと免疫応答する抗体を産生することにおける「免疫原」として利用され得る。より具体的には、このポリペプチド、フラグメント、変異体、融合タンパク質等は、抗体の形成を誘発する抗原決定基又はエピトープを含有する。
【０１４６】
これらの抗原決定基又はエピトープは、直線状か配座性（断続性）のいずれかでもよい。直線状のエピトープがポリペプチドのアミノ酸の単一部分からなるのに対し、配座又は断続性のエピトープはポリペプチド鎖の異なる領域からのアミノ酸部分からなり、これがタンパク質のフォールディング時にごく近傍に集められる（C. A. Janeway, Jr. and P. Travers, Immuno Biology 3: 9 (Garland Publishing Inc., 2nd ed. 1996)）。折り畳まれたタンパク質は複雑な表面を有するので、利用されるエピトープの数はきわめて多いものの、タンパク質のコンホメーションと立体障害により、エピトープへ実際に結合する抗体の数は利用可能なエピトープの数よりも少ない（C. A. Janeway, Jr. and P. Travers, Immuno Biology 2: 14 (Garland Publishing Inc., 2nd ed. 1996)）。エピトープは、当技術分野で知られている方法のいずれでも同定され得る。
【０１４７】
このように、本発明の１つの側面は、本発明の抗原エピトープに関する。そのようなエピトープは、以下により詳しく説明されるように、抗体、特にモノクローナル抗体を産生するのに有用である。さらに、本発明のポリペプチドに由来するエピトープは、アッセイにおける研究試薬として、及び培養ハイブリドーマ由来のポリクローナル血清又は上澄液のような物質から特異結合抗体を精製するために使用され得る。そのようなエピトープ又はその変異体は、固相合成、ポリペプチドの化学的又は酵素的開裂のような当技術分野で周知の技術を使用して、又は組換えＤＮＡ技術を使用して、産生され得る。
【０１４８】
本発明のポリペプチドのエピトープにより誘発され得る抗体に関して言えば、エピトープが単離されているか、又はポリペプチドの一部のままであるにせよ、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方が慣用技術により製造され得る。例えば、Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.), Plenum Press, New York (1980)；及び Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Land (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988) を参照のこと。
【０１４９】
本発明のポリペプチドについて特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も本明細書で企図される。そのようなハイブリドーマは慣用技術により産生され、同定され得る。そのようなハイブリドーマ細胞系を産生する１つの方法は、動物をポリペプチドで免疫し；免疫化した動物から脾臓細胞を採取し；前記脾臓細胞を骨髄腫細胞系へ融合させ、それによりハイブリドーマ細胞を産生し；そしてこのポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を同定することを含む。モノクローナル抗体は慣用技術により回収され得る。
【０１５０】
本発明のモノクローナル抗体にはキメラ抗体、例えば、マウスモノクローナル抗体のヒト化バージョンが含まれる。そのようなヒト化抗体は既知の技術により調製され、抗体がヒトへ投与されるときに低下した免疫原性の利点を提供し得る。１つの態様では、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス抗体の可変部（又はその抗原結合部位そのもの）と、ヒト抗体由来の定常部を含む。あるいは、ヒト化抗体フラグメントは、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位とヒト抗体由来の（抗原結合部位を欠く）可変部フラグメントを含み得る。キメラ抗体とさらに工学処理されたモノクローナル抗体の産生方法には、Riechmann et al. (Nature 332: 323, 1988); Liu et al. (PNAS 84: 3439, 1987); Larrick et al. (Bio/Technology 7: 934, 1989) 及び Winter and Harris (TIPS 14: 139, May, 1993) に記載のものが含まれる。トランスジェニックに抗体を作成する方法は、ＧＢ２，２７２，４４０号、米国特許第５，５６９，８２５号及び５，５４５，８０６号とそれらからの優先権を主張する関連特許に見出し得るが、これらはいずれも参照により本明細書に援用される。
【０１５１】
慣用技術により製造され得る、抗体の抗原結合フラグメントも本発明に含まれる。そのようなフラグメントの例には、限定しないが、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）2フラグメントが含まれる。遺伝子工学技術により産生される抗体のフラグメント及び誘導体も提供される。
【０１５２】
１つの態様では、抗体は本発明のポリペプチドに特異的であり、他のタンパク質と交叉反応しない。そのような抗体を同定しうるスクリーニング法はよく知られていて、例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィーを含み得る。
【０１５３】
本発明の抗体は、in vitro 又は in vivo のいずれかで、本発明のポリペプチド又はフラグメントの存在を検出するアッセイにおいて使用され得る。この抗体はまた、免疫アフィニティークロマトグラフィーにより本発明のポリペプチド又はフラグメントを精製することにおいても利用され得る。
【０１５４】
本発明のポリペプチドの結合パートナーへの結合をさらに阻止し得る抗体は、そのような結合から生じる生物学的活性を阻害するために使用され得る。そのような阻止抗体は、ＩＬ−１エータ受容体を発現するある細胞へのＩＬ−１エータの結合を阻害する能力について抗体を試験するような、適切なアッセイ法を使用して同定され得る。あるいは、阻止抗体は、本発明のポリペプチドがその結合パートナー、ターゲット細胞へ結合することから生じる生物学的効果を阻害する能力についてのアッセイにおいて同定され得る。抗体は、例えば、ＩＬ−１エータ仲介性、又は結合パートナー仲介性の細胞溶解を阻害する能力についてアッセイされ得る。
【０１５５】
そのような抗体は、抗体を産生する物質（entity）により仲介される生物学的活性を阻害するために in vitro の方法で利用され得るか、又は in vivo で投与され得る。本発明のポリペプチドの結合パートナーとの相互作用により（直接的又は間接的に）引き起こされるか又は増悪される障害が、このようにして治療され得る。治療法は、結合パートナー仲介性の生物学的活性を阻害することにおいて有効な量の阻止抗体を哺乳動物へ in vivo 投与することを含む。そのような治療法における使用にはモノクローナル抗体が概して好ましい。１つの態様では、抗原結合性の抗体フラグメントが利用される。
【０１５６】
抗体は、作動性の（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ）（即ち、リガンド模倣性の）機能についてスクリーニングされ得る。そのような抗体は、細胞表面受容体に結合すると、ＩＬ−１が細胞表面ＩＬ−１受容体に結合するときに誘発される生物学的効果に類似した生物学的効果（例えば、生物学的シグナルの伝達）を誘発する。作動性の抗体は、血管内皮細胞及びリンパ球を活性化し、局所の組織破壊及び発熱を誘発し（Janeway et al., 1996）、マクロファージ及び血管内皮細胞を刺激してＩＬ−６を産生させ、及び血管内皮細胞の表面上の分子をアップレギュレートするために使用され得る。
【０１５７】
本発明のポリペプチドに対して向けられる抗体、及び生理学的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体を含んでなる組成物が本明細書に提供される。そのような組成物の好適な成分は本発明のポリペプチドを含有する組成物について上記に説明した通りである。
【０１５８】
さらに本明細書に提供されるのは、抗体に結合した検出可能な（例えば、診断用）又は治療用の剤を含んでなるコンジュゲートである。そのような剤の例は上記に示されている。このコンジュゲートは in vitro 又は in vivo の方法において使用を見出す。
【０１５９】
以下の実施例は説明のために提供されるものであり、制限するためのものではない。当業者は、これらの実施例において具体化される本発明のバリエーションが、特に本明細書に引用される様々な参考文献（その開示内容はそのまま参照により本明細書に援用される）の教示に照らしてなされ得ることを認識されよう。
【０１６０】
実施例１：ＩＬ−１エータ（η）ポリヌクレオチドの単離
ＥＰ  ０８７９８８９Ａ２に開示されるｃＤＮＡの上流部分を含有するヒトゲノムＤＮＡをクローン化し、３’方向に伸長した。このゲノムＤＮＡの配列を決定し、ＩＬ−１ファミリーメンバーのＣ末端部分に対する潜在的な相同性について検査した。ＩＬ−１ファミリーメンバーのＣ末端部分と相同にコードする可能性のある領域を位置づけ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のポリヌクレオチド３７５〜５８５として開示する。３’又は逆プライマーに終止コドンを、及び５’又はセンスプライマーにＩＬ−１エータ  ｃＤＮＡ（ＥＰ  ０８７９８８９Ａ２のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の開始ＡＴＧを含有する、ＰＣＲプライマーを合成した。これらのプライマーを使用して、ヒト扁桃ｍＲＮＡからつくった第一鎖ｃＤＮＡからＩＬ−１エータ  ｃＤＮＡを増幅した。標準プロトコールを使用してＰＣＲを実施した。
【０１６１】
実施例２：精製したＩＬ−１エータポリペプチドの使用
ＩＬ−１エータ含有サンプル（５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ3，ＮａＯＨでｐＨ９へ）の希釈系列液で、Ｌｉｎｂｒｏ／Ｔｉｔｅｒｔｅｋ９６穴平底Ｅ．Ｉ．Ａ．マイクロ滴定プレート（ＩＣＮ  バイオメディカル社、オローラ、ＯＨ）上を１００：１／ウェルでコートする。４℃、１６時間のインキュベーションの後に、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有２００：１ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）でウェルを６回洗浄する。次いで、このウェルを、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）含有ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  １ｍｌ中のＦＬＡＧ（登録商標）−結合パートナー１ｍｇとともに９０分インキュベーション（各ウェルにつき１００：１）した後に、上記のように洗浄する。次いで、各ウェルを、５％ＦＣＳ含有ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  １ｍｌ中の抗ＦＬＡＧ（登録商標）−モノクローナル抗体Ｍ２  １ｍｇとともに９０分インキュベーション（各ウェルにつき１００：１）した後に、上記のように洗浄する。続いて、ウェルをポリクローナルヤギ抗ｍＩｇＧ１特異的西洋ワサビペルオキシダーゼ共役抗体（５％ＦＣＳ含有ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の市販ストックの５０００倍希釈液）とともに９０分インキュベーション（各ウェルにつき１００：１）する。このＨＲＰコンジュゲート抗体はサザン・バイオテクノロジー・アソシエーツ社、バーミンガム、アラバマから得られる。次いで、ウェルを上記のように６回洗浄する。
【０１６２】
ＥＬＩＳＡの顕色のために、基質混合物［ＴＭＢペルオキシダーゼ基質とペルオキシダーゼ溶液Ｂ（Kirkegaard Perry Laboratories, ゲイサースブルグ、メリーランド）の１：１前混合物、１００：１／ウェル］をウェルへ加える。十分な発色反応の後で、２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4（５０：１／ウェル）を加えてこの酵素反応を止める。発色強度（リガンドと受容体の結合を示す）を、Ｖ  Ｍａｘプレートリーダー（モレキュラーデバイス、サニーヴェイル、ＣＡ）で４５０ｎｍにおける吸光度を測定することによって決定する。
【０１６３】
実施例３：アミノ酸配列
ＩＬ−１エータのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の全ヌクレオチド配列の翻訳により決定した。
【０１６４】
実施例４：ＤＮＡ及びアミノ酸の配列
単離されたＩＬ−１エータのヌクレオチド配列とそれによりコードされるアミノ酸の配列を、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及び２に示す。ＰＣＲにより単離されたＩＬ−１エータＤＮＡフラグメントの配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド１〜５８５に対応するが、これはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１〜１５７をコードする。
【０１６５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列は、他の既知のＩＬ−１リガンドファミリーメンバーに対して有意な相同性を有する。
【０１６６】
実施例５：本発明のポリペプチドに結合するモノクローナル抗体
本実施例は、ＩＬ−１エータに結合するモノクローナル抗体を調製する方法を説明する。そのような抗体を作成するのに利用され得る好適な免疫原には、限定しないが、精製されたＩＬ−１エータポリペプチド、又は細胞外ドメインのようなその免疫原性フラグメント、又はＩＬ−１エータを含有する融合タンパク質（例えば、可溶性のＩＬ−１エータ／Ｆｃ融合タンパク質）が含まれる。
【０１６７】
精製されたＩＬ−１エータは、米国特許第４，４１１，９９３号に記載のような慣用技術を使用して、それと免疫応答性のモノクローナル抗体を作成するために使用され得る。簡潔に言うと、完全フロイントアジュバントに乳化したＩＬ−１エータ免疫原でマウスを免疫し、１０〜１００ｇの範囲の量を皮下又は腹腔内に注射する。１０〜１２日後、免疫した動物を、不完全フロイントアジュバントに乳化したさらなるＩＬ−１エータで追加免疫する。その後、１週〜２週間の免疫スケジュールに基づいて、マウスを周期的に追加免疫する。後眼窩出血又は尾先端切除により血清サンプルを周期的に採取し、ドットブロットアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定）又はＩＬ−１エータ受容体結合阻害により、ＩＬ−１エータ抗体について検査する。
【０１６８】
適切な抗体力価の検出に続き、陽性の動物に対し、ＩＬ−１エータの生理食塩水溶液を最後に１回静脈内注射する。３〜４日後、動物を屠殺し、脾臓細胞を採取し、脾臓細胞をマウス骨髄細胞系、例えばＮＳＩか、好ましくはＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８０）に融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が作成されるが、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害するために、これをＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）選択培地において多数のマイクロタイタープレートにおいて培養する。
【０１６９】
このハイブリドーマ細胞を、Engvall et al., (Immunochem. 8: 871, 1971) 及び米国特許第４，７０３，００４号に開示された技術の適用により、精製したＩＬ−１エータに対する反応性につきＥＬＩＳＡでスクリーニングする。好ましいスクリーニング技術は、Beckmann et al., (J. Immunol. 144: 4212, 1900) に記載の抗体捕捉技術である。陽性のハイブリドーマ細胞を、同系のＢＡＬＢ／ｃマウスへ腹腔内注射して、高濃度の抗ＩＬ−１エータモノクローナル抗体を含有する腹水を産生させることができる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、フラスコ又はローラーボトルにおいて様々な技術により in vitro で増殖させ得る。マウス腹水において産生されたモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈澱に次いで、ゲル排除クロマトグラフィーにより精製され得る。あるいは、ＩＬ−１エータへの結合に基づいたアフィニティー・クロマトグラフィーが使用され得るように、プロテインＡ又はプロテインＧに対する抗体の結合に基づいたアフィニティー・クロマトグラフィーも使用し得る。
【０１７０】
実施例６：ノーザンブロット分析
ＩＬ−１エータの組織分布を、以下のように、ノーザンブロット分析により研究する。放射標識リボプローブのアリコートを、２種の異なるヒト多組織ノーザンブロット（クローンテク、パロアルト、ＣＡ；バイオチェイン、パロアルト、ＣＡ）へ加える。このブロットを、１０ＸＤｅｎｈａｒｄｔｓ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），９００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  ピロリン酸Ｎａ，１％  ＳＤＳ，サケ精子ＤＮＡ２００μｇ／ｍＬにおいてハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションは、さきに記載された（March et al., Nature 315: 641-647, 1985）のように、５０％ホルムアミドにおいて６３℃で一晩実施する。次いで、このブロットを６８℃で３０分、２Ｘ  ＳＳＣ，０．１％  ＳＤＳとともに洗浄する。β−アクチン特異的プローブとの対照プロービングに比較して、最高レベルのＩＬ−１エータ・ｍＲＮＡを有する細胞及び組織を決定する。
【０１７１】
実施例７：結合アッセイ
完全長のＩＬ−１エータを発現させ、ＩＬ−１エータ受容体に結合する能力につき試験することができる。この結合アッセイは以下のように実施し得る。
【０１７２】
可溶性ＩＬ−１エータポリペプチドのＮ末端に融合したロイシンジッパーペプチドを含んでなる融合タンパク質がこのアッセイに利用される。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドをコードするＤＮＡを、三量体化を可能にする修飾されたロイシンジッパー部分をコードする配列に置き換えたこと以外は、ＦＬＡＧ（登録商標）（ＩＬ−１エータ）発現構築体の製造についての Wiley et al. (Immunity, 3: 673-682, 1995; 参照により本明細書に援用される）の記載と本質的に同じようにして、発現構築体を調製する。この構築体は、発現ベクターのｐＤＣ４０９において、ヒトサイトメガロウイルス由来のリーダー配列と、それに後続する可溶性エタポリペプチドのＮ末端に融合したロイシンジッパー部分をコードする。ＬＺ−ＩＬ−１エータはＣＨＯ細胞で発現され、培養上清から精製される。
【０１７３】
ｐＤＣ４０９と称される発現ベクターは、McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821-2832, 1991; 参照により本明細書に援用される）に記載のｐＤＣ４０６ベクターから誘導される哺乳動物の発現ベクターである。（ｐＤＣ４０６に比較して）ｐＤＣ４０９へ加えられる特徴には、多重クローニング部位（ｍｃｓ）における追加の独特な制限部位；ｍｃｓの下流に位置づけられる３つの終止コドン（各リーディングフレームに１つ）；及びｍｃｓの下流にある、ｍｃｓへ挿入されるＤＮＡの配列決定を促進するＴ７ポリメラーゼプロモーターが含まれる。
【０１７４】
完全長のヒトＩＬ−１エータタンパク質の発現については、コーディング領域全体（即ち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に表されるＤＮＡ配列）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。ＰＣＲに利用される鋳型は、実施例１に記載のような、扁桃から単離したｃＤＮＡクローンからの第一鎖ｃＤＮＡである。単離されて増幅されたＤＮＡを発現ベクターのｐＤＣ４０９へ挿入し、ｐＤＣ４０９−ＩＬ−１エータと称される構築体を産生する。
【０１７５】
ＩＬ−１エータポリペプチドを利用して、上記のように、組換え又は内因性のＩＬ−１エータ受容体を発現する宿主細胞に結合する能力について試験する。ＩＬ−１エータ受容体を発現する細胞を、１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン、ストレプトマイシン及びグルタミンで補充したＤＭＥＭにおいて培養する。ＬＺ−ＩＬ−１エータ（５ｍｇ／ｍｌ）とともに細胞を約１時間インキュベートする。インキュベーションの後で、細胞を洗浄して非結合のＬＺ−ＩＬ−１エータを除去し、ビオチニル化抗ＬＺ−モノクローナル抗体（５ｍｇ／ｍｌ）、及びフィコエリスリンコンジュゲートストレプタビジン（１：４００）とともにインキュベーションした後で、蛍光活性化細胞スキャニング（ＦＡＣＳ）により分析する。このサイトメトリー分析は、ＦＡＣスキャン（ベクトン・ディキンソン、サンホセ、ＣＡ）に基づいて実施した。
【０１７６】
ＩＬ−１エータ受容体を発現する細胞は、ＩＬ−１エータ受容体を発現しない対照細胞に比較して、ＬＺ−ＩＬ−１エータの有意に増強された結合を示した。
【０１７７】
実施例８：発現分析
クローンテク（パロアルト、ＣＡ）ヒト多組織ｃＤＮＡパネルＩ（カタログ番号：Ｋ１４２０−１）及びＩＩ（カタログ番号：Ｋ１４２１−１）とヒト免疫パネル（カタログ番号：Ｋ１４２６−１）に存在する第一鎖ｃＤＮＡを、センス及びアンチセンスプライマーを使用するＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡから生じる産物が識別され得るように、イントロンを含むようにプライマーを設計した。ある事例では、ネステッドプライマーを第二のＰＣＲ反応において使用した。遺伝子／組織の各組み合わせについての増幅産物の存在を、臭化エチジウムで染色したアガロースゲルの分析により判定した。
【０１７８】
あるいは、ヒト末梢血由来の個々の細胞型を単離し、様々な刺激を実施した（Kubin et al., Blood 83 (7): 1847-55 (1994); Kubin et al., J Exp Med 180 (1): 211-22 (1994)）。ＮＫ細胞は、２時間又は４時間の間、ＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄバイオシステムズ；１ｎｇ／ｍｌ）とともにインキュベートした。Ｔ細胞は、３０分又は４時間の間、抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３抗体、５ｎｇ／ｍｌでプラスチック上に固定化）、又は抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８（抗ＣＤ２８抗体は、腹水液の５００倍希釈液として可溶形態で使用されたＣＤ２４８であった）の組み合わせで、刺激するか又は刺激しなかった。単球は、２又は３時間の間、ＬＰＳ（シグマ；１μｇ／ｍｌ）で刺激するか又は刺激しなかった。Ｂ細胞は、３．５又は４時間、０．０５％  ＳＡＣ及びＣＤ４０Ｌ三量体（Ｉｍｍｕｎｅｘ）５００ｎｇ／ｍｌ及びＩＬ−４（Ｉｍｍｕｎｅｘ）５ｎｇ／ｍｌの組み合わせで刺激しないか、又は刺激した。樹状細胞は、単球と同じように、２又は４時間の間、ＬＰＳで刺激した。ＲＮＡの単離と第一鎖ｃＤＮＡの合成の後で、ＰＣＲ増幅とゲル分析を実施した。
【０１７９】
表１は、クローンテクからの第一鎖ｃＤＮＡのパネルのＰＣＲ分析により導かれた、ＩＬ−１エータ発現のデータを要約する。この表において、「−」は、ｍＲＮＡを捜したが見出せなかったことを示す。ポジティブな発現結果は「Ａ」により示される。
【０１８０】
【表１】
表１
ヒト組織源                ＩＬ−１エータの発現
脾臓                            −
リンパ節                        −
胸腺                            −
扁桃                            Ａ
骨髄                            Ａ
胎児肝臓                        −
白血球                          −
心臓                            Ａ
脳                              −
胎盤                            Ａ
肺                              Ａ
肝臓                            −
骨格筋                          −
腎臓                            −
膵臓                            −
前立腺                          −
精巣                            Ａ
卵巣                            −
小腸                            −
結腸                            Ａ
【配列表】
0004623342.tif 000004
0004623342.tif 000005