(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿素結合、チオ尿素結合、アミド結合及びアミノ基からなる群から選択される少なくとも１つの水素結合形成可能な官能基を有する材料であり、かつ、
イソシアネート化合物、イソチオシアネート化合物、酸、酸塩化物、酸無水物及びアミノ化合物からなる群から選択される少なくとも１つの化合物と、
ナイロン、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン、ポリスチレン、ポリエチレン及びポリビニルアルコールからなる群から選択される合成高分子、又は、セルロース、コラーゲン、キチン、キトサン及びそれらの誘導体からなる群から選択される天然高分子と、
を反応させて得られる材料、
を充填したカラムに、遊離リポタイコ酸を含む液体を通過させるか、又は、遊離リポタイコ酸を含む液体に前記材料を添加することによって、遊離リポタイコ酸を液体から除去あるいは解毒する方法。
【請求項２】
前記材料は、テトラエチレンペンタミン、エチレンジアミン、１，２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン及び１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパンからなる群から選択される化合物と、４−クロルフェニルイソシアネートと、クロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン繊維とを反応させて得られる繊維である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記材料は、４，４’−ジフェニルメタンジイソシアネート、イソチオシアン酸４−クロロフェニル及び４−クロロベンゾイルクロライドからなる群から選択される化合物と、キトサンビーズとを反応させて得られるビーズである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記液体は、血液又は血漿である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リポタイコ酸（以下ＬＴＡと略する）の毒素活性を失わせる（解毒）あるいは除去する材料に関するものである。特に血液中等の高濃度の蛋白質溶液中に存在するＬＴＡと結合することによってＬＴＡの毒素活性を失わせる（解毒）薬剤として、ＬＴＡを除去する浄化カラムあるいは被覆材料として好適に用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
近年ＬＴＡは、グラム陽性菌敗血症の原因と考えられ様々な研究が行われている。例えば、培養血管平滑筋細胞の一酸化窒素合成酵素を発現誘導すること（Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．,２０,Ｓ１４５−Ｓ１４７（１９９２））、ラットへの静脈内投与により血圧低下やノルアドレナリンによる昇圧反応の低下が起こること（Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｅｍａｃｏｌ．,１４４,１３１７−１３２３（１９９５））、動物に胸腔内投与することによって、胸腔内への好中球の浸潤が認められ胸膜炎病態が発症すること（特開平９−１６３８９６）、またＬＴＡとペプチドグリカンをラットに共投与すると、ショックや臓器障害が起こること（Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１８８（２），３０５−３１５（１９９８））などが報告されている。これに対して、一酸化窒素の産生が抗マウスＣＤ１４抗体（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｎｎ，２３３（２），３７５−３７９（１９９７））あるいは、Ｎ（ｏｍｅｇａ）−ｎｉｔｒｏ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ（Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｎｎ，６５（６），２０７４−２０７９（１９９７））で抑制されること、マウスへのＬＴＡ投与によるショック死を血小板活性化因子拮抗剤が抑制すること（特開平９−２０８４９３）が報告されており、アミノグアニジンやデキサメタゾン（Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１９（７），１４１１−１４２１（１９９６））の効果も検討されている。しかし、これらは全てＬＴＡによって開始される炎症反応の後期産生物質をターゲットとしており、ＬＴＡ自身をターゲットとした医薬品の報告はない。一方、医療用材料としては、ポリミキシン−Ｂ固定化繊維が、黄色ブドウ球菌培養上清（１０％ヒト血漿添加培地で希釈）によるＴＮＦ−α産生を２０％低下させるという報告（ＡＳＡＩＯ  Ｊ，４４（１），４８−５３（１９９８））がある。しかし、培養上清には種々の毒素が含まれており、ＬＴＡの除去は確認されておらず、また効果も２０％と低い。このように、血漿のような高蛋白質溶液においてＬＴＡと高い親和性を有するような材料はこれまで知られていなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はこれら従来技術の欠点を解消しようとするものであり、血液などの高蛋白質濃度の溶液中においてもＬＴＡの毒素活性を迅速に失わせる（解毒）あるいは除去できる材料を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明においては、上記課題を解決するため、下記の構成を有する。
【０００５】
(1)  ウサギ血漿中のリポタイコ酸の除去率がウサギ血漿中において６０％以上、アルブミンおよび／あるいはナトリウムの除去率が１０％以下であるリポタイコ酸除去用あるいは解毒用材料材料。また、
(2)上述した材料を用いた体液浄化カラムあるいは被覆材料。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において、ＬＴＡとは、グラム陽性菌、例えばストレプトコッカス属、ミクロコッカス属、ラクトバチルス属、スタフィロコッカス属、バチルス属、エンテロコッカス属等の細胞膜および細胞壁を構成する物質である。ストレプトコッカス属では化膿性連鎖球菌や肺炎連鎖球菌等が、スタフィロコッカス属では黄色ブドウ球菌や表皮ブドウ球菌等が挙げられる。
【０００７】
ＬＴＡは、リビトールやグリセロールがホスホジエステル結合で連結したポリマーで、これに糖やＤ−アラニンが付いている。末端に脂溶性の脂肪酸を持っているため、細胞質膜に結合し、細胞壁を貫通している（医科細菌学  吉川昌之介編  南江堂より）。
【０００８】
本発明の材料は、ウサギ血漿中のリポタイコ酸の除去率がウサギ血漿中において６０％以上、アルブミンおよび／あるいはナトリウムの除去率が１０％以下であり、さらに好ましくは白血球、リポタンパク質および医薬品から選ばれる少なくとも１つの除去率が１５％以下であるという特徴を有する。「アルブミンおよび／あるいはナトリウムの除去率が１０％以下」とは、アルブミン除去率が１０％であるか、ナトリウムの除去率が１０％以下であるか、アルブミン、ナトリウムのいずれの除去率も１０％以下であることを意味する。又、「白血球、リポタンパク質および医薬品から選ばれる少なくとも１つの除去率が１５％以下」とは、白血球、リボタンパク質、医薬品のうち、少なくとも１つについて、除去率が１０％以下であることを意味する。
【０００９】
ここで、リポタイコ酸の除去率、また、アルブミンおよび／あるいはナトリウムおよび／あるいは白血球および／またはリポタンパク質および／あるいは医薬品の除去率の測定法としては種々考えられるが、測定法の違い、例えば吸着体と被吸着液との容積比や被吸着液中の夾雑物濃度や反応時間、撹拌の有無等により除去率が変動すると考えられる。本発明における除去率の測定を以下に示す。
【００１０】
ウサギ血漿とは、１０週令のニュージーランドホワイトウサギ（雄）から採血した、総蛋白濃度が４．８〜５．８ｇ／ｄｌで白血球数４５００〜６５００／ｍｍ３、ヘマトクリット値４０〜４３％、ナトリウム濃度が１３０〜１４０ｍｍｏｌ／ｌ、かつリポタイコ酸に対する抗体がない血漿である。ウサギよりヘパリン（５Ｕ／ｍｌ）を用いて採血し、１５００Ｇ、１０分間遠心分離後の血漿を除去率の測定に用いた。吸着体３５ｍｇを血漿０．５ｍｌ中に添加し、反応温度は３７℃、反応時間は２時間、旋回撹拌の条件において吸着を行った。吸着前後における目的物質の濃度を測定し、下式（１）を用いて除去率を計算した。
【００１１】
（Ｃ０−Ｃ）／Ｃ０・・・・・・・（１）式
ここで、Ｃ０は目的物質の吸着前の溶液中の初期濃度、Ｃは目的物質の吸着後の溶液中の濃度である。
【００１２】
ここでは、血液成分のバラツキの少ないウサギ血漿を用いたが、ヒト、イヌ、マウス、ウシ、ヒツジ等の哺乳動物の血漿を用いても同様の除去率が得られる。
【００１３】
本発明において、水素結合形成可能な官能基としては特に限定はなく、例えば、尿素結合、チオ尿素結合、アミド基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、アルデヒド基、メルカプト基などが挙げられるが、尿素結合、チオ尿素結合、アミド結合、アミノ基および水酸基から選ばれる少なくとも一つ有することが好ましい。水素結合形成可能な基に続く構造としては特に限定はなく、プロパン、ヘキサン、オクタン、ドデカンなどの脂肪族化合物やシクロヘキサン、シクロペンタンのような脂環族化合物を用いることができるが、親和性の高さを考慮するとベンゼン、ナフタレン、アントラセン等の芳香族化合物がより好ましく用いられる。ブロモヘプタン、クロロシクロヘキサン、メチルベンゼン、クロロベンゼン、ニトロベンゼン、ジフェニルメタン、クロロナフタレン等の誘導体も好適に用いられる。また、水素結合形成可能な基を二つ以上有することがより好ましく、さらには、異なる官能基であることが好ましい。特に尿素結合、チオ尿素結合あるいはアミド結合に続く構造として例えば、アミノ基、水酸基、カルボキシル基等の水素結合形成可能な官能基をさらに有する構造が好ましく用いられる。例えばアミノ基を有する構造としては、アミノヘキサン、モノメチルアミノヘキサン、ジメチルアミノヘキサン、アミノオクタン、アミノドデカン、アミノジフェニルメタン、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール、３−アミノ−１−プロペン、アミノピリジン、アミノベンゼンスルホン酸、トリス（２−アミノエチル）アミン等や、より好ましくは、ジアミノエタン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ジプロピレントリアミン、ポリエチレンイミン、Ｎ’−メチル−２,２’ジアミノジエチルアミン、Ｎ−アセチルエチレンジアミン、１,２−ビス（２−アミノエトキシエタン）等のようなアミノ基を複数有する化合物（ポリアミンと言うことがある）が用いられる。また、水酸基を有する構造としては、ヒドロキシプロパン、２−エタノールアミン、１,３ジアミノ-２-ヒドロキシプロパン、ヒドロキシブタノン、ヒドロキシ酪酸、ヒドロキシピリジン等や、グルコース、グルコサミン、ガラクトサミン、マルトース、セルビオース、スクロース、アガロース、セルロース、キチン、キトサン等の単糖、オリゴ糖、多糖等の糖質あるいはそれらの誘導体を用いることができる。さらに、カルボキシル基を有する構造としては例えば、β−アラニン、ｎ−カプロン酸、イソ酪酸、γ−アミノ−β−ヒドロキシ酪酸等を用いることができる。最も好ましくは、本発明材料は尿素、チオ尿素あるいはアミド基に続く構造として芳香族化合物と水素結合形成可能な化合物の両方を有することができる。
【００１４】
さらに、尿素結合、チオ尿素結合、アミド結合を分子構造内に複数個有するような、ポリ尿素、ポリチオ尿素、ポリアミドも本発明材料として用いることができる。この場合にも、尿素結合、チオ尿素結合、アミド結合に続く構造として上記構造のいずれをも用いることができるが、最も好ましくは、水酸基、アミノ基やカルボキシル基を有する化合物（糖質あるいはその誘導体を含む）のような水素結合形成可能な基と芳香族化合物の両方を用いることができる。
【００１５】
また、本発明材料としては、モノマ、オリゴマ、ポリマのいずれでも良いため、上記構造あるいはその一部が重合されているものも本発明材料に含まれる。すなわち、上記構造あるいはその一部として、ナイロン、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリテトラフルオロエチレンなどの合成高分子や、セルロース、コラーゲン、キチン、キトサンおよびそれらの誘導体を含む天然高分子などが好適に用いられる。つまり、単独重合、共重合あるいはブレンドされたこれら合成高分子や天然高分子などに、水素結合形成可能な基を導入することが好適に行われる。さらに、金属、セラミックス、ガラスなどの無機材料を適当な高分子で被覆したものも好適に用いられる。本発明における担体とは本発明材料を固定する支持体を指すので、例えば上記に挙げたような合成高分子や天然高分子などがある。
【００１６】
本発明材料は一般に公知の方法で合成することができる。例えば脂肪族化合物や芳香族化合物に尿素結合あるいはチオ尿素結合を導入する場合には、イソシアネート化合物あるいはイソチオシアネート化合物とアミノ化合物とを反応させる方法を用いることができる。また、脂肪族化合物や芳香族化合物にアミド基を導入する場合には、例えば酸、酸塩化物あるいは酸無水物とアミノ化合物とを反応させる方法を用いることができる。アミノ化合物とイソシアネート化合物、イソチオシアネート化合物、酸、酸塩化物あるいは酸無水物の混合比は任意に選択でき、通常、イソシアネート化合物、イソチオシアネート化合物、酸、酸塩化物あるいは酸無水物１モルに対して０．１〜１０モルのアミノ化合物が好ましく用いられる。イソシアネート化合物あるいはイソチオシアネート化合物としては例えば、エチルイソシアネート、ステアリルイソシアネート、n-ブチルイソシアネート、ｉｓｏ−ブチルイソシアネート、n-プロピルイソシアネート、メチルイソチオシアネート、エチルイソチオシアネート、n-ブチルイソチオシアネート、ベンジルイソチオシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート、シクロヘキシルイソシアネート、シクロヘキシルイソチオシアネート、シクロヘキシルジイソシアネート等の脂肪族イソシアネート化合物あるいはイソチオシアネート化合物のいずれをも用いることができるが、より好ましくはフェニルイソシアネート、クロロフェニルイソシアネート、フルオロフェニルイソシアネート、ブロモフェニルイソシアネート、ニトロフェニルイソシアネート、トリルイソシアネート、メトキシフェニルイソシアネート、1-ナフチルイソシアネート、4,4'ジフェニルメタンジイソシアネート、3,3',5,5'テトラエチル4,4'ジイソシアナトジフェニルメタン、フェニルイソチオシアネート、クロロフェニルイソチオシアネート、フルオロフェニルイソチオシアネート、ニトロフェニルイソチオシアネート、トリルイソチオシアネート、メトキシフェニルイソチオシアネート、1-ナフチルイソチオシアネート、等の芳香族イソシアネート化合物あるいはイソチオシアネート化合物が用いられる。酸塩化物としては例えば、イソバレリルクロライド、ステアロイルクロライド、シクロヘキサンカルボニルクロライド、６−クロロニコチン酸クロライド等の脂肪族酸塩化物のいずれをも用いることができるが、より好ましくはベンゾイルクロライド、３,４−ジクロロベンゾイルクロライド、ニトロベンゾイルクロライド、４−クロロベンゾイルクロライド、４−トルオイルクロライド、ベンゾ−［ｂ］チオフェン−２−カルボニルクロライド等の芳香族酸塩化物を用いることができる。また、酸無水物としては例えば、無水酢酸、無水コハク酸、無水フタル酸、無水安息香酸等を好ましく用いることができる。また、本発明に用いるアミノ化合物のアミノ基としては１級アミノ基、２級アミノ基、３級アミノ基のいずれでも良く、アミノ化合物としては例えば、アンモニア、ｓｅｃ−オクチルアミン、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール、３−アミノ−１−プロペン、アミノピリジン、アミノベンゼンスルホン酸、トリス（２−アミノエチル）アミン等を好ましく用いることができる。また、尿素結合、チオ尿素結合��るいはアミド結合に加えて水素結合形成可能な基を導入できるような、ポリアミノ化合物や水酸基あるいはカルボキシル基を有するアミノ化合物も好ましく用いることができる。ポリアミノ化合物としては例えば、ジアミノエタン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ジプロピレントリアミン、Ｎ’−メチル−２、２'ジアミノジエチルアミン、ポリエチレンイミン、Ｎ−アセチルエチレンジアミン、１、２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン等のいずれをも用いることができる。水酸基を有するアミノ化合物としては、2-エタノールアミン、3-プロパノールアミン、6-ヘキサノールアミン、1,3ジアミノ-2-ヒドロキシプロパン、２−（２−アミノエトキシ）エタノール、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、グルカミン、N-メチル1,3-ジアミノプロパノール等の脂肪族アミン、あるいは、4-アミノフェノール、ジアミノフェノール、アミノヒドロキシピリミジン、ジアミノヒドロキシピリミジン、ジアミノヒドロキシピラゾール等の芳香族アミン、あるいはセリン、チロシン等のアミノ酸類が用いられる。また、エピクロロヒドリンおよびアミノ化合物、あるいは1,3ジブロモ-2-ヒドロキシプロパンを反応させることによって水酸基のみを有する化合物あるいはアミノ基のみを有する化合物から水酸基を有するアミノ化合物を合成することも可能である。また、糖質に水素結合形成可能な基を導入する場合も上記と同様な方法を用いることができる。すなわち、キトサンやグルコサミンのようなアミノ基を有する糖質の場合には、上述したようなイソシアネート化合物、イソチオシアネート化合物、酸、酸塩化物あるいは酸無水物を反応させることができる。セルロースのようなアミノ基を有さない糖質の場合には、糖質の水酸基をエピクロルヒドリン、トレシルクロライドなどを用いて活性化させた後に、アンモニアやジアミノエタンなどと反応させてアミノ基を導入し、このアミノ基を利用して、糖質に尿素結合、チオ尿素結合、アミド結合等の水素結合形成可能な基を導入することができる。カルボキシル基を有するアミノ化合物としては例えば、β−アラニン、４−アミノ−ｎ−酪酸、γ−アミノ−β−ヒドロキシ−ｎ−酪酸、６−アミノ−ｎ−カプロン酸等を用いることができる。
【００１７】
さらに、本発明材料がオリゴマあるいはポリマの場合には、例えば、イソシアネート基、カルボキシル基あるいはスクシンイミド基等のカルボン酸の活性エステル基を有するオリゴマあるいはポリマに、水素結合形成可能な基を有する化合物のアミノ基を反応させる方法が好ましく用いられる。また、アミノ基を有するオリゴマ、ポリマ、あるいはアンモニア、ジアミノエタン、1,3ジアミノプロパン、1,3ジアミノ-2-ヒドロキシプロパン、１、２−ビス（２−アミノエトキシ）エタン、トリス（２−アミノエチル）アミン、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノールなどによりアミノ基を導入したオリゴマ、ポリマに上述したようなイソシアネート化合物、イソチオシアネート化合物、酸、酸塩化物あるいは酸無水物を反応させることも好ましい方法である。また、酸塩化物やイソシアネート化合物がアミノ基以外の水素結合形成可能な基に反応しないように、反応時間、反応温度あるいは混合比などを制御したり、保護基を用いることが好ましい。アミノ基、イソシアネート基、カルボキシル基あるいはスクシンイミド基等のカルボン酸の活性エステル基、酸塩化物基、酸無水物基などの官能基は、必要に応じてオリゴマ、ポリマに導入することができる。
【００１８】
さらに本発明材料がポリ尿素あるいはポリチオ尿素の場合には、例えばポリイソシアネート化合物あるいはポリイソチオシアネート化合物とポリアミノ化合物とを反応させる方法を用いることができる。通常、試薬の量はポリイソシアネート化合物あるいはポリイソチオシアネート化合物１モルに対して、０．１〜１０モルのポリアミンが好ましく用いられる。ポリイソシアネート化合物あるいはポリイソチオシアネート化合物としてはヘキサメチレンジイソシアネート、シクロヘキシルジイソシアネート、トリレンジイソシアネート、4,4'ジフェニルメタンジイソシアネート、3,3',5,5'テトラエチル4,4'ジイソシアナトジフェニルメタン、キシレンジイソシアネート、メチレンビス（４−フェニルイソチオシアネート）等が好適に用いられる。また、ポリアミノ化合物としてはジアミノエタン、ジアミノプロパン、1,3ジアミノ-2-ヒドロキシプロパン、Ｎ’−メチル1,3−ジアミノ-2-プロパノール、ジアミノフェノール、Ｎ，Ｎ’−ジアミノピペラジン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ポリエチレンイミン、ジプロピレントリアミン、Ｎ’−メチル−２、２’−ジアミノジエチルアミンなどを好ましく用いることができる。さらに、本発明材料がポリアミドの場合には、例えばポリカルボン酸とポリアミンを重縮合させる方法を用いることができる。また、ポリ尿素、ポリチオ尿素、ポリアミドのいずれにおいても、ポリイソシアネート、ポリイソチオシアネート、ポリカルボン酸などを用いずに、各々の官能基を一つずつ順次導入することによって最終的にポリ尿素、ポリチオ尿素、ポリアミドを得る方法も好ましく行われる。
【００１９】
上記すべての反応は標準的には、反応温度は０〜１５０℃、反応時間は０．１〜２４時間で行われる。また、反応溶媒は必ずしも必要ではないが、一般的には溶媒の存在下に行われる。使用しうる溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ-ブタノール、ヘキサン、アセトン、Ｎ，Ｎジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の脂肪族炭化水素類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジクロロメタン、クロロホルム、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類等が挙げられる。反応終了後の反応液は、必要に応じ、ろ過、濃縮などの通常の後処理の後、カラムクロマトグラフィー、再結晶などの操作により、精製されることができる。また、水不溶性の材料の場合、ガラスフィルター等を用いて洗浄することも好ましい方法である。
【００２０】
本発明材料の中で水不溶性のものは、ＬＴＡ除去カラムあるいは被覆材料などとして好ましく用いられる。その形状としては特に限定はないが、カラムとして用いる場合には、ビーズ、繊維、中空繊維、糸束、ヤーン、ネット、編み地、織物等が好ましく、被覆材料の場合は、織物あるいはフィルム等の形状が好ましい。また、本材料は単独での使用のみならず、適当な材料にさらに固定化したり、他材料と混合して一つのカラムあるいは被覆材料として用いることもできる。固定化あるいは混合などの操作は、前記形状に加工する前に行っても良いし、加工した後に行っても良い。本発明の材料を用いたカラムを体外循環用カラムとして用いる場合には、体外に導出した血液を直接カラムに通しても良いし、血漿分離膜などと組み合わせて使用しても良い。
【００２１】
本発明の材料は、ＬＴＡ除去用の体液浄化カラムとして特に好適に用いられる。また、被覆材料としても好適に用いられ、敗血症ショック、感染症などの治療や予防が可能になる。
【００２２】
以下に実施例を用いて詳細に説明を加えるが、発明の内容が実施例に限定されるものではない。
【００２３】
【実施例】
（実施例１）修飾ポリスチレン繊維の作製
５０重量比の海成分（４６重量比のポリスチレンと４重量比のポリプロピレンの混合物）と５０重量比の島成分（ポリプロピレン）とからなるアメリカ特許4,661,260記載（実施例１）の海島型複合繊維（厚さ：２．６デニール、島の数：１６）を５０ｇのＮ−メチロール−α−クロロアセトアミド、４００ｇのニトロベンゼン、４００ｇの９８％硫酸、０．８５ｇのパラホルムアルデヒドの混合溶液と２０℃で１時間反応させた。そして、繊維をニトロベンゼンで洗浄し、水中に入れて反応を停止させた。その後、繊維を温水で再び洗浄することによって、クロロアセトアミドメチル化架橋ポリスチレン繊維（以下ＡＭＰＳｔ繊維と略す）を得た。
【００２４】
表１に示す試薬をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦと略す）５０ｍｌに溶解した。この溶液に、１ｇのＡＭＰＳｔ繊維（クロロ含量２ｍｍｏｌ相当）を攪拌しつつ加えた。反応は３０℃で３時間行った。その後、ＤＭＦ２００ｍｌを用いてガラスフィルター上で洗浄した。洗浄後、４−クロルフェニルイソシアネート０．１９ｇを溶解したＤＭＦ５０ｍｌの溶液中にＡＭＰＳｔ繊維を加え、２５℃で１時間、反応させた。その後、ガラスフィルター上で２００ｍｌのＤＭＦおよび２００ｍｌの蒸留水により洗浄した。
【００２５】
表１  ＡＭＰＳｔ繊維との反応に用いた試薬
【００２６】
【表１】
0004848573.tif 000002
【００２７】
実施例２  キトサンビーズへの尿素基、チオ尿素基およびアミド基の導入
粒径０．１ｍｍのキトサンビーズ（富士紡（株）製、”キトパール”ＡＬ−０１）１２ｍｌ（沈殿時体積、乾燥重量は１．０ｇ）を５０ｍｌのＤＭＦ中で攪拌し、ガラスフィルターによって、ビーズと溶液の分離を行った。この操作を１回５分間、２０回繰り返し、含有水分をＤＭＦと完全に置換させた。
【００２８】
表２の試薬を１００ｍｌのＤＭＦ中に溶解させたものにビーズを徐々に添加し、攪拌しながら室温で１時間反応させた。その後、ガラスフィルターを用いて、ビーズと溶液を分離し、ビーズを５０ｍｌのＤＭＦ中で５分間攪拌することによって洗浄を行った。この洗浄操作を２０回繰り返し、未反応の試薬を完全に除去した。次いで、蒸留水による洗浄操作を同様に行い、ＤＭＦを蒸留水と置換することによって、尿素結合、チオ尿素結合、アミド結合を有するキトサンビーズを得た。
【００２９】
表２  キトサンビーズとの反応に用いた試薬
【００３０】
【表２】
0004848573.tif 000003
【００３１】
実施例３  修飾ＡＭＰＳｔ繊維と修飾キトサンビーズによるＬＴＡの除去試験
実施例１で作製した修飾ＡＭＰＳｔ繊維と実施例２で作製した修飾キトサンビーズによるＬＴＡの吸着除去試験を行った。ＬＴＡは、黄色ブドウ球菌由来（シグマ社より購入）と連鎖球菌由来（シグマ社より購入）のものを用いた。また、医薬品としては抗生剤であるアルベカシン（以下ＡＲＫと略す。明治製菓（株）製）を用いた。吸着試験は、ウサギ血漿を用いて行った。抗凝固剤を用いてウサギより血液を採取した。その一部を３０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離することによって血漿を得た。この血漿に、黄色ブドウ球菌由来ＬＴＡ（以下ＬＴＡ−１と略する）と連鎖球菌由来ＬＴＡ（以下ＬＴＡ−２と略する）およびＡＲＫを各々１０μｇ／ｍｌとなるように添加した。ＬＴＡ添加血漿０．５ｍｌに対して、表１の修飾ＡＭＰＳｔ繊維を３５ｍｇ、または表２の修飾キトサンビーズ０．１ｍｌ（沈殿時体積）を添加し、３７℃で２時間振とうした。２時間反応後の溶液中のＬＴＡ濃度を酵素免疫学的測定法を用いて測定した。また、この時のアルブミン濃度をＢＣＧ法を用いて、ナトリウムイオン濃度を電極法を用いて、リポタンパク質である高密度リポタンパク質（以下ＨＤＬと略す。）の濃度をリンタングステン酸・Ｍｇ沈殿法により測定した。また、白血球に対する吸着能の測定には抗凝固剤を用いてウサギより採取した血液を遠心分離せずに用いた。この血液０．８mlに対して、表１の修飾ＡＭＰＳｔ繊維を３５ｍｇ、または表２の修飾キトサンビーズ０．１ｍｌ（沈殿時体積）を添加し、３７℃で２時間振とうした。
２時間反応後の溶液中の白血球数を血球計測器（日本光電社製）を用いて測定した。この結果を表３に示す。この結果から、尿素結合あるいはアミド基を有する材料は特異的にＬＴＡを吸着することが示された。
【００３２】
表３  修飾ＡＭＰＳｔ繊維と修飾キトサンビーズによるＬＴＡとアルブミンおよび／あるいはナトリウムの除去試験
【００３３】
【表３】
0004848573.tif 000004
【００３４】
実施例４  修飾ＡＭＰＳｔ繊維による培地中からのＬＴＡ除去試験−サイトカイン産生量による評価
実施例１で作製した修飾ＡＭＰＳｔ繊維（ａ）によるＬＴＡの除去をサイトカイン産生量によって測定した。ＲＰＭＩ１６４０培地に、ＬＴＡ−１を１０μｇ／ｍｌになるように添加した。このＬＴＡ添加培地０．５ｍｌに対して、修飾ＡＭＰＳｔ繊維（ａ）を３５ｍｇ添加し、３７℃で２時間振盪した。また、ヒト末梢血単核球（以下ＰＢＭＣと略する）浮遊液を作製するため、抗凝固剤を用いて健常人より血液を採取し、生食で２倍に希釈したものをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ社製）に重層し、２０００ｒｐｍ、２０分間室温で遠心した。ＰＢＭＣを採取し、遠心操作によって３回洗浄後、１０％牛胎児血清を添加したＲＰＭＩ１６４０培地を用いて、細胞数を３．０＊１０6個／ｍｌに調製した。調製したＰＢＭＣ浮遊液１００μｌに２時間反応後のＬＴＡ添加培地１００μｌを加え１３時間培養後、培養上清中のＩＬ−８およびＴＮＦ−α濃度を酵素免疫学的手法を用いて測定した。この結果を表４に示す。表４に示す通り、修飾ＡＭＰＳｔ繊維（ａ）を用いることにより、ＬＴＡが除去されサイトカインのような生物活性が著しく低減されることが示された。
【００３５】
表４  培地中からのＬＴＡ除去によるサイトカイン産生量の変化
【００３６】
【表４】
0004848573.tif 000005
【００３７】
実施例５  修飾ＡＭＰＳｔ繊維による血漿中からのＬＴＡ除去試験−サイトカイン産生量による評価
実施例４と同様の実験をヒト血漿を用いて行った。血漿は実施例３と同様の方法で作製した。この血漿に、ＬＴＡ−１を１０μｇ／ｍｌとなるように添加したものを除去試験に用いた。この結果を表５に示す。修飾ＡＭＰＳｔ繊維（ａ）は、ヒト血漿のような高蛋白質溶液中においてもＬＴＡと高い親和性を有し、ＬＴＡによるサイトカイン産生量を効率よく低下させることが示された。
【００３８】
表５  ヒト血漿中からのＬＴＡ除去によるサイトカイン産生量の変化
【００３９】
【表５】
0004848573.tif 000006
【００４０】
実施例６  修飾ＡＭＰＳｔ繊維によるＬＴＡ除去試験−循環法
実施例１の修飾ＡＭＰＳｔ繊維（ａ）を用いて、ＬＴＡの循環方法による除去試験を行った。各繊維１ｇをカラムに充填し、これに実施例３の方法で作製したウサギ血漿１０ｍｌを３７℃において１ｍｌ／ｍｉｎで６０分間循環させた時のＬＴＡ濃度を表６に示す。体外循環のような流動条件下においても、ＬＴＡ吸着能があることが示された。
【００４１】
表６  修飾ＡＭＰＳｔ繊維によるＬＴＡ除去試験−循環法
【００４２】
【表６】
0004848573.tif 000007
【００４３】
【発明の効果】
本発明により、血漿などの高蛋白質濃度の溶液中においてもＬＴＡを迅速に解毒あるいは除去できる、水素結合形成可能な官能基を含む材料が提供された。本発明の材料を用いて、血液、血漿などの体液や医薬品中に存在するＬＴＡの毒素活性を失わせる（解毒）ことができるので、敗血症ショック、感染症などの治療や予防が可能になる。また、この材料の中で水不溶性であるものを用いて、血液、血漿などの体液や医薬品中からＬＴＡを効率的に除去できるので、これにより、ＬＴＡ除去カラムや被覆材料を構成することで、敗血症ショック、感染症などの治療や予防が可能になる。