(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦｃγＲIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損し、かつ自己抗体反応は亢進しているが自己免疫病態を自然発症しないＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスと、ｌｐｒ／Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスとを交配させ、得られたヘテロ接合体マウス同士をインタークロスさせて得られ、かつ、
腹腔細胞におけるＢ１細胞及びプラズマ細胞、並びに、血清中の自己抗体が、交配した親マウスと比較して増加したことを特徴とする全身性エリテマトーデスモデルマウス。
【請求項２】
請求項１記載の全身性エリテマトーデスモデルマウスに被検物質を投与し、平均寿命、組織や器官あるいは細胞の変化、及び／又は血清中における抗核抗体価の変化を測定・評価することを特徴とする全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニング方法。
【請求項３】
請求項１記載の全身性エリテマトーデスモデルマウス由来の組織、器官、又は細胞を被検物質と接触させ、組織、器官、及び／又は細胞の変化を測定・評価することを特徴とする全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニング方法。
【請求項４】
組織又は器官の変化が、腎臓又は足関節の変化であることを特徴とする請求項２又は３記載の全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニング方法。
【請求項５】
細胞の変化が、Ｂ細胞の増殖若しくは減少の変化、又はＢ細胞の分化の変化であることを特徴とする請求項２又は３記載の全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニング方法。
【請求項６】
Ｂ細胞が、腹腔細胞又は脾臓細胞由来のＢ細胞であることを特徴とする請求項５記載の全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニング方法。
【請求項７】
血清中における抗核抗体価の変化が、血清中における抗二本鎖ＤＮＡ抗体価及び／又は抗一本鎖ＤＮＡ抗体価の変化であることを特徴とする請求項２記載の全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニング方法。
【請求項８】
請求項１記載の全身性エリテマトーデスモデルマウスと野生型マウスとの場合を比較・評価することを特徴とする請求項２〜７のいずれか記載の全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、全身性自己免疫疾患である全身性エリテマトーデスを発症するモデル非ヒト動物、及び該全身性エリテマトーデスモデル非ヒト動物を用いた全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニング方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体は、外界からの異物に対するのみならず、自己の成分に対してもアレルギー反応を起こすが、これをもとに自己免疫疾患を誘導する。かかる自己免疫疾患は、全身性の疾患であるが、悪性貧血、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、インスリン抵抗性糖尿病、萎縮性腎炎、多発性硬化症等の臓器特異的自己免疫疾患と、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性筋炎等の臓器非特異的自己免疫疾患とに大別されている。このような自己免疫疾患には、多彩な自己抗体や自己抗原感作リンパ球が存在し、それらが実際に組織障害とどのように関連しているかは重要な問題とされている。上記全身性エリテマトーデス（Systemic lupus erthematosus：ＳＬＥ）は、多彩な自己抗体の出現などの免疫異常を示し、多臓器障害を呈する代表的な全身性自己免疫疾患である。病因としては、遺伝的要因や、抗二本鎖ＤＮＡ抗体(抗ｄｓ−ＤＮＡ抗体)を中心に、多彩な自己抗体の産生を引き起こすＴ細胞及びＢ細胞の機能異常が指摘されている。実際の臨床症状は、皮膚粘膜症状や関節炎、胸膜・心膜炎、精神神経症状など全身にわたる多彩なものであるが、とりわけ糸球体腎炎は生命予後を決定する重要な病変である。
【０００３】
従来、全身性エリテマトーデスの代表的な疾患モデルマウスとしてはＭＲＬ／ｌｐｒマウスが知られており（Murphy ED, Roth JB : Autoimmunity and lymphoproliferation : Induction by mutant gene lpr, and acceleration by a male-associated factor in strain BXSB mice. Genetic Control of Autoimmune Disease (eds. Rose N, Bigazzi P, Warner N), Elsevier North Holland, New York, 1978,p207-221）、かかるＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、ＡＫＲ／Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ３Ｈ／Ｄｉ、ＬＧ／Ｊの交配から純系化されたマウスで、関節炎や糸球体腎炎を自然発症する。Ｌｐｒ遺伝子は、リンパ球の増殖を来たす常染色体劣性の突然変異遺伝子で、アポトーシスを誘導するＦａｓ抗原遺伝子の変異であり、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、Ｆａｓ抗原遺伝子の欠損型であることが認められている（Watanabe-Fukunaga R, Brannan CI, Copeland NG, Jelkins NA, Nagata S : Lymphoproliferation disorder in mice explained by defects in Fas antigen that mediates apoptosis. Nature 356:314-317,1992、Takahashi, T., Tanaka, M., Brannan, C.I., Jenkins, N.A., Copeland, N.G., Suda, T., and Nagata, S. (1994). Generalized lymphoproliferative disease in mice, caused by a point mutation in the Fas ligand. Cell 76, 969-976）。そのためＴ細胞、Ｂ細胞の異常増殖・免疫グロブリンの過剰産生やその詳細な機序は不明であるが、ヒト疾患と同様に各種自己抗体（抗ＤＮＡ抗体、抗Ｓｍ抗体など）産生を招くことが報告されている（Izui S, Eisenberg RA : Circulating anti-DNA-rheumatoid factor complex in MRL/l mice. Clin Immunol Immunopathological 15:436-551,1980、Gyotoku Y,, Abdelmoula M, Spertini F, Izui S, Lambert P-H : Crioglobulinemia induced by monoclonal immunoglobulin G rheumatoid factors dereived form autoimmune MRL/Mpj-lpr/lpr mice. J Immunol 138:3785-3792,1987）。また、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスは、上記のようにハプロタイプが異なる多種のマウスが混在したマウスであるが、自己免疫異常を自然発症しにくい系のマウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ、Ｃ５７ＢＬ／６，ＡＫＲ）に戻し交配すると、自己抗体産生はみられるものの、関節炎や腎炎といった病態を発症しないことが知られており（Theofilopoulos, A.N., and F.J. Dixon : Murine models of systemic lupus erythematosus. Adv. Immunol. 37: 269-390,1985）、そのためＭＲＬ／ｌｐｒの自己免疫病態にはその遺伝的背景が密接に関連していることが考えられている。他方、特開平９−１７２９０８号公報には、ＩＬ−１アルファ遺伝子を含む外来性遺伝子構築体を組み込んだ全身性エリテマトーデスモデル非ヒト脊椎トランスジェニック動物が開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、抗二本鎖ＤＮＡ抗体や抗一本鎖ＤＮＡ抗体産生を誘導し、さらに関節炎や糸球体腎炎を自然発症する全身性エリテマトーデスモデル非ヒト動物や、該全身性エリテマトーデスモデル非ヒト動物を用いた全身性エリテマトーゼス治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究し、各種抗体反応は亢進しているが自己免疫病態を自然発症しない、抑制性ＦｃＲであるＦｃγＲIIＢの遺伝子機能が染色体上で欠損したＦｃγＲIIＢ欠損マウスと、ハプロタイプＨ−２ｂであるＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスとを、１２世代戻し交配してＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウスを作製し、かかるＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウスの雄と、Ｌｐｒ／Ｂ６マウスの雌とを交配させ、両方の遺伝子がヘテロ接合体となったＦｃγＲIIＢ+/-／ｌｐｒ+/-マウスを作製し、さらにかかるＦｃγＲIIＢ+/-／ｌｐｒ+/-マウス同士を交配させ、ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウス（ＦｃγＲIIＢ-/-／ｌｐｒ+/+＝ＦｃγＲIIＢ-/-／ｌｐｒ）を作製した。上記ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスは、野生型マウスと比較して短命であり、著しいリンパ球増殖が認められ、抗ＤＮＡ抗体価が顕著に高く、１６週齢までに糸球体腎炎を、２４週齢までに関節炎を１００％自然発症することを確認し、Ｌｐｒ／Ｂ６マウスにＦｃγＲIIＢ遺伝子欠損を導入することにより、かかるマウスが重症の全身性エリテマトーデスになることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、（１）ＦｃγＲIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損し、かつ自己抗体反応は亢進しているが自己免疫病態を自然発症しないＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスと、ｌｐｒ／Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスとを交配させ、得られたヘテロ接合体マウス同士をインタークロスさせて得られ、かつ、
腹腔細胞におけるＢ１細胞及びプラズマ細胞、並びに、血清中の自己抗体が、交配した親マウスと比較して増加したことを特徴とする全身性エリテマトーデスモデルマウスに関する。
【０００７】
また本発明は、（２）上記（１）のいずれか記載の全身性エリテマトーデスモデルマウスに被検物質を投与し、平均寿命、組織や器官あるいは細胞の変化、及び／又は血清中における抗核抗体価の変化を測定・評価することを特徴とする全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニング方法や、（３）上記（１）記載の全身性エリテマトーデスモデルマウス由来の組織、器官、又は細胞を被検物質と接触させ、組織、器官、及び／又は細胞の変化を測定・評価することを特徴とする全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニング方法や、（４）組織又は器官の変化が、腎臓又は足関節の変化であることを特徴とする上記（２）又は（３）記載の全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニング方法や、（５）細胞の変化が、Ｂ細胞の増殖若しくは減少の変化、又はＢ細胞の分化の変化であることを特徴とする上記（２）又は（３）記載の全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニング方法や、（６）Ｂ細胞が、腹腔細胞又は脾臓細胞由来のＢ細胞であることを特徴とする上記（５）記載の全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニング方法や、（７）血清中における抗核抗体価の変化が、血清中における抗二本鎖ＤＮＡ抗体価及び／又は抗一本鎖ＤＮＡ抗体価の変化であることを特徴とする上記（２）記載の全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニング方法や、（８）上記（１）記載の全身性エリテマトーデスモデルマウスと野生型マウスとの場合を比較・評価することを特徴とする上記（２）〜（７）のいずれか記載の全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニング方法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の全身性エリテマトーデスモデル非ヒト動物とは、自己抗体反応は亢進しているが自己免疫病態を自然発症しない非ヒト動物に、Ｌｐｒ遺伝子等のリンパ球増殖誘導遺伝子を導入することにより、抗二本鎖ＤＮＡ抗体、抗一本鎖ＤＮＡ抗体等の抗核抗体産生を誘導し、さらに関節炎や糸球体腎炎を自然発症するものであればどのようなものでもよい。上記Ｌｐｒ遺伝子等のリンパ球増殖誘導遺伝子を導入する方法としては、プロモーターやウイルス等を用いた公知の遺伝子導入方法を具体的に挙げることができるがこれらに限定されるものではなく、その他、リンパ球増殖誘導遺伝子を発現する非ヒト動物を、自己抗体反応は亢進しているが自己免疫病態を自然発症しない非ヒト動物と交配させ、得られたヘテロ接合体非ヒト動物同士をさらに交配させることにより、自己抗体反応は亢進しているが自己免疫病態を自然発症しない非ヒト動物と、リンパ球増殖誘導遺伝子を発現する非ヒト動物との子孫にリンパ球増殖誘導遺伝子を導入する方法を挙げることができる。
【０００９】
上記自己抗体反応は亢進しているが自己免疫病態を自然発症しない非ヒト動物としては、多彩な自己抗体反応は亢進しているが、糸球体腎炎、皮膚粘膜症状や関節炎、胸膜・心膜炎、精神神経症状等の自己免疫病態を自然発症しないものであれば特に制限されるものではないが、例えば、ＦｃγＲIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物などを具体的に挙げることができる。かかるＦｃγＲIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損した非ヒト動物とは、ＦｃγＲIIＢをコードする非ヒト動物の内在性遺伝子の全部又は一部が破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化され、ＦｃγＲIIＢを発現する機能を失なった非ヒト動物をいう。本発明における非ヒト動物としては、マウス、ラット等の齧歯目動物を具体的に挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１０】
本発明における野生型の非ヒト動物とは、上記全身性エリテマトーデスモデル非ヒト動物と同種の動物を意味し、中でも同腹の動物を好適に例示することができる。メンデルの法則に従い出生してくる、これらの全身性エリテマトーデスモデル非ヒト動物とその同腹の野生型動物は個体レベルで正確な比較実験を行うことができる点で同時に用いることが好ましい。そして本発明の全身性エリテマトーデスモデル非ヒト動物の好適例としては、ＦｃγＲIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損し、かつ、Ｌｐｒ遺伝子を発現するマウス（ＦｃγＲIIＢ-/-／ｌｐｒマウス）を、野生型非ヒト動物としては該ＦｃγＲIIＢ-/-／ｌｐｒマウスと同腹の野生型マウスを、それぞれ具体的に挙げることができる。以下、非ヒト動物がマウスの場合を例にとって説明する。
【００１１】
本発明のＦｃγＲIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損し、かつ、Ｌｐｒ遺伝子を発現するマウス、すなわち、ＦｃγＲIIＢ-/-／ｌｐｒマウスの作製法としては、全身性エリテマトーデス、特に重症の全身性エリテマトーデスを発症したマウスを作製できる方法であればどのような方法でもよいが、具体的には、ＦｃγＲIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損したマウスをハプロタイプＨ−２ｂであるＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスと戻し交配することにより純化させたＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウスの雄と、リンパ球増殖誘導遺伝子であるＬｐｒ遺伝子を発現するＬｐｒ／Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスの雌とを交配させ、両方の遺伝子がヘテロ接合体となったＦｃγＲIIＢ+/-／ｌｐｒ+/-マウスを作製し、さらにかかるＦｃγＲIIＢ+/-／ｌｐｒ+/-マウス同士をインタークロスさせることによってＦｃγＲIIＢ-/-／ｌｐｒマウス（ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６）を作製する方法を挙げることができる。
【００１２】
また、上記ＦｃγＲIIＢ遺伝子機能が染色体上で欠損したマウス、すなわちＦｃγＲIIＢノックアウトマウスは、本発明者らの前掲の文献（Nature 379, 346-349, 1996）に記載する方法等によって作製することができる。具体的には、マウス遺伝子ライブラリーからＰＣＲ等の方法により得られた遺伝子断片を用いて、ＦｃγＲIIＢ遺伝子をスクリーニングし、スクリーニングされたＦｃγＲIIＢ遺伝子を、ウイルスベクター等を用いてサブクローンし、ＤＮＡシーケンシングにより特定する。このクローンのＳ2エキソン及びＥＣ1エキソンを含むフラグメントをｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換することによって、ターゲットベクターを調製する。この線状化されたベクターをエレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８等に抵抗性を示すＥＳ細胞を選択し、その細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型のマウスとインタークロスさせると、ヘテロ接合体マウスを得ることができ、また、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせることによって、ＦｃγＲIIＢノックアウトマウスを得ることができる。
【００１３】
本発明の全身性エリテマトーデスモデル非ヒト動物は、全身性エリテマトーデスの発症機構の解析に有用であり、また、かかる全身性エリテマトーデスモデル非ヒト動物を用いると、全身性エリテマトーデスの治療薬等の治療方法を開発することができる。
【００１４】
本発明の全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニング方法としては、本発明の全身性エリテマトーデスモデル非ヒト動物に被検物質を投与し、平均寿命、組織や器官あるいは細胞の変化、及び／又は血清中における抗核抗体価の変化を測定・評価し、平均寿命、組織や器官あるいは細胞の変化、血清中における抗核抗体価等が改善された物質を特定する方法を具体的に挙げることができるが、これらの方法に特に制限されるものではない。上記平均寿命の変化を測定・評価する方法としては、例えば、被検物質を用いた場合と用いない場合とで、平均寿命の変化を測定・評価し、かかる平均寿命が延びた物質を特定する方法を挙げることができる。組織又は器官の変化を測定・評価する方法としては、例えば、被検物質を用いた場合と用いない場合とで、腎臓、足関節等の組織又は器官の変化を測定・評価し、かかる組織又は器官が改善された物質を特定する方法を挙げることができる。細胞の変化を測定・評価する方法としては、例えば、被検物質を用いた場合と用いない場合とで、腹腔細胞又は脾臓細胞由来のＢ細胞の増殖又は減少の変化、腹腔細胞又は脾臓細胞由来のＢ細胞の分化の変化を測定・評価し、かかる細胞の機能異常が改善された物質を特定する方法を挙げることができる。血清中における抗核抗体価の変化を測定・評価する方法としては、例えば、被検物質を用いた場合と用いない場合とで、血清中における、抗一本鎖ＤＮＡ抗体価、抗二本鎖ＤＮＡ抗体価等の抗核抗体価の増加又は減少を測定・評価し、血清中における抗核抗体価が減少した物質を特定する方法を挙げることができる。
【００１５】
本発明の全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニング方法としては、本発明の全身性エリテマトーデスモデル非ヒト動物由来の組織、器官、又は細胞を被検物質と接触させ、組織、器官、細胞等の変化を測定・評価し、組織、器官、Ｂ細胞等の変化が改善された物質を特定する方法を具体的に挙げることができるが、これらの方法に特に制限されるものではない。組織又は器官の変化を測定・評価する方法としては、例えば、被検物質を用いた場合と用いない場合とで、腎臓、足関節等の組織又は器官の変化を測定・評価し、かかる組織又は器官が改善された物質を特定する方法を挙げることができる。細胞の変化を測定・評価する方法としては、例えば、被検物質を用いた場合と用いない場合とで、腹腔細胞又は脾臓細胞由来のＢ細胞の増殖又は減少の変化、腹腔細胞又は脾臓細胞由来のＢ細胞の分化の変化を測定・評価し、かかる細胞の機能異常が改善された物質を特定する方法を挙げることができる。これらの測定・評価する方法は特にこれらに制限されるものではないが、副作用の有無を確認するなどの面から、全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニングに際して、全身性エリテマトーデスモデル非ヒト動物と同腹の野生型非ヒト動物とを比較・評価することがより好ましい。
【００１６】
本発明の全身性エリテマトーデス治療薬のスクリーニング方法により得られる、糸球体腎炎、関節炎、血管炎、クリオグロブリン血症を発症する全身性エリテマトーデス治療薬は、全身性エリテマトーデスを発症した患者の治療等に用いることができる。本発明の全身性エリテマトーデス治療薬は、経口的あるいは非経口的に投与することができる。経口投与剤としては散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤などの固形製剤あるいはシロップ剤、エリキシル剤などの液状製剤とすることができる。また、非経口投与剤として注射剤、経皮製剤あるいは座薬等とすることができる。これらの製剤は活性成分に薬理学的、製剤学的に認容される助剤を加えることにより常法に従って製造することができる。助剤としては、例えば、経口剤および粘膜投与剤にあっては、軽質無水ケイ酸、澱粉、乳糖、結晶セルロース、乳糖カルシウム等の賦形剤、カルボキシメチルセルロ−ス等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシム等の滑沢剤などの製剤用成分が、また注射剤にあっては、生理食塩水、マンニトール、プロピレングリコ−ル等の溶解剤ないし溶解補助剤、界面活性剤などの懸濁化剤などの製剤用成分が、さらに外用剤にあっては、水性ないし油性の溶解剤ないし溶解補助剤、粘着剤などの製剤用成分が使用される。また、投与量は、対象疾患の種類、患者の年齢、性別、体重、症状、投与形態に応じて適宜決定することができる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
参考例（ＦｃγＲIIＢ欠損マウスの作製）
１２９／Ｓｖ／Ｊ（Ｈ−２ｂ）マウスのゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、ＦｃγＲIIＢ遺伝子のゲノムＤＮＡのクローンを単離した。このクローンのＳ2及びＥＣ1の２つの独立したエキソンを含む２．６５ＫｂのフラグメントをｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット（東洋紡社製）に、置換することによってターゲットベクターを作製した。この線状化したベクターをエレクトロポレーションによってＥＳ細胞（Ｊ１）に導入し、相同的組換えを行った。
【００１８】
上記の相同的組換えを起こしたＥＳ細胞からＥＳクローンを単離し、Ｇ４１８及びＧＡＮＣ（ガンシクロビア）に対してネオマイシン耐性ＥＳクローンをスクリーニングし、サザンブロット法によって相同的組換え体を同定した。その同定された相同的組換え体からゲノムＤＮＡを単離して、ＨｉｎｄIIIでダイジェストし、ｐＭＣ１ネオ遺伝子カセットを含むターゲティングされた対立遺伝子を含んでいることを確認した。かかる確認されたＥＳクローンを胚盤胞中にマイクロインジェクションし、キメラマウスを作製し、作製されたマウスを野生型のＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスとインタークロスさせることによってヘテロ接合体マウスを得て、また、ホモ接合体マウスを得るために、このヘテロ接合体マウスをインタークロスさせて、ＦｃγＲIIＢ遺伝子が染色体上で欠損した欠損マウスを作製した。
【００１９】
実施例１（ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスの作製）
上記ＦｃγＲIIＢ欠損マウスをハプロタイプＨ−２ｂであるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｂ６）と１２世代戻し交配し、ＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウスを作製した。かかるＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウスの雄とＬｐｒ／Ｂ６マウスの雌を交配し、両方の遺伝子がヘテロ接合体となったＦｃγＲIIＢ+/-／ｌｐｒ+/-マウスを作製し、さらにかかるＦｃγＲIIＢ+/-／ｌｐｒ+/-マウス同士を交配しＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスを作製した。かかるＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスの鑑別はＬｐｒ及びＦｃγＲIIＢ欠損についてＰＣＲ法により行った。Ｌｐｒは5'-agcatagattccatttgct-3'（配列番号１；Ｐ１）及び5'-caaattttattgttgcgaca-3'（配列番号２；Ｐ２）のプライマーを、野生型（Ｂ６）は5'-agcatagattccatttgct-3'（配列番号３；Ｐ３）及び5'-agtaatgggctcagtgca-3'（配列番号４；Ｐ４）のプライマーを用いたＰＣＲ法により鑑別した。同様にＦｃγＲIIＢ欠損は5'-ctcgtgctttacggtatcgcc-3'（配列番号５；Ｐ５）及び5'-ttgactgtggccttaaacgtgtag-3'（配列番号６；Ｐ６）で、野生型（Ｂ６）は5'-aaactcgaccccccgtggatc-3'（配列番号７；Ｐ７）及び5'-ttgactgtggccttaaacgtgtag-3'（配列番号８；Ｐ８）のプライマーを用いたＰＣＲ法により鑑別した。
【００２０】
実施例２（ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスの異常）
新生児ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウス（ＦｃγＲIIＢ-/-／ｌｐｒ）の形態的異常を調べるため、ＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウス（ＦｃγＲIIＢ-/-／Ｂ６）、Ｌｐｒ／Ｂ６マウス（Ｌｐｒ／Ｂ６）、又はＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６））と比較し、生存率を調べてみた（それぞれ３０匹）。
その結果を図１に示す。このことから、ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスにおいては、早いマウスで６週齢からの死亡が認められ、その後は週を追うごとに急激に生存率が低下しているのが確認できた。かかるＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスは、平均生存期間が約２０週齢であり、４０週齢では生存率約０％に達した。また、かかる生存率においては性差があり、雌マウスの方が早い段階で死亡していた。これに対して、他の３系統においては、４０週齢未満で死亡したマウスはいなかった。
【００２１】
実施例３（ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスにおける糸球体腎炎、関節炎の自然発症）
次に、ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスの病理組織学的検討のため、実施例１記載の方法により作製したＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウス（ＦｃγＲIIＢ-/-／ｌｐｒ）、ＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウス（ＦｃγＲIIＢ-/-／Ｂ６）、Ｌｐｒ／Ｂ６マウス（Ｌｐｒ／Ｂ６）、及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）をそれぞれエーテルで麻酔した後屠殺し、腎臓標本（図２及び３）及び足関節標本（図４及び５）をそれぞれヘマトキシリン−エオシン染色し、視覚化した。その結果を図２〜５にそれぞれ示す。なお、図２は２４週齢の各マウスの腎臓標本を２００倍にて、図３は２４週齢の各マウスの腎臓標本を４００倍にて、図４は２４週齢の各マウスの足関節標本を４０倍にて、図５は２４週齢の各マウスの足関節標本を１００倍にて視覚化したものである。これらの結果から、ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスは、生後第８週齢から糸球体腎炎、関節炎の自然発症が認められた。腎臓においては生後第１６週齢までに１００％のＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスが半月体形成を伴う糸球体腎炎（図２及び３）が認められ、足関節においては生後第２４週齢までに１００％のＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスに好中球、リンパ球の浸潤を伴う関節炎（図４及び５）が認められた。しかし、関節の破壊性の所見は確認できなかった。
【００２２】
実施例４（ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスにおけるＢ１細胞及びプラズマ細胞の増殖）
上記ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスにおいてびまん性の糸球体腎炎や炎症性の細胞浸潤を伴う関節炎が認められたことから、ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスにおけるＢ細胞増殖応答及びＢ細胞の分化を調べてみた。２４週齢のＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウス（ＦｃγＲIIＢ-/-／ｌｐｒ）、ＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウス（ＦｃγＲIIＢ-/-／Ｂ６）、Ｌｐｒ／Ｂ６マウス（Ｌｐｒ／Ｂ６）、及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）からそれぞれ腹腔細胞を単離し、TRI colorが結合した抗マウスＣＤ５抗体（Ｌｙ−１）（ＣＤ５−Ｔｒｉ）、及びＦＩＴＣが結合した抗マウスＢ２２０抗体（ＲＡ３−６Ｂ２）（Ｂ２２０−ＦＩＴＣ）で腹腔細胞を公知の手法により染色し、フローサイトメトリーで分析した。その結果を図６に示す。このことから、ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスにおいてＢ１細胞（Ｂ２２０+ＣＤ５+細胞；楕円部分）が顕著に増加しており、Ｂ１細胞の数は、ＦｃγＲIIＢ-/-／ｌｐｒ＞ｌｐｒ／Ｂ６＞ＦｃγＲIIＢ-/―／Ｂ６＝Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの順であることがわかった。
【００２３】
次に、２４週齢のＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウス（ＦｃγＲIIＢ-/-／ｌｐｒ）、ＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウス（ＦｃγＲIIＢ-/-／Ｂ６）、Ｌｐｒ／Ｂ６マウス（Ｌｐｒ／Ｂ６）、及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）からそれぞれ脾臓細胞を単離し、Ｂ２２０−ビーズ（Miltenyi Biotec社製）を用いたＭＡＣＳソーティングにより、脾臓細胞からＢ２２０+細胞を選択した。かかるＢ２２０+細胞をＰＥ（フィコエリトリン）が結合した抗マウスＩｇＤ抗体（１１−２６）（ＩｇＤ−ＰＥ）、TRI colorが結合した抗マウスＩｇＭ抗体（Ｒ６−６０．２）（ＩｇＭ−Ｔｒｉ）などのモノクローナル抗体（全ての抗体はBD PharMingen社製のものを使用）を用いて公知の手法に従いＢ２２０+細胞を染色し、Ｂ細胞の分化をフローサイトメトリー分析で調べてみた。その結果を図７に示す。ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスにおいてプラズマ細胞（Ｂ２２０+ＩｇＭ-ＩｇＤ-細胞；四角部分）が顕著に増加しており、プラズマ細胞の数は、ＦｃγＲIIＢ-/-／ｌｐｒ＞ｌｐｒ／Ｂ６＞ＦｃγＲIIＢ-/―／Ｂ６＝Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの順であることがわかった。
【００２４】
実施例５（ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスにおける全身性エリテマトーデスの発症）
全身性エリテマトーデスの病因としては、抗二本鎖ＤＮＡ抗体（抗ｄｓ−ＤＮＡ抗体）や抗一本鎖ＤＮＡ抗体（抗ｓｓ−ＤＮＡ抗体）などの自己抗体の産生を引き起こすＴ細胞及びＢ細胞の機能異常が知られている（Theofilopoulos, A.N., and F.J. Dixon : Murine models of systemic lupus erythematosus. Adv. Immunol. 37: 269-390,1985）。そこで、ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスが全身性エリテマトーデスを発症しているかどうかを調べるために、ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスにおける抗二本鎖ＤＮＡ抗体価及び抗一本鎖ＤＮＡ抗体価を調べてみた。ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウス（ＦｃγＲIIＢ-/-／ｌｐｒ）、ＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウス（ＦｃγＲIIＢ-/-／Ｂ６）、Ｌｐｒ／Ｂ６マウス（Ｌｐｒ／Ｂ６）、及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６））の眼窩から、生後第８，１６，２４週齢に血清を採取し、レビス Anti-ds-or ss-DNA mouse ELISA KIT（シバヤギ社）で検出し、Biolumin 960 Microplate Reader（Molecular Dynamics社）を用いて吸光度450 nmで各抗体価を測定した。その結果を図６に示す。その結果、自己抗体である抗ｄｓ−ＤＮＡ抗体価及びｓｓ−ＤＮＡ抗体価は、生後第１６，２４週齢で、交配に使用した他のマウスであるＬｐｒ／Ｂ６マウスやＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウス、さらにこれらの野生型マウスであるＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ６）マウスと比較して、有為に上昇しているのが確認できた。以上のことから、ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウスは全身性エリテマトーデスを発症していることが明らかとなった。
【００２５】
【発明の効果】
本発明の全身性エリテマトーデスモデル非ヒト動物は、抗二本鎖ＤＮＡ抗体や抗一本鎖ＤＮＡ抗体産生を誘導し、さらに関節炎や糸球体腎炎を自然発症するなどの重症の全身性エリテマトーデス症状を示すことから、糸球体腎炎、関節炎、血管炎、クリオグロブリン血症等の自己免疫疾患の発症過程の研究に有用であり、また、全身性エリテマトーデスに至るメカニズムを解析し、全身性エリテマトーデスの進行の予防や治療方法等を研究・開発することができる。
【００２６】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウス、Ｌｐｒ／Ｂ６マウス、ＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウス、及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの生存率曲線を示す図である。
【図２】本発明のＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウス、Ｌｐｒ／Ｂ６マウス、ＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウス、及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの腎臓標本（倍率２００倍）を観察した結果を示す図である。
【図３】本発明のＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウス、Ｌｐｒ／Ｂ６マウス、ＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウス、及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの腎臓標本（倍率４００倍）を観察した結果を示す図である。
【図４】本発明のＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウス、Ｌｐｒ／Ｂ６マウス、ＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウス、及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの足関節標本（倍率４０倍）を観察した結果を示す図である。
【図５】本発明のＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウス、Ｌｐｒ／Ｂ６マウス、ＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウス、及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの足関節標本（倍率１００倍）を観察した結果を示す図である。
【図６】２４週齢の４系統のマウス（ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウス、Ｌｐｒ／Ｂ６マウス、ＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウス、及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス）のそれぞれの腹腔細胞をＢ２２０（横軸）、ＣＤ５（縦軸）で展開したＦＡＣＳ像を示す図である。
【図７】２４週齢の４系統のマウス（ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウス、Ｌｐｒ／Ｂ６マウス、ＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウス、及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス）のそれぞれの脾臓細胞のＢ２２０+細胞をＩｇＭ（横軸）、ＩｇＤ（縦軸）で展開したＦＡＣＳ像を示す図である。
【図８】ＦｃγＲIIＢ欠損ｌｐｒ／Ｂ６マウス、Ｌｐｒ／Ｂ６マウス、ＦｃγＲIIＢ欠損Ｂ６マウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの抗二本鎖ＤＮＡ抗体価及び抗一本鎖ＤＮＡ抗体価を調べた結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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