(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の (a)又は(b)のタンパク質。
(a) 配列番号６、８、１０、１２、１８若しくは２４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質のうち、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる活性中心領域と配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなる陽性調節領域とを含み、かつ配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなる陰性調節領域を含まない部分断片からなるタンパク質
【請求項２】
以下の (a)又は(b)のタンパク質をコードする遺伝子。
(a) 配列番号６、８、１０、１２、１８若しくは２４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質のうち、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる活性中心領域と配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなる陽性調節領域とを含み、かつ配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなる陰性調節領域を含まない部分断片からなるタンパク質
【請求項３】
配列番号５、７、９、１１、１７若しくは２３に示される塩基配列からなるDNAを含む遺伝子。
【請求項４】
請求項２又は３記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項４記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項６】
請求項５記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からDel-1タンパク質の部分断片を採取することを特徴とするDel-1部分断片の製造方法。
【請求項７】
請求項１記載のタンパク質と細胞外基質とを反応させることにより、前記タンパク質が前記細胞外基質に沈着する部位を同定する方法。
【請求項８】
請求項１記載のタンパク質を含む、細胞外基質沈着部位同定用試薬。
【請求項９】
請求項１記載のタンパク質と発現の目的分子とが連結した融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項９記載の融合タンパク質を含有する薬物送達システム。
【請求項１１】
請求項２又は３記載の遺伝子と、発現の目的分子をコードする遺伝子とが連結された、融合タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１２】
請求項１１記載の遺伝子を含む組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１２記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項１４】
請求項１３記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からDel-1タンパク質の部分断片と発現の目的分子との融合タンパク質を採取することを特徴とする該融合タンパク質の製造方法。
【請求項１５】
請求項９記載の融合タンパク質を細胞外基質に沈着させ、目的分子を採取することを特徴とする目的分子の回収方法。
【請求項１６】
目的分子を沈着させる方法であって、以下の工程：
(a) 請求項１３記載の形質転換体を培養することによって、発現の目的分子とDel-1タンパク質の部分断片との融合タンパク質を生産させる工程、及び
(b) 前記融合タンパク質を細胞外基質に沈着させる工程
を含む前記方法。
【請求項１７】
目的分子を回収する方法であって、以下の工程：
(a) 請求項１３記載の形質転換体を培養することによって、発現の目的分子とDel-1タンパク質の部分断片との融合タンパク質を生産させる工程、
(b) 前記融合タンパク質を細胞外基質に沈着させる工程、及び
(c) 前記融合タンパク質から目的タンパク質を切断することによって、前記目的分子を採取する工程
を含む前記方法。
【請求項１８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質のうち、活性中心領域と陽性調節領域とを含み、かつ陰性調節領域は含まない部分断片を細胞外基質と反応させることを含む、細胞外基質への沈着活性を調節する方法であって、前記活性中心領域のアミノ酸配列が配列番号４に示されるものであり、前記陽性調節領域のアミノ酸配列が配列番号２０に示されるものであり、前記陰性調節領域のアミノ酸配列が配列番号２２に示されるものである、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、内皮細胞遺伝子座−１（Ｄｅｌ−１）タンパク質の部分断片である細胞外基質沈着タンパク質に関する。また、本発明は、上記部分断片を用いた細胞外基質沈着部位の同定方法、及び、Ｄｅｌ−１タンパク質と融合した目的分子（例えば、アルカリホスファターゼ）回収方法に関する。
【背景技術】  Ｄｅｌ−１（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｌｏｃｕｓ−１）タンパク質（単に「Ｄｅｌ−１」、「全長Ｄｅｌ−１」ともいう）は、ＥＧＦ（上皮増殖因子、ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）類似のドメイン及びジスコイジンＩ類似ドメインを有するタンパク質である。このタンパク質は細胞外基質タンパク質であり、血管内皮細胞表面のαｖβ３インテグリン受容体あるいはαｖβ５インテグリン受容体と呼ばれるタンパク質とＥＧＦ類似ドメインを介して結合し、内皮細胞の細胞外基質への接着を促進することが知られている（Ｈｉｄａｉ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，ＧＥＮＥＳ  ＆  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ  １２：２１−３３，１９９８）。
近年、全長Ｄｅｌ−１をコードする遺伝子がクローニングされた。全長Ｄｅｌ−１はその一部あるいは全部を介して細胞外基質中のプロテオグリカンと結合することができると推察されている。そこで、全長Ｄｅｌ−１を発現させて所定の分子（タンパク質、プロテオグリカン等）を全長Ｄｅｌ−１に結合させ、全長Ｄｅｌ−１に結合した分子（タンパク質、プロテオグリカン等）を回収する方法が知られている（例えば特表平１１−５０７５２７号公報を参照）。
従って、これらの結合部位を特定し結合様式を解析することは、目的分子の回収、及び全長Ｄｅｌ−１に結合する分子の研究解析のために重要である。
しかしながら、全長Ｄｅｌ−１の細胞外基質沈着能はそれほど高くないため、当該全長Ｄｅｌ−１に結合した目的分子を十分に回収することができなかった。
【発明の開示】
本発明は、細胞外基質に効率良く接着することができる領域を含むＤｅｌ−１の部分断片を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ジスコイジンＩ類似ドメイン付近の領域が効率的に細胞外基質に沈着することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１８若しくは２４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号１８若しくは２４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞外基質への沈着活性を有するタンパク質
（２）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号６、８、１０、１２、１８若しくは２４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号６、８、１０、１２１８若しくは２４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞外基質への沈着活性を有するタンパク質
（３）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞外基質への沈着を抑制する活性を有するタンパク質
（４）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１８若しくは２４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号１８若しくは２４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞外基質への沈着活性を有するタンパク質
（５）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号６、８、１０、１２、１８若しくは２４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号６、８、１０、１２、１８若しくは２４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、細胞外基質への沈着活性を有するタンパク質
（６）以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子。
（ａ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質
（ｂ）配列番号１４に示されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、細胞外基質への沈着を抑制する活性を有するタンパク質
（７）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１７若しくは２３に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号１７若しくは２３に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞外基質への沈着活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（８）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号５、７、９、１１、１７若しくは２３に示される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号５、７、９、１１、１７若しくは２３に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞外基質への沈着活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（９）以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡを含む遺伝子。
（ａ）配列番号１３に示される塩基配列を含むＤＮＡ
（ｂ）配列番号１３に示される塩基配列からなるＤＮＡに対し相補的な塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細胞外基質への沈着を抑制する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（１０）（４）〜（９）のいずれか１項に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（１１）（１０）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（１２）（１１）記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からＤｅｌ−１タンパク質の部分断片を採取することを特徴とするＤｅｌ−１部分断片の製造方法。
（１３）（１）〜（３）のいずれか１項に記載のタンパク質と細胞外基質とを反応させることにより、前記タンパク質が前記細胞外基質に沈着する部位を同定する方法。
（１４）（１）〜（３）のいずれか１項に記載のタンパク質を含む、細胞外基質沈着部位同定用試薬。
（１５）（１）〜（３）のいずれか１項に記載のタンパク質と発現の目的分子とが連結した融合タンパク質。
（１６）（１５）記載の融合タンパク質を含有する薬物送達システム。
（１７）（４）〜（９）のいずれか１項に記載の遺伝子と、発現の目的分子をコードする遺伝子とが連結された、融合タンパク質をコードする遺伝子。
（１８）（１７）記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（１９）（１８）記載の組換えベクターを含む形質転換体。
（２０）（１９）記載の形質転換体を培養し、得られる培養物からＤｅｌ−１タンパク質の部分断片と発現の目的分子との融合タンパク質を採取することを特徴とする該融合タンパク質の製造方法。
（２１）（１５）記載の融合タンパク質を細胞外基質に沈着させ、目的分子を採取することを特徴とする目的分子の回収方法。
（２２）目的分子を沈着させる方法であって、以下の工程：
（ａ）（１９）記載の形質転換体を培養することによって、発現の目的分子とＤｅｌ−１タンパク質の部分断片との融合タンパク質を生産させる工程、及び
（ｂ）前記融合タンパク質を細胞外基質に沈着させる工程
を含む前記方法。
（２３）目的分子を回収する方法であって、以下の工程：
（ａ）（１９）記載の形質転換体を培養することによって、発現の目的分子とＤｅｌ−１タンパク質の部分断片との融合タンパク質を生産させる工程、
（ｂ）前記融合タンパク質を細胞外基質に沈着させる工程、及び
（ｃ）前記融合タンパク質から目的タンパク質を切断することによって、前記目的分子を採取する工程
を含む前記方法。
（２４）配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、活性中心領域と陽性調節領域とを含む断片、及び／又は活性中心領域と陰性調節領域とを含む断片を細胞外基質と反応させることを特徴とする、細胞外基質への沈着活性を調節する方法。
（２５）活性中心領域のアミノ酸配列が配列番号４に示されるものである（２４）記載の方法。
（２６）陽性調節領域のアミノ酸配列が配列番号２０に示されるものである（２４）記載の方法。
（２７）陰性調節領域のアミノ酸配列が配列番号２２に示されるものである（２４）記載の方法。
本発明により、Ｄｅｌ−１部分断片が提供される。Ｄｅｌ−１部分断片の発現タンパク質は細胞外基質への沈着活性を有することから、Ｄｅｌ−１部分断片を用いることによって、Ｄｅｌ−１部分断片の発現タンパク質と結合した目的分子を細胞外基質に効率的に沈着させることができる。また当該沈着によって、目的分子を回収または除去することができる。
Ｄｅｌ−１部分断片を用いて目的分子を細胞外基質上に沈着させることによって、当該目的分子を標的組織で濃縮、限局することができる。特に、当該目的分子を血漿への流出を防ぐことによって、他の組織への移行を防止できる。
また、本発明のＤｅｌ−１部分断片の中には、細胞外基質への沈着を抑制する機能を有する蛋白を発現する断片も含まれている。従って、沈着活性を有する断片と細胞外基質への沈着を抑制する断片とを組み合わせて沈着活性を増減することによって、目的分子の回収、除去、濃縮等を制御することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明のＤｅｌ−１部分断片の塩基配列の概略と、各部分断片のアルカリホスファターゼ活性による沈着活性測定結果を示す図である。
図２は、本発明のＤｅｌ−１部分断片の細胞外基質への結合活性を示す図である。
図３は、各肝臓から採取した血漿中のＡＰ／Ｌａｃ比を示す図である。
図４は、各肝臓から採取した肝組織中のＡＰ／Ｌａｃ比を示す図である。
図５は、各肝臓から採取した肝組織のアルカリホスファターゼ染色結果を示す図である。
図６は、ウェスタンブロットを示す図である。
図７は、アルカリホスファターゼの回収結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、細胞外基質に特異的に結合する領域を含む全長Ｄｅｌ−１タンパク質の部分断片、すなわちＤｅｌ−１沈着蛋白及びＤｅｌ−１沈着抑制蛋白（単に、「Ｄｅｌ−１部分断片」ともいう）に関するものである。本発明のＤｅｌ−１部分断片は、全長Ｄｅｌ−１を種々の長さに切断することにより作製されたものであり、細胞外基質への沈着活性を有することを特徴とする。
本発明のＤｅｌ−１部分断片は、全長Ｄｅｌ−１遺伝子（配列番号１）の配列のうち、少なくとも１２７０〜１６６２番の塩基配列の領域によりコードされるアミノ酸（配列番号２に示すアミノ酸配列の２１８〜３４８番のアミノ酸配列）を含むものである。この領域の塩基配列を配列番号３に、これによりコードされるアミノ酸配列を配列番号４に示す。また、上記領域を含む本発明のＤｅｌ−１部分断片は、配列番号５、７、９、１１、１３、１５又は１７に示す塩基配列を有するものであり、これらの塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号６、８、１０、１２、１４，１６又は１８に示す。
上記Ｄｅｌ−１部分断片は、それをコードするアミノ酸配列から、プロテオグリカンと結合することができると推察されている。
全長Ｄｅｌ−１タンパク質またはＤｅｌ−１部分断片の検出には、アルカリホスファターゼを用いた検出法が採用されている。すなわち、遺伝子組み換えにより全長Ｄｅｌ−１タンパク質のＮ末端にアルカリホスファターゼを融合したタンパク質を細胞に発現させることによって、培養上清にも細胞外基質と同様にアルカリホスファターゼ活性を確認することができる。
また、本発明においては、上記アルカリホスファターゼを用いた検出法のほか、Ｄｅｌ−１部分断片等の検出にウェスタンブロット法を用いることもできる。具体的には、アルカリホスファターゼと全長Ｄｅｌ−１またはＤｅｌ−１部分断片とを融合したタンパク質をコードする塩基配列をｃｏｓ７細胞に導入し、一定時間培養後に培養液と細胞外基質を採取してウェスタンブロットを行うことによって検出できる。コントロールとしては例えばラミニンとアルブミンを用いることができる。なお、ウェスタンブロット法において、培養上清中のＤｅｌ−１タンパク質またはＤｅｌ−１部分断片の検出の感度を向上させるために、使用する培養液を増量し、タンパク質を濃縮してもよい。
上記検出法はどちらを採用することもできるが、アルカリホスファターゼを用いた検出法が好ましい。
本発明においては、既知の全長Ｄｅｌ−１を種々の方法によって切断することによって得られた本発明のＤｅｌ−１部分断片を作製し、当該Ｄｅｌ−１部分断片をアルカリホスファターゼを用いた前記検出方法およびウェスタンブロット法による細胞外基質沈着能を調べた。また、Ｄｅｌ−１部分断片の細胞外基質への沈着部位の同定、及び生体内特定部位へのＤｅｌ−１部分断片の固定を行なった。さらに、Ｄｅｌ−１部分断片を用いた目的遺伝子の発現産物の回収を行った。
以下、本発明の実施の形態について具体的に説明する。
１．Ｄｅｌ−１部分断片をコードするＤＮＡ
Ｄｅｌ−１部分断片は、全長Ｄｅｌ−１をコードするＤＮＡを種々の長さに切断し、これを発現させることにより得ることができる。
全長Ｄｅｌ−１遺伝子のクローニングは、公知手法に従って行うことができる（Ｈｉｄａｉ  Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，ＧＥＮＥＳ  ＆  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ，１２：２１−３３，１９９８）。すなわち、ゲノムライブラリーからエクソントラッピングによりエクソンを得、これを用いてｃＤＮＡをクローニングすることができる。
例えば、ゲノムクローンの断片をスプライシングベクターに挿入し、ｍＲＮＡの転写の際にスプライシングを起こさせる。次に、スプライスしたｍＲＮＡを逆転写及び増幅し、エクソンのシークエンスを行う。
得られたエクソンは、ｃＤＮＡライブラリーから目的ＤＮＡを釣り上げるためのプローブとして用いるか、あるいは５’−ＲＡＣＥ、３’−ＲＡＣＥのための遺伝子特異的プライマーの設計に用いられる。なお、ＲＡＣＥ法を行うには、市販のキット（例えば、ＭａｒａｔｈｏｎＴＭ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いることができる。
ｃＤＮＡの塩基配列の決定は、公知の任意の手法により行うことができるが、通常は自動塩基配列決定装置を用いて配列決定が行われる。
このようにして得られた全長ｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。また、配列番号１に示す塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に示す。
本発明の切断型Ｄｅｌ−１部分断片の１つは、配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１〜３４８番目のアミノ酸配列を含むものである。上記部分断片は、配列番号１に示す塩基配列を有するＤＮＡをＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩとＭｕｎｇ  ｂｅａｎ  ｎｕｃｌｅａｓｅを用いて３’末端から順次削除することにより得ることができる。削除される３’末端のＤＮＡはＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩの反応時間により決定される。この方法は市販の酵素（例えばＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ：タカラバイオ社製）を用いることができる。
全長Ｄｅｌ−１（Ｄｅｌ−１  ｍａｊｏｒ）、本発明の切断型Ｄｅｌ−１部分断片および当該部分断片の沈着活性に影響を与えるアミノ酸配列の模式図を図１の左側上部に示す。
図１において、ＣＹは配列番号２に示すアミノ酸配列のうち２１８〜３４８番（配列番号４）、４−１は１〜３４８番（配列番号６）、４−１４は１〜３６８番（配列番号１０）、４−１３は１〜３８５番（配列番号１２）、ＣＢは２１８〜４８０番（配列番号１４）、ＸＹは１２３〜３４８番（配列番号１８）の領域のアミノ酸配列を有する。
これらのＤｅｌ−１部分断片をコードするＤＮＡ（「本発明のＤＮＡ」という）は、ＣＹについては、配列番号１に示す塩基配列の１２７０〜１６６２番（３９３ｂｐ，配列番号３）、４−１については６１９〜１６６２番（１０４４ｂｐ，配列番号５）、４−１４については６１９〜１７２２番（１１０４ｂｐ，配列番号９）、４−１３については６１９〜１７７３番（１１５５ｂｐ，配列番号１１）、ＣＢについては１２７０〜２０５８（７８９ｂｐ，配列番号１３）、ＸＹについては、９８５〜１６６２（６７８ｂｐ，配列番号１７）の領域の塩基配列を有する。
また、ヒトの全長Ｄｅｌ−１においても、マウス断片ＸＹ（配列番号１８）に対応するｈｕｍａｎ  ＸＹ（配列番号２４）の沈着活性を測定した。ｈｕｍａｎ  ＸＹをコードするＤＮＡは、配列番号２３の塩基配列を有する。
図１には示されていないが、本発明の切断型上記Ｄｅｌ−１部分断片として、４−１５は配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１〜３６５番（配列番号８）、ＤＥは２１８〜３１９番（配列番号１６）の領域のアミノ酸配列を有する。これらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、４−１５については、配列番号１に示す塩基配列の６１９〜１７１３番（１０９５ｂｐ，配列番号７）、ＤＥについては１２７０〜１５７５（３０６ｂｐ，配列番号１５）の領域のアミノ酸配列を有する。
また、図１において、本発明のＤｅｌ−１部分断片の沈着活性を向上又は低減させるアミノ酸配列として、ＸＣは１２３〜２１７番（配列番号２０）、ＹＢは３４９〜４８０（配列番号２２）の領域のアミノ酸配列を有する。また、これらのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、ＸＣについては９８５〜１２６９（２８５ｂｐ，配列番号１９）、ＹＢについては１６６３〜２０５８（３９６ｂｐ，配列番号２１）の領域の塩基配列を有する。
さらに、本発明の部分断片は、上記配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも２１８〜３４８番のアミノ酸配列（配列番号４）に示すＣＹを含むものである。また、本発明の部分断片は、上記配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも２１８〜３４８番のアミノ酸配列（配列番号４）を複数連結したタンパク質を含むものである。これらの領域は、細胞外基質への沈着活性を有する中心領域である。上記ＣＹは、配列番号１に示す塩基配列の１２７０〜１６６２番の領域（配列番号３）によりコードされる。
また、配列番号２０に示すアミノ酸配列（ＸＣ）は細胞外基質への沈着活性を向上させるものであり、当該沈着活性の陽性調節領域である。他方、配列番号２２に示すアミノ酸配列（ＹＢ）は細胞外基質への沈着活性を低減させるものであり、当該沈着活性の陰性調節領域である。「陽性調節領域」とは、その領域だけでは沈着活性を生じないが、中心領域ＣＹが含まれることにより沈着活性を引き起こすことができる領域を意味する。「陰性調節領域」とは、その全部又は一部の存在により、中心領域ＣＹや陽性調節領域ＸＣの存在にかかわらず、沈着活性が低下して、可溶性分画が増加する断片の領域を意味する。
本発明のＤｅｌ−１部分断片（マウス及びヒト由来）の領域をまとめると表１の通りである。
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一度部分断片の領域が決定されると、その後は、当該領域を増幅させるようにプライマーを設計し、Ｄｅｌ−１をコードするＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、容易に部分断片をコードするＤＮＡを得ることができる。
ここで、本発明においては、上記Ｄｅｌ−１部分断片のアミノ酸配列からなるタンパク質が細胞外基質との沈着活性を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個、好ましくは１個又は数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
例えば、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２４に示すアミノ酸配列の１個又は数個、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２４に示すアミノ酸配列に、１個又は数個、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号６、８、１０、１２、１８又は２４に示すアミノ酸配列の１個又は数個、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。従って、上記変異が導入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子も、当該タンパク質が細胞外基質への沈着活性を有する限り本発明の遺伝子に含まれる。
また、本発明においては、上記Ｄｅｌ−１部分断片のアミノ酸配列からなるタンパク質が細胞外基質への沈着を抑制する機能を有する限り、当該アミノ酸配列において少なくとも１個、好ましくは１個又は数個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよい。
例えば、ＣＢ領域である配列番号１４に示すアミノ酸配列の１個又は数個、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失してもよく、配列番号１４に示すアミノ酸配列に、１個又は数個、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が付加してもよく、あるいは、配列番号１４に示すアミノ酸配列の１個又は数個、例えば１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換してもよい。従って、上記変異が導入されたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする遺伝子も、当該タンパク質が細胞外基質への沈着を抑制する活性を有する限り本発明の遺伝子に含まれる。
上記欠失、置換、付加等の変異の導入は、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばＧｅｎｅＴａｉｌｏｒＴＭ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン社）、ＴａＫａＲａ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｕｔａｎ−Ｋ、Ｍｕｔａｎ−Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ等：タカラバイオ社製）を用いて行うことができる。
さらに、本発明においては、上記Ｄｅｌ−１部分断片をコードするＤＮＡ（配列番号５、７、９、１１、１７又は２３）に対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって細胞外基質に対し結合活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。ストリンジェントな条件とは、例えば、塩（ナトリウム）濃度が１５０〜９００ｍＭであり、温度が５５〜７５℃、好ましくは塩（ナトリウム）濃度が１５０〜２００ｍＭであり、温度が６０〜７０℃での条件をいう。
さらに、本発明においては、Ｄｅｌ−１部分断片をコードするＤＮＡ（配列番号１３に示す）に対し相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるＤＮＡであって細胞外基質への沈着を抑制する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明の遺伝子に含まれる。
ここで、「細胞外基質」（ＥＣＭ）とは、動物組織中の細胞外に存在する生体構造物であって、細胞内で合成され細胞外に分泌・蓄積した生体高分子の会合体を意味する。主要な構成成分はコラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖タンパク質である。「沈着活性」とは、Ｄｅｌ−１の全部又は一部の領域が細胞外基質に結合する活性を意味し、例えば全長Ｄｅｌ−１よりも沈着活性が高いもの、全長Ｄｅｌ−１よりも沈着活性が低いもの、あるいは全長Ｄｅｌ−１より短いが沈着活性が同等であるものも含まれる。細胞外基質への沈着を抑制する活性とは、陰性調節領域の存在により、中心領域ＣＹや陽性調節領域ＸＣの存在にかかわらず、沈着活性が低下して、可溶性分画が増加する活性を意味する。沈着活性又は細胞外基質への沈着を抑制する活性の測定は、例えば以下の通り行われる。
本発明のＤＮＡにアルカリホスファターゼなどのマーカーをコードするＤＮＡを連結し、これを所定の細胞（例えばｃｏｓ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等）に導入して培養する。培養容器からその培養上清及び細胞を除去した後、培養容器に残った細胞外基質にアルカリホスファターゼの基質を加えて発色させ、沈着活性を測定する。Ｄｅｌ−１部分断片にはマーカー（アルカリホスファターゼ）も結合しているため、Ｄｅｌ−１部分断片が細胞外基質に沈着すると、マーカーを指標として結合活性を測定することができるとともに、結合位置を同定することができる。例えば、可溶性アルカリホスファターゼ基質を用いると、基質が発色（例えば、黄色等に発色）するため、特異的な波長での吸光度を測定することで容易に沈着活性を測定することができる。また、沈着性アルカリホスファターゼを用いると、沈着部位が発色（例えば、紫等）するため、顕微鏡観察等によりその沈着部位を容易に同定することができる。
なお、マーカーはアルカリホスファターゼに限定されるものではなく、その他ＧＦＰとその変異型、ｍｙｃやＨｉｓなどのｔａｇ、ＧＳＴ蛋白、アイソトープ、ビオチン化蛋白などを用いることができる。また、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、βガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子を用いてアッセイすることも可能である。
２．本発明のＤＮＡを含む組換えベクター及び形質転換体の作製
（１）ＤＮＡを含む組換えベクターの作製
本発明のＤＮＡを含む組換えベクターは、適当なベクターに本発明のＤＮＡを連結（挿入）することにより得ることができる。本発明のＤＮＡを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ウイルス等が挙げられる。
プラスミドＤＮＡとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドなどが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ等が挙げられる。またウイルスとしてはアデノウイルスやレトロウイルスなどが挙げられる。
本発明のベクターには、プロモーター、本発明のＤＮＡのほか、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）などを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。
（２）形質転換体の作製
本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、本発明のＤＮＡを発現できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、当分野において周知の細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞を用いることができる。また、マウスなどの実験動物やブタなどの家畜、イネ、トウモロコシなどの植物を用いることができる。
細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列を含めることができる。細菌としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが挙げられる。プロモーターとしては、例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーターなどが用いられる。細菌への組換えベクターの導入方法は特に限定されるものではなく、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）などが用いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発現できるものであれば特に限定されず、例えばｇａｌ１プロモーター、ｇａｌ１０プロモーター、ヒートショックタンパク質プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が挙げられる。酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞（ｃｏｓ７細胞）、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、マウスＬ細胞、ラットＧＨ３細胞、又はヒトＦＬ、ＨＥＫ２９３細胞などが用いられる。プロモーターとしては、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、β−アクチンプロモーター等が挙げられる。動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞などが用いられる。昆虫細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法などが用いられる。
また、動物、植物に対する遺伝子導入にはウィルスベクターを用いる方法や、リポフェクション法などがある。また生殖細胞やＥＳ細胞に対して遺伝子を導入し、遺伝子組み換え動物を作製することも可能である。
３．本発明のＤｅｌ−１部分断片の生産
本発明のＤｅｌ−１部分断片は、前記形質転換体を培養あるいは飼育し、その培養物あるいは飼育産物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。「飼育産物」とは動物、植物の本体、組織、分泌物、排泄物およびそれらの加工品のいずれをも意味するものである。
本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
細菌や酵母等を宿主とする形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。
無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。
培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、例えば３７℃で１２〜２４時間行う。ｐＨの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ−１６４０培地、ＤＭＥＭ培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等が用いられる。
培養は、通常、５％ＣＯ２存在下、３７℃で１〜４日行う。培養中は必要に応じてカナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
培養後、本発明のタンパク質が菌体内又は細胞内に生産される場合には、菌体又は細胞を破砕することによりタンパク質を抽出する。また、タンパク質が菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、前記培養物中から本発明のＤｅｌ−１部分断片を単離精製することができる。
動物（マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウシ等の実験動物又は家畜）、あるいは植物が形質変換体として用いられる場合、それらは通常の飼育、栽培方法以外に、無菌環境や特殊飼料など特殊な飼育培養方法を必要とする可能性もある。形質転換体が上記動物の場合、肉、卵、毛、母乳、尿、糞便などから、一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、本発明のＤｅｌ−１部分断片を単離精製することができる。
また形質転換体が植物の場合、葉、花、実、根などのほか、栽培に用いた土や水などから、一般的な生化学的方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、本発明のＤｅｌ−１部分断片を単離精製することができる。
本発明においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によるＤｅｌ−１部分断片の合成を採用することができる。この場合は、ＲＮＡを鋳型にする方法とＤＮＡを鋳型にする方法（転写／翻訳）の２通りの方法を用いることができる。鋳型ＤＮＡとしては、翻訳開始点の上流にプロモーターとリボゾーム結合部位を有している上記ＤＮＡ、あるいは翻訳開始点の上流に転写に必要なプロモーター等が組み込まれたＤＮＡが挙げられる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳システムは、市販のシステム、例えばＥｘｐｒｅｓｓｗａｙＴＭシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＴＮＴシステム（登録商標；Ｐｒｏｍｅｇａ社）などを用いることができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳システムによるＤｅｌ−１部分断片の翻訳後は、上記生化学的方法を単独で、又は適宜組み合わせることにより、目的の断片を単離精製することができる。
４．目的遺伝子の発現産物の回収
Ｄｅｌ−１部分断片及び目的分子を発現する細胞系又は動植物は、目的遺伝子を発現させることにより、その発現産物である目的分子（例えば、タンパク質、抗体、ペプチド、天然若しくは合成化合物、他の細胞、又は可溶性分子）を回収するために使用することができる。また、Ｄｅｌ−１部分断片を直接使用することもできる。
目的分子を回収する方法を以下に説明する。まず、目的分子とＤｅｌ−１部分断片とが結合した融合タンパク質を作製する。すなわち、当該分子をコードするＤＮＡ及びＤｅｌ−１部分断片コードするＤＮＡを連結し、これを適当なベクターに連結する。これを宿主細胞に導入して培養し、目的分子が連結した融合タンパク質を作製する。ベクターへの連結、細胞への導入、形質転換細胞の培養法、形質転換体の飼育栽培法は前記２項，３項の説明と同様である。
形質転換細胞を用いる場合、上記融合タンパク質のうち、Ｄｅｌ−１部分断片の全部又はその一部の領域は、培養容器上に広がる細胞外基質に沈着する。従って、培養後に培養上清及び細胞を除去しても、融合タンパク質は細胞外基質に沈着した状態で培養容器に残存している。そこで、培養容器から培養上清及び細胞を除去した後、融合タンパク質が沈着している細胞外基質を機械的にかきとることにより、目的分子を回収することができる。また、あらかじめ目的分子のＤＮＡ塩基配列とＤｅｌ−１部分断片の塩基配列の間に特異的な酵素（例えばＦａｃｔｏｒ  Ｘａ）の切断配列を挿入しておけば、その酵素を用いて目的分子のみ回収することも可能である。また、Ｄｅｌ−１部分断片の陰性調節領域を加えることで溶液中に回収することも可能である。
ここで、Ｄｅｌ−１部分断片と発現目的分子とが結合している融合タンパク質から、発現目的分子を同定し単離するために、Ｄｅｌ−１部分断片に標識を付けることが必要である。Ｄｅｌ−１部分断片は、アルカリホスファターゼ若しくは西洋わさびパーオキシダーゼ等の酵素、あるいはフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、フィコシアニン若しくはローダミンを含む蛍光標識などの試薬を用いて標識することができる。
また、本発明のＤｅｌ−１部分断片は、細胞外基質への沈着活性を有するため、結合検定、アフィニティークロマトグラフィー、免疫沈降法、ウエスタン法などに利用することができる。
Ｄｅｌ−１部分断片と結合できる発現目的ポリペプチドの同定は、組換えＤｅｌ−１部分断片によるペプチドライブラリーのスクリーニングによって行うことも可能である。
標識された前記融合タンパク質をランダムペプチドライブラリーとともにインキュベートし、Ｄｅｌ−１部分断片とライブラリー中のペプチドとを結合させる。次にそのライブラリーを洗浄し、未結合のポリペプチドを除去する。アルカリホスファターゼ又はパーオキシダーゼの基質、たとえば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を含むウェルにライブラリーのペプチドを添加し、数分インキュベートすると、アルカリホスファターゼ等が発色するため、目的分子を容易に同定し単離することができる。
形質転換体が動植物の場合、上記融合タンパク質を特定の部位に発現させると、本発明のＤｅｌ−１部分断片は細胞外基質に沈着するため、目的タンパクはその組織で濃縮される。従ってその農畜産物を直接食することや生化学的に抽出することで効率的に目的分子を回収し利用できる。
５．細胞外基質への沈着部位の同定
前記１項において説明したように、本発明のＤｅｌ−１部分断片は、細胞外基質への沈着活性を有する。沈着性マーカーを使用することにより、本発明のＤｅｌ−１部分断片は、視覚的に細胞外基質への沈着部位を観察することができる。
従って、本発明のＤｅｌ−１部分断片は、細胞外基質への沈着部位を同定するための試薬として使用することができ、マーカー、発色基質、マーカーに対する抗体等とともに、細胞外基質沈着部位同定用キットに含めることができる。
６．生物活性物質の生体内特定部位への固定
目的分子と本発明のＤｅｌ−１部分断片とからなる融合タンパク質を特定組織内で発現させた場合、その目的分子は細胞外基質の所定の部位に固定され他の部位へ移行しない。結果として、その部位で濃縮される。
これによって、本発明のＤｅｌ−１部分断片をコードする塩基配列は、適切な細胞、組織又は臓器に特異的なプロモーター配列と組み合わせて、目的分子を特定組織に発現させ、固定、限定、濃縮するためのベクターとして使用することができる。
さらにＢＣＩＰを用いた染色により、細胞外アルカリホスファターゼ活性は細胞外基質に存在することがわかった。（実施例２）
このように、Ｄｅｌ−１タンパク質の部分断片は、全長Ｄｅｌ−１タンパク質よりはるかに強力な細胞外基質沈着能を有し、アルカリホスファターゼのような他のタンパク質を細胞外基質に固定する働きがあることを意味している。
７．生物活性物質による人工物の修飾
ある生物活性物質とＤｅｌ−１部分断片の融合蛋白を産生する大腸菌や細胞を人工物上で培養することで、人工物に生物活性物質をその生物学的機能を損なうことなく沈着させることができる。例えば、図２の結果は、培養皿という人工物がアルカリホスファターゼという活性物質で修飾されたことを示している。血液透析の膜や植え込み用人工素材の修飾に応用できる。
８．沈着活性の調節、薬物送達システム
本発明のＤｅｌ−１部分断片は、目的分子を結合することにより当該目的分子を細胞外基質に沈着させることができる。また、本発明のＤｅｌ−１部分断片は、陽性調節領域と陰性調節領域を利用することで、沈着活性を人為的に調節することができる。例えば、図１に示すＹＢ領域又はＸＣ領域の存在又は不存在により、あるいはこれらの領域の長さを適宜変えることにより、沈着活性の程度を変えることができる（図１の４−８，４−１３，４−１，ＸＹ等）。具体的には、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、活性中心領域ＣＹ（配列番号４、５）と陽性調節領域（配列番号１９、２０）とを含む断片、活性中心領域ＣＹ（配列番号４、５）と陰性調節領域（配列番号２１、２２）とを含む断片、あるいはこれらの両者を、細胞外基質と反応させることにより、陽性調節又は陰性調節によって種々の強さの沈着活性を得る。従って、目的分子を所定の薬理作用を有するタンパク質とすれば、本発明の融合タンパク質を薬物送達システム（ドラッグデリバリーシステム：ＤＤＳ）として使用することも可能である。例えば、中心領域及び陽性調節領域を含む４−１と、抗ガン剤の前駆体を抗ガン剤に変換する酵素の融合蛋白をコードする遺伝子をガン組織に遺伝子導入しておく。その後、抗ガン剤の前駆体を大量に投与すると、ガン組織で健常組織に対して高い薬物濃度を得ることができる。治療後に陰性調節領域を含むＣＢ（配列番号１３、１４）の遺伝子を導入することにより、先に導入した遺伝子産物が血中に遊離し、血液透析などで除去することが可能になる。
【実施例】  以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕  Ｄｅｌ−１部分断片の作製
受精後９から１２日のマウス胎児よりＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてＲＮＡを抽出した。それを鋳型とし、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｐｔ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて逆転写反応を行いｃＤＮＡを作製した。配列番号２に示すアミノ酸配列のうち、シグナルペプタイドの配列を除いた塩基配列６９７〜２０８９を、ＰＣＲで増幅した後にベクターに挿入できる様に、プライマーの５末端に制限酵素認識配列を入れた。プライマーの塩基配列は以下の通りである。
0004817233.tif 000003
ＰＣＲは、以下の反応液組成を用いて、９４℃で３０秒、６２℃で３０秒、７２℃で１分３０秒の反応を３５回行った。
0004817233.tif 000004
このＰＣＲ産物を制限酵素のＢｇｌ  ＩＩとＸｈｏ  Ｉで処理し、プラスミドｐＡＰｔａｇ−５（フナコシ社）に連結した。この様にして作製したプラスミドをＸｈｏ  Ｉで切断した後、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ（タカラバイオ社）で１０秒から２分処理して、図１に示す様々な長さのＤｅｌ−１部分断片（４−８，４−１３，４−１４，４−１，４−１１，２−６，Ｄｅｌ−１  ｍｉｎｏｒ，１−１，２−３）を作製した。また、ＰＣＲを用いて図１に示す様々な長さのＤｅｌ−１部分断片（ＣＢ，ＣＹ，ＹＢ，ＸＹ，ＸＣ，ｈｕｍａｎ  ＸＹ，ＡＰ  ｏｎｌｙ）、および、図１に示されていない、Ｄｅｌ−１部分断片ＦＢ（配列番号１に示す塩基配列の１５７６〜２０５８番）、４−１５（配列番号８）、ＣＥ（配列番号１６）を作製した。
〔実施例２〕  Ｄｅｌ−１部分断片の細胞外基質への沈着活性
（１）実施例１で作製した部分断片のうち、４−８，４−１３，４−１４，４−１，４−１１，２−６，Ｄｅｌ−１  ｍｉｎｏｒ，１−１，２−３をプラスミドｐＡＰｔａｇ−５（フナコシ社）に連結し、ｃｏｓ７細胞に導入した。導入後３日後に培養上清、細胞及び細胞外基質を採取した。まず上清を採取した後、０．０５％ＥＤＴＡを含むＰＢＳを加えてインキュベートすることで細胞が培養皿の底から剥がれて採取可能になり、培養皿の底には細胞外基質が残される。こうしてそれぞれに含まれるアルカリホスファターゼ活性を検出した。対照として、野生型全長Ｄｅｌ−１（ＡＰ４Ｄｅｌ−１）及び培地のみのサンプルを作製し、アルカリホスファターゼ活性を検出した。アルカリホスファターゼ活性は、上清の活性に対する細胞外基質の比（ＡＰ活性比  ＥＣＭ／Ｍｅｄｉｕｍ）として求め、図１の右側にグラフで表示した。
図１より、４−１、４−８，４−１４及び４−１３が野生型Ｄｅｌ−１（Ｄｅｌ−１  ｍａｊｏｒ）よりも活性が強く、４−１１及び２−６は野生型Ｄｅｌ−１よりも活性は低下し、Ｄｅｌ−１  ｍｉｎｏｒではほとんど活性が認められなかった。
沈着活性の中心領域を検討するため、ＣＢ（配列番号１に示す塩基配列の１２７０〜２０５８番）、ＣＹ、ＹＢ、ＸＹ、ＸＣ、ｈｕｍａｎ  ＸＹおよびＡＰ  ｏｎｌｙを発現させて上記と同様にしてアルカリホスファターゼ活性を測定した。
その結果、ＸＹとｈｕｍａｎ  ＸＹでは、野生型全長Ｄｅｌ−１よりも高いアルカリホスファターゼ活性が認められ、またＣＢとＣＹでは、野生型全長Ｄｅｌ−１よりは高くないが、ある程度のアルカリホスファターゼ活性が認められた。これに対し、ＸＣとＹＢではアルカリホスファターゼ活性が認められなかった。
これらの結果から、活性中心領域は配列番号３で示されるＣＹ（配列番号１に示す塩基配列の１２７０〜１６６２番目の領域）、配列番号２に示すアミノ酸配列の２１８〜３４８番目のアミノ酸配列の領域であると考えられた。
ＣＹにＸＣを連結させたＸＹは、前記活性中心領域ＣＹのみに比べて約１０倍の沈着活性を有する。また、ＸＣのみでは、沈着活性をほとんど有しない。したがって、ＸＣは細胞外基質への沈着活性を向上させる、細胞外基質への沈着活性の陽性調節領域であると考えられた。
他方、ＣＹにＹＢを連結させたＣＢは、前記活性中心領域ＣＹのみに比べて、沈着活性が約０．５倍に低減する。したがって、ＹＢは細胞外基質への沈着活性を低減させる、細胞外基質への沈着活性の陰性調節領域であると考えられた。
（２）さらに、実施例１で作製したＤｅｌ−１部分断片のうち、Ｄｅｌ−１  ｍｉｎｏｒ（配列番号１に示す塩基配列の６１９〜１２７１番）又は４−１をプラスミドｐＡＰｔａｇ−５（フナコシ社）に連結し、ｃｏｓ７細胞に導入した。導入後３日後に培養上清、細胞及び細胞外基質を採取した。まず上清を採取した後、０．０５％ＥＤＴＡを含むＰＢＳを加えてインキュベートすることで細胞が培養皿の底から剥がれて採取可能になり、培養皿の底には細胞外基質が残される。そして、それぞれに含まれるアルカリホスファターゼ活性を検出した。
結果を図２に示す。図２において、Ａ〜ＤはＤｅｌ−１  ｍｉｎｏｒを用いて作製したサンプルの結果であり、Ｅ〜Ｈは、４−１を用いて作製したサンプルの結果である。また、Ａ及びＥは細胞を沈着性アルカリホスファターゼ基質（ＢＣＩＰ）で染色したものである。Ｂ及びＦは、細胞を０．０５％ＥＤＴＡを用いて剥がした後、残った細胞外基質をＢＣＩＰで染色した結果である。Ｃ及びＧは、細胞を０．０５％ＥＤＴＡを用いて剥がした後、残った細胞外基質に可溶性アルカリホスファターゼ基質（ＰＮＰＰ）を加えて発色させたときの結果である。Ｄ及びＨは、従来行われていたように、細胞培養液（培養上清）にＰＮＰＰを加え発色反応させたときの結果である。
紫色に染まった箇所がアルカリホスファターゼ活性部位、すなわち４−１の沈着部位である（Ｅ，Ｆ）。図２Ｅ及びＦの結果から、４−１は細胞及び細胞外基質に沈着したことが分かる。これに対し、Ｄｅｌ−１  ｍｉｎｏｒは、細胞及び細胞外基質のいずれにも沈着しなかった（Ａ，Ｂ）。
同様に、４−１を用いたときは、細胞外基質は可溶性基質であるＰＮＰＰによって黄色に染色されたのに対し（Ｇ）、Ｄｅｌ−１  ｍｉｎｏｒを用いたときは全く染色されなかった（Ｃ）。また、細胞培養液にＰＮＰＰを加え発色反応を行なった場合において、Ｄｅｌ−１  ｍｉｎｏｒを用いたときは培養液が黄色に染色されたのに対し（Ｄ）、４−１を用いたときは発色しなかった（Ｈ）。従って、４−１は細胞外基質に沈着し、Ｄｅｌ−１  ｍｉｎｏｒはほとんど沈着しなかったことが分かる。
ところで、本発明においては、図２Ｇに示すように可溶性アルカリホスファターゼを用いて基質を発色させることにより、そのまま吸光度計などを用いて細胞外基質中のアルカリホスファターゼ活性を測定することができる。
そこで、Ｄｅｌ−１部分断片（４−１）及び全長Ｄｅｌ−１について、細胞外基質内及び培養上清中のアルカリホスファターゼ活性を測定し、両者を比較したところ、Ｄｅｌ−１部分断片（４−１）は全長Ｄｅｌ−１より２．５倍も基質への沈着活性が高かった。
（３）実施例１で作製したＤｅｌ−１部分断片のうち、配列番号１７で示す切断型Ｄｅｌ−１遺伝子配列（ＸＹ）とアルカリホスファターゼ遺伝子とを連結したＤＮＡ（ＡＰ／ＸＹ）を導入したマウスの肝臓と、その対照として、アルカリホスファターゼ遺伝子（ＡＰ）のみ導入したマウスの肝臓を調製した。遺伝子導入から２４時間後に、各肝臓から血漿と肝組織を採取して、アルカリホスファターゼ活性を測定した。
ここで、遺伝子導入効率を標準化するため、ベーターガラクトシダーゼ遺伝子を、前記ＡＰ／ＸＹまたはＡＰと同時に導入し、アルカリホスファターゼ活性と共にベーターガラクトシダーゼ活性も測定した。そして、測定されたベーターガラクトシダーゼ活性をベーターガラクトシダーゼ活性の値で割った商を測定値（ＡＰ／Ｌａｃ比）とした。また、アルカリホスファターゼ遺伝子（ＡＰ）のみを導入したマウスの肝臓から採取した血漿または肝組織のＡＰ／Ｌａｃ比を「１」とした場合の、ＸＹとアルカリホスファターゼ遺伝子とを連結したＤＮＡ（ＡＰ／ＸＹ）を導入したマウスの肝臓から採取した血漿または肝組織中のＡＰ／Ｌａｃ比をグラフに示した。図３は各肝臓から採取した血漿中のＡＰ／Ｌａｃ比を示したものであり、図４は各肝臓から採取した肝組織中のＡＰ／Ｌａｃ比を示したものである。
肝組織中のＡＰ／Ｌａｃ比に関しては、ＡＰ／ＸＹを導入した肝臓から採取した肝組織の方が、ＡＰのみを導入した肝臓から採取した肝組織に比べて約８倍のＡＰ／Ｌａｃ比を示した（図４）。これに対し、血漿中のＡＰ／Ｌａｃ比に関しては、ＡＰ／ＸＹを導入した肝臓から採取した血漿では、ＡＰ活性がほとんど検出されなかったため、そのＡＰ／Ｌａｃ比もほとんど０であった。
（４）（３）で調製した、ＡＰ／ＸＹを導入したマウスの肝臓から肝組織の凍結切片を３つ作製した（Ｂ，Ｅ，Ｆ）。同様に、ＡＰのみ導入したマウスの肝臓から肝組織の凍結切片をそれぞれ３つ作製した（Ａ，Ｃ，Ｄ）。
図５は、各肝臓から採取した肝組織の凍結切片を用いてアルカリホスファターゼ染色（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｅ）とβガラクトシダーゼ（Ｄ，Ｆ）による染色を示す図である。ＡとＢは４０倍、Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆは２００倍の倍率での観察である。ＡＰ（Ａ）に対し、ＡＰ／ＸＹ（Ｂ）が著明に沈着していることがわかる。  Ｃ，ＤとＥ，Ｆはそれぞれ連続切片であり、アルカリホスファターゼ染色とβガラクトシダーゼ染色の両方で染色した。ＡＰ（Ｃ，Ｄ）でもＡＰ／ＸＹ（Ｅ，Ｆ）同様にβガラクトシダーゼ染色（Ｄ，Ｆ）で染まっており、遺伝子導入効率に差がないことがわかる。
（５）次に、ウェスタンブロット法を用いて、全長Ｄｅｌ−１および実施例１で作製したＤｅｌ−１部分断片であるＸＹを検出した。具体的には、下記の３種の遺伝子を用意し、各遺伝子をｃｏｓ７細胞に導入した。
（ｉ）配列番号１で示す全長Ｄｅｌ−１遺伝子配列（Ｄｅｌ−１  ｍａｊｏｒ）とアルカリホスファターゼ遺伝子とを連結したＤＮＡ（ＡＰ／Ｄｅｌ−１）
（ｉｉ）配列番号１７で示す切断型Ｄｅｌ−１遺伝子配列（ＸＹ）とアルカリホスファターゼ遺伝子とを連結したＤＮＡ（ＡＰ／ＸＹ）
（ｉｉｉ）また、その対照として、アルカリホスファターゼ遺伝子のみ（ＡＰ）と遺伝子を導入していない（ＮＣ）ｃｏｓ７細胞も用意した。
次に、前記４種のｃｏｓ７細胞をそれぞれ７２時間培養し、培養液（ｍｅｄｉｕｍ）と細胞外基質（ＥＣＭ）を採取してウェスタンブロットを行った。コントロールとしてラミニン（Ｌａｍｉｎｉｎ）とアルブミン（Ａｌｂｍｉｎ）を用いた。
図６は、ウェスタンブロット法による電気泳動を示す写真である。ラミニンをコントロールとして用いた電気泳動を示す写真が上段に、アルブミンをコントロールとして用いた電気泳動を示す写真が下段に配置されている。
図６によれば、ＡＰのみを導入したｃｏｓ７細胞では、遺伝子を導入されていない（ＮＣ）ｃｏｓ７細胞と同様、細胞外基質にアルカリホスファターゼの組換えタンパク質が検出されなかったが、培地では前記組換えタンパク質が検出された。これに対し、ＡＰ／Ｄｅｌ−１またはＡＰ／ＸＹを導入したｃｏｓ７細胞では、細胞外基質においてアルカリホスファターゼの組換えタンパク質が高度に検出された。
〔実施例３〕  目的分子の回収
本実施例は、アルカリホスファターゼを目的遺伝子の発現産物として回収した例を示すものである。アルカリホスファターゼの回収は、アルカリホスファターゼの基質との発色反応により検出を行うことで確認した。
アルカリホスファターゼ遺伝子と切断型Ｄｅｌ−１遺伝子配列（４−１）を連結したＤＮＡを導入したｃｏｓ７細胞と、対照として、野生型ｃｏｓ７細胞およびアルカリホスファターゼ遺伝子のみ導入したｃｏｓ７細胞を調製した。
それらの細胞を３日間培養した後に、０．０５％ＥＤＴＡ溶液で細胞を取り除き、スクレーパーで底面の細胞外基質を回収した。回収したサンプルを遠心器にかけて、遠心の後の上清を取り除くことによってペレットを作製した後、実施例２（図３Ｂ，Ｆ）と同様の操作を行いアルカリホスファターゼの基質であるＢＣＩＰを加えて発色させた。
結果を図７に示す。図７において、（ａ）は野生型ｃｏｓ７細胞、（ｂ）はアルカリホスファターゼ遺伝子のみを導入したｃｏｓ７細胞、（ｃ）は４−１部分断片とアルカリホスファターゼ遺伝子を連結した融合遺伝子を導入したｃｏｓ７細胞の結果である。図４に示したように、Ｄｅｌ−１部分断片（４−１）を導入したサンプル（ｃ）ではペレットが濃青紫に染色された。これによって、不溶性の細胞外基質にＤｅｌ−１部分断片（４−１）を介してアルカリホスファターゼが回収されたことがわかった。これに対し、対照ではほとんど発色しなかったことから、アルカリホスファターゼはほとんど回収されないことが示された。
【産業上の利用可能性】  本発明のＤｅｌ−１部分断片を用いることによって、目的分子を細胞外基質や人工素材に効率的に沈着させることができ、また当該沈着によって、目的分子を回収又は除去に用いることができる。  本発明によりＤｅｌ−１部分断片を用いて目的分子を細胞外基質上に沈着させ、血漿への流出を高度に防止することができるため、本発明のＤｅｌ−１部分断片と当該目的分子とを有する融合タンパク質は、副作用の少ないドラッグデリバリーシステムとして用いることができる。さらに、本発明のＤｅｌ−１部分断片を用いて沈着活性を調整することによって、当該目的分子の局所における濃縮や限局の程度を高度にコントロールすることができ、極めて高機能なドラッグデリバリーシステムとして用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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