(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子配列の集団中の選択される遺伝子配列の比を決定する方法で、
生物学的試料中の核酸鋳型分子を希釈して複数のアッセイ試料を含むセットを作製する段階、
アッセイ試料中の鋳型分子を増幅してセットのアッセイ試料中に増幅した分子の集団を作製する増幅段階、
セットのアッセイ試料中の増幅した分子を解析して選択される遺伝子配列を含むアッセイ試料の数すなわち第一の数および基準遺伝子配列を含むアッセイ試料の数すなわち第二の数を決定する解析段階、
第一の数を第二の数と比較して生物学的試料の組成を反映した比を求める段階
を含む方法。
【請求項２】
選択される遺伝子配列の存在を決定するための解析段階に必要な全遺伝子配列に対する選択される遺伝子配列の比より1/Nが大きくなるようなある数（N）の分子をセット中のアッセイ試料の少なくとも10分の1が含むまで希釈段階を行う、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ポリメラーゼ連鎖反応を行なった際にアッセイ試料の0.1〜0.9が増幅産物を生じるようになるまで希釈段階を行う、請求項1記載の方法。
【請求項４】
ポリメラーゼ連鎖反応を行なった際にすべてのアッセイ試料が増幅産物を生じ、各アッセイ試料に含まれる基準遺伝子配列を含む核酸鋳型分子が10未満になるまで希釈段階を行う、請求項1記載の方法。
【請求項５】
ポリメラーゼ連鎖反応を行なった際にすべてのアッセイ試料が増幅産物を生じ、各アッセイ試料に含まれる基準遺伝子配列を含む核酸鋳型分子が100未満になるまで希釈段階を行う、請求項1記載の方法。
【請求項６】
生物学的試料が細胞を含まない、請求項1記載の方法。
【請求項７】
セット中のアッセイ試料の数が10より大きい、請求項1記載の方法。
【請求項８】
セット中のアッセイ試料の数が50より大きい、請求項1記載の方法。
【請求項９】
セット中のアッセイ試料の数が100より大きい、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
セット中のアッセイ試料の数が500より大きい、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
セット中のアッセイ試料の数が1000より大きい、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
アッセイ試料に対する増幅段階および解析段階が同じ容器内で行われる、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
解析段階に、5'末端または3'末端のいずれか一端に光ルミネセンス性色素をもち他端に消光剤をもつステム−ループ構造を有するオリゴヌクレオチドである分子ビーコンプローブが用いられる、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
解析段階にゲル電気泳動を用いる、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
解析段階が少なくとも1つの核酸プローブに対するハイブリダイゼーションを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
解析段階が少なくとも2つの核酸プローブに対するハイブリダイゼーションを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
それぞれ異なる光ルミネセンス性色素をもつ2つの分子ビーコンプローブを用いる、請求項13記載の方法。
【請求項１８】
分子ビーコンプローブが選択される突然変異の遺伝子配列より選択される野生型の遺伝子配列をよりよく検出する、請求項13記載の方法。
【請求項１９】
増幅段階に1対のプライマーを用いる、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
増幅段階に加温後のみ活性化するポリメラーゼを用いる、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
増幅段階で加温および冷却のサイクルを少なくとも40回行う、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
増幅段階で加温および冷却のサイクルを少なくとも50回行う、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
増幅段階で加温および冷却のサイクルを少なくとも60回行う、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
生物学的試料が糞便、血液、およびリンパ節からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２５】
生物学的試料が抗癌療法を受けた白血病患者またはリンパ腫患者の血液または骨髄である、請求項1記載の方法。
【請求項２６】
選択される遺伝子配列が転座した対立遺伝子である、請求項1記載の方法。
【請求項２７】
選択される遺伝子配列が野生型の対立遺伝子である、請求項1記載の方法。
【請求項２８】
選択される遺伝子配列が新生物の発生中に増幅される領域中にある、請求項1記載の方法。
【請求項２９】
選択される遺伝子配列が稀なエクソン配列である、請求項1記載の方法。
【請求項３０】
核酸鋳型分子がRNA転写物のcDNAを含み、選択される遺伝子配列が第一の転写物のcDNA上に存在し、基準遺伝子配列が第二の転写物のcDNA上に存在する、請求項1記載の方法。
【請求項３１】
選択される遺伝子配列が第一の突然変異を含み、基準遺伝子配列が第二の突然変異を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３２】
選択される遺伝子配列および基準遺伝子配列が異なる染色体上にある、請求項1記載の方法。
【請求項３３】
5'末端または3'末端のいずれか一端に光ルミネセンス性色素をもち他端に消光剤をもつステム−ループ構造を有するオリゴヌクレオチドを含み、ループが16塩基対を含み、ループのTmが50〜51℃であり、ステムが配列5'-CACG-3'の4塩基対を含む分子ビーコンプローブ。
【請求項３４】
分子ビーコンプローブが選択される突然変異の遺伝子配列より選択される野生型の遺伝子配列をよりよく検出する、請求項33記載のプローブ。
【請求項３５】
分子ビーコンプローブが野生型の遺伝子配列より突然変異の遺伝子配列をよりよく検出する、請求項33記載のプローブ。
【請求項３６】
5'末端または3'末端のいずれか一端に光ルミネセンス性色素をもち他端に消光剤をもつステム−ループ構造を有するオリゴヌクレオチドを含み、ループが19〜20塩基対を含み、ループのTmが54〜56℃であり、ステムが配列5'-CACG-3'の4塩基対を含む分子ビーコンプローブ。
【請求項３７】
5'末端または3'末端のいずれか一端に第一の光ルミネセンス性色素をもち他端に消光剤をもつステム−ループ構造を有するオリゴヌクレオチドであり、ループがTm 50〜51℃の16塩基対を含み、ステムが配列5'-CACG-3'の4塩基対を含む、第一の分子ビーコンプローブ、および、
5'末端または3'末端のいずれか一端に第二の光ルミネセンス性色素をもち他端に消光剤をもつステム−ループ構造を有するオリゴヌクレオチドであり、ループがTm 54〜56℃の19〜20塩基対を含み、ステムが配列5'-CACG-3'の4塩基対を含む、第二の分子ビーコンプローブ
を含み、第一および第二の光ルミネセンス性色素が異なる、一組の分子ビーコンプローブ。
【請求項３８】
遺伝子配列の集団中の選択される遺伝子配列の比を決定する方法であって、
複数のアッセイ試料を含むセットに含まれる鋳型分子を増幅し、セットの各アッセイ試料中に増幅した分子の集団を生成する増幅段階、
選択される遺伝子配列の存在を決定するために必要な全遺伝子配列に対する選択される遺伝子配列の比より1/Nが大きくなるようなある数（N）の分子をセット中のアッセイ試料の少なくとも15分の1が含み、セットのアッセイ試料中の増幅した分子を解析して選択される遺伝子配列を含むアッセイ試料の数すなわち第一の数および基準遺伝子配列を含むアッセイ試料の数すなわち第二の数を決定する解析段階、
第一の数を第二の数と比較して生物学的試料の組成を反映した比を求める段階
を含む方法。
【請求項３９】
セット中のアッセイ試料の数が10より大きい、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
セット中のアッセイ試料の数が50より大きい、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
セット中のアッセイ試料の数が100より大きい、請求項38記載の方法。
【請求項４２】
セット中のアッセイ試料の数が500より大きい、請求項38記載の方法。
【請求項４３】
セット中のアッセイ試料の数が1000より大きい、請求項38記載の方法。
【請求項４４】
アッセイ試料に対する増幅段階および解析段階が同じ容器内で行われる、請求項38記載の方法。
【請求項４５】
解析段階に、5'末端または3'末端のいずれか一端に光ルミネセンス性色素をもち他端に消光剤をもつステム−ループ構造を有するオリゴヌクレオチドである分子ビーコンプローブが用いられる、請求項38記載の方法。
【請求項４６】
解析段階にゲル電気泳動を用いる、請求項38記載の方法。
【請求項４７】
解析段階が少なくとも1つの核酸プローブに対するハイブリダイゼーションを含む、請求項38記載の方法。
【請求項４８】
解析段階が少なくとも2つの核酸プローブに対するハイブリダイゼーションを含む、請求項38記載の方法。
【請求項４９】
それぞれ異なる光ルミネセンス性色素をもつ2つの分子ビーコンプローブを用いる、請求項45記載の方法。
【請求項５０】
分子ビーコンプローブが選択される突然変異の遺伝子配列より選択される野生型の遺伝子配列をよりよく検出する、請求項45記載の方法。
【請求項５１】
増幅段階に1対のプライマーを用いる、請求項38記載の方法。
【請求項５２】
増幅段階に加温後のみ活性化するポリメラーゼを用いる、請求項38記載の方法。
【請求項５３】
増幅段階で加温および冷却のサイクルを少なくとも40回行う、請求項38記載の方法。
【請求項５４】
増幅段階で加温および冷却のサイクルを少なくとも50回行う、請求項38記載の方法。
【請求項５５】
増幅段階で加温および冷却のサイクルを少なくとも60回行う、請求項38記載の方法。
【請求項５６】
糞便、血液、およびリンパ節からなる群より選択される、採取された試料から鋳型分子を得る、請求項38記載の方法。
【請求項５７】
抗癌療法を受けた白血病患者またはリンパ腫患者の、血液および骨髄からなる群より選択される、採取された試料から鋳型分子を得る、請求項38記載の方法。
【請求項５８】
選択される遺伝子配列が転座した対立遺伝子である、請求項38記載の方法。
【請求項５９】
選択される遺伝子配列が野生型の対立遺伝子である、請求項38記載の方法。
【請求項６０】
選択される遺伝子配列が新生物の発生中に増幅される領域中にある、請求項38記載の方法。
【請求項６１】
選択される遺伝子配列が稀なエクソン配列である、請求項38記載の方法。
【請求項６２】
核酸鋳型分子がRNA転写物のcDNAを含み、選択される遺伝子配列が第一の転写物のcDNA上に存在し、基準遺伝子配列が第二の転写物のcDNA上に存在する、請求項38記載の方法。
【請求項６３】
選択される遺伝子配列が第一の突然変異を含み、基準遺伝子配列が第二の突然変異を含む、請求項38記載の方法。
【請求項６４】
選択される遺伝子配列および基準遺伝子配列が異なる染色体上にある、請求項38記載の方法。
【請求項６５】
生物学的試料中の対立遺伝子の不均衡を決定する方法であって、
複数のアッセイ試料を含むセットに含まれる核酸鋳型分子を増幅し、セットの各アッセイ試料中に増幅した分子の集団を生成する段階であって、該鋳型分子が生物学的試料から得られる段階、
セットのアッセイ試料中の増幅した分子を解析して第一の染色体上の選択される遺伝子配列を含むアッセイ試料の数すなわち第一の数および第二の染色体上の基準遺伝子配列を含むアッセイ試料の数すなわち第二の数を決定する段階であって、アッセイ試料の0.1〜0.9で増幅産物が得られる段階、
アッセイ試料の第一の数をアッセイ試料の第二の数と比較して生物学的試料中の対立遺伝子の不均衡を確認する段階
を含む方法。
【請求項６６】
生物学的試料中の対立遺伝子の不均衡を決定する方法であって、
生物学的試料から核酸鋳型分子を分配して複数のアッセイ試料を含むセットを作製する段階、
アッセイ試料中の鋳型分子を増幅してセットのアッセイ試料中に増幅した分子の集団を作製する段階、
セットのアッセイ試料中の増幅した分子を解析して第一の染色体上の選択される遺伝子配列を含むアッセイ試料の数すなわち第一の数および第二の染色体上の基準遺伝子配列を含むアッセイ試料の数すなわち第二の数を決定する段階、
アッセイ試料の第一の数をアッセイ試料の第二の数と比較して生物学的試料中の第一の染色体と第二の染色体の間の対立遺伝子の不均衡を確認する段階
を含む方法。
【請求項６７】
遺伝子配列の集団中の選択される遺伝子配列の比を決定する方法で、
生物学的試料中の核酸鋳型分子を分配して複数のアッセイ試料を含むセットを作製する段階、
アッセイ試料中の鋳型分子を増幅し、セットのアッセイ試料中に増幅した分子の集団を生成する段階であって、アッセイ試料の0.1〜0.9で増幅産物が得られる増幅段階、
セットのアッセイ試料中の増幅した分子を解析して選択される遺伝子配列を含むアッセイ試料の数すなわち第一の数および基準遺伝子配列を含むアッセイ試料の数すなわち第二の数を決定する解析段階、
第一の数を第二の数と比較して生物学的試料の組成を反映した比を求める段階
を含む方法。
【請求項６８】
解析段階が塩基置換を検出する、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
解析段階が遺伝子増幅を検出する、請求項67記載の方法。
【請求項７０】
解析段階が選択的スプライシング産物を検出する、請求項67記載の方法。
【請求項７１】
解析段階が発現の変化を検出する、請求項67記載の方法。
【請求項７２】
解析段階が異なる対立遺伝子を識別する、請求項67記載の方法。
【請求項７３】
解析段階が２つのプローブへのハイブリダイゼーションを含む、請求項67記載の方法。
【請求項７４】
第一のプローブが増幅した分子内の配列にハイブリダイズし、第二のプローブが増幅した分子と同じ染色体腕の別の部分の配列にハイブリダイズする、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
第一のプローブが稀なエクソンにハイブリダイズし、第二のプローブが一般的なエクソンにハイブリダイズする、請求項73記載の方法。
【請求項７６】
第一のプローブが変異対立遺伝子内の変異にハイブリダイズし、第二のプローブが野生型対立遺伝子にハイブリダイズする、請求項73記載の方法。
【請求項７７】
第一のプローブが第一の転写産物にハイブリダイズし、第二のプローブが基準転写産物にハイブリダイズする、請求項73記載の方法。
【請求項７８】
第一のプローブが第一の対立遺伝子中の第一の変異にハイブリダイズし、第二のプローブが第二の対立遺伝子中の第二の変異にハイブリダイズする、請求項73記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は1999年8月2日に出願された米国特許第60/146,792号の利点を主張するものである。
【０００２】
米国政府は、国立衛生研究所からの助成金CA 43460、CA 57345、およびCA 62924でその基礎研究を助成したことにより、本発明における特定の権利を保持している。
【０００３】
発明の技術分野
本発明は診断的遺伝子解析に関する。具体的には、遺伝子の変化および遺伝子発現の検出に関する。
【０００４】
発明の背景
古典遺伝学では、疾患の理解において生殖細胞系列の突然変異のみが重要だと考えられていた。体細胞突然変異が癌の主たる原因であること（1）、および加齢でも役割を果たしている可能性があること（2、3）が認識されるのに伴い、遺伝子の新しい原理が提唱されている。これらの発見は、患者管理、並びに新形成の病因に関する基礎研究にも、多くの新たな機会をもたらしている。しかし、こうした機会の多くにおいて、大多数を占める正常細胞の中から少数の突然変異含有細胞を検出することが要となっている。この例としては、膀胱、結腸直腸、肺に癌を持つ患者の、それぞれ尿（4）、糞便（5、6）、および痰（7、8）から新形成細胞を検出することが挙げられる。一部の症例においては、原発腫瘍がまだ治療可能で患者が無症候の段階でこのような検出が可能であることが示されている。新形成細胞のDNA中の突然変異配列はまた、癌患者の血液中にも発見されている（9〜11）。リンパ節または外科切除周縁（surgical margin）の残留病変部の検出は、どの患者がそれ以上の治療によって最も利益を得るかを予測するうえで有用である可能性がある（12〜14）。基礎研究の観点からは、発癌物質の早期影響の解析は、少ない割合の突然変異細胞を検出できる能力に依存していることが多い（15〜17）。
【０００５】
このように多くの設定でこの課題は重要であるため、突然変異検出のための有用な技術が多数開発されている。DNAシーケンシングは生殖細胞系列の突然変異の検出において最も基本的な方法であるが、この方法が有用であるのは突然変異を起こした対立遺伝子の割合が〜20%より大きい場合に限られる（18、19）。突然変異に特異的なオリゴヌクレオチドを用いて、分析対象の細胞のうち小割合の細胞に存在する突然変異を検出できる場合もあるが、突然変異と野生型（WT）の鋳型を区別する信号雑音比にはばらつきがある（20〜22）。突然変異に特異的なプライマーの使用、または、特異的な制限エンドヌクレアーゼによるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物の消化は、このような突然変異を検出する非常に高感度な方法であるが、これらの方法では、最初の集団中に含まれる突然変異分子の割合を定量化することが困難である（23〜28）。この他、体細胞突然変異を検出する革新的なアプローチの検討が行われている（29〜32）。これらの方法における一般的な問題点は、同定された任意の突然変異の存在を独立に確認することが困難または不可能であるということである。
【０００６】
このように、当技術分野において、塩基配列の混合集団から遺伝子配列を検出するための正確かつ定量的な方法が求められている。
【０００７】
発明の概要
本発明の1つの目的は、遺伝子配列の集団中に選択される遺伝子配列が存在するか否かを決定する方法を提供することである。
【０００８】
本発明のもう1つの目的は、本発明の方法に有用な分子ビーコンプローブを提供することである。
【０００９】
本発明のこれらおよび他の目的は、遺伝子配列の集団中に選択される遺伝子配列が存在するか否かを決定する方法を提供することによって達成される。核酸鋳型分子からなる生物学的試料を希釈して1セットのアッセイ試料を作製する。アッセイ試料中の鋳型分子を増幅し、該セットのアッセイ試料中の分子を増幅した集団を作製する。次に、該セットのアッセイ試料中の増幅された分子を解析して、選択される遺伝子配列を含むアッセイ試料の数を決定してこれを第一の数とし、基準遺伝子配列を含むアッセイ試料の数を決定してこれを第二の数とする。第一の数を第二の数と比較し、この生物学的試料の組成を反映する比を求める。
【００１０】
本発明の別の態様として、遺伝子配列の集団に含まれる選択される遺伝子配列の比を決定する方法がある。複数のアッセイ試料からなるセットに含まれる鋳型分子を増幅し、該セットの各アッセイ試料中の分子を増幅した集団を作製する。該セットのアッセイ試料中の増幅された分子を解析して、選択される遺伝子配列を含むアッセイ試料の数を決定してこれを第一の数とし、また、基準遺伝子配列を含むアッセイ試料の数を決定してこれを第二の数とする。第一の数を第二の数と比較し、この生物学的試料の組成を反映する比を求める。
【００１１】
本発明の別の態様では、分子ビーコンプローブが提供される。このプローブは、5'末端または3'末端のいずれか一端に光ルミネセンス性色素を、他端に消光剤を有するステム−ループ構造をもつオリゴヌクレオチドからなる。ループは16塩基対で構成され、Tmは50〜51℃である。ステムは5'-CACG-3'の4塩基対で構成される。
【００１２】
別の態様では第二の種類の分子ビーコンプローブが提供される。このプローブは、5'末端または3'末端のいずれか一端に光ルミネセンス性色素を、他端に消光剤を有するステム−ループ構造をもつオリゴヌクレオチドからなる。ループは19〜20塩基対で構成され、Tmは54〜56℃である。ステムは5'-CACG-3'の4塩基対で構成される。
【００１３】
別の態様では、これら2種類の分子ビーコンプローブが、混合した状態もしくはキットとして別々の容器に入った状態で提供される。
【００１４】
このように本発明は、配列が混合した集団に含まれる特定のDNA配列またはRNA配列の定量的評価をデジタル（2進）信号を用いて得る方法に関する技術を提供する。
【００１５】
発明の詳細な説明
本発明者らの考案した方法は、少数の鋳型分子を別々に増幅し、それによって得られる生成物が、選択した検出手段で検出できる割合で分析対象塩基配列を有するようにすることに関するものである。この限界において、単一の鋳型分子は、生成物が完全に突然変異のみまたは野生型（WT）のみとなるよう増幅することができる。増幅産物は、この均一性により、既存の技術にで容易に識別することができる。
【００１６】
この方法は、多数の増幅産物を単純かつ高い信頼性で解析することを必要とするが、このような評価のための技術は開発されており、分析対象集団に含まれる突然変異の対立遺伝子の割合をデジタル読み出しできるようになっている。
【００１７】
用いようとする分析技術によって分析物を検出できるよう、鋳型分子の全分子に対してある割合の選択される遺伝子配列（分析物）が実用上使用可能な数の希釈試料に含まれるところまで生物学的試料を希釈する。希釈試料の実用上使用可能な数は分析方法の費用によって異なると思われる。典型的には、少なくとも希釈試料の1/50に分析物が検出可能な割合で含まれていることが望ましいと思われる。希釈試料の少なくとも1/10、1/5、3/10、2/5、1/2、3/5、7/10、4/5、または9/10に分析物が検出可能な割合で含まれていて差し支えない。有用な情報を提供する試料の割合が多いほど、アッセイ法全体は経済的となる。または、過度の希釈は、多くの試料を分析することになり、かつそれら試料からの信号が得られないことになるため、経済性を損なわせる。特に好ましい1つの希釈度は、各アッセイ試料が平均して半分の鋳型を含む程度までの希釈である。希釈はより濃度の高い試料から行うこともできる。また、希釈源として鋳型核酸を用いることもできる。すべての試料が増幅可能な鋳型分子を含んでいてもよい。望ましくは、増幅前の各アッセイ試料が100未満または10未満の鋳型分子を含むようにする。
【００１８】
デジタル増幅は、分析しようとする試料中に比較的低いレベルで存在している突然変異を検出するのに用いることができる。検出限界は、分析できるウェル数と、増幅に用いるポリメラーゼに内在する突然変異の率によって決まる。384ウェルのPCRプレートが市販されており、1536ウェルプレートも実用化が目前となっており、これにより突然変異の検出感度は理論上〜0.1%のレベルになっている。また、デジタル増幅はマイクロアレイの形でも実施することができ、感度がさらに一桁向上する可能性がある。この感度は最終的にポリメラーゼの誤りによって制限される可能性がある。本発明者らの用いた条件下ではPCRの有効誤り率が<0.3%であった。すなわち、正常細胞のDNAを用いた対照実験では、PCR産物を含む340個のウェルのいずれにおいても赤／緑比が>3.0にならなかった。個々の突然変異（c-Ki-rasのコドン12の2番目におけるGからCへの塩基転換など）の予測発生頻度は、ポリメラーゼに由来する突然変異の50分の1未満である（コドン12および13の中または周囲の塩基置換で高い赤／緑比を示すものは少なくとも50ある）。陽性ウェル中の推定突然変異の配列を本明細書に記載のようなダイレクトシーケンシングまたは他の方法で決定することにより、予測される突然変異の確実なバリデーションが可能である。すなわち、突然変異がインビボで起こった場合には、個々のウェル中の突然変異は大部分が同一であるはずである。陽性信号はポワソン分布に従うことから、有意性は厳密な統計分析によって確立することができる。さらに、あるデジタル増幅実験における誤り率は、正常細胞のDNA鋳型のデジタル増幅を行うことによって正確に決定することができる。
【００１９】
デジタル増幅は、ゲノムDNAへの適用と同じく、RNA鋳型から生成したRT-PCR産物にも容易に適用することができる。たとえば、選択的スプライシングを受けた、または突然変異したある遺伝子の転写物は、生成された各PCR産物にそれぞれ特異的な光ルミネセンス性プローブを用いて容易に決定することができる。同様に、デジタル増幅を用いてRNA集団中の遺伝子発現の相対レベルを定量化することも可能である。この増幅では、各ウェルに、構成的に発現している基準転写物を増幅するためのプライマーと、被験転写物に特異的なプライマーとを入れる。その後、1つの光ルミネセンス性プローブを用いて基準転写物のPCR産物を、もう1つの光ルミネセンス性プローブを用いて被験転写物を検出する。被験転写物の増幅がみられたウェルの数を基準転写物が増幅されたウェルの数で割ると、遺伝子発現の定量的測定値が得られる。別の例の一群は、標準的なDNA試料の配列解析時に2つの突然変異が観察された場合の対立遺伝子的な状態についての調査に関する。1つの異型が各対立遺伝子に存在しているか（に対して両方の異型が1つの対立遺伝子に生じているか）を識別するには、通常、PCR産物のクローニングが行われる。本明細書に記載のアプローチは、クローニングの必要性をなくすことによってこの分析を単純化する。この他、デジタル増幅の可能性のある応用を表1に示す。稀な対立遺伝子の検出ではなく、比較的一般的な2つの対立遺伝子または転写物の割合の定量化を目的とする場合は、分子ビーコンを使用する代わりにTaqManおよびリアルタイムPCRを採用した方法などで優れた結果が得られる。リアルタイムPCRの利点としては、簡便性と、複数の試料を同時に解析できることがある。しかし、予測される差が小さい場合（例：対立遺伝子の不均衡など、差が〜2倍しかない場合（55））には、こうした用途にデジタル増幅が有用である可能性がある。
【００２０】
デジタル増幅の根本的な有用性は、本来指数関数的な性質を持つPCRを比例関数的性質に変換できる点にある。したがって、個々の対立遺伝子や稀な変異体／突然変異の研究、またはPCR産物の定量分析を必要とする実験に有用となるはずである。
【００２１】
好ましい態様の1つでは、各希釈試料は平均して半分の鋳型分子を含む。これは、希釈試料の半数が鋳型分子を1つ含むことと同じである。これは増幅により実験的に決定することができる。この決定には分析物（選択される遺伝子配列）または基準遺伝子配列のどちらかを用いることができる。用いる分析法が20%のレベルで存在している分析物を検出できる場合には、有意数の希釈アッセイ試料が20%を上回る量の分析物を含むように希釈しなければならない。用いる分析法が検出に100%の分析物を必要とする場合には、単一の鋳型分子のレベルまで希釈することが必要となる。
【００２２】
単一鋳型分子レベルに近いレベルまでの希釈を達成するため、アッセイ試料の0.1〜0.9で増幅産物が得られるように希釈することができる。より好ましくは0.1〜0.6までの希釈とし、より好ましくはアッセイ試料の0.3〜0.5で増幅産物が得られるようにする。
【００２３】
デジタル増幅法では、意味のある結果を得るために多数の試料を解析する必要がある。好ましくは、少なくとも10個の希釈したアッセイ試料を増幅、解析する。より好ましくは、少なくとも15、20、25、30、40、50、75、100、500、または1000のアッセイ試料を増幅、解析する。任意の方法と同様、ある点までは試料数が増加するほど測定精度が向上する。多数の試料の解析を要することから、操作手順、特に試料輸送段階を減らすことが望ましい。したがって、増幅および解析の各段階が同じ容器で行われることが好ましい。これにより、本方法はインサイチューまたは「ワンポット(one-pot)」法となる。
【００２４】
デジタル増幅法の応用が考えられる様々な状況は数多くある。その一部を表1に示す。例に示すように、腫瘍細胞だけではない細胞集団に含まれる腫瘍突然変異の発見に用いることができる。例に示すように、特定の突然変異に対するプローブを用いる必要はないが、野生型プローブへの結合の減少を1つまたはそれ以上の突然変異が存在する指標として使用することができる。白血病またはリンパ腫は染色体の転座を特徴としており、治療の有効性の尺度としてこの転座を検出することができる。遺伝子増幅は特定の病状の特徴である。これをデジタル増幅で測定することができる。mRNAから作製したcDNAにデジタル増幅を用いることにより、選択的スプライシングを受けた形の転写物を検出し、他の形の転写物に対する定量化を行うことができる。同様に、mRNAから作製したcDNAを用いて、2つの異なる遺伝子の相対的転写レベルを決定することができる。デジタル増幅を用いて、ある個人において1つの対立遺伝子が2つの突然変異を含んでいる場合と1つの突然変異が2つの対立遺伝子のそれぞれに含まれている場合とを識別することができる。対立遺伝子の不均衡は病的状態から生じることが多い。デジタル増幅でこの不均衡を検出することができる。
【００２５】
本解析の出発材料として用いることができる生物学的試料は、そこからDNAまたはmRNAを単離できる任意の組織または体試料であればいかなるものに由来しても差し支えない。好ましい採取源としては、糞便、血液、およびリンパ節がある。好ましくは、生物学的試料は細胞を含まない溶解物である。
【表１】
Dig-PCRの可能性のある応用
0004653366.tif 000002
【００２６】
本発明による分子ビーコンプローブでは、検出可能成分として任意の光ルミネセンス性成分を使用することができる。典型的にはこれらは色素である。多くの場合これらは蛍光色素である。光ルミネセンスとは、材料が光などの照射によって励起され、電気的または振動的な励起状態に引き上げられ、続いてこの励起エネルギーを光子として再放出する任意の過程を指す。このような過程には蛍光が含まれる。蛍光とは、電子対を持つ励起状態（「一重項」状態）または不対電子を持つ励起状態（「三重項」状態）から、同じ多重度を持つ、より低い状態への遷移、すなわち量子力学的に「許容された」遷移を伴う放射である。光ルミネセンスには燐光も含まれる。燐光とは、三重項または一重項の励起状態から、多重度の異なる、より低い状態への遷移、すなわち量子力学的に「禁制された」遷移を伴う放射である。「許容」遷移と比べて、「禁制」遷移は励起状態の寿命が比較的長い。
【００２７】
光ルミネセンスの消光は主としてシグナル伝達の点で異なる様々な方法で分析することができる。消光は、光ルミネセンスの輝度比の変化として、または異なる2つの波長における光ルミネセンス輝度の比の変化として、または光ルミネセンスの寿命の変化として、または光ルミネセンスの偏光（異方性）の変化としてさえも変換することができる。当業者には、これら種々の光ルミネセンス性反応を測定する機器が公知であることが理解されると思われる。本実施例に取り上げられている、消光分析のための特定のレシオメトリックな(ratiometoric)方法は、本発明を特定のシグナル伝達形式に限定するものではない。光ルミネセンス輝度のレシオメトリックな測定には、輝度、光ルミネセンスの寿命、または偏光（異方性）さえの変化の測定が含まれうる。
【００２８】
実施例では増幅した希釈試料の分析方法として分子ビーコンプローブの使用を示しているが、他の方法を用いることも可能である。これには、シーケンシング、ゲル電気泳動、TaqMan（商標）（二重標識蛍光発生）プローブ（カリフォルニア州フォスターシティー、Perkin Elmer Corp./Applied Biosystems）およびピレン標識プローブを含む他の種類のプローブとのハイブリダイゼーション、および他の生化学的アッセイ法が含まれる。
【００２９】
以上の開示により本発明の全般を説明した。以下の具体的な実施例を参照することによってより完全な理解が得られると思われる。これら実施例は本明細書に説明のためだけに提供されるものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３０】
実施例1
段階1：PCR増幅
本節で説明するPCRの最適条件は、「結果」の項で説明している各種パラメータを変更することによって決定された。96ウェルのポリプロピレン製PCRプレート（ニューヨーク州ロチェスター、Marsh Biomedical Products）上で、体積7 ulでPCRを実施した。反応の組成は、67 mM Tris、pH 8.8、16.6 mM NH4SO4、6.7 mM MgCl2、10 mM β-メルカプトエタノール、1 mM dATP、1 mM dCTP、1 mM dGTP、1 mM TTP、6% DMSO、1 uM プライマーF1、1 uM プライマーR1、0.05 単位/ul Platinum Taqポリメラーゼ （Life Technologies、Inc.）、および、DNAの「半ゲノム相当」とした。半ゲノム相当に相当するDNAの量を決定するため、DNA試料を連続希釈しPCRで試験した。半数のウェルで増幅産物が得られた量は概ね〜1.5 pgの全DNAで、これを「半ゲノム相当」と定義し、以後のデジタル増幅実験において全ウェルでこの量を使用した。軽い鉱油50 ul（Sigma M-3516）を各ウェルに加え、HybAidサーマルサイクラーで、以下に示す温度で反応させた。すなわち、変性94度1分間；94度15秒間、55度15秒間、70度15秒間を60サイクル；70度5分間である。分析は、反応直後、もしくは室温で36時間放置した後の蛍光分析とした。
【００３１】
実施例2
段階2：蛍光分析
各ウェルに、以下に示す組成の溶液3.5 ulを加えた。67 mM Tris 、pH 8.8、16.6 mM NH4SO4 、6.7 mM MgCl2 、10 mM β-メルカプトエタノール 、1 mM dATP 、1 mM dCTP 、1 mM dGTP 、1 mM TTP 、6% DMSO 、5 uM プライマーINT 、1 uM MB-GREEN 、1 uM MB-RED 、0.1 単位/ul Platinum Taqポリメラーゼである。プレートを6000 gで20秒間遠心分離し、蛍光を読み取った。読み取りの際、励起／発光波長についてそれぞれ、MB-GREEN 485 nm/530 nm、MB-RED 530 nm/590 nmとした。鋳型を含まないウェルの蛍光の典型値は10,000〜20,000蛍光「単位」で、約75%が蛍光光度計バックグラウンドからの放射、残りがMBプローブからであった。次に、プレートをサーマルサイクラーに入れ、以下に示す温度で非対称増幅を行った。すなわち、94度1分間；94度15秒間、55度15秒間、70度15秒間を10〜15サイクル；94度1分間；60度5分間である。次に、プレートを室温に10〜60分間放置してインキュベートさせ、前述の方法で蛍光を測定した。非対称増幅前後の蛍光の差を特異的蛍光と定義した。赤／緑比は、MB-REDの特異的蛍光をMB-GREENの特異的蛍光で除したものとして定義した。陽性対照（実施例1に説明のとおり、25ゲノム相当の正常細胞DNA）が示した比で赤／緑比を標準化した。本発明者らは、本発明者らが用いた条件下でMBプローブがWT配列と突然変異配列を識別する能力は、比較的短い相補的一本鎖オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションでMBプローブを試験した実験からは正確に決定することができないこと、およびバリデーションには実際のPCR産物を用いなければならないこと、を見出した。
【００３２】
実施例3
オリゴヌクレオチドおよびDNAのシーケンシング
プライマーF1：
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；プライマーR1：
0004653366.tif 000004
；プライマーINT：
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；MB-RED：
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；MB-GREEN：
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。分子ビーコン（33、34）はMidland Scientificで、他のオリゴヌクレオチドはGene Link（ニューヨーク州トルンウッド）で合成された。これらはすべてTE（10 mM Tris 、pH 8.0/EDTA 1 mM）中に50 uMで溶解し、凍結して使用時まで暗所に保管した。PCR産物はQIAquick PCR精製キット（Qiagen）を用いて精製した。本文中に説明した関連実験では、単一のウェルから得た産物の20%をゲル電気泳動に、40%を各シーケンシング反応に使用した。シーケンシングに用いたプライマーは
0004653366.tif 000008
である。シーケンシングには、蛍光標識したABI Big DyeターミネーターおよびABI 377自動シーケンサーを用いた。
【００３３】
実施例4
実験の原理
実験の概要を図1Aに示す。まず、マルチウェルプレートに、平均してウェル2つにつき鋳型分子1つとなるようにDNAを希釈し、PCRを行う。次に、蛍光プローブを用いて、突然変異配列およびWT配列のPCR産物が存在するかについて各ウェルを分析する。
【００３４】
1つの鋳型分子から増幅されたPCR産物は配列が相同になるはずであるから、その存在の評価には様々な標準的手法を用いることができる。蛍光プローブを基礎とした技術はPCR産物に「インサイチュー」で（すなわち、同一ウェル内で）実施することができ、この用途に特に好適である（31、33〜40）。本発明者らはこの目的のため、このような技術の1つで分子ビーコン（MB）を使用したものの有用性を検証した（33、34）。MBプローブはステム−ループ構造をもつオリゴヌクレオチドで、5'末端に蛍光色素を、3'末端に消光剤 （ダブシル（Dabcyl））を有している（図1B）。蛍光エネルギー共鳴伝達による消光の度合いは、ダブシル類と蛍光色素の距離の6乗に反比例する。加温および冷却するとMBプローブはステム−ループ構造を再構築し、これにより色素からの蛍光信号が消光する（41）。加温／冷却サイクル中にこのループ配列と相補的な配列をもつPCR産物が存在すると、MBがPCR産物の一本鎖にハイブリダイゼーションすることによってダブシルと色素との距離が大きくなり、その結果蛍光が増す。
【００３５】
デジタル増幅に用いるオリゴヌクレオチドの略図を図1Cに示す。PCR反応用のプライマーとして、2つの非修飾オリゴヌクレオチドを使用する。それぞれ異なる蛍光体で標識した2つのMBプローブを用いてPCR産物を検出する。MB-GREENは、WT PCR産物の突然変異が疑われる部位に相補的なループ領域をもつ。PCR産物の対応塩基配列中に突然変異があれば、このMBプローブへのハイブリダイゼーションが有意に妨げられるはずである（33、34）。MB-REDは、PCR産物の別の部位で、突然変異がないと予測される部位に相補的なループ領域をもつ。したがってMB-REDは、ウェルにPCR産物が含まれていれば、PCR産物のMB-GREEN探索領域がWTまたは突然変異に関わらず信号を発するはずである。この両方のMBプローブを一緒に用いてPCR産物の存在と突然変異の状態とを同時に検出する。
【００３６】
実施の条件
再現性よくかつ一般的に適用できる条件を決定するため、多数の条件を最適化した。図1Aに示すように、第一の段階で単一の鋳型分子からの増幅を行う。少数の鋳型分子を増幅するためのプロトコルの多くは、入れ子手順、すなわち、1セットのプライマーによってできた産物が内部プライマーを使用した第二の反応の鋳型として使われる手順を用いている。デジタル増幅の応用の多くは数百または数千の増幅を別々に行う必要があると予測されることから、このような入れ子状態は不便であり、コンタミネーションの問題につながる可能性もある。したがって、入れ子状態ではない強力に増幅できる条件を探した。これら条件のうち最も重要であったのは、加温後にのみ活性化されるポリメラーゼを使用すること（44、45）、dNTP、プライマー、緩衝成分の濃度の最適化、および温度であった。実施例1〜3に示した条件はこれらの要素を個々に最適化した後に決定されたものであり、種々の異なるヒトゲノムDNA配列の増幅に適していることが確認された。PCRに要する時間は特に長いものではなかったが（〜2.5時間）、サイクル数は「平均的な」単一鋳型分子の増幅に要するサイクル数と比較して非常に多く、過剰なものであった。多数回のサイクルを要したのは、PCRサイクルを数回完了するまでは一部のウェルで鋳型の増幅が始まらない可能性があったためである。サイクルを多数回行うことにより、鋳型分子が存在している場合にはすべてのウェル（単に平均的なウェルではなく）で十分かつほぼ同量のPCR産物が得られるようにした。
【００３７】
図1Aの第二の段階はこれらPCR産物の検出である。デジタル増幅の用途で効果的に機能するよう、標準的なMBプローブのアプローチを大きく修正する必要があった。理論的には、検索対象の配列に起こりうる特定の突然変異それぞれについて、異なる１つのMBプローブを用いて検出することができる。WT配列に対応するMBを1つと突然変異配列に対応する別のMBを1つ含むことによって、PCR産物の性質を明らかにすることができる。いくつかの状況でこの戦略を効果的に使用できることは明白であるが、同一の検索対象配列中に複数の異なる突然変異が起こると予測される場合は複雑になる。たとえば、本明細書で検討しているc-Ki-Ras遺伝子の例では、コドン12および13にミスセンス突然変異を起こす塩基置換が理論的には12種類起こる可能性があり、これらのうち少なくとも7種類が自然発生したヒトの癌で確認されている。個々の分子ビーコンで12種類すべての突然変異並びにWTの塩基配列を検出するには13のプローブが必要となる。このように多数のMBプローブを使用すれば、バックグラウンドの蛍光が増加しアッセイ法の費用も高くなる。したがって本発明者らは、検索対象の配列において任意の突然変異配列よりもWT配列とより反応する単一のプローブを開発しようと試みた。本発明者らは、このようなプローブの有効性を決定する上でループの配列長、その融解温度、およびステムの塩基配列長がそれぞれ重要であることを見出した。手順の最適化にあたって、14〜26塩基のループと4〜6塩基のステムを試験し、並びにステム、ループとも多数の配列異型を試験した。WT配列と突然変異配列の識別（MB-GREENプローブ）には、16塩基対で融解温度（Tm）50〜51度のループと配列5'-CACG-3'の4塩基対のステムが最適であることがわかった。MB-REDプローブには、同じステムと19〜20塩基対でTm 54〜56度のループが最適であった。MB-GREENプローブとMB-REDプローブ間でループのサイズと融解温度が異なったことは、GREENプローブは密接に関連しあった配列を識別するよう設計されており、そのような識別を容易にするため相同領域がより短くなっていることを反映していた。
【００３８】
c-Ki-Rasの突然変異を含む結腸直腸腫瘍細胞から得たDNA鋳型の入ったレプリカウェルにおける比の例を図2に示す。この実験では、増幅前に50ゲノム相当のDNAを各ウェルに加えた。試験した6つの突然変異の各々において、赤／緑の蛍光の比が正常細胞のDNAにおける比を有意に上回っていた（正常DNAの1.0に対して突然変異では1.5〜3.4；それぞれp < 0.0001、スチューデントt検定）。これらの比の再現性はこの図で確認できる。蛍光分析用に用いたPCR産物を直接DNAシーケンシングしたところ、赤／緑比が鋳型集団中の突然変異遺伝子の相対的な割合に依存していることが示された（図2）。したがって、WTのc-Ki-Ras対立遺伝子2つにつき突然変異のc-Ki-Ras対立遺伝子を1つ有している細胞のDNAでは赤／緑比が1.5となり（Gly12Arg突然変異）、WT対立遺伝子1つにつき突然変異のc-Ki-Ras対立遺伝子を3つ有している細胞では赤／緑比が3.4となった（Gly12Asp）。これらのデータは、突然変異の対立遺伝子のみが入った（WTを含まない）ウェルでは比が3.0を超え、正確な値は特定の突然変異によって異なることを示唆していた。
【００３９】
このモードは多くの用途において最も便利であるが、本発明者らは、PCR増幅完了後にMBプローブを加えるのが有用であることを見出した（図1）。これにより、標準的なマルチウェルプレートの蛍光計を用いて、前もって生成したPCR産物の入った多数のマルチウェルプレートを連続分析することが可能になり、リアルタイムPCR装置を複数台用意する必要性を回避できた。さらに本発明者らは、MBプローブの存在下で非対称で直線的な増幅を数サイクル行えば、得られた蛍光信号を大幅に増強できることを見出した。非対称増幅は、MBプローブの添加時に単一の内部プライマー（図1CのプライマーINT）を過剰に含めることによって達成した。
【００４０】
実施例5
腫瘍細胞のDNAの分析
上述した原理上および実用上の考慮点は、2つの結腸直腸癌細胞株のDNAで実証された。1つはc-Ki-Rasのコドン12に、もう1つはコドン13に突然変異のある細胞株である。得られたMB-RED蛍光値の代表例を図3に示す。この分布は、「陽性」ウェルの値が10,000特異蛍光単位（SFU、「材料および方法」の項に定義）を超え、「陰性」ウェルが3500 SFU未満と、明らかな二相性を示した。このようなウェル127個についてゲル電気泳動を行った結果、すべての陽性のウェルには予測されたサイズのPCR産物が含まれており、陰性のウェルには全く含まれていなかった（図3）。陽性ウェルの赤／緑の蛍光比を図4に示す。再度二相性の分布が見られた。Gly12Asp突然変異を含む腫瘍を用いた実験では、陽性ウェルの64%で赤／緑比が3.0を超え、残り36%では比が0.8〜1.1となった。Gly13Asp突然変異を含む腫瘍を用いた場合は、陽性ウェルの54%で赤／緑比が>3.0となり、残りの陽性ウェルでは比が0.9〜1.1となった。陽性ウェル16個のPCR産物をシーケンシング用鋳型として用いた（図4）。比が3.0を上回ったウェルはすべて、予測された配列の突然変異c-Ki-Ras断片を含んでおり、一方、その他のPCR産物にはWT配列が確認された。相同のWT配列または突然変異配列が存在していたことから、増幅産物は概ね単一の鋳型分子に由来していたことが確認された。デジタル増幅アッセイ法で決定した、突然変異のPCR産物に対するWTのPCR産物の比は、これら2つの腫瘍細胞株のゲノムDNAのダイレクトシーケンス解析から推測した突然変異対立遺伝子の割合とも一致していた（図2）。
【００４１】
糞便DNAのデジタル解析
より実際的な例として、本発明者らは結腸直腸癌患者の糞便検体のDNAを解析した。このような実験の代表的な結果を図5に示す。腫瘍にc-Ki-Ras遺伝子の突然変異が含まれている患者の糞便検体を用いた以前の解析から、糞便から精製したc-Ki-Ras遺伝子の1〜10%が突然変異であると予測した。したがって、384ウェルのデジタル増幅実験を設定した。陽性対照として、48個のウェルに正常細胞のDNAを25ゲノム相当入れた（「材料および方法」の項に定義）。別の48個のウェルを陰性対照とした（DNA鋳型を加えなかった）。残り288個のウェルに、適切に希釈した糞便DNAを入れた。MB-RED蛍光により、これら288個の実験ウェルのうち102個にPCR産物が含まれ（平均 +/- 標準偏差、47,000 +/- 18,000 SFU）、残り186個にはPCR産物が含まれていない（2600 +/- 1500 SFU）ことが示された。陽性となった102個のウェルのうち5つは赤／緑比が2.1〜5.1となり、突然変異c-Ki-Ras遺伝子が含まれていることが示唆された。残り97個のウェルは比が0.7〜1.2の範囲となり、陽性対照ウェルの値と等しいものであった。5つの陽性ウェルに含まれていた糞便由来の突然変異c-Ki-Ras配列の性質を決定するため、PCR産物をダイレクトシーケンシングした。赤／緑比が3.0を超えていた4つのウェルは、突然変異c-Ki-Ras遺伝子のみを含んでいた（図5）。これらPCR産物のうち3つではこの配列にGly12Ala突然変異が見出され（コドン12がGGTからGCTに置換）、第4のPCR産物ではコドン13の3番目の位置にサイレントなCからTへのトランジションがあった。このトランジションはおそらく、WT鋳型を増幅する際の最初の産生サイクル中に生じたPCRエラーによるものである。比が2.1のウェルにはWT配列とGly12Ala突然変異配列が〜1:1で混合していた。したがって、この糞便試料中に存在していたc-Ki-Ras対立遺伝子の3.9%（4/102）がGly12Ala突然変異を含んでいた。これら患者の癌のDNAから生成したPCR産物のダイレクトシーケンシングで同一のGly12Ala突然変異が確認されたことから（本明細書中には示さず）、糞便中の突然変異対立遺伝子は患者の結腸直腸癌から生じたものであると考えられる。
【００４２】
参照文献
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0004653366.tif 000010
0004653366.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【図１】  実験デザインの略図。（A）2つの基本段階は以下を含んでいた。希釈したDNA試料にPCRを行った後、WT対立遺伝子と突然変異対立遺伝子とを区別する蛍光プローブを加え、続いて蛍光光度分析を行う。（B）分子ビーコン分析の原理。このステム−ループ構造において、オリゴヌクレオチドプローブの5'末端の色素から出る蛍光は3'末端のダブシル類により消光される。鋳型へのハイブリダイゼーションによって色素が消光剤から離れ、蛍光が増す。マラス（Marras）らの方法を改変。（C）オリゴヌクレオチドの設計。プライマーF1およびR1を用いて関心対象のゲノム領域を増幅する。続いて、非対称PCR段階中に、プライマーINTを用いてオリジナルのPCR産物から一本鎖DNAを得る（「材料および方法」の項を参照）。MB-REDは、検索対象のコドンにおいて、WTか突然変異かに関わらず該当する任意の適当なPCR産物を検出する分子ビーコンである。MB-GREENはWTのPCR産物を優先的に検出する分子ビーコンである。
【図２】  分子ビーコンによる、WTのPCR産物と突然変異のPCR産物との区別。c-Ki-Rasに指定の突然変異を含む、それぞれ〜50ゲノム相当の細胞DNAから生成した10のPCR産物を、本文中に説明した分子ビーコンプローブを用いて分析した。分子ビーコン分析に用いたPCR産物の代表例を精製し、ダイレクトシーケンシングした。Gly12CysおよびGly12Argの突然変異の場合では、腫瘍中に混じっていた非新生物細胞のために比が比較的低くなったものと推定される。Gly12SerおよびGly12Aspの場合では、ひとつひとつのWT対立遺伝子に対して突然変異したc-Ki-Rasの対立遺伝子が2つまたはそれ以上あったと見受けられた。両腫瘍とも異数性であった。
【図３】  MB-REDを用いたDig-PCR産物の検出。c-Ki-Ras遺伝子にGly12AspまたはGly13Aspの突然変異を持つ結腸直腸癌細胞を用いた実験における、代表的なウェルの特異的蛍光単位（SFU）。値が>10,000のウェルは黄色の影で示してある。選択されるウェルのPCR産物をポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析した結果を示す。蛍光値<3500のウェルには正しいサイズのPCR産物が含まれておらず、蛍光値>10,000 SFUのウェルには129塩基対のPCR産物が必ず含まれていた。Dig-PCRで必要な多数回のサイクルによって生成された非特異的産物は蛍光分析に影響を及ぼさなかった。M1およびM2は、左端に（塩基対数で）示した断片サイズの決定に用いた分子量マーカーである。
【図４】  Dig-PCRで得られたWTのPCR産物と突然変異のPCR産物との識別。「材料および方法」の項で説明したように、MB-REDおよびMB-GREENによる蛍光から赤／緑比を決定した。本図に示したウェルは図3に示したウェルと同一のものである。指定したウェルのPCR産物の塩基配列を、「材料および方法」の項に示した方法で決定した。赤／緑比が>3.0のウェルはすべて突然変異した配列を含んでおり、赤／緑比が〜1.0のウェルはWT配列を含んでいた。
【図５】  糞便試料のDNAのDig-PCR。この実験で用いた384個のウェルを示す。青で示したウェルは、正常細胞のDNAを25ゲノム相当含んでいた。これらはすべてMB-RED陽性となり、赤／緑比は1.0 +/- 0.1（平均 +/- 1標準偏差）であった。黄色で示したウェルは鋳型DNAを含んでおらず、すべてMB-RED陰性であった（すなわち、蛍光が<3500蛍光単位）。他の288個のウェルは、アルカリ抽出物で調製した糞便試料の希釈DNAを含んでいた（Rubeckら、1998、BioTechniques 25:588-592）。MB-RED陽性のウェルは、赤／緑比に応じて赤色または緑色になった。MB-RED陰性のウェルは白色になった。指定したウェルのPCR産物を自動シーケンシング解析に用いた。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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