(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化血液凝固第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）および血液凝固第Ｘ因子（ＦＸ）を単一容器内に混合して含有し、混合溶液のｐＨが５.０〜６.５の範囲にあることを特徴とする薬剤学的に安定な溶液状止血用組成物。
【請求項２】
含有されるＦＶＩＩａ及びＦＸの濃度が各々１〜２０μＭ、５〜４００μＭである請求項１記載の溶液状止血用組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の溶液状止血用組成物を凍結乾燥してなる凍結乾燥止血用製剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本願発明は医療用医薬品の分野に関し、血漿蛋白質を含有する新たな止血用組成物及び製剤に関する。詳細には、活性化血液凝固第ＶＩＩ因子（以下、「ＦＶＩＩａ」と称することがある）および血液凝固第Ｘ因子（以下、「ＦＸ」と称することがある）を単一容器内に混合して含有することを特徴とする治療用薬剤に関する。
背景技術
血友病インヒビター患者の止血管理には、活性型プロトロンビン複合体製剤（ＡＰＣＣ製剤）や遺伝子組換え活性型血液凝固ＶＩＩ因子製剤（ｒＦＶＩＩａ製剤）等が用いられている。しかしながら、前者は安全性において、後者は有効性において満足のいくものとは言えず、本願発明者等はこれらの欠点を補った止血剤として、ＦＶＩＩａとＦＸを複合した医薬組成物の有用性を特許出願公開２００１−１８１２０４（特願平１１−３６８１２２）に示した。
これら止血管理に用いる蛋白質を主要成分とする医薬組成物は静脈内投与が最適であり、使用に適した形態でアンプル、注射器やバイアル等の容器に封入した剤型として供給される。より一般的には、蛋白質を凍結乾燥物として含有する容器と、その凍結乾燥物の溶解に適した溶液を含有する容器とからなるセットが用いられている。血液凝固因子に関連した蛋白質濃縮物は、血漿由来もしくは遺伝子組換え技術を用いて調製された薬剤が製剤化されているが、それらの殆どが上記のような凍結乾燥粉末と溶解液のセットとして供給されている。
発明の開示
（発明が解決しようとする技術的課題）
ＦＶＩＩａとＦＸを複合した製剤の剤型を考案する場合、２つの方策がある。１つはＦＶＩＩａとＦＸを別々の容器に入れて用意する方策であり、もう１つはＦＶＩＩａとＦＸを混合して単一の容器に入れて用意する方策である。後者は混合した溶液の凍結乾燥粉末と溶解液からなるセットとなり、１セット計２個の容器で十分なのに対し、前者はそれぞれの因子につき凍結乾燥粉末と溶解液のセットとなり、２セット計４個の容器が必要となる。加えて、前者は溶解液を凍結乾燥粉末の容器に移注する装置や操作を余分に必要とするため、利便性の観点から好ましくない。このようにＦＶＩＩａとＦＸを混合して調製し、単一の容器に封入することができれば、薬剤本来の薬力学的な有用性だけでなく、さらに製剤学的な利便性も兼ね備えた製剤と成り得る。
図１に示すようにＦＶＩＩａとＦＸは酵素と基質の関係にあり、生理的条件下でＦＶＩＩａは、リン脂質やＣａ２＋存在下に、血管傷害部位に現れる組織因子と複合体を形成してＦＸを加水分解する。その結果生じたＦＸａは引き続き生じる酵素反応を惹起し、最終的には、不溶性のフィブリンを形成することで止血に至る。しかしながら、このＦＸａは、血管傷害部位のような出血局所にて産生される場合には、止血効果を示す有効な因子である一方で、全身循環で過剰に存在する場合には、全身的な過凝固を誘引することが報告されているだけでなく（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ６９：４９１−４９７（１９８８））、血管内皮細胞や糸球体間質細胞の活性化を介した炎症の惹起にも寄与していること（Ｐｒｏｃ  ｎａｔｌ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：５２５５−５２６０（２０００）；Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１２：８９１−８９９（２００１））が示唆されており、好ましくない。
ＦＶＩＩａによるＦＸの加水分解は、両者が高濃度で存在する場合にはＦＸａの産生は制御することができず、その結果、大量のＦＸａ産生を生じる。また、それらにより生じるＦＸａは、ＦＶＩＩａを基質として分解不活化してしまう（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４８：７７２９−７７４１（１９７３））ために、安定な溶液として存在することは困難である。このように、不安定な状態のままで製剤化することもできないし、かつそのような溶液を患者へ投与することはできない。
これまで述べてきたように、精製分取された酵素と基質を混合して単一容器内に封入するような概念の既存製剤はなく、従来、この課題に対して克服する技術がなかった。
（その解決方法）
そこで、本発明者らは酵素であるＦＶＩＩａと基質であるＦＸを混合して単一容器内へ封入した剤型を開発するべく鋭意研究した結果、驚くべきことに、従来試みられることのなかった極めて安定な酵素・基質の混合組成物及び製剤を得る方法を見出し、この知見に基づいて本願発明を完成するに至った。
すなわち、本願発明は、ＦＶＩＩａをその至適ｐＨであるｐＨ６．５〜１０．０を外れた酸性領域下（ｐＨ５．０〜６．５）においてＦＸと混合することにより単一容器内に封入された溶液状組成物及び、当該組成物を凍結乾燥して得られるＦＶＩＩａ及びＦＸを混合化した止血用の治療用薬剤を提供するものである。
すなわち、本願発明はＦＶＩＩａ及びＦＸの混合液状組成物並びに当該組成物の凍結乾燥製剤に関するものであり、組成物溶液のｐＨを特定の酸性領域に制御することに発明の本質が存する。そして、所定の酸性領域にｐＨを制御できるのであれば緩衝液組成を特に限定するものではないが、好ましい緩衝液組成として、酢酸緩衝液、酒石酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が例示される。
発明を実施するための最良の形態
緩衝液を調整する際のｐＨは５．０〜１０．０の範囲であることが好適であり、これより酸性側では溶液での安定性が十分ではなく、ＦＶＩＩａ及び／またはＦＸは徐々に失活する。また、これよりアルカリ性側でも、やはり溶液での安定性が十分ではなく、成分は徐々に失活する。しかしながら、ｐＨ６．５〜１０．０の範囲では、ＦＶＩＩａによる基質ＦＸのＦＸａへの変換が生じる。その意味でｐＨは通常５．０〜６．５、好ましくは５．４〜６．１が用いられ、その範囲では各々の成分の活性低下やＦＸからＦＸａの変換等は全く問題にならない。
本発明に使用されるＦＶＩＩａ及びＦＸを製造する方法は特に限定されることはなく、例えばヒト血液より分離する方法あるいは遺伝子組換え技術により作製する方法などによって製造することができる。
血液由来のＦＶＩＩａの製法としては、例えば、特開平３−１５５７９７、特開平１０−０５９８６６及び特開平１０−０５９８６７に示される方法がある。また、新鮮凍結ヒト血漿を冷融解・遠心処理してクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿から、陰イオン交換クロマトグラフィーにより粗精製後、抗ＦＶＩＩモノクローナル抗体固定化カラムを用いてのアフィニティークロマトグラフィーによってＦＶＩＩを精製した後、他の血漿蛋白質、例えば活性化血液凝固第ＸＩＩ因子、ＦＸａなどによりＦＶＩＩをＦＶＩＩａに活性化する方法がある。なお得られるＦＶＩＩａは、その安全性を確保するために、プロトロンビン、トロンビン、ＦＩＸ及びＦＩＸａを可能な限り伴なわない方が好ましい。
血液由来のＦＸの製法としては、例えば、新鮮凍結ヒト血漿を冷融解・遠心処理してクリオプレシピテートを除いた脱クリオ血漿から、陰イオン交換クロマトグラフィーにより粗精製後、抗ＦＸモノクローナル抗体固定化カラムを用いてのアフィニティークロマトグラフィーによってＦＸを精製する方法がある。前記と同様、得られるＦＸは、その安全性を確保するために、プロトロンビン、トロンビン、ＦＩＸ及びＦＩＸａを可能な限り伴なわない方が好ましい。
本願発明の溶液状組成物に使用される成分組成の、好適な含量は、ＦＶＩＩａ及びＦＸの濃度が各々１〜２０μＭ、５〜４００μＭであり、さらに、好ましい態様として、０．００１〜１重量％の非イオン性界面活性剤並びに０．０１重量％以上のアルブミン、糖類及びアミノ酸からなる群から選ばれた１種または２種以上の化合物の共存により、組成物の保存安定性のみならず、当該液状組成物を凍結乾燥した場合はその再構成時の溶解を容易にする。
当該組成物もしくは止血用製剤の投与対象は、様々な止血障害を有し出血傾向にある患者であれば特に限定されることはない。
以下、実施例に沿って本願発明をさらに詳細に説明するが、これらは本願発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１
ＦＶＩＩａ／ＦＸ混合物の緩衝溶液中の安定性を調べる目的で、所定のｐＨを有する各々の緩衝液（ＣａＣｌ２の非存在下、ＭＥＳ緩衝液：１００ｍＭ  ＭＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）下に、ＦＶＩＩａ０．４ｍｇ／ｍＬ及びＦＸ１．０ｍｇ／ｍＬを混合し、３７℃でインキュベーションした。各反応時間後のサンプル中のＦＶＩＩａ活性、ＦＸ活性及びＦＸａ活性はそれぞれの因子が影響することのない系を用いて測定した。なお、ここで用いたＦＶＩＩａは、特開平３−１５５７９７に記載の方法による血液由来の標品である。
その結果、ＦＶＩＩａ及びＦＸの両活性ともに、緩衝溶液中どのｐＨにおいても２４時間のインキュベーションにおいて９０％以上の活性を保持していた。ＦＸａ含量は、特異的な合成基質（Ｓ２２２２）水解活性から算出し、ＦＸとのモル比として図２に示した。ｐＨ５．５と６．０の緩衝液においては、ＦＸａ含量の増加は認められないが、ｐＨ７．０や８．０の緩衝液中ではＦＸａ含量の増加は顕著であった。
実施例２
ＦＶＩＩａ／ＦＸ混合物の緩衝溶液を凍結乾燥したときの安定性を調べる目的で、所定のｐＨを有する各々の緩衝液（ＣａＣｌ２非存在下、クエン酸緩衝液：１０ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％グリシン、２％アルブミン、５０ｐｐｍ  ツイーン８０）下に、ＦＶＩＩａ０．４ｍｇ／ｍＬ及びＦＸ１．０ｍｇ／ｍＬを混合してバルクとし、凍結乾燥を実施した。用いたＦＶＩＩａは、実施例１と同様、特開平３−１５５７９７に記載の方法による血液由来の標品である。
凍結乾燥前後の各因子の活性は実施例１と同様に測定し、ＦＸａ含量について図３に示した。ＦＶＩＩａ及びＦＸの双方とも、緩衝溶液中どのｐＨにおいても凍結乾燥前後で８０％以上の活性を保持していた。一方、ＦＸａ含量は、ｐＨ５．５と６．０の緩衝液においては、ＦＸａ含量の増加は認められないが、ｐＨ７．０の緩衝液中ではＦＸａ含量の顕著な増加が認められた。
（従来技術より有効な効果）
本願発明により、安全性及び有効性に優れかつ利便性が向上した新規な止血用製剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
図１は、内因系凝固と外因系凝固に関する二つの経路の血液凝固カスケードを示す図である。
図２は、ＦＶＩＩａ及びＦＸを混合してなる本願発明の溶液状組成物のいくつかのｐＨにおけるＦＸａの生成状況を示す図である。
図３は、ＦＶＩＩａ及びＦＸを混合してなる本願発明の凍結乾燥製剤の、凍結乾燥工程前後のいくつかのｐＨにおけるＦＸａの生成状況を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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