(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学顕微鏡によって取得された光学顕微鏡像に表示される試料上の個所を、荷電粒子線装置によって観察する試料観察方法において、
前記試料を染色するステップと、
前記光学顕微鏡によって、前記染色された試料の光学顕微鏡像を取得するステップと、
前記試料に荷電粒子線を走査したときに試料から放出されるＸ線の検出に基づいて元素マッピング像を取得するステップと、
前記染色された光学顕微鏡像と、前記元素マッピング像を比較するステップと、
前記染色された光学顕微鏡像と前記元素マッピング像の一致度が所定の値を越える試料上の個所、或いは一致度が最も高い個所について、前記荷電粒子線を走査し荷電粒子を検出、及び／又は当該個所の位置情報を検出することを特徴とする試料観察方法。
【請求項２】
請求項１において、
前記試料上の個所を、一致度の高い順番に順位付けをすることを特徴とする試料観察方法。
【請求項３】
請求項１において、
前記光学顕微鏡像、及び／又は前記元素マッピング像と、前記一致度が所定の値を越える試料上の個所、及び／又は前記一致度が最も高い試料上の個所の荷電粒子線像、或いは位置情報を１つのファイルとして記録することを特徴とする試料観察方法。
【請求項４】
光学顕微鏡によって取得された光学顕微鏡像と、荷電粒子線装置によって取得された像との比較を行う画像処理装置であって、以下のシーケンスを実行するようにプログラムされていることを特徴とする画像処理装置、
光学顕微鏡によって取得される、染色された試料の光学顕微鏡像と、荷電粒子線装置によるＸ線検出に基づく元素マッピング像を比較するステップ、及び
前記染色された試料の光学顕微鏡像と、前記元素マッピング像の一致度が、所定の値を越えた個所、或いは一致度が最も高い個所を、前記荷電粒子線装置による荷電粒子像取得個所、或いは二次電子像、及び／又は反射電子像記録個所として選択、或いは当該個所の位置情報を記憶するステップ。
【請求項５】
請求項４において、
前記試料上の個所を、一致度の高い順番に順位付けをすることを特徴とする画像処理装置。
【請求項６】
請求項４において、
前記光学顕微鏡像、及び／又は前記元素マッピング像と、前記一致度が所定の値を越える試料上の個所、及び／又は前記一致度が最も高い試料上の個所の荷電粒子線像、或いは位置情報を１つのファイルとして記録することを特徴とする画像処理装置。
【請求項７】
光学顕微鏡によって取得された光学顕微鏡像と、荷電粒子線装置によって取得された像を比較する画像処理装置であって、以下のシーケンスを実行するようにプログラムされていることを特徴とする画像処理装置、
光学顕微鏡によって取得される、染色された試料の光学顕微鏡像と、荷電粒子線装置によるＸ線検出に基づく元素マッピング像を比較するステップ、及び
前記染色された試料の光学顕微鏡像と、前記元素マッピング像の一致度が高い順番に、荷電粒子線装置による荷電粒子線像取得個所として選択するステップ。
【請求項８】
荷電粒子源と、
当該荷電粒子源から放出される荷電粒子線を染色された試料上で集束する対物レンズと、
前記試料から放出されるＸ線を検出するＸ線検出器と、
前記試料を移動させる試料ステージと、
当該試料ステージの移動を制御する制御装置を備えた荷電粒子線装置において、
前記制御装置は、前記試料について予め取得された、前記染色された試料の光学顕微鏡像と、前記Ｘ線検出器によって検出されるＸ線に基づいて形成される元素マップ像を比較し、前記染色された試料の光学顕微鏡像と、元素マップ像の一致度が所定値以上、或いは最も一致度が高い個所の位置座標を記憶することを特徴とする荷電粒子線装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料観察方法，画像処理装置、及び荷電粒子線装置に係り、特に、光学顕微鏡で観察した試料と同一視野を観察することに適した方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学電子顕微鏡で観察する試料は、たとえば、生物試料のような場合、試料成分や生理状態の違いに応じた染色法で、試料を色づけすることができるので、試料を生体に近い状態で観察することができる。こうした生体反応の解析には、細胞レベル、あるいは、高分子レベルでの微細構造解析が重要である。そのためには、分解能に限界がある光学顕微鏡では、倍率が不足し、微細構造を観察することが困難であるため、電子顕微鏡による観察が望ましい。
【０００３】
特許文献１には、電子顕微鏡とは別に設けた光学的像取り込み装置により、試料を観察して、その座標位置と電子顕微鏡の試料ステージの位置とを対応させることで、電子顕微鏡における視野探しを実施することが説明されている。
【０００４】
特許文献２には、走査電子顕微鏡の視野移動に関し、走査電子顕微鏡の観察視野幅に対応して試料ステージを移動させることが説明されている。
【０００５】
【特許文献１】特開平６−１３０１１号公報
【特許文献２】特開平８−１２９９８６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、光学顕微鏡像が主として試料からの反射光を検出して試料像形成を行うのに対し、電子顕微鏡では二次電子等の検出に基づいて試料像形成を行う。このように異なる信号に基づいて、試料像を形成しているため、像質が非常に異なり、光学顕微鏡を用いて取得された試料像に基づいて、電子顕微鏡の観察視野を検索することは困難であった。
【０００７】
本発明は、光学顕微鏡によって取得された像に基づいて、電子顕微鏡に代表される荷電粒子線装置にて取得すべき画像領域を選択するのに好適な試料像観察方法，画像処理装置，及び荷電粒子線装置を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、上記目的を達成するために、染色された試料の光学顕微鏡像と、荷電粒子線の照射によって検出されるＸ線に基づいて形成される元素マッピング像を比較することによって、荷電粒子検出のための位置を決定する方法、及び装置を提供する。このような構成によれば、例えば生体反応に対応した染色が施された光学顕微鏡像中の反応部位を、電子顕微鏡等の荷電粒子線装置の観察対象とすることが容易に実現できる。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、光学顕微鏡を用いて観察した試料について、荷電粒子線装置による観察のための視野探しを容易に実現することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明実施例を説明するために荷電粒子線装置の一例について、図面を用いて詳細に説明する。
【実施例１】
【００１１】
荷電粒子線装置は、走査電子顕微鏡，透過型電子顕微鏡，走査透過型電子顕微鏡、或いはイオンビーム照射装置等があるが、本例では走査電子顕微鏡を例として、本発明の一実施形態を、図１を用いて説明する。
【００１２】
図示のように、電子顕微鏡鏡本体１の電子銃２より放出された電子線３は、照射レンズ４により収束され、Ｘ方向およびＹ方向の偏向コイルで構成された走査コイル６により偏向される。２方向に偏向された電子線３は、対物レンズ５により、試料ステージ８に保持されている試料７上にフォーカスされ、試料７面上を走査する。
【００１３】
電子銃２は、電子銃制御装置１２により制御され、照射レンズ４，対物レンズ５は、それぞれ照射レンズ制御装置１３，対物レンズ制御装置１４により制御され、また、図示しない試料ステージ駆動機構は、試料ステージ制御装置１６により制御される。走査コイル６は、走査コイル制御装置１５により制御される。
【００１４】
これらの装置、すなわち、電子銃制御装置１２，照射レンズ制御装置１３，対物レンズ制御装置１４，走査コイル制御装置１５，試料ステージ制御装置１６が、観察条件制御装置を構成している。
【００１５】
試料７上を走査した電子線３により、試料７面上から発生した特性Ｘ線は、Ｘ線検出器１１より検出されて、画像処理装置１８に供給され、画像データとして記録，保存される。同時に、試料７から発生した二次電子は、二次電子検出器９により検出され、画像データとして画像処理装置１８に供給され、記録，保存される。同時に、試料７から発生した反射電子は、反射電子検出器１０により検出され、画像データとして画像処理装置１８に供給され、記録，保存される。
【００１６】
電子顕微鏡とは別に、光学的装置１７により取得された光学的像は、画像処理装置１８に供給され、画像データとして記録し、保存される。
【００１７】
この実施形態では、電子顕微鏡の観察条件設定装置、すなわち、電子銃制御装置１２，照射レンズ制御装置１３，対物レンズ制御装置１４，走査コイル制御装置１５，試料ステージ制御装置１６のそれぞれが、画像処理装置１８に所定の伝送線路で結合され、相互にデータの授受が行えるようになっていて、画像処理装置１８により試料ステージの駆動制御や各レンズの観察条件が設定できるように構成されている。
【００１８】
このため、画像処理装置１８は、たとえば、所定のプログラムが搭載されたコンピュータを備え、これにより、上記した試料ステージ駆動機構制御装置や観察条件設定装置に供給して、それらを制御するのに必要な制御データを生成することができるように構成されている。
【００１９】
以下、光学的装置で取り込んだ試料像と同一視野を荷電粒子装置で観察するときの動作の一例について、図２のフローチャートを用いて説明する。
【００２０】
本例では、“画像判定処理”，“画像記録処理”,“画像検索処理”,“条件登録処理”が、画像処理装置１８により実施される。
【００２１】
始めに、オペレータは光学顕微鏡用に染色された試料７を光学顕微鏡で観察し、その試料像を図１には示していないが、ＣＣＤカメラのような記録装置によって撮影し、その画像を画像処理装置１８に供給する。
【００２２】
次に、その光学顕微鏡用試料７を、走査型電子顕微鏡の試料室内の試料ステージ８にセットして、所定の手続きに従って、電子線３で試料７面上を走査し、発生した特性Ｘ線を、Ｘ線検出器１１により検出する（ステップ：２−１）。Ｘ線検出器１１によって検出された特性Ｘ線の強度を二次元的に表示した元素マッピング像を画像処理装置１８に供給し、画像データとして記録，保存される（ステップ：２−２）。
【００２３】
続いて、画像処理装置１８において、光学顕微鏡による試料像の画像データと元素マッピング像とを比較する。この際、画像相関法を用いると良い。画像相関の結果は、両画像の一致度であり、“一致度”として表示してもよい。
【００２４】
画像相関による結果から、最も合致度の高い元素マッピング像が選択されたら（ステップ：２−３）、その視野の二次電子像と反射電子像を観察する（ステップ：２−４）。なお、本例では、画像の一致度について所定のしきい値を設定しておき、そのしきい値を越えた画像を選択的に取得，観察、或いは記録するようにしても良い。
【００２５】
画像光学的装置による取得された試料像の元素マッピング像の取得と同時に、その視野の二次電子像と反射電子像を観察し、画像処理装置１８に画像データとして、記録してもよい。これら一連の画像データ、すなわち、光学的装置による試料像、その元素マッピング像、その二次電子像と反射電子像は、一つのデータ群として、画像処理装置１８に登録してもよい。
【００２６】
このとき、光学顕微鏡像の観察条件は、画像処理装置１８を介して、電子顕微鏡の観察条件設定装置に供給されているので、電子顕微鏡における観察条件は、光学顕微鏡の観察条件と一致している。画像のデータ群には、電子顕微鏡の観察条件設定装置のすべての条件が、たとえば、ｔｉｆ形式の画像フォーマットで保存された画像データの場合（ステップ：２−５）、タグ領域に、それらを書き込み、画像と対応して、電子顕微鏡の観察条件が記録されてもよい（ステップ：２−６，ステップ２−７）。つぎの観察位置へ試料ステージが移動し（ステップ：２−８）、必要に応じて、試料の観察に戻り、以降、同様のステップを実行する。
【００２７】
つぎに、この実施形態では、試料ステージの移動を光学的装置による観察領域を単位として移動するようにして、自動的に同じ視野を探しだす。このときの動作を図３のフローチャートを用いて説明する。
【００２８】
光学顕微鏡の試料像について、画像処理装置１８に供給された画像データから、光学顕微鏡の観察視野領域を求める（ステップ：３−１）。それを試料ステージの移動量の単位として、電子顕微鏡の試料ステージ制御装置１６により、試料ステージ８が移動するように制御する（ステップ：３−２）。
【００２９】
Ｘ線検出器１１による光学顕微鏡試料の元素マッピングの取得位置を、試料ステージの制御装置１６により読み取り、元素マッピング像と対応して記録する(ステップ：３−３)。Ｘ線検出器１１による光学顕微鏡試料の元素マッピングと、光学顕微鏡試料像との画像相関による結果を、たとえば、一致度として表示する（ステップ：３−４）。
【００３０】
Ｘ線検出器１１による光学顕微鏡試料の元素マッピングと、光学顕微鏡試料像との画像相関による合致度の順位によって、試料のマッピング像と二次電子像および反射電子像を順位付けする。光学顕微鏡試料像と、Ｘ線検出手段による光学顕微鏡試料の元素マッピング像と、二次電子像および反射電子像をデータ群として、画像処理装置１８に記録，保存する（ステップ：３−５）。また、この実施形態では、Ｘ線検出器１１による光学顕微鏡試料の元素マッピングの取得領域を、試料ステージの移動量として、試料ステージ８が移動するように、試料ステージ制御装置１６を制御するようにしてもよい。Ｘ線検出器１１による光学顕微鏡試料の元素マッピング像と、光学顕微鏡試料像との画像相関の結果、合致度が最も高いとき、或いは所定のしきい値を越えたときに、試料ステージ８の移動を停止し、その位置座標を記憶，保存する（ステップ：３−６）。
【００３１】
したがって、この実例によれば、走査型電子顕微鏡において、光学顕微鏡用試料を、電子顕微鏡用の特別な試料作製を施さずに、直接観察することができる。光学顕微鏡用試料の元素マッピング像と、その光学的装置による試料像との画像相関によって、光学顕微鏡の試料の観察部位と同一視野を走査型電子顕微鏡で観察することができる。生体反応に対応した染色が施されている光学顕微鏡用試料の反応部位を、直接、電子顕微鏡で観察することができるので、生体反応と微細構造の関連性を直接観察することができる。光学顕微鏡試料の元素マッピング像の取得領域を単位として、試料ステージを移動し、それらの座標情報を元素マッピング像と対応して保存する。光学顕微鏡試料の元素マッピング像と二次電子あるいは反射電子像をデータ群として保存し、合致度によって、順位付けし、最も一致度の高いところで、試料ステージの移動を自動的に停止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】走査型電子顕微鏡の一例を説明する図。
【図２】本発明実施例の動作を示すフローチャート（その１）。
【図３】本発明実施例の動作を示すフローチャート（その２）。
【符号の説明】
【００３３】
１…電子顕微鏡鏡体、２…電子銃、３…電子線、４…照射レンズ、５…対物レンズ、６…走査コイル、７…試料、８…試料ステージ、９…二次電子検出器、１０…反射電子検出器、１１…Ｘ線検出器、１２…電子銃制御装置、１３…照射レンズ制御装置、１４…対物レンズ制御装置、１５…走査コイル制御装置、１６…試料ステージ制御装置、１７…光学的装置、１８…画像処理装置。
【図１】
0004734148.tif 000002
【図２】
0004734148.tif 000003
【図３】
0004734148.tif 000004