(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式、
【化１】
0004629871.tif 000013
を有する化合物（II）、または、有機酸または無機酸から誘導されるその酸性塩であることを特徴とする単離された化合物。
【請求項２】
下記の式、
【化２】
0004629871.tif 000014
を有する請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
下記の式、
【化３】
0004629871.tif 000015
を有する化合物（II）、または、有機酸または無機酸から誘導されるその酸性塩を製造する方法であって、
下記の式、
【化４】
0004629871.tif 000016
を有する化合物(III)をNH2(CH2)2N(CH3)2と反応させて、生成化合物を得るステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
さらに、生成化合物を酸で処理するステップを含むことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
さらに、生成化合物を塩素酸ナトリウムおよび／または亜硫酸水素ナトリウムで後続処理するステップを含むことを特徴とする請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
核酸と、下記の式、
【化５】
0004629871.tif 000017
を有する化合物（II）またはそのＮ−オキシド誘導体、または、有機酸または無機酸から誘導されるその酸性塩と、を含むことを特徴とする蛍光複合体。
【請求項７】
前記核酸がＤＮＡであることを特徴とする請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
前記ＤＮＡが、生きている細胞内に存在することを特徴とする請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
一つ以上の核酸を含む細胞または生体材料を分析する方法であって、
ａ）下記の式、
【化６】
0004629871.tif 000018
を有する化合物（II）またはそのＮ−オキシド誘導体、または、有機酸または無機酸から誘導されるその酸性塩と、を含む生体融和性の溶液を製造し、
ｂ）前記細胞または生体材料を、前記生体融和性の溶液で処理し、
ｃ）処理された前記細胞または生体材料中の化合物（II）を光源によって励起し、
ｄ）放射蛍光信号を検出する、ステップを含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記光源が、化合物（IＩ）の最大吸収波長を含むスペクトル領域内に一つ以上の波長を与えることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
化合物（IＩ）が、一つ以上の他の蛍光色素または発光化合物を有する細胞または生体材料内に存在することを特徴とする請求項9または１0に記載の方法。
【請求項１２】
前記蛍光色素がスペクトルのＵＶまたは可視領域の放射を与えることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記一つ以上の他の化合物がアネクシンＶ結合の検出に使用されることを特徴とする請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、フローサイトメトリー分析のステップを含むことを特徴とする請求項１１から１３の中のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
下記の式、
【化５】
0004629871.tif 000019
を有する化合物（II）またはそのＮ−オキシド誘導体、または、有機酸または無機酸から誘導されるその酸性塩の、DNA色素としての化合物の使用。
【請求項１６】
バイオアッセイにおける請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記化合物（II）のＮ−オキシド誘導体の、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
サイトメトリーにおける、請求項１５に記載の使用。
【請求項１９】
前記化合物（II）のＮ−オキシド誘導体の、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の化合物の使用であって、前記サイトメトリーが単ビームまたは多ビームフローサイトメトリーであることを特徴とする使用。
【請求項２１】
顕微鏡検査における、請求項１５に記載の使用。
【請求項２２】
前記化合物（II）のＮ−オキシド誘導体の、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
請求項２１または２２に記載の化合物の使用であって、前記顕微鏡検査が、共焦点レーザー走査顕微鏡検査であることを特徴とする使用。
【請求項２９】
核染色剤としての、請求項１５に記載の使用。
【請求項３０】
像形成剤としての、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アントラキノンとその誘導体に関する。特に、またもっぱらというわけではないが、前記化合物の、蛍光検出技術の分野での使用に関する。
【０００２】
スペクトルのＵＶおよび可視領域の放射を与えるＤＮＡ結合蛍光色素がいくつか使用できる。最近、チアゾールオレンジの改質ダイマーを基材とする、非常に明るいＤＮＡ挿入シアニン蛍光色素が市販されるようになった。これらのシアニン色素は、他のＤＮＡ特異性ＵＶ活性化蛍光色素と細胞浸透性を共有していない。さらに、普通に使用されるＤＮＡ相互作用蛍光色素は、細胞の生物学的側面または生物学的構造を調べるための分子標識として使用され、可視光スペクトル範囲で活性化される他の蛍光色素の蛍光特性と重なる蛍光特性を有する。現在公知のシアニン色素の例は、米国特許第５４１００３０および第５４３６１３４号明細書に開示されている。
【０００３】
本発明は、スペクトルの赤外領域まで延びる蛍光特性を与えうる細胞浸透性のＤＮＡ相互作用薬剤を開発しようとするものである。そのような薬剤は、たとえば、固定試料と生きている細胞との両方に対する多レーザー／多蛍光色素使用において赤色線放射レーザーにより最大励起されうるようなものである。
【０００４】
したがって、本発明の第一の側面によれば、下記の式（Ｉ）、
【化７】
0004629871.tif 000002
を有し、この式において、Ｘ1およびＸ2のそれぞれが互いに独立にＮＨ−Ａ−ＮＲ1Ｒ2であり、ＡがＣ2-8アルキレン基であって、Ｒ1とＲ2が互いに独立に、水素、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4ヒドロキシアルキル、およびＣ2-4アミノアルキルから選択されるか、またはＲ1とＲ2が一緒に、Ｒ1およびＲ2が付加される窒素原子とともに複素環を形成するＣ2-6アルキレン基を形成する化合物、またはそのＮ−オキシド誘導体であって、
また、随意に、有機酸または無機酸から誘導される酸性塩の形とされることを特徴とする化合物（Ｉ）またはそのＮ−オキシド誘導体、が提供される。
【０００５】
ここでは、“アルキレン”という言葉を、アルキル鎖を意味するために使用する。
【０００６】
好ましい実施態様においては、Ｒ1とＲ2が複素環を形成し、該環がその中に３〜７個の炭素原子を有する。好ましくは、Ｘ1とＸ2は両方ともＮＨ（ＣＨ2）2ＮＲ1Ｒ2である。特に、好ましくは、Ｒ1とＲ2は両方ともＣ1-4アルキル基好ましくはメチル基である。
【０００７】
本発明の第二の側面によれば、下記の式（ＩＩ）、
【化８】
0004629871.tif 000003
を有することを特徴とする化合物、が提供される。
【０００８】
一つの実施態様においては、化合物（ＩＩ）はそのＮ−オキシド誘導体の形とすることができる。
【０００９】
一般式（Ｉ）の化合物、また特に特定化合物（ＩＩ）は、たとえば、ＤＮＡ色素として使用することができ、また生体融和性の溶剤たとえば水に可溶の純合成化合物とすることができる。化合物（ＩＩ）は、ＤＮＡに対する大きな親和性を有し（ＤＮＡ結合定数は約１０ｅ７ Ｍ−１である）、また生きている細胞に急速に入り込む能力を有する。
【００１０】
化合物（ＩＩ）の吸光度スペクトルは、６４７ｎｍ付近にＥｘλmaxを示し、また波長６６５ｎｍから波長７８０ｎｍを越えて延びる蛍光スペクトル（Ｅｍλmaxは約６７７．５ｎｍ）を生成する。
【００１１】
本発明のさらなる側面によれば、下記の式（Ｉ）、
【化９】
0004629871.tif 000004
を有し、この式において、Ｘ1およびＸ2のそれぞれが互いに独立にＮＨ−Ａ−ＮＲ1Ｒ2であり、ＡがＣ2-8アルキレン基であって、Ｒ1とＲ2が互いに独立に、水素、Ｃ１−４アルキル、Ｃ２−４ヒドロキシアルキル、およびＣ2-4アミノアルキルから選択されるか、またはＲ1とＲ2が一緒に、Ｒ1およびＲ2が付加される窒素原子とともに複素環を形成するＣ2-6アルキレン基を形成する化合物、またはそのＮ−オキシド誘導体であって、また、随意に、有機酸または無機酸から誘導される酸性塩の形とされる化合物（Ｉ）またはそのＮ−オキシド誘導体を製造する方法であって、
下記の式（ＩＩＩ）、
【化１０】
0004629871.tif 000005
を有する化合物を、Ａ、Ｒ1、およびＲ2が前記のものである、ＮＨ2−Ａ−ＮＲ1Ｒ2と反応させるステップから成ることを特徴とする方法、が提供される。
【００１２】
この方法は、好ましくは、さらに、生成化合物を酸好ましくは濃硫酸で処理するステップを含む。さらに、好ましい実施態様においては、この方法は、さらに、塩素酸ナトリウムおよび／または亜硫酸水素ナトリウムによる後続処理を含むことができる。
【００１３】
モデリングによれば、本発明の化合物はＤＮＡとともに安定な挿入複合体を形成することができる。したがって、本発明のさらなる側面によれば、
核酸と、
下記の式（Ｉ）、
【化１１】
0004629871.tif 000006
を有し、この式において、Ｘ1およびＸ2のそれぞれが互いに独立にＮＨ−Ａ−ＮＲ1Ｒ2であり、ＡがＣ2-8アルキレン基であって、Ｒ1とＲ2が互いに独立に、水素、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4ヒドロキシアルキル、およびＣ2-4アミノアルキルから選択されるか、またはＲ1とＲ2が一緒に、Ｒ1およびＲ2が付加される窒素原子とともに複素環を形成するＣ2-6アルキレン基を形成する化合物、またはそのＮ−オキシド誘導体であって、また、随意に、有機酸または無機酸から誘導される酸性塩の形とされる化合物（Ｉ）またはそのＮ−オキシド誘導体と、
から成ることを特徴とする蛍光複合体、が提供される。
【００１４】
好ましくは、前記核酸はＤＮＡである。このＤＮＡは生きている細胞中に存在しうることがわかった。本発明の化合物は固定されたヒトの染色体を染色することができる。ＤＮＡ：化合物モル比が増大すると、化合物＋ＤＮＡ溶液のスペクトルに深色移動が起る。生きている細胞内で実現できる大きなＤＮＡ：化合物比においては、このスペクトル移動が、すでに、化合物−ＤＮＡ放射スペクトルを赤色放射化合物Ｃｙ５の一例の放射スペクトルから有意に分離することに寄与する。
【００１５】
本発明のさらなる側面によれば、一つ以上の核酸を含む細胞または生体材料を分析する方法であって、
ａ）下記の式（Ｉ）、
【化１２】
0004629871.tif 000007
を有し、この式において、Ｘ1およびＸ2のそれぞれが互いに独立にＮＨ−Ａ−ＮＲ1Ｒ2であり、ＡがＣ2-8アルキレン基であって、Ｒ1とＲ2が互いに独立に、水素、Ｃ1-4アルキル、Ｃ2-4ヒドロキシアルキル、およびＣ2-4アミノアルキルから選択されるか、またはＲ1とＲ2が一緒に、Ｒ1およびＲ2が付加される窒素原子とともに複素環を形成するＣ2-6アルキレン基を形成する化合物、またはそのＮ−オキシド誘導体であって、また、随意に、有機酸または無機酸から誘導される酸性塩の形とされる化合物（Ｉ）またはそのＮ−オキシド誘導体、
を含む生体融和性の溶液を製造し、
ｂ）前記細胞または生体材料を、前記生体融和性の溶液で処理し、
ｃ）処理された前記細胞または生体材料中の化合物（Ｉ）を光源によって励起し、
ｄ）放射蛍光信号を検出する、
ステップから成ることを特徴とする方法、が提供される。
【００１６】
式（Ｉ）を有する化合物は、その遊離状態で存在することができ、あるいは他の分子と、たとえば共有または非共有付加により、複合することができる。
【００１７】
前記光源は、好ましくは、化合物（Ｉ）の最大吸収波長を含むスペクトル領域内の波長を与えるようなものである。
【００１８】
本発明の化合物の蛍光特性はスペクトルの赤外領域まで延びることがわかっている。本発明の化合物は、一つ以上の他の蛍光色素または発光化合物とともに、細胞または生体材料中に存在することができる。前記他の蛍光色素はスペクトルのＵＶまたは可視領域の放射を与えるものとすることができる。したがって、本発明の化合物は、普通に使用される可視領域のＤＮＡプローブのスペクトルと重なるスペクトルを有する他の蛍光色素を用いる、多パラメータ分析に有効である。
【００１９】
一つ以上の他の化合物を、たとえばアネクシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖの検出のために使用することができ、好ましくは、化合物（Ｉ）のＮ−オキシド誘導体とともに使用する。たとえば２レーザーモードの装置により、フローサイトメトリー分析を使用することができる。したがって、本発明は、いろいろな段階の細胞死を経験しつつある細胞から無傷の生きている細胞を区別する方法を提供しうるものである。
【００２０】
したがって、本発明の化合物は、無傷の細胞が必要となりうる細胞質ＤＮＡ分析に適した浸透性の遠赤外／赤外蛍光ＤＮＡ色素を与えるものであり、このような分析の例としては、細胞表面上の分子（たとえば、区別のための受容体分子またはマーカー）または細胞内の分子（たとえば、細胞質ゾル酵素）を、そのような分子の乱れまたは損失を防ぐために膜の完全性を保つ必要のある方法により、検出するものがある。
【００２１】
前述のように、この方法では、本発明の化合物が、固定されたヒトの染色体、固定細胞、および固定生体材料中の核酸を染色することができ、また生きている細胞膜の浸透性を変化させる方法により、核酸を染色することができる。
【００２２】
本発明のさらなる側面においては、バイオアッセイにおける化合物（Ｉ）の使用が提供される。化合物（Ｉ）は、このバイオアッセイにおいて、遊離状態、または共有または非共有付加により他の分子と複合した状態、で存在することができる。化合物（Ｉ）は、該化合物のＮ−オキシド誘導体として存在することができる。このバイオアッセイは、好ましくは、急速および／または大容量の処理方法である。細胞核に対する区別または識別パラメータとしての、化合物（Ｉ）によって示される本発明の化合物の使用を、フローサイトメトリーと共焦点レーザー走査顕微鏡検査との両方について示す。
【００２３】
本発明のさらなる側面によれば、化合物（Ｉ）のサイトメトリーにおける使用が提供される。化合物（Ｉ）は随意に該化合物のＮ−オキシド誘導体として存在する。このサイトメトリーの方法は、たとえば単ビームまたは多ビームフローサイトメトリーとすることができる。
【００２４】
例として、単ビーム（４８８ｎｍ）フローサイトメトリーを使用して、化合物（Ｉ）−核ＤＮＡ蛍光（好ましくは、化合物（ＩＩ）−核ＤＮＡ蛍光）のヒト血液細胞およびリンパ腫細胞に対する区別パラメータとしての有効性を、表面抗原の検出および亜集団識別のための蛍光色素標識づけ抗体との組合せの場合に、示した。化合物（Ｉ）蛍光は、細胞質ＤＮＡ含有量を反映することがわかった。これは、細胞周期年齢に関して細胞の定常または非同調分布を示す指数的増殖細胞集団の細胞周期ＤＮＡ分布プロファイル、またはたとえば薬剤の作用により細胞周期のある時点で細胞の遅れまたは停止が引起された擾乱細胞集団の細胞周期ＤＮＡプロファイルによって示される。一つの実施態様においては、２ビーム（４８８ｎｍ／６３３ｎｍ）フローサイトメトリーが、無傷の細胞における、化合物（Ｉ）好ましくは化合物（ＩＩ）とフルオレセインの選択的励起を示した。また、一つの実施態様においては、３ビームフローサイトメトリー（多重線ＵＶ／４８８ｎｍ／６３３ｎｍ）における化合物（Ｉ）好ましくは化合物（ＩＩ）の使用により、検出器への信号到着の遅れに関するビーム分離により蛍光放射信号に伴う励起ビームの区別を可能とする場合の、遅れ信号区別に関する用途を示した。
【００２５】
本発明のさらなる側面によれば、顕微鏡検査における化合物（Ｉ）の使用が提供される。化合物（Ｉ）は該化合物のＮ−オキシド誘導体として存在することができる。好ましくは、この顕微鏡検査は、共焦点レーザー走査顕微鏡検査（ＣＬＳＭ）である。例として、細胞内化合物（Ｉ）好ましくは細胞内化合物（ＩＩ）の６４７ｎｍまたは５６８ｎｍ波長励起を使用するＣＬＳＭにより、生きているヒトの細胞または固定されたヒトの細胞内での核構造を明らかにする、核内の特定位置からの蛍光を示した。
【００２６】
本発明のさらなる側面によれば、核染色剤としての化合物（Ｉ）の使用が提供される。化合物（Ｉ）は該化合物のＮ−オキシドとして存在することができる。
【００２７】
本発明のさらなる側面によれば、像形成剤（ｉｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔ）としての化合物（Ｉ）の使用が提供される。化合物（Ｉ）は該化合物のＮ−オキシド誘導体として存在することができる。
【００２８】
一つの実施態様においては、化合物（Ｉ）は多フォトン励起像形成における像形成剤として使用することができる。
【００２９】
核の形を明らかにするために化合物（Ｉ）を使用する２波長像形成は、全細胞のエステラーゼ依存フルオレセイン負荷、およびローダミン１２３標識づけによるミトコンドリアの機能評価における不均一性を示すのに使用することができる。そのような像形成用途においては、化合物（Ｉ）は光退色の兆候を示さず、そのまま存続した。
【００３０】
以上のことから、本発明の化合物は、蛍光にもとづく組織の使用、検量、標準化、および構成における薬剤としての用途のための蛍光色素と考えることができる。本発明の好ましい化合物は化合物（ＩＩ）すなわち深赤色蛍光発光ビスアルキルアミノアントラキノン（ＤＲＡＱ５）である。
【００３１】
ここでの発見によれば、赤色線レーザービームの組織内への大きな侵入と本発明の化合物の浸透性とにより、生きた組織内での核の三次元的配向決定と定位とを可能にする組合せが提供される。また、安価なＨｅＮｅレーザーまたはパワーを大きくした他の赤色光放射装置が使用できることにより、本発明の化合物が、蛍光特性を区別パラメータとして使用できる検出システムにおける用途を見出すことが可能になる。
【００３２】
以上、本発明を説明したが、本発明は、前述の特徴および以下で説明する特徴のすべての発明的組合せを含む。
【００３３】
以下、本発明の実施形態を、添付の図面と実施例とにより説明する。
【００３４】
実施形態１
ＤＲＡＱ５の合成
【化１３】
0004629871.tif 000008
【００３５】
手順：
１，５−ジクロロアントロキノン（１５ｇ、５４ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（４７．６ｇ、５４０ｍｍｏｌ）に溶解させ、１８ｈ、還流させた。反応を、ＴＬＣ（９：１のＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ）によってモニターした。混合物を室温に冷却し、水で希釈して、標記の化合物を析出させた。ろ過した固体を、メタノールから再結晶させ、結晶性固体として（Ａ）（１５．８９、８９％）を得た。Ｒf（９：１ ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ）：０．６０。
1Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ ９．８（ｔ、２Ｈ）、７．６（ｍ、４Ｈ）、６．９（ｍ、２Ｈ）、３．４（ｑ、４Ｈ）、２．７（ｔ、４Ｈ）、２．４（５、１２Ｈ）。
質量スペクトル、ｍ／ｚ ３８１（ｍ+＋ｌ）。
【００３６】
アントラセン−９，１０−ジオン誘導体（Ａ）（６ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）を、６５ｇの濃Ｈ2ＳＯ4に溶解し、１０℃に冷却した。無水塩素酸ナトリウム（６．５ｇ、６１．６ｍｍｏｌ）を部分に分けて１．５ｈかけて添加し、次に混合物を室温で３ｈ攪拌した。得られる青い溶液を、ゆっくりと、亜硫酸水素ナトリウム冷溶液（１％、１０００ｍｌ）に添加した。混合物を、５Ｍ ＮａＯＨにより、ｐＨ７に中和した。標記の化合物（Ｂ）を、ＣＨ2Ｃｌ2により水性相から抽出し、減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ2、９：１ ＣＨ2Ｃｌ2／ＭｅＯＨ）により、（Ｂ）（１．２ｇ、２０％）を得た。
【００３７】
実施形態２
ＤＲＡＱ５Ｎ［１，５−ビス−（（２−ジメチルアミノ−Ｎ−オキシド）エチル）アミノ−４，８−ジヒドロキシアントラセン−９，１０−ジオン］の合成
標記の化合物を実施形態１（ＤＲＡＱ５）から下記のようにして製造した。ＤＲＡＱ５（０．１ｇ、２４ｍｍｏｌ）を、乾性（ｄｒｙ）ジクロロメタンに溶かしたメタクロロペルオキシ安息香酸（純度８０％、０．１８６ｇ、０．９６ｍｍｏｌ）に添加し、−２０℃で一晩放置した。粗製生成物を、溶離溶剤として ９：１：０．１のジクロロメタン：メタノール：アンモニア（比重０．８８）を使用して、シリカカラムクロマトグラフィーにかけた。標記化合物を青い粉末として分離した。融点２２１℃。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）ｄ（デルタ）７．３９（ｄ、２Ｈ）、７．２（ｄ、２Ｈ）、４．０（ｔ、４Ｈ）、３．６５（ｔ、４Ｈ）、３．３０（Ｓ、１２Ｈ）  １３Ｃ ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）：ｄ（デルタ）１８９、１５６．５、１４７、１３０、１２２．５、１１６、６９．５、５９．５、３８．５。質量スペクトル ｍ／ｚ ４４５（Ｍ＋＋１）。
【００３８】
実施形態３
ＤＲＡＱ５のスペクトル分析
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｌａｍｂｄａ １６ ＵＶ分光計と、ジクロロメタンに溶解させた薬剤の１０μＭ溶液を使用し、１ｃｍ経路長の石英−シリカキュベット内で測定することにより、吸収スペクトルを得た。１ｃｍ経路長の半ミクロ石英シリカキュベット内の２０μＭ ＤＲＡＱ５の０．８ｍｌ溶液の蛍光スペクトルを、波長６４７ｎｍでの励起、または波長６７０ｎｍでの放射をモニターすることにより、決定した。蛍光の測定は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ５０分光蛍光計により、スリット幅を１０ｎｍに設定して、実施した。この分光蛍光計は赤に敏感な光電子増倍管（ＰＭＴ；タイプＲ９２８；浜松ホトニクス（株）、日本）を備えている。それぞれの条件に関して、四回の走査を蓄積し、展開シート（ｓｐｒｅａｄｓｈｅｅｔ）プログラムに移して、緩衝制御のための値を補正し、また放射最大値を決定した。ＤＮＡ−ＤＲＡＱ５蛍光は、マイクロリットルの体積の濃縮した子ウシの胸腺ＤＮＡ溶液を、攪拌しながらキュベットに装入することにより、測定した。薬剤とＤＮＡのどちらも、ＤＮＡ結合緩衝剤（０．０５Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ６．２、０．０５Ｍ ＮａＣｌ、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ；３）に溶かして製造した。得られたスペクトルは緩衝剤バックグラウンドを補正したが、ＰＭＴのスペクトル感度は補正しなかった。ローダミン１２３スペクトルは、４８８／５ｎｍ励起の使用または５３０／５ｎｍ放射のモニターにより、ＤＮＡ結合緩衝剤中で生成させた。すでに公表されている励起および放射スペクトルは、オリジナルのソースファイルから入手し、ピーク強度に関して規格化した。
【００３９】
ＤＲＡＱ５のスペクトルの特性、およびＤＲＡＱ５のＤＮＡとの相互作用
図１ａ〜ｃは、ＤＲＡＱ５のスペクトル特性を示す。
図１ａ：ＤＲＡＱ５（ジクロロメタン中に１０μＭ）の可視吸収スペクトル。
図１ｂ：それぞれの放射波長に対する励起スペクトルの比較。ＦＩＴＣ（○、６２０ｎｍ放射）、ローダミン１２３（▽、０．５μｇ／ｍｌ、５３０ｎｍ放射）、テキサスレッド（△、６６０ｎｍ放射）、Ｃｙ ５．１８（□、７１５ｎｍ放射）、ＤＲＡＱ５（●、６７０ｎｍ放射）。
図１ｃ：それぞれの励起波長に対する放射スペクトルの比較。ＦＩＴＣ（○、４２５ｎｍ励起）、ローダミン１２３（▽、０．５μｇ／ｍｌ、４８８ｎｍ励起）、テキサスレッド（△、５００ｎｍ励起）、Ｃｙ ５．１８（□、５７０ｎｍ励起）、２０μＭのＤＲＡＱ５（●、６４７ｎｍ励起）、および２０μＭのＤＲＡＱ５＋１２８０μＭのＤＮＡ（●、６４７ｎｍ励起）。
【００４０】
図１ａは、ｐＨ７．４のリン酸塩緩衝剤中のＤＲＡＱ５の可視吸収スペクトルを示す。このスペクトルは６２２および６７６ｎｍに極大を示し、またデータは示さないが２４０および３１４ｎｍに極大を示す。波長６７６ｎｍにおける消衰係数は、２０９４９ｃｍ-1ｍｏｌ-1と計算された。ＤＲＡＱ５の蛍光特性を調べ、フローサイトメトリーおよび共焦点像形成によって生成される蛍光計データの解釈ができるようにした。励起スペクトルは、４６０〜６６０ｎｍの範囲において、波長６８０ｎｍの放射に関して生成させ、ローダミン１２３に関して最適化した励起スペクトルおよび他の蛍光色素の励起スペクトルと比較した。図１ｂによれば、６３０〜６５０ｎｍ領域のＤＲＡＱ５の励起は、シアニン色素Ｃｙ５．１８の励起スペクトル（Ｅｘλmax ６４９ｎｍ）と本質的に似ているが、テキサスレッド（Ｅｘλmax ５９６ｎｍ）、ローダミン１２３（Ｅｘλmax ５１１ｎｍ）、およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ；Ｅｘλmax ４９０ｎｍ）の励起スペクトルとは異なる。図１に示すすべてのケースにおいて、スペクトルはＥｘλmaxまたはＥｍλmaxにおける強度値に対して規格化してある。
【００４１】
ＤＲＡＱ５だけの放射スペクトル（図１ｃ）によれば、６４７ｎｍ励起の場合、６６５ｎｍから７８０ｎｍを越える波長まで有意の放射が延びており、Ｅｍλmaxは６７７．５ｎｍである。この放射スペクトルは、Ｃｙ５．１８のそれに比して、有意の赤色移動を示している。ＤＲＡＱ５はずっと短い波長の場合にも残留励起性を示すように思われるが、ＤＲＡＱ５の波長５１４ｎｍ励起の場合の蛍光強度は、６４７ｎｍ励起の場合の値に比して、低下している。これは、励起スペクトルの特性と一致している（データ示さず）。
【００４２】
分子モデリングによれば、ＤＲＡＱ５は挿入によりＤＮＡと結合することができ、芳香環構造の対向辺上の側鎖がそれぞれＤＮＡ上の分子を安定させる能力を有する。
【００４３】
蛍光計実験によれば、ＤＮＡはＤＲＡＱ５の蛍光に複雑な仕方で影響し、ＤＮＡ：ＤＲＡＱ５比が大きくなると、赤色移動が起り、ＤＮＡ：ＤＲＡＱ５比が６４のとき、Ｅｍλmaxは６９７ｎｍとなる。ＤＮＡ相互作用に関するこの移動を、図１ｃに示す。生存できる細胞におけるものと同等の大きなＤＮＡ：ＤＲＡＱ５比の場合、色素−色素消光効果によるＤＲＡＱ５信号の損失は、最小限となる。Ｅｍλmaxの赤色移動と７３０ｎｍを越える波長におけるかなり小さな赤外／赤外信号とは、類似の励起特性であるにもかかわらず、Ｃｙ５．１８からこのプローブを消し去る。
【００４４】
実施形態４
新しい深赤／赤外蛍光ＤＮＡ結合プローブとしての、ＤＲＡＱ５の像形成と顕微鏡検査での使用
本発明の好ましい側面は、細胞質ＤＮＡのための区別または配向マーカーとして作用することができ、蛍光特性がスペクトルの赤外領域まで延びている、細胞浸透ＤＮＡ相互作用色素の開発に関する。本発明は、多レーザー、多蛍光色素、および多フォトン励起顕微鏡検査法を、固定試料と生きている細胞との両方に対して使用することを可能にする。ここでは、ＤＲＡＱ５のスペクトル特性について述べ、また共焦点レーザー走査顕微鏡検査を用いる生細胞および固定細胞の多パラメータ分析におけるこのＤＮＡプローブの使用可能性を示す。
【００４５】
細胞培養
ヒトの黒色腫細胞系Ａ３７５を、イーグルの最小必須培養液に１０％の胎児子ウシ血清、１ｍＭのグルタミン、および抗生物質を補充した培養液内での非同調培養物として成長させ、５％ＣＯ2空気雰囲気中、３７℃で培養した。像形成実験のために、処理に先立って、４８ｈ、６ウェルプレート内のオートクレーブ処理カバーガラス上の単層の形で５ｘ１０4細胞／ウェルの密度で、細胞を成長させた。貼りつけた生細胞を、顕微鏡検査のために新鮮なリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）内に導入した。明記してある場合、貼りつけた細胞を、再水和に先立って、−２０℃で１０ｍｉｎ、７０％メタノールで固定し、それから５ｍｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａの存在下で、５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムにより、１０ｍｉｎ、染色した。
【００４６】
薬剤の調製と処理
ＤＲＡＱ５を前述の原理によって合成し、１０ｍＭの貯蔵水溶液として、＋４℃で保存した。ＤＲＡＱ５の希釈液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）によって調製し、直接に培養物に加えた。フルオレセインジアセテート（ＦＤＡ；Ｋｏｃｈ Ｌｉｇｈｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１２ｍＭの貯蔵アセトン溶液として調製し、−２０℃で保存した。細胞を、そのまままたはＤＲＡＱ５への５０ｍｉｎ暴露のあと、３７℃で１０ｍｉｎ、０．２μＭのＦＤＡで処理した。同様にＤＲＡＱ５処理した細胞に、分析に先立って、２μｇ／ｍｌ培養液により、１０ｍｉｎ、ローダミン１２３（レーザーグレード；Ｋｏｄａｋ）で標識づけした。
【００４７】
無傷の細胞の共焦点レーザー走査顕微鏡検査（ＣＬＳＭ）
使用したシステムは、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ４Ｄ（ＬａｓｅｒＴｅｃｈｎｉｋ Ｇｍｂｈ、ドイツ）スキャナーを、Ｌｅｉｚ ＤＭ Ｒ顕微鏡に接続したものであり、Ｏｍｉｎｃｈｒｏｍｅのアルゴン／クリプトンレーザーを用いて動作させた。このレーザーは、可変パワーで、４８８、５６８、および６４７ｎｍの放射線を与える。カバーガラス培養物をＰＢＳで軽く洗浄し、スライドガラスに裏返しに取りつけて、このカバーグラスのへりをワセリンのパイプで支持して、細胞が圧迫されないようにした。ただちにこのスライドガラスを、ｘ１００またはｘ４０の油浸対物レンズを用いて、中間範囲のピンホールおよび光電子増倍管ゲイン設定により、観察した。ＤＲＡＱ５、フルオレセイン、およびローダミン１２３に対する励起／放射波長は、それぞれ、６４７ｎｍ／＞６６５ｎｍ、４８８ｎｍ／＞５１５ｎｍ、および４８８ｎｍ／＞５９０ｎｍである。ゲイン設定値は、大部分の蛍光薬剤処理試料が飽和直下のピクセル強度を与えるように調節した。黒レベル／オフセットは、未処理対照試料の像の１６ｘラインノイズろ過のあと、事実上ゼロのバックグラウンド（＜４のピクセル値に対して）が与えられるように調節した。このようにした場合、未処理対照試料は、最小の自己蛍光発光を示し、また認めうる像を与えず、したがってバックグラウンド補正の必要がなかった。記憶した像を、ＩＰ Ｌａｂ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｉｍａｇｅ 分析ソフトウェア（Ｓｉｇｎａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．Ｖｉｅｎｎａ、バージニア州、アメリカ）により、分析と合併のために変換した。
【００４８】
生きている細胞におけるＤＲＡＱ５蛍光のＣＬＳＭ分析
ＤＲＡＱ５蛍光の励起波長依存性、およびその蛍光信号と他のＤＮＡプローブの蛍光信号とのスペクトル分離、に関するある程度の知見を得るために、ＤＲＡＱ５または臭化エチジウムで着色した細胞を比較した。４８８ｎｍまたは５６８ｎｍ励起におけるＣＬＳＭの感度範囲を、臭化エチジウムで染色したエタノール固定細胞の蛍光に関して最適化し（図２ｄ〜ｆ）、また６４７ｎｍ励起の像形成はＤＲＡＱ５処理の生きている細胞に関して最適化した（図２ｃ）。図２ａ〜ｆによれば、核の像形成に適した蛍光色素濃度で、かつ適当な放射ろ過の場合、４８８ｎｍおよび６４７ｎｍ励起条件を、それぞれ、臭化エチジウムまたはＤＲＡＱ５染色の単独像形成に使用することができる。ＤＲＡＱ５は、また、無傷の生きている細胞に見られる核構造の多くを保存する固定細胞の像形成にも使用することができる（データ示さず）。蛍光活性化は、ＤＲＡＱ５で染色した固定細胞の多フォトン励起を用いた場合にも観察された（ヒトＢ細胞リンパ腫細胞；エタノール固定；２０μＭのＤＲＡＱ５；改変ＭＲＣ６００共焦点像形成システムによる１５ｍＷでのＹＬＦモード固定レーザー励起；Ｅｘλ＝１０４７ｎｍ；Ｅｍλ＝遠赤外；図２ｇ）。
【００４９】
６４７ｎｍ励起のＣＬＳＭにより（図２ｃ）、核定位蛍光が明瞭に見られる。これは、遮蔽した（ｓｃｒｅｅｎｅｄ）、他のアントラキノンおよびアンスラサイクリンを基剤とする薬剤から得られるものとはまったく異なる。これらの薬剤は、核と細胞質との両方の信号を生成する。図２ｃによれば、ＤＲＡＱ５処理した生きている細胞は、核構造の明瞭な境界ならびに核小体および核膜領域の端の限界を示している。
【００５０】
以上のことからわかるように、図２ａ〜ｆは、ＣＬＳＭによって検出されるＤＲＡＱ５に伴うＤＮＡ蛍光のスペクトル特性を示す。パネルａ〜ｃは、それぞれ、ヒトの生きているＡ３７５黒色腫細胞の波長４８８、５６８、および６４７ｎｍにおける励起。パネルｄ〜ｆは、それぞれ、臭化エチジウムで染色したエタノール固定細胞の波長４８８、５６８、および６４７ｎｍにおける励起。像は１００ｘ１００μｍの領域。
【００５１】
ＤＲＡＱ５の多フォトン像形成
２フォトン励起蛍光顕微鏡法の原理は、最初にＷｅｂｂとその共同研究者によって示された（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８、７３−７６（１９９０）；米国特許第５，０３４，６１３号明細書）。この方法は、基本的には、励起可能な分子による２個のフォトンの捕捉を、そのような事象に好ましい励起条件を整えることによって、実現するものである。多フォトン事象のための特定蛍光色素における励起スペクトルは、対応する単フォトン励起スペクトルとは異なるが、放射スペクトルは励起モードとは無関係である。像形成に使用するときの、励起システムの重要な要素は、大きな反復速度で超短パルスを与える調節可能または固定波長のモード固定レーザーである。この多フォトン顕微鏡は、一般に、調節可能なＴｉ−サファイヤレーザーを有し、このレーザーは、パルス幅約１００フェムト秒、反復速度８０ＭＨｚで、波長範囲７００〜９５０ｎｍの放射を与える。固定波長レーザー、たとえば１０４７ｎｍでの多フォトン励起を与えるＹＬＦモード固定レーザーも使用できる。そのようなレーザーのピーク強度は非常に大きく、したがって急速な継起の二つ以上のフォトンの吸収によって色素励起が起りうる。重要なことは、多フォトン励起が短い（たとえば、ＵＶ）励起波長の必要をなくすということである。さらに、蛍光励起が焦点スポット領域に局所化されるので、多フォトンシステムにより、小さな退色で走査対象を光学的に断面観察することができる。ＤＲＡＱ５の多（２）フォトン励起を、ＹＬＦモード固定レーザーによって実現した。固定細胞内の核定位蛍光を示す捕集像の例を、図２ｇに示す。また、波長７４０ｎｍの放射を与えるＴｉ−サファイヤレーザー（５Ｗポンピング）による、固定細胞の核内のＤＲＡＱ５の多フォトン励起をも観察した（ＵＶ励起ＤＲＡＱ５処理細胞核に対する能力に対応；図１１参照）。ＤＲＡＱ５の励起スペクトルは、他の蛍光色素に関する知見と一致して、短フォトン分光法によって決定されたものとは異なると予想される。赤外レーザービームの貫入性により、ＤＲＡＱ５の多フォトン励起には、核定位、定量、および形態のための深い断面／組織走査における用途が与えられ、複雑な細胞環境の正確な３次元再構成が可能となる。
【００５２】
図２ｇは、ＤＲＡＱ５染色細胞核の多フォトン像形成を示す。ヒトＢ細胞リンパ腫細胞を、エタノールで固定し、２０μＭのＤＲＡＱ５で染色した。１５ｍＷでのＹＬＦモード固定レーザー励起（Ｅｘ λ＝１０４７ｎｍ；Ｅｍ λ＝遠赤外）を使用し、６０ｘの開口数１．４の油浸対物レンズ、ズーム因子（ｚｏｏｍ ｆａｃｔｏｒ）１．９、およびＫａｌｍａｎ平均３７フレーム、を使用して、像を得た。
【００５３】
生きている細胞内のＤＲＡＱ５およびＮ−オキシド誘導体（ＤＲＡＱ５Ｎ）の蛍光のＣＬＳＭ分析
化合物（Ｉ）の一般式を有する化合物構造の変化が生きている細胞の染色特性におよぼす影響を明らかにすることを試みた。ＤＲＡＱ５のＮ−オキシド誘導体（すなわち、ＤＲＡＱ５Ｎ）は一般構造（Ｉ）を保存しているが、全体的に電荷を失っている。この変化は生きている細胞内での薬剤の結合能力の実効性に影響を与え、一方蛍光、細胞浸透性、および核定位を保持する。図２ｈ〜ｋによれば、生きているヒト細胞の核蛍光の検出のための同等の条件下で、核断面あたりのＤＲＡＱ５集積核蛍光強度は、ＤＲＡＱ５Ｎ処理細胞の場合に得られる値よりも約１０倍大きい。刊行文献（下記の引用文献１〜１０参照）には、アルキルアミノアントラキノンＮ−オキシドの特性、および生体還元（ｂｉｏｒｅｄｕｃｔｉｖｅ）プロドラッグとしてのその可能性が示されている。したがって、本明細書で述べるＤＲＡＱ５のＮ−オキシド（すなわち、ＤＲＡＱ５Ｎ）も、ＤＲＡＱ５へ生体還元転化できるというこの種類の薬剤の性質を共有していると考えられる。ＤＲＡＱ５の新しい蛍光特性は、細胞生体還元活性のためのマーカー、またおそらくＤＲＡＱ５Ｎの転化による低酸素状態を与えるものであると考えられる。したがって、本発明はＤＲＡＱ５Ｎの低酸素細胞に対するマーカーとしての使用を意図する。
【００５４】
たとえば、図２ｈ〜ｋは、１０μＭのＤＲＡＱ５または１０μＭのＤＲＡＱ５Ｎに１ｈ暴露した生きているＨＬ６０細胞の、透過フォトン（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）の同時ＣＬＳＭ捕捉（パネルｈおよびｊ）、および対応する遠赤外／低赤外蛍光（それぞれ、パネルｉおよびｊ）像を示す。
【００５５】
1. Patterson LH: Anthraquinone anticancer compounds with (disubstituted amino-N-oxide) alkylamino substituent. イギリス特許第GB2237283号明細書、１９８９。
2. Patterson, L.H: Rationale for the use of aliphatic N-oxides of cytotoxic anthraquinones as prodrug DNA binding agents: a new class of bioreductive agent. Cancer and Metastasis Revs. 12, 119-134, 1993.
3. Patterson, LH, Craven, MR, Fisher, GR and Teesdale-Spittle, P: Aliphatic amine N-oxides of DNA binding agents as bioreductive drugs. Oncology Research 6, 533-538, 1994.
4. Mckeown, SR, Hejmadi, MV, McIntyre, IA, McAleer, JJA and Patterson, LH:AQ4N an alkylaminoanthraquinone N-oxide showing bioreductive potential and positive interaction with radiation in vivo. Brit J Cancer, 72,76-81.
5. Mckeown,SR,Hejmadi,MV,McIntyre,IA,McAleer,JJA and Patterson,LH:AQ4N  an alkylaminoanthraquinone N-oxide showing bioreductive potential and positive interaction with radiation.  Brit.J Cancer,72,76-81,1995.
6. Wilson, Wr, Denny, WA, Pullen, SM, Thompson, KM, Li, AE, Patterson, LH:Tertiary amine N-oxides as bioreductive drugs: DACA N-oxide,nitracrine N-oxide and AQ4N, Brit J Cancer,74, S43-47, 1996.
7. McKeown SR, Friery, OP, McIntyre, IA, Hejmadi, MV, Patterson, LH: Evidence for a therapeutic gain when AQ4N or tirapazamine is combined with radiation. Brit J Cancer 74, S39-42, 1996.
8. Hejmadi, MV, McKeown, MV, Friery, OP, McIntyre, IA, Patterson, LHand Hirst, DG: DNA damage following combination of radiation with the bioreductive drug AQ4N: possible selective toxicity to oxic and hypoxic cells. Brit J Cancer, 73, 499-505, 1996.
9. Smith, PJ, Blunt, NJ, Desnoyers, R, Giles, Y and Patterson, LH: DNAtopoisomerase II dependent cytotoxicity of alkylaminoanthraquinones and their N-oxides. Cancer Chemotherap. Pharmacol, 39,455-461 (1997).
10. Smith, PJ, Desnoyers, R, Blunt, N, Giles, Y and Patterson, LH: Flow cytomeric analysis and confocal imaging of anticancer alkylaminoanthraquinones and their N-oxides in intact human cells using 647 nm Krypton laser excitation. Cytometry, 27, 1, 43-53, 1997.
【００５６】
２蛍光色素生細胞染色の場合のＣＬＳＭ像形成
ここでは、選択励起を使用することにより、ＤＲＡＱ５の蛍光信号の、他の普通に使用される蛍光色素の蛍光信号からのスペクトル分離を示す。図３ｂは、ＦＤＡをエステラーゼ分解により保持形（ｒｅｔａｉｎｅｄ ｆｏｒｍ）のフルオロセインに細胞内転化する、Ａ３７５細胞の能力の有意の変化を示す。同じ試料をＤＲＡＱ５の選択励起によって像形成させたものでは、核形態が明瞭に示され（図３ｃ）、一方透過像形成（図３ａ）では、細胞の全体の形が示されている。三重像形成分析では、娘細胞対（図３ｄにおいて、矢印ｘ、ｙ、およびｚで示す）が識別される。二重像形成を、細胞質細胞内小器官を明示しうる生体染色色素にまで拡張した。図４ａ〜ｃは、ＤＲＡＱ５（核）とローダミン１２３（ミトコンドリア）による同時標識づけ細胞を示す。
【００５７】
このように、図３ａ〜ｄはＣＬＳＭで分析される生きているＡ３７５細胞においてフルオレセインとＤＲＡＱ５の励起が異なることを示している。細胞には、１０μＭ ＤＲＡＱ５ｘ１ｈの処理を行い、そのあと１μＭのＦＤＡにより、１５ｍｉｎの標識づけを行った。各パネルは次のように像形成された同じ視野を示す。ａ：透過像、ｂ：フルオロセインの４８８ｎｍ励起、ｃ：ＤＲＡＱ５の６４７ｎｍ励起、ｄ：それぞれ青、緑、および赤でコード化したａ〜ｃの合併像。像の領域は２５０ｘ２５０μｍであり、娘細胞対を矢印で示す。
【００５８】
図４ａ〜ｃは、共焦点レーザー走査顕微鏡法で分析した、生きているＡ３７５細胞の、ローダミン１２３およびＤＲＡＱ５の異なる励起を示す像ａ〜ｃである。細胞は、１０μＭ ＤＲＡＱ５ｘ１ｈの処理を行い、そのあと２μｇ／ｍｌのローダミン１２３により５ｍｉｎの標識づけを行った。像ａおよびｂは、それぞれ４８８ｎｍまたは６４７ｎｍ励起による同じ視野を示す。像ｃはａ（緑でコード化）とｂ（赤でコード化）の合併像である。像の領域は、１００ｘ１００μｍである。
【００５９】
実施形態５
新しい深赤／赤外蛍光ＤＮＡ結合プローブとしてのＤＲＡＱ５のフローサイトメトリー用途
ここで使用するフローサイトメトリーは、単一細胞が単または多レーザービームの焦点位置を横断する流体流の形で測定装置を通過する細胞または粒子の光散乱または蛍光特性を測定する方法である。空間的に離れた焦点位置を通過する時間遅れは電子的にモニターし、サイトメーターが多ビーム構成の場合に完全に補正された多パラメータ測定値を与えるようにすることができる。ここでは、ヒトの細胞を用いる一組の応用例について、単、２、および３ビームシステムにおけるＤＲＡＱ５の使用を示す。
【００６０】
細胞培養
ＨＬ６０（ヒトの前骨髄球性白血病細胞系）およびＳＵＤ４（ヒトのＢ細胞リンパ腫細胞系）を、１０％の胎児子ウシ血清、１ｍＭのグルタミン、および抗生物質を含むＲＭＰＩ培養液内で懸濁培養物として成長させ、５％ＣＯ2空気雰囲気中、３７℃で培養した。フローサイトメトリー実験のために、薬品処理の２ｈ前に、非同調成長懸濁培養物を、２．５〜４ｘ１０5細胞／ｍｌまで希釈した。細胞周期擾乱集団を、ＳＵＤ４細胞を０．２５ｍＭの薬剤エトポキシド（ＶＰ−１６−２１３）で１８ｈ、処理することによって得た。細胞を、前述のように、ＤＲＡＱ５およびＦＤＡで処理した。細胞濃度をコールターカウンターによって決定し、また細胞周期分布を、蛍光色素で染色したＧ１およびＧ２細胞における蛍光強度プロファイルの正規分布に関するアルゴリズムによって決定した。
【００６１】
懸濁培養物を、洗浄なしでフローサイトメトリーによって分析した。ヒトの血液を健康な供血者から日常的な静脈穿刺によって得て、試料を、単核血液細胞の分離および抗体パネルによる表面抗原認識のための標準的な血液学的方法によって処理した（表１参照）。
【００６２】
【表１】
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【００６３】
表に対する脚注
ａ：ＦＬ３に関して検出し、適当な前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）特性に関してゲートを通過した細胞集団に関するパルス面積パラメータとして解析した、蛍光。すべての細胞調製試料は、明記しないかぎり、２．５ｘ１０５／ｍｌにおいて、リン酸緩衝生理食塩水＋１％のＢＳＡ（すなわち、分析緩衝剤）中で、２０μＭのＤＲＡＱ５なし（０ｍｉｎ）またはあり（５または１２０ｍｉｎ暴露）で、分析した。
ｂ：調製試料１：ＳＵＤ４ヒト小胞状Ｂ細胞リンパ腫細胞系の細胞培養物に由来し、分析緩衝剤に再懸濁させた細胞。ＲＮａｓｅ Ａ分解浸透性化細胞の通常の臭化エチジウム染色による試料の並行分析では、非同調培養物の場合、Ｇ１＝３４．９％、Ｓ期＝４８．０％、Ｇ２／Ｍ＝１７．１％が得られ、細胞毒性薬剤ＶＰ−１６（０．２５μＭｘ１８ｈ）による細胞処理による後期周期停止細胞の場合、Ｇ１＝０．６％、Ｓ期＝５５．３％、Ｇ２／Ｍ＝４４．０％が得られた。ＤＮＡ含有量の定量分析によれば、Ｇ１（ＳＵＤ４）：Ｇ２（正常な二倍体リンパ球）＝１．０８３が得られた。
ｃ：調製試料２：調製試料１と同様であるが、直接標識づけ抗体：抗ＣＤ５４−ＦＩＴＣ（ＦＬ１パラメータに関して検出）、抗ＣＤ１９−ＰＥ（ＦＬ２パラメータに関して検出）を用いて表面抗原分析のために処理した。
ｄ：調製試料３：フィコール勾配分離した、正常な供血者からの生存できる単核血液細胞。試料は日常的な静脈穿刺によって得（リンパ球：単球比＝１１．５：１）、分析緩衝剤に再懸濁させた。
ｅ：調製試料４：調製試料３と同様であるが、抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣによる表面抗原分析のために処理した。
ｆ：調製試料５：正常な供血者からの全血を、表面抗原分析のために処理し、抗ＣＤ４５−ＦＩＴＣ陽性度を赤血球を除去するためのＦＬ１パラメータマスタートリガーとして使用して、生きている細胞として分析した。ゲートを通過した集団は、２５．５％リンパ球、１３．３％単球、および６１．２％顆粒球である。ｇ：調製試料６：調製試料５と同様であるが、表面抗原分析のための処理のあと、細胞を固定し、赤血球をＦＡＣＳＬｙｓｅTMに溶解させ、分析緩衝剤に再懸濁させた。ＦＳＣパラメータをマスタートリガーとして使用した。ゲートを通過した集団は、４３．７％リンパ球、９．７％単球、４６．６％顆粒球であった。
【００６４】
フローサイトメトリー
細胞は、励起要件に応じて、四つのサイトメーターのうち一つを用いて分析した。
【００６５】
サイトメーターＡ：単ビームの大パワー６４７ｎｍクリプトンレーザー励起。このシステムは、注文製のサイトメーターであり、６４７ｎｍ線用に調節されたＩｎｎｏｖａ ３０００Ｋクリプトンレーザー（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｃｏｒｐ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、カリフォルニア州、アメリカ）を備えている。前方光散乱、９０°光散乱、および蛍光放射を、９０°光散乱パラメータをマスター信号として、１ｘ１０４細胞に関して集めた。この光学システムは、いろいろな蛍光放射波長、たとえば＞７１５ｎｍ（低赤外と呼ぶ）、およびここで報告する＞７８０ｎｍ蛍光（赤外）の分析を可能とする。前方および９０°光散乱を、細胞破片の識別のために解析した。レーザーパワーを、２００ｍＷに設定し、蛍光信号のために比例増幅器を使用した。分析光学系は低温の６７５ｎｍ二色性鏡を有し、周囲の研究室温度は約１２℃で、外被容器は１０℃に保った。フィルターは、Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｏｔ製のものである。それぞれの細胞集団全体の蛍光強度値の分布に関して、メジアン、平均、およびモードパラメータを計算した。すべての実験において、メジアン値とモード値は非常に近い値であった。メジアン値のみを報告する。このパラメータは定量上限を越える非常に蛍光の強い細胞の存在あによる影響をあまり受けないからである。
【００６６】
サイトメーターＢ：２ビームの低パワー６３３ｎｍ／大パワー４８８ｎｍレーザー励起。このシステムは、ＦＡＣＳ ４４０細胞選別器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｎｃ．、Ｃｏｗｌｅｙ、イギリス）であり、４８８ｎｍ線（出力１００ｍＷ）用に調節されたＳｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓのアルゴンイオンレーザー（最大出力５００ｍＷ）、および６３３ｎｍの放射を与える第二のＳｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓの１５６ヘリウム−ネオンレーザー（＜５ｍＷ放射）を備え、ビームの時間分離は約３０μｓｅｃである。前方光散乱、９０°光散乱、および蛍光放射を、１ｘ１０4細胞に関して、前方光散乱パラメータを主４８８ｎｍビームからのマスター信号として、集めた。一方側方散乱は、４８８／１０ｎｍバンドパスフィルターを通して集めた。この分析光学系は、ｉ）低温二色性鏡（＞６７５ｎｍを通す）、ｉｉ）信号遅れなしの５３５／１５ｎｍバンドパスフィルターによって保護されたＰＭＴにおいて検出される、４８８ｎｍビームによって励起されたフルオレセインからの蛍光、およびｉｉｉ）適当な時間遅れのある赤色敏感ＰＭＴ、から成る。ｉｉｉは、さらに６２０ｎｍロングパスフィルターによって保護され、６７５ｎｍを越える（高赤色およびスペクトルの赤外領域まで延びる）波長のＤＲＡＱ５に伴う蛍光の透過ビームを検出する。前方および９０°光散乱を、細胞破片を排除するために分析した。すべてのパラメータはＣｏｎｓｏｒｔ ３０ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により２５６チャンネル分解能で収集し、そのあとＷｉｎＭＤＩソフトウェア（Ｊ．Ｔｒｏｔｔｅｒ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア）によって分析した。このシステムは、４８８ｎｍ単ビームモードの場合にも、同じ分析光学系を使用するが、赤色敏感ＰＭＴのための信号遅れはない。
【００６７】
サイトメーターＣ：単ビーム低パワー４８８ｎｍレーザー励起。このシステムは、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｎｃ．、Ｃｏｗｌｅｙ、イギリス）であり、４８８ｎｍ線用に調節されたアルゴンイオンレーザー（最大出力１５ｍＷ）を備えている。前方光散乱、９０°光散乱、および蛍光放射を、１ｘ１０4細胞に関して、前方光散乱パラメータをマスター信号として、集めた。標準的な分析光学系は、ＦＬ１（青）／ＦＬ２（緑）／ＦＬ３（赤）ＰＭＴパラメータを、ＦＬ３からの信号に関して実施するパルス解析によって与える。
【００６８】
サイトメーターＤ：３ビーム中パワー６３３ｎｍ／中パワー４８８ｎｍ／中パワー多重線ＵＶレーザー励起。このシステムは、ＦＡＣＳ Ｖａｎｔａｇｅ細胞選別器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｎｃ．、Ｃｏｗｌｅｙ、イギリス）であり、多重線ＵＶ（３５０〜３６０ｎｍ範囲）および波長４８８ｎｍの同時放射を与えるＣｏｈｅｒｅｎｔ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ  ＩＩのレーザーを備え、ビームは二色分離器を使用して、非共線になるようにされる。ビーム結合光学系を使用して、ＵＶビームを、６３３ｎｍの放射を与えるＳｐｅｃｔｒａ Ｐｈｙｓｉｃｓ １２７−３５ヘリウム−ネオンレーザー（最大出力３５ｍＷ）のビームと整列させ、このとき主４８８ｎｍビームとの時間分離を約２５μｓｅｃとする。前方光散乱、９０°光散乱、および蛍光放射を、１ｘ１０4細胞に関して、前方光散乱パラメータを主４８８ｎｍビームからのマスター信号として、集め、一方、側方散乱を４８８／１０バンドパスフィルターを通して集めた。分析光学系は、ｉ）主ビームからの信号を、ＳＰ６１０およびＳＰ５６０二色性鏡通過後にＦＬ１（ＦＩＴＣフィルター；５３０／３０ｎｍのバリヤーフィルター）、またはＳＰ６１０二色性鏡透過およびＳＰ５６０二色性鏡反射後にＦＬ２（５８５／４２ｎｍまたは５７５／２６ｎｍのバリヤーフィルター）、またはＳＰ６１０二色性鏡反射後にＦＬ３（ＬＰ７１５ｎｍのバリヤーフィルター）において、分析し、ｉｉ）遅れビームからの信号を、それぞれＬＰ６４０二色性鏡透過または反射後に、ＦＬ４（ＬＰ６９５ｎｍのバリヤーフィルター）またはＦＬ５（ＤＦ４２４／４４ｎｍのバリヤーフィルター）において、分析する。細胞破片を排除するために、前方または９０°光散乱を分析した。すべてのパラメータを、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により、分析した。
【００６９】
フローサイトメトリーによって検出された全細胞蛍光
ＤＲＡＱ５励起は６４７ｎｍレーザー波長で最適になるにもかかわらず、予備研究によれば、このプローブはもっと小さな波長たとえば多重線ＵＶ、４８８ｎｍ、５１４ｎｍ、および６３３ｎｍにおいて、半最適励起されうる。ここでは、ＤＲＡＱ５のＤＮＡプローブとしてのフローサイトメトリーにおける使用を、下記の四つの異なるサイトメーター構成を比較することによって評価することを試みた。
サイトメーターＡ：単ビーム大パワー６４７ｎｍクリプトンレーザー励起。
サイトメーターＢ：２ビーム低パワー６３３ｎｍ／大パワー４８８ｎｍレーザー励起。
サイトメーターＣ：単ビーム低パワー４８８ｎｍレーザー励起。
サイトメーターＤ：３ビーム中パワー６３３ｎｍ／中パワー４８８ｎｍ／中パワー多重線ＵＶレーザー励起。
【００７０】
図５によれば、低パワーＨｅＮｅレーザー（サイトメーターＢ）を使用した場合、低い不飽和ＤＲＡＱ５濃度で処理した、生きているＨＬ−６０細胞の場合、自己蛍光信号とＤＲＡＱ５信号との完全な分離は起っていない。さらなる研究（データ示さず）によれば、２０μＭのＤＲＡＱ５による、２時間の培養後に完全な分離が実現された。しかし、これらの制限された励起条件下でも、６３３ｎｍによって生じるＤＲＡＱ５信号は、約２．５μＭの小さな値まで明瞭な線形投与量応答を示し（図５の挿入図参照）、これは最適６４７ｎｍ励起（サイトメーターＡによる）および波長＞７８０ｎｍでの検出の場合に得られる線形性に比肩しうるものである。
【００７１】
図６ａおよびｂによれば、低パワーＨｅＮｅレーザー（サイトメーターＢ）を使用して、２ビーム構成で分析したフルオレセイン負荷細胞における、ＤＲＡＱ５による蛍光を識別することができる。図６ｃおよびｄによれば、４８８ｎｍ波長の単ビームを用いて（サイトメーターＢ）、ＤＲＡＱ５とフルオレセインの同時励起が可能である。ＤＲＡＱ５の半最適励起から生じる低強度信号であるにもかかわらず、明瞭な重なっていないスペクトルにより、信号のはっきりした分離が見られる。
【００７２】
ＤＲＡＱ５の単ビームサイトメーター（すなわち、ＦＡＣＳｃａｎTM；サイトメーターＣ）における有効性を示すことを試みた。図７ａ〜ｄは、複合集団において凝集細胞を識別するＤＲＡＱ５の能力を示す代表的な結果である。図７ａは、無傷の細胞における、細胞周期分布と表面抗原発現との関係の検出結果を示す。図７ｂは、染色能力による亜集団の区別を示し、図７ｃおよびｄは、全血および溶解血における有核細胞の検出に対するＤＲＡＱ５の使用を示す。核を染色するＤＲＡＱ５の能力に関係する要因を分析し、前記表に示した。生きている培養非同調細胞（調製試料１）を使用した場合、ＤＲＡＱ５は細胞を再現性のある仕方で急速染色し、自己蛍光バックグラウンドから区別できる蛍光を生じた。大きな標準偏差値は、細胞周期全体に細胞が分散していることによる。平均値は、Ｇ２停止集団の場合に１．７倍に増大していることからわかるように、平均細胞ＤＮＡ含有量を反映している。表面抗原分析のための細胞処理（調製試料２）は、前記特性の影響を与えない。無傷の単核血液細胞の分離（調製試料３および４）は、便利な細胞密度範囲内で染色することができ、表面抗原分析のために処理することのできる試料を与える。調製試料３および４の場合、リンパ球に比して単球の染色能力が大きくなる（１．１４〜１．４倍）ことが一貫して観察され、これは生細胞染色能力を亜集団区別要因として使用できるということを示している。全血に関する結果によれば、有核細胞（顆粒球を含む）は赤血球細胞（ＲＢＣ）の存在下（調製試料５）またはＲＢＣ溶解および軽い固定のあと（調製試料６）、同程度に染色することができる。
【００７３】
図８には、調製方法１および２（表の脚注参照）を用いて得られた生細胞集団のＤＲＡＱ５染色におけるＤＲＡＱ５濃度依存性の違いをまとめて示す。各集団は類似の滴定曲線を示し、飽和は、濃度≧１０μＭのときの、相対ＤＮＡ含有量（それぞれの細胞種たとえばＳＵＤ４に対する）または核染色能力（たとえばリンパ球対単球）を反映する形で起っている。
【００７４】
図９は、４８８ｎｍ（ＦＩＴＣ）および多重線ＵＶ波長（サイトメーターＤ）で活性化した蛍光色素標識づけ抗体によって検出した、固定細胞内の細胞内たんぱく質の細胞周期特異性発現の検出に対するＤＲＡＱ５の有効性を示す。図１０ａ〜ｆによれば、３ビーム構成（サイトメーターＤ）において、二つの別々のビームによって活性化されたＤＲＡＱ５蛍光を、比較的まれな細胞周期事象たとえば非同調培養物のＧ２／Ｍにおける高サイクリンＢ１発現をモニターする第三のビームと区別して示すことができる。
【００７５】
図５は、生きているＨＬ６０細胞における、１時間暴露中のＤＲＡＱ５蓄積のフローサイトメーター分析を示す。周波数分布ヒストグラムは、サイトメーターＢによる低パワー６３３ｎｍ波長励起に関するものである。記号○、
【外１】
0004629871.tif 000010
、および
【外２】
0004629871.tif 000011
は、それぞれ０、５、および１０μＭ ＤＲＡＱ５を示す。挿入図は、二つの異なるサイトメーターを用いたときの、ＤＲＡＱ５の投与量応答の線形性を示す（すなわち、サイトメーターＢおよびＡにおいて、それぞれ６３３ｎｍおよび６４７ｍ励起の場合に０．９６および０．９７の相関係数を有する）。
【００７６】
図６ａ〜ｄは、フルオロセイン標識づけした生きているＨＬ６０細胞の、ＤＲＡＱ５による蛍光検出のための２ビームフローサイトメトリー分析（サイトメーターＢ）を示す。代表的なフローサイトメーター２変量プロットとして、全細胞蛍光信号の緑（ＦＬ２の高さ；フルオレセイン）と深赤／低赤外（ＦＬ１の高さ；ＤＲＡＱ５）との関係を示す。パネルａおよびｂは、フルオレセイン（４８８ｎｍ）およびＤＲＡＱ５（低パワー６３３ｎｍ）の２ビーム励起を示す。パネルａ：ＦＤＡ（単独で、０．２μＭ、１０ｍｉｎ）、パネルｂ：ＦＤＡ処理の前に１ｈ、５μＭ ＤＲＡＱ５で前処理した細胞。パネルｃおよびｄは、同じ細胞処理条件で繰り返したものであるが、フルオレセインおよびＤＲＡＱ５に対して４８８ｎｍの単ビーム励起を使用した。数字は、各象限領域内のゲート通過事象の百分率を示す。
【００７７】
図７ａ〜ｄは、培養した血液由来のヒト細胞に関する、ＤＲＡＱ５蛍光（ＦＬ３面積）と抗体蛍光（フィコエリトリン標識づけ抗ＣＤ１９をモニターするＦＬ２の高さまたはＦＩＴＣ標識づけ抗ＣＤ４５をモニターするＦＬ１の高さ）との関係の単ビームフローサイトメトリー分析（サイトメーターＣ）を示す。細胞懸濁状態（２．５ｘ１０5／ｍｌ）を、１％のウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水中で維持した。標準的なフィコール勾配分離を用いて得たヒト血液単核細胞亜集団を、その前方および側方光散乱特性により、識別し、ゲート切断した。ダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）は通常のＦＬ３面積：ＦＬ３幅パラメータ値に関するパルス分析ゲート切断により排除した。パネルａ：培養した非同調ＳＵＤ４リンパ腫細胞。パネルｂ：標準的なフィコール勾配分離によって得た血液単核細胞亜集団。パネルｃ：全血（ＣＤ４５＋ 事象に関してトリガー）。パネルｄ：溶解した全血。矢印をつけた亜集団Ｇ１、Ｓ、およびＧ２／Ｍは、細胞周期段階を示す。Ｌ：リンパ球、Ｍ：単球、Ｇ：顆粒球、Ｎ：核のない原形質膜。
【００７８】
図８は、室温で５ｍｉｎ、ＤＲＡＱ５にさらした、培養した血液由来のヒトの細胞蛍光強度の、単ビームフローサイトメトリー定量（サイトメーターＣ）を示す。データは平均値（±標準偏差）であり、代表的な実験からの結果を示す。記号○：培養した非同調ＳＵＤ４リンパ腫細胞、□：０．２５μＭのＶＰ−１６に１８ｈさらして細胞周期のＳ期およびＧ２期で細胞を停止させたＳＵＤ４細胞、●：リンパ球、
【外３】
0004629871.tif 000012
：単球。
【００７９】
図９は、サイクリンＢ１の細胞周期特異性発現の２ビームフローサイトメトリー分析（サイトメーターＤ）を示す。固定した、ＲＮａｓｅＡ分解およびＤＲＡＱ５染色（ＦＬ３；４８８ｎｍ励起）ＳＵＤ４細胞を、０．２５μＭ ＶＰ−１６に１８ｈさらしてＧ２／Ｍにある細胞を蓄積した非同調培養物から得た。Ｇ２／Ｍ期発現サイクリンＢ１蛋白質を、ＡＭＣＡ標識づけした第二の抗体（ＦＬ５の高さ；多重線ＵＶ励起）を用いた間接免疫蛍光検査によりモニターし、抗サイクリンＢ１（ＧＮＳ１）マウスモノクローナルＩｇＧの結合を検出した。パネルａおよびｃは、抗体対照試料（非特異性ＩｇＧ＋第二の抗体）を示す。パネルｂおよびｄは、特異性抗体＋第二の抗体に関する結果を示す。抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．から入手した。矢印で示した亜集団Ｇ１、Ｓ、およびＧ２／Ｍは、細胞周期段階を示す。文字を付していない矢印は高レベルのサイクリンＢ１を発現し、細胞周期のＧ２／Ｍにある細胞の予想される位置を示す。
【００８０】
図１０ａ〜ｆは、ＤＲＡＱ５染色した固定およびＲＮａｓｅ Ａ分解非同調ＳＵＤ４リンパ腫細胞の、３ビームフローサイトメトリー（サイトメーターＤ）分析を示す。ＤＲＡＱ５蛍光（パルス高さ）を、ＦＬ３（４８８ｎｍ励起）およびＦＬ４（６３３ｎｍ励起）によってモニターした。細胞周期に無関係のＣｄｃ２蛋白質およびＧ２／Ｍ期発現サイクリンＢ１蛋白質を、抗Ｃｄｃ２ ｐ３４（Ｈ−２９７）ウサギポリクローナルＩｇＧの結合を検出するためのＦＩＴＣ標識づけした第二の抗体（ＦＬ高さ；４８８ｎｍ励起）、および抗サイクリンＢ１（ＧＮＳ１）マウスモノクローナルＩｇＧの結合を検出するためのＡＭＣＡ標識づけした第二の抗体（ＦＬ高さ；多重線ＵＶ励起）を使用して、間接免疫蛍光検査によってモニターした。抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。パネルａおよびｂ：ＤＮＡ対Ｃｄｃ−２ ｐ３４。パネルｃおよびｄ：ＤＮＡ対サイクリンＢ１。パネルｅおよびｆ：それぞれ青および赤励起波長におけるＤＮＡヒストグラム。矢印を付した亜集団Ｇ１、Ｓ、およびＧ２／Ｍは細胞周期段階を示す。ＨＣｙＢは、細胞周期のＧ２／Ｍにある高サイクリンＢ１発現細胞。
【００８１】
ＤＲＡＱ５染色細胞の多重線ＵＶ励起のフローサイトメトリー分析
波長＜４００ｎｍで記録されている吸光度ピークは、近ＵＶ波長における発色団励起が可能であるということを示唆している（データ示さず）。ここで得られた結果によれば、生細胞のＤＲＡＱ５染色核は多重線ＵＶフローサイトメトリー（サイトメーターＤ；図１１ａ〜ｃ）の使用により示されるようにスペクトルの近ＵＶ領域で励起することができる。ＵＶ励起は６４７ｎｍ波長励起よりも低効率であり（図１１ｂ）、検出にはより大きな光電子増倍管信号の増幅が必要であるが、蛍光強度は細胞質ＤＮＡ含有量分布を明瞭に反映している（図１１ｃ）。これは、３ビーム組合せの場合、ＤＲＡＱ５が、ＵＶから得られるＤＮＡ区別信号と、可視範囲の励起波長とを与えることができる、ということを示している。
【００８２】
図１１ａ〜ｃは、＞６９５ｎｍ波長の放射のための、無傷のＳＵＤ４リンパ腫細胞内のＤＲＡＱ５の、４８８ｎｍ（パネルａ）、６４７ｎｍ（パネルｂ）、または多重線ＵＶ（３５０〜３６０ｎｍ範囲；パネルｃ）励起を、多ビームフローサイトメトリー（サイトメーターＤ）で分析したものを示す。太線は、ＤＲＡＱ５染色細胞の細胞質ＤＮＡ含有量を示し、細線は、非染色対照細胞を示し、点線は、６４７ｎｍ励起可能な標準として使用した、基準アロフィコシアニン（ＡＰＣ）染色基準マイクロビードを示す。
【００８３】
実施形態６
無傷細胞および死細胞の区別における、ＤＲＡＱ５のＮ−オキシド誘導体（ＤＲＡＱ５ＮＯ）の異なる細胞内蓄積
いろいろな段階の細胞死を経験しつつある細胞から無傷の生細胞を区別する能力は、ある種の蛍光色素を含む化学プローブの異なった細胞内蓄積によって実現することができる。アポトーシスと呼ばれるある特定の種類の細胞死は、無傷の細胞において起りうる認識できる初期段階を有する。区別は、生物学的検定および臨床的検定の両方において広く使用されている。たとえば、フローサイトメトリー検定は、細胞部分集合の識別、定量、分析、調製、または排除を可能としうる。プローブの取り込みと保持は、多数の要因、たとえば原形質膜の完全性（たとえば、プローブ取り込みに影響する）、およびプローブの細胞内挙動（たとえば、核ＤＮＡへのプローブの結合）に依存する。細胞死に対する現行のフローサイトメトリー検定は、無傷の生細胞をプローブ（たとえば、蛍光ＤＮＡ染色ヨウ化プロビジウム）を排除することにより無染色のままに保つ能力を使用することができ、一方欠陥のある膜を有する細胞は核ＤＮＡへのプローブの接近を可能とする。アポトーシス細胞死の初期段階を経験しつつある細胞は、蛍光色素標識づけ薬剤アネクシンＶの細胞表面結合によって識別することができるが、膜の完全性は損なわれない。原形質膜が破壊される、細胞死およびアポトーシスの後期段階は、大量のアネクシンＶの結合と大量のヨウ化プロピジウムＤＮＡ染色を伴う。
【００８４】
ここでは、生細胞と死細胞との区別を容易にする、ＤＲＡＱ５のＮ−オキシド誘導体（ＤＲＡＱ５ＮＯ）の使用例を示す。ＤＲＡＱ５ＮＯは、低レベルの場合、無傷の生細胞内にはいり込んで保持されうるので、無傷の細胞の積極的区別を可能とする。第二のプローブ（たとえば、アネクシンＶ）と組合せると、細胞死またはアポトーシスの過程全体を通じての細胞における進行段階の区別が容易になる。染色パターンによる四つの段階は、下記の通りである。
段階１：ＤＲＡＱ５ＮＯ陽性／アネクシンＶ陰性（無傷の生細胞）
段階２：ＤＲＡＱ５ＮＯ陽性／アネクシンＶ陽性（初期段階アポトーシス細胞）
段階３：ＤＲＡＱ５ＮＯ高度に陽性／アネクシンＶ陽性（後期段階アポトーシス／死細胞）
段階４：ＤＲＡＱ５ＮＯ陰性／アネクシンＶ陽性（無核細胞破片）
【００８５】
図１２ａ〜ｄおよび図１３ａ〜ｄは、０．２５μＭの抗ガン薬ＶＰ−１６（エトポシド）への１８ｈの暴露に応答してアポトーシスが進行しうるヒトＢ細胞リンパ腫細胞系を使用した例である。細胞は、アネクシンＶ−ＦＩＴＣ結合のための標準的な方法により、また、サイトメーターＤを用いるフローサイトメトリー分析の前に、５０μＭのＤＲＡＱ５ＮＯにさらしてからリン酸緩衝生理食塩水によって１：５に希釈することによって、調製した。装置は、ＦＩＴＣの４８８ｎｍ波長励起（パラメータＦＬ４−Ｈによってモニター）およびＤＲＡＱ５ＮＯの６３３ｎｍ波長励起（パラメータＦＬ４−Ｈによってモニター）を用いて、２レーザーモードで使用した。図１２ａ〜ｄは、対照細胞に対する薬剤処理の組合せ（Ａｎｘ＝アネクシンＶ−ＦＩＴＣ；ＡＱ５Ｎ＝ＤＲＡＱ５のＮ−オキシド誘導体）、また図１３ａ〜ｄは、ＶＰ−１６（すなわち、ＶＰ）処理培養物に対する同じ薬剤組合せを示す。結果は、段階１集団で実現される低レベルのＤＲＡＱ５ＮＯ染色、および段階３細胞における増大レベルを示す。アネクシンＶ陽性の細胞の頻度は、ＶＰ−１６処理によって増大するが、図に示す象限プロット解析によって認められる三つの集団（段階２〜４）から成る。ＤＲＡＱ５ＮＯの使用によって与えられる改善は、二つの特性に関する。第一に、２レーザーの使用によりプローブ励起事象の分離を可能とするＤＲＡＱ５ＮＯ誘導体の有利なスペクトル特性、および／またはプローブ放射信号の大きく低下したスペクトル重なり、である。第二に、無傷の細胞の無核細胞破片からの積極的区別である。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】  ＤＲＡＱ５のスペクトル特性を示す。
【図１ｂ】  ＤＲＡＱ５のスペクトル特性を示す。
【図１ｃ】  ＤＲＡＱ５のスペクトル特性を示す。
【図２ａ】  ＣＬＳＭによって検出された、ＤＲＡＱ５に伴うＤＮＡ蛍光のスペクトル特性を示す。
【図２ｂ】  ＣＬＳＭによって検出された、ＤＲＡＱ５に伴うＤＮＡ蛍光のスペクトル特性を示す。
【図２ｃ】  ＣＬＳＭによって検出された、ＤＲＡＱ５に伴うＤＮＡ蛍光のスペクトル特性を示す。
【図２ｄ】  ＣＬＳＭによって検出された、ＤＲＡＱ５に伴うＤＮＡ蛍光のスペクトル特性を示す。
【図２ｅ】  ＣＬＳＭによって検出された、ＤＲＡＱ５に伴うＤＮＡ蛍光のスペクトル特性を示す。
【図２ｆ】  ＣＬＳＭによって検出された、ＤＲＡＱ５に伴うＤＮＡ蛍光のスペクトル特性を示す。
【図２ｇ】  ＤＲＡＱ５染色細胞核の多フォトン像形成を示す。
【図２ｈ】  ＤＲＡＱ５またはそのＮ−オキシド誘導体（ＤＲＡＱ５Ｎ）によって染色された生きている細胞の比較を示す。
【図２ｉ】  ＤＲＡＱ５またはそのＮ−オキシド誘導体（ＤＲＡＱ５Ｎ）によって染色された生きている細胞の比較を示す。
【図２ｊ】  ＤＲＡＱ５またはそのＮ−オキシド誘導体（ＤＲＡＱ５Ｎ）によって染色された生きている細胞の比較を示す。
【図２ｋ】  ＤＲＡＱ５またはそのＮ−オキシド誘導体（ＤＲＡＱ５Ｎ）によって染色された生きている細胞の比較を示す。
【図３ａ】  ＣＬＳＭによって分析された、生きているＡ３７５細胞における、フルオレセインとＤＲＡＱ５の異なる励起を示す。
【図３ｂ】  ＣＬＳＭによって分析された、生きているＡ３７５細胞における、フルオレセインとＤＲＡＱ５の異なる励起を示す。
【図３ｃ】  ＣＬＳＭによって分析された、生きているＡ３７５細胞における、フルオレセインとＤＲＡＱ５の異なる励起を示す。
【図３ｄ】  ＣＬＳＭによって分析された、生きているＡ３７５細胞における、フルオレセインとＤＲＡＱ５の異なる励起を示す。
【図４ａ】  共焦点レーザー走査顕微鏡検査によって分析された、生きているＡ３７５細胞における、ローダミン１２３とＤＲＡＱ５の異なる励起を示す。
【図４ｂ】  共焦点レーザー走査顕微鏡検査によって分析された、生きているＡ３７５細胞における、ローダミン１２３とＤＲＡＱ５の異なる励起を示す。
【図４ｃ】  共焦点レーザー走査顕微鏡検査によって分析された、生きているＡ３７５細胞における、ローダミン１２３とＤＲＡＱ５の異なる励起を示す。
【図５】  １時間の暴露における、生きているＨＬ６０細胞のＤＲＱＡ５の蓄積のフローサイトメトリー分析を示す。
【図６ａ−ｄ】  フルオレセイン標識づけした生きているＨＬ６０細胞における、ＤＲＡＱ５に伴う蛍光の検出のための２ビームフローサイトメトリー分析を示す。
【図７ａ−ｄ】  培養した血液由来のヒトの細胞に関する、ＤＲＡＱ５蛍光と抗体蛍光との関係の単ビームフローサイトメトリー分析を示す。
【図８】  ＤＲＡＱ５に暴露した、培養した血液由来のヒトの細胞の蛍光強度の、単ビームフローサイトメトリー定量を示す。
【図９ａ−ｄ】  サイクリンＢ１の細胞周期特異性発現の、２ビームフローサイトメトリー分析を示す。
【図１０ａ−ｆ】  ＤＲＡＱ５染色固定およびＲＮａｓｅＡ分解非同調ＳＵＤ４リンパ腫細胞の、３ビームフローサイトメトリー分析を示す。
【図１１ａ−ｃ】  ４８８ｎｍ、６３３ｎｍ、または多重線ＵＶ励起を使用した、無傷のＳＵＤ４リンパ腫細胞の細胞質ＤＮＡ含有量のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１２ａ】  試薬処理のいろいろな組合せを用いたときの、ヒトＢ細胞リンパ腫細胞系における、細胞内蓄積の例を示す。
【図１２ｂ】  試薬処理のいろいろな組合せを用いたときの、ヒトＢ細胞リンパ腫細胞系における、細胞内蓄積の例を示す。
【図１２ｃ】  試薬処理のいろいろな組合せを用いたときの、ヒトＢ細胞リンパ腫細胞系における、細胞内蓄積の例を示す。
【図１２ｄ】  試薬処理のいろいろな組合せを用いたときの、ヒトＢ細胞リンパ腫細胞系における、細胞内蓄積の例を示す。
【図１３ａ】  ＶＰ−１６処理培養物について、同じ試薬組合せに関する例を示す。
【図１３ｂ】  ＶＰ−１６処理培養物について、同じ試薬組合せに関する例を示す。
【図１３ｃ】  ＶＰ−１６処理培養物について、同じ試薬組合せに関する例を示す。
【図１３ｄ】  ＶＰ−１６処理培養物について、同じ試薬組合せに関する例を示す。
【図１ａ】
0004629871.tif 000020
【図１ｂ】
0004629871.tif 000021
【図１ｃ】
0004629871.tif 000022
【図２ａ】
0004629871.tif 000023
【図２ｂ】
0004629871.tif 000024
【図２ｃ】
0004629871.tif 000025
【図２ｄ】
0004629871.tif 000026
【図２ｅ】
0004629871.tif 000027
【図２ｆ】
0004629871.tif 000028
【図２ｇ】
0004629871.tif 000029
【図２ｈ】
0004629871.tif 000030
【図２ｉ】
0004629871.tif 000031
【図２ｊ】
0004629871.tif 000032
【図２ｋ】
0004629871.tif 000033
【図３ａ】
0004629871.tif 000034
【図３ｂ】
0004629871.tif 000035
【図３ｃ】
0004629871.tif 000036
【図３ｄ】
0004629871.tif 000037
【図４ａ】
0004629871.tif 000038
【図４ｂ】
0004629871.tif 000039
【図４ｃ】
0004629871.tif 000040
【図５】
0004629871.tif 000041
【図６ａ−ｄ】
0004629871.tif 000042
【図７ａ−ｄ】
0004629871.tif 000043
【図８】
0004629871.tif 000044
【図９ａ−ｄ】
0004629871.tif 000045
【図１０ａ−ｆ】
0004629871.tif 000046
【図１１ａ−ｃ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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