(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物および脂質マトリックスを含む脂質マイクロ粒子であって、該薬物がＬＨＲＨアンタゴニストとして作用するデカペプチド及びＩＦＮ−βから成る群より選択され、該脂質マトリックスが該脂質マトリックスの重量に対して少なくとも７０％ｗ/ｗのモノグリセリド含量を有し、該マイクロ粒子が、該脂質及び該薬物を含有する混合物の−１９６〜０℃の温度における低温微粉砕によって製造されることを特徴とする脂質マイクロ粒子。
【請求項２】
該モノグリセリド含量が脂質マトリックスの重量に対して７５〜９９％ｗ／ｗであることを特徴とする、請求項１に記載の脂質マイクロ粒子。
【請求項３】
該デカペプチドが、Ｎ−Ａｃ−Ｄ−２−Ｎａｌ，Ｄ−ｐＣｌＰｈｅ，Ｄ−３−Ｐａｌ，Ｓｅｒ，ＮｉｃＬｙｓ，Ｄ−ＮｉｃＬｙｓ，Ｌｅｕ，Ｉｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ｄ−Ａｌａ，ＮＨ２であることを特徴とする、請求項１または２に記載の脂質マイクロ粒子。
【請求項４】
該デカペプチドがセトロレリックスであることを特徴とする、請求項１または２に記載の脂質マイクロ粒子。
【請求項５】
該マイクロ粒子が他の医薬的に許容できる賦形剤をも含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の脂質マイクロ粒子。
【請求項６】
該賦形剤が、アクリルポリマー、中鎖脂肪酸およびポリエチレングリコールよりなる群から選択される、生体接着性または吸収増強性を有するポリマーであることを特徴とする、請求項５に記載の脂質マイクロ粒子。
【請求項７】
該マイクロ粒子が３〜５００μｍの平均直径を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の脂質マイクロ粒子。
【請求項８】
医薬として使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の脂質マイクロ粒子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の脂質マイクロ粒子、および医薬的に許容できる担体、希釈剤または賦形剤を含有する、医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の脂質マイクロ粒子の製造方法であって、脂質及び薬物を含有する混合物を−１９６〜０℃の温度で粉砕することによって低温微粉砕を実施する工程を含む方法。
【請求項１１】
低温微粉砕の温度が−８０〜−２０℃である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
低温微粉砕の温度が−５０〜−３０℃である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
低温微粉砕後にふるい分け工程を含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
低温微粉砕の前に、摩砕によるサイズ予備縮小工程を含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
脂質及び薬物を含有する混合物の冷却を液体窒素注入により実施することを特徴とする、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
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【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ペプチドおよび／またはタンパク質の取込みを促進する、両親媒性成分に富む脂質から成る脂質マイクロ粒子、それらを得るための方法、ならびにそれらの使用に関する。低温微粉砕（cryogenic micronization）による製造方法も開示する。
【０００２】
発明の背景
マイクロスフェアは、幾つかの療法分野で高く評価されている薬物送達システムの一例である。それらは本質的に直径１〜５００μｍの固体粒子であり、血管内に物理的にトラップすることによりそれらの積載薬物をターゲティングさせ（化学的塞栓形成）、かつ制御放出により治療薬の作用を持続させることができる。マイクロスフェアは、タンパク質、多糖、ポリエステルおよび脂質を含めた広範な材料から多様な方法（乳化、熱安定化、コアセルベーションおよび転相などの技術）で製造できる。マイクロスフェアはモノリシック構造をもち、全体が固体であって、リポソームのようなより流体状で軟質の小胞系とは区別できる。マイクロスフェアは普通は直径１〜５００μｍであり、顆粒（＞１００μｍ）と微粒子（＜１μｍ）の間にある。それらは、その内部構造が小胞状ではなく均質なマトリックスであるため、マイクロカプセルと区別される。マイクロスフェアは多数の異なる生体適合性、生物分解性の材料から製造できる；たとえばタンパク質（アルブミンおよびゼラチン）（Biopharm. Drug Dispos. (1985) 6, pp.91-104およびIntern. J. Pharm. (1987) 35, pp.177-179）、ポリエステル（グリコシドおよびラクチド）（J. Microencap. (1986) 3, pp.181-193およびDrug Dev. Ind. Pharm. (1990) 16, pp.2353-2367）、多糖（デンプン、エチルセルロース、アルギナートおよびキトサン）（Drug Dev. Ind. Pharm. (1996) 22, pp.457-463およびJ. Contrl. Rel. (1997) 43, pp.65-74）、イオン交換樹脂（J. Contrl. Rel. (1989) 8, pp.251-257）および脂質（Adv. Drug Deliv. Rev. (1996) 20, pp.209-219）。
【０００３】
ミクロスフェアを形成し、同時に薬物を封入するために、これまでに下記を含めた多数の方法が開発された：
−化学的安定化（Biopharm. Drug Dispos. (1985) 6, pp.91-104）；
−熱安定化（Experientia (1983) 39, pp.913-916）；
−多重エマルジョン溶媒蒸発（J. Contr. Rel. (1994) 28, pp.121-129）；
−多重エマルジョン溶媒抽出（J. Contr. Rel. (1997) 43, pp.261-272）；
−コアセルベーション（Cancer Res. (1993) 53, pp.5841-5844）；
−転相ナノカプセル封入（ＰＩＮ）（Nature (1997) 386, pp.410-414）；
−噴霧乾燥（Pharm. Sci. (1997) 86, pp.603-607）。
【０００４】
場合により、粒子形成後に薬物をマイクロスフェアに添加し、またはそれに複合体形成させる。マトリックス材料および製造方法の選択が全般的性能の決定に重要である。
この選択は幾つかの要因に依存する：
−必要なマイクロスフェアのサイズ；
−薬物固有の特性、たとえば水溶性および安定性；
−粒子の表面特性、たとえば透過性および電荷；
−生物分解度および生体適合度；
−目的とする薬物放出プロフィル。
薬物がマイクロスフェアから放出される速度は、３つの主な要因に依存する：
−封入される薬物の溶解度および拡散プロセス；
−粒子の浸食および生物分解の速度；
−薬物と粒子マトリックスの、固定化を生じる相互作用。
ポリマーマイクロ粒子は、通常は単一／二重エマルジョン溶媒蒸発、コアセルベーションおよび噴霧乾燥などの方法で製造される。
【０００５】
しかしこれらの方法は幾つかの欠点を示す：溶媒蒸発法では普通は大量の塩素化有機溶媒が用いられ、制御された操作条件を達成できるのは稀である；さらに、ペプチドおよびタンパク質の場合、用いる溶媒が構造を変性させて効力を失わせる可能性がある。Ｏ／Ｗ単一および二重エマルジョン法では、有機／水界面層における両親媒性分子（すなわちタンパク質）の蓄積が薬物の凝集および沈殿を引き起こすことも報告されている（Pharmaceuticals Dosage Forms: Disperse systems, 第2版, Marcel Dekker社 (1998) pp.163-193）。
【０００６】
噴霧乾燥法は、媒質に溶解または懸濁したポリマーおよび薬物をチャンバーのノズルから噴霧し、その際、相対的に高い温度の作用により溶媒を蒸発させ、プロセスの最後にマイクロ粒子を粉末状で採集する方法である。このような蒸発法により得られるマトリックスは普通はかなり多孔質であるため、マトリックス中の薬物封入量は少なくなり、即時放出および大きな初期バースト効果を生じる。さらに、製造中に形成される空気／液体界面が表面における分子凝集（特にタンパク質について）を促進する（Mumenthaler M. et al., Pharm. Res., 11 (1994) No.1）。
【０００７】
したがって低温微粉砕は、脂質材料のマイクロ粒子を得るための製造方法において、ペプチド／タンパク質の安定性および初期バースト効果の低下という両方の点で顕著な利点をもたらす別法とみることができる。さらに、特定の物理的状態の脂質、すなわち多様な結晶状態（たとえば多形状態）の脂質を得ることにより、薬物放出プロフィルを調節できる。調査した先行技術においては、数例の脂質マイクロ粒子が薬物放出の分野で産業用として既に記載されている。W. Steberら（American Cyanamid Corporation, EP 257368）は３０〜９５％の脂肪またはろうおよび約２〜７０％の生物活性物質を含有するマイクロスフェア組成物を記載しており、この場合、脂質成分は含量５５〜７９％のグリセリルトリステアレートを含有する。M. W. Fountainら（The Liposome Company, US 4,610,868）は、疎水性化合物、両親媒性化合物を含む脂質マトリックス担体と生物活性物質を５００ｎｍ〜１００μｍの直径をもつ球状構造の形で組み合わせたものを記載している。この担体は、成分を乳化し、このエマルジョンを有機溶媒中へ注入することにより得られる。H. Augart（Warner Lambert Company, US 4,483,847）は、高融点と低融点の両方の脂質を含む薬物送達用組成物を記載している；これは融解、混合および冷却後に、錠剤製造のために造粒される。P. Orsoliniら（Debiopharm, US 5,192,741）は、ポリラクチド、すなわち乳酸とグリコール酸のコポリマーおよびペプチドを含有する医薬組成物を調製するための、低温摩砕工程を含む方法を記載している。このポリマーおよび生物活性物質を有機溶媒に溶解／分散し、固体残留物を造形しつつ溶媒を除去することにより、マイクロ粒子が得られる。
【０００８】
したがって本発明の目的は、持続放出性、特に低い「バースト効果」をもつ脂質マイクロ粒子を提供することである。
発明の説明：
特に本発明の主な目的は、薬物および脂質マトリックスを含む新規タイプの脂質マイクロ粒子であって、薬物がペプチドまたはタンパク質であり、脂質マトリックスが脂質マトリックスの重量に対して少なくとも７０％ｗ／ｗのモノグリセリド含量を有することを特徴とする脂質マイクロ粒子を提供することである。
【０００９】
脂質マトリックスへのペプチドおよび／またはタンパク質の取込みを高めるために、異なる親水性／疎水性および化学組成をもつ数種類の脂質、たとえばトリ−、ジ−およびモノ−グリセリド、ＰＥＧ−またはＰＰＧ−グリセリド、糖−グリセリド、脂肪酸、ならびにそれらの混合物をスクリーニングした。
【００１０】
驚くべきことに、モノグリセリドを高い含量で含有し、脂質マイクロ粒子に両親媒性を与える脂質マトリックスを用いることにより、ペプチドおよび／またはタンパク質の最大充填量を達成できることが認められた。脂質マトリックスのモノグリセリド含量を少なくとも７０％ｗ／ｗ、好ましくは７５〜９９％ｗ／ｗとすべきであることが見出された。したがって本発明によれば、前記の脂質またはそれらのうち１種類以上の混合物を使用できる。ただしモノグリセリドの全含量は前記のように少なくとも７０％ｗ／ｗである。
【００１１】
本発明の脂質マイクロ粒子は、医薬的に許容できる賦形剤、たとえばアクリルポリマー（カルボポール（登録商標）、ポリカルボフィル、ノベオン（登録商標））、中鎖脂肪酸およびポリエチレングリコールを含むか、またはこれらよりなる群から選択される生体接着性または吸収増強性をもつポリマーを含有してもよい。好ましい賦形剤は上記のアクリルポリマーである。
【００１２】
本発明の好ましい態様によれば、マイクロ粒子の全脂質含量は少なくとも９０％ｗ／ｗ、より好ましくは少なくとも９５％ｗ／ｗである。
一般に治療上有効であるいかなるペプチドまたはタンパク質も本発明の脂質マイクロ粒子に取り込ませることができる。治療に有用な大部分のタンパク質は３クラスに分類できる：
−調節因子：ホルモン、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、それらの受容体、ならびに細胞の増殖および代謝を調節する他の因子（酵素を含む）が含まれる；
−血液産物：血清由来の血液因子および酵素性フィブリノーゲン活性化因子が含まれる；
−モノクローナル抗体。
【００１３】
本発明の１態様によれば、前記の好適なタンパク質またはペプチドには下記の例が含まれるが、これらに限定されない：ＡＡＴ、ＵＫ、ＰＵＫ、ストレプトキナーゼ、ｔＰＡ、ＳＯＤ、インスリン、ＧＨ、ＧＲＦ、ＡＮＦ、ＧｎＲＨ、ＬＨＲＨ類似体、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３／多能ＣＳＦ、インターロイキン−４、インターロイキン−５（または好酸球−ＣＳＦ）、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、白血病阻害因子、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、幹細胞因子、およびそれらの受容体。
【００１４】
本発明の好ましい態様によれば、タンパク質またはペプチドはインターロイキン−６、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、ＧｎＲＨ、ＬＨＲＨ類似体、ＧＨ、ＧＲＦ、ゴナドトロピン（ＦＳＨ、ＬＨおよびｈＣＧなど）、およびＴＮＦ受容体またはその可溶性フラグメントよりなる群から選択される。
【００１５】
より好ましくは、ペプチドはＬＨＲＨ類似体、より好ましくはＬＨＲＨアンタゴニストとして作用するデカペプチドよりなる群から選択される。
本発明の特に好ましい態様において、限定ではないがペプチドのリストには下記の化合物が含まれる：
−アバレリックス（Abarelix）（ＷＯ９６／４０７５７号に開示）：ＬＨＲＨアンタゴニストとして作用し、次式により定められる：
Ｄ−アラニンアミド，Ｎ−アセチル−３−（２−ナフタレニル）−Ｄ−Ａｌａ−４−Ｃｌ−Ｄ−Ｐｈｅ−３−（３−ピリジニル）−Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｎ−メチル−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｓｎ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｎ６−（１−メチルエチル）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｐｒｏ。
【００１６】
−アンタレリックス（Antarelix）（ＷＯ９２／１９６５１号に開示）：ＬＨＲＨアンタゴニストとして作用し、次式により定められる：
Ｄ−アラニンアミド，Ｎ−アセチル−３−（２−ナフタレニル）−Ｄ−Ａｌａ−４−Ｃｌ−Ｄ−Ｐｈｅ−３−（３−ピリジニル）−Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｎ６−（アミノカルボニル）−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｎ６−（１−メチルエチル）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｐｒｏ。
【００１７】
−アザリンＢ（Azaline B）（ＵＳ５２９６４６８号に開示）：ＧｎＲＨアンタゴニストとして作用し、次式により定められる：
Ｄ−アラニンアミド，Ｎ−アセチル−３−（２−ナフタレニル）−Ｄ−Ａｌａ−４−Ｃｌ−Ｄ−Ｐｈｅ−３−（３−ピリジニル）−Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ−４−［（５−アミノ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）アミノ］−Ｌ−Ｐｈｅ−４−［（５−アミノ−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３−イル）アミノ］−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｎ６−（１−メチルエチル）−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｐｒｏ。
【００１８】
−ガニレリックス（Ganirelix）（ＥＰ２７７８２９号に開示）：ＬＨＲＨアンタゴニストとして作用し、次式により定められる：
Ｄ−アラニンアミド，Ｎ−アセチル−３−（２−ナフタレニル）−Ｄ−Ａｌａ−４−Ｃｌ−Ｄ−Ｐｈｅ−３−（３−ピリジニル）−Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｎ６−［ビス（エチルアミノ）メチレン］−Ｄ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｎ６−［ビス（エチルアミノ）メチレン］−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｐｒｏ。
【００１９】
本発明のより好ましい態様において、ＬＨＲＨアンタゴニストとして作用するペプチドはアンタイド（Antide）と呼ばれる特定のデカペプチドである。このデカペプチド（Ｎ−Ａｃ−Ｄ−２−Ｎａｌ，Ｄ−ｐＣｌＰｈｅ，Ｄ−３−Ｐａｌ，ＮｉｃＬｙｓ，Ｄ−ＮｉｃＬｙｓ，Ｉｌｙｓ，Ｄ−Ａｌａ，ＮＨ２）は、顕著な排卵抑制活性およびＬＨＲＨアンタゴニスト特性をもち、女性においてホルモン代謝に直接作用することが既に記載されている（ＥＰ３７７６６５号およびＵＳ５４７０９４７号）。
【００２０】
ＬＨＲＨアンタゴニストとして作用する他の特に好ましいペプチドは、セトロタイド（Cetrotide）（そのＩＮＮはＥＰ２９９４０２号に開示されるセトロレリックス（Cetrorelix））と呼ばれる他のデカペプチドであり、次式をもつ：Ｄ−アラニンアミド，Ｎ−アセチル−３−（２−ナフタレニル）−Ｄ−Ａｌａ−４−Ｃｌ−Ｄ−Ｐｈｅ−３−（３−ピリジニル）−Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｓｅｒ−Ｌ−Ｔｙｒ−Ｎ５−（アミノカルボニル）−Ｄ−オルニチル−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｒｇ−Ｌ−Ｐｒｏ。
【００２１】
したがって、ペプチドまたはタンパク質を充填した脂質マイクロ粒子が実際に医薬として医薬組成物の調製に使用するのに好適なことを本明細書に報告する。ペプチドがＬＨＲＨアンタゴニストとして作用するデカペプチドである好ましい態様において、本発明の医薬組成物は哺乳動物におけるホルモン代謝の調節または女性における異常なホルモン代謝活性に関連する障害の治療もしくは予防に有用である。より具体的には、ＬＨＲＨ経路の異常な活性に関連する障害の治療もしくは予防に有用である。この特定の態様においてペプチド充填した脂質マイクロ粒子は、ＬＨＲＨの拮抗が主要な役割をもつホルモン性疾患、病的状態の処置、または避妊活動に有用である：たとえば哺乳動物において排卵を阻害するための避妊薬、または哺乳動物においてホルモン依存性腫瘍の増殖もしくはテストステロン産生を阻害する薬剤。ペプチド充填した脂質マイクロ粒子は単独でまたは他の医薬と組み合わせて使用できる。
【００２２】
本発明のペプチドまたはタンパク質を充填した脂質マイクロ粒子を医薬として使用する場合、一般にそれらを医薬剤形で投与する。したがって、ペプチドまたはタンパク質を充填した脂質マイクロ粒子および医薬的に許容できる賦形剤、たとえば希釈剤、酸化防止剤、界面活性剤、補助界面活性剤、増粘剤、抗微生物薬、凍結保護剤を含む医薬組成物も、本発明の範囲に含まれる。そのような組成物は医薬技術分野で周知の方法により調製できる。一般に、本発明のペプチドまたはタンパク質を充填した脂質マイクロ粒子を治療上有効量で投与する。実際の投与量は一般に、処置すべき状態、選択した投与経路、各患者の年齢、体重および応答、患者の症状の重症度などを含めた関連状況を考慮して医師が決定する。
【００２３】
本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、皮膚、舌下、直腸、口腔、膣、鼻腔または肺などの経路を含めた多様な経路で投与できる。皮下経路は本発明による好ましい投与経路である。
【００２４】
意図する送達経路に応じて、化合物を液体または固体剤形として配合できる。経口投与用組成物は、バルク液剤もしくは懸濁液剤、またはバルク散剤の形をとることができる。
経口投与に適した液体剤形は、好適な水性または非水性ビヒクル、ならびに緩衝剤、沈殿防止剤および分散剤、着色剤、着香剤などを含有できる。
【００２５】
固体剤形は、たとえば下記の成分または同様な性質をもつ化合物をいずれも含有できる：結合剤、たとえば微結晶性セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチン；賦形剤、たとえばデンプンもしくは乳糖；崩壊剤、たとえばアルギン酸、プリモジェルもしくはコーンスターチ；滑沢剤、たとえばステアリン酸マグネシウム；滑剤（glidant）、たとえばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、たとえばショ糖もしくはサッカリン；または着香剤、たとえばペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジフレーバー。
【００２６】
注射用組成物は一般に、注射用無菌塩類溶液もしくはリン酸塩緩衝化塩類溶液、または当技術分野で公知の他の注射用担体を基礎とする。
本発明の他の目的は、前記のペプチドまたはタンパク質を充填した脂質マイクロ粒子を製造する方法である。本発明のペプチドまたはタンパク質を充填した脂質マイクロ粒子は、好ましい製造方法によれば、生物活性物質、好ましくはペプチドを含む脂質マイクロ粒子を製造するための新規な低温微粉砕法により製造でき、医薬組成物として使用できる。
【００２７】
この新規方法は、ペプチド、特にデカペプチドを含み、その持続放出を特徴とする好適な送達システムを得るための新規方法であるとみることができる（Eur. J. Pharm. Biopharm. 41 (1995) (1) pp.62-69およびEur. J. Pharm. Biopharm. 45 (1998) pp.149-155）。
【００２８】
本発明の１態様によれば、脂質マイクロ粒子の製造方法は下記の工程を含む：
−溶媒に溶解して薬物を脂質に充填し；
−溶媒を除去し；
−薬物充填した脂質マトリックスを冷却し；
−こうして得た材料のサイズを摩砕（grinding）により予備縮小し；
−冷却後に低温微粉砕を実施し、粉砕およびふるい分けする。
【００２９】
本発明の他の態様によれば、脂質マイクロ粒子の製造方法は下記の工程を含む：
−ペプチドを融解脂質に充填し；
−薬物充填した脂質マトリックスを冷却し；
−こうして得た材料のサイズを摩砕により予備縮小し；
−冷却後に低温微粉砕を実施し、粉砕およびふるい分けする。
最終工程の前に述べた摩砕プロセスに関して、この摩砕は医薬固体剤形の製造に際して粉末の粒度を低下させるための基本的方法である（Lachman L. and Lieberman H., Lea & Febiger (1986) pp.21-46）。しかし最近の装置改良により（高速ミル、ミクロナイザー、インライン分級機）、現在では制御された寸法および粒度分布をもつミクロンおよびミクロン以下の範囲の粒子を粉砕により得ることができる。
【００３０】
きわめて意外なことに、摩砕が脂質マイクロ粒子の製造方法として報告されるのは稀である。マイクロ粒子製造にポリマーを用いる場合、摩砕中に生じる衝撃／摩擦力は粒度低下のための手段としては有効でない。これは、用いられる最も一般的なポリマーの構造のためである；ポリマーはゴム様の特性（ガラス転移事象）を示し、このため摩砕法による粒度低下の効率が低下する（Geze et al., Int. J. Pharm. (1999) pp.257-268およびDomb et al., Handbook of Biodegradable Polymers, Harwood Academic Publishers (1997 ) pp.3-29）。
【００３１】
これに対し、脂質を扱う場合、それらの物理的構造の相異（特定の結晶化度により表わされる）のため、衝撃／摩擦力、したがって摩砕法を効果的に利用できる。
したがって微粉砕は、脂質材料のマイクロ粒子を得るための製造方法において、特にペプチド／タンパク質を取り込ませなければならない場合、顕著な利点をもたらす別法とみることができる。
【００３２】
さらに微粉砕法の他の利点は、低温条件下で操作できることである（「低温微粉砕」）。これは、温度感受性薬物（すなわちペプチド、タンパク質）、ガラス転移温度または融点の低い材料、たとえば脂質ブレンド、またはポリマー構造に近似する物理化学的特性をもつ複合材料を扱う場合に有用である。
【００３３】
本発明のより好ましい製造方法によれば、本発明のペプチド充填した脂質マイクロ粒子は溶媒ストリッピング法により製造される：
−有機溶媒に共溶解して脂質にペプチドを充填し；
−溶媒を除去し；
−薬物充填した脂質マトリックスを冷却し；
−こうして得たマトリックスのサイズを摩砕により予備縮小し；
−低温微粉砕を実施し；
−こうして得たマイクロ粒子を粉砕およびふるい分けする。
【００３４】
本発明の他の好ましい態様によれば、用いる溶媒は水、エタノール、プロパノール、ベンジルアルコール、イソプロパノールまたはそれらの混合物よりなる群から選択され、好ましくはエタノールとベンジルアルコールの混合物、より好ましくはベンジルアルコールである。
【００３５】
本発明の好ましい態様においては、溶媒の蒸発を３０〜９０℃、好ましくは４０〜８０℃、より好ましくは５５〜７５℃の温度で実施する。
本発明の好ましい製造方法によれば、ペプチド充填した脂質マイクロ粒子は下記の工程を含む共融法により製造される：
−ペプチドを融解脂質に充填し；
−薬物充填した脂質マトリックスを冷却し；
−こうして得たマトリックスのサイズを摩砕により予備縮小し；
−低温微粉砕を実施し；
−こうして得たマイクロ粒子を粉砕およびふるい分けする。
【００３６】
脂質マトリックスのサイズを予備縮小する工程は、ハンマー粉砕またはナイフ粉砕または振動粉砕により実施される。
低温微粉砕工程においては、薬物充填した脂質マトリックスを微粉砕する前に、液体窒素注入により−１９６〜０℃、好ましくは−８０〜−２０℃、より好ましくは−５０〜−３０℃の温度に冷却する。こうして得たマイクロ粒子のサイズは１〜５００μｍ、好ましくは１〜３００μｍ、より好ましくは１〜１００μｍ、特に５〜５０μｍである。
【００３７】
ふるい分け工程に関して、この操作は粒度要件および用いるミルの種類に依存する。微粉砕により得られる生成物の粒度はある用途については既に好適であり、したがってふるい分けは必要ない。
【００３８】
マイクロスフェアからの薬物放出に関する共通の問題は、全有効充填量の大部分（３０〜７０％）が短期間で（１時間以内）粒子から放出される可能性のある「バースト効果」として知られている。これは、マイクロスフェアの表面付近にある薬物が急速に放出されること、またはマトリックスが高多孔質であること、またはポリマー材料が急速に浸食されることが原因であると考えられる。
【００３９】
きわめて意外なことに、本発明方法により得られるアンタイド充填した脂質マイクロ粒子はin vivoで少なくとも１カ月間の持続放出を示し、初期バースト効果を制御および調節できる（２４時間以内に放出される薬物は１０％に低下）ことが認められた；これは製造操作条件（すなわち取り込ませる方法）および材料の物理化学的特性（すなわちグリセリド組成）の両方によるものである（図５に示す）。驚くべきことに、これら両要因が脂質マトリックス自体および薬物充填したマトリックスの構造配列様式に影響を及ぼし、その結果、薬物放出を制御してバーストを目的の数値に調節することができる。さらに、脂質相のモノグリセリド含量が高いと初期「バースト効果」は低下することが認められた（図１０参照）。
【００４０】
この節には種々の生物学的用語および分析用語の略号および定義、ならびに本明細書全体で用いる略語を示す。別途明記しない限り、これらは本明細書および特許請求の範囲全体にわたって適用されるものとする。
【００４１】
「両親媒性」は、２つの異なる環境に対して親和性をもつ化合物、たとえば親水性（極性）領域と親油性（非極性）領域をもつ分子を表わす。界面活性剤が古典的な例である。
「ＡＡＴ」は、α−１−アンチトリプシンを表わす。
【００４２】
「ＡＮＦ」は、心房性ナトリウム利尿因子を表わす。
「アンタイド」（提示されたＩＮＮはIturelix）は、下記のデカペプチドを表わす；
Ｎ−Ａｃ−Ｄ−２−Ｎａｌ，Ｄ−ｐＣｌＰｈｅ，Ｄ−３−Ｐａｌ，Ｓｅｒ，ＮｉｃＬｙｓ，Ｄ−ＮｉｃＬｙｓ，Ｌｅｕ，Ｉｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ｄ−Ａｌａ，ＮＨ２。
【００４３】
「バースト効果」は、マイクロスフェアからの薬物放出に関する共通の問題であって、全有効充填量の大部分（５０〜７０％）が短時間で（１時間）粒子から放出される可能性がある。これは、マイクロスフェアに適正に埋め込まれていない材料が急速に放出されることが原因である。
【００４４】
「共融法」は、薬物を特定の融解した脂質相材料に充填する方法を表わす。
「２−Ｎａｌ」は、３−（２−ナフチル）アラニンを表わす。
「Ｉｌｙｓ」は、Ｎ−イソプロピルリジンを表わす。
【００４５】
「ＮｉｃＬｙｓ」は、Ｎ−ニコチノイルリジンを表わす。
「３−Ｐａｌ」は、３−（３−ピリジル）アラニンを表わす。
「ＤＭＰＣ」は、ジミリストイルホスファチジルコリンを表わす。
【００４６】
「ＤＭＰＧ」は、ジミリストイルホスファチジルグリセロールを表わす。
「第ＶＩＩＩ因子」は、２３３１個のアミノ酸を含有する糖タンパク質を表わす。
「ＦＳＨ」は、卵胞刺激ホルモンを表わす。
【００４７】
「ＧＨ」は、成長ホルモンを表わす。
「グリセリド」は、Ｃ４〜Ｃ３０の飽和または不飽和脂肪酸のグリセロールエステルを意味するものとする。
【００４８】
「ＧＲＦ」は、成長ホルモン放出因子を表わす。
「ＧｎＲＨ」は、ゴナドトロピン放出ホルモンを表わす。
「ＨＰＨ」は、高圧均質化を表わす。
【００４９】
「ＬＤ」は、レーザー回折分析を表わす。
「ＬＨＲＨ」は、黄体形成ホルモン放出ホルモンを表わす。
「脂質」は、本発明によれば、水には難溶性であるが有機溶媒には可溶性である物質を表わす。本発明によれば、脂質には脂肪酸、モノ−、ジ−およびトリ−グリセリド、リン脂質、ＰＥＧ−グリセリド、糖−グリセリドまたはろう、並びにそのいずれかの混合物が含まれる。本発明によれば、脂質マトリックスは常に医薬的に許容できるものとする。
【００５０】
「ＬＭ」は、脂質マイクロ粒子を表わす。
「マイクロ粒子」は、その平均直径が３〜５００μｍにある粒子を表わす。
「モノグリセリド」は、下記に示すようにグリセロールアルコール官能基の１つを脂肪酸でエステル化することにより：
ＣＨ２ＯＨ−ＣＨＯＨ−ＣＨ２ＯＨ    →    ＣＨ２ＯＣＯＲ１−ＣＨＯＨ−ＣＨ２ＯＨ
グリセロール モノグリセリド
（式中のＲ１はＣ４〜Ｃ３０の飽和または不飽和炭化水素鎖である）、またはトリグリセリドの加水分解により得られる化合物を表わす。
【００５１】
「ＮＭＲ」は、核磁気共鳴を表わす。
「ＰＣＳ」は、光子相関分光分析を表わす。
「ＰＥＧ」は、ポリエチレングリコールを表わす。
【００５２】
「ペプチド」は、アミド基間に四面体炭素原子を含むポリアミド主鎖を意味する。ペプチド鎖はアミノ酸の縮合により得られる：１つのアミノ基が次のカルボキシル基に結合してペプチド結合を形成する。
【００５３】
「医薬的に許容できる」は、有効成分の生物活性の有効性を妨害せず、かつそれを投与する宿主に対して無毒性である物質を意味するものとする。
「タンパク質」は、ポリペプチドアミノ酸配列を含む分子を表わす。ペプチドとタンパク質の主な相異はサイズの相異である。本発明によれば、ペプチドは１００個以下のアミノ酸を含有し、一方タンパク質は１００個を超えるアミノ酸を含有する。
【００５４】
「ＰＵＫ」は、プロ−ウロキナーゼを表わす。
「糖（糖質）」は、少なくとも２個のヒドロキシル基をもつアルデヒド基またはケトン基を表わす。糖は幾つかの形態をとる：モノマー形（単糖）、ダイマー形（二糖）、トリマー形（三糖）、オリゴマー（オリゴ糖）およびポリマー（多糖）。
【００５５】
「ＳＯＤ」は、スーパーオキシドジスムターゼを表わす。
「溶媒ストリッピング法」は、溶媒に溶解した薬物（すなわちペプチド）を、融解または溶媒中で溶解した担体材料（すなわち脂質）に充填する方法を表わす。
【００５６】
「治療上有効量」とは、前記疾患の経過および重症度に影響を及ぼし、そのような病的状態の軽減または寛解に十分な量を表わす。この有効量は投与経路および患者の状態に依存するであろう。
【００５７】
「ＴＮＦ」は、腫瘍壊死因子を表わす。
「ｔＰＡ」は、組織プラスミノーゲン活性化因子を表わす。
「ＵＫ」は、ウロキナーゼを表わす。
【００５８】
「ｗ／ｗ」は、重量／重量を表わす。
本発明を幾つかの実施例により説明する。これらは、種々の脂質に各種方法を採用して種々の薬物を充填し、異なる放出速度を得るのが可能であることを証明する。ただしこれらは本発明の範囲を限定するためのものではない。実施例では添付の図面を参照する。
【００５９】
実施例
以下に報告する実施例で用いたペプチドはアンタイドである。このペプチドは、下記のデータが証明するように両親媒性をもつ。
【００６０】
表面張力分析：  Kruss張力計（液滴形状分析システム）を用いて種々の薬物濃度、すなわち０．０１、０．１、１．０、１０ｍＭのアンタイド水溶液について表面張力測定を実施した。結果を図１に示す。
【００６１】
分配係数：  有機相としてオクタノールを、親水相として水を用いて測定した。この２相をまず室温で２４時間、互いに飽和させた。次いでアンタイドを飽和より十分低い濃度で水相に溶解した。次いで等量の有機相を水相に添加し、混合物を室温で２４時間、撹拌し続けた。２相のアンタイド濃度をＲＰ−ＨＰＬＣにより測定し、有機相と水相の薬物濃度比から分配係数を求めた。
【００６２】
得られたオクタノール／水係数は８．５６×１０−２であった。
数種類の脂質中におけるアンタイド準定量的溶解度評価の結果を、脂質モノグリセリド含量と共に表１に示す。
【００６３】
材料および装置：
アンタイドバルク、Bachem。
Imwitor 900（グリセリルモノステアレート）、Condea Chemie−ＤＥ。
【００６４】
Compritol E ATO（グリセリルモノベヘネート）、Gattefosse−ＦＲ。
Compritol 888 ATO（グリセリルベヘネート）、Gattefosse−ＦＲ。
Imwitor 312（ラウリン酸モノグリセリド）、Condea Chemie−ＤＥ。
【００６５】
Imwitor 928（グリセリルモノ−／ジ−ココエート）、Condea Chemie−ＤＥ。
Geleol（グリセリル モノ−パルミテート／ステアレート）、Gattefosse−ＦＲ。
Compritol HD 5 ATO（グリセリル／ポリエチレングリコール ベヘネート）、Gattefosse−ＦＲ。
【００６６】
Superpolystate（ポリエチレングリコールステアレート）、Gattefosse−ＦＲ。
Precirol ATO 5（グリセリルモノ−／ジ−／トリ−パルミテート／ステアレート）、Gattefosse−ＦＲ。
【００６７】
Witepsol E 85（Ｃ１０〜Ｃ１８飽和脂肪酸トリグリセリド）、Massa Witepsol。
Softisan 142（水素化ヤシグリセリド）、Condea Chemie−ＤＥ。
Gelot 64（グリセリル／ポリエチレングリコールパルミテート／ステアレート）、Gattefosse−ＦＲ。
【００６８】
Monosteol（プロピレングリコールパルミテート／ステアレート）、Gattefosse−ＦＲ。
Gelucire 44/14（特定ブレンド：グリセロールおよびポリエチレングリコールのラウリン酸モノ−／ジ−／トリ−エステル）、Gattefosse−ＦＲ。
【００６９】
Gelucire 50/13（特定ブレンド：グリセロールおよびポリエチレングリコールのステアリン酸モノ−／ジ−／トリ−エステル）、Gattefosse−ＦＲ。
セチルアルコール、Sigma。
【００７０】
エタノール、Merck−Ｄ。
ベンジルアルコール、Sigma−ＵＳＡ。
ＩＦＮ−β液体製剤（ＲＥＢＩＦ（登録商標）−Serono）。
【００７１】
真空オーブン ＯＶＡ０３１．ＸＸ１．５、Sanyo Gallenkamp；真空ポンプ ＬＡ．１２、Ｄ．Ｖ．Ｐ．Vacuum Technology。
自動ふるいシステム、Retsch AS 200。
【００７２】
レーザー回折計 Mastersizer Microplus MAF 5001、Malvern。
Waters ＨＰＬＣシステム：２６９０分離モジュール；ＲＰカラム、Jupiter ５μｍ Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ、５μｍ）；２４８７二重λ吸光度検出器
低温ミル−Ａｐｅｘ、Ｍｏｄ．ＭＰＸ３：下記のように特注：
これらの試験に用いた低温ミルは、冷却ガス（すなわち液体窒素）をチャンバーへ導入するのに適したノズルを備えた一般的なハンマーミルである。予備摩砕試験後、本発明者らの要求にさらに適切なものにするためにミルを特注した。下記の改変を行った：
−粉砕チャンバーの温度測定のために検温プローブを導入した；
−粉砕チャンバーからの粉末損失を避けるために底スクリーンを盲ブレードでシールした；
−粉砕チャンバーへの粉末導入のためにピストンを取り付けた；
−断熱パイプで液体窒素タンクに接続した。
【００７３】
実施例１：  ２％薬物充填した脂質マイクロ粒子：脂質マトリックスとしてCompritol E ATOを用いて溶媒ストリッピング法により製造
重量比２：９８のペプチド（アンタイド）および脂質（Compritol E ATO）を８５℃で有機溶媒（ベンジルアルコールとエタノールの混合物、１：５）に撹拌下で溶解した。溶媒を真空下に８０℃で蒸発させた。次いで脂質マトリックスを室温に冷却し、予備摩砕し、そして低温条件下で微粉砕した。最後にマイクロスフェアを１２５μｍでふるい分けし、採集した。
【００７４】
実施例２：  ２％薬物充填した脂質マイクロ粒子：脂質マトリックスとしてImwitor 900を用いて溶媒ストリッピング法により製造
重量比２：９８のペプチド（アンタイド）および脂質（Imwitor 900）を８０℃で有機溶媒（ベンジルアルコールとエタノールの混合物、１：２）に撹拌下で溶解した。溶媒を真空下に６０℃で蒸発させた。次いで脂質マトリックスを室温に冷却し、予備摩砕し、そして低温条件下で微粉砕した。最後にマイクロスフェアを１２５μｍでふるい分けし、採集した。
【００７５】
実施例３：  ２％薬物充填した脂質マイクロ粒子：脂質マトリックスとしてCompritol E ATOを用いて共融法により製造
ペプチド（アンタイド）を融解脂質（Compritol E ATO）に撹拌下で取り込ませた（薬物−脂質重量比は２：９８）。次いで脂質マトリックスを氷浴中で冷却し、予備摩砕し、そして低温条件下で微粉砕した。最後にマイクロスフェアを１２５μｍでふるい分けし、採集した。
【００７６】
実施例４：  ２％薬物充填した脂質マイクロ粒子：脂質マトリックスとしてImwitor 900を用いて共融法により製造
脂質（Imwitor 900）をその融点より１５℃高い温度で融解させた。次いでペプチド（アンタイド）を融解脂質に撹拌下で取り込ませた（薬物−脂質重量比は２：９８）。次いで脂質マトリックスを氷浴中で冷却し、予備摩砕し、そして低温条件下で微粉砕した。最後にマイクロスフェアを１２５μｍでふるい分けし、採集した。
【００７７】
実施例５：  ＩＦＮ−βを充填した脂質マイクロ粒子：脂質マトリックスとしてImwitor 900およびImwitor 312（２５：７５）を用いて共融法により製造
粉末状のImwitor 900とImwitor 312を固体状態で混合し、次いで５８℃±２℃に温度調節した水浴中で共融させた。ＩＦＮ−β液体製剤（２４５μｇ／ｍＬ）を、５８℃±２℃に保持した融解脂質に添加し、穏やかに撹拌しながら２０分以内に溶解させた。次いでこの素材を室温で放冷し、手動で粗い粒子に砕き、−８０℃に保存した。粉砕前にＩＦＮ−β脂質製剤を少なくとも１２時間、−８０℃に保持した。操作条件としてローター速度１８０００ｒｐｍおよびスクリーンサイズ０．５ｍｍを用いて摩砕を実施した。摩砕した材料を４℃に保持した。レーザー回折計を用いて脂質マイクロ粒子特性をその粒度分布により解明した。粒度分析結果を表６に報告する。
【００７８】
実施例６：  １０％薬物充填した脂質マイクロ粒子：脂質マトリックスとしてCompritol E ATOを用いて溶媒ストリッピング法により製造
重量比１：９のペプチド（アンタイド）および脂質（Compritol E ATO）を８５℃で有機溶媒（ベンジルアルコール）に撹拌下で溶解した。溶媒を真空下に８５℃で蒸発させた。次いで脂質マトリックスを室温に冷却し、予備摩砕し、そして低温条件下で微粉砕した。最後にマイクロスフェアを１２５μｍでふるい分けし、採集した。
【００７９】
実施例７：  ２０％薬物充填した脂質マイクロ粒子：脂質マトリックスとしてCompritol E ATOを用いて溶媒ストリッピング法により製造
重量比１：４のペプチド（アンタイド）および脂質（Compritol E ATO）を８５℃で有機溶媒（ベンジルアルコール）に撹拌下で溶解した。溶媒を真空下に８５℃で蒸発させた。次いで脂質マトリックスを室温に冷却し、予備摩砕し、そして低温条件下で微粉砕した。最後にマイクロスフェアを１２５μｍでふるい分けし、採集した。
【００８０】
実施例８：  ２％薬物充填した脂質マイクロ粒子：脂質マトリックスとしてCompritol 888 ATOを用いて共融法により製造
ペプチド（アンタイド）を融解脂質（Compritol 888 ATO）に撹拌下で取り込ませた（薬物−脂質重量比は２：９８）。次いで脂質マトリックスを氷浴中で冷却し、予備摩砕し、そして低温条件下で微粉砕した。最後にマイクロスフェアを１２５μｍでふるい分けし、採集した。
【００８１】
実施例９：  ２％薬物充填した脂質マイクロ粒子：脂質マトリックスとしてCompritol 888 ATOを用いて溶媒ストリッピング法により製造
重量比２：９８のペプチド（アンタイド）および脂質（Compritol 888 ATO）を８５℃で有機溶媒（ベンジルアルコール）に撹拌下で溶解した。溶媒を真空下に８５℃で蒸発させた。次いで脂質マトリックスを室温に冷却し、予備摩砕し、そして低温条件下で微粉砕した。最後にマイクロスフェアを１２５μｍでふるい分けし、採集した。
【００８２】
実施例１０：  １０％薬物充填した脂質マイクロ粒子：脂質マトリックスとしてCompritol 888 ATOを用いて溶媒ストリッピング法により製造
重量比１：９のペプチド（アンタイド）および脂質（Compritol 888 ATO）を８５℃で有機溶媒（ベンジルアルコール）に撹拌下で溶解した。溶媒を真空下に８５℃で蒸発させた。次いで脂質マトリックスを室温に冷却し、予備摩砕し、そして低温条件下で微粉砕した。最後にマイクロスフェアを１２５μｍでふるい分けし、採集した。実施例１〜１０の記載に従って製造した脂質マイクロ粒子の特性解明を以下に報告する。
【００８３】
実施例１１：  封入効率の測定
脂質マイクロ粒子のアンタイド含量をＲＰ−ＨＰＬＣにより測定した：アンタイド充填した脂質マイクロ粒子５０ｍｇをまず５ｍＬのアセトンに溶解し、振とうし、２分間超音波処理した。５ｍＬの蒸留水をアセトン溶液に添加した。得られた混合物を２分間超音波処理し、次いで８０００ｒｐｍで１５分間遠心した。
【００８４】
透明な溶液をＨＰＬＣカラムに注入した。数種類の脂質マイクロ粒子配合物の封入効率値を以下に示す。封入効率を下記に従って計算した：
【００８５】
【数１】
0004748923.tif 000002
【００８６】
表２に記載するように、両方の薬物取込み法および両方の被験脂質について満足すべき封入効率が達成されたことが分かる。
実施例１２：  脂質マトリックス内におけるペプチド安定性の測定
２種類のアンタイド充填Imwitor 900配合物について、前の節の記載に従ってｔ＝０およびｔ＝３カ月目に脂質マイクロ粒子の薬物含量をＲＰ−ＨＰＬＣにより測定した。結果を表３に示す。
【００８７】
実施例１３：  マイクロ粒子の物理化学的特性解明
脂質マイクロ粒子の完全な物理化学的特性解明を、それらの粒度分布（レーザー回折計分析）、脂質マトリックスの表面分析、およびＮＭＲ検査を評価することにより行った。１２５μｍ未満の粒子は皮下投与に適するので、その画分の重量収率も測定した。
【００８８】
アンタイド充填した脂質マイクロ粒子配合物の粒度および粒度分布を、Malvernレーザー回折計を用いるレーザー回折分析（ＬＤ）により評価した。少量の脂質マイクロ粒子（約４０ｍｇ）を５０μＬのＴｗｅｅｎ２０に分散させ、次いで５ｍＬの脱イオン水中に希釈して、５〜３０％の混濁値を得た。分析中、試料を分散ユニット内で循環し続けた。各試料につき少なくとも３回の測定値を求め、フラウンフォーファー回折モデルによりデータを処理した。
【００８９】
ＬＤ頻度曲線、ならびに下記のように集団の粒度分布を定めるＤ（ｖ，０．１）、Ｄ（ｖ，０．５）およびＤ（ｖ，０．９）パラメーター：
−  Ｄ（ｖ，０．１）＝１０％（体積）の粒子がこの数値未満のサイズをもつ；
−  Ｄ（ｖ，０．５）＝５０％（体積）の粒子がこの数値未満のサイズをもつ；
−  Ｄ（ｖ，０．９）＝９０％（体積）の粒子がこの数値未満のサイズをもつ；
の例を、図３および表４に示す。これらから分かるように、両方の製造方法で同様なマイクロ粒子粒度分布が得られ、主に１〜１２５μｍからなっていた。
【００９０】
Kruss張力計（液滴形状分析システム）を用いて、脂質マトリックスの接触角分析を行った。接触角は、液滴とそれが展着している表面の角度である。それは０°（完全ぬれを表わす）または１８０°（ぬれが有意でない）の可能性がある。接触角はこれらの限界値の間の数値をもつ可能性もある。
【００９１】
水を用い、記載した製造方法に従って脂質マトリックスを製造して分析を行った。ストリッピング処理したアンタイド充填脂質マトリックスと共融したものとの表面分析結果の比較を表５に示す。
【００９２】
驚くべきことに、２つの製造方法は著しく異なるθ°値を示した。これは、ストリッピングしたマトリックスは共融マトリックス（より親水性）より水にかなりぬれにくい（より親油性）ことを意味し、かつマトリックス中と粒子中の脂質成分の構造配列様式が著しく異なることを示すと思われる。薬物の存在は脂質マトリックスの表面特性を有意には変化させなかった。したがってマトリックスのぬれやすさは取り込まれた薬物により影響されないと予想できる。
【００９３】
脂質マトリックスの特性を固相ＮＭＲ分析により解明した。バルク薬物中および前記の各方法で製造した脂質マトリックス中におけるアンタイド立体配座の１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを図４および５に示す。驚くべきことに、バルクアンタイドにみられた幅広いピーク（ピリジン残基３、５、６について）は、この薬物を溶媒ストリッピング法で取り込ませた場合にはなお存在するが、共融法により薬物を充填した場合には同じピークが有意に先鋭になる。これは、２種類のマトリックス内における薬物構造および薬物−脂質系全体の構造配列様式が、用いる製造方法および組成に依存することを証明するものである。これは、共融法を用いた場合は薬物分子の「マイクロドメイン」が存在し、これに対し溶媒ストリッピングによれば真の「固溶体」が形成されることに起因すると思われる。
【００９４】
実施例１４：  in vitro放出速度パターン評価：
脂質マイクロ粒子からのアンタイド放出を、放出媒体として水（保存剤として＋ＮａＮ３ ０．０５％）またはＰＢＳ（リン酸塩緩衝塩類溶液）を用いて評価した。約４０ｍｇの脂質マイクロ粒子を２０ｍＬの放出媒体に懸濁して実験を行った。これらの懸濁液を３７℃に温度調節した水浴中で撹拌し続けた。テフロン（登録商標）注射器および０．２μｍAcrodiscフィルターを用いて、１ｍＬの試料を種々の時点で取り出した。濾過した脂質マイクロ粒子を容器に戻し、等量の放出媒体を再導入した。
【００９５】
種々の脂質マイクロ粒子配合物の放出プロフィルを図６に示す。予想外に、これらの配合物すべてについて「バースト効果」が著しく低下した。ある配合物については１時間以内１０％未満にまで低下したことは注目すべきである。さらに、試験した種々の脂質すべてについて、溶媒ストリッピングしたマトリックスの方が低い放出速度を示した。これは、接触角測定で証明されるようにその表面のぬれやすさがより低いこと、および１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルが示すように共融マイクロ粒子中に薬物クラスターが存在することにより説明される。
【００９６】
溶媒ストリッピング法で得たCompritol E ATOマトリックスの場合、ほぼ「ゼロオーダー」の放出速度が達成されたことは注目すべきである。これは、抗がん剤の長期投与の場合にきわめて望ましいプロフィルである。生物分解性マイクロスフェア系ではゼロオーダーの薬物放出速度は通常は達成できないので、これは確かに予想外の現象である。
【００９７】
驚くべきことに、少なくとも試験した２〜２０％ｗ／ｗの範囲内ではこの「準ゼロオーダー」の放出はほとんど薬物充填と無関係と思われる。事実、図６から分かるように、１０％充填Compritol E ATO脂質マイクロ粒子からの最初の２４時間以内でのアンタイドの放出画分およびその放出速度は、対応する２％充填マトリックスについて得たものに匹敵する。マイクロ粒子システムからの薬物バーストは薬物充填量に伴って著しく増加することが一般に観察されているので、これは全く予想外である。
【００９８】
さらに驚くべきことに、Compritol E ATOマトリックスからの薬物放出はImwitor 900マトリックスからの放出速度より低かった。これは、脂質担体のグリセリド組成および物理化学的特性の相異に起因すると思われる。
【００９９】
生物学的結果
実施例１５：  in vitroアッセイ
図２に示す結果から、脂質マイクロ粒子製造方法が薬物活性を大きく変化させないことが確認される。これは、下記に従って実施したラット下垂体細胞アッセイにおいて証明された。
【０１００】
雌ラットから摘出した下垂体をまず酵素消化し、ラット下垂体細胞の初代培養を樹立した。回収した細胞を２４ウェルプレートに２．５×１０５個／ウェルで接種し、３７℃および５％ＣＯ２で７２時間培養した。
【０１０１】
ウェルを３回洗浄し、次いで０．７５、１．５、３、６および１２ｎｇ／ｍｌの２種類の脂質マイクロ粒子−アンタイド配合物または社内標準試料アンタイドについて三重試験法で２４時間処理した。基底レベルおよび最大レベルの分泌ＬＨウェルには培地のみを入れた。
【０１０２】
次いで洗浄した後、試料および標準アンタイド希釈液を新たなものと交換し、等量の培地を入れた基底ウェル以外のすべてのウェルにＬＨＲＨ（１０−８Ｍ）を添加した。４時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後、各ウェルから調製培地を採集し、ＬＨ含量をアッセイするまで−２０℃に保存した。
【０１０３】
分泌ＬＨの評価のために、市販ＲＩＡ（Amersham Pharmacia Biotech）を用いた。結果をアンタイドによるＬＨ分泌阻害率％として表わした。
ラット下垂体細胞において脂質マイクロ粒子によるin vitroＬＨ分泌阻害を評価することにより、本発明のマイクロ粒子製造方法はペプチドの生物学的統合性を低下させないことが証明された。図１の結果は、試験した製剤においてアンタイドの生物活性が保持されていることを示す。
【０１０４】
実施例１６：  in vivoアッセイ
成体（６３〜７０日齢および約３００ｇ）Sprague Dawley雄ラットをこの試験に用いた。飼料をすべての動物に「自由」摂取させた。飲料水も動物に「自由」摂取させた。
【０１０５】
アンタイドの脂質マイクロ粒子を含有する被験配合物を、アンタイド０．６ｍｇ（約２ｍｇ／ｋｇ）の１回皮下投与量として、各グループのラットに皮下経路で投与した。アンタイドの脂質マイクロ粒子は、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有する約５％のグルコース水溶液で投与された。
【０１０６】
ビヒクルのマイクロ粒子含量は約５０ｍｇ／ｍｌであった。投与量はラット１匹につき１ｍＬであった。
下記の実験計画に従った。
【０１０７】
【表１】
0004748923.tif 000003
【０１０８】
配合物１：アンタイド（２％ｗ／ｗ）−Compritol E ATO（ストリッピング）
配合物２：アンタイド（２％ｗ／ｗ）−Imwitor 900（ストリッピング）
配合物３：アンタイド（２％ｗ／ｗ）−Compritol E ATO（共融）
配合物４：アンタイド（２％ｗ／ｗ）−Imwitor 900（共融）。
【０１０９】
これらの配合物を、投与前一晩絶食させた動物に投与した。
第１〜５群の動物から約０．５〜１ｍｌの血液を、８時間までの各サンプリング時間に舌下または尾静脈より採取した。２４時間目（第１群については７２時間）に動物をエーテルで麻酔し、腹部大動脈からの放血により殺した。
【０１１０】
第５〜８群の動物を、指示したサンプリング時点に腹部大動脈からの放血によりサンプリングした。
ヘパリン添加試験管内に血液を採集し、４℃での遠心（２５００×ｇ）により血漿を分離した。殺した時点で得た血漿を少なくとも１ｍｌずつ３つのアリコートに分割した。
【０１１１】
アンタイドの血漿濃度を、質量分析検出を伴うＨＰＬＣ法（ＨＰＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により測定した。
殺した時点で得たすべての血漿試料について、薬理マーカーであるテストステロンを測定した。
【０１１２】
テストステロンレベルをDiagnostic Product Corporation（ＤＰＣ）製ＲＩＡキットにより測定した。
アンタイドおよびテストステロン血漿レベルを、投与後の異なる時点で測定した。それらの結果を図８および図９に示す。in vitro溶解速度試験でみられた「バースト低下」が、最初の２４時間以内に血漿プロフィルから確認される。１カ月間の観察中、薬物のＰＫプロフィルおよびテストステロン抑制に及ぼすＰＤ作用の両方とも、送達システムの持続放出性能と一致した。
【０１１３】
【表２】
0004748923.tif 000004
【０１１４】
【表３】
0004748923.tif 000005
【０１１５】
【表４】
0004748923.tif 000006
【０１１６】
【表５】
0004748923.tif 000007
【０１１７】
【表６】
0004748923.tif 000008
【０１１８】
【表７】
0004748923.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】種々の薬物濃度のアンタイド水溶液の表面張力に関するものである。
【図２】種々の脂質マトリックスに取り込ませたアンタイドのin vitro生物活性の評価を示す。配合物Ａ＝２％アンタイド−充填Compritol E ATO共融マトリックス。配合物Ｂ＝２％アンタイド−充填Compritol E ATOストリッピング処理マトリックス。
【図３】２％アンタイド−充填Imwitor 900共融脂質マイクロ粒子（ａ）、および２％アンタイド−充填ストリッピング処理Compritol E ATO脂質マイクロ粒子（ｂ）のＬＤ頻度（釣鐘形）およびふるい下体積（Ｓ字形）曲線を示す。
【図４】バルク薬物（Ｂ）および２０％のアンタイドを含有するストリッピング処理Imwitor 900マトリックス（Ａ）について得た固相１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図５】バルク薬物（Ｂ）および１０％のアンタイドを含有する共融Imwitor 900マトリックス（Ａ）について得た固相１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す。
【図６】種々の２％（ｗ／ｗ）アンタイド−充填脂質マトリックスからのアンタイド累積放出プロフィルを示す。
【図７】種々の薬物充填量のCompritol E ATOストリッピング処理マトリックスからのアンタイド放出を示す。
【図８】２％アンタイド−充填脂質マトリックスをラットにin vivo皮下投与した後のアンタイド血漿濃度／時間プロフィルを示す。
【図９】図８の説明に述べた４種類の脂質マイクロ粒子配合物をラットに皮下投与した後のテストステロン血漿濃度に関するものである。配合物１：アンタイド（２％ｗ／ｗ）−Compritol E ATO（ストリッピング）配合物２：アンタイド（２％ｗ／ｗ）−Imwitor 900（ストリッピング）配合物３：アンタイド（２％ｗ／ｗ）−Compritol E ATO（共融）配合物４：アンタイド（２％ｗ／ｗ）−Imwitor 900（共融）。
【図１０】脂質マイクロ粒子−アンタイド２％−Compritol C888（バッチ９３）および脂質マイクロ粒子−アンタイド２％−Compritol E ATO（バッチ１０６）の水中放出プロフィルを示す図である。Compritol 888は１２〜１８％のモノグリセリド含量をもち、一方Compritol E ATOは約８０％のモノグリセリド含量をもつ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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