(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニトリルヒドラターゼ活性を有する微生物を含む微生物触媒を利用してアクリロニトリルからアクリルアミドを製造する方法であって、
前記微生物触媒をアクリル酸水溶液で洗浄する工程と、
洗浄した前記微生物触媒をアクリロニトリルと接触させる工程と、
を含む、前記方法。
【請求項２】
微生物触媒が、バチルス(Bacillus)属、バクテリジューム(Bacteridium)属、ミクロコッカス(Micrococcus)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ノカルジア(Nocardia)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、アクロモバクター(Achromobacter)属及びシュードノカルディア(Pseudonocardia)属の微生物並びに外因性ニトリルヒドラターゼ遺伝子を有する形質転換された微生物の群より選択される少なくとも1つの微生物から調製されたものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アクリル酸水溶液のアクリル酸の濃度が0.01質量％〜10質量％である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
アクリル酸水溶液のpHが5〜11である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
アクリル酸水溶液がアクリル酸ナトリウムと水とから成る、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する分野】
本発明は、微生物由来の酵素ニトリルヒドラターゼの作用によりアクリロニトリルからアクリルアミドを製造する方法に関する。アクリルアミドは産業上重要な物質として広範な分野で使用されている。例えば、アクリルアミドの重合体は廃水処理用凝集剤、紙力増強剤、石油回収剤等に広く用いられている。
【０００２】
【従来の技術】
アクリルアミドは、従来、還元状態の銅を触媒として対応するアクリロニトリルを水和することにより工業的に製造されているが、近年、銅触媒に代えて微生物触媒を用いる方法が開発され、その一部は実用化されている。生体触媒法は、その反応条件が温和で副生成物も殆ど無く、極めてシンプルなプロセスが組めることから工業的製法として有力視されており、これまでにアクリロニトリルを水和してアクリルアミドに変換する触媒能を有する酵素（酵素名：ニトリルヒドラターゼ）を有する多くの微生物が見出されている。
【０００３】
これらの微生物としては、例えば、バチルス（Bacillus) 属、バクテリジューム（Bacteridium)属、ミクロコッカス（Micrococcus)属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium) 属〔以上、特公昭62-21519号公報参照〕、コリネバクテリウム（Corynebacterium)属、ノカルジア（Nocardia) 属〔以上、特公昭56-17918号公報参照〕、シュードモナス（Pseudomonas)属〔特公昭59-37951号公報参照〕、ロドコッカス（Rhodococcus)属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属〔以上、特公平4-4873号公報参照〕、ロドコッカス  ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous)種〔特公平6-55148 号公報参照〕、ロドコッカス（Rhodococcus)属菌株〔特公平7-40948 号公報参照〕等の微生物を挙げることができる。
また、前記微生物を微生物触媒として使用したアクリルアミドの製造方法として、特開平１１−１２３０９８、特開平７−２６５０９１、特公昭５６−３８１１８、反応方法として特開平１１−８９５７５等があげられる。
【０００４】
更に、酵素活性の向上や反応中の酵素活性の低下（失活）を抑制するための検討も種々なされており、例えば、反応を氷点から１５℃の低温で行う方法〔特公昭56-38118号公報参照〕、複数の供給口から低濃度の基質を連続的に供給する方法〔特公昭57-1234 号公報参照〕、微生物またはその処理物を有機溶媒で処理する方法〔特開平5-308980号公報参照〕、高級不飽和脂肪酸存在下で反応を行う方法〔特開平7-265090号公報参照〕、菌体をグルタルアルデヒド等で架橋処理する方法〔特開平7-265091号、特開平8-154691号公報参照〕等がある。
【０００５】
一方、微生物触媒の洗浄に関しては、酵素活性低下を抑制するために生理食塩水、リン酸やトリス塩酸の水溶液などの緩衝液を用いて洗浄することが一般に知られている。しかし、洗浄液成分が及ぼすアクリルアミドポリマー物性やモノマーの保存安定性への影響まで考慮した微生物触媒の洗浄に関するものはない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
微生物触媒によるアクリルアミドの製造法は、その反応条件が温和で副生成物も殆ど無いため、精製の必要が無く極めてシンプルなプロセスが組める可能性があることから工業的製法として有望視されている。
しかし、前記製造法は、酵素反応時の副生成物はないが、使用する微生物触媒の洗浄時に、洗浄液由来の不純物の混入が、アクリルアミドポリマーの物性やモノマーの保存安定性に影響を及ぼす問題点がある。そのような問題点を解決するために、晶析、イオン交換及び蒸留等の精製を行うことも可能であるが、微生物触媒を使用した製造法の大きな特徴である反応時の副生成物が殆ど無いことを生かせないだけでなく、エネルギー及び環境問題の点からも好ましくない。
【０００７】
【問題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題を解決すべく鋭意検討を行った結果、微生物由来の酵素ニトリルヒドラターゼを有する微生物触媒を用いてアクリロニトリルからアクリルアミドを製造する方法において、アクリル酸水溶液で洗浄した微生物触媒を反応時に使用することにより、アクリルアミドポリマー物性やモノマーの保存安定性に影響を及ぼさないアクリルアミドが製造できることを見出し本発明に至った。
すなわち、本発明は、アクリロニトリルをアクリルアミドに変換する微生物触媒を利用してアクリルアミドを製造する方法において、微生物触媒として、アクリル酸水溶液で洗浄した微生物触媒を使用することを特徴とするアクリルアミドの製造方法、である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明で使用できる微生物触媒とは、アクリロニトリルをアクリルアミドに変換する触媒活性（ニトリルヒドラターゼ活性）を有する微生物から調製されたものであれば、いずれでも構わない。微生物種としては、バチルス（Bacillus)属、バクテリジューム（Bacteridium)属、ミクロコッカス（Micrococcus)属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium)属、コリネバクテリウム（Corynebacterium)属、ノカルジア（Nocardia)属、シュードモナス（Pseudomonas)属、ミクロバクテリウム（Microbacterium）属、ロドコッカス（Rhodococcus)属、アクロモバクター(Achromobacter)属又はシュードノカルディア(Pseudonocardia)属に属する微生物が好ましい。該微生物は単独又は組み合わせて使用することができる。
【０００９】
また、前記微生物由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を取得し、そのまま又は人為的に改良し、任意の宿主に該遺伝子を導入した形質転換体を使用しても良い。
前記形質転換体としては、アクロモバクター(Achromobacter)属のニトリルヒドラターゼで形質転換した大腸菌MT10770（FERM P-14756）(特開平8-266277号公報)、シュードノカルディア(Pseudonocardia)属のニトリルヒドラターゼで形質転換した大腸菌MT10822（FERM BP-5785）(特開平9-275978号公報)またはロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous)種のニトリルヒドラターゼ（特開平4-211379号公報）で形質転換した微生物が好ましい。
前記微生物の培養方法は、微生物種により適宜の方法により実施することができる。
【００１０】
本発明でいう微生物から調製された微生物触媒とは、微生物を培養することにより得られた培養液、集菌操作等により得られた菌体、菌体を超音波処理等で破砕した菌体破砕物、菌体破砕後調製された粗酵素、部分精製酵素又は精製酵素をいう。これらの微生物触媒は、必要に応じ、ポリアクリルアミドゲル、アルギン酸塩、カラギーナン、イオン交換樹脂等で固定化しても良い。微生物触媒の使用形態は、酵素の安定性、生産規模等により適宜選択される。
【００１１】
本発明で言う洗浄とは、培養が終了した微生物菌体及び／又は反応で使用する微生物触媒を洗浄することをいう。よって、洗浄は、培養が終了した微生物菌体及び反応で使用する微生物触媒の両方をアクリル酸で洗浄しても良いし、反応に使用する微生物触媒のみをアクリル酸で洗浄しても良い。例えば、反応に使用する微生物触媒を一度、水、緩衝液等で洗浄した後、反応に供する前にアクリル酸で洗浄しても構わない。微生物触媒は、反応直前にアクリル酸で洗浄されていれば良い。
また、洗浄方法は、いずれの方法でも構わない。例えば、洗浄・遠心分離を繰り返す方法、中空糸膜による洗浄方法等が例示できる。また、固定化した微生物触媒を洗浄する場合には、固定化触媒を洗浄液中で攪拌、沈降、上清除去を繰り返すことにより実施することができる。
洗浄方法及び洗浄回数は、洗浄効率、酵素の安定性等を考慮して適宜、設定することができる。
【００１２】
洗浄の際に使用するアクリル酸の濃度は、アクリル酸水溶液中、０．０１質量％〜１０質量％が好ましい。さらに好ましくは、０．０５質量％〜１質量％である。
アクリル酸の濃度が、０．０１質量％以下であれば、洗浄時間及び洗浄回数が増加し、操作が煩雑となる。また、洗浄回数が増加することにより、洗浄中の菌体の破砕、固定化菌体の崩れ等を生じる。１０質量％以上になると酵素活性の低下を引き起こし好ましくない。また経済上も好ましくない。
アクリル酸水溶液は、水酸化ナトリウム、アンモニアなどを使用してpHを調整する。好ましくは、ｐＨを５〜１１、より好ましくは６〜１０に調整して使用する。
上記のごとく調製した微生物触媒は、アクリル酸水溶液に懸濁又は分散させた状態若しくは固液分離を行った状態で微生物触媒として使用することができる。
【００１３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１４】
〔実施例１〕
（１）培養及び洗浄菌体の調製方法
ニトリルヒドラターゼ活性を有するロドコッカス ロドクロス(Rhodococcus rhodochrous) J-1 (FERM BP-1478)（特公平6-55148 号公報記載）を、30Ｌ容ジャーファーメンター（高杉製作所社製）にてグルコース２質量％、尿素１質量％、ペプトン０．５質量％、酵母エキス０．３質量％、塩化コバルト０．０５質量％を含む培地（ｐＨ７．０）により、温度30℃で好気的に60時間培養した。
前記培養した培養液２０Ｌをクロスフロー型中空糸膜モジュール通して循環ろ過し、ろ液の量に対応する量の０．７質量％リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を連続的に培養液に供給して洗浄を行い洗浄菌体を得た。
前記培養した培養液２０Ｌをクロスフロー型中空糸膜モジュール通して循環ろ過し、ろ液の量に対応する量の０．７質量％リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を連続的に培養液に供給して洗浄を行い洗浄菌体を得た。
【００１５】
（２）微生物固定化担体の調整
（１）で得られた洗浄菌体懸濁液（乾燥菌体換算２０質量％）５００ｇにアクリルアミド、メチレンビスアクリルアミドおよび２ージメチルアミノプロピルメタクリルアミドが、それぞれ２０、２および２質量％濃度のモノマー混合溶液５００ｇを加え、良く懸濁した。これに５質量％の過硫酸アンモニウム２ｇ、５０質量％のN,N,N,N-テトラメチルエチレンジアミン２ｇを加え、重合、ゲル化させた。これを約１ｍｍ角の立方体に切断し微生物固定化担体を得た。
【００１６】
前記方法で得られた微生物固定化担体を、▲１▼０．１質量％のアクリル酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）に懸濁、攪拌、▲２▼静置沈降、▲３▼上澄み廃棄、の操作を１サイクルとし、２０サイクル行った。
【００１７】
（３）アミド生成反応
内容積５Ｌのセパラブルフラスコに０．２ｇ／Ｌのアクリル酸ナトリウム水溶液を３２００ｇ入れ、該アクリル酸水溶液に（２）で作成した固定化菌体を３ｇ添加した。該溶液をｐＨ７．０、温度２０゜Ｃに制御しながら攪拌した。
これに、アクリロニトリル濃度が常に２質量％となるように連続的にフィードし、アクリルアミドの濃度が５０質量％となるまで蓄積反応を行った。
反応終了後、孔径0.45μmのメンブレンフィルターにてろ過して触媒を除去した。
【００１８】
（４）ポリマー物性評価方法
水８０質量％に実施例１（３）で得られたアクリルアミド２０質量％を溶解し、ｐＨを８．０に調整後、ジュワー瓶に移し、系内を窒素で置換した。その後、過硫酸アンモニウム０．０００４％、硫酸鉄０．０００４％、４，４’−アゾビス−（４−シアノ吉草酸）０．０１％を加え、重合を行った。得られた含水ゲル状の重合体を肉挽き機で直径数ｍｍの粒子に解砕し、８０℃で１０時間乾燥を行い、ウイレー粉砕機で２ｍｍ以下の粒径に粉砕し、重合体粉末を得た。
得られた重合体粉末を５００ｇの水で０．２％濃度に室温で４時間攪拌、溶解した後、ブルックフィールド粘度（Ｂ型粘度計、ローター回転数３０ｒｐｍ、ローターＮｏ．１）を測定した。その後、８０メッシュの金網で濾過し、水洗後金網上に残った不溶物の質量を測定した。
【００１９】
（５）モノマー保存安定性評価方法
１００ｍｌのポリエチレン製瓶に実施例１（３）で得られた５０％アクリルアミドモノマー水溶液５０ｇおよび鉄テストピースを入れ、蒸発しないように蓋をした。これを５０℃の高温箱に保存して重合物の有無により安定性を判定した。
実施例１の（４）及び（５）の結果を表１及び表２に示した。
【００２０】
〔比較例１〕
実施例１の（２）微生物固定化担体の調製において、０．１質量％のアクリル酸ナトリウム水溶液（ｐＨ７．０）のかわりに、０．７％リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を使用した以外は、実施例１と同様に操作を行った。結果を表１及び表２に示した。
【００２１】
【表１】
0004668444.tif 000002
【表２】
0004668444.tif 000003
【００２２】
【発明の効果】
微生物触媒によるアクリルアミド製造時に、アクリル酸で洗浄を行った微生物触媒を使用することにより、保存安定性の高く、高品質なアクリルアミドを得ることが出来る。