(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の遊離アミノ基を含む分子を質量分析装置で特徴決定する方法であって、
（ａ）  分子中の１つ以上の遊離アミノ基は、アミノ基と反応可能な反応性官能基、及び反応性官能基と結合する３級アミノ基を含む質量タグ試薬と反応すること、及び
（ｂ）  分子を質量分析装置で特徴決定することを含み、
前記質量タグ試薬が次の化学式の１つを有する化合物から選択されることを特徴とする分子を質量分析装置で特徴決定する方法。
【化１】
0004744433.tif 000026
式中、Ｒ１、及びＲ２は、同じ又は異なり、アルキル基からそれぞれ独立して選択され；
Ｒ３は、水素及びアルキル基から選択され、Ｒ４はアルキル基であり；
ｎは、０、１又は２の整数であり；
反応性官能基ＲＦは、アミノ基と反応可能であり、かつ炭酸類、アルケニルスルホン類、ハロアルカン類、マレイミド類、イソシアネート類、イソチオシアネート類、ケトン類、アルデヒド類、スルホン酸ハライド類、カルボン酸ハライド類の活性エステル、酸無水物エステル類、アルケン類、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、ヒドロキシアザベンゾトリアゾールエステル、ニトロフェニルエステル、トリクロロフェニルエステル、及びペンタフルオロフェニルエステルから選択され；並びに
リンカーＬは、アルキレン基である。
【請求項２】
Ｒ１、及びＲ２は、それぞれ独立してメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、及びシクロヘキシルから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立して水素、メチル基、エチル基、プロピル基、及びイソプロピル基から選択される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ｎは、２である請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ＲＦは、炭酸エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、ヒドロキシアザベンゾトリアゾールエステル、ニトロフェニルエステル、トリクロロフェニルエステル、及びペンタフルオロフェニルエステルから選択される請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
Ｌは、置換又は未置換‐(ＣＨ２)ｎ‐（式中ｎは１から５の整数）である請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
Ｌは、‐ＣＨ２‐及び‐(ＣＨ２)３‐から選択される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
質量タグ試薬は、ジメチルアミノグリシンのエステルである請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
質量タグ試薬は、変更した同位体比を有する請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
次の原子タイプ、水素、炭素、窒素、酸素、硫黄、及びハロゲンの１つ以上の同位体比が、質量タグ試薬によって変更される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
同位体比は、１Ｈの一部、又は全部が２Ｈに、１２Ｃの一部、又は全部が１３Ｃに、１６Ｏの一部、又は全部が１８Ｏに、及び／又は１４Ｎの一部、又は全部が１５Ｎに置き換えられることで変更される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
分子は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、アミノ酸、又は上記の誘導体を含む請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
方法が、
（ａ）  分子中の遊離アミノ官能基を質量タグ試薬で標識、
（ｂ）  配列特異的切断試薬で分子を切断して切断産物を生成、
（ｃ）  切断試薬により分子中に形成された遊離アミノ基を第２の質量タグ試薬を用いて標識、及び
（ｄ）  質量分析装置で得られた切断産物を分析
を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
分子の複数性が質量分析装置で解析され、前記解析は、少なくとも１つの分子の定量解析を含む請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
各分子の同定及び定量が質量分析装置で行えるように、複数の分子の各々は相違する同位体標識質量タグ試薬で標識される請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
質量分析装置で特徴決定される標識分子用質量タグ試薬であって、前記質量タグ試薬が次の式の１つを有する、
【化２】
0004744433.tif 000027
式中、Ｒ１、及びＲ２は、同じ又は異なり、アルキル基からそれぞれ独立して選択され；
Ｒ３は、水素及びアルキル基から選択され、Ｒ４はアルキル基であり；
ｎは、０、１又は２の整数であり；
反応性官能基ＲＦは、アミノ基と反応可能であり、かつ炭酸類、アルケニルスルホン類、ハロアルカン類、マレイミド類、イソシアネート類、イソチオシアネート類、ケトン類、アルデヒド類、スルホン酸ハライド類、カルボン酸ハライド類の活性エステル、酸無水物エステル類、アルケン類、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、ヒドロキシアザベンゾトリアゾールエステル、ニトロフェニルエステル、トリクロロフェニルエステル、及びペンタフルオロフェニルエステルから選択され；並びに
リンカーＬは、アルキレン基である。
【請求項１７】
Ｒ１、及びＲ２は、それぞれ独立してメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、及びシクロヘキシルから選択される請求項１６に記載の質量タグ試薬。
【請求項１８】
Ｒ３、及びＲ４は、それぞれ独立して水素、メチル基、エチル基、プロピル基、及びイソプロピル基から選択される請求項１６から１７のいずれかに記載の質量タグ試薬。
【請求項１９】
ｎは、２である請求項１６から１８のいずれかに記載の質量タグ試薬。
【請求項２０】
ＲＦは、炭酸エステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、ヒドロキシアザベンゾトリアゾールエステル、ニトロフェニルエステル、トリクロロフェニルエステル、及びペンタフルオロフェニルエステルから選択される請求項１６から１９のいずれかに記載の質量タグ試薬。
【請求項２１】
Ｌは、置換又は未置換‐(ＣＨ２)ｎ‐（式中ｎは１から５の整数）である請求項１６から２０のいずれかに記載の質量タグ試薬。
【請求項２２】
Ｌは、‐ＣＨ２‐及び‐(ＣＨ２)３‐から選択される請求項１６から２１のいずれかに記載の質量タグ試薬。
【請求項２３】
質量タグ試薬が、変更した同位体比を有する請求項１６から２２のいずれかに記載の質量タグ試薬。
【請求項２４】
次の原子タイプ、水素、炭素、窒素、酸素、硫黄、及びハロゲンの１つ以上の同位体比が、変更された請求項１６から２３のいずれかに記載の質量タグ試薬。
【請求項２５】
同位体比が、１Ｈの一部、又は全部が２Ｈに、１２Ｃの一部、又は全部が１３Ｃに、１６Ｏの一部、又は全部が１８Ｏに、及び／又は１４Ｎの一部、又は全部が１５Ｎに置き換えられることで変更される請求項２４に記載の質量タグ。
【請求項２６】
質量分析装置で特徴決定される１つ以上の分子を標識する質量タグアレイであって請求項１６から２５のいずれかに定義される質量タグを２つ以上含むことを特徴とする質量タグアレイ。
【請求項２７】
アレイ中の全質量タグは同じ化学構造を有し、アレイの各質量タグが違う質量を有するようにアレイ中の各質量タグはアレイ中の他の質量タグのアイソトポマーである請求項２６に記載の質量タグアレイ。
【請求項２８】
請求項１６から２７のいずれかに定義されるような質量タグを１つ以上、及び陽イオン交換樹脂を含むことを特徴とする標識検体分子精製用キット。
【請求項２９】
前記キットは、検体分子にタグを連結するための反応バッファー、陽イオン交換樹脂を洗浄するためのバッファー、及び陽イオン交換樹脂から標識ペプチドを溶出するためのバッファーから選択される１つ以上の成分を更に含む請求項２８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識生体分子の精製、検出、及び分析（定量分析を含む）を支援するマーカーを用いて、不揮発性検体分子、特に生体分子を標識する方法に関し、特に、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）質量分析による分析に関する。詳細には、本発明は、天然又は合成生体分子中のアミノ基を標識可能な活性官能基に結合した３級アミノ化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
質量分析装置は、タンパク質及びペプチド同定、及び構造分析の強力なツールである。マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ）は、ペプチドマスフィンガープリンティングにおいて、２次元ゲルを用いて分離したタンパク質を同定するための強力なツールとなっている（非特許文献１〜３）。一方、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に連結したエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）−タンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）は、複合タンパク質混合物の消化産物を分析するための好ましい技術として頭角を現している。この方法は、特に、ペプチドの分離及び単離技術のための新しい技術、例えば、ＩＣＡＴ法（非特許文献４〜６）及びＭｕｄＰＩＴ法（非特許文献７〜１０）等と組み合わせて用いられる。
【０００３】
ＥＳＩ及びＭＡＬＤＩにより分析されたペプチドの配列情報は、プロトン化分子の衝突誘起解離（ＣＩＤ）後の生成イオンスペクトルからタンデム質量分析装置による分析で得ることができる。しかしながら、ＥＳＩ−ＭＳは、より良いＭＳ／ＭＳスペクトルを生成する傾向があるため、ペプチド同定に特に有用である。これは、ＥＳＩ法の多くの特徴により有用となる。ＥＳＩによるイオン化は、形成されたイオンに非常に少量の運動エネルギーを与える。更に、大気圧イオン源が衝突によりイオン温度を急速に均衡にする。これにより、イオンの加速を制御して正確な量の運動エネルギーを与えることができる。更に、低エネルギーＣＩＤに制御環境を提供する専用衝突セルを備えるタンデム質量分析器にＥＳＩを連結することは通例である。同様に、高い操作圧力を有するイオントラップ、及びイオンの選択的活性化もまた制御したＣＩＤ条件を提供する。対照的に、ＭＡＬＤＩは、ほぼ真空下で高エネルギーイオンを発生し、概してＥＳＩと異なるメカニズムで切断化をおこす。また、ＭＡＬＤＩ測定器に衝突セルを有することは希であり、衝突セルを有する少数の測定器においては、対応するＥＳＩ測定器よりも高い衝突エネルギーで操作される。その上、一般的に１価のイオンしか生成しないＭＡＬＤＩ（非特許文献１１）よりも高い電荷状態で、ＥＳＩはイオンを発生する（非特許文献１２）。このことはより多くのイオンが、機器の機能範囲で分析可能となること、そして、より高い電荷状態のペプチドは複数のイオン群を生じさせるので、よりよいＣＩＤスペクトルを概して与えることを意味し（非特許文献１３）、このことは、より多くの配列情報とペプチドの両末端の配列情報とを提供することにつながる。ＣＩＤにおいてペプチドが切断する現在認容されたモデルは次のとおりであるまずペプチド骨格がプロトン化し、続いてプロトン化したアミドのカルボニル部分をそのペプチド鎖中の次のＮ末端側のカルボニル残基が求核攻撃し、比較的に安定なオキサゾロンが形成され、その結果アミド結合が切断するに至り（非特許文献１４及び１５）２つの主な断片イオンシリーズ、それぞれｂタイプ（Ｎ末端残留物を含む）及びｙタイプ（Ｃ末端残留物）が得られる。より高い電荷状態は、両方のイオンクラスの形成を促進し、ペプチド配列を完全に解明する可能性を高める。しかしながら、ＭＳ／ＭＳによりペプチド配列を決定するには、沢山の落とし穴がある。例えば、ｂシリーズイオンは、カルボニル成分を失い、ａタイプイオンと呼ばれるイオンシリーズを生成する可能性がある。更に、ペプチドのＣＩＤの問題として、異性体の（ロイシン及びイソロイシン）、又は同重体の（リジン及びグルタミン）アミノ酸の同定がある。
【０００４】
しかしながら、ペプチド類の化学修飾は、ＭＳ／ＭＳ分析の結果を向上できることが示された。例えば、リジンの誘導体化によってグルタミンが区別可能になる。(非特許文献１６及び１７)。ペプチドのα−アミノ官能基のスルホン酸誘導体は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含むペプチド類等のイオントラップにおいて一般的に低いＭＳ／ＭＳスペクトルを与えるある種のペプチドについて、ＭＡＬＤＩ−イオントラップ型ペプチド分析で切断効率が上昇し、それによりスペクトルの改善が認められる（非特許文献１８)。強力な酸性官能基は、ＭＡＬＤＩにおいて１価の電荷を有するペプチド類のアミド主鎖のプロトン付加を促進するために、切断効率の増加をもたらす。また、ペプチドのスルホン酸誘導体は、陰イオンモードＥＳＩ−ＭＳの感度を向上することが示されている(非特許文献１９)。ペプチドのアミノナフタリンスルホン酸誘導体は、[Ｍ−Ｈ−]イオンを効率良く生成するために、陰イオンモードにおける低いノイズレベルを利用することを可能ならしめ、結果として非常に高い感度を与える。
【０００５】
４級アンモニウム誘導体化試薬は、ペプチド分析のための高速原子衝撃法（ＦＡＢ）(非特許文献２０)、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ（非特許文献２１）、及びＥＳＩ(非特許文献２２)を含む多くの質量分析技術でテストされてきた。一般的に、感度はＦＡＢ、ＭＡＬＤＩ、又はＥＳＩでは４級アンモニウム誘導体化によって著しい向上がなく、ＥＳＩにおいては感度の低下が報告されている(非特許文献２２)。しかしながら、これらのタグにより、切断反応が修飾され得る。４級アンモニウムイオン誘導体化されたペプチドは、Ｎ末端に誘導体化したペプチの場合、ａ及びｄシリーズイオンがより優勢となり、Ｃ末端でリジンに誘導体化したペプチドにおいては、より多くのｙ、ｖ及びｗシリーズを示すようになる(非特許文献２３)。
【０００６】
更に他の例として、リジンのグアニジン化は、ＭＡＬＤＩ分析においてリジンを含むペプチドの検出感度を向上することが示されている（非特許文献１６、２４及び２５)。同様に、Ｎ−スクシンイミジル−２−（３−ピリジル酢酸）（ＳＰＡ）は、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析においてペプチド誘導体化に使用されている（非特許文献２６及び１７）。ＳＰＡ試薬は、ＣＩＤ断片化経路を変化させ、結果としてより複雑でない生成イオンスペクトル、及びｂタイプイオンの形成を促進することが示されている。ペプチドでのＳＰＡ反応は、選択的にα及びε−アミノ基で発生し、アルギニンのグアニジノ基との反応ではない。
【０００７】
ペプチドを誘導体化するための様々な他の試薬もまた開発されている。ハロゲン化化合物、特に、ハロゲン化芳香族化合物は良く知られた電荷運搬体で、即ち、熱電子を非常に簡単に捕捉することは公知である。フッ素化芳香族化合物に基づく様々な誘導体化試薬（非特許文献２７)が、陰イオン質量分析法に使用可能な非常に高感度なイオン化及び検出方法である、電子捕獲検出法のために開発された（非特許文献２８）。
【０００８】
先行技術で開示されている誘導体化試薬の各々なタイプは、使用するイオン化方法、及び使用する質量分析方法次第で異なる利点及び制限がある（再考のために非特許文献２３参照)。感度を向上させるメカニズムもまた、各々の群のタイプにより異なる。誘導体化方法のいくつかは塩基性を増加させることによりプロトンと電荷の局在を促進させるが、他の方法は、標識したペプチドの界面活性を増加させ、これがマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）及び高速原子衝撃法（ＦＡＢ）の様な表面脱離技術における感度の向上をもたらす。陰イオン質量分析法は、しばしば、バックグランドノイズがより少ないために感度がより高くなる。
【０００９】
上記で考察された反応の殆どは、全タンパク質ではなくペプチドに対して行われる。概して、ペプチド誘導体化反応の動態は、全タンパク質のそれよりもより良好である。これはおそらく、大きな折りたたまれたポリペプチド中においては、反応基の空間的アクセスビリティーがより低いからであろう。大きいポリペプチドを上記試薬のいずれかを用いて標識する研究については、ほとんど報告がないが、これが、本発明の目的である。
【００１０】
【非特許文献１】Mann,  M.,  P.  Hojrup,  et  al.  (1993).  "Use  of  mass  spectrometric  molecular  weight  information  to  identify  proteins  in  sequence  databases."  Biol  Mass  Spectrom  22  (6):  338-45.
【非特許文献２】Pappin,  D.  J.  C.,  P.  Hoejrup,  et  al.  (1993).  "Rapid  identification  of  proteins  by  peptide-mass  fingerprinting."  Curr  Biol  3:  372-332.
【非特許文献３】Yates,  J.  R.,  3rd,  S.  Speicher,  et  al.  (1993).  "Peptide  mass  maps:  a  highly  informative  approach  to  protein  identification."  Anal  Biochem  214  (2):  397-408.
【非特許文献４】Gygi,  S.  P.,  B.  Rist,  et  al.  (1999).  "Quantitative  analysis  of  complex  protein  mixtures  using  isotope-coded  affinity  tags."  Nat  Biotechnol  17  (10):  994-9.
【非特許文献５】Han,  D.  K.,  J.  Eng,  et  al.  (2001).  "Quantitative  profiling  of  differentiation-induced  microsomal  proteins  using  isotope-coded  affinity  tags  and  mass  spectrometry."  Nat  Biotechnol  19  (10):  946-51.
【非特許文献６】Smolka,  M.  B.,  H.  Zhou,  et  al.  (2001).  "Optimisation  of  the  isotope-coded  affinity  tag-labelling  procedure  for  quantitative  proteome  analysis.  "Anal  Biochem  297  (1)  :  25-31.
【非特許文献７】Washburn,  M.  P.  and  J.  R.  Yates  (2000).  "Analysis  of  the  microbial  proteome."  Curr  Opin  Microbiol  3  (3):  292-297.
【非特許文献８】Washburn,  M.  P.,  D.  Wolters,  et  al.  (2001).  "Large-scale  analysis  of  the  yeast  proteome  by  multidimensional  protein  identification  technology."  Nat  Biotechnol  19  (3):  242-247.
【非特許文献９】Wolters,  D.  A.,  M.  P.  Washburn,  et  al.  (2001).  "An  automated  multidimensional  protein  identification  technology  for  shotgun  proteomics."  Anal  Chem  73  (23):  5683-5690.
【非特許文献１０】Washburn,  M.  P.,  R.  Ulaszek,  et  al.  (2002).  "Analysis  of  quantitative  proteomic  data  generated  via  multidimensional  protein  identification  technology."  Anal  Chem  74  (7):  1650-7.
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【非特許文献１２】Gaskell,  S.  (1997)."Electrospray  :  Principles  and  Practice."  Journal  of  Mass  Spectrometry  32:  677-688.
【非特許文献１３】Tang,  X.  J.,  P.  Thibault,  et  al.  (1993).  "Fragmentation  reactions  of  multiply-protonated  peptides  and  implications  for  sequencing  by  tandem  mass  spectrometry  with  low-energy  collision-induced  dissociation."  Anal  Chem  65  (20):  2824-2834.
【非特許文献１４】Polce,  M.  J.,  D.  Ren,  et  al.  (2000).  "Dissociation  of  the  peptide  bond  in  protonated  peptides."  J  Mass  Spectrom  35  (12)  :  1391-8.
【非特許文献１５】Schlosser,  A.  and  W.  D.  Lehmann  (2000).  "Five-membered  ring  formation  in  unimolecular  reactions  of  peptides:  a  key  structural  element  controlling  low-energy  collision-induced  dissociation  of  peptides."  J  Mass  Spectrom  35  (12):  1382-90.
【非特許文献１６】Bonetto,  V.,  A.  C.  Bergman,  et  al.  (1997).  "C-terminal  sequence  determination  of  modified  peptides  by  MALDI  MS."  J  Protein  Chem  16  (5):  371-374.
【非特許文献１７】Cardenas,  M.  S.,  E.  van  der  Heeft,  et  al.  (1997).  "On-line  derivatisation  of  peptides  for  improved  sequence  analysis  by  micro-column  liquid  chromatography  coupled  with  electrospray  ionisation-tandem  mass  spectrometry."  Rapid  Commun  Mass  Spectrom  11  (12):  1271-8.
【非特許文献１８】Keough,  T.,  M.  P.  Lacey,  et  al.  (2001).  "Atmospheric  pressure  matrix-assisted  laser  desorption/ionisation  ion  trap  mass  spectrometry  of  sulphonic  acid  derivatised  tryptic  peptides."  Rapid  Commun  Mass  Spectrom  15  (23):  2227-2239.
【非特許文献１９】Griffiths,  W.  J.,  I.  Lindh,  et  al.  (1995).  "Negative-ion  Electrospray  Mass  Spectra  of  Peptides  Derivatised  with  4-Aminonaphthalenesulphonic  acid."  Rapid  Commun  Mass  Spectrom  9:  667-676.
【非特許文献２０】Stults,  J.  T.,  R.  Halualani,  et  al.  (1989).  Amino-terminal  derivatisation  of  peptides  yields  improved  CAD  spectra.  Proc  37th  ASMS  Conf  Mass  Spectrom  Allied  Topics,  Miami  Beach,  Florida.
【非特許文献２１】Bartlet-Jones,  M.,  W.  A.  Jeffery,  et  al.  (1994).  "peptide  ladder  sequencing  by  mass  spectrometry  using  a  novel,  volatile  degradation  reagent."  Rapid  Commun  Mass  Spectrom  8  (9):  737-42.
【非特許文献２２】Stults,  J.  T.  (1992).  Amino-terminal  quaternary  ammonium  derivatives  of  peptides  alter  fragmentation  by  electrospray  ionisation/low  energy  collisionally  activated  dissociation.  Proc  40th  ASMS  Conf  Mass  Spectrom  Allied  Topics,  Washington,  DC.
【非特許文献２３】Roth,  K.  D.,  Z.  H.  Huang,  et  al.  (1998).  "Charge  derivatisation  of  peptides  for  analysis  by  mass  spectrometry."  Mass  Spectrom  Rev  17  (4):  255-274.
【非特許文献２４】Brancia,  F.  L.,  S.  G.  Oliver,  et  al.  (2000).  "Improved  matrix-assisted  laser  desorption/ionisation  mass  spectrometric  analysis  of  tryptic  hydrolysates  of  proteins  following  guanidination  of  lysine-containing  peptides."  Rapid  Commun  Mass  Spectrom  14  (21):  2070-3.
【非特許文献２５】Brancia,  F.  L.,  A.  Butt,  et  al.  (2001).  "A  combination  of  chemical  derivatisation  and  improved  bioinformatic  tools  optimises  protein  identification  for  proteomics."  Electrophoresis  22  (3):  552-9.
【非特許文献２６】Sherman,  N.  E.,  N.  A.  Yates,  et  al.  (1995).  A  novel  N-terminal  derivative  designed  to  simplify  peptide  fragmentation.  Proc  43rd  ASMS  Conf  Mass  Spectrom  Allied  Topics,  Atlanta,  GA.
【非特許文献２７】Bian  N.  et  al.,  Rapid  Commun  Mass  Spectrom  11  （16）:  1781-1784,  "Detection  via  laser  desorption  and  mass  spectrometry  of  multiplex  electrophore-labelled  albumin."  1997
【非特許文献２８】Abdel-Baky  S.  &  Giese  R.  W.,  Anal.  Chem.  63  （24）:  2986-2989,  "Gas  chromatography/electron  capture  negative-ion  mass  spectrometry  at  the  zeptomole  level."  1991
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、標識生体分子の精製ならびに、質量分析装置による標識生体分子の分析に有用である、生体分子、特にプロトン化可能な官能基を保持したタンパク質、に保護アミノ基を生成せしめるのに使用可能な方法及び標識体を提供することである。
【００１２】
本発明の目的は、質量標識体として所望の特徴を有する化合物、及びこの化合物により標識された検体の質量スペクトルを改善するための、それらの化合物の使用方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の第１の態様は、次の一般構造の基本質量タグ試薬を提供する：
３級アミノ基−リンカー−反応性官能基
であって、基本質量タグ試薬は、好ましくは下記化学式を含む群から選択される。
【００１４】
【化３】
0004744433.tif 000002
【００１５】
式中、Ｒ１、及びＲ２は、アルキル、又はアラルキル（例えば、それぞれ独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロヘキシル、ベンジル、又は置換ベンジル、及び好ましくはメチル、エチル、又はイソプロピル）であり；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、及びＲ６は、アルキル（例えば、それぞれ独立して、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、又は水素であり、好ましくはメチル、又は水素）であり；ｎは０〜２、好ましくは２を含み；Ｘはそれぞれ独立して、Ｎ−アルキル（アルキルは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル又はシクロヘキシル）、Ｓ又はＯであり、好ましくは、ＸはＯであり；ＲＦは反応性官能基であり、好ましくは、炭酸類、アルケニルスルホン類、ハロアルカン類、マレイミド類、イソシアネート類、イソチオシアネート類、ケトン類、アルデヒド類、スルホン酸ハライド類、カルボン酸ハライド類の活性エステル、酸無水物エステル類、及びアルケン類を含む群より選択され、好ましくは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ニトロフェニルエステル、トリクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル及びヒドロキシアザベンゾトリアゾールエステル等の活性炭酸エステルであり（Ｍｉｚｈｉｒｉｔｓｋｉｉ  ａｎｄ  Ｓｈｐｅｒｎａｔ  ２００２参照）；Ｌはリンカーで、アルキレンリンカーであり、例えば、それぞれ独立して‐(ＣＨ２)ｎ‐及び置換された‐(ＣＨ２)ｎ‐(ｎは１〜５を含む)、及び‐(Ｃ６Ｈ４)‐等のフェニレン、及び好ましくは‐ＣＨ２‐及び‐(ＣＨ２)３‐である。
【００１６】
上記の置換基は、特に限定されることなく、有機基、及び／又は、周期表のＩＩＩＡ、ＩＶＡ、ＶＡ、ＶＩＡ、又はＶＩＩＡ族のいずれかから１つ以上の原子、例えばＢ、Ｓｉ、Ｎ、Ｐ、Ｏ、若しくはＳ原子、又はハロゲン原子（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）を含み得る。
【００１７】
置換基が有機基を含む場合、有機基は、好ましくは、炭化水素基を含む。炭化水素基は、直鎖、分鎖、又は環状基を含み得る。炭化水素基は、独立して脂肪族、又は芳香族基を含み得る。また、炭化水素基は、独立して飽和、不飽和基を含み得る。
【００１８】
炭化水素が不飽和基を含む場合、１つ以上のアルケン官能基、及び／又は、１つ以上のアルキン官能基を含み得る。炭化水素が直鎖、又は分鎖基を含む場合、１つ以上の１級、２級及び／又は３級アルキル基を含み得る。炭化水素が環状基を含む場合、芳香環、脂肪環、複素環基、及び／又は、これらの基の縮合環誘導体を含み得る。従って、環状基は、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、インデン、フルオレン、ピリジン、キノリン、チオフェン、ベンゾチオフェン、フラン、ベンゾフラン、ピロール、インドール、イミダゾール、チアゾール、及び／又は、オキサゾール基および上記基の位置異性体を含み得る。
【００１９】
炭化水素基の炭素原子数は特に限定されないが、好ましくは、炭化水素基が炭素原子数１〜４０より成る。従って、炭化水素基は、低級炭化水素基（炭素原子数１〜６）又は、高級炭化水素基（炭素原子数７以上、例えば、７〜４０）であり得る。環状基の環の原子数は、特に限定されないが、好ましくは、環状基の環が原子数３〜１０、例えば、３、４、５、６又は７等を含む。
【００２０】
上記に記載の異種原子を含む群は、上記に定義する他の群と同様に、周期表のＩＩＩＡ、ＩＶＡ、ＶＡ、ＶＩＡ、又はＶＩＩＡ族から１つ以上のヘテロ原子、例えばＢ、Ｓｉ、Ｎ、Ｐ、Ｏ、若しくはＳ原子、又はハロゲン原子（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩ）を含み得る。従って、置換基は、有機化学における一般的な官能基のいずれか１つ以上を含み、例えば、ヒドロキシ基、カルボン酸基、エステル基、エーテル基、アルデヒド基、ケトン基、アミン基、アミド基、イミン基、チオール基、チオエーテル基、硫酸塩基、スルホン酸基、及びリン酸塩基等を含み得る。置換基は、またカルボン酸無水物、及びカルボン酸ハライド等これらの群の誘導体類も含み得る。
【００２１】
更に、全ての置換基は、上記で定義する置換基、及び／又は官能基の２つ以上の組み合わせも含み得る。
【００２２】
本発明の第１の態様の好適な実施形態において、基本質量タグ（ＢＭＴ）試薬は、特徴的な同位体存在比分布を有する。実施形態の１つは、ＢＭＴは１つ以上のハロゲン原子、又は重水素、１３Ｃ及び／又は１５Ｎ等の安定した同位体の原子と置換される。第２の実施形態において、ＢＭＴ試薬は、同じ化合物の２つ以上の同位体の混合物を含み、標識イオン群に特徴的な同位体比を与える。
【００２３】
本発明は、また、質量分析装置で解析可能な１つ以上の分子を標識するための質量タグアレイを提供し、該アレイは上記に定義されるような質量タグを２つ以上含む。実施形態の１つにおいて、アレイ中の全質量タグは、同じ化学構造を有し、アレイの各質量タグが違う質量を有するようにアレイ中の各質量タグはアレイ中の他の質量タグのアイソトポマーである。これらのタグアレイは、同時に複数の検体を調査する場合に有用である。
【００２４】
本発明の特有な第２の態様は、次の工程を含むポリペプチドの分析方法を提供する。
１．ポリペプチド中の遊離アミノ官能基を活性３級アミノ基含有試薬で標識する。
２．配列特異的切断試薬でポリペプチドを切断する。
３．切断試薬によりペプチド中に形成された遊離アミノ基を第２のアミノ基反応性試薬により標識する。
４．質量分析装置で切断ペプチドを分析する。
【００２５】
本発明のこの態様の好適な実施形態において、標識ペプチドは、質量分析装置による分析の前に１つ以上の分析分離技術を適用して分離される。より好ましい実施形態において、切断試薬により産生された標識ペプチドは、強陽イオン交換体（ＳＣＸ）クロマトグラフィーを使用するペプチドの分析分離により精製される。更により好ましい実施形態において、標識ペプチドは、標識ペプチドに次々に適用される多くの異なる分離技術での多次元分析分離の一部として、強陽イオン交換体（ＳＣＸ）を使用するペプチドの分析分離により精製される。
【００２６】
また、本発明は、本発明の基本質量タグ及び標識検体分子精製用陽イオン交換樹脂を含むキットを提供する。
【００２７】
好適な実施形態において、キットは、検体分子にタグを連結するための反応バッファー、及び未反応タグを洗浄後、樹脂から溶出する標識ペプチドのための樹脂及びバッファーに反応バッファーを負荷後、陽イオン交換樹脂を洗浄するためのバッファーを更に含み得る。好適な洗浄バッファーは、低ｐＨで水及びアセトニトリルを含み、一方、好適な溶出バッファーは酢酸アンモニウムを含む。好適な実施形態において、反応バッファーは、ホウ酸塩、尿素、及びチオ尿素を含む。好ましくは、尿素及びチオ尿素は、複合濃度が少なくとも１Ｍで存在する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
３級アミノ基
本発明の第１の態様である基本質量タグ試薬は、アミノ活性官能基に結合する３級アミノ基を含む。これらの試薬の目的は、天然又は合成生体分子、特にタンパク質、の中の１級アミノ基を、プロトン化可能な官能基を保持しつつ、保護することである。これは標識生体分子の精製、及び質量分析装置による標識生体分子の分析にもまた有利であり、かつエレクトロスプレーイオン化、及びＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ等の検体のイオン化のために主にプロトン付加に頼るイオン化技術に特に有利である。３級アミンは、容易にプロトン化するが、しかし求電子試薬への求核攻撃には直ぐには寄与しない。３級アミノ基内で窒素に対する置換基は、窒素のアクセシビリティを変える、及び窒素のプロトン親和力を変えられるように容易に修飾可能である。
【００２９】
３級アミンは、ＣＩＤによるペプチド配列決定を容易ならしめる「移動性」プロトンを保持するため、ペプチドの標識として利点がある（Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｈｍａｎｎ  ２０００；  Ｗｙｓｏｃｋｉ，  Ｔｓａｐｒａｉｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００)。従って、本発明のタグは、質量分析装置で分析する場合に標識ペプチドが非標識ペプチドと同様の挙動を示す保護基を提供する。
【００３０】
同様に、本発明の好ましい化合物では、標識ペプチド及び未標識ペプチドのクロマトグラフィー分離と比較した場合に、保持時間には非常に小さな変化しか観察されない。
【００３１】
本発明の目的においては、直鎖アルキル鎖を介して反応性官能基に結合させれば、メチル基は窒素を保護するのに十分である。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンは、活性エステルの調製に優れた試薬である。該化合物のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、本発明により提供される好適なタグである。立体障害がより大きい置換基もまた適用可能であるが、しかし非常に大きい置換基は標識生体分子のクロマトグラフィー特性を干渉するので好ましくない。
【００３２】
３級アミノ官能基を含む反応性タグ
本発明の第１の態様において、反応性３級アミノ基を含む分子を提供する。このような試薬は、多くの市販されている中間体から調製可能である。３級アミノ基がカルボン酸官能基に結合する化合物の多くが市販されている（下記実施例参照）。カルボン酸官能基は、従来の化学的方法で容易に活性エステル又は酸塩化物に変換され得る（例えば、Ｓｏｌｏｍｏｎｓ，“Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｗｉｌｅｙ参照)。好適な活性エステルは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、及びペンタフルオロフェニルエステルを含む。
【００３３】
反応性官能基
他の様々な反応性官能基は、本発明で使用するための３級アミノ含有反応性試薬の調製に適している。下記表１に本発明の試薬に組み込まれ得る反応性官能基をいくつか列挙する。これらの反応性官能基は、天然又は合成生体分子、特に、ペプチド及びポリペプチド中のアミノ基と反応し得る。求核性官能基と反応する反応性官能基は、２つの物質間に共有結合を形成する。共有結合は表の第３列に示す。合成オリゴヌクレオチドへの応用においては、標識を可能にするために、合成の際に分子の末端に１級アミンがしばしば導入される。下記のいずれの官能基も、本発明の化合物に導入し、質量マーカーを目的とする分子に付加させるために用いることができる。必要に応じて、反応性官能基を他の反応性官能基を持つ他のリンカー基を導入するためにも使用可能である。表１は、完全網羅することを意図しておらず、本発明は列挙した官能基のみの使用に限定されない。
【００３４】
【表１】
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【００３５】
ここで留意して欲しいのは、本発明の質量マーカーによるオリゴヌクレオチドの標識に関する用途において、上記の反応性官能基の一部又はそれらの得られる結合基は、オリゴヌクレオチド合成機に導入する前に保護しなければならないことである。好ましくは、非保護エステル、チオエーテルとチオエステル、アミンとアミド結合は、通常、オリゴヌクレオチド合成機中で安定しないので避けるべきである。多様な保護基が当分野公知であり、それらを使用すれば結合を望ましくない副反応から保護することができる。或いは、アミン官能基を有するオリゴヌクレオチドは公知の標準方法を使用して調製可能であり、これらはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル等のアミン反応性試薬で標識可能である。
【００３６】
特徴的な同位体存在比分布を有する基本質量タグ
ペプチドは、特徴的同位体存在比分布を有しているが、しばしば、特定の特性を同定可能にするために、ペプチドの同位体存在比分布を変更することも価値がある。ペプチド含有システインを同定する１つの方法は、ペプチドに特徴的同位体存在比分布を与える標識体でシステインをタグ付けすることである。多くの標識、及びタグ付け手順が、この目的のために開発されてきた（Ｓｅｃｈｉ  ａｎｄ  Ｃｈａｉｔ  １９９８；  Ａｄａｍｃｚｙｋ，  Ｇｅｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９  ；  Ｇｏｏｄｌｅｔｔ，  Ｂｒｕｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００；  Ｓｅｃｈｉ  ２００２)。
【００３７】
複合ペプチド混合物の一般的な分析において、ペプチドは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分離され、例えば、分析用ＥＳＩインターフェースを介した質量分析計に溶離物質が直接吹付けられる。通常、ペプチドは、適切な機器でＭＳ／ＭＳにより同定される。ＭＳ／ＭＳによるペプチド同定は相応に時間が掛かるため、このタイプの分析の速度が試料中のペプチド同定用の機器の全体の処理能力を決める。四重極／飛行時間型装置等の機器においては、ＭＳモードでのスペクトルの捕捉が比較的早いので、ＭＳモードにおいてイオンを生成しながら、どのイオン種を、ＭＳ／ＭＳにより分析するかを決定することができる。しかしながら、非修飾ペプチドを用いると、ＭＳモード中のペプチドイオンと非ペプチド混入物の同定が難しいことがある。これは、ペプチドでないイオンがＭＳ／ＭＳ分析のためにしばしば選択され、ペプチド同定用機器の全体の処理能力を低下させることを意味する。この問題を克服するために、本発明は、ポリペプチド及びペプチドの同位体存在比分布を変えるポリペプチド及びペプチド中のアミノ基を標識するためのタグを提供する。殆どのペプチド、又はポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ基を有するため、本発明は、ＭＳモードにおいて、修飾同位体存在比分布により、ポリペプチド及びペプチドイオンを標識し、これら由来のイオンを、他のイオンから識別可能にする方法を提供する。これは、ペプチドでないイオンをＣＩＤにより分析する時間を無駄しないことを確実にすることが利点である。従って、本発明の第１の態様の好適な実施形態において、特徴的な同位体比を有するＢＭＴ試薬が提供される。ペプチド又はポリペプチドを標識するために使用する場合、これらのタグは、標識種の同位体比を修飾する。実施形態の１つにおいて、通常、水素原子を置換することでタグに１つ以上のハロゲン原子を取り込み、特徴的同位体比を本発明のタグに付与可能である。臭素（Ｓｔｅｅｎ  ａｎｄ  Ｍａｎｎ  ２００２)及び塩素（Ｇｏｏｄｌｅｔｔ，  Ｂｒｕｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００）のどちらも、従来この目的に使用されており適当である。これらの原子は、対応する水素化された種と比較してより高い質量の同位体ピークの強度を高める。同様に、フッ素は、ほぼ一つの同位体よりなるので、標識された分子種の同位体比を変化させる。すなわち、対応する水素化された種と比較してより高い質量の同位体の強度を低下させる。ハロゲン原子は、また、タグ付けされたペプチドを識別する更なる手段を提供する質量欠損をおこす（Ｓｔｅｅｎ  ａｎｄ  Ｍａｎｎ  ２００２）。
【００３８】
特徴的同位体比を付与するシステインを標識するための試薬は、同じ分子の天然のものと同位体を濃縮したものとの混合物から調製可能である（Ａｄａｍｃｚｙｋ，  Ｇｅｂｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９）。他の実施形態において、ＢＭＴ試薬同位体の混合物を含むタグ試薬が提供される。特別な原子種のための濃縮されたタグを合成するために同位体濃縮化合物を得ることができる。例証の目的で下記実施例部分に規定されるタグについて検討する。この中では、多くの試薬の構成単位の１つとしてブロモ酢酸が使用されている。アルドリッチから９９％の１３Ｃ濃縮ブロモ酢酸(Ｂｒｌ３ＣＨ２ｌ３ＣＯＯＨ)を得ることが可能である(シグマアルドリッチ（株）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）、Ｅｓｃｈｅｎｓｔｒａｓｓｅ５、８２０２４、タウフキルへェン、ドイツ)。従って、下記に記載の合成手順にこの試薬を導入するのは些細なことである。このタグ自体が、特徴的な同位体存在比を有するであろうが、しかし、また天然の同位体存在比を含むブロモ酢酸から合成される試薬に対応してこの試薬を混合することも可能である。２つのタグの異なる比率が、同位体存在比が制御されたタグの生成を可能にする。
【００３９】
ＢＭＴ標識タンパク質から産生される切断ペプチドの更なる標識
本発明の第２の態様において、ＢＭＴ標識ポリペプチドは、配列特異的切断試薬で切断され、切断ペプチドは質量分析装置で分析される。本発明の第２の態様の好適な実施形態において、切断ペプチドは、ペプチドの切断により露出したアミノ基に更に標識される。ポリペプチドの標識は他の遊離アミノ基を全てブロックしてしまっているので、切断ペプチドのＮ末端に新たに露出したアミノ基のみがこの時点で標識可能である。更に、本発明のＢＭＴ試薬ですでにブロックされているため、親ポリペプチドのＮ末端ペプチドは、切断後に遊離アミノ基を有さない。
【００４０】
これは、親ポリペプチドのＮ末端断片を非Ｎ末端ペプチドから同定する手段を提供する。実施形態の１つにおいて、非Ｎ末端断片は、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ、チェスター、イギリス、又はシグマアルドリッチ（株）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）プール、ドーセット州、イギリス）等の購入可能なアミン反応性ビオチン試薬でビオチン化により標識可能であり、Ｎ末端ペプチドを単離可能にするアビジン化した支持体上に捕捉することができる。また、非Ｎ末端ペプチドのα−アミノ基は、溶液中にＮ末端ペプチドを残す１級アミン反応性固相支持体と反応可能である。
【００４１】
他の実施形態において、ＢＭＴ標識切断ペプチドは、アミン反応性ビオチン試薬で標識し、アビジン化した支持体上にペプチドを捕捉することにより、質量分析装置による分析の前にペプチドをコンディショニングすることができる。ここでペプチドのコンディショニングとは、親ポリペプチドのイオン化及び標識に使用された金属イオン、界面活性剤、及び他の試薬を取り除くために揮発性バッファーでペプチドを洗浄することを意味する。
【００４２】
更に他の実施形態において、切断ペプチドは、ＭＳ／ＭＳにより分析された有機分子質量マーカーが開示される国際公開第０１／６８６６４号パンフレット及び国際出願番号第ＰＣＴ／ＧＢ０２／０４２４０号明細書に開示されるような他のタグで標識可能である。これらの出願は、コリジョンにより開裂可能な基を用いて連結した二成分系質量マーカーを開示する。数組のタグを合成するが、この場合に作成されるマーカーの全質量は二成分の質量の合計と同じになる。質量マーカーはそれらの検体から切断後に分析してもよいし、あるいは検体に付加したまま検出してもよい。本発明の文脈において、質量マーカーは同定中のペプチドに付加したまま検出される。質量マーカーを適宜選定することにより、タンデム分析器の第１質量分析計において質量マーカーが付加されたペプチドをバックグランドから抽出することを可能にする。第２工程の機器中でマーカーが衝突することにより、タグの二成分は互いに分離する。これら成分の中の１個のみを第３質量分析計で検出する。これにより、第１質量分析計で選定されたピークは質量マーカーしたペプチドであることが確認できる。このプロセス全体により、分析のシグナル対ノイズ比が大幅に引き上げられ、感度が向上する。質量マーカーをこのように設計すれば、並列する質量マーカーが展開する質量範囲が圧縮される。更に、化学的に同一であり、質量も同一であるが質量分析装置により解像可能なマーカーを設計することができる。これは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）等の分析技術に必須であり、すなわち、異なるマーカーが異なるペプチド試料の移動度に及ぼす影響を最小にする必要があり、そうすれば、各試料からの対応ペプチドを質量分析計に一緒に流入することにより対応ペプチドの比率を測定することができる。従って、これらのマーカーは、高い選択性をもった検出能を利用しておりかつ構造が密接に関連しているので、本発明の目的には最も好ましい。ただし、他のマーカーも利用可能である。
【００４３】
タンパク質は、アミノ基に加えて、これらの官能基に対して反応する試薬を使用して標識可能である様々な求核性官能基を含む。タンパク質は、一般的に、チオール、アミノ、ヒドロキシル、及びイミダゾール基を含む。これらは、必要に応じて、全て適切な試薬で標識し得る。本発明の好適な実施形態において、チオール基は、遊離アミノ基の標識よりも前に、標識される。好ましい試薬はヨードアセトアミド、ビニルピリジン、フェニルビニルスルホン、及びマレイミド化合物を含むが、非常に多くのチオールの選択的標識方法が公知である。
【００４４】
標識生体分子の分析
本発明の第２の態様において、ポリペプチドの分析方法が提供される。この方法は生体分子を反応性３級アミノ基含有化合物で共有結合標識する。
【００４５】
分析用のポリペプチド、ペプチド、又はポリペプチド、若しくはペプチドの混合物は電気泳動、クロマトグラフィー、又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の方法のいずれかで単離可能である。質量分析計、特にＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析計の目的のため、ポリペプチド、又はタンパク質が塩又は界面活性剤、特に金属塩の不純物を含まないのが好ましい。ポリペプチド、又はペプチド混合物を脱塩する様々な技術が公知であり、例えば、ゲル濾過、透析、又は疎水性樹脂の使用等がある。特に便利で簡単なペプチドの脱塩方法は、Ｃ１８充填材料を内蔵するピペットチップでペプチド、又はポリペプチド混合物の溶液の少量吸引によるものである。塩、及び界面活性剤等の疎水性物質は、Ｃ１８誘導体に対して親和性が少なく、ペプチドがＣ１８マトリックスに付加する間に容易に洗浄される。捕捉されたペプチド物質が、続いて、分析のための適切な揮発性バッファーで溶出可能である。この種の「試料コンディショニング」は、ペプチドの分析の検出感度を実質的に向上する。適切な樹脂が事前に充填されたピペットチップ、及びその使用説明書はミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）から「Ｚｉｐ  Ｔｉｐ(R)」（ベッドフォード、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）として市販されている。必要であれば、脱塩処理は未反応タグを取り除く検体の標識後で行ってもよい。
【００４６】
発明者らは、また本発明のタグで標識したペプチドが陽イオン交換樹脂、特に強陽イオン交換樹脂に対して、タグ単独よりもより高い親和性を有することを認めた。これにより、本発明のタグで標識したペプチドが、陽イオン交換樹脂との反応混合物を反応させることで、未反応タグから生成可能になる。樹脂に標識ペプチドが付加し、一方で未反応タグ、界面活性剤、及びカオトロープが酸性水溶媒で洗浄可能である。そして、標識ペプチドは、適切なバッファーで溶出可能である。続く質量分析の目的のために、酢酸アンモニウム等の揮発性バッファーの溶出は、質量分析計と互換性のある形態のペプチドを回復するのに効果的である。従って、ペプチドチップ、スピンカラム、及び陽イオン交換樹脂を充填したカートリッジは標識試料の有効な調製用器具であり、分析の前に標識ペプチドを容易にきれいにするのに用い得る。
【００４７】
タグペプチドの分析分離
本発明の第２の態様の好適な実施形態において、ＢＭＴ標識タンパク質の切断により産生されたタグペプチドは、質量分析計による分析に先立ち、分析分離される。殆どの分析分離技術は、本発明に適用可能なペプチドに使用可能であり、例えば、キャピラリー電気泳動（Ｍｏｉｎｉ  ２００２）、高速液体クロマトグラフィー（Ｍｏｒａｎｄ,  Ｂｕｒｔ  ｅｔ  ａｌ.  ２００１)、キャピラリー等電点電気泳動(Ｔａｎｇ,  Ｈａｒｒａｔａ  ｅｔ  ａｌ.  １９９７；  Ｓｈｅｎ,  Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ.  ２０００)、イオン交換クロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィー（Ｌｉｕ,  Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ.  ２００２)等が挙げられる。
【００４８】
より好適な実施形態において、多次元クロマトグラフィー法（Ｗａｓｈｂｕｒｎ,  Ｗｏｌｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ.  ２００１；  Ｗｏｌｔｅｒｓ,  Ｗａｓｈｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ.  ２００１；  Ｌｉｕ,  Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ.  ２００２)がＢＭＴ標識タンパク質の切断により産生されたタグペプチドに適用される。
【００４９】
タグペプチドの定量分析
本発明は更に、分子の複数性を質量分析装置で解析する分子の解析方法を提供し、この解析においては少なくとも１つの分子の存在する量、又は２つ以上の分子の相対量の決定を含む。
【００５０】
この方法において、好ましくは、複数の分子のそれぞれは、本発明の異なる同位体標識質量タグ試薬で標識され、その結果、各分子の同定及び定量が質量分析装置で決定できる。本発明のこれらの実施形態において、特に好ましくは、質量タグ試薬がＤＭＧ質量タグ試薬を含む。
【００５１】
本発明の方法及びタグを使用すれば、十分に高品質の質量スペクトルを得ることができるので、スペクトルを統合することによって、存在する種の量に関する信頼できるデータを得ることが可能である。この手順の例が下記に規定され、試料スペクトルが、相違する同位体標識ＤＭＧタグを使用する二成分分析を表す図５に見られる。
【００５２】
同位体標識は、これらの分析に特に良く役立つ。なぜならば、タグの化学構造は同一で、同一の質量スペクトルのイオンパターンをもたらし、同位体標識による質量差のおかげで各パターンが他のパターンにとって代わるためである。この質量差は、タグの同位体標識の程度を変更することで調整可能である。パターンが同一であるため、より簡単に比較及び統一され、相対量のより正確な比較及び決定が可能となる。
絶対量もまた、調整された既知数と質量スペクトルデータを比較することで決定され得る。
【００５３】
タグペプチドの質量分析装置
質量分析計の不可欠な特徴は次の通りである：
導入系→イオン源→質量分析器→イオン検出器→データ捕捉系
大きな生体分子を分析するために使用可能な導入系、イオン源及び質量分析器が様々あるが、しかし、本発明の文脈において、イオン源は、好ましくは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源、又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）源である。ＥＳＩは、イオントラップ、四重極、及び三連四重極機器、直交軸飛行時間型及び四重極／飛行時間型質量分析器を含む質量分析器の殆どのタイプに連結可能である。同様に、いくつかの質量分析器の構造は、商業的に生産されないが、様々な質量分析器、イオン検出器、及びデータ捕捉系がＭＡＬＤＩと共に使用される。飛行時間型質量分析器は、一般的にＭＡＬＤＩと共に使用され、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分析器及び四重極／飛行時間型質量分析器も同様である。主に、イオントラップ、及びセクター方式装置もまた、ＭＡＬＤＩと共に使用可能であるが、これらは概して広く入手可能ではない。
【００５４】
エレクトロスプレーイオン化
エレクトロスプレーイオン化は、検体分子の希釈溶液を分析器中に「噴霧する」、すなわち微細なスプレー状態で注入することが必要である。一般的に、溶液を荷電針の先端から乾燥窒素の気流及び静電界に噴霧する。イオン化のメカニズムは十分に解明されていないが、次のようであると考えられている。窒素気流中に溶媒が気化する。小滴になると共に検体分子が濃縮される。大部分の生体分子には正味の電荷があるとすると、溶解した分子の静電的な反撥力が増大する。気化を続けるに従いその反撥力は最終的には滴の表面張力より大きくなるので、その滴は更に小さな滴に崩壊する。このプロセスは時々「クーロン破裂」と言われる。静電界はさらに滴の表面張力に打ち勝つのを助けるので、噴霧過程は促進される。更に小さな滴からの気化が続き、破裂を繰り返す。そして、溶媒も、生体分子も事実上、蒸気相に存在する状態となる。この技術では、イオン化の過程でイオンに賦課されるエネルギー量が比較的に小さく、かつ群の中でのエネルギー分布の範囲が他の技術に比較すると狭い傾向にあるため、この技術は質量標識体を使用する場合には特に重要である。電極を適切に配置して設定した電界を使用するとイオン化チャンバからイオンが加速されて出てくる。電界の極性を変えて負及び正のいずれかのイオンを抽出してもよい。電極間の電位差により、正及び負のいずれかのイオンが質量分析器に到達するかどうかが決まり、またイオンが質量分析計に入る際の運動エネルギーも決まる。このことは質量分析計でのイオンの開裂を考察する際に重要である。イオン群に賦課されるエネルギーが多いほど、検体分子が供給源に存在するガスとの衝突を介して開裂が起こる可能性が大きくなる。電界を調節してイオン化チャンバからイオンを加速すれば、イオン開裂を制御することができる。これは、標識生体分子からタグを除去する手段としてイオン開裂を利用する必要がある場合には有利である。
【００５５】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）
ＭＡＬＤＩでは、生体分子の溶液を大過剰モルの光励起「マトリックス」に埋設する必要がある。適切な振動数のレーザー光を当てると、マトリックスが励起し、次に閉じ込めた生物分子と一緒にマトリックスが迅速に気化する。酸性マトリックスから生物分子にプロトンが移動して生物分子のプロトン化形が生じ、これは陽イオン質量分析法、特に飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析法により検出することができる。陰イオン質量分析法もＭＡＬＤＩ  ＴＯＦにより可能である。この技術は、イオンにかなりの量の遷移エネルギーを付与するが、これにもかかわらず、過剰な分離を誘導しない傾向がある。電圧を増加することにより、この技術においても分解の制御を行うことができる。この技術は、質量範囲が大きいこと、１価に荷電したイオンが多いこと、及び複数ペプチドを同時に分析する能力があることなどから、ペプチド質量フィンガープリントの決定に非常に好まれる。
【００５６】
光励起性マトリックスは「染料」、即ち、特別な周波数の光を強力に吸収する化合物であり、好ましくは、蛍光、又は、りん光によりそのエネルギーを放射せず、熱でエネルギーを消散する、即ち振動モードを介してエネルギーを消散するようなものである。レーザー励起により生じるマトリックスの振動が、染料の急速な昇華を招き、同時に埋め込まれた検体を気相中に取り込む。
【００５７】
質量分析器
飛行時間型質量分析器
名前が暗示する通り、飛行時間型質量分析器は、イオンが所定の電位差の影響下で所定の距離を移動する時間を計測する。飛行時間型測定により、検出器にぶつかるイオンの質量電荷比の算出が可能となる。これらの機器は、試料内のほぼ全てのイオンの出現を測定するので、結果として非常に高感度であるが、この技術で選択性を達成するのはより難しい。この技術は、また、イオントラップ、又は四重極質量分析計で一般的に測定できるイオンより高い質量電荷比を弱めるイオンを検出可能である。ＴＯＦ質量分析器は、現在はＭＡＬＤＩと共に広く使用される。
【００５８】
イオントラップ
イオントラップ分析計は、四重極質量分析計に関連するものである。一般にイオントラップは３個の電極からなる構造をしており、すなわち各端に「キャップ」電極があり、それらによって空洞が形成されている円筒状電極である。円筒状電極には正弦波高周波数電位を与え、キャップ電極にはＤＣ又はＡＣ電位でバイアスをかける。空洞に注入されたイオンは円筒状電極の振動電界によりトラップ内の安定な円形軌道に拘束される。しかし、与えられた振幅の振動電位に対して特定のイオンは不安定な軌道をとり、トラップから放出される。振動高周波電位を変化することによって、トラップに注入したイオン試料をそれらの質量電荷比に応じてトラップから連続的に放出させることができる。次に放出されたイオンを検出することによって質量スペクトルが生成される。
【００５９】
一般にイオントラップは、イオントラップの空洞に存在する少量の「浴ガス」、例えばヘリウムで操作される。これにより装置の解像度と感度の両方が増加する。その理由は、トラップに入ったイオンは本質的には浴ガスとの衝突を経て浴ガスの環境温度にまで冷却されるからである。衝突すると、試料をトラップに導入した時のイオン化が増加し、それと共にイオン軌道の振幅と速度は減衰し、イオン軌道はトラップの中央近傍に保持される。これは、振動電位を変更することにより軌道が不安定になったイオンは減衰している循環イオンに比べると急速にエネルギーを獲得し、緊密な束となってトラップから飛び出し、その結果、ピークが狭く大きくなることを意味する。
【００６０】
イオントラップは、タンデム質量分析計の構造を模倣することができ、実際に多重質量分析計の構造を模倣することにより、トラップイオンの複雑な分析が可能になっている。試料から単一質量種をトラップに保持できる、すなわちその他の種は全てトラップから放出させることができ、保持した種は、注意しながら第１振動周波の上に第２振動周波を重ね合わせることにより励起することができる。次に励起されたイオンは浴ガスと衝突し、十分に励起されると開裂する。次にその開裂を更に分析することができる。更なる分析のために他のイオンをトラップから排出することによって開裂イオンを保持し、その開裂イオンを励起して開裂させることができる。十分な試料が存在する限りこのプロセスを反復することにより、更なる分析が可能になる。留意すべきこととして、これらの機器は一般に誘導開裂後の開裂イオンを高い存在割合で保持する。これらの機器及びＦＴＩＣＲ質量分析計(後記)は、線形質量分析計に存在する空間的に解決されたタンデム質量分析装置というよりもむしろ一時的に解決されたタンデム質量分析装置の形態を代表するものである。
【００６１】
フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析装置（ＦＴＩＣＲ  ＭＳ）
ＦＴＩＣＲ質量分析装置には、イオン試料が空洞内に保持されるという点でイオントラップと類似の特徴があるが、ＦＴＩＣＲ  ＭＳではイオンは交差電磁界により高真空チャンバに捕捉される。電界は箱の二つの側面を形成する一対の平板電極によって形成される。この箱は電界を形成しかつ捕捉平板と呼ばれる二枚の平板に連結しており、捕捉平板の間にあってかつ印加磁界に直交する円形軌道に注入イオンを拘束する超伝導磁石の磁界に含まれる。箱の他の対向側面を形成する二枚の「送信板」に高周波パルスを印加するとイオンはより大きな軌道の中に励起される。イオンの円形運動によりそれに対応する電界が、「受信板」を含む箱の残りの二つの対向側面に発生する。励起パルスによりイオンはより大きな軌道に励起されるが、衝突を経てイオンの凝集運動が失われるに従いこの軌道は崩壊する。受信板が検出した対応シグナルはフーリエ変換（ＦＴ）解析により質量スペクトルに変換される。
【００６２】
誘起開裂実験のために、これらの機器は、イオントラップと類似の方法、すなわち重要な単一種を除く全てのイオンがトラップから排出可能となるという方法で行うことができる。衝突ガスをトラップに導入して開裂を誘起することができる。その後に開裂イオンを分析することができる。一般に切断産物と浴ガスとが結合すると、「受信板」が検出したシグナルのＦＴ分析によって分析する場合に解像性が貧しくなる。しかし、開裂イオンを空洞から放出させ、例えば四重極を備えるタンデム構成で分析することができる。
【００６３】
衝突誘導解離によるペプチド同定
本発明の第２の態様において、ＢＭＴ標識ポリペプチド切断により産生されたタグペプチドは、質量分析装置で分析される。この分析は、質量分析装置によるペプチドの同定を含む。様々な質量分析器の構成が考えられる。例えば、イオントラップ、三連四重極、四重極／飛行時間型、飛行時間型／飛行時間型及び連続セクター方式装置等がペプチドの切断及び、断片の質量決定のために使用される。
【００６４】
ペプチドのＭＳ／ＭＳ及びＭＳｎ分析
タンデム質量分析計によって、質量対電荷の比を予め定められたイオンが衝突誘導解離（ＣＩＤ）によって選択され開裂される。次に開裂を検出することにより、選択されたイオンに関する構造情報が得られる。タンデム質量分析計でＣＩＤによりペプチドを分析すると、特徴的な開裂パターンが観察され、このパターンによってペプチドの配列を決定することができる。一般に天然ペプチドはペプチド骨格のアミド結合の位置で無作為に開裂され、そのペプチドに特徴的なイオンシリーズが得られる。イオンの電荷がイオンのＮ末端断片に保持される場合には、ｎ番目のペプチド結合での開裂に対するＣＩＤ断片シリーズはａｎ、ｂｎ、ｃｎ等と表示される。同様に、電荷がイオンのＣ末端断片に保持される場合には断片シリーズはｘｎ、ｙｎ、ｚｎ等と表示される。
【００６５】
【化４】
0004744433.tif 000004
【００６６】
トリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ及びトロンビンは、タンデム質量分析計にとって好ましい開裂剤である。なぜならば、これらは分子の両末端に塩基性基、すなわちＮ末端にα−アミノ基、Ｃ末端にリジン又はアルギニン側鎖を有するペプチドを産生するからである。これは二重荷電イオンの形成に有利であり、このイオンでは荷電中心が分子の両端にある。ＣＩＤを行うと、これらの二重荷電イオンからＣ末端イオンシリーズ及びＮ末端イオンシリーズが産生される。これを手がかりにしてペプチドの配列を決定する。一般的に言うと、所定のペプチドのＣＩＤスペクトルでは１個のみ、又は２個の可能なイオンシリーズが観察される。四重極装置に特徴的な低エネルギー衝突ではＮ末端断片のｂシリーズ、又はＣ末端断片のｙシリーズが優勢である。二重荷電イオンを分析する場合には両方のシリーズがしばしば検出される。一般に、ｙシリーズイオンはｂシリーズより優勢である。
【００６７】
一般に、ペプチドは、アミド主鎖のプロトン化とそれに続く分子内求核攻撃からの５員オキサゾロン構造の形成とプロトン化アミド結合の開裂に関するメカニズムによって切断する（Ｐｏｌｃｅ,  Ｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０００；  Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｈｍａｎｎ  ２０００）。このメカニズムは、求核攻撃を実施するには、プロトン化アミドのＮ末端側のプロトン化アミドに隣接するアミド結合からのカルボニル基を必要とする。荷電オキサゾロニウムイオンはｂシリーズイオンを生じるが、Ｎ末端断片からＣ末端断片へのプロトン転移は、ｙシリーズイオンを生じる。カルボニル基が適切に位置するためのこの必要条件は、Ｎ末端が保護されず、一般に、あるペプチド中のＮ末端と第２アミノ酸の間のアミドに対してｂシリーズイオンが認められない場合、Ｎ末端アミノ酸に隣接するアミド結合での開裂の原因とはならない。しかし、アセチル化Ｎ末端を有するペプチドは、このメカニズムの構造的必要条件を満たさず、このメカニズムによる第１アミノ酸直後のアミド結合で開裂が起こる可能性がある。本発明の活性エステルタグでリジン、又はα−アミノ基に標識したペプチドは、もし、タグ分子中に適切に位置するカルボニル基がなければ、低エネルギーＣＩＤ分析の間に、タグペプチドで有意な切断は見られないはずである。これは、スペクトルの数に応じて、タグの質量が変化するものの、標識ペプチドのＣＩＤスペクトルは未標識ペプチドのスペクトルときわめて類似するに違いないことを意味する。質量の変化については、ＣＩＤスペクトル等の分析において容易に補正できる。
【００６８】
同様に、ペプチドは、ポストソースディケイ（ＰＳＤ）と称されるプロセスにより飛行時間型(ＴＯＦ)質量分析装置単独で同定可能である（Ｋａｕｆｍａｎｎ，  Ｃｈａｕｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．  １９９６)。これは、特に遅延引き出しイオン光学を備えるＴＯＦ質量分析器において効果的である。ＭＡＬＤＩは、検体分子に対して高水準の運動エネルギーを付与する傾向があり、親ペプチドイオンの配列を推定するために使用できるイオン開裂の原因になり得る。
【００６９】
下記実施例は本発明のいくつかの特徴及び可能な実施形態を明らかにするが、他の実施形態も想定される。
【実施例】
【００７０】
実施例１
基本質量タグの合成
全ての試薬はアルドリッチ(シグマアルドリッチ（株）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）、Ｅｓｃｈｅｎｓｔｒａｓｓｅ５、８２０２４、タウフキルへェン、ドイツ)から得た。
基本質量タグは、標準の方法によりそれぞれの化合物のカルボン酸型のものを活性化し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとすることにより合成した。試薬であるＮ，Ｎ−ジメチルグリシン、Ｎ，Ｎ−３−アミノ酪酸は市販されている。
ＤＩＧ、ＰＡＡ、ＭＡＡ及びＤＭＡは、ジイソプロピルアミン、ピペリジン、モルホリン及びジメチルピペリジンをそれぞれブロモ酢酸エステルで反応させ、対応する酢酸エステル誘導体類を作り、次いで、遊離カルボン酸を活性化させるために脱保護した。詳細なプロトコルを下記に記載する。
【００７１】
ジイソプロピルアミノ酢酸ｔ−ブチルエステル  ２
【００７２】
【化５】
0004744433.tif 000005
【００７３】
ブロモ酢酸ｔ−ブチルエステル５．８５ｇ（３０ｍＭｏｌ）及びジイソプロピルアミン９．９ｍｌ(７０ｍＭｏｌ)をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）５０ｍｌ溶媒を用いた還流下で５〜７時間攪拌した。溶媒を取り除き、生成物を水に溶解し、溶液のｐＨを２規定水酸化ナトリウム（２Ｎ  ＮａＯＨ）を用いてｐＨ１１に調整した。不均一の反応混合物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で抽出し、水で洗浄し乾燥した（硫酸ナトリウム）。溶媒蒸発後の残留物をジクロロメタン／メタノール(１０／１  ｖ／ｖ（容量）)でシリカゲルカラムから溶出した。
収量：５．４ｇ(８４％)
ＲＦ＝０．５４(ジクロロメタン／メタノール（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ）＝５：１)
１Ｈ−ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ０．９８(ｄ、１２Ｈ、ｉＰｒｏｐ−ＣＨ３)、１．４２(ｓ、９Ｈ、ｔｅｒｔ−Ｂｕ)；３．０４(ｍ、２Ｈ、ｉＰｒｏｐ−ＣＨ)；３．０７(ｓ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２)
【００７４】
ジイソプロピルアミノ酢酸塩酸塩  ３
【００７５】
【化６】
0004744433.tif 000006
【００７６】
ジイソプロピルアミノ酢酸ｔ−ブチルエステル２  ５．４ｇ(２５ｍＭｏｌ)を１２Ｍ塩化水素（ＨＣｌ）６．２５ｍｌ(７５ｍＭｏｌ)と共に、水２５ｍｌ中で６０℃で２．５時間攪拌した。真空中で水、及び過剰の塩化水素を蒸留した後、残留物をトルエンで共沸乾燥した。
収量：４．１ｇ(８４％)
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１．２４（ｄ、１２Ｈ、ｉＰｒｏｐ−ＣＨ３）、３．６６（ｍ、２Ｈ、ｉＰｒｏｐ−ＣＨ）；４．０８（ｓ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２）；８．６（ｂｒ．ｓ、２Ｈ、Ｎ＋Ｈ、ＯＨ）
【００７７】
ジイソプロピルアミノ酢酸（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）エステル  ４
【００７８】
【化７】
0004744433.tif 000007
【００７９】
ジイソプロピルアミノ酢酸塩酸塩（３）３．８２ｇ（１９．５ｍＭｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５０ｍｌ溶媒を用いて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２．２４ｇ（１９．５ｍＭｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド８．０４ｇ（３９ｍＭｏｌ）に加えた。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。残留物をろ過し、ろ液を真空で蒸発し乾燥した。残留物をジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）に溶解後、溶液を炭酸水素ナトリム（ＮａＨＣＯ３）で洗浄し乾燥して（硫酸ナトリウム）、溶媒は蒸発した。そして、化合物をジイソプロピルエーテルから再結晶した。
収量：３．５ｇ（７０％）
融点９６℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．０４（ｄ、１２Ｈ、ｉＰｒｏｐ−ＣＨ３）、２．８１（ｓ、４Ｈ、Ｏ−Ｓｕ）；３．１１（ｍ、２Ｈ、ｉＰｒｏｐ−ＣＨ）；３．５９（ｓ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２）
【００８０】
(２，６−ジメチルピペリジン−１−イル)酢酸ｔ−ブチルエステル  ５
【００８１】
【化８】
0004744433.tif 000008
【００８２】
ブロモ酢酸ｔ−ブチルエステル１  １４．８ｍｌ(１００ｍＭｏｌ)及び２，６−ジメチルピペリジン２９．９ｍｌ(２３０ｍＭｏｌ)をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１５０ｍｌ溶媒を用いた還流下で５時間攪拌した。溶媒を取り除いた後、生成物を水に溶解し、溶液のｐＨを２規定水酸化ナトリウム（２Ｎ  ＮａＯＨ）を用いてｐＨ１１に変えた。不均一の反応混合物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で抽出し、水で洗浄し乾燥した（硫酸ナトリウム）。溶媒蒸発後の残留物を、ジイソプロピルエーテルでシリカゲルカラムから溶出した。
収量：２１．６ｇ(９５％)
ＲＦ＝０．５８(ジイソプロピルエーテル)
１Ｈ−ＮＭＲ(ＣＤＣｌ３)δ１．０９(ｄ、６Ｈ、２ｘ  Ｎ−Ｃ−ＣＨ３)、１．１６〜１．６７(ｍ、６Ｈ、Ｐｉｐ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２)；１．４３(ｓ、９Ｈ、ｔｅｒｔ−Ｂｕ)；２．８１(ｍ、２Ｈ、２ｘ  Ｎ−ＣＨ)；３，４５(ｓ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２)
【００８３】
(２，６−ジメチルピペリジン−１−イル)酢酸塩酸塩  ６
【００８４】
【化９】
0004744433.tif 000009
【００８５】
（２，６−ジメチルピペリジン−１−イル）酢酸ｔ−ブチルエステル（５）２１．６ｇ（９５ｍＭｏｌ）を１２Ｍ塩化水素（ＨＣｌ）２３．７５ｍｌ（２８５ｍＭｏｌ）を用いて、水１００ｍｌ中で６０℃で２時間攪拌した。真空中で水、及び過剰な塩化水素を蒸留した後、残留物をトルエンで共沸乾燥した。
収量：１９．５ｇ（＞９８％）
ＲＦ＝０．１８（ジクロロメタン／メタノール（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ）＝５：１）
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１．１〜１．３８（ｍ、６Ｈ）；１．４〜１．９（ｍ、６Ｈ）；３．３５〜３．６５（ｍ、２Ｈ）；４．０５（ｓ、２Ｈ）；９．０５（ｂｒ．ｓ、１Ｈ）；１０．８５（ｓ、１Ｈ）
【００８６】
（２，６−ジメチルピペリジン−１−イル）酢酸（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）エステル  ７
【００８７】
【化１０】
0004744433.tif 000010
【００８８】
（２，６−ジメチルピペリジン−１−イル）酢酸塩酸塩（６）４．１５ｇ（２０ｍＭｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）５０ｍｌ溶媒中で、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２．３ｇ（２０ｍＭｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド８．１ｇ（４０ｍＭｏｌ）に加えた。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。残留物をろ過し、ろ液を真空で蒸発し乾燥した。残留物をジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）に溶解し、溶液は炭酸水素ナトリム（ＮａＨＣＯ３）で洗浄し乾燥して（硫酸ナトリウム）、溶媒は蒸発した。そして、化合物がジイソプロピルエーテルから再結晶した(活性炭（Ａ−Ｋｏｈｌｅ）)。
収量：３．７ｇ(６９％)
融点７２℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．１４（ｄ、６Ｈ、２ｘ  Ｎ−Ｃ−ＣＨ３）、１．１８〜１．７（ｍ、６Ｈ、Ｐｉｐ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２）；２．７５〜２.８５（ｍ、２Ｈ、２ｘ  Ｎ−ＣＨ）；２．８２（ｓ、４Ｈ、Ｏ−Ｓｕ）；３．９（ｓ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２）
【００８９】
（ピペリジン−１−イル）酢酸ベンジルエステル  ９
【００９０】
【化１１】
0004744433.tif 000011
【００９１】
ブロモ酢酸ベンジルエステル８  １１．４５ｇ（５０ｍＭｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１００ｍｌ溶媒中でピペリジン９．３６ｇ（１１０ｍＭｏｌ）に注意深く加えた。反応混合物を還流下で４時間攪拌した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の蒸留後、残留物をジクロロメタン水溶液（ＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ）に溶解し、溶液のｐＨを２規定水酸化ナトリウム（２Ｎ  ＮａＯＨ）を用いてｐＨ１０．５に調整した。そして、生成物をジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）に抽出し、硫酸ナトリウムにて乾燥した。溶媒の蒸発後、生成物を酢酸エチルを使用してクロマトグラフィー精製した。
収量：１０．４ｇ(８９％)
ＲＦ＝０．６７（酢酸エチル(ＥｔＯＡｃ))
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）：＞９７％[ＥＴ  ２５０／８／４  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  ７μｍ  フェニル  Ｍａｃｈｅｒｙ  ＆  Ｎａｇｅｌ  ＃７２００１９；アセトニトリル:(Ｈ２Ｏ＋０．０１Ｍ  ＴＢＡＳ)＝９５：５；流速  １ｍｌ／Ｍｉｎ.；５．３分]
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．４２（ｍ、２Ｈ、Ｃ−Ｃ−ＣＨ２−Ｃ−Ｃ）、１．５７〜１．６２（ｍ、４Ｈ、Ｃ−ＣＨ２−Ｃ−ＣＨ２−Ｃ）；２．４９（ｔ，４Ｈ，ＣＨ２−Ｎ−ＣＨ２）；３．２１（ｓ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２−ＣＯ）；５．１４（ｓ、２Ｈ、Ｏ−ＣＨ２）；７．２８〜７．３３（ｍ、５Ｈ、Ｐｈ）
【００９２】
（ピペリジン−ｌ−イル）酢酸  １０
【００９３】
【化１２】
0004744433.tif 000012
【００９４】
（ピペリジン−１−イル）酢酸ベンジルエステル９  １０．４ｇ（４４ｍＭｏｌ）をパラジウムカーボン触媒（Ｐｄ／Ｃ）（５％）０．２５ｇと共にメタノール１００ｍｌ中で室温で攪拌した。標準圧力下で反応混合物を水素（Ｈ２）で還元（水和）した。触媒を取り除いた後、溶媒を蒸発し、残留物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で再懸濁し、ろ過した。
収量：６ｇ（９５％）
融点２３１℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１．４５（ｍ、２Ｈ、Ｃ−Ｃ−ＣＨ２−Ｃ−Ｃ）；１．６２〜１．６７（ｍ、４Ｈ、Ｃ−ＣＨ２−Ｃ−ＣＨ２−Ｃ）；２．８９（ｔ、４Ｈ、ＣＨ２−Ｎ−ＣＨ２）；３．１９（ｓ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２−ＣＯ）；４〜６（１Ｈ、ＯＨ）
【００９５】
（ピペリジン−１−イル）酢酸（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）エステル  １１
【００９６】
【化１３】
0004744433.tif 000013
【００９７】
（ピペリジン−１−イル）酢酸１０  ６ｇ（４２ｍＭｏｌ）をジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）１００ｍｌ中でＮ−ヒドロキシスクシンイミド４．８３ｇ（４２ｍＭｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド９．５３ｇ（４６．２ｍＭｏｌ）に加えた。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。残留物をろ過し、ろ液を真空で蒸発し乾燥した。そして、残留物をジエチルエーテルに溶解し、溶液をろ過した。ろ液を再度還元し、残留物をジイソプロピルエーテルに溶解した。溶液のろ過、及び溶媒の蒸発後、化合物がジイソプロピルエーテルから再結晶した。
収量：７．１ｇ（７０％）
融点８２℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．４５（ｍ、２Ｈ、Ｃ−Ｃ−ＣＨ２−Ｃ−Ｃ）；１．５８（ｍ、４Ｈ，Ｃ−ＣＨ２−Ｃ−ＣＨ２−Ｃ）；２．６（ｔ、４Ｈ、ＣＨ２−Ｎ−ＣＨ２）；２．８４（ｓ、４Ｈ、ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ）；３．５４（ｓ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２−ＣＯ）
【００９８】
（モルホリン−１−イル）酢酸ベンジルエステル  １２
【００９９】
【化１４】
0004744433.tif 000014
【０１００】
ブロモ酢酸ベンジルエステル８  １１．４５ｇ（５０ｍＭｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１００ｍｌ溶媒中でモルホリン９．５８ｇ（１１０ｍＭｏｌ）に注意深く加えた。反応混合物を還流下で４時間攪拌した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の蒸留後、残留物をジクロロメタン水溶液（ＣＨ２Ｃｌ２／Ｈ２Ｏ）に溶解し、溶液のｐＨを２規定水酸化ナトリウム（２Ｎ  ＮａＯＨ）を用いてｐＨ１０．５に調整した。そして、生成物をジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）に抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒の蒸発後、生成物を酢酸エチルを使用してクロマトグラフィー精製した。
収量：１１ｇ（９３．５％）
ＲＦ＝０．６３（酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ））
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）：＞９７％[ＥＴ  ２５０／８／４  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  ７μｍ  フェニル  Ｍａｃｈｅｒｙ  ＆  Ｎａｇｅｌ  ＃７２００１９；アセトニトリル:(Ｈ２Ｏ＋０．０１Ｍ  ＴＢＡＳ)＝９５：５;流速１ｍｌ／Ｍｉｎ.；４．０分]
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．５６（ｔ、４Ｈ、ＣＨ２−Ｎ−ＣＨ２）、３．２３（ｓ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２−ＣＯ）；３．７２（ｔ，４Ｈ，ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）；５．１４（ｓ、２Ｈ、Ｏ−ＣＨ２）；７．２８〜７．３３（ｍ、５Ｈ、Ｐｈ）
【０１０１】
（モルホリン−１−イル）酢酸  １３
【０１０２】
【化１５】
0004744433.tif 000015
【０１０３】
（モルホリン−１−イル）酢酸ベンジルエステル１２  １１ｇ（４６ｍＭｏｌ）をパラジウムカーボン触媒（Ｐｄ／Ｃ）（５％）０．２５ｇとともにメタノール１００ｍｌ中で室温で攪拌した。標準圧力下で、反応混合物を水素（Ｈ２）で還元した。触媒を取り除いた後、溶媒を蒸発し、残留物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で再懸濁し、ろ過した。
収量：６．３ｇ（９５％）
融点１６６℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ２．５７（ｔ、４Ｈ、ＣＨ２−Ｎ−ＣＨ２）；３．１４（ｓ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２−ＣＯ）；３．５８（ｔ、４Ｈ、ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）；３．１９）；９−１２（１Ｈ、ＯＨ）
【０１０４】
（モルホリン−１−イル）酢酸（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）エステル  １４
【０１０５】
【化１６】
0004744433.tif 000016
【０１０６】
（モルホリン−１−イル）酢酸１３  ６．３ｇ（４４ｍＭｏｌ）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド５．０６ｇ（４４ｍＭｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド９．９８ｇ（４８．４ｍＭｏｌ）にジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）１００ｍｌ中で加える。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。残留物はろ過され、ろ液を真空で蒸発し乾燥した。残留物をジエチルエーテルに溶解し、溶液をろ過した。ろ液を再度濃縮し、残留物をジイソプロピルエーテルに溶解した。溶液のろ過、及び溶媒の蒸発後、化合物がジイソプロピルエーテルから再結晶した。
収量：８．１ｇ（７６％）
融点  １４２℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．６２（ｔ、４Ｈ、ＣＨ２−Ｎ−ＣＨ２）；２．８（ｓ、４Ｈ、ＣＯ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ）；３．５２（ｓ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２−ＣＯ）；３．６９（ｔ、４Ｈ、ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２）
【０１０７】
ジメチルアミノ酢酸（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）エステル  １６
【０１０８】
【化１７】
0004744433.tif 000017
【０１０９】
ジメチルアミノ酢酸１５  ５．１５ｇ（５０ｍＭｏｌ）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド５．７５ｇ（５０ｍＭｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド１１．０５ｇ（５５ｍＭｏｌ）にジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）１００ｍｌ中で０℃で加えた。反応混合物を室温で２０時間攪拌した。残留物をろ過し、ろ液を真空で蒸発し乾燥した。残留物をジエチルエーテルに溶解し、活性炭（Ａ−Ｋｏｈｌｅ）と混合した。溶液をろ過し、蒸発した。得られた油を少量のジエチルエーテルに溶解し、生成物の結晶を得た。冷却した結晶溶液をろ過した。結晶を再度ジエチルエーテルに溶解し、活性炭（Ａ−Ｋｏｈｌｅ）で処理し、溶液をろ過した。これらの精製工程を１Ｈ−ＮＭＲに純粋な生成物を得るまで数回繰り返した。
収量：０．５〜１ｇ（５〜１０％）
融点:６７℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ２．４２（ｓ、６Ｈ、２ｘ  ＣＨ３）；２．８２（ｓ、４Ｈ，Ｏ−Ｓｕ）；３．５２（ｓ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２）
【０１１０】
４−ジメチルアミノ酪酸ベンジルエステル  １９
【０１１１】
【化１８】
0004744433.tif 000018
【０１１２】
４−ジメチルアミノ酪酸塩酸塩１８  ２５ｇ（１５０ｍＭｏｌ）、ベンジルアルコール２７．４ｇ（２５４ｍＭｏｌ）及び４−トルエンスルホン酸一水和物２９．５ｇ（１５５ｍＭｏｌ）をトルエン２００ｍｌを用いた還流下で攪拌し、約２時間かけて水分離器で水を取り除いた。反応混合物を冷却後、トルエン相を水で４回抽出した。そして、水相を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で３回抽出し、溶液のｐＨを水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いてｐＨ９．５に調整した。生成物をエチルアセテートを用いて抽出した。有機層を飽和塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）溶液で洗浄し、乾燥し、蒸発して純粋なベンジルエステルを得た。
収量：３０．４ｇ（９２％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１．８（ｍ、２Ｈ、Ｎ−Ｃ−ＣＨ２）、２．１７（ｓ、６Ｈ、２ｘ  ＣＨ３）；２．２６（ｔ、２Ｈ、ＣＨ２−ＣＯ）；２．３８（ｔ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２）；５．１１（ｓ、２Ｈ、Ｏ−ＣＨ２）；７．２８〜７．３７(ｍ、５Ｈ、Ｐｈ)
【０１１３】
４−ジメチルアミノ酪酸  ２０
【０１１４】
【化１９】
0004744433.tif 000019
【０１１５】
４−ジメチルアミノ酪酸ベンジルエステル１９  ８５ｇ（３８０ｍＭｏｌ）をパラジウムカーボン触媒（Ｐｄ／Ｃ）(５％)１ｇを用いてメタノール５００ｍｌ中で攪拌した。反応混合物を水素で４時間処理した。触媒を取り除いた後、メタノールを蒸留した。少量のエチルアセテートを残留物に加えると生成物が結晶化した。そして、生成物をろ過し、エチルアセテートで洗浄した。
収量：４２．５ｇ（８５％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１．６３（ｍ、２Ｈ、Ｎ−Ｃ−ＣＨ２）；２．２２（ｓ、６Ｈ、２ｘ  ＣＨ３）；２．２１（ｔ、２Ｈ、ＣＨ２ＣＯ）；２．３７（ｔ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２）；５．８（ｂｒ.ｓ、１Ｈ、ＯＨ）
【０１１６】
３−ジメチルアミノ酪酸−(２，５−ジオキソピロリジン−１−イル)エステルハイドロゲントシレート（ｈｙｄｒｏｇｅｎｔｏｓｙｌａｔｅ）  ２２
【０１１７】
【化２０】
0004744433.tif 000020
【０１１８】
３−ジメチルアミノ酪酸２０  ６．５５ｇ（５０ｍＭｏｌ）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド５．７５ｇ（５０ｍＭｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド１１．０５ｇ（５５ｍＭｏｌ)にジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）１００ｍｌ中で加えた。反応混合物を室温で１６時間攪拌した。得られた尿素をろ過し、溶液を蒸発した。アセトニトリル１０ｍｌに溶解した残留物を攪拌しながら４−トルエンスルホン酸一水和物９．５１ｇ（５０ｍＭｏｌ）の溶液にアセトニトリル溶液（３０ｍｌ）中で加えた。溶媒が真空下で蒸発し、生成物がアセトニトリル又はアセトンから再結晶した。
収量：１３．８ｇ（６９％）
融点１３３℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１．９７（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２−ＣＯ）；２．２９（ｓ、３Ｈ、Ｈ３Ｃ−Ｐｈ）；２．７６〜２．８２（“ｍ”、１２Ｈ、２ｘ  ＣＨ３、Ｏ−Ｓｕ、Ｃ−ＣＨ２−Ｃ)；３．１２（ｍ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２）；７．１３及び７．５０（ｍ、ｍ、４Ｈ、Ｐｈ）；９．３８（“ｓ”、１Ｈ、Ｎ＋Ｈ）
【０１１９】
３−ジメチルアミノ酪酸−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）エステルハイドロゲントシレート（ｈｙｄｒｏｇｅｎｔｏｓｙｌａｔｅ）  ２２
【０１２０】
【化２１】
0004744433.tif 000021
【０１２１】
３−ジメチルアミノ酪酸２０  ２．６２ｇ（２０ｍＭｏｌ）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド２．３ｇ（２０ｍＭｏｌ）及びｐ−トルエンスルホン酸一水和物３．８ｇ（２０ｍＭｏｌ）及びジシクロへキシルカルボジイミド８．２５ｇ（４０ｍＭｏｌ）にアセトニトリル１００ｍｌ中で加えた。反応混合物を室温で１６時間攪拌した後、得られた尿素化合物を取り除き、ろ液を蒸発した。残留物をアセトンから再結晶した。
収量：７ｇ（８６％）
融点１３３℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１．９７（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２−ＣＯ）；２．２９（ｓ、３Ｈ、Ｈ３Ｃ−Ｐｈ）；２．７６〜２．８２（“ｍ”、１２Ｈ、２ｘ  ＣＨ３、Ｏ−Ｓｕ、Ｃ−ＣＨ２−Ｃ)；３．１２（ｍ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２）；７．１３及び７．５０（ｍ、ｍ、４Ｈ、Ｐｈ）；９．３８（“ｓ”、１Ｈ、Ｎ＋Ｈ）
【０１２２】
実施例２
基本質量タグのβ−ＭＳＨへの結合
β−メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）  ３０ｎｍｏｌをＢＵＴ（ＢＵＴ:ホウ酸塩尿素チオ尿素（Ｂｏｒａｔｅ  Ｕｒｅａ  Ｔｈｉｏｕｒｅａ）バッファー）３０ｍＭに溶解した。ｐＨは７．５であった。そして、基本質量タグ（ＢＭＴ）３０ｍＭをペプチド溶液に加えた。２時間攪拌後、同量の基本質量タグ（ＢＭＴ）を再度加え、２時間攪拌した。そして、反応混合物をＳＣＸカートリッジで精製し、過剰な基本質量タグ（ＢＭＴ）を取り除き及びペプチド混合物をＬＣ−ＭＳ(ＬＣＱ)で分析した。
【０１２３】
実施例３
試験タンパク質の基本質量タグによる標識
一般的に生物学試料に適用しうるプロトコルを使用した。市販のタンパク質であるウサギピルビン酸キナーゼ５００μｇをまずトリプシンで消化した。すなわち、トリプシン３０μｇ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｇｒａｄｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔｒｙｐｓｉｎ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を加え、ｐＨを７．８に調整し、溶液を３７℃で２４時間反応させた。そして、ポリペプチドをＢＵＴバッファーに溶解し（最終濃度：３０ｍＭホウ酸、１．５Ｍ尿素、０．７Ｍチオ尿素）及びトリス２−カロボキシエチルホスフィン（Ｔｒｉｓ［２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ］ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ、ＴＣＥＰ）（１ｍＭ）を用いて室温、ｐＨ  ７．５にて、１時間還元した。ヨードアセトアミド（５ｍＭ）で還元したチオール基を標識した後、ジメチルグリシン（ＤＭＧ）  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル溶液（最終濃度３０ｍＭ）を反応混合物に加え、室温で４時間攪拌した。同量のタグを再び加え、反応混合物を少なくとも更に４時間攪拌した。過剰の標識試薬、グアニジン塩酸、及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を取り除き、ＭＳ分析用の試料を調製するために、標識ポリペプチド試料を抽出カートリッジで精製した（ＨＬＢ  Ｏａｓｉｓ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、ミルフォード、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）。
【０１２４】
実施例４
ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ分析
分析は、Ｆｉｎｎｉｇａｎ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＨＰＬＣシステムを用いたＦｉｎｎｉｇａｎ  ＬＣＱ  ＤＥＣＡを使用して液体クロマトグラフィー質量分析装置で行われた。（カラム：Ｔｈｅｒｍｏ−Ｈｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  ＢｉｏＢａｓｉｃ、１００×１ｍｍ、５μｍ  ＨｙＰＵＲＩＴＹ（Ｒ）Ｅｌｉｔｅ  Ｃ１８  ；溶媒：メタノール１００％から水１００％、どちらも蟻酸０．２％を含む)。
ペプチド同定は、ＣＩＤにより行った（ペプチドイオン衝突を起こし、イオンは「ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ」とそれに続く、ＳＥＱＵＥＳＴによるＭＳ／ＭＳスペクトルの自動解釈により選択した（Ｙａｔｅｓ，  Ｊ．Ｒ．，  ３ｒｄ；Ｅｎｇ，  Ｊ．Ｋ．；ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，Ａ．Ｌ．,  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．６７（１８）  ｐｐ．３２０２−３２１０，  “Ｍｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｅｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｎｇ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｄ  ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ”，  １９９５；  ＭａｃＣｏｓｓ，  Ｍ．Ｊ．;Ｗｕ，Ｃ．Ｃ．；Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．３rd，  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  ７４  （２１)  ｐｐ．５５９３−５５９９、“Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＳＥＱＵＥＳＴ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ”,  ２００２）。
【０１２５】
実施例５
ＤＭＧで標識したペプチドにおける小さく予測可能な移動度シフトの実証
記載の通りに調整されたジメチルグリシン（ＤＭＧ）のＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステルで標識したウサギピルベートキナーゼのトリプシン消化産物由来のペプチドを、ＳｅｑｕｅｓｔとＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて解析し、ペプチドの同定を行った。なお、平行して、未標識ウサギピルベートキナーゼからのトリプシン消化産物も同時分析した。両方の分析で同定された標識及び未標識ペプチドのそれぞれの保持時間を記録し、対応する保持時間を図２に示した。
【０１２６】
線形回帰分析を、このデータについて行った。回帰曲線についてパラメーターを推定した結果、未標識ペプチドの保持時間と比較してペプチドに対する単独タグの保持時間に１．６７分の遅れがあると想定した時に、最小二乗誤差が最低であることが分かった。図２の実線は、保持時間が標識及び未標識ペプチドに対して同じである地点を記録し、一方で、破線は回帰線を記録する。この回帰のＲ２値は、０．９７であり、標識ペプチドのみに対するＤＭＧタグの効果の正確なモデルであることを示した。
【０１２７】
実施例６
安定な同位体ＤＭＧ  １３Ｃ４,１５Ｎ：ジメチルアミノ酢酸[１３Ｃ４,１５Ｎ]−（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）エステルの合成
原料である  ジメチル１３Ｃ４アミン１５Ｎ塩酸塩（１）及びブロモ酢酸１３Ｃ２（２）をＣａｍｐｒｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃａｍｐｒｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ)より得た。
ブロモ酢酸[１３Ｃ２]ベンジルエステル  ３の合成
【０１２８】
【化２２】
0004744433.tif 000022
【０１２９】
ブロモ酢酸[１３Ｃ２]  １．９３g（１３．８９ｍＭｏｌ）をベンジルアルコール１.５４ｍｌ（１４．８８ｍＭｏｌ）及びジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）０．２ｇ（１．６ｍＭｏｌ）とジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）５０ｍｌ中で混合した。ジシクロヘキシルカルボジイミド３．０７ｇ(１４．８８ｍＭｏｌ)を０℃で溶液に加えた後、反応混合物を室温で２０時間攪拌した。混合物をろ過し、残留物をジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）で洗浄した。飽和炭酸水素ナトリム（ＮａＨＣＯ３）溶液３０ｍｌをろ液に加えた。溶液を５分間よく振った後、有機層が分離し、水相をジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）で抽出した。合わせた有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥し、溶媒を蒸発させた。生成物（３）をジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）を使用してクロマトグラフィーにより精製した。
収量：２.９７ｇ（９３．２％）
ＲＦ＝０.８５（ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２））
【０１３０】
ジメチルアミノ酢酸[１３Ｃ４，ｌ５Ｎ]ベンジルエステル  ４
【０１３１】
【化２３】
0004744433.tif 000023
【０１３２】
トルエンを用いて２．５Ｍブチルリチウム（ＢｕＬｉ）５．２８ｍｌ（１３．２ｍＭｏｌ）を−５０℃でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）４０ｍｌ中に溶解したジメチルアミン[１３Ｃ２，ｌ５Ｎ]塩酸塩（１）１．０５ｇ（１２．８８ｍＭｏｌ）に滴状で加えた。反応混合物を、反応温度が−１０℃に達するまで攪拌して溶液を得た。溶液は、−５０℃に再度冷却され、ジイソプロピルエチルアミン２．２６ｍｌ（１３．２ｍＭｏｌ）で混合したブロモ酢酸[１３Ｃ２]ベンジルエステル（３）２．９７ｇ（１３ｍＭｏｌ）を混合物にテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１５ｍｌ中で３０分以内に液状で加えた。そして、反応混合物を冷却浴で４時間放置してから室温で２０時間攪拌した。減圧下で溶媒の蒸発後、残留物を約４０ｍｌの炭酸水素ナトリム（ＮａＨＣＯ３）溶媒に溶解した。反応混合物は、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で何度か抽出され、有機相を硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒の蒸発後、残留物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）を使用してクロマトグラフィーにより精製した。
収量：１.２７ｇ（５０％）
ＲＦ＝０.３（酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ））
【０１３３】
ジメチルアミノ酢酸[１３Ｃ４，ｌ５Ｎ]  ５
【０１３４】
【化２４】
0004744433.tif 000024
【０１３５】
ジメチルアミノ酢酸[１３Ｃ４，ｌ５Ｎ]ベンジルエステル４  １．２７ｇ（６．４ｍＭｏｌ）をパラジウムカーボン触媒（Ｐｄ／Ｃ）（５％）２５０ｍｇと共にメタノール１００ｍｌ中で室温で攪拌した。標準圧力下で、反応混合物を水素（Ｈ２）で３０分間水和した。触媒をろ過で取り除いた後、溶媒を蒸発して白い化合物を得た。
収量：０．６２ｇ(９４％)
【０１３６】
ジメチルアミノ酢酸[１３Ｃ４，ｌ５Ｎ]−(２，５−ジオキソピロリジン−１−イル)エステル  ６
【０１３７】
【化２５】
0004744433.tif 000025
【０１３８】
ジメチルアミノ酢酸５  ０．６５g（６．４ｍＭｏｌ）をジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）２５ｍｌ中でＮ−ヒドロキシスクシンイミド０．７４ｇ（６．４ｍＭｏｌ）及びジシクロヘキシルカルボジイミド１．３８ｇ（６．７ｍＭｏｌ）に加えた。反応混合物を室温で２０時間攪拌した。混合物をジイソプロピルエーテル７０ｍｌで希釈し、１時間攪拌し、ろ過した。そして残留物をジイソプロピルエーテル２５ｍｌで洗浄し、ろ液を真空で蒸発し乾燥した。そして、残留物をジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）約１０ｍｌに溶解し、溶液を−５℃でジイソプロピルエーテル２３０ｍｌに攪拌しながら加えた。−５℃で１時間攪拌後、溶液をろ過し、減圧下で蒸発した。残留物をジイソプロピルエーテル約５０ｍｌから再結晶化した。
収量：０．７１ｇ(５４％)
融点:６３℃
【０１３９】
実施例７
基本質量タグを用いた試験タンパク質の定量分析のプロトコル
シアン基の事前切断工程
一般的に生物学試料に適用可能なプロトコルを使用した。市販のタンパク質ウシアルブミン（Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｂｏｖｉｎｅ）（シグマ）１ｍｇを９０％ギ酸溶液１ｍｌに溶解した。ブロモシアン１ｍｇ（ＣＮＢｒ、５Ｍ  アセトニトリル溶液）を溶液に加えた。反応混合物を２０時間暗所で振った後、溶液を１０ｍｌに希釈し、冷凍し、凍結乾燥した。
【０１４０】
還元及びアルキル化工程
残留物を変性バッファー１,１００μｌ（１００ｍＭホウ酸塩バッファー、０．４Ｍ尿素、０．２Ｍチオ尿素、及び０．４Ｍグアニジン塩酸塩、ｐＨ７．３）に溶解し、これを１００ｍＭトリス[２−カルボキシエチルホスフィン]（ＴＣＥＰ）(Ｐｉｅｒｃｅ)２５μｌに加えた。３０分間振った後、２００ｍＭヨードアセトアミド溶液（シグマ）７５μｌを加え、反応混合物を更に２時間振った。
【０１４１】
タンパク質標識工程
溶液を各々６００μｌに平等に２分割した。１つをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）(２Ｍ）に溶解したＤＭＧ  ［１３Ｃ４,１５Ｎ］標識体１５０μｌと３時間反応させた。他方、もう１つはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２Ｍ）に溶解したＤＭＧ  ［１２Ｃ４,１４Ｎ］標識体１５０μｌで同じ時間反応させた。３時間後、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（２Ｍ）に溶解した各ＤＭＧ試薬１５０μｌを各反応混合物に再度加え、一晩培養した。
【０１４２】
タンパク質プーリング工程
この段階において、標識反応後、２つの異なる標識ポリペプチド混合物をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）１μｌで酸性化し、ＤＭＧ  ［１２Ｃ４１４Ｎ］標識体、及びＤＭＧ  ［１３Ｃ４１５Ｎ］標識体で標識されたポリペプチドを含む２つの混合物の一部を所定の割合にて混合した。
【０１４３】
タンパク質精製及び消化工程
過剰な標識試薬、グアニジン塩酸塩及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を全て取り除くために、異なる標識ポリペプチド比率の混合物を分画分子量５,０００を有するセントリコン装置を使用してサイズ排除遠心分離法により精製した。６６ｍＭ尿素、及び３３ｍＭチオ尿素を含むｐＨ７．５の５０ｍＭホウ酸塩バッファーを希釈と回収を繰り返すために使用した。各比率の混合物について２５０μｌが回収された。トリプシン５μｇ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｇｒａｄｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔｒｙｐｓｉｎ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を各混合物に加え、ｐＨを７．８に調整し、溶液を３７℃で２０時間反応させた。
ＭＳ分析の前に、標識ポリペプチド試料を抽出カートリッジ（ＨＬＢ  Ｏａｓｉｓ,  Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．、ミルフォード、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）で精製した。
【０１４４】
実施例８
ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ分析
分析は、Ｗａｔｅｒｓ  ＣａｐＬＣシステムに連結したＷａｔｅｒｓ  Ｑ−ｔｏｆ  ＩＩを使用して、液体クロマトグラフィー質量分析法にて行った(カラム：  ＬＣ  Ｐａｃｋｉｎｇｓ（Ｄｉｏｎｅｘ）,  １５０×０．０７５ｍｍ,  ３μｍ,  １００ÅＰｅｐＭａｐ  Ｃ１８;溶媒：水１００％からアセトニトリル１００％、どちらもギ酸０．１％を含む)。
【０１４５】
ペプチド同定はＣＩＤ（選択ペプチドイオン衝突）に続き、ＳＥＱＵＥＳＴによるＭＳ／ＭＳスペクトルの自動解釈により行われた（Ｙａｔｅｓ，  Ｊ．Ｒ．，  ３rd；Ｅｎｇ，  Ｊ．Ｋ．；ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，Ａ．Ｌ．,  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．６７(１８)  ｐｐ．３２０２−３２１０，  “Ｍｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｅｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｎｇ  ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｎｄ  ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ”，  １９９５；  ＭａｃＣｏｓｓ，  Ｍ．Ｊ．;Ｗｕ，Ｃ．Ｃ．；Ｙａｔｅｓ，Ｊ．Ｒ．３rd，  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．  ７４  (２１)  ｐｐ．５５９３−５５９９、“Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＳＥＱＵＥＳＴ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ”,  ２００２）。
【０１４６】
ペプチド対の定量分析は、ＤＭＧ  ［１２Ｃ４１４Ｎ］及びＤＭＧ  ［１３Ｃ４１５Ｎ］標識ペプチドそれぞれの同位体パターンの統合後、ＭＳモードで手動で行われた。よって、ＤＭＧ  ［１２Ｃ４１４Ｎ］標識ペプチド及びＤＭＧ  ［１３Ｃ４１５Ｎ］標識ペプチドからもたらされるピーク面積の比較が実測比となる。
【図面の簡単な説明】
【０１４７】
本発明は、一例として図面を参照してより詳細に説明される。
【図１】図１は、実施例において合成プロトコルが示されているタグの分子構造を示す。
【図２】図２は、単一に標識されたペプチド及び未標識ペプチドの保持時間をそれぞれ示したものである。
【図３】図３は、ＤＭＧ  １２Ｃ４１４Ｎ／１３Ｃ４１５Ｎ同位体標識を使用するＣＮＢｒタンパク質消化物の定量化研究のための手順を示す。用いられるタンパク質は分子量が６９２９３Ｄａであるウシアルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  Ａｌｂｕｍｉｎ(ＡＬＢ＿ＢＯＶＩＮ)）であり、次の配列で表される:MKWVTFISLLLLFSSAYSRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFKGLVLIAFSQYLQQCPFDEHVKLVNELTEFAKTCVADESHAGCEKSLHTLFGDELCKVASLRETYGDMADCCEKQEPERNECFLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKADEKKFWGKYLYELARRHPYFYAPELLYYANKYNGVFQECCQAEDKGACLLPKIETMREKVLASSARQRLRCASIQKFGERALKAWSVARLSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTISSKLKECCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPENLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKDAFLGSFLYEYSRRHPEYAVSVLLRLAKEYEATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLVDEPQNLIKQNCDQFEKLGEYGFQNALIVRYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTRCCTKPESERMPCTEDYLSLILNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYVPKAFDEKLFTFHADICTLPDTEKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTVMENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGPKLVVSTQTALA
【図４】図４は、区別して標識をされたペプチド対K*VPQVSTPTLVEVSRの溶出時間の観察を示し、配列中の*は、安定同位体ＤＭＧ  １３Ｃ４１５Ｎ(重)、又はＤＭＧ  １２Ｃ４１４Ｎ(軽)を示しており、本実験により、標識ペプチド対が正確に共溶出していることがわかる。
【図５】図５は、１２Ｃ／１３Ｃ１５Ｎ  ＤＭＧ標識体を使用して区別して標識をされたペプチドK*VPQVSTPTLVEVSRの定量化を示し、１２Ｃ／１３Ｃ１５Ｎ  ＤＭＧ標識体から生じる５ａｍｕ差により２つの同位体パターンの効果的な識別を際立たせており、また、定量分析を可能にするパターン間の質量差の実効性をも際立たせている。
【図６】図６は、１２Ｃ／１３Ｃ４１５Ｎ  ＤＭＧ標識体を使用する定量分析の精度を示す。分析は、次の標識特徴を有する３つのペプチドに対して行われた。・ＤＭＧ  １２Ｃ４１４Ｎ、及びＤＭＧ  １３Ｃ４１５Ｎ標識体の７つの異なる比率。（１／３、１／２、２／３、１／１、２／１、３／２、及び３／１）・異なる標識体数。・異なるサイズ及び電荷状態。以下の通り。  (DMG)PCTEDYLSLILNR    (2+及び3+)    K(DMG)VPQVSTPTLVEVSR  (2+及び3+)    (DMG)AALK(DMG)AWSVAR  (2+及び3+)    図６のグラフは、上記３つのペプチドの７つの異なる期待比、及び観察比の回帰線を表す。
【０１４８】
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【図１】
0004744433.tif 000028
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図４】
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【図６】
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【配列表】
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