(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲル電気泳動によるタンパク質の分離方法であって、
緩衝液中に共有結合型染色剤及びドデシル硫酸アルカリ金属塩を含有する染色液をタンパク質含有サンプルに接触させる染色工程と、
前記染色工程後のタンパク質含有サンプルをゲル電気泳動に供する電気泳動工程と
を含み、該ドデシル硫酸アルカリ金属塩の染色液中の濃度が０．５〜１０ｗ／ｖ％である、分離方法。
【請求項２】
前記ドデシル硫酸アルカリ金属塩がドデシル硫酸ナトリウム又はドデシル硫酸リチウムである、請求項１に記載の分離方法。
【請求項３】
前記染色液中の前記緩衝液の濃度が１０ｍＭ以下である、請求項１又は２に記載の分離方法。
【請求項４】
前記共有結合型染色剤がアミノ基修飾型染色剤である、請求項１に記載の分離方法。
【請求項５】
前記アミノ基修飾型染色剤がシアニン色素である、請求項４に記載の分離方法。
【請求項６】
前記ゲル電気泳動がＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の分離方法。
【請求項７】
前記染色工程前にタンパク質含有サンプルを電気泳動に供する工程を備え、
前記染色工程のタンパク質含有サンプルが前記電気泳動後のタンパク質含有サンプルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の分離方法。
【請求項８】
前記電気泳動が等電点電気泳動である、請求項７に記載の分離方法。
【請求項９】
ゲル電気泳動におけるタンパク質の染色方法であって、
ゲル電気泳動に供する前に、緩衝液中に共有結合型染色剤及びドデシル硫酸アルカリ金属塩を含有する染色液をタンパク質含有サンプルに接触させることを含み、該ドデシル硫酸アルカリ金属塩の染色液中の濃度が０．５〜１０ｗ／ｖ％である、染色方法。
【請求項１０】
前記電気泳動が１次元目の電気泳動と、２次元目の電気泳動とを有する２次元電気泳動であり、
前記２次元目の電気泳動前に、前記１次元目の電気泳動終了後のタンパク質含有サンプルに前記染色液を接触させる、請求項９記載の染色方法。
【請求項１１】
緩衝液と、共有結合型染色剤と、ドデシル硫酸アルカリ金属塩とを備える、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法に使用するためのゲル電気泳動におけるタンパク質染色用キットであって、
該緩衝液と該共有結合型染色剤と該ドデシル硫酸アルカリ金属塩とを混合して得られる染色液中の該ドデシル硫酸アルカリ金属塩の濃度が０．５〜１０ｗ／ｖ％である、キット。
【請求項１２】
アルコールを更に備える、請求項１１に記載のタンパク質染色用キット。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の分離方法、又は請求項９若しくは１０に記載の染色方法、に関する説明を記載した書類を更に備える、請求項１１又は１２に記載のタンパク質染色用キット。
【請求項１４】
緩衝液中に共有結合型染色剤とドデシル硫酸アルカリ金属塩とを含有する、ゲル電気泳動用タンパク質染色液であって、
該ドデシル硫酸アルカリ金属塩の染色液中の濃度が０．５〜１０ｗ／ｖ％であるドデシル硫酸アルカリ金属塩である染色液。
【請求項１５】
アルコールを更に含有する、請求項１４に記載のゲル電気泳動用タンパク質染色液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電気泳動におけるタンパク質の分離方法及び染色方法、並びにこれらの方法に用いるタンパク質染色液及びタンパク質染色用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質を含む混合液中の各成分を最もよく分離する方法として、電気泳動法が知られている。電気泳動法の中でも、２次元ゲル電気泳動法は、細胞の粗抽出液を１，０００にものぼる各タンパク質成分に分離することができることから広く使用されている。かかる２次元ゲル電気泳動法は、例えば、１次元目の電気泳動後のタンパク質含有試料をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）処理し、次いで２次元目の電気泳動に供して分離されたタンパク質を染色、洗浄し、解析を行う方法である。タンパク質の染色には、ＣＢＢ染色法やＳｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ染色法等が使用されている（菅野，「電気泳動最新プロトコール」，羊土社，平成１２年１月１日）。
【０００３】
しかしながら、上記文献に記載の電気泳動法の多くは、染色操作に１時間から数時間を要し、また染色後において洗浄処理が不可欠であることから、染色操作に時間がかかり過ぎるという問題があった。
【０００４】
近年、このような問題を解決すべく、効率的な染色操作の可能なＥｔｔａｎ ＤＩＧＥ法が提案されている（Ｎｏｖｅｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｇｅｌ ａｎａｌｙｓｉ：ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ ａ ｐｏｏｌｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．３，３６−４４（２００３））。Ｅｔｔａｎ ＤＩＧＥ法は、タンパク質含有試料を染色剤と反応させ、その反応を停止した後、１次元目の電気泳動に供し、次いで電気泳動後のタンパク質含有試料をＳＤＳ処理し、２次元目の電気泳動に供してタンパク質の解析を行う方法である。
【発明の開示】
【０００５】
Ｅｔｔａｎ ＤＩＧＥ法は、従来公知の電気泳動法に比較して染色操作を短時間で行うことができるものの、染色剤の量をコントロールするために過剰の染色剤とタンパク質との反応を停止させる必要がある。このため、染色操作が煩雑となる。このように、従来の電気泳動法における染色操作は煩雑であることから、簡便かつ迅速にタンパク質の染色及び分離を行うことのできる方法が切望されている。
【０００６】
本発明はこのような実情に鑑みなされたものであり、その解決しようとする課題は電気泳動におけるタンパク質の染色及び分離を簡便かつ迅速に行うことのできる方法、並びにこれらの方法に用いるタンパク質染色液及びタンパク質染色用キットを提供することにある。
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、緩衝液中に染色剤及び界面活性剤を含有する染色液を用いて染色することにより、染色時間の短縮と染色感度の向上を得ることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の特徴を有する。
（１）ゲル電気泳動によるタンパク質の分離方法であって、緩衝液中に染色剤及び界面活性剤を含有する染色液をタンパク質含有サンプルに接触させる染色工程と、上記染色工程後のタンパク質含有サンプルをゲル電気泳動に供する電気泳動工程とを含む、分離方法。
（２）上記界面活性剤がドデシル硫酸アルカリ金属塩である、上記（１）に記載の分離方法。
（３）上記ドデシル硫酸アルカリ金属塩がドデシル硫酸ナトリウム又はドデシル硫酸リチウムである、上記（２）に記載の分離方法。
（４）上記染色液中の上記ドデシル硫酸アルカリ金属塩の濃度が０．５〜１０％である、上記（２）又は（３）に記載の分離方法。
（５）上記染色液中の上記緩衝液の濃度が１０ｍＭ以下である、上記（１）〜（４）のいずれか一に記載の分離方法。
（６）上記染色剤が共有結合型染色剤である、上記（１）〜（５）のいずれか一に記載の分離方法。
（７）上記共有結合型染色剤がアミノ基修飾型染色剤である、上記（６）に記載の分離方法。
（８）上記アミノ基修飾型染色剤がシアニン色素である、上記（７）に記載の分離方法。
（９）上記ゲル電気泳動がＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動である、上記（１）〜（８）のいずれか一に記載の分離方法。
（１０）上記染色工程前にタンパク質含有サンプルを電気泳動に供する工程を備え、上記染色工程のタンパク質含有サンプルが上記電気泳動後のタンパク質含有サンプルである、上記（１）〜（９）のいずれか一に記載の分離方法。
（１１）上記電気泳動が等電点電気泳動である、上記（１０）に記載の分離方法。
（１２）ゲル電気泳動におけるタンパク質の染色方法であって、ゲル電気泳動に供する前に、緩衝液中に染色剤及び界面活性剤を含有する染色液をタンパク質含有サンプルに接触させる、染色方法。
（１３）上記電気泳動が１次元目の電気泳動と２次元目の電気泳動とを有する２次元電気泳動であり、上記２次元目の電気泳動前に、上記１次元目の電気泳動終了後のタンパク質含有サンプルに上記染色液を接触させる、上記（１２）記載の染色方法。
（１４）緩衝液と、染色剤と、界面活性剤とを備える、ゲル電気泳動におけるタンパク質染色用キット。
（１５）アルコールを更に備える、上記（１４）に記載のタンパク質染色用キット。
（１６）上記（１）〜（１１）のいずれか一に記載の分離方法、又は上記（１２）若しくは（１３）に記載の染色方法、に関する説明を記載した書類を更に備える、上記（１４）又は（１５）に記載のタンパク質染色用キット。
（１７）緩衝液中に染色剤と界面活性剤とを含有する、ゲル電気泳動用タンパク質染色液。
（１８）アルコールを更に含有する、上記（１７）に記載のゲル電気泳動用タンパク質染色液。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図１は、実施例１における、本染色法により染色したマウス脳組織抽出液の２次元電気泳動像を示す図である。
図２は、実施例２における、本染色法により染色したマウス脳組織抽出液の２次元電気泳動像を示す図である。
図３は、実施例３における、本染色法により染色したマウス脳組織抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動像を示す図である。
図４は、実施例４における、本染色法により染色したマウス脳組織抽出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動像を示す図である。
図５は、比較例１における、ＳＤＳを含有しない染色液により染色したマウス脳組織抽出液の２次元電気泳動像を示す図である。
図６は、比較例２における、ＣＢＢ染色法により染色したマウス脳組織抽出液の２次元電気泳動像を示す図である。
図７は、比較例３における、本染色法及びＥｔｔａｎ ＤＩＧＥ染色法により染色したマウス脳組織抽出液の２次元電気泳動像を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
【００１１】
本発明のゲル電気泳動によるタンパク質の分離方法（以下、単に「分離方法」という。）は、染色工程と、電気泳動工程とを含むことを特徴とする。染色工程は、緩衝液中に染色剤及び界面活性剤を含有する染色液をタンパク質含有サンプルに接触させる工程である。また、電気泳動工程は、染色工程後のタンパク質含有サンプルをゲル電気泳動に供する工程である。
【００１２】
まず、染色工程について説明する。染色工程においては、タンパク質含有サンプルを支持体上に担持させる前に、タンパク質含有サンプルと染色液とを接触させる。タンパク質含有サンプルとしては、複数種のタンパク質を含む生体試料の抽出物を使用することができる。生体試料としては、例えば、ヒトの他ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、トリ等の家畜や家禽、マウス、ラット等の実験動物等の生体細胞、それを含む組織（例えば、肝組織、筋組織、脳組織、心組織、血液、血漿、血清、リンパ液等の体液、リンパ節）又は体分泌物（例えば、尿）等が挙げられる。なお、ゲル電気泳動後のタンパク質のスポット又はバンドが検出限界を超える場合には、予めタンパク質含有サンプルを分離精製や分画処理等を施しておくことが望ましい。
【００１３】
支持体としては、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル等のゲルが挙げられる。支持体のゲル濃度としては、分離すべきタンパク質の分子量に応じて適宜選択することが可能であるが、例えばポリアクリルアミドゲルの場合、通常３〜２０％である。また、分離すべきタンパク質の分子量が分からない場合や広範囲にわたる場合には、例えば５〜２０％の濃度勾配を有するゲルを使用してもよい。なお、前述したゲルとしては、例えばアクリルアミドと、Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミドとを重合して所望濃度のゲルを調製してもよいが、ＳｕｒｅＢｌｏｔゲル（藤沢薬品工業（株）社製）、レディーゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ Ｄｒｙ ｓｔｒｉｐゲル、Ｅｔｔａｎ ＤＡＬＴゲル、Ｍｕｌｔｉｐｈｏｒ ＩＩプレキャストゲル、Ｐｈａｓｔｓ ｓｙｓｔｅｍプレキャストゲル、Ｇｅｎｅｐｈｏｒプレキャストゲル（以上、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、ＮｕＰＡＧＥ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅゲル、Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅゲル、Ｔｒｉｃｉｎｅゲル、ＩＥＦゲル、Ｅ−ＧＥＬゲル、ＴＢＥゲル、ＴＢＥ−Ｕｒｅａゲル（以上、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ＰＡＧミニゲル（第一化学社製）、ＰＡＧＥＬ、ｅ−ＰＡＧＥＬ（以上、アトー（株）社製）、ＸＶ ＰＡＮＴＥＲＡゲル、Ｐｅｒｆｅｃｔ ＮＴゲル（以上、ＤＲＣ社製）等のプレキャストゲルとして商業的に入手してもよい。なお、本明細書において支持体のゲル濃度（％）は、ｗ／ｖ％を意味する。
【００１４】
タンパク質含有サンプルの染色に使用する染色液としては、本発明のゲル電気泳動用タンパク質染色液（以下、単に「染色液」という）を使用することができる。本発明の染色液は、緩衝液中に染色剤と界面活性剤とを含有することを特徴とする。
【００１５】
緩衝液としては、当該技術分野で公知の種々の緩衝液が使用され得るが、染色液の官能基と、該官能基と反応するタンパク質の官能基との反応を阻害しないものが好ましい。かかる緩衝液は、使用される染色剤の型を考慮して適宜選択することができ、例えば、炭酸緩衝液（Ｎａ２ＣＯ３及びＮａＨＣＯ３を組み合わせた緩衝液）、リン酸緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４及びＮａＨ２ＰＯ４を組み合わせた緩衝液）、Ｃｌａｒｋ ａｎｄ Ｌｕｂｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＫＨ２ＰＯ４及びＮａＯＨを組み合わせた緩衝液）、ＮａＨＣＯ３緩衝液（５％ＣＯ２又はＮａＯＨによりｐＨを調整したもの）、Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ−ＨＣｌ緩衝液（２，４，６−Ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｄｉｎｅ−ＨＣｌ緩衝液）、Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＭＯＰＳ）−ＫＯＨ緩衝液、バルビタール−ＨＣｌ緩衝液（Ｓｏｄｉｕｍ ５，５−ｄｉｅｔｈｙｌｂａｒｂｉｔｕｒａｔｅ及びＨＣｌを組み合わせた緩衝液）、Ｎ−ｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ−ＨＣｌ緩衝液、Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）−ＮａＯＨ緩衝液、Ｎ−２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−３−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＥＰＰＳ）−ＮａＯＨ緩衝液、Ｎ，Ｎ−（Ｂｉｓ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｇｌｙｃｉｎｅ（ＢＩＣＩＮＥ）−ＮａＯＨ緩衝液、Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ緩衝液、ＭＥＳ（２−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）緩衝液、ＴＲＩＣＩＮＥ緩衝液が挙げられる。これらの中では、例示として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド系のようなアミノ基修飾型染色剤（例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ７）を用いる場合には、炭酸緩衝液、ＮａＨＣＯ３緩衝液が好適である。染色液中の緩衝液の濃度は、１０ｍＭ以下が好ましく、より好ましくは３ｍＭ以下である。かかる濃度が１０ｍＭを超えると、電気泳動により分離されたタンパク質のバンドの波打ちが起こる傾向にある。なお、緩衝液の濃度が低過ぎてもバンドの波打ちが起こることがあるため、緩衝液の濃度は０．３ｍＭ以上とすることが望ましい。
【００１６】
染色剤としては、共有結合型染色剤が好ましい。ここで、共有結合型染色剤とは、有機化合物、核酸又はタンパク質等の構造中に存在するＮＨ２基、ＣＯＯＨ基、ＳＨ基又はＯＨ基等の官能基との化学反応により共有結合を形成可能な反応基、例えばｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ基、ＳＴＰ ｅｓｔｅｒ基、Ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ基、Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ（ＮＨＳ）ｅｓｔｅｒ基、Ａｌｋｙｌ ｈａｌｉｄｅ基、ｍａｌｅｉｍｉｄｅ基又はＳｙｍｍｅｔｒｉｃ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ基等を構造中に有する染色剤をいう。かかる染色剤としては、例えば、シアニン色素類（例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ３、Ｃｙ２、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製））、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ類、Ｂｉｏｔｉｎ類、ＢＯＤＩＰＹ類、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ類、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ類、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ類、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ類、Ｃｏｕｍａｒｉｎ類、ＮＢＤ（７−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌｅ）類等が挙げられる。これらの共有結合型染色剤の中でも、アミノ基（ＮＨ２）修飾型染色剤が好適であり、シアニン色素、特にＣｙ５、Ｃｙ３、Ｃｙ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）が好適である。染色液中の染色剤の濃度は、１００〜１，０００μｇ／ｍＬが好ましく、より好ましくは２００〜５００μｇ／ｍＬである。かかる濃度が１００μｇ／ｍＬ未満であると蛍光感度が顕著に低下する傾向にあり、他方１，０００μｇ／ｍＬを超えると蛍光感度が飽和する傾向にある。なお、非共有結合型染色剤もまた本発明において使用可能であり、例えば、Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ、Ｓｙｐｒｏ ｒｅｄ（以上、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）が使用可能である。
【００１７】
界面活性剤としては、タンパク質に対してマイナスチャージを付与可能な界面活性剤が好ましく、例えば陰イオン界面活性剤が挙げられる。かかる界面活性剤としては、例えばドデシル硫酸アルカリ金属塩が挙げられ、具体的にはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＳ）等が挙げられる。ＳＤＳ等の界面活性剤はタンパク質の可溶化剤としても機能するが、ＳＤＳと染色剤とを共存させることでタンパク質の染色とＳＤＳ化とが同時に行うことができる。これにより、タンパク質含有サンプルの簡便かつ迅速な染色が可能になる。また、染色液中の界面活性剤の濃度は、例えばドデシル硫酸アルカリ金属塩の場合、０．５〜１０％が好ましく、より好ましくは１．０〜５．０％、更に好ましくは１．０〜２．０％である。かかる濃度が０．５％未満であると蛍光感度が低下する傾向にあり、他方１０％を超えると蛍光感度が飽和する傾向にある。なお、本明細書において界面活性剤の濃度（％）は、ｗ／ｖ％を意味する。
【００１８】
また、本発明の染色液は、アルコールを更に含有してもよい。アルコールを含有することで、タンパク質の染色効率を向上させることができる。このような効果が得られる要因については明確に解明されていないが、染色液のゲルへの浸透性が改善されることが要因の一つであると、本発明者らは推察している。アルコールとしては、炭素数１〜４の直鎖又は分岐状のアルコールが好適であり、具体的には、メタノール、エタノール、プロパノール、ｉｓｏ−プロパノール、ブタノールｓｅｃ−ブタノール等が挙げられる。これらの中では、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが好ましく、メタノール、エタノール、プロパノールがより好ましい。染色液中のアルコールの濃度は、０．５〜３０％が好ましく、より好ましくは０．５〜１０％、更に好ましくは０．５〜１．０％である。かかる濃度が０．５％未満であるとアルコール添加による効果が十分得難い傾向にあり、他方３０％を超えると染色効率が低下する傾向にある。なお、本明細書においてアルコールの濃度（％）は、ｖ／ｖ％を意味する。
【００１９】
本発明の染色液のｐＨは、使用される染色剤に応じて適宜選択することができ、例えば、Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ型のＣｙ５、Ｃｙ３、Ｃｙ２のようなアミノ基修飾型染色剤を使用する場合には、染色液のｐＨは９．５〜１０．０であることが好ましい。
【００２０】
染色液とタンパク質含有サンプルとの接触には、本発明のゲル電気泳動におけるタンパク質の染色方法（以下、単に「染色方法」という。）を適用することができる。本発明の染色方法は、ゲル電気泳動に供する前に染色液とタンパク質含有サンプルとを接触させ、タンパク質の染色と界面活性剤処理（ＳＤＳ化等）を同時に行うことを特徴とする。なお、ゲル電気泳動が２次元電気泳動である場合には、２次元目の電気泳動前に、１次元目の電気泳動を終了したタンパク質含有サンプルと染色液とを接触させる。
【００２１】
染色液と、タンパク質含有サンプルとの接触は、タンパク質含有サンプルが支持されたゲルに染色液をピペットで滴下したり、ゲルを染色液に浸漬させる等の簡便な手段によって行うことができる。染色液とタンパク質含有サンプルとの接触時間は３０分程度としてもよいが、接触後直ちに電気泳動に供しても十分な染色が可能である。また、染色剤とタンパク質では分子量が大きく異なり、分子量に占めるマイナス電荷の割合（マイナス電荷／分子量）にも大きな違いがあることから、両者の泳動速度に大きな差が生ずる。これにより、過剰量の染色剤は電気泳動によってタンパク質よりも先に泳動されるため、過剰量の染色剤に影響されることなくタンパク質を検出することが可能になり、加えて洗浄操作も不要になる。したがって、簡便かつ迅速にタンパク質の染色を行うことができる。これに対し、従来の染色方法においては、染色剤とタンパク質とを十分に時間をかけて反応させる必要があり、更に洗浄操作も要することから、染色操作が煩雑で時間がかかるという不具合を生ずる。本発明の染色方法と従来公知のタンパク質の染色方法における染色時間の比較を表１に示す。
【００２２】
【表１】
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【００２３】
次に、電気泳動工程について説明する。電気泳動工程においては、染色工程でタンパク質の染色と界面活性剤処理（ＳＤＳ化等）が行われたタンパク質含有サンプルをゲル電気泳動に供する。なお、本発明においては、電気泳動の操作方法は従来公知の方法により行うことができる。ゲル電気泳動としては、タンパク質を分離し得る電気泳動法であれば特に制限されるものではないが、例えば、等電点電気泳動、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ディスクゲル電気泳動、スラブゲル電気泳動、ゲル等速電気泳動が挙げられる。これらの中では、１次元電気泳動の場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動が好ましい。また、２次元電気泳動の場合には、例えば等電点と分子量という２つの異なる要因からタンパク質を分離し得る２つの電気泳動法を組み合わせることが好ましい。具体的には、１次元目に等電点電気泳動を、２次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥを選択することが好ましい。
【００２４】
また、等電点電気泳動においてはゲル中にゲル勾配を形成する必要があるが、ゲル勾配の形成方法としては両性担体（Ｃａｒｒｉｅｒ ａｍｐｈｏｌｙｔｅｓ）をポリアクリルアミドゲルに添加して電場をかける方法、種々の等電点を有するアクリルアミド化合物を用いてゲルの調製と同時にｐＨ勾配を形成する方法等が挙げられる。また、等電点電気泳動とＳＤＳ−ＰＡＧＥとの２次元電気泳動おいては、等電点電気泳動によって分離されたタンパク質を含むゲルを２次元目のゲル端に載せ、等電点電気泳動の展開方向に対して直交する方向に泳動させることによりタンパク質が分離される。なお、ゲル電気泳動における通電条件は、電気泳動法等に応じて適宜設定することができるが、例えば、ＺＯＯＭ ＩＰＧ ｒｕｎｎｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた等電点電気泳動の場合には、例えば、２００Ｖ ２０分、４５０Ｖ １５分、７５０Ｖ １５分、２０００Ｖ ３０分のように段階的に電圧を上げていく条件に設定する。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合には、２００Ｖの通電条件で泳動する。
【００２５】
前述した電気泳動工程により分離されたタンパク質は、例えば、カッターナイフ等でバンド部分のみを切除し、蛍光分析装置を用いて特定波長における蛍光強度を測定することにより、タンパク質を検出することができる。さらに、このようにして検出されたタンパク質は、必要により脱色後、抽出や膜への転写等によって回収することで当該タンパク質の分子量、純度、同定、定量等の分析が可能である。
【００２６】
本発明のタンパク質染色用キットの実施態様としては、染色剤を含有する組成物と、界面活性剤を含有する組成物と、必要に応じて緩衝液及び／又はアルコールを個別の容器に収容したキットが挙げられ、タンパク質を染色する際に、それらを互いに混合することで所望の濃度及びｐＨを有する染色液を調製することが好ましい。また、他の実施態様としては、複数に区分けされた容器内に、染色剤を含有する組成物を収容する第１の区分と、界面活性剤を含有する組成物を収容する第２の区分と、必要に応じて緩衝液を収容する第３の区分及び／又はアルコールを収容する第４の区分を備えるタンパク質染色用キットが挙げられる。さらに、本発明のタンパク質染色用キットは、前述した本発明の分離方法や染色方法に関する説明を記載した書類を更に備えていてもよい。なお、染色剤を含有する組成物及び界面活性剤を含有する組成物は、予め所望の濃度に調整されていることが好ましい。
【実施例】
【００２７】
以下、本発明の実施例についてさらに詳細な説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２８】
（実施例１）
マウスの脳組織の抽出溶液（５．２ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）／２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ／０．３Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ １ｔａｂ／１０ｍＬ（Ｒｏｃｈｅ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））を２次元電気泳動により分離した。すなわち、本抽出液７．７μＬを膨潤液（６Ｍ Ｕｒｅａ／２Ｍ Ｔｈｉｏｕｒｅａ／２％ＣＨＡＰＳ溶液１９１μＬ，ａｍｐｈｏｌｉｔｅ（ｐＨ３−１０）１μＬ，０．１％ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ ４μＬ，１Ｍ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ ４μＬ）に添加し混和した後、本液１５５μＬを用いてｐＨ３−１０のｐＨ勾配を有するｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔ（ＩＰＧ）ｇｅｌ ｓｔｒｉｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１６時間膨潤させた。膨潤後、１次元目の等電点電気泳動（ＺＯＯＭ ＩＰＧ Ｒｕｎｎｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ）を２００Ｖ ２０ｍｉｎ，４５０Ｖ １５ｍｉｎ，７５０Ｖ １５ｍｉｎ及び２０００Ｖ ３０ｍｉｎの条件で電圧を段階的に上げて行った。
【００２９】
電気泳動後、アルカリ条件下でタンパク質のアミノ基に共有結合する蛍光試薬Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ型 Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた染色液（９７〜３７７μｇ／ｍＬ ２％ＳＤＳ／１００ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．９））５０μＬをＩＰＧ ｇｅｌ ｓｔｒｉｐ上にピペットマンにより振りかけることで染色し、即座に２次元目の４−１２％ｇｒａｄｉｅｎｔ ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ電気泳動ゲルにアプライし、２００Ｖ ４０ｍｉｎの条件で泳動を行った。なお、タンパク質と反応していない遊離Ｃｙ５は低分子量であるため、可視で水色に見えるバンドとして＋極側に先に泳動される。ゲル電気泳動後、＋極端の本バンド部分をカッターナイフ等で切除し、蛍光イメージアナライザーＰｒｏＥｘｐｒｅｓｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）を用いて励起波長６２５ｎｍで、６８０ｎｍの蛍光強度を測定することにより、タンパク質の泳動像を観察した。その結果、２％ＳＤＳを含むＣｙ５染色液を使用した場合には、バンドの波打ちが生ずるものの、タンパク質の染色が向上することが確認された（図１）。また、２次元電気泳動後のゲルを約１０５分かけて操作を行うクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色法と同様の電気泳動パターンが観察された。なお、ｇｌｙｃｅｒｏｌの濃度（％）はｗ／ｖ％を示し、以下同様である。
【００３０】
（実施例２）
炭酸ナトリウム緩衝液を３ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３に代えたこと以外は、実施例１と同様の方法により２次元電気泳動を行い、タンパク質の泳動像を観察した。その結果、タンパク質の染色効率を保った状態でバンドの波打ちを解消できることが確認された（図２）。実施例１と同様にＣＢＢ染色法と同様の電気泳動パターンが観察された。
【００３１】
（実施例３）
マウスの脳組織の抽出溶液（５ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）／２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ／０．３Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ １ｔａｂ／１０ｍＬ（Ｒｏｃｈｅ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。すなわち、本抽出液１０μＬにＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ型 Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）染色液（１ｍｇ／ｍＬ２％ＳＤＳ／１００ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．９））１０μＬを加えて、室温で３０分間インキュベートすることにより染色し、本液１０μＬを１０−２０％ｇｒａｄｉｅｎｔ ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ電気泳動ゲル（Ｓｕｒｅ Ｂｌｏｔ Ｆ１ゲル、藤沢薬品工業株式会社製）にアプライし、２４０Ｖ １５ｍｉｎの条件で泳動を行った。泳動後、ゲルを１０％メタノール／７％酢酸水溶液にて１時間洗浄後、蛍光イメージアナライザーＰｒｏＥｘｐｒｅｓｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）を用いて励起波長６２５ｎｍで、６８０ｎｍの蛍光強度を測定することにより、タンパク質の泳動像を観察した。また、染色液中にメタノール、プロパノール、ブタノールを各々５％添加した染色液を用いて同様の条件で染色し、泳動した。アルコール無添加の結果を図３のｌａｎｅ１に、メタノール添加した結果を図３のｌａｎｅ２に、プロパノールを添加した結果を図３のｌａｎｅ３に、ブタノールを添加した結果を図３のｌａｎｅ４に、それぞれ示した。アルコール無添加の場合と比較したところ、メタノール、プロパノール、ブタノールを添加した場合には高感度でタンパク質バンドが検出できることが明らかとなった。なお、酢酸の濃度（％）はｖ／ｖ％を示し、以下同様である。
【００３２】
（実施例４）
マウスの脳組織の抽出溶液（５ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｌ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）／２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ／０．３Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ １ｔａｂ／１０ｍＬ（Ｒｏｃｈｅ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。すなわち、本抽出液１０μＬにＮ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ型 Ｃｙ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）染色液（１ｍｇ／ｍｌ２％ＳＤＳ／１００ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．９））１０μＬを加えて、室温で３０分間インキュベートすることにより染色し、本液１０μＬを１０−２０％ｇｒａｄｉｅｎｔ ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ電気泳動ゲル（Ｓｕｒｅ Ｂｌｏｔ Ｆ１ゲル、藤沢薬品工業株式会社製）にアプライし、２４０Ｖ １５ｍｉｎの条件で泳動を行った。泳動後、ゲルを１０％メタノール／７％酢酸水溶液にて１時間洗浄後、蛍光イメージアナライザーＰｒｏＥｘｐｒｅｓｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）を用いて励起波長６２５ｎｍで、６８０ｎｍの蛍光強度を測定することにより、タンパク質の泳動像を観察した。染色液中に２％ＳＤＳの代わりに２％Ｌｉｔｈｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ（ＬＤＳ）を添加して同様の条件で染色し、泳動した結果と比較したところ、２％ＳＤＳ添加の場合（図４ ｌａｎｅ２）と比べて２％ＬＤＳ添加の場合（図４ ｌａｎｅ３）には、より高感度で蛋白質バンドが検出できることが明らかとなった。
【００３３】
（比較例１）
２％ＳＤＳを含まない染色液を用いたこと、染色後３０分経過してから２次元目の電気泳動を行ったこと以外は、実施例１と同様の方法により２次元電気泳動を行い、タンパク質の泳動像を観察した。その結果、２％ＳＤＳを含まない染色液を用いた場合には、染色されたタンパク質がほとんど認められなかった（図５）。
【００３４】
（比較例２）
２次元電気泳動後のゲルを約１０５分かけて操作を行うクーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色法を行った。ＣＢＢ染色は、Ｂｉｏｓａｆｅ−ＣＢＢ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いて行った。すなわち、電気泳動後のゲルをＨ２Ｏで５分間３回洗浄後、Ｂｉｏｓａｆｅ−ＣＢＢ溶液で６０分間染色した後、Ｈ２Ｏで３０分間洗浄することで染色を完了した。電気泳動パターンを図６に示した。
【００３５】
（比較例３）
マウスの肝臓組織の抽出溶液（６６ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）／２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ／０．３Ｍ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ−ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）１ｔａｂ／１０ｍＬ）を本染色方法又はＥｔｔａｎ ＤＩＧＥ染色方法により染色し、２次元電気泳動により分離した。Ｅｔｔａｎ ＤＩＧＥ染色方法は、常法に従った。すなわち、本抽出液１．５μＬ（１００μｇタンパク質量相当）に１ｍＭ ＣｙＤｙｅ ＤＩＧＥ Ｆｌｕｏｒｍｉｎｉｍａｌ ｄｙｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）／ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ溶液２μＬを添加し、３０分間室温にて反応させた後、１０ｍＭ ｌｙｓｉｎｅ水溶液２μＬを添加して氷上で１０分間反応させることで反応を停止させた。これに７Ｍ Ｕｒｅａ／２Ｍ ｔｈｉｏｕｒｅａ／４％ＣＨＡＰＳを加えることにより１００μＬにメスアップし、Ｃｙ５標識タンパク質溶液として２次元電気泳動を行った。すなわち、Ｃｙ５標識タンパク質溶液２０μｌを膨潤液（６Ｍ Ｕｒｅａ／２Ｍ Ｔｈｉｏｕｒｅａ／２％ＣＨＡＰＳ溶液１９１μＬ，ａｍｐｈｏｌｉｔｅ（ｐＨ３−１０）１μＬ，０．１％ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ ４μＬ，１Ｍ ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ ４μＬ）に添加し混和した後、本液１５５μＬを用いてｐＨ３−１０のｐＨ勾配を有するｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔ（ＩＰＧ）ｇｅｌ ｓｔｒｉｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を１６時間膨潤させた。膨潤後、１次元目の等電点電気泳動（ＺＯＯＭ ＩＰＧ Ｒｕｎｎｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ）を２００Ｖ ２０ｍｉｎ，４５０Ｖ １５ｍｉｎ，７５０Ｖ １５ｍｉｎ及び２０００Ｖ ３０ｍｉｎの条件で電圧を段階的に上げて行った。電気泳動後、ＬＤＳ平衡化バッファー１ｍＬ（４×ＬＤＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）２５０μＬ／Ｈ２Ｏ ７５０μＬ／２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ １０μＬ）中でＩＰＧ ｇｅｌ ｓｔｒｉｐを１５分間振とうさせ、２次元目の４−１２％ｇｒａｄｉｅｎｔ ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ電気泳動ゲルにアプライし、２００Ｖ ４０ｍｉｎの条件で泳動を行った。泳動後、蛍光イメージアナライザーＰｒｏＥｘｐｒｅｓｓ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社）を用いて励起波長６２５ｎｍで、６８０ｎｍの蛍光強度を測定することにより、タンパク質の泳動像を観察した。他方、本染色方法においては、前述の実施例に従って同重量のタンパク質抽出液を用いて２次元電気泳動を行い、蛍光イメージアナライザーによりタンパク質の泳動像を観察し、Ｅｔｔａｎ ＤＩＧＥ染色方法と比較した。その結果、本染色方法により得られた泳動像（図７ Ａ）は、Ｅｔｔａｎ ＤＩＧＥ染色方法により得られた泳動像（図７ Ｂ）より高感度検出が可能であることが明らかとなった。つまり、本染色方法は、Ｅｔｔａｎ ＤＩＧＥ染色方法と比較して短時間の操作で染色することができ、且つ高感度で検出可能であることが明らかとなった。
【００３６】
上記実施例から、２次元電気泳動において、１次元目と２次元目の間で染色液をタンパク質に接触させる本染色方法により、短時間で２次元電気泳動により分離したタンパク質の泳動像を観察できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００３７】
本発明によれば、ＳＤＳ等の界面活性剤を含有する染色液を用いることによりタンパク質含有サンプルを短時間で染色し、しかも高感度で発色させることができる。また、過剰量の染色剤は、電気泳動によってタンパク質よりも先に泳動されるため、洗浄操作も不要である。さらに、１次元目の電気泳動後に、ＳＤＳ等の界面活性剤を含有する染色剤で染色することにより、直ちに２次元目の電気泳動に供することもできる。そのため、従来のタンパク質の分離方法に比べて工程数を減らすことができ、分離操作の簡略化が可能になる。したがって、簡便かつ迅速に、電気泳動においてタンパク質を染色し、分離できる方法が提供される。また、本発明のタンパク質の染色方法及び分離方法に有用なタンパク質染色液及びタンパク質染色用キットが提供される。
【００３８】
なお、本出願は、日本で出願された特願２００４−３５３３９５を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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