(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）テンプレートにプライマーをハイブリダイズさせた基質、金属イオン及び逆転写酵素をインキュベーションして複合体を形成する工程、
（b）工程（a）の後に被検物質を添加し、インキュベーションする工程、
（c）工程（b）の後にdNTPsを添加し、DNA合成反応を開始させる工程、
（d）テンプレートから切断された核酸量を測定する工程、及び、
（e）該測定値を被検物質非存在下での測定値と比較する工程を含み、
該テンプレートが、５’−ＮＲＷＸＺ− ３’であり、該プライマーが３’−Ｙ− ５’であるか、又は
該テンプレートが、５’−ＮＲＷＸ− ３’であり、該プライマーが３’−ＹＺ− ５’であり、
ここで、
Ｎは１３〜１９ｍｅｒのDNA、RNA又はキメラ核酸、
ＲはRNA、
ＷはDNA又はキメラ核酸、
Ｘは１５ｍｅｒ以上のDNA、RNA又はキメラ核酸、
Ｙは、テンプレートのＸにハイブリダイズし、Ｘと同じ長さのDNA、RNA又はキメラ核酸であり、
Ｙのヌクレオチドの糖は、ハイブリダイズする際に対となるＸのヌクレオチドの糖と同じであり、
ＺはDNA、RNA又はキメラ核酸
（但し、WとＺは無くてもよい）である、
逆転写酵素のRNase H阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項２】
（a）テンプレートの３’末端とプライマーの５’末端がリン酸ジエステル結合により結合して一本鎖となっている基質、金属イオン及び逆転写酵素をインキュベーションして複合体を形成する工程、
（b）工程（a）の後に被検物質を添加し、インキュベーションする工程、
（c）工程（b）の後にdNTPsを添加し、DNA合成反応を開始させる工程、
（d）テンプレートから切断された核酸量を測定する工程、及び、
（e）該測定値を被検物質非存在下での測定値と比較する工程を含み、
該一本鎖の基質は、５’−ＮＲＷＸＺＹ−３’であり、
ここで、
Ｎは１３〜１９ｍｅｒのDNA、RNA又はキメラ核酸、
ＲはRNA、
ＷはDNA又はキメラ核酸、
Ｘは１５ｍｅｒ以上のDNA、RNA又はキメラ核酸、
Ｙは、Ｘにハイブリダイズし、Ｘと同じ長さのＤＮＡ、ＲＮＡ又はキメラ核酸であり、
Ｙのヌクレオチドの糖は、ハイブリダイズする際に対となるＸのヌクレオチドの糖と同じであり、
ＺはDNA、RNA又はキメラ核酸
（但し、WとＺは無くてもよい）である、
逆転写酵素のRNase H阻害剤のスクリーニング方法。
【請求項３】
ＮがRNA、Ｗが無く、ＸがRNA、ＹがRNAである、請求項１または２記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
ＮがRNA、Ｗが無く、ＸがDNA、ＹがDNAである、請求項１または２記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
Ｘが１８ｍｅｒ以上のDNA、RNA又はキメラ核酸である、請求項１〜３いずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
該金属イオンがMg2+又はMn2+である請求項１〜３いずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
工程（c）で、逆転写酵素、基質及び金属イオンの複合体の形成阻害剤をdNTPsと共に添加する請求項１または２記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
該形成阻害剤がへパリンである、請求項７記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
テンプレートが、５’末端又は３’末端が標識されたものである、請求項１または２記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
該逆転写酵素がウイルスの逆転写酵素である、請求項１または２記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
該ウイルスがHIVである請求項１０記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
該逆転写酵素がＹ１８８Ｌ耐性変異酵素である、請求項１０記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、逆転写酵素の活性を阻害する化合物の探索手段に関する。より詳しくは、逆転写酵素のH型RNA分解酵素（RNase H）阻害剤のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エイズ（AIDS）は現在でも人類の主な死因である。この病原体であるレトロウイルスは、逆転写酵素、インテグレース及びプロテアーゼの３つのウイルス特異的酵素を利用して宿主細胞内で増殖する。そのため、従来、レトロウイルスが原因とされる病気の予防剤及び治療剤を開発する目的で、ウイルスの特異的酵素の活性を阻害する化合物の探索が求められてきた。【０００３】
レトロウイルスの特異的酵素の１つである逆転写酵素は、核酸結合部位において二重鎖の核酸と結合し、RNAをテンプレートとしてDNAを合成することができるという点に特徴のある酵素として知られており、ポリメレース活性とRNase H活性という２つの酵素活性を持つ。ポリメレースの活性中心とRNase Hの活性中心間の距離は約１８ヌクレオチドであるが、核酸の配列によって約１４〜２０ヌクレオチドと多様であると推定されている（非特許文献１参照）。ポリメレース活性ドメインとRNase H活性ドメインのそれぞれのドメインに２価の金属イオンが結合すると活性が発現し、ポリメレース活性部位においてRNAテンプレートが逆転写され、RNase H活性部位においてRNA：DNAヘテロ二重鎖のRNAが加水分解により切断される。【０００４】
逆転写酵素のポリメレース活性はDNA合成を行う反応であり、DNA合成反応開始にテンプレート及びプライマーを必要とするが、該テンプレート及びプライマーはRNAでもDNAでも使用することが可能である。また、RNase H活性には、（ｉ）ポリメレースによるDNA合成に伴ってテンプレートのRNAを切断するという、ポリメレース依存的RNase H活性と、（ｉｉ）ポリメレースによるDNA合成を伴わず、逆転写酵素が二重鎖の核酸と結合した際にRNase H活性部位にRNA：DNAヘテロ二重鎖が存在するとRNAを切断するという、ポリメレース非依存的RNase H活性が存在する（非特許文献２参照）。【０００５】
現在認可されている逆転写酵素阻害剤である抗レトロウイルス薬は、全てポリメレース活性部位又は非核酸系阻害剤結合部位に結合し、ポリメレース活性を阻害する化合物である（非特許文献３参照）。すなわち、RNase H活性を阻害する化合物は新規作用機作の抗ウイルス薬となる可能性があり、逆転写酵素のポリメレース阻害剤、インテグレース阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤の全ての耐性ウイルスに対して効力を持つことが期待される。現在までに、HIV逆転写酵素のポリメレース活性を阻害すること無くRNase H活性を特異的に阻害する化合物として、4-[5-（ベンゾイルアミノ）チエン-2-イル]- 2,4-ジオキソブタン酸（非特許文献４参照）が報告されているが、この化合物は感染系アッセイにおいてはウイルス増殖を阻害することが出来ない。その他、マプシン類縁体の中にRNase H活性を阻害し、かつ、感染系アッセイにおいてもウイルス増殖を阻害することが出来る化合物が存在することが報告されている（特許文献１参照）。【０００６】
RNase H活性を阻害する逆転写酵素阻害剤をスクリーニングするためにはRNase H活性を測定する必要がある。これまで報告のあるRNase H活性測定法は、テンプレートとしてRN Aを、プライマーとしてDNAを用い、両者をハイブリダイズすることによりRNA：DNAヘテロ二重鎖を作製し、金属イオン存在下で酵素の基質とするものであった（非特許文献５参照）。この方法をスクリーニング方法として応用し、基質、金属イオン及び被検物質に逆転写酵素を加えて酵素反応を開始させるアッセイ系が使用されている（特許文献１参照）が、この条件下では、逆転写酵素‐基質複合体（テンプレートにプライマーをハイブリダイズさせた基質と逆転写酵素の複合体）が形成されるとすぐ、逆転写酵素のRNase H活性によりテンプレートが切断される。テンプレートが切断されると酵素が基質から離れ、ターンオーバーして別の基質と結合する。そのため、逆転写酵素阻害剤の候補物質として見出された被検物質の作用点について複数の可能性が考えられ、区別するためには更なる実験が必要となる。また、テンプレートが切断されるRNaseH反応は非常に速やかであるため、被検物質が逆転写酵素−基質複合体に対して結合することでRNase H活性を阻害する働きを持っている場合、逆転写酵素−基質複合体に対して結合する時間が十分に無い。さらに、逆転写酵素−基質複合体形成反応は酵素反応より時間がかかることから、RNase H阻害物質よりも逆転写酵素−基質複合体形成阻害物質の方が見出される可能性が高く、RNase H阻害剤のスクリーニング方法としては非常に効率が悪い。【０００７】
これらの欠点を補うために、RNase H活性の発現に必須の金属イオン非存在下で逆転写酵素、基質及び被検物質をプレインキュベーションした後、金属イオンを加えて酵素反応を開始させるアッセイ系が考えられた（非特許文献４及び非特許文献６参照）。しかし、このアッセイ系では、逆転写酵素−基質複合体を形成する際に金属イオンが存在しない状態であり、本来宿主細胞内で形成される複合体が形成されていない状態で化合物とプレインキュベーションを行っていることになる。そのため、このアッセイ系で得られる化合物は宿主細胞内では機能しない可能性がある。【０００８】
逆転写酵素のRNase H活性についてはまだ不明な点も多く、宿主細胞内での逆転写反応をin vitroで再現することにより、その反応機構を解明しようという研究がされている。その中には、テンプレートとしてRNAとDNAのキメラ核酸、プライマーとしてDNAを使用し、宿主細胞内での逆転写反応をin vitroで再現した文献がある（非特許文献７参照）。なお、本文献では、テンプレート及びプライマーの配列はウイルスが持つ配列であり、プレインキュベーションの概念が開示されておらず、薬剤のスクリーニング等を示唆していない。
【特許文献１】国際公開第０３／１０３６１０号パンフレット
【非特許文献１】C. Palaniappanら、ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７２巻、１１１５７−１１１６４頁（１９９７）
【非特許文献２】Arts, E. J.ら、プログレス  イン  ヌクレイック  アシッド  リサーチ  アンド  モレキュラー  バイオロジー (Prog Nucleic Acid Res Mol Biol.)、第５８巻、３３９−３９３頁（１９９８）
【非特許文献３】Parniak, M. A.ら、アドバンスト  ファーマコロジー(Adv. Pharmacol.)、第４９巻、６７−１０９頁（２０００）
【非特許文献４】C. A. Shaw-Reidら、ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７８巻、２７７７−２７８０頁（２００３）
【非特許文献５】P. Rychetskyら、アナリティカル  バイオケミストリー(Anal. Biochem.)、第２３９巻、１１３−１１５頁（１９９６）
【非特許文献６】C. Palaniappanら、ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７０巻、４８６１−４８６９頁（１９９５）
【非特許文献７】M. J. Rothら、ジャーナル  オブ  ビロロジー（J. Virol.）、７４巻、９６６８−９６７９頁（２０００）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記従来法の欠点を克服したRNase H阻害剤のスクリーニング方法を提供することを目的とする。具体的には、本来宿主細胞内で形成される機能的逆転写酵素‐基質複合体に対して作用する阻害剤の検出感度を向上させた新しいRNase H阻害剤のスクリーニング方法を提供する。本発明は、かかるスクリーニング方法により、簡便かつ迅速にRNase H阻害剤をスクリーニングすることも１つの目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、鋭意研究の結果、本来宿主細胞内で形成される金属イオンが結合した逆転写酵素−基質複合体と被検物質をプレインキュベーションする必要性を考慮し、適切なテンプレートとプライマーを用いることにより、DNA合成反応（ポリメレース反応）及びRNaseH反応を起こさずに金属イオン存在下で逆転写酵素−基質複合体を形成させ、該複合体に対して被検物質をプレインキュベーションすることを可能とし、RNase H阻害剤のスクリーニング方法の検出感度向上に成功した。【００１１】
以下に本発明において使用される基質について記載する。【００１２】
本発明においては、逆転写酵素−基質複合体を形成する際に、該逆転写酵素のRNase H活性部位に該当する位置にRNA：RNA又はDNA：DNAのホモ二重鎖を持つような基質を使用する必要がある。例えば、二重鎖の部分が全てホモ二重鎖である基質を用いる。該基質を用いることにより、RNase H反応の開始を抑え、金属イオン存在下における被検物質及び逆転写酵素−基質複合体のプレインキュベーションが可能になった。【００１３】
また、dNTPsの添加によりポリメレース反応が進行し、逆転写酵素がテンプレートの5’末端まで進む。従って、本発明においては、逆転写酵素がテンプレートの5’末端まで進んだ際に、RNase H活性部位にテンプレートのRNA及びポリメレース反応によって合成されたDNAのヘテロ二重鎖が位置するようなテンプレートを使用する必要がある。【００１４】
該テンプレートを用いることにより、被検物質とのプレインキュベーション後、dNTPsを添加するとポリメレース反応が起こり、逆転写酵素が移動し、RNase H活性部位がRNA：DNAのヘテロ二重鎖部分に移動することにより、テンプレートが切断され、切断された核酸量を測定することによってRNase H活性阻害作用を検出することができる。【００１５】
上記基質を使用することにより、ポリメレース活性を阻害すること無くRNase H活性を特異的に阻害する化合物をスクリーニングすることが可能になる。【００１６】
また、RNaseHドメインに結合することでRNase H活性とポリメレース活性を同時に阻害する化合物も、新規作用機作の逆転写酵素阻害剤であり、本明細書内でRNase H阻害剤と記載する。しかし、RNase H阻害活性とポリメレース阻害活性が同等に現れるので、現在公知の作用機作による逆転写酵素阻害剤（ポリメレース活性部位又は非核酸系阻害剤結合部位に結合してポリメレース活性を阻害する化合物）と測定結果がほぼ同じになる。このようなメカニズムのRNase H阻害剤については、RNase H 活性部位に変異を導入した酵素等を用いた実験を行うことで作用機作を同定することが可能となる。つまり、RNase H活性とポリメレース活性を同時に阻害する被検物質については、既知のポリメレース活性部位近傍に変異の入った逆転写酵素、例えばY188L変異酵素等、又は既知のRNase H活性部位近傍に変異の入った逆転写酵素、例えばY501W変異酵素等を使用することによって、該被検物質がポリメレース活性部位あるいはRNase H活性部位に結合してその機能を調節しているか否かを検出することも可能である。つまり、野生型の逆転写酵素を使用した場合に阻害活性を示すが、上記変異酵素を使用した場合に阻害活性を示さない被検物質は、該変異酵素の変異箇所を持った部位に結合して逆転写酵素の機能を調節する。【００１７】
その他、金属イオンは逆転写酵素の活性に必須の因子であり、RNase H活性部位とポリメレース活性部位に結合することが知られている。このことから、既知のポリメレース活性部位に変異の入った逆転写酵素、例えばD185Ｎ変異酵素等、又は既知のRNase H活性部位に変異の入った逆転写酵素、例えばD443N変異酵素等を使用することによって、被検物質がポリメレース活性部位又はRNase H活性部位に金属イオンを介して直接的に結合してその機能を調節しているか否かを検出することも可能である。つまり、野生型の逆転写酵素を使用した場合に阻害活性を示すが、上記変異酵素を使用した場合に阻害活性を示さない被検物質は、該変異酵素の変異箇所を持った部位に金属イオンを介して直接的に結合して逆転写酵素の機能を調節する。【００１８】
すなわち、本発明は、
（１）（a）テンプレートにプライマーをハイブリダイズさせた基質、金属イオン及び逆転写酵素をインキュベーションして複合体を形成する工程、
（b）工程（a）の後に被検物質を添加し、インキュベーションする工程及び、
（c）工程（b）の後にdNTPsを添加し、DNA合成反応を開始させる工程を含み、
該テンプレートが、５’−ＮＲＷＸＺ− ３’であり、該プライマーが３’−Ｙ− ５’（ＹはテンプレートのＸにハイブリダイズする）であるか、
該テンプレートが、５’−ＮＲＷＸ− ３’であり、該プライマーが３’−ＹＺ− ５’（ＹはテンプレートのＸにハイブリダイズする）であるか、又は、
該基質が、５’−ＮＲＷＸＺＹ− ３’（ＹはＸにハイブリダイズする）である、
ここで、
Ｎは１３〜１９ｍｅｒのDNA、RNA又はキメラ核酸、
ＲはRNA、
ＷはDNA又はキメラ核酸、
Ｘは１５ｍｅｒ以上のDNA、RNA又はキメラ核酸、
ＹはハイブリダイズするＸと同じ長さのDNA、RNA又はキメラ核酸であり、ハイブリダイズするＸがDNAの場合はDNA、ハイブリダイズするＸがRNAの場合はRNA、ハイブリダイズするＸがキメラ核酸の場合はキメラ核酸（キメラ核酸中、ハイブリダイズするＸがDNAの場合はDNA、ハイブリダイズするＸがRNAの場合はRNAである）、
ＺはDNA、RNA又はキメラ核酸
（但し、WとＺは無くてもよい）である、
逆転写酵素のRNase H阻害剤のスクリーニング方法、
（２）ＮがRNA、Ｗが無く、ＸがRNA、ＹがRNAである、（１）記載のスクリーニング方法、
（３）ＮがRNA、Ｗが無く、ＸがDNA、ＹがDNAである、（１）記載のスクリーニング方法、
（４）Ｘが１８ｍｅｒ以上のDNA、RNA又はキメラ核酸である、（１）〜（３）いずれかに記載のスクリーニング方法、
（５）該金属イオンがMg2+又はMn2+である（１）〜（３）いずれかに記載のスクリーニング方法、
（６）工程（c）で、逆転写酵素、基質及び金属イオンの複合体の形成阻害剤をdNTPsと共に添加する（１）記載のスクリーニング方法、
（７）該形成阻害剤がへパリンである、（６）記載のスクリーニング方法、
（８）工程（c）の後に、
（d）テンプレートから切断された核酸量を測定する工程及び、
（e）該測定値を被検物質非存在下での測定値と比較する工程を含む、（１）記載のスクリーニング方法、
（９）テンプレートが、５’末端又は３’末端が標識されたものである、（８）記載のスクリーニング方法、
（１０）該逆転写酵素がウイルスの逆転写酵素である、（１）記載のスクリーニング方法、
（１１）該ウイルスがHIVである（１０）記載のスクリーニング方法、
（１２）該逆転写酵素がＹ１８８Ｌ耐性変異酵素である、（１０）記載のスクリーニング方法、に関する。
【発明の効果】
【００１９】
本発明のスクリーニング方法により、逆転写酵素のRNase H阻害剤を簡便、かつ迅速にスクリーニングすることができる。また、このスクリーニング方法により、逆転写酵素のポリメレース阻害剤、インテグレース阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤の耐性ウイルスに対して効力を持つ抗ウイルス薬の候補化合物をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】キメラ基質の構造
【図２】HIV  Y188L耐性変異酵素を用いた場合の化合物１のRNase H阻害率とポリメレース阻害率
【図３】HIV  Y188L耐性変異酵素を用いた場合の化合物１の濃度−阻害率曲線
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明のスクリーニング方法である「逆転写酵素のH型RNA分解酵素阻害剤のスクリーニング方法」は、従来法と比較して、より簡易で効率的なスクリーニングを行うために、酵素反応を開始させる前に、金属イオン存在下でテンプレートにプライマーをハイブリダイズさせた基質及び逆転写酵素の複合体と被検物質をプレインキュベーションすることを特徴とする。【００２２】
「逆転写酵素」とは二重鎖の核酸と結合し、RNA及びDNAをテンプレートとして、相補的なDNAを合成するポリメレース活性とRNA：DNAヘテロ二重鎖のRNA部分のみを分解するRNase H活性を持つ酵素を意味する。逆転写酵素はDNAポリメラーゼと同様、その反応開始にRNA又はDNAプライマーを必要とする。DNAポリメラーゼと異なる点はRNAをテンプレートとして用いることができる点である。【００２３】
「逆転写酵素」としては、特に、ウイルスの逆転写酵素が好ましい。逆転写酵素を有するウイルスとしては、レトロウイルス科に属するウイルスが挙げられる。レトロウイルス科にはレンチウイルス亜科、オンコウイルス亜科、スプーマウイルス亜科等が知られており、レンチウイルス亜科に属するウイルスとしては、ヒト免疫不全ウイルス（HIV；Human immunodeficiency virus）、オンコウイルス亜科に属するウイルスとしては、肉腫ウイルス（Sarcoma virus）、成人T細胞白血病ウイルス(HTLV；Human T-lymphotropic virus)、乳癌ウイルス（Mammary tumor virus）等が挙げられる。特に、HIVが好ましい。【００２４】
「RNase H阻害剤」とはポリメレース活性を阻害すること無くRNase H活性を特異的に阻害する化合物、又はRNaseHドメインに結合することでRNase H活性とポリメレース活性を同時に阻害する、という新規作用機作により阻害する化合物のことを意味する。【００２５】
「核酸」とは塩基と糖とが共有結合した化合物であるヌクレオシドの糖分子にリン酸基がエステル結合した化合物であるヌクレオチドを構成単位とした高分子物質である。
「DNA」とは、糖部分がデオキシリボースであり、かつ、アデニン、グアニン、シトシン、チミンからなる群より選ばれた塩基を含むヌクレオチドから構成される核酸である。本明細書においては、上記ヌクレオチドから構成される１mer以上である核酸をDNAと呼ぶ。    
「RNA」とは、糖部分がリボースであり、かつ、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルからなる群より選ばれた塩基を含むヌクレオチドから構成される核酸である。本明細書においては、上記ヌクレオチドから構成される１mer以上である核酸をRNAと呼ぶ。
「キメラ核酸」とはDNAを構成するヌクレオチド及びRNAを構成するヌクレオチドから構成される２mer以上の核酸を意味する。【００２６】
「テンプレート」とは、一本鎖の核酸を意味し、DNA、RNA又はキメラ核酸から構成される。「プライマー」とは、上記テンプレートの一部に相補的な配列を持ち、テンプレートにハイブリダイズする核酸を意味し、DNA、RNA又はキメラ核酸から構成され、その３’末端がDNA合成に使われる。「テンプレート」と「プライマー」のハイブリダイズは当該分野で公知の方法により行われ得る。【００２７】
本発明に適した「テンプレート」としては、RNA又はキメラ核酸が挙げられる。本発明に適した「プライマー」としては、テンプレートにハイブリダイズする配列を持つDNA、RNA又はキメラ核酸が挙げられる。それぞれを以下の式で表すことが可能である。
テンプレート：５’−ＮＲＷＸＺ− ３’
プライマー  ：３’−Ｙ− ５’
（ＹはテンプレートのＸにハイブリダイズし、
Ｎは１３〜１９ｍｅｒのDNA、RNA又はキメラ核酸、
ＲはRNA、
ＷはDNA又はキメラ核酸、
Ｘは１５ｍｅｒ以上のDNA、RNA又はキメラ核酸、
ＹはハイブリダイズするＸと同じ長さのDNA、RNA又はキメラ核酸であり、ハイブリダイズするＸがDN Aの場合はDNA、ハイブリダイズするＸがRNAの場合はRNA、ハイブリダイズするＸがキメラ核酸の場合はキメラ核酸（キメラ核酸中、ハイブリダイズするＸがDNAの場合はDNA、ハイブリダイズするＸがRNAの場合はRNAである）、
ＺはDNA、RNA又はキメラ核酸である。
（但し、WとＺは無くてもよい））【００２８】
別の様態としては、以下の式で表すことも可能である。
テンプレート：５’−ＮＲＷＸ− ３’
プライマー  ：３’−ＹＺ− ５’
（ＹはテンプレートのＸにハイブリダイズし、
Ｎ、Ｒ、Ｗ、Ｘ、Ｙ及びＺは全て上記と同意義。）【００２９】
「Ｎ」は逆転写酵素のRNase H活性部位とポリメレース活性部位の活性中心間の距離の長さから１ヌクレオチド短い長さを持つRNA、DNA及びキメラ核酸である。１３〜１９merの長さの核酸が好ましい。【００３０】
「Ｒ」は逆転写酵素のポリメレース活性によりDNA合成がテンプレートの５’末端まで進み、続いてRNase H反応が起る際に切断される結合を含むRNAである。１mer以上の長さのRNAであればよい。【００３１】
「Ｗ」はDNA又はキメラ核酸のいずれでもよく、長さは限定されない。また、「Ｗ」は無くてもよい。【００３２】
「Ｘ」及び「Ｙ」は相補的な配列を持ち、ハイブリダイズする際に対となるヌクレオチドの糖が同じであれば、RNA、DNA又はキメラ核酸のいずれでもよい。逆転写酵素が二重鎖の核酸に結合してRNA：DNAヘテロ核酸のRNAを切断するポリメレース非依存的RNase H活性を持つことから、DNA合成反応開始前にこのRNase H活性によるテンプレートの加水分解を防ぐために、「Ｙ」は、ハイブリダイズする「Ｘ」部分の核酸とRNA：RNA又はDNA：DNAのホモ二重鎖を形成するように相補的な配列を持つ核酸であることが好ましい。プライマーの長さが１５merより短い場合DNA合成の効率が下がることから、効率良く本発明のスクリーニングを行うために、「Ｘ」及び「Ｙ」はヌクレオチドが１５以上、特に１８以上重合した核酸が好ましい。また、プライマー（「Ｙ」部分）は一般には１５mer〜３０merの長さが汎用されており、特に１８mer〜２５merの長さが好ましい。【００３３】
「Ｚ」はRNA、DNA又はキメラ核酸のいずれでもよく、長さは限定されない。また、「Ｚ」は無くてもよい。【００３４】
逆転写酵素は、テンプレートとプライマーがハイブリダイズした二重鎖のリン酸部分を認識して結合する。逆転写酵素のRNase H活性部位はRNA：DNAのヘテロ二重鎖のRNAを認識して切断する。上記の認識、結合、切断は共に配列非特異的である。そのため、テンプレート及びプライマーは、上記条件に合う核酸であれば特定の配列及び長さに限定されない。つまり、本明細書に記載する、Ｎ、Ｒ、Ｗ、Ｘ、Ｙ、Ｚの要件を満たすものであれば、特定の配列及び長さに限定されない。【００３５】
テンプレート及びプライマーの長さは、酵素の種類によって適宜選択すればよく、例えば、２９〜１００mer（好ましくは、２９〜５０mer）の長さのテンプレート及び１５〜５０mer（好ましくは１５〜３０mer）のプライマーを使用することができる。【００３６】
例えば、テンプレートが、RNAである時（例えば、５’−ＮＲＷＸＺ− ３’において、ＮがRNA、Ｗが無し、ＸがRNA、ＺがRNA又は無しの場合、又は、５’−ＮＲＷＸ− ３’において、ＮがRNA、Ｗが無し、ＸがRNAの場合）、該RNAの長さが３２mer以上、特に、該RNAの長さが３７me r以上であるRNAが好ましい。
テンプレートが５’−ＮＲＷＸＺ− ３’であり、上記に示したようなRNAである時、プライマー（３’−Ｙ− ５’）は、テンプレートのRNA（Ｘ部分）にハイブリダイズする１５mer以上、特に１８mer以上のＸと同じ長さのRNAであることが好ましい。
テンプレートが５’−ＮＲＷＸ− ３’であり、上記に示したようなRNAである時、プライマー（３’−ＹＺ− ５’）のＹ部分は、テンプレートのRNA（Ｘ部分）にハイブリダイズする１５mer以上、特に１８mer以上のＸと同じ長さのRNAであることが好ましい。【００３７】
また別の態様としては、以下のものが挙げられる。例えば、テンプレートが、５’末端側にRNA、３’末端側にDNAを持つキメラ核酸である時（例えば、５’−ＮＲＷＸＺ− ３’において、ＮがRNA、ＷがDNA又は無し、ＸがDNA、ＺがDNA又は無しの場合、又は、５’−ＮＲＷＸ− ３’において、ＮがRNA、Ｗが無く、ＸがDNAの場合）、該RNAの長さが１７mer以上、該DNAの長さが１５mer以上、特に、該ＲＮＡの長さが１９mer以上、該ＤＮＡの長さが１８mer以上であるキメラ核酸が好ましい。
テンプレートが５’−ＮＲＷＸＺ− ３’であり、上記に示したような５’末端側にRNA、３’末端側にDNAを持つキメラ核酸である時、プライマー（３’−Ｙ− ５’）は、テンプレートのDNA（Ｘ部分）にハイブリダイズする１５mer以上、特に１８mer以上のＸと同じ長さのDNAであることが好ましい。
テンプレートが５’−ＮＲＷＸ− ３’であり、上記に示したような５’末端側にRNA、３’末端側にDNAを持つキメラ核酸である時、プライマー（３’−ＹＺ− ５’）のＹ部分は、テンプレートのDNA（Ｘ部分）にハイブリダイズする１５mer以上、特に１８mer以上のＸと同じ長さのDNAであることが好ましい。【００３８】
特に、テンプレートが上記に示したような５’末端側にRNA、３’末端側にDNAを持つキメラ核酸である時、１９〜２５merのRNAを持ち、RNAの３’末端側に１８〜２５merのDNAを持つキメラ核酸であるテンプレート及び１８〜２５merのプライマー（DNA）の組み合わせが特に好ましい。【００３９】
また、基質として１本鎖の核酸を使用することもできる。例えば、上記「テンプレート」の３’末端と上記「プライマー」の５’末端はリン酸ジエステル結合により結合して一本鎖となっていてもよい。このような基質は次のような式で表すことができる。
基質：５’−ＮＲＷＸＺＹ− ３’
（Ｎ、Ｒ、Ｗ、Ｘ、Ｚ、Ｙは全て上記と同意義。）【００４０】
「金属イオン」としては、２価金属イオンが好ましく、例えば、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、 Co2+  等が挙げられる。特に、Mg2+及びMn2+が好ましい。【００４１】
「被検物質」とは、スクリーニングに使用される物質を意味し、化合物又はその塩が挙げられる。なお、本明細書においては、前記化合物又はその塩は、低分子化合物、高分子化合物、ポリペプチド又はその誘導体等を含む。かかる被検物質は、天然物質であってもよく、非天然物質であってもよい。ポリペプチドの誘導体としては、修飾基を付加して得られた修飾ポリペプチド、アミノ酸残基を改変することにより得られたバリアントポリペプチド等が挙げられる。【００４２】
「dNTPs」とは、デオキシヌクレオチド三リン酸を意味し、DNA合成に使用される基質、デオキシアデニル三リン酸（dATP）、デオキシグアノシン三リン酸（dGTP）、デオキシシチジン三リン酸（dCTP）、デオキシチミジン三リン酸（dTTP）から構成されている。dNTPsは、本発明に用いる基質に応じて選択することができる。例えば、テンプレート（５’−ＮＲＷＸＺ− ３’や５’−ＮＲＷＸ− ３’）のＮＲＷ部分に使用されている核酸に相補的なdNTPsを用いればよい。テンプレートのＮＲＷ部分が任意の塩基配列からなるDNA、RNA又はキメラ核酸である場合、「dNTPs」としては、dATP、dGTP、dCTP、dTTPの混合物を用いればよい。ＮＲＷ部分のヌクレオチドの糖が限られた種類であるテンプレートであれば、糖に相補的なdNTPsのみを用いればよい。【００４３】
「逆転写酵素のRNase H阻害剤」とは逆転写酵素のRNase H酵素反応を阻害する物質を意味する。指標としては、一般的には、酵素活性を５０％阻害することができる薬剤濃度（IC50値）が使用される。該阻害剤としては、IC50値が１００μＭ以下、特に、１０μＭ以下、さらには、１μＭ以下の物質が好ましい。    【００４４】
「逆転写酵素、基質及び金属イオンの複合体の形成阻害剤」とは逆転写酵素、基質及び金属イオンの複合体形成を阻害する化合物である。本発明おいては、工程（b）において基質と結合していない逆転写酵素が工程（c）において基質と結合し、酵素活性を発現することを回避すること、あるいは工程（c）においてdNTPsを入れて酵素反応を開始させた後に逆転写酵素がターンオーバーすることにより、再度基質と複合体を形成してRNase H反応が起る、という事態を回避することを目的として使用される。【００４５】
該形成阻害剤としては、逆転写酵素、基質及び金属イオンの複合体形成を阻害する性質を持つ化合物であれば、特に限定することなく使用することができ、例えば、ヘパリン、二本鎖核酸等を用いることができる。【００４６】
現在、逆転写酵素の阻害剤としてNevirapine等の非核酸系逆転写酵素阻害剤もスクリーニングされており、これらの化合物はHIVの逆転写酵素の非核酸系逆転写酵素阻害剤結合部位に結合することが知られている。また、現在知られている大半の非核酸系逆転写酵素阻害剤はＹ１８８Ｌの変異によって耐性を獲得することが知られている。【００４７】
本発明のスクリーニング方法において、HIV  野生型逆転写酵素を用いた場合、RNaseHドメインに結合することでRNase H活性とポリメレース活性を同時に阻害する被検物質は、RNase H阻害活性とポリメレース阻害活性が同等に現れるので、非核酸系逆転写酵素阻害剤である被検物質と測定結果がほぼ同じになる。【００４８】
そこで、本発明で使用する逆転写酵素として、１８８番目のチロシンをロイシンに変異させたＹ１８８Ｌ耐性変異酵素を使用すると、逆転写酵素のポリメレース阻害活性を有し、Nevirapine等と交差耐性を持つような被検物質が逆転写酵素の働きを阻害する可能性を除外することができ、効率良くRNa se H阻害剤をスクリーニングすることができる。【００４９】
本発明は、上記の適切なテンプレートとプライマーの選択により、金属イオン存在下で逆転写酵素−基質複合体と被検物質とのプレインキュベーションを可能にしたという特徴を持つスクリーニング方法に関するものであり、検出方法等は公知のものを利用することができるが、特に、莫大な数の化合物をアッセイするスクリーニング、特にハイスループットスクリーニング（HTS）において有用である。本発明を実施すれば、ノイズ（擬陽性）を減少させることができ、効果的にRNase H阻害剤を選択することができる。【００５０】
本発明のスクリーニング方法としては、具体的には、
（a）テンプレートにプライマーをハイブリダイズさせた基質、金属イオン及び逆転写酵素をインキュベーションして複合体を形成する工程、
（b）工程（a）の後に被検物質を添加し、インキュベーションする工程、
（c）工程（b）の後にdNTPsを添加し、DNA合成反応を開始させる工程、
（d）テンプレートから切断された核酸量を測定する工程及び、
（e）該測定値を被検物質非存在下での測定値と比較する工程を含む、スクリーニング方法が挙げられる。【００５１】
前記工程（a）のインキュベーションは、該逆転写酵素の本来の機能を妨げない溶液中において、テンプレートにプライマーをハイブリダイズさせた基質、金属イオン及び逆転写酵素とを混合し、適切な反応条件、例えば、適切な反応温度、反応時間の下、維持することによって行われ得る。【００５２】
前記「酵素の本来の機能を妨げない溶液」としては、例えば、MOPSバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等が挙げられる。【００５３】
また、前記「適切な反応条件」としては、特に限定されないが、例えば、MOPSバッファー、ＨＥＰＥＳバッファー、Ｔｒｉｓバッファー等の溶液中、ｐＨ６．０〜１０．０、好ましくは、ｐＨ７．０〜８．０、さらに好ましくは、ｐＨ７．４で、４℃〜５０℃、好ましくは、２５℃〜３７℃、さらに好ましくは、２５℃、１分〜１時間、好ましくは５分〜２０分、さらに好ましくは、１０分維持すること等が挙げられる。より具体的には、５０ mM MOPS(pH７．４)、１０mM MgCl2、１mM DTT、２mM EDTA、３４mM KCl、０．４８nM 基質中、前記条件下に維持することが挙げられる。【００５４】
前記工程（b）のインキュベーションは、該複合体の本来の機能を妨げない溶液中において、前記複合体と被検物質とを混合し、適切な反応条件、例えば、反応温度、反応時間等の下、維持することにより行なわれうる。溶液及び反応条件については、前記（a）のインキュベーション時と同様に行われ得る。工程（b）の適切なインキュベーション時間は、被検物質化合物によって異なるため、特に限定はされないが、好ましくは５分以上、より好ましくは１０分以上、更に好ましくは１５分以上維持することが挙げられる。工程（b）のインキュベーションが不充分であれば被検物質の阻害活性が見いだせないということが起こり得る。【００５５】
前記工程（c）のDNA合成は、逆転写酵素−基質複合体の本来の機能を妨げない溶液中において、前記複合体と被検物質とを混合し、適切な反応条件、例えば、反応温度、反応時間等の下、維持することにより行なわれうる。溶液及び反応条件については、前記（a）のインキュベーション時と同様に行われ得る。【００５６】
前記工程（d）のテンプレートから切断された核酸量を測定する方法としては、特に限定されず、当該分野において、一般的に、酵素活性を測定するために、核酸量を測定する方法として知られている方法を使用することができる。例えば、前記テンプレートから切断される核酸部分をあらかじめ標識しておけばよい。慣用の蛍光色素、放射性物質、ジゴキシゲニン等で標識することができる。標識部位はテンプレートの５’末端又は３’末端が好ましい。テンプレートから切断された核酸量の検出は、慣用の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動等において、オートラジオグラフィーや蛍光物質による可視化、標識テンプレートに基づく検出等を行なうこと等により行なわれうる。具体的には、エライザ法、キャピラリー電気泳動法、蛍光エネルギー転移反応、時間分解蛍光法（HTRF）等が挙げられる。【００５７】
工程（e）において、前記工程（d）における結果と、被検物質非存在下での測定値とを比較することによって、RNase H活性阻害の有無を調べることができる。被検物質非存在下においては、逆転写酵素は本来の働きを果たし、テンプレートの５’末端側の核酸が切断される。そのため、基質として使用したテンプレートより短い核酸の断片が検出される。前記工程（d）の短い核酸断片の測定値（核酸量）が、被検物質非存在下での測定値と比較して、同等あるいはそれ以上であれば、該被検物質はRNase H阻害剤として使用することはできない。一方、前記工程（d）の短い核酸断片の測定値（核酸量）が、被検物質非存在下での測定値と比較して、それ以下あるいは測定限界以下の値であれば、該被検物質はRNase H阻害剤となり得る。【００５８】
但し、被検物質が、現在知られている逆転写酵素阻害剤のようにポリメレース阻害作用を持つ場合も存在する。該被検物質がポリメレース阻害作用を持つ場合、DNA合成反応が開始せず、酵素が移動しないことから、RNase H反応は起らない。そのため、前記工程（d）の短い核酸断片の測定値（核酸量）が、被検物質非存在下での測定値と比較してそれ以下あるいは測定限界以下の値となる。このことから、RNase H阻害剤を目的としてスクリーニングを行う場合、さらに被検物質が逆転写酵素のポリメレース活性を阻害する物質か否かを調べる必要がある。【００５９】
被検物質が逆転写酵素のポリメレース活性を阻害するか否かを調べる方法としては、特に限定されず、当該分野において、公知のポリメレース活性を測定するアッセイを使用することができる。例えば、ショウ-レイド(C. A. Shaw-Reid)ら、ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（J. Biol. Chem.）、２７８巻、２７７７−２７８０頁（２００３）に記載のRNA依存的DNAポリメレース活性測定法等が挙げられる。【００６０】
また、本スクリーニング方法を利用して、被検物質が逆転写酵素のポリメレース活性を阻害するか否かを調べることができる。例えば、工程（a）〜（c）まで行った後、プライマーの長さを測定することによって調べることができる。被検物質非存在下においては、逆転写酵素は本来の働きを果たし、ポリメレース活性によりプライマーが伸張する。そのため、基質として使用したプライマーより長い核酸が検出される。工程（a）の時点より長いプライマーの測定値（核酸量）が、被検物質非存在下での測定値と比較して、同等あるいはそれ以上であれば、該被検物質はポリメレース活性を阻害しない。一方、工程（a）の時点より長いプライマーの測定値（核酸量）が、被検物質非存在下での測定値と比較して、それ以下あるいは測定限界以下の値であれば、該被検物質はポリメレース活性を阻害する。【００６１】
DNA合成により伸長したプライマー量を測定する方法としては、特に限定されず、当該分野において、一般的に、核酸量を測定する方法として知られている方法を使用することができる。例えば、前記プライマーをあらかじめ標識しておけばよい。慣用の蛍光色素、放射性物質、ジゴキシゲニン等で標識することができる。標識部位はプライマーの５’末端が好ましい。伸長したプライマーの検出は、慣用の変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動等において、オートラジオグラフィーや蛍光物質による可視化、標識プライマーに基づく検出等を行なうこと等により行なわれ得る。具体的には、エライザ法、キャピラリー電気泳動法、蛍光エネルギー転移反応、時間分解蛍光法（HTRF）等が挙げられる。【００６２】
しかし、上記方法でポリメレース活性を阻害すると判断される被検物質の中に、RNaseHドメインに結合することでRNase H活性とポリメレース活性を同時に阻害する物質も存在する。このような被検物質の場合、プライマーの伸長阻害とテンプレートの切断阻害は同等に現れ、結果としてプライマーの長さは工程（a）の時点と変化しない。そのため、現在公知の作用機作による逆転写酵素阻害剤（ポリメレース活性部位又は非核酸系阻害剤結合部位に結合してポリメレース活性を阻害する化合物）と測定結果がほぼ同じになる。【００６３】
上記のRNase H活性及びポリメレース活性阻害の測定結果により、被検物質は表１に記載のように判断することが出来る。なお、結果は被検物質存在下での核酸の測定量を対照としている。【００６４】
【表１】
0004748686.tif 000002
【００６５】
表１に記載のように、上記方法では、RNaseHドメインに結合することでRNase H活性とポリメレース活性を同時に阻害する物質と現在公知の作用機作による逆転写酵素阻害剤（ポリメレース活性部位又は非核酸系阻害剤結合部位に結合してポリメレース活性を阻害する化合物）を区別することが出来ない。このようなメカニズムのRNase H阻害剤については、RNase H 活性部位に変異を導入した酵素等を用いた実験を行うことで作用機作を同定することが可能となる。つまり、RNase H活性とポリメレース活性を同時に阻害する被検物質については、既知のポリメレース活性部位近傍に変異の入った逆転写酵素、例えばY188L変異酵素等、又は既知のRNase H活性部位近傍に変異の入った逆転写酵素、例えばY501W変異酵素等を使用した既知のRNase H活性測定法及び本発明のスクリーニング方法により、該被検物質がポリメレース活性部位あるいはRNase H活性部位に結合してその機能を調節しているか否かを調べることも可能である。【００６６】
また、金属イオンは逆転写酵素の活性に必須の因子であり、RNase H活性部位とポリメレース活性部位に結合することが知られている。当該分野で既知のポリメレース活性部位に変異の入った逆転写酵素、例えばD185Ｎ変異酵素等、又はRNase H活性部位に変異の入った逆転写酵素、例えばD443N変異酵素等を使用した既知のRNase H活性測定法及び本発明のスクリーニング方法により、被検物質がポリメレース活性部位又はRNase H活性部位に金属イオンを介して直接的に結合してその機能を調節しているか否かを調べることも可能である。【００６７】
本発明のスクリーニング法により得られた化合物又はその塩は、RNase H活性を有する逆転写酵素を持つ病原体（例えば、HIV等）により引き起こされる病気に対する治療又は予防作用を発揮し得る。したがって、前記スクリーニング方法により得られた化合物又はその塩により、RNase Hに関連する疾患、例えば、エイズ等の治療又は予防に用いるための医薬組成物が提供される。【００６８】
本発明のスクリーニング方法により得られた化合物又はその塩を有効成分として含有する医薬組成物は、前記RNase Hの機能に関連する疾患、該機能に関連して発症する疾患に対して、該RNase Hの機能の阻害を介して作用しうるという優れた効果を発揮する。また、該医薬組成物によれば、前記RNase Hの機能に関連して発症するエイズに対して、該機能の阻害を介して作用しうるという優れた効果を発揮する。したがって、該医薬組成物によれば、逆転写酵素のポリメレース、インテグレース及びプロテアーゼの活性を阻害することに基づく既存の抗ウイルス薬とは異なる作用機序によりウイルス性疾患を改善することができるという優れた効果を発揮する。【００６９】
上記の医薬組成物中における前記化合物又はその塩の含有量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により適宜調節することができ、治療上有効量であればよく、低分子化合物又は高分子化合物の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇであることが望ましい。【００７０】
上記の医薬組成物は、前記化合物又はその塩を安定に保持しうる種々の助剤をさらに含有してもよい。具体的には、有効成分の送達対象となる部位に到達するまでの間に、有効成分が分解することを抑制する性質を呈する薬学的に許容されうる助剤、賦形剤、結合剤、安定剤、緩衝剤、溶解補助剤、等張剤等が挙げられる。【００７１】
上記の医薬組成物の投与形態は、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。前記投与形態としては、皮下注射、筋肉内注射、静脈内注射、局所投与等が挙げられる。  【００７２】
また、上記の医薬組成物の投与量も、有効成分の種類；投与対象となる個体、器官、局所部位、組織；投与対象となる個体の年齢、体重等に応じて、適宜選択される。投与としては、特に限定されないが、有効成分が、低分子化合物又は高分子化合物である場合、前記有効成分の量として、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、ポリペプチド又はその誘導体の場合、例えば、０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の１回投与量となるように、１日につき、複数回、例えば、１〜３回投与すること等が挙げられる。
【実施例１】
【００７３】
基質の調製
プロリゴ社により合成されたRNA-DNAキメラ核酸、及びキアゲン社により合成されたDNAプライマーをハイブリダイズさせたものを基質（図１）として使用した。RNase H活性阻害作用を調べる際にはテンプレート側、ポリメレース活性阻害作用を調べる際にはプライマー側の5’末端をそれぞれT4 polynucleotide kinaseと[γ-32P]ATPを使って標識したものを使用する。標識した核酸は変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて精製後、等モルの未標識相補鎖と共にKTEバッファー液（組成：80mM KCl、1mM EDTA、10mM Tris-塩酸(pH 8.0)) 中で混合し、85℃で15分間加熱後、ゆるやかに温度を下げて相補鎖同士をハイブリダイズさせてから用いた。
【実施例２】
【００７４】
酵素反応
ポリプロピレン製のチューブに、酵素反応液（組成： 50 mM MOPS (pH7.4)、10 mM MgCl2、1 mM DTT、2 mM EDTA、34 mM KCl、0.48 nM 基質）を10.25μl分注した。次にHIVの逆転写酵素を含む酵素溶液（0.1 pmol 逆転写酵素）1μlを加え、良く混合した。室温で10分間インキュベート後、被検化合物のDMSO溶液1.25μl、ポジティブコントロール(PC)及びネガティブコントロール(NC)には、DMSO 1.25μlを加え、よく混合した。室温で15分間インキュベート後、反応開始液（組成：1 mg/mL ヘパリン、0.1 mM dNTPs）1μlを加え、室温で10分間インキュベートした後、反応停止液（組成：45% formamide、5 mM EDTA、0.05% bromo phenol blue、0.05% xylene cyanol）12. 5μlを加えた。NCについては反応開始液添加前に反応停止液12. 5μlを加えることで予め反応を停止させた。なお、表記濃度は全て終濃度である。
【実施例３】
【００７５】
阻害率の測定
反応液を85 ℃で5分間加熱し、氷上で2分間急冷後、変性ポリアクリルアミドゲル（ゲル組成： 8M urea、20% acrylamide）にて電気泳動を行い、反応産物を分離した。BAStation ver.3.0(Fujifilm)にて反応産物のバンド強度を定量し、以下の計算式に従ってRNase H反応阻害率、ポリメレース反応阻害率をそれぞれ求めた。被検化合物として、RNase H阻害剤（化合物１；4-[5-（ベンゾイルアミノ）チエン-2-イル]-2,4-ジオキソブタン酸）、コントロール化合物として、逆転写酵素に非特異的に結合するSuramin sodium及び非核酸系逆転写酵素阻害剤であるNevirapineを使用した。【００７６】
図２に化合物１のオートラジオグラフィー図と下記数式１によって求まる阻害率を示す。図３に化合物１の濃度‐阻害曲線を示す。表２にHIVの野生型逆転写酵素を使用した場合のIC50値を示す。IC50値は下記数式２によって求まる。単位はμg/mlである。表３にHIVのY188L耐性変異酵素を使用した場合のIC50値を示す。IC50値は下記数式２によって求まる。単位はμg/mlである。なお、表記濃度は全て終濃度である。【００７７】
【数１】
0004748686.tif 000003
【００７８】
【数２】
0004748686.tif 000004
【００７９】
【表２】
0004748686.tif 000005
【００８０】
【表３】
0004748686.tif 000006
【００８１】
これらの結果から、化合物１は、ポリメレース反応を阻害することなくRNase H活性を特異的に阻害するRNase H阻害剤であるが、その阻害活性を感度良く検出するためには、金属イオン存在下で構築される逆転写酵素−基質複合体に対してプレインキュベーションすることが肝要である。また野生型逆転写酵素の代わりに非核酸系逆転写酵素阻害剤が耐性になるY188L耐性変異酵素を使用すると、Nevirapineのポリメレース阻害活性は消失するがSuramin sodiumの阻害活性は野生型逆転写酵素を使用した場合とほぼ同等である。このことから、野生型逆転写酵素の代わりにY188L耐性変異酵素を使用することで、Nevirapine等と交差耐性を持つような被検物質が酵素の働きを阻害する可能性を除外することができるため、目的とするRNaseH阻害剤を効率よくスクリーニングすることができることがわかる。Suramin sodium は、ポリメレース活性とRNase H活性を同時に阻害するものであるが、非核酸系逆転写酵素阻害剤である可能性は低く、一般に様々な酵素系で阻害活性が報告されており、非特異的蛋白結合物質である。
【実施例４】
【００８２】
蛍光エネルギー転移反応を利用した阻害率の測定
テンプレートの３’末端をジゴキシゲニンで標識し、アッセイプレートに固定する。テンプレートの５’末端は6-FAM等の蛍光物質で標識する。dNTPsの中に予め蛍光物質のクエンチャーであるTAMRA等で標識されたデオキシヌクレオチド三リン酸を加えておき、ポリメレース反応終了時には蛍光物質近辺に、ポリメレース反応により取り込まれたデオキシヌクレオチド‐クエンチャーが存在し、蛍光物質から発せられる蛍光を消光させることができるようにテンプレート、プライマーの塩基配列を設計する。反応終了後、6-FAMの消光の度合いを測定することでポリメレース阻害活性を測定することが可能である。次にRNase H活性によって切断されたテンプレート断片がアッセイプレートから解離するような洗浄条件で洗浄した後、プレートに残存する6-FAMによる蛍光を測定することでRNase H阻害活性を測定することが可能である。その結果、逆転写酵素のRNase H阻害剤の候補化合物をスクリーニングすることができる。
【実施例５】
【００８３】
キャピラリー電気泳動法を用いた阻害率の測定
基質をRIで標識する代わりに2種類の蛍光物質を用いる。例えば５’末端を6-FAMで標識したキメラテンプレート、及び５’末端をPETTMで標識したプライマーをハイブリダイズさせたものを基質として使用する。反応後2.5μLの90mM EDTA溶液を加えて反応を停止させ、反応液3μLに対しGeneScan 120 LIZ Size StandardをHi Di Formamideで60倍希釈した溶液10μLを加え、85℃で5分間加熱し、氷上で2分間急冷後ABI PRISM 3100にてキャピラリー電気泳動を行う。泳動結果はGeneMapper3.5 で解析する。RNaseH活性は切断された6-FAM標識核酸のピーク量を、ポリメレース活性は44merまで伸長したPETTM標識核酸のピーク量を定量することにより求める。その結果RNaseH阻害剤の候補化合物をスクリーニングすることが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００８４】
本発明のスクリーニング方法を使用することによりポリメレース依存的RNase H活性を阻害する化合物を効率的にスクリーニングすることができる。スクリーニングされたRNase H阻害剤は新規作用機作の抗ウイルス薬であり、逆転写酵素のポリメレース阻害剤、インテグレース阻害剤及びプロテアーゼ阻害剤の耐性ウイルスに対して効力を持つ抗ウイルス薬を開発することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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