(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトミュラー管由来上皮細胞であって、ここで、該ミュラー管由来上皮細胞が、子宮、卵管、頸部、または膣の細胞に分化する多能性の可能性を保持し、該ミュラー管由来上皮細胞は、以下の工程：
（ａ）ミュラー管組織を、該ミュラー管由来上皮細胞を維持するのに十分な培養条件下で、無血清栄養培地中に配置する工程であって、ここで、該無血清培地が、インスリン、トランスフェリン、α−トコフェロールおよびアプロチニンを含む、工程；
（ｂ）工程（ａ）の培養条件を維持して、分化多能性能を有するミュラー管由来上皮細胞を、該無血清栄養培地へ移動させる工程；
（ｃ）工程（ａ）の培養条件を維持して、該ミュラー管由来細胞に単層のコロニーを形成させる工程；および
（ｄ）該単層のコロニーを継代培養して、該ミュラー管由来上皮細胞を得る工程、
を包含する単離方法によって得られたものである、ミュラー管由来上皮細胞。
【請求項２】
前記分化多能性能を有する前記ミュラー管由来上皮細胞の細胞表面が、実質的に血清の生体分子を含まない、請求項１に記載のミュラー管由来上皮細胞。
【請求項３】
前記分化多能性能を有する前記ミュラー管由来上皮細胞が、少なくとも１つの細胞表面マーカーの発現によって同定される、請求項１に記載のミュラー管由来上皮細胞。
【請求項４】
前記分化多能性能を有する前記ミュラー管由来上皮細胞の前記細胞表面のマーカーが、サイトケラチンである、請求項３に記載のミュラー管由来上皮細胞。
【請求項５】
請求項４に記載のミュラー管由来上皮細胞であって、ここで、前記サイトケラチンが、サイトケラチン１、サイトケラチン５、サイトケラチン６、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１０、サイトケラチン１１、サイトケラチン１３、サイトケラチン１５、サイトケラチン１６、サイトケラチン１８およびサイトケラチン１９からなる群より選択される、ミュラー管由来上皮細胞。
【請求項６】
前記分化多能性能を有する前記ミュラー管由来上皮細胞が、細胞表面マーカーとしてビメンチンをさらに発現する、請求項５に記載のミュラー管由来上皮細胞。
【請求項７】
前記分化多能性能を有する前記ミュラー管由来上皮細胞が、多角形形状の上皮細胞の細胞形態を有する、請求項６に記載のミュラー管由来上皮細胞。
【請求項８】
子宮、卵管、頸部、または膣の細胞に分化する多能性の可能性を有するミュラー管由来上皮細胞を生体外で単離する方法であって、
（ａ）ミュラー管組織を、該ミュラー管由来上皮細胞を維持するのに十分な培養条件下で、無血清栄養培地中に配置する工程であって、ここで、該無血清培地が、インスリン、トランスフェリン、α−トコフェロールおよびアプロチニンを含む、工程；
（ｂ）工程（ａ）の培養条件を維持して、該分化多能性能を有するミュラー管由来上皮細胞を、該無血清栄養培地へ移動させる工程；
（ｃ）工程（ａ）の培養条件を維持して、該ミュラー管由来細胞に単層のコロニーを形成させる工程；および
（ｄ）該単層のコロニーを継代培養して、該子宮、卵管、頸部、または膣の細胞への分化多能性能を有するミュラー管由来上皮細胞を得る工程、
を包含する、方法。
【請求項９】
異種レシピエントに対する免疫原の供給源を提供するための組成物であって、請求項１に記載のヒトミュラー管由来上皮細胞の複数を、該レシピエントにおける免疫応答を誘導するための有効量で含む、組成物。
【請求項１０】
非ヒト哺乳動物のレシピエントにおいてミュラー管由来細胞のヒト組織モデルを作製する方法であって、請求項１に記載のヒトミュラー管由来上皮細胞の複数を該レシピエントに投与する工程であって、ここで、該ミュラー管由来上皮細胞は、まず無血清培地中に維持され、次いで、該レシピエント内の位置で投与され、該位置は、該ミュラー管由来上皮細胞の増殖および分化を支持し得る、工程を包含する、方法。
【請求項１１】
レシピエントに対する細胞治療を提供するための組成物であって、請求項１に記載のヒトミュラー管由来上皮細胞の複数を含み、ここで、該ミュラー管由来上皮細胞は、無血清培地中で増殖されたものであり、該レシピエント内の位置で投与されるのに適しており、該位置は、該ミュラー管由来上皮細胞の増殖および分化を支持し得る、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、発生生物学および細胞生物学の分野にある。具体的には、本発明は、子宮、卵管、膣、および子宮頚管の細胞へと分化し得るミューラー管由来上皮細胞の集団、ミューラー管由来上皮細胞を単離する方法、ミューラー管由来上皮細胞の特徴づけ、およびミューラー管由来上皮細胞の使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
過去数十年間、女性の生殖器官の発生の研究にかなりの時間と労力が注がれてきた。研究の背後にある刺激は、研究室間でさまざまであるが、研究の労力の全ては、女性の健康全般に関する重要な一般的論点に対処している。これらの論点のいくつかとしては、以下が挙げられる：子宮頸癌、不妊症、子宮内膜症、子宮癌、異所性妊娠、卵巣嚢腫、および子宮繊維症。例えば、子宮頸癌は、この癌が全世界の女性の中で２番目に多い一般的な癌であり、毎年約４５０，０００の新たな症例が診断され、そしてほぼ２００，０００名が子宮頸がんが原因で死亡することを考慮すれば、女性の健康に関して特に重要なテーマである。Ｐｉｓａｎｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５５：８９１−９０３（１９９３）。子宮頸がんの病因学的原因は、今日でも未知のままであるが、ヒトパピローマウイルス、特に、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８への感染が、子宮頸がん発症の原因であり得るという報告が数多く存在する。子宮頸がんの研究は過去に進歩したが、最も重要な研究のうちのいくつかは、ヒト組織モデルがないことにより遅れている。同様に、卵巣がん、子宮ガン、子宮繊維症、または子宮内膜症に関する研究は、子宮頚管、子宮、卵管（ファローピウス管）および膣のヒト組織モデルがあることから、非常に有益である。
【０００３】
女性生殖器系の子宮頚管、子宮、卵管、および膣の一部は、胚形成の初期にミューラー管（中腎傍管としても公知）から形成される。ヒト胚において、始原生殖隆起は、原始性腺へと発生する。妊娠の約７週目に、両方の性別が、始原生殖管、ならびに皮質および髄質へと発生する原始性腺を有する。遺伝的女性において、皮質は、卵巣へと発生し、髄質は退行する。対照的に、遺伝的男性においては、髄質は精巣へと発生し、皮質は退行する。ヒト胚の発生が進行するにつれ、ミューラー阻害物質（またはＭＩＳ）の分泌とともに、男性におけるミューラー管は退行し始める。Ｇａｎｏｎｇ，Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｆ．Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２３「Ｔｈｅ  Ｇｏｎａｄｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｓｙｓｔｅｍ」Ｆｉｆｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ（１９９１）。ミューラー管は、中腎管にほぼ平行して中腎に沿って伸び、排出腔へと排出する２つの対になった胚管（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｔｕｂｅ）のいずれかである。女性では、ミューラー管の上部は卵管を形成する一方、下部は融合して子宮、子宮頚管、および膣の一部を形成する。
【０００４】
ミューラー管に対する以前の研究は、ミューラー管の解剖学的特徴および構造学的特徴に焦点を当ててきた。例えば、１つの研究では、トリにおけるミューラー隆起の移動およびミューラー管の免疫組織化学的染色がヒトにおいて見られるものと密接に類似していることが明らかになった。Ｊａｃｏｂ  Ｍら、Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  １６４（２）、６３−８１（１９９９）。別の研究においては、ヒト胎児が発生中の尿生殖管を研究するために超音波検査された。Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｗ．Ｄ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ  １６７（１）、１８５−１９３（１９９２）。他の研究は、発生中の胎児における遺伝子発現パターンに焦点を当ててきた。Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｉ  Ｍ．ら、Ａｎａｔ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．１９６（６）．４２７−４３３（１９９７）。それらそれぞれの範囲において重要であるが、これらの研究は、ミューラー管由来上皮細胞を単離する方法についてのいかなる教示も提供しておらず、この細胞がそれらの多能性能を保持するようにミューラー管由来上皮細胞を培養するための方法についてのいかなる教示も提供していない。あるとしても、単離されたミューラー管由来上皮細胞についての報告は非常に少なく、それどころか、子宮、子宮頚管、卵管および膣の細胞へと分化するための多能性能を有するミューラー管由来上皮細胞の報告は、より少ない。従って、ミューラー管由来上皮細胞の集団の発見、ならびにミューラー管由来上皮細胞を単離および特徴づけする方法が必要である。本明細書中に開示された発明は、これらの必要性を満たし、さらに使用方法もまた開示する。
【０００５】
（発明の開示）
１つの局面において、本発明は、卵管、子宮、膣または子宮頚管の細胞へと分化する多能性能を有する、実質的に純粋なヒトミューラー管由来上皮細胞の集団に関する。
【０００６】
別の局面において、本発明は、卵管、子宮、膣および子宮頚管の細胞へと分化する多能性能を有する、実質的に純粋なヒトミューラー管由来上皮細胞の集団を単離する方法に関する。
【０００７】
なお別の局面において、本発明は、卵管、子宮、膣および子宮頚管の細胞へと分化する多能性能を有する、実質的に純粋なヒトミューラー管由来上皮細胞の集団を維持する方法、ならびにミューラー管由来上皮細胞がそれらの多能性能を保持することを可能とするに十分な培養条件下で、これらのミューラー管由来上皮細胞を維持または培養する方法に関する。
【０００８】
さらに別の局面において、本発明は、異種レシピエントに免疫原の供給源を提供する方法、および免疫原としてのミューラー管由来上皮細胞の実質的に純粋な集団の使用に関する。
【０００９】
本発明のさらに別の局面において、本発明は、ミューラー管由来上皮細胞、もしくはミューラー管由来細胞の供給源としてこの細胞から分化した細胞の実質的に純粋な集団を用いて、ミューラー管由来細胞、またはミューラー管由来細胞から分化した細胞（すなわち、卵管、子宮、膣および子宮頚管の細胞）のヒト組織モデルを作製する方法、ならびに非ヒト哺乳動物レシピエントにミューラー管由来上皮細胞を投与する方法に関する。
【００１０】
本発明の別の局面において、本発明は、細胞治療を提供する方法に関し、それにより、ヒトミューラー管由来上皮細胞またはミューラー管由来上皮細胞から分化した細胞の実質的に純粋な集団がレシピエントに導入される。
【００１１】
本発明の別の局面において、本発明は、薬物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｒｕｇ）を開発するための手段を提供する方法に関し、ここでヒトミューラー管由来上皮細胞の実質的に純粋な集団は、ミューラー管由来の生物学的成分の供給源として用いられ、これらのミューラー管由来の生物学的成分のうちの１以上が開発されつつある薬物の標的である。
【００１２】
本発明の別の局面において、本発明は、バイオアッセイの開発をもたらす方法に関し、ここでヒトミューラー管由来上皮細胞の実質的に純粋な集団は、核酸またはタンパク質の供給源として用いられ、これらの核酸またはタンパク質は、バイオアッセイまたはバイオアッセイの開発において１以上の基本的な成分として用いられる。
【００１３】
（発明を実施するための形態）
以下の発明の詳細な説明は、本発明を実施することにおいて当業者の助けとするために提供される。この詳細な説明は、本明細書中に開示される実施形態の改変が本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく当業者により行われ得るように、本発明を限定すると解釈されるべきではない。本開示全体を通して、種々の刊行物、特許、および公開された特許明細書が引用により参照される。これらの刊行物、特許、および公開された特許の開示は、本開示にその全体が参考として援用される。
【００１４】
本発明の実施は、他に示さない限り、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの従来の技術を用い、これらの技術は、当該分野の技術範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第２版（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８７））；一連のＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５））；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，ならびにＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））を参照のこと。
【００１５】
（定義）
本明細書中および特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」は、複数の細胞を含み、それらの混合物を含む。
【００１６】
本明細書中および特許請求の範囲において用いられる場合、用語「ミューラー管由来上皮細胞」、「ミューラー管由来細胞」、「ミューラー管細胞（Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ  ｄｕｃｔａｌ  ｃｅｌｌ）」および「ミューラー管細胞（Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ  ｄｕｃｔ  ｃｅｌｌ）」は、交換可能に用いられ、そしてヒトミューラー管に由来する細胞をいう。これらの細胞は、分裂し得、そして末端分化（ｅｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）の本質的に分裂していない段階には未だ方向付けられていない。「ミューラー管由来上皮細胞」、「ミューラー管細胞」および「ミューラー管細胞」は、最終的に、ヒト胚における中腎傍管隆起に由来する。男性および女性両方の胚がミューラー管を有するが、男性におけるミューラー管は、胚発生およびミューラー阻害因子（ＭＩＳ）の分泌とともに退化するが、女性においては、ミューラー管は卵管、子宮、子宮内膜、子宮頚管および膣の上部へと発生する。
【００１７】
「ミュラー管上皮細胞」および「ＭＴＥ細胞」は、本明細書中で交換可能に使用され、そして、これらは、標準的なインビトロ細胞条件下の培養物中にあるミュラー管由来上皮細胞をいう。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、「中腎傍管」および「ミュラー管」は、交換可能に使用される。「中腎傍管」および「ミュラー管」は、胚発生の初期において原始生殖管から誘導される。
【００１９】
「多能性」および「多分化能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）」は、本明細書を通して交換可能に使用され、これらは、細胞が、依然として、複数の細胞のうちの１つの細胞となり得るが、身体中のいかなる型の細胞（すなわち、全能性）にはもはやなり得ない段階をいう。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「所定のミュラー管由来」とは、原始生殖隆起の部分である段階を超えて、かつ終末分化されたミュラー管由来細胞（例えば、成熟卵管細胞、子宮細胞、子宮頸細胞、および膣細胞）の段階前である、多分化能性細胞の発生の段階をいう。「所定のミュラー管由来」である細胞は、ミュラー管由来細胞になるように方向付けられるが、終末分化されたミュラー管由来細胞へまだ発生し始めていない。異なる因子が、所定のミュラー管由来細胞に分化を開始させる。非限定的な例としては、ホルモン（すなわち、エストロゲン、プロゲステロン、黄体化ホルモンなど）への曝露、周辺組織（すなわち、間葉組織）との細胞間接触、および細胞の微小環境が挙げられる。
【００２１】
「抗体」は、抗原を結合し得る免疫グロブリン分子である。本明細書中で使用される場合、この用語は、インタクトな免疫グロブリン分子のみならず、必要な特異性の抗原認識部位を含む、免疫グロブリン分子の抗イディオタイプ抗体、変異体、フラグメント、融合タンパク質、ヒト化タンパク質および改変体を包含する。
【００２２】
用語「抗原」は、抗体が結合し得る１個または複数のエピトープを含み得る分子である。抗原は、免疫原性特性を有し得る（すなわち、免疫応答を誘導し得る）物質である。抗原は、免疫原の１タイプであるとみなされる。本明細書中で使用される場合、用語「抗原」は、全長タンパク質、ならびに１個または複数のエピトープを含むかまたは構成するそれらのペプチドフラグメントを意味することが意図される。
【００２３】
用語「表面抗原」および「細胞表面抗原」は、本明細書中で交換可能に使用され、これらは、細胞の原形質膜成分をいう。これらの成分としては、内在性膜タンパク質および周辺膜タンパク質、糖タンパク質、ポリサッカリド、脂質、およびグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）結合タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。「内在性膜タンパク質」は、細胞の原形質膜の脂質二重層を横切って伸長する膜貫通タンパク質である。代表的な内在性膜タンパク質は、全体的に疎水性アミノ酸残基を含む、少なくとも１つの膜通過セグメントからなる。周辺膜タンパク質は、脂質二重層の疎水性内部へと伸長せず、これらは、他の膜タンパク質との非共有結合性の相互作用によって膜表面に結合される。ＧＰＩ結合タンパク質は、脂質二重層に挿入される脂質テールによって細胞表面上に保持されるタンパク質である。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体集団を有する抗体組成物をいう。抗体の供給源またはそれが作製される様式（例えば、ハイブリドーマまたは組換え合成による）に関して限定されることは意図されない。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に指向される。代表的に、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。
【００２５】
「モノクローナル抗体の集団」とは、複数の異種モノクローナル抗体（すなわち、この集団を構成する個々のモノクローナル抗体が、互いに異なる抗原決定基を認識し得る）をいう。
【００２６】
「免疫原」とは、免疫応答を誘導する任意の物質をいう。免疫原である物質は、「免疫原性」であると記載される。免疫応答の誘導としては、体液性応答（例えば、抗体の産生）または細胞性応答（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞のプライミング）、炎症性応答（例えば、白血球の動員）ならびにサイトカインおよびリンホカインの分泌の活性化が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
免疫または移植のために使用される細胞に対して適用される場合、用語「異種」とは、その細胞が、レシピエントとは遺伝子型的に異なる実体から誘導されることを意味する。例えば、異種細胞は、異なる種、またはレシピエントと同じ種由来の異なる個体から誘導され得る。ある種の個体から誘導された胚性細胞は、同じ種の成体に対して異種である。レシピエントに対して適用される場合、「異種」とは、そのレシピエントが、レシピエントに導入される細胞の供給源と遺伝子型的に異なる実体であることを意味する。
【００２８】
「外植片」とは、ヒト胎児から採取されたミュラー管組織をいう。一般に、外植片は、ミュラー管由来細胞の供給源として使用される。この外植片からこの細胞を単離することは、いくつかの方法により達成され得る。１つの方法は、ミュラー管組織外植片（組織全体またはより小さい切片のいずれか）を、基本規定培地に配置すること、およびそのミュラー管の細胞を、固形組織塊からその培地中へと自然に移動させることである。別の方法は、ミュラー管組織を酵素消化に供することか、またはその固形組織から細胞を離す、機械的力に供することである。
【００２９】
細胞は、胚の３つの胚葉−外胚葉、内胚葉または中胚葉のうちの１つに由来する場合、それぞれ、「外胚葉」起源、「内胚葉」起源、または「中胚葉」起源である。外胚葉は、表皮の細胞および神経系を生成する、外側の層である。内胚葉は、消化管の内層およびその関連器官を生成する、内側の層である。真ん中の層である中胚葉は、いくつかの器官（心臓、腎臓、中皮、および性腺を含むがこれらに限定されない）、結合組織（例えば、骨、筋肉、腱）、および血液細胞を生じる。
【００３０】
用語「培地」、「細胞培養培地」、および「培養培地」は、互換可能に使用される。この用語は、哺乳動物細胞が培養で増殖される、水性微小環境をいう。この培地は、物理化学的、栄養性、およびホルモン性の微小環境を包含する。
【００３１】
細胞培養培地は、その培地中の血清の体積パーセンテージが、細胞表面上の抗原性部位または抗体結合部位を遮蔽しない場合、「本質的に無血清」である。用語「本質的に無血清」は、一般には、その細胞培養培地が、（体積により）約５０％未満の血清、好ましくは約２５％未満の血清、なおより好ましくは約５％未満の血清、そして最も好ましくは約０，１％未満の血清を含む場合に適用する。
【００３２】
ミュラー管上皮細胞表面のうちの少なくとも約５０％、より好ましくはミュラー管上皮細胞表面のうちの少なくとも約７５％、なおより好ましくは、ミュラー管上皮細胞表面のうちの少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、ミュラー管上皮細胞表面のうちの少なくとも約９５％が、その細胞表面に結合する血清に由来する血清生体分子を有さず、その結果、抗原性部位または抗体結合部位が、抗体または抗体の一部により結合されるかまたは抗原性認識のために利用可能でない場合に、細胞表面は、「血清生体分子を実質的に含まない」。細胞表面は、顕微鏡検査法またはフローサイトメトリーのいずれかによって細胞のサイズを測定することによって、決定され得る。例えば、種々の既知のサイズの合成ビーズが、フローサイトメトリーにおける較正のために一般に使用される。少量の較正されたビーズが、ＭＴＥ細胞と混合され得、そして生じた集団が、フローサイトメトリーにより分析される。その後、ＭＴＥ細胞が、この較正されたビーズのサイズと比較され得る。細胞表面の量の計算が、達成され得る。なぜなら、このビーズのサイズが、既知であるからである。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、ミュラー管上皮細胞の「実質的に純粋な」集団は、少なくとも約８５％ミュラー管上皮細胞から構成され、好ましくは、少なくとも約９０％構成され、そしてなおより好ましくは約９５％以上構成される、細胞の集団である。
【００３４】
「規定培地」、「基本細胞維持培地」、「栄養培地」、および「基本栄養培地」は、本明細書中で互換可能に使用され、そしてこれらの用語は、培養で細胞の生存および／または増殖に必要な栄養所要量およびホルモン所要量を、その培地の成分が既知であるように含む、培地をいう。伝統的に、この規定培地は、増殖および／または生存に必要な栄養因子および増殖因子の添加によって、処方されている。代表的には、この規定培地は、以下のカテゴリーのうちの１つ以上からの少なくとも１つの成分を提供する：ａ）すべての必須アミノ酸、そして通常は、２０個のアミノ酸＋シスチンの基本的セット；ｂ）エネルギー源（通常は、グルコースのような、糖質の形態）；ｃ）低濃度で必要とされる、ビタミンおよび／または他の有機化合物；ｄ）遊離脂肪酸；およびｅ）微量要素（微量要素は、代表的には非常に低濃度で、通常はμＭの範囲で必要とされる、無機化合物または天然に存在する要素として規定される）。この規定培地はまた、以下のカテゴリーのうちのいずれかからの１つ以上の成分を、必要に応じて補充され得る：ａ）１つ以上のマイトジェン因子；ｂ）塩および緩衝剤（例えば、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸）；ｃ）ヌクレオシドおよび塩基（例えば、アデノシンおよびチミジン、ヒポキサンチン）；ならびにｄ）タンパク質および組織の加水分解産物。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「馴化培地」とは、ＭＴＥ細胞が増殖された、インタクトな細胞を含まない、培養培地をいう。栄養培地において増殖されたミュラー管由来細胞は、そのミュラー管上皮細胞の継続した生存、増殖、および分化前の既存の状態の維持を促進する、因子を放出し得る。馴化培地は、細胞ペレットを再構成するために使用され得るか、または培養プレート中にすでに存在する細胞を増加するために使用され得る。馴化培地はまた、単独で使用され得るし、またはミュラー管由来細胞に栄養供給するために使用される栄養培地を補充するために使用され得る。馴化培地は栄養培地に由来し、そして本明細書中に開示される栄養培地は、本質的に無血清であるので、馴化培地もまた、本質的に無血清である。
【００３６】
「標準的インキュベーション条件」とは、細胞が配置される、組織培養用に設計されたインキュベーターにおける物理化学的条件をいう。一般に、この標準的インキュベーション条件は、約３７℃であり、そして加湿されて約５％のＣＯ２含量である。すべての組織培養技術および組織培養装置は、滅菌条件下で実施されるべきである。
【００３７】
「ミュラー管上皮細胞凝集物」、「ＭＴＥ凝集物」および「ＭＴＥ細胞球」は、全体を通して互換可能に使用され、そしてこれらの用語は、物理的に近接した細胞のパッチでありかつ細胞間接触を有する、ミュラー管上皮細胞の単層塊をいう。
【００３８】
本明細書中で使用される、用語「移植組換え体」は、間葉組織ともに配置されたミュラー管上皮細胞凝集体の組み合わせ単位を指す。間葉組織は、ミュラー管または非ミュラー管起源であり得る。間葉組織は、移植片レシピエントと異種の種由来であり得る。間葉組織はまた、ミュラー管上皮細胞の供給源に対して異種の種由来でもあり得る。移植組換え体を、基質（好ましくは、軟らかい生物基質（例えば、寒天））上に約１時間ないし約９６時間の間、より好ましくは約６時間ないし約４８時間の間、さらに好ましくは約２４時間のインキュベーション時間の範囲で一晩インキュベートすることができる。
【００３９】
本明細書中で使用される、「血清」は、血液が凝固された後に残存する哺乳動物の血液の液相を指す。
【００４０】
本明細書中で使用される、「血清生体分子」は、血清中に見出される生体組成物を指す。例として、アルブミン、α１グロブリン、α２グロブリン、βグロブリン、およびγグロブリンが挙げられるが、これらに限定されない。血清生体分子は、血清中に天然に見出されるか、血清のプロセシングおよび操作に由来する全体または部分的な生体組成物を含み得る。
【００４１】
用語「哺乳動物」または「哺乳動物の」は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、サル、競技用動物、およびペットが含まれるが、これらに限定されない温血脊椎動物を指す。
【００４２】
（ミュラー管上皮細胞の単離および維持）
本発明のミュラー管上皮細胞をヒトミュラー管由来組織から単離する。胎児の年齢は、約１週齢ないし約４０週齢の間、好ましくは約８週齢ないし約３０週齢の間、さらにより好ましくは約１７週齢ないし約２５週齢の間である。ミュラー管由来組織を、肉眼解剖学、外観、および胎児内の位置によって同定することができる。ミュラー管を識別する外観は以下である：中腎に沿って伸びる２つの対になった胚性管のいずれかが中腎管にほぼ平行になり、雌性における排泄腔へつながり、管の上部は、卵管を形成するが、下部は、子宮および膣部分につながっている。一旦同定されると、胎児ミュラー管由来組織を、過剰の結合組織から分離し、基礎培地で洗浄し、次いで顕微解剖する。顕微解剖の目的は、固体組織の塊を組織全体の塊のより小さい部分に分け、それによって基礎栄養培地が、組織部分中のミュラー管由来細胞により行き渡るようにし、そして／またはミュラー管組織の塊由来のミュラー管由来細胞を分離するようにする。顕微解剖の非限定的な例には、機械的剪断力を付与するデバイス（すなわち、ホモジナイザー、乳鉢および乳棒、ブレンダーなど）、切断または裂くデバイス（すなわち、外科用メス、シリンジ、ピンセットなど）、または超音波処理デバイスが含まれる。あるいは、胎児ミュラー管由来組織を顕微解剖する別の方法は、酵素処理の使用である。顕微解剖組織に使用される種々の酵素処理は、当該分野で既知である。１つの方法は、ミュラー管由来組織から単離した細胞の生存能力を維持する緩衝培地中で部分的に剪断したミュラー管由来組織を消化するためのコラゲナーゼ−ディスパーゼの使用を含む。酵素量は、胎児の年齢およびミュラー管由来組織の大きさに依存する。１つの実施形態において、コラゲナーゼ−ディスパーゼを用いた酵素処理は、全体的な細胞収量を低下させ得る。従って、使用する酵素量は、減ずるかまたは全く用いない。他の実施形態において、酵素処理は、全体的な細胞収量を増大させ得る。従って、酵素処理は、単独また顕微解剖法と組み合せて用いられる。ミュラー管上皮細胞の生存を促進する液体のｐＨ範囲を維持し、酵素消化を行うことができる範囲内のさらなる液体体積を得ることができる広範な種々の基底細胞維持培地を使用することができる。非限定的な例には、Ｆ１２／ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、ＣＭＲＬ−１０６６、最少必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、およびイスコブ改変イーグル培地（ＩＭＥＭ）が含まれる。さらに、Ｈａｍ  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｎｃｅ  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．，  ５８：４４  （１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓａｔｏ  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０２：２５５  （１９８０）、またはＭａｔｈｅｒ，Ｊ．Ｐ．  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  Ｐ．Ｅ．、「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９８）に記載の任意の基本栄養培地を使用することもできる。
【００４３】
次いで、ミュラー管組織の小片を、基底細胞維持培地中にいれる。種々の基礎細胞維持培地が利用可能である。例として、Ｈａｍ’ｓＦ１２培地、ＲＰＭＩ−１６４０、およびＣＭＲＬ−１０６６が挙げられるが、これらに限定されない。ミュラー管上皮細胞の生存および成長を促進するより多くの至適条件のために、種々の栄養素を添加して基本培地を補足することができる。例として、インスリン、トランスフェリン、α−トコフェロール、およびアプロチニンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、以下の量の栄養素を使用して、ミュラー管上皮細胞の生存および成長を促進することができる：少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌのインスリンでかつ約１ｍｇ／ｍｌ以下のインスリン、より好ましくは約１０μｇ／ｍｌのインスリン；少なくとも約１μｇ／ｍｌのトランスフェリンでかつ約１００μｇ／ｍｌ以下のトランスフェリン、より好ましくは約１０μｇ／ｍｌのトランスフェリン；少なくとも約０．１μｇ／ｍｌのα−トコフェロールおよび約１ｍｇ／ｍｌ以下のα−トコフェロール、より好ましくは約５μｇ／ｍｌのα−トコフェロール；そして少なくとも約１μｇ／ｍｌのアプロチニンおよび約１００μｇ／ｍｌ以下のアプロチニン、より好ましくは約５μｇ／ｍｌのアプロチニン。
【００４４】
ミュラー管上皮細胞は、ミュラー管組織からミュラー管組織の置かれた培地中に遊走する。１つの実施形態において、ミュラー管上皮細胞は、ミュラー管組織から培地中に凝集体になって遊走する。別の実施形態において、ミュラー管上皮細胞は、ミュラー管組織から培地中に単一細胞の形で遊走する。別の実施形態において、ミュラー管組織から遊走するミュラー管由来上皮細胞は、もはやミュラー管組織に組みこまれず、組織に漫然と結合する。次いで、ミュラー管由来上皮細胞は、基礎細胞維持培地中に懸濁される。ミュラー管上皮細胞は、異なる基質で被覆するか、被覆しない組織培養容器（すなわち、フラスコ、プレートなど）において増殖させられ得る。使用することができる基質の非限定的な例には、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ポリリジン、ニトロセルロース、ナイロン、およびポリテトラフルオロエチレンが挙げられる。１つの実施形態では、ミュラー管上皮細胞を、ラミニン被覆組織培養容器上の上記の好ましい栄養培地中で成長させる。別の実施形態において、ミュラー管上皮細胞は、被覆していない培養容器中で上記の好ましい栄養培地中で増殖される。組織培養容器の大きさは、容器中に置かれるミュラー管組織の量に比例する。当業者は、組織培養容器の正しい大きさを組織培養容器に置かれたミュラー管組織の段階的な増殖により決定し得る。ミュラー管組織が最初に組織培養容器中に置かれたとき、培地は、全体的な濁度において一般に透明である。ミュラー管由来細胞は、ミュラー管組織片から遊走し、培地は、より不透明になり、より混濁する。ミュラー管組織から遊走したミュラー管由来細胞の量の増加またはミュラー管由来細胞の増殖のために培地が非常に混濁した時点で、さらなる栄養培地を組織培養容器中にいれ、ミュラー管細胞によって消費された栄養を補充する。あるいは、培地がミュラー管上皮細胞の量の増加に伴い混濁した場合、少量の細胞は、組織培養容器から取り出され得、細胞の生存能を、例えば、トリパンブルー染色などを用いて確認し得る。あまりに多くの細胞で超過した組織培養容器は、細胞の生存能の低下を示し始める。次いで当業者は、組織培養容器の中身をより大きな他の容器（例えば、より大きな体積）に移して、増加する細胞の量に順応し得る。１つの実施形態において、組織培養容器の全体の中身が別のより大きな体積の容器に移される。別の実施形態において、ミュラー管細胞懸濁物は、いくつかの別の組織培養容器に、新鮮な栄養培地とともに分けられる（「継代培養」としてまた知られる）。この様式において、実質的に純粋なミュラー管細胞の集団が得られ得る。
【００４５】
培地中のミュラー管細胞またはミュラー管上皮（ＭＴＥ）細胞は、異なる基質で被覆するか、被覆しない組織培養容器（すなわち、フラスコ、プレートなど）において増殖させられ得る。使用することができる基質の非限定的な例には、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、ポリリジン、ニトロセルロース、ナイロン、およびポリテトラフルオロエチレンが挙げられる。ＭＴＥ細胞は、好ましい栄養培地中で基質を伴ってかまたは伴わずに増殖する場合、単層を形成する。１つの実施形態において、被覆されない組織培養フラスコ中で増殖するＭＴＥ細胞は、単層を形成する。別の実施形態において、好ましい栄養培地中で高密度になったＭＴＥ細胞は、、好ましい栄養培地中で自由に浮遊する封入された拡張した嚢胞を形成する。さらなる別の実施形態において、ＭＴＥ細胞は、単層のパッチまたは単層凝集体を組織培養容器に形成する。なお別の実施形態において、ＭＴＥ凝集体は、組織培養容器の表面に接着し、単層細胞のコロニーとして増殖する。これらのコロニーは、継代培養され、ＭＴＥ細胞を増殖し得る。種々の方法が用いられて、ＭＴＥ細胞コロニーを継代し得る。１つの方法は、酵素処理であり、プラスチックの組織培養フラスコの側からＭＴＥ凝集体を解離する。さらに好ましい実施形態において、例えば、コラゲナーゼ−ディスパーゼのような酵素を細胞を凝集した形態のままで組織培養フラスコの側からコロニーを解離するための有効量で用いる。有効量は、少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約１％、そして最も好ましくは、少なくとも約０．１％容量のコラゲナーゼ−ディスパーゼである。組織培養フラスコの側からＭＴＥのコロニーを解離した後、酵素は、基礎培地（好ましくは本明細書で開示される栄養培地で）で洗い流され、ＭＴＥコロニーは、栄養培地、好ましくは、本明細書に開示された栄養培地と共に新たなフラスコに入れられる。ＭＴＥコロニーの全体を１つの組織培養フラスコに置き、栄養培地を添加するか、またはＭＴＥコロニーの一部を１つの組織培養フラスコに置き、栄養培地を添加する。この様式において継代することによって、コンフルエント細胞培養物を少なくとも約２ヶ月で、より好ましくは少なくとも約１月で、最も好ましくは、少なくとも約２〜３週間で得ることができる。あるいは、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）およびフォルスコリンのような増殖因子は、段階的に増加して添加され得て、増殖を刺激し得る。いくつかの実施形態において、ＦＧＦおよび／またはフォルスコリンの添加は、増殖のより速い速度を促進し、ＭＴＥ細胞の寿命を減少しない。従って、当業者によって、より速い増殖速度が所望される場合、ＦＧＦおよび／またはフォルスコリンの添加は利用され得る。他の実施形態において、ＦＧＦおよび／またはフォルスコリンの添加は、増殖のより速い速度を促進し、ＭＴＥ細胞の寿命を減少する。従って、当業者は、ＭＴＥ細胞の増加する数が、当業者の必要に応じて、所望されるＭＴＥ細胞の寿命を越えているかを決定し得る。
【００４６】
ミュラー管上皮細胞に栄養補給する頻度は、ＭＴＥ細胞の栄養代謝の速度に依存する。栄養代謝の速い速度では、より頻繁にＭＴＥ細胞に栄養補給する必要がある。一般に、培地の酸性度は、細胞が培地中で栄養を代謝すると共に増加する。いくつかの栄養培地（例えば、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭなど）は、培地に色を有し、酸性度を示し、その結果、高い酸性である培地は、明るい不透明なピンク色に変る。次いで、栄養培地が添加されて、既存の培地の酸性度を、ＭＴＥ細胞の寿命を維持し、そして増殖を促進する酸性度にする。あるいは、ＭＴＥ細胞のわずかな部分を組織培養容器から取り出し、細胞の生存能の確認を、例えば、トリパンブルー染色を用いて、し得る。栄養培地が代謝される場合、細胞生存能は乏しい（例えば、５０％以下）。１つの実施形態では、ミュラー管上皮細胞を、古い栄養培地の構成要素の新しい栄養培地への置換によって供給することができる。別の実施形態では、ミュラー管上皮細胞を、これらの細胞が成長した馴化培地で供給することができる。特許請求の範囲に記載のミュラー管上皮細胞は本発明に固有であり、かつこれらの細胞に特異的な因子を分泌するので、ミュラー管上皮細胞由来の馴化培地もまた固有である。ミュラー管上皮細胞の生存および成長の促進に好ましい供給頻度は、１週間に１回おきである。老化を伴わず、かつこれらミュラー管上皮細胞の最終的に分化した子宮細胞、子宮頚部細胞、膣細胞または卵管細胞への分化を誘導することなく本発明のミュラー管上皮細胞を複数回継代（約４〜５回）することができる。
【００４７】
（ミュラー管上皮細胞の特徴づけ）
本明細書中に開示の様式で単離した本発明のミュラー管上皮細胞集団は、いくつかの定義的な特徴を有する。第１に、ミュラー管上皮細胞は、「未分化のミュラー管由来」と説明することができる段階にある。本発明のミュラー管上皮細胞は、子宮細胞、子宮頚部細胞、膣細胞または卵管細胞のいずれかとなる能力を有する。ミュラー管上皮細胞の同定を、形態学または特異的マーカーまたはその両技術の組み合わせによって行うことができる。ＭＴＥ細胞の形態は、細胞と細胞同士が接触して、密なコロニーで増殖する、多角形または卵形の形状の細胞の外観単層形態によって特徴付けられる。ＭＴＥ細胞が組織培養容器中で高密度である場合、これらは、ドメイン様構造をとり得る。ドメイン様構造の形成は、腺上皮細胞に独特の特性を有する。ドメイン様構造の形成は、ＭＴＥ細胞が接着細胞間で、閉塞性の結合を作るか、接着結合を作ることを示す。閉塞性の結合は、慣用的あるいはフリーズフラクチャー法の電子顕微鏡によって、または閉塞性結合に対するマーカー（すなわち、帯状不顕性タンパク質ＺＯ１、ＺＯ２など）で染色することによって可視化し得る。ドメイン様構造の形成に加え、ＭＴＥ細胞はまた、タンパク質をドーム腔へ分泌し得る。このタンパク質は、色素（すなわち、ヘマトキシリン、エオジンなど）で染色することによって可視化し得る。ＭＴＥ細胞が存在し得る他の形態は、平坦な輪郭および細い突起を有する上皮細胞型であり、同様のものは、成人の子宮内膜由来の子宮内膜細胞培養物に見られる。
【００４８】
ＭＴＥ細胞検出に用いられ得るマーカーは、以下を含むが、これらに限定されない：ＭＴＥ細胞上のサイトケラチン（ＣＫ）１、５、６、７、８、１０、１１、１３、１５、１６、１８、および１９、ならびにビメンチン。これらの細胞表面マーカーは、ＣＫおよびビメンチンに対し特異的な抗体を用いることによって評価される。利用し得る抗体の例は、以下を含むが、これらに限定されない：Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から得られる抗サイトケラチン（ＣＫ）抗体クローン４．６２、クローン８．１２、クローン８．１３および抗ビメンチン抗体クローン１３．２。抗ＣＫ抗体および抗ビメンチン抗体は、直接または間接的にＭＴＥ細胞の染色を免疫組織化学またはフローサイトメトリーにおいて用いられ得る。
【００４９】
本発明のＭＴＥ細胞はまた、ＨＯＸ遺伝子の発現によって特定される。ＨＯＸ遺伝子は、脊椎動物類の恒常的選択遺伝子であり、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおける前椎−後椎に沿って位置的な値を規定する。Ｈｏｘａ９遺伝子発現は、ファローピウス管（卵管）に制限され、Ｈｏｘａ１０遺伝子発現は、子宮内膜の発現に制限され、Ｈｏｘａ１１遺伝子発現は、子宮内膜上皮細胞の発現に制限される。Ｔａｙｌｏｒ  Ｈ．Ｓ．ら、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ５７、１３３８〜１３４５（１９９７）。ＭＴＥ細胞は、単離されて、本明細書に開示される方法を用いて培養され、総ＲＮＡをＭＴＥ細胞から抽出し、Ｈｏｘａ９、Ｈｏｘａ１０、Ｈｏｘａ１１遺伝子配列に特異的なプライマーを用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）に供される。
【００５０】
本発明のＭＴＥ細胞はまた、異なるホルモンまたは化合物に対する感受性によって特定され得る。ミュラー阻害物質（ＭＩＳ）は、雄性胚のミュラー管の退行の原因として知られる。ＭＩＳのＭＴＥ細胞への適用は、いくつかの細胞形態的影響を生じ得、位相差顕微鏡によって観察し得る。あるいは、ＭＩＳレセプターの発現は、ＭＩＳへの曝露によって改変され得る。レセプター発現は、フローサイトメーターによって、ＭＩＳレセプター特異的抗体を用いて評価し得る。プロゲステロン、エストロゲン、または黄体形成ホルモン（ＬＨ）のようなホルモンは、ＭＴＥ細胞に影響し得る。雌性胚において、プロゲステロンおよびエストロゲンへの曝露は、ミュラー管の子宮、卵管、子宮頚部、および膣の一部への分化を生じる。ＬＨへの曝露において、ＭＴＥ細胞は、位相差顕微鏡によって細胞形態学的影響についてモニターされ得る。あるいは、増殖アッセイは、ＬＨに応答する細胞の増殖をモニターするために用いられ得る。なお別には、ＭＴＥ細胞は、子宮、卵管、子宮頚部、または膣組織に特異的なマーカーについて染色され得、免疫組織化学またはフローサイトメトリーによって分析され得る。
【００５１】
本発明のミュラー管上皮細胞は、血清不含培地にて、未分化のミュラー管由来状態として記載され得る段階において維持される。本明細書で開示される基礎細胞維持培地または好ましい栄養培地または馴化培地を用いて、インビトロでミュラー管上皮細胞を培養し得る。本発明のミュラー管上皮細胞は、本明細書で開示される好ましい無血清栄養培地において複数回継代される能力を有する。多分化能は、各継代の間、および各継代後の任意に時点において維持され、本発明のミュラー管上皮細胞は、機能的ミュラー管由来細胞に分化し得る。さらに、各継代後の任意に時点において、ミュラー管上皮細胞は、免疫原として細胞治療のため、バイオアッセイのため、ヒトミュラー管由来モデルを樹立するため、あるいは本明細書に開示されるような薬物の発見、および／または開発のため利用され得る。
【００５２】
本発明のミュラー管上皮細胞の別の特性は、レシピエント哺乳動物の腎嚢の下に移植された場合に、子宮、卵管、子宮頚部、または膣細胞に分化する能力である。ミュラー管上皮細胞は、単層で増殖し、次いで、間葉組織と合わせされ、そしてレシピエント哺乳動物の腎嚢の下に移植される。好ましくは、ヒトミュラー管上皮細胞凝集体は、ラット尿生殖器間葉組織と合わされ、レシピエント哺乳動物の腎嚢の下に移植される。移植片の一部分は、マーカー、形態学、またはこれらの組み合せを用いた分析のため取り出され、ミュラー管由来細胞およびこれからの細胞分化を同定し得る。
【００５３】
（ミュラー管上皮細胞の使用）
（免疫原としての使用）
ミュラー管上皮細胞は免疫原として使用される。本発明で開示されるように、固有の無血清培養条件により、ミュラー管上皮細胞の細胞表面に、表面に結合することができる血清タンパク質または血清生体分子を残すことができる。血清生体分子による結合で「マスク」することができる抗原部位の潜在的な問題は、開示された無血清単離および培養技術の使用によって回避される。したがって、血清を含む培養条件を使用する場合に「マスク」される新規に利用可能な抗原に対する抗体のパネルを生成することができる。本明細書中に開示の方法で単離および培養したミュラー管上皮細胞を、異種レシピエントに投与する免疫原として使用することができる。免疫原としてのＭＴＥ細胞の投与を、いくつかの方法によって行うことができる。異種レシピエントへの免疫原としてのＭＴＥ細胞の投与法には、以下が含まれるが、これらに限定されない：免疫化、塗布（ｓｗａｂｂｉｎｇ）またはスクラッチ（ｓｃｒａｔｃｈ）装置などの直接接触による膜への投与、エアゾールによる粘膜への投与、および経口投与。当該分野で既知のように、免疫は、受動免疫または能動免疫のいずれかであり得る。免疫法を、異なる経路（腹腔内注射、皮内注射、局所注射が含まれるが、これらに限定されない）を介して行うことができる。免疫の被験体には、マウスなどの哺乳動物を含み得る。免疫の経路およびスケジュールは、一般に、抗体刺激および産生のために確立された従来の技術に従う。この実施形態ではマウスを使用する一方で、ヒトを含む任意の哺乳動物被験体またはそれ由来の抗体産生細胞を本発明のプロセスにしたがって操作して、哺乳動物ハイブリドーマ細胞系の産生の基礎として使用することができる。典型的には、マウスを免疫原性量のＭＴＥ細胞を用いて腹腔内に接種して、次いで類似の量の免疫原を追加投与する。あるいは、非生体膜基質上で成長させた細胞を、宿主哺乳動物に手術によって腹腔内に移植する。リンパ球（好ましくは、マウス由来の脾臓リンパ球）を、最後のブースト投与から数日後に回収し、細胞懸濁液を融合用にこれらから調製する。
【００５４】
ハイブリドーマをリンパ球から調製し、Ｂｕｃｋ，Ｄ．Ｗ他、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ，１８：３７７−３８１（１９８２）によって改変されたＫｏｈｌｅｒ，Ｂ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）の一般的な体細ハイブリダイゼーション技法を使用して骨髄種細胞を不死化する。利用可能な骨髄腫系列（Ｘ６３−Ａｇ８．６５３およびＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  Ｃａｌｉｆ．，  ＵＳＡ由来の系列が含まれるが、これらに限定されない）をハイブリダイゼーションに使用することができる。この技術は、ポリエチレングリコールなどの融合剤を使用するか、当業者に周知の電気的手段によって骨髄腫細胞とリンパ球を融合することを含む。融合後、細胞を融合培地から分離し、選択成長培地（ＨＡＴ培地など）で成長させて、非ハイブリッド形成親細胞を消滅させる。本明細書中に記載の任意の培地を、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの培養に使用することができる。別の代替細胞融合技術として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して、本発明のモノクローナル抗体を産生する。ハイブリドーマを拡大またはサブクローニングし、所望ならば、上清を従来の免疫アッセイ法（例えば、放射免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、または蛍光免疫アッセイ）によって抗免疫原活性についてアッセイする。
【００５５】
このような抗体を産生するハイブリドーマを、既知の手順を使用してインビトロまたはインビボで成長させることができる。所望ならば、モノクローナル抗体を、従来の免疫グロブリン精製法（硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過）によって培養培地または体液から単離することができる。望ましくない活性が存在する場合、例えば、固相に結合した免疫原から生成された吸着物質へ調製物を流すこと、および免疫原から所望の抗体を溶出または放出することによって除去することができる。
【００５６】
この様式では、ミュラー管上皮細胞段階に特異的な細胞表面抗原に対する新規の抗体のパネルを、本発明のミュラー管上皮細胞を使用して生成することができる。一旦ミュラー管上皮細胞上の細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を、本明細書中に開示の方法によって作製すると、この抗体は、いくつかの用途を有する。抗体を、組換え抗体またはヒト化抗体を生成するために配列決定およびクローニングすることができる。ミュラー管上皮細胞特異的抗体の他の用途には、生物学的試験および精製（すなわち、フローサイトメトリーおよびパニングなどの方法によるミュラー管上皮細胞の単離）、治療用途（すなわち、標的細胞への抗体の結合による細胞成長の促進もしくは停止、または標的細胞への抗体の結合による細胞塊の成長の促進もしくは停止）、生物マーカー（すなわち、他のミュラー管由来細胞または非ミュラー管由来細胞の同定）、ならびに臨床診断（すなわち、癌性の子宮細胞、子宮頚部細胞、卵管細胞、または膣細胞の同定）が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
免疫原としての別の用途は、異種レシピエントにおける全体的な免疫応答を調整することである。当該分野で十分に実証されているように、異種レシピエントに導入された細胞または器官などの外来物質は、種々の免疫応答を誘導し得る。免疫応答は、拒絶（例えば、器官移植）、Ｔ細胞活性化（例えば、交差プライミング）、アネルギー、耐性の形態であり得る。全体的な免疫応答は、全身性または局所性であり得る。局所性免疫応答が望ましい場合（例えば、性腺領域）、ミュラー管上皮細胞などの免疫原を性腺領域に有効量で導入する。有効量を、漸増する量のミュラー管上皮細胞を異種レシピエントに導入してその後の免疫応答を監視する段階的様式で確定することができる。全体的な免疫応答（例えば、抗体産生、サイトカイン産生、Ｔ細胞増殖、アネルギー、耐性など）を、多数の方法（ＥＬＩＳＡ、増殖アッセイ、細胞表面マーカーを使用したフローサイトメトリー、および免疫組織化学が含まれるが、これらに限定されない）によってモニターすることができる。
【００５８】
（薬物発見のためのミュラー管上皮細胞の使用）
ミュラー管上皮細胞の別の用途は、薬物発見に関する。前分化多能性ミュラー管上皮細胞が開示の様式で単離および培養されていないので、ミュラー管上皮細胞集団は、これまで発見または特徴付けられていなかったタンパク質を分泌することができる。血清を使用した従来の培養技術は、タンパク質の分泌を阻害し得る。あるいは、タンパク質は、分泌され、血清生体分子と相互作用するので、機能、構造、または活性が変化し得る。ミュラー管上皮細胞によって分泌されたタンパク質は、血清生体分子からの干渉が最小であるので、より生理学的および位相的に正確であり得る。したがって、ミュラー管上皮細胞によって分泌されたタンパク質を、薬物開発のための標的として使用することができる。１つの実施形態では、インビボでミュラー管上皮細胞および／またはそれから分化した細胞上に特異的タンパク質が標的されるように薬物を作製することができる。薬物の結合により、ミュラー管上皮細胞の子宮、卵管、子宮頚部、および膣細胞への分化を促進することができる。このアプローチは、子宮、卵管、子宮頚部、または膣細胞新生が望ましい場合（例えば、一部または完全な子宮摘出術もしくは組織損傷の場合）に有用であり得る。
【００５９】
（細胞治療のためのミュラー管（ｔｒａｃｔ）上皮細胞の使用）
別の用途では、ミュラー管上皮細胞株は細胞治療に使用される。ミュラー管上皮細胞および底から誘導される細胞の移植は、このような細胞治療の一例である。成熟な性腺細胞（例えば、子宮、頸部、卵管、子宮内膜および膣細胞）が所望される場合、本発明のミュラー管由来細胞は、子宮、頸部、卵管、子宮内膜および膣細胞に分化し得ることから、有用である。この用途の実施のために、開示の方法を使用してミュラー管上皮細胞を単離し、無血清の栄養規定培地中で培養する。ミュラー管上皮細胞を、基材で被覆したかまたは被覆していないかのいずれかの組織培養容器上で増殖させて、ミュラー管上皮細胞の単層凝集体を得る。ミュラー管上皮細胞凝集体を、標準的なインキュベーション条件下で、少なくとも約１細胞周期の継代、より好ましくは少なくとも約２細胞周期の継代、より好ましくは少なくとも約３細胞周期の継代増殖させる。次いで、ミュラー上皮凝集体をレシピエントに投与して、分化させ得る。あるいは、ミュラー上皮凝集体を、遺伝子治療の細胞キャリアとして使用し得、ここで、ミュラー細胞は１つ以上の遺伝子でトランスフェクトされ、送達デバイスに封入され、次いでレシピエントに投与される。別の実施形態では、ミュラー細胞凝集体を腎臓嚢（ｃａｐｓｕｌｅ）下に置き、子宮、頸部、卵管および膣細胞に分化させる。別の実施形態では、ミュラー細胞凝集体を、免疫系の応答を制限するための、細胞を含み、他の細胞との接近を制限するデバイス（すなわち、Ｔｈｅｒａｃｙｔｅ（登録商標））中で使用する。
【００６０】
（ヒト組織モデルを作製するためのミュラー管上皮細胞の使用）
ミュラー管上皮細胞の別の用途は、非ヒト哺乳動物においてヒト組織モデルを作製することである。ミュラー管上皮細胞凝集体を、間葉組織の頂部に置いて移植片組換え体を形成させる。間葉組織は、ミュラー管由来組織または非ミュラー管由来組織のいずれかであり得、そしてミュラー管上皮細胞が単離された異なる種由来であり得る。この実施例の実行において、ヒトミュラー管上皮細胞を、ラット間葉組織尿生殖の頂部に置いて移植片組換え体を形成させる。当業者は、最初に本明細書中に開示の方法を使用してヒトミュラー管上皮細胞を単離し、その後異なる器官由来の間葉組織と組み合わせることによる、段階的様式で最適な組み合わせを決定し得る。いくつかの実施形態では、異なる種（例えば、ラット）を、ヒトミュラー管上皮細胞と組み合わせて間葉組織の供給源として使用する。異種の種の使用は、ヒト特異的マーカーを使用して分化したミュラー管由来細胞の同一性を確定することを可能にする。ラット間葉組織を使用した場合、偽陽性の可能性が減少する。同様に、ミュラー管由来の間葉組織を超える尿生殖間葉組織の使用により、分化したミュラー管由来細胞の同定における偽陽性の可能性が減少する。間葉組織上に置いたミュラー管上皮細胞球を含む移植片組換え体を、軟性基材（例えば、寒天）上で、好ましくは約半日〜約３日間、より好ましくは約１日間培養し、次いで、レシピエント哺乳動物中の腎臓嚢下に置く。可能なレシピエント哺乳動物には、マウスおよびラットが挙げられるが、これらに限定されない。典型的には、移植片の状況では、ドナー組織は、レシピエントの免疫系による攻撃に脆弱である。移植片拒絶を緩和するために、いくつかの技術を使用し得る。１つの方法は、レシピエントに致死用量以下の放射線を照射して移植片を攻撃し得る免疫細胞を破壊することである。別の方法は、レシピエントにシクロスポリンまたは他のＴ細胞免疫抑制薬を提供することである。レシピエント哺乳動物としてマウスを使用して、移植片拒絶を緩和するための広範な種々の方法が可能である。１つのこのような方法は、免疫不全マウス（ヌードまたは重症複合型免疫不全すなわちＳＣＩＤ）の使用である。作業例では、ヒトミュラー管上皮細胞球をラット尿生殖間葉組織上に置き、そして、免疫不全マウスの腎臓嚢下に置く。移植片組換え体は、レシピエント内で約１〜約５２週間、好ましくは約５週間〜約４０週間、さらにより好ましくは約６週間〜約８週間維持し、その後移植片を回収し、そしてミュラー管上皮細胞分化について分析する。いくつかの場合、移植片の小部分が分析に必要である。本明細書中に開示されるような、ＭＴＥ細胞およびそれから誘導された細胞に特異的なマーカーを、免疫組織化学分析で使用し得る。さらに、１つ以上のこれらのマーカーの組み合わせを細胞の形態学と組み合わせて使用して、移植の有効性を確定し得る。
【００６１】
１つの実施形態では、ヒトミュラー管由来モデルを、ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全）マウスにおいて生成し得る。このヒトミュラー管由来モデルを、本明細書中に開示した方法を用いて単離および培養したヒトミュラー管上皮細胞の使用および移植片組換え体を作製するためのヒトミュラー管上皮細胞の利用によって作製し得る。次いで、移植片組換え体を、マウスの腎臓嚢下に置く。腎臓嚢下での移植から約１〜１０週間後、好ましくは約６〜８週間後に、この移植片またはその一部を回収し、そして免疫組織化学によって分析した。使用され得るミュラー管由来細胞上の細胞表面マーカーとしては、ＣＫ１、ＣＫ５、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ１０、ＣＫ１１、ＣＫ１３、ＣＫ１５、ＣＫ１６、ＣＫ１８およびＣＫ１９ならびにビメンチンが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で開示される抗ＣＫ抗体または抗ビメンチン抗体は、組織モデル系の有効性を分析するために使用される。あるいは、ミュラー管由来組織の分化した細胞のレセプター（例えば、エストロゲンレセプターおよびプロゲステロンレセプター）に特異的なマーカーが使用される。ミュラー管上皮細胞の分化の結果を評価するためのなお別の方法は、形態によるものである。ミュラー管上皮細胞は、多角形または卵形の形状の外観を有するが、分化した細胞型は、当業者に周知の上皮細胞の形態に一致する形態を有する。形態は、より完全な評価のために細胞表面マーカーと組み合わされ得る。
【００６２】
（バイオアッセイにおけるミュラー管上皮細胞の使用）
本明細書中に開示のミュラー管上皮細胞を、種々のバイオアッセイに使用し得る。１つの使用において、ミュラー管上皮細胞を、生物学的因子が分化に必要であることを決定するために使用する。異なる生物学的化合物（ホルモン、特異的増殖因子など）と組み合わせた段階的様式におけるミュラー管上皮細胞の使用によって、１つ以上の特異的な生物学的化合物は子宮細胞への分化を誘導することを見出し得る。同一の段階的な組み合わせを使用して、１つ以上の特異的生物学的化合物が、卵管細胞ならびに頸部細胞および膣細胞について同様に、これらの細胞への分化を誘導することを見出し得る。バイオアッセイにおけるミュラー管上皮細胞の他の使用は、ディファレンシャルディスプレイ（すなわち、ｍＲＮＡのディファレンシャルディスプレイ）およびミュラー管上皮細胞由来の分泌タンパク質を使用したタンパク質−タンパク質相互作用である。タンパク質−タンパク質相互作用を、酵母ツーハイブリッドシステムなどの技術を使用して確定し得る。ミュラー管上皮細胞由来のタンパク質を使用して、ミュラー管上皮細胞と相互作用する他の未知のタンパク質または他の細胞型を同定し得る。これらの未知のタンパク質は、以下の１つ以上であり得る：成長因子、ホルモン、酵素、転写因子、翻訳因子、および腫瘍抑制因子。ミュラー管上皮細胞およびこれらの細胞が形成するタンパク質−タンパク質相互作用を含むバイオアッセイならびにタンパク質−タンパク質またはさらに細胞−細胞接触の効果を使用して、周囲組織（間葉組織など）がどのようにしてミュラー管上皮細胞の分化に寄与するのかを確定し得る。
【００６３】
以下の実施例は、ミュラー管上皮細胞の単離、特徴づけ、および使用の詳細な説明を提供する。これらの実施例は、本発明をいずれにも制限することを意図しない。
【００６４】
（実施例）
（実施例１  ミュラー管上皮細胞の単離）
在胎齢１７〜２５週の間のヒト胎児ミュラー管組織を、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｔ  Ａｌａｍｅｄａ  ｃｏｕｎｔｒｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから得た。組織到着後直ぐに、ミュラー管を、余分な結合組織を除去し、そして解剖顕微鏡下でカミソリの刃またはハサミで小切片に切断した。
【００６５】
各サンプル由来のミュラー管の切片を、Ｔ７５組織培養フラスコにプレートした。この培養培地は、３７℃および５％ＣＯ２での、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１０μｇ／ｍｌ）、α−トコフェロール（５μｇ／ｍｌ）、およびアプロチニン（５μｇ／ｍｌ）を補充した無血清Ｆ１２／ＤＭＥＭであった。付属の因子は、添加しなかった。管の切片の上皮細胞は、増殖し、移動し、そして初代培養の最初の一週間にプラスチック表面に付着するようになった。いくつかの切片は、培養培地中に浮遊する、封入された拡大した嚢を形成した。この組織切片のほとんどは、懸濁液中に保持された。フラスコに付着した上皮細胞は増殖し、大きいコロニーを形成した。コロニーの大きさは、約２週間で直径約１〜２ｃｍに達した。その時点で、細胞を、増殖のために継代培養し得た。
【００６６】
ＭＴＥ細胞のコロニーを、０．１容積％のコラゲナーゼ−ディスパーゼを用いて処理した。この酵素混合物は、小さい単層の凝集体細胞を保ちながら、細胞をプラスチックの表面から離脱させた。酵素を栄養培地で洗浄した後、このＭＴＥ細胞を１：１０の分割で栄養培地中にプレートした。このプレーティング効率は低いが、細胞の画分は継代培養後１週間で付着するようになり、そして２〜３週間内でコンフルエントな細胞培養物をもたらした。この培養培地を、週毎に補充した。塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）およびフォルスコリンは、細胞増殖を刺激し得たが、この増殖因子は細胞の寿命を短縮させるようであった。細胞を、この方法で４〜５継代ほど継代した。
【００６７】
（実施例２  ミュラー管上皮細胞の特徴付け）
位相差顕微鏡下で、初代培養中で増殖した細胞のコロニーを、形態に基づいて全て上皮細胞であると同定した。これらの細胞は、互いに密着し続けた。ＭＴＥ細胞によって示された細胞の形態は、２つの型のものであった。１つの型は密集した上皮細胞のコロニーであった（図１Ａに示す）。これらのＭＴＥ細胞は、活性な細胞分裂を経た。ＭＴＥ細胞は、小さいように見えた。高密度において、ＭＴＥ細胞は、ドーム様の構造を形成する傾向があった（図１Ｂに、矢印によって示される）。このドーム様の構造は、ＭＴＥ細胞が隣接する細胞との間で閉塞性の連結を形成したことを示した。さらに、ＭＴＥ細胞は、ドームの中空の管腔にタンパク質を分泌した。さらに、この細胞は、高密度においてプラスチックの表面に付着した底の層の頂部上に丸い細胞の第二の層を形成し得た。
【００６８】
観察された他の型の形態は、細長い突起を伴う滑らかな輪郭を有するＭＴＥ細胞であった（図１Ｃに示す）。この細胞の形態学はまた、ヒト成体の子宮内膜由来の子宮内膜上皮細胞培養物において観察された。これは、おそらく、ミュラー管が、多くの型の上皮細胞（すなわち、卵管、子宮、膣および頸部）を生じるという事実に起因する。
【００６９】
（実施例３  サイトケラチンおよびビメンチンについてのＭＴＥ細胞の免疫組織化学的染色）
ＭＴＥ細胞の単層培養物を、３％パラホルムアルデヒドで約１時間、インサイチュで固定した。あるいは、ＭＴＥ細胞の単層培養物を、−２０℃で約５秒間、エタノールで固定して空気乾燥させ得た。固定液をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、続いて細胞を、ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中の５％ヤギ血清および０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で約３０分間インキュベートし、次いで、一次抗体中で約１時間インキュベートし、次いで、抗マウスＩｇ−西洋ワサビペルオキシダーゼと共に約１時間インキュベートした。各工程の間には、ＰＢＳリンスを伴った。使用した一次抗体は、供給者によって推奨された希釈での、Ｓｉｇｍａからの抗サイトケラチンクローン４．６２、８．１２、８．１３、および抗ビメンチンクローンＶＩＭ１３．２であった。ＭＴＥ細胞の染色を抗体によって可視化するため、ＭＴＥ細胞を、Ｓｉｇｍａから錠剤で調製されるペルオキシダーゼ基質ＤＡＢ／Ｈ２Ｏ２中でインキュベートした。褐色の生成物は、特定の抗原の存在の指標であった（図２）。ＭＴＥ細胞におけるサイトケラチンの染色は、ＭＴＥ細胞におけるビメンチンの染色よりかなり強力であった。
【００７０】
（実施例４  ＭＴＥ細胞におけるＨＯＸ遺伝子転写物の検出）
未成熟のミュラー管上皮細胞は、３つ全てのＨｏｘ遺伝子、Ｈｏｘａ９、Ｈｏｘａ１０およびＨｏｘａ１１を発現する。Ｔａｙｌｏｒ  Ｈ．Ｓ．ら、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ５７：１３３８−１３４５（１９９７）。Ｈｏｘａ９は、卵管細胞に限定される；Ｈｏｘａ１０は、子宮内膜細胞に限定される；そしてＨｏｘａ１１は、頸部内上皮細胞に限定される。Ｈｏｘ遺伝子の発現を試験するため、５回の継代の後、ＭＴＥ細胞から総ＲＮＡを抽出し、そしてこのＲＮＡをＨｏｘ特異的なプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。使用したプライマーは、以下：
【００７１】
【化１】
0004748700.tif 000002
であった。
【００７２】
ＰＣＲ産物を、２％のアガロースゲルで分離し、そしてＰＣＲバンドを、エチジウムブロマイドを用いてアガロースゲルを染色することによって検出した。３つ全てのＨｏｘ遺伝子（Ｈｏｘａ９、Ｈｏｘａ１０およびＨｏｘａ１１）は、ＭＴＥ細胞によって発現された（図３に示す）。この結果をさらに、インサイチュハイブリダイゼーションによって確認した。
【００７３】
（実施例５  ヒト組織モデルを作製するためのまたは細胞治療のためのＭＴＥ細胞の使用）
３回の継代後に単層の培養物から収集したＭＴＥ細胞を、ラット尿生殖洞間葉組織と組み合わせて組織移植片組換え体を作製した。この移植片組換え体を、約２４時間寒天プレート上で培養した。その後、この移植片組換え体を、ヌード（重症複合型免疫不全すなわちＳＣＩＤ）マウスの腎臓嚢の下に移植した。このインプラントを、移植片組換え組織を摘出し、組織学によって分析する前に、約２ヶ月成長させた。この結果は、ＭＴＥ細胞が、子宮内膜または卵管に類似の構造を形成したことを示した（図４）。
【図面の簡単な説明】
本特許のファイルは、カラーで制作された少なくとも１つの図面を含む。カラーの図面をつけたこの特許のコピーは、請求および必要な料金の支払いに応じて特許商標庁により提供される。
【図１】  図１Ａは、緊密な上皮細胞コロニーとして位相差顕微鏡下で見られるミューラー管上皮（ＭＴＥ）細胞を示す。図１Ｂは、ＭＴＥ細胞がドーム様構造（矢印で示される）を形成する場合に培養物中で高密度の、位相差顕微鏡下で見られるＭＴＥ細胞を示す。図１Ｃは、位相差顕微鏡下で見られる、滑らかな細胞輪郭および細長い突起を有するＭＴＥ細胞を示す。この細胞形態は、子宮内膜上皮細胞培養物に対して見られるものと似ている。
【図２】  図２は、ＭＴＥ細胞上のいくつかのマーカーについての、免疫ペルオキシダーゼ染色の顕微鏡写真を示す。図２Ａは、サイトケラチン１９についてのＭＴＥ細胞の染色を示す。図２Ｂは、サイトケラチン１０、１１、および１８についてのＭＴＥ細胞の染色を示す。図２Ｃは、サイトケラチン１３および１６についてのＭＴＥ細胞のサイトケラチン染色を示す。図２Ｄは、ビメンチンについてのＭＴＥ細胞の染色を示す。
【図３】  図３は、ＲＴ−ＰＣＲアッセイの結果を示し、ここでＨｏｘａ９、Ｈｏｘａ１０、およびＨｏｘａ１１の遺伝子に対して特異的なＰＣＲプライマーを用いて、ＭＴＥ細胞から抽出した総ＲＮＡにおいてＨＯＸ遺伝子転写物を検出した。矢印は、ＨＯＸ遺伝子転写物のバンドの予測サイズを示す。
【図４】  図４は、ヌードマウスに移植されたミューラー管上皮細胞移植片（組換え体）の組織学的分析の結果を示す。ＭＴＥ細胞は、子宮内膜および卵管に似た構造を形成した。「Ｍ」は間葉の一部を示し、「Ｌ」は内腔を示し、長い矢印は、先端の上皮の位置を示し、そして短い矢印は、腺上皮の位置を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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