(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造式を有する化合物：
【化１】
0004643009.tif 000009
（I）
または
【化２】
0004643009.tif 000010
（II）
【請求項２】
癌を治療するための請求項１記載の化合物を含む組成物であって、該組成物を血清と混合して、患者に静脈注射により投与する、組成物。
【請求項３】
N-(全トランス-レチノイル)-ドキソルビシン(I)を含む医薬組成物。
【請求項４】
N-(13-シス-レチノイル) -ドキソルビシン(II) を含む医薬組成物。
【請求項５】
癌治療用のN-(全トランス-レチノイル)-ドキソルビシン(I) を含む医薬組成物。
【請求項６】
癌治療用のN-(13-シス-レチノイル) -ドキソルビシン(II) を含む医薬組成物。
【請求項７】
癌を治療するためのN-(全トランス-レチノイル)-ドキソルビシン(I)を含む医薬組成物であって、該組成物が静脈注射される、医薬組成物。
【請求項８】
癌を治療するためのN-(13-シス-レチノイル) -ドキソルビシン(II) を含む医薬組成物であって、該組成物が静脈注射される、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、癌治療に有用な新規化合物に関する。これらの化合物は、従来の細胞毒性医薬の効果を増加させるために使用される。
【０００２】
細胞増殖抑制化合物または細胞毒性化合物は、広く癌治療に使用される。ドキソルビシンは、アミノ配糖体アンスラサイクリン抗生物質であって、通常、この化合物群の代表的な化合物として使用される。
【０００３】
細胞膜は物理的バリアーに相当し、ドキソルビシンの吸収速度を決定するいくつかの要因がある。主要要因は、疎水性（これが増加すると吸収速度が増加する）およびアミノ基の陽子化度(解離度)−pKa(これが減少すると進入速度が増加する)である。ドキソルビシンは細胞増殖を阻害し、核物質に対して顕著な効果を示し、非特異的に濃縮、膠着または損傷をおこす。ドキソルビシンとDNAとの主な結合力は、平面的発色団のインターカレーション（挿入）であり、正電荷のアミノ糖残基とDNAの負電荷のホスフェート基との外側の静電気的結合によって安定化される。
【０００４】
挿入される薬物分子は、核酸合成を開始するために前段階として必要であるヘリックス構造における変化を妨ぐと思われる。主たるドキソルビシンの致死的な効果は、核酸合成の阻害である。結果として、該薬物は、細胞分裂している細胞に対してより活性であり、最大の効果は、細胞周期のＳ期の際である（Brown J.R.,ドキソルビシンおよび関連性アンスラサイクリン抗生物質；Progress in Medical Chemistry、G.P Ellis and G.B. West編, Elsevier/North-Holland Biomedical Press v.15, pp.125-164,1978)
【０００５】
いくつかの所見は、ドキソルビシンの正電荷のアミノ基とリン脂質（例えば、カルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチド酸）の負電荷のホスフェート基とで形成される静電性複合体について一致している。カルジオリピンは、ミトコンドリア内膜の最も特徴的な成分であり、心筋中に多い成分である。ミトコンドリア傷害の病因は、ドキソルビシンの心臓毒性を特徴づける主要かつより特異的な亜細胞性変化の１つである。ミトコンドリアに対してかなり選択的な毒性は、心筋ミトコンドリアにおける高濃度のカルジオリピンによるものであろう（Durarte-Karim M., et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.,v.71,N.2,pp658-663,1976）。
【０００６】
ドキソルビシンと脂質間の相互作用は、陰イオン性リン脂質と種々の両性リン脂質の混合物から構成される大きな単一ラメラ小胞（LUVET）を用いて試験される。電気的な力がドキソルビシン膜相互作用に非常に重要であるために、陰イオン性リン脂質と多様な両性リン脂質の希釈により、薬物の膜会合が低下する。しかし、ホスファチジルエタノールアミン（PE）と結合した陰イオン性リン脂質からなるLUVETとアドリアマシンとの結合は、陰イオン性脂質に加えて、ある範囲の別の両性イオン性脂質、例えば、ホスファチジルコリンおよびN-メチルエタノールアミンおよびPEのN,N-ジメチルエタノールアミン誘導体からなるLUVETとの結合よりも強い[Speelmans, G, et al.,Biochemistry, c36 N28.pp8657-8662,1997]。
【０００７】
ヒト赤血球とドキソルビシンの相互作用は、膜結合部位および生じた構造的な乱れを特定するために研究された。電気顕微鏡によると、ヒト血清中で薬物の治療学的濃度で培養された赤血球細胞が、その平円板形態を気孔状および棘状の両方に変える。薬物は分子モデルと共にインキュベートされた。分子モデルの１つは、ジミリストイルホスファチジルコリンとジミリストイルホスファチジルエタノールアミンとの多層からなり、これらはリン脂質の代表的なものであり、赤血球膜の外部および内部の各葉状器官に位置する。Ｘ線回析によると、アドリアマイシンの相互作用が、両脂質の極性頭部とアシル鎖部分を不安定にさせる。これによって、アドリアマイシンは赤血球の膜構造に作用する両方の赤血球葉状器官に組み込まれることが結論付けられた(Suwalsky M., Z Naturforsch[C]v.54,N3-4,pp.271-277,1999)。
【０００８】
大豆から得たステロールとジパルミトイルホスファアチジルコリンリポソームとの種々な物理化学的特性が研究された。リポソームのドキソルビシンは遊離の薬物と比較して薬理学的効果を増加させ、このことは副作用の低下と長時間循環を示唆する(Maitani Y., Yakugaku Zasshi, v.116,N.12 pp901-910, 1996)。
【０００９】
ポリエチレングルコールから得たリン脂質を含有するリポソームは、網状内皮取込系(reticulo-endothelial system)を回避し、それによって長期間、循環中にとどまり得る。定常的に安定化したリポソーム中にカプセル化されたドキソルビシンは、重度合併症免疫不全マウスにおいて確立されたヒト肺腫瘍異種移植片の増殖を抑制し、この腫瘍細胞の自発転位を阻害する(Sakakibara T., et al., Cancer Res.,v56, N,16,pp3764-3746,1996)。
【００１０】
リポソームのカプセル化は、皮下投与（s.c.）後の薬物の細胞毒性効果から周辺組織を保護し得る。「液体状態」のリン脂質からなるリポソームは、皮下注射した場合、ドキソルビシンの損傷効果を遅延させるのみである。さらに固体性質を有するリポソームは、皮下注射した場合、長期間にわたり局部の組織損傷を防止する点でより有効であった。(Oussoren C., et al., Biochim. Biophys. Acta, v.1369,N.1,pp.159-172,1998)。
【００１１】
外因性ポリ不飽和脂肪酸は、ヒト乳癌細胞系のMDA-MB-231において抗癌薬の細胞毒性活性を調節する。全ての試験されたポリ不飽和脂肪酸の中で、ドコサヘキサエン酸は、ドキソルビシン細胞毒性を増加させる点で最も影響があった(E. Geramin, et al ., Int. J.Caner, v75,pp.578-583,1998)。
【００１２】
癌治療のための新規化合物および方法に対する必要性がいまだ残っている。本発明は、ドキソルビシンなどの現在使用されている抗癌剤の薬理活性を増加させること、および癌治療への新しいアプローチを提供することを目的としている。
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、新規化合物および化合物の新規組合せを提供するものであって、既知の細胞毒性医薬または細胞抑制医薬と共に、癌を消滅するための可能性を改善する。さらに、本発明は、かかる化合物の合成方法および細胞増殖抑制医薬化合物；ドキソルビシンの修飾形態を開示する。
【００１４】
（発明の詳細）
過酸化脂質の量は、ヒト乳癌細胞（MDA-MB-231系）において、ドコサヘキサン酸と酸化体の存在において、ドキソルビシン(DXR)の作用後に発生することが証明されている。これは、腫瘍細胞に、ドキソルビシンの効果に耐えるその性質を低下させる代謝特性を付与するのであろう。
【００１５】
以前、本発明者は、ホスフェート基を含有する2-アミノエタノール、α-L-セリン、α-L-スレオニン、α-L-チロシンと、全トランス-レチノイン酸や13−シス-レチノイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、リノレン酸との新規アミドを提供した（WO-A-0047589）。本発明は、具体的な化合物の使用、特にドキソルビシンの薬理活性を増加するための適用を開示する。
【００１６】
これらの新規化合物は、ポリ不飽和脂肪酸の疎水残基、レチノイン酸残基、負電荷を有するホスフェート基を含有する。即ち、新規化合物とドキソルビシンの分子間の相互作用は、脂肪酸残基またはレチノイン酸残基とドキソルビシンの平面的発色体との疎水的相互作用、さらに両化合物の逆電荷官能基間の電気的相互作用によって生じるのであろう。
【００１７】
一方、これらの二成分複合体は、癌細胞膜を通って指向した送達のために必要な特性の全てを有し、「内部崩壊を促す(Trojan horse)もの」と云えよう。他方、癌細胞内でこれら二成分複合体の解離は、ドキソルビシンの「元の」正電荷分子を放出し、その結果として、DNAへのドキソルビシンの挿入について好ましい条件が構築される。
【００１８】
以下の化合物、1−4、1a−4a、5−20は、本発明の基本を形成する。かかる化合物は、1999年3月16日に出願したWO‐A‐0047589に、部分的に開示されている。
【００１９】
レチノイン酸誘導体：
1.  N-(全トランス-レチノイル)-O-ホスホ-2-アミノエタノール
1a．N-(13-シス-レチノイル)-O-ホスホ-２-アミノエタノール
2． N-(全トランス-レチノイル)-O-ホスホ-Ｌ-セリン
2a．N-(13-シス-レチノイル)-O-ホスホ-Ｌ-セリン
3.  N-(全トランス-レチノイル)-O-ホスホ-Ｌ-スレオニン
3a．N-(13-シス-レチノイル)-O-ホスホ-Ｌ-スレオニン
4.  N-(全トランス-レチノイル)-O-ホスホ-Ｌ-チロシン
4a. N-(13-シス-レチノイル）-O-ホスホ-Ｌ-チロシン
アラキドン酸誘導体：
5.  N-アラキドノイル-O-ホスホ-2-アミノエタノール
6.  N-アラキドノイル-O-ホスホ-L-セリン
7.  N-アラキドノイル-O-ホスホ-L-スレオニン
8.  N-アラキドノイル-O-ホスホ-L-チロシン
ドコサヘキサエン酸誘導体：
9.  N-ドコサヘキサエノイル-O-ホスホ-2-アミノエタノール
10. N-ドコサヘキサエノイル-O-ホスホ-L-セリン
11. N-ドコサヘキサエノイル-O-ホスホ-L-スレオニン
12. N-ドコサヘキサエノイル-O-ホスホ-L-チロシン
【００２０】
エイコサペンタエン酸誘導体：
9.   N-エイコサペンタエノイル-O-ホスホ-2-アミノエタノール
10.  N-エイコサペンタエノイル-O-ホスホ-L-セリン
11.  N-エイコサペンタエノイル-O-ホスホ-L-スレオニン
12.  N-エイコサペンタエノイル-O-ホスホ-L-チロシン
リノール酸誘導体：
13.  N-リノレノイル-O-ホスホ-2-アミノエタノール
14.  N-リノレノイル-O-ホスホ-L-セリン
15.  N-リノレノイル-O-ホスホ-L-スレオニン
16.  N-リノレノイル-O-ホスホ-L-チロシン
【００２１】
以下の説明および実施例において、上記化合物は、C1−C4、C1a−C4a、C5−C20として示す。
DXR単独の場合と比較して、ドキソルビシン(DXR)とC1−C4、C1a−C4a、C5−C20のいずれかの上記化合物との複合体の抗腫瘍効果の研究は、EAC(Ehrlich ascite carcinoma)マウスを用いて行った。試験化合物によって達成されたマウスにおけるEAC増殖阻害の程度は、DXRと比較して、各DXR/化合物複合体の抗腫瘍活性の評価に使用した。
DXRといずれかの化合物（C1−C4、C1a−C4a、C5−C20）単独との複合体では、抗腫瘍効果を示さなかった。特に、DXR/C4複合体において、化合物C4は、DXRの抗腫瘍作用を無効にし、マウスにおけるEAC増殖に対するいくらかの（有意でない）促進作用さえも示した。DXR/C5複合体において、化合物C5はDXRの抗腫瘍作用を無効にした。
【００２２】
しかし、本発明者は、DXRとC4またはC4aと5との複合体、DXR/C4(C4a)とC9、DXR/C4(C4a)とC13、およびDXR/C4(C4a)とC17との複合体が抗腫瘍効果を示すことを明らかにした。
【００２３】
添付した一連の試験結果は、上記所見を支持している。以下の用量を用いた：  DXR-3.5mg/体重kg
C4-8.15mg/体重kg
C4：C5のモル比が1:3、1:2.9、1:2.8、1:2.7および1:2.6では、EAC増殖阻害は各々45.0％、43.6％、46.0％、48.2％、50.4％を示した。
C4：C5のモル比が1:2.5、1:2.4、1:2.3および1:2.2では、EAC増殖阻害は各々48.7％、51.5％、53.4％および57.0％を示した。
C4：C5のモル比が1:2.1、1:2、1:1.9および1:1.8では、EAC増殖阻害は各々58.0％、59.5％、62.0％および65.2％を示した。
C4：C5のモル比が1:1.7、1:1.6、1:1.5および1:1.4では、EAC増殖阻害は各々67.1％、67.9％、69.1および70.0％を示した。
C4：C5のモル比が1:13、1:1.2、1:1.1および1:1では、EAC増殖阻害は各々69.4％、66.7％、62.5％および65.2％を示した。
C4：C5のモル比が1:1.7、1:1.6、1:1.5、1:1.4および1:1.3では、DXR群（正対照）と比較して、EAC増殖阻害が、各々38.8％、40.3％、42.6％、44.2％および41.1％を示したことは、注目に価する。
【００２４】
DXR-3.5mg/体重kg
C5-6.4mg/体重kg
C4：C5のモル比が1:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1および1.4:1では、EAC増殖阻害は各々65.2％、61.6％、66.2％、69.3％および69.8％を示した。
C4：C5のモル比が1.5:1、1.6:1、1.7:1および1.8:1では、EAC増殖阻害は各々74.9％、78.1％、74.1％および66.4％を示した。
C4：C5のモル比が1.9:1、2:1、2.1:1および2.2:1では、EAC増殖阻害は各々65.1％、61.8％、63.2％および58.0％を示した。
C4：C5のモル比が2.3:1、2.4:1、2.5:1、および2.6:1では、EAC増殖阻害は各々55.5％、58.7％、56.7％および57.6％を示した。
C4：C5のモル比が2.7:1、2.8:1、2.9:1、および3:1では、EAC増殖阻害は各々56.6％、55.0％、50.4％および45.3％を示した。
C4：C5のモル比が1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6：1および1.7:1では、DXR群（正対照）と比較して、EAC増殖阻害が各々43.2％、44.1％、51.4％、57.7％および49.8％を示したことは注目に価する。
特に、DXR/C4+C9複合体、DXR/C4+C13複合体、DXR/C4+C17複合体、DXR/C4a+C5複合体の抗腫瘍効果を試験するためのいくつかの試験は、このことを示した。
【００２５】
DXR/ C4+C9複合体：
DXR-3.5mg/体重kgおよびC4-8.15mg/体重kg
C4：C9のモル比が1:1、1:1.4、1:1.8および1:2.3では、EAC増殖阻害は各々61.8％、67.3％、62.5％および49.7％を示した。
C4：C9のモル比が1:1.4では、DXR群（正対照）と比較して、EAC増殖阻害は49.3％であった。
【００２６】
DXR/ C4+C13複合体：
DXR-3.5mg/体重kgおよびC4-8.15mg/体重kg
C4：C13のモル比が1:1.3、1:1.6、1:2および1:2.5では、EAC増殖阻害は各々67.0％、64.6％、54.2％および45.1％を示した。
C4：C13のモル比が1:1.3と1:1.3では、DXR群（正対照）と比較して、EAC増殖阻害は各々47.6％および43.8％を示した。
【００２７】
DXR/ C4+C17複合体：
DXR-3.5mg/体重kgおよびC17-6.0mg/体重kg
C4：C17のモル比が1:1、1.4:1、2:1および2.7:1では、EAC増殖阻害は各々62.9％、67.4％、60.3％および51.8％を示した。
C4：C17のモル比が1.4:1では、DXR群（正対照）と比較して、EAC増殖阻害は45.0％を示した。
【００２８】
DXR/ C4a+C5複合体：
DXR-3.5mg/体重kgおよびC5-6.4mg/体重kg
C4a：C5のモル比が1.2:1、1.6:1、1.9:1および2.5:1では、EAC増殖阻害は各々64.4％、72.4％、62.2％および52.5％を示した。
C4a：C5のモル比が1.6:1では、DXR群（正対照）と比較して、EAC増殖阻害は49.4％を示した。
【００２９】
本発明者は、DXR/(C4+C4a)+C5複合体、DXR/(C4+C4a)+(C5+C9+C13)複合体、DXR/(C4+C4a)+(C5+C9+C13+C17)複合体が、抗腫瘍効果を示すことを明らかにする。抗腫瘍効果をテストするための試験は、上記所見を支持するものである。
DXR/(C4+C4a)+C5複合体：DXR−3.5mg/体重kg、C5-6.4mg/体重kg
(C4+C4a):C5のモル比が1.2:1、1.6:1、1.9:1および2.5:1では、EAC増殖阻害は各々63.1％、71.6％、61.0％および47.3％であった。
(C4+C4a):C5のモル比が1.6:1では、DXR群(正対照)と比較して、EAC増殖阻害は53.1%を示した。
【００３０】
DXR/(C4+C4a)+(C5+C9+C13)複合体:DXR-3.5mg/体重kg、(C4+C4a)-8.15mg/体重kg
(C4+C4a):(C5+C9+C13) のモル比が 1:1、1:1.4、1:1.8および1:2.3では、EAC増殖阻害は、各々60.1%、68.3%、61.3%および47.2%を示した。
(C4+C4a)+(C5+C9+C13) のモル比が1:1.4では、 DXR群(正対照)と比較して、EAC増殖阻害は49.8%を示した。
【００３１】
DXR/(C4+C4a)+(C5+C9+C13+C17)複合体:DXR-3.5mg/体重kg、(C4+C4a)-8.15mg/体重kg
(C4+C4a):(C5+C9+C13+C17) のモル比が、1:1.3、1:1.6、1:2および1:2.5では、 EAC増殖阻害は各々68.0%、69.7%、56.3%および43.5%を示した。
(C4+C4a):(C5+C9+C13+C17)のモル比が1:1.3および1:1.6では、DXR群(正対照)と比較したEAC増殖阻害は各々45.3%および48.1%を示した。
【００３２】
DXR/C4+C5複合体、DXR/C4+C9複合体、DXR/ C4+C13複合体、DXR/C4+C17複合体、DXR/C4a+C5複合体の抗腫瘍効果についての検討は下記の結論を導く。
【００３３】
C4（またはC4a)：C5(またはC9またはC13またはC17)のモル比が1:3から1:1および1:1から3:1では、抗腫瘍作用の複合体は、DXR単独の効果を超える。この結果は、1:2-1:1および1:1-2:1の間の複合体に関して有意の効果を示し、さらに狭い範囲の1:1.7-1:1.3および1.3−1.7:1のものでは、改良された効果を有する。
【００３４】
DXR/(C4+C4a)+C5複合体、DXR/(C4+C4a)+(C5+C9+C13)複合体、DXR/(C4+C4a)+(C5+C9+C13+C17)複合体の抗腫瘍効果の研究は、この結論を確認するものである。さらに、複合体に関して、2から6つの化合物(4、4a、5、9、13、17)がDXRとの相互作用に関係していることは間違いない。
【００３５】
これらの結果は、新規化合物(C4、C4a、C5、C9、C13、C17)の臨界ミセル濃度を充分超える濃度で得られた。
【００３６】
水溶性芳香族化合物、例えばドキソルビシンは、水溶液でミセル形態で存在し得る。驚くべきことに、本発明者は、1-2mg/mlの濃度範囲にあるドキソルビシンが、より効果的に新規化合物(C4、C4a、C5、C9、C13、C17)と混合ミセルを形成することを明らかにした。 さらに、これら混合ミセルの抗腫瘍活性は、同濃度におけるドキソルビシン単独の活性に関する以上に非常に高かった。
【００３７】
このように、全トランス-レチノイン酸とO-ホスホ-L-チロシンとのアミドまたは／および13-シス-レチノイン酸とO-ホスホ-L-チロシンとのアミド、(C4またはC4a、C4+C4a）、ポリ不飽和酸とO-ホスホリルエタノールアミンとのアミド(C5またはC9またはC13またはC17、C5+C9、C5+C13、C5+C17、C9+C13、C9+C17、Cl3+C17、C5+C9+C13、C5+C9+C17、C5+C13+C17、C9+C13+C17、C5+C9+C13+C17)およびドキソルビシンからなる混合ミセルは、抗腫瘍活性を示す。
【００３８】
このように、全トランス-レチノイン酸とO-ホスホ-L-チロシンとのアミドまたは／および13-シス-レチノイン酸とO-ホスホ-L-チロシンとのアミド(C4またはC4a)、ポリ不飽和酸とO-ホスホリルエタノールアミンとのアミド(C5またはC9またはC13またはC17)、およびドキソルビシンからなる混合ミセルは、抗腫瘍活性を示す。
【００３９】
本発明者は、レチノイン酸およびポリ不飽和酸と、ホスフェート基を含有するヒドロキシアミノ酸およびエタノールアミンとのアミドを合成する普遍的方法を以前に説明している。本出願において、本発明者は、N-アシル-O-ホスホ-2-アミノエタノールおよびN-レチノイル-O-ホスホ-L-チロシンの合成方法を開示する。
【００４０】
該方法は、従来のものと比べて以下の利点を有する：
-１工程で合成を行ない得る
-収率が高く、90％に達する
-簡易かつ時間短縮した合成
-最終製品をクロマトグラフィーを用いずに精製し得る。
【００４１】
実施例：材料と方法
ドキソルビシンと化合物4(C4)または化合物4a(C4a)および化合物5(C5)または化合物9(C9)または化合物13(C13)または化合物17(C17)との複合体の抗腫瘍効果の研究は、ドキソルビシン(DXR)と比較して、エールリヒ(Ehrlich)腹水癌(EAC)マウスで実施した。自己哺育したICR系の無作為化交配したアルビノマウスのオスおよびメスをこの研究に用いた。飼育のための部屋は、19-21℃、相対湿度50-60％、濾過空気を１時間あたり15回取替えて、午前6時と午後6時での明暗変化によって光日12時間に調節した。マウスを、柔らかいおが屑を敷詰めた600cm2の床面積を有する透明なポリカーボネートのケージで飼育した。該動物は、家庭用飲料水のボトルおよび動物が本能的に生育するための標準的飼料と自由に接触し得る。2-2.5ヶ月令、19-22gの体重を有するマウスを、平均体重で標準化し、無作為に対照群および試験群に分類した。対照群および試験群は、各々10および7匹の動物個体を含む。各群のマウスは特定の耳マークで識別した。各群のマウスのケージを試験日、群番号、動物個体番号および性別を記したケージカードによって識別した。
【００４２】
EACの株は、自生腹水液(0.2ml)または生育7日目の腹膜内で育ったEACを用いて、1または2匹の動物から腹水液を生理食塩水で1:1に希釈した腹水液(0.5ml)を腹膜内注射によって、ICRマウスに継代した。腹水液は、トリパンブルー排除試験により98％以上の生存腫瘍細胞を含んでいた。各試験に関して、107生存腫瘍細胞／mlの濃度の滅菌生理食塩水のEAC細胞懸濁液を、7日目のEACを有するマウスの腹水液から無菌条件で調製した。
【００４３】
各対照および試験群のマウスを、2×106EAC細胞を0.2mlの体積で腹膜内注射によって0日目に接種した。この試験に関して静脈注射をマウスの尻尾毛細血管に、ECA細胞の接種に続いて１日おきに、3回(2、4および6日目)行なった。対照群のマウスに、2.5ml/体重kgの体積(20gの体重のマウスに50μl)で賦形剤を注射した。別の動物群(正対照)は、DXRの水溶液(1.4mg/mlの濃度)を3.5mg/体重kgおよび2.5mg/体重kg(50μl中70μgのDXRを20mgの体重のマウスに)用量で静脈注射投与した。試験群のマウスに、DXR/C4+C5の複合体(2つの実験系)、DXR/C4+C9の複合体(同じ実験系)、 DXR/C4+C13の複合体(同じ実験系)、DXR/C4+C17の複合体(同じ実験系)、DXR/C4a+C5の複合体(同じ実験系)を静脈注射した。試験群のマウスに、DXRを3.5mg/体重kgの用量、2.5ml/体重kgの体積（20gの体重のマウスに対して50μL中DXRを70μgに対応する)、DXR濃度1.4mg/mlで投与した。１つの実験系を、C4:C5のモル比を1:3から1:1に変えて、C5の含有濃度を変える以外は一定のC4濃度(8.15mg/体重kg)でのDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍効果の研究に対して構築した。別の実験系を、C4:C5のモル比を1:1から3:1に変えて、C4の含有濃度を変える以外は一定のC5濃度(6.4mg/体重kg)でのDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍効果の研究に対して構築した。時に部分的に皮下注射になってしまうと動物の痛反応、局所刺激損傷または潰瘍および壊死をもたらすことがあるので、複合体とドキソルビシンとの溶液を完全に静脈注射した。
【００４４】
マウスを、試験複合体による最終処置2日後の8日目に頚椎脱臼法により屠殺した。腹水液を除き、回収し、その体積を記録し、腹腔内を生理食塩水で6-7回洗浄し、双方の液体を回収した。1000r.p.m.、10分間の遠心分離後、腫瘍細胞ペレットの体積も記録した。生存腫瘍細胞数を血球計で計測した。各群について平均および標準誤差を計算した。対照群および試験群における腫瘍細胞数の比較を、スチューデント t 検定によって実施した。EAC増殖阻害に対する試験調製物の作用を、以下の式によって評価した：
【数１】
0004643009.tif 000002
DXRと比較して、試験調製物により作用を受けたマウスにおけるEAC増殖阻害の程度を、試験複合体の抗腫瘍活性の評価に用いた。
【００４５】
１
実施例１：DXR/C4複合体の抗腫瘍効果
ICRマウス （20−22ｇ）の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤を投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。試験群のマウスには、DXR/C4（DXR-3.5mg/kg、/C4-22.5mg/kg）複合体を投与した。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【００４６】
対照群のマウスは、腹腔内に（680.0±59.1)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は（510.9±52.9)×106のEAC細胞数を示し、EAC増殖阻害24.9％、ｐ＜0.05であった。DXR/C4複合体を投与した試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は（787.2±141.8）×106、p＞0.05であった。
【００４７】
３
即ち、DXR/C4複合体は抗腫瘍細胞作用を示さなかった。さらに、化合物11は、DXRの抗腫瘍作用を無効にし、負対照に比較して、マウスにおけるEAC増殖に対する有意でないいくらかの促進作用を発揮した。
【００４８】
実施例２：DXR／Ｃ５複合体の抗腫瘍効果
ICRマウス （20−22ｇ）の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤を投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。試験群のマウスには、DXR/C5（DXR-3.5mg/kg、/C5-12mg/kg）複合体を投与した。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【００４９】
対照群のマウスは、腹腔内に（680.0±59.1)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は（510.9±52.9)×106のEAC細胞数を示し、EAC増殖阻害24.9％、ｐ＜0.05であった。DXR/C5複合体を投与した試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は（635.6±122.2）×106、p＞0.05であった。
【００５０】
即ち、DXR/C5複合体は抗腫瘍細胞作用を示さなかった。さらに、C5は、DXRの抗腫瘍作用を無効にした。
【００５１】
DXR/C4+C5複合体の抗腫瘍効果の試験に関する一連の実験。DXR-3.5mg/体重kg。C4-8.15 mg/体重kg。C4:C5のモル比を1:3から1:1に変えた。
【００５２】
実施例3：C4+C5のモル比が1:3、1:2.9、1:2.8、1:2.7、1:2.6であるDXR／C4+C5複合体の抗腫瘍効果。
ICRマウス（体重20−22g）の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤のみを投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。第一の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:3であった）を投与した。第二の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:2.9であった）を投与した。第三の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:2.8であった）を投与した。第四の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:2.7であった）を投与した。第五の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:2.6であった）を投与した。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【００５３】
対照群のマウスは、腹腔内に（657.5±72.6)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は（407.4±75.9)×106を示し、EAC増殖阻害38.0％、ｐ＜0.05であった。第一の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(361.3±98.5)×106であり、EAC増殖阻害45.0％、ｐ＜0.05であった。第二の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(370.6±94.9)×106であり、EAC増殖阻害43.6％、ｐ＜0.05であった。第三の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(354.9±101.2)×106であり、EAC増殖阻害46.0％、ｐ＜0.05であった。第四の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(340.8±104.7)×106であり、EAC増殖阻害48.2％、ｐ＜0.05であった。第五の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(326.1±93.3)×106であり、EAC増殖阻害50.4％、ｐ＜0.05であった。
即ち、1:3.0から1:2.6の様々なC4:C5のモル比でのDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍活性は、DXR単独の効果を超えた。
【００５４】
実施例4：C4+C5のモル比が1:2.5、1:2.4、1:2.3および1:2.2であるDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍効果。
ICRマウス(20-22ｇ)の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤を投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。第一の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:2.5である）を投与した。第二の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:2.4である）を投与した。第三の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:2.3である）を投与した。第四の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:2.2である）を投与した。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【００５５】
対照群のマウスは、腹腔内に（935.1±107.8)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は（548.5±81.7)×106を示し、EAC増殖阻害41.3％、ｐ＜0.02であった。第一の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(479.4±103.8)×106であり、EAC増殖阻害48.7％、ｐ＜0.01であった。第二の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(453.7±125.1)×106であり、EAC増殖阻害51.5％、ｐ＜0.02であった。第三の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(435.5±99.8)×106であり、EAC増殖阻害53.4％、ｐ＜0.01であった。第四の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(402.0±116.9)×106であり、EAC増殖阻害57.0％、ｐ＜0.01であった。
即ち、1:2.5から1:2.2の様々なモル比でのDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍活性は、DXR単独の効果を超えた。
【００５６】
実施例5：C4:C5のモル比が1:2.1、1:2、1:1.9および1:1.8であるDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍効果。
ICRマウス(20-22ｇ)の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤を投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。第一の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:2.1である）を投与した。第二の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:2である）を投与した。第三の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:1.9である）を投与した。第四の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:1.8である）を投与した。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【００５７】
対照群のマウスは、腹腔内に（862.4±125.0)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は（455.3±131.3)×106を示し、EAC増殖阻害47.2％、ｐ＜0.05であった。第一の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(361.8±79.4)×106であり、EAC増殖阻害58.0％、ｐ＜0.01であった。第二の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(349.3±92.2)×106であり、EAC増殖阻害59.5％、ｐ＜0.01であった。第三の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(327.5±108.6)×106であり、EAC増殖阻害62.0％、ｐ＜0.01であった。第四の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(300.2±84.7)×106であり、EAC増殖阻害65.2％、ｐ＜0.01であった。
即ち、1:2.1から1:1.8の様々なC4:C5のモル比でのDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍活性は、DXR単独の効果を超えた。
【００５８】
実施例6：C4:C5のモル比が1:1.7、1:1.6、1:1.5および1:1.4であるDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍効果。
ICRマウス(20−22ｇ)の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤を投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。第一の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:1.7である）を投与した。第二の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:1.6である）を投与した。第三の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:1.5である）を投与した。第四の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:1.4であった）を投与した。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【００５９】
対照群のマウスは、腹腔内に（779.1±76.7)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は（419.0±53.4)×106を示し、EAC増殖阻害46.2％、ｐ＜0.002であった。第一の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(256.3±54.1)×106であり、DXR群(正対照)のEAC増殖阻害38.8％、p＜0.05に比較してEAC増殖阻害67.1％、ｐ＜0.001であった。第二の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(250.1±57.7)×106であり、DXR群(正対照)のEAC増殖阻害40.3％、p＜0.05に比較してEAC増殖阻害67.9％、ｐ＜0.001であった。第三の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(240.7±61.8)×106であり、DXR群(正対照)のEAC増殖阻害42.6％、p＜0.05に比較してEAC増殖阻害69.1％、ｐ＜0.001であった。第四の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(233.7±50.8)×106であり、DXR群(正対照)のEAC増殖阻害44.2％、p＜0.05に比較してEAC増殖阻害70.0％、ｐ＜0.001であった。
即ち、1:1.7から1:1.4の様々なC4:C5のモル比でのDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍活性は、DXR単独の効果を超えた。
【００６０】
実施例7：C4:C5のモル比は1:1.3、1:1.2、1:1.1および1:1であるDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍効果。
ICRマウス (20−22ｇ)の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤を投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。第一の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:1.3である）を投与した。第二の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:1.2である）を投与した。第三の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:1.1である）を投与した。第四の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:1である）を投与した。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【００６１】
対照群のマウスは、腹腔内に（793.4±72.8)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は（411.9±57.1)×106を示し、EAC増殖阻害48.1％、ｐ＜0.02であった。第一の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(242.6±54.3)×106であり、DXR群(正対照)のEAC増殖阻害41.1％、p＜0.05と比較して、EAC増殖阻害69.4％、ｐ＜0.001であった。第二の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(264.1±87.6)×106であり、EAC増殖阻害66.7％、p＜0.001であった。第三の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(297.7±94.3)×106であり、EAC増殖阻害62.5％、p＜0.001であった。第四の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(276.1±76.5)×106であり、EAC増殖阻害65.2％、p＜0.001であった。
即ち、1:1.3から1:1の様々なモル比でのDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍活性は、DXR単独の効果を超える。
【００６２】
DXR/C4+C5複合体の抗腫瘍効果の試験に関する一連の試験。DXR-3.5mg/体重kg。C5-6.4 mg/体重kg。C4:C5のモル比を1:1から3:1に変えた。
実施例8：C4:C5のモル比が1:1、1.1:1、1.3:1および1.4:1であるDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍効果。
ICRマウス (20−22ｇ)の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤を投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。第一の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1:1である）を投与した。第二の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1.1:1である）を投与した。第三の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1.2:1である）を投与した。第四の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1.3:1である）を投与した。第五の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1.4:1である）を投与した。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【００６３】
対照群のマウスは、腹腔内に（742.2±66.2)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は（400.3±63.5)×106を示し、EAC増殖阻害46.1％、ｐ＜0.001であった。第一の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(258.3±40.4)×106であり、65.2％のEAC増殖阻害、ｐ＜0.001であった。第二の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(284.8±97.5)×106であり、EAC増殖阻害61.6％、p＜0.002であった。第三の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(251.2±103.6)×106であり、66.2％のEAC増殖阻害、p＜0.001であった。第四の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(227.5±43.3)×106を示し、69.3％EAC増殖阻害、p＜0.001であり、DXR群(正対照)に比較して、EAC増殖阻害43.2％、p＜0.05であった。第五の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(223.8±43.2)×106であり、EAC増殖阻害69.8％、p＜0.001であり、DXR群(正対照)に比較してEAC増殖阻害44.1％、p＜0.05であった。
即ち、1:1から1.4:1の様々なC4:C5のモル比でのDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍活性は、DXR単独の効果を超える。
【００６４】
実施例9：C4:C5のモル比が1.5:1、1.6:1、1.7:1および1.8:1であるDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍効果。
ICRマウス (20−22ｇ)の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤を投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。第一の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1.5:1である）を投与した。第二の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1.6:1である）を投与した。第三の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1.7:1である）を投与した。第四の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1.8:1である）を投与した。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【００６５】
対照群のマウスは、腹腔内に（953.5±167.3)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は（492.1±85.3)×106を示し、EAC増殖阻害48.4％、ｐ＜0.05であった。第一の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(239.3±93.5)×106であり、EAC増殖阻害74.9％、ｐ＜0.002であり、DXR群(正対照)に比較してEAC増殖阻害51.4％、p＜0.05であった。第二の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(208.4±89.0)×106を示し、EAC増殖阻害78.1％、p＜0.002であり、DXR群(正対照)に比較してEAC増殖阻害57.7％、p＜0.05であった。第三の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(247.1±76.8)×106であり、EAC増殖阻害74.1％、p＜0.002であり、DXR群(正対照)に比較してEAC増殖阻害49.8％、p＜0.05であった。第四の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(320.4±120.6)×106であり、EAC増殖阻害66.4％、p＜0.01であった。
即ち、1.5:1から1.8:1の様々なC4:C5のモル比でのDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍活性は、DXR単独の効果を超える。
【００６６】
実施例10：C4:C5のモル比が1.9:1、2:1および2.2:1であるDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍効果。
ICRマウス (20−22ｇ)の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤を投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。第一の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は1.9:1である）を投与した。第二の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は2:1である）を投与した。第三の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は2.1:1である）を投与した。第四の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は2.2:1である）を投与した。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【００６７】
対照群のマウスは、腹腔内に（924.6±145.2)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は（481.0±105.3)×106を示し、EAC増殖阻害48.0％、ｐ＜0.01であった。第一の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(322.8±93.5)×106であり、65.1％のEAC増殖阻害、ｐ＜0.01であった。第二の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(353.2±74.4)×106であり、EAC増殖阻害61.8％、p＜0.01であった。第三の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(340.3±86.8)×106であり、63.2％のEAC増殖阻害、p＜0.01であった。第四の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(388.3±91.6)×106であり、58.0％のEAC増殖阻害、p＜0.01であった。
即ち、1.9:1から2.2:1の様々なC4:C5のモル比でのDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍活性は、DXR単独の効果を超える。
【００６８】
実施例11：C4:C5のモル比が2.3:1、2.4:1および2.5:1であるDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍効果。
ICRマウス (20-22ｇ)の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤を投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。第一の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は2.3:1である）を投与した。第二の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は2.4:1である）を投与した。第三の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は2.5:1である）を投与した。第四の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は2.6:1である）を投与した。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【００６９】
対照群のマウスは、腹腔内に（857.6±113.9)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は（525.2±104.5)×106を示し、EAC増殖阻害38.8％、ｐ＜0.05であった。第一の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(381.4±64.8)×106であり、55.5％のEAC増殖阻害、ｐ＜0.01であった。第二の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(354.2±78.1)×106であり、EAC増殖阻害58.7％、p＜0.01であった。第三の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、371.4±136.5)×106であり、56.7％のEAC増殖阻害、p＜0.02であった。第四の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(363.7±158.4)×106であり、57.6％のEAC増殖阻害、p＜0.05であった。
即ち、2.3:1から2.6:1の様々なC4:C5のモル比でのDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍活性は、DXR単独の効果を超える。
【００７０】
実施例12：C4:C5のモル比が2.7:1、2.8:1、2.9：１および3:1である、DXR/C4+C5複合体の抗腫瘍効果
ICRマウス (20−22ｇ)の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤を投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。第一の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は2.7:1であった）を投与した。第二の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は2.8:1であった）を投与した。第三の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は2.9:1であった）を投与した。第四の試験群のマウスには、DXR/C4+C5複合体(C4:C5のモル比は3:1であった）を投与した。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【００７１】
対照群のマウスは、腹腔内に（721.3±76.4)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は（503.8±64.5)×106を示し、EAC増殖阻害30.2％、ｐ＜0.05であった。第一の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(312.7±79.6)×106であり、56.6％のEAC増殖阻害、ｐ＜0.002であった。第二の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(324.5±72.8)×106であり、EAC増殖阻害55.0％、p＜0.002であった。第三の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(357.9±75.3)×106であり、50.4％のEAC増殖阻害、p＜0.01であった。第四の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(394.6±67.7)×106であり、45.3％のEAC増殖阻害、p＜0.01であった。
即ち、2.7:1から3:1の様々なC4:C5のモル比でのDXR/C4+C5複合体の抗腫瘍活性は、DXR単独の効果を超える。
【００７２】
実施例13：C4:C5のモル比が1:1、1:1.4および1:1.8および1:2.3であるDXR/C4+C9複合体の抗腫瘍効果。DXR-3.5mg/体重kg。C4-8.15 mg/体重kg。
ICRマウス (20−22ｇ)の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤を投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。第一の試験群のマウスには、DXR/C4+C9複合体(C4:C9のモル比は1:1である）を投与した。第二の試験群のマウスには、DXR/C4+C9複合体(C4:C9のモル比は1:1.4である）を投与した。第三の試験群のマウスには、DXR/C4+C9複合体(C4:C9のモル比は1:1.8である）を投与した。第四の試験群のマウスには、DXR/C4+C9複合体(C4:C9のモル比は1:2.3である）を投与した。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【００７３】
対照群のマウスは、腹腔内に（696.7±68.2)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は（449.4±77.1)×106を示し、EAC増殖阻害35.5％、ｐ＜0.05であった。第一の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(266.1±97.9)×106であり、61.8％のEAC増殖阻害、ｐ＜0.01であった。第二の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(227.8±69.1)×106であり、EAC増殖阻害67.3％、p＜0.001であり、DXR群(正対照)に比較してEAC増殖阻害49.3％、p＜0.05であった。第三の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(261.0±101.2)×106であり、62.5％のEAC増殖阻害、p＜0.01であった。第四の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(350.4±103.7)×106であり、49.7％のEAC増殖阻害、p＜0.02であった。
即ち、1:1、1:1.4、1：1.8、1：2.3のC4:C9のモル比でのDXR/C4+C9複合体の抗腫瘍活性は、DXR単独の効果を超える。
【００７４】
実施例14：C4:C13のモル比が1:1、1:1.4および1:1.8および1:2.3であるDXR/C4+C13複合体の抗腫瘍効果。DXR-3.5mg/体重kg。C4-8.15 mg/体重kg。
ICRマウス (20−22ｇ)の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤を投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。第一の試験群のマウスには、DXR/C4+C13複合体(C4:C13のモル比は1:1.3である）を投与した。第二の試験群のマウスには、DXR/C4+C13複合体(C4:C13のモル比は1:1.6である）を投与した。第三の試験群のマウスには、DXR/C4+C13複合体(C4:C13のモル比は1:2である）を投与した。第四の試験群のマウスには、DXR/C4+C13複合体(C4:C13のモル比は1:2.5である）を投与した。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【００７５】
対照群のマウスは、腹腔内に（645.8±62.5)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は(406.7±60.1)×106を示し、EAC増殖阻害37.0％、ｐ＜0.05であった。第一の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(213.1±53.0)×106であり、67.0％のEAC増殖阻害、ｐ＜0.001であり、DXR群(正対照)に比較してEAC増殖阻害47.6％、p＜0.05であった。第二の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(228.6±57.0)×106を示し、EAC増殖阻害64.6％、p＜0.001であり、DXR群(正対照)に比較してEAC増殖阻害43.8％、p＜0.05であった。第三の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(295.8±94.0)×106であり、54.2％のEAC増殖阻害、p＜0.01であった。第四の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(354.5±75.6)×106であり、45.1％のEAC増殖阻害、p＜0.01であった。
即ち、1:1.3、1:1.6、1：2および1：2.5のC4:C13のモル比でのDXR/C4+C13複合体の抗腫瘍活性は、DXR単独の効果を超える。
【００７６】
実施例15：C4:C17のモル比が1:1、1.4:1、2:1および2.7:1であるDXR/C4+C17複合体の抗腫瘍効果。DXR-3.5mg/体重kg。C17-6.0mg/体重kg。
ICRマウス (20−22ｇ)の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤を投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。第一の試験群のマウスには、DXR/C4+C17複合体(C4:C17のモル比は1:1である）を投与した。第二の試験群のマウスには、DXR/C4+C17複合体(C4:C17のモル比は1.4:1である）を投与した。第三の試験群のマウスには、DXR/C4+C17複合体(C4:C17のモル比は2:1である）を投与した。第四の試験群のマウスには、DXR/C4+C17複合体(C4:C17のモル比は2.7:1である）を投与した。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【００７７】
対照群のマウスは、腹腔内に（834.9±71.1)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は(495.1±68.0)×106を示し、EAC増殖阻害40.7％、ｐ＜0.01であった。第一の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(309.7±71.7)×106であり、62.9％のEAC増殖阻害、ｐ＜0.001であった。第二の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(272.2±68.0)×106であり、DXR群(正対照)のEAC増殖阻害45.0％、p＜0.05に比較してEAC増殖阻害67.4％、p＜0.001であった。第三の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(331.5±74.8)×106であり、60.3％のEAC増殖阻害、p＜0.001であった。第四の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(402.4±83.9)×106であり、51.8％のEAC増殖阻害、p＜0.002であった。
即ち、1:1、1.4:1、2：1および2.7：1のC4:C17のモル比でのDXR/C4+C17複合体の抗腫瘍活性は、DXR単独の効果を超える。
【００７８】
実施例16：C4a:C5のモル比は1.2:1、1.6:1、1.9:1および2.5:1である、DXR/C4a+C5複合体の抗腫瘍効果。DXR-3.5mg/体重kg。C5-6.4mg/体重kg。
ICRマウス (20−22ｇ)の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤を投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。第一の試験群のマウスには、DXR/C4a+C5複合体(C4a:C5のモル比は1.2:1である）を投与した。第二の試験群のマウスには、DXR/C4a+C5複合体(C4a:C5のモル比は1.6:1である）を投与した。第三の試験群のマウスには、DXR/C4a+C5複合体(C4a:C5のモル比は1.9:1である）を投与した。第四の試験群のマウスには、DXR/C4a+C5複合体(C4a:C5のモル比は2.5:1である）を投与した。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【００７９】
対照群のマウスは、腹腔内に（811.3±73.8)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は(442.2±51.5)×106を示し、EAC増殖阻害45.5％、ｐ＜0.001であった。第一の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(288.8±89.6)×106であり、64.4％のEAC増殖阻害、ｐ＜0.001であった。第二の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(223.9±68.8)×106であり、DXR群(正対照)のEAC増殖阻害49.4％、p＜0.05に比較してEAC増殖阻害72.4％、p＜0.001であった。第三の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(306.7±91.3)×106であり、62.2％のEAC増殖阻害、p＜0.001であった。第四の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は、(385.4±94.7)×106であり、52.5％のEAC増殖阻害、p＜0.01であった。
即ち、1.2:1、1.6:1、1.9：1および2.5：1のC4a:C5のモル比でのDXR/C4a+C5複合体の抗腫瘍活性は、DXR単独の効果を超える。
【００８０】
実施例17：N-アシル-O-ホスホ-2-アミノエタノールの合成
アシルは以下の通りである：
-シス−5,8,11,14-エイコサテトラエノイル(アラキドノル)(5)
-シス−4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサノイル（9）
-シス−5,8,11,14,17-エイコサペンタノイル（13）
-シス−9,12,15,-オクタデカトリエノイル(リノレノイル)（17）
【００８１】
ポリ不飽和酸(1mmol)およびトリエチルアミン(142μl, 1.02mmol)を、乾燥テトラヒドロフラン(2ml)に溶解し、次いで、乾燥アセトニトリル(4ml)を添加し、該混合物を-15℃に冷却し、131μl(1.02mmol)のブチルクロロホルメートを添加した。30分後、沈殿したトリエチルアミン塩酸塩を除去した混合物を、O-ホスホリルエタノールアミン(Sigma-Aldrich)(212mg、1.5mmol) のH2O(3ml)および1MのNa2CO3(3ml)の溶液に移した。得られた混合物を20-25 ℃で1時間撹拌し、１MのHClでpH2-3に酸性とし、クロロホルム・メタノール(2:1、v/v)で抽出した。該抽出物を、メタノール・水(10:9、v/v)で洗浄し、減圧下で濃縮し、クロロホルム・メタノール・NH3水溶液(13:5:1、v/v/v)に溶解した。該溶液を減圧下で蒸発させ、エタノール・水(2:3、v/v、15ml)に溶解した。得られたエマルジョンをエーテルで洗浄(2×10ml)し、減圧下で蒸発させて、N-アシル-O-ホスホ-2-アミノエタノールのアンモニウム塩を得た。
収率：84％(5)、88%(9)、83(13)、73%(17)
【００８２】
得られた全ての生成物は、N-アシル誘導体のリン酸エステル化のためにβ-シアノエチルホスフェートを用いる方法によって調製した化合物と同一である。
1H-NMRスペクトルのために、アンモニウム塩を、1M HClのクロロホルムメタノール(2:1、v/v)溶液で洗浄して酸性化形態に変換した。
【００８３】
実施例18：N-アシル-O-ホスホ-L-チロシンの合成
レチノイルは以下の通りである：
-全トランス-レチノイル（4）
-13-シス-レチノイル（4a）
【００８４】
レチノイン酸(1mmol)およびトリエチルアミン(142μl, 1.02mmol)を、テトラヒドロフラン(6ml)に溶解し、次いで、該混合物を-15℃に冷却し、131μl(1.02mmol)のブチルクロロホルメートを添加した。30分後、該混合物を、H2O(3ml)および1MのNa2CO3(3ml)のO-ホスホ-L-チロシン(Sigma-Aldrich)(261mg、1mmol)溶液に添加した。得られた混合物を20-25 ℃で4時間撹拌し、１MのHClでpH2-3に酸性とし、クロロホルム・メタノール(2:1、v/v)で抽出した。該抽出物を、メタノール・水(10:9、v/v)で洗浄し、減圧下で濃縮し、クロロホルム・メタノール-NH3水溶液(13:5:1、v/v/v)に溶解した。該溶液を減圧下で蒸発させ、エタノール・水(2:3、v/v、15ml)に溶解した得られたエマルジョンを、エーテルで洗浄(5×10ml)し、減圧下で蒸発させてN-アシル-O-ホスホ-L-チロシンのアンモニウム塩を得た。
収率：52％(4)、49%(4a)
【００８５】
得られた全ての生成物は、N-アシル誘導体のリン酸エステル化のためにβ-シアノエチルホスフェートを用いる方法によって調製した化合物と同一である。
1H-NMRスペクトルのために、アンモニウム塩を、1M HClのクロロホルムメタノール(2:1、v/v)溶液で洗浄して酸性化形態に変換した。
【００８６】
さらに、本発明は、治療学的に有用な化合物および癌の治療のために当該化合物を使用することに関する。また、本発明は、以下の構造を有するドキソルビシンと全トランス-レチノイン酸および13-シス-レチノイン酸とのアミドを合成することに関する。
1. N-(全トランス-レチノイル)-ドキソルビシン
【化３】
0004643009.tif 000003
2.N-(13-シス-レチノイル)-ドキソルビシン
【化４】
0004643009.tif 000004
【００８７】
化学的阻害活性に関して天然レチノイドの有用性が、その毒性によって制限されることが知られている。化学的阻害活性を有する合成レチンアミドは、天然のレチノイドより毒性が低い（Shcealy Y.F. et al., Med. Chem.V.31., P.190-196,1988）。標題の化合物は、腫瘍細胞に対して高い細胞毒性だけでなく、その調製物の毒性の低下も示した。
【００８８】
本発明者の試験結果によると、化合物1がC3Hマウスに移植されたエールリヒ腹水癌（EAC）に対して非常に高い抗腫瘍活性を示す。化合物1の抗腫瘍活性効果は、用量依存性であった。明らかなように、化合物1は、等しい用量の遊離ドキソルビシンの活性以上に高い活性を有する。用量50mcg/マウス（2.5mcg/kg）で化合物1の注射は、57％の腫瘍増殖阻害を示し、一方、同用量の遊離ドキソルビシンは、45％のEAC増殖阻害を示した。
【００８９】
アルファトプロテイン(AFP)産生ラット肝臓癌細胞に対するダウノマイシンとポリ不飽和酸の共役体の高い細胞毒性効果は、AFPのアラキドン酸およびドコサヘキサン酸に対する高い親和特性によるものであろう。ダウノマイシンによって修飾された脂肪酸とAFPとの複合体は、選択的にAFP産生ラット肝臓癌細胞に送達される。
AFPを産生しないEACを本試験で使用した。化合物1の抗腫瘍活性の低下は、調製物中のこのタンパク質（AFP）の存在によって生じる。この調製物をマウスへの注射に用いた。これらの試験結果は、ドキソルビシンによって修飾された、AFPとレチノイン酸とによって形成された可逆的平衡複合体の存在と解釈し得る。即ち、ドキソルビシンに比較して、化合物1の高い細胞毒性は、その構造的特性によるものであろう。化合物1は、2つの抗腫瘍剤-レチノイン酸とドキソルビシンのアミドを包含する。
【００９０】
実施例19：N-(全トランス-レチノイル)ドキソルビシンの合成
全トランス-レチノイン酸（300mg, 1mmol）およびトリエチルアミン(104mg, 1.02mmol)を、乾燥テトラヒドロフラン(1ml)に溶解し、次いで、乾燥アセトニトリル(4ml)を添加し、該混合物を-15℃に冷却した。ついで、140mg(1.02mmol)のブチルクロロホルメートを添加した。30分後、沈殿したトリエチルアミン塩酸塩を除去した混合物を、メタノール(1ml)とトリエチルアミン(0.1ml)の混合物中ドキソルビシン塩酸塩（400mg）とラクトース（2g）を含有するドキソレム（Doxolem）調製物の撹拌懸濁液に移し、-15℃で、15分間撹拌し、ついで得られた混合物を、室温にあたためた。混合物を、室温で2時間、アルゴンガスの下で撹拌した後、20mlのベンゼン・エタノール（4:1）で処理した。 該懸濁液を3000rpm、5分間、遠心機にかけ、かかる沈殿物を20mlのベンゼン・エタノール（4:1）で処理し、遠心（3000rpm、5分間）により回収した。得られた2つの上清を併せて、乾燥のために真空で蒸発した。残渣を、クロロホルムに溶解し、N-（全トランス-レチノイル）-ドキソルビシンを、シリカゲル（230-400メッシュ）の高速クロマトグラフィーにより精製した。カラムは、連続的にクロホルム、アセトン-クロロホルム（1:9,v/v)、アセトン-クロロホルム（1:4,v/v)、で溶出し、最後にベンゼン-エタノール（4:1）で溶出した。純粋な生成物を、真空下、深紅バンドとして、445mg(78%)のN-(全トランス-レチノイル)-ドキソルビシンを得た、TLC（ベンゼン-ジオキサン)酢酸（10:5:1）、Rf 0.5(ドキソルビシン 0.08);UV(エタノール) A0.1%(345nm)＝817； A0.1%(497nm)＝196 ；１H‐NMR (CD Cl3,200MHz）δ0.9-1.0 (tおよびs, 6H. 3 CH2レチノイン酸における環), 1.2-1.3 (d,3H, CH3-5'), 1.4-2.4(m,19H,5CH3-RA, CH2-2' および CH2‐8), 2.9‐3.3(q, 2H, CH2-10), 3.7(s, 1H. H-4'), 3.9-4.3 (m, 6H, OH-4', OCH3, H-3', H-5'), 4.6 (s, 1H, COCH2OH), 4.8 (s, 2H, COCH2OH), 5.0-5.1 (d, 1H, OH-9), 5.3 (s, 1H, H-7), 5.5 (s, 1H, H-1'), 5.6-7.0 (m, 7H. 6H C=C-RAおよびNH), 7.3-7.4 (d, 1H,OH-9), 7.7-7.8 (t,1H,H-2), 8.0-8.1(d, lH,H-1), 13.1および14.0 (2s, 2H. OH-6およびOH‐11)
【化５】
0004643009.tif 000005
【００９１】
実施例20: N−（全トランス-レチノイル）-ドキソルビシン(化合物1)のEACに対する抗腫瘍効果
化合物1の抗腫瘍効果の試験を、ドキソルビシンと比較して、C3Hマウスに移植したEACで行なった。C3Hマウス(20-22g)オスを用いた。対照群および試験群は、0日目に0.2ml体積で、5×106EAC細胞を腹膜内に接種した7個体を包含する。次に、通常マウス血清(NMS)(200μl)中のドキソルビシンと同用量の化合物1を、2日目および6日後の接種用量、20、50および100μg／マウスで静脈注射(i.v.)した。３つの動物群は、1、2.5および5μg/体重kgの用量（20、50および100μg/体重20gに応じて）のドキソルビシン水溶液を投与した。1つのマウス群は、非処理対照であった。試験結果は9日目とする。マウスを頚椎脱臼法によって屠殺した。腹水液を除去し、回収し、該体積を測定し、腹腔を生理食塩水で6-7回洗浄した。このようにして得た該液体を回収した。トリパンブルー排除試験により、生存腫瘍細胞数を血球計で計測した。各群のマウスについて平均および標準誤差を計算した。対照群および試験群における腫瘍細胞数の比較を、スチューデント t 検定によって実施した。EAC増殖阻害に対する試験調製物の作用を、以下の式によって評価した：
【数２】
0004643009.tif 000006
表１に示した試験結果から、化合物1はEACに対して高い抗腫瘍活性を示した。化合物1の抗腫瘍活性は用量依存性であった。1mg/kg(20μg/マウス)の用量で接種のあと2日目、4日目および6日目に化合物1の注射を3回繰り返すと、対照の非処理動物(p＜0.01)と比較して、47％のEAC増殖阻害を示した。明らかなように、化合物1は、同用量の遊離ドキソルビシンの活性以上に高い活性を有する。計画通りに、2.5mg/マウス（50μg/マウス）の用量で化合物1を注射すると、腫瘍増殖阻害が56％(p＜0.01)に達し、一方、同用量の遊離ドキソルビシンは、45％(p＜0.01)のEAC増殖阻害に達した。有意でない効果(53％のEAC増殖阻害)を、ドキソルビシン5mg/kg（100μg/マウス）に等しい用量で化合物1を注入する場合に得た。上記用量での遊離ドキソルビシンの細胞毒性効果は、化合物1の効果よりも高いとわかった。
即ち、ドキソルビシンの１および2.5mg/kgに相当する用量で化合物1は、EACに対して高い抗腫瘍効果を示し、さらに化合物1の細胞毒性は遊離ドキソルビシンのものよりも高かった。
【表１】
0004643009.tif 000007
【００９２】
実施例21： N-(全トランス-レチノイル)-ドキソルビシン(化合物1) とAFPの、マウスにおけるEACの増殖に対する効果
異なるAFP量による化合物1のEACの増殖への影響を試験した。この試験は、初期体重20-23gを有する同系のC3Hマウスで行なった。用いた腫瘍細胞株は、同系のマウスに腹膜内注射による移行によって継代した。試験開始時(0日目)に、各々7匹のマウスを含む4つの群をつくった。全ての動物に、生理食塩水の腫瘍細胞(マウスあたり0.2ml中、5×106細胞)を腹膜内に接種した。
【００９３】
AFPを有する化合物1およびドキソルビシンの種々の調製物の注射を、EAC細胞をマウスに腹膜内移植した後、2日目、4日目、6日目に行なった。動物の第一の群は非処理であった(負対照)。このマウスにNMSを注射した。第二の群を、1μg/体重kg(20μg/マウス)の用量でドキソルビシンを含有する化合物1を静脈注射した。NMSは溶媒として使用した。第三および第四の群の動物は、同用量の化合物1を注射し、該タンパク質をNMSに添加した(2.5および5μg/マウス、応じて)。EAC細胞の接種後9日目のマウスを殺し、腹腔内液を回収し、体積を記録した。腫瘍細胞懸濁液を調製し、アリコートを0.1％のトリパンブルー溶液と混合した。腫瘍細胞の量を赤血球計で計測した。
試験結果を、スチューデントt検定を用いる偏差統計法によって評価した。調製物の阻害効果の値を、対照と比較して、％として表示した。
【００９４】
試験の提示データから分かるように(表2)、1mg/kg(20μg/マウス)用量での化合物1は、EAC増殖を45％(p＜0.01)阻害した。これは、以前の試験と一致するものである。同時に、AFP(2.5μg/マウス)を負荷した化合物1の影響(20μg/マウス)は、腫瘍増殖阻害を33％(p＜0.01)に低下する。注射溶液中、AFPの2倍含量を有する化合物1の抗腫瘍効果の値（33％、p＜0.02）は、大きく変化しない。化合物1とAFP(2.5および5.0μg/マウス)の効果は、遊離のドキソルビシンの効果に近似する。
【表２】
0004643009.tif 000008
【００９５】
実施例22：マウスにおけるN-(13-シス-レチノイル)-ドキソルビシン(化合物2)のEAC増殖に対する抗腫瘍効果
C3Hマウス（20−22ｇ）の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（10ml/体重1kgまたは200μl/マウス、20gの体重あたりの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスにはNMSを投与した。2つのドキソルビシン(正対照)群のマウスには、1または2.5mg/体重kg(20または50μg/体重20ｇのマウス)の用量でドキソルビシンのみ(NMS中)を投与した。2つの試験群のマウスには、1または2.5mg/体重kgの用量(20または50μg/マウス体重20g)で、ドキソルビシンを含むNMSの化合物2を投与した。試験化合物による最終処置3日後のマウスを、頚椎脱臼法によって９日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【００９６】
対照群のマウスは、腹腔内に（975.4±81.37)×106のEAC細胞を有した。ドキソルビシンのみを1mg/kgの用量で投与した群では、腫瘍細胞数は（635.9±122.78)×106のEAC細胞数を示し、EAC増殖阻害34.8％、ｐ＜0.05であった。1mg/kgの用量でドキソルビシンを含む化合物2を投与した試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は（533.5±94.23)×106を示し、EAC増殖阻害45.3％、ｐ＜0.01であった。2.5mg/kgの用量でドキソルビシンのみを投与した群では、腫瘍細胞数は（537.4±92.89)×106のEAC細胞数を示し、EAC増殖阻害44.9％、ｐ＜0.01であった。2.5mg/kgの用量でドキソルビシンを含む化合物2を投与した試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は（405.7±120.62)×106を示し、EAC増殖阻害58.4％、ｐ＜0.002であった。
即ち、1および2.5mg/kgのドキソルビシンに対応する用量で化合物2は、EACに対して、高い抗腫瘍効果を示し、ドキソルビシンのみの効果を超える。
【００９７】
実施例23：N-(13-シス-レチノイル)-ドキソルブチン/化合物2の合成
この化合物は、化合物1に関して上記したように、1mmol(300mg)の13-シス-レチノイン酸を用いて調製した；収率429mg(75％)。
TLC（ベンゼン-ジオキサン-酢酸10:5:1) Rf 0.5（ドキソルビシン0.08に対して）；UV(エタノール)A0.1％(347mm)=817；A0.1％(497mm)=196；
(1HCDCl3, 200 MHz) δ0.9-1.0 (tおよびs, 6H, 3 CH2レチノイン酸における環), 1.2-2.4(m, 22H, CH3-5', 5 CH3-RA, CH2-2'およびCH2-8), 2.9-3.3 (q, 2H, CH2-10), 3.7(s, 1H, H-4'), 3.9-4.3(m, 6H, OH-4', OCH3 , H-3', H-5'), 4.6 (s, 1H, COCH20H), 4.8 (s, 2H, COCH2OH), 5.0-5.1(d, 1H, OH-9), 5.3 (s, 1H, H-7), 5.5 (s, lH, H-1'), 5.6-7.0 (m, 7H, 6HC=C-RAおよびNH), 7.3-7.4 (d, 1H, H-3), 7.7-7.8 (t, 1H, H-2), 8.0-8.1 (d, 1H, H-1), 13.1および14.0 (2s, 2H, OH-6およびOH-11)。
【００９８】
実施例24：DXR (C4+C4a)+C5複合体の抗腫瘍効果
（C4+C4a):C5のモル比は1.2:1、1.6:1、1.9:1および2.5:1である。C4+C4aのモル比は3:2である。DXR−3.5mg/体重kg、C5-6.4mg/体重kg
ICRマウス（20−22ｇ）の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤を投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。第一の試験群のマウスには、DXR/(C4+C4a)+C5の複合体を投与した。(C4+C4a)：C5のモル比は1.6：1であった。第二の試験群は、DXR/(C4+C4a)+C5複合体を投与した。第三の試験群は、DXR/(C4+C4a)+C5複合体を投与した。(C4+C4a)：C5のモル比は1.9：1であった。第四の試験群は、DXR/(C4+C4a)+C5複合体を投与した。(C4+C4a)：C5のモル比は2.5：1であった。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【００９９】
対照群のマウスは、腹腔内に（768.7±102.8)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は（465.1±62.8)×106のEAC細胞数を示し、EAC増殖阻害39.5％、ｐ＜0.05であった。第一の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は（283.6±71.4)×106を示し、EAC増殖阻害63.1％、ｐ＜0.002であった。第二の試験群のマウスでは、、腫瘍細胞数は（218.3±65.3)×106を示し、EAC増殖阻害71.6％、ｐ＜0.001であり、DXR群(正対照)に比較して、EAC増殖阻害53.1％、ｐ＜0.02であった。第三の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は（299.7±73.6)×106を示し、EAC増殖阻害61.0％、ｐ＜0.002であった。第四の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は（405.1±81.5)×106を示し、EAC増殖阻害47.3％、ｐ＜0.02であった。
即ち、DXR/(C4+C4a):C5のモル比が1.2、1、1.6:1および2.5、1での、DXR/(C4+C4a)+C5複合体の抗腫瘍活性は、DXRのみの効果を超えた。
【０１００】
実施例25：DXR (C4+C4a)+(C5+C9+C13)複合体の抗腫瘍効果
(C4+C4a):(C5+C9+C13)のモル比は、1:1、1:1.4、1:1.8および1:2.3であった。C4：C4aのモル比は2:3であった。C5：C9：C13のモル比は0.5：1：1であった。DXR−3.5mg/体重kg、(C4+C4a)-8.15mg/体重kg。
ICRマウス（20−22ｇ）の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤を投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。第一の試験群のマウスには、DXR/(C4+C4a)+(C5+C9+C13)複合体を投与した。(C4+C4a)：(C5+C9+C13)のモル比は1：1であった。第二の試験群は、DXR/(C4+C4a)+(C5+C9+C13)複合体を投与した。(C4+C4a)：(C5+C9+C13)のモル比は1：1.4であった。第三の試験群は、DXR/(C4+C4a)+(C5+C9+C13)複合体を投与した。(C4+C4a)：(C5+C9+C13)のモル比は1：1.8であった。第四の試験群は、DXR/(C4+C4a)+(C5+C9+C13)複合体を投与した。(C4+C4a)：(C5+C9+C13)のモル比は1：2.3であった。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【０１０１】
対照群のマウスは、腹腔内に（817.2±99.9)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は（517.7±74.9)×106のEAC細胞数を示し、EAC増殖阻害36.9％、ｐ＜0.05であった。第一の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は（326.1±92.8)×106を示し、EAC増殖阻害60.1％、ｐ＜0.01であった。第二の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は（259.0±72.6)×106を示し、EAC増殖阻害68.3％、ｐ＜0.001であり、DXR群(正対照) に比較してEAC増殖阻害49.8％、ｐ＜0.05であった。第三の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は（316.3±81.3)×106を示し、EAC増殖阻害61.3％、ｐ＜0.002であった。第四の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は（431.5±74.1)×106を示し、EAC増殖阻害47.2％、ｐ＜0.01であった。
即ち、DXR/(C4+C4a):(C5+C9+C13)のモル比が1:1、1.4、１:1.8および1:2.3でのDXR/(C4+C4a)+(C5+C9+C13)複合体の抗腫瘍活性は、DXR単独の効果を超えた。
【０１０２】
実施例26：DXR (C4+C4a)+(C5+C9+C13+C17)複合体の抗腫瘍効果
(C4+C4a):(C5+C9+C13+C17) のモル比は、1:1.3、1:1.6、1:1.2および1:2.5であった。C4：C4aのモル比は1:1であった。C5：C9：C13:C17のモル比は1：1：1：1であった。DXR−3.5mg/体重kg、(C4+C4a)-8.15mg/体重kg
ICRマウス （20−22ｇ）の腹膜内に2×106の生存EAC細胞を接種した。開始2日後（2日目）のマウスに、1日おきに1回（2.5 ml/体重1kgの体積）、静脈注射を3回（2、4および6日目）行なった。対照群のマウスには賦形剤を投与した。DXR群のマウスには、3.5mg/kgの用量でDXRのみを投与した。第一の試験群のマウスには、DXR/(C4+C4a)+(C5+C9+C13+C17)複合体を投与した。(C4+C4a)：(C5+C9+C13+C17)のモル比は1：1.3であった。第二の試験群は、DXR/(C4+C4a)+(C5+C9+C13+C17)複合体を投与した。(C4+C4a)：(C5+C9+C13+C17)のモル比は1：1.6であった。第三の試験群は、DXR/(C4+C4a)+(C5+C9+C13+C17)複合体を投与した。(C4+C4a)：(C5+C9+C13+C17)のモル比は1：2であった。第四の試験群は、DXR/(C4+C4a)+(C5+C9+C13+C17)複合体を投与した。(C4+C4a)：(C5+C9+C13+C17)のモル比は、1：2.5であった。試験複合体による最終処置２日後のマウスを、頚椎脱臼法によって８日目に屠殺した。腫瘍細胞数を測定し、マウスにおけるEAC増殖阻害の程度を評価した。
【０１０３】
対照群のマウスは、腹腔内に（738.1±73.9)×106のEAC細胞を有した。DXRのみを投与した群では、腫瘍細胞数は（431.1±57.4)×106のEAC細胞数を示し、EAC増殖阻害41.6％、ｐ＜0.01であった。第一の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は（235.9±65.1)×106を示し、EAC増殖阻害68.0％、ｐ＜0.001であり、DXR群(正対照)に比較してEAC増殖阻害45.3％、ｐ＜0.05であった。第二の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は（223.7±70.3)×106を示し、EAC増殖阻害69.7％、ｐ＜0.001であり、DXR群(正対照)に比較してEAC増殖阻害48.1％、ｐ＜0.05であった。第三の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は（322.6±88.5)×106を示し、EAC増殖阻害56.3％、ｐ＜0.01であった。第四の試験群のマウスでは、腫瘍細胞数は（417.2±69.7)×106を示し、EAC増殖阻害43.5％、ｐ＜0.01であった。
即ち、DXR/(C4+C4a):(C5+C9+C13+C17)のモル比が、1:1.3、1:1.6、１:2および1:2.5での、DXR/(C4+C4a)+(C5+C9+C13+C17)複合体の抗腫瘍活性は、DXRのみの効果を超えた。