(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
交互浸漬法により生体組織基体にりん酸カルシウム化合物を被覆する方法に於いて、浸漬溶液として水溶性カルシウム塩とホウ酸塩及び／又はＬ−ヒスチジンを含有した溶液とりん酸塩溶液とを使用することを特徴とする生体組織基体の被覆方法。
【請求項２】
水溶性カルシウム塩が塩化カルシウム、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、乳酸カルシウムから選ばれた水溶性カルシウム塩である請求項１記載の生体組織基体の被覆方法。
【請求項３】
ホウ酸塩がホウ酸、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウムから選ばれたホウ酸塩である請求項１又は２記載の生体組織基体の被覆方法。
【請求項４】
りん酸塩溶液がりん酸水素二ナトリウム及びりん酸二水素ナトリウムを含有した溶液である請求項１〜３のいずれか１項記載の生体組織基体の被覆方法。
【請求項５】
りん酸水素二ナトリウムの濃度が１０〜２００mmol/L、りん酸二水素ナトリウムの濃度が５〜１５０mmol/Lである請求項４記載の生体組織基体の被覆方法。
【請求項６】
水溶性カルシウム塩とホウ酸塩及び／又はＬ−ヒスチジンを含有した溶液のｐＨが６．５〜８．０である請求項１〜５のいずれか１項記載の生体組織基体の被覆方法。
【請求項７】
りん酸塩溶液のｐＨが６．５〜８．０である請求項１〜６のいずれか１項記載の生体組織基体の被覆方法。
【請求項８】
水溶性カルシウム塩とホウ酸塩及び／又はＬ−ヒスチジンを含有した溶液の濃度がそれぞれ水溶性カルシウム塩が５０〜３００mmol/L、ホウ酸塩が１０〜５０mmol/L、L-ヒスチジンが１０〜５０mmol/Lである請求項１〜７のいずれか１項記載の生体組織基体の被覆方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生体組織基体にりん酸カルシウム化合物を被覆する方法に於いて、とりわけ生体組織体が生体組織である場合、これに損傷を与えず、また被覆生体組織以外の生体組織に対しても極めてやさしく、且つ均一な被覆膜を形成させることが可能な生体組織基体の被覆方法を提供することを目的とする。
【０００２】
【従来技術】
整形外科においては、損傷靱帯等を再建する場合、自家腱を骨に開けた骨トンネルに通し固定する方法が広く実施されている。
この様な方法によれば、軟組織である腱と硬組織である骨とは、本質的に接着性が悪いため、移植腱と骨トンネルとの接着・固定性が悪く、術後のリハビリテーションの開始に大きく影響し、その回復を遅らせる原因となっていた。
この様な生体組織と骨との接着性を改善するために、生体組織、医療用材料等をカルシウム溶液とりん酸溶液に交互に浸漬することにより、材料表面にりん酸カルシウム化合物を被覆し、生体材料と骨との接着性を高める方法が知られている（特開2000-327314公報）。
更にまた、本発明者らはこの様な方法によって、生体組織である腱又は靱帯用組織基体の表面にりん酸カルシウム系化合物を固定化する方法を開発し、先に出願を行った(特願平11-323753号)。
【０００３】
このような方法は、カルシウムイオンを含み且つ実質的にりん酸イオンを含まないカルシウム溶液と、りん酸イオンを含み且つ実質的にカルシウムイオンを含まないりん酸溶液とに、腱又は靱帯用組織基体を交互に浸漬させて、該基体の少なくとも表面にりん酸カルシウム系化合物を生成・固定させる工程からなる方法である。
【０００４】
しかし、このような方法によれば、生体組織基体を交互に上述のような溶液に浸漬する際に、りん酸カルシウム化合物の生成に伴い溶液のｐＨは低下し、生体組織基体に直接りん酸カルシウム化合物を被覆する際に、生体組織基体の損傷を生じることが問題となった。
更に、このような溶液の浸透圧は、体液に近似するものを使用する必要があり、一般に使用されているような緩衝効果を有する化合物のみの使用では、その緩衝効果と浸透圧との関係で使用に限界があり、これらすべての条件を満たす、生体に対して安全性の高いりん酸カルシウム化合物を被覆する方法は見出されていないのが現状である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは前述のような現状に鑑み、生体組織基体にりん酸カルシウム化合物を被覆する方法に於いて、生体組織基体に対して組織の損傷を生じない、均一なヒドロキシアパタイトを主成分とする被膜を形成させることが可能な、更には体液との浸透圧の関係に於いて、その条件を満たす浸漬溶液を使用する生体組織基体の被覆方法について鋭意検討を重ねた。
その結果、このような浸漬溶液として、水溶性カルシウム塩にホウ酸塩またはＬ−ヒスチジンを併用することにより、前述の課題を解決することが出来ることを見い出し、係る知見に基づき本発明を完成させたものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明は交互浸漬法により生体組織基体にりん酸カルシウム化合物を被覆する方法に於いて、浸漬溶液として水溶性カルシウム塩とホウ酸塩及び／又はＬ−ヒスチジンを含有した溶液とりん酸塩溶液とを使用することを特徴とする生体組織基体の被覆方法に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下に本発明の生体組織基体の被覆方法について更に詳記する。
本発明の生体組織基体の被覆方法は、生体組織を浸漬溶液として水溶性カルシウム塩とホウ酸塩及び／またはＬ−ヒスチジンを含有した溶液とりん酸塩溶液とに交互に浸漬し、この生体組織基体にりん酸カルシウム化合物を被覆する方法である。
この様な浸漬溶液として、前記特開2000-327314公報では、ｐＨ緩衝効果を有するりん酸塩の例示があり、塩化カルシウムのトリス緩衝溶液、酢酸カルシウムのトリス緩衝溶液等が例示されている。
しかし、これらはカルシウム化合物の例示の一部であって、本発明のような浸漬溶液の生体組織基体への影響については全く考慮されていない。
尚、本発明の生体組織基体の被覆方法において、被覆材となるりん酸カルシウム化合物は、りん酸とカルシウムとが化学反応して得られるりん酸カルシウム系化合物であって、例えば、ヒドロキシアバタイト、りん酸三カルシウム、りん酸八カルシウム等が挙げられる。中でも、生体に最も近いという観点から、ヒドロキシアパタイトを形成することが最も好ましい。
【０００８】
先ず、本発明で使用する水溶性カルシウム塩とホウ酸塩及び／またはＬ−ヒスチジンを含有した溶液に関して云えば、本発明で使用する水溶性カルシウム塩としては、塩化カルシウム、臭化カルシウム、ヨウ化カルシウム、硝酸カルシウム、蟻酸カルシウム、酢酸カルシウム、プロピオン酸カルシウム、酪酸カルシウム、乳酸カルシウム等が挙げられるが、安全性、溶解度、価格等の点から塩化カルシウム、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、乳酸カルシウムの使用が望ましい。
また、ホウ酸塩の種類としては、ホウ酸、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウム、ホウ酸アンモニウム、ホウ酸マグネシウム、ホウ酸リチウム等を使用することができるが、ホウ酸、ホウ酸ナトリウム、ホウ酸カリウムの使用が安全性、溶解度、価格等の点から望ましい。
【０００９】
この様なホウ酸塩及び／またはＬ−ヒスチジンを含有した水溶性カルシウム塩溶液は、溶液中のカルシウムイオン濃度は特に限定されるものではないが、後述するりん酸塩溶液との反応によって生成するりん酸カルシウム化合物の生成量、更には溶液の浸透圧を考慮すると、５０〜３００mmol/Lが望ましい。
また、水溶性カルシウム塩溶液中のホウ酸塩の濃度及びＬ−ヒスチジンの濃度は、共に１０〜５０mmol/Lが望ましい。
更に、このカルシウム塩溶液のｐＨに関しては、溶液ｐＨは６．５〜８．０であり、特に好ましくはｐＨ７〜７．６であることが望ましい。尚、溶液は必要に応じて塩酸、苛性ソーダ等によってｐＨ調整を行っても良いが、その際には上述の溶液の浸透圧を考慮して使用することが必要である。
【００１０】
次に、本発明で使用するりん酸塩溶液に関して云えば、本発明で使用するりん酸塩としては、りん酸、りん酸水素二ナトリウム、りん酸二水素ナトリウム、りん酸水素二カリウム、りん酸二水素カリウム等が挙げられるが、これらりん酸塩の内、りん酸水素二ナトリウムとりん酸二水素ナトリウムを併用することが最も望ましい。また、この場合のりん酸塩溶液の濃度は、ｐＨ緩衝効果、溶液の浸透圧、りん酸カルシウム化合物としてハイドロキシアパタイトが生成しやすい条件を考慮し、りん酸水素二ナトリウムは１０〜２００mmol/L、りん酸二水素ナトリウムは５〜１５０mmol/Lであることが望ましい。
更に、このようなりん酸塩溶液のｐＨに関しては、ｐＨ６．５〜８．０、特に好ましくはｐＨ７．０〜７．６であることが望ましい。尚、溶液は必要に応じて塩酸、苛性ソーダ等によってｐＨ調整を行っても良いが、その際には上述の溶液の浸透圧を考慮して使用することが必要である。
【００１１】
前述のカルシウム塩溶液とりん酸塩溶液の浸透圧は、添加する塩類の濃度に依存するものであり、特に限定されるものではないが、生体への影響を考慮して生理食塩水と同等の浸透圧とすることが必要であり、具体的には２００〜４００mmol/kg、更に好ましくは２５０〜３５０mmol/kgであることが望ましい。
【００１２】
これらの溶液に生体組織基体を浸漬する順序に関しては、水溶性カルシウム塩とホウ酸塩及び／またはＬ−ヒスチジンを含有した溶液が先、あるいはりん酸塩溶液が先のいずれであっても良い。
要は、上記カルシウム塩溶液とりん酸塩溶液が交互に浸漬されれば良い。
尚その際に、望ましくは、それぞれいずれかの溶液に生体組織基体を浸漬した後、カルシウムイオン及びりん酸イオンを実質的に含まない溶液として、生理食塩水等を使用して洗浄を行うことが望ましい。
このような洗浄を行うことにより、生体組織基体の表面に付着した余分のカルシウムイオンまたはりん酸イオンを除去することができ、これによって過剰のりん酸カルシウム化合物の生成を防止できる。
また、浸漬を行う際のそれぞれの溶液の温度に関しては、特にその範囲が限定されるものではないが、生体組織基体を生体より摘出しながら被覆する場合には、好ましくは０〜５０℃、更に好ましくは２０〜４０℃で行うことが望ましい。
【００１３】
この様な交互浸漬法によってりん酸カルシウム化合物を被覆する生体組織基体としては、特にその種類が限定されるものではないが、例えば腱または靱帯等が挙げられ、外科的治療に際して直接これらの生体組織基体に対して被覆を行うことができる。あるいは動物等の生体から外科的に摘出した腱または靱帯等を用いて被覆することもできるが、何れの場合にもこのような被覆を行う生体組織基体としては、特に自家組織の使用が最も好ましい。
また、本法発明の被覆方法は、生体組織基体以外の生体材料にも適用することができ、このような生体材料として、キチン、キトサン、アルギン酸ナトリウム、コラーゲン、ゼラチン、ムコ多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ナイロン、ポリカーボネート、テフロン、シリコーン、ポリ-γ-グルタミン酸、セルロース等の生体材料を挙げることができる。
【００１４】
【実施例】
以下に本発明の実施例を掲げ更に説明を行うが、本発明はこれらに限定されるものではない。尚、実施例に於いて％は特に断らない限りすべて質量％を示す。
【００１５】
［実施例１］
数平均分子量２７万、脱アセチル化度９０％のキトサン(（株）共和テクノス社製、精製キトサン)５ｇを、１％の酢酸水溶液９５ｇに溶解し、内径３ｍｍのテフロンチューブに流し込み、−８０℃で凍結し凍結乾燥を行った。得られた乾燥キトサンをチューブから取り外し、４０ｍｍの長さに切断した。
これを１mol/L苛性ソーダに２時間浸漬した後、蒸留水で十分に洗浄を行いキトサンスティックを得た。
【００１６】
得られたキトサンスティックを１００mmol/Lの塩化カルシウム(和光純薬工業（株）社製,試薬特級)及び３０mmol/LのＬ−ヒスチジン(和光純薬工業（株）社製,試薬特級)を含有するカルシウム塩溶液２０ｍｌに、３０分間、３７℃で穏やかな撹拌下で浸漬した。次いで、生理食塩水２０ｍｌで３０秒間洗浄した後、２５mmol/Lのりん酸二水素ナトリウム(和光純薬工業（株）社製、試薬特級)及び１０９mmol/Lのりん酸水素二ナトリウム(和光純薬工業（株）社製、試薬特級)を含有するりん酸塩溶液２０ｍｌに、３０分間、３７℃で穏やかな撹拌下で浸漬した。その後、再び生理食塩水２０ｍｌで３０秒間洗浄した。
【００１７】
以上の工程を１サイクルとし、各工程毎に溶液のｐＨを測定し、溶液を新たなものに交換した。合計５サイクルの工程を繰り返し行った。
また、使用する浸漬溶液の浸透圧をWESCORI社製VAPROTM蒸気圧法オズモメータ５５２０型を用いて測定した。
更に、被覆後のりん酸カルシウム化合物の付着量を次の方法で求めた。まず、上述の方法で得られたりん酸カルシウム化合物が被覆されたキトサンスティックを蒸留水で十分水洗した後に真空乾燥を行い、次いで電気炉を用いて８００℃で２時間焼成した。焼成後残存する無機物をりん酸カルシウム化合物とし、焼成前のキトサンスティックとの重量変化から無機物含有量を算出し、これを被覆後のりん酸カルシウム化合物の付着量として求めた。
これらの結果を表１に示した。
【００１８】
［実施例２］
カルシウム塩溶液を、塩化カルシウム１００mmol/L、ホウ砂(和光純薬工業（株）社製、試薬)１０mmol/Lの濃度とし、３．６５％塩酸でｐＨ７．４９に調整したこと以外は、実施例１と同様に操作を行い、キトサンスティックの被覆処理を行った。同様に測定結果を表１に示した。
【００１９】
［実施例３］
カルシウム塩溶液を、塩化カルシウム１００mmol/L、Ｌ−ヒスチジン５０mmol/Lの濃度としたこと以外は、実施例１と同様に操作を行い、キトサンスティックの被覆処理を行った。同様に測定結果を表１に示した。
【００２０】
［実施例４］
りん酸塩溶液を、りん酸二水素ナトリウム３０mmol/Lとし、苛性ソーダでｐＨ７．４に調整した以外は、実施例１と同様に操作を行い、キトサンスティックの被覆処理を行った。同様に測定結果を表１に示した。
【００２１】
［実施例５］
カルシウム塩溶液を、硝酸カルシウム(和光純薬工業（株）社製、試薬特級)１００mmo/L、Ｌ−ヒスチジン３０mmol/Lの濃度としたこと以外は、実施例１と同様に操作を行い、キトサンスティックの被覆処理を行った。同様に測定結果を表１に示した。
【００２２】
［実施例６］
屠殺した日本白色家兎の後足から外科的に遊離腱を摘出し、これをキトサンスティックの代わりに使用したこと以外は、実施例１と同様に操作を行い、遊離腱の被覆処理を行った。同様に測定結果を表１に示した。
【００２３】
［比較例１］
カルシウム塩溶液を、乳酸カルシウム(和光純薬工業（株）社製、試薬特級)１４５mmol/L、の濃度のカルシウム塩溶液としたこと以外は、実施例１と同様に操作を行い、キトサンスティックの被覆処理を行った。同様に結果を表１に示した。
【００２４】
［比較例２］
カルシウム塩溶液を、塩化カルシウム１００mmol/L、硝酸カルシウム１００mmol/Lの濃度のカルシウム塩溶液としたこと以外は、実施例１と同様に操作を行い、キトサンスティックの被覆処理を行った。同様に結果を表１に示した。
【００２５】
［比較例３］
実施例６で摘出した日本白家兎後足から外科的に摘出した遊離腱の一部を使用したこと以外は、比較例１と同様に操作を行い、遊離腱の被覆処理を行った。同様に結果を表１に示した。
【００２６】
【表１】
0004685277.tif 000002
【００２７】
実施例６及び比較例３で被覆処理を行った遊離腱の表層の組織を切り出し、in vitroで細胞培養試験を行ったところ、実施例６の本発明の方法によって被覆された腱での表層組織は、順調な増殖を示したが、比較例３の方法で被覆された腱での表層組織は、その増殖は観察されなかった。
また、表１の結果から明らかなように、本発明の被覆方法では浸漬溶液のｐＨの変動は少なく、また浸透圧も生体組織への影響を及ぼさない範囲であることから、本発明の方法によれば、生体組織への影響が生じないものとなる。
【００２８】
【発明の効果】
本発明の生体組織基体の被覆方法は、生体組織基体にりん酸カルシウム化合物を被覆する方法に於いて、生体組織基体に対して組織の損傷を生じず、また均一なヒドロキシアパタイトを主成分とする被膜を形成させることが可能である。
更に、体液との浸透圧との関係に於いて、その条件を満たす浸漬溶液であることから、生体組織への影響が少ない。
従って、本発明の被覆方法は、生体組織である腱或いは靱帯等の生体組織基体に、直接りん酸カルシウム化合物を被覆するような場合には特に有用である。