(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式
【化１】
0004607760.tif 000029
｛式中、
各Zは、同じか又は異なり、そして、以下の：
【化２】
0004607760.tif 000030
であり、
各Xは、独立に、アミン基によってトリアジン環に連結された、-NH-、及びジアミノアルカン、ジエチレントリアミン又はトリス（アミノエチル）アミンのスペーサーから選ばれ；
各Yは、同じか又は異なるアミニル基であり；そして
Mは支持マトリックスである。｝
によって表される、支持体マトリックスに固定されたアフィニティーリガンドを含む化合物。
【請求項２】
２以上のトリアジン環、及び３個の独立したY基を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
３以上のトリアジン環、及び４個の独立したY基を含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
以下の式：
【化３】
0004607760.tif 000031
により表される、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
各ZがYである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
各Xが、ジアミノアルカンスペーサーである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
各Yが、場合により置換された脂肪族及び芳香族一級アミンから独立して選ばれる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
以下の式：
【化４】
0004607760.tif 000032
により表される、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
共通の支持体M上の、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物のライブラリー。
【請求項１０】
請求項９に記載のライブラリーの生成方法であって、中間体構造を一つ又は複数合成するステップ、上記構造をより小さな部分に分割するステップ、及び好適なその後の反応ステップを含む、前記方法。
【請求項１１】
ペプチド及びタンパク質の分離、単離、精製、特徴づけ、同定、定量又は発見のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１２】
タンパク質様物質の分離、精製、又は発見のための方法であって、上記物質を含む試料を、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を用いるアフィニティークロマトグラフィーにかけることを含む、前記方法。
【請求項１３】
上記タンパク質様物質が、天然又は組換えの供給源由来の融合タンパク質を含む、イムノグロブリン或いはそのサブクラス、断片、前駆体又は誘導体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物を用いて、生物学的化合物又は医薬化合物の調製物から、毒性又は病原性の物質を含む夾雑物を除去する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリアジン化合物及び多次元アフィニティーリガンドライブラリーの形成におけるその使用、そしてアフィニティーリガンドのマトリックスへの結合にも関する。本発明はさらに、天然の、組換えの又はトランスジェニックタンパク質性物質の精製のためのリガンドの使用にも関する。上記リガンドはまた、医療装置中でも使用されることができ、そして治療薬として使用されることもできる。
【背景技術】
【０００２】
アフィニティークロマトグラフィーの原理は、分子認識の現象に基づく。支持マトリックス上に固定化されたリガンドは、他の分子の混合物の存在下において、標的分子との特異的な可逆的相互作用を形成することができる。該相互作用の性質は水素結合、静電気力、好ましい幾何学の結果としてのスタッキング又はホスト‐標的間の関係を支援する他のいずれかの側面である。いったん標的に結合すると、リガンド‐標的の相互作用は、リガンド‐標的複合体をそのままに保ちつつ他の混入分子を混合物から除去することを可能とするのに十分に強力でなければならない。しかしながら、結合は、局所的に導入された変化、例えば緩衝液の状態が相互作用に破壊をもたらし、今やその精製された形態にある標的分子を放出するように、十分に弱くなければならない。今やタンパク質を有さない固定化リガンドは、続く精製のために再使用されることができる。アフィニティーリガンドの望ましい性質は、化学的及び温度に対する安定性、並びに高い選択性である。
【０００３】
リガンドは、分子モデリングを使用することによって特別な標的分子に適合するように設計されることができ、又はコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって選択されることができる。コンビナトリアルアプローチは、親水性、疎水性、荷電した又はされていない基を含む多様な化学分子、或いはそれらの混合物を取り込むように構築されることのできる多数のリガンドを与える。コンビナトリアルライブラリーは、アミノ酸、カルボン酸及びアミンを含む商業的に入手可能な化合物を、支持マトリックスの表面上での直接の段階的合成によって取り込むことによって、好都合に合成されることができる。或いは、リガンドは合成され、そして続いて支持マトリックスに結合されることができる。
【０００４】
塩化シアヌル、又は２，４，６‐トリクロロトリアジン（以後、トリアジンと称する）は、対称な分子である。２，４，６‐三置換トリアジンは、塩化シアヌルとアミン化合物のような求核試薬との反応によって容易に生成されることができる。トリアジン誘導体は、吸収剤として及び他の目的に有用である。ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ‐Ａ‐９７／１０８８７号及び同第ＷＯ‐Ａ‐００／６７９００号を参照のこと。
【０００５】
アフィニティーリガンドライブラリーは、架橋アガロースのような水酸基を有する支持体上に構築されることができる。今日まで、アガロース上に構築されたトリアジンに基づくリガンドライブラリーのすべては、一置換されたトリアジン成分を有するか（ＰＣＴ国際特許出願公開第ＷＯ‐Ａ‐９７／１０８８７号を参照のこと）又はトリアジン基を取り込んでいる大環状の環を有する（同第ＷＯ‐Ａ‐０１／４２２２８号を参照のこと）支持体を含むものである。
【発明の開示】
【０００６】
発明の要約
本発明は、単一のトリアジン環に基づくリガンドに比べて化学的多様性のより大きなそしてより選択性の亢進した大きなリガンドを提供するために有用なアフィニティーライブラリーが、2つ以上のトリアジン環を組み合わせて、一つのリガンド構造とすることによって得られることに基づく。
【０００７】
本発明によれば、新規化合物は以下の式Ｉ：
【化１】
0004607760.tif 000002
｛式中、
各Ｚは、同じか又は異なり、そして以下の：
【化２】
0004607760.tif 000003
であり；
各Ｘは、同じか又は異なり、そして多価（二価を含む）アミニル基又はジアミニル末端を有するスペーサーであり；
各Ｙは、同じか又は異なるアミニル基であり；そして
Ｍは、支持マトリックスである。｝
を有する。
【０００８】
本発明の他の側面は、以下の式：
【化３】
0004607760.tif 000004
｛式中、
Zは上記の定義のとおりである。｝
により表される化合物である。この化合物は、好適な官能基を有する支持体Mと反応することができる。
【０００９】
典型的には、本発明の化合物はマトリックスに固定されたアミンと塩化シアヌル、アミニル基Y、ジアミンX、塩化シアヌル、第二アミニル基Yそして第三アミニル基との連続的な反応によって作られる。より一般的には、スペーサー（X）とそれに続くトリアジン核の相互作用的付加によって、スペーサー‐トリアジン基の交互の連鎖を有するリガンドを構築することが可能となる。いかなる末端トリアジンの塩素原子もアミンによって置換されることができ、該アミンは、それ自体が多官能性であることができ、場合により配向性のある結合を容易にするために、ある官能基が保護基によってブロックされている。多官能性アミンスペーサー基は、より綿密なリガンドの構築を可能とし、分岐した、アンテナ状の（antennary）、管状の、又は球状の構造へ導く。さらに、リガンドのライブラリーは、共通の支持体M上で作成されることができる。これは、本発明のさらなる側面を構成する。
【００１０】
本発明の化合物は、「多次元性」である。次元の数は、異なる官能基Yの数に相当する。
【００１１】
（ライブラリーを含む）本発明の化合物は、ペプチド及びタンパク質の分離、単離、精製、特徴付け、同定、定量又は発見に使用されることができる。特に、該化合物はタンパク質様物質の分離、精製、又は発見のために使用されることができ、それは、該物質を含む試料をアフィニティークロマトグラフィーにかけることを含む。タンパク質様物質は、イムノグロブリン或いはそのサブクラス、断片、前駆体又は誘導体であることができ、天然又は組換え由来の融合タンパク質を含む。さらに、本発明の化合物は、毒性又は病原性を有する物質を含む混入物を生物学的化合物又は医薬化合物の調製物から除去するために使用されることができる。それはまた、薬物発見のためにも使用されることができる。
【００１２】
発明の説明
支持体材料Mは、粒子状又は非粒子状、可溶性又は不溶性、多孔質又は非多孔質のいかなる好適な化合物又は物質であることもできる。それは、定義されたアフィニティーリガンドに関しては、アフィニティーリガンドと接触させられる溶液中の溶質からアフィニティーリガンドを分離する便利な手段を提供する。
【００１３】
本発明の化合物を製造するためには、アガロースのような支持体材料は、アミン基又はスペーサーXの結合を容易にする反応性の基を導入するために、エピクロロヒドリンのような活性化剤との制御された反応に供される。導入された反応性の基の量は、好適なアッセイによって測定可能であり、μモル／安定化させたゲルのｇの単位で表される。過剰の溶媒は、アミンスペーサー基の結合前に吸引又は重力下でのろ過によって除去されることができる。活性化されたアガロースは、スペーサー（X）を提供するアミンと最初に反応させられることができる。
【００１４】
少なくとも、Xは二価であって連結している。Mをトリアジンに連結する場合、その結合価は少なくとも二価であって、アミンを含んでいる。同様に、Xが二つのトリアジンを連結する場合、その結合価は少なくとも二価であり、アミンを含んでいなければならない。典型的には、Xは最初は少なくともアンモニアのように一価、１，２‐ジアミノエタンのように二価、又はジエチレントリアミン若しくはトリス（アミノエチル）アミンのように三価である。Xがその官能性を失うことなく、水酸基のような基によって置換されるかもしれないとしても、これが本発明の範囲内にあることは理解されるであろう。
【００１５】
この最初の反応の生成物の例を以下の式：II、III、IV及びV：
【化４】
0004607760.tif 000005
に表す。
【００１６】
導入されるアミノ基の数は、TNBSのようないずれかの好適なアッセイによって測定されることができ、そしてアミンのμモル／安定化させたゲルのｇとして表される。この段階で導入された各脂肪族アミンは、次に塩化シアヌルと反応させられる。例えば、式IIの化合物は、反応させられて式VIのトリアジン‐活性化アガロースを生成する。
【化５】
0004607760.tif 000006
【００１７】
トリアジン‐活性化樹脂の総塩素含量は、アルカリ加水分解後に塩素イオンとして測定されることができる。
【００１８】
３Dライブラリー、すなわち、２つ以上のトリアジン基及び３つの独立して利用可能なY基を含む化合物、を作成するために、塩素原子の１つはアミンY1によって置換される。第二塩素原子は、任意の鎖長のジアミン、トリアミン又はテトラアミンであることのできる第二スペーサー（X2）によって置換される。X2は二価又は三価であることができる（例を上記に示す）。
【００１９】
トリアジン環への各アミン付加は、塩素イオンを除去し、これがアッセイされることができる。結果は、安定化させたゲルのグラムあたりの放出された塩素イオンのμモルによって表されることができる。活性化アッセイの結果＝A；アミンアッセイの結果＝B；１つの塩素イオンが除去される塩素アッセイの結果＝C（ｉ）として、出発物質の１００％が変換すると、以下の：
Ａ＝Ｂ＝Ｃ（ｉ）（μモル／安定化させたゲルのｇ）となり、
第二塩素イオン、Ｃ（ｉｉ）が除去されると、以下の：
Ａ＝Ｂ＝Ｃ（ｉ）＝Ｃ（ｉｉ）；そして
Ｃ（ｉ）＋Ｃ（ｉｉ）＝２Ａ＝２Ｂとなる。
【００２０】
第二のトリアジン置換ステップにより、以下の式VII：
【化６】
0004607760.tif 000007
により表される構造が生じる。
【００２１】
３Dライブラリーにおいては、第二トリアジン核上の両塩素原子が順次アミンY2及びY3に置換されて、以下の式VIII：
【化７】
0004607760.tif 000008
を有する生成物を生じる。
【００２２】
これらの構築ブロックから作られる他の構造の例を以下の式IX及びXに示す。
【化８】
0004607760.tif 000009
【００２３】
他のトリアジン及び多価スペーサー基は、式XI〜式XIIIに例示されるように、任意の数の独立して可変のアミン置換位置を有するリガンドの生成を可能とする。
【化９】
0004607760.tif 000010
【００２４】
式XI及びXIIは分岐の程度が異なるが、同程度の次元性を有する。これは、部分的には式XIII中におけるさらなる分岐がXにおけるものであること、すなわち、２つの同一のトリアジン環がさらなるトリアジン上ではなくここに導入されること、を原因とする。
【実施例】
【００２５】
以下の実施例は本発明を例示するものである。
【００２６】
実施例１
この実施例は、エポキシド‐活性化PuraBead樹脂の製造を例解する。PuraBeadは耐久性を助けるために架橋された多孔質ビーズ状のアガロース支持体である。
【００２７】
エポキシド活性化：PuraBead6XLの試料（３３３ｇ）を水（２１３mＬ）に懸濁し、１０MのNaOH（２６．６mＬ）と混合した。混合物をオーバーヘッドスターラーを用いて３４℃の一定温度となるまで攪拌した。エピクロロヒドリン（２４mＬ）を同じ分量で２回に分けて添加し、温度を４０℃に上昇させた。１時間後、スラリーをろ過し、水（１０×３５０mＬ）で洗浄した。洗浄された活性化樹脂に対するエポキシドアッセイは、２３．３μモルのエポキシド／安定化させたゲルのｇの置換レベルを示した。
【００２８】
実施例２
この実施例は、エポキシド活性化ゲルからのアミノ化ゲルの製造方法を例解する。
【００２９】
アミン活性化：実施例１において得られたエポキシ‐活性化ゲル（２２６ｇ）を水（１８０mＬ）中に懸濁し、０．８８アンモニア（４５mＬ）で処理した。反応混合物を４０℃で一夜攪拌しておいた。その後、ゲルをろ過し、水（１０×５００mＬ）で洗浄して、アミン活性化樹脂（約２２０ｇ）を得た。ゲルの一部分についてのTNBSアッセイは、２３．２μモル／安定化させたゲルのｇのアミンレベルを示した。
【００３０】
実施例３
この実施例は、アミン化樹脂と塩化シアヌルとの反応がジクロロトリアジン‐活性化ゲルを生じさせたことを例解する。
【００３１】
トリアジン活性化：実施例２で製造したアミン‐活性化ゲル（２００ｇ）を１．０Mのリン酸カリウム緩衝液（２００mＬ、pH７）で洗浄した。安定化させたゲルをビーカーに移し、水（５０mＬ）及び１．０Mリン酸カリウム緩衝液（５０mＬ、pH７）と混合した。混合物全体を１リッターの３つ首丸底フラスコに移した。激しく攪拌しながらアセトン（１００mＬ）を添加した。フラスコを定常温度の０℃に冷却した。冷アセトン（５０mＬ）中の塩化シアヌル（５ｇ）を側管から加えた。１時間後に反応を停止し、フラスコ内容物を焼結漏斗に移した。ジクロロトリアジンゲルを５０％アセトン（１L）、水（１L）、５０％アセトン（１L）及び水（２L）で洗浄して、トリアジン活性化樹脂（約２００ｇ）を得た。塩素アッセイによって、総塩素イオン含量が４６μモル／安定化させたゲルのｇであると決定した。
【００３２】
実施例４
この実施例は、ジクロロトリアジンゲルへの第１のアミンの付加を例解する。
【００３３】
Y1の置換：実施例３で製造されたジクロロトリアジンゲル（２００ｇ）を水（１００mＬ）に懸濁し、１０MのNaOH（４mＬ）で塩基性化した水（１００ｍL）中のβ‐アラニン溶液（０．２M）で処理した。反応容器を室温で１時間振とうし、その後、内容物をろ過し、５０％DMF（５×１２５mＬ）及び水（１０×１２５mＬ）で洗浄した。
【００３４】
実施例５
この実施例は、高温におけるジアミンスペーサーによる第二塩素イオンの置換を例解する。
【００３５】
スペーサーX2を付加するための第二の置換：実施例４で得られたY1−置換ゲルを水（１００mＬ）に懸濁し、水（１００mＬ）中のエチレンジアミン溶液（０．４M）で処理した。反応容器を６０℃で2日間、振とうした。冷却後、得られたゲルを５０％DMF（５×１２５mＬ）、水（５×１２５mＬ）、０．１MのＨＣｌ（５×１２５mＬ）、３０％イソプロパノール／０．２MのNaOH（５×１２５mＬ）、及び水（１０×１２５mＬ）で洗浄した。ゲルの試料についてのTNBSアッセイは、２６．７μモル／ｇのアミン置換を示した。上清についての塩素アッセイは、２７．２μモル／ｇの塩素放出を示した。
【００３６】
第二のトリアジンステップ：手順は、実施例３に記載した第一トリアジン活性化ステップと同じであった。
【００３７】
実施例６
この実施例は、第二トリアジン環への第１のアミンの付加を例解する。
【００３８】
Y2の置換：実施例５の第二トリアジン結合ステップから得られたゲルを８個のボトルに量り分けて入れた（各ボトル１２．５ｇ）。試料を５０％DMF（６．２５mＬ）中に懸濁した。そして、各ボトルに選択されたアミンの溶液（０．２M、６．２５mＬ）を入れた。カルボン酸塩部分を含むアミン又は塩酸塩として得られたものを必要量の１０M NaOHで塩基性化して、全体のpＨを約９〜１０とした。試料を室温で１時間振とうした。
【００３９】
上清（１００mＬ）を各ボトルから除去し、塩素イオンアッセイによって反応の進行を評価した。表１は、第１のアミン置換後の塩素放出量を表す。
【００４０】
【表１】
0004607760.tif 000011
【００４１】
８つの中間体ゲルを５０％DMF（５×１２．５mＬ）及び水（１０×１２．５mＬ）で洗浄した。
【００４２】
実施例７
この実施例は、最終的なアミン（Y3）の第二トリアジン環への付加の組み合わせによって、式VIIIによる３Dリガンドのライブラリーが得られることを例解する。
【００４３】
第二の置換Y3：これは、実施例５において行われた第二スペーサーアーム（X2）の置換を改変することによる方法の変化によって可能となった。合成はマイクロスピンカラム中で直接行った。或いは、９６−ウエルのブロックも使用することができる。
【００４４】
実施例６において得られた８個の中間体（４．０ｇ）のそれぞれを０．４％Tween-２０（２mＬ）中に懸濁した。第一の中間体（０．３７５mＬ）の懸濁液を８個のウエルからなる列に入れていった（1ウエルあたり０．３７５mＬ）。その過程を第二の中間体について第二のウエルの列において繰り返し、すべての第一段階の中間体を各列に入れるまで同様に行った。
【００４５】
５０％DMF中の最終段階の第１のアミン（Y3）の溶液（０．４M）を第一の列に対して直角方向のウエル中に入れ（１ウエルあたり０．１２５mＬ）、８個のウエルすべてに入るまで同様に行った。この手順を、８の列すべてに選択された最終段階のアミン（Y3）を入れるまで繰り返した。したがって、８×８配列の各ウエルは、個々に異なるリガンド構造を構成する。
【００４６】
Y3の添加が完了したら、ライブラリーブロックを６０℃のオーブン中で２日間振とうした。取り出して冷却した（１時間）後、ブロックを深型ウエルマイクロタイタープレート中に流れ込むようにした。集めたろ液をアッセイして塩素イオンの放出を測定し、こうして反応の程度を測定した。ライブラリーブロックを５０％DMF（２×１ｍｌ）、水（２×１ｍｌ）、０．１M HCl（２×１mＬ）、水（２×１ｍｌ）、０．２M NaOH／３０％イソプロパノール（２×１mＬ）、水（２×１mＬ）及び２０％エタノール（２×１mＬ）で洗浄した。
【００４７】
以下の表２中の結果は、ゲル１ｇあたりの放出された塩素のμモルで表された、第二の置換（Y3）後に得られた塩素放出データを示す。
【００４８】
【表２】
0004607760.tif 000012
【００４９】
得られたライブラリーを、多様な標的タンパク質に対する結合活性／親和性を試験するためにスクリーニングした。以下の表３は、ヒト血漿において実施されたスクリーニングの詳細を示す。先ず、２mLの２５mMリン酸ナトリウムpH７．０をゲル床の一番上に加え、そしてこれが重力によってゲル中を流れ、その中の２０％エタノールの保存液と交換することによって、エタノール保存液をライブラリーの各場所から洗い出した。ヒト血漿をリン酸緩衝生理食塩水で１：２０（v/v）に希釈し、２ｍLを各ゲルの一番上に加え、重力によってゲル中を流れるようにした。各ライブラリー要素を流れ去ったフロースルー（FT）を個別に集めた。２mＬのリン酸ナトリウム緩衝液を同様の方法で加えることによって、各ゲル床を洗浄して未結合のタンパク質を除去し；各ライブラリー要素を流れ去った洗浄画分（W）を個別に集めた。2つの溶出ステップのうちの結合タンパク質を除去するための第一のステップ（E１）においては、１mLの１０mMリン酸ナトリウム／クエン酸、pH６．５をゲル床の一番上から加えて重力によって流れさせ、個別に集めた。次に第一のステップで放出されなかったタンパク質を除去するための第二のステップ（E2）を適用し：１mLの５０mMクエン酸を各ゲル床の一番上に加え、重力によって流れさせ、個別に集めた。最後にすべてのゲル上の残留する混入物質を除去するための衛生化ステップ（San）を適用し：１mLの０．２M水酸化ナトリウム／３０％イソプソパノールを各ゲル床の一番上に加え、重力によって流れさせ、個別に集めた。
【００５０】
各ステップにおいて放出されたタンパク質を、集めた溶出画分のそれぞれ：FT、W、E1、E2及びSanにおいてアッセイした。結果を表３A〜Eに示す。ライブラリーから集めた各画分を表２の格子ごとに表す。数字は各ライブラリー要素から回収したタンパク質をμgで表す。
【表３】
0004607760.tif 000013
【００５１】
【表４】
0004607760.tif 000014
【００５２】
【表５】
0004607760.tif 000015
【００５３】
【表６】
0004607760.tif 000016
【００５４】
【表７】
0004607760.tif 000017
【００５５】
アミン（Y1、Y2及びY3）の性質
３Dライブラリーの合成のために選ばれるアミンは、一級、二級、脂肪族、芳香族、複素環、アリール、キラル、荷電したもの又はこれらの組み合わせのいかなるものであってもよい。反応条件は、選ばれるアミンの溶解度によって変化することができる。溶媒は水、５０％DMF及び純粋のDMFから選ばれる。塩酸塩として又はカルボン酸塩部分を含むものとして得られるアミンはすべて、必要なモル量のNaOHで反応前に中和する。
【００５６】
上記の３Dライブラリーにおいて生成した親水性リガンドの例は、以下の式XIV：
【化１０】
0004607760.tif 000018
によって表される。
【００５７】
この場合、X1はアンモニアに由来し；Y1はβ‐アラニンに由来し；X2は１，２‐ジアミノエタンに由来し；Y2は３‐アミノ安息香酸に由来し；そして、Y3は１‐（３‐アミノプロピル）モルホリンに由来する。
【００５８】
実施例８
この実施例は、他の３‐Dリガンドの使用を例解し、それは、細胞培地からのモノクローナル抗体並びに血漿及び血漿画分からのポリクローナル抗体の単離及び精製に特に有用であることがわかった。それは以下の式XV：
【化１１】
0004607760.tif 000019
により表される。
【００５９】
この場合、X1は1，２‐ジアミノエタンに由来し；Y１はβ‐アラニンに由来し；X2は１，２‐ジアミノエタンに由来し；Y2は２‐アミノフェノールに由来し；そしてY3は３‐アミノフェノールに由来する。
【００６０】
この実施例においては、式XVにより示される吸収剤がCEA（Kistler/Nitschmann法によって血漿から得られた沈殿Aからの清澄化された抽出物A）からのイムノグロブリンGの精製に使用される。（アガロースに２２ミリモル／gで負荷された）吸収剤をガラスのカラム（１０mL）に充填し、カラム１０個分の体積の２５mMリン酸ナトリウム、pH７．０で平衡化し、そして（４００mg以下のイムノグロブリンGを含む）CEAを負荷した。そして、カラムを２５mMリン酸ナトリウム、pH７．０（カラム５個分の体積）、次いでカラム５個分の体積の（クエン酸でpH６．５に平衡化した）１０mMリン酸ナトリウムで洗浄した。結合タンパク質を１０mMクエン酸ナトリウム、pH３．０、次いで５０mMのクエン酸で溶出した。使用後、カラム１０個分の体積の０．５M水酸化ナトリウムでカラムを衛生化した。
【００６１】
この吸収剤の結合能は、４３．２mg/mLであることがわかり、そして（2つの溶出画分中に溶出した総タンパク質である）溶出能は３２．８mg/mLであることがわかった。第一の溶出は、約９５％純度のIgGを含み、吸収剤の溶出能は２７mg/mLであった。
【００６２】
実施例９
この実施例は、芳香族、疎水性、陽性、及び極性の４つの広いアミンのクラスにグループ分けされたアミンを使用した「ライブラリーのライブラリー」のコンビナトリアル合成を例解する。表４に詳解されたアミンY1、Y2及びY3を用いて、１２のライブラリーのそれぞれを、実施例１〜７において記載されたライブラリーと同一の方法で合成した。
【００６３】
【表８】
0004607760.tif 000020
【００６４】
各ライブラリーについて、同一の第１のアミンY1を６４のライブラリー構成物に対して加え、（先の実施例に記載したとおり、）スペーサーアーム及びトリアジン付加のあとに付加した残りのアミンY2及びY3は、各ライブラリーを含む異なる６４のゲルを表示する。先の実施例において記載したように、塩素の放出及びTNBSアッセイを固相合成の各段階で実施した。
【００６５】
１〜１２のライブラリーそれぞれのアミンY1、Y2及びY3を示す（表５）。
【表９】
0004607760.tif 000021
【００６６】
実施例９に記載の「ライブラリーのライブラリー」の合成からの例示的な３‐D構造は以下のとおりである。
【化１２】
0004607760.tif 000022
【００６７】
実施例１０
この実施例は、その合成方法が実施例９に記載された「ライブラリーのライブラリー」の、Cohn IV-Iペーストからの（アルファ‐１‐プロテイナーゼ阻害剤としても知られる）アルファ‐１‐アンチトリプシンタンパク質の結合のスクリーニングにおける使用を記載する。Cohn-IV-Iペーストを−８０℃で凍結したペースト（20g）を、２５℃の水浴中で一夜連続的に攪拌しながら１５mMのリン酸ナトリウム緩衝液、pH８．１（３００mL）に溶解することによって調製した。そして、この混合物を２５℃で１５，０００rpmで１５分間遠心分離し、１．０mm及び０．４５mmのフィルターを通してろ過した。一回分０．５mLの１０mMトリス、２０mMクエン酸ナトリウム、１５０mM塩化ナトリウム、pH７．５を４回ゲル床の一番上に添加することによって、エタノール保存剤を各ライブラリー中の各位置から洗い出した。２０％エタノール保存剤と交換するように、各１回分を重力によってゲル中を流れさせた。そして、各ライブラリー要素の一番下を密封し、Cohn IV-Iペースト（０．２５mL）の調製物を各ゲル床の一番上に添加し、平衡化されたゲルと混合した。ライブラリーを負荷したCohn-VI-Iとともに３０分間インキュベートした。この後、ライブラリーを開封し、各ライブラリー要素からのフロースルー（FT）を個別に集めた。１回分０．２５mLの１０mMトリス、２０mMクエン酸ナトリウム、１５０mM塩化ナトリウム、pH７．５で各ゲル床を３回洗浄して、未結合のタンパク質を除去した。洗浄画分（W）を各ライブラリー要素から個別に集めた。１回の溶出ステップにおいて、8M尿素、２５mMトリス、１５０mM塩化ナトリウム、pH７．５を各ゲル床の一番上に添加し（３×０．２５mL）、各ライブラリー要素からの溶出液（E）を個別に集めた。最後に、１mLの０．２M水酸化ナトリウム／３０％イソプロパノールを含む、（ゲル上に結合して残ったいかなる物質も除去するように設計された）衛生化ステップ（San）を各ゲル床の一番上に加え、重力によって流れるようにし、個別に集めた。各ライブラリー要素からのFT及びE画分をSDS PAGEゲルに流し、FT画分中のアルファ‐１‐アンチトリプシンの消失及びE画分中でのアルファ‐１‐アンチトリプシンの出現を目で分析した。有望な候補中のアルファ‐１‐アンチトリプシンの存在又はアルファ‐１‐アンチトリプシンの消失もまた、比濁分析によって確認した。
【００６８】
実施例１１
スクリーニングされた７６８個のライブラリー要素から４つを選び、実施例１〜７においてライブラリー合成について記載されたのと同一の化学及びアッセイを用いて、個別に３０mLスケールで合成した。これらの４つの樹脂のアミン組成（Y1、Y2、Y3）を表６に示す。アミンの番号は表５と同じである。
【表１０】
0004607760.tif 000023
【００６９】
これらの４つの樹脂を以下のように評価した。
約１０mL容量、及び高さ１２cmのカラム（詳細は表７を参照のこと）をカラム４つ分の体積の１０mMトリス、２０mMクエン酸ナトリウム、１５０mM塩化ナトリウム、pH７．５を用いて平衡化した。実施例９に記載のとおりに調製したCohn IV-Iペースト（体積については表７を参照のこと）を５０cmh-1の流速でカラムに導入した。負荷後、カラム４つ分の体積の１０mMトリス、２０mMクエン酸ナトリウム、１５０mM塩化ナトリウム、pH７．５を２００cmh-1で用いて未結合のタンパク質を洗い出した。２つの溶出液を使用した：はじめはカラム４つ分の体積の１００mMリン酸ナトリウム、２０mMクエン酸ナトリウム、pH６．１、そして第二はカラム４つ分の体積の８M尿素、２５mMトリス、１５０mM塩化ナトリウム、pH７．５である。それぞれを２００cmh-1の流速で流す。
【００７０】
【表１１】
0004607760.tif 000024
【００７１】
比濁分析によって、未結合の（FT）及び溶出（E1及びE２）画分をアルファ‐１‐アンチトリプシンについてアッセイした。結果を、これらの条件下でのこれらの物質についての計算した結合能（BC）及び溶出能（EC）とともに表８に示す。
【００７２】
【表１２】
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【００７３】
実施例１２
この実施例は、３つのトリアジン基及び４つの独立して可変なY基を含む「４次元」ライブラリーの合成を記載する。PuraBead支持マトリックスを、実施例１に記載のようにエポキシド‐活性化して最終的なエポキシド負荷が５．６ミリモル／安定化させたゲルのｇとし、そして実施例５に記載のスペーサー付加に類似の方法でエチレンジアミンを使用してエポキシド樹脂を処理することによってスペーサーX1を取り込ませた。
【００７４】
実施例３に記載したようにこの樹脂をトリクロロトリアジンと反応させてジクロロトリアジンゲルを生成した。塩素レベルをアッセイし、１２．５ミリモル／安定化させたゲルのｇであることがわかった。
【００７５】
実施例４に記載のアミン付加と類似の方法で、トリプタミン溶液をジクロロトリアジンに添加することによって、第１のアミンY1（構造XI）を付加した。塩素レベルは、５．４ミリモル／安定化させたゲルのｇであった。
【００７６】
実施例５に記載のスペーサー付加と類似の方法で、エチレンジアミン溶液を添加することによって、スペーサーX2（構造XI）を取り込ませた。TNBSアッセイは、アミンレベルが５．４ミリモル／安定化させたゲルのgであることを示した。
【００７７】
そして、最初（上記を参照のこと）と同様の条件を用いて、第二のトリクロロトリアジン付加を達成した。塩素レベルは１２．１ミリモル／安定化させたゲルであった。
【００７８】
実施例４に記載のアミン付加と類似の方法で、チラミン溶液をジクロロトリアジンに添加することによって、第２のアミンY2（構造XI）を付加した。塩素レベルは、１２．１ミリモル／安定化させたゲルのgであった。
【００７９】
実施例２に記載のスペーサー付加と類似の方法で、０．８８アンモニアを添加することによって、スペーサーX3（構造XI）を取り込ませた。生成物質についてTNBSアッセイを行った（５．７ミリモル／安定化させたゲルのg）。
【００８０】
その後、最初の２つと類似の条件を用いてトリクロロトリアジンの第三の付加を達成した。塩素レベルは１２．５マイクロモル／安定化させたゲルのgであった。
【００８１】
先のステップで得られたビス‐クロロ‐ビス‐トリアジンゲルを８個のボトルに量り分けて入れ、実施例６記載の方法と類似の方法で８個の異なるアミンと反応させ、アミンY3（構造XI）を取り込ませた。これらの付加に関する塩素放出量（μモル／安定化させたゲルのｇ）を表９に示す。
【００８２】
【表１３】
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【００８３】
上記の中間のアミンの付加後、８つのゲルのそれぞれを懸濁し、実施例７に記載したような８個のウエルの列に分ける。８つの異なるアミンY4を８列のウエルにわたって添加し、全部で６４個の４重にアミン置換された異なる樹脂を生成した。表１０中の結果は、この最後の置換Y4後に得られた塩素放出データを、ゲル１ｇあたりの放出された塩素のミリモルで示す。
【００８４】
【表１４】
0004607760.tif 000027
【００８５】
例示的な４−D構造は以下のものである。
【化１３】
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