(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグと標的蛋白質との融合タンパク質を作製し、第１エピトープを認識する検出抗体と第２エピトープを認識する検出抗体を接触させ、該両検出抗体が互いに近接することにより生じる現象を検出する工程を含み、該第１エピトープ及び第２エピトープが、それぞれを認識する検出抗体が結合した場合に該両検出抗体が互いに近接することができるように配置されていることを特徴とする標的蛋白質の定量方法。
【請求項２】
該検出抗体が蛍光物質、発光体、ラジオアイソトープ及びビーズのいずれかにより標識されたものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
該検出抗体がともに蛍光物質により標識されたものである請求項２記載の方法。
【請求項４】
該蛍光物質がユウロピウム化合物及びアロフィコシアニン誘導体の組み合わせからなる請求項３記載の方法。
【請求項５】
該現象が蛍光の共鳴によるエネルギーの転移である請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該検出抗体のいずれか一方のVH領域のアミノ酸配列が配列番号４として示されるものであり、VL領域のアミノ酸配列が配列番号５として示されるものである請求項１記載の方法。
【請求項７】
該検出抗体のいずれか一方のVH領域のアミノ酸配列が配列番号６として示されるものであり、VL領域のアミノ酸配列が配列番号７として示されるものである請求項１または６に記載の方法。
【請求項８】
該エピトープがいずれも６個以上８個以下のアミノ酸残基からなる請求項１記載の方法。
【請求項９】
該エピトープのいずれか一方のアミノ酸配列が配列番号１に示されるものである請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該エピトープのいずれか一方のアミノ酸配列が配列番号２に示されるものである請求項８または9に記載の方法。
【請求項１１】
第１エピトープと第２エピトープが、ペプチドリンカーを通じて互いに連結されている請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該ペプチドリンカーが３個以上６個以下のアミノ酸残基からなる請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該エピトープタグが１５個以上２２個以下のアミノ酸残基からなる請求項１記載の方法。
【請求項１４】
該エピトープタグのアミノ酸配列が配列番号３に示されるものである請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
第１エピトープを認識する検出抗体、第２エピトープを認識する検出抗体、並びに第１エピトープ及び第２エピトープを有し、該第１エピトープ及び該第２エピトープが、それぞれを認識する検出抗体が結合した場合に該両検出抗体が互いに近接することができるように配置されていることを特徴とするエピトープタグをコードする遺伝子配列からなる遺伝子を有する発現ベクターを含んでなる標的蛋白質の定量用キット。
【請求項１６】
請求項６に記載の検出抗体、請求項７に記載の検出抗体、及び配列番号１４に示される配列からなる遺伝子を有する発現ベクターを含んでなる請求項１５記載の標的蛋白質の定量用キット。
【請求項１７】
第１エピトープを認識する検出抗体、第２エピトープを認識する検出抗体、および第１エピトープ及び第２エピトープを有し、該第１エピトープ及び該第２エピトープが、それぞれを認識する検出抗体が結合した場合に該両検出抗体が互いに近接することができるように配置されていることを特徴とするエピトープタグと標的蛋白質との融合タンパク質の複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２種類のエピトープを有するエピトープタグを用いた組換え蛋白質の迅速な定量方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
「プロテオーム」に代表される蛋白質研究において、クローニングした遺伝子を細胞に導入して、組換え蛋白質を発現、分離精製することは、蛋白質の性質や機能を研究するうえで最も重要なテクニックの一つである。
また創薬のスクリーニングや医薬品製造等で蛋白質が大量に必要な場合にも、組換え蛋白質の発現、分離精製は避けて通れないステップである。
組換え蛋白質を発現させ、分離精製する際、予想よりも発現量が少なかったり、発現はするものの不溶性の沈殿となってしまったりすることがしばしば起こる。そのため、発現、分離精製について至適な条件を調べる必要があるが、条件検討をする際、組換え蛋白質を定量する機会が頻繁に発生する。
このような場合、一般的にはタグを用いて精製した後に、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動方法の他、ELISA、ウェスタンブロット等のイムノアッセイ（非特許文献１）が利用されている。このときの精製効率を上げるための多くのタグが知られている（非特許文献２）。
【非特許文献１】「実験医学別冊  タンパク質実験ハンドブック」、p128〜134、羊土社、2004年
【非特許文献２】K.Terpe 、Appl Microbiol Biotechnol、p523〜533、2003年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、従来の組換え蛋白質の定量法は、洗浄など他の物質との分離工程が必要となるため、複雑な操作過程及び時間を要していた。また、従来の組換え蛋白質の定量法は、組換え蛋白質の発現を確認するための定性的なものにとどまり、正確な定量を行うまでには至らなかった。また培地中など混合物の状態では、目的の組換え蛋白質を正確に定量することは困難であった。
従って、本発明の課題は、迅速、簡便かつ正確に組換え蛋白質を定量するための方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
即ち本発明によれば、
[１]
第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグと標的蛋白質との融合タンパク質に、第１エピトープを認識する検出抗体と第２エピトープを認識する検出抗体を接触させ、該両検出抗体が互いに近接することにより生じる現象を検出する工程を含み、該第１エピトープ及び第２エピトープが、それぞれを認識する検出抗体が結合した場合に該両検出抗体が互いに近接することができるように配置されていることを特徴とする標的蛋白質の定量方法、
[２]
該検出抗体が蛍光物質、発光体、ラジオアイソトープ及びビーズのいずれかにより標識されたものである上記[１]記載の方法、
[３]
該検出抗体がともに蛍光物質により標識されたものである上記[２]記載の方法、
[４]
該蛍光物質がユウロピウム化合物及びアロフィコシアニン誘導体の組み合わせからなる上記[３]記載の方法、
[５]
該現象が蛍光の共鳴によるエネルギーの転移である上記[１]から[４]のいずれかに記載の方法、
[６]
該検出抗体のいずれか一方のVH領域のアミノ酸配列が配列番号４として示されるものであり、VL領域のアミノ酸配列が配列番号５として示されるものである上記[１]記載の方法、
[７]
該検出抗体のいずれか一方のVH領域のアミノ酸配列が配列番号６として示されるものであり、VL領域のアミノ酸配列が配列番号７として示されるものである上記[１]または[６]に記載の方法、
[８]
該エピトープがいずれも６個以上８個以下のアミノ酸残基からなる上記[１]記載の方法、
[９]
該エピトープのいずれか一方のアミノ酸配列が配列番号１に示されるものである上記[８]記載の方法、
[１０]
該エピトープのいずれか一方のアミノ酸配列が配列番号２に示されるものである上記[８]または[９]に記載の方法、
[１１]
第１エピトープと第２エピトープが、ペプチドリンカーを通じて互いに連結されている上記[１]記載の方法、
[１２]
該ペプチドリンカーが３個以上６個以下のアミノ酸残基からなる上記[１１]記載の方法、
[１３]
該エピトープタグが１５個以上２２個以下のアミノ酸残基からなる上記[１]記載の方法、
[１４]
該エピトープタグのアミノ酸配列が配列番号３に示されるものである上記[１３]記載の方法、  
[１５]  
配列番号１４に示される配列からなる遺伝子を有する発現ベクター、
[１６]
第１エピトープを認識する検出抗体、第２エピトープを認識する検出抗体、並びに第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグをコードする遺伝子配列からなる遺伝子を有する発現ベクターを含んでなる標的蛋白質の定量用キット、
[１７]
上記[６]に記載の検出抗体、上記[７]に記載の検出抗体、及び上記[１５]に記載の発現ベクターを含んでなる上記[１６]の標的蛋白質の定量用キット、
が提供される。
[１８]
請求項[１]の方法を使用するためのキット。
[１９]
第１エピトープを認識する検出抗体及び第２エピトープを認識する検出抗体と、第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグと標的蛋白質との融合タンパク質の複合体。
【発明の効果】
【０００５】
本発明を利用することにより、従来の技術では時間を要していた組換え蛋白質の定量が短時間で可能となる。また精製などの分離操作をすることなく定量が可能となることから、煩雑なステップを踏むことなく簡易に組換え蛋白質の正確な定量が可能となる。そのため、組換え蛋白質を発現させた培地中に他の蛋白質とともに存在する状態でも組換え蛋白質量を測定することもできる。なお、本発明はあらゆる種類の蛋白質に汎用できる技術である。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】本発明のエピトープタグ融合蛋白質の発現ベクターの一例を示す図である。
【図２】6G4抗体または2E6抗体を用いたウエスタンブロットで、エピトープタグ融合蛋白質を測定した結果を示す図である。
【図３】本発明によるエピトープタグ融合蛋白質量の測定について、標準物質としてエピトープタグ融合SPDSを用い、動物細胞、大腸菌、分裂酵母、昆虫細胞の抽出液及び培地成分の影響を調べた結果を示すグラフである。
【図４】本発明によるエピトープタグ融合蛋白質の測定について、標準物質としてエピトープタグ融合SPDSを用い、標準物質量と定量値の変動係数の関係を調べた結果を示すグラフである。
【図５】HEK293細胞の一過性発現系について、本発明のエピトープタグ融合蛋白質を実際に測定した結果を示す表である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
本発明は、第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグと標的蛋白質との融合タンパク質に、第１エピトープを認識する検出抗体と第２エピトープを認識する検出抗体を接触させ、該両検出抗体が互いに近接することにより生じる現象を検出する工程を含み、該第１エピトープ及び第２エピトープが、それぞれを認識する検出抗体が結合した場合に該検出抗体が互いに近接することができるように配置されていることを特徴とする標的蛋白質の定量方法である。以下に詳細を説明する。【０００８】
本発明は、下記の（１）ないし（３）の工程を含むことを特徴とする。
（１）第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグを標的蛋白質に融合させた融合蛋白質を作製する。ここで、第１エピトープ及び第２エピトープは、それぞれを認識する以下の検出抗体が結合した場合に該両検出抗体が互いに近接することができるように配置されている工程。
（２）第１エピトープを認識する検出抗体と第２エピトープを認識する検出抗体を該融合蛋白質に接触させる工程。
（３）各エピトープに結合した検出抗体が互いに近接することにより生じる現象を検出する工程。  
本発明に用いられる標的蛋白質とは、該蛋白質をコードするDNAを取得することが可能であって、そのDNAを発現させて蛋白質として生成できるものであればいかなるものであってもよい。また天然に存在する蛋白質、その変異体、人工蛋白質、及びその変異体等いずれも用いることができる。天然に存在する蛋白質としては、種々の生物の器官、組織または細胞に由来するcDNAライブラリーから転写翻訳されて得られるものでもよい。人工蛋白質としては、天然に存在する蛋白質の全てもしくは一部のアミノ酸配列を組み合わせた配列、またはランダムなアミノ酸配列を含むもの等が挙げられる。以下の実施例において、標的蛋白質としてスペルミジン合成酵素（SPDS）を定量する方法を示す。【０００９】
抗原分子上に存在する抗体結合領域はエピトープと呼ばれる。抗体およびその抗体のエピトープの種類については特に限定されないが、本発明を実施するには抗体およびその抗体のエピトープが特定されていることが必要である。また、標的蛋白質に連結させることができるエピトープをエピトープタグと呼び、抗原抗体反応を利用して、タグを融合させた蛋白質の追跡、分離精製に利用されている。本発明において、エピトープタグは少なくとも二種類のエピトープ（たとえば、第１エピトープ及び第２エピトープ）を有することを特徴とする。【００１０】
本発明の実施において使用するエピトープはそのアミノ酸配列が特定されていることが重要である。このとき、エピトープの配列としては、エピトープとして既知のアミノ酸配列を利用してもよく、また自らその配列を設計しても良い。このときエピトープは6個以上10個以下、好ましくは6個以上8個以下のアミノ酸残基から構成されることが望ましい。例えば、FLAG（DYKDDDDK、シグマ社、登録商標）、c-myc（EQKLISEEL）、ポリヒスチジン（HHHHHH）等はこの分野の当業者において公知のエピトープであり、これらのエピトープと特異的に結合できる抗体は市販されているので抗体の入手も容易である。これらのアミノ酸配列を含むものであればその前後にいかなるアミノ酸が添加されたものでも本発明のエピトープとして用いることができる。また、自らアミノ酸配列を設計する場合は、エピトープが抗体と特異的に結合する性質を有することを以下に示す記載の方法等によって確認することにより、本発明のエピトープとして用いることができる。【００１１】
抗体のエピトープを特定する方法としては、（A）ある抗体と特異的に結合するアミノ酸配列を特定することにより決定する方法と、（B）特定のペプチド抗原により免疫して作製した抗体を用いる方法があるが、本発明の方法を実施するにあたってはいずれかの方法に限定されるものではない。
（A）抗体と特異的に結合するアミノ酸配列を決定する方法としては、該抗体を用いたウェスタンブロット（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76,3116(1979)）により特定していく方法が挙げられる。具体的には、例えば抗原として蛋白質を用いた場合には、まず蛋白質をコードするDNAを50〜200個程度のアミノ酸をコードする断片に制限酵素等により切断し、それぞれのDNA断片を適当な発現ベクターに挿入し、これを適当な宿主により転写、翻訳させて蛋白質を発現させ、この蛋白質と抗体との結合性を調べる。適当な発現ベクターとは、これを導入する宿主に適したものであればいかなるものであってもよいが、例えば宿主として大腸菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等を用いる場合には、それぞれpET、pNMT、p cDNA、pFastBac（すべてインビトロジェン社などから入手可）等を用いることができる。また転写、翻訳を行う系として、ウサギ網状赤血球、抽出小麦胚芽、大腸菌からの抽出液（大腸菌Ｓ30抽出液）等に基づいて調製された無細胞転写翻訳系を用いることもできる。これによりあるペプチド断片にエピトープを絞り込み、引き続いてそのペプチド断片中のアミノ酸配列5〜50個程度をコードするDNA断片をポリメラーゼ連鎖反応（PCR）や合成オリゴヌクレオチド等で作製し、これを適当な蛋白質と連結させて融合蛋白質として発現させ、抗体との結合性を調べる。この融合蛋白質に用いる適当な蛋白質とは、解析する抗体に結合しないものであればいかなるものであってもよい。かくして抗体に結合するために必要かつ十分な最も小さい単位のポリペプチドであるエピトープを特定することができる。【００１２】
（B）一方、特定のペプチド抗原により免疫して作製した抗体を用いる方法とは、抗体を作製する際に予め特定のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、抗体のスクリーニングも該ペプチドにより行う方法である。このように作製された抗体のエピトープはすでに決定されているのであるから、該ペプチドを該抗体のエピトープとして特定することができる。【００１３】
ある蛋白質に含まれる特定のアミノ酸配列を特異的に認識する抗体の作製方法としては、例えば、Antibodies：A Laboratory Manual (1989)（Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載の方法等を用いることができる。具体的には以下の通りである。抗体を作製するにあたり、まず免疫原が必要となる。「免疫原」とは、通常生体内において免疫応答を生じる、あるいは引き起こす能力を有する物質を表す。免疫原は、それ自体公知あるいはそれに準ずる方法（Antibodies：A Laboratory Manual，(1989)（Cold Spring Harbor Laboratory Press））にしたがって製造することができる。免疫原は必要に応じて、例えばウシ血清アルブミン（BSA）、ウシチログロブリン（BTG）、カギアナカサガイのヘモシアニン(KLH) などのキャリアタンパクとの複合体として用いられる。 通常ペプチドは分子量が小さいため免疫応答性を有しないためこのような複合体を免疫原として用いることが望ましい。 【００１４】
免疫は、例えば上記の免疫原を哺乳動物に静脈内、皮内、皮下、腹腔内注射などにより投与することにより行い得る。より具体的には、例えば免疫原を生理食塩水含有リン酸緩衝液(PBS)、生理食塩水などで適当濃度に希釈し、所望により通常のアジュバントと併用して、供試動物に2〜6週間間隔で計3〜10回程度投与する。免疫される哺乳動物としては、一般には、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラットなどが用いられる。マウスを用いる場合は、一回の投与量を一匹あたり50μg程度とする。ここで前記アジュバントとは抗原と共に投与したとき、非特異的に抗原に対する免疫反応を増強する物質をいう。通常用いられるアジュバントとしては、百日咳ワクチン、フロインドアジュバントなどを例示できる。最終免疫後3〜10日目に哺乳動物の採血を行うことによって、ポリクロナル抗体を得ることができる。【００１５】
モノクロナル抗体の製造方法は、免疫原で免疫した哺乳動物の形質細胞(免疫細胞)と哺乳動物の形質細胞腫細胞(ミエローマ細胞)との融合細胞(ハイブリドーマ、hybridoma)を作製し、これより所望の抗原を認識するモノクロナル抗体を産生するクローンを選択し、該クローンを培養することにより実施できる。このモノクロナル抗体の製造は、基本的には常法に従うことができる(Kohler, G. and Milstein, C., Nature, 256, 495-497.(1975）参照)。【００１６】
該方法において、免疫される哺乳動物は、細胞融合に使用する形質細胞腫細胞との適合性を考慮して選択するのが望ましく、マウス、ラットなどが用いられる。【００１７】
得られた免疫細胞からハイブリドーマを得るには、例えば、「分子細胞生物学基礎実験法」（南江堂 堀江武一ら 1994）等に記載されている方法により、継代培養可能な細胞とすることを目的として、例えば、ポリエチレングリコール存在下、形質細胞腫細胞と抗体を産生する免疫細胞とを融合させて、ハイブリドーマを得ることができる。ここで用いられる形質細胞腫細胞は、同じ恒温動物でも同種の恒温動物由来の形質細胞腫細胞を用いることが望ましく、例えばマウスを免疫動物として得られた脾臓細胞と融合させる場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好ましい。形質細胞腫細胞はp3x63-Ag8.UIなどの公知のものを利用できる。【００１８】
ハイブリドーマは、通常HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）において培養することにより選択することができる。コロニーが確認された段階で、培養上清に分泌される抗体と抗原との結合を調べる（スクリーニングする）ことにより目的の抗体を産生するハイブリドーマを得ることができる。スクリーニングする方法としては、例えば、スポット法、凝集反応法、ウエスタンブロット法、ELISA法などの一般に抗体の検出に用いられている種々の方法が挙げられるが、好ましくは、ハイブリドーマの培養上清について、抗原との反応性を指標とするELISA法に従い実施される。このスクリーニングによって、抗原と特異的に反応する目的抗体産生株を選択することができる。【００１９】
目的抗体産生株のクローニングは、通常、限界希釈法などにより実施できる。クローニングされたハイブリドーマは、必要に応じて、血清培地または無血清培地で大量培養することができる。この培養によれば、比較的高純度の所望抗体を培養上清として得ることができる。また、ハイブリドーマと適合性のある哺乳動物、例えばマウスなどの腹腔に、ハイブリドーマを接種して、所望抗体をマウス腹水として大量に回収することもできる。【００２０】
本発明の抗体産生ハイブリドーマの培養上清およびマウスなどの腹水は、そのまま粗製抗体液として用いることができる。または硫酸アンモニウム分画、塩析、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテイクロマトグラフィ法などにより精製することができる。【００２１】
本発明の実施例において使用するエピトープとして、Downs等（Journal of Immunological Methods 247,2001年）によって 既に特定されているヒト2型コラーゲンに由来する配列番号１及び配列番号２として配列表に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを用いた。また、本エピトープを特異的に認識するモノクロナル抗体は本明細書中に記載の方法に従って作製した。【００２２】
このようにして作製した本発明の方法に使用できる抗体の具体的な例としては、例えば配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体としてハイブリドーマTAG-6G4により産生されるモノクローナル抗体（以下、「6G4抗体」と称することがある）、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する抗体としてハイブリドーマTAG-2E6により産生されるモノクローナル抗体（以下、「2E6抗体」と称することがある）が挙げられる。これらのハイブリドーマは、平成18年1月13日に、独立行政法人 産業技術総合研究所内 特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1 中央第6)に、「Mouse-Mouse Hybridoma TAG-2E6」（受領番号FERM ABP-10482）及び「Mouse-Mouse Hybridoma TAG-6G4」（受領番号FERM ABP-10483）なる表示で特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づいて国際寄託されている。【００２３】
これらの抗体は、以下の理化学的および免疫学的性質を有している。
6G4抗体
（a）アミノ酸配列GEPGDDAPSからなるペプチドと特異的に結合する。
（b）配列番号4で示されるH鎖の可変領域（VH領域）と、配列番号5で示されるL鎖の可変領域（VL領域）をもつH鎖50kDa、L鎖27kDaからなる150ｋDaの蛋白質である。
（c）免疫グロブリンクラスIgG１（k）に属する。
2E6抗体
（d）アミノ酸配列GPPGPQGからなるペプチドと特異的に結合する。
（e）配列番号6で示されるVH領域と、配列番号7で示されるVL領域をもつH鎖50kDa、L鎖27kDaからなる150ｋDaの蛋白質である。
（f）免疫グロブリンクラスIgG2b（k）に属する。【００２４】
エピトープタグは、周知技術に従って標的蛋白質を分離精製するためにも使用できる。例えば、本発明により標的蛋白質の定量した後、本発明において使用されたエピトープタグ及び該タグを認識する抗体等を利用して、標的蛋白質を分離精製することができる。典型的には、まずエピトープタグに対する結合性リガンド（例えば、抗体、金属など）を固体表面に共有結合又は非共有結合させて通常用いられるカラムチューブ等に充填する。次に標的蛋白質を含む懸濁液等をカラムに添加した後、該カラムを適当な緩衝液などで洗浄する。洗浄後、カラムの適当な溶出液を添加すること、あるいは合成エピトープペプチド鎖により標的蛋白質を溶出し、他の蛋白質や培地中の成分から分離することが可能となる。【００２５】
本発明の方法に使用するエピトープタグにおいては、少なくとも二つのエピトープが、それぞれのエピトープを認識する検出抗体が結合した場合に、該両検出抗体が互いに近接することができるように配置されていることを特徴とする。つまり、あるエピトープ（以下、「第１エピトープ」と称する）に免疫反応特異的に結合することができる検出抗体と、別のエピトープ（以下、「第２エピトープ」と称する）に免疫反応特異的に結合することができる検出抗体がエピトープにお互いが立体障害となることなく結合することを許容し、かつ各検出抗体が結合した状態で標識間に生じる反応を検出することができる位置関係にあることを意味する。２つのエピトープは直接連結されてもよく、適当なペプチドリンカーにより架橋されることもできる。一般的に抗体は分子量150KDaと、エピトープタグの大きさに比べて大きく、各検出抗体どうしの立体障害により抗体自身のエピトープへの結合を妨げる場合が生じる。そのため、適当な長さのペプチドリンカーを第１エピトープ及び第２エピトープ間に挿入することが望ましい。ペプチドリンカーにより２つのエピトープを架橋する場合は、通常0個以上20個以下、好ましくは3個以上6個以下のアミノ酸残基を挿入することが望ましい。またリンカーとして使用できるアミノ酸残基は特に限定されないが、エピトープ配列と交差反応性はなく、かつ、比較的小さな側鎖をもつように選ばれる。また第１エピトープ及び第２エピトープのアミノ酸配列については同一種由来に限定されず異種由来であっても良い。【００２６】
エピトープタグの長さは特に限定されないが、標的蛋白質と融合蛋白質として作製した時に、標的蛋白質の構造に影響を及ぼさない程度の大きさが望ましく、通常12個以上40個以下、好ましくは15個以上22個以下のアミノ酸残基で構成されるのが好ましい。またシスチン形成による重合を避けるためにエピトープタグのアミノ酸配列中にシステイン残基を含まないことが望ましい。エピトープタグ自身は生物活性を有さないだけでなく標的蛋白質の生物活性に影響を及ぼさないことが望ましい。【００２７】
本発明の方法に使用できるエピトープタグの具体的な例として、配列番号１として配列表に示すアミノ酸配列及び配列番号２として配列表に示すアミノ酸配列が３残基のペプチドリンカーを介して結合された19残基からなるアミノ酸配列（配列番号３）を有するポリペプチドが挙げられる。【００２８】
上記のような標的蛋白質と第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグとの融合蛋白質の発現方法としては、標的蛋白質、及びエピトープタグをコードするDNA断片をフレームが合うように結合して適当なプロモーターの制御下におかれるように適当な発現ベクターに導入し、これを適当な宿主により転写、翻訳させて発現させることにより行う方法が挙げられる。上記エピトープタグと標的蛋白質の結合の順序は特に制限はなく、アミノ末端、カルボキシル末端のどちらに結合させてもよい。またエピトープタグと標的蛋白質との間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキナーゼ、ファクターXaなど）が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、エピトープタグをこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。【００２９】
このときエピトープタグの遺伝子と、標的蛋白質の遺伝子を挿入するための制限酵素サイトを、あらかじめ挿入したベクターを調製しておくと汎用性があり、発現ベクターの構築が容易になる。このようなエピトープタグ融合蛋白質発現ベクターとして、例えば、図１に示すようなエピトープタグ遺伝子として、配列番号14を挿入した構成を有する発現ベクターが挙げられる。またこのようなエピトープタグをコードする遺伝子配列からなる遺伝子を有する発現ベクターは、発現された融合蛋白質のエピトープタグを認識できる２種類以上の抗体（例えば、6G4抗体や2E6抗体）を後述するように標識した検出抗体と組み合わせることにより標的蛋白質の定量用キットとして使用することができる。また、本キットは、組換え蛋白質の作製にも使用できる。【００３０】
適当な発現ベクターとしてはこれを導入する宿主に適したものであればいかなるものであってもよいが、例えば宿主として大腸菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等を用いる場合には、それぞれpET、pNMT、pcDNA、pFastBac（すべてインビトロジェン社などから入手可）等を用いることができる。また転写、翻訳を行う系として、ウサギ網状赤血球、抽出小麦胚芽、大腸菌からの抽出液（大腸菌Ｓ30抽出液）等に基づいて調製された無細胞転写翻訳系を用いることもできる。【００３１】
本発明の方法は、２種類の検出抗体を上記のように発現したエピトープタグ融合蛋白質に接触させることを特徴とする。２種類のエピトープに免疫特異的に結合することができる抗体を利用して目的の組換え蛋白質を定量する方法は、従来から知られている（例えば、  特開平14−191364号公報等）。しかし、いずれの方法も組換え蛋白質を定量する場合、一般的手法としてこの分野の当業者に公知であるウエスタンブロットや、ELISAが利用されてきた。これらの方法は、混在物を電気泳動法等により分離する、もしくは混在物より捕獲抗体を介して固体表面に結合させた後に洗浄を繰り返す、などの分離操作を必要としていた。そのため蛋白質の定量操作は煩雑となり時間を要するものであった。一方、本発明の方法では、エピトープタグ及び２種類の検出抗体を組み合わせることによって他の蛋白質からの前記のような分離操作を不要とするため迅速・簡便な蛋白質の定量が可能となった。これらは組換え蛋白質の生産工程において有用な技術であると言える。【００３２】
このとき検出抗体とは、抗体同士の近接を検出するため、標識物質により標識された抗体をさす。この検出抗体は予め宿主を培養する培地中に添加して培養してもよく、また培養終了後に添加、もしくは精製操作の後に添加しても良い。抗体は該エピトープを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを特異的に認識するものであればモノクローナル、ポリクローナルのどちらでもよいが、前者の方が望ましい。抗体の作製は上述した方法に準ずることにより可能となる。また、抗体を標識物質により標識するには、例えば「分子細胞生物学基礎実験法」（南江堂 堀江武一ら1994年）等に記載されている常法により、もしくは標識物質に附属するマニュアルに従って行うことができる。【００３３】
標識物質としては発光体、酵素、蛍光物質、ビーズ、ラジオアイソトープ、金属類、ビオチン等が挙げられる。発光体とは例えばルシフェノール、ルミノール、エクオリン、アクリジニウムエステルなどの化学発光物質をさす。酵素とは例えばルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどをさす。蛍光物質とは例えば、ユウロピウム(Eu)やテルビウム(Tb)などのランタニド元素、ユウロピウムクリプテートなどのランタニド元素誘導体、FITC（fluorescein isothiocyanate）などフルオロセイン誘導体、RITC（tetramethylrhodamin isothiocyanate）などローダミン誘導体、YFP、GFP、CFP、BFPアロフィコシアニン等の蛍光蛋白質が含まれる。ビーズとは例えばプロテイン Aビーズ、wheat germ agglutinin（WGA）ビーズ、ストレプトアビジンビーズなど特殊な処理を施されたビーズをさす。ラジオアイソトープとは例えば14C、125Ｉ、3H、35Ｓなどをさす。またこれらで標識された化合物も含むものとする。金属類とは例えばフェリチンや金コロイドなどをさす。【００３４】
ただし、標識物質を選択するにあたっては後述するように、検出抗体の近接に伴う現象を検出できるような組み合わせを選択する必要がある。このような組み合わせとして、例えば蛍光物質標識と蛍光物質標識、発光体標識と蛍光物質標識、放射性同位体標識とビーズ等の組み合わせが一般に知られている。【００３５】
本発明の方法は、２種類の検出抗体をエピトープタグ融合蛋白質に接触させた後に、両抗体が互いに近接することにより生じる現象を検出することを特徴とする。「近接することにより生じる現象を検出」とは、前記エピトープタグ融合蛋白質の第１エピトープを認識する検出抗体、第２エピトープを認識する検出抗体が結合して複合体を形成した状態において、二つの検出抗体の標識が互いに接近することにより生じる現象を検出することをさす。このような近接した二つの蛋白質（検出抗体）の相互作用を検出する方法はこの分野における研究者においてはよく知られており、例えばBRET法、FRET法、AlphaScreen法（登録商標）、SPA法(Scintillation Proximity Assay、登録商標）等が挙げられる。【００３６】
近接することにより生じる現象を検出する方法の好ましい形態としては、共鳴による励起エネルギーの移動を検出する方法を挙げることができる。例えば、蛍光物質は励起光が照射されると励起状態となりそのエネルギーは蛍光もしくは熱エネルギーとして放出して基底状態に戻る（消光）。このとき近くに別の蛍光物質が存在すると、エネルギーを受けることによりこの蛍光物質がさらに励起されて同様に蛍光を発するという現象が生じる。このような現象は、蛍光共鳴エネルギー移動( fluorescence resonance energy transfer：以下FRETともいう)として知られている。このときの蛍光強度をルミノメーター等の測定機器で測定すれば溶液中に存在する標的蛋白質を測定することが可能となる。【００３７】
この場合において、特に好ましい形態としては、蛍光寿命（消光するまでの時間）の長い蛍光物質をドナー（エネルギーを提供する分子）として選択する方法を挙げることができる。この方法ではプラスチックなどの妨害物質の蛍光が短寿命であるため、励起後、一定時間経過後に測定すればバックグラウンドの蛍光の影響を排除できる。このようなFRETを、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移（TR-FRET）と呼ぶ。TR-FRETを検出する方法として、HTRF（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence、登録商標、CISバイオインターナショナル社）やLANCE（パーキンエルマーライフサイエンス社、登録商標）等が挙げられる。【００３８】
HTRFは二種類の蛍光物質を用いることを特徴とする。具体的にはユウロピウム化合物であるユウロピウムクリプテート（以下クリプテート、トリスビピリジンの籠状構造の中に希土類元素のユウロピウムイオンが配位した構造をもつ）及び、アロフィコシアニン誘導体のXL665（藍藻由来蛍光性タンパクであるアロフィコシアニンを3分子架橋して安定化したもの）である。クリプテートに337nmの励起光を照射すると620nmの長寿命蛍光を発するが、検出抗体同士が接近して近傍にXL665が存在する場合、FRETにより、励起エネルギーがXL665へ移動するのでXL665から665nmの長寿命蛍光が生ずる。この長寿命蛍光を測定すればエピトープタグ融合蛋白質を測定することが可能となる。この方法の利点としてはクリプテートを励起後一定時間経過してから蛍光を測定することにより、測定試料や測定チューブに含まれる蛍光性物質に起因する短寿命のバックグラウンド蛍光（〜1 0ナノ秒）を排除して、長寿命蛍光（〜1ミリ秒）のみを選択的に検出することを可能にすることが挙げられる。また、XL665の665nmの蛍光とクリプテートの620nmの蛍光を同時に測定することにより、測定値を（665nmの蛍光強度÷620nmの蛍光強度）×10,000、で表すことで試薬添加量のばらつきや測定試料のカラークエンチング効果（インナーフィルター効果）による測定値の変動を補正することも可能にする。【００３９】
他の形態としてBRET(Bioluminescence resonance energy transfer)と呼ばれる、生体発光共鳴によるエネルギー転移を利用する検出方法も挙げられる。例えば、二種類の検出抗体として、ルシフェラーゼ及びGreen Fluorescent protein変異体（GFP変異体）により標識した抗体を用いる。これらの検出抗体が近接すると、ルシフェリンとルシフェラーゼの発光反応により生じたエネルギーの一部がGFP変異体に移動して蛍光を発する現象(BRET)が生じる。このとき、蛍光強度を測定することにより、エピトープタグ融合蛋白質量ひいては標的蛋白質量を測定することが可能となる。【００４０】
その他の形態として、ビーズ（例えばSPAビーズ、登録商標）及びラジオアイソトープ（例えば3H、14Cや125Ｉ等）で標識した検出抗体を組み合わせて使用する方法が挙げられる。２つの検出抗体が接近した場合、ラジオアイソトープから発せられたβ線などの放射線がビーズ内のシンチレーターに到達し、発光現象が生じるので、この発光を検出することにより、エピトープタグ融合蛋白質量ひいては標的蛋白質量を測定することが可能となる。【００４１】
また、上記検出方法において、濃度既知のエピトープタグ融合蛋白質（以下、「標準物質蛋白質」と称することがある）を用いることにより、試験試料に含まれるエピトープタグ融合蛋白質もしくは標的蛋白質を正確に定量することができる。【００４２】
更に、本発明に係わる上記の方法は、特定のキットの利用により簡便に実施可能であり、本発明はかかるキットをも提供する。【００４３】
本発明に係わるキットは、少なくとも、発現ベクター及び検出抗体をその構成成分としている。発現ベクターには、第１エピトープ及び第２エピトープを有するエピトープタグをコードする遺伝子配列が含まれており、ベクターに目的遺伝子を組み込んで常法に従えば２種類のエピトープを有するタグを末端に有した蛋白質をクローニングすることができる。また、検出抗体は２種類以上からなり各検出抗体はエピトープタグ部分に結合することができるものとする。また検出抗体は予め標識されたものであってもよい。さらに高効率な形質転換を可能とする宿主株を構成成分としてもよい。【００４４】
以下において、実施例により本発明をより具体的にするが本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００４５】
エピトープを認識するモノクロナル抗体の作製
（１）6G4抗体の作製
ヒト２型コラーゲンのアミノ酸番号757-765に相当する領域（配列番号１）のC末端側にシステインを付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドとカギアナカサガイのヘモシアニン（KLH、ピアス社製）を、スルフォスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレート（sulfo-SMCC、ピアス社製）を用いてコンジュゲートさせ、免疫原とした。免疫原をフロイントの完全アジュバント（ディフコ社製）と混合してエマルジョンとし、3週間毎にマウス（Balb/c CrSlc、6週齢、雌）の腹腔内に40μg投与した。4回免疫後にマウスの脾臓を摘出し、PEG法によりミエローマ細胞（p3×63-Ag8.UI、東京腫瘤研究所）と融合させ、ハイブリドーマを調製した。培養9日目に培養上清を採取し、抗体産生ハイブリドーマを含む陽性ウェルのスクリーニングを行った。スクリーニングは以下に述べる時間分解蛍光イムノアッセイ（DELFIA、アマシャム社、登録商標）で行った。抗マウスIgG抗体（シバヤギ社製）を固相したマイクロタイタープレート（住友ベークライト社製）に、測定緩衝液（150ｍM NaCl、0.01％Tween80、0.5％BSA、0.05％NaN3を含む50 mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5））50μl、培養上清50μl、標識抗原（20ng/mlビオチン標識抗原ペプチドと100ng/mlユウロピウム標識ストレプトアビジン（パーキンエルマーライフサイエンス社製）を含む測定緩衝液）50μlを連続して加え、4℃で16時間反応させた。洗浄液（150mM NaCl、0.02％NaN3、0.01％Tween20）200μlでプレートを2回洗浄した後、エンハンスメントソルーション（パーキンエルマーライフサイエンス社製）を150μl加え、1420ARVOsxマルチラベルカウンタ（パーキンエルマーライフサイエンス社製）で時間分解蛍光を測定した。本スクリーニングで反応性の高かった1ウェルを選択し、限界希釈法によるクローニングを2回繰り返して抗体産生ハイブリドーマTAG-6G4を確立した。TAG-6G4のサブクラスをマウスモノクロナル抗体アイソタイピングELISAキット（BD バイオサイエンス社製）で調べたところ、IgG1（k）であった。ハイブリドーマTAG-６G4をヌードマウス（BALB/cANNCrj-nu-nu）の腹腔内に投与して腹水を採取した（ラボプロダクツ社に委託）。プロテインAカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより腹水から精製抗体を得た。【００４６】
（２）2E6抗体の作製
ヒト2型コラーゲンのアミノ酸番号769-775に相当する領域（配列番号２）のN末端側にシステインを付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドとウシ血清アルブミン（BSA、ピアス社製）を（N-e-マレイミドカプロイロキシ）スルフォスクシンイミドエステル（Sulfo-EMCS、ピアス社製）を用いてコンジュゲートさせ、免疫原とした。TAG-6G4と同様、免疫原をマウス（A/J Jms Slc、6週齢、雌）へ投与し、脾臓を摘出して細胞融合を行った。DELFIAによるスクリーニングとクローニングを行い、抗体産生ハイブリドーマTAG-2E6を確立した。抗体のサブクラスはIgG2b（k）であった。ヌードマウスの腹水化とプロテインAカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製抗体を得た。【００４７】
（３）VH領域とVL領域のアミノ酸配列の決定
RneasyMiniキット（キアゲン社製）を用いて１×107個のハイブリドーマからtotal RNAを精製した。SMARTTMRACE cDNA増幅キット（BDバイオサイエンス社製）を利用して、キットの操作手順に従ってVH領域とVL領域の遺伝子配列を決定した。SMARTIIAオリゴヌクレオチドとTAG-6G4のVH領域に特異的なプライマー（配列番号8）、TAG-２E6のVH領域に特異的なプライマー（配列番号9）、Vl領域に特異的なプライマー（配列番号10）を用いてｃDNAを合成した。これらのｃDNAを鋳型として、ユニバーサルプライマーとTAG-6G4のVH領域に特異的なプライマー（配列番号11）、TAG-２E6のVH領域に特異的なプライマー（配列番号12）、Vl領域に特異的なプライマー（配列番号13）、を用いてPCRを行い、VH遺伝子、VL遺伝子を増幅した。これらのPCR産物をTOPO TAクローニングキット（インビトロジェン社製）でクローニングし、シークエンスを解析した（オペロンバイオテクノロジー社に依託）。得られた遺伝子配列からVH領域とVL領域のアミノ酸配列を決定した。    
【実施例２】
【００４８】
エピトープタグ融合蛋白質の作製
（１）発現ベクターの作製
Gatewayテクノロジー（インビトロジェン社）を利用して行った。標的蛋白質として、配列番号15として配列表に示されるヒトスペルミジン合成酵素(SPDS、GenBank Accession No.NP003123 )を用いた。この遺伝子を当業者に公知の方法でクローニングした後、制限酵素サイトSacIとNotIを介してエントリーベクターpENTR11に挿入し、エントリークローンを得た。さらに3×FLAGタグ（シグマ社製）とGateway Vector Conversion Systemの Reading Frame Cassette Aを連結した遺伝子をPCRで増幅し、NheIとKpnIの制限酵素サイトを介してpShuttleベクター（クロンテック社製）に挿入し、デスティネーションベクターとした。エントリークローンとデスティネーションベクターをClonase存在下混合してattサイト間の部位特異的組み換えを誘導することにより、アミノ末端に3×FLAGタグを繋いだヒトSPDSの発現ベクターをクローニングした。さらにSPDS遺伝子のApaIサイトとNotIサイト間の領域を取り除き、同領域にエピトープタグをコードする遺伝子配列（配列番号14）を有するDNAを連結させ、エピトープタグ融合蛋白質の発現ベクターとした。【００４９】
（２）エピトープタグ融合蛋白質 の発現と精製
リポフェクトアミン2000（インビトロジェン社製）と前記発現ベクターを用い、手順書に従ってHEK293細胞（ヒト胎児腎臓由来、アメリカンタイプカルチャーコレクション社より入手）にトランスフェクトした。この細胞を2日間培養した後、遠心分離して回収し、少量のプロテアーゼインヒビターカクテルを含む氷冷PBSに懸濁させ、超音波処理で破砕した。PBSで平衡化した2E6抗体を結合させた担体カラム（ピアス社製アミノリンク固定化キットを用いて手順書に従って調製したもの）に細胞破砕液を通し、PBSで十分に洗浄した。最後に0.2 Mグリシン緩衝液（pH3.0）をカラムに通してタンパク溶出分画を回収し、トリス塩酸（pH9.0）で中和してPBSで透析した。プロテインアッセイ試薬（バイオラッド社製）でタンパク濃度を決定し、標準物質とした。
【実施例３】
【００５０】
ウエスタンブロットによるエピトープタグ融合蛋白質の定量
ウエスタンブロットは一般的な手法（例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition（2001））で行った。アッセイバッファー（0.5%BSA、150mM NaClを含む50mMトリス緩衝液（pH7.4））を用いて標準物質 の2倍希釈系列を調製し、各々10μlを5-10％アクリルアミドゲル（アトー社製）で展開し、PVDFメンブレン（ミリポア社製）へ転写した。メンブレンをブロックエース（大日本製薬社製）でブロッキングした後、6G4抗体または2E6抗体を0.5-1μg/ml含むブロックエースに浸し、室温で1時間反応させた。メンブレンを洗浄バッファー（0.05%Tween20を含むPBS）で十分に洗浄した後、HRP標識抗マウスIgG抗体（アマシャム社製）をブロックエースで5,000倍に希釈した液に浸し、室温で0.5時間反応させた。メンブレンを再度洗浄した後、手順書に従って、化学発光試薬ECL plus（アマシャム社製）と反応させ、HyperFilm-ECL（アマシャム社製）に露光させた。【００５１】
（結果）ウエスタンブロットによるエピトープタグ融合蛋白質の測定結果を図2に示す。
6G4抗体、2E6抗体どちらを使った場合も、分子量3.5kDaの位置にエピトープタグ融合蛋白質に相当すると思われる単一のバンドが得られた。これらのバンドは使用した標準物質の量に依存して強くなった。またエピトープタグ融合蛋白質の検出限界は、6G4抗体を用いた場合が8.9fmol、2E6抗体を用いた場合が18fmolであった。
【実施例４】
【００５２】
本発明の方法によるエピトープ融合蛋白質の定量
（１）6G4抗体のクリプテート標識
6G4抗体を0.1 Mリン酸塩緩衝液（pH8.0）で1 mg/mlとした。抗体1モルに対してクリプテートTBPモノスベレート（CIS バイオインターナショナル社製）を15モル加えて、25 ℃で1時間反応させた。反応液につき、PBSで予め平衡化したPD- 10カラム（アマシャム社製）を用いたゲルろ過を行い標識抗体を分取した。標識抗体は0.1 % ウシ血清アルブミン、0.1 % Tween20、0.05%アジ化ナトリウムを添加して-70 ℃で保存した。【００５３】
（２）2E6抗体のXL665標識
0.1 Mリン酸塩緩衝液（pH7.0）に溶かした2E6抗体に、8倍モル量のN- スクシンイミジル 3- (2- ピリジルジチオ) プロピオネート（SPDP、Pierce社製）を加えて25 ℃で20分間反応させた。反応液に終濃度10 mMのジチオスレイトール（DTT）を加えてさらに10分間反応させた後、10 mM EDTAを含む0.1 Mリン酸塩緩衝液（pH7.0）で予め平衡化したPD-10カラムを用いたゲルろ過を行い、システイン基を導入した2E6抗体を分取した（SH-2E6抗体）。XL665（CISバイオインターナショナル社製）を0.1 Mリン酸塩緩衝液（pH7.0）に薄め、5倍モル量のSulfo-SMCCを加えて25 ℃で30分間反応させた。0.1 Mリン酸塩緩衝液（pH7.0）で予め平衡化したPD-10カラムを用いたゲルろ過を行い、マレイミド基を導入したXL665を分取した（マレイミド化XL665）。１モルのマレイミド化XL665に対して上記のSH- 2E6抗体を3モル加えて4 ℃で16時間反応させ、XL665標識抗体を得た。標識抗体は100倍モル量のN-エチルマレイミドを加えて室温で10分間放置した後、0.1 % ウシ血清アルブミン、0.1 % Tween20、0.05%アジ化ナトリウムを添加して-70 ℃で保存した。【００５４】
（３）エピトープタグ融合蛋白質の測定
アッセイバッファー（0.5%BSAを含むトリス緩衝生理食塩水（TBS））、動物細胞（HEK293細胞）、昆虫細胞（Sf9細胞）、分裂酵母および大腸菌を破砕した抽出液あるいはこれらの培養上清によって標準物質（実施例２参照）の2倍希釈系列を作製した。これらの標準物質希釈液を384ウェルアッセイプレートに1ウェルあたり10μlずつ添加し、さらに２種類の検出抗体を含むアッセイバッファー（200ng/mlクリプテート標識6G4抗体、5,000ng/ml  XL665標識2E 6抗体、0.8Mフッ化カリウム、0.5%BSAを含むTBS）を10 μl添加して室温で反応させた。反応開始5分後及び24時間後について、各ウェルの蛍光強度をRubystar（BMG Labtechnologis社製）により測定した。
次に、実施例2により作製した発現用プラスミドを用いてリポフェクトアミン2000（インビトロジェン社製）によりHEK293細胞をトランスフェクションして5％CO2存在下、37℃で三日間培養した後、遠心分離により細胞を回収し、プロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ社製）を含むP BSに懸濁させた。細胞を超音波破砕し、抽出液中に存在する蛋白質量を本発明の方法により測定した。【００５５】
（結果）動物細胞、大腸菌、分裂酵母、昆虫細胞の抽出液及び培地成分におけるエピトープタグ融合蛋白質（SPDS）の標準曲線を図3に示す。これらの結果は、本発明の測定方法が試料の影響をほとんど受けないことを示している。このことは、本発明の定量法に各種発現系の試料を精製することなく直接利用できることを示唆するものである。
次にアッセイで使用したバッファーで調製した既知濃度の標準物質について定量値の変動係数（CV、平均値に対する標準偏差の割合）を求めた（n=16）。このとき変動係数が15％未満の値を示す時の蛋白質の濃度を定量限界値とした。標準物質濃度と変動係数（％）の関係を図4に示す。
本発明の方法で測定を行った場合、5分間後の定量限界値は2.1fmol（210pmol/L）であった。また24時間後では0.27fmol（27pmol/L）であった。いずれの値もウエスタンブロットにおける検出限界（8.9fmol、18fmol）を上回るものであった。これらの結果は、目的のエピトープタグ融合蛋白質の発現量を調べるのに、ウエスタンブロットでは、結果を確認するまでほぼ二日間要するのに対して、本発明の方法では僅か5分間で同等の精度の測定が可能であることを示すものである。また24時間後では、その精度はウエスタンブロット法を超えており微量にしか発現できない組換え蛋白質の測定にも利用できる。
また、実際に標的蛋白質（SPDS）をHEK293細胞により発現させた後、本発明の方法により抽出液中に含まれる標的蛋白質（SPDS）の発現量を測定した結果、僅か5分間の反応で、抽出液中に含まれるエピトープタグ融合蛋白質（SPDS）の測定値を得ることができた（図5）。
以上の結果は、本発明のエピトープタグ融合蛋白質の定量法がウエスタンブロットなどの既存法と比べて迅速、簡便であり、また高感度検出が可能で定量性にも優れていることを示すものといえる。【００５６】
配列番号１は、抗体を作製するのに用いたポリペプチドの配列である。
配列番号２は、抗体を作製するのに用いたポリペプチドの配列である。
配列番号３は、エピトープタグとして用いたポリペプチドの配列である。
配列番号４は、6G4抗体の可変領域（VH）のアミノ酸配列である。
配列番号5は、6G4抗体の可変領域（VL）のアミノ酸配列である。
配列番号6は、2E6抗体の可変領域（VH）のアミノ酸配列である。
配列番号7は、2E6抗体の可変領域（VL）のアミノ酸配列である。
配列番号８は、6G4抗体のVH領域のcDNAを合成するために設計されたオリゴヌクレオチドである。
配列番号9は、2E6抗体のVH領域のcDNAを合成するために設計されたオリゴヌクレオチドである。
配列番号10は、6G4抗体及び2E6抗体のVL領域のcDNAを合成するために設計されたオリゴヌクレオチドである。
配列番号11は、6G4抗体のVH領域の遺伝子を増幅するために設計されたPCRのオリゴプライマーである。
配列番号12は、2E6抗体のVH領域の遺伝子を増幅するために設計されたPCRのオリゴプライマーである。
配列番号1３は、6G4抗体及び2E6抗体のVL領域の遺伝子を増幅するために設計されたPCRのオリゴプライマーである。
配列番号14は、配列番号３に記載したエピトープタグのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列である。
配列番号15は、ヒト由来スペルミジン合成酵素(SPDS)のcDNAである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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