(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド：
（ａ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列表の配列番号３２に記載のアミノ酸配列。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項３】
配列表の配列番号１５、２３又は３１に記載の塩基配列を有する請求項２記載の核酸。
【請求項４】
ポリペプチドを産生する能力を有する細胞を培養する工程、および培養物から該ポリペプチドを採取する工程を包含するポリペプチドの製造方法であって、該ポリペプチドは以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有する：
（ａ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列表の配列番号３２に記載のアミノ酸配列。
【請求項５】
ポリペプチドを用いて核酸を増幅する工程を包含する、核酸の増幅方法であって、該ポリペプチドは以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を有し、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有する：
（ａ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列；
（ｂ）配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配列；又は
（ｃ）配列表の配列番号３２に記載のアミノ酸配列。
【請求項６】
請求項１記載のポリペプチドを含有する核酸増幅用組成物。
【請求項７】
請求項１記載のポリペプチドを含有するキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学用試薬として有用な高Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードする遺伝子、該ポリペプチドの製造方法、さらに該ポリペプチドを用いた核酸の増幅方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡポリメラーゼは遺伝子工学用試薬として有用な酵素であり、ＤＮＡ塩基配列決定法、標識化、部位特異的変異導入法などに広く利用されている。また最近ではポリメラーゼ  チェーン  リアクション（ＰＣＲ）法の開発により、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが注目を集め、ＰＣＲ法に適した種々のＤＮＡポリメラーゼが開発され、商品化されている。
現在知られているＤＮＡポリメラーゼはそのアミノ酸配列の共通性から大きく４つのファミリーに分類することができ、中でもファミリーＡ（ポルＩ型酵素）とファミリーＢ（α型酵素）が大多数を占めている。それぞれのファミリーに属するＤＮＡポリメラーゼは概ね類似した生化学的特性を有しているが、詳細に比較すると個々の酵素によって基質特異性、基質アナログの取込み、プライマー伸長性の強さ及び速度、ＤＮＡ合成の様式、エキソヌクレアーゼ活性の付随、温度、ｐＨなどの至適反応条件、また阻害剤に対する感受性などについて異なる性質を有している。したがってこれまで実験操作に応じてそれぞれ現存する中で最も適した性質を有するＤＮＡポリメラーゼが選ばれ利用されている。
例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）由来ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、特許文献１〜５参照）は、最も耐熱性の高いＤＮＡポリメラーゼのひとつであり、校正（Ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ）活性として知られる３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を持ち、耐熱性酵素の中でも高いＦｉｄｅｌｉｔｙを示す。しかしながら当該酵素は、伸長速度が遅く、ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙが低いため、ＰＣＲに使用すると増幅に時間がかかり、また長鎖は増幅できないという問題を有している。【０００３】
また、最近では、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼと呼ばれる、Ｐｆｕ由来ＤＮＡポリメラーゼよりも高い３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を持ち、伸長速度が速くｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙの高いポリメラーゼが市販されている。（例えば、特許文献６〜７、非特許文献１参照）。当該酵素を用いて正確性の高いＰＣＲを短時間で行うことが可能であるが、強い３'→５'エキソヌクレアーゼ活性によりｐｒｉｍｅｒや増幅産物が分解されてしまうため反応の条件設定が比較的難しく、また長鎖の増幅には向いていないという問題を有している。【０００４】
さらに、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを改良した２種の酵素も開発されている。その一つであるＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼは、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼに２種類のモノクローナル抗体を加え、常温下におけるポリメラーゼ活性、３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を抑えることにより特別な操作なしでホットスタートＰＣＲが可能となっている。また反応Ｂｕｆｆｅｒ組成を至適化することにより、高いＦｉｄｅｌｉｔｙはそのままでＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼよりも増幅効率や長鎖長ＤＮＡの合成能力が向上している（例えば、特許文献８）。しかしながら、当該酵素の伸長速度はＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼよりかなり遅く、Ｐｆｕ由来ＤＮＡポリメラーゼと同等程度にまで低下しているという問題を有している。【０００５】
さらに、ＫＯＤ  Ｄａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂａｒｎｅｓらの方法（例えば、特許文献９、非特許文献２参照）に基づいて作られた混合型ＤＮＡポリメラーゼであり、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼと、遺伝子操作によって３'−５'エキソヌクレアーゼ活性を欠失させた改変型ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを最適な割合で混合することにより、増幅効率、伸長性が向上している（例えば、特許文献１０参照）。伸長速度もＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼと同様に速い。ただしＦｉｄｅｌｉｔｙは３'−５'エキソヌクレアーゼ活性が相対的に減少していることから、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ単独に比べて格段に低下しているという問題を有している。【０００６】
【特許文献１】米国特許第５４８９５２３号明細書
【特許文献２】米国特許第５５４５５５２号明細書
【特許文献３】米国特許第５８６６３９５号明細書
【特許文献４】米国特許第６４８９１５０号明細書
【特許文献５】米国特許第５９４８６６３号明細書
【特許文献６】米国特許第６０５４３０１号明細書
【特許文献７】米国特許第６２２５０６５号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００２／００７６７６８号明細書
【特許文献９】米国特許第５４３６１４９号明細書
【特許文献１０】米国特許第６００８０２５号明細書
【非特許文献１】Ｂａｒｎｅｓ  Ｗ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、ｖｏｌ．９１，Ｎｏ．６，ｐ．２２１６−２２２０（１９９４）
【非特許文献２】Ｔａｋａｇｉ  Ｍ．，外７名，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．１１，ｐ．４５０４−４５１０（１９９７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、クローニング、シークエンシング、核酸増幅のいずれにおいても有用なＦｉｄｅｌｉｔｙの高いＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードする遺伝子を提供することにある。また、本発明の他の目的は、当該ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法ならびに、該ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを用いた核酸の増幅方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意研究の結果、超好熱性古細菌であるＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属からこれまでのＤＮＡポリメラーゼにはない優れた性質を有する新規のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを見出した。さらに、当該活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングして、該ポリペプチドの製造方法を見出し、本発明を完成させた。
即ち、
本発明の第１の発明は、
（ａ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配列、又は
（ｃ）配列表の配列番号３２に記載のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列中の１ないしは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、置換したアミノ酸配列を有し、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドに関する。【０００９】
本発明の第２の発明は、第１の発明のポリペプチドをコードする核酸に関する。
本発明の第２の発明の核酸は、配列表の配列番号１５、２３又は３１に記載の塩基配列あるいはその一部を有する核酸であってもよく、更には該核酸に相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であり、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸であってもよい。【００１０】
本発明の第３の発明は、ポリペプチドを産生する能力を有する細胞を培養する工程、および培養物から該ポリペプチドを採取する工程を包含するポリペプチドの製造方法に関し、該ポリペプチドは
（ａ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配列、又は
（ｃ）配列表の配列番号３２に記載のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列中の１ないしは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、置換したアミノ酸配列を有し、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。【００１１】
本発明の第４の発明は、ポリペプチドを用いて核酸を増幅する工程を包含する、核酸の増幅方法に関し、該ポリペプチドは
（ａ）配列表の配列番号１６に記載のアミノ酸配列、
（ｂ）配列表の配列番号２４に記載のアミノ酸配列、又は
（ｃ）配列表の配列番号３２に記載のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列中の１ないしは数個のアミノ酸が欠失、挿入、付加、置換したアミノ酸配列を有し、かつＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。【００１２】
本発明の第５の発明は、本発明の第１の発明のポリペプチドを含有する組成物に関する。【００１３】
本発明の第６の発明は、本発明の第１の発明のポリペプチドを含有するキットに関する。【００１４】
本発明の第７の発明は、本発明の第一の発明のポリペプチドに結合する抗体に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、クローニング、シークエンシング、核酸増幅のいずれにおいても有用なＦｉｄｅｌｉｔｙの高いＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードする遺伝子ならびに当該ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法が提供される。本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを用いることにより、例えば、ＰＣＲにおいて多サイクル数であっても、エラー率の少ない増幅産物を得ることができる。従って、コピー数の少ない標的核酸の解析・同定において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＤＮＡポリメラーゼの活性と反応温度との関係を示す図である。図中、◇はＴｋｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、△はＴｃｅ  ＤＮＡポリメラーゼ、○はＴｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼについての結果を示す。
【図２】ＤＮＡポリメラーゼの活性とｐＨとの関係を示す図である。図中、◇はＴｋｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、△はＴｃｅ  ＤＮＡポリメラーゼ、○はＴｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼについての結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本明細書においてＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドとは、４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）を鋳型ＤＮＡの塩基配列にしたがって取り込み、鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ鎖の重合を触媒するポリペプチドのことを言う。【００１８】
本明細書においてプライマー伸長に適しているとは、１本鎖の鋳型ＤＮＡにプライマーがアニーリングした複合体を基質としてプライマーからＤＮＡを合成していく能力において優れている事を言い、例えば一本鎖ＤＮＡに対する親和性が高い事が挙げられる。一本鎖ＤＮＡに対する親和性が高いＤＮＡポリメラーゼは、核酸増幅反応において高い感度を示す事が期待できる。すなわち、コピー数の少ない鋳型核酸からの核酸増幅反応において有用である。ＤＮＡポリメラーゼの一本鎖ＤＮＡに対する親和性を示す指標としては、例えばＭ１３ファージの一本鎖ＤＮＡに対するＫｍ値が挙げられ、該Ｋｍ値は２．５μｇ／ｍｌ以下である事が好ましく、２．０μｇ／ｍｌ以下であることがより好ましく、１．５μｇ／ｍｌ以下であることが更に好ましい。【００１９】
本明細書においてＦｉｄｅｌｉｔｙ（忠実度）が高いとは、ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成反応における塩基取り込みの正確性が高いことを言う。その測定方法としては、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  １９８５  Ｍａｙ  １０；２６０（９）：５７８７−９６．）、シークエンシング法、Ｃｌｉｎｅらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １９９６  Ｓｅｐ  １５；２４（１８）：３５４６−５１．）などが例示される。その中でもシークエンシング法が最も信頼性が高い。本発明を特に限定するものではないが例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ−８のゲノムＤＮＡを鋳型として各ＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲを行い、当該増幅産物をベクターｐＵＣ１１８にクローニング後、得られた複数クローン中の増幅断片約５００ｂｐについてその塩基配列を確認し、エラーと思われる塩基の数を確認し、全シークエンシング塩基数に対するエラーの塩基数の％を求め、Ｆｉｄｅｌｉｔｙの評価を行う事ができる。【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする遺伝子
本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｐｆｕ由来ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ由来ＤＮＡポリメラーゼと比較してプライマー伸長に適した、さらにＤＮＡ合成時の正確性に優れたポリペプチドである。また、本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、代表的な高Ｆｉｄｅｌｉｔｙ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるＰｆｕ由来ＤＮＡポリメラーゼのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ｄａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼ並びにＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（いずれも東洋紡社製）に比較し、ＰＣＲ法において増幅できるＤＮＡの鎖長やその反応のＦｉｄｅｌｉｔｙという観点において優れている。【００２１】
本発明のＤＮＡポリメラーゼの理化学的性質は、以下の通りである。
（イ）分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により約８５−９０キロダルトンである。
（ロ）至適温度：７５℃〜８５℃
（ハ）至適ｐＨ：５．５〜６．５（７５℃）【００２２】
本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、上記理化学的性質を有しているものであれば特に限定はされないが例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１（以下、Ｔｋｓと称す）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｃｕｌｉ（以下、Ｔｓｉと称す）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ（以下、Ｔｃｅと称す）から得ることができる。【００２３】
本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列表の配列番号１６、２４又は３２に示されるアミノ酸配列からなるか、あるいはこれと実質的に同等の活性を有する機能的同等物であってもよい。天然に存在するポリペプチドにはそれをコードする遺伝子の多形や変異の他、生成後のポリペプチドの生体内および精製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中にアミノ酸の欠失、挿入、付加、置換等の変異が起こりうるが、それにもかかわらず変異を有しないポリペプチドと実質的に同等の生理学的活性、生物学的活性を示すものがあることが知られている。このように構造的に差異があってもその機能や活性については大きな違いが認められない機能的同等物も本発明に包含される。ここで変異したアミノ酸の数は、ポリペプチドが実質的に同等の生理学的活性、生物学的活性を示すものであるかぎり特に限定されるものではないが、１以上、例えば１ないしは数個、より具体的には１〜１０個の変異（欠失、挿入、付加、置換等）などが例示される。また、人為的にポリペプチドのアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合も同様であり、この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能である。【００２４】
さらに、遺伝子工学的にポリペプチドの生産を行う際には融合ポリペプチドとして発現させることがしばしば行われる。たとえば目的ポリペプチドの発現量を増加させるためにＮ末端に他のポリペプチド由来のＮ末端ペプチド鎖を付加したり、目的ポリペプチドのＮ末端、あるいはＣ末端に適当なペプチド鎖（例えばヒスチジン−タグやグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ等）を付加して発現させ、このペプチド鎖に親和性を持つ担体を使用することにより目的ポリペプチドの精製を容易にすることなどが行われている。したがって本発明のＤＮＡポリメラーゼとは一部異なったアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼであっても、それが本発明のＤＮＡポリメラーゼと本質的に同等の活性を示す限りにおいて、該酵素は「機能的同等物」として本発明の範囲内に属するものである。【００２５】
本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、配列表の配列番号１６、２４又は３２に示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡ、例えば、配列表の配列番号１５、２３又は３１に示される塩基配列の全部又は一部を含むＤＮＡが挙げられる。また、配列番号１６、２４又は３２のアミノ酸配列において、１以上の例えば１ないしは数個、より具体的には１〜１０個のアミノ酸が欠失、挿入、付加または置換などされたアミノ酸配列からなり、かつ上記ＤＮＡポリメラーゼとしての機能を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも挙げられる。また、さらにこれらのＤＮＡに相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能で、かつ上記ＤＮＡポリメラーゼとしての機能を有するポリペプチドをコードする塩基配列も本発明の範囲内である。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えばプローブとともに０．５％ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を示す）中、６８℃にて１２〜２０時間インキュベートする条件を言う。プローブにハイブリダイズしたＤＮＡは、例えば０．５％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中、６８℃にて洗浄を行った後に検出する事ができる。【００２６】
さらに、本発明の遺伝子は、ポリペプチドの翻訳後に自発的に前記ポリペプチドより切り出されるインテインと呼ばれる領域をコードする配列を含む事がある。このような配列を含むＤＮＡも、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする限り、本発明に包含される。【００２７】
ここで、「ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド」とは、特に限定はされないが例えば、前記に示された各種の理化学的性質を示すＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドが好ましい。【００２８】
ここで本明細書に記載の「アミノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ」なる用語について説明する。遺伝子上でアミノ酸を指定するコドン（３つの塩基の組み合わせ）はアミノ酸の種類ごとに１〜６種類ずつが存在することが知られている。従って、あるアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、そのアミノ酸配列にもよるが多数存在することができる。
さらに、同じアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子を人為的に作製することは種々の遺伝子工学的手法を用いれば困難なことではない。たとえば遺伝子工学的なポリペプチドの生産において、目的のポリペプチドをコードする本来の遺伝子上で使用されているコドンが宿主中では使用頻度の低いものであった場合にはポリペプチドの発現量が低いことがある。このような場合にはコードされているアミノ酸配列に変化を与えることなく、コドンを宿主で繁用されているものに人為的に変換することにより、目的ポリペプチドの高発現を図ることが行われている（例えば、特公平７−１０２１４６号公報）。このように特定のアミノ酸配列をコードする多種類の遺伝子は、人為的に作製可能なことは言うまでもなく、自然界においても生成されうるものである。従って本発明中に開示された塩基配列と同一の塩基配列を有する遺伝子ではなくても、それが本発明中に開示されたアミノ酸配列をコードする限り該遺伝子は本発明に包含されるものである。【００２９】
本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、試験管内でのプライマー伸長に適している。例えば、一本鎖ＤＮＡにプライマーがアニーリングした形の基質（Ｍ１３の一本鎖ＤＮＡに配列表の配列番号３３記載のＨＴプライマーがアニーリングした基質、以下Ｍ１３／ＨＴ  Ｐｒｉｍｅｒ基質、又はプライマー伸長型基質と称することがある）を用いてＤＮＡポリメラーゼ活性を測定した場合には、通常の活性測定に用いられる活性化ＤＮＡ（ＤＮａｓｅ  Ｉ処理仔牛胸腺ＤＮＡ）に比べて高いヌクレオチド取り込み活性が得られる。【００３０】
なお、上記のＭ１３／ＨＴ  Ｐｒｉｍｅｒ基質を用いて測定されたＤＮＡポリメラーゼ活性（以下、伸長活性と称する事がある）と活性化ＤＮＡを基質として用いて測定されたＤＮＡポリメラーゼ活性（以下、取込活性と称することがある）の比（伸長活性／取込活性）は、既知のピロコッカス  フリオサス由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ，ストラタジーン社製）やサーマス  アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）由来のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａＫａＲａ  Ｔａｑ，タカラバイオ社製）、サーモコッカス  コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来のＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ，東洋紡社製）に比べて、本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは高い値を示す。【００３１】
更に、上記のＭ１３／ＨＴ  Ｐｒｉｍｅｒ基質を用いた反応系中に競合基質となる活性化ＤＮＡを加えた場合には、上記３種のＤＮＡポリメラーゼのプライマー伸長活性は強く阻害されるのに対して、本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドはより軽度の阻害しか受けず、該ポリペプチドがプライマー伸長型の基質に高い親和性を持つことが示される【００３２】
また、本願発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、Ｍ１３ファージの一本鎖ＤＮＡに対するＫｍ値が２μｇ／ｍｌ以下であることからも、該ポリペプチドがプライマー伸長型の基質に高い親和性を持つことが示される。【００３３】
（２）本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法
本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、例えば、Ｔｋｓ、Ｔｓｉ、またはＴｃｅの菌株培養物から、あるいは当該ポリペプチドをコードする遺伝子を導入した形質転換体から大量生産することが可能である。【００３４】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの取得は、本発明のポリペプチドを生産する微生物のゲノムＤＮＡを出発材料として実施することができる。前記のゲノムＤＮＡを調製する方法としては、特に限定はされないが例えば、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ属古細菌を、８５℃で嫌気培養し、増殖した菌体を破砕してＤＮＡを抽出、精製する方法が挙げられる。また得られたＤＮＡを制限酵素で切断する方法等遺伝子クローニングに使用される種々の操作には公知の方法を用いる事ができ、当該方法の詳細は２００１年コールドスプリングハーバー  ラボラトリー発行、Ｊ．サムブルック（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ほか著、モレキュラー  クローニング，ア  ラボラトリー  マニュアル  第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）に記載されている。【００３５】
本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、特に限定はされないが例えば配列表の配列番号１５、２３又は３１記載の塩基配列を有する核酸又はその一部が組み込まれた組換えプラスミドで形質転換された形質転換体を適切な培養条件、例えば大腸菌を宿主とする場合には、ＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル，酵母エキス５ｇ／リットル，ＮａＣｌ５ｇ／リットル，ｐＨ７．２）中で培養することにより、その菌体内に発現させることができる。該ポリペプチドは上記の培養菌体より、たとえば超音波処理、熱処理、および陽イオン交換カラム、アフィニティ担体カラム、ゲル濾過カラムあるいは陰イオン交換カラムなどを用いたクロマトグラフィーを行うことにより、得ることができる。
このようにして得られた本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約８５−９０ダルトンを示す。【００３６】
また、本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、トリス緩衝液中、７５℃においてｐＨ５．５〜６．５の至適ｐＨを示す。また、該ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を種々の温度で測定した場合に７５℃〜８５℃で高い活性を示す。また、本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは高い熱安定性を有している。【００３７】
さらに本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が付随しており、ＤＮＡポリメラーゼ活性に対するエキソヌクレアーゼ活性の強さは、その活性が強いためにＤＮＡ合成の正確性が非常に高いことが知られているＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの活性比を越えている。また、本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドについて測定されたＤＮＡ合成反応中に起こる誤りの頻度は、Ｐｆｕ由来ＤＮＡポリメラーゼのものよりも低い。上記した種々の性質は本発明のＤＮＡポリメラーゼがＰＣＲ法などの遺伝子工学用試薬として非常に優れたものであることを示すものである。【００３８】
（３）本発明のＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸の増幅方法、該方法のための組成物ならびにキット
本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドはＦｉｄｅｌｉｔｙが高く、プライマー伸長に適しているという特徴を有し、当該ポリペプチドを用いることにより、標的核酸の正確な増幅、解析、同定を行う方法、該方法のための組成物ならびにキットが提供される。【００３９】
上記特徴により、本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドをＰＣＲ法に使用した場合には極めて優れた性能を示す。例えば、ＰＣＲ法に利用されるサーモコッカス  コダカラエンシス由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、東洋紡社製）は、単独では６キロ塩基対以上のＤＮＡ断片を増幅することは困難であり、他のＤＮＡポリメラーゼと組み合わせることによってのみ１５キロ塩基対以上のＤＮＡ断片の増幅を行なうことができる。これに対して本発明のＤＮＡポリメラーゼを使用した場合には、他の酵素の添加なしに該酵素単独で１５キロ塩基対のＤＮＡ断片の増幅が可能である。【００４０】
さらに、従来のＤＮＡポリメラーゼや複数のＤＮＡポリメラーゼを含有する組成物、例えばＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物ならびにキット、またＫＯＤ  ｄａｓｈ  ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物ならびにキット、さらに、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼを含む組成物ならびにキットに対しても、標的核酸の正確な増幅、解析、同定を行うことが出来る点で本発明のポリペプチドを含む組成物ならびにキットは優れている。【００４１】
上記の組成物及びキットとしては、本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、該ポリペプチドに至適化された緩衝液、４種のｄＮＴＰ、及び２価陽イオンを含むものが例示され、更に標的核酸を増幅及び／又は検出する為のプライマーセットを含んでいても良い。【００４２】
本発明により、本発明のポリペプチドに結合する抗体が提供される。前記抗体は本発明のポリペプチドを認識し、特異的に結合する能力を有するものであれば特に限定はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよい。さらに、前記抗体と同様の認識特性を有する抗体断片（例えばＦａｂフラグメント等）、一本鎖抗体等も本発明に包含される。【００４３】
本発明の抗体は公知の方法、例えば１９９２年、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｅｌｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．）発行、カレント・プロトコルズ・イン・イムノロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）に記載の方法により、本発明のポリペプチドまたはその一部を抗原としてマウスやウサギを免疫することにより作製することができる。さらに、常法にしたがって前記の免疫動物より採取した抗体産生細胞をもとにハイブリドーマを作製することにより、モノクローナル抗体を作製することもできる。【００４４】
上記の抗体は、本発明のポリペプチドの検出や精製に使用することができる他、該ポリペプチドの保持する活性、例えばＤＮＡポリメラーゼ活性や３’→５’エキソヌクレアーゼの阻害に使用することができる。ＤＮＡポリメラーゼ活性を抑制する能力を有する抗体は、例えばＰＣＲにおいて、反応開始前の低温時に非特異的にアニーリングしたプライマーからのＤＮＡ伸長の抑制に有用である。また、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を抑制する能力を有する抗体は、例えばＰＣＲにおいて、反応開始前のプライマー分解の抑制に有用である。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００４６】
実施例１
本実施例のＤＮＡポリメラーゼの活性測定に使用する活性化ＤＮＡは以下の方法で調製した。
すなわち、サケ精子ＤＮＡ（シグマ社製）あるいは仔牛胸腺ＤＮＡ（ワージントン社製）をＤＮａｓｅＩ処理によって活性化した。当該方法は、ハーバー  アンド  ロー社発行、Ｄ．Ｒ．Ｄａｖｉｓ編集のＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  第２６３−２７６頁（Ｃ．Ｃ．リチャードソン著）に記載の方法に基づくものである。【００４７】
また、ＤＮＡポリメラーゼの活性測定は、以下の方法で行なった。
すなわち、活性測定しようとする試料を活性測定用反応液（２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液  ｐＨ８．３、１０ｍＭ  塩化カリウム、６ｍＭ  硫酸アンモニウム、２ｍＭ  塩化マグネシウム、０．１％トライトンＸ−１００、０．００１％牛血清アルブミン、各２００μＭ  ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、１００μＭ  ｄＴＴＰ、０．２３８μＭ  「３Ｈ」−Ｍｅｔｈｙｌ  ＴＴＰ、０．４ｍｇ／ｍｌ活性型サケ精子ＤＮＡ）５０μｌ中、７４℃、５分間反応させた。
反応終了後、２％Ｎａｐｐｉ（ナカライ社製）を含む２０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を５００μｌ、ｓｈｅａｒｅｄ  ＤＮＡを５００μｌ添加し、氷上で１５分以上放置した後、グラスフィルター（ワットマン社製）に捕集した。次に５ｍｌの２％Ｎａｐｐｉを含む５％ＴＣＡで７回洗浄した後、エタノールで洗浄し、グラスフィルターを乾燥し、放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。上記の酵素活性測定方法によって３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を酵素１Ｕとした。【００４８】
実施例２
サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）  ｓｐ．ＫＳ−１株（ＪＣＭ１１８１６）、サーモコッカス  セラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｅｌｅｒ、ＪＣＭ８５５８）、サーモコッカス  シクリ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｉｃｕｌｉ、ＤＳＭＺ１２３４９）について以下の方法でゲノムＤＮＡを調製した。
すなわち、購入した培養液１０ｍｌを、８０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。得られた上清および上清と沈殿の界面にある黒層をさらに１５０００ｒｐｍ、１０分間遠心後、得られた沈殿に０．８ｍｌの２０％ショ糖、５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、０．１６ｍｌの５００ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．０８ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、室温で２時間反応させた。
反応終了後、この反応液に６．４ｍｌの１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．０８ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（タカラバイオ社製）及び０．４ｍｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。次いでこれに等量の１００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液（２５：２４：１、ｖ／ｖ）を加えて１０分間緩やかに混合した後、更に１０分間遠心（１００００×ｇ）を２回行った。遠心終了後、得られた上清をエタノール沈殿後、０．１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解してゲノムＤＮＡ溶液を得た。【００４９】
実施例３
（１）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子中央部のクローニング
様々な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の間で保存されている部分をもとにして配列表の配列番号１〜４記載のオリゴヌクレオチドＴＰＰｏｌＢＦ４、ＴＰＰｏｌＢＦ５、ＴＴＰｏｌＢＲ１並びにＴＴＰｏｌＢＲ４をＤＮＡ合成機で合成した。
次に上記実施例２で調製したサーモコッカス  ｓｐ．ＫＳ−１由来ゲノムＤＮＡ２５０ｎｇを鋳型にして、５０ｐｍｏｌのＴＰＰｏｌＢＦ４と５０ｐｍｏｌのＴＴＰｏｌＢＲ１、５０ｐｍｏｌのＴＰＰｏｌＢＦ４と５０ｐｍｏｌのＴＴＰｏｌＢＲ４、５０ｐｍｏｌのＴＰＰｏｌＢＦ５と５０ｐｍｏｌのＴＴＰｏｌＢＲ１のプライマーの組み合わせで、１００μｌの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲにおいてＤＮＡポリメラーゼはタカラＥｘＴａｑ（タカラバイオ社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃、３分間反応後、９４℃  ３０秒、５０℃  ３０秒、７２℃  ２分を１サイクルとする、４０サイクル反応を行った。
反応終了後、それぞれの反応液をフェノール処理した後、マイクロコン−１００（タカラバイオ社製）で、プライマーを除去すると同時に増幅ＤＮＡ断片の濃縮を行った。【００５０】
濃縮した３ｋｂのＴＰＰｏｌＢＦ４−ＴＴＰｏｌＢＲ１増幅断片、２ｋｂのＴＰＰｏｌＢＦ４−ＴＴＰｏｌＢＲ４増幅断片、０．７ｋｂ  ＴＰＰｏｌＢＦ５−ＴＴＰｏｌＢＲ１増幅断片についてダイレクトシークエンシングを行い塩基配列を決定し、様々な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と比較した。その結果、サーモコッカス  ｓｐ．ＫＳ−１  ＤＮＡポリメラーゼがインテイン配列を含むことが明らかになった。【００５１】
（２）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子上流部分のクローニング
上記実施例３−（１）で得られた塩基配列をもとに上流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドＴｋｓ０１（配列表の配列番号５）を合成した。さらに、下記表１に示す３２種類のプライマーを合成した。表１中のタグ配列を配列表の配列番号６に示す。【００５２】
【表１】
0004685768.tif 000002
【００５３】
実施例２で調製したサーモコッカス  ｓｐ．ＫＳ−１由来ゲノムＤＮＡ１ｎｇを鋳型にして、１０ｐｍｏｌのＴｋｓ０１と各１０ｐｍｏｌの表１記載３２種類のプライマーとの組み合わせで２０ｍＭ  トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ８．５）、５０ｍＭ  酢酸カリウム、３ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、各３００μＭ  ｄＮＴＰ混合物、１．２５ＵのタカラＥｘＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を含む５０μｌ反応液中でＰＣＲをおこなった。ＰＣＲは９４℃  ３分インキュベートした後、９８℃  １０秒、５０℃  １０秒、７２℃  ４０秒を１サイクルとする、４０サイクル反応を行った。得られたＰＣＲ産物の一部をアガロース電気泳動し、シングルバンドになったものを選び出し、それらの反応液をマイクロコン−１００（タカラバイオ社製）で、プライマーを除去すると同時に濃縮し、ダイレクトシークエンスを行い、ＤＮＡポリメラーゼの上流部分を含む断片をスクリーニングした。その結果、約１３００ｂｐのＰＣＲ増幅断片Ｔｋｓ０１２Ｇに目的のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の上流が含まれていることがわかった。また、この断片に実施例３−（１）とは、異なるインテイン配列が含まれていることも確認できた。【００５４】
さらに上流スタートコドン周辺をクローニングするためにＴｋｓ０１２Ｇの配列をもとに特異的なオリゴヌクレオチドＴｋｓ０４（配列表の配列番号７）を合成した。実施例２で調製したサーモコッカス  ｓｐ．ＫＳ−１由来ゲノムＤＮＡ１ｎｇを鋳型にして、１０ｐｍｏｌのＴｋｓ０４と各１０ｐｍｏｌの表１記載３２種類のプライマーとの組み合わせで上記の５０μｌ反応液中でＰＣＲをおこなった。ＰＣＲ条件及び精製操作は、上記条件と同様にした。得られた増幅断片のダイレクトシークエンスを行い、ＤＮＡポリメラーゼの上流含む断片をスクリーニングした。その結果、約１８００ｂｐのＰＣＲ増幅断片  Ｔｋｓ０４１Ｂに目的のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のスタートコドン周辺が含まれていることがわかった。【００５５】
（３）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子下流部分のクローニング
上記実施例３−（１）で得た塩基配列をもとに上流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドＴｋｓ０２（配列表の配列番号８）を合成した。次に実施例２で調製したサーモコッカス  ｓｐ．ＫＳ−１由来ゲノムＤＮＡ１ｎｇを鋳型にして、１０ｐｍｏｌのＴｋｓ０２と各１０ｐｍｏｌの表１記載３２種類のプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は前記条件と同様にして行った。得られたＰＣＲ産物の一部をアガロースゲル電気泳動し、その中のＴｋｓ０２２Ｄの約２５００ｂｐ  ＤＮＡ断片を回収し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いて末端を平滑化した後、ＨｉｎｃＩＩ（タカラバイオ社製）で消化したｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）にＴ４  ＤＮＡリガーゼ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、該プラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。さらに形質転換体を培養し、約２５００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＴｋｓ０２２Ｄを得、挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。【００５６】
（４）ＤＮＡポリメラーゼ発現させるためのプラスミドの構築
サーモコッカス  ｓｐ．ＫＳ−１  ＤＮＡポリメラーゼが配列中に２箇所インテイン配列を含むことが明らかになった。
そこで、インテイン配列を除去したＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を構築した。
実施例３−（３）で得られた配列をもとに配列表の配列番号９〜１４記載のオリゴヌクレオチド、ＴｋｓＮｄｅ、Ｔｋｓ１ＥｎｄＢｇ、Ｔｋｓ２ＳｔａＢｇ、Ｔｋｓ２ＥｎｄＢａｌ、Ｔｋｓ３ＳｔａＢａｌおよびＴｋｓＢｇＰｓを合成した。
次に実施例２で調製したサーモコッカス  ｓｐ．ＫＳ−１由来ゲノムＤＮＡ１００ｎｇを鋳型にして２０ｐｍｏｌのＴｋｓＮｄｅと２０ｐｍｏｌのＴｋｓ１ＥｎｄＢｇ（ＴｋｓＡ）、２０ｐｍｏｌのＴｋｓ２ＳｔａＢｇと２０ｐｍｏｌのＴｋｓ２ＥｎｄＢａｌ（ＴｋｓＢ）、２０ｐｍｏｌのＴｋｓ３ＳｔａＢａｌと２０ｐｍｏｌのＴｋｓＢｇＰｓ（ＴｋｓＣ）のプライマー組み合わせで、１００μｌの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲにおいてＤＮＡポリメラーゼはＰｙｒｏｂｅｓｔ（タカラバイオ社製）を添付のプロトコールに従って用い、９４℃  ３０秒、５０℃  ３０秒、７２℃  ３分を１サイクルとする、４０サイクル反応を行い、約１．３ｋｂのＴｋｓＡ、約０．３ｋｂのＴｋｓＢ、約０．９ｋｂのＴｋｓＣ  各ＤＮＡ増幅断片を得た。さらに、同様の方法で上記ＰＣＲ反応液ＴｋｓＢ  １μｌとＰＣＲ反応液ＴｋｓＣ  １μｌを混ぜたものを鋳型にして、２０ｐｍｏｌのＴｋｓ２ＳｔａＢｇと２０ｐｍｏｌのＴｋｓＢｇＰｓ（ＴｋｓＤ）プライマーを用いて、１００μｌの容量で上記条件でＰＣＲを行い、約１．２ｋｂのＴｋｓＤ  ＤＮＡ増幅断片を得た。
得られたＴｋｓＡ  ＤＮＡ断片は制限酵素ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩで、ＴｋｓＤ  ＤＮＡ断片は制限酵素ＢｇｌＩＩとＰｓｔＩで消化した後、制限酵素ＮｄｅＩとＰｓｔＩで消化したｐＴＶ１１９Ｎｄ（ｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変換したもの）と常法によりライゲーションし、プラスミドｐＴｋｓ５９を構築した。当該プラスミドは、ｐＴｋｓ５９と命名、表示され、平成１６年５月１４日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３１２として寄託されている。【００５７】
（５）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例３−（４）で得られたｐＴｋｓ５９の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、目的のＤＮＡポリメラーゼをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号１５に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号１６に示す【００５８】
（６）サーモコッカス  ｓｐ．ＫＳ−１  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現
ｐＴｋｓ５９で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム）培地に植菌し、３７℃で６時間した培養液５０μｌを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１ｍＭ  ＩＰＴＧを含む５ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１晩振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を３６μｌのソニケーションバッファー（５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．０、２ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール）に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を８０℃、１０分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、熱処理上清液を得た。
上記で得られた熱処理上清液について、実施例１に記載の方法により酵素活性を測定した結果、ＤＮＡポリメラーゼ活性が確認できた。【００５９】
（７）精製ＤＮＡポリメラーゼ標品の調製
実施例３−（５）で得られたプラスミドｐＴｋｓ５９で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．１％グルコースを含む４００ｍｌＬＢ培地に植菌し、３７℃で一晩振盪培養後、全量を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２０リットルＬＢ培地に添加し、３７℃でＯＤ６００が１．０になるまで培養した。ＯＤ６００が１．０になったら、最終濃度０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で４時間培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を７３２ｍｌのバッファーＡ〔５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ジチオスレイトール、１ｍＭ  フェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離を行った。得られた上清に最終濃度０．２Ｍになるように硫酸アンモニウム（硫安）を添加し、７５℃、１５分間の熱処理にかけた後、０℃  ３０分間放置し、再度１２０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離を行った。さらに、上清をポリエチレンイミンによる除核酸処理、硫安沈殿を行った後、バッファーＢ〔５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭ  ジチオスレイトール、１ｍＭ  フェニルメタンスルフォニルフルオライド〕２リットルを外液として、２時間の透析を２回、一晩の透析を１回行なった。透析後の酵素液２００ｍｌをバッファーＢで平衡化したホスホセルロースＰ−１１カラム（ワットマン社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム  ファルマシア  バイオテク社製）を用いて０〜５００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）直線濃度勾配により溶出した。【００６０】
溶出したＤＮＡポリメラーゼ画分をバッファーＣ〔２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．２％ツイーン２０、１ｍＭ  ジチオスレイトール〕１リットルを外液として、２時間の透析を２回、一晩の透析を１回行なった。透析後の酵素液１００ｍｌをバッファーＢで平衡化したヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜７００ｍＭ  ＫＣｌ直線濃度勾配により溶出した。
この画分をバッファーＤ〔２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．２％ツイーン２０、１ｍＭジチオスレイトール〕１ｌを外液として、２時間の透析を２回、一晩の透析を１回行なった。透析後の酵素液５０ｍｌをバッファーＤで平衡化したＱ−セファロース（ファルマシア  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜３００ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。
この画分を保存バッファー〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％ツイーン２０、０．１％ノニデットＰ−４０、１ｍＭジチオスレイトール、５０％グリセロール〕１リットルを外液として、２時間の透析を２回、一晩の透析を１回行なった。こうして得られたＤＮＡポリメラーゼをＴｋｓ  ＤＮＡポリメラーゼ標品とした。
得られたＴｋｓ  ＤＮＡポリメラーゼ標品を用いて、実施例１で記載した方法で活性を測定したところ、ＤＮＡポリメラーゼ活性が確認できた。【００６１】
実施例４
（１）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子中央部のクローニング
様々な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の間で保存されている部分をもとにして配列表の配列番号１７、２、３、１８記載のオリゴヌクレオチドＴＰＰｏｌＢＦ１、ＴＰＰｏｌＢＦ５、ＴＴＰｏｌＢＲ１並びにＴＴＰｏｌＢＲ５を合成した。
次に上記実施例２で調製したサーモコッカス  セラー由来ゲノムＤＮＡ２５０ｎｇを鋳型にして、５０ｐｍｏｌのＴＰＰｏｌＢＦ１と５０ｐｍｏｌのＴＴＰｏｌＢＲ１、５０ｐｍｏｌのＴＰＰｏｌＢＦ１と５０ｐｍｏｌのＴＴＰｏｌＢＲ５、５０ｐｍｏｌのＴＰＰｏｌＢＦ５と５０ｐｍｏｌのＴＴＰｏｌＢＲ１のプライマーの組み合わせで、１００μｌの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件並びに精製操作は実施例３−（１）記載と同様にして行った。得られた約２ｋｂのＴＰＰｏｌＢＦ１−ＴＴＰｏｌＢＲ１、約１ｋｂのＴＰＰｏｌＢＦ１−ＴＴＰｏｌＢＲ５並びに約０．８ｋｂのＴＰＰｏｌＢＦ５−ＴＴＰｏｌＢＲ１の各増幅断片についてダイレクトシークエンシングを行い、塩基配列を決定した。【００６２】
（２）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子上流および下流部分のクローニング
上記実施例４−（１）で得た塩基配列をもとに上流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドＴｃｅ０１（配列表の配列番号１９）および下流をクローニングするためのオリゴヌクレオチドＴｃｅ０２（配列表の配列番号２０）を合成した。
次に実施例２で調製したサーモコッカス  セラー由来ゲノムＤＮＡ１ｎｇを鋳型にして、１０ｐｍｏｌのＴｃｅ０１またはＴｃｅｏ２と各１０ｐｍｏｌの実施例３−（２）表１記載の３２種類のプライマーとの組み合わせで、実施例３−（２）記載の方法と同様にＰＣＲならびに精製操作を行った。得られた増幅産物についてダイレクトシークエンシングを行い、目的のＤＮＡポリメラーゼの上流領域を含む断片をスクリーニングした。その結果、約６５０ｂｐのＰＣＲ増幅断片Ｔｃｅ０１３ＣにＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の上流、約６５０ｂｐのＰＣＲ増幅断片Ｔｃｅ０２２ＦにＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の下流が含まれていることがわかった。【００６３】
（３）ＤＮＡポリメラーゼ発現させるためのプラスミドの構築
実施例４−（２）で得られた配列をもとに配列表の配列番号２１及び２２記載のオリゴヌクレオチドＴｃｅＮｄｅおよびＴｃｅＢｇＰｓを合成した。
実施例２で調製したサーモコッカス  セラー由来ゲノムＤＮＡ１００ｎｇを鋳型にして２０ｐｍｏｌのＴｃｅＮｄｅと２０ｐｍｏｌのＴｃｅＢｇＰｓをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行なった。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼとしてパイロベスト（タカラバイオ社製）を添付のプロトコールに従って用い、９４℃  ３０秒、５０℃  ３０秒、７２℃  ２分を１サイクルとする、４０サイクル反応を行った。得られた約２．３ｋｂのＤＮＡ増幅断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢｇｌＩＩ（ともにタカラバイオ社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎｄ（ｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変換したもの）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込み、プラスミドｐＴｃｅ１９を作製した。当該プラスミドは、ｐＴｃｅ１９と命名、表示され、平成１６年５月１４日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３１１として寄託されている。【００６４】
（４）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
上記ｐＴｃｅ１９の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、目的のＤＮＡポリメラーゼをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号２３に示す。また、該塩基配列から推定されるＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号２４に示す【００６５】
（５）サーモコッカス  セラー  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現
ｐＴｃｅ１９で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を実施例３−（６）記載の方法で培養し、遠心分離によって集めた菌体を６４μｌのソニケーションバッファーに懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を８０℃、１０分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、熱処理上清液を得た。
上記得られた熱処理上清液について、実施例１に記載の方法により酵素活性を測定した結果、ＤＮＡポリメラーゼ活性が認められた。【００６６】
（６）精製ＤＮＡポリメラーゼ標品の調製
上記ｐＴｃｅ１９で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を実施例３―（７）記載の方法で培養した。精製はヘパリン−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア  バイオテク社製）を用いて０〜７００ｍＭ  ＫＣｌ直線濃度勾配により溶出するまでは実施例３−（７）と同様にして行った。
溶出したＤＮＡポリメラーゼ画分は、さらに０．３Ｍ  塩化ナトリウムを含むバッファーＣ  １リットルを外液として、２時間の透析を２回、一晩の透析を１回行なった。透析後の酵素液９５ｍｌを０．３Ｍ塩化ナトリウムを含むバッファーＣで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘＧ２００（ファルマシア  バイオテク社製）に供し、０．３Ｍ塩化ナトリウムを含むバッファーＣで溶出した。
溶出したＤＮＡポリメラーゼ画分をバッファーＤ  １リットルを外液として、２時間の透析を２回、一晩の透析を１回行なった。透析後の酵素液４５ｍｌをバッファーＤで平衡化したＱ−セファロース（ファルマシア  ファルマシア  バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜３００ｍＭ  ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。
この画分を保存バッファー  １リットルを外液として、２時間の透析を２回、一晩の透析を１回行なった。こうして得られたＤＮＡポリメラーゼをＴｃｅ  ＤＮＡポリメラーゼ標品とした。
上記で得られたＴｃｅ  ＤＮＡポリメラーゼ標品を用いて、実施例１に記載した方法により酵素活性を測定した結果、Ｔｃｅ  ＤＮＡポリメラーゼ標品にＤＮＡポリメラーゼ活性が確認できた。【００６７】
実施例５
（１）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子中央部のクローニング
様々な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の間で保存されている部分をもとにして配列表の配列番号１７、２、３、４、１８記載のオリゴヌクレオチドＴＰＰｏｌＢＦ１、ＴＰＰｏｌＢＦ５、ＴＴＰｏｌＢＲ１、ＴＴＰｏｌＢＲ４並びにＴＴＰｏｌＢＲ５を合成した。
次に実施例２で調製したサーモコッカス  スクリ由来ゲノムＤＮＡ２５０ｎｇを鋳型にして、５０ｐｍｏｌのＴＰＰｏｌＢＦ１と５０ｐｍｏｌのＴＴＰｏｌＢＲ４、５０ｐｍｏｌのＴＰＰｏｌＢＦ１と５０ｐｍｏｌのＴＴＰｏｌＢＲ５、５０ｐｍｏｌのＴＰＰｏｌＢＦ５と５０ｐｍｏｌのＴＴＰｏｌＢＲ１のプライマーの組み合わせで、１００μｌの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件並びに精製操作は、実施例３−（１）記載のものと同様にして行った。得られた約１．２ｋｂのＴＰＰｏｌＢＦ１−ＴＴＰｏｌＢＲ４、約１ｋｂのＴＰＰｏｌＢＦ１−ＴＴＰｏｌＢＲ５、約２ｋｂ  ＴＰＰｏｌＢＦ５−ＴＴＰｏｌＢＲ１の各増幅断片についてダイレクトシークエンシングを行い、塩基配列を決定した。その結果、サーモコッカス  スクリ  ＤＮＡポリメラーゼがインテイン配列を含むことが明らかになった。【００６８】
（２）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子上流および下流部分のクローニング
上記実施例５−（１）で得た塩基配列をもとに上流をクローニングするための特異的なオリゴヌクレオチドＴｓｉ０１（配列表の配列番号２５）および下流をクローニングするためのオリゴヌクレオチドＴｓｉ０６（配列表の配列番号２６）を合成した。
次に実施例２で調製したサーモコッカス  スクリ由来ゲノムＤＮＡ１ｎｇを鋳型にして、１０ｐｍｏｌのＴｓｉ０１またはＴｓｉ０６と各１０ｐｍｏｌの表１記載３２種類のプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件ならびに精製操作は実施例３−（２）と同様にして行った。得られた増幅断片は、ダイレクトシークエンシングを行い、ＤＮＡポリメラーゼの上流含む断片をスクリーニングした。その結果、約２９００ｂｐのＴｓｉ０１１Ａ断片にＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の上流、約４００ｂｐのＴｓｉ０６５Ｂ断片にＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の下流が含まれていることがわかった。【００６９】
（３）ＤＮＡポリメラーゼ発現させるためのプラスミドの構築
サーモコッカス  スクリ  ＤＮＡポリメラーゼの配列中に１箇所インテイン配列を含むことが明らかになった。そこで、インテイン配列除去したＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を構築した。
すなわち、実施例５−（２）で得られた配列をもとに配列表の配列番号２７〜３０記載のオリゴヌクレオチドＴｓｉＮｄｅ、ＴｓｉＡ、ＴｓｉＢおよびＴｓｉＢａｍＰｓｔを合成した。
実施例２で調製したサーモコッカス  スクリ由来ゲノムＤＮＡ１００ｎｇを鋳型にして２０ｐｍｏｌのＴｋｓＮｄｅと２０ｐｍｏｌのＴｓｉＢ（ＴｓｉＩ）２０ｐｍｏｌのＴｓｉＡと２０ｐｍｏｌのＴｓｉＢａｍＰｓｔ（ＴｓｉＩＩ）のプライマー組み合わせで、１００μｌの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は実施例５−（２）と同様にして行い、約１．５ｋｂのＴｓｉＩ、約０．９ｋｂのＴｓｉＩＩＤＮＡ断片を得た。さらに、同様の方法で上記ＰＣＲ反応液ＴｓｉＩ  １μｌとＰＣＲ反応液ＴｓｉＩＩ  １μｌを混ぜたものを鋳型にして、２０ｐｍｏｌのＴｓｉＮｄｅと２０ｐｍｏｌのＴｓｉＢａｍＰｓｔ）プライマーを用いて、１００μｌの容量でＰＣＲを行い、約２．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。
得られた約２．４ｋｂのＤＮＡ断片は、制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化した後、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで消化したｐＴＶ１１９Ｎｄ（ｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変換したもの）とライゲーションし、プラスミドｐＴｓｉ１６を構築した。当該プラスミドは、ｐＴｓｉ１６と命名、表示され、平成１６年５月１４日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ  ＢＰ−１０３１０として寄託されている。【００７０】
（４）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
実施例５−（３）で得られたｐＴｓｉ１６の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＤＮＡポリメラーゼをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号３１に示す。また、該塩基配列から推定されるＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号３２に示す。【００７１】
（５）サーモコッカス  スクリ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現
プラスミドｐＴｓｉ１６で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を実施例３−（６）記載の方法で培養し、遠心分離によって集めた菌体を５２μｌのソニケーションバッファーに懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を８０℃、１０分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、熱処理上清液を得た。
上記で得られた熱処理上清液について、実施例１に記載の方法により酵素活性を測定した結果、ＤＮＡポリメラーゼ活性が認められた。【００７２】
（６）精製ＤＮＡポリメラーゼ標品の調製
プラスミドｐＴｓｉ１６で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を実施例３−（７）記載の方法で培養した。精製は実施例３−（７）と同様にして行った。
こうして得られたＤＮＡポリメラーゼをＴｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼ標品とした。得られたＴｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼ標品を用いて、実施例１に記載されている方法で活性を測定した結果、Ｔｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼ標品にＤＮＡポリメラーゼ活性が確認できた。【００７３】
実施例６
（１）各種ＤＮＡポリメラーゼの取込および伸長活性
Ｔｋｓ、Ｔｃｅ及びＴｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼの取込および伸長活性を測定した。対照として市販のＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いた。
鋳型として、取込活性を測定する場合は１μｇ活性型仔牛胸腺ＤＮＡを用いた。また、伸長活性を測定する場合は１μｇＭ１３ファージの１本鎖ＤＮＡとこれに相補的な１ｐｍｏｌの、配列表の配列番号３３記載のＨＴプライマーをアニーリングさせたもの（Ｍ１３／ＨＴ  Ｐｒｉｍｅｒ）を用いた。緩衝液は、１ｍＭ  塩化マグネシウムを含むＫＯＤ＃１バッファーを用いた。ＤＮＡポリメラーゼの活性測定は、以下の方法で行った。
すなわち、活性を測定しようとする酵素試料、上記鋳型、４０μＭ  ｄＮＴＰ、０．２３８μＭ  「３Ｈ」ｍｅｔｈｙｌ−ＴＴＰ（アマシャム社製）、１ｍＭ  塩化マグネシウムを含むＫＯＤ＃１バッファー（東洋紡社製）５０μｌで、７５℃、５分間反応させた。反応液のうち４０μｌをＤＥ８１ペーパー（ワットマン社製）にスポットし、５％Ｎａ２ＰＯ４で４回洗浄を行った後にＤＥ８１ペーパー上に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。上記の酵素活性測定方法によって３０分間に１０ｎｍｏｌのｄＮＭＰを基質ＤＮＡに取り込む酵素量を酵素１Ｕとした。その結果を表２に示す。表２中、「取込」は鋳型となる核酸中のニック部位に対する取り込み能力を示し、「伸長」は鋳型となる核酸にアニーリングしたプライマーからの伸長のための取り込み能力を示す。【００７４】
【表２】
0004685768.tif 000003
【００７５】
表２に示したようにＴｋｓ、Ｔｃｅ及びＴｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＫＯＤ＃１バッファー中において鋳型ＤＮＡへの核酸の取り込みよりもプライマー伸長のための取り込みの方が活性が高いことが確認できた。また、対照となるＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼと比較しても、プライマー伸長のための取り込みが非常に高いことが確認できた。このことから本発明のＤＮＡポリメラーゼは、プライマー伸長に非常に適していることが確認できた。【００７６】
（２）Ｍ１３の１本鎖ＤＮＡに対する親和性
Ｔｋｓ、Ｔｃｅ及びＴｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼの取込およびＭ１３の１本鎖ＤＮＡポリメラーゼに対する親和性を調べた。対照として、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた。
鋳型として、様々な濃度のＭ１３の１本鎖ＤＮＡを用いた。プライマーとしてこれに相補的な１ｐｍｏｌのＨＴプライマーを使用した。緩衝液は１ｍＭ塩化マグネシウムを含むＫＯＤ＃１バッファーを用いた。ＤＮＡポリメラーゼ活性測定は、上記実施例６−（１）記載の方法で測定した。その結果を表３に示す。【００７７】
【表３】
0004685768.tif 000004
【００７８】
表３に示したように本発明のＴｋｓ、Ｔｃｅ及びＴｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼよりＭ１３の１本鎖ＤＮＡに対する親和性が非常に高いことが確認できた。このことから本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲの検出感度という観点においてＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼより優れていることが示唆された。【００７９】
（３）Ｔｋｓ及びＴｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼのＦｉｄｅｌｉｔｙ
Ｔｋｓ、Ｔｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼのＦｉｄｅｌｉｔｙを調べた。対照として、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（いずれも東洋紡社製）及びＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いた。
鋳型としてサーマス  サーモフィラス  ＨＢ８  ゲノムＤＮＡ（タカラバイオ社製）を使用した。また、配列表の配列番号３４及び３５記載のｃ２８０／ＲＧ３４−Ｆ及びＲプライマーを使用した。【００８０】
Ｆｉｄｅｌｉｔｙの測定は、以下の方法で行った。すなわち、サーマス  サーモフィラス  ＨＢ８  ゲノムＤＮＡ  １０ｎｇを鋳型にして、上記ｃ２８０／ＲＧ３４−Ｆ及びＲプライマーとの組み合わせ、５０μｌの容量でＰＣＲを行った。上記プライマー対で増幅する領域はＧＣ含量が７０％と高いため、ＤＭＳＯを濃度２％となるよう添加した。Ｔｋｓ、Ｔｓｉ並びにＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は、ＫＯＤ  ｐｌｕｓバッファーを使用し、その添付のプロトコールに従って用いた。また、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合は、ＫＯＤ＃１バッファーを使用し、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ添付のプロトコールに従って用いた。さらにＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼは、添付の緩衝液及びプロトコールに従って行った。ＰＣＲ条件は、９６℃  ２分インキュベートした後、９８℃  ５秒、６８℃  ３０秒を１サイクルとした、３０サイクル反応を行った。反応終了後、等量の１００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液（２５：２４：１、ｖ／ｖ）を加えて混合した後、１０分間遠心（１００００×ｇ）を２回行った。遠心終了後、得られた上清をクロロホルム／イソアミルアルコール混合液（２４：１、ｖ／ｖ）を加えて混合した後、１０分間遠心（１００００×ｇ）を行った。得られた上清をエタノール沈殿後、２０μｌのＨ２Ｏに溶解して約０．５ｂｐのＤＮＡ断片を得た。  ８μｌの約０．５ｂｐのＤＮＡ断片をＴａＫａＲａ  ＢＫＬ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）のプロトコールに従って処理した後、得られた溶液５μｌで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換体を培養し、約５００ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたクローン１２−２４クローンについて塩基配列を決定し、読み取った総塩基数に対する変異塩基数の比を求めＦｉｄｅｌｉｔｙとした。その結果を表４に示す。【００８１】
【表４】
0004685768.tif 000005
【００８２】
表４に示したように本発明のＴｋｓ及びＴｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＫＯＤ、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ並びにＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼのいずれよりも変異の頻度が少ないことが確認できた。このことから、ＫＯＤ、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ並びにＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼよりもクローニング用酵素として優れていることが明らかになった。【００８３】
（４）Ｔｋｓ及びＴｃｅ  ＤＮＡポリメラーゼのＦｉｄｅｌｉｔｙ
Ｔｋｓ及びＴｃｅ  ＤＮＡポリメラーゼのＦｉｄｅｌｉｔｙを調べた。対照として、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（いずれも東洋紡社製）及びＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いた。
鋳型としてサーマス  サーモフィラス  ＨＢ８  ゲノムＤＮＡ（タカラバイオ社製）を使用した。また、配列表の配列番号３６及び３７記載のｃ２４０／ＲＡ１８−Ｆ及びＲプライマーを使用した。【００８４】
Ｆｉｄｅｌｉｔｙの測定は、サーマス  サーモフィラス  ＨＢ−８  ゲノムＤＮＡ  １０ｎｇを鋳型にして、上記ＴＥＭＰ１０−Ｆ及びＲプライマーとの組み合わせ、５０μｌの容量でＰＣＲを行った。上記プライマー対で増幅する領域のＧＣ含量は７０％と高いため、ＤＭＳＯを濃度２％となるよう添加した。緩衝液は、ＫＯＤ＃１バッファーを使用し、その添付のプロトコールに従って用いた。ＰＣＲ条件及びＦｉｄｅｌｉｔｙの算出方法は、上記実施例６−（３）記載の方法と同様にした。その結果を表５に示す。【００８５】
【表５】
0004685768.tif 000006
【００８６】
表５に示したように本発明のＴｋｓ及びＴｃｅ  ＤＮＡポリメラーゼは、ＫＯＤよりも変異の頻度が少ないことが確認できた。このことからもクローニング用酵素として優れていることが明らかになった。【００８７】
実施例７
（１）各種ＤＮＡポリメラーゼの至適温度
Ｔｋｓ、Ｔｃｅ及びＴｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼの至適温度を測定した。鋳型としては２０μｇ活性型仔牛胸腺ＤＮＡを用いた。また、緩衝液としてはＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼに添付のバッファーを用いた。ＤＮＡポリメラーゼの活性測定は、以下の方法で行った。
まず、活性を測定しようとする酵素試料５ｍＵ（実施例６−（１）に記載の取込活性の測定方法により算出）、上記鋳型、２００μＭ  ｄＡＴＰ、２００μＭ  ｄＧＴＰ、２００μＭ  ｄＣＴＰ、１００μＭ  ｄＴＴＰ、０．２０４μＭ  「３Ｈ」ｍｅｔｈｙｌ−ＴＴＰ（アマシャム社製）、１×Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼに添付のバッファー（タカラバイオ社製）を含む計５０μｌの反応液を調製した。次に、それぞれの酵素試料について、６５℃〜８５℃の所望の温度で５分間反応させた。反応液のうち４０μｌをＤＥ８１ペーパー（ワットマン社製）にスポットし、５％Ｎａ２ＰＯ４で４回洗浄を行った後にＤＥ８１ペーパー上に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。上記の活性測定方法で測定された活性と反応温度との関係を図１に示す。なお、図１では、８５℃での反応における活性を１００％としている。【００８８】
図１に示したように、Ｔｋｓ、Ｔｃｅ及びＴｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼは、活性型仔牛胸腺ＤＮＡを鋳型として用いた場合に７５℃〜８５℃の至適温度を持つ。【００８９】
（２）各種ＤＮＡポリメラーゼの至適ｐＨ
Ｔｋｓ、Ｔｃｅ及びＴｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼの至適ｐＨを測定した。鋳型としては１０μｇ活性型仔牛胸腺ＤＮＡを用いた。また、緩衝液としては、７５℃におけるｐＨがｐＨ５．０〜ｐＨ８．０の所望の値に調整された１２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用いた。ＤＮＡポリメラーゼの活性測定は、以下の方法で行った。
まず、活性を測定しようとする酵素試料０．０５Ｕ（実施例６−（１）に記載の取込活性の測定方法により算出）、上記鋳型、上記緩衝液、１０ｍＭ  ＫＣｌ、６ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．００１％  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４０μＭ  ｄＮＴＰ、０．２０４μＭ  「３Ｈ」ｍｅｔｈｙｌ−ＴＴＰ（アマシャム社製）を含む計５０μｌの反応液を調製した。次に、それぞれの酵素試料について、７５℃で５分間反応させた。反応液のうち４０μｌをＤＥ８１ペーパー（ワットマン社製）にスポットし、５％Ｎａ２ＰＯ４で４回洗浄を行った後にＤＥ８１ペーパー上に残存する放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。上記の活性測定方法で測定された活性とｐＨとの関係を図２に示す。なお、図２ではｐＨ６．０(７５℃)における活性を１００％としている。【００９０】
図２に示したように、Ｔｋｓ、Ｔｃｅ及びＴｓｉ  ＤＮＡポリメラーゼは、活性型仔牛胸腺ＤＮＡを鋳型として用いた場合にｐＨ５．５〜ｐＨ６．５（７５℃）の至適ｐＨを持つ。【００９１】
実施例８
本発明のＤＮＡポリメラーゼのＰＣＲ反応における性能を、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼと比較するために、λ−ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応を行った。Ｔｋｓ、Ｔｃｅ及びＴｓｉのＤＮＡポリメラーゼ用の反応液組成は１×ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼに添付の緩衝液、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４とし、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ用の反応液組成は１×ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼに添付の緩衝液、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２とし、１ｎｇ／５０μｌ λ−ＤＮＡ（宝酒造社製）１０ｐｍｏｌ／５０μｌ  プライマーｌａｍｂｄａ−１、１０ｐｍｏｌ／５０μｌ  プライマーｌａｍｂｄａ−９Ｂ、０．６２５Ｕ／５０μｌＤＮＡポリメラーゼ を含む反応液５０μｌを調製した。【００９２】
プライマーｌａｍｂｄａ−１、およびプライマーｌａｍｂｄａ−９Ｂの塩基配列を配列表の配列番号３８、および配列番号３９にそれぞれ示す。上記の反応液について９８℃、１０秒〜６８℃、１０分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲ反応を行った後、反応液のうちの３μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅されたＤＮＡ断片を確認した。この結果、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたものではＤＮＡ断片の増幅が認められなかった。これに対し、Ｔｋｓ、Ｔｃｅ及びＴｓｉＤＮＡポリメラーゼでは、いずれのＤＮＡポリメラーゼを用いた場合においても、約１２キロ塩基対のＤＮＡ断片の増幅が確認された。【００９３】
次に、プライマーをプライマーｌａｍｂｄａ−１、及びプライマーｌａｍｂｄａ−１０Ｄに変更して実験を行った。プライマーλ１０Ｄの塩基配列を配列表の配列番号４０に示す。上記同様の反応液組成で１ｎｇ／５０μｌ λ−ＤＮＡ（宝酒造社製）１０ｐｍｏｌ／５０μｌ  プライマーｌａｍｂｄａ−１、１０ｐｍｏｌ／５０μｌ  プライマーｌａｍｂｄａ−１０ｄ、０．６２５Ｕ／５０μｌＤＮＡポリメラーゼ を含む反応液５０μｌを調製した。上記の反応液について９８℃、１０秒〜６８℃、１０分を１サイクルとした３０サイクルのＰＣＲ反応を行った後、反応液のうちの３μｌをアガロースゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイド染色によって増幅されたＤＮＡ断片を確認した。この結果、ＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼを用いたものではＤＮＡ断片の増幅が認められなかった。これに対し、Ｔｋｓ、Ｔｃｅ及びＴｓｉＤＮＡポリメラーゼでは、いずれのＤＮＡポリメラーゼを用いた場合においても、約１５キロ塩基対のＤＮＡ断片の増幅が確認された。【００９４】
実施例８
（１）マウスハイブリドーマ細胞系の作成
実施例２で調製したＴｋｓ ＤＮＡポリメラーゼ標品２１０μｇ（１００μｌ）、実施例４で調製したＴｃｅ ＤＮＡポリメラーゼ標品２１０μｇ（１００μｌ）実施例６で調製したＴｓｉ ＤＮＡポリメラーゼ標品２００μｇ（１００μｌ）のそれぞれにＰＢＳ ８００μｌを加え、フロイント・コンプリート・アジェバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂ．社製）１ｍｌと共にエマルジョン化させ、抗原調整物とした。これらの抗原調製物をそれぞれＢａｌｂ／ｃマウス（１０週齢のメス、日本クレア製）４匹ずつに等分して腹腔内投与した。この２週間後と５週間後に、前記と同量のＤＮＡポリメラーゼ標品にＰＢＳ ９００μｌ、リビ・アジュバント（ＲＩＢＩ社製）を加えた抗原調製物を調製し、各マウスに等分して腹腔内投与し追加免疫を行った。さらに、初回の抗原投与から６週間後に、前記と同量の各ＤＮＡポリメラーゼ標品にＰＢＳ ９００μｌを加えた抗原調整物を作製し、各群のマウスに等分して腹腔内投与し、最終免疫した。【００９５】
最終免疫の３日後に免疫動物２匹より脾臓を摘出し、５０％ポリエチレングリコール存在下にてＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１マウスエミローマ細胞と細胞融合した。得られた細胞は９６ウェルプレート１０枚に分注して培養した。【００９６】
（２）ハイブリドーマ細胞系のスクリーニング
実施例８−（１）で抗原に用いた各ＤＮＡポリメラーゼ標品の溶液（５μｇ／ｍｌ）を使用し、各ＤＮＡポリメラーゼでコートされた９６ウェルプレートを作製した。上記の細胞融合で得られた細胞のうち、細胞の成育の見られたウェルより上清を採取し、前記のＤＮＡポリメラーゼコートプレート上でＥＬＩＳＡ法を実施して培養上清中の抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体の有無を検定した。各ＤＮＡポリメラーゼを抗原として得られた、９００株以上の細胞株についてこの検定を実施した。この操作により抗体の産生があると判定された株（Ｔｋｓ ＤＮＡポリメラーゼ：９５株、Ｔｃｅ ＤＮＡポリメラーゼ：１０３株、Ｔｓｉ ＤＮＡポリメラーゼ：６１株）を選択した。【００９７】
選択した細胞株を元株細胞として培養し、その培養上清について、各ＤＮＡポリメラーゼの４２℃におけるポリメラーゼ活性の阻害を確認した。阻害活性の測定は、各ハイブリドーマの培養上清中のＩｇＧを結合させた抗マウスＩｇＧマグネットビーズ（Dynabeads M-280 Sheep anti-Mouse IgG、ダイナル バイオテック社製）とＤＮＡポリメラーゼとを室温で１０分間インキュベートした後、４２℃でＤＮＡポリメラーゼ活性を測定し、ＤＮＡポリメラーゼ単独でのＤＮＡポリメラーゼ活性測定結果と比較するという方法で行った。その結果、Ｔｋｓ ＤＮＡポリメラーゼ：１８株、Ｔｃｅ ＤＮＡポリメラーゼ：２８株、Ｔｓｉ ＤＮＡポリメラーゼ：１１株の培養上清でＤＮＡポリメラーゼ活性の阻害が確認された。これらの細胞株について、限界希釈法によりクローニングを実施した。【００９８】
クローン化された細胞の培養上清について、各ＤＮＡポリメラーゼの４２℃におけるポリメラーゼ活性の阻害を確認した。ポリメラーゼ活性を９５％以上阻害するハイブリドーマクローン株として、Ｔｋｓ ＤＮＡポリメラーゼ：１株、Ｔｃｅ ＤＮＡポリメラーゼ：２株、Ｔｓｉ ＤＮＡポリメラーゼ：２株が選択された。これらのハイブリドーマクローン株が産生する抗体のアイソタイプを検討したところ、Ｔｋｓ、Ｔｃｅ ＤＮＡポリメラーゼに対する抗体はＩｇＧ２ｂタイプ、Ｔｓｉ ＤＮＡポリメラーゼに対する抗体はＩｇＧ１タイプとＧ２ｂタイプのものであった。なお、これらのハイブリドーマの培養上清より調製した抗体を９４℃、５分加熱した場合にはＤＮＡポリメラーゼを阻害する活性は完全に消失した。したがって、これらの抗体は低温時特異的に耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの活性を阻害できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明により、クローニング、シークエンシング、核酸増幅のいずれにおいても有用なＦｉｄｅｌｉｔｙが高く、プライマー伸長に適したＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチド並びに該ポリペプチドをコードする遺伝子ならびに当該ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法が提供される。本発明のＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを用いることにより、例えば、ＰＣＲにおいて多サイクル数であっても、エラー率の少ない増幅産物を得ることができる。従って、コピー数の少ない標的核酸の解析・同定において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１００】
SEQ ID No:1; Designed oligonucleotide primer TPPolBF4 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No:2; Designed oligonucleotide primer TPPolBF5 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No:3; Designed oligonucleotide primer TTPolBR1 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No:4; Designed oligonucleotide primer TTPolBR4 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No:5; Designed oligonucleotide primer Tks01 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1
SEQ ID No:6; Designed oligonucleotide Tag sequence region to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No:7; Designed oligonucleotide primer Tks04 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1
SEQ ID No:8; Designed oligonucleotide primer Tks02 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1
SEQ ID No:9; Designed oligonucleotide primer TksNde to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1
SEQ ID No:10; Designed oligonucleotide primer Tks1EndBg to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1
SEQ ID No:11; Designed oligonucleotide primer Tks2StaBg to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1
SEQ ID No:12; Designed oligonucleotide primer Tks2EndBal to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1
SEQ ID No:13; Designed oligonucleotide primer Tks3StaBal to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1
SEQ ID No:14; Designed oligonucleotide primer TksBgPs to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp. KS-1
SEQ ID No:17; Designed oligonucleotide primer TPPolBF1 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No:18; Designed oligonucleotide primer TTPolBR5 to amplify a genomic DNA of Thermococcus sp.
SEQ ID No:19; Designed oligonucleotide primer Tce01 to amplify a genomic DNA of Thermococcus celer
SEQ ID No:20; Designed oligonucleotide primer Tce02 to amplify a genomic DNA of Thermococcus celer
SEQ ID No:21; Designed oligonucleotide primer TceNde to amplify a genomic DNA of Thermococcus celer
SEQ ID No:22; Designed oligonucleotide primer TceBgPs to amplify a genomic DNA of Thermococcus celer
SEQ ID No:25; Designed oligonucleotide primer Tsi01 to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi
SEQ ID No:26; Designed oligonucleotide primer Tsi06 to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi
SEQ ID No:27; Designed oligonucleotide primer TsiNde to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi
SEQ ID No:28; Designed oligonucleotide primer TsiA to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi
SEQ ID No:29; Designed oligonucleotide primer TsiB to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi
SEQ ID No:30; Designed oligonucleotide primer TsiBamPst to amplify a genomic DNA of Thermococcus siculi
SEQ ID No:33; Designed oligonucleotide primer HT to amplify a genomic DNA of M13SEQ ID No:34; Designed oligonucleotide primer c280/RG34-F to amplify a genomic DNA of Thermus thermophilus HB-8
SEQ ID No:35; Designed oligonucleotide primer c280/RG34-R to amplify a genomic DNA of Thermus thermophilus HB-8
SEQ ID No:36; Designed oligonucleotide primer c240/RA18-F to amplify a genomic DNA of Thermus thermophilus HB-8
SEQ ID No:37; Designed oligonucleotide primer c240/RA18-R to amplify a genomic DNA of Thermus thermophilus HB-8
SEQ ID No:38; Designed oligonucleotide primer lambda-1 to amplify a DNA of bacteriophage lambda
SEQ ID No:39; Designed oligonucleotide primer lambda-9B to amplify a DNA of bacteriophage lambda
SEQ ID No:40; Designed oligonucleotide primer lambda-10D to amplify a DNA of bacteriophage lambda
【図１】
0004685768.tif 000007
【図２】
0004685768.tif 000008
【配列表】
0004685768000001.app