(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１４９〜１９８番目のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１４９〜１９８番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プロテアーゼを阻害せずに抗菌活性を有するポリペプチド
【請求項２】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする核酸。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１４９〜１９８番目のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１４９〜１９８番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プロテアーゼを阻害せずに抗菌活性を有するポリペプチド
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の４９９〜６４８番目の塩基配列からなる核酸
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の４９９〜６４８番目の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロテアーゼを阻害せずに抗菌活性を有するポリペプチドをコードする核酸
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３１〜２４３番目のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３１〜２４３番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プロテアーゼを阻害せずに抗菌活性を有するポリペプチド
【請求項５】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする核酸。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３１〜２４３番目のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１３１〜２４３番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、プロテアーゼを阻害せずに抗菌活性を有するポリペプチド
【請求項６】
以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の４４５〜７８３番目の塩基配列からなる核酸
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の４４５〜７８３番目の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、プロテアーゼを阻害せずに抗菌活性を有するポリペプチドをコードする核酸
【請求項７】
請求項２、３、５若しくは６記載の核酸を含み、かつ請求項１若しくは４記載のポリペプチドを発現する組換えベクター。
【請求項８】
請求項２、３、５若しくは６記載の核酸、又は請求項７記載の組換えベクターで形質転換され、かつ請求項１又は４記載のポリペプチドを発現する形質転換体。
【請求項９】
植物である、請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
植物が、植物体、植物器官、植物組織又は植物培養細胞である、請求項９記載の形質転換体。
【請求項１１】
植物がイネ科に属する植物である、請求項９又は１０記載の形質転換体。
【請求項１２】
イネ科に属する植物がコムギである、請求項１１記載の形質転換体。
【請求項１３】
雪腐病菌に対する抵抗性を示す、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項１４】
雪腐病菌が紅色雪腐病菌である、請求項１３記載の形質転換体。
【請求項１５】
低温、塩及び乾燥からなる群より選択される非生物ストレスに対する抵抗性を示す、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の形質転換体。
【請求項１６】
請求項９〜１５のいずれか１項に記載の形質転換体から得られる種子であって、請求項２、３、５若しくは６記載の核酸、又は請求項７記載の組換えベクターを含み、かつ請求項１又は４記載のポリペプチドを発現する種子。
【請求項１７】
請求項８記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からポリペプチドを採取することを特徴とする、プロテアーゼを阻害せずに抗菌活性を有するポリペプチドの製造方法。
【請求項１８】
請求項２、３、５若しくは６記載の核酸、又は請求項７記載の組換えベクターを用いて植物を形質転換する工程、及び請求項１又は４記載のポリペプチドを発現する形質転換体から植物体を再生する工程を含むことを特徴とする、抵抗性植物の作出方法。
【請求項１９】
雪腐病菌に対する抵抗性植物を作出する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
低温、塩及び乾燥からなる群より選択される非生物ストレスに対する抵抗性植物を作出する、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
植物がイネ科に属する植物である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
イネ科に属する植物がコムギである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
以下の（ａ）〜（ｄ）の少なくとも１つからなることを特徴とする抗菌剤。
（ａ）請求項１若しくは４記載のポリペプチド
（ｂ）請求項２、３、５若しくは６記載の核酸
（ｃ）請求項７記載の組換えベクター
（ｄ）請求項８記載の形質転換体
【請求項２４】
植物に使用するものである、請求項２３記載の抗菌剤。
【請求項２５】
雪腐病菌に対する抗菌活性を有するものである、請求項２３又は２４記載の抗菌剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗菌性シスタチンタンパク質及びそれをコードする核酸に関する。また本発明は、病原菌（特に雪腐病菌）又は非生物ストレスに対する抵抗性を有する植物、及びその作出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
システインプロテアーゼインヒビターは、５０年代後期に哺乳動物組織において最初に同定され、ニワトリ卵白から単離されたパパイン様システインペプチダーゼインヒビターは「シスタチン」と命名されている（非特許文献１）。植物シスタチンは、最初にイネにおいて報告され（非特許文献２）、その後、多くの単子葉及び双子葉植物においてフィトシスタチンが同定されている。最近、植物シスタチンは、別個のサブファミリーに分類されている（非特許文献３）。大部分のフィトシスタチンは分子量１２〜１６ｋＤａであり、有意なアミノ酸配列相同性を示し、ジスルフィド結合を含まない。システインプロテアーゼインヒビターはイネ（非特許文献２など）、トウモロコシ（非特許文献４など）、ダイズ（非特許文献５など）において十分に特性決定されている。フィトシスタチンは、主に種子から精製される（非特許文献６など）が、塊茎、葉、果実、花粉、花芽及び花弁においても検出されている（非特許文献７など）。特定の植物発育期におけるシスタチンの発現、またストレス応答の結果が報告されている。種子成熟及び発芽過程のタンパク質代謝におけるシステインプロテアーゼインヒビターの関与もまた報告されている（非特許文献８など）。害虫及び病原体に対するシスタチンの防御機能は、システインプロテアーゼインヒビターを過剰発現するトランスジェニック植物によって証明されている（非特許文献９など）。
【０００３】
一方、越冬穀類及び多年生牧草類は、氷点下温度及び病原体が襲う冬季においても生存する。植物の耐冷性は、低温であるが非凍結温度に対する曝露期間の後に実質的に高まっている。北方地域においては、ムギ、オオムギ、ライムギ及び多数の牧草を含む冬穀物はしばしば好冷性糸状菌である雪腐病菌（M. nivale, Thphula spp., Sclerotinia borealis）により攻撃を受けるが、雪に覆われた凍結からは防御される。低温に抵抗性のある越冬性多年生牧草類においては低温耐性の獲得と雪腐病菌抵抗性の獲得が相関している（非特許文献１０）。雪腐病菌感染は日和見的であり、積雪下で長期間をかけて徐々に進行する独特なものである。従って、雪腐病抵抗性の機構は分子生理学的にはほとんど解明されていない。
【０００４】
雪腐病菌に対する対策として、根雪前の薬剤処理が行われている。イミノクダジン酢酸塩、チオファネートメチル、有機銅、硫酸銅等が使用されており一定の効果が見られる。しかしながら、薬剤による防除は散布適期の決定が難しく、散布が早いと降雨による土壌への流出が起こり、効果が減少する。また、環境への多大な負荷等も問題となっている。年度毎に根雪期間の変動が大きく、効果が安定しない点も問題である。また、病原菌毎に用いる薬剤が異なることは農家へのコスト的な負担となっている。
【０００５】
また微生物に対する植物防御の別の方法として、抗菌性タンパク質遺伝子を植物に導入して、病原菌耐性を向上させた報告が多くなされている（非特許文献１１及び１２等）。しかし、病原菌の種類によりその効果は異なり、この方法によって寒冷地の冬コムギ等越冬性作物生産に大きな驚異となっている雪腐病菌に対する抵抗性を向上させた例はない。
【０００６】
従って、植物に雪腐病菌に対する抵抗性を付与するための方法及び手段が望まれていた。
【非特許文献１】Barret, A.J., Trends Biochem. Sci. 第12巻, 193-196頁, 1987年
【非特許文献２】Abe, K. et al., J. Biol. Chem. 第262巻, 16793-16797頁, 1987年
【非特許文献３】Margis, E. et al., Arch. Biochem. Biophys. 第359巻, 24-30頁, 1998年
【非特許文献４】Abe, M. et al., Eur. J. Biochem. 第209巻, 933-937頁, 1992年
【非特許文献５】Hines, M.E. et al., J. Agric. Food Chem. 第39巻, 1515-1520頁, 1991年
【非特許文献６】Hirashiki, I. et al., J. Biochem (Tokyo) 第108巻, 2259-2264頁, 1990年
【非特許文献７】Diop, N.N. et al., FEBS Lett. 第577巻, 545-550頁, 2004年
【非特許文献８】Salmia, M.A. et al., Physiol. Plant 第48巻, 266-270頁, 1980年
【非特許文献９】Inanaga, H. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 第65巻, 2259-2264頁, 2001年
【非特許文献１０】Tronsmo, A.M. et al., Acta. Agric. Scand. 第43巻, 89-96頁, 1993年
【非特許文献１１】Cocca et al., Plant Mol Biol. 第54巻, 245頁, 2004年
【非特許文献１２】Clausen et al., Nat Biotechnol. 第18巻, 446頁, 2000年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、雪腐病菌に対する抵抗性を示す植物を作出するための方法及び手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、公知の穀類シスタチンの構造とは異なる新規冬コムギ由来シスタチンをコードするｃＤＮＡを単離することに成功し、また該シスタチンが植物に雪腐病菌及び非生物ストレスに対する抵抗性を付与することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、以下を包含する。
１．以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の３８〜２４３番目のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の３８〜２４３番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗菌活性を有するタンパク質
２．以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする核酸。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の３８〜２４３番目のアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の３８〜２４３番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗菌活性を有するタンパク質
３．以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の１６６〜７８６番目の塩基配列からなる核酸
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の１６６〜７８６番目の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗菌活性を有するタンパク質をコードする核酸
【００１０】
４．以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の４０〜１２９番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の４０〜１２９番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗菌活性を有するポリペプチド
５．以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする核酸。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の４０〜１２９番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の４０〜１２９番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗菌活性を有するポリペプチド
６．以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の１７２〜４４１番目の塩基配列からなる核酸
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の１７２〜４４１番目の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗菌活性を有するポリペプチドをコードする核酸
【００１１】
７．以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１５０〜２１０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１５０〜２１０番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗菌活性を有するポリペプチド
８．以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードする核酸。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１５０〜２１０番目のアミノ酸を含むポリペプチド
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列の１５０〜２１０番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗菌活性を有するポリペプチド
９．以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の５０２〜６８４番目の塩基配列からなる核酸
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列の５０２〜６８４番目の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗菌活性を有するポリペプチドをコードする核酸
【００１２】
１０．以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗菌活性を有するタンパク質
１１．以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする核酸。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗菌活性を有するタンパク質
１２．以下の（ａ）又は（ｂ）の核酸。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなる核酸
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗菌活性を有するタンパク質をコードする核酸
【００１３】
１３．上記核酸を含む組換えベクター。
１４．上記核酸、又は上記組換えベクターで形質転換された形質転換体。
上記形質転換体は、任意の細胞、微生物、植物、動物などでありうるが、植物であることが好ましい。また、植物としては、限定されるものではないが、植物体、植物器官、植物組織及び植物培養細胞などが含まれる。また植物は、イネ科に属する植物、特にコムギであることが好ましい。
また上記形質転換体は、雪腐病菌、例えば紅色雪腐病菌に対する抵抗性を示すものである。あるいは上記形質転換体は、低温、塩及び乾燥からなる群より選択される非生物ストレスに対する抵抗性を示すものでありうる。
【００１４】
１５．上記形質転換体から得られる種子。
１６．上記タンパク質又は上記ポリペプチドに対する抗体。
１７．上記形質転換体を培養し、得られる培養物からタンパク質を採取することを特徴とする、シスタチンタンパク質の製造方法。
【００１５】
１８．上記核酸、又は上記組換えベクターを用いて植物を形質転換する工程、及び得られる形質転換体から植物体を再生する工程を含むことを特徴とする、抵抗性植物の作出方法。
上記方法により、雪腐病菌に対する抵抗性植物が作出される。また、上記方法により、低温、塩及び乾燥からなる群より選択される非生物ストレスに対する抵抗性植物が作出される。植物には、限定されるものではないが、イネ科に属する植物、好ましくはコムギが含まれる。
【００１６】
１９．以下の（ａ）〜（ｈ）の少なくとも１つを含むことを特徴とする抗菌剤。
（ａ）前項１若しくは１０記載のタンパク質
（ｂ）前項４若しくは７記載のポリペプチド
（ｃ）前項２若しくは１１記載の核酸
（ｄ）前項５若しくは８記載の核酸
（ｅ）前項３若しくは１２記載の核酸
（ｆ）前項６若しくは９記載の核酸
（ｇ）前項１３記載の組換えベクター
（ｈ）前項１４記載の形質転換体
上記抗菌剤は、植物に使用することが好ましい。また、上記抗菌剤は、雪腐病菌に対する抗菌活性を有するものである。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、植物を始めとする多様な生物に抗菌活性を付与するタンパク質（ポリペプチド）及びそれをコードする遺伝子が提供される。また、該タンパク質及びそれをコードする遺伝子を利用することにより、病原菌及び非生物ストレスに対する抵抗性が向上した植物（イネ科植物、特にコムギ）を作出することができる。また、該タンパク質及びそれをコードする遺伝子を利用した抗菌剤も提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．シスタチンタンパク質（ＴａＭＤＣ１）及びそれをコードする遺伝子
（１）コムギ由来シスタチンタンパク質
本発明は、コムギ由来の新規シスタチンタンパク質（ＴａＭＤＣ１）及びそれをコードする遺伝子に関する。シスタチンとは、パパインファミリーに属するシステインプロテアーゼ群を特異的に阻害する内在性のインヒビタータンパク質の総称である。ＴａＭＤＣ１タンパク質は、約２３ｋＤａからなり、Ｎ末端にシグナル配列を持ち、オリザシスタチンに代表される植物シスタチンと相同なシスタチンドメイン（ドメインＩ）と、植物シスタチンに低い相同性を示すシスタチン様ドメイン（ドメインＩＩ）の２つのドメインを有する（図１において灰色背景で示す）。推定ドメインＩ（４０〜１２９番、図１）は、他の植物シスタチンのＣＹドメインとアライメントをとった場合に９９．１％の同一性を示した。また、Ｇｌｙ４３、反応部位モチーフＱＸＶＸＧ（Ｑ８６Ｔ８７Ｖ８８Ａ８９Ｇ９０）、Ｗ１１７モチーフ、及びフィトシスタチンにおいて高度に保存されているＬＡＲＦＡＶモチーフ等を含むシステインプロテアーゼ阻害活性に必要な高度に保存されたモチーフの全てを含んでいた（図１において黒背景と白抜き文字で示す）。Ｃ末端伸長部分を形成するＴａＭＤＣ１の推定ドメインＩＩ（１５０〜２１０番、図１）は、他の植物シスタチンのＣＹドメインとは部分的にしか一致せず（５７％）、上記の保存されているモチーフはこのドメインＩＩにおいて見出されなかった。
【００１９】
ＴａＭＤＣ１タンパク質は、シスタチン活性、すなわちプロテアーゼ阻害活性（パパイン阻害）を有し、かつ抗菌活性を有する。この抗菌活性は、糸状菌の１種である紅色雪腐病菌（Microdochium nivare）に対して５０μｇ／ｍｌの低濃度でほぼ完全に菌体の生長を阻害する程度の強力な活性である。ここで、ＴａＭＤＣ１タンパク質のドメインＩはシスタチン活性及び抗菌活性の両方を示し、ドメインＩＩはシスタチン活性を示さないが抗菌活性を示すものである。従って、ＴａＭＤＣ１タンパク質のドメインＩＩを含むポリペプチドは、プロテアーゼを阻害せずに抗菌活性を示すものとなる。
【００２０】
また、後述する実施例においては、ＴａＭＤＣ１タンパク質が、低温順化の過程でその発現が誘導されること、塩、乾燥及びアブシジン酸（ＡＢＡ）処理下においても発現が誘導されることが確認されたので、ＴａＭＤＣ１タンパク質は、低温、塩、乾燥及びアブシジン酸などの非生物ストレスに対する抵抗性にも関与している可能性がある。
【００２１】
（２）遺伝子のクローニング
本発明において、ＴａＭＤＣ１タンパク質をコードする遺伝子は、植物組織から抽出したＲＮＡから精製したｍＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ若しくはｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングを行うことによりコムギのシュート、冠組織又は葉組織から得ることができる。特に、ＴａＭＤＣ１遺伝子の発現は低温順化の過程で誘導されるため、低温順化したコムギのシュート、冠組織又は葉組織からＲＮＡを抽出することが好ましい。ただし、本発明の遺伝子の供給源となる植物は、コムギのシュート、冠組織及び葉組織に限定されるものではなく、例えば成長した植物体、植物器官（例えば葉、花弁、茎等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）、又は植物培養細胞（例えばカルス）などであってもよい。さらに本発明の遺伝子の供給源とする植物は、コムギ属（Triticum）に属する植物であれば、特に限定されるものではなく、例えばコムギ（Triticum aestivum）、特に冬コムギが好ましい。
【００２２】
コムギからのｍＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡライブラリーの作製は常法に従って行うことができる。
【００２３】
ｍＲＮＡの調製は、通常行われる手法により行うことができる。例えば、上記供給源から、グアニジウムチオシアネート−トリフルオロ酢酸セシウム法などにより全ＲＮＡを抽出した後、オリゴｄＴ−セルロースやポリＵ−セファロース等を用いたアフィニティーカラム法により、あるいはバッチ法によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を得ることができる。さらに、ショ糖密度勾配遠心法等によりポリ（Ａ）＋ＲＮＡをさらに分画してもよい。
【００２４】
このようにして得られたｍＲＮＡを鋳型として、オリゴｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した後、該一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成する。次に、得られた二本鎖ｃＤＮＡを適当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。そしてこの組換えベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性等を指標として形質転換体を選択することにより、ｃＤＮＡのライブラリーを得ることができる。また、プラスミド以外のクローニングベクター、例えばλファージ（λｇｔ１１等）を用いることもできる。
【００２５】
上記のようにして得られる形質転換体から目的のＤＮＡを有する株を選択するには、例えば、配列番号１に示される塩基配列に基づいて設計したプライマー（例えば配列番号３及び４）を合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、得られた断片をプローブとして、ｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法などを行うことができる。
【００２６】
このようにして得られたＤＮＡ増幅断片を、３２Ｐ、３５Ｓ又はビオチン等で標識してプローブとし、これを形質転換体のＤＮＡを変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られたポジティブ株を検索することによりスクリーニングすることができる。
【００２７】
次に、得られたクローンから全長のｃＤＮＡをクローニングする。ｃＤＮＡのクローニングには、例えばＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA ends）法が用いられる。ＲＡＣＥ法とは、ｃＤＮＡの５’又は３’欠失部位をＰＣＲにより迅速に回収する方法である。なお、ＲＡＣＥ法は、市販のキット（MarathonTMcDNA Amplification Kit（Clonetech社））を用いて行うこともできる。
【００２８】
上記スクリーニングにおいて得られたｃＤＮＡの単離クローンについて、ＰＣＲ産物をテンプレートにしてｃＤＮＡの塩基配列を決定し、確認する。
【００２９】
（３）塩基配列及びアミノ酸配列
配列番号１に、ＴａＭＤＣ１タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を、配列番号２にＴａＭＤＣ１タンパク質のアミノ酸配列を例示する。ＴａＭＤＣ１タンパク質の成熟形態は配列番号２に示されるアミノ酸配列の３８〜２４３番目のアミノ酸配列に相当すると推定され、配列番号１に示される塩基配列の１６６〜７８６番目の塩基配列によってコードされる。本発明においては、上記アミノ酸配列を含むタンパク質が抗菌活性を有する限り、当該アミノ酸配列において複数個、好ましくは１若しくは数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
【００３０】
例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列の３８〜２４３番目のアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号２で表わされるアミノ酸配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号２で表されるアミノ酸配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。
【００３１】
抗菌活性の有無を確認するには、ＴａＭＤＣ１タンパク質を精製し、各種菌株の生育培地に添加して、その増殖抑制効果を確認すればよい。使用する病原菌としては、限定されるものではないが、雪腐病菌、例えば紅色雪腐病菌（Monographella nivalis）、褐色雪腐病菌（Pythium iwayamai, P. paddicum等）、雪腐小粒菌核病菌（Typhula incarnata, T. ishikarienis）、雪腐大粒菌核病菌（Sclerotinia borealis）などが挙げられる。
【００３２】
一旦遺伝子の塩基配列が確定されると、その後は化学合成によって、又はクローニングされたｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、あるいは該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイズさせることによって、遺伝子を得ることができる。さらに、部位特定変異誘発等によってＴａＭＤＣ１タンパク質をコードする修飾された核酸を合成することもできる。なお、遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。例えば部位特異的突然変異誘発法を利用した市販の変異導入用キットなどを用いて変異の導入が行われる。また、エラー導入ＰＣＲやＤＮＡシャッフリング等の手法により、遺伝子の変異導入やキメラ遺伝子を構築することもできる。エラー導入ＰＣＲ及びＤＮＡシャッフリング手法は、当技術分野で公知の手法であり、例えばエラー導入ＰＣＲについてはChen K, and Arnold FH. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90: 5618-5622を、またＤＮＡシャッフリングについてはStemmer, W. P. 1994, Nature, 370:389-391及びStemmer W. P., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91: 10747-10751を参照されたい。
【００３３】
変異した遺伝子により作製される組換えタンパク質が目的の機能（抗菌活性）を有するか否かは、変異遺伝子で形質転換体において発現させ、得られる組換えタンパク質の抗菌活性を、上述したように測定することにより確認することができる。
【００３４】
さらに、配列番号１に示される塩基配列の２６６〜７８６番目の塩基配列からなる核酸の全部又は一部の配列に相補的な配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗菌活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も本発明の遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。
【００３５】
（４）ＴａＭＤＣ１におけるシスタチンドメイン及びシスタチン様ドメイン
また本発明は、ＴａＭＤＣ１タンパク質のシスタチンドメイン（ドメインＩ）又はシスタチン様ドメイン（ドメインＩＩ）を含むポリペプチド（以下シスタチンドメインポリペプチドとも称する）に関する。ＴａＭＤＣ１タンパク質のドメインＩは、シスタチン活性、すなわちプロテアーゼ阻害活性（パパイン阻害）と抗菌活性の両方を示す。一方、ドメインＩＩは、シスタチン活性を示さないが抗菌活性を示す。従って、ＴａＭＤＣ１タンパク質のドメインＩを含むポリペプチド、及び／又はドメインＩＩを含むポリペプチドもまた有用である。特に、ＴａＭＤＣ１タンパク質のドメインＩＩを含むポリペプチドは、プロテアーゼを阻害せずに抗菌活性を示すため、摂取された場合に生物体内での消化不良等の影響が回避される。従って、植物において発現させることを意図した場合に、その植物の可食部に組換えタンパク質が蓄積・残留しても生物への影響が少なく、また食品・医薬品添加物として利用される場合に有用である。
【００３６】
ＴａＭＤＣ１タンパク質の推定ドメインＩは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の４０〜１２９番目のアミノ酸からなり、推定ドメインＩＩは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１５０〜２１０番目のアミノ酸からなる。従って、本発明のポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の４０〜１２９番目のアミノ酸、及び／又は１５０〜２１０番目のアミノ酸を含む。ただし、ポリペプチドが抗菌活性を有する限り、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００３７】
また、ＴａＭＤＣ１タンパク質のドメインＩ及びドメインＩＩをコードする核酸を提供する。かかる核酸は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の４０〜１２９番目のアミノ酸を含むポリペプチド、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の４０〜１２９番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗菌活性を有するポリペプチドをコードするものである。例えば、ＴａＭＤＣ１タンパク質のドメインＩをコードする核酸としては、配列番号１に示される塩基配列の１７２〜４４１番目の塩基配列からなる核酸、及び配列番号１に示される塩基配列の１７２〜４４１番目の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗菌活性を有するポリペプチドをコードする核酸を例示することができる。また、ＴａＭＤＣ１タンパク質のドメインＩＩをコードする核酸としては、例えば配列番号１に示される塩基配列の５０２〜６８４番目の塩基配列からなる核酸、及び配列番号１に示される塩基配列の５０２〜６８４番目の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗菌活性を有するポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
【００３８】
さらに、上記ドメインＩＩの範囲をさらに縮小化し、かつ抗菌活性を保持する縮小化ドメインＩＩも提供する。本明細書中、「縮小化ドメインＩＩ」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１４９〜１９８番目のアミノ酸からなる。従って、本発明のポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１４９〜１９８番目のアミノ酸を含むものであってもよい。ただし、ポリペプチドが抗菌活性を有する限り、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００３９】
また、上記縮小化ドメインＩＩをコードする核酸を提供する。かかる核酸は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１４９〜１９８番目のアミノ酸を含むポリペプチド、又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の１４９〜１９８番目のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、抗菌活性を有するポリペプチドをコードするものである。例えば、縮小化ドメインＩＩをコードする核酸としては、配列番号１に示される塩基配列の４９９〜６４８番目の塩基配列からなる核酸、及び配列番号１に示される塩基配列の４９９〜６４８番目の塩基配列に相補的な配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、抗菌活性を有するポリペプチドをコードする核酸を例示することができる。
【００４０】
２．抗体
本発明においては、ＴａＭＤＣ１タンパク質又はシスタチンドメインポリペプチドに対する抗体を作製し、使用することができる。本発明において「抗体」とは、抗原であるタンパク質又はその部分ペプチドに結合可能な抗体分子全体又はそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメントなど）を意味し、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。本発明において、抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体）は例えば以下の手法により作製することができる。
【００４１】
抗体作製のための免疫原としては、全長のＴａＭＤＣ１タンパク質又はシスタチンドメインポリペプチドを使用してもよいし、あるいはそれらの部分ペプチドを使用してもよい。部分ペプチドの例としては、限定するものではないが、例えば配列番号２に示されるアミノ酸配列の５５〜７０番のアミノ酸配列などを含むペプチドが挙げられる。免疫原は、タンパク質又はその部分ペプチドを緩衝液に溶解して調製し、必要であれば、免疫を効果的に行うためにアジュバント（完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント等）を添加してもよい。
【００４２】
ポリクローナル抗体を作製する場合は、免疫原を、哺乳動物、例えばウサギ、ラット、マウスなどに投与する。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内に注入することにより行われる。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、１〜５回の免疫を行う。その後、最終の免疫日から一定期間経過後に、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ又はＥＩＡ、ＲＩＡ）等で抗体価を測定し、最大の抗体価を示した日に採血し、抗血清を得る。その後は、抗血清中のポリクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡ法などで測定する。
【００４３】
モノクローナル抗体を作製する場合は、免疫原を、ポリクローナル抗体の場合と同様に哺乳動物、例えばウサギ、ラット、マウスなどに投与する。そして、最終の免疫日から一定期間経過後に抗体産生細胞（脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞等）を採集し、ミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを作製する。細胞融合は、血清を含まない動物細胞培養用培地中で、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合し、細胞融合促進剤（例えばポリエチレングリコール等）の存在のもとで融合反応を行う。また、エレクトロポレーションを利用した市販の細胞融合装置を用いて細胞融合させることもできる。
【００４４】
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。また、ハイブリドーマの培養上清中に、ＴａＭＤＣ１タンパク質又はシスタチンドメインポリペプチドに反応する抗体が存在するか否かをスクリーニングする。ハイブリドーマのスクリーニングは、通常の方法に従えばよく、例えば酵素免疫測定法、放射性免疫測定法等を採用することができる。融合細胞のクローニングは、限界希釈法等により行い、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを樹立する。
【００４５】
樹立したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法として、通常の細胞培養法又は腹水形成法等を採用することができる。上記抗体の採取方法において抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【００４６】
上述のようにして得られたＴａＭＤＣ１タンパク質又はシスタチンドメインポリペプチドに対する抗体は、これらのタンパク質の精製及び検出などに使用することができる。
【００４７】
３．組換えベクター及び形質転換体
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに上記遺伝子（核酸）を連結（挿入）することにより得ることができる。本発明で使用するベクターとしては、宿主中で複製可能なもの又は目的の核酸を宿主ゲノムに組み込み可能なものであれば特に限定されない。例えば、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどが挙げられる。
【００４８】
プラスミドＤＮＡとしては、放線菌由来のプラスミド（例えばｐＫ４，ｐＲＫ４０１，ｐＲＦ３１等）、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９，ｐＵＣ１８等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３，ＹＥｐ２４，ＹＣｐ５０等）などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。また、アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター（ｐＢＩ１２１等）を使用することができる。
【００４９】
ベクターにＤＮＡ（核酸配列）を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００５０】
核酸は、ＴａＭＤＣ１タンパク質又は又はシスタチンドメインポリペプチドが発現されるようにベクターに組み込まれることが必要である。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、核酸配列のほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。
【００５１】
形質転換体は、ＴａＭＤＣ１タンパク質をコードする核酸、シスタチンドメインポリペプチドをコードする核酸、又はそれらの核酸を含む組換えベクターを、当該タンパク質又はポリペプチドが発現し得るように宿主細胞に導入することにより得ることができる。
【００５２】
形質転換に使用する宿主としては、タンパク質又はポリペプチドを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、酵母、植物細胞、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
【００５３】
細菌を宿主とする場合は、組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、ＴａＭＤＣ１タンパク質又はシスタチンドメインポリペプチドをコードする核酸、転写終結配列により構成されていることが好ましい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・コリ（Escherichia coli）ＤＨ５αなどが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）などが挙げられる。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
【００５４】
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）などが用いられる。酵母への組換えベクターの導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
【００５５】
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞等が用いられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
【００５６】
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。
【００５７】
また、本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子等）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織等）又は植物培養細胞のいずれをも意味するものである。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱又は双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。単子葉植物綱及び双子葉植物綱に属する植物の例を以下に示すが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
（単子葉植物綱）
イネ科：イネ（Oryza sativa）、コムギ（Triticum aestivum）、オオムギ（Hordeum vulgare）、トウモロコシ（Zea mays）、ペレニアルライグラス（Lolium perenne L.）、オーチャードグラス（Dactylis glomerata L.）、メドウフェスク（Festuca pratensis Huds.）等の芝草類など
サトイモ科：サトイモ（Colocasia esculenta）、コンニャク（Amorphophallus rivieri）等
パイナップル科：パイナップル（Ananas comosus）等
ヤシ科：ココヤシ（Cocos nucifera）等
ユリ科：ネギ（Allium fistulosum）、タマネギ（Allium cepa）、ニンニク（Allium sativum）、アスパラガス（Asparagus officinalis）、カタクリ（Erythronium Japonicum）等
【００５９】
（双子葉植物）
アカザ科：ホウレンソウ（Spinacia oleracea）、テンサイ（Beta vulgaris）等
アブラナ科：キャベツ、コマツナ、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、アブラナ(Brassica campestris L.)、ハクサイ(Brassica pekinensis Rupr.)、ダイコン(Raphanus sativus L.)、ナタネ(Brassica campestris L., B. napus L.)等
ウリ科：キュウリ（Cucumis sativus）、メロン（Cucumis melo）、スイカ（Citrullus lanatus）等
キク科：レタス（Lactuca sativa）、ゴボウ（Arctium lappa）、ベニバナ（Carthamus tinctorius）等
コショウ科：コショウ（Piper nigrum）等
シソ科：セージ（Salvia officinalis）、バジル（Ocimum basilicum）等
ナス科：ナス（Solanum melongena）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、トマト（Lycopersicum esculentum）、ピーマン（Capsicum annuum）、タバコ（Nicotiana tabacum）等
バラ科：ウメ（Prunus mume）、モモ（Prunus persica）、リンゴ（Maluspumila var.domestica）、イチゴ（Fragaria x ananassa）等
ヒルガオ科：サツマイモ（Ipomonea batatas）等
ブドウ科：ブドウ（Vitis vinifera, Vitis labrusca）等
マメ科：エンドウ（Pisum sativum）、ソラマメ（Vicia faba）、ラッカセイ（Arachis hypogaea）、ダイズ（Glycine max）、アズキ（Vigna angularis）等
ミカン科：ウンシュウミカン（Citrus unshiu）、グレープフルーツ（Citrus paradisi）、レモン（Citrus limon）等。
【００６０】
本発明において形質転換対象となる植物は、イネ科に属する植物、特に雪腐病菌に対する抵抗性を付与することが望まれる植物、例えばコムギ、オオムギ、芝草類であることが好ましい。
【００６１】
上記組換えベクターは、通常の形質転換方法、例えばアグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等によって植物中に導入することができる。例えばアグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム、例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著，植物遺伝子操作マニュアル，１９９０，２７−３１ｐｐ，講談社サイエンティフィック，東京）等に従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。
【００６２】
また、パーティクルガン法を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）等）を用いて処理することができる。処理条件は植物又は試料により異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。
【００６３】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターをパーティクルガン法、エレクトロポレーション法等で培養細胞に導入する。
【００６４】
形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養又は器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライド等）の投与などにより植物体に再生させることができる。
【００６５】
遺伝子が宿主に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、形質転換体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光又は酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用することができる。あるいは、薬剤による形質転換体の選抜を行ってもよい。
【００６６】
４．タンパク質・ポリペプチドの製造
本発明のＴａＭＤＣ１タンパク質及びシスタチンドメインポリペプチドは、前述したコムギから当技術分野で公知のタンパク質の精製方法によって製造することができる。また、当技術分野で公知の化学的ペプチド合成方法、例えば固相合成法などによって製造することもできる。また、ＴａＭＤＣ１タンパク質又はシスタチンドメインポリペプチドをコードする核酸が導入された形質転換体を培養し、得られる培養物から該タンパク質を回収することによっても製造することができる。このような遺伝子工学的手法を利用したタンパク質の生産方法は当技術分野で周知であり、以下に具体的に説明する。
【００６７】
本発明のＴａＭＤＣ１タンパク質及びシスタチンドメインポリペプチドは、前記形質転換体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞若しくは培養菌体又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
【００６８】
大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。
【００６９】
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、２０〜３７℃で１２時間〜３日間行う。
【００７０】
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で６時間〜４日間行う。
【００７１】
培養後、本発明のタンパク質又はポリペプチドが菌体内又は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより上記タンパク質を採取する。また、当該タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精製することができる。
【００７２】
５．抵抗性植物
前記ＴａＭＤＣ１タンパク質をコードする遺伝子、若しくはＴａＭＤＣ１のシスタチンドメインポリペプチドをコードする遺伝子、又は組換えベクターを植物に導入すると、得られる形質転換植物は、病原菌、特に雪腐病菌に対する抵抗性を獲得する。従って、当該形質転換植物は、病原菌抵抗性植物として使用することができる。ここで、「病原菌」とは、植物の病害の原因となる細菌、真菌などを意味する。本発明において病原菌は、細菌及び真菌であれば特に限定されるものではないが、例えば糸状菌である雪腐病菌、イネイモチ病菌（Magnaporthe grisea）、コムギ赤カビ病菌（Fusarium graminearum）、細菌であるイネ白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae）等が挙げられる。雪腐病菌には、例えば紅色雪腐病菌（Monographella nivalis）、褐色雪腐病菌（Pythium iwayamai, P. paddicum等）、雪腐小粒菌核病菌（Typhula incarnata, T. ishikarienis）、雪腐大粒菌核病菌（Sclerotinia borealis）などが含まれる。さらに、得られる形質転換植物は、低温、塩及び乾燥などの非生物ストレスに対する抵抗性も獲得しうる。ここで、「抵抗性」とは、病原菌や非生物ストレスに対し抵抗性を示す、すなわち、病原菌若しくは非生物ストレスによる影響を低減させるか、又は全く影響を受けないことによって、植物が生存、栄養生長、生殖生長などを継続することができることを意味する。
【００７３】
本発明の形質転換植物の病原菌抵抗性は、以下の方法によって検定することができる。例えば、得られた形質転換植物の葉に針等で傷を付け（Ｍｏｃｋ処理）、病原菌を含む菌液を接種し、感染によって傷害を受けた部分の面積を、同様に処理した非形質転換植物のものと比較することにより、形質転換植物の抵抗性を検定することができる。当業者であれば、検定条件が検定される植物種及び病原菌種により変更しうることは明らかである。検定の際に、組織又は細胞を固定した後又は生きた状態のまま、アニリンブルー（Eschrich W.及びCurrier H.B., (1964) Stain Technology 39, 303-307）等の色素で染色することによってさらに容易に比較することができる。あるいは、形質転換植物から得られる種子を、病原菌液に浸漬した後に土壌に蒔き、発芽及び生育させて、正常に生育する個体数と、同様に処理した非形質転換植物の種子から生育する個体数とを比較することによって調べることもできる。その他、形質転換した植物細胞及び非形質転換植物の細胞を病原菌を加えた培地で所定の期間（例えば、６時間〜５日）培養し、その生存数を比較することによって検定してもよい。本発明の形質転換植物の病害抵抗性の検定方法は、上記に限定されない。
【００７４】
また、本発明の形質転換植物の非生物ストレス抵抗性は、得られた形質転換植物を非生物ストレスの存在下で発芽、生育又は花芽形成などさせて、正常な個体数と、同様に処理した非形質転換植物の個体数とを比較することによって調べることができる。
【００７５】
本発明の抵抗性植物は、ＴａＭＤＣ１タンパク質をコードする核酸若しくはシスタチンドメインポリペプチドをコードする核酸、又はそれらの核酸を含む組換えベクターを導入した形質転換植物（トランスジェニック植物）を、抵抗性植物として使用し得る程度に育種することにより作出することができる。この場合、植物にとって上記各種病害又は非生物ストレスが生じる条件において枯死等をせずに抵抗性を示す植物を選抜すればよい。抵抗性植物としての使用開始時期は、形質転換直後であっても、形質転換後に１日〜約９０日間培養又は栽培した後であってもよい。
【００７６】
また、本発明の抵抗性植物は、交配（例えば、自家受粉、形質転換植物間での受粉、又は形質転換植物と非形質転換植物との間の受粉）により繁殖のための種子を形成させることができる。
【００７７】
さらに、上記の感染細胞からの植物体の分化／誘導の手順を用いて、形質転換された植物体の組織（例えば、根、茎、葉）又は器官（例えば、生長点、花粉）の組織培養によって、生殖過程（種子）を介することなく、さらなる形質転換植物を得ることができる。このような技術及び手順は当業者には公知であり、組織培養の一般的な方法は、種々の実験マニュアルに記載されている。
【００７８】
このようにして得られた本発明の抵抗性植物は、正常に生育し、かつＴａＭＤＣ１タンパク質又はシスタチンドメインポリペプチドの発現によって病原菌又は非生物ストレスに対して高い抵抗性を示す。さらに、形質転換植物から得られる種子もまた正常に発芽及び成長し、そして高い抵抗性を示す。これは導入された核酸又は組換えベクターが次世代においても保存されることを示し、それゆえ上記抵抗性が安定して後代に受け継がれることを示す。従って、本発明により、高い抵抗性を示す実用的で有用な植物が得られる。
【００７９】
６．抗菌剤
ＴａＭＤＣ１タンパク質及び該タンパク質のＣＹドメインポリペプチドは、病原菌に対する抗菌活性を有する。従って、ＴａＭＤＣ１タンパク質及びシスタチンドメインポリペプチド、該タンパク質又はポリペプチドをコードする核酸、該核酸を含む組換えベクター、形質転換体などは、抗菌剤として使用することができる。
【００８０】
本発明に係る抗菌剤は、上記のタンパク質若しくはポリペプチド、核酸、組換えベクター又は形質転換体のうち、１種のみを単独で含有してもよいし、複数種を含有してもよい。また本発明の抗菌剤は、他の抗菌剤及び／又は添加剤などをさらに含有するものであってもよい。このような他の抗菌剤及び添加剤は、本発明の抗菌剤に含まれる成分の抗菌活性を低減させるものでなければ任意のものを使用することができる。
【００８１】
本発明の抗菌剤の形態は特に限定されず、ＴａＭＤＣ１タンパク質又はシスタチンドメインポリペプチドを適当な溶媒中に溶解若しくは懸濁することにより液剤として、又は粉剤若しくは錠剤として調製することも可能である。また上記形質転換体を培養して得られる培養物をそのまま本発明の抗菌剤として使用することもできる。
【００８２】
液剤において使用可能な溶媒もまた特に限定されないが、例えば、水、メタノール、ジメチルスルホキシドなどが挙げられる。液剤として調製する場合、有効成分の濃度は、抗菌活性を発揮できる範囲であれば特に限定されない。また本発明の抗菌剤を粉剤又は錠剤として調製する場合には、上記タンパク質、ポリペプチド、核酸等の他、無機塩、糖類、タルク、バーミュライトなどの当業者に公知の粉末を適宜選択して混合し、粉剤又は錠剤とすることができる。
【００８３】
本発明の抗菌剤を適用する対象としては、特に限定されるものではないが、病原菌が発生する植物（例えばイネ科に属する植物、好ましくはコムギ、オオムギ、芝草類など）、植物が生育する田畑、庭園、湖沼などが挙げられる。
【００８４】
本発明の抗菌剤は、対象となる植物に直接散布する、又は領域に直接散布する若しくは植物を生育する容器を抗菌剤に浸漬するなどにより使用することができる。使用量は、対象の種類、周囲の環境などにより左右される。
【００８５】
本発明の抗菌剤により殺菌される又は生育が抑制される病原菌としては細菌及び真菌などが含まれるが、本発明の抗菌剤は、特に糸状菌である雪腐病菌に対して効果がある。雪腐病菌には、例えば紅色雪腐病菌（Monographella nivalis）、褐色雪腐病菌（Pythium iwayamai, P. paddicum等）、雪腐小粒菌核病菌（Typhula incarnata, T. ishikarienis）、雪腐大粒菌核病菌（Sclerotinia borealis）などが含まれる。
【００８６】
本発明の抗菌剤は、コムギ由来のタンパク質及び該タンパク質のドメインからなるポリペプチドなどであり、環境にやさしく安全性に優れた抗菌剤として農薬及び医薬分野において広範な利用が期待される。
【００８７】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００８８】
本実施例においては、コムギから抗菌性タンパク質を単離することを試みた。
（１）植物材料及び低温順化
冬コムギ（Triticum aestivum L. cv. Chihoku）の表面を滅菌し、発芽後に市販の土壌混合物に植えた。植物は、発育室において２２℃／１８℃（１６時間照明／８時間暗室）で１４日間成長させた。低温順化は、６℃／２℃（８時間照明／１６時間暗室）でさらに２週間実施した。低温順化の解除については、２２℃／１８℃（１６時間照明／８時間暗室）で３日間成長させた。
【００８９】
冠部及び葉の組織を、順化前（非順化（ＮＡ）、０日）、低温順化（ＣＡ）の１、３、７、１０、１４日目、順化解除（ＤＡ）の１及び３日目に採取した。採取した植物材料を液体窒素で凍結し、ＲＮＡ及びタンパク質の抽出まで−８０℃で保存した。
【００９０】
（２）ｃＤＮＡの単離と配列分析
低温順化した冠組織から構築したｃＤＮＡライブラリーにおける低温調節ｃＤＮＡクローンのスクリーニングは、マクロアレイ手法を用いて実施した。
【００９１】
具体的に説明すると、上述の方法により低温馴化処理した冬コムギ（Triticum aestivum L. cv. Chihoku）冠部組織よりＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）を用いて全ＲＮＡを抽出し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（DYNAL）を用いてｍＲＮＡを精製した。ZAP express cDNA synthesis Kit（Stratagene）を用いてｃＤＮＡライブラリーを製造者指定方法により作製した。
【００９２】
ｃＤＮＡクローンからのプラスミドＤＮＡを変性し、真空イムノブロッター（Atto, Tokyo, Japan）を用いてＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋膜（Amersham Biosciences）上にスロットブロットした。続いて、膜をＵＶ固定し、ＮＡ及びＣＡ冠組織から単離したｍＲＮＡから合成した二本鎖ｃＤＮＡとハイブリダイズさせ、Ａｌｋ Ｐｈｏｓ Ｄｉｒｅｃｔ Ｋｉｔ（Amersham Biosciences）で標識した。ハイブリダイゼーション及び膜の洗浄は、製造業者のプロトコールに従って行った。シグナルの検出及び定量は、Ａｒｒａｙ Ｇｒａｎｄｅｕｒソフトウエアを用いてＬＡＳ３０００イメージアナライザー（Fuji Film, Tokyo, Japan）により実施した。低温によりアップレギュレートされたクローンを、Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit v 1.1 v 3.1（Applied Biosystem）を用いてＤＮＡシーケンサー３７３Ａ（Applied Biosystem, San Jose, CA）で配列決定した。配列決定データの分析は、ＳＴＡＤＥＮ ＰＡＫＡＧＥソフトウエアで行い、配列アライメントはＣＬＵＳＴＡＬ Ｘで行った。多遺伝子系統樹は、近隣結合法を用いて求め、Ｔｒｅｅ Ｖｉｅｗソフトウエアにより表示した。
【００９３】
得られたクローンの遺伝子は、ＢＬＡＳＴＸのサーチによって、植物シスタチンファミリーの新規クラスに属することが判明した。この遺伝子をＴａＭＤＣ１と命名した。ｃＤＮＡクローンの塩基配列及び推定アミノ酸配列は図１、並びにそれぞれ配列番号１及び２に示す。図１において、下線のコドンは翻訳開始コドンを示し、星印は終止コドンを示す。全長ｃＤＮＡクローンは９９８ヌクレオチドを含み、ポリＡテールを含まず、７３１ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを有し、３’非翻訳領域に１つの推定ポリアデニル酸付加シグナルを有する（図１の塩基配列中の下線部分）。コードされる２４３アミノ酸のタンパク質は、３７アミノ酸の推定Ｎ末端分泌シグナルを有する（図１のアミノ酸配列中の下線部分）。前駆タンパク質の推定分子量は２６，４７７Ｄａであり、成熟タンパク質は２３，３２５Ｄａである。
【００９４】
ＣＤＤサーチ（Marchler-Bauer, A., J. B. Anderson, et al. (2005). Nucleic Acids Res 33 Database Issue: D192-6）を推定アミノ酸配列を用いて行ったところ、保存されているシスタチン様ドメイン（ＣＹドメイン；ｓｍａｒｔ０００４３）と相同性を示す２つのドメインが同定された（図１において灰色背景で示す）。最初の推定ドメイン（４０〜１２９番、図１）は、ＣＹドメインとアライメントをとった場合に９９．１％の同一性を示した。また、Ｇｌｙ４３、反応部位モチーフＱＸＶＸＧ（Ｑ８６Ｔ８７Ｖ８８Ａ８９Ｇ９０）、Ｗ１１７モチーフ、及びフィトシスタチンにおいて高度に保存されているＬＡＲＦＡＶモチーフ等を含むシステインプロテアーゼ阻害活性に必要な高度に保存されたモチーフの全てを含んでいた（図１において黒背景と白抜き文字で示す、Arai, S., et al. 1991, J. Biochem. (Tokyo) 109: 294-8；Margis et al. 1998, Arch Biochem Biophys 359: 24-30）。Ｃ末端伸長部分を形成するＴａＭＤＣ１の第２の推定ドメイン（１５０〜２１０番、図１）は、保存されているＣＹドメインとは部分的にしか一致せず（５７％）、上記の保存されているモチーフはこのドメインにおいて見出されなかった。
【００９５】
ＢＬＡＳＴＰサーチをＴａＭＤＣ１タンパク質の推定アミノ酸配列（配列番号２）を用いて行ったところ、他の植物シスタチンとの相同性が明らかになった。ＴａＭＤＣ１は無名のイネ由来シスタチン様タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿９１２９３５）とある程度の相同性を有し、８９％の同一性を示す。ＴａＭＤＣ１と公知の植物シスタチンとを比較した結果を図２に示す。図２において、黒塗りは同一の残基を示し、灰色は部分的に保存されている残基を示す。図２に示すアライメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムにより行い、ＧｅｎｅＤｏｃソフトウエアを用いて色を付した。
【００９６】
図２に示すように、ダイズシスタチン（ＢＡＡ１９６０８）と６７％、リンゴシスタチン（ＡＡＯ１９６５２）と６８％、タロイモ由来シスタチン（ＡＡＭ８８３９７）と６０％、キャベツシスタチン（ＡＡＣ３７４７９）と６４％の同一性を示した（図２）。イネ由来のシスタチンとＴａＭＤＣ１との相同性は、オリザシスタチンＩ（ＯＣＩ；ＡＡＡ３３９０３）とは５９％同一性（７１％類似性）、オリザシスタチンＩＩ（ＯＣＩＩ；ＡＡＡ３３９１１）とは５３％同一性（７０％類似性）を有する（図２）。ＴａＭＤＣ１と他の報告されているコムギシスタチンとの同一性は、コムギシスタチンＷＣ１（ＢＡＢ１８７６６）、ＷＣ２（ＢＡＢ１８７６９）、ＷＣ３（ＢＡＢ１８７６８）及びＷＣ４（ＢＡＢ１８７６７）と５４％、５５％、５５％、及び４７％の同一性であり、ＷＣ５（ＡＡＬ５６４０１）とはわずかに３２％の同一性を有する。また、ＴａＭＤＣ１は、ＷＣ１〜ＷＣ５とは、それぞれ７０％、７３％、７１％、６２％及び５１％の相同性を有する。
【実施例２】
【００９７】
本実施例では、ＴａＭＤＣ１タンパク質をコードする遺伝子を用いて、大腸菌において組換え発現させた。
【００９８】
ＴａＭＤＣ１ ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅を、ｐＧＥＸ６Ｐ−３発現ベクター（Amersham Biosciences, UK）にクローニングするためのＢａｍＨＩ及びＸｍａＩ部位を組み込む特異的プライマーを用いて行った。使用したプライマーは、センスプライマー（5'-GGATCC GCCATGGCCAGCCACGTCCT-3'；配列番号３）とアンチセンスプライマー（5'-CCCGGG TCACTGGCTGCTAGATTCGT-3'；配列番号４）である。得られる構築物を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の形質転換に使用した。組換えタンパク質（ＧＳＴ−ＴａＭＤＣ１）の精製は、グルタチオン−セファロース４Ｂカラム（Amersham Biosciences, UK）により実施し、融合物ＧＳＴ−ＴａＭＤＣ１はＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（登録商標）プロテアーゼ（Amersham Biosciences）を用いて４℃にて１６時間かけて消化した（ＧＳＴを切除した）。精製されたタンパク質を、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−１０カラム（Millipore Corporation, USA）により濃縮し、ＢｉｏＲａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（BioRad Laboratories, USA）を用い、ＢＳＡを基準として使用して濃度を測定した。タンパク質サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、標準的なプロトコールを用いてクーマシーブルー色素で染色した。
【００９９】
その結果を図３に示す。図３において、レーン１は総タンパク質画分、レーン２はＩＰＴＧ誘導の１時間後の総タンパク質画分、レーン３は可溶性画分、レーン４は精製シスタチン、レーンＭは低分子量ペプチド基準を示す。
【０１００】
ＴａＭＤＣ１の推定成熟形態（ｍＴａＭＤＣ１）は、推定疎水性シグナル配列（配列番号２におけるＭｅｔ１−Ａｌａ３５）を欠損し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において、ｐＧＥＸ６Ｐ３ベクターにおけるＮ末端ＧＳＴ融合物として発現された。なお、ｍＴａＭＤＣ１の発現のために、推定成熟部分（配列番号２の３８〜２４３番のアミノ酸）を含む配列番号２の３６〜２４３番のアミノ酸配列に基づいて発現ベクターを設計した。ＧＳＴ−ＴａＭＤＣ１融合タンパク質の発現は、ＩＰＴＧの添加により誘導した（図３、レーン２）。ＧＳＴ−ｍＴａＭＤＣ１融合タンパク質の大部分は可溶性画分において検出された（図３、レーン３）。またＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、分子量約２８ｋＤａの精製ＴａＭＤＣ１タンパク質の単一バンドの存在が示された（図３、レーン４）。
【実施例３】
【０１０１】
本実施例においては、成熟型ＴａＭＤＣ１タンパク質（ｍＴａＭＤＣ１）の酵素阻害アッセイ及びＫｉ値の測定を行った。
【０１０２】
ｍＴａＭＤＣ１（配列番号２における３８〜２４３番のアミノ酸を含む）によるパパイン（Sigma Chemical Co.）の酵素阻害は、Ｙｏｚａ（Yoza, K. et al. (2002). Biosci Biotechnol Biochem 66: 2287-91）により記載されている方法に従ってＢＡＰＡ（ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド；Peptide Institute Inc., Osaka, Japan）を基質として用いて行った。簡単に説明すると、種々の濃度のｍＴａＭＤＣ１のパパイン（０．１ｍｇ／ｍｌ）に対する阻害活性を、活性化バッファー（１００ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ６．８、２．５ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を用い、ＢＡＰＡ（１０ｍＭ）を基質として用いて分析した。酵素の活性化及びＢＡＰＡとのインキュベーションは、各ステップ１５分で３７℃にて行った。酵素反応の吸光度をＢｉｏＲａｄマイクロプレートリーダーを用いて４０５ｎｍにて測定した。酵素阻害反応は、分析したｍＴａＭＤＣ１の濃度それぞれについて３回試験を行った。パパインに対するｍＴａＭＤＣ１のＫｉ値はＥｘｃｅｌソフトウエアを用いてＬＢプロットから算出した。
【０１０３】
結果を図４に示す。図４は、ｍＴａＭＤＣ１のパパインに対する阻害活性を、ＢＡＰＡを基質として用いた場合の種々の濃度のインヒビター濃度における残りの酵素活性として表している。図４において縦の線は標準偏差を表す。ｍＴａＭＤＣ１の濃度を増加させて酵素の滴定を行ったところ、パパインは、等モル量のシスタチンにおいてほぼ全ての活性を喪失し、このことは、その相互作用機構が１対１であることを示唆している（図４）。
【０１０４】
パパインに対するｍＴａＭＤＣ１のＫｉ値は、４つの異なる基質濃度及び３つのインヒビター濃度の阻害曲線から計算した。Ｋｉの測定値はｍＴａＭＤＣ１について５．８×１０−７Ｍであり、他の植物シスタチン（１０−７〜１０−９Ｍ）に匹敵するものであった。
【実施例４】
【０１０５】
本実施例においては、植物におけるＴａＭＤＣ１タンパク質の発現を観察した。
（１）ノーザンブロット分析
実施例１において準備したコムギから総ＲＮＡを単離し、ノーザンブロット分析を行った。総ＲＮＡは、コムギのシュート、根及び冠組織から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）を用いて単離した。総ＲＮＡ（２０μｇ）を、ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲルで分離させ、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋膜（Amersham Biosciences）上に転写した。ハイブリダイゼーションは、製造業者の指示に従って、ＥＣＬキット（Amersham Biosciences）で標識した全長ＴａＭＤＣ１ ｃＤＮＡ（配列番号１における１〜１０３１番の塩基配列）を用いて行った。シグナルの検出及び定量は、ＬＡＳ３０００イメージアナライザー（Fuji Film, Tokyo, Japan）により実施した。
【０１０６】
結果を図５に示す。図５においては、短期間の低温処理（４℃）を行ったシュート組織（０〜４８時間）と、長期間の低温順化（０〜１４日間）と順化解除（２２℃、＋１、＋３日）を行った冠組織を示す。ＴａＭＤＣ１の蓄積は、７２時間において最大の誘導を示し、シュート及び冠組織において低温処理により強く誘導された（図５）。また発現レベルは、順化解除の１日後に未処理対照のレベルにまで戻った（図５、右側）。
【０１０７】
（２）ウエスタンブロット分析
実施例１で準備したＮＡ、ＣＡ及びＤＡコムギの冠組織及び葉組織を液体窒素で磨砕し、総タンパク質を、ＰＭＳＦ（１ｍＭ）及びＰＶＰＰを添加したリン酸ナトリウムバッファー（５０ｍＭ，ｐＨ７．５）を用いて抽出した。遠心分離後、ＢｉｏＲａｄタンパク質アッセイキット（BioRad Laboratories, USA）を用いて、ＢＳＡを基準として使用して、上清中のタンパク質濃度を測定した。抽出された総タンパク質（５０μｇ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ ｅｘｔｒａ膜（Amersham Biosciences）上に転写した。ハイブリダイゼーションは、組換えｍＴａＭＤＣ１（１：５０００ｖ／ｖ）に対して惹起されたポリクローナルウサギ血清、及び抗ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ結合抗体（１：１０００００ｖ／ｖ）（Amersham Biosciences）を用いて行った。抗ＴａＭＤＣ１抗体は、大腸菌より精製した組換えｍＴａＭＤＣ１を抗原としてウサギに免疫し、抗血清を得た。
【０１０８】
シグナルの検出は、ＥＣＬシステム（Amersham Biosciences）を用いて製造業者の指示に従って行った。
【０１０９】
結果を図６に示す。図６においては、低温順化（４℃、０〜１４日）及び順化解除（２２℃、＋１、＋３日）の小麦の冠組織及び葉組織の結果を示す。ＴａＭＤＣ１タンパク質の低温誘導蓄積は、精製ｍＴａＭＤＣ１に対して惹起されたポリクローナル抗血清によるウェスタンブロット分析により示された（図６）。１日目に明らかな誘導が検出され、最大タンパク質蓄積は冠組織において低温順化の７日及び１０日に観察された（図６、下）。タンパク質の発現は、２２℃における順化解除の３日目において対照レベルに戻った。ＴａＭＤＣ１タンパク質は、冠と比較して葉組織において蓄積が低かった（図６、下）。それにも関わらず、葉においても処理の３日後に明らかな誘導が観察された。
【実施例５】
【０１１０】
本実施例においては、植物における非生物ストレス処理によるＴａＭＤＣ１タンパク質の発現を観察した。
（１）非生物ストレス処理
冬コムギ（Triticum aestivum L. cv. Chihoku）の発芽種子を、蒸留水で容器を満たしたプラスチックメッシュ格子上で水栽培した。苗を成長室において連続照明下で２２℃で７日成長させた。続いて、それぞれ冷水（４℃）、５０μＭ アブシジン酸（ＡＢＡ）、若しくは２００ｍＭ ＮａＣｌを含む、又は水を含まないプラスチック容器に植物を移して、種々の非生物ストレス（低温、ＡＢＡ、塩、乾燥）について植物を試験した。シュート及び根の組織を、処理前（０時間）、並びにそれぞれのストレスでの処理の１、２、４、６、１０、２４及び４８時間後に、採取した。サンプルを液体窒素で凍結し、ＲＮＡ及びタンパク質の抽出まで−８０℃で保存した。
【０１１１】
（２）ノーザンブロット分析
種々の非生物ストレス処理におけるＴａＭＤＣ１の発現パターンはノーザンブロット分析により調べた。総ＲＮＡは、コムギのシュート及び根から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）を用いて単離した。総ＲＮＡ（２０μｇ）を、ホルムアルデヒドを含む１．２％アガロースゲルで分離させ、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋膜（Amersham Biosciences）上に転写した。ハイブリダイゼーションは、製造業者の指示に従って、ＥＣＬキット（Amersham Biosciences）で標識した全長ＴａＭＤＣ１ ｃＤＮＡを用いて行った。シグナルの検出及び定量は、ＬＡＳ３０００イメージアナライザー（Fuji Film, Tokyo, Japan）により実施した。
【０１１２】
結果を図７に示す。図７において、臭化エチジウムで染色したゲルは、同じＲＮＡサンプルを導入したものである。ＴａＭＤＣ１ ｍＲＮＡの蓄積は、ＡＢＡ処理により根において６時間目に誘導されたが、シュートにおける発現レベルは変化しないままだった（図７、上段）。ＡＢＡとは対照的に、塩及び乾燥処理により、シュート及び根の両方の組織においてＴａＭＤＣ１メッセージの発現が誘導された（図７、中段及び下段）。しかしながら、根における応答がより早くまた顕著であった。ＴａＭＤＣ１メッセージの有意な誘導は、塩処理の２時間と同様に根において観察されたが、シュートにおいては処理の１２時間後に誘導が検出された（図７、中段）。同様に、乾燥処理により、根においては処理の１０時間後に、シュート組織においては２４時間後に発現上昇が検出された（図７、下段）。従って、ＴａＭＤＣ１タンパク質は、植物における低温、塩、アブシジン酸及び乾燥などの非生物ストレスに対する抵抗性の獲得にも関与していると考えられる。
【実施例６】
【０１１３】
本実施例においては、ｍＴａＭＤＣ１の抗菌活性アッセイを行った。
植物病原性真菌（Microdochium nivale MCW222-7株）を１５℃にて１〜２週間にわたりＰＤＡ（Potato Dextrose Agar, Difco）上で培養した。真菌の菌糸を水を用いて抽出し、小さなコロニー形成単位（ｃｆｕ）での切断後、２つの並行実験により抗菌活性アッセイに使用した。。
【０１１４】
ｍＴａＭＤＣ１の阻害活性は、ＰＤＢ（Potato Dextrose Broth, Difco）、Ｍ．ｎｉｖａｌｅ菌糸（１０３〜１０４ｃｆｕ／ｍｌ）及び種々の量のｍＴａＭＤＣ１（０、１０、２０、３０、４０及び５０μｇ／ｍｌ）を含む試験管（総容量１ｍｌ）において試験した。試験管を１５℃にて７日間インキュベートし、菌糸の成長を直接及び顕微鏡（OLYMPUS BX51）で観察した。菌糸の顕微鏡観察のためのサンプルを、Ｌａｃｔｏ−Ｆｕｃｈｉｎｅで染色し、４００×倍率を使用した。
【０１１５】
相対真菌増殖は、ＰＤＢ（総容量２００μｌ）及び種々の量のｍＴａＭＤＣ１（０、１０、２０、３０、４０及び５０μｇ／ｍｌ）を含むマイクロプレート上で、Ｍ．ｎｉｖａｌｅの菌糸（１０３〜１０４ｃｆｕ／ｍｌ）の成長により評価した。菌糸の成長は、１５℃にて７日間のインキュベーション後に４９２ｎｍにおける吸光度を測定（BioRad Microplate Reader）することによりモニターし、相対菌糸成長を評価した。実験は３回行った。
【０１１６】
その結果を図８〜１０に示す。図８は、各試験管内で成長した菌糸の写真を示している。ｍＴａＭＤＣ１の不在下、及び３０μｇ／ｍｌまでのｍＴａＭＤＣ１の存在下では、活発な菌糸の成長が観察された。４０μｇ／ｍｌ ｍＴａＭＤＣ１を用いた場合の試験管への菌糸の成長は顕著に阻害され、５０μｇ／ｍｌのｍＴａＭＤＣ１を使用したサンプルでは菌糸の成長が全く観察されなかった（図８）。
【０１１７】
図９は、種々の濃度のｍＴａＭＤＣ１の抗菌活性ををｍＴａＭＤＣ１の不在下における菌糸成長に対する割合（％）として表したものである。縦軸は標準偏差を表す。ｍＴａＭＤＣ１タンパク質の阻害活性は、５０μｇ／ｍｌ ｍＴａＭＤＣ１で１００％であった（図９）。シスタチンの不在下、及び１０、２０、３０及び４０μｇ／ｍｌのｍＴａＭＤＣ１での培養物中の対照試験管における菌糸体の成長は、１０２％〜１５％であり、それぞれ１００％、１０２％、９３％、６８％、１５％であった（図９）。
【０１１８】
図１０は、種々の濃度におけるｍＴａＭＤＣ１の抗菌活性を顕微鏡で観察した結果を示す。図１０において、対照の試験管（１）、１０μｇ／ｍｌのｍＴａＭＤＣ１の存在下（２）、及び５０μｇ／ｍｌのｍＴａＭＤＣ１の存在下（３）におけるＭ．ｎｉｖａｌｅ菌糸を示す。ｍＴａＭＤＣ１を含まない対照培地（図１０の１）においては、菌糸が成長し、Ｍ．ｎｉｖａｌｅに典型的な形態の菌糸体となった。同様の真菌の成長は、１０、２０及び３０μｇ／ｍｌのｍＴａＭＤＣ１を添加した培地において観察された（図１０の２）。高濃度のｍＴａＭＤＣ１の存在下では、菌糸の発達が顕著に阻害された。菌糸の形態学的変化（隆起及び断片化など）は、４０及び５０μｇ／ｍｌのｍＴａＭＤＣ１を含むサンプルで観察された（図１０の３）。重要なことは、阻害濃度のｍＴａＭＤＣ１は上記の形態学的変化に加えて胞子形成も誘導した。
【実施例７】
【０１１９】
本実施例においては、ＴａＭＤＣ１タンパク質のドメインＩ及びＩＩを含むポリペプチドを作製し、その抗菌活性を確認した。
（１）ドメインＩ（４０〜１２９）を含むポリペプチド（Ｍｅｔ３６−Ｔｈｒ１３３）の作製
ＴａＭＤＣ１全長ｃＤＮＡを鋳型とし、プライマーｄ１ＢｍＦ（5'-GCGCGCGGATCCATGGCCAGCCACGTCCT-3'；配列番号５）及びｄ１ＸｍＲ（5'-GCGCGCCCCGGGTCAGGTGGCGTCCCCGGT-3'；配列番号６）を用いてＰＣＲで増幅した断片をＢａｍＨＩ及びＸｍａＩで消化後、発現ベクターｐＧＥＸ６Ｐ−３（Amersham Biosciences, UK）にクローン化した。以降、実施例２に記載のように、ｍＴａＭＤＣ１と同様に誘導及び精製を行った。
【０１２０】
（２）ドメインＩＩ（１５０〜２１０）を含むポリペプチド（Ａｓｐ１３１−Ｑ２４３）の作製
ＴａＭＤＣ１全長ｃＤＮＡを鋳型とし、プライマーｄ２ＢｍＦ４５１（5'-GCGCGCGGATCCGACGCCACCTCCTTCACC-3'；配列番号７）及びｄ２ＸｍＲ７９８（5'- GCGCGCCCCGGGTCAGATTCACTGGCTGCT-3'；配列番号８）を用いてＰＣＲで増幅した断片をＢａｍＨＩ及びＸｍａＩで消化後、発現ベクターｐＧＥＸ６Ｐ−３にクローン化した。以降、実施例２に記載のように、ｍＴａＭＤＣ１と同様に誘導及び精製を行った。
【０１２１】
（３）パパイン阻害活性の確認
実施例３に記載の方法と同様の方法で、（１）及び（２）で作製したドメインＩ又はＩＩを含むポリペプチドのパパイン阻害活性を確認した。結果を図１１に示す。その結果、ドメインＩを含むポリペプチドはパパイン阻害活性を濃度依存的に示すのに対して、ドメインＩＩを含むポリペプチドは高濃度の存在下でもパパイン阻害活性を示さないことがわかった。
【０１２２】
（４）抗菌活性の確認
実施例６に記載の方法と同様の方法で、（１）及び（２）で作製したドメインＩ又はＩＩを含むポリペプチドの抗菌活性を確認した。結果を図１２に示す。その結果、ドメインＩを含むポリペプチド及びドメインＩＩを含むポリペプチドの両方が、Ｍ．ｎｉｖａｌｅに対して濃度依存的に菌糸成長阻害活性（抗菌活性）を有することが示された。
【０１２３】
（５）縮小化ドメインＩＩを含むポリペプチド（Ｐｒｏ１４９−Ｐｈｅ１９８）の作製
ＴａＭＤＣ１全長ｃＤＮＡを鋳型とし、プライマーｄ２＿６７ＢｍＦ（5'-GCGCGCGGATCCATGCCTGGATGGCGTGA-3'；配列番号９）及びｄ２＿２１７ＸｍＲ（5'- GCGCGCCCCGGGTTAGAAGTCTTCAACCA-3'；配列番号１０）を用いてＰＣＲで増幅した断片をＢａｍＨＩ及びＸｍａＩで消化後、発現ベクターｐＧＥＸ６Ｐ−３にクローン化した。以降、実施例２に記載のように、ｍＴａＭＤＣ１と同様に誘導及び精製を行い、縮小化ドメインＩＩを含むポリペプチド（ｍＤＩＩ）を得た。
【０１２４】
（６）抗菌活性の確認
実施例６に記載の方法と同様の方法で、（５）で作製した縮小化ドメインＩＩを含むポリペプチド（ｍＤＩＩ）の抗菌活性を確認した。結果を図１３に示す。その結果、縮小化ドメインＩＩを含むポリペプチドが、Ｍ．ｎｉｖａｌｅに対して濃度依存的に菌糸成長阻害活性（抗菌活性）を有することが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明により、植物を始めとする多様な生物に抗菌活性を付与するタンパク質（ポリペプチド）及びそれをコードする遺伝子が提供される。また、該タンパク質及びそれをコードする遺伝子を利用することにより、病原菌及び非生物ストレスに対する抵抗性が向上した植物（イネ科植物、特にコムギ）を作出することができる。また、該タンパク質及びそれをコードする遺伝子を利用した抗菌剤も提供される。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】コムギシスタチンタンパク質ＴａＭＤＣ１をコードする核酸の塩基配列（配列番号１）及び推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図２】コムギシスタチンタンパク質ＴａＭＤＣ１と、種々の植物シスタチンタンパク質との配列アレイメントを行った結果を示す。
【図３】組換えｍＴａＭＤＣ１タンパク質の大腸菌における発現を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【図４】ｍＴａＭＤＣ１のパパイン阻害活性を示すグラフである。
【図５】ＴａＭＤＣ１遺伝子発現についてのノーザンブロット分析の結果である。
【図６】ＴａＭＤＣ１発現についてのウエスタンブロット分析の結果である。
【図７】ＡＢＡ、塩及び乾燥に応答して発現したＴａＭＤＣ１遺伝子のノーザンブロット分析の結果である。
【図８】試験管内で成長した菌糸の写真を示す。
【図９】種々の濃度のｍＴａＭＤＣ１の抗菌活性をｍＴａＭＤＣ１の不在下における菌糸成長に対する割合（％）を示す。
【図１０】種々の濃度におけるｍＴａＭＤＣ１の抗菌活性を顕微鏡で観察した結果を示す。
【図１１】ドメインＩを含むポリペプチド及びドメインＩＩを含むポリペプチドのパパイン阻害活性を示すグラフである。
【図１２】ドメインＩを含むポリペプチド及びドメインＩＩを含むポリペプチドの抗菌活性を示す。
【図１３】縮小化ドメインＩＩを含むポリペプチド（ｍＤＩＩ）の抗菌活性を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１２７】
配列番号３〜１０：合成オリゴヌクレオチド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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