(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチルビオロゲン、キシレノールオレンジ、及び4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)よりなる群から選択される１種の化合物を、(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランと混合し、次いでアンモニアの存在下でテトラエチルオルソシリケートと混合する工程を有する、
シリカ粒子内に、上記メチルビオロゲン、キシレノールオレンジ、及び4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)よりなる群から選択される１種の化合物を含有してなる機能性シリカ粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性シリカ粒子及びその用途に関する。より詳細には、本発明は特定の化合物をシリカ粒子に固定化することによって、新たな特性を発現してなる新規機能性シリカ粒子、並びにその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、信号強度を得るための色素分子の高濃度化は、会合体や凝集体の生成を引き起こし、色素分子自身の特性とは異なった好ましくない特性を引き起こしていた。それは、例えば蛍光分子であれば濃度消光であり、色素であれば凝集形成による吸収の変化であり、安定ラジカルであればスピンスピン相互作用によるESRピークのブロード化、それによる強度低下であった（例えば、非特許文献１〜３参照のこと）。【０００３】
色素分子を高濃度化する一つの方法として、色素を何らか支持体に固定化する方法が考えられる。かかる支持体として、種々のガラスビーズが提案されている（例えば、非特許文献４参照のこと）。【０００４】
しかしながらそれらは、粒子サイズがマイクロメーター以上と大きく、所望の大きさに調整できないので、例えばナノ領域やマイクロ領域での使用はできないという短所がある。
【非特許文献１】Ferrer,M. L.; Monte, F.;Levy,D.. Rhodamine 19 Fluorescent Dimers Resulting from Dye aggregation on the Porous Surface of Sol-Gel Silica Glasses; Langmuir (19) 2003;pp2782-2786.
【非特許文献２】Wehry,E.L .;Rogers,L.B. In Fluorescence and Phosphorescence Analysis; Hercules, D.M..Ed.; Interscience: New York, 1966;pp81-149.
【非特許文献３】Keith, A. D.; Snipes, W.;Metlhorn, R.J.;Gunter, T. Factors Resricting Diffusion of Water-soluble Spin Labels; BiophysicalJournal 1977(19);pp205-218.
【非特許文献４】Imhof,A.;Megens,M.;Engelberts,J.J.; Lang,D.T.N.;;Sprik,R.;Vos,W.L.; Spectroscopy of Fluorescein (FITC) Dyed Colloidal Silica Spheres; J. Phys. Chem. B1999(103);pp1408-1415.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記分子としてメチルビオロゲン、キシレノールオレンジ、または4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)を利用することにより、新規でしかも有用な特性を発現した機能性材料を提供することを目的とする。特に本発明は、当該機能性材料として、ナノ領域やマイクロ領域で有効に使用できる、機能性シリカ粒子を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、上記目的を達成するために日夜鋭意検討していたところ、シリカ粒子にメチルビオロゲン、キシレノールオレンジ、または4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)といった化合物を固定化することによって、これらの化合物が本来有さない新たな機能を有するシリカ粒子が得られるか、またはこれらの化合物の機能をより一層効果的に発揮し得るシリカ粒子が得られることを見いだし、これらがいずれも機能性シリカ粒子として極めて有用な材料となることを確認するに至った。【０００７】
本発明は、かかる知見に基づいて完成したものである。【０００８】
すなわち、本発明は第１に、シリカナノ粒子内に、メチルビオロゲン、キシレノールオレンジ、及び4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)よりなる群から選択される１種の化合物を含有してなる、機能性シリカ粒子を要旨とするものである。【０００９】
かかる機能性シリカ粒子は、下記（１）〜（３）に分類することができる：
（１）シリカ粒子内に、メチルビオロゲンを含有する機能性シリカ粒子（以下、便宜上「メチルビオロゲン／SiO2粒子」ともいう）
当該機能性シリカナノ粒子の特性として、（ａ）蛍光を有する、（ｂ）酸素存在下、紫外線照射することにより無色透明から黄色に変色する、及び（ｃ）紫外線照射により励起／蛍光波長が長波長側にシフトする、ことを挙げることができる。【００１０】
（２）シリカ粒子内に、キシレノールオレンジを含有する機能性シリカ粒子（以下、便宜上「キシレノールオレンジ／SiO2粒子」ともいう）
当該機能性シリカ粒子の特性として、（ｄ）酸性下で黄色、アルカリ下で赤色を呈する、及び（ｅ）酸性下でＦｅ3＋の存在により紫色を呈する、ことを挙げることができる。なお、機能性シリカ粒子は、アルカリ下ではＦｅ3＋の存在の有無に関わらず赤色を呈している。【００１１】
（３）シリカ粒子内に、4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)を含有する機能性シリカ粒子（以下、便宜上「4-アミノTempo／SiO2粒子」ともいう）
当該機能性シリカ粒子の特徴として、内部に「4-アミノTempo」をシリカ層に保護された状態で安定に包含することによって、安定した（ｆ）ラジカルを有する、ことを挙げることができる。【００１２】
更に本発明は、上記機能性シリカ粒子の製造方法として、下記の方法を提供する：
メチルビオロゲン、キシレノールオレンジ、及び4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)よりなる群から選択される１種の化合物を、(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランと混合し、次いでアンモニアの存在下でテトラエチルオルソシリケートと混合する工程を有する、上記（１）〜（３）のいずれかに記載する機能性シリカ粒子の製造方法。【００１３】
以下、本発明について説明する。【００１４】
（１）メチルビオロゲン／SiO2粒子
本発明のメチルビオロゲン／SiO2粒子は、シリカから形成される微粒子（シリカ粒子）に複数のメチルビオロゲン分子が固定化されてなるものである。固定化の態様は、シリカ粒子の内部にメチルビオロゲン分子が取り込まれた形で存在していればよく、特に制限されるものではない。シリカ粒子はシリカ（SiO2）が幾層もの層をなして形成されているが、当該シリカ粒子内におけるメチルビオロゲン分子の存在様式としては、例えば図１に示すように、シリカ粒子の当該層と層との間に、複数のメチルビオロゲンが存在している態様を例示することができる。但し、これに制限されるものではない。【００１５】
本発明のメチルビオロゲン／SiO2粒子の大きさは、特に制限されず、目的に応じて適宜調整することができる。例えば、後述するメチルビオロゲン／SiO2粒子の製造方法において、アンモニア存在下でのテトラオルソシリケートとの反応回数を調整したり、また当該反応に使用するテトラオルソシリケートの濃度を調整することによって、メチルビオロゲン／SiO2粒子を、数ｎｍから数百ｎｍといったナノオーダーの粒径（直径）を有するナノ粒子として調製したり、また数μｍから十数μｍといったマイクロオーダーの粒径（直径）を有するマイクロ粒子として調製したりと、所望に応じて自在にその粒径を調整することができる。好ましいメチルビオロゲン／SiO2粒子は、直径がナノオーダーであるナノ粒子（シリカナノ粒子）であり、かかるナノ粒子として、例えば直径2〜1000nm、好ましくは直径2〜100nm、より好ましくは直径5〜60nm程度、さらにより好ましくは直径10〜40nm程度、一層好ましくは直径15〜30nm程度、特に好ましくは直径20〜30nm程度のシリカナノ粒子を挙げることができる。【００１６】
シリカ粒子内にはメチルビオロゲン分子を複数含ませることが可能である。例えば、直径30nmのシリカナノ粒子を例にすると、その１粒子中には１〜５分子、好ましくは５〜10分子、より好ましくは15分子程度のメチルビオロゲン分子を含めることができる。なお、１粒子中にメチルビオロゲンを15分子の割合で含有する粒子の場合、当該メチルビオロゲンの粒子内濃度は約1.8 mMとなる。【００１７】
メチルビオロゲン（Methyl Viologen）は、パラコートとも呼ばれる、下記式で示される公知の化合物である。【００１８】
【化１】
0004820963.tif 000002
【００１９】
当該メチルビオロゲンそれ自体は、蛍光を有さない無色透明な化合物であるが、これをシリカ粒子に保有させることにより、新たに下記（ａ）〜（ｃ）の特性を有するようになる。
（ａ）蛍光を有する
波長357nmの励起光を照射することによって、波長430nmの発光を生じる。
（ｂ）酸素存在下、紫外線照射することにより無色透明から黄色に変色する
なお、メチルビオロゲンそのものは無色透明であり、酸素存在下で紫外線照射しても色の変化は生じない。但し、酸素非存在下で紫外線照射すると無色透明から青色に変色する。
（ｃ）紫外線照射により励起／蛍光波長が長波長側にシフトする
後述する実施例１に示すように、紫外線（ピーク波長365nm）を照射すると、照射前の励起光／発光の極大ピーク波長（357nm／430nm）が、長波長側にシフトする。かかる長波長側へのシフト幅は、シリカ粒子に保有させるメチルビオロゲンの割合を変更することによって調整することができる。【００２０】
上記に示すように、本発明のメチルビオロゲン／SiO2粒子は、紫外線照射により可視光領域に蛍光を発するため、蛍光標識剤として有効に利用することができる。また、紫外線照射によって400〜500nmの範囲で連続的に蛍光波長を変化させることも可能であることから、400-500nmの蛍光に関して細胞等の波長選択的蛍光標識剤として有効に利用できると考えられる。【００２１】
さらに、メチルビオロゲンの還元体は、メチルビオロゲンラジカルと呼ばれ、生体内で容易に酸素分子を還元して活性酸素ラジカルを生じることが知られている（Bahnemann, D. W.; Fisher, C.-H.; Janata, E.; Henglein, A.; The Two-electron Oxidation of Methyl Viologen;J. Chem. Soc. Faraday Trans. 1, 1987(83);pp2559-2571.）。【００２２】
一般に、腫瘍の放射線治療は、γ線を腫瘍部に照射して腫瘍周辺にある水の放射線分解によって生じたラジカルや、γ線直接の高エネルギーによって、腫瘍を破壊するというものである。このときに、水だけでなく、本発明のメチルビオロゲン／SiO2粒子を腫瘍部に取り込ませておけば、照射されるγ線によって、水が分解して生成するラジカルに加えて、メチルビオロゲン／SiO2粒子に担持されているメチルビオロゲンが還元されて電子が貯まり、その還元力によって、腫瘍を攻撃することが可能になると考えられる。こうすることにより、通常のγ線照射量を低くすることが可能であり、γ線照射によって生じる副作用を低減できるものと考えられる。このように、本発明のメチルビオロゲン／SiO2粒子は、放射線治療におけるγ線照射の増感剤としての用途も期待される。【００２３】
また、生体内で生じたラジカルを非侵襲に測定するための装置としてESR-CTが知られており、これを利用することによって、生きたままで生体内でのラジカルを追跡することができる。従って、例えば、メチルビオロゲン／SiO2粒子で、標的の薬物を標識することにより、その体内での代謝を観測することが可能である。また、放射線治療の際に生じたラジカルがどのように生成し消滅し、腫瘍を攻撃するか、あるいは、正常細胞がどのように攻撃されて副作用が起こるかについて、リアルタイムで観測するためにも利用することが可能である。【００２４】
本発明のメチルビオロゲン／SiO2粒子は、まずメチルビオロゲンを(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランと混合し、次いでシリカ粒子形成の触媒としてのアンモニア水溶液の存在下で、テトラエチルオルソシリケートと混合することによって製造することができる。【００２５】
始めの工程として、メチルビオロゲンを(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランと混合する工程を採用することにより、シリカ粒子内にメチルビオロゲンを高濃度（例えば、粒径30nmのナノ粒子に15分子/粒子以上、好ましくは粒径20nmのナノ粒子に5分子/粒子以上の割合）に固定化することができる。かかる操作は、具体的には、メチルビオロゲンをジメチルスルホキシド溶液に溶解し、これと(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランとを混合することによって実施することができる。この場合、メチルビオロゲンと(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランとの配合割合として、例えば、メチルビオロゲン2.5 mgに対する(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランの配合割合として、通常0.5〜1μｌ、好ましくは1〜2μｌ、より好ましくは2.3μl程度の割合を例示することができる。また、これをモル比の割合で示すと、メチルビオロゲン１モルに対して使用される(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランの配合割合としては、通常0.5〜1モル、好ましくは1〜2モル、より好ましくは１モル程度を挙げることができる。【００２６】
ここで混合条件は特に制限されない。例えば混合時の温度として、通常室温を挙げることができる。その他の混合条件も特に制限されないが、攪拌しながら、20〜24時間程度、十分混合することが好ましい。【００２７】
次いで、得られた反応液をテトラエチルオルソシリケートと混合する。この場合の反応は、シリカ粒子を形成するためのテトラエチルオルソシリケートの重縮合反応であるが、この反応（シリカ粒子生成）は、触媒としてアンモニアの存在下で用いて行うことが好ましい。さらにかかる反応は、溶媒として含水アルコール、好ましくは含水エタノールの中で行うことが好ましい。ここで反応系のアルコール濃度として、制限されないが、好ましくは80容量％程度を挙げることができる。【００２８】
当該反応に使用するテトラエチルオルソシリケートの割合は、特に制限されないが、前工程で使用したメチルビオロゲンの量8.5μmol/mlに対して、400〜500倍、好ましくは500〜600倍、より好ましくは500〜550倍の割合で用いられることが好ましい。これをモル比で示すと、メチルビオロゲン１モルに対して使用されるテトラエチルオルソシリケートの配合割合として400〜500モル、好ましくは500〜600モル、より好ましくは500〜550モルを挙げることができる。【００２９】
かかる混合条件も特に制限されないが、例えば20〜25℃の条件下、攪拌しながら20〜24時間程度、十分混合する方法を例示することができる。【００３０】
次いで得られた反応液を、例えばメンブランフィルターをセットした限外濾過装置等を利用して固液分離し、また必要に応じて水で洗浄することにより、本発明のメチルビオロゲン／SiO2粒子を取得することができる。【００３１】
（２）キシレノールオレンジ／SiO2粒子
本発明のキシレノールオレンジ／SiO2粒子は、シリカから形成される微粒子（シリカ粒子）に複数のキシレノールオレンジ分子が固定されてなるものである。固定化の態様は、シリカ粒子の内部にキシレノールオレンジ分子が取り込まれた形で存在していればよく、特に制限されるものではない。例えば、シリカ粒子の内部におけるキシレノールオレンジ分子の存在様式としては、（１）で説明したメチルビオロゲン／SiO2粒子と同様に、粒子を形成しているシリカ（SiO2）の層と層との間に、複数のキシレノールオレンジが存在している態様を例示することができるが、これに制限されるものではない。【００３２】
本発明のキシレノールオレンジ／SiO2粒子の大きさは、特に制限されず、目的に応じて適宜調整することができる。例えば、後述するキシレノールオレンジ／SiO2粒子の製造方法において、アンモニア存在下でのテトラオルソシリケートとの反応回数を調整したり、また当該反応に使用するテトラオルソシリケートの濃度を調整することによって、キシレノールオレンジ／SiO2粒子を、数ｎｍから数百ｎｍといったナノオーダーの粒径（直径）を有するナノ粒子として調製したり、また数μｍから十数μｍといったマイクロオーダーの粒径（直径）を有するマイクロ粒子として調製したりと、所望に応じて自在にその粒径を調整することができる。好ましいキシレノールオレンジ／SiO2粒子は、直径がナノオーダーであるナノ粒子（シリカナノ粒子）であり、かかるナノ粒子として、例えば直径2〜1000nm、好ましくは直径2〜100nm、より好ましくは直径5〜60nm程度、さらにより好ましくは直径10〜40nm程度、一層好ましくは直径15〜30nm程度、特に好ましくは直径20〜30nm程度のシリカナノ粒子を挙げることができる。【００３３】
なお、シリカ粒子内にはキシレノールオレンジ分子を複数含ませることが可能である。例えば、直径30nmのシリカナノ粒子を例にすると、その１粒子中には１〜10分子、好ましくは50〜150分子、より好ましくは100〜150分子、さらにより好ましくは112分子程度のキシレノールオレンジ分子を含めることができる。なお、１粒子中にキシレノールオレンジを112分子の割合で含有する粒子の場合、当該キシレノールオレンジの粒子内濃度は約13mMとなる。【００３４】
キシレノールオレンジは下記式で示される公知の化合物である。【００３５】
【化２】
0004820963.tif 000003
【００３６】
キシレノールオレンジはｐＨの変化に応じて異なる色を呈するという性質を有し（酸性下で黄色、アルカリ下で赤色を有する）、それ自体ｐＨ指示薬としての用途を有する化合物である。また、これをシリカナノ粒子に保有させることによっても、同様に下記（ｄ）に示す性質を有する：
（ｄ）酸性下（例えばｐＨ２）で黄色、アルカリ下（例えばｐＨ９）で赤色を呈する
当該本発明のキシレノールオレンジ／SiO2粒子は、前述するようにナノオーダーやマイクロオーダーの微粒子に調整することができ、しかもその内部にキシレノールオレンジをその性質を損なうことなく濃縮した形で包含させることができるため、従来キシレノールオレンジ単独使用では難しかった、マクロファージ内部や微小細胞ならびに微細組織などのマイクロ領域におけるｐＨの測定やｐＨの変化の測定に、ｐＨ指示薬として有効に利用することができる。
（ｅ）酸性下で、Ｆｅ3＋の存在により紫色を呈する
前述するように、キシレノールオレンジ／SiO2粒子は、酸性条件下で、例えばFe2＋が存在する場合であってもFe３＋非存在下では黄色を呈するが、Fe3＋の存在下ではFe3＋と配位して紫色を呈する。但し、アルカリ条件下では、Fe3＋の存在・非存在に関わらず赤色を呈している。【００３７】
かかる現象は、キシレノールオレンジをSiO2粒子に固定化することによって、Fe3＋に対する配位能力が増大したことによると考えられる。本発明のキシレノールオレンジ／SiO2粒子のこうした性質は、細胞等におけるFe3+の検出薬として利用することができる。【００３８】
また、本発明のキシレノールオレンジ／SiO2は、下記に説明するように、放射線感光用色素として放射線に係る個人被ばく管理・汚染管理・医療被曝管理、あるいは放射線線量計測のための化学線量計に利用することができる：
Fe2+を含む水溶液は、γ線照射されると、まず水の放射線分解が起こり、OHラジカルやHラジカル、水和電子など生成する。これらのラジカルは、溶存酸素と反応し、過酸化水素やOHラジカルを多く生成し、この中にFe2+が共存する場合には、これらが酸化剤となってFe2+をFe3+へと酸化する。従って、この酸化量（Fe2+→Fe3+）から、どれだけの放射線を受けたか、放射線の吸収線量を測定することができる。本発明のキシレノールオレンジ/SiO2粒子は、１つのSiO2粒子内にキシレノールオレンジ分子が高濃度に含まれているので（言い換えると、１粒子中にキシレノールオレンジが濃縮されて含まれている）、わずかの線量でFe2+から生じたFe3+を効果的に捕捉することができ、わずかの線量を色変化（黄色→紫）によって定性的にまた定量的に示すことが可能である。【００３９】
本発明のキシレノールオレンジ／SiO2粒子は、まずキシレノールオレンジを(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランと混合し、次いでシリカ粒子形成の触媒としてのアンモニア水溶液の存在下で、テトラエチルオルソシリケートと混合することによって製造することができる。【００４０】
始めの工程として、キシレノールオレンジを(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランと混合することにより、シリカ粒子内にキシレノールオレンジを高濃度（例えば、30nmのナノ粒子に112分子／粒子以上の割合で）に固定化することができる。かかる操作は、具体的には、キシレノールオレンジをジメチルスルホキシド溶液に溶解し、これと(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランとを混合することによって実施することができる。この場合、キシレノールオレンジと(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランとの配合割合として、例えばキシレノールオレンジ14μmol/mlに対して、(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランをモル比として0.5〜2、好ましくは0.5〜1.5、より好ましくは0.5程度の割合で混合する方法を挙げることができる。【００４１】
ここで混合条件は特に制限されない。例えば混合時の温度として、通常室温を挙げることができる。その他の混合条件も特に制限されないが、攪拌しながら、20〜24時間程度、十分混合することが好ましい。【００４２】
次いで、得られた反応液をテトラエチルオルソシリケートと混合する。この場合の反応は、シリカ粒子を形成するためのテトラエチルオルソシリケートの重縮合反応であるが、この反応（シリカ粒子生成）は、触媒としてアンモニアの存在下で行うことが好ましい。さらにかかる反応は、溶媒として含水アルコール、好ましくは含水エタノールの中で行うことが好ましい。ここで反応系のアルコール濃度として、制限はされないが好ましくは80容量％程度を挙げることができる。【００４３】
当該反応に使用するテトラエチルオルソシリケートの割合は、制限されないが、前工程で使用したキシレノールオレンジの量 7μmol/mlに対して、200〜500倍、好ましくは500〜700倍、より好ましくは600〜650倍の割合で用いられることが好ましい。これをモル比で示すと、キシレノールオレンジ１モルに対して使用されるテトラエチルオルソシリケートの配合割合として200〜500モル、好ましくは500〜700モル、より好ましくは600〜650モルを挙げることができる。【００４４】
かかる混合条件も特に制限されないが、例えば20〜25℃の条件下、攪拌しながら20〜24時間程度、十分混合する方法を例示することができる。【００４５】
次いで得られた反応液を、例えばメンブランフィルターをセットした限外濾過装置等を利用して固液分離し、また必要に応じて水で洗浄することにより、本発明のキシレノールオレンジ／SiO2粒子を取得することができる。【００４６】
（３）4-アミノTempo／SiO2粒子
本発明の4-アミノTempo／SiO2粒子は、シリカから形成される微粒子（シリカ粒子）に複数の4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)〔4-アミノTempo〕分子が固定化されてなるものである。固定化の態様は、シリカナノ粒子の内部に4-アミノTempo分子が取り込まれた形で存在していればよく、特に制限されるものではない。例えば、シリカナノ粒子の内部における4-アミノTempo分子の存在様式としては、（１）で説明したメチルビオロゲン／SiO2粒子と同様に、粒子を形成しているSiO2の層と層との間に、複数の4-アミノTempo存在している態様を例示することができるが、これに制限されるものではない。【００４７】
本発明の4-アミノTempo／SiO2粒子の大きさは、特に制限されず、目的に応じて適宜調整することができる。例えば、後述する4-アミノTempo／SiO2粒子の製造方法において、
アンモニア存在下でのテトラオルソシリケートとの反応回数を調整したり、また当該反応に使用するテトラオルソシリケートの濃度を調整することによって、4-アミノTempo／SiO2粒子を、数ｎｍから数百ｎｍといったナノオーダーの粒径（直径）を有するナノ粒子として調製したり、また数μｍから十数μｍといったマイクロオーダーの粒径（直径）を有するマイクロ粒子として調製したりと、所望に応じて自在にその粒径を調整することができる。好ましい4-アミノTempo／SiO2粒子は、直径がナノオーダーであるナノ粒子（シリカナノ粒子）であり、かかるナノ粒子として、例えば直径2〜1000nm、好ましくは直径2〜100nm、より好ましくは直径5〜60nm程度、さらにより好ましくは直径10〜40nm程度、一層好ましくは直径15〜30nm程度、特に好ましくは直径20〜30nm程度のシリカナノ粒子を挙げることができる。【００４８】
なお、シリカ粒子内には4-アミノTempo分子を複数含ませることが可能である。例えば、直径30nmのシリカナノ粒子を例にすると、その１粒子中には、１〜100分子、好ましくは100〜200分子、より好ましくは150分子程度の4-アミノTempo分子を含めることができる。なお、１粒子中に4-アミノTempoを150分子の割合で含有する粒子の場合、当該4-アミノTempoの粒子内濃度は約17mMとなる。【００４９】
4-アミノTempo（4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)）は下記式で示される公知の化合物である。【００５０】
【化３】
0004820963.tif 000004
【００５１】
当該4-アミノTempo分子はラジカル分子であり、それ自体、標識試薬としての用途を有する化合物である。本発明の4-アミノTempo／SiO2粒子は、シリカ粒子内に、4-アミノTempo分子をラジカル分子として安定に、またシリカ層内でそれを保護する状態で保有することによって下記（ｆ）に示す性質を有する：
（ｆ）ラジカルを有する
4-アミノTempo／SiO2粒子のこうした性質は、生体内にラジカルを投与する場合に、ラジカルの酸化や消失を防ぎ、有効な標識物質として利用することができる。【００５２】
本発明の4-アミノTempo／SiO2粒子は、まず4-アミノTempoを（3-チオシアネートプロピル）トリエトキシシランと混合し、次いでシリカ粒子形成の触媒としてのアンモニア水溶液の存在下で、テトラエチルオルソシリケートと混合することによって製造することができる。【００５３】
始めの工程として、4-アミノTempoを、(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランと混合することにより、シリカ粒子内に4-アミノTempoを高濃度（例えば、30nmの粒子として150分子／粒子以上の割合で）に固定化することができる。かかる操作は、具体的には、4-アミノTempoをジメチルスルホキシド溶液に溶解し、これと(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランとを混合することによって実施することができる。この場合、4-アミノTempoと(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランとの配合割合として、例えば、4-アミノTempo分子7μmol/mlに対して、(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランをモル比で0.5〜2、好ましくは0.5〜1.5、より好ましくは１程度の割合で混合する方法を挙げることができる。【００５４】
ここで混合条件は特に制限されない。例えば混合時の温度として、通常室温を挙げることができる。その他の混合条件も特に制限されないが、攪拌しながら、20〜24時間程度、十分混合することが好ましい。【００５５】
次いで、得られた反応液をテトラエチルオルソシリケートと混合する。この場合の反応は、シリカ粒子を形成するためのテトラエチルオルソシリケートの重縮合反応であるが、この反応（シリカ粒子生成）は、触媒としてアンモニアの存在下で行うことが好ましい。さらにかかる反応は、溶媒として含水アルコール、好ましくは含水エタノールの中で行うことが好ましい。ここで反応系のアルコール濃度として、制限されないが、好ましくは80容量％程度を挙げることができる。【００５６】
当該反応に使用するテトラエチルオルソシリケートの割合は、制限されないが、前工程で使用した4-アミノTempoの量 7μmol/mlに対して、200〜400倍、好ましくは400〜550倍、より好ましくは550〜600倍の割合で用いられることが好ましい。これをモル比で示すと、4-アミノTempo１モルに対して使用されるテトラエチルオルソシリケートの配合割合として200〜400モル、好ましくは400〜550モル、より好ましくは550〜600モルを挙げることができる。【００５７】
かかる混合条件も特に制限されないが、例えば20〜25℃の条件下、攪拌しながら20〜24時間程度、十分混合する方法を例示することができる。【００５８】
次いで得られた反応液を、例えばメンブランフィルターをセットした限外濾過装置等を利用して固液分離し、また必要に応じて水で洗浄することにより、本発明の4-アミノTempo／SiO2粒子を取得することができる。
【発明の効果】
【００５９】
本発明によれば、メチルビオロゲン、キシレノールオレンジ、または4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)を、シリカ粒子中に安定に、また高濃度に、保持させることができ、その結果、上記各分子単品では得られなかった新しい機能または特性を得ることが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】予想されるメチルビオロゲン／SiO2粒子の形態（SiO2粒子中のメチルビオロゲンの存在様式）を示す模式図である。
【図２】実施例１において、メチルビオロゲン／SiO2粒子の励起／蛍光スペクトルを、紫外線照射前（点線）と紫外線照射後（実線）で比較した図である。縦軸は蛍光強度(Intensity)を、横軸は波長（Wavelength：nm）を意味する。
【図３】実施例２において、キシレノールオレンジ／SiO2粒子の吸収スペクトルを示す図である。縦軸は吸光度(Absorbance)を、横軸は波長（Wavelength：nm）を意味する。
【図４】実施例２（５）において、Fe2+／キシレノールオレンジ／SiO2試薬の水溶液にγ線を約10Gy照射（60-Coγ線照射装置で30分間照射）した前後における、当該水溶液の吸光度（520〜700nm）を測定したスペクトルである。γ線照射による色変化によって、600nmにおける吸光度が約0.15増大することがわかる。ｂはγ線照射前のスペクトル、ａはγ線照射後のスペクトルを示す。
【図５】実施例２（５）において、Fe2+／キシレノールオレンジ／SiO2試薬にゼラチン（0.2g/mlのゼラチンを1ml）を配合した水溶液にγ線を約10Gy照射（60-Coγ線照射装置で30分間照射）し、その前後における当該水溶液の吸光度（300〜800nm）を測定したスペクトルである。点線はγ線照射前の当該水溶液のスペクトル、実線はγ線照射後の当該水溶液のスペクトルである。
【図６】実施例３において調製した4-アミノTempo／SiO2粒子の、電子スピン共鳴（ESR）スペクトルを示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
以下に、本発明の構成ならびに効果をより明確にするために、実施例を記載する。但し本発明は、これらの実施例に何ら影響されるものではない。
【実施例１】
【００６２】
メチルビオロゲンを含有するシリカ粒子（メチルビオロゲン／SiO2粒子）
（１）メチルビオロゲンｎ水和物（和光純薬工業株式会社製）2.1mgを、１mlのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、これに、(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシラン〔(3-Thiocyanatopropyl)triethoxy silane〕原液をDMSOで10倍に希釈した溶液 18μlを混合して、約25℃で約１時間混合した。次いでこの反応溶液１mlに、エタノール3ml、テトラエチルオルソシリケート（TEOS）0.1ml、 蒸留水1ml、及び 30容量％ アンモニア水溶液  0.1mlを加えて、約25℃で約１日中攪拌しながら混合した。その後、得られた反応液を、Amicon YM-100メンブランフィルター（Amicon社製、孔径:15nm）をセットした限外ろ過装置を利用して濾過して、メチルビオロゲン／SiO2粒子（粒径：20〜30nm）を濾取し、これを蒸留水で洗浄した。【００６３】
（２）得られたメチルビオロゲン／SiO2粒子を水で30倍に希釈した水溶液の260nmの吸光度を測定したところ、吸光度0.072であった。分子吸光係数が204170であることから、濃度は10.5μMとなる。この溶液が20ml得られたので、20mlあたり0.21μmolとなる。したがって、30nmの粒子としてその粒子内のメチルビオロゲン濃度は、約1.8mMである。いままでに、このような濃度でメチルビオロゲン分子をシリカナノ粒子に固定された例は知られていない。【００６４】
（３）原料に使用したメチルビオロゲンは蛍光を発しない物質であるのに対し、上記で得られたメチルビオロゲン／SiO2粒子は蛍光を有しており、スリット幅（Ex/Em）=5/5nmで、励起光357nmで430nmにブロードな発光が観測された。このことから、メチルビオロゲン／SiO2粒子は、それ自体蛍光物質として有用であり、例えば、紫外線照射により可視光領域に蛍光を発する蛍光標識等として利用できると考えられる。【００６５】
（４）次いで、このメチルビオロゲン／SiO2粒子の30倍希釈水溶液に、500W超高圧水銀ランプ(Ushio-500)を用いて、紫外線を約10分間照射した後、再び蛍光を測定した。すると、上記水溶液が黄色に着色し、表１及び図２に示すように、励起光および発光波長がいずれも長波長側にシフトしていることが観察された。【００６６】
【表１】
0004820963.tif 000005
【００６７】
このように、メチルビオロゲン／SiO2粒子に紫外線照射することで蛍光波長が長波長（低エネルギー側）にシフトすることから、メチルビオロゲン／SiO2粒子内には、メチルビオロゲン分子の重なりが起こり、生じた電子が非局在化していると考えられる。限定されるものではないが、上記で得られたメチルビオロゲン／SiO2粒子は、図１に示すように、複数のメチルビオロゲン分子が、SiO2が形成する層の間に内包されて、粒子を形成していると考えられる。【００６８】
また、かかるメチルビオロゲン／SiO2粒子は、内包させるメチルビオロゲン分子の量を変えることで、紫外線照射後の蛍光波長のシフト波長が変わるとともに１粒子あたりの電子の補足量も増加し得るので、例えば、400-500nmの蛍光に関して細胞等の波長選択的蛍光標識として有効に利用できると考えられる。
【実施例２】
【００６９】
キシレノールオレンジを含有するシリカナノ粒子（キシレノールオレンジ／SiO2粒子）
（１）キシレノールオレンジ（Aldrich社製）2.1mgを、2mlのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、これに、(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシラン〔(3-Thiocyanatopropyl)triethoxy silane〕原液を3.8μl混合して、反応液中に含まれるキシレノールオレンジ：(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシランの重量比が２：１になるように調整した。これを約25℃で約１時間攪拌混合した。次いでこの反応溶液 2mlに、エタノール 6ml、 テトラエチルオルソシリケート（TEOS）0.1ml、 蒸留水2ml、及び 30容量％ アンモニア水溶液 0.2mlを加えて、約25℃で約１日中攪拌しながら混合した。その後、得られた反応液を、Amicon YM-100メンブランフィルター（Amicon社製、孔径：15nm）をセットした限外ろ過装置を利用して濾過して、キシレノールオレンジ／SiO2粒子（粒径20〜30nm）を濾取し、これを蒸留水で洗浄した。なお、限定されるものではないが、得られたキシレノールオレンジ／SiO2粒子は、メチルビオロゲン／SiO2粒子と同様に、SiO2が層をなして形成する粒子の各層の間に、複数のキシレノールオレンジ分子が内包されてなる形態を有していると考えられる。【００７０】
（２）得られたキシレノールオレンジ／SiO2粒子を水で10倍に希釈した水溶液の578nmの吸光度を測定したところ、2.173であった（図３）。分子吸光係数が47000であることから、0.462 mMのキシレノールオレンジ分子がシリカ粒子内に固定されたこと、すなわち原料として使用したキシレノールオレンジの約6.6％がシリカ粒子内に固定されたことが確認された。したがって、30nmの粒子としてその粒子内のキシレノールオレンジ分子濃度は、約13mMとなる。いままでに、このような濃度でキシレノールオレンジ分子をシリカナノ粒子に固定された例は知られていない。【００７１】
（３）上記のキシレノールオレンジ／SiO2粒子の10倍希釈水溶液は、原料として用いたキシレノールオレンジと同様に、酸性条件下（pH＜7）で黄色、アルカリ条件下（pH＞７）で赤色を呈した。キシレノールオレンジは、それ自体ｐＨ指示薬であるが（酸性条件下で黄色、アルカリ条件下で赤色を示す）、上記のことから、キシレノールオレンジは、SiO2に担持されて濃縮された状態でもｐＨ指示薬として使用できることが確認できた。さらに、SiO2に担持させることによって、キシレノールオレンジをそのまま使用する場合では難しかった、特定領域のpH測定（例えば水溶液中に分散された物質あるいは細胞などの内部のpH測定）に使用することが可能である。このことから本発明のキシレノールオレンジ／SiO2粒子によれば、例えばマクロファージ等の生体内の微小組織内のｐＨを測定することも可能と考えられる。【００７２】
（４）前述するように、キシレノールオレンジ／SiO2粒子の10倍希釈水溶液は、酸性条件下（pH＜7）で黄色を示した。次いで、この中にFe3＋を添加したところ、紫色に色が変化した。キシレノールオレンジ／SiO2粒子のこの現象を利用することによって、SiO2で保護されたキシレノールオレンジによって細胞中等のFe3+を検出することが可能である。【００７３】
（５）キシレノールオレンジ／シリカ粒子の水溶液0.4ml、10mMの硫酸アンモニウム鉄（II）(1N)水溶液0.1ml、及び1N 硫酸0.1mlを混合して、Fe2+／キシレノールオレンジ／SiO2試薬の水溶液（酸性、ｐＨ２、黄色）を調製した。次いで、このFe2+／キシレノールオレンジ／SiO2試薬水溶液に、室温でγ線を約10Gy照射（60-Coγ線照射装置で30分間照射）した。すると、上記水溶液が黄色から紫色へと色変化することが観測された。この色変化は、γ線照射によって水溶液中のFe2+が酸化されて生成したFe3+が、キシレノールオレンジに配位したことによって生じたものと思われる。また、600nmにおける吸光度を測定したところ、γ線照射による色変化によって、当該吸光度が約0.15増大することがわかった（図４、スペクトルｂからスペクトルａに変化）。以上のことから、キシレノールオレンジをシリカナノ粒子に固定した本発明のキシレノールオレンジ／SiO2粒子を利用することによって、γ線照射に伴って生じる吸光度変化が観測できることが判明した。【００７４】
次いで、キシレノールオレンジ／シリカ粒子の水溶液0.4mlまたは0.2mlと、10mMの硫酸アンモニウム鉄(II)(1N)水溶液0.1ml、1N 硫酸0.1ml、及び蒸留水0.6〜2.4mlを混合してFe2+／キシレノールオレンジ／SiO2試薬の水溶液（酸性、ｐＨ２、黄色）を調製した後、これに0.2g/mlのゼラチンを1ml〜3mlの割合で配合し、これらの水溶液にγ線を約10Gy照射した（60-Coγ線照射装置で30分間照射）。その結果、上記と同様に、γ線照射によりFe2+の酸化により生じたFe3+がキシレノールオレンジに配位することにより色変化（黄色から紫色への変化）が観測できた。またこの色変化を吸光度測定によって観察したところ、0.2g/mlのゼラチンを1ml配合した場合に、紫色の吸光度が最大に変化することが確認された（586nmで1.329の吸光度）。この値から、本発明のキシレノールオレンジ／シリカ粒子によると、照射後のキシレノールオレンジの吸光度について、文献〔Radiation Physics and Chemistry, 61 (2001) 433-435〕の約1.2倍の感度が得られたことがわかった（図５）
【実施例３】
【００７５】
4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)を含有するシリカナノ粒子〔4-アミノTempo／SiO2粒子〕
（１）4-アミノ-(2,3,6,6-テトラメチル-1-ピペリジニルオキシ)〔以下、「4-アミノTempo」という〕（Aldrich社製）0.9mgを、1mlのジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、これに、(3-チオシアネートプロピル)トリエトキシシラン〔(3-Thiocyanatopropyl)triethoxy silane〕原液をDMSOで10倍に希釈した溶液 18μlと混合して、これを約25℃で約１時間攪拌混合した。次いでこの反応溶液 0.05mlに、エタノール3.95ml、テトラエチルオルソシリケート（TEOS）0.05ml、 蒸留水1ml、及び 30容量％ アンモニア水溶液 0.1mlを加えて、約25℃で約１日中攪拌しながら混合した。その後、得られた反応液を、Amicon YM-100メンブランフィルター（Amicon社製、孔径：15nm）をセットした限外ろ過装置を利用して濾過して、4-アミノTempo／SiO2粒子（粒径：20〜30nm）を濾取し、これを蒸留水で洗浄した。【００７６】
（２）得られた4-アミノTempo／SiO2粒子を蒸留水に分散してコロイド状態に調製し、このうち170μlを水溶液測定用石英製扁平セル（JEOL DATUM LC12）に採取して、室温下で電子スピン共鳴（ESR）スペクトルを測定した（日本電子株式会社製のJEOL TE-300 [X-band] 使用）。結果を図６に示す。【００７７】
図６に示すように、ピーク間隔は17.2gaussであり、4-アミノTempoそのものを同様に測定した場合のピーク間隔（15gauss）よりも少し大きくなっていた。これは、ラジカル（4-アミノTempo）の自由回転が抑えられていること、すなわち4-アミノTempo がSiO2に固定化されていることを示唆するものである。限定されるものではないが、これらのことから、得られた4-アミノTempo／SiO2粒子は、メチルビオロゲン／SiO2粒子と同様に、SiO2が層を成して形成する粒子の、当該各層の間に、複数の4-アミノTempo分子が内包され固定化されてなる形態を有していると考えられる。【００７８】
従来、生体内にラジカル（4-アミノTempo）を投与した場合に、生体内では酸化されたり、シグナルを消失するという問題があったが、本発明によれば、前述するようにラジカル（4-アミノTempo）を、SiO2粒子に安定に固定化できることから、こうした問題を生じることなく、ラジカル信号を観測することができる。このことから、4-アミノTempo／SiO2粒子は、生体内での薬物代謝等の動態を評価するための標識試薬として有効に利用できるものと考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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