(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトあるいは動物の血漿製剤または血清製剤の製造方法であって、
下記（ａ−１）工程、（ａ−２）工程および（ｂ）工程を順次行う血漿製剤または血清製剤の製造方法。
（ａ−１）ヒトあるいは動物由来の全血から血漿を分離する工程、
（ａ−２）前記分離した血漿から白血球を減少させる工程
（ｂ）前記白血球を減少させた血漿をウイルス除去膜で濾過する工程
【請求項２】
ヒトあるいは動物の血漿製剤または血清製剤の製造方法であって、
下記（ａ’−１）工程、（ａ’−２）工程および（ｂ’）工程を順次行う血漿製剤または血清製剤の製造方法。
（ａ’−１）ヒトあるいは動物由来の全血から即時に血漿を分離する工程、
（ａ’−２）即時に前記分離した血漿から白血球を減少させる工程
（ｂ’）前記白血球を減少させた血漿をウイルス除去膜で濾過する工程
【請求項３】
（ｂ）工程、又は（ｂ’）工程のウイルス除去膜の平均孔径が１００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１あるいは２に記載の製造方法。
【請求項４】
（ａ−２）工程、又は（ａ’−２）工程が白血球除去膜による白血球減少工程である請求項１〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
（ａ−１）工程、（ａ−２）工程および（ｂ）工程、又は（ａ’−１）工程、（ａ’−２）工程および（ｂ’）工程が２５〜４０℃の温度環境下で行なわれることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
（ａ−１）工程、（ａ−２）工程および（ｂ）工程、又は（ａ’−１）工程、（ａ’−２）工程および（ｂ’）工程が９８ｋＰａ以下の圧力環境下で行なわれることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項７】
（ａ−１）工程、（ａ−２）工程および（ｂ）工程、又は（ａ’−１）工程、（ａ’−２）工程および（ｂ’）工程において通過させる血液の量が１００ｍｌ〜５００ｍｌであることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
【請求項８】
（ｂ）工程、又は（ｂ’）工程の処理時間が４０分以下であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
【請求項９】
（ｂ）工程、又は（ｂ’）工程に用いるウイルス除去膜の平均孔径が、７５ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１０】
（ｂ）工程、又は（ｂ’）工程に用いるウイルス除去膜が、平均孔径７５ｎｍとそれに続く平均孔径３５ｎｍのウイルス除去膜の組み合わせであることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、安全性の高いヒトおよび動物の血漿あるいは血清、およびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの血漿あるいは血清、および動物の血漿あるいは血清は、潜在的にウイルス混在の可能性がある。従って、血漿、血清およびそれを原料として製造される血液製剤の使用により、ヒトであれば、エイズウイルスおよび各種肝炎ウイルスなどの危険性の高いウイルスに感染する可能性は否定できない。
【０００３】
従来、これら血液製剤使用に関するウイルス感染を防ぐ方法が提案されてきた。例えば、血液製剤中に存在するウイルスを不活化する方法として、界面活性剤やメチレンブルーを使用する化学的な不活化方法などが知られている。しかし、いずれの方法も、蛋白質の活性の低下、用いた化学物質の除去などのために煩雑な操作が必要であり、又化学物質の残存といった欠点を有している。
【０００４】
一方、膜を利用しウイルスを除去する方法は、蛋白質を変性させず、活性の低下も実質的になくウイルスに対する安全性を高める方法としては、他の方法に比較して優れている。例えば、特開昭６１−１６８３７号公報および特開昭６３−６８１７６号公報には、血漿を特別な性能を有する多孔質中空糸で処理することにより、Ｃ型肝炎ウイルスあるいはエイズウイルスに対して高い安全性を確保する方法が記載されている。
【０００５】
同様に、特開平１−１９２３６８号公報および特開平１−２５４２０５号公報には、再生セルロースの濾過膜を用いる濾過方法およびそのシステムが開示されている。これらはいずれも、ウイルスをその大きさにより分離する方法を提案している。一方、特開平１０−２８５８１号公報には、溶液の特殊な条件下で、ウイルスの粒子径より大きな孔を有する膜によりウイルスを除去する方法が開示されている。
【０００６】
又、特開２０００−３３４０３７号公報には、エンベロープウイルスがＬＤＬ（Ｌｏｗ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ；低比重リポ蛋白）と結合することに着目し、ＬＤＬ除去用の膜を利用してウイルスを除去する方法が提案されている。
【０００７】
しかし、これらのいずれの方法も欠点を有している。上記特許文献５および６は、ウイルスを特殊な条件下で凝集させ、あるいは他の混合物と結合させることにより、排除あるいは吸着により除去する方法である。当該方法は、除去されるウイルスの種類が限定されること、および条件の変動により除去の効果が一定でないといった欠点を有する。
【０００８】
一方、特開昭６１−１６８３７号公報および特開昭６３−６８１７６号公報は、ウイルスの粒子径とそれより小さな粒子径の蛋白質を大きさにより分離する方法であるが、当該膜では、ウイルスの除去率、タンパクの透過性能ともに満足行くものではない。一方、特開平１−１９２３６８号公報および特開平１−２５４２０５号公報は、ウイルス除去率に関しては優れた方法であるが、蛋白質処理量に問題があり、実用に供し得ない。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の課題は、ウイルス汚染の可能性のある血漿、血清から効果的にウイルスを除去し、しかも工業的に有効である安全な血漿製剤、血清製剤を製造する方法、および該方法により製造された血漿製剤、血清製剤を提供することである。
【００１０】
以上述べたように、膜を使用して蛋白質に変性を与えずにウイルスに対する安全性を高める方法は、従来から検討されてきたが、血漿、血清は、混在する蛋白質も多く、かつ分子量の高い有用蛋白質が多く含まれることから、有用蛋白質の透過性を確保し、かつ重篤なウイルスを確実に除去する方法の提供は困難であった。
【００１１】
本発明者らは、上記の課題を解決するために種々の研究をかさねた結果、原料となるヒトあるいは動物の血漿を、ウイルス除去膜で濾過する前に、白血球を除去する工程を導入することにより効率的なウイルス除去が可能であることを見出し、さらに検討を重ね本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、
（１）  ヒトあるいは動物の血漿製剤または血清製剤の製造方法であって、
下記（ａ−１）工程、（ａ−２）工程および（ｂ）工程を順次行う血漿製剤または血清製剤の製造方法。
（ａ−１）ヒトあるいは動物由来の全血から血漿を分離する工程、
（ａ−２）前記分離した血漿から白血球を減少させる工程
（ｂ）前記白血球を減少させた血漿をウイルス除去膜で濾過する工程
（２）  ヒトあるいは動物の血漿製剤または血清製剤の製造方法であって、
下記（ａ’−１）工程、（ａ’−２）工程および（ｂ’）工程を順次行う血漿製剤または血清製剤の製造方法。
（ａ’−１）ヒトあるいは動物由来の全血から即時に血漿を分離する工程、
（ａ’−２）即時に前記分離した血漿から白血球を減少させる工程
（ｂ’）前記白血球を減少させた血漿をウイルス除去膜で濾過する工程
（３）  （ｂ）工程、又は（ｂ’）工程のウイルス除去膜の平均孔径が、１００ｎｍ以下であることを特徴とする上記（１）あるいは（２）に記載の製造方法。
（４）  （ａ−２）工程、又は（ａ’−２）工程が白血球除去膜による白血球減少工程である上記（１）〜（３）のいずれかに記載の製造方法。
（５）  （ａ−１）工程、（ａ−２）工程および（ｂ）工程、又は  （ａ’−１）工程、（ａ’−２）工程および（ｂ’）工程が２５〜４０℃の温度環境下で行なわれることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）  （ａ−１）工程、（ａ−２）工程および（ｂ）工程、又は  （ａ’−１）工程、（ａ’−２）工程および（ｂ’）工程が９８ｋＰａ以下の圧力環境下で行なわれることを特徴とする上記（１）〜（５）のいずれかに記載の製造方法。
（７）  （ａ−１）工程、（ａ−２）工程および（ｂ）工程、又は  （ａ’−１）工程、（ａ’−２）工程および（ｂ’）工程において通過させる血液の量が１００ｍｌ〜５００ｍｌであることを特徴とする上記（１）〜（６）のいずれかに記載の製造方法。
（８）  （ｂ）工程、又は（ｂ’）工程の処理時間が１０−４０分であることを特徴とする上記（１）〜（７）のいずれかに記載の製造方法。
（９）  （ｂ）工程、又は（ｂ’）工程に用いるウイルス除去膜の平均孔径が、７５ｎｍ以下であることを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれかに記載の製造方法。
（１０）  （ｂ）工程、又は（ｂ’）工程に用いるウイルス除去膜が、平均孔径７５ｎｍとそれに続く平均孔径３５ｎｍのウイルス除去膜の組み合わせであることを特徴とする上記（１）〜（９）のいずれかに記載の製造方法。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、新鮮凍結血漿の凍結前の血漿を、ウイルス除去膜で濾過する際、あらかじめ白血球を減少させることにより、有用物質の透過性を確保しつつ、ウイルスを効率的に確実に除去することができることを見出したことに基づくものである。
【００１４】
また、本発明は、全血から白血球除去を行うのでなく、全血からまず血漿を分離した後に白血球を減少させることにより、ウイルスを効率的に確実に除去することができることを見出したものである。
【００１５】
本発明のヒトあるいは動物の血漿製剤または血清製剤の製造の原料となる血漿又は血清は、新鮮凍結血漿の凍結前の原料血漿であることが好ましい。また、凍結前の保存期間が長い血漿は、含まれる蛋白質、脂質等が結合し、濾過操作の際に、透過率の低下、および透過量の低下量の低下を引き起こすので、凍結前の保存期間が短い血漿が好ましい。
【００１６】
本発明において、白血球を減少する工程は、白血球を減少させ得るものであれば、どのような方法でもよい。例えば、超遠心分離による方法等があるが、白血球除去膜を用いる方法が簡単であり好ましい。白血球除去膜は、白血球を減少させる膜であれば、材質など問わないが、例えばポリエステル不織布を使用することが望ましい。
【００１７】
本発明におけるウイルス除去膜とは、少なくともウイルスと蛋白質をその大きさの違いにより分離する機能を有する膜を意味し、再生セルロース、ポリエチレン、ポリフッ化ビニリデンなど材質は問わないが、再生セルロースは、蛋白質の吸着が少なく好ましい。
【００１８】
又、従来使用されている各種ウイルス除去膜では、その平均孔径を表示する方法・尺度が統一されていないが、本発明においてウイルス除去膜の平均孔径とは、ウイルス除去膜における平均孔径をウイルス除去性能により以下のように定義する。
【００１９】
すなわち、平均孔径Ａｎｍのウイルス除去膜とは、粒子径Ａｎｍ以上の粒子径を有するウイルスを効果的に除去できることを意味する。効果的に除去するとは、対数除去率（ＬＲＶ＝−ｌｏｇ１０（濾過後ウイルス濃度／濾過前ウイルス濃度））が３以上、好ましくは４以上、より好ましくは６以上を意味する。例えば、平均孔径１００ｎｍのウイルス除去膜とは、粒子径１００ｎｍ以上のウイルスを効果的に除去できることを意味する。
【００２０】
よって、除去したいウイルスの平均粒子径によって、使用するウイルス除去膜を選択する。例えば、１００ｎｍの平均孔径を有するウイルス除去膜が除去対象とするウイルスは、具体的には、エイズウイルス（ＨＩＶ，平均粒子径１００−１２０ｎｍ）、仮性狂犬病ウイルス（ＰＳＲ，平均粒子径１２０−２００ｎｍ）、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ，平均粒子径１２０−１５０ｎｍ）等である。
【００２１】
血漿または血清からエイズウイルス（ＨＩＶ）を除去するためには、ウイルス除去膜の平均孔径は、１００ｎｍ以下であるものが有用である。さらに、平均孔径が７５ｎｍ以下であれば、エイズウイルスの混入の可能性は更に低下し好ましく、さらに１００ｎｍ以下７５ｎｍ以上の粒子系を有するウイルスも除去され、得られる製剤の安全性が増加する。
【００２２】
蛋白質の透過性は高いほど好ましい。総蛋白質の透過率は、７０％以上が好ましく、より好ましくは８０％以上である。
【００２３】
また、ウイルス除去膜は、適当な孔径を選択することにより病原性因子や不要の血漿混入物も除去可能である。
【００２４】
本発明は新鮮血漿から（ａ）白血球除去膜等を用いて白血球を減少させる工程と、（ｂ）（ａ）工程を行った後ウイルス除去膜を使用してウイルスを濾過除去する工程とからなる安全性の高い血漿を製造する方法であり、これらの工程は、どのような装置・操作を行なっても良いが、（ｉ）温度制御手段および（ｉｉ）加圧手段を有する製造雰囲気の制御可能な条件下で行えば、操作結果の再現性が期待され、濾過後の血漿の品質が安定するので好ましい。
【００２５】
温度制御手段（（ｉ））により制御された温度は、蛋白質が変性しない温度であれば何度でもよいが、２５〜４５℃が好ましい。濾過する温度が２５℃未満だと、血漿の粘度が高くなるため、濾過に長い処理時間を要し、実用的な時間範囲内に処理するのが困難となる。このようなことから、温度は２５℃以上が好ましい。一方、処理温度が４５℃より高くなると、蛋白質の品質が熱により低下する可能性があり好ましくない。より好ましくは３０〜３７℃である。
【００２６】
処理時の圧力は、膜の耐圧以下であればどのような値でもよいが、９８ＫＰａ以下の圧力であれば蛋白質の変性が少ないため好ましく、より好ましくは８０ＫＰａ以下である。
【００２７】
また、本発明はヒトあるいは動物由来の全血から血漿を分離する際は、即時に血漿を分離することが望ましい。「即時」とは、血漿中の蛋白質が凝集等により膜の透過性が低下しない時間をいい、通常４時間以内、好ましくは２時間以内、さらに好ましくは１時間以内、最も好ましくは１０分以内をいう。
【００２８】
１回に処理する血漿の容量は、特に制限はないが、一個体から採取できる血漿は通常１００〜５００ｍｌであるため、１００ｍｌ〜５００ｍｌが通常１回に処理する容量である。１００ｍｌ以下であると１回の処理量としては経済上好ましくなく、５００ｍｌ以上であると一個体から採取するには個体への負担が大きい。より好ましくは２００〜４００ｍｌである。
【００２９】
また、処理時間は、処理する血漿量と膜の面積などにより決定されるが、４０分以下にするように設定することが好ましい。個体からの採血と同時に濾過する場合、４０分以下であれば個体への負担が少ないためであり、あまりに濾過時間が長いと製剤の変性の可能性も場合によっては考えられるからである。
【００３０】
さらに、上記したような操作において、白血球を減少させた後の血漿を孔径が７５ｎｍのウイルス除去膜で濾過し、それに続いて孔径が３５ｎｍのウイルス除去膜で濾過した場合は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ，平均粒子径３０−６０ｎｍ）などの危険なウイルスが除去され、更に安全性の高い血漿製剤が提供される。
【００３１】
また、あらかじめ血漿からフィブリノゲンを除去したものである血清を原料として使用することもできる。または血漿製剤製造工程のいずれかにおいてフィブリノゲンを除去する等により、同様に安全性の高い血清製剤を製造することができる。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を挙げて本発明を説明する。
【００３３】
[実施例１]
Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ社製血漿分離採取装置ＡＦ１０４を用いて献体者の血液から分離した血漿を直ちに、旭化成製白血球除去膜「セパセル」で濾過し、さらに旭化成社製ウイルス除去膜「プラノバ」で濾過した。使用した「プラノバ」は、膜面積０．０６ｍ2で、最初に平均孔径７５ｎｍのウイルス除去膜で濾過し、続いて３５ｎｍのウイルス除去膜で濾過した。濾過は、ＪＭＳ社製ポンプＯＴ−６０１を使用し一定の流速で行った。
濾過温度は３５℃±２℃に制御した。
血漿量２５０ｍｌを３０分で処理し、圧力は０．３〜０．６ｋｇ／ｃｍ2であった。蛋白質の透過量を表１に記載する。表１より、ウイルス除去膜の平均口径７５ｎｍで濾過した場合の蛋白質の透過量は７５％以上であり、平均口径３５ｎｍでも、グロブリンおよびアルブミンは９０％以上、Ｆ−ＶＩＩＩも５０％以上であり、実用上問題ないことがわかる。
【００３４】
[比較例１]
実施例１における白血球除去膜による「セパセル」濾過および平均孔径７５ｎｍのウイルス除去膜による「プラノバ」濾過を行わない点以外は実施例１と同様に行った。平均孔径３５ｎｍ、膜面積０．０６ｍ2のプラノバで濾過開始後、５０ｍｌ濾過した時点で圧力が１．０ｋｇ／ｃｍ2を越えたので濾過を中止した。
【００３５】
【表１】
0004646114.tif 000002
【００３６】
[比較例２]
全血液を採血した後、抗凝固液を加え、直ちに４℃で２時間保存した。その後旭化成製白血球除去膜「セパセル」で白血球を除去した後、遠心分離により血漿を分離した。  分離した血漿は、実施例１と同様の条件で、膜面積０．０６ｍ2、平均孔径７５ｎｍのウイルス除去膜による「プラノバ」を用い初期圧力０．３ｋｇ／ｃｍ2で濾過を開始したが、７０ｍｌ濾過した時点で、圧力が１．０ｋｇ／ｃｍ2を超え濾過を中止した。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明によって得られた血漿製剤あるいは血清製剤は、濾過するウイルス除去膜の平均孔径に応じてウイルスの安全性が高まるので、その使用目的に応じて、そのまま輸血用に使用されるか、あるいは凍結新鮮血漿として保管され、さらに輸血、あるいは分画製剤の原料血漿として使用することができる。