(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効性分に含む腹痛抑制剤であって、ここで、Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制剤は、ミベフラジルである腹痛抑制剤。
【請求項２】
Ｔ−タイプカルシウムチャンネル抑制活性を調査して腹痛抑制剤をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ-タイプカルシウムチャンネルを調節して腹痛を抑制する方法、Ｔ-タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分に含む腹痛抑制剤及びＴ-タイプカルシウムチャンネル抑制活性を調査して腹痛抑制剤をスクリーニングする方法に関するものである。
【０００２】
より詳細には、中枢神経系でアルファ1G Ｔ-タイプカルシウムチャンネルの機能を活性化させて腹痛を抑制し、末梢神経系でアルファ1H 及びアルファ1I Ｔ-タイプカルシウムチャンネルの機能を抑制して腹痛を抑制する方法、Ｔ-タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分に含む腹痛抑制剤及びT-タイプカルシウムチャンネル抑制活性を調査して腹痛抑制剤をスクリーニングする方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
腹痛は、内臓器官の過度な膨脹やこれらの組織の壊死または内臓筋肉細胞の強い収縮または急性弛緩によって起きる。原因としては、内臓器官の腫瘍生成や感染、充血がある時に軽い機械的な刺激や酸または塩基溶液によってとても強い痛みが誘発される。特に、腫瘍による腹痛は、過度の量のモルヒネによっても抑制されないため脊髄の部分切開のような神経外科的な施術がよく利用されている(非特許文献１)。しかし、脊髄視床路(spinothalamic tract)の両側切開(bilateral cordotomies)や交連脊髄切開(commissural myelotomy)は、多くの副作用を生む。相対的にT10 脊髄部位の上段中央を切除する正中脊髄切開術(midline myelotomy)が効果的な処方として知られている(非特許文献２)。
【０００４】
上記結果は、腹痛信号が脊髄背中側を沿って頭脳に伝達されるという証拠になり、これは腹痛が他の種類の痛症とは差別化された通路にしたがって移動するという事実を裏づけしている。腹痛が誘発された猿におけるMRI実験結果、腹痛は視床細胞の活性を誘発する(非特許文献３)。
【０００５】
結局、腹痛は内臓末端の痛覚細胞から脊髄背中側を通って視床(thalamus)に伝達されるという事実を表している。特に、視床は受け入れた刺激を大脳皮質に伝達する役割をするための重要な感覚信号編集(sensory processing)器官として知られている(非特許文献４)。
【０００６】
神経細胞内カルシウムは、神経細胞間の信号伝達に重要な役割をする。カルシウムは色々な流通経路が存在するが末端刺激の伝達時には、電圧-依存性カルシウムチャンネルが重要な役割をする。電圧依存性カルシウムチャンネルは、相対的に静止膜電位(resting membrane potential)より高い電圧で活性化される高電圧依存性カルシウムチャンネル(high voltage-activated calcium channels; 以下「HVA」と略称する)と、より低い電圧で活性化される低電圧-依存性カルシウムチャンネル(low voltage-activated calcium channels; 以下「LVA」と略称する)に分けられる。HVAカルシウムチャンネルは誘発する電流の薬理学的な性質によってさらに L、P/Q、N、及びR-タイプに細分化され、LVAカルシウムチャンネルは、上記とは別にT-タイプに区分される(非特許文献５)。
【０００７】
HVA カルシウムチャンネルは、感覚末端細胞から中枢神経系に至るまで一様に発現され痛覚伝達及び反射作用に重要な役割をするものであるとよく知られていて、これらチャンネルに対する抑制剤は色々な痛症の鎮痛剤にすでに商用化されている実情である(非特許文献６)。しかし、T-タイプカルシウム電流を生成するLVAカルシウムチャンネルの痛症調節機能は、まだ正確に明かされていない。
【０００８】
T-タイプカルシウム電流を LVAカルシウムチャンネルの機能に分類する理由は、これらのカルシウム電流は神経細胞の興奮性が下がる時に生成され、再び興奮性(excitability)を高める役割をするためである(非特許文献７および８)。
【０００９】
このようにＴ-タイプカルシウムチャンネルによって興奮した神経細胞は多発性発火(burst firings)をするようになり、Ｔ-タイプカルシウムチャンネルが関与する緊張性発火(tonic firings)とは異なった形態の興奮性を誘導する(非特許文献７)。Ｔ-タイプカルシウムチャンネルの通路蛋白質は、三つの遺伝子が暗号化しているが、各々アルファ1G、アルファ1H及びアルファ1Iと命名される(非特許文献９)。これらの中でアルファ1G 及びアルファ1H T-タイプカルシウムチャンネルが脊髄背中側部位で発現され、アルファ1Gが視床の感覚伝達細胞(thalamocortical relay neurons)で発現されるという事実(非特許文献１０)が知られており、これは腹痛感覚移動通路と一致する。
【００１０】
最近、末梢神経部位でT-タイプカルシウム電流の機能が還元剤による機械的または熱刺激による痛覚過敏(hyperalgesia)反応と関連があるという事実がT-タイプカルシウム電流抑制剤のミベフラジル(mibefradil)を利用した実験から究明されたが(非特許文献１１)、どんなＴ-タイプカルシウムチャンネルが関与するのかは知らされなかった。ミベフラジル(RO40-5967)は初期血圧降下効能(非特許文献１２および１３)で知られた薬剤であり、以後、Ｔ-タイプカルシウムチャンネルをはじめとするいくつかのカルシウムチャンネル抑制効果が報告されたことがあるが(非特許文献１４)、最近ではＴ-タイプカルシウムチャンネルに最も選択的な抑制効果を示していると報告されている。
【００１１】
それで、本発明者達は、アルファ1G-/-遺伝子変異二十日鼠を利用して腹痛に関する研究を行っていた際に、アルファ1G-/-二十日鼠が酢酸による腹痛に過敏痛覚反応を示し、正常二十日鼠ではミベフラジルを処理した時、酢酸による腹痛に対し鎮痛現象を誘発することを発見してＴ-タイプカルシウムチャンネルを調節すれば腹痛を抑制できることを明らかにして本発明を完成した。
【００１２】
【非特許文献１】Gybels、「Pain Headache」、1989年、第11巻、p.1-402
【非特許文献２】Nauta、「J. Neurosurg.」、1997年、第86巻、p.538-542
【非特許文献３】Willis、「Proc. Natl. Acad. Sci. USA.」、1999年、第96巻、p.7675-79
【非特許文献４】McCormick、「Curr. Opin. Neurobiol.」、1994年、第4巻、p.550-556
【非特許文献５】Tsien、「Trends Neurosci.」、1988年、第11巻、p.431-438
【非特許文献６】Schaible、「Prog. Brain Res.」、2000年、第129巻、p.173-190
【非特許文献７】Llinas、「J. Physiol(Lond)」、1981年、第315巻、p.549-567
【非特許文献８】McCormick、「Neuroscience」、1990年、第39巻、p.103-113
【非特許文献９】Perez-Reyes、「Nature」、1998年、第391巻、p.896-900
【非特許文献１０】Talley、「J. Neurosci.」、1999年、第19巻、p.1895-1911
【非特許文献１１】Todorovic、「Neuron」、2001年、第31巻、p.75-85
【非特許文献１２】Clozel、「Cardiovasc Drugs Ther.」、1990年、第4巻、p.731-736
【非特許文献１３】Hefti、「Arzneimittelforschung」、1990年、第40巻、p.417-421
【非特許文献１４】Viana、「Cell Calcium」、1997年、第22巻、p.299-311
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、Ｔ-タイプカルシウムチャンネルを調節して腹痛を抑制する方法、Ｔ-タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分に含む腹痛抑制剤及びＴ-タイプカルシウムチャンネル抑制活性を調査して腹痛抑制剤をスクリーニングする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記目的を達成する為に、本発明はＴ-タイプカルシウムチャンネルを調節して腹痛を抑制する方法を提供する。
【００１５】
また、本発明はＴ-タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分に含む腹痛抑制剤を提供する。
【００１６】
また、本発明はＴ-タイプカルシウムチャンネル抑制活性を調査して腹痛抑制剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明はＴ-タイプカルシウムチャンネルを調節して腹痛を抑制する方法を提供する。
【００１８】
本発明は中枢神経系でアルファ1G Ｔ-タイプカルシウムチャンネルの機能を活性化させ腹痛を抑制し、末梢神経系でアルファ1H 及びアルファ1I Ｔ-タイプカルシウムチャンネルの機能を抑制して腹痛を抑制する方法を提供する。
【００１９】
Ｔ-タイプカルシウムチャンネルは小孔形成構成単位によってアルファ1G、アルファ1H 及びアルファ1Iに区分される。本発明では、アルファ1G Ｔ-タイプカルシウムチャンネルの構成成分のアルファ1G蛋白質の機能を抑制させたアルファ1G-/-遺伝子変異二十日鼠を利用して痛症に関連した実験を行なった。
【００２０】
機械的刺激は、急性痛症(acute pains)反応による脊髄反射によって調節され末端部位から入ってくる痛覚の強さにその反応性が比例すると知られている。アルファ1G-/-二十日鼠は、足引っ込めと尾振りテスト等の機械的刺激に対しては正常二十日鼠と反応の差を示さなかった(図 1 参照)。
【００２１】
また、脊髄反射及び棘上脊髄(supraspinal)メカニズムが関与する輻射熱分析を利用して(Hargreaves, Pain, 1988, 32:77-88)温度痛症反応を分析してみると、アルファ1G-/-二十日鼠は赤外線照査による熱刺激あるいは炎症反応による熱刺激痛覚過敏に対しても正常二十日鼠と反応の差を見せなかった(図 2 参照)。
【００２２】
上記のように、アルファ1G-/-二十日鼠が熱または機械的刺激に対して正常的に反応することから、アルファ1G Ｔ-タイプカルシウムチャンネルの欠損が末端感覚器官、脊髄反射及び炎症反応に関与する神経等の発達自体には影響を与えないことが分かる。
【００２３】
本発明では、酢酸によって誘導される内臓痛症反応を観察してみると、アルファ1G-/-二十日鼠は酢酸によって誘導される腹痛に深刻な痛覚過敏反応を示す(図 3 参照)。
【００２４】
上記事実は、アルファ1G Ｔ-タイプカルシウムチャンネルが腹痛感覚の調節に選択的に関与していることを示している。それで、本発明では腹痛調節に関連したアルファ1G T-タイプカルシウムチャンネルの機能が末梢神経部位で起きるのかそうでなければ脊髄から視床及び頭脳に連結される部位で起きるのかを調べるために、正常二十日鼠に T-タイプ抑制剤のミベフラジルを腹痛誘発剤の酢酸の投与部位と同じく腹腔に注射すると、酢酸によって誘発される腹痛に対して鎮痛現象(analgesia)が起きる(図 4 参照)。ここで、ミベフラジルは体内で脳関門(brain barrier)を通過できないため末梢神経系でだけＴ-タイプカルシウムチャンネルを抑制する。
【００２５】
上記結果から、アルファ1G Ｔ-タイプカルシウムチャンネルの腹痛抑制効果は、末梢神経部位ではなく中枢神経系でだけ作用することが分かり、また末梢神経部位ではまた異る種類のＴ-タイプカルシウムチャンネルのアルファ1H またはアルファ1I Ｔ-タイプカルシウムチャンネルが腹痛を増加させる役割をしていることが分かる。
【００２６】
上記のようにＴ-タイプカルシウムチャンネルは腹痛調節に関連して末梢神経及び脊髄棘上水準でお互いに反対する機能を行なっていて、Ｔ-タイプカルシウムチャンネルは静止膜電位が下がった時に活性化され結局膜電位が下がることを抑制する役割を果たすことによって末端の腹痛体感覚細胞の活性を増加させる役割を果たす。これは、還元剤によって誘導された機械的及び熱刺激に対する過敏痛覚反応にＴ-タイプカルシウムチャンネルが作用するという事実がこれを裏付けしている。
【００２７】
腹痛の場合、腸細胞の拡大または壊死による多量の細胞内還元的基質の流出が随伴されるため正常的な痛症反応にすでに過敏痛覚反応を基本的に含んでいる可能性が高い。
【００２８】
また、本発明はＴ-タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分に含む腹痛抑制剤を提供する。
【００２９】
Ｔ-タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分に含む腹痛抑制剤を体内に投与すると、末梢神経系でアルファ1H 及びアルファ1I Ｔ-タイプカルシウムチャンネルに作用して上記アルファ1H 及びアルファ1I Ｔ-タイプカルシウムチャンネルの機能を抑制して腹痛を抑制するようになる。
【００３０】
本発明でＴ-タイプカルシウムチャンネル抑制剤は、ミベフラジル(mibefradil)及びニッケルイオン(Ni2+)で構成された群から選択したものを使用する。
【００３１】
また、本発明はＴ-タイプカルシウムチャンネル抑制活性を調査して腹痛抑制剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００３２】
本発明では、化学物質または天然物質のＴ-タイプカルシウムチャンネル抑制活性を調査してＴ-タイプカルシウムチャンネル抑制活性を持った物質を選別して、上記で選別した物質を正常二十日鼠及びアルファ1G-/-二十日鼠を利用して痛症に関連した実験を行ない、酢酸等によって誘導される腹痛にだけ特異的に鎮痛効果を持った物質を探し出す。
【００３３】
本発明によると、Ｔ-タイプカルシウムチャンネル抑制剤は副作用無しに正確なメカニズムで腹痛に対する抑制効果を示すため、このようなT-タイプカルシウム抑制剤をスクリーニングして選別された物質を腹痛抑制剤に使用できることは自明な事であると言える。
【００３４】
本発明に係る方法においては、（１）Ｔ-タイプカルシウムチャンネルを調節して腹痛を抑制する方法であることを特徴とする。
【００３５】
また、本発明に係る方法においては、（２）上記Ｔ-タイプカルシウムチャンネルは、アルファ1G、アルファ1H 及びアルファ1I Ｔ-タイプカルシウムチャンネルで構成された群から選択されることを特徴とする上記(1)に記載の腹痛を抑制する方法であることを特徴とする。
【００３６】
また、本発明に係る方法においては、（３）中枢神経系でアルファ1G Ｔ-タイプカルシウムチャンネルの機能を活性化させ腹痛を抑制する上記(1)に記載の方法であることを特徴とする。
【００３７】
また、本発明に係る方法においては、（４）末梢神経系でアルファ1H 及びアルファ1I Ｔ-タイプカルシウムチャンネルの機能を抑制して腹痛を抑制する上記(1)に記載の方法であることを特徴とする。
【００３８】
また、本発明に係る腹痛抑制剤においては、（５）Ｔ-タイプカルシウムチャンネル抑制剤を有効成分に含む腹痛抑制剤であることを特徴とする。
【００３９】
また、本発明に係る腹痛抑制剤においては、（６）上記Ｔ-タイプカルシウムチャンネルは、アルファ1Hまたはアルファ1I Ｔ-タイプカルシウムチャンネルであることを特徴とする上記(5)に記載の腹痛抑制剤であることを特徴とする。
【００４０】
また、本発明に係る腹痛抑制剤においては、（７）上記Ｔ-タイプカルシウムチャンネル抑制剤は、ミベフラジル及びニッケルイオンで構成された群から選択されることを特徴とする上記(5)に記載の腹痛抑制剤であることを特徴とする。
【００４１】
また、本発明に係る方法においては、（８）Ｔ-タイプカルシウムチャンネル抑制活性を調査して腹痛抑制剤をスクリーニングする方法であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００４２】
上記で詳しく見たように、本発明のＴ-タイプカルシウムチャンネルを調節して腹痛を抑制し、正確なメカニズムによって副作用無しに腹痛を抑制できる。
【００４３】
［発明の実施の形態］
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
但、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
実施例１．アルファ1G-/-遺伝子変異二十日鼠の製造及び管理
<1-1> アルファ1G-/-遺伝子変異二十日鼠の製造
本発明者達はＴ-タイプカルシウムチャンネルのアルファ1G+/-遺伝子形をした受精卵(国際寄託機関韓国生命工学研究院遺伝子銀行、寄託番号 : KCTC 10086BP)を利用してアルファ1G-/-遺伝子形をした遺伝子変異二十日鼠を製造した。
【００４５】
具体的に、上記アルファ1G+/-遺伝子形をした受精卵を代理母に移植してアルファ1G+/-遺伝子形をした異形接合体(heterozygote)遺伝子変異二十日鼠を製造し、上記異形接合体遺伝子変異二十日鼠のメスとオスを交配させてアルファ1G-/-遺伝子形をした同形接合体(homozygote)遺伝子変異二十日鼠を製造した。    
【００４６】
<1-2> 動物管理
全ての動物は温度、湿度が調節された環境で食物と水に自由に接近できるようにして、朝8時に昼が始まる夜/昼12時間周期の条件下で飼育した。F2 二十日鼠のメス、オス全て実験に使用し、8〜15週経った二十日鼠を使用した。
【００４７】
実施例２．機械的刺激に対する反応分析
本発明者達はアルファ1G-/-二十日鼠の機械的刺激に対する反応を観察する為に、まず、足引っ込めと尾振りテストを行なった。
【００４８】
<2-1> 足引っ込めテスト(paw withdrawal test)
足引っ込めテストは、モギルの文献にしたがって行なった(Mogil, J. Neurosci., 1999, 19:RC25)。具体的に、アルファ1G-/-二十日鼠を各々微細な網目金属板にのせておいて2時間の間慣れさせた。機械的閾値は補正されたポンプレーフィラメント(Stoelting)を使用して測定し二十日鼠が足を縮める時の曲げる力をグラムで定義した。フィラメントは網目を通して金属板の下から各足の足の裏まで適用した。反応スコアーは、各々のフィラメントに対して10回の連続的な実験から足引っ込めの回数を測定した。反応の平均値を分析に使用した。
【００４９】
<2-2> 尾振りテスト(tail flick test)
尾振りをさせるのに必要な地域的圧力をポンプレーフィラメントを使用して決定した。アルファ1G-/-二十日鼠を2週間、一日に30分ずつ抑制(restrainer)を実施して飼育した。各々のモノフィラメントの曲げ力はテーブルで休んでいる尾に地域的に適用した。圧力を受けた尾振りだけを侵害受容と定義した。反応スコアーは、各々のフィラメント適用の間で10分の間隔で10回の連続した実験から尾振り回数を平均して測定した。
【００５０】
その結果、アルファ1G-/-二十日鼠は、熱または本プレーを利用した機械的な刺激に対する反射作用において正常二十日鼠と有意な差が見られなかった(図 1)。
【００５１】
実施例３．輻射熱及び熱板に対する反応
本発明者達は脊髄反射及び棘上脊髄(supraspinal)メカニズムが関与する輻射熱分析(Hargreaves テスト)を利用して温度痛症反応を測定した。
【００５２】
<3-1> 足引っ込めテスト
引っ込め潜伏性をハルグレーブ方法(Hargreaves, Pain, 1988, 32:77-88)によってユゴバシル(Ugo Basile)足の裏テスト器具(Stoelting)を使用して測定した。高く設置したガラスプレート上のプレクシグラス(Plexiglas)箱に二十日鼠を入れてテスト前に2時間の間慣れるようにした。テストは、低い強度(20)と高い強度(40)で行なった。反応は頭を回した時と足嘗めが観察された時、足引っ込めと定義した。時間は足引っ込め潜在と定義した。両側後ろ足各々の実験の間に5〜10分間隔をおいて4〜5回実験を平均した。
【００５３】
<3-2> 熱板テスト
熱痛症反応を熱板(Mogil, J. Neurosci., 1999, 19:RC25)を使用して評価した。熱板テストのために、二十日鼠を金属床の透明なテストボックス(14 X 14 X 20cm)で2日間 飼育した。その次に、二十日鼠を温度-調節水槽で目標温度まで前もって暖めておいた箱にのせて、始めて後ろ足を嘗めるまたはジャンプ反応をするまでの時間を記録した(カットオフ時間、60秒)。
【００５４】
その結果、アルファ1G-/-二十日鼠は、赤外線照査による熱刺激または炎症反応による熱刺激痛覚過敏反応においても正常二十日鼠と有意な差を示さなかった(図 2)。アルファ1G-/-二十日鼠は熱または機械的刺激に対する正常的な反応を示すため、アルファ1G Ｔ-タイプカルシウムチャンネルの欠損が末端感覚器官、脊髄反射及び炎症反応に関与する神経等の発達自体には影響を与えないものである事が分かった。
【００５５】
実施例４．酢酸による腹痛誘発(writhing test)
本発明者達は酢酸誘導内臓痛症反応を観察する為に、0.6%酢酸を二十日鼠の腹膜腔に注入した。内臓痛症は遅延された炎症反応に対して2次的に現われ腹部伸ばし(abdominal stretching)及び身悶え行動を誘導する(Gyires, Arch Int. Pharmacodyn. Ther., 1984, 267:131-140). 鼠を透明ケース(24 X 18 X 12 cm)に各々入れて60分間適応させた。そして、0.6%酢酸(5.0mg/kg)を腹膜(peritoneum)に注入してテストチェンバーに戻した。腹部(abdominal)伸ばしまたは身悶え活動の回数を20分間測定した。全ての二十日鼠は、この実験に一回ずつ使用した。
【００５６】
その結果、アルファ1G-/-二十日鼠は、酢酸による腹痛に深刻な痛覚過敏反応を見せた(図 3)。このような事実は、アルファ1G Ｔ-タイプカルシウムチャンネルが腹痛感覚の調節に選択的に関与していることを示している。
【００５７】
実施例５．ミベフラジル投与による腹痛分析
本発明者達は腹痛調節に関連したアルファ1G T-タイプカルシウムチャンネルの機能がどんな水準で、つまり、末梢神経部位なのかそうでなければ脊髄で視床及び頭脳に連結される部位なのか調べるために、T-タイプ抑制剤のミベフラジルを正常二十日鼠の腹痛誘発剤の酢酸の投与部位と同一な腹腔に注射して調べてみた。
【００５８】
具体的に、T-タイプカルシウムチャンネル機能抑制剤のミベフラジルの機能を調べるためにミベフラジルを5mg/mlの濃度で0.9%NaClに溶かした。1、10、30mg/kgの量で二十日鼠腹腔に注射した後、20分後に酢酸による腹痛誘発実験を行ない身悶え(writhing)の程度を測定した。対照群には0.9%NaClだけを同量注射した二十日鼠の反応を測定した。
【００５９】
その結果、正常二十日鼠においてミベフラジルはかえって酢酸による腹痛に対して鎮痛現象(analgesia)を誘発した。(図 4)。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】足引っ込めと尾振りテスト等の機械的刺激に対するアルファ1G-/-二十日鼠と正常二十日鼠の反応を示したグラフである。黒丸: 正常二十日鼠、白丸: アルファ1G-/-。
【図２】赤外線照射による熱刺激または炎症反応による熱刺激痛覚過敏に対するアルファ1G-/-二十日鼠と正常二十日鼠の反応を示したグラフである。黒四角: 正常二十日鼠、白四角: アルファ1G-/-。
【図３】酢酸によって誘導される内臓痛症によるアルファ1G-/-二十日鼠と正常二十日鼠の反応を示したグラフである。黒丸: 正常二十日鼠、白丸: アルファ1G-/-。
【図４】Ｔ-タイプカルシウムチャンネル抑制剤のミベフラジルを投与する濃度によって腹痛を抑制する程度を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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