(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量のＴＮＦおよびＣＤ１３受容体のリガンドまたはそれにつきコード化するポリヌクレオチドのコンジュゲーション生成物、および有効量のＩＦＮγまたはそれにつきコード化するポリヌクレオチドを含み、前記リガンドがＮＧＲモチーフを含有するペプチドであり、該ペプチドがＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ、ＮＧＲＡＨＡ、ＧＮＧＲＧ、シクロＣＶＬＮＧＲＭＥＣ、線状ＣＮＧＲＣ、および環状ＣＮＧＲＣからなる群より選択される医薬組成物。
【請求項２】
医薬上許容される担体および賦形剤を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＴＮＦがＴＮＦαまたはＴＮＦβである請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＴＮＦがスペーサーを通じて前記ペプチドに結合される請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記ペプチドが線状ＣＮＧＲＣ、または環状ＣＮＧＲＣであり、前記ＴＮＦのアミノ末端がグリシンを通じてＣＮＧＲＣペプチドに連結される請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＴＮＦがポリエチレングリコールまたはアシル残基で誘導体化された請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記ＴＮＦが抗体、および抗体断片からなる群より選択される化合物でさらにコンジュゲートされており、前記抗体またはその断片は腫瘍抗原、腫瘍脈管形成マーカーまたは細胞外マトリックスの成分からからなる群より選択される化合物に対して作られる請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記ＴＮＦが、異なるＴＮＦサブユニット上のＮＧＲモチーフを含有するペプチド、および前記化合物の双方にコンジュゲートされている請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
注射溶液または懸濁液または注入用の液体の形態である請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
リポソームの形態である請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
さらに、もう一つの抗腫瘍剤または診断腫瘍イメージング化合物を含む請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
もう一つの抗腫瘍剤がドキソルビシンである請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
有効量のＴＮＦおよびＣＤ１３受容体のリガンドまたはそれにつきコード化するポリヌクレオチドのコンジュゲーション生成物、および有効量のＩＦＮγまたはそれにつきコード化するポリヌクレオチドの癌の治療または診断用医薬組成物の製剤のための使用であって、前記リガンドがＮＧＲモチーフを含有するペプチドであり、該ペプチドがＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ、ＮＧＲＡＨＡ、ＧＮＧＲＧ、シクロＣＶＬＮＧＲＭＥＣ、線状ＣＮＧＲＣ、および環状ＣＮＧＲＣからなる群より選択される使用。
【請求項１４】
請求項１３に記載の使用であって、他の抗腫瘍剤または診断腫瘍イメージング化合物をさらに含めた、癌の治療または診断用医薬組成物の製剤のための使用。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の使用であって、前記コンジュゲーション生成物が、請求項１〜８のいずれかに記載のコンジュゲーション生成物である使用。
【請求項１６】
有効量のＴＮＦおよびＣＤ１３受容体のリガンドまたはそれにつきコード化するポリヌクレオチドのコンジュゲーション生成物、および有効量のＩＦＮγまたはそれにつきコード化するポリヌクレオチドを含み、組み合わせた、別々のまたは順次の製剤で用いることができ、前記リガンドがＮＧＲモチーフを含有するペプチドであり、該ペプチドがＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ、ＮＧＲＡＨＡ、ＧＮＧＲＧ、シクロＣＶＬＮＧＲＭＥＣ、線状ＣＮＧＲＣ、および環状ＣＮＧＲＣからなる群より選択される組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の組成物であって、前記コンジュゲーション生成物が、請求項１〜８のいずれかに記載のコンジュゲーション生成物である組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療で用いられる修飾されたサイトカインに関する。さらに詳しくは、本発明は腫瘍血管および抗原提示細胞に「ホーミングする」ことができるサイトカイン誘導体に関する。また、本発明は、修飾されたサイトカインを含む相乗的組合せに関する。
【背景技術】
【０００２】
幾つかのサイトカインの抗腫瘍活性は周知であり、記載されている。既にヒトにおいても治療的に用いられているサイトカインもある（２９）。例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびインターフェロンα（ＩＦＮα）のようなサイトカインは、腎臓転移性癌腫、毛様細胞白血病、カポシ肉腫、メラノーマ、多発性ミエローマ等のような異なるタイプの腫瘍を有する患者においてポジティブな抗腫瘍活性を示してきた。ＩＦＮβ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＴＮＦβ、ＩＬ−１、４、６、１２、１５およびコロニー刺激因子（ＣＦＳ）のような他のサイトカインは、幾つかのタイプの腫瘍に対してある種の抗腫瘍活性を示しており、したがって、さらなる研究の目的である。
【０００３】
一般に、サイトカインの治療的使用はその全身毒性によって強く制限されている。例えば、ＴＮＦは、元来、幾つかの腫瘍の出血性壊死を誘導するその能力につき（１）、および異なる腫瘍系に対するそのインビトロ細胞傷害性効果につき（２）発見されたが、それは、引き続いて、強い炎症誘発性活性を有することが判明し、これは、過剰生産条件の場合には、ヒト身体に危険なほど影響を及ぼす可能性がある（３）。
【０００４】
全身毒性はヒトにおける薬理学上活性量のサイトカインの使用に伴う基本的な問題であるので、新規な誘導体および治療的戦略は、その治療効果を維持しつつこのクラスの生物学的エフェクターの毒性効果を低下させることを目指して、現在評価中である。
【０００５】
幾つかの新規なアプローチは以下のものを対象とする。
ａ）ＴＮＦを腫瘍に送達し、局所濃度を増加させることができる融合タンパク質の開発。例えば、ＴＮＦおよび腫瘍特異的抗体からなる融合タンパク質が製造されている（４）。
ｂ）抗腫瘍活性を維持し、低下した全身毒性を有するＴＮＦ突然変異体の開発。したがって、ただ一つの受容体（ｐ５５またはｐ７５）を選択的に認識することができる突然変異体が既に調製されている（５）。
ｃ）その抗腫瘍活性を損なうことなくＴＮＦの幾つかの毒性効果を低下させることができる抗−ＴＮＦ抗体の使用。そのような抗体は既に文献で記載されている（３０）。
ｄ）より長い半減期を有するＴＮＦ誘導体の使用（例えば、ポリエチレングリコールとコンジュゲートしたＴＮＦ）。
【０００６】
腫瘍部位を選択的に標的化することができるＴＮＦ誘導体の調製が最近報告されている。例えば、抗−トランスフェリン受容体ｍＡｂの重鎖の遺伝子およびＴＮＦ遺伝子を融合することによって得られる融合タンパク質（４）、または腫瘍関連ＴＡＧ７２抗原に対するモノクローナル抗体の「ヒンジ」領域とＴＮＦとの融合タンパク質、またはＦｖ−ＴＮＦ融合タンパク質（６）が記載されている。
【０００７】
ＥＰ  ２５１  ４９４は、アビジンまたはストレプトアビジンとコンジュゲートした抗体、前記コンジュゲートした抗体およびビオチンでコンジュゲートされた診断または治療剤からなる化合物を複合体化できる剤を含む診断または治療剤を投与するシステムを開示しており、順次に投与され、適切に遅延されて抗体によって認識される標的細胞に対するビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介する治療または診断剤の局所化を可能とする。記載された治療または診断剤は金属キレート、特に、放射性核種のキレート、およびシスプラチン、ドキソルビシンのような低分子量抗腫瘍剤を含む。
【０００８】
ＥＰ  ４９６  ０７４はビオチン化抗体、アビジンまたはストレプトアビジンおよびビオチン化診断または治療剤の順次の投与を提供する方法を開示している。リシンのような細胞傷害剤は一般に記載されているが、放射性標識化合物に対する適用がほとんど開示されている。
【０００９】
ＷＯ  ９５／１５９７９は、リガンドまたは抗リガンドとコンジュゲートした特異的標的分子を含む第一のコンジュゲートの投与、引き続いての、抗リガンドに、またはリガンドに結合した毒性剤からなる第二のコンジュゲートの投与に基づく、細胞標的に対して強い毒性剤を局所化させる方法を開示する。
【００１０】
ＷＯ  ９８／１０７９５は、アミノ酸配列ＮＧＲを含有するペプチドを含む腫瘍に住みつく分子を開示する。サイトカインを腫瘍に対して標的化するためのペプチドの使用は記載されていない。
【００１１】
ＷＯ  ９９／１３３２９は、分子とＮＧＲ受容体のリガンドとのコンジュゲーションに基づく、分子を腫瘍脈管形成血管に標的化する方法を開示する。多数の分子が可能な候補として提案されているが、ドキソルビシンのみが具体的に記載されている。免疫応答を誘導するためのサイトカイン溶剤としてのＮＧＲ受容体のリガンドの使用は開示されていない。
【００１２】
ＷＯ  ０１／６１０１７は、ＴＮＦまたはＩＦＮγから選択されるサイトカインとＣＤ１３受容体のリガンドとの間のコンジュゲーション産物を開示する。
【００１３】
今回、驚くべきことに、ＣＤ１３受容体のリガンドとカップリングしたＴＮＦおよびＩＦＮγは、個々に、有効用量未満である用量での共投与に際して効果的な抗腫瘍活性が見られるように相乗的に作用することが判明した。加えて、我々は、修飾されたＴＮＦ、およびドキソルビシンなどのもう一つの抗腫瘍剤の組合せの抗腫瘍活性が、ＩＦＮγの投与によって増加されることを見出した。
【発明の開示】
【００１４】
本発明の態様によると、有効量のＴＮＦおよびＣＤ１３受容体のリガンドのコンジュゲーション産物、および有効量のＩＦＮγを含む医薬組成物が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本発明の種々の好ましい特徴および実施形態が、今回、非限定的例によって記載される。
【００１６】
ＣＤ１３受容体の前記リガンドは抗体またはＦａｂ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖなどのその断片、ペプチドまたはペプチド類似体、すなわち、任意で、修飾された非天然のアミノ酸を含有する、ＣＤ１３受容体に結合できるペプチド様分子であり得る。
【００１７】
ＣＤ１３は種々の種で高度に保存された１５０ｋＤａの膜貫通糖タンパク質である。それは、正常な細胞で、ならびに骨髄系腫瘍細胞系において、脈管形成内皮において、およびいくつかの上皮において発現される。ＣＤ１３は、通常「ＮＧＲ」受容体として同定される。リガンドは天然のもの、または合成されたものであってもよい。用語「リガンド」は、化学的に修飾されたリガンドともいう。リガンドの１以上の結合ドメインは、例えば、受容体に対する天然リガンド、または受容体に対する結合親和性を保持する天然リガンドの断片からなることができる。合成リガンドはデザイナーリガンドを含む。本明細書で用いるように、用語「デザイナーリガンド」とは、受容体の三次元形状と比較したその三次元形状に基づいた受容体に結合する可能性がある物質をいう。
【００１８】
リガンドは、好ましくは、ＣＮＧＲＣＶＳＧＣＡＧＲＣ、ＮＧＲＡＨＡ、ＧＮＧＲＧ、シクロＣＶＬＮＧＲＭＥＣまたはシクロＣＮＧＲＣのようなＮＧＲモチーフ、より好ましくはペプチドＣＮＧＲＣを含む直鎖または環状ペプチドである。そのようなリガンドは、本明細書に参考として組み込むＷＯ  ９８／１０７９５に記載されている。ＣＤ１３受容体のリガンドを同定する方法は、本明細書に参考として組み込むＷＯ９９／１３３２９に開示されている。
【００１９】
１つの実施形態において、ＣＤ１３受容体に結合することができる剤をスクリーニングする方法であって、前記方法は、細胞表面分子を剤と接触させ、前記剤が前記細胞表面分子に結合するかを決定することを含む。
【００２０】
本明細書で用いるように、用語「剤」は、限定されるものではないが、天然であるか否かを問わず、いずれかの適当な源から得ることができるか、あるいはいずれかの適当な源によって製造させることが可能であるテスト化合物などの化合物を含む。前記剤はペプチドを含むことがきる化合物のライブラリー、ならびに小有機分子、特に新しいリード化合物のような他の化合物から設計し、または得ることができる。例として、前記剤は、天然物質、生物学的高分子、または細菌、真菌、または動物（特に哺乳動物）細胞または組織、有機または無機分子、合成テスト化合物、半合成テスト化合物、構造または機能的ミメティック、ペプチド、ペプチドミメティック、誘導体化テスト化合物、全タンパク質から切断されたペプチド、または（例として、ペプチドシンセサイザーを用いるように）合成的にまたは組換え技術によって、またはその組合せにより合成されたペプチド、組換えテスト化合物、天然または非天然テスト化合物、融合タンパク質またはその同等物、およびその突然変異体、誘導体または組合せのような生物学的物質から作成された抽出物であってもよい。
【００２１】
前記剤はアミノ酸配列またはその化学的誘導体であり得る。前記物質は有機化合物または他の化学物質でもよい。
【００２２】
本明細書で用いるように、用語「ペプチド類似体」は、広義には、ＣＤ１３リガンドの結合活性を有するペプチド様分子をいう。
【００２３】
別法として、リガンドは免疫グロブリン（Ｉｇ）可変領域からの重鎖および軽鎖配列に由来してもよい。そのような可変領域は天然ヒト抗体、またはげっ歯類抗体などの他の種からの抗体に由来してもよい。あるいは、可変領域はヒト化抗体などの作成された抗体、または免疫化または非免疫化動物からのファージディスプレイ、または突然変異誘発ファージディスプレイライブラリーに由来してもよい。第二の代替物として、可変領域は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に由来することができる。リガンドは多量体化を達成するために、または結合ドメインの間のスペーサーとして作用するために、あるいはＩｇヒンジ配列または新規のスペーサーおよび人工リンカー配列を含む、リガンドをコード化する遺伝子中の制限部位の挿入に由来する他の配列を含むことができる。
【００２４】
リガンドは、１つ以上の免疫グロブリン可変領域に加えて、Ｉｇ重鎖定常領域の全てまたは一部を含んでもよく、従って、それは、天然全Ｉｇ、人工Ｉｇ、人工Ｉｇ様分子、一本鎖Ｉｇまたは一本鎖Ｉｇ様分子を含むことができる。代わりに、あるいは加えて、ＢＰはトキシンなどの他のタンパク質からの１以上のドメインを含んでもよい。
【００２５】
本明細書中で用いるように、「抗体」とは免疫ブロブリン遺伝子または免疫ブロブリン遺伝子の断片によって実質的にコード化された１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質をいう。抗体は無傷免疫ブロブリンとして、または種々のペプチダーゼでの消化によって生じた十分に特徴付けられた断片を含む多数の断片として存在してもよい。種々の抗体断片は無傷抗体の消化の項目で規定されるが、当業者であれば、抗体断片は化学的に、または組換えＤＮＡ方法を利用することによって新規に合成することができるのを認識するであろう。従って、本明細書中で用いる用語抗体は、全抗体の修飾によって生じた、または組換えＤＮＡ方法を用いて新規に合成された抗体断片も含む。用語「抗体」の使用により包含される抗体断片は、制限されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ二重特異性抗体、およびＦｄ断片を含む。
【００２６】
もしポリクローナル抗体が望まれるならば、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等）を、エピトープを有する免疫原性ポリペプチドで免疫化する。免疫化動物からの血清を収集し、公知の手法に従って処理する。もしエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清が他の抗原に対する抗体を含めば、ポリクローナル抗体は免疫親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。ポリクローナル抗血清を生産し、加工する技術は当分野で知られている。そのような抗体が作成できるためには、本発明は、動物またはヒトにおいて免疫原として用いるための他のポリペプチドにハプテン化された本発明のポリペプチドまたはその断片も提供する。
【００２７】
ポリペプチドにおける結合細胞表面エピトープに対するモノクローナル抗体も当業者によって容易に製造することができる。ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作成するための一般的な方法は周知である。不死化抗体生産細胞系は細胞融合によって、およびＢリンパ球のオンコジーンＤＮＡでの直接的形質転換、またはエプスタイン・バーウイルスでのトランスフェクションなどの他の技術によっても作り出すことができる。エピトープに対して生産されたモノクローナル抗体のパネルは、種々の特性、すなわち、イソタイプおよびエピトープ親和性をもってスクリーニングすることができる。
【００２８】
代替技術はファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることを含み、そこでは、例えば、ファージは、多種多様の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するそのコートの表面にｓｃＦｖ断片を発現する。この技術は当分野で周知である。
【００２９】
本発明の目的では、用語「抗体」は、特に断りのない限り、標的抗原に対するその結合活性を保有する全抗体の断片を含む。前記したように、そのような断片はＦｖ、Ｆ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）2断片、ならびに一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む。さらに、抗体およびその断片は、例えば、ＥＰ−Ａ−２３９４００に記載されたようにヒト化抗体であってもよい。
【００３０】
本明細書中で用いる用語「ペプチド」はポリペプチドおよびタンパク質を含む。用語「ポリペプチド」は一本鎖ポリペプチド分子ならびに、個々の構成ポリペプチドが共有結合または非共有結合手段によって連結される複数−ポリペプチド複合体を含む。用語「ポリペプチド」は、典型的には、５、１０または２０よりも多いアミノ酸を有する、長さが２以上のアミノ酸のペプチドを含む。
【００３１】
本発明で用いるポリペプチド配列は特定の配列またはその断片に制限されず、いずれかの源、例えば、関連ウイルス／細菌タンパク質、細胞類似体および合成ペプチド、ならびにその変種または誘導体から得られた相同配列も含むことは理解されるであろう。本発明のポリペプチド配列は、本発明のポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチドも含む。
【００３２】
本発明のアミノ酸配列に関連する用語「バリアント」または「誘導体」は、前記配列供給からのまたはそれへの１（以上）のアミノ酸のいずれかの置換、変形、修飾、置換、欠失または付加を含み、得られたアミノ酸配列は、好ましくは、標的化活性を有し、好ましくは、配列表に提示されたポリペプチドとしての活性の少なくとも２５〜５０％、より好ましくは少なくとも実質的に同一な活性を有する。
【００３３】
従って、本発明で用いるために配列を修飾することができる。典型的には、配列の活性を維持する修飾を行う。従って、１つの実施形態において、アミノ酸置換は、例えば、１、２または３〜１０、２０または３０置換からなすことができ、但し、修飾された配列は少なくとも約２５〜５０％の、または実質的に同一な活性を保有するものとする。しかしながら、別の実施形態においては、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、意図的に、ポリペプチドの生物的活性を低下させるようにすることができる。例えば、標的分子に結合できるままであるが、機能的エフェクタードメインを欠く欠失ポリペプチドは有用であり得る。
【００３４】
一般に、変種または誘導体のアミノ酸残基の２０％、１０％または５％未満が、配列表に示された対応する領域と比較して改変される。
【００３５】
アミノ酸置換は、例えば、治療的に投与されたポリペプチドの血漿半減期を増加させるための非天然の類似体の使用を含むことができる（療法で用いるペプチド誘導体の製造についてのさらなる詳細は後記参照）。
【００３６】
保存的置換は、例えば、以下の表に従ってなすことができる。第二の欄における同一ブロックおよび、好ましくは、第三の欄における同一行のアミノ酸は相互に置き換えることができる。
【００３７】
【表１】
0004761963.tif 000002
【００３８】
本発明のポリペプチドは前記ポリペプチドの断片およびそのバリアントも含み、配列の断片も含む。好ましい断片はエピトープまたは結合ドメインを含むものを含む。適当な断片は長さが少なくとも約５、例えば、１０、１２、１５または２０アミノ酸であろう。それらは、また、長さが２００、１００または５０アミノ酸未満であってもよい。タンパク質のポリペプチド断片およびその対立遺伝子および種変種は１以上（例えば、２、３、５または１０）の置換、欠失または挿入を含むことができ、これは保存された置換を含む。置換、欠失および／または挿入が、例えば、組換え技術によってなされた場合、配列表に示されたアミノ酸残基の好ましくは２０％、１０％または５％未満が改変される。
【００３９】
本発明のポリペプチドおよびコンジュゲートは、典型的には、例えば後記するように組換え手段によってなされる。しかしながら、それらは、固相合成のような当業者に周知の技術を用いて合成手段によってなすこともできる。化学合成ペプチドのための種々の技術は、ＢｏｒｇｉａおよびＦｉｅｌｄｓ，２０００，Ｔｉｂｔｅｃｈ  １８：２４３−２５１にレビューされており、そこに含まれる文献に詳細に記載されている。
【００４０】
ペプチドは、直接的にあるいは単一アミノ酸、６−アミノカプリル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ酸配列または有機残基であり得るスペーサーを通じて間接的にサイトカインにカップリングさせることができる。カップリング手法は当業者に知られており、遺伝子工学、または化学合成技術を含む。
【００４１】
ペプチドリガンドは、好ましくは、サイトカインＮ末端に連結し、従って、修飾されたサイトカインのその受容体への結合におけるいずれの干渉も最小化する。別法として、ペプチドは、分子上に天然に生じるまたは遺伝子工学技術で人工的に挿入されたアミド−またはカルボキシル−結合受容体であるアミノ酸残基に結合することができる。修飾されたサイトカインは、好ましくは、ペプチドをコード化する５’−連続配列を含むｃＤＮＡの使用によって調製される。
【００４２】
好ましい実施形態による、ＴＮＦおよびＣＮＧＲＣ配列の間のコンジュゲーション産物が提供される。より好ましくは、ＴＮＦのアミノ末端はスペーサーＧ（グリシン）を通じてＣＮＧＲＣペプチドに連結される。
【００４３】
得られた産物（ＮＧＲ−ＴＮＦ）は、ＲＭＡ−Ｔリンパ腫動物モデル上のＴＮＦよりも、より活性があることが判明した。さらに、ＮＧＲ−ＴＮＦで処理された動物は、さらなる腫瘍形成用量のＲＭＡ−ＴまたはＲＭＡ細胞を拒絶することができた。正常なＴＮＦと比較して、抗腫瘍活性の増加は免疫適格性動物では観察ができたが、免疫欠乏動物では観察できなかった。これは、「ＮＧＲ」ペプチドとコンジュゲートしたＴＮＦの抗腫瘍活性の増加が、コンジュゲートの直接的細胞傷害活性よりもむしろ増強された免疫応答によるものであることを示す。
【００４４】
また、ＮＧＲ−ＴＮＦによって誘導された、インビボ免疫効果は直接的にＣＤ１３受容体に関連することも示された。例えば、ＣＤ１３受容体に対する抗体ならびにＧＮＧＲＣリガンドはインビボにてＮＧＲ−ＴＮＦと競合することが観察されており、従って、ＮＧＲ−ＴＮＦによる受容体標的化のメカニズムを示唆する。
【００４５】
ＴＮＦ／ＣＤ１３リガンドコンジュゲートの治療指数は、２つのＴＮＦ受容体、ｐ７５ＴＮＦＲおよびｐ５５ＴＮＦＲのうちの１つに選択的に結合することができるＴＮＦの突然変異体形態を用いることによってさらに改良することができる。前記ＴＮＦ突然変異体は部位特異的突然変異誘発によって得ることができる（５；７）。
【００４６】
本発明による修飾されたサイトカインの薬物動態は、サイトカインそれ自体の血漿中半減期を延長することができるポリエチレングリコール誘導体を調製することによって改良することができる。
【００４７】
本発明のさらなる実施形態は二官能性誘導体によって提供され、そこでは、ＣＤ１３リガンドで修飾されたサイトカインは、腫瘍抗原または他の腫瘍脈管形成マーカー、例えば、αｖインテグリン、メタロプロテアーゼまたは血管成長因子に対する抗体、またはその断片、あるいは抗−テナシン抗体または抗−フィブロネクチンＥＤＢドメインのような細胞外マトリックスの成分に対して作られた抗体またはその断片とコンジュゲートされる。ＴＮＦと、胃および卵巣腺癌によって発現される腫瘍関連ＴＡＧ７２抗原に対するｍＡｂのヒンジ領域との間の融合産物の調製が最近報告されている（６）。
【００４８】
本発明のさらなる実施形態はビオチン／アビジン系での腫瘍前標的化によって提供される。このアプローチによると、三元複合体が異なる段階において腫瘍抗原部位で得られ、これは、１）ビオチン化ｍＡｂ、２）アビジン（またはストレプトアビジン）および３）ＣＤ１３リガンドおよびビオチンで修飾されたニ価サイトカインによって形成される。多数の論文が、免疫コンジュゲートでの従来の標的化と比較して、前標的化アプローチは、現実的には、遊離活性分子に対する標的にホーミングした活性分子の比率を増大させることができ、従って、治療毒性を低下させることを証明した（１１、１０、９、８）。このアプローチは、インビトロにて細胞傷害性を誘導でき、正常なＴＮＦが不活性な条件下で腫瘍細胞増殖を減少させることができるビオチン化ＴＮＦでの好都合な結果を生じた（１４、２６）。また、同時に腫瘍抗原および修飾されたサイトカインに結合する二重特異的抗体を用いることによって２相手法で行うこともできる。癌胎児性抗原およびＴＮＦに対して作られた二重特異的抗体の使用は、最近ＴＮＦ腫瘍前標的化のための手段として記載されている（３１）。
【００４９】
さらなる実施形態によると、本発明は、異なるＴＮＦサブユニット上の、（直接的に、またはビオチン−アビジンブリッジを介して間接的に）ＣＤ１３リガンドおよび抗体、またはその断片の双方にコンジュゲートしたＴＮＦ分子を含み、前記抗体またはその断片は、腫瘍細胞または腫瘍間質の他の成分、例えば、テナシンおよびフィブロネクチンＥＤＢドメイン上に発現された抗原に対して作られる。この結果、修飾されたサイトカインの腫瘍ホーミング特性がさらに改良され、トリマー−モノマー−トリマー転移を通じて腫瘍内微少環境において後者がゆっくりと放出される。以前の研究で示されているように、事実、ＴＮＦコンジュゲートの修飾されたサブユニットは標的化複合体から解離し、再度会合して、未修飾三量体ＴＮＦ分子を形成することができ、これは、次いで、腫瘍内微少環境で拡散する。生体活性ＴＮＦの放出は、標的化から２４〜４８時間以内に起こることが示されている（２１）。
【００５０】
本発明のペプチドは、治療的に患者に投与することができる。天然に生じるアミノ酸だけからなるのではなく、修飾されて、例えば、免疫原生を低下させ、患者の体内での循環半減期を増加させ、生物学的利用性を増強し、および／または効率および／または特異性を高めるペプチドを用いるのが好ましい。
【００５１】
治療への適用でペプチドを修飾するために、多数のアプローチが用いられてきた。１つのアプローチは、ペプチドまたはタンパク質を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）のような種々のポリマーに連結させることである。例えば、米国特許第５，０９１，１７６号、第５，２１４，１３１号および米国特許第５，２６４，２０９号参照。
【００５２】
ペプチドを修飾するために、Ｄ−アミノ酸およびＮ−メチルアミノ酸などの種々の未コードまたは修飾アミノ酸での天然に生じるアミノ酸の置き換えを用いることも可能である。
【００５３】
もう１つのアプローチはＮ−スクシンイミジル３−（２ピリジルジチオ）プロピオネート、スクシンイミジル６−［３−（２ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート、およびスルホスクシンイミジル６−［３−（２ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエートのような二官能性架橋剤を用いることである（米国特許第５，５８０，８５３号参照）。
【００５４】
立体配座的に拘束された本発明のペプチドの誘導体を用いるのが望ましいであろう。立体配座的拘束とは、ペプチドによって採られた三次元形状の安定性および好ましい立体配座をいう。立体配座的拘束は、ペプチド中の単一残基の立体配座移動度を制限することを含む局所的拘束、いくつかの二次構造ユニットを形成することができる残基の群の立体配座的移動度を拘束することを含む地域的拘束、および全ペプチド構造を含む全体的拘束を含む。
【００５５】
ペプチドの活性な立体配座は、環化のような共有結合修飾によって、またはγ−ラクタムまたは他のタイプのブリッジの取込みによって安定化することができる。例えば、側鎖を骨格に環化させて、相互作用部位の各側にＬ−γ−ラクタム部位を作り出すことができる。一般に、Ｈｒｕｂｙ  ｅｔ  ａｌ，「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｎｓ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ：２５９−３４５（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．１９９２）参照。環化は、例えば、システインブリッジの形成、各末端アミノ酸のアミノおよびカルボキシ末端基のカップリング、またはＬｙｓ残基のアミノ基または関連ホモログのＡｓｐ，Ｇｌｕまたは関連ホモログのカルボキシ基とのカップリングによって達成することもできる。ポリペプチドのα−アミノ基の、無水ヨード酢酸を用いるリシン残基のε−アミノ基とのカップリングも行うことができる。Ｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｗｅｔｚｅｌ，１９９２，Ｉｎｔ’ｌ  Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．３９：５３３−３９参照。
【００５６】
米国特許第５，８９１，４１８号に記載されたもう１つのアプローチは、ペプチド構造中に金属イオン錯体化骨格を含むことである。典型的には、好ましい金属ペプチド骨格は、所定の錯体化金属イオンの配位圏によって要求される必要な数の特定の配位基に基づく。一般に、有用であることが判明するであろう金属イオンのほとんどは４〜６の配位数を有する。ペプチド鎖中の配位基の性質は、アミン、アミド、イミダゾール、またはグアニジノ官能性を有する窒素原子、チオールまたはジスルフィドの硫黄原子、およびヒドロキシ、フェノール、カルボニル、またはカルボキシル官能性の酸素原子を含む。加えて、ペプチド鎖または個々のアミノ酸は、例えば、オキシム、ヒドラジノ、スルフヒドリル、ホスフェート、シアノ、ピリジノ、ピペリジノまたはモルホリノのような配位基を含むように化学的に改変することができる。ペプチド構造体は線状または環状いずれかであり得るが、線状構造体が典型的には好ましい。小さな線状ペプチドの１つの例はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙであり、これは、配位数４にて金属イオンに錯体化することができる骨格中に４つの窒素を有する（Ｎ4錯体化系）。
【００５７】
治療ペプチドの特性を改良するさらなる技術は、非ペプチドペプチド類似体を用いることである。広く種々の有用な技術を用いて、ペプチドの正確な構造を解明することができる。これらの技術はアミノ酸配列決定、ｘ線結晶学、質量分光測定、核磁気共鳴分光学、コンピューター−援助分子モデリング、ペプチドマッピング、およびその組合せを含む。ペプチドの構造解析は、一般には、ペプチドのアミノ酸配列ならびにその原子成分の三次元位置決定を含む大量のデータを提供する。この情報から、治療活性のための必要な化学的官能性を有するが、より安定な、例えば、生物学的分解に対して感受性が低い非ペプチドペプチド類似体を設計することができる。このアプローチの例は米国特許第５，８１１，５１２号に提供されている。
【００５８】
本発明の治療ペプチドを化学的に合成するための技術は前記文献に記載されており、また、Ｂｏｒｇｉａ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ，２０００，ＴｉｂＴｅｃｈ  １８：２４３−２５１にレビューされており、そこに含まれた文献に詳細に記載されている。
【００５９】
治療で用いるには、本発明の修飾されたサイトカインは、経口または非経口投与用の医薬製剤に適切に処方される。非経口投与用の処方が好ましく、それは、注射溶液または懸濁液および注入用液体を含む。非経口形態の調製では、有効量の有効成分を滅菌担体に溶解または懸濁させ、所望により、可溶化剤、等張剤、保存剤、安定化剤、乳化剤または分散剤のような賦形剤を添加し、それを引き続いて密封されたバイアルまたはアンプルに分配する。
【００６０】
より詳細には、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを含む本発明のコンジュゲートは、好ましくは、種々の成分と組み合わせて、本発明の組成物を製造することができる。好ましくは、組成物は医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、（ヒトまたは動物用途であり得る）医薬組成物を製造する。適当な担体および希釈剤は等張生理食塩水、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水を含む。賦形剤の詳細はＴｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，２ｎｄ  Ｅｄｎ，Ｅｄｓ  Ｗａｄｅ  ＆  Ｗｅｌｌｅｒ，米国薬学会、に見出すことができる。本発明の組成物は直接的注射によって投与することができる。組成物は非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、経口または経皮投与用に処方することができる。
【００６１】
組成物は、毎日、毎週または毎月の投与が所望の日用量を提供するように処方することができる。組成物は、便宜には、２、４、６、８、１０または１２時間毎のように余り頻繁ではなく投与するために処方してもよい。
【００６２】
ポリペプチド成分をコード化するポリヌクレオチド／ベクターは、好ましくは、さらに、宿主細胞ゲノムに相同なフランキング配列を含む裸の核酸構築体として直接的に投与することができる。
【００６３】
哺乳動物細胞による裸の核酸構築体の摂取はいくつかの公知のトランスフェクション技術、例えば、トランスフェクション剤の使用を含むものによって増強される。これらの剤の例はカチオン性剤（例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストラン）およびリポフェクタント（例えば、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍ（商標）およびｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標））を含む。典型的には、核酸構築体をトランスフェクション剤と混合して、組成物を得る。
【００６４】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを医薬上許容される担体または希釈剤と組み合わせて、医薬組成物を得る。適当な担体および希釈剤は等張生理食塩水、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水を含む。組成物は非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内または経皮投与用に処方することができる。
【００６５】
記載された投与経路および投与方法は指針のみを目的とする。というのは、当業者であれば、いずれかの特定の患者および疾患について最適な投与経路および投与方法を容易に決定することができるからである。
【００６６】
リポソームの形態のサイトカインの製剤はその生物学的活性を改良することができる。事実、ＴＮＦアミノ基のアシル化は、インビトロにおける生物学的活性の喪失なしでその疎水性の増加を誘導することが観察された。さらに、脂質に結合したＴＮＦはインビトロにおいて影響されない細胞傷害性、インビボにて免疫変調効果および低下した毒性を有することが報告されている（１２、１３）。
【００６７】
ヒトにおけるボーラスＴＮＦの最大許容用量は２１８〜４１０μｇ／ｍ2（３２）であり、動物における有効用量よりも約１０倍低い。ネズミモデルからのデータに基づき、少なくとも１０倍高い用量が、ヒトにおいて抗腫瘍効果を達成するのに必要であると考えられる（１５）。高熱単離四肢灌流についての第一の臨床試験において、メルファランおよびインターフェロンγと組み合わせた４ｍｇのＴＮＦのユニークな用量で高応答速度が得られた（１６）。他の研究は、インターフェロンγは省略することができ、治療応答を誘導するのにより低い用量のＴＮＦでさえ十分であり得ることを示した（１７、１８）。二つのサイトカインは内皮細胞に対して相乗的効果を発揮するので、それに対するそれらの組み合わせられた選択的標的化はより強い抗腫瘍活性をもたらし、従って、組み合わせて用いる同一サイトカインでの癌療法で通常遭遇する全身毒性の問題を克服するのを可能とする。さらに、ＴＮＦは内皮ライニング血管のバリアー機能を減少させることができ、従って、高分子に対するそれらの浸透性を増加させることが知られている。本発明による修飾されたＴＮＦ分子での処置のより低い毒性、およびそれらの腫瘍血管ホーミング特性を利用し、別の適用は、治療または診断目的いずれかで、腫瘍血管の他の化合物に対する浸透性を増加させるためのそれらの使用である。例えば、修飾されたＴＮＦを用いて、腫瘍の放射免疫シンチグラフィーまたは放射免疫療法における放射性標識抗体またはホルモン（腫瘍イメージング化合物）の腫瘍摂取を増加させることができる。別法として、化学療法薬物、イムノトキシン、薬物または遺伝子を運ぶリポソーム、または他の抗癌薬物の摂取は、それらの抗腫瘍効果が高められるように増大させることも可能である。
【００６８】
従って、本発明のサイトカインは、癌の治療または診断において、他の診断または治療物質と共に、組み合わせた、別々のまたは順次の製剤で用いることができる。
【００６９】
本発明は、修飾されたＴＮＦ、およびＩＦＮγの組合せの使用に関する。この組合せは、組み合わせた、別々のまたは順次の製剤で用いることができる。効果的には、前記組合せは、ドキソルビシンおよびメファランのような癌の治療または診断において他の診断または治療物質と一緒にすることもできる。従って、本発明は、修飾されたＴＮＦおよびＩＦＮγの組合せおよび、所望により、もう一つの腫瘍診断または抗腫瘍治療物質を含む医薬組成物を提供する。再度、この組合せは、組み合わせた、別々のまたは順次の製剤で用いることができる。
【００７０】
我々の特許出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０３／０２１８７において、我々は、ピコグラム用量のサイトカインの標的化送達が化学療法薬物の侵入を促進し、化学療法薬物の治療指標を増加させるための新規かつ驚くべき戦略を提供することを見出した。特許出願番号ＰＣＴ／ＩＢ０３／０２１８７は、その全体を本明細書に参考として組み込む。より詳細には、我々は、非常に低い用量のサイトカインの、腫瘍、および腫瘍血管系を含めた腫瘍関連環境への送達は、負のフィードバックメカニズムを回避し、薬物−侵入バリアーを改変するその能力を保持する新しいアプローチを表すことを見出した。
【００７１】
本発明の組成物は非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内、経口または経皮投与用に処方することができる。本発明のこの態様の一つの実施形態において、本発明のコンジュゲートを０．５〜５００ｎｇ／ｋｇの範囲、好ましくは１〜５０ｎｇ／ｋｇの範囲、より好ましくは５〜１５ｎｇ／ｋｇの範囲からの用量にて投与することができる。
【００７２】
本発明のこの態様の別の実施形態において、ＩＦＮγと組み合わせた本発明のコンジュゲートを含む医薬組成物が提供され、ここに、コンジュゲートは、コンジュゲートまたはその代謝物が約３５，０００ｎｇ／日以下、好ましくは約３，５００ｎｇ／日、より好ましくは約１，０００／日の量にて治療すべき対象の血漿に提供されるような量で存在させる。
【００７３】
前記用量は７０ｋｇ対象についての用量に関する。当業者であれば、７０ｋｇ以外の質量を有する対象についての引用された用量を容易に変更することができよう。
【００７４】
記載された投与経路および投与方法は単に指針のみを目的とする。というのは、当業者は、いずれかの特定の患者および疾患のための最適な投与経路および投与方法を容易に決定することができるからである。
【００７５】
本発明のもう一つの態様は、好ましくは、前記した住み着きペプチドにつき、ＣＤ１３リガンドをコード化する５’−または３−連続ＤＮＡ配列の添加によってサイトカインｃＤＮＡから調製することができる、本明細書に開示するコンジュゲーテッドサイトカインをコード化するｃＤＮＡに関する。組み合わせたｃＤＮＡは、それ自体、あるいは遺伝子治療のためのベクターへの挿入後に用いることができる。適当なベクターの調製および治療的適用は、本明細書に参考として組み込む（１９）に開示されている。
【００７６】
本発明で用いるポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドコンジュゲートをコード化する核酸配列を含む。多数の異なるポリヌクレオチドが、遺伝子暗号の縮重の結果として同一のポリペプチドをコード化することができるのは当業者に理解されるであろう。加えて、当業者であれば、ルーチン的技術を用い、本発明のポリペプチドがそこで発現されるべきいずれかの特定の宿主生物のコドン用法を反映する、本発明のポリヌクレオチドによってコード化されるポリペプチド配列に影響しないヌクレオチド置換をなすことができるのは理解される。
【００７７】
本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができる。それらは一本鎖または二本鎖であってもよい。それらは、その中に合成または修飾されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なるタイプの修飾が当分野で知られている。これらがメチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリシン鎖の添加を含む。本発明の目的では、ここに記載するポリヌクレオチドは当分野で利用できるいずれの方法によっても修飾することができるのは理解される。そのような修飾を行って、本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強させることができる。
【００７８】
本発明のポリヌクレオチドは組換複製可能ベクターに取り込むことができる。前記ベクターを用いて、適合する宿主細胞において核酸を複製することができる。従って、さらなる実施形態において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを複製可能ベクターに導入し、前記ベクターを適合する宿主細胞に導入し、次いで、ベクターの複製を行わせる条件下で宿主細胞を増殖させることによって、本発明のポリヌクレオチドの製法を提供する。前記ベクターは宿主細胞から回収することができる。適当な宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉのような細菌、酵母、哺乳動物細胞系および他の真核生物細胞系、例えば、昆虫Ｓｆ９細胞を含む。
【００７９】
好ましくは、ベクター中の本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞（すなわちベクターが発現ベクターである）によるコード配列の発現を提供することができる対照配列に作動可能に連結される。用語「作動可能に連結した」は、記載された成分が、それがその意図した方法で機能することを可能とする関係にあることを意味する。コード配列に「作動可能に連結した」調節配列は、対照配列と適合する条件下でコード配列の発現が達成されるように連結される。
【００８０】
対照配列は、例えば、対照配列によって指令される転写のレベルを、転写モジュレーターに対してより応答しやすくするためのさらなる転写調節エレメントの添加によって修飾することができる。
【００８１】
本発明のベクターは、後記する適当な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトして、本発明のタンパク質の発現を提供することができる。このプロセスは、タンパク質をコード化するコード配列のベクターによる発現を可能とする条件下で前記した発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養し、所望により、発現されたタンパク質を回収することを含んでもよい。
【００８２】
ベクターは、例えば、複製起点、所望により、前記ポリヌクレオチドの発現用のプロモーターおよび、所望により、プロモーターのレギュレーターを備えたプラスミドまたはウイルスベクターであってよい。ベクターは１以上の選択マーカー遺伝子、例えば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子、または哺乳動物ベクターではネオマイシン耐性遺伝子を含むことができる。ベクターを用いて、例えば、宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換することができる。
【００８３】
本発明のタンパク質をコード化する配列に作動可能に連結した対照配列はプロモーター／エンハンサーおよび他の発現調節シグナルを含む。これらの対照配列は、発現ベクターがそこで用いるように設計される宿主細胞と適合するように選択することができる。用語「プロモーター」は当分野で周知であり、サイズおよび複雑性において、最小プロモーターから、上流エレメントおよびエンハンサーを含めたプロモーターまでの核酸領域を含む。
【００８４】
原核生物プロモーターおよび他の真核生物細胞で機能するプロモーターを用いることもできるが、プロモーターは、典型的には、哺乳動物細胞において機能的なプロモーターから選択される。プロモーターは、典型的には、ウイルスまたは真核生物遺伝子のプロモーター配列に由来する。例えば、それは、発現が起こるべき細胞のゲノムに由来するプロモーターであってもよい。真核生物プロモーターに関しては、それらは（ａ−アクチン、ｂ−アクチン、チューブリンなどの）普遍的な方法、あるいは、（ピルビン酸キナーゼについての遺伝子のプロモーターのような）組織特異的方法において機能するプロモーターであり得る。ある種の細胞に特異的な組織特異的プロモーターを用いることもできる。また、それらは、特異的刺激に応答するプロモーター、例えば、ステロイドホルモン受容体に結合するプロモーターであってもよい。また、ウイルスプロモーター、例えば、モロニーネズミ白血病ウイルス末端反復（ＭＭＬＶ  ＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、またはヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーターを用いることもできる。
【００８５】
異種遺伝子の発現のレベルが細胞の生きた間に調節できるように、プロモーターは誘導性であるのが有利であろう。誘導性とは、プロモーターを用いて得られた発現のレベルを調節できることを意味する。
【００８６】
加えて、これらのプロモーターのいずれも、さらなる調節配列、例えば、エンハンサー配列の添加によって修飾することができる。また、前記した２つ以上の異なるプロモーターからの配列エレメントを含むキメラプロモーターを用いることもできる。
【００８７】
本発明のベクターおよびポリヌクレオチドは、ベクター／ポリヌクレオチドを複製する、および／または本発明のポリヌクレオチドによってコード化された本発明のタンパク質を発現する目的で宿主細胞に導入することができる。本発明のタンパク質は宿主細胞として原核生物細胞を用いて製造することができるが、真核生物細胞、例えば、酵母、昆虫または哺乳動物細胞、特に哺乳動物細胞を用いるのが好ましい。
【００８８】
本発明のベクター／ポリヌクレオチドは、トランスフェクション、形質転換およびエレクトロポレーションのような当分野で公知の種々の技術を用いて適当な宿主細胞に導入することができる。本発明のベクター／ポリヌクレオチドを動物に投与する場合、いくつかの技術、例えば、レトロウイルス、単純疱疹ウイルスおよびアデノウイルスのような組換ウイルスベクターでの感染、核酸の直接的注入およびバイオリスティック形質転換が当分野で知られている。
【００８９】
本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を用いて、本発明のコンジュゲートを発現させることができる。本発明のポリペプチドおよびコンジュゲートの発現を可能とする適当な条件下で宿主細胞を培養することができる。本発明の生成物の発現は、それが継続的に生産されるように構成されていてもよいか、または誘導的であってよく、発現を開始するのに刺激を必要とする。誘導性発現の場合には、タンパク質生産は、必要な場合、例えば、培養液への誘導物質、例えば、デキサメタゾンまたはＩＰＴＧの添加によって開始することができる。
【００９０】
本発明のコンジュゲートは、酵素的、化学的および／または浸透圧溶解および物理的破壊を含む当分野で知られた種々の技術によって宿主細胞から抽出することができる。
【００９１】
以下の実施例は本発明をさらに説明する。
【実施例１】
【００９２】
ネズミＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの調製
ネズミ組換えＴＮＦおよびＣｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＴＮＦ（ＮＧＲ−ＴＮＦ）はＥ．ｃｏｌｉにおける細胞質ｃＤＮＡ発現によって生産された。ネズミＭｅｔ−ＴＮＦ1-156（２０）をコードするｃＤＮＡは、３’および５’プライマーとして、
５’−ＣＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＣＴＣＣＡＡＡＧ−３’および
５’−ＴＧＣＣＴＣＡＣＡＴＡＴＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣ−３’
を用い、リポ多糖−刺激ネズミＲＡＷ−２６４．７単球−マクロファージ細胞から単離されたｍＲＮＡに対する逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって調製した。
【００９３】
増幅された断片をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）で消化し、同一酵素（ｐＴＮＦ）で既に消化されたｐＥＴ−１１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）にクローン化した。
【００９４】
Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−ＴＮＦ1-156をコードするｃＤＮＡは、５’プライマーとしての５’−ＧＣＡＧＡＴＣＡＴＡＴＧＴＧＣＡＡＣＧＧＣＣＧＴＴＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＣ−３’、および前記３’プライマーを用い、ｐＴＮＦに対するＰＣＲによって増幅された。増幅された断片を消化し、前記したようにｐＥＴ−１１ｂにクローン化し、これを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換した。ＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの発現は、ｐＥＴ１１ｂ製造業者の指示に従い、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導した。２ｍＭエチレンジアミン四酢酸、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中での細菌音波処理、続いての遠心（１５０００×ｇ，２０分，４℃）によって、可溶性ＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦを２リットルの培養から回収した。双方の抽出物を硫酸アンモニウム（飽和２５％）と混合し、４℃にて１時間放置し、前記したようにさらに遠心した。次いで、上清中の硫酸アンモニウムを飽和の６５％とし、４℃にて２４時間放置し、さらに遠心した。各ペレットを２００ｍｌの１Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に溶解させ、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ）での疎水性相互作用クロマトグラフィー（グラジエント溶出、緩衝液Ａ：５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、１Ｍ硫酸アンモニウムを含有、緩衝液Ｂ：２０％グリセロール、５％メタノール、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）によって精製した。ＴＮＦ免疫反応性物質（ウェスタンブロッティングによる）を含有する画分をプールし、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に対して透析し、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ）によるイオン交換クロマトグラフィー（グラジエント溶出、緩衝液Ａ：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；緩衝液Ｂ：１Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）によってさらに精製した。ＴＮＦ−免疫反応性を含む画分をプールし、予め平衡化して、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．３（ＰＢＳ）で溶出したＳｅｐｈａｃｒｙｌ−Ｓ−３００  ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ）でのゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。４００００〜５００００Ｍｒ生成物に対応する画分をプールし、分注し、−２０℃にて凍結保存した。クロマトグラフィー工程で使用した全ての溶液は滅菌水およびエンドトキシンフリーの水（Ｓａｌｆ，Ｂｅｒｇａｍｏ，Ｉｔａｌｙ）で調製した。最終収率はＴＮＦが４５ｍｇ、およびＮＧＲ−ＴＮＦが３４．５ｍｇであった。
【００９５】
精製されたＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの分子量は電子スプレー質量分析によって測定した。タンパク質含有量は市販のタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて測定した。ＮＧＲ−ＴＮＦおよびＴＮＦのエンドトキシン含有量は、定量的発色性Ｌｙｍｕｌｕｓ  Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ（ＬＡＬ）テスト（ＢｙｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）によって測定して、各々、０．７５ユニット／μｇおよび１．３８ユニット／μｇであった。
【００９６】
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウェスタンブロット分析は、標準的手法によって、１２．５または１５％ポリアクリルアミドゲルを用いて行った。
【００９７】
可溶性ｐ５５−ＴＮＦ受容体（ｓＴＮＦ−Ｒ１）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅでのアフィニティークロマトグラフィーによって、少量のＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦをさらに以下のように精製した。５ｍｇの組換えｓＴＮＦ−Ｒ１を記載されたように調製し（２２）、製造業者の指示に従って２ｍｌのＡｃｔｉｖａｔｅｄ−ＣＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にカップリングさせた。２つの別々のカラム（各々、１ｍｌ）を滅菌したエンドトキシンのない溶液で十分に洗浄し、ＰＢＳ中の精製されたＴＮＦまたはＮＧＲ−ＴＮＦを負荷し、グラジエント溶出（１時間、緩衝液Ａ：ＰＢＳ、緩衝液Ｂ：０．５Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ）によって脱着した。ＴＮＦ−抗原含有画分を中和し、滅菌生理食塩水に対して透析した。エンドトキシンのないヒト血清アルブミンを透析前に添加して（０．５ｍｇ／ｍｌ）、膜上へのタンパク質吸着を防止した。各画分におけるＴＮＦ含有量をＥＬＩＳＡおよび細胞溶解アッセイによって測定した。
【００９８】
ＴＮＦの非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、モノマーＴＮＦにつき予測されるように１７〜１８ｋＤａの単一のバンドを示した（図示せず）。それとは相違して、非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびＮＧＲ−ＴＮＦのウェスタンブロット分析は、モノマー、ダイマーおよびトリマーに対応するらしい１８、３６および５０ｋＤａの異なる免疫反応性形態を示した。還元性条件下では、５０および３６ｋＤａバンドのほとんどは１８ｋＤａ形態に変換されたが、これは鎖間ジスルフィドブリッジを有するＮＧＲ−ＴＮＦ分子の存在を示す。１８ｋＤａバンドは全物質の約２／３を占め、他方、３６ｋＤａは残りの部分のほとんどを占めた。これらの電気泳動パターンは、ＮＧＲ−ＴＮＦが、正しい鎖内ジスルフィド（少なくとも５０％）を有する３つのモノマーサブユニットから形成されるトリマー、および１以上の鎖間ジスルフィドを有するトリマーがほとんどの残りの部分の混合物であったことを示唆する。還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって依然として観察された３６ｋＤａバンドは、ＮＧＲ−ＴＮＦが不可逆的変性ダイマー（全体の約１０％）も含んだことを示唆する。
【００９９】
ＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦモノマーの分子量は、エレクトロスプレー質量分析によると、各々、１７３８６．１±２．０Ｄａおよび１７８４３．７±２．５Ｄａであった。これらの値はＭｅｔ−ＴＮＦ1-156（１７３８６．７Ｄａ）およびＣＮＧＲＣＧ−ＴＮＦ1-156（１７８４４．２Ｄａ）につき予測される質量に確実に一致している。
【実施例２】
【０１００】
ネズミＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦのインビトロ細胞傷害性活性
ＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの生物活性は、記載されている（２３）Ｌ−Ｎマウス線維芽細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１．２）に基づく標準的な細胞溶解アッセイによって見積もった。ＲＭＡ−Ｔ細胞に対するＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの細胞溶解活性は３０ｎｇ／ｍｌアクチノマイシンＤの存在下でテストした。各試料を３つの異なる希釈にて二連で分析した。結果を２〜３の独立したアッセイの平均±ＳＤとして表す。
【０１０１】
ＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦのインビトロ細胞傷害性活性は、Ｌ−Ｍ細胞での標準細胞溶解アッセイによると、各々、（１．２±０．１４）×１０8ユニット／ｍｇおよび（１．８±０．７）×１０8ユニット／ｍｇであった。これらの結果は、ＮＧＲ−ＴＮＦ分子におけるＣＮＧＲＣＧ部位が、折りたたみ、オリゴマー化、およびＴＮＦ受容体への結合を妨げないことを示す。
【０１０２】
以前の研究において、我々は、ＲＮＡ−Ｔ細胞が３０ｎｇ／ｍｌアクチノマイシンＤの存在下でＴＮＦによって殺傷され得るのに対し、転写阻害剤の不存在下では、これらの細胞は、数日のインキュベーションの後にさえＴＮＦに対して耐性であることを示した。アクチノマイシンＤの存在下におけるＲＭＡ−Ｔ細胞に対するＮＧＲ−ＴＮＦのインビトロ細胞傷害性活性は、標準としてＴＮＦ（（１．２±０．１４）×１０8ユニット／ｍｇ）を用いて測定して、（１．４±０．８）×１０8ユニット／ｍｇであった。従って、ＮＧＲ−ＴＮＦおよびＴＮＦの細胞傷害性活性は、Ｌ−Ｍ細胞およびＲＭＡ−Ｔ細胞双方に対して同様であった。
【実施例３】
【０１０３】
ネズミＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの治療および毒性活性の特性
Ｃ５７ＢＬ／６起源のラウシャーウイルス誘導ＲＭＡリンパ腫を、ＲＰＭＩ１６４０、５％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ、２ｍＭグルタミンおよび５０μＭ２−メルカプトエタノール中でインビトロにて維持した。ＲＭＡ−Ｔは、Ｔｈｙ１．１対立遺伝子をコード化する構築体でのトランスフェクションによってＲＭＡ細胞系から誘導し、記載されているように培養した（１４）。
【０１０４】
Ｂ１６Ｆ１メラノーマ細胞をＲＰＭＩ  １６４０、５％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ、２ｍＭグルタミン、１％ＭＥＭ非必須アミノ酸中で培養した（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，ベルギー）。
【０１０５】
動物モデルについてのインビボ研究は、Ｓａｎ  Ｒａｆｆａｅｌｅ  Ｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの倫理委員会によって承認されており、所定のガイドラインに従って行った。Ｃ５７ＢＬ／６（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｌｃｏ，イタリア）（１６〜１８ｇ）を、各々、５×１０4ＲＭＡ−ＴまたはＢ１６Ｆ１生細胞で左脇腹を皮下注射した。腫瘍移植から１０日〜１２日後、マウスを２５０μｌのＴＮＦまたはＮＧＲ−ＴＮＦ溶液で腹腔内処理し、エンドトキシンフリーの０．９％塩化ナトリウムで希釈した。予備的実験は、抗腫瘍活性が、担体としての、ＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦ溶液へのヒト血清アルブミンの添加によって変化しなかったことを示した。各実験は群当たり５匹のマウスで行った。腫瘍増殖は、腫瘍サイズをキャリパーで測定することによって毎日モニターした。腫瘍の面積はｒ１×ｒ２を計算することによって見積もり、他方、腫瘍用量はｒ１×ｒ２×ｒ３×４／３を計算することによって見積もり、ここで、ｒ１およびｒ２は長手方向および横方向半径であり、ｒ３は正常な皮膚の表面から突き出た腫瘍の厚みである。腫瘍が１．０〜１．３ｃｍ直径に到達する前に動物を殺した。腫瘍のサイズは平均±ＳＥ（図面の脚注に示したように群当たり５〜１０匹の動物）として示し、ｔ検定によって比較した。
【０１０６】
ＮＧＲ−ＴＮＦの抗腫瘍活性および毒性を、Ｃ５７ＢＬ６マウスにおけるＲＭＡ−Ｔリンパ腫およびＢ１６Ｆ１メラノーマモデルを用いてＴＮＦのそれと比較した。ＲＭＡ−Ｔモデルはすでに特徴付けられており、それを用いて、異なる標的プロトコル（２６）にてＴＮＦの抗腫瘍活性を調べているので、我々は、本実験においてもこのモデルを用いるように決定した。
【０１０７】
確立された皮下ＲＭＡ−Ｔ腫瘍を担う動物に投与されたネズミＴＮＦは、腫瘍の中央部分において腫瘤の２４時間後における低下および出血性壊死を引き起こし、続いて、数日間の有意な成長の遅れを引き起こす（２６）。ＴＮＦでの単一処理は、ＬＤ５０に近い用量においてさえ、この腫瘍の完全な退縮を誘導しない。というのは、壊死領域の周りに残る生細胞は処理から数日後には再び増殖を開始するからである。
【０１０８】
実験の第一の組においては、我々は、動物生存に対する種々の用量（腹腔内）のＴＮＦまたはＮＧＲ−ＴＮＦの効果を調べた。過剰な罹患を回避するために、腫瘍の直径が１〜１．３ｃｍよりも大きくなると動物を屠殺した。ＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの致死率は、処理から３日後には、同様であり（各々、ＬＤ５０、６０μｇおよび４５μｇ）、他方、それらの抗腫瘍活性は顕著に異なった（表１）。
【０１０９】
【表２】
0004761963.tif 000003
【０１１０】
例えば、１または３μｇのＮＧＲ−ＴＮＦ、次いで、２７μｇのＴＮＦは腫瘍増殖をより効果的に遅らせ、これは、ＮＧＲ−ＴＮＦが少なくとも一桁活性が大きかったことを示す。興味深いことには、何匹かの動物はＬＤ５０よりも低いＮＧＲ−ＴＮＦの用量で治癒され、他方、ＴＮＦではいずれの動物も全く治癒されなかった。治癒された動物をＲＭＡ−Ｔまたは野生型ＲＭＡ細胞いずれかの腫瘍形成性用量でのさらなる攻撃を拒絶し、これは、ＮＧＲ−ＴＮＦでの単一処理が保護的免疫性を誘導できたことを示唆する。ＴＮＦまたはＮＧＲ−ＴＮＦの用量を９〜２７μｇを超えて増加させると、毒性を顕著に増加させ、治療効果は不十分にしか増加させず、または増加させないことは価値あることである。
【０１１１】
ＴＮＦ処理に続いての体重の減少は全身毒性の周知の兆候である（２６）。従って、ＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの効果／毒性の比率をさらに比較するために、我々は、処理の後における腫瘍の増殖および動物の体重をモニターした。腫瘍増殖に対する１μｇのＮＧＲ−ＴＮＦの効果は９μｇのＴＮＦのそれと同様であるか、またはそれよりも高く（図１ａ）、他方、処理から１日〜２日後における体重の減少は１μｇのＴＮＦのそれと匹敵した（図１ｃ）。我々はデータを用量−応答プロットした対数曲線に内挿すると、我々は、第１４日における９μｇのＴＮＦの治療効果が、わずか０．６μｇのＮＧＲ−ＴＮＦで得ることができるのを見出した（図１ｂ）。対照的に、匹敵する毒性効果を誘導するのに８．５μｇを必要とした（図１ｄ）。従って、これらの条件下でのＮＧＲ−ＴＮＦの計算された効果／毒性比率はＴＮＦのそれよりも１４倍高い。
【０１１２】
同様の結果がＢ１６Ｆ１メラノーマモデルで得られた。第１１日および第１７日における１μｇのＮＧＲ−ＴＮＦでの処理により、４μｇのＴＮＦで得られたよりも大きく、かつ１２μｇのＴＮＦで得られたのと同様な抗腫瘍応答が第１９日に誘導された（データは示さず）。対照的に、１μｇのＮＧＲ−ＴＮＦによって引き起こされた体重の減少は、４および１２μｇのＴＮＦによって引き起こされたのよりも顕著に低かった。１２μｇのＮＧＲ−ＴＮＦでの処理はより強い抗腫瘍効果さえ引き起こし、他方、毒性効果は１２μｇのＴＮＦのそれと同様であった。
【０１１３】
第１９日に第３の注射を行うと、全ての群において１〜２日後に何匹かの動物が死亡した（生理食塩水および１２μｇのＮＧＲ−ＴＮＦで処理した群においては５匹のうち２匹、および残りの群においては５匹のうち１匹）。注目すべきは、１２μｇのＮＧＲ−ＴＮＦで処理した１匹の動物は腫瘍を完全に拒絶した。この動物を第２の腫瘍形成用量のＢ１６Ｆ１細胞で攻撃すると、１８日後に触知可能な腫瘍が発生し、他方、対照動物は６〜７日以内に腫瘍を発生した。
【０１１４】
これらの結果は、全てを統合すると、腫瘍増殖を阻害するにおけるＮＧＲ−ＴＮＦの効果はＴＮＦのそれよりも１０〜１５倍大きく、他方、毒性は同様であることを示唆する。さらに、ＮＧＲ−ＴＮＦはＴＮＦよりもより効果的に保護免疫応答を誘導することができる。
【実施例４】
【０１１５】
ＮＧＲ−ＴＮＦの作用メカニズム
抗−マウスＣＤ１３  ｍＡｂ  Ｒ３−６３は、プロテイン−Ｇセファロースクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ，Ｕｐｐｓａｌａ，スウェーデン国）によって腹水から精製し、０．９％で塩化ナトリウムに対して透析した。
【０１１６】
ウサギポリクローナル抗血清はＰｒｉｍｍ  ｓｒｌ（ミラノ，イタリア国）から購入し、プロテイン−Ａ−セファロース（Ｐｈａｒｉｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ）でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ＣＮＧＲＣおよびＣＡＲＡＣペプチドは以前に記載されているように調製した（２８）。
【０１１７】
ＮＧＲ−ＴＮＦの改良された活性がＮＧＲ部位を介する腫瘍標的化に依存するという証拠を提供するために、我々は、ＮＧＲ−ＴＮＦのインビボ活性がＣＮＧＲＣによって部分的に競合され得るか否かを調べた。この目的で、我々は、モル過剰のＣＮＧＲＣがある場合、もしくは無い場合、ＲＭＡ−Ｔ腫瘍担持マウスにＮＧＲ−ＴＮＦ（１μｇ）を投与した。平行して、他の動物を、再度、ＣＮＧＲＣの有る場合または無い場合で、ＴＮＦ（３または９μｇ）で処理した。予測どおり、ＣＮＧＲＣはＮＧＲ−ＴＮＦの抗腫瘍活性を有意に減少させたが（図２ａ）、ＴＮＦのそれは有意に減少させなかった（図２ｂ）。それとは相違して、対照ペプチド（ＣＡＲＡＣ）はＮＧＲ−ＴＮＦ活性の有意な減少を引き起こすことができなかった（図２ｃ）。これらの結果は、ＮＧＲ−ＴＮＦのＣＮＧＲＣ受容体への結合につきＣＮＧＲＣが競合することを示唆し、改良された活性に対する標的化メカニズムの仮説を支持する。注意すべきことには、ＣＮＧＲＣはＮＧＲ−ＴＮＦのインビトロ細胞傷害性活性を減少させることができなかった（データは示さず）。
【０１１８】
最近、アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）はＣＮＧＲＣペプチドに対する受容体であることが報告されているので、次いで、我々はＮＧＲ−ＴＮＦの標的化メカニズムにおけるこの受容体の貢献を調べた。この目的で、我々は、ＮＧＲ−ＴＮＦおよびＴＮＦの抗腫瘍活性に対する抗−ＣＤ１３ｍＡｂ（Ｒ３−６３）の効果を調べた。ｍＡｂ  Ｒ３−６３はＮＧＲ−ＴＮＦの抗腫瘍活性を有意に阻害した（図２ａ）が、ＴＮＦのそれは阻害せず（図２ｂ）、これは、ＣＤ１３が実際にＮＧＲ−ＴＮＦの抗腫瘍活性に非常に関与することを示す。ＲＭＡ−Ｔ細胞表面でのＣＤ１３の発現は、ｍＡｂ  Ｒ３−６３での培養細胞のＦＡＣＳ分析によって観察されず（示さず）、これは、他の細胞がインビボにて抗体によって認識されたことを示唆する。
【０１１９】
これらのデータは、ＣＤ１３はＮＧＲ−ＴＮＦに対する重要な受容体であることを示すが、我々は、他の未だ同定されていないＮＧＲ受容体への結合もまた、より程度は低いが、標的化メカニズムに対して寄与することを完全には排除できない。
【０１２０】
部分的タンパク質分解の予備的実験は、ＴＮＦのＮ末端セグメント（残基２〜３）におけるＡｒｇ−Ｓｅｒ結合はトリプシンに対して非常に感受性であり、他方、分子の残りはかなり抵抗性であることを示した。従って、ＮＧＲ−ＴＮＦの改良された活性がそのＮＧＲ部位に関連するというさらなる証拠を提供するために、我々は、固定化トリプシンでの部分的消化によってムテインのＮ末端領域からＮＧＲドメインを切り出すことを試みた。この処理はＮＧＲ−ＴＮＦおよびＴＮＦ双方を、ＴＮＦ３−１５６断片（予測される質量１６９８６．２Ｄａ；測定された質量および予測された配列については図３ａ参照）に対応する分子に変換した。
【０１２１】
消化はＬ−Ｍ細胞に対するＮＧＲ−ＴＮＦのインビトロ細胞溶解活性を減少させなかった（２．３±１．４）×１０8Ｕ／ｍｇ、そのインビボ抗腫瘍活性はＴＮＦのレベルまで減少した（図３ｂ）。注目すべきことには、処理から１日後における動物の体重減少から判断して（図３ｂ、右側のパネル）、ＮＧＲ−ＴＮＦおよびＴＮＦの毒性は消化の前および後の双方において同様であり、これは、ＮＧＲ依存性標的化メカニズムが毒性を改変しないことを示唆する。
【実施例５】
【０１２２】
ヒトＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの調製および特徴付け
（ＣＮＧＲＣＧのＣ末端と融合させたヒトＴＮＦ１−１５７からなる）ヒト組換えＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦは組換えＤＮＡ技術によって調製し、実質的には、ネズミＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦについて記載したように精製した。ヒトＮＧＲ−ＴＮＦをコードするｃＤＮＡは、以下のプライマー：
−ＮＧＲ−ｈＴＮＦ／１（センス）：５’Ａ  ＴＡＴ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＴＧＣ  ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＣＧＴ  ＴＧＣ  ＧＧＣ  ＧＴＣ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＴＣｄＴ  ＴＣＴ  ＣＧ３’
−ＮＧＲ−ｈＴＮＦ／２（アンチセンス）：５’ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＧＡＣ３’
を用い、ｈＴＮＦコード配列（３３）を含むプラスミドｐＥＴ１１ｂ／ｈＴＮＦに対するＰＣＲによって調製した。
【０１２３】
増幅された断片を消化し、ｐＥＴ−１１ｂ（ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ）にクローン化し、これを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換した。ＮＧＲ−ｈＴＮＦの発現は、ｐＥＴ１１ｂ製造業者の指示に従ってイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導した。可溶性ＮＧＲ−ＴＮＦは、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の細菌音波処理、続いての遠心（１５０００×ｇ，２０分，４℃）によって２リットルの培養から回収した。
【０１２４】
抽出物を硫酸アンモニウム（飽和の３５％）と混合し、４℃にて１時間放置し、前記したようにさらに遠心した。次いで、上清中の硫酸アンモニウムを飽和の６５％とし、４℃にて２４時間放置し、さらに遠心した。各ペレットを１Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に溶解させ、フェニル−セファロース６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ）での疎水性相互作用クロマトグラフィー（グラジエント溶出、緩衝液Ａ、１Ｍ硫酸アンモニウムを含有する１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０；緩衝液Ｂ、７０％エチレングリコール、５％メタノール、１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）によって精製した。（ＥＬＩＳＡによる）ｈＴＮＦ免疫反応性物質を含有する画分をプールし、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に対して透析し、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ）でのイオン交換クロマトグラフィー（グラジエント溶出、緩衝液Ａ：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０；緩衝液Ｂ：１Ｍ塩化ナトリウム，２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０）によってさらに精製した。クロマトグラフィー工程で使用した全ての溶液は滅菌されたエンドトキシンフリーの水（Ｓａｌｆ，Ｂｅｒｇａｍｏ，イタリア国）で調製した。
【０１２５】
この時点で、約３０ｍｇのＴＮＦおよび３２ｍｇのＮＧＲ−ＴＮＦを２リットルの培養から回収した。非還元性ＳＤＳ−ＴＡＧＥはモノマー、ダイマーおよびトリマーに対応するバンドを示し、これは、ネズミＮＧＲ−ＴＮＦで観察して、ヒトＮＧＲ−ＴＮＦもまた正しい鎖内ジスルフィドを有するトリマーおよび１以上の鎖間ジスルフィドブリッジを有するトリマーの混合物であることを示唆する（図４Ａ、レーンｂ）。
【０１２６】
正しい鎖内ジスルフィドブリッジを有するトリマーは、以下のように、４−工程変性−再折畳みプロセスによってこの混合物から単離された。精製されたヒトＮＧＲ−ＴＮＦを７ｍ尿素で変性し、７Ｍ尿素、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０で平衡化したＨＲ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラム（１０２５ｍｌ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を通してゲル濾過した。モノマーＴＮＦに対応する画分をプールし、ＹＭ  ＭＷＣＯ  １０ｋＤａ膜（Ａｍｉｃｏｎ）を通じて限外濾過し、３３容量の４℃の２．３３Ｍ尿素、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８（１４０分）、続いての１．５５Ｍ尿素、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８（１４０分）および１Ｍ尿素、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８（１４０分）に対する透析によってリフォールディングを行った。最後に、生成物を８０容量の１００ｍＭトリス−ＨＣｌに対して透析し（１６時間）、１３０００×ｇで遠心し（３０分）、ＳＦＣＡ  ０．４５μｍ膜（Ｎａｌｇｅｎｅ）を通して濾過し、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５Ｍリン酸ナトリウム（ＰＢＳ）で予め平衡化したＨＲ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００カラム（１０２０ｍｌ）を通してゲル濾過した。約２３ｍｇのリフォールディングされたタンパク質が回収された。
【０１２７】
最終生成物は非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図４Ａ、レーンｃ）後にはほとんどモノマーであり、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ＨＲカラムでの分析ゲル−濾過ＨＰＬＣによるトリマーヒトＴＮＦのそれと同様な流体力学容量を有し（示さず）、エレクトロスプレー質量分析による（ＣＮＧＲＣＧ−ＴＮＦ１−１５７，１７９３９．４Ｄａで予測された）１７９３７．８＋１．８Ｄａの分子量を有した。マウスＬ−Ｍ細胞に対するリフォールディングされていない、もしくはリフォールディングされたＮＧＲ−ＴＮＦのインビトロ細胞溶解活性は、各々、（６．１１×１０７）＋４．９および（５．０９×１０７）＋０．３ユニット／ｍｇであり、他方、精製されたヒトＴＮＦのそれは（５．４５×１０７）＋３．１ユニット／ｍｇであった。これらの結果は、変性−リフォールディングプロセスがヒトＮＧＲ−ＴＮＦとネズミｐ５５受容体との相互作用に影響しなかったことを示唆する。
【０１２８】
１μｇのヒトＮＧＲ−ＴＮＦ（リフォールディングされていない）のインビボ抗腫瘍活性は１０μｇのＴＮＦよりも大きく（図４Ｂ）、他方、動物体重喪失によって判断して、毒性は有意により低かった（図４Ｃ）。リフォールディングの後、０．３μｇのＮＧＲ−ＴＮＦは、１０μｇのＴＮＦで達成されたよりも強い抗腫瘍効果を誘導するのに十分であった（図４Ｄ、４Ｅ）。
【０１２９】
これらの結果は、ヒトＮＧＲ−ＴＮＦの抗腫瘍活性がヒトＴＮＦのそれよりも大きいことを示す。
【０１３０】
さらに、我々は、再度折り畳まれたヒトおよびマウスＮＧＲ−ＴＮＦが毒性効果の証拠なしで非常に低い用量（１〜１０ｎｇ／マウス）においてさえＲＭＡ−Ｔ−担持マウスに対して有意な抗腫瘍効果を誘導することができ、他方、ＴＮＦはこれらの用量において有意な効果を誘導することができなかった（示さず）ことを観察した。
【実施例６】
【０１３１】
マウスＮＧＲ−ＩＦＮγの調製および特徴付け
ＣＮＧＲＣＧと融合させた組換えネズミインターフェロン（ＩＦＮ）γ（ＮＧＲ−ＩＦＮγ）は、実質的にはＮＧＲ−ＴＮＦについて記載したように組換えＤＮＡ技術によって調製した。ＣＮＧＲＣドメインはＩＦＮγのＣ末端と融合させた。さらに、位置１３４におけるシステインをセリンで置き換え、メチオニンをＥ．ｃｏｌｉ細胞での発現のために位置−１に導入した。ＮＧＲ−ＩＦＮγ  ｃＤＮＡの生産で用いたＰＣＲプライマーは、５’−Ａ  ＴＡＴ  ＣＴＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＣＡＣ  ＧＧＣ  ＡＣＡ  ＧＴＣ  ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  Ｃ（センス）および５’−ＴＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＡＣＧ  ＧＣＣ  ＧＴＴ  ＧＣＡ  ＧＣＣ  ＧＧＡ  ＧＣＧ  ＡＣＴ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＣＣＧ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＧＣであった。前記ｃＤＮＡをｐＥＴ−１１ｂ（Ｎｄｅ  Ｉ／ＢａｍＨＩ）にクローン化し、これを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）を形質転換した。ｐＥＴ１１ｂ製造業者の指示に従い、タンパク質の発現はイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導した。生成物は、標準的な技術に従い、アガロースに固定化された抗−マウスＩＦＮγ  ｍＡｂ（ＡＮ１８）を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーによってＥ．ｃｏｌｉ抽出物から精製した。最終生成物の還元性および非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、１６ｋＤａの単一バンドを示した。電子スプレー質量分析は、ネズミＭｅｔ−ＩＦＮγ１−１３４（Ｃ１３４Ｓ）ＣＮＧＲＣ（ＮＧＲ−ＩＦＮγ）に対応する１６２２３＋３．６Ｄａ（予測、１６２５．５Ｄａ）の分子量を示した。
【０１３２】
腫瘍関連血管への抗−ＣＤ１３抗体の結合に競合するＮＧＲ−ＩＦＮγおよびＮＧＲ−ＴＮＦの能力を、免疫組織化学アプローチを用いることによって調べた。
【０１３３】
ヒト腎臓細胞癌腫の新鮮な外科的検体はＳａｎ  Ｒａｆｆａｅｌｅ  Ｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの組織病理学部門から入手した。ボウイン（Ｂｏｕｉｎ）−固定（４〜６時間）パラフィン包埋検体の切片（５〜６μｍ厚み）を調製し、ポリリシン−被覆スライドに吸着させた。ＣＤ１３抗原を以下のようにアビジン−ビオチン複合体を用いて検出し、標準的な手法に従い、組織切片をキシレンおよび上質アルコール系を用いて再度水和した。組織切片を１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する容器に入れ、マイクロ波オーブン（１０００Ｗ）を用いて７分間煮沸した。次いで、容器に再度１ｍＭ  ＥＤＴＡを充填し、再度５分間煮沸した。組織切片を冷却させ、０．３％過酸化水素を含有するＰＢＳ中で１５分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼをクエンチした。次いで、試料をＰＢＳで洗浄し、１００〜２００μｌのＰＢＳ−ＢＳＡ（室温で１時間）、続いてｍＡｂ  ＷＭ１５（抗−ｈＣＤ１３）単独で、あるいはＰＢＳ−ＢＳＡ中の種々の競合剤（表２参照）と混合して（４℃で一晩）でインキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳで３回洗浄し（各々３分）、２％正常ウマ血清を含有するＰＢＳ−ＢＳＡ（ＰＢＳ−ＢＳＡ−ＮＨＳ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と共に５分間インキュベートした。次いで、溶液をＰＢＳ−ＢＳＡ−ＮＨＳ中の３μｇ／ｍｌビオチン化ウマ抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で置き換え、室温にて、さらに１時間インキュベートした。スライドを再度洗浄し、ＰＢＳ中に１：１００希釈したＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ試薬（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と共に３０分間インキュベートした。次いで、３，３’−ジアミノ−ベンチジン−テトラヒドロクロライド（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ国）の錠剤を、０．０３％過酸化水素を含有する１０ｍｌ脱イオン水に溶解させ、０．２μｍの膜を通して濾過し、組織切片上に５〜１０分間重ねた。スライドを前記したように洗浄し、Ｈａｒｒｉｓのヘマトキシリンで対比染色した。腫瘍関連血管は、組織の系列的切片を抗−ＣＤ３１  ｍＡｂ（ＤＡＫＯ，コペンハーゲン，デンマーク国からのｍＡｂ  ＪＣ／７０Ａ，抗−ヒトＣＤ３１，ＩｇＧ１）で染色することによって同定した。
【０１３４】
結果を表２にまとめる。表に示されたように、腫瘍関連血管へのＷＭ１５の結合は過剰のＮＧＲ−ＴＮＦ、ＮＧＲ−ＩＦＮγおよびＣＮＧＲＣによって阻害されるが、ＮＧＲモチーフを欠く他の対照試薬によっては阻害されなかった。これは、ＣＤ１３上のＮＧＲ結合部位がＷＭ１５エピトープとは立体的に重ならないことを示す。対照的に、ＮＧＲ−ＴＮＦは内皮細胞への１３Ｃ０３の結合と競合しなかった。
【０１３５】
我々は、ＮＧＲ−ＩＦＮγおよびＮＧＲ−ＴＮＦのＮＧＲ部位が、腫瘍関連血管上のｍＡｂ  ＷＭ１５によって認識されるＣＤ１３形態と相互作用できると結論する。さらに、これらの結果は、ＣＮＧＲＣモチーフが、サイトカインＮ末端、またはＣ末端いずれかに結合した場合に機能的であることを示す。
【０１３６】
【表３】
0004761963.tif 000004
【実施例７】
【０１３７】
抗腫瘍抗体およびアビジンを用いるビオチン化ＮＧＲ−ＴＮＦの腫瘍への標的化送達（前標的化）
以下の実施例は、腫瘍ホーミング抗体およびペプチドＣＮＧＲＣの組合せに基づく、ＴＮＦの「デュアル」標的化の可能性を示す。
【０１３８】
ビオチン−ＮＧＲ−ＴＮＦコンジュゲートは、１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．８中でＮＧＲ−ＴＮＦをＤ−ビオチニル−６−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシイミドエステル（Ｓｏｃｉｅｔａ  Ｐｒｏｄｏｔｔｉ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｉ  Ｓ．ｐ．Ａ，ミラノ，イタリア国）と混合することによって（室温にて３時間）調製した（２１）。反応は１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５でブロックした。
【０１３９】
前記コンジュゲートを質量分析によって特徴付けし、１ビオチン／トリマー（平均）を含有することが判明した。次いで、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｌｃｏ，イタリア国）を５×１０4ＲＭＡ−Ｔ生細胞で左脇腹を皮下攻撃した。腫瘍の面積が４０ｍｍ2に到達すると、以前に記載されているように（２６）「３日」プロトコルに従って、ビオチニル化抗体、アビジンおよびビオチン−ＴＮＦの順次の注射によってマウスを処理した。我々は、各々、１８時間および１９時間後に４０μｇビオチン−ｍＡｂ１９Ｅ１２（腹腔内、工程Ｉ）、６０μｇアビジンおよび６０μｇストレプトアビジン（腹腔内、工程ＩＩ）、２４時間後に３μｇのビオチン−ＮＧＲ−ＴＮＦ（腹腔内、工程ＩＩＩ）を注射した。各化合物を滅菌０．９％塩化ナトリウム溶液で希釈した。対照実験では、アビジンおよびストレプトアビジンを省略した。各実験を５マウス／群で行った。腫瘍のサイズをキャリパーで測定することによって、腫瘍の増殖を毎日モニターした。処理前および処理から１０日後の腫瘍の面積は、ｍＡｂ  １９Ｅ１２−ビオチン／アビジン／ストレプトアビジン／ビオチン−ＮＧＲ−ＴＮＦで処理した群においては、各々、３９±４ｍｍ2および８±５ｍｍ2であった（５動物、平均±ＳＥ）。（ｍＡｂ  １９Ｅ１２−ビオチン／ビオチン−ＮＧＲ−ＴＮＦ単独で処理した）対照群においては、処理前および処理から１０日後における腫瘍面積は、各々、４０±４ｍｍ2および２０±６ｍｍ2であり、これは、腫瘍住み着き抗体およびアビジンでの前標的化がＮＧＲ−ＴＮＦの活性を増加させたことを示す。
【実施例８】
【０１４０】
ＮＧＲ−ＴＮＦおよびインターフェロン−γの間の相乗的活性
マウスＢ１６Ｆ１メラノーマ細胞を従前に記載されているように培養した（Ｃｕｒｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｍｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【０１４１】
中和抗−ＩＦＮγモノクローナル抗体ＡＮ１８は、親切にも、Ｐ．Ｄｅｌｌａｂｏｎａ（ミラノ，イタリア国）から贈られた。ドキソルビシン（アドリブラスチナン）はＰｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ（ミラノ，イタリア国）から購入した。組換えネズミＩＦＮγはＰｅｐｒｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（ＵＳＡ）から購入した（エンドトキシン含有量：＜１ユニット／μｇ）。ＢＡＬＢ／ｃ自然発生乳癌腫からのＴＳ／Ａ細胞はＲＰＭＩ  １６４０培地、１０％胎児ウシ血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ、２ｍＭグルタミン、および非必須アミノ酸を含む１％の最小必須培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｖｅｒｖｉｅｒｓ，ベルギー国）中で培養した。
【０１４２】
ネズミＴＮＦおよび（ＣＮＧＲＣＧのＣ末端と融合させたＴＮＦからなる）ＮＧＲ−ＴＮＦは組換えＤＮＡ技術によって調製し、記載されているように（Ｃｕｒｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，２０００）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞抽出物から精製した。クロマトグラフィー工程で用いた全ての溶液は滅菌しかつエンドトキシンのない水（Ｓａｌｆ，Ｂｅｒｇａｍｏ，イタリア国）で調製した。タンパク質濃度は市販のタンパク質定量アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で測定した。ＮＧＲ−ｍＴＮＦの細胞溶解活性は９．１×１０7ユニット／ｍｇであった。ＮＧＲ−ｍＴＮＦの流体力学容量は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，スウェーデン国）でのゲル濾過クロマトグラフィーによると、ｍＴＮＦ、ホモトリマータンパク質（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｇｌｉｏｎｉ，１９８７）のそれと同様であった。ＮＧＲ−ｍＴＮＦのエンドトキシン含有量は０．０８２ユニット／μｇであった。
【０１４３】
ＤＮＡ操作は標準的な組換えＤＮＡ方法によって行った。ネズミＩＦＮγをコードするｃＤＮＡは、以下のプライマー：５’ＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＣＧＣＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＡＴＣＴＴＧＧＣ３’（順方向プライマー）；５’ＴＡＴＡＴＴＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＣＡＧＣＧＡＣＴＣＣＴＴＴＴＣＣＧＣ３’（逆方向プライマー）を用い、フォルボール１２−ミリステート１３−アセテートで刺激したネズミリンパ球から得られたｃＤＮＡに対するＰＣＲによって調製した。プライマーは、リーダー配列を含む全長マウスＩＦＮγをコードするｃＤＮＡ配列を増幅するように設計した。それらは、哺乳動物発現ベクターｐＲＳ１−ｎｅｏにクローン化してｐＲＳ１ｎｅｒｏ−ＩＦＮγを生じさせるためのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位（下線）を含む。次いで、Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．−Ｄｉａｇｅｎ，ＧｍｂＨ，ドイツ国）を用いて調製し、滅菌したエンドトキシンフリーの水（Ｓ．Ａ．Ｌ．Ｆ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏ  Ｆａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃｏ  ＳｐＡ，Ｂｅｒｇａｍｏ，イタリア国）中に１ｍｇ／ｍｌに希釈した。ｐＲＳ１ｎｅｏ−ＩＦＮγ（３μｇ）をＲＰＭＩ１６４０中の１００μｌの０．０３ｍｇ／ｍｌリポフェクチン試薬（Ｇｉｂｃｏ  Ｂｒｌ）と混合し、室温で２０分間インキュベートした。次いで、混合物を、１日前に２４ウェルマイクロタイタープレートに入れたＴＳ／Ａ細胞に添加した（ウェル当たり２００μｌの培養液中に４×１０4細胞）。３７℃、５％ＣＯ2における４時間のインキュベーションの後、２ｍｌの培養基を各ウェルに添加した。インキュベーションの４８時間後、培養液を、１０％胎児ウシ血清、２ｍＭグルタミンを追加した、１ｍｇ／ｍｌジェネテシンを含有するＲＰＭＩ１６４０で交換した。１週間後に、細胞生存選択を、ジェネテシンの存在下における９６−ウェルマイクロタイタープレート中での限界希釈によってクローン化した。各クローンの上清をＩＦＮγ−ＥＬＩＳＡによってテストした。１０のＩＦＮγ−分泌クローンが得られた。培養液１ｍｌ当たり１．１３μｇのＩＦＮγを生産するＴＳ／Ａ−ＩＦＮγという名称の１つのクローンを選択し、インビボ実験で用いた。
【０１４４】
ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＡ。ＰＣＶマイクロタイタープレート（べクトンディッキンソン，ｃｏｄ．３９１２）をＰＢＳ中で５μｇ／ｍｌ  ｍＡｂ  ＡＮ１８で被覆した（４℃にて１６時間）。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした（ＰＢＳ−ＢＳＡ，３７℃にておいて１時間）。次いで、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、細胞培養上清またはＰＢＳ−ＢＳＡ中に希釈したマウスＩＦＮγ標準溶液と共にインキュベートした。プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｍｅｒｃｋ）を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−ＴＷ）で８回洗浄し、ｍＡｂ  ＸＭＧ１．２−ｂｉｏと共にインキュベートした（ＰＢＳ中０．２μｇ／ｍｌ，３７℃において１時間）。プレートをＰＢＳ−ＴＷで再度洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡ中に１：３０００希釈したストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（シグマ）と共に３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−ＴＷで洗浄した後、結合したペルオキシダーゼをｏ−フェニレンイジアミンニ塩酸塩ペルオキシダーゼ基質（シグマ）で検出した。１０％硫酸を添加することによって、発色反応を３０分後にブロックした。ＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダー（バイオラッド）でＡ490を測定した。
【０１４５】
動物モデルにおいての実験は、Ｓａｎ  Ｒａｆｆａｅｌｅ  Ｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの倫理委員会によって承認され、所定のガイドラインに従って行った。体重が１６〜１８ｇのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｌｃｏ，イタリア国）を５×１０4またはＢ１６Ｆ１生細胞の皮下注射を左脇腹に試みた。５日後、マウスをＮＧＲ−ｍＴＮＦおよびｍＩＦＮγ溶液（１００μｌ）で処理し、２時間後に、ドキソルビシン溶液（１００μｌ）を投与した。全ての薬物を腹腔内（ｉ．ｐ）投与した。０．９％塩化ナトリウム単独で希釈したドキソルビシンを除き、薬物は１００μｇ／ｍｌのエンドトキシンフリーのヒト血清アルブミン（Ｆａｒｍａ−Ｂｉａｇｉｎｉ，Ｌｕｃｃａ，イタリア国）を含有する０．９％塩化ナトリウムで希釈した。腫瘍の増殖は、従前に記載されているように（Ｇａｓｐａｒｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）キャリパーで腫瘍を測定することによって毎日モニターした。腫瘍が直径１．０〜１．５ｃｍに達する前に動物を屠殺した。腫瘍のサイズは平均±ＳＥとして示す（５動物／群）。
【０１４６】
内因性ＩＦＮはＮＧＲ−ＴＮＦ／ドキソルビシン治療活性にとって重要である。
【０１４７】
我々は、以前、ＮＧＲ−ｍＴＮＦおよびドキソルビシンがＢ１６−Ｆ１腫瘍担持免疫適格性マウスにおいて相乗的効果を奏し、ドキソルビシンの抗腫瘍活性は０．１ｎｇのＮＧＲ−ｍＴＮＦの前投与によって増加することを示した（前記およびＣｕｒｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。従って、ドキソルビシン（８０μｇ）と組み合わせた低量のＮＧＲ−ｍＴＮＦ（０．１ｎｇ）のＢ１６−Ｆ１０腫瘍担持マウスの投与は、ドキソルビシン単独で得られたものよりも強い抗腫瘍効果を誘導した（図５）。ＮＧＲ−ＴＮＦ単独は低用量（０．１ｎｇ）で用いた場合には貧弱な活性であるのでこれらの薬物は相乗的に作用する（Ｃｕｒｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０１４８】
免疫適格性マウスにおけるＮＧＲ−ｍＴＮＦの抗腫瘍活性における内因性ｍＩＦＮγの機能的重要性を評価するために、我々は、Ｃ５７ＢＬ６マウスにおけるＮＧＲ−ｍＴＮＦ／ドキソルビシンの抗腫瘍活性に対する中和抗−ｍＩＦＮγ抗体（ｍＡｂ  ＡＮ１８）の効果を調べた。
【０１４９】
この抗体をＮＧＲ−ｍＴＮＦの２４時間前に投与すると、ＮＧＲ−ｍＴＮＦおよびドキソルビシンの間の相乗効果は消失し（図５）、これは、内因性ｍＩＦＮγがＮＧＲ−ｍＴＮＦの抗腫瘍活性において重要な作用体であるという仮説を支持する。
【０１５０】
これらの薬物に対する治療的応答におけるＩＦＮの役割をさらに指示するために、我々は、皮下マウスＴＳ／Ａ−乳腺癌腫を担うＢＡＬＢ／ｃＩＦＮγ-/-「ノックアウト」マウスを用いて他のインビボ実験を行った。平行して、我々は野生型ＢＡＬＢ／ｃ  ＩＦＮγ+/+マウスを用いて同様な実験を行った。ＮＧＲ−ＴＮＦ／ドキソルビシンはＢＡＬＢ／ｃＩＦＮγ+/+マウスにおいて腫瘍塊を有意に減少させた（図６、黒色棒線）が、ＢＡＬＢ／ｃＩＦＮγ-/-マウスにおいてはそうでなかった（白色棒線）。注目すべきは、ＮＧＲ−ＴＮＦおよびドキソルビシンと組み合わせた内因性ＩＦＮ（３００ｎｇ）のＢＡＬＢ／ｃＩＦＮγ-/-マウスへの投与はこれらの薬物の間の共同作用を回復した（図６、白色棒線）。これらの結果は、ＩＦＮがＮＧＲ−ＴＮＦ／ドキソルビシン相乗的活性で必要であるという仮説を確認する。ＮＧＲ−ＴＮＦなしでのＩＦＮおよびドキソルビシンの共投与はＢＡＬＢ／ｃＩＦＮγ-/-マウスにおいて有意な抗腫瘍効果を誘導せず（図６、白色棒線）、これは、このサイトカインがＮＧＲ−ＴＮＦと相乗的に作用し、ドキソルビシンとはほとんどまたは全くそのように作用しないことを示す。
【０１５１】
ＮＧＲ−ＴＮＦ／ドキソルビシン治療活性におけるＴ−細胞および局所的に生産されたＩＦＮの役割
ＴおよびＮＫ細胞は免疫適格性マウスにおけるＩＦＮの一次源である。ＮＧＲ−ＴＮＦ／ドキソルビシン組合せ療法におけるＩＦＮの源としてのＴ−細胞の重要性を調べるために、我々は、Ｔ−細胞を欠くＢ１６Ｆ１腫瘍担持ｎｕ／ｎｕマウスにおいてこれらの薬物の効果を調べた。このモデルにおいて、ＮＧＲ−ＴＮＦ／ドキソルビシンの相乗的活性は失われた（図７Ａ〜Ｃ）。しかしながら、これらの薬物をＩＦＮと組み合わせて投与した場合、相乗効果が再度観察された（図７Ｄ）。これらの動物における内因性ＩＦＮの量は、ＮＧＲ−ＴＮＦ／ドキソルビシン共同作用を活性化するのに十分ではなく、他方、内因性ＩＦＮの投与は共同投与を回復したようである。
【０１５２】
免疫適格性ｎｕ／ｎｕマウスでのインビボ実験の結果は、ｎｕ／ｎｕマウスはそうではないが、免疫適格性マウスの腫瘍塊内に存在するＴ−細胞はＮＧＲ−ＴＮＦおよび化学療法の間の相乗的応答を刺激するのに十分な量のＩＦＮを生じさせることを示唆し得る。腫瘍ミクロ環境内のＩＦＮの生産がｎｕ／ｎｕマウスにおいて相乗効果を回復できるか否かを評価するために、我々は、ＴＳ／Ａ細胞をネズミＩＦＮ  ｃＤＮＡでトランスフェクトした（図８）。培養液にＩＦＮを分泌できる一つのクローンを選択し、ＴＳ／Ａ−ＩＦＮと命名した。次いで、ＴＳ／Ａ−ＩＦＮおよび野生型ＴＳ／Ａ細胞をｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植した。予測されるように、ＮＧＲ−ＴＮＦ／ドキソルビシンはＴＳＡ−ＩＦＮに対して有意な抗腫瘍効果を発揮したが、ＴＳ／Ａ腫瘍に対しては発揮せず、これは、局所的に生産されたＩＦＮがＮＧＲ−ＴＮＦ／ドキソルビシン共同作用に対して実際に重要であることを強く示唆する。
【０１５３】
結論として、これらおよび前記結果は、ＮＧＲ−ＴＮＦ／ドキソルビシンの治療活性が、腫瘍浸潤リンパ球によって分泌されるらしいＩＦＮの局所的生産に強く依存することを示す。
【０１５４】
内因性ＩＦＮは、免疫適格性マウスにおいてＮＧＲ−ＴＮＦ／ドキソルビシンの治療活性を増強する。
【０１５５】
次いで、Ｂ１６Ｆ１腫瘍を担うＣ５７Ｂ１６マウスを用い、内因性ＩＦＮ（３００ｎｇ）と組み合わせたＮＧＲ−ＴＮＦおよびドキソルビシンの治療活性を評価した。図９に示したように、三重組合せの抗腫瘍活性はＮＧＲ−ＴＮＦ／ドキソルビシンのそれよりも大きかった。従って、ＮＧＲ−ＴＮＦ／ドキソルビシンと一緒にした内因性ＩＦＮの投与は、免疫適格性マウスにおいてもより強い抗腫瘍効果を誘導した。
【０１５６】
三重組合せ（ＩＦＮ、ＮＧＲ−ＴＮＦおよびドキソルビシン）の作用メカニズム
我々は、既に、ＮＧＲ−ＴＮＦ／ドキソルビシン共同作用に対する重要なメカニズムはＮＧＲ−ＴＮＦによる内皮バリアー機能の改変および腫瘍におけるドキソルビシンの増大した侵入に関連することを示した。従って、我々は、ＩＦＮがこの効果に対して臨界的であるか否かを調べた。この目的で、我々は、ＴＳ／Ａ腫瘍におけるドキソルビシンの侵入に対する内因性ＩＦＮの効果を測定した（図１０）。この実験は、ドキソルビシンが蛍光化合物である、処理後に動物から回収された腫瘍細胞の蛍光強度が、腫瘍に侵入したドキソルビシンの量の指標であるという事実を利用する。実験は、内因性ＩＦＮの効果を低下させるためにｎｕ／ｎｕマウスで行った。腫瘍担持マウスをＮＧＲ−ＴＮＦで処理し、２時間後に、ドキソルビシンで処理すると、未処理対照と比較して、ドキソルビシンの有意な増加は腫瘍細胞では見出されなかった。しかしながら、ＮＧＲ−ＴＮＦと組み合わせたＩＦＮの投与は腫瘍におけるドキソルビシンの侵入を増加させた。これは、ＩＦＮが化学療法薬物のＴＮＦ誘導侵入に対して重要であることを示唆する。
【０１５７】
この実験の結果は、内因性ＩＦＮがＮＧＲ−ＴＮＦ／ドキソルビシン相乗的活性に対して重要であり、およびＮＧＲ−ｍＴＮＦと一緒になって内因性ｍＩＦＮγは免疫欠損および免疫適格性マウス双方においてより強い自己−腫瘍効果を誘導することを示唆する。この見解は、ａ）中和抗−ＩＦＮ抗体が免疫適格性マウスにおいてＮＧＲ−ＴＮＦ／ドキソルビシン相乗活性を顕著に阻害し、およびｂ）ＩＦＮ遺伝子を欠くマウス（ＩＦＮ−／−マウス）では共同作用は起こらないという前記観察によって支持される。
【０１５８】
Ｔ−およびＮＫ−細胞は免疫適格性マウスにおいてＩＦＮの一次源であり、および無胸腺ｎｕ／ｎｕマウスはＴ−細胞を欠くことを仮定すれば、前記結果は、Ｔ細胞がＮＧＲ−ＴＮＦ／ドキソルビシン活性に必要なＩＦＮの主な源であることを強く示唆する。この見解に合致するのは、（ＩＦＮ  ｃＤＮＡでトランスフェクトされた腫瘍細胞によって生産された）外因性または内因性ＩＦＮがｎｕ／ｎｕマウスにおいてＮＧＲ−ＴＮＦ／ドキソルビシン相乗活性を回復するという知見である。
【０１５９】
これらの結果は、ＮＧＲ−ＴＮＦおよびドキソルビシンと一緒になって腫瘍血管標的化においてＩＦＮに対する非常に重要な役割を指摘する。
【０１６０】
（ＮＧＲ−ＴＮＦなしで）ドキソルビシンと組み合わせたＩＦＮの治療効果の欠如は、このサイトカインがＮＧＲ−ＴＮＦと共同作用し、ドキソルビシンとはほとんどまたは全くしないことを示唆する。化学療法薬物は血管壁を通過し、間隙を通って移動して癌細胞に到達することを考慮すると、ＩＦＮおよびＮＧＲ−ＴＮＦの作用部位は血管の内皮ランニングのようである。ＴＮＦが、内皮細胞において、細胞骨格アクチンの改変および細胞間ギャップの形成を誘導でき、高分子に対する増大した浸透性に導くことは周知である。同一細胞では、ＴＮＦは白血球接着分子、プロ炎症性サイトカイン、フィブリン沈積、一酸化窒素生産、およびアポトーシスを誘導できる。したがって、我々は、西洋ワサビペルオキシダーゼに対するｅＡ内皮細胞単層のインビトロ浸透性が、ＴＮＦ単独と比較して、ＩＦＮと組み合わせたＴＮＦへの暴露によって増強されたことを見出した。我々は、ＴＮＦおよびＩＦＮ双方が内皮細胞に対して働くことができるという種々の効果に鑑みると、インビボでの血管浸透性の改変は、内皮浸透性に影響する他の重要な炎症性分子の局所的放出に関連する間接的効果の結果でもあり得ることを排除できない。
【０１６１】
我々の発見は他の重要な意味も有し得る。動物モデルおよび患者における幾つかの実験は、ＴＮＦが腫瘍血管に選択的に影響し、それを損傷し得るが、正常な組織に関連する血管にはそうできないことを示した。したがって、正常な組織ではなく腫瘍のミクロ血管系およびマクロ血管系は、患者にメルファランと組み合わせてＴＮＦでの単離された四肢灌流を与えた後にかなり損傷されることが観察された。この選択性の分子的基礎は明らかでない。腫瘍血管内の構造的差および／または腫瘍由来「感作因子」の存在がＴＮＦ血管選択性を担うと仮定されている。我々の結果は、ＩＦＮの局所的生産がこれらの感作因子の１つであることを示唆する。
【０１６２】
前記明細書で引用した全ての刊行物は本明細書に参照として組み込む。記載した方法および本発明のシステムの種々の修飾および変形は、本発明の範囲および精神を逸脱することなく当業者に明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態に関連して記載してきたが、特許請求する発明はそのような特定の実施形態に限定されるべきではないと理解されるべきである。事実、分子生物学または関連分野における当業者に明らかな本発明を実施するための記載された形態の種々の修飾は、特許請求の範囲の範囲内にあることを意図する。
【０１６３】
引用文献
【表４Ａ】
0004761963.tif 000005
【表４Ｂ】
0004761963.tif 000006
【表４Ｃ】
0004761963.tif 000007
【表４Ｄ】
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【図面の簡単な説明】
【０１６４】
【図１】ＲＭＡ−Ｔリンパ腫（ａおよびｂ）の増殖および動物体重（ｃおよびｄ）に対するＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの効果を示す。  ５匹の動物／群を、腫瘍移植から１０日後に単一用量のＴＮＦまたはＮＧＲ−ＴＮＦ（腹腔内）で処理した。用量の関数としての第１４日における腫瘍面積値（ｂ）および処理後の体重の喪失（第１１日および第１２日の平均）（ｄ）を対数曲線から内挿した。第１４日における１μｇまたは９μｇのＮＧＲ−ＴＮＦによって誘導された抗腫瘍効果は匹敵する量のＴＮＦによって誘導されたものよりも大きく（各々、Ｐ＝０．０２４およびＰ＝０．０３２）、他方、これらの処理の後における体重の減少は同様であった。矢印は、匹敵する効果を誘導するＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦの外挿用量を示す。
【図２】ＮＧＲ−ＴＮＦ（ａ）およびＴＮＦ（ｂ）の抗腫瘍活性に対するｍＡｂ  Ｒ３−６３およびＣＮＧＲＣの効果を示す。  ｍＡｂ  Ｒ３−６３またはＣＮＧＲＣをＮＧＲ−ＴＮＦまたはＴＮＦと混合し、腫瘍移植から１２日後に、ＲＭＡ−Ｔ腫瘍担持動物に投与した（ｎ＝５匹動物／群）。別の実験（ｃ）において、ＴＮＦおよびＮＧＲ−ＴＮＦをＣＮＧＲＣまたはＣＡＲＡＣ（対照ペプチド）と共に、１１日齢腫瘍を担う動物に共投与した（ｎ＝５）。１μｇのＮＧＲ−ＴＮＦの抗腫瘍効果は９μｇのＴＮＦのそれよりも強く（Ｐ＝０．００９、２０日におけるｔ検定）、ＣＮＧＲＣ（Ｐ＝０．０３５）およびｍＡｂ  Ｒ３−６３（Ｐ＝０．０１１）によって有意に阻害された。
【図３】ＮＧＲ−ＴＮＦおよびＴＮＦの限定されたトリプシン消化のそれらの塊（ａ）および抗腫瘍活性（ｂ）の効果を示す。  製造業者の指示に従い、１ｍｇのトリプシンを１ｍｌの活性化ＣＨ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｕｐｊｏｈｎ）にカップリングさせることによって、トリプシン−アガロースを調製した。ＮＧＲ−ＴＮＦおよびＴＮＦ（３００μｌの０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０５Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．３中の各々１７０μｇ）を１５μｌの樹脂懸濁液（１：４）または緩衝液単独と混合し、３７℃にて、示した時間、端をつないで回転させた。４種の生成物を０．２２μｍのＳｐｉｎ−Ｘデバイス（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を通して濾過し、使用するまで−２０℃で貯蔵した。（ａ）電子スプレー質量分光分析。分子質量値および対応する生成物（Ｎ末端配列）を各ピークに示す。配列上の矢印は切断の部位を示す。（ｂ）ＲＭＡ−Ｔ腫瘍の増殖、および動物体重に対する、トリプシンなしで（上側パネル）またはそれと共に（下側パネル）インキュベートした１または３μｇのＮＧＲ−ＴＮＦおよびＴＮＦの効果（１および３μｇ用量で処理した群の平均±ＳＥ）。腫瘍移植から１３日後に動物を処理した（ｎ＝５匹動物／群）。
【図４】変性／リフォールディング前および後におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ、およびヒトＮＧＲ−ＴＮＦの抗腫瘍活性を示す。  実施例Ｖに記載したヒトＴＮＦ（ａ）、変性／再折畳みプロセスの前（ｂ）および後（ｃ）のＮＧＲ−ＴＮＦの非還元性条件（Ａ）下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。  ＲＭＡ−Ｔリンパ腫の増殖に対する（Ｂ）および体重に対する（Ｃ）ＴＮＦおよび非再折畳みＮＧＲ−ＴＮＦの効果。ヒトＴＮＦ（Ｄ）および（鎖内ジスルフィドと共に＞９５％トリマーからなる）再折畳みＮＧＲ−ＴＮＦ（Ｅ）の腫瘍増殖に対する効果。動物（各パネルに示した１５または５マウス／群）を、腫瘍移植から１０日後に、１つの腹腔内用量のＴＮＦまたはＮＧＲ−ＴＮＦで処理した。
【図５】Ｃ５７ＢＬ６マウスにおける、中和抗−ｍＩＦＮγ抗体（ＡＮ１８）のＮＧＲ−ｍＴＮＦの抗腫瘍活性に対する、およびドキソルビシンのＢ１６Ｆ１腫瘍に対する効果を示す。
【図６】ＩＦＮノックアウトマウスにおけるＮＧＲ−ＴＮＦおよびドキソルビシンの効果を示す。
【図７】ＮＧＲ−ｍＴＮＦ、ｍＩＦＮγおよびドキソルビシン（単独または組み合わせての）ヌードマウスにおけるＢ１６Ｆ１腫瘍に対する効果を示す。
【図８】ヌードマウスにおけるＮＧＲ−ＴＮＦおよびドキソルビシンの効果を示す。
【図９】ＮＧＲ−ｍＴＮＦ、ｍＩＦＮγおよびドキソルビシンの、免疫適格性マウス（Ｃ５７ＢＬ６）におけるＢ１６Ｆ１腫瘍に対する効果を示す。
【図１０】ＩＦＮは、ＩＦＮノックアウト動物における、ＮＧＲ−ＴＮＦと組み合わせた場合の腫瘍におけるドキソルビシンの侵入を増加させる。
【図１ａ】
0004761963.tif 000009
【図１ｂ】
0004761963.tif 000010
【図１ｃ】
0004761963.tif 000011
【図１ｄ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ−４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ−４ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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