(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１に示す天然のリシンA鎖毒素のアミノ酸配列の97位のアスパラギン残基における突然変異を含む変異リシンA鎖毒素を含む薬学的組成物であって、該変異リシンA鎖毒素は、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する天然のリシンA鎖毒素と比較して、対象において血管漏出症候群（VLS）を誘発する能力が低下しており、かつリシンA鎖毒素の酵素活性を有する、薬学的組成物。
【請求項２】
変異リシンA鎖毒素が配列番号：１に示すアミノ酸配列の48位のアルギニン残基における突然変異をさらに含む、請求項１記載の薬学的組成物。
【請求項３】
配列番号：１に示すアミノ酸配列の48位のアルギニン残基がアラニン残基に変異している、請求項２記載の薬学的組成物。
【請求項４】
配列番号：１に示すアミノ酸配列の97位のアスパラギン残基がアラニン残基に変異している、請求項１〜３のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項５】
配列番号：１に示すアミノ酸配列の48位のアルギニン残基がアラニン残基に変異し、かつ配列番号：１に示すアミノ酸配列の97位のアスパラギン残基がアラニン残基に変異している、請求項２記載の薬学的組成物。
【請求項６】
変異リシンA鎖毒素が、配列番号：１に示す天然のリシンA鎖毒素のアミノ酸配列の74位のロイシン残基、75位のアスパラギン酸残基、または76位のバリン残基における少なくとも一つの突然変異をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項７】
少なくとも一つの抗体、および変異リシンA鎖毒素を含む免疫毒素であって、該変異リシンA鎖毒素は、配列番号：１に示す天然のリシンA鎖毒素のアミノ酸配列の48位のアルギニン残基、および／または97位のアスパラギン残基における突然変異を含み、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する天然のリシンA鎖毒素と比較して、対象において血管漏出症候群（VLS）を誘発する能力が低下しており、かつリシンA鎖毒素の酵素活性を有する、免疫毒素。
【請求項８】
変異リシンA鎖毒素が配列番号：１に示すアミノ酸配列の48位のアルギニン残基における突然変異を含む、請求項７記載の免疫毒素。
【請求項９】
配列番号：１に示すアミノ酸配列の48位のアルギニン残基がアラニン残基に変異している、請求項７または８記載の免疫毒素。
【請求項１０】
変異リシンA鎖毒素が配列番号：１に示すアミノ酸配列の97位のアスパラギン残基における突然変異を含む、請求項７〜９のいずれか一項記載の免疫毒素。
【請求項１１】
配列番号：１に示すアミノ酸配列の97位のアスパラギン残基がアラニン残基に変異している、請求項７〜１０のいずれか一項記載の免疫毒素。
【請求項１２】
変異リシンA鎖毒素が配列番号：１に示すアミノ酸配列の48位のアルギニン残基、および97位のアスパラギン残基の両方における突然変異を含む、請求項７記載の免疫毒素。
【請求項１３】
配列番号：１に示すアミノ酸配列の48位のアルギニン残基がアラニン残基に変異し、かつ配列番号：１に示すアミノ酸配列の97位のアスパラギン残基がアラニン残基に変異している、請求項７記載の免疫毒素。
【請求項１４】
変異リシンA鎖毒素が、配列番号：１に示す天然のリシンA鎖毒素のアミノ酸配列の74位のロイシン残基、75位のアスパラギン酸残基、または76位のバリン残基における少なくとも一つの突然変異をさらに含む、請求項７〜１３のいずれか一項記載の免疫毒素。
【請求項１５】
請求項７〜１４のいずれか一項に記載の免疫毒素を含む薬学的組成物。
【請求項１６】
薬学的組成物を調製するための、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の免疫毒素の使用。
【請求項１７】
血管漏出症候群（VLS）を誘発する能力が低下した免疫毒素を調製する方法であって：
a)配列番号：１に示す天然のリシンA鎖毒素のアミノ酸配列の48位のアルギニン残基、および／または97位のアスパラギン残基を突然変異させる段階であって、変異リシンA鎖毒素は、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する天然のリシンA鎖毒素と比較して、対象においてVLSを誘発する能力が低下しており、かつリシンA鎖毒素の酵素活性を有する、段階、および
b)該変異リシンA鎖毒素を、少なくとも一つの抗体を含む組成物に結合させて免疫毒素を生成する段階
を含み、生成された免疫毒素は、配列番号：１に示すリシンA鎖毒素のアミノ酸配列の48位のアルギニン残基、および97位のアスパラギン残基が突然変異していない類似の免疫毒素と比べた場合、VLSを誘発する能力が低下している、方法。
【請求項１８】
変異リシンA鎖毒素が配列番号：１に示すアミノ酸配列の48位のアルギニン残基における突然変異を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
配列番号：１に示すアミノ酸配列の48位のアルギニン残基がアラニン残基に変異している、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
変異リシンA鎖毒素が配列番号：１に示すアミノ酸配列の97位のアスパラギン残基における突然変異を含む、請求項１７〜１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
配列番号：１に示すアミノ酸配列の97位のアスパラギン残基がアラニン残基に変異している、請求項１７〜２０のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
変異リシンA鎖毒素が、配列番号：１に示すアミノ酸配列の48位のアルギニン残基、および97位のアスパラギン残基の両方における突然変異を含む、請求項１７記載の方法。
【請求項２３】
配列番号：１に示すアミノ酸配列の48位のアルギニン残基がアラニン残基に変異し、かつ配列番号：１に示すアミノ酸配列の97位のアスパラギン残基がアラニン残基に変異している、請求項１７記載の方法。
【請求項２４】
変異リシンA鎖毒素が、配列番号：１に示す天然のリシンA鎖毒素のアミノ酸配列の74位のロイシン残基、75位のアスパラギン酸残基、または76位のバリン残基における少なくとも一つの突然変異をさらに含む、請求項１７〜２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
薬学的組成物を調製するための、変異リシンA鎖毒素の使用であって、該変異リシンA鎖毒素は、配列番号：１に示す天然のリシンA鎖毒素のアミノ酸配列の97位のアスパラギン残基における突然変異を含み、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する天然のリシンA鎖毒素と比較して、対象において血管漏出症候群（VLS）を誘発する能力が低下しており、かつリシンA鎖毒素の酵素活性を有する、使用。
【請求項２６】
変異リシンA鎖毒素が配列番号：１に示す天然のリシンA鎖毒素のアミノ酸配列の48位のアルギニン残基における突然変異をさらに含む、請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
配列番号：１に示すアミノ酸配列の48位のアルギニン残基がアラニン残基に変異している、請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
配列番号：１に示すアミノ酸配列の97位のアスパラギン残基がアラニン残基に変異している、請求項２５〜２７のいずれか一項記載の使用。
【請求項２９】
配列番号：１に示すアミノ酸配列の48位のアルギニン残基がアラニン残基に変異し、かつ配列番号：１に示すアミノ酸配列の97位のアスパラギン残基がアラニン残基に変異している、請求項２６記載の使用。
【請求項３０】
変異リシンA鎖毒素が、配列番号：１に示す天然のリシンA鎖毒素のアミノ酸配列の74位のロイシン残基、75位のアスパラギン酸残基、または76位のバリン残基における少なくとも一つの突然変異をさらに含む、請求項２５〜２９のいずれか一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本出願は、2002年10月29日に出願されたU.S. Application Serial No. 10/282,935の優先権を主張する。
【０００２】
政府は、国立衛生研究所からの許可番号CA-77701にしたがって本発明において権利を保有することができる。
【０００３】
1.  発明の分野
本発明は一般に、生理学および癌生物学の分野に関し、特に、血管漏出症候群(VLS)を誘発または発症させる毒素および他のタンパク質に関する。本発明は、VLSおよび他の毒性副作用を誘発するアミノ酸配列を欠くように突然変異させた免疫毒素(IT)およびサイトカインを提供する。開示されるものは、VLSおよび他の毒性副作用を誘発する配列を欠く免疫毒素が生成されるよう、サイトカインまたは免疫毒素をコードするDNAセグメントを突然変異させる方法である。
【背景技術】
【０００４】
2.  関連技術の説明
VLSは、バクテリア性敗血症でしばしば認められ、IL-2および多様な他のサイトカインを伴う可能性がある(BalunaおよびVitetta、1996)。VLSの基礎にある機構は不明であるが、内皮細胞(EC)に始まり、炎症カスケードおよびサイトカインを伴う事象のカスケードを含む可能性が高い(Engertら、1997)。VLSは、血管内皮細胞(EC)への損傷ならびに間質性水腫、体重増および、もっとも重篤な形態では、腎損傷、失語症および肺水腫を発症させる流体およびタンパク質の溢血を含む複雑な病因を有する(SausvilleおよびVitetta、1997、BalunaおよびVitetta、1996、Engertら、1997)。血管漏出症候群(VLS)は、これまでヒトにおいて試験されてきたすべてのITならびにサイトカイン、たとえばインターロイキン2(IL-2)、TNFおよびアデノウイルスベクターに関して主要な問題であった(Rosenbergら、1987、Rosenstenら、1986)。
【０００５】
ITは、植物、真菌またはバクテリアからの毒素、毒素サブユニットまたはリボソーム不活性化タンパク質(RIP)に生化学的または遺伝子学的に結合した、モノクロナール抗体(MAb)または他の細胞結合リガンドからなるハイブリッド分子である(Vitettaら、1993)。過去20年間、脱グリコシル化(dg)リシンA鎖(dgRTA)を含有するITが開発され、安定性および活性に関して構造的に最適化され、インビトロならびにマウス、サルおよびヒトにおけるインビボの両方で活性に関して評価されてきた(Vitettaら、1993、SausvilleおよびVitetta、1997、BalunaおよびVitetta、1996)。
【０００６】
dgRTA-ITが血管内皮細胞を損傷することによってVLSを誘発すると考えられてきた(Soler-Rodriguezら、1993、Balunaら、1996)。植物毒素、リシン(RTA)および他の毒素の触媒A鎖で調製されたIL-2およびITは、ヒトECをインビトロおよびインビボで損傷する(Dutcherら、1991、Rosenbergら、1987、VialおよびDescotes、1992)。ヒト臍静脈EC(HUVEC)を使用した研究は、dgRTAまたはdgRTAで調製されたITがこれらの細胞を1時間以内に損傷することができ(Soler-Rodriguezら、1993)、その一方でタンパク質合成の阻害には4時間以上を要するということを実証した。dgRTA-ITはまた、フィブロネクチン(Fn)媒介癒着を妨害する(Balunaら、1996)。Fnは、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)に対するdgRTA媒介損傷を阻害する(Balunaら、1996)。Fnへの細胞癒着は、Fn分子中のRGDおよびLDV配列を認識するインテグリンによって媒介される(MakaremおよびHumphries、1991、WaynerおよびKovach、1992)。
【０００７】
dgRTAに結合した三つのMAbが、第一相試験として、200名を超える、再発した薬品治療不応性のリンパ腫、骨髄腫、ホジキン病および移植片対宿主病(GVHD)の患者で評価された(SausvilleおよびVitetta、1997)。これらのITは、骨髄毒性または肝毒性の証拠を示さなかったが、すべてが、低アルブミン血症、体重増ならびに、もっとも重篤な場合には、肺水腫および低血圧症によって顕著に示されるように、最大耐量(MTD)でVLSを誘発した(Balunaら、1996)。加えて、これらのITは筋肉痛を誘発し、患者の3％では、MTDで横紋筋融解症を誘発した(SausvilleおよびVitetta、1997)。この副作用もまた、VLSに関連し、筋水腫から生じるものかもしれない。さらに、患者の5％未満で失語症が起こったが、これらの症状は、大脳微小血管における水腫が原因であるかもしれない。
【０００８】
この用量限定毒性(DLT)にもかかわらず、dgRTA-ITを使用する臨床応答は有望であり、薬品治療不応性の再発リンパ腫患者の15〜30％が第一相臨床試験において客観的な部分的または完全な応答を経験した(SausvilleおよびVitetta、1997)。しかし、DLT、VLSが、患者における第二相および第三相試験へと継続する熱意を低下させた。
【０００９】
臨床薬剤としてのdgRTA-ITならびに毒素およびRIPを含有する他のITならびにサイトカインのさらなる開発がVLSの解消および軽減によって大きく促進されるであろうことは明白である。VLSを回避または軽減することができるならば、現在遭遇されている用量限定副作用なしで、はるかに高い用量の多様な治療剤、たとえばIT、遺伝子治療およびサイトカインを使用することが可能になるであろう。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、種々のタンパク質性化合物が毒性作用を誘発する能力を改変する方法および毒性作用を誘発する能力が調節するように修飾されているタンパク質性組成物を提供することにより、当技術分野における欠点を解消する。いくつかの態様で、本発明は、たとえばVLSをはじめとするそのような毒性作用を促進または誘発する能力が低下しているITの作製を考慮する。本発明にしたがって作製されたITは、任意の数の治療用途、たとえばGVHD、非ホジキンおよびホジキンリンパ腫、骨髄腫ならびに一部の固形腫瘍の治療に用いられる。本発明はまた、多数の毒性作用のいずれをも誘発または促進する配列の突然変異によってタンパク質性組成物のVLS促進能力を低下させる方法を提供する。本発明は、たとえば、毒性作用を促進する能力が低下しているIT、IL-2、TNFおよびアデノウイルスならびに他のタンパク質またはウイルスならびにそのような化合物を使用する方法を提供する。
【００１１】
(x)D(y)トリペプチド配列に隣接するアミノ酸(隣接領域)を改変して、VLSを誘発するタンパク質性組成物の能力を低下させることができる。本明細書で使用する「タンパク質性組成物」とは、約200個を超えるアミノ酸または遺伝子から翻訳された全長内在性配列のタンパク質、約100個を超えるアミノ酸のポリペプチドおよび／または約3〜約100個のアミノ酸のペプチドをいい、アミノ酸3、4、5、6個など、10、11、12、13、14個など、20、21、22個など、30、40、50、60個など、100、110、120個など、200、220、240個など、300、350、400個など、500、600、700個などおよび1000個の長さのペプチドを含む。特定の態様では、この配列および／または隣接アミノ酸を改変する方法は、アミノ酸またはアミノ酸配列の除去または置換による方法である。
【００１２】
特定の態様では、修飾タンパク質性組成物は、(x)D(y)配列および(x)D(y)配列がVLSを誘発する能力を改変する少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有するタンパク質を含むことができる。本発明のタンパク質は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれを超える数の突然変異を含むことができる。突然変異は、隣接領域、タンパク質の活性部位および／またはタンパク質中の(x)D(y)配列にあることができる。隣接領域内に位置すると定められるアミノ酸は、天然タンパク質構造の(x)D(y)配列中のアスパラギン酸から約10オングストローム以内に位置する、天然タンパク質構造の酵素部位残基(活性部位)から約6オングストロームを超えるところに位置する、天然タンパク質構造の表面に少なくとも部分的に露出して位置する、またはこれらのパラメータの二つ以上の組み合わせに当てはまるアミノ酸を含むことができる。隣接領域内のアミノ酸の突然変異が、本明細書に記載される他いずれかの突然変異と組み合わさってもよい。(x)D(y)を含むタンパク質は、毒素、サイトカインまたはウイルスタンパク質であることができる。特定の態様では、タンパク質は毒素である。毒素としては、リシンA鎖毒素(RTA)、アブリンA鎖、ジフテリア毒素(DT)A鎖、シュードモナス外毒素(PE)、志賀毒素A鎖、ゲロニン、モモルジン、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、サポリン、トリコサンチンまたはオオムギ毒素があるが、これらに限定されない。具体的な態様では、毒素はリシンA鎖毒素である。
【００１３】
種々の態様では、修飾タンパク質性組成物は、(x)D(y)配列および、タンパク質の毒性を改変する、隣接配列中の少なくとも一つのアミノ酸突然変異を有するタンパク質を含む。本明細書で記載する組成物のタンパク質はさらに、本明細書で記載する他の突然変異を含むことができる。特定の態様、たとえばワクチン組成物およびワクチン接種法では、不活性化タンパク質(たとえば、活性部位に不活性化改変を含むタンパク質)が好ましいかもしれない。タンパク質の突然変異体アミノ酸は、上記のような(x)D(y)配列に隣接するアミノ酸を含むことができる。タンパク質は、本明細書で記載するような毒素、サイトカインまたはウイルスタンパク質であることができる。種々の態様で、毒素はリシンA鎖毒素である。
【００１４】
種々の態様では、リシンA鎖毒素は、隣接領域内に少なくとも一つの突然変異を含み、本明細書で記載するように、リシンA鎖毒素に対するワクチン接種で使用することができるタンパク質の活性部位中および／またはタンパク質の(x)D(y)配列中の突然変異または改変と組み合わさってもよい。具体的な態様では、リシンA鎖毒素中の突然変異は、R48、N97またはR48およびN97を含むが、これらに限定されない、隣接領域配列のアミノ酸中に少なくとも一つの突然変異を含む。タンパク質の突然変異としては、天然アミノ酸の置換、修飾または欠失がある。特に、天然アミノ酸はアラニン残基で置換されていることができる。本発明の組成物は、医薬品または薬学的に許容される組成物として提供することができる。
【００１５】
本発明はまた、前記方法および本明細書の他の場所で記載される方法にしたがって、隣接領域配列内の改変と組み合わせて調製された、(x)D(y)を含む配列の少なくとも一つのアミノ酸が天然タンパク質性組成物の配列に対して改変されている修飾タンパク質性組成物を提供する。特定の態様では、タンパク質性組成物は、毒素、サイトカイン、ウイルス配列またはそれらの組み合わせを含む。特定の態様では、毒素は、たとえば、植物毒素、真菌毒素、バクテリア毒素、RIPまたはそれらの組み合わせである。さらなる態様では、毒素は、アブリンA鎖、ジフテリア毒素(DT)A鎖、シュードモナス外毒素、RTA、志賀毒素A鎖、ゲロニン、モモルジン、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、サポリン、トリコサンチン、オオムギ毒素またはそれらの組み合わせを含む。他の態様では、タンパク質性組成物は、サイトカイン、たとえばインターロイキン-2を含む。他の態様では、タンパク質性組成物は、ウイルス配列、たとえばアデノウイルス配列を含む。
【００１６】
特定の局面において、組成物はさらに抗体を含む。具体的な態様では、組成物はさらにITを含む。さらなる局面において、ITはさらに、少なくとも一つの第二の作用物質、たとえば少なくとも一つのエフェクター分子を含む。具体的な態様では、エフェクター分子は、毒素、抗腫瘍剤、治療用酵素、抗ウイルス剤、ウイルス、サイトカイン、成長因子またはそれらの組み合わせである。他の態様では、作用物質は少なくとも一つのレポーター分子である。
【００１７】
本発明はさらに、VLS、アポトーシス、インテグリン様活性またはEC損傷を誘発する能力が低下している少なくとも一つのタンパク質性分子を含み、そのタンパク質性分子が少なくとも一つの改変された(x)D(y)および／または隣接領域配列を有するITを提供する。
【００１８】
特定の態様では、組成物は、治療剤、たとえば少なくとも一つのIT、抗体、サイトカイン、ウイルスまたはそれらの組み合わせを含む。具体的な態様では、組成物と治療剤とは共有結合している。具体的な態様では、組成物は治療剤である。
【００１９】
本発明はまた、74位〜76位を含む(x)D(y)配列が改変されている、患者において毒性を促進する能力が低下しているRTAを提供する。特定の態様では、74位のロイシンが改変されている、75位のアスパラギン酸が改変されている、および／または、76位のバリンが改変されている。特定の態様では、(x)D(y)配列はさらに、(x)D(y)トリペプチド配列の(x)または(y)の約1〜約6個の残基の位置を含む。種々の態様では、(x)D(y)配列の改変は、隣接領域配列の改変と組み合わされている。
【００２０】
本発明は、VLSを誘発する能力が低下しているタンパク質性組成物を提供する。ある態様では、タンパク質性組成物は、配列(x)D(y)を含む組成物に隣接する少なくとも一つのアミノ酸配列を除去するように改変されている。本発明の特定の態様では、タンパク質性組成物は、ゲロニン、モモルジン、ポークウィード抗ウイルスタンパク質(PAP)、サポリンまたはトリコサンチンを含むが、これらに限定されないリボソーム不活性化タンパク質(RIP)であってもよいし、アブリンA鎖、ジフテリア毒素(DT)A鎖、シュードモナス外毒素-A(PE38-lys)、RTA、志賀毒素A鎖またはオオムギ毒素を含むが、これらに限定されない毒素または毒素サブユニットであってもよいし、IL-2を含むが、これに限定されないサイトカインであってもよい。タンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドは、本発明の方法および組成物で使用されるRIP、毒素またはサイトカインに由来することができる。特定の態様では、タンパク質性組成物は、VLSを促進または増強する能力が低下しているITを作製するために使用することができる。他の態様では、ITで使用するためのタンパク質性組成物は、RIPおよび／または毒素配列である。
【００２１】
本発明の特定の態様は、以下の段階を含む、タンパク質性組成物がVLSを誘発する能力を低下させる方法を含む：(x)は、ロイシン、イソロイシン、グリシンおよびバリンの群から選択され、(y)は、バリン、ロイシンおよびセリンの群から選択される、少なくとも一つの(x)D(y)アミノ酸配列を含むタンパク質を同定する段階、ならびに上記(x)D(y)配列の隣接領域内で少なくとも一つのアミノ酸残基を改変し、VLSを誘発する能力を低下させる段階。
【００２２】
種々の態様は、VLSを誘発する能力が低下している免疫毒素を調製する方法であって、(x)は、ロイシン、イソロイシン、グリシンおよびバリンの群から選択され、(y)は、バリン、ロイシンおよびセリンの群から選択される、少なくとも一つの(x)D(y)アミノ酸配列を含む毒素を同定する段階、上記(x)D(y)配列の隣接領域で少なくとも一つのアミノ酸残基を改変し、VLSを誘発する能力を低下させる段階、ならびに前記毒素を、少なくとも一つの抗体を含む組成物に結合させて免疫毒素を作製する段階を含み、作製された免疫毒素が、隣接アミノ酸配列が毒素から改変されていない同種の免疫毒素を比べた場合、VLSを促進する能力が低下している方法を含む。
【００２３】
いくつかの態様では、本発明は、タンパク質性組成物が毒性作用を誘発する能力を調節する方法であって、(x)は、ロイシン、イソロイシン、グリシンおよびバリンの群から選択され、(y)は、バリン、ロイシンおよびセリンの群から選択される配列(x)D(y)を含む、少なくとも一つのアミノ酸配列を同定する段階、ならびに配列(x)D(y)を含むアミノ酸配列を改変する段階を含む方法を提供する。特定の態様では、改変は、アミノ酸配列の少なくとも一つの突然変異を含む。他の態様では、アミノ酸配列を除去する。具体的な態様では、アミノ酸配列は配列(x)D(y)を含み、(x)D(y)配列は、
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である。より具体的な特定の態様では、本発明は、(x)は、ロイシン、イソロイシン、グリシンおよびバリンの群から選択され、(y)は、バリン、ロイシンおよびセリンの群から選択される(x)D(y)を含む配列の少なくとも一つのアミノ酸が天然タンパク質性組成物の配列に対して改変されている修飾タンパク質性組成物を薬剤としての使用のために提供する。
【００２４】
タンパク質性組成物は、(x)D(y)トリペプチド配列を有する、現在公知であるものまたは将来見いだされるもののいずれであってもよい。いくつかの態様では、タンパク質性組成物は、毒素、サイトカイン、ウイルス配列またはそれらの組み合わせを含む。具体的な態様では、毒素は、植物毒素、真菌毒素、バクテリア毒素、RIPまたはそれらの組み合わせを含む。さらなる態様では、毒素は、アブリンA鎖、ジフテリア毒素(DT)A鎖、シュードモナス外毒素、RTA、志賀毒素A鎖、ゲロニン、モモルジン、ポークウィード抗ウイルスタンパク質、サポリン、トリコサンチン、オオムギ毒素またはそれらの組み合わせを含む。他の態様では、タンパク質性組成物は、サイトカイン、たとえばインターロイキン-2を含む。さらなる態様では、タンパク質性組成物は、ウイルス配列、たとえばアデノウイルス配列を含む。特定の態様では、タンパク質性組成物はさらに、ITを含むか、ITで構成されている。
【００２５】
本明細書で使用する「一つの」は、一つ以上を意味することができる。語「一つの」は、請求項の中で語「含む」と組み合わせて使用される場合、一つ以上を意味することができる。
【００２６】
以下の詳細な説明から本発明の他の目的、特徴および利点が理解される。しかし、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示すものであるが、実例として記載されるにすぎず、この詳細な説明から、本発明の本質および範囲における多様な変更および修正が当業者には自明である。
【００２７】
例示的な態様の説明
細胞損傷、特に内皮細胞損傷は、毒素、たとえばヘビ毒または敗血症性ショックを生じさせる分子によって生じるか、治療剤、たとえばITまたはインターロイキンによって生じるかにかかわらず、患者にとって依然として問題である。細胞損傷のタイプとしては、VLS、ディスインテグリン様活性およびアポトーシスがある。
【００２８】
VLSを緩和する方法および組成物を考案するため、VLSを生じさせる分子の候補配列を評価して、RTA、毒素、RIPSおよびIL-2が、細胞-細胞および細胞-基質相互作用を妨害することによってヒトECを損傷する原因である構造モチーフを共有するかどうかを判定した。VLS誘発毒素、RIPSおよびIL-2の配列を比較すると、(x)がL、I、GまたはVであることができ、(y)がV、LまたはSであることができる(x)D(y)共通モチーフが同定された。RTAおよびIL-2の場合、分子モデル化が、これらのモチーフがそれぞれの分子の表面に完全または実質的に露出しているということを示した。類似したモチーフが、インテグリンの機能を混乱させるウイルスディスインテグリンによって共有されており、RTA、IL-2およびおそらくは他の毒素が、それらの(x)D(y)モチーフのせいでECを損傷し、ひいてはディスインテグリンでありうるということが示される。
【００２９】
LDV同族体配列もまた、血管細胞癒着分子1(VCAM-1)をはじめとする、IDS配列を含有する多様な非毒性分子およびGDV配列を含有するフィブリノーゲンのγ鎖の血管機能において役割を演じることから(Clementsら、1994)、このモチーフの血管漏出促進活性は驚くべきことであり、かつ予想外である。LDVは、α4β1インテグリンレセプターへの結合の原因である、フィブロネクチンのCS1ドメインの中に最小活性部位を構成する(MakaremおよびHumphries、1991、WaynerおよびKovach、1992、Nowlinら、1993)。フィブロネクチンはこの配列を有するが、HUVECを損傷することはない。それどころか、FNはHUVECをRTA媒介損傷から保護する(Balunaら、1996)。これは、このモチーフを有する毒性作用物質のVLS活性とは全く対照的である。
【００３０】
このモチーフがEC損傷の原因であるかどうかを判断するため、RTAまたはIL-2からのペプチドをそれぞれ含有する短いLDVまたはLDLを生成し、マウスMAbに結合させ、インビトロでHUVECに結合し、それを損傷し、インビボで皮膚異種移植片中のマウス肺血管系およびヒト血管系を損傷する能力に関して研究した。RTAの一つの活性部位突然変異体およびいくつかのLDV突然変異体を生成した。これらのLDV突然変異体は、モデル化されると、RTAの活性部位に影響しないと予想される保存的変更を含むものであった。配列(L74、D75、V76)を含有するRTAからの抗体結合ペプチドは、欠失または改変された配列を有するペプチドは除いて、二つの動物モデルでインビトロでのEC損傷およびインビボでの血管損傷を誘発した(Balunaら、1999)。これらの結果は、VLS誘発部位が活性部位を要しないことを実証した。LDVを包含しない、RTAの非隣接活性部位は、ECを損傷することを要しないし、血管の損傷にも部分的にしか寄与しないと考えられる。
【００３１】
これらの結果は、活性部位が血管損傷を誘発する必要はないかもしれず、VLS促進活性が低下している一つ以上の活性ペプチドまたはポリペプチドを作製することができるということを実証する。この発見により、今や、(x)D(y)配列および／または隣接領域配列の一つ以上のアミノ酸欠失または突然変異がVLSを軽減または防止し、治療指数またはVLS誘発分子の耐量を改善するということが可能である。VLS促進作用物質によって誘発されるVLSを軽減または解消する、少なくとも一つの突然変異モチーフおよび／または一つ以上の隣接領域配列を含む一つ以上のペプチドおよび小分子薬物阻害剤を作製することができると期待される。
【００３２】
種々の態様では、活性部位および／または(x)D(y)モチーフの物理的領域、空間または付近に位置する他の残基を突然変異または改変させて、VLSを抑止、軽減または解消することができる。隣接領域中の突然変異の標的とされるアミノ酸としては、天然タンパク質の表面またはその近くにあるアミノ酸、特にRTAおよびその誘導体がある。この改変は、(x)D(y)モチーフの領域中の荷電残基を除去または置換することができ、それが、タンパク質表面上の特定区域の電荷を打ち消すまたは逆にすることができる。改変はまた、タンパク質の(x)D(y)配列または活性部位の物理的領域、空間または付近のアミノ酸のサイズおよび／または親水性を変化させることができる。二つの典型的な隣接残基は、RTAの三次元構造中(x)D(y)モチーフに物理的に隣接するところに見いだされるアルギニン48(R48)およびアスパラギン97である。
【００３３】
特定の態様では、タンパク質性組成物のディスインテグリンまたはディスインテグリン様活性を低下または増強させることができると考えられる。ディスインテグリンは、ECを損傷する能力、細胞癒着を妨害する能力および／または血小板凝集を妨害する能力をはじめとする種々の活性を有する。(x)D(y)配列の一つ以上のアミノ酸欠失もしくは突然変異および／または一つ以上の隣接領域残基が、これらの配列を含む一つ以上の分子のディスインテグリン様活性を低下または阻止することができると考えられる。このような作用物質のディスインテグリン様活性を低下または解消する、少なくとも一つの突然変異モチーフおよび／または一つ以上の隣接配列を含む一つ以上のペプチドおよび小分子薬物阻害剤を作製することができると期待される。
【００３４】
さらには、RTAのLDV部位がECでアポトーシスを誘発した。多くの毒素およびITが、タンパク質合成を阻害するだけでなく、アポートシスを誘発するということが報告されている。また、(x)D(y)配列の一つ以上のアミノ酸欠失もしくは突然変異および／または少なくとも一つの隣接領域残基が、これらの配列を含む一つ以上の分子のアポトーシス活性を低下または阻止することができると考えられる。このような作用物質のアポトーシス活性を低下または解消する、少なくとも一つの突然変異モチーフおよび／または少なくとも一つの隣接配列を含む一つ以上のペプチドおよび小分子薬物阻害剤を作製することができると期待される。したがって、アポトーシス活性は、毒素またはサイトカイン誘発VLSを生じさせる、またはそれに寄与することができる。
【００３５】
また、(x)D(y)配列の一つ以上のアミノ酸欠失もしくは突然変異および／または一つ以上の隣接領域残基が、これらの配列を含む分子がEC損傷を誘発する能力を低下または阻止することができると考えられる。このような作用物質のEC損傷活性を低下または解消する、少なくとも一つの突然変異モチーフおよび／または一つ以上の隣接残基を含む一つ以上のペプチドおよび小分子薬物阻害剤を作製することができると期待される。
【００３６】
本明細書に記載されるものは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは他のタンパク質性物質中の(x)D(y)モチーフの(x)D(y)、(x)D(y)Tまたは隣接領域中の、そのような配列をそれぞれ除去または追加する突然変異に基づいて、VLS促進活性が低下または増強している作用物質を生成する方法および当該作用物質を含む組成物である。また、VLS促進活性の低下または増強に関して記載した同じ突然変異が、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質のアポトーシス活性、EC損傷および／または一つ以上のディスインテグリン様活性をそれぞれ低下または増強させると考えられる。したがって、VLS促進活性が増強または低下しているタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの作製に関して本明細書で記載したすべての方法が、アポトーシス活性、EC損傷および／または一つ以上のディスインテグリン様活性が低下しているタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを作製するために適用されるということが理解される。すべてのそのような方法およびそのような方法によって同定または作製される組成物が本発明に包含される。
【００３７】
A.  VLS誘発作用物質中の(x)D(y)モチーフの同定
細胞-細胞および細胞-基質相互作用に作用し、それによってヒトECを損傷することができるRTA、他の毒素、RIPおよびIL-2の中の同族構造モチーフを同定し、モデル系でVLSを促進する能力に関して試験した。この(x)D(y)モチーフ(x= L、I、GまたはVであり、y= V、LまたはSである)(表1)は、VLSを誘発するRTA、他の毒素、RIPおよびサイトカインの配列に共通である。このモチーフはまた、インテグリンの機能を混乱させるウイルスディスインテグリンによって共有されている(Coulsonら、1997)。
【００３８】
(表１)VLSを誘発する分子中の(x)D(y)モチーフの非限定的例
0004845381.tif 000003
1ホロトキシンの酵素活性鎖
2PE38とは、PE中の酵素活性ドメインIII(残基405〜613)ならびに残基253〜354および381〜404を指す。
3植物毒素の酵素的活性A鎖の同族体であるリボソーム不活性化タンパク質(RIP)
【００３９】
1.  RTA、ディスインテグリン、PE38-lysおよびIL-2中の(x)D(y)モチーフの局在化
VLSの促進における(x)D(y)配列の重要度の発見により、今や、有効なITを作製するのに重要である酵素的活性を保持し、また、VLS誘発性が低下しているRTA突然変異体を作製することが可能である。
【００４０】
RTA中のLDVモチーフ(残基74〜76、SEQ ID NO:1)は、活性部位に含まれるTyr-80残基に近い第一ドメインのβ-ストランドのC末端にある(Mlsnaら、1993)。酵素の活性部位(残基80、123、177、180、209および211)はLDV配列を含まず、そのため、RTAの酵素活性がこの配列中の突然変異または欠失によって影響を受けることはないはずである(MunishkinおよびWool、1995)。
【００４１】
RTAおよびIL-2の結晶構造を検査するため、RTA(PDBアクセッション番号1br5.pdb)およびIL-2(PDBアクセッション番号1irl.pdb)の三次元構造の空間充填モデルを比較した。具体的には、RTAのLDV残基の原子、IL-2のLDL残基の原子およびRTAの活性部位残基(Y80、Y123、E177、R180、N209およびW211)の原子を、構造中のそれらの相対的な位置付けに関して分析した。Insight IIプログラム(MSI)を用いてモデルを生成した。RTAの結晶構造の検査は、このモチーフは部分的にしか露出していないが、分子中の構造的変動変異がその接触性を高めることができることを示す。このことおよび本明細書に記載する他のデータから、(x)D(y)モチーフ、C末端隣接アミノ酸、N末端隣接アミノ酸、隣接領域配列またはそれらの組み合わせのいずれかの改変が、多様な作用物質によるVLS誘発活性の損失を招くことができると考えられる。
【００４２】
ディスインテグリンと呼ばれるもう一つのタンパク質の系統群は通常、RGD配列を含有する。ロタウイルス中に存在するある種のディスインテグリンの場合、LDV配列が存在する(Coulsonら、1997)。ディスインテグリンは、ECを損傷したり、細胞癒着および／または血小板凝集を妨害したりする(McLaneら、1998、Huang、1998、Tselepisら、1997)。ヘビ毒ディスインテグリンキストリンにおいては、ディスインテグリン機能を犠牲にすることなく、LDVによってRGDを置換することができる(Tselepisら、1997)。したがって、ヒトECの損傷においては、RTAおよび多様な他の分子が、キストリンと性質を共有するディスインテグリンでありうる(BlobelおよびWhite、1992、LazarusおよびMcDowell、1993)。特定の態様では、ディスインテグリンまたはディスインテグリン様活性を有する分子は、ECを損傷する能力が低下する、細胞癒着を妨害する能力が低下する、および／または血小板凝集を妨害する能力が低下するように改変または作製することができると考えられる。このような分子は、(x)D(y)配列中の少なくとも一つの残基または少なくとも一つの隣接残基を突然変異させることによって作製することができる。また、ディスインテグリンの活性をブロックする(x)D(y)および／または隣接配列のペプチドまたはペプチド模倣物を作製することもできると考えられる。
【００４３】
PE38-lysでは、GDL配列は活性部位から遠位にある(Liら、1995)。したがって、PE38-lysも同様に、その活性を完全に消失させることなく、そのVLS促進活性が低下または消失するように突然変異させることができると考えられる。
【００４４】
IL-2では、残基19〜21のLDL配列(SEQ ID NO:2)は、αらせんの中に位置し、同じく部分的に露出している。LDLモチーフ中の、Asp-20の突然変異(表1)が、IL-2レセプターのβ鎖へのIL-2の結合およびそれに続く細胞増殖をなくす(Collinsら、1988)。IL-2は、インビトロでのアルブミンに対する血管内皮の透過性を直接高め、この作用が抗IL-2レセプターMAbによって阻害されることができると報告されている(Downieら、1992)。実施例1の結果は、IL-2中のLDL配列がHUVECを損傷することを実証している。しかし、RTAとは対照的に、IL-2のLDL中のAsp-20はレセプター結合および機能活性に関与している(Collinsら、1988)。したがって、特定の態様では、VLSを解消または軽減するためのIL-2の(x)D(y)配列および／または隣接配列中の突然変異は、Asp-20を保存しなければならないか、またはIL-2の生物学的活性が低下しうると考えられる。
【００４５】
2.  隣接配列中の突然変異
(x)D(y)配列だけがVLSの促進の原因ではないかもしれない。特定の態様では、(x)D(y)配列に隣接するさらなる配列を突然変異させて、VLSを促進するペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の能力を増強または低下させることもできると考えられる。これらの隣接配列は、(x)D(y)配列からの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100またはそれを超える数のアミノ酸であるアミノ酸を含むことができる。ならびに、天然タンパク質構造の(x)D(y)配列中のアスパラギン酸から約10オングストロームの隣接領域内に位置する、天然タンパク質構造の活性部位残基から約6オングストロームを超えるところに位置する、天然タンパク質構造の表面に少なくとも部分的に露出して位置する、またはこれらのパラメータの二つ以上の組み合わせに当てはまるアミノ酸。
【００４６】
たとえば、LDVは、α4β1インテグリンレセプターへのその結合の原因であるフィブロネクチンのCS1ドメイン中の最小活性部位を構成する(MakaremおよびHumphries、1991、WaynerおよびKovach、1992、Nowlinら、1993)。しかし、フィブロネクチン(FN)はHUVECを損傷しない。それどころか、FNはHUVECをRTA媒介損傷から保護する(Balunaら、1996)。FNは、RTAとは違い、スレオニンの代りにC末端LDV隣接プロリンを有する。
【００４７】
ディスインテグリンでは、RGDに隣接する残基がリガンド結合において役割を演じる(Luら、1996)。LDVまたは同族体含有分子が血管完全性を促進する(たとえばFN)能力またはそれを損なわせる能力(たとえばRTA)の違いは、LDVモチーフの配向、または相互作用(すなわち結合)のための利用性、ひいては隣接配列に依存することができる。したがって、この配列の一つ以上のアミノ酸またはNもしくはC末端隣接配列の一つ以上のアミノ酸の変化が、分子を、内皮細胞を損傷するもの(ディスインテグリン様)から内皮細胞の成長を増強するものに転換することができる。(x)D(y)配列の一つ以上の隣接残基の変化が、VLSを促進する分子の能力を増強または低下させることができると考えられる。さらに、(x)D(y)配列をタンパク質の外面に露出させて他のタンパク質、たとえばレセプターと相互作用させる変化がVLS促進活性を高めるであろうが、より露出の少ない構造はVLS促進活性を低下させることができると考えられる。
【００４８】
a.  リシンA鎖-VLS突然変異のための候補残基を同定するための構造分析
隣接領域残基としてのアミノ酸の同定は、NCBI(GenBank)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/から入手可能であるリシンA鎖結晶構造の少なくとも一つによって決定することができる。これら二つの典型的な構造は、突然変異または複合体中の他の実体との共結晶化を有しない、RTA単独の二つの構造である。これらの構造は、NCBIから入手可能なソフトウェアCn3D v.4.0を使用することによって解析し、操作することができる。使用することができる典型的な配列または構造としては、RTA(GenBankアクセッション番号1RTC)D.Mlsna, A.F.Monzingo, B.J.Katzin, S.Ernst & J.D.Robertus, 29-Oct-92およびrRTA(GenBankアクセッション番号: 1IFT)S.A.Weston, A.D.Tucker, D.R.Thatcher, D.J.Derbyshire & R.A.Pauptit, 5-Jul-96ならびにこれらおよび他のデータベースで容易に利用可能である(x)D(y)配列を含有するものとして同定される他の配列があるが、これらに限定されない。
【００４９】
改変されるとVLSを解消、軽減または抑止することができる残基を同定する方法は、a)(x)D(y)配列、特にLDV配列の10Å以内のすべての残基を同定すること(たとえばアスパラギン酸(D)、特にRTA D75からの残基の距離を測定すること)、b)残基ごとに「活性部位」からの距離を測定すること(たとえば、RTAの6個の主要活性部位残基(Y80、Y123、E177、R180、N209、W211)を選択し、活性部位の最近点までの各候補の距離を「計測」した)、c)残基ごとに表面露出を目視で検査すること(「Y」(露出)、「P」(部分的に露出)または「N」(露出なし)でランク付けする)および／またはd)タンパク質の表面上のどこで残基が見られるかに関して各残基を目視で検査して「F」(前面)または「B」(背面)または両方(「端」にあるか、分子中を延びているか)として(x)D(y)、LDVおよび／または活性部位に対してランク付けすることを含むが、これらに限定されない。
【００５０】
RTAの場合、別個のRTA構造からの残基を比較する表を編纂し、アミノ酸の間の各距離を解析し、確認することができる。通常、表面／埋設前面／背面の差を評価し、残基ごとにコンセンサスに到達させる(これらの評価の主観性のせいで、たとえば部分露出と露出との差は確定しにくかもしれない。表面への任意の露出は通常、少なくとも「部分的に」露出していると分類される)。RTAの典型的なリストが表2に提供されている(LDVTおよびLDVから10Å以内の活性部位(AS)の4個の残基を含む80個の残基が提供されている)。
【００５１】
加えて、方法はまた、e)リストからすべての「ターン」残基、たとえばP(プロリン)G(グリシン)(RTAの場合、8残基)を除外し(一般に、これらは、分子の完全性を完全に損なうことなく変化させることはできない)、f)リストから、埋もれた残基（buried residue）(上から「N」と標識されたもの、RTAの場合、17残基、L74は比較のためのもの)およびもっぱら分子の背面で露出したすべての残基(上記で決定したもの、RTAの場合、27残基、V76は比較のためのもの)を除外し、g)リストから、活性部位から6Å以内(この距離は任意に選択したものであるが、3.0Å離れているRTA D75突然変異体の活性の損失および6.0Å(6残基)離れている二つのV76突然変異体のRTA活性の保持に基づく)のすべての残基を除外することを含む。たとえば、この方法は、表2の典型的なリストを表3の典型的なリスト(比較のため、LDVTおよび活性部位残基をなおも含む22残基)まで減らす。
【００５２】
残りの14残基(LDVTおよび活性部位を差し引いたもの)が、表4に、おおよそRTAのLDV領域からの距離の順で一覧に示されている。この保存的リストの残基は、改変されると、RTAのVLS活性を解消、低下または抑止することができるが、表2および3からの他の残基の改変もまた、適切な結果をもたらすことができる。この選択は通常、1)(x)D(y)、RTAの場合、LDV領域への近接、2)活性部位からの距離、および3)(x)D(y)配列と同じ分子面への表面露出に基づく。たとえば、これらの構造規準を満たすRTAのN97およびR48はいずれも、RTA活性を保持しながらも、VLSが軽減、解消または抑止されている。本明細書に記載するこれらの改変の一つ以上を単独でまたは他の改変と組み合わせて使用して、低下した毒性、低下したVLS特性、低下した酵素活性またはそれらの組み合わせを有するタンパク質を作製することもできる。
【００５３】
(表２)RTAの場合のアミノ酸距離の典型的な編纂リスト
0004845381.tif 000004
0004845381.tif 000005
0004845381.tif 000006
【００５４】
(表３)さらなる基準を使用した、RTAの場合のアミノ酸距離の典型的な編纂リスト
0004845381.tif 000007
【００５５】
(表４)RTAの場合の特定の隣接残基の典型的な編纂リスト
0004845381.tif 000008
【００５６】
B.  VLS活性が改変された組成物の作製
VLSを誘発し、アポトーシスおよび他の作用を誘発するものとして(x)D(y)および(x)D(y)Tモチーフを同定すると、新たな系統群のVLS阻害剤分子の作製が、これらの分子が最大限の有益作用を及ぼすことを可能にする。たとえば、本明細書に開示される組成物および方法を使用する抗癌治療剤の毒性の低下は、より大きな腫瘍またはより進行した疾病を治療することを可能にする。今や、細胞と、VLS促進性、アポトーシス促進性、EC損傷性および／またはディスインテグリン様の分子との相互作用を遮断する小さな薬物分子を同定または合成することが可能である。特定の態様では、(x)D(y)および／または(x)D(y)Tモチーフもしくはその隣接配列に基づくペプチドまたは薬物模倣体を使用して、VLSまたは他の活性をインビボで阻害することもできる。敗血症、IL-2治療などをはじめとする多様な他の状況で内皮細胞上のLDVモチーフ結合部位と競合し、VLSまたは他の作用を阻止するペプチドまたはペプチド-担体結合体（conjugate）を作製することが可能である。
【００５７】
また、特定の態様では、より大きな分子に加えられる一つ以上の(x)D(y)、(x)D(y)Tモチーフおよび／または特定の隣接配列が組織への溢血を増すことが可能である。本開示を考慮すると、抗炎症剤または転移抑制剤として試験されている(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列を含有するペプチド(Jacksonら、1997、Maedaら、1997、Greenspoonら、1994)は、溢血の増大および血管系に対する毒性作用の両方に関して観察されるはずである。しかし、特定の態様では、組織への溢血を増大させるタンパク質性組成物を作製することが望ましいかもしれない。本発明のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを用いた治療組成物の溢血の改善、すなわち治療組成物の溢血の促進により、治療剤の組織への接触が増大する。したがって、一つ以上のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは治療剤の溢血を増強または低下させる方法が提供される。好ましい治療剤としては、一つ以上のIT、抗体、サイトカイン、ウイルス、薬物などがあるが、これらに限定されない。
【００５８】
(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列を欠くペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を作製するためには、保存されたアスパラギン酸(D)を欠失または突然変異させてもよいし、別のアミノ酸でアスパラギン酸を置換してもよいし、その位置またはその位置に隣接するところに一つ以上のアミノ酸を挿入してもよい。欠失または突然変異事象の結果として、任意のアミノ酸が配列中の(D)残基を置換してもよい。
【００５９】
または、一つ以上のアミノ酸の挿入によって(x)残基を欠失、置換または移動させて、(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列を除去してもよい。欠失または突然変異事象の結果として配列中の(x)残基を置換することができるアミノ酸は、好ましくは、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、グリシン(G)またはバリン(V)ではない。
【００６０】
または、一つ以上のアミノ酸の挿入によって(y)残基を欠失、置換または移動させて(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列を除去してもよい。欠失または突然変異事象の結果として配列中の(y)残基を置換することができるアミノ酸は、好ましくは、バリン(V)、ロイシン(L)またはセリン(S)ではない。
【００６１】
さらには、(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列を、この配列を改変または変化させる突然変異によって除去することもできる。そのような突然変異としては、アミノ酸の切断、挿入、置換および欠失があるが、これらに限定されない。また、化学的修飾が(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列を改変して、VLSを誘発または促進するその能力を低下させることができると考えられる。
【００６２】
したがって、(x)D(y)配列または隣接配列に作用するそのような突然変異が、ポリペプチドがVLSを促進する能力またはこれらの配列に伴う他の能力を改変することができると考えられる。たとえば、VLSを生じさせた一つの好ましい作用物質は、そのアミノ酸配列の68位〜70位にIDV配列を含有するアブリンA鎖(GenBankアクセッション番号X76721、SEQ ID NO:3)である。グリシン(G)が67位にある。したがって、68位のイソロイシンの欠失は、結果として、67位のグリシンを元の69位のアスパラギン酸残基(D)に隣接させることになる。次に、創出されたこの新たな配列は、突然変異アブリンA鎖の67位〜69位でGDVとなる。この新たなトリペプチド配列はなおもVLS誘発配列(x)D(y)および／または(x)D(y)Tに該当する。しかし、このような欠失は、作製される突然変異アブリンA鎖タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの構造中の三アミノ酸配列の位置を移動させると考えられる。三アミノ酸配列の位置の移動は、VLSを促進または誘発するための細胞、レセプターまたは分子と接触する際により不都合な位置にそれを移動させることができる。得られる突然変異アブリンA鎖タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、VLSを促進または誘発する能力が低下している可能性があり、したがって、本発明に含まれる。
【００６３】
同様に、表1で一覧に示すものを含むが、それらに限定されない、VLSを誘発する他の毒素または化合物を、一つ以上の(x)D(y)および／または一つ以上の隣接残基が除去される(すなわち突然変異される)ように突然変異させることもできる。しかし、VLSを誘発する能力が低下している毒素または化合物を作製するためには、残りの(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの表面に対する露出が減少していることが好ましい。
【００６４】
たとえば、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの非露出部分に少なくとも部分的に位置するか、分子の表面への完全または部分的な露出から他の方法で隠蔽されている(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列は、VLSを促進または誘発するための細胞、レセプターまたは他の分子とさほど相互作用しないであろうと考えられる。したがって、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの一次構造からの(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列の完全な排除は、VLSを誘発または促進する能力が低下している毒素または分子を作製するのには不要であると考えられる。しかし、組成物がVLSを誘発または促進する能力を最小限しか有しないことを保証するため、すべての(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列の除去が好ましい。
【００６５】
突然変異が、さほど露出していない(x)D(y)および／または(x)D(y)Tモチーフを有するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを作製する可能性が高いかどうかを判断するためには、X線結晶構造解析、NMRまたはコンピュータモデル化を含むが、それらに限定されない、当業者に公知の方法によって決定される、突然変異した配列と、非突然変異タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの第二級および第三級構造の配列との比較により、移動または欠失した(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列の推定上の場所を決定することができる。また、種々のポリペプチドおよびペプチド構造のコンピュータモデルが文献またはコンピュータデータベースで利用可能である。非限定的な例では、Entrezデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/)を当業者が使用して、突然変異誘発のための標的配列および領域を同定することができる。Entrezデータベースは、同定されたアミノ酸配列(既知のものである場合)のための3D構造のデータベースと相互接続されている。このような分子モデルを使用して、外部分子(たとえばレセプター)との接触に対してペプチドまたはポリペプチドの内部に埋め込まれた類似の配列よりも露出しているペプチドおよびポリペプチド中の(x)D(y)、(x)D(y)Tおよび／または隣接配列を同定することができる。外部分子との接触に対してより露出している(x)D(y)、(x)D(y)Tおよび／または隣接配列は、VLSおよびこれらに配列に伴う他の毒性作用の促進または低下に寄与する可能性がより高く、したがって、突然変異誘発のための主要な標的であるべきである。特定の態様では、少なくとも一つの(x)D(y)、(x)D(y)Tおよび／または隣接配列を加えることが望ましい場合、外部分子との接触に対してより露出しているタンパク質の領域が、そのような配列を加える部位として好ましい。突然変異または野生型のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの構造は、当業者には公知であるように、インビトロまたはインビボアッセイの直前に、X線結晶構造解析またはNMRによって決定することができる。
【００６６】
ひとたび(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列を含むアミノ酸配列が、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の中で改変される、またはペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に加えられると、少なくとも一つの毒性作用を促進するその能力の変化を、本明細書に記載する技術のいずれかによって、または当業者には公知であるように、アッセイすることができる。
【００６７】
本明細書で使用する、(x)D(y)配列、(x)D(y)Tまたは隣接領域配列を含むアミノ酸配列の「改変」は、当業者には公知であるような、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド中の(x)D(y)、(x)D(y)Tおよび／または隣接領域配列を含むアミノ酸配列の化学的修飾ならびに挿入、欠失、切断または置換を含むが、それらに限定されない、そのようなアミノ酸配列の突然変異を含むことができる。そのような変化が、(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列を含む一つ以上のアミノ酸配列の少なくとも一つの毒性作用(すなわち、VLS、EC損傷、アポトーシス、ディスインテグリン様活性を促進する能力)を改変することが好ましい。本明細書で使用する、(x)D(y)配列または(x)D(y)T配列を含むアミノ酸配列は、(x)D(y)および／または(x)D(y)Tトリペプチドまたはクアトロペプチド（quatra-peptide）配列に対してCおよび／またはN末端に少なくとも一つの隣接配列を含むことができる。このような「改変」は、合成ペプチドにおいて行うこともできるし、発現して突然変異タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを作製する核酸配列において行うこともできる。
【００６８】
本発明の態様で、(x)D(y)、(x)D(y)Tおよび／または隣接領域配列を含むアミノ酸配列の改変は、アミノ酸配列の除去を含む。本明細書で使用する、(x)D(y)、(x)D(y)Tおよび／または隣接領域配列を含むアミノ酸配列の「除去」とは、(x)D(y)および／または(x)D(y)Tトリペプチドもしくはクアトロペプチド配列および／または少なくとも一つの天然隣接配列の存在を排除する、またはその活性を低下させる、主要なアミノ酸配列の突然変異をいう。「除去」または「欠失」は互換可能に使用することができる。
【００６９】
たとえば、フェニルアラニン(F)、システイン／シスチン(C)、メチオニン(M)、アラニン(A)、スレオニン(T)、セリン(S)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)、プロリン(P)、ヒスチジン(H)、グルタミン酸(E)、グルタミン(Q)、アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)、リジン(K)およびアルギニン(R)の群から選択されるが、それらに限定されない、また、表1に示されたものを含むが、それらに限定されない少なくとも一つのアミノ酸の、一つ以上の(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列の位置(x)における少なくとも一つの挿入または置換を含むが、それに限定されない突然変異が、VLSを促進するその能力を低下させると考えられる。以下の表5は、本発明の特定の態様で有用であると考えられる、典型的ではあるが非限定的な修飾アミノ酸または異常アミノ酸を一覧に示す。
【００７０】
(表５)修飾アミノ酸および異常アミノ酸
0004845381.tif 000009
【００７１】
また、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、システイン／シスチン(C)、メチオニン(M)、アラニン(A)、グリシン(G)、スレオニン(T)、セリン(S)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)、プロリン(P)、ヒスチジン(H)、グルタミン酸(E)、グルタミン(Q)、アスパラギン(N)、リジン(K)およびアルギニン(R)の群から選択され、また、表1に示されたものを含むが、それらに限定されない少なくとも一つのアミノ酸の、一つ以上の(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列の位置(D)における少なくとも一つの挿入または置換を含むが、それに限定されない突然変異が、VLSを促進するその能力を低下させると考えられる。
【００７２】
イソロイシン(I)、フェニルアラニン(F)、システイン／シスチン(C)、メチオニン(M)、アラニン(A)、グリシン(G)、スレオニン(T)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)、プロリン(P)、ヒスチジン(H)、グルタミン酸(E)、グルタミン(Q)、アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)、リジン(K)およびアルギニン(R)の群から選択され、また、表1に示されたものを含むが、それらに限定されない少なくとも一つのアミノ酸の、一つ以上の(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列の位置(y)における少なくとも一つの挿入または置換を含むが、それに限定されない突然変異が、VLSを促進するその能力を低下させると考えられる。
【００７３】
また、(x)D(y)配列の(x)または(y)いずれかの残基に隣接するアミノ酸が、VLSを促進するその能力に寄与することができる。たとえば、イソロイシン(I)、バリン(V)、ロイシン(L)、フェニルアラニン(F)、システイン／シスチン(C)、メチオニン(M)、アラニン(A)、グリシン(G)、セリン(S)、トリプトファン(W)、チロシン(Y)、プロリン(P)、ヒスチジン(H)、グルタミン酸(E)、グルタミン(Q)、アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)、リジン(K)およびアルギニン(R)の群から選択され、また、表1に示されたものを含むが、それらに限定されない少なくとも一つのアミノ酸の、一つ以上の(x)D(y)T配列の位置Tにおける少なくとも一つの挿入または置換を含むが、それに限定されない突然変異が、VLSを促進するその能力を低下させると考えられる。
【００７４】
さらに、(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列のNまたはC末端隣接配列における少なくとも一つの突然変異、化学的修飾、移動または他の改変が、VLSを促進する能力が低下しているタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを作製すると考えられる。好ましくは、そのような突然変異または改変は、活性部位に作用しない一つ以上の残基で起こる。他の態様では、突然変異または改変は、(x)D(y)トリペプチド配列への約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200またはそれを超える数のN末端および／またはC末端の一つ以上の残基で起こる。他の態様では、(x)D(y)トリペプチドに隣接しない一つ以上の残基が(x)D(y)モチーフの機能に寄与することができる。このような残基は、本明細書で記載するように、また、当業者に公知であるように、三次元モデル中のトリペプチド配列への近接によって同定することができ、隣接配列の一部として改変のために考慮される。このような改変は、一つ以上の「野生型」隣接残基が改変、除去、移動、化学的修飾などを受ける限り、(x)D(y)および(x)D(y)T配列の改変に関して上記した改変のいずれをも含むことができる。
【００７５】
本発明の方法を使用して作製される、VLSを誘発する能力が低下しているタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドは、(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列を含有する組成物によって生じるVLSに対する保護剤として働く用途を有する。このようなタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドは、(x)D(y)および／または(x)D(y)T配列の活性を遮断する阻害剤として働くことができると考えられる。さらには、このようなタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドは、VLSを生じさせる能力が低下しているITの作製に使用することができる。
【００７６】
1.  突然変異誘発
特定の態様では、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸の突然変異誘発を利用して、VLS、アポトーシスまたは(x)D(y)および隣接配列に伴う他の作用を促進する組成物の能力を増強または低下させるのに望ましい突然変異を生じさせることができる。突然変異誘発は、本明細書に開示されている、または当業者には公知である任意の手段によって実施することができる。
【００７７】
一つの特に有用な突然変異誘発技術は、多数の残基を個々にアミノ酸アラニンで置換して、タンパク質構造における大規模な撹乱の危険を最小限にしながらも側鎖相互作用を失う作用を判定することができるアラニン走査突然変異誘発である(Cunninghamら、1989)。
【００７８】
特定のアミノ酸を標的にすることができるため、部位特異的突然変異誘発は、基礎にあるDNAの特異的突然変異によって個々のペプチドまたは生物学的に機能的な等価タンパク質もしくはペプチドを調製するのに有用な技術である。この技術はさらに、一つ以上のヌクレオチド配列変更をDNAに導入することにより、前記考慮の一つ以上を組み入れながら配列の変異型を調製し、試験するための簡易な能力を提供する。部位特異的突然変異誘発は、所望の突然変異のDNA配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列ならびに横切る突然変異部位の両側で安定な二重鎖を形成するのに十分なサイズおよび配列複雑性のプライマー配列を提供するのに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用により、突然変異体の作製を可能にする。通常、配列の接合部の両側で約5〜10個の残基が改変されている長さ約17〜25ヌクレオチドのプライマーが好ましい。
【００７９】
一般に、部位特異的突然変異誘発の技術は当技術分野で周知である。理解されるように、この技術は通常、一本鎖型および二本鎖型の両方で存在するバクテリオファージベクターを使用する。部位特異的突然変異誘発で有用である典型的なベクターとしては、M13ファージのようなベクターがある。これらのファージベクターは市販されており、それらの使用は一般に当業者には周知である。また、二本鎖プラスミドが部位特異的突然変異誘発で日常的に使用され、それが、対象の遺伝子をファージからプラスミドに移す段階を省く。
【００８０】
一般に部位特異的突然変異誘発はまず、一本鎖ベクターを得る、すなわち所望のタンパク質をコードするDNA配列をその配列中に含む、二本鎖ベクターの二本の鎖を溶融することによって実施される。所望の突然変異配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを合成によって調製する。次に、このプライマーを一本鎖DNA試料にアニーリングさせ、DNA重合酵素、たとえば大腸菌ポリメラーゼIクレノー断片に付して、突然変異を有する鎖の合成を完了する。このようにして、一本の鎖が元の非突然変異配列をコードし、第二の鎖が所望の突然変異を有するヘテロ二本鎖を形成する。次に、このヘテロ二本鎖ベクターを使用して適切な細胞、たとえば大腸菌細胞を形質転換し、突然変異配列構造を有する組換えベクターを含むクローンを選択する。または、一対のプライマーを二本鎖ベクターの二本の別個の鎖にアニーリングさせ、所望の突然変異を有する対応する相補鎖をPCR(商標)反応で同時に合成することもできる。
【００８１】
部位特異的突然変異誘発を使用する選択された遺伝子の変異配列の調製は、潜在的に有用な種を作製する手段として提供されるが、遺伝子の変形配列を得るための方法は他にもあるため、限定的であることを意図しない。たとえば、所望の遺伝子をコードする組換えベクターを突然変異誘発作用物質、たとえばヒドロキシルアミンで処理して変異配列を得ることもできる。
【００８２】
2.  組換えベクター、宿主細胞および発現
「発現ベクターまたは構築物」とは、核酸コード配列の一部または全部が転写を受けることができる遺伝子産物のための核酸コーディングを含有する任意のタイプの遺伝子構築物をいう。転写物はタンパク質に翻訳されることができるが、その必要はない。したがって、特定の態様では、発現は、遺伝子の転写および遺伝子産物へのRNAの翻訳の両方を含む。他の態様では、発現は、たとえばアンチセンス構築物を産生するための、核酸の転写のみを含む。
【００８３】
特に有用なベクターは、DNAセグメントのコード部分が、完全長タンパク質をコードするのか、ポリペプチドをコードするのか、より小さなペプチドをコードするのかにかかわらず、プロモーターの転写制御下に置かれるベクターであると考えられる。「プロモーター」とは、遺伝子の特異的転写を開始するために必要な、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列をいう。「作用的に配置されている」、「制御下にある」または「転写制御下にある」という語句は、プロモーターが、RNAポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御するために、遺伝子産物の核酸コーディングに対して正しい場所および向きにあることをいう。
【００８４】
プロモーターは、本明細書で開示されている組成物と関連して、たとえば組換えクローニングおよび／またはPCR(商標)技術を使用してコーディングセグメントまたはエキソンの上流に位置する5'非コーディング配列を単離することによって得ることができるような、遺伝子と自然に関連しているプロモーターの型でもよい(PCR(商標)技術は、それぞれ参照として本明細書に組み入れられるU.S.Patent 4,683,202およびU.S.Patent 4,682,195に開示されている)。
【００８５】
他の態様では、コーディングDNAセグメントを組換えまたは異種プロモーターの制御下に置くことによって特定の利点が得られると考えられる。本明細書で使用する組換えまたは異種プロモーターとは、その天然の環境下で通常は遺伝子と関連していないプロモーターをいう。このようなプロモーターは、通常は他の遺伝子と関連しているプロモーターおよび／または他のバクテリア、ウイルス、真核生物または哺乳動物細胞から単離されたプロモーターおよび／または人の手によって作製された「天然に存在しない」、すなわち異なるプロモーターからの異なる要素または発現を増大、減少もしくは改変する突然変異を含有するプロモーターを含むことができる。
【００８６】
当然ながら、発現に選択された細胞型、生物または動物におけるDNAセグメントの発現を効果的に指示するプロモーターを用いることが重要である。タンパク質発現のためのプロモーターと細胞型との組み合わせの使用は一般に分子生物学の当業者には公知である。たとえば、参照として本明細書に組み入れられるSambrookら、(1989)を参照すること。用いられるプロモーターは、構成的であっても誘導性であってもよく、組換えタンパク質またはペプチドの大規模作製で有利であるように、導入されるDNAセグメントの高レベル発現を指示するのに適切な条件下で使用することができる。
【００８７】
一般に、プロモーター中の少なくとも一つのモジュールがRNA合成の出発部位を位置決めするように働く。このもっともよく知られた例はTATAボックスであるが、TATAボックスを欠く一部のプロモーター、たとえば哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびSV40後期遺伝子のプロモーターでは、出発部位そのものに重なる別個の要素が開始の場所を固定するのに役立つ。
【００８８】
さらなるプロモーター要素が転写開始の頻度を調整する。通常、これらの要素は、開始部位から30〜110bp上流の領域に位置するが、多数のプロモーターが、開始部位の下流にも機能要素を含むということが示されている。プロモーター要素どうしの間隔は、要素が互いに対して反転または移動したときでもプロモーター機能が保存されるよう、しばしば柔軟性がある。tkプロモーターでは、活性が低下し始める前に、プロモーター要素どうしの間隔が50 bpまで増大することもある。プロモーターに依存して、転写を起動するために、個々の要素が協働または独立して機能することができるように思われる。
【００８９】
核酸の発現を制御するために用いられる特定のプロモーターは、それが標的細胞中で核酸を発現させることができる限り、決定的ではないと考えられている。したがって、ヒト細胞が標的とされる場合、核酸コード領域を、ヒト細胞中で発現することができるプロモーターに隣接させて、その制御下に位置させることが好ましい。概して、このようなプロモーターは、ヒトまたはウイルスプロモーターを含むかもしれない。
【００９０】
発現においては、通常、転写物の適切なポリアデニル化を生じさせるため、ポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功に重要ではないと考えられ、任意のそのような配列を使用することができる。好ましい態様は、好都合であり、種々の標的細胞中で良好に作用することが知られている、SV40ポリアデニル化シグナルおよびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。同じく発現カセットの要素として考慮されるものはターミネーターである。これらの要素は、メッセージレベルを高め、カセットから他の配列への読み過ごしを最小限にするように働くことができる。
【００９１】
また、コーディング配列の効率的な翻訳のためには特定の開始信号が必要になるかもしれない。これらの信号は、ATG開始コドンおよび隣接配列を含む。ATG開始コドンをはじめとする外因性翻訳制御シグナルが提供されなければならないかもしれない。当業者は、容易にこれを決定し、必要なシグナルを提供することができるであろう。開始コドンは、インサート全体の翻訳を保証するため、所望のコーディング配列の読み取り枠と「インフレーム」でなければならない。外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然であっても合成であってもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素の包含によって高めることができる。
【００９２】
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、他の選択されたタンパク質と同時発現させてもよく、それらのタンパク質は、同じ細胞中で同時発現させてもよいし、別の選択されたタンパク質をすでに有する細胞に遺伝子を提供してもよい。同時発現は、それぞれが各DNAいずれかのコピーを有する二つの別個の組換えベクターで細胞を同時に形質移入することによって達成することができる。または、単一の組換えベクターを、両方のタンパク質のコード領域を含むように構築したのち、それらのタンパク質を単一のベクターで形質移入された細胞中で発現させることもできる。いずれにしても、本明細書における用語「同時発現」は、同じ組換え細胞中での遺伝子および他の選択されたタンパク質の両方の発現をいう。
【００９３】
本明細書で使用する語「操作された」および「組換え」細胞または宿主細胞は、外因性DNAセグメントまたは遺伝子、たとえばcDNAもしくはタンパク質をコードする遺伝子が導入されている細胞をいう。したがって、操作された細胞は、組換えによって導入された外因性DNAセグメントまたは遺伝子を含まない天然に存在する細胞から区別することができる。したがって、操作された細胞は、人の手を介して導入された遺伝子を有する細胞である。組換え細胞は、導入されたcDNAまたはゲノム遺伝子を有する細胞を含み、また、特定の導入遺伝子に自然には関連しないプロモーターに隣接して配置された遺伝子を含む。
【００９４】
本発明にしたがって、突然変異であろうと野生型であろうと、組換えタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現させるためには、一つ以上のプロモーターの制御の下、野生型または突然変異タンパク質コード核酸を含む発現ベクターを調製する。コーディング配列をプロモーターの「制御下」に置くためには、転写読み取り枠の転写開始部位の5'末端を、一般に、選択したプロモーターの約１〜50ヌクレオチド「下流」(すなわち3')に位置づける。「上流」のプロモーターがDNAの転写を刺激し、コードされる組換えタンパク質の発現を促進する。これが、この文脈における「組換え発現」の意味である。
【００９５】
多様な宿主発現系においてタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド発現を達成するために、適切な核酸および転写／翻訳制御配列を含有する発現ベクターを構築するためには多くの標準技術が利用可能である。発現に利用可能な細胞型としては、バクテリア、たとえば、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された大腸菌および枯草菌があるが、これらに限定されない。
【００９６】
原核生物宿主のいくつかの例は、大腸菌株RR1、大腸菌LE392、大腸菌B、大腸菌X1776(ATCC番号31537)および大腸菌W3110(F-、λ-、原栄養菌、ATCC番号273325)、桿菌、たとえば枯草菌ならびに他の腸内細菌科の菌、たとえばサルモネラ菌、レイ菌および種々のシュードモナス種である。
【００９７】
一般に、宿主細胞と適合性である種に由来するレプリコンおよび制御配列を含有するプラスミドベクターがこれらの宿主とともに使用される。ベクターは通常、複製部位ならびに形質転換された細胞中で表現型選択を提供することができるマーキング配列を有する。たとえば、大腸菌は、pBR322の誘導体、大腸菌種に由来するプラスミドを使用して形質転換されることが多い。pBR322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含み、したがって、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。pBRプラスミドまたは他の微生物プラスミドもしくはファージもまた、微生物がそれ自体のタンパク質の発現のために使用することができるプロモーターを含有しなければならないか、含有するように修飾されなければならない。
【００９８】
加えて、宿主微生物と適合性であるレプリコンおよび制御配列を含有するファージベクターを、これらの宿主とともに形質転換ベクターとして使用することもできる。たとえば、宿主細胞、たとえば大腸菌LE392を形質転換するために使用することができる組換えファージベクターを作製する際には、ファージλGEM(商標)-11を用いることができる。
【００９９】
さらなる有用なベクターとしては、pINベクター(Inouyeら、1985)および、後で精製および分離または切断するためのグルタチオンS-転移酵素(GST)可溶性融合タンパク質の生成で使用するためのpGEXベクターがある。他の適当な融合タンパク質は、β-ガラクトシダーゼ、ユビキチンなどのタンパク質である。
【０１００】
組換えDNA構築でもっとも一般に使用されるプロモーターとしては、β-ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)、ラクトースおよびトリプトファン(trp)プロモーター系がある。これらはもっとも一般に使用されているが、他の微生物プロモーターが見いだされ、利用されており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細が公表されて、当業者がそれらをプラスミドベクターに機能的にライゲーションさせることが可能になっている。
【０１０１】
バクテリア細胞、たとえば大腸菌における組換えタンパク質作製に関する以下の詳細は、組換えタンパク質作製全般に関する典型的な情報として提供する。特定の組換え発現系へのその応用は当業者には公知である。
【０１０２】
発現ベクターを含有するバクテリア細胞、たとえば大腸菌を、多数の適当な培地のいずれか、たとえばLB中で増殖させる。組換えタンパク質の発現は、たとえば、IPTGを培地に添加することによって、またはインキュベーションをより高温に切り換えることによって誘発することができる。さらなる期間、一般には2〜24時間バクテリアを培養したのち、遠心分離によって細胞を回収し、残りの培地を洗い落とす。
【０１０３】
次に、バクテリア細胞を、たとえば細胞破砕機での破壊によって溶解させ、遠心分離にかけて、高密度封入体および細胞膜を可溶性細胞成分から分離する。この遠心分離は、緩衝剤への糖、たとえばショ糖の配合および選択的速度での遠心分離によって高密度封入体が選択的に濃縮される条件下で実施することができる。
【０１０４】
多くの場合に当てはまるように、組換えタンパク質が封入体の中で発現するならば、いくつかの溶液のいずれかの中で封入体を洗浄して汚染性宿主タンパク質の一部を除去したのち、還元剤、たとえばβ-メルカプトエタノールまたはDTT(ジチオトレイトール)の存在下、高濃度の尿素(たとえば8M)またはカオトロピック剤、たとえば塩酸グアニジンを含有する溶液に可溶化することができる。
【０１０５】
本発明の方法によって作製されたタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、「過剰発現」する、すなわち、細胞中のその自然な発現に対して増大したレベルで発現することができると考えられる。このような過剰発現は、放射能標識および／またはタンパク質精製をはじめとする多様な方法によって評価することができる。しかし、簡単で直接的な方法、たとえばSDS/PAGEおよびタンパク質染色またはウェスタンブロッティングののち、得られたゲルまたはブロットの定量分析、たとえば比重走査を含む方法が好ましい。宿主細胞によって作製され、たとえばゲル上で目視可能な他のタンパク質に対する特定のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの相対存在比と同様に、天然の細胞のレベルと比較した場合の組換えタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのレベルの比増分が過剰発現を示す。
【０１０６】
3.  タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド
本発明はまた、精製された、好ましい態様では実質的に精製された、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを提供する。本明細書で使用する語「精製されたタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド」とは、哺乳動物細胞または組換え宿主細胞から単離することができるタンパク質性組成物であって、少なくとも一つのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドがその天然に得ることができる状態に対して、すなわち細胞抽出物中のその純度に対して任意の程度に精製されている組成物をいう。したがって、精製されたタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドはまた、それが天然に存在する環境から離れている野生型または突然変異のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをいう。
【０１０７】
種々の遺伝子に関するヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド配列はすでに開示されており、当業者には公知であるコンピュータ化データベースで見いだすことができる。一つのそのようなデータベースは、National Center for Biotechnology Information's Genbank and GenPeptデータベース(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)である。これら公知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示された技術または当業者には公知であろう任意の技術を使用して増幅および／または発現させることができる。さらには、ペプチド配列は、当業者に公知の方法、たとえば、自動化ペプチド合成機、たとえばApplied Biosystems(米カリフォルニア州Foster City)から市販されているものを使用するペプチド合成によって合成することができる。
【０１０８】
一般に、「精製された」とは、分画に供されて種々の他のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを除去されているが、たとえば本明細書で以下に記載するタンパク質アッセイによって評価することができるように、または当業者には公知であるように、望ましいタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに関してその活性を実質的に保持する、特定のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド組成物をいう。
【０１０９】
用語「実質的に精製された」が使用される場合、それは、特定のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが組成物の主要成分を構成している、たとえば組成物中のタンパク質の約50％以上を構成していることをいう。好ましい態様では、実質的に精製されたタンパク質は、組成物中のタンパク質の60％、700％、80％、90％、95％、99％またはそれ以上を構成する。
【０１１０】
本発明で適用される「均質状態まで精製されている」ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質とは、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が、他のタンパク質および生物学的成分を実質的に含まないレベルの純度を有することをいう。たとえば、精製されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、分解性配列決定を良好に実施するのに十分な程度に他のタンパク質成分を含まない。
【０１１１】
本開示を考慮すると、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの精製度を定量する種々の方法が当業者に理解されるであろう。これらには、たとえば、分画のタンパク質比活性の測定またはゲル電気泳動による分画中のポリペプチドの数の評価がある。
【０１１２】
所望のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを精製するためには、少なくともいくつか特定のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む天然または組換え組成物を分画して、種々の他の成分を組成物から除去する。本明細書で以下に詳述する技術に加えて、タンパク質精製で使用するのに適した種々の他の技術が当業者に周知であろう。これらには、たとえば、硫酸アンモニウム、PEG、抗体などまたは熱変性による沈殿後の遠心分離、クロマトグラフィー工程、たとえばイオン交換、ゲルろ過、逆相、ヒドロキシアパタイト、レクチンアフィニティーおよび他のアフィニティークロマトグラフィー工程、等電点電気泳動、ゲル電気泳動およびそのような技術と他の技術との組み合わせがある。
【０１１３】
もう一つの例は、特異的結合パートナーを使用する、特定の融合タンパク質の精製である。このような精製法は当技術分野では日常的である。本発明は特定のタンパク質のDNA配列を提供するため、今やいかなる融合タンパク質精製法をも実施することができる。これは、特定のタンパク質-グルタチオンS-トランスフェラーゼ融合タンパク質の作製、大腸菌における発現ならびにグルタチオン-アガロースでのアフィニティークロマトグラフィーを使用する均質状態までの単離またはタンパク質のNもしくはC末端におけるポリヒスチジンタグの生成およびNiアフィニティークロマトグラフィーを使用するその後の精製によって例示される。しかし、多くのDNAおよびタンパク質が既知であるが、本明細書に記載の方法を使用して同定および増幅することができ、任意の精製法を使用することができる。
【０１１４】
特定の態様における使用には好ましいが、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが常にそのもっとも精製された状態で提供されなければならないという一般的要件はない。実際、さほど精製されていないにもかかわらず、所望のタンパク質組成物が天然の状態に比べて濃縮されているタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは特定の態様で用途があると考えられる。
【０１１５】
比較的低い精製度しか示さない方法は、タンパク質産物の総回収率または発現したタンパク質の活性の維持の点で有利であるかもしれない。また、不活性な産物は、特定の態様で、たとえば抗体産生によって免疫原性を決定する場合に用途がある。
【０１１６】
4.  抗体
本明細書で使用する語「抗体」とは、広義には、免疫学的結合剤、たとえばIgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEをいう。一般に、IgGおよび／またはIgMが、生理学的状況でもっとも一般的な抗体であり、験室設備でもっとも容易に作製されるため、好ましい。
【０１１７】
用語「抗体」は、抗体断片、たとえばFab'、Fab、F(ab')2、単一ドメイン抗体(DAB)、Fv、scFv(単鎖Fv)などを含む、抗原結合領域を有する抗体様分子を指すためにも使用される。種々の抗体に基づく構築物および断片を調製し、使用する技術が当技術分野で周知である。抗体を調製し、特徴づける手段もまた当技術分野で周知である(たとえば、参照として本明細書に組み入れられるAntibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory、1988を参照)。
【０１１８】
モノクロナール抗体(MAb)が特定の利点、たとえば再現性および大量生産を有すると認識されており、その使用が一般に好ましい。したがって、本発明は、ヒト、マウス、サル、ラット、ハムスター、ウサギおよびさらにはニワトリ起源のモノクロナール抗体を提供する。調製および試薬入手の容易さにより、マウスモノクロナール抗体がしばしば好まれる。
【０１１９】
しかし、「ヒト化」抗体もまた、ヒト定常および／または可変領域ドメインを有するマウス、ラットまたは他の種からのキメラ抗体、二重特異性抗体、組換えおよび操作された抗体ならびにそれらの断片がそうであるように、考慮される。患者の疾病に対して「特注の」抗体を開発する方法が同じく公知であり、そのような特注の抗体もまた考慮される。
【０１２０】
一般に、モノクロナール抗体(MAb)を産生する方法は、ポリクロナール抗体を調製する方法と同じ方針で出発する。手短にいうならば、ポリクロナール抗体は、本発明にしたがって、免疫原性タンパク質組成物で動物を免疫化するか、または標的エピトープを構成し、その免疫化動物から抗血清を回収することによって調製される。
【０１２１】
当技術分野で周知であるように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる、免疫応答の非特異的刺激物質の使用によって増強することができる。適当なアジュバントとしては、許容しうるすべての免疫刺激性化合物、たとえばサイトカイン、毒素または合成組成物がある。
【０１２２】
使用することができるアジュバントとしては、IL-1、IL-2、IL-4、IL-7、IL-12、γ-インターフェロン、GMCSP、BCG、水酸化アルミニウム、MDP化合物、たとえばthur-MDPおよびnor-MDP、CGP(MTP-PE)、脂質Aならびにモノホスホリル脂質A(MPL)がある。また、バクテリアから抽出された三つの成分、すなわちMPL、トレハロースジミコレート(TDM)および細胞壁骨格(CWS)を2％スクアレン／Tween 80エマルション中に含有するRIBIが考慮される。MHC抗原を使用することもできる。典型的な、多くの場合に好ましいアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント(死滅結核菌を含有する免疫応答の非特異的刺激物質)、不完全フロイントアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントがある。
【０１２３】
アジュバントに加えて、T細胞免疫性を上方制御し、サプレッサー細胞活性を下方制御することが明らかにされている生体応答調整物質(BRM)を同時投与することが望ましいかもしれない。このようなBRMとしては、シメチジン(CIM、1200 mg/d)(Smith/Kline、PA)、低用量シクロホスファミド(CYP、300 mg/m2)(Johnson/Mead, NJ)、サイトカイン、たとえばγ-インターフェロン、IL-2もしくはIL-12または免疫ヘルパー機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子、たとえばB-7があるが、これらに限定されない。
【０１２４】
MAbは、周知の技術、たとえば参照として本明細書に組み入れられるU.S.Patent 4,196,265に例示されている技術の使用によって容易に調製することができる。通常、この技術は、野生型組成物であるか突然変異組成物であるかを問わない、選択した免疫原組成物、たとえば精製または部分的に精製されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはドメインで適当な動物を免疫化することを含む。免疫化組成物は、抗体産生細胞を刺激するのに効果的な方法で投与される。
【０１２５】
一般に、モノクロナール抗体(MAb)を産生する方法は、ポリクロナール抗体を調製する方法と同じ方針で出発する。齧歯類、たとえばマウスおよびラットが好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジまたはカエル細胞の使用もまた可能である。ラットの使用が特定の利点を提供することができるが(Goding、1986, pp. 60-61)、マウスが好ましく、BALB/cマウスが、もっとも通例に使用されており、また一般により高い割合で安定な融合を提供するため、もっとも好ましい。
【０１２６】
一般に、上記のように動物に抗原を注射する。必要ならば、抗原を担体分子、たとえばアオガイヘモシアニンと結合させてもよい。抗原は通常、アジュバント、たとえば完全または不完全フロイントアジュバントと混合する。同じ抗原による追加抗原注射を約二週間の間隔で実施する。
【０１２７】
免疫化ののち、抗体を産生する能力を有する体細胞、具体的にはBリンパ球(B細胞)を、MAb産生プロトコルにおける使用のために選択する。これらの細胞は、生検した脾臓、扁桃腺またはリンパ節から得ることもできるし、末梢血試料から得ることもできる。脾臓細胞および末梢血細胞が好ましく、それは前者の場合、分裂形質芽細胞段階にある抗体産生細胞の豊富な供給源であり、後者の場合、末梢血が採取しやすいからである。
【０１２８】
しばしば、動物のパネルを免疫化し、最高の抗体力価を有する動物の脾臓を取り出し、脾臓を注射器でホモジナイズすることによって脾リンパ球を採取する。通常、免疫化されたマウスからの脾臓は約5×107〜2×108個のリンパ球を含有する。
【０１２９】
次に、免疫化された動物からの抗体産生性Bリンパ球を、不死骨髄腫細胞、一般には免疫化された動物と同じ種の細胞と融合させる。ハイブイドーマ産生融合手順で使用するのに適した骨髄腫細胞株は、好ましくは、非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、所望の融合細胞(ハイブリドーマ)の増殖だけを支援する特定の選択培地でそれらが増殖することを不可能にする酵素欠損症を有する。
【０１３０】
当業者に公知であるような多数の骨髄腫細胞のいずれを使用してもよい(Goding, pp. 65-66, 1986、Campbell, pp. 75-83, 1984)。たとえば、免疫化された動物がマウスである場合、P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp2/0-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7およびS194/5XX0 Bulを使用することができ、ラットである場合、R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、IR983Fおよび4B210を使用することができ、ヒト細胞融合に関してはU-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2およびUC729-6がすべて有用である。
【０１３１】
一つの好ましいマウス骨髄腫細胞は、NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repositoryから細胞株貯蔵番号GM3573を要求することによって容易に入手することができるNS-1骨髄腫細胞株(P3-NS-1-Ag4-1ともいう)である。使用することができるもう一つのマウス骨髄腫細胞株は、8-アザグアニン耐性マウス骨髄腫SP2/0非産生細胞株である。
【０１３２】
抗体産生脾臓またはリンパ節細胞と骨髄腫細胞とのハイブリッドを産生する方法は、通常、体細胞と骨髄腫細胞とを2:1の比で混合することを含むが、この比は、細胞膜の融合を促進する作用物質(化学的または電気的)の存在下、約20:1〜約1:1で変化しうる。センダイウイルスを使用する融合法がKohlerおよびMilstein(1975、1976)によって記載されており、ポリエチレングリコール(PEG)、たとえば37％(v/v)PEGを使用する方法がGefterら(1977)によって記載されている。電気誘発融合法の使用もまた適切である(Goding pp. 71-74, 1986)。
【０１３３】
融合法は普通、約1×10-6〜1×10-8の低い頻度で生存可能なハイブリッドを産生する。しかし、生存可能な融合ハイブリッドは選択培地での培養によって非融合親細胞(特に、正常ならば際限なく分裂し続ける非融合骨髄腫細胞)から区別されるため、これは問題にならない。選択培地は一般に、組織培地中でのヌクレオチドの新規合成を遮断する作用物質を含有する培地である。典型的で好ましい作用物質は、アミノプテリン、メトトレキサートおよびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートはプリンおよびピリミジンの両方の新規合成を遮断するが、アザセリンはプリン合成のみを遮断する。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、培地にはヌクレオチドの供給源(HAT培地)としてのヒポキサンチンおよびチミジンが補足される。アザセリンが使用される場合、培地にはヒポキサンチンが補足される。
【０１３４】
好ましい選択培地はHATである。ヌクレオチドサルベージ経路を作動させることができる細胞だけがHAT培地中で生き残ることができる。骨髄腫細胞は、サルベージ経路のかぎ酵素、たとえばヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)中で不完全であり、生き残ることはできない。B細胞は、この経路を作動させることができるが、培養中には限られた寿命しかなく、一般には約2週間以内に死滅する。したがって、選択培地中で生き残ることができる唯一の細胞は、骨髄腫細胞およびB細胞から形成されたハイブリッドである。
【０１３５】
この培養がハイブリドーマの個体群を提供し、その中から特定のハイブリドーマが選択される。通常、ハイブリドーマの選択は、細胞をマイクロタイタープレート中、単細胞クローン希釈によって培養したのち、個々のクローン上澄み(約2〜3週後)を所望の反応性に関して試験することによって実施される。アッセイ法は、たとえばラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞毒アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合アッセイなど、高感度で簡単かつ迅速であるべきである。
【０１３６】
次に、選択されたハイブリドーマを連続希釈し、個々の抗体産生細胞株へとクローニングしたのち、そのクローンを際限なく増殖させてMAbを得ることができる。細胞株は、二つの基本的な方法でMAb産生に利用することができる。第一に、ハイブリドーマの試料を、最初の融合の場合に体細胞および骨髄腫細胞を提供するために使用したタイプの組織適合性動物(たとえば同系のマウス)に注射(多くの場合、腹腔内へ)することができる。任意で、注入に先立ち、動物を炭化水素、特にプリスタン(テトラメチルペンタデカン)などの油で初回刺激する。注射を施された動物は、融合細胞ハイブリッドによって産生される特異的モノクロナール抗体を分泌する腫瘍を発生する。次に、その動物の体液、たとえば血清または腹水を注出してMAbを高濃度で得ることができる。第二に、個々の細胞株をインビトロで培養して、MAbを自然に培地中に分泌させて、その培地から高濃度で容易に採取することもできる。
【０１３７】
いずれかの手段によって産生されたMAbを、所望により、ろ過、遠心分離および種々のクロマトグラフィー法、たとえばHPLCまたはアフィニティークロマトグラフィーを使用してさらに精製してもよい。このように産生されたモノクロナール抗体から、酵素、たとえばペプシンもしくはパパインを用いる消化および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断をはじめとする方法により、本発明のモノクロナール抗体の断片を得ることができる。または、本発明によって包含されるモノクロナール抗体断片は、自動ペプチド合成機を使用して合成することもできる。
【０１３８】
また、分子クローニング手法を使用してモノクロナールを産生することもできると考えられる。この場合、免疫化した動物の脾臓から単離したRNAからコンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリを調製し、抗原を発現する細胞および対照細胞を使用するパニングにより、適切な抗体を発現するファージミドを選択する。従来のハイブリドーマ技術に対するこの手法の利点は、1回で約104倍の数の抗体を産生し、スクリーニングすることができること、ならびにHおよびL鎖の組み合わせによって新たな特異性を生じさせることができ、それが、適切な抗体を見いだす可能性をさらに高めることである。
【０１３９】
または、本発明によって包含されるモノクロナール抗体断片は、自動ペプチド合成機を使用して合成することもできるし、大腸菌中での全長遺伝子または遺伝子断片の発現によって合成することもできる。
【０１４０】
C.  IT
毒素および／またはMabは、天然の供給源に由来するものでもよいし、組換えDNA技術を使用して生成することもできる。少なくとも一つの毒素と少なくとも一つの抗体とを組み合わせて免疫毒素(IT)を形成することもできる。ITは組み合わさって、リガンドの精巧な特異性および毒素の異常な毒性をもつ分子となる。ITは、その概念的簡素さにもかかわらず、その共通の成分、たとえば一つ以上の結合基、一つ以上の架橋剤および一つ以上の毒素それぞれが、ITがインビボで最適に機能するためには対処されなければならない異なる一連の問題を招くため、最適なインビボ活性のために絶えず改良されている大きく複雑な分子である。
【０１４１】
十分な選択性、特異性または親和性の任意の抗体をITの基礎として使用することができる。このような性質は、当業者に公知である従来の免疫学的スクリーニング法を使用して評価することができる。抗体分子中の生物学的活性分子への結合のための部位は、正準抗原結合部位の他にも、病原体、B細胞スーパー抗原、T細胞補助レセプターCD4およびHIV-1エンベロープに結合することができる、可変ドメイン中に存在する部位を含む(Sassoら、1989、Shorkiら、1991、Silvermannら、1995、Clearyら、1994、Lenertら、1990、Berberianら、1993、Kreierら、1991)。加えて、可変ドメインは、抗体自己結合にも関与し(Kangら、1988)、抗抗体によって認識されるエピトープ(イディオトープ)を含有する(Kohlerら、1989)。
【０１４２】
本発明で使用するための抗体または抗体断片(たとえばFab'、FabまたはF(ab')2)の起源または由来は、用いられる抗体または断片が最終的に意図されるITの用途に望まれる性質を有する限り、本発明の実施にとって重要ではない。したがって、モノクロナール抗体が使用される場合、それは、ヒト、マウス、サル、ラット、ハムスター、ニワトリまたはさらにはウサギ起源のものであることができる。本発明はまた、ヒト抗体、ヒト定常および／または可変領域ドメインを有する、マウス、ラットまたは他の種からの「ヒト化」またはキメラ抗体、単鎖抗体、Fvドメインならびに組換え抗体およびそれらの断片の使用を考慮する。当然、調製しやすさおよび試薬の入手しやすさのせいで、通常はマウスMabが好ましい。
【０１４３】
特定の治療の態様では、固形腫瘍に対して高い選択性を有するような公知の抗体、たとえば、大腸腫瘍の場合にはB72.3、PRBC5またはPR4D2、乳房腫瘍の場合にはHMFG-2、TAG72、SM-3または抗p 185.sup.Her2、肺腫瘍の場合には抗p 185.sup.Her2、黒色腫の場合には9.2.27、卵巣腫瘍の場合にはMO v18およびOV-TL3ならびにリンパ腫および白血病の場合には抗Id、CD19、CD22、CD25、CD7およびCD5を使用することができる。抗CD2、抗CD25、抗CD4および抗CD45R°ITは、本発明にしたがって精製し、悪性T細胞またはHIV感染細胞を殺すために使用することができる。また、CD3特異的ITならびにCD4およびCD25特異的ITは、骨髄移植後の急性GVHDを防ぐために精製して使用することができる。
【０１４４】
他の態様では、別の免疫源を使用し、新たなMabを調製することもできる。Mabを調製するための技術は非常に簡単であり、KohlerおよびMilstein(1975)の技術によって例示されるような当業者に周知の技術を使用して容易に実施することができる。一般には、免疫源をマウスに腹腔内注射する。この過程を2週間隔で三回繰り返し、最後の免疫化を静脈内経路によって実施する。三日後、脾細胞を採取し、標準プロトコル(KohlerおよびMilstein、1975)によってSP2/0骨髄腫細胞と融合させる。次に、適切な反応性を有するハイブリドーマ産生抗体を限界希釈によってクローニングする。
【０１４５】
ITを形成するために使用されてきた毒素は、バクテリアまたは植物に由来し、タンパク質合成の阻害剤である。これらの毒素は、知られる限りもっとも強力な細胞毒に属する。サイトゾルに侵入すると、10個に満たない数の分子が細胞を殺す(もっとも、侵入過程が非効率的であるため、その何倍もの数の分子が細胞表面に結合しなければならない)。当初、この異常な効力が、そのような毒は強すぎて制御しきれないという心配を招いた。しかし、これらの毒素は、その細胞結合ドメインまたはサブユニットを除去または修飾するだけで無害化することができる(標的細胞に向けられた場合を除く)。次に、毒素の残り部分(細胞結合ドメインを欠く)を、標的細胞に対する毒性部分を標的とするリガンド(たとえば抗体)に結合させる。望まれない交差反応性を欠く抗体を選択することにより、ITは、大部分の従来の抗癌剤よりも安全になり、より少ない非特異的細胞障害作用を有するようになる。これらの毒素の他の主な魅力は、これらがタンパク質合成の阻害剤であるため、分裂細胞と同じくらい効率的に休止細胞を殺すということである。したがって、治療時に分裂周期中ではない腫瘍または感染細胞でさえ、ITの細胞障害作用を逃れることはできない。
【０１４６】
本明細書中、「毒素」は、抗細胞作用物質を指す場合に使用され、細胞毒および抗細胞作用物質の任意の組み合わせを含むが、それらに限定されない。化学療法剤の場合、ホルモン、たとえばステロイドのような薬剤、シトシンアラビノサイド、フルオロウラシル、メトトレキサートまたはアミノプテリンのような代謝拮抗物質、アントラサイクリン、マイトマイシンC、ビンカアルカロイド、デメコルチン、エトポシド、ミトラマイシンまたはクロランブシルもしくはメルファランのような抗腫瘍性アルキル化剤を使用することができる。
【０１４７】
しかし、好ましい毒素は、植物、真菌またはバクテリア由来の毒素であり、例として、種々のA鎖毒素、特にRTA；RIP、たとえばサポリンもしくはゲロニン、α-サルシン、アスペルギリンもしくはレストリクトシン、リボヌクレアーゼ、たとえば胎盤リボヌクレアーゼ、アンジオゲニン、ジフテリア毒素およびシュードモナス外毒素が挙げられる。VLSを誘発する配列の配置、たとえば表1で一覧に示す残基、本明細書で記載した残基および他のタンパク質中の等価の残基を除去または改変するように突然変異させることができる典型的な毒素。
【０１４８】
植物ホロトキシンは、二本のジスルフィド結合鎖、すなわちAおよびB鎖を含有することが多い。B鎖は、細胞結合領域(レセプターが特徴付けされていないことが多い)および転座領域の両方を有し、それが、A鎖を酸性細胞内区画の膜に通してサイトゾルに挿入しやすくする。次に、A鎖が、取り込まれたのち、細胞を殺す。インビボで使用するためには、リガンドと毒素とを、血流および組織中を通過する間は安定にとどまり、さらに標的細胞の中では不安定になって毒素部分をサイトゾル中に放出することができるような方法で結合させなければならない。
【０１４９】
本発明に関連して使用するのにもっとも好ましい毒素成分は、RTA、特に、炭水化物残基を改変または除去するように処理されている毒素A鎖、いわゆるdgRTAである。大腸菌中で発現し、同じく炭水化物を欠く組換えA鎖を使用することもできる。特定の態様では、RTAは、以下、実施例3で記載するように作製することができる。
【０１５０】
しかし、薬理学的観点から、可能な最小の分子であって、それにもかかわらず適切な生物学的応答を提供する分子を使用することが望ましいかもしれない。したがって、十分な抗細胞応答を提供する小さめのA鎖ペプチドまたは他の毒素を用いることが望まれるかもしれない。このために、30個のN末端アミノ酸をNagarase(Sigma)によって除去することによってRTAを「切断」することができ、それでもなお、RTAが十分な毒素活性を保持するということが他者によって見いだされている。望まれる場合、この切断されたA鎖を本発明にしたがって結合体中で使用してもよいと提案される。
【０１５１】
または、本発明にしたがって組換えDNA技術を毒素成分に適用すると、さらなる有意な利点が得られるということを見いだすことができる。今や他者の公表物によって生物学的に活性なRTAおよび他のVLS誘発毒素のクローニングおよび発現が可能になったため(O'Hareら、1987、Lambら、1985、Hallingら、1985)、より小さいペプチドまたは他のやり方で変容しているが、それでいて適切な毒素活性を示すペプチドを同定し、調製することが可能である。そのうえ、RTAおよび他のVLS誘発毒素がクローニングされているという事実が部位特異的突然変異誘発の適用を可能にし、それを通じて、A鎖および他のVLS誘発毒素、毒素由来ペプチドを容易に調製し、スクリーニングし、本発明に関連して使用するためのさらなる有用な成分を得ることができる。ひとたび同定されると、これらの成分を突然変異させて、本明細書に記載されるような配列または当業者に公知であるような配列の、VLS、アポトーシス、ディスインテグリン様活性、EC損傷活性および他の作用を促進する能力が低下している毒素を生成することができる。
【０１５２】
当業者には公知であるように、PE、DT-Aなどとの任意の組み合わせの融合ITが組換えDNA技術によって作製される。抗体、サイトカインまたは可溶性レセプターDNAをそのような調製物に使用することができる。
【０１５３】
結合体の、すべてではないが多くの毒素と結合剤領域との架橋が本発明の重要な側面である。RTAの場合、生物学的活性を有する結合体を望むならば、ジスルフィド機能を示す架橋剤が必要であると考えられる。この理由は解明されていないが、ひとたび結合剤が毒素を標的細胞の中に「送達」したならば毒素成分が結合剤から容易に放出可能でなければならないためである可能性が高い。架橋剤の各タイプおよび架橋が実施される方法が、得られる結合体の薬力学的性質を変化させる傾向にある。最終的には、体内の、結合体が良好な「放出」特性を有することが望ましい所期の作用部位を除くあらゆる場所で見いだされる条件下で無傷のまま残る結合体を有することが望まれる。したがって、使用される特定の架橋試薬および架橋される構造を特に含む特定の架橋スキームが重要である。
【０１５４】
架橋試薬は、二つの異なるタンパク質(たとえば毒素および架橋剤)の官能基を結び付ける分子ブリッジを形成するために使用される。二つの異なるタンパク質を段階的に結合するためには、望まれないホモポリマー形成を排除するヘテロ二官能性架橋剤を使用することができる。典型的なヘテロ二官能性架橋剤は二つの反応性基を含有し、その一方が第一級アミノ基(たとえばN-ヒドロキシスクシンイミド)と反応し、他方がチオール基(たとえばピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど)と反応する。架橋剤は、第一級アミン反応性基を介して一方のタンパク質(たとえば選択された抗体または断片)のリジン残基と反応することができ、すでに第一のタンパク質と結び付いた架橋剤は、チオール反応性基を介して他方のタンパク質(たとえばdgRTA)のシステイン残基(遊離スルフヒドリル基)と反応する。
【０１５５】
架橋剤のこれら二つの反応性基の間のスペーサアームは、異なる長さおよび化学組成を有することができる。長めのスペーサアームは、結合体成分のより良好な柔軟性を許すが、ブリッジ中のいくつかの特定の成分(たとえばベンゼン基)は、反応基に対する余分な安定性または種々の側面の作用に対して化学結合の耐性(たとえば、還元剤に対するジスルフィド結合の耐性)を増大させることができる。
【０１５６】
もっとも好ましい架橋剤は、隣接するベンゼン環およびメチル基によって「立体障害を受けている（sterically hindered）」ジスルフィド結合を含有する二官能性架橋剤であるSMPTである。ジスルフィド結合の立体障害が、組織および血液中に存在することができるチオレートアニオン、たとえばグルタチオンによる攻撃から結合を保護する機能を果たし、それにより、結合体が結合剤によって作用部位に送達される前の結合体のデカップリングを防ぐのに役立つと考えられている。SMPT架橋試薬は、多くの他の公知の架橋試薬と同様に、官能基、たとえばシステインのSHまたは第一級アミン(たとえばリジンのεアミノ基)を架橋させる能力を与える。もう一つの可能なタイプの架橋剤としては、切断可能なジスルフィド結合を含むヘテロ二官能性光反応性フェニルアジド、たとえばスルホスクシンイミジル-2-(p-アジドサリチルアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオネートがある。N-ヒドロキシ-スクシンイミジル基は第一級アミノ基と反応し、フェニルアジドは、光分解すると、非選択的に任意のアミノ酸残基と反応する。
【０１５７】
本発明の実施には「障害」のある架橋剤が一般に好ましいが、障害のない架橋剤を用いても本発明に伴う利点を実現することはできる。保護されたジスルフィドを含有または生成するとは考えられていない他の有用な架橋剤としては、SATA、SPDPおよび2-イミノチオランがある。このような架橋剤の使用は当技術分野で十分に理解されている。
【０１５８】
1.  IT結合体
本発明は、標的エピトープ、たとえば患部組織または疾病発症細胞で発現するエピトープに対してITを提供する。特定の態様では、ITは、本明細書に記載される少なくとも一つの毒素を含む。他の態様では、ITまたは毒素はさらに、少なくとも第二の作用物質を含む。このような作用物質は分子または成分であることができる。そのような分子または成分は、少なくとも一つのエフェクターまたはレポーター分子を含むが、それに限定されない。エフェクター分子は、所望の活性、たとえば細胞毒活性を有する分子を含む。抗体に結合しているエフェクター分子の非限定的な例は、毒素、抗腫瘍剤、治療酵素、放射能標識ヌクレオチド、抗ウイルス剤、キレート化剤、サイトカイン、成長因子およびオリゴまたはポリヌクレオチドを含む。対照的に、レポーター分子は、アッセイを使用して検出することができる成分と定義される。抗体に結合されているレポーター分子の非限定的な例は、酵素、放射能標識、ハプテン、蛍光標識、リン光分子、化学発光分子、クロモフォア、発光分子、光親和性分子、着色粒子またはリガンド、たとえばビオチンを含む。
【０１５９】
少なくとも第二の作用物質の特定の例は、少なくとも一つの検出可能な標識を含む。「検出可能な標識」とは、特定の機能性および／または化学特性により検出することができる化合物および／または要素であり、その使用は、それが結合している抗体を検出および／または、所望により、さらに定量することを可能にする。
【０１６０】
多くの適切な造影剤が、それらを抗体に結合させる方法とともに、当技術分野で公知である(たとえば、それぞれ参照として本明細書に組み入れられるU.S.Patent No. 5,021,236、4,938,948および4,472,509を参照)。使用される画像化成分は、常磁性イオン、放射性同位元素、蛍光色素、NMR検出可能な物質、X線画像化であることができる。
【０１６１】
また、アジド基を含有する分子を使用して、低輝度紫外線によって生成される反応性ニトレン中間体を介してタンパク質への共有結合を形成することができる(PotterおよびHaley、1983)。特に、プリンヌクレオチドの2-および8-アジド類似体が、粗細胞抽出物中のヌクレオチド結合タンパク質を同定するための部位特異的フォトプローブ（photoprobe）として使用されている(OwensおよびHaley、1987、Athertonら、1985)。2-および8-アジドヌクレオチドはまた、精製タンパク質のヌクレオチド結合ドメインをマッピングするために使用されており(Khatoonら、1989、Kingら、1989およびDholakiaら、1989)、抗体結合剤として使用することもできる。
【０１６２】
抗体をその結合体成分に付着または結合するためのいくつかの方法が当技術分野で公知である。いくつかの付着方法は、金属キレート錯体の使用を含み、たとえば、抗体に付着させた有機キレート化剤、たとえばジエチレントリアミン五酢酸無水物(DTPA)、エチレントリアミン四酢酸、N-クロロ-p-トルエンスルホンアミドおよび／またはテトラクロロ-3α-6α-ジフェニルグリコリル-3を用いる(それぞれ参照として本明細書に組み入れられるU.S.Patent No. 4,472,509および4,938,948を参照)。また、モノクロナール抗体をカップリング剤、たとえばグルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩の存在下で酵素と反応させてもよい。フルオレセインマーカとの結合体は、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアネートとの反応によって調製される。U.S. Patent Nos. 4,938,948では、モノクロナール抗体を使用する乳房腫瘍の画像化が達成され、検出可能な画像化成分が、リンカー、たとえばメチル-p-ヒドロキシベンズイミデートまたはN-スクシンイミジル-3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオネートを使用して抗体に結合されている。
【０１６３】
他の態様では、抗体結合部を改変しない反応条件を使用してスルフヒドリル基を免疫グロブリンのFc領域に選択的に導入することによる免疫グロブリンの誘導体化が考慮される。この方法にしたがって作製された抗体結合体は、改善された寿命、特異性および感度を示すと開示されている(参照として本明細書に組み入れられるU.S. Pat. No. 5,196,066)。また、エフェクターまたはレポーター分子がFc領域の炭水化物残基に結合されるエフェクターまたはレポーター分子の部位特異的付着が文献に開示されている(O'Shannessyら、1987)。この手法は、現在臨床評価を受けている診断的および治療的に有望な抗体を産生すると報告されている。
【０１６４】
2.  IT調製方法
ITを作製し、調製する方法は当業者に公知である。このような方法は、それぞれ参照として本明細書に組み入れられるU.S. Patent 5,686,072、U.S. Patent 5,578,706、U.S. Patent 4,792,447、U.S. Patent 5,045,451、U.S. Patent 4,664,911およびU.S. Patent 5,767,072に開示されている。ITの毒素成分は、当技術分野で一般に使用されている多様な毒素のいずれであってもよい。無傷の毒素であってもよいし、毒素A鎖であってもよいし、天然に存在する単鎖RIPであってもよい。本発明によって包含される毒素としては、ジフテリア毒素(DT)およびDT(CRM-45)、シュードモナス外毒素由来PE38、RTAおよびアブリンならびにこれら両方の遮断型、ゲロニンならびにサポリンがあるが、これらに限定されない。
【０１６５】
最近、障害のあるジスルフィドリンカーによってdgRTAに共有結合したMabを含むITが、非ホジキン(B細胞)リンパ腫、ホジキンリンパ腫新生物またはGVHDの治療のための臨床試験に入った。これらの「第二世代」ITは安定であり、長寿命であり、標的細胞に対して強力な細胞毒性を示す。これらのITを高収率で速やかに調製するための標準化手法が開発された(Ghetieら、1991)。
【０１６６】
たとえばdgRTAでITを調製するための手法は、MabをSMPTで誘導体化し、dgRTAをジチオトレイトール(DTT)で還元したのち、二つの成分を反応させて障害のある分子内ジスルフィド結合を達成することを含む。この化学架橋反応が抗体、毒素およびITの混合物を生じさせたのち、これを精製して、まず遊離抗体および遊離毒素分子を除去し、次いで一つ、二つ、三つまたは三つを超える数の毒素分子それぞれに結合した一つの抗体分子を含む種々のIT種を分離させる。架橋反応の未反応成分をアフィニティークロマトグラフィーカラム、たとえば活性化色素／アガロースでの連続クロマトグラフィーによって除去して遊離抗体を除去したのち、ゲルろ過を実施して高分子量物質および遊離毒素を除去することができる。
【０１６７】
この手順の結果、異なる毒素／抗体比の結合体の混合物が得られる。本発明の重要な態様は、異なる毒素／抗体比のITから分離された単一の毒素／抗体比のITから本質的になる調製物を得るためのこの混合物のさらなる精製である。この精製は、アフィニティークロマトグラフィーによって達成することができるさらなるクロマトグラフィー分離により、たとえば種々のIT種を溶離させるための塩勾配およびITをより大きな分子から分離するためのゲルろ過を使用して達成される。
【０１６８】
本発明のもう一つの重要な態様は、どの毒素／IgG比が、薬理学的調製物で使用されるもっとも有効な細胞障害作用物質になるかを決定する能力である。本発明によって可能になるITの単独種それぞれの単離および特徴付けは、実施者が特定の状況で投与されるべきITの有効量をより正確に制御することを許すため、臨床用途で特に有利である。
【０１６９】
3.  ゲルろ過
本発明の手順で使用されるゲルは、ランダム構造を有する三次元ネットワークである。モレキュラーシーブゲルは、分析または分離される物質と結合または反応しない架橋ポリマーを含む。ゲルろ過の目的の場合、ゲル物質は一般に非荷電状態である。ゲル内の空間が液体で満たされ、液相がゲル体積の大部分を構成する。ゲルろ過カラムで一般に使用される材料としては、デキストラン、アガロースおよびポリアクリルアミドがある。
【０１７０】
デキストランは、グルコース残基で構成される多糖であり、SEPHADEX(Pharmacia Fine Chemicals, Inc.)の名称で市販されている。ビーズは、種々の孔径を提供することによって異なるサイズの分子を分けるため、異なる架橋度で調製される。アルキルデキストランをN,N'-メチレンビスアクリルアミドと架橋させると、SEPHADEXが達成することができるよりも大きな範囲で分別する強いビーズを作製することを可能にするセファクリルS100〜S1000が形成される。
【０１７１】
また、ポリアクリルアミドをゲルろ過媒体として使用することができる。ポリアクリルアミドは、N,N'-メチレンビスアクリルアミドを架橋剤として用いて調製される架橋アクリルアミドのポリマーである。ポリアクリルアミドは、異なるサイズの粒子の分離に使用するため、Bio-Rad Laboratories(米国)から多様な孔径で市販されている。
【０１７２】
ゲル材料は、水および数種の有機溶媒の中で膨潤する。膨潤とは、溶離剤として使用される液体で細孔が満たされる過程である。より小さな分子は細孔に侵入するため、ゲルを通過するそれらの分子の進行は、細孔に入らないより大きな分子に比べて遅れる。これが分離の基礎である。ビーズは、種々の用途で使用されるために異なる細度で市販されている。ビーズが粗くなればなるほど、流れは速くなり、分離度は劣る。最大限の分離度のためにはスーパーファインが使用されるが、流れは非常に遅くなる。ファインは、より速い流量を要する大きなカラムでの分取作業に使用される。より粗いグレードは、分離度が時間よりも重要ではない大規模分取の場合または分子量に大きな差がある分子の分離の場合に使用される。ゲルクロマトグラフィーの論考に関しては、参照として本明細書に組み入れられるFreifelder, Physical Biochemistry, Second Edition, pages 238-246を参照すること。
【０１７３】
本発明で使用するのにもっとも好ましいゲルろ過法は、分子を180〜240キロダルトン範囲で分離することができる、デキストランゲル、たとえばSEPHADEXを使用する方法およびデキストラン-ポリアクリルアミドゲル、たとえばセファクリルを使用する方法である。
【０１７４】
4.  アフィニティークロマトグラフィー
アフィニティークロマトグラフィーは一般に、リガンドまたは抗体のような物質によるタンパク質の認識に基づく。カラム材料は、結合分子、たとえば活性化色素をたとえば不溶性マトリックスに共有結合させることによって合成することができる。次に、カラム材料が溶液から所望の物質を吸着することができる。次に、条件を、結合が起こらず、基質が溶離される条件に変更する。アフィニティークロマトグラフィー成功の要件は、マトリックスが分子を吸着し、リガンドを、その結合活性を改変することなく結合させ、十分に強固な結合を有するリガンドを選択し、物質を破壊することなく溶離させることができるということである。
【０１７５】
本発明の好ましい態様は、マトリックスが反応性色素-アガロースマトリックスであるアフィニティークロマトグラフィー法である。シバクロンブルー3GAとアガロースまたはセファロースで構成されたカラムマトリックスであるブルーセファロースをアフィニティークロマトグラフィーマトリックスとして使用することができる。もっとも好ましいマトリックスは、Sigma Chemical Companyからリアクティブブルー2として市販されているセファロースCL-6B、カタログ番号R8752である。このマトリックスは、本発明のITと直接結合し、塩勾配を用いる溶離によるその分離を可能にする。
【０１７６】
5.  ELISA
ELISAを本発明とともに使用してもよい。ELISAアッセイでは、毒素A鎖配列を含むタンパク質またはペプチドを、選択した表面、好ましくはタンパク質親和性を示す表面、たとえばポリスチレンマイクロタイタプレートの穴に固定化する。不完全に吸着された物質を洗い落としたのち、アッセイプレート穴を、試験抗血清に関して抗原的に中性であることが知られている非特異的タンパク質、たとえばウシ血清アルブミン(BSA)、カゼインまたは粉乳の溶液と結合させるか、またはそれで被覆することが望ましい。これは、固定化面上の非特異的吸着部位のブロッキングを可能にし、したがって、表面への抗血清の非特異的結合によって生じるバックグラウンドを減らす。
【０１７７】
抗原性物質を穴に結合し、バックグランドを減らすために非反応性物質で被覆し、非結合物質を洗い落としたのち、固定化面と、試験される抗血清または臨床もしくは生物学的抽出物とを、免疫複合体(抗原／抗体)形成を招く方法で接触させる。このような条件は、好ましくは、抗血清を希釈剤、たとえばBSA、ウシγ-グロブリン(BGG)およびリン酸緩衝食塩水(PBS)／TWEENで希釈することを含む。これら添加される作用物質もまた、非特異的バックグランドの低減に役立つ傾向にある。次に、層状化した抗血清を、好ましくは25℃〜37℃程度の温度で2〜4時間インキュベートする。インキュベートののち、抗血清接触面を洗浄して非免疫複合化物質を除去する。好ましい洗浄手順は、PBS／TWEENのような溶液またはホウ酸緩衝剤で洗浄することを含む。
【０１７８】
試料と結合抗原との間で特異的免疫複合体を形成し、次いで洗浄したのち、同免疫複合体を、第一の抗体に対して特異性を有する第二の抗体に付すことにより、免疫複合体形成の発生および量を測定することができる。検出手段を提供するために、第二の抗体は、好ましくは、適切な色素生成基質とともにインキュベートされると発色する、対応する酵素を有する。したがって、たとえば、抗血清結合面をウレアーゼまたはペルオキシダーゼ結合抗ヒトIgGと接触させ、一定期間、免疫複合体形成の発生に有利な条件下でインキュベートする(たとえば、PBS含有溶液、たとえばPBS-Tween中、室温で２時間インキュベート)ことが望まれる。
【０１７９】
第二の抗体で標識された抗体でインキュベートし、次いで非結合物質を洗い落としたのち、酵素標識としてペルオキシダーゼを用いる場合、色素生成基質、たとえば尿素およびブロモクレゾールパープルまたは2，2'-アジノ-(3-エチル-ベンズチアゾリン-6-スルホン酸［ABTS］およびH2O2を用いるインキュベートにより、標識の量を定量する。次に、たとえば可視スペクトル分光光度計を使用して発色の程度を計測することにより、定量を達成する。
【０１８０】
D.  ワクチン接種
本発明は、免疫化態様で使用するためのワクチンを考慮する。一つ以上の(x)D(y)、(x)D(y)Tおよび／または隣接領域配列における改変によってVLSまたは他の毒性作用を促進する作用が低下しているタンパク質性組成物が抗原として有用であると考えられる。具体的な態様では、一つ以上の(x)D(y)、(x)D(y)Tおよび／または隣接領域配列を含むペプチドが有用な抗原として考慮される。好ましくは、抗原性物質を広く透析して望まれない低分子量分子を除去したり、凍結乾燥させて所望の溶剤への配合を容易にしたりする。また、他の態様では、一つ以上の活性部位残基を欠く毒素(すなわちトキソイド)をワクチンとして使用することが可能である。
【０１８１】
1.  免疫調節物質
免疫調節物質をワクチンに含めて患者の応答を増強することができると考えられる。免疫調節物質は、精製タンパク質として含むこともできるし、細胞が組成物の一部である場合、それらの発現を細胞へと操作することもできる。以下の部分は、対象となる免疫調節物質の例を挙げる。
【０１８２】
a.  サイトカイン
インターロイキンおよびサイトカインならびにインターロイキンおよびサイトカインを発現するベクターが、可能なワクチン成分として考えられる。インターロイキンおよびサイトカインとしては、インターロイキン1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、β-インターフェロン、α-インターフェロン、γ-インターフェロン、アンギオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、METH-1、METH-2、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、腫瘍壊死因子、TGFβ、LTおよびそれらの組み合わせがあるが、これらに限定されない。
【０１８３】
b.  ケモカイン
ケモカインまたはケモカインをコードする遺伝子もまた、ワクチン成分として使用することができる。ケモカインは一般に、免疫エフェクター細胞をケモカイン発現部位に動員する化学誘引物質として作用する。特定のケモカイン遺伝子をたとえばサイトカイン遺伝子と組み合わせて発現させて、治療部位への他の免疫系成分の動員を増強することが有利であるかもしれない。このようなケモカインとしては、RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-βおよびIP-10がある。当業者は、特定のサイトカインが化学誘引作用を有することもまた知っており、ケモカインとして分類されてもよいということを認識する。
【０１８４】
多価ワクチンの調製は一般に、すべて参照として本明細書に組み入れられるU.S. Patents 4,608,251、4,601,903、4,599,231、4,599,230、4,596,792および4,578,770によって例示されるように、当技術分野で十分に理解されている。通常、このようなワクチンは注射液として調製される。溶液または懸濁液のいずれかとして：注射の前に液体に溶解または懸濁させるのに適した固体剤形を調製してもよい。また、調製物を乳化してもよい。多くの場合、活性免疫原性成分を、薬学的に許容され、有効成分と適合性である賦形剤と混合する。適当な賦形剤は、たとえば、水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどおよびそれらの組み合わせである。加えて、所望により、ワクチンは、少量の補助物質、たとえば湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤またはワクチンの有効性を増強するアジュバントを含有することもできる。
【０１８５】
ワクチンは、通常、注射、たとえば皮下注射、皮内注射または筋肉内注射によって非経口的に投与することができる。他の投与形態に適したさらなる剤形として、座剤および場合によっては経口剤または経鼻剤がある。座剤の場合、従来の結合剤および担体として、たとえばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドがある。このような座剤は、有効成分を約0.5％〜約10％、好ましくは約1〜約2％の範囲で含有する混合物から形成することができる。経口剤は、通常に用いられるような賦形剤、たとえば医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放性剤または粉剤の形態をとり、有効成分を約10％〜約95％、好ましくは約25％〜約70％含有する。
【０１８６】
ワクチンは、剤形と適合する方法で、治療的に有効であり、免疫原性を発揮するような量で投与される。投与量は、たとえば個体の免疫系が抗体を合成する能力および所望の保護の程度を含め、治療を受ける対象に依存する。投与されなければならない有効成分の正確な量は、実施者の判断に依存する。しかし、適当な用量範囲は、1回のワクチン接種あたり有効成分数百マイクログラムのオーダーである。初期投与およびブースター投与に適した投与計画もまた異なるが、典型的には、初期投与ののち後続の接種または他の投与を実施する。インビボでの半減期が短い毒素の場合には、筋肉内経路が好ましいかもしれない。
【０１８７】
ワクチンに関してアジュバント作用を達成する種々の方法は、通常はリン酸緩衝食塩水中約0.05％〜約0.1％溶液として使用される水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム(ミョウバン)のような薬剤を使用し、約0.25％溶液として使用される糖の合成ポリマー(Carbopol(登録商標))を添加混合し、ワクチン中のタンパク質を約70℃〜約101℃の範囲の温度で30秒〜2分の期間熱処理することによって凝集させることを含む。アルブミンに対するペプシン処理(Fab)抗体で再活性化することによる凝集、バクテリア細胞、たとえばC. parvumもしくは外毒素またはグラム陰性バクテリアのリポ多糖成分との混合、生理学的に許容される油性溶剤、たとえばマンニドモノオレエート(Arecel A)への乳化またはブロック代用物として使用されるペルフルオロカーボン(Fluosol-DA(登録商標))の20％溶液での乳化を用いることもできる。
【０１８８】
多くの場合、複数回、通常は6回以下、より通常には4回以下、好ましくは1回以上、通常は少なくとも約3回のワクチン接種を実施することが望ましい。これらの技術は周知であり、これらのタイプのアッセイを例示するものとしての多様な特許、たとえばU.S. Patent Nos. 3,791,932、U.S. Patent Nos. 4,174,384およびU.S. Patent Nos. 3,949,064で見いだすことができる。
【０１８９】
2.  アジュバント
免疫化プロトコルは、応答を刺激するためにアジュバントを長年にわたり使用している。一部のアジュバントは、抗原が提示される方法に影響する。たとえばタンパク質抗原がミョウバンによって沈殿すると、免疫応答は増大する。また、抗原の乳化が抗原提示の期間を延ばす。他のアジュバント、たとえばバクテリアから得られる特定の有機分子は、抗原よりも宿主に対して作用を及ぼす。一例は、バクテリアペプチドグリカンであるムラミルジペプチド(N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン[MDP])である。MDPの作用は、大部分のアジュバントと同じく、十分には解明されていない。MDPは、マクロファージを刺激するが、B細胞を直接刺激するようにも思われる。したがって、アジュバントの作用は抗原特異的ではない。しかし、精製された抗原とともに投与されるならば、抗原に対する応答を選択的に促進するために使用することができる。
【０１９０】
アジュバントは、未知の抗原に対する免疫の全般的増大を促進するために実験的に使用されている(たとえばU.S. Patent Nos. 4,877,611号)。これは、特に癌の治療で試行されている。多くの癌の場合、免疫系が腫瘍細胞に対する宿主防衛に参与するという反論しがたい証拠があるが、今日まで、腫瘍特異的抗原の可能性の高い総数のごく一部しか同定されていないと考えられる。
【０１９１】
本発明は、多様なアジュバントを細胞、たとえば腫瘍細胞の膜に用いて、結果的に改善された免疫原性組成物を得ることができると考える。唯一の要件は、一般に、アジュバントが、当該細胞の細胞膜への組み込み、当該細胞の細胞膜との物理的会合または当該細胞の細胞膜との結合が可能であるということである。
【０１９２】
当業者は、本発明にしたがって細胞ワクチンに結合することができる種々のアジュバントを察知し、それらには、とりわけ、アルキルリゾリン脂質(ALP)、BCGおよびビオチン(ビオチニル化誘導体を含む)がある。特に使用を考慮される特定のアジュバントは、グラム陰性細胞からのタイコ酸である。これらには、リポタイコ酸(LTA)、リビトールタイコ酸(RTA)およびグリセロールタイコ酸(GTA)がある。それらの合成対応物の活性型を本発明に関連して使用することもできる(Takadaら、1995)。
【０１９３】
また、ヘモシアニンおよびヘモエリトリンを本発明で使用することもできる。アオガイヘモシアニン(KLH)の使用が特に好ましいが、他の軟体動物および節足動物のヘモシアニンおよびヘモエリトリンを用いることもできる。
【０１９４】
また、種々の多糖アジュバントを使用してもよい。たとえば、Yinら(1989)は、マウスの抗体応答に対する種々の肺炎球菌多糖アジュバントの使用を記載している。多糖のポリアミン変種、たとえば脱アセチル化キチンをはじめとするキチンおよびキトサンが特に好ましい。
【０１９５】
さらなる好ましいアジュバントの群は、バクテリアペプチドグリカンのムラミルジペプチド(MDP、N-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン)群である。ムラミルジペプチドの誘導体、たとえばアミノ酸誘導体トレオニル-MDPおよび脂肪酸誘導体MTPPEもまた考慮される。
【０１９６】
U.S. Patent 4,950,645は、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールから形成される人造リポソームにおける使用を提案されているムラミルジペプチドの親油性二糖トリペプチド誘導体を記載している。細胞性担体との使用を提案されていないU.S. Patent 4,950,645およびPCT Patent Application WO 91/16347の化合物が今、本発明における使用に関して提案される。
【０１９７】
本発明の好ましいアジュバントはBCGである。BCG(ミコバクテリアの弱毒化株である、bacillus Calmette-guerin)およびBCG細胞壁骨格(CWS)を、トレハロースジミコレートとともに、またはトレハロースジミコレートなしで、本発明でアジュバントとして使用することもできる。トレハロースジミコレートは、U.S. Patent 4,579,945に記載のようにして調製することができる。
【０１９８】
BCGの細胞壁抽出物は、優れた免疫アジュバント活性を有することが証明されている。ミコバクテリアに関して最近開発された分子遺伝学的手段および方法が、異種遺伝子をBCGに導入するための手段を提供した(Jacobsら、1987、Snapperら、1988、Hussonら、1990、Martinら、1990)。BCGおよび他のミコバクテリアは非常に効果的なアジュバントであり、ミコバクテリアに対する免疫応答は広く研究されている(Luelmo、1982、Lotteら、1984)。典型的なBCGワクチンがTICE(登録商標)BCG(Organon Inc., West Orange, NJ)として販売されている。本発明の典型的な実施では、当技術分野で公知の方法(たとえば、Dubosら、1947、Rosenthal、1937)によってミコバクテリアbovis-BCGの細胞を増殖させ、回収する。
【０１９９】
両親媒性界面活性剤、たとえばサポニンおよび誘導体、たとえばQS21(Cambridge Biotech)が、本発明の免疫原と使用するのに好ましいアジュバントのもう一つの群を形成する。また、非イオンブロックコポリマー界面活性剤(Rabinovichら、1994、Hunterら、1991)を使用してもよい。Yamamotoら(1988)によって記載されているオリゴヌクレオチドがもう一つの有用な群のアジュバントである。Quil Aおよびレンチネン(lentinen)が今のところ好ましいアジュバントのリストを完成させる。各薬剤および以下に記載する外毒素がアジュバントとして周知であるが、これらの化合物は、本明細書で示すように、以前に標的細胞の膜に組み込まれたことはない。
【０２００】
本発明で使用するのに特に好ましいアジュバントの一つの群は、解毒された外毒素、たとえばU.S. Patent 4,866,034の精製解毒外毒素である。これらの精製解毒外毒素は、哺乳動物でアジュバント応答を発生させるのに効果的である。
【０２０１】
解毒外毒素を他のアジュバントと組み合わせてマルチアジュバント取り込み細胞を調製してもよい。U.S. Patent 4,435,386に記載されているように、解毒外毒素とトレハロースジミコレートとの組み合わせが考えられる。また、解毒外毒素とトレハロースジミコレートおよび外毒性糖脂質との組み合わせが考慮され(米国特許第4,505,899号)、同じく、U.S. Patent 4,436,727、4,436,728および4,505,900に記載のように、解毒外毒素と細胞壁骨格(CWS)またはCWSおよびトレハロースジミコレートとの組み合わせが考慮される。U.S. Patent 4,520,019に記載されているような、解毒外毒素なしの、CWSとトレハロースジミコレートだけの組み合わせもまた有用であると想像される。
【０２０２】
たとえば抗体を産生する、または後で活性化T細胞を得ることを望む場合、種々のアジュバントを、ヒトには一般に使用されないものを含め、動物では使用することができる。たとえば非照射腫瘍細胞を使用した場合に起こるおそれのあるような、アジュバントまたは細胞のいずれかから生じるかもしれない毒性または他の副作用は、そのような状況では無関係である。
【０２０３】
E.  薬学的調製物
本発明の薬学的水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体中に溶解または分散した一つ以上のIT、VLS阻害ペプチドもしくはポリペプチド、VLS刺激性ペプチドもしくはポリペプチドおよび／またはサイトカインを有効量で含む。語句「薬学的または薬理学的に許容される」とは、分子実体および組成物が、ヒトに投与された場合、副作用、アレルギーまたは他の有害反応を生じさせないことをいう。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」は、あらゆる溶媒、分散媒、抗菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などを含む。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当技術分野で周知である。従来の媒体または薬剤が有効成分と非適合性である場合を除き、治療組成物におけるその使用が考えられる。また、補足的な有効成分を組成物に配合することもできる。
【０２０４】
本発明の薬学的調製物の調製における使用に関して以下の緩衝剤および試薬が特に考慮される。dgRTA、脱グリコシル化リシンA鎖；DMF、ジメチルホルムアミド(Pierce, Rockford, Ill.)；DTT(Pierce)；PBE、0.05 Mリン酸ナトリウム、pH7.5、1 mM EDTA含有；PBES、0.05 Mリン酸ナトリウム、pH7.5、異なる濃度のNaCl(たとえば0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.4 Mおよび0.5 M NaCl)および1mM EDTA含有；PBES、0.01 Mリン酸ナトリウム、pH7.5、0.17 M NaClおよび1 mM EDTA含有；SMPT、N-スクシンイミジル-オキシカルボニル-α-メチル-α(2-ピリジルジチオ)トルエン(Pierce)。すべての緩衝剤は、外毒素を含まない蒸留水で、酵素品質の塩(Fisher Biotec, Springfield, N.J.)を使用して調製することができる。
【０２０５】
IT、ペプチドもしくはポリペプチドおよび／またはサイトカインは、非経口投与、たとえば静脈内、筋肉内または皮下経路を介する注射のために処方することができるが、他の経路、たとえばエアゾール投与を使用することもできる。本開示を考慮すると、参照として本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed. Mack Publishing Company、1980によって例示されるように、少なくとも一つのIT、タンパク質性物質および／またはサイトカインを有効成分として含有する水性組成物の調製が当業者に理解される。そのうえ、ヒトへの投与の場合、調製物は、米国食品医薬品局、生物学的基準局（Office of Biological Standards）によって求められる無菌性、発熱原性、安全性全般および純度の基準を満たすべきであることが理解される。
【０２０６】
通常、このような組成物は、注射用として、溶液または懸濁液のいずれかとして調製することができる。注射の前に液体の添加によって溶液または懸濁液を調製するのに適した固体剤形を調製することもでき、また、調製物を乳化させてもよい。組成物は、無菌状態であり、容易に注射可能である程度に流動性であり、作製および貯蔵の条件下で安定であり、微生物、たとえばバクテリアおよび真菌の汚染作用に対して防腐処理される。外毒素汚染は安全レベル、たとえばタンパク質1 mgあたり0.5 ng未満で最低限に維持されるべきであることが理解される。
【０２０７】
IT、ペプチドもしくはポリペプチドおよび／またはサイトカインの溶液は、他の非有効成分を含有する、注射に適するように作られた無菌水中で調製されることが非常に好ましいが、そのような有効成分の溶液は、望むならば、界面活性剤、たとえばヒドロキシプロピルセルロースと適当に混合された水中で調製することもできる。また、液状ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物ならびに油中の分散系を調製することもできる。担体はまた、たとえば水、エタノール、ポリオール(たとえばプロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど)、それらの適当な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒であることができる。適切な流動性は、たとえば、レシチンのような被覆剤の使用、分散系の場合に必要な粒度の維持および界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０２０８】
微生物の作用の阻止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、たとえば糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の長期的な吸収は、吸収を遅らせる薬剤、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。
【０２０９】
処方において、溶液は剤形と適合する方法で、治療的に有効であるような量で投与される。たとえば水溶液中での非経口投与の場合、必要ならば溶液を適当に緩衝し、液体希釈剤をまず十分な塩水またはグルコースで等張状態にすべきである。これら特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、用いることができる無菌水性媒体は、本開示を考慮すると、当業者には理解される。治療される対象の状態に依存して、用量のいくらかの変動は必然的に起こる。いずれにしても、投与の責任を負う人物が個々の対象に適切な用量を決定する。
【０２１０】
特に、適当な薬学的IT、ペプチドまたはポリペプチド組成物は一般に、所望のIT結合体、ペプチドまたはポリペプチド約10 mg〜約100 mgを、許容される薬学的希釈剤または賦形剤、たとえば無菌水溶液と添加混合して、結合体に対して約0.25 mg/ml〜約2.5 mg/mlの最終濃度がたとえばpH7.5〜9.0の0.15 M NaCl水溶液中で得られるようにしたものを含むが、それに限定されない。調製物は、-10℃〜-70℃で凍結させた状態で少なくとも一年間貯蔵することができる。
【０２１１】
F.  キット
さらなる態様では、本発明は、上記のITまたはワクチン接種法と使用するためのキットに関する。VLS促進作用または毒性作用が低下している毒素、サイトカインまたは抗原性組成物をキットの中に提供することができる。このようなキットは、毒素を特異的抗体と組み合わせてITを作製したり、毒性が低下しているサイトカインを提供したり、ワクチン接種のための抗原を、すぐに使える貯蔵可能な容器に入れて提供したりするために使用することができる。さらには、VLS発症配列のペプチド阻害剤またはタンパク質性溢血増強剤をキットに含むことができる。しかし、そのような成分の組み合わせを含むキットを提供することもできる。したがって、キットは、VLS促進活性が低下または増強しているタンパク質性組成物を適当な容器中に含む。キットは、抗体またはITを適当な容器中に含むことができる。
【０２１２】
キットの容器は一般に、少なくとも一つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器および／または他の容器を含み、その中に少なくとも一つのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを配置および／または、好ましくは、適当に分注することができる。本発明のキットは、少なくとも一つの抗体、ITおよび／または他の試薬容器を販売用に密閉して収容するための手段を含むことができる。そのような容器は、所望のバイアルが中に保持される射出および／または吹込み成形プラスチック容器を含むことができる。
【０２１３】
実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含む。以下の実施例に開示される技術が、本発明の実施において十分に機能することが本発明者によって見いだされた技術を表し、したがって、本発明の実施のための好ましい形態を構成するものとみなされるということが当業者によって理解されよう。しかし、当業者は、本開示を考慮して、開示される具体的な態様に多くの変更を加えることができ、それでもなお、本発明の本質および範囲を逸することなく、同様または類似の結果が得られるということを理解するはずである。
【０２１４】
実施例1
血管漏出症候群を誘起するための構造モチーフ
この実施例は、毒素およびIL-2中の三アミノ酸配列モチーフ(x)D(y)が血管ECを損傷する原因であることを実証する。隣接グリシンおよびシステインを含有するRTAまたはIL-2からの短い(アミノ酸20個未満)(x)D(y)モチーフ含有ペプチドならびに欠失または突然変異した配列を有するペプチドを生成した。これらのペプチドを、システインを介して、HUVECとは反応しないマウスIgG1 Mab(RFB4)に付着させた。このIgG-ペプチド結合体(IgG-RTA)のVLS誘発能力を三つのVLSモデル系で比較した。第一のモデル系は、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)に対するインビトロ損傷であり(Soler-Rodriguezら、1993)、第二のモデル系は、マウス肺におけるインビボ流体貯留であり(BalunaおよびVitetta、1996)であり、第三のモデル系は、SCIDマウスにおけるインビボヒト皮膚異種移植片であった(BalunaおよびVitetta、1999)。
【０２１５】
ペプチド合成
RTAからの13個のアミノ酸(残基69〜81、SEQ ID NO:1)を表し、溶解度を高めるためにNおよびC末端グリシン残基が加えられたペプチド(表6)を合成した。(x)D(y)モチーフを含有するペプチドは、さらなる三つの隣接グリシンをペプチドの各末端に加えても、可溶化が困難であった。この理由から、これらのペプチドを可溶性担体タンパク質に結合させた。RFB4-dgRTAはプロトタイプITであり、したがって、RFB4-ペプチドはITを「模倣」するため、MAb RFB4を選択した。
【０２１６】
N末端システインを加えてペプチドをRFB4 MAbに結合させた。二つのRTA対照ペプチド(表6)を合成した。また、IL-2からの残基15〜23を表すアミノ酸9個のペプチドおよび対照ペプチド(表6)を合成した。ここでもまた、隣接グリシンおよびシステインを加えた。すべてのペプチドは、Applied Biosystemsモデル430A固相ペプチド合成機で合成した。
【０２１７】
RFB4へのペプチドの結合
すべてのペプチドは、マレインイミド誘導体化RFB4との結合を容易にするため、N末端システイン残基を含有していた。RFB4を25倍過剰モルのスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシレートで処理し、ゲルろ過によって過剰な試薬を除去した。各RFB4分子に導入されたマレイミド基の数を、Ellman試薬(HusainおよびBieniarz、1994)を使用する2-メルカプトエチルアミンの逆滴定によって測定した。誘導体化RFB4を10倍過剰のSH-ペプチドと室温で4時間反応させ、PBSに対する透析によって過剰なペプチドを除去した。マレイミド反応により、付着したペプチド基の数が遊離マレイミド基の数に類似しているIgG1-C-Sペプチド結合体の形成が達成された。
【０２１８】
(表６)RTAおよびIL-2からのペプチド1
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1前記のとおり、各ペプチドをマウスMAb、RFB4に結合した。
【０２１９】
HPLCおよび放射能標識によって測定されるように、RFB4-ペプチド結合体(表6)は、IgG1分子1個あたり6〜9個のマレイミド基を含有し、これらの基が、システイン含有ペプチドとの反応によって安定なチオエーテル結合を形成した。
【０２２０】
HUVEC単層の形態に対するRFB4-ペプチドの作用
RTA中のLDV配列およびIL-2中のLDL配列がHUVECを損傷するかどうかを判定するため、単層を異なる濃度のRFB4-RTA-ペプチド、RFB4-IL-2-ペプチドまたは対照とともにインキュベートした。HUVECを単離し、培養し、顕微鏡検査した(Balunaら、1996、Soler-Rodriguezら、1993)。
【０２２１】
HUVEC単層を、10-6M RFB4-LDV+、RFB4-LDV-、RFB4-GQT、RFB4-LDL+、RFB4-LDL-または培地のみで37℃で18時間インキュベートしたのち、位相差顕微鏡検査(倍率×20)によって検査した。正常な単層は、細長い形状の高度に詰まった細胞からなるものであったが、損傷した細胞は凝集し、プレートから分離した。未処理のHUVECは、固く詰まった細長い細胞からなるものであった。10-6M RFB4-LDV+またはRFB4-LDL+による処理により、2時間のインキュベート後に細胞の凝集が生じ、18時間後には単層中にギャップが形成された。RFB4-LDV-、RFB4-GQTまたはRFB4-LDL-を使用した場合、HUVECに対する毒性作用は認められなかった。LDVまたはLDLを含有するRFB4-ペプチドの毒性作用は用量依存性であり、RFB4-dgRTAを使用して認められた作用に匹敵しうるものであった(表7)。これらの結果は、RTA中のLDV配列およびIL-2中のそのLDL同族体がこれらの作用物質のEC毒性に関与していることを示す。
【０２２２】
(表７)HUVEC単層の形態に対する種々の濃度のRFB4-ペプチド構築物の作用1
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1HUVECを増殖させて96穴組織培養プレート中に密集させ、細胞を、2％ FCSを含むM199中、異なる濃度のRTA由来ペプチド構築物で18時間処理した。
2形態変化を、「-」変化なし、「+」細胞凝集、および「++」細胞単層からの細胞の分断および離脱としてスコア付けした。
【０２２３】
RFB4-ペプチドのインビボ作用
IL-2の血管毒性は実験動物では確認されているが(OrucevicおよびLala、1995、Puriら、1989、PuriおよびRosenberg、1989、Rosensteinら、1986)、VLSのdgRTA-IT媒介全身性出現をマウス、ラットまたはサルにおいて誘発することは困難であった(Soler-Rodriguez、1992)。血管化ヒト皮膚をSCIDマウスに移植し、マウスにdgRTA-ITを注射し、移植片中の流体貯留を湿／乾重量比として計測することにより、インビボでのヒト内皮細胞に対するITの作用を研究するためのモデルが開発された(Balunaら、1998)。凍結乾燥の前後で皮膚移植片のパンチ生検試料を計量することにより、ヒト皮膚中の流体貯留を計測した。このモデルを使用して、RFB4-LDV+、RFB4-GQT+およびRFB4-dgRTAのインビボでの作用を評価した(図1A)。
【０２２４】
また、IL-2がマウスの肺で流体貯留を誘発するときの、正常なSCIDマウスの肺における流体貯留を評価した(OrucevicおよびLala、1995)。肺または皮膚移植片の水分含量を湿／乾重量比として計算した。
【０２２５】
RTA-ITを注射されたマウスにおけるVLSの全身的出現を実証することは困難であったが、SCIDマウス中のヒト皮膚移植片で血管漏出が起こる。RFB4-LDV+およびRFB4-dgRTA注射後、ヒト皮膚移植片の湿／乾重量比の増大が見られたが、RFB4-GQT+注射後にそれは見られなかった。これらの異種移植片における流体貯留は、RFB4-dgRTAまたはRFB4-LDV+を使用した場合と同程度であった。SCIDマウス肺を使用した場合、同程度の結果が得られた(図1B)。図中の差は小さく見えるかもしれないが、統計的には有意であり、IL-2を使用した場合の報告(OrucevicおよびLala、1995)と合致している。
【０２２６】
HUVECへのdgRTAおよびRFB4-ペプチドの結合のフローサイトメトリー分析
RFB4-LDV+およびRFB4-LDL+がHUVECを損傷するという事実は、これらのペプチドがHUVEC上の結合部位と相互作用するということを暗示するが、無傷のIL-2またはRTA分子では、(x)D(y)モチーフは、ECのための第一の結合部位ではないかもしれない。毒素に関するこれらの問題に対処するため、一連の結合および結合／阻害実験を実施した。
【０２２７】
タンパク質をフルオレセインイソシアネート(FITC)(Sigma, St. Louis, MO)に結合させた。105個のHUVECを、1％ウシ血清アルブミン(BSA)および0.01％アジ化ナトリウムを含有する冷PBS(PBS/BSA/AZ)中で2回洗浄し、同じ緩衝剤100μl中に再懸濁させ、FITC試薬とともに暗所の氷上で30分間インキュベートし、PBS/BSA/AZで3回洗浄し、1％パラホルムアルデヒドPBS/AZ 0.5 ml中で固定し、FACScan(Becton Dickinson, Mountain View, CA)およびCytoQuestソフトウェアを使用して分析した。
【０２２８】
HUVECへのdgRTA、PE38-lysおよびRFB4-ペプチドの結合を試験した。105個のHUVECを、異なる濃度のPBS/BSA/AZ 100μl中のFITC試薬とともに氷上で30分間インキュベートし、洗浄し、1％パラホルムアルデヒド中で固定し、フローサイトメトリーによって分析した。数値は、FITC-dgRTA、FITC-PE38-lysおよび対照としてのFITC-炭酸脱水酵素を使用した3回実験の平均±SDを表す。HUVECへのdgRTA、PE38-lysおよび炭酸脱水酵素の結合のフローサイトメトリー分析のヒストグラムを作成した。また、FITC-RFB4-LDV+(▲)、FITC-RFB4-LDV-、FITC-RFB4-GQT+、FITC-RFB4、FITC-RFB4-LDL+およびFITC-RFB4-LDL-の結合を評価した。RFB4-LDV+、RFB4-LDL+およびRFB4のヒストグラムを作成した。この研究の結果は、FITC-dgRTAおよびFITC-PE38-lysの最大結合の50％が、細胞105個あたりそれぞれ0.035μgおよび>100μgをそれぞれ要し、dgRTAが、PE38-lysに対するよりもHUVECに対して>3対数高い相対結合親和性を有するということを実証した。これは、HUVECにおけるLDVレセプターがPE38-lys中の同族配列に対してより低い親和性を有するという事実および／またはRTA中のLDVがより露出しているという事実によるものかもしれない。また、RTA中(しかしPE38-lys中ではない)の他の非同族配列がHUVECに結合することが可能である。FITC-dgRTA(0.035μg/細胞105個/100μl)とFITC-RFB4-LDV+(0.5μg/細胞105個／100μl)の相対結合親和性の差は、モル基準で計算するならば、わずか2倍であった。LDV配列が欠失または突然変異しているRFB4-ペプチド結合体はHUVECに結合しなかったため、(x)D(y)モチーフが結合に関与していることは明らかである。
【０２２９】
HUVECへのdgRTAおよびRFB4-ペプチドの結合の阻害
HUVECへのRTAの結合における(x)D(y)モチーフの役割のさらなる証拠を提供するため、一連の結合阻害実験を実施した。最大結合の20％〜50％を表す濃度のFITC-dgRTAまたはFITC-RFB4-LDV+(dgRTAの場合は0.035μg/細胞105個、RFB4-LDV+の場合は1.0μg/細胞105個)を、100倍過剰のdgRTA(Inland Laboratories, Austin, Texas)、RFB4-LDV+、RFB4、Fn(GIBCO Laboratories, Grand Island, NY)またはPE38-lys(NCI, Bethesda)の存在または非存在下で、HUVECとともに暗所の氷上で30分間インキュベートした。洗浄した細胞を1％パラホルムアルデヒド中で固定し、FACSで分析した。
【０２３０】
HUVECへのFITC-dgRTAの結合が、dgRTAによっては>90％阻害され、RFB4-LDV+によっては>60％阻害されるということが見いだされ、dgRTAの結合が特異的であり、少なくとも部分的にLDV配列が関与するということを示した(図2A)。同族体含有PE38-lysがdgRTAの結合を阻害することができないという事実(図2A)は、HUVECに対するその相対親和性が3を超える対数だけ低いという事実によるかもしれない。加えて、dgRTAは、RFB4-LDV+がその結合を60％阻害し、100％は阻害しなかったという事実によって示唆されるように、HUVECに対するさらなる非同族結合部位を有するかもしれない。さらには、逆実験では、dgRTAおよびRFB4-LDV+の両方がHUVECへのFITC-RFB4-LDV+の結合を同様な程度に阻害し(図2B)、RTA中のLDV配列がHUVECへの結合に関与していることをさらに示した。驚くことに、PE38-lysは、HUVECへのFITC-LDV+の結合を非常に効果的に阻害し(図2B)、LDV同族配列の一つ以上がLDV含有ペプチドの結合に関してLDVモチーフと競合することができるということを示した。PE38-lys中の一つ以上の同族配列(GDL-348-350、GDV-430-432またはGDL-605-607)がHUVECに結合し、HUVECを損傷すると考えられる。Fnもまた、HUVECに対するFITC-dgRTA(図2A)およびFITC-RFB4-LDV+(図2B)の両方の結合を阻害したが、さほど効果的には阻害しなかった。これに関して、FnもまたLDVモチーフを含有するが、Fnは、そのLDVモチーフの可用性で役割を演じるかもしれない異なる隣接残基を有する。
【０２３１】
上記のデータは、RTA中にLDVモチーフを含有するペプチドおよびIL-2中にLDLモチーフを含有するペプチドが、RFB4 MAbに付着されると、インビトロでHUVECに特異的に結合し、HUVECを損傷するということを実証する。IgG-ペプチド結合体およびIgG-RTA ITは、内皮細胞損傷の誘発において同等に有効であり、三つすべてのモデルで血管透過性を増大させた。
【０２３２】
天然の、突然変異または欠失を有しないLDV配列を含有するRFB4-RTA-ペプチドの注射がRFB4-dgRTA  ITの場合と同じやり方で肺およびヒト皮膚異種移植片で血管漏出を生じさせたため、RTA中のLDV配列がインビボでVLS様症状につながる事象の誘起の原因であるかもしれない。このモチーフを含有するペプチドまたはタンパク質が、HUVECへのRTAの用量依存性の飽和性結合を阻害したため、dgRTAはHUVECに結合するためにそのLDV配列を少なくとも部分的に使用する。
【０２３３】
RTA中のLDVおよびIL-2中のLDLの立体像は、これらのモチーフが部分的に露出しており、細胞と相互作用するはずであることを示す。RTAの場合、これは、インビトロでのHUVECへのその用量依存性の飽和性結合によって裏付けられる。HUVECへのRFB4-LDV+の結合は、dgRTAによってだけでなく、LDVまたはLDV同族体を含有するタンパク質、すなわちFnおよびPE38-lysによっても部分的に阻害されることができるため、これはさらに、いくつかの分岐的分子中の(x)D(y)モチーフの機能的保存を示す。この配列中の欠失もしくは突然変異または非損傷性遮断（blocking）ペプチドの使用は、多様な植物またはバクテリア毒素で調製されたIL-2およびITの治療指数を高めることができる。
【０２３４】
実施例２
dgRTAの作製および精製
Inland LaboratoriesがdgRTAを作製した。しかし、以下の実施例は、本発明で使用するためのdgRTAを作製する手順を記載する。
【０２３５】
トウゴマの粉末アセトン抽出物が出発原料である。この粉末からリシンを抽出し、そのリシンを脱グリコシル化し、A鎖およびB鎖に分離し、dgRTAを精製する。
【０２３６】
バルク原料であるトウゴマの粉末アセトン抽出物は、Sigma Bulk Chemical Salesから購入することができる。原料は、1.O Lの容量を有し、粉末200グラムを含有するプラスチックボトルに入れて届けられる。このボトルは、手順を開始するまで、施錠したキャビネットに保管しておく。
【０２３７】
表8は、手順に必要な緩衝剤および溶液の組成を一覧に示し、表9は、緩衝剤および溶液の規格を一覧に示す。表10は、dgRTAの作製および精製に使用される設備を一覧に示し、表11は、この手順で使用される工程およびカラムの概要を提供する。
【０２３８】
(表８)
0004845381.tif 000012
【０２３９】
(表９)緩衝剤規格
0004845381.tif 000013
【０２４０】
(表１０)装置
0004845381.tif 000014
【０２４１】
(表１１)カラム規格
0004845381.tif 000015
*すべてのカラムを負圧冷却器中4℃で保持する。
【０２４２】
バルクリシンの抽出
各抽出バッチは、トウゴマ粉末の二本のボトルからなることができる。これらのボトルを生物学的安全キャビネット(フード)内で開封し、PBS 1.0Lを各ボトルに加える。各ボトルを元のフタで栓をし、フード中の循環型シェーカに載せ、室温で、毎分200サイクルで1時間振とうする。ボトルを4℃で30分間放置して粒子状物質を沈降させる。各ボトルからの上澄みを、カバーおよび注ぎ口を備えた中間容器に注ぎ、その容器から、液体を750 mlプラスチック遠心分離ボトルに注ぎ入れる。これら両工程はフードの中で実施する。遠心分離ボトルに栓をし、湿った紙タオルできれいに払拭したのち、ボトルをフードから取り出す。遠心分離ボトルを遠心分離器のキャリアーに配置し、3,700 rpmで20分間4℃で遠心分離する。遠心分離ボトルを取り出し、フードに移し、上澄みをデカントし、Technicloth TX609紙に通してろ過しながら6L三角フラスコに入れる。
【０２４３】
第二の抽出を実施する。二本の工場ボトル中の沈降物を1.OL PBSで再懸濁させ、室温で1時間振とうしたのち遠心分離し、ろ過することを含む抽出手順を繰り返す。
【０２４４】
リシンの精製
以下の手順すべてを負圧クロマトグラフィーボックス中4℃で実施する。
【０２４５】
第一および第二の抽出物を貯留し、Whatman 90377A(1.0 pm)カプセルフィルタに通してろ過する。280 nmでの吸光度を測定し、粉末から抽出された全タンパク質を計算し、記録する。
【０２４６】
次に、清澄化された上澄みをフラスコから酸処理セファロース4Bカラムに汲み上げる。非結合画分を回収し、オートクレーブ処理し、捨てる。結合した画分をBB＋0.2Mガラクトースで溶離させる(図3)。溶離物を直接CH2 Amicon濃縮器に回収し、1.5Lまで濃縮する。濃縮物をフラスコに移し、量を計測する。アリコートを使用して280 nmでの吸光度を計測し、ODU中の全タンパク質を記録する。
【０２４７】
タンパク質を、フラスコからセファクリルS-200カラムに汲み上げ、AAで平衡化する。ピーク1(RCA1=リシンアグルチニン)およびピーク2(RCA2=リシン毒素)の分離を、ピーク1とピーク2との間の280 nmの最低吸光度によって測定する(図4参照)。
【０２４８】
第一のピークはリシンアグルチニンを含有し、これを捨てる。第二のピークはリシンを含有し、これを直接Amicon濃縮器に回収し、2.5 mg/mlまで濃縮する。量、OD 280およびタンパク質全量をmg単位で記録する。リシンを濃縮器から栓をした容器に汲み入れたのち、その容器を湿った紙タオルで払拭し、クロマトグラフィー冷却器から取り出す。
【０２４９】
リシンの脱グリコシル化
リシン溶液を含有する容器をフードの中で開封する。等量の脱グリコシル化緩衝剤を加える。容器に栓をし、払拭し、クロマトグラフィー冷却器に入れて4℃で4時間インキュベートする。次に、容器をフードに入れ、開封し、グリセロールを最終濃度1％まで加えて反応を止める。容器に再び栓をし、払拭し、クロマトグラフィー冷却器に入れ、4℃で一夜維持する。
【０２５０】
リシンAおよびB粒子の分離およびdgRTAの精製
一夜インキュベートしたのち、容器を冷却器から取り出し、フードに入れる。容器を開封し、pHが8.0に達するまでトリスを加える。中和したリシン溶液を、クロマトグラフィー冷却器中で直列に接続された2本のカラムに汲み入れる。第一のカラムはDEAFセファロースを含み、第二のカラムは酸処理セファロース4Bを含む。両カラムをBBで平衡化させる。DEAEセファロースカラムの目的は、外毒素を結合することである。ひとたび酸処理セファロース413カラムからの溶出物の280 nmでの吸光度が0.05 ODU(ピーク1の終わり、図5)まで低下すると、リシンはDEAEセファロースカラムを通過し、酸処理セファロース4Bカラムに入っており、そこで結合する。
【０２５１】
ピーク1は、酸処理セファロース4Bに結合しない少量のdgRTAを表す。次に、カラムを分離し、280 nmでの吸光度が還元性BBの吸光度(0.12 ODU)に等しくなるまで還元性BBを酸処理セファロース4Bカラムに汲み入れる。次に、ポンプを止め、カラムを4℃で4時間インキュベートする。この期間中、リシンAおよびB鎖の間のS-S結合が還元される結果、二本の鎖の分離が起こる。
【０２５２】
リシンB鎖は、酸処理セファロース413カラムに結合したまま残る。次に、このカラムを還元性BBで洗浄し、遊離dgRTAを回収する(ピーク2、図5)。280 nmでの吸光度が還元性BBの吸光度まで戻ったとき、回収を止める。回収した溶出物(dgRTA溶液)のOD 280を計測し、ODU中の量およびタンパク質濃度を記録する。
【０２５３】
酸処理したセファロース4BカラムをBB＋0.2Mガラクトースで溶離させ、溶離したリシンB鎖を捨てる。
【０２５４】
次に、還元性BB中のdgRTA溶液を、BBで平衡化させたブルーセファロースCL-4Bのカラムに汲み上げ、4℃で保持する。280 nmでの吸光度がベースラインまで低下するまでカラムをBBで洗浄する。次に、小さなピークが溶離し(ピーク2)、280 nmでの吸光度がベースライン値に戻るまでカラムをBB+0.2 Mガラクトースで洗浄する。この手順を適用して、セファロースマトリックスと相互作用することができる全リシン毒素(RCA2)またはB鎖の全量を除去する。図6のピーク3で示すように、ブルーセファロースカラムからBB+1M NaClでdgRTAを溶離させ、量および280 nmでの吸光度を計測し、記録する。
【０２５５】
次に、溶離物を、BBで平衡化させたAsialofetuinセファロースカラムに汲み上げ、4℃で保持する。図7に示すように吸光度が0.05 ODUを超えると開始し、0.05 ODUに戻ると終了する非結合画分をAmicon濃縮器で透析ろ過してNaCl濃度を0.25 Mに下げ、タンパク質濃度を2 mg/mlに上げる。次に、DTTを最終濃度10 mMまで加え、溶液を0.22μmフィルタに通してろ過する。還元したdgRTA溶液を等量のグリセロールと混合し、-20℃で貯蔵する。カラムをBB+0.2 Mガラクトースで溶離させ、溶離物を捨てる。
【０２５６】
試験および規格
表12は、dgRTの試験および規格を一覧に示す。
【０２５７】
(表１２)dgRTAの試験および規格
0004845381.tif 000016
【０２５８】
実施例3
VLSを軽減または解消する隣接領域の改変
LDV配列またはその三次元構造でこの配列に隣接する二つの残基の一方(たとえばR48またはN97)に単一の残基変更を有する組換え(r)RTA突然変異体のパネルを生成した。候補は通常、以下の基準を満たさなければならなかった。1)高収率作製および長期安定性、2)無細胞アッセイにおける全酵素活性、3)ITとしての良好な細胞毒性、4)SCIDマウスにおいてITとして使用された場合に肺血管漏出(PVL)を誘発しないこと、5)野生型(wt)rRTAのLD50よりも高いLD50、6)wt rRTAを含有するITの薬物動態に類似する、マウスにおける薬物動態(PK)、および7)本発明者らのSCID/Daudi腫瘍モデルにおけるRFB4-rRTA ITの効力。一般に、この実施例で使用する材料および方法は上記のとおりである。
【０２５９】
プラスミドおよび突然変異誘発
IPTG誘発性制御の下でwt rRTAを含有するpKK223プラスミドは、英国CoventryのWarwick大学Department of Biology SciencesのJ. Michael Lord氏の懇意によって提供された(O'Hareら、1987およびSimpsonら、1995)。標準的技術(Sambrookら、1989)を使用してすべてのDNA操作を実施した。QuikChange(登録商標)(Stratagene, Lajolla, California)および以下のような変異原性プライマーの対を使用して突然変異を導入した(相補対あたり一つのプライマーだけを掲載し、突然変異に下線を入れた)。
【０２６０】
(表１３)変異原性プライマー
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【０２６１】
肺血管漏出
SCIDマウス(Taconic, Germantown, New York)に対し、三日間の過程で、体重1gあたり合計15μgのITを腹腔内注射した。最後のIT注射ののち、1匹あたり5〜7μCiの125I標識アルブミンを静脈内注射し、24時間後、右肺の125I含有量を計測し、塩水で処理した対照と比較した。全身および血液中の放射能レベルを測定したのち、屠殺した(データ示さず)。
【０２６２】
治療プロトコル
播種性Daudiリンパ腫のSCIDマウスを、前記のように、1匹あたり100μgのIT、MAbまたはPBSで処理した。マウスを観察し、後肢麻痺が生じたところで屠殺した。対数ランクおよびウィルコクソン試験(Shahら、1993)を使用して生存曲線の比較を実施した。対数ランク試験によって5％有意レベルでマウスの生存期間中央値を計算した。
【０２６３】
薬物動態
実験中、18〜22gのSCIDマウスに対し、甘みを付けた飲用水中0.05％のルゴール溶液を与えた。放射能標識タンパク質を、最大量100μLで、1〜5×107cpmの放射性負荷および5μgの用量で、尾の静脈内に注射した。注射直後、6日間毎日AtomLab 100用量キャリブレーター(Atomic Products Corporation, Shirley, New York)を使用して全身放射能をカウントした。結果を初期全身放射能に対して表した(％)。非コンパートメントモデルをPKCALCプログラム(Schumaker、1986)とともに使用して、薬物動態パラメータを決定した。
【０２６４】
rRTAおよび突然変異rRTAを用いて調製したITのインビトロ活性
wt rRTAを含有する(ベクターpKK233中)プラスミドを出発原料として使用した。L74A、L74M、D75N、D75A、D75E、V76AおよびV76Mをはじめとする、LDV配列中の保存的変化ならびにDLV配列に隣接し、活性部から遠位にある表面残基R48AおよびN97Aに対する保存的変化によっていくつかの突然変異体を生成した(図8)。精製rRTA調製物は純度>90％であった(データは示さず)。次に、これらの突然変異体rRTA、wt rRTAおよびdgRTAの酵素活性を無細胞ウサギ網状赤血球アッセイ(Pressら、1986)で分析した。また、これらをマウスIgG1抗ヒトCD22 MAb、RFB4(Shenら、1988)に結合させ、還元後、再び無細胞網状赤血球アッセイで評価した。最後に、ITを、CD22陽性Daudi細胞に対して、本明細書で記載したインビトロ細胞毒性アッセイで試験した。
【０２６５】
表14に示すように、網状赤血球アッセイで試験されると、wt rRTAおよびdgRTAは非常に類似した活性を示したが、wt rRTAのほうがわずかに活性が高かった。RFB4  MAbに結合したのち、双方とも網状赤血球アッセイで活性を保持し、Daudi細胞細胞毒性アッセイで同じ相対活性を示した。6種のRTA突然変異体R48A、L74A、L74M、V76A、V76MおよびN97Aは、網状赤血球アッセイでは、dgRTAと同等以上の活性を示した。これらの突然変異体は、RFB4に結合され、還元され、再試験されたのちも、この活性を保持した。L74Aを除き、同じITはDaudi細胞細胞毒性アッセイでも活性が高かった。
【０２６６】
(表１４)rRTAおよびこれらのrRTAを用いて調製したITの酵素活性
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a実験12回
b実験6回
c実験20回未満
d<1は活性増を示す。
e突然変異体あたり実験3〜12回
【０２６７】
これら6種の突然変異体とは対照的に、D75A、D75EおよびD75Nを含有するrRTAは、活性が、網状赤血球アッセイではITの2分の1〜9分の1の低さであり、Daudi細胞毒性アッセイではITの200分の1に満たない低さであった。これらの結果に基づいて、R48A、L74M、V76A、V76MおよびN97A突然変異体をさらなる試験のために選択した。
【０２６８】
RTAを含有するITがインビボでPVLを誘発する能力
ヒトとは違い、RTA含有ITを注射されたマウスは、全身性VLSを示さないが、PVLを示す(Balunaら、1999およびSoler-Rodriguezら、1992)。したがって、SCIDマウスに対し、Daudi細胞スクリーニングアッセイに「合格」した突然変異体rRTAで調製したITを注射し、PVLを観察した(Rosensteinら、1986)。マウスに対して、wt rRTA、dgRTA、L74M、V76AまたはV76Mを含有するITを体重1gあたり15μg注射した場合、PVLが認められた(図9)。対照的に、R48AまたはN97Aを含有するITはPVLを誘発しなかった。従来の放射線治療が患者においてVLSを悪化させるという本発明者らの以前の考察(Schindlerら、2001)を考慮して、IT治療の前にマウスに150 cGyを前照射したが、R48AまたはN97Aを用いて調製されたITに関してPVLは認められなかった(データは示さず)。
【０２６９】
RFB4-ITのLD50
二つのRFB4結合突然変異体rRTAであるR48AおよびN97Aがマウスに対して毒性であるかどうかを判定した。マウス10匹の群に異なる用量の各ITを腹腔内注射した。マウスを一週間毎日計量した。マウスが体重の20％を失うと、その量の体重減少は常に死につながるため、屠殺した。RFB4-dgRTAおよびRFB4-wt rRTAのLD50sは10μg/gであったが、RFB4-R48AまたはRFB4-N97AのLD50sは>100μg/gであった(試験した最大用量)。したがって、R48AおよびN97A ITは、インビトロでDaudi細胞に対してRFB4-dgRTAと同等の活性を示したが、マウスに対してはせいぜい10分の1の毒性しかなく、RFB4-dgRTAと同じ用量ではPVLを生じさせない。
【０２７０】
突然変異体rRTAのPK
RFB-4結合突然変異体およびwt rRTA-ITのPKおよびインビボ安定性を試験した。N97AおよびR48Aで調製されたITの場合の種々のPKパラメータは、wt rRTAを含有するITに関して観察されたパラメータに十分匹敵する(図15)。これらの動物からの血清を実験の最後に回収し、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによって試験した。マウス中で7日間ののち、ITは無傷であり、明白な凝集はなかった(データは示さず)。
【０２７１】
(表１５)rRTAで構築されたITのマウスにおける薬物動態
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1  曲線の下の面積、2  分別異化速度、3  平均滞留時間
【０２７２】
インビボでの突然変異体rRTA
N97AおよびR48Aを含有するITは事実上、十分な活性、良好なPK、低いインビボ毒性を有し、PVLを誘発しなかったため、これらのITを、RFB4-ITとして、播種性SCID／Daudiモデル中、インビボで評価した(Ghetieら、1990)。R48AまたはN97Aを用いて調製されたITを注射されたSCID／Daudiマウスは、それぞれ60日および72日の平均麻痺時間(MPT)を示した(図10)。したがって、RFB4-N97Aは、以前の実験(73日間のMPT)(O'Hareら、1987)で使用されたRFB4-dgRTAと同等に有効であり、RFB4-R48Aは、RFB4に対して統計的に有意な改善を示した。しかし、いずれもRFB4-wt rRTAよりも効果が低かった(90日間のMPT)(図10)。N97AおよびR48Aを用いて調製されたITのLD50は>10倍の高さであるため、これらは、より高い用量ではdgRTA-IT(およびwt rRTA-IT)をしのぐ性能を示すはずである。
【０２７３】
本明細書で開示し、主張するすべての組成物および／または方法は、本発明の開示を考慮すると、過度な実験なしで作製し、実施することができる。好ましい態様に関して本発明の組成物および方法を記載したが、当業者には、本発明の概念、本質および範囲を逸することなく、本明細書に記載した組成物および／または方法ならびに方法の工程または工程の順序に変更を加えうることが明らかである。より具体的には、化学的かつ生理学的に関連する特定の薬剤を本発明に記載した薬剤に代えて用いても、同じまたは類似の結果が達成されるであろうことは明らかである。当業者には自明であるそのようなすべての類似の代用および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の本質、範囲および概念に入るものとみなされる。
【０２７４】
参考文献
下記の参考文献が、本明細書で述べたものを補足する典型的な手法または他の詳細を提供する程度に、参照として本明細書に組み入れられる。
【０２７５】
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【図面の簡単な説明】
【０２７６】
図面は、本明細書の一部を構成し、本発明の特定の態様をさらに説明するために含められる。これらの図面の一つ以上を本明細書で提示する具体的な態様の詳細な説明と併せて参照することにより、本発明をより良く理解することができる。
【図１】RFB4-RTAペプチドのインビボ作用。(図1A)血管化ヒト異種皮膚片を移植したSCIDマウスに対し、200μgのRFB4-dgRTA(べた塗り)、RFB4-LDV+(無地)、RFB4-GQT(斜交平行線)または塩水(斜線)を注射し、ヒト皮膚の生検組織の湿／乾重量比を測定した。(図1B)図1Aで記載したようにSCIDマウスに注射を施し、肺の湿／乾重量比を測定した。数値は、三回の実験の平均±SDを表す。星印は、塩水(-)処理したマウスとの統計的に有意な差を示す(*,p<0.02、**p<0.01)。
【図２】HUVECへのdgRTAおよびRFB4-LDV+の結合の阻害。(図2A)105個のHUVECを、100μl PBS/BSA/アジ化物中、100倍過剰のdgRTA(べた塗り)、RFB4-LDV+(斜交平行線)、RFB4(陰影付き)、Fn(斜線)またはPE38-lys(無地)の存在または非存在下で、FITC-dgRTAとともに氷上で30分間インキュベートした。HUVECへの結合の阻害率が提示されている。数値は、三回の実験の平均±SDを表す。(図2B)105個のHUVECを、FITC-RFB4-LDV+とともに氷上で30分間インキュベートしたことを除き、図2Aと同じ。
【図３】リシンの酸処理セファロース4Bカラム精製のプロフィール。
【図４】RCA-1およびRCA-2のセファクリルS-200カラム分離のプロフィール。
【図５】dgRTAおよびdgRTB鎖のDEAEセファロースカラムおよび酸処理セファロース4Bカラム分離のプロフィール。
【図６】dgRTAのブルーセファロースCL-4Bカラム精製のプロフィール。
【図７】dgRTAのAsialofetuinセファロースカラム精製のプロフィール。
【図８】RTAのリボン図。活性部位残基側鎖、LDVモチーフならびにR48およびN97を有するリシンA鎖のX線結晶学的構造のリボン表現である。
【図９】RFB4-RTA ITのインビボVLS作用。種々のRTA-ITで処理したSCIDマウスの肺の中の125Iアルブミン保持量を、比較のためのBPS処理マウスによる保持量に対し、重量基準で正規化した(n=マウスの数。P値は、各グループとPBSグループとを比較する)。
【図１０】SCID/Daudi生存曲線。「方法」で記載したように処理したSCIDマウス(n=10)を、いずれかがこのモデルにおける終点である生存または麻痺に関して観察した。(無地の菱形)PBS、(べた塗りの菱形)RFB4、(無地の三角)RFB4-R48A、(べた塗りの三角)RFB4-N97A、(無地の四角)RFB4-wt rRTA。P値(対数ランクまたはウィルコクソン試験): RFB4-R48A対RFB4、P=0.0093またはP=0.0037、RFB4-N97A対RFB4、P=0.0018またはP=0.00012、RFB4-wt rRTA対RFB4、P=0.0022またはP=0.00012。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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