(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造式（１）で表される、ガラクトース残基のすべての水酸基が、ベンジル基またはベンジリデン基、もしくは４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基またはベンジリデン基で保護され、Ｎ−アセチルグルコサミン残基のすべての水酸基が、ベンジル基または４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基で保護され、および、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基の３位の水酸基が、ベンジル基または４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基で保護され、かつ、トレオニン残基またはセリン残基のアミノ基が９−フルオレニルメトキシカルボニル基で保護された、コア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体。
【化１】
0004813838.tif 000013
（式中、Ｂｎはベンジル基もしくは４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基を、Ｐｈはフェニル基もしくは４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するフェニル基を、Ａｃはアセチル基を、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカルボニル基を、Ｒは水素原子またはメチル基を表す。）
【請求項２】
［１］構造式（２）で表される、ガラクトース残基およびＮ−アセチルグルコサミン残基のすべての水酸基がベンジル基またはベンジリデン基、もしくは４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基またはベンジリデン基で保護され、かつ、Ｎ−アセチルグルコサミン残基のＮ−アセチル基がＮ−トリクロロアセチル基であって、該残基の１位がフッ素原子で置換された二糖類と、構造式（３）で表される、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基のアセトアミド基がアジド化され、３位の水酸基がベンジル基または４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基で保護され、かつ、トレオニン残基またはセリン残基のアミノ基が９−フルオレニルメトキシカルボニル基で保護され、該残基のカルボキシル基がアリル基で保護された単糖アミノ酸誘導体とを縮合反応させて、構造式（４）で表される、トリクロロアセトアミド基およびアジド基を有し、かつ、コア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体を合成し、
【化２】
0004813838.tif 000014
【化３】
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［式（２）中、Ｂｎはベンジル基もしくは４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基を、Ｐｈはフェニル基もしくは４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するフェニル基を表す。］
［式（３）中、Ｂｎはベンジル基もしくは４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基を、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカルボニル基を、Ｒは水素原子またはメチル基を表す。］
【化４】
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［式（４）中、Ｂｎ、Ｐｈ、ＦｍｏｃおよびＲは前記と同じである。］
［２］ついで、構造式（４）で表される、コア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体を還元して、トリクロロアセチル基をアセチル基に、アジド基をアミノ基に変換した後、さらに、該アミノ基をアセチル化して、構造式（５）で表される、アリル基を有する、コア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体を合成し、
【化５】
0004813838.tif 000017
［式（５）中、Ｂｎ、Ｐｈ、ＦｍｏｃおよびＲは前記と同じである。Ａｃはアセチル基を表す。］
［３］ついで、構造式（５）で表される、コア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体を、脱アリル化して、構造式（１）で表される、ガラクトース残基のすべての水酸基が、ベンジル基またはベンジリデン基、もしくは４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基またはベンジリデン基で保護され、Ｎ−アセチルグルコサミン残基のすべての水酸基が、ベンジル基または４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基で保護され、および、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基の３位の水酸基が、ベンジル基または４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基で保護され、かつ、トレオニン残基またはセリン残基のアミノ基が９−フルオレニルメトキシカルボニル基で保護された、コア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体を合成する方法。
【化６】
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（式中、Ｂｎ、Ｐｈ、Ａｃ、ＦｍｏｃおよびＲは前記と同じである。）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖機能の解明に有用で、かつ糖ペプチドの固相合成に利用可能なコア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体およびその化学合成法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
天然に存在するタンパク質の半数以上は、糖鎖が結合した糖タンパク質として存在すると言われている。この糖鎖はタンパク質の構造や物理化学的性質を保持する役割の他に、糖タンパク質が他の生体分子との相互作用の中で、正しくその機能を果たすためのシグナルまたは機能制御の役割を担っているものと考えられている。糖タンパク質の糖鎖は、主にアスパラギン残基の側鎖アミド上に糖鎖が結合するＮ−結合型糖鎖と、トレオニンやセリンの側鎖水酸基に糖鎖が結合するＯ−結合型糖鎖に大別される。後者はアミノ酸水酸基とαグリコシド結合したＮ−アセチルガラクトサミンを共通とし、さらに生合成過程において、糖残基付加がなされ、大きな糖鎖へと変換されるが、付加する糖残基、結合位置、グリコシド結合様式（立体配置）によって基本分岐構造がコア１−８型に分類される。
【０００３】
Ｏ−結合型糖鎖をもつ典型的な糖タンパク質としてムチンが知られている。ムチンは４００−１０００kDaに及ぶ巨大な分子量をもつ糖タンパク質であり、その大分子量の大半は糖鎖に由来する。タンパク質部分には、８アミノ酸残基からなる繰り返し配列を基本骨格とするＭＵＣ５ＡＣをはじめ、１６９アミノ酸の繰り返しを持つＭＵＣ６まで、さまざまな長さの基本構造が知られる。ヒトムチンでは１０数種のＭＵＣ構造の存在が報告されている。これらの配列には多くのトレオニン残基とセリン残基が含まれており、その大部分に前記Ｏ−結合型糖鎖が結合して糖鎖クラスターを呈している。ムチンにおけるこれらの構造は高い親水性を保持するものであることから、粘膜の乾燥からの保護や、病原性微生物からの保護、さらに機械的な損傷からの保護のためにその役割があるものと考えられている。粘膜表面に存在するムチンばかりでなく、例えば乳汁などに分泌されるムチンも、多くは組織や個体の保護を目的として存在しているものと思われている。
【０００４】
一方、ムチンまたはムチン様糖タンパク質が、ガン化や悪性化を生じた細胞から発現される場合、ムチン自身の発現量の変化とともに、その結合している糖鎖構造に大きな変化が現れることが知られている。発現する糖鎖は正常細胞のそれと異なり不完全なものであったり、糖鎖の伸長に係わる糖転移酵素の異常な発現により、長大なＮ−アセチルラクトサミン繰返し構造が付加したものであったりする。これらは腫瘍マーカーとして免疫学的な診断の基盤となっている。異常糖鎖の発現は診断のみでなく、免疫に着目した療法やワクチンの開発につながるものとして注目されている。クラスター状で存在する糖鎖の構造は均質なものではなく、いくつかのコア構造に属する糖鎖群の混在したものである。
【０００５】
したがって、糖鎖機能を応用する新しい生体制御技術の開発をめざすには、先ず糖鎖構造の定性的および定量的な変化を的確に捉える方法を確立することが必須の要件となる。
現在マススペクトルを活用した糖タンパク質の構造解析法が種々研究されている。それにより、糖タンパク質の分子量を知ることができるばかりでなく、糖鎖の構成および結合様式までを明らかにできるようになった。
【０００６】
例えば、コア６型構造を有するＯ−結合型糖タンパク質の糖鎖は、近縁のコア２型構造、コア４型構造を有するＯ−結合型糖タンパク質の糖鎖などと共存しており、ヒトミルクカゼイン、ヒト大腸がんムチン、ヒト卵巣嚢糖タンパク質、ヒト胎便ムチンなどから、その誘導体の存在が見出されているが、その生理的な意義はまだ不明である。
【０００７】
前記のような研究を遂行する上で確定した糖鎖構造をもつ、均一なコア６型構造を有する糖タンパク質の安定的な取得は不可欠である。しかしながら、極微量にしか得られない天然の糖タンパク質に、これを求めることは困難である。糖タンパク質の化学合成法は構造解析のための試料を提供するばかりでなく、糖鎖機能を応用するワクチン開発などの技術につながるため、その化学合成法の確立は重要である。そのため、該糖タンパク質の化学合成による取得が大いに期待されている。
【０００８】
ところで、糖タンパク質の固相反応による化学合成においては、糖鎖の水酸基のＯ−アシル化を回避するために、水酸基を保護しておくことが好ましい。該保護方法として、アセチル基を用いる方法が一般的であるが、コア６型構造を有するＯ−結合型糖タンパク質の糖鎖誘導体の１９９７年のPaulsenによる合成、Kogantyによる合成、および１９９８年のDanishefskyによる合成のいずれの場合も、保護基としてアセチル基を使用している（非特許文献１〜４）。そのため、該糖鎖誘導体から糖ペプチドを合成する場合には、最終工程の脱アセチル化反応を塩基性条件で行わなければならない。しかし、ナトリウムメトキシドなどを使用する強い塩基性条件下では、アミノ酸部分のラセミ化やトレオニン残基やセリン残基の側鎖から糖鎖がβ脱離するなどの副反応が起きることが懸念される。
【０００９】
また、保護糖鎖形成に、ベンジル化合物とベンジリデン化合物を用いる場合には、糖のグリコシド結合の化学的安定性を損なわない酸性条件で、それらを除去でき、ペプチド合成に要する側鎖官能基脱保護条件と同調できることが、本発明者らにより明らかにされている（非特許文献５）。
このように、保護基の種類によって、各々一長一短があり、糖ペプチド合成を効率的に行なうには、糖鎖および／または目的の糖ペプチドの種類、構造、特性などに適した保護基の選択が重要である。
【００１０】
【非特許文献１】J.Chem.Soc., Perkin 1, 1997, 281-293.
【非特許文献２】J.Chem.Soc., Perkin 1, 1997, 2359-2368.
【非特許文献３】Tetrahedron Lett., 1997, 38, 45-48,
【非特許文献４】J.Am.Chem.Soc., 1998, 120, 7760-7769.
【非特許文献５】Tetrahedron Lett., 1997, 38, 7211-7214
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ムチン型の多様な構造の糖鎖を有する、新規なコア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体を提供することである。また、本発明の第二の目的は、糖ペプチドを合成する場合に、トレオニン側鎖やセリン側鎖の水酸基の保護基を脱離する工程における副反応を抑制できる、該コア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体を化学合成する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第一の本発明は、構造式（１）で表される、ガラクトース残基のすべての水酸基が、ベンジル基またはベンジリデン基、もしくは４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基またはベンジリデン基で保護され、Ｎ−アセチルグルコサミン残基のすべての水酸基が、ベンジル基または４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基で保護され、および、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基の３位の水酸基が、ベンジル基または４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基で保護され、かつ、トレオニン残基またはセリン残基のアミノ基が９−フルオレニルメトキシカルボニル基で保護された、コア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体、である。
ここで、ガラクトース残基はＮ−アセチルグルコサミン残基と、該Ｎ−アセチルグルコサミン残基はＮ−アセチルガラクトサミン残基と、各々グリシド結合されている。
【００１３】
【化７】
0004813838.tif 000002
【００１４】
式中、Ｂｎはベンジル基もしくは４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基を、Ｐｈはフェニル基もしくは４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するフェニル基を、Ａｃはアセチル基を、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカルボニル基を、Ｒは水素原子またはメチル基を表す。
【００１５】
第二の本発明は、［１］構造式（２）で表される、ガラクトース残基およびＮ−アセチルグルコサミン残基のすべての水酸基がベンジル基またはベンジリデン基、もしくは４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基またはベンジリデン基で保護され、かつ、Ｎ−アセチルグルコサミン残基のＮ−アセチル基がＮ−トリクロロアセチル基であって、該残基の１位がフッ素原子で置換された二糖類と、構造式（３）で表される、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基のアセトアミド基がアジド化され、３位の水酸基がベンジル基または４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基で保護され、かつ、トレオニン残基またはセリン残基のアミノ基が９−フルオレニルメトキシカルボニル基で保護され、該残基のカルボキシル基がアリル基で保護された単糖アミノ酸誘導体とを縮合反応させて、構造式（４）で表される、トリクロロアセトアミド基およびアジド基を有し、かつ、コア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体を合成し、
【００１６】
【化８】
0004813838.tif 000003
【００１７】
式中、Ｂｎはベンジル基もしくは４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基を、Ｐｈはフェニル基もしくは４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するフェニル基を表す。
【００１８】
【化９】
0004813838.tif 000004
【００１９】
式中、Ｂｎはベンジル基もしくは４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基を、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカルボニル基を、Ｒは水素原子またはメチル基を表す。
【００２０】
【化１０】
0004813838.tif 000005
【００２１】
式中、Ｂｎ、Ｐｈ、ＦｍｏｃおよびＲは前記と同じである。
【００２２】
［２］ついで、構造式（４）で表される、コア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体を還元して、トリクロロアセチル基をアセチル基に、アジド基をアミノ基に変換した後、さらに、該アミノ基をアセチル化して、構造式（５）で表される、アリル基を有する、コア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体を合成し、
【００２３】
【化１１】
0004813838.tif 000006
【００２４】
式中、Ｂｎ、Ｐｈ、ＦｍｏｃおよびＲは前記と同じである。Ａｃはアセチル基を表す。
【００２５】
［３］ついで、構造式（５）で表される、コア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体を、脱アリル化して、構造式（１）で表される、ガラクトース残基のすべての水酸基が、ベンジル基またはベンジリデン基、もしくは４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基またはベンジリデン基で保護され、Ｎ−アセチルグルコサミン残基のすべての水酸基が、ベンジル基または４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基で保護され、および、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基の３位の水酸基が、ベンジル基または４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基で保護され、かつ、トレオニン残基またはセリン残基のアミノ基が９−フルオレニルメトキシカルボニル基で保護された、コア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体を合成する方法、である。
【００２６】
【化１２】
0004813838.tif 000007
【００２７】
式中、Ｂｎ、Ｐｈ、Ａｃ、ＦｍｏｃおよびＲは前記と同じである。
【発明の効果】
【００２８】
本発明により、天然からの取得が困難な糖鎖構造を持つコア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸を、脱離容易な保護基を有する誘導体として提供することができる。また、糖ペプチドを化学合成する際の、特に最終の保護基の脱離工程における副反応を抑制できる、コア３型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体を、化学合成する方法を提供できる。よって、該Ｏ−結合型糖アミノ酸誘導体を用いて、糖鎖タンパク質の学問的解析や応用面での大きな進展が期待できる。例えば、ペプチド上に展開したり、酵素によってさらに糖鎖の伸長を施すなどの関連分子ライブラリー化への応用が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明に係る新規物質は、構造式（１）で表される、コア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体［以下、誘導体（１）、または化合物（１）と略記することがある。その他についても同様に略記することがある。］である。該誘導体（１）は、Ｆｍｏｃ法による糖ペプチドの固相合成のためのキー中間体として有用な構造を備えており、糖水酸基の保護基としてベンジル基およびベンジリデン基を用いるところに特徴がある。該誘導体（１）は、ガラクトース残基がＮ−アセチルグルコサミン残基とグリシド結合しており、さらに、該Ｎ−アセチルグルコサミン残基がＮ−アセチルガラクトサミン残基とグリシド結合している。該誘導体（１）（Ｒが水素原子）はセリンの誘導体であり、タンパク質中のセリン残基がコア６型糖鎖によって、グリコシル化された糖アミノ酸構造を有するものである。該誘導体（１）（Ｒがメチル基）はトレオニンの誘導体であり、そのグリコシル化された糖アミノ酸構造体である。
これらの保護基は、ペプチド鎖の化学的安定性を損なわない酸性条件下で糖のグリコシド結合をも侵すことなく脱離させることができる。
【００３０】
誘導体（１）（ただし、Ｒがメチル基の場合）は、トレオニンの誘導体であり、タンパク質中のトレオニン残基がコア６型構造を有するＯ−結合型糖鎖によってグリコシル化された糖ペプチド構造を表すものであり、誘導体（１）（ただし、Ｒが水素原子の場合）は、セリンが同様にグリコシル化されたものに相当する。誘導体（１）は、既知化合物（２）および（３）を出発原料として、以下の３工程を経て合成される。
【００３１】
工程［１］：  化合物（２）と化合物（３）（ただし、Ｒが水素原子）を、予め調製したビスシクロペンタジエニルジルコノセンジクロリドと過塩素酸銀の混合物を縮合促進剤として、ジクロロメタン溶媒を用いて、低温下に縮合反応させると、立体選択的なグリコシド化が進行し、化合物（４）（ただし、Ｒが水素原子）が主生成物として得られる。同様に、化合物（２）と化合物（３）（ただし、Ｒがメチル基）を反応させると、化合物（４）（ただし、Ｒがメチル基）が得られる。
縮合促進剤としては、ビスシクロペンタジエニルハフノセンジクロリドなども使用することができる。また、過塩素酸銀の代わりに、トリフルオロメタンスルホン酸銀、トリフルオロメタンスルホン酸第一スズを使用してもよい。
縮合反応は−２０〜０℃程度の低温で行うと、副反応が少ない。
反応溶媒は、化合物（２）および化合物（３）を溶解するものであれば、特に限定されないが、ジクロロメタン、ジクロロエタン、ジエチルエーテル、トルエン、アセトニトリルなどが好適である。
縮合反応生成物をろ過し、ろ液を濃縮し、抽出により、化合物（４）を精製分離する。
【００３２】
【化１３】
0004813838.tif 000008
【００３３】
式中、Ｂｎはベンジル基もしくは４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基を、Ｐｈはフェニル基または４位に炭素数１〜４のアルキル基もしくはアルコキシ基を有するフェニル基を表す。
【００３４】
【化１４】
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【００３５】
式中、Ｂｎはベンジル基もしくは４位に炭素数１〜４のアルキル基またはアルコキシ基を有するベンジル基を、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカルボニル基を、Ｒは水素原子またはメチル基を表す。
【００３６】
【化１５】
0004813838.tif 000010
【００３７】
式中、Ｂｎ、Ｐｈ、ＦｍｏｃおよびＲは前記と同じ意味である。
【００３８】
工程［２］：  化合物（４）（ただし、Ｒが水素原子）は、ジクロロメタン溶媒中で、亜鉛末と酢酸の存在下で攪拌され、トリクロロアセチル基がアセチル基に、アジド基がアミノ基に還元される。還元反応生成物は精製することなく、引続き、無水酢酸でアミノ基をアセチル化して、化合物（５）（ただし、Ｒが水素原子）を得る。同様に、化合物（４）（ただし、Ｒがメチル基）からは、化合物（５）（ただし、Ｒがメチル基）が得られる。
還元剤は化合物（４）の種類に応じて適宜選択して使用される。
還元反応は０〜２０℃程度の温度で行うと、副反応が少ない。
還元反応溶媒は、化合物（４）を溶解するものであれば、特に限定されないが、ジクロロメタン、ジクロロエタンなどが好適である。
アセチル化剤としては塩化アセチル、アセチルイミダゾールなども使用することができる。
アセチル化反応は０〜２０℃程度の温度で行うと、副反応が少ない。
アセチル化反応溶媒は、前記化合物を溶解するものであれば、特に限定されないが、ジクロロメタン、酢酸エチル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどが好適である。
アセチル化反応生成物は、その後ろ過し、ろ液を濃縮し、抽出操作を施すことによって、化合物（５）を精製分離する。
【００３９】
【化１６】
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【００４０】
式中、Ｂｎ、Ｐｈ、ＦｍｏｃおよびＲは前記と同じ意味である。
【００４１】
工程［３］：  化合物（５）（ただし、Ｒが水素原子）は、テトラヒドロフラン中、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウムを触媒として、５，５−ジメチル−１，３−シクロヘキサンジオン（略名ジメドン）の存在下に、脱アリル化反応を行うことで、化合物（１）（ただし、Ｒが水素原子）が得られる。同様にして、化合物（５）（ただし、Ｒがメチル基）からは、化合物（１）（ただし、Ｒがメチル基）が得られる。
脱アリル化剤としては前記テトラキストリフェニルホスフィンパラジウムとＮ−メチルアニリンとの組合わせも好適である。
脱アリル化反応は０〜２０℃程度の温度で行うと、副反応が少ない。
脱アリル化反応溶媒は、前記化合物を溶解するものであれば、特に限定されないが、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどが好適である。
脱アリル化反応生成物を、濃縮、ろ過し、ろ過残渣を精製し、溶剤抽出により、化合物（１）を得る。
【００４２】
【化１７】
0004813838.tif 000012
【００４３】
式中、Ｂｎ、Ｐｈ、ＦｍｏｃおよびＲは前記と同じ意味である。
【００４４】
本発明のコア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体（１）やその他のコア６型構造を有するＯ−結合型糖アミノ酸誘導体の構造は、質量分析および核磁気共鳴分光法により決定される。また、化合物の性状は、比旋光度およびＲｆ値によって特徴づけられる。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例により、詳細に説明する。もとより、本発明は、本実施例に限定されるものではない。なお、実施例において、成分組成、濃度、収率の百分率は質量基準である。
【００４６】
（実施例１）
＜工程［１］：  構造式（４）で表される化合物［本実施例１においては、式（１）および式（３）〜式（５）で表される化合物のＲはすべて水素原子であることから、以下では、（Ｒが水素原子の表記を省略する。）の合成：  N-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-O-[2.3-ジ-O-ベンジル-4.6-O-ベンジリデン-b-D-ガラクトピラノシル-(1(R)4)-3.6-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-2-トリクロロアセトアミド- b-D-グルコピラノシル-(1(R)6)-2-アジド-3-O-ベンジル-2-デオキシ-a-D-ガラクトピラノシル]-L-セリン  アリルエステルの合成＞
予め減圧下で加熱乾燥した粉末モレキュラーシーヴス４Ａ(７００ｍｇ）、ビスシクロペンタジエニルジルコノセンジクロリド(８７ｍｇ）、過塩素酸銀(１２３ｍｇ）、 および化合物（２）(１４５ｍｇ)の混合物を褐色フラスコ中アルゴン気流下−１５℃に冷却し、ジクロロメタン(６ｍｌ)を加えて1時間撹拌した。ここに化合物（３）(１４０ｍｇ)のジクロロメタン(７ｍｌ)溶液を加えた。反応液を−１５℃で１．５時間撹拌した後、過剰の飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を止め、クロロホルムで希釈した。その後、セライト上でろ過をした。ろ液の有機層を集めて分液ロートに移し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮して得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。トルエン−酢酸エチル（８５：１５）の混合溶媒で溶出して化合物（４）(１６９ｍｇ、 收率７２％)を得た。
【００４７】
＜構造式（４）で表される化合物の性状＞
[a]D+41.2° (c 1.1, クロロホルム)
1H-NMR (CDCl3): d 7.71 (d, 2H, J = 7.4 Hz, Ar), 7.61 (d, 1H, J = 7.3 Hz, Ar), 7.56 (d, 1H, J = 7.3 Hz, Ar), 7.49-7.14 (m, 35H, Ar, -NH), 5.89 (m, 1H, -CH2CH=CH2), 5.75 (d, 1H, J = 7.6 Hz, -NH), 5.45 [s, 1H, PhCH(O)2], 5.32 (brd, 1H, J = 17.1 Hz, -CH=CH2), 5.23 (brd, 1H, J = 10.5 Hz, -CH=CH2), 5.19 (d, 1H, J = 10.5 Hz, -CH2Ph), 4.94 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1b), 4.82 (brs, 1H, H-1a), 3.38 (dd, 1H, J = 3.7, 9.5 Hz, H-3c), 2.98 (brs, 1H, H-5c); 13C-NMR (CDCl3): d 92.4(-COCCl3), 98.3 (1JCH 171.7 Hz, GalN3 C-1), 99.2 (1JCH163.4Hz, GlcNTCA C-1), 101.2 [PhCH(O)2], 102.8 (1JCH167.5Hz, Gal C-1). 
MALDI TOF MS: calcd for C83H84N5O19Cl31559.48 found; 1582,05 (+Na)+, 1598.01 (+K)+.
元素分析Calcd for C83H84N5O19Cl3: C, 63.82; H, 5.42; N, 4.48. Found: C, 63.86; H, 5.27; N, 4.11.
以上の測定結果から、構造式（４）で表される化合物であることが同定された。
【００４８】
＜工程［２］：  構造式（５）で表される化合物の合成：  N-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-O-[2.3-ジ-O-ベンジル-4.6-O-ベンジリデン-b-D-ガラクトピラノシル-(1(R)4)-2-アセトアミド-3.6-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ- b-D-グルコピラノシル-(1(R)6)-2-アセトアミド-3-O-ベンジル-2-デオキシ-a-D-ガラクトピラノシル-L-セリン  アリルエステルの合成＞
化合物（４）(１３９ｍｇ)のジクロロメタン(１３ｍｌ)溶液に室温で撹拌しつつ酢酸(０．５ｍｌ)と亜鉛末(０．５ｇ)を2時間おきに4回加えた。その後一夜撹拌を続けた。薄層クロマトグラフィー上で生成物が一点に収束したことを確認し撹拌を止め、セライトを通して反応混合物をろ過し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をジクロロメタン(１０ｍｌ)とメタノール(５ｍｌ)の混合液に溶解し、無水酢酸(５０ mｌ)を加え1時間撹拌した。反応液をクロロホルムで希釈して分液ロートに移し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、飽和食塩水で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥した後、減圧濃縮して得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。クロロホルム−メタノール（９７：３）の混合溶媒で溶出して化合物（５）(１１６ｍｇ、 收率８８％)を得た。
【００４９】
＜構造式（５）で表される化合物の性状＞
[a]D +43.3° (c 0.5, クロロホルム)
1H-NMR (CDCl3): d 7.72 (d, 2H, J = 7.3 Hz, Ar), 7.61 (brt, 2H, J = 6.5 Hz, Ar), 7.47 (m, 2H, Ar), 7.34-7.18 (m, 32H, Ar). 6.22 (d, 1H, J = 7.8 Hz, -NH), 5.98 (d, 1H, J = 7.1 Hz, -NH), 5.85 (m, 1H, -CH2CH=CH2), 5.43 [s, 1H, PhCH(O)2], 5.39 (d, 1H, J = 9.3 Hz, -NH), 5.29 (brd, 1H, J = 17.1 Hz, -CH=CH2), 5.20 (brd, 1H, J = 10.0 Hz, -CH=CH2), 1.89 (s, 3H, Ac), 1.80 (s, 3H, Ac). 13C-NMR (CDCl3): d 98.5 (GalNAc C-1), 100.3 (GlcNAc C-1), 101.2 [PhCH(O)2], 102.9 (Gal C-1). 
MALDI TOF MS: calcd for C85H91N3O201473.62. found; 1496.59 (+Na)+, 1512.62 (+K) +.
元素分析 Calcd for C85H91N3O20: C, 69.23; H, 6.22; N, 2.85. Found: C, 69.07; H, 6.18; N, 2.74.
以上の測定結果から、構造式（５）で表される化合物であることが同定された。
【００５０】
＜工程［３］：  構造式（１）で表される化合物の合成：  N-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-O-[2.3-ジ-O-ベンジル-4.6-O-ベンジリデン-b-D-ガラクトピラノシル-(1(R)4)-2-アセトアミド-3.6-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ- b-D-グルコピラノシル-(1(R)6)-2-アセトアミド-3-O-ベンジル-2-デオキシ-a-D-ガラクトピラノシル-L-セリン  の合成＞
化合物（５） (１０２ｍｇ)、テトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(５ｍｇ)、 5.5-ジメチル-1.3-シクロヘキサンジオン(２００ｍｇ)のテトラヒドロフラン(１０ｍｌ)溶液をアルゴン気流下、室温で2時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製した。先ずクロロホルム−エタノール（９５：５）の混合溶媒で過剰の5.5-ジメチル-1.3-シクロヘキサンジオンおよび低極性の副生成物を溶出し、次に酢酸（１％）を含むクロロホルム-メタノール（92：8）で溶出して化合物（１） (９４ｍｇ、 收率９５％)を得た。
【００５１】
＜構造式（１）で表される化合物の性状＞
[a]D +42.9° (c 0.5, クロロホルム)
1H-NMR (DMSO-d6): d 12.86 (br, 1H, -CO2H), 7.87 (d, 2H, J = 7.6 Hz, Ar), 7.70 (d, 2H, J = 7.3 Hz, Ar), 7.61-7.17 (m, 37H, Ar, NH), 5.64 [s, 1H, PhCH(O)2], 5.09 (d, 1H, J = 11.0 Hz, -CH2Ph), 1.83 (s, 3H, Ac), 1.80 (s, 3H, Ac); 13C-NMR (CDCl3-CD3OD): d 98.1 (GalNAc C-1), 100.8 (GlcNAc C-1), 100.9 [PhCH(O)2], 102.5 (Gal C-1). 
MALDI TOF MS: calcd for C82H87N3O20 1433.58. found; 1456.47 (+Na)+.
元素分析 Calcd for C82H87N3O20: C, 68.65; H, 6.11; N, 2.93. Found: C, 68.35; H, 6.01; N, 2.94.
以上の測定結果から、構造式（１）で表される化合物であることが同定された。
【００５２】
（実施例２）
＜工程［１］：  構造式（４）で表される化合物（本実施例２においては、式（１）および式（３）〜式（５）で表される化合物のＲはすべてメチル基であることから、以下では、Ｒがメチル基の表記を省略する。）の合成：  N-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-O-[2.3-ジ-O-ベンジル-4.6-O-ベンジリデン-b-D-ガラクトピラノシル-(1(R)4)-3.6-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ-2-トリクロロアセトアミド- b-D-グルコピラノシル-(1(R)6)-2-アジド-3-O-ベンジル-2-デオキシ-a-D-ガラクトピラノシル]-L-トレオニン  アリルエステルの合成＞
実施例１の構造式（４）で表される化合物（ただし、Ｒが水素原子）の合成法に倣い、同一条件のもと、化合物（２） (１７０ｍｇ)と化合物（３） (１４３ｍｇ)を用いて縮合反応を行った。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。トルエン−酢酸エチル（８５：１５）の混合溶媒で溶出して化合物（４）(１８６ｍｇ、 收率６５％)を得た。
【００５３】
＜構造式（４）で表される化合物の性状＞
[a]D +30.5° (c 1.4, クロロホルム)
1H-NMR (CDCl3): d 7.75 (d, 2H, J = 7.3 Hz, Ar), 7.62 (d, 1H, J = 7.3 Hz, Ar), 7.47-7.18 (m, 34H, Ar), 6.98(d, 1H, J = 7.7 Hz, -NH), 5.93 (m, 1H, -CH2CH=CH2), 5.65 (d, 1H, J = 9,0 Hz, -NH), 5.45 [s, 1H, PhCH(O)2], 5.35 (brd, 1H, J = 16.1 Hz, -CH=CH2), 5.25 (brd, 1H, J = 10.2 Hz, -CH=CH2), 5.17 (d, 1H, J = 10.5 Hz, -CH2Ph), 4.94 (d, 1H, J = 7.8 Hz, H-1b), 4.89 (d, 1H, J = 3.4 Hz, H-1a), 3.38 (dd, 1H, J = 3.7, 9.8 Hz, H-3c), 2.99 (brs, 1H, H-5c) 1.29 (d, 3H, J = 6.3 Hz, Thr-gH); 13C-NMR (CDCl3): d 92.4(-COCCl3), 99.2 (1JCH170.0 Hz, GalN3 C-1), 99.6 (1JCH 161.8 Hz GlcNTCA C-1), 101.2 [PhCH(O)2], 102.8 (1JCH165.9 Hz Gal C-1).
MALDI TOF MS: calcd for C84H86N5O19Cl31573.49 found; 1596.38 (+Na)+, 1617.36 (+K)+.
元素分析Calcd for C84H86N5O19Cl3: C, 64.02; H, 5.50; N, 4.44. Found: C, 64.12; H, 5.48; N, 4.06.
以上の測定結果から、構造式（４）で表される化合物であることが同定された。
【００５４】
＜工程［２］：  構造式（５）で表される化合物の合成：  N-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-O-[2.3-ジ-O-ベンジル-4.6-O-ベンジリデン-b-D-ガラクトピラノシル-(1(R)4)-2-アセトアミド-3.6-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ- b-D-グルコピラノシル-(1(R)6)-2-アセトアミド-3-O-ベンジル-2-デオキシ-a-D-ガラクトピラノシル-L-トレオニン  アリルエステルの合成＞
化合物（４）(１７５ｍｇ)を用い、実施例１の化合物（４）（ただし、Ｒは水素原子）の製造法に倣い、亜鉛末と酢酸によるトリクロロアセチル基の脱クロル化およびアジド基のアミノ基への変換をした後、アセチル化して化合物（５）(１３０ｍｇ、 收率７９％)を得た。
【００５５】
＜構造式（５）で表される化合物の性状＞
[a]D + 36.1° (c 1.5, クロロホルム)
1H-NMR (CDCl3): d 7.75 (d, 2H, J = 7.1 Hz, Ar), 7.60 (brd, 2H, J = 7.3 Hz, Ar), 7.36 (m, 2H, Ar), 7.31-7.21 (m, 32H, Ar), 5.84 (m, 2H, , -NH, -CH2CH=CH2), 5.53 (d, 1H, J = 9.3 Hz, -NH), 5.46 (d, 1H, J = 9.3 Hz, -NH), 5.43 [s, 1H, PhCH(O)2], 5.29 (brd, 1H, J = 17.1 Hz, -CH=CH2), 5.23 (brd, 1H, J = 10.2 Hz, -CH=CH2), 1.94 (s, 3H, Ac), 1.82 (s, 3H, Ac), 1.24 (d, 3H J = 6.3 Hz, Thr-gH). 13C-NMR (CDCl3): d 99.9 (GalNAc C-1), 100.5 (GlcNAc C-1), 101.2 [PhCH(O)2], 103.0 (Gal C-1).
MALDI TOF MS: calcd for C86H93N3O20 1487.63. found; 1510.57 (+Na)+, 1526.64 (+K) +.
元素分析 Calcd for C86H93N3O20: C, 69.39; H, 6.30; N, 2.82. Found: C, 69.26; H, 6.26; N, 2.87.
以上の測定結果から、構造式（５）で表される化合物であることが同定された。
【００５６】
＜工程［３］：  構造式（１）で表される化合物の合成：  N-(9-フルオレニルメトキシカルボニル)-O-[2.3-ジ-O-ベンジル-4.6-O-ベンジリデン-b-D-ガラクトピラノシル-(1(R)4)-2-アセトアミド-3.6-ジ-O-ベンジル-2-デオキシ- b-D-グルコピラノシル-(1(R)3)-2-アセトアミド-3-O-ベンジル-2-デオキシ-a-D-ガラクトピラノシル-L-トレオニンの合成＞
実施例１の化合物（１）（ただし、Ｒが水素原子）の製造法に倣い、化合物（５）(１２５ｍｇ)をテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム(５ｍｇ)、 5.5-ジメチル-1.3-シクロヘキサンジオン(２００ｍｇ)とともにテトラヒドロフラン(１０ｍｌ)中で脱アリルエステル反応した。同様のクロマトグラフィー操作により定量的に化合物（１）(１２２ｍｇ)を得た。
【００５７】
＜構造式（１）で表される化合物の性状＞
[a]D +48.5° (c 1.0, クロロホルム)
1H-NMR (DMSO-d6): d 12.88 (br, 1H, -CO2H), 7.93-7.87 (m, 3H, -NH, Ar), 7.72 (d, 2H, J = 7.3 Hz, Ar), 7.58-7.19 (m, 36H, Ar, NH), 5.64 [s, 1H, PhCH(O)2], 5.09 (d, 1H, J = 11.0 Hz, -CH2Ph), 4.80 (d, 1H, J = 4,6 Hz, H-1a), 1.86 (s, 3H, Ac), 1.82 (s, 3H, Ac), 1.12 (d, 3H, J = 6.1 Hz, Thr-gH). 
MALDI TOF MS: calcd for C83H89N3O20 1447.60. found; 1470.28 (+Na)+, 1486.28 (+K)+.
元素分析 Calcd for C83H89N3O20・H2O: C, 67.97; H, 6.25; N, 2.87. Found: C, 68.06; H, 6.08; N, 2.81.
以上の測定結果から、構造式（５）で表される化合物であることが同定された。