(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
赤血球溶解液中のカルボニックアンヒドラーゼＩ（ＣＡＩ）のエステラーゼ活性を測定する方法であって、測定に使用する基質又は基質と阻害剤の組合せとして、以下（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかを用いることを特徴とするＣＡＩ活性の測定法。
（Ａ）基  質：２−ヒドロキシ−５−ニトロ−α−トルエンスルホン酸スルトン、ｏ−ニトロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルチオエステル及びβ−ナフチルエステルから選ばれるＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質
（Ｂ）基  質：２−ヒドロキシ−５−ニトロ−α−トルエンスルホン酸スルトン、ｏ−ニトロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルチオエステル及びβ−ナフチルエステルから選ばれるＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質
阻害剤：プロテアーゼインヒビターカクテル、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルフォニルフルオライド、α−フェニルメタンスルホニルフルオライド及びペプスタチンから選ばれる１種又は２種以上のＣＡ以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤
（Ｃ）基  質：２−ヒドロキシ−５−ニトロ−α−トルエンスルホン酸スルトン、ｏ−ニトロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルチオエステル及びβ−ナフチルエステルから選ばれるＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質
阻害剤：ドルゾールアミド、ブリンゾールアミド、アセタゾールアミド、メタゾールアミド及びカルバモイルホスフェートから選ばれるＣＡＩとＣＡＩＩの両方を阻害するＣＡの阻害剤
（Ｄ）基  質：ｐ−ニトロフェニルエステル及びα−ナフチルエステルから選ばれるＣＡＩとＣＡＩＩの両方に反応する基質
阻害剤：イミダゾール、ＣＮＳ-、ＣＮＯ-、ＣＮ-及びＩ-から選ばれるＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するＣＡの阻害剤
（Ｅ）基  質：２−ヒドロキシ−５−ニトロ−α−トルエンスルホン酸スルトン、ｏ−ニトロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルチオエステル及びβ−ナフチルエステルから選ばれるＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質
阻害剤：イミダゾール、ＣＮＳ-、ＣＮＯ-、ＣＮ-及びＩ-から選ばれるＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するＣＡの阻害剤
【請求項２】
（Ａ）の基質又は（Ｂ）組み合わせの基質と阻害剤を用い、赤血球溶解液中のＣＡＩのエステラーゼ活性を測定する、請求項１記載の測定法。
【請求項３】
（Ｂ）の組み合わせの基質と阻害剤を用い、更にホルムアルデヒド、アセトアルデヒド又はグルタルアルデヒドを併用する、請求項１又は２記載の測定法。
【請求項４】
（Ｃ）、（Ｄ）又（Ｅ）の組み合わせの基質と阻害剤を用い、赤血球溶解液中のエステラーゼ活性を阻害剤の存在下と非存在下の２つの条件下で測定し、その差をＣＡＩのエステラーゼ活性とする、請求項１記載の測定法。
【請求項５】
ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質が、ｏ−ニトロフェニルアセテートである、請求項１〜４のいずれか１項記載の測定法。
【請求項６】
ＣＡＩとＣＡＩＩの両方に反応する基質が、ｐ−ニトロフェニルアセテートである、請求項１又は４記載の測定法。
【請求項７】
ＣＡＩとＣＡＩＩの両方を阻害するＣＡの阻害剤が、アセタゾールアミドである、請求項１又は４記載の測定法。
【請求項８】
ＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するＣＡの阻害剤が、ヨウ素イオンである、請求項１又は４記載の測定法。
【請求項９】
赤血球溶解液中のＣＡＩのエステラーゼ活性を測定するためのキットであって、測定に使用する基質又は基質と阻害剤の組合せとして、以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかを含有することを特徴とするＣＡＩ活性の測定用キット。
（Ａ）基  質：２−ヒドロキシ−５−ニトロ−α−トルエンスルホン酸スルトン、ｏ−ニトロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルチオエステル及びβ−ナフチルエステルから選ばれるＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質
（Ｂ）基  質：２−ヒドロキシ−５−ニトロ−α−トルエンスルホン酸スルトン、ｏ−ニトロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルチオエステル及びβ−ナフチルエステルから選ばれるＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質
阻害剤：プロテアーゼインヒビターカクテル、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルフォニルフルオライド、α−フェニルメタンスルホニルフルオライド及びペプスタチンから選ばれる１種又は２種以上のＣＡ以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤
（Ｃ）基  質：２−ヒドロキシ−５−ニトロ−α−トルエンスルホン酸スルトン、ｏ−ニトロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルチオエステル及びβ−ナフチルエステルから選ばれるＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質
阻害剤：ドルゾールアミド、ブリンゾールアミド、アセタゾールアミド、メタゾールアミド及びカルバモイルホスフェートから選ばれるＣＡＩとＣＡＩＩの両方を阻害するＣＡの阻害剤
（Ｄ）基  質：ｐ−ニトロフェニルエステル及びα−ナフチルエステルから選ばれるＣＡＩとＣＡＩＩの両方に反応する基質
阻害剤：イミダゾール、ＣＮＳ-、ＣＮＯ-、ＣＮ-及びＩ-から選ばれるＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するＣＡの阻害剤
（Ｅ）基  質：２−ヒドロキシ−５−ニトロ−α−トルエンスルホン酸スルトン、ｏ−ニトロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルチオエステル及びβ−ナフチルエステルから選ばれるＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質
阻害剤：イミダゾール、ＣＮＳ-、ＣＮＯ-、ＣＮ-及びＩ-から選ばれるＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するＣＡの阻害剤
【請求項１０】
（Ａ）の基質又は（Ｂ）の組み合わせの基質と阻害剤を用い、赤血球溶解液中のＣＡＩのエステラーゼ活性を測定する、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
（Ｂ）の組み合わせの基質と阻害剤を用い、更にホルムアルデヒド、アセトアルデヒド又はグルタルアルデヒドを併用する、請求項９又は１０記載のキット。
【請求項１２】
（Ｃ）、（Ｄ）又（Ｅ）の組み合わせの基質と阻害剤を用い、赤血球溶解液中のエステラーゼ活性を阻害剤の存在下と非存在下の２つの条件下で測定し、その差をＣＡＩのエステラーゼ活性とする、請求項９記載のキット。
【請求項１３】
ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質が、ｏ−ニトロフェニルアセテートである、請求項９〜１２のいずれか１項記載のキット。
【請求項１４】
ＣＡＩとＣＡＩＩの両方に反応する基質が、ｐ−ニトロフェニルアセテートである、請求項９又は１２記載のキット。
【請求項１５】
ＣＡＩとＣＡＩＩの両方を阻害するＣＡの阻害剤が、アセタゾールアミドである、請求項９又は１２記載のキット。
【請求項１６】
ＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するＣＡの阻害剤が、ヨウ素イオンである、請求項９又は１２記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カルボニックアンヒドラーゼＩ（ＣＡＩ；カルボニックアンヒドラーゼＢと称されることもある）活性の測定法及び測定用キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
赤血球中には、カルボニックアンヒドラーゼ（ＣＡ）ＩとＣＡＩＩが存在し、臨床検査においてＣＡＩとＣＡＩＩの総量は、鉄欠乏性貧血、ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ等の診断に用いられている。アイソザイムであるＣＡＩは、ＣＡ総量とは違った甲状腺機能亢進症・低下症等の臨床診断への応用が示唆されている（非特許文献１）。【０００３】
ＣＡのアイソザイム活性を分別測定する方法としては、免疫拡散法が挙げられるが、操作が煩雑で時間がかかるため、臨床検査の場においては利用されていない。【０００４】
また、ＣＡは炭酸脱水酵素活性以外にも、加水分解酵素活性を有しており、この加水分解酵素活性を利用すれば、例えば分光学的方法により簡便にＣＡのアイソザイム活性を測定できる可能性がある（非特許文献２）。しかし、臨床検体のように、ＣＡ以外の加水分解酵素類が多量に存在し、それらの酵素による添加した基質の分解が無視できない条件下、例えば添加した基質が速やかに分解してしまうような条件下では、ＣＡアイソザイムの加水分解酵素活性を特異的に測定することは不可能と考えられていた。【０００５】
このため、ＣＡＩに対する抗血清を用いて、免疫吸着前後の加水分解酵素活性を測定し、ＣＡＩ活性を特異的に測定する方法が報告されているが（非特許文献３）、この方法とても簡便な測定法とはいえなかった。【０００６】
さらに、ＣＡ特異的な阻害剤であるアセタゾールアミド（ａｃｅｔａｚｏｌａｍｉｄｅ）を用いて全加水分解酵素中の総ＣＡ活性を測定することは可能であるものの（非特許文献４）、ＣＡアイソザイム活性の特異的な測定法に関しては何ら報告されていない。
【非特許文献１】Ｔｏｈｏｋｕ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９６，１７８，３４５−３５６
【非特許文献２】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６７；２４２（１８）：４２２１−４２２９
【非特許文献３】Ｃｌｉｎｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，６０（１９７５），  ３４７−３５３
【非特許文献４】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６６；２４１（１０）：５１３７−５１４９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、ＣＡのアイソザイム活性を特異的に測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は鋭意研究を重ねた結果、特定の基質、あるいは特定の基質と阻害剤及び必要によりさらに増強剤を組み合わせて用いることで、ＣＡのアイソザイム活性、特にＣＡＩの加水分解酵素活性を特異的に測定することができ、この方法はＣＡ以外の加水分解酵素類が多量に存在するような全血などの臨床検体へも適用可能であることを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は、試料中のカルボニックアンヒドラーゼＩ（ＣＡＩ）の加水分解酵素活性を測定する方法であって、測定に使用する基質又は基質と阻害剤の組合せとして、以下（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかを用いることを特徴とするＣＡＩ活性の測定法を提供するものである。
（Ａ）基  質：ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質
（Ｂ）基  質：ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質
阻害剤：ＣＡ以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤
（必要により、上記阻害剤の阻害作用を増強する薬剤を併用してもよい）
（Ｃ）基  質：ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質
阻害剤：ＣＡＩとＣＡＩＩの両方を阻害するＣＡの阻害剤
（Ｄ）基  質：ＣＡＩとＣＡＩＩの両方に反応する基質
阻害剤：ＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するＣＡの阻害剤
（Ｅ）基  質：ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質
阻害剤：ＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するＣＡの阻害剤【００１０】
また、本発明は、試料中のＣＡＩの加水分解酵素活性を測定するためのキットであって、測定に使用する基質、基質と阻害剤、又は基質と阻害剤と増強剤の組合せとして、前述の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかを含有することを特徴とするＣＡＩ活性の測定用キットを提供するものである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の測定法によれば、特定の基質、特定の基質と阻害剤、又は特定の基質と阻害剤と増強剤の組合せを使用することにより、試料中のＣＡＩの加水分解酵素活性を特異的、選択的あるいは実質的に測定することができ、また操作も簡便である。しかも臨床検体のようにＣＡ以外の加水分解酵素類が多量に存在し、それら酵素による添加した基質の分解が無視できないような条件下、具体的には添加した基質が速やかに分解してしまうような条件下でも適用することができるため、実用的なＣＡＩ活性の測定法である。その中でも、特に上記（Ｂ）の特定の基質と阻害剤と増強剤の組合せを使用する方法は、ＣＡ以外の加水分解酵素類の影響を排除でき、一回の測定でＣＡＩの加水分解酵素活性を特異的に測定することができるため、極めて有用な方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明において、試料（サンプル）は、赤血球成分が含まれる試料であれば特に制限されないが、好ましくは赤血球溶解液である。また、赤血球以外の血液成分が混在していても試料として用いることができる。【００１３】
本発明は、前述したように、試料中のＣＡＩの加水分解酵素活性を測定する方法であって、測定に使用する基質、基質と阻害剤、又は基質と阻害剤と増強剤の組合せとして、以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかを用いることを特徴とする測定法である。
（Ａ）基  質：ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質
（Ｂ）基  質：ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質
阻害剤：ＣＡ以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤
（必要により、上記阻害剤の阻害作用を増強する薬剤を併用してもよい）
（Ｃ）基  質：ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質
阻害剤：ＣＡＩとＣＡＩＩの両方を阻害するＣＡの阻害剤
（Ｄ）基  質：ＣＡＩとＣＡＩＩの両方に反応する基質
阻害剤：ＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するＣＡの阻害剤
（Ｅ）基  質：ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質
阻害剤：ＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するＣＡの阻害剤【００１４】
すなわち、本願発明の方法としては、基質、基質と阻害剤、又は基質と阻害剤と増強剤の組合せとして、上記（Ａ）又は（Ｂ）のいずれかを用いて、サンプル中の加水分解酵素活性、具体的にはエステラーゼ活性を測定し、その加水分解酵素活性をＣＡＩの加水分解酵素活性とする方法と、基質と阻害剤の組合せとして、上記（Ｃ）〜（Ｅ）のいずれかを用いて、試料中の加水分解酵素活性、具体的にはエステラーゼ活性を、ＣＡ阻害剤の存在下と非存在下の２つの条件下で測定し、その差をＣＡＩの加水分解酵素活性とする方法の２つの方法を包含するものである。【００１５】
本発明において、「ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質」とは、基質濃度、反応時間等の設定により、ＣＡＩの酵素蛋白量当りの反応量（基質変化量）がＣＡＩＩの反応量よりも２倍以上となる基質を意味する。例えば２−ヒドロキシ−５−ニトロ−α−トルエンスルホン酸スルトン、ｏ−ニトロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェニルチオエステル、β−ナフチルエステル等のエステル類が挙げられ、特にｏ−ニトロフェニルエステルが好ましい。これらのエステルは脂肪酸のエステルが好ましく、さらに炭素数１〜６の脂肪酸エステルが好ましく、具体的にはｏ−ニトロフェニルアセテートが好ましい。【００１６】
「ＣＡＩとＣＡＩＩの両方に反応する基質」とは、基質濃度、反応時間等の設定により、ＣＡＩの酵素蛋白量当りの反応量（基質変化量）がＣＡＩＩの反応量よりも２倍未満である基質を意味する。例えばｐ−ニトロフェニルエステル、α−ナフチルエステル等の上記とは異なるエステル類が挙げられ、特にｐ−ニトロフェニルエステルが好ましい。これらのエステルは脂肪酸のエステルが好ましく、さらに炭素数１〜６の脂肪酸エステルが好ましく、具体的にはｐ−ニトロフェニルアセテートが好ましい。【００１７】
「ＣＡ以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤」とは、基質濃度、阻害剤濃度、反応時間等の設定により、阻害剤を用いない場合より、ＣＡ以外の加水分解酵素の酵素蛋白量当たりの反応量（基質変化量）の、ＣＡの反応量に対する比を小さくできる阻害剤を意味する。例えばプロテアーゼインヒビターカクテル（ｃａｔ．ｎｏ．Ｐ２７１４やＰ８３４０など；シグマ社）、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルフォニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）、α−フェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、ペプスタチン等が挙げられる。【００１８】
「該阻害剤の阻害作用を増強する薬剤」とは、それ単独での阻害作用はないが、上記加水分解酵素阻害剤の阻害作用を増強させる薬剤を意味する。増強剤としては、例えばホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、グルタルアルデヒド等のアルデヒド類が挙げられる。【００１９】
「ＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するＣＡの阻害剤」とは、基質濃度、阻害剤濃度、反応時間等の設定により、ＣＡＩの酵素蛋白量当りの反応変化量への阻害作用がＣＡＩＩの反応量への阻害作用に対して２倍以上となるＣＡ阻害剤を意味する。例えばイミダゾール、アニオン類（ＣＮＳ-，ＣＮＯ-，ＣＮ-，Ｉ-等）等が挙げられる。【００２０】
「ＣＡＩとＣＡＩＩの両方を阻害するＣＡの阻害剤」とは、基質濃度、阻害剤濃度、反応時間等の設定により、阻害剤を用いない場合より、ＣＡＩの酵素蛋白量当りの反応量（基質変化量）への阻害作用が、ＣＡＩＩの反応量への阻害作用に対して２倍未満であるＣＡ阻害剤を意味する。例えばアミド類（例、ドルゾールアミド、ブリンゾールアミド、アセタゾールアミド、メタゾールアミド等）又はカルバモイルホスフェートが挙げられ、特にアセタゾールアミドが好ましい。【００２１】
上記（Ａ）〜（Ｅ）の組み合わせにおいて、基質、阻害剤、増強剤の好ましい組み合わせとしては、以下の通りである。
（Ａ）基  質：ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質として、ｏ−ニトロフェニルエ
ステル類、特にｏ−ニトロフェニルアセテート
（Ｂ）基  質：ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質として、ｏ−ニトロフェニルエ
ステル類、特にｏ−ニトロフェニルアセテート                                        阻害剤：ＣＡ以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤として、プロテアーゼインヒ                ビターカクテル、ＡＥＢＳＦ又はペプスタチン、特にＡＥＢＳＦ
増強剤：阻害剤の作用を増強する薬剤として、アルデヒド類、特にホルムアルデ                ヒド
（Ｃ）基  質：ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質として、ｏ−ニトロフェニルエ
ステル類、特にｏ−ニトロフェニルアセテート
阻害剤：ＣＡＩとＣＡＩＩの両方を阻害するＣＡの阻害剤として、アミド類、特
にアセタゾールアミド
（Ｄ）基  質：ＣＡＩとＣＡＩＩの両方に反応する基質として、ｐ−ニトロフェニルエ
ステル類、特にｐ−ニトロフェニルアセテート
阻害剤：ＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するＣＡの阻害剤として、アニオン類、
特にヨウ素イオン
（Ｅ）基  質：ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質として、ｏ−ニトロフェニルエ
ステル類、特にｏ−ニトロフェニルアセテート
阻害剤：ＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するＣＡの阻害剤として、アニオン類、
特にヨウ素イオン【００２２】
なお、酵素蛋白量当たりの反応量は、酵素の反応速度を測定する常法を採用すればよく、基質濃度、酵素濃度、阻害剤濃度、反応温度、反応ｐＨ及び反応時間等、一定条件の設定により測定できる。
また、上記の例示した基質、阻害剤及び増強剤以外にも、加水分解酵素で分解される基質、ＣＡ以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤、該阻害剤の加水分解酵素活性を阻害する作用を増強する増強剤、あるいはＣＡ以外の加水分解酵素を阻害しないＣＡの阻害剤で、上記した性質を有するものであれば、本発明の基質、阻害剤、増強剤として利用可能である。【００２３】
試料中の加水分解酵素活性の測定は、特に制限されず、使用した基質に適した常法を採用すればよい。具体的には、分光光度計を使用する方法、ジアゾニウム塩とアゾ色素を生成させ、これを定量する方法、ｐＨスタット法等を採用することができる（例えば、金井正光編「臨床検査法提要」（金原出版株式会社、平成８年１２月１０日第３０版発行、第３１２〜３１５頁、日本化学会編、生化学データブックＩＩ、６〜２６９頁参照））。【００２４】
また本発明は、前述した（Ａ）〜（Ｅ）の組合せのいずれかを含有するＣＡＩの加水分解酵素活性測定用のキットを提供することができる。このようなキットには、下記の試薬を含むことができる。また、阻害剤や増強剤をあらかじめ添加した試料希釈液あるいは基質液としてもよい。
（１）試料希釈液
（２）基質液
（３）阻害剤液（必要により添付）【００２５】
なお、上記阻害剤の他に、さらに増強剤を添付してもよい。また、上記各試薬の他に、必要により、ジアゾニウム塩試薬、反応停止用試薬、標準酵素試薬、サンプル前処理用試薬などの各試薬から測定法に応じた試薬を適宜選択し、本発明のキットに添付してもよい。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明について実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何等限定されるものではない。【００２７】
実施例１
＜試薬＞
基質としてＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高いｏ−ニトロフェニルアセテート（ｏ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）を用い、阻害剤は用いなかった。
＜方法＞
（１）精製水を用いて２５μｇ／ｍｌヒトＣＡＩ溶液と５μｇ／ｍｌヒトＣＡＩＩ溶液を用意した。
（２）３０ｍＭジメチルマロン酸緩衝液（ｐＨ８）を用意した。
（３）精製水を用いて、９ｍＭのｏ−ニトロフェニルアセテート溶液を用意した。ただし、基質はアセトンに溶解してから添加し、アセトン含量は２％（ｖ／ｖ）である。
（４）酵素及び基質毎に（１）、（２）及び（３）のそれぞれの溶液を５０μｌずつを混合し、室温で５分間反応させ、４０５ｎｍの吸光度変化（ΔＡ）を測定した。
ただし、（１）の対照溶液として精製水を用い、上記と同様に反応させてそれぞれの吸光度変化を測定し、吸光度変化を下式によって算出し、ＣＡ特異的な吸光度変化とした。【００２８】
ΔＡ１：（１）溶液、（２）溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ３：（１）対照溶液、（２）溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化【００２９】
＜算出式＞
ＣＡ特異的な吸光度変化＝ΔＡ１−ΔＡ３【００３０】
＜結果＞
測定の結果を表１に示す。表１から明らかなように、ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質ｏ−ニトロフェニルアセテート単独でも、ＣＡＩを実質的に測定できることが明らかとなった。【００３１】
【表１】
0004820289.tif 000002
【００３２】
実施例２
＜試料＞
ヒト赤血球溶解液を試料として使用した。
＜試薬＞
基質としてｏ−ニトロフェニルアセテートを用い、阻害剤は用いなかった。
＜方法＞
（１）ヒト赤血球溶解液を精製水で２５０倍に希釈し試料溶液とする。
（２）３０ｍＭジメチルマロン酸緩衝液（ｐＨ８）を用意した。
（３）精製水を用いて、９ｍＭのｏ−ニトロフェニルアセテート溶液を用意した。ただし、基質はアセトンに溶解してから添加し、アセトン含量は２％（ｖ／ｖ）である。
（４）（１）、（２）及び（３）のそれぞれの溶液を５０μｌずつを混合し、室温で５分間反応させ、４０５ｎｍの吸光度変化（ΔＡ）を測定した。
ただし、（１）の対照溶液として精製水を用い、上記と同様に反応させてそれぞれの吸光度変化を測定し、吸光度変化を下式によって算出し、ＣＡＩ特異的な吸光度変化とした。【００３３】
ΔＡ１：（１）溶液、（２）溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ３：（１）対照溶液、（２）溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化【００３４】
＜算出式＞
ＣＡＩ特異的な吸光度変化＝ΔＡ１−ΔＡ３【００３５】
＜結果＞
結果を図１に示す。なお、縦軸のＣＡＩ濃度は、２０μｇ／ｍｌヒトＣＡＩ溶液を試料溶液の代わりに用い、その結果を基にヒト赤血球溶解液中のＣＡＩ量をｍｇに換算し、さらにこれをヘモグロビン（Ｈｂ）量で除し、ｍｇ／ｇＨｂとして示した。また、横軸の亜鉛濃度は、ＣＡＩが赤血球中の亜鉛の８割以上と結合している亜鉛酵素であることから、原子吸光法により求めた試料中の亜鉛濃度（ｍｇ／ｌ）を示した。【００３６】
この結果から明らかなように、ｙ切片に相当するＣＡ以外の加水分解酵素による活性がかなり混在しているが、ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質を使えば、阻害剤を用いなくともＣＡＩ濃度と亜鉛濃度は良好な相関関係を示し（相関係数：０．９３８０、ｙ切片：６．２５２４）、本発明方法が臨床検体などのＣＡ以外の加水分解酵素類が多量に存在し、その酵素による添加した基質の分解が無視できない条件下でも適用可能な実用的なＣＡＩの特異的な測定法であることが確認された。【００３７】
実施例３
＜試薬＞
基質としてＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高いｏ−ニトロフェニルアセテート（ｏ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）を用い、ＣＡ以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤として４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルフォニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）、及びその増強剤としてホルムアルデヒドを用いた。
＜方法＞
（１）精製水を用いて２５μｇ／ｍｌヒトＣＡＩ溶液と５μｇ／ｍｌヒトＣＡＩＩ溶液を用意した。
（２）３０ｍＭジメチルマロン酸緩衝液（ｐＨ８）、０．１ｍＭＡＥＢＳＦ、５０ｍＭホルムアルデヒドを用意した。
（３）精製水を用いて、９ｍＭのｏ−ニトロフェニルアセテート溶液を用意した。ただし、基質はアセトンに溶解してから添加し、アセトン含量は２％（ｖ／ｖ）である。
（４）酵素及び基質毎に（１）、（２）及び（３）のそれぞれの溶液を５０μｌずつを混合し、室温で５分間反応させ、４０５ｎｍの吸光度変化（ΔＡ）を測定した。
ただし、（１）の対照溶液として精製水を用い、上記と同様に反応させてそれぞれの吸光度変化を測定し、吸光度変化を下式によって算出し、ＣＡ特異的な吸光度変化とした。【００３８】
ΔＡ１：（１）溶液、（２）対照溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ３：（１）対照溶液、（２）対照溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化【００３９】
＜算出式＞
ＣＡ特異的な吸光度変化＝ΔＡ１−ΔＡ３【００４０】
＜結果＞
測定の結果を表２に示す。表２から明らかなように、ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質ｏ−ニトロフェニルアセテートとＣＡ以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤およびその増強剤を用いれば、ＣＡＩをより特異的に測定できることが明らかとなった。【００４１】
【表２】
0004820289.tif 000003
【００４２】
実施例４
＜試料＞
ヒト赤血球溶解液を試料として使用した。
＜試薬＞
基質としてＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高いｏ−ニトロフェニルアセテート（ｏ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）を用い、ＣＡ以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤として４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルフォニルフルオライド（ＡＥＢＳＦ）、及びその増強剤としてホルムアルデヒドを用いた。
＜方法＞
（１）ヒト赤血球溶解液を精製水で２５０倍に希釈し試料溶液とする。
（２）３０ｍＭジメチルマロン酸緩衝液（ｐＨ８）、０．１ｍＭＡＥＢＳＦ、５０ｍＭホルムアルデヒドを用意した。
（３）精製水を用いて、９ｍＭのｏ−ニトロフェニルアセテート溶液を用意した。ただし、基質はアセトンに溶解してから添加し、アセトン含量は２％（ｖ／ｖ）である。
（４）（１）、（２）及び（３）のそれぞれの溶液を５０μｌずつを混合し、室温で５分間反応させ、４０５ｎｍの吸光度変化（ΔＡ）を測定した。
ただし、（１）の対照溶液として精製水を用い、上記と同様に反応させてそれぞれの吸光度変化を測定し、吸光度変化を下式によって算出し、ＣＡＩ特異的な吸光度変化とした。【００４３】
ΔＡ１：（１）溶液、（２）溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ３：（１）対照溶液、（２）溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化【００４４】
＜算出式＞
ＣＡＩ特異的な吸光度変化＝ΔＡ１−ΔＡ３【００４５】
＜結果＞
結果を図２に示す。なお、縦軸のＣＡＩ濃度は、２０μｇ／ｍｌヒトＣＡＩ溶液を試料溶液の代わりに用い、その結果を基にヒト赤血球溶解液中のＣＡＩ量をｍｇに換算し、さらにこれをヘモグロビン（Ｈｂ）量で除し、ｍｇ／ｇＨｂとして示した。また、横軸の亜鉛濃度は、ＣＡＩが赤血球中の亜鉛の８割以上と結合している亜鉛酵素であることから、原子吸光法により求めた試料中の亜鉛濃度（ｍｇ／ｌ）を示した。【００４６】
この結果から明らかなように、ＣＡ以外の加水分解酵素を阻害する阻害剤およびその増強剤を使えばその混在する加水分解酵素活性を抑制することができ、ＣＡＩ濃度と亜鉛濃度は良好な相関関係とｙ切片を示し（相関係数：０．９５７７、ｙ切片：２．０８９８）、本発明方法が臨床検体などのＣＡ以外の加水分解酵素類が多量に存在し、その酵素による添加した基質の分解が無視できない条件下でも適用可能な実用的なＣＡＩの特異的な測定法であることが確認された。【００４７】
実施例５
＜試薬＞
基質としてＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高いｏ−ニトロフェニルアセテート（ｏ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）を用い、阻害剤としてＣＡＩとＣＡＩＩの両方を阻害するアセタゾールアミド（ａｃｅｔａｚｏｌａｍｉｄｅ）を組み合わせて用いた。また、比較として、基質としてＣＡＩに特異性の低い（ＣＡＩとＣＡＩＩの両方に反応する）ｐ−ニトロフェニルアセテート（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）を用い、ＣＡの阻害剤として上記と同様にアセタゾールアミド（ａｃｅｔａｚｏｌａｍｉｄｅ）を組み合わせて用いた。
＜方法＞
（１）精製水を用いて２５μｇ／ｍｌヒトＣＡＩ溶液と５μｇ／ｍｌヒトＣＡＩＩ溶液を用意した。
（２）３０ｍＭジメチルマロン酸緩衝液（ｐＨ８）を用いて、３ｍＭアセタゾールアミド溶液を用意した。ただし、アセタゾールアミドはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解してから添加し、ＤＭＳＯ含量は０．１５％（ｖ／ｖ）である。
（３）精製水を用いて、６ｍＭのｏ−ニトロフェニルアセテート溶液と３ｍＭのｐ−ニトロフェニルアセテート溶液を用意した。ただし、それぞれの基質はアセトンに溶解してから添加し、アセトン含量は２％（ｖ／ｖ）である。
（４）酵素及び基質毎に（１）、（２）及び（３）のそれぞれの溶液を５０μｌずつを混合し、室温で５分間反応させ、４０５ｎｍの吸光度変化（ΔＡ）を測定した。
ただし、（１）の対照溶液として精製水を、（２）の対照溶液として０．１５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ含有３０ｍＭジメチルマロン酸緩衝液を用い、上記と同様に反応させてそれぞれの吸光度変化を測定し、アセタゾールアミドによって阻害される酵素の特異的な吸光度変化を下式によって算出し、ＣＡ特異的な吸光度変化とした。【００４８】
ΔＡ１：（１）溶液、（２）対照溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ２：（１）溶液、（２）溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ３：（１）対照溶液、（２）対照溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ４：（１）対照溶液、（２）溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化【００４９】
＜算出式＞
ＣＡ特異的な吸光度変化＝［ΔＡ１−ΔＡ３］−［ΔＡ２−ΔＡ４］【００５０】
＜結果＞
測定の結果を表３に示す。表３から明らかなように、ｐ−ニトロフェニルアセテートとアセタゾールアミドの組み合わせでは、ｐ−ニトロフェニルアセテートの基質としての反応性がＣＡＩとＣＡＩＩで２倍以下の差しかなく、ｐ−ニトロフェニルアセテートの反応性がＣＡＩに特異的ではなくＣＡＩとＣＡＩＩ両方に反応してしまうため、ＣＡＩを特異的に測定できないのに対し、ｏ−ニトロフェニルアセテートとアセタゾールアミドの組み合わせでは、ｏ−ニトロフェニルアセテートの基質としての反応性がＣＡＩとＣＡＩＩで２倍以上の差があるため、ＣＡＩを特異的に測定できることが明らかとなった。【００５１】
【表３】
0004820289.tif 000004
【００５２】
実施例６
＜試料＞
ヒト赤血球溶解液を試料として使用した。
＜試薬＞
基質としてｏ−ニトロフェニルアセテートを用い、阻害剤としてアセタゾールアミドを組み合わせて用いた。
＜方法＞
（１）ヒト赤血球溶解液を精製水で２５０倍に希釈し試料溶液とする。
（２）３０ｍＭジメチルマロン酸緩衝液（ｐＨ８）を用いて、３ｍＭアセタゾールアミド溶液を用意した。ただし、アセタゾールアミドはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解してから添加し、ＤＭＳＯ含量は０．１５％（ｖ／ｖ）である。
（３）精製水を用いて、９ｍＭのｏ−ニトロフェニルアセテート溶液を用意した。ただし、基質はアセトンに溶解してから添加し、アセトン含量は２％（ｖ／ｖ）である。
（４）（１）、（２）及び（３）のそれぞれの溶液を５０μｌずつを混合し、室温で５分間反応させ、４０５ｎｍの吸光度変化（ΔＡ）を測定した。
ただし、（１）の対照溶液として精製水を、（２）の対照溶液として０．１５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ含有３０ｍＭジメチルマロン酸緩衝液を用い、上記と同様に反応させてそれぞれの吸光度変化を測定し、アセタゾールアミドによって阻害される酵素の特異的な吸光度変化を下式によって算出し、ＣＡＩ特異的な吸光度変化とした。【００５３】
ΔＡ１：（１）溶液、（２）対照溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ２：（１）溶液、（２）溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ３：（１）対照溶液、（２）対照溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ４：（１）対照溶液、（２）溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化【００５４】
＜算出式＞
ＣＡ特異的な吸光度変化＝［ΔＡ１−ΔＡ３］−［ΔＡ２−ΔＡ４］【００５５】
＜結果＞
結果を図３に示す。なお、縦軸のＣＡＩ濃度は、２０μｇ／ｍｌヒトＣＡＩ溶液を試料溶液の代わりに用い、その結果を基にヒト赤血球溶解液中のＣＡＩ量をｍｇに換算し、さらにこれをヘモグロビン（Ｈｂ）量で除し、ｍｇ／ｇＨｂとして示した。また、ＣＡＩが赤血球中の亜鉛の８割以上と結合している亜鉛酵素であることから、横軸には原子吸光法により求めた試料中の亜鉛濃度（ｍｇ／ｌ）を示した。【００５６】
この結果から明らかなように、ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質とＣＡＩとＣＡＩＩの両方を阻害するＣＡの阻害剤を使えば、実施例４と同様にＣＡ特異的な測定が可能であり、ＣＡＩ濃度と亜鉛濃度は良好な相関関係とｙ切片を示し（相関係数：０．９６４２、ｙ切片：１．６２８２）、本発明方法が臨床検体などのＣＡ以外の加水分解酵素類が多量に存在し、それらの酵素による添加した基質の分解が無視できない条件下でも適用可能な実用的なＣＡＩの特異的な測定法であることが確認された。【００５７】
実施例７
＜試薬＞
基質としてＣＡＩとＣＡＩＩの両方に反応するｐ−ニトロフェニルアセテート（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）を用い、ＣＡの阻害剤としてＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するヨウ素イオン（Ｉ-）を組み合わせて用いた。
＜方法＞
（１）精製水を用いて２５μｇ／ｍｌヒトＣＡＩ溶液と５μｇ／ｍｌヒトＣＡＩＩ溶液を用意した。
（２）３０ｍＭジメチルマロン酸緩衝液（ｐＨ８）を用いて、３ｍＭヨウ化カリウム溶液を用意した。
（３）精製水を用いて、３ｍＭのｐ−ニトロフェニルアセテート溶液を用意した。ただし、基質はアセトンに溶解してから添加し、アセトン含量は２％（ｖ／ｖ）である。
（４）酵素及び基質毎に（１）、（２）及び（３）のそれぞれの溶液を５０μｌずつを混合し、室温で５分間反応させ、４０５ｎｍの吸光度変化（ΔＡ）を測定した。
ただし、（１）の対照溶液として精製水を、（２）の対照溶液として３０ｍＭジメチルマロン酸緩衝液を用い、上記と同様に反応させてそれぞれの吸光度変化を測定し、ヨウ素イオンによって阻害される酵素の特異的な吸光度変化を下式によって算出し、ＣＡ特異的な吸光度変化とした。【００５８】
ΔＡ１：（１）溶液、（２）対照溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ２：（１）溶液、（２）溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ３：（１）対照溶液、（２）対照溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ４：（１）対照溶液、（２）溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化【００５９】
＜算出式＞
ＣＡ特異的な吸光度変化＝［ΔＡ１−ΔＡ３］−［ΔＡ２−ΔＡ４］【００６０】
＜結果＞
測定の結果を表４に示す。表４から明らかなように、ＣＡＩとＣＡＩＩの両方に反応する基質ｐ−ニトロフェニルアセテートでも、ＣＡの阻害剤としてＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するヨウ素イオンと組み合わせれば、ＣＡＩを特異的に測定できることが明らかとなった。【００６１】
【表４】
0004820289.tif 000005
【００６２】
実施例８
＜試料＞
ヒト赤血球溶解液を試料として使用した。
＜試薬＞
基質としてｐ−ニトロフェニルアセテートを用い、ＣＡの阻害剤としてヨウ素イオンを組み合わせて用いた。
＜方法＞
（１）ヒト赤血球溶解液を精製水で２５０倍に希釈し試料溶液とする。
（２）３０ｍＭジメチルマロン酸緩衝液（ｐＨ８）を用いて、３ｍＭヨウ化カリウム溶液を用意した。
（３）精製水を用いて、３ｍＭのｐ−ニトロフェニルアセテート溶液を用意した。ただし、基質はアセトンに溶解してから添加し、アセトン含量は２％（ｖ／ｖ）である。
（４）（１）、（２）及び（３）のそれぞれの溶液を５０μｌずつを混合し、室温で５分間反応させ、４０５ｎｍの吸光度変化（ΔＡ）を測定した。
ただし、（１）の対照溶液として精製水を、（２）の対照溶液として３０ｍＭジメチルマロン酸緩衝液を用い、上記と同様に反応させてそれぞれの吸光度変化を測定し、ヨウ素イオンによって阻害される酵素の特異的な吸光度変化を下式によって算出し、ＣＡＩ特異的な吸光度変化とした。【００６３】
ΔＡ１：（１）溶液、（２）対照溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ２：（１）溶液、（２）溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ３：（１）対照溶液、（２）対照溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ４：（１）対照溶液、（２）溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化【００６４】
＜算出式＞
ＣＡＩ特異的な吸光度変化＝［ΔＡ１−ΔＡ３］−［ΔＡ２−ΔＡ４］【００６５】
＜結果＞
結果を図４に示す。なお、縦軸のＣＡＩ濃度は、２０μｇ／ｍｌヒトＣＡＩ溶液を試料溶液の代わりに用い、その結果を基にヒト赤血球溶解液中のＣＡＩ量をｍｇに換算し、さらにこれをヘモグロビン（Ｈｂ）量で除し、ｍｇ／ｇＨｂとして示した。また、横軸の亜鉛濃度は、ＣＡＩが赤血球中の亜鉛の８割以上と結合している亜鉛酵素であることから、原子吸光法により求めた試料中の亜鉛濃度（ｍｇ／ｌ）を示した。【００６６】
この結果から明らかなように、ＣＡＩとＣＡＩＩの両方に反応する基質を使っても、ＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するＣＡの阻害剤を使えば、実施例６と同等の測定が可能となって、ＣＡＩ濃度と亜鉛濃度は良好な相関関係とｙ切片を示し（相関係数：０．９５８８、ｙ切片：−０．１６１５）、本発明方法が臨床検体などのＣＡ以外の加水分解酵素が多量に存在し、その酵素による添加した基質の分解が無視できない条件下でも適用可能な実用的なＣＡＩの特異的な測定法であることが確認された。【００６７】
実施例９
＜試薬＞
基質としてＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高いｏ−ニトロフェニルアセテート（ｏ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）を用い、ＣＡの阻害剤としてＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するヨウ素イオン（Ｉ-）を組み合わせて用いた。
＜方法＞
（１）精製水を用いて２５μｇ／ｍｌヒトＣＡＩ溶液と５μｇ／ｍｌヒトＣＡＩＩ溶液を用意した。
（２）３０ｍＭジメチルマロン酸緩衝液（ｐＨ８）を用いて、３００ｍＭヨウ化カリウム溶液を用意した。
（３）精製水を用いて、９ｍＭのｏ−ニトロフェニルアセテート溶液を用意した。ただし、基質はアセトンに溶解してから添加し、アセトン含量は２％（ｖ／ｖ）である。
（４）酵素及び基質毎に（１）、（２）及び（３）のそれぞれの溶液を５０μｌずつを混合し、室温で５分間反応させ、４０５ｎｍの吸光度変化（ΔＡ）を測定した。
ただし、（１）の対照溶液として精製水を、（２）の対照溶液として３０ｍＭジメチルマロン酸緩衝液を用い、上記と同様に反応させてそれぞれの吸光度変化を測定し、ヨウ素イオンによって阻害される酵素の特異的な吸光度変化を下式によって算出し、ＣＡ特異的な吸光度変化とした。【００６８】
ΔＡ１：（１）溶液、（２）対照溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ２：（１）溶液、（２）溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ３：（１）対照溶液、（２）対照溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ４：（１）対照溶液、（２）溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化【００６９】
＜算出式＞
ＣＡ特異的な吸光度変化＝［ΔＡ１−ΔＡ３］−［ΔＡ２−ΔＡ４］【００７０】
＜結果＞
測定の結果を表５に示す。表５から明らかなように、ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質ｏ−ニトロフェニルアセテートと、ＣＡの阻害剤としてＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するヨウ素イオンと組み合わせても、当然ＣＡＩを特異的に測定できることが明らかとなった。【００７１】
【表５】
0004820289.tif 000006
【００７２】
実施例１０
＜試料＞
ヒト赤血球溶解液を試料として使用した。
＜試薬＞
基質としてｏ−ニトロフェニルアセテートを用い、ＣＡの阻害剤としてヨウ素イオンを組み合わせて用いた。
＜方法＞
（１）ヒト赤血球溶解液を精製水で２５０倍に希釈し試料溶液とする。
（２）３０ｍＭジメチルマロン酸緩衝液（ｐＨ８）を用いて、３００ｍＭヨウ化カリウム溶液を用意した。
（３）精製水を用いて、９ｍＭのｏ−ニトロフェニルアセテート溶液を用意した。ただし、基質はアセトンに溶解してから添加し、アセトン含量は２％（ｖ／ｖ）である。
（４）（１）、（２）及び（３）のそれぞれの溶液を５０μｌずつを混合し、室温で５分間反応させ、４０５ｎｍの吸光度変化（ΔＡ）を測定した。
ただし、（１）の対照溶液として精製水を、（２）の対照溶液として３０ｍＭジメチルマロン酸緩衝液を用い、上記と同様に反応させてそれぞれの吸光度変化を測定し、ヨウ素イオンによって阻害される酵素の特異的な吸光度変化を下式によって算出し、ＣＡＩ特異的な吸光度変化とした。【００７３】
ΔＡ１：（１）溶液、（２）対照溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ２：（１）溶液、（２）溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ３：（１）対照溶液、（２）対照溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化
ΔＡ４：（１）対照溶液、（２）溶液及び（３）溶液使用時の吸光度変化【００７４】
＜算出式＞
ＣＡＩ特異的な吸光度変化＝［ΔＡ１−ΔＡ３］−［ΔＡ２−ΔＡ４］【００７５】
＜結果＞
結果を図５に示す。なお、縦軸のＣＡＩ濃度は、２０μｇ／ｍｌヒトＣＡＩ溶液を試料溶液の代わりに用い、その結果を基にヒト赤血球溶解液中のＣＡＩ量をｍｇに換算し、さらにこれをヘモグロビン（Ｈｂ）量で除し、ｍｇ／ｇＨｂとして示した。また、横軸の亜鉛濃度は、ＣＡＩが赤血球中の亜鉛の８割以上と結合している亜鉛酵素であることから、原子吸光法により求めた試料中の亜鉛濃度（ｍｇ／ｌ）を示した。
この結果から明らかなように、ＣＡＩＩよりＣＡＩに反応性の高い基質とＣＡＩＩよりＣＡＩを強く阻害するＣＡの阻害剤を使えば、当然ＣＡＩ濃度と亜鉛濃度は良好な相関関係とｙ切片を示し（相関係数：０．９６１８、ｙ切片：１．１６６１）、本発明方法が臨床検体などのＣＡ以外の加水分解酵素類が多量に存在し、それらの酵素による添加した基質の分解が無視できない条件下でも適用可能な実用的なＣＡＩの特異的な測定法であることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、実施例２における測定結果を示したもので、横軸に比較対照の原子吸光法による亜鉛濃度、縦軸に本法によるＣＡＩ濃度をとり、８検体の測定結果をプロットしたものである。
【図２】図２は、実施例４における測定結果を示したもので、横軸に比較対照の原子吸光法による亜鉛濃度、縦軸に本法によるＣＡＩ濃度をとり、８検体の測定結果をプロットしたものである。
【図３】図３は、実施例６における測定結果を示したもので、横軸に比較対照の原子吸光法による亜鉛濃度、縦軸に本法によるＣＡＩ濃度をとり、８検体の測定結果をプロットしたものである。
【図４】図４は、実施例８における測定結果を示したもので、横軸に比較対照の原子吸光法による亜鉛濃度、縦軸に本法によるＣＡＩ濃度をとり、８検体の測定結果をプロットしたものである。
【図５】図５は、実施例１０における測定結果を示したもので、横軸に比較対照の原子吸光法による亜鉛濃度、縦軸に本法によるＣＡＩ濃度をとり、８検体の測定結果をプロットしたものである。
【図１】
0004820289.tif 000007
【図２】
0004820289.tif 000008
【図３】
0004820289.tif 000009
【図４】
0004820289.tif 000010
【図５】
0004820289.tif 000011