(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガラクトース誘導系を有し、
構成的プロモーターの制御下に連結されるＧａｌ１活性タンパク質をコードするコード領域と、
構成的プロモーターの制御下に連結されるＧａｌ２活性タンパク質をコードするコード領域と、
を、保持する、形質転換体。
【請求項２】
さらに、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に連結されるＧａｌ４活性タンパク質をコードするコード領域を保持する、請求項１に記載の形質転換体。
【請求項３】
前記構成的プロモーターは、ＨＩＳ３プロモーター、ＴＤＨ３プロモーター及びＡＤＨ１プロモーターから選択される、請求項１又は２に記載の形質転換体。
【請求項４】
さらに、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に内在性又は外来性の所望のタンパク質をコードするコード領域を保持する、請求項１〜３のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項５】
前記ガラクトース誘導性プロモーターは、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ２プロモーター、ＧＡＬ３プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、ＧＡＬ５プロモーター、ＧＡＬ７プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター及びＭＥＬ１プロモーターからなる群から選択される、請求項４に記載の形質転換体。
【請求項６】
前記ガラクトース誘導性プロモーターは、Ｇａｌ４結合部位を上流側に備えＧａｌ４タンパク質によって活性化可能なガラクトース代謝遺伝子以外の内在性プロモーター又は外来性プロモーターである、請求項４又は５に記載の形質転換体。
【請求項７】
前記外来性プロモーター又は前記内在性プロモーターは、ＣＹＣ１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター及びＨＯＲ７プロモーターから選択される、請求項６に記載の形質転換体。
【請求項８】
宿主細胞が酵母である、請求項１〜７のいずれかに記載の形質転換体。
【請求項９】
前記酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ポンベ、ピキア・パストリス、クルイベロマイセス・ラクティス及びカンジダ・アルビカンスから選択される、請求項８記載の形質転換体。
【請求項１０】
第１の構成的プロモーターと、
該第１の構成的プロモーターの制御下に連結されるＧａｌ１活性を有するタンパク質をコードするコード領域と、
第２の構成的プロモーターと、
該第２の構成的プロモーターの制御下に連結されるＧａｌ２活性を有するタンパク質をコードするコード領域と、
を備える、核酸コンストラクト。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸コンストラクトを備える発現ベクター。
【請求項１２】
プラスミド又はウイルスである、請求項１１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
請求項１１又は１２に記載の発現ベクターを保持する宿主細胞。
【請求項１４】
形質転換体の培養方法であって、
請求項１〜９のいずれかに記載の形質転換体を、実質的にガラクトースを含まない培地で培養する培養工程を、備える、培養方法。
【請求項１５】
さらに、実質的にグルコースを含まず前記形質転換体の前記ガラクトース誘導系を発現可能な程度のガラクトースの存在下で前記形質転換体を培養する培養工程を、備える、請求項１４に記載の培養方法。
【請求項１６】
遺伝子の発現方法であって、
請求項１〜９のいずれかに記載の形質転換体を、実質的にガラクトースを含まない培地で培養する第１の培養工程と、
実質的にグルコースを含まず、前記形質転換体の前記ガラクトース誘導系を発現可能な程度のガラクトースの存在下で前記形質転換体を培養し、前記所望のタンパク質を発現させる第２の培養工程と、
を備える、発現方法。
【請求項１７】
前記２の培養工程におけるガラクトースの初期濃度は２０ｇ／ｌ未満である、請求項１６に記載の発現方法。
【請求項１８】
前記第２の培養工程は、ガラクトースを含む培地に培地交換して開始する、請求項に１６又は１７に記載の発現方法。
【請求項１９】
形質転換体を用いた物質の生産方法であって、
請求項１６〜１８のいずれかに記載の遺伝子発現方法により発現させた所望のタンパク質又はそのタンパク質による代謝産物を回収する工程を備える、生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガラクトース誘導系を用いた遺伝子発現技術に関し、詳しくは、形質転換体、核酸コンストラクト、発現ベクター、培養方法、遺伝子発現方法、物質生産方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞等において遺伝子発現を所望のタイミングで誘導することが望まれている。例えば、形質転換体を用いた発酵生産においては、細胞を最大限増殖させた上で所望の遺伝子産物を生産させることがエネルギー収支及び遺伝子産物の回収操作等においても好ましい。一般に、こうした遺伝子の発現誘導に利用できる要素としては、グルコースの欠乏と新たな基質の供給が挙げられる。グルコースは多くの生物にとって最も利用しやすい栄養源であり、生物においてはグルコースの欠乏により種々の応答が生じるやすくなる。
【０００３】
こうしたグルコース欠乏時の応答として出芽酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomycereivisiae）等におけるガラクトース誘導がある。ガラクトース誘導は、グルコースの欠乏時においてガラクトースによりガラクトース代謝遺伝子（ＧＡＬ遺伝子）群が活性化され誘導されるシステムである。ガラクトース誘導は、ただ一つの転写活性化因子であるＧａｌ４タンパク質（以下、単に、Ｇａｌ４と称する。）によってガラクトース代謝に関連するＧＡL遺伝子群を正に制御しており、培地にガラクトースが存在しない間はＧＡＬ遺伝子群の転写開始を抑制しているが、培地中にグルコースがなくガラクトースが添加されると、この抑制が解除されてＧＡＬ遺伝子群の発現が誘導される。
【０００４】
Ｇａｌ４は、出芽酵母等においてガラクトース代謝に必要なＧＡＬ１（ガラクトカイネース）遺伝子、ＧＡＬ２（ガラクトパーミアーゼ）遺伝子、ＧＡＬ７（α−Ｄ−ガラクトース−１−リン酸  ウリジルトランスフェラーゼ）遺伝子及びＧＡＬ１０（ウリジンホスホガラクトース−１−エピメラーゼ）遺伝子（以下、単に、ＧＡＬ１０等と称する。）の各遺伝子を活性化するほか、ＧＡＬ８０、ＧＡＬ３及びＭＥＬ１を活性化するとされている（非特許文献１）。
【０００５】
このようなＧａｌ４のＧＡＬ遺伝子群の転写活性化能力を利用して、ＧＡＬ４遺伝子をガラクトース誘導性プロモーターの制御下に連結して出芽酵母の染色体に組み込むことが開示されている（特許文献１）。すなわち、この特許文献では、こうした組換え酵母において、培地中のグルコース量及びガラクトース量を制御して、Ｇａｌ４を過剰発現させることを意図している。
【特許文献１】特許第２７０８１５４号
【非特許文献１】D. Lohr et al,The FASEB Journal (1995), p.777-787
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
この手法では、正の転写調節因子としてのＧａｌ４の量が非常に少量であることに鑑み、Ｇａｌ４をガラクトースによって誘導して過剰に発現させることにより他の多数のガラクトース誘導性プロモーターに連結される所望の外来遺伝子の発現を効果的に行おうとするものである。
【０００７】
しかしながら、こうしたＧａｌ４をガラクトース誘導的に過剰に発現させても必ずしも意図したように外来遺伝子がガラクトース誘導的に発現されるわけではなかった。反応基質であるガラクトースをグルコースと同等程度に要したり、反応時間が長くかかるなどその応答性は十分なものではなかった。
【０００８】
そこで、本発明では、良好な応答性を有する遺伝子発現の誘導系を有する形質転換体及びその用途を提供することを目的とする。すなわち、本発明は、感度のよい応答性を有する遺伝子発現誘導のための形質転換体、核酸コンストラクト、発現ベクター、培養方法、遺伝子発現方法、物質生産方法を提供することを一つの目的とする。また、本発明は、迅速な応答性を有する遺伝子発現誘導のための形質転換体、核酸コンストラクト、発現ベクター、培養方法、遺伝子発現方法、物質生産方法を提供することを一つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ガラクトース誘導系について詳細に検討した結果、ガラクトース誘導系は、Ｇａｌ４自体を制御するよりもむしろＧａｌ４の制御下にあってＧａｌ８０によるＧａｌ４活性の抑制解除に関与するタンパク質やガラクトースの取り込みに関与するタンパク質を構成的に発現させることにより、ガラクトースに対して良好な応答性でガラクトース誘導系が発現されてくることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明によれば、以下の手段が提供される。
【００１０】
本発明の他の一つの形態によれば、ガラクトース誘導系を有し、構成的プロモーターの制御下にＧａｌ４活性を有するタンパク質による転写活性化を支援する支援タンパク質をコードするコード領域を宿主染色体上又は宿主染色体外に保持する、形質転換体が提供される。
【００１１】
この形態においては、前記支援タンパク質は、Ｇａｌ８０結合活性及び／又はガラクトカイネース活性を有するタンパク質を含むことができる。この態様において、前記支援タンパク質は、Ｇａｌ１活性を有するタンパク質及びＧａｌ３活性を有するタンパク質から選択してもよい。さらに、前記Ｇａｌ８０結合活性を有するタンパク質は、Ｇａｌ１活性を有するタンパク質としてもよい。
【００１２】
この形態においては、前記支援タンパク質は、ガラクトーストランスポーター活性を有するタンパク質を含むことができ、前記支援タンパク質は、Ｇａｌ２活性を有するタンパク質としてもよい。
【００１３】
この形態においては、さらに、前記支援タンパク質は、Ｇａｌ８０結合活性及び／又はガラクトカイネース活性を有するタンパク質とガラクトーストランスポーター活性を有するタンパク質とを含むことが好ましい。この態様において、前記支援タンパク質は、Ｇａｌ１活性を有するタンパク質とＧａｌ２活性を有するタンパク質とを含むことが好ましい。
【００１４】
この形態においては、前記構成的プロモーターは、ＨＩＳ３プロモーター、ＴＤＨ３プロモーター及びＡＤＨ１プロモーター選択されることが好ましい。
【００１５】
また、この形態においては、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下にＧａｌ４活性を有するタンパク質をコードするコード領域を宿主染色体上又は宿主染色体外に保持することが好ましい。また、この形態においては、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に内在性又は外来性の所望のタンパク質をコードするコード領域を保持することが好ましい。これらの態様においては、前記ガラクトース誘導性プロモーターは、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ２プロモーター、ＧＡＬ３プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、ＧＡＬ５プロモーター、ＧＡＬ７プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター及びＭＥＬ１プロモーターからなる群から選択されることが好ましい態様である。さらに、前記ガラクトース誘導性プロモーターは、Ｇａｌ４結合部位を上流側に備えＧａｌ４活性を有するタンパク質によって活性化可能なガラクトース代謝遺伝子以外の内在性プロモーター又は外来性プロモーターであってもよい。この態様において、前記外来性プロモーター又は前記内在性プロモーターは、ＣＹＣ１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター及びＨＯＲ７プロモーターから選択することができる。
【００１６】
本前記宿主細胞は酵母であることが好ましく、酵母は、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ポンベ、ピキア・パストリス、クルイベロマイセス・ラクティス及びカンジダ・アルビカンスから選択されることができる。
【００１７】
本発明の他の一つの形態によれば、構成的プロモーターと、該構成的プロモーターの制御下に連結されＧａｌ４活性を有するタンパク質による転写活性化を支援する支援タンパク質をコードするコード領域と、を備える、核酸コンストラクトが提供される。
【００１８】
本形態においては、前記支援タンパク質は、Ｇａｌ８０結合活性及び／又はガラクトカイネース活性を有するタンパク質を含むことが好ましく、前記支援タンパク質は、Ｇａｌ１活性を有するタンパク質及びＧａｌ３活性を有するタンパク質から選択することができる。
【００１９】
本形態においては、前記支援タンパク質は、ガラクトーストランスポーター活性を有するタンパク質を含むことが好ましく、前記支援タンパク質は、Ｇａｌ２活性を有するタンパク質とすることができる。
【００２０】
また、本発明の他の一つの形態によれば、第１の構成的プロモーターと、該第１の構成的プロモーターの制御下に連結されるＧａｌ８０結合活性を有するタンパク質及び／又はガラクトカイネース活性を有するタンパク質をコードする第１のコード領域と、第２の構成的プロモーターと、該第２の構成的プロモーターの制御下に連結されるガラクトーストランスポーター活性を有するタンパク質をコードする第２のコード領域と、を備える、核酸コンストラクトが提供される。
【００２１】
本発明の他の一つの形態によれば、上記いずれかに記載の核酸コンストラクトを備える発現ベクターが提供される。本形態においては、プラスミド又はウイルスとすることができる。また、本発明の他の一つの形態によれば、前記発現ベクターを保持する宿主細胞も提供される。
【００２２】
本発明の他の一つの形態によれば、上記いずれかに記載の形質転換体を、実質的にガラクトースを含まない培地で培養する培養工程を、備える、培養方法が提供される。本形態においては、さらに、実質的にグルコースを含まず前記形質転換体の前記ガラクトース誘導系を発現可能な程度のガラクトースの存在下で前記形質転換体を培養する培養工程を、備えることができる。
【００２３】
本発明の他の一つの形態によれば、遺伝子の発現方法であって、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に内在性又は外来性の所望のタンパク質をコードするコード領域を保持する上記いずれかに記載の形質転換体を、実質的にガラクトースを含まない培地で培養する第１の培養工程と、実質的にグルコースを含まず前記形質転換体の前記ガラクトース誘導系を発現可能な程度のガラクトースの存在下で前記形質転換体を培養し、前記所望のタンパク質を発現させる第２の培養工程と、を備える、発現方法が提供される。
【００２４】
本形態においては、前記第２の培養工程におけるガラクトースの初期濃度は２０ｇ／ｌ未満であることが好ましい。また、前記第２の培養工程は、ガラクトースを含む培地に培地交換して開始することができる。
【００２５】
本発明の他の一つの形態によれば、形質転換体を用いる物質生産方法であって、上記遺伝子発現方法により発現させた所望のタンパク質又はそのタンパク質による代謝産物を回収する工程を備える、生産方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明の形質転換体、核酸コンストラクト、ベクター、細胞の培養方法、物質の生産方法の各種形態は、Ｇａｌ４活性を有するタンパク質（以下、単にＧａｌ４活性タンパク質という。）による転写活性化を支援する支援タンパク質を構成的に発現させることを意図している。本発明の各種形態は、こうした支援タンパク質を恒常的に発現させることにより、応答性よくガラクトース誘導系を誘導できることを見出したことに基づいている。
【００２７】
図１に、ガラクトース誘導系において考えられる制御機構のうちガラクトース、Ｇａｌ４及び各種の支援タンパク質との関係についての概略を示す。図１（ａ）に示すように、Ｇａｌ４は、ＧＡＬ遺伝子群の転写活性化因子として、ＧＡＬ１などのＧＡＬプロモーターの上流側のＵＡＳｇａｌ部位にＧａｌ４が結合して転写活性化作用を奏する。図（ｂ）に示すように、培地中にガラクトースが存在していないときには、Ｇａｌ４に阻害因子であるＧａｌ８０が結合するため、転写を活性化することができず、ＧＡＬ１の発現は抑制されている。一方、図１（ｃ）に示すように、培地中にグルコースがなくガラクトースが存在しているときには、Ｇａｌ８０の阻害作用が解除され、ＧＡＬ１の転写が活性化される。また、ガラクトースと結合したＧａｌ１やＧａｌ３はＧａｌ８０と結合できることが知られているが、Ｇａｌ１やＧａｌ３の全ての機能は解明されているわけではない。また、培地中のガラクトースは、ガラクトースパーミアーゼ活性を有するＧａｌ２により細胞内に取り込まれ、Ｇａｌ１はガラクトース代謝の第１段階の酵素であるガラクトカイネース活性を有している。しかしながらこれらの関係もまた解明されているわけではない。
【００２８】
本発明者らによれば、例えば、Ｇａｌ８０結合活性及び／又はガラクトカイネース活性を有するタンパク質などの支援タンパク質を構成的に発現させることでガラクトースの存在下に、予想を超えて迅速そして高感度にガラクトース誘導性プロモーターを作動させることができることがわかった。このため、ガラクトースの非存在下で、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下の遺伝子、例えば、外来タンパク質などの質的及び／又は量的に異質なタンパク質を発現させることなく、すなわち、増殖を阻害する可能性のある遺伝子を発現させることなく形質転換体を十分に増殖させることができる。そして、その後に、高密度又は大規模容量に増殖された形質転換体においてガラクトース誘導性プロモーター制御下の遺伝子をガラクトース誘導的に一挙にかつ多量に発現させることができる。本発明によれば、Ｇａｌ４を誘導的に過剰発現するよりも応答性よくガラクトース誘導系を誘導できる。
【００２９】
なお、本明細書において、例えば、Ｇａｌ４活性タンパク質などとタンパク質の名称に活性タンパク質を付記して表記するとき、該名称に係るタンパク質のほか、該名称に係るタンパク質以外のタンパク質であって該名称に係るタンパク質の生理活性のうち本発明に必要な生理活性を有しているタンパク質も包含している。したがって、こうした生理活性を有している限り、該名称に係る天然のタンパク質を改変したり人工的に合成したタンパク質も包含される。また、サッカロマイセス・セレビシエ以外の他の細胞のガラクトース誘導系におけるＧａｌ４に相当するタンパク質も包含される。なお、タンパク質を改変するには、天然タンパク質における生理活性部位についての情報が必要である。生理活性部位の情報は、部位特異的変異の挿入等の手法を用いて特定することができる。また、天然タンパク質のホモログ、オルソログ又はパラログを公知の相同性検索システムを用いて検索し、これらのタンパク質間において可能性ある生理活性部部位を特定することによっても得ることができる。
【００３０】
以下、本発明の形質転換体、核酸コンストラクト、ベクター、培養方法及び形質転換体を用いた物質の生産方法について順次説明する。
【００３１】
（形質転換体）
（ガラクトース誘導系）
本発明の形質転換体は、ガラクトース誘導系を有している。本明細書において、ガラクトース誘導系とは、栄養源としてのガラクトースによって転写活性化されるガラクトース代謝に関連する遺伝子群を意味している。ガラクトース誘導系としては、例えばサッカロマイセス・セレビシエ酵母が備えるＧＡＬ遺伝子群が知られている。サッカロマイセス・セレビシエにおけるＧＡＬ遺伝子群としては、ＧＡＬ４及びＧＡＬ４の遺伝子産物であるＧａｌ４によって正に制御されるＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ５、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０が挙げられる。また、同様にＧａｌ４によって正に制御されるＧＡＬ８０、ＧＡＬ３及びＭＥＬ１が挙げられる。なお、ガラクトース誘導系を構成するコンポーネントには、これら構造遺伝子のほか、プロモーターやそのＧａｌ４結合部位などの調節領域が含まれる。
【００３２】
形質転換体の有するガラクトース誘導系は、宿主細胞が本来的に有するガラクトース誘導系であることが好ましい。すなわち、宿主細胞としてガラクトース誘導系を有する細胞を用いる。こうした細胞は、同等のガラクトース誘導系を備える細胞であればよく、サッカロマイセス・セレビシエのほか、サッカロマイセス・ポンベ、カルルスベンゲルス、ノルベンシス、ジアストチクス、オビホルミス、ウバルム、ロウキシ、モンタヌス、クルイベリ、エロンギスポルス等の他の種であってもよい。また、ピキア、クルイベロミセス等の他の属の酵母であってもよい。さらに、カンジダ・アルビカンスなどのカンジダ属であってもよい。ガラクトース誘導系を備える細胞を宿主細胞として用いることで形質転換体へ導入する外来遺伝子数を抑制できる。
【００３３】
なお、形質転換体の有するガラクトース誘導系は、宿主細胞の内在性遺伝子からなるガラクトース誘導系であってもよいが、一部又は全部が人工的に構築されていてもよい。すなわち、宿主細胞は、ガラクトース誘導系を本来的に有する細胞のほか、ガラクトース誘導系を遺伝子工学的手法により構築された細胞を用いることができる。例えば、ガラクトース誘導系のない宿主細胞にガラクトース誘導系を構築可能な外来遺伝子群を導入したり、ガラクトース代謝能力を有するがガラクトース誘導的でない場合においてガラクトース誘導的に改変したり、宿主のガラクトース誘導系の構造遺伝子や調節領域の一部又は全部を外来性遺伝子で置換したりしてもよい。また、ガラクトース誘導系のコンポーネントは、ガラクトース誘導的にガラクトース代謝が可能である限り、内在性の構造遺伝子や転写調節領域等が改変されていたり、欠損されていたりしてもよい。例えば、サッカロマイセス・セレビシエのガラクトース誘導系におけるＧａｌ４やＧａｌ８０を改変してＧａｌ４活性タンパク質やＧａｌ８０活性タンパク質を発現するように改変されていてもよい。また、ガラクトース誘導系は、その全てが宿主染色体上にある必要はなく、機能可能に宿主染色体及び／又は宿主染色体外に保持されていればよい。
【００３４】
以上のことから、本発明の宿主細胞としては、酵母などの単細胞真核生物が好ましい。こうした宿主細胞としては、なかでも、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ポンベ、カンジダ・アルビカンス、ピキア・パストリス、クルイベロミセス・ラクティスが好ましいものとして挙げられる。より好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエ、クルイベロミセス・ラクティスである。
【００３５】
（構成的プロモーター）
形質転換体は、構成的プロモーターの制御下にＧａｌ４活性タンパク質による転写活性化支援タンパク質をコードするコード領域を保持している。ここで、構成的とは、宿主細胞の生育条件とは無関係に、という意味であり、構成的プロモーターとは、宿主細胞の生育条件とは無関係に制御下にある遺伝子を発現させるプロモーターを意味している。構成的プロモーターは、特に限定しないで使用する宿主細胞の種類に応じてまた制御する遺伝子の種類等に応じて適宜選択すればよい。例えば、サッカロマイセス・セレビシエにおける構成的プロモーターとしては、ＡＤＨ１プロモーター、ＨＩＳ３プロモーター、ＴＤＨ３プロモーター、ＣＹＣ３プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター及びＨＯＲ７プロモーターが挙げられる。なお、本明細書において、例えば、ＡＤＨ１プロモーターと記載した場合、このプロモーターの塩基配列の一部のみからなる改変体や塩基配列の一部が置換,欠失、挿入等された改変体などの各種の改変体も含んでいる。構成的プロモーターは、支援タンパク質の種類に応じた発現レベルのものを選択することができる。例えば、Ｇａｌ８０結合活性及び／又はガラクトカイネース活性を有するタンパク質の構成的プロモーターとしてはＨＩＳ３プロモーター、ＣＹＣ１プロモーターを選択することができる。また、Ｇａｌ２活性タンパク質などのガラクトーストランスポーター活性を有するタンパク質の構成的プロモーターとしては、ＨＩＳ３プロモーターを使用できる。ＨＩＳ３プロモーターは、ガラクトーストランスポーター活性タンパク質を、Ｇａｌ８０結合活性及び／又はガラクトカイネース活性を有するタンパク質と同時に発現させる態様において好ましい、
【００３６】
（Ｇａｌ４活性タンパク質による転写の活性化を支援する支援タンパク質）
本発明において、Ｇａｌ４活性タンパク質による転写活性化を支援する支援タンパク質とは、Ｇａｌ４活性タンパク質以外のタンパク質であって、結果として、Ｇａｌ８０活性タンパク質のＧａｌ４活性タンパク質に対する転写活性化阻害作用を解除するタンパク質であればよい。なお、Ｇａｌ４活性タンパク質とは、具体的には、染色体上等のＧａｌ４結合部位やＵＡＳｇａｌに結合するとともに、Ｇａｌ８０活性タンパク質等との相互作用により下流の遺伝子の転写活性を正に制御するタンパク質であればよい。したがって、サッカロマイセス・セレビシエのＧａｌ４のほか、Ｇａｌ４結合部位への結合活性と転写制御活性を維持して人工的に改変されたタンパク質であってもよい。また、Ｇａｌ４に相当する他の種又は属の酵母等のタンパク質であってもよい。既に、Ｇａｌ４の全アミノ酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：Ｚ７３６０４）及びＤＮＡ結合活性部位、転写活性化部位等は知られており（D. Lohr et al,TheFASEB Journal (1995), p.777-787）、こうした配列に基づいて人工的なタンパク質を作製するのは当業者であれば容易に行うことができる。
【００３７】
本発明においては、支援タンパク質として、Ｇａｌ８０結合活性及び／又はガラクトカイネース活性を有するタンパク質であることが好ましい。Ｇａｌ８０結合活性を有するタンパク質は、Ｇａｌ８０活性タンパク質のＧａｌ４活性タンパク質に対する転写活性化阻害作用を解除できると考えられる。また、ガラクトカイネース活性を有するタンパク質は、ガラクトースの細胞内取り込みを促進するものと考えられ、Ｇａｌ８０結合活性を有するタンパク質の該結合活性を促進するものと考えられるからである。なお、Ｇａｌ８０結合活性とは、Ｇａｌ８０活性タンパク質に対する結合活性であって結果としてＧａｌ８０活性タンパク質のガラクトース誘導系の転写阻害作用を解除するような結合活性である。また、Ｇａｌ８０活性タンパク質とは、サッカロマイセス・セレビシエのＧａｌ８０（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：Ｘ０１６６７）のほか、Ｇａｌ４に結合してその転写活性化作用を阻害する活性を維持して人工的に改変されたタンパク質であってもよい。また、Ｇａｌ８０に相当する他の種又は属の酵母等のタンパク質であってもよい。
【００３８】
Ｇａｌ８０結合活性及びガラクトカイネース活性を有するタンパク質としては、Ｇａｌ１活性タンパク質を用いることができる。また、Ｇａｌ８０結合活性を有するタンパク質としては、Ｇａｌ１活性タンパク質及びＧａｌ３活性タンパク質を用いることができる。ガラクトカイネース活性を有するタンパク質としては、Ｇａｌ１活性タンパク質を用いることができる。サッカロマイセス・セレビシエのガラクトース誘導系においては、Ｇａｌ１及びＧａｌ３は、Ｇａｌ８０と結合能力があり、Ｇａｌ８０によるＧａｌ４に対する転写活性化阻害作用の解除を促進することが知られている。また、Ｇａｌ１は、ガラクトカイネース活性を有している。
【００３９】
Ｇａｌ１活性タンパク質としては、Ｇａｌ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：Ｚ３５８８９）のほか、Ｇａｌ１のガラクトースキナーゼ活性及びＧａｌ８０結合活性を有するタンパク質、ガラクトカイネース活性を有するタンパク質及びＧａｌ８０結合活性を有するタンパク質のいずれかを用いることができる。好ましくは、Ｇａｌ１、ガラクトカイネース活性及びＧａｌ８０結合活性を有するタンパク質を用いることができる。Ｇａｌ３活性タンパク質としては、Ｇａｌ３のほか、Ｇａｌ３のＧａｌ８０結合活性を有するタンパク質を用いることができる。なお、Ｇａｌ１活性タンパク質とは、サッカロマイセス・セレビシエのＧａｌ１のほか、Ｇａｌ８０結合活性及び／又はガラクトカイネース活性を有して、Ｇａｌ８０活性タンパク質のＧａｌ４活性タンパク質に対する転写活性阻害作用を解除できるものであればよく、人工的に構築又は改変されたタンパク質であってもよい。また、Ｇａｌ１に相当する他の種又は属の酵母等のタンパク質であってもよい。また、Ｇａｌ３活性タンパク質とは、サッカロマイセス・セレビシエのＧａｌ３（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：Ｚ７４３０５）のほか、Ｇａｌ８０結合活性を有して、Ｇａｌ８０活性タンパク質のＧａｌ４活性タンパク質に対する転写活性阻害作用を解除できるものであればよく、人工的に構築又は改変されたタンパク質であってもよい。また、Ｇａｌ３に相当する他の種又は属の酵母等のタンパク質であってもよい。
【００４０】
また、支援タンパク質としては、ガラクトーストランスポーター活性を有するタンパク質を用いることができる。ガラクトーストランスポーターは、ガラクトースを細胞内に取り込みを促進でき、Ｇａｌ８０結合活性を有するタンパク質の該結合活性を促進するものと考えられるからである。ガラクトーストランスポーター活性を有するタンパク質としては、Ｇａｌ２活性タンパク質を用いることができる。Ｇａｌ２活性タンパク質は、グルコースの存在下では細胞内において分解されることがわかっている。このため、この支援タンパク質を単独で用いてガラクトース誘導系を応答性よく発現させるには、Ｇａｌ８０結合活性等を有するタンパク質と併用する場合と同等若しくは高レベルに構成的に発現させることが好ましく、そうしたプロモーターを選択することが好ましい。Ｇａｌ２活性タンパク質としては、Ｇａｌ２（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：Ｚ７３２５３）のほか、Ｇａｌ２のガラクトーストランスポーター活性を有するタンパク質を用いることができる。なお、Ｇａｌ２活性タンパク質とは、サッカロマイセス・セレビシエのＧａｌ２のほか、ガラクトーストランスポーター活性を有するものであればよく、人工的に構築又は改変されたタンパク質であってもよい。また、Ｇａｌ２に相当する他の種又は属の酵母等のタンパク質であってもよい。
【００４１】
本発明では、こうした支援タンパク質として、少なくともＧａｌ８０結合活性及び/又はガラクトカイネース活性を有するタンパク質を用いることが好ましく、より好ましくはＧａｌ８０結合活性及びガラクトカイネース活性を有するタンパク質を用いることが好ましい。すなわち、Ｇａｌ１活性タンパク質かＧａｌ３タンパク質を好ましく用いることができ、Ｇａｌ１活性タンパク質をより好ましく用いることができる。本発明を拘束はしないが、Ｇａｌ８０結合活性とガラクトカイネース活性とを有するタンパク質を構成的に発現させることで、ガラクトースの細胞内取り込みを促進するとともに、取り込んだガラクトースと結合してＧａｌ結合活性を発揮し、細胞核内におけるＧａｌ８０活性タンパク質の濃度を速やかに低下させることができると推論される。Ｇａｌ８０結合活性を有するタンパク質及びガラクトカイネース活性を有するタンパク質のいずれかを構成的に発現させることでも、細胞核内におけるＧａｌ８０活性タンパク質濃度を速やかに低下させ、ガラクトース誘導系を応答性よく誘導させることができると推論される。
【００４２】
また、本発明の支援タンパク質としては、Ｇａｌ８０結合活性タンパク質及び／又はガラクトカイネース活性を有するタンパク質とともにガラクトーストランスポーター活性を有するタンパク質を用いることが好ましい。すなわち、Ｇａｌ１活性タンパク質及び／又はＧａｌ３活性タンパク質とともにＧａｌ２活性タンパク質を用いることが好ましく、Ｇａｌ１活性タンパク質及びＧａｌ２活性タンパク質を用いることが好ましい。本発明を拘束するものではないが、ガラクトーストランスポーター活性を有するタンパク質を構成的に発現させることで、グルコースの欠乏に伴って、ガラクトーストランスポーター活性タンパク質が速やかに細胞膜に保持されるようになり、ガラクトースの取り込みを促進し、細胞核内におけるＧａｌ８０活性タンパク質濃度を低下させ、ガラクトース誘導系を応答性よく誘導させることができると推論される。
【００４３】
形質転換体は、こうした支援タンパク質をコードするコード領域を保持している。コード領域は、各種支援タンパク質の公知のアミノ酸配列及び塩基配列に基づいて決定することができるし、また、ガラクトース誘導系の各種タンパク質の各種活性部位の情報や部位特異的変異導入等の手法による活性化部位の決定結果に基づいて決定することもできる。コード領域するポリヌクレオチドは、好ましくはＤＮＡであり、ＤＮＡは、ｃイントロンを含んでいてもよいが好ましくはｃＤＮＡである。なお、コード領域には、人工的なデオキシリボヌクレオチドを含んでいてもよく修飾がなされていてもよい。また、構成的プロモーター及びコード領域は、宿主染色体上にあっても宿主染色体外にあってもよい。好ましくは宿主染色体上に保持される。
【００４４】
（Ｇａｌ４活性タンパク質）
形質転換体は、Ｇａｌ４活性タンパク質をガラクトース誘導的に発現するものであってもよい。すなわち、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下にＧａｌ４活性タンパク質をコードするコード領域を保持していてもよい。支援タンパク質を構成的に発現させることなくＧａｌ４活性タンパク質をガラクトース誘導的に発現させても良好な応答性は得られていないが、支援タンパク質を構成的に発現させた上でＧａｌ４活性タンパク質をガラクトース誘導的に発現させることで、構成的に発現される支援タンパク質によるガラクトース誘導系の誘導の応答性を高め、発現強度を増強できる。
【００４５】
ガラクトース誘導性プロモーターとしては、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ３、ＧＡＬ５、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０及びＭＥＬ１の各遺伝子のプロモーターを用いることができる。本明細書において、こうしたプロモーターはガラクトース誘導的である限り改変されていてもよく、そうした改変プロモーターも包含されるのは既に述べたとおりである。また、これらのプロモーターには、ＵＡＳｇａｌ等のＧａｌ４活性タンパク質結合部位を含んでいる。好ましくは、ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０のいずれかのプロモーターであり、より好ましくは、ＧＡＬ１０プロモーターを用いる。
【００４６】
また、Ｇａｌ４結合部位を上流側に備えＧａｌ４活性を有するタンパク質によって活性化可能なガラクトース代謝遺伝子以外の内在性プロモーター又は外来性プロモーターをガラクトース誘導性プロモーターとして用いることができる。なお、いわゆるガラクトース誘導性プロモーターでないプロモーターであっても、その上流側にＧａｌ４結合部位を備えることでガラクトース誘導性プロモーターとして機能することはよく知られている。例えば、宿主細胞が本来的に有するプロモーターの上流側にＧａｌ４結合部位を保持させることで該内在性プロモーターをガラクトース誘導性プロモーターとして利用できる。ガラクトース誘導的でない外来性プロモーターについても同様である。こうした内在性プロモーター及び外来性プロモーターとしては、ＣＹＣ１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター及びＨＯＲ７プロモーターを好ましく用いることができる。
【００４７】
Ｇａｌ４活性タンパク質をガラクトース誘導的に発現させるための領域は、宿主染色体上に保持されていても宿主染色体外に保持されていてもよいが、好ましくは宿主染色体上に保持される。
【００４８】
以上説明した本発明の形質転換体は、ガラクトース誘導的に所望の遺伝子を応答性よく発現させるのに適した改変されたガラクトース誘導系を備えるものとなっている。すなわち、こうした形質転換体において、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に所望の遺伝子を発現させることで、効率的な物質生産に適した形質転換体を得ることができる。したがって、こうした形質転換体を、ガラクトース誘導系の制御下に所望の遺伝子を発現させるのに好ましい宿主細胞として用いることができる。
【００４９】
（ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に内在性又は外来性の所望のタンパク質をコードするコード領域を保持する形質転換体）
本発明の形質転換体は、ガラクトース誘導的に内在性又は外来性の所望のタンパク質を発現する形質転換体とすることができる。すなわち、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に内在性又は外来性の所望のタンパク質をコードするコード領域を保持することができる。この形質転換体によれば、ガラクトース誘導系の応答性が向上されているため、ガラクトース誘導的に応答性よく遺伝子を発現させて所望のタンパク質又はその代謝物を得ることができる。ガラクトース誘導性プロモーターとしては、既に説明したものから適宜選択して用いることができる。好ましくは、ＧＡＬ１プロモーターを用いる。
【００５０】
ガラクトース誘導的に発現させる所望のタンパク質としては、ガラクトース代謝に関連するタンパク質以外であることが好ましく、必要に応じて選択される。例えば、研究用途等において発現レベルを視覚化するためにＧＦＰなどの各種の蛍光タンパク質を用いることができる。こうした所望のタンパク質をガラクトース誘導的に発現させるための領域は、宿主染色体上及び宿主染色体外のいずれにあってもよいが、好ましくは宿主染色体上にある。
【００５１】
（形質転換体の製造方法）
こうした形質転換体は、好ましくは、ガラクトース誘導系を有する宿主細胞に、構成的プロモーターの制御下に連結されたＧａｌ結合活性を有するタンパク質のコード領域などを含む発現カセットを備える核酸コンストラクトをトランスフォーメーション法や、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、酢酸リチウム法、パーティクルガン法等の公知の遺伝子導入法を用いて導入することによって得ることができる。適当な選択培地によって形質転換体を選択し、遺伝子の導入の確認できたものを用いることができる。
【００５２】
（核酸コンストラクト）
本発明の核酸コンストラクトは、構成的プロモーターと、該構成的プロモーターの制御下に連結されＧａｌ４活性を有するタンパク質による転写活性化を支援する支援タンパク質をコードするコード領域と、を備えている。構成的プロモーターとしては、既に説明したのと同様のプロモーターを用いることができる。また、支援タンパク質についても既に説明した支援タンパク質を用いることができる。また、転写調節領域としてターミネーター他、必要に応じてエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）を連結することができる。選択マーカーとしては、特に限定しないで、薬剤抵抗性遺伝子、栄養要求性遺伝子などを始めとする公知の各種選択マーカー遺伝子を利用できる。
【００５３】
核酸コンストラクトは、１種の支援タンパク質をコードするのであってもよいが、２種類以上の支援タンパク質をコードするものであってもよい。例えば、第１の構成的プロモーターと、該第１の構成的プロモーターの制御下に連結されるＧａｌ８０結合活性を有するタンパク質及び／又はガラクトカイネース活性を有するタンパク質などの第１の支援タンパク質をコードする第１のコード領域と、第２の構成的プロモーターと、該第１の構成的プロモーターの制御下に連結されるガラクトーストランスポーター活性を有するタンパク質等の第２の支援タンパク質をコードする第２のコード領域と、を備えるようにしてもよい。核酸コンストラクトは、宿主染色体との一つ以上の相同性領域を備えさせることで染色体導入型として構築することもできる。
【００５４】
核酸コンストラクトにおける各種のコンポーネントは、ＰＣＲ法等従来公知の手法により取得することができ、こうした核酸コンストラクトは適当なプラスミドベクター等に保持される。用いる遺伝子導入法に応じ、必要時に制限酵素等により切り出されてコンストラクト自体が用いられる。コンポーネントの取得及びコンストラクトの構築操作は従来公知の手法に従って行うことができる。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual second edition（Maniatis et al.,Cold Spring Harbor Laboratory press.1989）に従うことができる。
【００５５】
（発現ベクター）
こうした核酸コンストラクトは、各種ベクターの形態で提供される。ベクターとしては、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、トランスポゾン、人工染色体（ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ等）を、外来遺伝子の導入形態（染色体上あるいは染色体外）や宿主細胞の種類に応じて選択される。また、こうした発現ベクターは、適当な宿主細胞に保持された状態で提供される。
【００５６】
（形質転換体の培養方法）
本発明の形質転換体の培養方法は、Ｇａｌ４活性を有するタンパク質による転写活性化を支援する支援タンパク質を構成的に発現するとともに、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に内在性又は外来性の所望のタンパク質をコードするコード領域を宿主細胞の染色体上又は染色体外に保持する形質転換体を、実質的にガラクトースを含まない培地で培養する培養工程を備えている。こうした培養工程を備えることで、形質転換体におけるガラクトース誘導的に発現される外来性遺伝子等は発現されないで、細胞にとって質的及び／又は量的に異常にタンパク質が発現されることなく細胞が増殖される。これにより、容易に高密度又は大規模に細胞を増殖させることができる。さらに、この形質転換体によれば、応答性よくガラクトース誘導系を発現させることができる。したがって、本培養方法によれば、ガラクトース誘導系を感度よく、短時間でしかも大量に発現させるのに適した細胞増殖状態を容易に得ることができる。なお、本明細書において、「実質的にガラクトースを含まない培地」とは、ガラクトースを含まない培地又は形質転換体の有するガラクトース誘導系が誘導されない程度の濃度を限度としてガラクトースを含む培地を含んでいる。
【００５７】
形質転換体の培養には、宿主細胞や形質転換内容に応じて培養条件を選択することができる。宿主を酵母とする形質転換体を培養する培地としては、酵母が資化可能なガラクトース以外の炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、デンプン、セルロース等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコールを用いることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物の他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等を用いることができる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどを用いることができる。
【００５８】
培養方法は、特に限定しないで、従来公知の培養方法を利用できる。例えば、回分培養、半回分培養、連続培養等のいずれかあるいはこれらを組み合わせて実施することができる。また、酸素供給方式や攪拌方式も、形質転換体の種類に応じて選択すればよい、サッカロマイセス・セレビシエなどの酵母の場合には、通常、振とう培養または通気攪拌培養等の好気条件下、２８〜３０℃で６〜２４時間行う。また、培養中は、必要に応じてアンピシリン、テトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。
【００５９】
（遺伝子の発現方法）
本発明の遺伝子の発現方法は、Ｇａｌ４活性を有するタンパク質による転写活性化を支援する支援タンパク質を構成的に発現するとともに、ガラクトース誘導性プロモーターの制御下に内外性又は外来性の所望のタンパク質をコードするコード領域を宿主細胞の染色体上又は染色体外に保持する形質転換体を、実質的にガラクトースを含まない培地で培養する第１の培養工程と、グルコースを実質的に含まないでガラクトース誘導系を発現可能な程度のガラクトースの存在下で形質転換体を培養し、内在性又は外来性のタンパク質を発現させる第２の培養工程とを備えている。この発現方法によれば、上記第１の培養工程を備えることで、上記したように、ガラクトース誘導系を感度よく、短時間でしかも大量に発現させるのに適した状態となっている。次いで、第２の培養工程においてガラクトースを添加してガラクトース誘導系を発現させることで、一挙にかつ大量にガラクトース誘導的にガラクトース誘導系を発現させてガラクトース誘導的に所望のタンパク質を発現させて該タンパク質又はその代謝物を得ることができる。
【００６０】
本発現方法における第１の培養工程は、本発明の培養方法と同様の各種態様で実施することができる。第２の培養工程においては、グルコースを実質的に含まない。本明細書において、「グルコースを実質的に含まない」とは、グルコースを含まないか又は形質転換体の有するガラクトース誘導系の誘導を抑制しない程度の濃度を限度としてグルコースが含まれてもよいことを意味している。
【００６１】
また第２の培養工程におけるガラクトース誘導系を発現可能な程度のガラクトースの初期濃度は、２０ｇ／ｌ未満とすることができる。好ましくは２ｇ／ｌ以下であり、さらに好ましくは１ｇ／ｌ以下である。また、好ましくは、０．０５ｇ／ｌ以上である。一過性のガラクトース誘導の場合には、ガラクトース濃度は特に維持する必要はないが、必要に応じて維持する場合もある。また、好気的条件で行うことが好ましく、撹拌操作も行うことができる。      
【００６２】
（遺伝子産物又はその二次産物の生産方法）
本発明の遺伝子産物又はその二次産物の生産方法は、本発明の遺伝子発現方法により発現させた所望のタンパク質又はそのタンパク質による代謝産物を回収する工程を備えることができる。タンパク質やその代謝産物の回収工程は、例えば、形質転換体内にこれらの産物が生産された場合は、常法により菌体を超音波破壊処理、摩砕処理、加圧破砕などで細胞を破壊した後、産物と細胞と分離することができる。この場合、必要に応じてプロテアーゼを添加する。また、菌体外に産物が生産された場合には、この培養液等を、ろ過、遠心分離などにより菌体などの固形分を除去する。これらの粗抽出画分に対しては、従来公知の各種精製分離法等を利用して、これらの産物を精製することができる。
【実施例】
【００６３】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において、種々なる形態で実施しすることができる。
【００６４】
（実施例１）ベクターの構築
本実施例においては、サッカロマイセス・セレビシエ由来のイミダゾールグリセロールリン酸脱水素酵素遺伝子（ＨＩＳ３遺伝子）プロモーター配列の制御下で、目的遺伝子としてサッカロマイセス・セレビシエ由来のガラクトカイネース遺伝子（ＧＡＬ１遺伝子）及びガラクトースパーミアーゼ遺伝子（ＧＡＬ２遺伝子）を使用した。さらに、サッカロマイセス・セレビシエ由来のＵＤＰ−グルコース−４−エピメラーゼ遺伝子（ＧＡＬ１０遺伝子）プロモーター配列の制御下でサッカロマイセス・セレビシエ由来のＧＡＬ４遺伝子を使用した。以上に加え、サッカロマイセス・セレビシエ由来のガラクトカイネース遺伝子（ＧＡＬ１遺伝子）プロモーター配列の制御下でオワンクラゲ由来のＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ遺伝子（ＧＦＰ遺伝子）を使用した。
【００６５】
本実施例のために新たに構築した染色体導入型ベクターをｐＢＳ−ＨＩＳ３ｐ−ＧＡＬ１−ＨＩＳ３ｐ−ＧＡＬ２（図２）、ｐＢＳ−ＧＡＬ１０ｐ−ＧＡＬ４（図３）、ｐＢＳ−ＧＡＬ１ｐ−ＧＦＰ（図４）と名付け、以下に本ベクター構築例の詳細を記す。なお本実施例の概要を図２〜４に示す。但し、ベクター構築の手順はこれに限定されるものではない。ベクターの構築にあたって、必要な遺伝子断片であるＨＩＳ３遺伝子のプロモーター断片（ＨＩＳ３ｐ）３２９ｂｐ、ＧＡＬ１遺伝子ｃＤＮＡ断片（ＧＡＬ１ｃ）１６０８ｂｐ、ＧＡＬ２遺伝子ｃＤＮＡ断片（ＧＡＬ２ｃ）１７４６ｂｐ、ＧＡＬ１０遺伝子のプロモーター断片（ＧＡＬ１０ｐ）３８０ｂｐ、ＧＡＬ４遺伝子ｃＤＮＡ断片（ＧＡＬ４ｃ）２６６７ｂｐ、ＣＹＣ１遺伝子のターミネーター断片（ＣＹＣ１ｔ）２３１ｂｐはサッカロマイセス・セレビシエＷ３０３−１ａ株（ＡＴＣＣ：Ｔｈｅ Ｇｌｏｂａｌ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｃｅｎｔｅｒ）のゲノムＤＮＡを鋳型として使用したＰＣＲ増幅法によって単離を行った。
【００６６】
また、ＵＲＡ３遺伝子断片（ＵＲＡ３ｇ）１０５６ｂｐはプラスミドｐＲＳ４０６（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ＴＲＰ１遺伝子断片（ＴＲＰ１ｇ）１０２１ｂｐはプラスミドｐＲＳ４０４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ＬＥＵ２遺伝子断片（ＬＥＵ２ｇ）２２３７ｂｐはプラスミドｐＲＳ４０５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ＧＦＰ遺伝子ｃＤＮＡ断片（ＧＦＰｃ）７４１ｂｐはプラスミドｐＱＢＩ２５（和光純薬社）のＤＮＡをそれぞれ鋳型として使用したＰＣＲ増幅法によって単離を行った。
【００６７】
サッカロマイセス・セレビシエＷ３０３−１ａ株のゲノムＤＮＡは、ゲノム調製キットＦａｓｔ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ １０１社）を用い、詳細は付属のプロトコールに従い、調製した。ＤＮＡ濃度は分光光度計Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ３０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にて測定した。ＰＣＲ反応には、増幅酵素として、増幅断片の正確性が高いとされるＫＯＤ＋ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社）を使用した。上記手法にて調製したサッカロマイセス・セレビシエＷ３０３−１ａ株のゲノムＤＮＡ ５０ｎｇ／サンプル、プライマーＤＮＡ ５０ｐｍｏｌ／サンプル、及びＫＯＤ＋ ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．２ユニット／サンプルを合計で５０μｌの反応系に調製した。反応溶液を、ＰＣＲ増幅装置ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）によってＤＮＡ増幅を行った。ＰＣＲ増幅装置の反応条件は、９４℃、３０秒の後、（９４℃、３０秒→５０℃、３０秒→６８℃、３分）を３０サイクル行い、その後４℃とした。ＨＩＳ３ｐ増幅断片１及び２、ＧＡＬ１ｃ増幅断片、ＧＡＬ２ｃ増幅断片、ＧＡＬ１０ｐ増幅断片、ＧＡＬ４ｃ増幅断片、ＣＹＣ１ｔ増幅断片１〜３、ＵＲＡ３増幅断片、ＴＲＰ１増幅断片、ＬＥＵ２増幅断片、ＧＦＰｃ増幅断片を１％ＴＢＥアガロースゲル電気泳動にて遺伝子増幅断片の確認を行った。なお反応に使用したプライマーＤＮＡは、合成ＤＮＡ（サワデーテクノロジー社）を用い、このプライマーのＤＮＡ配列は以下の通りである。
【００６８】
HIS3p増幅断片1
・KpnI-His3p （29mer）末端に制限酵素KpnIサイトを付加：AGA GGT ACC CGT TTT AAG AGC TTG GTG AG（配列番号１）
・His3-BamHI （31mer）末端に制限酵素BamHIサイトを付加：AGA GGA TCC CTT TGC CTT CGT TTA TCT TGC C
HIS3p増幅断片2（配列番号２）
・SalI-His3 （29mer）末端に制限酵素SalIサイトを付加：AGA GTC GAC CGT TTT AAG AGC TTG GTG AG（配列番号３）
・His3-XhoI（31mer）末端に制限酵素XhoIサイトを付加：AGA CTC GAG CTT TGC CTT CGT TTA TCT TGC C（配列番号４）
GAL1c増幅断片
・BglII-Gal1c （39mer）末端に制限酵素BglIIサイトを付加：AGA AGA TCT ATA ATG ACT AAA TCT CAT TCA GAA GAA GTG（配列番号５）
・Gal1c-NheI （34mer）末端に制限酵素NheIサイトを付加：AGA GCT AGC TTA TAA TTC ATA TAG ACA GCT GCC C（配列番号６）
GAL2c増幅断片
・SalI-Gal2c （38mer）末端に制限酵素SalIサイトを付加：AGA GTC GAC ATA ATG GCA GTT GAG GAG AAC AAT GTG CC（配列番号７）
・Gal2c-XbaI （32mer）末端に制限酵素XbaIサイトを付加：GAG TCT AGA TTA TTC TAG CAT GGC CTT GTA CC（配列番号８）
GAL10p増幅断片
・SacI-Gal10p （29mer）末端に制限酵素SacIサイトを付加：AGA GAG CTC AAA GCT AGT ATT GTA GAA TC（配列番号９）
・Gal10p-BamHI （32mer）末端に制限酵素BamHIサイトを付加：AGA GGA TCC TTA TAT TGA ATT TTC AAA AAT TC（配列番号１０）
GAL4c増幅断片
・BglII-Gal4c （34mer）末端に制限酵素BglIIサイトを付加：AGA AGA TCT ATA ATG AAG CTA CTG TCT TCT ATC G（配列番号１１）
・Gal4-NheI （32mer）末端に制限酵素NheIサイトを付加：AGA GCT AGC TTA CTC TTT TTT TGG GTT TGG TG（配列番号１２）
CYC1t増幅断片1
・XbaI-Cyc1t （31mer）末端に制限酵素XbaIサイトを付加：GAA TCT AGA ACA GGC CCC TTT TCC TTT GTC G（配列番号１３）
・Cyc1t-SalI （27mer）末端に制限酵素SalIサイトを付加：AGA GTC GAC GTT ACA TGC GTA CAC GCG（配列番号１４）
CYC1t増幅断片2
・NheI-Cyc1t （31mer）末端に制限酵素NheIサイトを付加：GAA GCT AGC ACA GGC CCC TTT TCC TTT GTC G（配列番号１５）
・Cyc1t-SalI （27mer）末端に制限酵素SalIサイトを付加：AGA GTC GAC GTT ACA TGC GTA CAC GCG（配列番号１６）
CYC1t増幅断片3
・XbaI-Cyc1t （31mer）末端に制限酵素XbaIサイトを付加：GAA TCT AGA ACA GGC CCC TTT TCC TTT GTC G（配列番号１７）
・Cyc1t-KpnI （27mer）末端に制限酵素KpnIサイトを付加：AGA GGT ACC GTT ACA TGC GTA CAC GCG（配列番号１８）
URA3g増幅断片
・SalI-Ura3g （30mer）末端に制限酵素SalIサイトを付加：AGA GTC GAC GAT TCG GTA ATC TCC GAA CAG（配列番号１９）
・Ura3g-SacI （35mer）末端に制限酵素SacIサイトを付加：AGA GAG CTC GGG TAA TAACTG ATA TAA TTA AAT TG（配列番号２０）
TRP1g増幅断片
・SalI-5-Trp1g（41mer）末端に制限酵素SalIサイトを付加：AGA GTC GAC AAC GAC ATT ACT ATA TAT ATA ATA TAG GAA GC（配列番号２１）
・Trp1g-SacI （30mer）末端に制限酵素SacIサイトを付加：AGA GAG CTC AGG CAA GTG CAC AAA CAA TAC（配列番号２２）
LEU2g増幅断片
・SacI-Leu2g （40mer）末端に制限酵素SacIサイトを付加：AGA GAG CTC TCG AGG AGA ACT TCT AGT ATA TCT ACA TAC C（配列番号２３）
・Leu2-SacI （33mer）末端に制限酵素SacIサイトを付加：AGA GAG CTC TCG ACT ACG TCG TAA GGC CGT TTC（配列番号２４）
GFPc増幅断片
・BglII-Gfpc （36mer）末端に制限酵素BglIIサイトを付加：AGA AGA TCT ATA ATG GCT AGC AAA GGA GAA GAA CTC（配列番号２５）
・Gfpc-BlnI （32mer）末端に制限酵素ApaIサイトを付加：GAG CCT AGG TCA GTT GTA CAG TTC ATC CAT GC（配列番号２６）
【００６９】
上記反応にて取得した各増幅断片をそれぞれ、エタノール沈殿処理によって精製した後、ＨＩＳ３ｐ増幅断片１を制限酵素ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ、ＨＩＳ３ｐ増幅断片２を制限酵素ＳａｌＩ／ＸｈｏＩ、ＧＡＬ１ｃ増幅断片を制限酵素ＢｇｌＩＩ／ＮｈｅＩ、ＧＡＬ２ｃ増幅断片を制限酵素ＳａｌＩ／ＸｂａＩ、ＧＡＬ１０ｐ増幅断片を制限酵素ＳａｃＩ／ＢａｍＨＩ、ＧＡＬ４ｃ増幅断片を制限酵素ＢｇｌＩＩ／ＮｈｅＩ、ＣＹＣ１ｔ増幅断片１を制限酵素ＸｂａＩ／ＳａｌＩ、ＣＹＣ１ｔ増幅断片２を制限酵素ＮｈｅＩ／ＳａｌＩ、ＣＹＣ１ｔ増幅断片３を制限酵素ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ、ＵＲＡ３ｇ増幅断片を制限酵素ＳａｌＩ／ＳａｃＩ、ＴＲＰ１ｇ増幅断片を制限酵素ＳａｌＩ／ＳａｃＩ、ＬＥＵ２ｇ増幅断片を制限酵素ＳａｃＩ／ＳａｃＩ、ＧＦＰｃ増幅断片を制限酵素ＢｇｌＩＩ／ＢｌｎＩでそれぞれ制限酵素反応処理を行った。なお以下に用いた酵素類はすべて宝酒造社製のものを用いた。また、エタノール沈殿処理、制限酵素処理の一連操作の詳細なマニュアルはＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ．１９８９）に従った。
【００７０】
ベクターの構築における一連の反応操作は、一般的なＤＮＡサブクローニング法に準じて行った。すなわち、適当な制限酵素処理を行い、脱リン酸化酵素（ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＢＡＰ、宝酒造社））処理を施したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に対して、制限酵素処理を施した上記のＤＮＡ増幅断片をＴ４ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ反応によって、連結させた。Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ反応には、ＬｉｇａＦａｓｔ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社）を用い、詳細は付属のプロトコールに従った。次にＬｉｇａｔｉｏｎ反応を行った溶液を、コンピテント細胞へ形質転換を行った。コンピテント細胞は大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡社）を用い、詳細は付属のプロトコールに従って行った。得られた培養液は抗生物質アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有したＬＢプレートにまいて一晩培養した。生育したコロニーをＬＢ液体培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）で一晩培養して、ミニプレップによるプラスミドＤＮＡ調製を行い、その溶液を制限酵素処理による確認をして、目的とするコンストラクトを持つ株を単離した。上記の操作を繰り返して、ｐＢＳ−ＨＩＳ３ｐ−ＧＡＬ１−ＨＩＳ３ｐ−ＧＡＬ２、ｐＢＳ−ＧＡＬ１０ｐ−ＧＡＬ４、ｐＢＳ−ＧＡＬ１ｐ−ＧＦＰの３つの染色体導入型ベクターを作製した。
【００７１】
コントロール実験用の染色体導入型ベクターとして、ＧＡＬ１遺伝子のみの効果を検証するｐＢＳ−ＨＩＳ３ｐ−ＧＡＬ１、ＧＡＬ２遺伝子のみの効果を検証するｐＢＳ−ＨＩＳ３ｐ−ＧＡＬ２、ウラシル栄養要求性マーカーのみのｐＢＳ−ＵＲＡ３ｇ、ロイシン栄養要求性マーカーのみのｐＢＳ−ＬＥＵ２ｇも作製した。
【００７２】
構築した染色体導入型ベクターの確認の為に塩基配列決定を行った。塩基配列解析装置としてＡＢＩＰＲＩＳＭ ３１０ ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を使用し、試料の調製法、及び機器の使用方法などの詳細は本装置付属のマニュアルに従った。試料となるベクターＤＮＡはアルカリ抽出法により調製したものを用い、これをＧＦＸＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にてカラム精製した後、分光光度計Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ ３０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）にてＤＮＡ濃度を測定したものを用いた。
【００７３】
（実施例２）（形質転換酵母の作製）
宿主である酵母Ｗ３０３−１ａ株（半数体株、ＴＲＰ１変異、ＬＥＵ２変異、ＵＲＡ３変異）はトリプトファン合成能、ロイシン合成能、ウラシル合成能を欠損した株である。この株をＳＤ培養液５ｍｌにて、３０°Ｃで対数増殖期（ＯＤ６６０ｎｍ＝０．８）まで培養した。これにＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩキット（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社製）を用いてコンピテントセルを作製した。キット添付のプロトコールに従い、このコンピテントセルに上述の実施例にて構築した染色体導入型ベクターｐＢＳ−ＧＡＬ１ｐ−ＧＦＰを制限酵素ＸｂａＩ処理し、遺伝子導入した。この形質転換試料を洗浄後、１００μｌの滅菌水に溶解させてトリプトファン選抜培地に塗沫し、それぞれについて３０°Ｃ静置培養下で形質転換体の選抜を行った。
【００７４】
得られたそれぞれのコロニーを新たなトリプトファン選抜培地で再度単離し、生育能を安定に保持している株を形質転換候補株とした。次に、これらの候補株をＹＰＤ培養液２ｍｌで一晩培養し、これにゲノムＤＮＡ調製キット、ＧｅｎとるくんＴＭ−酵母用−（タカラバイオ社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。調整した各ゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ解析を行い、導入遺伝子の有無が確認できたものを形質転換株１とした。形質転換株１における染色体中の導入遺伝子の構造を図５に示す。
【００７５】
形質転換株１を用いて、上記と同様の方法でコンピテントセルを作製した。このコンピテントセルに上述の実施例にて構築した染色体導入型ベクターｐＢＳ−ＵＲＡ３ｇ、ｐＢＳ−ＨＩＳ３ｐ−ＧＡＬ２、ｐＢＳ−ＨＩＳ３ｐ−ＧＡＬ１、ｐＢＳ−ＨＩＳ３ｐ−ＧＡＬ１−ＨＩＳ３ｐ−ＧＡＬ２をそれぞれ制限酵素ＮｃｏＩ処理し、遺伝子導入した。この形質転換試料を洗浄後、１００μｌの滅菌水に溶解させてウラシル選抜培地に塗沫し、それぞれについて３０°Ｃ静置培養下で形質転換体の選抜を行い、上記と同様の方法で導入遺伝子の確認を行い、有無が確認できたものをそれぞれ形質転換株２〜５とした。これらの形質転換酵母株における染色体中の導入遺伝子の構成を表１に示し、構造を図６〜図９に示す。
【００７６】
【表１】
0004765520.tif 000002
【００７７】
形質転換株２及び５を用いて、上記と同様の方法でコンピテントセルを作製した。これらのコンピテントセルに上述の実施例にて構築した染色体導入型ベクターｐＢＳ−ＧＡＬ１０ｐ−ＧＡＬ４を制限酵素ＥｃｏＲＩ処理し、遺伝子導入した。また、形質転換株５のコンピテントセルにはｐＢＳ−ＬＥＵ２ｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ処理し、遺伝子導入した。これらの形質転換試料を洗浄後、１００μｌの滅菌水に溶解させてロイシン選抜培地に塗沫し、それぞれについて３０°Ｃ静置培養下で形質転換体の選抜を行い、上記と同様の方法で導入遺伝子の確認を行い、有無が確認できたものをそれぞれ形質転換株６〜８とした。それぞれの形質転換酵母株における染色体中の導入遺伝子の構成を表１に示し、構造を図１０〜１２に示す。
【００７８】
（実施例３）発酵試験によるガラクトース誘導性能の検証）
これらの形質転換株２〜８について以下の条件でグルコース存在下（ガラクトース添加なし）で培養し、その後、培地交換してガラクトース存在下（０．０５ｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌ、グルコース添加なし）で培養し、産生したタンパク質を抽出し、ウェスタンブロッティングによりＧＦＰタンパク量を評価した。
【００７９】
（培養条件）
ＳＤ培養液（グルコース２％）５ｍｌにて、各形質転換株を３０°Ｃで一夜前培養した。ＳＤ培養液（グルコース２％）１０ｍｌにこの前培養液１００μｌを植菌して、３０°ＣでＯＤ６６０ｎｍ＝１．０〜１．２のものを０時間とし、培養液１ｍｌを採取して、遠心を行って集菌して−２０°Ｃ保存した。残りの培養液を遠心して菌体を集めて、８ｍｌのＳＣ培地（ガラクトース濃度：０．０５ｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌ）を加えて懸濁して３０°Ｃで０〜４時間、好気条件下で培養を行った（Ｌ字試験管、７０ｒｐｍ（小型振盪培養装置（ＡＤＶＡＮＴＥＣ））。経時的（１ｈ，２ｈ及び４ｈ）に培養液１ｍｌを採取して、遠心を行って集菌して、−２０°Ｃ保存した。
【００８０】
（タンパク質抽出）
−２０°Ｃ保存した菌体を融解し、その６μｌを５０ｍＭ ＰＭＳＦと５０μｌ Ｙ−ＰＥＲ Ｙｅａｓｔ ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）を加えて、ゆるく振とうしながら室温で２０分間処理した。４°Ｃ、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心し、上清を別の１．５ｍｌチューブに移して、タンパク質溶液とした。このタンパク質溶液を１／３希釈し、ＱｕｉｃｋＳｔａｒｔ プロテインアッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて、ＢＳＡ溶液を基準としてＯＤ５９５の吸光度を分光光度計Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ ３０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で測定し、タンパク質濃度を決定した。
【００８１】
（ウエスタンブッロッティング）
１２％のアクリルアミドゲルを作製し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動をＴｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅバッファーを用いて、１００Ｖの定電圧で行った。ゲルをＴｏｗｂｉｎの転写バッファー（２５ｍＭＴｒｉｓ，１９２ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ，２０％ Ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｐＨ８．３）（ｒｅｆ）に２０分間浸して平衡化した。トランスブロットＳＤセル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を用いて、上記の転写バッファーで既に平衡化を行ったタンパク質転写用メンブレンＨｙｂｏｎｄ−Ｐ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に対してゲル中のタンパク質を１５Ｖの定電圧で４０分間転写した。メンブレンを軽く水ですすいだ後、２％ＢＳＡを含む１ｘＴＢＳバッファー中に浸して、室温で一夜振とうしてブロッキングを行った。
【００８２】
抗オート蛍光たん白、モノクローナル抗体Ａｎｔｉ−ＡＦＰ，ｍＡｂ（１１Ｅ５）（和光純薬社製）を一次抗体として、１ｘＴＢＳバッファーに１：１０００倍希釈した。この溶液中にメンブレンを浸して、室温で２時間振とうした。０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を含む１ｘＴＢＳバッファーで１０分間・室温で振とうしてメンブレンを洗浄した。バッファーを取り替えて、この洗浄操作を３回繰り返した。
【００８３】
次に、ＥＣＬＰｌｕｓ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇｒｅａｇｅｎｔ ｐａｃｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に含まれているＡｎｔｉ ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌｉｎｋｅｄ）を二次抗体として、１ｘＴＢＳバッファーに１：１００００倍希釈した。この溶液中にメンブレンを浸して、室温で２時間振とうした。０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）を含む１ｘＴＢＳバッファーで１０分間・室温で振とうしてメンブレンを洗浄した。バッファーを取り替えて、この洗浄操作を３回繰り返した。
【００８４】
ＥＣＬＰｌｕｓキットのプロトコールにしたがって、化学発光を行い（２％，０．２％２ｍｉｎ；０．０１％，０．００５％，１０ｍｉｎ）、化学発光検出器（アイシン精機）でシグナルを検出し、画像データと発光強度の数値データを得た。形質転換株２〜５についての画像データを図１３に示し、得られた測定値に基づくグラフを図１４に示す。なお、これらのグラフにおける発光強度は、メンブレン毎の相対的な数値データであり、メンブレン内の形質転換株４を２時間ガラクトース誘導培地で培養した後の発光強度を１とした場合の比で表した。また、形質転換株６〜８についての画像データを図１５に示す。
【００８５】
図１３及び図１４に示すように、Ｇａｌ１をＨＩＳ３プロモーターで構成的に発現させた形質転換株４とＧａｌ１とＧａｌ２とをＨＩＳ３プロモーターで構成的に発現させた形質転換株５とは、全てのガラクトース濃度においても最も強い発光強度を示した。また、Ｇａｌ２のみを比Ｓ３プロモーターで発現させた形質転換株３は、ガラクトース濃度が２０ｇ／ｌのとき、対照となる形質転換株２を上回った。このことから、Ｇａｌ４による転写活性化を支援するタンパク質であるＧａｌ１、Ｇａｌ３及びＧａｌ２のいずれかを構成的に発現させることで、ガラクトース誘導的にＧＦＰを効率的に発現させることができることがわかった。
【００８６】
また、ガラクトース濃度が２０ｇ／ｌ及び２ｇ／ｌのときには、Ｇａｌ１のみを構成的に発現させた形質転換株４がＧａｌ１とＧａｌ２とを構成的に発現させた形質転換株５よりも上回っていた。一方、ガラクトース濃度が０．１ｇ／ｌ及び０．０５ｇ／ｌのときには、形質転換株５が形質転換株４を大きく上回っていた。すなわち、比較的高濃度のガラクトース存在下では、形質転換株４と５とでは、Ｇａｌ１のみを構成的に発現させた形質転換株４のほうがどちらかといえば優勢ではあるがガラクトース誘導の応答性はそれほど大きく変らないのに対し、ガラクトース濃度が低くなると、これらの応答性は逆転ししかも濃度が低いほど応答性の差は顕著に拡大した。以上のことから、比較的低濃度のガラクトース濃度で有効な応答性を得ようとする場合、Ｇａｌ１とＧａｌ２とを組み合わせて使用することが好ましいことがわかった。また、Ｇａｌ２（ガラクトパーミアーゼ）は、ガラクトース濃度が低い場合において、Ｇａｌ１との相乗作用が増強されることがわかった。さらに、Ｇａｌ２のＨＩＳ３プロモーターによるＧａｌ２のみの構成的発現では、ガラクトース濃度がある程度高い場合には効果的であり、より強力な構成的発現による効果の増大が期待できることがわかった。
【００８７】
また、図１５に示すように、Ｇａｌ１とＧａｌ２とを構成的に発現する形質転換株７，８では、いずれも、Ｇａｌ４をガラクトース誘導的に発現する形質転換株６よりも早くかつ多量のＧＦＰを産生していた。少なくとも、２時間以内においては、形質転換株６においては、有意なシグナルを検出できなかった。また、特に、Ｇａｌ１とＧａｌ２とを構成的に発現するとともにＧａｌ４をガラクトース誘導的に発現する形質転換株７においては、形質転換株６よりも良好な応答性を示した。
【００８８】
以上のことから、Ｇａｌ４をガラクトース誘導的に発現させるだけでは、ガラクトース誘導系を応答性よく誘導できないことがわかった。また、Ｇａｌ１やＧａｌ２などの支援タンパク質を構成的に発現させるともに、Ｇａｌ４をガラクトース誘導的に発現させることで相乗的な効果があることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【００８９】
配列番号１〜２６：プライマー
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１】ガラクトース誘導系におけるガラクトース、Ｇａｌ８０、Ｇａｌ４及び支援タンパク質の関係を示す図。
【図２】pBS-HIS3p-GAL1-HIS3p-GAL2を示す図。
【図３】pBS-GAL10p-GAL4を示す図。
【図４】pBS-GAL1p-GFPを示す図。
【図５】形質転換株1を示す図。
【図６】形質転換株２を示す図。
【図７】形質転換株３を示す図。
【図８】形質転換株４を示す図。
【図９】形質転換株５を示す図。
【図１０】形質転換株６を示す図。
【図１１】形質転換株７を示す図。
【図１２】形質転換株８を示す図。
【図１３】実施例３におけるウェスタンブロッティングのメンブランの画像データを示す図。
【図１４】図１３の画像データをグラフ化した図。
【図１５】実施例３におけるウェスタンブロッティングのメンブランの画像データを示す図。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１】
0004765520.tif 000014
【図１３】
0004765520.tif 000015
【図１４】
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【図１５】
0004765520.tif 000017
【配列表】
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