(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のペプチドを、NidA、NidB、及びルブレドキシンと共にアルキル基を有する単環式芳香族炭化水素と反応させ、その後、アルキル基が水酸化された単環式芳香族炭化水素を採取することを特徴とするアルキル基が水酸化された単環式芳香族炭化水素の製造法、
（ａ）配列番号３２記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号３２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつNidA、NidB、及びルブレドキシを構成タンパク質とするオキシゲナーゼに、単環式芳香族炭化水素の芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与する機能を持つペプチド、
（ｃ）配列番号３１記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、NidA、NidB、及びルブレドキシを構成タンパク質とするオキシゲナーゼに、単環式芳香族炭化水素の芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与する機能を持つペプチド。
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のペプチドをコードする遺伝子を、nidA遺伝子、nidB遺伝子、及びルブレドキシンをコードする遺伝子と共に導入して得られる微生物を、アルキル基を有する単環式芳香族炭化水素を含む培地で培養し、培養物又は菌体からアルキル基が水酸化された単環式芳香族炭化水素を採取することを特徴とするアルキル基が水酸化された単環式芳香族炭化水素の製造法、
（ａ）配列番号３２記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号３２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつNidA、NidB、及びルブレドキシを構成タンパク質とするオキシゲナーゼに、単環式芳香族炭化水素の芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与する機能を持つペプチド、
（ｃ）配列番号３１記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、NidA、NidB、及びルブレドキシを構成タンパク質とするオキシゲナーゼに、単環式芳香族炭化水素の芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与する機能を持つペプチド。
【請求項３】
以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のペプチドをコードする遺伝子を、nidA遺伝子、nidB遺伝子、及びルブレドキシンをコードする遺伝子と共に導入して得られる微生物を、アルキル基を有する単環式芳香族炭化水素を含む液体と接触させ、その後、前記液体中からアルキル基が水酸化された単環式芳香族炭化水素を採取することを特徴とするアルキル基が水酸化された単環式芳香族炭化水素の製造法、
（ａ）配列番号３２記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号３２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつNidA、NidB、及びルブレドキシを構成タンパク質とするオキシゲナーゼに、単環式芳香族炭化水素の芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与する機能を持つペプチド、
（ｃ）配列番号３１記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、NidA、NidB、及びルブレドキシを構成タンパク質とするオキシゲナーゼに、単環式芳香族炭化水素の芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与する機能を持つペプチド。
【請求項４】
微生物が、大腸菌であることを特徴とする請求項２又は３に記載のアルキル基が水酸化された単環式芳香族炭化水素の製造法。
【請求項５】
アルキル基を有する単環式芳香族炭化水素が、o-キシレン、m-キシレン、p-キシレン、トルエン、エチルベンゼン、又は1,2,4,5-テトラメチルベンゼンであり、アルキル基が水酸化された単環式芳香族炭化水素がそれぞれ、o-メチルベンジルアルコール、m-メチルベンジルアルコール、p-メチルベンジルアルコール、ベンジルアルコール、1-フェネチルアルコール、又は2,4,5-トリメチルベンジルアルコールであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のアルキル基が水酸化された単環式芳香族炭化水素の製造法。
【請求項６】
以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のペプチドをコードする遺伝子を、nidA遺伝子、nidB遺伝子、及びルブレドキシンをコードする遺伝子と共に導入して得られる微生物を用いて、アルキル基を有する単環式芳香族炭化水素で汚染された環境を浄化することを特徴とする環境の浄化方法。
（ａ）配列番号３２記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号３２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつNidA、NidB、及びルブレドキシを構成タンパク質とするオキシゲナーゼに、単環式芳香族炭化水素の芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与する機能を持つペプチド、
（ｃ）配列番号３１記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、NidA、NidB、及びルブレドキシを構成タンパク質とするオキシゲナーゼに、単環式芳香族炭化水素の芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与する機能を持つペプチド。
【請求項７】
アルキル基を有する単環式芳香族炭化水素が、o-キシレン、m-キシレン、p-キシレン、トルエン、エチルベンゼン、又は1,2,4,5-テトラメチルベンゼンであることを特徴とする請求項６に記載の環境の浄化方法。
【請求項８】
配列番号３３記載の塩基配列からなるDNA、又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ微生物に導入し、発現させることにより、その微生物に、単環式芳香族炭化水素の芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与し得るDNAを導入して得られる微生物を、アルキル基を有する単環式芳香族炭化水素を含む培地で培養し、培養物又は菌体からアルキル基が水酸化された単環式芳香族炭化水素を採取することを特徴とするアルキル基が水酸化された単環式芳香族炭化水素の製造法。
【請求項９】
配列番号３３記載の塩基配列からなるDNA、又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ微生物に導入し、発現させることにより、その微生物に、単環式芳香族炭化水素の芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与し得るDNAを導入して得られる微生物を、アルキル基を有する単環式芳香族炭化水素を含む液体と接触させ、その後、前記液体中からアルキル基が水酸化された単環式芳香族炭化水素を採取することを特徴とするアルキル基が水酸化された単環式芳香族炭化水素の製造法。
【請求項１０】
微生物が、大腸菌であることを特徴とする請求項８又は９に記載のアルキル基が水酸化された単環式芳香族炭化水素の製造法。
【請求項１１】
アルキル基を有する単環式芳香族炭化水素が、o-キシレン、m-キシレン、p-キシレン、トルエン、又はエチルベンゼンであることを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか一項に記載のアルキル基が水酸化された単環式芳香族炭化水素の製造法。
【請求項１２】
配列番号３３記載の塩基配列からなるDNA、又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ微生物に導入し、発現させることにより、その微生物に、単環式芳香族炭化水素の芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与し得るDNAを導入して得られる微生物を用いて、アルキル基を有する単環式芳香族炭化水素で汚染された環境を浄化することを特徴とする環境の浄化方法。
【請求項１３】
アルキル基を有する単環式芳香族炭化水素が、o-キシレン、m-キシレン、p-キシレン、トルエン、又はエチルベンゼンであることを特徴とする請求項１２に記載の環境の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オキシゲナーゼ（酸素添加酵素）に、芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与する機能を持つペプチドとこれをコードする遺伝子、これらを利用したアルキル基が水酸化された芳香族化合物の製造法、及び芳香族化合物で汚染された環境の浄化方法に関するものである。
【０００２】
多くの芳香族化合物は毒性または発癌性を持ち、環境中においては汚染物質となる。その一方で環境中には、芳香族化合物を栄養源として利用し資化する微生物が存在する。本発明は、そのような微生物が有する代謝酵素関連遺伝子を利用した環境浄化の分野、及び産業上有用な有機化合物の合成の分野に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
単環式芳香族炭化水素であるベンゼンにおけるメチル基等アルキル基の置換体（複数のアルキル基の置換体も含む）及び二環式芳香族炭化水素であるナフタレンにおけるメチル基等アルキル基の置換体（複数のアルキル基の置換体も含む）を基質として利用し、これらを水酸化するオキシゲナーゼ酵素や遺伝子の研究は、環境浄化分野 及び産業上有用な有機化合物の合成分野の両分野において広く実施されてきており、多くの知見が集積している。
【０００４】
キシレンの微生物による酸化に関わる遺伝子については、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）属PaW1株のTOLプラスミド上にトルエンまたはキシレンのメチル基を酸化し、水酸化体を経てそれぞれ安息香酸とメチル安息香酸に代謝する遺伝子群が存在することが古くから知られている（Worsey, M.J., Williams, P.A., Metabolism of toluene and xylenes by Pseudomonas putida (arvilla) mt-2: evidence for a new function of the TOL plasmid, J. Bacteriol., 124, 7-13, 1975）。これらの遺伝子群はすでに単離され機能解析されている（Harayama S, Rekik M, Wubbolts M, Rose K, Leppik RA, Timmis KN., Characterization of five genes in the upper-pathway operon of TOL plasmid pWW0 from Pseudomonas putida and identification of the gene products. J. Bacteriol.，171, 5048-5055, 1989、及び、Suzuki M, Hayakawa T, Shaw JP, Rekik M, Harayama S., Primary structure of xylene monooxygenase: similarities to and differences from the alkane hydroxylation system, J. Bacteriol., 173, 1690-1695, 1991）。初発酵素のモノオキシゲナーゼはXylMとXylAとの複合酵素であり、各々、xylM及びxylAと呼ばれる遺伝子にコードされている。xylMの遺伝子産物（XylM）のアミノ酸配列はシュードモナス・プチダの膜結合性のアルカンヒドロキシラーゼ（Kok, M, Oldenhuis, R, van der Linden, M.P., Raatjes, P., Kingma, J., van Lelyveld, P.H., and Witholt, B., The Pseudomonas oleovorans alkane hydroxylase gene. Sequence and expression, J. Biol. Chem., 264, 5435-5441, 1989）と相同性を示すことが知られており、xylAにコードされているポリペプチド（XylA）は電子伝達に関与していると考えられている。このオキシゲナーゼの基質特異性は広いことが知られているが、キシレンを基質とした場合、m- 及びp-キシレンは各々、対応するモノアルコール体へと酸化されるが、o-キシレンは酸化されない（Wubbolts, M.G., Reuvekamp, P., and Witholt, B., TOL plasmid-specified xylene oxygenase is a wide substrate range monooxygenase capable of olefin epoxidation, Enzyme. Microb. Technol., 16, 608-615, 1994）。
【０００５】
o-キシレンは他のキシレンより毒性が強く、環境中で分解されにくいことが知られており（Solano-Serena, F., Marchal, R., Lebeault, J.M., and Vandecasteele, J.P., Selection of microbial populations degrading recalcitrant hydrocarbons of gasoline by monitoring of culture-headspace composition, Lett. Appl. Microbiol., 30, 19-22, 2000）、その酸化による代謝経路の報告例自体が少ない。o-キシレンの酸化による代謝経路は、以下の3つに大別されると考えられている。すなわち、芳香族ジオキシゲナーゼによる芳香環への隣り合った位置における２つの水酸基の導入（cis-ジヒドリジオール体の生成）を経るもの、芳香族モノオキシゲナーゼによる芳香環への水酸基の連続的な導入（o-キシレン→ジメチルフェノール→ジメチルカテコール）を経るもの、及び、芳香環上のメチル基への水酸基の導入を経るものの３種類に分類され、前二者ではジメチルカテコールを経て芳香環の開裂が起きるのに対し、後者では芳香環は3-メチルカテコールを経て開裂されると推察されている。芳香族ジオキシゲナーゼによるo-キシレンの酸化例としてはコリネバクテリウム（Corynebacterium）属C125株が挙げられる（Schraa, G., Bethe, B.M., van Neerven, A.R., Van den Tweel, W.J., van der Wende, E., and Zehnder, A.J., Degradation 1,2-dimethylbenzene by Corynebacterium strain C125, Antonie Van Leeuwenhoek., 53(3), 159-170, 1987）。芳香族モノオキシゲナーゼによる酸化例としては、シュードモナス・シュチュゼリ（Pseudomonas stutzeri）OX1株が報告されており、ここではo-キシレンの芳香環の水酸化に関わる構成タンパク質の遺伝子配列が明らかにされている（Bertoni, G., Martino, M., Galli, E., and Barbieri, P., Analysis of the gene cluster encoding toluene/o-xylene monooxygenase from Pseudomonas stutzeri OX1, Appl Environ Microbiol., 64(10), 3626-3632, 1998）。一方、芳香環上のメチル基への水酸基の導入を伴う経路としてはロドコッカス（Rhodococcus）属B3株による例（Bickerdike, S.R., Holt, R.A., and Stephens, G.M., Evidence for metabolism of o-xylene by simultaneous ring and methyl group oxidation in a new soil isolate, Microbiology., 143, 2321-2329, 1997）、及び、ロドコッカス・オパカス（Rhodococcus opacus）R7株による例（Di Gennaro,  P., Rescalli, E., Galli, E., Sello, G., and Bestetti, G., Characterization of Rhodococcus opacus R7, a strain able to degrade naphthalene and o-xylene isolated from a polycyclic aromatic hydrocarbon-contaminated soil, Res Microbiol., 152(7), 641-651, 2001）が報告されている。これらの株はそれぞれ複数のオキシゲナーゼを有しており、o-キシレンの資化においてはメチル基の酸化の他にも芳香環の水酸化による経路を併せ持つことが知られているが、両株のいずれにおいてもメチル基の酸化（メチル基への水酸基の導入）に関わる遺伝子は明らかにされていない。
【０００６】
また、シュードモナス（Pseudomonas）属NCIB9816-4株からはナフタレンジオキシゲナーゼ（NahAaAbAcAd）遺伝子が単離され、広く機能解析されている。ナフタレンジオキシゲナーゼは、フェレドキシン(ferredoxin)（NahAb）及びフェレドキシンレダクターゼ（還元酵素）(ferredoxin reductase) （NahAa）を構成タンパク質とし、さらにジオキシゲナーゼ本体酵素［鉄イオウタンパク質；大サブユニット（α−サブユニット）（NahAc）と小サブユニット（β−サブユニット）（NahAd）の2つからなる］からなる多成分酵素（multi-component enzyme）である（以後本酵素を「フェレドキシン性の芳香族ジオキシゲナーゼ」と呼ぶ場合がある）。現在では、このナフタレンジオキシゲナーゼ以外にも、多くのフェレドキシン性の芳香族ジオキシゲナーゼの例が知られており、これらの酵素の構造や機能の解析も実施されている。シュードモナス属NCIB9816-4株由来のナフタレンジオキシゲナーゼ（NahAaAbAcAd）は、o-, m-, p-キシレン及び2-, 3-, 4-ニトロトルエンを、各々対応するモノアルコール及び、（基質が2-ニトロトルエン以外の場合は）モノアルデヒドに酸化することが報告されている（Lee, K. and Gibson, D.T., Toluene and ethylbenzene oxidation by purified naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. strain NCIB 9816-4, Appl Environ Microbiol., 62(9), 3101-3106, 1996）。また、シュードモナス・プチダF1株及びシュードモナス属JS150株由来のトルエンジオキシゲナーゼが2-, 3-ニトロトルエンを、それぞれ対応するベンジルアルコールに、4-ニトロトルエンを2-メチル-5-ニトロフェノールおよび3-メチル-6-ニトロカテコールに酸化することが報告されている（Robertson, J.B., Spain, J.C., Haddock, J.D., and Gibson., D. T., Oxidation of nitrotoluenes by toluene dioxygenase: evidence for a monooxygenase reaction. Appl Environ Microbiol., 58(8), 2643-2648, 1992）。ただし、これらのトルエンジオキシゲナーゼは、p-キシレン、トルエン、エチルベンゼンや他の多くの単環式炭化水素の置換体を基質とする場合、通常側鎖ではなく、ベンゼン環を直接酸化し、cis-ジヒドロジオール体を生成することが知られている（Hudlicky, T., Gonzalez, D., and Gibson, D.T., Enzymatic dihydroxylation of aromatics in enantioselective synthesis: Expanding asymmetric methology. Aldlichimica Acta, 32, 35-62, 1999）。
【０００７】
前述したナフタレンジオキシゲナーゼ及びトルエンジオキシゲナーゼは共にフェレドキシン性のジオキシゲナーゼであり、これらの構造と機能解析が広く実施されてきたが、特に前者についてはタンパク質の構造が詳細に明らかにされている。すなわち、シュードモナス属NCIB9816-4株由来のナフタレンジオキシゲナーゼの各々の構成タンパク質は単離・精製され（Ensley B. D, Gibson D. T., Naphthalene dioxygenase: purification and properties of a terminal oxygenase component., J Bacteriol., 155(2), 505-511, 1983、Haigler B. E, Gibson D.T., Purification and properties of NADH-ferredoxinNAP reductase, a component of naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. strain NCIB 9816., J Bacteriol., 172(1), 457-464, 1990、Haigler B. E, Gibson D. T., Purification and properties of ferredoxinNAP, a component of naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. strain NCIB 9816., J Bacteriol., 172(1), 465-468, 1990、Suen W. C, Gibson D. T., Isolation and preliminary characterization of the subunits of the terminal component of naphthalene dioxygenase from Pseudomonas putida NCIB 9816-4., J Bacteriol., 175(18), 5877-5881, 1993）、Ｘ線結晶構造解析によりオキシゲナーゼ本体酵素の三次元構造が3α3βであることが明らかにされている（Kauppi B, Lee K, Carredano E, Parales R. E, Gibson D. T, Eklund H, Ramaswamy S., Structure of an aromatic-ring-hydroxylating dioxygenase-naphthalene 1,2-dioxygenase., Structure., 6(5), 571-586, 1998）。また、このナフタレンジオキシゲナーゼは前述のようにキシレン上のメチル基をアルコールに変換する他、ナフタレンからは(+)-cis- (1R,2S)-ジヒドロキシ-1,2-ジヒドロナフタレンを（Ensley B. D, Gibson D. T, Laborde A. L., Oxidation of naphthalene by a multicomponent enzyme system from Pseudomonas sp. strain NCIB 9816., J Bacteriol., 149(3), 948-954, 1982）、スチレンからは(R)-l-フェニル-1,2-エタンジオールを（Lee K, Gibson D. T., Stereospecific dihydroxylation of the styrene vinyl group by purified naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. strain NCIB 9816-4., J Bacteriol., 178(11), 3353-3356, 1996）、9,10-ジヒドロアントラセンからは(+)-cis- (1R,2S)-1,2-ジヒドロキシ-1,2,9,10-テトラヒドロアントラセンを、9,10-ジヒドロフェナントレンからは(+)-cis- (3S,4R)-3,4-ジヒドロキシ-3,4,9,10-テトラヒドロフェナントレンを生成する（Resnick S. M, Gibson D. T. Regio- and stereospecific oxidation of 9,10-dihydroanthracene and 9,10-dihydrophenanthrene by naphthalene dioxygenase: structure and absolute stereochemistry of metabolites., Appl Environ Microbiol., 62(9), 3355-3359, 1996）。また本酵素は、フルオレン、ジベンゾフラン、ジベンゾチオフェンから主生成物としてそれぞれ、(+)-(3S,4R)-cis-3,4-ジヒドロキシ-3,4-ジヒドロフルオレン、(1R,2S)-cis-1,2-ジヒドロキシ-1,2-ジヒドロジベンゾフラン、(+)-(1R,2S)-cis- 1,2-ジヒドロキシ-1, 2-ジヒドロジベンゾチオフェンを位置選択的かつ光学選択的に生成することが知られている（Resnick S. M, Gibson D. T., Regio- and stereospecific oxidation of fluorene, dibenzofuran, and dibenzothiophene by naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. strain NCIB 9816-4., Appl Environ Microbiol., 62(11), 4073-4080, 1996）。また以上のような芳香族化合物中のベンジル位の酸化、芳香環またはスチレン側鎖オレフィンのジヒドロキシル化の他に、不飽和結合生成、アルコールからアルデヒドへの酸化反応も触媒することも知られており、in vivoおよびin vitroにおいてその性質および機能が幅広く解析されるところとなっている（Lee K, Resnick S. M, Gibson D. T., Stereospecific oxidation of (R)- and (S)-1-indanol by naphthalene dioxygenase from Pseudomonas sp. strain NCIB 9816-4., Appl Environ Microbiol., 63(5), 2067-2070, 1997）。
【０００８】
以上示してきたように、シュードモナス属を始めとするグラム陰性細菌においてはジオキシゲナーゼについて広く構造と機能の解析が進められているものの、ロドコッカス属を始めとするグラム陽性細菌におけるジオキシゲナーゼの構造及び機能については不明な部分が多い。最近、Priefertらはロドコッカス属（Rhodococcus sp.）I24株より、トルエンによって誘導される芳香族ジオキシゲナーゼ遺伝子群（tidABCD）を単離し、大腸菌での発現、抽出タンパク質を用いたインデン酸化反応の解析について報告している（Priefert, H.et al, Indene bioconversion by a toluene inducible dioxygenase of Rhodococcus sp. I24. Appl. Microbiol. Biotechnol., Springer-Verlag 2004, web上）。本酵素は、インデンをcis-インダンジオールと1-インデノールに、ナフタレンをcis-ジヒドロナフタレンジオール（ナフタレン cis-ジヒドロジオール）に変換することを観察した。また、本酵素は、効率は悪いながらもトルエンを1,2-ジヒドロ-3-メチルカテコールに変換した。一方、Treadwayらは、同じロドコッカス属I24株より、ナフタレンで誘導される芳香族ジオキシゲナーゼ遺伝子群を単離した（非特許文献１）。このジオキシゲナーゼの大及び小サブユニットの遺伝子はそれぞれ、nidA及びnidB遺伝子（nidは naphthalene-inducible dioxygenaseから由来している）と名づけられた。Treadwayらはさらに、I24株由来のnidA及びnidB遺伝子を含む11.0 kb以上のDNA断片（塩基配列が決定されたのが11.0 kb）を導入したロドコッカス属（Rhodococcus sp.）SQ1株がインデン（indene）を変換して、cis-インダンジオール（cis-indandiol）、1-インデノール（1-indenol）、1-インダノン（1-indanone）等を合成することを示した（SQ1株は元々、インデンを変換できない）（非特許文献１）。このロドコッカス組換え体による他の芳香族化合物の変換反応は示されていない。なお、このNidA及びNidBタンパク質は構造的にユニークな芳香族ジオキシゲナーゼであり、前述したXylMAを始めとする芳香族モノオキシゲナーゼとは、全体の領域に対して何ら意義深い相同性を有していなかった。本NidABタンパク質はまた、前述したシュードモナス属NCIB9816-4株由来のナフタレンジオキシゲナーゼ大小サブユニット（NahAa）とわずかに30％程度の相同性しか有していなかった。NidA及びNidBタンパク質は低いながらも既知のジオキシゲナーゼと相同性を有することから、これらがインデンの酸化に関わっていることが推察されるものの、nidA及びnidB遺伝子がインデンの酸化に直接関与していることを示す証拠はなく、そのためTreadwayらは11.0 kb中のnidA及びnidB遺伝子以外の遺伝子コンポーネントがインデンの酸化に関与している可能性についても言及している。また、このnidAB遺伝子群の周辺には既知のフェレドキシンおよびフェレドキシンレダクターゼと相同性を持つ遺伝子配列は見つかっておらず、このジオキシゲナーゼシステムが既知のフェレドキシン性芳香族ジオキシゲナーゼとは異なるシステムを持つことが示唆されている。
【０００９】
また、LarkinらはTreadwayらと独立に、ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）NCIMB12038株より、ナフタレンジオキシゲナーゼ本体酵素である鉄イオウタンパク質（NarAaAb）を単離精製し、このナフタレンジオキシゲナーゼ本体酵素がナフタレンと結合する性質を持つこと、及びナフタレンからcis-ジヒドロナフタレンジオールへの変換に必要な本体酵素であることを示した（Larkin M. J, Allen C. C, Kulakov L. A, Lipscomb D. A., Purification and characterization of a novel naphthalene dioxygenase from Rhodococcus sp. strain NCIMB12038., J Bacteriol.,  181(19), 6200-6204, 1999）。しかしこの場合も、ジオキシゲナーゼ本体である鉄イオウタンパク質は単独ではナフタレンを酸化できず、少なくとも一つの未知のタンパク質がナフタレンからナフタレン cis-ジヒドロジオールへの変換に同時に関与していることが明らかにされており、そのコンポーネントについては未同定のままである。また、この単離されたナフタレンジオキシゲナーゼのナフタレン以外の基質に対する反応性についても明らかにされていない。発明者らが、このロドコッカス属NCIMB12038株のNarAaとNarAbのアミノ酸配列（accession no. AF082663）を見たところ、このNarAaとNarAbは、前述のロドコッカス属NidAとNidBと同一酵素であることがわかった。
【非特許文献１】Treadway, S.L., Yanagimachi, K.S., Lankenau, E., Lessard, P.A., Stephanopoulos, G., and Sinskey, A.J., Isolation and characterization of indene bioconversion genes from Rhodococcus strain I24, Appl. Microbiol. Biotechnol., 51, 786-793, 1999.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
o-、m-、p-キシレン、トルエン、メチルナフタレン、ジメチルナフタレン等の分子内にメチル基を有する芳香族化合物は環境中で分解を受けにくいが、特に、o-キシレンの分解は困難である。本発明の目的は、o -キシレンを資化できる微生物においてo -キシレンの分解能の原因となっている初発酵素（遺伝子）を明らかにし、その酵素（遺伝子）を用いて、産業上有用な物質への生変換、または、環境毒物の分解、浄化に利用することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、o -キシレンの資化能を有するグラム陽性細菌ロドコッカス属TKN14株から得られた、o-キシレンを変換するオキシゲナーゼ遺伝子群を発現した大腸菌が、o-キシレン（o-xylene）だけでなく、m-キシレン（m-xylene）、p-キシレン（p-xylene）、トルエン（toluene）、エチルベンゼン（ethylbenzene）、ナフタレン（naphthalene）、1-メチルナフタレン（1-methylnaphthalene）、1,2-ジメチルナフタレン（1,2-dimethylnaphthalene）などの広範な芳香族化合物に水酸基を導入し、これらの化合物の分解における初発酵素遺伝子群になっていることを見出した。本発明者により得られたオキシゲナーゼ遺伝子群がコードする本体酵素は、Treadwayらによりロドコッカス属（Rhodococcus sp.）I24株から単離されたナフタレン誘導性ジオキシゲナーゼ（naphthalene-inducible dioxygenase）（非特許文献１）と高い相同性を有することがわかった。すなわち、本発明者らが単離した二種類のオキシゲナーゼのサブユニットのうち、分子量の大きいサブユニットは、I24株から単離されたナフタレン誘導性ジオキシゲナーゼ大サブユニット（NidA；nidは naphthalene-inducible dioxygenaseから由来している）と98％の相同性を持ち、分子量の小さいサブユニットは、I24株の小サブユニット（NidB）と99％の相同性を持っていた（以後、発明者らが単離したサブユニットの遺伝子も、nidA及びnidBと呼称する場合がある）。Treadwayらはさらに、I24株由来のnidA及びnidB遺伝子を含むDNA断片を導入したロドコッカス属（Rhodococcus sp.）SQ1株がインデン（indene）を変換して、cis-インダンジオール（cis-indandiol）、1-インデノール（1-indenol）、1-インダノン（1-indanone）等を合成することを示した（SQ1株は元々、インデンを変換できない）（非特許文献１）。
【００１２】
本発明者らは、ロドコッカス属TKN14株由来のnidAとnidB遺伝子を含む7.26 kbのDNA断片（プラスミド pN54-1-5）を有する大腸菌が、o-キシレン（o-xylene）だけでなく、m-キシレン（m-xylene）、p-キシレン（p-xylene）、トルエン（toluene）、エチルベンゼン（ethylbenzene）、ナフタレン（naphthalene）、1-メチルナフタレン（1-methylnaphthalene）、1,2-ジメチルナフタレン（1,2-dimethylnaphthalene）などの広範な芳香族化合物を変換できることを見出した。単環式芳香族炭化水素であるベンゼンにおけるメチル基等アルキル基の置換体である、o-キシレン、m-キシレン、p-キシレン、トルエン、エチルベンゼン、1,2,4,5-テトラメチルベンゼンにおいては、そのベンゼン環ではなく、側鎖のメチル基やエチル基を効率的に水酸化することを見出した。しかしながら、上記の7.26 kbのDNA断片の中から、nidAとnidB遺伝子を取り出し、この2つの遺伝子のみを大腸菌に導入し発現させても、いずれの芳香族化合物も変換できなかった。上記の7.26 kbのDNA断片の中にルブレドキシン（rubredoxin）の配列があったので、このルブレドキシン（Rd）遺伝子を取り出し、nidAとnidB遺伝子とともに大腸菌に導入し発現させたところ、種々の芳香族化合物の中でナフタレン、1-メチルナフタレン、1,2-ジメチルナフタレン等のナフタレンを持つ芳香族炭化水素のみを基質とし、ジヒドロナフタレンジオールに変換することがわかった。したがって、アルキル基を持つ単環式炭化水素を水酸化するには、上記の7.26 kbのDNA断片の中にさらに必要なコンポーネントがあることが示唆された。発明者らは、本7.26 kb断片内のORFを検索し、各々のORFを取り出し、nidA、nidB及びルブレドキシン（Rd）遺伝子と共に大腸菌に導入し発現させ、種々の基質の変換試験を行った。その結果、機能未知の１つのORF（本明細書では「ORF5」と呼んでいる）が、アルキル基を持つ単環式炭化水素を含む広範な芳香族化合物に水酸基を導入するのに必要なコンポーネントをコードしていることを突き止め、本発明を完成するに至った。本発明は以上のような知見を基に完成されたものである。
【００１３】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１６）を提供するものである。
（１）以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に記載のペプチド：
（ａ）配列番号３２記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号３２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつオキシゲナーゼに、芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与する機能を持つペプチド、
（ｃ）配列番号３１記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、オキシゲナーゼに、芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与する機能を持つペプチド。
（２）（１）に記載のペプチドをコードする遺伝子。
（３）（１）に記載のペプチドを、芳香族オキシゲナーゼの大小サブユニットとルブレドキシンと共にアルキル基を有する芳香族化合物と反応させ、その後、アルキル基が水酸化された芳香族化合物を採取することを特徴とするアルキル基が水酸化された芳香族化合物の製造法。
（４）（２）に記載の遺伝子を、芳香族オキシゲナーゼの大小サブユニットとルブレドキシンをコードする遺伝子と共に導入して得られる微生物を、アルキル基を有する芳香族化合物を含む培地で培養し、培養物又は菌体からアルキル基が水酸化された芳香族化合物を採取することを特徴とするアルキル基が水酸化された芳香族化合物の製造法。
（５）（２）に記載の遺伝子を、芳香族オキシゲナーゼの大小サブユニットとルブレドキシンをコードする遺伝子と共に導入して得られる微生物を、アルキル基を有する芳香族化合物を含む液体と接触させ、その後、前記液体中からアルキル基が水酸化された芳香族化合物を採取することを特徴とするアルキル基が水酸化された芳香族化合物の製造法。
（６）微生物が、大腸菌であることを特徴とする（４）又は（５）に記載のアルキル基が水酸化された芳香族化合物の製造法。
（７）アルキル基を有する芳香族化合物が、o-キシレン、m-キシレン、p-キシレン、トルエン、エチルベンゼン、又は1,2,4,5-テトラメチルベンゼンであり、アルキル基が水酸化された芳香族化合物がそれぞれ、o-メチルベンジルアルコール、m-メチルベンジルアルコール、p-メチルベンジルアルコール、ベンジルアルコール、1-フェネチルアルコール、又は2,4,5-トリメチルベンジルアルコールであることを特徴とする（３）乃至（６）のいずれか記載のアルキル基が水酸化された芳香族化合物の製造法。
（８）（２）に記載の遺伝子を、芳香族オキシゲナーゼの大小サブユニットとルブレドキシンをコードする遺伝子と共に導入して得られる微生物を用いて、アルキル基を有する芳香族化合物で汚染された環境を浄化することを特徴とする環境の浄化方法。
（９）アルキル基を有する芳香族化合物が、o-キシレン、m-キシレン、p-キシレン、トルエン、エチルベンゼン、又は1,2,4,5-テトラメチルベンゼンであることを特徴とする（８）に記載の環境の浄化方法。
（１０）配列番号３３記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ微生物に導入し、発現させることにより、その微生物に、芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与し得るDNA。
（１１）（１０）に記載のDNAを導入して得られる微生物を、アルキル基を有する芳香族化合物を含む培地で培養し、培養物又は菌体からアルキル基が水酸化された芳香族化合物を採取することを特徴とするアルキル基が水酸化された芳香族化合物の製造法。
（１２）（１０）に記載のDNAを導入して得られる微生物を、アルキル基を有する芳香族化合物を含む液体と接触させ、その後、前記液体中からアルキル基が水酸化された芳香族化合物を採取することを特徴とするアルキル基が水酸化された芳香族化合物の製造法。
（１３）微生物が、大腸菌であることを特徴とする（１１）又は（１２）に記載のアルキル基が水酸化された芳香族化合物の製造法。
（１４）アルキル基を有する芳香族化合物が、o-キシレン、m-キシレン、p-キシレン、トルエン、又はエチルベンゼンであることを特徴とする（１１）乃至（１３）のいずれか記載のアルキル基が水酸化された芳香族化合物の製造法。
（１５）（１０）に記載のDNAを導入して得られる微生物を用いて、アルキル基を有する芳香族化合物で汚染された環境を浄化することを特徴とする環境の浄化方法。
（１６）アルキル基を有する芳香族化合物が、o-キシレン、m-キシレン、p-キシレン、トルエン、又はエチルベンゼンであることを特徴とする（１５）に記載の環境の浄化方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、o-、m-、p-キシレン、トルエン、エチルベンゼン、及び1,2,4,5-テトラメチルベンゼン等のアルキル基を有する芳香族化合物からアルキル基が水酸化された芳香族化合物を製造できるようになる。また、本発明により、o-、m-、p-キシレン、トルエン、エチルベンゼン、及び1,2,4,5-テトラメチルベンゼン等のアルキル基を有する芳香族化合物を含む環境の浄化方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．遺伝子源の土壌細菌ロドコッカス属TKN14株
目的とする遺伝子群の供給源となった土壌細菌ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）TKN14株は、岩手県釜石市の土壌から、o-キシレンで優占化するo-キシレン資化細菌として、発明者らが所属する(株)海洋バイオテクノロジー研究所により釜石土壌より単離されたものである（特開2002-238551号公報）。本TKN14株は、16S rDNAやgyrB遺伝子の配列の分析により、ロドコッカス属細菌に分類されたものである。一般に土壌中で、m-キシレンやp-キシレンと比べて、o-キシレンは非常に分解しにくい物質として知られており、o-キシレン分解細菌や分解系遺伝子の知見はほとんど存在していなかった。なお、本発明者は、本TKN14菌が、o-キシレンの分解において、そのベンゼン環の直接酸化ではなく、その側鎖のメチル基の酸化により代謝することを確かめていた。ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）TKN14株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（受託番号：FERM P-18195、受託日：平成13年2月2日）。なお、本菌株は、当初「TKN14株」ではなく、「KN14株」と呼んでいたため、前記寄託センターにおいては、「Rhodococcus sp. KN-14」という名称で寄託されている。
【００１６】
２．オキシゲナーゼに、芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与する機能を持つペプチド（以下、「本発明のペプチド」という場合がある。）
本発明のペプチドには、（ａ）配列番号３２記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号３２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつオキシゲナーゼに、芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与する機能を持つペプチド、（ｃ）配列番号３１記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、オキシゲナーゼに、芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与する機能を持つペプチドの３種類のペプチドが含まれる。
【００１７】
（ａ）のペプチドは、ロドコッカス属TKN14株から得られる164アミノ酸配列よりなるペプチド（実施例中のORF5にコードされるペプチド）である。このペプチドは、芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を持たないオキシゲナーゼに、前記した能力を付与する機能を持つ。例えば、ロドコッカス属TKN14株由来のオキシゲナーゼの大サブユニット（NidA、配列番号３）、小サブユニット（NidB、配列番号５）、及びルブレドキシン（配列番号３０）を構成タンパク質とするオキシゲナーゼは、二環式芳香族炭化水素の芳香環に作用し、ジヒドロジオールを生成するが、キシレンやトルエン等のアルキル基を含む単環式芳香族炭化水素には作用しない。しかし、この３つの構成タンパク質に、（ａ）のペプチドが加わると、キシレンやトルエン等のメチル基を水酸化する酵素活性を示すようになる。なお、（ａ）のペプチドに加えて、芳香族ジオキシゲナーゼ本体タンパク質（NidAB）及びルブレドキシン（Rd）を含むロドコッカス属TKN14株由来の15.01 kbのNotI断片を有する大腸菌（この大腸菌は、前記断片を大腸菌ベクターpBluescript II SK+に挿入して作製したプラスミドp700Not1-9を、大腸菌JM101株に導入することによって作製した。）は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（受託番号 FERM P-19698、受託日：平成16年2月20日）。
【００１８】
（ｂ）のペプチドは、（ａ）のペプチドに対して、その機能を失わせない程度の変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、元のペプチドの持つ機能を失わせない限り、その個数は制限されないが、通常は、20アミノ酸以内であり、好ましく10アミノ酸以内であり、更に好ましくは5アミノ酸以内である。
【００１９】
（ｃ）のペプチドは、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる細菌由来のペプチドである。（ｃ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは、元のDNAと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、90％以上の相同性を指す。
【００２０】
本発明のペプチドをコードする遺伝子は、以下の手順で得ることができる。先ず、ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）TKN14株のゲノムDNAを調製し、適当な制限酵素で切断後、適当なベクターに連結し、ゲノムDNAライブラリーを作製する。ベクターにはSuperCos 1やλファージ由来の各種ベクター、例えば、λgt10やλZap11 等、コスミドベクターpRAFR3等、又はpUC18 やpBluescript II等のプラスミドベクターを用いることができる。目的の遺伝子を保持するクローンの選択には、適当な配列からプローブDNAを作製し、コロニーハイブリダイゼーション法等により、陽性のクローンを選択すればよい。本発明のペプチドをコードする遺伝子群はクラスターを形成している。それゆえ、選択されたクローン及びそのクローンの持つDNAと重複するDNA断片を持つクローンの塩基配列を、サンガー法やマキサム−ギルバート法等の一般的な方法により決定することによって、上記ペプチド等をコードするDNAを単離することができる。
【００２１】
３．本発明のペプチド以外のオキシゲナーゼ構成タンパク質
本発明のペプチドは、オキシゲナーゼ本体タンパク質及び電子伝達タンパク質と共存することによって、芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する酵素活性を発揮する。このとき共存させるオキシゲナーゼ本体タンパク質及び電子伝達タンパク質は特に限定されないが、本体タンパク質としては、以下の（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）のペプチド（芳香族オキシゲナーゼ大サブユニット）と以下の（ｇ）、（ｈ）又は（ｉ）のペプチド（芳香族オキシゲナーゼ小サブユニット）を使用するのが好ましく、電子伝達タンパク質としては、以下の（ｊ）、（ｋ）又は（ｌ）のペプチド（ルブレドキシン）を使用するのが好ましい。
（ｄ）配列番号３記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｅ）配列番号３記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつオキシゲナーゼのサブユニットとして機能するペプチド、
（ｆ）配列番号２記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、オキシゲナーゼのサブユニットとして機能するペプチド、
（ｇ）配列番号５記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｈ）配列番号５記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつオキシゲナーゼのサブユニットとして機能するペプチド、
（ｉ）配列番号４記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、オキシゲナーゼのサブユニットとして機能するペプチド、
（ｊ）配列番号３０記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｋ）配列番号３０記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつルブレドキシンとして機能するペプチド、
（ｌ）配列番号２９記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、ルブレドキシンとして機能するペプチド。
【００２２】
上記（ｆ）及び（ｉ）のペプチドにおける「オキシゲナーゼのサブユニットとして機能する」とは、オキシゲナーゼを構成する他のサブユニットと複合体を形成し、オキシゲナーゼ活性を発揮できることをいう。
【００２３】
上記（ｅ）、（ｈ）及び（ｋ）のペプチドにおける付加、欠失等するアミノ酸の個数は、上記（ｂ）のペプチドの場合と同様である。
【００２４】
上記（ｆ）、（ｉ）及び（ｌ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」の意味は上記（ｃ）のペプチドの場合と同様である。
【００２５】
４．微生物に、芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与し得るDNA（以下、このDNAを「本発明のDNA」という場合がある。）
本発明のDNAは、配列番号３３記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ微生物に導入し、発現させることにより、その微生物に、芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を付与し得るDNAである。
【００２６】
配列番号３３記載の塩基配列は、配列番号１記載の塩基配列の1382-8640番目の塩基に対応し、この塩基配列からなるDNAを導入、発現させた大腸菌は、芳香環上のアルキル基に水酸基を導入する能力を持つ（実施例４及び５）。なお、「ストリンジェントな条件」の意味は上記（ｃ）のペプチドの場合と同様である。
【００２７】
５．アルキル基が水酸化された芳香族化合物の製造法
本発明のペプチド、又は本発明のペプチドをコードする遺伝子を利用してアルキル基が水酸化された芳香族化合物を製造することができる。具体的には、（１）本発明のペプチドを、芳香族オキシゲナーゼの大小サブユニットとルブレドキシンと共に、アルキル基を有する芳香族化合物と反応させ、その後、アルキル基が水酸化された芳香族化合物を採取する方法、（２）本発明のペプチドをコードする遺伝子を、芳香族オキシゲナーゼの大小サブユニットとルブレドキシンをコードする遺伝子と共に導入して得られる微生物を、アルキル基を有する芳香族化合物を含む培地で培養し、培養物又は菌体からアルキル基が水酸化された芳香族化合物を採取する方法、（３）本発明のペプチドをコードする遺伝子を、芳香族オキシゲナーゼの大小サブユニットとルブレドキシンをコードする遺伝子と共に導入して得られる微生物を、アルキル基を有する芳香族化合物を含む液体と接触させ、その後、前記液体中からアルキル基が水酸化された芳香族化合物を採取する方法などを例示できる。
【００２８】
本発明のペプチドをコードする遺伝子、及び芳香族オキシゲナーゼの大小サブユニットとルブレドキシンをコードする遺伝子の代わりに、本発明のDNAを用いても、アルキル基が水酸化された芳香族化合物を製造することができる。
本発明においてアルキル基とは、主としてメチル基及びエチル基を意味する。また、アルキル基を有する芳香族化合物の具体例としては、o-キシレン、m-キシレン、p-キシレン、トルエン、エチルベンゼン、又は1,2,4,5-テトラメチルベンゼン、を挙げることができる。
大腸菌や放線菌等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入・発現法は、多くの実験書に記載されているので（たとえば、Sambrook, J., Russel,D. W., Molecular Cloning  A Laboratory Manual, 3rd Edition, CSHL Press, 2001; Hopwood, D. A., Bibb, M. J., Chater, K. F., Bruton, C. J., Kieser, H. M., Lydiate, D. J., Smith, C. P., Ward, J. M., Schrempf, H.  Genetic manipulation of Streptomyces: A laboratory manual, The John Innes Institute, Norwich, UK, 1985）、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。
【００２９】
６．芳香族化合物で汚染された環境の浄化方法
本発明の微生物は、芳香族化合物（特にアルキル基を有する芳香族化合物）で汚染された環境の浄化に利用することができる。ここでいう「環境」には、土壌、海洋、大気のほか、排水なども含まれる。環境の浄化は、上記条件で培養した微生物の培養液、あるいは、微生物を凍結乾燥処理した乾燥粉末を汚染環境に散布することにより行われる。この際、乾燥粉末と増殖を補助する無機塩類を混合・造粒し、粉末状及び顆粒状等に製剤化したものを汚染環境に散布しても良い。処理に用いる微生物の量は、土壌及び海水の汚染状況等に応じ、任意に定めることができるが、通常、汚染土壌1m3あるいは汚染海域100m2に培養液であれば0.02L、乾燥菌体であれば0.1g程度である。また、汚染された大気の浄化は、上記培養液あるいは乾燥菌体を固定化担体を設置した気体の浄化装置に添加し、これに汚染大気を通気することで行う。さらに、汚染された排水の浄化は、同じく上記培養液あるいは乾燥菌体を汚染排水と混合し、好気条件で7〜60日程度培養することで行う。
【実施例】
【００３０】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕  遺伝子操作実験
プラスミドの調製、制限酵素処理、ライゲーション反応、形質転換などの通常の遺伝子操作実験は、SambrookらのMolecular Cloning（Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., 1989, “Molecular cloning -a laboratory manual”, 2nd edition、または、 Sambrook, J., Russell, D.W., 2001, "Molecular cloning -a laboratory manual", Third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）に示された方法、または、試薬のプロトコールに示された方法により行った。
【００３１】
〔実施例２〕  ロドコッカス属TKN14株からの染色体DNAの調製
ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）TKN14株（FERM P-18195）は、難分解性芳香族化合物であるo-キシレンで優占化するo-キシレン資化細菌として、発明者らが所属する(株)海洋バイオテクノロジー研究所により釜石土壌より単離されたものである（特開2002-238551号公報）。
【００３２】
ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）TKN14株（FERM P-18195）を300 mlのTryptic Soy Broth (TSB)培地（Difco）で30℃、2日間培養した。菌体を集菌後、STE緩衝液（100 mM NaCl, 10 mM Tris・HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0 ）で二回洗浄し、68℃で15分間熱処理をした後、5 mg/ml のリゾチーム（Sigma）と100 μg/mlのRNase A (Sigma)を含むI液 (50 mM グルコース、25 mM Tris・HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0)に懸濁した。37℃で一時間インキュベートした後、250 μg/mlになるようにProtenase K (Sigma)を加え、37℃で10分間インキュベートした。さらに最終濃度が1% になるようにN-Lauroylsarcosin・Naを添加し、転倒混和により穏やかに完全に混合した後37℃で3時間インキュベートした。さらにフェノール/クロロホルム抽出を数回行った後、2倍量のエタノールをゆっくりと添加しながら、析出してきた染色体DNAをガラス棒で巻きつけ、70% エタノールでリンスした後、2 mlのTE緩衝液（10 mM Tris・HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）に溶解して、染色体DNA溶液とした。
【００３３】
〔実施例３〕  コスミドライブラリーの作製とスクリーニング
ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）TKN14株の染色体DNAを約30−42 kbの長さのDNA断片が回収できるようにSau3AIによって部分的に切断し、フォスファターゼ（CIAP、TAKARA社製）処理した。DNAのSau3AIによる切断パターンの確認はTAEアガロースゲルを用いた電気泳動で行った。コスミドベクターとしてSuperCos 1（Stratagene）を用い、XbaI消化した後、フォスファターゼ処理を行った。さらに、このベクターDNAをBamHIで消化した後、上記の染色体DNAのSau3AI部分分解物とのライゲーション反応（Ligation High TOYOBO社製）を行った。次に、in vitroパッケージング（LAMBDA INN, Wako社製）を行った後、大腸菌（Escherichia coli）XL1-Blue MR株への感染を行った。感染した大腸菌はアンピシリンを含むLBプレートによって選択し、約1,000個の大腸菌クローンを用意した。
【００３４】
各クローンをLB寒天培地から密閉できる試験管に入れたＭ９培地（Sambrook ら, Molecular Cloning, 2001 (前述の文献)）へ一白菌耳植菌し、50％エタノールに溶解したo-キシレンを最終濃度50 ppmになるように添加し、30℃で培養を行った。７日間培養後、培養液を100 μlサンプリングし、同量のメタノールを加えて撹拌後、５分間超音波処理を行った。５分間遠心分離して上清を回収して、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で分析を行った。分析カラムはXTerra MS C18（5 μm、4.6 mmψｘ100 mm、Waters社製）を用い、0.1％リン酸水溶液：アセトニトリル（75：25）→ アセトニトリル（100％）のグラジエント条件で溶離し、フォトダイオードアレイ検出器にて198 nmの波長で検出を行った。その結果、2-メチルベンジルアルコールを生成していると思われる株を1株取得した。この株をRKN700と名づけた。図１に、2-メチルベンジルアルコール標品や関連代謝候補物質（o-トルイルアルデヒドやo-トルイル酸）の標品のHPLC分析の結果（図１a）、及び、o-キシレン変換反応後のRKN700培養液からの抽出液をHPLCで分析した結果（図１b）を示す。また図２に2-メチルベンジルアルコール標品（図２a）およびRKN700抽出液における溶出時間（RT）3.7分のピーク（図２b）の紫外線吸収スペクトルを示す。RKN700株による変換生成物の溶出時間、紫外線吸収スペクトルともに標品の2-メチルベンジルアルコールと一致した。なお、o-トルイルアルデヒドやo-トルイル酸が検出された株は見られなかった。
【００３５】
〔実施例４〕o-キシレン変換遺伝子のサブクローニングとシークエンス解析
RKN700株に導入されたプラスミド（以下、cosmid RKN700と略記する）を抽出して様々な制限酵素で切断処理後、アガロース電気泳動を行った結果を図３に示す。各断片の大きさの合計からこのプラスミドに挿入された遺伝子断片の大きさはベクター由来の部分（7.9 kb）を除いて約35 kb弱であると推定された。次に、このcosmid RKN700の各種制限酵素処理断片を大腸菌ベクター pBluescript II SK+に挿入したプラスミドを調製し、これらのJM109形質転換体の2-メチルベンジルアルコール生成活性を実施例３に記載の方法により調べた。その結果、NotI処理で得られた約15 kbの断片が挿入されたプラスミド（p700Not1-9と命名）を導入した形質転換体にo-キシレンを2-メチルベンジルアルコールに変換する活性が認められた。次に、p700Not1-9における約15 kbの挿入DNA断片のシークエンス解析を行った。シークエンス反応はTakara PCR Thermal Cycler MP（宝酒造社製）、BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit Ver. 2.0（Applied Biosystems社製）を用い、ジメチルスルホキシド（DMSO）を５％添加の条件で、98℃  5分、98℃  10秒、50℃  5秒、60℃  4分、25サイクルで行った。反応生成物はApplied Biosystems  3700 DNA Analyzer（Applied Biosystems社製）により解析した。また、解析の結果得られた15,009 bpの塩基配列を配列番号１に示す。遺伝子配列の相同性の解析、ORFの検索をNCBIホームページよりそれぞれBLAST 2.0（gapped BLAST）、 ORF finderで行った。その結果については図４に示す。なお、プラスミドp700Not1-9を導入した大腸菌JM101株は、受託番号 FERM P-19698として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００３６】
この15,009 bpの配列中に芳香族化合物代謝にかかわると予想される遺伝子配列として、Rhodococcus sp.I24株における、インデンから1-インデノールおよびcis-(1R, 2S)-インダンジオールへの変換反応にかかわる遺伝子として報告されたジオキシゲナーゼα及びβサブユニットの遺伝子（nidA及びnidB遺伝子；nidは naphthalene-inducible dioxygenaseから由来している）（Treadway, S.L. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 51, 786-793, 1999）とそれぞれ98％、99％の相同性を持つ配列が見つかった（以後それぞれnidA及びnidBと呼称する）。nidA（配列番号１中の塩基番号6710−8116）の塩基配列及びコードされるアミノ酸配列をそれぞれを配列番号２及び配列番号３に、nidB（配列番号１中の塩基番号8120−8638）の塩基配列及びコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４及び配列番号５に示す。また、デヒドロゲナーゼ及びアルドラーゼとして報告のある遺伝子（nidC及びnidD遺伝子）（Treadway, S.L. et al, Appl. Microbiol. Biotechnol. 51, 786-793, 1999）とそれぞれ98％、97％の相同性を持つ配列も見つかった（以後それぞれnidC及びnidDと呼称する）。
【００３７】
次に、プラスミドp700Not1-9の挿入断片中の配列番号１の1382−8640（nidAとnidBの全長を含み、nidCとnidDを含まないDNA領域）の塩基配列部分をPCR法により増幅し、TAクローニング法によってpT7Blue vector（Novagen社製）に挿入したプラスミド（pN54-1-5と命名）を調製し、JM109の形質転換体を作製した。この形質転換体を用いて、o-キシレンから2-メチルベンジルアルコールへの変換活性を実施例３に記載と同様の方法により調べた結果、o-キシレン変換活性が認められた。従ってこのpN54-1-5に挿入された7.26 kbのDNA断片に含まれるORFがo-キシレン酸化反応に関与しているものと考えられた。
【００３８】
〔実施例５〕  大腸菌形質転換体のo-キシレン変換活性の比較
o-キシレン変換活性を有するDNA配列を含むプラスミドであるcosmid RKN700  （約35 kbのDNA断片がコスミドベクター SuperCos 1に挿入されたもの）、p700Not1-9（nidABCDを含む15.01 kbのDNA断片がpBluescript II SK+に挿入されたもの）、pN54-1-5（nidAとnidBの全長を含む7.26 kbのDNA断片がpT7Blue vectorに挿入されたもの）のそれぞれについて、大腸菌JM109とJM101の形質転換体（以下、JM109/cosmid RKN700、JM101/cosmid RKN700、JM109/p700Not1-9、JM101/p700Not1-9、JM109/pN54-1-5、JM101/pN54-1-5と略記する）を作製し、o-キシレン変換実験を行った。それぞれ、アンピシリン150 μl/mlを含むLB培地（1％トリプトン、0.5％ イーストエキス、0.5％ NaCl）で30℃にて９時間培養を行った後、アンピシリン150 μl/ml、0.8％（w/v）グルコース、0.01％（w/v）チアミンを含むM9培地5 mlに対しそれぞれ5％植菌し、さらに30℃で14時間培養を行った。菌体を遠心操作により回収後、栓つき試験管中、2 mlの同培地に懸濁した。o-キシレンの100 mM DMSO溶液をo-キシレン最終濃度1 mMとなるように添加し、蓋を密閉して30℃で３日間共培養を行った。この培養液100 μlに対しメタノール 100 μlを加えボルテックス攪拌を行い、５分間超音波処理後、10,000 ｒｐｍで５分間遠心し上清をHPLCサンプルとした。HPLCサンプルは実施例３に記載の条件で分析を行った。また、o-キシレンとの共培養液の残りに対し1 mlの酢酸エチル、1N  塩酸100 μｌ、塩化ナトリウム1 gを添加した後30℃で１時間振とうし、3000 rpmで５分間遠心後、酢酸エチル相をGC/MS用サンプルとした。GC/MSは島津のmodel QP5050A、カラムはJ&W Scientific社製のDB-5 column（30 ｘ0.25 ｍｍ）を使用した。カラム温度は最初40℃で５分間を保った後、70℃まで１５℃／分、105℃まで５℃／分、240℃まで20℃／分の速度で昇温した（１サンプルにつき計20.75分の測定条件）。注入温度と検出温度は250℃であった。いずれのサンプルについてもHPLCおよびGC/MSによる分析の結果から2-メチルベンジルアルコールが生成していることが明らかとなった。2-メチルベンジルアルコールのピークエリア面積の比較からベンジルアルコールの生成量については、JM109およびJM101いずれの形質転換体においてもpN54-1-5＞p700Not1-9＞cosmid RKN700の関係が認められ、nidAとnidBの全長を含む7.26 kbのDNA断片を挿入した形質転換体が最もo-キシレン変換活性が高いことが明らかとなった。
【００３９】
〔実施例６〕  芳香族化合物の変換反応
実施例５に記載の形質転換体であるJM101/pN54-1-5のグリセロールストックを作製し、アンピシリン150 μl/mlを含むLB培地（1％トリプトン、0.5％ イーストエキス、0.5％ NaCl）5 mlに1％植菌した。30℃にて7.5時間培養を行い、この培養物をアンピシリン150 μ/ml、0.8％（w/v）グルコース、0.01％（w/v）チアミン、硫酸鉄1 mMを含むM9培地5 mlに対しそれぞれ5％植菌したものを所定の本数用意し、30℃で18.5時間培養を行った。菌体を遠心操作により回収後、栓つき試験管中2 mlの同培地にそれぞれ懸濁し、それぞれo-キシレン、2-メチルベンジルアルコール、m-キシレン、p-キシレン、トルエン、エチルベンゼン、ナフタレン、インデンの100 mM  DMSO溶液を基質の最終濃度が0.5 mMになるように添加し、蓋を密閉して30℃で３日間培養を行った。この培養液それぞれに対し、1 mlの酢酸エチル、1N 塩酸100 μl、塩化ナトリウム 1 gを添加した後30℃で１時間振とうし、3000 rpmで５分間遠心後、酢酸エチル相をGC/MSにて実施例５に記載の条件で分析を行った。市販の標準品とのマスパターンおよびリテンションタイムの比較から、o-キシレンからは2-メチルベンジルアルコール、2-メチルベンジルアルコールからはo-メチル安息香酸、m-キシレンからは3-メチルベンジルアルコール、p-キシレンからは4-メチルベンジルアルコールと痕跡量の2,5-ジメチルフェノール、トルエンからはベンジルアルコール、エチルベンゼンからは1-フェニルエタノール、ナフタレンからはナフタレン-1,2-ジヒドロジオール、インデンからは1-インデノール、1-インダノン、1,2-インダンジオールが生成していることが確認された。この結果からo-キシレン酸化に関与する遺伝子は、m-キシレン、p-キシレン、トルエン、エチルベンゼンにおいても芳香環上のアルキル基の酸化を行う能力があり、基質特異性が広いことが確認された。また、ナフタレンやインデンを基質とした場合に芳香環をジヒドロジヒドロキシル化する活性が見られたことから、芳香環ジオキシゲナーゼが発現しておりo-キシレン酸化にも関与していると考えられた。
【００４０】
〔実施例７〕  欠失株の調製とo-キシレン変換活性の確認
o-キシレン酸化に関与する遺伝子コンポーネントを特定するため、pN54-1-5に挿入された７.26 kb中の特定のORFを破壊したプラスミドを作製し、大腸菌JM101の形質転換体を調製してo-キシレン変換活性の有無について検討を行った。破壊するORFについてはnidA（配列番号１中の塩基番号6710−8116）、nidB（配列番号１中の塩基番号8120−8638）、hypothetical protein（ORF1; 配列番号１中の塩基番号3530-1719）、hypothetical protein（ORF2; 配列番号１の塩基番号4962-4420）、hypothetical protein（ORF3; 配列番号１の塩基番号5212-4754）を選定した。
【００４１】
例としてnidA部分のORFを破壊したプラスミドの調製について説明する。まずそれぞれAscI部位を有する配列番号６と配列番号７に記載のプライマーおよびLA TAQ with GC buffer（Takara社製）を用いて、pN54-1-5プラスミドを鋳型としたLong PCR反応を行った。温度条件は94℃  2分および94℃  １分、59℃  30秒、72℃  11分を30サイクルで行った。PCR産物をフェノールクロロホルム抽出およびエタノール沈殿で精製後、AscIで処理し、処理後のDNA断片をゲルから切り出して精製を行った。次にこのDNA断片の両末端に存在するAscI部位のライゲーション反応を行い（Ligation High、Toyobo社製）、ライゲーション液を用いてJM109の形質転換を行った。目的とするクローンの選定については、アンピシリンを含むLBプレートに生じた複数のコロニーを培養後プラスミド抽出を行い、様々な制限酵素による切断パターンの分析により行った。選択したクローンから抽出したプラスミドの塩基配列について実施例４に記載の方法によりシークエンス解析を行ったところ、配列番号１中の塩基番号6810−8009部分が欠質しており、nidA部分のORFが破壊されていることを確認した。また、調製したプラスミドを用いてJM101を形質転換し、JM101におけるnidAの破壊株の作製も行った（以下それぞれ、disrupt-nidA/JM109、disrupt-nidA/JM101などと略記する）。
【００４２】
同様に配列番号８と配列番号９に記載のプライマーを用いることで配列番号１中の塩基番号8220−8539部分が欠質した形質転換体であるnidBの破壊株（以下それぞれ、disrupt-nidB/JM109、disrupt-nidB/JM101などと略記する）、配列番号１０と配列番号１１に記載のプライマーを用いることで配列番号１中の塩基番号1819−3428部分が欠質した形質転換体であるhypothetical protein（ORF1）（配列番号１中の塩基番号3530-1719）の破壊株（以下それぞれdisrupt-ORF1/JM109、disrupt-ORF1/JM101と略記する）、配列番号１２と配列番号１３に記載のプライマーを用いることで、配列番号１中の塩基番号4470−5163部分が欠質した形質転換体である２つのhypothetical protein（ORF2及びORF3）（配列番号１中の塩基番号4962-4420および5212-4754）の破壊株（以下それぞれdisrupt-ORF23/JM109、disrupt-ORF23/JM101と略記する）を得た。
【００４３】
これらの内disrupt-nidA/JM101、disrupt-nidB/JM101、disrupt-ORF1/JM101、disrupt-ORF23/JM101を用いて実施例６に記載の反応条件および分析条件でo-キシレン、m-キシレン、p-キシレン、トルエン、インデンの変換反応を行った。その結果、disrupt-nidA/JM101、disrupt-nidB/JM101を用いた場合については、いずれの基質を用いた場合も変換反応産物は生成されなかったのに対し、disrupt-ORF1/JM101、disrupt-ORF23/JM101を用いた場合は、いずれもo-キシレンからは2-メチルベンジルアルコール、m-キシレンからは3-メチルベンジルアルコール、p-キシレンからは4-メチルベンジルアルコール、トルエンからはベンジルアルコール、インデンからは1-インデノール、1-インダノン、1,2-インダンジオールの生成が確認された。以上の結果からnidA、nidB、hypothetical protein（ORF1）、hypothetical protein（ORF2）、hypothetical protein（ORF3）の内、芳香族ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子部分であるnidA（配列番号１中の塩基番号6710−8116）と nidB（配列番号１中の塩基番号8120−8638）がキシレン上のメチル基の酸化とインデンの1,2-ジヒドロキシル化に最低限必要なコンポーネントであることが証明された。
【００４４】
〔実施例８〕  o-キシレン酸化に関わるDNA領域のスクリーニング
nidA（配列番号１中の塩基番号6710−8116）と nidB（配列番号１中の塩基番号8120−8638）以外のo-キシレン酸化に関わる遺伝子コンポーネントを同定するため、p700Not1-9に挿入された約15-kbの内、実施例７に記載のORF3からnidAまでの間に存在する幾つかのDNA領域のクローニング、およびo-キシレン変換活性の有無について検討を行った。本実施例でサブクローニングを行ったDNA領域の詳細については図５に示す。BamHI部位を付加した配列番号１４に記載のプライマーおよびPstI部位を付加した配列番号１５に記載のプライマーを用いることでnidAおよび nidBを含む、配列番号１中の塩基番号6710−8638部分の増幅をp700Not1-9を鋳型として行った（以下、全てのPCR反応においてp700Not1-9を鋳型として用いた）。得られたPCR産物はBamHIおよびPstIによる切断処理を行い、ベクターpTrcHisA（Invitrogen社製）のBamHI-PstI部位に挿入し、nidAおよび nidBを含むプラスミドであるpTrcHisNidABおよびその形質転換大腸菌であるpTrcHisNidAB/JM109を得た。また、PstI部位を付加した配列番号１６に記載のプライマーおよびKpnI部位を付加した配列番号１７に記載のプライマーを用いることでルブレドキシン（配列番号１中の塩基番号3787−3527、以下Rdと記載する）を含む配列番号１中の塩基番号3798-3527部分を増幅した。得られたPCR産物はPstIおよびKpnIによる処理を行い、プラスミドpTrcHisAのPstI- KpnI部位に挿入し、プラスミドpTrcHisRdおよびその形質転換大腸菌であるpTrcHisRd/JM109を得た。また、プラスミドpTrcHisNidAB から、nidAと nidBを含む配列番号１中の塩基番号6710−8638部分の挿入断片をBamHIおよびPstIにて切り出し、これをpTrcHisRdのBamHI-PstI部位にクローニングすることで、nidA、 nidBおよびRdを導入したプラスミドであるpTrcHisNidABRd、およびその形質転換大腸菌であるpTrcHisNidABRd /JM109を得た。次に、KpnI部位を付加した配列番号１８に記載のプライマーおよびHindIII部位を付加した配列番号１９に記載のプライマーを用いることでDNA領域W（配列番号１中の塩基番号5252-5845）を増幅し、KpnI部位を付加した配列番号２０に記載のプライマーおよびHindIII部位を付加した配列番号２１に記載のプライマーを用いることでDNA領域X（配列番号１中の塩基番号4928-5625）を増幅し、KpnI部位を付加した配列番号２２に記載のプライマーおよびHindIII部位を付加した配列番号２３に記載のプライマーを用いることでDNA領域Y（配列番号１中の塩基番号5834-6462）を増幅し、さらに、KpnI部位を付加した配列番号２４に記載のプライマーおよびHindIII部位を付加した配列番号２５に記載のプライマーを用いることでDNA領域Z（配列番号１中の塩基番号6801-5347）の増幅を行った。得られたそれぞれW、X、Y、ZのDNA領域を含むPCR産物はKpnIおよびHindIIIによる消化処理を行い、プラスミドpTrcHisRdのKpnI- HindIII部位にクローニングを行い、Rdと増幅したそれぞれのDNA領域を含むプラスミドであるpTrcHisRdW、pTrcHisRdX、pTrcHisRdY、pTrcHisRdZおよびそれぞれその形質転換大腸菌であるpTrcHisRdW/JM109、pTrcHisRdX/JM109、pTrcHisRdY/JM109、pTrcHisRdZ/JM109を得た。さらに、nidAおよび nidBを含む、配列番号１中の塩基番号6710−8638部分の増幅DNA断片のBamHIおよびPstIによる処理物をそれぞれ、プラスミドpTrcHisRdW、pTrcHisRdX、pTrcHisRdY、及び、pTrcHisRdZのBamHI-PstI部位に挿入することで、nidA、nidB、Rd、DNA領域Wを導入したプラスミドであるpTrcHisNidABRdWおよびその形質転換大腸菌であるpTrcHisNidABRdW /JM109、nidA、nidB、Rd、DNA領域Xを導入したプラスミドであるpTrcHisNidABRdXおよびその形質転換大腸菌であるpTrcHisNidABRdX/JM109、nidA、nidB、Rd、DNA領域Yを導入したプラスミドであるpTrcHisNidABRdYおよびその形質転換大腸菌であるpTrcHisNidABRdY /JM109、nidA、nidB、Rd、DNA領域Zを導入したプラスミドであるpTrcHisNidABRdZおよびその形質転換大腸菌であるpTrcHisNidABRdZ /JM109を得た。次にpTrcHisNidABRdW /JM109、pTrcHisNidABRdX /JM109、pTrcHisNidABRdY /JM109、pTrcHisNidABRdZ /JM109の４つの形質転換大腸菌についてo-キシレン変換活性の有無について検討を行った。それぞれの菌体のコロニーを、アンピシリン150 μl/mlを含むLB培地（1％トリプトン、0.5％ イーストエキス、0.5％ NaCl）5 mlに植菌した。37℃にて9 時間培養を行い、この培養物をアンピシリン150 μ/ml、0.8％（w/v）グルコース、0.01％（w/v）チアミン、硫酸第一鉄アンモニウム100 μMを含むM9培地10 mlに対しそれぞれ2.5％植菌し、30℃で15 時間培養を行った。さらにこの培養物を同じ組成のM9培地にOD600が0.2になるように植え継ぎ、30℃で1 時間培養を行った。イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（IPTG）を1 mMになるよう添加した後、引き続き30℃で4 時間培養を行った。菌体を遠心操作により回収後、栓つき試験管中2 mlの1 ％グルコースを含む50 mMリン酸緩衝液（pH 7.4）に懸濁し、o-キシレン50 mM  DMSO溶液を基質の最終濃度が0.5 mMになるように添加し、蓋を密閉して30℃で2.5 日間培養を行った。この反応液それぞれに対し、1 mlの酢酸エチル、1 N 塩酸200 μl、塩化ナトリウム 1 gを添加した後30℃で１ 時間振とうし、3000 rpmで５分間遠心後、酢酸エチル相をGC/MSにて実施例５に記載の条件で分析を行った。pTrcHisNidABRdW /JM109、pTrcHisNidABRdX /JM109、pTrcHisNidABRdY /JM109のo-キシレン反応液からは2-メチルベンジルアルコールが検出されなかったのに対し、pTrcHisNidABRdZ /JM109のo-キシレン反応液からは2-メチルベンジルアルコールが検出された。この結果からo-キシレン酸化に必要不可欠な遺伝子がDNA領域Z中に存在することが明らかとなった。
【００４５】
〔実施例９〕  o-キシレン酸化に関わるORFの同定
DNA領域Z中に含まれるORFである、ORF4（配列番号１中の塩基番号6057-5347）、ORF5（配列番号１中の塩基番号6579-6085）、ORF6（配列番号１中の塩基番号6792-6589）の内どのORFがo-キシレン酸化に必要不可欠であるかについて検討を行った。p700Not1-9を鋳型としたPCRにより、KpnI部位を付加した配列番号２６に記載のプライマーおよびHindIII部位を付加した配列番号２５に記載のプライマーを用いることでORF4を含むDNA領域であるZ4（配列番号１中の塩基番号6063-5347）の増幅を行った。同様に、KpnI部位を付加した配列番号２７に記載のプライマーおよびHindIII部位を付加した配列番号２８に記載のプライマーを用いることでORF5を含むDNA領域であるZ5（配列番号１中の塩基番号6585-6085）、KpnI部位を付加した配列番号２７に記載のプライマーおよびHindIII部位を付加した配列番号２５に記載のプライマーを用いることでORF4とORF5を含むDNA領域であるZ45（配列番号１中の塩基番号6585-5347）、KpnI部位を付加した配列番号２４に記載のプライマーおよびHindIII部位を付加した配列番号２８に記載のプライマーを用いることでORF5とORF6を含むDNA領域であるZ56（配列番号１中の塩基番号6801-6085）の増幅を行った。本実施例でクローニングを行ったDNA領域については図５に示す。得られたそれぞれZ4、Z5、Z45、Z56のDNA領域を含むPCR産物はKpnIおよびHindIIIによる処理を行い、プラスミドpTrcHisRdのKpnI- HindIII部位にクローニングを行い、Rdと増幅したそれぞれのDNA領域を含むプラスミドであるpTrcHisRdZ4、pTrcHisRdZ5、pTrcHisRdZ45、pTrcHisRdZ56およびそれぞれその形質転換大腸菌であるpTrcHisRdZ4/JM109、pTrcHisRdZ5/JM109、pTrcHisRdZ45/JM109、pTrcHisRdZ56/JM109を得た。さらに、実施例８に記載の、nidAおよび nidBを含む、配列番号１中の塩基番号6710−8638部分の増幅フラグメントのBamHIおよびPstIによる処理物を、それぞれプラスミドpTrcHisRdZ4、pTrcHisRdZ5、pTrcHisRdZ45、pTrcHisRdZ56のBamHI-PstI部位に挿入することで、nidA、 nidB、Rd、DNA領域Z4を導入したプラスミドであるpTrcHisNidABRdZ4およびその形質転換大腸菌であるpTrcHisNidABRdZ4 /JM109、nidA、 nidB、Rd、DNA領域Z5を導入したプラスミドであるpTrcHisNidABRdZ5およびその形質転換大腸菌であるpTrcHisNidABRdZ5 /JM109、nidA、 nidB、Rd、DNA領域Z45を導入したプラスミドであるpTrcHisNidABRdZ45およびその形質転換大腸菌であるpTrcHisNidABRdZ45 /JM109、nidA、 nidB、Rd、DNA領域Z56を導入したプラスミドであるpTrcHisNidABRdZ56およびその形質転換大腸菌であるpTrcHisNidABRdZ56 /JM109を得た。次にpTrcHisNidABRdZ /JM109、pTrcHisNidABRdZ4 /JM109、pTrcHisNidABRdZ5 /JM109、pTrcHisNidABRdZ45 /JM109、pTrcHisNidABRdZ56 /JM109の５つの形質転換大腸菌についてo-キシレン変換活性の有無について検討を行った。それぞれの菌体のコロニーまたはグリセロールストックをアンピシリン150 μ/ml、0.8％（w/v）グルコース、0.01％（w/v）チアミン、硫酸第一鉄アンモニウム100 μMを含むM9培地5  mlに植菌し、30℃で16 時間培養を行った。この終夜培養物を同じ組成のM9培地10 mlにOD600が0.2になるように植え継ぎ、30℃でOD600が0.5〜0.6になるように培養を行った。イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（IPTG）を1 mMになるよう添加した後、引き続き30℃で4 時間培養を行った。菌体を遠心操作により回収後、栓つき試験管中2 mlの1％グルコースを含む50 mMリン酸緩衝液（pH 7.4）に懸濁し、o-キシレン50 mM  DMSO溶液を基質の最終濃度が0.5 mMになるように添加し、蓋を密閉し��30℃で4 日間培養を行った。この反応液それぞれに対し、1 mlの酢酸エチル、1 N 塩酸200 μl、塩化ナトリウム 1 gを添加した後30℃で1 時間振とうし、3000 rpmで5分間遠心後、酢酸エチル相をGC/MSにて実施例５に記載の条件で分析を行った。pTrcHisNidABRdZ /JM109、pTrcHisNidABRdZ5 /JM109、pTrcHisNidABRdZ45 /JM109、pTrcHisNidABRdZ56 /JM109のo-キシレン反応液からは2-メチルベンジルアルコールが検出されたのに対し、pTrcHisNidABRdZ4 /JM109のo-キシレン反応液からは2-メチルベンジルアルコールは検出されなかった。この結果からDNA領域Zに含まれるORFの内、ORF5がo-キシレン酸化に必要不可欠なコンポーネントであることが明らかとなった。
【００４６】
〔実施例１０〕  キシレン上のベンジル位酸化およびナフタレンの芳香環ジヒドロジヒドロキシル化に関わる最小コンポーネントの同定
キシレン上のベンジル位酸化およびナフタレンの芳香環ジヒドロジヒドロキシル化に関わる最小コンポーネントの同定を行った。実施例９に記載のKpnI部位を付加した配列番号２７に記載のプライマーおよびHindIII部位を付加した配列番号２８に記載のプライマーを用いることで増幅した、ORF5を含むDNA断片をKpnIおよびHindIIIで処理し、プラスミドpTrcHisA のKpnI-HindIII部位に挿入することで、DNA領域Z5を含むプラスミドであるpTrcHisZ5およびその形質転換大腸菌であるpTrcHisZ5 /JM109を得た。次に、実施例８に記載の、nidAおよび nidBを含む、配列番号１中の塩基番号6710−8638部分の増幅フラグメントのBamHIおよびPstIによる処理物を、pTrcHisZ5のBamHI-PstI部位に挿入することで、nidA、 nidB、DNA領域Z5を導入したプラスミドであるpTrcHisNidABZ5およびその形質転換大腸菌であるpTrcHisNidABZ5 /JM109を得た。このpTrcHisNidABZ5 /JM109および実施例９に記載のpTrcHisNidABRdZ5 /JM109、実施例８に記載のpTrcHisNidAB /JM109、pTrcHisNidABRd /JM109の4種の株を用いて、o-, m-, p-キシレン、エチルベンゼン、1,2,4,5-テトラメチルベンゼン、ナフタレン、1-メチルナフタレン、2-メチルナフタレン、1,2-ジメチルナフタレンの変換反応を行った。菌体の培養条件および反応条件、反応液の後処理は実施例９に記載と同様の方法により行い、基質はそれぞれ50 mMのDMSO溶液を菌体懸濁液量の1/100容量添加し、最終濃度0.5 mMで行った。反応液の酢酸エチル抽出物をGC/MSにて実施例５に記載の条件で分析を行った結果、pTrcHisNidABRdZ5 /JM109による反応産物からは、基質がo-キシレンの場合はo-メチルベンジルアルコール、m-キシレンの場合はm-メチルベンジルアルコール、p-キシレンの場合はp-メチルベンジルアルコール、エチルベンゼンの場合は1-フェネチルアルコール、1,2,4,5-テトラメチルベンゼンの場合は2,4,5-トリメチルベンジルアルコールが生成しており（図６参照）、基質がナフタレンの場合は1,2-ジヒドロナフタレン-1,2-ジオールと１-ナフトール、1-メチルナフタレンの場合は8-メチル-1,2-ジヒドロナフタレン-1,2-ジオール、2-メチルナフタレンの場合は7-メチル-1,2-ジヒドロナフタレン-1,2-ジオール、1,2-ジメチルナフタレンの場合は7,8-ジメチル-1,2-ジヒドロナフタレン-1,2-ジオールが生成していた（図７参照）。このうち、p-キシレンの反応性は低く、o-, m-キシレンと比べメチルベンジルアルコールへの変換率が低いことが明らかとなった。また、pTrcHisNidABRd /JM109による反応産物からは、基質がナフタレン環を持つ芳香族化合物の場合のみ反応し、ナフタレンからは、1,2-ジヒドロナフタレン-1,2-ジオールと1-ナフトールが生成し、1-メチルナフタレンの場合は8-メチル-1,2-ジヒドロナフタレン-1,2-ジオール、2-メチルナフタレンの場合は7-メチル-1,2-ジヒドロナフタレン-1,2-ジオール、1,2-ジメチルナフタレンの場合は7,8-ジメチル-1,2-ジヒドロナフタレン-1,2-ジオールが生成することが解った（図７参照）。ナフタレンを基質とした反応では非酸性条件下で酢酸エチル抽出を行った場合に1,2-ジヒドロナフタレン-1,2-ジオール（ナフタレン cis-ジヒドロジオール）が検出されることから、1-ナフトールはナフタレンジオキシゲナーゼ活性により生成したナフタレン cis-ジヒドロジオールが反応サンプルの酸処理で脱水分解して生成したものであると考えられる。一方、pTrcHisNidABZ5/JM109およびpTrcHisNidAB/JM109の反応産物からはいずれ��基質を用いた場合にも酸化生成物は確認されなかった。図６、７に本実施例で用いた基質と菌体反応による生成物を示す。以上の結果から、ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）TKN14株におけるナフタレンジオキシゲナーゼ活性（ナフタレン、1-メチルナフタレン、2-メチルナフタレン、及び、1,2-ジメチルナフタレンにおけるナフタレン環へのジヒドロジオール化）はnidA、nidB、Rd遺伝子のみで検出できるが、それ以外のメチル基等アルキル基を有する芳香族化合物の水酸化（o-, m-, p-キシレン、エチルベンゼン、1,2,4,5-テトラメチルベンゼン等単環式炭化水素のベンジル位の水酸化）についてはORF5（配列番号３１）が必要不可欠であることがわかった。すなわち、nidA（配列番号２）、nidB（配列番号４）、Rd（配列番号２９）、ORF5（配列番号３１）が、ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）TKN14株における多様な芳香族化合物の最初のオキシゲナーゼ反応における最小構成タンパク質遺伝子群であることが証明された。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】上段a)はo-キシレンのメチル基の酸化の過程で生じると考えられる中間体の標品、下段b)はo-キシレン変換反応後のRKN700培養液からの抽出液をHPLCで分析した結果を示す図である。
【図２】2-メチルベンジルアルコール標品（上段 a)）、及び、図1下段b)における溶出時間（RT）3.7分のピーク（下段 b)）の紫外線吸収スペクトルを示す図である。
【図３】コスミドクローンRKN700から抽出したプラスミドを様々な制限酵素で切断処理後、アガロースゲル電気泳動を行った結果を示す図である。
【図４】コスミドクローンRKN700から抽出したプラスミドをNotI消化して得られた15.01 kbのDNA断片中のORFを解析した結果を示す図である。
【図５】pN54-1-5に挿入されたo-キシレン変換活性を有する7.26-kbのDNA断片中に存在する各種ORFとORFの機能解析用スキームを示す図である。
【図６】実施例１０に示した形質転換大腸菌を用いた単環式芳香族化合物の変換反応における生成物を示す図である。
【図７】実施例１０に示した形質転換大腸菌を用いた二環式芳香族化合物の変換反応における生成物を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図３】
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【配列表】
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