(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原性細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫から選ばれる抗原および有効なアジュバント量の変異コレラホロトキシンを含んでなる抗原組成物であって、該コレラホロトキシンが、野生型コレラホロトキシンに比較して低下された毒性をもち、そして該コレラホロトキシンのＡサブユニットの位置２９におけるグルタミン酸残基がヒスチジン残基により置換されており、かつ、該ホロトキシンが、該抗原に対する脊椎動物宿主における免疫応答を増強する、抗原組成物。
【請求項２】
選ばれる抗原が、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ｐ４外膜タンパク質、ヘモフィルス・インフルエンゼＰ６外膜タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｒｉｃｏｂａｃｔｅｒ  Ｐｙｌｏｒｉ）ウレアーゼタンパク質または呼吸合胞体ウイルス融合タンパク質である、請求項１記載の抗原組成物。
【請求項３】
選ばれる抗原が、ヘモフィルス・インフルエンゼＰ４外膜タンパク質またはヘモフィルス・インフルエンゼＰ６外膜タンパク質である、請求項２記載の抗原組成物。
【請求項４】
選ばれる抗原が、ヘリコバクター・ピロリ  ウレアーゼタンパク質である、請求項２記載の抗原組成物。
【請求項５】
選ばれる抗原が、呼吸合胞体ウイルス融合タンパク質である、請求項２記載の抗原組成物。
【請求項６】
希釈剤もしくはキャリアーをさらに含有する、請求項１記載の抗原組成物。
【請求項７】
変異コレラホロトキシンに加えて第２のアジュバントをさらに含む、請求項１記載の抗原組成物。
【請求項８】
少なくとも１つのさらなる変異が、アミノ酸２９以外の位置でコレラホロトキシンのＡサブユニットになされている、請求項１記載の抗原組成物。
【請求項９】
少なくとも１つのさらなる変異が、アミノ酸の位置７のアルギニン、位置９のアスパラギン酸、位置１１のアルギニン、位置４４のヒスチジン、位置５３のバリン、位置５４のアルギニン、位置６１のセリン、位置６３のセリン、位置７０のヒスチジン、位置９７のバリン、位置１０４のチロシン、位置１０６のプロリン、位置１０７のヒスチジン、位置１１０のグルタミン酸、位置１１２のグルタミン酸、位置１１４のセリン、位置１２７のトリプトファン、位置１４６のアルギニンおよび位置１９２のアルギニンについての置換としてなされている、請求項８記載の抗原組成物。
【請求項１０】
請求項１記載の抗原組成物を有効成分として含んでなる病原性細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫から選ばれる抗原を含有する抗原組成物の、脊椎動物宿主の免疫応答を誘起する能力を増強するための製薬学的製剤。
【請求項１１】
請求項２記載の抗原組成物を有効成分として含んでなるヘモフィルス・インフルエンゼ抗原を含有する抗原組成物の、脊椎動物宿主の免疫応答を誘起する能力を増強するための製薬学的製剤。
【請求項１２】
請求項４記載の抗原組成物を有効成分として含んでなるヘリコバクター・ピロリ抗原を含有する抗原組成物の、脊椎動物宿主の免疫応答を誘起する能力を増強するための製薬学的製剤。
【請求項１３】
請求項５記載の抗原組成物を有効成分として含んでなる呼吸合胞体ウイルス抗原を含有する抗原組成物の、脊椎動物宿主の免疫応答を誘起する能力を増強するための製薬学的製剤。
【請求項１４】
コレラホロトキシンのＡサブユニットの位置２９のグルタミン酸残基がヒスチジン残基で置換されている免疫原性変異コレラホロトキシンをコードしているＤＮＡ配列を含み、かつ、該ＤＮＡ配列がアラビノース誘導プロモーターに操作可能に結合されている、単離、精製されたＤＮＡ配列を含有するプラスミド。
【請求項１５】
請求項１４記載のプラスミドにより形質転換、形質導入もしくはトランスフェクションされた宿主細胞。
【請求項１６】
野生型コレラホロトキシンに比較して低下された毒性をもち、そしてコレラホロトキシンのＡサブユニットの位置２９のグルタミン酸残基がヒスチジン残基で置換されている、免疫原性変異コレラホロトキシンの製造方法であって、請求項１４記載のプラスミドにより宿主細胞を形質転換、形質導入もしくはトランスフェクションする工程、およびこうして得られた宿主細胞を該宿主細胞により該免疫原性解毒化タンパク質の発現を可能にする条件下で培養する工程を含んでなる、上記方法。
【請求項１７】
抗原組成物を製造するための、病原性細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫から選ばれる抗原と併用される、有効なアジュバント量の変異コレラホロトキシンの使用であって、該ホロトキシンホロトキシンが、野生型コレラホロトキシンに比較して低下された毒性をもち、そしてコレラホロトキシンのＡサブユニットの位置２９のグルタミン酸残基がヒスチジン残基により置換されており、かつ、該ホロトキシンが、該抗原に対する脊椎動物宿主における免疫応答を増強する、上記使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
発明の分野
本発明は、選択された抗原に対する脊椎動物宿主における免疫応答を増強するためのアジュバントとしての、野生型コレラトキシンに比較して低下された毒性をもち、そしてコレラホロトキシンのＡサブユニットの位置２９のグルタミン酸についてアスパラギン酸以外の置換をもつ、免疫原性変異コレラホロトキシンの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
免疫系は、病原体を攻撃するために種々のメカニズムを使用する。しかしながら、これらのメカニズムのすべてが、免疫感作後に必ずしも活性化はされない。免疫感作によって誘導される防御免疫は、病原体に抵抗するか、またはそれを除去するための適当な免疫応答を誘起するワクチンの能力に依存する。病原体に応じて、これは、細胞媒介性および／または体液性免疫応答を要求するであろう。
【０００３】
免疫原もしくは抗原と一緒に投与される場合免疫応答を増強する物質は、アジュバントとして知られている。
【０００４】
グラム陰性細菌ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）は、胃腸疾患コレラの病原因子である。Ｖ．コレレによって引き起こされる下痢は、コレラトキシン（ＣＴ）の分泌による。
【０００５】
ＣＴは、トキシンの酵素活性に関与する１個の単一Ａサブユニット（ＣＴ−Ａ）、そして腸上皮細胞、ならびに細胞の表面にガングリオシドＧＭ1を含有する他の細胞へのトキシンの結合に係わる５個の同一Ｂサブユニット（ＣＴ−Ｂ）を含有する。共同して、ＣＴ−ＡおよびＣＴ−Ｂサブユニットは、ホロトキシンを含有する。ＣＴの配列は、既に記述されている（文献１）。
【０００６】
ＣＴａは、１個のＡポリペプチドおよび５個の同一Ｂポリペプチドからなるヘキサヘテロマー複合体である（２）。Ｂペンタマーは、細胞表面レセプターガングリオシドＧＭ1への結合に必要とされる（３）。Ａサブユニットは、Ｃ１８７およびＣ１９９間に単一のジスルフィド結合されたループ内でタンパク質分解的に開裂されて、酵素的に活性なＡ１ポリペプチド（４）およびより小さいポリペプチドＡ２を生成することができ、これはＢペンタマーにフラグメントＡ１を結合する（５）。腸細胞（ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅ）内へ入ることによって、ＣＴ−Ａ１は、調節Ｇタンパク質（Ｇｓα）をＡＤＰ−リボシル化し、これが、アデニル酸シクラーゼの構成的活性化、ｃＡＭＰの細胞内濃度の増加、そして小腸の管腔内へ液および電解質の分泌をもたらす（６）。イン・ビトロの、ＣＴのＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性は、ＡＲＦと呼ばれる補助タンパク質（７）、真核生物内の小胞伝達に関与しているＧＴＰ結合タンパク質、の存在によって刺激される。
【０００７】
効果的な免疫感作操作の必要性は、胃腸、肺、鼻咽頭もしくは性尿器に急性感染症を惹起したり、またそれらを通して体内へ入り込む感染性生物に関して特に大きい。これらの場所は粘液に浸されていて、大部分が分泌ＩｇＡからなる免疫グロブリンを含有する（８，９，１０）。この抗体は、これらの粘膜下にある固有層領域に浸潤している多数のＩｇＡ産生形質細胞に由来する（１１，１２）。ＩｇＡは、特に、分泌成分の作用をとおして管腔表面に輸送される（１３）。  しかしながら、非経口的免疫感作養生は、分泌ＩｇＡ応答を誘導するには、通常は効果的ではない。分泌免疫は、ほとんどが、粘膜に関連するリンパ組織の直接免疫感作を介して達成される。１つの粘膜部位におけるそれらの誘導に続いて、ＩｇＡ産生形質細胞の前駆体が、高率のＩｇＡ合成への最終分化が起きる多様な粘膜組織まで溢出し、播種する（１４，１５，１６）。広範な研究が、この共通する粘膜性免疫系を誘導するための粘膜免疫感作の可能性を例証した（１７）、しかし、わずかな例外はあるが、効果的な免疫感作を達成するために求められる大用量の抗原が、精製ワクチン抗原に関してこのアプローチを実際的ではないものにした。ＣＴは、もっとも有力なアジュバントの１つであり、そして無関係な抗原とＣＴの同時投与が、その抗原に対して同時に起こる循環性および粘膜性抗体応答の誘導をもたらすことが知られている（１８）。かくして、ＣＴはアジュバントとして働くことができる。
【０００８】
野生型ＣＴによって惹起される下痢という望ましくない症候を減退するために、低下された毒性をもつＣＴホロトキシンの形態をアジュバントとして使用することは好ましいことであろう。かくして、ＣＴホロトキシンの毒性を低下しつつも免疫応答を増強することができる変異ＣＴホロトキシンを同定するニーズが存在する。
【０００９】
発明の概要
したがって、本発明の目的は、病原性細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫から選ばれる抗原に対して脊椎動物宿主における免疫応答を増強する抗原組成物において、アジュバントとして野生型ＣＴに比較して低下された毒性をもつ変異形態のＣＴホロトキシンを利用することである。
【００１０】
本発明のこれらの目的は、グルタミン酸残基が、アスパラギン酸以外のアミノ酸によって置換されている、Ａサブユニットのアミノ酸２９にける点変異を特徴とする変異コレラホロトキシンを用いて達成される。本発明の特定の実施態様では、アミノ酸２９はヒスチジンである。変異されたＣＴ（また、ＣＴ−ＣＲＭと言及される）は、病原性細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫から選ばれる抗原に対する脊椎動物宿主における免疫応答を増強するために、抗原組成物においてアジュバントとして有用である。変異ＣＴは、慣用の技術を用いて、野生型ＣＴをコードしているＤＮＡの部位特異的変異誘発によって作成される。抗原組成物は、希釈剤もしくはキャリヤーをさらに含有してもよい。
【００１１】
また、本発明は、ホロトキシンが、野生型ＣＴに比較して低下された毒性をもち、そしてコレラホロトキシンのＡサブユニットのアミノ酸位置２９のグルタミン酸が、アスパラギン酸以外のアミノ酸、特にヒスチジンによって置換されている、有効なアジュバント量の変異コレラホロトキシンを含むことによって、病原性細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫から選ばれる抗原を含有する抗原組成物の、脊椎動物宿主の免疫応答を誘起する能力を増強する方法に対向される。
【００１２】
さらに、本発明は、コレラホロトキシンのＡサブユニットの位置２９のグルタミン酸についてアスパラギン酸以外の置換をもつ免疫原性変異コレラホロトキシンをコードしているＤＮＡ配列を含み、そしてそのようなＤＮＡ配列がアラビノース誘導プロモーターに操作可能に結合されている単離、精製されたＤＮＡ配列を含有するプラスミド、ならびにそのようなプラスミドにより形質転換、形質導入もしくはトランスフェクションされた適当な宿主細胞に関する。免疫原性変異コレラホロトキシンは、上記プラスミドにより宿主細胞を形質転換、形質導入もしくはトランスフェクションし、そして宿主細胞による該組み換え免疫原性解毒化タンパク質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって生産される。
【００１３】
発明の詳細な記述
抗原組成物のためのアジュバントとして変異形態の利用が、本明細書において記述される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において変異ＣＴクローン（ＣＴ−ＣＲＭ）のセットが生成された。データは、より優れたアジュバント性をもつＣＴ−ＣＲＭが、Ａサブユニットにおける位置２９に非保存アミノ酸置換（グルタミン酸からヒスチジンへ）をもつ変異体（ＣＴ−ＣＲＭE29H）であることを示している。累積データは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hがホロトキシンであり、そして野生型ＣＴより低い毒性であることを例証する。重要なことには、ＣＴ−ＣＲＭE29Hは、全く異なるワクチン抗原の胃内（ＩＧ）もしくは鼻内（ＩＮ）いずれかの投与に続いて、粘膜性および全身性免疫応答を増大することができる。これらのワクチン抗原は、いずれか細菌もしくはウイルス病原体に由来する。ヘリコバクター・フェリス（Ｈｅｒｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｆｅｌｉｓ）、ロタウイルスおよび呼吸シンシチアルウイルス（ＲＳＶ）感染のマウスモデルにおける結果は、ＣＴ−ＣＲＭE29Hで調製されたワクチンによる胃内もしくは鼻内免疫によって助長される免疫応答は防御的であることを示している。データは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hが、野生型ＣＴと少なくとも同様にアジュバントとして活性があることを示している。前以て存在する抗ＣＴ免疫応答の存在においてさえも、ＣＴ−ＣＲＭE29Hは、粘膜アジュバントとして役立つことができる。
【００１４】
変異ＣＴ−Ａは、ＣＴ−Ｂと集合して、そのアジュバント性において野生型ＣＴに類似するホロトキシンを形成する能力を保持していたが、野生型ＣＴに比較して低下された毒性を示した。Ｂサブユニットは、それらの本来の配列をもっていても、またそれ自体変異されていてもよい。
【００１５】
得られる低下されたレベルの毒性は、アジュバントとしての使用のための改変されたＣＴを提供する。本発明による免疫原性変異ＣＴは、抗原組成物により免疫される脊椎動物宿主よって安全に許容される一方、そのタンパク質がアジュバントとして機能するように、低下された毒性と保持されるアジュバント性のバランスを発揮する。
【００１６】
本発明の抗原組成物は、病原性細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫から選ばれる抗原、およびＣＴが、野生型ＣＴに比較して低下された毒性をもち、そしてコレラホロトキシンのＡサブユニットの位置２９のグルタミン酸が、アスパラギン酸以外のアミノ酸によって置換されている変異ＣＴの有効なアジュバント量を含んでなる抗原組成物の投与後、脊椎動物宿主の抗体応答および細胞媒介免疫応答を改良することによって免疫応答を調節する。本発明の特に好適な実施態様では、アミノ酸２９はヒスチジンである。
【００１７】
本明細書に使用されるように、用語「ホロトキシンは低下された毒性をもつ」は、ＣＴ−ＣＲＭ変異体、例えばＣＴ−ＣＲＭE29Hが、野生型ＣＴに比較して、精製トキシンタンパク質の１単位当たり実質的に低い毒性を示すことを意味し、このことは、その変異体を、有意な副作用を惹起することなく抗原組成物においてアジュバントとして使用することを可能にする。
【００１８】
本明細書に使用されるように、用語「有効なアジュバント量」は、脊椎動物宿主において増強された免疫応答を誘起するのに適当である、ＣＴ−ＣＲＭ変異体、例えばＣＴ−ＣＲＭE29Hの用量を意味する。特定の用量は、年令、体重および宿主の医療条件、ならびに投与方法に依存するであろう。適当な用量は、当業者によって容易に決定される。
【００１９】
５種のＣＴ−ＣＲＭが、Ａサブユニットにおける次の変異により、以下の実施例１に記述されるように作成された：
【００２０】
【表１】
0004673974.tif 000002
【００２１】
ＣＴの構造および機能に及ぼすこれらの変異の表現型効果が、次に調査された。
【００２２】
変異体ＣＴ−ＡのＲ７Ｋ，Ｅ２９Ｈ，Ｅ１１０ＤおよびＥ１１２Ｄは、ガングリオシドＧＭ1結合アッセイによって決定されるように、免疫反応性ホロトキシンに組み立てることができる（図１）。しかしながら、精製Ｒ１１Ｋの一部分は、実施例２において記述されるポリクローナル抗体により試験された場合、ホロトキシンではないように見えた。
【００２３】
各ホロトキシン変異体は、Ｙ−１副腎腫瘍細胞アッセイ（１９）において試験されて、野生型ＣＴホロトキシンに比較されるその残存毒性を決定された。表２に提示される結果は、ＣＴ−ＣＲＭE29Hおよび市販のＣＴ−Ｂ（Ｓｉｇｍａ）が、１．２％の残存毒性をもつことを例証した。市販のＣＴ−Ｂに伴う１．２％の残存毒性は、混入しているＡサブユニット（約０．５％）によることがもっとも考えられる。アミノ酸位置７，１１，１１０もしくは１１２に変異をもつ残りのＣＴ−ＣＲＭの残存毒性は、０．４％未満もしくは同等であった。
【００２４】
ＣＴ−ＣＲＭE29Hは、毒性のイン・ビボ測定として腸管液滞留を評価する開出マウス消化管重量アッセイ（２０）において試験された。表３に提示される結果は、ＣＴ−ＣＲＭE29Hが、野生型ＣＴよりもマウスの腸管中への液滞留における増加を刺激することにおいて有意に低い活性があることを例証した。
【００２５】
また、各ＣＴ−ＣＲＭは、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性アッセイにおいてＣＴに比較された。結果は、一般に、Ｙ−１副腎細胞アッセイにおいて得られたものと一致し、そしてＡ１サブユニットにおける変異は、野生型ＣＴに比較された場合、種々のＣＴ−ＣＲＭによって減少されたＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性をもたらすことを示唆した（表４）。最大の酵素活性をもつ変異体は、ＣＴ−ＣＲＭE29Hであると考えられる。この活性は、野生型ＣＴの約１０％であった。
【００２６】
ＣＴ−ＣＲＭE29Hの３７℃におけるトリプシン消化は、ウエスタンブロット解析に基づいて、野生型ＣＴの処理とは区別できない様式でフラグメントＡ１およびＡ２へのＣＴ−Ａの開裂を惹起した。これは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hの構造が、野生型ＣＴのそれに類似している証拠をさらに提供する。
【００２７】
Ｙ−１副腎腫瘍細胞およびＡＤＰ−リボシル化活性アッセイにおけるＣＴ−ＣＲＭE29Hの活性の明らかな差異は、後者のアッセイにおける変異ホロトキシンのトリプシン活性化によっている。かくして、Ｅ．コリにおける低下されたプロテアーゼ活性によるＡ１およびＡ２サブユニットへのＣＴ−Ａ開裂の欠如は、Ｅ．コリ発現ＣＴ−ＣＲＭE29Hの弱毒化に貢献する。総括すると、蓄積されたデータは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hは、ガングリオシドＧＭ1に結合するホロトキシンであり、そして野生型ＣＴより有意に低い毒性があることを示す。
【００２８】
一連の研究は、次のようなワクチン候補として同定された細菌もしくはウイルス抗原を含有する組成物について、粘膜アジュバントとしてのＣＴ−ＣＲＭE29Hの有効性を評価するべく導びかれた：（１）型検出不能の（ｎｏｎｔｙｐａｂｌｅ）ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（ＮＴＨｉ）組み換えＰ４タンパク質、またタンパク質「ｅ」（ｒＰ４）として知られる（２１）、組み換えＮＴＨｉＰ６タンパク質（ｒＰ６）（２２）、および精製されたネイティブのヘモフィルス・インフルエンゼ接着および浸透（Ｈａｐ）タンパク質（２３）；（２）ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｒｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）組み換えウレアーゼタンパク質（ｒウレアーゼ）（２４）；（３）ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）グループＢ組み換えクラス１ピリン（２５）およびナイセリア・メニンギチジスグループＢクラス１外膜タンパク質（２６）；（４）呼吸シンシチアルウイルス精製ネイティブ融合タンパク質（ＲＳＶ  Ｆ）（２７）；および（５）ロタウイルスの２／６−ウイルス様粒子（２８）。
【００２９】
ＣＴ−ＣＲＭE29Hは、ＮＴＨｉ  ｒＰ４およびｒＰ６タンパク質のためのアジュバントとして４種の他のＣＴ変異体および野生型ＣＴと比較された。結果は、５種の異なるＣＴ−ＣＲＭｒＰ４およびｒＰ６タンパク質の、全身性体液性免疫応答を誘起する能力を増大することを示した（表５および６）。例えば、３次のＩＮ免疫感作２週後、ＣＴ−ＣＲＭE29HもしくはＣＴ−ＣＲＭE110Dのいずれかとともに製剤化されたｒＰ４およびｒＰ６タンパク質により免疫感作されたマウスの抗ｒＰ４ＩｇＧ抗体タイターは、ＰＢＳ単独中の組み換えタンパク質により免疫感作されたマウスのそれよりも４０倍高かった（表５）。組み換えタンパク質プラス野生型ＣＴホロトキシンを投与されたマウスの抗体タイターは、２０倍に上昇された。ＣＴ−ＣＲＭR11Kにより免疫感作されたマウスの抗ｒＰ４抗体タイターは、１０倍上昇された。
【００３０】
血清が、抗ネイティブＰ６抗体タイターについて試験された場合は、より劇的な違いさえ観察された。２次ＩＮ免疫感作２週後、ワクチンに製剤化されたＣＴ−ＣＲＭE29HもしくはＣＴ−ＣＲＭE110Dのいずれかにより免疫感作されたマウスの血清抗ネイティブＰ６抗体タイターは、ｒＰ６プラスＰＢＳにより免疫感作されたマウスのそれよりも３０倍以上大きかった。比較すると、野生型ＣＴを用いて調製されたワクチンは、ＰＢＳで調製された製剤によって生じるタイターよりも９０倍大きい抗ネイティブＰ６抗体タイターを誘起した。ＣＴ−ＣＲＭE112D、ＣＴ−ＣＲＭR7KもしくはＣＴ−ＣＲＭR11K製剤のいずれかにより免疫感作されたマウスの抗ネイティブＰ６抗体タイターは、ＰＢＳ単独とともに製剤化されたｒＰ４プラスｒＰ６により免疫感作されたレシピエントのそれよりも２〜４倍高いだけであった。  さらに、３次免疫感作２週後の粘膜分泌液におけるタンパク質特異的抗体の試験は、ＣＴ−ＣＲＭが、ｒＰ４タンパク質に対する局所的免疫応答の生成を促進することを示した。さらにまた、抗ｒＰ４抗体タイターが、野生型ＣＴによって誘導されるそれらと比較された（表７）。局所的抗体タイターは、ネイティブＰ６タンパク質に対しては検出されなかった（データ未掲載）。かくして、データは、一緒にすると、ｒＰ４およびｒＰ６タンパク質に対する両全身および局所的抗体応答を生成するために、もっとも都合のよい変異ＣＴは、位置２９もしくは１１０において変異を含有するＣＴ−ＣＲＭであることを示唆した。
【００３１】
付加的研究は、アジュバントとしてのＣＴ−ＣＲＭE29Hの潜在力を確認し、そしてＩＮ免疫感作のために適当な用量を決定するために遂行された（表８）。その結果は、ＣＴ−ＣＲＭE29H１μｇが、ｒＰ４タンパク質に対する最大の全身的および局所的体液性免疫応答を促進することを示した。ＣＴ−ＣＲＭE29Hの用量が、１用量当たり１〜１０もしくは３０μｇに増加された場合、両全身および粘膜性免疫応答は減少された。例えば、ＣＴ−ＣＲＭE29H１０μｇにより免疫感作されたマウスの血清抗Ｐ４ＩｇＧ抗体タイターは、研究４８日目においてＣＴ−ＣＲＭE29H１μｇにより免疫感作されたマウスのそれの７分の１であった（表８）。さらにまた、前者のグループの気管支肺胞および膣洗浄液からの局所的抗Ｐ４ＩｇＡ抗体タイターは、４９日目のマウスの後者のグループのそれの３〜４分の１および６分の１であった。このデータは、ｒＰ４プラスｒＰ６／ＣＴ−ＣＲＭE29Hにより免疫感作されたマウスの局所的および全身的体液性免疫応答は、野生型ＣＴアジュバントのワクチンによる免疫感作後に達成されるものと本質的に同じであった（表８）。
【００３２】
Ｈａｐタンパク質による免疫感作によって誘起される血清抗体応答に及ぼすＣＴ−ＣＲＭE29H添加の効果が試験された。ＣＴ−ＣＲＭE29Hの添加は、Ｈａｐタンパク質に対する血清抗体応答の誘導を助けた（表９）。免疫応答は、７週の血清において見られた；抗体タイターはより早期の血清には検出されなかった。免疫マウスから得られた血清の抗ＨａｐのＥＬＩＳＡタイターが表９に示される。応答は用量依存様式で増強し、そしてＣＴ−ＣＲＭE29H０．１μｇの添加によって約３倍増大した。この増大は、両用量レベルにおいて生じた。
【００３３】
エィッチ・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）のｒウレアーゼによる胃内（ＩＧ）免疫感作後、全身および局所的体液性免疫応答を増大する５種の異なるＣＴ−ＣＲＭの潜在力が、マウスモデルを用いて調査された。結果は、鼻内投与後にＮＴＨｉタンパク質により得られた結果に類似していた。データは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hが、ＩＧ免疫感作後の全身および局所的体液性免疫応答を増大するために、もっとも強い能力をもつ変異体であることを示した。ＣＴ−ＣＲＭE29Hで製剤化されたワクチンによって誘起された幾何平均血清抗ｒウレアーゼＩｇＧ（表１０）およびＩｇＡ（表１１）抗体タイターは、研究２８日目にはＣＴ−ＣＲＭE110Dによって誘導されるものよりも、それぞれ６および７倍大きかった。さらにまた、ＣＴ−ＣＲＭE29Hで製剤化されたワクチンによって誘起された血清ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体タイターは、野生型ＣＴを含有するワクチンによって生成されるものに等しかった。
【００３４】
もっとも重要なことには、ＣＴ−ＣＲＭE29Hとともに製剤化されたｒウレアーゼによるＩＧ免疫感作は、最大の局所的体液性免疫応答を生成するようであった（表１２）。このことは、気管支肺胞洗浄液の試験後に、もっとも明瞭であった。気管支肺胞洗浄液における抗ｒウレアーゼＩｇＡ抗体タイターは、ＣＴ−ＣＲＭE110Dで調製されたワクチンによって誘起されるものよりも５倍大きかった。野生型ＣＴ製剤と比較して、抗ｒウレアーゼＩｇＧ抗体タイターは５分の１のレベルであった。しかしながら、ＣＴ−ＣＲＭE29Hで製剤化されたワクチンにより免疫感作された群の膣洗浄液中のタンパク質特異的ＩｇＡ抗体タイターは、野生型ＣＴで調製されたワクチンによって誘起されるものに本質的に等しかった（表１２）。
【００３５】
非経口的免疫感作が、ＣＴ−ＣＲＭE29Hで調製されたワクチンによってＩＧ免疫感作されたマウスにおいて誘起されるものと比較した場合、気管支肺胞洗浄液中の顕著なｒウレアーゼ特異的ＩｇＡ抗体を誘起しなかったことを、データが暗示していることは、注目する価値があった（表１２）。
【００３６】
したがって、第２の研究は、ＣＴ−ＣＲＭE29Hを用いて製剤化されたｒウレアーゼによって生成される免疫応答の有効性を試験するべく導かれた。そのデータは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hが、エィッチ・フェリス（ｆｅｌｉｓ）に対する防御免疫応答の誘導を支持する上で野生型ＣＴと同様に強力であることを示唆している（表１３）。前者の群の血清抗ｒウレアーゼＩｇＡ抗体タイターは、研究の２８日目において後者の群のマウスのタイターと等価であった。ｒウレアーゼ＋ＳｔｉｍｕｌｏｎTMＱｓ−２１により非経口的に免疫感作されたマウスの血清中のタンパク質特異的ＩｇＡ抗体タイターは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hで調製されたワクチンによりＩＧ免疫感作されたマウスのそれよりも１２倍大きかった。しかしながら、ＣＴ−ＣＲＭE29Hにより免疫感作されたマウスの気管支肺胞洗浄液中のタンパク質特異的ＩｇＡ抗体タイターは、非経口的に免疫感作されたマウスのそれよりも１０倍以上大きかった（表１３）。
【００３７】
結果は、ＩＧ免疫感作と胃組織からエィッチ・フェリス（ｆｅｌｉｓ）を取り除くマウスの能力との間の相関関係を示唆した。最後のチャレンジ後１０日目にＣＴもしくはＣＴ−ＣＲＭE29Hのいずれかとともに製剤化されたワクチンによりＩＧ免疫感作されたマウスの８０％が、胃組織からウレアーゼ含有細菌を取り除くことができた。反対に、ネイティブ対照マウス（１０％）、ｒウレアーゼ＋ＰＢＳ単独でＩＧ免疫感作されたマウス（２０％）、またはＳｔｉｍｕｌｏｎTMＱｓ−２１と混合されたｒウレアーゼにより皮下に免疫感作されたマウス（３０％）は、エィッチ・フェリス（ｆｅｌｉｓ）を根絶する能力は低いようであった（表１３）。データが、有効性と気管支肺胞洗浄液中のタンパク質特異的ＩｇＡ抗体タイターとの間の関係を示唆しなかったことは、注目に値する。ｒウレアーゼ＋野生型ＣＴによりＩＧ免疫感作されたマウスの気管支肺胞洗浄液中のタンパク質特異的ＩｇＡ抗体タイターは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hで免疫感作されたマウスの１０分の１であった（表１３）。なお８０％の防御は、いずれのワクチンによっても達成された。かくして、肺組織における局所的体液性免疫応答を追跡することは、胃において生じる防御免疫応答にはほとんど関係をもたないかもしれない。
【００３８】
Ｃ５７Ｂ１／６マウスは、ＢＡＬＢ／ｃマウスとは異なり、エィッチ・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）による感染後のヒトにおいて観察されたものに類似する疾患に会うことが、Ｄｒ．Ｊａｎｉ  Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ；私信）によって示唆された。胃組織からエィッチ・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）を除去するべくＣＴ−ＣＲＭE29Hによって促進される抗ｒウレアーゼ免疫応答の有効性を試験するため、別の一連の研究がＣ５７Ｂ１／６マウスを用いて開始された。その結果は、ＣＴ−ＣＲＭE29Hを用いて製剤化されたｒウレアーゼによるＩＧ免疫感作は、野生型ＣＴを用いて製剤化されたｒウレアーゼによって誘起されるものに類似する全身および局所的体液性免疫応答を生じることを示唆した（表１４）。研究２８日目に野生型ＣＴもしくはＣＴ−ＣＲＭE29Hいずれかで調製されたワクチンによって免疫感作されたマウスの血清および気管支肺胞と膣洗浄液抗ｒウレアーゼＩｇＡ抗体タイターは区別することはできなかった。唯一相違は、ＣＴ−ＣＲＭE29Hで調製されたワクチンにより免疫感作されたマウスからの糞ペレットの抽出液中に検出されたＩｇＡ抗体タイターであり、これは３倍高かった（表１４）。ｒウレアーゼ＋ミョウバンにより非経口的に免疫感作されたマウスの糞中のタンパク質特異的ＩｇＡ抗体タイターは、野生型ＣＴかＣＴ−ＣＲＭE29Hいずれかの製剤でＩＧ免疫感作されたマウスのそれよりも実質的に低かった（それぞれ、３８分の１および１４分の１）ことは注目に値された。かくして、Ｃ５７Ｂ１／６マウスモデルは、ＩＧ免疫後生じる免疫応答をアジュバントするＣＴ−ＣＲＭE29Hの能力を調査することを可能にすると考えられた。さらにまた、そのモデルが、エィッチ・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）から粘膜表面を防御する上での局所的および全身的免疫応答の役割を確定することができることを、データは示した。
【００３９】
ＣＴが、粘膜性免疫応答のためのアジュバントとして禁忌されるということが報告された（３０，３１）。ＣＴが、ワクチンを望ましくない高いＩｇＥ抗体タイターを誘起させるという仮説があった。ＩｇＥは、過敏性およびアレルギー反応に関連する。さらに、Ｅ．コリの熱に不安定なトキシン（ＬＴ）、またはＬＴ−ＣＲＭ、は、高いＩｇＥ抗体タイターを誘起する能力が低いことが示唆された。それ故、ＬＴもしくはＬＴ−ＣＲＭは、粘膜性免疫応答の生成のための、より適当なワクチンアジュバントであることが結論された。この仮説を試験するために、ｒウレアーゼからなるワクチンが、ＣＴ、ＬＴもしくはＣＴ−ＣＲＭE29Hのいずれかを用いて製剤化され、そしてＣ５７Ｂ１／６マウスにおいてＩＧ免疫後のＩｇＥ抗体誘起能について試験された（表１５）。データは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hもしくは野生型ＣＴいずれかで調製されたワクチンは、野生型ＬＴよりも、循環中に総合的またはウレアーゼ特異的ＩｇＥ抗体を産生する可能性が低いことを示唆した。実際に、ＣＴ−ＣＲＭE29Hによって製剤化されたワクチンは、上昇されたＩｇＥ抗体タイターを生成する可能性が低いことが示唆された。両終点の総合およびｒウレアーゼ特異的ＩｇＥ抗体タイターは、野生型ＬＴを用いて調製されたワクチンによって免疫感作されたマウスのそれの４分の１であった（表１５）。かくして、これらのデータは、少なくともｒウレアーゼ製剤では、ＣＴ−ＣＲＭE29Hが、アジュバントとしてＬＴよりも好ましいことを示唆する。
【００４０】
理論に拘束されることなく、近年、ｖａｎ  ｄｅｎ  Ａｋｋｅｒら（３２）によって提案されたＬＴ活性のメカニズムは、Ｅ２９内もしくは周辺において改変されたＣＴ変異体の低下された毒性についてより可能性のある説明を提示している。ジスルフィドループの開裂およびドメインＡ１とＡ２に結合しているジスルフィド結合の還元後、Ａ１ドメイン中の残基３０−３３からなるループは、ドメインＡ２の長いらせんの動きの結果として位置を変化することが提案されている。Ｅ２９についての置換は、ループ３０−３３の行動を変化させ、ＣＴ−Ａ１の低い活性化をもたらすであろう。また、ＣＴ−Ｙ３０ＷＡＨおよびＣＴ−Ｇ３４ＧＧＰの低下された毒性に関する可能性のある説明は、ＣＴ−Ａ１の活性化に有害である３０−３３ループへの影響によって解釈できる。提案された活性化経路における次の段階は、全２５−３６ループの動きであり、これは、Ｒ２５およびＹ５５間の相互作用を破壊する。ＣＴ−Ｒ２５Ｇは、ＣＴ−Ｒ２５Ｗよりも大きい度合で毒性における低下を示したが、多分その理由は、Ｒ２５およびＹ５５の側鎖が疎水的な相互作用に関与していて、ＣＴ−Ｒ２５Ｗによっては保持されるが、ＣＴ−Ｒ２５Ｇでは保持されないからであろう。本発明者らの変異体の表現型は、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ａｋｋｅｒら（３２）によって提案された熱不安定エンテロトキシンの活性化のモデルと一致する。
【００４１】
一連の実験は、ナイセリア・メニンギチジス  グループＢ由来の２種のワクチン候補のための粘膜および非経口アジュバントとしてのＣＴ−ＣＲＭE29Hの有効性を評価すべく誘導された。第１の候補は、組み換えクラス１ピリン（ｒピリン）であった（２５）。第２の候補は、クラス２／３タンパク質を発現しない変異髄膜球菌株によって発現されるクラス１外膜タンパク質（ＰｏｒＡ）であった（２６）。
【００４２】
粘膜アジュバント効果は、第１の実験において示され、そこではｒピリン特異的血清ＩｇＧ抗体は、ＣＴ−ＣＲＭE29H添加群において増強され、生理食塩水中ｒピリンを受けているマウスにおいて得られたタイターに比較して３〜１９倍の増加にわたった（表１６）。また、特異的血清ＩｇＡは、ＣＴ−ＣＲＭE29H（両０．１および１．０μｇにおいて）において送達されたｒピリンにより免疫感作されたマウスでは２〜５倍増強された。ＣＴ−ＣＲＭE29H（１μｇ）が、鼻、膣および気管支肺胞洗液においてｒピリン特異的ＩｇＡを３〜１０倍増強したことは注目に値する。さらにまた、ｒピリン＋ＣＴ−ＣＲＭE29HによるＩＮ免疫感作は、グループＢのＮ．メニンギチジス同族菌株による鼻コロニー形成を、Ｓｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスにおいて検出レベルまで有意に低下させた（図２）。
【００４３】
第２の実験は、ＣＴ−ＣＲＭE29Hが、同族の髄膜球菌株に対するｒピリンの防御を増強することを例証するべく誘導された。表１７に示されるように、髄膜球菌Ｂの全細胞ＥＬＩＳＡの血清ＩｇＧタイターは、ｒピリン＋ＣＴ−ＣＲＭE29H群において、ｒピリンのみを受けているマウスかのタイターに比較すると、同族菌株、ならびに異種菌株ＦＡＭ１８およびＭ９８２に比べて少なくとも４倍増強された。対照として、ＫＬＨプラスＣＴ−ＣＲＭE29Hにより免疫感作されたマウスは、全細胞ＥＬＩＳＡにおいては試験されたいずれの菌株に対しても血清ＩｇＧを誘導しなかった。表１８では、ｒピリン特異的ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体は、アジュバントされなかった群に比較すると、ｒピリン＋ＣＴ−ＣＲＭE29H群において実質的に増強された。さらに、ｒピリンのための粘膜アジュバントとしてのＣＴ−ＣＲＭE29Hは、同族のグループＢ髄膜球菌株による鼻のコロニー形成に対してマウスを防御した（図３）。
【００４４】
次に、ＩＮ免疫感作におけるＰｏｒＡプラスＣＴ−ＣＲＭE29Hの免疫原性が例証された。ＣＴ−ＣＲＭE29HをアジュバントされたＰｏｒＡを受けている群は、Ｎ．メニンギチジスＨ４４／７６全細胞に対して増強された血清ＩｇＧ抗体を産生し、そしてアジュバントされなかったＰｏｒＡ群と比べて７および１４倍高いＰｏｒＡ特異的抗体を産生した（表１９）。しかしながら、ＰｏｒＡＨ４４／７６に対する血清ＩｇＡ抗体は検出されなかった。また、収集されたいずれの粘膜分泌サンプルにおいても、ＰｏｒＡ特異的抗体は検出されなかった（表１９）。
【００４５】
第４の実験は、ＣＴ−ＣＲＭE29Hが、異種の髄膜球菌株に対するｒピリンもしくはＰｏｒＡいずれかによる防御を増強することを例証するべく誘導された。特に、表２０からのデータは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hとともに送達されたクラス１ｒピリンもしくはＰｏｒＡのＩＮ投与は、抗体および髄膜球菌Ｂの全細胞に対して高い血清抗体タイターを誘起したのみならず、また、グループＢのＮ．メニンギチジスの異種菌株による鼻コロニー形成に対してＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを防御した。特に、ＣＴ−ＣＲＭE29Hは、アジュバントされなかった群のそれに比べられるようなクラス１ｒピリンに対する血清抗体応答を増強した。同様に、アジュバントされたクラス１ｒピリン群は、細菌の増強された鼻クリアランスを提供した。
【００４６】
次に、髄膜球菌の非経口免疫感作のためのアジュバントとして用いられるＣＴ−ＣＲＭE29Hの能力が試験された。図５に示されるように、ＭＰＬTMもしくはＣＴ−ＣＲＭE29HのいずれかによりアジュバントされたＰｏｒＡ  Ｈ３５５が、グループＢ髄膜球菌異種株８７０２２７の鼻コロニー形成を有意に低下した。特に、ＰｏｒＡＨ３５５プラスＣＴ−ＣＲＭE29Hにより皮下に免疫感作されたマウスは、鼻の２４時間後チャレンジにおいてＰｏｒＡＨ３５５プラスＭＰＬTM群よりも全く有意に少ないコロニーを有した、しかしながら、殺細菌活性は、単にＰｏｒＡのみで免疫感作した群およびＭＰＬTMでアジュバント化された熱殺菌全細胞で免疫感作された群からのそれぞれの血清において検出された（表２２）が、ＰｏｒＡプラスＣＴ−ＣＲＭE29H群からでは検出されなかった。ＣＴ−ＣＲＭE29HをアジュバントされたＰｏｒＡは、ＭＰＬTMアジュバントのそれに類似する同族の殺細菌活性を誘起しなかったけれども、異種グループＢ髄膜球菌株によるコロニー形成を低下する上で高度に有効であった。
【００４７】
呼吸シンシチアウイルス（ＲＳＶ）糖タンパク質に対する全身および粘膜性免疫応答を増強するＣＴ−ＣＲＭE29Hの能力が、精製されたネイティブ融合（Ｆ）タンパク質を用いて試験された。さらに、アジュバントとしてのＣＴ−ＣＲＭE29Hの効力に及ぼす既に存在している抗ＣＴ抗体の影響が研究された。その結果は、ＣＴもしくはＣＴ−ＣＲＭE29HのいずれかでアジュバントされたＦタンパク質によってＩＮに免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃマウスは、全身および局所的抗ＣＴ  ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体タイターを生成することを例証した（表２３）。さらにまた、データは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hを含有する製剤によって生成された抗体タイターが、野生型ＣＴを含有する製剤によって誘起されるそれに等しいことを示した。例えば、Ｆタンパク質／ＣＴ−ＣＲＭE29H（１用量当たり１μｇ）による第２次免疫１０日後に、血清抗ＣＴ  ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体タイターは、Ｆタンパク質／ＣＴ（１用量当たり１μｇ）により免疫感作されたマウスのそれよりもわずかに低かった。同様の結果が、また、１もしくは１０μｇＣＴ−ＣＲＭE29Hとともに調製されたＦタンパク質により免疫感作されたマウスからの膣洗浄液の試験後に得られた（表２３）。したがって、データは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hが野生型ＣＴと同じくらい免疫原性であることを示唆している。
【００４８】
抗ＣＴ免疫応答がＦ抗原の免疫原性に悪影響を与えるか否かの問題が、ＢＡＬＢ／ｃマウスが、ＰＢＳ単独中のいずれか野生型ＣＴもしくはＣＴ−ＣＲＭE29Hによる２回のＩＮ投与によって１次感作された第２の実験において調べられた（表２４）。その後、適当なマウスが、いずれか野生型ＣＴもしくはＣＴ−ＣＲＭE29Hと混合されたＦタンパク質によって２回免疫感作された。最後の投与後２週目（５６日目）に回収された血清の検査は、既に存在している抗ＣＴ抗体が、局所的もしくは全身的抗Ｆタンパク質ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体のレベルにおいてネガティブな影響をもたないことを示した。事に、データは、既に存在している抗ＣＴ抗体が抗Ｆタンパク質抗体応答の生成には有利であることを示した。このことは、粘膜表面に誘起された抗Ｆタンパク質抗体タイターが比較された場合にもっとも明白であった（表２４）。第２の免疫感作２週後、ＣＴ−ＣＲＭE29Hで１次感作され、次いでＦタンパク質／ＣＴ−ＣＲＭE29Hにより免疫感作されたマウスの気管支肺胞および膣洗浄液中の抗Ｆタンパク質ＩｇＡ抗体タイターは、Ｆタンパク質／ＣＴ−ＣＲＭE29Hのみにより免疫感作されたナイーブマウスのそれよりも、７および１７倍それぞれ大きかった（表２４）。
【００４９】
第３の実験では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質およびＣＴ−ＣＲＭE29H、ＣＴ−ＢもしくはミョウバンによりＩＮ免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃマウスの全身性および粘膜性免疫応答が検査された。表２５は、３次免疫感作後９日に収集された血清の体液性免疫応答を表す。Ｆタンパク質とＣＴ−ＣＲＭE29H１もしくは１０μｇを含有して免疫感作を受けたマウス（それぞれ群７７７および７７８）は、Ｆ／ＰＢＳ、Ｆ／ＡｌＯＨもしくはＲＳＶ（それぞれ７８４，７８５および９０７）により免疫感作されたマウスに比較した場合ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａについて有意に上昇したタイターを示した。さらに、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29Hを含有するワクチンによって生成されたタイター（７７７および７７８）は、Ｆタンパク質およびＣＴＢによって刺激されたタイター（７７９および７８０）と少なくとも同等であった。
【００５０】
気管支肺胞洗浄液、膣および鼻洗液が、最終免疫感作後１週目に免疫感作された動物から収集されてＩｇＧおよびＩｇＡ抗体ＥＬＩＳＡを遂行した。表２６に示されるデータは、マウス５匹のプールからのタイターを示す。ＣＴ−ＣＲＭE29Hにより免疫感作されたマウスは、両膣および鼻洗液（群７７７および７７８）において検出しうるＩｇＡを誘起した。ＩｇＡは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hにより免疫感作されたマウスから得られたＢＡＬ中には見られず、そしてこれは、ＲＳＶで免疫感作されたマウス（群９０７）およびＦ／ＣＴＢで免疫感作されたマウス（７８０）のＢＡＬにおいて見られるのとは対照的であった。ＩｇＧは、ＢＡＬからの洗液を含むすべての粘膜洗液において見い出された。ＣＴ−ＣＲＭE29H免疫感作されたマウスからの洗液に見られるＩｇＧのレベルは、ＣＴＢ（群７７９および７８０）および生ＲＳＶでの免疫感作によって得られたレベルに匹敵した。
【００５１】
第４の実験では、免疫マウス由来のイン・ビトロ刺激された脾細胞によって誘起される細胞溶解活性が調査された。データは図６に提示される。ＲＳＶ免疫感作マウスは、約６０％の抗原特異的細胞溶解を示したのに対して、残りの各マウスのＣＴＬ活性は、２０％未満に留まった。かくして、ＣＴ−ＣＲＭE29Hは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する両全身性および粘膜性体液性免疫応答を誘導できる（表２５および２６）けれども、ＲＳＶ感染した標的細胞に対する細胞媒介免疫応答は、観察されなかった。
【００５２】
第５の実験では、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29Hの鼻内送達が、生ＲＳＶチャレンジに対して防御を促進するか否かを研究するために、ウイルス防御アッセイが遂行された。データは図７に提示される。
【００５３】
図７に示される結果のＡＮＯＶＡによる統計的解析は、次ぎのとおりである：ｐ＜０．０５：Ｆ／ＰＢＳ対Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（１μｇおよび１０μｇＣＴ−ＣＲＭE29H）、Ｆ／ＣＴＢ（１μｇおよび１０μｇ）、Ｆ／ＡｌＯＨ．
ｐ＞０．０５：ＰＢＳ／ＣＴ−ＣＲＭE29H対Ｆ／ＰＢＳ
ｐ＞０．０５：Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（１μｇおよび１０μｇＣＴ−ＣＲＭE29H）対Ｆ／ＣＴＢ（１μｇおよび１０μｇ）対Ｆ／ＡｌＯＨ．
Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29HもしくはＦ／ＣＴＢを含有するＩＮワクチンを受けたマウスは、Ｆ／ＡｌＯＨにより筋肉内に免疫感作されたマウスにおいて達成されたタイターに匹敵する肺ウイルスタイターを有した（ｐ＞０．０５）。さらにまた、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29Hによる鼻内免疫感作は、Ｆ／ＰＢＳもしくはＰＢＳ／ＣＴ−ＣＲＭE29HそれぞれによるＩＮ免疫感作に比較してＬｏｇ10１．６およびＬｏｇ10１．４まで肺ウイルスタイターを低下するのが見られた。Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29HおよびＦ／ＰＢＳもしくはＰＢＳ／ＣＴ−ＣＲＭE29H間の差異は、統計的に有意であることが分かった（ｐ＜０．０５）。
【００５４】
第６の実験では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質およびＣＴ−ＣＲＭE29HもしくはミョウバンによりＩＮに免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃマウスの全身性および粘膜性免疫応答が調査された。表２７は、３次免疫後２週目に回収された血清の体液性免疫応答を示した。Ｆタンパク質およびＣＴ−ＣＲＭE29H１μｇを含有する免疫感作を受けたマウス（群２５６）は、Ｆ／ＰＢＳもしくはＰＢＳ／ＣＴ−ＣＲＭE29Hにより免疫感作されたマウス（それぞれ群２５０および２５７）に比較した場合、ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａについて有意に上昇されたタイターを表した。Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（２５６）およびＦ／ＡｌＯＨ（２５８）の間のＩｇＧ１タイターにおいては、有意な差異は観察されなかった。しかしながら、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29HによるＩＮ免疫感作は、Ｆ／ＡｌＯＨ（２５８）による免疫感作によって見られるものに比較して有意に上昇したＩｇＧ２ａタイターを誘起した。総括すれば、これらの結果は、表２５に提示された結果と一致する。血清ＩｇＡは、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29Hを受けているマウス群において検出されるけれども、そのタイターは、これまで観察されたよりも非常に低かった（群７７７について１６，２０２±２，０３１および群２５６について４４４±１，４５８）。明らかな差異の理由は分からない。それにもかかわらず、ＩＮ送達Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29Hの血清ＩｇＡ誘導能は、両研究において一致しており、そして有利には、これに関してはＦ／ＡｌＯＨの能力とは対照的である。
【００５５】
気管支肺胞洗浄液、膣および鼻洗液が、最終免疫感作後２週目に免疫感作された動物から収集されてＩｇＧおよびＩｇＡ抗体ＥＬＩＳＡを遂行した。表２８に示されるデータは、マウス５匹のプールからのタイターを示す。表２６に見られる結果に類似して、ＣＴ−ＣＲＭE29Hにより免疫感作されたマウスは、両膣および鼻洗液（群２５６）において検出しうるＩｇＡを誘起した。また表２６に示されたデータに類似して、ＩｇＡは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hにより免疫感作されたマウスから得られたＢＡＬ中には見られなかった。しかしながら、ＩｇＧは、ＢＡＬからの洗液を含むすべての粘膜洗液において見い出された。Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H免疫感作されたマウスからの洗液に観察されるＩｇＧのレベルは、生ＲＳＶでの免疫感作によって得られたレベルに少なくとも匹敵した（表２８、群２５６対２５９）。
【００５６】
第７の実験では、免疫マウス由来のイン・ビトロ刺激された脾細胞によって誘起される細胞溶解（ＣＴＬ）活性が調査された。データは図８に提示される。ＲＳＶ免疫感作マウスは、約４５％の抗原特異的細胞溶解を示したのに対して、残りの各マウスのＣＴＬ活性は、１０％未満に留まった。データは、脾臓リンパ球集団におけるＲＳＶ感染標的細胞に対して細胞媒介免疫防御を誘導する、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29HによるＩＮ免疫感作の能力がないことを確認した。これは、以前の観察を確認した（図８）。
【００５７】
第８の実験では、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29HのＩＮ送達が、生ＲＳＶチャレンジに対して防御を促進するか否かを研究するために、さらなるウイルス防御アッセイが遂行された。図９に示される結果のＡＮＯＶＡによる統計的解析は、次ぎのとおりである：
ｐ＜０．０５：Ｆ／ＰＢＳ対Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H、Ｆ／ＡｌＯＨ、ＲＳＶ．
ｐ＜０．０５：ナイーブ対Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H、Ｆ／ＡｌＯＨ、ＲＳＶ
ｐ＞０．０５：Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H対Ｆ／ＡｌＯＨ、ＲＳＶ．
図７に示された結果と同様に、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29Hを含有するＩＮワクチンを受けたマウスは、Ｆ／ＡｌＯＨにより筋肉内か、または生ＲＳＶによりＩＮに免疫感作されたマウスにおいて達成されたものに統計的に匹敵する（ｐ＞０．０５）程度に肺におけるウイルス複製を防御した（それぞれＬｏｇ10１．８７対Ｌｏｇ10１．９９およびＬｏｇ10１．９４）。Ｆ／ＰＢＳによるＩＮ免疫感作、または免疫されなかったマウス（ナイーブ）は、それぞれＬｏｇ10４．５およびＬｏｇ10４．３の肺ウイルスタイターを示した。さらにまた、これらの群は、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H、Ｆ／ＡｌＯＨもしくはＲＳＶにより免疫感作されたマウスから得られたウイルスタイターに比較して、統計的に上昇されたことが分かる（ｐ＜０．０５）肺ウイルスタイターを有した。したがって、このデータは、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29HのＩＮ点滴が、感染性ＲＳＶのチャレンジに対して防御するという結論を支持する。
【００５８】
第９の実験では、抗Ｆ血清抗体応答が調べられた。結果は、抗Ｆタンパク質ＩｇＧが、ＰＢＳ単独において送達されたそれらの特定のＦタンパク質に比べて、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．１もしくは１．０μｇ）により免疫感作されたマウスにおいて有意に増加されることを示した。その上、ＣＴ−ＣＲＭE29H０．１もしくは１．０μｇのいずれかでアジュバントされたＦタンパク質は、抗Ｆタンパク質ＩｇＧ応答を刺激する上で、少なくともＦ／ＡｌＯＨ（筋肉内）か、またはＲＳＶによる実験的感染のいずれとも同じくらいに効果的であった。タイターが、ＣＴ−ＣＲＭE29H０．０１μｇに対して１．０μｇを受けたマウスにおいて有意により大きいように、抗Ｆタンパク質抗体タイターの大きさは、製剤におけるＣＴ−ＣＲＭE29Hの用量に依存した。Ｆ／ＰＢＳに対する比較では、抗Ｆタンパク質ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの両タイターは、０．１もしくは１．０μｇいずれのＣＴ−ＣＲＭE29Hによっても増強された。ＣＴ−ＣＲＭE29Hは、タイプ１および２免疫コンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）の両方を刺激した。有意に高い血清抗Ｆタンパク質ＩｇＡ応答は、ＲＳＶによる実験的感染に比較して、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．１もしくは１．０μｇ）によるＩＮ免疫感作によって刺激された。反対に、血清ＩｇＡ抗Ｆタンパク質抗体は、Ｆ／ＰＢＳ（ＩＮ）もしくはＦ／ＡｌＯＨの非経口投与への応答においては観察されなかった（表２９）。
【００５９】
また、抗ＣＴタイターは、抗Ｆタンパク質タイターと一致する用量依存パターンに従った（表２９）。統計的に等価の抗ＣＴタイターは、いずれかＣＴ−ＣＲＭE29H（１．０μｇ）もしくはＦ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（１．０μｇ）により免疫感作されたマウスから得られた血清中に観察された。しかしながら、これらのタイターは、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．１もしくは０．０１μｇ）に比べて有意に上昇された。さらに、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．１μｇ）により免疫感作されたマウスの血清中の抗ＣＴタイターは、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．０１μｇ）により免疫感作されたマウスからのタイターに比べて統計的に高められた。したがって、抗Ｆタンパク質抗体応答のためのＣＴ−ＣＲＭE29Hのアジュバント効果は、変異コレラホロトキシンへの抗体応答と相関された（ｒ＝０．９７）。
【００６０】
この第９実験では、また、粘膜性免疫が調べられた。粘膜ＩｇＡは、いずれかＦ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（１．０μｇ）もしくはＦ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．１μｇ）により免疫感作されたマウスからのプールされた鼻洗液中にのみ観察された（表３０）。その上、また、精製Ｆタンパク質およびＣＴ−ＣＲＭE29H（０．０１〜１．０μｇ）を含有するＩＮ免疫感作を受けたマウスは、膣洗液（ＶＷ）中に抗Ｆタンパク質ＩｇＡを有した。Ｆタンパク質特異的ＩｇＧは、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．１および１．０μｇ）もしくはＦ／ＡｌＯＨを受けたマウスの気管支肺胞洗液（ＢＡＬ）、ＶＷおよび／またはＮＷ中に観察された。反対に、抗Ｆタンパク質ＩｇＡは、Ｆ／ＡｌＯＨによりＩＭ免疫感作されたマウスにおいては検出されなかった。
【００６１】
第１０実験では、ＣＴ−ＣＲＭE29Hとともに製剤化されたＦタンパク質により免疫感作されたマウスにおける機能性免疫が調査された。補体の存在下で、統計的に高められた抗ＲＳＶ中和抗体が、Ｆ／ＰＢＳもしくはＣＴ−ＣＲＭE29H単独投与に比較して、Ｆタンパク質およびＣＴ−ＣＲＭE29H、Ｆ／ＡｌＯＨもしくはＲＳＶ  Ａ２のいずれか０．１もしくは１．０μｇを受けたマウスの血清中に検出された（表３１）。補体の不在下では、検出しうる中和抗体は、いずれの群においても観察されなかった（ｌｏｇ10＜１．３）。血清および粘膜抗体データ（表２９および３０）と一致して、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．０１μｇ）による免疫は、抗ＲＳＶ中和抗体を産生するのに十分ではなかった。
【００６２】
第１１実験では、免疫マウスは、続いての感染に対するＦ／ＣＴ−ＣＲＭE29Hの防御能を決定するために、３次免疫感作後２週目にチャレンジされた。結果は、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．１もしくは１．０μｇ）により免疫感作されたマウスが防御されることを例証した（表３２）。ナイーブマウス、またはＦ／ＰＢＳもしくはＣＴ−ＣＲＭE29H単独で免疫感作されたマウスに比べて、Ｆタンパク質およびいずれか０．１もしくは１．０μｇＣＴ−ＣＲＭE29Hにより免疫感作されたマウスの肺は、有意に低下されたウイルスレベルを有した。その上、有意に低下されたウイルスレベルは、未免疫ナイーブマウスまたはＦ／ＰＢＳにより免疫感作されたマウスに比較して、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．１および１．０μｇ）により免疫感作されたマウスの鼻組織中に観察された。これに対して、Ｆ／ＡｌＯＨにより非経口的に免疫感作されたマウスは、Ｆ／ＰＢＳ免疫マウスに比べて、肺組織における低下されたウイルスレベルを示したが、鼻組織では有意な低下はなかった。総括すると、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．１もしくは１．０μｇ）のＩＮ投与は、続く生ＲＳＶのチャレンジに対する呼吸組織の防御に貢献するであろう両局所および全身体液性免疫応答を生成するには十分であった。
【００６３】
実施例１０において提示されるデータは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質のためのＩＮワクチン開発への成長可能なアプローチを具体的に説明した。そのデータは、両体液性および粘膜性ＩｇＧおよびＩｇＡの産生が、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29HのＩＮ送達によって刺激されることを示している。観察された抗体タイターが有意であることは、２つの方法で例証される：第１、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29Hにより免疫感作されたマウスにおいて分析される各体液性および粘膜性抗体応答は、Ｆ／ＰＢＳにより免疫感作されたマウスに比較して、質的には類似しており、そして量的には上昇された。第２、上昇されたタイターは、図７および９に示される観察された防御レベルによって示されるように、生物学的に関連する免疫応答に翻訳される。Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29Hによる免疫感作は、Ｆ／ＰＢＳもしくはＰＢＳ／ＣＴ−ＣＲＭE29Hによる免疫感作に比べて生ＲＳＶチャレンジに対して有意に防御を増強した。  総括すれば、データは、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29Hを含有するＩＮ免疫感作プロトコールに応じて刺激されるいずれか粘膜性もしくは体液性免疫グロブリンによる、感染性ウイルスの中和を伴うメカニズムを示唆する。
【００６４】
マウスは、組み換え的に発現されるＶＰ２およびＶＰ６タンパク質の形態において、その他のウイルス抗原、ロタウイルスにより免疫感作された。ＳＡ１１ロタウイルスＶＰ２およびＶＰ６を発現する組み換えバキュロウイルス・ベクターが、既に記述されているように構築された（２８）；組み換え的に発現されるロタウイルス構造タンパク質が、形態的にビリオンと区別できない粒子に自己集合することが知られている。そのように発現されたタンパク質は、２／６ウイルス様粒子（ＶＬＰ）へと共に集合した。
【００６５】
相同性遺伝的背景をもつ近交系ＢＡＬＢ／ｃマウスが使用されたが、それらのすべてが免疫感作に応答性であり、かくして、ＶＬＰ単独およびＣＴ−ＣＲＭE29Hアジュバントと組み合わせた場合に、ＶＬＰ対する全身性および粘膜性免疫グロブリンのプロフィルを明らかにできることが期待される。また、遺伝的に異種の非近交系ＣＤ−１マウスが、免疫および防御の誘導に必要な因子に及ぼす遺伝的多様性の影響を決定するために使用された。
【００６６】
２匹の非応答性の経口的に免疫感作されたＣＤ−１マウスを除いて、すべて免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃおよびＣＤ−１マウスの血清は、両ＶＰ２およびＶＰ６に対する抗体を含有した。免疫前の血清ならびに免疫されなかったマウスの血清は、ｍｏｃｋおよび／またはＶＰ２−６バキュロウイルス感染細胞においてウイルス抗原を検出しなかった。２／６−ＶＬＰで免疫感作された血清または未感染細胞に曝露されたＶＰ６およびＶＰ２に特異的なｍＡｂは、反応性を示さなかった（データ未掲載）。また、２／６−ＶＬＰの免疫原性は、２／６−ＶＬＰならびにロタウイルスのＳＡ１１株に対する各マウスからの、チャレンジ前および免疫感作された血清を用いてウエスタンブロット解析によって確認された（データ未掲載）。
【００６７】
２／６−ＶＬＰ単独によりＩＮ免疫感作された群におけるロタウイルス特異的血清ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡのパターンは、２／６−ＶＬＰおよびＣＴ−ＣＲＭE29Hにより免疫感作された群におけるそれに類似していた（図１０）。しかしながら、３種の血清抗体イソタイプの１３週目のレベルは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hとともに２／６−ＶＬＰを受けている動物において有意により高かった（図１０）（それぞれＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡについてＰ＝０，Ｐ＝０．００４およびＰ＝０．０２）。このことは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hが、２／６−ＶＬＰに対する体液性応答を有意に増強することを示した。１３週目は、２回の免疫感作の後であるがチャレンジ前に生成された抗体レベルの指標として選択された。
【００６８】
図１１Ａに示されるように、ＶＬＰ  ＩＮを与えられたＢＡＬＢ／ｃマウスは、経口的に免疫感作されたマウスよりも大きいロタウイルス特異的全身性ＩｇＧ応答を生じた。２群間の血清ＩｇＧタイターにおける統計的に有意な差異は、１３週目において明らかであった（Ｐ＝０）。同様に、血清ＩｇＭレベルは、チャレンジ前（１３週目）の値が分析された場合、経口群とは反対にＩＮ群においてより高かった（Ｐ＝０）（図１１Ｂ）。血清ＩｇＭレベルは、２週目にピークに達し、そしてＩＮおよび混合群においては４週目に減少したが、一方、経口群では、低いが比較的一定の血清ＩｇＭレベルが、研究をとおして検出された。経口的およびＩＮ免疫感作された動物におけるピークの血清ＩｇＡは、４週目に起きた。血清ＩｇＡレベルにおける有意な差異は、１３週目の検査時点では３つの実験群では区別されなかった（図１１Ｃ）。総括すれば、ＩＮ免疫感作は、経口的免疫感作よりも高いレベルの全身性ＩｇＧおよびＩｇＭ応答を生成した。ＩＮ群における有意に高いレベルのＩｇＧおよびＩｇＭの誘導は、ＩＮ免疫感作が、将来のワクチン候補の投与のための好適な経路であろうという考え方を支持する。かくして、強い全身性中和応答へと導くＩＮ免疫感作は、粘膜バリヤーに浸透するウイルス病原体に対して効果的であろう。
【００６９】
両ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａは、ＩＮおよび経口的に免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃマウスの血清において見い出された（ず１２）。ＩＮ群は、経口群に比べて統計的に有意なより高いレベルの両ＩｇＧサブクラスをもっていた（ＩｇＧ１，Ｐ＝０．００５，ＩｇＧ２ａ，Ｐ＝０．０５）。しかしながら、各群内のサブクラス間には有意な差異はなかった。これらのデータは、両Ｔヘルパー経路（ＴＨ−１およびＴＨ−２）の効果的誘導のためのＩＮ免疫感作の利用を確定する。
【００７０】
すべて３実験群についての糞ＩｇＡのピークレベルは、最初の免疫感作後４週目に起き、血清ＩｇＡレベルが経口的およびＩＮ免疫感作された動物において最大である時点と一時的に一致した（図１１Ｃ）。統計的に有意な差異は、チャレンジ前の糞ＩｇＡレベルが試験された場合には、３つの免疫感作プロトコール間には見いだされなかった（図１３Ａ）。また、糞ＩｇＧは、４週目に最大であった（図１３Ｂ）；しかしながら、ＩＮ群は、経口もしくは混合群に比べて、１３週目において有意に多いＩｇＧを有した（それぞれＰ＝０およびＰ＝０．００２）。一般に、すべての２／６−ＶＬＰ免疫マウスは、血清ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ、ならびに糞ＩｇＧおよびＩｇＡを産生した。糞ＩｇＭは、いずれの動物においても検出されなかった。
【００７１】
２／６−ＶＬＰ  ＩＮを受けているすべてのＣＤ−１マウス（ｎ＝４）および経口的に免疫感作された４匹のマウスのうち２匹は、ロタウイルス特異的抗体応答を生じた（データ未掲載）。抗体応答のプロフィルをより正確に決定するために、血清および糞サンプルが、２６週間毎週分析された。ＣＤ−１マウスにおける血清および糞抗体の誘導パターンは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるものと類似していた（図１１および１３）。
【００７２】
ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、２／６−ＶＬＰおよびＣＴ−ＣＲＭE29Hによる２回のＩＮ免疫感作（ＰＲＡＳ＝９８．７％）は、２／６−ＶＬＰ単独によるＩＮ免疫感作（ＰＲＡＳ＝３９％）（Ｐ＝０．００７）とは対照的に防御的であることが証明された。混合免疫感作、ＩＮに続く経口的免疫感作は、経口およびＩＮ群と同じ程度にマウスを防御したが、これは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、混合免疫感作がまた効果的であることを示している。このことは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hによる防御的免疫応答における有意な増大を例証した。すべて３免疫群におけるＢＡＬＢ／ｃマウスは、チャレンジからのほとんど完全な防御を示した。ＰＲＡＳは、それぞれ経口、ＩＮおよび混合群について９９．６％、９８．８％および９８．８％であった（図１４Ｂ）。免疫されなかった対照群は、３つの免疫感作群よりも有意に多いウイルス抗原を脱落した（Ｐ＝０）。３免疫感作群についてＰＲＡＳ値間の有意な差異はなかった。
【００７３】
ＩＮ免疫感作は、すべての免疫ＣＤ−１マウスにおいて、両全身性および粘膜性応答を誘導し、そしてこれらの動物を防御した（ＰＲＡＳ＝９７．９％）（図１４Ｃ）。経口的免疫ＣＤ−１マウス４匹中２匹のみが、全身性および粘膜性抗体応答および防御を示した（３匹中２匹、ＰＲＡＳ＝６５．８％）（図１４Ｃ）；これに対して、すべての経口的に免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃマウスが、粘膜性および全身性応答を示し、そして防御された。注目すべきは、免疫応答を生じなかったＣＤ−１マウスは、感染から防御されず、一方、免疫応答性マウスは防御された（図１４Ｃ）。免疫感作に対して抗体応答をもたない経口群の１マウスは、チャレンジ前に死んだ。２匹のＣＤ−１マウスは、抗体応答の解析におけるサンプル数を減らすために対照として使用された。しかしながら、統計的解析は、防御成績が有意であることを明らかに示した（９５％信頼レベルにおいて、Ｐ＝０）。経口的免疫感作実験は、動物が２６週よりむしろ１３週目にチャレンジされた以外、同じ条件下でＣＤ−１マウスを用いて繰り返された。免疫群では４マウスおよび対照群として５マウスを用いて、類似の防御レベルが観察された（ＰＲＡＳ＝７１．２％）（データ未掲載）。まとめると、これらの結果は、ＣＤ−１マウスにおいて、鼻内免疫感作が経口的免疫感作よりも効果的であることを示唆する、Ｏ  Ｎｅａｌら（３４，３５）により近年公表された結果を支持する。
【００７４】
ワクチンアジュバントとしてのＣＴ−ＣＲＭE29Hのこの例証された利用に関して、この材料の適当量の生産が所望される。ｐＩＩＢ２９Ｈ（実施例１において記述される）を用いて、いくつかの試みが、Ｅ．コリにおけるＣＴ−ＣＲＭE29H発現のために行われた。精製されたＣＴ−ＣＲＭE29Hホロトキシンの得られる収量は、培養培地１リットル当たり約５０μｇであった。元来のプラスミド、ｐＩＩＢ２９Ｈに対する改変によってＣＴ−ＣＲＭE29H収量を増加させる最初の試み、プラスミドｐＰＸ２４９２（実施例１参照）を作成することは、ほとんどまたは全く効果を示さなかった。収量における若干の増加は、ビブリオ・コレレＤｓｂＡおよびＥ．コリＲｐｏＨを用いて、ｐＩＩＢ２９Ｈおよび誘導体の発現をとおして達成された。同時発現および精製変法が、１リットル当たり約２ｍｇまでＣＴ−ＣＲＭE29Hの収量を増加した。
【００７５】
ＣＴ−ＣＲＭE29Hの発現を増加させるために、ラクトース誘導プロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により置換され、これが、ＣＴ−ＣＲＭE29HをコードしているＤＮＡ配列に操作可能に結合された。クローニングにおいて、プラスミドｐＩＩＢ２９Ｈが、ビブリオ・コレレ２１２５株由来のｃｔｘＢ遺伝子に結合されたＶ．ｃ５６９Ｂ株由来のｃｔｘＡ遺伝子を含有することが決定された。これらの遺伝子の交差整列は、２つのｃｔｘＢ遺伝子間の７塩基置換およびｃｔｘＡ遺伝子間の１つの単一塩基変化を指示した。これらの塩基置換の若干は、成熟サブユニットにおけるアミノ酸変化をもたらした。特に注意すべきは、Ａ−２部分、またはＡサブユニットのホロトキシン・アッセンブリードメイン内のアミノ酸変化をもたらすｃｔｘＡ遺伝子間の置換であることである。これらの遺伝子間の不均一性が、トキシン発現もしくはホロトキシン・アッセンブリーにネガティブな力をもつか否かは知られていなかった；しかしながら、両トキシンサブユニット遺伝子が同じ起源から生まれるということが、革新的見地から先ず考えられた。それ自体、アラビノース誘導系の構築に使用された両ｃｔｘＡおよびｃｔｘＢ遺伝子は、ビブリオ・コレレ５６９Ｂ株から生まれた。プラスミドｐＰＸ２４９０の構築は実施例１２に記述される。ｐＰＸ２４９０からのＣＴ−ＣＲＭE29Hの生産は、培養液１リットル当たり精製物質約３０ｍｇである。
【００７６】
さらに、本発明は、コレラホロトキシンのＡサブユニットの位置２９のグルタミン酸についてアスパラギン酸以外の置換をもつ免疫原性変異コレラホロトキシンをコードしているＤＮＡ配列を含み、そしてそのＤＮＡ配列がアラビノース誘導プロモーターに操作可能に結合されている単離、精製されたＤＮＡ配列を含有するプラスミド、ならびに慣用技術によってそのようなプラスミドによって形質転換、形質導入もしくはトランスフェクションされた適当な宿主細胞に関する。
【００７７】
種々の宿主細胞−プラスミドベクター系が、免疫原性変異コレラホロトキシンを発現するために使用される。好ましくはアラビノース誘導プロモーターを含むベクター系は、使用される宿主細胞と適合性である。適当な宿主細胞は、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡもしくはバクテリオファージＤＮＡにより形質転換された細菌；ワクシニアウイルスおよびアデノウイルスのようなウイルス；ピヒア（Ｐｉｃｈｉａ）細胞のような酵母；ｓｆ９もしくはｓｆ２１細胞のような昆虫細胞；またはチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞のような哺乳類細胞：ならびに他の慣用の生物を含む。
【００７８】
種々の慣用の転写および翻訳要素が、宿主細胞−ベクター系のために使用することができる。ＣＴ−ＣＲＭをコードしているＤＮＡは、発現系中に挿入され、そしてプロモーター（好ましくはアラビノース誘導プロモーター）および他の調節要素は、プラスミドベクターが宿主細胞中に挿入された（使用される宿主細胞−ベクター系に応じた形質転換、形質導入もしくはトランスフェクションによって）場合、ＣＴ−ＣＲＭをコードしているＤＮＡが宿主細胞によって発現されるように、ベクター内の特定の部位中に連結される。
【００７９】
変異原性変異コレラホロトキシンは、上記プラスミドを用いて宿主細胞を形質転換、形質導入もしくはトランスフェクションし、そして宿主細胞による該組み換え変異原性解毒化タンパク質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって生産される。
【００８０】
本発明は、アミノ酸２９にヒスチジンをもつＣＴ−ＣＲＭ変異体によって代表されるけれども、野生型グルタミン酸残基の他の非保存変異もまた、本発明の範囲内にはいる。グルタミン酸は、酸性（負電荷の）分子である。したがって、非保存変異は、置換が、また酸性分子であるアスパラギン酸以外のアミノ酸に対してなされる変異であってもよい。適当な代替アミノ酸は、ヒスチジンのような、塩基性（正電荷の）分子であるアミノ酸リジンおよびアルギニンを含む。さらに、適当な代替アミノ酸は、非極性官能基をもつアミノ酸、例えばアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリン、そして非電荷の極性官能基をもつアミノ酸、例えばアスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニンおよびチロシンを含む。
【００８１】
病原性細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生虫から選ばれる抗原との組み合わせにおいて、ホロトキシンが、野生型コレラホロトキシンに比較して低下された毒性をもち、そしてコレラホロトキシンのＡサブユニットの位置２９のグルタミン酸についてアスパラギン酸以外の置換をもつ、変異コレラホロトキシンの有効量は、該ホロトキシンが、該抗原に対する脊椎動物宿主における免疫応答を増強する抗原組成物を製造するために使用される。
【００８２】
また、本発明の抗原組成物は、アミノ酸２９以外の位置における少なくとも１つのさらなる変異を含有するＣＴ−ＣＲＭを含む。引用によって本明細書に組み入れられている国際特許出願ＷＯ９３／１３２０２（３６）は、コレラホロトキシンの毒性を低下するために用いられるＡサブユニットにおける一連の変異を記述している。これらの変異は、アミノ酸７のアルギニン、位置９のアスパラギン酸、位置１１のアルギニン、位置４４のヒスチジン、位置５３のバリン、位置５４のアルギニン、位置６１のセリン、位置６３のセリン、位置７０のヒスチジン、位置９７のバリン、位置１０４のチロシン、位置１０６のプロリン、位置１０７のヒスチジン、位置１１０のグルタミン酸、位置１１２のグルタミン酸、位置１１４のセリン、位置１２７のトリプトファン、位置１４６のアルギニンおよび位置１９２のアルギニンについて置換を作成することを含む。コレラホロトキシンのＡサブユニットをコードしているヌクレオチド配列は、国際特許出願ＷＯ９３／１３２０２に記述される。引用によって本明細書に組み入れられている国際特許出願ＷＯ９８／４２３７５（３７）は、コレラホロトキシンの毒性を低下するために用いられるＡサブユニットにおけるアミノ酸１０９のセリンについて置換することを記述している。したがって、慣用の技術を用いて、１つ以上のこれらの付加的な位置における変異が生成される。
【００８３】
本発明の抗原組成物は、限定されるものではないが、鼻内、経口、膣内、肛門内、非経口、皮内、経皮（例えば、引用によって本明細書に組み入れられている国際特許出願ＷＯ９８／２０７３４（３８）参照）、筋肉内、腹腔内、皮下、静脈内および動脈内を含む、種々の経路によって、ヒトもしくは非ヒト脊椎動物に投与される。抗原成分または抗原組成物の成分の量は、抗原の特性に応じて、ならびに宿主の年令、体重および医療条件に応じて、ならびに投与方法に応じて変わるであろう。また、適当な用量は、当業者によって容易に決定される。必ずしも必要ではないけれども、抗原および変異ＣＴが同時に投与されることが好ましい。また、抗原組成物についての用量数および投薬処方は、当業者によって容易に決定される。防御は、抗原組成物の単回用量によって与えられてもよく、または防御を維持すべきより遅い時間における増加用量に加えて、数回の用量の投与を求めてもよい。いくつかの例では、変異ＣＴのアジュバント性が、必要な用量数もしくは投薬処方の時間経過を減少できる。
【００８４】
本発明の抗原組成物は、ＣＴ−ＣＲＭE29Hに加えてさらなるアジュバントを含んでもよい。そのようなアジュバントの例は、限定されるものではないが、ＳｔｉｍｕｌｏｎTMＱＳ−２１（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）、ＭＰＬTM（３−ｏ−デアシル化モノホスホリルリピドＡ；ＲＩＢＩ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムおよびＩＬ−１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を含む。また、抗原組成物は、慣用の方法において免疫学的に許容しうる希釈剤もしくはキャリヤーと混合されてもよい。
【００８５】
本発明の免疫原性変異コレラホロトキシンは、ヒトおよび非ヒト脊椎動物に感染する、限定されるものではないが細菌、ウイルス、真菌もしくは寄生微生物を含む、広範な種々の病原性微生物からの広範な種々の抗原を含有する抗原組成物において、アジュバントとしての使用に適している。抗原は、全細胞もしくはウイルス、または１種以上のサッカリド、タンパク質、タンパク質サブユニットもしくはフラグメント、ポリ−もしくはオリゴヌクレオチド、または他の高分子成分を含んでもよい。所望であれば、抗原組成物は、同じか異なる病原性微生物からの１種以上の抗原を含有してもよい。
【００８６】
アジュバントとしてのＣＴ−ＣＲＭ変異体を含む望ましい細菌ワクチンは、限定されるものではないが、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（検出可能型および検出不能型の両方）、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ）、モラキセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｉａｅ）、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｒｉｃｏｂａｃｔｅｒ  Ｐｙｌｏｒｉ）、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア・ゴノローエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、クラミジア・ニューモニエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クラミジア・シタチ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｓｉｔｔａｃｉ）、ボルデテラ・ペルツッシア（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉａ）、サルモネラ・チフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・コレレスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、ミコバクテリウム・ツベルクロシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ミコバクテリウム・アブウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ）−ミコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｒｉｕｍ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）複合体、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロテウス・ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、パスツレラ・ヘモリチカ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、パスツレア・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、アクチノバチルス・プルーロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびマイコプラズマ・ガリセプチカム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）によって引き起こされる疾病の予防および／または治療に対向されるワクチンを含む。
【００８７】
アジュバントとしてのＣＴ−ＣＲＭ変異体を含む望ましいウイルスワクチンは、限定されるものではないが、呼吸シンシチアルウイルス、パラインフルエンザウイルス１−３型、インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、カリシウイルス、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、風疹ウイルス、アデノウイルス、狂犬病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、コロナウイルス、パルボウイルス、感染性鼻気管炎ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルス、トリ感染性粘液嚢病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、Ｍａｒｅｋ病ウイルス、ブタ呼吸および生殖症候群ウイルス、ウマ動脈炎ウイルスおよび種々の脳炎ウイルスによって引き起こされる疾病の予防および／または治療に対向されるワクチンを含む。
【００８８】
アジュバントとしてのＣＴ−ＣＲＭ変異体を含む真菌病原体に対する望ましいワクチンは、限定されるものではないが、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシジオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）およびヒストプラズマ（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）によって引き起こされる疾病の予防および／または治療に対向されるワクチンを含む。
【００８９】
アジュバントとしてのＣＴ−ＣＲＭ変異体を含む寄生虫に対する望ましいワクチンは、限定されるものではないが、ライシュマニア・マヨール（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）、アスカリス（Ａｓｃａｒｉｓ）、トリクリス（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、ギアルジア（Ｇｉａｒｄｉａ），シストソマ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ）、トキソプラズマ・ゴンジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）およびニューモシスチス・カリニイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）によって引き起こされる疾病の予防および／または治療に対向されるワクチンを含む。
【００９０】
また、ＣＴ−ＣＲＭ変異体は、ポリヌクレオチドワクチン（また、ＤＮＡワクチンとして知られている）におけるアジュバントとしての含有に適している。そのようなワクチンは、ｂｕｐｉｖｉｃａｉｎｅ（ブピビカイン）（引用によって本明細書に組み入れられている米国特許第５，５９３９７２号（３９）、参照）のような促進剤をさらに含んでもよい。
【００９１】
ＣＴ−ＣＲＭE29Hは、ブピビカインとともに製剤化された、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）２型の全長糖タンパク質Ｄ（ｇＤ２）をコードしているプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）の投与のためのアジュバントとして野生型ＣＴと比較された（４０）。その結果は、皮内経路によってＨＳＶ−２についてのｐＤＮＡワクチンとともにＣＴ−ＣＲＭE29Hを受けたＢＡＬＢ／ｃマウスが、皮内経路によってｐＤＮＡ  ＨＳＶｇＤ２ワクチンそれだけを受けたマウスよりも高い平均細胞応答を生成した（表３４）。それに加えて、ＣＴ−ＣＲＭE29HとともにｐＤＮＡ  ＨＳＶｇＤ２ワクチンを受けたマウスの血清における平均抗体応答は、アジュバントなしでｐＤＮＡ  ＨＳＶｇＤ２ワクチンを受けたマウスについて見られる応答とほぼ同じレベルであった（表３５）。
【００９２】
同様に、ｐＤＮＡ  ＨＳＶｇＤ２ワクチンは、皮内もしくは筋肉内経路によって無アジュバントワクチンの送達後に見られるものに匹敵するレベルにおいて、膣洗浄サンプル中にｇＤ２特異的抗体応答を生じた（表３６）。
【００９３】
ＣＴ−ＣＲＭE29HもしくはＣＴでアジュバントされ、そして皮内経路によって送達されたｐＤＮＡ  ＨＳＶｇＤ２ワクチンにより免疫感作されたマウスは、アジュバントなしでｐＤＮＡ  ＨＳＶｇＤ２ワクチンを受けたマウスよりも実質的に高いγ−インターフェロンのレベルを生じた（表３７）。また、ＣＴ−ＣＲＭE29Hを受けたマウスはＩＬ−５を産生した。
【００９４】
かくして、ＣＴ−ＣＲＭE29Hは、ＨＳＶに対するプラスミドＤＮＡワクチンを投与された場合、増殖性およびγ−インターフェロン応答を増強した。
【００９５】
本発明が、より良く理解されるために、次の実施例が記述される。実施例は、例示の目的のためにのみあり、そして本発明の範囲を限定するものと考えるべきではない。
【００９６】
実施例
例１  ＣＴ変異体の発現
細菌菌株、プラスミドおよび増殖条件
ＸＬ１  ｂｌｕｅ由来ＦＴｃ，ｌａｃＩq（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ；（４１））およびＣＪ２３６（ＦＴｃ，ｌａｃＩq）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を担持しているＥ．コリ  ＴＧ１（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、およびＴＸ１、ＴＧ１のナリジキシン酸耐性誘導株が、組み換えプラスミドをクローニングし、そして変異されたタンパク質の発現のための宿主として使用された。プラスミド含有菌株は、必要とされる抗生物質（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ；カナマイシン２５μｇ／ｍｌ；テトラサイクリン１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天プレート上に維持された。Ｖ．コレレ０３９５からの完全ＣＴオペロンが、ｌａｃプロモーターの調節下のファージミドベクターｐＳＫＩＩ-中にサブクローニングされて、ｐＭＧＪ６７と命名されたＩＰＴＧ誘導プラスミドを作成した（４２）。
【００９７】
ｃｔｘＡ遺伝子の変異誘発
Ｋｕｎｋｅｌの方法（４３）が、プラスミドｐＭＧＪ６７において作成されるオリゴヌクレオチド由来変異体を選択するために使用された。５種の変異ＣＴ−ＣＲＭを作成するために使用されたオリゴヌクレオチドは表１に記述される。
【００９８】
【表２】
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【００９９】
簡単に言えば、各一本鎖オリゴヌクレオチドがリン酸化され、そしてＥ．コリｄｕｔ ｕｎｇ  ＣＪ２３６株（Ｆ’Ｔｃ，ｐＭＧＪ６７）からレスキューされたウラシル含有の一本鎖ＤＮＡ鋳型において第２鎖合成を導くために使用された。連結およびｕｎｇ’ＴＸ１株の形質転換の後、一本鎖ＤＮＡが、ＡｍｐR形質転換株からレスキューされ、そしてジデオキシ・チェインターミネーター法（４４）によって配列決定された。
【０１００】
ＣＴ−ＣＲＭE29Hをコードしているプラスミドの構築
ＣＴ−ＣＲＭE29HをコードしているプラスミドはｐＩＩＢ２９Ｈと命名される。プラスミドは、ＣＴをコードするＶ．コレレ遺伝子ｃｔｘＡおよびｃｔｘＢのポリシストロンを含有する。このプラスミド中のｃｔｘＡ遺伝子は、ＣＴ−Ａのアミノ酸位置２９のヒスチジンをコードするために、前記のように変異誘発された。野生型ポリシストロンが、また、ネイティブＴｏｘＲ誘導プロモーターを除去し、そしてラクトース誘導プロモーターによりそれを置換することによって変化された。さらにまた、ｃｔｘＡおよびｃｔｘＢシグナル配列をコードしている領域が、ＣＴ−ＣＲＭE29Hの分泌を促進する目的で、Ｅ．コリＬＴ（ＬＴＩＩｂ−Ｂリーダー）のシグナル配列コーディング領域により置換された。次いで、プラスミドｐＩＩＢ２９Ｈが、ＣＴ−ＣＲＭE29Hの発現を増加する試みで改変された。得られるｐＰＸ２４９２と呼ばれるプラスミドは、各ｃｔｘＡおよびｃｔｘＢの上流に合成シャインダルガルノ配列を含有した。２個の遺伝子は、遺伝子が重複しているＶ．コレレにおけるのとは異なり、ｐＰＸ２４９２では遺伝的に分離されている。また、２遺伝子は、各上流にＬＴＩＩｂ−Ｂリーダー配列をもつ。
【０１０１】
変異ｃｔｘＡアレレの発現
各変異ホロトキシンの生産は、３７℃で振盪（２００ｒｐｍ）しつつ１２５ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中ＴＢ培地の５ｍｌ培養液において試験された。対数増殖期細胞（Ａ600＝０．８−１．０）が、ＩＰＴＧの０．４ｍＭまでの添加に続く一夜増殖によって誘導された。ポリミキシンＢが１ｍｇ／ｍｌまで添加され、続いて３７℃で１０分間インキュベートされた。細胞が遠心によって除去され、そして上澄液は、下記のようにホロトキシンおよびＢペンタマーの濃度を決定するためにアッセイされた。
【０１０２】
具体的には、Ｅ．コリにおけるＣＴ−ＣＲＭE29Hの生産は、遺伝子Ｅ．コリ由来ｒｐｏＨおよびＶ．コレレ由来のｄｓｂＡの同時発現を伴う。これらの遺伝子産物は、ＣＴの両ＡおよびＢサブユニットの配座成熟に関与する。
【０１０３】
例２  インタクトホロトキシンのＧＭ１結合アッセイ
ＣＴ−ＣＲＭが、ガングリオシドＧＭ1依存性固相ラジオイムノアッセイ（４２）において試験されて、インタクトホロトキシンが、精製後存在するか否か決定された。酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、ＥＬＩＳＡプレートミクロウェルが、ガングリオシドＧＭ1（１０μｇ／ｍｌ）により４℃で一夜コーティングされて使用された。その後、次の試薬が、室温における１時間のインキュベーション間隔で順に添加された：ＣＴ−ＣＲＭE29H（３μｇ／ｍｌ〜０．００１３７μｇ／ｍｌに滴定された）、ウサギ抗ＣＴ−Ａ血清（１：１，０００）およびアルカリホスファターゼ共役ヤギ抗ウサギ抗体（１：２，０００）１００μｌ。反応を可視化するために、ジエタノールアミン中１μｇ／ｍｌのリン酸ｐ−ニトロフェニル１００μｌが添加され、そして３０分間インキュベートされた。反応は、２ＮＮａＯＨ  １００μｌを添加して停止され、そして直ちにＭｉｃｒｏｅｌｉｓａオートリーダーによって読まれた。野生型ＣＴと比較した場合、データは、位置７，２９，１１０もしくは１１２にアミノ酸置換をもつＣＴ−ＣＲＭがインタクトホロトキシンであることを示した（図１）。しかしながら、その結果は、精製されたＣＴ−ＣＲＭR11Kの一部がホロトキシンではなさそうであることを暗示した。
【０１０４】
例３  ＣＴ−ＣＲＭの残存毒性についてのＹ−１副腎細胞アッセイ
変異ＣＴ−ＣＲＭが、マウスＹ−１副腎腫瘍細胞アッセイにおいて毒性について野生型ホロトキシンと数回比較された。Ｙ−１副腎細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７９）が、９６穴平底プレートに１ウェル当たり１０4細胞の濃度で接種された。その後、ＣＴ−ＣＲＭの３倍連続希釈液が、腫瘍細胞に添加され、そして３７℃（５％ＣＯ2）で４８時間インキュベートされた。次いで、細胞は、毒性の証拠について光学検鏡法によって検査された（丸まっている細胞）。終点タイターは、丸まっている細胞５０％超を与えるのに必要なトキシンの最小濃度として定義された。残存毒性のパーセントは、野生型ＣＴの終点タイター／ＣＴ−ＣＲＭによって誘起されたタイターＸ１００を用いて算出される。表２は、Ｙ−１副腎細胞アッセイにおいて試験された数種の精製変異ホロトキシンの残存毒性を示す。
【０１０５】
【表３】
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【０１０６】
例４  開放マウス消化管重量アッセイ
このアッセイでは、野生型ＣＴもしくはＣＴ−ＣＲＭE29H１０μｇが、ＢＡＬＢ／ｃマウスの各群に胃内投与された（１群当たり３マウス）。腸は、３時間後に注意深く取り出され、秤量された。結果が表３に提示される。データは、１群当たりの平均消化管／死体重量比として表される。
【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
例５  ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ・アッセイ
ＮＡＤ+：アグマチンＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性は、放射能標識されたＮＡＤ+からの［カルボニル−14Ｃ］ニコチンアミドの遊離として測定された。簡単には、ＣＴおよびＣＴ−ＣＲＭが、トリプシン活性化され、そしてＴＥＡＮバッファー（ＴｒｉｓTM／ＥＤＴＡ／アジ化ナトリウム／塩化ナトリウム）（ｐＨ８．０）中５０ｍＭグリシン／２０ｍＭジチオトレイトールを用いて３０℃で３０分間インキュベートされた。その後、次の物質が反応に添加された：ダイズ・トリプシンインヒビター０．１ｍｇ、５０ｍＭリン酸カリウム、１０ｍＭアグマチン、２０ｍＭジチオトレイトール、１０ｍＭ塩化マグネシウム、１００μＭＧＴＰ、３ｍＭジミリストイルホスファチジルコリン、０．２％胆汁酸塩、卵白アルブミン０．０３ｍｇ、１００μＭ［アデニン−Ｕ−14Ｃ］ＮＡＤ（Ｄｕｐｏｎｔ  ＮＥＮTM，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）および最終容量３００μｌまでの水。３０℃で９０分間のインキュベーション後、サンプル１００μｌが、ＡＧ１−Ｘ２のカラム（０．６４ｘ５ｃｍ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に適用され、これは、蒸留／脱イオンＨ2Ｏ  １．０ｍｌにより５回洗浄された。［14Ｃ］ＡＤＰ−リボシルアグマチンを含有する溶出液が放射能アッセイのために収集された。溶出液中の14Ｃ平均回収率は、カラムに適用されたそれのパーセントとして表される。結果は表４に提示される。
【０１０９】
【表５】
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【０１１０】
例６  型検出不能ヘモフィルス・インフルエンゼ（ＮＴＨｉ）の組み換え（ｒ）Ｐ４およびＰ６外膜タンパク質により免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫応答
第１の実験では、１群当たり５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスが、ｒＰ４  ５μｇもしくはｒＰ６  １０μｇ、プラス  表５および６（１群はアジュバントを受けなかった）に示されるアジュバント１μｇを含有する１０μｌ用量を用いて、０，２１および３５日目に鼻内に免疫感作された。抗ｒＰ４  ＩｇＧ抗体タイターは、０，２１，３５および４８日目に収集された保存サンプルにおいてＥＬＩＳＡによって決定され、そして結果は表５に示された。抗ｒＰ６  ＩｇＧ抗体タイターは、０，２１，３５および４８日目に収集された保存サンプルにおいてＥＬＩＳＡによって別に決定され、そして結果は表６に示された。また、ｒＰ４に対する粘膜性抗体応答は、最後の免疫感作２週後に測定された。表７は、それぞれ鼻、気管支肺胞および膣洗液からのＩｇＡおよびＩｇＧタイターを記す。
【０１１１】
第２の実験では、１群当たり５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスが、ｒＰ４  ５μｇもしくはｒＰ６  １０μｇ、プラス  表８（他の群は、各々ＣＴもしくはＣＴ−Ｂを受け；１群はアジュバントを受けなかった）に示されるようにＣＴ−ＣＲＭE29Hの増加用量を含有する３０μｌ用量を用いて、０，２１および３５日目に鼻内に免疫感作された。血清抗ｒＰ４  ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体タイターは、２１，３５および４８日目に収集された保存サンプルにおいてＥＬＩＳＡによって決定され、そして結果は表８に示された。また、４９日目の気管支肺胞および膣洗液からのＩｇＡおよびＩｇＧタイターが決定され、そして表８に示される。
【０１１２】
【表６】
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【０１１３】
a  マウスは、０，２１および３５日目に鼻内に（ＩＮ、１０μｌ容量）免疫感作された。
【０１１４】
b  組み換えＰ４およびＰ６タンパク質は、それぞれ１用量当たり５および１０μｇにおいて投与された。
【０１１５】
c  抗組み換えＰ４  ＩｇＧ抗体タイターは、指示された時間において収集された保存サンプルにおけるＥＬＩＳＡによって決定された。１群当たり５マウスであった。
【０１１６】
d  ＣＴおよびＣＴ変異体は、１用量当たり１μｇにおいて投与された。
【０１１７】
【表７】
0004673974.tif 000008
【０１１８】
a  マウスは、０，２１および３５日目に鼻内に（ＩＮ、１０μｌ容量）免疫感作された。
【０１１９】
b  組み換えＰ４およびＰ６タンパク質は、それぞれ１用量当たり５および１０μｇにおいて投与された。
【０１２０】
c  抗組み換えＰ６  ＩｇＧ抗体タイターは、指示された時間において収集された保存サンプルにおけるＥＬＩＳＡによって決定された。１群当たり５マウスであった。
【０１２１】
d  ＣＴおよびＣＴ変異体は、１用量当たり１μｇにおいて投与された。
【０１２２】
【表８】
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【０１２３】
a  マウスは、０，２１および３５日目に鼻内に（ＩＮ、１０μｌ容量）免疫感作された。
【０１２４】
b  組み換えＰ４およびＰ６タンパク質は、それぞれ１用量当たり５および１０μｇにおいて投与された。
【０１２５】
c  抗組み換えＰ４  ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体タイターは、最後の免疫感作（４９日目）後２週目に収集された保存サンプルにおけるＥＬＩＳＡによって決定された。１群当たり５マウスであった。
【０１２６】
d  ＮＷ，ＢＡＷおよびＶＷは、それぞれ鼻洗液、気管支肺胞洗液および膣洗液を指す。
【０１２７】
e  ＣＴおよびＣＴ変異体は、１用量当たり１μｇにおいて投与された。
【０１２８】
【表９】
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【０１２９】
a  マウスは、組み換えＰ４（５μｇ）およびＰ６（１０μｇ）タンパク質により、０，２１および３５日目に鼻内に（ＩＮ、３０μｌ容量）免疫感作された。抗組み換えＰ４  ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体タイターは、指示された時間において収集された保存サンプルにおけるＥＬＩＳＡによって決定された。１群当たり５マウスであった。
【０１３０】
b  ＢＡＷおよびＶＷは、それぞれ気管支肺胞洗液および膣洗液を指す。
【０１３１】
例７  ＮＴＨｉのネイティブＨａｐタンパク質により免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫応答
ＮＴＨｉ菌株Ｐ８６０２９５（４６）は、Ｄｒ．Ｃｈａｒｌｅｓ（Ｂｒｉｎｔｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）から得られた。それは、ＮＴＨｉ誘導中耳炎を有する小児の鼻咽腔から得られた。ＮＴＨｉ菌株ＴＮ１０６（４７）は、Ｄｒ．Ｅｒｉｃ  Ｈａｎｓｅｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｄａｌｌａｓ）から得られた。ＴＮ１０６のストレプトマイシン耐性変異株は、ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｓ，ＭＯ）１００μｇ／ｍｌを含有するＢＨＩ−ＸＶプレート上での選択によって得られた。この変異株は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻咽腔において２回継代され、そして菌株ＴＮ１０６．Ｐ２として凍結された。
【０１３２】
ＮＴＨｉ菌株Ｐ８６０２９５由来のＨａｐタンパク質は、次のように精製された。ＮＴＨｉ菌株Ｐ８６０２９５は、ＢＨＩ−ＸＶ培地において通気しつつ３５℃で１８時間増殖された。細菌細胞は、４℃で１０Ｋｘｇの遠心によって沈殿され、そして廃棄された。上澄液が、固体（ＮＨ4）2ＳＯ4により６０％飽和にされ、室温で２−３時間保持され、そして沈殿が遠心によって回収された。沈殿は、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ５．８、１ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＮａＣｌ（バッファー１）中に溶解され、そして前記バッファーに対して透析された。ベッドボリューム１０ｍｌのＣＭ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅTMカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が、バッファー１によって平衡化され、そして上記溶解材料３０ｍｌが、流速１ｍｌ／ｍｉｎにおいてカラムに負荷された。カラムは、ＯＤ280がベースラインに達するまでバッファー１によって洗浄された。通過する材料は廃棄された。結合されたタンパク質は、３段階濃度勾配：（１）リン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ７．０、１ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＮａＣｌ；（２）リン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ８．０、１ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＮａＣｌ；および（３）リン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ８．０、０．５ＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡを用いて樹脂から溶出された。各段階で溶出されたタンパク質は保存され、そして分析のために使われた。保存液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４８）分析は、Ｈａｐタンパク質が勾配段階２と３において溶出することを示した。これらの保存液は、高度に精製されたＨａｐを含有し、そして合体された。
【０１３３】
次いで、６週令のメスＢａｌｂ／ｃマウス（１群当たり１０匹）が、ＮＴＨｉ菌株Ｐ８６０２９５から精製されたＨａｐによりＩＮ免疫感作された。Ｈａｐタンパク質は、ＣＴ−ＣＲＭE29Hを含んでも含まなくても、Ｄ−ＰＢＳにおいて５もしくは１５μｇ／４０μｌに希釈された。使用する場合、ＣＴ−ＣＲＭE29Hは０．１μｇ／マウスの用量で使用された。また、Ｄ−ＰＢＳ中ＣＴ−ＣＲＭE29Hを含有する対照製剤、Ｄ−ＰＢＳ単独およびホルマリン固定ＴＮ１０６．Ｐ２（ＮＴＨｉチャレンジ菌株）が、４０μｌ容量においてマウスに投与された。
【０１３４】
ＩＮ免疫感作前に、マウスは麻酔され、次いで、ピペットから２０μｌ／鼻孔の鼻内接種によって免疫感作された。ピペットは、先端が鼻孔の開口部に触れるように保たれ、そして製剤は、吸気の間に鼻孔内に自動的に注入された。マウスは、製剤もしくはチャレンジの投与後、鼻が何物にも触れないように仰臥位に置かれた。マウスは、０，１，３および５週目に免疫感作された。血清は７週目に抜き取られた。結果は表９に示される。
【０１３５】
【表１０】
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【０１３６】
例８  ヘリコバクター・ピロリの組み換え（ｒ）ウレアーゼタンパク質により免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７Ｂｌ／６マウスの免疫応答
第１の実験では、１群当たり５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスが、次のように免疫感作された：７群は、ｒウレアーゼ１００μｇプラス表１０−１２に示されるようなアジュバント１０μｇを用いて、０，２，１４および１６日目に胃内に免疫感作された。１群は、臀部の皮下にｒウレアーゼ１０μｇにより免疫され；他の群は、首の皮下にｒウレアーゼ１０μｇにより免疫され；また、両群は、０および１６日目にアジュバントとしてのＳｉｍｕｌｏｎTMＱＳ−２１  ２０μｇを受けた。抗ｒウレアーゼ抗体タイターは、２８日目に収集された保存サンプルにおいてＥＬＩＳＡによって決定された。ＩｇＧ結果は表１０に示され、そしてＩｇＡ結果は表１１に示される。また、ｒウレアーゼに対する粘膜性抗体応答は、２９日目に測定された。表１２は、それぞれ気管支肺胞および膣洗液からのＩｇＡおよびＩｇＧタイターを記す。
【０１３７】
第２の実験では、エィッチ・フェリス（ｆｅｌｉｓ）によるチャレンジに対してマウスを防御するｒウレアーゼ＋アジュバントの能力が調べられた。１群当たり１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスが、次のように免疫感作された：２群は、ｒウレアーゼ１００μｇプラス表１３に示されるようなアジュバント１０μｇを用いて、０，２，１４および１６日目に胃内に免疫され；対照群は、ｒウレアーゼの代わりにＰＢＳ＋アジュバント１０μｇを受けた。１群は、０および１６日目にｒウレアーゼ＋ＳｉｍｕｌｏｎTMＱＳ−２１  ２０μｇにより皮下に免疫感作された。抗ｒウレアーゼ抗体タイターは、２８日目に収集された保存サンプルにおいてＥＬＩＳＡによって決定された。また、マウスは、２９，３１および３４日目にエィッチ・フェリス（ｆｅｌｉｓ）１０8個の３用量によりチャレンジされ、そして４４日目に防御についてアッセイされた。防御は、急速ウレアーゼ試験によって調査された。急速ウレアーゼ試験では、２分の１の胃が、尿素２％およびフェノールレッド、ｐＨ指示薬７μｇ／ｍｌを含有するウレアーゼ試験媒質０．５ｍｌ中で、３７℃で５時間インキュベートされた。ウレアーゼ活性は、尿素からアンモニアおよび重炭酸塩を生じ、かくして、ｐＨを上昇させ、そして５５０ｎｍにおいて、より高い吸光度をもつ溶液の発色変化を誘起する。ウレアーゼ活性のレベルは、分光測光分析によって測定された。吸光度値の平均が、未感染マウスの胃組織について得られる平均以上の２つの標準偏差である場合に、試験は、エィッチ・フェリス（ｆｅｌｉｓ）についてポジティブと見なされた。結果は表１３に示される。
【０１３８】
第３の実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの２群（１群当たり５匹）が、ｒウレアーゼ１００μｇプラス表１４に示されるようなアジュバント１０μｇを用いて、０，２，１４および１６日目に胃内に免疫感作された。第３群は、ｒウレアーゼ１０μｇ＋ミョウバン１００μｇにより０および１６日目に皮下に免疫感作された。第４群は、ｒウレアーゼ１０μｇによりアジュバントなしで０，２，１４および１６日目に胃内に免疫感作された。抗ｒウレアーゼ抗体タイターは、２８日目に収集された保存サンプルにおいてＥＬＩＳＡによって決定された。表１４は、それぞれ血清、気管支肺胞洗液、糞ペレット抽出液および膣洗液からのＩｇＡおよびＩｇＧタイターを記す。
【０１３９】
第４の実験では、１群当たり５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスが、次のように免疫感作された：マウスの３群は、ｒウレアーゼ１００μｇプラス表１５に示されるようなアジュバント１０μｇを用いて、０，２，１４および１６日目にＩＧ免疫され；第４群はアジュバントを受けなかった。抗ｒウレアーゼ抗体タイターは、２９日目に収集された保存サンプルにおいてＥＬＩＳＡによって決定された。ＩｇＡおよびＩｇＧ結果は表１５に示される。また、表１５は、ＩｇＥ（ＰＣＡ）および総ＩｇＥタイターを提示する。ＰＣＡは、ＩｇＥ抗体タイターが、受動皮膚アナフィラキシー反応によって決定されることを指す。ＰＣＡは、メスＳｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて行われた。ラットは、ケタミン／キシラジンにより鎮静にされ、剃毛され、そしていずれかＣＴ，ＬＴもしくはＣＴ−ＣＲＭE29Hとともに製剤化されたｒウレアーゼにより免疫感作されたＣ５７Ｂ１／６マウスからの血清（連続的に４倍希釈された）０．１ｍｌにより皮内に注射された。ラットは、４８〜６０時間後に鎮静にされ、次いで、１％Ｅｖａｎ’ｓブルー染料を含有するＰＢＳ中ｒウレアーゼ２μｇを用いて尾静脈をとおして静脈内に注射（０．１ｍｌ）された。
【０１４０】
【表１１】
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【０１４１】
a  幾何平均抗組み換えウレアーゼ抗体タイターは、２８日目に収集された血清サンプルにおいてＥＬＩＳＡによって決定された。１群当たり５マウスであった。
【０１４２】
b  マウスは、０および１６日目に臀部（Ｒ）もしくは首（Ｎ）における皮下（ＳＣ）に、ｒウレアーゼ１０μｇにより免疫感作された。胃内（ＩＧ）に免疫感作されたマウスは、０，２，１４および１６日目にｒウレアーゼ１００μｇを受けた。アジュバントは、ＳｉｍｕｌｏｎTMＱＳ−２１（２０μｇ）、ＣＴ（１０μｇ）もしくはＣＴ変異体（１０μｇ）のいずれかであった。
【０１４３】
【表１２】
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【０１４４】
a  幾何平均抗組み換えウレアーゼＩｇＡ抗体タイターは、２８日目に収集された血清サンプルにおいてＥＬＩＳＡによって決定された。１群当たり５マウスであった。
【０１４５】
b  マウスは、０および１６日目に臀部（Ｒ）もしくは首（Ｎ）における皮下（ＳＣ）に、ｒウレアーゼ１０μｇにより免疫感作された。マウスは、０，２，１４および１６日目にｒウレアーゼ１００μｇを受けて胃内（ＩＧ）に免疫感作された。アジュバントは、ＳｉｍｕｌｏｎTMＱＳ−２１（２０μｇ）、ＣＴ（１０μｇ）もしくはＣＴ誘導体（１０μｇ）のいずれかであった。
【０１４６】
【表１３】
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【０１４７】
a  抗ｒウレアーゼＩｇＧおよびＩｇＡ抗体タイターは、２９日目に収集された保存サンプルにおいてＥＬＩＳＡによって決定された。１群当たり５マウスであった。
【０１４８】
b  ＢＡＷおよびＶＷは、それぞれ気管支肺胞および膣洗液を指す。
【０１４９】
c  マウスは、０および１６日目に臀部（Ｒ）もしくは首（Ｎ）において皮下（ＳＣ）に、ｒウレアーゼ１０μｇにより免疫感作された。マウスは、０，２，１４および１６日目にｒウレアーゼ１００μｇを受けて胃内（ＩＧ）に免疫感作された。アジュバントは、ＳｉｍｕｌｏｎTMＱＳ−２１（２０μｇ）、ＣＴ（１０μｇ）もしくはＣＴ誘導体（１０μｇ）のいずれかであった。
【０１５０】
【表１４】
0004673974.tif 000015
【０１５１】
a  抗組み換え（ｒ）ウレアーゼＩｇＡ抗体タイターは、２８日目に収集された保存サンプルにおいてＥＬＩＳＡによって決定された。１群当たり１０マウスであった。
【０１５２】
b  マウスは、０，２，１４および１６日目に１用量当たりｒウレアーゼ１００μｇにより胃内（ＩＧ）に免疫感作された。対照マウスは、０および１６日目に１用量当たりｒウレアーゼ１０μｇを皮下（ＳＣ）に注射された。
【０１５３】
c  ｒウレアーゼは、１用量当たりＣＴもしくはＣＴ−ＣＲＭ１０μｇのいずれかを用いて製剤化されるか、または１用量当たりＳｉｍｕｌｏｎTMＱＳ−２１  ２０μｇと混合された。
【０１５４】
d  ＢＡＷは、気管支肺胞洗液を指す。
【０１５５】
e  マウスは、２９，３１および３４日目にエィッチ・フェリス（ｆｅｌｉｓ）１０8個の３用量によりチャレンジされ、そして４４日目に防御についてアッセイされた。防御は、急速ウレアーゼ試験によって調査された。
【０１５６】
【表１５】
0004673974.tif 000016
【０１５７】
a  終点抗ｒウレアーゼ抗体タイターは、２８日目に収集された保存血清サンプルにおいてＥＬＩＳＡによって決定された。１群当たり５マウスであった。
【０１５８】
b  ＢＡＷ、ＦＰおよびＶＷは、それぞれ気管支肺胞洗液、糞ペレット抽出液および膣洗液を指す。
【０１５９】
c  マウスは、０および１６日目に皮下（ＳＣ）にｒウレアーゼ１０μｇにより免疫感作された。胃内（ＩＧ）に免疫感作されたマウスは、０，２，１４および１６日目にｒウレアーゼ１００μｇを受けた。アジュバントは、ミョウバン（１００μｇ）、ＣＴ（１０μｇ）もしくはＣＴ−ＣＲＭE29H（１０μｇ）のいずれかであった。
【０１６０】
【表１６】
0004673974.tif 000017
【０１６１】
a  終点ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体タイターは、２９日目に収集された保存血清サンプルにおいてＥＬＩＳＡによって決定された。１群当たり５マウスであった。
【０１６２】
b  マウスは、０，２，１４および１６日目にｒウレアーゼ１００μｇにより胃内（ＩＧ）に免疫感作された。アジュバントは、ＣＴ、ＣＴ−ＣＲＭE29HもしくはＬＴ１０μｇであった。
【０１６３】
c  ＰＣＡは、ＩｇＥ抗体タイターが、受動皮膚アナフィラキシー反応によって決定されることを指す。ＰＣＡは、メスＳｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて行われた。ラットは、ケタミン／キシラジンにより鎮静にされ、剃毛され、そしていずれかＣＴ，ＬＴもしくはＣＴ−ＣＲＭE29Hとともに製剤化されたｒウレアーゼにより免疫感作されたＣ５７Ｂ１／６マウスからの血清（連続的に４倍希釈された）０．１ｍｌにより皮内に注射された。ラットは、４８〜６０時間後に鎮静にされ、次いで、１％Ｅｖａｎ’ｓブルー染料を含有するＰＢＳ中ｒウレアーゼ２μｇを用いて尾静脈をとおして静脈内に注射（０．１ｍｌ）された。
【０１６４】
d  数字は、ｎｇ／ｍｌ中である。ＮＤは検出不能を指す。
【０１６５】
例９  ナイセリア・メニンギチジスの組み換えクラス１ピリンおよびクラス１外膜タンパク質により免疫感作されたＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスの免疫応答
第１の実験では、６−８週令のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（１群当たり１５匹）が、ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．１もしくは１μｇ／マウス）とともに製剤化された精製組み換えクラス１ピリン（ｒピリン）５μｇにより、０，２および３週目にＩＮ（１０μｌ）免疫感作された。血清サンプル、気管支肺胞洗液（ＢＡＷ）、鼻洗液（ＮＷ）および膣洗液（ＶＷ）が、４週目に、ＥＬＩＳＡによってＮ．メニンギチジス・ピリンに特異的な血清および粘膜ＩｇＡおよびＩｇＧ抗体を決定するために、各群の５マウスから収集された。結果は表１６に提示された。平行して免疫感作された各群の残りの１０マウスは、４週目に、同族Ｎ．メニンギチジス菌株Ｈ３５５Ｐ+．ｐ２１Ｒ（乳児ラットで２回継代される）の２ｘ１０7ＣＦＵによってＩＮチャレンジされた。チャレンジ後２４時間目の鼻組織からのグループＢ  Ｎ．メニンギチジスの回収は、図２において示されるように定量的培養によって決定された。
【０１６６】
第２の実験では、同族髄膜球菌株に対するＣＴ−ＣＲＭE29Hとともに製剤化されたｒピリンの防御が、無関係なタンパク質、ＫＬＨと混合されたＣＴ−ＣＲＭE29Hの防御に比較された。５匹のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（６週令）の群は、ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．１μｇ）の有無におけるｒピリン５μｇか、またはＣＴ−ＣＲＭE29H（０．１μｇ）を含むＰｏｒＡ  Ｈ３５５によって、０，２および３週目にＩＮ（１０μｌ容量）免疫感作された。対照群は、免疫されなかった（ナイーブ群）か、またはＫＬＨ（５μｇ）プラスＣＴ−ＣＲＭE29H（０．１μｇ）によりＩＮ免疫感作されたかいずれかであった。終点抗体タイターは、髄膜球菌菌株Ｈ３５５Ｐ+の１ｘ１０7ＣＦＵによるチャレンジ前４週目に収集された保存血清サンプルにおいて、全細胞および抗原特異的ＥＬＩＳＡによって決定された。結果は表１７および１８に示される。
【０１６７】
第３の実験では、ＩＮ免疫感作についてＣＴ−ＣＲＭE29Hとともに製剤化された髄膜球菌ＰｏｒＡの免疫原性が調査された。１群当たり５匹のＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウスが、表１９に指示されるように、ＣＴ−ＣＲＭE29H（１μｇ／用量）の有無における髄膜球菌Ｈ４４／７６株からのＰｏｒＡ  ２０μｇ／用量によって、０，２および３週目にＩＮ免疫感作された。抗ＰｏｒＡ  Ｈ４４／７６抗体タイターおよびＩｇＧについての全細胞ＥＬＩＳＡは、実験４週目に収集された保存血清および粘膜サンプルにおいてアッセイされた。結果は表１９に示される。
【０１６８】
第４の実験では、髄膜球菌の異種菌株のチャレンジに対する、ＣＴ−ＣＲＭE29HをアジュバントされたｒピリンおよびＰｏｒＡのマウス防御能が調べられた。１群当たりＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス１０匹が、ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．１μｇ）とともに製剤化された、いずれかｒピリン、菌株Ｈ３５５からのＰｏｒＡまたは菌株８７０２２７からのＰｏｒＡ  ５μｇによって、０、２および３週目にＩＮ（１０μｌ容量）免疫感作された。対照群は、熱失活された髄膜球菌８７０２２７株全細胞またはＫＬＨ（５μｇ）プラスＣＴ−ＣＲＭE29H（０．１μｇ）のいずれかであった。終点ＩｇＧおよびＩｇＡタイターは、８７０２２７株によるチャレンジ前４週目に収集された保存血清サンプルにおいて、全細胞および抗原特異的ＥＬＩＳＡによって決定された。結果は表２０および２１に示される。鼻組織からの細菌回収は、８７０２２７株によるチャレンジ後２４時間に定量的培養によって決定され、そしてＬｏｇ10ＣＦＵ±標準偏差として表された。結果は図４に示される。
【０１６９】
第５の実験は、非経口免疫感作のためのアジュバントとしてのＣＴ−ＣＲＭE29Hの能力を検査するために実施された。メスＳｗｉｓｓ−Ｗｅｂｓｔｅｒマウス、５−６週令１０匹の群が、いずれかＣＴ−ＣＲＭE29H（１０μｇ）もしくはＭＰＬTM（１００μｇ）とともに製剤化されたＰｏｒＡ  Ｈ３５５  ５μｇによって、０および４週目に皮下に免疫感作された。対照群は、熱失活された髄膜球菌８７０２２７全細胞またはＫＬＨ（５μｇ）プラスＭＰＬTM（１００μｇ）により皮下に免疫感作された。マウスは、髄膜球菌菌株８７０２２７株の１．２ｘ１０7ＣＦＵにより６週目にＩＮチャレンジされた。チャレンジ後２４時間目に、マウスは犠牲にされ、そして鼻組織がホモジナイズされ、そして選択培地に塗布された。コロニーは、３７℃で一夜培養後にカウントされ、そしてＬｏｇ10ＣＦＵ±標準偏差として表された。この実施の結果は、表２２および図５に提示される。
【０１７０】
【表１７】
0004673974.tif 000018
【０１７１】
【表１８】
0004673974.tif 000019
【０１７２】
【表１９】
0004673974.tif 000020
【０１７３】
【表２０】
0004673974.tif 000021
【０１７４】
ＮＤ＝データなし
ＷＣＥ＝Ｈ４４／７６菌株に対する全細胞ＥＬＩＳＡ
ＰｏｒＡ＝ＰｏｒＡ  Ｈ４４／７６特異的ＥＬＩＳＡ。
【０１７５】
【表２１】
0004673974.tif 000022
【０１７６】
【表２２】
0004673974.tif 000023
【０１７７】
【表２３】
0004673974.tif 000024
【０１７８】
例１０  呼吸シンシチアウイルス（ＲＳＶ）の精製ネイティブ融合（Ｆ）糖タンパク質により免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫応答
第１の実験では、６−８週令のＢＡＬＢ／ｃマウス（５マウス／群）が、ＣＴ−ＣＲＭE29H（１μｇもしくは１０μｇ／マウス）、野生型ＣＴ（１μｇ／マウス）、ＣＴ−Ｂ（１μｇもしくは１０μｇ／マウス）もしくは無アジュバントとともに製剤化された精製ネイティブタンパク質３μｇにより、０および１４週目に鼻内に（１０μｌ）免疫感作された。終点ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体タイターは、実験２４日目にＥＬＩＳＡによってアッセイされた。タイターは、血清、気管支肺胞洗液および膣洗液から得られた。結果は表２３に提示される。
【０１７９】
第２の実験では、６−８週令のＢＡＬＢ／ｃマウス（５マウス／群）が、いずれか野生型ＣＴ（１μｇ／マウス）もしくはＣＴ−ＣＲＭE29H（１μｇ／マウス）により、０および１４週目に鼻内に（５０μｌ）前免疫感作された。対照群は前免疫されなかった。その後、２８および４２日目に、全マウスが、同量のＣＴもしくはＣＴ−ＣＲＭE29Hとともに製剤化されたＦタンパク質３μｇにより鼻内に免疫感作された。終点抗体タイターは、５６日目（血清）および５７日目（気管支肺胞洗液および膣洗液）に収集された保存サンプルにおいてＥＬＩＳＡによって決定された。結果は表２４に提示される。
【０１８０】
第３の実験では、ナイーブなメスＢＡＬＢ／ｃマウス（６−８週令、５マウス／群）が、ＲＳＶ  Ａ２由来の精製ネイティブ融合（Ｆ）タンパク質により０，１および２週目に鼻内に（ＩＮ）免疫感作された。免疫感作は、ＣＴ−ＣＲＭE29H（１μｇもしくは１０μｇ／マウス）、ＣＴ−Ｂ（１μｇもしくは１０μｇ／マウス）もしくはミョウバン（１００μｇ／マウス）とともにＦタンパク質（３μｇ／マウス）を製剤化することによって用意された。ワクチンは、鼻孔の先端に置かれたワクチンにおいて、麻酔されたマウスに吸気させることによって鼻内に投与された。用量の総容量は、０，１および２週目においてマウス当たり１０μｌであった（表２５）。対照マウスは、Ｆ／ＡｌＯＨを含有する筋肉内の１次免疫感作を受けるか、または鼻内に送達される生存ＲＳＶ  Ａ２の１次および２次免疫感作を受けた。全身性体液性免疫応答は、３次免疫感作後９日目に（表２５および２６）ＥＬＩＳＡによってアッセイされた。また、気管支肺胞洗液、膣洗液および鼻洗液が収集され、そして粘膜性抗体応答の特徴付において利用された。免疫マウスからの脾臓は、ＭＨＣ適合性ＲＳＶ感染標的細胞に対する抗原依存性キラー細胞活性をアッセイするために使用された。同一免疫感作スケジュールを受けたマウスの第２の群は、生存ＲＳＶによりチャレンジされた。続いて、この群内での肺コンパートメントの防御が、チャレンジ後４日目に、収集され、ホモジナイズされた肺組織におけるウイルスプラークの決定によって分析された。統計的解析はＡＮＯＶＡを用いて行われた。結果は表２５および２６に提示される。
【０１８１】
第４の実験では、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＣＴ−ＣＲＭE29H（１μｇもしくは１０μｇ／マウス）、ＣＴＢ（１μｇもしくは１０μｇ／マウス）もしくはＰＢＳと組み合わせにおける精製ＲＳＶ  Ｆタンパク質（３μｇ／マウス）により０，１および２週目に鼻内に免疫感作された。また、対照として、マウスは、ＲＳＶの鼻内送達またはＦ／ＡｌＯＨの筋肉内送達を受けた。脾臓が、最終免疫感作後９日目に単離され、そして同遺伝子型ＲＳＶ感染スティミュレーター細胞によりイン・ビトロで刺激された。培養６日後、抗原依存性キラー細胞活性が、ＲＳＶ感染標的細胞による51クロム放出の定量によって決定された。結果は図６に示される。
【０１８２】
第５の実験、ウイルス防御アッセイでは、免疫感作マウスの肺コンパートメントが、生存ＲＳＶによるチャレンジ後４日目に単離され、ホモジナイズされ、そして感染性ウイルスの定量が実施された。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＲＳＶ由来精製Ｆタンパク質およびいずれかＣＴ−ＣＲＭE29H、ＣＴＢもしくはＰＢＳを含有するワクチンにより鼻内に免疫感作された。また、マウス群は、対照としてＦ／ＡｌＯＨにより筋肉内に免疫感作された。最終免疫感作後８日目（Ｆ／ＡｌＯＨワクチン後３週目）に、マウスは、生存ＲＳＶによりチャレンジされた。４日後、肺組織が採取され、そして感染性ウイルスの定量において利用された。結果は図７に示される。
【０１８３】
第６の実験では、ナイーブなメスＢＡＬＢ／ｃマウス（６−８週令、５マウス／群）が、ＲＳＶ  Ａ２由来の精製ネイティブ融合（Ｆ）タンパク質により０，１および２週目に鼻内に（ＩＮ）免疫感作された。免疫感作は、ＣＴ−ＣＲＭE29H（１μｇ／マウス）もしくはミョウバン（１００μｇ／マウス）とともにＦタンパク質（３μｇ／マウス）を製剤化することによって用意された。ワクチンは、鼻孔の先端に置かれたワクチンにおいて、麻酔されたマウスに吸気させることによって鼻内に投与された。１用量当たりの総容量は、０，１および２週目においてマウス当たり５μｌであった（表２７）。対照マウスは、Ｆ／ＡｌＯＨを含有する筋肉内の１次免疫感作を受けるか、または鼻内に送達される生存ＲＳＶ  Ａ２の１次および２次免疫感作を受けた。全身性体液性免疫応答は、３次免疫感作後２週目に（表２７および２８）ＥＬＩＳＡによってアッセイされた。また、気管支肺胞洗液、膣および鼻洗液が収集され、そして粘膜性抗体応答の特徴付において利用された。免疫マウスからの脾臓は、ＭＨＣ適合性ＲＳＶ感染標的細胞に対する抗原依存性キラー細胞活性をアッセイするために使用された。同一免疫感作スケジュールを受けたマウスの第２の群は、生存ＲＳＶによりチャレンジされた。続いて、この群内での肺コンパートメントの防御が、チャレンジ後４日目に、収集され、ホモジナイズされた肺組織におけるウイルスプラークの決定によって分析された。統計的解析はＡＮＯＶＡを用いて行われた。結果は表２７および２８に提示される。
【０１８４】
第７の実験では、第４の実験からのプロトコールが、ＲＳＶ感染標的細胞に対する抗原依存性ＣＴＬ活性をアッセイするために使用された。結果は図８に提示される。
【０１８５】
第８の実験、その他のウイルス防御アッセイでは、ＢＡＬＢ／ｃマウス（５マウス／群）が、ＣＴ−ＣＲＭE29Hの有無において精製ＲＳＶＦタンパク質を含有する製剤により鼻内に免疫感作された。また、マウス群は、Ｆ／ＡｌＯＨにより筋肉内に免疫され、そして対照として未免疫（ナイーブ）のまま残された。最終免疫感作後２週目（Ｆ／ＡｌＯＨ投与後４週目）に、全群が、生存ＲＳＶによりチャレンジされた。４日後、肺組織が採取され、そして感染性ウイルスの定量において利用された。結果は図９に示される。
【０１８６】
第９の実験では、３用量プロトコールが、より詳細にＣＴ−ＣＲＭE29Hのアジュバント応答を検討するために用いられた。ＢＡＬＢ／ｃマウス５匹の群が、ＣＴ−ＣＲＭE29Hいずれか０．０１，０．１もしくは１μｇと混合されるＦタンパク質（３μｇ）により０，１および２週目にＩＮ（５μｌ）免疫感作された。対照マウスは、Ｆ／ＡｌＯＨ（筋肉内）もしくはＲＳＶ  Ａ２（ＩＮ）により０日に感作された。血清抗体タイターは、３次免疫感作後２週目に決定された。結果は表２９に提示される。データは、ｌｏｇ10幾何平均抗体タイター（±１ＳＤ）として示される。同様の結果が２つの別の研究において得られた。
【０１８７】
Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29HによるＩＮ免疫感作後、また、第９の実験におけるマウスは、Ｆタンパク質に対するそれらの局所抗体応答について試験された。粘膜洗浄サンプルが、３次免疫感作後２週目に犠牲にされたマウスから採取され、そして抗Ｆタンパク質特異的ＩｇＧおよびＩｇＡについてＥＬＩＳＡによって分析された。結果は表３０に示される。データは、ｌｏｇ10幾何平均終点タイターとして示され、ＯＤ410０．０３であった。同様の結果が２つの別の研究において得られた。
【０１８８】
第１０の実験では、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29Hによって誘導される体液性免疫応答の機能性を検討するために、血清が、ＲＳＶ  Ａ２に対する中和抗体タイターについてプラーク減少アッセイにおいて試験された。結果は表３１に示される。幾何平均中和抗体タイター（ｌｏｇ10）は、補体起源としての５％モルモット血清の存在（＋Ｃ’）もしくは不在（−Ｃ’）下で個々の血清（５マウス／群）において決定された。同様の結果が２つの別の研究において得られた。
【０１８９】
第１１の実験では、マウス（５匹／群）は、０，７および１４日目にＣＴ−ＣＲＭE29H０．０１，０．１もしくは１μｇとともに製剤化されたＦタンパク質のＩＮ免疫感作を受けた。対照マウスは、Ｆ／ＡｌＯＨ（筋肉内）もしくはＲＳＶ  Ａ２（ＩＮ）により免疫感作された。免疫感作されたマウスは、３次免疫感作後２週目にチャレンジされて、続く感染に対するＦ／ＣＴ−ＣＲＭE29Hの防御能を決定された。感染後４日目に、ウイルスレベルが、個々のマウスのホモジナイズされた肺および鼻組織において決定された。結果は表３２に提示される。データは、組織１ｇ当たりの幾何平均ウイルスタイター（±１標準偏差）として示される。
【０１９０】
【表２４】
0004673974.tif 000025
【０１９１】
a  終点抗体タイターは、研究２４日目に収集された保存サンプルにおいて決定された。ＢＡＷおよびＶＷは、それぞれ気管支肺胞および膣洗液を指す。１群当たり５マウスであった。
【０１９２】
b  マウスは、いずれか野生型ＣＴ、市販ＣＴ−ＢもしくはＣＴ−ＣＲＭE29Hの指示量と混合されたネイティブＦタンパク質３μｇによって、０および１４日目に鼻内に（１０μｌ）免疫感作された。
【０１９３】
c  ＮＤ＝データなし
【０１９４】
【表２５】
0004673974.tif 000026
【０１９５】
a  終点抗体タイターは、５６日目（血清）および５７日目（気管支肺胞（ＢＡＷ）および膣（ＶＷ）洗浄液）に収集された保存サンプルにおいてＥＬＩＳＡによって決定された。１群当たり５マウスであった。
【０１９６】
b  マウスは、いずれか野生型ＣＴ（１μｇ）もしくはＣＴ−ＣＲＭE29H（１μｇ）により、０および１４日目に前免疫（鼻内に、５０μｌ）された。その後、２８および４２日目に、全マウスは、いずれか野生型ＣＴもしくはＣＴ−ＣＲＭE29Hの同量（１μｇ）とともに製剤化されたＦタンパク質（３μｇ）により免疫（鼻内に、５０μｌ）された。いずれか野生型ＣＴもしくはＣＴ−ＣＲＭE29Hにより前免疫され、続いてＦタンパク質によって免疫感作されたマウスの終点抗ＣＴ抗体タイターは、４２日目に１，０００，０００を超えていた。
【０１９７】
【表２６】
0004673974.tif 000027
【０１９８】
総ＩｇＧについて：
ｐ＜０．０５：７７７〜７８０対７８４；７８０対７７９；７７７〜７８０対７８５；７７７，７７８，７８０対９０７（７７９対９０７  ｐ＝０．７）
ｐ＞０．０５：７７８対７７７（ｐ＝０．１２５）；
ＩｇＧ１について：
ｐ＜０．０５：７７７〜７８０対７８４；７７７〜７８０対９０７；７７７〜７８０対７８５
ｐ＞０．０５：７８１〜７８０対９０７
ＩｇＧ２ａについて：
ｐ＜０．０５：７７７〜７８０対７８４
【０１９９】
【表２７】
0004673974.tif 000028
【０２００】
【表２８】
0004673974.tif 000029
【０２０１】
総ＩｇＧについて：
ｐ＜０．０５：２５６対２５０および２５７
ｐ＞０．０５：２５６対２５８および２５９
ＩｇＧ１について：
ｐ＜０．０５：２５６対２５０および２５７
ｐ＞０．０５：２５６対２５８
ＩｇＧ２ａについて：
ｐ＜０．０５：２５６対２５０、２５７および２５８
ｐ＞０．０５：２５６対２５９
ＩｇＡについて
ｐ＜０．０５：２５６対２５９
【０２０２】
【表２９】
0004673974.tif 000030
【０２０３】
【表３０】
0004673974.tif 000031
【０２０４】
a  ｐ＜０．０５    Ｆ／ＰＢＳもしくはＦ／ＣＴ−Ｅ２９Ｈ（０．０１μｇ）に比較される
b  ｐ＞０．０５    Ｆ／ＣＴ−Ｅ２９Ｈ（０．０１μｇ）もしくはＦ／ＡｌＯＨに比較される
c  ｐ＜０．０５    Ｆ／ＣＴ−Ｅ２９Ｈ（０．１および０．０１μｇ）およびＦ／ＰＢＳに比較される．ｐ＞０．０５    ＣＴ−Ｅ２９Ｈ（１．０μｇ）に比較される
d  ｐ＜０．０５    Ｆ／ＰＢＳおよびＦ／ＣＴ−Ｅ２９Ｈ（０．０１μｇ）に比較される
e  ｐ＞０．０５    Ｆ／ＰＢＳに比較される
f  ｐ＜０．０５    Ｆ／ＣＴ−Ｅ２９Ｈ（０．１および１．０μｇ）に比較される
g  ＮＤ＝実施せず
【０２０５】
【表３１】
0004673974.tif 000032
【０２０６】
【表３２】
0004673974.tif 000033
【０２０７】
a  ｐ＜０．０５    Ｆ／ＰＢＳもしくはＦ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．０１μｇ）に比較される
ｐ＞０．０５    Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．１μｇ）、Ｆ／ＡｌＯＨもしくはＲＳＶ  Ａ２に比較される
b  ｐ＜０．０５    Ｆ／ＰＢＳもしくはＦ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．０１μｇ）に比較される．
ｐ＞０．０５    Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（１μｇ）、Ｆ／ＡｌＯＨもしくはＲＳＶ  Ａ２に比較される
【０２０８】
【表３３】
0004673974.tif 000034
【０２０９】
a  ｐ＜０．０５    Ｆ／ＰＢＳ、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．０１μｇ）、ＣＴ−ＣＲＭE29Hもしくはナイーブに比較される、 ｐ＞０．０５    Ｆ／ＡｌＯＨもしくはＲＳＶ  Ａ２に比較される
b  ｐ＞０．０５    Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．１μｇ）に比較される．
c  ｐ＜０．０５    Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．０１μｇ）、Ｆ／ＰＢＳ、ＣＴ−ＣＲＭE29Hもしくはナイーブ、ｐ＞０．０５    Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．１μｇ）、Ｆ／ＡｌＯＨもしくはＲＳＶ  Ａ２に比較される．
d  ｐ＜０．０５    Ｆ／ＰＢＳ、Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（０．０１μｇ）、ＣＴ−ＣＲＭE29Hもしくはナイーブに比較される、 ｐ＞０．０５    Ｆ／ＣＴ−ＣＲＭE29H（１μｇ）、Ｆ／ＡｌＯＨもしくはＲＳＶ  Ａ２に比較される
例１１  ロタウイルス組み換えウイルス様粒子により免疫感作されたマウスの免疫応答
スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ｓｆ−９）細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）は、ＳＦ−９００  ＩＩ血清不含培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）において維持された。ｓｆ９細胞は、サル・ロタウイルスＳＡｌｌ株由来のＶＰ２およびＶＰ６遺伝子を発現する組み換えバキュロウイルス構築物により同時感染された（３２）。
【０２１０】
放出される２／６−ＶＬＰは、次のように、これらの感染されたｓｆ９細胞の増殖培地から精製された。細胞が、室温で８３０ｘｇ、３０分間の遠心によって清澄にされた。次いで上澄液が、８０００ｘｇ、３０分間の遠心によってさらに清澄にされた。ＶＬＰは、ＴＮＣバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓ、１４０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭ）ＣａＣｌ2、ｐＨ８．０）中３５％スクロースをとおして、９６５００ｘｇ、２時間で、２回の遠心によって上澄液から精製され、次いで、ＴＮＣバッファーに懸濁され、そして４℃で保存された。精製ＶＬＰは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、続いて銀およびコマシーブリリアントブルー染色によって解析されて純度を決定し、ウエスタンブロット解析でタンパク質組成を解析し、電子顕微鏡で粒子の姿を決定し、そしてＢＣＡタンパク質アッセイで総タンパク質濃度を測定した。
【０２１１】
精製２／６−ＶＬＰのコマシーブリリアントブルー、銀染色およびウエスタンブロット解析は、ＶＰ２およびＶＰ６タンパク質の存在、ならびにそれらの純度および特異モノクローナル抗体との免疫反応性を確認した。ＶＬＰの純度は、ゲルにおけるバンド強度から約９５％であると評価された。さらに、これらの精製２／６−ＶＬＰの電子顕微鏡解析は、それらの形態学的姿を確認した（データ未掲載）。
【０２１２】
マウスは、次のように免疫感作された。この研究において使用されたＢＡＬＢ／ｃおよびＣＤ−１マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｔｏｒｅｒｉｄｇｅ，ＮＹ）から購入され、ロタウイルスの存在しない環境において飼育された。４週令ＢＡＬＢ／ｃマウスは、０および２週目に、それぞれ２／６−ＶＬＰ  １００および１０μｇにより、いずれか経口（ｎ＝４）もしくはＩＮ（ｎ＝５，ｎ＝４）に２回免疫感作された；各用量が、ＣＴ−ＣＲＭE29H１０μｇとともに製剤化された。ＢＡＬＢ／ｃマウスの第３群（ｎ＝４）は、ＣＴ−ＣＲＭE29Hとともに２／６−ＶＬＰをＩＮに受け、続いて経口ブースター免疫感作された（すなわち、混合群）。この実験における対照マウスは、ＣＴ−ＣＲＭE29H（ｎ＝１０）、１ｘＴＮＣバッファー（ｎ＝５）もしくは２／６−ＶＬＰプラス１ｘＴＮＣバッファー（ｎ＝５）により免疫感作された。各マウスは、１分間隔で交替に鼻孔中に、接種量２０μｌ、１回に２μｌをＩＮ免疫感作された。血清および糞サンプルは、０，１，２，４，６，８，１０，１３週に全動物から収集され、そして産生されたロタウイルス特異的血清ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体、ならびに糞ＩｇＧおよびＩｇＡのレベルが、ＥＬＩＳＡによって決定された。血清抗体結果は、図１０および１１に提示され；糞抗体結果は図１３に提示される。１３週目の血清サンプルは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａサブクラスを決定するために使用された。抗体サブクラスの結果は、図１２に提示される。
【０２１３】
１：１００希釈された免疫感作前血清および免疫感作前糞サンプルの１：２希釈液は、ＥＬＩＳＡにおいて反応性を示さなかった。ＴＮＣバッファーもしくはＣＴ−ＣＲＭE29Hのみを受けている対照からの血清および糞が並行して解析された。対照群は、研究をとおしてロタウイルス特異的血清もしくは糞抗体を示さなかった。
【０２１４】
４週令ＣＤ−１マウスは、アジュバントとしてＣＴ−ＣＲＭE29Hを用いて上記のように０、２および１３週目に、経口（ｎ＝４）もしくはＩＮ（ｎ＝４）に３回免疫感作された。対照群（ｎ＝２）は、ＣＴ−ＣＲＭE29Hのみを受けた。血清および糞サンプルは、０−９，１１−１４，２６−２８週に収集され、そしてロタウイルス特異的血清および糞抗体のレベルが決定された。
【０２１５】
糞および血清サンプルにおけるＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡの検出および定量では、９６穴塩化ポリビニルミクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）が、リン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）中に希釈された高免疫モルモット抗ＳＡｌｌロタウイルス血清によってコーティングされ、そして３７℃で４時間または室温で一夜インキュベートされた。次いで、プレートは、５％ＢＬＯＴＴＯ（ＰＢＳ中５％ｗ／ｖ無脂肪粉乳）を用いて３７℃で２時間ブロックされた。懸濁保存サンプルは、１％ＢＬＯＴＴＯ中１：１希釈され、そしてプレートに添加された。次いで、プレートは、４℃で一夜インキュベートされ、その後、ＴＮＣバッファー＋０．０５％ＴｗｅｅｎTm２０（ＴＮＣ−Ｔ）を用いて３回洗浄された。ウサギ抗アカゲザル・ロタウイルス高免疫血清は、１％ＢＬＯＴＴＯ＋２．５％正常モルモット血清（ＮＧＰＳ）中に希釈され、そして３７℃で１時間プレートに添加された。次いで、プレートは、ＴＮＣ−Ｔで３回洗浄された。西洋ワサビペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）が、１％ＢＬＯＴＴＯ＋２．５％ＮＧＰＳ中に希釈され、そしてプレートに添加され、３７℃で１時間インキュベートされた。次いで、プレートは、ＴＮＣ−Ｔで４回洗浄された。ＴＭＢ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が添加され、生成される呈色反応が、室温で７分間発色させられた。反応は、１Ｍリン酸の添加によって停止された。ＯＤは、ミクロプレートリーダー（ＢＩＯ−ＴＥＫ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を用いて４５０ｎｍにおいて決定された。ブランクを超える０．１の測定値は、有意と見なされた。ＳＡｌｌ保存ウイルスは、１％ＢＬＯＴＴＯ中に希釈され、そしてプレートに添加され、次いで、プレートは、４℃で一夜インキュベートされた。プレートは、ＴＮＣ−Ｔを用いて３回洗浄された；その後、１％ＢＬＯＴＴＯ中１：１希釈された糞サンプル、または１％中連続希釈された血清サンプルが適用された。ネガティブ対照として、２並列の保存サンプルが、抗ＳＡｌｌ抗体コーティングされてないウェルに添加された。プレートは３７℃で２時間インキュベートされ、次いで、ＴＮＣ−Ｔで３回洗浄された。西洋ワサビペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡが、１％ＢＬＯＴＴＯ＋２．５％ＮＧＰＳ中に希釈され、そしてウェルに添加され；免疫感作前抗体検出のために、ペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウスＩｇＡ＋ＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）抗体が、同様に希釈され、そしてウェルに添加された。プレートは、３７℃で１時間インキュベートされ、次いで、ＴＮＣ−Ｔで４回洗浄された。プレートは、抗原検出ＥＬＩＳＡのために上記のように発色された。ＩｇＧサブクラスを決定するために使用されたＥＬＩＳＡプロトコールは、第２の抗体としてＨＲＰ標識ラット（モノクローナル）抗マウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）を用いるよう記述された���ロトコールの変法であった。
【０２１６】
Ｉｓｈｉｄａらによって記述されている免疫組織化学的アッセイが改変され、使用されて、２／６−ＶＬＰにより免疫感作されたマウスの血清中の抗ロタウイルスＶＰ２およびＶＰ６抗体を検出した。簡単に言えば、振盪フラスコにおける早期の対数増殖期ｓｆ９細胞が、濃度２．５ｘ１０4細胞／ウェルにおいて９６穴組織培養プレート中に接種され、次いで室温（ＲＴ）で１時間インキュベートされた。続いて、細胞は、感染多重度１０においてＶＰ２およびＶＰ６遺伝子をコードしている組み換えバキュロウイルスにより感染され、そして感染は、２８℃で３日間進行させられた。次いで、培養基が廃棄され、プレートは、真空オーブン中でＲＴで１時間乾燥され、そしてＰＢＳ中１０％ホルマリン（１０−１５％メタノールを含有する３７％ホルムアルデヒド溶液；Ｓｉｇｍａ）によりＲＴで３０分間固定された。続いて、細胞は、ＲＴで５分間、ＴＮＣバッファー中１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）により透過性にされた。
【０２１７】
指定されたロタウイルスタンパク質を発現している感染細胞の各セットが、各ＢＡＬＢ／ｃもしくはＣＤ−１マウスからのチャレンジ前もしくは免疫感作後の血清に対して曝露され、続いて免疫学的に染色された。マウス血清サンプルは、５％ＦＣＳを用いてＰＢＳ中に連続希釈された。サンプルがウェルに添加され、そしてプレートは、３７℃で２時間インキュベートされた。次いで、プレートはＰＢＳによって４回洗浄された。西洋ワサビペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭもしくはＩｇＡ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が、５％ＦＣＳとともにＰＢＳ中に添加され、そして３７℃で１時間インキュベートされた。染色された細胞は、ＰＢＳによって２回ウェルを洗浄後、３−アミノ−９−エチル−カルバゾール基質（ＡＥＣ）（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出された。未感染ｓｆ９細胞、未免疫マウスからの血清、および免疫マウスからの免疫感作前血清が、ネガティブ対照として使用された。ＶＰ６（７Ｄ９，５Ｅ６）およびＶＰ２（ＢＰ２）に対するモノクローナル抗体が、ポジティブ対照として使用された（５０）。
【０２１８】
未免疫動物および２／６−ＶＬＰにより免疫感作された動物が、２６週目（ＣＤ−１マウス）もしくは１３週目（ＢＡＬＢ／ｃマウス）に野生型マウスＥＤＩＭロタウイルス（５１）のＳＤ50１０を用いて摂食によってチャレンジされた。ＥＤＩＭ株のタイターは、脱落（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）用量５０（ＳＤ50）、成熟マウスの５０％において糞のウイルス脱落を誘導するのに必要な用量として決定された。トリプシン活性化チャレンジウイルス（１００μｌ）が、胃の酸性を中和するための４％重炭酸ナトリウム溶液１００μｌの経口投与後に投与された。ウイルスは、Ｍ１９９培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）において希釈され、そしてウイルス保存溶液１ｍｌ当たりトリプシン保存液（１ｍｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１０μｌにより活性化された。チャレンジに続いて、糞サンプルが、９日間全動物から収集された。
【０２１９】
糞サンプル中に脱落するロタウイルス抗原が、ＥＬＩＳＡによって測定され、そしてネットの光学濃度（ＯＤ）値、すなわちチャレンジ後の糞サンプルのＯＤマイナス同じマウスからのチャレンジ前サンプルのＯＤ、として表された。各動物についての脱落曲線下の面積が決定され、そして各動物の抗原脱落におけるパーセント減少（ＰＲＡＳ）が、対照動物の平均面積に対する各動物の曲線下の面積を比較することによって計算された。次いで、平均ＰＲＡＳが、各免疫群について計算された。５０％以上のＰＲＡＳレベルのみが、防御的と見なされた。結果は図１４に提示される。
【０２２０】
統計的解析が、Ｗｉｎｄｏｗｓのバージョン８．０用ＳＰＳＳ（ＳＰＳＳ，Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を用いて実施された。独立ｔ検定が、チャレンジ前の幾何平均タイター値および群間のＰＲＡＳを比較するために使用された。小数点以下３桁までが、Ｐ値を算出することに考慮された（０．０００＝０）。
【０２２１】
例１２  アラビノース誘導プロモーターの使用によるＣＴ−ＣＲＭE29Hの発現増強
アラビノース誘導系の構築は、次のとおりであった：ＰＣＲプライマーは、ｐＩＩＢ２９Ｈからの二シストロン（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎ）をコードしているトキシンを増幅するために合成された。
プライマー #1, CT29 正 NheI： 5′-
TTTTTTGGGCTAGCATGGAGGAAAAGATG AGC-3′ (配列番号:6);
プライマー #2, CT29 逆 HindIII: 5′-
GCAGGTCGAAGCTTGCATGTTTGGGC-3′ (配列番号:7)。
ＰＣＲフラグメントをコードしているＣＴ−ＣＲＭE29HｃｔｘＡおよびｃｔｘＢが、エンドヌクレアーゼ部位ＮｈｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐＢＡＤ１８−Ｃｍ中にクローン化されて、構築物ｐＣＴ１８を得た。ｐＣＴ１８からのｃｔｘＢ（Ｖ．コレレ２１２５）遺伝子が、ＣｌａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて除去され、そしてＶ．コレレ５６９Ｂ株由来のｃｔｘＢ遺伝子をコードしていることが分かっているプラスミドｐＭＧＪ１４２からの類似するフラグメントにより置換された。得られる構築物、ｐＰＸ７４９０は、アラビノースプロモーターの調節下で菌株５６９Ｂ由来のＣＴ−ＣＲＭE29HｃｔｘＡおよびｃｔｘＢ遺伝子をコードしていて、そしてＬＴＩＩｂ−Ｂリーダー配列をもつ。
【０２２２】
ＣＴ−ＣＲＭE29Hの大規模発現および精製のためのプロトコールが開発され、そして次のとおりであった：３Ｌのひだ付きフェルンバッハ（ｆｌｕｔｅｄ  Ｆｅｒｎｂａｃｈ）フラスコが使用され、１フラスコ当たりＨｙ−Ｓｏｙ増殖培地（１リットル当たり：Ｈｙ−Ｓｏｙ  １０ｇ；酵母エキス  １２．５ｇ；塩化ナトリウム  ５ｇ；リン酸ナトリウム、１塩基性  ３．３ｇ；リン酸ナトリウム、２塩基性  １３．１ｇ）１Ｌが入れられた。スターター保存調製物では、クロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌおよび滅菌５０％グルコース２０ｍｌが、１個のフラスコに添加された（１％最終グルコース濃度）。次いで、フラスコは、ｐＰＸ７４９０により形質転換され、−７０℃で凍結保存されていたＤＨ５α３００μｌを用いて植菌された。フラスコは、２００ｒｐｍにおいて振盪しつつ３０℃で一夜培養された。使用される全増殖培地が、翌日、２００ｒｐｍにおいて３７℃一夜の振盪によって予め暖められた。翌日、一夜培養液の１：４０希釈は、クロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌおよび炭素源として滅菌グリセロール１０ｍｌ（１％最終グリセロール濃度）を補足されたＨｙ−Ｓｏｙ増殖培地中に作成された。この培養は、Ｆｅｒｎｂａｃｈフラスコ中でＯＤ600４．５−５．５（バイオリアクターにおけるよりも高い）まで３７℃で発芽後増殖された。次いで、培養は、Ｌ−アラビノース２０ｍｌ（０．５％最終濃度）を用いて誘導され、そしてさらに３時間インキュベートされた。３時間のインキュベーション後、多量のトキシンは細胞に結合されていた。細胞が遠心によって収穫され、そしてペレットは、１０ｍＭＮａＰＯ4、１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）バッファー中に、元の培養液容量９％に再懸濁された。細胞懸濁液は、ミクロフルーダイザーをとおして機械的に破壊され、そして８５００ｘｇで１０分間遠心されて細胞破片が除去された。細胞溶解液（上澄液）は、さらに、４５Ｔｉローターにおいて４２，０００ｒｐｍ１時間、１６０，０００ｘｇAVで清澄化された。清澄細胞溶解液は、１０ｍＭＮａＰＯ4（ｐＨ７．０）で平衡化されたカルボキシメチル（ＣＭ）−ＳｅｐｈａｒｏｓｅTMカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に負荷された。約３００ｍｌのＣＭ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅTMが、培養液容量１０リットル当たり使用された。細胞溶解液は、カラム上に速度０．１０２ｃｍ／ｍｉｎ（２ｍｌ／ｍｉｎ）において負荷された。カラムは、１０ｍＭＮａＰＯ4（ｐＨ７．０）の１０−１５カラム容量を用いて０．２５５ｃｍ／ｍｉｎ（５ｍｌ／ｍｉｎ）において十分に洗浄されて混入物が除去された。ＣＴ−ＣＲＭE29Hホロトキシンは、１０ｍＭＮａＰＯ4（ｐＨ８．３）の４カラム容量を用いて０．２５５ｃｍ／ｍｉｎにおいて溶出された。ＣＴ−ＣＲＭE29H含有溶出液は、濾過によってバッファー交換されるか、またはＰＢＳに対して透析され、次いで４℃で保存された。
【０２２３】
例１３  単純ヘルペスウイルス２型の全長糖タンパク質ＤをコードしているプラスミドＤＮＡにより免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫応答
６−８週令メスＢＡＬＢ／ｃマウスが、０．２５％ブピバカイン（ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ）とともに製剤化され、そして野生型ＣＴ、ＣＴ−ＣＲＭE29Hによってアジュバントされるか、またはアジュバントなしで、単純ヘルペスウイルス２型の全長糖タンパク質Ｄ（ｇＤ２）をコードしているプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）により免疫感作された（ｇＤ２遺伝子を含有しているプラスミドは、引用によって本明細書に組み入れられている、Ｐａｃｈｕｋらにより記述されている（４０））。動物は、１次後３週目に２次免疫感作を与えられ、最後の注射後２週目に安楽死された。免疫感作プロトコールは次のとおりであった。
【０２２４】
【表３４】
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【０２２５】
０２４＝ｇＤ２遺伝子を含有するｐＤＮＡ；０２３＝ｇＤ２遺伝子インサートのないｐＤＮＡ骨格
ＩＤ＝皮内；ＩＭ＝筋肉内
群４はポジティブ対照として使われ；群５はネガティブ対照として使われた。
【０２２６】
増殖アッセイは、次のとおり実施された：１ｘ１０5脾細胞が、１０％ＦＣＳを含む完全ＲＰＭＩ培地においてｇＤ２タンパク質２００ｎｇ／ｍｌの存在もしくは不在下で培養された。５％ＣＯ2存在下で３７℃４日の培養後、培養は、3［Ｈ］によって一夜パルスされた。3［Ｈ］取り込みがβカウンターにおいて測定された。カウントは、ＳＩ（刺激指数＝抗原刺激存在下のカウント割る抗原刺激不在下のカウント）として報告された。結果は表３４に提示される。
【０２２７】
ＥＬＩＳＡは、血清および膣洗液における抗原特異的体液性応答を測定するために実施された。簡単に言えば、９６穴平底プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ，Ｎｕｎｃ）が、濃度０．４μｇ／ｍｌにおいて精製ｇＤ２タンパク質によって４℃で一夜コーティングされた。プレートは、ＰＢＳで３回洗浄され、そして室温で１時間４％ＢＳＡによってブロックされた。血清サンプル５０μｌ（１：１００希釈）または膣洗液サンプル５０μｌがプレートに添加された。血清については１時間そして膣洗液については４℃で一夜インキュベーション後、プレートはＰＢＳによって５回洗浄され、そしてペルオキシダーゼ共役抗マウスＩｇ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｓ，ＭＯ）１：３０００希釈液が添加され、そしてプレートは１時間インキュベートされた。プレートは、基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）−Ｈ2Ｏ（Ｂｉｏｔｅｃｘ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を添加する前に、ＰＢＳによって洗浄された。呈色は、３０分間発色させられ、その後ＥMAXミクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙａｌｅ，ＣＡ）において４５０ｎｍで読み取られた。結果は、表３５（血清）および表３６（膣洗液）に提示される。
【０２２８】
サイトカインは、上記のように標準ＥＬＩＳＡを用いて測定された。プレートは、それぞれ２４時間もしくは７２時間のｇＤ２−刺激培養液の上澄液からのいずれかＩＬ−５もしくはγ−インターフェロンを補足するために適当にコーティングされた。結果は表３７に提示される。
【０２２９】
【表３５】
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【０２３０】
【表３６】
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【０２３１】
【表３７】
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【０２３２】
【表３８】
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【０２３３】
【表３９】
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【０２３４】
【表４０】
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【０２３５】
【表４１】
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【０２３６】
【表４２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＣＴ−ＣＲＭのガングリオシドＧＭ1への結合能力を示す。各ＣＴ−ＣＲＭは、初発濃度３μｇ／ｍｌにおいて３倍希釈され、そして２並列で試験された。結合能力は、各希釈について４１０ｎｍにおける平均吸光度として表された。
【図２】  図２は、ＣＴ−ＣＲＭE29Hアジュバントの有無における髄膜球菌の（ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃａｌ）組み換えピリン（ｒピリン（ｒｐｉｌｉｎ））により鼻内に免疫感作されたマウス（ｎ＝１０／群）、または免疫されなかったマウスであって、各群が、次いで、同族の髄膜球菌菌株によりチャレンジされたマウスにおける、鼻当たり平均Ｌｏｇ10ｃｆｕにおける鼻のコロニー形成の減少を示す。
【図３】  図３は、ＣＴ−ＣＲＭE29Hアジュバントの有無における髄膜球菌ｒピリン、ＣＴ−ＣＲＭE29Hアジュバントとともに髄膜球菌クラス１外膜タンパク質（ＰｏｒＡ）、ＣＴ−ＣＲＭE29HアジュバントとともにＫＬＨにより鼻内に免疫感作されたマウス（ｎ＝５／群）、または免疫されなかったマウスであって、各群が、次いで、同族の髄膜球菌菌株によりチャレンジされたマウスにおける、鼻当たり平均Ｌｏｇ10ｃｆｕにおける鼻のコロニー形成の減少を示す。
【図４】  図４は、各々ＣＴ−ＣＲＭE29Hでアジュバントされた、髄膜球菌のｒピリン、髄膜球菌Ｈ３５５株由来ＰｏｒＡ、髄膜球菌８７０２２７株由来ＰｏｒＡ、熱失活された髄膜球菌８７０２２７株全細胞またはＫＬＨにより鼻内に免疫感作されたマウス（ｎ＝１０／群）であって、各群が、次いで、異種の髄膜球菌菌株（８７０２２７）によりチャレンジされたマウスにおける、鼻当たり髄膜球菌８７０２２７株の平均Ｌｏｇ10ｃｆｕにおける鼻のコロニー形成の減少を示す。
【図５】  図５は、ＣＴ−ＣＲＭE29HもしくはＭＰＬTMアジュバントとともに髄膜球菌Ｈ３５５株由来ＰｏｒＡ、ＭＰＬTMアジュバントとともにＫＬＨ、またはＭＰＬTMアジュバントとともに熱失活された髄膜球菌８７０２２７株全細胞により皮下に免疫感作されたマウス（ｎ＝１０／群）であって、各群が、次いで、異種の髄膜球菌菌株（８７０２２７）によりチャレンジされたマウスにおける、鼻当たり髄膜球菌８７０２２７株の平均Ｌｏｇ10ｃｆｕにおける鼻のコロニー形成の減少を示す。
【図６】  図６は、呼吸シンシチアルウイルス（ＲＳＶ）感染標的細胞に対する抗原依存性細胞溶解活性の第１アッセイを、細胞溶解％対エフェクター：標的比として示す。
【図７】  図７は、Ｆタンパク質＋アジュバントを用いる免疫感作による、ＲＳＶチャレンジに対するマウス肺の防御の第１アッセイであって、肺のウイルスタイターが、１ｇ当たりＬｏｇ10ＰＦＵとして測定されるアッセイを示す。
【図８】  図８は、ＲＳＶ感染標的細胞に対する抗原依存性細胞溶解活性の第２アッセイを、細胞溶解％対エフェクター：標的比として示す。
【図９】  図９は、Ｆタンパク質＋アジュバントを用いる免疫感作による、ＲＳＶチャレンジに対するマウス肺の防御の第２アッセイであって、肺のウイルスタイターが、１ｇ当たりＬｏｇ10ＰＦＵとして測定されるアッセイを示す。
【図１０】  図１０は、ＣＴ−ＣＲＭE29Hアジュバントの有無における２／６−ＶＬＰにより鼻内に免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるロタウイルス特異的血清抗体応答を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hを含む（ｎ＝４）か、または含まない（ｎ＝５）２／６−ＶＬＰにより鼻内に免疫され、そしてロタウイルス特異的ＩｇＧ（図１０Ａ）、ＩｇＭ（図１０Ｂ）およびＩｇＡ（図１０Ｃ）のレベルが測定された。標準偏差が示される。
【図１１】  図１１は、２／６−ＶＬＰにより免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃ近交系マウスにおけるロタウイルス特異的血清抗体応答を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスの群は、０および２週目に２／６−ＶＬＰプラスＣＴ−ＣＲＭE29Hにより、経口的に（四角、ｎ＝４））、鼻内に（ひし形、ｎ＝５）または組み合わせ（鼻内プラス経口、丸、ｎ＝４）において免疫感作された。血清サンプルが、示された週において各群の個々のマウスから採取され、そして血清ＩｇＧ（図１１Ａ）、ＩｇＭ（図１１Ｂ）およびＩｇＡ（図１１Ｃ）のレベルが、ＥＬＩＳＡによって各マウスについて決定された。幾何平均タイター（ＧＭＴ）が各群について計算され、そして週後の免疫感作に対してプロットされた。
【図１２】  図１２は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩｇＧ１およびＩｇＧ２抗体サブクラスを示す。ロタウイルス２／６−ウイルス様粒子（ＶＬＰ）プラスＣＴ−ＣＲＭE29Hにより経口もしくはＩＮに免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃマウスのチャレンジ前血清が、ＩｇＧサブクラスを決定するために使用された。標準偏差が示される。
【図１３】  図１３は、２／６−ＶＬＰにより免疫感作された近交系ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるロタウイルス特異的腸管抗体応答を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスの群は、図１１について記述されたように２／６−ＶＬＰプラスＣＴ−ＣＲＭE29Hにより免疫され、そして腸管ＩｇＡ（図１３Ａ）およびＩｇＧ（図１３Ｂ）のレベルが測定された。ロタウイルス特異的腸管ＩｇＭは、いかなるマウスにも検出されなかった。
【図１４】  図１４は、マウスロタウイルスによるチャレンジ後の、２／６−ＶＬＰで免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃおよびＣＤ−１マウスの防御を示す。図１４Ａは、ＣＴ−ＣＲＭE29Hを含む（ｎ＝５）か、または含まない（ｎ＝４）２／６−ＶＬＰにより免疫感作されたマウス間の抗原脱落における減少パーセント（ＰＲＡＳ）の比較を示す。各マウスについてのＰＲＡＳ（○）および各群の平均値（−）が計算された。図１４Ｂは、指示される異なる経路によって、２／６−ＶＬＰプラスＣＴ−ＣＲＭE29Hにより免疫感作されたＢＡＬＢ／ｃマウスの群を示し、防御レベルが、上記のように決定された。図１４Ｃは、上記のように経口的および鼻内に、２／６−ＶＬＰプラスＣＴ−ＣＲＭE29Hにより免疫感作された非近交系ＣＤ−１マウスの群を示す。２６週目において、免疫および対照マウスがチャレンジされ、そしてＰＲＡＳが、上記のように計算された。経口群（ｎ＝４）では、１マウスが、チャレンジ前に死んだ（防御についてはｎ＝３）。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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