(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）その表面にクラスＩ  ＭＨＣ分子を発現させたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞断片を含む支持体であって、該ＭＨＣ分子はＭＨＣ重鎖およびβ２ミクログロブリンの両方を含み；
ｂ）選択されたペプチドに結合でき、かつ該支持体に作動可能に連結できる該ＭＨＣ分子の細胞外部分；および
ｃ）該ＭＨＣの細胞外部分および補助分子が、ペプチドとＭＨＣ分子の細胞外部分が結合した場合に該ペプチドに対してＴ−細胞リンパ球の集団を活性化するのに十分な数で存在するように、該支持体に作動可能に連結された補助分子であって、該補助分子がＢ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＬＦＡ−３および抗−ＣＤ２８抗体からなる群より選択される；
を含む合成抗原−提示マトリックス。
【請求項２】
ＭＨＣ分子の細胞外部分がＭＨＣ分子全体の一部である請求項１に記載のマトリックス。
【請求項３】
該補助分子がコスティミュラトリー分子である請求項１に記載のマトリックス。
【請求項４】
該コスティミュラトリー分子がＢ７．１またはＢ７．２である請求項３に記載のマトリックス。
【請求項５】
該コスティミュラトリー分子が抗−ＣＤ２８抗体の少なくとも一部である請求項３に記載のマトリックス。
【請求項６】
該補助分子が接着分子である請求項１に記載のマトリックス。
【請求項７】
該接着分子がＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３またはＬＦＡ−３である請求項６に記載のマトリックス。
【請求項８】
２つの補助分子を有しており、第１の補助分子がコスティミュラトリー分子であり、第２の補助分子が接着分子である請求項１に記載のマトリックス。
【請求項９】
ＭＨＣ分子の細胞外部分がペプチドと複合体化または結合していない請求項１に記載のマトリックス。
【請求項１０】
該ペプチドがＭＨＣ分子の細胞外部分と結合している請求項１に記載のマトリックス。
【請求項１１】
該ペプチドがＭＨＣ分子の細胞外部分と結合している請求項８に記載のマトリックス。
【請求項１２】
ａ）その表面にクラスＩ  ＭＨＣ分子を発現させたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞を含む支持体であって、該ＭＨＣ分子はＭＨＣ重鎖およびβ２ミクログロブリンの両方を含み；
ｂ）選択されたペプチドに結合でき、かつ該支持体に作動可能に連結できる該ＭＨＣ分子の細胞外部分；および
ｃ）該ＭＨＣの細胞外部分および補助分子が、ペプチドとＭＨＣ分子の細胞外部分が結合した場合に該ペプチドに対してＴ−細胞リンパ球の集団を活性化するのに十分な数で存在するように、該支持体に作動可能に連結された補助分子であって、該補助分子がＢ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＬＦＡ−３および抗−ＣＤ２８抗体からなる群より選択される；
を含む合成抗原−提示マトリックス。
【請求項１３】
ａ）その表面にクラスＩ  ＭＨＣ分子を発現させたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞またはその断片を含む支持体であって、該ＭＨＣ分子はＭＨＣ重鎖およびβ２ミクログロブリンの両方を含み；
ｂ）選択されたペプチドと結合でき、かつ該支持体に作動可能に連結できる該ＭＨＣ分子の細胞外部分；
ｃ）該支持体に作動可能に連結したＢ７．１またはＢ７．２あるいはその組合せ；および
ｄ）ペプチドがＭＨＣ分子の細胞外部分と結合した場合に該ペプチドに対してＴ−細胞リンパ球の集団を活性化するのに十分な量で存在するように該支持体に作動可能に連結したＩＣＡＭ−１分子；
を含む合成抗原−提示マトリックス。
【請求項１４】
ａ）請求項１０記載のマトリックスを提供し；
ｂ）マトリックス細胞をＣＤ８＋Ｔ−細胞とイン・ビトロで接触させる；
ことを含む、選択されたペプチドに対してＣＤ８＋Ｔ−細胞を活性化させる方法。
【請求項１５】
ａ）請求項１１記載のマトリックスを提供し；
ｂ）ナイーブなＣＤ８＋Ｔ−細胞を該マトリックスとイン・ビトロで接触させる；
ことを含む、選択されたペプチドに対して細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ−細胞を生成させる方法。
【請求項１６】
コスティミュラトリー分子がＢ７．１またはＢ７．２である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
コスティミュラトリー分子が抗−ＣＤ２８抗体の少なくとも一部である請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
接着分子がＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３またはＬＦＡ−３である請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ａ）その表面にクラスＩ  ＭＨＣ分子を発現させたショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞を含む支持体であって、該ＭＨＣ分子はＭＨＣ重鎖およびβ２ミクログロブリンの両方を含み；
選択されたペプチドに結合でき、かつ該支持体に作動可能に連結できる該ＭＨＣ分子の細胞外部分；および
該ＭＨＣの細胞外部分および補助分子が、ペプチドとＭＨＣ分子の細胞外部分が結合した場合に該ペプチドに対してＴ−細胞リンパ球の集団を活性化するのに十分な数で存在するように、該支持体に作動可能に連結された補助分子であって、該補助分子がＢ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＬＦＡ−３および抗−ＣＤ２８抗体からなる群より選択される；を含む合成抗原−提示マトリックスを提供し；
ｂ）ナイーブなＣＤ８＋Ｔ−細胞を該マトリックスとイン・ビトロで接触させる；
ことを含む、選択されたペプチドに対して細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ−細胞を生成させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国政府の援助の下でなされ、米国政府は本発明においてある種の権利を有する。
【０００２】
関連出願のクロスリファレンス
本出願は、１９９５年３月８日に出願され、同一の発明の名称を有する米国特許出願第０８／４００，３３８号の一部継続出願である。
【０００３】
技術分野
本発明は、特定の抗原性ペプチドに特異性を有する、Ｔ−細胞を活性化する物質および方法、種々の疾病状態の治療のためのイン・ビボでの活性化Ｔ−細胞の使用、およびこれらの使用に適した組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
免疫系を活性化して感染症以外のタイプの病気を克服することが可能であろうと考えられていたので、免疫系が個体を感染症から救済しまたは保護する効率は常に科学者の興味をそそるものであった。かかる病気は、免疫抑制された患者における癌、ＡＩＤＳ、肝炎および感染性疾病を含む。抗体の使用を含めた種々の手法がこれらのタイプの病気で使用されてきたが、もしあったとしても細胞傷害性Ｔ−細胞を用いて成功した試みはほとんど記録されていない。理論的には、細胞傷害性Ｔ−細胞は、前記したタイプの病気を治療する好ましい手段であろう。しかしながら、特異的に細胞傷害性Ｔ−細胞を活性化する手法は利用しうるものがなかった。
【０００５】
現在知られている細胞傷害性Ｔ−細胞、またはＣＤ８＋細胞（すなわち、分子ＣＤ８を発現する細胞）はウイルス感染に対して主要な系列の防御を示す。ＣＤ８リンパ球はウイルスによって感染された細胞を特異的に認識し、それを殺す。かくして、ウイルス感染を排除せんとする失費は、感染細胞の随伴する喪失である。ＣＤ８＋細胞の表面上のＴ−細胞受容体は外来性抗原を直接認識することができない。抗体とは対照的に、抗原がまず受容体に対して提示されなければならない。
【０００６】
抗原のＣＤ８＋Ｔ−細胞への提示には、クラスＩタイプの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子が関与する。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）とは、免疫応答で重要な役割を演じる糖蛋白質の広範なファミリーをコードする大きな遺伝子座をいう。ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）複合体ともいうＭＨＣ遺伝子はヒトでは第６番染色体に位置する。ＭＨＣ遺伝子によってコードされる分子は細胞表面に存在し、組織移植における「非自己」としての認識の大きな原因である。このように、膜結合ＭＨＣ分子は、Ｔ−細胞による抗原の認識に密接に関与する。
【０００７】
ＭＨＣ産物はＩ、ＩＩおよびＩＩＩという３つの主要なクラスにグループ分けされる。主としてヘルパー細胞として働くＴ−細胞はＣＤ４を発現し、主としてクラスＩＩ分子と相互作用し、他方、ほとんどは細胞傷害性エフェクター細胞を表すＣＤ８−発現細胞はクラスＩ分子と相互作用する。
【０００８】
クラスＩ分子は膜糖蛋白質であり、内因性蛋白質の細胞内分解から主として由来するペプチドに結合する能力を持つ。ＭＨＣ分子と、ウイルス、細菌および他の外来性蛋白質に由来するペプチドとの複合体は、Ｔ−細胞の抗原応答性をトリガーするリガンドを含む。対照的に、ＭＨＣ分子と通常の細胞産物に由来するペプチドとの複合体は、胸腺において、自己ペプチドを寛容するようにＴ−細胞を「教示する」役割を演じる。クラスＩ分子は全部の完全な抗原を提示せず、むしろ、それらは、それらの「ペプチド結合グローブ」に「ロードされた」そのペプチド断片を提示する。
【０００９】
長年の間、免疫学者は、ウイルス、レトロウイルスおよび癌細胞を標的化する特異的細胞傷害性細胞を生起させることを望んでいた。一般に、ウイルス病に対する標的化は生ワクチンまたは弱毒化ワクチンの接種によってイン・ビボで達成することができるが、レトロウイルスまたは癌細胞では同様の成功は達成されていない。さらに、ワクチン法は免疫抑制された患者では所望の効率を有していなかった。少なくとも１人の研究者が、ＩＬ−２、Ｔ−細胞成長因子と共にイン・ビトロでインキュベートすることによって、存在するＣＤ８＋細胞を「ブーストする（boosting）」という非特異的アプローチを採用した。しかしながら、（ＬＡＫ細胞療法として知られている）このプロトコルは、すでに活性化されたＣＤ８＋細胞の増殖を可能とするに過ぎないであろう。ある１つの理由または別の理由で、免疫系は常に活性であるので、ＩＬ−２で刺激された細胞のほとんどは病気を克服する目的では重要でないであろう。事実、このタイプの療法が所望の特異性でもっていずれかの細胞を活性化するということはこれまで記載されていない。したがって、ＬＡＫ細胞療法の利点はせいぜい議論を呼ぶもので、副作用が典型的にはかなりひどくて多くの研究は中断された。
【００１０】
ペプチドローディング法に関与すると思われるいくつかの新規な分子が最近同定されている。また、結合ペプチドをもたないクラスＩ分子（すなわち、「空の」分子）がある種の制限的状況下で産生され得ることも注目されている。しかしながら、これらの「空の」分子は、結合ペプチドをもたないクラスＩ分子が非常に熱不安定なので、しばしば細胞表面に到達できない。かくして、「空の」クラスＩ分子は細胞の内部から細胞表面へのその輸送の間に分解する。
【００１１】
ペプチドに結合したクラスＩ  ＭＨＣ分子の提示のみでは一般にＣＤ８＋細胞を活性化するのに効果的でない。天然では、ＣＤ８＋細胞は、ペプチドが結合したクラスＩ  ＭＨＣ分子のみならず共刺激性分子（costimulatory molecule）を提示する抗原提示細胞によって活性化される。かかる共刺激性分子には、今日Ｂ７．１およびＢ７．２と命名された２つのサブグループであると認識されているＢ７が含まれる。また、インテグリンのごとき細胞接着分子がこのプロセスを助けることが見い出されている。
【００１２】
ＣＤ８＋Ｔ−細胞がクラスＩ  ＭＨＣおよび共刺激性分子によって結合されたペプチドを有する抗原−提示細胞と相互作用する場合、ＣＤ８＋Ｔ−細胞は活性化されて増殖し、アームの付いたエフェクターＴ−細胞となる。一般に、参考として本明細書に含めるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９９４）によって発行されたＪａｎｅｗａｙおよびＴｒａｖｅｒｓのＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ参照のこと。
【００１３】
従って、必要とされているのは、Ｔ−細胞が増殖し、細胞傷害性となるようにＴ−細胞を活性化する手段である。もし活性化がイン・ビトロでなされ、活性化された細胞傷害性Ｔ−細胞を患者に再導入できれば有用であろう。また、もし活性化が、選択されたペプチドを提示するのみならず活性化の有効性を増大させる他の共刺激性因子を提示する細胞のごとき物質からなる合成抗原−提示マトリックスによってなされ得るならば望ましいであろう。
【００１４】
また、そのペプチドを提示する細胞に対して細胞傷害性である実質的にＣＤ８＋細胞のみが活性されるようにペプチドを選択するのが可能であれば有利であろう。
【００１５】
発明の概要
本発明は、ペプチドと複合体化されたＭＨＣ分子、およびＴ−細胞の活性化を助けるＴ細胞援助分子（assisting molecule）を提示する合成抗原−提示系に関する。
【００１６】
１の実施態様において、該系は、支持体および該支持体に作動可能に結合した選択ペプチドに結合できるクラスＩ  ＭＨＣ分子の少なくとも細胞外部分を有する合成抗原−提示マトリックスに関する。また、該マトリックスは該支持体に作動可能に結合した援助分子を含む。ＭＨＣおよび援助分子は、ペプチドがＭＨＣ分子の細胞外部分に結合した場合に該ペプチドに対するＴ−細胞リンパ球の集団を活性化するのに十分な数存在させる。
【００１７】
援助分子と共にＭＨＣ分子またはＭＨＣ分子の一部を共に有する抗原−提示マトリックスは、ペプチドに対してＴ−細胞リンパ球を活性化する際に相乗的反応を提供することが判明した。援助分子の例はＢ７．１およびＢ７．２のごとき共刺激性分子、またはＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３のごとき接着分子である。かかる共刺激性分子の細胞外部分も使用できる。もう１つのタイプの共刺激性分子は、抗−ＣＤ２８抗体またはその機能性部分、例えばＦａｂ部分のごときＣＤ２８分子と反応するものである。
【００１８】
特に効果的な相乗的反応は、ペプチドと結合したＭＨＣ分子、共刺激性分子、および接着分子を有する抗原−提示マトリックスに起因する。特に、細胞傷害性Ｔ−細胞活性の高度に効果的な相乗的作用はＢ７．１およびＩＣＡＭ−１の組合せに依拠する。
【００１９】
マトリックスに使用する支持体はいくつかの異なる形態を採り得る。支持体についての例は金属またはプラスチックのごとき個体支持体、樹脂または修飾されたセルロースカラムのごとき多孔性物質、マイクロビーズ、マイクロタイタープレート、赤血球細胞およびリポソームを含む。
【００２０】
別のタイプの支持体は、細胞膜断片のごとき細胞断片、または完全細胞である。この実施態様において、マトリックスは、実際には、ＭＨＣ分子および援助分子を細胞表面に提示して抗原−提示細胞（ＡＰＣ）を生成するようにトランスフェクトされた細胞である。これは、第１のプロモーターに作動可能に連結したＭＨＣ重鎖をコードする少なくとも１つの発現可能クラスＩ  ＭＨＣヌクレオチド配列、好ましくはｃＤＮＡ配列、および第２のプロモーターに作動可能に連結した発現可能β−２ミクログロブリンヌクレオチド配列、を含有する細胞系を産生することによってなされる。ＭＨＣ重鎖およびβ−２ミクログロブリンは一緒に会合してペプチドに結合するＭＨＣ分子を形成する。ＭＨＣ蛋白質は抗原性ペプチドと結合し、それを細胞の表面に提示する。また、該細胞は第３のプロモーターに作動可能に連結した援助分子のヌクレオチド配列についての遺伝子を含む。また、援助分子も細胞表面に提示される。これらの分子は、ペプチドが複合体に結合した場合に、該ペプチドに対してＴ−細胞リンパ球の集団を活性化するのに十分な数にて細胞の表面に提示される。細胞の表面または炭水化物部分のごとき細胞断片上の他の分子はＴ−細胞に対していくらかの共刺激も付与する。
【００２１】
該細胞系は、少なくとも１つの前記遺伝子が、該細胞系が由来する細胞に天然では存在しない点で合成的である。ＭＨＣ分子は熱不安定であるので変温性細胞系を用いるのが好ましい。ある範囲の種がこの目的で有用である。例えば、参考として本明細書に取り込む、この使用のための多数の種を議論するＰｅｔｅｒｓｅｎらに対する米国特許第５，３１４，８１３号参照のこと。真核生物細胞特に昆虫細胞を使用するのが好ましい。
【００２２】
１の実施態様において、少なくとも２つの援助分子（１つは共刺激性分子であり、他は接着分子である）を有するのが特に好ましい。この組合せは相乗効果を有し、組み合わせた個々の分子の各々よりも大きなＴ−細胞活性化を与えることが判明した。また、誘導可能なプロモーターの制御下にある少なくとも１つのトランスフェクトされた遺伝子を有するのが有利であって好ましいことも判明した。
【００２３】
本発明を用い、ＭＨＣ分子を産生しつつペプチドを細胞に導入し、ＭＨＣ分子が依然細胞内にありつつそれに該ペプチドを結合させることが可能である。あるいは、ＭＨＣ分子を細胞表面に空の分子として発現させ、該分子が細胞表面で発現された後にペプチドを細胞に導入することができる。この後者の手法において、変温性細胞の使用が特に有利である。何故ならば、空のＭＨＣ分子（まだ複合体化していないかペプチドと結合していないもの）は熱不安定だからである。
【００２４】
クラスＩ  ＭＨＣ分子はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（果実ハエ）細胞のごとき昆虫細胞で発現された。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａは哺乳動物免疫系の全ての成分を有しないので、ペプチドローディング機構に関与する種々の蛋白質をかかる細胞に存在させないべきである。ペプチドローディング機構の欠如はクラスＩ分子が細胞表面で空の分子として発現されるのを可能とする。
【００２５】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ系のごとき昆虫細胞の使用のもう１つの利点は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞が３７℃よりもむしろ２８℃を好むことである。この事実は、空のクラスＩ  ＭＨＣ分子が熱不安定であって３７℃で崩壊する傾向にあるので非常に重要である。クラスＩ分子に結合できるペプチドと共にクラスＩ−発現Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞をインキュベートすることによって、実質的に各クラスＩ分子が１つの同一のペプチドを含有するようにすることが可能である。従って、クラスＩ分子が多くの異なるタイプのペプチドを含有し、そのほとんどが自分自身の無害細胞蛋白質に由来する場合、細胞は哺乳動物細胞とは非常に異なる。
【００２６】
また、本発明は、イン・ビトロで活性化されたＣＤ８＋細胞を生産する方法に関する。１つの方法は、イン・ビトロで、ＣＤ８＋細胞を前記した抗原−提示マトリックスの１つと、ＣＤ８＋細胞を抗原特異的に活性化するのに十分な時間接触させることよりなる。該方法は、さらに、（１）活性化ＣＤ８＋細胞を抗原−提示マトリックスから分離し；（２）活性化ＣＤ８＋細胞を許容される担体または賦形剤に懸濁させ；次いで、（３）該懸濁液を治療を必要とする個体に投与することよりなることができる。該抗原は天然または未分解蛋白質もしくはポリペプチドよりなることができるか、あるいはそれらは、ヒト・クラスＩ  ＭＨＣ分子とのインキュベーションに先立ってペプチド断片に切断された抗原性ポリペプチドよりなることができる。
【００２７】
別の変形において、本発明は、患者において疾患を治療し、ヒト患者において標的細胞を特異的に殺す方法に関する。該方法は、（１）患者から休止または天然ＣＤ８＋細胞を含有する流体試料を得、（２）イン・ビトロで、ＣＤ８＋細胞を抗原−提示マトリックスと、ＣＤ８＋細胞を抗原−特異的に活性化するのに十分な時間接触させ；次いで、（３）活性化ＣＤ８＋細胞を患者に投与することよりなる。例えば、腫瘍特異的ペプチドの使用は、細胞傷害性活性化ＣＤ８＋Ｔ−細胞を生産することによって、腫瘍関連病の治療を可能とする。また、本発明は、適当な懸濁液中の抗原−提示マトリックスを投与することによって医療疾患を治療する方法に関する。種々の実施態様において、該疾患は癌、腫瘍、新形成物（neoplasia）、ウイルスまたはレトロウイルス感染、自己免疫または自己免疫型疾患を含み得る。１の実施態様において、マトリックスを投与する方法は静脈内注射を包含する。
【００２８】
図面の簡単な説明
図１−図３は、発現プラスミドｐＲｍＨａ−２およびｐＲｍＨａ−３を示す図である。図１において、ｐＲｍＨａ−２構築を示す；図２において、ｐＲｍＨａ−３の構築を示す；および図３において、ｐＲｍＨａ−３ベクターを示し、制限、ポリリンカー、プロモーターおよびポリアデニル化、ならびにヌクレオチド配列を発現のために挿入できる部位を示す。
【００２９】
図４および５は、ＨＩＶペプチドによるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞の表面に発現されたＨＬＡ  Ｂ２７およびＨＬＡ  Ａ２．１のペプチド−誘導熱安定化を示す。各細胞集団の平均蛍光をインキュベーション条件に対してプロットして示す。
【００３０】
図６は、昆虫細胞が抗原をプロセスし、それをクラスＩ分子にロード（load）できるか否か、および後者が内因的にまたは外因的に由来する抗原をＴ−細胞に提示できるか否かを判断するために設計した実験からのデータを示す。Ｋｂ／β２でトランスフェクトされたＳｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２（ＳＣ２）または３Ｔ３細胞を等張（Ｉｓｏ）または低張（Ｈｙｐ）媒体中、オボアルブミン蛋白質（ＯｖＰｒｏ）またはオボアルブミンペプチド、ＯＶＡ２４（ＯｖＰｅｐ）と共にインキュベートした。（マウス細胞系ＢＡＬＢ／３Ｔ３は受託番号ＣＣＬ  １６３下でＡＴＣＣから入手可能である）。処理の後、細胞をＴ−細胞ハイブリドーマＢ３／ＣＤ８と共に培養した。Ｂ３／ＣＤ８は、Ｂ３（Ｃａｒｂｏｎｅら，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １６９：６０３−１２（１９８９）、Ｈ−２ＫｂクラスＩ分子によって提示されたオボアルブミンペプチド２５３−２７６に特異的な細胞傷害性Ｔ−細胞と、ＣＤ８担持ＩＬ−２分泌細胞系との間のＴ−細胞ハイブリドーマである。抗原刺激に際して、Ｂ３／ＣＤ８は、ＩＬ−２−依存性細胞系ＣＴＬＬへの３Ｈチミジン取り込みによって測定されるＩＬ−２を産生する（Ｇｉｌｌｉｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：２０２７（１９７８））。かくして、産生されたＩＬ−２の量を測定することによって、Ｔ−細胞認識についてアッセイすることができる。共培養からの上清を、ＩＬ−２−依存性細胞系ＣＴＬＬ（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ  ２１４）による３Ｈチミジン取り込みによって分析した。取り込まれた３Ｈチミジンの量を初期細胞処理に対してプロットする。
【００３１】
図７は、本発明による、トランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ハエ）細胞の表面でのＢ７．１、ＩＣＡＭ−１およびＭＨＣの発現を示す。
【００３２】
図８は、赤血球細胞に結合した組換えＬｄマウスＭＨＣを用いる蛍光−活性化細胞選別（sorter）実験の結果を示すグラフである。
【００３３】
図９は、赤血球細胞に結合した組換えＫｂマウスＭＨＣを用いる蛍光−活性化細胞選別実験の結果を示すグラフである。
【００３４】
図１０は、標識抗体の使用による組換えＫｂのマイクロタイタープレートへの結合を示すグラフである。
【００３５】
図１１は、トランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞で刺激されたＣＤ８＋２Ｃ細胞上でのＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を示す蛍光−活性化細胞選別実験からの結果を示す一連のグラフである。
【００３６】
図１２は、ＬｄのみでトランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞によって提示されたペプチドによって誘導されたＣＤ８＋２Ｃ細胞のＩＬ−２−依存性増殖応答を示す一対の棒グラフである。
【００３７】
図１３は、トランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞によって提示されたペプチドによって誘導されたＣＤ８＋２Ｃ細胞の第３日目の増殖応答に対するペプチド濃度の影響を示すグラフである。
【００３８】
図１４は、トランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞によって提示されたペプチドにより誘導されたＣＤ８＋２Ｃ細胞の第３日目の増殖応答およびＩＬ−２産生に対する抗原−提示細胞用量の影響を示す一対のグラフである。
【００３９】
図１５は、Ｌｄ．Ｂ７、Ｌｄ．ＩＣＡＭおよびＬｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭでトランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞により誘導されたＣＤ８＋２Ｃ細胞の増殖応答に対するペプチド濃度の影響を示す一連りグラフである。
【００４０】
図１６は、Ｌｄ、Ｌｄ．Ｂ７、Ｌｄ．ＩＣＡＭおよびＬｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭ＋ＱＬ９ペプチドでトランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞により誘導されたＣＤ８＋およびＣＤ８＋２Ｃ細胞の増殖応答の動力学を示す一連のグラフである。
【００４１】
図１７は、外因性サイトカインの不在下、Ｌｄ．Ｂ７、Ｌｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭまたはＬｄ．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞＋ＱＬ９ペプチド（１０μＭ）でトランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞により刺激されたＣＤ８＋２Ｃ細胞のＣＴＬ活性を示す一連のグラフである。
【００４２】
図１８は、外因性ＩＬ−２（２０ｕ／ｍｌ）の不在下（左）または存在下（右）、Ｌｄ．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞＋ＱＬ９ペプチド（１０μＭ）でトランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞により刺激されたＣＤ８＋２Ｃ細胞のＣＴＬ活性を示す一対のグラフである。
【００４３】
図１９は、トランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞によって提示されたペプチドに対する正常（非−トランスジェニック）ＣＤ８＋Ｔ−細胞の増殖応答（左側パネル）および外因性サイトカインの添加なくして、３日間、ペプチドの不在下で５×１０５  Ｂ１０．Ｄ２（Ｌｄ）脾臓細胞（２０００ｃＧｙ）と共に培養したＮ  Ｂ６および２Ｃ  Ｂ６  ＣＤ８＋細胞の等級分けした用量によって誘導された応答（右側パネル）を示す一対のグラフである。
【００４４】
図２０は、ペプチドＱＬ９で固定化された分子で被覆したプレートにおいて培養した精製２Ｃ＋Ｔ−細胞（ウェル当たり５０，０００細胞）の刺激された分裂促進を示すグラフである（実線＝Ｌｄおよび抗−ＣＤ２８抗体、破線＝Ｌｄのみ）。
【００４５】
図２１は、Ｌｄおよび抗−ＣＤ２８抗体で被覆した９６−ウェルプレートにおいて培養した、種々の示したペプチドでの、培養５日目における精製２Ｃ＋Ｔ−細胞の刺激された分裂促進を示す棒グラフである（ハッチングを施した棒＝ＩＬ−２無し、黒色棒＝ＩＬ−２添加）。
【００４６】
図２２は、Ｌｄおよび抗−ＣＤ２８抗体で被覆したプレート中での１２日間の培養後に回収し、ペプチドＱＬ９に暴露し、２Ｃ  Ｔ−細胞受容体特異的抗体１Ｂ２を用いて染色した細胞のフローサイトメトリー分析の結果のグラフ表示である（Ｍ２＝陽性染色細胞、Ｍ１＝陰性染色細胞）。
【００４７】
図２３は、Ｌｄおよび抗−ＣＤ２８抗体で被覆したプレート中での１２日間の培養後に回収し、ペプチドｐ２Ｃａに暴露し、２Ｃ  Ｔ−細胞受容体特異的抗体１Ｂ２を用いて染色した細胞のフローサイトメトリー分析の結果のグラフ表示である（Ｍ２＝陽性染色細胞、Ｍ１＝陰性染色細胞）。
【００４８】
図２４は、Ｌｄおよび抗−ＣＤ２８抗体で被覆したプレート中での１２日間の培養後に回収し、ペプチドＳＬ９に暴露し、２Ｃ  Ｔ−細胞受容体特異的抗体１Ｂ２を用いて染色した細胞のフローサイトメトリー分析の結果のグラフ表示である（Ｍ２＝陽性染色細胞、Ｍ１＝陰性染色細胞）。
【００４９】
図２５は、活性化されたＴ−細胞による標的細胞の細胞溶解を示すグラフである（実線＝ペプチドＱＬ９、破線＝対照ペプチドＬＣＭＶ）。
【００５０】
図２６は、インフルエンザマトリックスペプチドをロードした抗原−提示細胞でのヒトＣＤ８＋Ｔ−細胞の活性化に起因した細胞傷害性溶解のグラフ表示である。
【００５１】
図２７は、ＨＩＶ−ＲＴペプチドをロードした抗原−提示細胞でのヒトＣＤ８＋Ｔ−細胞の活性化に起因した細胞傷害性溶解のグラフ表示である。
【００５２】
図２８は、チロシナーゼペプチドをロードした抗原−提示細胞でのヒトＣＤ８＋Ｔ−細胞の活性化に起因した細胞傷害性溶解のグラフ表示である。
【００５３】
発明の詳細な説明
本発明は、Ｔ−細胞リンパ球を活性化するのに用いることができる合成抗原−提示系に関する。活性化されたＣＤ８＋Ｔ−細胞は増殖し、サイトカインを産生し、細胞傷害性となるか、あるいはこれらの結果の組合せとなる。１つの好ましい実施態様において、該系は細胞傷害性ＣＤ８＋細胞を活性化し、これは次いで増殖し、次いで活性化されて標的細胞を探し、それを破壊する。本発明を用いて、イン・ビトロでＴ−細胞を活性化し、次いで活性化されたＴ−細胞を、元来それが由来する患者に戻すことができるか、あるいはＴ−細胞のイン・ビボ活性化に用いることができる。
【００５４】
本発明の合成抗原−提示系は２つの主要な成分を有する。最初の成分は、選択されたペプチドに結合できるクラスＩ  ＭＨＣ分子の少なくとも細胞外部分である。第２の主要成分はＴ−細胞の活性化を助ける援助分子である。各場合において、より大きい分子の細胞外部分を用いることができるが、ある具体例では、分子全体を用いる。
【００５５】
説明を容易にするため、一般にＭＨＣ分子について記載するが、ＭＨＣ分子の細胞外部分を用いることもできることが理解される。本発明で必要なＭＨＣ分子の部分は選択されたペプチドに結合し、Ｔ−細胞にペプチドを提示する部分である。
【００５６】
ペプチドは、実施すべき処理に応じて、適当なＴ−細胞を活性化するように選択される。例えば、特定の癌の治療において、活性化されたＴ−細胞と反応する癌細胞の表面に、ある抗原性ペプチドが提示される。かくして、次いで、癌細胞と結合し、それを破壊する適当なＴ−細胞を活性化するように選択されたペプチドを用いるのが適当である。
【００５７】
本発明は、ＭＨＣ分子と既に複合体化されたペプチドでもって、ＭＨＣ分子が細胞により産生され、あるいはＭＨＣ分子が、それらで複合体化されたペプチドをまだ有しない空のＭＨＣ分子を産生させることができる。この後者の具体例は特に有用である。というのは、それはペプチドが、ＭＨＣ分子が調製された後に選択されるのを可能とするからである。
【００５８】
クラスＩ  ＭＨＣ分子は時々アルファ鎖と呼ばれる重鎖、およびβ−２ミクログロブリンを包含する。ここに議論するごとく、クラスＩ  ＭＨＣ分子の細胞外部分はβ−２ミクログロブリンと共にＭＨＣ重鎖の細胞外部分よりなる。
【００５９】
支持体に結合させるべきＭＨＣの細胞外部分を調製することにおいて、可溶性分子を後記するごとく調製する。これらの分子は一般にＭＨＣ分子中に膜貫通および細胞質ドメインを欠く。
【００６０】
援助分子は、それがペプチド／ＭＨＣ分子複合体と共に提示された場合にＴ−細胞の活性化を容易とする。本発明は援助分子の２つの主要なカテゴリーを含む。第一のカテゴリーは（従前Ｂ７として知られ、またＣＤ８０としても知られている）Ｂ７．１およびＴ−細胞上のＣＤ２８に結合する（ＣＤ８６としても知られている）Ｂ７．２のごとき共刺激性分子よりなる。他の共刺激性分子は抗−ＣＤ２８抗体またはかかる抗体の機能的部分、例えばＣＤ２８に結合するＦａｂ部分である。
【００６１】
本発明の援助分子の他の主要なカテゴリーは接着分子である。これらは、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３およびＬＦＡ−３を含めた種々のＩＣＡＭ分子を含む。結合で用いるＭＨＣ分子に結合したペプチドと、これらの援助分子のうちの１つとの組合せは、従来見られなかった程度までＴ−細胞を活性化する。
【００６２】
共刺激性分子および接着分子双方と組み合わせたペプチド−結合ＭＨＣ分子を用いることによって、より大きな相乗的反応さえ達成された。これは細胞傷害性ＣＤ８＋細胞を生産するにおいて特に効果的であることが判明した。
【００６３】
本発明によると、ＭＨＣ分子および援助分子が、ペプチドがＭＨＣ分子の細胞外部分に結合した場合に該ペプチドに対してＴ−細胞リンパ球の集団を活性化するのに十分な数にて存在するように、ＭＨＣ分子および援助分子を支持体に作動可能に結合させる。該ペプチドはＭＨＣ分子が支持体に結合される前または後にＭＨＣ分子に結合させることができる。
【００６４】
支持体は多くの異なる形態を採り得る。それはプラスチックまたは金属材料のごとき固体支持体であり得、それは分離カラムで通常使用されるごとき多孔性材料であり得、それはリポソームまたは赤血球細胞であり得、あるいはそれは細胞または細胞断片でさえあり得る。後記にてより詳細に議論するごとく、細胞が支持体として働く場合、ＭＨＣおよび援助分子は細胞によって産生され得る。次いで、ＭＨＣ分子は、少なくとも膜貫通ドメイン、もしなければＭＨＣの可溶性形態で存在しないであろう細胞質ドメイン、によって細胞に結合される。
【００６５】
ＭＨＣ分子および援助分子の細胞外部分は、支持体上に固定化された抗体に反応するエピトープを供することによって支持体に結合できる。加えて、ＭＨＣまたは援助分子は、支持体の部分を形成することにおいてニッケルと反応する（Ｈｉｓ）６と共にまたはそれに結合して産生され得る。ＭＨＣ分子を支持体に固定化するまたは結合する他の手段は当該分野でよく知られている。
【００６６】
前記で議論したごとく、支持体は細胞膜または細胞全体であり得る。かかる場合、Ｔ−細胞リンパ球で用いる合成抗原−提示細胞系となるように真核生物細胞系を修飾する。説明を容易にするため、抗原−提示細胞（ＡＰＣ）を刺激体細胞（stimulator cells）とも呼ぶ。空のＭＨＣ分子は熱不安定である故に、培養細胞は変温性であるのが好ましく、種々の細胞系を後記にて詳細に議論する。
【００６７】
細胞の培養をまず確立する。次いで、培養を、プロモーターに作動可能に連結した発現可能クラスＩ  ＭＨＣ重鎖遺伝子でトランスフェクトする。遺伝子は、それがクラスＩ  ＭＨＣ重鎖を発現できるように選択する。また、細胞系を、第２のプロモーターに作動可能に連結した発現可能β−２ミクログロブリン遺伝子でトランスフェクトする。遺伝子は、それがＭＨＣ重鎖と共にＭＨＣ分子を形成するβ−２ミクログロブリンを発現できるように選択する。後記にて詳細に議論するごとく固体支持体等と共に使用されるＭＨＣ分子の可溶性細胞外部分の場合、トランケート型ＭＨＣ重鎖遺伝子を用いる。
【００６８】
また、培養を、第３のプロモーターに作動可能に連結された発現可能援助分子遺伝子でトランスフェクトする。援助分子遺伝子は、Ｔ−細胞リンパ球上の分子と相互作用する援助分子として発現され得る。後記するごとく、各これらの遺伝子は種々の方法を用いてトランスフェクトできるが、好ましい方法は２以上のプラスミドを用いることである。
【００６９】
トランスフェクトされた細胞系は導入されるべき遺伝子のうちの少なくとも１つを欠くので、それを選択する。昆虫細胞は、それが変温性であるのみならずこれらの遺伝子、およびペプチドに結合したＭＨＣ分子を産生するメカニズム、を欠くので有利である。これは、ペプチド−結合ＭＨＣ分子の産生、および空のＭＨＣ分子の産生におけるより大きな制御を可能とする。ＭＨＣ重鎖は、好ましくは、異なる種、より好ましくは哺乳動物のような恒温動物、最適にはヒトからのものである。
【００７０】
好ましい細胞系は、ＭＨＣ重鎖の発現を制御するように誘導可能な第１のプロモーターを有する安定な変温性細胞系である。細胞が空のＭＨＣ分子を組み立て、それらをペプチドが所望ならば選択されるように細胞表面上に提示するのが好ましい。
【００７１】
得られたＭＨＣ分子はペプチドに結合し、ペプチドがＭＨＣ分子に結合した場合に該ペプチドに対してＴ−細胞リンパ球の集団を活性化するのに十分な数にて細胞表面上の援助分子と共に存在させる。
【００７２】
さらなる実施態様において、第２の援助分子遺伝子も培養細胞にトランスフェクトする。この場合、第１の援助分子遺伝子は共刺激性分子の代わりになり得、第２の援助分子遺伝子は接着分子の代わりになり得る。
【００７３】
少なくとも１つの遺伝子、特にＭＨＣ重鎖は誘導性プロモーターに連結されているのが好ましい。これは、ＭＨＣ分子が、注目するペプチドが利用可能であって、産生されたＭＨＣ分子と反応するように培養中に提示された場合にのみ産生されるようにＭＨＣ分子の産生を制御することを可能とする。これは望まないＭＨＣ分子／ペプチド複合体を最小化する。
【００７４】
細胞系が既に１以上の所望の分子を産生する場合、細胞で欠失する遺伝子の代わりに発現可能遺伝子で培養をトランスフェクトすることが必要なだけである。例えば、もし細胞がそれらの表面上にＭＨＣ分子を既に提示していれば、援助分子に代えて発現可能遺伝子で培養をトランスフェクトすることのみ必要である。
【００７５】
ペプチドは、細胞がＭＨＣ分子を産生しつつある時点で培養細胞に導入することができる。浸透圧ショックのごとき方法を通じて、ペプチドを細胞に導入し、産生されたＭＨＣ分子に結合させることができる。別法として、特に変温性細胞系の場合、ＭＨＣ分子を細胞表面上に空で提示することもできる。次いで、ペプチドを培養に添加し、所望のＭＨＣ分子に結合することができる。
【００７６】
細胞はその表面にＭＨＣおよび援助分子を有するものとして産生された後、それらを凍結乾燥し、細胞の断片を用いてＴ−細胞リンパ球の集団を活性化することができる。
【００７７】
トランスフェクトされた培養細胞を用いて、ＭＨＣ分子および援助分子の細胞外部分を産生することができる。固体支持体のごとき支持体と結合させた細胞外部分の使用は、産生のある利点を有する。生細胞を用いて合成抗原−提示細胞を提供する場合、少なくとも３種の遺伝子、すなわちＭＨＣ分子を産生するための２つの遺伝子および援助分子のための１つの遺伝子が細胞に導入されなければならない。しばしば、抗生物質耐性のためのごとき付加的遺伝子もトランスフェクトされる。
【００７８】
固体支持体系を使用すべき場合、１の細胞系は、もう１つの細胞系が援助分子の細胞外部分を産生しつつＭＨＣ分子の細胞外部分を産生できる。次いで、ＭＨＣ分子部分および援助分子部分をそれらの各培養から収穫することができる。次いで、該分子を、ペプチドがＭＨＣ分子の細胞外部分に結合した場合に該ペプチドに対してＴ−細胞リンパ球の集団を活性化するのに十分な数で適当な支持体に結合させる。産生の観点より、２つの異なる培養を用いることができるが、同一培養を用いることも可能である。しかしながら、該培養は援助分子の細胞外部分のためのさらなる遺伝子でトランスフェクトされる必要がある。
【００７９】
この実施態様のさらなる変形は、発現可能な第２の援助分子遺伝子でトランスフェクトされた第３の培養細胞を提供することである。この例においては、第２の培養細胞は共刺激性分子の細胞外部分を産生し、一方、第３の培養細胞は接着分子の細胞外部分を産生する。接着分子部分を収穫し、支持体に結合させる。
【００８０】
また、本発明は、選択されたペプチドに対してＣＤ８＋Ｔ−細胞を活性化する方法に関する。該方法はそれらの細胞表面上にペプチドを結合するＭＨＣ分子および援助分子を提示する細胞系を提供することに関する。天然ＣＤ８＋Ｔ−細胞は、治療すべき患者から取り出すことによって得ることができる。次いで、培養細胞をＣＤ８＋Ｔ−細胞リンパ球を活性化するのに十分な時間、ＣＤ８＋Ｔ−細胞と接触させ、その結果、Ｔ−細胞が増殖し、形質転換してアーム付きのエフェクター細胞となる。
【００８１】
次いで、活性化されたＣＤ８＋Ｔ−細胞を細胞系から分離し、許容される担体中に懸濁し、患者に投与することができる。別法はＣＤ８＋細胞を活性化するための合成抗原−提示マトリックスの使用を含む。
【００８２】
ヒト遺伝子を用い、従って、ヒト分子アナログが産生されるのが好ましい。先行米国特許第５，３１４，８１３号に示されているごとく、マウス系はＴ−細胞活性化の作動をテストする特に有用なモデルを提供し、ヒト系のためのプロセスの適用可能性を示す。また、Ｓｙｋｕｌｅｖら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：１５−２２（１９９４）参照のこと。
【００８３】
１．ヒト・クラスＩ  ＭＨＣ分子
クラスＩ  ＭＨＣ分子は重鎖およびβ−ミクログロブリン蛋白質よりなる。本発明のヒト・クラスＩ  ＭＨＣ重鎖はＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−ＦおよびＨＬＡ−Ｇよりなる群から、より好ましくはＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃよりなる群から選択される。重鎖は可溶性または不溶性いずれの形態にても有用である。可溶性（「ｓｏｌ」）形態において、停止コドンを、膜貫通ドメインに先行させて選択されたＨＬＡ分子をコードする核酸配列に入れる。
【００８４】
適当な変異体を有する公知の確立された細胞系、例えば、形質転換細胞系ＪＹ、ＢＭ９２、ＷＩＮ、ＭＯＣおよびＭＧからヒト・クラスＩ  ＭＨＣ重鎖をコードするヌクレオチド配列を単離することが可能であるが、適当なプライマーを用い、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を介して遺伝子の部分からヌクレオチド配列を合成するのがより現実的である。この方法は、全長ＨＬＡ  ｃＤＮＡをクローンするのに首尾よく用いられており；例えば、ＨＬＡ−Ａ２５、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ５７、ＨＬＡ−Ｂ５１、およびＨＬＡ−Ｂ３７についての配列は各々受託番号Ｍ３２３２１、Ｍ３２３２２、Ｍ３２３１７、Ｍ３２３１８、Ｍ３２３１９およびＭ３２３２０の下でＧｅｎＢａｎｋデータベースに寄託されている。コンセンサス配列を含めた公知の部分的かつ推定的ＨＬＡアミノ酸および核酸配列は公表されており（例えば、ＺｅｍｍｏｕｒおよびＰａｒｈａｍ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３３：３１０−３２０（１９９１）参照）、ＨＬＡ変異体を発現する細胞系は公知であって、同様に一般に入手可能であり、多くはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）から入手可能である。従って、ＰＣＲを用い、ヒト・クラスＩ  ＭＨＣをコードするヌクレオチド配列を合成し、次いで、これをベクターに作動可能に連結させ、これを用いて適当な細胞を形質転換し、それで発現させることができる。
【００８５】
本発明のクラスＩ  ＭＨＣ重鎖、β−２ミクログロブリン蛋白質および助力分子(assisting molecules)を産生する特に好ましい方法は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）でプライマーとして予め選択されたオリゴヌクレオチドを使用してここに記載するごとくＰＣＲ反応産物を形成させることに依拠する。遺伝子調製は、典型的には、プライマー伸長、好ましくはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）フォーマットにおけるプライマー伸長によって達成される。
【００８６】
もし遺伝子を（ＰＣＲ）増幅によって産生させるべきならば、２種のプライマー、すなわちＰＣＲプライマー対を増幅すべき核酸の各暗号鎖用に用いなければならない。（簡単のために、例示的ＨＬＡ重鎖変異体配列の合成を議論するが、記載するＰＣＲ増幅方法はβ−２ミクログロブリン、共刺激性分子、接着分子、およびその完全な配列が現在知られていないものを含めた全てのＨＬＡ変異体の合成に同等に適用されることをはっきりと理解すべきである。）
第１のプライマーはアンチセンス（マイナスまたは相補的）鎖の部分となり、ＨＬＡ（プラスまたは暗号）鎖の間で保存されたヌクレオチド配列にハイブリダイズする。暗号ＤＮＡ相同体を産生するには、従って、第１のプライマーを選択してＭＨＣ遺伝子内の保存された領域、好ましくはコンセンサス配列または各ＨＬＡ群内の同様の保存された領域、すなわち、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、および低ポリマー群ＨＬＡ−Ｅ、−Ｆおよび−Ｇ内のコンセンサス配列にハイブリダイズさせる（すなわち、それらに相補的である）。
【００８７】
第２のプライマーは暗号（プラス）鎖の一部となり、マイナス鎖内の保存されたヌクレオチド配列にハイブリダイズする。ＨＬＡ−暗号ＤＮＡ相同体を産生するには、従って、第２のプライマーを選択して、リーダーまたは最初のフレームワーク領域につきコードするその領域におけるごとくＨＬＡをコードする遺伝子の５’末端の保存されたヌクレオチド配列とハイブリダイズさせる。コーディングＤＮＡ相同体の増幅において、第２のプライマーの保存された５’ヌクレオチド配列は、Ｌｏｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７−２２０（１９８９）によって記載されているターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて外因的に付加された配列と相補的とし得る。第１および第２プライマーの一方または双方は、エンドヌクレアーゼ認識部位を規定するヌクレオチド配列を含有できる。該部位は増幅すべき免疫グロブリン遺伝子に対して異種とでき、典型的には、プライマーの５’末端にまたはその近くにあるようである。
【００８８】
ＲＮＡポリメラーゼの高代謝回転速度は、Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎら，  Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｐ．Ｂｏｙｅｒ編，８７−１０８頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）によって記載されているごとく出発ポリヌクレオチドを増幅させる。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのもう１つの利点は、Ｊｏｙｃｅら，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１７：７１１−７２２（１９８９）によって従前に記載されているごとく、ｃＤＮＡの一部を１以上の突然変異誘発性オリゴデオキシヌクレオチド（ポリヌクレオチド）で置き換え、部分的にミスマッチの鋳型を直接転写させることによって、突然変異をポリヌクレオチド合成に導入することができる。転写に基づく増幅系はＧｉｎｇｅｒａｓら，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２４５−２５２頁，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）によって記載されている。
【００８９】
ＰＣＲ増幅方法は米国特許第４，６８３，１９２号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号および第４，９６５，１８８号ならびに「ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｈ．Ｅｒｈｌｉｃｈ編，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）；および「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｉｎｎｉｓら編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）を含めた少なくとも数種のテキストに詳細に記載されている。ここに使用される種々の好ましい方法およびプライマーを以後記載し、また例えばＮｉｌｓｓｏｎら，  Ｃｅｌｌ  ５８：７０７（１９８９），Ｅｎｎｉｓら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：２８３３−７（１９９０）、およびＺｅｍｍｏｕｒら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３３：３１０−２０（１９９１）に記載されている。特に、保存された配列を選択し、ＨＬＡ対立遺伝子（例えば、−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｅ、−Ｆまたは−Ｇ対立遺伝子）の５’および３’非翻訳領域の比較からプライマーを設計するのが好ましい。また、制限部位を５’および３’プライマーに取り込んで、増幅産物が配列決定または発現ベクターにサブクローンされるのを可能とすることもできる。また、４−塩基スペーサー配列を制限部位の基部側に位置させて、酵素での増幅産物の切断の効率を改良するのが有用であろう。
【００９０】
以下のプライマーが、好ましくは別々の反応において、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｅ、−Ｆ、および−Ｇ  ｃＤＮＡの増幅で好ましい。次いで、得られたｃＤＮＡをクローンし、ここに記載するごとく配列決定することができる。これらのプライマーは、全ての公知のおよび現在知られていないタイプのＨＬＡを増幅するのに用いるのに適する。
ＨＬＡ  Ａ
５’プライマー：５’  ＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＣ  ＧＴＣ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＣＣＣ  ３’（配列番号１）  
３’プライマー：５’  ＧＧ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＴＣＴ  ＧＡＧ  ３’（配列番号２）
ＨＬＡ  Ｂ
５’プライマー：５’  ＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＣＣＣ  ３’（配列番号３）
３’プライマー：５’  ＧＧ  ＡＣＴ  ＣＧＡ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＡＴＣ  ３’（配列番号４）
ＨＬＡ  Ｃ
５’プライマー：５’  ＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＣＧＧ  ＧＴＣ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＣＣＣ  ３’（配列番号５）
３’プライマー：５’  ＧＧ  ＴＣＡ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＧＡＴ  ＧＡＧ  ３’（配列番号６）
ＨＬＡ  Ｅ
５’プライマー：５’  ＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＣＧＧ  ＧＴＡ  ＧＡＴ  ＧＣＣ  ＣＴＣ  Ｃ  ３’（配列番号７）
３’プライマー：５’  ＧＧ  ＴＴＡ  ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＡＧＡ  ＣＴＣ  ＡＧＡ  ３’（配列番号８）
ＨＬＡ  Ｆ
５’プライマー：５’  ＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＣＣＣ  ＣＧＡ  ＡＧＣ  ＣＴＣ  ３’（配列番号９）
３’プライマー：５’  ＧＧ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＡＧＣ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  Ａ  ３’（配列番号１０）
ＨＬＡ  Ｇ
５’プライマー：５’  ＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＣＣＣ  ＣＧＡ  ＡＣＣ  ＣＴＣ  ３’（配列番号１１）
３’プライマー：５’  ＧＧ  ＴＣＡ  ＣＡＡ  ＴＴＴ  ＡＣＡ  ＡＧＣ  ＣＧＡ  ＧＡＧ  ３’（配列番号１２）
好ましい具体例において、第１および第２プライマーのただ一対を増幅反応当たりに用いる。各々複数の異なるプライマー対を用いる、複数の異なる増幅から得られた増幅反応産物を次いで合わせる。しかしながら、また、本発明は、共−増幅（２対のプライマー使用）、および多重増幅（約８、９または１０プライマー対を使用）を介するＤＮＡ相同体生産に関する。
【００９１】
好ましい具体例において、ＰＣＲプロセスは、種々のヒト・クラスＩをコードするＤＮＡ分子を生産するのみならず、高度に多形のＨＬＡ遺伝子座で観察されるものに匹敵し得る突然変異を誘導し、あるいは単一の親クローンから多様性を創製し、それによりより大きな異種性を有するクラスＩ  ＭＨＣ分子をコードするＤＮＡ「ライブラリー」を供するために用いる。前記した変形を含めた突然変異に加えて、米国特許第４，６８３，１９５号に引用されており、米国特許第５，３１４，８１３号に議論されている。
【００９２】
２．ＤＮＡ発現ベクター
本発明のベクターは、細胞中で自律複製可能な核酸（好ましくは、ＤＮＡ）分子であり、それに、ＤＮＡセグメント、例えば遺伝子またはポリヌクレオチドを作動可能に連結させて、付着セグメントの複製を実行させることができる。ベクター配列に作動可能に連結させるべきヌクレオチドセグメントの１つは、哺乳動物クラスＩ  ＭＨＣ重鎖の少なくとも一部をコードする。好ましくは、ＭＨＣ重鎖の全ペプチド暗号配列をベクターに挿入し、発現させる；しかしながら、いくつかの非暗号ＭＨＣ配列も同様に含むベクターを構築することも可能である。好ましくは、ＭＨＣの非暗号配列は排除される。別法として、クラスＩ  ＭＨＣ重鎖の可溶性（「ｓｏｌ」）形態についてのヌクレオチド配列を利用することができ；「ｓｏｌ」形態は、それがアルファ３ドメインの末端または膜貫通ドメインの前に挿入された「停止」コドンを含有する点で非−ｓｏｌ形態とは異なる。もう１つの好ましいベクターは、発現用のベクターに作動可能に連結した哺乳動物β−２ミクログロブリン分子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む。さらにもう１つの好ましいベクターは、発現用のベクターに作動可能に連結した哺乳動物助力分子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む。また、クラスＩ  ＭＨＣ重鎖およびβ−２ミクログロブリンおよび助力分子、またはこれらのいくつかの組合せをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを構築することも可能である。
【００９３】
好ましいベクターは、方向性連結に適合したヌクレオチドの配列を介して発現するために作動可能に連絡した１以上の翻訳可能なＤＮＡ配列を含むカセットよりなる。該カセットは、好ましくは、翻訳可能ＤＮＡ配列が、方向性連結に適したヌクレオチドの配列を介してカセットに方向性よく挿入された場合に産生されるポリペプチドまたは蛋白質を発現するためのＤＮＡ発現制御配列を含む。また、カセットは、好ましくは、翻訳可能ＤＮＡ配列の上流のプロモーター配列、および哺乳動物ＭＨＣ重鎖配列から下流のポリアデニル化配列を含む。また、該カセットは選択マーカーを含むこともできるが、かかるマーカーはもう１つの発現ベクター配列に作動可能に連結したヌクレオチド配列にコードされるのが好ましい。
【００９４】
本発明のカセットが作動可能に連結されるベクターの選択は、当業者によく知られているごとく、所望の機能的特性、例えば、ベクター複製および蛋白質発現、および形質転換すべき宿主細胞に直接依存し、これらは組換えＤＮＡ分子を構築する分野に固有の限定である。
【００９５】
種々の具体例において、ＭＨＣ変異体および抗原性ペプチドを含めた、本発明で有用なポリペプチドの生産用にベクターを利用する。例示的ベクターは、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  （Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から入手可能なプラスミドｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能なｐＰＬおよびｐＫＫ２２３、およびｐＢＳおよびＭ１３ｍｐ１９（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を含む。他の例示的ベクターはｐＣＭＵを含む（Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ５８：７０７（１９８９））。他の適当なベクターは公知の方法に従って合成することもできる；例えば、ここに種々の適用で使用されるベクターｐＣＭＵ／ＫｈおよびｐＣＭＵＩＩはｐＣＭＵＩＶ（Ｎｉｌｓｏｎら，前掲）の修飾である。
【００９６】
加えて、好ましくは、プロモーター配列をコードする翻訳可能ヌクレオチド配列の上流に配列がある。好ましくは、プロモーターは条件的である（例えば、誘導性）。ここに使用される好ましい条件的プロモーターはメタロチオネインプロモーターまたは熱ショックプロモーターである。
【００９７】
ベクターはよく知られたベクター構築技術のいずれかを利用して構築することができる。しかしながら、これらの技術は、宿主細胞のゲノムに挿入されるべき翻訳可能ヌクレオチド配列が適当なプロモーターによって本発明の変形と配列の「上流で」隣接する程度に修飾され、ある本発明の変形例では翻訳可能ヌクレオチド配列はポリアデニル化部位により「下流で」隣接される。これは、「宿主」細胞が昆虫細胞であって、ヌクレオチド配列がトランスフェクションを介して伝達される場合に特に好ましい。トランスフェクションは、リン酸カルシウム方法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、安定な導入方法、エレクトロポレーションを含めた多数の方法を介して、あるいはリポソーム媒介法を介して達成できる。公知のトランスフェクション方法およびヌクレオチドを細胞に導入する他の手法を記載する多数のテキストが利用できる；例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９１）参照。
【００９８】
ベクターそれ自体は、ウイルスベクター（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、裸の直鎖または環状ＤＮＡ、または核酸物質および細胞に挿入されるべきいずれかのポリペプチドを含有する小胞またはエンベロープのごときいずれの適当なタイプのものであってもよい。小胞に関しては、リポソームのごとき脂質小胞の構築のための技術がよく知られている。かかるリポソームは、リポソームの外部上の抗体または他の特異的結合性分子を提供するごとき他の常法技術を用いて特定の細胞に対して標的化することができる。例えば、Ａ，Ｈｕａｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：８０１５−８０１８（１９８０）参照。例えば、Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：４８７−５１１（１９９０）参照。
【００９９】
好ましい具体例において、ベクターは選択マーカーも含有する。発現の後、翻訳可能ヌクレオチド配列の産物を、次いで、その配列に対する抗体を用いて精製することができる。選択マーカーの１つの例はネオマイシン耐性である。ｐｈｓｈｎｅｏ、ｐｈｓｎｅｏ、またはｐｃｏｐｎｅｏのごときネオマイシン耐性をコードするプラスミドを、選択遺伝子（類）を発現する細胞の集団が選択培地でトランスフェクタントを増殖させることによって確認できるように各トランスフェクションに含ませることができる。
【０１００】
本発明で用いる好ましいベクターはプラスミドである；より好ましくは、それは高コピー数プラスミドである。また、誘導性プロモーターは、（しばしば非天然またはキメラヌクレオチド配列を担持するように構築された）ベクターが導入された細胞に対する選択圧を限定する傾向にあるので、該ベクターは誘導性プロモーター配列を含有するのも望ましい。また、選択ベクターは選択宿主での発現に最良に適合するのが好ましい。もし宿主細胞集団がＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞培養物であれば、適合するベクターはｐ２５−ｌａｃＺ（ＢｅｌｌｏおよびＣｏｕｂｌｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４６；４８０（１９９０）参照）またはｐＲｍＨａ−１、−２、または−３（Ｂｕｎｃｈら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０４３−１０６１（１９８８）参照）のごときものと機能的に同等のベクターを含む。好ましい具体例において、該ベクターはｐＲｍＨａ−３であり、これは図３に示す。このベクターはメタロチオネインプロモーターを含み、これは好ましくは、ＭＨＣ配列が挿入される部位の上流にあり、ポリアデニル化部位は好ましくは該ＭＨＣ配列の下流にある。昆虫細胞、特にＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞が本発明で好ましい宿主である。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２（Ｓ２）のごときＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞はプロモーターの活性化に必要なトランス−作用因子を有し、かくして、なおさらに好ましい。
【０１０１】
発現ベクターｐＲｍＨａ−３は細菌プラスミドｐＲｍＨａ−１（図２）に基づき、その後者はプラスミドｐＵＣ１８をベースとし、受託番号３７２５３を有し、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）に寄託されている。ｐＲｍＨａ−３ベクターはプロモーター、Ｒ１およびＳｔｕ部位が除去されたメタロチオネイン遺伝子の５’非翻訳リーダー配列（配列１−４２１、配列番号１３）を含有する。また、それはポリアデニル化部位を含めたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＡＤＨ遺伝子（配列＃６４３５−７２７０、配列番号１４）の３’部分も含有する。従って、クローン化ＤＮＡはメタロチオネインプロモーターによって転写的に調節され、ポリアデニル化されている。ｐＲｍＨａ−１プラスミドの構築はＢｕｎｃｈら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０４３−１０６１（１９８８）に記載されている。ｐＲｍＨａ−３およびｐＲｍＨａ−２プラスミド（その後者はＥｃｏＲＩ断片として除去し得るメタロチオネインプロモーター配列を有する）の構築は図１、２および３に示す。本発明で使用するのに好ましいプラスミドｐＲｍＨａ−３に関しては、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩがプロモーター断片中にあり、従って、ユニークではない。ＸｂａはＡＤＨ断片中にあり（その３’末端から４塩基）、またユニークでない。しかしながら、以下の制限部位はｐＲｍＨａ−３でユニークである：ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ、Ｎｉｎｃ２、およびＡｃｃＩ。
【０１０２】
本発明のＤＮＡ発現ベクターにおけるカセットは、翻訳可能ＤＮＡ配列の挿入に際して、適当な宿主において、本発明の融合蛋白質を発現できるヌクレオチドの配列を形成するベクターの領域である。ヌクレオチドの発現−コンピテント配列をシストロンという。かくして、カセットは、好ましくは、１以上の翻訳可能ＤＮＡ配列に作動可能に連結したＤＮＡ発現制御エレメントよりなる。翻訳可能ＤＮＡ配列がその目的に適合したヌクレオチドの配列を介して、制御エレメントの間に方向性よく挿入された（方向性よく連結された）場合にシストロンが形成される。得られた翻訳可能ＤＮＡ配列、すなわち挿入配列は、好ましくは、適当なリーディングフレームに作動可能に連結される。
【０１０３】
ＤＮＡ発現制御配列は、構造遺伝子産物用のＤＮＡ発現シグナルの一組よりなり、よく知られているように、シストロンが構造遺伝子産物を発現できるように、該シストロンに作動可能に連結された５’および３’エレメント双方を含む。５’制御配列は転写を開始するためのプロモーターおよび上流の翻訳可能ＤＮＡ配列の５’末端に作動可能に連結されたリボソーム結合部位を規定する。
【０１０４】
かくして、本発明のＤＮＡ発現ベクターは、カセット部分に翻訳可能ＤＮＡ配列をクローンして、本発明の融合蛋白質を発現できるシストロンを得るための系を提供する。
【０１０５】
３．細胞系
本発明の好ましい細胞系は培養中で連続的に増殖でき、その細胞の表面に哺乳動物クラスＩ  ＭＨＣ分子および助力分子を発現できる。細菌、酵母、昆虫および哺乳動物細胞系を含めた種々の形質転換および非形質転換細胞または細胞系のいずれもこの目的に適する。（例えば、種々の細胞系、他えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを培養しそれを使用する要約および手法については、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９１）参照）。
【０１０６】
好ましくは、細胞系は真核細胞系である。より好ましくは、細胞系は変温性である（すなわち、哺乳動物細胞系よりも温度攻撃に対して感受性が低い）。より好ましくは、それは昆虫細胞系である。ガ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８０）、アワヨトウ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）、カ幼虫（ＡＴＣＣ系ＣＣＬ  １２５、ＣＣＬ  １２６、ＣＲＬ  １６６０、ＣＲＬ  １５９１、ＣＲＬ６５８５、ＣＲＬ  ６５８６）およびカイコ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８８５１）を含めた種々の昆虫細胞系が本発明の使用に入手できる。好ましい具体例において、細胞系はＳｃｈｎｅｉｄｅｒ２（Ｓ２）細胞系（Ｓ２／Ｍ３）のごときＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞系であり（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ  Ｅｍｂｒｙｌ．  Ｅｘｐ．  Ｍｏｒｐｈ．２７：３５３−３６５（１９７２）参照。）；好ましくは、細胞系はＭ３培地での増殖に適したＳｃｈｎｅｉｄｅｒ２（Ｓ２）細胞系（Ｓ２／Ｍ３）である（Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔら，  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ５８：１６３  （１９８２）参照）。
【０１０７】
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞は実質的には以下のごとくに調製できる。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ｏｒｅｇｏｎ−Ｒ）卵を約４時間間隔にわたって収集し、２．５％水性次亜塩素酸ナトリウム中で脱塩素化し、７０％エタノール中に２０分間浸漬することによって表面滅菌し、続いて７０％エタノール中の０．０５％ＨｇＣｌ２中でさらに２０分間浸漬することによって表面滅菌する。滅菌蒸留水中で徹底的にすすいだ後、予め共に培地で湿らせたＭｉｌｌｉｐｏｒｅプレフィルターで裏打ちした滅菌Ｍｅｔｒｉｃｅｌ黒色フィルターを含有するペトリ皿に卵を移す。卵を一晩２２℃のインキュベーターに入れ、２０−２４時間経ってから培養のために取り出す。胚を各半分または１／３に切断し、次いでＲｉｎａｌｄｉｎｉ塩溶液（Ｒｉｎａｌｄｉｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）１７３：１１３４−１１３５（１９５４））中の０．２％トリプシン（１：２５０、Ｄｉｆｃｏ）に室温で２０−４５分間入れる。１００−３００の胚を用いて各培養を開始する。
【０１０８】
胎児ウシ血清（ＦＢＳ）の添加の後、断片を１００×ｇにて２−３分間遠心し、１．２５ｍｌ培養培地に再懸濁し、ガラスＴ−９フラスコに接種する。雰囲気空気のガス相にて、培養を約２２−２７℃±０．５℃に維持する。さらに１００ｍｌ培地当たり５００ｍｇの細菌学的ペプトンを含有し、１５％不活化ＦＢＳを補足したＳｃｈｎｅｉｄｅｒの培養基（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．１５６：９１−１０４（１９６４）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．１５：２７１−２７９（１９６６））が好ましく使用される。ｐＨ（好ましくは、６．７−６．８）を０．０１％フェノールレッドでモニターする。細胞系は、好ましくは、３−７日ごとに継代培養することによって維持する。細胞はガラスに容易に付着するが、トリプシン処理が必要なほどはしっかりとは付着しない；典型的には、単純なビペッティングがほとんどの細胞をフラスコの底から流すのに適する。細胞の形態学的外観はＳｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．２７：３５３−３６５（１９７２）に記載されている。それらは、外観が実質的に上皮細胞様であり、直径が５−１１μｍ、長さが１１−３５μｍの範囲である。丸い細胞を含有する小さなポケットを他の細胞全体にランダムに分配させることができる。
【０１０９】
好ましくは、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２（Ｓ２）細胞はＳｃｈｎｅｉｄｅｒのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地＋ペニシリン（１００ユニット／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）含有する１０％ＦＢＳ中に維持する。細胞を０．５×１０５／ｍｌを超える密度で維持し、それを２４−３０℃の温度範囲で増殖させるのが好ましい。細胞は２４時間未満で倍化し、増殖して高細胞密度、すなわち約２×１０７／ｍｌまたはそれ以上となる傾向がある。また、細胞を後の使用または分析のために９０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯ中で凍結することもできる。細胞を−７０℃に置き、次いで、液体窒素中で保存することができる。
【０１１０】
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２（Ｓ２）と確認される本発明による好ましい細胞系は、ブダペスト条約に基づき、１９９２年２月１８日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託し、受託番号ＣＲＬ１０９７４が付与された。
【０１１１】
本発明の細胞は、各々発現ベクターに挿入された（すなわち、作動可能に連結された）、（ヒト）ＭＨＣ重鎖、β−２ミクログロブリンおよび１以上の助力分子をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトする。より好ましい具体例において、ベクターは、ヒト・クラスＩ  ＭＨＣ重鎖、ヒトβ−２ミクログロブリンまたはヒト助力分子をコードする発現可能ヌクレオチド配列がここに開示する技術を用いて挿入されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現プラスミドｐＲｍＨａ−３よりなる。好ましくは、ＭＨＣ重鎖をコードするｃＤＮＡ、β−２ミクログロブリンをコードするｃＤＮＡ、および助力分子をコードするｃＤＮＡは別の発現プラスミドに作動可能に連結し、培養細胞に共トランスフェクトする。別法として、ＭＨＣ重鎖、β−２ミクログロブリンおよび助力分子をコードするｃＤＮＡは同一発現プラスミドに作動可能に連結させ、その同一プラスミドを介して共トランスフェクトすることもできる。もう１つの変形において、ＭＨＣ重鎖、β−２ミクログロブリン、助力分子、およびＩＬ−２のごときサイトカインをコードするｃＤＮＡを発現プラスミドに作動可能に連結し、本発明の細胞系に共トランスフェクトする。ＨＬＡ遺伝子の選択、適当なベクターの構築およびプライマー選択は前記により詳しく記載されている。
【０１１２】
うまく形質転換された細胞、すなわち本発明の発現可能ヒトヌクレオチド配列を含有する細胞はよく知られた技術を介して同定できる。例えば、本発明のｃＤＮＡまたはｒＤＮＡの導入から得られる細胞をクローン化して、モノクローナルコロニーを得ることができる。それらのコロニーから細胞を収穫し、溶解し、それらのＤＮＡ含有量をＳｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ９８：５０３（１９７５）によって記載されているもののごとき方法を用いて、ｒＤＮＡの存在につき調べる。ｒＤＮＡの存在についての直接的アッセイに加えて、形質転換またはトランスフェクションの成功は、ｒＤＮＡが対象キメラポリペプチドを直接発現できる場合はよく知られた免疫学的方法によって確認することができる。例えば、発現ベクターで首尾よく形質転換された細胞は、適当な抗体を用いて容易に測定される特定の抗原特性を呈する蛋白質を産生することができる。加えて、成功した形質転換／トランスフェクションは前記したごときネオマイシン耐性のごときマーカー配列を担持するさらなるベクターの使用を介して確認することができる。
【０１１３】
また、培養物は安定で低温で保持された増殖が可能であるのが好ましい。例えば、培養物をほぼ室温で、例えば２４−２７℃で維持するのが好ましい。他の具体例において、特にＣＤ８＋細胞を活性化するプロセスの間、培養物を高温に維持するのが好ましい。かくして、本発明による培養物は約３０℃ないし約３７℃の温度攻撃に耐えることができるのが好ましい。β−２ミクログロブリンの培養物への添加はクラスＩ  ＭＨＣを少なくとも３０℃の攻撃まで安定化させ；β−２ミクログロブリンおよびペプチドの添加の結果、より高い温度、すなわち３７℃でより大きな熱安定性となる。
【０１１４】
空の、より好ましくはペプチド−結合したＭＨＣ分子の発現のための培養物を調製するには、培養物は、例えば、ＣｕＳＯ４誘導を介して、所定の時間の刺激をまず要するであろう。適当な誘導時間、例えば、約１２−４８時間の後、ペプチドを所定の濃度（例えば、約１００μｇ／ｍｌ）で添加することができる。後記するごとくペプチドを調製することができる。さらなるインキュベーション時間、例えば２７℃における約１２時間の後に、培養物はＣＤ８＋細胞の活性化で使用される。このさらなるインキュベーション時間は短縮化あるいは恐らくは省略することができるが、もし休止または天然ＣＤ８＋細胞の添加に先立った時間の間、インキュベートさせれば、培養物は温度攻撃に対して益々安定となる傾向がある。例えば、ペプチドが添加された本発明による培養物は、３７℃で延長された時間インキュベートした場合でさえ、かなりの量のペプチド−負荷クラスＩ  ＭＨＣ分子を発現できる。
【０１１５】
形質転換宿主細胞を培養するにおいて有用な栄養培地は当該分野でよく知られているか、あるいは多数の商業的入手源から得ることができる。宿主細胞が哺乳動物である具体例においては、「無血清」培地が好ましくは使用される。
【０１１６】
４．ヒトβ−２ミクログロブリンおよび助力分子
治療上有用な量の表面発現されたヒト・クラスＩ  ＭＨＣ分子を産生できる細胞系を確立するためには、β−２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結したベクターで本発明による細胞系を共トランスフェクトして、該細胞系においてヒトＭＨＣ分子の適当なレベルの発現を行うのが好ましい。マウスβ−２ミクログロブリンのごとき哺乳動物β−２ミクログロブリンをコードするヌクレオチド配列は本発明の細胞系において発現されるヒト・クラスＩ  ＭＨＣ分子の安定性を増大させるが、ヒトβ−２ミクログロブリンをコードする発現可能ヌクレオチド配列に作動可能に連結したベクターで細胞系を共トランスフェクトするのが好ましい。
【０１１７】
前記したごとく、本発明による好ましいベクターは、発現用のベクターに作動可能に連結した哺乳動物β−２ミクログロブリン分子の少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む。助力分子のための遺伝子を同一またはもう１つのベクターに連結させることができる。また、クラスＩ  ＭＨＣ重鎖およびβ−２ミクログロブリンを共にコードするヌクレオチド配列を含むベクターを構築することもできる。
【０１１８】
助力分子で使用される配列決定およびプライマーは後記にてより詳しく記載する。しかしながら、プロトコルは同様である。
【０１１９】
ヒトβ−２ミクログロブリンｃＤＮＡ配列は公表されており（Ｓｕｇｇｓら，ＰＮＡＳ  ７８：６６１３−１７、１９８１参照）、以下のプライマーを用い、該配列をポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）用の鋳型として用いた。
５’プライマー
５’ＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣ  ３’
（配列番号１５）
３’プライマー
５’ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＧＧＴＴＡＣＡＴＧＴＣＧＣＧＡＴＣＣＣＡＣＴＴＡＡＣ  ３’
（配列番号１６）
プライマーは標準的なＰＣＲ反応で使用される（前記およびそれで引用された文献参照）。反応産物をフェノールで抽出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキット（Ｂｉｏ  １０１、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて精製し、ＢａｍＨＩで消化し、ｐＢＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＢａｍＨＩ部位にクローン化する。配列の確認の後、このＢａｍＨＩ断片を適当な発現ベクターのＢａｍＨＩ部位にクローン化する。好ましい具体例において、ヒトβ−２ミクログロブリンｃＤＮＡを合成し、発現ベクターｐＲｍＨａ−３に作動可能に連結させる。
【０１２０】
５．ペプチド
ウイルス抗原に加えて実質的に全ての細胞蛋白質を用いて、可能なクラスＩ  ＭＨＣリガンドとして働く関連ペプチド断片を生成することができる。従って、ほとんどの哺乳動物細胞において、いずれの特定のＭＨＣペプチド複合体も、細胞表面に見い出される全ＭＨＣコード分子の小さな割合しか表さないであろう。従って、ＣＤ８＋細胞を特異的に活性化させる増大した能力を有する表面発現されたヒト・クラスＩ  ＭＨＣ分子を生成させるためには、適当なサイズでクラスＩ分子への抗原性特性を持つペプチド断片を単離し負荷するのが好ましい。
【０１２１】
本発明のペプチドはクラスＩ  ＭＨＣ分子に結合する。結合はイン・ビトロと同様にイン・ビボで作成できる生物学的条件下で起こる。ペプチドの結合の正確な性質は本発明の実施では知られている必要はない。
【０１２２】
好ましい具体例において、クラスＩ  ＭＨＣ分子に負荷されるべきペプチドは抗原性である。また、ペプチドは均一サイズ、好ましくは８−量体または９−量体、最も好ましくは８−量体であるのが好ましい。また、ＭＨＣ分子へ負荷するために調製したペプチドは単一の種であるのが、すなわち、ＭＨＣに負荷される全てのペプチドはサイズおよび配列が同一であるのが好ましい。このようにして、モノ抗原性ペプチドを負荷したＭＨＣ分子を産生することができる。
【０１２３】
ペプチドは種々の手段を介して細胞に提示することができる。好ましくは、ペプチドはそれをペプチドの細胞内プールに侵入させるように提示する。例えば、ペプチドを浸透圧負荷を介して提示することができる。典型的には、ペプチドを培養基に添加する。ペプチドは完全なポリペプチドまたは蛋白質の形態で培地に添加することができ、これを引き続いて細胞プロセスを介して、例えば酵素的分解を介して分解させる。別法として、完全なポリペプチドまたは蛋白質は、細胞培養物へのその添加に先立って、化学分解（例えば、臭化シアノゲン）またはプロテアーゼ（例えば、キロトリプシン）のごときいくつかの他の手段を介して分解することもできる。他の具体例において、ペプチドは、エピトープアミノ酸配列よりなるものでも、あるいはなるものでないものでもよいより小さいセグメントにて提示される。
【０１２４】
好ましい具体例において、十分量の蛋白質（類）またはペプチド（類）を細胞培養物に添加して、クラスＩ  ＭＨＣ分子を結合させ、引き続いて、本発明のヒト・クラスＩ  ＭＨＣ−発現細胞の表面に、好ましくは各ＭＨＣに付着した同一種のペプチドと共に、高密度のペプチドを提示する。また、ＭＨＣ分子にペプチドを細胞内で提示する前に、ヒト・クラスＩ  ＭＨＣ重鎖およびヒトβ−２ミクログロブリンを結合させる、すなわちヘテロダイマーを形成させるのが好ましい。
【０１２５】
本発明のもう１つの具体例において、ペプチドを本発明のトランスフェクトされた細胞に添加して、細胞によつて発現されるＭＨＣ分子の熱安定性を増強させる。前記したごとく、ペプチドは、好ましくは、培養基に添加する。クラスＩ分子に結合する抗原性ペプチドはＭＨＣ分子を熱安定化させ、また細胞表面発現を増加させるように働く。ＭＨＣ分子に結合するペプチドが添加された培養物は、かくして、ペプチド無添加の培養物よりも温度攻撃に対してかなり感受性が低い。
【０１２６】
本発明の１の具体例において、抗原性ペプチドを種々の形態で形質転換／トランスフェクト細胞系に提示する。例えば、全蛋白質または他の抗原性ポリペプチドを化学的にまたは酵素的に分解させることができ、例えば、この形態で細胞系に添加することができる。例えば、当該蛋白質をキモトリプシンで分解し、得られたペプチド「断片」の混合物を形質転換またはトランスフェクトされた細胞培養物に添加する；次いで、これらの細胞により（しばしば、より小さいペプチド、好ましくは８−量体または９−量体である）適当なペプチドを「選択」せしめて、クラスＩ  ＭＨＣ分子に負荷する。別法として、全蛋白質またはポリペプチド配列を適当なベクターにクローン化し、真核細胞に挿入し、それにより細胞は有意量の抗原性ポリペプチドを生成し、このポリペプチドを次いで収穫し、精製し、ペプチドへと消化し、次いで、ペプチドを形質転換／トランスフェクト真核細胞培養物に添加する。細胞により再度、発現されたＭＨＣに負荷すべきペプチドを「選択」させる。
【０１２７】
６．休止または前駆体ＣＤ８＋細胞の単離
休止（または天然もしくは前駆体）ＣＤ８＋細胞、すなわち特定の抗原を標的化するように活性化されていないＴ−細胞を、好ましくは、本発明の形質転換培養物と共にＣＤ８＋細胞インキュベートする前に患者から抽出する。また、前駆体ＣＤ８＋細胞は、特異的に活性化されるＣＤ８＋細胞の能力に干渉し得る他の治療または療法の開始に先立って患者から採取するのが好ましい。例えば、もし新生物または腫瘍を持つ個体を治療しようと意図するならば、化学療法または照射処置の開始に先立って細胞および培養物を得るのが好ましい。
【０１２８】
リンパ球を抽出し、培養する方法はよく知られている。例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇに対する米国特許第４，６９０，９１５号は、リンホサイトフォレシスを介する多数のリンパ球を得る方法を記載している。使用する適当な培養条件は哺乳動物細胞についてのものであり、これは典型的には３７℃で行う。
【０１２９】
また、種々の方法が前駆体ＣＤ８＋細胞の培養を分離しおよび／または富化させるのに適する。細胞分離のための一般的方法のいくつかの例は、特異的被覆表面への細胞の間接的結合を含む。もう１つの例において、ＣＤ８＋細胞を含むヒト末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって単離する。しかる後直ちにＰＢＬリンパ芽球を用いることができるか、あるいは１０％ＤＭＳＯを含有するＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で凍結した後、液体窒素中で貯蔵することができ、これは細胞の生存性およびリンパ球の機能を保存する。
【０１３０】
前駆体細胞の培養物を分離しおよび／または富化させる別の方法は、陽性および陰性選択手法を共に含む。陽性選択では、リンパ球−富化ＰＢＬ集団を全血から調製した後、ＣＤ８＋リンパ球の亜集団をＣＤ８受容体抗原の存在に向けられるアフィニティー−ベースの分離技術によってそれから単離する。これらのアフィニティー−ベースの技術はフロレスサンス−活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）等のフローミクロフルオロメトリー、細胞接着および同様の方法を含む。（例えば、ＳｃｈｅｒおよびＭａｇｅ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編，７６７−７８０頁，Ｒｉｖｅｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８４）参照）。アフィニティー方法はアフィニティー試薬ソースとして抗−ＣＤ８受容体抗体を利用することができる。別法として、ＣＤ８受容体の天然リガンド、またはリガンド類似体をアフィニティー試薬として用いることもできる。これらの方法で用いる種々の抗−Ｔ−細胞および抗−ＣＤ８モノクローナル抗体は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）およびＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含めた種々の商業的入手源から一般に入手できる。
【０１３１】
陰性選択手法は、ＣＤ８＋集団から非−ＣＤ８の除去を行うのに利用される。この技術の結果、ロイコフォレシス処理した患者のＴ−およびＢ−細胞集団からＣＤ８＋細胞が富化される。抗原提示に応じて、異なる抗体が適当であろう。（命名法の議論およびレビュー、抗原命名、およびＴ−細胞を含めたヒト初血球についての割り当てられた抗体については、Ｋｎａｐｐら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １０：２５３−２５８（１９８９）およびＪａｎｅｗａｙら，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，前掲参照）。例えば、モノクローナル抗体ＯＫＴ４（抗−ＣＤ４、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  ８００２）、ＯＫＴ５（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  ８０１３および８０１６）、ＯＫＴ８（抗−ＣＤ８、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  ８０１４）、およびＯＫＴ９（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ  ８０２１）は細胞系およびハイブリドーマのＡＴＣＣカタログ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中、各々、ヒトＴリンパ球、ヒトＴ−細胞サブセット、および活性化Ｔ−細胞と反応性であることで同定される。種々の他の抗体がＴ−細胞種を同定し単離するのに入手できる。
【０１３２】
さらなる具体例において、ＣＤ８＋細胞は陽性および陰性両選択手法を組み合わせることによって単離できる。（例えば、ＣａｉおよびＳｐｒｅｎｔ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：２００５−２０１５（１９９４）参照）
好ましくは、次いで、ＰＢＬを精製する。例えば、Ｆｉｃｏｌｌ勾配をこの目的で利用できる。精製されたＰＢＬを、次いで、適当な抗原性ペプチドと共にプレインキュベートした同系Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞と混合する。
【０１３３】
７．ＣＤ８＋細胞のイン・ビトロ活性化
特異的細胞毒性Ｔ−細胞の生成のためのイン・ビトロ条件を最適化するために、抗原−提示細胞の培養物を適当な培地中に維持する。好ましい具体例において、抗原−提示細胞はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞であり、これは好ましくは無血清培地（例えば、Ｅｘｅｌｌ  ４００）中に維持する。
【０１３４】
活性化すべき細胞、例えば前駆体ＣＤ８＋細胞と共に抗原−提示細胞をインキュベートするに先立って、一定量の抗原ペプチドを、抗原−提示細胞の表面で発現させるべきヒト・クラスＩ分子に負荷させるのに十分な量抗原−提示細胞培養物に添加する。本発明によると、十分量のペプチドは、約２００ないし約５００，０００、好ましくは約２００ないし１，０００またはそれ以上の、ペプチドが負荷させたヒト・クラスＩ  ＭＨＣ分子が各抗原−提示細胞の表面で発現されることを可能とする量である。好ましくは、抗原−提示細胞を＞２０μｇ／ｍｌペプチドと共にインキュベートする。
【０１３５】
次いで、休止または前駆体ＣＤ８＋細胞を、ＣＤ８＋細胞の集団を活性化し、それにつきさらに富化させるのに十分な時間、適当な抗原−提示細胞と共に培養物中でインキュベートする。好ましくは、かくして、ＣＤ８＋細胞は抗原−特異的に活性化されるはずである。抗原−提示細胞に対する休止または前駆体ＣＤ８＋（エフェクター）細胞の比は個体間で変化し得、培養条件に対する個体のリンパ球の受容可能性ならびに記載内の処置様式が用いられる病気状態または他の条件の種類および重症度のごとき変数にさらに依存し得る。しかしながら、好ましくは、リンパ球：抗原−提示細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞）比は好ましくは約３０：１ないし３００：１の範囲である。例えば、１の具体例において、３×１０７ヒトＰＢＬおよび１×１０６生Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞を混合し、２０ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０培養基中で維持した。
【０１３６】
エフェクター／抗原−提示培養を、治療上使用するまたは有効な数のＣＤ８＋細胞の集団につき、活性化し富化させるのに必要なだけの長さの時間維持する。一般に、最適時間は約１日および５日の間であり、「プラトー」、すなわち「最大」特異的ＣＤ８＋活性化レベルは一般に培養の５日後に観察される。本発明の１の具体例において、ＣＤ８＋細胞のイン・ビトロ活性化は細胞系のトランスフェクション後短時間内に検出される。１の具体例において、ＣＤ８＋細胞を活性化できるトランスフェクト細胞における一過性発現はトランスフェクションから４８時間内に検出可能である。これは、ヒト・クラスＩ  ＭＨＣを発現する形質転換細胞の安定なまたは一過性培養物はＣＤ８＋細胞を活性化するにおいて効果的であることを明らかに示す。
【０１３７】
好ましくは、ＣＤ８＋細胞の富化および合致した活性化は抗原−提示細胞への暴露の１週間内に最適である。しかる後、好ましい具体例において、富化され活性化させたＣＤ８＋細胞を、部位制限、抗体−赤血球細胞調製物の再セッティング、カラムクロマトグラフィー等によってさらに精製する。精製に続き、得られたＣＤ８＋細胞調製物を１０９活性化ＣＤ８＋細胞の集団を得るのに十分な時間、培養中に維持することによってさらに増殖させる。この時間は細胞の複製時間に依存して変化し得るが、一般に１４日である。ＣＤ８＋細胞の活性化および増殖はＲｉｄｄｅｌｌら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：４８４−４９１（１９９３）によって記載されている。
【０１３８】
８．ＣＤ８＋細胞のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞からの分離
活性化ＣＤ８＋細胞は種々の公知の方法のうちの１つを用いて刺激体（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞から効果的に分離することができる。例えば、刺激体細胞に、刺激体細胞上に負荷させたペプチドに、またはＣＤ８＋細胞（またはそのセグメント）に特異的なモノクローナル抗体を利用して、それらの適当な相補的リガンドに結合させることができる。次いで、適当な手段を介して、例えばよく知られた免疫沈降またはイムノアッセイ法を介して、抗体標識細胞を刺激体−エフェクター細胞混合物から抽出することができる。
【０１３９】
９．活性化ＣＤ８＋細胞の投与
有効・細胞毒性の量の活性化ＣＤ８＋細胞は、イン・ビトロおよびイン・ビボ使用の間で変化し得、同様に、これらのキラー細胞の最終標的である細胞の量およびタイプで変化し得る。また、該量は患者の状態に応じて変化し、実行者による全ての適当なファクターの考慮を介して決定されるべきである。しかしながら、マウスで使用される約５×１０６−５×１０７細胞と比較して、好ましくは、約１×１０６ないし約１×１０１２、より好ましくは約１×１０８ないし約１×１０１１、さらにより好ましくは約１×１０９ないし約１×１０１０の活性化されたＣＤ８＋細胞を成人ヒトで利用する。
【０１４０】
好ましくは、前記したごとく、活性化ＣＤ８＋細胞は処置されるべき個体へのＣＤ８＋細胞の投与に先立ってＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞培養から収穫される。しかしながら、他の現存の提案されている処置方法とは異なり、本方法は腫瘍形成性でない細胞培養系（すなわち、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞）を用いることに注意するのは重要である。従って、哺乳動物腫瘍−促進性細胞の投与は極端に有害であるが、もしＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞およびかつ成果ＣＤ８−細胞の完全な分離が達成されなくても、少数のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞の投与に伴うことが知られている固有の危険はない。
【０１４１】
細胞成分を再導入する方法は当該分野で知られており、Ｈｏｎｓｉｋらに対する米国特許第４，８４４，８９３号およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇに対する米国特許第４，６９０，９１５号に例示されているもののごとき手法を含む。例えば、静脈内注入を介する活性化ＣＤ８＋細胞の投与が適当である。
【０１４２】
１０．ＨＬＡタイプ分け
前記したごとく、ＨＬＡハプロタイプ／アロタイプは個体間で変化し、他方、本発明の実施には個体のＨＬＡタイプを決定するのは必須ではないが、それはしばしば助けとなる。ＨＬＡタイプは標準的なタイプ分け手法およびＦｉｃｏｌｌ勾配によって精製されたＰＢＬを介して決定できる。次いで、精製したＰＢＬを、適当な抗原性ペプチド、例えばウイルス感染、癌、または悪性疾患に関連する治療適用における、ウイルス−または癌−特異的蛋白質に由来するペプチドと共にプレインキュベートした同系Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞と混合する。
【０１４３】
特定のウイルス−または癌−特異的抗原のペプチドが特徴付けられている場合において、例えばウイルスまたは悪性を継続して使用して、これらのエピトープをコードする合成ペプチドが好ましく使用される。好ましい抗原性ペプチドが正確に決定されていない場合において、ウイルス−または癌−特異的蛋白質のプロテアーゼ消化物を使用できる。かかる抗原のためのソースとして、ウイルス−または癌−特異的蛋白質をコードするｃＤＮＡを細菌発現プラスミドにクローン化し、それを用いて、例えばここに開示する方法を介して細菌を形質転換する。
【０１４４】
ＨＬＡのタイプ分けの後、もし好ましいＨＬＡを発現するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞が得られない場合、ポリメラーゼ鎖反応の使用を介して、好ましいＨＬＡをコードするｃＤＮＡをクローン化できる。前記Ｂ．１節に記載したプライマー（配列番号１ないし配列番号１２）を用いて、別々の反応にて適当なＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｅ、−Ｆ、または−ＧｃＤＮＡを増幅し、次いで、後記Ａ２．１につ開示した方法にて記載するごとく、これをクローン化し、配列決定する。次いで、クローン化ＨＬＡを発現する安定な細胞系をＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞で確立することができる。別法として、ＰＣＲ反応からクローン化組換え分子の大集団を一過的に発現する昆虫細胞の集団をイン・ビトロＣＤ８＋活性化で用いることができる。
【実施例】
【０１４５】
以下の実施例は本発明を説明するもので、それを限定するものではない。
【０１４６】
実施例１
ヒト・クラスＩ  ＭＨＣ分子の発現
Ａ．ｐＲｍＨａ−３発現ベクターの調製
本発明で記載されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２（Ｓ２）細胞でＭＨＣ蛋白質を発現させるのに用いられるｐＲｍＨａ−３発現ベクターは、ＳｐｈＩ線状化ｐＲｍＨａ−１  ＤＮＡ発現ベクターと、後記するｐＲｍＨａ−２発現ベクターのＳｐｈＩ制限消化物から得られたＤＮＡ断片を連結することによって構築された。ｐＲｍＨａ−１とｐＲｍＨａ−２断片とのこのような連結を行って、ｐＲｍＨａ−１に存在する２つのＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼクローニング部位のうちの１つを除去した。かくして、得られたｐＲｍＨａ−３発現ベクターは、種々のＭＨＣ−コーディングＤＮＡ断片が実施例に記載されるごとくに挿入された多重クローニング部位（ポリリンカー）中に１つのＥｃｏＲＩ制限部位のみを含有した。
【０１４７】
１．ｐＲｍＨａ−１発現ベクターの調製
メタロチオネインプロモーター、金属応答コンセンサス配列（ＭＴと命名）およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから単離されたポリアデニル化シグナルを含有するアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）遺伝子を含むｐＲｍＨａ−１発現ベクターはＢｕｎｃｈら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０４３−６１（１９８８）によって記載されているごとくに構築した。最終ｐＲｍＨａ−１構築体の概略を図２に示す。ＡＴＣＣ受託番号３７２５３を有するプラスミド発現ベクターｐＵＣ１８を、それから続いてのここに記載するベクターが得られる源ベクターとして用いた。ｐＵＣ１８プラスミドは多重クローニング部位に５’から３’にかけて以下の制限部位を含有し、その全ては図１のｐＵＣ１８−由来ベクターの模式的表示に示していない：ＥｃｏＲＩ；ＳａｃＩ；ＫｐｎＩ；同一位置に存在するＳｍａＩおよびＳｍａＩ；ＢａｍＨＩ；ＸｂａＩ；ＳａｌＩ、同一位置に存在するＡｃｃＩおよびＨｉｎｃＩＩ；ＰｓｔＩ；ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ。まず、ｐＵＣ１８ベクターをＨｉｎｄＩＩＩで消化して線状化ｐＵＣ１８を形成させた。次いで、Ｍａｎｉａｔｉｓら編，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）によって記載されているごとく、ＨｉｎｄＩＩＩ末端をＤＮＡポリメラーゼＩ大断片で満たすことによって平滑末端を生成させた。
【０１４８】
得られた線状化平滑末端ｐＵＣ１８ベクターを、ポリアデニル化シグナルを含有するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒＡＤＨ遺伝子からの７４０塩基対（ｂｐ）ＨｉｎｆＩ断片と連結した。ＨｉｎｆＩでの消化、続いてのクレノウでの末端平滑化によって、連結したＡＤＨ対立遺伝子をまずＧｏｌｄｂｅｒｇら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７７：５７９４−５７９８（１９８０）によって記載されているプラスミドｐＳＡＣＩから単離し、配列番号１４にリストされたヌクレオチド配列が得られた。ランダムな高分子量（１５ｋｂを超える）を含有するバクテリオファージラムダライブラリーから選択されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＤＮＡの４．７キロベース（ｋｂ）ＥｃｏＲＩ断片をｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ受託番号３１３４４）にサブクローンすることによって、ＡＤＨ対立遺伝子を含有するｐＳＡＣＩベクターを構築した。５’ＨｉｎｆＩ制限部位が、Ｋｒｅｉｔｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０４：４１２−４１７（１９８３）によって記載されているごとく、１７７０位にＡＤＨ遺伝子で天然に生じた。３’ＨｉｎｆＩ部位は、ＡＤＨ遺伝子がクローン化されたｐＵＣ１８ベクターから得られた。この位置はＡＤＨ遺伝子の２５００位のＸｂａＩ部位から４塩基３’側であった。ＡＤＨセグメントは、ＡＤＨ  ｍＲＮＡの３’非翻訳部分におけるポリアデニル化／切断配列の３５ｂｐ上流からポリアデニル化シグナルの７００ｂｐ下流まで伸びた。ＡＨＤ遺伝子断片を含有する得られたｐＵＣ１８−由来ベクターを図１に示すごとくｐＨＡ−１と命名した。
【０１４９】
４２１  ｂｐ  ＥｃｏＲＩ／ＳｔｕＩ  ＭＴ遺伝子断片は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのゲノムＤＮＡライブラリー中のほぼ１５．３ｋｂのＤＮＡを含有するクローンから得られた。成熟ＤＮＡのＭｂｏＩ部分消化で調製された該ライブラリーをラムダ誘導体ＥＭＢＬ４にクローン化した。該断片はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＭＴ遺伝子のＭＴプロモーターおよび金属応答コンセンサスエレメントを含有した（Ｍａｒｏｎｉら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１２：４９３−５０４（１９８６））。プロモーターおよびヌクレオチド＋１の転写開始部位を含有するこの領域は、ＭＴ遺伝子の位置−３７０ないしヌクレオチド位置＋５４に対応していた（配列番号１３）。次いで、得られた断片を、予めＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで線状化してある前記調製のｐＨＡ−１発現ベクターに結んだ。ＳｔｕＩ消化によって生成したＭＴの３’末端はＳｍａＩ消化によって生成したｐＨＡ−１における平滑末端に適合した。５’Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＭＴ遺伝子断片および３’ＡＤＨ遺伝子断片を含有する得られたｐＵＣ１８−由来ベクターをｐＲｍＨａ−１と命名した。図２に示されたｐＲｍＨａ−１発現ベクターは、ｐＨａ−１ベクターについての図１に示されるごとく、ｐＵＣ１８からの複製起点（ｏｒｉ）およびアンピシリンに対する耐性（Ａｍｐｒ）を付与するベータラクタマーゼ遺伝子を含有した。また、ｐＲｍＨａ−１のダイアグラムはＭＴ遺伝子断片の５’ないし３’隣接部分、多重クローニング部位およびＡＤＨ遺伝子断片を示す。ｐＲｍＨａ−１ベクターをｃ．で後記するごとくｐＲｍＨａ−３発現ベクターの構築で用いた。
【０１５０】
２．ｐＲｍＨａ−２発現ベクターの調製
ｐＲｍＨａ−２の構築は図１に示す。ｐＲｍＨａ−２発現ベクターを構築するために、少し修飾した前記ｐＲｍＨａ−１の構築で記載したごとく、前記調製のＭＴ断片をｐＵＣ１８−由来ベクターｐＨＡ−１に挿入した。ＥｃｏＲＩリンカーを前記調製のＥｃｏＲＩ／ＳｔｕＩ−単離したＭＴ遺伝子断片のＳｔｕＩ部位に負荷して、ＥｃｏＲＩ制限部位を両末端に有するメタロチオネイン断片を形成させた。次いで、得られた断片を、予めＥｃｏＲＩで線状化してあるＡＤＨ断片含有ｐＵＣ１８発現ベクターに連結した。５’Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＭＴ遺伝子および多重クローニング部位の５’側にＥｃｏＲＩ制限部位を有する３’ＡＤＨ遺伝子断片を含有する得られたｐＵＣ１８−由来ベクターをｐＲｍＨａ−２と命名した。図１に示すｐＲｍＨａ−２発現ベクターは複製起点（ｏｒｉ）およびｐＵＣ１８からのアンピシリンに対する耐性（Ａｍｐｒ）を付与するベータラクタマーゼ遺伝子を含有した。ｐＲｍＨａ−２のダイアグラムはＭＴ遺伝子断片の５’ないし３’隣接位置、多重クローニング部位およびＡＤＨ遺伝子断片も示す。ｐＲｍＨａ−２ベクターは後記ｃ．に記載するごとくｐＲｍＨａ−２発現ベクターの構築でｐＲｍＨａ−１と共に使用した。
【０１５１】
３．ｐＲｍＨａ−３発現ベクターの調製
ただ１つのＥｃｏＲＩ制限部位を有するｐＲｍＨａ−３発現ベクターを調製するために、ｐＲｍＨａ−２からの断片をｐＲｍＨａ−１に連結した。この構築のために、前記ｂ．で調製したｐＲｍＨａ−２をまずＳｐｈＩで消化した。ＭＴ遺伝子の中央で始まり、多重クローニング部位のＳｐｈＩ部位で終わる得られたＳｐｈＩ断片をまずｐＲｍＨａ−２ベクターから単離し、次いで、前記Ａ．１で調製したｐＲｍＨａ−１に連結した。ｐＲｍＨａ−１ベクターは予め修飾して、ＭＴ遺伝子の５’側のＥｃｏＲＩ制限部位を除去し、次いでＳｐｈＩで線状化してあったものである。このプロセスを図２に模式的に示す。ｐＲｍＨａ−１中のＥｃｏＲＩ部位を除去するために、該ベクターをＥｃｏＲＩで消化して線状化ベクターを形成させ、次いでマングビーンヌクレアーゼで平滑末端化し、再度連結した。
【０１５２】
ＥｃｏＲＩ部位を欠くｐＲｍＨａ−１ベクターを次いでＳｐｈＩで消化して、ｐＲｍＨａ−２からのＳｐｈＩ断片インサートに対応する領域を除去し、線状化ｐＲｍＨａ−１ベクターを形成させた。次いで、ｐＲｍＨａ−２からのＳｐｈＩ断片をＳｐｈＩ線状化ｐＲｍＨａ−１に連結してｐＲｍＨａ−３発現ベクターを形成させた。ｐＲｍＨａ−３ベクターの概略を図３に示す。ｐＲｍＨａ−３がそれから誘導されたｐＵＣ１８ベクターからの種々の制限部位の相対的位置を図に示す。加えて、注目するＭＨＣ遺伝子がクローン化される多重クローニング部位（ポリリンカー）によって隔てられたＭＴおよびＡＤＨ遺伝子断片の相対的位置および長さを図に示す。ｐＵＣ１８に由来するｐＲｍＨａ−３ベクターは複製起点およびアンピシリン耐性を付与するベータラクタマーゼ遺伝子を含有する。かくして、本発明におけるごとく調製され、ｐＲｍＨａ−３の多重クローニング部位にクローン化されたＭＨＣをコードするＤＮＡ断片を、ＭＴプロモーターによって転写調節され、ＡＤＨ遺伝子を経てポリアデニル化された。
【０１５３】
Ｂ．ｃＤＮＡ合成
種々のＨＬＡグループのクラスＩ  ＭＨＣ分子の詳細な記載は、ここに出典明示して本明細書の一部とみなすＰｅｔｅｒｓｏｎらに対する米国特許第５，３１４，８１３号中に見い出すことができる。
【０１５４】
いずれかの好ましいＨＬＡをコードするｃＤＮＡを、ポリメラーゼ鎖反応の使用を介してクローン化することができる。前記Ｂ．１節に開示したプライマー（配列番号１ないし配列番号１２）を用いて、別々の反応にて適当なＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｅ、−Ｆまたは−ＧｃＤＮＡを増幅することができ、次いで、前記ＨＬＡ  Ａ２．１につき開示した方法に記載されたごとくに、これをクローン化し、配列決定することができる。ヒト細胞からのｃＤＮＡの調製はＥｎｎｉｓら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：２８３３−２８３７（１９９０）に記載されているごとくに行われる。略言すると、個体から血液試料を得、遠心後に細胞を収集し、これを用いて全ＲＮＡを調製する。オリゴ（ｄＴ）および鳥類骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素を使用することによって、第１鎖ｃＤＮＡを合成する。得られたｃＤＮＡを、前記Ｂ．１節で記載した適当なプライマー、およびＧｅｎｅＡｍｐキットおよびサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）を利用するＰＣＲ増幅反応で用いる。反応条件は、好ましくは、以下の通りである。１００ｎｇのｃＤＮＡ鋳型および５０ピコモルの各オリゴヌクレオチドプライマーを用いる。３０サイクルを以下のごとくに行う：（ａ）９４℃における１分間；（ｂ）６０℃における１分間；および（ｃ）７２℃における１分、３０秒間。次いで、ＰＣＲ反応物を１０分間１００℃まで加熱してＴａｑポリメラーゼを破壊し、Ｔ４ポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によってＤＮＡの末端を平滑とする。
【０１５５】
ＨＬＡ  Ａ２．２を合成するために、完全なＡ２．２をコードするｃＤＮＡ（公表された配列として、Ｈｏｌｍｅｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３９：９３６−４１（１９８７）参照）をＭ１３ｍｐ１９プラスミド（商業的に入手可能なバクテリオファージベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）にクローン化する。ｃＤＮＡはＡ２の公表された配列に由来するプライマーを用いるＰＣＲによって合成される。該ｃＤＮＡはＮｏｔＩ（クレノウで満たされた突出）／ＥｃｏＲＩ断片としてＭ１３ｍｐ１９クローンから放出される。（クレノウ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌ  Ｉをスブチリシンで処理することによって生成された、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ分子の一部である。それを用いて、制限ヌクレアーゼによって生じたＤＮＡ分子の末端の５’または３’突出を「満たす」）。ＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、ＢｇＩＩＩ（クレノウで満たされた末端）およびＥｃｏＲＩで消化したｐＳＰ６４Ｔに挿入する。ｐＳＰ６４Ｔは、効率的に翻訳される（β−グロビン）ｍＲＮＡからの５’および３’フランキング領域を、それ自体の開始コドンを含有するいずれかのｃＤＮＡに供するように設計されたＳＰ６クローニングベクターである。この翻訳ＳＰ６ベクターは、ｐＳＰ６４−ＸβｍをＢａｌＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化し、互い違いになった末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで満たし、連結によってＢｇｌＩＩリンカーを付加することによって構築した。ＢａｌＩはＡＴＧ（開始コドン）の２塩基上流でβ−グロビンｃＤＮＡを切断し、ＢｓｔＩ  ＥＩＩはＴＡＡ（停止コドン）の８塩基上流で切断する。ＰｓｔＩないしＥｃｏＲＩにかけて、ポリリンカー断片において切断する制限酵素を更に用いて転写のためにプラスミドを線状化することができるように、ｐＳＰ６４Ｔにはただ１つのＢｇｌＩＩ部位がある。（やはりプラスミドｐＳＰ６４−Ｘβｍの構築を記載するＫｒｅｉｇおよびＭｅｌｔｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １２：７０５７−７０７０，（１９８４）参照）。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩ（クレノウで満たした末端）およびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、これをＨｉｎｄＩＩＩ（５’）およびＳｔｕＩ（３’）の間のｐＣＭＵＩＩポリリンカーにクローン化する。（Ｐａａｂｏら，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１９２１−１９２７（１９８６）参照）。全ｃＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ（クレノウで満たした末端）およびＢａｍＨＩ断片として取り出し、これをＳｍａＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＲｍＨａ−３にクローン化する。
【０１５６】
ＨＬＡ  Ａ２．２可溶性形態は、膜貫通ドメインに直ぐ先行する前記Ａ２．２ｃＤＮＡに停止コドンを作成することによって調製した。修飾は、真核生物発現ベクターｐＣＭＵＩＩにクローン化したＡ２．２ｃＤＮＡを、ＭｂｏＩＩおよびＢａｍＨＩで、ＨｉｎｄＩＩＩ５’およびＳｔｕＩ３’（前記参照）の間で切断することによって達成し、以下のオリゴヌクレオチドを挿入した。
【０１５７】
５’プライマー：５’ＧＧＡＧＣＣＧＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＧ  ３’
（配列番号１７）
３’プライマー：５’ＣＣＣＴＣＧＧＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＣＣＴＡＧ  ３’（配列番号１８）
得られた組換えプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、突出末端をクレノウで満たし、次いで、ＢａｍＨＩで切断して制限断片が放出され、これをＡ２．２全長におけるごとくにｐＲｍＨａ−３にクローン化する。
【０１５８】
１．ネズミＩＣＡＭ−１発現ベクターの構築
脾臓細胞をＢａｌｂ／ｃマウスから単離した。脾臓細胞をｃｏｎＡで刺激し；製造業者の指示に従って、ＦａｓｔＴｒａｃｋキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてｍＲＮＡを単離した。製造業者の指示に従い、ＡＭＶ逆転写酵素キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用い、ｃＤＮＡをｍＲＮＡから合成した。公表されたｃＤＮＡヌクレオチド配列（Ｓｉｕ，Ｇ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３，３８１３−３８２０（１９８９））に基づき、以下のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして合成した。
５’：ＴＴＴＡＧＡＡＴＴＣＡＣ  ＣＡＴＧＧＣＴＴＣＡ  ＡＣＣＣＧＴＧＣＣＡ  ＡＧ
３’：ＴＴＴＡＧＴＣＧＡＣＴＣ  ＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧ  ＧＧＣＴＴＧＴＣＣ
合成したｃＤＮＡを、これらのプライマーを用いるＰＣＲに付した。産物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化してあるｐＲｍＨａ−３に連結した。
【０１５９】
２．ネズミＢ７．１発現ベクターの構築
Ｂａｌｂ／ｃマウスから脾臓細胞を単離し、ｃｏｎＡで刺激した。製造業者の指示に従い、メッセンジャーＲＮＡをＦａｓｔＴｒａｃｋキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて単離した。製造業者の指示に従い、ＡＭＶ逆転写酵素キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてｃＤＮＡをｍＲＮＡから合成した。
【０１６０】
公表されたｃＤＮＡヌクレオチド配列（Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：６２５−６３１（１９９１））に基づき、以下のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして合成した。
５’ＴＴＴＡＧＡＡＴＴＣＡＣ  ＣＡＴＧＧＣＴＴＧＣ  ＡＡＴＴＧＴＣＡＧＴ  ＴＧ
３’ＴＴＴＡＧＴＣＧＡＣＣＴ  ＡＡＡＧＧＡＡＧＡＣ  ＧＧＴＣＴＧＴＴＣ
これらのプライマーを用い、合成したｃＤＮＡをＰＣＲに付した。産物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断してあるｐＲｍＨａ−３に連結した。
【０１６１】
３．ネズミＢ７．２発現ベクターの構築
（ＡＴＣＣから入手した）ＩＣ−２１細胞を、１０％胎児ウシ血清を含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で増殖させた。製造業者の指示に従い、ＦａｓｔＴｒａｃｋキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、ｍＲＮＡをこれらの細胞から単離した。製造業者の指示に従い、ＡＭＶ逆転写酵素キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてｃＤＮＡをｍＲＮＡから合成した。公表されているｃＤＮＡヌクレオチド配列（Ｆｒｅｅｍａｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２１８５−２１９２（１９９３））に基づき、以下のオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして合成した。
５’：ＴＴＴＡＧＡＡＴＴＣＡＣ  ＣＡＴＧＧＡＣＣＣＣ  ＡＧＡＴＧＣＡＣＣＡ  ＴＧＧＧ
３’：ＴＴＴＡＧＴＣＧＡＣＴＣ  ＡＣＴＣＴＧＣＡＴＴ  ＴＧＧＴＴＴＴＧＣＴ  ＧＡ
合成したｃＤＮＡをこれらのプライマーを用いるＰＣＲに付した。産物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断し、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断してあるｐＲｍＨａ−３に連結した。
【０１６２】
表１にリストしたリン酸カルシウム方法を用い、前記発現構築体をＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＳ２細胞にトランスフェクトした。５００μｇ／ｍｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎを細胞培養基に含ませることによって、安定な細胞系が選択された。
【０１６３】
【表１】
0004629650.tif 000002
【０１６４】
ヒト・アクセサリーおよび共刺激性分子を、特定の蛋白質に特異的なモノクローナル抗体でのＦＡＣＳ分析によってこれらの蛋白質を発現することが示されているヒト細胞系からクローン化した。インテグリンファミリーに属する接着分子ＩＣＡＭ−Ｉ（ＣＤ５４）およびＬＦＡ−３（ＣＤ５８）を、各々、ヒト細胞系Ｋ５６２およびＨＬ６０からクローン化した。ヒト慢性骨髄性白血病に由来するＫ５６２細胞をＡＴＣＣ（ＣＣＬ−２４３）から入手し、推奨される条件（すなわち、５％ＣＯ２、３７℃にて１０％胎児ウシ血清を含有するＲＰＭＩ）下で培養した。ヒト前骨髄細胞白血病に由来するＨＬ６０細胞をＡＴＣＣ（ＣＣＬ−２４０）から入手し、ＡＴＣＣの推奨に従って培養した。共刺激性分子Ｂ７．１およびＢ７．２も、各々、Ｋ５６２およびＨＬ６０細胞からクローン化した。
【０１６５】
４．ｃＤＮＡ
修飾されたチオシアン酸グアニジニウム法（Ｃｈｒｏｍｃｚｙｎｓｋｉら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２：１５６−１５９、１９８７）、続いて、オリゴ（ｄｔ）−セルロースカラム（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，６．２２−６．３４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣＳＨ，ＮＹ）上のポリＡ＋  ＲＮＡ選択によって単離されたＲＮＡからの各細胞系から、メッセンジャーＲＮＡ試料を調製した。（通常いくらかの細胞表面分子を発現させる必要がある）ビタミンＤ３でのＨＬ６０細胞の誘導はＢ７．２およびＬＦＡ−３分子を得るのに必要ではなく、蛋白質を誘導不存在下で発現させた。ｃＤＮＡは製造業者の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に従ってＡＭＶ逆転写酵素を用いて調製した。
【０１６６】
５．ＰＣＲプライマー
ＰＣＲプライマーを設計し、ＧＥＮＥＷＯＲＫＳデータベース（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ）から既知の配列のコピーを得、適当なベクターにクローン化するために必要である末端を考慮した後に、合成した。それらは以下の通りであり、各蛋白質の頂部配列は５’プライマーおよび底部は３’プライマーであった。
Ｂ７．１  
５’−ＡＣＣＣＴＴＧＡＡＴ  ＣＣＡＴＧＧＧＣＣＡ  ＣＡＣＡＣＧＧＡＧＧ  ＣＡＧ−３’
５’−ＡＴＴＡＣＣＧＧＡＴ  ＣＣＴＴＡＴＡＣＡＧ  ＧＧＣＧＴＡＣＡＣＴ  ＴＴＣＣＣＴＴＣＴ−３’
Ｂ７．２  
５’−ＡＣＣＣＴＴＧＡＧＣ  ＴＣＡＴＧＧＡＴＣＣ  ＣＣＡＧＴＧＣＡＣＴ  ＡＴＧ−３’
５’−ＡＴＴＡＣＣＣＣＣＧ  ＧＧＴＴＡＡＡＡＡＣ  ＡＴＧＴＡＴＣＡＣＴ  ＴＴＴＧＴＣＧＣＡＴ  ＧＡ−３’
ＬＦＡ−３
５’−ＡＣＣＣＴＴＧＡＧＣ  ＴＣＡＴＧＧＴＴＧＣ  ＴＧＧＧＡＧＣＧＡＣ  ＧＣＧＧＧＧ−３’
３’−ＡＴＴＡＣＣＧＧＡＴ  ＣＣＴＴＡＡＡＧＡＡ  ＣＡＴＴＣＡＴＡＴＡ  ＣＡＧＣＡＣＡＡＴＡ  ＣＡ−３’
ＩＣＡＭ−１
５’−ＡＣＣＣＴＴＧＡＡＴ  ＴＣＡＴＧＧＣＴＣＣ  ＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣ  ＣＧＧＣＣＣ−３’
３’−ＡＴＴＡＣＣＧＧＡＴ  ＣＣＴＣＡＧＧＧＡＧ  ＧＣＧＴＧＧＣＴＴＧ  ＴＧＴＧＴＴＣＧＧ−３’
６．ＤＮＡ断片の発現
各細胞系からのｃＤＮＡ調製物を用いて、所望の蛋白質をクローンした。ポリメラーゼ鎖反応を用い、適当なＰＣＲプライマー（前記参照）を利用してｃＤＮＡ断片を生成させた。適当なＤＮＡ断片をＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ハエ・ベクターｐＲＭＨＡ−３にクローン化した。プラスミド調製物は全調製物から調製し、今やハエ細胞へのトランスフェクションの準備ができている。
【０１６７】
公表された部分的ｃＤＮＡ配列（Ｓｕｇｇｓら，ＰＮＡＳ  ７８：６６１３−１７，１９８１）を用いてヒトβ−２ミクログロブリンを調製し、これを以下のプライマーにてのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）用の鋳型として用いる。
５’プライマー
５’  ＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣ  ３’
（配列番号１５）
３’プライマー
５’ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＧＧＴＴＡＣＡＴＧＴＣＧＣＧＡＴＣＣＣＡＣＴＴＡＡＣ  ３’
（配列番号１６）
プライマーを標準的なＰＣＲ反応（Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｃｅｌｌ  ５８：７０７（１９８９））で使用する。反応生成物をフェノールで抽出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキット（Ｂｉｏ  １０１，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて精製し、ＢａｍＨＩで消化し、ｐＢＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＢａｍＨＩ部位にクローン化した。配列の確認後、このＢａｍＨＩ断片をｐＲｍＨＡ−３のＢａｍＨＩ部位にクローン化する。
【０１６８】
実施例に示すごとく、ネズミ・クラスＩ  ｃＤＮＡを種々の例で用いた。ネズミ・クラスＩ  ｃＤＮＡは以下のごとくに調製した。
【０１６９】
Ｈ−２Ｋｂ：完全なＫｂ分子をコードするｃＤＮＡは以下のごとくに構築した発現プラスミドｐＣＭＵ／Ｋｂから得られる。リーダー配列およびほとんどのアルファＩドメインを欠く部分的Ｈ−２ＫｂｃＤＮＡは、Ｒｅｙｅｓら，ＰＮＡＳ  ７９：３２７０−７４（１９８２）の方法に従って調製し、ｐＨ２０２を得る。このｃＤＮＡを用いて、全長分子を得る。Ｈ−２Ｋｂ（Ｃａｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ２９１：３５−３９，１９８１）をコードするゲノムクローンを鋳型として用いて、ＮｏｔＩ部位が隣接する５’プライマー、続いてリーダー配列の最後の７つのアミノ酸をコードする２１ヌクレオチドおよびアルファＩドメインの始まりに相補的に１８ヌクレオチドおよびＳｔｙＩ部位を含む領域に相補的な３’プライマーを用いるＰＣＲ反応にて、失われた配列を供する。得られた断片をＳｔｙＩ部位にてｐＨ２０２で連結する。シグナル配列の残りをコードする５’配列は、ＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ断片としてのＤｂｃＤＮＡ（後記参照）から得られる。全暗号配列をＢａｍＨＩ断片として発現プラスミドから切断し、ＢａｍＨＩで切断したｐＲｍＨａ−３にクローン化する。
【０１７０】
Ｈ−２Ｌｄ：完全なＬｄ分子をコードするｃＤＮＡは発現プラスミドｐＣＭＵＩＶ／Ｌｄ（ＪｏｌｙおよびＯｌｄｓｔｏｎｅ，Ｇｅｎｅ  ９７：２１３，１９９１）から得られる。完全なｃＤＮＡはＢａｍＨＩ断片として真核生物発現ベクターｐＣＭＵ  ＩＶ／Ｌｄから切断し、ＫｂとしてｐＲｍＨａ−３にクローン化する。
【０１７１】
前記したごとく、ｐＣＭＵベクター（ｐＣＭＵＩＶ）はＮｉｌｓｓｏｎら，前掲に記載されているごとくに真核生物ベクターｐＣ８１Ｇから誘導される。今度は、ベクターｐＣ８１Ｇは、Ｐａａｂｏら，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１９２１−７（１９８６）に開示されている方法に従って、ｐＡ８１Ｇ（Ｐａａｂｏら，Ｃｅｌｌ  ３３：４４５−４５３（１９８３））から誘導される。
【０１７２】
Ｈ−２Ｄｂ：完全なＤｂ分子をコードするｃＤＮＡは真核生物プラスミドｐＣＭＵＩＶ／Ｄｂ（ＪｏｌｙおよびＯｌｄｓｔｏｎｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１２８３−８５，１９９１）から得られる。完全なｃＤＮＡをＢａｍＨＩ断片として真核生物発現ベクターｐＣＭＵＩＶ／Ｄｂから切断し、ＫｂとしてｐＲｍＨａ−３にクローン化する。
【０１７３】
ネズミβ−２ミクログロブリン：全長ネズミβ−２ミクログロブリンｃＤＮＡはＨｉｎｄＩＩＩ（５’）（クレノウで満たされる）／ＢｇｌＩＩ（３’）断片としてｐＳＶ２ｎｅｏ（ＡＴＣＣ番号３７１４９）マウスβ−２ミクログロブリンｃＤＮＡから得られ、ＳｍａＩおよびＢａｍＨＩで切断したｐＲｍＨａ−３にクローン化する。
【０１７４】
ベクターｐｈｓｈｓｎｅｏはネオマイシン（Ｇ４１８）耐性を与え、さらなる熱ショックプロモーター（ｈｓ）を持つｐｈｓｎｅｏの誘導体（ｐＵＣｈｓｎｅｏ）であり、これはＳｔｅｌｌｅｒら，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：１６７（１９８５）に記載されているごとくに商業的に入手可能なｐＵＣ８から合成できる。これらのベクターに含有された熱ショックプロモーターはｈｓｐ７０プロモーターである。ネオマイシン耐性（Ｇ４１８耐性）を与える他の有用なベクターはコスミドベクターｓｍａｒｔ２（ＡＴＣＣ  ３７５８８）（これはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｈｓｐ７０プロモーターの制御下にある）およびプラスミドベクターｐｃｏｐｎｅｏ（ＡＴＣＣ  ３７４０９）を含む。
【０１７５】
Ｃ．遺伝子の発現ベクターへの挿入
制限産物を１％アガロースゲル上の電気泳動に付す（Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２））。制限産物をコードするｃＤＮＡをゲルから切り出し、製造業者の指示（Ｂｉｏ  １０１，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に従い、「Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ」を用いてアガロースから精製する。製造業者の指示（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に従い、発現プラスミドｐＲｍＨａ−３（図３）を、Ｏｎｅ  Ｐｈｏｒ  Ａｌｌ緩衝液中の適当な制限酵素で切断し、製造業者の文献（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に記載されているごとくにアルカリ性ホスファターゼで処理する。１００ｎｇの切断されリン酸化されたｐＲｍＨａ−３ベクターを３００ｎｇのアガロース精製クラスＩ  ＭＨＣ重鎖ｃＤＮＡまたはβ−２ミクログロブリンｃＤＮＡと混合し、製造業者の文献に従い、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼおよびＯｎｅ  Ｐｈｏｒ  Ａｌｌ緩衝液を用いて連結する。１６℃における５時間のインキュベーションの後、連結混合物を用いて、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ８３（Ｍａｎｉａｔｉｓら，前掲（１９８２））を形質転換する。
【０１７６】
Ｍａｎｉａｔｉｓら，前掲に開示されている方法を用いて、必要なｃＤＮＡを調製する。ＭＨＣ重鎖ｃＤＮＡの存在およびベクター中での向きを制限マッピングによって決定する。メタロチオネインプロモーターに対して正しい向きにあるｃＤＮＡと共にベクターを含有する細菌を、アルカリ溶解方法および塩化セシウム勾配精製を用いる大規模なＤＮＡの調製で用いる。得られたＤＮＡの量は分校光度法によって測定する。
【０１７７】
Ｄ．Ｓ２細胞のトランスフェクションおよび標識
１０％胎児ウシ血清（５５℃で１時間熱処理）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１ｍＭグルタミンを補足したＳｃｈｎｅｉｄｅｒ培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中でＳ２細胞を増殖させる。（便宜のため、この補足培地を以後Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ培地という）。細胞を２７℃で増殖させ、典型的には、新鮮な培地中に１：１７希釈することによって７日毎に継代する。５０％Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ／５−％Ｅｘｃｅｌｌ  ４０１での最初の希釈によって、無血清培地（１００ユニット／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭグルタミン、および５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｅｎｅｘａ，ＫＳ）を補足したＥｘｃｅｌｌ  ４００または４０１）中で、細胞を増殖に転じさせる。１週間後、細胞を１０％Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ培地／９０％Ｅｘｃｅｌｌ  ４０１に継代でき、１週間後１００％Ｅｘｃｅｌｌ  ４０１に継代できる。細胞をこの培地中に維持し、新鮮な培地中に２：１７希釈することによって７日毎に継代する。
【０１７８】
ｍｌ当たり１０６細胞の濃度の１５×１０６  Ｓ２細胞を８５ｍｍペトリ皿中で平板培養する。１２時間後、後記するごとくに調製したリン酸カルシウム／ＤＮＡ沈殿（１ｍｌ）を細胞に滴下する。４８時間後、上清を注意深く除去し、細胞を、５００μｇ／ｍｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含有するＳｃｈｎｅｉｄｅｒ培地５０ｍｌの全容量にての１７５ｃｍ２フラスコに移す。２１日後、５００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含有するＳｃｈｎｅｉｄｅｒ培地３０ｍｌを含有する新鮮なフラスコに、２０ｍｌの培養を取り出す。１０日後、弱くフラスコに接着し、ほぼ２４時間の倍加時間で増殖した細胞の安定な集団が得られ、これらの細胞を引き続いて培養し、前記したごとくに選択培地中で継代する。これらの細胞の凍結したアリコットを、遠心により５−２０×１０６細胞を収集し、それを１ｍｌの細胞凍結培地（９３％胎児ウシ血清／７％ジメチルスルホキシド）中に再懸濁することによって調製する。次いで、アリコットを−７０℃に１週間置き、引き続いて液体窒素貯蔵に移す。
【０１７９】
２５μｇのＤＮＡをトランスフェクション当たりに使用する以外は、Ｐａａｂｏら（ＥＭＢＯ  Ｊ．，５：１９２１−２７（１９８６））によってリン酸カルシウム沈殿を記載されているごとくに調製する。ＤＮＡの以下の組合せを用いて、示されたトランスフェクタントを調製する。
（ａ）ＭＨＣクラスＩ重鎖単独：２３μｇ重鎖発現ベクターＤＮＡ＋２μｇのｐｈｓｈｓｎｅｏ  ＤＮＡ
（ｂ）ＭＨＣクラスＩ重鎖＋β−２ミクログロブリン：１１．５μｇ重鎖発現ベクターＤＮＡ＋１１．５μｇのβ−２ミクログロブリン（ヒトまたはマウス）発現ベクターＤＮＡ＋２μｇのｐｈｓｈｓｎｅｏ  ＤＮＡ
マウス遺伝子の他の組合せは表１に示す。
【０１８０】
代謝標識に２４時間先立って、１ｍＭ  ＣｕＳＯ４を含有するＳｃｈｎｅｉｄｅｒ培地中、３−５×１０６細胞／ｍｌ（１０ｍｌ／８５ｍｍペトリ皿）の細胞密度で細胞を平板培養する。標識に３０分先立って、培地を皿から吸引し、細胞を２×１０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、次いで、メチオニンおよびシステインを除いたＧｒａｃｅの昆虫培地（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから特別注文）中で２０分間、次いで、０．１ｍＣｉ  ３５Ｓ  Ｔｒａｎｓ標識（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ；ｄｕＰｏｎｔ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を含有するこの培地１ｍｌ中でインキュベートする。標識時間の後、標識溶液を吸引し、氷冷ＰＢＳ／１％トリトンＸ１００（１ｍｌ）で細胞を氷上で直ちに溶解させるか、あるいはＳｃｈｎｅｉｄｅｒまたはＥｘｃｅｌｌ  ４００培地（５ｍｌ）（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含有するメチオニンの存在下での追跡時間の後に溶解する。もし可溶性クラスＩ  ＭＨＣ分子を分析すべきならば、追跡培地を収集する。
【０１８１】
溶解物を冷たく保ちつつ（８℃未満）以下の操作を全て行う。溶解物をエッペンドルフ試験管に収集し、１３，０００×ｇにて１５分間ミクロ遠心管中で遠心し、プロテインＡセファロースの１０％スラリー１００μｌを含有する新鮮な試験管に移し、エンド・オーバー・エンドローター上に２時間置いた。ミクロ遠心管中での１５分間のさらなる遠心に続き、細胞溶解物は分析の準備ができている。
【０１８２】
ネズミＭＨＣを利用する実験において、ＣａＰＯ４沈殿法を用い、Ｓ２細胞を前記ネズミＭＨＣ組換体でトランスフェクトし；各重鎖を単独で、あるいはβ−２ミクログロブリンをコードするベクターとの５０：５０ミックスとしてトランスフェクトする。ネオマイシン耐性をコードするプラスミド、ｐｈｓｈｓｎｅｏＤＮＡを各トランスフェクションに含めて、選択培地（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ  Ｇ４１８−硫酸塩，Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中でトランスフェクタントを増殖させることによってＨＣクラス  Ｉを安定に発現した細胞の集団が得られようにした。
【０１８３】
Ｅ．ペプチド生成
本発明による抗原性ペプチドは天然に存在する源から得ることができるか、あるいは公知の方法を用いて合成することができる。ここに開示する種々の例において、ペプチドはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ合成器，ＡＢＩ  ４３１Ａ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で合成し、引き続いてＨＰＬＣによって精製する。
【０１８４】
「ランダム」ペプチドの単離または合成も、特に、特定のエピトープを確認して空のＭＨＣ分子に前駆体ＣＤ８−細胞をもっとも刺激するらしいペプチドを負荷する場合には適当であり得る。「ランダム」ペプチドの混合物はプロテアソーム（例えば、実施例２．Ｂ．６参照）の使用を介して、あるいは蛋白質またはポリペプチドを分解プロセス、例えばキモトリプシンでの分解に付すことによって生成させることができるか、あるいはペプチドを合成することができる。我々は本発明の細胞系が蛋白質およびポリペプチドをヒト・クラスＩ  ＭＨＣ分子に負荷できるより小さなペプチドに分解できることを観察したが、より小さなペプチド、例えば８−量体および９−量体を直接細胞培養に導入して、より迅速な負荷および発現プロセスを容易とするのが好ましい。
【０１８５】
もしペプチド、例えばランダム８−、９−および１８−アミノ酸ペプチドを合成するのならば、全ての種々のアミノ酸を好ましくは合成の各サイクルの間に取り込む。しかしながら、種々のパラメーター、例えばあるアミノ酸の溶媒不適合性の結果、あるアミノ酸を欠くペプチドを含有する混合物となる。かくして、該プロセスは要すれば、溶媒および反応条件を変更することによって調整して最大種類のペプチドを得るべきである。
【０１８６】
前記したごとく、ヒトβ−２ミクログロブリンと複合体化したネズミ重鎖は、もしネズミβ−２ミクログロブリンと複合体化した場合よりもほぼ６−８度高い温度で安定であった。また、ペプチドおよび異種β−２ミクログロブリンによって与えられた安定性は相加的であることが観察された。もし８−９量体を用いれば、１２−２５量体と比較して、クラスＩ分子の熱安定性の大きな増加が起こり；事実、より大きなペプチドと比較して８−９量体によって与えられた安定化の間の差異は、従前に観察されたものよりも大きいであろう。というのは、ペプチドはＨＰＬＣによって精製されたが、８−９量体によるより大きなペプチドのいくらかの汚染があるからである。
【０１８７】
クラスＩ分子の熱安定性は見かけ上、（１）β−２ミクログロブリンの起源；（２）ペプチドの存在；および（３）このペプチドの長さおよび配列に依存する。
【０１８８】
従前の研究（Ｐｅｔｅｒｓｏｎらに対する米国特許第５，３１４，８１３号；Ｊａｃｋｓｏｎら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９：１２１１７−１２１２１（１９９２））は、クラスＩ  ＭＨＣ重鎖が単独で、あるいはそれらがβ−２ミクログロブリンと会合した場合にペプチドに結合できることを示している。しかしながら、ペプチド−負荷ヒト・クラスＩ  ＭＨＣの表面発現は、重鎖をβ−２ミクログロブリンと複合体化させた後に、分子にペプチドを負荷することによって最高に助長されるようである。
【０１８９】
１．ヒトＭＨＣの発現
一旦我々がクラスＩ分子の熱安定性がβ−２の起源、ペプチドの存在、およびこのペプチドの長さおよび配列に依存すると判断したので、我々は、ペプチド−負荷ヒト・クラスＩ  ＭＨＣ分子の発現を介して、ＣＤ８−細胞を特異的に活性化できる細胞系の生成でこの情報を利用した。
【０１９０】
熱不安定性はクラスＩ分子の固有の特性のようであり；それは、恐らくは、ペプチドを含有しないかまたは貧弱な結合特性（これは、熱安定性をほとんど与えない）のペプチドを含有するクラスＩ分子が自己破壊することを確実にするように展開している。このようにして、細胞はその表面上の空のクラスＩ分子の数を最小化する。というのは、かかる状況は、恐らくは、外因的に誘導されたペプチドは結合され提示される点で危険だからである。ヒトβ２と共に昆虫細胞で発現されたヒト・クラスＩ分子は３７℃での延長されたインキュベーションに対して安定ではなく；クラスＩ分子へのペプチド負荷に欠陥があるこれが示された突然変異体細胞系Ｔ２で発現されたヒト・クラスＩ分子もそうでなかった（ＨｏｅｓｋｅｎおよびＢｅｖａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４８：３６７−７０（１９９０）；Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：４４９−４５２（１９９０））。かくして、重鎖とβ−２ミクログロブリンとの間の親和性は分子の共−進化を通じて注意深く保存され、従って、空のクラスＩ分子、または貧弱に結合するペプチドを担持するものは、「宿主」生物の体温で自己破壊するようである。
【０１９１】
ヒト・クラスＩ  ＭＨＣ分子をＳ２細胞で発現させた。従前に記載されている方法を用い、ヒトβ−２ミクログロブリンおよびＨＬＡ  Ａ２．２Ｙ、ＨＬＡ  Ａ２．１、ＨＬＡ  Ｂ７、またはＨＬＡ  Ｂ２７を共発現する細胞系を確立した。略言すると、前記蛋白質をコードするｃＤＮＡをＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ発現ベクターｐＲｍＨａ−３にクローン化し、ここに開示する方法を介して、ヒトβ−２ミクログロブリン含有プラスミドｐｈｓｈｓｎｅｏプラスミドでＳ２細胞に共トランスフェクトした。３週間または４週間後、Ｇ４１８−耐性Ｔ−細胞の集団を新鮮な選択培地で１：５希釈した。一旦健康に増殖する細胞集団が得られたならば、ＣｕＳＯ４を細胞のアリコットに添加し、２４時間後、β−２ミクログロブリンと会合した場合にヒト・クラスＩ重鎖の単形決定基を認識するモノクローナル抗体Ｗ６／３２（ＡＴＣＣ  ＨＢ９５、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いるフローサイトメトリーを介して細胞を分析した。（Ｂａｒｎｓｔａｂｌｅら，Ｃｅｌｌ  １４：９（１９７８）参照）。ＣｕＳＯ４の添加によって、ヒト・クラスＩ分子の各々の高レベルの発現が誘導された（データは示さず）。これらの安定な集団を、後記するサイトフロメトリーを用いる高発現細胞のために貯蔵した。全ての引き続いての実験で用いたのは細胞のこれらの分けた集団である。
【０１９２】
ＦＡＣＳ分析に２４時間先立って、ＣｕＳＯ４を安定にトランスフェクトされたＳ２細胞（３−４×１０６細胞／ｍｌ）に１ｍＭの最終濃度まで添加し、それによりトランスフェクトされた遺伝子からの発現に「スイッチを入れた」。細胞を２４−ウェル培養皿中で平板培養した（ウェル当たり２ｍｌ）。ＦＡＣＳ分析に８時間先立って、ＣｕＳＯ４培地を、５０μｇ／ｍｌの濃度のペプチドを含むまたは含まない新鮮な培地（１ｍｌ）で置き換える。分析のために細胞を収穫するに先立って、種々の時間間隔にて３７℃の室内で皿を平坦な表面に移すことによって、３７℃の温度攻撃を行う。
【０１９３】
Ｓ２細胞でのクラスＩ  ＭＨＣの表面発現を分析するために、細胞のアリコット（５×１０５）を氷上の試験管に移し、遠心（１，０００×ｇ、４分間）によって収集し、３ｍｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウムに再懸濁し、遠心によって収集し、適当な一次抗体（腹水Ｙ３、２８：１４：８Ｓ、３０．５．７．，Ｗ６／３２，１：２００希釈）を含有するＰＢＳ／ＢＳＡ（０．５ｍｌ）に再懸濁する。ウサギ抗血清を１：５００希釈し、Ｂ２２．２９３ハイブリドーマ上清を直接用いる。氷上での１時間のインキュベーションの後、細胞を３ｍｌのＰＢＳ／ＢＳＡ中で２回洗浄し、ＦＩＴＣ標識二次抗体（Ｃａｐｐｅｌｌ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）および１ｎｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムを含有するＰＢＳ／ＢＳＡ０．５ｍｌに再懸濁する。氷上での３０分のインキュベーションの後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡで１回洗浄し、１×１０６／ｍｌの濃度のこの緩衝液中に再懸濁する。次いで、ＦＡＣＳ  ４４０（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって試料を分析する。ヨウ化プロピジウムで染色された死滅細胞を、分析に生ゲートを含ませることによって排除する。
【０１９４】
細胞ソーティングのために、全ての染色操作を滅菌フード中で行う以外は、前記で概説したのと同一の手法を用いる。抗体を含む溶液を濾過滅菌し、ＰＢＳ／ＢＳＡの代わりにＳｃｈｎｅｉｄｅｒ培地またはＥｘｃｅｌｌ  ４００を用いる。一次抗体に特異的に結合する細胞を、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎセルソーターを用いて分ける。分けた細胞（２−８×１０５）を、２×１０５細胞／ｍｌの濃度で平板培養する前に培地中で１回洗浄する。
【０１９５】
Ｆ．ペプチドとのイン・ビトロインキュベーションによる膜−結合した空のＭＨＣ分子の負荷
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞の表面で発現されるヒト・クラスＩ分子が空の場合、細胞を３７℃で２時間インキュベートし、細胞表面発現をサイトフルオリメトリーによって分析した。ＨＬＡ  Ｂ２７およびＡ２．１双方の表面発現は、もし細胞を３７℃で２時間インキュベートすると大いに低下する；しかしながら、クラスＩ分子に結合することが知られているＨＩＶペプチド中で細胞をプレインキュベートすると、クラスＩに対して有意な熱安定性が与えられ、他方、結合しないペプチドはほとんど効果を有しない（図４参照）。（ＨＩＶのＰＯＬ蛋白質からの９−アミノ酸ペプチドＩＬＫＥＰＶＨＧＶ（配列番号４２）はＨＬＡ  Ａ２．１に結合し、それを安定化する。ＨＩＶのＶｐｒ蛋白質からの９−アミノ酸ペプチドはＢ２７（ＦＲＩＧＣＲＨＳＲ；配列番号４１）に結合しそれを安定化させる）。これらのデータは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞の表面で発現されたヒト・クラスＩ分子が空であり、結合特異的ＨＩＶペプチドによって安定化できることを示す。
【０１９６】
図４および５は、ＨＩＶペプチドによるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞の表面に発現されたＨＬＡ  Ｂ２７およびＨＬＡ  Ａ２．１のペプチド−誘導熱安定化を示す。ＨＬＡ  Ｂ２７またはＡ２．１いずれかを発現するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞を示したペプチドと共にインキュベートし、次いで、（ＡＴＣＣ  ＨＢ９５からの）抗体Ｗ６／３２およびサイトフルオリメトリーの使用によるクラスＩ分子の表面発現の分析に先立って、２時間２８℃で維持するか、あるいは３７℃でインキュベートした。各細胞集団の平均蛍光をインキュベーション時間に対してプロットして示す。ＨＩＶ  ＰＯＬペプチド（ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ，配列番号４２）はＡ２．１を安定化させるがＢ２７を安定化させず（図４）、他方、ＨＩＶ  Ｖｐｒペプチド（ＦＲＩＧＣＲＨＳＲ、配列番号４１）はＢ２７を安定化させるがＡ２．１を安定化させない（図５）。
【０１９７】
実施例２
合成抗原−提示細胞の調製
Ａ．浸透圧負荷
オボアルブミン蛋白質でのＳＣ２および３Ｔ３細胞の浸透圧負荷はＭｏｏｒｓｅら，Ｃｅｌｌ  ５４：７７７−７８５（１９８８）によって記載されているごとくに行った。アッセイ手法は以下の通りである。９６−ウェルの皿中、１×１０５Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞（負荷したペプチド／蛋白質を含むまたは含まない）または３Ｔ３細胞を、１０％胎児ウシ血清を補足したＲＰＭＩ培地２００μｌ中の１×１０５  Ｂ３／ＣＤ８Ｔ−細胞ハイブリドーマ細胞と共に培養した。インキュベーションの２４時間後、これらの培養からの上清１００μｌを５，０００のＣＴＬＬ細胞を含有するＲＰＭＩの１００μｌに添加した。１μＣｉの３Ｈチミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加すると、細胞を３７℃で２４時間共培養した。３７℃における１５時間のさらなるインキュベーションの後、放射性同位体標識のＣＴＬＬ細胞への取り込みをシンチレーションカウンティングによって測定した。
【０１９８】
また、ネズミＭＨＣで行ったアッセイにより、昆虫細胞はペプチドをクラスＩ分子に負荷することができることが確認された。特定の抗原を含有する２００−５００と少ないＭＨＣ分子を発現する細胞はＴ−細胞によって検出できる。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞はクロムを蓄積しないので、Ｂ３／ＣＤ８、Ｔ−細胞ハイブリドーマに基づく抗原提示アッセイを用いた。Ｂ３／ＣＤ８はＢ３（Ｈ−２ＫｂクラスＩ分子によって提示されるオボアルブミンペプチド２５３−２７６に特異的な細胞傷害性Ｔ−細胞）、およびＣＤ８−を担持するＩＬ−２分泌細胞系の間のハイブリドーマである（Ｃａｒｂｏｎｅら，前掲，１９８９参照）。抗原刺激に際して、ＩＬ−２−依存性Ｔ−細胞系ＣＴＬＬへの３Ｈチミジン取り込みによって測定するとＢ３／ＣＤ８はＩＬ−２を産生する（Ｇｉｌｌｉｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：２０２７（１９７８））。かくして、産生されたＩＬ−２の量を測定することによって、Ｔ−細胞認識についてのアッセイをすることができる。
【０１９９】
ＯＶＡペプチドが由来するオボアルブミン蛋白質の細胞内プールを供するために、オボアルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，ＭＯ）をＭｏｏｒｅら，前掲（１９８８）によって記載されているごとくに浸透圧により細胞に負荷した。負荷の直後、細胞をＴ−細胞ハイブリドーマと混合した。２日間のインキュベーションの後、培地を取り出し、ＩＬ−２につき検定した。ＩＬ−２の量は、ＩＬ−２−依存性Ｔ−細胞系ＣＴＬＬの増殖を支持する培地の能力によって測定し（Ｇｉｌｌｉｓら，前掲，１９７８）、増殖は、細胞へ取り込まれた放射性チミジンの量によって定量した。
【０２００】
Ｋｂ／β２でトランスフェクトしたＳ２または３Ｔ３細胞を、等張（Ｉｓｏ）または高張（Ｈｙｐ）培地中、オボアルブミン蛋白質（ＯｖＰｒｏ）またはオボアルブミンペプチド、ＯＶＡ２４（ＯｖＰｅｐ）と共にインキュベートした。（ネズミ細胞系は受託番号ＣＣＬ１６３でＡＴＣＣから入手可能である。）処理後、細胞をＴ−細胞ハイブリドーマＢ３／ＣＤ８と共培養した。Ｂ３／ＣＤ８は、Ｂ３（Ｃａｒｂｏｎｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：６０３−１２（１９８９））、Ｈ−２ＫｂクラスＩ分子によって提示されたオボアルブミンペプチド２５３−２７６に特異的な細胞傷害性Ｔ−細胞、およびＣＤ８を担持するＩＬ−２分泌細胞系との間のＴ−細胞ハイブリドーマである。抗原刺激に際して、ＩＬ−２−依存性細胞系ＣＴＬＬへの３Ｈチミジンの取り込みによって測定して、Ｂ３／ＣＤ８はＩＬ−２を産生する（Ｇｉｌｌｉｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：２０２７（１９７８））。かくして、産生されたＩＬ−２の量を測定することによって、Ｔ−細胞認識につき検定できる。共培養からの上清は、ＩＬ−２−依存性細胞系ＣＴＬＬ（ＡＴＣＣ番号  ＴＩＢ２１４）による３ＨチミジンによってＩＬ−２につき分析した。取り込まれた３Ｈチミジンの量を最初の細胞処理に対してプロットする。
【０２０１】
図６より、もしオボアルブミンペプチドを培養基に添加したならば、Ｔ−細胞はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞によく応答し、もし細胞にオボアルブミンペプチドを負荷すれば、認識は起こらないことが分かる。昆虫細胞の細胞表面に発現されたＭＨＣクラスＩ分子は、もしペプチドを培養基に添加したならば該ペプチドに結合できる点で十分に機能的であり、Ｔ−細胞によってそれが認識されるよう正しい意味でそれを提示できる。
【０２０２】
Ｂ．イン・ビトロ条件の最適化
特異的細胞傷害性Ｔ−細胞の生成のためのイン・ビトロ条件の最適化のために、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞刺激体細胞の培養を好ましくは無血清培地（例えば、Ｅｘｃｅｌｌ  ４００）中で維持する。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞刺激体細胞を好ましくは＞２０μｇ／ｍｌペプチドと共にインキュベートする。エフェクター：刺激体比率（リンパ球：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞比率）は好ましくは約３０：１ないし３００：１の範囲である。最大特異的ＣＤ８＋は一般に５日間の培養の後に観察される。アッセイを殺すための標的細胞の培養は好ましくは無血清培地に維持する。
【０２０３】
実施例３
アーム付きエフェクターＴ−細胞の増殖および分化の刺激
我々は、ＭＨＣクラスＩ分子および特異的助力（assisting）分子でトランスフェクトしたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞がイン・ビトロでＴ−細胞からの一次応答を刺激できることを見い出した。我々はマウスモデル系から本実施例において以下のデータを示す。本実施例では、マウスＭＨＣクラスＩ（Ｌｄ）、β２ミクログロブリン、特異的助力分子をコードする構築体を用い、Ｔ−細胞受容体導入マウスのリンパ節からのＣＤ８+細胞でテストした。
【０２０４】
図７のデータは、トランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞がトランスフェクトされたネズミ遺伝子の蛋白質産物を発現する証拠を提供する。蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）および蛍光的に標識した抗体を用いるフローサイトメトリーを用いて、トランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞によるＬｄ（重鎖およびβ２を含むＭＨＣ分子）および特異的助力分子Ｂ７．１（ＣＤ８０）およびＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）の発現を示した。トランスフェクトされた細胞をＦＡＣＳで分離して、Ｌｄ分子を発現する細胞が得られ、次いで、イン・ビトロで維持した。
【０２０５】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞のトランスフェクションを表２にまとめる。該データは、ＣｕＳＯ４での誘導後における細胞系でのフローサイトメトリーによって測定されたＬｄ、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１発現を示す。対照抗体（ｃｔｒ  Ａｂ）に対し、トランスフェクタントの全ては細胞表面でＬｄ分子を発現することが明らかである。同様に、ＬｄおよびＢ７．１で共トランスフェクトされた細胞（Ｌｄ．Ｂ７）はＩＣＡＭ−１ではなくＢ７．１を発現し、他方、ＬｄおよびＩＣＡＭ−１で共トランスフェクトされた細胞（Ｌｄ．ＩＣＡＭ）はＢ７．１ではなくＩＣＡＭ−１を発現し；Ｌｄ、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１での三重トランスフェクション（Ｌｄ．Ｂ７．１．ＩＣＡＭ）は３種の分子全ての発現に導いた。
【０２０６】
標準的な組織培養系（Ｃａｉ，Ｚ．およびＳｐｒｅｎｔ，Ｊ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：２００５−２０１５）を用い、５×１０４用量の精製ＣＤ８＋２Ｃリンパ節（ＬＮ）細胞を、３×１０５用量のトランスフェクトされたハエ細胞±ペプチド（１０μＭ最終濃度）と共に３７℃で培養した。ペプチドはＲ．Ｗ．Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｓｙｋｕｌｅｖら，（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １：１５−２２によって合成した。増殖応答は、収穫の８時間前に３ＨＴｄＲ（１μＣｉ／ウェル）を添加することによって測定した。ＩＬ−２産生は、４８時間に培養から上清を取り出し、５０μｌの上清をＩＬ−２応答インジケーター細胞系（ＣＴＬＬ）に添加することによって測定した；インジケーター系の増殖は３ＨＴｄＲの添加によって測定した。表２に示されるデータは三連の培養の平均値である。トランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞は３７℃で迅速に死滅し、この温度では３ＨＴｄＲを取り込まなかった。
【０２０７】
表２におけるデータは、トランスフェクタントがマウスＴ−細胞の一次応答を刺激できることを示す。
【０２０８】
表２
２Ｃ  Ｔ−細胞受容体導入マウスからのＣＤ８＋リンパ節細胞による一次増殖応答およびＩＬ−２産生を刺激するトランスフェクトされたハエ細胞の能力
【０２０９】
【表２】
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【０２１０】
２Ｃ  Ｔ−細胞受容体（ＴＣＲ）は、ある種のペプチド、例えばｐ２Ｃａ（配列番号４６）またはＱＬ９（配列番号４７）と複合体化したＬｄ分子に対して強力に反応性である。これらの２種のペプチドは、可溶性Ｌｄ分子に対して中程度ないし高い親和性を有する（ｐ２Ｃａにつき４×１０６Ｍ−１、およびＱＬ９につき４×１０９Ｍ−１（Ｓｙｋｕｌｅｖら））。可溶性Ｌｄ分子に複合体化させた場合、２種のペプチドは可溶性２Ｃ  ＴＣＲ分子に対して高い結合親和性を有する。しかしながら、ＴＣＲ結合およびＬｄ結合双方において、ＱＬ９ペプチドはｐ２Ｃａペプチドよりも高い親和性を明らかに有する。
【０２１１】
表２は、より弱いペプチドｐ２Ｃａに対する応答体２Ｃ細胞による増殖応答およびＩＬ−２産生が、刺激体Ｌｄ−トランスフェクト細胞がＢ７．１およびＩＣＡＭ−１双方を発現すること；Ｌｄ＋Ｂ７．１またはＬｄ＋ＩＣＡＭ−１いずれかを発現する細胞の混合物は非刺激性であるを要することを示す。対照的に、より強いペプチドＱＬ９に関しては、Ｂ７またはＩＣＡＭを発現するＬｄ．ハエ細胞は明らかに有意な応答を誘導するが、Ｂ７およびＩＣＡＭの組合せ発現はかなり高い応答を生成する。Ｔ−細胞増殖についてのこれらの発見とは対照的に、ＱＬ９ペプチドに応答してのＩＬ−２産生はＢ７およびＩＣＭＡの同時発現を要し；別々の細胞でこれらの分子の発現は効果的でない。
【０２１２】
結果は、ネズミ・クラスＩ分子および共刺激性分子でトランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞がペプチド抗原に応答してＴ−細胞を誘導して、一次増殖応答およびリンホカイン（ＩＬ−２）産生を上昇させることを示す。また、該系はヒトＴ−細胞に適用でき、これを用いて、イン・ビトロで腫瘍−特異的抗原に特異的な非感作（または感作）Ｔ−細胞を刺激することができ；腫瘍−特異的抗原に特異的なクローン的に増殖したＴ−細胞のイン・ビボ融合は癌を持つ患者を治療するであろう。ウイルス抗原に特異的なＴ−細胞の融合はウイルス感染、例えばＨＩＶを持つ患者で有用であろう。
【０２１３】
実施例４
アビジン−被覆赤血球細胞に対するビオチニル化ＭＨＣ分子の固定化
ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン、ニュートラアビジンおよびビオチン−ＢＭＣＣはＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から購入した。ヒツジ赤血球細胞はＣｏｌｏｒａｄｏ  Ｓｅｒｕｍ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｄｅｎｖｅｒ，ＣＯ）から得た。Ｌｄおよび組換えＬｄを発現するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞は実施例１および２に記載したごとくに調製した。モノクローナル抗体３０．５．７（抗−Ｌｄ）および１Ｂ２（２Ｃ  Ｔ−細胞受容体に対する抗−クロノタイプ抗体）はハイブリドーマ細胞培養上清として用いた。
【０２１４】
使用したプロトコルはＭｕｚｙｋａｎｔｏｖおよびＴａｙｌｏｒ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９４）２２３，４２−１４８）によって記載されている。略言すると、ＳＲＢＣをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で４回洗浄し、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンを用いてビオチン化し、ＰＢＳ中で再度４回洗浄し、ニュートアビジンと共にインキュベートし、最後に４回洗浄し、３％胎児ウシ血清および０．０２％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中、４℃で保存した。
【０２１５】
ビオチン−ＢＭＣＣ、チオール基と反応するマレイミドにカップリングしたビオチンを用い組換えＬｄをビオチン化した。Ｌｄは遊離チオール基、システイン１２１の側鎖（これは、ペプチド結合部位にはない）を呈する。ビオチン化は製造業者によって推奨されるごとくに行った。未反応ビオチンをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ１０を用いて除去した。
【０２１６】
アビジン−被覆ＳＲＢＣと共に０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で３０分間インキベートし、続いて、１０％胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中で洗浄することによって、ビオチン化Ｌｄを固定化した。Ｌｄが付着したＳＲＢＣを直ちに使用した。
【０２１７】
マウスのリンパ節からの２Ｃ  ＴＣＲトランスジーンを発現するＴ−細胞を、磁性枯渇（magnetic depletion）によって精製した。精製したＴ−細胞は、抗−クロノタイプ抗体１Ｂ２を用いるサイトフルオロメトリーにおける染色に終始９７−９８％陽性であった。
【０２１８】
ビオチン化Ｌｄのアビジン−被覆ＳＲＢＣへの固定化は前記したごとくに行った。付着は、抗−Ｌｄ抗体３０．５．７を用いるフローサイトフルオロメトリーを用いて評価した。
【０２１９】
典型的な実験は図８に示す。陰性対照（細胞マイナス抗体）は点線で示す。塗られたピークは蛍光抗体で標識された細胞よりなる。細胞の９９．７８％が標識された。蛍光強度は、我々が合成抗原−提示細胞上のＬｄにつき観察した強度の最高レベルと同一範囲であった。
【０２２０】
同一手法を用い、Ｋｂ（重鎖およびβ２を含むＭＨＣ分子）もビオチン化した。我々は、フローサイトフルオロメトリーによって評価してアビジン−被覆ＳＲＢＣ上にビオチン化Ｋｂを固定化することができた（図９）。細胞の９９．８８％が標識された。
【０２２１】
ロゼッティング実験により、付着ＭＨＣ分子がＴ−細胞と機能的に相互作用することが確認された。Ｌｄ、Ｌｄ−被覆ＳＲＢＣを発現するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞を氷上でＱＬ９ペプチド（０．０２ｍＭ）または無関係ペプチド（ＭＣＭＶ、０．０２ｍＭ）と共に３０分間インキベートし；次いで、２Ｃ＋Ｔ−細胞を添加し、１Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞につき２Ｃ＋Ｔ−細胞であり、あるいは１  ２Ｃ＋Ｔ−細胞につき１０ＳＲＢＣであり；混合物をペレット化し、氷上に少なくとも３０分間保持した。次いで、細胞を注意深く再懸濁し、ロゼットをカウントし、ロゼットは少なくとも３つの２Ｃ＋Ｔ−細胞に結合したＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞、または少なくとも３つのＳＲＢＣに結合した２Ｃ＋Ｔ−細胞である。ロゼットは全ての場合に観察された。典型的には、ＱＬ９ペプチドを添加した場合、リンパ球の３０−４０％がロゼットに含まれた。無関係ペプチドの存在下ではロゼットは観察されなかったが、場合により少数の単細胞の付着が観察された。
【０２２２】
これらの例は、大量のＭＨＣクラスＩ分子を、モノクローナル抗体結合およびロゼッティング実験（Ｔ−細胞受容体結合）によって判断して、天然のコンフォメーションにて、種々の表面（ハエ細胞、赤血球細胞、ラテックスビーズ）に固定化する新しい方法を記載する。この方法は人工リン脂質膜を含めた他の合成表面へ拡大させることができる。ホスファチジルエタノールアミンならびにアビジンがカップリングしたリン脂質は我々の研究に特に関係がある。これらのリン脂質はＬｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，カナダ国から商業的に入手可能である。
【０２２３】
実施例５
アビジン−被覆ラテックスビーズへのビオチン化ＭＨＣ分子の固定化
６ミクロン直径ラテックススルフェートビーズはＩｎｔｅｒｆａｃｉａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）から購入し、実施例４に記載したプロトコルに従ってビオチン化した。
【０２２４】
アビジン−被覆ラテックスビーズは、室温で１ｍｇ／ｍｌのニュートラアビジンを含有するＰＢＳ中にて１時間インキュベートしたラテックスビーズの１％懸濁液を用いて調製した。次いで、１０％胎児ウシ血清を含有する等容量のＰＢＳを添加した。室温でのインキュベーションの１時間後、ビーズを３回洗浄し、組換えビオチン化Ｌｄの結合に用いた。
【０２２５】
組換えビオチン化Ｌｄは、アビジン−被覆ラテックスビーズと共に０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度でインキュベートし、続いて１０％胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ中で洗浄することによって固定化した。Ｌｄが付着したＳＲＢＣを直ちに使用した。
【０２２６】
ロゼッティング実験により、ラテックスビーズ上に付着したＭＨＣ分子はＴ−細胞と機能的に相互作用することが確認された。組換えＬｄおよびＬｄ−被覆ラテックスビーズを発現するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞を氷上でＱＬ９ペプチド（０．０２ｍＭ）または無関係ペプチド（ＭＣＭＶ、０．０２ｍＭ）と共に３０分間インキュベートし；次いで、２Ｃ＋Ｔ−細胞を添加し、割合は１Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞につき１０の２Ｃ＋Ｔ−細胞、または１の２Ｃ＋Ｔ−細胞につきＬｄ−ラテックスビーズであり；混合物をペレット化し、氷上に少なくとも３０分間保持した。次いで、細胞を注意深く再懸濁し、ロゼットをカウントし、ロゼットは少なくとも３つの２Ｃ＋Ｔ−細胞に結合したＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞、または少なくとも３つのラテックスビーズに結合した２Ｃ＋Ｔ−細胞であった。ロゼットは全ての場合に観察された。典型的には、ＱＬ９ペプチドを添加した場合、リンパ球の３０−４０％がロゼットに含まれた。無関係ペプチドの存在下ではロゼットは観察されなかったが、場合によってし少数の単細胞の付着が観察された。
【０２２７】
実施例６
プラスチックマイクロウェルプレートのごとき種々の固体支持体に結合させた組換え蛋白質の固定化および検出
ＭＨＣ分子はマイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）への直接結合によって固定化し、以下のごとくに検出した。
【０２２８】
ＭＨＣ  Ｋｂ分子をＰＢＳ中に所望の濃度まで、例えば、１００ｎｇ／ウェルに対して０．００１ｇ／ｍｌまで希釈した。１００μｌの希釈したＫｂをプラスチックマイクロタイタープレート上の各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳ＋（０．０５％）およびＴｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）中の２００μｌの２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加し、室温でさらに１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、ビオチン化抗−ＫｂｍＡｂをＰＢＳ中の２％ＢＳＡに添加した（１：２５００）。プレートを室温でさらに１時間インキュベートし、ＰＢＳＴで３回洗浄した。アビジン−コンジュゲーテッドＨＲＰをＰＢＳ中の２％ＢＳＡに添加した（１：２５００）。室温でのさらに１時間後、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄し、Ｈ２Ｏ２またはトフェニルジアミンを添加した。Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。反応生成物を４９０ｎｍで比色法により検出した。
【０２２９】
図１０は、３つの異なるモノクローナル抗体を用いる、ＭＨＣ  Ｋｂ分子の存在の検出結果を示す。
【０２３０】
別法として、組換えＭＨＣ  Ｋｂ分子はビオチン−アビジン連結相互作用を介して基質と結合することができる。この具体例では、マイクロウェルプレートをＰＢＳ中に０．００１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した１００μｌアビジンで被覆した。過剰のアビジンをＰＢＳ洗浄によって除去した。Ｋｂを提示しその結合を検出する前記手法を次に行った。
【０２３１】
別法として、基質に結合したニッケルと相互作用するＭＨＣに付加されたポリヒスチジンタグに基づく結合によって組換えＭＨＣ分子を固定化することもできる。
【０２３２】
ニッケルキレート被覆マクイロウェルプレート（Ｘｅｎｏｐｏｒｅ）を用いて、結合および検出についての前記手法を行い、前記ベクターｐＲｍＨａ／Ｈｉｓ６を用いて、ポリヒスチジンタグを持つ組換えＭＨＣ分子を発現させた。
【０２３３】
実施例７
可溶性の空のクラスＩ  ＭＨＣ分子へのイン・ビトロでのペプチドの直接結合
Ａ．手法
Ｈ−２Ｋｂ：実施例１．Ｂに記載したごとくに調製。
【０２３４】
Ｈ−２Ｋｂ  Ｓｏｌ：Ｋｂ  ｓｏｌ  ｃＤＮＡは、クラスＩ  ＭＨＣ分子の細胞外部分をコードする、Ｋｂの誘導体である。Ｋｂ  ｓｏｌ  ｃＤＮＡは、Ｅｎｎｉｓら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：２８３３−７（１９９０）およびＺｅｍｍｏｕｒら，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３３：３１０−２０（１９９１）に記載されているもののごとき、公知方法に従ってＰＣＲによって生成させることができる。具体的には、アミノ酸位置＋２７５のアルファ３ドメインの末端に挿入された停止コドンを持つ切形Ｋｂ分子をコードするｃＤＮＡをＢａｍＨＩ断片としてｐＣＭＵ発現プラスミドから切り出し、Ｋｂ  ｃＤＮＡとしてｐＲｍＨａ−３にクローン化する。Ｋｂ  ｓｏｌ  ｃＤＮＡは完全なＫｂ  ｃＤＮＡの誘導体であり（前記参照）、これはＳｔｙＩ部位を含む５’オリゴヌクレオチド、および以下の３’オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応において鋳型として用いる。
５’  ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＣ  ３’
（配列番号４３）
得られたＰＣＲ断片を平滑末端とし、ｐＢＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）のＳｍａＩ部位にクローン化し、配列決定し、Ｋｂの残りの５’配列をＳｔｙＩ部位にクローン化する。完全なＫｂ蛋白質をコードするｃＤＮＡはＢａｍＨＩ制限断片として得ることができた。
【０２３５】
Ｈ−２ＤｂおよびＨ−２Ｌｄは前記実施例１．Ｂに記載したごとくに調製する。
【０２３６】
Ｋｂ  α１α２α３ドメイン（２７４残基）およびネズミβ−２ミクログロブリン（９９残基）をコードするｃＤＮＡを、各々、メタロチオネインプロモーターｐＲＭＨａ−３（Ｂｕｎｃｈら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１６：１０４３−１０６１（１９８８））を保有する発現ベクターの唯一のＢａｍＨＩ部位にクローン化した。前記したリン酸カルシウム沈殿法によって、プラスミドｐｈｓｈｓｎｅｏ（ネオマイシン耐性遺伝子を含有）に加えてこれらの組換えプラスミドでＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２／Ｍ３細胞を形質転換した。ネオマイシン−アナログ抗生物質Ｇ４１８に対して選択された形質転換細胞を無血清培地中で２７℃にて増殖させ、０．７ｍＭ  ＣｕＳＯ４の添加によって可溶性重鎖Ｋｂおよびβ−２ミクログロブリンを共発現させた。
【０２３７】
製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の指示に従い、抗−Ｋｂモノクローナル抗体Ｙ３を用いるアフィニティークロマトグラフィー、続いてＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＦＰＬＣカラム上のイオン交換クロマトグラフィーによって、Ｋｂの組み立てられたヘテロダイマーを培養上清から精製した。Ｋｂ調製物のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、続いてのクーマシーブルーでの染色は、約３２，０００における相対的分子量（Ｍｒ）のただ１つのバンドおよび約１２，０００におけるＭｒの１つのバンドを示し、検出可能な不純物はなかった。高度に精製されたＫｂをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に対して透析し、濾過滅菌し、さらなる実験の使用した。可溶性Ｋｂ（「Ｋｂｓｏｌ」）蛋白質（４３．２ｋＤａ）の吸光係数は２８０ｎｍにおいて６９，２００Ｍ−１ｃｍ−１である。
【０２３８】
１％ＴＸ−１００を含有するまたは含有しないＰＢＳ中の精製されたＫｂｓｏｌ（０．３μＭ）を種々の温度（すなわち、４℃、２３℃、３２℃、３７℃、４２℃および４７℃）に１時間暴露した。次いで、４℃にて、モノクローナル抗体Ｙ３およびプロテインＡセファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と共にインキュベートすることによって、蛋白質を２時間で各々免疫沈降させた。１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いてのクーマシーブルーでの染色によって試料を分析した。ゲル上の２つの濃厚なバンドは抗体Ｙ３の軽鎖および重鎖である。もう１つの手法において、Ｋｂｓｏｌ（０．３μＭ）を２３℃にてＰＢＳ中の５０μＭペプチドと共に２時間インキュベートして、Ｋｂｓｏｌ−ペプチド複合体を形成させた。１％ＴＸ−１００の添加の後、試料を１２℃、３７℃または４７℃の温度に１時間暴露した。複合体を免疫沈降させ、前記したごとくにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。第３の手法において、２３℃にて、Ｋｂｓｏｌ（２．７μＭ）を、各々、５０μＭのＯＶＡ−８、ＶＳＶ−８またはＳＥＶ−８ペプチドと共に２時間インキュベートした。試料を５％ポリアクリルアミドＩＥＦゲルに適用した。ＩＥＦをｐＨ５−７から流し、ゲルを銀で染色した。
【０２３９】
次に、クロラミン−Ｔ方法（Ｈｕｎｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  １９４：４９５−６（１９６２））を用いてＶＳＶ−８ペプチドを放射性ヨウ素標識し、Ｃ１８カラム（ＯＰＣ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって遊離１２５Ｉを除去した。標識したペプチドをＣ１８逆相ＨＰＬＣによってさらに精製した。溶出の後、標識ペプチドを凍結乾燥し、ＰＢＳ中に再懸濁した。
【０２４０】
２７４ｎｍにおけるチロシンの吸光係数（１４２０Ｍ−１ｃｍ−１）を用いることによって、［１２５Ｉ］ＶＳＶ−８の特異的活性（約２５０Ｃｉ／ミリモル）を分光光度法によって測定した。まず、２３℃にてＫｂｓｏｌ（０．５μＭ）を［１２５Ｉ］ＶＳＶ−８（１．５ｎＭ）および未標識ＶＳＶ−８（５０ｎＭ）と１６時間で混合して、複合体形成を行った。試料の一部をＰＢＳ中のゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって分析した。溶出後、各画分（０．０５ｍｌ）に含まれる放射能を測定した。２８０ｎｍにおける吸光度によって蛋白質をモニターした。
【０２４１】
第２の手法において、［１２５Ｉ］ＶＳＶ−８（０．３９ｎＭ）を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中の種々の濃度のＫｂｓｏｌと混合した。２３℃における２−１６時間のインキュベーションの後、ＰＢＳ中の小ゲル濾過（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ３０，ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）によって、Ｋｂ−ペプチド複合体を遊離ペプチドから分離した。Ｐ３０ゲル濾過は約５分以内に結合および遊離ペプチドの９５％を越える分離を可能とした。結合および遊離ペプチドの放射能を測定し、データを直線回帰によって解析した。供されたＫｂｓｏｌの最大レベルにおいて、全標識ペプチドの約６５％が結合した。Ｋｂｓｏｌ蛋白質への標識ペプチドのこの最大結合能力は、恐らくは、ＶＳＶ−８に結合した１２５Ｉによる放射のため、時間と共に低下した。
【０２４２】
第３の手法において、各試料は０．３９ｎＭの［１２５Ｉ］ＶＳＶ−８（約１８，０００ｃｐｍ）、示した濃度の未標識ペプチド、および７２μｌの最終容量で未標識ペプチドの不存在下で［１２５Ｉ］ＶＳＶ−８結合の約５０％を与える３０ｎＭのＫｂｓｏｌを含有した。全ての成分を溶解させ、１％ＢＳＡを含有するＰＢＳに希釈した。２３℃における２−１６時間のインキュベーションの後、前記したＰ３Ｏゲル濾過によって５０μｌ試料を分析した。未標識ペプチドについての解離定数を［１２５Ｉ］ＶＳＶ−８および未標識ペプチドのモル濃度から決定し、前記したＫｂｓｏｌへの［１２５Ｉ］ＶＳＶ−８結合の５０％阻害を与えた。（Ｍｕｌｌｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２，５８９−６０１（１９８３）参照）。
【０２４３】
次いで、４℃、２３℃および３７℃で、Ｋｂｓｏｌ（０．３μＭ）および［１２５Ｉ］ＶＳＶ−８（０．３９ｎＭ）をインキュベートし、Ｐ３０ゲル濾過によって種々の時点で会合を測定した。示した濃度でのインキュベーションの前に、要すれば、ネズミβ−２ミクログロブリンを添加した。組換えＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞の培養上清から抗−β−２ミクログロブリンポリクローナル抗体Ｋ３５５を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、ネズミβ−２ミクログロブリンを調製した。（Ｌｏｇｄｂｅｒｇら，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．１４：５７７−５８７（１９７９）も参照）。もう１つの実験において、２３℃にて、Ｋｂｓｏｌ（０．３μＭまたは１．８μＭ）および［１２５Ｉ］ＶＳＶ−８（２．４ｎＭ）を２時間インキュベートし、Ｐ３０ゲル濾過によってペプチド−Ｋｂｓｏｌ複合体を単離した。試料は非常に少量の［１２５Ｉ］ＶＳＶ−８およびＫｂｓｏｌ複合体（最大で２．４ｎＭ）ならびに約５０ないし３００ｎＭの最終濃度の空のＫｂｓｏｌを含有した。いくらかの試料に、３μＭのβ−２ミクログロブリン、３μＭのβ−２ミクログロブリン＋２０ｎＭの未標識ＶＳＶ−８、２０μＭの未標識ＶＳＶ−８、または１％ＴＸ−１００を添加した。３７℃で試料を種々の時間インキュベートし、Ｐ３０カラムを通すことによって解離を測定した。
【０２４４】
Ｂ．考察
クラスＩ  ＭＨＣ分子は抗原性ペプチドを細胞傷害性Ｔ−リンパ球に提示する。イン・ビトロでのペプチドのクラスＩ分子への直接結合は、結合部位における先に結合したペプチドの存在（ＣｈｅｎおよびＰｅｒｈａｍ，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：７４３−５（１９８９））または結合特異性の欠如によって妨害された。（例えば、Ｆｒｅｌｉｎｇｅｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：８２７−３４（１９９０）；Ｃｈｏｐｐｉｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：８８９−９９（１９９０）；Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：９３１−６（１９９０）参照）。切形Ｈ−２Ｋｂｓｏｌおよびネズミβ−２ミクログロブリン遺伝子で形質転換したＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞から精製された可溶性の空のクラスＩ分子へのペプチド結合のイン・ビトロ分析はをここに開示する。結果は、ペプチド結合が非常に迅速で、天然でプロセッシングされたペプチド（オクタペプタド；例えば、Ｖａｎ  Ｂｌｅａｋら，Ｎａｔｕｒｅ３４８：２１３−６（１９９０）；Ｆａｌｋら，Ｎａｔｕｒｅ３５１：２９０−６（１９９１）参照）はナノモル範囲のＫｂｓｏｌに対する最高の親和性を有することを示し、オクタペプタドと複合体化したＫｂｓｏｌは安定であるが、他方、わずかに短いまたは長いペプチドと複合体化したものは寿命が短いことを示す。遊離重鎖およびβ−２ミクログロブリンとの間の相互作用は、界面活性剤の不存在では基本的に可逆的である。ペプチドは、β−２ミクログロブリンの解離なくして、自然発生的に空のクラスＩ分子の結合する。しかしながら、過剰のβ−２ミクログロブリンは、ヘテロダイマーが不安定である条件下での遊離重鎖とβ−２ミクログロブリンとの再会合の結果として、空のクラスＩヘのペプチドの結合を明らかに促進する。
【０２４５】
（重鎖のα１α２α３ドメインよりなる）可溶性Ｈ−２Ｋｂ分子およびネズミβ−２ミクログロブリンを、切形重鎖およびβ−２ミクログロブリン遺伝子で同時に形質転換されたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞の培養上清から精製した。予備的実験は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞が細胞表面の内因性ペプチドを欠くクラスＩ  ＭＨＣ分子を発現することを示唆した。空のクラスＩ分子の特性のいくつかは、それらが３７℃で安定性が低く、それらの構造はペプチドの結合によって安定化されるという観察を含む。（例えば、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら，Ｃｅｌｌ  ６２：５６３−７（１９９０）；Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：４７６−８０（１９９０）参照）。精製された可溶性Ｋｂも空であることを確認するために、界面活性剤を含まない溶液中でのそれらの熱安定性を調べた。驚くべきことに、４７℃で１時間加熱された蛋白質は、コンフォメーション抗体Ｙ３を用いる免疫沈降によって十分回収された。この予期せぬ結果は我々をして界面活性剤、１％トリトンＸ−１００（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル）を蛋白質溶液に添加せしめた。というのは、クラスＩ分子の安定性をテストするための同様の実験は界面活性剤溶解物中で常に行われてきたからである（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら，前掲参照）。界面活性剤の存在下で得られた結果は、精製されたＫｂｓｏｌが今や３７℃で不安定であることを示す。このおよび他の系列の証拠は、Ｋｂｓｏｌヘテロダイマーが高温で重鎖およびβ−２ミクログロブリンに解離し、β−２ミクログロブリンが解離した遊離重鎖と再会合するのを界面活性剤が妨げることを示唆する（後記参照）。第２に、ペプチドで精製されたＫｂｓｏｌを安定化させる可能性を調べた。最初に記載した実験の結果は、ペプチドは、それが天然にプロセッシングされたペプチドであることが示された（Ｖａｎ  Ｂｌｅｅｋら，前掲引用）オクタペプタド（水泡性口内炎ウイルスヌクレオキャプシド蛋白質［ＶＳＶ−８］、後記表３参照）と混合された場合のみ安定化できることを示唆する。これらの観察は前記した空のクラスＩ分子の特性と合致する。
【０２４６】
精製されたＫｂｓｏｌ分子は空であるという独立したサポートは、天然条件下での等電点電気泳動（ＩＥＦ）によって供される（データは示さず）。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞から精製された可溶性Ｋｂはヒト・リンパ芽球細胞系から精製されたＨＬＡ−Ａ２分子よりもかなり単純なパターンを呈した（Ｓｉｌｖｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：６１９−２２（１９９１）の図３参照）。ＩＥＦでのＨＬＡ−Ａ２の複雑なパターンは、分子に結合した異種ペプチドの存在の結果と推定される。精製されたＫｂｓｏｌの単純なバンドは内因性ペプチドの不存在を示す。加えて、Ｋｂｓｏｌと抗原性ペプチドとのインキュベーションはＩＥＦゲルでのバンドの顕著なシフトを引き起こし、これはペプチド結合によるＫｂｓｏｌの等電点の変化を反映する。先に結合した内因性ペプチドの除去後に、ＨＬＡ−Ａ２を「復元条件」にペプチドと共にインキュベートするのでなければ、かかるバンドのシフティングは、ＨＬＡ−Ａ２分子をペプチドと単純に混合した場合は該分子では観察されなかったことに注意すべきである。考え併せると、天然ＩＥＦ上でのこれらの観察も、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞から精製された可溶性Ｋｂが空であることを示す。
【０２４７】
１２５Ｉ−標識ＶＳＶ−８とＫｂｓｏｌとの会合がゲル濾過によって示された（示さず）。高分子量物質の放射能はペプチド−Ｋｂｓｏｌ複合体に対応し、他方、低分子量物質のそれは遊離ペプチドに対応する。未標識ＶＳＶおよびオボアルブミン（ＯＶＡ）ペプチドは標識ＶＳＶ−８と競合でき（後記参照）、［１２５Ｉ］ＶＳＶ−８はＫｂｓｏｌ分子に特異的に結合していることを証明する。逆相ＨＰＬＣは、Ｋｂ−結合［１２５Ｉ］ＶＳＶ−８が入力ペプチドと同一の保持時間を有することを明らかとした。標識ＶＳＶ−８へのＫｂｓｏｌの結合は飽和性であり、約３３ｎＭの解離定数（ＫＤ）を示す（示さず）。Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロットのｘ−軸から、標識ＶＳＶ−８の約６５％がＫｂに結合し得ることが分かった。
【０２４８】
種々のペプチドのＫｂに対する親和性を測定するために、［１２５Ｉ］ＶＳＶ−８を用いる競合ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を行った（データは示さず）。ＲＩＡで用いた阻害性ペプチドを表３にリストする。各ペプチドについてのＫＤを同様に表３にまとめる。
【０２４９】
【表３】
0004629650.tif 000004
【０２５０】
ＶＳＶ−８：水泡性口内炎ウイルスヌクレオキャプシド蛋白質５２−５９（Ｖａｎ  Ｂｌｅｅｋら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：２１３−２１６（１９９０））。
【０２５１】
ＯＶＡ−８：オボアルブミン２５７−２６４（Ｃａｒｂｏｎｅら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：６０３−１２（１９８９））；
ＳＥＶ−９：センダイウイルスヌクレオ蛋白質３２４−３３２（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：７０３−７０６（１９９１））
＊全てのペプチドはＣ１８逆相ＨＰＬＣによって精製して、異なる結合特性を持つより短い汚染ペプチドを排除した。各ペプチドについての３−文字記号表示および配列番号を以下に与える。
【０２５２】
ＶＳＶ−７：ＧｌｙＴｙｒＶａｌＴｙｒＧｌｎＧｌｙＬｅｕ（配列番号４０、残基番号４−１０）
ＶＳＶ−８：ＡｒｇＧｌｙＴｙｒＶａｌＴｙｒＧｌｎＧｌｙＬｅｕ（配列番号４０、残基番号３−１０）
ＶＳＶ−９Ｎ：ＬｅｕＡｒｇＧｌｙＴｙｒＶａｌＴｙｒＧｌｎＧｌｙＬｅｕ（配列番号４０、残基番号２−１０）
ＶＳＶ−１０Ｎ：ＡｓｐＬｅｕＡｒｇＧｌｙＴｙｒＶａｌＴｙｒＧｌｎＧｌｙＬｅｕ（配列番号４０）
ＶＳＶ−９Ｃ：ＡｒｇＧｌｙＴｙｒＶａｌＴｙｒＧｌｎＧｌｙＬｅｕＬｙｓ（配列番号４４、残基番号１−９）
ＶＳＶ−１０Ｃ：ＡｒｇＧｌｙＴｙｒＶａｌＴｙｒＧｌｎＧｌｙＬｅｕＬｙｓＳｅｒ（配列番号４４）
ＯＶＡ−８：ＳｅｒＩｌｅＩｌｅＡｓｎＰｈｅＧｌｕＬｙｓＬｅｕ（配列番号３９、残基番号５−１２）
ＯＶＡ−９Ｎ：ＧｌｕＳｅｒＩｌｅＩｌｅＡｓｎＰｈｅＧｌｕＬｙｓＬｅｕ（配列番号３９、残基番号４−１２）
ＯＶＡ−１０Ｎ：ＬｅｕＧｌｕＳｅｒＩｌｅＩｌｅＡｓｎＰｈｅＧｌｕＬｙｓＬｅｕ（配列番号３９、残基番号３−１２）
ＯＶＡ−９Ｃ：ＳｅｒＩｌｅＩｌｅＡｓｎＰｈｅＧｌｕＬｙｓＬｅｕＴｈｒ（配列番号３９、残基番号５−１３）
ＯＶＡ−１０Ｃ：ＳｅｒＩｌｅＩｌｅＡｓｎＰｈｅＧｌｕＬｙｓＬｅｕＴｈｒＧｌｕ（配列番号３９、残基番号５−１４）
ＯＶＡ−２４：ＧｌｕＧｌｎＬｅｕＧｌｕＳｅｒＩｌｅＩｌｅＡｓｎＰｈｅＧｌｕＬｙｓＬｅｕＴｈｒＧｌｕ−ＴｒｐＴｈｒＳｅｒＳｅｒＡｓｎＶａｌＭｅｔＧｌｕＧｌｕＡｒｇ（配列番号３９）
ＳＥＶ−９：ＰｈｅＡｌａＰｒｏＧｌｙＡｓｎＴｙｒＰｒｏＡｌａＬｅｕ（配列番号４５）
天然にプロセッシングされたサイズのペプチド（ＶＳＶおよびＯＶＡについては８量体、およびセンダイウイルス核蛋白質（ＳＥＶ）については９量体）は２．７ないし４．１ｎＭの範囲からの最高で顕著に類似の親和性を有した。天然ペプチドのこの過度に高い親和性は最近の観察と合致する。（例えば、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ３５０：７０３−６（１９９１）；Ｃｈｒｉｓｔｎｉｃｋら，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６７−７０（１９９１）参照）。しかしながら、１または２残基のように少しだけ短いまたは長いペプチドは２ないし１００のファクターだけ親和性を低下させた。親和性のこの低下はかなり長いペプチドでより顕著である；すなわち、２４量体ペプチド（ＯＶＡ−２４）の親和性はＯＶＡ−８のそれよりも１０，０００倍低い。これらの結果は、より長いペプチドを用いる初期の報告がマクイロモル範囲の親和性を主張しているのが何故であるのかを説明する助けとなる。例えば、ＦｒｅｌｉｎｇｅｒらおよびＣｈｏｐｐｉｎら，共に前掲にて引用参照）。カルボキシル末端におけるペプチドの伸長はアミノ末端における伸長よりも親和性の破壊がかなり低いことは特に興味深い。ＨＬＡ−Ａ２の三次元構造によると、ペプチド結合溝（groove）は反平行β鎖上の２つの長いαラセンによって形成され、窪み（cleft）は約２５オングストローム長であり、これは約８残基の伸長ペプチドペプチド鎖を収容すると提案されている（例えば、Ｂｊｏｒｋｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ３２９：５０６−１２（１９８７））。窪みの一方の端部において、α１およびα２ラセンは密に接近し、他方、他の端部においては、窪みはかなり解放されている。今や、ＶＳＶおよびＯＶＡペプチドは同一方向で窪みに結合し＊、ペプチドのカルボキシル末端は、カルボキシル末端におけるペプチドの伸長がひどい立体障害を引き起こさないように、窪みの比較的解放された端部と相互作用をするらしいと推定される。
【０２５３】
次いで、実験を行って、各々、４℃および２３℃におけるＫｂへのペプチド結合の速度を測定した（示さず）。結合は特に２３℃で非常に迅速で、標識ペプチドの極端に低い濃度においてさえ（約０．４ｎＭ）約５分の半減期であった。これは、約２時間の会合の半減期を示す従前の観察とは対照的である。（例えば、Ｃｈｏｐｐｉｎら、前掲にて引用参照）。再度、全標識ペプチドの６５％のみが結合することができた。過剰のβ−２ミクログロブリンの添加は、Ｋｂヘテロダイマーが安定であるような（会合したまま）低温でのペプチド結合反応速度に影響しなかった。これは、β−２ミクログロブリンの変化がペプチド結合の前提要件ではない、すなわち、ペプチドは、β−２ミクログロブリンの解離なくして自然に空のクラスＩ分子に結合できることを意味する。対照的に、過剰の遊離β−２ミクログロブリンは見かけ上３７℃においてペプチド結合を促進する（データは示さず）。添加したβ−２ミクログロブリンの濃度が増加するに従い、より多くのペプチドがＫｂ分子に結合した。空のＫｂは３７℃で不安定であるので、ある分率のヘテロダイマーは重鎖およびβ−２ミクログロブリンに解離し、それにより、ヘテロダイマーは遊離重鎖および遊離β−２ミクログロブリンと平衡している。そこで、β−２ミクログロブリンの付加は平衡を、ペプチドに結合できるヘテロダイマーの形成の方向にシフトするはずである。この見解は、通常の細胞表面にはかなりの数のクラスＩ遊離重鎖があり、外因的に付加されたβ−２ミクログロブリンは、β−２ミクログロブリンと遊離重鎖との再会合の結果として細胞表面の空のクラスＩ分子へのペプチドの結合を容易とするという最近の観察によって裏付けられる。例えば、Ｒｏｃｋら，Ｃｅｌｌ  ６５：６１１−６２０（１９９１）；Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：７４−７７（１９９１）；Ｖｉｔｉｅｌｌｏに，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：１４２３−６（１９９０）参照）。
【０２５４】
次いで、３７℃におけるペプチドの解離速度が観察された。ゲル濾過によって［１２５Ｉ］ＶＳＶ−８およびＫｂ複合体を単離した直後、５０または３００ｎＭのＫｂを含有する試料を３７℃の温度に暴露した。いくらかの試料には３μＭのβ−２ミクログロブリンおよび／または２０μＭの未標識ＶＳＶ−８、または１％ＴＸ−１００を補足した。Ｋｂからの標識ペプチドの解離を種々の時点で測定した（示さず）。大過剰の未標識ペプチドの存在下では、ペプチドの解離速度は一次反応に従い、解離半減期は約３６分であった（３．２×１０−４ｓ−１の解離速度定数）。この予期せぬ標識ペプチドの比較的速い解離は、安定なペプチド−クラスＩ複合体のいくつかの現在の見解と適合しない。事実、確認された結果（示さず）は、ＫｂおよびＶＳＶ−８複合体が安定であることを示す。この矛盾は、未標識ＶＳＶ−８（３．７ｎＭ）と比較して、放射性同位体標識ＶＳＶ−８の１０−倍低い親和性（３３ｎＭ）から生起するに違いない。
【０２５５】
未標識ペプチドの代わりに界面活性剤を添加した場合にも一次反応が観察され、これは界面活性剤はペプチド解離プロセスを不可逆なものとすることを示す。対照的に、ペプチド解離プロフィールは、未標識ペプチドまたは界面活性剤の不存在下では一次反応には従わなかった。これは、ペプチドの会合／解離が可逆的で、ペプチドの結合はヘテロダイマーの濃度に依存することを示唆する（Ｋｂの５０ｎＭおよび３００ｎＭの間の速度論を比較されたし）。これは、過剰のβ−２ミクログロブリンを添加した場合により明らかとなった。これらの結果は、重鎖、β−２ミクログロブリンおよびペプチドの間の相互作用が、界面活性剤の不存在下では、基本的には３７℃において全くではないにせよ可逆的であるという従前の議論を支持する。恐らくは、ＴＸ−１００のごとき界面活性剤はβ−２ミクログロブリンが３７℃で遊離重鎖と再会合するのを妨げるであろう。これは、界面活性剤の不存在下で一旦高温まで加熱されたＫｂが何故コンフォメーション抗体によって効果的に免疫沈降されるかを合理的に説明し得る（示さず）。興味深いことには、過剰の未標識ペプチドの存在下でβ−２ミクログロブリンの添加がペプチド解離を抑制せず、これは、未標識ペプチドはβ−２ミクログロブリンの解離なくして複合体から放出されることを示す。しかしながら、［１２５Ｉ］ＶＳＶ−８の親和性は天然ペプチドのそれよりも約１０倍低いことを思い出すべきである。従って、これは天然ペプチドの場合には必ずしも当てはまらない。
【０２５６】
イン・ビトロのペプチド−結合アッセイ系を用いる実験は、クラスＩ分子へのペプチド結合が単純な質量作用かつリガンド−受容体相互作用であることを示唆する。ここに使用したアプローチは、クラスＩ分子のペプチド結合特異性、およびＴ−細胞受容体とのペプチド−クラスＩ複合体の相互作用の特徴付けを可能とする。
【０２５７】
実施例８
治療的適用
Ａ．クラスＩ分子バンク
５０ないし１００の最も通常のクラスＩ  ＭＨＣ重鎖のうちの１つ、β−ミクログロブリン、ならびに少なくとも１つの助力分子（assisting molecule）を発現する各細胞系でもって、昆虫細胞系の貯蔵器または「バンク」を確立し、維持できる。これらの蛋白質をコードするｃＤＮＡを、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を介して、それを含有する細胞系から得られたＨＬＡ変異体に基づいてクローン化し（Ｅｎｎｉｅら，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８７：２８３３−７（１９９０）参照）、昆虫発現ベクターのごとき適当なベクターに挿入して、各ＨＬＡ変異体を発現する細胞系を得ることができる。
【０２５８】
例えば、以下のプロトコルに従うテストを用いて、選択したウイルスに由来するいずれのペプチドが種々のクラスＩ  ＭＨＣ分子に最良に結合するかを判断することができる。種々の培養を適当に標識しまたはカタログを付して、いずれのクラスＩ  ＭＨＣ分子が特定のペプチドでの使用に最良であるかを示すことができる。別法として、要すれば、一過性培養を確立することができる。ここに議論するごとく、昆虫細胞とベクターとの培養のぼ４８時間のインキュベーションの後に、その培養は、ＣＤ８＋細胞を活性化する目的で選択されたペプチド（類）を負荷できる空のＭＨＣ分子を明らかに発現できる。
【０２５９】
Ｂ．「特異的」細胞系の調製
ＨＬＡのタイプ分けの後、もし好ましいＨＬＡを発現する昆虫細胞系が入手できなければ、好ましいＨＬＡおよび助力分子をコードするｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応の使用を介してクローン化できる。前記Ｂ．１節に開示したプライマー（配列番号１ないし配列番号１２）を用いて、別々の反応において、適当なＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｅ、−Ｆまたは−Ｇ  ｃＤＮＡを増幅でき、次いで、実施例１に開示した方法に記載したごとくに、これをクローン化し配列決定できる。次いで、Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎキット（Ｂｉｏ  １０１、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてＤＮＡをＰＣＲ反応から精製し、ｐＲｍＨａ−３のＳｍａＩ部位に直接連結することができる。個々のクローンを単離し、配列を確認し、ＨＬＡを発現する安定なＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞系を確立した。別法として、組換えプラスミドの大集団を大規模に増殖させ、塩化セシウム勾配によってＤＮＡを精製することができる。次いで、精製したＤＮＡを用いて、リン酸カルシウム沈殿法を用い、Ｓ２細胞をトランスフェクトする。２４時間後、沈殿を細胞から洗い去り、１ｍＭ  ＣｕＳＯ４を含有する新鮮なＳｃｈｎｅｉｄｅｒ培地で置き換える。４８時間後、一過的にトランスフェクトされた細胞の大集団を、同系ペプチドまたは特異的蛋白質のプロテアーゼ消化物とのインキュベーションの後に、ＣＤ８＋のイン・ビトロ活性化で用いる。
【０２６０】
次いで、クローン化ＨＬＡを発現する安定な細胞系を確立することができる。別法として、ＰＣＲ反応からのクローン化組換え分子の大集団を一過的に発現する昆虫細胞の集団をイン・ビトロＣＤ８＋活性化で用いることができる。
【０２６１】
また、細胞系で発現されたＩ  ＭＨＣがイン・ビボで発現されたエレメントではない場合、ペプチドと共にインキュベートされたクラスＩ  ＭＨＣを発現する昆虫細胞を用い、ハプロタイプ−特異的ＣＤ８を活性化することが可能である。これは、対立遺伝子制限のためにイン・ビボでは可能でない、特定のＭＨＣと会合した特異的抗原を認識するＣＤ８＋細胞を増殖させるユニークな機会を提供する。例えば、インフルエンザウイルスの核蛋白質からのペプチド（ＮＰ）は通常Ｄｂ分子に制限されている；しかしながら、我々は、かかるペプチドはＫｂ（Ｄｂよりも弱いにも拘わらず）に結合でき、Ｋｂに対するある程度の熱安定性を生じさせることができることを見い出した（図３参照）。さらにＮＰペプチドと共にプレインキュベートし、Ｂ６マウスからの脾臓細胞と共培養したＫｂ−発現Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞により、ＮＰペプチドと会合したＫｂ分子を特異的に認識するＣＤ８＋がイン・ビトロで活性化される。加えて、オボアルブミンに由来するＫｂ−制限ペプチド（ＯＶＡ）およびＤｂ−発現Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞を用いる逆実験の結果、ＯＶＡペプチドを含有するＤｂを特異的に認識するＣＤ８＋が増殖される。かかるＣＤ８は、オボアルブミンをコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞（ＥＬ４  ＯＶＡ）を殺すことができ、これは、イン・ビボで、いくらかのＤｂ分子にＯＶＡペプチドが負荷されることを示す。
【０２６２】
従って、この系は、イン・ビボでは、そのペプチドに対して制限的エレメントではないクラスＩ分子によって提示された特異的抗原に対してＣＤ８＋を増殖させるユニークな機会を提供する。十分な抗原が、ＣＤ８＋によって認識され殺されるべき細胞に対して該クラスＩによってイン・ビボで提示され、かかるＣＤ８をイン・ビボで増殖させるのは十分ではない。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞によって発現される空のクラスＩ分子にペプチドを負荷させることにより、我々は、十分な抗原がクラスＩによって提示されて、この複合体を認識する特異的ＣＤ８＋を活性化するように、非競合的環境において過剰の抗原性ペプチドをクラスＩ分子に供することによってイン・ビボ制限をなくすることができる。
【０２６３】
Ｃ．ＡＩＤＳ−治療
イン・ビボ療法のために、イン・ビトロ活性化細胞を患者に投与することができる。好ましくは、個体のクラスＩ  ＭＨＣ遺伝子型（ハプロタイプ）をまず決定する。慣用的な組織タイプ分けがこの目的に適し、治療センターによって、あるいはある適当な商業的操作によって行うことができる。一旦個体のＨＬＡタイプ（類）が決定されたならば、個々の患者に適したペプチドおよびクラスＩ  ＭＨＣ分子の最良の組合せを確認し、前記したごとくに調製し、適当な昆虫細胞系およびペプチドを供する。次いで、患者の血液からの休止中のまたは前駆体ＣＤ８＋Ｔ−細胞を、昆虫細胞培養によって生成された適当なペプチド−負荷ＭＨＣで刺激する。活性化の後、ＣＤ８＋細胞を患者の血流に再度導入し、患者における病気のプロセスを継続してモニターする。細胞成分を取り出し、再度導入する方法は当該分野で公知であり、Ｈｏｎｓｉｋらに対する米国特許第４，８４４，８９３号およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇに対する米国特許第４，６９０，９１５号に例示されているもののごとき手法を含む。
【０２６４】
要すれば、病気が十分に治癒されるまで、さらなる治療を加えることができる。同様の治療プロトコルは、移植患者、老人等を含めた他の免疫抑制された個体での使用に適する。
【０２６５】
Ｄ．癌治療
癌患者において、前記したのと同様の治療手法が利用される。しかしながら、かかる患者においては、腫瘍塊を減少させる通常の療法をここに記載する免疫療法に先行させることができることは予期される。従って、免疫細胞を破壊する傾向にある、照射または化学療法のごとき通常の療法の開始に先立って、推定患者からの血液試料を得て、（例えば、凍結を介して）それを保存するのが好ましい。もしあってもウイルス感染に応答して生起する癌の形態は少ないので、免疫治療のための標識ペプチドは容易には観察されない。しかしながら、最近の研究は、オンコジーンｒａｓ、ｎｅｕ、およびｐ５３における突然変異が癌の全ケースのうち５０％までにおいて癌に寄与することを示している。かくして、これらの突然変異した分子領域に由来するペプチドは本療法のための標的として第一の候補である。ここに開示するプロトコルに従い、個々の患者のためのペプチドおよびクラスＩ分子の最良の組合せを決定し、投与することができる。
【０２６６】
例えば、多くの腫瘍は冒された個体に由来するＣＤ８＋細胞によってイン・ビトロで認識される抗原を発現する。本発明の方法を用いる正確に標的化された免疫治療のために、通常の細胞では発現されないかかる抗原はかくして同定でき、ならびにそれをＣＤ８＋細胞に提示するＨＬＡタイプも同様である。例えば、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎらは、その発現が特異的遺伝子によって指示される抗原を記載しており、その抗原はＨＬＡ  Ａ１によって提示されるようである（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６４３−１６４７（１９９１））。種々のヒト腫瘍抗原が単離され、記載されているので、それらはここに記載するごとく免疫治療適用のための良好な候補となる。
【０２６７】
もう１つの別の治療様式において、他の免疫原と組み合わせて、本発明のイン・ビトロで活性化したＣＤ８＋細胞を投与することも可能である。例えば、米国特許第５，０４５，３２０号に開示されている大きな多価免疫原を活性化ＣＤ８＋細胞と組み合わせて投与できる。
【０２６８】
また、Ｔ−細胞の分化および活性化を媒介するＩＬ−２およびＩＬ−４のごときサイトカインも同様に投与できる。というのは、サイトカインはイン・ビボで腫瘍細胞に対するＴ−細胞応答を刺激できるからである。ＩＬ−２はＣＤ８＋前駆体の増殖および分化ならびにＣＤ８＋増殖で主要な役割を演じていると考えられている。ＩＬ−２の癌患者への投与は、しばしば、腫瘍−特異的Ｔ−細胞の誘導に関連するようである改良された抗−腫瘍応答と関連する。しかしながら、ＩＬ−２の最良の治療効果は、ＩＬ−２の全身的ではなくむしろ継続的な局所投与によって得られ、かくして、ＩＬ−２の毒性を最小化し、その生物学的活性を延ばす。ＩＬ−２遺伝子構築体で腫瘍細胞をトランスフェクトすることによって局所的送達を達成することができる。
【０２６９】
ＩＬ−２  ｃＤＮＡはＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：９７−１０４（１９８８）においてＫａｒａｓｕｙａｍａおよびＭｅｌｃｈｅｒｓによって記載されているごとくに構築される。ＩＬ−２の完全なｃＤＮＡ配列はプラスミドｐＢＭＧｎｅｏ  ＩＬ−２からＸｈｏＩ断片として得られ（ＫａｒａｓｕｙａｍａおよびＭｅｌｃｈｅｒｓ，前掲参照）、ｐＲｍＨａ−３中のＳａｌＩ部位に直接連結される。（ＨｉｎｄＩＩＩでの制限マッピングを介して決定して）正しい向きのインサートを持つ組換えｐＲｍＨａ−３プラスミドはセシウム勾配によって精製され、これを用いて、リン酸カルシウム技術を用い、Ｓ２細胞を共トランスフェクトする。（プラスミドＤＮＡの混合物をこの目的で調製した；ＩＬ−２  ｃＤＮＡを含有する１０μｇのｐＲｍＨａ−３、ＭＨＣクラスＩ重鎖またはβ−２ミクログロブリンを含有する各々６μｇのｐＲｍＨａ−３プラスミドおよび２μｇのｐｈｓｈｓｎｅｏＤＮＡ）。ＣｕＳＯ４を介して誘導できて、重鎖、β−２ミクログロブリンおよびＩＬ−２を発現する安定な細胞系は、トランスフェクタントをＧ４１８培地で増殖させることによって得た。これらの安定な細胞系をペプチドで被覆し、前記したごとくイン・ビトロアッセイで用いた。ＩＬ−２でトランスフェクトした腫瘍細胞は、親腫瘍細胞に対するＣＴＬ（ＣＤ８）活性を増給し、イン・ビボでの抗腫瘍または細胞傷害性応答の誘導におけるＣＤ４およびＴ−ヘルパー機能を逸らすことが観察されている。従って、ＩＬ−２遺伝子との共トランスフェクションを介するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ系の可能性を増大させることをここに提案する。
【０２７０】
実施例９
抗原−提示系を用いる活性化Ｔ−細胞の産生の用量依存性
抗原−提示細胞（antigen-presenting cells：ＡＰＣ）は、実施例３に記載したごとくにＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞をトランスフェクトすることによって生成させ、次いで、トランスジェニックマウス  の２Ｃ系からのＴ−細胞に抗原を提示するその能力につきテストした。抗原−提示細胞としてのマウス細胞に関しては、この系は、クレブス回路酵素、２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ＯＧＤＨ）に由来する内因性８−量体ペプチド，ｐ２Ｃａ（Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ、配列番号４６）で複合体化したＬｄ分子につき強力なアロ反応性を呈する。該ｐ２ＣａペプチドはＢ１０．Ｄ２細胞のごときＨ−２ｄ細胞の表面のＬｄに暴露されて天然でそれに結合する。該ｐ２Ｃａペプチドは可溶性Ｌｄ分子に対して中程度の結合親和性（４×１０６Ｍ−１）および２Ｃ  ＴＣＲ分子に対して高親和性（２×１０６Ｍ−１ないし１×１０７Ｍ−１）を有する。
【０２７１】
密接に関連する９−量体ペプチド、ＱＬ９（Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ、配列番号４７）はこれらの分子に対して高親和性（Ｌｄに対して２×１０８Ｍ−１および２Ｃ  ＴＣＲに対して２×１０７Ｍ−１）を有する。Ｎ末端の１つの付加的アミノ酸（グルタミン）を除き、ＱＬ９はｐ２Ｃａと同一の配列を有し、ｐ２Ｃａと同様に、ＯＧＤＨの天然配列の一部を形成する。
【０２７２】
（合成形態で調製した）ｐ２ＣａおよびＱＬ９ペプチドを用いて、成熟非感作２Ｃ  ＣＤ８＋細胞に対する抗原−提示細胞要件をイン・ビトロで調べた。まず、ｍＡｂ＋補体処理、続いて陽性パニングにより、ＣＤ４＋細胞、クラスＩＩ−陽性細胞およびＢ細胞を除去することによって、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｂ６、Ｈ−２ｂ）バックグラウンド上の２Ｃマウスのプールしたリンパ節（ＬＮ）から応答体ＣＤ８＋細胞を精製した。
【０２７３】
組織グラインダーを用い、若い成体マウスのプールした頸部、腋窩、鼠蹊および腸間膜ＬＮから細胞懸濁液を調製した。細胞の精製には、ＬＮ細胞をまず３７℃でｍＡｂ（抗−ＣＤ４、抗−ＨＳＡ、抗−Ｉ−Ａｂ）＋補体のカクテルで４５分間処理した。生き残った細胞を、抗−ＣＤ８ｍＡｂで被覆したペトリ皿上で４℃で６０〜９０分間パニングすることで、更にＣＤ８＋細胞とＣＤ８−（ＣＤ４−）細胞に分けた。付着されたＣＤ８＋細胞を、３７℃で５分間インキュベートし、続いて激しくピペッティングすることによって回収した。非付着細胞を溶出させ、抗−ＣＤ８  ｍＡｂおよび補体で処理してＣＤ８−  １Ｂ２＋  ２Ｃ細胞を得た。得られたＣＤ８＋細胞の９５％より多くがクロノタイプ−陽性（ＩＢ２＋）であって、これらの細胞の９８％がナイーブな（ＣＤ４４ｌｏ）表現型を呈した。
【０２７４】
ＴＣＲ刺激は細胞内事象の複合体パターンを誘導し、これは細胞表面のＣＤ６９およびＣＤ２５（ＩＬ−２受容体またはＩＬ−２Ｒ）の初期上昇調節に導いた。これらの変化は刺激から数時間内に明白であり、続いて、サイトカイン合成および細胞増殖が起こる。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞をＬｄ、ＬｄおよびＢ７．１（Ｌｄ，Ｂ７）、ＬｄおよびＩＣＡＭ−１（Ｌｄ．ＩＣＡＭ）またはＬｄ，Ｂ７，１およびＩＣＡＭ−１（Ｌｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭ）についての遺伝子でトランスフェクトした。図１１は、トランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞およびｐ２Ｃａ対ＱＬ９ペプチド、濃度１０μＭで１２時間刺激した精製ナイーブＣＤ８＋２Ｃ細胞上のＣＤ６９およびＣＤ２５発現を示す。精製ＣＤ８＋２Ｃ細胞を、バルク（２ｍｌ）培養中の種々のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞＋ペプチド（ｐ２ＣａまたはＱＬ９いずれか、１０μＭ）と共に１２時間インキュベートし、次いで、ＣＤ６９またはＣＤ２５につき染色した。Ｌｄ．Ｂ７、Ｌｄ．ＩＣＡＭまたはＬｄ．Ｂ７，ＩＣＡＭでトランスフェクトしたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞によって提示されたｐ２ＣａまたはＱＬ９はＣＤ６９およびＣＤ２５の上昇調節を刺激するにおいて効果的であった。しかしながら、ペプチドまたはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞なくしての非培養２Ｃ細胞はＣＤ６９およびＣＤ２５の上昇調節を示さなかった（頂部パネル）。
【０２７５】
Ｌｄ単独を発現するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞の存在下において、ＣＤ８＋２Ｃ細胞上のＣＤ６９およびＣＤ２５の誘導は、強力なＱＬ９ペプチドに関しては、低いものの有意であったが、弱いｐ２Ｃａペプチドではかろうじて検出可能であった。Ｌｄ．Ｂ７またはＬｄ．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞に関しては、両ペプチドはＣＤ６９およびＣＤ２５の顕著な上昇調節を誘導した。しかしながら、Ｌｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞はこれらの分子のより高い発現を誘導した。
【０２７６】
Ｌｄ単独でトランスフェクトしたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞は外因性リンホカインの不存在下で２Ｃ  ＣＤ８＋細胞のｐ２ＣａまたはＱＬ９ペプチドいずれかへの増殖を引き起こさず、ＣＤ６９およびＣＤ２５発現を誘導する抗原−提示細胞としてのこれらの細胞の最小能力と合致する。結果を図１２に示す。示した濃度のペプチドの存在下または不存在下で、５×１０６の精製ＣＤ８＋  ２Ｃ細胞を２×１０５のＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞と共に３日間培養することによって、ｐ２Ｃａ（上方）およびＱＬ９（下方）に対する応答を測定した。培養の最後の８時間の間に［３Ｈ］ＴｄＲを添加し；ｒＩＬ−２を２０ユニット／ｍｌの最終濃度で添加した。データは三連の培養の平均値である。しかしながら、外因性ＩＬ−２を補足した場合、両ペプチドは高用量（１０μＭ）で有意な増殖応答を刺激した。ＱＬ９によって誘導された増殖応答はｐ２Ｃａよりもはるかに強力であった（上方および下方パネルのｘ−軸の縮尺の間の大きな差異に注意されたし）。
【０２７７】
ｐ２Ｃａペプチドペプチドを提示し、Ｌｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭでトランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞によって誘導された第３日における増殖についての用量−依存的関係を、ＱＬ９ペプチドを提示するＬｄ．Ｂ７．、Ｌｄ．ＩＣＡＭまたはＬｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭでトランスフェクトしたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞によって誘導されたものと比較した。結果（三連培養の平均）を図１３に示す。Ｄｅｏｓｏｐｈｉｌａ  ＡＰＣ（２×１０６細胞）をペプチドの存在下または不存在下で５×１０４ＣＤ８＋  ２Ｃ細胞と共に３日間培養した。［３Ｈ］ＴｄＲを培養の最後の８時間の間に添加し；ＩＬ−２は培養に添加しなかった。
【０２７８】
第３日におけるＬｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞によって誘導された最適増殖応答は高濃度のｐ２Ｃａペプチド、例えば１０μＭ（１０−５Ｍ）を要した（図１３）。ＱＬ９ペプチドについての結果は異なっていた。Ｌｄ．Ｂ７抗原−提示細胞＋ＱＬ９およびＬｄ・ＩＣＡＭ抗原−提示細胞＋ＱＬ９についての用量−応答曲線を、Ｌｄ／Ｂ７．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞＋ｐ２Ｃａについての結果に近似した（図１３）。しかしながら、Ｌｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞に関しては、第３日におけるＱＬ９に対する増殖応答は１００ｎＭ（１０−７Ｍ）で最大であり、１０ｐＭと低い用量（１０−１１Ｍ）で明らかに明白であった（図１３）。高用量、例えば１０μＭ（１０−５Ｍ）では、ＱＬ９は第３日において増殖応答を阻害した（図１３、対数スケールに注意されたし）。
【０２７９】
Ｌｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞およびＱＬ９ペプチドによる増殖の阻害はＩＬ−２産生については当てはまらず（図１４、右）、それは高用量の抗原−提示細胞で観察されたに過ぎなかった（図１４、左）。Ｌｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞＋ＱＬ９ペプチドは、再度、Ｌｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞＋ｐ２ＣａペプチドよりもＩＬ−２産生を誘導するにおいてより効果的であることが判明した（図１４、右）。データは、ペプチドなくしての抗原−提示細胞がテストした抗原−提示細胞密度の１００倍の範囲にわたっていずれかの応答を誘導するにおいて効果が無かったことを示している（図１４、「−ｐｅｐ」開いた四角）。
【０２８０】
ＱＬ９ペプチドとＬｄ．Ｂ７、Ｌｄ．ＩＣＡＭまたはＬｄ・Ｂ７．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞を用い、第３日、第４日および第５日におけるＣＤ８＋  ２Ｃ細胞の応答の用量−応答関係における変化を調べた。結果を図１５に示す。示したペプチド濃度にて５×１０６ＣＤ８＋  ２Ｃ細胞および３×１０５抗原−提示細胞にて応答を測定した。データは三連の培養の平均結果である。
【０２８１】
１００ｎＭ（１０−７Ｍ）ＱＬ９ペプチドの中間的用量に関しては、Ｌｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞に対する増殖応答は第３日には高く（図１５、左）、第４日にはピークに達し（図１５、中央）、次いで、第５日には低レベルまで減衰した（図１５、右）。しかしながら、１０μＭ（１０−５Ｍ）ＱＬ９ペプチドの高用量に関しては、応答は第３日には低く（図１５、左）、しかし次いで第５日には高ピークまで顕著に増加した（図１５、右）。
【０２８２】
Ｔ−細胞／ＡＰＣ相互作用の親和性が非常に高い場合には、第３日にＱＬ９によって誘導された増殖の一過性阻害が観察されたに過ぎなかった。低用量のＡＰＣ（図１４、左）または低用量のＱＬ９ペプチド（図１５、左）を用いることによって、Ｔ−細胞／ＡＰＣ相互作用の親和性を低下させると、第３日の増殖応答を増大させた。Ｔ−細胞／ＡＰＣ相互作用の親和性を低下させると、初期（第３日）増殖応答を増強させたが、後期（第５日）応答を低下させ、また、ＩＬ−２産生（図１６、右）を低下させた。図１６において、第２日、第３日、第４日および第５においてＣＤ８＋  ２ＣおよびＣＤ８−細胞を用いて得られた結果を比較する。
【０２８３】
観察は高度に免疫原性のＬｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞に適用される。しかしながら、免疫原性のより低いＬｄ．Ｂ７またはＬｄ．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞に関しては、ＱＬ９ペプチドに対する増殖応答には高用量のペプチドを要し（図１３、図１５）、応答体細胞によるＣＤ８発現に大きく依存した（図１６）。Ｌｄ．Ｂ７およびＬｄ．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞でのこれらの応答は（第５日ではなくむしろ）第３日または第４日にピークに達し、Ｌｄ・Ｂ７．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞でのものよりもはるかに低かった。低用量のＱＬ９、例えば１ｎＭ（１０−９Ｍ）では、Ｌｄ．Ｂ７およびＬｄ．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞での増殖応答は全く検出できなかった（＜１００ｃｐｍ）（図１３）。これは、１ｎＭ  ＱＬ９が高応答に導いた（＞１０，０００ｃｐｍ）、Ｌｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞を用いて観察された結果と顕著に対照的であった（図１３）。高用量のＱＬ９ペプチド（１０μＭ、表２）での結果とは対照的に、増殖応答についてのＢ７およびＩＣＡＭの間の相乗的相互作用が低ペプチド用量で顕著となった。
【０２８４】
理解されるごとく、Ｌｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭ細胞はナイーブ２Ｃ細胞に対して極度に優れた抗原−提示細胞として作用する。Ｔ−細胞／ＡＰＣ相互作用の親和性を高レベルまで上昇させると、初期の増殖応答を阻害するが、後期応答を増強し、ＩＬ−２産生は増強される。ＱＬ９のごとき高親和性ペプチドについては、Ｂ７およびＩＣＡＭの間の共働が低用量の抗原で顕著である。
【０２８５】
実施例１０
抗原提示系を用いる細胞傷害性Ｔ−細胞の産生
実施例３に記載したごとくにＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞をトランスフェクトすることによって抗原−提示細胞（ＡＰＣ）を生産し、次いで、ＣＴＬ活性を誘導するその能力につきテストした。ＣＴＬ活性は、ＱＬ９ペプチド、ペプチドは無しかまたは無関係ペプチト（ＭＣＭＶ）で感作した５１Ｃｒ−標識ＲＭＡ．Ｓ−Ｌｄ標的でテストした。２４−ウェル培養プレート（Ｃａｉ，Ｚ．およびＪ．Ｓｐｒｅｎｔ（１９９４））中、２ｍｌの容量にて、ＣＤ８＋  ２Ｃ細胞（５×１０６）を２×１０６トランスフェクトＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞と共に培養した。１０ｍＭの濃度にて培養の間にペプチドを存在させた。４日後、細胞をプールし、所要数に調整した。標的を調製するために、ペプチドの存在下または不存在下でＲＭＡ−Ｓ．Ｌｄ細胞を３７℃にて５１Ｃｒ（１００ｍＣｉ／１−２×１０６細胞）で９０分間標識した。標識の後、細胞を徹底的に洗浄し、ペプチドを含むまたは含まない培地に再懸濁した。特異的５１Ｃｒ放出を確立された手法によって計算した（前掲）。
【０２８６】
バルク培養中、１０μＭＱＬ９ペプチドに対してＣＴＬ活性を誘導するＬｄ．Ｂ７、Ｌｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭおよびＬｄ．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞の能力を図１７に示す。強力に免疫原性のＬｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞はＱＬ９−特異的ＣＴＬを生成するのに効果的であった（図１７、中央）。有意には、Ｌｄ．Ｂ７抗原−提示細胞もＱＬ９に対してＣＴＬを生成するのに効果的であった（図１７、左）。しかしながら、驚くべき発見は、Ｌｄ．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞が全くＣＴＬ生成を刺激できなかったことである（図１７、右）。この結果（３つの異なる実験の代表）は予期せぬことであった。何故ならば、Ｌｄ．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞はＱＬ９に対する増殖応答を誘導するにおいてＬｄ．Ｂ７抗原−提示細胞ほど低くはなかったからである（図１３および１５）。図１７におけるＬｄ．ＩＣＡＭ−刺激培養は多数の芽細胞を含有し、合計細胞収量は入力数よりも３倍高かった。
【０２８７】
驚くべき発見は、Ｌｄ．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞が外因性リンホカインを補足しなかった培養に対して適用されたＣＴＬ生成を全く刺激できなかったことである。しかしながら、外因性ＩＬ−２を培養に添加すると、Ｌｄ．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞はＱＬ９に対して強力なＣＴＬ活性を誘導した（図１８、右；２０μ／ｍｌ外因性ＩＬ−２）。
【０２８８】
実施例１１
抗原−提示系によって誘導された通常Ｔ−細胞の増殖
抗原−提示細胞（ＡＰＣ）は、実施例３に記載されたごとくにＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞をトランスフェクトすることによって生成させ、次いで、正常（非トランスジェニック）ネズミＴ−細胞において増殖を誘導するそれらの能力につきテストした。
【０２８９】
２Ｃ  ＴＣＲトランスジェニックＣＤ８−細胞の強力な一次応答を誘導するＬｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞の能力は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞が正常（非トランスジニック）ＣＤ８＋細胞について抗原−提示細胞として作用し得るか否かという議論を生じた。２ＣマウスはＢ６（Ｈ−２ｂ）バックグラウンド上にあったので、正常Ｂ６  ＣＤ８＋細胞の応答をテストした。通常Ｂ６マウスからのＣＤ８＋細胞の段階移行用量を、Ｌｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ抗原−提示細胞によって提示された１０μＭ  ＱＬ９ペプチドと共に培養した。すなわち、発散レパートリーのＴ−細胞を高濃度ではあるが単一のアロ抗原（Ｌｄ＋ＱＬ９）のみに暴露した状況であった。図１９（左）に示すごとく、Ｌｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞によるＱＬ９の提示は、事実、正常Ｂ６  ＣＤ８＋細胞に対して免疫原性であって、添加されたサイトカインの不存在下で、大用量の応答体細胞（１×１０６）にて第３日に認識され得る増殖応答に導いた；無関係ペプチドＭＣＭＶに対する応答はかなり低く（しかし有意）、ペプチドの不存在下では応答は起こらなかった。予期されたごとく、正常Ｂ６  ＣＤ８＋細胞のＱＬ９＋Ｌｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞に対する応答は抗原提示細胞としての正常Ｂ１０．Ｄ２脾臓細胞についてのものよりも実質的に低かった（ここに、アロ刺激体は、低濃度ではあるが、Ｌｄ、ＫｄおよびＤｄに結合した多数の自己抗原によって供した）（図１９、右、Ｙ軸の縮尺に注意）。
【０２９０】
実施例１２
固定化精製組換えＭＨＣクラスＩ分子および助力分子を用いる細胞傷害性Ｔ−細胞の活性化
断りのある場合を除き、細胞、材料および試薬は実施例４に記載したごとくに調製した。ビオチン化抗−マウスＣＤ２８モノクローナル抗体（クローン３７．５１）はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。また、この抗体はＣａｌｔａｇ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）からも入手可能である。ＣＤ２８共刺激性受容体、Ｔ−細胞の表面のＢ７．１およびＢ７．２のリガンドに結合するこの抗体はＴ−細胞の増殖を増加させる（Ｇｒｏｓｓら，Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９，３８０−３８８，１９９２）。ＩＬ−２をコンカナバリンＡ上清として用いた（１０％最終濃度）。
【０２９１】
基材は以下のごとく調製した：１マイクログラム／ｍｌのニュートラビジンを含有する５０マイクロリットルのＰＢＳを９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  カタログ＃２５８６０）の各ウェルに添加した。室温での２時間後、ビオチン化分子とのインキュベーションに先立って、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。実施例４でアビジン−被覆ヒツジ赤血球細胞につき記載したごとくに、アビジン−被覆マウス赤血球細胞を調製した。アビジン−被覆ラテックスビーズは実施例４に記載したごとくに調製した。
【０２９２】
組換えＬｄのビオチン化は実施例４に記載したごとくに行った。ビオチン化組換えＬｄを、ビオチン化抗−ＣＤ２８抗体と共に基材上に固定化した。アビジン−被覆赤血球細胞またはラテックスビーズを０．２ｍｇ／ｍｌのビオチン化Ｌｄ、０．０２５ｍｇ／ｍｌビオチン化抗−ＣＤ２８、またはその混合物と共に室温にて３０分間インキュベートし、次いで、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で３回洗浄し、直ちに使用した。アビジン−被覆９６ウェルプレートをウェル当たり５０マイクロリットルの２マイクログラム／ｍｌビオチン化Ｌｄ、０．２５マイクログラム／ｍｌ抗−ＣＤ２８、またはその混合物と共に室温で３０分間インキュベートし、次いで、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭを用いて３回洗浄し、直ちに使用した。
【０２９３】
２Ｃ＋Ｔ−細胞は実施例４に記載したごとくに調製した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのＣＤ８＋細胞は磁気涸渇によってこれらのマウスのリンパ節から調製した。精製した細胞は、フローサイトフルオロメトリーで測定して、ＣＤ８発現につき一貫して９０−９２％陽性であった。
【０２９４】
Ｔ−細胞活性化は精製Ｌｄ分子および抗−ＣＤ２８抗体で被覆した培養プレートで行った。Ｔ−細胞およびペプチド（０．０２ｍＭ最終濃度）を、０．２ｍｌ／ウェルの最終容量にて、Ｌｄおよび／または抗−ＣＤ２８で被覆した９６ウェルプレートに添加し、５％ＣＯ２を含有する湿潤雰囲気中、３７℃にて適当な時間培養した。
【０２９５】
精製Ｌｄ分子および抗−ＣＤ２８抗体で被覆した赤血球細胞またはラテックスビーズを用いるＴ−細胞活性化は、非被覆培養プレートで行った。Ｔ−細胞およびペプチド（０．０２ｍＭ）を、１００，０００赤血球細胞またはラテックスビーズと共に各ウェルに添加した。最終容量は０．２ｍｌであった。培養条件は前記した通りである。
【０２９６】
Ｔ−細胞分裂促進は、三連の培養により、ウェル当たり１μＣｉのトリチウム化チミジンのパルスの取り込みによってアッセイした。８時間後に細胞を収穫し、チミジン取り込みをシンチレーションカウンター中の濾液をカウントすることによって測定した。
【０２９７】
Ｌｄを発現するＲＭＡ．Ｓ細胞（標識細胞）を３７℃にて放射性標識クロムと共に９０分間インキュベートし、３回洗浄し、０．０１ｍＭの適当なペプチドの存在下、９６ウェルＵ−底プレート（Ｃｏａｓｔｅｒ  カタログ番号３７９９）中に分配した（ウェル当り５０００〜１００００細胞）。種々の量の活性化Ｔ−細胞（エフェクター細胞）を、１５０および１の間の範囲のエフェクター／標的比率（Ｅ／Ｔ比率）に到達するように添加した。３７℃での５時間のインキュベーション後、０．１ｍｌの上清を各ウェルから収集し、ガンマカウンターでカウントした。パーセント溶解を標準的方法（Ｃｏｌｉｇａｎら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３．１１節，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１））によって測定した。
【０２９８】
固定化精製Ｌｄおよび抗−ＣＤ２８抗体は２Ｃ＋Ｔ−細胞に対して分裂促進的であった。ＱＬ９ペプチドを用いる場合、ウェル当たり１００，０００ｃｐｍを超えるチミジン取り込みが一貫して３−５日の培養によって測定された（図２０）。３つの活性化方法（プラスチック上、赤血球細胞上またはラテックスビーズ上に固定化された分子）のうちいずれを用いてもその同一範囲の最大チミジン取り込みが得られた。活性化分子をプラスチックに固定化した場合、プラスチック上の固定化したＬｄ単独は一過性分裂促進を誘導し（図２０、破線）、他方、Ｌｄ＋抗−ＣＤ２８抗体はより高くより持続した分裂促進を誘導した（図２０、実線）。Ｌｄに加えて、抗−ＣＤ２８抗体が、赤血球細胞を用いるモデルにおいて、いずれの分裂促進の誘導にも必要であった。しかしながら、抗−ＣＤ２８抗体単独ではいずれの分裂促進も誘導しなかった。
【０２９９】
ＱＬ９−Ｌｄ複合体は高親和性をもって２Ｃ  Ｔ−細胞受容体によって認識される。低い親和性をもってこの受容体によって認識される他のペプチドおよびＬｄの複合体は２Ｃ＋Ｔ−細胞を活性化させることができた；これらはペプチドｐ２ＣａおよびＳＬ９を含んだ（図２１）。しかしながら、培養の第２日に添加したＩＬ−２がこれらのペプチドを用いる分裂促進を観察するのに必要であった。ＬＣＭＶペプチド（２Ｃ  Ｔ−細胞受容体によって認識されない対照ペプチド）は活性化を誘導しなかったので、活性化はペプチド特異的であった。ウェル（９６プレートウェル）当たり７００と少ないＴ−細胞で開始して、分裂促進は測定可能であり、これは該方法がペプチド特異的に非常に少数のＴ−細胞を活性化したことを示す。
【０３００】
２Ｃ＋Ｔ−細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスからの全ＣＤ２８−細胞と１／９９の比率で混合し、ペプチドＱＬ９の存在下で、細胞を固定化Ｌｄおよび抗−ＣＤ２８抗体と共に培養した。ＩＬ−２は培養の第２日に添加し、引き続いて１日置きに添加した。集団の形成、徐々にウェルで拡大した拡大細胞の存在によって示されるごとき、細胞の活性化および増殖が認められた。培養の第１２日に、細胞を収穫し、抗クロノタイプ抗体で染色し、フローサイトフルオロメトリーによって分析することによって、２Ｃ  Ｔ−細胞受容体を発現する細胞のパーセントを評価した；ペプチドＱＬ９の存在下で最初に培養した細胞の４３％が２Ｃ＋であり（図２２）、他方、ペプチドｐ２Ｃａでの刺激の後に細胞の４９％が２Ｃを発現し（図２３）、ペプチドＳＬ９での刺激の後に２２％が発現した（図２４）。これは、培養１２日後における特異的Ｔ−細胞のかなりの富化（４３倍、４９倍および２２倍）を示す。富化はＳＬ９（２Ｃ  Ｔ−細胞受容体とで低親和性複合体を形成するペプチド）でも観察された。かくして、この方法はＴ−細胞の異種混合物から抗原特異的Ｔ−細胞の小亜集団を活性化し、富化させることができる。
【０３０１】
ＱＬ９ペプチドの存在下でＬｄおよび抗−ＣＤ２８抗体を用いて活性した２Ｃ＋Ｔ−細胞を５日間培養し、次いで、それらの細胞傷害性能力を評価した。図２５に示す結果は、固定化活性化分子が細胞を誘導してエフェクター細胞傷害性Ｔ−細胞に分化させたことを示す。溶解はＱＬ９ペプチドの存在下で観察されたが、対照ペプチド（ＬＣＭＶ）の存在下では観察されなかったので、特異的であった。かくして、休止Ｔ−細胞は固定化分子によって活性化されて、標的を特異的に殺すことができる細胞傷害性Ｔ−細胞に分化した。
【０３０２】
理解されるごとく、固定化精製ＭＨＣクラスＩおよび助力分子を用いて、ナイーブ休止Ｔ−細胞を特異的に活性化して、細胞傷害性Ｔ−細胞とすることができる。ＭＨＣクラスＩおよび助力分子は活性化に十分であり；抗原−提示細胞起源のさらなるシグナルは必要ない。細胞培養プレートのごとき基材上に固定化されたＭＨＣクラスＩおよび助力分子は、Ｔ−細胞活性化のための適当なツールを提供する。かかる被覆基材によっていくつかの利点が提供される。それらは調製したり操作するのが容易であり、それらはよく制御された量の分子で被覆することができ、再現可能な活性化条件を保証する。
【０３０３】
実施例１３
ヒト細胞傷害性Ｔ−細胞の活性化
ヘパリン（１０μ／ｍｌ）中に収集したヒト血液（４５０ｍｌ）のユニットを、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｃｌｉｎｉｃ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡのＧｅｎｅｒａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＧＣＲＣ）を介して入手した。製造業者の仕様に従い、血液をまず５０ｃｃ円錐遠心管内のＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配中で加工した、一旦バッフィコートが得られたならば、試料を緩衝液１（Ｃａ＋＋またはＭＧ＋＋を含まないＤ−ＰＢＳ）、次いで、緩衝液２（４％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を含むＰＲＭＩ）および緩衝液３中の最終洗液（Ｄ−ＰＢＳ＋１％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、２５％Ｂｕｍｉａｔｅ／Ｂａｘｔｅｒ−Ｈｙｌａｎｄ）および０．２％クエン酸ナトリウム（ｗ／ｖ））中で洗浄した。
【０３０４】
全末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）調製物を洗浄した細胞からカウントした。次いで、この調製物をＭａｘＳｅｐＴＭ単離手法（Ｂａｘｔｅｒ）を介して採取し、ここに、ＣＤ８＋細胞は陰性選択によって選択した。除去するための標的化細胞に対するｍＡｂのカクテル（ＣＤ１９−ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，ＣＤ４−Ｏｒｔｈｏ−ｍｕｎｅ，ＣＤ１５−ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，ＣＤ５６−ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，ＣＤ１４−ＰＲＩ）を２μｇ／ｍｌ細胞にて調製した。合計ＰＢＭＣ細胞カウントを緩衝液３中で２０×１０６／ｍｌまで希釈し、抗体を添加した。
【０３０５】
混合物（ほぼ４０ｍｌ）を４℃にて回転振盪機で回転させ（４ｒｐｍ）、合計３０分間、チューブが試料を上下にして混合するようにした。感作相の後、細胞を緩衝液３で洗浄し、ヒツジ−抗−マウスＩｇＧ（ＳＡＭ）で被覆した磁性Ｄｙｎａｌビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ４５０  ＃１１０．０２）と共に同緩衝液に再懸濁した。ビーズのストックは通常４×１０８ビーズ／ｍｌであった。最終ビーズ：標的細胞比率は１０：１である。
【０３０６】
使用するビーズの最終容量を測定するために、以下の式に従った：
（感作合計細胞）×（標的細胞の集団の％）＝合計理論標的細胞数
合計理論標的細胞数×１０＝所要合計ビーズ
所要合計ビーズ／ストックのビーズ濃度＝所要ビーズの容量
最終感作細胞：ビーズ混合物の容量はほぼ５０ｍｌであった。混合物を１５０ｍｌのＦｅｎｗａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐａｃｋ（＃４Ｒ２００１）に入れ、ニードルで空気を加え、前記と同様の条件下で混合物を回転させた（３０分間、４℃、４ｒｐｍ、上下に撹拌）。インキュベーション時間の最後に、製造業者の仕様に従い、標的細胞をＭａｘＳｅｐＴＭ分離デバイスで取り出した。分離した細胞をバッグから移し、カウントして回収を測定した。ＦＡＣＳ分析を行って、試料の純度を測定した。
【０３０７】
トランスフェクトされ、ヒトＨＬＡ  Ａ２．１、Ｂ７．１および／またはＬＦＡ−３を発現することが示されているＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ハエ）抗原−提示細胞で、得られた分離されたヒトＣＤ８＋細胞を刺激した。ハエ細胞を、１０％ＦＣＳ血清を含むＳｃｈｎｅｉｄｅｒの培地中、１０６／ｍｌに希釈した。翌日、ＣｕＳＯ４を培養細胞に添加し、これを２７℃で２４時間インキュベートし、収穫した。収穫した細胞を洗浄し、１００μｇ／ｍｌの最終ペプチド濃度にて昆虫Ｘ−ｐｒｅｓｓ培地中に懸濁し、２７℃で３時間インキュベートした。
【０３０８】
使用したペプチドはＨＩＶ−ＲＴ（ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ）（配列番号４８）、チロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）（ＹＭＮＧＴＭＳＱＶ）（配列番号４９）、およびインフルエンザ・マトリックス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｍａｔｒｉｘ）（ＧＩＬＧＦＶＦＴＬ）（配列番号５０）であった。
【０３０９】
対照ペプチドは肝炎ウイルスのコアに由来し、配列ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ（配列番号５１）を有していた。
【０３１０】
ハエ抗原−提示細胞を１：１０（ＡＰＣ：ＣＤ８＋Ｔ−細胞）の比率でＣＤ８＋細胞に添加した。３７℃にて、細胞を平坦底ウェル（４８ウェル）中、４日間インキュベートした。第５日、ＩＬ−２（１０μ／ｍｌ）およびＩＬ−７（１０μ／ｍｌ）（Ｇｅｎｚｙｍｅ）を培地の交換と共に添加した。第１１日に、ＣＴＬアッセイを行った。
【０３１１】
クロム放出アッセイにおいて、ＪＹ（ＨＬＡ２．１、Ｂ７を発現するＥＢＶ−形質転換ヒトＢ細胞系）を標的細胞として使用した。Ｖｉｓｓｅｒｅｕ，Ｍ．Ｊ．Ｗ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：３９９１−３９９８（１９９５）。アッセイの２４時間前に、ＪＹ細胞を３×１０５細胞／ｍｌにて、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ中に接種した。ＪＹ細胞をカウントし、ＲＰＭＩ洗浄溶液（ＲＰＭＩ中４％Ｒｅｈａｕｔｉｎ  ＦＣＳ、１％ＨＥＰＥＳ、０．０２５％ゲンタマイシン）中で１回洗浄して、試料当たり５×１０６細胞を得た。細胞ペレットを１００μｌの５１クロムストック（０．１ｍＣｉ，ＮＥＮ）中に温和に再懸濁し、３７℃の水浴に１時間入れ、１５分毎に撹拌した。標識されたＪＹ溶液を、１０ｍｌのＲＰＭＩ洗液中、各１４００ｒｐｍにて６分間４回洗浄した。細胞をＲＰＭＩ／１０％Ｈｙｃｌｏｎｅ中、１×１０５細胞／ｍｌに調整した。標的細胞標識化の効率は、標準的なガンマカウンター技術によって確認する。
【０３１２】
標識細胞のペプチド負荷については、２ｍｌの標識ＪＹ細胞（２×１０６細胞）を室温にて１０μｇ／ｍｌのペプチドと共に３０分間インキュベートした。ペプチドストック溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を−７０℃で保存した。９６ウェル丸底プレート中、１００μｌのエフェクター細胞および１００μｌのペプチド負荷標的細胞を８４：１、１７：１および３．４：１（エフェクター：標的）の比率で合わせた。自然放出および５１Ｃｒの最大放出を測定するための対照を二連で含ませた。試料を３７℃で６時間インキュベートした。
【０３１３】
１０％ＦＣＳと共にＲＰＭＩ中の１０７／ｍｌの濃度のＫ５６２細胞を２０：１の比率（未標識Ｋ５６２：標識ＪＹ）で添加した。この赤白血病細胞系を用いて、クロム放出アッセイにおいて、ＮＫバックグラウンド細胞溶解を低下させた。プレートを１０００ｒｐｍで５分間遠心し、各試料からの１００μｌの上清を９６チューブの収集チューブに移した。細胞溶解の分析は、標準的なガンマカウンティング技術（Ｇａｍｍａｃｅｌｌ  １０００，Ｎｏｒｄｉｏｎ）によって決定する。
【０３１４】
インフルエンザマトリックスペプチド（配列番号５０）を負荷した抗原−提示細胞でヒトＣＤ８＋Ｔ−細胞を活性化することによって生成したＣＴＬ活性を図２６に示す。インフルエンザウイルスへの先の暴露は、このＣＴＬ活性が二次的応答であることを示す。データ点は三連培養からの値の平均である。Ａ２．１、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１を発現する抗原−提示細胞は、Ａ２．１およびＢ７．１を発現する抗原−提示細胞またはＡ２．１、Ｂ７．１およびＬＦＡ−３を発現する抗原−提示細胞よりもより効果的であった。
【０３１５】
ＨＩＶ−ＲＴペプチド（配列番号４８）を負荷した抗原−提示細胞でヒトＣＤ８＋Ｔ−細胞を活性化する結果を図２７に示す。この患者の血液のスクリーニングはＨＩＶへの先行暴露を示さなかったので、これらの結果はＣＴＬ活性は一次応答に基づくものであったことを示す。この場合、Ａ２．１、Ｂ７．１およびＩＣＡＭ−１を発現する抗原−提示細胞のみが、対照レベルよりも有意に大きいＣＴＬ活性を生じた。
【０３１６】
図２８は、チロシナーゼペプチド（配列番号４９）を負荷した抗原−提示細胞によって活性化されたヒトＣＤ８＋Ｔ−細胞のＣＴＬ活性を示す。チロシナーゼはメラノーマ腫瘍細胞で過剰発現される通常に生じる酵素である。再度、すべての３種の分子、ＩＣＡＭ−１ならびにＡ２．１およびＢ７．１を発現する抗原−提示細胞が、特にテストした低いエフェクター：標的比率において最も効果的であつた。
【０３１７】
これらの結果は、抗原提示系が、腫瘍細胞で過剰発現される内因性蛋白質に由来するペプチドに対して向けられたヒトＣＤ８＋Ｔ−細胞において効果的なＣＴＬ活性を生じることができることを示す。また、これは、Ｂ７およびＩＣＡＭを共に用いるＣＤ８＋Ｔ−細胞のこのイン・ビトロ刺激が、さもなければ自己として認識されるペプチドに対してさえ細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ−細胞を生じることを示す。これは、かかる「自己」ペプチドを用いて細胞傷害性Ｔ−細胞を生じさせることができないという現在の知識とは対照的である。この方法は、腫瘍に対してＣＤ８＋Ｔ−細胞を活性化させるのに使用できる可能な腫瘍特異的抗原の数を大いに増やす。
【０３１８】
前記したのは本発明を説明する意図のもので、限定的なものではない。本発明の精神および範囲を逸脱することなく、多数の変形および修飾を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【０３１９】
【図１】発現プラスミドｐＲｍＨａ−２の構築を示す。
【図２】発現プラスミドｐＲｍＨａ−３の構築を示す。
【図３】ｐＲｍＨａ−３ベクターを示し、制限、ポリリンカー、プロモーターおよびポリアデニル化、ならびにヌクレオチド配列を発現のために挿入できる部位を示す。
【図４】ＨＩＶペプチドによるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞の表面に発現されたＨＬＡ  Ｂ２７およびＨＬＡ  Ａ２．１のペプチド−誘導熱安定化を示す。各細胞集団の平均蛍光をインキュベーション条件に対してプロットして示す。
【図５】ＨＩＶペプチドによるＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞の表面に発現されたＨＬＡ  Ｂ２７およびＨＬＡ  Ａ２．１のペプチド−誘導熱安定化を示す。各細胞集団の平均蛍光をインキュベーション条件に対してプロットして示す。
【図６】昆虫細胞が抗原をプロセスし、それをクラスＩ分子にロード（load）できるか否か、および後者が内因的にまたは外因的に由来する抗原をＴ−細胞に提示できるか否かを判断するために設計した実験からのデータを示す。Ｋｂ／β２でトランスフェクトされたＳｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２（ＳＣ２）または３Ｔ３細胞を等張（Ｉｓｏ）または低張（Ｈｙｐ）媒体中、オボアルブミン蛋白質（ＯｖＰｒｏ）またはオボアルブミンペプチド、ＯＶＡ２４（ＯｖＰｅｐ）と共にインキュベートした。（マウス細胞系ＢＡＬＢ／３Ｔ３は受託番号ＣＣＬ  １６３下でＡＴＣＣから入手可能である）。処理の後、細胞をＴ−細胞ハイブリドーマＢ３／ＣＤ８と共に培養した。Ｂ３／ＣＤ８は、Ｂ３（Ｃａｒｂｏｎｅら，  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  １６９：６０３−１２（１９８９）、Ｈ−２ＫｂクラスＩ分子によって提示されたオボアルブミンペプチド２５３−２７６に特異的な細胞傷害性Ｔ−細胞と、ＣＤ８担持ＩＬ−２分泌細胞系との間のＴ−細胞ハイブリドーマである。抗原刺激に際して、Ｂ３／ＣＤ８は、ＩＬ−２−依存性細胞系ＣＴＬＬへの３Ｈチミジン取り込みによって測定されるＩＬ−２を産生する（Ｇｉｌｌｉｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０：２０２７（１９７８））。かくして、産生されたＩＬ−２の量を測定することによって、Ｔ−細胞認識についてアッセイすることができる。共培養からの上清を、ＩＬ−２−依存性細胞系ＣＴＬＬ（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ  ２１４）による３Ｈチミジン取り込みによって分析した。取り込まれた３Ｈチミジンの量を初期細胞処理に対してプロットする。
【図７】本発明による、トランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ハエ）細胞の表面でのＢ７．１、ＩＣＡＭ−１およびＭＨＣの発現を示す。
【図８】赤血球細胞に結合した組換えＬｄマウスＭＨＣを用いる蛍光−活性化細胞選別（sorter）実験の結果を示すグラフである。
【図９】赤血球細胞に結合した組換えＫｂマウスＭＨＣを用いる蛍光−活性化細胞選別実験の結果を示すグラフである。
【図１０】標識抗体の使用による組換えＫｂのマイクロタイタープレートへの結合を示すグラフである。
【図１１】トランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞で刺激されたＣＤ８＋２Ｃ細胞上でのＣＤ６９およびＣＤ２５の発現を示す蛍光−活性化細胞選別実験からの結果を示す一連のグラフである。
【図１２】ＬｄのみでトランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞によって提示されたペプチドによって誘導されたＣＤ８＋２Ｃ細胞のＩＬ−２−依存性増殖応答を示す一対の棒グラフである。
【図１３】トランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞によって提示されたペプチドによって誘導されたＣＤ８＋２Ｃ細胞の第３日目の増殖応答に対するペプチド濃度の影響を示すグラフである。
【図１４】トランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞によって提示されたペプチドにより誘導されたＣＤ８＋２Ｃ細胞の第３日目の増殖応答およびＩＬ−２産生に対する抗原−提示細胞用量の影響を示す一対のグラフである。
【図１５】Ｌｄ．Ｂ７、Ｌｄ．ＩＣＡＭおよびＬｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭでトランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞により誘導されたＣＤ８＋２Ｃ細胞の増殖応答に対するペプチド濃度の影響を示す一連りグラフである。
【図１６】Ｌｄ、Ｌｄ．Ｂ７、Ｌｄ．ＩＣＡＭおよびＬｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭ＋ＱＬ９ペプチドでトランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞により誘導されたＣＤ８＋およびＣＤ８＋２Ｃ細胞の増殖応答の動力学を示す一連のグラフである。
【図１７】外因性サイトカインの不在下、Ｌｄ．Ｂ７、Ｌｄ．Ｂ７．ＩＣＡＭまたはＬｄ．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞＋ＱＬ９ペプチド（１０μＭ）でトランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞により刺激されたＣＤ８＋２Ｃ細胞のＣＴＬ活性を示す一連のグラフである。
【図１８】外因性ＩＬ−２（２０ｕ／ｍｌ）の不在下（左）または存在下（右）、Ｌｄ．ＩＣＡＭ抗原−提示細胞＋ＱＬ９ペプチド（１０μＭ）でトランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞により刺激されたＣＤ８＋２Ｃ細胞のＣＴＬ活性を示す一対のグラフである。
【図１９】トランスフェクトされたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞によって提示されたペプチドに対する正常（非−トランスジェニック）ＣＤ８＋Ｔ−細胞の増殖応答（左側パネル）および外因性サイトカインの添加なくして、３日間、ペプチドの不在下で５×１０５  Ｂ１０．Ｄ２（Ｌｄ）脾臓細胞（２０００ｃＧｙ）と共に培養したＮ  Ｂ６および２Ｃ  Ｂ６  ＣＤ８＋細胞の等級分けした用量によって誘導された応答（右側パネル）を示す一対のグラフである。
【図２０】ペプチドＱＬ９で固定化された分子で被覆したプレートにおいて培養した精製２Ｃ＋Ｔ−細胞（ウェル当たり５０，０００細胞）の刺激された分裂促進を示すグラフである（実線＝Ｌｄおよび抗−ＣＤ２８抗体、破線＝Ｌｄのみ）。
【図２１】Ｌｄおよび抗−ＣＤ２８抗体で被覆した９６−ウェルプレートにおいて培養した、種々の示したペプチドでの、培養５日目における精製２Ｃ＋Ｔ−細胞の刺激された分裂促進を示す棒グラフである（ハッチングを施した棒＝ＩＬ−２無し、黒色棒＝ＩＬ−２添加）。
【図２２】Ｌｄおよび抗−ＣＤ２８抗体で被覆したプレート中での１２日間の培養後に回収し、ペプチドＱＬ９に暴露し、２Ｃ  Ｔ−細胞受容体特異的抗体１Ｂ２を用いて染色した細胞のフローサイトメトリー分析の結果のグラフ表示である（Ｍ２＝陽性染色細胞、Ｍ１＝陰性染色細胞）。
【図２３】Ｌｄおよび抗−ＣＤ２８抗体で被覆したプレート中での１２日間の培養後に回収し、ペプチドｐ２Ｃａに暴露し、２Ｃ  Ｔ−細胞受容体特異的抗体１Ｂ２を用いて染色した細胞のフローサイトメトリー分析の結果のグラフ表示である（Ｍ２＝陽性染色細胞、Ｍ１＝陰性染色細胞）。
【図２４】Ｌｄおよび抗−ＣＤ２８抗体で被覆したプレート中での１２日間の培養後に回収し、ペプチドＳＬ９に暴露し、２Ｃ  Ｔ−細胞受容体特異的抗体１Ｂ２を用いて染色した細胞のフローサイトメトリー分析の結果のグラフ表示である（Ｍ２＝陽性染色細胞、Ｍ１＝陰性染色細胞）。
【図２５】活性化されたＴ−細胞による標的細胞の細胞溶解を示すグラフである（実線＝ペプチドＱＬ９、破線＝対照ペプチドＬＣＭＶ）。
【図２６】インフルエンザマトリックスペプチドをロードした抗原−提示細胞でのヒトＣＤ８＋Ｔ−細胞の活性化に起因した細胞傷害性溶解のグラフ表示である。
【図２７】ＨＩＶ−ＲＴペプチドをロードした抗原−提示細胞でのヒトＣＤ８＋Ｔ−細胞の活性化に起因した細胞傷害性溶解のグラフ表示である。
【図２８】チロシナーゼペプチドをロードした抗原−提示細胞でのヒトＣＤ８＋Ｔ−細胞の活性化に起因した細胞傷害性溶解のグラフ表示である。
【０３２０】
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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