(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌疾患を処置した対象における前記癌疾患の再発を予測する方法であって、
チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）蛋白親和性リガンドを前記対象から採取した体液サンプルと接触させる工程（前記リガンドは特異的に結合している）、
前記サンプル中の前記ＴＫ１蛋白および／または前記ＴＫ１蛋白と他の分子との複合体のリガンド結合量を測定する工程、
前記測定した前記リガンド結合量に基づきかつ前記ＴＫ１の酵素活性レベルを測定することなく、前記癌疾患の処置後の二つの特定の検査日の測定値の比を用いて癌疾患の再発の確度を推定する工程
からなる方法。
【請求項２】
前記リガンド結合量測定を前記癌疾患処置の開始後１カ月以内に行い、
その後、前記リガンド結合量の再測定を、前記癌処置開始後の１カ月から６カ月後に行う、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リガンド結合量測定を前記癌処置の２１日後に行い、
前記リガンド結合量の再測定を、前記癌処置開始後の３カ月後に行う、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
測定した前記二つのリガンド結合量測定値の比が１を超える場合は、前記癌疾患が再発していることを予測する工程をさらに含む
請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記リガンド結合量と、前記ＴＫ１蛋白および／または前記ＴＫ１蛋白と他の分子との複合体の集中度の関係を、再結合ＴＫ１結合反応レベルと濃度レベルとの関連性を作成し、
前記リガンド結合量および前記作成した関連性から前記濃度レベルを決定し、
前記癌疾患の処置後の１年後の再発の確度を推定する工程が、前記決定した濃度レベルに基づいて前記癌疾患の再発の確度を推定する
請求項１ないし請求項４のいずれかの項に記載の方法。
【請求項６】
前記リガンドがＴＫ１のＣ末端部に特異的に結合する抗体である
請求項１ないし請求項５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項７】
前記リガンドが
配列番号：１によるアミノ酸配列、および
配列番号：２によるアミノ酸配列
から選択されるペプチド配列に対して生成する抗体である
請求項１ないし請求項６のいずれかの項に記載の方法。
【請求項８】
前記リガンド結合測定工程が、高性能化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）ドットブロットイムノアッセイによって前記リガンド結合を測定する工程を含む
請求項１ないし請求項７のいずれかの項に記載の方法。
【請求項９】
前記癌疾患が充実腫瘍癌疾患である
請求項１ないし請求項８のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１０】
前記癌疾患の進行の前記確度が前記リガンド結合量に直接基づいて推定される
請求項１ないし請求項９のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＫ１蛋白と他の分子との複合体が、前記ＴＫ１蛋白と、蛋白またはポリペプチドなどのその他分子と複合体化した酵素的活性または不活性のＴＫ１蛋白を含む
請求項１ないし請求項１０のいずれかの項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌疾患の観察および予測に関し、特に癌疾患の進行および再発の早期予測に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌は人間の主要死亡原因であり、冒される人の数は毎年増加している。癌に対する種々の処置法、例えば化学療法、内分泌治療、放射線治療および外科手術などは最近数十年の間に驚くほど改良されたとはいえ、それらは完全とはほど遠いものであり、特に後期の癌患者ではそう言える。このため患者の腫瘍の早期発見のために多くの研究が費やされてきた。
【０００３】
腫瘍および腫瘍病期を決定するために用いられる一つの方法は、患者における細胞増殖の測定である。腫瘍におけるＤＮＡ−合成細胞（Ｓ−期細胞）の割合がそれらの増殖速度の尺度として使用される。ＤＮＡ−合成細胞は以前は放射性標識チミジンによって測定された（オートラジオグラフィー）。チミジンのハロゲン同族体（ＢｒｄＵ）およびこれらに対する抗体類の取り込みが定量的フローサイトメトリーＤＮＡ測定値と共に使用された。同位体標識チミジンおよびＢｒｄＵを使用する際の欠点は、生きている細胞だけが測定できることである。そのためこれらの方法は選ばれた患者並びに限られた数の研究に使用されたに過ぎない［非特許文献１］。さらに、フローサイトメトリー法は増殖細胞と非増殖細胞とを見分けることができない。Ｓ−期細胞の測定は腫瘍ではさらに複雑である、というのは癌腫細胞のＤＮＡ含有量は良性細胞のそれと差がないからである（非特許文献２）。
【０００４】
ＤＮＡ合成そのものを測定する代わりに、増殖細胞に関連するマーカー、例えばＫｉ−６７およびＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）などが使用されてきた。Ｋｉ−６７は、Ｇ０を除く全ての細胞周期に現れる（非特許文献３）。Ｋｉ−６７に対する抗体類は新鮮組織並びにホルマリン固定およびパラフィン埋封組織で利用できる。細胞増殖速度に応じて、ＰＣＮＡは全ての細胞周期に現れる。種々の固定法において、ＰＣＮＡはＫｉ−６７ほど敏感ではない（非特許文献４）。ＤＮＡ合成に関係するその他のタイプの蛋白および酵素に対する抗体類（ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチド還元酵素）について試験が行われたが、成功する結果は限られていた［非特許文献５］。
【０００５】
ピリミジン・サルベージ経路の酵素であるピリミジンチミジンキナーゼ（ＴＫ）はチミジンからチミジン一燐酸への燐酸化を触媒する。ヒト細胞におけるＴＫは、異なる遺伝子によってコードされる２種類の型、すなわち細胞質蛋白（ＴＫ１）およびミトコンドリア蛋白（ＴＫ２）としてあらわれる。ヒトＴＫ１およびＴＫ２はそれぞれ染色体１７ｑ２３．２−ｑ２５．３および１６ｑ２２−ｑ２３．１に位置する。ＴＫ１転写体は、ヌクレオシドキナーゼ類に典型的な高度に保存された領域を有する２５．５ｋＤａ蛋白をコードする。しかしこの酵素ファミリの結晶構造はまだ決定されていない。ＴＫ１の発現は細胞周期によって調節され、ＴＫ１の調節はｍＲＮＡレベルと共に増殖中の細胞においてピークになる。ＴＫ１  ｍＲＮＡのスプライシングおよび翻訳も、異なる増殖期の細胞では変動する。ＴＫ１レベルは主として翻訳後メカニズムによって調節され、特に分裂細胞における非常に活発なプロテアーゼ発現による差別的分解によって調節される。ＴＫ１のＣ末端領域は特殊配列、ＫＥＮ、を含む。これはアナファーゼ促進複合体／サイクロソーム−Ｃｄｈ１−媒介性経路によるＴＫ１の有糸分裂的分解のシグナルであることが最近判明した［非特許文献６］。ＴＫ２は細胞周期によって調節されず、静止細胞に見いだされる唯一のＴＫ酵素である［非特許文献７〜非特許文献１２］。
【０００６】
上記マーカー類の大部分は組織における細胞増殖を確認するために使用されている。しかしチミジンキナーゼ活性は、ヒト乳癌における増殖マーカーとして組織の細胞質フラクションに確認されてきた。１６９２名の乳癌患者の研究では［ブレト（Ｂｒｏｅｔ）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１９巻：ｐ．２７７８、２０００］、細胞質中の高いＴＫ１活性は、短い生存期間並びに内分泌治療（タモキシフェン）結果の不良と関連していた［非特許文献１３］。その他にチミジンキナーゼは、その酵素活性を測定することによって、血清中の細胞増殖マーカーとしても用いられている。
【０００７】
血清ＴＫ（ＳＴＫ）酵素活性と高増殖との間には密接な関連性があるため、それは細胞増殖の、したがって悪性腫瘍発見の敏感で有用なマーカーと考えられている［非特許文献１４〜非特許文献３０］。こうして、ＳＴＫ酵素活性は種々の血液腫瘍患者における腫瘍マーカーとして使用されている。しかし、ＳＴＫ活性は充実癌の患者では良いマーカーでないことが判明した。
【０００８】
ＳＴＫ酵素活性の９５％以上がＴＫ１に対応し、その一方で５％未満がＴＫ２に対応する。ＳＴＫの組成および特性はまだ十分には理解されていない。結果は、ＳＴＫがその他の血清蛋白と結合したとも考えられるＴＫ１の重合体型であり、約７００ｋＤａの総分子量を有することを示している［非特許文献３１］。
【０００９】
１９８４年に、基質としてチミジン類似体である５−ヨード−２’−デオキシウリジンを用い、ＳＴＫ活性は血清学的増殖マーカーとして確認された［非特許文献３２］。そして現在は市販のＲＩＡ−キット−［１２５Ｉ］−ラジオアッセイとして入手できる（サングテク・メディカルＡＢ（Ｓａｎｇｔｅｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＢ），ストックホルム、スエーデン、最近ディアソリン社（ＤｉａＳｏｒｉｎ  Ｉｎｃ．）によって買収された）。ＳＴＫ活性アッセイは急性白血病および慢性白血病（ＣＬＬ）、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫の患者の腫瘍の広がりおよび予後を推定するのに有用であるが、充実腫瘍の症例においては役に立たない［非特許文献３３］。ＣＬＬ患者において、ＳＴＫ酵素活性は治療に対する反応性及び生存期間の両方に関して有用な予後情報を提供する。この方法は、特に白血病およびリンパ腫疾患には相対的に有効であるとはいえ、５−ヨード−２’−デオキシウリジンはＳＴＫ（ＴＫ１）活性のための特異的基質ではない。さらに、［１２５Ｉ］−ラジオ−ヨード−デオキシウリジンは短い半減期（４週間）をもち、ＳＴＫ酵素活性は温度およびｐＨの変化に非常に敏感であり、ラジオアッセイは専門的機器（γ−シンチレーションカウンタ）、同位元素研究室および高度に熟練した人を必要とする。このようなラジオアッセイ法の欠点がこのアッセイの臨床的使用を妨げていると考えられる。
【００１０】
そのため、ＳＴＫ反応産物に対する抗体に基づく新しいＳＴＫ活性キットが最近開発された。抗−ＴＫ１抗体も最近１０年間に作られたが、大部分は基礎研究のためのポリクローナル抗体で、商業的使用のためのものではない。最近マウスモノ−およびポリクローナル抗−ＴＫ１抗体が、可能な臨床的目的のために、すなわち乳癌［非特許文献３４］および肺癌［非特許文献３５］のために開発された。臨床的使用のためではなく基礎研究のために一つの抗−ＴＫ１モノクローナル抗体が市販されている（ＱＥＤビオサイエンス社、サンジエゴ、ＵＳＡ、２００３）。
【００１１】
米国特許第５，６９８，４０９号においてオネイル（Ｏ’Ｎｅｉｌ）は、ラジ（Ｒａｊｉ）細胞から得た、ＴＫ１の酵素的活性１００ｋＤａテトラマー型に対して生成したモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を開示している。上記ｍＡｂは、患者の生物学的サンプル中のこの酵素的活性型ＴＫ１だけを確認するために使用される。さらに、オネイルは、上記ｍＡｂを使用することに加えてラジオ標識チミジンを使用してＴＫ活性を測定しなければならない。測定されたＴＫ１活性を用いて種々の型の癌を診断し、観察する。それらの抗−ＴＫ１モノクローナル抗体の特性から、これら抗体の特異性について疑問が生まれた、すなわちそれらはＳＤＳゲル電気泳動ウエスタンブロット法によって期待されるものよりも高分子量の蛋白と反応する（ヒトＨｅＬａ細胞の抽出液中の４５ｋＤａ  対  ２５ｋＤａ）。さらに、上記抗体類はこの分野のその他の研究者によって見いだされた別の（より高い）濃度範囲に出現する血清蛋白を検出する。すなわちある人は血清を１６０００倍希釈しなければならず、またある人は未希釈の血清を使用する。これらの事実は、それらの抗体が酵素的活性を有するＴＫ１および／またはＴＫ２に加えて、その他の蛋白とも反応することを示唆する。その上、オネイルの方法は上記のラジオ標識チミジン類似体を使用する場合と同様な問題で障害がある。
【００１２】
クロイワら［非特許文献３６］は２６の抗−ＴＫ１モノクローナル抗体を開発し、試験した。これらの抗体の特性はより期待できるものである、すなわちそれらはウエスタンブロット法で、ヒトＨｅＬａの抽出液中の２５ｋＤａの分子量を有する蛋白と反応し、その他の蛋白との交差反応性は報告されていない。ＥＬＩＳＡ法において充実腫瘍患者からの血清中でこれらの抗体を使用した際、彼らは上記血清ＴＫ１レベルと健常者からの血清ＴＫ１レベルとの間に有意差を見いださなかった。
【特許文献１】米国特許第５，６９８，４０９号
【非特許文献１】ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ），Ａｃｔａ  Ｏｎｃｏｌ．，３０巻：ｐ．９０３、１９９１
【非特許文献２】トリブカイト（Ｔｒｉｂｕｋａｉｔ）、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｕｒｏｌ．５巻：ｐ．１０８、１９８７年
【非特許文献３】ショルゼン（Ｓｃｈｏｌｚｅｎ）、Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１８２巻：ｐ．３１１、２０００年
【非特許文献４】ホール（Ｈａｌｌ）、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｎｅｔ．，２５巻：ｐ．５０２、１９９０年
【非特許文献５】ウィルソン、Ａｃｔａ  Ｏｎｃｏｌ．３０巻：ｐ．９０３、１９９１年
【非特許文献６】キー（Ｋｅ）、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２４巻：ｐ．５１４、２００４年
【非特許文献７】ウィンタースバーガー（Ｗｉｎｔｅｒｓｂｅｒｇｅｒ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，２５巻：ｐ．３０３、１９９７
【非特許文献８】シャーリ（Ｓｈｅｒｌｅｙ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３巻：ｐ．８３５０、１９８８年
【非特許文献９】ヒー（Ｈｅ）、Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｌｉｆ．２４巻：ｐ．３、１９９１年
【非特許文献１０】カウフマン（Ｋａｕｆｆｍａｎ）  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１巻：ｐ．２５３８、１９９１年
【非特許文献１１】ヘングストシュレーガ（Ｈｅｎｇｓｔｓｃｈｌ  ｇｅｒ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９巻：ｐ．１３８３６、１９９４年
【非特許文献１２】ムンチ−ピータ−スン（Ｍｕｎｃｈ−Ｐｅｔｅｒｓｅｎ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６巻：ｐ．９０３２、１９９１年
【非特許文献１３】フェケンス（Ｆｏｅｋｅｎｓ）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６１巻：ｐ．１４２１、２００１年
【非特許文献１４】ヒー、Ｉｎｔｅｒｎａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒ，１５巻：ｐ．１３９、２０００年
【非特許文献１５】ズー（Ｚｏｕ）、Ｉｎｔｅｒｎａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒ、１７巻：ｐ．１３５、２００２年
【非特許文献１６】ヒー、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１２８９巻：ｐ．２５、１９９６年
【非特許文献１７】ヒー、Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、７０巻：ｐ．１１７、１９９６年
【非特許文献１８】ウー（Ｗｕ）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６巻：ｐ．４８６７、２０００年
【非特許文献１９】マオ（Ｍａｏ）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｖｅｓ．２０巻：ｐ．９２２、２００２年
【非特許文献２０】ワング（Ｗａｎｇ），Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｅｌｌ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２３巻：ｐ．１１、２００１年
【非特許文献３０】キロイワ（Ｋｉｒｏｉｗａ）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５３巻ｐ．１、２００１年
【非特許文献３１】カールストレム（Ｋａｒｌｓｔｒ  ｍ）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２巻；ｐ．２３、１９９０年
【非特許文献３２】グロノウィッチ（Ｇｒｏｎｏｗｉｃｈ）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４７巻：ｐ．４８７、１９８３年
【非特許文献３３】グロノウィッチ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１５巻：ｐ．５、１９８４年
【非特許文献３４】ツァング（Ｚｈａｎｇ）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｅｖ．２５巻：ｐ．８、２００１年
【非特許文献３５】ボエラ（Ｖｏｅｌｌｅｒ）、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  １２巻：ｐ．５５５、２００１年
【非特許文献３６】Ｋｕｒｉｏｗａ、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５３巻：ｐ．１、２００１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の一般的目的は、対象における癌疾患の進行および再発を早期に予測するための試験を提供することである。
【００１４】
本発明のまた別の目的は、対象における癌疾患の進行の確度を推定するための決定補助法（決定をサポートする方法）を提供することである。
【００１５】
本発明の特別な目的は、癌処置後の対象における腫瘍の局所的および／または転移性出現または再発を早期に予測することである。
【００１６】
これらのおよびその他の目的は、添付の特許請求の範囲により規定される本発明によって明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
要するに本発明は、癌と診断され、癌の可能な処置を受けている患者における癌の進行および再発の確度を早期に予測または推定することに関するものである。本発明は、癌と診断された、または癌処置後（例えば手術、化学療法、内分泌療法、放射線治療および／または免疫治療後）の対象、好ましくは哺乳動物対象、より好ましくはヒト対象から得たサンプル、好ましくは血清サンプルなどの体液サンプル中の、チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）蛋白を含む免疫反応性物質（ＩＭ）の結合反応レベルを測定することに基づく。この測定されたＩＭ結合反応レベルに基づいて腫瘍再発の確度が推定される。
【００１８】
測定されるＩＭ結合反応レベルはある実施形態においては上記対象で複数回測定される。好ましくは第一回目のサンプル採取および結合反応測定は上記対象において癌処置開始後１カ月以内、より好ましくは治療が終わる前、例えば癌処置を開始する前におこなわれる。第二のサンプルは処置開始後に、例えば癌処置後１年以内に採取するのが好ましい。より好ましくは第二のＩＭ結合反応レベルの測定は、上記対象で処置開始後、または処置終了後１カ月から１年までの間、例えば１カ月から６カ月までの間、または約３カ月後におこなわれる。いずれの場合も、第二のＩＭ結合反応レベルは、上記同一対象において第一のＩＭ結合反応レベル測定から最低１週間、例えば数週間、１カ月、または複数月経過するまでは測定しない。
【００１９】
このように癌疾患の進行予測は２つのＩＭ結合反応レベルの比較に基づいて、またはそれらから誘導される量の吟味によって行われる。例えば、第二のＩＭ結合反応レベルが第一のＩＭ結合反応レベルに等しいかまたはそれを超えている場合、上記対象は腫瘍再発の高い確度を有する。言い方を変えると、第二の（後続の）ＩＭ結合反応レベルと第一のＩＭ反応レベルとの比が１より大きいかまたは１に等しい場合は腫瘍再発の確度が高い。
或いは、対象の測定ＩＭ結合レベルを健常者の体液サンプルから測定された正常ＩＭ結合反応レベルに比較することができ、局所的および／または転移腫瘍の出現をこの比較に基づいて予測することができる。
【００２０】
ＩＭ結合反応レベルは、体液（例えば血清）サンプルと、ＴＫ１蛋白に親和性を有するリガンドとを接触させることによって測定するのが好ましい。本発明の好ましい実施形態において、上記リガンドはＴＫ１蛋白の表面露出エピトープに特異的に結合する抗体、より好ましくはＴＫ１蛋白のＣ−末端部の明確に決められた免疫原性配列に特異的に結合する抗体である。このリガンドは好ましくは酵素的に活性な型および不活性な型両方のＴＫ１蛋白を検出することができ、その他の巨大分子と複合体化したＴＫ１蛋白も検出できると考えられる。その後抗体結合量を適切な高感度のアッセイによって、好ましくは高性能化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）ドットブロットアッセイ系、より好ましくはニトロセルロース膜を使用するＥＣＬドットブロットアッセイ系によって測定される。
【００２１】
この測定されたＩＭ結合反応レベルから、例えば組換えヒトＴＫ１（ｒｈＴＫ１）などの標準を使用してＩＭ濃度を決定できる。このような場合、抗−ＴＫ１抗体を使用する結合反応を種々の既知濃度のｒｈＴＫ１を含むサンプル中で測定し、結合反応対濃度の標準曲線を作成する。癌の処置を受けた対象のその後のＩＭ結合反応レベル測定値を、標準曲線を使用して対応するＩＭ濃度に関連づけることができる。癌進行および再発の確度はこのＩＭ濃度に直接基づいて推定される。
【００２２】
これは、本発明において癌疾患の処置を受けた患者の癌疾患の再発はＴＫ１蛋白を含む免疫反応性物質の結合反応レベルまたは濃度レベルに基づいて決められることを意味する。これは腫瘍再発予測のためにチミジンキナーゼ活性を使用する先行技術とは明らかに異なる。
【００２３】
癌と診断され、処置した後最初の数カ月以内にＩＭ結合反応レベルを決定することによって、その後（処置後１ないし３年、恐らく１０年以内に）癌疾患再発のリスクの高い患者を検知し、確認することができる。かくして本発明は腫瘍再発の高いおよび低いリスクを有する患者を早期に検出することができ、これによって鑑別処置を可能にし、上記処置の成功の機会を高め、患者の生存期間を延ばすだけでなく、非効率で不必要な処置を回避することもできる。
【００２４】
ＴＫ１蛋白含有免疫反応性物質としては、血清ＴＫ１蛋白などのＴＫ１蛋白、酵素的活性および／または不活性のモノマーおよび／またはポリマー（ジメア、テトラマーなど）型のＴＫ１蛋白、および／またはその他の分子、例えばインヒビタのような蛋白などと複合体化したＴＫ１蛋白がある。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は大部分の型の癌に適用でき、特に充実腫瘍、例えば乳癌、胃癌および肺癌などに適する。本発明は下記の利点を有する。
−腫瘍再発のリスクを有する処置ずみ癌患者の早期発見。
−過剰処置を回避して鑑別癌処置を可能にし、および／または治療方針の変更を可能にする決定補助を提供する。
−癌患者の生存の機会および生活の質を高めることができる。
【００２６】
本発明によって提供されるその他の利点は、以下に記す本発明の実施形態の説明を読むことによって理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は本発明のその他の目的および利点と共に、下記の説明および添付の図面を参照することによって非常によく理解される。
【００２８】
別途記載がない限り、本明細書に使用される全ての技術的および科学的用語は本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本発明を明確にするために、本明細書には次の定義が使用される。
【００２９】
“チミジンキナーゼ”（ＡＴＰ：チミジン−５’ホスフォトランスフェラーゼ、インターナショナル・ユニオン・オブ・バイオケミストリー・クラシフィケーション・システムではＥＣ．２．７．１．２１）はピリミジン・サルベージ経路の酵素であり、チミジンを燐酸化してチミジン一燐酸にする。ヒト細胞ではＴＫは２種類の型がある。異なる遺伝子によってコードされる細胞質チミジンキナーゼ１（ＴＫ１）型と、ミトコンドリアチミジンキナーゼ２（ＴＫ２）型である。“ＴＫの酵素活性”とは、チミジンからチミジン一燐酸への燐酸化を触媒するＴＫの役割を言う。
【００３０】
“ＴＫ１蛋白を含む免疫反応性物質（ＩＭ）”とは、ＴＫ１蛋白を含む物質または組成物を言う。ＩＭ物質はＴＫ１蛋白の酵素的活性および不活性型の両方を含み、モノマー、ポリマー（例えばジメア、テトラマー）ＴＫ１蛋白型および／またはＴＫ１蛋白の全ての型を含む。上記物質は、それに加えて、またはそれに代わって、蛋白およびポリペプチドなどのその他分子と複合体化した（酵素的活性または不活性）ＴＫ１蛋白を含むことができる。
【００３１】
本発明の一態様により、癌処置を受ける対象、好ましくは哺乳動物対象、より好ましくはヒト対象において癌疾患の進行および再現または再発を早期に予測する方法が提供される。上記方法は上記対象から採取したサンプル中のチミジンキナーゼ１（ＴＫ１）蛋白を含む免疫反応性物質の結合反応レベルを測定することを含む。外観または癌腫瘍の再現によって示されるような癌疾患の進行確度を、その後測定ＩＭ結合反応レベルに直接基づいて推定する。
【００３２】
本発明の特定の態様において、結合反応レベルは、酵素的活性および不活性型両方のＴＫ１蛋白を含む免疫反応性物質において測定される。本発明の実施形態において、この結合反応レベルは、ＴＫ１に親和性を有するリガンドを使用して、対象から得たサンプル中のＩＭ濃度レベルとして表される。癌の進行および再発の確度は測定されたＩＭ濃度レベルに直接基づいて推定される。
【００３３】
本発明の実施形態において、ＩＭ結合反応レベルは上記対象において複数時点、すなわち少なくとも２時点で測定される。疾患再現の確度はこれら少なくとも２つの結合反応レベルの比較に基づく。本発明の好ましい実施形態において、第１回のサンプル採取および結合反応測定は癌処置の開始後１カ月以内、より好ましくは処置の終わる前、例えば上記対象の癌処置が開始する前、または上記癌疾患の診断に伴って行われる。少なくとも第二のサンプルは好ましくは処置の開始後、例えば癌処置後１年以内に対象から採取され、ＩＭ結合反応レベルが分析される。より好ましくは、第二のＩＭ結合反応レベルは、処置の開始後または処置が終わった後１カ月から１年までの間に、例えば１カ月と６カ月との間、または大体３カ月に測定される。いずれの場合でも、第二のＩＭ結合反応レベルは、同じ対象の第１回のＩＭ結合反応レベルの測定から少なくとも１週間、例えば数週間、１カ月または数カ月までは測定しないのが好ましい。
【００３４】
癌疾患の進行および／または腫瘍再発の予測は２つのＩＭ結合反応レベルの比較、またはそれらから誘導された量の研究に基づいておこなわれる。例えば、第二のＩＭ結合反応レベルが第一のＩＭ結合反応レベルに等しいかまたはそれを超えている場合上記対象は癌再発の確度が高い。言い換えれば、第二の（後の）ＩＭ結合反応レベルと第一のＩＭ結合反応レベルとの比が１を超えているか１である場合、腫瘍再発の確度が高い。
【００３５】
対象におけるＩＭ結合反応レベルは、好ましくは癌処置中および処置後の数時点に、例えば上記患者の手術後、化学療法処置開始後、内分泌療法処置の開始後、放射線療法処置の開始後、および／または免疫療法処置の開始後に、周期的または間欠的に測定される。したがってＩＭレベルを治療後の翌年中に、例えば次の５ないし１０年までに測定してできるだけ早く対象の癌疾患の進行を見つけるのが好ましい。しかし大部分の型の癌、特に充実癌の型では本発明の方法は癌処置後最初の６カ月以内、例えば最初の３カ月に何らかの癌再発を見いだすことができると考えられる。これらのその後の結合反応レベルは同じ対象でより早く測定された対応する結合反応レベル、例えば上述の第一のＩＭ結合反応レベルに比較するのが好ましい。
【００３６】
言い換えれば、本発明は、癌処置後最初の数カ月（一般的には０−６カ月、ある癌では０−３カ月）以内に、対象に新たに（局所的および／または転移性）腫瘍が戻ってきたかどうかを予測することができる。こうして、癌疾患が処置後２年以内に始めて再出現するとしても、本発明は処置後数カ月以内にその進行および再発を予測できる。このような早期予測によって、追加的処置および／または処置法の変更が行われ、予測された局所的および／または転移性腫瘍の出現を阻止できる。それに加えて、再発の可能性が高いと予測された対象は、新しい腫瘍ができるだけ早く発見されるように綿密な監視下に置かれ、それによって対象の生存の機会は高まるかも知れない。同じアッセイによる低リスク患者の確認も、過剰処置または不必要な処置を受けるリスクを減らすというやり方で患者の生活の質をも改善する。
【００３７】
本発明の別の実施形態では、測定されたＩＭ結合反応レベルを、腫瘍のない健常者から測定された正常な結合反応レベルと比較する。この場合癌進行および再発の確度の推定はこの比較に基づく。例えば測定ＩＭレベルが正常ＩＭレベルより有意に高い場合、疾患が進行および再発する可能性がある。上に述べたように、ＩＭ結合反応レベルは複数の異なる時点に、例えば癌処置前から始めて、処置中および処置後も続けて測定するのが好ましい。
【００３８】
測定ＩＭレベルと比較するための正常なまたは健常者のＩＭ結合反応レベル（濃度または量）は、健常者からの一連のサンプル、好ましくは血清サンプルなどの体液サンプルのＩＭ結合反応を測定することによって決定できる。これらの健康な対象は証明できる腫瘍を一切もたない、またはもったことがない、すなわち腫瘍または癌疾患の臨床的徴候を何ら示さないのが好ましい。これらの対照健常者のＩＭ結合反応レベルは、以下により詳細に述べるように、被検対象における結合反応レベルの測定と同じ方法を使用して測定される。ある実施形態において、正常なＩＭ結合反応レベルは健康対象の一連のサンプルから測定されるＩＭ結合反応レベルの平均値である。
【００３９】
健康なヒト対象におけるＩＭ濃度レベルは約１ｐＭ以下であり、ヒト腫瘍患者ではこのレベルは数百ｐＭに上昇する。２または３ｐＭまたはそれ以上の測定ＩＭ濃度を異常レベルと決めることができ、したがって腫瘍疾患進行の確度に対応する。しかし癌疾患再発の確度に相当する濃度レベルは、腫瘍の型や対象の種類の違いによって異なることがある。
米国特許第５，６９８，４０９号によって代表される先行技術の予測法は、背景の段落で簡単に述べたように、血清サンプル中のＴＫ（およびＴＫ１）の酵素活性の測定値に基づく。上述の患者において、オネイルはＴＫ１の酵素的活性なテトラマー１００ｋＤａ型に結合し（ＴＫ１のテトラマー１００ｋＤａ型の活性部位に結合すると考えられる）、ＴＫ１酵素活性を阻害するモノクローナル抗体を使用している。ＴＫ酵素活性に基づいて腫瘍の再発を予測するために、オネイルは（血清）ＴＫ酵素活性と、ＴＫ１含有免疫反応性物質のレベル（濃度）との間に直接的相関性があると仮定している。本発明によって示されるように、そのような相関関係は健常者や、非癌−疾患、例えば腎不全、出血および肺感染症などの患者に存在する。ＴＫ血清活性と濃度との相関関係は癌のわずかの型で癌処置前にも見いだされる。しかしそのような相関関係は癌処置中または、特に癌処置後には見いだされない。癌患者における血清ＴＫ１（ＳＴＫ１）濃度と血清ＴＫ（ＳＴＫ）の酵素活性との相関関係の欠如を説明するものとして考えられるのは、ＳＴＫ１濃度およびＳＴＫ活性がチミジンキナーゼの異なるサブ集団を反映しているということである。その上、ＩＭ／ＳＴＫ１濃度および／またはＳＴＫ酵素活性をコントロールする血清中の調節因子（類）が考えられる。さらに、ＴＫ酵素活性はｐＨおよび温度の変化に非常に敏感であることも知られている。
【００４０】
癌処置後にＳＴＫ酵素活性の測定に基づいて（すなわち酵素活性領域の測定値に基づく）腫瘍再発の確度を判断する先行技術の方法、例えば米国特許第５，６９８，４０９号に開示されたモノクローナル抗体を使用し、ＳＴＫ１の結合反応（濃度）レベルとＳＴＫ酵素活性との相互関係を推定する前記方法は間違った予測を与える、特に充実腫瘍の場合にこれが言える。
【００４１】
しかし、本発明に述べる抗体を使用してＩＭ（ＳＴＫ１）の結合反応レベルまたは濃度を測定し、測定された結合反応レベルまたは濃度（すなわち結合反応または濃度領域における測定値）に直接基づいて癌疾患の進行を推定することによって、はるかに正確な腫瘍疾患予測がおこなわれる。
【００４２】
本発明による癌進行の予測は、対象からの生物学的サンプル、好ましくは体液サンプル、例えば血清サンプル中のＩＭの結合反応（濃度または量）レベル、例えばＴＫ１蛋白濃度などに基づく。（血清）サンプル中の１Ｍの結合反応レベルは種々のリガンドを使用する当業者に公知の数種の方法で測定できる。本発明の現在好ましい実施形態において、ＩＭ結合反応レベルはサンプルを特殊のＴＫ抗体と接触させ、その後上記抗体の結合を測定する。この抗体結合は当業者に公知の幾つかの方法によって測定できる。ＩＭ結合反応レベルは化学的に明確な標準に関連づけるのが好ましい。現在好ましい実施形態において、上記標準はヒトＴＫ１、例えば組換え、単離され、実質的に精製されたヒトＴＫ１（ｒｈＴＫ１）である。これはワング（Ｗａｎｇ）らによって記載された方法［ワング、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８巻：ｐ．１６９９３、１９９９］によって作製される。こうして、癌処置を受ける対象またはすでに癌を処置した対象から採取したサンプルに使用される同じ抗−ＴＫ抗体（リガンド）を、種々の濃度既知のｒｈＴＫ１を含む試験サンプルに使用する。それぞれの試験サンプルの抗体結合を測定することによって、抗体結合と濃度レベルとの相互関係の標準曲線が得られる。ＩＭ濃度はその後、測定された抗体結合並びに標準曲線から決定できる。濃度レベルと結合反応レベルとのもう一つの関係は、測定したＩＭ結合反応測定値を対応する濃度値のインプットおよびアウトプットとして使用するマッピング関数である。このような関数は上記標準曲線および／またはｒｈＴＫ１含有試験サンプルを用いて決定できる。
【００４３】
抗体結合のために使用するアッセイ法は対象、特に健常者の少量のＩＭを十分敏感に検出しなければならない。アッセイ法は少なくとも１ｐＭ、好ましくは少なくとも０．７ｐＭ、より好ましくは少なくとも０．５ｐＭ、例えば少なくとも０．３ｐＭのＩＭ濃度レベルを十分敏感に検出しなければならない。このような高感度のアッセイ法の一例は、高性能化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）ドットブロットアッセイである。当業者には公知であるように、ＥＣＬドットブロットアッセイの操作はウエスタンブロット法と実質的に同じである。基本的には、血清（またはその他の体液）をニトロセルロース膜などの膜上に塗布する。（任意に）ブロックした後、一次（抗−ＴＫ１）抗体を加え、その後ビオチニル化二次抗体を加える。膜を、その後Ｈ２Ｏ２を含む緩衝溶液に浸し、その後アビジン−ＨＲＰ−ストレプトアビジン（アビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ−ストレプトアビジン）および／またはストレプトアビジン−ＨＲＰを含む緩衝溶液と共にインキュベートする。その後例えばデジタルＣＣＤ（Ｃｈａｒｇｅｄ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ）カメラによって、またはＸ線フィルムにさらすことによって光を検出する。ＥＣＬドットブロットアッセイは０．３ｐＭ未満の濃度レベルを検出することができる［ヒー、Ｉｎｔｅｒｎａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒ、１５巻：ｐ．１３９、２０００］。
【００４４】
もう一つの可能なアッセイ法はＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）である。この方法では（抗−ＴＫ１）抗体を同位元素、例えば１２５Ｉで標識化する。この方法はＥＣＬドットブロットと同様に敏感であるとはいえ、使用する１２５Ｉは、半減期が数週間という不安定な同位元素である。その上、抗体結合の測定には通常、高価な検出機器（γ−シンチレーションカウンタ）が必要である。
【００４５】
上述のＩＭアッセイ法に使用する抗体類は、ＴＫ１蛋白のエピトープ、好ましくはヒト対象からのＴＫ１蛋白のエピトープ、より好ましくはヒトＴＫ１蛋白の酵素的活性型および不活性型両方のエピトープに特異的に結合するポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体である。上記エピトープは好ましくはＴＫ１の活性部位から（物理的に）離れている、すなわち抗体類は、活性部位に直接結合することによってＴＫ１の酵素活性に実質的に影響を与えたり前記酵素活性を阻害したりしてはいけない。本発明により上記抗体類は好ましくはＴＫ１蛋白のＣ−末端部分に特異的に結合し、より好ましくはアミノ酸１７９からアミノ酸２３４までのＴＫ１蛋白配列、またはその部分、例えばアミノ酸１９５からアミノ酸２２５までの配列、例えばアミノ酸２１０からアミノ酸２２４までの配列など、またはアミノ酸１７９からアミノ酸２３４までのＴＫ１蛋白のアミノ酸配列を含むポリペプチド配列に特異的に結合する。このような抗体類の例は米国特許第６，０８３，７０７号に記載されており、この内容は参考として本発明に含まれる。この米国特許において、ＴＫ１のＣ−末端の１５アミノ酸（ＫＰＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦＡＰＱ、配列番号：１またはアセチル−ＫＰＧＥＡＶＡＡＲＫＬＦＡＰＱ、配列番号：２）長さの配列に対するポリクローナル抗体が作製される。本発明の抗体はＴＫ１蛋白の表面露出部分（エピトープ）に対して作られる。上記の配列の一つに対する抗体を使用することによって、ＴＫ１蛋白の結合反応レベルおよび濃度、そして多分その他の分子と複合体化したＴＫ１の結合反応レベルおよび濃度レベルを測定できる。これは、本発明の抗体類が、上記抗体が親和性を有するエピトープを含むＴＫ１抗体の総量（ＴＫ１蛋白の酵素的活性型および不活性型、およびその他の分子と複合体化したＴＫ１蛋白も含む）を好適に決定することを意味する。
【００４６】
ある血清中の作用物質をブロックすると、例えば抗体が結合するエピトープをブロックすることによって、および／またはＴＫ１蛋白への結合に際して抗体結合エピトープが接近可能な（表面）部位から抗体が接近できない部位に移動するように変化することによって、ＴＫ１蛋白に対する抗体類の結合が阻止されるかも知れない。
【００４７】
ある特定の実施形態において、本発明の予想法は決定補助法、すなわち非診断的方法である。これが意味するところは、決定補助法は決定補助情報、例えば単に暫定的な結果である結合反応、濃度または見込み値を生み出すということである。最終的診断を下すには追加的データ並びに医者の能力が一般的に必要である。さらに、ＩＭ結合反応レベル（ＩＭ濃度レベル）以外のその他のパラメーター、例えば対象の病歴、年齢および性別、腫瘍のタイプ、遺伝因子などが腫瘍疾患の進行に影響するかも知れない。したがって本発明は、どの測定値を採用すべきかを医者が決断する際の基礎となる決定補助を与えるものである。
【００４８】
本発明は非制限的に次のような数種類の型の癌に適用できる；線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、骨膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝（細胞）癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルム腫瘍、頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状膠細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣細胞腫、血管芽細胞腫、乏突起［神経］膠腫、メラノーマ、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫、白血病、例えば急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）および急性骨髄性白血病（骨髄芽細胞性、前骨髄性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）、慢性白血病（慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、および慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症およびＨ鎖病など。本発明は、特に乳癌および胃癌などの充実腫瘍を伴う癌の進行の予測に適用される。
【００４９】
本発明の腫瘍モニタリングおよび予測法を図７にまとめる。工程Ｓ１で始まり、癌を処置した対象、好ましくは哺乳動物対象、より好ましくはヒト対象から得たサンプル、好ましくは体液サンプル、例えば血清サンプルにおいて、（酵素的活性および不活性）ＴＫ１蛋白を含む免疫反応性物質（ＩＭ）の結合反応レベルを測定する。対象からのサンプル採取が行われるときに癌処置が終了している必要はない。ＩＭ結合反応レベルはリガンド、好ましくはＴＫ１蛋白に特異的に結合する抗体、より好ましくはＴＫ１蛋白のＣ−末端部分に特異的に結合する抗体を用いて測定する。工程Ｓ２において、局所的および／または転移腫瘍の再発または出現によって示されるような、癌疾患の進行または再現の確度を、測定されたＩＭ結合反応レベルに直接基づいて推定する。この確度は測定されたＩＭ結合反応レベルと、同一対象または健康な対象について前に測定したＩＭ結合反応レベルとの比較に基づいて推定してもよい。
【００５０】
発明のもう一つの態様により、癌処置を受けた対象における癌疾患の進行を予測するためのシステムが提供される。上記対象においてＩＭ結合反応レベルまたはＩＭの濃度レベル、例えば血清ＴＫ１蛋白濃度などを上に述べたアッセイ法の一つによって測定する。測定された結合反応レベルまたは濃度は、上記システムのインプットデータであり、より好ましくはそれと同時に健常者のＩＭ結合反応（濃度）レベルおよび／または上記対象で前に測定された結合反応レベルも上記システムにインプットされ、上記対象における癌再発の確度を推定する。
【００５１】
上記システムは、腫瘍進行予測または神経網様構造に適用できる専用ソフトウエアを備えたコンピューター装置でよい。そのようなソフトウエアを設計するために、癌処置を受けた対象およびその後腫瘍が進行した対象および腫瘍が再発しない対象それぞれから得られる幾つかのＩＭレベル測定値を使用する。これらの測定値に直接基づいて、上記ソフトウエアはＩＭ結合反応レベルから腫瘍進行および再発を推定することができる。
【００５２】
上記システムはより正確な推定のために追加的インプットパラメーター、例えばその他の病歴のパラメーター、対象の年齢および性別、癌のタイプ、遺伝マーカー、その他の生化学的パラメーターなども必要であるかも知れない。上記システムまたは上記システムの専用ソフトウエアは等式を用いるようになっており、その等式にはＩＭ結合反応レベルまたはＩＭ濃度（およびその他のパラメーターも）が入力される。上記ソフトウエア／システムがその後上記の確度推定値を計算する。或いは１つまたは複数のカットオフ限界値を用いて推定値を決定する。こうして、対象で測定されたＩＭ結合反応または濃度の数値に直接基づいて腫瘍再発の確度を推定することは、測定されたＩＭ結合反応値（濃度）が、多分その他のインプットパラメーターと共に、或る（基礎的）関数に入力されることも予期している。基礎的アイディアは、上記推定が結合反応（濃度）領域の測定値に直接基づいており、推定のために結合反応領域から酵素活性領域へのマッピングを必要としないことである。
【００５３】
上記システムは対象サンプル中のＩＭ結合反応レベルを決定するための装置も組み込むことができる。このような場合、体液サンプルが上記システムに入れられる。上記システムはＩＭレベルを測定し、そのＩＭレベルに直接基づいて腫瘍進行および再発確度の推定値を計算する。そのような結合反応測定装置は上記のアッセイ法、すなわち抗−ＴＫ１抗体を用いるＥＣＬドットブロットまたはＲＩＡのいずれかに基づく。
【実施例】
【００５４】
ＥＣＬドットブロットアッセイ
ＥＣＬドットブロットアッセイの操作法は、少し変更を加えたウエスタンブロット法操作と同じである［ヒー、Ｉｎｔｅｒｎａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒ、１５巻：ｐ．１３９、２０００］。非ヘパリン加血液チューブから静脈血の血清３μｌをニトロセルロース膜上に直接塗布する（ＨｙｂａｎｄＴＭ−Ｃ、アマーシャム）。血液サンプルを朝７時から９時までの間に朝食前の人から採取した。非ヘパリン加チューブに採取した静脈血は＋４℃で少なくとも２４時間は保存することができ、または１５００ｇで５分間遠心分離し、その後−２０℃で５年間、−８０℃で１０年以上保存することができる。その後、最初にヒーらが報告したように［ヒー、Ｅｕｒｏｐ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．，７０巻：ｐ．１１７、１９９６］組換えヒトＴＫ１（ｒｈＴＫ１）を標準として使用し、その後ワングらが記載したように変更を加えた［ワング、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８巻：ｐ．１６９９３、１９９９］。使用した膜をＴＢＳ（トリス緩衝食塩液）中で１０％脱脂ミルクで４時間ブロックし、その後一次（抗−ＴＫ１）抗体を加え、＋４℃で一晩、または室温で２時間インキュベートした。ビオチニル化二次抗体と共に室温で１時間インキュベーション後、膜を３％Ｈ２Ｏ２を加えたＴＢＳ緩衝液中に５分間浸した。膜をその後ＴＢＳ緩衝液中でアビジン−ＨＲＰ−ストレプトアビジンと共にインキュベートし、Ｘ−線フィルムにさらした。フィルム上の単一スポットの強度をレーザー濃度計によって測定した。既知濃度のｒｈＴＫ１の強度から、ＩＭの強度を再計算し、ｐＭとして表した。
【００５５】
抗−ＴＫ１抗体の特徴づけ
抗−ＴＫ１抗体をウエスタンブロット、等電点電気泳動、免疫沈降反応および免疫組織化学によって特徴づけた。結果は下の表１にまとめる。ウエスタンブロット法によると、１５アミノ酸長ペプチド配列（配列番号：２）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ１Ｄ１１およびｍＡｂ１Ｅ３）またはｒｈＴＫ１に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ２６−３およびｍＡｂ２６−５）はヒト腫瘍細胞中のＴＫ１蛋白のネイティブ型並びに悪性腫瘍患者の血清中のＴＫ１蛋白を認識するが、ＴＫ１蛋白の変性２５サブユニットを認識しない。電気泳動ゲルにおいて、健常者血清のＴＫ１陰性細胞には、または拮抗抗原の存在下では、バンドは見つからなかった。免疫沈降試験の結果、ｍＡｂ１Ｅ３は、ＴＫ１蛋白の活性部位に指向していないとはいえ、ＴＫ１の酵素活性に影響を与えることが判明した。ｍＡｂ２６−３＋５およびｍＡｂ１Ｄ１１は、ＴＫ１蛋白と免疫複合体を形成することによって上澄み液のＴＫ１活性を阻害する。上記複合体はペレットとして集められる。等電点電気泳動法の結果、ｍＡｂ２６−３＋５でブロットされたＴＫ１蛋白がｐＩ値≒７．０を有することが判明した。しかしｍＡｂ１Ｄ１１およびｍＡｂ１Ｅ３でブロットした場合はバンドは検出されなかった。ポリクローナル・ウサギ抗−ＴＫ１抗体（ｐＡｂ）はＳＤＳゲル電気泳動法でサブユニット２５ｋＤａを認識し、ＴＫ１のｐＩ値≒８．３を与える。ＴＫ１蛋白の３１アミノ酸配列またはアミノ酸１９４〜２２５に対するヒナドリＩｇＹ抗−ＴＫ１抗体（ＳＳＴＫ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，中国）は、ＴＫ１のネイティブ型もサブユニット２５ｋＤａも両方共認識し、ｐＩ値≒８．３を与える。全ＴＫ１蛋白（ＱＥＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ  ＵＳＡ）はＴＫ１の２５ｋＤａサブユニットを認識する。
【表１】
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上述の、および表１に示した全ての抗体は細胞系でもパラフィン埋封材料中でも免疫組織化学的染色のために使用できる。抗−ＴＫ１抗体反応は、腫瘍細胞の細胞質に局在した。ＴＫ１酵素活性に欠ける突然変異細胞並びに静止リンパ球では染色は全くまたはほとんど見られなかった。こうして、被検抗−ＴＫ１抗体を使用してＩＭ結合反応レベルおよび濃度を測定できる。これらの抗体はＴＫ１蛋白の異なるエピトームも認識する。これはＴＫ１の種々のサブ集団を同定すると考えられる。
【００５６】
健康対象におけるＩＭ濃度およびＳＴＫ酵素活性
上記のドットブロットＥＣＬイムノアッセイによって測定されるＩＭ（ＳＴＫ１）濃度を健常者のＲＩＡアッセイによって測定したＳＴＫ酵素活性と比較し、結果を図１および表２に示す。ＩＭ濃度およびＳＴＫ酵素活性は両方共低かった（それぞれ２ｐＭおよび２Ｕ／Ｌ未満）。これらの健常者ではＩＭ濃度とＳＴＫ酵素活性間に有意な相関関係があった（ｒ＝０．６７、ｐ＜０．０１）。
ＩＭ濃度およびＳＴＫ活性を非癌患者でも測定した。腎機能異常、出血、肝硬変および肺感染症および非感染性疾患などの患者１９名中６名において、ＩＭ濃度およびＳＴＫ活性は健康対照に比較してそれぞれ１．６倍および１．８倍上昇した。１出血症例および１肝硬変症例ではＩＭ濃度はカットオフ値２ｐＭの５倍、ＳＴＫ活性は２．４Ｕ／Ｌの２−４倍であった。非癌患者のこれらのタイプの患者ではＩＭ（ＳＴＫ１）濃度とＳＴＫ活性との間に有意な相関関係があった（表２）
【表２】
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ａ：有意値は０．０５より小さく、０．０１より大きい。
【００５７】
処置前の腫瘍患者におけるＩＭ濃度およびＳＴＫ活性
９種類の悪性腫瘍を有する腫瘍患者７５２名のＩＭ（ＳＴＫ１）濃度をＥＣＬドットブロットイムノアッセイによって測定し、健常者に比較して２００倍も高いことが判明した。ＩＭ濃度を形態学的良性病巣を有する患者の血清でも測定した。測定濃度の結果を図２に示した。図２中、Ａは白血病患者、Ｂは胃の腫瘍、Ｃは結腸腫瘍、Ｄは直腸腫瘍、Ｅは乳腫瘍、Ｆは肺腫瘍、Ｇはリンパ腫、Ｈはヘパトーマ、Ｉは脳腫瘍、Ｊはその他の悪性腫瘍、Ｋは形態学的良性病巣およびＬは健常者をそれぞれ示す。悪性腫瘍患者ではＩＭ濃度はほぼ正常値（カットオフ２ｐＭ）（２９／７５２）から１００ｐＭまで（７１１／７５２）に見いだされ、若干の症例では２００ｐＭにもなった（１３／７５２）。このように、悪性腫瘍患者の約９５パーセントがＩＭのカットオフ値２ｐＭよりも高いＩＭ濃度を示す。
【００５８】
腫瘍、良性病巣、非癌性疾患の患者および健常者２６４名においてＳＴＫ酵素活性も平行して測定した。ＩＭ濃度は種々の患者間で広く変動したが、ＳＴＫ活性の変動は限られていた。良性病巣、白血病、乳癌および胃癌では、癌処置前の患者のＩＭ濃度とＳＴＫ活性との間に有意な相関関係が認められた（表２を参照されたい）が、大部分の被検腫瘍タイプにおいて未処置患者に相関関係は認められなかった。図４を参照されたい。
【００５９】
胃腸管の癌を有する６８名の手術前の患者のＩＭ（ＳＴＫ１）濃度を、臨床ＴＮＭ（ＵＩＣＣ、第５版、１９９７）に示されるガイドラインにより、転移のあるなし（転移なし（Ｍ０）ｎ＝４６、転移あり（Ｍ１）ｎ＝２２）および分化程度（高いまたは中程度の分化ｎ＝５６および低い分化ｎ＝１２）に関しても研究した。結果を表３にまとめる。ＩＭ濃度は転移患者（Ｍ１）では転移のない患者（Ｍ０）に比べて４．５倍高かった（ｐ＜０．０１）。低分化腫瘍を有する患者の濃度も、高／中程度分化腫瘍を有する患者に比べて有意差はないとはいえ（ｐ＞０．０５）、高かった。
【表３】
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【００６０】
胃癌
胃癌（ＧＣ）患者４３名においてＩＭ（ＳＴＫ１）濃度およびＳＴＫ酵素活性をドットブロットＥＣＬイムノアッセイおよびＲＩＡ活性アッセイによってそれぞれ測定した。図３は腫瘍患者の１例（Ｐ３）からのウエスタンブロットおよびドットブロット、健常者（ｈｅａｌｔｈｙ（健康））のドットブロットおよび種々濃度のヒト組換えＴＫ１（ｒｈＴＫ１）のドットブロットを示す。術前患者の測定ＳＴＫ１濃度およびＳＴＫ活性値を表４に示す。手術前の腫瘍患者ではＩＭ濃度およびＳＴＫ活性は有意に高かった。
【表４】
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【００６１】
術後３５日に、腫瘍のない症例においてＩＭ濃度は約半分に有意に減少し（ｐ＝０．０１０６）、その一方でＳＴＫ酵素活性は減少しなかった。転移患者（Ｍ１）では術後３５日にＩＭ濃度はさらに１７３％に増加した。このような増加はＳＴＫ酵素活性には見られなかった。表５を参照されたい。術後７日目のＭ０患者のＩＭ濃度が変化しなかったのは、一部は手術傷と関連したＩＭ濃度の増加によるものである（データは示されず）。
【表５】
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表４および表５から明らかなように、ＳＴＫ酵素活性とは対照的に、ＩＭ濃度を使用して胃癌の処置の結果をモニターすることができる。さらにＩＭ濃度レベルは癌疾患の再発を検知することができるが、ＳＴＫ活性はできない。
【００６２】
白血病
白血病患者２４名において、ＩＭ（ＳＴＫ１）濃度をドットブロットＥＣＬイムノアッセイによって測定し、ＳＴＫ酵素活性をＲＩＡアッセイによって測定した。処置開始前の上記患者ではこれら２パラメーター間に有意な相関関係があった（ｒ＝０．４４）。図４のＡを参照されたい。
【００６３】
これら２４名の患者中、６名を処置中および処置後に追跡した。化学療法を受けている患者ではＩＭ濃度は減少した。化学療法が終わったときにＩＭ濃度は増加した。ＳＴＫ酵素活性は処置開始後も高かった。これはＩＭ濃度がＳＴＫ活性に比べて、処置の結果を予測するためのより確実なアッセイであることを示唆する。
【００６４】
乳癌
アジュバント内分泌療法のコントロールド臨床試験に含まれた１２０名の乳癌患者群で、これら患者の６７名において術後３カ月目に血清中ＩＭ（ＳＴＫ１）濃度を抗−ＴＫ１ヒナドリＩｇＹ抗体を用いて測定した（表１参照）。３カ月目のＩＭ濃度を術後２１日目のそれと関連づけた。１２名の患者に遠隔転移癌が発生し、中間追跡期間１１．６年の間に７つの局所領域の腫瘍が最初の事象として発生した。
【００６５】
上記６７名の患者を相対的ＩＭ濃度＜０．７８、０．７８−１．０８または＞１．０８を有する等しい大きさの３患者群に分類した。上記相対的ＩＭ濃度は術後３カ月のＩＭ濃度を術後２１日目の対応するＩＭ濃度で割ることによって得られる。腫瘍再発（遠隔領域または局所領域）が起きた患者の多変量解析を、結節−およびＥＲ状態、腫瘍サイズ、内分泌療法および年齢を考慮して行った結果、相対的ＩＭ濃度＞１．０８の患者は相対的ＩＭ濃度＜０．７８を有する患者とは統計的有意に異なることが判明した（ｐ＝０．００４）。相対的ＩＭ濃度＞１．０８を有する患者における再発の危険率は、相対的濃度＜０．７８を有する患者より約６−７倍高かった。
【表６】
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ａ：年齢（＜４５歳、≧４５歳）、結節状態（ｐＮ０、ｐＮ＋）、腫瘍サイズ（＜２０ｍｍ、≧２０ｍｍ）、ＥＲ状態（ＥＲ−、ＥＲ＋）および内分泌療法（あり、なし）を調製。患者７名はＥＲ状態に関する情報がなかったためこの分析から除外された。
ｂ：術後３カ月目および３週間目に測定したＩＭ濃度の比率。カットオフ点はＩＭ分布を３つの等しい大きさの群に分けることによって得た。
ｃ：トレンドの試験。
ｄ：信頼限界
ｅ：局所領域−または遠位−再発
【００６６】
５年の累積的再発発生率の推定値は相対的ＳＴＫ１濃度＜０．７８、０．７８−１．０８および＞１．０８それぞれで０．０９（９５パーセントＣＩ：０．０２−０．３４）、０．２３（９５％ＣＩ：０．１１−０．４９）および０．４８（９５％ＣＩ：０．３１−０．７３）であった。図５を参照されたい。このように、癌処置後３カ月目の高いＩＭ濃度（群＞１．０８によって示されるような）は、（局所地域または遠位）腫瘍再発の高い確度を明白に示すものである。
【００６７】
ＩＭ（ＳＴＫ１）濃度およびＳＴＫ酵素活性を３７名の患者で測定した。これらの結果を、腫瘍マーカー分野では“ゴールデン・マーカー”と見なされているＣＡ  １５−３測定値とも比較した。図６は、術後３カ月目に測定されたＩＭ濃度、ＳＴＫ活性およびＣＡ  １５−３濃度を、術後２１日目の対応する数値のパーセントとして表したものである。１５名の患者では（Ａ）、術後１ないし５年以内に腫瘍が再発した。その一方で２２名の患者（Ｂ）では腫瘍再発はなかった。図に示されるように、１ないし５年後に腫瘍が再発した患者（Ａ）の５０−６０％では術後３カ月目にＩＭ濃度はすでに顕著により高かった。しかし、ＳＴＫ活性またはＣＡ  １５−３値には、再発腫瘍のある患者（Ａ）またはない患者（Ｂ）で差はなかった。ＩＭ濃度は、その後再発性癌疾患が起きなかった２５−３０％の患者（Ｂ）も予測した。
【００６８】
かくして、１１．６年までの追跡期間中、遠位および／または局所領域再発性癌疾患が発生する患者はより高い相対的ＩＭ濃度を示す顕著な傾向があると結論づけられる。
【００６９】
このような情報を使用して、改善されたリスク評価により、アジュバント治療を回避、延長、または変更することができる。
【００７０】
添付の請求項によって決められる本発明の範囲を逸脱することなく本発明に種々の変更および変化が加えられ得ることは当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】健常者における血清チミジンキナーゼ（ＳＴＫ）酵素活性と、ＴＫ１蛋白含有免疫反応性物質（ＩＭ）濃度（ＳＴＫ１）との相関関係を示す。
【図２】健常者および種々の型の腫瘍を有するヒト患者の血清中のＩＭ濃度（ＳＴＫ１）を示す。図中、Ａは白血病をあらわし、Ｂは胃腫瘍をあらわし、Ｃは結腸腫瘍をあらわし、Ｄは直腸腫瘍をあらわし、Ｅは乳腫瘍をあらわし、Ｆは肺腫瘍をあらわし、Ｇはリンパ腫をあらわし、Ｈは肝（細胞）腫をあらわし、Ｉは脳腫瘍をあらわし、Ｊはその他の悪性腫瘍をあらわし、Ｋは形態学的良性病巣をあらわし、Ｌは健常者をあらわす。
【図３】胃癌患者（Ｐ３）の、ウエスタンブロットおよびドットブロットによって測定したＩＭ濃度（ＳＴＫ１）、健常者およびヒト組換えＴＫ１のドットブロットを示す。
【図４】良性病巣をもつ患者および癌処置前の悪性腫瘍患者におけるＩＭ濃度（ＳＴＫ１）とＳＴＫ酵素活性との相関関係を示す。図中、Ａは白血病をあらわし、Ｂは胃腫瘍をあらわし、Ｃは結腸腫瘍をあらわし、Ｄは直腸腫瘍をあらわし、Ｅは肺腫瘍をあらわし、Ｆはリンパ腫をあらわし、Ｇは肝（細胞）癌をあらわし、Ｈは脳をあらわし、Ｉは形態学的良性病巣あらわし、Ｊは乳癌をあらわす。
【図５】術後３カ月目に測定されたＴＫ１濃度を術後２１日目の対応するＳＴＫ１濃度で割ることによって決定される相対的ＳＴＫ１濃度  ＜０．７８、０．７８−１．０８および＞１．０８を有する等しい３群に分けられた６７名の乳癌患者における再発の累積的発生率を示す。
【図６】後に癌腫瘍が再発した（Ａ）および再発しなかった３７名の乳癌患者における術後３カ月目の血清中のＩＭ濃度（ＳＴＫ１）、ＳＴＫ酵素活性およびＣＡ  １５−３濃度の比較である。これらは術後２１日目の測定値のパーセントとして表されている。
【図７】本発明の腫瘍再発予測法のフローダイアグラムの説明である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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