(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の一般式（３’）で表される化合物と一般式（４’）で表される化合物とを、酢酸エチルの存在下で反応させて生成物を沈殿させる反応工程と、
上記反応工程によって得られた沈殿物を濾過によって分離し、当該沈殿物からベタインを精製する工程と、
を含むことを特徴とするベタインの製造方法：
【化１】
0004761265.tif 000059
ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり；
【化２】
0004761265.tif 000060
Ｒ6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、
当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ｒ7はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ1はハロゲンを表す。
【請求項２】
上記一般式（３’）は、さらに下記の（I）の条件を満たすことを特徴とする請求項１に記載のベタインの製造方法：
（I）Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が炭素数２以上の基である。
【請求項３】
上記Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が炭素数２〜４の基であることを特徴とする請求項２に記載のベタインの製造方法。
【請求項４】
上記一般式（３’）において、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が同一の基であることを特徴とする請求項１から３の何れか１項に記載のベタインの製造方法。
【請求項５】
核酸の融解温度を低下させるために使用される組成物であって、
当該組成物が、以下の化合物４、化合物５、化合物６および化合物８からなる群から選択される１つ以上の化合物、またはそれらの塩を含むことを特徴とする組成物。
【化３】
0004761265.tif 000061
【請求項６】
核酸の融解温度を低下させるために使用されるキットであって、請求項５に記載の組成物を含むことを特徴とするキット。
【請求項７】
請求項５に記載の組成物と核酸とを少なくとも含む混合物を、加熱する工程を含むことを特徴とする核酸の熱変性方法。
【請求項８】
請求項５に記載の組成物、鋳型となる核酸分子、核酸合成酵素、少なくとも一対のプライマー、および１種類以上のヌクレオチドを少なくとも含む混合物を、加熱する工程を含むことを特徴とする核酸の合成方法。
【請求項９】
ポリメラーゼ連鎖反応により行われる、請求項８に記載の核酸の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応法（以下「ＰＣＲ法」という）をはじめとする核酸合成法において、核酸合成効率を向上させることができる化合物を含む組成物、および当該組成物を用いた核酸の変性方法、核酸の合成方法、並びに当該化合物の効率的な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＣＲ法をはじめとする核酸合成法は、分子生物学のみならず、臨床検査、ＤＮＡ鑑定、食品分析などの様々な分野においてきわめて有用な技術である。例えば、ＰＣＲ法については例えば非特許文献１に記載されている。
【０００３】
ＰＣＲ法は、(1)一般的には約９０〜１００℃における鋳型ＤＮＡの熱変性、(2)約３７〜７５℃における鋳型ＤＮＡとプライマーとのアニーリング、および(3)約５５〜８０℃におけるプライマーの伸長反応からなる反応サイクルを繰り返すことで、プライマーに区切られた領域のＤＮＡを高度に増幅する技術である。
【０００４】
ところでＤＮＡの熱安定性は２つの塩基対（Ａ（アデニン）−Ｔ（チミン）、Ｇ（グアニン）−Ｃ（シトシン））の含量に依存して変化することが知られている。ＧＣ含量が増大するとその熱安定性は高くなる、つまり融解温度が高くなることが一般的に知られている。
【０００５】
このようにＧＣ含量が高いＤＮＡ領域をＰＣＲ法によって増幅する場合、融解温度が熱変性温度よりも高い場合がある。かかる場合、通常の熱変性温度では鋳型ＤＮＡの熱変性が十分に起こらない。また熱変性温度をいたずらに高くすれば、ＤＮＡポリメラーゼが失活してしまう。よって、ＧＣ含量の高いＤＮＡ領域を、ＰＣＲ法で増幅することは困難な場合が多々見られた。特に鋳型ＤＮＡとして用いられるゲノムＤＮＡ上にはＧＣ含量が高い領域が多く、かかる領域を増幅することは困難であった。
【０００６】
上記問題点を解決するために、これまでに耐熱性のＤＮＡポリメラーゼが種々開発され利用されている。また、上記問題を解決するために、高いＧＣ含量のＤＮＡ領域の融解温度を低下させるための添加剤（「融解温度調整剤」という）が種々開発され、利用されるようになった。ここで上記融解温度調整剤としては、グリシンベタイン、メチルグリシン、サルコシン、グリシン、プロリン、グリセロール、エクトイン、アミン−Ｎ−オキシド、スルホキシド（ＤＭＳＯなど）、多糖、ＰＥＧ、非イオン性界面活性剤（Tween20、NP40など）、アミド（ＤＭＦ、ホルムアミドなど）、カルボン酸誘導体（クエン酸、シュウ酸など）、ＳＳＢタンパク質、ＢＳＡなどが報告されている。これらの融解温度調整剤は、単独または混合物として、ＰＣＲの反応バッファー中へ調整剤に固有の最適濃度となるように（例えばグリシンベタインの場合、０．５〜３．０Ｍの濃度となるように）添加される。そして、ＤＮＡの融解温度を熱変性温度以下に降下させている。例えば、特許文献１〜５には、核酸合成の反応溶液中に上記で例示した各種融解温度調整剤を添加することが開示されている。融解温度調整剤としては、グリシンベタインが一般的に利用されている。
【非特許文献１】Nature, ３２４巻（６０９３）, １９８６年, ｐ．１３−１９
【特許文献１】特開平８−３８１９８号公報（公開日：平成８年（１９９６）２月１３日）
【特許文献２】特開２０００−３４２２８７号公報（公開日：平成１２年（２０００）１２月１２日）
【特許文献３】特表２００２−５０５８８６号公報（公表日：平成１４年（２００２）２月２６日）
【特許文献４】特開２００３−１４４１６９号公報（公開日：平成１５年（２００３）５月２０日）
【特許文献５】特開２００４−１４１１０５号公報（公開日：平成１６年（２００４）５月２０日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、ホルムアミド、ＤＭＳＯなどの溶剤系融解温度調整剤は融解温度を降下させる効果が比較的高い。ただし、それと同時にＤＮＡポリメラーゼを失活させてしまうという問題点を溶剤系融解温度調整剤は有している。よって結果として、ＧＣ含量高いＤＮＡ領域を合成することは依然困難な場合が多い。また、グリセロール、エクトイン、グリシンベタイン、ポリエチレングリコールなどの非溶剤系融解温度調整剤はＤＮＡポリメラーゼを失活させることはほとんどないが、融解温度を降下させる効果が低いという問題点を有しており、非溶剤系融解温度調整剤を高濃度添加しなければならない。また融解温度調整剤を種々混合する場合であっても、融解温度を効果的に降下させるために、ＤＮＡやポリメラーゼ等の反応条件に応じて、融解温度調整剤の配合割合を変化させなければならない。よって従来公知の融解温度調整剤は、十分に満足が得られるものではなかった。
【０００８】
ところで、グリシンベタインをはじめとするベタインは、双性イオン化合物であるため、極性が高くベタインを液相で合成しても分離精製が極めて困難である。例えば、ベタインの液相合成については非特許文献２および３に記載されている。よってベタインは、固相合成で製造されている（例えば非特許文献４および５参照）。そのため、ベタインを大量に合成することができないという問題点もある。
【非特許文献２】J. W. Conforth, A. J. Henry, J. Chem. Soc., ９巻, １９５２年, ｐ．６０１−６０２
【非特許文献３】A. Le Berre, A. Delacroix, Bull. Soc. Chim. Fr.,１９７３年, ｐ．２４０４−２４１０
【非特許文献４】A. Cosquer, V. Pichereau, D. Le Mee, M. Le Roch, J. Renault, B. Carboni, P. Uriac, T. Bernard, Toxicity and osmoprotective activities of analogues of glycine betaine obtained by solid phase organic synthesis towards Sinorhizobium meliloti, Bioorg. Med. Chem. Lett., ９巻, １９９９年, ｐ．４９−５４
【非特許文献５】A. Cosquer, M. Ficamos, M. Jebbar, J. - C. Corbel, G. Choquet, C. Fontenelle, P. Uriac, T. Bernard, Antibacterial acitivity of glycine betaine analogues: involvement of osmoporters, Bioorg. Med. Chem. Lett., １４巻, ２００４年, ｐ．２０６１−２０６５  そこで本発明は、ＤＮＡをはじめとする核酸の融解温度を降下する効果が高く、かつＤＮＡポリメラーゼ等の核酸合成酵素を失活させない化合物を見出し、核酸合成の際に使用する組成物、核酸合成に使用するキット、並びに当該組成物を用いた核酸の変性方法および核酸の合成方法を提供することを目的とした。
【０００９】
さらに本発明は上記化合物の効率的な製造方法を提供することを目的とした。より具体的には効率的なベタインをはじめとする双性イオン化合物の製造方法を本発明は提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、特定の構造を有するベタインが融解温度調整剤として顕著に優れているということを本発明者らが発見し、本発明を完成させるに至った。さらに、本発明者らはベタインをはじめとする双性イオン化合物を簡便かつ効率的に製造できる方法を見出すことに成功した。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
【００１１】
本発明にかかる組成物は、核酸を合成する際に使用される組成物であって、
当該組成物が、以下の一般式（１）および一般式（２）で表される化合物からなる群から選択される１つ以上の化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含むことを特徴としている：
【００１２】
【化１】
0004761265.tif 000002
【００１３】
ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ｒ6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ａ1は長周期型周期表における５Ｂ族元素、かつ、
Ｚ1は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表し、かつ、
下記の（I）または（II）の１つ以上を満たす：
（I）Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ6が炭素数３以上の基である；
【００１４】
【化２】
0004761265.tif 000003
【００１５】
ここで、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、およびＲ14は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ｒ15およびＲ16は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、また２つのＲ16は同一であっても異なっていてもよく、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ａ11およびＡ12は長周期型周期表における５Ｂ族元素を表し、同一であっても異なっていてもよく、かつ、
Ｚ11は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表し、２つのＺ11は同一であっても異なっていてもよく、かつ、
下記の（III）または（IV）の１つ以上を満たす：
（III）Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（IV）Ｒ15およびＲ16のいずれか１つ以上が炭素数３以上の基である。
【００１６】
また本発明にかかる組成物は、核酸を合成する際に使用される組成物であって、
当該該組成物が、以下の一般式（１’）および一般式（２’）で表される化合物からなる群から選択される１つ以上の化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含むことを特徴とする組成物であってもよい：
【００１７】
【化３】
0004761265.tif 000004
【００１８】
ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ｒ6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
下記の（I）または（II）の１つ以上を満たす：
（I）Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ6が炭素数３以上の基である；
【００１９】
【化４】
0004761265.tif 000005
【００２０】
ここで、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、およびＲ14は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ｒ15およびＲ16は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、また２つのＲ16は同一であっても異なっていてもよく、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
下記の（III）または（IV）の１つ以上を満たす：
（III）Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（IV）Ｒ15およびＲ16のいずれか１つ以上が炭素数３以上の基である。
【００２１】
また本発明にかかる組成物は、上記Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、およびＲ14が、末端に極性官能基を含まない基であることが好ましい。
【００２２】
また本発明にかかるキットは、核酸を合成する際に使用されるキットであって、上記本発明にかかる組成物を含むことを特徴としている。
【００２３】
また本発明にかかる核酸の熱変性方法は、上記本発明にかかる組成物と核酸とを少なくとも含む混合物を、加熱する工程を含むことを特徴としている。
【００２４】
また本発明にかかる核酸の合成方法は、上基本発明にかかる組成物、鋳型となる核酸分子、核酸合成酵素、少なくとも一対のプライマー、および１種類以上のヌクレオチドを少なくとも含む混合物を、加熱する工程を含むことを特徴としている。
【００２５】
また本発明にかかる核酸の合成方法は、ポリメラーゼ連鎖反応により行われることが好ましい。
【００２６】
一方、本発明にかかる双性イオン化合物の製造方法は、以下の一般式（３）で表される化合物と一般式（４）で表される化合物とを、エステル系溶媒の存在下で反応させる反応工程を含むことを特徴としている：
【００２７】
【化５】
0004761265.tif 000006
【００２８】
ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、Ａ1は長周期型周期表における５Ｂ族元素を表し、；
【００２９】
【化６】
0004761265.tif 000007
【００３０】
Ｒ6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ｒ7はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ1はハロゲンを表し、
Ｚ1は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表す。
【００３１】
また本発明にかかる双性イオン化合物の製造方法は、以下の一般式（３）で表される化合物と一般式（４）で表される化合物とを、エステル系溶媒の存在下で反応させる反応工程を含むことを特徴としている：
【００３２】
【化７】
0004761265.tif 000008
【００３３】
ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、Ａ1は長周期型周期表における５Ｂ族元素を表し、；
【００３４】
【化８】
0004761265.tif 000009
【００３５】
Ｒ6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ｒ7はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ1は、ハロゲンを表し、Ｚ1は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表し、
さらに下記の（I）または（II）の１つ以上の条件を満たす：
（I）Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ6が炭素数３以上の基である。
【００３６】
また上記本発明にかかる双性イオン化合物の製造方法は、上記エステル系溶媒が酢酸エチルであることが好ましい。
【００３７】
また本発明にかかる双性イオン化合物の製造方法は、以下の一般式（５）で表される化合物と、一般式（６）で表される化合物とを、アルコールの存在下で反応させる反応工程を含むことを特徴としている：
【００３８】
【化９】
0004761265.tif 000010
【００３９】
ここで、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、およびＲ14は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ｒ15は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、Ａ11およびＡ12は長周期型周期表における５Ｂ族元素を表し、同一であっても異なっていてもよく；
【００４０】
【化１０】
0004761265.tif 000011
【００４１】
Ｒ16は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ｒ17はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ11はハロゲンを表し、
Ｚ11は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表す。
【００４２】
また本発明にかかる双性イオン化合物の製造方法は、以下の一般式（５）で表される化合物と、一般式（６）で表される化合物とを、アルコールの存在下で反応させる反応工程を含むことを特徴とする双性イオン化合物の製造方法：
【００４３】
【化１１】
0004761265.tif 000012
【００４４】
ここで、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、およびＲ14は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ｒ15は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ａ11およびＡ12は長周期型周期表における５Ｂ族元素を表し、同一であっても異なっていてもよく；
【００４５】
【化１２】
0004761265.tif 000013
【００４６】
Ｒ16は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ｒ17はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、
Ｘ11は、ハロゲンを表し、
Ｚ11は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表し、
さらに下記の（III）または（IV）の１つ以上を満たす：
（III）Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（IV）Ｒ15およびＲ16のいずれか１つ以上が炭素数３以上の基である。
【００４７】
また本発明にかかる双性イオン化合物の製造方法は、上記アルコールがエタノールであることが好ましい。
【００４８】
また上記本発明にかかる双性イオン化合物の製造方法は、上記反応工程によって得られた沈殿物から双性イオン化合物を精製する工程を含む方法であってもよい。
【００４９】
一方、本発明にかかるベタインの製造方法は、以下の一般式（３’）で表される化合物と一般式（４’）で表される化合物とを、エステル系溶媒の存在下で反応させる反応工程を含むことを特徴としている：
【００５０】
【化１３】
0004761265.tif 000014
【００５１】
ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり；
【００５２】
【化１４】
0004761265.tif 000015
【００５３】
Ｒ6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ｒ7はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ1はハロゲンを表す。
【００５４】
また本発明にかかるベタインの製造方法は、以下の一般式（３’）で表される化合物と一般式（４’）で表される化合物とを、エステル系溶媒の存在下で反応させる反応工程を含むことを特徴とする方法であってもよい：
【００５５】
【化１５】
0004761265.tif 000016
【００５６】
ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり；
【００５７】
【化１６】
0004761265.tif 000017
【００５８】
Ｒ6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ｒ7はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ1は、ハロゲンを表し、
さらに下記の（I）または（II）の１つ以上の条件を満たす：
（I）Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ6が炭素数３以上の基である。
【００５９】
また上記本発明にかかるベタインの製造方法は、上記エステル系溶媒が酢酸エチルであることが好ましい。
【００６０】
また本発明にかかるベタインの製造方法は、以下の一般式（５’）で表される化合物と、一般式（６’）で表される化合物とを、アルコールの存在下で反応させる反応工程を含むことを特徴とする方法であってもよい：
【００６１】
【化１７】
0004761265.tif 000018
【００６２】
ここで、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、およびＲ14は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ｒ15は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり；
【００６３】
【化１８】
0004761265.tif 000019
【００６４】
Ｒ16は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ｒ17はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、かつＸ11は、ハロゲンを表す。
【００６５】
また本発明にかかるベタインの製造方法は、以下の一般式（５’）で表される化合物と、一般式（６’）で表される化合物とを、アルコールの存在下で反応させる反応工程を含む方法であってもよい：
【００６６】
【化１９】
0004761265.tif 000020
【００６７】
ここで、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、およびＲ14は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよく、当該アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基は官能基を含んでいてもよい基であり、かつ、
Ｒ15は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり；
【００６８】
【化２０】
0004761265.tif 000021
【００６９】
Ｒ16は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基であり、当該アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基は官能基を含んでいてもよい基であり、
Ｒ17はアルキル基、アリール基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、
Ｘ11は、ハロゲンを表し、
さらに下記の（III）または（IV）の１つ以上を満たす：
（III）Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（IV）Ｒ15およびＲ16のいずれか１つ以上が炭素数３以上の基である。
【００７０】
また上記本発明にかかるベタインの製造方法は、上記アルコールがエタノールであることが好ましい。
【００７１】
また本発明にかかるベタインの製造方法は、上記反応工程によって得られた沈殿物からベタインを精製する工程を含む方法であってもよい。
【発明の効果】
【００７２】
上記本発明にかかる組成物は、ＤＮＡの融解温度を低下させる効果に関し、融解温度調整剤として一般的に利用されており、かつその効果が高いとされているグリシンベタインと比較して１０倍以上の効果を奏するものである。また本発明の組成物は、タンパク質の高次構造に影響を与えない、すなわちタンパク質を変性させないものである。よって、本発明にかかる組成物を用いることによって、ＰＣＲ等の核酸合成の反応液中に対する融解温度調整剤の添加量を少なくすることができる。また、本発明にかかる組成物はＤＮＡポリメラーゼ等の核酸合成酵素を失活させないために、核酸合成反応を効率よく、継続的に行うことができる。
【００７３】
したがって、本発明によれば、これまで困難であったＧＣ含量の高い核酸領域を熱変性させることが可能となり、当該ＧＣ含量の高い核酸領域を効率よく合成することができるという効果を享受できる。
【００７４】
また本発明にかかる分子内に１組の双性イオンを持つ双性イオン化合物（例えばベタイン）の製造方法は、反応溶媒として酢酸エチルをはじめとするエステル系溶媒を用いて行うことを特徴としている。そうすることで、前駆体（例えばベタイン前駆体）が生成と共に沈殿する。それゆえ、前駆体（例えばベタイン前駆体）を濾過のみで簡便に分離精製することができる。さらに前駆体（例えばベタイン前駆体）を水に溶解させ、陰イオン交換樹脂に通過させて乾燥させると、目的物である双性イオン化合物（例えばベタイン）へ定量的に転化することができる。
【００７５】
また本発明にかかる分子内に２組の双性イオンを持つ双性イオン化合物（例えばベタイン）の製造方法は、反応溶媒としてアルコール（例えばエタノール）を用いて行うことを特徴としている。そうすることで、反応中間体であるモノ付加体が沈殿することなく、反応の進行と共に目的物である前駆体（例えばベタイン前駆体）のみが沈殿する。その後、前駆体（例えばベタイン前駆体）を水に溶解させ、陰イオン交換樹脂に通過させ乾燥させると、目的物である双性イオン化合物（例えばベタイン）へ定量的に転化することができる。それゆえ、目的物である双性イオン化合物（例えばベタイン）を簡便に分離精製することができる。
【００７６】
したがって、本発明にかかる双性イオン化合物（例えばベタイン）の製造方法によれば、これまで大量製造が困難であった双性イオン化合物（例えばベタイン）を簡便かつ効率的に製造することができるという効果を享受することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７７】
本発明の一実施形態について説明すると以下の通りである。ただし、本発明はこれに限定されるものではなく、記述した範囲内で種々の変形を加えた態様で実施できるものである。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。なお、本明細書において特記しない限り「☆☆〜★★」は、「☆☆以上、★★以下」を意味する。
【００７８】
＜本発明にかかる組成物＞
本発明にかかる組成物は、核酸を合成する際に使用される組成物に関する。ここで「核酸を合成する」とは、ＰＣＲをはじめとする核酸増幅、逆転写反応、および塩基配列決定反応等の核酸合成反応を意味する。また上記「核酸」にはＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ただし本発明にかかる組成物は、これまで融解温度が高いことが原因でＰＣＲ等の合成反応が困難であった核酸の融解温度を低下させることを原理として効果を奏するものであるため、本発明の説明における「核酸」は特に二本鎖を意味する。また本発明にかかる組成物は、特にＧＣ含量の高い核酸を合成する際に有効である。ここで「ＧＣ含量が高い」とは、ＧＣ含量が５０％以上、より好ましくは６０％以上であることを意味する。
【００７９】
本発明にかかる組成物は、既述の一般式（１）および一般式（２）で表される化合物からなる群から選択される１つ以上の化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体を含む組成物である。一般式（１）および（２）で表される化合物は、その構造から双性イオン化合物であることがわかる。特に記述の一般式（１’）および一般式（２’）で表される化合物は、ベタインに属することがわかる。なお、一般に「グリシンベタイン＝トリメチルグリシン」のことを単に「ベタイン」と称する場合があるが、本発明の説明においては「グリシンベタイン＝トリメチルグリシン」を「ベタイン」の下位概念であるとして、それぞれを区別する。
【００８０】
一般式（１）において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択される基である。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3は全て同一であっても、異なっていてもよい。また上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基には、エーテル、エステル、カルボニル、アミド、アミノ、ハロ、ニトロ、ニトリル、スルホン、スルフィド等の官能基が含まれていてもよい。ただし、上記Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3の末端には、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホン酸基、リン酸基、アミド基、エポキシ基をはじめとする極性官能基が含まれないことが好ましい。上記Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3の末端に極性官能基が含まれない方が、核酸の融解温度を降下させる効果が高い場合があるからである。
【００８１】
また一般式（１）において、Ｒ6はアルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基である。そして上記アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、またはアリーレン基には、エーテル、エステル、カルボニル、アミド、アミノ、ハロ、ニトロ、ニトリル、スルホン、スルフィド等の官能基が含まれていてもよい。
【００８２】
また一般式（１）においてＡ1は、窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）をはじめとする長周期型周期表における５Ｂ族元素を表す。
【００８３】
また一般式（１）において、Ｚ1は−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表す。
【００８４】
さらに一般式（１）において下記の（I）または（II）の１つ以上が満たされる。
（I）Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（II）Ｒ6が炭素数３以上の基である。
【００８５】
なお、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ6の炭素数は、一般式（１）で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体（以下「化合物等」という）が核酸合成を行う反応溶液中に溶解する程度の条件であれば、炭素数の上限は特に限定されるものではない。
【００８６】
また一般式（２）において、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14は、水素を除く、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、およびアリール基からなる群より独立して選択される基であり、これらは同一であっても異なっていてもよい。また上記アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基には、エーテル、エステル、カルボニル、アミド、アミノ、ハロ、ニトロ、ニトリル、スルホン、スルフィド等の官能基が含まれていてもよい。ただし、上記Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14の末端には、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホン酸基、リン酸基、アミド基、エポキシ基をはじめとする極性官能基が含まれないことが好ましい。上記Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14の末端に極性官能基が含まれない方が、核酸の融解温度を降下させる効果が高い場合があるからである。
【００８７】
また一般式（２）におけるＲ15、Ｒ16は、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基からなる群より独立して選択され、同一であっても異なっていてもよい。なお、一般式（２）において２つ存在するＲ16同士についても、同一であっても異なっていてもよい。また上記アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、およびアリーレン基には、エーテル、エステル、カルボニル、アミド、アミノ、ハロ、ニトロ、ニトリル、スルホン、スルフィド等の官能基が含まれていてもよい。
【００８８】
また一般式（２）におけるＡ11およびＡ12は、窒素（Ｎ）、リン（Ｐ）をはじめとする長周期型周期表における５Ｂ族元素を表し、同一であっても異なっていてもよい。
【００８９】
また一般式（２）におけるＺ11は、−ＣＯＯ、−ＳＯ3、−ＮＯ3、または−ＨＰＯ4を表す。なお一般式（２）において２つ存在するＺ11同士についても、同一であっても異なっていてもよい。
【００９０】
そして一般式（２）において下記の（III）または（IV）の１つ以上が満たされる。
（III）Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13およびＲ14のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である、
（IV）Ｒ15およびＲ16のいずれか１つ以上が炭素数３以上の基である。
【００９１】
なお、Ｒ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ15およびＲ16の炭素数は、一般式（２）で表される化合物、またはそれらの塩もしくは誘導体（以下「化合物等」という）が核酸合成を行う反応溶液中に溶解する程度の条件であれば、炭素数の上限は特に限定されるものではない。
【００９２】
本発明にかかる組成物は、上記一般式（１）および一般式（２）で表される化合物かららなる群から選択される１つ以上の化合物が含まれていればよい。また本発明にかかる組成物には上記一般式（１）および一般式（２）で表される化合物の塩、またはそれらの誘導体であってもよい。また２つ以上の化合物等が組成物に含まれる場合の配合比率は特に限定されるものではなく、核酸の合成反応に適した配合比率を適宜検討のうえ、採用すればよい。
【００９３】
なお本発明にかかる組成物に含まれる一般式（１）および一般式（２）で表される化合物は、分子内に少なくとも１組以上のカチオンとアニオンとの双性イオンを有する双性イオン化合物（例えばベタイン）であって、(a)カチオンとアニオンと間のスペーサー長が少なくともＣ3以上である、および／または（b）アンモニウム基の置換基がＣ2以上である双性イオン化合物（例えばベタイン）であるとも表現できる。
【００９４】
また本発明にかかる組成物には、核酸合成時に好適に使用されている緩衝剤または塩類が含まれていてもよい。上記、緩衝剤としては特に限定されるものではないが、トリス（ＴＲ１Ｓ）、トリジン（ＴＲｌＣ１ＮＥ）、ビスートリシン（ＢｌＳ-ＴＲ１Ｃ１ＮＥ）、へペス（ＨＥＰＥＳ）、モプス（ＭＯＰＳ）、テス（ＴＥＳ）、タプス（ＴＡＰＳ）、ピペス（Ｐ１ＰＥＳ）、及びキャプス（ＣＡＰＳ）等が挙げられる。また上記塩としては特に限定されるものではないが、例えば塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウ七、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、酢酸リチウム等が挙げられる。
【００９５】
さらに本発明にかかる組成物には、融解温度調整剤として公知である、グリシンベタイン、メチルグリシン、サルコシン、グリシン、プロリン、グリセロール、エクトイン、アミン−Ｎ−オキシド、スルホキシド（ＤＭＳＯなど）、多糖、ＰＥＧ、非イオン性界面活性剤（Tween20、NP40など）、アミド（ＤＭＦ、ホルムアミドなど）、カルボン酸誘導体（クエン酸、シュウ酸など）、ＳＳＢタンパク質、ＢＳＡ等が、補助成分として含まれていてもよい。
【００９６】
さらに本発明にかかる組成物には、核酸合成活性を有する酵素（「核酸合成酵素」という）が含まれていてもよい。上記核酸合成酵素は、ＤＮＡポリメラーゼであっても、ＲＮＡポリメラーゼであっても、逆転写酵素であってもよい。
【００９７】
さらに本発明にかかる組成物には、核酸合成に必要なヌクレオチド成分（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、α−チオ−ｄＮＴＰ類、ビオチン−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｄＵＴＰ、シゴキシゲニン−ｄＵＴＰ等）が含まれていてもよい。
【００９８】
また本発明にかかる組成物の状態は、特に限定されるものではなく、液体であっても、固体の状態であってもよい。
【００９９】
また上記本発明にかかる組成物を用いて、核酸を合成する際に使用されるキット（「核酸合成キット」という）を構成することができる。本発明にかかる核酸合成キットには、本発明の組成物の他に、既述の緩衝剤、塩類、核酸合成酵素、ヌクレオチド成分等が含まれていてもよい。また本発明にかかる核酸合成キットには、核酸合成に必要なプライマー、鋳型となる核酸が含まれていてもよい。また上記核酸合成キットを構成する成分を格納するための１つ以上の容器（例えば、バイアル、管、アンプル、ビンなど）が含まれていてもよい。
【０１００】
＜本発明にかかる組成物の製造方法＞
上記で説示した、本発明にかかる組成物の製造方法は、特に限定されるものではなく、当業者が通常行い得る合成方法を用い、一般式（１）または（２）、あるいは一般式（１’）または一般式（２’）で表される化合物等を製造することによって達成される。なお、以後の説明において、一般式（１’）で表される化合物、および一般式（２’）で表される化合物の製造方法を一実施形態として説明するが、一般式（１）または（２）で表される他の化合物についても同様に製造することができる。なお、一般式（１’）で表される化合物のことを「ベタイン１」と称し、一般式（２’）で表される化合物のことを「ベタイン２」と便宜上称する。ベタイン１および２は、例えば、非特許文献２や３に記載された方法（液相合成）、または非特許文献４や５に記載された方法（固相合成）にしたがって合成され得る。ただし、目的とするベタイン１および２は双性イオン化合物であるため、極性が高い。よって上記液相合成でベタイン１および２を合成しても、分離精製が極めて困難である。一方、固相合成では、ベタイン１および２を大量に合成することができないという問題点もある。
【０１０１】
そこで、本発明者らは、ベタイン１およびベタイン２を効率よく合成し得る方法（以下「本方法」という）を独自に完成させた。本方法によれば、目的物であるベタイン１の前駆体およびベタイン２の前駆体が反応液中に沈殿する。よって、目的物の分離精製が極めて簡便に行うことができる。なお、本方法は、ベタイン１およびベタイン２のみに適用されるわけではなく、ベタイン全般の合成に利用可能であるということを当業者は容易に理解する。
【０１０２】
以下に本方法の一実施形態を、図２を用いて説明する。なお本方法はこれに限定されるものではない。図２（ａ）はベタイン１の製造方法を示し、同図（ｂ）はベタイン２の製造方法を示す図である。
【０１０３】
図２（ａ）に示される方法では、まず既述の一般式（３’）で表される化合物（便宜上「化合物III」と称する）と、既述の一般式（４’）で表される化合物（便宜上「化合物IV」と称する）とを、酢酸エチルの存在下で反応させる反応工程を経て前駆体１を製造している。そして反応工程によって得られた前駆体１を水に溶解し、陰イオン交換カラム（陰イオン交換樹脂：Amberlite（アンバーライト：登録商標）IR-402、ローム  アンド  ハース社製）を用いてベタイン１を取得している。より具体的に説明すれば以下の通りである。
(a)化合物IIIを酢酸エチルに溶解して溶液とし、化合物IVを当該溶液に滴下し反応させることによって前駆体１が溶液中に沈殿物として生成させる（反応工程）。
(b)反応工程で得られた前駆体１を濾別し、これを蒸留水（またはイオン交換水）に溶解する。この前駆体１の水溶液を、陰イオン交換カラム（陰イオン交換樹脂：Amberlite（アンバーライト：登録商標）IR-402、ローム  アンド  ハース社製）に通液する。陰イオン交換カラムに吸着したベタイン１を、蒸留水またはイオン交換水を用いて溶離させる。その後、溶離液を真空乾燥させて最終的にベタイン１を取得する（精製工程）。
【０１０４】
上記反応工程において化合物IIIを酢酸エチルに溶解する際の比率は特に限定されるものではなく適宜設定され得る。また反応工程において化合物IVを、化合物IIIの酢酸エチル溶液に滴下し、反応させる際には、反応効率の観点から、溶液を撹拌することが好ましい。撹拌は従来公知の撹拌手段を用いればよい。また上記反応時間は、特に限定されるものではく、前駆体１の生成量を指標に適宜設定すればよい。また反応温度についても特に限定されるものではないが、安全性の観点から室温で行うことが好ましい。
【０１０５】
一方、精製工程においては、Amberlite（アンバーライト：登録商標）IR-402が充填されたカラムを使用しているが、本方法はこれに限定されるものではなく、ベタインを吸着し得る陰イオン交換樹脂が利用可能である。Amberlite（アンバーライト：登録商標）IR-402の他に、本方法に適用可能なイオン交換樹脂としては例えば、DOW社製  Dowex1x8が挙げられる。ベタイン１の溶離条件はイオン交換樹脂に応じて最適な条件を適宜採用すればよい。
【０１０６】
なお図２（ａ）では一般式（４’）のＲ7がエチル基（図２（ａ）中「Ｅｔ」で示す）である場合、および酢酸エチル（図２（ａ）中「ＡｃＯＥｔ」で示す）を溶媒として用いる場合について示しているが、本方法はこれに限定されない。また、一般式（３’）および一般式（４’）におけるＲ1〜Ｒ6の説明は、一般式（１’）の説明と共通するために省略する。一般式（４’）におけるＲ7は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基であれば特に限定されるものではない。アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基の炭素数は、１〜１２であることが好ましい。またアルキル基は直鎖であっても分岐鎖であってもよい。
【０１０７】
ベタイン１を製造する際に利用可能な溶媒は、上記酢酸エチルに限られず、酢酸メチル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒が適用可能である。そして、製造する化合物に応じて適宜最適な溶媒を選択すればよい。
【０１０８】
一方、一般式（４’）におけるＸ1はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等のハロゲンを表す。上記Ｘ1としては、特にＢｒが好ましい。
【０１０９】
また本方法を、本発明にかかる組成物を構成する化合物以外に利用し得る。この場合、例えば、一般式（３’）および一般式（４’）は、下記（I）および（II）の条件を満たす必要はない。
（I）Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3のいずれか１つ以上が炭素数２以上の基である。
（II）Ｒ6が炭素数３以上の基である。
【０１１０】
一方、図２（ｂ）は既述の一般式（５’）で表される化合物（便宜上「化合物V」と称する）と、既述の一般式（６’）で表される化合物（便宜上「化合物VI」と称する）とを、エタノールの存在下で反応させる反応工程を経て、前駆体２を製造している。そして反応工程によって得られた前駆体２を水に溶解し、陰イオン交換カラム（陰イオン交換樹脂：Amberlite（アンバーライト：登録商標）IR-402、ローム  アンド  ハース社製）を用いてベタイン２を取得している。より具体的に説明すれば以下の通りである。
(c)化合物Vをエタノールに溶解して溶液とし、化合物VIを当該溶液に滴下し反応させることによって前駆体２が溶液中に沈殿物として生成させる（反応工程）。
(d)反応工程で得られた前駆体２を濾別し、これを蒸留水（またはイオン交換水）に溶解する。この前駆体２の水溶液を、陰イオン交換カラム（陰イオン交換樹脂：Amberlite（アンバーライト：登録商標）IR-402、ローム  アンド  ハース社製）に通液する。陰イオン交換カラムに吸着したベタイン２を、蒸留水またはイオン交換水を用いて溶離させる。その後、溶離液を真空乾燥させて最終的にベタイン２を取得する（精製工程）。
【０１１１】
ベタイン１の製造方法と共通する事項については、ベタイン２の製造方法の説明においてそれを援用する。
【０１１２】
上記反応工程において化合物Vをエタノールに溶解する際の比率は特に限定されるものではなく、適宜設定され得る。
【０１１３】
なお図２（ｂ）では一般式（６’）のＲ7がエチル基（図２（ｂ）中「Ｅｔ」で示す）である場合、およびエタノール（図２（ｂ）中「ＥｔＯＨ」で示す）を溶媒として用いる場合について示しているが、本方法はこれに限定されない。また、一般式（５’）および一般式（６’）におけるＲ11〜Ｒ16の説明は、一般式（２’）の説明と共通するために省略する。一般式（６’）におけるＲ17は、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基であれば特に限定されるものではない。アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、またはアリール基の炭素数は、１〜１２であることが好ましい。またアルキル基は直鎖であっても分岐鎖であってもよい。
【０１１４】
ベタイン２を製造する際に利用可能な溶媒は、上記エタノールに限られず、メタノール、ブタノール等のアルコールが適用可能である。そして、製造する化合物に応じて適宜最適な溶媒を選択すればよい。
【０１１５】
一方、一般式（６’）におけるＸ11はＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ等のハロゲンを表す。上記Ｘ1としては、特にＢｒが好ましい。
【０１１６】
なお、一般式（１）で表される双性イオン化合物は、一般式（３）および一般式（４）で表される化合物を用いて製造され得る。この場合は、上記ベタイン１の製造方法における化合物IIIを一般式（３）で表される化合物と読み替え、化合物IVを一般式（４）で表される化合物と読み替えればよい。また一般式（３）および一般式（４）において一般式（１）と共通する官能基に関する説明については、一般式（１）のそれを援用する。
【０１１７】
また、一般式（２）で表される双性イオン化合物は、一般式（５）および一般式（６）で表される化合物を用いて製造され得る。この場合は、上記ベタイン２の製造方法における化合物Vを一般式（５）で表される化合物と読み替え、化合物VIを一般式（６）で表される化合物と読み替えればよい。また一般式（５）および一般式（６）において一般式（２）と共通する官能基に関する説明については、一般式（２）のそれを援用する。
【０１１８】
＜本発明にかかる組成物の利用＞
本発明にかかる組成物は、核酸の融解温度を降下させる効果が極めて高いものである。それゆえ、これまで融解温度が高く熱変性させることが困難であった核酸、特にＧＣ含量の高い核酸領域を容易に熱変性させることが可能である。融解温度が高く熱変性させることが困難であった核酸、特にＧＣ含量の高い核酸領域を容易に熱変性させることが可能となることで、これまで熱変性させることができなかったことが原因で合成することが困難であった核酸領域を合成することが可能となる。ここで「熱変性させる」とは、二本鎖の核酸を熱作用によって一本鎖にすることを意味する。また「核酸の溶解温度を降下させる」とは、熱変性する温度を降下させる効果のことを意味する。
【０１１９】
ここで核酸が熱変性したどうかについては、核酸溶液中の紫外線吸収スペクトルを測定することによって判断できる。溶液中において核酸は二本鎖を形成することで紫外可視吸収スペクトルにおける極大吸収波長（おおよそ２６０ｎｍ付近）の吸光度の減少（「淡色効果」という）が確認される。この淡色効果の消失を確認することによって、核酸が二本鎖から一本鎖になった（熱変性した）ことを判断することができる。また、温度−吸光度からなるシグモイド状の曲線（融解曲線）における変曲点（融解温度）の変化を確認することによって、核酸の融解温度の変化を確認することができる。
【０１２０】
本発明にかかる組成物を用いて核酸を熱変性させる場合、本発明にかかる組成物と熱変性させようとする核酸とを少なくとも含む混合物（反応液）に含まれていることが好ましい双性イオン化合物（例えばベタイン１、ベタイン２）またはそれらの塩もしくは誘導体の濃度は、変性させようとする核酸の種類や濃度によって異なるために特に限定されるものではないが、通常、ＧＣ含量が６０％を超えるものでは、０．０００１〜３．０Ｍの濃度で含まれていることが好ましく、０．００１〜１．０Ｍの濃度で含まれていることがさらに好ましく、０．０１〜０．１Ｍの濃度で含まれていることが最も好ましい。また、ＧＣ含量が６０％未満のものに関してはさらに低い濃度で適宜、調整を行う。本発明にかかる組成物は、核酸の融解温度を降下させる効果が極めて高いために、上記のごとく低い濃度であっても十分な効果が得られる。
【０１２１】
また本発明にかかる組成物を用いて核酸を合成する場合は、ＰＣＲ等の核酸増幅反応、逆転転写反応、塩基配列決定時の核酸合成反応における反応溶液中に本発明にかかる組成物が含まれるようにすればよい。よって、核酸を合成する反応の詳細については特に限定されるものではない。例えば、ＰＣＲ法による核酸合成において本発明にかかる組成物を用いる場合は、当該組成物、鋳型となる核酸、核酸合成酵素、少なくとも１対のプライマー、および１種類以上のヌクレオチドを少なくとも含む混合物を反応溶液として、熱変性→アニーリング→伸長のサーマルサイクルを繰り返し実施すればよい。この反応溶液中に含まれていることが好ましい双性イオン化合物（例えばベタイン１、ベタイン２）またはそれらの塩もしくは誘導体の濃度については既述の通りである。
【実施例】
【０１２２】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これに限定されるものではない。
【０１２３】
〔合成例１〕前駆体１の合成
分子内に１組の双性イオンを持つベタイン（「ベタイン１」という）は、アルキル鎖長や組み合わせによらず、図２（ａ）に示すスキームに従って合成することが可能である。ここでは、一例として図２（ａ）のＲ1、Ｒ2、Ｒ3がエチル基で、Ｒ6がメチレン基である前駆体１（2-(N,N,N-トリエチルアンモニウム)-酢酸エチルエステル臭化物塩）の合成例を示す。なお、その他の前駆体１の合成は、下記に準じて行われた。
【０１２４】
トリエチルアミン１００ｍｌを酢酸エチル１００ｍｌに溶解させた。この溶液に対してブロモ酢酸エチル（３７．５ｇ）をゆっくりと滴下した。滴下後、この溶液を室温で一晩攪拌した。その後、生成した沈殿を濾別した。得られた沈殿を真空乾燥して、前駆体１（2-(N,N,N-トリエチルアンモニウム)-酢酸エチルエステル臭化物塩）を得た（収量５０．２ｇ、収率８６％）。
【０１２５】
上記で得られた化合物の同定は、ＩＲ、および1Ｈ  ＮＭＲによって行われた。表１にＩＲ解析の結果を、表２に1Ｈ  ＮＭＲ解析の結果を示す。
【０１２６】
【表１】
0004761265.tif 000022
【０１２７】
【表２】
0004761265.tif 000023
【０１２８】
ＩＲ、および1Ｈ  ＮＭＲの結果、目的物である2-(N,N,N-トリエチルアンモニウム)-酢酸エチルエステル臭化物塩（すなわち、図１における化合物４の前駆体）が合成されたことが確認できた。
【０１２９】
図１における化合物２の前駆体を合成した結果を、表３（ＩＲ）および表４（1Ｈ  ＮＭＲ）に示す。表３および４によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【０１３０】
【表３】
0004761265.tif 000024
【０１３１】
【表４】
0004761265.tif 000025
【０１３２】
図１における化合物３の前駆体を合成した結果を、表５（ＩＲ）および表６（1Ｈ  ＮＭＲ）に示す。表５および６によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【０１３３】
【表５】
0004761265.tif 000026
【０１３４】
【表６】
0004761265.tif 000027
【０１３５】
図１における化合物５の前駆体を合成した結果を、表７（ＩＲ）および表８（1Ｈ  ＮＭＲ）に示す。表７および８によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【０１３６】
【表７】
0004761265.tif 000028
【０１３７】
【表８】
0004761265.tif 000029
【０１３８】
図１における化合物６の前駆体を合成した結果を、表９（ＩＲ）および表１０（1Ｈ  ＮＭＲ）に示す。表９および１０によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【０１３９】
【表９】
0004761265.tif 000030
【０１４０】
【表１０】
0004761265.tif 000031
【０１４１】
図１における化合物７の前駆体を合成した結果を、表１１（ＩＲ）および表１２（1Ｈ  ＮＭＲ）に示す。表１１および１２によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【０１４２】
【表１１】
0004761265.tif 000032
【０１４３】
【表１２】
0004761265.tif 000033
【０１４４】
図１における化合物８の前駆体を合成した結果を、表１３（ＩＲ）および表１４（1Ｈ  ＮＭＲ）に示す。表１３および１４によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【０１４５】
【表１３】
0004761265.tif 000034
【０１４６】
【表１４】
0004761265.tif 000035
【０１４７】
〔合成例２〕前駆体２の合成
分子内に２組の双性イオンを持つベタイン（「ベタイン２」という）は、アルキル鎖長や組み合わせによらず、図２（ｂ）のスキームに従って合成することが可能である。ここでは、一例として図２（ｂ）のＲ11、Ｒ12、Ｒ13、Ｒ14がメチル基で、Ｒ15がエチレン基、Ｒ16がメチレン基である前駆体２（1,2-ビス{[N,N-ジメチル-N-(酢酸エチルエステル-2-イル)]-アンモニウム-N-イル}エタン二臭化物塩）の合成例を示す。なお、その他の前駆体２の合成は、下記に準じて行われた。
【０１４８】
N,N,N’,N’-テトラメチルエチレンジアミン２５．０ｇをエタノール４００ｍｌに溶解させ、ブロモ酢酸エチル（１００ｍｌ）をゆっくりと滴下した。滴下後、この溶液を室温で４日間攪拌を続け、生成した沈殿を濾別した。得られた沈殿を真空乾燥して、前駆体２2-(N,N,N-トリエチルアンモニウム)-酢酸エチルエステル臭化物塩を得た（収量６６．６ｇ、収率６９％）。
【０１４９】
上記で得られた化合物の同定は、ＩＲ、および1Ｈ  ＮＭＲによって行われた。表１５にＩＲ解析の結果を、表１６に1Ｈ  ＮＭＲ解析の結果を示す。
【０１５０】
【表１５】
0004761265.tif 000036
【０１５１】
【表１６】
0004761265.tif 000037
【０１５２】
表１５および１６によれば、ＩＲ、および1Ｈ  ＮＭＲの結果、目的物である1,2-ビス{[N,N-ジメチル-N-(酢酸エチルエステル-2-イル)]-アンモニウム-N-イル}エタン二臭化物塩（すなわち、図１における化合物９の前駆体）が合成されたことを確認することができた。
【０１５３】
〔実施例１〕ベタインの合成
ベタイン１およびベタイン２は、共通の方法で定量的に合成することができる。ここでは、一例としてＲ1、Ｒ2、Ｒ3がエチル基でＲ6がメチレン基であるベタイン１（2-(N,N,N-トリエチルアンモニウム)-アセテート）の合成方法を示す。
【０１５４】
合成例１にて得られた前駆体１（2-(N,N,N-トリエチルアンモニウム)-酢酸エチルエステル臭化物塩）１．０ｇを蒸留水１０ｍｌに溶解した。この溶液を陰イオン交換カラム（アンバーライト：登録商標IR-402、ローム  アンド  ハース社製）を充てんしたカラムに通した。溶離液をエバポレーターで減圧濃縮し、五酸化二リンの共存下、減圧乾燥し、ベタイン１（2-(N,N,N-トリエチルアンモニウム)-アセテート）を得た（０．５９ｇ、１００％）。
【０１５５】
上記で得られた化合物の同定は、ＩＲおよび1Ｈ  ＮＭＲによるエステルピークの消失確認と、Ｃ、Ｈ、Ｎ元素分析による塩の混入の有無を確認することで行った。表１７にＩＲ解析の結果を、表１８に1Ｈ  ＮＭＲ解析の結果を、表１９に元素分析の結果を示す。
【０１５６】
【表１７】
0004761265.tif 000038
【０１５７】
【表１８】
0004761265.tif 000039
【０１５８】
【表１９】
0004761265.tif 000040
【０１５９】
表１７〜１９の結果、目的物である2-(N,N,N-トリエチルアンモニウム)-アセテート（すなわち、図１における化合物４）が得られたことが確認された。
【０１６０】
図１における化合物２を合成した結果を、表２０（ＩＲ）、表２１（1Ｈ  ＮＭＲ）、および表２２（元素分析）に示す。表２０〜２２によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【０１６１】
【表２０】
0004761265.tif 000041
【０１６２】
【表２１】
0004761265.tif 000042
【０１６３】
【表２２】
0004761265.tif 000043
【０１６４】
図１における化合物３を合成した結果を、表２３（ＩＲ）、表２４（1Ｈ  ＮＭＲ）、および表２５（元素分析）に示す。表２３〜２５によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【０１６５】
【表２３】
0004761265.tif 000044
【０１６６】
【表２４】
0004761265.tif 000045
【０１６７】
【表２５】
0004761265.tif 000046
【０１６８】
図１における化合物５を合成した結果を、表２６（ＩＲ）、表２７（1Ｈ  ＮＭＲ）、および表２８（元素分析）に示す。表２６〜２８によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【０１６９】
【表２６】
0004761265.tif 000047
【０１７０】
【表２７】
0004761265.tif 000048
【０１７１】
【表２８】
0004761265.tif 000049
【０１７２】
図１における化合物６を合成した結果を、表２９（ＩＲ）、表３０（1Ｈ  ＮＭＲ）、および表３１（元素分析）に示す。表２９〜３１によれば目的とする化合物が合成されたことを確認することができた。
【０１７３】
【表２９】
0004761265.tif 000050
【０１７４】
【表３０】
0004761265.tif 000051
【０１７５】
【表３１】
0004761265.tif 000052
【０１７６】
図１における化合物７を合成した結果を、表３２（ＩＲ）、表３３（1Ｈ  ＮＭＲ）、および表３４（元素分析）に示す。表３２〜３４によれば目的とする化合物が合成されたことが確認できた。
【０１７７】
【表３２】
0004761265.tif 000053
【０１７８】
【表３３】
0004761265.tif 000054
【０１７９】
【表３４】
0004761265.tif 000055
【０１８０】
図１における化合物８を合成した結果を、表３５（ＩＲ）、表３６（1Ｈ  ＮＭＲ）、および表３７（元素分析）に示す。表３５〜３７によれば目的とする化合物が合成されたことが確認できた。
【０１８１】
【表３５】
0004761265.tif 000056
【０１８２】
【表３６】
0004761265.tif 000057
【０１８３】
【表３７】
0004761265.tif 000058
【０１８４】
〔試験例１〕ベタインのカチオンとアニオンと間のスペーサー長が二本鎖ＤＮＡの安定性に与える影響
図１に示す化合物２（スペーサー長：Ｃ3）および化合物３（スペーサー長：Ｃ5）を用いて、ベタインのカチオンとアニオンと間のスペーサー長が二本鎖ＤＮＡの安定性に与える影響を評価した。
【０１８５】
比較例として、市販のグリシンベタイン（化合物１、スペーサー長：Ｃ1）を用いた。また、二本鎖ＤＮＡとしては、ＤＮＡ１（５’−ＣＧＧＣＧＣＣＧ−３’（配列番号１）／５’−ＣＧＧＣＧＣＣＧ−３’（自己相補鎖、配列番号２））を用いた。
【０１８６】
融解温度の測定は、１００ｍＭ ＮａＣｌ存在下、１０ｍＭトリス緩衝溶液中（ｐＨ８．０）に、３種類のベタイン（化合物１、化合物２、化合物３）のそれぞれ、およびＤＮＡ１を添加し、融解温度の測定を行った。ＤＮＡの濃度は、ＤＮＡ１が４０μＭとなるように反応液に添加した。また、ベタインの濃度は０．５Ｍで行った。またベタインを添加していない場合の融解温度の測定を行った。融解温度は下記の通り行われた。ＵＶ融解曲線は、ペルチェ素子でサンプルセル内の温度を自動制御できるUV-1700（島津社製）を用いて測定された。融解曲線を測定するためのサンプル溶液は、測定前に一度９０℃まで加熱し一本鎖ＤＮＡに完全に融解させた後、２℃／分の速度で０℃までゆっくりと降温させ、二本鎖ＤＮＡを完全に形成させた。その後、０℃で３０分放置し、０．５℃／分の速度でサンプル溶液の温度を昇温させながら各温度における２６０ｎｍの吸光度を測定し、ＵＶ融解曲線を得た。ＵＶ融解曲線の変曲点より融解温度を算出した。
【０１８７】
図３に化合物１を反応液に添加した場合の融解温度の変化量を示す。図３の縦軸は、化合物を反応液に添加しない場合の融解温度に対して化合物を添加した場合の融解温度の変化量を示す。図３よりスペーサー長が長くなるにつれて融解温度が低下することがわかる。グリシンベタイン（化合物１、スペーサー長：Ｃ1）の場合、０．５Ｍの添加濃度ではほとんど融解温度を降下させる効果（不安定化効果）を奏さない。これに対して化合物２（スペーサー長：Ｃ3）および化合物３（スペーサー長：Ｃ5）を用いた場合、０．５Ｍの添加濃度であっても十分な不安定化効果があることがわかった。またスペーサー長が長くなるにつれて、不安定化効果が高くなることが確認された。特に化合物３（スペーサー長：Ｃ5）を用いた場合は、特に顕著な不安定化効果が確認された。
【０１８８】
〔試験例２〕ベタインのカチオン基の特性が二本鎖ＤＮＡの安定性に与える影響
アンモニウム基に連結した置換基の化学構造の効果を、図１に示す化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、化合物８を用いて検討した。
【０１８９】
比較例として、市販のグリシンベタイン（化合物１、Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝ＣＨ3）を用いた。また、二本鎖ＤＮＡとしては、ＧＣ含量および鎖長が異なる３つの配列（ＤＮＡ１：５’−ＣＧＧＣＧＣＣＧ−３’（配列番号１）／５’−ＣＧＧＣＧＣＣＧ−３’（自己相補鎖、配列番号２）、ＤＮＡ２：５’−ＡＴＧＣＧＣＡＴ−３’（配列番号３）／５’−ＡＴＧＣＧＣＡＴ−３’（自己相補鎖、配列番号４）、ＤＮＡ３：５’−ＧＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＧＧＴＴＡＣＣＴＧＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＧＡＴＡＣＧＡＴＣＧ−３’（配列番号５）／５’−ＣＧＡＴＣＧＴＡＴＣＡＡＧＡＣＡＴＧＧＴＣＡＧＧＴＡＡＣＣＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＣ−３’（配列番号６））を用いた。
【０１９０】
融解温度の測定は、１００ｍＭ ＮａＣｌ存在下、１０ｍＭトリス緩衝溶液中（ｐＨ８．０）に、３種類のベタイン（化合物１、化合物２、化合物３）のそれぞれ、および上記３種類のＤＮＡ（ＤＮＡ１、ＤＮＡ２、ＤＮＡ３）のそれぞれを添加し、融解温度の測定を行った。ＤＮＡの濃度は、ＤＮＡ１＝４０μＭ、ＤＮＡ２＝４０μＭ、ＤＮＡ３＝２０μＭとなるように反応液に添加した。また、ベタインの濃度は０．５Ｍで行った。またベタインを添加していない場合の融解温度の測定を行った。その他の融解温度の測定方法については試験例１と同様にした。
【０１９１】
図４に化合物１、化合物４、化合物５、化合物６、化合物７、または化合物８を反応液に添加した場合の融解温度の変化量を示す。図４の化合物４、化合物５、化合物６の不安定化効果を比較した結果、アンモニウム基の構造が嵩高くなればなるほど、その効果は高くなることが示された。特に化合物６を用いた場合の不安定化効果は、比較例（化合物１）を用いた場合の１０倍を超えるものであった。また、置換基の末端に極性官能基を持つ化合物７と、置換基の末端に極性官能基を持たない化合物８との不安定化効果を比較したところ、アンモニウム基の構造の嵩高さだけでなく、置換基の末端には親水性の置換基（極性官能基）を持たないことが重要であるということがわかった。
【０１９２】
〔試験例３〕ベタインのイオン対の数が二本鎖ＤＮＡの安定性に与える影響
ベタインの分子内に存在する双性イオンの数の効果を、図１に示す化合物９を用いて検討した。測定条件は試験例１の条件と同一の条件で行った。比較例として、市販のグリシンベタイン（化合物１、双性イオン数：１）を用いた。
【０１９３】
図５に化合物１または化合物９を反応液に添加した場合の融解温度の変化量を示す。図５より、類似したスペーサー長およびアンモニウム基の化学構造を持つベタイン同士を比較すると、双性イオンの数が多い方が不安定化効果が高くなるということが示された。
【０１９４】
〔試験例４〕ベタインの添加濃度と不安定化効果の検討
図１に示す化合物６を用いて添加濃度と融解温度を降下させる効果と関係を検討した。ＤＮＡ３を使用し、化合物の添加濃度を種々変化させる以外は、試験例１と同一の条件下で行った。比較例として、市販のグリシンベタイン（化合物１）を用いた。
【０１９５】
図６に化合物１または化合物６を反応液に添加した場合の融解温度の変化量を示す。図６における直線の傾きがＤＮＡに対する不安定化効果を示すものである。図６よれば市販のグリシンベタイン（化合物１）の直線の傾きが−２．１（℃／Ｍ）であったのに対して、化合物６の直線の傾きは−２３．２（℃／Ｍ）であった。すなわち、化合物６の直線の傾きは、市販のグリシンベタイン（化合物１）の直線の傾きに対して１１倍であるということがわかった。この結果は、化合物６を用いてグリシンベタイン（化合物１）と同様の効果を得るためには、グリシンベタイン（化合物１）の１１分の１の添加量で足りるということを示している。
【０１９６】
〔試験例５〕ベタインがタンパク質の高次構造に与える影響
本発明にかかる組成物を構成するベタインのタンパク質の高次構造に与える影響を、図１に示す化合物６を用いて検討した。タンパク質としては、αへリックス、βシートなどの高次構造の含量の異なる３つの一般的なタンパク質（γグロブリン、コンカナバリンＡ、牛血清アルブミン）を用いて評価した。評価は、１００ｍＭ ＮａＣｌ存在下、１０ｍＭトリス緩衝溶液中（ｐＨ８．０）に、化合物６（添加濃度：０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５Ｍ）、および上記３種類のタンパク質（γグロブリン、コンカナバリンＡ、または牛血清アルブミン）を添加し、円二色性スペクトルを測定することにより行われた。タンパク質の添加濃度は、[γグロブリン]＝１．０ｍｇ／ｍｌ、[コンカナバリンＡ]＝０．８ｍｇ／ｍｌ、[牛血清アルブミン]＝０．２ｍｇ／ｍｌであった。
【０１９７】
図７に円二色性スペクトルの結果を示す。図７（ａ）はγグロブリンの結果、（ｂ）はコンカナバリンＡの結果、（ｃ）は牛血清アルブミンの結果を示す。図７に示すいずれの結果においても、ベタイン濃度の上昇に伴って円二色性スペクトルの強度が変化することはなかった。よって、本発明にかかる組成物を構成するベタイン（化合物６）はタンパク質の高次構造を変化させない、すなわちタンパク質を変性させないということが明らかとなった。
【０１９８】
〔試験例６〕本発明にかかる組成物を構成するベタインがＰＣＲに与える効果
本発明にかかる組成物を構成するベタインを添加することによって、高いＧＣ含量を有し、一般的なＰＣＲ条件下では増幅されないＤＮＡ配列を増幅し得るかどうかについて、図１に示す化合物６を用いて検討した。比較例として、市販のグリシンベタイン（化合物１）を用いた。
【０１９９】
上記検討は、ヒトゲノム中のＤＩＰ２Ａ（アンプリコンのＧＣ含量は７１％、１１８５ｂｐ）をＰＣＲ増幅することによって行われた。当該ＤＮＡ配列は融解温度が極めて高く非常に安定である。よって、添加剤を添加しない通常の条件下でのＰＣＲでは、当該ＤＮＡ配列を全く増幅することができない。ＤＩＰ２ＡおよびそのＰＣＲについては「M. Ralser, R. Querfurth, H. - J. Warnatz, H. Lehrach, M. - L. Yaspo, S. Krobitsch, Biocem. Biophys. Chem. Commun., 347, 747-751 (2006)」を参照のこと。
【０２００】
ゲノムＤＮＡは発明者の口腔粘膜細胞を採取し、DNeasy Tissue Kit（キアゲン社製、登録商標）にて精製した。プライマーは５‘−ａｇｇｇｇａａｇｇａａｇｃａｇｇａｃｔ−３’（配列番号７）、５‘−ｃａｇｃｔｃａｇｃｃａｇｇｃｔｃｔｃ−３’（配列番号８）を用いた。ＰＣＲは３０μｌのvolumeで行い、ＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ｖｅｒ．２（東洋紡社製、登録商標）を使用した。またプライマー濃度は０．６μＭ、ｄＮＴＰ濃度は２５μＭ、ＤＮＡポリメラーゼは０．５Ｕに調整し、鋳型となるゲノムＤＮＡは５０ｎｇの濃度で添加した。サイクルは９４℃で４分の後、９４℃で１分→７２℃で２分を４０回繰り返し、最後に７２℃で９分間、伸長反応を行った。
【０２０１】
図８に化合物１または６を１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、４００ｍＭ、８００ｍＭ、１０００ｍＭの濃度添加してＰＣＲを行った場合の増幅産物の電気泳動図を示す。図８の結果より、添加剤（化合物１または６）を加えることによって、目的とするアンプリコンが増幅するということが確認された。アンプリコンの増幅は、比較例として用いた化合物１の場合でも、化合物６の場合でも確認されたが、化合物１では４００ｍＭ以上を添加しなければ増幅されないのに対して、本発明にかかる組成物を構成する化合物６ではその２０分の１の濃度である２０ｍＭであっても増幅が確認された。よって、本発明にかかる組成物を構成する化合物６によれば、低濃度であっても、これまで増幅が困難であった高いＧＣ含量のＤＮＡを十分増幅できるということがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０２０２】
上記の通り本発明によれば、これまで困難であったＧＣ含量の高い核酸領域を熱変性させることが可能となり、当該ＧＣ含量の高い核酸領域であっても効率よく合成することができるという効果を享受できる。また本発明によれば、ＧＣ含量の高い核酸領域の合成を可能にするベタインを、簡便かつ効率的に製造することができるという効果を享受できる。
【０２０３】
ＰＣＲをはじめとする核酸合成技術は、分子生物学等の学術分野のみならず、(a)髪の毛、口腔粘膜細胞から抽出したゲノムＤＮＡを使った遺伝子鑑定、(b)遺伝子診断、(c)食品の原産地検査や品種鑑定、(d)犯罪捜査における遺伝子鑑定、(e)細胞内におけるｍＲＮＡの産生を調査するＲＴ−ＰＣＲ等、広範な分野においてに利用可能である。それゆえ本発明は、ＰＣＲ等の核酸合成を利用する全ての産業（医薬品産業、農業、食品産業、水産業、畜産業等）において利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】各種ベタイン（化合物１〜９）の構造を示す図である。
【図２】本発明にかかるベタインの製造方法のスキームを示す図であり、（ａ）は分子内に１組の双性イオンを持つベタインの製造スキームを示し、（ｂ）は分子内に２組の双性イオンを持つベタインの製造スキームを示す。
【図３】化合物１、化合物２、または化合物３を反応液に添加した場合における二本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡ１）の融解温度の変化量を示す図である。
【図４】化合物１、または化合物４〜８を反応液に添加した場合における二本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡ１、２、３）の融解温度の変化量を示す図である。
【図５】化合物１、または化合物９を反応液に添加した場合における二本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡ１、２、３）の融解温度の変化量を示す図である。
【図６】化合物１、または化合物６の反応液への添加量と、二本鎖ＤＮＡ（ＤＮＡ３）の融解温度の変化量との関係を示す図である。
【図７】化合物６の各種タンパク質に対する影響を円二色性スペクトルを測定することによって評価した結果であり、（ａ）はγグロブリンの結果、（ｂ）はコンカナバリンＡの結果、（ｃ）は牛血清アルブミンの結果をそれぞれ示す。
【図８】ＰＣＲの反応液に、化合物１または６を、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、４００ｍＭ、８００ｍＭ、１０００ｍＭとなるように添加してＰＣＲを行った場合の増幅産物のアガロースゲル電気泳動像である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0004761265.tif 000069
【配列表】
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