(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケモカインに対するＣＣＸ  ＣＫＲの結合のモジュレーターを同定するための方法であって、以下：
（ａ）単離されたＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドもしくは組換えＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドおよび該ケモカインを、試験化合物の存在下で接触させる工程であって、ここで、該ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドは、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むか、またはそのフラグメントもしくは改変体であり、ここで、該改変体は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、そして（ｉｉ）該試験化合物の非存在下で該ケモカインに結合し得、そして該ケモカインは、ＥＢＩ−１リガンドケモカイン（ＥＬＣ）、二次的リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）、胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、ＢＬＣ、ＣＴＡＣＫ、ｍＭＩＰ−１γおよびｖＭＩＰＩＩからなる群より選択される、工程、ならびに
（ｂ）（ａ）における該ケモカインおよび該ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドの結合レベルを、該試験化合物の非存在下における該結合レベルと比較する工程、
を包含し、
ここで、結合における減少が、該試験化合物は結合のインヒビターであることを示し、そして結合における増加が、該試験化合物は結合のエンハンサーであることを示す、方法。
【請求項２】
前記接触させる工程が、前記ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドを発現する細胞を接触させることを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ケモカインが標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試験化合物が標識されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標識が、蛍光標識、化学発光標識、アイソトープ標識および酵素標識からなる群より選択される、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドが細胞画分の部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＣＣＸ  ＣＫＲ活性のモジュレーターを同定する方法であって、
（ａ）ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドを発現する細胞を、ケモカインの存在下で試験化合物と接触させる工程であって、ここで、該ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドは、（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むか、またはそのフラグメントもしくは改変体であり、ここで、該改変体は、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、そして（ｉｉ）該試験化合物の非存在下で該ケモカインに結合し得、そして該ケモカインは、ＥＢＩ−１リガンドケモカイン（ＥＬＣ）、二次的リンパ組織ケモカイン（ＳＬＣ）、胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、ＢＬＣ、ＣＴＡＣＫ、ｍＭＩＰ−１γおよびｖＭＩＰＩＩからなる群より選択される、工程、ならびに
（ｂ）該試験化合物の存在下での生物学的活性の調節を検出する工程を包含し、ここで、該生物学的活性の調節は該試験化合物がＣＣＸ  ＣＫＲ活性のモジュレーターであることを示し、そしてここで該生物学的活性は、細胞質ゾルの遊離カルシウムまたは走化性の変化である、方法。
【請求項８】
前記ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドは、組換えポリペプチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ケモカインはＥＬＣである、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ケモカインはＳＬＣである、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１１】
前記ケモカインはＴＥＣＫである、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１２】
前記ケモカインはＢＬＣである、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１３】
前記ケモカインはＣＴＡＣＫである、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１４】
前記ケモカインはｍＭＩＰ−１γである、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１５】
前記ケモカインはｖＭＩＰＩＩである、請求項１または７に記載の方法。
【請求項１６】
前記改変体は、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するか、または前記改変体は、配列番号２に対して少なくとも９８％の配列同一性を有する、請求項１または７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ヒトケモカインレセプターに関し、そしてこのレセプターおよびそのリガンドに媒介される生理学的および病理学的な状態を診断および治療するために有用な組成物および方法に関する。本発明は、生物医学的な適用を見出す。
【０００２】
（関連の出願の相互参照）
本願は、米国仮特許出願第６０／１５９０１５号（１９９９年１０月１２日出願）、６０／１５９２１０号（１９９９年１０月１３日出願）、６０／１７２９７９号（１９９９年１２月２０日出願）、６０／１７３３８９号（１９９９年１２月２８日出願）、および６０／１８６６２６号（２０００年３月３日出願）から優先権を主張する。前述の出願それぞれの開示は、本明細書中で全体としておよび全ての目的のために、明確に参照として援用される。
【０００３】
（発明の背景）
ケモカインは、炎症応答反応、白血球輸送、新脈管形成、および他の細胞の移動および活性化に関連する生物的プロセスにおいて重要な役割を果たすサイトカインのクラスである。ケモカインは病理的な状態において、走化性および炎症のメディエイターとして役割を果たす。例えば、慢性関節リウマチに罹患した患者の滑液中では、他の関節疾患に罹患した患者の滑液よりも、ケモカインＭＣＰ−１の濃度がより高くなる。
【０００４】
公知のケモカインは、代表的にはシステインモチーフの配置に基く４つのサブファミリーの中の１つに割り当てられる。例えば、いわゆるαケモカインでは、（アミノ末端から始まる）４つのシステインの最初の２つのシステインが、介在するアミノ酸により分離されている（すなわち、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフを有する）。βケモカインは、最初の２つのシステインの間に介在アミノ酸が存在しないことにより特徴付けられる（すなわち、Ｃ−Ｃモチーフを含む）。より小さいγケモカインファミリーおよびδケモカインファミリーは、単一のＣ残基（γ）または３つの残基により分離された１対のシステイン（δ；すなわち、ＣＸ3Ｃモチーフを含む）により特徴付けられる。ケモカインに関する近年の総説については、Ｗａｒｄら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９：１−１１、およびＢａｇｇｉｏｌｉｎｉら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：５６５−５６８、ならびに本明細書中で引用される参考文献を参照のこと。
【０００５】
ケモカイン活性は、レセプターにより媒介され得る。例えば、Ｃ−Ｃケモカインについてのいくつかの７回膜貫通ドメインＧタンパク質結合レセプターがクローニングされている：ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、およびＭＩＰ−５を認識するＣ−Ｃケモカインレセプター−１（Ｎｅｏｔｅら、１９９３、Ｃｅｌｌ、７２：４１５−４１５）；ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、およびＭＣＰ−４、またはＭＣＰ−５についてのレセプターであるＣＣＲ２；ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＩＰ−５、およびエオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）についてのレセプターであるＣＣＲ３；ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、およびＲＡＮＴＥＳについてのレセプターであるＣＣＲ５；ＭＤＣまたはＴＡＲＣについてのレセプターであるＣＣＲ４；ＬＡＲＣについてのレセプターであるＣＣＲ６；およびＳＬＣおよびＥＬＣ（ＭＩＰ−３β；Ｓａｌｌｕｓｔｏら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １９：５６８およびＷａｒｄら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９：１−１１に総説される）についてのレセプターであるＣＣＲ７。
【０００６】
走化性および炎症のメディエイターとしてのケモカインおよびそれらのレセプターの重要性に起因して、炎症応答および免疫応答の調節を容易にするために、このケモカインレセプターファミリーのメンバーを同定、単離、および特徴付けする必要ある。
【０００７】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は新規のケモカインレセプターであるＣＣＸ  ＣＫＲを提供する。１つの実施形態において、本発明は単離されたＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチド、実質的に純粋なＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチド、または組換えＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチド、もしくはそれらの免疫原性のフラグメントを提供する。１つの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号２と同一のアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、このポリペプチドは、保存的な変異により配列番号２と異なるアミノ酸配列（配列番号２と少なくとも６０％、８０％、または９０％同一）、および／または免疫学的に、配列番号２によりコードされる全長ポリペプチドと交差反応性であるアミノ酸配列を有する。１つの実施形態において、本発明のこのポリペプチドは融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、ケモカイン（例えば、ＥＬＣ、ＳＬＣ、ＴＥＣＫ、ＢＬＣ、またはｖＭＩＰＩＩ）と結合するようなＣＣＸ  ＣＫＲの活性を有する。１つの実施形態において、このポリペプチドは、高い親和性でＥＬＣ、ＳＬＣ、およびＴＥＣＫと結合する。
【０００８】
関連する局面において、本発明は、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、またはＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドをコードする配列に相補的な単離されたポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、このポリペプチドは、配列番号１と同一の、または配列番号１と厳密に相補的な、少なくとも１０、１５、２５、５０、または１００個の隣接する塩基を有する。種々の実施形態において、このポリヌクレオチドは、配列番号１の全長の配列であり、本発明のＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチド（例えば、配列番号２の配列またはそれらのフラグメントを有する）をコードし、高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で選択的に配列番号１のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする。本発明のこのポリヌクレオチドは、プロモーターと作動可能に連結され得る。本発明は、本発明のＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドを発現する組換えベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。１つの局面において、本発明は、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドの活性（例えば、ケモカイン結合活性）を有するポリペプチドをコードする配列を有するポリヌクレオチドを提供する。そしてそのポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号１または配列番号３の配列を有するポリヌクレオチド；または（ｂ）ストリンジェントな条件下で（ａ）とハイブリダイズするポリヌクレオチド；あるいは（ｃ）（ａ）または（ｂ）で定義される配列について遺伝暗号の結果として縮重しているポリヌクレオチド配列、である。
【０００９】
本発明はさらに、本発明の組換えＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドを含む細胞（例えば、細菌細胞、真核生物細胞、哺乳動物細胞、またはヒト細胞）を提供し、そしてこの組換えＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドを含む細胞を、このポリペプチドが発現する条件下で培養することにより、ＣＣＸ  ＣＫＲタンパク質、ＣＣＸ  ＣＫＲペプチド、またはＣＣＸ  ＣＫＲ融合タンパク質を産生する方法を提供する。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、本発明のＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドに特異的に結合する抗体、抗体フラグメント、または結合フラグメント（ファージディスプレイにより産生する）を提供する。この抗体はモノクローナル抗体であり得、そして少なくとも約１０8Ｍ-1の親和性で結合し得る。本発明はまた、この抗体を分泌し得る単離された細胞または単離されたハイブリドーマを提供する。この抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。
【００１１】
１つの局面において、本発明は、（ａ）このサンプルと、この遺伝子産物に特異的に結合するプローブとを接触させ（このプローブとこの遺伝子産物が複合体を形成する）、そしてその複合体の形成を検出することにより；または（ｂ）生物学的サンプル中のこの遺伝子を特異的に増幅し（前述の遺伝子産物はポリヌクレオチドである）、そして増幅産物を検出することにより、サンプル中のＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子産物を検出する方法を提供する；ここで、生物学的サンプル中のこの複合体の形成またはこの増幅産物の存在は、ＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子産物の存在と相関する。１つの実施形態において、この遺伝子産物はポリペプチドであり、そしてプローブは抗体である。異なる実施形態において、この遺伝子産物は、ＲＮＡであり、このプローブはポリヌクレオチドである。
【００１２】
本発明はまた、ケモカインおよびＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドまたはそれらのフラグメントに結合するリガンドを接触させ、試験化合物を添加し、そしてこのケモカインの結合における任意の減少を測定することにより、化合物が直接的にＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドと相互作用するか否かを決定する方法を提供する。種々の実施形態において、このケモカインは、ＥＬＣ、ＳＬＣ、ＴＥＣＫ、ＢＬＣ、ｍＣＴＡＣＫ、ｍＭＩＰ−１γ、またはｖＭＩＰＩＩもしくはＣＣＸ  ＣＫＲにより結合される天然に存在するリガンドである。いくつかの実施形態において、このケモカインは放射性標識される。従って、１つの局面において、本発明は、（ａ）試験化合物の存在下で、コードされたＣＣＸ  ＣＫＲのポリペプチドおよびケモカインを接触させることにより、および（ｂ）試験化合物の非存在下での結合レベルと、（ａ）におけるケモカインとポリペプチドとの結合レベルを比較する（結合の減少は、試験化合物が結合のインヒビターであることを示し、そして結合の増大は、試験化合物が結合のエンハンサーであることを示す。）ことにより、ケモカインに対するＣＣＸ  ＣＫＲの結合のモジュレーターを同定する方法を提供する。１つの実施形態において、このケモカインは、ＥＬＣ、ＳＬＣ、ＴＥＣＫ、ＢＬＣ、ｍＣＴＡＣＫ、ｍＭＩＰ−１γ、またはｖＭＩＰＩＩである。１つの実施形態において、このＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドは細胞により発現される。
【００１３】
関連する局面において、本発明は、組換えＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドを発現する細胞と試験化合物を接触させ、そしてこの試験化合物の存在下では生じるが非存在下では生じない、生物学的な効果をアッセイすることにより、ＣＣＸ  ＣＫＲ活性のモジュレーターを同定する方法を提供する（生物学的な効果を誘導する試験化合物は、ＣＣＸ  ＣＫＲ活性のモジュレーターとして同定される）。１つの実施形態において、このアッセイされる生物学的な効果は、レセプターのインターナリゼーションである。いくつかの実施形態において、この方法はまた、アッセイの間のレセプター（例えば、ＥＬＣ、ＳＬＣ、ＴＥＣＫ、ＢＬＣ、ｍＣＴＡＣＫ、ｍＭＩＰ−１γ、またはｖＭＩＰＩＩ）に結合するケモカインとこの細胞とを接触させる工程を包含する。
【００１４】
別の関連する局面において、本発明は、ＣＣＸ  ＣＫＲ活性（例えば結合）のモジュレーターを薬学的な用途のために処方することにより、薬学的組成物を作製するプロセスを提供する。
【００１５】
本発明はまた、ＣＣＸ  ＣＫＲ媒介性の疾患および状態の処置に有用な化合物を、この化合物がＣＣＸ  ＣＫＲと相互作用するか否かを決定することにより、同定するための方法を提供する。
【００１６】
別の局面において、本発明は、哺乳動物細胞または哺乳動物組織中のＣＣＸ  ＣＫＲの活性または発現を減少または増加させることによるか、またはこの哺乳動物にＣＣＸ  ＣＫＲ機能のモジュレーターを投与することにより、哺乳動物におけるＣＣＸ  ＣＫＲ媒介性の状態を処置する方法を提供する。種々の実施形態において、ＣＣＸ  ＣＫＲ機能のモジュレーターはケモカイン（例えばＥＬＣ）とＣＣＸ  ＣＫＲとの結合のインヒビターであるか、またはケモカイン（例えばＥＬＣ）とＣＣＸ  ＣＫＲとの結合のエンハンサーである。１つの実施形態において、本発明は、ＣＣＸ  ＣＫＲとケモカインとの結合を阻害する化合物の有効量を投与することにより、ＣＣＸ  ＣＫＲ媒介性の状態または疾患の処置が必要な被験体における、そのような状態または疾患を治療する方法を提供する。種々の実施形態において、このＣＣＸ  ＣＫＲ媒介性の状態または疾患は、炎症性またはアレルギー性の疾患、自己免疫疾患、移殖片拒絶、癌、新形性疾患、網膜障害、黄斑変性、感染症、または免疫抑制性疾患である。
【００１７】
（詳細な説明）
（Ｉ．定義）
以下の定義は、本発明の実施において読者を補助するために提供される。
【００１８】
用語「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」とは、本明細書中で用いられる場合、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドをコードする遺伝子（すなわち、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）の天然に存在する代替形態を言う。対立遺伝子は、変異（すなわち、核酸配列の変化）から生じ、そしてしばしば、改変および／または示差的に調節されたｍＲＮＡまたはポリペプチド（それらの構造および／または機能は、改変されてもされなくてもよい）を産生する。対立遺伝子を生じる共通の変異的な変化は、一般的には、ヌクレオチドの天然での欠失、付加または置換に基き、これらはそのコードされたアミノ酸に影響を与えても与えなくてもよい。これらの型の変化のそれぞれは、単独で起こり得るか、他の変化と組み合わせて起こり得るか、または所定の遺伝子、染色体、もしくは他の細胞性ポリヌクレオチド内で１回以上起こり得る。任意の所定の遺伝子は、対立遺伝子の形態を有さないかもしれないし、あるいは、１つまたは多数の対立遺伝子を有する。本明細書中で用いられる場合、用語「対立遺伝子」とは、遺伝子またはその遺伝子から転写されたｍＲＮＡのいずれかあるいは両方を言う。
【００１９】
用語「アミノ酸」とは、本明細書中で用いられる場合、天然に存在するアミノ酸および合成的なアミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を言う。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によりコードされたアミノ酸、ならびに後に改変されるそれらのアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、およびＯ−ホスホセリン）である。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基が結合するα炭素、を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を言う。そのようなアナログは、修飾されたＲ基を有する（例えば、ノルロイシン）か、または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造は保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化学化合物を言う。
【００２０】
用語「アンチセンス配列」とは、ＲＮＡ配列と相補的な配列を有するポリヌクレオチドを言う。これらの用語は特に、ｍＲＮＡまたはそれらの一部に結合し、リボソームによるｍＲＮＡの転写をブロックする核酸を含む。一般的にアンチセンス法は当該分野で周知である（ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１２６３３号、およびＮｉｅｌｓｅｎら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４：１４９７；ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ、Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ、Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ（１９９３、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ）を参照のこと）。
【００２１】
用語「組成物」とは、本明細書中で用いられる場合、特定の量の特定の成分を含む産物、ならびに、特定の量の特定の成分の組み合わせから直接的にかまたは間接的に生じる任意の産物を含むことを意図する。
【００２２】
用語「保存的置換」とは、ポリペプチドについて記載される場合、ポリペプチドの活性を実質的に変化させない、ポリペプチドのアミノ酸組成における変化、すなわち、重要なアミノ酸の置換でさえ実質的に活性を変化させないような、同様の性質を有する他のアミノ酸とのアミノ酸の置換を言う。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当該分野で周知である。以下の６つのグループは各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｌ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８４、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙもまた参照のこと）。
【００２３】
上記に定義した保存的置換に加えて、アミノ酸残基の他の改変で、「保存的に改変された改変体」を生じ得る。例えば、陽性であるか陰性であるかに関わらず、全ての荷電アミノ酸は互いに置換とみなし得る。さらに保存的に改変された改変体はまた、そのコードされた配列の１つのアミノ酸または数パーセントのアミノ酸（例えば、しばしば、５％未満）を置換、付加または欠失する、個々の置換、欠失、または付加から生じ得る。さらに保存的に改変された改変体は、ネイティブまたは野生型の遺伝子により使用されるアミノ酸に対するコドンを、同じアミノ酸に対する異なるコドンと置換することによる組換えポリペプチドから生製され得る。
【００２４】
用語「制御エレメント」または「調節配列」は、エンハンサー、プロモーター、転写ターミネーター、複製起点、染色体組み込み配列、５’および３’非翻訳領域、それらと相互作用して転写および翻訳を行うポリペプチドまたは他の生体分子を含む。真核細胞について、制御配列は、プロモーターおよび好ましくはエンハンサー（例えば、免疫ブロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウィルスに由来するエンハンサー）およびポリアデニル化配列を含み、そしてスプライシングドナー配列およびアクセプター配列を含み得る。用いられるベクター系および宿主に依存して、多くの適切な転写要素および翻訳要素（構成性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）が用いられ得る。ＣＣＸ  ＣＫＲについて言及する場合、ＣＣＸ  ＣＫＲコード配列と天然で結合しているプロモーター以外のプロモーターは、「異種」プロモーターと呼ばれ得る。
【００２５】
本明細書中で使用されるように、「誘導体化された」ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または核酸は、誘導体化置換基を含むオリゴおよびポリヌクレオチドをいう。いくつかの実施形態では、置換基は、相補的ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションに関して実質的に干渉しないものである。付随の化学置換基で修飾された誘導体化（例えば、以前に合成されたオリゴまたはポリヌクレオチドの修飾による、または合成の間の修飾塩基または骨格アナログの取り込みにより）されたオリゴまたはポリヌクレオチドが、代謝的に活性な真核細胞に導入されて、ＣＣＸ  ＣＫＲ  ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質に対してハイブリダイズし得、ここで、それらは、局所的ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質に対する改変または化学的修飾を生じる。あるいは、誘導体化されたオリゴまたはポリヌクレオチドは、ＣＣＸ  ＣＫＲ  ＤＮＡもしくはＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子産物と相互作用するか、またはＣＣＸ  ＣＫＲ  ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはタンパク質の発現もしくは機能を改変もしくは調整するＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドもしくはタンパク質と相互作用し得るか、もしくは改変し得る。例示の付着された化学置換基は、以下を包含する：ユーロピウム（ＩＩＩ）テキサフィリン、架橋剤、ソラレン、金属キレート剤（例えば、鉄／ＥＤＴＡキレート（鉄触媒開裂のため）、トポイソメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、リガーゼ、ホスホジエステラーゼ、光力学的ポルフィリン、化学療法薬（例えば、アドリアマイシン、ドキソルビシン）、インターカレート剤、塩基修飾剤、免疫グロブリン鎖、およびオリゴヌクレオチド。鉄／ＥＤＴＡキレート剤は、核酸配列の局所開裂が望ましい場合にしばしば使用される化学置換基である（Ｈｅｒｔｚｂｅｒｇら、１９８２，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １０４：  ３１３；  ＨｅｒｔｚｂｅｒｇおよびＤｅｒｖａｎ，  １９８４，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：  ３９３４；  Ｔａｙｌｏｒら、１９８４，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４０：  ４５７；  Ｄｅｒｖａｎ，  １９８６，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：  ４６４）。例示の付着化学は、以下を包含する：例えば、付随の反応性アミノ基を介する直接連結、（ＣｏｒｅｙおよびＳｃｈｕｌｔｚ，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：  １４０１，  これは、本明細書中に参考として援用される）および他の直接連結化学。しかし、ストレプトアビジン／ビオチンおよびジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン抗体連結もまた使用され得る。化学置換基を連結する方法は、米国特許第５，１３５，７２０号、同第５，０９３，２４５号および同第５，０５５，５５６号（これらは、本明細書中に参考として援用される）において提供される。他の連結化学は、実施者の判断で使用され得る。
【００２６】
本明細書中で使用されるように、「検出可能な標識」は、当該分野における通常の意味を有し、そして検出する（例えば、物理的特性または化学的特性に起因して）、分子の存在を示す、またはそれが共有結合するかもしくは他の結合を行っている別の分子の結合を可能にするために使用される、または使用できる原子（例えば、放射性核種）、分子（例えば、フルオレセイン）、または複合体をいう。用語「標識」はまた、基質において作用して検出可能な原子、分子、もしくは複合体を生じる、共有結合された分子または他に結合された分子（例えば、酵素のような生体分子）をいう。本発明における使用に適した検出可能な標識は、分光光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、化学的手段などによって検出可能な任意の組成物を包含する。
【００２７】
用語「エピトープ」は、抗体により認識される抗原における部位という、その通常の意味を有する。エピトープは、代表的には、ポリペプチド全体の小部分である、アミノ酸のセグメントである。エピトープは、構造的（すなわち、不連続）であり得る。すなわち、それらは、タンパク質フォールディングにより併置された一次配列の非連続部分によってコードされるアミノ酸から形成され得る。
【００２８】
用語「融合タンパク質」は、通常単一のアミノ酸配列で一緒に融合されない２つ（またはそれより多くの）異なる異種のポリペプチドから構成された複合ポリペプチド（すなわち、単一の連続したアミノ酸配列）をいう。従って、融合タンパク質は、これらの配列が、通常、天然に見られる単一のアミノ酸配列において同じ立体配置で一緒に見られないという条件で、２つの全体に異なるアミノ酸配列または２つの類似のもしくは同一のポリペプチド配列を含む単一のアミノ酸配列を含み得る。融合タンパク質は、組換え核酸方法を用いて（すなわち、組換え遺伝子融合産物（これら融合は、本発明のポリペプチドをコードするセグメントおよび異種ポリペプチドをコードするセグメントを含む）の転写および翻訳の結果として）または当該分野で周知の化学的合成方法によってのいずれかで、一般に調製され得る。
【００２９】
用語「遺伝子産物」は、遺伝子から転写されたＲＮＡ分子、または遺伝子によりコードされたもしくはＲＮＡから翻訳されたポリペプチドをいう。
【００３０】
本明細書で使用するように、ＩｇＧ抗体について「高親和力」との用語は、少なくとも約１０6Ｍ-1、より好ましくは少なくとも約１０8Ｍ-1、より好ましくは少なくとも約１０9Ｍ-1以上、例えば、１０12Ｍ-1以上まで、の会合定数（Ｋａ）をいう。しかし、「高親和力」結合は、他の抗体アイソタイプに対しては変動し得る。
【００３１】
用語「免疫原」および「免疫原性」は、当該分野における通常の意味を有する。すなわち、免疫原は、ヒトおよび動物への注入の際に適応免疫応答（ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を惹起し得る分子（例えば、ポリペプチドまたは他の抗原）である。
【００３２】
本明細書中で種々の形態で使用されるように、ケモカインレセプター活性の「モジュレーター」および「調整」との用語は、特定のケモカインレセプター、好ましくは、ＣＣＸ  ＣＫＲレセプターと関連した活性のアンタゴニズム、アゴニズム、部分的アンタゴニズム、および／または部分的アゴニズムを包含することが意図される。種々の実施形態において、「モジュレーター」は、ＣＣＸ  ＣＫＲ発現または活性を阻害または刺激し得る。
【００３３】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよび一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のそれらのポリマーをいう。特に限定されなければ、ポリヌクレオチド配列の開示は、相補配列もまた言及することが意図される。本明細書中で使用されるように、用語「ポリヌクレオチド」はオリゴヌクレオチドを包含する。
【００３４】
用語「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、およそ７ヌクレオチド以上、およびおよそ１００ヌクレオチド程度の多さの核酸配列をいい、これらは、プライマーまたはプローブとして使用され得る。オリゴヌクレオチドは、しばしば約１０および約５０ヌクレオチドの間の長さであり、よりしばしば約１２および約５０ヌクレオチドの間、非常にしばしば、約１５および約２５ヌクレオチドの間の長さである。
【００３５】
用語「作動可能に連結された」は、２つ以上のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）セグメントの間の機能的関係をいう：例えば、プロモーターまたはエンハンサーが、これが適切な宿主細胞または他の発現系において配列の転写を刺激する場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されている配列は、連続的であり、そしてシグナル配列の場合、連続し、かつ読み枠内にある。しかし、エンハンサーは、それらが転写を増強するコード配列に極めて接近して位置する必要はない。
【００３６】
用語「ペプチド模倣性」および「模倣性」は、本発明のＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドと実質的に同じ構造的特徴および機能的特徴を有する合成化学化合物をいう。ペプチドアナログは、テンプレートペプチドの特性に類似した特性を有する非ペプチド薬物として、製薬業において通常使用される。これらの非ペプチド化合物タイプは、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と呼ばれる（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６）；Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳ  ｐ．３９２（１９８５）；およびＥｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７）、これらは、本明細書中に参考として援用される）。治療的に有用なペプチドに構造的に類似であるペプチド模倣物は、等価のまたは増強された治療的または予防的効果を生じるために使用され得る。一般に、ペプチド模倣物は、パラダイムポリペプチド（すなわち、生物学的または薬理学的活性を有するポリペプチド）（例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲ）に構造的に類似するが、以下からなる群から選択される連結によって必要に応じて置換される１つ以上のペプチド連結を有する：例えば、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−。模倣物は、合成の非天然アミノ酸アナログで全体的に合成され得るか、または部分的に天然のペプチドアミノ酸と部分的に非天然のアミノ酸アナログとのキメラ分子である。模倣物はまた、任意の量の天然アミノ酸保存的置換を、このような置換が模倣物の構造および／または活性を実質的に変えない限り、取り込み得る。例えば、模倣物組成物は、それが、ＣＣＸ  ＣＫＲの結合または酵素活性を実施し得る場合、本発明の範囲内である。
【００３７】
「薬学的に受容可能」とは、キャリア、希釈液、または賦形剤が、処方物の他の成分と適合性であり、それらのレシピエントに有害であってはならないことを意味する。
【００３８】
用語「ポリペプチド」は、用語「タンパク質」と交換可能に使用され、そしてアミド連結によって連結されるアミノ酸残基で構成されるポリマー（合成、天然に存在する、および天然に存在しないそれらのアナログ（アミノ酸および連結）を含む）をいう。ペプチドはポリペプチドの例である。
【００３９】
本明細書中で使用されるように、プローブは、ポリヌクレオチドおよび抗体の背景で使用される場合、別の分子に特異的に結合する分子をいう。プローブの一例は、「核酸プローブ」であり、これは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のポリヌクレオチドであり得る。核酸プローブについて特定の配列が与えられる場合、相補鎖もまた同定され、そして含まれることが理解される。この相補鎖は、標的が、実質的に相補的である核酸に対して特異的に結合する（例えば、アニールするか、またはハイブリダイズする）二本鎖核酸である状況において等しく十分に働く。プローブの別の例は、対応する抗原またはエピトープに特異的に結合する「抗体プローブ」である。
【００４０】
用語「組換え」は、インビトロで合成されるか、または他に操作されたポリヌクレオチド（例えば、「組換えポリヌクレオチド」）、組換えポリヌクレオチドを使用して細胞または他の生物系において遺伝子産物を生成する方法、または組換えポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチド（「組換えタンパク質」）をいう。従って、「組換え」ポリヌクレオチドは、その生成方法およびその構造のいずれかによって定義される。その生成方法に関して、プロセスは、組換え核酸技術の使用である（例えば、ヌクレオチド配列おけるヒトの介入（例代表的には、選択または生成）を包含する）。あるいは、これは、互いに対して天然には連続しない２つのフラグメントの融合を含む配列を生成することによって作製されたポリヌクレオチドであり得、天然の産物を除外することを意味する。従って、例えば、任意の天然に存在しないベクターで細胞を形質転換することによって作製される産物は、任意の合成オリゴヌクレオチドプロセスを用いて誘導される配列を含むポリヌクレオチドと同様に包含される。同様に、「組換え」ポリペプチドは、組換えポリヌクレオチドから発現されるものである。
【００４１】
句「〜に選択的にハイブリダイズする」は、ポリヌクレオチドプローブが、標的配列が全細胞ＤＮＡまたはＲＮＡの調製物中に存在する場合に特定の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対してハイブリダイズするか、二重鎖形成するか、または結合することをいう。
【００４２】
抗体とタンパク質またはポリペプチドとの間の相互作用に言及する場合、句「〜に特異的に免疫反応性である」または「特異的に結合する」は、抗体が、目的のタンパク質（例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲ）を特異的に認識し、そしてこれに対して相対的に高い親和力で結合し、これによりこの結合が、タンパク質および他の生物製剤の異種の集団におけるタンパク質の存在に決定的であることをいう。従って、指定された免疫アッセイ条件下では、特定化された抗体は、特定のポリペプチドに結合し、サンプル中に存在する他のポリペプチドと有意な量で結合しない。種々の免疫アッセイフォーマットが、特定のポリペプチドと特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイは、ポリペプチドと特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために慣用的に使用される。免疫アッセイフォーマットおよび特異的免疫反応性を決定するのに使用され得る条件については、Ｈａｒｌｏｗ，１９８８，  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（本明細書中、以降、「Ｈａｒｌｏｗ」）を参照のこと。
【００４３】
本明細書中で使用されるように、「実質的に配列同一」とは、２つ以上の配列またはサブ配列が、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて測定されるように、または目視検査によって、比較して最大に一致するように整列した場合、少なくとも６０％、好ましくは８０％、最も好ましくは、９０％、９５％、９８％、または９９％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有することをいう。２つの配列（アミノ酸またはヌクレオチド）は、その全長にわたって（例えば、それらが実質的に異なる長さである場合は、２つのうち短い方の長さ）、あるいは少なくとも約５０、約１００、約２００、約５００、もしくは約１０００の連続したヌクレオチドのサブ配列、または少なくとも約１０、約２０、約３０、約５０または約１００の連続したアミノ酸残基のサブ配列にわたって比較され得る．
配列比較のために、代表的には、１つの配列が参照配列として作用し、これに対して試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、サブ配列座標を指定し、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。
【００４４】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター実行（ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，  およびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって、または目視検査（一般には、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  １９９９）を参照のこと）によって実施され得る。これらの参考文献およびアルゴリズムの各々は、その全体が本明細書中に参考として援用される。前述のアルゴリズムのいずれかを使用する場合、「ウインドウ」長、ギャップペナルティーなどのデフォルトパラメーターが使用される。
【００４５】
配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するために適切であるアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載される。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）より公に入手可能である。このアルゴリズムは、クエリー配列における短い長さのワードＷ（これは、データベース配列中で同じ長さのワードと整列した場合、いくつかのポジティブ値の閾値スコアＴに適合するか、またはこれを満足する）を同定することによって、高スコアリング配列ペア（ＨＳＰ）をまず同定することを包含する。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）。これらの初期近隣ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとして働く。次いで、ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大され得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。各方向へのワードヒットの伸長は、以下の場合中止される：累積アラインメントスコアが、その最大達成値から量Ｘだけ減少する；累積スコアが、ゼロ以下になる（１つ以上のネガティブスコアリング残基アラインメントの累積に起因する）；または、いずれかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）を参照のこと）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を、デフォルトとして使用する。
【００４６】
配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的解析を実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７（１９９３）を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される１つの類似性基準は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））（これは、２つのヌクレオチド配列または２つのアミノ酸配列間の適合が偶然に生じる確率の指標を提供する）である。例えば、核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小合計確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列に類似するとみなされる。
【００４７】
２つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることのさらなる指標は、第一のポリペプチド（例えば、第一の核酸によりコードされるポリペプチド）が、第二のポリペプチド（例えば、第二の核酸によりコードされるポリペプチド）と免疫学的に交差反応性であることである。従って、ポリペプチドは、代表的には、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、第二のポリペプチドと実質的に同一である。
【００４８】
２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。実質的な同一性は、セグメントが、代表的にはプローブヌクレオチド配列に由来する少なくとも約５０の連続したヌクレオチドの配列を用いて、鎖またはその相補体に対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合に存在する。
【００４９】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、標的配列および標的に正確なまたはほぼ正確な相補性を有するプローブの融解温度（Ｔｍ）より約５℃から約２０℃または２５℃下回る範囲の条件をいう。本明細書中で使用されるように、融解温度は、二本鎖核酸分子の集団が半解離して一本鎖になる温度である。核酸のＴｍを計算するための方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２：Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．；前出；（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと）。標準的な参考文献によって示されるように、Ｔｍ値の簡便な概算値が、以下の式によって計算され得る：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）（核酸が１Ｍ  ＮａＣｌの水溶液中にある場合）（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，  「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  （１９８５）を参照のこと）。他の参考文献は、構造ならびに配列特徴をＴｍの計算に考慮に入れた、より精巧なコンピュータ計算を包含する。ハイブリッドの融解温度（およびストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件）は、プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）ならびに標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶液中に存在するかまたは固定化された、など）、ならびに塩および他の成分の濃度（例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの存在または不在）のような種々の要因によって影響される。これら要因の効果は周知であり、そして当該分野における標準的な参考文献において考察されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出およびＡｕｓｕｂｅｌ、前出を参照のこと）。代表的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、代表的には約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（ｐＨ７．０〜８．３）の塩濃度、および短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）については少なくとも約３０℃および長いプローブ（例えば、５０ヌクレオチドより大きい）については少なくとも約６０℃の温度である。示したように、ストリンジェントな条件はまた、脱安定化剤（例えば、ホルムアミド）の添加によって達成され得る。この場合、より低い温度が用いられ得る。
【００５０】
用語「実質的に純粋な」または「単離された」は、タンパク質およびポリペプチド（例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲ）に対して言及する場合、これらポリペプチドが、天然に付随するタンパク質または他の夾雑物から分離されていることを示す。タンパク質またはポリペプチドは、タンパク質が、そのタンパク質を含む組成物の総タンパク質含量の約５０％より多く、および代表的には、総タンパク質含量の約６０％より多くを構成する場合、実質的に純粋であるとみなされる。より代表的には、実質的に純粋なまたは単離されたタンパク質またはポリペプチドは、総タンパク質の少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％を構成する。好ましくは、タンパク質は、組成物において総タンパク質の約９０％より多く、およびより好ましくは、約９５％より多くを構成する。ポリヌクレオチドに言及する場合、用語「実質的に純粋」または「単離された」は、一般に、一般に付随する夾雑物（例えば、脂質、タンパク質、および他のポリヌクレオチド）から分離されたポリヌクレオチドをいう。本発明の実質的に純粋なまたは単離されたポリヌクレオチドは、純度が約５０％より高い。代表的には、これらのポリヌクレオチドは、約６０％より高い純度、より代表的には約７５％から約９０％の純度、および好ましくは約９５％から約９８％の純度である。
【００５１】
用語「治療有効量」は、研究者、獣医師、および医師または他の臨床家によって探索される組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を惹起する被験化合物の量を意味する。
【００５２】
本明細書中で使用されるように、レセプター媒介「生物学的効果」は、天然に存在するリガンドへのレセプターの結合（例えば、ＥＬＣのＣＣＸ  ＣＫＲ結合）から生じる細胞機能または構造の変化をいい、そしてこれは、レセプターインターナリゼーション、レセプター媒介シグナル伝達（例えば、哺乳動物Ｇタンパク質の活性化、細胞質ゾル遊離カルシウムの濃度の迅速かつ一過性の増加の誘導）、細胞応答機能（例えば、化学走性の刺激または炎症メディエーターの放出）などを含み得る。
【００５３】
（ＩＩ．ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチド）
本発明は、単離された、実質的に純粋な、または組換えのＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドおよび哺乳動物ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドの免疫原性フラグメントを提供する。１つの実施形態において、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドまたはフラグメントは、配列番号２に記載の配列またはそれらのサブ配列に同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する。
【００５４】
（Ａ．  ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドおよび改変体）
本発明は、実質的に純粋な、単離された、または組換えのＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列に同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する。他の実施形態において、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基の保存的置換によって特徴付けられた改変体および変異体である。
【００５５】
本発明のポリペプチドは、全長（例えば、図１に示した種について約３５０アミノ酸を含む）であり得るか、または全長タンパク質のフラグメントをコードし得る（例えば、本発明のＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドおよび改変体の少なくとも２０、少なくとも４０、少なくとも６０、または少なくとも１００残基を含む）。配列番号２のアミノ酸配列に対して何らかの様式で改変された（例えば、短縮化された、変異された、誘導体化された、または他の配列に融合された（例えば、融合タンパク質を形成するために））ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドもまた、本発明により提供される。いくつかのＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドは、配列番号２に対するアミノ酸残基の挿入、欠失、または置換を含む。例えば、いくつかの保存的アミノ酸置換が行われ得る。すなわち、選択されたアミノ酸を類似の構造的特徴（例えば、正味の電荷、疎水性など）を有する異なるアミノ酸と置換する。
【００５６】
代表的には、ＣＣＸ  ＣＫＲ改変体は、配列番号２の配列を有するＣＣＸ  ＣＫＲ対立遺伝子に構造的および機能的に類似する。構造類似性は、例えば、実質的配列同一性（上記で定義）、または免疫学的交差反応性によって示される。機能類似性は、例えば、天然に存在するＣＣＸ  ＣＫＲ対立遺伝子ＣＣＸ  ＣＫＲ対立遺伝子（配列番号２の配列を有する）と類似または同一のリガンド結合特異性（例えば、高親和力でＥＬＣ、ＳＬＣ、およびＴＥＣＫに結合する）によって示される。いくつかの実施形態において、本発明のＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドは、配列番号２においてコードされた全長ポリペプチドの融合タンパク質またはフラグメント（例えば、リガンド結合フラグメント）である。この背景において使用されるように、ＣＣＸ  ＣＫＲの「リガンド結合フラグメント」は、ＥＬＣ（例えば、ヒトまたはマウスＥＬＣ）、ＳＬＣ（ヒトまたはマウス）、またはＴＥＣＫ（ヒトまたはマウス）に、高親和力（例えば、約１５ｎＭ未満の見かけＫｉまたはリレーショナルＩＣ５０）または中程度の親和力（例えば、約１５および約２００ｎＭの間の見かけＫｉまたはリレーショナルＩＣ５０）で結合するレセプターポリペプチドのフラグメントである。結合を検出するための適切なアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ｅ．Ｃ  Ｈｕｌｍｅ「Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」、Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ／ＴＨＥ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  ＳＥＲＩＥＳ  （Ｓｅｒｉｅｓ  Ｅｄｓ  Ｄ．Ｒｉｃｋｗｏｏｄ  ａｎｄ  ＢＤ  Ｈａｍｅｓ）  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９２），特にＣｈ．６、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  ｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，」およびＣｈ．７，Ｈｕｌｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙｓ」を参照のこと；また、Ｓｉｓｓｏｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，「Ａ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ＨＴＳ  ｏｎ  ＦｌａｓｈＰｌａｔｅ  ｐｌｕｓＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎｃ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ  ０２１１８も参照のこと。
【００５７】
１つの実施形態において、結合は、Ｄａｉｒａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７２：２８２０６−２０９（あらゆる目的のためその全体が参考として援用される）ＣＣＲ３トランスフェクタントをＣＣＸ  ＣＫＲトランスフェクタントに置き換える）により記載されるように検出される。１つの実施形態において、結合は、Ｄａｉｒａｇｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１５６（あらゆる目的のためその全体が参考として援用される）（例えば、図４において示されるように）により記載のフィルターベースの技術を用いて検出される。簡潔には、この技術は、拡大された、効率が最大にされた放射性リガンド結合を利用する濾過プロトコルを用いる。これらのアッセイにおいて、１×１０5  ＣＣＸＣＫＲ−２９３  ＨＥＫ細胞を、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣ１２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および０．２％ウシ血清アルブミン（ｐＨ７．１に調整）中で４℃で３時間、未標識ケモカインの存在下で125Ｉ標識ＥＬＣ（ＭＩＰ３β）（最終濃度およそ０．０５ｎＭ）とインキュベートする。反応を、ＰＥＩ処理ＧＦ／Ｂガラスフィルター上で細胞採集器（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて吸引した。フィルターを２回洗浄し（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣ１２、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２（ｐＨ７．１に調整））、そしてシンチラント（例えば、ＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ  ２０；５０μｌ）を乾燥フィルターに添加し、計数する（例えば、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｔｏｐｃｏｕｎｔシンチレーションカウンターを使用する）。競合用量応答曲線を標準的な方法によって分析し、ＩＣ５０値を決定する（例えば、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）を使用する）。さらに、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ変換を使用して、１細胞当たりのレセプター部位を概算し得る（例えば、ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ  Ｉｇｏｒソフトウェア（Ｌａｋｅ  Ｏｓｗｅｇｏ，  ＯＲ）を使用する）。
【００５８】
示されるように、結合アッセイは周知であり、そしてそれは、結合が種々の緩衝液条件ならびにインキュベーション時間および温度を用いて検出され得ることが理解される。例えば、アッセイは、３７°から４℃の範囲、好ましくは約４℃および約２５℃の間、最も好ましくは４℃の温度で、またはならびに１時間から一晩（例えば、約３時間）までのインキュベーション時間で実行され得る。緩衝液ｐＨは、６．８から７．６の範囲であり得、そしてＮａＣｌ濃度は、０〜１６０ｍＭ（例えば、生理緩衝液条件）であり得る。含まれるＢＳＡの割合はまた、０．１％から０．５％まで変動し得る。模範的な条件は、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＭｇＣ１２、および０．２％ウシ血清アルブミン（ｐＨ７．１に調整）中での４℃で３時間の０．０５ｎＭ125Ｉ標識ＥＬＣとのインキュベーションである。他の変形もまた当該分野で公知である。
【００５９】
本明細書中で使用されるように、ケモカインは、これが、少なくともレセプター、ならびに野生型ＣＣＸ  ＣＫＲと高いまたは、あるいは中程度の親和力で結合することが公知である特定化された参照ケモカイン（例えば、ＥＬＣ、ＳＬＣ、ＴＥＣＫ、ｍＭＩＰ−１γ、ｈＢＬＣ−１、ｍＭＩＰ−１γ、ＣＴＡＣＫ）に結合する場合、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドと特異的に結合する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本発明のＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドは、免疫原として使用され得る（例えば、抗ＣＣＸ  ＣＫＲ抗体を生成するために）。代表的には、本発明の免疫原性ＣＣＸ  ＣＫＲフラグメントは、配列番号２の少なくとも約６の連続した残基、よりしばしば少なくとも約８、約１０、または約１２、または約１６の連続した残基を含む。
【００６１】
本発明の実質的に純粋な、単離された、または組換えＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドはまた、配列番号２に示される配列を有するポリペプチドと特異的に免疫反応性である抗体に結合する能力によって特徴付けられ得る。特異的な免疫反応性は、通常、少なくとも１０7、１０8、１０9、または１０10Ｍ-1のそのリガンド（例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲ）に対する抗体の特異的結合親和力によって特徴付けられる。
【００６２】
多くの適用について、所定の環境におけるポリペプチドの同定、検出および定量を容易にするために、標識された実体（すなわち、検出可能な標識もしくは基、または架橋基に共有結合的に付着もしくは連結された）として本発明のＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドを提供することもまた望ましい。これらの検出可能な基は、検出可能なポリペプチド基（例えば、アッセイ可能な酵素または抗体エピトープ）を含み得る。あるいは、検出可能な基は、種々の他の検出可能な基または標識（例えば、放射性標識（例えば、125Ｉ、32Ｐ、35Ｓ）または化学発光基もしくは蛍光基）から選択され得る。同様に、検出可能な基は、基質、補因子、インヒビターまたはアフィニティーリガンドであり得る。
【００６３】
さらに、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸残基を同じタイプのＤ−アミノ酸（例えば、リジンの代わりにＤ−リジン）と置換することによって修飾されて、より安定なペプチドを生成し得る。同様に、アミノ末端またはカルボキシル末端の修飾もまた、本発明のポリペプチドに安定化特性を付与するために使用され得る（例えば、カルボキシル末端のアミド化またはアミノ末端のアシル化またはＰＥＧ化誘導体）。
【００６４】
（Ｂ．ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドの産生および単離）
本発明のＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドは、組換え方法または合成方法を使用して調製され得るか、または天然の細胞供給源から単離され得る。
【００６５】
ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドをＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドから発現するための適切な組換え技術は、以下に開示される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，（２ｎｄ  ｅｄ．）Ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、およびＡｕｓｕｂｅｌ、上記を参照のこと。ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチド、改変体またはフラグメントのようなポリペプチドを合成するための合成方法は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３，Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２４５６，Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，ＳＯＬＩＤ  ＰＨＡＳＥ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−３４７に記載される。
【００６６】
本発明のＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドの単離および精製は、当該分野において一般的に周知である方法によって実行され得る。これらの方法には、限定しないが、所望の純度を達成するために、イオン交換、疎水性相互作用、ＨＰＬＣまたはアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。１つの実施形態において、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドは、イムノアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製される。例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント（例えば、配列番号２の配列または下位配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有する）に対して惹起される抗体は、適切な固体支持体に連結され、このペプチドと抗体との会合に助けとなる条件下で、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドを含むポリペプチドの混合物（例えば、脳組織のホモジネート）と接触される。一旦、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドが固定化抗体に結合されると、固体支持体は、結合していない物質および／または非特異的に結合したポリペプチドを除去するために洗浄される。次いで、所望のポリペプチドが、例えば、ｐＨまたは緩衝液の塩濃度の変化によって、実質的に純粋な形態で固体支持体から溶出され得る。
【００６７】
（Ｃ．ＣＣＸ  ＣＫＲのペプチドアナログおよびペプチド模倣物）
「タンパク質」または「ポリペプチド」の項で主に記載されるが、当業者は、上記ポリペプチドの構造的アナログおよび誘導体（例えば、ペプチド模倣物など）が、例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲアゴニストとして、あるいはＣＣＸ  ＣＫＲ活性アンタゴニストとして、ＣＣＸ  ＣＫＲの置換として使用され得ることを理解する。ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ、ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）は、鋳型ペプチドの性質と類似した性質（例えば、生物学的活性）を有する非ペプチド薬物として薬学的工業において通常使用されるペプチドアナログである（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，１９８６，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９；Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９）。これらは、通常、コンピュータ化された分子モデリングの援助の下で開発される。治療的に有用なペプチドに構造的に類似したペプチド模倣物は、等価な治療的効果を生成するために使用され得る。ペプチド模倣物は、例えば、より経済的な生成およびより大きな化学的安定性を含むポリペプチドの実施形態に対する有意な利点を有し得る。
【００６８】
（ＩＩＩ．ＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチド）
一つの局面において、本発明は、哺乳動物（例えば、ラットまたはヒト）ＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子またはＲＮＡの配列または下位配列を有するポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡまたはキメラ）は、一本鎖、二本鎖または混合ハイブリッドであり得る。一つの実施形態において、ポリヌクレオチドは、配列番号１（図１）の配列またはその下位配列（例えば、本発明のポリヌクレオチドおよび改変体の少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、または少なくとも５００塩基を含む）を有する。本発明はまた、本明細書中に開示されるＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドに対する実質的な配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供する。従って、本発明は、配列番号１のＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドのヒト対立遺伝子改変体のような哺乳動物（例えば、ヒト）ＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子の天然の対立遺伝子を提供する。
【００６９】
以下に記載されるように、いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２（図１）に対して実質的な配列同一性を有するポリペプチドをコードするか、またはこのようなポリペプチドのフラグメントをコードする（例えば、融合タンパク質）。遺伝子コードの縮重に起因して、配列番号１に実質的に類似しないが、配列番号２のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドもまた意図される。他の実施形態において、本発明は、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドを必ずしもコードしないが、例えば、プローブ、プライマー、アンチセンス、三重鎖またはリボザイム試薬などとして有用であるＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドを提供する。
【００７０】
本発明はまた、ＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドを含む発現ベクター、細胞株、およびトランスジェニック生物を含む。いくつかの実施形態において、本発明のベクター、細胞および生物は、コードされるＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドを発現し得る。
【００７１】
本発明の開示の手引きを使用して、本発明のＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドは、組換え手段によって産生され得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５２：Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照のこと。あるいは、ＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドまたはフラグメントは、当該分野において周知の慣用的な方法を使用して化学的に合成され得る（Ｎａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９を参照のこと）。いくつかの実施形態において、本発明のＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドは、非天然の塩基（例えば、デオキシイノシン）（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８を参照のこと）あるいは改変骨格残基または連結を含む。
【００７２】
（Ａ．ＣＣＸ  ＣＫＲをコードするポリヌクレオチド）
１つの局面において、本発明は、配列番号２の配列を有するＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチド、そのフラグメント、その改変体（例えば、保存性改変体または対立遺伝子改変体）、あるいはＣＣＸ  ＣＫＲ融合タンパク質のようなＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の配列またはそのフラグメントを含む。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、天然のＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドまたはフラグメントをコードするが、（例えば、遺伝子コードの縮重の結果として）配列番号１とは異なる配列を有する。本発明のいくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現配列タグＨ６７２２４、ＡＩ１３１５５、ＡＡ２１５５７７、ＡＷ１９０９７５またはＡＩ７６９４６６、あるいはウシＰＰＲ１をコードするポリヌクレオチド以外である（Ｍａｔｓｕｏｋａ  ｅｔ  ａｌ，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  １９９４；５４０−１１）。
【００７３】
本発明のポリヌクレオチドは、ＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチド（例えば、センスまたはアンチセンスＲＮＡ）およびポリペプチドの発現に有用である。ポリヌクレオチドおよびタンパク質の組換え発現のための方法は、当該分野において周知である。代表的には、本発明のＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドは、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドおよびポリヌクレオチドの調製のための発現ベクターにおいて使用される。発現ベクターは、代表的には、転写制御シグナルおよび／または翻訳制御シグナル（例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、およびＡＴＧ開始コドン）を含む。さらに、発現の効率は、使用において細胞系に適切なエンハンサーの含有によって増強され得る。例えば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーは、哺乳動物宿主細胞において発現を増加するために使用され得る。
【００７４】
１つの実施形態において、本発明のＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドをコードするＤＮＡは、宿主細胞（例えば、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、昆虫（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）または哺乳動物細胞培養系）にインビトロで導入され、発現し得るＤＮＡ構築物に挿入される。本発明のポリペプチドの発現および産生に有用な哺乳動物細胞培養系の例には、ヒト胚腎臓株（２９３；Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）；ＣＨＯ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ６１およびＣＲＬ  ９６１８）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；および当該分野で公知の他のものが挙げられる。ポリペプチドを発現するための哺乳動物組織細胞培養物の使用は、一般的に、Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，ＦＲＯＭ  ＧＥＮＥＳ  ＴＯ  ＣＬＯＮＥＳ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．，１９８７）およびＡｕｓｕｂｅｌ上記において議論される。
【００７５】
いくつかの実施形態において、哺乳動物遺伝子由来または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが、例えば、哺乳動物細胞株における発現に使用される。適切なプロモーターは、構成的、細胞型特異的、段階特異的、ならびに／あるいは調整可能（ｍｏｄｕｌａｔａｂｌｅ）または調節可能（例えば、グルココルチコイドのようなホルモンによる）であり得る。有用なプロモーターには、メタロチオネインプロモーター、構成性アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、および当該分野において公知のプロモーター−エンハンサーの組み合わせが挙げられるが、これらには限定されない。
【００７６】
ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドまたはフラグメントはまた、宿主細胞染色体に組み込む適切な発現ベクターを使用して、トランスジェニック動物（マウス、ヒツジ、ウシなど）および植物（タバコ、シロイヌナズナ（ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）など）において発現され得る。
【００７７】
（Ｂ．ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー）
１つの実施形態において、本発明は、ＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドを検出するかまたは増幅するためのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブおよび／またはプライマーを提供する。種々の実施形態において、ポリヌクレオチド（例えば、プローブおよびプライマー）は、配列番号１に同一かまたは正確に相補的な少なくとも１０の連続塩基、普通は、１２塩基、代表的には少なくとも１５塩基、一般的には、少なくとも１８塩基、そして頻繁には少なくとも２５、少なくとも５０、または少なくとも１００塩基を含む。本発明のＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドは、プローブまたはプライマーとして使用される場合、これらは、一般的に、約３０００塩基長未満であり；代表的には、これらは配列番号１に同一かまたは正確に相補的な、約１２と約１００の連続したヌクレオチド、より頻繁には、約１２と約５０の間の連続ヌクレオチド、なおより頻繁は、約１５と約２５の間の連続のヌクレオチドを含む。
【００７８】
いくつかの実施形態において、プローブおよびプライマーは、例えば、プローブまたはプライマーに制限部位を加えることによって、改変される。他の実施形態において、本発明のプライマーまたはプローブは、さらなる配列（例えば、リンカー）を含む。なおいくつかの他の実施形態において、本発明のプライマーまたはプローブは、検出可能な標識を用いて改変される。例えば、プライマーおよびプローブは、例えば、誘導されるか、改変ヌクレオチド塩基を組み込むか、または抗リガンド（例えば、ビオチン）によって結合され得るリガンドを含むように、化学的に改変される。
【００７９】
本発明のＣＣＸ  ＣＫＲプローブおよびプライマーは、例えば、以下により詳細に議論されるように、生物学的サンプルにおけるＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドを検出または増幅するために、多くの目的に使用され得る。例えば、本明細書中の手引きが提供され、当業者は、ＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡの全てまたは一部をサンプルにおいて特異的に増幅するプライマー対を選択し得る。好ましい実施形態において、プライマー対および増幅条件は、例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲプライマーと他の遺伝子配列との間の３’ミスマッチに起因して、サンプル中に存在する他のケモカインレセプターＲＮＡを増幅しないように選択する。
【００８０】
（ＣＣＸ  ＣＫＲ阻害性ポリヌクレオチド）
本発明は、ＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドを標的とするかまたはＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドにハイブリダイズするアンチセンス、三重鎖およびリボザイム試薬のようなポリヌクレオチドを提供する。
【００８１】
（１．アンチセンスポリヌクレオチド）
１つの局面において、本発明は、ＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子の発現を阻害するために使用され得るアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを提供する。本発明のいくつかの治療方法（以下にさらに詳細に記載される）は、インビボの生理学的な条件下でＣＣＸ  ＣＫＲ活性を阻害するかまたは刺激するために機能し、そして治療的効果に十分な時間の間、それらの条件下で比較的安定であるオリゴヌクレオチドの投与を包含する。ポリヌクレオチドは、このような安定性を与え、そして所望の組織、器官または細胞にオリゴヌクレオチドの標的化送達を促進するために改変され得る。
【００８２】
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、ＣＣＸ  ＣＫＲをコードするｍＲＮＡまたはＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子から転写されるｍＲＮＡからの配列に特異的にハイブリダイズする、少なくとも約１０塩基、代表的には少なくとも１２または１４、そして約３０００までの連続したヌクレオチドのアンチセンス配列を含む。さらに頻繁には、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、約１２〜約５０ヌクレオチドの長さ、または約１５〜約２５ヌクレオチドの長さである。一般的に、アンチセンスポリヌクレオチドは、安定な二重鎖を形成するのに十分長くあるべきだが、送達の様式に依存して、望ましい場合、インビボで投与するのに十分、短くあるべきである。標的配列への特異的ハイブリダイゼーションに必要なポリヌクレオチドの最小の長さは、いくつかの因子、例えば、他の因子もあるが、Ｇ／Ｃ内容、ミスマッチ塩基（もしあれば）の位置、標的ポリヌクレオチドの集団と比較した配列の特異性の程度、およびポリヌクレオチドの化学的性質（例えば、メチルホスホネート骨格、ペプチド核酸、ホスホロチオエート）に依存する。
【００８３】
一般的に、特異的なハイブリダイゼーションを確実にするために、アンチセンス配列は、標的ＣＣＸ  ＣＫＲ配列に実質的に相補的である。特定の実施形態において、アンチセンス配列は、標的配列に正確に相補的である。しかし、アンチセンスポリヌクレオチドはまた、ＣＣＸ  ＣＫＲ  ＲＮＡまたはその遺伝子に対応する関連する標的配列への特異的結合が、ポリヌクレオチドの機能的な性質として保持される限り、ヌクレオチド置換、付加、欠失、遷移、転位または改変、あるいは他の核酸配列または非核酸部分を含み得る。
【００８４】
一つの実施形態において、アンチセンス配列は、ＣＣＸ  ＣＫＲ  ｍＲＮＡの比較的アクセス可能な配列に相補的である（例えば、２次構造を比較的欠く）。これは、例えば、ＭＦＯＬＤプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を使用して推定のＲＮＡ２次構造を分析することによって、そして当該分野で公知のようにインビトロまたはインビボで試験することによって決定され得る。効果的なアンチセンス組成物を同定するための別の有用な方法は、オリゴヌクレオチドのコンビナトリアルアレイを使用する。（例えば、Ｍｉｌｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：５３７を参照のこと）。
【００８５】
本発明はまた、アンチセンス配列に加えて（すなわち、抗ＣＣＸ  ＣＫＲセンス配列に加えて）配列を有するアンチセンスポリヌクレオチドを提供する。この場合、アンチセンス配列は、より長い配列のポリペプチド内に含まれる。別の実施形態において、ポリヌクレオチドの配列は、アンチセンス配列から本質的になるかまたはアンチセンス配列である。
【００８６】
アンチセンス核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、改変、アナログなど）は、核酸を産生するための任意の適切な方法、例えば、化学合成および本明細書中に開示される組換え方法を使用して、なされ得る。一つの実施形態において、例えば、本発明のアンチセンスＲＮＡ分子は、新規な化学合成によってまたはクローニングによって調製され得る。例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲ  ｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンスＲＮＡは、ベクター（例えば、プラスミド）中のプロモーターに作動可能に連結された逆方向に、ＣＣＸ  ＣＫＲ  ＤＮＡ配列（例えば、配列番号１またはそのフラグメント）を挿入（ライゲーション）することによって作製され得る。プロモーターならびに好ましくは、停止シグナルおよびポリアデニル化シグナルが適切に位置付けられる場合、非コード鎖に対応する挿入配列の鎖は、転写され、そして本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドとして作用する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、無細胞抽出物、細胞、および動物（哺乳動物およびヒトを含む）におけるＣＣＸ  ＣＫＲ活性を阻害するために使用され得る。
【００８７】
アンチセンスポリヌクレオオチドに関連する一般的な方法について、ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＲＮＡ  ＡＮＤ  ＤＮＡ，（１９８８），Ｄ．Ａ．Ｍｅｌｔｏｎ，Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照のこと。Ｄａｇｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１８０５もまた参照のこと。アンチセンス両方の総説について、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０）を参照のこと。
【００８８】
（三重鎖オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド）
本発明は、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡなど）を提供し、これは、二本鎖または二重鎖ＣＣＸ  ＣＫＲ核酸（例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲ  ＲＮＡの折り畳まれた領域、またはＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子）に結合し、三重鎖らせん含有、または「三重鎖」核酸を形成する。三重鎖らせんの形成は、例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子の転写を阻害し、従って、細胞中のＣＣＸ  ＣＫＲを減少させるかまたは除去することによって、ＣＣＸ  ＣＫＲ発現の阻害を生じる。任意の特定の機構によって束縛されることを意図しないが、三重鎖らせん対形成は、ポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合が生じるように十分開く、二重らせんの能力を損なうと考えられる。
【００８９】
本発明の三重鎖オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、三重らせん形成の塩基対形成規則を使用して（例えば、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１５１１０；Ｆｅｒｒｉｎ  ａｎｄ  Ｃａｍｅｒｉｎｉ−Ｏｔｅｒｏ，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５４：１４９４；Ｒａｍｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７３９５；Ｓｔｒｏｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１６３９；およびＲｉｇａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：９５９１；本明細書中において参照として援用される）そしてＣＣＸ  ＣＫＲ  ｍＲＮＡおよび／または遺伝子配列を使用して構成される。代表的には、本発明の三重鎖形成オリゴヌクレオチドは、ＣＣＸ  ＣＫＲ  ＲＮＡまたは遺伝子の特異的な配列に「相補的な」約１０〜少なくとも約２５のヌクレオチドまたはより長い特定の配列を含む（すなわち、安定な三重らせんを形成するのに十分長いが、望ましいならば、インビボで投与されるためのい送達の様式に依存する）。この文脈において、「相補性」は、安定な三重らせんを形成し得ることを意味する。１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子の制御領域（例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲ５’隣接配列、プロモーター、およびエンハンサー）にまたは転写開始部位（例えば、転写開始部位から−１０と＋１０の間）に特異的に結合するように設計される。三重鎖ＤＮＡを使用する細菌の治療的進歩の総説について、Ｇｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｂｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｒｒ，１９９４，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣ  ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ，Ｆｕｔｕｒａ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，Ｍｔ  Ｋｉｓｃｏ  ＮＹ  ａｎｄ  Ｒｉｎｉｎｓｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：５８５４を参照のこと。これらは、本明細書中において参考として援用される。
【００９０】
（３．リボザイム）
本発明はまた、ＣＣＸ  ＣＫＲ活性の阻害に有用なリボザイムを提供する。本発明のリボザイムは、ＣＣＸ  ＣＫＲ  ｍＲＮＡを結合し、そして特異的に切断し、そして不活化する。有用なリボザイムは、ＣＣＸ  ＣＫＲ  ｍＲＮＡに相補的な５’末端および３’末端配列を含み得、本明細書中に開示されるＣＣＸ  ＣＫＲ  ｍＲＮＡ配列に基づいて当業者によって操作され得る（ＰＣＴ公開  ＷＯ９３／２３５７２を参照のこと、上記）。本発明のリボザイムは、グループＩイントロンリボザイム（Ｃｅｃｈ，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３２３）を有するものおよびハンマーヘッドリボザイム（Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎ，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：２５６）を含む。
【００９１】
本発明のリボザイムは、ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣのような切断部位を有するリボザイムを含む。本発明に従うＣＣＸ  ＣＫＲ活性のリボザイム媒介阻害に最適な他の切断部位は、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０２５９５およびＷＯ９３／２３５６９に記載されるものであり、これらはともに、参考として援用される。切断部位を含む標的ＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子の領域に対応する１５と２０の間のリボヌクレオオチドの長さの短いＲＮＡオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドをより望ましくし得る２次構造的特徴について評価され得る。切断部位の適切性もまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのアクセス性を試験することによって、または当該分野で公知の標準的な手順に従ってインビトロリボザイム活性について試験することによって、評価され得る。
【００９２】
Ｈｕら、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／０３５９６（本明細書中において参考として援用される）によって記載されるように、アンチセンスおよびリボザイムの機能は、単一のオリゴヌクレオチド中で組み合わせられ得る。さらに、リボザイムは、本発明の例示的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの記載とともに上記のように、１つ以上の改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド間の改変連結を含み得る。
【００９３】
１つの実施形態において、本発明のリボザイムは、インビトロで作製され、そして細胞または患者に導入される。別の実施形態において、遺伝子治療法は、エキソビボまたはインビボで標的細胞中のリボザイムの発現のために使用される。
【００９４】
（４．オリゴヌクレオチドの投与）
代表的には、本発明の治療方法は、インビボの生理学的な条件下でＣＣＸ  ＣＫＲ活性を阻害するかまたは刺激するように機能し、治療効果に十分な時間の間、これらの条件下で比較的安定であるオリゴヌクレオチドの投与を包含する。上に記すように、改変核酸は、このような安定性を与える際、ならびに所望の組織、器官または細胞にオリゴヌクレオチドを標的化送達するために有用であり得る。
【００９５】
オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるように、適切な薬学的処方物中の薬物として直接送達されるか、または細胞へ核酸を導入する手段（リポソーム、免疫リポソーム、銃式（ｂａｌｌｓｔｉｃｓ）、細胞への直接取り込みなどを含む）によって間接的に送達され得る。疾患の処置について、本発明のオリゴヌクレオチドは、治療的有効量で患者に投与される。治療的有効量は、疾患の症状を改善するかまたは標的細胞中のＣＣＸ  ＣＫＲ活性を調節するのに十分な量である。治療目的のためのオリゴヌクレオチドの送達に有用な方法は、米国特許第５，２７２，０６５号に記載され、これは、本明細書中において参考として援用される。薬学的に活性な化合物の投与の他の詳細は、以下に提供される。別の実施形態において、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、本発明の遺伝子治療および組換えＤＮＡ発現プラスミドを使用して送達され得る。
【００９６】
（Ｄ．遺伝子治療）
遺伝子治療は、別の外因性のポリヌクレオチドの導入をいい、これは、このポリヌクレオチドが移される（代表的には）哺乳動物細胞に対する医療的に有用な表現型の効果を作る。一つの局面において、本発明は、ＣＣＸ  ＣＫＲ関連状態の処置のための遺伝子治療方法および組成物を提供する。例示的な実施形態において、遺伝子治療は、ＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子産物（例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲ活性を増加させるために配列番号２の配列を有するＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドに実質的に類似したＣＣＸ  ＣＫＲタンパク質、または活性を減少させるための阻害性ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチド）を発現するか、ＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子またはｍＲＮＡ配列（例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲ活性を減少させるためのアンチセンスＲＮＡ）を有する核酸を発現するか、そうでなければＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子産物（例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲ活性を減少させるためのＣＣＸ  ＣＫＲ  ｍＲＮＡに向けられたリボザイム）の発現に影響するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを発現するか、外因性ＣＣＸ  ＣＫＲ配列を置換または破壊する（例えば、遺伝子置換および遺伝子ノックアウト、それぞれ）ベクターを細胞に導入することを含む。多くの他の実施形態が、本明細書中の開示から当業者に明かである。
【００９７】
ＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子治療に有用なベクターは、ウイルスまたは非ウイルスであり得、本発明のＣＣＸ  ＣＫＲ発現系に関連して上に記載されたものを含む。遺伝子治療ベクターは、本発明の開示に記載されるように、プロモーターおよび他の調節またはプロセシング配列を含み得ることが当業者に理解される。普通、ベクターは、プロモーターを含み、必要に応じて、オリゴリボヌクレオチドの転写を駆動するのに役立つエンハンサー（プロモーター配列内に含まれるいずれとも別）、ならびに望ましい場合、エピソーム維持または染色体一体化および高レベルの転写を提供する他の調節エレメントを含む。遺伝子治療に有用なプラスミドは、他の機能的なエレメント（例えば、選択マーカー、識別領域、および他の配列）を含み得る。さらなる配列は、細胞外と細胞内の両方で安定性、特定の器官、組織、または細胞集団にＣＣＸ  ＣＫＲヌクレオチド配列（センスまたはアンチセンス）の標的送達、細胞への侵入の媒介、細胞の核への侵入の媒介、および／または核ＤＮＡ内での一体化の媒介を与える役割を有し得る。例えば、アプタマー様ＤＮＡ構造、または他のタンパク質結合部分部位は、細胞表面またはレセプターに結合する血清タンパク質へのベクターの結合を媒介するために使用され得、これによって細胞へのＤＮＡの移動の効率を増加する。他のＤＮＡ部位および構造は、核膜のレセプター、または核に行く他のタンパク質に直接的または間接的に結合し得、これによって、ベクターの核取り込みを促進する。他のＤＮＡ配列は、一体化の効率に直接的または間接的に影響し得る。
【００９８】
適切な遺伝子治療ベクターは、複製起点を有しても有さなくてもよい。例えば、患者への投与の前にベクターの増殖のためにベクターに複製起点を含むことが有用である。しかし、複製起点はしばしば、ベクターが宿主染色体ＤＮＡに取り込まれるかまたは宿主ｍＲＮＡまたはＤＮＡに結合するように設計される。
【００９９】
記載されるように、本発明はまた、遺伝子置換療法（すなわち、内因性ＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子の組換え遺伝子での相同置換による置換）のための方法および試薬を提供する。相同組換えによって一体化のために特異的に設計されたベクターが使用され得る。相同組換えを最適化するための重要な因子は、配列同一性の程度、染色体配列に対する相同性の長さを含む。相同組換えを媒介する特異的な配列はまた、重要である。なぜなら、一体化は、転写的に活性なＤＮＡにおいてずっとより容易に生じる。相同標的構築物を構築するための方法および材料は、例えば、Ｍａｎｓｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３６：３４８；Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：５３４に記載される。米国特許第５，６２７，０５９号；同第５，４８７，９９２号；同第５，６３１，１５３号；および同第５，４６４，７６４号も参照のこと。一つの実施形態において、遺伝子置換治療は、調節されるべきＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子の発現を制御する調節配列の全てまたは一部を変化させるかまたは置換することを含む。例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲプロモーター配列（図５）は、（ＣＣＸ  ＣＫＲ発現を減少させるため、または転写制御部位を無効にするために）破壊され得るか、あるいは外因性プロモーター（例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲ発現を増加するために）置換され得る。
【０１００】
本発明はまた、ＣＣＸ  ＣＫＲ「遺伝子ノックアウト」（すなわち、組換え的に産生されたベクターを使用して内因性ＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子の相同組換えによる欠失または破壊）のための方法および試薬を提供する。遺伝子ノックアウトにおいて、標的配列は、調節配列（例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲプロモーター）、あるいはＲＮＡまたはタンパク質コード配列であり得る。内因性遺伝子の発現を変化させるための相同組換えの使用は、米国特許第５，２７２，０７１号、ＷＯ９１／０９９５５、ＷＯ９３／０９２２２、ＷＯ９６／２９４１１、ＷＯ９５／３１５６０、およびＷＯ９１／１２６５０に詳細に記載される。Ｍｏｙｎａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．５：８７５もまた参照のこと。
【０１０１】
遺伝子治療ベクターは、インビボ、インビトロまたはエキソビボで細胞または組織に導入され得る。エキソビボ治療のために、ベクターは、患者から得られる細胞（例えば、幹細胞）に導入され得、そして同じ患者に戻す自己移植のためにクローン的に増殖される（例えば、米国特許第５，３９９，４９３号および同第５，４３７，９９４号を参照のこと、これらは、本明細書中において参考として援用される）。
【０１０２】
（ＩＶ．抗体）
本発明は、ヒトＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドと特異的な免疫反応性である抗体を提供する。従って、本発明の抗体は、配列番号２のアミノ酸配列、またはその免疫原性フラグメントに同一または実質的に同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを特異的に認識し結合する。本発明の抗体は、普通、少なくとも約１０7、１０8、１０9、または１０10Ｍ-1のＣＣＸ  ＣＫＲに対する特異的結合を示す。
【０１０３】
本発明の抗ＣＣＸ  ＣＫＲ抗体は、種々の使用（例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドの単離（例えば、イムノアフィニティークロマトグラフィー）、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドの検出、およびＣＣＸ  ＣＫＲ活性の阻害（例えば、インビボまたはインビトロ））を有する。
【０１０４】
（Ａ．抗ＣＣＸ  ＣＫＲ抗体の産生）
本発明の抗ＣＣＸ  ＣＫＲ抗体は、当業者に周知の種々の手段（例えば、前述のようなもの）により製造され得る。Ｉ節（前述）に記されるように、抗体は、本明細書において広範に規定されており、そして具体的に、フラグメント、キメラ、およびＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドまたはエピトープに特異的に結合する類似の結合因子（例えば、ファージディスプレー技術の産物）を含む。しかし、用語「抗体」は、ＣＣＸ  ＣＫＲによって結合される（すなわち、そのリガンドである）ケモカイン（例えば、ＥＬＣ、ＳＬＣ、ＴＥＣＫ、ＢＬＣ、およびｖＭＩＰＩＩ）をいうことは意図されない。
【０１０５】
ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の産生方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ（１９９１）；Ｓｔｉｔｅｓら（編）ＢＡＳＩＣ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（第７版）Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，ＣＡ，およびそこで引用される参考文献（「Ｓｔｉｔｅｓ」）；Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ（第二版）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８６）；ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９６−９７；ならびにＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅを参照のこと。これらの技術には、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗体調製が含まれる。Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−８１；およびＷａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−４６を参照のこと。
【０１０６】
ポリクローナル抗体の産生のために、適切な標的免疫系が選択される（代表的には、マウスまたはウサギであるが、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリ、モルモット、サル、ラットもまた含まれる）。宿主によって産生される免疫グロブリンは、慣用の方法（アフィニティー精製を含む）で沈降、単離、および精製され得る。実質的に単一特異的な抗体集団は、ポリクローナル血清のクロマトグラフィー精製によって産生され得る。
【０１０７】
モノクローナル抗体のために、適切な動物が選択され、そして所望の免疫プロトコルに従う。本発明の抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥであり、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＭが最も好ましい。）のものであり得る。好ましいモノクローナル抗体である抗ＣＣＸ  ＣＫＲ抗体は、ＣＣＸ  ＣＫＲの１つ以上の生物学的活性を中和する（すなわち、阻害またはブロックする）。このような抗体は、所望の阻害活性についてハイブリドーマ上清をスクリーニングすることによって得られ得る。１０8リットル／モルの親和性、好ましくは、１０9〜１０10またはそれより強い親和性を有するモノクローナル抗体は、以下に記載される方法によって産生され得る。非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス、ウサギ、またはウマ）の産生は、周知であり、そして、例えば、宿主動物をＣＣＸ  ＣＫＲまたはそのフラグメントを含有する調製物で免疫することによって達成され得る。免疫化動物から得られる抗体産生細胞は、不死化され、そしてスクリーニングされるか、またはＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドに結合する抗体の産生のためにまずスクリーニングされ、次いで不死化される。
【０１０８】
本発明のいくつかの抗ＣＣＸ  ＣＫＲモノクローナル抗体は、それらの標的に対する親和性を減少せずにそれらの潜在的な抗原性を減少するために、ヒト化されているか、またはヒトもしくはキメラである。ヒト化抗体は、当該分野で記載されている。例えば、Ｑｕｅｅｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９；米国特許第５，５６３，７６２号；同第５，６９３，７６１号；同第５，５８５，０８９号および同第５，５３０，１０１号を参照のこと。ヒト化のために使用されるヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体であるか、またはいくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であり得る。Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：７７３（１９９１）；Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６：９７１（１９９３）を参照のこと。
【０１０９】
ＣＣＸ  ＣＫＲに対するヒト化モノクローナル抗体もまた、ヒト免疫系のエレメントを有するトランスジェニック動物を使用して産生し得る（例えば、米国特許第５，５６９，８２５号；同第５，５４５、８０６号；同第５，６９３，７６２号；同第５，６９３，７６１号；および同第５，７１２４，３５０号を参照のこと）。
【０１１０】
有効な抗ＣＣＸ  ＣＫＲ結合組成物もまた、ファージディスプレイ技術を使用して産生し得る（例えば、Ｄｏｗｅｒら、ＷＯ９１／１７２７１およびＭｃＣａｆｅｒｔｙら、ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）。これらの方法において、ファージのライブラリーが産生され、そこでのメンバーは、それらの外側表面上に異なる抗体を提示する。抗体は、通常、ＦｖまたはＦａｂフラグメントとして提示される。所望の特異性を有するファージディスプレイ抗体は、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドに対するアフィニティー富化によって選択される。
【０１１１】
一旦発現されると、本発明の全抗体、それらのダイマー、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態は、当該分野の標準的な手順（硫安沈殿、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳導など）に従って、精製され得る（一般的に、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ  ３ＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，１９９４を参照のこと）。
【０１１２】
抗体（例えば、抗ＣＣＸ  ＣＫＲ抗体）は、調製物中に存在する少なくとも約８０％、よりしばしば少なくとも約９０％、さらによりしばしばには少なくとも約９５％、最もしばしば少なくとも約９９％またはそれ以上のポリペプチド分子が、同じ抗原（例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチド）に特異的に結合する場合、実質的に純粋である。薬学的な使用のために、少なくとも約９０〜９５％均一性の抗ＣＣＸ  ＣＫＲ免疫グロブリンが好ましく、そして９８から９９％またはそれ以上の均一性がもっとも好ましい。
【０１１３】
（Ｂ．ＣＣＸ  ＣＫＲ抗体の改変）
本発明の抗体は、改変して、または改変なしで使用し得る。頻繁には、その抗体は、共有結合によるかまたは非共有結合により、検出可能なシグナルを提供する物質と結合させることによって標識される。このような標識には、当該分野で周知のもの（例えば、放射性標識、蛍光標識、または生物活性（例えば、酵素）標識）が含まれる。標識された結合部分として、本発明の抗体は、診断的応用に特に有用であり得る。
【０１１４】
ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドに対する抗体の特異性を共有するが、第二の部分に特異的に結合することもまた可能であるハイブリッド抗体もまた、本発明に包含される。ハイブリッド抗体において、１つの重鎖および軽鎖の対は、１つの抗体からであり、そして他の対は、別のエピトープに対して惹起されたものからである。これは、多機能結合価、すなわち、少なくとも２つの異なるエピトープに同時に結合する能力、の特性を生じる。このようなハイブリッドは、それぞれの成分抗体を産生するハイブリドーマの融合によって、または組換え技術によって形成され得る。
【０１１５】
（Ｃ．非交差反応抗体の選択）
いくつかの実施形態において、ＣＣＸ  ＣＫＲと特異的に免疫反応し、かつ、他のケモカインレセプターに対して低交差反応性を有するように選択された抗ＣＣＸ  ＣＫＲモノクローナル血清または抗ＣＣＸ  ＣＫＲポリクローナル血清が生成され、そして任意のそのような交差反応性は、免疫アッセイにおける使用の前に免疫吸着によって除去される。特異性に関してモノクローナル抗体をスクリーニングしそして特徴づけするための方法は、当該分野で周知であり、そして一般にＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（前出）に記載される。
【０１１６】
ポリクローナル抗血清を産生するために（例えば、免疫アッセイにおいて使用するため）、配列番号２のタンパク質、ポリクローナル抗血清が、当該分野で周知の方法（例えば、前出のようなもの）を使用して調製される。例えば、組換えタンパク質は、哺乳動物細胞株において産生され得る。ｂａｌｂ／ｃのようなマウスの同系交配の株は、配列番号２のタンパク質を用いて、標準的なアジュバント（例えば、Ｆｒｅｕｎｄアジュバント）および標準的なマウス免疫プロトコル（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（前述）を参照のこと）を使用して、免疫化される。あるいは、本明細書に開示される配列に由来し、そしてキャリアタンパク質に結合体化された合成ペプチドが、免疫原として使用され得る。ポリクローナル血清が収集され、そして免疫アッセイ（例えば、免疫原が固体支持体に固定されている固相免疫アッセイ）において免疫原タンパク質に対して力価測定される。１０4またはそれ以上の力価を有するポリクローナル抗血清が選択され、そして他のヒトケモカインレセプター（例えば、１つ以上のＣＣＲ１、ＣＣＲ２、（ＣＣＲ２Ａ、ＣＣＲ２Ｂ）、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９Ａ／Ｂ、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸ3ＣＲ１、およびＸＣＲ１）または他のＧタンパク質結合レセプター（例えば、ウシＰＰＲＩ）に対するそれらの交差反応性について競合結合免疫アッセイ（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（前述）の５７０−５７３頁に記載されるもの）を使用して試験される。競合結合形式での免疫アッセイは、交差反応性決定のために使用され得る。例えば、配列番号２のタンパク質は、固相支持体に固定され得る。アッセイに添加されるタンパク質は、固定された抗原に対する抗血清の結合と競合する。固定されたタンパク質への抗血清の結合と競合する上記のタンパク質の能力は、配列番号２のタンパク質と比較される。上記のタンパク質についてのパーセント交差反応性が、標準的な計算を使用して計算される。上記のタンパク質の各々との１０％未満の交差反応性を有する抗血清が選択されそしてプールされる。次いで、交差反応する抗体は、プールされた抗血清から上記のタンパク質との免疫吸着によって除去される。
【０１１７】
（Ｖ．ＣＣＸ  ＣＫＲリガンドの同定）
ＣＣＸ  ＣＫＲが結合するケモカインは、実施例４から６において以下に記載されるように同定された。ＣＣＸ  ＣＫＲに結合するリガンドの範囲には、高親和性を有するＥＬＣ、ＳＬＣ、ＣＴＡＣＫ、およびＴＥＣＫ、ならびに低親和性を有するＢＬＣ、ｍＭＩＰ−１γ、およびνＭＩＰＩＩが含まれる。ケモカインＥＬＣ（ＭＩＰ−３βとも呼ばれる）およびＳＬＣ（６Ｃｋｉｎｅとも呼ばれる）、ならびにその同族レセプターであるＣＣＲ７は、樹状細胞（ＤＣ）およびＴ細胞の調節に対して顕著な効果を有する。ＥＬＣおよびＳＬＣは、成熟（未成熟ではないが）ＤＣの主要な誘引物質であることが示されており、そしてそれらは、新たに仮定されたＴ中心記憶（ｃｅｎｔｒａｌ  ｍｅｍｏｒｙ）（ＴCM）リンパ球の移動を制御することが示唆されている。ＥＬＣ、ＳＬＣ、またはＣＣＲ７の天然のまたは標的化された遺伝子欠失は、ＤＣ、Ｔ、およびＢ細胞のトラフィッキングにおける顕著な不全、ならびに二次的リンパ器官構造の形態学的破壊を生じる（Ｓａｌｌｕｓｔｏら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：７０８；Ｆｏｒｓｔｅｒら、１９９９、Ｃｅｌｌ  ９９：２３；Ｇｕｎｎら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５：２５８；Ｇｕｎｎら、１９９９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：４５１；Ｙａｎａｇｈｉｈａｒａら、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｍｕｎｏｌ．１６１：３０９６；Ｙｏｓｈｉｄａら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１３８０３；Ｙｏｓｈｉｄａら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：７１１８）。ＣＣＲ７は、別のケモカインレセプターであるＣＣＲ９（以前は、オーファンクローンＧＰＲ９．６）に関連し、ＣＣケモカインＴＥＣＫに対するレセプターであることが示されている（Ｚａｂｅｌら、１９９９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：１２４１；Ｚａｂａｌｌｏｓら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：５６７１）。ＣＣＲ９／ＴＥＣＫ対合は、胸腺細胞ならびに腸に標的化したホーミングパターンを有するリンパ球の調節にとって重要であることが報告されている（Ｙｏｕｎら、１９９９、Ｂｌｏｏｄ  ９４：２５３３）。現在までに、ＣＣＲ９は、報告された唯一のＴＥＣＫレセプターであり、そしてＣＣＲ７は、ＳＬＣ結合の周辺の矛盾する報告にもかかわらず（Ｊｅｎｈら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３７６５；Ｓａｔｏら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８２０５）、ＥＬＣおよびＳＬＣについての唯一の信憑性のあるレセプターであった。
【０１１８】
（ＶＩ．ＣＣＸ  ＣＫＲ活性のモジュレーターのスクリーニングおよび同定）  本発明はまた、ＣＣＸ  ＣＫＲの活性を調節する化合物をスクリーニングし得るアッセイ方法を提供する。特に興味深いのは、ＣＣＸ  ＣＫＲに結合する化合物（ケモカインＥＬＣとの結合について競合する化合物を含む）である。本発明は、種々の薬物スクリーニング技術において組換えレセプターを使用することによる化合物のスクリーニングのために特に有用である。したがって、本発明は、ＣＣＸ  ＣＫＲ機能の推定の特異的アゴニストまたはアンタゴニストを評価するための方法を含む。したがって、本発明は、ＣＣＸ  ＣＫＲケモカインレセプターの活性を調節する化合物のためのスクリーニングアッセイの調製および実行におけるこれらの化合物の使用に関する。例えば、本発明の化合物は、レセプター変異体を単離するために有用であり、これは、より強力な化合物のための優れたスクリーニングツールである。さらに、本発明の化合物は、ＣＣＸ  ＣＫＲケモカインレセプターに対する他の化合物の結合部位を樹立するかまたは決定することにおいて（例えば、競合阻害により）、有用である。本発明の化合物はまた、ＣＣＲ−１、ＣＣＲ−２（ＣＣＲ２Ａ、ＣＣＲ２Ｂ）、ＣＣＲ−３、ＣＣＲ−４、ＣＣＲ−５、およびＣＸＣＲ−４を含む他のケモカインレセプターに比較して、ＣＣＸ  ＣＫＲケモカインレセプターの推定特異的モジュレーターの評価のための有用である。
【０１１９】
ＣＣＸ  ＣＫＲ結合アッセイ、ＣＣＸ  ＣＫＲシグナリングアッセイ、走化性アッセイ、セカンドメッセンジャーレベル（すなわち、Ｃａ＋＋）；細胞増殖；イノシトールホスフェートプール変化；および細胞応答の他のアッセイを含む種々のアッセイは、ＣＣＸ  ＣＫＲモジュレーターを評価するために使用され得る。
【０１２０】
薬物スクリーニングの１つの方法は、ＣＣＸ  ＣＫＲ（例えば、配列番号２を有するタンパク質）を発現する組換えＤＮＡ分子で安定にトランスフェクトされた真核生物または原核生物の宿主細胞を利用する。このような細胞は、生存形態または固定された形態のいずれかで、標準的なリガンド／レセプター結合アッセイのために使用され得る（Ｐａｒｃｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：２４３−２４７；およびＯｗｉｃｋｉら、１９９０、Ｐｅｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：４００７−４０１１（これは、細胞応答を検出するための感度のよい方法を記載する）を参照のこと）。試験化合物は、結合について、または結合のために別のリガンドとの競合についてアッセイされ得る。しばしば、試験化合物または「その他のリガンド」のいずれかが、標識される。種々の実施形態において、試験化合物は、ＣＣＸ  ＣＫＲまたはそのリガンド結合フラグメントへの結合に対してケモカインまたは他のリガンドとの競合について評価される。いくつかの実施形態において、そのケモカインは、ＥＬＣ、ＳＬＣ、ＴＥＣＫ、ＢＬＣ、ＣＴＡＣＫ、ｍＭＩＰ−１γ、またはνＭＩＰＩＩである。関連する実施形態において、ケモカインは、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドにが高い親和性または中程度の親和性で結合するＥＬＣ、ＳＬＣ，ＴＥＣＫ、ＢＬＣ、ＣＴＡＣＫ、ｍＭＩＰ−１γ、またはνＭＩＰＩＩ以外のケモカインである。
【０１２１】
適切なアッセイにおいて、ヒトＣＣＸ  ＣＫＲタンパク質の少なくとも１つの特性、活性または機能的特徴を有するＣＣＸ  ＣＫＲタンパク質（単離されたものであろうと組換えであろうと）が使用される。その特性は、結合プロフィール（例えば、ＥＬＣ、ＳＬＣ、およびＴＥＣＫに対する結合であるが、ＣＣＸ  ＣＫＲレセプターポリペプチド（例えば、配列番号２の）がほとんどかまたは全く親和性を有さずに結合するケモカインに対する結合ではない（例えば、ＴＥＣＫおよびＥＬＣの両方またはＳＬＣに対する結合）のような結合特性（例えば、リガンドまたはインヒビターに対する）、シグナリング活性（例えば、哺乳動物Ｇタンパク質の活性化、迅速および一過性の細胞質遊離カルシウム［Ｃａ++］ｉの濃度の増大の誘導）、細胞応答機能（例えば、白血球による走化性の刺激または炎症ミディエーターの放出）などであり得る。
【０１２２】
１つの実施形態において、ＣＣＸ  ＣＫＲタンパク質またはその改変体を含有する組成物は、結合に対して適切な条件下で維持される。ＣＣＸ  ＣＫＲレセプターは、試験されるべき推定因子（または少なくとも１つの推定因子を含有する第二の組成物）と接触され、そして結合が検出または測定される。
【０１２３】
１つの実施形態において、そのアッセイは、細胞ベースのアッセイであり、そしてＣＣＸ  ＣＫＲレセプターをコードする核酸配列を有するベクターまたは発現カセットで安定にまたは一過的にトランスフェクトされた細胞が使用される。その細胞は、レセプターの発現にとって適切である条件下で維持され、そして推定因子と結合が生じるのに適切な条件下で接触される。結合は、標準的な技術を使用して検出され得る。例えば、結合の程度は、適切なコントロールに比較して（例えば、推定因子の非存在下でバックグラウンドに対して、または公知のリガンドに対して）決定され得る。必要に応じて、そのレセプターを含有する細胞画分（例えば、膜画分）が全細胞の代わりに使用され得る。
【０１２４】
結合または複合体形成の検出は、直接的にまたは間接的に検出され得る。例えば、推定因子は、適切な標識（例えば、蛍光標識、化学発光標識、アイソトープ標識、酵素標識など）を使用して標識され得、そして結合は、標識の検出によって決定され得る。特異的および／または競合的結合は、競合または置換研究によって、標識していない因子またはリガンド（例えば、ＥＬＣ、ＳＬＣ、ＴＥＣＫ、ＢＬＣ、ｍＣＴＡＣＫ、ｍＭＩＰ−１γ、またはνＭＩＰＩＩ）を競合剤として使用して、評価され得る。
【０１２５】
他の実施形態において、結合阻害アッセイは、本発明の化合物を評価するために使用され得る。これらのアッセイにおいて、ＥＬＣ、ＳＬＣ、ＴＥＣＫ、ＢＬＣ、またはνＭＩＰＩＩを使用してリガンド結合のインヒビターとして評価される。この実施形態において、ＣＣＸ  ＣＫＲレセプターは、ＥＬＣ、ＳＬＣ、ＴＥＣＫ、ＢＬＣ、ｍＣＴＡＣＫ、ｍＭＩＰ−１γ、またはνＭＩＰＩＩのようなリガンドと接触され、そしてリガンド結合の測定がなされる。次いで、そのレセプターは、リガンドの存在下（例えば、ＥＬＣ、ＳＬＣ、ＴＥＣＫ、ＢＬＣ、ｍＣＴＡＣＫ、ｍＭＩＰ−１γ、またはνＭＩＰＩＩ）で試験因子と接触され、結合の第二の測定がなされる。リガンド結合の程度の減少は、試験因子による結合の阻害の指標である。その結合の阻害アッセイは、ＣＣＸ  ＣＫＲを発現する全細胞を使用して行われ得るか、またはＣＣＸ  ＣＫＲを発現する細胞からの膜画分を使用して行われ得る。
【０１２６】
Ｇタンパク質に結合したレセプターへの、例えば、アゴニストの結合は、レセプターによるシグナリング事象を生じ得る。したがって、シグナリングアッセイはまた、本発明の化合物を評価するために使用され得、そして因子によるシグナリング機能の誘導が、任意の適切な方法を使用してモニターされ得る。例えば、Ｇタンパク質活性（例えば、ＧＴＰのＧＤＰへの加水分解またはレセプター結合により誘発される後期（ｌａｔｅｒ）シグナリング事象）は、公知の方法によってアッセイされ得る（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９７／１５９１５；Ｎｅｏｔｅら、１９９３、Ｃｅｌｌ  ７２：４１５−２５；Ｖａｎ  Ｒｉｐｅｒら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７：８５１−５６およびＤａｈｉｎｄｅｎら、１９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：７５１−５６を参照のこと）。
【０１２７】
走化性アッセイもまた、レセプター機能を評価するため、および本明細書において提供される化合物を評価するために使用され得る。これらのアッセイは、因子によってインビトロまたはインビボで誘導された細胞（組換えＣＣＸ  ＣＫＲを発現する細胞）の機能的移動に基づいており、そしてリガンド、インヒビター、またはアゴニストの走化性に対する結合および／または抗化合物を評価するために使用され得る。適切なアッセイは、ＰＣＴ／ＵＳ９７／１５９１５；Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、ＷＯ９４／２０１４２；Ｂｅｒｍａｎら、１９８８、Ｉｍｕｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１７：６２５−７７（１９８８）；およびＫａｖａｎａｕｇｈら、１９９１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４６：４１４９−４１５６に記載される。
【０１２８】
本明細書において提供される試験化合物ＣＣＸ  ＣＫＲ活性モジュレーターまたは推定モジュレーターおよびその他の化合物はまた、その化合物がインビボで効果を発揮する能力を評価するために炎症のモデルを使用して評価され得る。適切なモデルは、以下のように記載されている：肺炎のためのヒツジモデル（Ｗｅｇら、１９９３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：５６１を参照のこと）；およびラット遅延型過敏モデル（Ｒａｎｄら、１９９６、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１４８：８５５−８６４を参照のこと）。本発明の化合物を評価するための別の有用なモデルは、多発性硬化症についての実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルであり、これはケモカインレセプター発現および機能をプローブする（Ｒａｎｓｏｈｏｆｆら、１９９６、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．，７：３５−４６、およびＫａｒｐｕｓら、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：２６６７−２６７１を参照のこと）。
【０１２９】
さらに、白血球炎症アッセイはまた、化合物を評価するために使用され得る（Ｖａｎ  Ｄａｍｍｅら、１９９２、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：５９−６５；Ｚａｃｈａｒｉａｅら、１９９０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：２１７７−２１８２；およびＪｏｓｅら、１９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：８８１−８８７を参照のこと）。
【０１３０】
自動化アッセイのいくつかの方法が、短期間に数万の化合物のスクリーニングを可能にするために、近年において開発されている。Ｆｏｄｏｒら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７３および複数の化合物による結合親和性の試験のための手段を記載する化学的多様性ライブラリーのその他の記載を参照のこと。適切なアッセイの開発は、本発明によって提供されるように、大量の精製ＣＣＸ  ＣＫＲおよび／または組換えＣＣＸ  ＣＫＲを発現する細胞の利用可能性により大いに容易化され得る。
【０１３１】
本発明の検出方法およびスクリーニング法の実施形態において、ケモカインおよびＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドは、同じ種のものである。関連する実施形態において、ケモカインは、レセプターに天然に結合する。
【０１３２】
（ＶＩＩ．ＣＣＸ  ＣＫＲ媒介状態または疾患を処置する方法）
なお別の局面において、本発明は、このような疾患または条件を有する被験体に、治療有効量のＣＣＸ  ＣＫＲ機能のモジュレーター（すなわち、ＣＣＸ  ＣＫＲ機能または遺伝子発現のアゴニスト（刺激剤）およびアンタゴニスト（阻害剤））を投与することによって、ＣＣＸ  ＣＫＲ媒介条件または疾患を処置する方法を提供する。このようなモジュレーターには、ＣＣＸ  ＣＫＲ機能の低分子アゴニストおよびアンタゴニスト；ポリペプチドインヒビター（例えば、優勢ネガティブ変異体）；アンチセンス、リボザイム、および三重鎖ポリヌクレオチド；遺伝子治療（阻害のための；例えば、遺伝子ノックアウトまたは過剰発現）などが含まれる。
【０１３３】
炎症、感染、および癌に関連する疾患および状態は、本発明の化合物および組成物によって処置され得る。実施形態の１つのグループにおいて、ヒトまたはその他の種の疾患または状態（慢性疾患を含む）は、ＣＣＸ  ＣＫＲ機能のインヒビターで処置され得る。これらの疾患または状態には、（１）炎症またはアレルギー疾患（全身性過敏症または過敏応答、薬物アレルギー、昆虫の刺創アレルギー）；炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎および腸炎））；膣炎；乾癬および炎症性皮膚疾患（例えば、皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹）；血管炎；脊椎関節症；強皮症；呼吸器アレルギー性疾患（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患など）、（２）自己免疫疾患（例えば、関節炎（慢性関節リウマチおよび乾癬）、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、糖尿病、糸球体腎炎など）、（３）移植片拒絶（同種移植片拒絶および対宿主性移植片病を含む）、ならびに（４）所望でない炎症性応答が阻害されるべき他の疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、筋炎）が含まれる。別の実施形態のグループにおいて、疾患または状態は、ＣＣＸ  ＣＫＲ機能のアゴニストまたはＣＣＸ  ＣＫＲ発現を増大するための試薬または方法で処置される。ＣＣＸ  ＣＫＲアゴニストで処置されるべき疾患の例には、癌、血管形成または新血管形成が役割を果たす疾患（新生物疾患、網膜症、および黄斑変性）、感染疾患、ならびに免疫抑制疾患が含まれる。ＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子産物、アゴニスト、およびアンタゴニストは、組織および器官の再モデリング、修復、および再生において同様に用途を見出す。
【０１３４】
例えば、モジュレーターＣＣＸ  ＣＫＲ活性は、炎症性応答に関与する細胞の増殖および分裂を阻害し得る。用語「炎症」は当該分野で通常の意味を有し、急性の応答（すなわち、炎症性プロセスが活性である応答）および慢性応答（すなわち、新たな結合組織の遅い進行および形成が特徴である）をいう。急性および慢性炎症は、関与する細胞型によって区別され得る。急性炎症は、しばしば、多系核の好中球が関与する；一方、慢性炎症は、通常、リンパ組織球増多症および／または肉芽腫症応答によって特徴付けられる。炎症には、特異的および非特異的防御系の両方の反応が含まれる。特異的防御系反応は、抗原（おそらく自己抗原も含まれる）に対する特異的な免疫系反応応答である。非特異的防御系反応は、免疫学記憶し得る白血球によって媒介される炎症性応答である。このような細胞には、顆粒球、マクロファージ、好中球、および好酸球が含まれる。炎症についてのアッセイは、当該分野で周知である。本発明によって提供される試薬は、慢性および急性状態の両方の炎症状態であって、感染に関連する炎症（例えば、敗血症性ショック、敗血症、または全身性炎症応答症候群（ＳＩＲＳ）、虚血性再灌流障害、内毒素致死性、関節炎、補体媒介超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導性肺疾患、炎症性腸疾患、クローン病）、またはサイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１）の過剰産生から生じるものを含むものを処置するために使用され得る。特定のタイプの炎症の例は、びまん性炎症、病巣炎症、クループ性炎症、間質性炎症、閉塞性炎症、実質性炎症、反応性炎症、特異的炎症、毒性炎症、および外傷性炎症である。
【０１３５】
本発明の方法および試薬は、哺乳動物のような動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス）処置において、または動物において、またはヒト疾患のインビトロモデル（例えば、細胞培養）で使用され得る。
【０１３６】
（ＶＩＩＩ．薬学的組成物）
本発明は、ＣＣＸ  ＣＫＲのアゴニスト、アンタゴニスト、またはリガンドを含む治療組成物、およびＣＣＸ  ＣＫＲによって媒介される生理学的または病理学的状態を処置する方法をさらに提供する。
【０１３７】
ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチド、そのフラグメント、センスおよびアンチセンスポリペプチド、抗ＣＣＸ  ＣＫＲ抗体またはその結合フラグメント、ならびにＣＣＸ  ＣＫＲ活性のアンタゴニストまたはアゴニスト（例えば、低分子モジュレーター）は、滅菌条件下で処置されるべき宿主に直接投与され得る。しかし、活性成分は、単独で、投与されることが可能であり、それは、しばしば、薬学的処方物として提示することが好ましい。処方物は、代表的には、少なくとも１つの活性成分を、１つ以上の受容可能なそのキャリアと一緒に含む。各キャリアは、他の成分と適合性であり、そしてその患者に対して傷害性でないという意味において、薬学的にも生理学的にも受容可能であるべきである。例えば、生物活性剤は、半減期のような安定性または薬学的な特性を増強するために、投与前にオボアルブミンまたは血清アルブミンのようなキャリアタンパク質と複合体化され得る。さらに、本発明の治療処方物は、他の化学療法剤または化学予防剤と組み合わせて、または関連して、使用され得る。
【０１３８】
治療処方物は、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）（１９９０）ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（第８版）  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；および（１９９０）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１７版）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐ．ａ．；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｌｉｅｖｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．；およびＬｅｉｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。
【０１３９】
処置されるべき疾患および被験体の状態に依存して、本発明の化合物は、経口、非経口（例えば、筋肉内注射または注入、腹腔内注射または注入、静脈内注射または注入、ＩＣＶ注射または注入、嚢内注射または注入、皮下注射、または移植）により、吸入スプレー、鼻内、膣内、直腸内、舌下、または局所的投与経路により投与され得、そして単独もしくは各投与経路にとって適切な従来の非毒性の薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント、およびビヒクルを含有する適切な投薬単位処方物において一緒に、処方され得る。活性成分を含有する薬学的組成物は、経口使用のため、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性の懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、エマルジョン、ハードカプセルもしくはソフトカプセル、またはシロップもしくはエリキシルとして、適切な形態であり得る。経口使用のために意図される組成物は、当該分野で公知の任意の方法にしたがって、薬学的組成物の製造のために調製され得、そしてそのような組成物は、薬学的にエレガントかつ口当たりのよい調製物を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤、および保存剤からなる群から選択される１つ以上の薬剤を含有し得る。錠剤は、錠剤の製造に適切な非毒性の薬学的に受容可能な賦形剤と混合して活性成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば、不活性な希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム）；顆粒化剤および崩壊剤（例えば、コーンスターチまたはアルギン酸）；結合剤（例えば、スターチ、ゼラチン、アカシア）、および潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）であり得る。錠剤は、被覆されていなくてもよく、またはそれらは、胃腸管において崩壊および吸収を遅延させ、それにより長期にわたって持続的な作用を提供するために、公知の技術によって被覆されていてもよい。例えば、時間遅延物質（例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレート）が利用され得る。それらはまた、米国特許第４，２５６，１０８号；同第４，１６６，４５２号；および同第４，２６５，８７４号に記載される技術によってもまた、制御放出のための浸透圧治療錠剤を形成するために、被覆され得る。
【０１４０】
経口使用のための処方物はまた、硬質ゼラチンカプセル（ここでは、活性成分は、不活性な固体希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン）と混合される）として存在し得るか、または軟質ゼラチンカプセル（ここでは、活性成分は、水または油性媒体（例えば、ラッカセイ（ｐｅａｎｕｔ）油、液状パラフィンまたはオリーブ油）と混合される）として存在し得る。
【０１４１】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適切な賦形剤との混合物中に活性材料を含有する。このような賦形剤は、懸濁剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシ−プロピルメチル−セルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、カラヤゴムおよびアラビアゴム）であり；分散剤または湿潤剤は、天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、または脂肪酸と酸化アルキレンとの縮合生成物（例えば、ポリオキシ−エチレンステアレート）、または長鎖脂肪族アルコールとエチレンオキシドとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、または脂肪酸およびヘキシトールから誘導される部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）、または無水ヘキシトールおよび脂肪酸から誘導される部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物（例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。この水性懸濁液はまた、１以上の防腐剤（例えば、エチルまたはｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシベンゾエート）、１以上の着色剤、１以上の香味料、および１以上の甘味料（例えば、スクロースまたはサッカリン）を含んでもよい。
【０１４２】
油性懸濁液は、活性成分を植物油（例えば、ラッカセイ（ａｒａｃｈｉｓ）油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油）中、または鉱油（例えば、液体パラフィン）中に懸濁することにより調合され得る。油性懸濁液は、増粘剤（例えば、みつろう、硬質ワックスまたはセチルアルコール）を含んでもよい。上記のような甘味料および香味剤が添加されて、口当たりのよい経口調製物を提供し得る。これらの組成物は、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸）の添加により保存され得る。
【０１４３】
水の添加による水性懸濁液の調製に適切な分散性散剤および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１以上の防腐剤との混合物中に活性成分を提供する。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤は、既に上記されるものにより例示される。さらなる賦形剤（例えば、甘味料、香味剤および着色剤）もまた存在し得る。
【０１４４】
本発明の薬学的組成物はまた、オイル−イン−ウォーター乳濁液の形態であり得る。油相は、植物油（例えば、オリーブ油またはラッカセイ油）もしくは鉱油（例えば、液体パラフィン）またはそれらの混合物であり得る。適切な乳化剤は、は、天然に存在するゴム（例えば、アラビアゴムもしくはカラヤゴム）、天然に存在するホスファチド（例えば、ダイズ、レシチン）、または脂肪酸および無水ヘキシトールから誘導されるエステルもしくは部分エステル（例えば、ソルビタンモノオレエート）、およびエチレンオキシドとのその部分エステルの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。乳濁液はまた、甘味剤および香味剤を含んでもよい。
【０１４５】
シロップおよびエリキシルは、甘味剤（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロース）を用いて調合され得る。このような調合物はまた、粘滑剤、防腐剤ならびに香味剤および着色剤を含んでもよい。
【０１４６】
薬学的組成物は、注射用水性懸濁液または油性懸濁液の形態であり得る。この懸濁液は、これらの適切な分散剤または湿潤剤、および上記されている懸濁剤を使用して、公知の技術に従って処方され得る。この滅菌注射可能な調製物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒（例えば、１，３−ブタンジオール溶液）中の滅菌注射可能な溶液または懸濁液であり得る。受容可能なビヒクルおよび溶媒のなかでも、水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液を使用し得る。さらに、滅菌不揮発性油は、溶媒または懸濁培地として都合良く使用される。この目的のために、任意のブランドな油を使用し得、これらとしては、合成モノグリセリドおよびジグリセリドが挙げられる。さらに、脂肪酸（例えば、オレイン酸）が、注射可能物（ｉｎｆｅｃｔａｂｌｅ）の調製において用途を見出す。
【０１４７】
本発明の化合物はまた、薬物の直腸投与のための坐薬の形態で投与され得る。これらの組成物は、通常の温度では固体であるが、直腸の温度では液体であり、これにより直腸内で溶解して薬物を放出する、非刺激性賦形剤と薬物とを混合することにより調製され得る。このような材料は、ココアバターおよびポリエチレングリコールである。
【０１４８】
局所的な使用のために、本発明の化合物を含有する、クリーム剤、軟膏、ゼリー、溶液または懸濁液などが、使用され得る。本明細書中で使用される場合、局所適用はまた、口洗浄および含嗽薬の使用を含むことが意図される。
【０１４９】
本発明の薬学的組成物および方法はさらに、本明細書に記載されるように、上記病理学的状態の処置において通常適用される他の治療的に活性な化合物を含み得る。
【０１５０】
ケモカインレセプター調節を必要とする状態の処置または予防において、適切な用量レベルは、一般に一日に患者の体重１ｋｇあたり約０．００１〜１００ｍｇであり、これは、単回用量または複数投与で投与され得る。好ましくは、投与量レベルは、一日あたり約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇであり、より好ましくは一日あたり約０．０５〜約１０ｍｇ／ｋｇである。適切な投与量レベルは、１日あたり約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ、一日あたり約０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１日あたり約０．１〜５ｍｇ／ｋｇであり得る。この範囲内で、投与量は、一日あたり約０．００５〜約０．０５、０．０５〜０．５または０．５〜０．５ｍｇ／ｋｇであり得る。経口投与のために、組成物は、好ましくは、処置される患者への投与量の症候性適応について、約１〜１０００ミリグラム（好ましくは、約１５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７５０、８００、９００および１０００ミリグラムの活性成分）の活性成分を含む錠剤の形態で提供される。この化合物は、一日あたり１〜４回（好ましくは、一日あたり１回または２回）のレジメンで投与され得る。
【０１５１】
しかし、任意の特定の患者のための特定の用量レベルおよび頻度が変化し得、そして以下を含む種々の因子に依存することは、理解される：使用される特定の化合物の活性、代謝安定性およびこの化合物の作用の長さ、年齢、体重、全体的な健康、性別、食事、投与の様式および時間、排出速度、薬物の組み合わせ、特定の状態の重症度、および宿主が受けている治療。
【０１５２】
本発明の化合物は、炎症および免疫調節の障害および疾患（ぜん息およびアレルギー性疾患、ならびに自己免疫病理（例えば、慢性関節リウマチおよびアテローム性動脈硬化症）ならびに上記の病理が挙げられる）を予防および処置するための関連した有用性を有するほかの化合物と組み合わされ得る。
【０１５３】
例えば、炎症の処置または予防において、本発明の化合物は、抗炎症剤または鎮痛剤と組み合わせて使用され得る（例えば、アヘン剤アンタゴニスト、リポキシゲナーセインヒビター（例えば、５−リポキシゲナーゼのインヒビター）、シクロオキシゲナーゼインヒビター（例えば、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビター）、インターロイキンインヒビター（例えば、インターロイキン−１インヒビター）、ＮＭＤＡアンタゴニスト、酸化窒素のインヒビターまたは酸化窒素の合成のインヒビター、非ステロイド系抗炎症剤、またはサイトカイン抑制抗炎症剤（例えば、アセトアミノフェン、アスピリン、コジエン（ｃｏｄｉｅｎｅ）、フェンタニル、イブプロフェン、インドメタシン、ケトロラック、モルヒネ、ナプロキセン、フェナセチン、ピロキシカム、ステロイド系鎮痛薬、サフェンタニル、サンリンダク（ｓｕｎｌｉｎｄａｃ）、テニダプなど））。同様に、即時化合物は、鎮痛剤；相乗因子（例えば、カフェイン、Ｈ２−アンタゴニスト、シメチコン、水酸化アルミニウムまたは水酸化マグネシウム）；うっ血除去薬（例えば、フェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、プソイドエヘドリン（ｐｓｅｕｄｏｐｈｅｄｒｉｎｅ）、オキシメタゾリン、エピネフリン（ｅｐｈｉｎｅｐｈｒｉｎｅ）、ナファゾリン、キシロメタゾリン、プロピルヘキサドリン、またはレボ−デスオキシ−エフェドリン）；鎮咳薬（ａｎｔｉｉｔｕｓｓｉｖｅ）（例えば、コデイン、ヒドロコドン、カラミフェン、カルベタペンタンまたはデキサトラメトルファン（ｄｅｘｔｒａｍｅｔｈｏｒｐｈａｎ））；利尿薬；および鎮静または非鎮静抗ヒスタミンと投与され得る。同様に、本発明の化合物は、本発明の化合物が有用である疾患または状態の処置／予防／抑制または寛解において使用される他の薬物と組み合わせて使用され得る。このような他の薬物は、本発明の化合物と同時または続いて、そのために通常使用される経路により、そして通常使用される量で、投与され得る。本発明の化合物が１以上のほかの薬物と同時に使用される場合、本発明の化合物に加えてこのような他の薬物を含有する薬学的組成物が好ましい。従って、本発明の薬学的組成物はまた、本発明の化合物に加えて他の１以上の活性成分を含む。別々に投与されるかまたは同じ薬学的組成物中でかのいずれかで投与される、本発明の化合物と組み合わせられ得る他の活性成分の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（ａ）ＶＬＡ−４アンタゴニスト、（ｂ）ベクロメタゾン、メチルプレニドゾロン、プレドニゾン、デキサメタゾンおよびヒドロコルチゾンのようなステロイド、（ｃ）シクロスポリン、タクロリムス（ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）、ラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）および他のＦＫ−５０６型免疫抑制薬のような免疫抑制薬；（ｄ）ブロモフェニルアミン、クロルフェニルアミン、ｄ−クロルフェニラミン、トリプロリジン、クレマスチン、ブロモジフェンヒドラミン、ジフェニルピラリン、トリペレナミン、ヒドロキシジン、メトジラジン、プロメタジン、トリメプラジン、アザタジン、シプロヘプタジン、アンタゾリン、フェニラミン、ピリラミン、アステミゾール、テルフェナジン、ロラダジン、セチリジン、フェクソフェンナジン（ｆｅｘｏｆｅｎａｄｉｎｅ）、デスカルボエトキシロラタジン（ｄｅｓｃａｒｂｏｅｔｈｏｘｙｌｏｒａｔａｄｉｎｅ）などのような抗ヒスタミン（Ｈ１−ヒスタミンアンタゴニスト）；（ｅ）β２−アゴニスト（テルブタリン、メタプロテレノール、フェノテロール、イソエタリン、アルブテロール、ビオルテロールおよびピルブテロール）、テオフィリン、クロモリンナトリウム、アトロピン、イプラトロピウムブロミド、ロイコトリエンアンタゴニスト（ザフィルカスト（ｚａｆｉｒｌｕｋａｓｔ）、モンテルカスト（ｍｏｎｔｅｌｕｋａｓｔ）、プランルカスト（ｐｒａｎｌｕｋａｓｔ）、イラルカスト（ｉｒａｌｕｋａｓｔ）、ポビルカスト（ｐｏｂｉｌｕｋａｓｔ）、ＳＫＢ−１０６，２０３）、ロイコトリエン生合成インヒビター（ジロイトン、ＢＡＹ−１００５）、のような非ステロイド系抗ヒスタミン剤；（ｆ）プロピオン酸誘導体（アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロクス酸、カルプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドプロフェン、ケトプロフェン、ミロプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、スプロフェン、チアプロフェン酸およびチオキサプロフェン）、酢酸誘導体（インドメタシン、アセメタシン、アルクロフェナック、クリダナク（ｃｌｉｄａｎａｃ）、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、フェンクロジン酸、フェンチアザク、フロフェナク（ｆｒｏｆｅｎａｃ）、イブフェナク（ｉｂｕｆｅｎａｃ）、イソキセパック、オキソピナク（ｏｘｐｉｎａｃ）、スリンダク、チオピナク（ｔｉｏｐｉｎａｃ）、トルメチン、ジドメタシン（ｚｉｄｏｍｅｔａｃｉｎ）およびゾメピラック）、フェナム酸誘導体（フルフェナム酸、メクロフェナム酸、メフェナム酸、ニフルム酸およびトルフェナム酸）、ビフェニルカルボン酸誘導体（ジフルニサルおよびフルフェニサール）、オキシカム（イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカムおよびテノキシカム）、サリチレート（アセチルサリチル酸、スルファサラジン）およびピラゾロン（アパゾン、ベズピペリロン（ｂｅｚｐｉｐｅｒｙｌｏｎ）、フェプラゾン、モフェブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン）のような非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）；（ｇ）シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）インヒビター；（ｈ）ホスホジエステルＩＶ型（ＰＤＥ−ＩＶ）のインヒビター；（ｉ）ケモカインレセプター（特にＣＣＲ−１、ＣＣＲ−２、ＣＣＲ−３およびＣＣＲ−５）の他のアンタゴニスト；（ｊ）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビター（ロバスタチン、シンバスタチンおよびプラバスタチン、フルバスタチン（ｆｌｕｖａｓｔａｔｉｎ）、アトルバルタチン（ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）、ならびに他のスタチン）、金属イオン封鎖剤（ｓｅｑｕｓｔｒａｎｔ）（コレスチラミンおよびコレスチポール）、ニコチン酸、フェノフィブル酸誘導体（ゲムフィブロジル、クロフィブレート、フェノフィブラート、およびベンザフィブラート（ｂｅｎｚａｆｉｂｒａｔｅ））およびプロブコールのようなコレステロール低下剤；（ｋ）インスリン、スルホニル尿素、���グアミド（ｂｉｇｕａｎｉｄｅｓ）（メトホルミン）、α−グルコシダーゼインヒビター（アカルボース）およびグリタゾン（トログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）およびピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ））のような抗糖尿病剤；（ｌ）インターフェロンβの調製物（インターフェロンβ−１α、インターフェロンβ−１β）；（ｍ）５−アミノサリチル酸およびそれらのプロドラッグ、代謝拮抗物質（例えば、アザチオプリンおよび６−メルカプトプリン）ならびに細胞障害性化学治療剤のような他の化合物。第２の活性成分に対する本発明の化合物の重量比は、変化し得、そして各成分の有効量に依存する。一般に、各々の有効量が使用される。従って、例えば、本発明の化合物がＮＳＡＩＤと組み合わされる場合、ＮＳＡＩＤに対する本発明の化合物の重量比は、概して、約１０００：１〜約１：１０００、好ましくは、約２００：１〜約１：２００の範囲である。本発明の化合物と他の活性成分との組み合わせも、概して、上記範囲内であるが、各々の場合で、有効量の各活性成分が使用されるべきである。
【０１５４】
（ＩＸ．ＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドおよびポリペプチドの検出および定量化）
本発明は、生物学的サンプル中のＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドおよびポリペプチドの検出および定量化のための多くの方法を提供する。１つの実施形態では、ＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子産物（例えば、ポリペプチドまたはｍＲＮＡ）の発現および過剰発現は、ＣＣＸ  ＣＫＲにより媒介されるか、またはＣＣＸ  ＣＫＲと関連する疾患または状態に相関する。ＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子産物の検出が、細胞状態を同定するため（例えば、非成熟（成熟と対照的に）樹状細胞ならびに活性化Ｔ細胞を同定するため）に特に有用であることは、ＣＣＸ  ＣＫＲ  ｍＲＮＡ（図２Ｂ）の発現パターンから評価される。
【０１５５】
生物学的サンプルとしては、血液サンプル、血清、細胞（全細胞、細胞画分、細胞抽出物および培養細胞または細胞株を含む）、組織（生検から得られる組織を含む）、体液（例えば、尿、痰、羊水、滑液）または媒体由来（培養細胞または細胞株由来）、などが挙げられるがこれらに限定されない。ＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドを検出または定量化する方法としては、シグナル増幅を用いるかまたは用いない増幅ベースのアッセイ、ハイブリダイゼーションベースのアッセイ、および増幅−ハイブリダイゼーションを組み合わせたアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドの検出および定量化について、例示的な方法は、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドに特異的に結合する抗体もしくは他の結合因子またはエピトープを使用するイムノアッセイである。
【０１５６】
（Ａ．ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドのついてのアッセイ）
（１．増幅ベースの方法）
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはそのバリエーションは、例示的な増幅ベースのアッセイである。当業者をインビトロ増幅法へ導くに十分な技術の例は、ＰＣＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＤＮＡ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ編，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）；ＰＣＲ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ：Ａ  ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｉｎｎｉｓ，Ｇｅｌｆｌａｎｄ，ＳｎｉｓｋｙおよびＷｈｉｔｅ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に見出される。他の適切な標的増幅法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；例えば、ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０）；ストランドディスプレイスメントアンプリフィケーション（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ；例えば、Ｗａｌｋｅｒら，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３９２−３９６）；核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ，Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ；例えば、Ｃｏｍｐｔｏｎ，１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：９１）などが挙げられる。
【０１５７】
ＰＣＲの１つの有用な改変は、ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡ（例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  カタログ番号１  ６３６  １１１）であり、ここでは、ジゴキシゲニン−ｄＵＴＰが、ＰＣＲ産物へ導入される。ＰＣＲ反応混合物は、変性され、そしてＰＣＲ産物の内部配列へアニーリングするように設計されたビオチン標識化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。このハイブリダイズ産物は、ストレプトアビジンコートされたプレート上に固定され、そして抗ジゴキシゲニン抗体を使用して検出される。
【０１５８】
（２．ハイブリダイゼーションベースの方法）
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション技術を用いる特定のＤＮＡおよびＲＮＡの測定に関する種々の方法は、当業者に公知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、前出）。ハイブリダイゼーションベースのアッセイは、ポリヌクレオチドプローブが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズするアッセイをいう。通常、本発明のポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブは、ＣＣＸ  ＣＫＲ核酸配列の連続配列に完全または実質的に同一である。好ましくは、ポリヌクレオチドプローブは、少なくとも約１０塩基であり、しばしば、少なくとも約２０塩基であり、そしてときどき、約少なくとも２００塩基以上の長さである。ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションにおける使用のためのポリヌクレオチドプローブ配列を選択する方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）に議論される。
【０１５９】
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーション形式は、当業者に公知である。いくつかの形式において、少なくとも１つの標的およびプローブが固定される。固定されるポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または別のオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドであり得、そして天然に存在するヌクレオチドもしくは天然に存在しないヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド骨格を含み得る。このようなアッセイは、以下に挙げられるいくつかの形式のうちのいずれかであり得る：サザンブロット、ノーザンブロット、ドットブロットおよびスロットブロット、高密度ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドアレイ（例えば、ＧｅｎｅＣｈｉｐｓTM  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）、ディップスティック、ピン、チップ、またはビーズ。これらの技術の全ては、当業者に周知でありそして多くの市販の診断キットの基礎である。ハイブリダイゼーション技術は、概してＨａｍｅｓら、編、ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ，Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）；ＧａｌｌおよびＰａｒｄｕｅ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．、６３：３７８−３８３（１９６９）；およびＪｏｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２２３：５８２−５８７（１９６９）に記載される。
【０１６０】
１つの実施形態において、インサイチュハイブリダイゼーションが、サンプル中のＣＣＸ  ＣＫＲ配列を検出するために使用される。インサイチュハイブリダイゼーションアッセイは、周知であり、そして概して、Ａｎｇｅｒｅｒら、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＥＮＺＹＭＯＬ．、１５２：６４９−６６０（１９８７）およびＡｕｓｕｂｅｌ（前出）に記載される。
【０１６１】
（Ｂ．ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドアッセイ）
１つの実施形態において、ＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチドは、本発明の抗ＣＣＸ  ＣＫＲ抗体を用いてサンプル中で検出される。多数の十分に確立された免疫学的結合アッセイが、本発明のＣＣＸ  ＣＫＲを検出および定量するのに適している。例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；同第４，３７６，１１０号；同第４，５１７，２８８号；および同第４，８３７，１６８号、ならびにＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＶＯＬＵＭＥ  ３７：ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＩＮ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ａｓａｉ、編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＢＡＳＩＣ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第７版、ＳｔｉｔｅｓおよびＴｅｒｒ、編（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ、前出［例えば、第１４章］、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ、前出［例えば、第１１章］（これらの各々は、その全体が参考として、そして全目的のために援用される）を参照のこと。
【０１６２】
ＣＣＸ  ＣＫＲを検出するための免疫アッセイは、競合的であっても、非競合的であってもよい。通常、アッセイされるＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子産物は直接または検出可能な標識を用いて間接的に検出される。このアッセイに使用される特定の標識または検出可能な基は、通常、これらがこのアッセイに使用される抗体の特定の結合を有意に妨害しない限り、本発明の重要な局面ではない。標識は、捕獲因子（例えば、抗ＣＣＸ  ＣＫＲ抗体）に共有結合されても、捕獲因子によって認識されるよりもＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドを異なるエピトープにおいて特異的に結合する第３の部分（例えば、別の抗体）に結合されてもよい。
【０１６３】
（非競合免疫アッセイ）
非競合免疫アッセイは、捕獲分析物（ここでは、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチド）の量が直接測定されるアッセイである。１つのこのようなアッセイは、２部位の、モノクローナルベースの免疫アッセイであり、これは、捕獲分析物上の２つの干渉しないエピトープに反応性のモノクローナル抗体を使用する。例えば、背景情報に関しては、Ｍａｄｄｏｘら、１９８３、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１５８：１２１１を参照のこと。このようなアッセイにおいて、サンプル中のＣＣＸ  ＣＫＲ量は、直接測定される。例えば、いわゆる「サンドイッチ」アッセイを用いて、捕獲因子（ここでは、抗ＣＣＸ  ＣＫＲ抗体）は、捕獲因子が固定される固体基板に直接結合され得る。次いで、これらの固定された抗体は、試験サンプル中に存在するポリペプチドを捕獲する。このようにして固定されたＣＣＸ  ＣＫＲは次いで、標識因子（例えば、標識を保有する第２のＣＣＸ  ＣＫＲ抗体）によって結合される。あるいは、第２のＣＣＸ  ＣＫＲ抗体は、標識を欠くが、これは次に、第２の抗体が誘導される種の抗体に特異的な、標識された第３の抗体によって結合され得る。この第２のものは、検出可能な部分（例えば、ビオチン）で修飾され得、ここに、第３の標識された分子が、特異的に結合し得る（例えば、酵素標識ストレプトアビジン）。
【０１６４】
（２．競合免疫アッセイ）
競合アッセイにおいて、サンプル中に存在するＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドの量は、サンプル中に存在する分析物（例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチド）により捕獲因子（例えば、抗ＣＣＸ  ＣＫＲ抗体）から置換された（または競合して放された）、添加された（外因性）ＣＣＸ  ＣＫＲの量を測定することによって、間接的に測定される。１つの競合アッセイにおいて、既知量のＣＣＸ  ＣＫＲが、サンプルに添加され、次いでこのサンプルは、ＣＣＸ  ＣＫＲを特異的に結合する捕獲因子（例えば、抗ＣＣＸ  ＣＫＲ抗体）と接触される。この抗体に結合したＣＣＸ  ＣＫＲの量は、サンプル中に存在するＣＣＸ  ＣＫＲの濃度と逆比例する。
【０１６５】
好ましくは、この抗体は、固体基板上に固定される。この抗体に結合したＣＣＸ  ＣＫＲの量は、ＣＣＸ  ＣＫＲ／抗体複合体に存在するＣＣＸ  ＣＫＲの量を測定することによってか、あるいは複合体化されていないままのＣＣＸ  ＣＫＲの量を測定することのいずれかによって決定され得る。ＣＣＸ  ＣＫＲの量は、標識されたＣＣＸ  ＣＫＲ分子を提供することによって検出され得る。
【０１６６】
例えば、ハプテン阻害アッセイを用いて、分析物（この場合、ＣＣＸ  ＣＫＲ）は、固体基板上に固定される。既知量の抗ＣＣＸ  ＣＫＲ抗体が、サンプルに添加され、次いで、このサンプルは、固定化ＣＣＸ  ＣＫＲと接触される。この場合、固定化ＣＣＸ  ＣＫＲに結合した抗ＣＣＸ  ＣＫＲ抗体の量は、サンプル中に存在するＣＣＸ  ＣＫＲの量と逆比例する。さらに、固定された抗体の量は、抗体の固定された分画または溶液中に残ったままである抗体の分画のいずれかを検出することによって、検出され得る。検出は、直接（抗体が標識される場合）であっても、間接的（上記のように抗体へ特異的に結合する標識部分の引き続く添加による）であってもよい。
【０１６７】
（３．他のアッセイ）
競合的および非競合的のＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチド免疫アッセイに加えて、本発明はまた、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドの検出および定量のための他のアッセイを提供する。例えば、ウエスタンブロット（免疫ブロット）分析が使用されて、サンプル中のＣＣＸ  ＣＫＲの存在を検出および定量し得る。この技術は、一般的に、サンプルポリペプチドを分子量に基づいてゲル電気泳動によって分離する工程、この分離されたポリペプチドを適切な固体支持体（例えば、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルター、またはナイロンフィルターの誘導物）へトランスファーする工程、およびこのサンプルをＣＣＸ  ＣＫＲに特異的に結合する抗体とインキュベートする工程を包含する。この抗ＣＣＸ  ＣＫＲ抗体は、固体支持体上のＣＣＸ  ＣＫＲに特異的に結合する。これらの抗体は、直接標識されるか、あるいは、抗ＣＣＸ  ＣＫＲに特異的に結合する標識抗体（例えば、標識ヒツジ抗マウス抗体）を用いて引き続き検出され得る。
【０１６８】
さらに、リポソーム免疫アッセイ（ＬＩＡ）のようなアッセイがまた、本発明によって含まれる。ＬＩＡは、特定の分子（例えば、抗体）を結合し、カプセル化された試薬もしくはマーカーを放出するために設計されたリポソームを使用する。次いで、この放出された化学物質は、標準的な技術に従って検出される（Ｍｏｎｒｏｅら、１９８６、Ａｍｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｖ．５：３４−４１を参照のこと）。
【０１６９】
異なる実施形態において、このＣＣＸ  ＣＫＲタンパク質は、レセプターに結合する検出可能に標識されたケモカインリガンド（例えば、標識されたＥＬＣ、ＳＬＣ、ＴＥＣＫ、ＢＬＣ、ｍＣＴＡＣＫ、ｍＭＩＰ−ｌγおよびｖＭＩＰＩＩ）を用いて検出され得る。
【０１７０】
（Ｘ．キット）
本発明の治療方法および診断（検出）方法に有用な試薬は、キット形態で好都合に提供される。従って、本発明は、本発明のポリペプチド、抗体、およびポリヌクレオチドを含むキットを含む。
【０１７１】
１つの実施形態において、このキットは、容器の中に１つ以上の以下を含む：（１）ＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチド（例えば、ＣＣＸ  ＣＫＲ  ｃＤＮＡ配列に対応し、標的ポリヌクレオチドを増幅し得るオリゴヌクレオチドプライマーもしくはプローブ）；（２）抗ＣＣＸ  ＣＫＲ抗体；（３）必要に応じて固体表面（例えば、スライドガラス、マルチウェルプレート、または試験管）上にコートされる、ＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチドまたはフラグメント、（４）ＣＣＸ  ＣＫＲポリヌクレオチド（例えば、アッセイにおいてポジティブコントロールとして使用するため）、および（５）チューブ。本発明の検出方法を実施するための指示書、および較正曲線がまた、含まれ得る。
【０１７２】
（ＸＩ．ケモカインの参考文献）
ケモカインは、当該分野で周知である。例示的なケモカインとしては、図４（ａ）に列挙されるものおよび他の種（例えば、哺乳動物、マウス、ラットウサギ、ヒト、非ヒト霊長類など）におけるホモログが挙げられる。以下の参考文献は、特定のサイトカインを記載する。これらおよび当該分野で公知の他のケモカインを記載するさらなる参考文献は、Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ（１９９９）および（２０００）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、６１４  ＭｃＫｉｎｌｅｙ  Ｐｌａｃｅ  Ｎ．Ｅ．ＭＮ  ５５４１３）、Ｒ  ＆  Ｄオンラインカタログ（ｗｗｗ．ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ（例えば、１９９９年１０月１０日））（これらの両方は、全ての目的のために参考として援用される）、ＣＦＢ（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ、１９９４、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．）（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  Ｆａｃｔｓ  Ｂｏｏｋ、１９９７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．）（これは、全ての目的のために参考として援用される）、およびＧｅｎＢａｎｋタンパク質配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ）に提供される。
【０１７３】
【化１】
0004754143.tif 000002
0004754143.tif 000003
（ＸＩＩ．実施例）
以下の実施例は、本願発明を制限するためではなく、例示のために提供される。いくつかの実験は、Ｇｏｓｌｉｎｇら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍ．１６４：２８５１−５６（これは、その全体が本明細書中に全ての目的に対して援用される）に記載される。
【０１７４】
（Ａ．略語）
ＥＳＴ、発現された配列のタグ；ＯＲＦ、オープンリーディングフレーム；ＤＣ、樹状細胞；ＥＬＣ、ＥＢＩ１リガンドケモカイン；ＳＬＣ、二次的リンパ組織ケモカイン；ＴＥＣＫ、胸腺発現ケモカイン；ＨＥＫ２９３、ヒト胚腎臓２９３細胞；ＰＥＩ、ポリエチレネミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｍｉｎｅ）；ＣＣＲ、ＣＣケモカインレセプター。
【０１７５】
（Ｂ．材料および方法）
ヒト、ウイルス、およびマウスの組換えケモカインは、Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ；ｈｔｔｐ：／／ｃｙｔｏｋｉｎｅ．ｒｎｄｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｃｙｔ＿ｃａｔ／ｃｙｔ＿ｃａｔ．ｈｔｍｌ）から得た。125Ｉ標識のＥＬＣおよびＴＥＣＫは、Ａｍｅｒｓｈａｍから得た。全長ＣＣＸ  ＣＫＲ発現構築物は、ＦＬＡＧエピトープタグおよびプロラクチンシグナル配列を用いてｐＩＲＥＳｐｕｒｏ発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）中に作製し、そしてＨＥＫ２９３細胞中に安定な形質転換体を作製するために使用した。ＣＣＸ  ＣＫＲおよびストークカイン（ｓｔａｌｋｏｋｉｎｅ）に関して一過性のトランスフェクトおよび安定なトランスフェクトは、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を製造者らのプロトコールに従って使用して行った。安定な方は、７日間、２ｕｇ／ｍＬ  プロマイシン中で選択することによって作製し、発現は、抗ＦＬＡＧ  Ｍ１（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および２’抗マウスＰＥ結合体（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）を用いたＦＬＡＧエピトープのＦＡＣＳ分析によって確認した。
【０１７６】
（実施例１）
（ＣＣＸ  ＣＫＲの同定およびクローニング）
公知のケモカインレセプターのＢＬＡＳＴ分析によって、ウシレセプターＰＰＲ１（味覚レセプターとして表される（Ｍａｔｓｕｏｋａら、１９９３、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  １９４：５４０−１１））を同定した。ＰＰＲ１配列を用いたヒトＥＳＴデータベースの検索によって、２つの非連続ＥＳＴ：Ｈ６７２２４およびＡＩ１３１５５５を同定した。プライマーを、Ｈ６７２２４の５’末端に対して設計し（５’ＡＡＴ  ＴＴＧ  ＧＣＴ  ＧＴＡ  ＧＣＡ  ＧＡＴ  ＴＴＡ  ＣＴＣ  Ｃ  ３’［配列番号４］）、そしてＡＩ１３１５５５の３’末端に対して逆方向で設計し（５’ＧＣＴ  ＡＡＡ  ＡＧＴ  ＡＣＴ  ＧＧＴ  ＴＧＧ  Ｃ  ３’［配列番号５］）、そしてヒト軟膜から単離されたゲノムＤＮＡのＰＣＲ（５％  ＤＭＳＯ、アニーリング５８℃）に使用した。この反応は、ＥＳＴおよび連続する配列を含む８５５ｂｐの産物を生じた。この８５５ｂｐフラグメントの産物を、Ｒａｐｉｄ  ＳｃｒｅｅｎTMアレイされた脾臓ｃＤＮＡライブラリー（Ｏｒｉｇｅｎｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のアンカーＰＣＲスクリーンにおける使用のためのさらなるプライマーを設計するために使用し、５’伸長されたクローンを生じた；このクローンを、最終的にフィルターハイブリダイゼーションによってヒトゲノムライブラリーをスクリーニングするために使用した。全長コード配列を、校正Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）酵素と共にＯｒｉｇｅｎｅクローンＰＣＲの５’配列からの逆プライマーを用いたゲノムクローンの配列分析によって推定した。この再び見いだされた配列を、いくつかのクローンに対して確認し、そして図１に示す。［予備的な配列決定は、以下の位置において図１と異なった：４７、６４、７８、１２０、１３１、５４５、５７１、５７４（図１の番号付けを用いて）、これらは、それぞれ、Ｇ、Ｇ、Ｇ、Ｃ、Ｃ、Ｔ、Ａ、およびＴであり（配列番号３）、この改変体がまた、本発明によって意図される］。このコード配列を、ＦＬＡＧエピトープタグおよびプロラクチンシグナル配列とともにｐＩＲＥＳｐｕｒｏ発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）にクローン化した。
【０１７７】
ＣＣＸ  ＣＫＲ  ｃＤＮＡによってコードされる推定アミノ酸配列を、配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬ（ＧｅｎｅＷｏｒｋｓ）を用いて他のヒトケモカインレセプターに対して比較した。ヒトＣＣＲ６、７、９およびオーファンＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏと整列されたＣＣＸ  ＣＫＲアミノ酸配列が示される（図２Ａ）。領域ＴＭ１〜ＴＭ７に広がる疎水性膜の位置を、配列の上の傍線によって示す。ＣＣＸ  ＣＫＲと他のケモカインレセプターとの間で同一のアミノ酸を、四角で囲む。これらおよび他のヒトケモカインレセプター配列とのＣＣＸ  ＣＫＲによってコードされるタンパク質の複数配列整列は、２９〜３５％の範囲のアミノ酸同一性を示した。
【０１７８】
（実施例２）
（白血球および種々の組織におけるＣＣＸ  ＣＫＲ発現）
ＣＣＸ  ＣＫＲ  ｍＲＮＡの発現を、ヒトｃＤＮＡのＰＣＲ分析ならびに種々の組織から単離されたＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによって決定した。第１に、造血細胞および造血組織におけるＣＣＸ  ＣＫＲ発現を、調べた。レセプター発現は、未成熟樹状細胞（ＤＣ）（ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を用いて処置後、単球から誘導された）、３人のドナー中２人からの初代Ｔ細胞、ならびに脾臓組織およびリンパ節組織において明らかであった（図２Ｂ）。さらに、発現を、非リンパ組織（例えば、心臓、腎臓、胎盤、気管、および脳）で検出した；同じパネル上の分画されていない白血球がまた、ポジティブであった（図２Ｂ）。ＧＡＰＤＨに関するコントロールＰＣＲ産物によって、全ての出発ＲＮＡの完全性を確認した。
【０１７９】
観察されたＣＣＸ  ＣＫＲパターンは、ＮＣＢＩデータベースで見出されたヒトの発現された配列タグに関して報告された分布と重複し、そしてこれを拡張した。これらのＥＳＴは、腎臓、胎児心臓、嗅上皮、および扁桃Ｂ細胞から単離されている。従って、ＣＣＸ  ＣＫＲは、末梢の運動性細胞、ならびにリンパ組織および非リンパ組織において発現されるようである。
【０１８０】
（実施例３）
（ＣＣＸ  ＣＫＲタンパク質の安定発現）
ＣＣＸ  ＣＫＲ  ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質の機能特性（その潜在的なケモカイン結合プロフィールを含む）を評価するために、本発明者らは、付加されるＮ末端Ｆｌａｇエピトープを用いてＣＣＸ  ＣＫＲをコードする発現プラスミドを構築した。これは、抗Ｆｌａｇ  ｍＡｂを用いて、最も高度に発現される安定形質転換体の検出および選択を可能にする。Ｍ１フラッグエピトープタグ化されたＣＣＸ  ＣＫＲを安定に発現するヒト胚腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を、ＦＡＣＳによって確認し（図２Ｃ）、そしてさらなる分析のために選択した。Ｆｌａｇ−ＣＣＸ  ＣＫＲ融合プラスミドでトランスフェクトされた細胞株を、「Ｆ−ＣＣＲ１０細胞」（例えば、Ｆ−ＣＣＲ１０  ２９３細胞）という。
【０１８１】
（実施例４）
（ＣＣＸ  ＣＫＲトランスフェクト体のＥＬＣ−ストークカインへの接着）
（Ａ．ストークカインに対する接着によるレセプターインテロゲーション（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ））
「ストークカイン」技術を使用して、ＣＣＸ  ＣＫＲによって結合されるケモカインを同定した。簡単にいうと、固定化されたネイティブなケモカイン単独は、同族のレセプターを保有する細胞を捕獲し得ない（Ｉｍａｉら、１９９７、Ｃｅｌｌ  ９１：５２１）。本発明者らは、非ネイティブなケモカイン構造のストークカインを開発し、これは、伸長された修飾ムチンに対するＮ末端接着に関して操作されたケモカイン部分を含む（Ｂａｚａｎら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：６４０）。１つの実施形態において、一過性トランスフェクト後にＨＥＫ２９３細胞の上清中で収集されたストークカインを、カルボキシル末端に対して操作されたキャリアドメイン（例えば、ポリＨｉｓエピトープ）に対する抗体を介して固体基板に固着させ、候補オーファンレセプターと相互作用するためにケモカインドメインを遊離にした。
【０１８２】
ＣＣＸ  ＣＫＲによって結合されるリガンドの同定に加えて、ストークカイン技術を使用して、接着を介して他のレセプター（例えば、オーファンケモカインレセプター）に対するリガンドを同定し得ることが理解される。
【０１８３】
ＣＣＸ  ＣＫＲに対するリガンド結合を決定するために、ＨＥＫ２９３−ＣＣＸ  ＣＫＲ細胞を使用して、ケモカイン「ストークカイン」（ＳＫ）（すなわち、個々のケモカインドメインが伸長された柄（ｓｔａｌｋ）構造の末端につなぎとめるように操作された分子）を呼びかけ（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）た。ストークカインは、最初に抗Ｈｉｓ固定抗体（ＰＢＳ中１０ｕｇ／ｍｌ、一晩、室温）を用いてコートされた８ウェルのチャンバスライドガラスを用いて呼びかけ、洗浄し、そして「ブロック」（ＰＢＳ中２％  ＦＢＳ／０．５％  ＢＳＡ）し；２５０ｕｌのＨＥＫ２９３細胞ストークカイン上清を用いて処理し（１時間、３７℃で）、そして５００，０００のＨＥＫ２９３−ＣＣＸ  ＣＫＲトランスフェクト体を用いてインキュベートした（１．５時間、室温）。可溶性サイトカインを用いた競合による接着の阻害を、細胞を、５〜１０ｕｇ／ｍｌの組換えケモカインを用いてインキュベートすることによって実行した。全ての場合において、非接着細胞を、ＰＢＳ中で洗浄することによって除去し；残存する接着細胞を、１％のグルタルアルデヒドを用いて固定し、写真画像化し、そして計数した。一次スクリーンの場合、この接着は、推定レセプター−リガンド相互作用を明らかにする。
【０１８４】
ＣＣＸ  ＣＣＲ細胞は、ＥＬＣ  ストークカインへ十分に接着した（ＥＬＣ−ＳＫ；図３Ａ）。さらに、ＥＬＣ−ＳＫ媒介接着を、コンペティターとして可溶性ネイティブＥＬＣの存在下で消滅させた（図３Ａ、上の列）。本発明者らはまた、可溶性ＳＬＣならびに可溶性ＴＥＣＫの存在下でのＨＥＫ２９３−ＣＣＸ  ＣＫＲ細胞のＥＬＣ−ＳＫ媒介接着における有意な減少を観察したが、可溶性ＭＣＰ−３では観察されなかった（図３Ａ、下の列）。これらの実験は、数回の独立した試行に対して実行し、そして定量し、この例は、図３Ｂに提供され、そして非常に再現可能であることが見出された。さらに、放射性標識されたＥＬＣを漸増する濃度の未標識ＥＬＣの存在下で従来の相同な競合アッセイに使用した。この結果により、ＨＥＫ２９３−ＣＣＸ  ＣＫＲ細胞に対するＥＬＣの有意な結合、しかし野生型（ｗｔ）ＨＥＫ２９３細胞に対して有意でない結合が明らかになった（図３Ｃ）。ほとんど同一な結果を、コールドのＴＥＣＫを用いた放射性標識ＴＥＣＫの相同な競合において得た（示さず）。これらを考慮すると、ストークカインベースの接着および放射性標識リガンド結合／相同な競合アッセイは、ＣＣＸ  ＣＫＲがケモカインの新規補体に結合する新規ケモカインレセプターであることを示す。
【０１８５】
（実施例５）
（ＣＣＸ  ＣＫＲの完全なリガンド結合「フィンガープリント」）
迅速かつ完全に所定のケモカインレセプターのリガンド結合フィンガープリントを規定するために、本発明者らは、精製されたケモカインおよびケモカイン改変体の大きなアレイを用いてケモカインレセプターを包括的にプロファイルするためのアプローチを確立した。本発明者らは、ＥＬＣおよび他のケモカインとＣＣＸ  ＣＫＲとの相互作用を個々に確認するためにこのアプローチを使用した。ＣＣＸ  ＣＫＲの安定なトランスフェクト体に対する125Ｉ−標識−ＥＬＣまたは125Ｉ−ＴＥＣＫの放射性リガンド結合を使用して、新規レセプターに対するケモカイン特異性を決定した。約８０個の異なる精製されたケモカインおよびケモカイン改変体を、結合実験において125Ｉ標識ＥＬＣ（図４Ａ）または125Ｉ−ＴＥＣＫ（示さず）に対するコールドのコンペティターとして使用した（最初は、２００ｎＭの飽和終濃度で）；結果は各々に関して比較可能であった。放射性標識されたリガンド結合の置換データによって、ＣＣＸ  ＣＫＲがヒトおよびマウスのＥＬＣ、ＳＬＣ、ＴＥＣＫに十分に結合し、そしてｍＭＩＰ−１γ（しかし、そのヒトホモログは、結合しなかった）に温和に結合したことを確認した。さらに、ＣＸＣケモカインＢＬＣ、およびヒトカポージ肉腫ヘルペスウイルスＨＨＶ８由来のウイルス性のコードされたｖＭＩＰＩＩを含む、能力がより低い親和性の他のケモカインリガンドを、明らかにした（図４Ａ）。試験された全ての他のケモカインは、放射性標識されたＥＬＣと一貫して競合しなかった。
【０１８６】
（実施例６）
（結合定数の決定）
結合分析を、「Ｄｉｓｐｌａｃｅ  Ｍａｘ」で示される濾過プロトコールを使用する効果的に最大化された放射性リガンド結合を用いて実行した（Ｄａｉｒａｇｈｉら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１５６９）。これらのアッセイにおいて、ＤｉｓｐｌａｃｅＭａｘは、記載されるプロトコール（Ｄａｉｒａｇｈｉら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１５６９）を用いて、放射性標識されたＥＬＣまたはＴＥＣＫを置換する能力における８０より多くの異なる精製されたケモカインによるＣＣＸ  ＣＫＲトランスフェクト体の同時インテロゲーションを使用した。
【０１８７】
一次スクリーンにおいて同定される結合相互作用を、ＣＣＸ  ＣＫＲ安定トランスフェクト体に対する広範囲な放射性リガンド結合競合および置換データのスキャッチャード変換によって定量的に試験した（図４Ｂ）。この結果により、Ｋｄ  約５〜１５ｎＭの間の親和性を有するヒトＥＬＣ、ＳＬＣ、およびＴＥＣＫの高い親和性結合を確認した。各場合において、マウスバージョンのこれらのケモカインはまた、さらにより大きな親和性で結合し；明白なＫｄ’は、図４Ｂに列挙される。興味深いことに、ＣＣケモカインＢＬＣがまた（より小さい親和性であるが）十分に結合し、急勾配に変曲された競合曲線を示す。ウイルスケモカインｖＭＩＰ−ＩＩは、温和から小さい親和性を示し、そしてＣＣＸ  ＣＫＲとの任意の相互作用を示す唯一のウイルスケモカインであった。同様の実験において、マウスＣＴＡＣＫは、約９ｎＭのＫｄでレセプターに結合した（示さず）。ＣＴＡＣＫはまた、ＣＣＬ２７、ＡＬＰ、ＩＬＣ、およびＥＳｋｉｎｅといわれる。
【０１８８】
ＨＥＫ２９３−ＣＣＸ  ＣＫＲ細胞は、いくつかの試験において強い細胞質カルシウムシグナルを示さなかったが、これは、Ｇタンパク質の希釈に起因し得る。なぜなら、このトランスフェクト体は、１細胞あたり２５０，０００より多くの部位でＣＣＸ  ＣＫＲタンパク質を安定に発現するからである（示さず）。さらに、予備的なケモカイン分析において、ＣＣＸ  ＣＫＲトランスフェクト体は、ＥＬＣおよびＳＬＣに応じて温和な移動を示したが、結合活性を有さないケモカインに対しては示さなかった（示さず）。これらを考慮すると、これらのデータは、生理学的に相関する範囲のＣＣＸ  ＣＫＲに対するリガンドとして、ＥＬＣ、ＳＬＣおよびＴＥＣＫ、可能性のあるより低い親和性相互作用でＣＸＣケモカインＢＬＣとウイルスケモカインｖＭＩＰ−ＩＩが挙げられることが、示される。
【０１８９】
（実施例７）
（ＣＣＸ  ＣＫＲの小分子モジュレーターの同定）
本実験は、このレセプターのアゴニストおよびアンタゴニストを同定する際に使用されるスクリーニング手順を示す。化学ライブラリーの供給源のプレートは、市販の供給元から得、そしてＤＭＳＯ中５ｍｇ／ｍＬで保存する。これらから、各ウェルに１０個の化合物を含む複数化合物プレートを作製し、そしてこれらを２０％  ＤＭＳＯ中５０μｇ／ｍＬの濃度に希釈する。各混合物の２０μＬのアリコートを、試験プレートに入れ、これらを使用するまで凍結保存する。
【０１９０】
Ｍ１フラッグエピトープタグ化されたＣＣＸ  ＣＫＲを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞（実施例３に記載される、前出）を、ＤＭＥＭ−１０％  ＦＢＳ中で培養し、そして、濃度が０．５〜１．０×１０6細胞／ｍＬの間のときに収集する。これらの細胞を、遠心分離し、そして５．６×１０6細胞／ｍＬの濃度までアッセイ緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ2、５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および０．２％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４）中で再懸濁する。
【０１９１】
マルチプローブ自動化システムを用いて、０．０９ｍＬの細胞を、化合物を含むアッセイ試験プレートの各ウェルに添加し、続いて、アッセイ緩衝液中で希釈された０．０９ｍＬの125Ｉ−ＭＩＰβ３／ＥＬＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈより）（最終濃度は約２５〜１００ｐＭ、各ウェルあたり約５０，０００ｃｐｍを有する）を添加する。この化合物の最終濃度は、各々１〜５μｇ／ｍＬである。このプレートを、密封し、そして振盪台上で約３時間４℃でインキュベートする。このアッセイプレートを、真空収集装置上でＰａｃｋａｒｄ  ＧＰ／Ｂフィルタープレートを用いて収集し、ＰＥＩ溶液中で予備浸漬する。シンチレーション液（５０μＬ）を各ウェルに添加し、このプレートを密封し、そしてＴｏｐ  Ｃｏｕｎｔシンチレーションカウンター中で計数する。コントロールウェルは、希釈物のみ（総カウントに対して）または過剰のＥＬＣ（１μｇ／ｍＬ、非特異的結合に対して）のいずれかを含み、そして各セットの化合物に対するＥＬＣ結合の全阻害のパーセントを算出するために使用する。ＥＬＣとＣＣＸ  ＣＫＲとの間の結合を阻害または増強することが見出される化合物が、同定される。
【０１９２】
（実施例８）
（ＣＣＸ  ＣＫＲのリガンド誘導インターナリゼーション）
Ｆｌａｇ−ＣＣＸ  ＣＫＲ融合プラスミドでトランスフェクトされた２９３細胞（すなわち、「２９３Ｆ−ＣＣＲ１０細胞」実施例３を参照のこと）を、３７℃で変動する濃度のケモカイン（ＥＬＣ、ＳＬＣ、ＴＥＣＫ、マウスＣＴＡＣＫおよびＭＣＰ−４）を用いて１５分間または４５分間インキュベートした。インキュベーション後、この細胞を、洗浄し、そして３％のパラホルムアルデヒドを用いて１５分間氷上で固定した。この細胞を、抗Ｆｌａｇ  Ｍ１抗体を用いて染色し、続いて、ＰＥ−結合体化抗マウス二次抗体を用いて染色した。次いで、ＦＡＣＳ分析を実行して、レセプターの表面発現を決定した。
【０１９３】
結果：リガンドの存在下における抗体結合の減少は、レセプターのリガンド誘導インターナリゼーションの指標である。氷上でリガンドとインキュベートされ、次いで洗浄された細胞、またはリガンドの非存在下一次抗体とインキュベートされた細胞は、細胞表面上のレセプターに対する抗体結合の阻害を示さなかった（すなわち、レセプターのインターナリゼーションがない；データは示さず）。レセプターのインターナリゼーションは、１００ｎＭのＥＬＣ、ＳＬＣ、ＴＥＣＫ、およびマウスＣＴＡＣＫの存在下で観察された（図６を参照のこと）。ＭＣＰ−４は、インターナリゼーションを引き起こさなかった。レセプターのインターナリゼーションは、用量および時間依存性で見出された。
【０１９４】
＊＊＊
本明細書中に引用される全ての参考文献は、各個々の刊行物または特許出願が詳細かつ個々に全ての目的に対してその全体が参考として援用されることが示されるたのように同じ程度で、その全体が本明細書中に参考として、そして全ての目的のために援用される。
【０１９５】
本発明の多くの改変およびバリエーションが、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得、同様に、当業者に明らかである。本明細書中に記載される特定の実施形態は、例としてのみ提供され、そして本発明は、添付の特許請求の範囲が与えられるものと等価な全範囲と共に、この添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ヒトＣＣＸ  ＣＫＲ（配列番号１）についてのヌクレオチド配列、およびヒトＣＣＸ  ＣＫＲポリペプチド（配列番号２）についての推定されるアミノ酸配列を示す。
【図２Ａ】  図２Ａは、他のケモカインレセプターの配列に整列させたＣＣＸ  ＣＫＲ配列を示す。図２Ａは、他のケモカインレセプターのＣＣＸ  ＣＫＲコード領域との配列相同性を示す。
【図２Ｂ】  図２Ｂは、ＣＣＸ  ＣＫＲ  ＲＮＡの発現パターンを示す。図２Ｂは、示される種々の器官由来の培養した初代細胞および組織全体由来の細胞質ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより分析した、ＣＣＸ  ＣＫＲ  ＲＮＡを発現する細胞および組織を示す。
【図２Ｃ】  図２Ｃは、ＣＣＸ  ＣＫＲを発現する安定な細胞株の生成を示す。図２Ｃは、野生型ＨＥＫ２９３細胞に対して、抗ＦＬＡＧ  ｍＡｂ染色の強度を比較した、Ｎ末端ＦＬＡＧエピトープを含むＣＣＸ  ＣＫＲタンパク質を安定に発現するトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の集団を示す。
【図３Ａ】  図３は、ストークカイン（ｓｔａｌｋｏｋｉｎｅ）に対する接着によるＣＣＸ  ＣＫＲリガンドの同定を示す。図３Ａは、ＨＥＫ２９３−ＣＣＸ  ＣＫＲ細胞による、固定されたストークカイン（ＳＫ）の応答信号（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）を示す。「コントロール」＝ストークカインを含まないウェル（固着した抗体および培地は存在する）に対するＨＥＫ２９３−ＣＣＸ  ＣＫＲ細胞のバックグラウンドの接着；ＥＬＣ−ストークカイン（ＳＫ）＝固着した抗体を介して固定されたＥＬＣ−ストークカインを含む位置へのＨＥＫ２９３−ＣＣＸ  ＣＫＲ細胞の強い接着；ＥＬＣ−ＳＫ＋可溶性ＥＬＣ、可溶性ＴＥＣＫまたは可溶性ＳＬＣ＝示されるような過剰濃度の可溶性組換え「ネイティブ形態」ケモカインの存在下での接着の解離；ＥＬＣ−ＳＫ＋可溶性ＭＣＰ−３＝多くの非競合ケモカインの代表としてのＭＣＰ−３の存在下での接着の非減少。野生型ＨＥＫ２９３細胞はこのいずれの場所にも接着しないことが示された（データは示していない）。
【図３Ｂ】  図３は、ストークカインに対する付着によるＣＣＸ  ＣＫＲリガンドの同定を示す。図３Ｂは、表示の実験からの可溶性ケモカインの存在下および非存在下でのＥＬＣ−ストークカインに対するＨＥＫ２９３−ＣＣＸ  ＣＫＲ細胞の接着量を示す。
【図３Ｃ】  図３は、ストークカインに対する付着によるＣＣＸ  ＣＫＲリガンドの同定を示す。図３Ｃは、ＨＥＫ２９３−ＣＣＸ  ＣＫＲ細胞（黒四角）または野生型ＨＥＫ２９３細胞（白四角）のいずれかに対する、漸増濃度のコールドＥＬＣの存在下で放射性標識ＥＬＣを用いた、相同的競合結合アッセイの結果を示す。
【図４Ａ】  図４は、ＣＣＸ  ＣＫＲのリガンド結合フィンガープリントを示す。図４Ａは、結合競合にあるウイルス、ヒトおよびマウスのケモカインの広範なアレイに対して125Ｉ−ＥＬＣを用いることにより示される、ＣＣＸ  ＣＫＲタンパク質の結合活性の定義である。特異的結合のパーセント阻害を棒グラフで示し、ケモカインが、潜在的な「高い」親和性（黒棒）、潜在的な「中程度〜低い」親和性（斜線棒）、または「非」親和性（白棒）のカテゴリーに分類され得ることを強調する。結果は３回の測定の平均であり、全ての場合においてＳＥＭ≦２０％である；誤差棒は、明確化のために省略されている。アッセイ間の実験上の誤差は±約２０％であるので、０％の経線から左右にこの範囲内にある測定値は統計的に重要ではないと思われる。
【図４Ｂ】  図４は、ＣＣＸ  ＣＫＲのリガンド結合フィンガープリントを示す。図４Ｂは、高い親和性のＣＣＸ  ＣＫＲリガンド結合についての順列である。ＣＣＸ  ＣＫＲへの125Ｉ−ＥＬＣの結合に対する非標識ケモカインの競合を反映する多点測定。コールド（非標識）ＥＬＣ、ＳＬＣ、ＴＥＣＫ、ＢＬＣ、およびｖＭＩＰ−ＩＩを用いた平衡結合の代表的な結果および、下の表における計算されたＩＣ５０の比較。
【図５】  図５は、ゲノムクローンから決定された、ＣＣＸ  ＣＫＲ遺伝子の５’から翻訳開始部位までのＤＮＡ配列を示す。
【図６Ａ】  図６Ａは、レセプター−ＦＬＡＧエピトープ融合プラスミドでトランスフェクトした２９３細胞における、ＣＣＸ  ＣＫＲのリガンド誘導性のインターナリゼーションを示す。図６Ａは、ケモカイン（１ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭのＥＬＣ、ＳＬＣ、ＴＥＣＫ、ＣＴＡＣＫまたはＭＣＰ４）またはアイソタイプ抗体コントロールの存在下または非存在下で４５分間インキュベートした細胞のＦＡＣＳスキャンを示す。
【図６Ｂ】  図６Ｂは、レセプター−ＦＬＡＧエピトープ融合プラスミドでトランスフェクトした２９３細胞における、リガンド誘導性のＣＣＸ  ＣＫＲの取り込みを示す。図６Ｂは、１５分間のインキュベーションの同じ実験を示す。
【図１】
0004754143.tif 000004
【図２Ａ】
0004754143.tif 000005
【図２Ｂ】
0004754143.tif 000006
【図２Ｃ】
0004754143.tif 000007
【図３Ａ】
0004754143.tif 000008
【図３Ｂ】
0004754143.tif 000009
【図３Ｃ】
0004754143.tif 000010
【図４Ａ】
0004754143.tif 000011
0004754143.tif 000012
【図４Ｂ】
0004754143.tif 000013
【図５】
0004754143.tif 000014
【図６Ａ】
0004754143.tif 000015
【図６Ｂ】
0004754143.tif 000016