(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部構造（１）及び前記内部構造（１）が完全密封状態で内部に収容される外ボックス（１５）を含み、
前記内部構造（１）は、固定ボックス部分（２）及び前記固定ボックス部分（２）が載置される状態で取り付けられる台座部分（５）を含み、そのうち、
前記固定ボックス部分（２）には、洗浄液パック（３）、及び増幅物（７）を含有するＰＣＲ管（１１）を、それぞれの下端側の一部が前記固定ボックス部分（２）から突出した状態で入れるのに用いられる、それぞれに対応する孔が前記台座部分（５）への取付側にあり、
前記台座部分（５）は、前記固定ボックス部分（２）の前記孔から突出した前記洗浄液パック（３）の一部を収容すると共にこの洗浄液パック（３）に対応した液パック突き刺し針（４）を有する洗浄液収納ユニット（２１）、前記固定ボックス部分（２）の前記孔から突出した前記ＰＣＲ管（１１）の一部を収容すると共にこのＰＣＲ管（１１）に対応したカッター（９）を有する増幅物収納ユニット（２２）、前記両ユニット（２１）及び（２２）の間にある密封仕切り（６）、前記両ユニット（２１）及び（２２）中に入れられテスト・ストリップ（１３）底部につながるグラスファイバー・ペーパー（８）、及び前記グラスファイバー・ペーパー（８）の前記増幅物収納ユニット（２２）側の端部と接続された前記テスト・ストリップ（１３）とこのテスト・ストリップ（１３）に対応する透明窓（１２）とを有すると共に前記台座部分（５）の前記増幅物収納ユニット（２２）側の端部に立設されて内部に前記テスト・ストリップ（１３）をその立設方向に沿って収容するテスト・ストリップ密封部分（１４）を含み、さらに、
前記外ボックス（１５）は、前記内部構造（１）が挿入される開口部を閉塞するレバー・カバー（１６）、前記レバー・カバー（１６）の内側に位置し前記開口部の閉塞時に前記固定ボックス部分（２）を前記台座部分（５）側に押圧するための固定ボックス圧迫部分（１７）、前記洗浄液パック（３）に圧力を加える洗浄液パック圧迫部分（１８）、及び前記テスト・ストリップ密封部分（１４）の配置側の端面に形成された前記透明窓（１２）に対応する透明窓（２０）を含み、
さらに前記固定ボックス部分（２）の前記ＰＣＲ管（１１）に対応する前記孔と前記台座部分（５）との間に位置するガスケット・リング（１０）を含み、このガスケット・リング（１０）により前記ＰＣＲ管（１１）に対応する前記孔と前記台座部分（５）との接触が吻合し、前記孔と前記台座部分（５）との間が密封され、前記増幅物（７）が前記固定ボックス部分（２）まで逆流しないことを保証する
完全密封標的核酸増幅物高速検査装置。
【請求項２】
前記外ボックス（１５）の前記レバー・カバー（１６）は、前記開口部の閉塞時に前記固定ボックス圧迫部分（１７）によって前記固定ボックス部分（２）を前記台座部分（５）側に押圧することで、これらを密封状態にすると共に前記内部構造（１）自体を前記外ボックス（１５）内に完全密封し、
前記液パック突き刺し針（４）及び前記カッター（９）は、前記固定ボックス圧迫部分（１７）により前記固定ボックス部分（２）が前記台座部分（５）側に押圧されることにより、密封状態の前記内部構造（１）の前記洗浄液収納ユニット（２１）及び前記増幅物収納ユニット（２２）内においてそれぞれ前記洗浄液パック（３）及び前記ＰＣＲ管（１１）に突き刺さる位置に配置されている
請求項１に記載の完全密封標的核酸増幅物高速検査装置。
【請求項３】
さらに前記密封仕切り（６）によって前記増幅物（７）が前記洗浄液収納ユニット（２１）側に逆流せず、前記増幅物収納ユニット（２２）側に単方向移動する前記洗浄液と混合後、前記グラスファイバー・ペーパー（８）を通って前記テスト・ストリップ（１３）によって吸収されることを保証する
請求項１または請求項２に記載の完全密封標的核酸増幅物高速検査装置。
【請求項４】
さらに前記外ボックス（１５）が前記レバー・カバー（１６）によって完全密封される環境を構成し、実験プロセスにおいて、前記外ボックス（１５）がいったんロックされれば、二度と開くことができず、それによって前記外ボックス（１５）内の汚染の可能性のある物品が事故によって外漏れするのを防止する
請求項１〜３のいずれか１項に記載の完全密封標的核酸増幅物高速検査装置。
【請求項５】
さらに前記密封仕切り（６）によって前記増幅物（７）が前記洗浄液収納ユニット（２１）側に逆流せず、前記増幅物収納ユニット（２２）側に単方向移動する前記洗浄液と混合後、前記グラスファイバー・ペーパー（８）を通って前記テスト・ストリップ（１３）によって吸収されることを保証し、さらに前記外ボックス（１５）が前記レバー・カバー（１６）によって完全密封される環境を構成し、実験プロセスにおいて、前記外ボックス（１５）がいったんロックされれば、二度と開くことができず、それによって前記外ボックス（１５）内の汚染の可能性のある物品が事故によって外漏れするのを防止する
請求項１または請求項２に記載の完全密封標的核酸増幅物高速検査装置。
【請求項６】
請求項１から請求項５のうちいずれか１項に記載の完全密封標的核酸増幅物高速検査装置を使用して、核酸配列増幅物を検査する
標的核酸増幅物高速検査方法。
【請求項７】
さらに請求項１から請求項５のうちいずれか１項に記載の完全密封標的核酸増幅物高速検査装置を使用して、核酸配列増幅物を高速検査し、核酸増幅物交雑汚染を防止し、偽陽性を防ぐ
標的核酸増幅物高速検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は完全密封標的核酸増幅物検査装置に関するものであり、さらに具体的には、核酸薄膜クロマトグラフィー（テスト・ストリップ）技術を完全密封した検査装置に利用した、標的核酸配列増幅物を高速検査する方法に関するものである。本発明はさらに完全密封した高速検査装置における標的核酸増幅物高速検査試薬キットの応用及びその伝染病病原体検査における用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応(Polymerase Chain Reaction, PCR)は1985年に米国Cetus社が発明したDNA変性及び復元原理を利用し、体外DNAポリメラーゼが存在する条件下でDNA断片を特定する高効率の体外増幅技術である。PCRが世に出て以来、国際的に極めて大きな反響を呼び、驚くべき速さで生命科学の数多くの分野で広範に応用され、疾病診断及び検査においても広く応用があり、その発明者Mullisも1993年ノーベル化学賞を受賞する栄誉に浴した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
ここ数年、PCR技術は急速に発展し、医学、分子生物学、遺伝子エンジニアリング、腫瘍学、法医学等の各分野において広範に応用されている。体外の特定の条件下で、PCRは数時間内で単一コピーのDNA断片を数百億コピーにまで増幅し、それによって大幅に特異遺伝子検査の感度を向上した。まさに特異性が大きく、感度が高く、高速簡便で再現性が優れている等の長所を有するため、PCRは臨床医学及び生命科学の特定の遺伝子増幅及び検査において広範に応用され、例えば各種病原体のPCR検査はすでに伝染性疾病診断の重要な手段のひとつとなっている。しかし高い増幅効率及びPCR産物の検査方法（アガロース・ゲル電気泳動）により、きわめて実験室における増幅物の汚染を引き起こしやすく、偽陽性という検査結果を招き、PCR検査結果が非常に混乱し、特に性病遺伝子検査分野において、一連の道徳倫理、家庭紛争並びに社会及び法律問題を引き起こす場合さえある。PCR技術の臨床応用において現れる一連の問題については衛生部管理層がかなり重視しており、そのため、PCRの臨床応用について一連の条項及び規定が制定された。一方、どのようにしてPCR偽陽性結果をなくすかについては、科学研究に従事する者たちが解決すべき大きな難題となっている。
【０００４】
実験室における増幅物汚染が引き起こす偽陽性を防止するため、国家衛生部は、PCR臨床診断においてサンプル処理、増幅及び検査を隔離された室内で行い、かつ物流はサンプル処理から、増幅及び検査への一方通行で行われなければならず、さもなければ増幅後の試験管は開放検査を行うことができない、と規定した。現在、実験室における増幅物汚染防止に最も普遍的に採用されている方法はUNG-dUTPシステムである。該システムはUNG（ウラシル-N-グリコシラーゼ）がdUTPを含むDNA断片中のウリジンを加水分解できるという特徴を利用して、DNA断片中のUを加水分解し、加水分解されたDNAに熱を加えた後、加水分解された箇所から断裂し、テンプレートとなる機能を失わせ、それによって汚染を防止するという目的を達成する。しかし、該システムを用いて汚染を防止するための前提条件は、PCRシステム全体が最初からすべてdTTPの変わりにdUTPを用いなければならないということであり、かつUNG-dUTPシステム汚染防止試薬の価格も該試薬の使用が制限される要因になっている。
【０００５】
蛍光定量PCRは近年発展してきた新技術である。蛍光定量PCR技術はPCR技術核酸増幅の高い効率性、プローブ技術の高い特異性及びスペクトル技術の高い感度並びに計量の高い正確性等の長所を巧妙に利用するだけでなく、同時に普通PCR技術の汚染されやすく、定量できず、プローブハイブリダイゼーション感度が高くなく、分離溶出条件が制御しにくい等の欠点を克服し、疾病の遺伝子臨床診断において広範に応用が可能になった。その最も顕著な特徴は、完全密封式反応、PCR増幅プロセスのリアルタイム検査であり、PCR増幅産物に対して後処理を行う必要がなく、それによって従来のPCR技術の汚染されやすいという欠点を完全に克服した。ゆえに検査分野において、ますます重要な検査手段となってきており、病原体の臨床検査においてきわめて広範な応用が可能になった。しかし計器及び試薬が高価であり、操作員に対して高い技術が要求されるため、この技術は多くの小規模病院にはあまりふさわしくないものとなっている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記のように、PCR増幅物汚染によって、PCRの診断は大きな制限を受けている。実験室汚染によって引き起こされる偽陽性を防ぐために、本出願人は核酸テスト・ストリップ高速検査技術と結びつけ（本発明者のもうひとつの特許出願参照、出願番200610003429.1）、完全密封された標的核酸増幅物の高速検査装置を開発した。名称は完全密封式標的核酸増幅物高速検査装置である。本方法は簡単、高速で、かつ汚染を引き起こさず、生命科学分野に広範に応用できる。例えば、分子生物学実験室核酸増幅検査、臨床診断、植物及び動物疾病の検査、税関検疫、法医学鑑定等の核酸増幅物の検査等においてである。
【０００７】
簡単に言えば、本発明の完全密封標的核酸増幅物高速検査装置はふたつの面での用途を提供している。
第一に、標的核酸増幅物を高速検査する方法を提供した。
第二に、核酸増幅物交雑汚染を防止し、偽陽性を防ぐ方法を提供した。
【０００８】
［発明内容の概略］
本発明は、標的核酸増幅産物の交錯汚染を防止、偽陽性を防ぐ、標的核酸増幅産物を高速に検査する方法を提供する。
本発明は、ＰＣＲ、恒温増幅またはその他の方法で増幅された産物に核酸検査テスト・ストリップを応用した完全密封高速検査装置を提供した。
具体的には、標的核酸増幅産物の交錯汚染を防止、偽陽性を防ぐ、標的核酸増幅産物を高速に検査する方法であって、
ａ）増幅反応完了後、標的核酸増幅産物が漏れ出して汚染を引き起こさないよう反応管のキャップを開けないこと、
ｂ）キャップを開けていない反応管を密封式の装置に入れ、標的核酸増幅産物を物理的に密封された環境中で反応管から検査試験紙まで移動すること、
ｃ）肉眼で見ることができる形式で検査を行い、結果を判定すること、
及び
ｄ）検査後は密封式装置を開けずに全体を安全な場所に廃棄すること、
を含む。
具体的には、本発明は完全密封標的核酸増幅物高速検査装置を提供し、それには内部構造１及び外ボックス１５が含まれ、内部構造１には固定ボックス部分２及び台座部分５が含まれ、固定ボックス部分２には対応する孔があり、洗浄液パック３及び増幅物７を含有するＰＣＲ管１１を入れるのに用い、台座部分５には液パック突き刺し針４を有する洗浄液収納ユニット２１、カッター９を有する増幅物収納ユニット２２、密封仕切り６、グラスファイバー・ペーパー８、並びにテスト・ストリップ１３及び透明窓１２を有するテスト・ストリップ密封部分１４が含まれ、さらに外ボックス１５にはレバー・カバー１６、固定ボックス圧迫部分１７、洗浄液パック圧迫部分１８及び透明窓２０が含まれる。
【０００９】
本発明は完全密封式検査装置を用い、本出願人の核酸高速検査テスト・ストリップ検査技術と結びつけて増幅物を検査する。この方法の操作は簡単、高速で、汚染がなく、増幅物検査に対する根本的な革新となる。本発明と本出願人のその他の技術（ニッカーゼ標的核酸配列増幅方法及び標的核酸配列を増幅するのに用いる試薬キット、本発明者のもうひとつの特許出願参照、出願番号200610057262.7）を結びつけ、新たな核酸高速検査技術のプラットフォームを発展させることができる。該技術プラットフォームを利用して核酸に対して定性及び半定量検査を行うことができ、かつ実験室及び周辺環境に対して汚染を生じず、それによって臨床疾病の診断及び検査並びにその他の生命科学分野にさらに広範に応用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
［発明内容の詳述］
本発明はＰＣＲ、恒温増幅またはその他の方法で増幅した産物を完全密封した装置中で核酸高速テスト・ストリップを応用して検査を行う。この方法は操作が簡単、高速であるほか、最も重要なのは増幅物が実験室を汚染し偽陽性を引き起こすのを防ぎ、大幅に体外診断試薬の信頼性をアップさせることができる、全く新しい検査方法であるということである。この病原微生物に対する検査には非常に重要な意義があり、かつ国家衛生部門の関連規定にも適合する。
具体的には、本発明は、標的核酸増幅産物の交錯汚染を防止、偽陽性を防ぐ、標的核酸増幅産物を高速に検査する方法であって、
ａ）増幅反応完了後、標的核酸増幅産物が漏れ出して汚染を引き起こさないよう反応管のキャップを開けないこと、
ｂ）キャップを開けていない反応管を密封式の装置に入れ、標的核酸増幅産物を物理的に密封された環境中で反応管から検査試験紙まで移動すること、
ｃ）肉眼で見ることができる形式で検査を行い、結果を判定すること、
及び
ｄ）検査後は密封式装置を開けずに全体を安全な場所に廃棄すること、
を含む方法を提供する。
本発明のすぐれた実施方案においては、前記密封式装置はいったんロックされれば二度と開くことができず、それによってボックス内の汚染の可能性のある物品が事故によって外漏れするのを防止する。
本発明のさらにすぐれた実施方案においては、前記措置ｂ）では、反応管と洗浄液を物理的に密封された環境中で開け、標的核酸増幅産物を洗浄液によって動かし検査試験紙まで移動する。
【００１１】
具体的には、本発明は完全密封標的核酸増幅物高速検査装置を提供し、それには内部構造１及び内部構造１が完全密封状態で内部に収容される外ボックス１５が含まれ、内部構造１には固定ボックス部分２及び固定ボックス部分２が載置される状態で取り付けられる台座部分５が含まれ、固定ボックス部分２には、洗浄液パック３、及び増幅物７を含有するＰＣＲ管１１を、それぞれの下端側の一部が固定ボックス部分２から突出した状態で入れるのに用いられる、それぞれに対応する孔が台座部分５への取付側にあり、台座部分５には、固定ボックス部分２の孔から突出した洗浄液パック３の一部を収容すると共に液パック突き刺し針４を有する洗浄液収納ユニット２１、固定ボックス部分２の孔から突出したＰＣＲ管１１の一部を収容すると共にカッター９を有する増幅物収納ユニット２２、洗浄液収納ユニット２１及び増幅物収納ユニット２２の間を仕切る密封仕切り６、洗浄液収納ユニット２１から密封仕切り６を通って増幅物収納ユニット２２に渡るように配置されたグラスファイバー・ペーパー８、並びにグラスファイバー・ペーパー８の増幅物収納ユニット２２側の端部と接続されたテスト・ストリップ１３とこのテスト・ストリップ１３を視認可能にするための透明窓１２とを有すると共に台座部分５の増幅物収納ユニット２２側の端部に立設されて内部にテスト・ストリップ１３を立設方向に沿って収容するテスト・ストリップ密封部分１４が含まれ、さらに外ボックス１５には、内部構造１が挿入される開口部を閉塞するレバー・カバー１６、レバー・カバー１６の内側に位置し開口部の閉塞時に固定ボックス部分２を台座部分５側に押圧する固定ボックス圧迫部分１７、洗浄液パック（３）に圧力を加える洗浄液パック圧迫部分１８、及びテスト・ストリップ密封部分１４の配置側の端面に形成されて透明窓１２を視認可能にするための透明窓２０が含まれる。
【００１２】
さらに具体的には、本発明は完全密封標的核酸増幅物高速検査装置を提供し、それには内部構造１及び内部構造１が完全密封状態で内部に収容される外ボックス１５を含み、内部構造１には固定ボックス部分２及び固定ボックス部分２が載置される状態で取り付けられる台座部分５が含まれ、固定ボックス部分２には、洗浄液パック３、及び増幅物７を含有するＰＣＲ管１１を、それぞれの下端側の一部が固定ボックス部分２から突出した状態で入れるのに用いられる、それぞれに対応する孔が台座部分５への取付側にあり、台座部分５には、固定ボックス部分２の孔から突出した洗浄液パック３の一部を収容すると共にこの洗浄液パック３に対応する液パック突き刺し針４を有する洗浄液収納ユニット２１、固定ボックス部分２の孔から突出したＰＣＲ管１１の一部を収容すると共にこのＰＣＲ管１１に対応するカッター９を有する増幅物収納ユニット２２、両ユニット２１及び２２の間にある密封仕切り６、両ユニット２１及び２２中に置かれ、テスト・ストリップ１３底部とつながっているグラスファイバー・ペーパー８、並びにグラスファイバー・ペーパー８の増幅物収納ユニット２２側の端部と接続されたテスト・ストリップ１３とこのテスト・ストリップ１３に対応する透明窓１２とを有すると共に台座部分５の増幅物収納ユニット２２側の端部に立設されて内部にテスト・ストリップ１３を立設方向に沿って収容するテスト・ストリップ密封部分１４が含まれる。外ボックス１５には、内部構造１が挿入される開口部を閉塞するレバー・カバー１６、レバー・カバー１６の内側に位置し開口部の閉塞時に固定ボックス部分２を台座部分５側に押圧する固定ボックス圧迫部分１７、洗浄液パック３に圧力を加える洗浄液パック圧迫部分１８、及びテスト・ストリップ密封部分１４の配置側の端面に形成された透明窓１２に対応する透明窓２０が含まれる。
【００１３】
図１では本発明の完全密封標的核酸増幅物高速検査装置の構造を説明した。
本発明のすぐれた実施方案において、完全密封検査装置にはさらに固定ボックス部分２のＰＣＲ管１１に対応する孔と台座部分５との間に位置するガスケット・リング１０を含み、それによってＰＣＲ管１１に対応する孔と台座部分５との接触が、吻合、密封されていることを確保し、それによって増幅物が固定ボックス部分２に逆流しないことを確保する。
【００１４】
本発明のもうひとつのすぐれた実施方案において、完全密封式検査装置にはさらに密封仕切り６によって増幅物が洗浄液収納ユニット２１側に逆流せず、増幅物収納ユニット２２側に単方向移動する洗浄液と混合した後、テスト・ストリップ１３に吸収されることを確保する。
【００１５】
本発明のもうひとつのすぐれた実施方案において、さらに密封検査装置に外ボックス１５を含み、レバー・カバー１６によって１個の完全密封された環境を構成し、実験プロセスにおいては、外ボックス１５がいったんロックされれば二度と開くことができず、それによって外ボックス内の汚染の可能性のある物品が事故のために外に漏れるのを防止する。
【００１６】
本発明のさらにすぐれた実施方案において、完全密封検査装置にはさらに固定ボックス部分２のＰＣＲ管１１に対応する孔と台座部分５との間に位置するガスケット・リング１０を含み、それによってＰＣＲ管１１に対応する孔と台座部分５との接触が吻合し、密封されることを確保し、これにより増幅物が固定ボックス部分２に逆流しないことを確保する。密封仕切り６によって増幅物が洗浄液収納ユニット２１側に逆流しないことを確保し、増幅物収納ユニット２２側に単方向移動する洗浄液と混合した後テスト・ストリップ１３によって吸収され、さらに外ボックス１５がレバー・カバー１６によって１個の完全密封された環境を構成し、実験プロセスにおいては、外ボックス１５がいったんロックされれば二度と開くことができず、それによって外ボックス内の汚染の可能性のある物品が事故によって外に漏れることを防止する。
【００１７】
図２では本発明のすぐれた完全密封標的核酸増幅物高速検査装置の構造を説明した。
全体の操作プロセスが完全密封の状態で行われるので、物理的隔離方式で増幅物が実験室を汚染するのを防止し、それによって体外診断試薬の正確性を向上させることができる。本発明の完全密封検査装置の具体的操作手順及び検査メカニズムは以下の通り。
【００１８】
（１）増幅後開けられていないＰＣＲ管１１を固定ボックス部分２のＰＣＲ管孔中に入れる（洗浄液パック３はあらかじめ洗浄液パック管孔中に入れる）。
【００１９】
（２）固定ボックス部分２を外ボックス１５中に入れ、ガスケット・リング１０がＰＣＲ管孔の箇所と台座５の接触が吻合し、密封されていることを保証する。
【００２０】
(3)検査装置の密封カバー16をかぶせる。
【００２１】
（４）検査装置のカバー１６をカバーがしっかり閉まりロックされるまで押し付ける。このとき固定ボックス圧迫部分１７の圧迫で、台座のカッター９が増幅物７を含有するＰＣＲ管１１を割り、洗浄液パック圧迫部分１８の作用で、台座の洗浄液パック突き刺し針４がプラスチックの洗浄液パックの底部を突き破る。
【００２２】
（５）グラスファイバー・ペーパー８の毛細管現象によって、増幅物７及び洗浄液がテスト・ストリップ１３のサンプル・パッド中に吸着される。
【００２３】
(6)液体がサンプル・パッド中を移動、混合しゆっくりと核酸検査テスト・ストリップ底部まで移動する。
【００２４】
(7)混合後の液体が毛細管現象によってテスト・ストリップ底部からゆっくりと核酸検査テスト・ストリップ頂部へ移動し、検査反応液と核酸検査テスト・ストリップ上の検査ラインに抗原抗体特異反応が発生し、検査プロセスを完成する。
【００２５】
(8)10分間静置し、検査結果を観察する。
【００２６】
(9)検査結果を記録し、密封された検査装置全体を安全な場所に廃棄する。
【００２７】
図３では本発明の検査装置の操作手順を説明した。
本発明のすぐれた実施方案においては、前記反応管はＰＣＲ反応管である。
本発明は、前記完全密封標的核酸増幅物高速検査装置を使用して核酸配列増幅物を検査することを含む標的核酸増幅産物高速検査方法をさらに提供する。
本発明は、前記完全密封標的核酸増幅物高速検査装置を使用して、核酸配列増幅物を高速検査し、核酸増幅物の交錯汚染を防止し、偽陽性を防ぐ方法をさらに提供する。
本発明の最もすぐれた実施方案において、本発明は、標的核酸増幅産物の交錯汚染を防止し、偽陽性を回避する、標的核酸増幅産物を高速に検査する方法であって、
ａ）増幅反応完了後、標的核酸増幅産物が漏れ出して汚染を引き起こさないよう反応管のキャップを開けないこと、
ｂ）キャップを開けていない反応管を密封式の装置に入れ、標的核酸増幅産物を物理的に密封された環境中で反応管から検査試験紙まで移動すること、
ｃ）肉眼で見ることができる形式で検査を行い、結果を判定すること、
及び
ｄ）検査後は密封式装置を開けずに全体を安全な場所に廃棄すること、
を含む方法を提供し、前記密封式装置は、前記完全密封標的核酸増幅物高速検査装置であり、実験プロセスにおいて、いったんロックされれば、二度と開くことができず、これによってボックス内の汚染の可能性のある物品が事故によって外漏れするのを防止する。
【００２８】
本出願人のもうひとつの特許（出願番号200610003429.1）では核酸テスト・ストリップ検査の原理及び方法を描写した。該発明は免疫反応を基礎とするタンパク質テスト・ストリップ検査技術を核酸診断試薬に改造した。その要点は検査前の標的核酸増幅物を免疫原性を有する分子または分子複合物に変化させることにある。このようにして、免疫反応を基礎とするタンパク質テスト・ストリップ検査技術の基本的方法はすべて核酸テスト・ストリップ検査に応用できる。
【００２９】
検査前の標的核酸増幅物を免疫原性を有する分子または分子複合物に変化させる基本的方法は、抗原または半抗原(以下「抗原」と略称する)標識プローブを用いて、標識の特異性プローブと検査前の標的核酸増幅物を交雑し、それによって免疫原性を有する分子複合物を形成し、該複合物をタンパク質テスト・ストリップ検査と類似する方法を用いて検査することができる。
【００３０】
図4では単一プローブ法核酸テスト・ストリップ検査の基本原理を説明した。図5では核酸増幅物検査テスト・ストリップの基本構造を説明した。
【００３１】
該発明は核酸増幅物検査に用いるテスト・ストリップを提供した。それには感圧接着剤を伴うライナー２７上に順にサンプル・パッド３１、有色粒子結合物パッド３２、繊維膜２３及び吸水フィルター・パッド２４が含まれ、上記各部分は隣り合った部分が重なり合い、繊維膜上にはさらに検査ライン２５及び品質コントロール・ライン２６が設置され、そのうち有色粒子結合物パッド３２の有色粒子は抗Ａ抗体コーティングを有し、検査ライン２５上に、抗Ｂ抗体コーティング
を有し、品質コントロール・ライン２６上には抗Ａ抗体コーティングを有する。有色粒子はコロイド状金粒子またはラテックス粒子であり、繊維膜は通常ニトロ・セルロース膜またはナイロン膜である。
【００３２】
核酸テスト・ストリップ高速検査技術及び核酸テスト・ストリップ構造に関する詳細な説明は、本出願人のもうひとつの特許を参照。（出願番号200610003429.1）
【００３３】
［発明の効果］
核酸増幅物反応の最大の特徴は、大きな増幅能力及びきわめて高い感度を有することであるが、重大な問題は増幅産物が非常に実験室の汚染を招きやすいことである。きわめて微量の増幅物汚染でも偽陽性を引き起こす可能性がある。増幅後の産物のコピー量が大きく（一般に1011コピー/μl）、さらに増幅物が小分子の物質であるので、空気中に漂ったり、実験台上及び各種実験用品の表面に散乱したりしやすい。操作にわずかな不注意があれば（避けられないときもある）、偽陽性を引き起こす。一方通常のPCR増幅反応終了後、PCR管の管カバーを開け、増幅産物のすべてまたは一部を吸い出し、アガロース・ゲル電気泳動またはその他の方法で検査を行わなければならない。この開放式検査は実験室環境の汚染を招きやすい。そのためいかに汚染を防ぐか、または密封条件で増幅産物の検査を実現するかが科学研究者たちの研究の重点となっている。現在、蛍光定量PCR以外には完全密封という条件で核酸に対する検査プロセスを完成することができる方法はない。
【００３４】
本発明の完全密封式標的核酸増幅物高速検査装置と通常のPCR検査技術を比べると、主に以下の長所がある。
【００３５】
(1)完全密封検査。検査装置の内から外まですべて密封され、二重密封の効果がある。
【００３６】
（A）内部構造密封。増幅反応後のPCR管の管カバーを開く必要がなく、物理学的観点から増幅物の外漏れを防止し、増幅物汚染の機会を最低レベルに低下させ、それによって検査中の偽陽性の発生を防止する。固定ボックスのガスケット・リングが増幅物の固定ボックスへの逆流がないよう確保し、それによって固定ボックスに汚染がないことを保証する。台座の三重密封仕切りも同様に増幅物がグラスファイバー・ペーパーを通って洗浄液パック管底部まで逆流しないよう保障する。
【００３７】
（B）外ボックス密封。ケーシング、レバー・カバー、透明窓からなる外ボックスが1個の完全密封された環境を構成し、実験プロセス中にいったんロックされれば、二度と開けることはできず、それによってボックス内の物品の外漏れを防止する。
【００３８】
(2)特異性が大きい。増幅反応中2個の特異なプライマーを加えるだけでなく、1〜2個の特異なプローブを加えるため（核酸テスト・ストリップ高速検査技術、本発明者のもうひとつの特許参照、出願番号200610003429.1、その検査基本原理は図4参照）、検査反応をさらに特異なものにする。
【００３９】
(3)増幅後標的核酸増幅物検査の高感度を保持する。
【００４０】
(4)操作が簡単で、高速である。検査プロセス全体にわずか10〜15分前後の時間しか必要としない。従来のアガロース・ゲル電気泳動では少なくとも1〜2時間必要。
【００４１】
(5)増幅後検査にいかなる計器設備も必要としない。
該装置によって核酸増幅物の検査及び分析をともに密封状態で完成できるようにしたため、通常の増幅後の核酸検査法中の交雑汚染の危険性を最大限度低下した。この方法は操作が簡単で、時間が短く、同時に検査コストも低減し、検査結果をさらに高速にし、信頼できるものにする。本密封式標的核酸増幅物高速検査装置は、臨床検査での使用において、伝染性疾病診断の正確性を大幅に増加し、患者の医者にかかる時間を短縮し、医療保険システム全体のコストをも低減することができる。この装置は操作が簡単、高速であり、コストは低廉であり、さらに核酸増幅物の実験室に対する汚染を防止するので、生命科学分野で作業し標的核酸増幅物検査が必要な科学技術者にとっても大きな助けとなる。
【００４２】
密封式核酸増幅物検査の汎用技術プラットフォームとして、本発明の方法及びその装置は伝染病病原体臨床検査、突発的な公共衛生事件の戦略的技術ストック、農牧業及び食品工業、税関検査検疫、環境検査、生物兵器検査、人類遺伝病検査、婚前、産前検査及び優生・優育（優良な出産と優れた育児）並びに法医学鑑定、血縁鑑定等の分野に広範に用いることができる。
【００４３】
よく見られる病原体には細菌、真菌、ウィルス、マイコプラズマ、クラミジア、寄生虫等が含まれる。
【００４４】
密封式核酸増幅物検査装置はこれらの病原体を識別できるだけでなく、それらのサブタイプ、有毒菌株、突然変異株及び耐薬性等も識別することができる。
【００４５】
また、本発明の密封式核酸増幅物検査装置は突発的公衆衛生事故の戦略的技術ストックとすることができる。国家はすでに巨額を投資し、全国的な伝染病予防及びコントロール・システムを構築しており、激症型伝染病を診断する高速診断試薬はこれらのセンターにおける通常ストックとなり、突発的公衆衛生事件の発生時に迅速に病原体を識別し、有効にコントロールすることができるようになるだろう。これらの面での検査対象には、例えば、鳥インフルエンザ、SARS、コレラ、ペスト、炭疽病、エボラ出血熱、流行性出血熱等が含まれる。
【００４６】
また、本発明の密封式核酸増幅物検査装置は食品工業に用いることができる。食物中毒はしばしば発生するため、牛乳、飲料、肉類製品等の出荷前検査に特に必要なものである。例えばカビ、大腸桿菌、サルモネラ菌、ボツリヌス菌等がある。
【００４７】
また、本発明の密封式核酸増幅物検査装置は農業に用いることができ、主な農作物有害微生物に対する識別診断は、巨大な経済的及び社会的利益を生むだろう。
【００４８】
また、本発明の密封式核酸増幅物検査装置は牧畜に用いることができ、家畜、魚類及び家禽の疾病診断分野に広い市場を有している。
【００４９】
また、本発明の密封式核酸増幅物検査装置は税関輸出入検疫に用いることができる。これも安定した信頼できる市場である。例えば対外貿易輸入において、国外の有害微生物、病虫卵、遺伝子組み換え製品が我が国に入るのを防止するため等である。完全で感度がよく信頼性のある高速診断システムが必要である。例えば対外貿易輸出において、輸入国に完全な検疫資料を提供し、我が国の農牧業、林業、食品工業等の製品の対外貿易輸出を促進し、貿易摩擦を減少させることができる。
【００５０】
また、本発明の密封式核酸増幅物検査装置は土壌、水源、空気等の環境有害微生物の検査及び識別に用いることができる。簡便で感度がよく高速な現場検査方法は環境検査に対して重要な意義を有している。
【００５１】
また、本発明の密封式核酸増幅物検査装置は生物兵器検査に用いることができる。各国は生物兵器検査の技術を発展させており、我が国も至急に準備しなければならない。よく見られる生物兵器病原体には、コレラ、ペスト、炭疽病、エボラ出血熱、流行性出血熱及び人工的に改造された細菌及びウィルス等がある。
【００５２】
また、本発明の密封式核酸増幅物検査装置は遺伝子突然変異検査に用いることができる。現代分子遺伝学はすでに人類の絶対多数の疾病がさまざまな程度で遺伝子と関連があることを証明している。単一ヌクレオチド多型（SNP）の研究によると、各人のゲノム・タイプはすべて異なっている。このため、各種疾病に対する感受性及び薬物に対する感受性も異なる。ゆえに「個性化医学」を提唱した。例えば重要疾病感受性予測等である。各人の遺伝子タイプに基づき薬物に対する感受性及び耐性を決定し、正確に投薬する等である。よく見られる遺伝子突然変異が引き起こす疾病は100種以上になり、遺伝子欠損、遺伝
子置き換え等の遺伝子突然変異を含む。本発明の密封式核酸増幅物検査装置は人類遺伝病系列診断製品の開発に用いることができ、この巨大な市場需要を満たすことができる。
【００５３】
また、本発明の密封式核酸増幅物検査装置は婚前検査、産前検査、優生・優育等に用いることができる。
【００５４】
また、本発明の密封式核酸増幅物検査装置は犯罪現場の血液、精液、毛髪及びその他のサンプルのDNA鑑定、及び犯罪被疑者DNAの鑑定に用いることができる。
また、本発明の密封式核酸増幅物検査装置は血縁鑑定、遺伝子身分証、集団遺伝子データベース等の面に用いることができる。
【００５５】
以下の実施例ではさらに本発明の技術方案の説明を補充するが、本発明の保護範囲に対する制限を構成するものではない。
【実施例１】
【００５６】
淋菌を例にとった標的核酸PCR増幅物検査。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
2.検査
増幅物を含有するPCR管を固定ボックスのPCR管孔中に入れる。
（洗浄液パックはあらかじめ洗浄液パック管孔中に入れる）
固定ボックスをロックし、検査装置中に入れる。
検査装置のレバー・カバーを閉じる。
検査装置を圧迫するレバー・カバーをしっかりとロックされるまで押して閉める。
10分後結果を判読する。
検査結果を記録し、密封された検査装置全体を安全な場所へ廃棄する。
【００５９】
実施例1の検査結果は図6参照。図6では陽性サンプルが検査ライン（Tライン）で赤色になり、陰性サンプルが無色であることが示されている。陽性サンプル及び陰性サンプルは品質コントロール・ライン（Cライン）のところでともに色が現れ、結果が有効であることが示されている。
【実施例２】
【００６０】
淋菌クローンDNAをテンプレートとした恒温増幅（ニッカーゼ標的核酸配列増幅の方法及び核酸配列増幅に用いる試薬キットは本発明者のもうひとつの特許出願を参照、(出願番号200610003429.1）標的核酸産物の検査
【００６１】
【表２】
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【００６２】
2.検査
増幅物を含有するPCR管を固定ボックスのPCR管孔中に入れる。
（洗浄液パックはあらかじめ洗浄液パック管孔中に入れる）
固定ボックスをロックし、検査装置中に入れる。
検査装置のレバー・カバーを閉じる。
検査装置を圧迫するレバー・カバーをしっかりとロックされるまで押して閉める。
10分後結果を判読する。
検査結果を記録し、密封された検査装置全体を安全な場所へ廃棄する。
【００６３】
実施例２の検査結果は図7参照。図7では陽性サンプルが検査ライン（Tライン）で赤色になり、陰性サンプルが無色であることが示されている。陽性サンプル及び陰性サンプルは品質コントロール・ライン（Cライン）のところでともに色が現れ、結果が有効であることが示されている。
【実施例３】
【００６４】
Leber’s病ミトコンドリアDNA G11778A単一ヌクレオチド多型の検査及びサブタイプLeber’s遺伝性視神経病は母性遺伝の両眼視神経疾病である。1988年W. allaceらがまずミトコンドリアDNA（mtDNA）第11778ヌクレオチド部位原発性突然変異（G→A）がLHONを引き起こしている可能性があることを報告した。現在までに本病と関連するmtDNA部位突然変異が25個あることがすでに発見され、近年の報告において3460または14484等原発性部位突然変異のLHON及び原発・続発突然変異並存のLHON患者の臨床表現が11778部位突然変異に類似している場合、臨床医がその臨床表現に基づいて識別を行うことが難しいため、異なる病因のLeber’s病については分子生物学遺伝子検査が第一に選択される方法でとなる。ミトコンドリアG11778AサブタイプについてのLeber’s遺伝性視神経病に対する診断意義にかんがみ、本特許新発明のSNP密封式核酸増幅物検査装置を応用してG11778A部位多型に対する検査を行う。具体的実施法は以下の通り。
【００６５】
１．サンプリング
被験者の抹消静脈抗凝血（凍結保存）5μlに、杭州優思達生物技術有限公司が生産した微量DNA高速抽出試薬キットを応用して核酸抽出を行い、それによって遺伝子増幅を行う。
【００６６】
２．ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
ゲノム中偽遺伝子のミトコンドリア遺伝子増幅に対する干渉を排除するため、2回増幅を行う必要があり、1回目の増幅産物をテンプレートとして2回目の増幅を行い、その後2回目の増幅産物を利用してSBEを行う。
【００６７】
【表３】
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【００６８】
【表４】
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【００６９】
【表５】
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【００７０】
【表６】
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【００７１】
【表７】
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【００７２】
５．検査
SBE反応物を含有するPCR管を固定ボックスのPCR管孔中に入れる（洗浄液パックはあらかじめ洗浄液パック管孔中に入れる）固定ボックスをロックし、検査装置中に入れる。
検査装置のレバー・カバーを閉める。
検査装置のレバー・カバーをしっかりとロックされるまで押して閉める。
10分後結果を判読する。
検査結果を記録し、密封された検査装置全体を安全な場所に廃棄する。
【００７３】
密封式核酸増幅物検査装置のSNP検査結果は図8参照。図8の結果から、被験者のミトコンドリアND4遺伝子11778部位に突然変異が発生し、GからAに変わり、シーケンス解析結果と一致することがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】本発明の完全密封標的核酸増幅物高速検査装置の構造を示す斜視図及び分解斜視図である。
【図２】本発明のすぐれた完全密封標的核酸増幅物高速検査装置の構造を示す説明図である。
【図３】本発明の検査装置の操作手順を示す説明図である。
【図４】単一プローブ法核酸テスト・ストリップ検査の基本原理を示す説明図である。
【図５】核酸増幅物検査テスト・ストリップの基本構造を示す説明図である。
【図６】実施例１の検査結果を示す説明図である。
【図７】実施例２の検査結果を示す説明図である。
【図８】密封式核酸増幅物検査装置のSNP検査結果を示す説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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