(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種ポリペプチドの組換え製造方法であって、
（ｉ）融合タンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された細菌宿主細胞を培養し、該融合タンパク質がペスチウイルスの自己プロテアーゼＮｐｒｏの自己タンパク質分解機能を示す第１ポリペプチドと、該第１ポリペプチドのＣ末端において該第１ポリペプチドに結合した第２ポリペプチドとを含み、該第２ポリペプチドは異種ポリペプチドであって、該第１ポリペプチドの自己タンパク質分解活性により該融合タンパク質から切断されて均一なＮ末端を有することを特徴とするものであり（該培養は、該融合タンパク質の発現および対応する細胞質封入体の形成を引き起こす条件下で行う）、
（ｉｉ）該宿主細胞から該封入体を単離し、
（ｉｉｉ）単離された封入体を可溶化し、
（ｉｖ）該可溶化物を希釈して、該融合タンパク質からの該異種ポリペプチドの自己タンパク質分解切断が行われる反応溶液を得、
（ｖ）均一なＮ末端を有する切断された異種ポリペプチドを単離することを含んでなる、異種ポリペプチドの該組換え製造方法。
【請求項２】
該ペスチウイルスが、ＣＳＦＶ、ＢＤＶおよびＢＶＤＶよりなる群から選ばれる請求項１記載の製造方法。
【請求項３】
該ペスチウイルスがＣＳＦＶである請求項２記載の製造方法。
【請求項４】
該第１ポリペプチドがアミノ酸配列：
【化１】
0004820512.tif 000014
または自己タンパク質分解活性を有し且つアミノ酸２−２１の領域内の１以上のアミノ酸が欠失し又は置換されたＮ末端領域を有する誘導体のアミノ酸配列を含む請求項３記載の製造方法。
【請求項５】
該第１ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸配列Ｇｌｕ２２−Ｃｙｓ１６８または自己タンパク質分解活性を有し且つアミノ酸２−２１の領域内の１以上のアミノ酸が欠失し又は置換されたＮ末端領域を有する誘導体を含み、該第１ポリペプチドが更にＭｅｔをＮ末端として有し、該異種ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸Ｃｙｓ１６８に直接的に結合している請求項３記載の製造方法。
【請求項６】
該第１ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸配列Ｐｒｏ１７−Ｃｙｓ１６８または自己タンパク質分解活性を有し且つアミノ酸２−２１の領域内の１以上のアミノ酸が欠失し又は置換されたＮ末端領域を有する誘導体を含み、該第１ポリペプチドが更にＭｅｔをＮ末端として有し、該異種ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸Ｃｙｓ１６８に直接的に結合している請求項３記載の製造方法。
【請求項７】
該核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項１〜６のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項８】
該発現ベクターがプラスミドである、請求項１〜７のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項９】
該細菌宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である請求項１〜８のいずれか１項記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、明らかに定められた均一なＮ末端を有する所望の異種ポリペプチドの、細菌宿主細胞内での組換え製造方法であって、まず、ペスチウイルスの自己プロテアーゼ（ａｕｔｏｐｒｏｔｅａｓｅ）Ｎｐｒｏの自己タンパク質分解活性を有するペプチドと該異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質を該宿主細胞内で細胞質封入体の形態で産生させ、ついで該封入体を単離し、所望の異種ポリペプチドが該Ｎｐｒｏ自己タンパク質分解活性により該融合タンパク質から切断されるように処理することを特徴とする製造方法に関する。
【０００２】
異種生物における組換えタンパク質の製造、例えば、細菌細胞内でのヒトまたは他の真核生物のタンパク質の発現においては、１００％に可能な限り近く均一な明らかに定められたＮ末端を得ることは困難な場合が多い。これは、ヒト／動物に天然で存在するアミノ酸配列と多くの場合に同一であるべきアミノ酸配列を有する組換え医薬タンパク質の場合に特に言えることである。
【０００３】
例えばヒトにおける天然発現に際しては、用いられた多数の医薬タンパク質は細胞外腔内に輸送され、この目的のために前駆体タンパク質内に存在するシグナル配列の切断は、明らかに定められたＮ末端を与える。いくつかの理由により、そのような均一なＮ末端は、例えば細菌細胞内では常に容易に生成されるわけではない。
【０００４】
産業規模の製造では、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））の細胞質内で多数の医薬タンパク質が製造される。なぜなら、適量のその蓄積が可能であり、さらに、後処理および精製における大きな利点を有する不溶性封入体（ＩＢ）がしばしば生成するからである。また、ＩＢの形態で発現されたタンパク質は、細胞内プロテアーゼによるプロテアーゼ分解から防御される（Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ．Ｊｅｆｆｒｅｙ  Ｌ．ＣｌｅｌａｎｄおよびＣｈａｒｌｅｓ  Ｓ．Ｃｒａｉｋ編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，（１９９５），ＩＳＢＮ  ０−４７１−１０３５４−３）。
【０００５】
しかし、ＩＢ物質の製造は、発現されたタンパク質のインビトロでのリフォールディングを要する。これは、多くの場合、自体公知の方法により行うことができる（Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈら（１９９６），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ：Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．編，１−３９）。これを行うためには、ＩＢ形態のタンパク質を、還元条件下、強力な変性剤を加えることにより可溶化し、ついで再生させる。
【０００６】
原核性または真核性シグナル配列による細菌ペリプラズム内への輸出が適当なのは、稀な場合にすぎない。なぜなら、細菌輸出装置の低い輸送能のため、通常は、この場合には非常に少量の産物だけしか蓄積することができないからである。
【０００７】
しかし、該細菌細胞質は真核生物の細胞外腔とはかなり異なる。一方においては、そこには還元条件が存在し、他方においては、Ｎ末端リーダー配列を切断して成熟タンパク質を形成するメカニズムが存在しない。すべての細胞質タンパク質の合成は、適当な開始コドン（ＡＴＧ＝翻訳の開始）により特定されるメチオニンから開始する。このＮ末端メチオニンは多数のタンパク質内に保持されているが、他のタンパク質においては、それは、細胞質内に存在する該宿主に固有のメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）により切断される。該切断の効率は、以下の２つのパラメーターに実質的に左右される：１．後続のアミノ酸の性質、および２．該タンパク質の三次元構造におけるＮ末端の位置。Ｎ末端メチオニンは、後続のアミノ酸がセリン、アラニン、グリシン、メチオニンまたはバリンである場合、およびＮ末端が露出している場合（すなわち、該タンパク質内に「隠れて」いない場合）に優先的に欠失する。一方、後続のアミノ酸が、異なるアミノ酸、特に荷電アミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、アルギニン）である場合、またはＮ末端が該タンパク質の内部に位置する場合には、ほとんどの場合、Ｎ末端メチオニンの切断は生じない（Ｋｎｉｐｐｅｒｓ，Ｒｏｌｆ（１９９５）Ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｋ，第６版，Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．ＩＳＢＮ  ３−１３−１０３９１６−７）。
【０００８】
該切断を促進するアミノ酸が２位に存在する場合であっても、該切断はめったに完全ではない。かなりの割合（１〜５０％）がＭＡＰにより影響されないままであるのが普通である。
【０００９】
細菌細胞内での組換え医薬タンパク質の製造の初期においては、その方法は、単に、メチオニンコード化ＡＴＧ開始コドンを成熟（すなわち、シグナル配列も他のＮ末端伸長も有さない）タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の前に配置するだけであった。したがって、発現されるタンパク質は配列Ｈ２Ｎ−Ｍｅｔ−標的タンパク質を有していた。該宿主に固有のＭＡＰによるＮ末端メチオニンの完全な切断が達成されうるのは、少数の場合にすぎない。したがって、このようにして製造されたタンパク質のほとんどはＮ末端に関して不均一であるか（Ｍｅｔ形態と無Ｍｅｔ形態との混合物）、またはそれらのすべてはＮ末端に追加的な外来アミノ酸（Ｍｅｔ）を有する（Ｍｅｔ形態のみ）。
【００１０】
しかし、この不均一性または天然配列からの逸脱は、多くの場合には許容されない。なぜなら、これらの産物は、しばしば、異なる免疫学的（例えば、抗体生成の誘導）および薬理学的（半減期、薬物動力学）特性を示すからである。これらの理由により、ほとんどの場合には、天然と同一の産物（Ｎ末端において均一であり外来アミノ酸を有さないもの）を製造することが現在必要とされている。細胞質発現の場合には、ここでのほとんどの場合の対処法は、特異的エンドペプチドダーゼ（例えば、因子Ｘａ、エンテロキナーゼ、ＫＥＸエンドペプチダーゼ、ＩｇＡプロテアーゼ）またはアミノペプチダーゼ（例えば、ジペプチジルアミノペプチダーゼ）の切断配列（リーダー）を標的タンパク質のＮ末端に融合させることである。しかし、これは、経費および材料の出費を伴う、該産物の更なる後処理（いわゆる下流プロセシング）中の追加的な工程を必要とする。また、ＩＢの存在下では、多くの場合、該リーダー配列によるリフォールディングの妨害または更には完全な阻止が生じる。
【００１１】
したがって、細菌細胞内で封入体の形態で発現され、ついでそれから、均一な所望のＮ末端を有する標的タンパク質が製造されうる、所望の異種標的タンパク質の製造方法が必要とされている。ペスチウイルス由来のウイルス自己プロテアーゼＮｐｒｏを使用して封入体から所望の標的タンパク質を製造するためのそのような方法を、本発明の範囲内で開発した。
【００１２】
ペスチウイルスは、世界中でブタおよび反芻動物において深刻な経済的損失を引き起こす一群の病原体を構成する。届出伝染病の病原体として、古典的豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）は特に重要である。牛ウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）により引き起こされる損害（特に、胎仔の子宮内感染の定常的発生によるもの）も著しい。
【００１３】
ペスチウイルスは、ｍＲＮＡとして直接作用する１２．３ｋｂのサイズのゲノムを有する、エンベロープを有する小さなウイルスであり、該ウイルス遺伝子産物は細胞質内で該ゲノムから転写される。これは、約４０００アミノ酸を含みウイルスプロテアーゼおよび細胞プロテアーゼの両方により約１２個の成熟タンパク質に分解される単一のポリタンパク質の形態で生じる。
【００１４】
現在までに、ペスチウイルスにおいては２つのウイルスコード化プロテアーゼ（自己プロテアーゼＮｐｒｏおよびセリンプロテアーゼＮＳ３）が同定されている。Ｎ末端プロテアーゼＮｐｒｏは該ポリタンパク質のＮ末端に位置し、２３ｋｄの見掛け分子量を有する。それは、それ自身のＣ末端（Ｃｙｓ１６８）とヌクレオカプシドプロテインＣのＮ末端（Ｓｅｒ１６９）との間で生じる切断を触媒する（Ｒ．Ｓｔａｒｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（１９９３），７０８８−７０９５）。また、細胞病原性ＢＶＤＶウイルスにおけるＮｐｒｏ遺伝子の重複が記載されている。これらにおいては、同様に重複したＮＳ３プロテアーゼのＮ末端にＮｐｒｏの第２のコピーが存在する。この場合にも、該Ｎｐｒｏ‐ＮＳ３タンパク質の自己タンパク質分解切断が観察される（Ｒ．Ｓｔａｒｋら，前記を参照されたい）。
【００１５】
Ｎｐｒｏは、１６８アミノ酸の長さおよび約２０，０００ｄの見掛けＭｒ（インビボ）を有する自己プロテアーゼである。それはペスチウイルス（例えば、ＣＳＦＶ、ＢＤＶ（ボーダー病ウイルス）またはＢＶＤＶ）のポリタンパク質における最初のタンパク質であり、後続のヌクレオカプシドプロテインＣからの自己タンパク質分解切断を受ける（Ｍ．Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５（１９９１），４５０８−４５１４；Ｓｔａｒｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（１９９３），７０８８−７０９５）。この切断は、Ｎｐｒｏの配列内の最後のアミノ酸Ｃｙｓ１６８の後で生じる。
【００１６】
驚くべきことに、本発明において、細菌発現系内で封入体の形態で発現されペスチウイルスの自己プロテアーゼＮｐｒｏと異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質から該異種ポリペプチドを切断するために、自己プロテアーゼＮｐｒｏの自己タンパク質分解機能が利用可能であることが、本発明の範囲内で見出された。これは、未切断Ｎｐｒｏ融合タンパク質が封入体から単離され可溶化されリフォールディング中に切断されることを含む。
【００１７】
したがって、１つの態様において、本発明は、
（ｉ）融合タンパク質（該融合タンパク質は、ペスチウイルスの自己プロテアーゼＮｐｒｏの自己タンパク質分解機能を示す第１ポリペプチドと該第１ポリペプチドのＣ末端において該第１ポリペプチドに結合した第２ポリペプチドとを含み、該第２ポリペプチドは、該第１ポリペプチドの自己タンパク質分解活性により該融合タンパク質から切断されることが可能であり、該第２ポリペプチドは異種ポリペプチドである）をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された細菌宿主細胞を培養し（該培養は、該融合タンパク質の発現および対応する細胞質封入体の形成を引き起こす条件下で行う）、
（ｉｉ）該宿主細胞から該封入体を単離し、
（ｉｉｉ）単離された封入体を可溶化し、
（ｉｖ）該可溶化物を希釈して、該融合タンパク質からの該異種ポリペプチドの自己タンパク質分解が行われる反応溶液を得、
（ｖ）切断された異種ポリペプチドを単離することを含んでなる、異種ポリペプチドの組換え製造方法に関する。
【００１８】
ペスチウイルスの自己プロテアーゼＮｐｒｏの自己タンパク質分解活性を有するポリペプチドは、特に、ペスチウイルスの自己プロテアーゼＮｐｒｏ、または自己タンパク質分解活性を有するその誘導体である。
【００１９】
本発明の目的においては、「異種ポリペプチド」なる語は、天然に生じる融合タンパク質またはポリタンパク質からペスチウイルスの自己プロテアーゼＮｐｒｏにより天然では切断されないポリペプチドを意味する。異種ポリペプチドの具体例としては、産業用酵素（プロセス酵素）、または医薬活性、特にヒト用医薬活性を有するポリペプチドである。
【００２０】
ヒト用医薬活性を有する好ましいポリペプチドの具体例としては、サイトカイン、例えばインターロイキン、例えばＩＬ−６、インターフェロン、例えば白血球インターフェロン、例えばインターフェロンα２Ｂ、増殖因子、特に造血系または創傷治癒増殖因子、例えばＧ−ＣＳＦ、エリトロポエチンまたはＩＧＦ、ホルモン、例えばヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、抗体またはワクチンが挙げられる。
【００２１】
本発明の方法においては、該ペスチウイルスは、好ましくは、ＣＳＦＶ、ＢＤＶおよびＢＶＤＶよりなる群から選ばれ、ＣＳＦＶが特に好ましい。
【００２２】
さらに好ましい本発明方法は、該融合タンパク質の第１ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸配列：
【化２】
0004820512.tif 000002
または自己タンパク質分解活性を有するその誘導体のアミノ酸配列を含むものである（ＥＭＢＯデータベースアクセッション番号Ｘ８７９３９も参照されたい）（Ｎ末端からＣ末端への方向に読み取った場合にアミノ酸１−１６８）。
【００２３】
また、自己プロテアーゼＮｐｒｏの自己タンパク質分解活性を示すポリペプチドは、突然変異誘発、特にアミノ酸の置換、欠失、付加および／またはアミノ酸の挿入によりペスチウイルスのこの自己プロテアーゼＮｐｒｏから誘導されたペスチウイルスの自己プロテアーゼＮｐｒｏの誘導体でありうる。ただし、これは、特に、均一なＮ末端を有する所望の異種ポリペプチドの生成に要求される自己タンパク質分解活性が保有されている場合に限られる。突然変異誘発によりそのような誘導体を得るための方法は当業者によく知られている。自己プロテアーゼＮｐｒｏの活性を、該融合タンパク質から切断される種々の異種タンパク質に関して最適化することは、そのような突然変異により可能である。天然に存在する自己プロテアーゼＮｐｒｏと比較して１以上の突然変異を示す自己プロテアーゼＮｐｒｏ誘導体を所望の異種タンパク質の他に含む融合タンパク質をコードする核酸の製造後、該自己タンパク質分解活性を測定することにより、その要求される機能が存在するか否かを確認する。
【００２４】
該自己タンパク質分解活性は、例えば、まず、単離された／精製されたＩＢを７Ｍ  グアニジン／ＨＣｌ溶液中に可溶化し次いで反応溶液中で１：１００希釈することにより検出することができる。約２４時間のインキュベーションの後、切断が生じたことに関して、該反応溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検査する。プロセシング体および未プロセシング体の比率を同定するために、ウエスタンブロットを行う。切断された物質の比率を、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのデンシトメトリー分析により測定する。
【００２５】
本発明の好ましい方法は、例えば、アミノ酸２−２１の領域内の１以上のアミノ酸が欠失した又は置換されたＮ末端領域を有する融合タンパク質（得られた誘導体は、自己プロテアーゼＮｐｒｏの自己触媒機能を望ましい程度で示し続けている）をコードする核酸分子を該発現ベクターが含むものである。本発明の目的においては、該融合タンパク質において好ましい自己プロテアーゼＮｐｒｏ誘導体は、例えば、アミノ酸２−１６または２−２１の欠失を有するＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸配列を含む。また、例えば、精製を補助するアミノ酸配列を導入するために、アミノ酸配列を交換または導入することがアミノ酸の置換または付加により可能である。
【００２６】
本発明の方法において特に好ましい核酸分子は、該第１ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸配列Ｇｌｕ２２−Ｃｙｓ１６８または自己タンパク質分解活性を有するその誘導体を含む融合タンパク質（該第１ポリペプチドは更にＭｅｔをＮ末端として有し、該異種ポリペプチドはＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸Ｃｙｓ１６８に直接的に結合している）をコードしているものである。
【００２７】
本発明の方法において同様に好ましい核酸分子は、該第１ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸配列Ｐｒｏ１７−Ｃｙｓ１６８または自己タンパク質分解活性を有するその誘導体を含む融合タンパク質（該第１ポリペプチドは更にＭｅｔをＮ末端として有し、該異種ポリペプチドはＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮｐｒｏのアミノ酸Ｃｙｓ１６８に直接的に結合している）をコードしているものである。
【００２８】
特に、前記核酸分子は、本発明の方法においてはＤＮＡ分子の形態である。
【００２９】
本発明の方法で使用する発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの発現制御配列を含む。発現制御配列としては、特に、プロモーター（例えば、ｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７、ｔｒｐ、ｇａｃ、ｖｈｂ、ラムダｐＬまたはｐｈｏＡ）、リボソーム結合部位（例えば、前記プロモーターに属する天然リボソーム結合部位、ｃｒｏ、または合成リボソーム結合部位）、または転写ターミネーター（例えば、ｒｒｎＢ  Ｔ１Ｔ２またはｂｌａ）が挙げられる。前記宿主細胞は、好ましくは、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌細胞、特に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。しかし、他の細菌細胞を使用することも可能である（後記を参照されたい）。好ましい実施形態においては、該発現ベクターはプラスミドである。
【００３０】
本発明の方法で使用する細菌宿主細胞は、例えば、以下の微生物の群から選ばれうる：グラム陰性菌、例えばエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、または他のグラム陰性菌、例えばシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、例えばシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、またはカウロバクター（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ）種、例えばカウロバクター・クレセンツス（Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、あるいはグラム陽性菌、例えばバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、特にバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）。宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が特に好ましい。
【００３１】
該細菌宿主細胞、すなわち、該発現株は、自体公知の微生物学的慣例に従い培養する。該株は、一般には、栄養培地上で単コロニーから成長させるが、凍結保存細胞懸濁液（細胞バンク）を使用することも可能である。更なる使用のための十分なバイオマスを得るために、一般には、該株を多段階方法で培養する。
【００３２】
小規模の場合には、これを振とうフラスコ内で行い、ほとんどの場合には、複合培地（例えばＬＢブロス）を使用することが可能である。しかし、規定培地（例えばクエン酸培地）を使用することも可能である。該培養のために、該宿主株（単コロニーまたは凍結培養由来の細胞懸濁液で接種されたもの）の小容積の予備培養を成長させる。この培養の温度は、一般には、後続の発現結果に対して決定的なものではなく、通常は、比較的高い温度（例えば３０℃または３７℃）で実施することが可能である。主培養は、大容積（例えば５００ｍｌ）で準備し、この場合、良好な通気（内容物の容積と比較して大きな容積のフラスコ、高速の回転）を確保することが特に必要である。発現は可溶性封入体の形態で生じると意図されるため、該主培養は、ほとんどの場合、それよりいくらか高い温度（例えば３０または３７℃）で行われるであろう。封入体の製造には、誘導系（例えば、ｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃまたはｐｈｏＡプロモーターによるもの）が特に適している。後期対数期（通常は振とうフラスコ内で０．５〜１．０の光学密度）に達した後、これらの場合には誘導物質（例えばインドールアクリル酸、イソプロピルβ‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド＝ＩＰＴＧ）を加え、インキュベーションを１〜５時間継続する。この時間中に、該Ｎｐｒｏ−標的タンパク質融合タンパク質のほとんどが該細菌細胞質中で封入体として析出する。得られた細胞を集め、更に加工することができる。
【００３３】
大規模の場合には、該多段階系は、複数のバイオリアクター（発酵槽）よりなり、この場合には、該方法のプロセス工学制御を改善するために、規定栄養培地を使用することが好ましい。また、特に栄養を計量供給することにより（フェド・バッチ）、著しくバイオマスおよび産物の生成を増加させることが可能である。その他の点では、該方法は該振とうフラスコの場合と同様である。例えば、予備段階の発酵槽および主段階の発酵槽を使用し、該培養温度は該振とうフラスコの場合と同様に選択する。該予備段階の発酵槽には、振とうフラスコ内の凍結培養または単コロニーから一般に増殖させたいわゆる接種物を接種する。該発酵槽においては及び特にその主段階においては、良好な通気および十分な誘導物質濃度も確保されなければならない。しかし、いくつかの場合には、該誘導期を、該振とうフラスコの場合より著しく長く行わなければならない。得られた細胞をもう一度、更なる加工に付す。
【００３４】
本発明の方法においては、例えば、Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈら（１９９６）：Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．（編），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９９６），１−３９；Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈ：Ｈ．Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ（編），Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，（１９９０），１４９−１７１；Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈ：Ｊ．Ｌ．Ｃｌｅｌａｎｄ  ＆  Ｃ．Ｓ．Ｃｒａｉｋ（編），Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ．Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，（１９９５），２８３−２９８に記載の公知方法により、該封入体を該宿主細胞から単離する。
【００３５】
例えば、該発酵を行った後、該細胞を遠心分離により集める。例えば低い回転速度での単純な遠心分離による高圧分散により該細胞を破裂させた後、その中に存在する封入体（ＩＢ）を得ることができる。ついで、例えばＮａＣｌ（例えば０．５〜１．０Ｍ）および／または界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）の存在下で該ＩＢを種々のバッファーに複数回再懸濁させることにより、所望の標的タンパク質に関する純度を向上させることができる。通常、これにより、該ＩＢ中の外来タンパク質のほとんどが除去される。残留外来タンパク質は、通常、該自己タンパク質分解切断を妨げない。
【００３６】
該可溶化は、通常、該ＩＢを例えばグアニジン含有バッファー（例えば０．１Ｍ  トリス／ＨＣｌ、６．０Ｍ  グアニジン／ＨＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＤＴＴ）に溶解することにより行う（例えば、Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈら，（１９９６）；Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈ（１９９０）、Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈ（１９９５），前掲を参照されたい）。不溶性物質を例えば遠心分離により除去した後、該上清に関してタンパク質測定を行うことができる。
【００３７】
該融合タンパク質からの該異種ポリペプチドの自己タンパク質分解切断は、該可溶化物を切断バッファー（例えば１ｍｌの可溶化物＋９９ｍｌの切断バッファー）、例えばトリス含有切断バッファー（好ましい濃度は０．８〜１．０Ｍ）またはアルギニン含有切断バッファー（好ましくは、０．４〜０．６Ｍ  アルギニンを含有する）で例えば中性ｐＨ、好ましくはｐＨ７．０〜７．５および例えば３０℃未満の温度、好ましくは１０〜２０℃で希釈して該反応溶液を生成させることにより行う（Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈら，（１９９６），前掲も参照されたい）。ついで該切断溶液を特定の時間、例えば１２時間インキュベートし、該Ｎｐｒｏ切断の程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析することができる。
【００３８】
好ましい実施形態においては、該可溶化物をアルギニン含有バッファーで希釈して、アルギニンの最終濃度を１．０Ｍまで、好ましくは０．４〜０．６Ｍとなるようにする。あるいは、希釈は、適当なアルギニン含有切断バッファーに対して該可溶化封入体を透析することによっても可能である。
【００３９】
該切断のための反応溶液の温度は、例えば、０℃〜３０℃である。該温度は、好ましくは１０℃〜２０℃でありうる。
【００４０】
該反応溶液のｐＨは、例えば、５．０〜９．０である。該ｐＨは、好ましくは、７．０〜８．０、特に、７．０〜７．５である。
【００４１】
適宜、該反応溶液は、０．５〜１００ｍＭの濃度のＤＴＴを含有する。該ＤＤＴ濃度は、好ましくは、約５．５ｍＭである。
【００４２】
該切断中の該反応溶液中のタンパク質濃度は、例えば、２０〜１５０μｇ／ｍｌの領域内でありうる。該タンパク質濃度は、好ましくは、４０μｇ／ｍｌ未満である。
【００４３】
該反応溶液は、該切断中に例えば１．０Ｍまでの濃度のトリス／ＨＣｌを含有しうる。該トリス／ＨＣｌ濃度は、好ましくは、０．８Ｍ〜１．０Ｍである。
【００４４】
アルギニン含有および／またはトリスＨＣｌ含有バッファーの代わりに、他の緩衝系も可能である。
【００４５】
特に好ましい実施形態においては、該切断バッファーのｐＨは７．０〜７．５であり、該切断中の温度は１０℃〜２０℃であり、該タンパク質濃度は４０〜５０μｇ／ｍｌを超えず、該切断バッファーは還元剤として約５ｍＭ  ＤＴＴを含有する。
【００４６】
最後に、該融合タンパク質から切断された異種ポリペプチド質を、自体公知の方法により単離する（例えば、Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，（１９９０），３０９−３９２）を参照されたい）。
【００４７】
以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００４８】
（実施例）
実施例１：Ｎｐｒｏ−ｈＧＨ（ヒト成長ホルモン）の発現およびインビトロ切断
該融合タンパク質を、発現系（ベクターｐ１６０ＴＰ１および宿主Ｗ３１１０）における大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）内での異種発現により産生させる。該ベクターを構築するためのこの系内のすべての要素は、該大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムに由来する。
【００４９】
ｐ１６０ＴＰ１は、欠失したアテニュエーターを有する修飾大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｔｒｐプロモーターの制御下で発現が生じるｐＢＲ３２２由来ベクターである。同じオペロンからのアテニュエーターペプチドのシャイン・ダルガルノ配列を、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）として使用する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｒｒｎＢ遺伝子由来の二重ターミネーターＴ１Ｔ２は、該構築物中に残存するｂｌａ遺伝子ターミネーターと共に、該転写の効率的な終結を保証する。反時計回り（すなわち、テトラサイクリン耐性遺伝子の配向の反対）の方向に、ｐＢＲ３２２  ＥｃｏＲＩ切断部位から、該発現カセットを挿入する。βラクタマーゼ遺伝子（ｂｌａ）を該プロモーターと共に欠失させる。発現させる異種タンパク質の構造遺伝子を、３５０６位のＸｂａＩ切断部位を介して（一般には、所望のサイズに切断されたＰＣＲ断片として）導入する。
【００５０】
発現プラスミド（ＮＰＨ−ｐＥＴ）は、Ｎｐｒｏ−ｈＧＨ構造遺伝子源として働く。該プラスミドは、公知発現ベクターｐＥ１１ａ（Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５（１９９０），６０−８９）を含む。まず、ＮｐｒｏとＣＳＦＶヌクレオカプシドタンパク質とから構成される融合タンパク質を、発現ベクター内にクローニングする。これにより、天然Ｎｐｒｏ配列の最初の１６アミノ酸（ＭＥＬＮＨＦＥＬＬＹＫＴＳＫＱＫ）が１０アミノ酸長のオリゴ−ヒスチジン精製補助体（ＭＡＳＨＨＨＨＨＨＨ）により置換される。ＳｐｅＩ切断部位を、標的化突然変異誘発により、Ｎｐｒｏとヌクレオカプシドタンパク質との結合部において、得られた発現プラスミド内に導入する。これは、ＳｐｅＩ（５’末端において）およびＸｈｏＩ（３’末端において）での制限酵素処理により該ベクターから該ヌクレオカプシドタンパク質の構造遺伝子を欠失させうる。対応する線状化Ｎｐｒｏ−ｐＥＴ１１ａベクターを、該ヌクレオカプシド遺伝子断片から、分取ゲル電気泳動により取り出す。ついで、「付着」ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ末端を介してｈＧＨ構造遺伝子を導入することが可能である。
【００５１】
この目的には、ｈＧＨ遺伝子に関する以下の予備的研究が必要である。高精度ＰＣＲ（例えば、Ｒｏｃｈｅ  ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓのＰｗｏポリメラーゼ；手順は該製造業者により記載されているとおり）を用いて加工（プロセッシング）されうる（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ヒト脳由来のｃＤＮＡバンクから該構造遺伝子を増幅する。この目的には、以下のオリゴヌクレオチドを使用する：
オリゴヌクレオチド１（「Ｎ末端」）：
【化３】
0004820512.tif 000003
オリゴヌクレオチド２（「Ｃ末端」）：
【化４】
0004820512.tif 000004
【００５２】
ＳｐｅＩ切断部位を５’末端に、ＸｈｏＩ切断部位を３’末端に、使用するオリゴヌクレオチドを介して導入する。また、翻訳の効率的な終結のために、二重ｏｃｈｒｅ終結コドン（ＴＡＡＴＡＡ）を該構造遺伝子の末端に導入する。前端のＳｐｅＩ切断部位は、前記のＮｐｒｏ−ｐＥＴ１１ａベクターとリーディングフレームが合った連結を可能にする。後端のＸｈｏＩ切断部位は定方向のクローニングを可能にする。このようにして得られるプラスミドはＮＰＨ−ｐＥＴと称される。
【００５３】
このプラスミドＮＰＨ−ｐＥＴが、既に記載されているとおり、Ｎｐｒｏ−ｈＧＨ融合タンパク質の構造遺伝子源として使用するプラスミドである。この目的のために、ＸｈｏＩで線状化されたプラスミドＮＰＨ−ｐＥＴを鋳型として使用して、Ｐｗｏポリメラーゼによる高精度ＰＣＲを再び用いる。クローニング可能な断片を得るために、以下のプライマーを使用する。
該構造遺伝子の前端（該タンパク質のＮ末端に対応する）：
【化５】
0004820512.tif 000005
該構造遺伝子の後端（該タンパク質のＣ末端に対応する）：
【化６】
0004820512.tif 000006
【００５４】
後でクローニング（前および後）のために使用するＸｂａＩ切断部位は下線で示されており、開始（ＡＴＧ）および終結（ＴＡＡＴＡＡ）コドンは大文字で示されている。
【００５５】
これらの２つのオリゴヌクレオチドは、Ｈｉｓ７精製補助体および先行アミノ酸（翻訳の開始に必要なメチオニンは例外である）が完全に欠失した融合タンパク質（ＦＰ）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する構造遺伝子の増幅をもたらす。
【００５６】
Ｎｐｒｏ−ｈＧＨ融合タンパク質のオープンリーディングフレームを含有するＰＣＲ断片の配列（１０７２ｂｐ）を以下に示す。開始コドンおよび２つの終結コドンは太字で示されており、該クローニングに用いられるＸｂａＩ切断部位は下線で示されている。
【００５７】
【化７】
0004820512.tif 000007
【００５８】
したがって、このＯＲＦは、以下に示す融合タンパク質をコードしており、その２位のプロリンは天然Ｎｐｒｏタンパク質の１７位のプロリンに対応する。したがって、ＮｐｒｏｈＧＨ融合タンパク質の配列（３４４アミノ酸であり、そのうちの１５３アミノ酸はＮｐｒｏであり、１９１アミノ酸はｈＧＨである）は、以下のとおりであり（Ｎ末端からＣ末端の方向に読取られる）、天然Ｎｐｒｏ配列からのプロリン１７（該融合タンパク質の２位）は斜体で示されており、該ｈＧＨ配列は太字で示されている。
【００５９】
【化８】
0004820512.tif 000008
【００６０】
還元状態のＦＰは３９  ３１６．９２ｄのＭｒを有し、可能な切断の後のＭｒは、Ｎｐｒｏ部分（還元型）に関しては１７  ２２０．０２ｄおよびｈＧＨ部分（還元型）に関しては２２  １１４．８８ｄであろう。Ｎｐｒｏは６個のシステインを有し、ｈＧＨは４個のシステインを有する。細菌細胞質内では、これらのシステインの大部分は還元型であると考えられる。後続のプロセシング中に、おそらく、ジスルフィド架橋の少なくとも部分的な形成が生じるのであろう。該融合タンパク質内（またはＮｐｒｏ部分内）のＮ末端メチオニンは、主として、該宿主に固有のメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）により切断され、それは各場合においてＭｒを約１３１ｄ減少させてそれぞれ３９  １８６ｄ（ＦＰ）および１７  ０８９ｄ（Ｎｐｒｏ）にすると予想されるに違いない。
【００６１】
記載されているＦＰの構造遺伝子を有するＰＣＲ断片を精製し、ＸｂａＩで切断し、所望の２つの切断産物を該標的断片から取り出す。この断片を、記載されているとおりに発現ベクターｐ１６０ＴＰ１に連結する。
【００６２】
この目的のために、該ベクターを、まず、ＸｂａＩで線状化し、仔ウシ腸ホスファターゼ（ＣＩＰ）で５’脱リン酸化する。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを連結に使用する。該連結ＤＮＡをエレクトロポレーションにより大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ−１２  ＤＨ１０Ｂ内に導入し、１５ｍｇ／Ｌ  テトラサイクリンを含有するルリア（Ｌｕｒｉａ）ブロス（ＬＢ）寒天プレート上でプレーティングする。この形質転換から多数のクローンコロニーが生じる。プラスミドＤＮＡをいくつかのクローンから単離し、正しいサイズと配向とを有するインサートの存在に関して制限酵素分析により検査する。１個のクローンを選択し、制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定による詳細な特徴づけに付す。該プラスミドは、すべての研究における予測に従った挙動をする。このプラスミドはｐＮＰＨ１と称され、それを後続の研究に使用する。
【００６３】
Ｎｐｒｏ−ｈＧＨ発現プラスミドｐＮＰＨ１の配列（４８４０ｂｐ）を以下に示す。該Ｎｐｒｏ−ｈＧＨ融合タンパク質の開始コドンおよび終結コドンは下線で示されている。この形態で示される場合、該オープンリーディングフレームは逆方向に伸長する。
【００６４】
【化９】
0004820512.tif 000009
0004820512.tif 000010
【００６５】
Ｎｐｒｏ−ｈＧＨ融合タンパク質を発現させるための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）宿主株は、生産性および生物学的安全性の考慮に基づき選択される。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ−１２は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）種の最も良く特徴づけられた系統であり（Ｂ．Ｊ．Ｂａｃｈｍａｎｎ；ｉｎ：Ｊ．Ｌ．Ｉｎｇｒａｈａｍら，（編）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．（１９８７ａ），ｐｐ．１１９１−１２１９；Ｂ．Ｊ．Ｂａｃｈｍａｎｎ  １９８７ｂ；Ｂａｒｂａｒａ  Ｊ．（１９８７ｂ）Ｌｉｎｋａｇｅ  ｍａｐ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２，第７版．Ｉｎ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｖｏｌ．２：Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄ編．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ（１９８７ｂ），８０７−８７６；Ｋ．Ｆ．Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５（１９９３），３４０１−３４０７）、その代表体は一般には安全であるとみなされている。
【００６６】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ−１２  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７３２５）は原栄養性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｉｃ）誘導体であり、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ−１２の野生型に非常に近く、異種タンパク質を発現させるための宿主株としてしばしば使用される。それはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されており、以下の遺伝子型を有する：
［Ｆ−  ｍｃｒＡ  ｍｃｒＢ  ＩＮ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ）１  ラムダ−］。
【００６７】
該株はＡＴＣＣから購入することができる。その増殖は、複合窒素源を含有しない完全合成培地上で優良であり、非常に有効なそのプロセス工学制御が可能である。
【００６８】
発現株Ｗ３１１０［ｐＮＰＨ１］は、前記発現プラスミドｐＮＰＨ１をＷ３１１０内に形質転換することにより得られる。該形質転換は、１０％  グリセロールを懸濁媒体として使用するエレクトロポレーションにより行う。水中の５０ｎｇ（１μＬ）のｐＮＰＨ１溶液を３０μＬのＷ３１１０細胞懸濁液と混合し、１ｍｍキュベット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ  ２５１０）中で１８００Ｖのパルスに付す。該細胞をＳＯＣ培地に再懸濁させ、３７℃で１時間振とうし、ついで１５ｍｇ／Ｌ  テトラサイクリンを含有するルリアブロス寒天プレート上でプレーティングする。３７℃でのインキュベーション（一晩）の後、この形質転換から多数のクローンが生じる。
【００６９】
明瞭な縁を有する中等度のサイズのコロニーを拾う。それは適当な発現株Ｗ３１１０［ｐＮＰＨ１］の基礎となる。該クローンを培養し、凍結アンプル内で−８０℃で保存する（マスター細胞バンクＭＣＢ）。日常的な使用のために、該株をＬＢ−テトラサイクリン寒天プレート上に画線する。
【００７０】
株Ｗ３１１０［ｐＮＰＨ１］を寒天プレート上の単コロニーから継代培養し、これを使用してルリアブロス＋１５ｍｇ／Ｌ  テトラサイクリン（１Ｌのバッフルフラスコ内の２００ｍｌ）内の予備培養に接種する。該予備培養を２５０ｒｐｍ、３０℃で１４時間振とうすると、この間に約１．０のＯＤ６００に達する。ついで予備培養の１０ｍｌ部分を使用して該主培養（各場合、１Ｌのバッフルフラスコ内の３３０ｍｌのクエン酸培地）（３％  接種物）に接種する。該ＯＤ６００が０．８に増加するまで該主培養を３７℃（２５０ｒｐｍ）で成長させ、ついで該融合タンパク質の産生を培養１ｍＬ当たり５０μｇのインドールアクリル酸で誘導する（最終濃度；１００％  分析等級ＥｔＯＨ中のストック溶液５ｍｇ／ｍＬ）。該培養物を更に、３７℃、２５０ｒｐｍで４時間培養すると、その間に、該ＯＤ６００は約１．５〜３．０に達する。
【００７１】
該培養物を無菌５００ｍｌ遠心ボトルに移し、１０，０００ｇで３０分間遠心分離する。該遠心分離上清を完全に廃棄し、該ペレットを更なる加工まで−８０℃で凍結する。
【００７２】
ついで約１２ｇ（湿潤重量）のＢＬ１２  １（ＤＥ３）細胞ペレットを３０ｍＬの０．５ｍＭ  トリス／ＨＣｌ、５ｍＭ  ベンズアミジン（ｐＨ８．０）に懸濁させ、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを使用してホモジナイズする。０．５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１（ｗ／ｖ）リゾチームの添加後、該細胞懸濁液を氷浴内で３０分間インキュベートする。後続の超音波処理（各場合に２０秒間停止させて７×２０秒間）は該細胞の完全な破壊を引き起こす。ついで１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．００６％（ｗ／ｖ）ＤＮアーゼを該破壊懸濁液に加え、４℃で３０分間インキュベートする。ついで不溶性および可溶性構成成分を遠心分離（ＪＡ２０；７７００ｇ）により分離する。該ペレットを４０ｍＬの５０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ、５ｍＭ  ベンズアミジン、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に懸濁させ、再び遠心分離（ＪＡ２０；７７００ｇ）する。この工程を更に２回繰返し、得られたペレットを４０ｍＬの２０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に懸濁させる。２０ｍＬの１．５Ｍ  ＮａＣｌ、６０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）を該懸濁液に加え、氷浴内で３０分間インキュベートする。最後に、更なる遠心分離（ＪＡ２０；７７００ｇ）およびＨ２Ｏ洗浄工程を行う。得られたペレットはＮｐｒｏ−ｈＧＨ  ＩＢ（封入体）物質に相当する。
【００７３】
通常、この後、約１００ｍｇのＩＢ物質を２ｍＬの６．０Ｍ  塩酸グアニジン、０．１Ｍ  トリス、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＤＴＴ（ｐＨ９．０）に室温で３０分間懸濁させる。ついで不溶性構成成分を遠心分離（１０分間／３００００ｇ）により除去する。この上清に関してタンパク質測定を行う（タンパク質濃度は約２０ｍｇ／ｍＬ）。このようにして得られた可溶化物は、切断試験で直ちに使用するか又は−２０℃で保存する（最長７日間）。
【００７４】
実施例２：種々の条件下での封入体融合タンパク質の切断
Ｎｐｒｏ部分の切断は、原則として、切断バッファー（塩酸グアニジンの残留濃度＜０．０６Ｍ）中の１：１００（またはそれ以上の）の希釈度の該可溶化物（前記を参照されたい）により可能である。この間のタンパク質濃度は、通常、２０μｇ／ｍＬ（それ以外の場合には以下で指摘される）。
【００７５】
さらに、切断バッファーに対する該可溶化物質の透析（１：１００）によりＮｐｒｏ部分の切断を達成することが可能である。
【００７６】
該Ｎｐｒｏ部分の切断の程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより該切断産物を検出することにより測定することができる。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後で該ポリアクリルアミドゲルを写真撮影し適当なバンドの強度を測定することを含む。適当なバンドは、予備試験においてウエスタンブロットにより同定される。
【００７７】
実施例２．１．アルギニンによるＮｐｒｏ−ｈＧＨのインビトロ切断
該切断は、切断バッファー（２０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．０および特定のアルギニン濃度）中に該可溶化物を室温で希釈（１：１００）することにより行う。該切断混合物中のタンパク質濃度は２０μｇ／ｍＬである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に該切断産物を検出することにより、２４時間後の該切断の程度を測定する。
【００７８】
アルギニンを該切断バッファーに加えることにより該Ｎｐｒｏ切断効率が著しく増加することが判明する。最大切断は０．４〜０．６Ｍ  アルギニンの濃度で生じる。
【００７９】
実施例２．２  種々の温度におけるアルギンによるＮｐｒｏ−ｈＧＨからのＮｐｒｏの切断
該切断は、切断バッファー（２０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．０−１．０Ｍ  アルギニン）中に該可溶化物を特定の温度で希釈（１：１００）することにより行う。該切断混合物中のタンパク質濃度は２０μｇ／ｍＬである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に該切断産物を検出することにより、２４時間後の該切断の程度を測定する。
【００８０】
最大切断は１０〜２０℃の温度で生じることが判明する。
【００８１】
実施例２．３  種々の温度におけるｐＨの関数としてのＮｐｒｏ−ｈＧＨからのＮｐｒｏの切断の程度
該切断は、切断バッファー（２０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、０．５Ｍ  アルギニン）中に該可溶化物を特定のｐＨで希釈（１：１００）することにより行う。該切断混合物中のタンパク質濃度は２０μｇ／ｍＬである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に該切断産物を検出することにより、２４時間後の該切断の程度を測定した。
【００８２】
該切断バッファー中のｐＨをｐＨ５．０から９．０まで系統的に変化させる。用いたアルギニン濃度の範囲内では、７．０〜７．５のｐＨが該Ｎｐｒｏ融合タンパク質の切断に最適である。
【００８３】
実施例２．４：種々のＤＴＴ濃度におけるＮｐｒｏ−ｈＧＨからのＮｐｒｏの切断
ＤＴＴ濃度に対する該切断効率の依存性を調べる。
【００８４】
該切断は、切断バッファー（２０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０、０．５Ｍ  アルギニン、０〜１００ｍＭ  ＤＴＴ（１５℃））中に該可溶化物を希釈（１：１００）することにより行う。該可溶化物中のＤＴＴ濃度のため、「０ｍＭＤＴＴ」の混合物は依然として０．５ｍＭ  ＤＴＴを含有する。該切断混合物中のタンパク質濃度は２０μｇ／ｍＬである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に該切断産物を検出することにより、２４時間後の該切断の程度を測定する。
【００８５】
Ｎｐｒｏ部分の最大切断は約５．５ｍＭ  ＤＴＴで達せられる。
【００８６】
実施例２．５  Ｎｐｒｏ−ｈＧＨの切断のための可溶化物中のｐＨの変化
該切断は、切断バッファー（２０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．０、０〜０．８Ｍ  アルギニン（１５℃））中に該可溶化物を種々のｐＨ値（ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０）で希釈（１：１００）することにより行う。ＩＢと混合する前に、該可溶化バッファーを適当なｐＨ値に滴定することにより、該ｐＨ値を調節する。該切断混合物中のタンパク質濃度は２０μｇ／ｍＬである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に該切断産物を検出することにより、２４時間後の該切断の程度を測定する。
【００８７】
該可溶化物中の７．０〜８．０のｐＨが最適であることが判明する。
【００８８】
実施例２．６：Ｎｐｒｏ−ｈＧＨからのＮｐｒｏの切断の速度論
変性Ｎｐｒｏ−ｈＧＨの再活性化を、２０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ、０．５Ｍ  アルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．０中、１５℃での希釈により開始する。
【００８９】
約２４時間後に該切断の終点に達することが判明する。
【００９０】
実施例２．７  種々のタンパク質濃度での希釈によるＮｐｒｏ−ｈＧＨからのＮｐｒｏの切断
該切断は、切断バッファー（２０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ、０．５Ｍ  アルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．０（１５℃））中に該可溶化物を希釈（１：１００）することにより行う。約２４時間後に該切断が生じたか否かを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に該切断産物を検出することにより確認する。
【００９１】
４０μｇ／ｍＬ以上のタンパク質濃度は該切断効率における顕著な減少を招くことが判明する。更なる試験は、最適タンパク質濃度が２０〜４０μｇ／ｍｌであることを示している。
【００９２】
実施例２．８：タンパク質濃度の関数としての透析によるＮｐｒｏ−ｈＧＨからのＮｐｒｏの切断
２０ｍＭ  トリス／ＨＣｌ、０．５Ｍ  アルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＤＴ、ｐＨ７．０に対する４℃における透析（１：１００）により、塩酸グアニジンを可溶化Ｎｐｒｏ−ｈＧＨ  ＩＢ物質から除去し、それにより該切断を開始する。約２４時間後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、Ｎｐｒｏ−ｈＧＨの切断が生じたことに関して分析する。該Ｎｐｒｏ部分の切断は、該可溶化物質の希釈だけではなくその透析によっても達成されうることが判明する。
【００９３】
実施例２．９：トリス／ＨＣｌ濃度の関数としてのＮｐｒｏ−ｈＧＨからのＮｐｒｏの切断の効率
該切断は、切断バッファー（２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．０、０．１〜１．０Ｍ  トリス／ＨＣｌ（１５℃））中に該可溶化物を希釈（１：１００）することにより行う。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に該切断産物を検出することにより、２４時間後の該切断を確認した。
【００９４】
該バッファー中のトリス／ＨＣｌ濃度を０．８Ｍまで増加させると該Ｎｐｒｏ融合タンパク質切断収率が向上することが判明する。これを上回る増加は、該Ｎｐｒｏ切断の測定可能な増強を引き起こさない。
【００９５】
したがって、該反応は０．８〜１．０Ｍのトリス／ＨＣｌ濃度で好ましく生じるはずである。
【００９６】
実施例３：Ｎｐｒｏ−ｐＧＨ（ブタ成長ホルモン）の発現およびインビトロ切断
Ｎｐｒｏ−ｐＧＨ発現ベクターの産生をｐＮＰＨ１から開始させる（実施例１を参照されたい）。該プラスミドをＢｇｌＩＩで線状化し、ＰＣＲにより増幅する。これは、ｈＧＨ構造遺伝子領域以外の全プラスミド（Ｐｈｅ１のコドン〜Ｐｈｅ１９１のコドン）をＰｗｏポリメラーゼと５’−リン酸を有さないプライマーとで増幅することを含む。精製されたＰＣＲ断片を、ｐＧＨ構造遺伝子との連結におけるベクターとして使用する。５’−リン酸の除去（例えば、仔ウシ腸ホスファターゼ、北極シュリンプアルカリホスファターゼを使用するもの）は自己連結による環化を防ぐ。
【００９７】
同様にして、該ｐＧＨ構造遺伝子をＰＣＲ増幅により得る。使用する鋳型はブタｃＤＮＡバンク（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈからのブタ肝臓５’伸長ｃＤＮＡライブラリーまたはブタ脳または下垂体ｃＤＮＡバンク）である。該増幅には以下のプライマーを使用し、各場合において該合成中に５’−リン酸がそれらに付与される：
該構造遺伝子の前端（該タンパク質のＮ末端に対応する）（Ｐｈｅ１〜Ｓｅｒ７）
【化１０】
0004820512.tif 000011
該構造遺伝子の後端（該タンパク質のＣ末端に対応する）（Ｐｈｅ１９０〜Ｖａｌ１８４）
【化１１】
0004820512.tif 000012
【００９８】
該ＰＣＲ断片は、専ら、成熟ｐＧＨのＯＲＦ（構造遺伝子）を含有する。連結（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）は、ｐＮＰＨ１のものに類似したＮｐｒｏ−ｐＧＨのＯＲＦを与える。後記の融合タンパク質はこのＯＲＦによりコードされる。該連結ＤＮＡをエレクトロポレーションにより大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ−１２  ＤＨ１０Ｂ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから供給されたエレクトロコンピテント細胞、遺伝子型Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ−１２  Ｆ−  ｍｃｒＡ  Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）φ８０ｌａｃＺΔＭ１５  ΔｌａｃＸ７４  ｄｅｏＲ  ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ａｒａＤ１３９Δ（ａｒａ，ｌｅｕ）７６９７  ｇａｌＵ  ｇａｌＫ  λ−ｒｐｓＬ  ｎｕｐＧ）内に導入し、１５ｍｇ／Ｌ  テトラサイクリンを含有するルリアブロス（ＬＢ）寒天プレート上でプレーティングする。この形質転換は多数のクローンコロニーを与える。該プラスミドＤＮＡをいくつかのクローンから単離し、正しいサイズと配向との存在に関して制限酵素分析により検査する。１個のクローンを選択し、制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定による詳細な特徴づけに付す。該プラスミドは、すべての研究における予測に従った挙動をする。このプラスミドはｐＮＰＰ１と称され、それを後続の研究に使用する。
【００９９】
Ｎｐｒｏ−ｐＧＨ融合タンパク質の以下のアミノ酸配列（Ｎ末端からＣ末端の方向に読取られる）（３４２アミノ酸であり、そのうちの１５３アミノ酸はＮｐｒｏであり、１８９アミノ酸はｐＧＨである）においては、天然Ｎｐｒｏ配列からのプロリン１７（該融合タンパク質の２位）は斜体で示されており、該ｐＧＨ配列は太字で示されている。
【０１００】
【化１２】
0004820512.tif 000013
【０１０１】
還元状態のＦＰは３８  ８１９．８２ｄのＭｒを有し、可能な切断の後のＭｒは、Ｎｐｒｏ部分（還元型）に関しては１７  ２２０．０２ｄおよびｐＧＨ部分（還元型）に関しては２１  ６１７．７９ｄであろう。Ｎｐｒｏは６個のシステインを有し、ｐＧＨは４個のシステインを有する。細菌細胞質内では、これらのシステインの大部分は還元型であると考えられる。後続のプロセシング中に、おそらく、ジスルフィド架橋の少なくとも部分的な形成が生じるのであろう。該融合タンパク質内（またはＮｐｒｏ部分内）のＮ末端メチオニンは、主として、該宿主に固有のメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）により切断され、それは各場合においてＭｒを約１３１ｄ減少させてそれぞれ３８  ６８９ｄ（ＦＰ）および１７  ０８９ｄ（Ｎｐｒｏ）にすると予想されるに違いない。
【０１０２】
実施例１に記載のとおりに、発現プラスミドｐＮＰＰ１を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ−１２  Ｗ３１１０内に形質転換（エレクトロポレーション）することにより、発現株Ｗ３１１０［ｐＮＰＨ１］を産生させる。この場合にもまた、詳細な特徴づけさえも、予想される制限酵素処理パターンからの逸脱を何ら示さなかった。
【０１０３】
明瞭な縁を有する中等度のサイズのコロニーを該形質転換プレートから拾う。それは発現株Ｗ３１１０［ｐＮＰＰ１］の基礎となる。該クローンを培養し、凍結アンプル内で−８０℃で保存する（マスター細胞バンクＭＣＢ）。日常的な使用のために、該株をＬＢ−テトラサイクリン寒天プレート上に画線する。
【０１０４】
該Ｎｐｒｏ−ｈＧＨ融合タンパク質に関して実施例１に記載されているとおりに、該Ｎｐｒｏ−ｐＧＨ融合タンパク質の発現を行う。
【０１０５】
Ｎｐｒｏ−ｈＧＨ融合タンパク質に関して実施例１に記載されているとおりに、Ｎｐｒｏ−ｐＧＨ  ＩＢの調製を行う。
【０１０６】
実施例４：Ｎｐｒｏ−ｐＧＨからのＮｐｒｏのインビトロ切断
Ｎｐｒｏ−ｈＧＨに関して前記したものに対応する可溶化および再生試験を、Ｎｐｒｏ−ｐＧＨ融合タンパク質に関して行う。既に記載されているパラメーター（前記を参照されたい）を変化させた後、該Ｎｐｒｏ−ｐＧＨ融合タンパク質の場合においても可溶化および再生後にＮｐｒｏ部分のインビトロ切断が可能であることが判明する。