(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）４８．５％の中性脂質、および３％のミリスチン酸、２６％のパルミチン酸、１５％のステアリン酸、４０％のオレイン酸および６％のリノール酸を含む４０．５％の極性脂質、を含む医薬として許容される脂質配合物、
（ii）４７％のラウリン酸、２０％のミリスチン酸、１２％のパルミチン酸、１２％のステアリン酸および３％のオレイン酸を含む医薬として許容される脂質配合物、又は
（iii）４４％のラウリン酸、２０％のミリスチン酸、１６％のパルミチン酸および１９％ステアリン酸を含む医薬として許容される脂質配合物、並びに
（iv）固形またはペースト様の脂質マトリックスの全体に均一に分配されている、抗原として有効量の生きた微生物を含む少なくとも１種の抗原性成分
を含む、抗原性組成物。
【請求項２】
前記脂質配合物が３０℃〜４０℃の間で固体から液体への転移を受ける、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記脂質配合物が３０℃〜３７℃の間で固体から液体への転移を受ける、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
追加の抗原性成分を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗原性成分または前記追加の抗原性成分が、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド成分を有する因子あるいはこれらの混合物であって、前記成分が１０〜１０００μｇ／脂質配合物ｇの量で存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記脂質配合物が、次の配合：４７％のラウリン酸、２０％のミリスチン酸、１２％のパルミチン酸、１２％のステアリン酸および３％のオレイン酸を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記生きた微生物が生物学的に純粋な培養物である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記生きた微生物が菌類、原生動物、細菌類およびウイルス類からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ウイルスが、１×１０3〜１×１０10プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌの濃度で存在する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ウイルスがＨＩＶまたはＳＩＶである、請求項８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記細菌がブルセラ属（Brucella）、炭疽菌(Anthrax）およびマイコバクテリウム(Mycobacterium）属より選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記細菌がマイコバクテリウムである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記マイコバクテリウムが、マイコバクテリウム・ツベロクロシス複合体（マイコバクテリウム・ツベロクロシス(M. tuberculosis）、マイコバクテリウム・ボービス（M. bovis）、マイコバクテリウム・アフリカナム（M. africanum）およびマイコバクテリウム・ミクロティ(M. microtii）を含んでなるもの）、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラール複合体（マイコバクテリウム・イントラセルラール(M. intracellulare）およびマイコバクテリウム・アビウム（M. avium）を含んでなるもの）、マイコバクテリウム・パラツベロクロシス(M. paratuberculosis）、マイコバクテリウム・ワッカ(M. vaccae）、マイコバクテリウム・スメグマチス（M. smegmatis）、マイコバクテリウム・チェロナ(M. chelonae）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（M. fortuitum）、マイコバクテリウム・カンサイ（M. kansaii）、マイコバクテリウム・レプラ(M. leprae）、マイコバクテリウム・マリナム（M. marinum）、マイコバクテリウム・ウルセランス(M. ulcerans）、マイコバクテリウム・シミア(M. simiae）、マイコバクテリウム・ハエモフィラム（M. haemophilum）、マイコバクテリウム・マルモエンス（M. malmoense）、マイコバクテリウム・シモイデイ（M. shimoidei）、マイコバクテリウム・ガストリ(M. gastri）、マイコバクテリウム・テラ(M. terrae）複合体、およびマイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム(M. nonchromogenicum）、並びにこれらの菌株の機能的に等価な変異株、天然または遺伝子工学による純株、突然変異株および組換え体、およびこれらの抗原性成分より選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記マイコバクテリウムが、マイコバクテリウム・ボービス（M. bovis）である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記マイコバクテリウム・ボービスがカルメット・ゲラン杆菌(Bacille Calmette Guerin）（ＢＣＧ）である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記マイコバクテリウム・ボービスが、デーニッシュ（Danish）1311株、83/6235、パスツール（Pasteur） 1173P2、グラクソ(Glaxo）1077、ジャパニーズ（Japanese） 172、プラハ（Prague）、ロシアン(Russian）、ブラジリアン(Brazilian）、デーニッシュ（Danish）1331、コペンハーゲン（Copenhagen）、コンノート(Connaught）、マイコバクテリウム・ボービスの機能的に等価な変異株および他の弱毒化菌株、これらの菌株の純株（clones）、突然変異株および組換え体、並びにこれらの抗原性成分からなる群より選ばれる、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記マイコバクテリウムが、１×１０5〜１×１０10コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌの濃度にある、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
一方の抗原性成分が生きた微生物であり、一方の抗原性成分がタンパク質またはペプチドである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記タンパク質が免疫避妊性タンパク質である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記タンパク質またはペプチドが低い免疫原性である、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
水性成分を含まない、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
非経口投与用、皮下投与用または経口投与用に配合されている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
１以上の香味料、誘引剤または着臭剤を更に含む経口投与用に配合されている、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
アルブミン・デキストロース・カタラーゼ（ＡＤＣ）を更に含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
ワクチンである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
ワクチンアジュバントである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が、保護的にコーティングされている、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記保護コーティングがゼラチンである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
非ヒト動物を免疫するための、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
非ヒト動物における粘膜免疫応答を刺激するための、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記脂質配合物（iii）が、オリーブ油またはココナッツ油を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３２】
前記オリーブ油またはココナッツ油が、水素添加されている、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記非ヒト動物が、ウシ、シカ、ヒツジ、アナグマまたはフクロネズミである、請求項２９または３０に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗原性組成物、特に生細菌ワクチン、を配合するための脂質の使用に関し、また該組成物を使用して動物を免疫化するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
結核（ＴＢ）を引き起こす病原など、大抵のヒトおよび動物の病原は粘膜表面を通じて感染を開始する。従って、このような病原に対する保護性免疫が強い粘膜免疫反応を誘導することを必要とする場合がある。しかしながら、粘膜免疫反応は非経口的な免疫化を受けて一般に弱い。粘膜部位を保護するためにワクチン、特にＴＢワクチンに対する明らかな必要性にもかかわらず、今日使用されているワクチンは皮内または皮下注射により行われる。それ故に、より効果的な組成物および／または代替的ルートによるワクチン送達システムの開発が望ましい。特にワクチンの経口投与は、投与の容易性および粘膜免疫反応のターゲッティングなど多数の利点を有する。これにもかかわらず、動物およびヒトの経口ワクチン接種により粘膜免疫および／または全身免疫を行うことは今日まで概ね効果をあがっていない。このようなワクチンの効力は、ワクチンが消化管を通過する際にワクチンの分解により阻害されてきた。特に、大抵の抗原性成分は、消化管における胃酸およびタンパク質分解酵素により容易に分解するペプチド結合を有している。
【０００３】
多数のワクチンが微生物の凍結乾燥調製物の使用に依存している。例えば、ヒトＴＢに対する現在のワクチンは、カルメット・ゲラン杆菌(Bacille Calmette Guerin）（ＢＣＧ）と呼ばれる生（live）の弱毒化細菌の凍結乾燥調製物に基づく。しかしながら、凍結乾燥方法はＢＣＧ生存度の３０〜５０％の損失を生じ、残存する生菌の回復を害する（７）。使用前の高い微生物生存度を保持する組成物は、このようなワクチンの有効性に大きく寄与するものとなろう。
【０００４】
免疫反応を改善するために、抗原は、免疫原性を刺激する多数のアジュバント（免疫助成剤）と混合されてきた。これらのアジュバントは主にミョウバンそして水中油エマルジョンである。後者の群はフロイントの鉱物油アジュバントに代表される。しかしながら、
ヒトおよび家畜ワクチンにおいてフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）を使用することは、報告されている毒性反応のために禁忌されている。これらの理由のために、フロイントのアジュバントも経口投与のために不適当となる場合がある。
【０００５】
他の水中油エマルジョンでは、高い含油量のために界面活性剤を必要としている。界面活性剤の洗剤特性によって該エマルジョンは非経口投与および経口投与のために不適当となる。更に、承認されている界面活性剤についても毒性反応が報告されている。エマルジョンを使用する場合の更なる欠点は、不混和性の一つの液が他の液に分散される不均一系であるということである。これは不安定であって、経時的に水性相の分離を生じる。このことが安定な懸濁液中でワクチンを維持することを困難にしている。更に、油中水エマルジョンの水性相に捕らえられた抗原は、胃での分解から保護されることが困難である。
【０００６】
リポソームおよび脂質ベシクルも、ワクチンと共に、特に容易に被包され得る小さな抗原性成分と共に使用するために検討されてきた。一般に、リポソームおよびベシクルは大きな抗原、例えば生きた微生物、の被包(encupsulation）にとって有用でない。更に、リポソームおよびベシクルはその生産に費用と時間がかかるので、その調製における抽出手順はワクチン調製物の化学構造または生存度に変化を生じさせ、従ってその免疫原性に変化を生じさせる場合がある。例えば、熱および溶媒は、タンパク質などの抗原性成分の生物学的完全性を変化させ得る。
【０００７】
したがって、本発明の目的は、これらの要望に応えるか又は少なくとも有用な選択肢を公衆に供する、抗原性組成物および／または送達システムを提供することを目的とする。
【発明の開示】
【０００８】
従って、一つの態様において本発明は、医薬として許容される脂質配合物と、抗原として有効量の生きた微生物を含む少なくとも１種の抗原性成分とを含んでなり、経口投与用に配合されている抗原性組成物を提供する。
【０００９】
好ましくは、脂質配合物は固形である。
【００１０】
別の態様において本発明は、固形であって約３０℃〜４０℃の間で固体から液体への転移を受ける医薬として許容される脂質配合物と、抗原として有効量で存在する少なくとも１種の抗原性成分とを含んでなる抗原性組成物を提供する。
【００１１】
本発明に係る組成物に使用するために好適な脂質配合物は、長鎖脂肪酸を含む。
【００１２】
脂肪酸組成の点から、好適な脂質配合物は４０〜１００％、好ましくは６０〜１００％、より好ましくは８０％〜１００％、そして一層好ましくは９０〜１００％のＣ16 および／またはＣ18 脂肪酸を含む。
【００１３】
更に好適な組成は、３５％未満、好ましくは２５％未満、そしてより好ましくは１０％未満のＣ14 又はより短鎖の脂肪酸を含む。
【００１４】
一つの実施態様において、脂質配合物は以下を含む：
２０％〜６０％の飽和脂肪酸；
２５％〜６０％の一不飽和脂肪酸；および
０．５〜１５％の多不飽和脂肪酸。
【００１５】
特に好適な組成では、脂質配合物は以下を含む：
３５％〜５０％の飽和脂肪酸；
４０％〜５５％の一不飽和脂肪酸；および
５〜９％の多不飽和脂肪酸。
【００１６】
本発明に使用するために現在のところ好適な脂質配合物は、以下の配合を有する：３％ミリスチン酸、２６％パルミチン酸、１５％ステアリン酸、４０％オレイン酸、および６％リノール酸。
【００１７】
抗原性成分はタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド成分を有する因子であってよい。
【００１８】
１つの実施態様において、抗原性成分は生きた微生物を含む。好ましくは、生物学的に純粋な培養物として含む。
【００１９】
好ましくは、本発明に係る組成物における生きた微生物は細菌、特に非病原性微生物であり、より好ましくはマイコバクテリウム(Mycobacterium）属に属する細菌である。本発明に使用するために特に好適なマイコバクテリウムは、マイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis） BCG である。
【００２０】
１つの実施態様において、組成物は少なくとも２種の抗原性成分を含む。第１の抗原性成分は生きた微生物であることが好ましく、第２の抗原性成分は病原菌に由来するか又は弱免疫原性のタンパク質もしくはペプチドであることが好ましい。
【００２１】
別の態様において本発明は、本発明に係る抗原性組成物を調製するための方法であって、該抗原性成分を脂質配合物と混合することを含んでなる方法を提供する。
【００２２】
更に別の態様において本発明は、動物を免疫化するための方法であって、前記動物に対して本発明に係る抗原性組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。
【００２３】
別の態様において本発明は、動物の粘膜免疫反応を刺激する方法であって、前記動物に対して本発明に係る抗原性組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。
【００２４】
これらの方法における組成物の投与は、好ましくは経口ルートにより行われる。
【００２５】
本発明は、本発明に係る抗原性組成物の調製における脂質配合物の使用にも関する。
ここで本発明の態様を添付図面に関連して説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
従って、第１の態様において本発明は、医薬として許容される脂質配合物と、抗原として有効量の生きた微生物を含む少なくとも１種の抗原性成分とを含んでなり、経口投与用に配合されている抗原性組成物を提供する。
【００２７】
脂質は固形であることが好ましい。脂質は１０℃以上の温度で固形であることが好適である。
【００２８】
別の態様において本発明は、固形であって約３０℃〜４０℃の間で固体から液体への転移を受ける医薬として許容される脂質配合物と、抗原として有効量で存在する少なくとも１種の抗原性成分とを含んでなる抗原性組成物を提供する。
【００２９】
上記配合物に用いられる脂質は、動物またはヒトの消費を含む投与のために適していることが好ましく、広範囲の天然（植物および動物由来）または合成の脂質生成物、例えば油、脂肪およびワックスより選択してよい。
【００３０】
最も普通には、該脂質材料は約３０℃よりも高い温度で液状となる。すなわち、脂質は該脂質が最も普通には経口ルートにより投与される動物の生理学的温度における融点を達成するように選択されるべきである。脂質は大気圧で１０〜３０℃において固形となり、好ましくは大気圧で２０℃〜３０℃においても固形であることが望ましい。しかしながら、脂質の融点は限定的でなく、ある範囲の融点をもった油、脂肪およびワックスを含んでよい。
【００３１】
ここで使用するために好適な脂質は、約３０℃と約４０℃、一般には３７℃の生理学的温度との間で固相から液相への転移を受ける。脂質相の挙動の概説が当該技術分野で利用可能であり、例えば（１０）を参照。従って、当業者は当該技術分野における情報および簡単な実験に基づいて、所望の特性および融点を有する脂質を選択することができる。
【００３２】
適した脂質配合物は、カルボン酸グリセリルエステル、脂肪族鎖と−ＣＯＯＨ末端からなる化合物、飽和および不飽和脂肪酸、およびこれらの混合物を含む、トリグリセリド類である。
【００３３】
現在のところ好適な脂質は、主にＣ8 〜Ｃ20 アシル基、例えばミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、パリン酸（parinic acid）、ラウリン酸、リノレン酸、アラキドン酸およびエイコサペンタエン酸、またはこれらの混合物、を含むトリグリセリド類である。
【００３４】
本発明に有用な脂質配合物として、長鎖脂肪酸、例えばＣ16 〜Ｃ18 が好適であることも実証された。長鎖脂肪酸は、マウスおよびフクロネズミに投与されるワクチン中の微生物、例えばＢＣＧ、を保護するのに効果的であることが見出された。このような点からみて、本発明に使用するために好適な脂質配合物は、４０〜１００％、好ましくは６０〜１００％、好ましくは８０％〜１００％、そして一層好ましくは９０〜１００％のＣ16 および／またはＣ18 脂肪酸を含む。
【００３５】
一般には、Ｃ16 脂肪酸は、全脂肪酸含有量の１０％〜４０％、より好ましくは２０％〜３５％、そして一層好ましくは２５％〜３２％であり、そしてＣ18 脂肪酸は、全脂肪酸含有量の４０％〜９０％、好ましくは５０％〜８０％、そして一層好ましくは６０％〜７０％Ｃ18 である。
【００３６】
また、好適な脂質配合物は、３５％未満、好ましくは２５％未満、そしてより好ましくは１０％未満のＣ14 又はより短鎖の脂肪酸を含む。
【００３７】
鎖長の点で、好適な脂質配合物は、５％未満のＣ14 又はより短鎖の脂肪酸、２５％〜３２％のＣ16 脂肪酸、および６０％〜７０％のＣ18 脂肪酸鎖を含む。
【００３８】
脂肪酸含有量の点で、本発明に使用するための脂質配合物は、２０％〜６０％、好ましくは３０％〜５５％、そして一層好ましくは４０％〜５０％の量の飽和脂肪酸；２５％〜６０％、好ましくは３０％〜６０％、そして一層好ましくは４０％〜５５％の量の一不飽和脂肪酸；および０．５％〜１５％、好ましくは３％〜１１％、そして一層好ましくは５％〜９％の量の多不飽和脂肪酸を含んでよい。
【００３９】
本発明に使用するための特に好適な脂質配合物は、４０％〜５０％の飽和脂肪酸、４０％〜５０％の一不飽和脂肪酸、および５％〜９％の多不飽和脂肪酸を含んでなる。
【００４０】
本発明に使用するために現在のところ好適な脂質配合物は、ＨＰＬＣ分析によって決定される、次の配合：３％ミリスチン酸、２６％パルミチン酸、１５％ステアリン酸、４０％オレイン酸、および６％リノール酸を有する。
【００４１】
また、現在のところ好適な脂質配合物としては、動物由来の分別された脂質複合物、１種以上の水素添加植物油、特にオリーブ油またはココナッツ油、市販の座薬基剤、および他の脂質配合物、またはこれらの混合物が挙げられる。
【００４２】
上記脂質配合物は、抗原性組成物の調製に、及び該組成物内の抗原を分解から保護するのに有用である。脂質配合物は、生きた微生物、特に細菌、の生存度を維持するのに特に有用である。脂質配合物は微生物を生きているが休眠状態に維持するように作用する。このことは経口投与用に配合される生きた微生物を含んでなるワクチンにとって特に重要である。また、脂質は抗原を均一な分散体中に維持する。すなわち本発明に係る組成物において、抗原性成分、および特に、生きた微生物は、固形またはペースト様の脂質マトリックスの全体に均一に分配されている。また、脂質は経口投与時に胃腸分泌物による破壊から抗原を保護する。他のルート、例えば皮下、による投与時にマクロファージの攻撃からの保護も起こり得る。このことは抗原および特に生きた微生物が胃腸粘膜を通じて取り込まれること、及び次に微生物が宿主内で複製されることを可能とする。生きた微生物の宿主内での複製は、病原性細菌で抗原投与(challenge）を受けた疾患の重症度の低減により決定される、保護性免疫反応を刺激する。
【００４３】
広範囲の送達ルート用の配合物はまた、添加剤、例えば限定されることなく、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、界面活性剤、沈殿防止剤、保存剤、着色剤、塩類、酸化防止剤、例えばグルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）、ビタミン類、例えばビタミンＥ、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、アルブミン・デキストロース・カタラーゼ（ＡＤＣ）、保護コーティング、誘引剤および着臭剤、ならびに脂質中に含まれる微生物の生存補助剤等を含んでもよい。
【００４４】
保護コーティングまたは腸溶性コーティングは、例えばゲル、パラフィン、およびゲラチンを含む可塑物から選択してよい。これらのコーティングは更に、経口投与ルートが選択される場合に胃酸および酵素に対して曝露されるのを防止することを助ける。
【００４５】
上記配合物は、経口投与用に使用される場合に、例えば嗜好性を改善する添加剤、例えば香味料（アニス油、チョコレートおよびペパーミントを含む）および甘味料（グルコース、フルクトース、または他の何れかの糖もしくは人工甘味料）を含んでもよい。
【００４６】
抗原性成分は、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド成分を有する因子、好ましくは単離され及び／又は精製されたもの、あるいはこれらの混合物であってよい。抗原性成分は、動物における免疫反応を生じさせるために使用し得る物質に由来してよい。
【００４７】
最も普通には、抗原は、治療される動物種に病原性である微生物上に存在する少なくとも１種のエピトープを有し得る。当該技術分野で公知である等の他の抗原性構造物も使用し得る。例えば、多糖、糖脂質、および担体に結合されたハプテンが挙げられる。
【００４８】
好ましくは、抗原性成分は生きた微生物、好ましくは生物学的に純粋な培養物である。
【００４９】
本発明の組成物における生きた微生物は、菌類、原生動物、細菌類およびウイルス類からなる群より選択し得る。例えば、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ブルセラ属（Brucella）および炭疽菌(Anthrax）が挙げられる。好ましくは、微生物は細菌である。経口または皮下の送達用に配合される組成物に使用するのが好適なのは、非病原性細菌から現在選択される微生物である。好適な細菌は、マイコバクテリウム(Mycobacterium）属、例えばマイコバクテリウム・ツベロクロシス複合体（マイコバクテリウム・ツベロクロシス(M. tuberculosis）、マイコバクテリウム・ボービス（M. bovis）、マイコバクテリウム・アフリカナム（M. africanum）およびマイコバクテリウム・ミクロティ(M. microtii）を含んでなるもの）、マイコバクテリウム・アビウム−イントラセルラール複合体（マイコバクテリウム・イントラセルラール(M. intracellulare）およびマイコバクテリウム・アビウム（M. avium）を含んでなるもの）、マイコバクテリウム・パラツベロクロシス(M. paratuberculosis）、マイコバクテリウム・ワッカ(M. vaccae）、マイコバクテリウム・スメグマチス（M. smegmatis）、マイコバクテリウム・チェロナ(M. chelonae）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（M. fortuitum）、マイコバクテリウム・カンサイ（M. kansaii）、マイコバクテリウム・レプラ(M. leprae）、マイコバクテリウム・マリナム（M. marinum）、マイコバクテリウム・ウルセランス(M. ulcerans）、マイコバクテリウム・シミア(M. simiae）、マイコバクテリウム・ハエモフィラム（M. haemophilum）、マイコバクテリウム・マルモエンス（M. malmoense）、マイコバクテリウム・シモイデイ（M. shimoidei）、マイコバクテリウム・ガストリ(M. gastri）、マイコバクテリウム・テラ(M. terrae）複合体、およびマイコバクテリウム・ノンクロモゲニカム(M. nonchromogenicum）より選択される非病原性菌株である。特に好適な実施態様において、該物質はカルメット・ゲラン杆菌(Bacille Calmette Guerin：ＢＣＧ）、マイコバクテリウム・ボービス（M. bovis）の弱毒化菌株、例えば以下の菌株： 83/6235、パスツール（Pasteur） 1173P2、グラクソ(Glaxo）1077、ジャパニーズ（Japanese） 172、プラハ（Prague）、ロシアン(Russian）、ブラジリアン(Brazilian）、デーニッシュ（Danish）1331、コペンハーゲン（Copenhagen）、コンノート(Connaught）、ならびにマイコバクテリウム・ボービスの機能的に等価な変異株および他の弱毒化菌株、これらの菌株の純株（clones）、突然変異株(mutants）および天然の組換え体または広範囲の遺伝子工学技術のいずれかにより生産された組換え体を含め組換え体（recombinants）、およびこれらの抗原性成分である。
【００５０】
以下の説明から、抗原性成分がタンパク質もしくはペプチドの複合体等であってよいことが理解されるであろう。
【００５１】
一つの実施態様において、本発明の組成物は、上記で特定される抗原性成分のいずれかより選択される少なくとも２種の抗原性成分を含み、サブユニット抗原の複数からなる組合せを含んでよい。３種以上の抗原性成分が適している。
【００５２】
本発明の組成物における抗原性成分の濃度は、動物に対する投与による免疫反応、特に小腸の消化管関連リンパ組織における免疫反応、を刺激するのに有効な量で存在する限り、当業界で公知のプロトコルに従って変更してよい。マイコバクテリアの場合には、１×１０5 〜１×１０10 コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌの範囲が適当である。その濃度は１×１０7 〜１×１０9 ＣＦＵ／ｍｌであることが好ましい。タンパク質およびペプチド型抗原の場合には、１０〜１０００μｇ／配合物ｇの範囲が適当である。ウイルス型抗原の場合には、１×１０3 〜１×１０10 、好ましくは１×１０5 〜１×１０8 プラーク形成単位（ＰＦＵ）／ｍｌが適当である。免疫反応は、体液性であっても、又は粘膜免疫反応など細胞媒介性であってもよい。
【００５３】
従って、別の態様において本発明は、動物に対して本発明に係る抗原性組成物を投与することによる、動物の粘膜免疫反応を刺激する方法に関する。
【００５４】
本発明の組成物は、当業界で公知の方法を用いて調製し得る。好適には、該脂質配合物が必要に応じ加熱されて液化し、そして上述のような抗原性成分および他の成分（使用される場合）が添加される。抗原性組成物の分散は、混合、振盪または抗原性成分の生存度に悪影響を与えない他の方法により達成し得る。
【００５５】
本発明に使用するために更に好適な組成物は、水などの水性成分を実質的に含まないものでもある。ここで用いられる「実質的に含まない」という用語は、組成物に含まれる水性成分が１０％未満、そして好ましくは水性成分が５％未満であることを意味する。上で示したように、成分、特に水性溶媒が存在することは、特に消化管における脂質配合物の保護効果を低減する。
【００５６】
１つの実施態様において、抗原性組成物はワクチンである。
【００５７】
代替的な実施態様において、抗原性組成物は、ワクチンの効力を増大させるために、ワクチンを用いた投与に有用なアジュバントである。マイコバクテリウム含有抗原性組成物およびＢＣＧ含有抗原性組成物が、アジュバントして使用するために特に好適である。
【００５８】
本発明に係る抗原性組成物はまた、抗原性成分について上記で示したタイプ、特に弱免疫原性の第２の又は更なる抗原性分子に対する反応を生じさせるために有用となり得る。このことは、本発明の抗原性組成物の抗原性成分に抗原性分子を結合させることにより、該組成物中の第２の又は更なる抗原性分子を同時送達することによって達成し得る。結合は当業界で標準的な方法（９）を使用して行い得る。特に、関心ある抗原を生体内(in vivo）での抗体産生を妨げないリンカー基により抗原性担体またはアジュバントに結合させ得る。抗原性担体またはアジュバントは、上記で特定される微生物を含む抗原性成分のいずれであってもよいが、好ましくはマイコバクテリウム属であり、より好ましくはＢＣＧである。適したリンカー基としては、マンノースレセプター結合性タンパク質、例えばオブアルブミン、およびＦｃレセプターに結合するものが挙げられる。第２の又は更なる抗原性分子は、好ましくはタンパク質またはペプチドである。特に好適なタンパク質は免疫避妊性(immunocontraceptive）タンパク質である。脂質はまた送達マトリックスとして作用する。このワクチン送達システムの例を図１２に示す。上記組成物が投与されると、結合された分子または同時送達された分子に対する増大した免疫反応が生じる。
【００５９】
別の態様において本発明は、動物を免疫化するための方法であって、前記動物に対して本発明に係る抗原性組成物を投与することを含んでなる方法も提供する。
【００６０】
ここで用いられる「動物」という用語は、温血動物、特に哺乳動物をいう。ヒト、イヌ、ネコ、鳥類、ウシ、ヒツジ、シカ、ヤギ、ラット、マウス、ウサギ、フクロネズミ、アナグマ、モルモット、フェレット、ブタおよびバッファローが、この用語の意味の範囲内の動物の例である。単胃動物および反芻動物が特に、この用語の範囲内と考えられる。
【００６１】
本発明に係る組成物は、非経口（皮下、皮内、筋肉内）、粘膜、エアゾールおよび経口投与を含むがこれらに限定されない多様なルートにより投与し得る。１つの実施態様において、経口投与が好適である。本発明の組成物は、ペレット剤、錠剤、カプセル剤、舐剤、または他の適した配合物の形態で経口投与し得る。経口投与は、針と注射器の使用を避けることができる点で広く消費者に受け入れられるとともに、野生生物をワクチン接種するための経済的で実用的な方法である。そのため、１つの実施態様において、本出願人は経口投与用に配合された新規な生ワクチンを提供している。
【００６２】
代替的な実施態様において、本発明の組成物は、注射による非経口投与用に配合し得る。この投与形態には、体組織との適合性がある注射用皮下デポー配合物も含まれ得る。該デポー剤からの経時放出吸収(time release absorption）は、脂質配合物を単独で又は追加的な生分解性ポリマーと共に使用して達成し得る。該デポー剤は、感染プロセスと非常に近似するプロセスで抗原性成分の遅延放出を可能とし、当該組成物が投与される動物における免疫反応の増大を促進する。これらの投与形態では脂質保護効果も生じる。
【００６３】
本発明の組成物は、特に非経口投与のための、単一用量として投与することができ、又は経時的に反復用量で投与することができる。例えば、時間間隔をおいて初回量およびブースター量で投与できる。投与量は、免疫性成分の放出速度とともにその抗原性により決定される。動物の体重、年齢、性別、併用処理（該当する場合）、および処理される抗原の性質など通常の事項を考慮に入れてよい。一般に、経口によるワクチン接種の場合の用量範囲は上述したように、用量当たり１×１０5 〜１×１０10 、好ましくは１×１０7 〜１×１０9 ＣＦＵ／ｋｇである。タンパク質およびペプチド型抗原の場合には、用量範囲は１〜１０，０００μｇ、好ましくは１０〜１０００μｇである。ウイルス型抗原の場合には、用量範囲は１×１０3 〜１×１０10 、好ましくは１×１０5 〜１×１０8 ＰＦＵ／ｍｌである。どの送達方法を使用しても、生きた微生物をワクチン配合物で使用する場合には、それらの微生物が宿主内で増殖して免疫反応を促進することが期待される。
【００６４】
本発明の組成物は、集団ワクチン接種計画のための複数用量製剤として又は単一用量製剤として調製することもできる。
【００６５】
使用のために必要とされるまで、本発明の組成物は、室温において一定期間保存してよく、又は好ましくは約４℃において通常の冷蔵条件の下で保存してよい。４℃において、脂質配合物は休眠しているが生存可能な状態にある微生物を劣化することなく保存および維持することを容易にする。非経口送達の場合に、組成物は次に３０〜４０℃に温められて投与前に液化する。経口投与の場合に、組成物は固形またはペーストである。
【００６６】
上述した説明は例示のためだけに示されるものであって、当業者に公知である材料および方法の両方における変形が考えられる。
【００６７】
本発明を例示する非限定的な例を以下に示す。
【実施例】
【００６８】
材料および方法
細菌。
マイコバクテリウム・ボービス（M. bovis） BCG パスツール（Pasteur） 1173P2 （Pasteur institute, Paris）をワクチン菌株として用いた。マクロファージ感染研究とフクロネズミ抗原投与(challenge）のための用いたM. bovis菌株は、M. bovis 83/6235 （AgResearch, Wallaceville, New Zealand）であり、これは元々ブラッシュテイルフクロネズミの結核病巣から単離され、そして従前のマクロファージおよびフクロネズミ接種研究で使用されたものである（１，４）。ＢＣＧ配合およびマクロファージ感染のために、アルブミン・デキストロース・カタラーゼ（ＡＤＣ；BBL, Becton Dickinson, Maryland, USA）で補充したMiddlebrook 7H9 培地（Difco, Detroit, Mich.)を含む１７５ｍｌフラスコ（Falcon）内で菌を中間対数増殖期まで増殖させた。桿菌を遠心分離により集菌し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で２回洗浄した後に−７０℃で保存した。フクロネズミ抗原投与のために、０．００６％ｖ／ｖアルカリ化オレイン酸、０．５％ｗ／ｖアルブミン・フラクションＶおよび０．２５％ｗ／ｖグルコースで補充したデュボス液体培地（Difco Laboratories, Detroit, USA）を含むツウィーン・アルブミン液体培地（ＴＡＢ）中でM. bovisを中間対数増殖期まで増殖させ、細菌数を懸濁度により評価した。フクロネズミに接種するための希釈をＴＡＢ中で行った。ＢＣＧまたはM. bovisのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を従前に記載されているようにして決定した（５）。
【００６９】
配合物組成。
ＢＣＧと共に配合するための均一懸濁液中にＢＣＧを維持する能力および融点に基づいて、３種の脂質製品を選んだ。３７℃で液状であるが３０℃よりも低い温度で固形となる脂質をＢＣＧ生存度研究において試験するために選んだ。生存度試験の後に、マウスおよびフクロネズミにおいて経口ワクチン試験を行うために、以下の３種の配合物を選んだ：
配合物Ｃ − 動物由来の分別された脂質複合物；  配合物Ｋ − 精製された水素添加ココナッツ油のトリグリセリドからなる；  配合物Ｎ −ノバルタ(Novarta) B、市販の座薬基剤。これら３種の配合物をガスクロマトグラフィにより分析して、脂肪酸群の比率を決定した。
【００７０】
ＢＣＧの配合。
ペレット化したＢＣＧを、３７℃まで温められた配合媒体中に再懸濁した。フクロネズミのワクチン接種のために、ＢＣＧを１×１０7 ＣＦＵ／ｍｌの濃度に再懸濁した。フクロネズミに対する誘引性および嗜好性を増大させるために、配合物ｍｌ当たり１０ｍｇのグルコースおよび１０μｌのアニス油（Pharmacare, Auckland  NZ）を添加した。マウスの経口ワクチン接種のために、配合物ｍｌ当たり１０ｍｇのグルコース、１ｍｇのグルタミン酸一ナトリウム塩(Sigma）および１０％ｖ／ｖ ＡＤＣ を添加した。これらの添加剤が配合脂質に分散され、ＢＣＧの生存度に影響を与えないことが前もって示された。ＢＣＧ配合物を１５ｍｌチューブ（Falcon）に移し、４℃で穏やかに混合しながら固化させた。チューブから配合物を取り出して、生存度試験およびワクチン接種研究のために必要とされる１ｇペレットに無菌状態で切断した。ペレットを、7H11寒天プレートで培養して以下に述べるようにＣＦＵをカウントすることにより、ＢＣＧの分散について試験した。
【００７１】
ＢＣＧ生存度。
４℃または室温（１０〜２５℃）において保存した後の配合物中のＣＦＵ数を、従前に記載されているように（４）決定した。３種のＢＣＧ配合物の１００ｍｇアリコートを３７℃に１５分間温め、 7H9液体培地中で直列的に１０倍希釈を行うことによって、培養用のサンプルを集めた。オレイン酸・ＡＤＣ（ＯＡＤＣ; Becton Dickinson, Maryland）および０．５％グリセロールで補充したMiddlebrook 7H11寒天プレート(Difco）上で１００μｌの各エマルジョンを接種して、生存可能な微生物の数を決定した。エマルジョンはガラス・スプレッダを使用して分散させた。プレートをパラフィンで密封し、３７℃で５％ＣＯ2 中でインキュベートした。培養の２〜３週後にコロニー数をカウントした。結果はＣＦＵ／ＢＣＧ配合物μｇとして表わす。
【００７２】
マウスのワクチン接種。
特定の病原の無い雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）をオタゴ大学動物実験科学部門、ダニディン（University of Otago  Department of Animal Laboratory Sciences, Dunedin）より入手した。オタゴ大学動物倫理委員会からの倫理承認（承認番号： 51/2000）の下でマウス実験を行った。マウスを個々のかごに分けて入れ、経口ワクチン接種前１２時間食餌を絶った。非配合の対照群は、クレイグ（Craig）の無保存料ストロベリー・ジャム(Heinz-Watties Ltd., Hastings, New Zealand）中のM. bovis BCG からなる。従前の研究により、２４時間間隔におけるM. bovis BCGの生存度が、M. bovis BCGを該ジャム中で混合することによっても影響を受けないことが示されている（データは示さない）。非接種の対照群は脂質配合物のみからなる。用量反応および経時実験のために、マウスに２４時間の間隔で２種の別個の用量でワクチンを与えた。エアゾール抗原投与実験のために、マウスに単一経口用量（５×１０7 ＣＦＵ）を与えるか、又は１×１０6 ＣＦＵで皮下的にワクチン接種した。ペレットおよびジャムの消費時に種々の間隔でマウスを観察して、全用量が食べられていることを確認した。ワクチン接種後の種々の間隔で、５％ＣＯ2 吸入によりマウスを殺し、その脾臓を無菌状態で取り出した。
【００７３】
脾臓細胞の増殖アッセイ。
セルストレーナ（７０μｍメッシュ； Beckton Dickinson）を通じて細胞を濾過することにより、脾臓細胞懸濁液を調製した。赤血球を０．８３％ＮＨ4 Ｃｌ（ｐＨ７．２）中で溶解させた。細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、１０％致死性仔ウシ血清（ＦＣＳ）、１００Ｕ／ｍｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５．５×１０-5 Ｍ  ２−メルカプトエタノールを含有するダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ；全てGibco-BRL, USAから）中で１×１０6 ／ｍｌに再懸濁した。細胞をＲＰＭＩ＋１０％致死性仔ウシ血清(Gibco）中で１０7 ／ｍｌの濃度に再懸濁した。脾臓細胞（５×１０5 ／ウェル）をプレートから出して９６ウェルプレート(Nunc.）の３つのウェルに入れた。細胞を、M. bovis培養物から由来する精製タンパク質（ウシＰＰＤ； CSL, Melbourne, Australia）、６０μｇ／ｍｌ最終濃度、または培地のみで培養した。細胞を４日後に収穫し、１μＣｉの［3Ｈ］チミジン（Amersham, Buckinghamshire, England）による１８時間パルス後、取り込まれたチミジンを従前に記載されているように（５）測定した。ウシＰＰＤでインキュベートした３つの培養物についての平均カウント数／分（ｃｐｍ）を、培地のみで培養した脾臓細胞についての平均ｃｐｍで割り算することによって、刺激指数（ＳＩ）を得た。
【００７４】
脾臓細胞によるサイトカイン産生についての生体外（in vitro）アッセイ。
脾臓細胞増殖アッセイのために、脾臓細胞懸濁液を上述したように調製した。１ｍｌの細胞懸濁液を２４ウェルプレート（Costar）に分散させ、そのウェルに１００μｌのＰＢＳまたはＰＰＤ（６０μｇ／ｍｌ最終濃度）を添加した。培養物を３７℃において５％ＣＯ2 中で７２時間インキュベートし、その後２００μｌの培養上清を集め、−７０℃で凍結して、サイトカイン分析に用いた。市販キット（R&D Systems, Duoset, City, Country）を使用し、製造業者の指示に従って、インターロイキン−２（ＩＬ−２）捕捉ＥＬＩＳＡおよびインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）捕捉ＥＬＩＳＡを行った。培養上清中のサイトカインレベルを標準曲線からの外挿によって定量した。２種のＥＬＩＳＡの最小感度(minimum sensitivities）は、ＩＦＮ−γについて５０ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ−２について３５ｐｇ／ｍｌと定量された。
【００７５】
M. bovis阻害アッセイ。
腹膜由来マクロファージを、自己リンパ球を用いないで又は自己リンパ球を用いて共培養の後に、M. bovisの細胞内増殖の阻害について試験した。従前に記載されているプロトコルの修正方法に従って実験を行った。腹膜滲出細胞（ＰＥＣ）を雌ＢＡＬＢ／ｃマウスからの洗浄によって得た。細胞を１％ＢＳＡおよび２０Ｕ／ｍｌへパリンで補充されたＰＢＳ中で集め、１回洗浄し、１０％致死性仔ウシ血清および１００Ｕ／ｍｌペニシリンを含有するＤＭＥＭ（補充ＤＭＥＭ）中で２×１０6 ／ｍｌに再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェル平坦プレート（Nunc）中に分散させた。３７℃において５％ＣＯ2 中で２時間インキュベートした後に、非付着性細胞を取り出し、洗浄して、補充ＤＭＥＭ中に５×１０6 ／ｍｌの濃度で再懸濁した。非不着性細胞は、２５ｍｌフラスコ(facon）中でのインキュベーションにより残留する付着性集団が選択的に除去されたものである。非付着性ＰＥＣ（ＮＰＥＣ）はメイグリュンワルド／ギムザ(May-Grunwald/Giemsa）染色により９０％より多くのリンパ球を含むことが決定された。温かい補充ＤＭＥＭを、５×１０4 細胞／ウェルを含むと推定される付着性単層に添加した。この集団は非特異的エステラーゼ染色キット（カタログ番号１８１−Ｂ；Sigma, St. Louis, MO, USA）により９８％陽性であることが分かり、以下マクロファージと称する。従前に記載されているように（２）マクロファージ当たり２桿菌(Bacilli）のＭＯＩでマクロファージにM. bovisを感染させた。穏やかな洗浄により、貪食されなかった（non-phagocytosed）細菌を除去した。（５×１０6 細胞を含有する）１００μｌの自己ＮＥＰＣを、感染マクロファージを含有する各ウェルに加え、培養物を更に３７℃において５％ＣＯ2 中でインキュベートした。得られた１０：１のＮＰＥＣ／マクロファージ比は、末梢血液単核細胞において見られる比のものと近似するように選択された。対照ウェルはM. bovis感染マクロファージのみからなるか、又は未感染ＮＰＥＣおよびマクロファージからなる。７２時間後、細胞を１．０μＣｉの［3Ｈ］ウラシルにより１８時間パルスした。細胞を０．１％サポニンにより溶解させ、８０〜９０℃で２０分間加熱殺菌した後に、自動セルハーベスター(Cambridge Technology, USA）を用いて、ガラス繊維フィルター上で収穫した（Whatman Inc, Finland）。液体β−シンチレーションカウンター(Wallac, Country）を用いて［3Ｈ］ウラシルの取込み量を測定した。
【００７６】
M. bovisによるマウスのエアゾール抗原投与。
ワクチン群当たり６匹のマウスをワクチン接種後８週で病原性M. bovisを含むエアゾールで抗原投与(challenge）した。Grover et al., 1967 により記載されている方法の修正方法を使用してM. bovisの単一細胞懸濁液を調製し、−７０℃で保存した。これらの懸濁液を調製するために、該細菌細胞をソニケータにより３０秒間分散させ、８μｍ膜フィルターを通じて濾過した。歯槽空間に入るために適当なサイズの飛沫核を生じさせるエアゾールチャンバーを使用して、マウスに呼吸経路を介して感染させた。生存可能なM. bovisの濃度をネブライザ(nebuliser）内で経験的に調整して、マウス肺当たり５〜２０の生存可能な微生物の吸入と保持を行った(B. Buddle and G. de Lisle, 未公表データ）。類似の手順によりモルモットの肺の再現性のある均一な感染を生じることが示された。バイオハザード設備内での厳格な単離条件の下でエアゾール感染および次の感染マウスの維持と操作を行った。
【００７７】
M. bovisの単離。
エアゾール抗原投与後３７〜４０日でマウスを安楽死させた。各マウスからの肺と脾臓をマイコバクテリウム単離のために個別に処理した。該微生物をTen-Broeckグラインダー中でホモジェナイズし、サンプルを３５００ｇで２０分間遠心分離した。沈降物を１ｍｌの蒸留水中で再懸濁した。ＴＡＢ中で適当な希釈を行い、０．１ｍｌ量の希釈された又は希釈されないサンプルを修正マイコバクテリア7H11寒天プレートに接種した（１）。各希釈物について２つの複製物を調製した。従前に記載されているように（１）培養条件および単離物同定方法を実行した。
【００７８】
データ解析
ワクチン群について平均サイトカインレベル差およびｌｏｇ10 変換された脾臓細胞増殖反応の統計的解析をスチューデントｔ検定により求めた。肺および脾臓からの細菌数をｌｏｇ10 変換し、分散解析により解析した。統計的目的のために、組織から培養される細菌が存在しない場合には、最低検出可能数の半分（％ＣＦＵ／臓器）を使用した。
【００７９】
フクロネズミのワクチン接種および抗原投与。
従前に記載されているように（４）フクロネズミを捕獲し収容した。フクロネズミの２つの群（５匹／群）にＢＣＧを供給した。配合されたＢＣＧの１ｇペレット（１×１０8 ＣＦＵ）を１つの群の各フクロネズミに与えた。第２の群には配合手順の対照のためにジャム中のＢＣＧ（１×１０8 ＣＦＵ）を与えた。該ジャムはＢＣＧ生存度を阻害することが従前から示されている（データは示さない）。第３の群（６匹／群）には配合媒体のみを含有するペレットを与え、非ワクチン接種対照とした。ペレットの消費時にフクロネズミを観察して、全ペレットが食べられていることを確認した。次の日にワクチン接種を繰り返した（全ＢＣＧ用量２×１０8 ＣＦＵ／フクロネズミ）。ワクチン接種後４１日で、フクロネズミの全てをエアゾール経路により抗原投与した。
【００８０】
第２の実験において、４種の経口用脂質ＢＣＧ配合物を皮下ワクチン接種と比較した。ワクチン接種後８週で、ワクチン群当たり６匹のフクロネズミを、病原性M. bovisを含むエアゾールで抗原投与した。脂質Ｃ、Ｋ、ＮおよびＦ（Ｋの修正点は１０％致死性仔ウシ血清を含有する）。
【００８１】
M. bovisによるフクロネズミのエアゾール抗原投与。
フクロネズミに、元々はTaumaranui, New Zealand からのフクロネズミのリンパ節より単離された（５）M. bovis 83/6235を用いて抗原投与した。Grover et al., 1967 により記載されている方法の修正方法を使用して該単離物の単一細胞懸濁液を調製し、−７０℃で保存した。これらの懸濁液を調製するために、該細菌細胞を超音波処理により３０秒間分散させ、８μ膜フィルターを通じて濾過した。歯槽空間に入るために適当なサイズの飛沫核を生じさせるエアゾールチャンバーを使用して、ケタミンＨＣｌ（３０ｍｌ／ｋｇ； Parnell Laboratories, Auckland, New Zealand）の筋肉内注射により麻酔されたフクロネズミに、呼吸経路により感染させた。生存可能なM. bovisの濃度をネブライザ(nebuliser）内で経験的に調整して、フクロネズミ当たり１０〜２０の生存可能な微生物の吸入と保持を行った(B. Buddle and G. de Lisle, 未公表データ）。この抗原投与用量（challenge dose）は、感染後４週で非ワクチン接種フクロネズミの肺に肉眼で観察される主いぼの数から従前に推定されたものである。類似の手順によりモルモットの肺の再現性のある均一な感染を生じることが示されている（Wiegeshaus et al., 1970； Smith et al., 1970）。バイオハザード設備内での厳格な単離条件の下でエアゾール感染および次の感染フクロネズミの維持と操作を行った。
【００８２】
フクロネズミの検死。
抗原投与後５６〜５７日で全てのフクロネズミを殺し、広範な全体的な死後検査の対象とした。肺を周囲組織から単離し、秤量した。
【００８３】
フクロネズミ組織からのM. bovisの単離。
各動物より、肉眼による病巣から重さ約１ｇの肺および脾臓のサンプルを取り出し、又は病巣が無い場合には、該臓器の予め定めた部分からサンプルを取り出して、マイコバクテリウム単離のために個別に処理した。サンプルを秤量し、Ten-Broeckグラインダー中でホモジェナイズし、０．７５％塩化セチルピリジウム中で１時間除染した。サンプルを３５００ｇで２０分間遠心分離し、沈降物を１ｍｌの蒸留水中で再懸濁した。ＴＡＢ中で適当な希釈を行い、０．１ｍｌ量の希釈された又は希釈されないサンプルを修正マイコバクテリア7H11寒天プレートに接種した。各希釈物について２つの複製物を調製した。従前に記載されているように（１）培養条件および単離物同定方法を実行した。
【００８４】
フクロネズミ末梢血液リンパ球増殖アッセイ。
ＰＰＤ−ＢおよびＰＰＤ−Ａ（CSL Limited, Parkville, Australia）に対する増殖反応(proliferative responses）を、赤血球除去した全血を用いて測定した。コンカナバリンＡ(Con A）に対する反応も試験した。簡潔に述べると、１ｍｌのへパリン添加血液を５０ｍｌ ０．１７Ｍ Ｔｒｉｓ−０．１６Ｍ ＮＨ4Ｃｌ、ｐＨ７．２と３７℃で１０分間混合し、２０℃のＰＢＳ中で２回洗浄し、２ｍＭグルタミンおよび２％正常フクロネズミ血清で補充したＤＭＥＭ組織培養培地中で合計３ｍｌとした。その細胞（２００μｌ）を、５０μｌのＰＢＳ中ＰＰＤ−Ｂ、ＰＰＤ−ＡもしくはコンカナバリンＡを含有するか又はＰＢＳのみを含有する平底９６ウェルプレートに入れた。プレートをエアインキュベータ内の５％ＣＯ2 中に７２時間置き、１μＣｉ／ウェルの3Ｈ−トリチウム標識チミジン(Amersham, UK）でパルスし、更に１８時間後に収穫し、Micro Beta Trilux（Wallac, Finland）中で 3Ｈカウントした。ＰＰＤで刺激された３つの培養物からのカウント数／分（ｃｐｍ）を、培地およびＰＢＳでの３つの培養物からのｃｐｍで割り算することによって、刺激指数（ＳＩ）を得た。
【００８５】
データの解析
マウスサイトカイン分泌の統計学的有意差を、スチューデントｔ検定を用いて決定した(GraphPad, San Diego, Calif.）。これらの研究は類似の結果をもって２回行われた。フクロネズミのリンパ球増殖反応のために、３．５よりも大きな刺激指数はバックグラウンドの平均（ワクチン接種前のＰＰＤ−Ｂについての平均ＳＩ）よりも大きな少なくとも３の標準偏差を表わすので、これを陽性反応として評価した。種々異なる処理群についてのフクロネズミの体重変化、肺重量、リンパ球芽球発生反応および細菌数を分散の一方向解析により最初に比較した。次に、ダンカンの多重検定（Duncan's multiple range test）を用いて個々の群の平均を比較した。肺および脾臓からのリンパ球増殖反応および細菌数をｌｏｇ10 変換して解析を行った。統計的目的のために、組織から培養される細菌が存在しない場合には、最低検出可能数の半分（５ＣＦＵ／臓器）を使用した。
【００８６】
結果
Ａ．  配合物脂質の脂肪酸組成。
経口用ＢＣＧを配合するのに使用するために選択された脂質を、ガスクロマトグラフィにより分析した。図１は、マウスおよびフクロネズミのワクチン接種試験に使用される３種の脂質の脂肪酸組成を示す。
【００８７】
３種の脂質配合物中の脂肪酸の相対比率を図１に示す。ＨＰＬＣによる脂質の化学分析により、３種の配合物が以下の脂肪酸の混合物からなることが示された。
【００８８】
配合物Ｃ
８９％全脂質（４８．５％中性、４０．５％極性 − ３％ミリスチン酸、２６％パルミチン酸、１５％ステアリン酸、４０％オレイン酸および６％リノール酸を含んでなる）。
【００８９】
配合物Ｋ
４７％ラウリン酸、２０％ミリスチン酸、１２％パルミチン酸、１２％ステアリン酸および３％オレイン酸。
【００９０】
配合物Ｎ
ノバルタ（Novarta)B は、分別された植物油の水素添加エステル化混合物ならびに合成トリグリセリド混合物からなる市販の座薬基剤であり、４４％ラウリン酸、２０％ミリスチン酸、１６％パルミチン酸、１９％ステアリン酸を含んでなる。
【００９１】
Ｂ．  配合後のＢＣＧ生存度
４℃での保存後の配合ＢＣＧの生存度を図２ａに示す。１６週の期間にわたって、配合物Ｃおよび配合物Ｋは高レベルのＢＣＧ生存度を維持し、配合物Ｋ（５２％）に比べ、配合物Ｃは生存度（９８％）を高く保持することを示した。対照的に、配合物ＮはＢＣＧ生存度の累進的損失を示し、１６週で９７％より多くの生存可能な微生物の損失を生じた。これらの結果は、配合物Ｎに比べ、配合物Ｃおよび配合物Ｋが４℃でのＢＣＧ生存度の維持に適していることを示唆する。
【００９２】
室温（１０〜２５℃）での保存後の配合ＢＣＧの生存度を図２ｂに示す。配合物Ｃおよび配合物Ｋは高レベルのＢＣＧ生存度を維持し、生存度（平均ｌｏｇ10 ＣＦＵ／μｇ＝１０）が２２日である配合物Ｋに比べ、配合物Ｃは４０日の長期にわたる生存度（平均ｌｏｇ10 ＣＦＵ／μｇ＝１０）の保持を示した。対照的に、配合物Ｎは１２日でＢＣＧ生存度（平均ｌｏｇ10 ＣＦＵ／μｇ＝１０）の急速な損失を示した。これらの結果は、配合物Ｎに比べ配合物Ｃおよび配合物Ｋが室温でのＢＣＧ生存度の維持に適していることを示唆する。
【００９３】
Ｃ．  配合ＢＣＧのマウスにおける免疫原性。
配合M. bovis BCGの経口送達はマウスにおける免疫反応を誘導する。M. bovis BCGの経口送達を受けた全身免疫反応を測定する適当な方法を決定するために、１０7 ＣＦＵの液状配合BCG またはジャム中のM. bovis BCG（非配合M. bovis BCG）の経口送達後８週でのウシＰＰＤ誘導脾細胞増殖（ＬＴＡ）反応、脾臓ＩＬ−２反応およびＩＦＮ−γ反応を比較した。表１は、ＬＴＡアッセイおよびＩＦＮ−γアッセイが配合および非配合の経口M. bovis BCGグループ間で有意な差を示したのに対し、ＩＬ−２アッセイについては差が有意でないことを示した。結核に対する保護におけるＩＦＮ−γの重要性のため、全身免疫反応をモニターするための更なる実験にＩＦＮ−γアッセイを用いた。
【００９４】
経口送達後のM. bovis BCGの用量の効果を決定するために、ワクチン接種後８週での配合または非配合M. bovis BCGの用量を種々変化させてワクチン接種したマウス中のウシＰＰＤに対する脾臓ＩＦＮ−γ反応を比較した。図２は、１０6 ＣＦＵのM. bovis BCGによる経口免疫化を受けた配合群において低レベルのＩＦＮ−γ（＜２００ｐｇ／ｍｌ）が検出されたが、ワクチン群間では有意な差が無かったことを示した。用量を１０7 ＣＦＵに増大させたときに、非配合群におけるＩＦＮ−γ反応は低いままであったのに対し、配合M. bovis BCGに対する反応は有意に増大した。同様の差が１０8 ＣＦＵのM. bovis BCGの場合にも見られた。ワクチン用量を１０9 ＣＦＵのＢＣＧに増大させたときに、非配合群においてＩＦＮ−γレベルの増大が見られたのに対し、配合群は高いままであった。１０7 〜１０9 ＣＦＵの範囲のM. bovis BCGの用量では、配合M. bovis BCG群におけるＩＦＮ−γ反応は非配合M. bovis BCGのものよりも有意に高かった。非配合M. bovis BCG群において高い用量で見られるＩＦＮ−γ反応の増大は、配合M. bovis BCGに比べ、かなり高い用量のM. bovis BCGが免疫反応の誘導に必要とされることを示す。経口M. bovis BCGに対する免疫反応の経時変化を決定するために、M. bovis BCGによる経口または皮下のワクチン接種後２週間の間隔で、脾臓ＩＦＮ−γ反応を比較した。図３は、皮下ワクチン接種後のＩＦＮ−γ反応が４週をピークとして６週および８週で徐々に減少することを示す。これに比べて、配合M. bovis BCGによる経口ワクチン接種後のＩＦＮ−γ反応は６週で最初に増大し、ワクチン接種後８週で高いままであった。非配合M. bovis BCGまたは配合剤のみに対するＩＦＮ−γ反応は２〜８週で低いままであった。これらの結果は、M. bovis BCGが配合された経口ワクチン接種を受けた免疫反応が、皮下ワクチン接種と比べて遅延するが少なくとも８週まで持続するように見えることを示す。
【００９５】
配合M. bovisで経口ワクチン接種されたマウスからの腹膜由来リンパ球が自己マクロファージ内でのM. bovisの増殖を阻害する。
リンパ球媒介エフェクター機構がM. bovisの細胞内増殖を阻害し得るかどうかを決定するために、経口M. bovis BCG配合物でワクチン接種されたマウスからのM. bovis感染マクロファージに対するＮＰＥＣの添加を行った。マクロファージ内でのM. bovisの増殖は［3Ｈ］ウラシル取込みにより決定した。単独マクロファージ内での、又は経口ワクチン接種されたマウスからのＮＰＥＣと共に同時培養したときのの、M. bovisの増殖を図４に示す。配合または非配合M. bovis BCGで経口ワクチン接種されたマウスあるいは配合剤のみが与えられたマウスから調製されたマクロファージは、M. bovisの増殖を抑制する能力に有意な差を示さなかった。配合M. bovis BCGでワクチン接種されたマウスからのＮＰＥＣが自己M. bovis感染マクロファージと共に同時培養された場合は、非配合M. bovis BCGまたは配合剤のみでワクチン接種されたマウスからのＮＰＥＣの同時培養に比べて、［3Ｈ］ウラシルカウント数が有意に減少した（Ｐ＜０．０５）。これらの結果は、配合M. bovis BCGで経口ワクチン接種されたマウスからのリンパ球がマクロファージを活性化してM. bovisの細胞内増殖を阻害するようにすることを実証する。生体外（in vitro）でのM. bovisの細胞内増殖の抑制は、宿主内でのM. bovisの蔓延の減少につながる生体内(in vivo）での増殖阻害を反映し得る。
【００９６】
配合M. bovis BCGによる経口ワクチン接種は病原性M. bovisによるエアゾール抗原投与に対して保護する。
配合された経口用M. bovis BCGの保護効果を決定するために、マウスに５×１０7 ＣＦＵの配合M. bovis BCGをワクチン接種するか、又は１×１０6 ＣＦＵのM. bovis BCGを皮下ワクチン接種した。非ワクチン接種マウスを対照とした。マウスをワクチン接種後８週でエアゾール経路により病原性M. bovisで抗原投与し、抗原投与後３７〜４０日で安楽死させた。表２は、皮下M. bovisワクチン接種が肺細菌数を約２．３４ｌｏｇ減少させ、また脾臓細菌数を１．９０ｌｏｇ減少させることを示す。これに比べて、配合された経口M. bovis BCGは肺細菌数を約１．０ｌｏｇ 減少させ、また脾臓細菌数を１．４８ｌｏｇ減少させた。表２の結果は、経口配合M. bovis BCGおよび皮下M. bovis BCGが病原性M. bovisによるエアゾール抗原投与に対する著しい保護を誘導するが、肺における皮下M. bovis BCGの保護効果は経口配合M. bovis BCG群の場合よりも大きいことを示した。
【００９７】
Ｄ．  フクロネズミにおける免疫反応および病理学
リンパ球芽球発生反応。
ウシＰＰＤに対する全血リンパ球芽球発生反応に及ぼす配合ＢＣＧによる経口ワクチン接種の効果を図５および表３に示す。ワクチン接種後６週で、配合ＢＣＧ群についてのＰＰＤ−Ｂに対する平均刺激指数（ＳＩ）は、非配合ＢＣＧ群の場合および非ワクチン接種対照群の場合よりも有意に高かった（Ｐ＜０．０５）。M. bovisで抗原投与後４週で、全ての群が２０よりも大きなＰＰＤ−Ｂに対する平均ＳＩを示した。これらの結果は、配合ＢＣＧの経口送達が、非配合ＢＣＧに比べフクロネズミにおいて強い免疫反応を誘導することを示す。
【００９８】
更なる実験により、皮下ワクチン接種による４種の経口脂質ＢＣＧ配合物に対する免疫反応を比較した（図１１）。皮下的にワクチン接種されたフクロネズミは、ワクチン接種後４週をピークとし（平均ＳＩ  ４２．５）８週でＳＩ＝３０まで徐々に低下する強いＬＴＡ反応を示した。対照的に、脂質Ｎ配合経口ＢＣＧは８週のワクチン期間の間ＬＴＡ反応を誘導しなかった。脂質Ｃ、脂質Ｋおよび脂質Ｆに配合された経口ＢＣＧは、ワクチン接種後４週で弱いが（ＳＩ＝１〜７）ワクチン接種後８週まで累進的に増大し持続する（ＳＩ＝１５〜２２）ＬＴＡ反応を誘導した。これらの結果は、経口ワクチン接種に対する全身免疫反応が皮下ワクチン接種の場合に比べて遅延するが、長く持続し得ることを示す。配合物Ｎは、非ワクチン接種フクロネズミの場合に見られるよりも高いＬＴＡ反応を誘導せず、またM. bovisによるエアゾール抗原投与に対する保護も行わなかった（表４参照）。経口ＢＣＧを配合するために用いられる脂質の種類が結核に対する保護にとって重要であることを示した。
【００９９】
臨床知見。
異なる群の間での抗原投与と検死の間の平均体重の変化を図６に示す。配合ＢＣＧでワクチン接種されたフクロネズミの平均体重は、抗原投与と検死の間で０．０２ｋｇ増加した。対照的に、非配合ＢＣＧ群および非ワクチン接種群については、平均体重がこの間にそれぞれ０．３５ｋｇおよび０．２３ｋｇ減少した。しかしながら、これらの差は統計学的に有意でなかった。
【０１００】
４種の経口脂質ＢＣＧ配合物と皮下ワクチン接種とを比較する更なる実験（表４）において、抗原投与と検死の間での平均体重変化が、非ワクチン接種群（０．１４７ｋｇ）に比べ、皮下ワクチン接種群（平均体重損失０．０１２ｋｇ）および経口脂質ＢＣＧ群の１つ（Ｆ群）（０．０３５ｋｇ）については有意に減少した。比較して、残りの経口ＢＣＧ群についての平均体重損失は、０．０６０ｋｇ（脂質Ｃ）、０．０６７ｋｇ（脂質Ｋ）および０．１２２ｋｇ（脂質Ｋ）であった。ワクチン接種に対する免疫反応を示さなかったフクロネズミ（すなわち非ワクチン接種群および脂質Ｎ群）は、反応したフクロネズミに比べて大きな体重損失を示した。
【０１０１】
病理学。
抗原投与した動物の全ての肺において肉眼による病巣を観察した。結核性肺炎の程度は肺重量から推定することができる（図７）。高い肺重量は広範な結核性肺炎に関連する（３）（４）。肺重量差を体重変動で標準化するために、各動物の平均肺重量を体重と比較し、比で表わした。配合ＢＣＧでワクチン接種された動物の平均肺重量と体重の比は１．６２であった。比較して、非配合ＢＣＧ群および非ワクチン接種対照群の平均肺重量と体重の比はそれぞれ２．８６および３．０であった。配合ＢＣＧでワクチン接種したフクロネズミの平均肺重量と体重の比は、非配合ＢＣＧ群および非ワクチン接種対照群とは有意な差がある（Ｐ＜０．０５）。一般には、肺の病巣は、その病巣の中央に黄色の壊死領域をもった葉様硬化または小硬化領域である。最も広範な肺病巣をもった動物では肥大した気管支リンパ節が観察される。
【０１０２】
４種の経口脂質ＢＣＧ配合物と皮下ワクチン接種とを比較した第２の実験（表４）において、ワクチン群の間で平均肺重量と体重の比に有意差は無かった。しかしながら、ワクチン接種に対する免疫反応を示さなかったフクロネズミ（すなわち非ワクチン接種群および脂質Ｎ群）は、反応したフクロネズミに比べて高い肺重量を示した。
【０１０３】
細菌学。
マイコバクテリウム・ボービス(Mycobacterium bovis）をM. bovisで抗原投与したフクロネズミの肺および脾臓から単離した。異なる群について肺および脾臓から単離された平均M. bovis数を図８および図９に示す。非配合群および配合ＢＣＧ群についての平均肺細菌数は、非ワクチン接種対照群のものよりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。配合ＢＣＧ群についての平均脾臓細菌数は、非配合ＢＣＧ群よりも約１０倍少なく、また非ワクチン接種群よりも約４０倍少なかった。配合ＢＣＧ群についての平均脾臓細菌数は、非配合ＢＣＧ群および非ワクチン接種対照群のものよりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。
【０１０４】
４種の経口脂質ＢＣＧ配合物と皮下ワクチン接種とを比較した第２の実験（表４）において、経口ワクチン接種群のうちの３群および皮下ワクチン接種群について脾臓細菌数は非ワクチン接種群と比べて有意に低かった（Ｐ＜０．０５）。残りの経口脂質ＢＣＧ群（脂質Ｎ）は脾臓細菌数の有意な低下を示さなかった。肺細菌数を比較した場合には、これらの群の間で有意差が見られなかった。一般に、ワクチン接種に対する免疫反応を示さなかったフクロネズミ（すなわち非ワクチン接種群および脂質Ｎ群）は反応したフクロネズミに比べて高い平均脾臓および肺細菌数を示した。
【０１０５】
【表１】
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【０１０６】
【表２】
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【０１０７】
【表３】
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【０１０８】
【表４】
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【産業上の利用可能性】
【０１０９】
産業上利用
抗原性組成物には、安定なマトリックス中に抗原を維持し、マトリクス中に抗原が均一に分散された脂質配合物が含まれる。この抗原性組成物は、一定用量の抗原の投与を促進し、高用量投与（dose dumping）および非効率な低用量投与を回避する。脂質配合物は、本出願人により、その中に含まれる生きた微生物の生存度および保存を改善することも示されている。脂質配合物はまた、胃酸および酵素による分解から抗原および生きた微生物を保護する。脂質系配合物における微生物の生存度の損失は、凍結乾燥製品について報告されているものよりも著しく低い。配合物の疎水的性質のために、劣化することなく、湿性または湿気条件下での保存も達成することができる。
【０１１０】
ワクチン製剤における微生物、特に細菌、の生存度は、強くて長期間持続する保護性免疫を誘導するために重要であることが実証されている。このことは本発明の組成物を使用することによって達成し得る。本発明の組成物はまた、調製し易く、生産費用が廉価で、針と注射器の使用を避けることができる点で消費者の受け入れ易さと安全性の増大が認められる。
【０１１１】
本発明の組成物は、皮下を含め多様な経路で投与し得るが、特に経口送達に適している。本出願人は、組成物における脂質配合物が微生物の生存度およびその構成要素である抗原を胃での分解から保護することができ、生きた微生物が免疫系に対する処理、複製および提示のために胃腸粘膜により吸収されることを可能とすることを見出した。さらに、本出願人は、投与される用量が従前に経口投与について予期されていた（８）よりも少ない用量で効果的となり得ることを決定している。
【０１１２】
例えばフクロネズミ等のような野生動物のワクチン接種には、抗原が粘膜ルートにより送達される必要がある。経口食餌ワクチンはそれ故に実用的で費用対効果に優れた送達の選択肢となる。ヒトの経口ワクチン接種も費用対効果に優れたワクチン接種方法であり、使用者の支持を受け易い。
【０１１３】
例えば皮下等の他の経路で投与される場合に、脂質配合物は、攻撃、例えばマクロファージによる攻撃から保護をも与える。皮下投与または注射による投与の場合に、脂質デポー配合物は、持続した放出をも可能として、感染プロセスを模倣し、そして免疫反応の増大を促進する。
【０１１４】
本発明の組成物が、多数の高コストの注射用ワクチン製剤を上回る実質的な利点を与えることが理解されるであろう。
【０１１５】
本発明の組成物は、広範囲の感染性微生物、例えば胃腸および呼吸系の病原、特に結核に対する免疫反応を誘導するのに効果的である。
【０１１６】
本発明の組成物は、広範囲の抗原に対するワクチン送達システムとして、または抗原性分子の同時送達または共役送達、特にその用量または抗原性の理由が低い免疫原性である抗原性分子の同時送達または共役送達にも使用し得る。本発明の組成物はワクチンアジュバントとしても有用である。
【０１１７】
本説明が例示のみのために与えられ、本発明の範囲がこれに限定されないことが当業者に更に理解されるであろう。
【０１１８】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】脂質配合物の脂肪酸組成を示す図である。脂質は標準的プロトコルに従ってガスクロマトグラフィにより分析された。各脂質の脂肪酸組成は全脂肪酸組成の比率として表わされる。
【図２】４℃（２ａ）または室温（１０〜２５℃）における脂質中での配合および保存の後のＢＣＧ生存度を示す図である。ＢＣＧ配合物は３７℃に温めれ 7H9液体培地中で乳化される。生存可能な微生物の数は7H11寒天プレート上への各エマルジョンの直列的な１０倍希釈液を接種することによって決定した。配合媒体のＣＦＵ／ｕｌ数は培養の２〜３週後に決定した。結果は２重実験を代表し、平均として表わされる。
【図３】種々異なる用量の配合M. bovis BCGによる経口ワクチン接種後のウシＰＰＤ誘導ＩＮＦ−γ反応を示す図である。配合M. bovis BCG（丸）、非配合M. bovis BCG（三角）または配合剤のみ（菱形）による経口免疫化後８週で、マウスを殺した。脾臓細胞をウシＰＰＤと共に７２時間インキュベートした。次に上清を集め、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて分析した。各処理群は６匹のマウスを含んだ。脾臓を個別に処理した。結果は pg/mlで表わされ、三重測定の平均として示される。棒は標準誤差を示す。
【図４】ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるM. bovis BCGワクチン接種に対する抗原誘導脾臓ＩＮＦ−γ反応を示す図である。１０6 ＣＦＵの皮下M. bovis BCG（四角）、１０7 ＣＦＵの配合M. bovis BCGの経口送達（丸）、非配合M. bovis BCG（三角）または配合剤のみ（菱形）によるワクチン接種後２週、４週、６週および８週でマウスを安楽死させた。脾臓細胞をウシＰＰＤと共に７２時間インキュベートした。次に上清を集め、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて分析した。各処理群は５〜６匹のマウスを含んだ。脾臓を個別に処理した。結果は pg/mlで表わされ、三重測定の平均として示される。８週での結果は２つの別個の実験から得られたものである。Ｐ値＜０．０５（スチューデントｔ検定）。棒は標準誤差を示す。
【図５】非不着性腹膜滲出細胞（ＮＰＥＣ）と共に同時培養されたマクロファージによるM. bovisの増殖阻害。マクロファージ当たり２桿菌のＭＯＩでマクロファージにM. bovisを感染させた。非不着性自己ＮＰＥＣをマクロファージ当たり１０ＮＰＥＣの比で加えた。次に［3Ｈ］ウラシルの取込み量を感染後７２時間でアッセイした。M. bovisを含有しない細胞培養物による平均［3Ｈ］ウラシル取込み量は４６０ｃｐｍであった。同時培養マクロファージおよびＮＰＥＣからの細胞内桿菌の増殖を三重測定の平均として表わした。結果は２つの実験を代表する。* は配合剤のみの対照群の平均から有意な差がある平均を表わし；棒は標準誤差を示す。
【図６】ＰＰＤ−Ｂに対する生体外（in vitro）腹膜血液リンパ球芽球発生反応に及ぼす配合ＢＣＧによるフクロネズミの経口ワクチン接種の効果を示す図である。配合ＢＣＧ  ◆----◆；非配合ＢＣＧ  □（黒）----□（黒）；非ワクチン接種対照群  ×----×；結果は平均刺激指数（ＳＩ）として表わされる。* は非ワクチン接種対照群の平均から有意な差がある平均を表わす。棒はＳＥを示す。
【図７】M. bovisで抗原投与されたフクロネズミの体重に及ぼす配合ＢＣＧによる経口ワクチン接種の効果を示す図である。平均体重変化は抗原投与から検死までの期間にわたって測定された。抗原投与の直前のフクロネズミの平均体重は３．０±０．０７（±ＳＥ）ｋｇである。棒はＳＥを示す。
【図８】M. bovisで抗原投与されたフクロネズミの肺重量に及ぼす配合ＢＣＧによる経口ワクチン接種の効果を示す図である。平均肺重量は検死時に測定された。肺重量の差を体重の変動で標準化するために、各動物の肺重量を体重と比較し、比として表わした。* は非ワクチン接種対照群の平均から有意な差がある平均を表わし；棒はＳＥを示す。
【図９】M. bovisで抗原投与を受けた肺から単離されたマイコバクテリアの平均数に及ぼす配合ＢＣＧによるフクロネズミの経口ワクチン接種の効果を示す図である。結果はＣＦＵ（ｌｏｇ10 ）／組織のｇの幾何平均数として表わされる。* は非ワクチン接種対照群の平均から有意な差がある平均を表わし；棒はＳＥを示す。
【図１０】M. bovisで抗原投与を受けた脾臓から単離されたマイコバクテリアの平均数に及ぼす配合ＢＣＧによるフクロネズミの経口ワクチン接種の効果を示す図である。結果はＣＦＵ（ｌｏｇ10 ）／組織のｇの幾何平均数として表わされる。* は非ワクチン接種対照群の平均から有意な差がある平均を表わし；棒はＳＥを示す。
【図１１】４種の経口脂質ＢＣＧ配合物または皮下ワクチン接種に対する免疫反応の比較を示す図である。図はワクチン接種（０週）および抗原投与（８週）を受けたフクロネズミにおけるＰＰＤ−Ｂに対する生体外（in vitro）腹膜血液リンパ球芽球発生反応に及ぼす効果を示す。結果は平均刺激指数（ＳＩ）として表わされる。
【図１２】本発明による包括的なワクチン送達システムの図である。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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