(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
凍結乾燥処理したスポンジ・パッドの製造方法において、
コラーゲンが１０％以下で変性している精製コラーゲン繊維の酸性化ペーストを供給する工程と、
繊維の少なくとも８０％が２０μｍ乃至１０００μｍの範囲内の長さを有している酸化再生セルロース繊維を供給する工程と、
前記コラーゲンおよび前記酸化再生セルロース繊維を６０：４０乃至４０：６０のコラーゲン：酸化再生セルロース繊維の重量比率で均質な水性分散液内において混合する工程とを備えており、当該水性分散液が２．８乃至３．２の範囲内のｐＨ値に酸性化されて、全体で０．８重量％乃至１．２重量％の固形物濃度を有しており、さらに、
前記水性分散液を１ｃｍ以上の深さでトレイ内に注ぐ工程と、
前記水性分散液を−３０℃以下の温度に凍結させた後に、５重量％乃至１５重量％の最終の水分含有率まで温度プログラム制御した凍結乾燥処理および熱的脱水架橋処理を行なう工程と、
前記凍結乾燥処理した分散液を分割して表面層を除去すると共に１個以上のパッドを形成する工程と、
前記１個以上のパッドをガンマ線照射により滅菌処理する工程とを備えている方法。
【請求項２】
化学的架橋剤を実質的に全く使用することなく行なわれる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記コラーゲンを供給する工程が、ウシの真皮の新鮮で無膨張状態の分離物を供給する工程と、前記真皮分離物を次亜塩素酸塩溶液で処理して微生物活性を阻害する工程と、前記真皮分離物を水酸化ナトリウムおよび過酸化水素を含有する溶液により処理して当該真皮を膨張させて滅菌処理する工程と、前記真皮分離物を１０日乃至１４日の期間にわたり１２以上のｐＨ値および５０℃以下の温度において水性アルカリ溶液により処理する工程と、前記真皮分離物を０．８乃至１．２のｐＨ値および５０℃以下の温度において水性酸溶液により処理する工程と、前記真皮分離物を洗浄して、当該真皮を十分な水と共に粉砕してペーストを形成する工程とを備えている請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酸化再生セルロース繊維を供給する工程が酸化再生セルロースの布を微粉砕してその微粉砕した粒子をスクリーニングすることにより２０μｍ以下または１０００μｍ以上の粒径を有する粒子を除去する工程を備えている請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記コラーゲンおよび酸化再生セルロースを分散させる工程が、酸膨張処理したコラーゲン／水のペーストを酸性化した水に添加する工程と、酸化再生セルロース繊維を前記酸性化した水に添加する工程と、得られた混合物を均質化する工程とを備えている請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記凍結処理の工程が前記水性分散液を入れたトレイをフリーザーの中の冷却した棚に載置した後に凍結処理が完了するまで−３０℃以下の温度でこのトレイを保持することにより行なわれる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記凍結乾燥処理の工程が熱的脱水架橋処理により行なわれる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記滅菌処理の工程が１８ＫＧｙ乃至２９ＫＧｙの照射線量におけるガンマ線照射により行なわれる請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記コラーゲンの酸化再生セルロースに対する重量比率が５０：５０乃至５５：４５であり、前記水性分散液のｐＨ値が２．９乃至３．１である請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はコラーゲンおよび酸化再生セルロース（ＯＲＣ）の混合物を主要部分として含む凍結乾燥処理したパッド、および当該パッドの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ９８／００１８０号は慢性傷治療用の酸化再生セルロース（ＯＲＣ）にコラーゲンを添加混合した凍結乾燥処理したスポンジの使用について記載している。このようなスポンジは実用において純度、滅菌度および非抗原性に関する厳しい要求を満たす必要がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
高い再現性および湿潤時および乾燥時の両方において高い引張強度を示すコラーゲン／ＯＲＣ混合物のスポンジを提供することはこれまで不可能であった。特に、コラーゲンはガンマ線照射により滅菌処理されると変性しやすい。さらに、コラーゲン・スポンジは傷流体、特にコラーゲナーゼ酵素の存在下において、かなり速く分解しやすい。この問題はグルタルアルデヒドのような架橋剤によるコラーゲン・スポンジの化学的架橋処理により解消可能であるが、このような架橋材の使用により毒性および抗原性の問題が生じるおそれがある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明の目的は高い引張強度を示すコラーゲン／ＯＲＣ混合物に基づく生理学的に許容可能な無菌スポンジ・パッドを提供することである。
【０００５】
本発明の別の目的は極めて高い純度および滅菌度、および極めて低い生物担持性（bioburden）を有するコラーゲン／ＯＲＣ混合物に基づく生理学的に許容可能な無菌スポンジ・パッドを提供することである。
【０００６】
本発明の別の目的は高い均一性を有するコラーゲン／ＯＲＣ混合物に基づく生理学的に許容可能な無菌スポンジ・パッドを提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は模擬的な生理学的諸条件下において減少した吸収速度を示すコラーゲン／ＯＲＣ混合物に基づく生理学的に許容可能な無菌スポンジ・パッドを提供することである。
【０００８】
本発明の別の目的は化学的架橋処理を行なうことなく高い機械的強度および長い吸収時間を示すコラーゲン／ＯＲＣ混合物に基づく生理学的に許容可能な無菌スポンジ・パッドを提供することである。
【０００９】
本発明は無菌の凍結乾燥処理したスポンジを提供し、当該スポンジの少なくとも８０重量％は６０：４０乃至４０：６０の重量比率におけるコラーゲンおよび酸化再生セルロースの混合物によってのみ構成されており、当該スポンジは、本明細書において決定しているように、３ニュートン（Ｎ）よりも高い乾燥時引張強度を有している。
【００１０】
上記の凍結乾燥処理したスポンジは無菌である。好ましくは、この滅菌度の保証値は１０-6よりも優れている。好ましくは、このスポンジはガンマ線照射により滅菌処理されている。
【００１１】
上記のスポンジは少なくとも８０重量％の６０：４０乃至４０：６０の重量比率におけるコラーゲンおよびＯＲＣの混合物を含有している。好ましくは、この重量比率は５０：５０乃至４０：６０のＯＲＣ：コラーゲンの範囲内で僅かに過剰のコラーゲンを含む。好ましくは、上記の凍結乾燥処理したスポンジはコラーゲン、ＯＲＣ、水、および５％までの１種類以上の成長因子のような治療学的に活性な物質により実質的に構成されている。好ましくは、上記の凍結乾燥処理したスポンジはコラーゲン、ＯＲＣおよび水以外の成分を１重量％以下で含有している。
【００１２】
コラーゲンの含有率はこのコラーゲンをその成分アミノ酸に加水分解して後に詳述するようにヒドロキシプロリンについて分析することにより決定される。このコラーゲン含有率はヒドロキシプロリン含有率の７．１９倍であると計算されている。一方、ＯＲＣ含有率はこのＯＲＣをその成分単糖類に加水分解して後に詳述するようにグルクロン酸について分析することにより決定される。
【００１３】
好ましくは、上記の凍結乾燥処理したスポンジは、以下に説明するように測定した場合に、２．３乃至４．０、さらに好ましくは２．５乃至３．０のｐＨ値を有している。
【００１４】
好ましくは、本発明による無菌の凍結乾燥処理したスポンジは、後に説明するように測定した場合に、１５％以下、さらに好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下の程度のコラーゲン変性を含む。このようにコラーゲンが滅菌処理において使用するガンマ線照射による変性に対して安定であることは本発明による凍結乾燥処理したスポンジの特に有利な特徴である。このコラーゲンの変性の程度は変性したコラーゲンを溶解するためのトリプシンによる処理（トリプシンは天然コラーゲンを溶解しない）、およびこれに続く濾過および以下に詳述するような濾液内のヒドロキシプロリンの定量により決定される。
【００１５】
好ましくは、本発明による無菌の凍結乾燥処理したスポンジは３ニュートン以上、さらに好ましくは４ニュートン以上の乾燥時引張強度（以下に説明するように測定した場合の最大負荷）を有している。好ましくは、以下に説明するように測定した場合の、２０％延伸時における乾燥時引張強度の負荷は２．５ニュートン以上、さらに好ましくは３．５ニュートン以上である。好ましくは、以下に説明するように測定した場合の、乾燥時破断点伸びは１５％乃至３０％、さらに好ましくは２０％乃至２５％である。
【００１６】
本発明によるスポンジの引張強度特性は試験前にＰＢＳ（リン酸塩バッファー化塩類溶液）中に１５分間浸漬したサンプルについての湿潤時強度測定によりさらに特徴付けられる。好ましくは、この結果として得られる湿潤時強度の最大負荷は１ニュートン以上、さらに好ましくは１．２５ニュートン以上である。また、２０％延伸時における湿潤時負荷は０．１ニュートン以上、好ましくは０．２ニュートン以上、最も好ましくは０．２ニュートン乃至０．３ニュートンである。さらに、湿潤時破断点伸びは好ましくは７５％乃至１００％、さらに好ましくは８０％乃至９０％である。
【００１７】
好ましくは、本発明による無菌の凍結乾燥処理したスポンジは化学的に架橋処理されていない。本発明によるスポンジは凍結乾燥処理の結果としての部分的な熱的脱水架橋処理（dehydrothermal cross-linking）の作用を受ける可能性があるが、グルタルアルデヒド等による化学的架橋処理の作用が全く存在していないことが好ましい。このことにより、スポンジの抗原性および処理コストが減少できる。本発明はスポンジの組成および製造条件を極めて慎重に制御することによりスポンジの十分な物理的特性およびイン・ビボにおける十分に長い吸収時間を達成する。特に、上記のスポンジはＯＲＣ繊維を含有していることが好ましく、この場合に、その繊維の少なくとも８０容量％は２０μｍ乃至１０００μｍの範囲内の長さを有している。このような寸法分布は、例えば、ＯＲＣ布を微粉砕した後に、この粉砕したパウダーを篩分けして上記の範囲外の繊維を除去することにより達成できる。好ましくは、このＯＲＣ繊維の長さの平均値（容量平均値）は２５０μｍ乃至４５０μｍの範囲内である。
【００１８】
上記の範囲内のＯＲＣ繊維の長さの選択により、このＯＲＣとコラーゲンとの容易な混合が行なえて高い均質性の製品が得られる。このようにＯＲＣがコラーゲンに対してより完全に複合化できることにより、スポンジの治療学的特性が改善できる。さらに、このようなＯＲＣは滅菌処理中のガンマ線照射によるコラーゲンの変性を減少するのにさらに効果的に作用する。特に注目すべきことは、上記のようなＯＲＣ繊維の小さい寸法にも拘わらず、スポンジの引張強度を維持しながらこれらの利点が達成できることである。
【００１９】
さらに、本発明による凍結乾燥処理したスポンジの所望な物理化学的特性はコラーゲン繊維を実質的に変性させずにコラーゲンを精製するために連続的なアルカリおよび酸の処理工程を通して処理したコラーゲンを使用することにより達成できる。好ましくは、本発明による凍結乾燥処理したスポンジの生物担持性（ＴＶＣ（全生存細胞数））は１００ｃｆｕ（コロニー形成単位）／ｇ以下、さらに好ましくは１０ｃｆｕ／ｇ以下、最も好ましくは１ｃｆｕ／ｇ以下である。
【００２０】
本発明による無菌の凍結乾燥処理したスポンジは高くて均一な多孔性および高い液体吸収性を有している。０．９％塩類溶液中における上記の無圧縮状態のパッドについて測定される吸収性は１２ｇ／１００ｃｍ2 であるのが好ましく、１５ｇ／１００ｃｍ2 であればさらに好ましい。
【００２１】
好ましくは、本発明の無菌の凍結乾燥処理したスポンジは以下に詳述するような模擬的な生理学的条件下において４８時間よりも長い吸収時間を有している。
【００２２】
さらに、本発明は、コラーゲンが１０％以下で変性している精製コラーゲン繊維の酸性化ペーストを供給する工程と、少なくとも８０％の繊維が２０μｍ乃至１０００μｍの範囲内の長さを有している酸化再生セルロース繊維を供給する工程と、上記コラーゲンおよび上記ＯＲＣ繊維を６０：４０乃至４０：６０のコラーゲン：ＯＲＣの重量比率で均質な水性分散液内において混合する工程とを備えており、当該水性分散液が２．８乃至３．２の範囲内のｐＨ値に酸性化されて、全体で０．８重量％乃至１．２重量％の固形物濃度を有しており、さらに、上記水性分散液を１ｃｍ以上の深さでトレイ内に注ぐ工程と、分散液を−３０℃以下の温度に凍結させた後に、５重量％乃至１５重量％の最終の水分含有率まで温度プログラム制御した凍結乾燥処理および熱的脱水架橋処理を行なう工程と、凍結乾燥処理した分散液を分割して表面層を除去すると共に１個以上のパッドを形成する工程と、上記の１個以上のパッドをガンマ線照射により滅菌処理する工程とを備えている凍結乾燥処理したスポンジ・パッドの製造方法を提供する。
【００２３】
好ましくは、本発明による方法はあらゆる化学的架橋剤を実質的に使用することなく実行される。
【００２４】
好ましくは、上記のコラーゲンを供給する工程は、ウシの真皮の新鮮で無膨張状態の分離物を供給する工程と、上記の真皮分離物を水酸化ナトリウムおよび過酸化水素を含有する溶液により処理して当該真皮を膨張させて滅菌処理する工程と、上記の真皮を１０日乃至１４日の期間にわたり１２以上のｐＨ値および５０℃以下の温度において水性アルカリ溶液により処理する工程と、上記の真皮分離物のｐＨ値が２．５以下に下がるまで０．８乃至１．２のｐＨ値および５０℃以下の温度において水性酸溶液により当該真皮を処理する工程と、上記の真皮を洗浄して、当該真皮を十分な水と共に粉砕してペーストを形成する工程とを備えている。
【００２５】
上記の処理により、コラーゲンを著しく変性させることなく極めて高い純度および均一性のコラーゲンを得ることができる。上記のコラーゲン・ペーストは凍結状態で保存可能であるが、上記の各工程とコラーゲンをＯＲＣに混合する工程との間においてコラーゲンを凍結乾燥処理しない方が好ましい。
【００２６】
好ましくは、上記の酸化再生セルロース繊維を供給する工程は酸化再生セルロースの布を微粉砕してその微粉砕した粒子をスクリーニングすることにより２０μｍ以下または１０００μｍ以上の粒径を有する粒子を除去する工程を備えている。
【００２７】
好ましくは、上記のコラーゲンおよびＯＲＣを分散させる工程は、酸膨張処理したコラーゲン／水のペーストを酸性化した水に添加する工程と、酸化再生セルロース繊維を上記の酸性化した水に添加する工程と、得られた混合物を均質化する工程とを備えている。
【００２８】
【発明の実施の形態】
上記の分散液を少なくとも１０ｍｍ、好ましくは少なくとも２０ｍｍの深さまでトレイの中に注ぎいれて、凍結乾燥処理の前にトレイ内においてブロック状に凍らせた。この凍結処理は−５５℃に予備冷却した棚の上に上記のスラリーを入れたトレイを置くことにより行った。その後、このトレイを−５０℃で２時間維持した後に、凍結乾燥工程を開始するまで−４０℃に維持した凍結乾燥装置の中で保持した。この凍結処理方法により、さらに均一に分布した氷の結晶が得られ、トレイ内のスラリーを単純に噴射凍結処理するよりも、さらに均一な製品が得られる。
【００２９】
上記の凍結乾燥工程は−４０℃乃至＋３０℃の範囲内の温度プログラムによる熱的脱水架橋処理を伴って行うことにより凍結乾燥した材料のブロックを得ることが好ましい。さらに、これらのブロックを分割して表面層を除去すると共に１個以上のパッドを形成する。上記のコラーゲンおよびＯＲＣ繊維をトレイに入れることにより最終的なパッド内の所望のコラーゲンおよびＯＲＣ繊維の配向が得られる。さらに、比較的大きなブロックから最終的なパッドを分割することにより、これらが確実に高い均質性および表面の均一性を有することができる。
【００３０】
好ましくは、上記の滅菌処理工程は１８ＫＧｙ（キログレイ）乃至２９ＫＧｙの照射線量のガンマ線照射により行われる。この滅菌処理工程において著しく少ないコラーゲンの変性が生じることが分かっており、これはＯＲＣの安定化作用によるものと考えられる。
【００３１】
本発明による方法の好ましい実施形態において、酸化再生セルロースに対するコラーゲンの重量比率は５０：５０乃至５５：４５であり、水性分散液のｐＨ値は２．９乃至３．１である。
【００３２】
以下、本発明による方法および製品の特定の実施形態を例示的に説明する。
【００３３】
実施例１
凍結乾燥処理したコラーゲン／ＯＲＣスポンジを以下のように作成する。
【００３４】
先ず、コラーゲン成分を以下のようにウシの真皮から作成する。すなわち、ウシの真皮を牛皮から分離し、削り取って次亜塩素酸ナトリウム溶液（０．０３％重量／容積）に浸漬してその後の処理における微生物活性の影響を阻止する。
【００３５】
その後、上記の真皮を水で洗浄し、水酸化ナトリウム（０．２％重量／容積）および過酸化水素（０．０２％重量／容積）を含有する溶液により処理して、この真皮を周囲温度において膨張および滅菌処理する。
【００３６】
次に、この真皮分離物を、アミド窒素量が０．２４ｍｍｏｌ（ミリモル）／ｇに到達するまで、混転（tumbling）を伴う１０日乃至１４日の期間にわたる周囲温度で１２．２以上のｐＨ値の水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、および炭酸水素ナトリウム（それぞれ、０．４％重量／容積、０．６％重量／容積、および０．０５％重量／容積）を含有する溶液中におけるアルカリ処理工程において処理する。
【００３７】
その後、上記の真皮分離物を周囲温度およびｐＨ０．８乃至１．２における１％塩酸による酸処理工程において処理する。真皮分離物が十分な酸を吸収してｐＨ値が２．５以下になるまでこの処理を混転しながら継続する。その後、真皮分離物のｐＨ値が３．０乃至３．４に到達するまで各分離物を水で洗浄する。
【００３８】
その後、真皮分離物を最初は粗い粉砕処理の設定でその後微細な粉砕処理の設定によりボール・チョッパー内において氷と共に粉砕する。この結果、１００ｇの氷としての水に対して６５０ｇの真皮分離物の比率で作成したペーストを凍結して次の処理段階において使用するまで保存した。しかしながら、次の段階でＯＲＣに対して添加混合する前においては、コラーゲンは凍結乾燥処理しない。
【００３９】
凍結乾燥処理したパッドのＯＲＣ成分を以下のように作成する。温度を６０℃以下に維持しながら、SURGICEL布（Johnson & Johnson Medical社、アーリントン）をスクリーン−プレートを通しながらロータリー・ナイフ・カッターにより微粉砕する。
【００４０】
その後、微粉砕したＯＲＣパウダーおよび必要量の（固形物含有量による）凍結したコラーゲン・ペーストを酢酸により酸性化した十分な量の水に添加して３．０のｐＨ値および全体の固形物含有量を１．０％にした。この混合物をFryma MZ130Dホモジナイザーにより均質化して凝固物を積極的に減少することにより均質なスラリーを形成する。このスラリーのｐＨ値を２．９乃至３．１に維持する。また、スラリーの温度を２０℃以下に維持し、固形物含有量を１±０．０７％に維持する。
【００４１】
得られたスラリーをガス抜き用容器にポンプ供給する。真空処理を開始して攪拌を断続的に行いながら少なくとも３０分間スラリーのガス抜きを行なう。このスラリーを２５ｍｍの深さまで凍結乾燥用トレイの中にポンプ供給する。このトレイを温度を予め−４０℃に設定したフリーザーの棚に載置する。その後、凍結乾燥プログラムを開始してコラーゲンおよびＯＲＣの乾燥および熱的脱水架橋処理を行なって厚いスポンジ・パッドを形成する。
【００４２】
上記の工程が完了した時点で真空状態を解除し、凍結乾燥処理した各ブロックを取り出して、分割処理を行なって上部および下部の表面層を除去し、各ブロックの残りの部分を３ｍｍ厚のパッドに分割する。この凍結乾燥処理した各ブロックをパッドに分割する工程はFecken Kirfel K1スリッターにより行なう。
【００４３】
その後、各パッドをダイ−カッター上において所望の寸法および形状にダイ切断し、包装して、１８ＫＧｙ乃至２９ＫＧｙのコバルト６０−ガンマ線照射処理により滅菌処理する。この場合に特に注目すべきことは、上記の照射処理がコラーゲンの著しい変性を生じないことであり、コラーゲンがＯＲＣの存在により安定化されていると考えられる。
【００４４】
得られた凍結乾燥処理したコラーゲン／ＯＲＣパッドは均一な白色のビロードのような外観を有している。これらのパッドの厚さは３．２±０．１７ｍｍ（Ｎ＝８バッチ）である。コラーゲン含有率は５４±３．８％（Ｎ＝１２バッチ）である。ヒドロキシプロリン含有率は７．６±０．５％（Ｎ＝１２バッチ）である。カルボキシレート含有率は１０．９８±０．８１％（Ｎ＝１２バッチ）である。灰分量は０．１６±０．１％（Ｎ＝１２バッチ）である。重金属（鉛）含有率は１ｐｐｍ以下である。ｐＨ値は２．７８±０．１５である。変性率は４．８７±１．５４％である。内毒素量は３３．５±０．９ｃｆｕ／ｇである。生物担持量は０．２±０．３ｃｆｕ／ｇである。さらに、水分含有率（乾燥時における損失）は１２．０±１２．８％である。
【００４５】
処理１
本発明による材料のコラーゲン含有量は以下のように測定する。
【００４６】
コラーゲンを各成分アミノ酸に加水分解する。次に、アミノ酸のヒドロキシプロリンの量をクロラミンＴにより酸化した後に４−ジメチルアミノ・ベンズアルデヒドによりカップリングして着色生成物を生成することにより決定し、この濃度を５５０ナノメートルにおける吸光分光分析により測定する。
【００４７】
各サンプル（試料）の加水分解は消化が完了するまで１０５℃において６モル塩酸により行ない、この処理は少なくとも１６時間かかる。次に、この溶液を６モル水酸化ナトリウム溶液によりｐＨ６に中和する。その後、この溶液を希釈する。一般に、１０ｍｇのサンプルに対して、この処理では１ｍｌの６モル塩酸を使用し、希釈時の分析物の最終容積は５００ｍｌである。
【００４８】
上記試験溶液の１．０ｍｌサンプルを７ｍｇのクロラミンＴを６００ｍｌのクエン酸塩バッファー中に溶解することにより作成した酸化体溶液の１．０ｍｌにより処理する。この混合物を１０分間放置した後に、１．０ｍｌの２０％過塩素酸を添加混合して、室温で５分間放置する。
【００４９】
その後、この混合物を３０ｍｇの４−ジメチルアミノ・ベンズアルデヒドを４５ｍｌの過塩素酸（６０％重量／容量）に溶かした後に２５０ｍｌのプロパン−２−オール中に希釈することにより作成した着色試薬の１．０ｍｌにより処理する。次に、この混合物を６０℃で２０分間水槽中で処理し、５分間冷却した後に、５５０ナノメートルにおける光学濃度を測定する。この光学濃度を種々の濃度における純粋なコラーゲン、種々の濃度における純粋なヒドロキシプロリンの対照サンプル、およびブランクの対照サンプルにおいて測定した値に対して比較する。
【００５０】
重量％のサンプルのコラーゲン含有率を重量％の測定したヒドロキシプロリン含有率に７．１９を掛けることにより算出した。
【００５１】
処理２
本発明による材料中に存在する変性したコラーゲンの量は以下のように決定する。
【００５２】
天然のコラーゲンは特定のコラーゲナーゼを除く蛋白分解酵素に対してその三重螺旋構造により保護されている。この螺旋構造が損傷すると、これにより生じる変性したコラーゲンがトリプシンのような別のプロテアーゼの影響を受けやすくなり、ペプチドに分解する。この過程において、耐トリプシン性の天然コラーゲンが分解したペプチドから塩析により分離されて、濾液中に存在する非天然コラーゲンがヒドロキシプロリン分析により定量される。
【００５３】
本発明による材料のサンプル（１００ｍｇ）を秤量して５０ｍｌの円錐形フラスコの中に入れる。このフラスコに５００単位のトリプシンを含有するトリス塩酸バッファー溶液の１０ｍｌを添加する。さらに、トリプシン酵素の無いブランク実験も行なった。これらの混合物を４℃で５時間振盪した。その後、３モル酢酸中における２５％塩化ナトリウム溶液の２．５ｍｌを各容器に加えて、完全に混合した。その後、これらの容器を冷蔵庫の中に入れて４℃で少なくとも１６時間保存した。冷却した抽出物をWhatman 541フィルター・ペーパーを通して５０ｍｌビーカーの中に濾過し、この濾液サンプルのヒドロキシプロリン含有率を上記の処理１に記載した方法により測定する。変性コラーゲンは７．１９×（測定したヒドロキシプロリン量）として計算され、変性コラーゲンの割合は処理１により測定した全体のコラーゲン含有率との比較により計算される。
【００５４】
処理３
本発明による材料のＯＲＣ含有率はAnalytical Chemistry第４巻（１９６２年）、第３００頁乃至第３３４頁においてBitterおよびMuirにより記載される方法と同様の方法により測定される。
【００５５】
すなわち、材料は硫酸により個々の成分に加水分解される。この加水分解時に、ＯＲＣはグルクロン酸（約８０％）およびグルコース（２０％）に分解する。その後、このグルクロン酸残基をカルバゾールによる着色反応にかけて、その吸光度を測定し、一連のＯＲＣ標準値に対して比較することによりＯＲＣ含有率の推定値を決める。
【００５６】
試験にかける材料の各サンプル（１０ｍｇ）を加水分解用試験管の中に入れる。その後、脱イオン水（０．５ｍｌ）および濃硫酸（３ｍｌ）を添加し、この混合物を渦ミキサー（vortex mixer）で１５分間混合して、サンプルの完全な溶解について調べた。
【００５７】
各サンプルの加水分解物の一部（０．１ｍｌ）を２．９ｍｌの四ホウ酸ナトリウム溶液（濃硫酸中で０．０２５モル）に添加して、渦ミキサーにより混合する。これらのサンプル試験管を沸騰している水槽中で１０分間保持した後に冷却する。その後、０．１ｍｌのカルバゾール溶液（エタノール中で０．１２５％）を各試験管に添加して渦ミキサーにより完全に混合した後に、各試験管を沸騰している水槽中で１５分間保持した後に冷却する。その後、５２３ナノメートルにおけるこれらの溶液の吸光度を測定し、ゼロ濃度ＯＲＣの標準値に対して比較した。
【００５８】
処理４
本発明による材料中に存在するバクテリア、真菌類または酵母のような微生物の数は以下のように測定する。
【００５９】
上記材料の２ｍｇのサンプルを１００ｍｌの無菌の１／４強度リンゲル溶液により抽出して、その一部（５ｍｌ）を無菌濾過処理用の無菌膜フィルター（孔径０．４５μｍ）に通した。これらのフィルターをペトリ皿中の培養培地に載置し、３０℃において４８時間無菌条件下で培養して、裸眼または必要に応じて立体顕微鏡により計数可能な微生物コロニーの成長を可能にする。さらに、適当な対照ブランク実験を行なう。
【００６０】
各サンプルの微生物汚染量は以下の式に従う微生物当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｇ）における全生存細胞数（ＴＶＣ）として表現される。
ＴＶＣ＝［（Ｎ×１００）／（５×Ｗ）］
この式において、Ｎはコロニーの数であり、Ｗはグラム単位のサンプル重量であり、１００はｍｌ単位の抽出剤溶液の容積であり、５は濾過した一部分（５ｍｌ）の容積である。
【００６１】
処理５
本発明による材料の湿潤時および乾燥時の引張強度は以下のように測定する。
【００６２】
各サンプルを上記材料の３ｍｍ厚のパッドからダイ切断する。このサンプル寸法は２．５×１２ｃｍである。次に、各サンプルをあご面寸法が５０×２５ｍｌであるインストロン引張試験機の中に装填する。乾燥時引張強度を２０％伸び時における負荷および破断点負荷として測定する。破断点伸びは初期的なあご分離の割合として表現される。少なくとも５個の試料を試験する。
【００６３】
湿潤時引張強度測定はリン酸塩バッファー処理化塩類溶液（ＰＢＳ）中に１５分間浸漬したサンプルについて同様に行なう。
【００６４】
処理６
本発明による固形物材料のｐＨ値は１００ｍｇの材料を１００ｍｌの脱イオン水に浸軟（macerating）して、ガラス電極で得られたスラリーのｐＨ値を測定することにより測定される。
【００６５】
処理７
本発明による複合材料の吸収速度は以下のように模擬的な傷流体の流れの中において測定される。
【００６６】
厚さ３ｍｍで直径６ｃｍの被試験材料の円形パッドを円筒形の凹部の中に入れて、液体非通過性の支持材料の層により被覆する。模擬的な傷流体（リン酸塩バッファー化塩類溶液中における３．４５ｍｇ／ｌのコラーゲナーゼ）を被試験円板における中心下方の開口部からこの被試験円板の下方で当該被試験円板の各端部周辺に放射状に配置された６個の開口部に向けて２．５ｍｌ／２４時間、７．５ｍｌ／２４時間、または１２ｍｌ／２４時間の速度で放射状にポンプ供給して、模擬的な低度、中程度、および高度の傷浸出流体の速度を作成した。吸収時間を被試験パッドの完全な溶解に要する時間として推定した。この時間は上記の高い流速の場合に少なくとも２日であり、中程度の流速の場合に少なくとも３日であり、低い流速の場合に少なくとも６日であった。
【００６７】
処理８
本発明による材料の液体吸収性を以下のように測定した。
【００６８】
被試験材料のサンプル（一般的に２．５ｃｍ×２．５ｃｍ×０．３ｃｍ）を乾燥状態で秤量した後に、リン酸塩バッファー化塩類溶液（ＰＢＳ）中に１５分間浸漬して、ピンセットにより取り出して再び秤量した。その後、液体吸収性を１グラム（乾燥時重量）の材料当たりに吸収された液体のグラム数で計算した。
【００６９】
処理９
本発明による材料中の内毒素量は以下のように決定する。
【００７０】
グラム陰性バクテリアの細胞壁からの内毒素はリムルスアメーバ様細胞分解産物（ＬＡＬ）をゲル中に生じる。この試験は予備設定した内毒素濃度を基準に判定してサンプルが試験に対して陽性または陰性であることを決定する制限試験として行われる。陽性および陰性の対照物が必要であり、簡単な試験を行なうことにより実施できる。この対照物の標準的内毒素は基準とされる標準的内毒素（ＵＳＰ−ＥＣ６）に対して照合された効力を有する。この方法についての詳細はCarl FreudenbergのMethod 091, 102（発熱性）、USP（米国薬局方）XXIII（１９８５年）、FDA Guidelines（１９８７年）、および欧州薬局方２．６．１４（１９９８年）に記載されている。
【００７１】
上記実施例１の実施形態は例示のみのために説明した。当該技術分野における熟練者においては本発明の範囲に該当する多くの別の組成物および方法が明らかになる。
【００７２】
本発明の実施態様、参考態様は以下の通りである。
（参考態様Ａ）
無菌の凍結乾燥処理したスポンジにおいて、当該スポンジの少なくとも８０重量％が６０：４０乃至４０：６０の重量比率におけるコラーゲンおよび酸化再生セルロースの混合物によってのみ構成されていて、当該スポンジが３ニュートン以上の本明細書において定めるような乾燥時引張強度を有しているスポンジ。
（１）前記スポンジが化学的架橋部分を実質的に含まない参考態様Ａに記載の無菌の凍結乾燥処理したスポンジ。
（２）前記コラーゲンが２０％以下の変性度を有している参考態様Ａに記載の無菌の凍結乾燥処理したスポンジ。
（３）前記コラーゲンが１０％以下の変性度を有している参考態様Ａに記載の無菌の凍結乾燥処理したスポンジ。
（４）前記酸化再生セルロース繊維の８０容量％が２０μｍ乃至１０００μｍの長さである参考態様（２）に記載の無菌の凍結乾燥処理したスポンジ。
（５）前記酸化再生セルロース繊維の平均の長さが２５０μｍ乃至４５０μｍである参考態様（４）に記載の無菌の凍結乾燥処理したスポンジ。
【００７３】
（６）前記酸化再生セルロースが繊維の形態であり、当該繊維の少なくとも９０容量％が１ｍｍ以下の長さである参考態様Ａに記載の無菌の凍結乾燥処理したスポンジ。
（７）前記コラーゲンの酸化再生セルロースに対する比率が５０：５０乃至５５：４５である参考態様Ａに記載の無菌の凍結乾燥処理したスポンジ。
（８）前記スポンジの生物担持性（全生存細胞数（ＴＶＣ））が１００ｃｆｕ／ｇ以下、好ましくは１０ｃｆｕ／ｇ以下、さらに好ましくは１ｃｆｕ／ｇ以下である参考態様Ａに記載の無菌の凍結乾燥処理したスポンジ。
（９）前記スポンジが５重量％乃至１５重量％の水を含有している参考態様Ａに記載の無菌の凍結乾燥処理したスポンジ。
（１０）前記スポンジの３ｍｍの厚さの層が約１５ｇ／１００ｃｍ2乃至２０ｇ／１００ｃｍ2 の０．９％塩類溶液の無圧縮状態における吸収能力を有している参考態様Ａに記載の無菌の凍結乾燥処理したスポンジ。
【００７４】
（１１）前記スポンジが模擬的な生理学的条件下において４８時間以上の被吸収時間を有している参考態様Ａに記載の無菌の凍結乾燥処理したスポンジ。
（参考態様Ｂ）
無菌の凍結乾燥処理したスポンジにおいて、当該スポンジの少なくとも８０重量％が６０：４０乃至４０：６０の重量比率におけるコラーゲンおよび酸化再生セルロースの混合物によってのみ構成されていて、当該スポンジが１ニュートン以上の本明細書において定めるような湿潤時引張強度を有しているスポンジ。
（実施態様Ｃ）
凍結乾燥処理したスポンジ・パッドの製造方法において、
コラーゲンが１０％以下で変性している精製コラーゲン繊維の酸性化ペーストを供給する工程と、
繊維の少なくとも８０％が２０μｍ乃至１０００μｍの範囲内の長さを有している酸化再生セルロース繊維を供給する工程と、
前記コラーゲンおよび前記酸化再生セルロース繊維を６０：４０乃至４０：６０のコラーゲン：酸化再生セルロース繊維の重量比率で均質な水性分散液内において混合する工程とを備えており、当該水性分散液が２．８乃至３．２の範囲内のｐＨ値に酸性化されて、全体で０．８重量％乃至１．２重量％の固形物濃度を有しており、さらに、
前記水性分散液を１ｃｍ以上の深さでトレイ内に注ぐ工程と、
前記水性分散液を−３０℃以下の温度に凍結させた後に、５重量％乃至１５重量％の最終の水分含有率まで温度プログラム制御した凍結乾燥処理および熱的脱水架橋処理を行なう工程と、
前記凍結乾燥処理した分散液を分割して表面層を除去すると共に１個以上のパッドを形成する工程と、
前記１個以上のパッドをガンマ線照射により滅菌処理する工程とを備えている方法。
（１２）化学的架橋剤を実質的に全く使用することなく行なわれる実施態様Ｃに記載の方法。
（１３）前記コラーゲンを供給する工程が、ウシの真皮の新鮮で無膨張状態の分離物を供給する工程と、前記真皮分離物を次亜塩素酸塩溶液で処理して微生物活性を阻害する工程と、前記真皮分離物を水酸化ナトリウムおよび過酸化水素を含有する溶液により処理して当該真皮を膨張させて滅菌処理する工程と、前記真皮分離物を１０日乃至１４日の期間にわたり１２以上のｐＨ値および５０℃以下の温度において水性アルカリ溶液により処理する工程と、前記真皮分離物を０．８乃至１．２のｐＨ値および５０℃以下の温度において水性酸溶液により処理する工程と、前記真皮分離物を洗浄して、当該真皮を十分な水と共に粉砕してペーストを形成する工程とを備えている実施態様Ｃに記載の方法。
（１４）前記酸化再生セルロース繊維を供給する工程が酸化再生セルロースの布を微粉砕してその微粉砕した粒子をスクリーニングすることにより２０μｍ以下または１０００μｍ以上の粒径を有する粒子を除去する工程を備えている実施態様Ｃに記載の方法。
（１５）前記コラーゲンおよび酸化再生セルロースを分散させる工程が、酸膨張処理したコラーゲン／水のペーストを酸性化した水に添加する工程と、酸化再生セルロース繊維を前記酸性化した水に添加する工程と、得られた混合物を均質化する工程とを備えている実施態様Ｃに記載の方法。
【００７５】
（１６）前記凍結処理の工程が前記水性分散液を入れたトレイをフリーザーの中の冷却した棚に載置した後に凍結処理が完了するまで−３０℃以下の温度でこのトレイを保持することにより行なわれる実施態様Ｃに記載の方法。
（１７）前記凍結乾燥処理の工程が熱的脱水架橋処理により行なわれる実施態様Ｃに記載の方法。
（１８）前記滅菌処理の工程が１８ＫＧｙ乃至２９ＫＧｙの照射線量におけるガンマ線照射により行なわれる実施態様Ｃに記載の方法。
（１９）前記コラーゲンの酸化再生セルロースに対する重量比率が５０：５０乃至５５：４５であり、前記水性分散液のｐＨ値が２．９乃至３．１である実施態様Ｃに記載の方法。
【００７６】
【発明の効果】
従って、本発明によれば、高い引張強度、極めて高い純度および滅菌度、極めて低い生物担持性、および／または、高い均一性を示すコラーゲン／ＯＲＣ混合物に基づく生理学的に許容可能な無菌スポンジ・パッドを提供することができる。さらに、本発明によれば、模擬的な生理学的諸条件下において減少した吸収速度、および／または、化学的架橋処理を行うことなく高い機械的強度および長い吸収時間を示すコラーゲン／ＯＲＣ混合物に基づく生理学的に許容可能な無菌スポンジ・パッドが提供できる。