(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト組織因子（TF）をコードする遺伝子であってヒトTFの翻訳開始コドン及び３'UTRを含むものが、非ヒト動物の組織因子遺伝子の翻訳開始コドンの上流に挿入されており、これにより前記ヒトの翻訳開始コドンが非ヒト翻訳開始コドンに先行しているためにヒトTF遺伝子が優先的に翻訳され、当該非ヒト動物組織因子を実質的に産生せずに、ヒト組織因子を産生する非ヒト動物。
【請求項２】
ヒト組織因子をコードする遺伝子が、その3’-末端側に不安定化シグナルまたはpolyAシグナルを含むことを特徴とする請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項３】
ヒト組織因子をコードする遺伝子が、その3’-末端側に不安定化シグナル及びpolyAシグナルを含むことを特徴とする請求項２記載の非ヒト動物。
【請求項４】
非ヒト動物がげっ歯類であることを特徴とする請求項１から３いずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項５】
非ヒト動物がマウスであることを特徴とする請求項４記載の非ヒト動物。
【請求項６】
ヒト組織因子に起因する疾患の治療薬のスクリーニング方法において、
(a)被験物質を、請求項１〜５のいずれか１項に記載の非ヒト動物に投与し、
(b)前記被験物質を投与した非ヒト動物において、ヒト組織因子に起因する疾患の症状が抑制されたか否かを測定する、
ことを含んで成る方法。
【請求項７】
ヒト組織因子に起因する疾患が血栓症であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
ヒト組織因子に起因する疾患が敗血症であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
被験物質が安全か否かを確認する方法において、
(a)被験物質を、請求項１〜５のいずれか１項に記載の非ヒト動物に投与し、
(b)前記被験物質を投与した非ヒト動物が出血症状を引き起こしているか否かを確認する、
ことを含んで成る方法。
【請求項１０】
抗腫瘍薬のスクリーニング方法において、
(a)被験物質を、請求項１〜５のいずれか１項に記載の非ヒト動物に投与し、
(c)前記被験物質を投与した非ヒト動物において、腫瘍が抑制されているか否かを測定する、
ことを含んで成る方法。
【請求項１１】
血管新生阻害薬のスクリーニング方法において、
(a)被験物質を、請求項１〜５のいずれか１項に記載の非ヒト動物に投与し、
(c)前記被験物質を投与した非ヒト動物において、血管新生が抑制されているか否かを測定する、
ことを含んで成る方法。
【請求項１２】
動脈硬化治療薬のスクリーニング方法において、
(a)被験物質を、請求項１〜５のいずれか１項に記載の非ヒト動物に投与し、
(b)前記被験物質を投与した非ヒト動物において、動脈硬化が抑制されたか否かを測定する、ことを含んで成る方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の非ヒト動物に、該非ヒト動物由来の組織因子を免疫することを特徴とする、抗非ヒト動物組織因子抗体の作製方法。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ヒト組織因子（ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ；ｈＴＦ）を産生するノックイン非ヒト動物に関する。
背景技術
組織因子（ＴＦ）の阻害物質は、血液凝固阻害薬、抗血管新生阻害薬、動脈硬化等の治療薬などとして有用である。しかしながら、ヒト組織因子に対する阻害物質は種特異性が高く、例えば、抗ヒト組織因子抗体は霊長目以外の動物の組織因子に反応しない。そのため、ヒト組織因子に対する阻害物質を評価する上で、ヒト組織因子を発現する動物の作製が望まれている。
ヒト組織因子のノックアウトマウスは胎生致死であるが、ヒト組織因子を発現させると胎生致死を回避できる（Ｐａｒｒｙ  ＧＣＮら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：５６０−５６９（１９９８））。しかし、このマウスはヒト組織因子ミニジーンを導入しているため、組織因子発現量が低いため、交配成績が悪い（Ｅｒｌｉｃｈ  Ｊら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９６：８１３８−８１４３（１９９９））。
発明の開示
従って、本発明は、ヒト組織因子を産生することができる非ヒト動物を提供しようとするものである。
上記の課題を解決するため、本発明は、非ヒト動物組織因子を実質的に産生せずに、ヒト組織因子を産生する非ヒト動物を提供する。より具体的には、本発明は、ヒト組織因子をコードする遺伝子が挿入されているゲノムを有することを特徴とする非ヒト動物を提供する。好ましくは、ヒト組織因子をコードする遺伝子は、非ヒト動物の組織因子と同じ染色体上に挿入される。好ましくは、ヒト組織因子をコードする遺伝子は、非ヒト動物の組織因子遺伝子の翻訳開始コドンの上流に挿入される。好ましくは、ヒト組織因子をコードする遺伝子は、その３’−末端側に不安定化シグナルまたはｐｏｌｙＡシグナルを含む。より好ましくは、ヒト組織因子をコードする遺伝子が、その３’−末端側に不安定化シグナル及びｐｏｌｙＡシグナルを含む。好ましくは、非ヒト動物はげっ歯類であり、例えばマウスである。
本発明はまた、上記のノックイン非ヒト動物の種々の利用方法を提供する。
即ち、本発明は、ヒト組織因子に起因する疾患の治療薬のスクリーニング方法において、
（ａ）被験物質を、本発明のヒト組織因子を産生するノックイン非ヒト動物、又は該非ヒト動物と他の非ヒト動物を交配させて得られた非ヒト動物に投与し、
（ｂ）前記被験物質を投与した非ヒト動物において、ヒト組織因子に起因する疾患の症状が抑制されたか否かを測定する、
ことを含んで成る方法を提供する。例えば前記ヒト組織因子に起因する疾患は、血栓症又は敗血症である。
本発明はまた、被験物質が安全か否かを確認する方法において、
（ａ）被験物質を、本発明のヒト組織因子を産生するノックイン非ヒト動物、又は該非ヒト動物と他の非ヒト動物を交配させて得られた非ヒト動物に投与し、
（ｂ）前記被験物質を投与した非ヒト動物が出血症状を引き起こしているか否かを確認する、
ことを含んで成る方法を提供する。
本発明はまた、抗腫瘍薬のスクリーニング方法において、
（ａ）被験物質を、本発明のヒト組織因子を産生するノックイン非ヒト動物、又は該非ヒト動物と他の非ヒト動物を交配させて得られた非ヒト動物に投与し、
（ｃ）前記被験物質を投与した非ヒト動物において、腫瘍が抑制されているか否かを測定する、
ことを含んで成る方法を提供する。
本発明はまた、血管新生阻害薬のスクリーニング方法において、
（ａ）被験物質を、本発明のヒト組織因子を産生するノックイン非ヒト動物、又は該非ヒト動物と他の非ヒト動物を交配することにより得られる非ヒト動物に投与し、
（ｃ）前記被験物質を投与した非ヒト動物において、血管新生が抑制されているか否かを測定する、ことを含んで成る方法を提供する。
本発明はまた、動脈硬化治療薬のスクリーニング方法において、
（ａ）被験物質を、本発明のヒト組織因子を産生するノックイン非ヒト動物、又は該非ヒト動物と他の非ヒト動物を交配させて得られた非ヒト動物に投与し、
（ｂ）前記被験物質を投与した非ヒト動物において、動脈硬化が抑制されたか否かを測定する、ことを含んで成る方法を提供する。
本発明はさらに、上記の非ヒト動物に、該非ヒト動物由来の組織因子を免疫することを特徴とする、抗非ヒト動物組織因子抗体の作製方法を提供する。
発明の実施の形態
非ヒト動物においてヒトＴＦを産生させるためには、非ヒト動物ゲノム遺伝子中の適当な部位にヒトＴＦをコードする遺伝子を挿入すればよい（トランスジェニック非ヒト動物）が、非ヒト動物ＴＦを産生せず、且つヒトＴＦを産生するという２条件を備えた非ヒト動物を得るには、非ヒト動物の生来のＴＦ遺伝子を不活性化する必要がある。他方、ＰａｒｒｙらＪ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｖｏｌ．１０１，ｐ５６０（１９９８）により、ＴＦのエクソン１とエクソン２との間のイントロン１には発現調節エレメントが存在することが知られているため、非ヒト動物ＴＦゲノム遺伝子を欠失させることはせず、非ヒト動物ＴＦ遺伝子の発現を不活性化する手法を採用した。
すなわち、本発明において、ヒトＴＦをコードする遺伝子を挿入する部位としては、非ヒト動物のＴＦゲノム遺伝子と同じ染色体上、特に非ヒト動物のＴＦゲノム遺伝子の翻訳開始コドンの上流が好ましい。これにより、複数の開始コドンが直列的に存在する場合には最初の開始コドンが優先的に使用されるという生物学的法則から、ヒトＴＦ遺伝子のみが発現され、非ヒト動物ＴＦ遺伝子は発現されないことが期待される。さらに、ヒトＴＦｃＤＮＡの３’−側にｐｏｌｙＡ付加シグナルを存在せしめることにより、ヒトＴＦｃＤＮＡから、非ヒト動物ＴＦゲノム遺伝子のリードスルーを防止することが可能となる。
本発明のヒトＴＦは、全長のアミノ酸配列を有するヒトＴＦでも、ヒトＴＦの断片（好ましくはアミノ酸残基が１００個以上のペプチドであり、さらに好ましくは２００個以上のペプチド（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，５０，１２９−１３５（１９８７）記載のアミノ酸残基−３２〜２４２の２７４アミノ酸を含むペプチド）である）でもよいが、好ましいのは全長アミノ酸配列を有するヒトＴＦである。従って、ヒトＴＦをコードする遺伝子も特に限定されず、全長ヒトＴＦをコードする遺伝子でも、その断片をコードする遺伝子でもよいが、好ましいのは全長ヒトＴＦをコードする遺伝子である。
本発明のヒトＴＦをコードする遺伝子は、ヒトＴＦを発現可能な遺伝子であれば特に限定されず、例えば、ｃＤＮＡやゲノムＤＮＡを用いることが可能である。本発明において好ましいヒトＴＦをコードする遺伝子はｃＤＮＡである。又、本発明のヒトＴＦをコードする遺伝子は、該遺伝子の発現を調節する調節遺伝子などの他の遺伝子が付加されていてもよい。ヒトＴＦに付加される調節因遺伝子などは、その由来は特に制限されず、ヒト由来のものでもよいし、非ヒト動物由来のものでもよい。
さらに、本発明においては、ヒトＴＦをコードする遺伝子に不安定化シグナル、ｐｏｌｙＡシグナル、非翻訳領域（ＵＴＲ）などを付加することができる。不安定化シグナルは、当業者に公知の配列を用いることができ、例えば、ＡＴＴＴＡなどを使用することができる。ｐｏｌｙＡシグナルは、当業者に公知の配列を用いることができ、例えば、ＡＡＴＡＡＡなどを使用することができる。非翻訳領域としては、例えば、３’ＵＴＲや５’ＵＴＲなどを挙げることができるが、好ましいのは３’ＵＴＲである。本発明で用いる不安定化シグナル、ｐｏｌｙＡシグナル、非翻訳領域などは、その由来は特に制限されず、ヒト由来のものや非ヒト動物由来のもの等を用いることができる。
ヒトＴＦをコードする遺伝子に、不安定化シグナル、ｐｏｌｙＡシグナル、非翻訳領域などを付加する場合には、それらのうちいずれか一種類を付加してもよいがそれらのうち二種類以上を付加することが好ましい（例えば、不安定化シグナルとｐｏｌｙＡシグナル、又は非翻訳領域とｐｏｌｙＡシグナル、など）。又、不安定化シグナル、ｐｏｌｙＡシグナル、非翻訳領域などを付加する場合には、同一種類のものを複数付加することも可能である（例えば、ｐｏｌｙＡシグナルを付加する場合、同一配列のｐｏｌｙＡシグナル又は異なる配列のｐｏｌｙＡシグナルを２つ以上付加することも可能である）。次に、上記の構造を含むベクターを常法に従ってＥＳ細胞に導入し、非ヒト動物胚にＥＳ細胞を注入し、非ヒト動物を再生せしめる。
非ヒト動物ＴＦを実質的に産生しないとは、非ヒト動物ＴＦの発現が人為的に抑制されていることを意味し、好ましくは非ヒト動物ＴＦが検出されないことを意味する。非ヒト動物ＴＦの検出方法としては、例えば、実施例２に記載の抗非ヒト動物ＴＦ抗体を用いた検出方法などを挙げることができる。
本発明の非ヒト動物は特に限定されず、マウス・ラット・ハムスター等のげっ歯類、サル・チンパンジーなどの非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、ブタなどの哺乳動物や、鳥類、両生類、爬虫類、魚類などを用いることが可能であるが、好ましくはげっ歯類であり、さらに好ましくはマウスである。
本発明のノックイン非ヒト動物は、ヒトＴＦに起因する疾患のモデル動物として利用できる。ヒトＴＦに起因する疾患としては、例えば、血栓症（例えば、播種性血管内血液凝固症候群（Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ；ＤＩＣ）、動脈狭窄及び閉塞、脳梗塞、静脈血栓症、肺塞栓症、心房血栓等）や、感染症などによる敗血症などが挙げられる。又、本発明のノックイン非ヒト動物は、上記疾患以外にも、腫瘍や血管新生、動脈硬化などの疾患モデル動物の作製にも利用することが可能である。
従って，本発明のノックイン非ヒト動物をこれらの疾患モデルとして使用する事により、これらの疾患の治療剤又は予防剤のスクリーニングを行うことが出来る。
例えば、血栓症を惹起させた本発明のノックイン非ヒト動物に被検物質を投与し、その後、この非ヒト動物においてヒトＴＦに起因する疾患が抑制されるか否かを確認することにより、ヒトＴＦに起因する疾患の治療薬又は予防薬のスクリーニングを行うことができる。
又、本発明の非ヒト動物に食餌による負荷などを与えた非ヒト動物を用いてスクリーニングを行うことも可能である。例えば、高脂肪食負荷をして得られた非ヒト動物を用いて抗動脈硬化薬のスクリーニングを行うことが可能である。さらに、本発明の非ヒト動物に腫瘍を移植して得られた非ヒト動物を用いて抗腫瘍薬もしくは血管新生阻害薬のスクリーニングを行うことも可能である。
血管新生阻害薬のスクリーニング方法の場合、本発明の非ヒト動物に、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦなどの当業者に公知の血管新生惹起物質を投与して得られた非ヒト動物を用いることも可能である。
又、敗血症治療薬又は予防薬のスクリーニング方法の場合、本発明の非ヒト動物に細菌若しくは細菌の成分を投与することにより、若しくは外科的手法を用いて非ヒト動物の腸内に存在する細菌などを腸外に出すことにより、敗血症を発症させた非ヒト動物を用いることも可能である。細菌としては、例えば、髄膜菌・緑膿菌などのグラム陰性菌や、ブドウ球菌・リステリアなどのグラム陽性菌を挙げることができるが、好ましくはグラム陰性菌である。細菌成分の好適な例としては、細菌の細胞壁成分として存在するエンドトキシンを挙げることができ、また、エンドトキシンの一成分であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）を単独で用いることも可能である。
更に、本発明のノックイン非ヒト動物と他の非ヒト動物とを交配させることにより得られた非ヒト動物を用いてスクリーニングを行うことも可能である。従って、本発明においては、本発明の非ヒト動物を用いる場合だけでなく、本発明の非ヒト動物と他の非ヒト動物を交配して得られた非ヒト動物を用いた場合でも、本発明の非ヒト動物を用いたスクリーニング方法に含有される。
例えば、マウスの場合には、本発明のノックインマウスと癌易発性マウスとを交配させて得られたマウスを用いれば抗腫瘍薬又は抗血管新生阻害薬のスクリーニングを行うことが可能である。癌易発性マウスは当業者に公知のマウスを用いることができ、例えば、Ｃ３Ｈマウス、ＡＫＲマウス、１２９マウスなどを用いることができる。さらに、重症複合免疫不全症（Ｓｅｖｅｒｅ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ；ＳＣＩＤ）マウス（Ｂｏｓｍａ  ＧＣら、Ｎａｔｕｒｅ，３０１，５２７−５３０（１９８３）；日本クレア株式会社より入手可能）やヌードマウスと交配させて得られたマウスに腫瘍を移植し、抗腫瘍薬又は抗血管新生阻害薬のスクリーニングを行うことも可能である。
又、本発明のノックインマウスと当業者に公知の動脈硬化易発性マウス（例えば、アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）ノックアウトマウス（Ｐｉｅｄｒａｈｉｔａ  ＪＡら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８９，４４７１−４４７５（１９９２）；Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＵＳＡ）より入手可能）、ＬＤＬＲノックアウトマウス、など）を交配させて得られたマウスを用いれば抗動脈硬化薬のスクリーニングを行うことが可能である。上記のようにして得られたマウスを用いてスクリーニングを行う場合でも、本発明のマウスを用いたスクリーニング方法に含まれる。
スクリーニングに用いる被検物質は特に限定されず、例えばペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出物などが挙げられる。
本発明のスクリーニング法には、本発明のノックイン非ヒト動物、及び当該ノックイン非ヒト動物と他の非ヒト動物との交配により得られる非ヒト動物のみならず、これらの非ヒト動物から採取した臓器、組織、細胞、血液などの生体材料を用いることも可能である。
ヒトＴＦに起因する疾患が抑制されるか否かは、例えば疾患が播種性血管内血液凝固症候群（Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ；ＤＩＣ）の場合には、厚生省ＤＩＣ診断基準（１９８８年改訂）やＤＩＣスコアリングシステム（Ｔａｙｌｏｒ  ＦＢ，Ｊｒ．ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８６；１３２７−１３３０）を指標にするなどして判断でき、動脈狭窄及び閉塞の場合には、血管開通率や再閉塞の有無などにより判断でき、脳梗塞の場合には、中大脳動脈閉塞モデルなどで脳梗塞巣形成が抑制されるか否かなどにより判断でき、敗血症の場合には、死亡率が改善されるか否かなどにより判断でき、静脈血栓症の場合には、血栓量が減少するか否かなどにより判断でき、肺塞栓症の場合には、死亡率が改善されるか否かなどにより判断でき、心房血栓の場合には、血栓量が減少するか否かなどにより判断できる。
又、腫瘍増殖又は血管新生が抑制されたか否かは、それらの大きさや形成される頻度などにより判断することができ、動脈硬化が抑制されたか否かは非侵襲的血管内治療を施したのちの新生内膜の肥厚が抑制されるか否かなどにより判断することができる。
本発明の非ヒト動物は非ヒト動物ＴＦを産生しないという特徴を有しているので、抗非ヒト動物ＴＦ抗体の作製に利用することも可能である。抗非ヒト動物ＴＦ抗体は、正常非ヒト動物の脳などから精製した非ヒト動物ＴＦ又は大腸菌、酵母、昆虫細胞や哺乳動物細胞などの宿主を利用して作製した組換え型非ヒト動物ＴＦ、もしくは非ヒト動物ＴＦの一部のペプチド断片を、本発明のノックイン非ヒト動物に免疫する（Ｄｅｃｌｅｒｃｋ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，８３９７−８４００：ノックアウト動物への免疫による抗体作製法の１例）、または非ヒト動物ＴＦを発現するｎａｋｅｄ  ＤＮＡを本発明の非ヒト動物に注入することにより作製することができる。抗体の作成は周知の常法に従って行うことが出来、ポリクローナル抗体（抗血清）又はモノクローナル抗体を作成することが出来る。
又、本発明の非ヒト動物はヒトＴＦに起因する疾患の治療薬、例えば抗ヒトＴＦ抗体やヒトＴＦに結合する物質など、を投与した場合の安全性の評価、例えば出血症状の評価、等に利用できる。
さらに、本発明の非ヒト動物から採取した臓器、組織、細胞、血液などの生体材料を用いて、ヒトＴＦに由来する診断薬または試薬を調製することが可能である。これらの診断薬または試薬はヒトＴＦに起因する疾患の診断だけではなく、治療薬の評価にも利用できる。例えば、ヒト由来トロンボプラスチン試薬に替わるプロトロンビン時間測定試薬として使用できる。
次に、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。
実施例１．ノックインマウスの作出
（１）ベクターの構築
マウスＴＦ（ｍＴＦ）ゲノム遺伝子はＭａｃｋｍａｎらの報告（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  Ｖｏｌ．１２  ｐ４７４，１９９２）を参考にして、ＰＣＲ法によってクローニングした。ｍＴＦのエクソン１からエクソン２までの約３ｋｂの領域をｍＴＦ１ＳｐＳ、及びｍＴＦ２Ａのプライマーセットで増幅し、その後にｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。プライマーの配列は次の通りである。ｍＴＦ１ＳｐＳ：５’−ＣＧＡ  ＧＣＡ  ＡＡＴ  ＧＣＴ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＡＧＧ  ＡＴＡ  ＡＧＴ  ＧＡＴ  ＣＧＴ  ＣＴＡ  ＡＧＧ  Ｃ−３’（配列番号：１）、ｍＴＦ２Ａ：５’−ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＡＧＴ  ＧＴＡ  ＧＧＴ  ＡＴＡ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＧＧＧ  ＴＴＴ  ＧＧＧ  ＴＴＧ−３’（配列番号：２）。
ＰＣＲ法における反応混合物の組成はマウスゲノムＤＮＡ（ＥＳ細胞由来、１２９系マウス、４００μｇ／ｍｌ）１μｌ；１０ＸＬＡ緩衝液  ５μｌ；ｄＮＴＰ  ８μｌ；ｍＴＦ１ＳｐＳ（１００μＭ）０．１μｌ；ｍＴＦ２Ａ（１００μＭ）０．１μｌ；蒸留水  ３５．３μｌ；ＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）酵素  ０．５μｌであった。ＰＣＲは、９４℃にて１分間の前加熱、９８℃にて２０秒間及び６８℃にて１５分間の増幅反応３０サイクル、並びに７２℃にて１０分間の複加熱とした。
また、ｍＴＦ遺伝子のエクソン２からエクソン６までの約１０．５ｋｂ領域もＰＣＲ法によってクローニングした。プライマーセットは以下の通りで、ＰＣＲ条件は上記と同じである。ｍＴＦ１ＳｐＳ：５’−ＣＧＡ  ＧＣＡ  ＡＡＴ  ＧＣＴ  ＡＣＴ  ＡＧＴ  ＡＧＧ  ＡＴＡ  ＡＧＴ  ＧＡＴ  ＣＧＴ  ＣＴＡ  ＡＧＧ  Ｃ  −３’（配列番号：１）；ｍＴＦｅ６ＳｃＡ：５’−ＡＴＣ  ＡＧＡ  ＧＣＴ  ＣＴＣ  ＣＧＣ  ＡＡＣ  ＡＧＴ  ＧＣＣ  ＧＴ−３’（配列番号：３）。ここで増幅したフラグメントをＳａｃ  Ｉ制限酵素で切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）にクローニングした。
ヒトＴＦ（ｈＴＦ）ｃＤＮＡの３’ＵＴＲ（発現調節領域）は、Ｊ８２細胞（ヒト膀胱癌）のｍＲＮＡより、以下のプライマーとＢｃａＢＥＳＴ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてクローニングした。ＳｈＴＦ３：５’−ＴＧＴ  ＴＣＡ  ＡＧＣ  ＡＧＴ  ＧＡＴ  ＴＣＣ  Ｃ−３’（配列番号：４）；ＲｈＴＦ２：５’−ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＣＣＴ  Ｔ−３’（配列番号：５）。
クローニングした１．３７ｋｂのフラグメントは、配列を確認した後にＨｐａ  ＩサイトでｈＴＦのコード配列（ＣＤＳ）部分と結合させ、完全長ｈＴＦ  ｃＤＮＡを作製した。この完全長ｈＴＦ  ｃＤＮＡは、開始コドン周辺をＫｏｚａｋ配列に変換してあるものの、３’ＵＴＲ部分はＭａｃｋｍａｎらの報告（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２８，ｐ１７５５，１９８９）を参考にしており、ｐｏｌｙＡが付加される部分（ＡＡＴＡＡＡＧＧＴＧＡＣＴＧＧＧＡＡＴＴＧＴＴ、下線はｈＴＦのｐｏｌｙＡ付加シグナル）（配列番号：６）までの領域が含まれている。
この配列を配列番号：７に示す。この配列中、塩基番号１〜１１はＫｏｚａｋ配列（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｖｏｌ．１５，ｐ８１２５  １９８７）に改変されており、塩基１２〜１４のＡＴＧはヒトＴＦの翻訳開始コドンであり、ヒトＴＦコード領域は塩基８９６において終了する。
これらのｍＴＦゲノムＤＮＡ、及び完全長ｈＴＦ  ｃＤＮＡを用いて、図１に示すノックインベクターを構築した。ｍＴＦのエクソン１内で開始コドン（ＡＴＧ）前にあるＫｐｎ  Ｉサイトに、ヒトＴＦ（ｈＴＦ）ｃＤＮＡを薬剤耐性遺伝子（ｎｅｏ）とともに挿入した。Ｐａｒｒｙらが、ＴＦ遺伝子のイントロン（エクソン１とエクソン２の間）に発現調節エレメントの存在を報告していることから（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｖｏｌ．１０１，ｐ５６０，１９９８）、ｍＴＦのゲノムを欠失させる操作は行わなかった。
しかし、このベクターではｍＴＦ遺伝子の前にｈＴＦ  ｃＤＮＡが存在し、しかもｐｏｌｙＡ付加シグナルが存在することから、このノックインマウスではｈＴＦ遺伝子のみ発現するものと予想された。たとえ、ｈＴＦにｐｏｌｙＡが付加せずにリードスルーしてｍＴＦ遺伝子が転写されたとしても、最初の開始コドンが優先されて蛋白質の翻訳がなされるという生物学的法則から、そのｆｕｓｉｏｎ  ｍＲＮＡからはｈＴＦのみが翻訳され、ｍＴＦ蛋白質は産生されないものと考えられた。
さらには、このベクターではｍＴＦのエクソン２を並列につないでコンストラクトを作製していることから、仮にｍＴＦの蛋白質が翻訳されたとしても、機能的なものにはならないと考えられた。ジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴＡ）の遺伝子は、相同組み換え体を効率よく得るための、ネガティブ選択マーカーである。また、薬剤耐性遺伝子であるｎｅｏにはｐｇｋ遺伝子のプロモーターが付加されており、ＥＳ細胞内ではｎｅｏ遺伝子が発現することになるが、この部分は上流に導入したｈＴＦ遺伝子の発現を抑制することから、後にこの部分（ｎｅｏ）を抜く操作を加えることにした。その為に、ｎｅｏ遺伝子の両側にはｌｏｘＰ配列（ＡＴＡ  ＡＣＴ  ＴＣＧ  ＴＡＴ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＴＡＴ  ＡＣＧ  ＡＡＧ  ＴＴＡ  Ｔ）（配列番号：８）を配置し、Ｃｒｅを作用させると組換えによって、間に挟まれたｎｅｏ遺伝子が抜ける仕組みになっている。
（２）ＥＳ細胞への導入
ＴＡＫＡＲＡから販売されているＴｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｋｉｔ（ＬＥＸＩＯＮ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  Ｉｎｃ．）を用いて、ＥＳ細胞（１２９ＳｖＥｖマウス由来のＡＢ２．２細胞）に、上記のｈＴＦノックイン（ＫＩ）ベクターをエレクトロポレーションにより導入し、相同組み換え体をＰＣＲ法によってスクリーニングした。ベクターは、６０μｇをＮｏｔ  Ｉで直鎖状化しフェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿させＰＢＳに溶解して用いた。
スクリーニングで用いるＥＳ細胞は９６穴プレートで培養し、１ウェルあたり２００μｌのＰＢＳ溶液で２回洗浄後、以下の組成の細胞溶解緩衝液（１０ＸＬＡ緩衝液（ＴＡＫＡＲＡ  ＬＡ  Ｔａｑ用）５μｌ；５％  ＮＰ−４０  ５μｌ；プロティナーゼ  Ｋ（ＴＡＫＡＲＡ，２０ｍｇ／ｍｌ）４μｌ；蒸留水  ３６μｌ）を加えて５５℃  ２時間処理し、続いて９５℃にて１５分処理することで、プロティナーゼ  Ｋを失活させてＰＣＲサンプルとした。
ＰＣＲ反応混合物はサンプル１μｌ、２  Ｘ  ＧＣ緩衝液  ２５μｌ、ｄＮＴＰ（２．５ｍＭ）８μｌ、プライマー（各２０μＭ）各１μｌ、ＬＡ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ）０．５μｌ、及び蒸留水  １３．５μｌ（全  ５０μｌ）とした。また、ＰＣＲ条件は、９５℃にて１分間の前加熱、９５℃にて３０秒間、６４℃にて３０秒間及び７２℃にて１分２０秒間の増幅サイクル４０サイクル、並びに７２℃にて７分間の複加熱とした。
プライマーは以下の通りで、相同組み換えを起こしたＥＳ細胞のサンプルでは、約１．１ｋｂのバンドが増幅される。プライマーはｍＴＦ２がＫＩベクターの外で５’側のｍＴＦゲノム領域に配置し、ｈＴＦ−ＡはｈＴＦ  ｃＤＮＡ内に配置した（図１を参照）。ｍＴＦ２（前方）５’−ＣＣＡ  ＧＴＡ  ＧＧＡ  ＴＡＡ  ＧＴＧ  ＡＴＣ  ＧＴＣ  ＴＡＡ  ＧＧＣ−３’（配列番号：９）；ｈＴＦ−Ａ（後方）５’−ＧＣＣ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＴＴＴ  ＧＴＡ  ＧＴＧ  ＣＣＴ  ＧＡＡ  ＧＣ−３’（配列番号：１０）。
以下にスクリーニング結果（相同組み換え効率）を示す。２回の実験で、１，１８０個のＥＳ細胞を解析した結果、計１３個の相同組み換えを起こしたクローンが得られた（組み換え効率は２回の実験で平均１．１％であった）。
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（３）ノックインマウスの作出
相同組換えＥＳクローンをトリプシン処理により浮遊させ、ＥＳ細胞培地で洗浄した。４８時間間隔で５ＩＵのウマ絨毛ゴナドトロピン（ｅＣＧ）およびヒト絨毛ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を腹腔内投与することにより、過剰排卵処理を施したＣ５７ＢＬ／６Ｊの雌マウスを同系統の雄マウスと交配した。雌マウスのプラグが確認された日を０．５日とし、妊娠２．５日に子宮および卵管を灌流し、８細胞期から桑実期の胚を回収した。回収した胚を３７℃にて一晩培養し、胚盤胞に発生した胚を宿主胚として１０〜１５個のＥＳ細胞を注入した。注入後の胚は２．５日齢となるように偽妊娠させたＩＣＲ系の受容雌の子宮内に移植し、１７日後に産仔を得た。
以下の表が、その時の注入の成績をまとめたものである。毛色によりＥＳクローンの寄与率が高く（野生色の割合が高いマウスで）、しかもＥＳ細胞はＸＹ染色体を持つことから、雄マウスの割合が高いＥＳクローンから作製されたキメラマウスが、相同組み換えを起こしたノックイン（ＫＩ）対立遺伝子を効率よく仔に伝えることができるものと期待される。すなわち、ＥＳクローンの７、７６及び８０からのキメラマウスが、ＫＩ対立遺伝子を伝達できるマウスであると期待された。
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Ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎの検討
相同組み換え体である３つのＥＳクローンから作出されたマウスの毛色キメラ率が良かったことから、これらのキメラマウスをＣ５７ＢＬ／６Ｊの雌マウスと交配し、ＥＳクローン由来の染色体のｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎを検討した。以下の表がそのまとめである。
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クローン７由来の６匹のキメラマウス（すべて、毛色キメラ率が９０％）のうち、４匹のキメラマウスが効率良くｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎし、計９５匹のＦ１マウスを得ることができた。また、クローン８０由来のキメラマウスは、ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎしなかったものの、クローン７６由来のキメラマウスは、ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎしたことから、独立した２系統のノックインマウスを樹立することができた。以後、これらのクローン由来のマウスを、それぞれ０７系統、７６系統と称する。
ＫＩマウスの遺伝子解析
Ｆ１マウスは、毛色によってＥＳクローン由来の仔（野生色）か、宿主胚由来の仔（黒色）か判断できる。しかし、ＥＳクローン由来の仔でも、実際に相同組み換えを起こした側の染色体を持っているか否かは１／２の確率になる。それらを判別するために、マウスは離乳された後に約２ｃｍの尾を採取され、ＫＵＲＡＢＯのＮＡ−１０００によってゲノムＤＮＡを抽出される。解析は、この１００ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて、前述のスクリーニング時に使ったＰＣＲ法によって行った。
（４）ｎｅｏ遺伝子の除去
体外受精によって、ｈＴＦ  ＫＩマウス（♂）とＣ５７ＢＬ／６Ｊ（♀）との受精卵を採取し、Ｃｒｅ遺伝子を発現させるベクター（約３ｎｇ／μｌ）を、その前核にインジェクションすることによってｎｅｏ遺伝子を除去した。この際、用いたベクターは二種類ｐＣＡＧＧＳ−Ｃｒｅ−ＮＬＳ、ｐＣｒｅ−Ｐａｃである。ｐＣＡＧＧＳ−Ｃｒｅ−ＮＬＳはｐＣＡＧＧＳベクターに、Ｃ末側に核移行シグナル（ＮＬＳ）が付加されるＣｒｅ遺伝子が挿入されている。
ｐＣＡＧＧＳベクターはサイトメガロウィルスのエンハンサーと、ニワトリのβアクチンのプロモーターによって構成され、挿入された遺伝子を哺乳類の細胞で強く発現することが可能なベクターである。一方、ｐＣｒｅ−Ｐａｃは、ＭＣ−１のプロモーターによって、Ｎ末側にＮＬＳが付加されるＣｒｅが発現するようなベクターである。これらのベクターによって、ｎｅｏ遺伝子を除去する操作を行った。以下の表が、そのまとめである。
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上記の表のように、どちらのベクターを用いてもｎｅｏを除去する効率は等しく１００％であったが、ＮＬＳを付加されていないＣｒｅを用いると、ｎｅｏが完全には抜けていないキメラ状態になっていた。なお、この解析はマウスのゲノムＤＮＡ  ５μｇを使用して、ドットサザンブロット法によって行った。すなわち、ｎｅｏ遺伝子、及びｈＴＦ遺伝子をプローブにし、ｈＴＦ遺伝子のみ検出できたものがｎｅｏの除去されたｈＴＦ  ＫＩマウスであり、両方のプローブで検出されたものは、ｎｅｏが除去されなかったｈＴＦ  ＫＩマウスと判断した。
（５）ｈＴＦホモマウスの作製
上記で得られたｈＴＦ  ＫＩマウス（−ｎｅｏ）同士を交配させ、ｈＴＦのホモマウス（ＴＦヒト型化マウス）を作製した。このマウスの遺伝子解析は、前述のＰＣＲ法にてｈＴＦＫＩ対立遺伝子の有無を判定し、さらにプライマーセット〔ｍＴＦ−５（前方）５’−ＴＴＣＡＣＴＣＡＡＡＣＣＣＡＣＴＧＣＧＧ−３’（配列番号：１１）；ｍＴＦ−Ｈ（後方）５’−ＧＣＴＡＣＧＣＴＡＣＡＧＧＡＧＣＧＡＴＣＧ−３’（配列番号：１２）〕で野生型対立遺伝子の有無を判定した。ＰＣＲの条件はともに同じであるが、別々にＰＣＲ反応を行った。完全にヒト型化されたホモＴＦ  ＫＩマウスは、ＫＩ対立遺伝子を判別するためのＰＣＲのみバンドが増幅される。
ｈＴＦマウスの発現解析
ｍＴＦの発現する組織をノザンブロット法を用いて検討した。マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの♂８週齢を４匹用いた。脳、肺、胸腺、心臓、肝臓、脾臓、リンパ節、腎臓、精巣よりｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを調製し、そのうちの５μｇを実験に用いた（図２）。それぞれの組織で、ｍＴＦの発現が確認されたが、その中でも脳、肺に於ける発現が高かったことから、作製したｈＴＦ  ＫＩマウスの発現解析は、これらの組織で行うことにした。その結果を図３に示す。
使用したマウスは、１ヶ月齢の野生型マウス♀（＋／＋）（レーン１及び８）および同じ１ヶ月齢の０７系統の♀（レーン２〜５、９〜１２）である。そのうちヘテロマウス（ＫＩ／＋）（レーン２、４、９及び１１）、ホモマウス（ＫＩ／ＫＩ）（レーン３、５、１０及び１２）で、さらにｎｅｏを除去しているもの（−ｎｅｏ）（レーン４、５、１１及び１２）、していないもの（＋ｎｅｏ）（レーン２、３、９及び１０）での脳（レーン１〜５）と肺（レーン８〜１２）におけるｍＴＦの発現を比較した。さらに、０７系統（レーン６及び１３）と７６系統（７及び１４）の♀の４ヶ月齢のヘテロマウスで系統間でのｈＴＦの発現比較を行ない、さらに０７系統（レーン２と６、９と１３）で週齢間でのｈＴＦの発現比較を行った。
これらのデータから、デザイン通りにノックインベクターが相同組み換えを起こし、ｍＴＦのかわりにｈＴＦが発現するマウスが得られたことが確認された。すなわち、作製されたｈＴＦ  ＫＩマウスのｈＴＦの発現パターンは、本来のｍＴＦの発現パターンに類似していることから、ノックインマウスの作製は成功したものと考えられる。また、週齢や系統間で発現の差は認められなかった。
こうして作製されたｈＴＦ  ＫＩマウス（ＫＩ／ＫＩ，＋ｎｅｏ）同士を交配させ、繁殖性を調べた。その結果、野生型マウスと同程度の繁殖性を示し、Ｅｒｌｉｃｈらが報告しているｍＴＦノックアウトマウスとｈＴＦゲノムトランスジェニックマウスとの、ダブルトランスジェニックマウスで明らかになっている妊娠中の問題点（Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ，Ｓｃｉ，ＵＳＡ  Ｖｏｌ９６  ｐ８１３８  １９９９）は、本マウスでは認められなかった。
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実施例２．ノックインマウスにおけるＴＦの発現の確認
（１）ＴＦタンパク質の抽出
野生型マウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ（日本クレア）雌雄それぞれ５匹及び７６系統ヒトＴＦノックインマウス雌雄それぞれ７匹より脳アセトン粉末を調製した。マウスを頚椎脱臼したのち、開頭して全脳を摘出して、液体窒素で急速に凍結した。これに脳重量１ｇあたり１ｍＭ  ＰＭＳＦ（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ）を含むＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ−ｓａｌｉｎｅ；宝酒造）２ｍＬを加え、金属製及びテフロン製ホモジナイザーで組織を破砕した。４℃下、１０，０００×ｇで１時間遠心分離し、上清を除去した。
沈渣に前述と同量のＴＢＳを加え、よく撹拌したのち、４℃下、１０，０００×ｇで１時間遠心分離して、上清を除去した。得られた沈渣に、脳重量１ｇあたり２ｍＬの氷冷したアセトンを加え、よく懸濁した。４℃下、約２，０００×ｇで２０分間遠心し、上清を除去した。これを再度行い、脱脂した。得られた沈渣に窒素ガスを噴射して乾燥させ、これを脳アセトン粉末とした。
野生型マウス雌雄、ヒトＴＦノックインマウス雌雄それぞれの脳アセトン粉末を１０ｍｇに２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むＴＢＳを４００μＬ加えて、１時間超音波を与えて懸濁した。遠心操作（４℃，１５，０００ｒｐｍ，１０分間）により上清を回収し、１．２ｍＬのＴＢＳを加えて希釈し、１Ｍ  ＭｎＣｌ２及び１Ｍ  ＣａＣｌ２を終濃度１ｍＭになるように加えた。０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＴＢＳ（含む１ｍＭ  ＭｎＣｌ２，１ｍＭ  ＣａＣｌ２）で平衡化したＣｏｎＡ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）約５０μＬに前述の抽出液を加え、４℃下で一晩転倒混和した。
樹脂の１０倍容量の０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＴＢＳ（含む１ｍＭ  ＭｎＣｌ２，１ｍＭ  ＣａＣｌ２）で洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加えて溶出し、９５℃で５分間処理し、遠心操作（２５℃，１５，０００ｒｐｍ，１分間）により上清を回収し、試料とした。ＣＨＯ細胞由来可溶型ヒトＴＦ（ＷＯ９９／５１７４３参照）及びＣＨＯ細胞由来可溶型マウスＴＦはＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と等量混和し、試料とした。分子量マーカーはＰｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳｔａｎｄａｒｄｓＴＭ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた。
（２）ＴＦの抗体検出
脳アセトン粉末からの抽出物は３ｍｇ／ｌａｎｅ由来相当を、精製可溶型ＴＦは１００ｎｇ／ｌａｎｅを、１０％ポリアクリルアミドゲル（テフコ）２枚にて電気泳動した。セミドライ型ブロッキング装置にてＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気的に転写し、１×ＰＢＳ／Ｃａｓｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にてブロッキングした。一方（ヒトＴＦ検出系）は２μｇ／ｍＬの抗ヒトＴＦ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｉｎｃ．Ｃａｔ．＃４５０３）にて、もう一方（マウスＴＦ検出系）は２μｇ／ｍＬの抗マウスＴＦ抗体ＭＦＲ−３７にて室温で１時間反応させた。  ０．０５％  ＴｗｅｅｎＴＭ  ２０を含むＰＢＳで５分間、３回洗浄したのち、１０００倍に希釈した二次抗体を反応させた。ヒトＴＦ検出系にはアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＺＹＭＥＤ、Ｃａｔ．＃６２−６５２２）を、マウスＴＦ検出系にはアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗ラットＩｇ（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ、Ｃａｔ．＃ＡＲＩ３４０５）を用い、室温で１時間反応させた。０．０５％  ＴｗｅｅｎＴＭ  ２０を含むＰＢＳで５分間、３回洗浄したのち、１ｓｔ  Ｓｔｅｐ  ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ＰＩＥＲＣＥ）により発色させた。結果を図４に示す。図４においてＡは抗マウスＴＦ抗体ＭＦＲ−３７によって検出した結果であり、Ｂは抗ヒトＴＦ抗体ＡＤＩ＃４５０３によって検出した結果である。抗マウスＴＦ抗体によっては、野生型マウスの脳組織にしかＴＦが検出されず、抗ヒトＴＦ抗体によってはヒトＴＦノックインマウスの脳組織にしかＴＦが検出されなかった。
（３）ヒトＴＦ活性の検出
前述のように調製した脳アセトン粉末を用い、血漿凝固活性によりヒトＴＦ活性を検出した。ヒト血漿は標準ヒト血漿（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｍａｒｂｕｒｇ  ＧｍｂＨ）を、マウス血漿はＩＣＲマウスよりクエン酸血漿を採取したものを用いた。脳アセトン粉末を８ｍｇ／ｍＬとなるようにＴＢＳに懸濁し、ＴＢＳで希釈したヒト型化抗ヒトＴＦ抗体ｈＡＴＲ−５（ｉｂ２）（ＷＯ９９／５１７４３）４０，４，０．４，０μｇ／ｍＬと等量混和し、室温で１時間反応させた。１００μＬ／ｃｕｐの血漿にアセトン粉末−抗体混合液５０μｌ／ｃｕｐを加え、３７℃で３分間加温した。これに２０ｍＭ  ＣａＣｌ２（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  ＧｍｂＨ）を加え、凝固を開始させ、Ａｍｅｌｕｎｇ  ＫＣ−１０Ａ（Ｈｅｉｎｒｉｃｈ  Ａｍｅｌｕｎｇ  ＧｍｂＨ）で凝固時間を測定した。  結果を図５及び図６に示す。図５は、マウス血漿凝固時間を測定した結果で、縦軸に血漿凝固時間を示し、各カラムは抗体の終濃度を示す。マウス血漿の凝固活性は野生型及びヒトＴＦノックインマウスに同程度に認められ、抗ヒトＴＦ抗体によっては、ヒトＴＦノックインマウス由来のＴＦ活性しか阻害できなかった。図６は、ヒト血漿凝固時間を測定した結果で、縦軸に血漿凝固時間を示し、各カラムは抗体の終濃度を示す。野生型マウスＴＦの活性はヒトＴＦノックインマウスの活性に比べ非常に弱かった（Ｊａｎｓｏｎ  ＴＬ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  １４，４４０−４４４）。また、抗ヒトＴＦ抗体によっては、ヒトＴＦノックインマウス由来のＴＦ活性しか阻害できなかった。
実施例３．改良型ノックインマウスの作製
（１）ノックインマウスの作製
実施例１で作成したマウスにおいて、以下の２点が変更されたマウスを実施例１と同様の方法で作製した。
変更点１
マウスのＴＦ遺伝子の蛋白質翻訳開始点である開始コドンＡＴＧをＣＴＧに変換して、マウスＴＦ遺伝子に変異を入れた。
変更点２
ヒトＴＦ遺伝子（配列番号７）の終止コドン（配列番号７の８９７−８９９番目にあたるコドンＴＡＡ）より後ろの配列（９００−２０４１番目）を、マウスＴＦの３’ＵＴＲの配列に変更した。
マウスＴＦ遺伝子の３’ＵＴＲ配列は、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｏｓｉｓ  Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．４，ｐ４７４，（１９９２）に記載されているマウスゲノム配列の３’ＵＴＲ部分（該文献中の配列９８９番目の塩基〜最後の塩基まで（ＴＡＧＡＧＧＡＡＡ〜ｔｇａｃｔｃｃｇ））を用いた。
具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのゲノムを鋳型とし、以下のＰＣＲプライマーを用いて、ＰＣＲクローニングを行った（鋳型ゲノムＤＮＡを１００ｎｇ、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑを用いて、ｔｏｔａｌ  ５０μｌの反応系でＰＣＲを行い、ＰＣＲ条件は９５℃  １分の後、（９５℃  ０．５ｍｉｎ、６２℃  ０．５ｍｉｎ、７２℃  １ｍｉｎ）を３５サイクル、最後に７２℃  ７ｍｉｎの処理を行い、４℃で反応を終了した）。
ＦｍＴＦ３ＵＴＲ：５’−ＴＣＡＴＣＣＴＣＣＴＧＴＣＣＡＴＡＴＣＴＣＴＧＴＧＣ−３’（配列番号：１３）
ＲｍＴＦ３ＵＴＲ：５’−ＣＧＧＡＧＴＣＡＣＣＴＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＣＣＡＡＧ−３’（配列番号：１４）
増幅をしたフラグメントはＴＡクローニング（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を行い、シーケンスを確認し、上記論文記載の配列と同一であることを確認した。
得られたＣ５７ＢＬ／６マウスのｍＴＦ  ３’ＵＴＲを、ｈＴＦのｃｏｒｄｉｎｇ領域（ｈＴＦ  ＣＤＳ）にアセンブルＰＣＲにより付加した。アセンブルＰＣＲにはＰｙｒｏｂｅｓｔ（ＴａＫａＲＡ）を用いた。
ｈＴＦ  ｃｏｒｄｉｎｇ領域、ｍＴＦ  ３’ＵＴＲをそれぞれプライマーｈＴＦａｓｓｅｍ−ｍＴＦｈＴＦ、ｍＴＦａｓｓｅｍ−ｈＴＦｍＴＦ（ｈＴＦａｓｓｅｍ：５’−ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＡＧＧ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＡＧＡ  ＣＣＣ  ＣＴＧ−３’（配列番号：１５）（Ｘｈｏ  Ｉ，ＢａｍＨ  Ｉサイト付加）、ｍＴＦａｓｓｅｍ：５’−ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＡＧＴ  ＣＡＣ  ＣＴＡ  ＡＴＧ  ＴＧＡ−３’（配列番号：１６）（Ｘｈｏ  Ｉ，Ｘｂａ  Ｉサイト付加）、ｈＴＦｍＴＦ：５’−ＡＣＴ  ＣＣＣ  ＣＡＣ  ＴＧＡ  ＡＴＧ  ＴＴＴ  ＣＡＴ  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＡＡＧ  ＧＣＴ  ＧＡＡ  ＧＣＧ  Ｃ−３’（配列番号：１７）、ｍＴＦｈＴＦ：５’−ＧＣＧ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＴＴＣ  ＣＴＴ  ＴＡＴ  ＧＡＡ  ＡＣＡ  ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＧＧＧ  ＧＡＧ  Ｔ−３’）（配列番号：１８）を用いてＰＣＲにより増幅し、得られたフラグメントを精製した。ＰＣＲは９５℃  １ｍｉｎ，（９５℃  ０．５ｍｉｎ，６０℃  ０．５ｍｉｎ，７２℃  １ｍｉｎ）Ｘ  ３０ｃｙｃｌｅｓ，７２℃  ７ｍｉｎ，４℃の条件で行った。
精製したｈＴＦ  ｃｏｒｄｉｎｇ領域、ｍＴＦ  ３’ＵＴＲフラグメントを混合し、以下の条件でアセンブルＰＣＲを行った。プライマー非存在下で（９４℃  ２ｍｉｎ，５８℃  ２ｍｉｎ，７２℃  ２ｍｉｎ）を２サイクル行った後に、ｈＴＦａｓｓｅｍ及びｍＴＦａｓｓｅｍプライマーを添加し、（９５℃  ０．５ｍｉｎ，５８℃  ０．５ｍｉｎ，７２℃  ２１ｍｉｎ）を３０サイクル，最後に７２℃  ７ｍｉｎの処理を行い，４℃で反応を終了した。
得られたＤＮＡを用いて実施例１と同様の方法でノックインマウスを作製した。
（２）ｈＴＦの発現解析
実施例１と同様の方法で、脳におけるＴＦの発現をノザンブロット法を用いて解析した。その結果を図７に示す。
なお、発現解析には、改良前ノックインマウス（実施例１のマウス）及び改良型ノックインマウスいずれも染色体の片方にのみヒトＴＦ遺伝子（ノックインした遺伝子）が存在し、もう片方は保存されている（野生型）ものを用いた。従って、改良型ノックインマウス、改良前ノックインマウスはともに、ヒト及びマウスのＴＦを両方とも発現している。しかしながら、改良型ノックインマウスの方が、改良前ノックインマウスよりも、ｈＴＦを高発現していることが確認された（図７）。
従って、マウスに挿入したヒト遺伝子を高発現させる場合に、ヒト３’ＵＴＲのかわりにマウス３’ＵＴＲを用いることは、非常に有効な方法である。
この方法はマウスだけでなく、他のノックイン非ヒト動物を作製する場合にも応用できると考えられ、挿入する遺伝子にノックイン非ヒト動物由来の３’ＵＴＲを付加することにより、挿入した遺伝子が高発現するよう調節することが可能である。
実施例４．動脈閉塞モデル
ヒトＴＦノックインマウス７６系統（♂，８〜２０週齢）を用い、動脈血栓モデルを作製した。マウスをペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ，ｉ．ｐ．）投与により麻酔し、マウスを背位に保定して、直腸温測定プローブを装着した。頸部を切開して左総頸動脈を露出し、動脈に並走する神経を剥離して動脈を他組織より単離した。ヒト型化抗ヒトＴＦ抗体ｈＡＴＲ−５（ｉｂ２）（ＷＯ９９／５１７４３）（３０ｍｇ／ｋｇ）もしくはその溶媒（１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０））を尾静脈もしくは右総剄静脈より静脈内投与（５０μＬ／１０ｇ  Ｂ．Ｗ．）した。Ｐｕｌｓｅｄ  Ｄｏｐｐｌｅｒ  Ｆｌｏｗ／Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｏｄｅｌ  ＳＡＧＥ３（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）に接続したソフトカフプローブ０．５ｍｍ，２０ＭＨｚ（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を動脈に装着し、チャートレコーダーＬＩＮＥＡＲＣＯＲＤＥＲ  ｍａｒｋ  ＶＩＩ  ＷＲ３１０１（Ｇｒａｐｈｔｅｃ）上でモニターした。薬物投与５分以上経過したのち、直腸温３６〜３７℃の状態で動脈に刺激を与えた。４０ｗ／ｖ％  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏを含むグリセリン溶液（ＦｅＧ）を、総頚動脈のプローブ装着部位より心臓側の血管表面に、滴状に付着させて刺激した。２分間の刺激ののち、ＦｅＧを除去し、チャート上に示される血流をモニターしながら、動脈の開通状態をモニターした。刺激開始から３０分間観察し、開通時間を測定し、その開通率を算出した。
ｈＡＴＲ−５（ｉｂ２）投与により、開通時間が有意に延長し、開通率が有意に増加したことから、動脈閉塞を有意に抑制した。
0004683821.tif 000007
実施例５．ヒトＴＦノックインマウスを用いた抗マウスＴＦ抗体の作製
マウスＴＦを等容量のフロインド（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジュバンド（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とガラスシリンジ内で混合することによりエマルジョン化した。マウスＴＦにはＣＨＯ細胞由来可溶型ＴＦ（ｓｍＴＦ）を用い、１０μｇ／マウスを皮下注射により、雄性ノックインマウス０７系統ならびに７６系統それぞれ３匹に免疫した。２週間後、ｓｍＴＦを等容量のフロインド（Ｆｒｅｕｎｄ）不完全アジュバンド（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とガラスシリンジ内で混合することによりエマルジョン化（ｓｍＴＦ−ＦＩＡ）し、１０μｇ／マウスを皮下注射により免疫した。以降、１週間毎にｓｍＴＦ−ＦＩＡを皮下投与により免疫した。２回目から４回目は１０μｇ／ｍｏｕｓｅ、５回目は３０μｇ／ｍｏｕｓｅ、６，７回目は２０μｇ／ｍｏｕｓｅ相当のｓｍＴＦを免疫した。
また、各回の免疫する直前に眼窩より採血し、血清を分離して、ＥＬＩＳＡにより抗マウスＴＦ抗体の抗体価を測定した。なお、７回目免疫後の採血は、免疫の４日後に行った。ＥＬＩＳＡの手順は以下に示す。
固相化バッファーでｓｍＴＦを１μｇ／ｍＬに希釈し、９６ウェルマイクロウェルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ；Ｎｕｎｃ）に１００μＬ／ｗｅｌｌで分注し、ｓｍＴＦを固相化した。固相化バッファーには０．０２ｗ／ｖ％  ＮａＮ３を含む炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ９．６）を用いた。洗浄バッファー３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄し、ブロッキングバファー２００μＬ／ｗｅｌｌでブロッキングした。洗浄バファーには０．０５ｖｏｌ％のＴｗｅｅｎ登録商標  ２０を含むＰＢＳ（−）、ブロッキングバッファーには０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．０５ｖｏｌ％  Ｔｗｅｅｎ登録商標  ２０，０．０２ｗ／ｖ％  ＮａＮ３，１ｗ／ｖ％ウシ血清アルブミンを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．１）を用いた。ブロッキングバッファーを除去したのち、ブロッキングバッファーで適当に希釈した抗血清を１００μＬ／ｗｅｌｌ反応させた（室温、１時間）。洗浄バッファー３００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄したのち、ブロッキングバッファーで１，０００倍に希釈したＡＰ−Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＺＹＭＥＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ反応させた（室温、２時間）。洗浄バッファー３００μＬ／ｗｅｌｌで５回洗浄したのち、アルカリホスファターゼ基質溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌ分注して、室温で発色させ、４０５ｎｍの吸光度（対照６５５ｎｍ）を測定した。吸光度はＭｏｄｅｌ  ３５５０Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて測定した。基質溶液には１ｍｇ／ｍＬのＳＩＧＭＡ登録商標１０４，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む５０ｍＭ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ９．８）を用いた。
その結果、マウスＴＦに対する抗体価が上昇し、抗血清が得られた。
結果を図７〜図１２に示す。
実施例６．ＬＰＳ惹起ＤＩＣモデルの作製
野生型マウスとヒトＴＦノックインマウスのそれぞれにＬＰＳを投与して敗血症を惹起させた。野生型マウスにはＣ５７ＢＬ／６Ｊ（日本クレア）、雌、１５週齢を、ヒトＴＦノックインマウスには７６系統、雌、１４週齢を用いた。ＬＰＳは大腸菌（セロタイプ０１１１：Ｂ４）由来のもの（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）を用いた。ＬＰＳを生理食塩水に溶解し、野生型マウスには０，５ｍｇ／ｋｇを、ｈＴＦノックインマウスには０，１，５，２５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与（０．１ｍＬ／１０ｇ  Ｂ．Ｗ．）した。投与６時間後、エーテル麻酔下で腹部大静脈より採血した。この際、抗凝固物質として３．８％クエン酸を最終１／１０容となるように加えた。血小板数は自動血球計数装置Ｆ−８００（シスメックス）にて測定した。
血小板数が減少し、ＤＩＣ様の症状を呈することが確認された。
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参考例１．抗マウスＴＦ抗体の作製
（１）抗原の調製
マウス組織因子（マウスＴＦ）のアミノ酸番号１〜２５１（Ｈａｒｔｚｅｌｌ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，２５６７−２５７３）の内、Ｎ末端側アミノ酸番号１〜２９の配列を大腸菌発現用にメチオニン（Ｍ）に置換し、Ｃ末端にＦＬＡＧペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を付した組換え型ｓｏｌｕｂｌｅマウス組織因子タンパク質（ｓｍＴＦ）をコードする遺伝子をＴ７プロモーターを含む大腸菌用発現ベクターに挿入して大腸菌ＢＬ２１株に導入した。
組換え大腸菌の培養中に終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加してｓｍＴＦを発現誘導し、大腸菌を回収し、その溶菌液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した結果、ｓｍＴＦが分子量およそ２５ｋＤａのタンパク質として発現した。組換え大腸菌を２Ｌ培養して、６００ｎｍの吸光度が０．２になった時点で終濃度１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加して更に５時間培養して菌体を回収し、回収した菌体を−８０度Ｃにて凍結保存した。
菌体を超音波破砕した後、菌体破砕後の沈殿物を４％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００および２Ｍ尿素にて３回洗浄し更にＭｉｌｌｉＱ水で２回洗浄した後、１００ｍＬの８Ｍ尿素／１０ｍＭジチオスレイトール／５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で可溶化した。２５，０００ｘＧで２０分間遠心分離して不溶物を除去し可溶物を回収して、これをｓｍＴＦ（Ｕ）とした。ｓｍＴＦ（Ｕ）をリフォールディングさせるため、５０ｍＬのｓｍＴＦ（Ｕ）を５Ｌの５ｍＭ還元型グルタチオン／１ｍＭ酸化型グルタチオン／２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で透析し、２時間後と６時間後に透析外液を交換して更に１６時間透析した。
透析した内液を２５，０００ｘＧで２０分間遠心分離して得られた溶液を２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で脱塩してグルタチオンを除去した後、２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ６ｍＬカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に添加し、２カラム容量の同緩衝液で洗浄した。２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中、ＮａＣｌ濃度を０Ｍから０．３Ｍまで直線的に上げ、可溶型マウスＴＦを溶出した。得られた可溶型マウスＴＦ画分をｓｍＴＦ（Ｒ）とした。
（２）免疫とハイブリドーマの作製
組換え型可溶性マウス組織因子（ＴＦ）を等容量のフロインド（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とガラスシリンジ内で約３０分間混合することによりエマルジョン化（油中水型）し、ＴＦとしてｓｍＴＦ（Ｒ）は５０μｇ／ラット、ｓｍＴＦ（Ｕ）は１００μｇ／ラットで６週齢のＷｉｓｔｅｒ雄性ラット（日本チャールスリバー）の尾根部皮下に接種した。
追加免疫では、フロインド完全アジュバントの代わりにフロインド不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して同様にエマルジョンを調製し、これを、初回免疫から１５日後及び２２日後に、ｓｍＴＦ（Ｒ）は５０μｇ／ラットの量で、ｓｍＴＦ（Ｕ）は１００μｇ／ラットの量で投与し、更に、初回免疫から２９日後、４３日後及び５０日後に、ｓｍＴＦ（Ｒ）は２５μｇ／ラットの量で、ｓｍＴＦ（Ｕ）は５０μｇ／ラットの量で、ラットの尾根部皮下に接種した。後述する免疫原を抗原としたＥＬＩＳＡにより充分な抗体価の上昇を確認後、最終免疫として、初回免疫から５７日後にｓｍＴＦ（Ｒ）は５０μｇ／ラットの量で、ｓｍＴＦ（Ｕ）は１００μｇ／ラットの量で、尾静脈内投与した。
最終免疫３日後にラットから無菌的に脾細胞を調製し、調製した脾細胞１．８５×１０８個とマウスミエローマ細胞Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（以下、Ｐ３Ｕ１）１．８５×１０７個を混合し、常法（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｒｙ）に従ってポリエチレングリコール１５００（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ  ＭＡＮＮＨＥＩＭ）を用いて細胞を融合させた。融合細胞を１０％ウシ胎仔血清（ＩＮＴＥＲＧＥＮ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＭ）（以下、ＲＰＭＩ培地）に浮遊し、Ｐ３Ｕ１密度で５×１０４細胞／１００μＬ／ウエルとなるよう９６ウエル．マイクロプレートに播種し培養した。
細胞を播種する９６ウエル．マイクロプレートの枚数は、ラット１匹あたり４枚（ウエル数３５２個）とした。翌日、２％  ＢＭ−ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１（ＢＯＥＨＲＩＮＧＥＲ  ＭＡＮＮＨＥＩＭ）およびＨＡＴ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（以下、ＨＡＴ培地）を１００μＬ／ウエルで添加し、さらに細胞融合の２日、３日及び５日後に半量をＨＡＴ培地に置換することによりＨＡＴ選択を行った。
細胞融合９日後に、１次スクリーニングとしてｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡにより各ウエルの抗体価を測定した。高い吸光度を示したウエルから１２枚のウエルプレートに継代培養し、２次スクリーニングに供した。
１次スクリーニングの４日後に、２次スクリーニングとしてｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ、ｓｍＴＦ（Ｕ）およびＣＯＳ細胞で発現させたｓｍＴＦ（ｓｍＴＦ（ｃｏｓ））を抗原としたＥＬＩＳＡによる抗体価の測定、並びにＦａｃｔｏｒ  Ｘａ産生阻害活性、の測定を行った。Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ産生阻害活性が認められたウエルについてはＦａｃｔｏｒ  Ｘ結合阻害活性を測定し、抗体のタイプ分けを行った。
２次スクリーニングで選択したハイブリドーマは限界希釈法を２回繰り返すことによりクローン化して、２％  ＢＭ−ｃｏｎｄｉｍｅｄ  Ｈ１を含むＲＰＭＩ１６４０培地に馴化した後、抗体産生能に変化がないことを確認し、これをもってハイブリドーマの樹立を完了した。
最終的に、ヒトＦａｃｔｏｒ  Ｘａ産生阻害活性、ヒトＦａｃｔｏｒ  Ｘ結合阻害活性のどちらも有する抗体６クローン（ＭＦＲ−３６、ＭＦＲ−３７、ＭＦＲ−４０、ＭＦＲ−６６（ＩｇＧ２ａ）、ＭＦＲ−２５、ＭＦＲ−５１（ＩｇＭ））を樹立した。
（３）腹水の作製及び抗体の精製
樹立したハイブリドーマの腹水の作製は常法に従って行った。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで継代したハイブリドーマ（ＭＦＲ−３７）１×１０６個を、予め鉱物油を２回腹腔内に投与しておいたＢＡＬＢ／ｃ系雄性ヌードマウスＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ／ｎｕ（日本チャールスリバー）の腹腔内に移植した。移植後１〜２週目で腹部が肥大したマウスから腹水を回収した。
腹水からの抗体（ＭＦＲ−３７）の精製はＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムクロマトグラフィー、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦカラムクロマトグラフィー操作を組み合わせて行った。すなわち、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で１０倍に希釈し、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（５０ｍｍＩＤ×１３０ｍｍＨ）に吸着させ、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄したのち、５００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出した。溶出画分を１Ｍトリス水溶液でｐＨを６前後に調整し、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦカラム（１６ｍｍＩＤ×１２５ｍｍＨ）に吸着させた。
カラムの約１０倍容量の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄したのち、５０ｍＭ酢酸で溶出した。溶出画分を精製水で２倍に希釈したのち、１Ｍトリス水溶液でｐＨを５．０に調整して、ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬカラム（１０ｍｍＩＤ×１００ｍｍＨ）に吸着させた。カラムの約１０倍容量の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）で洗浄し、さらにカラムの約１０倍容量の２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄したのち、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で溶出させ、精製抗体とした。
参考例２．ＣＨＯ細胞由来可溶型マウスＴＦの調製
ＴＦのアミノ酸番号１〜２５１（Ｈａｒｔｚｅｌｌ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，２５６７−２５７３）のＣ末端にＦＬＡＧペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を付したタンパク質をコードする遺伝子を、ＤＨＦＲ発現遺伝子を含む哺乳動物細胞用発現ベクターに挿入し、ＣＨＯ細胞に導入した。メトトレキサートにて発現増幅をかけ、可溶型マウスＴＦ発現ＣＨＯ細胞を樹立した。
この細胞を無血清培地ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ  ＩＩ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）で培養し、可溶型マウスＴＦを含む培養上清を得た。培養上清に２倍容量の２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）を加え、３倍希釈した。２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（２００ｍＬ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に添加し、３カラム容量の同緩衝液で洗浄した。２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中、ＮａＣｌ濃度を０Ｍから１Ｍまで直線的に上げ、可溶型マウスＴＦを溶出した。
得られた可溶型マウスＴＦ画分に３０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、遠心操作により夾雑タンパク質を沈殿させた。上清を回収し、５０％飽和となるように硫酸アンモニウムを追加添加し、遠心操作により夾雑タンパク質を沈殿させた。上清をＢｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（２１．５ｍＬ、ＴＯＳＯＨ）に添加し、３カラム容量の１．８Ｍの硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）で洗浄した。５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ６．８）中、硫酸アンモニウム濃度を１．８Ｍから０Ｍまで直線的に下げ、可溶型マウスＴＦを溶出させた。
可溶型マウスＴＦを含むピーク画分をＣｅｎｔｒｉ−Ｐｒｅｐ  １０（アミコン）で濃縮した。１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＧカラム（２１．５×６００ｍｍ、ＴＯＳＯＨ）に濃縮液を添加し、可溶型マウスＴＦのピーク画分を回収した。これを０．２２μｍのメンブランフィルターで滅菌し、ＣＨＯ細胞由来可溶型マウスＴＦとした。試料の吸光度２８０ｎｍのモル吸光係数をε＝３９，６７０、分子量を４５，０００として、試料の濃度を算出した。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のヒト組織因子（ＴＦ）ノックインマウスの作製におけるゲノムＤＮＡの形成を模式的に示す図である。この図中、ＡはマウスＴＦゲノムＤＮＡ（１）と挿入されるべき完全長ヒトＴＦｃＤＮＡ及びネオマイシン耐性遺伝子（２）との関係を模式的に示す。Ｂは、マウスＴＦゲノムＤＮＡ（ａ）及びノックインベクター（ｂ）が相同性組換えを起してノックインされたゲノムＤＮＡ（ｃ）が生成する様子を模式的に示す図であり、（ａ）と（ｂ）との間の×印は（ａ）と（ｂ）の間で相同性組換えが生ずることを示す。
図２はマウスにおけるＴＦ遺伝子の発現の組織分布を示すノザンブロット解析の結果を示す図である。
図３は本発明に関連する種々のマウスの発現生成物の様子を示すノザンブロット解析の結果を示す図である。
図４において、野生型マウス及びノックインマウスの脳のおけるＴＦの発現を、Ａは抗マウスＴＦ抗体ＭＦＲ−３７によって検出した結果であり、Ｂは、抗ヒトＴＦ抗体ＡＤＩ＃４５０３によって検出した結果であり、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット解析の結果を示す写真である。
図５は、野生型マウス及びヒトＴＦノックインマウスでの、抗ヒトＴＦ抗体によるマウス血漿凝固阻害を、血漿凝固時間として測定した結果を示すグラフでり、縦軸に血漿凝固時間を、各カラムは抗体の終濃度を示す。
図６は、図５と同様であるが、ヒト血漿凝固時間を測定した結果を示すグラフである。
図７は、実施例５における抗マウスＴＦ抗体の作製の結果を示すグラフであり、縦軸は４０５ｎｍの吸光度（対照６５５ｎｍ）を示し、横軸は血清希釈率をしめす。０７系統マウスＮｏ．１の結果を示す。
図８は、図７と同様であり、０７系統マウスＮｏ．２の結果を示す。
図９は、図７と同様であり、０７系統マウスＮｏ．３の結果を示す。
図１０は、図７と同様であり、７６系統マウスＮｏ．４の結果を示す。
図１１は、図７と同様であり、７６系統マウスＮｏ．５の結果を示す。
図１２は、図７と同様であり、７６系統マウスＮｏ．６の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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