(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ−複素環式、Ｏ−複素環式又はＳ−複素環式の１核又は多核の芳香族化合物の微生物学的な酸化のための方法であって、
ａ１）調節核酸配列の遺伝的制御下で、モノオキシゲナーゼをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの発現構築物を含むベクターによって形質転換された組み換えシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを生産する微生物を培養培地中で外生の基質又は中間形成した基質の存在下に培養するか、又は
ａ２）基質を含有する反応培地を細菌起源のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼと一緒にインキュベートし、かつ
ｂ）形成した酸化生成物又はその副生成物を培地から単離することを含み、
ここで、上記モノオキシゲナーゼは、８７位；または、８７位及び１８８位；または、８７位、１８８位、及び７４位において下記の機能的変異：
Ｐｈｅ８７のＡｌａ、Ｖａｌ、又はＬｅｕによる置換；
Ｌｅｕ１８８のＡｓｎ又はＧｌｎによる置換；および
Ａｌａ７４のＶａｌ又はＧｌｙによる置換
を有する、配列番号２のアミノ酸配列を有するバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＢＭ−３に由来するものである、
上記方法。
【請求項２】
外生の基質又は中間形成した基質が、置換されていてよいＮ−複素環式、Ｏ−複素環式又はＳ−複素環式の一核又は多核の芳香族化合物から選択されている、請求項１記載の方法。
【請求項３】
置換されていてよい一核又は多核の芳香族化合物；直鎖状又は分枝鎖状のアルカン及びアルケン；および置換されていてよいシクロアルカン及びシクロアルケンから選ばれる化合物の微生物学的な酸化のための方法であって、
ａ１）調節核酸配列の遺伝的制御下で、モノオキシゲナーゼをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの発現構築物を含むベクターによって形質転換された、組み換えシトクロムＰ４５０を生産する微生物を培養培地中で外生の基質又は中間形成した基質の存在下に培養するか、又は
ａ２）基質を含有する反応培地をシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼと一緒にインキュベートし、かつ
ｂ）形成した酸化生成物又はその副生成物を培地から単離することを含み、
ここで、上記モノオキシゲナーゼは、８７位；または、８７位及び１８８位；または、８７位、１８８位、及び７４位において下記の機能的変異：
Ｐｈｅ８７のＡｌａ、Ｖａｌ、又はＬｅｕによる置換；
Ｌｅｕ１８８のＡｓｎ又はＧｌｎによる置換；および
Ａｌａ７４のＶａｌ又はＧｌｙによる置換
を有する配列番号２のアミノ酸配列を有するバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＢＭ−３に由来するものである、
上記方法。
【請求項４】
外生の又は中間形成した基質が、下記の化合物の群ａ)〜ｃ）：
ａ）置換されていてよい一核又は多核の芳香族化合物；
ｂ）直鎖状又は分枝鎖状のアルカン及びアルケン；
ｃ）置換されていてよいシクロアルカン及びシクロアルケン；
から選択されている、請求項３記載の方法。
【請求項５】
外生の基質として、請求項４に定義される化合物の群ａ)〜ｃ）から選択される少なくとも１つの化合物を培地に添加し、基質含有培地を２０〜４０℃の温度及び６〜９のｐＨにおいて酸素の存在下に酵素反応によって酸化を実施し、その際、基質含有培地が基質に対して更に１０ないし１００倍のモル過剰の還元当量を有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
外生の基質として、インドール、ｎ−ヘキサン、ｎ−オクタン、ｎ−デカン、ｎ−ドデカン、クメン、１−メチルインドール、５−Ｃ１−インドール又は５−Ｂｒ−インドール、インデン、ベンゾチオフェン、α−イオノン、β−イオノン及びγ−イオノン、アクリジン、ナフタレン、６−メチルキノリン又は８−メチルキノリン、キノリン及びキナルジンから選択される化合物を使用する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
インジゴ及び／又はインジルビンの微生物学的な製造のための方法であって、
ａ１）インドールを酸化するシトクロムＰ４５０を生産する組み換え微生物を培養培地中で外生の又は中間形成したインドールの存在下に培養するか、又は
ａ２）インドールを含有する反応培地を、インドールを酸化するシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼと一緒にインキュベートし、かつ
ｂ）形成した酸化生成物又はその副生成物を培地から単離することを含み、
ここで、上記モノオキシゲナーゼは、８７位；または、８７位及び１８８位；または、８７位、１８８位、及び７４位において下記の機能的変異：
Ｐｈｅ８７のＡｌａ、Ｖａｌ、又はＬｅｕによる置換；
Ｌｅｕ１８８のＡｓｎ又はＧｌｎによる置換；および
Ａｌａ７４のＶａｌ又はＧｌｙによる置換
を有する配列番号２のアミノ酸配列を有するバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＢＭ−３に由来するものである、
上記方法。
【請求項８】
培地から、中間形成したインドールの酸化によって生産されたインジゴ及び／又はインジルビンを単離する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
インドール酸化を酸素の存在下での微生物を２０〜４０℃の培養温度及び６〜９のｐＨで培養することによって実施する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記変異が、以下の１つ以上のアミノ酸置換：
ａ）Ｐｈｅ８７Ｖａｌ；
ｂ）Ｐｈｅ８７Ｖａｌ、Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎ；又は
ｃ）Ｐｈｅ８７Ｖａｌ、Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎ、Ａ１ａ７４Ｇｌｙ
の少なくとも１つを有する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
８７位；８７位及び１８８位；または、８７位、１８８位、及び７４位において下記の機能的変異：
Ｐｈｅ８７のＡｌａ、Ｖａｌ、又はＬｅｕによる置換；
Ｌｅｕ１８８のＡｓｎ又はＧｌｎによる置換；および
Ａｌａ７４のＶａｌ又はＧｌｙによる置換
を有する配列番号２のアミノ酸配列を有するバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）からのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＢＭ−３由来のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼの使用であって、
ａ）置換されていてよいＮ−複素環式、Ｏ−複素環式又はＳ−複素環式の一核又は多核の芳香族化合物；
ｂ）置換されていてよい一核又は多核の芳香族化合物；
ｃ）直鎖状又は分枝鎖状のアルカン及びアルケン；及び／又は
ｄ）置換されていてよいシクロアルカン及びシクロアルケン
の微生物学的な酸化のための上記使用。
【請求項１２】
前記モノオキシゲナーゼが以下の複数のアミノ酸置換：
ａ）Ｐｈｅ８７Ｖａｌ；
ｂ）Ｐｈｅ８７Ｖａｌ、Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎ；又は
ｃ）Ｐｈｅ８７Ｖａｌ、Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎ、Ａｌａ７４Ｇｌｙ
の少なくとも１つを有する、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
調節核酸配列の遺伝的制御下で、請求項１１又は１２のいずれかに定義されるモノオキシゲナーゼをコードする核酸配列を含む少なくとも１つの発現構築物を含むベクター、または少なくとも１つの該ベクターを含む組換え微生物の使用であって、
ａ）置換されていてよいＮ−複素環式、Ｏ−複素環式又はＳ−複素環式の一核又は多核の芳香族化合物；
ｂ）置換されていてよい一核又は多核の芳香族化合物；
ｃ）直鎖状又は分枝鎖状のアルカン及びアルケン；及び／又は
ｄ）置換されていてよいシクロアルカン及びシクロアルケン
の微生物学的な酸化のための上記使用。
【請求項１４】
前記微生物が、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌から選ばれる、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に定義されるインドールを酸化するシトクロムＰ４５０を生産する微生物の、インジゴ及び／又はインジルビンの調製のための使用。
【請求項１６】
請求項１１もしくは１２のいずれかに定義される酵素、または、請求項１３もしくは１４のいずれかに定義される組み換え微生物を固定化された形で含むバイオリアクターであって、使用される該酵素が８７位及び１８８位；または、８７位、１８８位、及び７４位において機能的変異を有する、上記バイオリアクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は有機基質、例えばＮ−複素環式芳香族化合物の酸化を可能にする改変された基質特異性を有する新規のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ、それらをコードするヌクレオチド配列、この配列を有する発現構築物及びベクター、これによって形質転換された微生物、種々の有機基質、例えばＮ−複素環式の芳香族化合物の微生物学的酸化のための方法並びに、特にインジゴ及びインジルビンの製造のための方法に関する。
【０００２】
新規の機能及び特性を有する酵素は天然試料のスクリーニングによるか、公知の酵素のタンパク質工学によっても調製できる。後者の方法は場合によっては、天然の分泌経路においては生じ得ない特性を誘発するために適当な方法であることがある。酵素のエンジニアリングのための多大な苦労にもかかわらず、今までは規定の基質に関する酵素変異体の触媒活性の促進のための研究は殆ど成功が得られなかった（１〜１０）。前記の公知の場合において、その基質は構造的にそれぞれの酵素の本来の基質と密に関連している。今までは、改変によって酵素の本来の基質とは構造的に全く異なる化合物の変換を触媒する酵素のエンジニアリングによる成功の報告はない。
【０００３】
細菌のバシラス メガテリウムから単離されたシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼは通常、長鎖の飽和酸及び相応のアミド及びそのアルコールの末端近くのヒドロキシル化又は不飽和の長鎖脂肪酸又は中鎖長を有する飽和脂肪酸のエポキシ化を触媒する（１１〜１３）。飽和脂肪酸の最適な鎖長は１４〜１６個の炭素原子である。１２未満の鎖長を有する脂肪酸はヒドロキシル化されない（１１）。
【０００４】
Ｐ４５０ ＢＭ−３のヘムドメインの構造は、Ｘ線構造分析によって規定された（１４〜１６）。基質結合部位は長いトンネル状の開口の形で存在し、該開口は分子表面からヘム−分子にまで達し、ほとんど主に疎水性アミノ酸残基によって定義づけられている。ヘムドメインの表面上の唯一の帯電した残基は残基Ａｒｇ４７及びＴｙｒ５１である。これらの残基は水素架橋結合の形成による基質とカルボキシレート基との結合に関与していると考えられている（１４）。Ａｒｇ４７のＧｌｕへの突然変異はアラキドン酸のための酵素の不活性化を引き起こす（１３）が、Ｃ１２〜Ｃ１４−アルキルトリメチルアンモニウム化合物に対する活性は高まる（１７）。芳香族化合物、特に一核、二核又は多核の、場合により複素環式の芳香族化合物、アルカン、アルケン、シクロアルカン及びシクロアルケンのための基質の使用は該酵素に関しては記載されていない。従って、今まではこの専門分野において従来に記載された別の有機基質として、例えばインドールはＰ４５０ ＢＭ−３の本来の基質との明らかな構造的な差異に基づいて、特に前記の残基が基質ポケットに結合できる機能的な基の欠如に基づいて基質ではないと考えられている。
【０００５】
従って本発明の課題は改変された基質特異性又は改変された基質プロフィールを有する新規のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼを広範に調製することである。特に、変異していない野生型の酵素と比較して構造的に明らかに別の基質と酵素活性を有するモノオキシゲナーゼ突然変異体を調製すべきである。
【０００６】
“改変された基質プロフィール”は本発明による突然変異体に関して野生型の酵素と比較して観察されるべきである。それぞれの突然変異体に関しては、特に反応性の改善、例えば特異的活性の増大（ナノモルでの変換される基質／分／ナノモルのＰ４５０−酵素として表される）、及び／又はａ）ないしｄ）の群に定義される酸化可能な化合物の少なくとも１つの変換におけるＫｃａｔ、Ｋｍ及びＫｃａｔ／Ｋｍ（例えば少なくとも１％だけ、例えば１０〜１０００％、１０〜５００％、又は１０〜１００％）から選択される少なくとも１つのキネティックパラメーターの改善が観察される。本発明による酸化反応は少なくとも１つの外生の（すなわち反応媒体に添加される）又は内生の（すなわち反応媒体に既に存在する）有機基質の酵素触媒される酸化を含む。特に本発明による酸化反応は、脂肪族又は芳香族のＣＨ−基のモノヒドロキシル化及び／又はポリヒドロキシル化、例えばモノヒドロキシル化及び／又はジヒドロキシル化、又は有利には非芳香族のＣ＝Ｃ−基のエポキシ化を含む。また前記の反応の組合せも考えられる。直接の反応生成物を更に非酵素的な副反応又は二次反応の範囲において再び変換できる。そのような酵素的及び非酵素的なプロセスの組合せも同様に本発明の対象である。
【０００７】
前記課題は意想外にも、Ｎ−複素環式の二核又は多核の芳香族化合物の酸化を可能にする新規のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼによって解決されることが判明した。
【０００８】
特に本発明の対象は基質結合部位が部位特異的突然変異誘発によって新規の、例えばＮ−複素環式の基質の機能的な受容を可能にするようなモノオキシゲナーゼである。
【０００９】
本発明の有利な実施形においては、新規のモノオキシゲナーゼは可溶性である、すなわち膜に結合していない形で存在し、その形で酵素的に活性である。
【００１０】
本発明によるモノオキシゲナーゼは、有利には細菌起源のシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼに由来し、特に配列番号２によるアミノ酸配列を有し、少なくとも１つの機能的な、すなわち新規の有機基質（特に以下の化合物の群ａ）ないしｄ）を参照のこと）、例えばＮ−複素環式の一核、二核又は多核の芳香族化合物の酸化を促進する突然変異を１７２〜２２４（Ｆ／Ｇ−ループ領域）、３９〜４３（β−ストランド１）、４８〜５２（β−ストランド２）、６７〜７０（β−ストランド３）、３３０〜３３５（β−ストランド５）、３５２〜３５６（β−ストランド８）、７３〜８２（ヘリックス５）及び８６〜８８（ヘリックス６）のアミノ酸配列領域の１つに有するバシラス メガテリウムからのシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼＢＭ−３に由来する。
【００１１】
本発明により調製されるシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ突然変異体は、有利には以下の反応：
ａ）置換されていてよいＮ−複素環式、Ｏ−複素環式又はＳ−複素環式の一核又は多核の芳香族化合物の酸化；
ｂ）置換されていてよい一核又は多核の芳香族化合物の酸化；
ｃ）直鎖状又は分枝鎖状のアルカン及びアルケンの酸化；
ｄ）置換されていてよいシクロアルカン及びシクロアルケンの酸化
の少なくとも１つを可能にする。
【００１２】
有利なモノオキシゲナーゼ突然変異体は、配列領域７３〜８２、８６〜８８及び１７２〜２２４の少なくとも１つに少なくとも１つの機能的突然変異、特にアミノ酸置換を有する。このようにＰｈｅ８７は脂肪族側鎖を有するアミノ酸、例えばＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、特にＶａｌによって置換されていてよく、Ｌｅｕ１８８はアミド側鎖を有するアミノ酸、例えばＡｓｎ又は特にＧｌｎによって置換されていてよく、かつＡｌａ７４は脂肪族側鎖を有する別のアミノ酸、例えばＶａｌ、特にＧｌｙによって置換されていてよい。
【００１３】
前記の型の特に有利なモノオキシゲナーゼ突然変異体は、以下の１つ以上のアミノ酸置換：
ａ）Ｐｈｅ８７Ｖａｌ；
ｂ）Ｐｈｅ８７Ｖａｌ、Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎ；又は
ｃ）Ｐｈｅ８７Ｖａｌ、Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎ、Ａｌａ７４Ｇｌｙ
を有することを特徴とし、並びにそれらの機能的な等価物である。数値はこの場合には突然変異の位置を与え、数値の前で起源のアミノ酸を、数値の後で新規に挿入されたアミノ酸を与えている。
【００１４】
“機能的な等価物”又は具体的に開示された突然変異体の類似体はその関連において、更に前記の酸化反応ａ）ないしｄ）の少なくとも１つの範囲内で、従って例えば複素環式の芳香族化合物に対して所望の基質特異性を有し、かつ例えばインドールをヒドロキシル化するか、又は更に所望の、野生型の酵素に対して“改変された基質プロフィール”を示す種々の突然変異体である。
【００１５】
“機能的な等価物”とは本発明によれば、前記の配列位置の少なくとも１つにおいて、具体的に挙げたアミノ酸置換とは別であるが、それにもかかわらず具体的に挙げた突然変異体と同様に野生型の酵素に対して“改変された基質プロフィール”を示し、前記の酸化反応の少なくとも１つを触媒する突然変異体も意味する。機能的な等価物は、特に基質プロフィールにおける改変が質的に一致している、すなわち例えば同じ基質を種々の速度で変換する場合に見なされている。
【００１６】
“機能的な等価物”は、具体的に挙げたＰ４５０ ＢＭ３突然変異体と同様に別の生物からのＰ４５０酵素の突然変異によって得られるＰ４５０−モノオキシゲナーゼ突然変異体も含む。例えば相同配列領域の配列比較によって規定することができる。最近の分子モデリングの方法によって、本発明の具体的な規定値に依存して等価な反応パターンに影響を及ぼす突然変異を実施できる。
【００１７】
“機能的な等価物”は同様に１つ以上の付加的なアミノ酸付加、アミノ酸置換、アミノ酸欠失及び／又はアミノ酸逆位によって得られる突然変異体も含み、その際、挙げられる付加的な改変は、前記の範囲での改変された基質プロフィールを有する突然変異体に至るかぎりは、それぞれの配列位置において生じうる。
【００１８】
本発明により酸化可能な群ａ）の基質は置換されていてよい複素環式の一核、二核又は多核の芳香族化合物、特定の酸化可能又はヒドロキシル化可能なＮ−複素環式、Ｏ−複素環式又はＳ−複素環式の一核、二核又は多核の芳香族化合物である。これらは、有利には２員又は３員の、特に２員、４員ないし７員の、特に６員又は５員の縮合環を含み、その際、少なくとも１つの、有利には全ての環は芳香族性を有し、その芳香環の少なくとも１つは１〜３個の、有利には１つのＮ−ヘテロ原子、Ｏ−ヘテロ原子又はＳ−ヘテロ原子を環中に有する。全体の環構造中に、場合により１又は２つの更なる同一又は異なるヘテロ原子を有していてよい。芳香族化合物は更に１〜５個の置換基を環−炭素原子又はヘテロ原子に有してよい。適当な置換基のための例は、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル又はｉ−プロピル又はｎ−ブチル、ｉ−ブチル又はｔ−ブチル又はＣ２〜Ｃ４−アルケニル、例えばエテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル又は３−ブテニル、ヒドロキシル及びハロゲン、例えばＦ、Ｃｌ及びＢｒである。前記のアルキル置換基又はアルケニル置換基は、場合によりケト基又はアルデヒド基を有していてよく、このための例はプロパン−２−オン−３−イル、ブタン−２−オン−４−イル、３−ブテン−２−オン−４−イルである。適当な複素環式の基質のための限定されない例は、特に二核の複素環、例えばインドール、Ｎ−メチルインドール及び１〜３個の前記に定義した置換基によって炭素原子で置換されたその類似体、例えば５−クロロ−インドール又は５−ブロモ−インドール、並びにキノリン及びキノリン誘導体、例えば８−メチルキノリン、６−メチルキノリン及びキナルジン、及びベンゾチオフェン及び１〜３個の前記に定義した炭化水素における置換基で置換されたその類似体である。更に三核の複素芳香族は、例えばアクリジン及び１〜３個の前記に定義された置換基によって炭素原子で置換されたその類似体であるとみなされる。
【００１９】
本発明により酸化可能な群ｂ）の基質は、置換されていてよい一核又は多核の、特に一核又は二核の芳香族化合物、例えばベンゼン及びナフタレンである。これらの芳香族化合物は、場合により一置換又は多置換されていてよく、例えば１〜５個の置換基を環−炭素原子に有していてよい。適当な置換基のための例はＣ１〜Ｃ４−アルキル、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル又はｉ−プロピル又はｎ−ブチル、ｉ−ブチル又はｔ−ブチル、又はＣ２〜Ｃ４−アルケニル、例えばエテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル又は３−ブテニル、ヒドロキシル及びハロゲン、例えばＦ、Ｃｌ、及びＢｒである。前記のアルキル置換基又はアルケニル置換基は、場合によりケト基又はアルデヒド基を有していてよく、そのための例は、プロパン−２−オン−３−イル、ブタン−２−オン−４−イル、３−ブテン−２−オン−４−イルである。この芳香族化合物は、場合により４員ないし７員の、非芳香族環と縮合していてよい。非芳香族環は場合により１又は２個のＣ＝Ｃ−二重結合を有してよく、前記の置換基で一置換又は多置換されていてよく、かつ場合により１又は２個の環ヘテロ原子を有していてよい。特に使用可能な芳香族化合物のための例は一核の芳香族化合物、例えばクメン並びに二核の置換基、例えばインデン及びナフタレン、並びに１又は３個の前記に定義した置換基によって炭素原子において置換されたその類似体である。
【００２０】
本発明により酸化可能な群ｃ）の置換基は、４〜１５個の、有利には６〜１２個の炭素原子を有する直鎖状又は分枝鎖状のアルカン又はアルケンである。例としては、ｎ−ブタン、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン、ｎ−オクタン、ｎ−ノナン、ｎ−デカン、ｎ−ウンデカン及びｎ−ドデカン、並びに前記の化合物の１回以上分枝した類似体、例えば１〜３個のメチル側基を有する類似の化合物、又は前記のアルカンの一不飽和以上、例えば一不飽和の類似体である。
【００２１】
本発明により酸化可能な群ｄ）の基質は、置換されていてよい４〜８個の環−Ｃ−原子を有するシクロアルカン及びシクロアルケンである。このための例は、シクロペンタン、シクロペンテン、シクロヘキサン、シクロヘキセン、シクロヘプタン及びシクロヘプテンである。環構造は、この場合群ａ）及びｂ）の化合物に関しての前記の定義のような１つ以上、例えば１〜５個の置換基を有してよい。このための限定されない例は、イオノン、例えばα−イオノン、β−イオノン及びγ−イオノン、並びに相応のメチルイオノン及びイソメチルイオノンである。α−イオノン及びβ−イオノンが特に有利である。
【００２２】
本発明の対象は、本発明によるモノオキシゲナーゼをコードする核酸配列である。有利な核酸配列は配列番号１に由来し、これらは前記の官能性アミノ酸突然変異に導く少なくとも１つの核酸置換を有する。更に本発明の対象は単一又は複数のヌクレオチドの付加、置換、挿入及び／又は欠失によって得られる核酸の機能的類似体であり、これらは更に所望の基質特異性、例えばインドール酸化活性を有するモノオキシダーゼをコードする。
【００２３】
本発明によれば、いわゆるサイレント突然変異を有するか、又は特定の起源生物又は宿主生物のコドン利用に相応して具体的に挙げられた配列と比較して改変されているような核酸と同様に天然に存在するその突然変異体も含まれる。本発明によれば更に遺伝子的なコドンの縮重（すなわち一致するアミノ酸配列の変更なく）又は保存的核酸置換（すなわち一致するアミノ酸は同じ荷電、サイズ、極性及び／又は溶解度の他のアミノ酸によって置換される）によって得られる核酸配列の変更と同様にヌクレオチド付加、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド逆位又はヌクレオチド欠失によって改変された、“改変された基質プロフィール”を有する本発明によるモノオキシゲナーゼをコードする配列並びに相応の相補配列も含まれる。
【００２４】
更に本発明の対象は調節核酸配列の遺伝子的コントロール下に少なくとも１つの、本発明による突然変異体をコードする核酸配列を含む発現構築物並びにこれらの発現構築物の少なくとも１つを含むベクターである。
【００２５】
有利には本発明による構築物はそれぞれのコーディング配列の５′−上流にプロモーターを、かつ３′下流にターミネーター配列、場合により他の慣用の調節エレメントを有し、特にそれぞれはコーディング配列と構成的に結合している。構成的な結合とはプロモーター、コーディング配列、ターミネーター及び場合により他の調節エレメントの配列的な配置が、調節エレメントのそれぞれがその機能をコーディング配列の発現において規定のように満たすことができることを意味する。構成的に結合可能な配列のための例は、ターゲティング配列並びに翻訳強化因子、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどである。他の調節エレメントは選択可能なマーカー、増幅シグナル、複製起点などである。
【００２６】
人工的な調節配列の他に、天然の調節配列を本来の構造遺伝子の前になおも存在していてよい。遺伝子的変更によって、この天然の調節を場合によりオフにし、かつ遺伝子の発現を増大又は低下させてもよい。しかしながら、該遺伝子構築物は容易に合成できる、つまり付加的な調節シグナルは構造遺伝子の前に挿入されず、その調節を有する天然のプロモーターを排除しない。その代わりに、天然の調節配列はもはや調節を行わず、かつ遺伝子発現を増大又は低下させるように突然変異させる。核酸配列は、遺伝子構築物に１つ以上のコピーで含まれていてよい。
【００２７】
使用可能なプロモーターのための例は：ｃｏｓ−プロモーター、ｔａｃ−プロモーター、ｔｒｐ−プロモーター、ｔｅｔ−プロモーター、ｔｒｐ−ｔｅｔ−プロモーター、ｌｐｐ−プロモーター、ｌａｃ−プロモーター、ｌｐｐ−ｌａｃ−プロモーター、ｌａｃＩｑ−プロモーター、Ｔ７−プロモーター、Ｔ５−プロモーター、Ｔ３−プロモーター、ｇａｌ−プロモーター、ｔｒｃ−プロモーター、ａｒａ−プロモーター、ＳＰ６−プロモーター、ｌ−ＲＰ−プロモーター又はｌ−ＰＬ（これらは有利にはグラム陰性細菌で使用が見受けられる）並びにグラム陽性プロモーターのａｍｙ及びＳＰＯ２、酵母プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ又は植物プロモーターのＣａＭＶ／３５Ｓ、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ｌｉｂ４、ｕｓｐ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ｎｏｓ又はユビキチンプロモーター又はファゼオリンプロモーターである。特に有利には、誘導可能なプロモーター、例えば光、特に温度で誘導可能なプロモーター、例えばＰｒＰｌ−プロモーターの使用である。
【００２８】
原則的に、それらの調節配列を有する全ての天然プロモーターを使用できる。また更に合成プロモーターを有利に使用できる。
【００２９】
挙げられたレギュレーター的な配列は、核酸配列の意図的な発現及びタンパク質発現を可能にすべきである。このことは、例えば宿主生物に応じて、遺伝子が誘導の後に発現又は過剰発現されるか、又は直ちに発現及び／又は過剰発現されることを意味している。
【００３０】
レギュレーター的な配列もしくは因子は、この場合、有利には発現にポジティブな影響を及ぼし、かつそれによって発現は増大又は低下される。このようにレギュレーター的なエレメントの強化は有利には転写レベルで、強力な転写シグナル、例えばプロモーター及び／又は“エンハンサー”を使用することによって実施する。その他に、しかしながら転写の強化を、例えばｍＲＮＡの安定性を改善することによっても可能である。
【００３１】
発現カセットの製造は、適当なプロモーターと適当なモノオキシゲナーゼ−ヌクレオチド配列並びにターミネーター又はポリアデニル化シグナルの融合によって実施する。このために、T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring harbor Laboratory, Cold Spring Habor, NY(1989) 並びに T.J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Gusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1984) 及び Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience(1987) に記載されているような通常の組み換え技術及びクローニング技術を使用する。
【００３２】
組み換え核酸構築物もしくは遺伝子構築物は、適当な宿主生物における発現のために、有利には宿主中で最適な遺伝子発現を可能にする宿主特異的なベクターに挿入する。これらのベクターは当業者によく知られており、例えば“クローニングベクター”（Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985）から引用できる。ベクターとは、プラスミドの他にファージ、ウイルス、例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、バキュウロウイルス及びアデノウイルス、トランスポゾン、ＩＳ−エレメント、ファズミド、コスミド及び直鎖状のＤＮＡ又は環状のＤＮＡのような当業者に公知の全ての別のベクターを意味する。これらのベクターは宿主生物中で自律的に複製され、又は染色体により複製されうる。
【００３３】
本発明によるベクターを使用して、例えば少なくとも１つの本発明よるベクターで形質転換され、突然変異体の作成のために使用できる組み換え微生物を製造できる。有利には前記の本発明による組み換え構築物を適当な宿主系に導入し、発現させる。この場合、有利には当業者に公知のよく知られたクローニング法及びトランスフェクション法を使用して、前記の核酸をそれぞれの発現系に発現のために導入する。適当な系は、例えばMolecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997の最近のプロトコールに記載されている。
【００３４】
宿主生物として、原則的に本発明による核酸、それらのアレル変異体、それらの機能的な等価物又は誘導体の発現を可能にする全ての生物である。宿主生物とは、例えば細菌、菌類、酵母、植物細胞又は動物細胞を意味するべきである。有利な生物は、微生物、例えば属エシェリキア、例えばエシェリキア コリ、ストレプトマイセス、バシラス又はシュードモナス、真核の微生物、例えばサッカロマイセス セレビシエ、アスペルギルス、より高等な動物又は植物からの真核細胞、例えばＳｆ９又はＣＨＯ細胞である。
【００３５】
所望であれば、遺伝子構築物はトランスジェニック生物、例えばトランスジェニック動物、例えばマウス、ヒツジ又はトランスジェニック植物において発現させてもよい。トランスジェニック生物は、いわゆるノックアウト動物又は植物であり、これらにおいては該当する内在性の遺伝子を、例えば突然変異又は部分的もしくは完全な欠失によってオフにしている。
【００３６】
効果的に形質転換された生物の選択は同様にベクター又は発現カセット中に含まれているマーカー遺伝子によって実施できる。かかるマーカー遺伝子のための例は抗生物質耐性及び形質転換された細胞の着色に作用する呈色反応を触媒する酵素のための遺伝子である。これらはその際、自動的な細胞選別によって実施できる。効果的にベクターで形質転換された、相応の抗生物質耐性遺伝子（例えばＧ４１８又はハイグロマイシン）を有する微生物は相応の抗生物質含有培地又は培養基によって選択できる。細胞表面に現れるマーカータンパク質はアフィニティークロマトグラフィーによる選択のために使用できる。
【００３７】
宿主生物及びその生物に適当なベクター、例えばプラスミド、ウイルス又はファージ、例えばＲＮＡ−ポリメラーゼ／プロモーター系、ファージλ、μ又は別の溶原ファージ又はトランスポゾン及び／又は他の有利なレギュレーター的な配列からなる組合せは発現系を形成する。例えば、概念“発現系”とはホニュウ類細胞、例えばＣＨＯ細胞及びホニュウ類細胞に適当なベクター、例えばｐｃＤＮＡ３ｎｅｏベクターからなる組合せを意味する。
【００３８】
前記のように、遺伝子産物は有利にはトランスジェニック動物、例えばマウス、ヒツジ又はトランスジェニック植物において発現される。同様に、核酸に由来するＲＮＡを有する細胞不含の転写系を計画することができる。
【００３９】
本発明の対象は、更に本発明のモノオキシゲナーゼを、モノオキシゲナーゼ産生微生物を培養し、場合によりモノオキシゲナーゼの発現を誘導し、かつモノオキシゲナーゼを培養から単離して製造するための方法である。本発明によるモノオキシゲナーゼは、所望であれば大工業的な規模で製造できる。
【００４０】
微生物は、公知の方法で培養及び発酵させることができる。細菌は、例えばＴＢ培地又はＬＢ培地中で、温度２０〜４０℃、ｐＨ値６〜９で増殖させることができる。詳細には適当な培養条件は、例えばT. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1989)に記載されている。
【００４１】
これらの細胞は、モノオキシゲナーゼを培養培地中で分泌しない場合には、溶解され、モノオキシゲナーゼは公知のタンパク質単離法によって溶解物から得られる。これらの細胞は選択的に高周波の超音波によって、高圧によって、例えばフレンチプレスセル中で、浸透圧溶解（Osmolyse）によって、デタージェント、溶解酵素又は有機溶剤の作用によって、ホモジェネーターによって、又は挙げられた複数の方法の組合せによって溶解させることができる。モノオキシゲナーゼの精製は公知のクロマトグラフィー法、例えばモレキュラーシーブ−クロマトグラフィー（ゲル濾過）、例えばＱ−セファロース−クロマトグラフィー、イオン交換−クロマトグラフィー及び疎水性クロマトグラフィー並びに別の通常の方法、例えば限外濾過、結晶化、塩析、透析及び本来のゲル電気泳動によって達成できる。適当な方法は、例えばCooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York又はScopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlinに記載されている。
【００４２】
特に有利には、組み換えタンパク質の単離のために、ｃＤＮＡを規定のヌクレオチド配列に関して伸張させ、それによって改変された容易な精製のために役立つポリペプチド又は融合タンパク質をコードするベクター系又はオリゴヌクレオチドを使用する。そのような適当な改変は、例えばアンカーとしての役割を果たすいわゆる“タグ”、例えばヘキサ−ヒスチジン−アンカーとして公知の改変又は抗体の抗原として認識できるエピトープ（例えばHarlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N. Y.) Pressに記載されている）である。これらのアンカーは、タンパク質の固体担体、例えばポリマーマトリクスへの付着のために役立ち、これは例えばクロマトグラフィーカラム中に充填できるか、又はマイクロタイタープレートもしくは通常の支持体上で使用できる。
【００４３】
同時にこれらのアンカーはタンパク質の認識のために使用できる。タンパク質の認識のために、更に通常のマーカー、例えば蛍光色素、基質との反応の後に検出可能な反応生成物を形成する酵素マーカー又は放射性マーカーを単独又はタンパク質の誘導体化のためのアンカーと組み合わせて使用できる。
【００４４】
本発明は、更に有機化合物、例えば前記の定義のようなＮ−複素環式の一核、二核又は多核の芳香族化合物の微生物的な酸化のための方法において、
ａ１）前記の定義のような組み換え微生物を培養培地中で外生の（外部から添加された）又は中間形成する本発明によるモノオキシゲナーゼにより酸化可能な基質の存在下に、有利には酸素（すなわち好気的）の存在下に培養するか、又は
ａ２）基質を有する反応媒体を本発明による酵素で、有利には酸素及び電子供与体の存在下にインキュベートし、かつ
ｂ）形成した酸化生成物又はその副生成物を培地から単離する
ことを特徴とする方法に関する。
【００４５】
変換のために必要な酸素は、周囲空気から反応媒体中に獲得されるか、又は必要であれば自体公知の方法で添加できる。
【００４６】
有利には酸化可能な基質は、
ａ）置換されていてよいＮ−複素環式の一核、二核又は多核の芳香族化合物、
ｂ）置換されていてよい一核又は多核の芳香族化合物、
ｃ）直鎖状又は分枝鎖状のアルカン及びアルケン；
ｄ）置換されていてよいシクロアルカン及びシクロアルケン
から選択される。
【００４７】
有利な変法は、インジゴ／インジルビンの形成に向けられ、これは基質が培地中で中間形成したインドールであり、培養培地から生じる、中間形成したヒドロキシインドールの酸化によって生産され生じるインジゴ及び／又はインジルビンを単離することを特徴としている。
【００４８】
本発明による酸化を組み換え微生物によって実施するのであれば、有利にはまず微生物の培養を酸素及び天然培地、例えばＴＢ培地又はＬＢ培地の存在下に約２０〜４０℃の培養温度及び約６〜９のｐＨ値において、十分な細胞密度が達成されるまで実施する。外生のインドールの添加は通常は必要ない。それというのもこれは微生物によって中間形成されるからである。別の基質の変換においては、それに対して外生の基質の添加を必要とすることがある。酸化反応をより良好に制御するために、有利には誘導可能な、特に温度誘導可能なプロモーターが使用される。この場合に、温度を必要な誘導温度、例えばＰｒＰｌプロモーターでは４２℃に高め、これを十分な時間にわたり、例えば１〜１０又は５〜６時間の間、モノオキシゲナーゼ活性の発現のために保持し、引き続き温度を約３０〜４０℃の値に再び低下させる。培養は、酸素の存在下に１２時間〜３日間継続する。特にインドール−酸化の場合にはｐＨ値はＮａＯＨの添加によって、例えば９〜１０に高め、それによってインジゴ形成もしくはインジルビン形成を酵素によって形成した酸化生成物である２−ヒドロキシインドール及び３−ヒドロキシインドールの空気酸化を付加的に必要とする。
【００４９】
本発明によるインジゴ／インジルビン形成を以下の反応式によって具体的に示す：
【００５０】
【化１】
0004791664.tif 000002
【００５１】
本発明による酸化をそれに対して精製された又は濃縮された酵素変異体によって実施するのであれば、本発明による酵素は外生の基質を含む、例えばインドールを含む培地（約０．０１〜１０ｍＭ、又は０．０５〜５ｍＭ）中に溶解し、変換を、有利には酸素の存在下に、約１０〜５０℃、例えば３０〜４０℃の温度及び約６〜９（例えば１００〜２００ｍＭのリン酸バッファー又はトリスバッファーによって調整する）のｐＨ値において、かつ還元剤の存在下に実施し、その際基質含有培地を更に酸化されるべき基質に対して約１〜１００倍、又は１０〜１００倍の還元当量のモル過剰で含有する。有利な還元剤はＮＡＤＰＨである。還元剤の添加は必要であれば少しずつ実施してよい。
【００５２】
類似のように、酸化可能な基質として有利には、ｎ−ヘキサン、ｎ−オクタン、ｎ−デカン、ｎ−ドデカン、クメン、１−メチルインドール、５−Ｃｌ−インドール又は５−Ｂｒ−インドール、インデン、ベンゾチオフェン、α−イオノン、β−イオノン及びγ−イオノン、アクリジン、ナフタレン、６−メチルキノリン又は８−メチルキノリン、キノリン及びキナルジンが使用される。
【００５３】
例えば本発明による酵素酸化反応は以下の条件下に実施できる：
基質濃度：０．０１〜２０ｍＭ
酵素濃度：０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ
反応温度：１０〜５０℃
ｐＨ：６〜８
バッファー：０．０５〜０．２Ｍのリン酸カリウム又はトリス／ＨＣｌ
電子供与体：これを少しずつ添加する（出発濃度は約０．１〜２ｍｇ／ｍｌ）
例えば電子供与体（例えばＮＡＤＰＨ）の添加による反応の開始の前に、短時間（１〜５分間）、前インキュベートしてよい（約２０〜４０℃で）。この変換は好気的に実施し、場合により付加的な酸素の導入において実施する。
【００５４】
本発明による基質酸化プロセスにおいては、反応培地に含有する、又は添加される酸素を還元的に酵素により分解する。必要な還元当量は、添加される還元剤（電子供与体）から提供される。
【００５５】
形成された酸化生成物は、通常の方法で、例えば抽出又はクロマトグラフィーによって培地から分離及び精製できる。
【００５６】
本発明の他の対象は、本発明による酵素又は本発明による組み換え微生物を固定された形で含有するバイオリアクターに関する。
【００５７】
本発明の最後の対象は、本発明によるシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼ又は本発明によるベクター又は微生物を群ａ）ないしｄ）からの基質、特にＮ−複素環式の一核、二核又は多核の芳香族化合物の微生物的な酸化のため、並びに有利にはインジゴ及び／又はインジルビンの形成のために使用することに関する。
【００５８】
本発明をなおも以下の実施例に関してより詳細に記載する。
【００５９】
例１：Ｐ４５０ ＢＭ−３の特定のコドンの無作為化
この実験は実質的に（１９）に記載のように実施した。３つの位置（Ｐｈｅ８７、Ｌｅｕ１８８及びＡｌａ７４）は部位特異的突然変異誘発を使用してストラタジーンのＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキット（La Jolla, CA, USA）の使用下に無作為化した。以下のＰＣＲプライマーを個々の位置に関して使用した：
Ｐｈｅ８７：
５′−ｇｃａｇｇａｇａｃｇｇｇｔｔｇｎｎｎａｃａａｇｃｔｇｇａｃｇ−３′（配列番号３）、
５′−ｃｇｔｃｃａｇｃｔｔｇｔｎｎｎｃａａｃｃｃｇｔｃｔｃｃｔｇｃ−３′（配列番号４）
Ｌｅｕ１８８：
５′−ｇａａｇｃａａｔｇａａｃａａｇｎｎｎｃａｇｃｇａｇｃａａａｔｃｃａｇ−３′（配列番号５）、
５′−ｃｔｇｇａｔｔｔｇｃｔｃｇｃｔｇｎｎｎｃｔｔｇｔｔｃａｔｔｇｃｔｔｃ−３′（配列番号６）、
Ａｌａ７４：
５′−ｇｃｔｔｔｇａｔａａａａａｃｔｔａａａｇｔｃａａｎｎｎｃｔｔａａａｔｔｔｇｔａｃｇ−３′（配列番号７）、
５′−ｃｇｔａｃａａａｔｔｔａａｇｎｎｎｔｔｇａｃｔｔａａｇｔｔｔｔｔａｔｃａａａｇｃ−３′（配列番号８）
ＰＣＲのための条件は全ての３つの位置に関して同一であった。特に、５０μｌの反応容量あたり１７．５ピコモルのそれぞれのプライマー、２０ピコモルのテンプレートプラスミドＤＮＡ、３ＵのＰｆｕポリメラーゼ及び３．２５ナノモルのそれぞれのｄＮＴＰを使用した。ＰＣＲ反応は９４℃／１分間で開始し、次いで以下の温度サイクルを２０回実施した：９４℃  １分間；４６℃  ２．５分間；７２℃  １７分間。２０サイクルの後に、反応を７２℃で１５分間継続した。ＰＣＲの後に、テンプレートＤＮＡを２０ＵのＤｐｎＩで３７℃において３時間消化した。引き続きＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞を１５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢアガープレート上にプレーティングした。引き続き３７℃で１８時間インキュベートした。
【００６０】
例２：
Ｐ４５０ ＢＭ−３の発現及び精製並びにその突然変異体及び青色顔料の製造
Ｐ４５０ ＢＭ−３遺伝子及びその突然変異体を強力な温度誘導可能なプラスミドｐＣＹＴＥＸＰ１のプロモーターＰＲＰＬ−プロモーターのコントロール下にＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αで既に記載したように（２０）発現させた。コロニーを滅菌ようじで採取し、それぞれの窪みに２００μｌのＴＢ培地及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する９６個の窪みを有するマイクロタイタープレートに移した。引き続き３７℃でオーバーナイトでインキュベートした。それぞれの窪みの細胞培養の４０μｌを引き続き、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを有する２ｍｌのＴＢ培地を含有する培養チューブに移した。引き続き３７℃で２時間培養した。次いで温度を誘導のために６時間４２℃に高めた。次いで培養を３７℃でオーバーナイトで継続し、その際、青色顔料が製造された。
【００６１】
酵素又は青色顔料の調製用の製造を３００ｍｌの細胞培養（ＯＤ５７８ｎｍ＝０．８〜１．０）から出発して実施した。酵素の単離のために、細胞を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、０．１ＭのＫｘＰＯ４バッファー（ｐＨ７．４）中に再懸濁した。氷冷した細胞をＢｒａｎｓｏｎの超音波発生器Ｗ２５（Dietzenbach, Deutschland）を使用して８０Ｗのエネルギー出力において２分間の超音波負荷を３回実施することによって慎重に溶解させた。懸濁液を３２５７０×ｇで２０分間遠心分離した。粗抽出物を活性測定もしくは酵素精製のために使用した。酵素精製は、（２１）に既に記載したように実施し、これをもって引用されたものとする。精製された酵素の濃度を、４５０及び４９０ｎｍでの吸光度の差異によって、（１１）で既に記載したように９１ｍＭ-１ｃｍ-１の吸光係数εの使用下に測定した。
【００６２】
例３：
大量の青色顔料を製造する突然変異体の単離
それぞれ１００個のコロニーをそれぞれの位置の、相応の位置のコドンのランダム突然変異誘発によって生じた突然変異体から単離した。これらのコロニーを培養チューブ中で青色顔料の製造のために培養した。細胞を水で洗浄して、緩慢な遠心分離工程（５００ｒｐｍ）を複数回行った後に、青色顔料をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で抽出した。青色顔料の溶解度はＤＭＳＯ中で最も高かった。抽出物の吸光は６７７ｎｍで測定した。規定の位置の全ての突然変異体によって青色顔料を大量に製造するそれぞれの突然変異体をＤＮＡ配列決定（ＡＢＩ ＤＮＡシーケンシング−キット；ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ３７７ ＤＮＡシーケンサー）のために使用し、更に部位特異的なランダム突然変異誘発のためのテンプレートとして使用した。
【００６３】
例４：
インドール−ヒドロキシル化のための活性試験
インドール−ヒドロキシル化活性をＤＭＳＯ中の１０〜５００ｍＭのインドール溶液８μｌ、８５０μｌのトリス−ＨＣｌバッファー（０．１Ｍ、ｐＨ８．２）及び０．６ナノモルのＰ４５０ ＢＭ−３野生型又は突然変異体を１ｍｌの最終容量で含有する溶液中で試験した。この混合物を９分間、前インキュベートし、次いで反応を５０μｌのＮＡＤＰＨの１ｍＭ水溶液の添加によって開始させた。反応を２０秒後に６０μｌの１．２ＭのＫＯＨの添加によって停止させた。５〜３０秒（好気的条件下に）以内に、酵素生成物は完全にインジゴ（［Δ２，２′−ビインドリン］−３，３′−ジオン）及びインジルビン（［Δ２，３′−ビインドリン］−２′，３−ジオン）に変換された。インジゴ生成をその６７０ｎｍでの吸光によって測定した。純粋なインジゴによる検定曲線は３．９ｍＭ-１ｃｍ-１の吸光係数を波長で示した。インジゴ生成に関して４０秒の反応時間で０．６ナノモルの野生型もしくはＰ４５０ ＢＭ−３突然変異体及び０．０５〜５．０ｍＭのインドールの使用下に線形の曲線経過が得られた。インジルビンは６７０ｎｍで弱い吸光を示し、形成されたインジルビン量は形成されたインジゴ量よりもかなり低かった。インジルビンの形成は、キネティックパラメーターの測定において無視した。ＮＡＤＰＨ消費は３４０ｎｍで測定し、６．２ｍＭ-１ｃｍ-１の吸光係数を使用して（１７）のようにして計算した。
【００６４】
例５：
インジゴ及びインジルビンの精製
細胞を水で洗浄し、繰り返し５００ｇで遠心分離した後に、形成された青色ペレットをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）で抽出した。抽出物をほぼ乾燥するまで蒸発させ、赤色顔料を５０ｍｌの無水エタノールで複数回抽出した。残留する青色の固体をＴＨＦ中に溶解させ、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって分析した。エタノール溶液を蒸発させ、シリカゲルクロマトグラフィー（DC 60, Merck, Darmstadt, Deutschland;２ｃｍ×３０ｃｍ）によって精製し、次いでこれらをＴＨＦ及び石油エーテルによって１：２の比で洗浄した。得られた赤色溶液を蒸発させ、その純度をＴＬＣによって測定した。青色及び赤色の顔料の吸収スペクトルをＵｌｔｒａｓｐｅｃ３０００分光光度計（ファルマシア、Uppsala, Sweden）を使用して４００〜８００ｎｍの範囲内で測定した。更に青色及び赤色の色素を質量分析計及び１Ｈ−ＮＭＲ分光器によって分析した。
【００６５】
実験結果
１．Ｐ４５０ ＢＭ−３突然変異誘発による青色顔料についての生産性の向上
ネイティブのＰ４５０ ＢＭ−３は青色のインジゴ含有顔料もしくは２−ヒドロキシインドールもしくは３−ヒドロキシインドールの前駆物質の製造のための能力を有さない。十分な量の青色顔料を製造しうるために、Ｐ４５０ ＢＭ３を意図的な進化（Evolution）に曝した。青色顔料を製造する全ての突然変異体の配列決定を実施した。以下の３つの位置の少なくとも１つに突然変異を有することが保証された：Ｐｈｅ８７、Ｌｅｕ１８８及びＡｌａ７４。従ってこれらの３つの位置が青色顔料の製造においてＰ４５０ ＢＭ−３の活性に役割を果たすことが想定される。パルミトレイン酸と錯形成したシトクロム−Ｐ４５０−ＢＭ３のヘムドメイン構造から、Ｐｈｅ８７がヘム基における基質の接近を妨げることが解った（１４）。突然変異体Ｐｈｅ８７Ｖａｌは（１４Ｓ，１５Ｒ）アラキドン酸（１３）のエポキシ化における高いレジオ選択性及び立体選択性を示し、突然変異体Ｐｈｅ８７Ａｌａはヒドロキシル化位置ω−１、ω−２及びω−３をシフトさせる（２２）。位置８７は従ってＰＣＲによる部位特異的なランダム突然変異誘発のための最初の位置として選択される。チューブ培養において、僅かな量の青色顔料が誘導の後に生じる７個のコロニーが得られた。最も大量の青色顔料を産生するコロニーをＤＮＡ配列決定のために選択した。配列データからＰｈｅ８７のＶａｌによる置換が判明した。突然変異体Ｐｈｅ８７Ｖａｌを引き続き位置Ｌｅｕ１８８での第２のサイクルの部位特異的なランダム突然変異誘発のためのテンプレートとして使用した。パルミトレイン酸と錯形成したヘムドメインの構造は、Ｆ−ヘリックス及びＧ−ヘリックスの再配置が残基Ｌｅｕ１８８を基質と直接接触させることを示している（１４）。この位置は従って基質結合又は基質配向において重要な役割を果たすことがある。第２のスクリーニング過程の後に、青色顔料を産生する３１個のクローンが観察された。最も大量の顔料を産生する突然変異体は置換Ｐｈｅ８７Ｖａｌ及びＬｅｕ１８８Ｇｌｎを有する。この突然変異体を引き続き位置Ａｌａ７４において第３の部位特異的なランダム突然変異誘発の過程で突然変異させた。この場合、複数ｍｇの青色顔料を３００ｍｌのＴＢ培地を含有する２リットルのフラスコ中で産生する３重の突然変異体Ｆ８７Ｌ１８８Ａ７４（Ｐｈｅ８７Ｖａｌ、Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎ及びＡｌａ７４Ｇｌｙ）が得られた。この量は青色顔料の単離及び特徴付けのために十分である。
【００６６】
２．青色顔料の単離及び同定
細胞の洗浄の後に、残留した青色のペレットをＴＨＦで抽出し、ＴＬＣ分析した。青色顔料は迅速に移動する青色成分と緩慢に移動する赤色顔料に分離された。両者の成分は市販のインジゴ試料の成分と全く同じ移動度パラメーターを示した。
【００６７】
精製の後に、両者の成分のＤＭＳＯ中での吸収スペクトルを測定した。この青色成分は市販のインジゴ試料と同じスペクトルを示した。精製された青色及び赤色の成分をそれぞれ質量分析によって分析した。両者の顔料の質量スペクトルはｍ／ｚ＝２６２での強力な分子イオンピーク及び２つのｍ／ｚ＝２３４及び２０５での２つの断片ピーク（相対強度  それぞれ１０％）を示す。このパターンはインジゴイド化合物に典型的である。これらのイオンの元素組成は高分解能の質量分析器によってＣ１６Ｈ１０Ｎ２Ｏ２、Ｃ１５Ｈ１０Ｎ２ＯもしくはＣ１４Ｈ９Ｎ２と測定された。これはインジゴ型の構造に関して同様に特徴的である。従って青色顔料はインジゴとして、かつ赤色顔料はインジルビンとして規定された。構造の確認のために両者の顔料の５００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルをＤＭＳＯ−Ｄ６−溶液において実施した。結果は文献のデータ（２３）と一致した。
【００６８】
３．単離された酵素によるインジゴの製造
インジゴが微生物の形質転換によって得られることは公知である（２４〜２６）。しかしながらこれらの微生物系のいずれもＰ４５０モノオキシゲナーゼを有さない。本発明によればまずインドールのための精製酵素の触媒活性を測定した。突然変異体Ｆ８７Ｌ１８８Ａ７４をインドールと混合した。いかなる呈色反応も観察されなかった。反応混合物にＮＡＤＰＨを添加した後に初めて約２０分後に青色顔料が形成された。反応混合物のｐＨ値をＮＡＤＰＨの添加の３０秒後に約１１に調整することによって、数秒以内に青色の着色が見られる。ネイティブのＰ４５０ ＢＭ−３を使用するコントロール試験は、酵素、インドール及びＮＡＤＰＨの高められた濃度の使用下でさえも常に陰性であった。青色顔料を酢酸エチルで抽出し、ＴＬＣによって分析した。青色顔料を迅速に移動する青色成分と緩慢に移動する赤色成分に分離した。Ｒｆ値及び吸収スペクトルは発酵ブロスからの抽出物の値と同じであった。Ｐ４５０ ＢＭ−３のＦ８７Ｌ１８８Ａ７４突然変異体は従ってインドールヒドロキシラーゼである。
【００６９】
今まではインドールのインジゴへの酵素による転換は２つの過程が述べられてきた。一方の過程はジオキシゲナーゼによって、他方ではスチレンモノオキシゲナーゼによって触媒される（２４，２５）。ＮＡＤＰＨ化学量論比は両者の場合において２である。従ってジオキシゲナーゼに対して本発明による突然変異体Ｆ８７Ｌ１８８Ａ７４はインドールを１つだけの位置でヒドロキシル化して、オキシインドール（２−ヒドロキシインドール）又はインドキシル（３−ヒドロキシインドール）を形成すると想定される。
【００７０】
４．インドールヒドロキシル化のキネティックパラメーター
野生型酵素Ｐ４５０ ＢＭ−３及び突然変異体Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎ、Ｐｈｅ８７Ｖａｌ、Ｆ８７Ｌ１８８及びＦ８７Ｌ１８８Ａ７４の純粋な試料をインドールヒドロキシル化のキネティックパラメーターの測定のために使用した。結果を以下の第１表にまとめる。
【００７１】
第１表：インドール−ヒドロキシル化のためのＰ４５０ ＢＭ−３突然変異体のキネティックパラメーター
【００７２】
【表１】
0004791664.tif 000003
【００７３】
過剰の精製酵素及び高められたインドール濃度でさえも、野生型はインドールを酸化できない。突然変異体Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎは僅かな活性を示している。突然変異体Ｐｈｅ８７Ｖａｌは１１９Ｍ-１ｓ-１のインドールヒドロキシル化のための触媒作用を示している。２重の突然変異体Ｆ８７Ｌ１８８（Ｐｈｅ８７Ｖａｌ、Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎ）の触媒効率は５４３Ｍ-１ｓ-１に高まり、更なる置換Ａｌａ７４Ｇｌｙの導入によって１３６５Ｍ-１ｓ-１に高まった。Ｋｃａｔ値はＰｈｅ８７Ｖａｌから３重の突然変異体に向かって全体で３５％だけ高まり、一方でＫｍ値は約７倍だけ減少した。このことは、Ａｌａ７４Ｇｌｙ及びＬｅｕ１８８Ｇｌｎが主に基質結合に関与していることを示している。
【００７４】
インドール−転換速度（Ｋｃａｔ＝２．７３ｓ-１）は３重の突然変異体Ｆ８７Ｌ１８８Ａ７４に関しては少なくともＰ４５０−酵素よりも１０倍以上高かった（１８）。
【００７５】
例６：
改変されたシトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼによるｎ−オクタンヒドロキシル化
これらの変換は以下の突然変異を有するＰ４５０ ＢＭ−３−モノオキシゲナーゼ突然変異体によって実施した：Ｐｈｅ８７Ｖａｌ  Ｌｅｕ１８８Ｇｌｎ  Ａｌａ７４Ｇｌｙ。
【００７６】
基質としてはｎ−オクタンを選択した。ｎ−オクタンのヒドロキシル化のために、以下の好気的な反応バッチを使用した：
Ｐ４５０ ＢＭ−３突然変異体：    １７．５ｍｇ（凍結乾燥物）
反応バッファー：    ９．１ｍｌ（リン酸カリウムバッファー  ５０ｍＭ、ｐＨ７．５）
基質：    ６０ｍＭの溶液（アセトン中）の５０μｌ
温度：    ２５℃
酵素凍結乾燥物を５００μｌの反応バッファー中に溶解し、まず基質及び反応バッファーを一緒に室温で５分間インキュベートした。引き続き３００μｌのＮＡＤＰＨ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）の添加を実施した。ＮＡＤＰＨの添加を更に２回繰り返した。反応の進行を３４０ｎｍの吸収測定によって追跡し、その際、ＮＡＤＰＨの低下が観察されることがある。その場合、ＮＡＤＰＨを３００μｌずつ添加する。それというのも反応溶液中での高すぎるＮＡＤＰＨ濃度は酵素の不活性化を導くからである。生成物の単離のために、引き続き反応溶液を５ｍｌのジエチルエーテルで３回抽出した。合した有機相をＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。引き続き生成物をＤＣ、ＧＣ／ＭＳ及びＮＭＲによって特徴付けした。
【００７７】
反応混合物のＧＣ／ＭＳ分析によって以下の結果が得られた：
化合物                      Ｒｔ［分］１）                  変換率［％］
４−オクタノール              １３．５１                          ３７
３−オクタノール              １４．０８                          ４７
２−オクタノール              １４．２６                          １６
１）  温度プログラム：４０℃  １分間  等温  ／  ３℃／分  ９５℃  ／  １０℃／分  ２７５℃；装置：Finnigan MAT 95；ＧＣ：HP 5890 Series II Split Injector；カラム：HP-5MS（メチルシロキサン）30m x 0.25mm；キャリヤーガス：０．０６５ｍｌ／分のＨｅ。
【００７８】
出発材料はもはや見いだされなかった。
【００７９】
例７：
芳香族化合物、複素芳香族化合物及びトリメチルシクロヘキセニル化合物のヒドロキシル化
ａ）例６を繰り返すが、基質としてｎ−オクタンの代わりにナフタレンを使用した。生成物として１−ナフトール及びシス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロナフタレンが同定された。使用されたナフタレンのうち８８％が変換された。
【００８０】
ナフタレンによる変換のための分析
ＧＣ：
装置：Carlo Erba Strumentazion Typ HRGC 4160  on Column Injector；カラム：ＤＢ５ ３０ｍ×０．２ｍｍ；材料：５％のジフェニル−９５％のジメチルポリシロキサン；キャリヤーガス：０．５バールのＨ２；
温度プログラム：４０℃  １分間  等温  ／  １０℃／分〜３００℃
Ｒｔ（１−ナフトール）＝１６．６８
ＮＭＲ：
１Ｈ−ＮＭＲにおいて、１−ナフトール及びシス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロナフタレンを同定できた。
【００８１】
ｂ）例６を繰り返すが、基質としてｎ−オクタンのかわりに８−メチルキノリンを使用した。主生成物として５−ヒドロキシ−８−メチルキノリンが更なる誘導体の他に同定された（生成物比５：１）。使用された出発生成物のうち３５％が変換された。
【００８２】
ｃ）例６を繰り返すが、基質としてｎ−オクタンの代わりにα−イオノンを使用した。主生成物として、３−ヒドロキシ−α−イオノンが更なる誘導体の他に同定された（生成物比７６：２４）。使用された出発材料のうち６０％が変換された。
【００８３】
ｄ）例６を繰り返すが、基質としてｎ−オクタンの代わりにクメン（ｉ−プロピルベンゼン）を使用した。５種のモノヒドロキシ生成物及び１種のジヒドロキシ生成物が同定された。使用された出発材料のうち７０％が変換された。
【００８４】
文献
【００８５】
【外１】
0004791664.tif 000004
【００８６】
【外２】
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【配列表】
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