(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物病害に対する防除能を有する乳酸菌を含有する植物病害防除剤であって、前記乳酸菌が、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６５菌株、及びラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＮＩＴＥ ＢＰ−１０８菌株からなる群から選択された少なくとも一種の微生物であることを特徴とする植物病害防除剤。
【請求項２】
植物病害に対する防除能を有する乳酸菌で植物及び／又は土壌を処理する植物病害防除方法であって、前記乳酸菌が、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６５菌株、及びラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＮＩＴＥ ＢＰ−１０８菌株からなる群から選択された少なくとも一種の微生物であることを特徴とする植物病害防除方法。
【請求項３】
ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６５菌株、及びラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＮＩＴＥ ＢＰ−１０８菌株からなる群から選択された少なくとも一種の乳酸菌で、植物及び／又は土壌を処理する発芽改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物病害防除剤および防除方法に関し、より詳細には、人の健康に対しても有用とされている乳酸菌を用いて農作物の病害を抑制することができる植物病害の防除剤および防除方法に関するものである。本発明はまた、特定の乳酸菌を用いた植物及び／又は土壌の処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化学合成農薬では防除が困難な植物病害に対して、有用微生物を用いた防除である生物防除の適用が検討されている。また、環境への負荷に配慮した農法、即ち環境保全型農業の推進が強く求められており、化学合成農薬の使用を抑える目的で、有用微生物による生物防除が積極的に検討されている。【０００３】
例えば、下記特許文献１〜３には、シュードモナス属（Pseudomonas）に属する微生物を用いた植物病害の防除技術が提案されている。また、下記特許文献４には、土壌病害の原因微生物に対して拮抗性を有する放線菌と、粘性物質を生産する微生物とを併用して、植物病害を防除する技術が提案されている。また、下記特許文献５には、クラドスポリウム属（Cladsporium）に属する微生物と、バチルス属（Bacillus）に属する微生物を併用して、植物病害を防除する技術が提案されている。
【特許文献１】日本国特許第３４３１９２６号公報（特開平５−９１６号公報）
【特許文献２】日本国特許第２５３３８２８号公報（特開平６−９３２５号公報）
【特許文献３】日本国特許第３１３５７０８号公報（特開平６−１０７５１１号公報）
【特許文献４】日本国特開２００３−２７７２１２号公報
【特許文献５】日本国特開２００３−３００８０３号公報
【特許文献６】日本国特開平１０−１６４９８７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
植物病害防除を目的として用いる微生物については、その防除効果を表示して販売する場合には、農薬取締法上、農薬登録を行なう必要がある。農薬登録においては、植物病害に対する防除効果以外に、人や動植物、自然環境に対する影響評価等の安全性審査が必須となっており、その審査に合格した微生物だけが農薬として登録され、販売することが可能となる。【０００５】
また、消費者の「食品」の安全性への関心が高まる中、食品中の微生物についても関心が向けられており、有用微生物を利用した病害防除を行なった農作物についても、その点に配慮することが重要な課題である。【０００６】
一方、消費者の「健康」に対する意識の高まりから、身体に対して有効な機能性成分や、その成分を含んだ食品などが人気を集めている。その中で、整腸作用やがん抑制作用などの効果があるとされる乳酸菌にも関心が高まっている。【０００７】
そこで、人の健康に対して有用とされている乳酸菌を用いて農作物の病害を防除することができれば、農薬登録での安全性審査上の問題を生じることなく、消費者の安全性に対する懸念も払拭され、更に農作物の機能性や商品性を向上させることになるため、理想的な病害防除となる。【０００８】
本発明は、以上に鑑みてなされたものであり、人の健康にも有益とされる乳酸菌を用いることにより、安全・安心で安定した農作物生産を可能とする植物病害の防除剤および防除方法を提供することを目的とする。【０００９】
なお、上記特許文献６には、種子の段階から出荷可能な段階に至る栽培過程において栽培環境を人工的に制御可能な植物の栽培方法（例えば、水耕栽培）において、植物を洗浄した後、人体に対して無害である微生物として乳酸菌を植物表面に定着させ、乳酸菌により植物表面を被覆することにより、雑菌や病原菌の浸入および繁殖を抑制するという植物の栽培技術が提案されている。しかしながら、この技術は、バイオプリザベーションと称される食品保存技術に関するものであり、用いられている乳酸菌は、かいわれ大根などの植物が人に対して害のある菌（大腸菌など）によって汚染されないようにするためのものである。そのため、無数の微生物が存在する環境下である圃場での栽培を主として、植物自体の病害である植物病害を防除するために乳酸菌を用いている本発明とは明らかに相違する技術である。【００１０】
また、上記特許文献４には、ラクトバチルス属（Lactbacillus）に属する微生物を使用することが開示されているが、この微生物は、それ自身が植物病害に対する防除能を持つ菌としてではなく、拮抗菌である放線菌とともに併用する粘性物質を生産する微生物として記載されているにすぎない。そのため、同文献は、乳酸菌が土壌病害などの植物病害の防除効果を有することを示唆するものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、人の健康に対して有用とされている乳酸菌を用いて農作物の植物病害を防除できることを見い出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は、植物病害に対する防除能を有する乳酸菌を含有していることを特徴とする植物病害防除剤に係るものである。本発明はまた、植物病害に対する防除能を有する乳酸菌で植物及び／又は土壌を処理することを特徴とする植物病害防除方法に係るものである。本発明では、上記乳酸菌として、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６５菌株、及びラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＮＩＴＥ ＢＰ−１０８菌株からなる群から選択された少なくとも一種の乳酸菌を用いる。
【００１３】
本発明は更に、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６５菌株、及びラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＮＩＴＥ ＢＰ−１０８菌株からなる群から選択された少なくとも一種の乳酸菌で、植物及び／又は土壌を処理する発芽改善方法に係るものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、乳酸菌を用いて農作物の植物病害を防除するものであるため、高い安全性を確保しながら、安定した農作物生産を可能とすることができる。また、乳酸菌で処理したことにより、それらが農作物に高密度に共生した場合には、整腸作用やガン抑制作用などの機能性を農作物に付与できる可能性もあり、農作物の商品性を高めることも可能となる。【００１５】
また、上記ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６５菌株及びＮＩＴＥ ＢＰ−１０８菌株には、植物病害に対する防除効果とともに、環境ストレス条件下での種子の発芽率向上効果がある。そのため、これら微生物を用いた上記処理方法は、植物病害防除方法としてだけでなく、発芽改善方法としても利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明について詳細に説明する。【００１７】
本発明において植物病害を防除するために用いる乳酸菌は、植物が病原微生物に感染するのを防御する能力、即ち植物病害に対する防除能を有するものであれば、特に限定されない。かかる病害防除能としては、抗生作用、競合作用および抵抗性誘導作用のいずれの作用によるものでもよく、またこれらのいずれか２以上の作用の組み合わせによるものでもよい。ここで、抗生作用とは、乳酸菌が抗生物質を生産し、それによって病原微生物を抑制する作用であり、拮抗性ともいう。また、競合作用とは、乳酸菌が病原微生物との間で空間あるいは栄養分を取り合い、乳酸菌の生育が盛んで先に空間を占有しあるいは栄養分を先取して、病原微生物を抑制する作用である。さらに、抵抗性誘導作用とは、乳酸菌が植物に作用して生産させる物質によって、病原微生物の感染や増殖を抑制する作用である。【００１８】
本発明において、乳酸菌とは、（１）グラム陽性、（２）細胞形態が桿菌または球菌、（３）カタラーゼ陰性、（４）消費したブドウ糖に対して５０％以上の乳酸を産生する、（５）内性胞子形成しない、及び、（６）非運動性または稀に運動性を示すものがある、という条件を満たすものをいう。【００２０】
具体的には、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）に属するＫＭＣ０５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６５菌株）、およびラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に属するＳＨＨ１５株（ＮＩＴＥ ＢＰ−１０８菌株）が、後記実施例に示されるように植物病害の防除効果にとりわけ優れることから、本発明では、上記乳酸菌として、これらの少なくとも一種を用いる。
【００２１】
また、これらＫＭＣ０５株、ＳＨＨ１５株であると、後記実施例に示されているように環境ストレス条件下での種子の発芽率向上が得られることから、植物病害の防除効果と相俟って、種子の健全で安定した発芽および生育に寄与することができる。そのため、該微生物は、植物病害防除方法に対してだけでなく、発芽改善方法にも利用することができる。発芽改善方法として利用される場合、該微生物は、種子に対して処理され、あるいはまた、播種前又は播種後の土壌に対して処理される。【００２２】
本発明で防除の対象とする植物病害は特に限定されず、土壌病害を始めとする各種植物病害の防除に適用することができる。例えば、ホウレンソウなどのアカザ科作物、イネ、トウモロコシなどのイネ科作物、サトイモ、カラー、ポトスなどのサトイモ科作物、ネギ、タマネギ、チューリップ、ユリなどのユリ科作物、キャベツ、ハクサイ、ダイコン、ストック、ハボタンなどのアブラナ科作物、イチゴ、ウメ、モモ、リンゴなどのバラ科作物、ダイズ、アズキなどのマメ科作物、ニンジン、パセリなどのセリ科作物、トウガラシ、ナス、トマト、ジャガイモ、ペチュニアなどのナス科作物、キュウリ、スイカ、カボチャなどのウリ科作物、ゴボウ、レタス、キク、コスモス、ヒマワリなどのキク科作物、グラジオラスなどのアヤメ科作物、スターチスなどのイソマツ科作物、セントポーリアなどのイワタバコ科作物、キンギョソウ、トレニアなどのゴマノハグサ科作物、カーネーション、カスミソウなどのナデシコ科作物、アサガオなどのヒルガオ科作物、スイセンなどのヒガンバナ科作物、カトレア、シンビジウムなどのラン科作物、カキなどのカキノキ科作物、イチジクなどのクワ科作物、ブドウなどのブドウ科作物、クリなどのブナ科作物、温州ミカン、レモンなどのミカン科作物、キウイフルーツなどのマタタビ科作物などに生じる萎凋病、立枯病、株腐病、半身萎凋病、黒斑病、根こぶ病、疫病、白さび病、べと病、さび病、紫紋羽病、白絹病、うどんこ病、炭そ病、灰色かび病、いもち病、軟腐病、青枯病、黒腐病、かいよう病、斑点細菌病、根頭がん腫病、そうか病などが挙げられる。【００２３】
また、病原微生物としては、フザリウム属（Fusarium）、ピシウム属（Phytium）、リゾクトニア属（Rhizoctonia）、バーティシリウム属（Verticillium）、アルタナリア属（Alternaria）、プラズモディオフォラ属（plasmodiophora）、フィトフィトラ属（Phytophthora）、アルブゴ属（Albugo）、ペロノスポーラ属（Peronospora）、プクシニア属（Puccinia）、ヘリコバシディウム属（Hericobasidium）、スクレロティウム属（Sclerotium）、スフェロテカ属（Sphaerotheca）、コレトトリカム属（Colletotrichum）、ボトリチス（Botrytis）、ピリクラリア属（Pyricularia）などの糸状菌や、エルヴィニア属（Erwinia）、ラルストニア属（Ralstonia）、キサントモナス属（Xanthomonas）、クラビバクター属（Clavibacter）、シュードモナス属（Pseudomonas）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）などの細菌、ストレプトミセス属（Streptomyces）などの放線菌が挙げられる。【００２４】
本発明の植物病害防除剤は、上記乳酸菌を含有するものであり、その形態は通常の農薬がとりうる形態、例えば粒剤、粉剤、水和剤、乳剤など特に限定されない。例として、上記乳酸菌を製剤学的に許容される担体に吸着させて粉剤または粒剤として提供することができ、その場合、担体としては、珪藻土、クレー、タルク、パーライト、もみ殻、骨粉などを用いることができる。【００２５】
本発明の植物病害防除方法は、上記乳酸菌を植物や土壌に処理するというものであり、その処理方法は特に限定されない。例えば、次の方法が挙げられる。【００２６】
（１）上記乳酸菌の培養液などの乳酸菌が分散した液体を植物に処理する方法。これには、かかる乳酸菌の分散液を種子に噴霧したり、該分散液に種子を浸漬するなどして、種子に対して処理することが含まれる。また、該分散液に定植前の苗の根部を浸漬すること、該分散液を葉や茎などに穿刺接種することなども含まれる。【００２７】
（２）上記乳酸菌の分散液を土壌に処理する方法。これには、該分散液を播種用培土や育苗用培土、圃場などに噴霧したり、灌注することが含まれ、その場合、植物の定植前や種子の播種前の土壌に処理してもよく、定植後や播種後の土壌に処理してもよい。【００２８】
（３）上記乳酸菌をそれ自体粉末化し、又は担体に付着させて調製した粉末又は粒状の防除剤を、植物に処理する方法。これには、かかる粉末又は粒状の防除剤を種子表面に付着させたり、又は種子と混合して播種するなどして、種子に対して処理することが含まれる。【００２９】
（４）上記粉末状又は粒状の防除剤を土壌に処理する方法。これには、該粉末又は粒状の防除剤を、上記した各種培土や圃場の土に混ぜ込んだり、あるいは圃場の土の上にふりかけたりすることが含まれる。
【実施例】
【００３０】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。【００３１】
（実施例１：ホウレンソウ萎凋病の防除効果）
ホウレンソウの植物病害を乳酸菌を用いて防除する技術を確立することを目的として、ホウレンソウの土壌病害の１つである萎凋病の発病を抑制する乳酸菌を以下のようにして選抜した。【００３２】
まず、発酵乳や発酵食品などから分離した主として乳酸菌であると推測される１４９菌株の細菌を供試して、一次選抜を実施した。一次選抜では、各細菌をＭＲＳ液体培地８ｍｌで３７℃、３日間静置培養した後、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を滅菌水で３回洗浄した後、滅菌水で１０９ｃｆｕ／ｍｌに調製した懸濁液に、該懸濁液と等量のホウレンソウ種子（品種：おかめ）を２３℃で２４時間浸漬処理した。次いで、市販の培土を詰めた直径１０．５ｃｍのビニルポットに、浸漬処理した種子を１０粒／１ポットで６ポットに播種し、２０℃に保った温室内で育成した。播種１０日後に、萎凋病菌密度が土壌１ｇ当たり５×１０３ｃｆｕ（コロニー形成単位）になるように、各ポットに対して萎凋病菌（フザリウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）Ｈｏ４株）を潅注接種し、３０℃の温室で３０日間育成した後、発病株数を調査した。なお、対照区には、細菌の懸濁液に代えて、滅菌蒸留水に浸漬処理した種子を用いた。各細菌について、防除価を下記式より算出し、防除価が４０以上である１５菌株を、植物病害防除能を有する乳酸菌として選抜した。防除価と菌株数との関係は下記表１の通りであった。【００３３】
防除価＝（１−各処理区の発病株率／対照区の発病株率）×100
【表１】
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【００３４】
一次選抜で選抜した１５菌株について二次選抜を実施した。二次選抜では、一次選抜と同様の方法で細菌懸濁液に浸漬処理したホウレンソウ種子を、萎凋病菌密度が土壌１ｇ当たり１×１０４ｃｆｕに調整した土壌を充填した直径１５．０ｃｍビニルポットに１５粒／１ポットで４ポットに播種し、播種後１０日間は２０℃に保った温室内で育成し、その後３０日間は３０℃の温室で栽培して、播種４０日後に発病株数を調査した。その結果、ホウレンソウ萎凋病に対して有効な乳酸菌として８菌株が選抜され、その中で特に萎凋病の発病抑制効果に優れる細菌ＫＭＣ０５株を選抜した。ＫＭＣ０５株の発病株数と防除価は下記表２の通りであった。
【表２】
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【００３５】
ＫＭＣ０５株の分類学的性状は下記表３に示す通りである。
【表３】
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【００３６】
表３より、ＫＭＣ０５株は、ペディオコッカス属またはラクトコッカス属に属する菌株と推定され、更に１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析の結果、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）に帰属する菌株であると同定された。【００３７】
ＫＭＣ０５株は、京都府の一機関である京都府農業資源研究センター（所長：並木 隆和、あて名：郵便番号６１９−０２４４ 日本国京都府相楽郡精華町大字北稲八間小字大路７４番地）の名称で、次の通り寄託されている。  
・寄託機関の名称：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター、
・寄託機関のあて名：郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６、
・寄託日：２００４年６月１８日（国内受託日）
・受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３６５（２００４年６月１８日に国内寄託されたＦＥＲＭ  Ｐ−２００９１から２００５年７月１日に国際寄託された。）。【００３８】
なお、上記二次選抜においてＫＭＣ０５株とともに選抜された他の有望な乳酸菌は下記表４の通りであり、それぞれ防除価とともに分離源を示す。
【表４】
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【００３９】
（実施例２：ホウレンソウ立枯病の防除効果）
ホウレンソウ萎凋病の発病を抑制する細菌として選抜した乳酸菌ＫＭＣ０５株が、ホウレンソウの他の土壌病害である立枯病に対して防除効果を有しているかを確認した。【００４０】
立枯病菌（ピシウム・ウルチマム（Pythium ultimum）ＯＰＵ４０７株（大阪府立大学から分譲））を使用し、これをホウレンソウ種子１ｇと蒸留水５ｍｌで作成した培地２本で２２℃、２週間培養した。その菌体を少量の滅菌土壌で磨砕した後、滅菌土壌で１００ｇにして、汚染源を作製した。得られた汚染源を滅菌土壌で２００倍と３００倍に希釈し、直径１０．５ｃｍのビニルポットに詰めて汚染土とした。【００４１】
ＫＭＣ０５株について、ＭＲＳ液体培地８ｍｌで３７℃、３日間培養した後、遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を滅菌水で３回洗浄した後、滅菌水で１０９ｃｆｕ／ｍｌに調製した懸濁液に、該懸濁液と等量のホウレンソウ種子（品種：おかめ）を２３℃で２４時間浸漬処理した。次いで、浸漬処理した種子を、上記した２００倍希釈と３００倍希釈の各汚染土に対し、それぞれ１０粒／１ポットで１２ポットに播種し、最低温度を２０℃に保った温室内で育成した。播種６日後に発芽調査を行い、播種２０日後に立枯れ調査を実施し、発芽した株に対する立ち枯れした株の割合を示す立枯株率を求めた。なお、対照区には、ＫＭＣ０５株の懸濁液に代えて、滅菌蒸留水に浸漬処理した種子を用いた。
【表５】
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【００４２】
結果は、表５に示す通りであり、ＫＭＣ０５株で処理することにより、発芽前の土壌中での種子腐敗が減少し、健全な状態で発芽する株が増加した。また、発芽した株についても立ち枯れを起こす株の割合が減少した。【００４３】
（実施例３：土壌水分過剰条件でのホウレンソウ種子の発芽率向上）
上記乳酸菌ＫＭＣ０５株が環境ストレス条件下での農作物の種子の発芽を促す効果を持っているかを確認するために、ＫＭＣ０５株をＭＲＳ液体培地８ｍｌで３７℃、３日間培養した後、遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を滅菌水で３回洗浄した後、滅菌水で１０９ｃｆｕ／ｍｌに調製した懸濁液に、該懸濁液と等量のホウレンソウ種子（品種：おかめ）を２３℃で２４時間浸漬処理した。次いで、浸漬処理した種子を、６００ｍｌ容のプラスチックカップに１０粒／１ポットで１０ポットに播種し、２３℃に保った恒温器内で育成した。育成に際しては、土壌水分が最大容水量の１１０％、１２０％、１３０％量になるように潅水し、水分過剰な状態にした。播種７日後に発芽調査を実施した。なお、対照区には、ＫＭＣ０５株の懸濁液に代えて、滅菌蒸留水に浸漬処理した種子を用いた。
【表６】
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【００４４】
結果は表６に示す通りであり、ＫＭＣ０５株で処理することにより、環境ストレス条件下でのホウレンソウ種子の発芽率を向上させることができた。このことから、ＫＭＣ０５株を用いて処理した場合、植物病害に対する防除効果を持つだけでなく、環境ストレス条件下での種子の発芽率を向上して、発芽安定効果を付与することができる。【００４５】
（実施例４：トウガラシ疫病に対する防除効果）
上記乳酸菌ＫＭＣ０５株をＭＲＳ液体培地８ｍｌで３０℃、３日間静置培養した後、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を滅菌水で３回洗浄した後、滅菌水で１０９ｃｆｕ／ｍｌに調製した懸濁液に、該懸濁液と等量のトウガラシ種子（品種：伏見とうがらし）を２３℃で２４時間浸漬処理した。次いで、浸漬処理した種子を市販の培土を詰めたセルトレイに播種し、３０℃で４０日間育成した。【００４６】
Ｖ８液体培地２００ｍｌで疫病菌（フィトフィトラ・カプシシ（Phytophthora capsici）ｐｐｈ株）を２３℃、１０日間培養し、その後、液体培地ごとホモジナイズし、それを滅菌水で１０倍に希釈した。【００４７】
セルトレイで育成した苗を、市販の培土を詰めた直径１０．５ｃｍのビニルポットに移植し、株もとに対し、上記でホモジナイズして得られた疫病菌磨砕液を２０ｍｌ灌注した。なお、対照区には、同様の条件で滅菌水に浸漬処理した種子を用いた。また、それぞれ２４ポット供試した。【００４８】
移植・疫病菌灌注から１ヶ月後に発病を調査した。発病調査は、健全を０、下位葉萎れを１、中位葉萎れを２、上位葉萎れを３、枯死を４として評価し、発病度と防除価を下の式により算出した。【００４９】
発病度＝(0×A＋1×B＋2×C＋3×D＋4×E)／(4×(A＋B＋C＋D＋E))×100
式中のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅは、それぞれ、健全株、下位葉萎れ株、中位葉萎れ株、上位葉萎れ株、枯死株の株数である。【００５０】
防除価＝（１−各処理区の発病度／対照区の発病度）×100【００５１】
【表７】
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【００５２】
結果は、表７に示す通りであり、ＫＭＣ０５株で処理することにより、明らかにトウガラシ疫病の発病抑制効果が認められた。【００５３】
（実施例５：野菜類軟腐病の防除効果）
発酵乳や発酵食品などから分離した主として乳酸菌であると推測される４１０菌株の細菌を供試して、一次選抜を実施した。一次選抜では、各細菌をＭＲＳ液体培地８ｍｌで３０℃、２日間静置培養した後、５０００ｒｐｍで５分間遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を滅菌水で３回洗浄した後、滅菌水で１０９ｃｆｕ／ｍｌに懸濁し、そこに軟腐病菌（エルヴィニア・カルトボーラ（Erwinia carotovora）ＭＡＦＦ３０２８１８株）が１０７ｃｆｕ／ｍｌになるように調整して加えた。直径１ｃｍのキャベツ葉のディスク８枚を上記の懸濁液に２４℃、１時間浸漬処理した後、ディスク表面の水分を取り、９ｃｍ滅菌シャーレに並べ、２８℃２４時間静置した。なお、対照区では、滅菌蒸留水に軟腐病菌が１０７ｃｆｕ／ｍｌになるように調整して加えた液にディスクを浸漬処理した。【００５４】
各ディスクの病徴面積が０％、１〜４９％、５０〜９９％、１００％をそれぞれ発病指数０、１、２、３と評価して次式により発病度及び防除価を算出し、防除価４０以上の２７菌株を、植物病害防除能を有する乳酸菌として選抜した。【００５５】
発病度＝(0×Ａ＋1×Ｂ＋2×Ｃ＋3×Ｄ)／(3×(Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ))×100
式中のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、それぞれ、病斑面積０％、１〜４９％、５０〜９９％、１００％のキャベツ葉のディスク数である。【００５６】
防除価＝（１−各処理区の発病度／対照区の発病度）×100【００５７】
上記で一次選抜した２７菌株について、二次選抜を実施した。二次選抜では、一次選抜と同様の方法で培養し、１０８ｃｆｕ／ｍｌに調整した乳酸菌懸濁液に軟腐病菌が１０７ｃｆｕ／ｍｌになるように調整して加えた液を用いて、一次選抜と同様の方法により、防除価４０以上を示す９菌株を選抜した。【００５８】
次いで、この９菌株について三次選抜を実施した。三次選抜では、一次選抜と同様の方法で培養し、滅菌水で１０９ｃｆｕ／ｍｌに調整した乳酸菌懸濁液に、軟腐病菌が１０７ｃｆｕ／ｍｌになるように調整して加えた。得られた懸濁液に、裁縫針１０本を束にしたものの先を漬け、播種２５日後のハクサイ葉（品種：無双）の中ろく部に穿刺接種した。接種は１株当たり３箇所、各区５株接種した。なお、対照区には、滅菌水に軟腐病菌を同じ濃度になるよう調製した液を用いた。【００５９】
播種１０日後に発病を調査した。発病調査は、接種部位ごとに、健全又は褐変のみを０、病徴１ｃｍ未満を１、病徴１ｃｍ以上を２として評価し、発病度と防除価を下の式により算出した。【００６０】
発病度＝(0×Ａ＋1×Ｂ＋2×Ｃ)／(2×(Ａ＋Ｂ＋Ｃ))×100
式中のＡ、Ｂ、Ｃは、それぞれ、健全又は褐変のみ、病徴１ｃｍ未満、病徴１ｃｍ以上の接種部位数である。【００６１】
防除価＝（１−各処理区の発病度／対照区の発病度）×100【００６２】
その結果、ハクサイ軟腐病に対して有効な乳酸菌として３菌株が選抜され、その中で特に防除効果に優れる細菌ＳＨＨ１５株を選抜した。ＳＨＨ１５株の発病度と防除価は下記表８の通りであった。
【表８】
0004817323.tif 000009
【００６３】
１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析の結果より、ＳＨＨ１５株は、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に帰属する菌株であると同定された。ＳＨＨ１５株は、京都府の一機関である京都府農業資源研究センター（所長：並木 隆和、あて名：郵便番号６１９−０２４４ 日本国京都府相楽郡精華町大字北稲八間小字大路７４番地）の名称で、次の通り寄託されている。  
・寄託機関の名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター、
・寄託機関のあて名：郵便番号２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、
・寄託日：２００５年６月３０日
・受託番号：ＮＩＴＥ ＢＰ−１０８。【００６４】
表８に示すように、ＳＨＨ１５株はハクサイ軟腐病に対する優れた防除効果を有し、これらで処理することにより、ハクサイの軟腐病の発病が明らかに抑制されていた。【００６５】
なお、上記三次選抜でＳＨＨ１５株とともに選抜された他の有望な乳酸菌は下記表９の通りであり、それぞれ防除価とともに分離源を示す。
【表９】
0004817323.tif 000010
【００６６】
（実施例６：土壌水分過剰条件でのホウレンソウ種子の発芽率向上）
上記乳酸菌ＳＨＨ１５株が環境ストレス条件下での農作物の種子の発芽を促す効果を持っているかを確認するために、ＳＨＨ１５株をＭＲＳ液体培地８ｍｌで３０℃、３日間培養した後、遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体を滅菌水で３回洗浄した後、滅菌水で１０９ｃｆｕ／ｍｌに調製した懸濁液に、該懸濁液と等量のホウレンソウ種子（品種：おかめ）を２４℃で２４時間浸漬処理した。次いで、浸漬処理した種子を、６００ｍｌ容のプラスチックカップに１０粒／１ポットで１０ポットに播種し、２５℃に保った恒温器内で育成した。育成に際しては、土壌水分が最大容水量の１２０％量になるように潅水し、水分過剰な状態にした。播種７日後に発芽調査を実施した。なお、対照区にはＳＨＨ１５株の懸濁液に代えて、滅菌蒸留水に浸漬処理した種子を用いた。
【表１０】
0004817323.tif 000011
【００６７】
結果は表１０に示す通りであり、ＳＨＨ１５株で処理することにより、環境ストレス条件下でのホウレンソウ種子の発芽率を向上させることができた。このことから、ＳＨＨ１５株を用いて処理した場合、植物病害に対する防除効果を持つだけでなく、環境ストレス条件下での種子の発芽率を向上して、発芽安定効果を付与することができる。
【産業上の利用可能性】
【００６８】
本発明に係る植物病害防除剤および防除方法は、人の健康にも有益とされる乳酸菌を用いて植物病害を防除することができることから、安全で安定した農作物生産に寄与することができる。