(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンドロイチナーゼＡＢＣを含有する、線維輪組織におけるコラーゲン分解促進剤。
【請求項２】
コンドロイチナーゼＡＢＣ及びインターロイキン−１を含有する、線維輪組織におけるコラーゲン分解促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はコンドロイチナーゼの新規な用途に関する。より詳細には、コンドロイチナーゼを含有するコラゲナーゼ産生促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コンドロイチナーゼは、コンドロイチン硫酸（以下、「ＣＳ」ともいう）の分解を触媒する酵素である。コンドロイチナーゼには種々の種類が知られており、例えばコンドロイチナーゼＡＢＣ(chondroitinase ABC)〔EC 4.2.2.4〕は、哺乳動物軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａ、鮫軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｃ及び哺乳動物皮膚由来のコンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）の分解を強力に触媒し、ヒアルロン酸（以下「ＨＡ」ともいう）の分解を弱く触媒する酵素である。
【０００３】
一方、椎間板ヘルニアは、椎間板内の髄核の突出等に起因する疾患であり、突出した髄核が付近の神経を刺激するために、腰痛等の症状が現れる。
近年、コンドロイチナーゼを椎間板に投与して突出した髄核を融解して椎間板ヘルニアを治療する方法が試みられている〔米国特許4696816号明細書、Clinical Orthopaedics, 253,301-308(1990)〕。
【０００４】
Ｓｐｉｎｅ（１９９６年）第２１巻、第２４０５−２４１１頁には、コンドロイチナーゼＡＢＣを椎間板に注入して髄核を融解し、融解前後の組織の乾燥重量を比較したところ、「融解処理による組織の減少量」が「組織に含有されるＣＳ等の重量」を上回るという現象が観察され、タンパク質分解の可能性が示唆されることが記載されている。ところがカゼインの分解活性によりタンパク質分解を評価したところ、これを裏付ける結果は得られず、結局その原因は不明のままである旨が記載されている。
【０００５】
また、Ｓｐｉｎｅ（１９９７年）第２２巻、第１０６５−１０７３頁には、椎間板の変性やヘルニアに、マトリックスメタロプロテイナーゼが関与している旨が記載されている。さらに、コラゲナーゼはマトリックスメタロプロテイナーゼの一種であることが知られている。
【０００６】
しかしコンドロイチナーゼがコラゲナーゼの産生を促進することについては知られていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、コンドロイチナーゼ、特にコンドロイチナーゼＡＢＣの新規な用途、具体的にはコラゲナーゼ産生促進剤を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、コンドロイチナーゼを含有するコラゲナーゼ産生促進剤（以下、「本発明促進剤」ともいう）、及び本発明促進剤からなる医薬（以下、「本発明医薬」ともいう）を提供するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）コンドロイチナーゼを含有する、コラゲナーゼ産生促進剤。
（２）コンドロイチナーゼが、コンドロイチナーゼＡＢＣである、（１）に記載の促進剤。
（３）（１）又は（２）に記載の促進剤からなる医薬。
（４）椎間板又は脊髄硬膜外腔投与用の（３）に記載の医薬。
【００１０】
【発明の実施の形態】
＜１＞本発明促進剤に用いるコンドロイチナーゼ
本発明促進剤に用いることができるコンドロイチナーゼは、ＣＳを分解する酵素である限りにおいて特に限定されるものではない。コンドロイチナーゼとして、具体的には、コンドロイチナーゼＡＢＣ（Proteus vulgaris由来；特開平６−１５３９４７号公報、T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, S. Suzuki,J. Biol. Chem., 243, 1523(1968)、S. Suzuki, H. Saito, T. Yamagata, K. Anno, N. Seno, Y. Kawai, T. Furuhashi, J. Biol. Chem., 243, 1543(1968))、コンドロイチナーゼＡＣ(Flavobacterium heparinum由来；T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523(1968))、コンドロイチナーゼＡＣII(Arthrobacter aurescens由来；K. Hiyama, S. Okada, J. Biol.Chem.,250, 1824 (1975)、K. Hiyama, S. Okada, J. Biochem.(Tokyo), 80, 1201(1976))、コンドロイチナーゼＡＣIII(Flavobacterium sp. Hp102由来；宮園博文、菊池博、吉田圭一、森川清志、徳安清親、生化学、61、1023(1989))、コンドロイチナーゼＢ(Flavobacterium heparinum由来；Y. M. Michelacci, C. P.Dietrich, Biochem. Biophys. Res. Commun.,56, 973(1974)、Y. M. Michelacci, C. P. Dietrich, Biochem. J., 151, 121(1975)、前山賢一、多和田明、上野暁子、吉田圭一、生化学、57, 1189(1985))、コンドロイチナーゼＣ(Flavobacterium sp. Hp102由来；宮園博文、菊池博、吉田圭一、森川清志、徳安清親、生化学、61、1023(1989))等が知られており、これらのコンドロイチナーゼのいずれをも用いることができる。また、特開平９−１６８３８４号公報に記載されているヒト由来のコンドロイチン硫酸分解酵素や、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼ(chondroitin sulfate ABC exolyase； A. Hamai, N. Hashimoto, H. Mochizuki, F. Kato, Y. Makiguchi, K. Horie and S. Suzuki, J. Biol. Chem.,272, 9123-9130(1997))等のコンドロイチナーゼも、本発明促進剤に用いることができる。
【００１１】
これらの各種コンドロイチナーゼはあくまで例示であり、本発明促進剤で用いることができるコンドロイチナーゼはこれらに限定されるものではない。なお、本発明促進剤において用いるコンドロイチナーゼは、１種類のコンドロイチナーゼであってもよく、あるいは複数種のコンドロイチナーゼの組み合わせであってもよく、本明細書において単に「コンドロイチナーゼ」といった場合には、これら両方の意味を包含する。
【００１２】
本発明促進剤に用いるコンドロイチナーゼとして、コンドロイチナーゼＡＢＣを用いることが極めて好ましい。また、コンドロイチナーゼＡＢＣの中でも、特に、Proteus vulgaris由来のコンドロイチナーゼＡＢＣを用いることが好ましい。
【００１３】
ここでコンドロイチナーゼの由来とは、当該コンドロイチナーゼをコードする遺伝子を元来保有する生物を起源とすることをいう。従って、例えばProteus vulgaris由来のコンドロイチナーゼＡＢＣとは、Proteus vulgarisが元来保有する遺伝子によって産生されるコンドロイチナーゼＡＢＣを意味する。よって、Proteus vulgaris由来のコンドロイチナーゼＡＢＣには、Proteus vulgaris自体により産生されるものはもちろん、Proteus vulgarisから取得されたコンドロイチナーゼＡＢＣ遺伝子を利用して他の細胞で産生させたもの等も含まれる。
【００１４】
本発明促進剤に用いるコンドロイチナーゼの純度は特に限定されず、使用の目的等に応じて適宜選択することができる。例えば、本発明促進剤を後述の「本発明医薬」とする場合には、用いるコンドロイチナーゼは、医薬として使用できる程度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まない酵素であることが好ましい。
【００１５】
例えば本発明促進剤に用いるコンドロイチナーゼは、300U/mg蛋白以上の比活性を有する精製されたコンドロイチナーゼであることが好ましく、300U/mg蛋白以上の比活性を有し、エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量が検出限界以下である精製されたコンドロイチナーゼがより好ましく、このような特性をもつ精製されたコンドロイチナーゼＡＢＣが特に好ましい。
【００１６】
なお、本明細書においてコンドロイチナーゼの１Ｕ(単位)は、至適ｐＨ及び至適温度付近の条件において、ＣＳから１分間に１マイクロモルの反応生成物を遊離させる酵素量である。念のため、以下に各種コンドロイチナーゼの１Ｕの定義を示す。
【００１７】
コンドロイチナーゼＡＢＣの１Ｕとは、pH8.0、37℃で１分間にコンドロイチン 6-硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。またコンドロイチナーゼＡＣ(Flavobacterium heparinum由来)の１Ｕとは、pH7.3、37℃で１分間にコンドロイチン 6-硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。
【００１８】
また、コンドロイチナーゼＡＣII(Arthrobacter aurescens由来)の１Ｕとは、pH6.0、37℃で１分間にコンドロイチン 6-硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。
【００１９】
また、コンドロイチナーゼＢ(Flavobacterium heparinum由来)の１Ｕとは、pH8.0、30℃で１分間にデルマタン硫酸から１マイクロモルのヘキスロン酸残基に相当するUV吸収物質を遊離させる酵素量と定義される。
【００２０】
例えば、比活性が300U/mg蛋白以上であるコンドロイチナーゼＡＢＣを使用することにより、本発明促進剤を本発明医薬（後述）として生体内に投与した際にも目的部位のプロテオグリカン（ＣＳやＨＡを含む）を効率的に分解することができ、かつ、コラゲナーゼ産生を効果的に促進することができる。このようなコンドロイチナーゼＡＢＣは、例えば、特開平６−１５３９４７号公報に記載の方法で得ることができる。
【００２１】
＜２＞本発明促進剤の形態等
本発明促進剤は、上記のようなコンドロイチナーゼを、コラゲナーゼの産生を促進するために有効な量含有する。ここで「コラゲナーゼの産生を促進するために有効な量」とは、コラゲナーゼの産生の促進を検知可能な程度とすることができる量を意味する。この量は、用いるコンドロイチナーゼの種類、コラゲナーゼの産生を企図する細胞や組織等（以下、単に「組織等」という）の種類や状態、組織等が由来する哺乳動物の種類や症状等によっても異なるものであり、当業者が適宜決定することができるが、例えばコンドロイチナーゼとしてコンドロイチナーゼＡＢＣを用い、健常なウサギから摘出した椎間板組織においてコラゲナーゼの産生を促進せしめる場合には、当該組織を０．０１〜１０００Ｕ/ｍｌ程度の酵素溶液に接触させることによって、コラゲナーゼの産生を促進することができる。
【００２２】
例えば、１回の投与に用いられる本発明促進剤中のコンドロイチナーゼＡＢＣの含量としては５Ｕ以上が例示され、５〜４００Ｕ程度がより好ましく、５〜２００Ｕ程度がさらに好ましい。
【００２３】
本発明促進剤は、コンドロイチナーゼ以外に、さらに医薬的あるいは試薬的に許容される担体を含有していてもよい。
このような担体としては、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤等、通常医薬あるいは試薬に用いられる成分が例示され、使用の目的や、本発明促進剤の形態（剤型等）に応じて適宜選択することができる。例えば本発明促進剤は、溶液状態、凍結状態、乾燥形態のいずれの形態であってもよいが、保存安定性等の面では乾燥形態、特に凍結乾燥形態が好ましい。
【００２４】
本発明促進剤中に含有させることができる担体としては、特開平１１−２３６３３６号公報に記載されているものを採用することが好ましい。本発明促進剤の調製は、コンドロイチナーゼと所望の担体を用い、製剤学的に公知の方法により行なうことができる。
【００２５】
＜３＞本発明促進剤の使用方法等
本発明促進剤は、組織等のコラゲナーゼの産生促進を目的として使用することができる。かかる使用目的が意図される限りにおいて、本発明促進剤の具体的な用途は限定されず、試薬用途・医薬用途のいずれにも使用することができる。また具体的な用途に応じて、使用方法等を適宜決定することができる。
【００２６】
試薬用途として使用する場合には、例えば、生体から分離された組織等に本発明促進剤を接触させ、コラゲナーゼの産生を促進せしめることができる。また医薬用途として使用する場合については、後述の「本発明医薬」において詳細に説明する。
【００２７】
＜４＞本発明医薬
本発明医薬は本発明促進剤からなる医薬であり、本発明促進剤を医薬用途に応用したものである。本発明医薬は、本発明促進剤の医薬用途への使用が意図される限りにおいて、その具体的な使用方法等も限定されず、具体的な目的に応じて適宜決定することができる。
【００２８】
本明細書中で「医薬」とは、医療に用いられる薬品を意味する。従って、医療に用いられる薬品である限りにおいては、名称の如何にかかわらず、ここでいう「医薬」に包含される。
【００２９】
本発明医薬は、コラゲナーゼの産生の促進が望まれる組織等に投与することにより、本発明医薬に含有されるコンドロイチナーゼの作用が発揮され、当該組織及び周辺組織のコラゲナーゼの産生を促進することができる。
【００３０】
本発明医薬は、ヒトを含む哺乳類全般に投与することができるが、ヒトに投与されるものであることが特に好ましい。
本発明医薬が投与される組織等は、コラゲナーゼの産生促進を所望する組織である限りにおいて特に限定されないが、産生されたコラゲナーゼの作用によるコラーゲン等のタンパク質分解が望まれる組織であることが好ましく、産生されたコラゲナーゼの作用によるタンパク質分解に加えてコンドロイチナーゼ本来の作用によるＣＳ及び/又はＨＡの分解が望まれる組織であることが好ましい。
【００３１】
このような組織等として好ましいのは、椎間板ヘルニアに罹患した哺乳動物の椎間板組織、あるいは硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアに罹患した哺乳動物の脊髄硬膜外腔である。従って本発明医薬は、椎間板又は脊髄硬膜外腔投与用とすることが好ましい。
【００３２】
本発明医薬をこのような椎間板組織等に投与することにより、コンドロイチナーゼ本来の作用によって髄核中のＣＳやＨＡが分解され、髄核中のＣＳ量、ＨＡ量及びこれらによって保持されていた水分量が減少し、その結果として髄核自体の体積を減ずることができるのみならず、コンドロイチナーゼによって産生が促進されたコラゲナーゼの作用によって髄核自体やその周辺部位のコラーゲン等のタンパク質の分解を促進することができることから、髄核自体の体積をさらに減ずることができ、加えて髄核が納まるスペースをも増加させることができる。この結果、突出した髄核による神経への刺激を速やかに除去することができ、腰痛等の椎間板ヘルニアの諸症状を効果的に改善することができる。
尚、後記実施例に示した結果では、コンドロイチナーゼＡＢＣの投与によるコラゲナーゼ産生促進は、髄核組織よりも線維輪組織において顕著であったが、髄核にコンドロイチナーゼを投与した場合であっても、コンドロイチナーゼは線維輪にも拡散し、線維輪内でコラゲナーゼ産生が促進され、この産生されたコラゲナーゼが髄核にも拡散して、髄核の融解が促進されると考えられる。
【００３３】
従って本発明医薬は、椎間板ヘルニアの処置（症状の改善、悪化防止、治療等）のために用いられるものであることが好ましい。
また本発明医薬はコラゲナーゼの産生を促進することから、線維症等のコラーゲン増加に起因する疾患の処置にも用いることができる。
【００３４】
このような本発明医薬は、コンドロイチナーゼを含有する注射用製剤として主に使用される。本発明医薬を溶液状態の注射用製剤として提供する場合には、溶液状態の本発明医薬を、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させあるいは保存し、注射剤として投与に供することができる。また凍結状態の注射用製剤として提供する場合には、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器中に凍結状態の本発明医薬を密封状態で保持させて、流通させあるいは保存し、投与前に融解させて注射剤として投与に供することができる。また、本発明医薬を乾燥形態の注射用製剤として提供する場合には、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器中に乾燥状態の本発明医薬を密封状態で保持させて、流通させあるいは保存し、投与前に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液又はソルビトール水溶液等で溶解し、注射剤として投与に供することができる。乾燥形態の本発明医薬は、溶解用の溶媒とセットで提供してもよい。このような種々の形態の注射用製剤の中でも、乾燥形態、特に凍結乾燥形態のものが好ましい。すなわち、本発明医薬は注射用凍結乾燥製剤の形態であることが特に好ましい。
【００３５】
本発明医薬の投与量は、用いるコンドロイチナーゼの種類、投与される哺乳動物の種類や症状等、投与対象となる組織等の種類やその状態等によって個別に設定されるべきものであり、特に限定されないが、例えばコンドロイチナーゼとしてコンドロイチナーゼＡＢＣを用い、成人の椎間板ヘルニア症患者の椎間板１箇所に投与する場合、１回あたりコンドロイチナーゼＡＢＣの量として概ね０．１〜２００Ｕ程度、好ましくは０．５〜１００Ｕ程度、特に好ましくは０．５〜  ５０Ｕ程度を投与することができる。
【００３６】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。
【００３７】
以下の実施例では、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の一種であるゼラチナーゼ（MMP-2、MMP-9）及びコラゲナーゼの産生に対するコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｃ−ＡＢＣ）の効果を、インビトロで検討した。
【００３８】
Ｃ−ＡＢＣがインビボで椎間板内注射されると、椎間板細胞は、周囲のマトリックス内でのＣＳの分解という変化によって活性化されることが知られている（Clin Orthop, 253, 301-308(1990)）。以下の実施例では、培養組織中の細胞を活性化してよりインビボに近い細胞状態を再現するための刺激剤として、ＩＬ−１を用いた。
【００３９】
＜１＞椎間板組織の培養
（１）組織の調製
新鮮な線維輪及び髄核を、６匹の雌の日本白ウサギ（３．８〜４．４Ｋｇ）の腰椎椎間板（Ｌ１−Ｌ２及びＬ５−Ｌ６間）から切開して得た。各ウサギから得た椎間板組織は、異なる群に割り当てた。各群それぞれ６つの線維輪又は髄核を用いた。２５ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸及び１０％のウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（日水製薬、東京、日本）を、完全培地として用いた。各組織を生理的食塩水で洗浄し、完全培地（線維輪：２ｍｌ、髄核：１ｍｌ）で満たされたカルチャープレート（線維輪：１２ウェルプレート、髄核：２４ウェルプレート）の各ウェルに入れた。
【００４０】
（２）培養手順
用意された組織は、３７℃で５％ ＣＯ2ガス中で、培地を毎日交換する４日間の予備培養及び３日間の連続培養でからなる７日間の培養を行った。高純度精製医薬品グレードのＣ−ＡＢＣ（生化学工業株式会社製；比活性３８０Ｕ／ｍｇ蛋白、エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量は検出限界以下）、及び市販の組み換えヒトインターロイキン−１ｂ（ＩＬ−１ｂ）（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ、米国）を、培地への添加物として使用した。各組織は、１日目は完全培地のみで培養した。以下に示すＣ−ＡＢＣ群及びＩＬ−１＋ＡＢＣ群においては、２〜４日目に２０Ｕ／ｍｌの濃度でＣ−ＡＢＣを添加した。
【００４１】
続いて、各組織をリン酸緩衝生理食塩水及び上記血清フリー培地ですすいだ。培地を各々、何も含まない（コントロール群）、２０Ｕ／ｍｌ濃度のＣ−ＡＢＣを含む（Ｃ−ＡＢＣ群）、１０ｎｇ／ｍｌ濃度のＩＬ−１を含む（ＩＬ−１群）、又は１０ｎｇ／ｍｌ濃度のＩＬ−１及び２０Ｕ／ｍｌ濃度のＣ−ＡＢＣを含む（ＩＬ−１＋Ｃ−ＡＢＣ群）無血清培地に交換した。さらに、各組織を７２時間培養した後、培地及び組織を採収した。
【００４２】
＜２＞採収した組織の乾燥重量の統計学的分析
採収した組織を凍結乾燥し、乾燥重量を測定した。ダンネットの多重比較検定（Dunnett's multiple comparison test）を用いて、コントロール群及び他の群との間の統計学的分析を行った。
【００４３】
結果を表１に示す。各群間で統計学的な有意差はなかった。したがって、コラゲナーゼの値を乾燥重量によって標準化して差し支えない。
【００４４】
【表１】
0004778629.tif 000002
【００４５】
＜３＞マトリックスメタロプロテイナーゼの検出
（１）培地中のゼラチナーゼの検出
ゼラチナーゼは、ザイモグラフィー法を用いて、以下のように検出した。培地の一部を用いて、０．１％のゼラチンを含むポリアクリルアミドゲルを用いて非還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動後、ゲルを２．５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００で洗浄し、ＣａＣｌ2及びＺｎＣｌ2を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．５）中で２２時間、３７℃でインキュベートした。その後、ゲルをクマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色し、ゼラチン分解性のバンドを可視化した。スタンダードとして、ヒトのｐｒｏＭＭＰ−２（ＭＭＰ−２の前駆体）及びｐｒｏＭＭＰ−９（ＭＭＰ−９の前駆体）（ノヴァス  モレキュラー、サンディエゴ、カリフォルニア、米国）を、同じゲルの１レーンに添加した。
【００４６】
結果を図１に示す。線維輪については、いずれの群においても同程度ｐｒｏＭＭＰ−２（６６ｋＤａ）の産生が見られた。ＩＬ−１は高分子量のゼラチン分解性の産物（１０７ｋＤａ、上部矢印）を誘導した（ＩＬ−１群）。しかしながら、Ｃ−ＡＢＣではその誘導は見られず、低分子量のゼラチン分解性の産物（５６ｋＤａ、下部矢印）を誘導した（ＩＬ−１＋Ｃ−ＡＢＣ群）。高分子量及び低分子量のゼラチン分解性のバンドが何であるかは不明であるが、後者はＭＭＰ−１及びＭＭＰ−３の可能性がある（Dev Biol, 147, 425-439(1991); J Clin Invest, 92, 179-185(1993)）。髄核においては、Ｃ−ＡＢＣは単独でｐｒｏＭＭＰ−２を若干誘導した（Ｃ−ＡＢＣ群）。しかしながら、ＩＬ−１は、Ｃ−ＡＢＣの存在下又は非存在下で、ｐｒｏＭＭＰ−２産生を減少させた（ＩＬ−１群及びＩＬ−１＋Ｃ−ＡＢＣ群）。ｐｒｏＭＭＰ−９（８８ｋＤａ）は、両組織のどの群でも若干検出されるだけであった。
【００４７】
還元条件下で９８又は１００ｋＤａに泳動するＣ−ＡＢＣに相当するバンド（J Biol Chem, 272, 9123-9130(1997); Carbohydr Res, 255, 145-163(1994)）は、Ｃ−ＡＢＣ群及びＩＬ−１＋Ｃ−ＡＢＣ群において、９４ｋＤａの分子量の位置に観察された。これらのゼラチン分解活性の産生は、各グループの他の３つの組織から得られた培地を用いた場合にも、再現性よく観察された。
【００４８】
また、線維輪におけるＣ−ＡＢＣを伴うＩＬ−１刺激下でのゼラチン分解プロファイルは、ＩＬ−１単独によるＩＬ−１刺激下でのプロファイルとは明らかに異なる。したがって、Ｃ−ＡＢＣ処理は、線維輪のマトリックスにおける浸透性に関連したＩＬ−１効果を単に促進するものではないと考えられる。
【００４９】
（２）培地中のコラゲナーゼ活性の検定
椎間板によるＭＭＰ産生に対するＣ−ＡＢＣの効果をさらに検討するために、培地中のコラゲナーゼ活性を検定した。
【００５０】
コラゲナーゼの検定は、アイソトープ標識基質の代わりにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識Ｉ型コラーゲン（ヤガイ、山形、日本）を用いて、以前に報告されている方法に準じて行った（Anal. Biochem., 99, 340-345(1979)）。ＦＩＴＣ標識コラーゲンを、潜在的な酵素前駆体の活性化処理を行った培地、及びＣａＣｌ2とＺｎＣｌ2を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．５）で２０時間、３７℃でインキュベートした。反応を、ｏ−フェナンスロリンで停止し、反応液の上清の蛍光強度をマイクロプレートフルオロメーター（Fluoroskan II、ラボシステムズ、ヘルシンキ、フィンランド）を用い、９６−ブラックウェルマイクロプレートで測定した。培地中のコラゲナーゼ活性は、市販のＭＭＰ−１（ヤガイ）を用いて作成した標準曲線から検量した。
【００５１】
結果を図２に示す。なお、図２中の＊は、ＩＬ−１群に対してｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−検定）で有意差があることを示す。線維輪において、Ｃ−ＡＢＣ及びＩＬ−１は、それぞれコラゲナーゼ産生を若干増加させた（ＩＬ−１群及びＣ−ＡＢＣ群）。さらに、ＩＬ−１＋Ｃ−ＡＢＣ群は、コラゲナーゼ産生を顕著に増加させ、それはＩＬ−１群よりも有意に高かった。髄核においては、各群におけるコラゲナーゼ産生のプロファイルは、ｐｒｏＭＭＰ−２（図１）のプロファイルに似た傾向を示した。すなわち、ＩＬ−１は、Ｃ−ＡＢＣの存在下又は非存在下でコラゲナーゼ産生を減少させた（ＩＬ−１群及びＩＬ−１＋Ｃ−ＡＢＣ群）。
【００５２】
（３）結果
以上のように、Ｃ−ＡＢＣがＭＭＰの一種であるコラゲナーゼの産生を有意に促進させることが明らかにされた。産生されたＭＭＰにより、Ｃ−ＡＢＣが、コラーゲンを間接的に分解することが示唆された。
【００５３】
【発明の効果】
本発明により、コラゲナーゼ産生促進剤が提供される。本発明のコラゲナーゼ産生促進剤は、試薬として、又は椎間板若しくは脊髄硬膜外腔投与用の医薬、具体的には例えば椎間板ヘルニアの処置用の医薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ウサギ椎間板の線維輪組織（上）及び髄核組織（下）の培養後の培地のザイモグラフィー分析を示す図である。
【図２】  線維輪及び髄核による培地中へのコラゲナーゼ産生を示す図である。
【図１】
0004778629.tif 000003
【図２】
0004778629.tif 000004