(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（VIII）
【化１】
0004629175.tif 000006
｛ここで、Ｒ1は蛋白質、Ｒ2は、水素原子を示す。｝で示される基を有する結合体を特異的に認識する、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成９年１２月１５日に寄託番号（ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７５）として寄託されている６Ａ３−３株によって産生されることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項２】
式（VIII）で示される基を有する結合体が、１３−ハイドロパーオキシ−９（Ｚ）−１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸又はその代謝物である１３−オキソオクタデカジエン酸に、２'−デオキシグアノシンを付加して得られる付加化合物と、蛋白質とを反応して得た結合体であることを特徴とする請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
蛋白質が、ヘモシアニン、牛血清アルブミン、卵白アルブミンおよびカゼインからなる群より選ばれる、少なくとも一つの蛋白質である請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、１３−ハイドロパーオキシ−９（Ｚ）−１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸又はその代謝物に２'−デオキシグアノシンを付加して得られる付加化合物によって形成された基に特異性を有するモノクローナル抗体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内の脂質成分としては、トリグリセリド、リン脂質、コレステロールエステルあるいは遊離脂肪酸などが知られている。これらの化合物が高度不飽和脂肪酸残基を有する場合、生体に作用する様々な酸化ストレスにより、高度不飽和脂肪酸は脂質過酸化反応を受け、生成した脂質過酸化物が蛋白質や酵素、核酸などの生体構成成分と反応して、種々の生成物を生じる。これらの一連の脂質過酸化による酸化ストレスに由来する傷害が様々な病態に関与することが知られている。そのため、これらの脂質過酸化物が生体構成成分と反応して生じた産物を評価することが重要視されるようになった。
【０００３】
１３−ハイドロパーオキシ−９（Ｚ）−１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸はリノール酸に由来する過酸化初期生成物で、血液中の存在量は老化に関連した疾病の発症との間に高い関連性があることが報告されている脂質過酸化物である。１３−ハイドロパーオキシ−９（Ｚ）−１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸が疾病に関与する原因の一つとして、１３−ハイドロパーオキシ−９（Ｚ）−１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸が蛋白質と付加体を形成することが考えられている（Ｋａｔｏ  Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．３８，７２−８４頁，１９９７年）。
また、１３−ハイドロパーオキシ−９（Ｚ）−１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸をカギアナカサガイのヘモシアニンと反応させて得た抗原を免疫することにより得られるポリクローナル抗体についても報告されており、生体内のリポフスチン様物質の測定に有効であることが知られている（特開平９−２４１２９９号公報）。このように、１３−ハイドロパーオキシ−９（Ｚ）−１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸と生体構成成分の反応物は、生体内脂質過酸化による酸化ストレスの非常に良いマーカーとなる。しかしながら、これらはポリクローナル抗体であり、１３−ハイドロパーオキシ−９（Ｚ）−１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸と生体構成成分の反応物を認識することのできるモノクローナル抗体については知られていなかった。
【０００４】
また、ＤＮＡの構成成分である２’−デオキシグアノシンと脂質過酸化物である１３−ハイドロパーオキシ−９（Ｚ）−１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸が付加反応することにより生ずるＤＮＡと１３−ハイドロパーオキシ−９（Ｚ）−１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸の付加化合物を認識する抗体も知られていなかった。これまでに知られているポリクローナル抗体は、１３−ハイドロパーオキシ−９（Ｚ）−１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸と蛋白質との付加体のみを認識するものであった。しかし、このような脂質過酸化物による生体成分の損傷は、蛋白質だけに生じるものではない。ＤＮＡと１３−ハイドロパーオキシ−９（Ｚ）−１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸の付加化合物を認識することのできる抗体は、ＤＮＡに対する酸化ストレスを簡易に評価できるため、その開発が望まれていた。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、前記式（VIII）で示される基を有する結合体を特異的に認識することを特徴とするモノクローナル抗体を提供することにある。
【０００６】
【発明を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点に鑑み鋭意検討した結果、１３−ハイドロパーオキシ−９（Ｚ）−１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸又はその代謝物にＤＮＡの構成成分の１つである２'−デオキシグアノシンを付加して得た付加化合物と、蛋白質とを反応させて得た結合体を抗原として調製し、該抗原で免疫したマウスから得られる抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とのハイブリッド細胞が、前記式（VIII）で示される基を有する結合体を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生することの知見を得て、本発明を完成した。
【０００８】
本発明によれば、下記式（VIII）
【化２】
0004629175.tif 000002
【０００９】
｛ここで、Ｒ1は蛋白質、Ｒ2は、水素原子を示す。｝で示される基を有する結合体を特異的に認識する、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成９年１２月１５日に寄託番号（ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７５）として寄託されている６Ａ３−３株によって産生されることを特徴とするモノクローナル抗体が提供される。
【００１０】
また、式（VIII）で示される基を有する結合体が、１３−ハイドロパーオキシ−９（Ｚ）−１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸又はその代謝物に２'−デオキシグアノシンを付加して得られる付加化合物と、蛋白質とを反応して得た結合体であることを特徴とする前記モノクローナル抗体が提供される。
【００１１】
前記蛋白質が、ヘモシアニン、牛血清アルブミン、卵白アルブミンおよびカゼインからなる群より選ばれる、少なくとも一つの蛋白質である前記モノクローナル抗体が提供される。
【００１７】
【本発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体は、前記式（VIII）で表される構造を持つ分子基を特異的に認識することを特徴とするモノクローナル抗体であって、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成９年１２月１５日に寄託番号（ＦＥＲＭ Ｐ−１７６７５）として寄託されている６Ａ３−３株によって産生されるモノクローナル抗体ある。より詳細には、１３−ハイドロパーオキシ−９（Ｚ）−１１（Ｅ）−オクタデカジエン酸（以下、１３−ＨＰＯＤＥと略することもある）又はその代謝物と２'−デオキシグアノシン（以下、ｄＧと略することもある）の付加した構造、即ち１３−ＨＰＯＤＥ又はその代謝物にｄＧを付加して得られる付加化合物により形成される基を特異的に認識することを特徴とするモノクローナル抗体である。
【００１８】
本発明のモノクローナル抗体を得るには、初めに１３−ＨＰＯＤＥ又はその代謝物とｄＧとの付加化合物を蛋白質と反応させて得られた結合体を抗原として調製し、次に該抗原で免疫した恒温動物から得られる抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させてハイブリッド細胞とし、最後に該ハイブリッド細胞を培養して培養液中からモノクローナル抗体を取得すればよい。このようにして得られるモノクローナル抗体は、１３−ＨＰＯＤＥ又はその代謝物とＤＮＡの構成成分であるｄＧとの付加化合物に対する高い特異性を有する。
【００１９】
本発明のモノクローナル抗体は、前記式（VIII）で示される化合物と蛋白質との結合体を調製し、これを抗原として免疫された恒温動物から得られる抗体産生細胞と、得られた抗体産生細胞を継代培養可能なミエローマ細胞とのハイブリッド細胞を調製し、このハイブリッド細胞の中から目的のモノクローナル抗体のみを産生するハイブリッド細胞をスクリーニングし、このハイブリッド細胞が抗体を産生する環境下で大量培養し、培養物から取得することにより、製造される。
【００２０】
本発明には、例えば、１３−ＨＰＯＤＥあるいはその代謝物（１３−オキソオクタデカジエン酸、以下、１３−ＯＸＯと略することもある）とｄＧの付加物と蛋白質との反応物や１３−ＨＰＯＤＥあるいはその代謝物である１３−ＯＸＯとＤＮＡの反応物を抗原として用いることができるが、好ましくは１３−ＨＰＯＤＥあるいはその代謝物である１３−ＯＸＯとｄＧの付加物と蛋白質との反応物を用いるのがよい。
１３−ＨＰＯＤＥあるいはその代謝物である１３−ＯＸＯとｄＧの付加物を調製するための方法としては、１３−ＨＰＯＤＥあるいは１３−ＯＸＯとｄＧを適当な緩衝液下で混合すれば良く、反応後、逆相高速液体クロマトグラフィー等で精製すればよい。用いる緩衝液としては、トリス、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩等の緩衝液が挙げられ、緩衝液の濃度は、例えば、１ｍＭ〜０．２Ｍ、好ましくは１０〜１００ｍＭ（リン酸緩衝液）である。また、反応条件としては、例えば、２５〜４５℃で１時間〜１０日間が挙げられ、好ましくは３０〜４０℃で１〜５日間である。
【００２１】
ここで、１３−ＨＰＯＤＥあるいはその代謝物（例えば、１３−ＯＸＯと略することもある）とｄＧの付加物と蛋白質との反応物について、概略を次式（II）および式（III）に示す。
【００２２】
【化４】
0004629175.tif 000003
【００２３】
【化５】
0004629175.tif 000004
【００２４】
ここで、Ｚ3、Ｚ4はそれぞれ、リノール酸の二重結合部分を挟んで、簡略化した際の残りの基を示す。
式（Ｉ）のなかでも、Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈ、Ｚ1＝−ＣＨ2−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ2）4ＣＨ3、Ｚ2’＝Ｈの場合の式（VIII）の化合物を好ましく挙げることができる。
【００２５】
【化６】
0004629175.tif 000005
【００２６】
ここで、Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈで、環化した構造を7-(heptan-2-onyl9-5,9-dihydro-9-oxo-3-β-D-deoxyribofuranosylimidazo［1,2-a］purineという。なお、このものを抗原用付加化合物という場合もある。
【００２７】
抗原を調製するための１３−ＨＰＯＤＥあるいはその代謝物である１３−ＯＸＯとｄＧの付加物と蛋白質との反応物蛋白質の反応は、１３−ＨＰＯＤＥあるいはその代謝物である１３−ＯＸＯとｄＧの付加物を蛋白質と結合可能な官能基を導入後に適当な緩衝液中で混合攪拌して実施することができる。
ここで、結合可能な官能基を導入するということは、前記の式（III）の化合物VIに、化学的に結合する基を導入後、若しくは、二官能性の試薬で後述の蛋白質、ＤＮＡ等と反応させることができる。例えば、抗原用化合物のＣ−５位にカルボキシル基等の官能基を導入する方法としては、コハク酸、フタル酸、マレイン酸、アジピン酸などのジカルボン酸やこれらの酸無水物および酸クロリドと反応させる方法が挙げられる。その後、アミノ基−カルボン酸基との反応では、カルボジイミド等によりアミド化することができる。また直接蛋白質のアミノ基等と反応させるためにグルタルアルデヒド等のジアルデヒドや、ヘキサメチレンジイソシアネート等のジイソシアネートと反応させてもよい。
【００２８】
用いる緩衝液としては、トリス、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩等の緩衝液が挙げられ、緩衝液の濃度は、例えば、１ｍＭ〜０．２Ｍ、好ましくは１０〜１００ｍＭ（リン酸緩衝液）である。反応条件は、例えば、２５〜４５℃で１時間〜１０日間が挙げられ、好ましくは３０〜４０℃で１〜５日間である。蛋白質としては、例えば、牛血清アルブミン（略号：ＢＳＡ）、卵白アルブミン、リポプロテイン、ヘモシアニンなどが挙げられ、好ましくはカギアナカサガイのヘモシアニン（略号：ＫＬＨ）が用いられる。
【００２９】
本発明で免疫される動物は恒温動物が使用できる。該免疫動物としては、例えばマウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ニワトリ等であれば特に制限されないが、抗体産生細胞を融合するミエローマ細胞がマウス由来のものであるため、好ましくはマウスが使用される。
【００３０】
免疫する方法は、通常の公知の免疫方法を用いて、例えば、７ないし３０日、特に１２ないし１６日間隔で２または３回の投与が好ましい。抗原投与量は免疫される動物により異なるが、１回につき、例えば、約０．０５〜２ｍｇ程度を目安とする。投与経路は皮下注射、皮内注射、腹膜腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射等を選択することができるが、好ましくは腹膜腔、皮下もしくは筋肉内に注射して行う投与形態である。さらに好ましくは、前記投与経路を２ないし３組み合わせた投与経路、例えば、腹膜腔内注射、皮下注射および筋肉内注射全ての投与経路を組み合わせる投与形態である。
【００３１】
なお、この場合、抗原は適当な緩衝液、例えばフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントの１種を含有するナトリウムリン酸緩衝液、生理食塩水等に溶解して用いることができるが、上記のようなアジュバントを使用しなくとも良い。ここで、アジュバントとは抗原と共に投与した時、非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。
【００３２】
上記の抗原を免疫した恒温動物を７〜３０日間処置せずに飼育した後、該恒温動物の血清を少量採取し、抗体価をウエスタンブロット法、凝集法、酵素免疫測定法、一元放射状免疫拡散法等から選ばれた測定法により抗体価を測定することができる。より簡便には酵素免疫測定法により測定することができる。抗体価が上昇してきたら、状況に応じて抗原の投与を適当回数実施する。例えば、０．０１〜１ｍｇ、好ましくは、０．０５〜０．５ｍｇの抗原の投与量で１もしくは２回の追加投与が行われる。最後の投与の１ないし３０日後、特に好ましくは１〜７日後に免疫した恒温動物から抗体を産生するリンパ球を含む組織を摘出する。摘出する組織は、抗体を産生するリンパ球を含む抹消リンパ系組織であればいずれでも良いが、好ましくは脾臓である。
【００３３】
得られた組織は、例えば、「単クローン抗体実験操作法入門」（講談社サイエンティフィック  安藤民衛ら、１９９１年）等に記載されている方法により、継代培養可能な細胞とするために、例えば、仙台ウイルスやポリエチレングリコール存在下、ある種のガン細胞と細胞融合させて、ハイブリッド細胞を得ることができる。ここで用いられるガン細胞は、同じ恒温動物でも同種の恒温動物のガン細胞を用いることが好ましく、例えばマウスを免疫動物として得られた脾臓細胞と融合させる場合、マウスミエローマ細胞を用いることが好ましい。
【００３４】
実際に用いられる細胞融合の方法としては、公知の技術（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄ  第３９巻：第２８５〜３０８頁，１９８０年）を用いることができる。例えば、免疫されたマウスから得られた脾細胞とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコール存在下で融合させ、ハイブリッド細胞のみが生育可能であるＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン添加培地）により選択的にハイブリッド細胞を増殖させ、ハイブリッド細胞がコロニーを形成した後、培養上清中の抗体をスクリーニングすることで目的の抗体を産生するハイブリッド細胞を得ることができる。
【００３５】
スクリーニングする方法としては、例えば、ウエスタンブロット法あるいは酵素免疫化学的測定法等が挙げられる。また、目的の抗体を産生するハイブリッド細胞は、限界希釈法を繰り返すことにより最終的に単一のハイブリッド細胞を得ることができる。さらには、これら目的の抗体を産生するハイブリッド細胞は抗体を産生する環境下で大量培養することにより抗体を製造することができる。さらに、これらの目的とする抗体を産生するハイブリッド細胞が産生した抗体は、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いる蛋白質分画、水性二層分配法、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動等の蛋白質に関する一般的な生化学的分離方法を、単独もしくはいくつかの方法を組み合わせて使用することにより精製することができる。
【００３６】
本発明のモノクローナル抗体はヒトの１３−ＨＰＯＤＥあるいはその代謝物が付加したＤＮＡの検出だけでなく、ヒト以外の異種の恒温動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリなどの生体中に存在する１３−ＨＰＯＤＥあるいはその代謝物が付加したＤＮＡの検出にも応用することができる。
【００３７】
【発明の効果】
以上の説明から明らかなように、本発明は、１３−ＨＰＯＤＥあるいはその代謝物とＤＮＡの付加体を特異的に認識するモノクローナル抗体を提供することができる。本発明のモノクローナル抗体は、脂質過酸化物の１つである１３−ＨＰＯＤＥの生体に対する影響を明らかにするために非常に有用であり、臨床診断、臨床病理、分析等において利用されることが期待される。
【００３８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
なお用いた分析機種は次のとおりである。
Ｍ／Ｓは、ＪＥＯＬ  Ｔｈｅ  Ｍｓｔａｔｉｏｎ  ＪＭＳ７００、ＮＭＲはＢｒｕｋｅｒ  ＡＲＸ４００である。
〔実施例１〕
１．抗原の調製
１）抗原用付加化合物の調製
１３−ＨＰＯＤＥ（５ｍＭ）あるいは１３−ＯＸＯ（５ｍＭ）および２’−デオキシグアニン（２ｍＭ）を５０ｍＭリン酸緩衝液中で反応させた。この反応溶液をカラム（Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ−ＯＤＳ−ＨＧ−５、野村化学社製）を用い、溶出溶媒（５０％メタノール水溶液）を、流速６．０ｍｌ／分、検出器をＵＶ（波長２３０ｎｍ）とする高速液体クロマトグラフィーを行い、相対保持時間１５分のピークを集め、抗原用付加化合物を得た。この抗原用付加化合物についてＭ／ＳおよびＮＭＲ分析して、前記の式（VIII）で表される化合物で、Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈの構造である7-(heptan-2-onyl9-5,9-dihydro-9-oxo-3-β-D-deoxyribofuranosylimidazo［1,2-a］purineの構造を有することを確認した。
前記と同様にして得られた抗原用付加化合物（１００ｍＭ）は、ピリジン中、無水コハク酸（２００ｍＭ）と反応させてＣ−５位のヒドロキシル基をスクシニル化し、抗原の調製に用いた。
２）抗原の調製
カギアナカサガイのヘモシアニン（略号：ＫＬＨ）（２ｍｇ／ｍｌ）と上記により最終的に得られたスクシニル化抗原用付加化合物（４ｍＭ）をＮ−ヒドロキシスルホサクシンイミド（２ｍｇ／ｍｌ）の共存下、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２） １ｍｌ中で３７℃、２４時間反応させ、抗原用付加化合物−ＫＬＨ複合体を得た。
【００３９】
２．免疫方法
抗原用付加化合物−ＫＬＨ複合体（１ｍｇ／ｍｌ）は等量のフロイントの完全アジュバントとよく混合してエマルジョンとし、これをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、オス、６〜８週齢）の腹膜腔内に１００μｌ免疫した。初回免疫から１０〜１４日後、抗原とフロイントの不完全アジュバントをよく混合してエマルジョンとして、追加免疫を行った。追加免疫から３週間後、抗原とリン酸緩衝生理食塩水（略号：ＰＢＳ）を混合して最終免疫を行った。なお、抗体価は、追加免疫の１週間後、マウス眼孔静脈から血液を採取し、得られた血清を用いて酵素免疫化学的方法で抗原に対する抗体が産生していることを確認した。酵素免疫化学的方法では、免疫したマウスから得られた血清と比較対照となる免疫前のマウスから得られた血清の間に比較的大きな抗体価の差異が見られ、抗体価の上昇が確認された。
【００４０】
３．抗体価の確認方法
抗体価は抗原用付加化合物と牛血清アルブミンを固相とした酵素免疫測定法により確認した。すなわち、抗原の調製に記載した方法と同様に牛血清アルブミン（略号：ＢＳＡ）と抗原用付加化合物を反応させて、抗原用付加化合物−ＢＳＡ複合体を得た。これを９６穴イムノプレートに物理吸着させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−トリス緩衝液（ｐＨ７．４）（略号：ＴＴＢＳ）で３回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ７．４）（以下、「ブロッキング液」と略すこともある。）でブロッキングを行った。このプレートのウエルにマウスから得られた血清（１００μｌ／ウエル）を入れて、３７℃で１時間反応させた。ウエルを洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されているマウス抗体に対するウサギ抗体をＴＴＢＳで５０００倍希釈した液（１００μｌ／ウエル）（以下、「酵素標識抗体溶液」と略すこともある。）を入れて、３７℃で１時間反応させた。ウエルをＴＴＢＳで３回洗浄した後、ο−フェニレンジアミン（０．４ｍｇ／ｍｌ）および過酸化水素（０．００３％）を含む０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５）（１００μｌ／ウエル）（以下、「発色液」と略すこともある。）を入れて室温で１５〜２０分間反応させた。発色反応は１Ｍの硫酸（５０μｌ／ウエル）（以下、「反応停止液」と略すこともある。）を入れることで停止し、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定して抗体価の確認を行った。
【００４１】
４．融合細胞の調製
免疫したマウスからマウス脾臓を摘出し、よくほぐして脾細胞を得た。得られた脾細胞はＲＰＭＩ−１６４０培地で洗浄した。この洗浄した脾細胞と同様にＲＰＭＩ−１６４０培地でよく洗浄したミエローマ細胞であるマウス６５３細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８，６５３：ＣＲＬ・１５８０）を細胞数が７：１の割合になるように混和し、培地に対して５０（ｗ／ｖ）％のポリエチレングリコール１５４０水溶液を徐々に加えて５分間混和した。これにＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて反応を停止させた後、５分間遠心分離して上清を廃棄した。これにＲＰＭＩ−１６４０培地を加えた後、５分間遠心分離を行い上清を廃棄した。この操作を２回繰り返して細胞を洗浄し、融合細胞を調製した。
【００４２】
５．クローニング
前述の得られた融合細胞に３０ｍｌのＨＡＴ培地を加えて細胞を懸濁し、９６穴マイクロプレートの各ウエルに１００μｌずつ分注し、ＨＡＴ培地により選択的にハイブリッド細胞を増殖させた。融合から１０日後、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリテンを除いたもの）でウエル中の１／２量の培養上清を置換した。この操作を２〜３回繰り返した。この培養上清を用いて２つの抗体活性に関するスクリーニングを行い、２つのスクリーニングで抗体活性が認めれれたウエル中の融合細胞を好ましいものとして選別した。抗体活性の確認されたウエルの細胞は限界希釈を行い培養し、最終的にはスクリーニングと限界希釈を繰り返すことにより１３−ＨＰＯＤＥあるいはその代謝物とＤＮＡの構成成分の１つである２’−デオキシグアノシン（略号：ｄＧ）との付加体に対して高い抗体活性を有し、且つ単一の細胞からなるクローン４株を得た。得られた４株のクローンの内、抗体活性の強かった６Ａ３−３株のモノクローナル抗体について、マウスＩｇＧサブクラスの検討を行った。培養上清を試料としてマウスＩｇＧサブクラス検定キット（商品名：Mouse monoclonal antibody isotyping kit RPN29、アマシャム社製）で抗体のサブクラスの検討を行ったところ、ＩｇＧ２ａ、κ鎖であった。この培養上清の一部を用いて抗体の精製について検討したところ、硫酸アンモニウムによる塩析、あるいはプロテインＡをリガンドとするアフィニティークロマトグラフィーを常法通り行うことにより本発明のモノクローナル抗体を精製することができた。
【００４３】
６．抗体活性に関するスクリーニング方法−１
前記で得られた培養上清を試料として用い、酵素免疫化学的方法による抗体価の確認方法と同様に、抗原用付加化合物−ＢＳＡ複合体に対する抗体活性を評価した。
【００４４】
７．抗体活性に関するスクリーニング方法−２
１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液（０．１ｍｌ）に、４ｍＭの１３−ＨＰＯＤＥ（０．１ｍｌ）を混合し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で全量を０．２ｍｌとした後、３７℃で４日間インキュベ−トして１３−ＨＰＯＤＥ付加ＤＮＡを調製した。得られた１３−ＨＰＯＤＥ付加ＤＮＡを５μｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭリン酸緩衝液で希釈し、９６穴イムノプレートに各ウエル当たり１００μｌを加えて物理吸着させた。この後の洗浄あるいはブロッキング工程は、酵素免疫化学的方法による抗体価の確認方法と同様に行い最終的に１３−ＨＰＯＤＥ付加ＤＮＡに対する抗体活性を４９２ｎｍにおける吸光度として測定した。なお、コントロールには未処理のＤＮＡを用いた。
【００４５】
〔実施例２〕
前記実施例１で得た４株クローンから得られたモノクローナル抗体の内、６Ａ３−３株のモノクローナル抗体の反応特異性について確認を行った。該６Ａ３−３株は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成９年１２月１５日に寄託番号（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７６７５）として寄託されている。なお、検討に用いるモノクローナル抗体は、培養上清を希釈してそのまま用いた。
【００４６】
１． モノクローナル抗体の反応特異性の評価−１
本発明のモノクローナル抗体のｎａｔｉｖｅ−ＤＮＡあるいは各種脂質過酸化物−ＤＮＡ複合体に対する反応特異性を評価した。すなわち、１３−ＨＰＯＤＥ、１３−ＯＸＯ、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、４−ヒドロキシ−２−ノネナールＨＮＥ、アクロレイン（ＡＣＲ）、２−ヘキセナール、および２−ノネナールとＤＮＡの複合体を実施例１の７に示した方法と同様に調製し、９６穴イムノプレートにウエル当たり１００μｌのｎａｔｉｖｅ−ＤＮＡあるいは脂質過酸化物−ＤＮＡ複合体（５μｇ／ｍｌ）を加え、４℃で一昼夜静置してプレートに物理吸着させ、ウエル当たり３００μｌのＴＴＢＳで３回洗浄した後、１％ＢＳＡ含有ＴＴＢＳもしくは蒸留水で４倍希釈したブロックエース（雪印社製）をウエル当たり３００μｌ加えてブロッキングした。このプレートを上記と同様にＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μｌのＴＴＢＳで希釈した本モノクローナル抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）を加えて、３７℃で３時間インキュベートした。なお、コントロールとしてはＴＴＢＳのみを加えた。このプレートを上記と同様にＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μｌの酵素標識抗体溶液を加えて３７℃で１時間インキュベートした。このプレートをＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエル当たり１００μｌの発色液を加えて室温で１５〜２０分間インキュベートした。ウエル当たり５０μｌの反応停止液を加えた後、マイクロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定し、本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を評価した。その結果を縦軸は各種脂質過酸化物−ＤＮＡ複合体、横軸は４９２ｎｍの吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示したグラフとして図１に示した。図１に示すように１３−ＨＰＯＤＥおよびその代謝物である１３−ＯＸＯで修飾したＤＮＡは認識されるものの、他の脂質過酸化物で修飾されたＤＮＡは全く認識されなかった。
【００４７】
２． モノクローナル抗体の反応特異性評価−２
本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートに抗原用付加化合物−蛋白質複合体を加えてプレートに物理吸着させたプレートのウエルに、本発明によるモノクローナル抗体（１μg／ｍｌ）に各種濃度の２’−デオキシグアノシンあるいは7-(heptan-2-onyl9-5,9-dihydro-9-oxo-3-β-D-deoxyribofuranosylimidazo［1,2-a］purine（抗原用付加化合物）を加えたものを試料とする以外は前項に記載の方法と同様にして吸光度を測定し、本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を評価した。結果を図２に示す。その結果を縦軸Ｂ／−Ｂ０（競合物質が０のときの吸光度に対する競合物質を添加したとき得られる吸光度）、横軸に競合物質濃度を示した図である。その結果より、本発明のモノクローナル抗体は、7-(heptan-2-onyl9-5,9-dihydro-9-oxo-3-β-D-deoxyribofuranosylimidazo［1,2-a］purineに特異的に反応することがわかる。
【００４８】
以上の結果から、本発明の実施例１、２では、１３−ＨＰＯＤＥあるいはその代謝物とＤＮＡの付加体を特異的に認識するモノクローナル抗体であることがわかる。また、該モノクローナル抗体は、脂質過酸化物の１つである１３−ＨＰＯＤＥの生体に対する影響を明らかにするために非常に有用であり、臨床診断、臨床病理、分析等において利用されることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  種々の脂質過酸化物をＤＮＡに修飾させた修飾物に対する本発明のモノクローナル抗体の反応性について、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラフである。
【図２】  本発明のモノクローナル抗体の認識部位について、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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