(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
４−ブロモ−３−オキソブタン酸エステルに、４−ブロモ−３−オキソブタン酸エステルを（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸エステルに還元する能力を有するペニシリウム属に属する菌株の菌体又は菌体処理物を作用させ、生成物をアルカリ土類金属水酸化物及びアルカリ土類金属ハロゲン化物の存在下に金属シアン化物と反応させ、次いでジアルキル硫酸と反応させることを特徴とする（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エステルの製造法。
【請求項２】
４−ブロモ−３−オキソブタン酸エステルに、４−ブロモ−３−オキソブタン酸エステルを（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸エステルに還元する能力を有するペニシリウム・シトリナム（Penicillium citrinum）に属する菌株の菌体又は菌体処理物を作用させ、生成物をアルカリ土類金属水酸化物及びアルカリ土類金属ハロゲン化物の存在下に金属シアン化物と反応させ、次いでジアルキル硫酸と反応させることを特徴とする（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エステルの製造法。
【請求項３】
４−ブロモ−３−オキソブタン酸エステルに、４−ブロモ−３−オキソブタン酸エステルを（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸エステルに還元する能力を有するペニシリウム・シトリナム（Penicillium citrinum）ＩＦＯ４６３１株の菌体又は菌体処理物を作用させ、生成物をアルカリ土類金属水酸化物及びアルカリ土類金属ハロゲン化物の存在下に金属シアン化物と反応させ、次いでジアルキル硫酸と反応させることを特徴とする（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エステルの製造法。
【請求項４】
アルカリ土類金属水酸化物が水酸化カルシウムであり、アルカリ土類金属ハロゲン化物が塩化カルシウムであることを特徴とする請求項１〜３に記載の（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エステルの製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エステルの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
医薬中間体として有用な化合物である（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エステルは（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルをシアノ化することにより製造することができることが知られている。
しかし、（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルをシアノ化して（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エステルを製造する反応の収率が低いため、高純度の（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エステルを得るためには未反応まま残存する（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルを除く工程が必須であった。
さらに、未反応の（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルを除くためには（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルの熱分解を抑制するために低温低圧下で減圧蒸留する方法及びある種の溶剤の存在下に蒸留する方法等の特殊な精製操作が必要とされていた（特開平１０−２３１２７８号公報）。
本発明は高純度（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エステルを特殊な精製操作を経ることなく製造する方法を提供することを課題とする。
【０００３】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために種々検討した結果、４−ブロモ−３−オキソブタン酸エステルに、４−ブロモ−３−オキソブタン酸エステルを（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸エステルに還元する能力を有する微生物の菌体又は菌体処理物を作用させ、次いでアルカリ土類金属水酸化物及びアルカリ土類金属ハロゲン化物の存在下に金属シアン化物と反応させ、次いで（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸とジアルキル硫酸とを反応させることにより（Ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルが実質的に残存しない（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エステルが簡便に得られ、特殊な精製操作を経ることなく高純度の（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エステルが得られることを見出し本発明を完成した。
【０００４】
すなわち、本発明は４−ブロモ−３−オキソブタン酸エステルに、４−ブロモ−３−オキソブタン酸エステルを（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸エステルに還元する能力を有する微生物の菌体又は菌体処理物を作用させ、次いでアルカリ土類金属水酸化物及びアルカリ土類金属ハロゲン化物の存在下に金属シアン化物と反応させ、次いでジアルキル硫酸と反応させることを特徴とする（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エステルの製造法を提供する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明の原料である４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸エステルとしては、例えばＣ１−Ｃ８アルキルエステル（メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、イソブチルエステル、ペンチルエステル、ヘキシルエステル、へプチルエステル及びオクチルエステル等）が挙げられる。
【０００６】
まず、４−ブロモ−３−オキソブタン酸エステルに、４−ブロモ−３−オキソブタン酸エステルを（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸エステルに還元する能力を有する微生物の菌体又は菌体処理物を作用させる第１のプロセスについて説明する。
【０００７】
第１のプロセスに用いられる４−ブロモ−３−オキソブタン酸エステルを（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸エステルに還元する能力を有する微生物の菌体又は菌体処理物としては、例えばペニシリウム（Penicillium）属に属する菌株の菌体または菌体処理物が挙げられ、具体的には例えばペニシリウム・シトリナム（Penicillium citrinum）の菌体又は菌体処理物が挙げられ、さらに具体的には例えばペニシリウム・シトリナム（Penicillium citrinum）ＩＦＯ４６３１の菌体又は菌体処理物が挙げられる。
【０００８】
ここで第１のプロセスに用いられる微生物の培養について説明する。
第１のプロセスに用いられる微生物は炭素源、窒素源、有機塩、無機塩等を適宜含有する各種の微生物培養用の培地中で培養することができる。
【０００９】
該培地中に含まれる炭素源としては、例えばグルコース、スクロース等の単糖類、でんぷん等の多糖類、グリセロール、有機酸類及び廃糖蜜が挙げられ、窒素源としては、例えば酵母エキス、肉エキス、ペプトン、カザミノ酸、麦芽エキス、大豆粉、コーンスティープリカー（corn steep liquor）、綿実粉、乾燥酵母、硫安及び硝酸ナトリウムが挙げられ、有機塩及び無機塩としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム、炭酸カルシウム、酢酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸第１鉄及び塩化コバルトが挙げられる。
【００１０】
微生物の培養方法としては、例えば固体培養、液体培養（試験管培養、フラスコ培養、ジャーファーメンター培養等）が挙げられる。
培養温度及び培養液のｐＨは第１のプロセスに用いられる微生物が培養できる範囲で任意に定めることができるが、例えば培養温度については１５〜４５℃の範囲内、培養液のｐＨについては４〜８の範囲内を挙げることができる。
微生物の培養時間は、培養条件により適宜定めることができるが、通常は１〜７日間の範囲内である。
【００１１】
培養により得られた微生物の菌体はそのまま第１のプロセスに用いることができる。微生物の菌体をそのまま用いる方法としては、培養液をそのまま反応に用いる方法、培養液を遠心分離することにより菌体を集め、該菌体を緩衝液等で洗浄した湿菌体を用いる方法等が含まれる。
【００１２】
第１のプロセスには培養により得られた微生物の菌体処理物を用いることもできる。反応に用いることができる菌体処理物としては、培養により得られた菌体を有機溶媒（アセトン、エタノール等）処理したもの、凍結乾燥処理したもの、アルカリ処理したもの及び菌体を物理的又は酵素的に破砕したものを挙げることができる。さらに菌体処理物には、菌体に前記の処理を施した後、公知の方法により固定化処理したものも含まれる。
【００１３】
上記微生物の菌体又は菌体処理物を４−ブロモ−３−オキソブタン酸エステルに作用させる方法としては、上記微生物の菌体又は菌体処理物と４−ブロモ−３−オキソブタン酸エステルとを混合して反応させる方法が挙げられる。
【００１４】
第１のプロセスの反応は下記の式で示される。
【化１】
0004765217.tif 000002
【００１５】
該反応は通常、水の存在下で行われ、この場合の水は緩衝液の形態であってもよく、緩衝液に用いられる緩衝剤としては、例えばリン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸のアルカリ金属塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸のアルカリ金属塩が挙げられる。
反応時の水層のｐＨは反応が進行する範囲で適宜変化させることができるが、通常ｐＨ３〜１０の範囲内である。
該反応はさらに疎水性有機溶媒を用いて、水と疎水性有機溶媒との二層系で行うこともできる。この場合に用いられる疎水性有機溶媒としては、例えばギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、ｎ−ブチルアルコール、ｎ−アミルアルコール、ｎ−オクチルアルコール等のアルコール類、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジイソプロイピルエーテル、メチル−ｔ−ブチルエーテル等のエーテル類、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類が挙げられる。
また、反応液には必要に応じてグルコース、スクロース、フルクトース等の糖類、界面活性剤等を加えることもできる。
【００１６】
反応温度は通常０〜６０℃の範囲であり、反応時間は通常０．５時間から１０日間の範囲である。
反応の終点は、４−ブロモ−３−オキソブタン酸エステルを加え終わった後に、例えば反応液中の４−ブロモ−３−オキソブタン酸エステルの量を、高速液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー又は薄層クロマトグラフィー等により測定することにより確認することができる。
反応終了後は反応液を有機溶媒抽出、濃縮等の後処理を行うことにより（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸エステルを単離でき、必要に応じてカラムクロマトグラフィー、蒸留等によりさらに精製することもできる。
【００１７】
次に、（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸エステルをアルカリ土類金属水酸化物及びアルカリ土類金属ハロゲン化物の存在下に金属シアン化物と反応させて（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸を製造する第２のプロセスについて説明する。
該プロセスの反応は以下の式で示される。
【化１】
0004765217.tif 000003
【００１８】
該反応に用いられる金属シアン化物としては例えばシアン化ナトリウム及びシアン化カリウムが挙げられる。アルカリ土類金属水酸化物としては例えば水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム及び水酸化バリウムが挙げられる。アルカリ土類金属ハロゲン化物としては、例えばアルカリ土類金属塩化物及びアルカリ土類金属臭化物が挙げられ、具体的には例えば塩化カルシウムが挙げられる。
【００１９】
該反応は通常水の存在下で行われ、必要に応じてアルコール等の有機溶媒を加えることもできる。
反応温度は通常−１０〜１００℃、好ましくは−１０〜４０℃の範囲であり、反応時間は通常０．５〜４８時間の範囲である。
反応に用いられる金属シアン化物の量は、（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸エステル１モルに対して、通常０．８〜２．０モルの割合である。
反応に用いられるアルカリ土類金属水酸化物及びアルカリ土類金属ハロゲン化物の量は（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸エステル１モルに対して、通常アルカリ金属水酸化物とアルカリ土類金属ハロゲン化物との合計量として、通常０．８〜５．０モルの割合である。
【００２０】
該反応の反応終点は例えば反応液中の（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸エステルの量をガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー又は薄層クロマトグラフィー等により測定することにより確認することができる。
反応終了後は例えば反応混合物に酸性水（塩酸、硫酸等の無機酸の水溶液又はクエン酸等の有機酸の水溶液等）を加えた後、有機溶媒抽出し、得られる有機層を乾燥、濃縮することにより（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸を単離することができる。
【００２１】
次に、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸にジアルキル硫酸を反応さ（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エステルを製造する第３のプロセスについて説明する。
該プロセスの反応は以下の式で示される。
【化３】
0004765217.tif 000004
【００２２】
該反応は通常溶媒中、塩基の存在下に行われる。
反応に用いられるジアルキル硫酸は一般式Ｒ’2ＳＯ4（式中、Ｒ’は低級アルキル基を表す。）で示される化合物であり、具体的には例えば、ジメチル硫酸、ジエチル硫酸が挙げられる。
反応に用いられる溶媒としては、例えば酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン等のエーテル類、水及びこれらの混合物が挙げられ、塩基としては、例えば４−ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン等の第３級アミンが挙げられる。
該反応の反応温度は通常０〜１００℃の範囲であり、反応時間は通常０．１〜２４時間の範囲である。
反応に用いられる試剤の量は、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸１モルに対して、ジアルキル硫酸は通常０．７〜３モルの割合であり、塩基は通常１〜３モルの割合である。
反応時間は通常０．１〜２４時間の範囲内である。
該反応の反応終点は、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー又は薄層クロマトグラフィー等の分析手段を用いて（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸の量を確認することにより決定することができる。
反応終了後は、反応液に重曹水を加えた後、有機溶媒抽出し、得られる有機層を濃縮することにより（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エステルを単離することができ、必要に応じてカラムクロマトグラフィー、蒸留等によりさらに精製することもできる。
【００２３】
なお、第２のプロセスの後、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸を単離することなく、例えば反応混合物に酸性水（塩酸、硫酸等の無機酸の水溶液又はクエン酸等の有機酸の水溶液等）を加えた後、有機溶媒抽出した溶液を必要により乾燥して、第３のプロセスに用いることもできる。この場合、反応に用いられる試剤の量は、（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸エステル１モルに対して、ジアルキル硫酸は通常０．７〜３モルの割合であり、塩基は通常１〜３モルの割合である。
【００２４】
本発明の製造法において用いられる出発物質の４−ブロモ−３−オキソブタン酸エステルはアセト酢酸エステルを公知の方法に準じて臭素化することにより製造することができる化合物である。
【００２５】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこの例に限定されるものではない。
【００２６】
実施例
５００ｍｌ坂口フラスコに液体培地（１Ｌの水にポテト抽出物２００ｇ及びデキストロース２０ｇを加え、滅菌したもの）１００ｍｌを入れ、ペニシリウム・シトリナムＩＦＯ４６３１の菌体を植菌した。これを３０℃で好気条件下、振盪培養した。その後、培養液を遠心分離し、菌体を集めた。この菌体を氷冷した生理食塩水５ｍｌ及び氷冷したアセトン３００ｍｌに懸濁した後、濾過した。得られた菌体を室温で減圧乾燥してペニシリウム・シトリナムＩＦＯ４６３１アセトン処理菌体を得た。この操作を１５回行いペニシリウム・シトリナムＩＦＯ４６３１アセトン処理菌体を全量で１５０ｇ得た。
リン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１５００ｇにグルコース７５ｇ、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸０．８５ｇ、グルコースデヒドロゲナーゼ（グルコース“アマノ”２；アマノエンザイム社製）０．１１ｇを溶解し、ここに３０℃で酢酸ブチル１３００ｇ及び４−ブロモ−３−オキソブタン酸メチル３７ｇを加えた。さらに、前述のペニシリウム・シトリナムＩＦＯ４６３１アセトン処理菌体１５０ｇを加え攪拌した。攪拌中、反応液に１５％炭酸ナトリウム水溶液を徐々に加えることにより、反応液のｐＨを６．５±０．５に保持した。
２４時間攪拌後、反応混合物にセライト９０ｇを加え、減圧濾過した。濾液を分液して得られた有機層を減圧濃縮して（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸メチル２８ｇを得た。（化学純度８８％、光学純度９７％ｅｅ）
なお、生成物の絶対立体配置は（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸メチルの標品と比較することにより決定した。
【００２７】
（化学純度分析条件）
ガスクロマトグラフィー
カラム：ＨＲ−２０Ｍ（０．５３ｍｍ×３０ｍ、１μｍ）（信和化工製）
カラム温度：１２０℃→３℃／分→１５０℃（５分）→１０℃／分→２００℃（５分）
キャリアガス：ヘリウム（２０ｍｌ／分）
検出器：ＦＩＤ
【００２８】
（光学純度分析条件）
高速液体クロマトグラフィー
カラム：キラルセルＯＤ（４．６ｍｍφ×２５ｃｍ、１０μｍ）
移動層：ｎ−ヘキサン／イソプロピルアルコール＝８０／２０（０．５ｍｌ／分）
カラム温度：４０℃
検出器：ＵＶ（２２０ｎｍ）
【００２９】
水５０ｇに塩化カルシウム２３ｇ、水酸化カルシウム８．４ｇを加え、室温で２０分間攪拌した。ここに上記（Ｓ）−４−ブロモ−３−ヒドロキシブタン酸メチル２８ｇを５分間かけて滴下し、さらに室温で１０分間攪拌した。その後、反応液を氷冷し、シアン化ナトリウム８．７ｇを加え、続いて内温２５〜３３℃で４．５時間攪拌した。反応液に濃塩酸を加え、反応液のｐＨを１未満とした後、酢酸エチルで５回抽出した。有機層を合わせて減圧下濃縮し、残渣を酢酸エチル２００ｍｌに溶解した。この酢酸エチル溶液を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過して（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸の溶液を得た。
【００３０】
上記の（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸の溶液に氷冷下で、トリエチルアミン２０ｇ及び硫酸ジエチル２７ｇを滴下し、室温まで自然昇温させながら攪拌した。さらに５５〜６３℃で４０分間攪拌した後、氷冷し、反応混合物に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍｌ）を加えた。その後、有機層を分液し、水層は酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせて飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、濃縮した。残渣を減圧蒸留し、（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エチル１４ｇを得た。（純度９５％；光学純度９７％ｅｅ
ＭＳ（ＥＩ，ｍ／ｚ）  １５７（Ｍ+）
1Ｈ−ＮＭＲ（δ，ｐｐｍ，ＣＤＣｌ3）：１．２９（ｔ，３Ｈ）、２．５７−２．７１（ｍ，４Ｈ）３．５７（ｄ，１Ｈ）、４．２０（ｑ，２Ｈ）、４．３０−４．３９（ｍ，１Ｈ）
［α］D25  −２８°（ｃ  １．０２，ＣＨＣｌ3）
【発明の効果】
本発明により（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブタン酸エステルが簡便に得ることができる。