(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびモノヌクレオチドからなる群より選択される輸送される分子、ならびに
ｂ）１または２個以上の式Ｉ：
【化１】
0004791665.tif 000037
（式中、
アリールは、Ｆ１’、Ｆ３’、Ｆ４’およびＦ’６〜Ｆ１１’からなる群より選択され、
【化２】
0004791665.tif 000038
ＸはＯまたはＮであり、
ＹはＯ、ＳまたはＮＨ−Ｒ2であり、
Ｒ1は、置換または非置換のＣ1〜Ｃ23アルキルラジカルであり、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよく、また二重および／または三重結合を含有していてもよく、
Ｒ2は、置換または非置換のＣ1〜Ｃ18アルキルラジカルであり、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよく、また二重および／または三重結合を含有していてもよく、
ｎは１または１以上の整数であり、
ここで、アリールラジカルが輸送される分子に化学結合を介して直接的にまたは化学基を介して間接的に結合し、結合が輸送される分子のヌクレオチド間ホスホジエステル結合
による場合には化学基はＣＨ2−Ｓではない）
のアリールラジカルを含む接合体。
【請求項２】
化学基が−Ｃ（＝Ｏ）基または−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）基である、請求項１に記載の接合体。
【請求項３】
ａ）ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびモノヌクレオチドからなる群より選択される輸送される分子、ならびに
ｂ）Ｆ１およびＦ３〜Ｆ１１からなる群より選択される１または２個以上のアリールラジカル：
【化３】
0004791665.tif 000039
【化４】
0004791665.tif 000040
を含む、接合体。
【請求項４】
輸送される分子はオリゴヌクレオチドである請求項１〜３のいずれかに記載の接合体。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドは修飾されている請求項１〜４のいずれかに記載の接合体。
【請求項６】
輸送される分子は分子量＜５００ダルトンを有する低分子量化合物である請求項１〜３のいずれかに記載の接合体。
【請求項７】
アリールラジカルは５′末端および／または３′末端および／または１または２以上の核酸塩基および／または１または２以上の糖ラジカルおよび／または１または２以上のヌクレオシド間結合に、および／または非ヌクレオチド構築ブロックを介して結合している、請求項１〜６のいずれかに記載の接合体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の接合体を製造する方法において、ａ）アリールラジカルが結合される位置に反応性機能を有する輸送される分子を作成し、ついでｂ）アリールラジカルを作成し、ｃ）輸送される分子をアリールラジカルと反応させ
て接合体を得る方法。
【請求項９】
反応性機能はアミノ基、メルカプト基、クロロアセチル基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、カルボン酸基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基またはカルボニルクロリド基である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
輸送される分子とアリールラジカルの反応はｐＨ≦７.５において行われる請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
輸送される分子とアリールラジカルの反応はｐＨ＝７.０において行われる請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
インビトロで生体膜を横切って分子を輸送するための、請求項１〜７のいずれかに記載の接合体の使用。
【請求項１３】
インビトロで膜を横切って分子を輸送する方法において、ａ）請求項１〜７のいずれかに記載の接合体を作成し、ついでｂ）その接合体を膜とインキュベートする方法。
【請求項１４】
インビトロで細胞内に分子を輸送する方法において、ａ）請求項１〜７のいずれかに記載の接合体を作成し、ついでｂ）その接合体を細胞とインキュベートし、それによってｃ）接合体はアリールラジカルが切断されることなく細胞内に輸送される方法。
【請求項１５】
細胞は真核細胞または原核細胞である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞は細菌細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞である請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
細胞はヒト細胞である請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
細胞は腫瘍細胞である請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
医薬の製造方法であって、ａ）医薬的に活性な化合物としてポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはモノヌクレオチドを作成し、この場合上記医薬的に活性な化合物はアリールラジカルが結合される位置に少なくとも１個の反応性機能を含有し、ｂ）式Ｉまたは請求項３に記載のアリールラジカルを調製し、ｃ）医薬的に活性な化合物をこのアリールラジカルと反応させて接合体を得ることを含む、上記方法。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれかに記載の接合体を含む医薬。
【請求項２１】
請求項１〜７のいずれかに記載の接合体を含む診断補助剤。
【請求項２２】
請求項１〜７のいずれかに記載の接合体を含む試験キット。
【請求項２３】
特定の遺伝子の発現もしくは過剰発現を伴う疾患の予防もしくは処置用の医薬の製造および／またはこのような疾患の診断もしくは早期検出用の診断薬の製造のための、請求項１〜７のいずれかに記載の接合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は接合体、それらの製造方法、および生体膜を横切って低分子量化合物および高分子を、特に細胞内へ分子を輸送するために、これらの接合体の使用を提供する。本発明はまたこれらの接合体を含有するかまたはそれらが使用されている医薬、診断補助剤および試験キットを提供する。
【０００２】
【背景技術】
標的が細胞内にある分子の治療的利用のための制限因子は、それらの不満足な細胞取り込みおよび好ましくない細胞内分布にあることがしばしばである。典型的な例には、細胞のＤＮＡまたはＲＮＡに配列特異的な様式で結合し、したがって遺伝子の発現を阻害する核酸のような巨大分子がある。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ワトソン-クリック型塩基対を介して相補性ｍＲＮＡに結合する短い一本鎖核酸であり、その相当するタンパク質への翻訳が阻害される。トリプレックス形成オリゴヌクレオチドは、いわゆる「フーグスティーン型塩基対」を介しＤＮＡ二重ヘリックス形成トリプルヘリックスの深部溝に結合して遺伝子の転写を配列特異的な様式で阻害する。他の細胞内活性オリゴヌクレオチドには、転写因子の結合領域を模倣する、たとえばいわゆる「デコイ」オリゴヌクレオチドがある。デコイオリゴヌクレオチドでの処理により、ある種の転写因子は配列特異的様式で遮断され、転写の活性化が阻害されることがある。細胞内活性オリゴヌクレオチドの更なるグループ、キメラプラストは標的化遺伝子の修正のために使用される（Cole-Straussら、Science 1996, 273: 1386-1389）。この遺伝子修正のためには、またキメラプラストオリゴヌクレオチドの細胞内取り込みも必須である。更なる細胞内活性核酸の例には細胞内酵素特にテロメラーゼと相互作用する核酸がある（Nortonら、Nat.Biotech. 1996, 14: 615）。核酸の更なるクラス、好ましくは二本鎖ＤＮＡは遺伝子療法の意図で細胞内において発現されるある種のタンパク質をコードすることができる。
【０００３】
たとえば、細胞培養メジウムへのオリゴヌクレオチドの単なる添加によるインビトロでの細胞へのオリゴヌクレオチドの取り込みは、現実に細胞内に取り込まれる添加したオリゴヌクレオチドの小分画にすぎないので、比較的不適当な方法である。取り込み過程は長時間を要し、多くの場合わずか８〜１６時間後にはプラトーに達してしまう。オリゴヌクレオチドはエンドサイトーシス様の過程で取り込まれるものと推定される。しかしながら、エンドサイトーシスによる取り込みの一般的な問題は、大部分のオリゴヌクレオチドが細胞質内では遊離の形で存在せず、ある種の細胞構造中、たとえば、リソソームおよびエンドソーム中に封入されていることである。蛍光で標識したオリゴヌクレオチドの場合は、この局在した分布を実際に蛍光顕微鏡によって観察することができる。この小胞内局在により、実際にｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションに利用される遊離のオリゴヌクレオチドの濃度はかなり低下する。その上、細胞の種類および存在する条件に依存して、第一に、ある分画の細胞のみがオリゴヌクレオチドを取り込む。したがってアンチセンスオリゴヌクレオチドの効率的な使用のためには、浸透エンハンサーたとえば陽イオン性脂質との混合物が一般的に使用されている（Bennettら、Mol. Pharmacol. 1992, 41: 1023）。
【０００４】
分子、特に高分子たとえばオリゴヌクレオチドの細胞内取り込みを改良することが本発明の目的であった。
【０００５】
オリゴヌクレオチドの細胞取り込み試験は、一般に放射性標識または蛍光標識オリゴヌクレオチドのいずれかを用いて行われる。オリゴヌクレオチドの蛍光標識は、たとえばオリゴヌクレオチドのアミノ機能をフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）と反応させることにより行われる。フルオレセインはオリゴヌクレオチドのたとえば３′末端に市販品を利用できるフルオレセイン誘導体化した固相支持体を介して、または５′末端に市販品を入手可能なフルオレセインホスフィチル化試薬を用いて導入することができる。いずれの場合も、オリゴヌクレオチド結合フルオレセインは、カルボン酸機能により強い蛍光を有する陰性に荷電した構造エレメントとして存在する。
【０００６】
【化５】
0004791665.tif 000002
【０００７】
フルオレセインとは異なり、フルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）は２個のエステル基が除去され、ラクトン環が開裂したのちにのみ、蛍光を発するフルオレセインに変換され、ラクトン型では蛍光を発しない中性の生存色素である。
【０００８】
中性の非蛍光分子としてＦＤＡ（以下「Ｆ３」とも呼ぶ）は生存細胞により受動拡散によって取り込まれ、細胞内でエステラーゼにより切断されて蛍光を発するフルオレセインを与える（Breeuwerら、Appl. Environ. Microbiol. 1995, 61: 1614; Maedaら、Cell Struct. Funct. 1982, 7: 177）。これまでに記載されているＦＤＡ誘導体はたとえばイソチオシアナートのようなアミン反応性基を含有する誘導体のみであり、これらのＦＤＡ誘導体は細胞内タンパク質または細胞成分の染色のために使用されている。ＦＤＡと他の分子の接合体はこれまでに記載されていない。したがって、ＦＤＡ−標識オリゴヌクレオチド（ＦＤＡとオリゴヌクレオチドの接合体）も同様にこれまで記載されていない。
【０００９】
細胞質内でＦＤＡはエステラーゼによって切断される。したがって、オリゴヌクレオチドのＦＤＡ標識により、「遊離の」オリゴヌクレオチドの比率すなわち細胞質中にどの位ハイブリダイゼーションに利用できるオリゴヌクレオチドが存在するかを、小胞中に存在するオリゴヌクレオチド（「捕獲された」オリゴヌクレオチド）すなわちハイブリダイゼーションに利用されないオリゴヌクレオチドに関連して決定することができる。オリゴヌクレオチド中の陰性電荷のきわめて高い総数ならびにＦＤＡ−標識およびフルオレセイン−標識オリゴヌクレオチドは（オリゴヌクレオチドが同一である場合）には１正味電荷のみ異なることにより、ＦＤＡ−標識およびフルオレセイン−標識オリゴヌクレオチドはきわめて類似した細胞取り込みおよび分布を示すことが期待された。
【００１０】
しかしながら驚くべきことに、ＦＤＡ−標識およびフルオレセイン−標識オリゴヌクレオチドは細胞への取り込みに、すなわちオリゴヌクレオチドの取り込みの持続および効率の両者に関して、さらにまた取り込まれたオリゴヌクレオチドの細胞内局在に関してかなり異なることが見出されたのである。ＦＤＡ標識オリゴヌクレオチドは相当するフルオレセイン標識オリゴヌクレオチドよりもはるかに迅速に細胞によって取り込まれる。一方、放射標識およびフルオレセイン標識オリゴヌクレオチドの取り込みには数時間を要し、ＦＤＡ標識オリゴヌクレオチドは、たとえばヒト細胞との単純なインキュベーション後わずかに５分で細胞内に検出することができた。また驚くべきことに、ＦＤＡ標識オリゴヌクレオチドは事実上任意の細胞（細胞の＞９０％）に取り込まれたのに対し、一方オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを細胞内に輸送するためこれまでに記載された方法での取り込み率は一般的にかなり低く、後者の場合、約３０〜６０％のみの細胞がオリゴヌクレオチドにより負荷されることが多かった。ＦＤＡ標識オリゴヌクレオチドの細胞内分布がはるかに均一であることも有利である。このさらに均一な分布は、上述のように、オリゴヌクレオチドが主として小胞（たとえば、エンドソーム、リソソーム）に封入されているのではなく、全細胞中、すなわち細胞質および核に分布していることを指示する。これは「遊離」オリゴヌクレオチドの大きな分画が存在することの指示である。これらの「遊離」オリゴヌクレオチドのみが標的（標的分子、標的核酸）への結合または活性化合物として利用可能である。他の利点は、脂質陽イオン性浸透エンハンサーの使用は細胞膜の障害を起こすことが多いのに対して、ＦＤＡ標識オリゴヌクレオチドを用いた場合には、細胞に対する障害が観察されないという事実である。これらの予期されなかった性質の結果、ＦＤＡ標識オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの細胞内への導入のためにこれまで記載された方法に比較して、それらが細胞により効率的に導入できて、しかもこの場合、それらはより良好に利用されることが決定的な利点である。これによりＦＤＡ標識オリゴヌクレオチドはかなり改良された生物活性を有する。生物活性が改良されたため、より少ないオリゴヌクレオチドを使用することができる。これにより、またＦＤＡ標識オリゴヌクレオチドが細胞により効率的に取り込まれるという事実から−いずれも量および時間に関して−（毒性的）副作用は低下する。
【００１１】
驚くべきことに有利な性質はＦＤＡ標識オリゴヌクレオチドに限定されるものではなく実際上任意の分子を、ＦＤＡ標識の補助によって−すなわち輸送される分子をＦＤＡとカップリングさせるかまたはそれに接合させることで（「ＦＤＡ接合体」）効果的に細胞内に導入または生体膜を横切って輸送させることができる。さらに、この原理はＦＤＡ接合体に限定されるものではなく、ある種の化学構造のすべてのアリールエステル接合体に適用されることが発見された。すなわち、本発明は生体膜を横切って分子を輸送するための新規な原理に関する。これらの化合物は１つの例外を除いて、これまで先行技術に記載されたことがなく、相当する接合体−ある種の化学構造のアリールエステルとカップリングまたは接合した輸送される分子−は同様に本発明の一部の主題を形成する。これらの接合体は、既知の方法では製造できない。したがって、本発明はまたその接合体の製造方法を提供する。
【００１２】
オリゴヌクレオチドのプロドラッグとして提案された生物可逆性のＯ−アシルアリール接合体（Iyerら、Bioorganic & Med. Chem. Lett. 1997, 7: 871-876）は公知である。これらの化合物の化学構造は−アリールラジカルが芳香族６員環である場合には本発明の接合体の化学構造に等しい。しかしながら、生物可逆性のＯ−アシルアリール接合体では、エステルの加水分解によりアリールラジカルとオリゴヌクレオチドのホスホトリエステルの間の結合の不安定化を生じ、したがって、生物可逆性のＯ−アシルアリール接合体はその成分、すなわち遊離オリゴヌクレオチドとＯ−アシルアリールラジカルに分解する。このプロドラッグのコンセプトはヌクレオチド内のホスフェート橋の陰性電荷を遮蔽する働きがあり、したがってオリゴヌクレオチドの細胞内取り込みを促進する。しかしながら、本発明の接合体とは異なり、これらのプロドラッグにはオリゴヌクレオチドの細胞への加速された取り込みはなく、また同時にオリゴヌクレオチドの均一な細胞内分布も見出されない。さらに、他の臓器へのオリゴヌクレオチドの取り込みも報告されていない。これに反し、本発明の接合体では、アリールラジカルとオリゴヌクレオチドの間の共有結合が細胞への取り込み時に保存され、アリールラジカルとオリゴヌクレオチドの間の共有結合の保持は、たとえばＦＤＡの場合のようにエステルの切断後、芳香族ユニットが唯一蛍光を有していれば、蛍光顕微鏡により容易に測定することができる。
【００１３】
本発明は、輸送される少なくとも１個の分子と少なくとも１個の式Ｉ：
【化６】
0004791665.tif 000003
（式中、
アリールは芳香族性を有する少なくとも１個の環を含有する基であり、
ＸはＯまたはＮ；好ましくはＯであり、
ＹはＯ、ＳまたはＮＨ−Ｒ2、好ましくはＯであり、
Ｒ1は、置換または非置換のＣ1〜Ｃ23アルキルラジカルであり、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよく、また二重および／または三重結合を含有していてもよく、
Ｒ2は、置換または非置換のＣ1〜Ｃ18アルキルラジカルであり、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよく、また二重および／または三重結合を含有していてもよく、
ｎは１または１以上の整数である。ただし、アリール基は輸送される分子に直接化学結合または間接的に化学基のいずれかを介して結合し、結合が輸送される分子のヌクレオチド内ホスホジエステル結合による場合には化学基はＣＨ2−Ｓではない）
のアリールラジカルからなる接合体を提供する。
【００１４】
輸送される分子は任意の分子とすることができる。輸送される分子は好ましくは≧３５０ダルトンの分子量を有する。本発明の一実施態様では、輸送される分子は高分子であり、その分子量はたとえば≧５００ダルトン、好ましくは＞１０００ダルトン、特に好ましくは＞２０００ダルトンまたはそれ以上である。
【００１５】
輸送される分子はまた低分子量化合物たとえば分子量＜５００、好ましくは３５０〜５００ダルトンの分子量有する化合物とすることもできる。低分子量化合物はモノヌクレオチドとすることもできる。
【００１６】
輸送される分子は様々な化学物質のクラスに属する化合物であることができる。たとえば、それは生物ポリマーたとえばポリヌクレオチド好ましくはオリゴヌクレオチド、ポリペプチド好ましくはペプチドまたはタンパク質、ペプチド-核酸（ＰＮＡ）または３個の芳香環イミダゾール、ピロールおよびヒドロキシピロールからなるポリアミド（Kielkopfら、Science 1988, 282: 111-115）またはポリサッカライド好ましくはオリゴサッカライドまたは上記化合物の誘導体とすることができる。輸送される分子はペプチド模倣体とすることもできる。
【００１７】
ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびモノヌクレオチドは天然に存在する核酸またはそれらの既知の誘導体のいずれかである。誘導体は特に、輸送される接合体または分子から誘導される塩、特に生理学的に許容されるそれらの塩、およびたとえば修飾されたまたは安定化された核酸を意味するものとして理解すべきである。
【００１８】
輸送される分子は、転写因子たとえばＮＦ−κＢ、ｃ−ｆｏｓまたはｃ−ｊｕｎ、細胞周期タンパク質たとえばサイクリンＤ、キナーゼたとえばｃ−Ｓｒｃ、チロシンまたはＭＡＰキナーゼ、細胞内イオンチャネル、イムノフィリンたとえばＦＫ５０６結合タンパク質、プロリル−４−ヒドロキシラーゼ、トポイソメラーゼ、ウイルスプロテアーゼ、多重薬物抵抗性タンパク質、ホスファターゼたとえばプロテインチロシンホスファターゼのインヒビターとすることができる。
【００１９】
輸送される分子は１または２個以上のアリールラジカル、たとえば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれ以上のアリールラジカルと接合させることができる。
【００２０】
アリールラジカル（「アリールラジカル」は特に式Ｉのアリールラジカルおよび／または式IIのアリールラジカルである）は１個または２個以上を輸送される分子に結合させることができる。この場合、結合はアリールラジカルの異なる位置に存在させることができる。複数個のアリールラジカルが輸送される分子に結合する場合には、これらは同種でも異種でもよい。
【００２１】
アリールラジカルはアリール基（式ＩおよびII中の「アリール」を指す）を含有する。すなわち、アリール基は１または２以上の環からなり、環の少なくとも１個は芳香性を有する。アリール基はまた芳香性をもつかまたはもたないヘテロ環を含有してもよい。アリール基はたとえば１〜８個またはそれ以上の環（また「環システム」）、好ましくは１、２、３、４、５、６、７または８個の環を含有する。個々の環は３〜７個の環原子、好ましくは５〜６個の環原子サイズを有する。環システムの例にはフェニル環、ピリジニル環、ピリミジニル環、ピロリル環、フラニル環、チオフェニル環、５−員環ラクトン、６−員環ラクトン、スピロラクトン、ベンゾキノン、シクロヘキサジエニル環およびシクロヘキセニル環がある。これらの環システム、アリール基またはアリール基の個々の環はモノまたはポリ置換されていてもよい。好ましくは、アリール基の少なくとも１つの環は１個のアシルラジカルを有する。
【００２２】
アリール基は、たとえば式Ｆ１′、Ｆ２′、Ｆ３′、Ｆ４′、Ｆ６′、Ｆ７′、Ｆ８′、Ｆ９′、Ｆ１０′、Ｆ１１′の１つを有することができる。これらの式は図１に示す。
【００２３】
アリールラジカルは、輸送される分子に直接または化学基を介して結合させることができる。本発明は、化学基がアリールラジカルとともに式II：
【化７】
0004791665.tif 000004
（式中、Ｘ、ＹおよびＲ1は上に定義した通りであり、Ｒ3は化学基であり、Ｒ3はたとえば−Ｃ(＝Ｏ)基または−ＮＨ−Ｃ(＝Ｓ)基である）を有する接合体を提供する。
【００２４】
式IIのアリールラジカルの例は式Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９、Ｆ１０およびＦ１１のアリールラジカルである。これらの式は図２ａおよび図２ｂに示す。
【００２５】
特定の実施態様においては、輸送される分子はオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドはたとえば、ヌクレオチドアデノシンホスフェート、グアノシンホスフェート、イノシンホスフェート、シチジンホスフェート、ウリジンホスフェートおよびチミジンホスフェートの全体で構築される。本発明の他の実施態様においては、オリゴヌクレオチドは適宜、１または２以上の修飾たとえば化学修飾を含有する。オリゴヌクレオチドは複数個の同種および／または異種の修飾を有していてもよい。
【００２６】
化学修飾の例は本技術分野の熟練者には周知であり、たとえばE. Uhlmann andA. Peyman, Chemical Reviews 1990, 90: 543および“Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and AnalyticalTechniques, S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, USA, 1993およびJ. Hunziker and C. Leumann  inModern Synthetic Methods (Ed. Beat Ernst and C. Leumann), Verlag HelveticaChimica Acata, Basle, pp. 331-417に記載されている。
【００２７】
オリゴヌクレオチドの化学修飾は、たとえば
ａ）ホスホジエステル橋の、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ＮＲ1Ｒ1′−ホスホロアミデート、ボラノホスフェート、ホスフェート (Ｃ1〜Ｃ21）−Ｏ−アルキルエステル、ホスフェート［（Ｃ6〜Ｃ12）アリール−（Ｃ1〜Ｃ21）−Ｏ−アルキル]エステル、(Ｃ1〜Ｃ8）アルキル-ホスホネートおよび／または (Ｃ6〜Ｃ12）−アリールホスホネート橋による完全なまたは部分的置換（式中Ｒ1およびＲ1′は互いに独立に水素、(Ｃ1〜Ｃ18）−アルキル、(Ｃ6〜Ｃ20）−アリール、(Ｃ6〜Ｃ14）−アリール−（Ｃ1〜Ｃ8）−アルキル、好ましくは水素、(Ｃ1〜Ｃ4）−アルキルおよび／またはメトキシエチルであるか、Ｒ1およびＲ1′はそれらが結合する窒素原子とともに５または６員のヘテロ環を形成し、その環はさらにＯ、ＳおよびＮよりなる群からのヘテロ原子を含有していてもよい）；
【００２８】
ｂ）３′− および／または５′−ホスホジエステル橋の、「デホスホノ」橋（たとえば Uhlmann, E. and Peyman, A. in “Methods in Molecular Biology", Vol. 20, “Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., HumanaPress, Totowa 1993, Chapter 16, 355ff. に記載されている）たとえばホルムアセタール、３′−チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム、メチレンジメチルヒドラゾ、ジメチレンスルホンおよび／またはシリル基による完全なまたは部分的置換；
【００２９】
ｃ）糖ホスフェート骨格の、たとえば「モルホリノ」オリゴマー（たとえば、E. P. Stirchakら、Nucleic Acids Res. 1989, 17: 6129およびJ. Summerton andD. Weller, Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 1897, 7: 187-195に記載されている）および／またはポリアミド核酸（ＰＮＡ）（たとえばP. E. Nielsenら、Biononj. Chem. 1994, 5: 3に記載されている）および／またはホスホン酸モノエステル核酸（ＰＨＯＮＡ）（たとえば、Peymanら、Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996, 35: 2632-2638に記載されている）による完全または部分的置換；
【００３０】
ｄ）β−Ｄ−２′−デオキシリボース単位の、たとえばα−Ｄ−２′−デオキシリボース、Ｌ−２′−デオキシリボース、２′−Ｆ−２′−デオキシリボース、２′−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル−リボース、２′−Ｏ−（Ｃ2〜Ｃ6）−アルケニル-リボース、２′−［Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル−Ｏ−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル］−リボース、２′−ＮＨ2−２′−デオキシリボース、β−Ｄ−キシロフラノース、α−アラビノフラノース、２,４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロ−ヘキソピラノース、コンフォーメーション的に限定された糖類縁体たとえばＬＮＡ（ロックされた核酸；Singhら、Chem. Commun. 1998, 4: 455; Singhら、Chem. Commun. 1998, 12: 1247）および炭素環（たとえば、Froehler, J. Am. Chem. Soc. 1992, 114: 8320に記載されている）および／または開鎖た糖類縁体（たとえばVandendriesscheら、Tetrahedron, 1993, 49: 7223に記載されている）および／または二環糖類縁体（たとえば、M. Tarkovら、Helv. Chim. Acta 1993, 76: 481に記載されている）による完全なまたは部分的置換；
【００３１】
ｅ）天然のヌクレオシド塩基の、たとえば、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−アミノウラシル、シュードウラシル、シュードイソシトシン、ジヒドロウラシル、５−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル-ウラシル、５−（Ｃ2〜Ｃ6）−アルケニル−ウラシル、５−（Ｃ2〜Ｃ6）−アルキニル−ウラシル、５−（Ｃ1〜Ｃ6）−アルキル-シトシン、５−（Ｃ2〜Ｃ6）−アルケニル−シトシン、５−（Ｃ2〜Ｃ6）−アルキニル-シトシン、５−フルオロウラシル、５−フルオロシトシン、５−クロロウラシル、５−クロロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ブロモシトシンまたは７−アザ−７−置換プリンによる修飾および／または完全なまたは部分的置換；
からなる。
【００３２】
オリゴヌクレオチドの化学修飾にはさらに、オリゴヌクレオチドの特定の性質に対して好ましい作用、たとえばヌクレアーゼに対する安定性、標的配列に対する親和性およびファーマコキネティクスたとえば修飾オリゴヌクレオチドの標的配列とのハイブリダイゼーション時における標的配列への結合性および／または架橋性を有するさらに１または２個以上の分子へのオリゴヌクレオチドの結合が包含される。更なるこのような分子の例には、ポリリジン、挿入剤、たとえばピレン、アクリジン、フェナジンまたはフェナントリジン、蛍光化合物、たとえばフルオレセイン、架橋剤、たとえばソラレンまたはアジドプロフラビン、親油性分子、たとえば（Ｃ12〜Ｃ20）−アルキル基好ましくは（Ｃ12〜Ｃ20）−アルキル基、脂質たとえば１,２−ジヘキサアデニル−ｒａｃ−グリセロール、ステロイド、たとえばコレステロールまたはテストステロン、ビタミン、たとえばビタミンＥ、ポリまたはオリゴエチレングリコール、(Ｃ12〜Ｃ18）−アルキルホスフェートジエステル、好ましくは（Ｃ14〜Ｃ18）−アルキルホスフェートジエステル、および−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ(ＯＨ）−Ｏ−（Ｃ12〜Ｃ18）−アルキル基、好ましくは−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−Ｏ−（Ｃ12〜Ｃ18）−アルキル基である。これらの更なる分子は５′−および／または３′−末端および／またはその配列内で、たとえば核酸塩基に接合していてもよい。このような修飾オリゴヌクレオチドの製造方法は本技術分野の熟練者には周知であり、たとえばUhlmann, E. & Peyman, A., Chem. Rev. 1990, 90: 543および／またはM. Manoharan in “Antisense Research and Applications", Crooke andLebleu, Ed., CRC Press, Boca Raton, 1993, Chapter 17, p. 303ff. および／またはEP-A 0 552 766に記載されている。
【００３３】
本発明のさらに特異的な実施態様においては、３′−および／または５′−末端において３′−３′および／または 5'-5'反転を有していてもよい。このタイプの化学修飾は本技術分野の熟練者に周知であり、たとえばKogaら、J. Org. Chem. 1991, 56: 3757に記載されている。
【００３４】
１または２以上のオリゴヌクレオチドおよび１または２以上のアリールラジカル好ましくは式ＩまたはIIからなる接合体においては、オリゴヌクレオチドへのアリールラジカルの接合は、たとえばオリゴヌクレオチドの５′−末端（Ａ）、３′−末端（Ｆ）、ヘテロ環塩基（ＥおよびＧ）、糖（Ｃ）またはヌクレオシド間の橋（Ｂ）で行うことができる。しかしながら、たとえばケース（Ｄ）の場合接合は非ヌクレオチド構築ブロックを介して行うこともできる。これらの例は図３に示す。
【００３５】
上述の修飾はもちろん、比較的長いポリヌクレオチドにも同様に、また、適宜、モノまたはジヌクレオチド、またはヌクレオシドにも適用することができる。
【００３６】
オリゴヌクレオチドはたとえば８〜５０ヌクレオチド、好ましくは１０〜２０ヌクレオチドの長さを有する。しかしながら、長さたとえば５０〜１０,０００ヌクレオチド、好ましくは１００〜１０００ヌクレオチドの適宜二本鎖として存在するさらに長いオリゴまたはポリヌクレオチドも適当である。
【００３７】
オリゴヌクレオチドは、任意の配列を有していてよい。オリゴヌクレオチドの配列は、選択された標的に応じて選択または設計される。標的が核酸の場合には、その配列に依存し、標的がタンパク質の場合には、この標的タンパク質をコードする核酸配列に依存する。たとえば、標的がウイルスたとえばＣＭＶ、ＨＩＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、インフルエンザ、Ｂ型肝炎またはパピローマウイルスの場合には、オリゴヌクレオチドはたとえば以下の配列の１つを有する。
【００３８】
ａ）ＣＭＶに対して
配列番号：12    5′-ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧ
ｂ）ＨＩＶに対して、たとえば
配列番号：13    5′-ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴＧＧ-3′、または
配列番号：14    5′-ＡＧＧＴＣＣＣＴＧＴＴＣＧＧＧＣＧＣＣＡ-3′、または
ｃ）ＨＳＶ−１に対して、たとえば
配列番号：15    5′-ＧＣＧＧＧＧＣＴＣＣＡＴＧＧＧＧＧＴＣＧ-3′
【００３９】
標的にはたとえば、癌の形成への関与または癌の増殖に関係するタンパク質がある。このような標的の例には：
１）核内癌タンパク質、たとえばｃ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｆｏｓ／ｊｕｎ、ＰＣＮＡ、ｐ１２０；
２）細胞質／膜−会合癌タンパク質、たとえば、ＥＪ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ｒｒｇ、ｂｃｌ−２、ｃｄｃ−２、ｃ−ｒａｆ−１、ｃ−ｍｏｓ、ｃ−ｓｒｃ、ｃ−ａｂｌ、ｃ−ｅｔｓ；
３）細胞受容体たとえば、ＥＧＦ受容体、Ｈｅｒ−２、ｃ−ｅｒｂＡ、ＶＥＧＦ受容体（ＫＤＲ-1）、レチノイド受容体、タンパク質キナーゼの調節サブユニット、ｃ−ｆｍｓ、Ｔｉｅ−２、ｃ−ｒａｆ−１キナーゼ、ＰＫＣ−α、タンパク質キナーゼＡ（Ｒ１α）;４）サイトカイン、成長因子、細胞外マトリックス、たとえばＣＳＦ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ミエロブラスチン、フィブロネクチンがある。
【００４０】
このような標的に向けられたオリゴヌクレオチドはたとえば以下の塩基配列を有することができる：
ａ）ｃ−Ｈａ−ｒａｓに対して、たとえば
配列番号：16    5′-ＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＣＣＡＧＣ-3′または
配列番号：17    5′-ＴＡＴＴＣＣＧＴＣＡＴ-3′または
配列番号：18    5′-ＴＴＣＣＧＴＣＡＴＣＧＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧＧ-3′
ｂ）ｂＦＧＦ、たとえば
配列番号：19    5′-ＧＧＣＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＣＣ-3′
ｃ）ｃ−ｍｙｃ、たとえば
配列番号：20    5′-ＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＧＧＧＧＣＡＣＡＣ-3′
配列番号：21    5′-ＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ-3′
【００４１】
ｄ）ｃ−ｍｙｂ、たとえば
配列番号：22    5′-ＧＴＧＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＧＧＧＣ-3′
ｅ）ｃ−ｆｏｓ、たとえば
配列番号：23    5′-ＣＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＧ-3′
配列番号：24    5′-ＧＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＧＧＴＣＧＡＡＡＧ-3′
配列番号：25    5′-ＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＴＣＡＴＧＧＴＣＧＡＡＧ-3′
配列番号：26    5′-ＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＧ-3′
ｆ）ｐ１２０、たとえば
配列番号：27    5′-ＣＡＣＣＣＧＣＣＴＴＧＧＣＣＴＣＣＣＡＣ-3′
【００４２】
ｇ）ＥＧＦ受容体、たとえば
配列番号：28    5′-ＧＧＧＡＣＴＣＣＧＧＣＧＣＡＧＣＧＣ-3′
配列番号：29    5′-ＧＧＣＡＡＡＣＴＴＴＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣ-3′
ｈ）ｐ５３腫瘍サプレッサー、たとえば
配列番号：30    5′-ＧＧＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧ-3′
配列番号：31    5′-ＧＧＣＡＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＴＴＣＧＧＡＧ-3′
ｉ）ｂｃｌ−２
配列番号：32    5′-ＴＣＴＣＣＣＡＧＣＧＴＧＣＧＣＣＡＴ
【００４３】
ｋ）ＶＥＧＦ
配列番号：33    5′-ＧＣＧＣＴＧＡＴＡＧＡＣＡＴＣＣＡＴＧ
配列番号：34    3′-ＣＣＡＧＣＣＣＧＧＡＧＧ-5′
5′-ＧＧＡＧＧＣＣＣＧＡＣＣ-3′
配列番号：35    3′-ＣＧＧＡＧＧＣＴＴＴＧＧ-5′
5′-ＧＧＴＴＴＣＧＧＡＧＧＣ-3′
配列番号：36    3′-ＧＡＴＧＧＡＧＧＴＧＧＴ-5′
5′-ＴＧＧＴＧＧＡＧＧＴＡＧ-3′
配列番号：37    3′-ＧＧＡＧＧＴＧＧＴＡＣＧ-5′
5′-ＧＣＡＴＧＧＴＧＧＡＧＧ-3′
配列番号：38    3′-ＧＧＴＧＧＴＡＣＧＧＴＴ-5′
5′-ＴＴＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧ-3′
配列番号：39    3′-ＣＡＣＣＡＧＧＧＴＣＣＧ-5′
5′-ＧＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＣ-3′
配列番号：40    3′-ＣＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＣ-5′
5′-ＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＣＣ-3′
配列番号：41    3′-ＡＧＧＧＴＣＣＧＡＣＧＴ-5′
5′-ＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡ-3′
配列番号：42    3′-ＧＧＧＴＣＣＧＡＣＧＴＧ-5′
5′-ＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧ-3′
配列番号：43    3′-ＧＧＴＣＣＧＡＣＧＴＧＧ-5′
5′-ＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧ-3′
配列番号：44    3′-ＣＣＧＡＣＧＴＧＧＧＴＡ-5′
5′-ＡＴＧＧＧＴＧＣＡＧＣＣ-3′
配列番号：45    3′-ＧＴＡＧＡＡＧＴＴＣＧＧ-5′
5′-ＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧ-3′
配列番号：46    3′-ＡＣＧＣＣＣＣＣＧＡＣＧ-5′
5′-ＧＣＡＧＣＣＣＣＣＧＣＡ-3′
配列番号：47    3′-ＣＣＣＣＣＧＡＣＧＡＣＧ-5′
5′-ＧＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＣ-3′
【００４４】
ｌ）ｃ−ｒａｆキナーゼ
配列番号：48    5′-ＴＣＣＣＧＣＣＴＧＴＧＡＣＡＴＧＣＡＴＴ
ｍ）ＰＫＣ−α
配列番号：49    5′-ＧＴＴＣＴＣＧＣＴＧＧＴＧＡＧＴＴＴＣＡ
ｎ）プロテインキナーゼＡ
配列番号：50    5′-ＧＣＧＴＧＣＣＴＣＣＴＣＡＣＴＧＧＣ
【００４５】
標的がインテグリンまたは細胞-細胞接着受容体、たとえばＶＬＡ−４、ＶＬＡ−２、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭまたはＥＬＡＭである場合には、オリゴヌクレオチドはたとえば以下の配列の１つとすることができる：
ａ）ＶＬＡ−４、たとえば
配列番号：51    5′-ＧＣＡＧＴＡＡＧＣＡＴＣＣＡＴＡＴＣ-3′または
【００４６】
ｂ）ＩＣＡＭ−１、たとえば
配列番号：52    5′-ＧＣＣＣＡＡＧＣＴＧＧＣＡＴＣＣＧＴＣＡ
配列番号：53    5′-ＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＣＴＣ-3′
配列番号：54    5′-ＣＴＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＣＣＴＣ-3′
配列番号：55    5′-ＧＣＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＡＧＣＧＡＧＧ-3′
ｃ）ＥＬＡＭ−１、たとえば
配列番号：56    5′-ＡＣＴＧＣＴＧＣＣＴＣＴＴＧＴＣＴＣＡＧＧ-3′
配列番号：57    5′-ＣＡＡＴＣＡＡＴＧＡＣＴＴＣＡＡＧＡＧＴＴＣ-3′
ｄ）インテグリンα（Ｖ）
配列番号：58    5′-ＧＣＧＧＣＧＧＡＡＡＡＧＣＣＡＴＣＧ
【００４７】
標的が増殖もしくは遊走に関与するかまたはこの過程（単数または複数）に包含されるタンパク質、たとえば
１）核内トランスアクティベータータンパク質およびサイクリン、たとえば、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｆｏｓ／ｊｕｎ、サイクリンおよびｃｄｃ２キナーゼ；
２）マイトジェンまたは成長因子、たとえばＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦおよびＴＧＦ−β；
【００４８】
３）細胞受容体、たとえばｂＦＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体およびＰＤＧＦ受容体である場合には、
オリゴヌクレオチドはたとえば以下の塩基配列の１つを有することができる：
ａ）ｃ−ｍｙｂ
配列番号：59    5′-ＧＴＧＴＣＧＧＧＧＴＣＴＣＣＧＧＧＣ-3′
ｂ）ｃ−ｍｙｃ
配列番号：60    5′-ＣＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ-3′
ｃ）ｃｄｃ２キナーゼ
配列番号：61    5′-ＧＴＣＴＴＣＣＡＴＡＧＴＴＡＣＴＣＡ-3′
ｄ）ＰＣＮＡ（ラットの増殖細胞核内抗原）
配列番号：62    5′-ＧＡＴＣＡＧＧＣＧＴＧＣＣＴＣＡＡＡ-3′
【００４９】
標的がたとえば、アデノシンＡ１受容体、アデノシンＡ３受容体、ブラジキニン受容体またはＩＬ−３である場合には、これらの配列はたとえば
配列番号：63    5′-ＧＡＴＧＧＡＧＧＧＣＧＧＣＡＴＧＧＣＧＧＧ
とすることが可能である。
【００５０】
以下のオリゴヌクレオチド（５′→３′）が調製された。
ＯＮ1 ：5′-ｄ（Ｇ*ＣＧＡＣ*ＧＣ*ＣＡＴ*ＧＡＣ*Ｇ*Ｇ）   配列番号：1
ＯＮ2 ：5′-ｄ（Ｃ*ＧＡＣ*ＧＣ*ＣＡＴ*Ｇ*Ａ*Ｃ）         配列番号：2
ＯＮ3 ：5′-ｄ（Ａ*Ｔ*ＧＡＣ*ＧＧＡＡ*Ｔ*Ｔ*Ｃ）         配列番号：3
ＯＮ4 ：5′-ｄ（ＴＡＴＴＣＣＧＴＣＡＴ）                 配列番号：4
ＯＮ5 ：5′-(ｄＡ)20                                     配列番号：5
ＯＮ6 ：5′-(ｄＡ)50                                     配列番号：6
ＯＮ7 ：5′-(ｄＡ)80                                     配列番号：7
ＯＮ8 ：5′-Ｔ*Ｔ*ＣＣ*ＡＴ*ＧＧ*ＴＧ*Ｇ*Ｃ              配列番号：8
ＯＮ9 ：5′-Ｔ*Ｔ*ＣＡ*ＣＴ*ＧＴ*ＧＧ*Ｇ*Ｃ              配列番号：9
ＯＮ10：5′-Ｔ*Ｇ*ＧＣ*ＧＣ*ＣＧ*ＧＧ*Ｃ*Ｃ              配列番号：10
ＯＮ11：5′-Ｔ*Ｇ*ＣＣ*ＧＧ*ＣＣ*ＧＧ*Ｇ*Ｃ              配列番号：11
式中、*はホスホジエステル橋がホスホロチオエートヌクレオシド内の架橋によって置換された位置を示す。
【００５１】
これらの配列は以下の接合体（ＣＯ）に変換された。
ＣＯ_１：                Ｆ３−Ｌｉ１−ＯＮ１
ＣＯ_２：                Ｆ０−Ｌｉ１−ＯＮ１
ＣＯ_３：                Ｆ３−Ｌｉ１−ＯＮ２
ＣＯ_４：                Ｆ０−Ｌｉ１−ＯＮ２
ＣＯ_５：                Ｆ３−Ｌｉ１−ＯＮ３
ＣＯ_６：                Ｆ９−Ｌｉ１−ＯＮ３
ＣＯ_７：                Ｆ２−Ｌｉ１−ＯＮ３
ＣＯ_８：                Ｆ０−Ｌｉ１−ＯＮ３
ＣＯ_９：                Ｆ３−Ｌｉ１−ＯＮ３−ローダミン
ＣＯ_１０：              Ｆ９−Ｌｉ１−ＯＮ３−ローダミン
ＣＯ_１１：              Ｆ６−Ｌｉ１−ＯＮ３−ローダミン
ＣＯ_１２：              Ｆ０−Ｌｉ１−ＯＮ３−ローダミン
ＣＯ_１３：              Ｆ３−Ｌｉ１−ＯＮ４
ＣＯ_１４：              Ｆ３−Ｌｉ１−ＯＮ５
ＣＯ_１５：              Ｆ３−Ｌｉ１−ＯＮ６
ＣＯ_１６：              Ｆ３−Ｌｉ１−ＯＮ７
ＣＯ_１７：              Ｆ３−Ｌｉ１−ＯＮ８
ＣＯ_１８：              Ｆ３−Ｌｉ１−ＯＮ９
ＣＯ_１９：              Ｆ３−Ｌｉ１−ＯＮ１０
ＣＯ_２０：              Ｆ３−Ｌｉ１−ＯＮ１１
ＣＯ_２１：              Ｆ７−Ｌｉ１−ＯＮ３
【００５２】
式中、「Ｆ１〜Ｆ１１」は式Ｆ１〜Ｆ１１（たとえば図２）の任意のアリールラジカルであり、
「Ｌｉ１」はオリゴヌクレオチドの５′−末端に結合した６−アミノヘキシルホスフェートラジカルであり（たとえば、図４の枠内参照）、
「ＯＮ１〜ＯＮ１１」は配列番号：１〜配列番号：１１に記載したオリゴヌクレオチドであり、
「ローダミン」はオリゴヌクレオチドの３′−末端におけるローダミン標識であり、これはフルオレセインへの添加で検出できる。
【００５３】
本発明はまた、本発明による接合体の製造方法を提供する。本発明は輸送される分子と少なくとも１種のアリールラジカル、好ましくは式ＩまたはIIのアリールラジカルからなる接合体の製造方法であって、
ａ）アリールラジカルを結合すべき位置に反応性機能を含有する、輸送される分子を調製し、
ｂ）任意のアリールラジカルを調製し、ついで
ｃ）輸送される分子をアリールラジカルと反応させて接合体を得る方法を提供する。
【００５４】
反応性機能は、好ましくはアミノ基、メルカプト基、クロロアセチル基、イソシアナート基、イソチオシアナート基、カルボン酸基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基またはカルボニルクロリド基である。輸送される分子のアリールラジカルとの反応はｐＨ≦７.５；好ましくはｐＨ≦７.３特に好ましくはｐＨ７.０またはそれ以下のｐＨで、たとえばｐＨ＜７、好ましくはｐＨ≦６.５で行われる。これらのカップリング反応では、他の反応性の基はすべて反応前に、本技術分野の熟練者には周知の保護基を使用して保護しなければならない。この方法の特定の実施態様においては、輸送される分子はポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはモノヌクレオチドである。
【００５５】
製造方法は、第一工程では輸送される分子の製造からなる。これに関連して、本発明はまた、オリゴヌクレオチドの製造方法に関する。オリゴヌクレオチドは様々な既知の化学方法によりたとえば Eckstein, F., 1991,“Oligonucleotidesand Analogues, A Practical Approach", IRL Press, Oxford に記載されたようにして製造することができる。オリゴヌクレオチドはまた適宜、１または２以上の酵素工程からなる方法によっても製造することができる。オリゴヌクレオチド接合体の製造は原理的には文献（J. Goodchild, Bioconjugate Chem., 1990, 1:165; S. Beaucage & R. Iyer, Tetrahedron, 1993, 49: 1925; S. Agrawal, Methodsin Molecular Biology Vol. 26, “Protocols for oligonucleotide conjugates", 1994, Humana Press）に記載されている。
【００５６】
しかしながら、式Ｉによるオリゴヌクレオチド接合体を合成する場合、それらがアルカリ性メジウム中では分解することがあるので注意すべきである。したがってオリゴヌクレオチドシンセサイザー中、たとえば慣用方法を用いてＦＤＡ−標識オリゴヌクレオチドを合成することは、支持体からのオリゴヌクレオチドの切断およびヘテロ環塩基のアミノ保護基の切断に要求されるアンモニア処理時にＦＤＡのエステル基が加水分解されるので不可能である。したがって、オリゴヌクレオチドは最初に脱保護型の前駆体として製造し、最終工程で式Ｉの基と融合させる（図５）。オリゴヌクレオチド前駆体は反応性または活性化可能な機能を有し、これはついで本技術分野の熟練者には周知の方法により、本発明の式Iの基を含有する試薬で誘導体化される。適当な反応性または活性化可能な機能は、たとえばアミノ、メルカプト、クロロアセチル、イソ（チオ）シアナートおよびカルボン酸機能である。市販品を利用できる試薬を用いて、オリゴヌクレオチドにいわゆるアミノリンカーを導入するのが特に容易である。アミノリンカーオリゴヌクレオチドをついで、たとえば式Iの基を含有する反応性試薬と反応させる。このような反応性試薬はたとえば相当するイソチオシナナートである。この場合、式Ｉの基はチオ尿素機能を介して結合される（枠４）。他の反応性試薬はたとえば、相当するカルボン酸のＮ-ヒドロキシスクシンイミドである。活性化可能な基はたとえば、ペプチドカップリング試薬たとえばＨＢＴＵ、ＴＢＴＵまたはＴＯＴＵとカップリングできる相当するカルボン酸である。この場合、式Ｉの基はアミド機能を介して結合される。原理的に、本発明の式Ｉの基はオリゴヌクレオチドの任意の位置に導入することができる。好ましくは図３に示す位置である。
【００５７】
修飾オリゴヌクレオチドは、標準方法たとえばホスホロアミダイト法での固相合成によるオリゴヌクレオチド鎖の構築および市販品を利用できる５′−アミノモディファイヤーＣ６（たとえば、Eurogentec, Seraing, Belgiumから）での５′−末端誘導体化によって合成された。
【化８】
0004791665.tif 000005
【００５８】
アンモニア処理による支持体からのオリゴヌクレオチド誘導体の切断およびすべての不安定性保護基の脱保護後、モノメトキシトリチル基を常温で８０％酢酸で処理して除去する。これにより、５′−アミノヘキシル−ホスフェート修飾オリゴヌクレオチドが得られる。このオリゴヌクレオチド誘導体のアミノ機能をついで、０.２Ｍトリエチルアンモニウム重炭酸塩緩衝液（ＴＢＫ緩衝液）ｐＨ７／ＤＭＦ中ＦＤＡ−イソチオシアナートと反応させる。わずか２〜３時間後に、アミノリンカーオリゴヌクレオチドは完全に所望のＦＤＡ誘導体に変換された（図４）。フルオレセインイソチオシアナートとの反応は通常、ｐＨ８で行われる。しかしながら、このｐＨではＦＤＡのジ酢酸塩は加水分解される。もちろん、他のアミノリンカー試薬たとえば５′−アミノモディファイヤーＣ３、５′−アミノモディファイヤーＣ１２、５′−アミノモディファイヤーＣ５または５′−チオールモディファイヤーＣ６（すべてＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃより）を使用することも可能である。
【００５９】
３′−アミノモディファイヤー固相、たとえば３′−アミノモディファイヤーＣ３ ＣＰＧ（Eurogentecより）を使用することにより、３′−アミノアルキル基を有するオリゴヌクレオチド誘導体を調製することが可能であり、これはついでＦＤＡ−イソチオシアナートと反応させる。これにより、
【化９】
0004791665.tif 000006
が３′−末端に結合する本発明の式Ｉの基に含有されるオリゴヌクレオチド誘導体が得られる。
【００６０】
ヌクレオチドのヘテロ環塩基において接合体に導入するためには、通常のホスホロアミダイト構築ブロックの代わりにチミジンから誘導される相当するアミノモディファイヤーＣ６ ｄＴ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃより）を合成に使用することができる。オリゴヌクレオチド合成の最後に、アンモニアで処理してトリアセチル保護基を除去し、遊離アミノ機能を溶液中ＦＤＡ−イソチオシアナートと反応させる。
【００６１】
【化１０】
0004791665.tif 000007
【００６２】
同様にして、本発明の式Ｉの基をオリゴヌクレオチドの任意の位置に導入することができる。同種または異種の基の多重導入も容易である。
【００６３】
輸送される分子がペプチド核酸（ＰＮＡ）である接合体の製造方法では、アミノエチル基の一級アミノ機能をＦＤＡ−イソチオシアナートと反応させることができる。輸送される分子がポリペプチドである接合体の製造方法においては、たとえばポリペプチドのアミノ末端またはリジン側鎖のアミノ機能をＦＤＡ−イソチオシアナートとの反応に使用することが可能である。
【００６４】
本発明はまた、接合体の使用特に接合体の上述の有利な性質に基づく使用を提供する。本発明の特定の実施態様は生体膜を横切って分子を輸送するための接合体の使用に関する。本発明はまた、アリール基、好ましくは式ＩまたはIIのアリール基を、このアリール基に結合した分子を生体膜を横切って輸送するためのの使用に関する。生体膜は好ましくは細胞、小胞またはオルガネラの成分である。
【００６５】
本発明はまた、膜を横切って分子を輸送するための方法において、
ａ）輸送される分子が式ＩまたはIIの少なくとも１個のアリールラジカルに結合した接合体を調製し、ついで
ｂ）接合体を膜とインキュベートする方法を提供する。
【００６６】
特に、分子を細胞内に輸送する方法において、
ａ）輸送される分子が式ＩまたはIIの少なくとも１個のアリールラジカルに結合した接合体を調製し、ついで
ｂ）接合体を細胞とインキュベートし、それにより
ｃ）接合体を、アリールラジカルが切断されることなく細胞内に輸送する方法が提供される。
【００６７】
これは特に、細胞が真核細胞または原核細胞、たとえば細菌細胞、酵母細胞または哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞である方法に関する。特定の実施態様においては、細胞は病的に修飾された細胞、たとえば腫瘍細胞である。
【００６８】
接合体の改良された細胞内取り込みは哺乳動物細胞では観察されたのみでなく、他の真核細胞および原核細胞でも証明された。
本発明による接合体は、生存細胞への取り込みについて顕微鏡的に検査した。最初に、ＦＤＡ−標識オリゴヌクレオチドを、ＣＯ_１およびＣＯ_３の細胞内へ侵入する能力について検査した。相当するフルオレセイン標識オリゴヌクレオチドＣＯ_２およびＣＯ_４を従来技術から既知の化合物として使用した。すべての生存動物細胞培養液を試験し、５〜１０分以内にＣＯ_１およびＣＯ_３（ＦＤＡ−接合体）は取り込まれていたが、一方、この時間後に生存細胞中にＣＯ_２およびＣＯ_４（フルオレセイン接合体）を検出することはできなかった。
【００６９】
細菌および酵母への取り込みは哺乳動物細胞の場合に比べてかなり遅かったが、本発明のオリゴヌクレオチドはある種の細胞には２時間後に取り込まれ、一方、通常のフルオレセイン標識オリゴヌクレオチドではこれらの条件下に取り込みは認められなかった。これまでに検討されたすべての生物体で本発明のオリゴヌクレオチドは既知のオリゴヌクレオチド誘導体の場合より良好な取り込みを示したことは原理的に驚くべきことである。これらの生物体には特に動物細胞、鞭毛虫、酵母、カビおよび細菌が包含される（表３）。
【００７０】
さらに癌細胞は、そのオリゴヌクレオチドを特によく取り込むことが見出された。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドの使用は、腫瘍療法に特に適している。ｅｇ５に対して向けられたＦＤＡ-標識アンチセンスオリゴヌクレオチドＣＯ_１は、単にメジウムに添加するだけでＡ５４９細胞の増殖を阻害すのに対し、相当する非修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドＯＮ１およびフルオレセイン標識オリゴヌクレオチドＣＯ_２は浸透エンハンサーたとえばセルフェクチンと製剤化したのちにのみ癌細胞の増殖を阻害した。
【００７１】
本発明は、輸送される分子が一本鎖および／または二本鎖核酸たとえばＤＮＡ（たとえば、遺伝子、ｃＤＮＡ）および／またはＲＮＡ（たとえばプレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ）とハイブリダイゼーションさせるためのオリゴヌクレオチドである接合体の使用に関する。これらの接合体はまた、細胞内タンパク質、たとえば酵素たとえばポリメラーゼもしくはテロメラーゼまたは転写因子に配列特異的に結合することができる。本発明はさらに、ある種の標的遺伝子の修飾および完全または部分的な発現阻害たとえば転写および／または翻訳の完全または部分的な阻害のためのこのような接合体の使用に関する。本発明はまた、このような接合体のアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、センスオリゴヌクレオチド、トリプルヘリックス形成オリゴヌクレオチド、キメラプラストおよび／またはデコイオリゴヌクレオチドとしての使用に関する。さらに、これらの接合体は分子生物学における補助物質として使用することができる。
【００７２】
本発明はさらに、オリゴヌクレオチドの医薬および／または診断補助剤としての使用、ならびにオリゴヌクレオチドの医薬および／または診断補助剤の製造のための使用に関する。特に、オリゴヌクレオチドはある種の遺伝子の発現または過剰発現に伴う疾患の予防および／または処置のための医薬に使用することができる。さらに、オリゴヌクレオチドはこのような疾患の診断、またはそれらを早期に検出するために使用することができる。本発明のオリゴヌクレオチドの細胞内に侵入する能力はきわめて高いので、それらはインビトロ診断、たとえば、全臓器または健康な臓器のインシトゥハイブリダイゼーションに使用することができる。
【００７３】
本発明はまた、本発明の１または２種以上の接合体からなる医薬を提供する。本発明はまた、本発明の１または２種以上の接合体からなる診断補助剤を提供する。本発明はまた、本発明の１または２種以上の接合体からなる試験キットを提供する。
【００７４】
本発明はまた、核酸およびそれらの類縁体の検出、分離および増幅のためのオリゴヌクレオチドの使用に関する。接合体は特に細胞内特に生存細胞内の核酸の検出に特に適している。これらの細胞は、ヒトまたは動物起源のいずれであってもよい。接合体はまた、表３に掲げた生物体に特に適当であり、特に病的生物体の検出に適当である。本発明のオリゴヌクレオチドは、核酸の増幅の既知の技術的変法において、特にＬＭＰＣＲ（リゲーション仲介ポリメラーゼ連鎖反応）、「インベーダーアッセイ」（登録商標、Third Wave Technologies,Inc., Wisconsin）、ＴａｑＭａｎシステム（登録商標）およびマルチプレックスゲノタイピング）に使用することができる。増幅の定量をリアルタイムで可能にする光サイクラーを用いる、核酸の増幅のためのオリゴヌクレオチドの使用も有利である。蛍光染料がオリゴマー中の第二の基によって消光するため、結合しないと蛍光を発しない分子「ビーコン」の原理による検出は、本発明のオリゴヌクレオチドの使用の可能性をさらに拡大する。たとえば、ＦＤＡ誘導体（たとえば、オリゴヌクレオチドの５′−末端における誘導体）を、非結合状態ではＦＤＡ誘導体がフルオレセイン誘導体に変換されたのちにも蛍光シグナルを消光するダブシルラジカル（たとえば、３′−末端で接合）と組み合わせることが可能である。これらのＦＤＡ修飾ビーコンは、細胞への取り込みおよび標的ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーション後にのみ蛍光シグナルを発光する。
【００７５】
本発明はまた、特定の遺伝子の過剰発現によりまたはそれに伴って起こる疾患の処置のためのこれらのオリゴヌクレオチドの使用またはこれらのオリゴヌクレオチドからなる医薬の使用に関する。本発明の医薬は、たとえばウイルスたとえばＣＭＶ、ＨＩＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、インフルエンザ、ＶＳＶ、Ｂ型肝炎またはポリオーマウイルスにより起こされる障害の処置に使用することができる。本発明の医薬はまたたとえば癌の処置に適当である。本発明の医薬はさらに、たとえばインテグリンまたは細胞−細胞接着分子受容体たとえばＶＬＡ−４、ＶＬＡ−２、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭまたはＥＬＡＭによって影響される障害の処置に適当である。本発明の医薬はまた、たとえば再狭窄の予防、白斑および他の色素脱失疾患または色素脱失障害（たとえば、皮膚、毛髪または眼）たとえば白皮症および乾癬、ならびに喘息の処置に適当である。
【００７６】
医薬はたとえば、ａ）経口的にたとえば錠剤、糖衣錠、硬質または軟質カプセル、溶液、乳化液または懸濁液の形態で、ｂ）経直腸的にたとえば坐剤の形態で、またはｃ）非経口的にたとえば注射用溶液の形態で投与できる医薬製剤に関する。医薬の製造のためには、接合体をたとえば治療的に不活性な有機および／または無機担体と処理することができる。錠剤、糖衣錠および硬質ゼラチンカプセルに適当な担体は、たとえばラクトース、トウモロコシデンプンまたはその誘導体、獣脂およびステアリン酸またはその塩である。溶液に適当な担体は水、ポリオール、スクロース、転化糖およびグルコースであり、注射用溶液に適当な担体は水、アルコール、ポリオール、グリセロールおよび植物油であり、坐剤に適当な担体は植物油および水添油、ワックス、油脂および半液体ポリオールである。医薬はさらに防腐剤、溶媒、安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、賦香剤、浸透圧を変化させる塩、緩衝剤、抗酸化剤、および適宜他の治療的に活性な化合物から構成することができる。医薬は好ましくは局所的または局部的に、たとえばカテーテルを用いて、または吸入によって適用されるか、または注射もしくは輸液により投与される。注射のためには、接合体は液体溶液中、好ましくは生理学的に許容される緩衝液たとえばハンク溶液またはリンゲル溶液中に製剤化される。しかしながら、接合体はまた、固体の形態に製剤化して使用前に溶解または懸濁させてもよい。全身投与に好ましい投与量は１日体重１kgあたり約０.０１mg〜約５０mgである。
【００７７】
接合体および／またはそれらの生理学的に許容される塩は医薬として動物好もしくは哺乳動物特にヒトにそれら単独で、互いに混合物として、または局所、経皮、非経口または経腸的な使用が可能であり、活性成分として有効用量の少なくとも１種の接合体からなり、さらに慣用の医薬的に許容される担体および添加物を加えてなる医薬製剤の形態で投与することができる。製剤は通常、約０.１〜９０重量％の治療的に活性な化合物からなる。皮膚疾患たとえば乾癬または白皮症の処置のためには、たとえば軟膏、ローションまたはチンキ油、乳化剤、懸濁剤の形態で局所的に使用するのが好ましい。医薬はそれ自体公知の方法（たとえば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co., Easton, PA）で医薬的に不活性な無機および／または有機担体を用いて製造される。丸剤、錠剤、糖衣錠および硬質ゼラチンカプセルの製造には、たとえばラクトース、トウモロコシデンプンおよび／またはその誘導体、タルク、ステアリン酸および／またはその塩等が使用できる。軟質ゼラチンカプセルおよび／または坐剤に適当な担体は、たとえば、油脂、ワックスおよび半固体および液体ポリオール、天然油および／または水添油等である。溶液および／またはシロップの製造に適当な担体には、たとえば水、スクロース、転化糖、グルコース、ポリオール等がある。注射溶液の製造に適当な担体は、たとえば、水、アルコール、グリセロール、ポリオール、植物油等である。マイクロカプセル、移植片および／またはロッドに適当な担体は、グリコール酸および乳酸の混合ポリマーである。さらに、本技術分野の熟練者には周知のリポソーム製剤（N. Weiner, Drug Develop Ind Pharm, 1989, 15: 1523; “Liposome Dermatics, Springer Verlag 1992）たとえばＨＪＶリポソーム（Hayashi, Gene Therapy, 1996, 3: 878）も適している。
【００７８】
活性化合物および担体に加えて、医薬はまた添加物たとえば充填剤、増量剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、安定剤、乳化剤、防腐剤、甘味剤、賦香剤または芳香剤、増粘剤、希釈剤、緩衝物質、さらに溶媒および／または可溶化剤および／またはデポ作用を与える賦形剤、浸透圧を変化させる塩、コーティング剤および／または抗酸化剤から構成される。それらはまた、２または３種以上のオリゴヌクレオチドおよび／またはそれらの生理学的に許容される塩から構成されてもよく、さらに少なくとも１種のオリゴヌクレオチドに加えて１または２種以上の他の治療的に活性な物質から構成されてもよい。用量は広い範囲内で変動し、各場合により個々の環境に調整されなければならない。
【００７９】
【実施例】
実施例１：
オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチドは自動ＤＮＡシンセサイザー（Applied Biosystems 380B型または394型）上標準ホスホロアミダイト化学およびヨウ素による酸化を用いて合成した（F. Eckstein, Ed. “Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", IRL Press, Oxford, 1991）。混合ホスホロチオエートおよびホスホジエステルオリゴヌクレオチド中ホスホロチオエート橋の導入のための酸化はに、ヨウ素の代わりにＴＥＴＤ（テトラエチルチウラムジスルフィド）またはビューケージ試薬を使用した。固体支持体（ＣＰＧまたはＴentagel）からの切断および保護基の除去を濃ＮＨ3により５５℃で１８時間実施したのちオリゴヌクレオチドをまずブタノールから沈殿させ精製した（Sawadogo, Van Dyke, Nucl. Acids Res. 1991, 19: 674）。オリゴヌクレオチドは製造用ゲル電気泳動またはＦＰＬＣにより精製した。ついで、０.５Ｍ ＮａＣｌ溶液から２.５容量部のエタノールを用いて沈殿させ、ナトリウム塩を得た。
【００８０】
オリゴヌクレオチドは、
ａ）２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５４Ｍトリス-ボレート緩衝液、ｐＨ７.０中分析用ゲル電気泳動および／または
ｂ）ＨＰＬＣ分析：Waters GenＰak FAX、勾配：ＣＨ3ＣＮ（４００ml）、Ｈ2Ｏ（１.６ml）、ＮａＨ2ＰＯ4（３.１ｇ）、ＮａＣｌ（１１.７ｇ）、ｐＨ６.８（１Ｍ ＮａＣｌ）→ＣＨ3ＣＮ（４００ml）、Ｈ2Ｏ（１.６ml）、ＮａＨ2ＰＯ4（３.１ｇ）、ＮａＣｌ（１７５.３ｇ）、ｐＨ６.８（１.５Ｍ ＮａＣｌ）および／または
ｃ）毛細管ゲル電気泳動Beckmann capillary eCAP（登録商標）、Ｕ１００Ｐゲルカラム、長さ６５cm、Ｉ.Ｄ.１００mm、窓部一端から１５cm、緩衝液１４０μMトリス、３６０mMホウ酸、７Ｍ尿素および／または
ｄ）エレクトロスプレーマススペクトル
によって分析した。
【００８１】
オリゴヌクレオチドの分析では、それが各場合９０％以上、大部分の場合９５％以上の純度で存在することを示した。
【００８２】
実施例２：
オリゴヌクレオチド中への５′−アミノ−リンカーの導入
オリゴヌクレオチドは実施例１に記載したようにして合成した。最後のヌクレオチドのカップリング後、５′−末端におけるジメトキシトリチル基を除去した。遊離のヒドロキシル基を、市販品を入手できる５′−アミノモディファイヤーＣ６（Eurogentec, Seraing, Belgiumから）とテトラゾール触媒下に反応させ、ヨウ素水で酸化した。ついでオリゴヌクレオチドを、５０℃において濃アンモニアで一夜処理して担体から切断し、ヌクレオシドオ内の基およびヘテロ環塩基アミノ機能におけるすべての塩基不安定保護基を切断除去した。最終工程で、モノメトキシトリチル保護基を、８０％濃度の酢酸により常温で３時間処理して切断した。得られたオリゴヌクレオチドを実施例１に記載したように分析した。
【００８３】
実施例３：
アミノ-リンカーオリゴヌクレオチドのＦＤＡイソチオシアナートとの接合
実施例２からの５′−アミノ−リンカーオリゴヌクレオチド１０ＯＤ（２６０）を１６μlの０.２Ｍトリエチルアンモニウム重炭酸塩（ＴＢＫ）緩衝液に溶解し、１２５μlのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）と混合した。この混合物に、ＦＤＡイソチオシアナート１.５mgを加え、ついで混合物を遮光下に３時間振盪した。反応の結果をＨＰＬＣによってチェックした。ついで２μlの濃酢酸を加え、混合物を減圧下に濃縮した。ついで、生成物をブタノールで沈殿させて精製した。補正した分子量はＥＳＩマススペクトルで測定した。芳香族エステルの加水分解を避けるため、サンプルは常にｐＨ７未満に保持した。
【００８４】
実施例４：
ＣＯ_１（５′−Ｆ３−Ｇ*ＣＧＡＣ*ＧＣ*ＣＡＴ*ＧＡＣ*Ｇ*Ｇ−３′；Ｆ３＝ＦＤＡ）の合成
オリゴヌクレオチドは、３′−末端を介して結合したデオキシグアノシン１μmolを有するＣＰＧ担体に出発し実施例１に記載したように合成した。*の印を付した位置はホスホロチオエートを導入するためにビューケージ試薬で酸化した。ついで、５′−アミノモディファイヤーＣ６とのカップリングを実施例２に記載のように実施した。濃アンモニアおよび８０％酢酸での脱保護によって、９６ＯＤ（２６０）の５′−アミノ−リンカ−Ｇ*ＣＧＡＣ*ＧＣ*ＣＡＴ*ＧＡＣ*Ｇ*Ｇ−３′が得られた。
【００８５】
５′−アミノ−リンカーオリゴヌクレオチド１０ＯＤ（２６０）をついで実施例３に記載のようにＦＤＡイソチオシアナートと反応させた。ブタノールで沈殿させると、８.４ＯＤ（２６０）の所望のＦＤＡ−標識オリゴヌクレオチドが得られた。ジＮａ塩のＥＳＩ−ＭＳ：５３９５.９３（ジＮａ塩の計算値：５３９５.０９）。
【００８６】
実施例５：
ＣＯ_１３（５′−Ｆ３−ＴＡＴＴＣＣＧＴＣＡＴ−３′）の合成
オリゴヌクレオチドは、３′−末端を介して結合したチミジン１μmolを有するＣＰＧ担体に出発し実施例１に記載したように合成した。すべての酸化はヨウ素水を用いて実施した。ついで、５′−アミノモディファイヤーＣ６とのカップリングを実施例２に記載のように実施した。濃アンモニアおよび８０％酢酸での脱保護によって、７２ＯＤ（２６０）の５′−アミノ−リンカ−ＴＡＴＴＣＣＧＴＣＡＴ−３′が得られた。
【００８７】
５′−アミノ−リンカーオリゴヌクレオチド１０ＯＤ（２６０）をついで実施例３に記載のようにＦＤＡイソチオシアナートと反応させた。ブタノールで沈殿させると、９.１ＯＤ（２６０）の所望のＦＤＡ−標識オリゴヌクレオチドが得られた。ＥＳＩ−ＭＳ：３９３４.１（計算されたＭＷ：３９３３.８）。
【００８８】
実施例６：
ＣＯ_２１（５′−Ｆ７−Ａ*Ｔ*ＧＡＣ*ＧＧＡＡ*Ｔ*Ｔ*Ｃ）の合成
オリゴヌクレオチドは、３′−末端を介して結合したＮ−ベンゾイルシチジン１μmolを有するＣＰＧ担体に出発し実施例１に記載したように合成した。すべての酸化はヨウ素水を用いて実施した。ついで、５′−アミノモディファイヤーＣ６とのカップリングを実施例２に記載のように実施した。濃アンモニアおよび８０％酢酸での脱保護によって、１４５ＯＤ（２６０）の５′−アミノ−リンカ−Ａ*Ｔ*ＧＡＣ*ＧＧＡＡ*Ｔ*Ｔ*Ｃ−３′が得られた。
【００８９】
５′−アミノ−リンカーオリゴヌクレオチド１０ＯＤ（２６０）を０.２Ｍ ＴＢＫ緩衝液１６μlおよびＤＭＦ ９５μlに溶解し、混合物を予め調製したｐ−アセトキシ安息香酸の活性化エステル３０μlと反応させた。活性化エステルは ０.２Ｍ ｐ−アセトキシ安息香酸５０μlを各場合ＤＭＦ中０.３Ｍ ＴＢＴＵ ５０μlと混合し、ついで常温で１時間反応させて調製した。アミノ−リンカーオリゴヌクレオチドを活性化エステルと４時間反応させたのち、２μlの半濃縮酢酸を加え、混合物を減圧下に濃縮した。過剰の試薬をブタノールで沈殿させて除去した。これにより、１０.７ＯＤ（２６０）の所望のオリゴヌクレオチド接合体が得られた。ＥＳＩ−ＭＳ：４１０９.２（計算されたＭＷ：４１０８.２）。
【００９０】
実施例７：
オリゴヌクレオチド接合体の細胞取り込みの試験
細胞取り込みを試験するために、１mlの細胞懸濁液を培養メジウム（または、固有の蛍光を有するメジウムの場合はＰＢＳ中で濯いだのち）中Ｂａｃｈｏｆｅｒチャンバー内で、顕微鏡による制御下に１mlのオリゴヌクレオチド接合体１μmol溶液と混合し、混合はピペットを用い、またチャンバーを振盪して行った。顕微鏡試験は Zeiss Axiovert 135 TV 装置（100×Plan-Neofluar）により位相差様式で実施した。用いた蛍光フィルターは０９（４５０−４９０／ＦＴ５１０／ＬＰ５２０）／ＨＢＯ５９Ｗフィルターとした。用いた対照はアセトン／ＰＢＳ緩衝液（１：１０００v：v）中２.４μMのＦＤＡ（Aldrich Chem. Co., FW. 416. 39）とした。ＦＤＡ接合体の場合はエステル切断によって形成されたフルオレセインリガンドの固有の蛍光を取り込み後にモニターすることができる。非蛍光リガンドたとえばアセトキシナフタレンカルボン酸の場合には、適当な蛍光標識（ＦＩＴＣ、ローダミン、シアニン染料Ｄｙ３またはＤｙ５）をさらにオリゴヌクレオチドに結合させた。ＣＯ_９におけるような二重標識はＦＤＡがオリゴヌクレオチドから切断されていないことの証明に有効であった。個々のサンプルはオリゴヌクレオチド接合体の添加後２〜１２０分で評価した。Ｒｅｈ細胞の場合、蛍光は５〜１０分後に明らかに認められた。Ｋ５６２および接着細胞ならびに昆虫細胞の場合には、添加６０分後まである程度の増加がみられた。非寄生性原生動物の場合は、取り込みは１時間まで行われた。酵母の場合、取り込みは長時間後にのみ起こり、すべての細胞で均一ではなかった。ＦＤＡオリゴヌクレオチド接合体カビ胞子への取り込みは菌糸細胞への取り込みよりも良好であった。結果は表１〜３にまとめる。
【００９１】
実施例８：
オリゴヌクレオチド接合体の抗増殖活性の試験
ＲＥＨ細胞（ヒトプレ−Ｂ細胞白血病、ＤＳＭ ＡＣＣ ２２）またはＡ５４９腫瘍細胞を１０％ウシ胎児血清（FCS，Gibco-BRL）を加えたＯｐｔＭＥＭ中３７℃、５％ＣＯ2で培養した。実験の前日に、細胞を２４時間後に約１×１０6／mlの細胞濃度が達成されるように二次培養した。オリゴヌクレオチドまたはそれらの接合体を蒸留水に溶解し、１mM保存溶液を作成して−２０℃の冷蔵庫で保存した。細胞を２４−ウエルプレートに散布した（１０％ＦＣＳ含有ＯｐｔＭＥＭ中１×１０6細胞／ml）。検査のためにはオリゴヌクレオチド誘導体を２μM（ＯｐｔＭＥＭ中ＦＣＳなし）に希釈した。各ウエルにつき、１００μlのオリゴヌクレオチド溶液と１００μlの細胞懸濁液を混合した（総容量２００μl／ウエル；オリゴ濃度１μM、血清濃度５％ＦＣＳ、細胞濃度０.５×１０6細胞／ml）。３７℃、５％ＣＯ2において４時間インキュベートしたのち、各ウエルに１１％ＦＣＳ含有ＯｐｔＭＥＭ ８００μlを添加し（細胞濃度は現時点で１×１０5細胞／ml、血清濃度は現時点で１０％ＦＣＳ）、インキュベーションを続けた。３７℃、５％ＣＯ2において９６時間後、Ｃａｓｙ １（Schaerfeから）を用いて細胞濃度を測定した。この目的では、各ウエルの細胞を１０００μlのピペットに吸引することにより混合し、再び吹き出してこれを１０回反復し、直ちにＣａｓｙｔｏｎで１：１００（細胞の増殖が著しい場合には１：２００）に希釈した。各場合１バッチの３つの同一サンプルから細胞密度の平均値を決定した。
【００９２】
実施例９：
５′−Ｆ４′(ＣＯ−ＮＨ)−Ａ*Ｔ*ＧＡＣ*ＧＧＡＡ*Ｔ*T*Ｃの合成
オリゴヌクレオチドは、３′−末端を介して結合したＮ−ベンゾイルシチジン１μmolを有するＣＰＧ担体に出発し実施例１に記載したように合成した。ホスホロチオエートラジカル（配列中に*がある場合）の導入するための酸化はヨウ素水またはビューケージ試薬を用いて実施した。ついで、5'-アミノモディファイヤーＣ６とのカップリングを実施例２に記載のように実施した。濃アンモニアおよび８０％酢酸での脱保護によって、１４５ＯＤ（２６０）の５′−アミノ−リンカ−Ａ*Ｔ*ＧＡＣ*ＧＧＡＡ*Ｔ*Ｔ*Ｃ−３′が得られた。
【００９３】
５′−アミノ−リンカーオリゴヌクレオチド１０ＯＤ（２６０）を０.２Ｍ ＴＢＫ緩衝液１６μlおよびＤＭＦ ９５μlに溶解し、混合物を１２.５μlのジクロロフルオレセインジアセテートヒドロキシスクシンイミド（ＭＷ：６２６.３６）と反応させた。アミノ-リンカーオリゴヌクレオチドをヒドロキシスクシンイミドと３時間反応させたのち、２μlの半濃縮酢酸を加え、混合物を減圧下に濃縮した。ＮＡＰカラム（登録商標、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で脱塩したのち、ブタノールにより沈殿させた。これにより、２.８ＯＤ（２６０）の所望のオリゴヌクレオチドジクロロフルオレセインジアセテート接合体が得られた。ＥＳＩ−ＭＳ：４４０３.３（計算値：４４０３.２）。
【００９４】
実施例１０：
５′−Ｆ２′(ＣＯ−ＮＨ)−Ａ*Ｔ*ＧＡＣ*ＧＧＡＡ*Ｔ*Ｔ*Ｃの合成
５′−アミノ−リンカ−Ａ*Ｔ*ＧＡＣ*ＧＧＡＡ*Ｔ*Ｔ*Ｃ−３′オリゴまーを、実施例９に記載のように製造した。５′−アミノ−リンカーオリゴヌクレオチド１０ＯＤ（２６０）を０.２Ｍ ＴＢＫ緩衝液１６μlおよびＤＭＦ ９５μlに溶解して、混合物を１２.５μlのカルボキシフルオレセインジピバレートヒドロキシスクシンイミド（ＭＷ：６４１.６４）と反応させた。アミノ-リンカーオリゴヌクレオチドをヒドロキシスクシンイミドと２時間反応させたのち、さらに１２.５μlのヒドロキシスクシンイミドを加え、さらに２時間反応を続けた。ついで２μlの半濃縮酢酸を加え、混合物を減圧下に濃縮した。ＮＡＰカラム（登録商標、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で脱塩し、ついでブタノールにより沈殿させた。これにより、８.１ＯＤ（２６０）の所望のオリゴヌクレオチドフルオレセインジピバレート接合体が得られた。ＥＳＩ−ＭＳ：４４７２.９（計算値されたＭＷ：４４７１.６）。
【００９５】
実施例１１：
５′−Ｆ９−Ａ*Ｔ*ＧＡＣ*ＧＧＡＡ*Ｔ*Ｔ*Ｃの合成
５′−アミノ−リンカ−Ａ*Ｔ*ＧＡＣ*ＧＧＡＡ*Ｔ*Ｔ*Ｃ−３′ オリゴマーを、実施例９に記載のように製造した。５′−アミノ−リンカーオリゴヌクレオチド１０ＯＤ（２６０）を０.２Ｍ ＴＢＫ緩衝液１６μlおよびＤＭＦ ９５μlに溶解して、混合物を２５μlのアセトキシナフチルカルボン酸の活性化エステルと反応させた。活性化エステルは１２.５μlの０.２Ｍアセトキシナフチルカルボン酸（５０μlのＤＭＦ中２.５mg）を１２.５μlのＴＢＴＵ（５０μlのＤＭＦ中４mg）と混合し、ついで常温で１時間反応させて製造した。アミノ−リンカーオリゴヌクレオチドを活性化エステルと１７−時間反応させたのち、２μlの半濃縮酢酸を加え、混合物を減圧下に濃縮した。ＮＡＰカラム（登録商標、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で脱塩し、ついでブタノールにより沈殿させた。これにより、８.５ＯＤ（２６０）の所望のオリゴヌクレオチドアセトキシナフチル接合体が得られた。ＥＳＩ−ＭＳ：４１５８.２（計算されたＭＷ：４１５７.２）。
【００９６】
実施例１２：
５′−Ｆ８−Ａ*Ｔ*ＧＡＣ*ＧＧＡＡ*Ｔ*Ｔ*Ｃの合成
５′−アミノ−リンカ−Ａ*Ｔ*ＧＡＣ*ＧＧＡＡ*Ｔ*Ｔ*Ｃ−３′オリゴマーを、実施例９に記載のように製造した。５′−アミノ−リンカーオリゴヌクレオチド１０ＯＤ（２６０）を０.２Ｍ ＴＢＫ緩衝液１６μlおよびＤＭＦ ９５μlに溶解し、混合物を２５μlのアセトキシクマリンカルボン酸の活性化エステルと反応させた。活性化エステルは１２.５μlの０.２Ｍアセトキシクマリンカルボン酸（５０μlのＤＭＦ中２.７mg）を１２.５μlのＴＢＴＵ（５０μlのＤＭＦ中４mg）と混合し、ついで常温で１時間反応させて製造した。アミノ−リンカーオリゴヌクレオチドを活性化エステルと１７−時間反応させたのち、２μlの半濃縮酢酸を加え、混合物を減圧下に濃縮した。ＮＡＰカラム（登録商標、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で脱塩し、ついでブタノールにより沈殿させた。これにより、８.０ＯＤ（２６０）の所望のオリゴヌクレオチドアセトキシクマリン接合体が得られた。ＥＳＩ−ＭＳ：４１７８.５（計算されたＭＷ：４１７５.２）。
【００９７】
実施例１３：
５′−Ｆ３−（ｄＡ)nｄＡ*ｄＡ*ｄＡ（ｎ＝１７、４７および７７、Ｆ３＝ＦＤＡ）の合成
オリゴヌクレオチドは、３′−末端を介してＮ６−ベンゾイル−２′−デオキシアデノシンで誘導体化されたＣＰＧ担体に出発し実施例１に記載したように合成した。最初の２つのカップリング後、ホスホロチオエートラジカル（配列中に*によりマーク）を導入するための酸化はビューケージ試薬を用い、他のすべての酸化はヨウ素水を用いて実施した。ついで、５′−アミノモディファイヤーＣ６とのカップリングを実施例２に記載のように実施した。濃アンモニアおよび８０％酢酸での脱保護ならびにプレパラティブポリアクリルアミドゲル上の精製により、２.９５ＯＤ（２６０）の５′−アミノ−リンカ−(ｄＡ)17ｄＡ*ｄＡ*ｄＡ、４.９ＯＤ（２６０）の５′−アミノ−リンカ−(ｄＡ)47ｄＡ*ｄＡ*ｄＡ、および５ＯＤ（２６０）の５′−アミノ−リンカ−(ｄＡ)77ｄＡ*ｄＡ*ｄＡが得られた。各場合、５′−アミノ−リンカーオリゴヌクレオチドは０.２Ｍ ＴＢＫ緩衝液８μlおよびＤＭＦ ６２μlに溶解し、混合物を１.６μlのＦＤＡイソチオシアナートと反応させた。３時間反応させたのち、さらにＦＤＡイソチオシアナートを加え反応を２時間継続した。２μlの半濃縮酢酸を加え、ついで、混合物を減圧下に濃縮した。ＮＡＰカラム（登録商標、Pharmacia）上で脱塩し、ついでブタノールにより沈殿させた。これにより、１.５ＯＤ（２６０）の５′−Ｆ３−(ｄＡ)17ｄＡ*ｄＡ*ｄＡ、２.２ＯＤ（２６０）の５′−Ｆ３−(ｄＡ)47ｄＡ*ｄＡ*ｄＡ、よび０.９ＯＤ（２６０）の５′−Ｆ３−(ｄＡ)77ｄＡ*ｄＡ*ｄＡが得られた。
【００９８】
実施例１４：
二重標識オリゴヌクレオチド５′−Ｃｙ３−Ａ*Ｔ*ＧＡＣ*ＧＧＡＡ*Ｔ*Ｔ*Ｃ−Ｃ６−Ｆ３の合成；Ｆ３＝ＦＤＡ
オリゴヌクレオチドは、３′−末端におけるＣ６−アミノ−リンカーの導入を可能にするＣＰＧ担体に出発し実施例１に記載したように合成した（Petrieら、1992, Bioconjugate Chem. 3: 85-87）。ホスホロチオエートラジカル（配列中に*によりマーク）を導入するための酸化はヨウ素水またはビューケージ試薬を用いて実施した。最後のジメトキシトリチル保護基を切断したのち、オリゴヌクレオチドの５′−末端をＣｙ３−ＣＥホスホロアミダイト（Glen Research, Sterlin, VAより; カタログ番号10-5913-xx）と反応させ、ヨウ素水で酸化した。濃アンモニア（７０℃で２時間）で脱保護すると３.８ＯＤ（２６０）の粗生成物が得られた。プレパラティブポリアクリルアミドゲル上で精製すると、３.８ＯＤの５′−Ｃｙ３−Ａ*Ｔ*ＧＡＣ*ＧＧＡＡ*Ｔ*Ｔ*Ｃ−Ｃ６−アミノ−リンカ−３′の３.８ＯＤが得られ、その３.５ＯＤ（２６０）を０.２Ｍ ＴＢＫ緩衝液８μlおよびＤＭＦ ６２μlに溶解し、１.６μmolのＦＤＡイソチオシアナートと反応させる。アミノ-リンカーオリゴヌクレオチドをヒドロキシスクシンイミドと３.５時間反応させたのち、１μlの半濃縮酢酸を加えて、混合物を減圧下に濃縮した。ＮＡＰカラム（登録商標、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で脱塩したのち、ブタノールにより沈殿させた。これにより、３.５ＯＤ（２６０）の所望の二重標識されたオリゴヌクレオチド、５′−Ｃｙ３−Ａ*Ｔ*ＧＡＣ*ＧＧＡＡ*Ｔ*Ｔ*Ｃ−Ｃ６−Ｆ３が得られた。ＥＳＩ−ＭＳ：４９２６.２（計算されたＭＷ：４９２７.１）。
【００９９】
実施例１５：
５′−Ｆ３−Ａ*Ｔ*ＧＡＣ*ＧＧＡＡ*Ｔ*Ｔ*Ｃの合成；Ｆ３＝ＦＤＡ
５′−アミノ-リンカ−Ａ*Ｔ*ＧＡＣ*ＧＧＡＡ*Ｔ*Ｔ*Ｃ−３′オリゴまーを、実施例９に記載のように製造した。５′−アミノ−リンカーオリゴヌクレオチド１０ＯＤ（２６０）を０.２Ｍ ＴＢＫ緩衝液１６μlおよびＤＭＦ ９５μlに溶解し、混合物を２５μlのＦＤＡイソチオシアナート（１００μlのＤＭＦ中５mg）と反応させた。アミノ−リンカーオリゴヌクレオチドをチオシアナートと３時間反応させたのち、さらに５μlのチオシアナートを追加し、反応をさらに２時間継続させた。ついで２μlの半濃縮酢酸を加え、混合物を減圧下に濃縮した。ＮＡＰカラム（登録商標、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で脱塩し、ついでブタノールにより沈殿させた。これにより、８.５ＯＤ（２６０）の所望のオリゴヌクレオチドフルオレセインジアセテート接合体が得られた。ＥＳＩ−ＭＳ：４４１８.４（計算されたＭＷ：４４１８.５）。
【０１００】
実施例１６：
様々な長さの５′−Ｆ３−（ｄＡ）nｄＡ*ｄＡ*ｄＡ（ｎ＝17、47および77、Ｆ３＝ＦＤＡ）のオリゴヌクレオチド接合体の細胞取り込みの比較
実施例１２からの様々な長さおよび分子量の接合体の細胞取り込みをＲＥＨ細胞を用い実施例７に記載の原理によって実施した。定量はフローサイトメトリーを用いて行った。６０分後、５′−Ｆ３−（ｄＡ）１７ｄＡ*ｄＡ*ｄＡ（Ａ＝２０）は49、５′−Ｆ３−（ｄＡ）４７ｄＡ*ｄＡ*ｄＡ（Ａ＝５０）は３４、５′−Ｆ３−（ｄＡ）７７ｄＡ*ｄＡ*ｄＡ（Ａ＝８０）は９１である。驚くべきことに、最も大きなオリゴヌクレオチド残基、計８０ヌクレオチドからなるＦＤＡ接合体のＲＥＨによる取り込みが最も効果的であった。
【０１０１】
実施例１７：
様々な誘導体化を有するオリゴヌクレオチド接合体の細胞取り込みの比較
フルオレセインジピバレートはエステル基の安定性が増大した、フルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）の関連化合物である。相当するオリゴヌクレオチド接合体について、フローサイトメトリーを用い、その取り込み調べた。ピバレートのアルカリおよびエステラーゼに対する安定性の増大は相当するオリゴヌクレオチド接合体の取り込みの低下を生じる。すなわち、６０分後フルオレセインジアセテートについて測定された相対蛍光は１９５であるが、相当するフルオレセインジピバレート接合体については、わずか５５である。
【０１０２】
実施例１８：
実施例１３からの二重標識オリゴヌクレオチド接合体５′−Ｃｙ３−Ａ*Ｔ*ＧＡＣ*ＧＧＡＡ*Ｔ*Ｔ*Ｃ−Ｃ６−ＦＤＡの細胞取り込みの検査
ＦＡＣＳｃａｎでは、Ｃｙ３オリゴヌクレオチドＦ３接合体はＲＥＨ細胞によって迅速に取り込まれることを示した。この細胞をオリゴヌクレオチド／セルフェクチン複合体で処理すると、類似の、しかしかなり均一性の低下した取り込みを生じる。ＦＤＡ接合体の作用はセルフェクチンオリゴヌクレオチド複合体の作用でかなり妨害される。
【０１０３】
細胞とインキュベートするオリゴヌクレオチド上の２つの異なるマーカー基の共発色も、測定された蛍光が切断されたＦＤＡまたはフルオレセインのみに基づく可能性を排除するために検査した。Ｃｙ３オリゴヌクレオチドＦ３接合体は５′−末端に共有結合したシアニンを有し、３′−末端に共有結合したＦＤＡを有した。図９はＲＥＨ細胞をＣｙ３オリゴヌクレオチドＦ３接合体と４時間インキュベートすると緑色および赤色の蛍光を示す。細胞中に２つのマーカーの共発色が観察できることから、オリゴヌクレオチドは無傷の形態で取り込まれると推定できる。非蛍光ＦＤＡラジカルが明らかに蛍光性フルオレセインラジカルに変換されたので、ＦＤＡ残基のアセチル基のみが多分エステラーゼによって加水分解されたと思われる。２つのマーカーは添加後わずか７分で検出できたことから、Ｃｙ３／ＦＤＡ接合体の取り込みはきわめて迅速であった。
【０１０４】
実施例４からのオリゴヌクレオチドＦＤＡ接合体ＣＯ_１の４種の濃度をＡ４５９腫瘍細胞の抗増殖活性について調べた。接合体は侵入エンハンサーを加えないでも増殖を阻害した。Ｆ３接合体なしでの相当するオリゴヌクレオチド（ＯＮ１）は、侵入エンハンサー（Cellfectin, Gibco-BRLより）と複合体の形成後にのみ増殖を阻害する。結果は表４に示す。
【０１０５】
【表１】
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【０１０６】
【表２】
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【０１０７】
【表３】
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【０１０８】
【表４】
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【０１０９】
【表５】
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【０１１０】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  式（Ｉ）のアリールラジカルの例を示す。
【図２ａ】  式（II）のアリールラジカルの例を示す。
【図２ｂ】  式（II）のアリールラジカルの例を示す。
【図３】  輸送される分子（この場合、オリゴヌクレオチド）と式（I）のアリールラジカルの接合体の様々な例（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｄ、Ｆ、Ｇ）を示す。
【図４】  本発明による接合体（この場合、ＦＤＡ−イソチオシアナートとオリゴヌクレオチド）の製造の可能性を示す。
【図５】  メジウムからの時間の経過に伴うＲＥＨ細胞への接合体ＣＯ_５の取り込みを示す。メジウムに血清を含まない（黒塗り菱形）、メジウムに血清を含む（黒塗り四角）、細胞への取り込みはＦＡＣＳを用いて測定した。
【図６】  ＣＯ_１（ＦＤＡ−接合体；黒塗り菱形）およびＣＯ_２（ＦＩＴＣオリゴマー；黒塗り三角）の細胞への取り込みをＦＡＣＳ法で測定したグラフである。細胞外オリゴヌクレオチド接合体に初期濃度は１μＭであり、○および□は対照。
【図７】  長さの関数としての、ＲＥＨ細胞へのＦＤＡ−接合ポリＡ−ヌクレオチドのトランスフェクション。
【図８】  フルオレセインジアセテートおよびフルオレセインジピバレート接合体の細胞への取り込みの比較。
Ｋ３９：実施例１５からのカルボキシフルオレセインジアセテート（Ｆ３＝ＦＤＳ）、そしてＫ４１：実施例１０からのカルボキシフルオレセインジピバレート（Ｆ２）。
【図９】  二重標識Ｃy３オリゴヌクレオチドＦ３接合体（１μM）をＲＥＨ細胞とインキュベーションした場合の細胞への取り込みの蛍光顕微鏡による検査を示す。４時間後の取り込み。
左：蛍光標識、中：シアニン染料、右：位相差像
上：オリゴヌクレオチドＫ３３、下：オリゴヌクレオチドＫ３４
【配列表】
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【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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