(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）アナログポリペプチドであって、以下：
ａ）１０９番目の位置のアスパラギン酸をヒスチジンに置換した、［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦ；
ｂ）１１２番目の位置のアスパラギン酸をヒスチジンに置換した、［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦ；および
ｃ）必要に応じてＮ末端メチオニル残基を含む、該アナログ（ａ〜ｂ）のいずれか、
からなる群より選択される配列番号２の配列におけるアミノ酸置換を含む、Ｇ−ＣＳＦアナログポリペプチド。
【請求項２】
１以上の水溶性ポリマーで誘導体化されている、請求項１に記載のＧ−ＣＳＦアナログポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のＧ−ＣＳＦアナログポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項４】
ヒトＧ−ＣＳＦアナログポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該ポリペプチドが、以下：
ａ）１０９番目の位置のアスパラギン酸をヒスチジンに置換した、［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦ；
ｂ）１１２番目の位置のアスパラギン酸をヒスチジンに置換した、［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦ；および
ｃ）必要に応じてＮ末端メチオニル残基を含む、該アナログ（ａ〜ｂ）のいずれか、
からなる群より選択される配列番号２の配列におけるアミノ酸置換を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載のポリヌクレオチドであって、該分子が、以下：
ａ）配列番号３または５に記載のＤＮＡ配列；ならびに
ｂ）Ｎ末端メチオニル残基をさらにコードする、（ａ）のＤＮＡ配列、
からなる群より選択される、ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項４または５に記載のポリヌクレオチドを含む、発現構築物。
【請求項７】
請求項４または５に記載のポリヌクレオチドあるいは請求項６に記載の発現構築物を含む、宿主細胞。
【請求項８】
細菌、哺乳動物細胞、癌細胞、酵母細胞および昆虫細胞からなる群より選択される、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
Ｇ−ＣＳＦアナログポリペプチドである［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦ、［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦまたはこれらのＭｅｔ−１種を、このようなアナログをコードする核酸を含む宿主細胞より生成するためのプロセスであって、ここで、該プロセスは、以下：
ａ）請求項７または８に記載の宿主細胞を、このようなＧ−ＣＳＦアナログポリペプチドの発現を容易にする条件下で培養する工程；および
ｂ）このようなＧ−ＣＳＦアナログポリペプチドを得る工程、
を包含する、プロセス。
【請求項１０】
造血、神経または生殖に関連する状態を処置するための薬学的組成物を調製するための、請求項１または２に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１１】
請求項１０に記載のポリペプチドの使用であって、前記状態が、造血機能の低下、免疫機能の低下、好中球数の低下、好中球動員の低下、末梢血前駆細胞の動員、敗血症、重篤な慢性好中球減少症、骨髄移植、感染症、白血球減少症、血小板減少症、貧血、移植中の骨髄移植の増強、放射線処置における骨髄再生の増強、化学薬品または化学療法によって誘導される骨髄発育不全または骨髄抑制、および後天性免疫不全症候群からなる群より選択される、使用。
【請求項１２】
化学療法および放射線療法に細胞を感作させるための薬学的組成物の調製のための、請求項１または２に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれかに記載のポリペプチドの使用であって、前記薬学的組成物は、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、Ｍ−ＧＤＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、インターロイキン、ＩＧＦ−１、ＬＩＦ、インターフェロン、神経栄養因子、ｆｌｔ−３／ｆｌｋ−２リガンドおよび線維芽細胞増殖因子の中から選択される少なくとも１つのさらなる因子を含む、使用。
【請求項１４】
インビトロで造血細胞を培養する方法であって、以下の工程：
ａ）請求項１に記載のＧ−ＣＳＦアナログポリペプチドを含む適切な培養培地中に該細胞を置く工程；および
ｂ）該造血細胞の増殖に適切な条件を提供する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、前記培養は、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、Ｍ−ＧＤＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、インターロイキン、ＩＧＦ−１、ＬＩＦ、インターフェロン、神経栄養因子、ｆｌｔ−３／ｆｌｋ−２リガンドおよび線維芽細胞増殖因子の中から選択される少なくとも１つのさらなる因子の使用を含む、方法。
【請求項１６】
以下：
ａ）請求項１に記載のアナログポリペプチドのいずれか；
ｂ）造血細胞を培養するための培地を調製するために適切な成分；ならびに
ｃ）必要に応じて、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、Ｍ−ＧＤＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、インターロイキン、ＩＧＦ−１、ＬＩＦ、インターフェロン、神経栄養因子、ｆｌｔ−３／ｆｌｋ−２リガンドおよび線維芽細胞増殖因子の中から選択される少なくとも１つのさらなる因子、
を含む造血細胞を培養するための成分を備える、キット。
【請求項１７】
配列番号３または５に記載のＤＮＡ配列に対して相補的なＤＮＡ配列を含む、ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年９月８日に出願された米国仮出願番号第６０／２３１，４６４号（これは、その全体において本明細書中で参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）ポリペプチドアナログ組成物、関連する核酸、およびベクター、宿主細胞、ならびに本発明のＧ−ＣＳＦアナログポリペプチドの組換えＤＮＡ産生のためのプロセスに関する。さらに、薬学的組成物および使用方法が、提供される。本発明のいくつかの局面は、Ｇ−ＣＳＦアナログ組成物の範囲を超えても、同様に一般化可能であるべきである。
【０００３】
（発明の背景）
多くの治療用リガンドは、細胞応答を誘発するための細胞表面レセプターに結合することによって、細胞応答を誘発する。薬剤の設計は、典型的には、その意図される標的に密接かつ特異的に結合するリガンドの能力に焦点があてられる。しかし、薬剤がタンパク質でありそして標的が細胞表面レセプターである場合には、系−レベル分析によって検討すべきさらなる問題が存在する。治療用リガンドが細胞表面上のレセプターに結合すると、細胞内シグナル伝達カスケードが開始される。この細胞内シグナル伝達カスケードは最終的には、適切な細胞応答を生じる。さらに、これらのシグナルの調節（一般的には、減衰作用）が、リガンド−レセプター複合体の細胞輸送（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）によってほぼ直ちに始まる。細胞表面上の複合体は、エンドソーム区画と融合する小胞中に内在化させられる。エンドソームから、分子はリソソーム中での崩壊へと導かれ得るか、または細胞表面に対してインタクトなまま再利用され得るかのいずれかであり、ここでは、遊離のレセプターおよびリガンド結合レセプターが再度提示され、そして遊離のリガンドが細胞外培地に放出される。最近の証拠は、増殖因子またはサイトカインを含む複合体についてのこの分類の決定の結果が、リガンド−レセプター相互作用について一定のエンドソーム親和性定数にたいてい関係していることを示唆する：結合したままである複合体は容易に分離され、一方で解離したものは再利用される（Ｌａｕｆｆｅｎｂｕｒｇｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：Ｒ２５７−Ｒ２６３（１９９８））。一般的には、エンドソーム内での複合体の解離は、レセプターの再利用を増進するようである。なぜなら、これは、レセプターとエンドソーム保持成分との間の相互作用の変更を生じるからである。
【０００４】
さらに、少ない数の細胞内複合体に関して（これは、多くの臨床的に重要なサイトカイン−レセプター系に関する場合である）、モデリングは、エンドソーム親和性の逆数と再利用されるリガンドの分数との間の特に強力な正相関を示す（ＦｒｅｎｃｈおよびＬａｕｆｆｅｎｂｕｒｇｅｒ、Ａｎｎ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２５：６９０−７０７（１９９７））。従って、リガンドがその標的細胞へ結合し、そしてその標的細胞内でシグナルを生成した後にエンドソームの解離を増進するように設計され得る場合には、薬剤は、レセプターのダウンレギュレーションを減らし得、その結果、細胞は、さらなるリガンドによる刺激に対してより敏感になる。薬剤の寿命および効力もまた、リガンドの再利用がエンドソームの解離によって増大させられる場合に増進され得る。このことは、増大させられた親和性を通じてリガンドの能力の改良を試みる従来のアプローチとは対照的である。細胞外親和性の増進がエンドソームにまで及ぶ場合には、このような試みは実際には逆効果であるかもしれない。なぜなら、これらは、レセプターのダウンレギュレーションを増大させそしてリガンドの枯渇の可能性があるからである。従って、細胞輸送は、リガンド能力の増大において、特に、レセプター媒介性のエンドサイトーシスによる分解が重要である場合には、障害であり得る。
【０００５】
細胞輸送特性の最適化が効力に深い影響を与え得る系は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびそのレセプター（Ｇ−ＣＳＦＲ）の系である。Ｇ−ＣＳＦは、１９ｋＤａのサイトカインであり、これは、造血性増殖因子の１つであり、コロニー刺激因子とも呼ばれる。Ｇ−ＣＳＦは、このような細胞の血中レベルが危険なほどまでに低い場合に、白血球（好中球）数を増加させるために使用される。これは、一般的には、特定の抗生物質、抗ＨＩＶ療法、および／または化学療法によって骨髄が抑制される場合に起こる。最近の研究は、Ｇ−ＣＳＦは血中の好中球数を増大させるだけではなく、それらの細胞の機能的な殺傷能力をもまた増進させることを実証する（Ｖｅｃｃｈｉａｒｅｌｌｉら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７１：１４４８−１４５４（１９９５））。Ｇ−ＣＳＦは成熟好中球への好中球前駆細胞の増殖および分化を特異的に刺激し（Ｆｕｋｕｎａｇａら、Ｃｅｌｌ  ７４：１０７９−１０８７（１９９３））、そしてこれは、好中球減少状態の処置に有用である（Ｗｅｌｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１５２６−１５３０（１９８５）；Ｓｏｕｚａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：６１−６５（１９８６）；Ｇａｂｒｉｌｏｖｅ，Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２６（２）：１−１４（１９８９））。Ｇ−ＣＳＦは循環している顆粒球数を増大させ、そして敗血症モデルにおいて感染を改善することが報告されている。Ｇ−ＣＳＦの投与はまた、敗血症の間の組織損傷および拒絶に重要なサイトカインである腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の放出を阻害する（Ｗｅｎｄｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：９１８−９２４（１９９２））。Ｇ−ＣＳＦは、逆平行の４個の螺旋型束状構造によって特徴付けられるサイトカインのＩ群スーパーファミリーのメンバーであり、これには、エリスロポエチンおよび成長ホルモンのような他の治療上重要な薬剤が含まれる。Ｇ−ＣＳＦはＧ−ＣＳＦＲに対して特異的、かつ高い親和性で結合し（見かけのＫＤ  約１００ｐＭ）（Ｍｏｒｓｔｙｎ，ＤｅｘｔｅｒおよびＦｏｏｔｅ（編）Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ（ｒ−ｍｅｔＨｕＧ−ＣＳＦ）：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８））、これによって２：２の化学量論のリガンド：レセプター複合体を生じる（Ｈｏｒａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：４８８６−４８９６（１９９６）；Ｈｏｒａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２１：３７０−３７５（１９９７））。Ｇ−ＣＳＦＲの細胞外領域は、リガンド結合サイトカインレセプターホモロジー（ＣＲＨ）ドメインを含み（Ｆｕｋｕｎａｇａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：２８５５−２８６５（１９９１））、そして最近、Ｇ−ＣＳＦＲのＣＲＨドメインと複合体を形成したＧ−ＣＳＦの結晶構造が解明された。これは予想された２：２のリガンド：レセプター化学量論を示している（Ａｒｉｔｏｍｉら、Ｎａｔｕｒｅ、４０１：７１３−７１７（１９９９））。
【０００６】
ヒトにおいては、内因性のＧ−ＣＳＦは血漿中で検出可能である（Ｊｏｎｅｓら、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅ’ｓ  Ｃｌｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２（１）：８３−１１１（１９８９））。Ｇ−ＣＳＦは、線維芽細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、栄養芽細胞、内皮細胞、および上皮細胞によって産生され、そして１コピーの遺伝子の発現産物は、１７番染色体状に位置する４個のエキソンおよび５個のイントロンから構成される。この遺伝子座の転写によって、異なってプロセシングされるｍＲＮＡ種を産生し、２つの形態のＧ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ（１つのバージョンは、１７７アミノ酸のタンパク質をコードし、他方は１７４アミノ酸のタンパク質をコードする）を生じる（Ｎａｇａｔａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５：５７５−５８１（１９８６））。１７４アミノ酸を含む形態は、インビボでの生物学的活性において特異性を有することが見出されている。配列番号１は、Ｇ−ＣＳＦの１７４アミノ酸の種をコードするＤＮＡを示し、そして対応するアミノ酸配列が配列番号２に示される。Ｇ−ＣＳＦは種交差反応性であり、その結果、ヒトＧ−ＣＳＦが別の哺乳動物（例えば、マウス、イヌ、またはサル）に投与された場合に、持続した好中球性白血球増加症が誘発される（Ｍｏｏｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７１３４−７１３８（１９８７））。
【０００７】
ヒトＧ−ＣＳＦは、多数の供給源から得ることができそして精製され得る。天然のヒトＧ−ＣＳＦは、培養されたヒト腫瘍細胞株の上清から単離され得る。組換えＤＮＡ技術の開発によって、真核生物宿主細胞の発現産物としてのグリコシル化形態のＧ−ＣＳＦ、および原核生物宿主細胞の発現産物としての非グリコシル化形態のＧ−ＣＳＦの商業的規模の量の産生が可能になった。例えば、本明細書中で参考として援用される、米国特許第４，８１０，６４３号（Ｓｏｕｚａ）を参照のこと。
【０００８】
Ｇ−ＣＳＦは、好中球の増大が利点を提供する適応の処置に有用であることが見出されている。例えば、癌患者については、Ｇ−ＣＳＦは、化学療法または放射線治療によって生じる造血不足を補うための、好中球の産生を選択的に刺激する手段として有用である。他の適応として、種々の感染症および関連する症状（例えば、敗血症（これは、典型的には、細菌の代謝生成物によって引き起こされる））の処置が挙げられる。Ｇ−ＣＳＦはまた、培養物中の細胞の増殖または拡大について（例えば、骨髄移植またはエキソビボでの展開について）、単独で、または他の化合物（例えば、他のサイトカイン）と組合せて有用である。Ｇ−ＣＳＦは、感染の処置または好中球減少症の処置に適合するように、移植患者に対して投与されている（Ｄｉｆｌｏら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １６：ＰＡ２７８（１９９２）；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １４：ＰＡ４８（１９９１）；Ｌａｃｈａｕｘら、Ｊ．Ｐｅｄ．１２３：１００５−１００８（１９９３）；Ｃｏｌｑｕｅｈｏｕｎら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５６：７５５−７５８（１９９３））。しかし、Ｇ−ＣＳＦは、Ｇ−ＣＳＦＲを発現する骨髄中の末梢好中球および前駆細胞によるレセプター媒介性エンドサイトーシスを通じて迅速に取り除かれる（Ｍｏｒｓｔｙｎ，Ｄｅｘｔｅｒ、およびＦｏｏｔｅ（編）Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ（ｒ−ｍｅｔＨｕＧ−ＣＳＦ）：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８））。従って、薬剤の効力は、この負のフィードバック機構によって減少させられる。細胞は本来少数のＧ−ＣＳＦＲを発現するので、複合体のエンドソーム親和性の減少はレセプターのダウンレギュレーションを減らすだけではなく、モデリングによって予想されるように、リガンド再利用をもまた増進し得る（ＦｒｅｎｃｈおよびＬａｕｆｆｅｎｂｕｒｇｅｒ、Ａｎｎ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２５：６９０−７０７（１９９７））。従って、Ｇ−ＣＳＦは輸送特性を増強し、それによって薬剤効力を改良するための、突然変異誘発の最重要候補である。
【０００９】
種々の変更されたＧ−ＣＳＦが報告されている。一般的に、薬剤の設計について、特定の変化が特定の構造的効果を有することが、公知である。例えば、１つのシステインの欠失は、その変更されていない状態においては、通常はジスルフィド結合によって折り畳まれる分子のアンフォールディングを生じ得る。タンパク質の機能を変更するためのアミノ酸の付加、欠失、または置換に関する当業者に公知の他の方法が存在する。
【００１０】
組換えヒトＧ−ＣＳＦ変異体が調製されているが、調製方法は全体の構造／機能の関係の情報を含まない。例えば、Ｃｙｓ１８の変異および生化学的改変が報告されている（Ｋｕｇａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１５９：１０３−１１１（１９８９）；Ｌｕら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６８：８１−９２（１９８９））。
【００１１】
「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  Ｃｏｌｏｎｙ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ」と題された米国特許第４，８１０，６４３号（本明細書中で参考として援用される）においては、Ｇ−ＣＳＦのポリペプチドアナログおよびペプチドフラグメントが一般的に開示されている。開示された特異的なＧ−ＣＳＦアナログには、（１７４アミノ酸の種または１７５アミノ酸（さらなるアミノ酸はＮ末端のメチオニンである）の）１７位、３６位、４２位、６４位、および７４位のシステインが別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されたもの、ならびに第１位（Ｎ末端）にアラニンを有するＧ−ＣＳＦが挙げられる。
【００１２】
「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｇ−ＣＳＦ」と題された第ＥＰ０３３５４２３号は、報告によれば、ｈＧ−ＣＳＦ活性を有しているポリペプチド中の少なくとも１つのアミノ基の改変を開示している。
【００１３】
「Ｎｏｖｅｌ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」と題された第ＥＰ０２７２７０３号は、報告によれば、Ｎ末端でまたはその「近く」でのアミノ酸置換または欠失を有しているＧ−ＣＳＦ誘導体を開示している。また、Ｏｋａｂｅら（Ｂｌｏｏｄ  ７５（９）：１７８８−１７９３（１９９０））は、報告によれば、ヒトＧ−ＣＳＦのＮ末端領域の５位の改変を開示している。
【００１４】
「Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ」と題された第ＥＰ０４５９６３０号は、報告によれば、天然に存在しているＧ−ＣＳＦの生物学的特性の少なくとも１つを有しておりそして５ｍｇ／ｍＬで少なくとも３５％の溶液安定性を有している、天然に存在しているＧ−ＣＳＦの誘導体を開示している。この誘導体は、ネイティブの配列の少なくともＣｙｓ１７がＳｅｒ１７残基で置きかえられており、そしてネイティブの配列のＡｓｐ２７がＳｅｒ２７残基で置きかえられている。
【００１５】
「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇ−ＣＳＦ  ａｎｄ  Ｍｕｔｅｉｎｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ」と題された第ＥＰ０２５６８４３号は、報告によれば、Ｇ−ＣＳＦをコードする改変型ＤＮＡ配列を開示している。ここでは、Ｎ末端が、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく組換え宿主細胞中でのタンパク質の発現を増進するように、改変される。
【００１６】
「Ｈｕｍａｎ  Ｇ−ＣＳＦ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」と題された第ＥＰ０２４３１５３号は、報告によれば、酵母を使用する組換え産生において収量を増大させるために、少なくとも１つの酵母ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活化させることによって改変されるＧ−ＣＳＦを開示している。
【００１７】
「Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ」と題されたＳｈａｗの米国特許第４，９０４，５８４号は、報告によれば、リジンが変更されたタンパク質を開示している。
【００１８】
第ＷＯ／９０１２８７４号は、報告によれば、タンパク質のシステインが変更された改変体を開示している。
【００１９】
「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題されたオーストラリア特許出願番号第ＡＵ−Ａ−１０９４８／９２号は、報告によれば、原核生物での発現後の分子の折りたたみを補助する目的のための、Ｇ−ＣＳＦ分子のいずれかの末端へのアミノ酸の付加を開示している。
【００２０】
「Ｍｕｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ（Ｇ−ＣＳＦ）」と題されたオーストラリア特許出願番号第ＡＵ−Ａ−７６３８０／９１号は、報告によれば、１７４アミノ酸のＧ−ＣＳＦの５０〜５６位、および１７７アミノ酸のＧ−ＣＳＦの５３〜５９位の配列Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ中でのＧ−ＣＳＦのムテイン、ならびに／あるいは１７４アミノ酸の成熟Ｇ−ＣＳＦの４３位、７９位、１５６位、および１７０位、または１７７アミノ酸の成熟Ｇ−ＣＳＦの４６位、８２位、１５９位、または１７３位での４個のヒスチジン残基のうちの少なくとも１つにおけるＧ−ＣＳＦのムテインを開示している。
【００２１】
「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｇｅｎｅ」と題された第ＧＢ２２１３８２１号は、報告によれば、選択された領域のカセット突然変異誘発を容易にするための制限部位、および所望される発現系への遺伝子の取り込みを容易にするための隣接する制限部位を取り込んでいる、合成のＧ−ＣＳＦをコードする核酸配列を開示している。
【００２２】
米国特許第５，２１４，１３２号は、報告によれば、アミノ酸１位、３位、４位、５位、および１７位でのヒトＧ−ＣＳＦの改変を開示している（Ｋｕｇａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５９：１０３−１１１（１９８９）をもまた参照のこと）。
【００２３】
米国特許第５，２１８，０９２号は、報告によれば、アミノ酸１位、３位、４位、５位、１７位、１４５位、および１４７位でのヒトＧ−ＣＳＦの改変を開示している。
【００２４】
米国特許第５，５８１，４７６号（本明細書中で参考として援用される）は、原子レベルでのＧ−ＣＳＦの３次元構造を開示している。この３次元構造によって、Ｇ−ＣＳＦ分子の組成中のどの変化が構造上の変化を生じ得るかを、実質的な確実性で予測することが可能である。これらの構造特性は、Ｇ−ＣＳＦアナログを設計しそして産生するための生物学的活性と相関し得る。
【００２５】
Ｇ−ＣＳＦが細胞の代謝に影響を与えるような様式のシグナル伝達は、現在完全には理解されていない。一般的には、Ｇ−ＣＳＦは、Ｇ−ＣＳＦ細胞表面レセプターに結合し、そしてこれをコンフォメーションの変化を通じて活性化する。それによって、この結合はシグナル伝達カスケード（例えば、細胞質ドメインへのキナーゼの動員）を開始し、これは明らかに特定の先祖細胞内での変化を開始し、分化、増殖、および移動のような細胞応答を導く。Ｇ−ＣＳＦ／Ｇ−ＣＳＦＲ複合体は、インターナリゼーションのエンドサイトーシス性輸送プロセスをうけ、そして再利用または分解へと分類されると考えられる（ＬａｕｆｆｅｎｂｕｒｇｅｒおよびＬｉｎｄｅｒｍａｎ、Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ，Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３））。
【００２６】
Ｇ−ＣＳＦのエンドサイトーシスによる取り込みは、エンドソームおよび／またはリソソーム区画での細胞内タンパク質溶解性のサイトカイン分解を強化する。内在化したサイトカインレセプターは、再利用されない場合は分解され得る。従って、エンドサイトーシス性輸送は、細胞外培地からのＧ−ＣＳＦの枯渇、ならびにＧ−ＣＳＦレセプターのダウンレギュレーションを引き起こし得る。従って、Ｇ−ＣＳＦ構造を、シグナル伝達のために適切なレセプターの活性化を保持するが、エンドサイトーシス性インターナリゼーションを減少させ、そして／または分解よりもむしろ再利用するようにエンドソームの分類を増進させる様式で変更させることが、有用である（Ｌａｕｆｆｅｎｂｕｒｇｅｒら、Ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ  Ｔｈｅ  （Ｃｅｌｌ）  Ｓｕｒｆａｃｅ：Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｌｉｇａｎｄ／Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｃｈｅｍ  ＆  Ｂｉｏｌ．５：Ｒ２５７−Ｒ２６３（１９９８））。
【００２７】
従って、Ｇ−ＣＳＦのより良い治療用リガンドを開発することが必要とされている。リガンドがエンドサイトーシスおよびそれに続くリソソーム性分解の傾向にはない場合には、このような薬剤は、より長い半減期を有し、そしてより大きな細胞増殖を誘導する。従って、本発明の目的は、これらのリガンド、ならびにその産生方法および試験方法を提供することである。
【００２８】
（発明の要旨）
本発明において、本発明者らは、細胞輸送における設計された改善を通して、Ｇ−ＣＳＦの効力を改善するためのアプローチを記載する。本発明の置換が、１位にメチオニン残基を有する配列番号２のＧ−ＣＳＦまたは１位にメチオニン残基を有する組換えＧ−ＣＳＦ（「ｍｅｔＧ−ＣＳＦ」または「ｒ−ｍｅｔ−ＨｕＧ−ＣＳＦ」）と比較して、細胞輸送に効果を有するＧ−ＣＳＦアナログを生じることが、見出されている。本明細書中に他に示されない限り、これらの種は、総称して「野生型」と称される。これらの改変からの効果は、他のＧ−ＣＳＦ種では見出されない、安定性および効力における利点を実証する。特に、これらのアナログは、細胞応答（Ｇ−ＣＳＦアゴニスト型の活性）の増強を提供する。細胞応答におけるこのような変化は、Ｇ−ＣＳＦレセプター結合ならびに／またはリガンド／レセプターエンドサイトーシス輸送経路を介した分類、再利用および分解のプロセスに影響を及ぼすことによって生じる。
【００２９】
本発明は、以下：１）１０９位におけるアスパラギン酸のヒスチジンでの置換、［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦ；２）１１２位におけるアスパラギン酸のヒスチジンでの置換、［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦ；３）１１９位におけるグルタミンのヒスチジンでの置換、［Ｈｉｓ１１９］Ｇ−ＣＳＦ；および４）必要に応じて、Ｎ末端メチオニル残基を含む上記ポリペプチドアナログのうちのいずれか、からなる群より選択される、配列番号２の配列中にアミノ酸置換を含む、ヒトＧ−ＣＳＦアナログポリペプチドに関する。このようなアナログは、さらに、１つ以上の水溶性ポリマーを用いて誘導体化され得る。
【００３０】
なお別の局面において、本発明は、上記のヒトＧ−ＣＳＦアナログポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。現在好ましいポリヌクレオチドは、配列番号３、５または７のＤＮＡ配列（およびこれらの相補鎖）に示され、そしてＮ末端メチオニル残基をさらにコードするものも含まれる。
【００３１】
なお別の局面において、本発明は、上記のポリヌクレオチドを含む発現構築物を含む。
【００３２】
さらに、本発明は、上記のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。現在好ましい宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、腫瘍細胞、酵母細胞、および昆虫細胞からなる群より選択される。
【００３３】
なお別の局面において、本発明は、Ｇ−ＣＳＦアナログポリペプチドである［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦ、［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦ、［Ｈｉｓ１１９］Ｇ−ＣＳＦ、およびこれらのＭｅｔ−１種を、このようなアナログをコードする核酸を含む宿主細胞から産生するためのプロセスを提供し、ここで、このプロセスは、上記のポリペプチドを含有する宿主細胞を、このようなポリペプチドの発現を促進する条件下で培養する工程；ならびに、このようなＧ−ＣＳＦアナログポリペプチドを得る工程を包含する。
【００３４】
本発明はまた、上記のＧ−ＣＳＦアナログポリペプチドならびに薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。これらの組成物は、造血に関連する状態、神経に関連する状態、または生殖に関連する状態を処置するための方法に使用され得、この方法は、上記の組成物の有効量を、この組成物を必要とする患者に投与する工程を包含する。このような状態としては、造血機能の低下、免疫機能の低下、好中球数の減少、好中球の動員の減少、末梢血前駆細胞の動員、敗血症、重篤な慢性好中球減少症、骨髄移植、感染症、白血球減少症、血小板減少症、貧血、移植の間の骨髄の定着（ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）の増進、放射線治療の間の骨髄の回復の増進、化学的または化学療法によって誘導された骨髄形成不全または骨髄抑制、ならびに後天性免疫不全症候群が挙げられる。
【００３５】
なお別の局面において、本発明は、化学療法および放射線治療に対して細胞を感作する方法を提供し、この方法は、上記の薬学的組成物の有効量を、この薬学的組成物を必要とする患者に投与する工程を包含する。
【００３６】
本発明はまた、インビトロで造血細胞を培養するための方法を提供し、この方法は、適切な培養培地中に上記の細胞を配置する工程であって、上記の適切な培養培地は、上記のＧ−ＣＳＦアナログポリペプチドを含む、工程；および、上記の造血細胞の増殖のための適切な条件を提供する工程を包含する。
【００３７】
本発明はまた、上記の処置、感作、または培養が、以下：ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、Ｍ−ＧＤＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、インターロイキン、ＩＧＦ−１、ＬＩＦ、インターフェロン、神経栄養因子、ｆｌｔ−３／ｆｌｔ−２リガンド、および線維芽細胞増殖因子の間から選択される少なくとも１つのさらなる因子の使用を含む、上記の方法を提供する。本発明は、相応して、上記のポリペプチドアナログのいずれか；造血細胞の培養のための培地を調製するために適切な成分；および、必要に応じて、上記に示された少なくとも１つのさらなる因子を含む、造血細胞を培養するための成分を含むキットを提供する。
【００３８】
（発明の詳細な説明）
Ｇ−ＣＳＦは、好中球の増大が利益を提供する種々の状態の処置において有用であることが見出されている。例えば、癌患者については、Ｇ−ＣＳＦは、化学療法または放射線治療によって生じた造血不足を補うための、好中球の産生の選択的な刺激の手段として有用である。他の適応として、種々の感染性疾患および関連する状態（例えば、敗血症（これは、典型的には、細菌の代謝生成物によって引き起こされる））の処置が挙げられる。Ｇ−ＣＳＦはまた、培養物中の細胞の増殖または拡大について（例えば、骨髄移植またはエキソビボでの拡大のため）は、単独で、または他の化合物（例えば、他のサイトカイン）と組合せて有用である。Ｇ−ＣＳＦは、感染の処置または好中球減少症の処置に適合するように、移植患者に対して投与されている。しかし、Ｇ−ＣＳＦは、末梢好中球およびＧ−ＣＳＦＲを発現する骨髄中の前駆細胞によるレセプター媒介性エンドサイトーシスを通じて迅速に取り除かれ、従って、薬剤の効力は、この負のフィードバック機構によって減少させられる。細胞は本来少数のＧ−ＣＳＦＲを発現するので、複合体のエンドソーム親和性の減少はレセプターのダウンレギュレーションを減らし得るだけではなく、モデリングによって予想されるリガンド再利用をもまた増進し得る。従って、Ｇ−ＣＳＦの薬剤効力は、輸送特性を増強するＧ−ＣＳＦへの変異によって改良される。
【００３９】
本発明は、他のＧ−ＣＳＦ種では見られない安定性において有利性を示す新規のＧ−ＣＳＦアナログポリペプチドを記載する。詳細には、これらのアナログは、野生型Ｇ−ＣＳＦと比較して、増進した細胞応答を提供するアナログ（スーパーアゴニストまたはＧ−ＣＳＦアゴニスト型活性）である。細胞応答におけるこのような変化は、Ｇ−ＣＳＦレセプター結合、および／またはリガンド／レセプターのエンドサイトーシスによる輸送経路を介した選別、再循環、および分解のプロセスによって生じ得る。
【００４０】
本発明の全てのアナログの変化は、配列番号２のＧ−ＣＳＦについての１７４のアミノ酸配列に基づく。当業者は、本発明のアナログがまたＮ末端のメチオニン残基を伴っても構築され得ることを理解する。
【００４１】
見出しのセクションは、構成の目的だけのために本明細書中で使用され、そして記載される本発明の内容を限定するようには解釈されない。
【００４２】
（Ａ．好中球減少症の処置におけるＧ−ＣＳＦの役割）
Ｇ−ＣＳＦは、好中球の増大が利益を提供する症状の処置において有用であることが、見出されている。例えば、癌患者については、Ｇ−ＣＳＦは、化学療法または放射線治療によって生じる造血不足を補うための、好中球の産生の選択的な刺激の手段として有用である。他の適応として、種々の感染性疾患および関連する症状（例えば、敗血症（これは、典型的には、細菌の代謝生成物によって引き起こされる））の処置が挙げられる。Ｇ−ＣＳＦはまた、培養物中の細胞の増殖または拡大について（例えば、骨髄移植またはエキソビボでの拡大のため）は、単独で、または他の化合物（例えば、他のサイトカイン）と組合せて有用である。Ｇ−ＣＳＦは、感染の処置または好中球減少症の処置に適合するように、移植患者に対して投与されている（Ｄｉｆｌｏら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １６：ＰＡ２７８（１９９２）；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １４：ＰＡ４８（１９９１）；Ｌａｃｈａｕｘら、Ｊ．Ｐｅｄ．１２３：１００５−１００８（１９９３）；Ｃｏｌｑｕｅｈｏｕｎら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５６：７５５−７５８（１９９３））。
【００４３】
用語「好中球減少症」は、異常に少ない数の好中球を末梢循環中に有する状態をいう。好中球は、骨髄から生じ、そしてそれが循環に放出される際には完全に成熟している。次いで、これは、細胞防御の第１線としてのその役割において機能するように完全に調製される。これは、誘発刺激の部位にそれを引きつける、特定の炎症誘発性媒介因子および走化性因子に対してそれが暴露されることによって、活性化される（すなわち、その機能の多くを実行することが可能になる）。重症の好中球減少症は、それが重症の感染症を導く場合があるので、生命にかかわる場合がある。
【００４４】
あるいは、用語「好中球増加症」は、異常に多数の好中球が末梢循環中にある状態をいう。好中球増加症、または白血球数の増大は、多くの原因を有し、これには、極度の低温、熱への暴露、最近の（ｒｅｃｅｎｔ）外科手術、心理的外傷、任意の型の感染、火傷、ショック、腫瘍、非感染性の炎症（例えば、通風、関節炎、甲状腺の障害）、および薬物が含まれる。
【００４５】
（Ｂ．本発明のＧ−ＣＳＦアナログ）
本発明は、野生型Ｇ−ＣＳＦポリペプチドおよびこれらのコードするポリペプチドのアナログならびにこれらのＭｅｔ−１種の産生を企図し、ここで、１）ヒスチジンは、１０９位のアスパラギン酸と置換され（［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦ）；２）ヒスチジンは、１１２位のアスパラギン酸と置換され（［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦ）；そして３）ヒスチジンは、１１９位のグルタミンと置換される（［Ｈｉｓ１１９］Ｇ−ＣＳＦ）。上の置換は、配列番号２の番号付けに従う。これらの３つのアナログのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、６、および８において見出され得る。本発明は、野生型Ｇ−ＣＳＦと比較して、細胞増殖を刺激するための増加した効力および増加した半減期を有するヒトＧ−ＣＳＦアナログポリペプチドの産生を企図する。細胞応答におけるこのような変化は、Ｇ−ＣＳＦレセプターの結合、ならびに／またはリガンド／レセプターのエンドサイトーシスによる輸送経路を介した選別、再循環、および分解に影響を与えることによって生じる。
【００４６】
これらのアナログは、ヒスチジン（これは、細胞輸送特性を改善するためにｐＨ活性型スイッチとして作用する）への単一置換を使用して、リガンドの設計のための一般的なコンピューター枠組みによって開発される。本明細書中に記載されるストラテジーは、リガンド−レセプター複合体のエンドソーム親和性を減少させるためのヒスチジンプロトン化のためのスイッチとして、細胞外培地とエンドソーム区画との間のｐＨ差異を利用し、これは、細胞外培地へのインタクトなリガンドの再循環を強化することが推定される。
【００４７】
ヒスチジンへの変異のための残基の選択は、静電気の考慮によって導かれた。この意図は、中性のヒスチジンに対する野生型に近い（または、可能な場合、より大きい）親和性でＧ−ＣＳＦＲを結合するが、正に荷電したヒスチジンを不十分に結合するＧ−ＣＳＦアナログを作製することである。酸性ｐＨにおいて、結合親和性は、未結合のＧ−ＣＳＦにおいてヒスチジンを脱プロトン化する費用によって、中性ｐＨでの結合親和性よりも減少する［ＹａｎｇおよびＨｏｎｉｇ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３１：４５９−４７４（１９９３）］。未結合タンパク質におけるヒスチジンのｐＫａが６．５である場合［Ｔａｎｏｋｕｒａ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．７４２：５７６−５８５（１９８２）］、これは、ｐＨ５．５において１０倍低い親和性を生じる。
【００４８】
候補ヒスチジン変異は、インシリコで、３部の手順によって同定された。最初に、静電気的結合相互作用の性質を、リガンドの脱溶媒和および相互作用を明確に説明し、そして最適な結合についていくらか負またはいくらか正である界面における領域を位置付ける方法［ＫａｎｇａｓおよびＴｉｄｏｒ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１０９：７５２２−７５４５（１９９８）］を使用して定量した。第２に、試験ヒスチジンＧ−ＣＳＦアナログ（中性アナログおよび正に荷電したアナログの両方）を構築し、そしてエネルギーを最小化した。第３に、各々の静電気的結合自由エネルギーを計算した。
【００４９】
本明細書中で詳しく述べられる概念は、合理的に選択されたＧ−ＣＳＦの新規な変異体を含む。Ｇ−ＣＳＦとそのレセプターＧ−ＣＳＦＲとの間の結晶構造は、リガンドとレセプターとの間の主要な結合界面において正味の静電気電位を計算するために使用された。残渣の正味静電気電位に寄与するＧ−ＣＳＦ上のアミノ酸残基は、変異誘発の候補として選択された。非常に負の領域が優性であることは、荷電した残基Ｇｌｕ１９、Ａｓｐ１０９、およびＡｓｐ１１２ならびに極性残基Ｇｌｎ２０、Ｔｈｒ１１６、およびＧｌｎ１１９を含む、過剰な負の電荷密度を示す。結合への静電気的寄与は、これらの６つの部位におけるリガンド上の減少した負の電荷で強化され得；中性のヒスチジンは、複合体中で耐性であり得るが、正に荷電したヒスチジンは、レセプターの正の電荷密度を拒絶し得る。これらの部位を試験するために、個々のヒスチジン変異体を、同定された残基に関して、計算的に構築した。
【００５０】
Ｇ−ＣＳＦとそのレセプター（Ｇ−ＣＳＦＲ）との間の複合体の三次元結晶構造を使用して、リガンドとレセプターとの間の主要な結合境界における静電気電位を、計算し得る。米国特許第５，５８１，４７６号（本明細書中に参考として援用される）；Ａｒｉｔｏｍｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０１（６７５４）：７１３−７１８（１９９９）を参照のこと。残渣の正味静電気電位に寄与するＧ−ＣＳＦに関するアミノ酸残基は、変異誘発の候補として選択される。Ｇ−ＣＳＦ上の６つのこのような残基を同定した：Ａｓｐ１１２、Ａｓｐ１０９、Ｇｌｎ１１９、Ｇｌｎ２０、Ｔｈｒ１１６、およびＧｌｕ１９。特に、提案された単一ヒスチジン置換の３つが作製され、そして試験された：Ａｓｐ１０９Ｈｉｓ（［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦ）、Ａｓｐ１１２Ｈｉｓ（［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦ）、およびＧｌｎ１１９Ｈｉｓ（［Ｈｉｓ１１９］Ｇ−ＣＳＦ）（−１位にメチオニンを有する配列番号２の番号付けを使用する）。
【００５１】
Ｇ−ＣＳＦのヒスチジン変異誘発の理論的根拠は、Ｇ−ＳＣＦおよび／またはＧ−ＣＳＦＲの細胞輸送に影響することである。細胞の表面上のＧ−ＣＳＦＲに結合する際、Ｇ−ＣＳＦは、細胞に内部移行され、そして選別決定が、エンドソーム小胞において行なわれる。複合体の成分は、リソソーム中で分解されるか、またはインタクトで表面に再循環されるかのいずれかであり得る。多数の他のリガンド／レセプター系において、リガンドおよびレセプターが複合体中に残ったままである場合、これらは、優先的に分解される；しかし、この複合体がエンドソーム中で解離する場合、リガンドおよび／またはレセプターの再循環が強化されることが公知である。細胞表面において、環境のｐＨは、およそ７．０である；エンドソームにおいて、ｐＨは、約５．０〜６．０である。アミノ酸のヒスチジンは、このｐＨ範囲で滴定されることが予想される唯一の残基であるので、ヒスチジン置換は、細胞輸送特性に影響することが予想される。より詳細には、単一のヒスチジン変異は、ｐＨ５．０における変異ヒスチジンのプロトン化のみに起因して、ｐＨ７．０対ｐＨ５．０における静電気結合自由エネルギーにおける差異に基づく輸送特性を変更する。
【００５２】
本発明によって特に企図されるのは、野生型Ｇ−ＣＳＦポリペプチドのゲノム配列、ｃＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列の部位特異的変異誘発である。本発明の現在好ましいポリヌクレオチド配列としては、配列番号３［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦ；配列番号５［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦ；配列番号７［Ｈｉｓ１１９］Ｇ−ＣＳＦ；およびそれらのＭｅｔ−１種のＤＮＡ配列が挙げられる。これらのＤＮＡ配列はまた、天然に存在するヒトＧ−ＣＳＦの造血生物学的特性の少なくとも１つを有するＧ−ＣＳＦの別のバージョンをコードするように改変され得る。好ましくは、この生物学的特性は、Ｇ−ＣＳＦレセプターに結合する特性であるが、別の生物学的特性は、造血細胞の増殖を刺激し得る能力である。他の生物学的特性は、当業者に明らかである（例えば、Ｓｏｕｚａ、前出もまた参照のこと）。
【００５３】
これらのＤＮＡ配列は、微生物宿主中でのｍＲＮＡの転写および翻訳を促進するコドンを取り込み得る。このような製造配列は、当該分野で周知の方法に従って容易に構築され得る。Ａｌｔｏｎら、ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ８３／０４０５３号をもまた参照のこと。上記のＤＮＡはまた、必要に応じて、Ｎ末端メチオニル残基をコードする。
【００５４】
本発明によって提供されるＤＮＡ配列は、新規かつ有用なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクター、新規かつ有用な形質転換されたおよびトランスフェクトされた原核生物および真核生物宿主細胞（培養物中で増殖された細菌、酵母、および哺乳動物細胞を含む）、ならびに、本発明のＧ−ＣＳＦアナログを発現し得るこのような宿主細胞の増殖物を培養するための新規であり、かつ有用な方法を作成することにおいて、有用である。本明細書中の生物学的に活性なＧ−ＣＳＦアナログをコードするＤＮＡ配列（または対応するＲＮＡ）は、Ｇ−ＣＳＦの生産不足が緩和されるかまたはＧ−ＣＳＦのレベルの上昇を必要とする場合の遺伝子治療に有用であり得る。
【００５５】
本発明はまた、本発明のＧ−ＣＳＦアナログの組換えＤＮＡ産生のためのプロセスを提供する。以下を包含する、このようなアナログをコードする核酸を含有している宿主細胞からＧ−ＣＳＦアナログを産生するためのプロセスが、提供される：ａ）このようなＤＮＡ分子の発現を促進する条件下で、このようなＧ−ＣＳＦアナログをコードする核酸を含有している上記の宿主細胞を培養する工程；およびｂ）このようなＧ−ＣＳＦアナログを得る工程。
【００５６】
必要に応じて、このプロセスにおいて得られた他の成分からこのようなＧ−ＣＳＦアナログを精製および単離することもできる。精製方法は、米国特許第５，８４９，８８３号に見出され得る（本明細書中で参考として援用されている）。他の方法が、当該分野で周知である（Ｓｏｕｚａ、前出をもまた参照のこと）。
【００５７】
宿主細胞は、原核生物細胞または真核生物細胞であり得、そしてこれには、細菌、哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、サル細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、癌細胞、または他の細胞）、酵母細胞、および昆虫細胞が含まれる。商業的な産生における最も重要なものについては、細菌宿主細胞を使用する産生が好ましい。
【００５８】
（Ｃ．タンパク質の産生）
ヒトＧ−ＣＳＦアナログポリペプチドの上記の開示を考慮すると、当業者がヒトＧ−ＣＳＦアナログポリペプチドを、自動ペプチド合成によって、組換え技術によって、または両方によって産生することが可能である。
【００５９】
本発明のヒトＧ−ＣＳＦアナログは、従来技術に従って溶液中で、または固体支持体上で合成され得る。種々の自動合成装置が市販されており、そして公知のプロトコールに従って使用され得る。例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（１９８４）；Ｔａｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６４４２（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−３４７（１９８６）；ならびにＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１−２８４（１９７９）を参照のこと。これらのそれぞれは本明細書中で参考として援用されている。活性なタンパク質が容易に合成され得、次いで反応性ペプチドを同定するように設計されたスクリーニングアッセイにおいてスクリーニングされ得る。
【００６０】
あるいは、種々の発現ベクター／宿主系が、ヒトＧ−ＣＳＦアナログをコードする配列を含み、そしてそれを発現するように利用され得る。これらとして、以下が挙げられるがこれらに限定されない：微生物（例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌）；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させられた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）でトランスフェクトされたかまたは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは動物細胞系。組換えタンパク質の産生に有用な哺乳動物細胞として、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、および２９３細胞。タンパク質の組換え発現のための例示的なプロトコールが、本明細書中で以下に記載される。
【００６１】
酵母系は、本発明のヒトＧ−ＣＳＦアナログを作成するために使用され得る。ヒトＧ−ＣＳＦアナログｃＤＮＡのコード領域がＰＣＲによって増幅される。酵母プレプロαリーダー配列をコードするＤＮＡが、１〜２０ヌクレオチドのα接合因子遺伝子を含有している１つのプライマー、およびこの遺伝子の２５５〜２３５ヌクレオチドに相補的な別のプライマーを使用するＰＣＲ反応において、酵母のゲノムＤＮＡから増幅される（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３（１９８２））。プレプロαリーダーをコードする配列およびヒトＧ−ＣＳＦアナログをコードする配列フラグメントが、酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２）プロモーターを含有しているプラスミド中に連結され、その結果、プロモーターが成熟ヒトＧ−ＣＳＦアナログポリペプチドに融合されたプレプロα因子からなる融合タンパク質の発現を指向する。ＲｏｓｅおよびＢｒｏａｃｈ（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８５：２３４−２７９、Ｇｏｅｄｄｅｌ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））によって教示されるように、ベクターはさらに、クローニング部位の下流のＡＤＨ２転写終結配列、酵母の「２マイクロン」複製起点、酵母ｌｅｕ−２ｄ遺伝子、酵母ＲＥＰ１およびＲＥＰ２遺伝子、Ｅ．ｃｏｌｉのβ−ラクタマーゼ遺伝子、およびＥ．ｃｏｌｉの複製起点を含む。β−ラクタマーゼおよびｌｅｕ−２ｄ遺伝子は、それぞれ、細菌および酵母中での選択を提供する。ｌｅｕ−２ｄ遺伝子はまた、より高い発現レベルを誘導するために、酵母のプラスミドのコピー数の増大を促進する。ＲＥＰ１およびＲＥＰ２遺伝子は、プラスミドのコピー数の調節に関係している。
【００６２】
先の段落に記載されるＤＮＡ構築物は、公知の方法（例えば、酢酸リチウム処理）を使用して酵母細胞中に形質転換される（Ｓｔｅａｒｎｓら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８５：２８０−２９７（１９９０））。ＡＤＨ２プロモーターは、増殖培地中のグルコースの枯渇の際に誘導される（Ｐｒｉｃｅら、Ｇｅｎｅ  ５５：２８７（１９８７））。プレプロα配列は、細胞からの融合タンパク質の分泌を実行する。それに付随して、酵母ＫＥＸ２タンパク質は、成熟ヒトＧ−ＣＳＦアナログからプレプロ配列を切断する（Ｂｉｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：５３３０−５３３４（１９８４））。
【００６３】
あるいは、ヒトＧ−ＣＳＦアナログは、市販の発現系（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を使用して、製造業者の説明書に従って、酵母中で組換え発現され得る。この系はまた、プレプロα配列が分泌を指向することに依存するが、挿入物の転写は、メタノールによる誘導の際にアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターによって駆動される。
【００６４】
分泌されたヒトＧ−ＣＳＦアナログは、例えば、細菌および哺乳動物の細胞上清からヒトＧ−ＣＳＦアナログを精製するために使用される方法によって、酵母増殖培地から精製される。
【００６５】
あるいは、ヒトＧ−ＣＳＦアナログをコードするｃＤＮＡは、バキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中にクローン化され得る。このヒトＧ−ＣＳＦアナログを含有しているベクターは、次いで、ｓＦ９タンパク質非含有培地中のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染させ、そして組換えタンパク質を産生するために、製造業者の説明書（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に従って使用される。タンパク質は、ヘパリン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）および連続分子サイジングカラム（Ａｍｉｃｏｎ  Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用して精製されそして培地から濃縮され、そしてＰＢＳ中に再懸濁される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、単一のバンドを示し、そしてタンパク質の大きさを確認する。そしてＰｒｏｔｏｎ  ２０９０  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ上でのＥｄｍａｎ配列決定によって、そのＮ末端配列を確認する。
【００６６】
あるいは、ヒトＧ−ＣＳＦアナログは、昆虫系中で発現され得る。タンパク質発現のための昆虫系は、当業者に周知である。１つのこのような系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ（ＡｃＮＰＶ）が、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａの幼虫の中で外来遺伝子を発現されるためのベクターとして使用される。ヒトＧ−ＣＳＦアナログをコードする配列が、ウイルスの必須ではない領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中にクローン化され、そしてポリヘドリンプロモーターの制御下に配置される。ヒトＧ−ＣＳＦアナログの挿入の成功によって、ポリヘドリン遺伝子を不活化し、そしてコートタンパク質のコーティングを有さない組換えウイルスを産生する。次いで、組換えウイルスは、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａの幼虫を感染させるために使用される。その中で、ヒトＧ−ＣＳＦアナログが発現される（Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５８４（１９８３）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ  ＥＫら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３２２４−７（１９９４））。
【００６７】
別の例においては、タンパク質の成熟形態をコードするＤＮＡ配列がＰＣＲによって増幅され、そして適切なベクター（例えば、ｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））中にクローン化される。ｐＧＥＸベクターは、このベクターによってコードされるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびこのベクターのクローニングサイト中に挿入されたＤＮＡフラグメントによってコードされるタンパク質を含有している融合タンパク質を産生するように設計されている。ＰＣＲのためのプライマーは、例えば、適切な切断部位を含むように作製され得る。
【００６８】
次いで、この組換え融合タンパク質は、融合タンパク質のＧＳＴ部分から切断され得る。ｐＧＥＸ−３Ｘ／ヒトＧ−ＣＳＦアナログ構築物は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）中に形質転換され、そして個々の形質転換体は、単離されそして増殖させられる。個々の形質転換体に由来するプラスミドＤＮＡが精製され、そして所望のヒトＧ−ＣＳＦアナログをコードする遺伝子挿入物の適切な方向での存在を確認するために、自動配列決定装置を使用して部分的に配列決定される。
【００６９】
本発明の特定の実施態様は、合成ペプチド合成装置および続くＦＰＬＣ分析ならびにシステイン二重結合の適切な再折り畳みを使用してヒトＧ−ＣＳＦアナログタンパク質を産生することを意図するが、組換えタンパク質の産生もまた、ヒトＧ−ＣＳＦアナログペプチド組成物を産生するために使用され得ることが意図される。例えば、ＧＳＴ／ヒトＧ−ＣＳＦアナログ融合タンパク質の誘導は、６００ｎｍの波長で０．４の吸光度にまで、ＬＢ培地（カルベニシリンを補充した）中で３７℃にて、形質転換したＸＬ−１  Ｂｌｕｅ培養物を増殖させること、続いて０．５ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）の存在下でさらに４時間インキュベートすることによって達成される。
【００７０】
細菌中で不溶性封入体として産生されると予想される、この融合タンパク質は、以下のように精製され得る。細胞は、遠心分離によって回収され；０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１ｍＭのＥＤＴＡ中で洗浄され；そして０．１ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）で室温で１５分間処理される。溶解物は超音波処理によって明澄化され、そして細胞の破片は、１２，０００×ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化される。融合タンパク質を含有しているペレットは、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）および１０ｍＭのＥＤＴＡ中に再懸濁され、５０％のグリセロール上に重層され、そして６０００×ｇで３０分間遠心分離される。ペレットは、Ｍｇ＋＋およびＣａ＋＋を含まない標準的なリン酸緩衝化生理食塩水溶液（ＰＢＳ）中に再懸濁される。融合タンパク質はさらに、変性ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で再懸濁されたペレットを分画することによって精製される（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。このゲルは、タンパク質を視覚化するために０．４ＭのＫＣｌ中に浸される。タンパク質は、切り取られ、そしてＳＤＳを含まないゲル泳動緩衝液中で電気的に溶出される。ＧＳＴ／ヒトＧ−ＣＳＦアナログ融合タンパク質は、可溶性タンパク質として細菌中で産生される場合には、ＧＳＴ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して精製され得る。
【００７１】
この融合タンパク質は、成熟ヒトＧ−ＣＳＦアナログタンパク質からＧＳＴを切断するための消化に供され得る。消化反応物（２０〜４０μｇの融合タンパク質、２０〜３０単位のヒトトロンビン（０．５ｍＬのＰＢＳ中の４０００Ｕ／ｍｇ（Ｓｉｇｍａ））は、室温で１６〜４８時間インキュベートされ、そして反応生成物を分画するために変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に充填される。ゲルは、タンパク質のバンドを視覚化するために０．４ＭのＫＣｌ中に浸される。ヒトＧ−ＣＳＦアナログの予想される分子量に対応するタンパク質のバンドの同定は、自動配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ４７３Ａ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、部分的アミノ酸配列分析によって確認され得る。
【００７２】
あるいは、予想される成熟ヒトＧ−ＣＳＦアナログタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、所望のプロモーター、および必要に応じてリーダー配列を含有しているプラスミド中にクローン化され得る（例えば、Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−４３（１９８８）を参照のこと）。この構築物の配列は、自動配列決定によって確認され得る。次いで、このプラスミドは、ＣａＣｌ２インキュベーションおよび細菌の熱ショック処理を利用する標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１株に形質転換される。形質転換された細菌は、カルベニシリンを補充したＬＢ培地中で増殖させられ、そして発現されるタンパク質の産生は、適切な培地中での増殖によって誘導される。存在する場合には、リーダー配列は、成熟ヒトＧ−ＣＳＦアナログタンパク質の分泌に影響を与え、そして分泌の間に切断される。
【００７３】
分泌された組換えタンパク質は、本明細書中で以下に記載される方法によって細菌培養培地から精製される。
【００７４】
組換えタンパク質の発現のための哺乳動物宿主系もまた、当業者に周知である。宿主細胞株は、発現されたタンパク質をプロセシングするか、タンパク質活性を提供する際に有用である特定の翻訳後修飾を生じる特定の能力について選択され得る。ポリペプチドのこのような改変として、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングもまた、正確な挿入、折り畳み、および／または機能のために重要であり得る。種々の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８など）は、特定の細胞機構およびこのような翻訳後活性についての特徴的な機構を有し、そして導入された外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするように選択され得る。
【００７５】
本発明のヒトＧ−ＣＳＦアナログタンパク質の組換え発現の特に好ましい方法において、２９３細胞は、ｐＣＭＶベクター（５’ＣＭＶプロモーター、３’ＨＧＨポリＡ配列）中にヒトＧ−ＣＳＦアナログｃＤＮＡを含有しているプラスミドおよびｐＳＶ２ｎｅｏ（ｎｅｏ耐性遺伝子を含有している）を用いて、リン酸カルシウム法によって同時トランスフェクトされる。好ましくは、これらのベクターは、トランスフェクションの前にＳｃａＩで直鎖状にされるべきである。同様に、ｎｅｏ遺伝子が取り込まれた類似のｐＣＭＶベクターを使用する代替の構築物が、使用され得る。安定な細胞株が、１０〜１４日間の、０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（ネオマイシン様抗生物質）を含有している増殖培地中での限界稀釈によって、単一の細胞クローンから選択される。細胞株は、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロットによってヒトＧ−ＣＳＦアナログの発現についてスクリーニングされ、そして高く発現する細胞株が、大規模な増殖のために拡大させられる。
【００７６】
形質転換された細胞が、長期の高収量のタンパク質の産生のために使用されることが好ましく、そしてこのような安定な発現が所望される。一旦、このような細胞が、所望の発現カセットとともに選択マーカーを含むベクターで形質転換されると、この細胞は、富化培地中で１〜２日間増殖させられ得、その後、選択培地に切り替えられる。選択マーカーは、選択のための耐性を付与するように設計され、そしてその存在は、導入された配列を良好に発現する細胞の増殖および回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の抵抗性の凝集塊は、この細胞に適切な組織培養技術を使用して増殖され得る。
【００７７】
多数の選択系が、組換えタンパク質の産生のために形質転換されている細胞を回収するために使用され得る。このような選択系として、それぞれ、ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞またはａｐｒｔ細胞中の、ＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗剤耐性は、ｄｈｆｒ（メトトレキセートに対する耐性を付与する）；ｇｐｔ（ミコフェノール酸に対する耐性を付与する）；ｎｅｏ（アミノグリコシドであるＧ４１８に対する耐性を付与する；また、クロルスルフロンに対する耐性を付与する）；およびｈｙｇｒｏ（ハイグロマイシンに対する耐性を付与する）についての選択基準として使用され得る。有用であり得るさらなる選択可能な遺伝子として、ｔｒｐＢ（これは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする）またはｈｉｓＤ（これは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする）が挙げられる。形質転換体の同定のための視覚的な指標を生じるマーカーとして、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質であるＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質であるルシフェリンが挙げられる。
【００７８】
（Ｄ．タンパク質の精製）
本発明によって生成されるヒトＧ−ＣＳＦアナログタンパク質を精製することが所望される。タンパク質の精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、あるレベルでの、ポリペプチドおよび非ポリペプチド画分への、細胞環境の粗分画化を含む。他のタンパク質からポリペプチドを分離すると、目的のポリペプチドがさらに、部分的または完全な精製（すなわち、均質までの精製）を達成するために、クロマトグラフィー技術および電気泳動技術を使用して精製され得る。純粋なペプチドの調製に特に適している分析方法は、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動である。特に効果的なペプチド精製方法は、高速タンパク質液体クロマトグラフィー、またはさらにＨＰＬＣである。
【００７９】
本発明の特定の局面は、精製に関し、そして特定の実施態様においては、コードされるタンパク質またはペプチドの実質的な精製に関する。用語「精製されたタンパク質またはペプチド」は、本明細書中で使用される場合には、他の成分から単離可能な組成物をいうことが意図される。ここで、このタンパク質またはペプチドは、その天然に得ることができる状態と比較していくらかの程度精製されている。従って、精製されたタンパク質またはペプチドはまた、それが天然に存在し得る環境から分離されている、タンパク質またはペプチドをいう。
【００８０】
一般的には、「精製された」は、種々の他の成分を除くために分画化に供されたタンパク質またはペプチド組成物をいい、そしてこの組成物は、その発現された生物学的活性を実質的に保持している。用語「実質的に精製された」が使用される場合には、この表記は、タンパク質またはペプチドが組成物の主要な成分を形成する（例えば、組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれ以上を構成する）組成物をいう。
【００８１】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量化するための種々の方法は、本発明の開示を参照して当業者に公知である。これらには、例えば、活性な画分の特定の活性を決定する工程、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析により画分中のポリペプチドの量を評価する工程が含まれる。画分の純度を評価するための好ましい方法は、その画分の特定の活性を計算し、最初の抽出物のその特定の活性に対してその画分を比較し、このようにして「〜倍の精製（−ｆｏｌｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）」によって本明細書中で評価される純度を計算することである。活性の量を示すために使用される実際の単位は、もちろん、精製後に選択される特定のアッセイ技術、および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すかどうかに依存する。
【００８２】
タンパク質の精製における使用に適切な種々の技術が、当業者に周知である。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などでの沈殿；熱変性、続く遠心分離；イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびアフィニティークロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー工程；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにこのような技術および他の技術の組合せが挙げられる。当該分野で一般的に公知であるように、種々の精製工程を実行する順序が変更され得るか、またはその特定の工程が省略され得、そしてなお実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製のための適切な方法を生じると考えられる。
【００８３】
タンパク質またはペプチドがそれらの最も精製された状態で常に提供されることは、普遍的な必要条件ではない。実際、実質的にはあまり精製されていない産物が特定の実施態様において有用性を有することが意図される。部分的な精製は、より少ない精製工程を組合せて使用することによって、または同じ一般的な精製スキームの異なる形態を利用することによって、達成され得る。例えば、ＨＰＬＣ装置を利用して行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に、低圧クロマトグラフィーシステムを利用する同じ技術よりも大きな「〜倍の」精製を生じることが認識されている。比較的低い程度の精製を示す方法は、タンパク質生成物の全体的な回収において、または発現されたタンパク質の活性を維持する際に利点を有し得る。
【００８４】
ポリペプチドの移動が、異なる条件のＳＤＳ／ＰＡＧＥ（Ｃａｐａｌｄｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．７６：４２５（１９７７））で、しばしば有意に変化し得ることが公知である。従って、異なる電気泳動条件下では、精製されたかまたは部分的に精製された発現産物の見かけの分子量は異なり得ることが理解される。
【００８５】
必要に応じて、プロセスにおいて得られた他の成分からこのようなＧ−ＣＳＦアナログを精製および単離することが可能である。精製方法は、米国特許第５，８４９，８８３号に見出され得る（これは、本明細書中で参考として援用されている）。他の方法が、当該分野で周知である（Ｓｏｕｚａ、前出をもまた参照のこと、それぞれが本明細書中で参考として援用されている）。これらの文献は、本発明のＧ−ＣＳＦアナログの単離および精製に有用であり得るＧ−ＣＳＦ組成物の単離および精製のための特定の例示的方法を記載している。これらの特許の開示を鑑み、当業者は、所定の供給源からＧ−ＣＳＦを精製するために使用され得る多数の精製技術を十分に認識していることが明らかである。
【００８６】
陰イオン交換クロマトグラフィーとイムノアフィニティークロマトグラフィーとの組合せが、本発明の精製されたＧ−ＣＳＦアナログ組成物を産生するために使用され得ることもまた、意図される。
【００８７】
（Ｅ．クローニング、遺伝子導入、および発現のためのベクター）
上記の節で議論されるように、発現ベクターは、ヒトＧ−ＣＳＦアナログポリペプチド産物を発現するために使用され、この産物は次いで、好中球減少症の処置のために精製および使用され得る。他の実施態様においては、発現ベクターは、ヒトＧ−ＣＳＦアナログをコードする核酸を、それを必要としている細胞中に導入するため、および／またはそのような細胞中でのヒトＧ−ＣＳＦアナログの発現を誘導するための遺伝子治療適用において使用され得る。この節は、このような発現ベクターの産生の記載に関する。
【００８８】
発現は、適切なシグナルが、種々の調節エレメント（例えば、宿主細胞中での目的の遺伝子の発現を駆動する、ウイルスおよび哺乳動物の両方の供給源に由来するエンハンサー／プロモーター）を含むベクター中に提供されることを必要とする。宿主細胞中でのメッセンジャーＲＮＡの安定性および翻訳可能性を最適化するように設計されたエレメントもまた、記載される。生成物を発現する、永久に安定な細胞クローンを確立するための、多数の優性薬物選択マーカーの使用のための条件もまた、提供される。なぜなら、これは、ポリペプチドの発現のための薬物選択マーカーの発現と連関する要素であるからである。
【００８９】
（ａ．調節エレメント）
（プロモーターおよびエンハンサー）本出願の全体に渡って、用語「発現構築物」または「発現ベクター」は、遺伝子産物をコードする核酸を含む任意の型の遺伝子構築物を含むことが意味され、ここで、核酸コード配列の一部またはすべてが、転写され得る。転写物は、タンパク質に翻訳され得るが、しかし翻訳される必要性はない。特定の実施形態において、発現は、遺伝子の転写および遺伝子産物へのｍＲＮＡの翻訳の両方を含む。遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの翻訳制御下にある。「プロモーター」は、細胞の合成機構によって認識されるか、または遺伝子の特異的転写の開始に必要な合成機構を導入するＤＮＡ配列をいう。句「転写制御下」は、プロモーターが、核酸に関して正確な位置および配向にあって、ＲＮＡポリメーラゼの開始および遺伝子の発現を制御することを意味する。
【００９０】
用語「プロモーター」は、本明細書中で使用されて、ＲＮＡポリメラーゼＩＩについての開始部位の周囲に密集する転写制御モジュールの群をいう。プロモーターの編成のされ方についての見解の多くは、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）およびＳＶ４０初期転写単位についてのプロモーターを含むいくつかのウイルスプロモーターの分析に由来する。より最近の研究によって強化されたこれらの研究は、プロモーターが、別個の機能的モジュールから構成され、各々が、およそ７〜２０ｂｐのＤＮＡからなり、そして転写アクチベーターまたはリプレッサータンパク質についての１つ以上の認識部位を含むことを示している。
【００９１】
各々のプロモーターにおいて少なくとも１つのモジュールは、ＲＮＡ合成についての開始部位を配置するように機能する。これの最も良く知られた例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーター（例えば、哺乳動物ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子についてのプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子についてのプロモーター）において、その開始部位上に重なる別個のエレメントそれ自体が、開始の場所の固定を助ける。
【００９２】
さらなるプロモーターエレメントが、転写開始の頻度を調節する。代表的には、これらは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、多くのプロモーターが、開始部位の下流に機能的エレメントを同様に含むことが最近示されている。プロモーターエレメント間の間隔は、しばしば順応性があり、その結果、プロモーター機能は、エレメントが互いに関して逆転または移動される場合に保持される。ｔｋプロモーターにおいて、プロモーターエレメント間の間隔は、５０ｂｐまで離れて増大され得、その後、活性が低下し始める。このプロモーターに依存して、個々のエレメントが、協同的または独立的のいずれかで機能して、転写を活性化し得るようである。
【００９３】
目的の核酸配列の発現の制御に利用される特定のプロモーターは、標的細胞において核酸の発現を指向し得る限りは、重要ではないと考えられる。従って、ヒト細胞が標的化される場合、プロモーターの近傍およびそのプロモーターの制御下に、核酸コード領域を配置することが好ましく、このプロモーターは、ヒト細胞において発現され得る。一般的に言えば、このようなプロモーターは、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターのいずれかを含み得る。
【００９４】
種々の実施形態において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復、β−アクチン、ラットインスリンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーターおよびグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター（これらのすべては、周知のプロモーターであり、そして当業者に容易に利用可能である）が使用されて、目的のコード配列の高レベルの発現を獲得し得る。発現のレベルが、所定の目的に十分であれば、当該分野で周知であり、目的のコード配列の発現を達成する他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞性プロモーターあるいは細菌性ファージプロモーターの使用が、同様に意図される。周知の性質を有するプロモーターを利用することによって、トランスフェクションまたは形質転換後の目的のタンパク質発現のレベルおよびパターンが、最適化され得る。
【００９５】
特定の生理学的シグナルまたは合成シグナルに応答して調節されるプロモーターの選択は、遺伝子産物の誘導性の発現を可能にし得る。いくつかの誘導性のプロモーター系は、ウイルスベクターの産生のために利用可能である。１つのこのような系は、哺乳動物細胞における目的の遺伝子発現の調節を可能にするように設計されたエクジソン系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。この系は、導入遺伝子の基礎的レベルの発現は実質的に不可能であるが、２００倍を超える誘導可能性を可能にする厳重に調節された発現機構からなる。
【００９６】
有用である別の誘導可能な系は、Ｔｅｔ−ＯｆｆＴＭ系またはＴｅｔ−ＯｎＴＭ系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）であり、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄによって本来開発された［ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １５；８９（１２）：５５４７〜５１（１９９２）；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８（５２１８）：１７６６〜９（１９９５）］。
【００９７】
いくつかの状況において、遺伝子治療ベクターにおける導入遺伝子発現の調節が望ましくあり得る。例えば、種々の活性強度を有する異なるウイルスプロモーターが、所望の発現レベルに依存して利用され得る。哺乳動物細胞において、ＣＭＶ前初期プロモーターが頻繁に使用されて、強力な転写活性化を提供する。より強力ではないＣＭＶプロモーターの改変バージョンがまた、導入遺伝子の発現レベルの減少が所望される場合に使用されている。造血細胞における導入遺伝子の発現が所望される場合、レトロウイルスプロモーター（例えば、ＭＬＶまたはＭＭＴＶ由来のＬＴＲ）が、頻繁に使用される。所望の効果に依存して使用され得る他のウイルスプロモーターとしては、ＳＶ４０、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＨＩＶ−１  ＬＴＲおよびＨＩＶ−２  ＬＴＲ、アデノウイルスプロモーター（例えば、Ｅ１Ａ、Ｅ２ＡまたはＭＬＰ領域由来のプロモーター）、ＡＡＶ  ＬＴＲ、カリフラワーモザイクウイルス、ＨＳＶ−ＴＫならびにトリ肉腫ウイルスが挙げられる。
【００９８】
同様に、非標的組織に対する潜在的毒性または望ましくない効果を減少するように、組織特異的プロモーターが使用されて、特定の組織または細胞において転写を果たし得る。例えば、ＰＳＡ、プロバシン（ｐｒｏｂａｓｉｎ）、前立腺酸性ホスファターゼまたは前立腺特異的腺カリクレイン（ｈＫ２）のようなプロモーターが使用されて、前立腺における遺伝子発現を標的し得る。
【００９９】
特定の指示において、遺伝子治療ベクターの投与後に、特定の時間で転写を活性化することが望ましくあり得る。これは、ホルモンまたはサイトカイン調節可能であるようなプロモーターを用いて行われ得る。例えば、遺伝子治療適用において（ここで、適応症は、特定のステロイドが産生されるかまたは送られる性腺組織である）、アンドロゲン調節プロモーターまたはエストロゲン調節プロモーターの使用が有利であり得る。ホルモン調節可能なこのようなプロモーターとしては、ＭＭＴＶ、ＭＴ−１、エクジソンおよびＲｕＢｉｓｃｏが挙げられる。他のホルモン調節プロモーター（例えば、甲状腺ホルモン、下垂体ホルモンおよび副腎ホルモンに応答するプロモーター）が、本発明において有用であることが期待される。使用され得るサイトカインおよび炎症性タンパク質応答プロモーターとしては、ＫキニノーゲンおよびＴキニノーゲン  ［Ｋａｇｅｙａｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（５）２３４５〜５１（１９８７）］、ｃ−ｆｏｓ、ＴＮＦ−α、Ｃ反応性タンパク質［Ａｒｃｏｎｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６（８）：３１９５〜２０７（１９８８）］、ハプトグロビン［Ｏｌｉｖｉｅｒｏら、ＥＭＢＯ  Ｊ．６（７）：１９０５〜１２（１９８７）］、血清アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰα、ＩＬ−１、ＩＬ−６［ＰｏｌｉおよびＣｏｒｔｅｓｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６（２１）：８２０２〜６（１９８９）］、補体Ｃ３［Ｗｉｌｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０（１２）：６１８１〜９１（１９９０）］、ＩＬ−８、α−１酸性糖タンパク質［ＰｒｏｗｓｅおよびＢａｕｍａｎｎ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８（１）：４２〜５１（１９８８）］、α−１アンチトリプシン、リポタンパク質リパーゼ［Ｚｅｃｈｎｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８（６）：２３９４〜４０１（１９８８）］、アンギオテンシノーゲン［Ｒｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１（５）：２８８７〜９５（１９９１）］、フィブリノーゲン、ｃ−ｊｕｎ（ホルボールエステル、ＴＮＦ−α、ＵＶ照射、レチノイン酸および過酸化水素によって誘導性である）、コラゲナーゼ（ホルボールエステルおよびレチノイン酸によって誘導される）、メタロチオネイン（重金属およびグルココルチコイド誘導性）、ストロメライシン（ホルボールエステル、インターロイキン−１およびＥＧＦによって誘導性である）α−２マクログロブリンならびにα−１アンチキモトリプシンが挙げられる。
【０１００】
本発明に従って使用され得る他のプロモーターとしては、Ｌａｃ調節可能な熱（高熱）誘導性プロモーター、および放射線誘導性プロモーター（例えば、ＥＧＲ［Ｊｏｋｉら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６（１２）：１５０７〜１３（１９９５）］）、α−インヒビン、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ  ｔＲＮＡ  ｍｅｔならびに他のアミノ酸プロモーターであるＵ１  ｓｎＲＮＡ［Ｂａｒｔｌｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２０；９３（１７）：８８５２〜７（１９９６）］、ＭＣ−Ｉ、ＰＧＫ、β−アクチンおよびα−グロビンが挙げられる。有用であり得る多くの他のプロモーターは、ＷａｌｔｈｅｒおよびＳｔｅｉｎ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７４（７）：３７９〜９２（１９９６）］に列挙される。
【０１０１】
単独または別のプロモーターと組み合わせた上記のプロモーターのいずれかが、所望の作用に依存して、本発明に従って有用であり得ることが予見される。さらに、プロモーターのリストは、網羅的または制限されるように解釈されるべきではなく、そして本明細書中で開示されるプロモーターおよび方法とともに使用され得る他のプロモーターは、当業者に公知である。
【０１０２】
本発明における使用について意図される別の調節エレメントは、エンハンサーである。遺伝子エレメントが存在し、これは、ＤＮＡの同じ分子上の異なる位置に位置するプロモーターからの転写を増大する。エンハンサーは、プロモーターのように編成される。すなわち、エンハンサーは、多くの個々のエレメントから構成され、これらの各々は、１つ以上の転写タンパク質に結合する。エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な差異は、操作である。全体としてのエンハンサー領域は、少し離れて転写を刺激し得なければならない；これは、プロモーター領域またはその成分エレメントにも該当する必要はない。一方、プロモーターは、１つ以上のエレメントを有さなければならず、このエレメントは、特定の部位および特定の配向で、ＲＮＡ合成の開始を指向し、一方、エンハンサーは、これらの特異性を欠如する。プロモーターおよびエンハンサーは、頻繁に重複および連続し、頻繁に、極めて類似のモジュラー編成を有するようである。本発明に有用なエンハンサーは、当業者に周知であり、そして利用されている特定の発現系に依存する［Ｓｃｈａｒｆら、Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５〜６２（１９９４）；Ｂｉｔｔｎｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６〜５４４（１９８７）］。
【０１０３】
（ポリアデニル化シグナル）ｃＤＮＡ挿入物が利用される場合、代表的には、ポリアデニル化シグナルを含むことが望まれて、遺伝子転写物の適切なポリアデニル化を果たす。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の首尾良い実行に決定的ではないと考えられ、そして、ヒトまたはウシの成長ホルモンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのような任意のこのような配列が利用され得る。また、ターミネーターが、発現カセットのエレメントとして意図される。これらのエレメントが、メッセージレベルの増強、および他の配列へのカセットからの読み過ごし（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）の最小化に役立ち得る。
【０１０４】
（ＩＲＥＳ）本発明の特定の実施形態において、内部リボソーム侵入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）（ＩＲＥＳ）エレメントが、多重遺伝子メッセージまたは多シストロン性メッセージを作製することが意図される。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化キャップ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを回避し得、そして内部部位で翻訳を開始し得る［ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：３２０〜３２５（１９８８）］。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオウイルスおよび脳心筋炎）由来のＩＲＥＳエレメント（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８、前出）、ならびに哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳ［ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ、Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：９０〜９４（１９９１）］が記載されている。ＩＲＥＳエレメントは、異種のオープンリーディングフレームに結合され得る。複数のオープンリーディングフレームは、ともに転写され得、各々は、ＩＲＥＳによって分離され、多シストロン性メッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントによって、各々のオープンリーディングフレームは、効率的な翻訳についてリボソームにアクセス可能である。複数の遺伝子は、１つのプロモーター／エンハンサーを用いて、効率的に発現されて、１つのメッセージを転写し得る。
【０１０５】
任意の異種オープンリーディングフレームは、ＩＲＥＳエレメントに結合され得る。これは、分泌タンパク質、独立の遺伝子によってコードされるマルチサブユニットタンパク質、細胞内タンパク質または膜結合タンパク質、および選択可能マーカーについての遺伝子を含む。このようにして、いくつかのタンパク質の発現は、１つの構築物および１つの選択可能マーカーとともに、１つの細胞中において同時に操作され得る。
【０１０６】
（ｂ．発現ベクターの送達）
発現ベクターが細胞に導入され得る多くの方法が存在する。本発明の特定の実施形態において、発現構築物は、ウイルスゲノムに由来するウイルス構築物または操作された構築物を含む。他の実施形態において、非ウイルス性送達が意図される。レセプター媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に入り、宿主細胞ゲノム中に組込み、そして安定かつ有効にウイルス遺伝子を発現する特定のウイルスの能力は、これらのウイルスを、哺乳動物遺伝子への外来遺伝子の移入についての興味を引く候補物にする［Ｒｉｄｇｅｗａｙ、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ、ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ（編）、Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、４６７〜４９２、１９８８；ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ、ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ（編）、Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、４９３〜５１３、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（編）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１１７〜１４８、１９８６；Ｔｅｍｉｎ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（編）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、１４９〜１８８、１９８６］。遺伝子ベクターとして使用される第一のウイルスは、パポバウイルス（シミアンウイルス４０、ウシパピローマウイルスおよびポリオーマ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８、前出；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６、前出）ならびにアデノウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８、前出；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６、前出）を含むＤＮＡウイルスであった。これらは、外来ＤＮＡ配列について、比較的低い受容力を有し、そして制限された宿主スペクトルを有する。さらに、許容細胞におけるこれらの腫瘍形成の可能性および細胞変性効果が、安全性懸念を高める。これらは、８ｋｂまでのみの外来遺伝物質を収容し得るが、種々の細胞株および実験動物に容易に導入され得る（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８、前出；Ｔｅｍｉｎ、１９８６、前出）。
【０１０７】
ＤＮＡが、種々のウイルスベクターを用いて細胞に導入され得ることが、現在広く認識される。このような実施形態において、目的の遺伝子を含むウイルスベクターを含む発現構築物は、以下であり得る：アデノウイルスベクター（例えば、各々が、本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，８２４，５４４号；米国特許第５，７０７，６１８号；米国特許第５，６９３，５０９号；米国特許第５，６７０，４８８号；米国特許第５，５８５，３６２号を参照のこと）、レトロウイルスベクター（例えば、各々が、本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，８８８，５０２号；米国特許第５，８３０，７２５号；米国特許第５，７７０，４１４号；米国特許第５，６８６，２７８号；および米国特許第４，８６１，７１９号を参照のこと）、アデノ随伴ウイルスベクター（例えば、各々が、本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，４７４，９３５号；米国特許第５，１３９，９４１号；米国特許第５，６２２，８５６号；米国特許第５，６５８，７７６号；米国特許第５，７７３，２８９号；米国特許第５，７８９，３９０号；米国特許第５，８３４，４４１号；米国特許第５，８６３，５４１号；米国特許第５，８５１，５２１号；および米国特許第５，２５２，４７９号を参照のこと）、アデノウイルス−アデノ随伴ウイルスハイブリッドベクター（例えば、本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，８５６，１５２号を参照のこと）あるいはワクシニアウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクター（例えば、各々が、本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，８７９，９３４号；米国特許第５，８４９，５７１号；米国特許第５，８３０，７２７号；米国特許第５，６６１，０３３号；および米国特許第５，３２８，６８８号を参照のこと）。
【０１０８】
遺伝子構築物のウイルス移入に対する多くの代案が存在する。この節は、非ウイルス性遺伝子移入の方法および組成物の議論を提供する。本発明のＤＮＡ構築物は、一般的に、細胞に送達され、そして特定の状況において、移入されるべき核酸またはタンパク質が、非ウイルス性方法を用いて移入され得る。
【０１０９】
培養哺乳動物細胞への発現構築物の移入についてのいくつかの非ウイルス性方法が、本発明によって意図される。これらとしては、リン酸カルシウム沈殿［ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６〜４６７（１９７３）；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２７４５〜２７５２（１９８７）；Ｒｉｐｐｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：６８９〜６９５（１９９０）］、ＤＥＡＥ−デキストラン［Ｇｏｐａｌ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：１１８８〜１１９０（１９８５）］、エレクトロポレーション［Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：７１６〜７１８（１９８６）；Ｐｏｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：７１６１〜７１６５（１９８４）］、直接微量注入［ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０１：１０９４〜１０９９（１９８５）］、ＤＮＡ負荷リポソーム［ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．７２１：１８５〜１９０（１９８２）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：３３４８〜３３５２（１９７９）；Ｆｅｌｇｎｅｒ、Ｓｃｉ．Ａｍ．２７６（６）：１０２〜１０６（１９９７）；Ｆｅｌｇｎｅｒ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７（１５）：１７９１〜３（１９９６）］、細胞超音波処理［Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：８４６３〜８４６７（１９８７）］、高速微小発射体を用いた遺伝子ボンバードメント［Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９５６８〜９５７２（１９９０）］、ならびにレセプター媒介性トランスフェクション［ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２（１９８７）；ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７：８８７〜８９２（１９８８）；ＷｕおよびＷｕ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．１２：１５９〜１６７（１９９３）］が挙げられる。
【０１１０】
一旦、構築物が細胞に送達されると、治療遺伝子をコードする核酸が、異なる部位に配置され、そして発現され得る。特定の実施形態において、治療遺伝子をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定に組込まれ得る。この組込みは、相同組換えを介して、同族の位置および配向になり得るか（遺伝子置換）、またはランダムな非特異的位置に組込まれ得る（遺伝子増強）。なおさらなる実施形態において、核酸は、分離されたエピソームセグメントのＤＮＡとして、細胞において安定に維持され得る。このような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞サイクルから独立して、またはこの宿主細胞サイクルと同時に、維持および複製を可能にするに十分な配列をコードする。発現構築物が細胞に送達される理由、および核酸がとどまる細胞内の場所は、利用される発現構築物の型に依存する。
【０１１１】
本発明の特定の実施形態において、発現構築物は、リポソームに捕捉され得る。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒体によって特徴付けられる小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離される複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁される場合、自発的に形成する。脂質成分は、脂質二重層間の閉構造ならびに捕捉水および溶解溶質の形成の前に、自己再配列を受ける［ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ、Ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｌｉｇａｎｄｓ、ＷｕおよびＷｕ（編）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、８７〜１０４頁（１９９１）］。陽イオン性リポソームへのＤＮＡの添加は、リポソームから光学的に複屈折の液体−クリスタリン濃縮小球への位相転移を引き起こす［Ｒａｄｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５（５３０１）：８１０〜４（１９９７）］。これらのＤＮＡ−脂質複合体は、遺伝子治療および送達における使用について、潜在的な非ウイルスベクターである。
【０１１２】
インビトロでの外来ＤＮＡのリポソーム媒介性核酸送達および発現は、極めて首尾良い。また、本発明において、「リポフェクション」技術を含む種々の商業的アプローチが意図される。本発明の特定の実施形態において、リポソームは、赤血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）と複合体化され得る。これは、細胞膜との融合を容易にし、そしてリポソーム被包性ＤＮＡの細胞エントリーを促進することが示されている［Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：３７５〜３７８（１９８９）］。他の実施形態において、リポソームは、核の非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）とともに複合体化され得るか、または利用され得る［Ｋａｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：３３６１〜３３６４（１９９１）］。なおさらなる実施形態において、リポソームは、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方とともに複合体化され得るか、または利用され得る。これにおいて、このような発現構築物が、インビトロおよびインビボで、核酸の移入および発現に首尾良く利用されている。次いで、このような発現構築物は、本発明について適用可能である。
【０１１３】
治療遺伝子をコードする核酸の細胞への送達に利用され得る他のベクター送達系は、レセプター媒介性送達ビヒクルを含む。これらは、ほぼすべての真核生物細胞におけるレセプター媒介性エンドサイトーシスによって、高分子の選択的取り込みを利用する。種々のレセプターの細胞型特異的分布のために、送達は、極めて特異的であり得る（ＷｕおよびＷｕ、１９９３、前出）。
【０１１４】
レセプター媒介性の遺伝子標的ビヒクルは、一般的に、以下の２つの成分からなる：細胞レセプター特異的リガンドおよびＤＮＡ結合因子。いくつかのリガンドは、レセプター媒介性の遺伝子移入について使用されている。最も広範に特徴付けられるリガンドは、アシアロオロソムコイド（ａｓｉａｌｏｏｒｏｓｏｍｕｃｏｉｄ）（ＡＳＯＲ）（ＷｕおよびＷｕ、１９８７、前出）およびトランスフェリンである［Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７（９）：３４１０〜３４１４（１９９０）］。最近、合成の最新糖タンパク質（これは、ＡＳＯＲと同じレセプターを認識する）が、遺伝子送達ビヒクルとして使用されており［Ｆｅｒｋｏｌら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：１０８１〜１０９１（１９９３）；Ｐｅｒａｌｅｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４０８６〜４０９０（１９９４）］、そして上皮増殖因子（ＥＧＦ）がまた使用されて、扁平上皮癌細胞に遺伝子を送達している（Ｍｙｅｒｓ、ＥＰＯ  ０２７３０８５）。
【０１１５】
他の実施形態において、送達ビヒクルは、リガンドおよびリポソームを含み得る。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕら［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１５７〜１７６（１９８７）］は、リポソームに組込まれるラクトシル（ｌａｃｔｏｓｙｌ）−セラミド、ガラクトース末端アシアロガングリオシド（ａｓｉａｌｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ）を利用し、そして肝細胞によるインスリン遺伝子の取り込みにおける増大を観察した。従って、治療遺伝子をコードする核酸がまた、リポソームを含むかまたは含まない任意の数のレセプター−リガンド系によって、特定の細胞型に特異的に送達され得ることが実現可能である。
【０１１６】
本発明の別の実施形態において、発現構築物は、単に、裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドからなり得る。構築物の移入は、上記の方法のいずれかによって行われ得、この方法は、物理学的または化学的に細胞膜を透過する。これは、特にインビトロ移入について適用可能である；しかし、同様にインビボ使用について適用され得る。Ｄｕｂｅｎｓｋｙら［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：７５２９〜７５３３（１９８４）］は、活性なウイルス複製および急性の感染を示す成体マウスおよび新生マウスの肝臓および脾臓に、ＣａＰＯ４沈殿の形態で、ポリオーマウイルスＤＮＡを首尾良く注入した。ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＮｅｓｈｉｆ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：９５５１〜９５５５（１９８６）］はまた、ＣａＰＯ４沈殿プラスミドの直接的腹腔内注入が、トランスフェクトされる遺伝子の発現をもたらすことを実証した。
【０１１７】
細胞への裸のＤＮＡ発現構築物の移入についての本発明の別の実施形態は、粒子ボンバードメントを含み得る。この方法は、高速により、ＤＮＡがコーティングされた微小発射体を加速する能力に依存し、この細胞を殺傷せずに細胞膜の穴あけ、および細胞の侵入を可能にする［Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０〜７３（１９８７）］。小粒子の加速についてのいくつかのデバイスが開発されている。１つのこのようなデバイスは、高電圧放電によって電流を生成し、これは順番に、原動力を提供する［Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９５６８〜９５７２（１９９０）］。使用される微小発射体は、生物学的に不活性の物質（例えば、タングステンまたは金ビーズ）からなっている。
【０１１８】
（Ｆ．好中球減少症の処置方法）
本明細書中の上記のように、このようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むヒトＧ−ＣＳＦアナログまたはベクターが、好中球減少症の処置についての置換療法プロトコルにおいて利用されることが意図される。Ｇ−ＣＳＦは、種々の状態の処置に有用であることが見出されており、ここで、好中球の増大が、利益を提供する。例えば、癌患者について、Ｇ−ＣＳＦが、好中球産生の選択的刺激の手段として有用であり、化学療法または放射線療法から生じる造血欠損を補償する。他の指示は、種々の感染性疾患および関連状態（例えば、敗血症）の処置を含み、これは、代表的には、細菌の代謝産物によって引き起こされる。Ｇ−ＣＳＦはまた、培養物における細胞の増殖または拡張について（例えば、骨髄移植またはエキソビボ拡張について）、単独または他の化合物（例えば、他のサイトカイン）と組み合わせて有用である。Ｇ−ＣＳＦが投与されて、感染症の処置の付属としてかまたは好中球減少症の処置のために患者を移植する。
【０１１９】
（ａ．タンパク質ベースの治療）
本発明の治療実施形態のうちの１つは、本発明のヒトＧ−ＣＳＦアナログを含む組成物の、その組成物を必要とする被験体への供給である。上記で議論されるように、タンパク質は、組換え手段を介してまたは自動ペプチド合成によって作製されているかもしれない。このような治療についてのヒトＧ−ＣＳＦアナログ処方物は、投与経路に基づいて選択され得、そしてリポソーム処方物ならびに古典的な薬学的調製物を含み得る。
【０１２０】
ヒトＧ−ＣＳＦアナログタンパク質は、適切な調製物に処方され、そして治療有効量において、被験体内部の１つ以上の部位に投与される。特定の好ましい実施形態において、ヒトＧ−ＣＳＦアナログタンパク質ベースの治療は、連続的な静脈内投与または断続的な静脈内投与を達成する。「治療有効量」によって、本発明は、Ｇ−ＣＳＦの１つ以上の生物学的活性のレベルにおける観察可能な変化を支持するに十分なヒトＧ−ＣＳＦアナログの量をいう。この変化は、Ｇ−ＣＳＦ活性レベルの増大のどちらかであり得る。好ましくは、この変化は、好中球増殖の増大である。
【０１２１】
当業者は、治療用途について、ヒトＧ−ＣＳＦアナログ量が変化し得ることを理解する。ヒトＧ−ＣＳＦアナログタンパク質調製物の特異的活性は、およそ１００単位／ｍｇのタンパク質〜およそ５００単位／ｍｇのタンパク質の範囲にあり得ることが意図される。従って、ヒトＧ−ＣＳＦアナログの所定の調製物は、およそ１００単位／ｍｇタンパク質、およそ１２５単位／ｍｇタンパク質、およそ１５０単位／ｍｇタンパク質、およそ１７５単位／ｍｇタンパク質、およそ２００単位／ｍｇタンパク質、およそ２２５単位／ｍｇタンパク質、およそ２５０単位／ｍｇタンパク質、およそ２７５単位／ｍｇタンパク質、およそ３００単位／ｍｇタンパク質、およそ３２５単位／ｍｇタンパク質、およそ３５０単位／ｍｇタンパク質、およそ３７５単位／ｍｇタンパク質、およそ４００単位／ｍｇタンパク質、およそ４２５単位／ｍｇタンパク質、およそ４５０単位／ｍｇタンパク質、およそ４７５単位／ｍｇタンパク質およびおよそ５００単位／ｍｇタンパク質を含み得る。特に好ましい範囲は、およそ１００単位／ｍｇタンパク質〜およそ２００単位／ｍｇタンパク質であり；より好ましい範囲は、およそ１５０とおよそ２００単位／ｍｇタンパク質との間である。好ましくは、タンパク質組成物は、汚染因子を実質的に含まず、汚染レベルは、０．０２％（ｗ／ｗ）未満である。患者への注入に適切なヒトＧ−ＣＳＦアナログ組成物は、例えば、精製ヒトＧ−ＣＳＦアナログおよび安定化塩を含む凍結乾燥サンプルの薬理学的に受容可能な希釈剤との再構成によって調製され得る。
【０１２２】
組成物の投与は、全身性または局所性であり得、そして治療有効量のヒトＧ−ＣＳＦアナログタンパク質組成物の一部位注入を含み得る。長期投与についての例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与またはカテーテルを含む本発明の治療組成物の投与についての当業者に公知の任意の経路が意図される。あるいは、治療組成物が、複数の部位で患者に送達され得ることが意図される。複数の投与は、同時に行われ得るか、または数時間にわたって投与され得る。特定の場合において、治療組成物の連続流入を提供することが有用であり得る。さらなる治療は、時間をもとにして、例えば、毎日、毎週または毎月投与され得る。
【０１２３】
（ｂ．組み合わせ治療）
単にヒトＧ−ＣＳＦアナログの送達に基づく治療に加えて、組み合わせ治療が、特に意図される。本発明の文脈において、ヒトＧ−ＣＳＦアナログ治療が、好中球減少症の処置について一般的に使用される他の因子とともに、同様に使用され得ることが意図される。
【０１２４】
適切な治療結果を達成するために、本発明の方法および組成物を使用して、一般的に、ヒトＧ−ＣＳＦアナログおよび少なくとも１つの他の治療因子（第二の治療因子）を含む組成物を提供する。本発明において、第二の治療因子が、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＧＤＦ、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２または他の種々のインターロイキン、ＩＧＦ−１、ＬＩＦ、インターフェロン（例えば、α、β、γまたはコンセンサス）、神経栄養因子（例えば、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＣＴＮＦまたはノギン）、他の多能性増殖因子（例えば、これらが、このような多能性増殖因子、ｆｌｔ−３／ｆｌｋ−２リガンド、幹細胞増殖因子および分化全能性幹細胞因子であると実証される範囲まで）、線維芽細胞増殖因子（例えば、ＦＧＦ）、ならびに上記のアナログ、融合分子または他の誘導体の中から選択される少なくとも１つのさらなる因子の投与または包含を含み得ることが意図される。例えば、ＳＣＦと組み合わせたＧ−ＣＳＦは、インビボで末梢血前駆細胞を動員することが見出されている。例えば、エキソビボで、ＳＣＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−６と組み合わせたＧ−ＣＳＦが、末梢血細胞の拡張に有用であることが見出されている。同様に、本発明のＧ−ＣＳＦアナログが、類似の用途に備える。
【０１２５】
組み合わせ治療組成物は、好中球減少症の処置における所望の治療結果を産生するに有効な組み合わせ量で提供される。このプロセスは、細胞を、同時にヒトＧ−ＣＳＦアナログ、および第二の因子（ａｇｅｎｔ）または因子（ｆａｃｔｏｒ）と接触させる工程を包含し得る。これは、両方の因子を含む１つの組成物または薬理学的処方物の同時投与によってか、あるいは２つの別個の組成物または処方物の同時投与によって達成され得、ここで、一方の組成物は、ヒトＧ−ＣＳＦアナログの治療組成物を含み、そして他の組成物は、第二の治療因子を含む。
【０１２６】
あるいは、ヒトＧ−ＣＳＦアナログ処置は、分から週に及ぶ間隔によって、他の因子の処置に先立ち得るか、または引き続き得る。第二の治療因子およびヒトＧ−ＣＳＦアナログが、別々に投与される場合の実施形態において、一般的に、有意な期間が、各々の送達の時間の間で終了せず、その結果、第二の因子およびヒトＧ−ＣＳＦアナログが、有利な組み合わせ効果をなお発揮し得ることを確実にする。このような場合において、互いのおよそ１２〜２４時間以内、そしてより好ましくは、互いのおよそ６〜１２時間以内で、両方のモダリティーを投与し、およそ１２時間のみの遅延時間が、最も好ましいことが意図される。いくつかの状況において、処置についての時間を有意に拡張することが望ましくあり得るが、しかし、数日（２、３、４、５、６または７）〜数週（１、２、３、４、５、６、７または８）が、それぞれの投与の間を経過する場合である。
【０１２７】
患者へのヒトＧ−ＣＳＦアナログ発現構築物またはタンパク質の全身性送達は、治療的に有効な遺伝子の送達について極めて有効な方法であって、疾患の即時の臨床徴候を妨害し得る。あるいは、ヒトＧ−ＣＳＦアナログおよび／または第二の治療因子の局所送達が、特定の情況において適切であり得る。
【０１２８】
（Ｇ．Ｇ−ＣＳＦアナログ活性および結合の決定についてのアッセイ）
本発明の特定の局面において、ヒトＧ−ＣＳＦアナログの活性を決定することが必要であり得る。特に、好中球減少症に対する本発明の治療組成物の効果は、モニターされる必要があり得る。当業者は、極めて多くのアッセイを知っており、Ｇ−ＣＳＦ活性を決定し、これらのうちのいくつかは、本節に記載される。これは、このようなアッセイの完全なリストであると決して意図されず、そして当業者に周知の特定の例示的なアッセイを提供することが単に意図され、これは、本発明のＧ−ＣＳＦ活性の決定において使用され得る。さらに、本節はまた、そのレセプターへのＧ−ＣＳＦ結合の決定についてのアッセイを記載する。これらの活性の決定についての例示的なインビトロアッセイおよびインビボアッセイは、本明細書中の以下に提供される。
【０１２９】
（ａ．インビトロアッセイ）
（細胞増殖アッセイ）細胞増殖アッセイ（このうちのいくつかは、本明細書中に記載される）を用いて、細胞増殖の誘導に対するＧ−ＣＳＦアナログ効果を決定する。多くのアッセイが、当該分野で周知であり、そしてこれらのアッセイのうちのいくつかが、以下に記載される。
【０１３０】
（細胞計数）細胞を、細胞増殖実験の開始の２４時間前に、補充ＭＥＭα培地（Ｇ−ＣＳＦを含まない）に継代し、この時点で、１０５細胞／ｍＬの密度での細胞の並列フラスコを、１２５ｐＭ  野生型Ｇ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦアナログを含むＭＥＭα培地においてインキュベートする。各々のフラスコにおける細胞増殖を、以下のように、２日目、５日目および８日目に測定する。手短に言えば、細胞を、等張溶液（ＩＳＯＴＯＮ  ＩＩ、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）に希釈し、そしてＣｏｕｌｔｅｒカウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）において計数する。
【０１３１】
（３Ｈ−チミジン取り込み）このアッセイは、細胞分裂ときの細胞の新規に合成されたＤＮＡへの標識３Ｈ−チミジンの取り込みに基づく。ある研究者らはまた、増殖アッセイにおいて、［３Ｈ］−チミジンの代わりに、チミジンアナログ、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いる。手短に言えば、細胞を、細胞増殖実験の開始の２４時間前に、補充ＭＥＭα培地（Ｇ−ＣＳＦを含まない）に継代し、この時点で、１０５細胞／ｍＬの密度の細胞の並列ウェル／フラスコを、１２５ｐＭ  野生型Ｇ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦアナログを含むＭＥＭα培地においてインキュベートする。３Ｈ−チミジンを、計数（実験の終了）の１２〜２４時間前に細胞培養物に添加し、そしてアッセイの終わりに、ＤＮＡにおける放射能取り込みの量を、液体シンチレーションカウンターにおいて測定する。この方法の詳細は、当業者に周知である。
【０１３２】
（ＭＴＴ）ＭＴＴを、例えば、増殖因子およびサイトカインに応じた、細胞増殖および活性化の定量決定のために使用する。これはまた、例えば、腫瘍壊死因子−αまたは腫瘍壊死因子−βによって媒介される抗増殖効果または細胞傷害性効果の定量のために、そしてインターフェロン作用の測定のために使用される。このアッセイは、代謝活性化細胞による、黄テトラゾリウム塩、ＭＴＴの紫ホルマザン結晶への開裂に基づく。これらの塩結晶は、水溶液中で不溶性であるが、キットに含まれる可溶化溶液の添加、および給湿雰囲気（例えば、３７℃、６．５％  ＣＯ２）における一晩のプレートのインキュベートによって可溶化され得る。可溶化ホルマザン生成物は、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて、分光光度計によって定量される。生存細胞数の増加は、サンプルにおける総代謝活性の増加をもたらす。この増加は、吸光度によってモニターする場合、形成される紫ホルマザン結晶の量に直接相関する。市販のＭＴＴアッセイは、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入され得る。
【０１３３】
（リガンド枯渇アッセイ）各々のタンパク質についてのリガンド枯渇を、本明細書中に記載されるように、時間にわたって測定する。上記の実験のように、Ｇ−ＣＳＦ依存性（ＯＣＩ／ＡＭＬ１）細胞を、リガンド枯渇実験の開始の２４時間前に、補充ＭＥＭα培地（Ｇ−ＣＳＦを含まない）に継代し、この時点で、１０５細胞／ｍＬの密度の細胞の並列フラスコを、１２５ｐＭ  野生型Ｇ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦアナログを含むＭＥＭα培地においてインキュベートする。２４時間後、各々のフラスコにおける細胞数を、上記のように測定し、そして細胞破片をペレット化する遠心分離後に得られる各々の培地上清のアリコートを、Ｇ−ＣＳＦ濃度の測定のために、−２０℃で保管する。これを、２４時間毎に８日間繰り返す。次いで、培地上清サンプルにおけるＧ−ＣＳＦの濃度を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から得られる固相酵素免疫検定法アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを用いて定量する。
【０１３４】
（インターナリゼーションおよびリサイクリング実験）公表された研究［Ｋｕｗａｂａｒａら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂｏｌ．３２：Ｅ１〜Ｅ９（１９９５）］と同様のインターナリゼーション実験を、５分間にわたって行う。手短に言えば、１０８細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、氷上で標識リガンドにおいて、３０分間インキュベートして、表面複合体を得る。この細胞を、再び氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、そしてＭＥＭαにおいて、３７℃でｔ＝０で再懸濁する。表面複合体および内部複合体における変化を、５分間追跡する；内部複合体のプロット対表面複合体の時間積分は、線形関係を生じ、この勾配は、複合体インターナリゼーションの速度定数である［Ｗｉｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：４２２２〜４２２９（１９８２）］。リサイクリング実験を、２５分間を超えて実施する以外は、インターナリゼーション実験と同一に行う。リサイクリング実験からのデータは、リサイクリング速度定数を獲得するように適合されるパラメータである。
【０１３５】
（結合アッセイ）分子結合アッセイ（これらのうちのいくつかは、本明細書中に記載される）を用いて、Ｇ−ＣＳＦＲに対するＧ−ＣＳＦアナログ結合を評価する。これらのインビトロアッセイおよび細胞ベースのアッセイを、以下の通りに記載する。
【０１３６】
（ＢＩＡＣＯＲＥ）Ｇ−ＣＳＦレセプターに対するＧ−ＣＳＦアナログのリガンド結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて測定する。ヒスチジンタグ化野生型Ｇ−ＣＳＦを、チップ表面に固定化し、そして遊離レセプター（約０．２５〜１０ｎＭ）を、チップ上に通過させて、標準平衡曲線を作製し、そして１：１結合モデルを使用して、野生型結合親和性を計算する。各々の変異体結合親和性を決定するために、２ｎＭの遊離レセプターを、既知濃度の変異体リガンドと混合し、そしてチップ上を通過させる。変異体の平衡結合親和性を、競合を伴う１：１結合モデルを用いて決定する。結合親和性データを、ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて分析し；そして平衡解離定数（ＫＤ）を決定する。
【０１３７】
（ＥＬＩＳＡ）Ｇ−ＣＳＦＲへのＧ−ＣＳＦ変異体アナログの結合を、ＥＬＩＳＡ型競合アッセイにおいて測定する。このアッセイにおいて、Ｇ−ＣＳＦＲを、製造業者のプロトコルによって、非中和Ｇ−ＣＳＦレセプター抗体、ＬＭＭ７４１（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて捕捉する。次いで、アナログタンパク質を、レセプター結合について、ＨＲＰ標識されたＧ−ＣＳＦと競合するその能力についてアッセイする。
【０１３８】
（ｂ．インビボアッセイ）
本発明のヒトＧ−ＣＳＦアナログ組成物が、ヒト治療プロトコルにおいて利用される前に、動物モデルにおいて、このような組成物の効果をモニターすることが望ましくあり得る。本発明において有用であり得る、当業者に公知のインビボアッセイにおいて使用され得る多くの動物モデルが存在する。
【０１３９】
本発明のヒトＧ−ＣＳＦアナログタンパク質および遺伝子治療組成物の効能を決定するために、このような動物は、本発明の組成物を用いて、筋肉内注入および／または静脈内注入され得、そしてこの組成物の存在下および非存在下において好中球増殖を刺激する能力が、決定され得る。このような決定は、投与の投薬量および時間、ならびに好中球減少症に対する所定の組成物の効能に対する手引きの提供に有用である。遺伝子治療プロトコルにおいて、生検を行われた筋肉から得られる切片の免疫蛍光染色を行い得、そして形質導入される筋繊維におけるヒトＧ−ＣＳＦアナログの発現が決定され得る。
【０１４０】
（Ｈ．薬学的組成物）
本発明はまた、Ｇ−ＣＳＦ治療に有用な薬学的に受容可能な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／またはキャリアと組み合わせた、有効量の本発明のポリペプチド産物を含む薬学的組成物を含む。このような組成物は、種々の緩衝液内容（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸、リン酸）、ｐＨおよびイオン強度の希釈剤；界面活性剤および可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、防腐剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）、およびバルキング物質（例えば、ラクトース、マンニトール）のような添加剤；ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸など）の微粒子調製物への物質の取込み、またはリポソームに関連する取込みを含む。このような組成物は、本発明のＧ−ＣＳＦアナログの物理的状態、安定性、インビボ放出速度およびインビボクリアランス速度に影響を与える。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１４３５〜１７１２頁（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１４１】
本発明のＧ−ＣＳＦアナログの誘導体がまた、本明細書中に含まれる。このような誘導体としては、１つ以上の水溶性ポリマー分子（例えば、ポリエチレングリコール）によって改変される分子、またはポリアミノ酸の添加（融合タンパク質を含む）によって改変される分子が挙げられる（これらについての手順は、当該分野で周知である）。このような誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）は、Ｎ末端またはＣ末端で単独に生じ得るか、あるいは誘導体化の複数の部位が存在し得る。リジンでの１つ以上のアミノ酸の置換は、誘導体化についてのさらなる部位を提供し得る。（本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，８２４，７８４号および米国特許第５，８２４，７７８号を参照のこと。）
本発明のアナログまたはその誘導体は、当業者が認識するように、注入、あるいは経口投与、鼻投与、肺投与、局所投与、または他の型の投与について処方され得る。この処方物は、再構成のために、液体であっても固体（例えば、凍結乾燥）であってもよい。
【０１４２】
一般に、本発明のアナログ（または、その誘導体）は、本発明のアナログが、細胞応答の増強（スーパーアゴニストまたはＧ−ＣＳＦアゴニスト活性）を提供することを除いて、現在入手可能なＧ−ＣＳＦが有用であることと同じ点で有用である。細胞応答におけるこのような変化は、Ｇ−ＣＳＦレセプター結合、ならびに／またはリガンド／レセプター細胞内輸送経路を介したソーティング、リサイクリングおよび分解の工程に影響を及ぼすことによって生じる。
【０１４３】
これらの用途は、種々の造血関連状態、神経学的関連状態および生殖関連状態の処置を含む。従って、薬剤の製造についての本発明の組成物および方法は、このような状態の処置に有用であり得る。本発明のアナログの投与によって軽減または調節される状態は、代表的には、造血機能または免疫機能の減少、そしてより特に、好中球数の減少によって特徴付けられる状態である。このような状態は、他の目的についての１コースの治療として（例えば、化学療法または放射線療法）誘導され得る。このような状態は、感染性疾患（例えば、細菌性疾患、ウイルス性疾患、真菌性疾患または他の感染性疾患）から生じ得る。例えば、敗血症は、細菌性感染から生じる。または、このような状態は、遺伝性であり得るか、または環境によって引き起こされ得る（例えば、重篤な慢性の好中球減少症または白血病）。年齢はまた、老人病学環境におけるような因子を果たし得る；患者は、減少した好中球数または減少した好中球動員を有し得る。このような状態のうちのいくつかは、Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ（ｒ−ｍｅｔＨｕＧ−ＣＳＦ）：Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、ＭｏｒｓｔｙｎおよびＤｅｘｔｅｒ（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）、３５１頁に概説される。本発明のアナログの投与によって、軽減または調節され得る他のあまり研究されていない状態は、血流および特定の心臓血管状態における脂質（またはコレステロール）の減少を含み得、これは、Ｇ−ＣＳＦがプラスミノーゲンアクチベーターの産生を誘導し得るからである。さらに、本発明のＧ−ＣＳＦアナログ組成物は、末梢血前駆細胞の動員について使用され得る。
【０１４４】
本発明のＧ−ＣＳＦアナログ（または誘導体組成物）はまた、インビトロで使用され得る。例えば、遺伝子治療環境において、外因性ＤＮＡを用いて造血細胞をトランスフェクトすることが望まれ得、そして本発明のＧ−ＣＳＦアナログ処方物を用いて、上記の細胞を培養することが望まれ得る。従って、なお別の局面において、本発明は、インビトロでの造血細胞の培養についての方法を含み、この方法は、以下の工程：ａ）上記の細胞を、適切な培養培地に配置し、この適切な培養培地は、本発明に従ったＧ−ＣＳＦアナログ組成物を含む工程、およびｂ）上記の造血細胞の増殖に適切な状態を提供する工程から構成される。
【０１４５】
より具体的には、本発明は、外因性ＤＮＡを用いた造血細胞のトランスフェクトの方法を提供し、この方法は、以下の工程：ａ）上記の造血細胞を、本発明に従ったＧ−ＣＳＦアナログ組成物とともに培養する工程、およびｂ）上記の培養細胞を、外因性ＤＮＡを用いてトランスフェクトする工程を包含する。この造血細胞は、例えば、骨髄細胞または末梢血前駆細胞であり得る。さらに、当業者に周知の他の細胞が用いられ得る。
【０１４６】
臨床使用についての組成物を含むヒトＧ−ＣＳＦアナログを調製するために、薬学的組成物として、すなわち、インビボ適用に適切な形態で、ウイルス発現ベクター、タンパク質および核酸を調製することが必要である。一般に、これは、発熱物質、ならびにヒトまたは動物に有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物の調製を必然的に伴う。
【０１４７】
一般的に、適切な塩および緩衝液を利用して、送達ベクターを安定にし、そして標的細胞による取り込みを可能にすることが望ましい。緩衝液はまた、組換え細胞が、患者に導入される場合に利用される。本発明の水性組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体に溶解または分散された、有効量のヒトＧ−ＣＳＦアナログまたは発現ベクターを細胞に含む。このような組成物はまた、接種原といわれる。句「薬学的または薬理学的に受容可能」は、動物またはヒトに投与される場合において、有害な反応、アレルギー反応または他の都合の悪い反応を産生しない分子および組成物をいう。本明細書中で使用される不都合な場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質についてのこのような媒体および因子の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または因子が、本発明のベクターまたは細胞と不適合である範囲を除いて、治療組成物におけるこの使用が企図される。補充の活性成分がまた、この組成物に組込まれ得る。
【０１４８】
本発明の活性な組成物は、古典的な薬学的調製物を含む。本発明に従ったこれらの組成物の投与は、標的組織が、この経路を介して応じられる限りは、任意の一般の経路を介する。この薬学的組成物は、任意の従来方法によって（例えば、静脈内送達、皮内送達、筋肉内送達、乳房内送達、腹腔内送達、鞘内送達、眼球後送達、肺内送達（例えば、限定期間放出）によって；経口送達、舌下送達、鼻送達、肛門送達、膣送達または経皮送達、あるいは特定の部位での外科移植によって）、被験体に導入され得る。この処置は、時間にわたる単回用量または複数回用量からなり得る。
【０１４９】
この活性な化合物は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中での遊離塩基または薬理学的に受容可能な塩の溶液として、投与にのための調製され得る。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物ならびに油において調製され得る。貯蔵および使用の通常の状態下で、これらの調製物は、防腐剤を含み、微生物の増殖を妨げる。
【０１５０】
注入可能使用に適切な薬学的形態は、滅菌水溶液または分散液、および滅菌の注入可能溶液または分散液の即座の調製にための滅菌粉末を含む。あらゆる場合において、この形態は、滅菌性でなければならず、そして容易な注射器可動が存在する範囲まで流動性でなければならない。これは、製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保護されなければならない。キャリアは、溶媒または分散媒体（例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）を含む）、それらの適切な混合物ならびに植物油であり得る。適切な流動度は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散液の場合は、必要とされる粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の活動の防止は、種々の抗菌剤、抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によってもたらされ得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注入可能組成物の延長された吸収は、組成物における吸収を遅延する因子（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によってもたらされ得る。
【０１５１】
滅菌注入可能溶液は、適切な溶媒における必要量の活性化合物を、上記で列挙された種々の他の成分に組込むことによって調製され、必要に応じて、その後濾過滅菌が行われる。一般的に、分散液は、種々の滅菌活性成分を滅菌ビヒクルに組込むことによって調製され、このビヒクルは、基本的な分散媒体および上記で列挙された成分由来の必要な他の成分を含む。滅菌注入可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合において、好ましい調製方法は、真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、これらの技術は、以前に滅菌濾過されたその溶液由来の活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる。
【０１５２】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、任意およびすべての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質についてのこのような媒体および因子の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または因子が、活性成分と不適合である範囲を除いて、治療組成物におけるこの使用が企図される。補充の活性成分がまた、この組成物に組込まれ得る。
【０１５３】
経口投与のために、本発明のポリペプチドは、賦形剤に組込まれ得、そして非摂取のうがい薬および歯磨き剤の形態で使用され得る。適切な溶媒（例えば、ホウ酸ナトリウム溶液（Ｄｏｂｅｌｌ’ｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ））において必要量の活性成分を組込むうがい薬が調製され得る。あるいは、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび重炭酸カリウムを含む殺菌洗浄液に組込まれ得る。活性成分はまた、以下を含む歯磨き剤に分散され得る：ゲル、ペースト、粉末およびスラリー。活性成分は、治療有効量で、ペースト歯磨き剤に添加され得、この歯磨き剤は、水、バインダー、研磨剤、香味剤、発泡剤および湿潤剤を含み得る。
【０１５４】
本発明の組成物は、中性形態または塩形態で処方され得る。薬学的に受容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）を含み、そしてこれは、無機酸（例えば、塩酸、またはリン酸のような）、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄（ＩＩＩ））、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来し得る。
【０１５５】
本発明の組成物は、中性形態または塩形態で処方され得る。薬学的に受容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）を含み、そしてこれは、無機酸（例えば、塩酸、またはリン酸のような）、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成される塩はまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化鉄（ＩＩＩ））、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来し得る。
【０１５６】
処方の際に、溶液は、投薬処方に適合する様式および治療有効量で投与される。処方物は、種々の投薬形態（例えば、注入可能溶液、薬物放出カプセルなど）において容易に投与される。水溶液における非経口投与について、例えば、溶液は、必要であれば、適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤は、第一に、十分な生理食塩水またはグルコースを用いて等張にされるべきである。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に適切である。
【０１５７】
一般的に、有効量の本発明のＧ−ＣＳＦアナログ（または誘導体）は、レシピエントの年齢、体重および疾患の状態または重篤度によって決定される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出、６９７〜７７３頁（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。代表的には、１日当たりおよそ０．００１μｇ／ｋｇ体重と１日当たりおよそ１０００μｇ／ｋｇとの間の投薬量が使用され得るが、しかし、幾分、当業者が認識するように使用され得る。投薬は、１日１回以上、またはより少ない頻度であり得、そして本明細書中に記載されるような他の組成物と組合され得る。本発明が、本明細書中に列挙される投薬に限定されないことに注意すべきである。
【０１５８】
「単位用量」は、適切なキャリアに分散される別個の量の治療組成物の個々の量として規定される。例えば、ポリペプチドが、非経口投与されている場合、このポリペプチド組成物は、一般的に、１日当たり１μｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重にの範囲の用量、好ましくは、１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜およそ５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の用量で注入される。非経口投与は、最初のボーラス、その後の連続的注入で行われて、薬物産物の治療循環レベルを維持し得る。当業者は、良好な医療および個々の患者の臨床状態によって決定されるように、有効な投薬量および投与レジメンを容易に最適化する。
【０１５９】
投薬の頻度は、因子の薬物動態学的パラメータおよび投与経路に依存する。最適な薬学的組成物は、投与経路および所望の投薬量に依存して、当業者によって決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出、１４３５〜１７１２頁（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。このような処方は、投与因子の物理学的状態、安定性、インビボ放出速度およびインビボクリアランス速度に影響を与え得る。投与経路に依存して、適切な用量が、体重、体表面積または生物のサイズに従って計算され得る。最適な処置用量の決定に必要な計算のさらなる精密化は、当業者によって、過度の実験を伴わずに、特に、本明細書中に開示される投薬量情報およびアッセイ、ならびに動物またはヒトの臨床試験において観察される薬物動態学的データを考慮して慣用的に行われる。
【０１６０】
適切な投薬量は、関連した用量反応データとともに、好中球減少症のレベルの決定についての確立されたアッセイの使用を通じて確認され得る。最終投薬レジメンは、薬物の作用を改変する因子（例えば、薬物の特異的活性、損傷の重篤度および患者の応答、患者の年齢、状態、体重、性別および食餌、任意の感染の重篤度、投与時間ならびに他の臨床因子）を考慮して、主治医によって決定される。研究が行われるにつれて、特定の疾患および状態についての適切な投薬レベルおよび処置の継続時間に関するさらなる情報が明らかになる。
【０１６１】
ウイルス送達を利用する遺伝子治療実施形態において、単位用量は、投与されるウイルス粒子の用量に関して計算され得る。ウイルス用量は、特定の数のウイルス粒子またはプラーク形成単位（ｐｆｕ）を含む。アデノウイルスを含む実施形態について、特定の単位用量は、１０３ｐｆｕ、１０４ｐｆｕ、１０５ｐｆｕ、１０６ｐｆｕ、１０７ｐｆｕ、１０８ｐｆｕ、１０９ｐｆｕ、１０１０ｐｆｕ、１０１１ｐｆｕ、１０１２ｐｆｕ、１０１３ｐｆｕまたは１０１４ｐｆｕを含む。粒子用量は、感染欠陥粒子の存在に起因して、幾分より高く（１０〜１００倍）あり得る。
【０１６２】
本発明の薬学的組成物および処置方法が、ヒト医学および獣医学の分野において有用であり得ることが理解される。従って、処置されるべき被験体は、哺乳動物、好ましくは、ヒトまたは他の動物であり得る。獣医学目的について、被験体は、例えば、農場動物（ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマおよびヤギを含む）、コンパニオンアニマル（例えば、イヌおよびネコ）、外来動物および／または動物園動物、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびハムスターを含む）；ならびに家禽（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルおよびガチョウ）を含む。
【０１６３】
さらに、本発明は、以下から構成される骨髄細胞または末梢血前駆細胞の培養についての成分を含むキットを企図する：ａ）本発明のＧ−ＣＳＦアナログ組成物；およびｂ）骨髄細胞または末梢血前駆細胞の培養についての培地の調製に適切な成分。
【０１６４】
（Ｉ．実施例）
本発明は、以下の非制限的な実施例に関してより詳細に記載し、この実施例は、本発明をより完全に例示するために提供されるが、本発明の範囲を制限するように解釈されるべきではない。本実施例は、本発明のＧ−ＣＳＦアナログの調製、およびインビトロでのこれらのアナログの試験を例示する。当業者は、これらの実施例に記載される技術が、本発明者らによって記載される技術を表して、本発明の実施において、良好に機能し、そしてそれ自体、本発明の実施についての好ましい様式を構成することを理解する。しかし、当業者は、本発明の開示を考慮して、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、多くの変化が、開示される特定の方法においてなされ得、そして同様または類似の結果をなお獲得し得ることを理解すべきであることが理解されるべきである。
【０１６５】
（実施例１）
（ヒスチジン変異体設計の理論的根拠）
ヒスチジン滴定が細胞表面上では比較的緊密な結合を維持し得るが、エンドソーム区画においてはそれより弱い結合を導くという原理に基づき、Ｇ−ＣＳＦ変異体を設計した。細胞表面での約７からエンドソームでの５〜６へのｐＨの減少を利用して、細胞外のｐＨにおいて静電気的相互作用を大いに維持する（または改善する）が、エンドソームのｐＨにおいてはその相互作用を弱めるように、変異体を設計した。遊離リガンドの表面におけるヒスチジンのｐＫａ（約６．５）［Ｔａｎｏｋｕｒａ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．７４２：５７６−５８５（１９８２）］は、適切な局所的タンパク質環境が与えられる場合、ヒスチジン滴定は、細胞外媒体とエンドソーム媒体との間の結合に対してｐＨに大きく依存する効果を示し得ることを示唆する。ヒスチジン置換の候補位置を同定するための計算を使用した。好ましい位置は、算出される結合親和性が、中性のヒスチジンの野生型に相当し、かつ正に荷電したヒスチジンに対して有意に低い位置であった。
【０１６６】
（実施例２）
（Ｇ−ＣＳＦアナログの調製および特徴付け）
Ｇ−ＣＳＦアナログを、ＰＣＲ重複伸長方法（ＰＣＲ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）［Ａｉｙａｒら、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：１７７〜１９１（１９９６）］を用いて、ｒ−ｍｅｔ−ＨｕＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡの挿入による変異誘発または部位特異的変異誘発のいずれかにより調製した。配列分析により変異を確認した後、各々の変異体を、［Ｌｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：８７７０〜８７７７（１９９２）］に記載されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２において発現し、リフォールディングし、そして精製した。プロトコルおよび手順については、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＰＣＲ」、Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｈｉｇｕｃｈｉ、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆａｎｄ、Ｓｎｉｎｓｋｙ、およびＷｈｉｔｅ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９９）；ならびに「Ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ＤＮＡ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｉｓ（編）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＣＳＨ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）（両方とも、本明細書中で参考として援用される）もまた参照のこと。ｒ−ｍｅｔ−ＨｕＧ−ＣＳＦのＥ．ｃｏｌｉ発現は、以前に報告された。米国特許第４，８１０，６４３号および米国特許第５，８４９，８８３号を参照のこと（両方とも、本明細書中で参考として援用される）。組換えヒトＧ−ＣＳＦをコードするＤＮＡは、開始メチオニンコドン、次に、ヒトＧ−ＣＳＦの１７４アミノ酸種のコドンを有した。精製したｒ−ｍｅｔ−ＨｕＧ−ＣＳＦアナログは、開始Ｍｅｔ（−１位のＭｅｔ）を保持する。
【０１６７】
［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列および核酸配列を、配列番号３（ＤＮＡ）および配列番号４（アミノ酸）に示す。［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列および核酸配列を、配列番号５（ＤＮＡ）および配列番号６（アミノ酸）に示す。［Ｈｉｓ１１９］Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸配列および核酸配列を、配列番号７（ＤＮＡ）および配列番号８（アミノ酸）に示す。
【０１６８】
本発明のＧ−ＣＳＦアナログの同一性の確認を、インタクトなタンパク質のＮ末端アミノ酸配列決定によって達成した。精製したＧ−ＣＳＦアナログの配列は、配列番号３、５、および７に示されるような、それぞれのＤＮＡ配列から推定される配列に一致した。このような方法は、当該分野で周知である［Ｓｈｉｖｅｌｙ、ＥＸＳ  ８８：９９〜１１７（２０００）］。
【０１６９】
（ヒスチジン変異体の構造的調製）
Ｇ−ＣＳＦＲのリガンド結合ドメインとの２：２複合体におけるＧ−ＣＳＦのＸ線結晶構造が、Ａｒｉｔｏｍｉら［Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：７１３−７１７（１９９９）］により、ｐＨ７．５で成長および維持した結晶からの２．８Åまでのデータを用いて解かれた［Ａｒｉｔｏｍｉら、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５６：７５１−７５３（２０００）］。この構造（エントリー１ＣＤ９）を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）から獲得した［Ｂｅｒｍａｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２３５−２４２（２０００）］。ここで記載される計算は、セグメントＡおよびセグメントＢにより形成される界面に注目している。この界面は、１つのＧ−ＣＳＦ分子（Ａ）および１つのＧ−ＣＳＦＲのＣＲＨドメイン（Ｂ）に関する主要な結合界面である。これらの鎖の座標を、この座標ファイルから抽出し、そして極性の水素原子位置および芳香族の水素原子位置を、ＣＨＡＲＭＭ［Ｂｒｏｏｋｓら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．４：１８７−２１７（１９８３）；ＢｒｕｎｇｅｒおよびＫａｒｐｌｕｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ４：１４８−１５６（１９８８）］を用いて確立した。あるいは、少数の喪失した重原子位置（これらは全て、界面から遠い）を、ＣＨＡＲＭＭを用い、標準的な幾何学において構築した。野生型複合体中の界面の滴定可能な側鎖（これらのいずれもがヒスチジンではない）の試験は、これらは全て、標準的な中性ｐＨ滴定状態に残っていることを示唆する。
【０１７０】
（ヒスチジン変異体のためのＧ−ＣＳＦのインシリコ変異誘発）
潜在的なヒスチジン変異部位を、インシリコでの手順により同定した。変異の１０Å以内（その変異自体を含む）の結合界面における全てのリガンドおよびレセプター側鎖のコンホメーションを、標準的な回転異性体ライブラリーを用いて、剛体骨格上で詰め直した（ｒｅｐａｃｋｅｄ）［ＤｕｎｂｒａｃｋおよびＫａｒｐｌｕｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３０：５４３−５７４（１９９３）］。エネルギー関数は、ＣＨＡＲＭＭ１９［Ｂｒｏｏｋｓら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．４：１８７−２１７（１９８３）；ＧｉｌｓｏｎおよびＨｏｎｉｇ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：８４−８６（１９８７）］において実行される場合、距離依存的な誘電率（ε＝４γ、ここで、γはÅである）により、カットオフを用いずに、ファンデルワールス相互作用および静電気的相互作用を含み、ＰＡＲＳＥ部分原子電荷［Ｓｉｔｋｏｆｆら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９８：１９７８−１９８８（１９９４）］まで含めた。エネルギー最小化した複合体を、デッドエンドエリミネーション（ｄｅａｄ−ｅｎｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）（およびＡ＊）［Ｄｅｓｍｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：５３９−５４２（１９９２）；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６６：１３３５−１３４０（１９９４）］を用いて見出した。野生型複合体に適用される場合、この手順は、回転異性体ライブラリーの分解能内で結晶構造を正確に再構築した。
【０１７１】
（ヒスチジン変異体についての静電的計算）
ヒスチジンに対する変異のための、Ｇ−ＣＳＦ中の残基の選択を、静電的な考慮により決定した。計算上の詳細は、公開された文献［ＨｅｎｄｓｃｈおよびＴｉｄｏｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．８：１３８１−１３９２（１９９９）］と同様であった。連続的な静電気的計算を、ＤＥＬＰＨＩコンピュータープログラムの部分的に改変したバージョン［ＧｉｌｓｏｎおよびＨｏｎｉｇ、Ｎａｔｕｒｅ  ３３０：８４−８６（１９８７）；Ｇｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．９：３２７−３３５（１９８８）；ＳｈａｒｐおよびＨｏｎｉｇ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１９：３０１−３３２（１９９０）］を用いる差分法により線形ポアソン−ボルツマン式を解くことによって実施した。ＰＡＲＳＥパラメータを、原子半径および部分原子電荷について用いた［Ｓｉｔｋｏｆｆら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９８：１９７８−１９８８（１９９４）］。タンパク質の誘電率について、４の値を用い、そして溶媒については８０を用いた。分子表面を、１．４Åのプローブスフィア（ｐｒｏｂｅ  ｓｐｈｅｒｅ）を用いて描写し、そして、バルクのイオン強度を、２Åのシュテルン層を用いて１４５ｍＭになるように選択した。２３％および９２％充填（ｆｉｌｌ）を用いた２工程のフォーカス手順により、計算を実施した。静電気ポテンシャルの可視化のために、６５×６５×６５グリッド単位の立方体格子を用いた。静電結合自由エネルギーの計算のために、１９１×１９１×１９１グリッドを使用し（最終グリッド間隔０．４７６Å）、そして与えられた各々の値は、このグリッドに対する分子の１０のオフセットの平均であった。静電気的相補性は、６つの候補変異部位を示した。荷電残基Ｇｌｕ１９、Ａｓｐ１０９、およびＡｓｐ１１２、ならびに極性残基Ｇｌｎ２０、Ｔｈｒ１１６、およびＧｌｎ１１９に対応する位置を含む、高度に負の領域の優勢は、過剰な負電荷密度を示した。
【０１７２】
（ヒスチジン変異体構造の生成）
６つのリガンド残基（Ｇｌｕ１９、Ｇｌｎ２０、Ａｓｐ１１２、Ｔｈｒ１１６、およびＧｌｎ１１９）の各々が一つずつヒスチジンに変異している変異体複合体をコンピューター上で生成した。各々の位置を２つの中性ヒスチジン互変体（σ窒素またはε窒素のいずれかにおいてプロトン化されており、それぞれ、Ｈｉｓσ０およびＨｉｓε０と示される）および正電荷ヒスチジン（Ｈｉｓ＋）で置換した。拘束最小化手順（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を用い、この手順において、デッドエンドエリミネーションおよびＡ＊に基づくアルゴリズムを用いて、変異体の側鎖および隣接残基の側鎖に完全な自由度を与え、リパックした［Ｄｅｓｍｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：５３９−５４２（１９９２）；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６６：１３３５−１３４０（１９９４）；ＬｅａｃｈおよびＬｅｍｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３３：２２７−２３９（１９９８）］。変異複合体の相補性を可視化し、そして野生型を比較した。
【０１７３】
（ヒスチジン変異体の候補の選択）
変異体は、より良い結合性のＨｉｓ０互変体の野生型（細胞表面状態に対応する）とほぼ同等にレセプターに結合し（またはそれよりも良く結合しさえする）、そしてＨｉｓ＋の野生型（エンドソーム状態に対応する）よりも有意に乏しく結合するはずであるという原理に基づく実験的試験のために、候補を選択した。Ｈｉｓ０とＨｉｓ＋との間の差異が数ｋｃａｌ／ｍｏｌより大きくなった場合、それ以上大きくする利点がなくなった。なぜならば、それは、未結合状態においてＨｉｓ＋を脱プロトン化するコストおよびＨｉｓ０として結合するコストよりも大きいからである。従って、Ａｓｐ１０９ＨｉｓおよびＡｓｐ１１２Ｈｉｓを、実験による特徴付けのために作製および精製した。さらに、Ｇｌｎ１１９Ｈｉｓは、細胞表面において、野生型よりも良く結合することが予想されるので、結合がエンドソームにおいて有意に弱いか否かは、計算から明らかではないけれども、これもまた作製および精製した。
【０１７４】
（野生型およびヒスチジン変異体の静電結合自由エネルギー値）
野生型ならびにＨｉｓσ０、Ｈｉｓε０、およびＨｉｓ＋変異体の各々の結合自由エネルギーへの静電気的な寄与を、単純な剛体結合モデルおよび連続静電気学（ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓ）を用いて計算した。結合する全ての細部を明示的に処理しないが、このモデルは、直接的に適用され、そして複合体間の中程度から高度の結合の差を区別し得るはずである。この結果は、ある程度異なる挙動を示す。ほとんどの変異体は、野生型とほぼ同程度であるが野生型ほどではない程度にＨｉｓ０（ヒスチジン互変体の少なくとも１つ）結合することを示す（最大２．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ劣る）。２つの例外は、Ｇｌｕ１９Ｈｉｓ０およびＧｌｎ１１９Ｈｉｓ０である。Ｇｌｕ１９Ｈｉｓ０は、複合体中で許容ではなく（野生型よりもほぼ１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ劣ると算出される）、そしてＧｌｎ１１９Ｈｉｓ０は、野生型よりもいくらか良く結合すると算出される（Ｈｉｓσ０互変体については１．７ｋｃａｌ／ｍｏｌの差）。興味深いことに、Ｇｌｕ１９は、レセプター結合に欠かせないようである［Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：９０３４−９０４１（１９９４）；Ｌａｙｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１７４４５−１７４５１（１９９９）］。細胞増殖アッセイにおいて、Ｇｌｕ１９Ａｌａは、本質的に応答を誘発しない（データは示していない）。このことは、この計算と一致する。変異体のうちの３つ［Ｇｌｕ１９Ｈｉｓ（［Ｈｉｓ１９］Ｇ−ＣＳＦ）、Ａｓｐ１０９Ｈｉｓ（［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦ）、およびＡｓｐ１１２Ｈｉｓ（［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦ）］について、結合のｐＨ依存は、所望の方向に変化すると予想される。なぜならば、Ｈｉｓ＋は、Ｈｉｓ０よりもほぼ５ｋｃａｌ／ｍｏｌ劣る（および野生型よりも７ｋｃａｌ／ｍｏｌ以上劣る）算出された結合自由エネルギーを有するからである。他の３つの変異体［Ｇｌｎ２１Ｈｉｓ（［Ｈｉｓ２１］Ｇ−ＣＳＦ）、Ｔｈｒ１１７Ｈｉｓ（［Ｈｉｓ１１７］Ｇ−ＣＳＦ）、およびＧｌｎ１１９（［Ｈｉｓ１１９］Ｇ−ＣＳＦ）］について、Ｈｉｓ０とＨｉｓ＋との間の結合における差異は、小さすぎてその予測について確信的でない（１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満）。
【０１７５】
（実施例３）
（実験材料および細胞培養）
最少必須培地α（ＭＥＭα）、Ｌ−グルタミン、ペニシリン−ストレプトマイシンおよびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。コールターカウンター用の等張溶液（ＩＳＯＴＯＮ  ＩＩ、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）を、Ｃｕｒｔｉｎ  Ｍａｔｈｅｓｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）から入手した。
【０１７６】
Ｇ−ＣＳＦ依存性懸濁細胞株であるＯＣＩ／ＡＭＬ１（Ｅｒｎｅｓｔ  Ａ．ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ［Ｏｎｔａｒｉｏ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＯＣＩ）、Ｐｒｉｎｃｅｓｓ  Ｍａｒｇａｒｅｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、６１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｍ５Ｇ  ２Ｍ９、Ｃａｎａｄａ］から頂いた）を、すべての実験について使用した。細胞を、慣用的に、５％ＣＯ２を含む給湿雰囲気において、２０％ＦＢＳ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍＬ  ペニシリン、１００ｇ／ｍＬ  ストレプトマイシンおよび２７０ｐＭ  Ｇ−ＣＳＦを補充したＭＥＭαにおいて、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ７５−ｃｍ２組織培養フラスコにおいて培養した。細胞を、３〜４日毎に、１０５細胞／ｍＬに継代した。
【０１７７】
（実施例４）
（ヒスチジン変異を用いた実験結果）
（細胞増殖アッセイ）
３つ全てのヒスチジン変異体、［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦ、［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦ、および［Ｈｉｓ１１９］Ｇ−ＣＳＦを、Ｇ−ＣＳＦ依存的細胞増殖アッセイにおいて野生型Ｇ−ＣＳＦと比較した。ＯＣＩ／ＡＭＬ１細胞を、細胞増殖アッセイを開始する２４時間前に、補充したＭＥＭα培地（Ｇ−ＣＳＦを含まない）に継代した。この時点で、１０５細胞／ｍＬの密度の細胞のパラレルフラスコを、１２５ｐＭ  野生型Ｇ−ＣＳＦ、［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦ、［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦ、および［Ｈｉｓ１１９］Ｇ−ＣＳＦと共にＭＥＭα培地中でインキュベートした。各々のフラスコにおける細胞増殖を、コールターカウンターを用いて２日目、５日目、および８日目に測定した。２日後、細胞増殖における差異は、検出され得なかった。しかし、５日後、［Ｈｉｓ１１９］Ｇ−ＣＳＦは、細胞増殖を有意に増加させた。８日目まで、［Ｈｉｓ１１９］Ｇ−ＣＳＦで処理した細胞は、コントロールのほぼ２倍の数であり、そして［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦおよび［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦで処理した細胞は、より小規模であるが、コントロールに対する有意な増加を示した。従って、全ての変異した残基がレセプターとの界面に直接的に位置という事実にも関わらず、全ての変異体は、細胞増殖を促進する点で、野生型Ｇ−ＣＳＦよりも強力だった。
【０１７８】
（リガンド枯渇）
各々のタンパク質についてのリガンド枯渇を、経時的に測定する。上記の実験のように、ＯＣＩ／ＡＭＬ１細胞を、リガンド枯渇実験の開始の２４時間前に、補充ＭＥＭα培地（Ｇ−ＣＳＦを含まない）に継代した。この時点で、１０５細胞／ｍＬの密度の細胞のパラレルフラスコを、１２５ｐＭ  野生型Ｇ−ＣＳＦ、［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦ、［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦ、および［Ｈｉｓ１１９］Ｇ−ＣＳＦと共にＭＥＭα培地においてインキュベートした。２４時間後、各々のフラスコにおける細胞数を、上記のように測定し、そして各々の培地上清のアリコートを獲得し、その後遠心分離して細胞片をペレット状にし、Ｇ−ＣＳＦ濃度の測定のために−２０℃で保管する。これを、２４時間毎に８日間繰り返す。次いで、培地上清サンプルにおけるＧ−ＣＳＦ、［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦ、［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦ、および［Ｈｉｓ１１９］Ｇ−ＣＳＦの濃度を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から入手した酵素免疫検定法アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットを用いて定量した。各々の上清サンプルを、二連でアッセイした。輸送性の点で最良だと予想される両方のＡｓｐ→Ｈｉｓ変異体は、野生型Ｇ−ＣＳＦの半減期の少なくとも１０倍の半減期を生じた。実際、野生型と比較して、Ａｓｐ→Ｈｉｓ変異体｛［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦおよび［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦ｝の細胞増殖における８日目までの初期に顕著な増加（ｅａｒｌｉｅｒ−ｎｏｔｅｄ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）は、細胞を刺激するのに利用可能な十分なリガンドを有することの直接的な結果である。さらに、Ｇｌｎ→Ｈｉｓ変異体、［Ｈｉｓ１１９］Ｇ−ＣＳＦは、野生型の半減期よりも６倍大きい半減期を有した。このことは、この変異体の能力により、８日目までに野生型のほぼ２倍多い細胞が生じるという理由で、重要である。従って、この変異体の細胞輸送は、野生型よりも大きいことが期待され得る。
【０１７９】
少なくとも２つの独立した実験を、細胞増殖およびリガンド枯渇研究の両方のために実施した。
【０１８０】
（リガンド結合）
Ｇ−ＣＳＦレセプターに対するＧ−ＣＳＦアナログのリガンド結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いて測定する。ヒスチジンタグ化野生型ＧＣＳＦを、チップ表面に固定化し、そして遊離レセプター（約０．２５〜１０ｎＭ）を、チップ上に通過させて、標準平衡曲線を作製し、そして１：１モデルを使用して、野生型結合親和性を計算する。各々の変異体リガンド結合親和性を決定するために、２ｎＭの遊離レセプターを、既知濃度の変異体リガンドと混合し、そしてチップ上を通過させる。変異体の平衡結合親和性を、競合する１：１結合モデルを用いて決定する。結合親和性のデータを、ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．１ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて分析し；そして平衡解離定数（ＫＤ）を決定する。
【０１８１】
変異体の半減期および効力における増加がより高いリガンドリサイクル速度に寄与し得るか否かを決定するために、複合体のインターナリゼーションおよびリガンドのリサイクルを示す速度定数を測定し、そしてこれを以下に報告する。
【０１８２】
（Ｇ−ＣＳＦアナログのインターナリゼーション）
公表された研究［Ｋｕｗａｂａｒａら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂｏｌ．３２：Ｅ１〜Ｅ９（１９９５）］と同様のインターナリゼーション実験を、５分間にわたり、Ｇ−ＣＳＦアナログ、［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦ、［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦに対して行った。簡潔にいうと、１０８細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、標識リガンド中で氷上にて３０分間インキュベートして、表面複合体を得した。この細胞を、再度、氷冷したＰＢＳで２回洗浄し、そしてＭＥＭαにおいて、３７℃、ｔ＝０で再懸濁した。表面複合体および内部複合体における変化を、５分間追跡した；内部複合体のプロット  対  表面複合体の時間積分は、線形の関係を生じ、この勾配は、複合体インターナリゼーションの速度定数である［Ｗｉｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：４２２２〜４２２９（１９８２）］。野生型Ｇ−ＣＳＦと［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦアナログおよび［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦアナログとの間のインターナリゼーション速度における差異は検出されなかった。インターナリゼーション実験に伴う誤差は、少なくとも３つの独立した実験の標準偏差である。
【０１８３】
（Ｇ−ＣＳＦアナログのリサイクル）
リサイクリング実験を、２５分間にわたる以外は、インターナリゼーション実験と同一に、Ｇ−ＣＳＦアナログ、［Ｈｉｓ１０９］Ｇ−ＣＳＦ、［Ｈｉｓ１１２］Ｇ−ＣＳＦに対して行った。リサイクル実験からのデータは、リサイクル速度定数を獲得するために適合されるパラメータである。変異体のリサイクル速度定数は、野生型のリサイクル速度定数よりも少なくとも５０％大きいことが見出された（２サンプルｔ検定による９５％の信頼性）。リサイクル実験に伴う誤差は、少なくとも３つの独立した実験の標準偏差であった。リガンドのリサイクルにおけるこの改善はまさに、本明細書に示されるコンピューターモデリングの使用を通じて追求される目標であった。リサイクルにおいて測定された増加は、１ラウンドのインターナリゼーションから有効であるが、変異体の半減期における大規模な増加は、インターナリゼーション、リサイクル、および再インターナリゼーションなどの組み合わせから生じる。従って、リサイクル減少の反復的な効果は、インビボでの半減期を増加させ、そして標的レセプターを発現する細胞の、薬物により誘導される増殖により広がるネガティブフィードバックを減少させることにより、薬物の能力を大いに改善し得る。
【０１８４】
従って、上記のように、本発明のヒスチジン置換により、細胞増殖アッセイにおいて野生型Ｇ−ＣＳＦと比較して同じかまたはそれより高い能力を有するＧ−ＣＳＦアナログが生成される。また、変異体の半減期は、野生型Ｇ−ＣＳＦの半減期の６〜１０倍であった。さらに［Ｈｉｓ１１９］Ｇ−ＣＳＦは、８日目までに、野生型Ｇ−ＣＳＦの細胞増殖のほぼ２倍の細胞増殖を誘導した。さらに、リガンドのリサイクルは、インターナリゼーション速度が不変であったにも関わらず、有意に改善された。これらの結果は重要である。なぜならば、これらにより、この変異体の細胞輸送が野生型と比較して改善されるということが示唆されるからである。細胞応答におけるこのような変化は、Ｇ−ＣＳＦレセプター結合に影響を及ぼすことにより、および／またはリガンド／レセプターのエンドサイトーシス性輸送経路を通じた仕分け（ｓｏｒｔｉｎｇ）、リサイクル、および分解のプロセスにより生じる。
【０１８５】
本明細書中に示される方法は、Ｇ−ＣＳＦ／Ｇ−ＣＳＦＲ以外の他のシステムにも同様に汎用化可能である。リガンド−レセプター複合体の結晶構造が与えられれば、「ヒスチジンスイッチ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）」技術は、輸送された複合体の成分の増強されたエンドソームリサイクルにより変異体を作製するためのフレームワークを提供する。これは、システムレベルの細胞輸送分析の関係において（個々の結合現象またはシグナル伝達現象自体ではなく）、合理的な薬物設計を実証する最初の作業である。
【０１８６】
本発明を、好ましい実施形態に関して記載してきたが、変更および改変が、当業者によりなされることが理解される。従って、添付の特許請求の範囲が、請求される発明の範囲の中で生じるすべてのこのような同等の変化を包含することが意図される。
【配列表】
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