(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
【化１】
0004818500.tif 000010
（式中Ｒ２はグリシン、Ｎ−アルキルグリシン、及びＮ，Ｎ−ジアルキルグリシンから選択されるアミノ酸のハロゲン化水素酸塩のカルボン酸残基を意味する。Ｒ１，Ｒ３は水素原子またはメチル基を意味する）
で表されるトコトリエノールのアミノ酸エステル誘導体。
【請求項２】
請求項１記載の誘導体において、前記Ｎ−アルキルグリシン、Ｎ，Ｎ−ジアルキルグリシンが、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、Ｎ，Ｎ−ジエチルグリシンからなる群より選択される少なくとも一種であることを特徴とするトコトリエノールのアミノ酸エステル誘導体。
【請求項３】
請求項１もしくは２記載の誘導体を含有する静脈内投与可能な水溶性製剤で、投与後に前記誘導体が速やかに肝臓に移行し加水分解されてトコトリエノールを生成することを特徴とする水溶性製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はトコトリエノール誘導体およびその製造方法、特にその水溶性の改良に関する。
【従来の技術】
【０００２】
トコトリエノール類は、パーム油や穀類の子実に含まれるビタミンＥ同族体であり、トコフェロールと同様に６−クロマノール骨格を有する。そして、クロマノール骨格２位の炭素１６個からなる疎水性基が異なっており、トコトリエノールはトリプレニル基を、トコフェロールはフィチル基を有する。トコトリエノールはクロマノール骨格のメチル基の置換数と置換部位によって、α，β，γ，δ−トコトリエノールの四種類に分類されている。
【０００３】
これらのトコトリエノール類は、医薬品としてはコレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、癌、免疫賦活、アルツハイマー、酸化的障害が原因となる病態（心臓、脳、肝臓、皮膚）に対する優れた効果が期待されている。また、最近ではナトリウム利尿ホルモン様利尿剤、パーオキシニトリルの捕捉薬としての期待が寄せられている。
更に、トコトリエノールはＵＶによるタンパク質の酸化、脂質過酸化、ＤＮＡ損傷に対して保護作用を持つことから、コラーゲンタンパク質の酸化的障害の防護効果、すなわち皺取りと皺予防効果、及び美白効果が期待される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、トコトリエノール類は、いずれも酸化に対して不安定であり、しかも油状で水に全く溶解しない化合物である。このため、トコトリエノールの水溶性製剤または水性化粧品の調製には大量の非イオン性界面活性剤の添加による可溶化方法が検討されているが、大量の界面活性剤はアナフィラキシーショック等の重篤な問題を生じる場合がある。
【０００５】
そこで、酸化に対して安定性を示すとともに、高い水溶性を有し、生体内で容易に加水分解されて遊離のトコトリエノールを生成するようなトコトリエノール誘導体が求められている。
【０００６】
従来、水分散性ないし水溶解性を有するトコトリエノール誘導体として、トコトリエノールコハク酸エステルとトコトリエノールコハク酸エステルのポリエチレングリコール誘導体が知られている（米国特許５，８６９，７０４）
しかしながら、これらの化合物は室温で油状あるいはワックス状であり、また生体内でのトコトリエノールへの再変換が非常に遅いという問題が残っていた。
【０００７】
本発明は前記従来技術の課題に鑑みなされたものであり、その目的は高い水溶性とともに生体内で迅速に遊離トコトリエノールを生成し得るトコトリエノール誘導体を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するために本発明者等が鋭意検討を行った結果、特定のトコトリエノールカルボン酸エステル誘導体が、優れた水溶性および生体内での遊離トコトリエノール放出性を発揮し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明にかかるトコトリエノールカルボン酸エステル誘導体は、一般式（Ｉ）
【化２】
0004818500.tif 000002
（式中Ｒ２は窒素置換基を有するカルボン酸残基を意味する。Ｒ１，Ｒ３は水素原子またはメチル基を意味する）
で表されることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明において、窒素置換基を有するカルボン酸残基が、アミノ酸、Ｎ−アシルアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ酸、ピリジンカルボン酸及びそれらのハロゲン化水素酸塩またはアルキルスルホン酸塩の残基からなる群より選択される少なくとも一種であることが好適である。
【００１１】
また、本発明にかかるトコトリエノールカルボン酸エステル誘導体の製造方法は、１級または２級アミノ基あるいは側鎖に水酸基、チオール基を有するアミノ酸のアミノ基を保護基で保護し、該保護基結合アミノ酸とトコトリエノールとをエステル化反応させることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明にかかる他の製造方法は、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ酸のハロゲン化水素酸塩を用いて活性エステル化試薬の存在下にトコトリエノールとエステル化反応させることを特徴とする。
なお、一般式（Ｉ）で表されるトコトリエノール誘導体は、クロマノール骨格の２位に不整炭素を有するので、ｄ，ｄｌ体などの立体異性体が存在するが、本発明はこれらの異性体を包含するものである。
【００１３】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
本発明において、窒素置換基を有するカルボン酸残基は、窒素原子に対し水素原子ないし、１または２のアルキル基、アシル基が結合したものが好適である。このアルキル基としては、炭素数１〜６の直鎖、もしくは分枝のアルキル基、例えばメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、n−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソプロピル基、イソブチル基、１−メチルプロピル基、tert−ブチル基、１−エチルプロピル基、イソアミル基などを例示することが可能であり、特にメチル基、エチル基が好ましい。また、アシル基を有する場合の炭化水素鎖も同様に定義可能である。
【００１４】
アミノ基とカルボニル基の間は、好ましくは炭素数１〜７の直鎖、分枝または環状のアルキレン基で結合される。分枝状のアルキレン基とは、例えばイソプロピル、イソブチル、tert−ブチル、１−エチルプロピルなどのアルキル基から誘導されたアルキレン基を意味する。環状アルキレン基とは、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、あるいはメチルシクロヘキサン環などを構造中に含むアルキレン基を意味する。アルキレン基として特に好ましいのは、メチレン基あるいはエチレン基である。
【００１５】
ハロゲン化水素酸塩としては、ＨＣｌ塩、ＨＢｒ塩などが好ましい。本発明において、ハロゲン化水素酸塩は結晶化ないし固形化する場合が多く、製剤にあたっての取り扱いが容易になるという利点がある。
また、アルキルスルホン酸塩としては、メタンスルホン酸等が例示される。このアルキルスルホン酸塩とした場合には、吸湿性の低い固形化が可能である。
【００１６】
次に、本発明にかかるトコトリエノール誘導体の製造方法としては、以下のようなものが例示される。
【化３】
0004818500.tif 000003
一般式（II）で表されるトコトリエノール類と、窒素置換基を有するカルボン酸、もしくはその反応性酸誘導体、またはこれらのハロゲン化水素酸塩とを、常法によりエステル化反応を行うことにより、本発明の目的物質（Ｉ）を得ることができる。
【００１７】
トコトリエノール類のエステル化反応は常法に従うが、１級、２級アミノ基あるいは側鎖に水酸基、チオール基を有するアミノ酸のエステル化を行う際は、tert-ブトキシカルボニル基（以下、ｔ−ＢＯＣ基という）、ベンジルオキシカルボニル基（以下、Ｚ基という）などの適切な保護基で保護して用いることが好ましい。
【００１８】
また、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ酸はハロゲン化水素酸塩を用いて、ジシクロヘキシルカルボジイミド（以下、ＤＣＣという）、Ｎ，Ｎ−ジサクシニミドオキザレート（以下、ＤＳＯという）などの活性エステル化試薬の存在下に反応を行うことが好ましい。この際の溶媒としては、無水ピリジンが好ましい。
【００１９】
また、反応性酸誘導体を用いる方法では、酸ハロゲナイト、特に酸クロリドを用いる方法が好ましい。この際の溶媒としては、無水ベンゼン−無水ピリジン混合物が好ましい。ハロゲン化水素酸塩及びアルキルスルホン酸塩は、常法により遊離のアミノ酸エステルとハロゲン化水素酸またはアルキルスルホン酸を反応させて製造する。また、Ｎ−アシルアミノ酸エステルを製造した後、常法によりハロゲン化水素酸で脱保護基化することによって、ハロゲン化水素酸塩を製造することができる。
なお、本発明にかかるトコトリエノールカルボン酸エステル誘導体は、胆汁酸塩とすることも可能である。
【００２０】
ここで、胆汁酸塩とは、具体的には、タウロコール酸、グリココール酸、コール酸、タウロデオキシコール酸、デオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸の塩等をいう。そして、前記トコトリエノールカルボン酸エステルとこれらの胆汁酸を反応させて胆汁酸塩を得ることができる。例えばメタノール、エタノール、プロパノールなどの低級アルコール系の溶媒を用い、反応終了後、溶媒を減圧下で留去することによりトコトリエノールカルボン酸エステル胆汁酸塩を得ることができる。
【００２１】
本発明で得られる目的物質（Ｉ）は、生体内に広範囲に存在する加水分解酵素で容易に加水分解されてトコトリエノールを生成する。また、ハロゲン化水素酸塩及びアルキルスルホン酸塩は結晶性の粉末であり、製剤技術上、取り扱いが容易且つ簡便であり、比較的高い水溶性を有する。従って、静脈内投与可能な製剤、点眼剤、経口投与剤、水性塗布剤として有用である。
【００２２】
【実施例】
以下、本発明の好適な実施例について説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２３】
実施例１〜１８
下記製造方法Ａ〜Ｄに示す方法により表１、表３に示すトコトリエノール誘導体を製造した。また、表１に示す化合物の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表２に示す。
【００２４】
［製造方法Ａ］
アミノ酸０．１molを蒸留水−ジオキサン（１：１，v／v）１００mlに溶解し、トリエチルアミン３０mlを加え、さらにジ−tert−ブチルジカルボネートを徐々に加え、３０分間室温で攪拌する。減圧下ジオキサンを留去し、炭酸水素ナトリウム水溶液（０．５Ｍ）５０mlを加え、酢酸エチル１００mlで洗う。酢酸エチル層を５０mlの炭酸水素ナトリウム液で洗い、水層を合わせて氷冷下でクエン酸水溶液（０．５Ｍ）を加えて酸性（ｐＨ３）とし、塩化ナトリウムを飽和させた後、酢酸エチルで抽出する（１００ml×３回）。抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水後、減圧下に溶媒を留去し、油状残渣をイソプロピルエーテルを加えるか、または冷却にて結晶化させてＮ−ｔ−ＢＯＣアミノ酸を得る。
【００２５】
アルゴンガス雰囲気下で、トコトリエノール５mmol，Ｎ−ｔ−ＢＯＣアミノ酸５mmol、ＤＣＣ５mmolを無水ピリジン３０mlに加え室温で２０時間攪拌する。溶媒を減圧下留去し、残渣に酢酸エチルを加えて可溶性画分を抽出する（１００ml×２回）。抽出液を減圧下濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離溶媒；n−ヘキサン−酢酸エチル＝９：１）で分離精製し、トコトリエノールＮ−ｔ−ＢＯＣ−アミノ酸エステルを得る。
【００２６】
トコトリエノールＮ−ｔ−ＢＯＣ−アミノ酸エステルを少量のアセトンに溶解し、塩酸−ジオキサン（２．５〜４．０Ｎ）を塩酸量がエステルの２０倍モル量に相当する量加え、１時間攪拌後、減圧下溶媒を留去する。残渣をアセトン−メタノール系または酢酸エチル−メタノール系で再結晶して、トコトリエノールアミノ酸の塩酸塩を得る。
【００２７】
［製造方法Ｂ］
トコトリエノールアミノ酸の塩酸塩３mmolを水１５０mlに加え、炭酸水素ナトリウムを加えて溶液のｐＨを７〜８にした後に、酢酸エチルで抽出する（１００ml×３回）。抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下溶媒を留去し、油状のトコトリエノールアミノ酸を得る。
【００２８】
［製造方法Ｃ］
アルゴンガス雰囲気下で、トコトリエノール５mmol、塩酸Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ酸５mmol、ＤＣＣ５mmolを無水ピリジン３０mlに加え、室温で２０時間攪拌する。溶媒を減圧下留去し、残渣を蒸留水に懸濁させ炭酸水素ナトリウムを加えて溶液のｐＨを７〜８にした後、酢酸エチルで抽出する（１００ml×３回）。抽出液を無水硫酸ナトリウムで脱水後減圧下溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離溶媒：ｎ−ヘキサン−酢酸エチル＝８：２）で分離精製し、トコトリエノールＮ，Ｎ−ジアルキルアミノ酸を得る。
【００２９】
［製造方法Ｄ］
トコトリエノールアミノ酸またはトコトリエノールＮ，Ｎ−ジアルキルアミノ酸２mmolをアセトン２０mlに溶解し、塩酸−ジオキサン（２．５〜４．０Ｎ）を塩酸量がエステルの１０倍モル量に相当する量、またはアルキルスルホン酸２mmolを加え、減圧下溶媒を留去する。残渣をアセトン−メタノール系または酢酸エチル−メタノール系で再結晶して、トコトリエノールアミノ酸またはトコトリエノールＮ，Ｎ−ジアルキルアミノ酸の塩酸塩を得る。
【００３０】
以下、本発明にかかる化合物の具体的化学式及びその物性、製造方法について、図１，３に示す。なお、実施例１〜７については、質量分析（ｍ／ｚ，ＦＡＢ−ＭＳ）及び核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ，δｐｐｍ，内部標準ＴＭＳ）を表２に示す。
【００３１】
【表１】
0004818500.tif 000004
【００３２】
【表２】
0004818500.tif 000005
0004818500.tif 000006
【００３３】
一般にトコトリエノール類は、非常に粘性の高い油状物質であり、正確な秤量を含め、取り扱いが困難である。これに対し、本発明のトコトリエノールカルボン酸エステル誘導体のハロゲン化水素塩は、前記実施例１〜７のように結晶ないし固形となり、取り扱いが極めて簡便となる利点を有する。この点、前記従来のトコトリエノールコハク酸エステルなどは、油状ないしワックス状であり、取り扱いは一般のトコトリエノール類と同様困難であり、ハロゲン化水素塩は本発明の特に好ましい形態として特筆される。
【００３４】
【表３】
0004818500.tif 000007
【００３５】
水溶性試験
１）実験方法
ｄ−α−トコトリエノール、ｄ−γ−トコトリエノール、ｄ−δ−トコトリエノール、ｄ−α−トコトリエノール  アミノアセテート塩酸塩（実施例１：以下、ｄ−α−Ｔ３ＡＡ）、ｄ−α−トコトリエノール  Ｎ−メチルアミノアセテート塩酸塩（実施例２：以下、ｄ−α−Ｔ３ＭＡ）、ｄ−α−トコトリエノール  Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアセテート塩酸塩（実施例５：以下、ｄ−α−Ｔ３ＤＭＡ），ｄ−γ−トコトリエノール  アミノアセテート塩酸塩（実施例３：以下、ｄ−γ−Ｔ３ＡＡ）、ｄ−γ−トコトリエノール  Ｎ−メチルアミノアセテート塩酸塩（実施例４：以下、ｄ−γ−Ｔ３ＭＡ）、ｄ−γ−トコトリエノール  Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアセテート塩酸塩（実施例６：以下、ｄ−γ−Ｔ３ＤＭＡ）、ｄ−δ−トコトリエノール  Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアセテート塩酸塩（実施例７：以下、ｄ−δ−Ｔ３ＤＭＡ）のそれぞれ０．２５０mmolをメスフラスコにとり、蒸留水を加えて５mlとし、２０℃、２４時間攪拌後、溶液中の各添加化合物濃度を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定した。
【００３６】
２）結果
ｄ−α−トコトリエノール、d−γ−トコトリエノール及びｄ−δ−トコトリエノールはいずれもＨＰＬＣの検出限界以下で、溶解度は測定できなかった。ｄ−α−Ｔ３ＡＡ，ｄ−α−Ｔ３ＭＡ，ｄ−γ−Ｔ３ＡＡ，ｄ−γ−Ｔ３ＭＡ，ｄ−γ−Ｔ３ＤＭＡ及びｄ−δ−Ｔ３ＤＭＡはいずれも溶液となり、溶解度は５０ｍＭ以上であった。
【００３７】
加水分解性実験
１）方法
ＳＤ系ラット肝臓ミクロソーム及びラット血漿の等張リン酸緩衝液に、ｄ−α−トコトリエノール  Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアセテート塩酸塩（実施例５：以下、ｄ−α−Ｔ３ＤＭＡ）、ｄ−α−トコトリエノール  Ｎ−メチルアミノアセテート塩酸塩（実施例２：以下、ｄ−α−Ｔ３ＭＡ）、ｄ−γ−トコトリエノール  Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアセテート塩酸塩（実施例６：以下、ｄ−γ−Ｔ３ＤＭＡ）、ｄ−γ−トコトリエノール  Ｎ−メチルアミノアセテート塩酸塩（実施例４：以下、ｄ−γ−Ｔ３ＭＡ）、ｄ−γ−トコトリエノールアミノアセテート塩酸塩（実施例３：以下、ｄ−γ−Ｔ３ＡＡ）を添加し、３７℃で経時的に反応溶液中に生成するｄ−α−トコトリエノール及びｄ−γ−トコトリエノールを高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定した。
【００３８】
比較例として、同様にｄ−α−トコトリエノールコハク酸エステル（以下、ｄ−α−Ｔ３Ｓ）とｄ−γ−トコトリエノールコハク酸エステル（以下、ｄ−γ−Ｔ３Ｓ）について加水分解実験を行った。
ＨＰＬＣ条件：カラムはＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  ＵＧ１２０、移動相はメタノール−アセトニトリル（５：５ｖ／ｖ）、流速０．７ml/min、検出は２８３nmの吸光度と蛍光光度（励起２９８nm、蛍光３２５nm）で行った。
【００３９】
２）結果
ラット肝ミクロソーム及びラット血漿溶液におけるｄ−α-トコトリエノール及びｄ−γ−トコトリエノールの生成のMichaelis-Mentenモデルに従った速度論パラメータを表４及び表５に示した。
【００４０】
【表４】
0004818500.tif 000008
【００４１】
【表５】
0004818500.tif 000009
【００４２】
トコトリエノールの窒素置換基を有するカルボン酸エステルはトコトリエノールコハク酸エステルに比較して速やかにトコトリエノールを生成した。この加水分解反応はエステラーゼ阻害剤で強く阻害される（図１参照）ことから、エステラーゼで触媒されることが明らかになった。本発明化合物は、従来のコハク酸エステルに比較してトコトリエノールの優れた誘導体であることが理解される。
【００４３】
［動物実験］
静脈内投与
１）ＳＤ系雄性ラット（体重２６０〜２８５ｇ）を薬物投与前１６時間から食餌を氷砂糖に変更して用いた。ｄ-α−Ｔ３ＤＭＡ（実施例５）、ｄ−γ−Ｔ３ＤＭＡ（実施例６）、ｄ−α-トコトリエノール（以下、ｄ−α−Ｔ３）、ｄ−γ−トコトリエノール（以下、ｄ−γ−Ｔ３という）を軽度麻酔下、左大腿静脈内に投与した。ｄ−α−Ｔ３ＤＭＡとｄ−γ−Ｔ３ＤＭＡの投与液は１０％プロピレングリコールを含む蒸留水に溶解し、メンブランフィルター（０．２２μm）で濾過して用いた。ｄ−α−Ｔ３とｄ−γ−Ｔ３の投与液は、非イオン性界面活性剤ＨＣＯ−６０を用いて溶解した。投与量は、各トコトリエノール当量２５mg/kgとした。投与０．２５，０．５，１，２，４，８，２４時間後にエーテル麻酔下で採血後、肝臓、心臓、腎臓を採取した。血漿は速やかに分離採取した。各臓器重量の３倍量の１．１５％塩化カリウム溶液を加え、ホモジネートした。各試料０．２mlにエタノール０．７mlを加え、２分間攪拌後、遠心分離し、上清を前記ＨＰＬＣで分析した。
【００４４】
結果を図２，３に示す。
図２は、ｄ−α−Ｔ３ＤＭＡとｄ−α−Ｔ３を投与した場合のラット体内動態を検討した結果を示し、横軸は投与後の時間を、縦軸は各組織または臓器中の量を示す。ｄ−α−Ｔ３ＤＭＡは投与後速やかに血漿から消失し肝臓に移行した。肝臓中のｄ−α−Ｔ３量は急速に高くなり、ｄ−α−Ｔ３投与群と同程度の量で推移し、肝臓中ｄ−α−Ｔ３のバイオアベイラビリティは１３０％となった。このことから、ｄ−α−Ｔ３ＤＭＡは、投与後速やかにラット体内で加水分解されてｄ−α−Ｔ３を生成することが支持される。
【００４５】
図３はｄ−γ−Ｔ３ＤＭＡとｄ−γ−Ｔ３を投与した場合のラット体内動態を検討した結果を示し、横軸は投与後の時間を、縦軸は各組織または各臓器中の量を示す。ｄ−γ−Ｔ３ＤＭＡは投与後速やかに血漿から消失し、肝臓に移行した。肝臓中のｄ−γ−Ｔ３量は急激に高くなり、ｄ−γ−Ｔ３投与群と比較して優位に高く推移し、肝臓中ｄ−γ−Ｔ３のバイオアベイラビリティは２１３％となった。また、血漿中ｄ−γ−Ｔ３も急速に高くなり、肝臓で生成したｄ−γ−Ｔ３は速やかに血漿中に移行することが支持される。ｄ−γ−Ｔ３ＤＭＡは、投与後速やかにラット体内で加水分解され、ｄ−γ−Ｔ３を生成することが理解される。
【００４６】
【発明の効果】
以上説明したように本発明にかかるトコトリエノールカルボン酸エステル誘導体によれば、窒素置換基を有するカルボン酸とトコトリエノールのエステルとすることにより、水溶性が向上し、しかも生体内で迅速且つ効率的にトコトリエノールの放出がなされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】トコトリエノールカルボン酸エステル誘導体の加水分解反応に対するエステラーゼ阻害剤の影響の説明図である。
【図２】ｄ−α−Ｔ３ＤＭＡとｄ−α−Ｔ３を投与した場合のラット体内動態を検討した結果の説明図である。
【図３】ｄ−γ−Ｔ３ＤＭＡとｄ−γ−Ｔ３を投与した場合のラット体内動態を検討した結果の説明図である。
【図１】
0004818500.tif 000011
【図２】
0004818500.tif 000012
【図３】
0004818500.tif 000013