(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡをスクリーニングする方法であって、ｃＤＮＡライブラリー由来の候補ｃＤＮＡを大腸菌ＳＯＬＲ株に導入し、得られた形質転換大腸菌を３５０ｍＭ以上の塩濃度条件下で培養し、培養後に生育しているクローンを選択し、選択されたクローンから導入した候補ｃＤＮＡを単離することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２】
塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡをスクリーニングする方法であって、ｃＤＮＡライブラリー由来の候補ｃＤＮＡを大腸菌ＳＯＬＲ株に導入し、得られた形質転換大腸菌を３５０ｍＭ以上の塩濃度条件下で培養し、培養後に生育しているクローンを選択し、選択されたクローンから導入した候補ｃＤＮＡを単離し、単離された候補ｃＤＮＡにランダムな変異を導入し、この変異ｃＤＮＡを宿主細胞に導入し、変異前のｃＤＮＡの選択条件より厳しい条件下で選抜する工程を１又は２回以上繰り返すことを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項３】
以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ａ)配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２又は３４に示されるアミノ酸配列からなる少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質
(ｂ)配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２又は３４に示されるアミノ酸配列と相同性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質
【請求項４】
配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１又は３３に示される塩基配列、あるいはこれらの配列の全部を含む塩基配列であって、少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ａ)配列番号３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列からなる少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質
(ｂ)配列番号３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列と相同性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質
【請求項６】
配列番号３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１又は６３に示される塩基配列、あるいはこれらの配列の全部を含む塩基配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項７】
配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２又は３４に示されるアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質。
【請求項８】
配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２又は３４に示されるアミノ酸配列と相同性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質。
【請求項９】
配列番号３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質。
【請求項１０】
配列番号３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列と相同性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか記載のタンパク質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１２】
請求項１１記載のベクターを宿主細胞に導入することにより得られることを特徴とする、少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有する形質転換植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、塩ストレス等の環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ及びそのスクリーニング方法や、塩ストレス等の環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質や、トランスジェニック植物などのこれらＤＮＡやタンパク質の利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
自然界に存在する生物は塩ストレス、高温ストレス、低温ストレス、凍結ストレス、乾燥ストレス等の種々の環境ストレスに曝されている。特に、塩ストレスは多くの高等植物の生育を阻害する大きな要因の１つである。高等植物の耐塩性強化は、農産物生産の増大につながるため、遺伝子導入により高等植物の耐塩性を強化させる試みが、近年、活発に進められている。
【０００３】
例えば、H. J. Bohnertらは大腸菌由来のマンニトール合成酵素をタバコに導入することで、タバコの耐塩性が強化された事を報告している（Science Vol.259, No.22, p508-510, 1993）。このような高等植物の耐塩性強化はプロリン合成系酵素（Plant Physiol Vol.108, p1387-1394, 1995）やグリシンベタイン合成系酵素を導入することでも同様な効果が得られることが示されている（Plant J Vol. 12, p133-142, 1997、Plant Mol Biol Vol.38, 1011-1019, 1998）。しかしながら、これらの酵素をコードする遺伝子の導入で得られる組み換え植物は、海水程度の塩水に対して十分に適応できるものではない。
【０００４】
一般に塩ストレス等の環境ストレスは複数の生体反応に対して悪影響をもたらす。つまり、塩濃度の高い環境で安定に生育できる遺伝子組み換え植物を作出するためには、複数の塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードする遺伝子群の利用が必要となる。これまでの環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードする遺伝子群を単離するための主たる手法は、「ストレスに対抗する機構はストレスがかけられたときに発現する」という前提条件に基づいている。具体的には、環境ストレスが植物にかかったときに、特異的に発現するタンパク質やｍＲＮＡを検出し、それに対する遺伝子を分子生物学的手法によって獲得し，これをストレスに弱い植物に遺伝子導入することで、環境ストレス耐性が見られるようになるかどうかを検討するという手法が用いられてきた。確かにこれまでこのような方法によって環境ストレス特異的に誘導される遺伝子が単離されてきたが、その遺伝子を環境ストレスに弱い植物に遺伝子導入することによって、環境ストレスに強い植物体が作出された例は稀である。例えば、高い塩濃度というストレス条件下で生育する植物において、耐塩性にかかわる遺伝子はストレスの有無にかかわらず発現しているのであれば、従来の方法でストレス耐性遺伝子を見い出すことは不可能である。また、近年ストレスに強い植物種のゲノム・プロジェクトが進められているが、塩基配列あるいはアミノ酸配列がわかったところで、他のゲノム・プロジェクトにおけると同様に、その機能が不明なものが多く、どのタンパク質が環境ストレス耐性にかかわっているのかは特定できないのが現状である。
【０００５】
一方、沿岸及び河口近くの高濃度の塩分を含む土壌に生息する樹木類にマングローブ植物がある。マングローブ植物は進化の過程で特殊な耐塩性機構を獲得したものと考えられることから、マングローブ植物の耐塩性に関わる遺伝子群を単離できれば、高等植物の耐塩性の強化への応用が期待できる。しかしながら、マングローブ植物の耐塩性機構を遺伝子レベルで解析した例はこれまでに全く知られていない。かかる理由としては、このような樹木類から直接耐塩性に関与する遺伝子のｍＲＮＡを抽出することが極めて困難であったことが挙げられる。
【０００６】
近年、Mimuraらがマングローブ植物の一種であるBruguiera sexangulaの培養細胞系を確立した（J Res Vol.110, p25-29, 1997）。この培養細胞は懸濁培養が可能であり、また塩濃度１５０ｍＭ以上の環境下でも安定に生育することができるといった、他の植物培養細胞とは異なる極めて特異的な性質を有している（J. Plant Res Vol.110, p31-36, 1997）。しかしながら、この培養細胞を利用してマングローブ植物のｃＤＮＡライブラリーを構築し、マングローブ植物の耐塩性に関わる遺伝子群を探索しようとする試みさえも、これまで全く検討されていない。また、その他の塩生植物由来の遺伝子を導入することで高等植物の耐塩性を強化した例もほとんどなく、塩生植物の一種であるアイスプラント (Masembryanthenum crystallinum) 由来のイノシトールメチルトランスフェラーゼ遺伝子をタバコに導入することで、形質転換細胞内に適合溶質の一種であるオノニトールの含有量を増大させ、 これによりタバコの耐塩性を強化した例(Plant Physiol Vol. 115, p1221-1219, 1998) や、比較的耐塩性が高い大麦由来のストレス誘導性タンパク質 (ＬＥＡタンパク質) をコードする遺伝子をイネに導入することで、イネの耐塩性をわずかに向上させた例 (Plant Physiol Vol. 110, p249-257, 1996) が代表的な例であるといえる。このように、塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードする遺伝子群を効率よく単離する技術が確立されていないため、マングローブ植物群をはじめとした、多くの塩生植物の環境ストレス耐性遺伝子に関する研究が十分に行われてきたとは言い難いのが現状である。
【０００７】
また、塩ストレス耐性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を人為的に改変することにより、タンパク質の塩ストレス耐性を向上させる機能を強化させることができれば、より強力な塩ストレス耐性植物を作出することが可能になる。大腸菌由来のコリンデヒドロゲナーゼを植物で発現させるときに、一部のコドンを改変することで、植物内でのコリンデヒドロゲナーゼ発現量を安定化させ、これによりコリンデヒドロゲナーゼの代謝産物であるグリシンベタイン (適合溶質の一種、植物の耐塩性を高める働きがある) レベルを安定化させる試みがなされている(Stress responses of photosynthesis organisms (ed. Satoh K., Murata N.) p115-131, Elsevier Science, Amsterdam) が、これはタンパク質のアミノ酸配列を変化させたものではない。アミノ酸配列を改変 (改良) した塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質を導入することにより、高等植物の塩ストレス耐性を強化した例はこれまで報告されていない。そして、耐塩性に関与する遺伝子やその改変遺伝子は塩ストレスのみならず、その他の環境ストレス（熱、凍結、浸透圧、乾燥、紫外線）の全て、あるいはそれらのうちのいくつかのストレスに対する耐性を向上させる活性を有する可能性が期待できる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、各種生物の環境ストレスに対する耐性を強化する効果を有する遺伝子の効率のよいスクリーニング方法や、かかるスクリーニング方法により得られる環境ストレス耐性を向上させる活性を有するタンパク質（環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質）の遺伝子や、環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質や、耐塩性が増強されたトランスジェニック植物等を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するため、本発明者らは塩生植物の一種であるマングローブに着目し、既に培養細胞系が確立されているBruguiera sexangulaの培養細胞の分与を得て、この細胞株を１００ｍＭのＮａＣｌ存在下で培養し、培養細胞から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡライブラリーを作製し、この中からマングローブの耐塩性に関与する遺伝子の探索を試みた。通常、耐塩性関連遺伝子をスクリーニングする方法としては、ディファレンシャルスクリーニング法が広く利用されている（塩ストレスにより誘導される新規チオニン遺伝子に関する特開平１０−２９５３８０号公報参照)が、このスクリーニング方法で単離される遺伝子は、ストレス条件下で特異的に誘導される遺伝子であり、その遺伝子を他の細胞で発現させることでその細胞のストレス耐性を強化できるとは限らない。そこで、本発明者らはストレス耐性に関与する遺伝子の探索に大腸菌の遺伝子発現系を利用する方法を新たに開発した。
【００１０】
大腸菌の遺伝子発現系を利用して、耐塩性に関与する遺伝子をスクリーニングする場合、大腸菌自身の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）に対する防御機構が強く働くことが問題になる。現在、分子生物学の分野で広く利用されているＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９等の大腸菌は１０００ｍＭ以上のＮａＣｌを含む２ＹＴ寒天培地でもコロニー形成能を有する。これらの株を用いて上記のスクリーニングを行った場合、上記ｃＤＮＡライブラリー由来の候補ｃＤＮＡの発現により耐塩性が強化されたクローンの他に、大腸菌自身の耐塩性機構が強力に働くことで耐塩性に全く関与しないｃＤＮＡが導入されたクローンも得られてしまうことになり、これら両者の明確な判別は極めて困難である。このような理由から、大腸菌の遺伝子発現系を利用して耐塩性関連遺伝子の選抜はこれまで全く行われていなかった。本発明者等は、他の大腸菌と比べ、耐塩性機構の働きが低下した大腸菌を見い出し、これを利用することで、初めて大腸菌を利用した耐塩性関連遺伝子のスクリーニングを行なうことに成功した。
【００１１】
本発明者らによる上記方法で単離したマングローブ等の塩性植物由来の遺伝子（ｃＤＮＡ）群は、それぞれ大腸菌の耐塩性を強化する機能を有することが確認された。植物遺伝子を異種生物である大腸菌で発現させて、該大腸菌の耐塩性を向上させることができたため、これらの遺伝子群は、原核生物から真核生物にいたる幅広い生物群で、耐塩性を強化する機能を有するものと考えられた。実際、本発明者らは、ｍａｎｇ１遺伝子と命名した単離したストレス耐性に関与する遺伝子群の中の１つの遺伝子を導入することにより、酵母、植物細胞（タバコ培養細胞）、そして植物体（タバコ）の耐塩性を強化させることにも成功した。また、ｍａｎｇ１は耐塩性の他に、熱、浸透圧、凍結等の環境ストレスに対する耐性を強化する機能を有することも確認された。さらに、ｍａｎｇ１ｃＤＮＡにランダムな変異を導入し、この変異ｃＤＮＡを大腸菌に導入し、変異前の選択条件より厳しい条件下で選抜する工程を１又は２回以上繰り返すことにより、より強い耐塩性向上活性を有するタンパク質を得ることができることを見い出した。本発明はかかる一連の研究に基づいて完成するに至ったものである。
【００１２】
すなわち本発明は、（１）塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡをスクリーニングする方法であって、ｃＤＮＡライブラリー由来の候補ｃＤＮＡを大腸菌ＳＯＬＲ株に導入し、得られた形質転換大腸菌を３５０ｍＭ以上の塩濃度条件下で培養し、培養後に生育しているクローンを選択し、選択されたクローンから導入した候補ｃＤＮＡを単離することを特徴とするスクリーニング方法や、（２）塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡをスクリーニングする方法であって、ｃＤＮＡライブラリー由来の候補ｃＤＮＡを大腸菌ＳＯＬＲ株に導入し、得られた形質転換大腸菌を３５０ｍＭ以上の塩濃度条件下で培養し、培養後に生育しているクローンを選択し、選択されたクローンから導入した候補ｃＤＮＡを単離し、単離された候補ｃＤＮＡにランダムな変異を導入し、この変異ｃＤＮＡを宿主細胞に導入し、変異前のｃＤＮＡの選択条件より厳しい条件下で選抜する工程を１又は２回以上繰り返すことを特徴とするスクリーニング方法に関する。
【００１３】
また本発明は、（３）以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ；(ａ)配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２又は３４に示されるアミノ酸配列からなる少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質：(ｂ)配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２又は３４に示されるアミノ酸配列と相同性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質：や、（４）配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１又は３３に示される塩基配列、あるいはこれらの配列の全部を含む塩基配列であって、少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、（５）以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ；(ａ)配列番号３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列からなる少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質：(ｂ)配列番号３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列と相同性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質：や、（６）配列番号３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１又は６３に示される塩基配列、あるいはこれらの配列の全部を含む塩基配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡに関する。
【００１４】
また本発明は、（７）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２又は３４に示されるアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質や、（８）配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２又は３４に示されるアミノ酸配列と相同性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質や、（９）配列番号３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質や、（１０）配列番号３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列と相同性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質や、（１１）上記（７）〜（１０）のいずれか記載のタンパク質をコードするＤＮＡを含むことを特徴とするベクターや、（１２）上記（１１）記載のベクターを宿主細胞に導入することにより得られることを特徴とする、少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有する形質転換植物細胞に関する。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明の環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡのスクリーニング方法としては、ｃＤＮＡライブラリー由来の候補ｃＤＮＡを宿主細胞に導入し、得られた形質転換細胞を宿主細胞が実質的に生育できない環境条件下で培養し、培養後に生育しているクローンを選択し、選択されたクローンから導入した候補ｃＤＮＡを単離するスクリーニング方法であれば、特に制限されるものではない。このスクリーニング方法はこの方法で得られた環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質の機能強化にも利用できる。すなわち、本発明の他の態様の環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡをスクリーニングする方法として、ｃＤＮＡライブラリー由来の候補ｃＤＮＡを宿主細胞に導入し、得られた形質転換細胞を宿主細胞が実質的に生育できない環境条件下で培養し、培養後に生育しているクローンを選択し、選択されたクローンから導入した候補ｃＤＮＡを単離し、単離された候補ｃＤＮＡにランダムな変異を導入し、この変異ｃＤＮＡを宿主細胞に導入し、変異前のｃＤＮＡの選択条件より厳しい条件下で選抜する工程を１又は２回以上繰り返すことを特徴とするスクリーニング方法を挙げることができる。
【００２１】
上記の、一次スクリーニングの結果得られた遺伝子断片にランダムな変異を導入したものを作製し、この中からこの遺伝子がスクリーニングされた条件より厳しい条件で選抜することを繰り返すことで、環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質の機能向上を図る方法における、任意の遺伝子断片に対してランダムな変異を導入する方法としては、ＰＣＲを利用する方法が一般的であり、例えば、ＰＣＲ反応溶液にマンガンを添加することで、fidelityを低下させる方法 (A Journal of Methods in Cell and Molecular Biology Vol1, p11-15(1989)、Yeast Vol8, p79-82(1992)) が最も簡便である。また、この他のランダムミューテーションの方法として、DNA shuffling (Proc Natl Acad Sci USA, Vol . 91, p10747-10751, 1994 ) を用いることもできる。
【００２２】
上記環境ストレスとしては、環境要因に基づくストレスであればどのようなストレスでもよく、具体的に、化学物質ストレス、高温ストレス、低温ストレス、凍結ストレス、乾燥ストレス、オゾンストレス、紫外線ストレス、放射線ストレス、浸透圧ストレス等を例示することができ、これら環境ストレスは、単独要因に基づくストレスであっても、複数の要因に基づくストレスであってもよい。また、化学物質ストレスとしては、化学物質に起因するストレスであれば特に制限されるものではないが、塩ストレスや毒性物質ストレスを例示することができる。
【００２３】
上記ｃＤＮＡライブラリーとしては、環境ストレスに関与する遺伝子のｃＤＮＡが含まれるものであれば、植物・動物・微生物等由来する生物種など特に制限されるものではない。例えば、塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡをスクリーニングする場合、塩生植物、例えば、マングローブ（ハマザクロ、オヒルギ、メヒルギ、ヤエヤマヒルギ、ヒルギモドキ、ヒルギダマシ、ニッパヤシ）、マツバギク、シチメンソウ、ウラギク、アッケシソウ、マツナ、ハマアカザ等の生物種より調製したｃＤＮＡライブラリーを用いることができる。また、ｃＤＮＡライブラリーの調製方法としては、当業者に公知の方法であればどのような方法でもよい。例えば、実施例記載のように、細胞からの全ｍＲＮＡの抽出は、Ostremらの方法（Plant Physiol Vol.84, p1270-1275, 1987）に従って調製することができ、また、調製したｍＲＮＡからのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡの精製は、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜ｓｕｐｅｒ＞（第一化学社）を用いて行なうことができる。ｃＤＮＡライブラリーは、精製したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを基に、ZAP-cDNA/Gigapack Cloning Kit（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を利用して構築することができる。
【００２４】
上記ｃＤＮＡライブラリーに由来するスクリーニング対象となる候補ｃＤＮＡが導入される宿主細胞としては、細菌や酵母等の微生物細胞や、動植物細胞を例示することができるが、宿主−ベクター系に関する知見が確立している大腸菌、枯草菌、サッカロミセス・セルビッシェ、ＢＨＫ細胞等の動物細胞などが好ましく、中でもかかる知見が豊富で、生育が早く、取り扱いが容易な大腸菌が好ましい。また、宿主細胞としては、ｃＤＮＡライブラリー由来の候補ｃＤＮＡが導入された形質転換細胞は生育しうる環境条件下において、実質的に生育できない細胞、例えば塩感受性細胞や、熱塩感受性細胞等が好ましく、かかる細胞は野生株からのスクリーニングにより、あるいは野生株を変異処理することにより調製することができる。
【００２５】
次に、形質転換細胞は、上記宿主細胞へｃＤＮＡライブラリー由来の候補ｃＤＮＡを導入することによって行われるが、かかる導入方法としてはトランスフォーメーション法、エレクトロポレーション法など公知の遺伝子導入方法であれば特に制限されるものではない。そして、候補ｃＤＮＡが導入された形質転換細胞は、前記宿主細胞が実質的に生育できない環境条件下、例えば、高塩濃度条件下、高温度条件下、乾燥条件下で培養される。続いて、培養後に生育しているクローンが公知の方法により選択され、選択されたクローンから導入した候補ｃＤＮＡが公知の方法により単離することができる。
【００２６】
本発明のスクリーニング方法を、以下、環境ストレスが塩ストレスであり、宿主細胞が大腸菌である場合を例に挙げてより具体的に説明する。宿主細胞として用いられる大腸菌としては、耐塩性機構の働きが低下した大腸菌が好ましく、塩に対する最小生育阻害濃度が低い大腸菌がより好ましい。例えば、７５０ｍＭ以上、好ましくは５００ｍＭ以上、より好ましくは３５０ｍＭ以上のＮａＣｌを含む培地中でコロニー形成が抑制される大腸菌を用いることが、耐塩性関連遺伝子のスクリーニング効率を向上させることができるので好ましい。かかるＮａＣｌ感受性の大腸菌として、低濃度の塩（３５０ｍＭ以上のＮａＣｌ）を含む寒天培地上でほとんど生育できないことが本発明者らにより見い出された大腸菌の一種であるＳＯＬＲ株（TOYOBO社、Stratagene社、理研ジーンバンク等から市販されている）を具体的に挙げることができる。このＳＯＬＲ株を用いる場合、候補ｃＤＮＡの導入は、前記ZAP-cDNA/Gigapack Cloning Kit（Stratagene社）に含まれているＳＯＬＲ株とExAssist helper phage によるin vivo excision systemを利用することができ、これらの操作は全て上記のキットの手引き書に従うことで容易に行うことができる。
【００２７】
このようにして得られた候補ｃＤＮＡが導入されたＳＯＬＲ株を、約４００ｍＭのＮａＣｌを含む培地で培養を行ない、生育した細胞を選択することにより、耐塩性タンパク質をコードするＤＮＡで形質転換されたクローンを選抜することができる。かかるクローンの選抜は、例えば、寒天培地等で３７℃で８〜２０時間培養し、寒天培地上に形成されるコロニーを選択すればよい。選抜されたクローンからのｃＤＮＡの単離は、例えば、文献（Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (1987）)に示された方法により、プラスミドＤＮＡを抽出することにより行うことができる。
【００２８】
また、目的とする形質転換大腸菌を得るためのスクリーニングは、複数回繰り返して行なうこともできる。例えば、ｃＤＮＡライブラリーが導入された大腸菌を、まず、最小生育阻害濃度の塩を含む培地で培養して、この条件で生育するクローンを選抜する（一次スクリーニング）。次いで、選抜したクローンからｃＤＮＡを単離し、これを大腸菌に再度導入して、最小生育阻害濃度よりも高い塩を含む培地で該大腸菌を培養し、この条件で生育するクローンを選抜する（二次スクリーニング）。このようにスクリーニングを繰り返すことで、塩耐性関連遺伝子の単離の効率を高めることができる。また、前記のように、単離されたｃＤＮＡにランダムな変異を導入した変異ｃＤＮＡを用いて二次スクリーニングを行うこともできる。
【００２９】
本発明の環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡは、上記スクリーニング方法により得られるＤＮＡであれば特に制限されるものではなく、例えば、塩ストレス等の化学物質ストレス、熱ストレス、乾燥ストレス、オゾンストレス、紫外線ストレス、放射線ストレス、浸透圧ストレスなどの１又は２以上のストレスに対する耐性を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができる。そして特に、塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、植物由来、好ましくはオヒルギ（Brugfuiera sexangula）等の塩性植物由来のＤＮＡを例示することができる。そして、マングローブ由来の塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列表の配列番号１，３，５，７，９，１１又は１３に示される塩基配列を有するＤＮＡを具体的に例示することができ、また、アイスプラント(Mesembryanthemum crystallinum) 由来の塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列表の配列番号１５，１７，１９，３５，６３に示される塩基配列を有するＤＮＡを、シチメンソウ(Sueada japonica) 由来の塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列表の配列番号２１，３７，３９，５１，５３，５７に示される塩基配列を有するＤＮＡを、オカヒジキ(Salsola komarovii) 由来の塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列表の配列番号２３，２５，４１，４７，４９，５９，６１に示される塩基配列を有するＤＮＡを、ヒルギダマシ(マングローブの一種、Avicennia marina) 由来の塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列表の配列番号２７，２９，３１，３３，４３，４３，５５に示される塩基配列を有するＤＮＡを、それぞれ具体的に例示することができる。
【００３０】
本発明のＤＮＡとしては、上記配列表の配列番号に示される塩基配列若しくはそれらの相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含むＤＮＡや、かかるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列と相同性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列表の配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを挙げることができる。これらのＤＮＡを各種生物に導入することで耐塩性等が強化されたという報告はこれまでになく、本発明者等により初めて見出されたものである。
【００３１】
本発明のタンパク質としては、配列表の配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列表の配列番号２に示されるアミノ酸配列と相同性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質や、配列表の配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質を挙げることができる。
【００３２】
上記配列番号８，１４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示したアミノ酸配列は、タンパク質の全長をコードしたものではないと考えられるが、それ自体に塩ストレス耐性を強化させる活性が存在したため、それぞれの全長タンパク質の機能領域であるといえる。本発明は、上記のように、これら機能領域を含む全長タンパク質および該全長タンパク質をコードするＤＮＡを含むものである。そして、部分長ｃＤＮＡを基に全長ｃＤＮＡを単離する方法としては、例えば、Marathon cDNA Amplification Kit（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、3'-Full RACE Core Set（宝酒造社）、5'-Full RACE Core Set（宝酒造社）等のキットを用い、それらの手引き書に従うのが適当である。
【００３３】
上記のように、本発明には、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡが包含される。一般に、生理活性を有するタンパク質で、少数のアミノ酸が置換、欠失、挿入があっても、その生理活性が維持される場合があることはよく知られており、また、タンパク質中のアミノ酸を変異させる公知の種々の方法もよく知られている上に、既にいくつかのキットも市販されている。例えば、変異を導入したプライマーを合成し、QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いれば容易にタンパク質中のアミノ酸を変異させることが可能である。
【００３４】
また、上記のように、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても、各種生物細胞（例えば、植物細胞、大腸菌、酵母など）の少なくとも塩ストレス耐性を含む環境ストレス耐性を強化する活性を有すれば、それらは全て本発明の範囲に含まれる。
【００３５】
また、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡは、ハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術（Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)）によっても調製することが可能である。例えば、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１又は６３に示される塩基配列の全部若しくは一部をプローブとして、各種生物由来のＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、目的とする少なくとも塩ストレス耐性を含む環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等を得ることができる。
【００３６】
このようなＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む洗浄バッファーによる４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ，０．１％のＳＤＳを含む洗浄バッファーによる６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００３７】
また、配列番号１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３３，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７，４９，５１，５３，５５，５７，５９，６１又は６３に示される塩基配列の情報を基に調製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして各種生物由来のＤＮＡ（またはＲＮＡ）を鋳型にポリメラーゼ連鎖反応を行なうことによっても、目的とする少なくとも塩ストレス耐性を含む環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等を得ることができる。本発明には、各種生物細胞（例えば、植物細胞、大腸菌、酵母など）の少なくとも塩ストレス耐性を含む環境ストレス耐性を強化する活性を有する限り、このようなハイブリダイゼーション技術や遺伝子増幅技術を利用して単離しうるＤＮＡも含まれる。
【００３８】
上記配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質は、上記配列番号に示されるアミノ酸配列とそのアミノ酸配列において高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％以上）の配列の同一性をいう。本発明には、前記のように、このように上記配列番号に示されるアミノ酸配列とそのアミノ酸配列において高い相同性を有し、各種生物細胞（例えば、植物細胞、大腸菌、酵母など）の少なくとも塩ストレス耐性を強化する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが含まれる。例えば、配列番号２のアミノ酸配列は１から８６番目のアミノ酸を含む領域が塩ストレス耐性を強化する活性を有することから、例えばこの領域を含むアミノ酸配列をコードする遺伝子ＤＮＡは全て本発明の範囲に含まれる。配列の相同性は、例えば、遺伝情報処理ソフトウェアのGENETYX-MAC（ソフトウエア開発株式会社）のマルチアライン機能を利用することにより決定できる。
【００３９】
本発明の環境ストレス耐性の向上方法としては、上記本発明のＤＮＡ、すなわち塩ストレス等の化学物質ストレス、高温ストレス、低温ストレス、凍結ストレス、乾燥ストレス、オゾンストレス、紫外線ストレス、放射線ストレス、浸透圧ストレスから選ばれる１又は２以上の環境ストレスに対する耐性を向上させる活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを用いる方法であれば特に制限されるものではなく、この環境ストレス耐性の向上方法により、植物・動物及びそれらの組織、器官、細胞並びに細菌、酵母、カビ等の微生物の環境ストレス耐性を向上させることができる。
【００４０】
本発明の塩ストレス等の化学物質ストレス、熱ストレス、乾燥ストレス、オゾンストレス、紫外線ストレス、放射線ストレス、浸透圧ストレスなどの１又は２以上の環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質に特異的に結合する抗体としては、前記本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体であればどのようなものでもよく、かかる抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列番号２に示されるアミノ酸配列と相同性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質や、配列番号２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２４，２６，２８，３０，３２，３４，３６，３８，４０，４２，４４，４６，４８，５０，５２，５４，５６，５８，６０，６２又は６４に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ少なくとも塩ストレス耐性向上活性を有するタンパク質を抗原として用いて作製することができる。これら抗体は、例えば、環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質の分子機構を明らかにする上で有用である。
【００４１】
上記環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質に対する抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に該環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質又はエピトープを含む断片、類似体若しくは細胞を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ技法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc.,1985)など任意の技法を用いることができる。
【００４２】
本発明の上記環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質に対する一本鎖抗体をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,946,778 号）を適用することができる。また、ヒト化抗体を発現させるために、トランスジェニック植物又はトランスジェニック動物等を利用したり、上記抗体を用いて、その環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質を発現するクローンを単離・同定したり、アフィニティークロマトグラフィーでそのポリペプチドを精製することもできる。
【００４３】
本発明のベクターとしては、塩ストレス等の化学物質ストレス、高温ストレス、低温ストレス、凍結ストレス、乾燥ストレス、オゾンストレス、紫外線ストレス、放射線ストレス、浸透圧ストレスなど前記環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクターであれば特に制限されるものではない。また、本発明の形質転換細胞としては、かかるベクターを植物細胞等の宿主細胞に導入することにより得られるものであれば特に制限されるものではない。そしてまた、本発明の環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質の製造方法としては、上記本発明の形質転換細胞を培養し、該形質転換細胞又はその培養液の上清から組換えタンパク質を回収する方法であれば特に制限されるものではない。さらに、本発明のトランスジェニック植物としては、前記環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ又は前記ベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞の分裂・増殖と再分化を行わせることにより得られるものであれば特に制限されるものではない。以下、上記本発明のベクター、形質転換細胞、環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質の製造方法、及びトランスジェニック植物について説明する。
【００４４】
上記のように、本発明のＤＮＡは組換えタンパク質の調製に利用することができる。組換えタンパク質の調製は、上記本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入して、該ＤＮＡを発現させ、次いで、発現させたタンパク質を該形質転換細胞又はその培養上清から回収することにより行うことができる。組換えタンパク質の発現に用いられる宿主−ベクター系としては、例えば、IMPACT-CN System（宿主: E. coli strain ER2566、ベクター:pTYB1、pYB2、pYB11、pYB12 (ＢｉｏＬａｂｓ社)）、あるいはpET Expression System（宿主: Epicurian Coli BL21、ベクター:pET3シリーズ(Ｎｏｖａｇｅｎ社)）が挙げられる。宿主細胞へのベクターの導入法としては、当業者に公知の方法、例えば、エレクトロポレーション法やヒートショック法が挙げられる（遺伝子ライブラリーの作製法、羊土社（１９９４）、植物細胞工学入門、学会出版センター（１９９８））。また、組換えタンパク質を発現させるための形質転換体の培養は、当業者に一般的に用いられている方法および条件にて行なうことができる。発現させたタンパク質は、例えば、IMPACT-CN Systemを利用した場合にはキチンビーズ(ＢｉｏＬａｂｓ社)で、pET Expression Systemを利用した場合にはHis Bind Resin（Ｎｏｖａｇｅｎ社）により精製できる。
【００４５】
上記本発明のＤＮＡは、また、少なくとも塩ストレス耐性が強化されたトランスジェニック生物の作出に利用できる。本発明のＤＮＡを用いてトランスジェニック生物を作出する生物種としては特に限定されるものではないが、用いる遺伝子がマングローブに由来する場合には、高等植物であることが好ましい。かかるトランスジェニック植物の作出は、該ＤＮＡを植物細胞内でその発現を保証するベクターに挿入し、これを植物細胞に導入し、トランスジェニック植物を得るために該形質転換植物細胞を再生させることにより有利に行うことができる。
【００４６】
トランスジェニック植物の作出に用いられるベクターとしては、例えば、東洋紡から市販されているpBI101、あるいはpIG121Hm（Plant J, Vol 6, p271-282(1994)）を好適に用いることができる。ベクターを導入する植物細胞の種類に特に制限はないが、例えばイネ、小麦、トウモロコシ、大豆、タバコ、ニンジン等が考えられる。植物細胞の形態としては、例えば、プロトプラスト、カルス、植物体の部分(リーフディスク、ヒポコチル等)がある。宿主植物細胞へのベクターの導入法としては、アグロバクテリウム法が好適であるがその他にも、例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法などを用いることができる（モデル植物の実験プロトコール、秀潤社（1996））。
【００４７】
ベクターの導入された植物細胞を植物体へ再生させる方法は、植物種により異なる。例えば、イネの場合、以下のようにして行なうことができる。完熟種子からカルス誘導を行い、これにｃＤＮＡを導入したアグロバクテリウムを感染させる。共存培養を経て、選抜培地に移し培養する。約３週間後カルスを再分化培地に移し、再分化するまで培養する。４、５日馴化させた後ポットに移すことで形質転換体を再生させる（モデル植物の実験プロトコール、秀潤社（1996）)。また、ニンジン、タバコ等の再生の方法としては、それぞれ加藤、庄野博士等の方法（植物組織培養の技術 朝倉書店（1983））が適当である。
【００４８】
本発明のトランスジェニック植物に由来する繁殖材料としては、上記トランスジェニック植物体に由来する繁殖材料であればどのようなものでもよく、例えば、植物の種類に応じて、種子、塊根、切穂、メリクローン等の培養増殖材料を挙げることができる。また、かかる繁殖材料を基に本発明のトランスジェニック植物を量産することが可能である。
【００４９】
【実施例】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
実施例１  マングローブ及びその他の塩生植物のｃＤＮＡライブラリーの作製
マングローブ懸濁培養細胞は、Mimuraらが確立したBruguiera sexangulaの懸濁培養細胞系（J Plant Res Vol.110, p25-29 (1997)）を用いた。この培養細胞は１００ｍＭのＮａＣｌを含むＡＡ培地を用い、５００ｍｌフラスコに１２０ｍｌの分量で、２６℃、暗所で往復振とう培養（７０ｒｐｍ）した。マングローブのｃＤＮＡライブラリーは、この懸濁培養細胞を用い、以下に示す手順で行った。まず、Ostremらの方法（Plant Physiol Vol.84 p1270-1275(1987)）に従って全ｍＲＮＡを抽出し、ここからOligotex-dT30<super>（第一化学社）を用いｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。精製したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、λＺａｐII（Stratagene社）ラムダファージベクターに導入してｃＤＮＡライブラリーを構築した。λＺａｐIIを用いたｃＤＮＡライブラリーの構築方法は周知の方法であり、実際の手順はStratagene社の手引き書に従った。その結果、１０６の独立クローンを含むマングローブｃＤＮＡライブラリーの構築に成功した。また、その他の塩生植物であるヒルギダマシ (マングローブの一種、Avicennia marina)、シチメンソウ(Sueada japonica)、オカヒジキ (Salsola komarovii)、アイスプラント (Mesembryanthemum crystallinum) のｃＤＮＡライブラリーを作成するための材料にはそれぞれの植物体の葉を用いた。ｃＤＮＡライブラリーの作成方法としては、上記マングローブにおける方法と同じ方法を用いた。得られたｃＤＮＡライブラリーは、それぞれ１０５から１０６の独立クローンを含んでいた。
【００５０】
実施例２  耐塩性に関与するｃＤＮＡのスクリーニング条件の決定
マングローブ及びその他の塩生植物のｃＤＮＡライブラリーの中から耐塩性に関与するｃＤＮＡのスクリーニング方法として、本発明者らは大腸菌の遺伝子発現系を利用した。即ち、大腸菌にマングローブ及びその他の塩生植物のｃＤＮＡを導入し、耐塩性が強化された形質転換大腸菌を選抜することで、耐塩性に関わるｃＤＮＡを獲得する新規な方法を開発した。耐塩性が強化された形質転換大腸菌の選抜には、適当な濃度のＮａＣｌを含む２ＹＴ寒天培地を用いた。このスクリーニングを開始するにあたり、本発明者らは、上記のスクリーニングに適した宿主大腸菌の選別を目的とし、各種大腸菌（ＤＨ５α，ＪＭ１０９，ＨＢ１０１，ＳＯＬＲ）のＮａＣｌに対する最小生育阻害濃度を決定した。これらの大腸菌は周知の株であり、TOYOBO社やStratagene社等から市販されているものである。ＤＨ５α，ＪＭ１０９，及びＨＢ１０１は１２００ｍＭのＮａＣｌを含む２ＹＴ寒天培地上で、著しく生育が阻害されるものの、コロニー形成を行うことが可能であり、１５００ｍＭのＮａＣｌでその生育が完全に抑制される。これに対し、ＳＯＬＲは３００ｍＭのＮａＣｌで著しく生育が抑制され、４００ｍＭのＮａＣｌでその生育が完全に抑制される。この事から、ＳＯＬＲは塩感受性の高い株であり、他の大腸菌と異なり、強力な耐塩性機構を持たないことが明らかとなった。宿主大腸菌自身の耐塩性機構が強力に働かないことは、上記のスクリーニングを行う上で非常に有効である。よって、ｃＤＮＡライブラリーからの耐塩性に関与するｃＤＮＡのスクリーニングは、宿主大腸菌としてＳＯＬＲを用い、選択寒天培地のＮａＣｌ濃度を４００ｍＭに設定し、以下に示す手順でスクリーニングを行った。
【００５１】
実施例３  マングローブ及びその他の塩生植物ｃＤＮＡライブラリーからの耐塩性に関与するｃＤＮＡのスクリーニング
マングローブ及びその他の塩生植物のｃＤＮＡライブラリーをin vivo excision system（Stratagene社）により、pBluescript SK に組み込んだ形でＳＯＬＲに導入した。遺伝子導入は、ZAP-cDNA /Gigapack Cloning Kit（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）の手引き書に従って行なった。マングローブ及びその他の塩生植物のｃＤＮＡが導入されたＳＯＬＲの中から耐塩性関連のｃＤＮＡが導入されたＳＯＬＲを選抜するために本発明では以下に示す２段階スクリーニングを行った。一次スクリーニングは、マングローブ及びその他の塩生植物のｃＤＮＡが導入されたＳＯＬＲを４００ｍＭのＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．０５ｍＭのＩＰＴＧを含む２ＹＴ寒天培地に植菌し、２０時間、３７℃で培養した。この条件で得られたコロニー全てを再度、上記の寒天培地に植菌し、それらの生育を観察した。その結果、Bruguieraにおいて、耐塩性が強化された１６８個のクローンを獲得した。その他の塩生植物のｃＤＮＡライブラリーが導入された形質転換大腸菌においてもほぼ同数の耐塩性が強化されたクローンの獲得に成功した。これらのクローンの中には何らかの原因で宿主大腸菌由来の耐塩性機構が強化されている可能性が考えられたため、以下に示す二次スクリーニングを行った。
【００５２】
一次スクリーニングで得た各クローンからプラスミドを抽出し、これらを全てＳＯＬＲに再導入した。新たに得られた形質転換体は、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．０５ｍＭのＩＰＴＧを含む２ＹＴ液体培地で対数増殖期になるまで培養し、これを２ＹＴ液体培地で希釈シリーズを作製し、上記の寒天選択培地に２５μｌずつスポットした。液体が乾くまで風乾した後、３７℃で一晩培養した。この結果、BruguieraｃＤＮＡライブラリーにおいては３０のクローンに明らかな耐塩性の向上が確認された。代表例として、配列番号１に示したｃＤＮＡが導入された大腸菌のスポット実験の結果を図１に示す。次に、この３０クローンに導入されたｃＤＮＡの塩基配列をThermo Sequenase Cycle Sequencing Kit（Amersham社）及び ＤＮＡシーケンサーＬＩＣ−４０００Ｌ（ＬＩ−ＣＯＲ）を用い、製造者の手引き書に従って決定した。その結果、３０個のクローンから得られたBruguieraｃＤＮＡは７種類に分類できた。即ち、配列番号１に示したｃＤＮＡを２３個、配列番号３に示したｃＤＮＡを１個、配列番号５に示したｃＤＮＡを２個、配列番号７に示したｃＤＮＡを２個、配列番号９に示したｃＤＮＡを１個、配列番号１１に示したｃＤＮＡを１個、配列番号１３に示したｃＤＮＡを１個獲得した。
【００５３】
また同様にして、アイスプラントからは配列番号１５，１７，１９，３５，６３に示したｃＤＮＡを、シチメンソウからは配列番号２１，３７，３９，５１，５３，５７に示したｃＤＮＡを、オカヒジキからは配列番号２３，２５，４１，４７，４９，５９，６１に示したｃＤＮＡを、ヒルギダマシからは配列番号２７，２９，３１，３３，４３，４５，５５に示したｃＤＮＡを、それぞれ獲得した。
【００５４】
ＢＬＡＳＴ相同性検索プログラムを用い、これらのＤＮＡがコードするアミノ酸配列の相同性検索を行った。その結果、配列番号２に示されるアミノ酸配列はSwiss protein，ＰＩＲ等のデータベース中に相同性を有するタンパク質が登録されていないことから、新規のタンパク質と考えられた。そこで、本願発明者らはこのｃＤＮＡがコードする新規のタンパク質（総アミノ酸数、１４１）をマングリン（ｍａｎｇｒｉｎ）、この遺伝子をｍａｎｇ１と命名した。次に、マングリンの機能領域の決定を試みた。１６，４２，６５，８７，１０９，１４２番目のアミノ酸に終止コドン、また、１６，３５，４９番目のアミノ酸にメチオニン（その直前に終止コドンを導入）を導入したサブクローンを作製し、これをＳＯＬＲに導入して上記のスポット実験を行った結果、１７から８６番目のアミノ酸配列が耐塩性強化に関わる領域であることが明らかとなった（図２）。
【００５５】
配列番号４に示されるアミノ酸配列はArabidopsis thalianaのt-complex polypeptide 1（pir JN0448）と約９０％の相同性を有した。配列番号６に示されるアミノ酸配列は、Ricinus communisのMetallothionein-like protein TYPE 2（EMBL L02306）と約８０％の相同性を有した。配列番号８に示されるアミノ酸配列はHomo sapiensのRubB-like DNA helicase（AB024301）と約６３％の相同性を有した。配列番号１０に示されるアミノ酸配列はRattus norvegicus のRibosomal protein S29（pir S30298）約４５％の相同性を有した。配列番号１２に示されるアミノ酸配列はZea maysのElongation factor eEF-1 alpha chain (pir S66339) と約９０％の相同性を有した。配列番号１４に示されるアミノ酸配列はSchizosaccharomyces pombeのcdc21（pir S26640）と約７０％の相同性を有した。配列番号２，４，６，８，１０，１２又は１４に示したタンパク質をそれぞれコードする配列番号１，３，５，７，９，１１又は１３に示されるｃＤＮＡは、実際に大腸菌の耐塩性を向上させる機能を有することから大腸菌等の原核生物から高等植物を含む幅広い生物群の耐塩性を強化する機能を有するものと考えられる。
【００５６】
また同様に、配列番号１６に示されるアイスプラント由来のアミノ酸配列はArabidopsis thalianaのF13O11.15 gene product（gp AC006193_15）と６８％の相同性を有した。配列番号１８に示されるアイスプラント由来のアミノ酸配列はArabidopsis thalianaのH+-transporting ATPase (EC 3.6.1.35) 14K chain（pir T01087）と７８％の相同性を有した。配列番号２０に示されるアイスプラント由来のアミノ酸配列はArabidopsis thalianaの40S RIBOSOMAL PROTEIN S20（pir T12992）と９１％の相同性を有した。配列番号２２に示されるシチメンソウ由来のアミノ酸配列はAtriplex canescensのozone-inducible protein（prf 2316438B）と６３％の相同性を有した。配列番号２４に示されるオカヒジキ由来のアミノ酸配列はArabidopsis thalianaのGIBBERELLIN-REGULATED PROTEIN 1 PRECURSOR（sp GAS1_ARATH）と５８％の相同性を有した。配列番号２６に示されるオカヒジキ由来のアミノ酸配列はVigna unguiculataのADP-ribosylation factor（gp AF022389_1）と９９％の相同性を有した。配列番号２８に示されるヒルギダマシ由来のアミノ酸配列はSolanum demissumのtuberization-induced protein（prf 2310431A）と５６％の相同性を有した。配列番号３０に示されるヒルギダマシ由来のアミノ酸配列はMedicago sativaのEnod93 protein（gp MSA248334_1）と６９％の相同性を有した。配列番号３２に示されるヒルギダマシ由来のアミノ酸配列はOryza sativaの40S RIBOSOMAL PROTEIN S21（pir S38357）と６９％の相同性を有した。配列番号３４に示されるヒルギダマシ由来のアミノ酸配列はMesembryanthemum crystallinum の protein phosphotase 2C homolog (AF097667)と７９％の相同性を有した。Mesembryanthemum crystallinum の protein phosphotase 2C homolog (AF097667)と79%の相同性を有した。
【００５７】
また、配列番号３６に示されるアイスプラント由来のアミノ酸配列はRibes nigrumのpRIB5 protein（gp RNI7578_1）と５８％の相同性を有した。配列番号３８に示されるシチメンソウ由来のアミノ酸配列はMesembryanthemum crystallinumのtonoplast intrinsic protein（pir T12439）と８４％の相同性を有した。配列番号４０に示されるシチメンソウ由来のアミノ酸配列はSpinacia oleraceaのphosphoethanolamine N-methyltransferase（gp AF237633_1）と８６％の相同性を有した。配列番号４２に示されるオカヒジキ由来のアミノ酸配列はSelenicereus wittiiのphosphoenolpyruvate carboxylase（gpu SWI17843_1）と８３％の相同性を有した。配列番号４４に示されるヒルギダマシ由来のアミノ酸配列はArabidopsis thalianaのputative chaperonin（gp ATAC021640_16）と８４％の相同性を有した。配列番号４６に示されるヒルギダマシ由来のアミノ酸配列はArabidopsis thalianaのhypothetical protein T5F17.40（pir T10653）と８８％の相同性を有した。
【００５８】
また、配列番号４８に示されるオカヒジキ由来のアミノ酸配列はGlycine maxのcysteine proteinase inhibitor（pir T07139）と６３％の相同性を有した。配列番号５０に示されるオカヒジキ由来のアミノ酸配列はArabidopsis thalianaのnucleotide sugar epimerase-like protein（gp ATCHRIV73_7）と８７％の相同性を有した。配列番号５２に示されるシチメンソウ由来のアミノ酸配列はArabidopsis thalianaのputative protein（gp ATT20K12_12）と５７％の相同性を有した。配列番号５４に示されるシチメンソウ由来のアミノ酸配列はArabidopsis thalianaのputative WD-40 repeat protein（gp AC006569_14）と７８％の相同性を有した。配列番号５６に示されるヒルギダマシ由来のアミノ酸配列はMedicago sativaのcdc2MsE gene product（gp MSCDC2MSE_1）と７５％の相同性を有した。配列番号５８に示されるシチメンソウ由来のアミノ酸配列はArabidopsis thalianaのputative protein（gp ATF17C15_9）と３９％の相同性を有した。配列番号６０に示されるオカヒジキ由来のアミノ酸配列はNicotiana tabacumのtranscription factor E2F（prf 2601241A）と６６％の相同性を有した。配列番号６２に示されるオカヒジキ由来のアミノ酸配列はArabidopsis thalianaのhypothetical protein T26B15.5（pir T02548）と３４％の相同性を有した。配列番号６４に示されるアイスプラント由来のアミノ酸配列はHomo sapiensのHomo sapiens cDNA FLJ10298 fis, clone NT2RM1001115, weakly similar to ENDOCHITINASE 2 PRECURSOR (EC 3.2.1.14)（pir T02548）と３０％の相同性を有した。
【００５９】
実施例４  酵母におけるマングローブｃＤＮＡの効果
配列番号１に示したｃＤＮＡがクローニングされたpBluescript SKを制限酵素EcoRI, NotIで切断し、これをアガロースゲル電気泳動した。ここで得られた約１ｋｂの断片を切り出し、GENECLEAN Kit（ＢＩＯ１０１社）で精製した。これをLigation Kit ver2（宝酒造）を用い、制限酵素EcoRI, NotIで切断した、酵母発現ベクターｐＹＥＳ２（Invitrogen）に導入した。次に、これをエレクトロポレーション法により酵母に導入した。酵母はSaccharomyces cereviciae YM4271（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用した。形質転換酵母の選択にはウラシルを含まないＳＤ寒天培地（以下、−ＵｒａＳＤ寒天培地）を用いた。形質転換酵母の耐塩性の評価は以下のように行った。対数増殖期後期まで−ＵｒａＳＤ培地で培養した形質転換酵母を１２００ｍＭのＮａＣｌを含む−ＵｒａＳＤ培地、及びＮａＣｌを含まない−ＵｒａＳＤ培地に植菌（初期濃度ＯＤ６００＝０．１）し、３０℃で振とう培養を開始した。２４時間ごとに細胞懸濁液を採取し、その吸光度を測定した。吸光度の測定には島津製作所のＵＶ−１２００を利用した。比較としてベクターであるｐＹＥＳ２のみを導入した酵母についても同様な検討を行った。その結果を図３に示した。図３からも明らかなように、スクリーニングの結果得られたｃＤＮＡは酵母においても、大腸菌の場合と同様に耐塩性を強化する機能を有することが確認された。
【００６０】
実施例５  タバコ培養細胞におけるマングローブｃＤＮＡの効果
配列番号１に示したｃＤＮＡがクローニングされているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫを制限酵素Ｘｂａ１，Ｘｈｏ１で切断し、これをアガロースゲル電気泳動した。ここで得られた約１ｋｂの断片を切り出し、GENECLEAN Kit（ＢＩＯ１０１）で精製した。これをLigation Kit ver2（宝酒造社）を用い、植物発現ベクターｐＢＩ１０１（EMBOJ Vol6, p3901-3907(1987)）の制限酵素EcoRI, NotIサイトに導入した。得られたプラスミドをエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウムに導入し、これをタバコ培養細胞（Nicotiana tabacum L. Cv. Bright Yellow 2）に感染させた。アグロバクテリウムを用いた植物細胞への遺伝子導入法は周知の方法である。ここでは、アグロバクテリウムにAgrobacterium tumefaciens EHA 101を用い、An の方法（Plant Physiol Vol.79, p568-570(1985)）に従った。形質転換タバコ培養細胞の耐塩性の評価は以下にように行った。形質転換タバコ培養細胞のカルスを拾い、Ｌｉｎｓ−Ｍａｙｅｒ培地で対数増殖期後期まで培養した。これをＮａＣｌ濃度０，１００，及び１５０ｍＭとなるように調整した４５ｍｌのＬｉｎｓ−Ｍａｙｅｒ培地にそれぞれ１ｍｌの割合で植え継ぎ、２６℃で振とう培養を開始した。培養開始後、７日または１３日目の細胞懸濁液から細胞を回収し、その湿重量を測定した。比較として、マングローブｃＤＮＡのかわりに、ｐＢＩ１０１を用いてＧＵＳ遺伝子を導入したタバコ培養細胞についても同様な検討を行った。その結果を図４に示す。図４からも明らかなように、スクリーニングの結果得られたｃＤＮＡはタバコ培養細胞においても大腸菌の場合と同様に、耐塩性を強化する機能を有することが確認された。
【００６１】
実施例６  タバコ（植物体）におけるマングローブｃＤＮＡの効果
実施例５で得られたプラスミドをエレクトロポレーション法によりアグロバクテリウムに導入し、これをタバコリーフディスクに感染させた。アグロバクテリウムを用いたタバコリーフディスクへの遺伝子導入法は周知の方法である。ここでは、アグロバクテリウムにAgrobacterium tumefaciens EHA 101を用い、植物細胞工学入門（学会出版センター（１９９８））記載の方法に従った。形質転換タバコ（植物体）の耐塩性の評価は以下にように行った。形質転換タバコをＮａＣｌ濃度１５０ｍＭとなるように調整したＭＳ寒天培地に植え継ぎ、２６℃、明暗周期の光照射下（明：１６時間／暗：８時間）で培養した。培養開始３０日後の植物体の生育を観察し、その耐塩性を評価した。マングローブｃＤＮＡのかわりに、ｐＢＩ１０１を用いてＧＵＳ遺伝子を導入したタバコ培養細胞についても同様な検討を行った。その結果を図５に示す（参考写真参照）。図５からも明らかなように、スクリーニングの結果得られたｃＤＮＡを導入したタバコ植物体は、ＮａＣｌ存在下においても根、葉、茎の生長が良好であった。このことから、スクリーニングの結果得られたｃＤＮＡは植物体レベルにおいても耐塩性強化機能を有することが確認された。
【００６２】
実施例７  各種環境ストレスに対するマングローブｃＤＮＡの効果
（１）熱ストレス
配列番号１に示したｃＤＮＡがクローニングされているpBluescript SKが導入されたＳＯＬＲを５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．０５ｍＭのＩＰＴＧを含む２ＹＴ液体培地で３７℃、および４０℃で培養した。対照としてベクターであるpBluescript SKが導入されたＳＯＬＲについても同様な検討を行った。その結果を図６に示した。図６からも明らかなように、スクリーニングの結果得られたｃＤＮＡは耐熱性を強化する機能を有することが確認された。
【００６３】
（２）浸透圧ストレス
配列番号１に示したｃＤＮＡがクローニングされているpBluescript SKが導入されたＳＯＬＲを５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．０５ｍＭのＩＰＴＧを含む２ＹＴ液体培地で対数増殖期になるまで培養し、これを２ＹＴ液体培地で希釈シリーズを作製し、８００ｍＭの２ＹＴ寒天選択培地に２５μｌずつスポットした。液体が乾くまで風乾した後、３７℃で一晩培養した。その結果を図７に示した。図７からも明らかなように、スクリーニングの結果得られたｃＤＮＡは浸透圧耐性を強化する機能を有することが確認された。
【００６４】
（３）凍結ストレス
配列番号１に示したｃＤＮＡがクローニングされているpBluescript SKを導入したＳＯＬＲを５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．０５ｍＭのＩＰＴＧを含む２ＹＴ液体培地で対数増殖期になるまで培養し、これを２ＹＴ液体培地で５０００ｃｅｌｌｓ／２５μｌになるように希釈した。これをプラスチックチューブに移し、３分間の液体窒素による凍結と３７℃、１０分間の融解を繰り返した。融解時の菌体懸濁液の一部（２５μｌ）を採取し、ＳＯＬＲを５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、０．０５ｍＭのＩＰＴＧを含む２ＹＴ寒天培地にスポットした。比較としてベクターであるpBluescript SKが導入されたＳＯＬＲについても同様な検討を行った。その結果を図８に示した。図８からも明らかなように、スクリーニングの結果得られたｃＤＮＡは凍結ストレスに対する耐性を強化する機能を有することが確認された。
【００６５】
実施例８  環境ストレス耐性向上活性を有するタンパク質の分子進化
図２に示した、マングリンｃＤＮＡの最小機能領域と考えられる領域 (アミノ酸番号：１７−８６) がクローニングされたプラスミドを鋳型としたＰＣＲを行うことにより、マングリン最小機能領域と考えられる領域 (mangrin core) にランダムな変異の導入を試みた。プライマーには、配列番号６５で示される5' - GCTCTGAGAACCGTCTAGACTTAGATGAAGGTG - 3' 及び配列番号６６で示される5' - TCTCTCGTTCATCTCGAGCTATTACAGCTC- 3' を用いた。これらのプライマーは、mangrin coreを開始コドン及び終止コドン、さらにその外側に制限酵素 (Xba1, Xho1) サイトを付加したかたちで増幅できるように設計したものである。ＰＣＲには、ＤＮＡポリメラーゼとして、Takara Taq (Ｍｇ２＋free buffer) (宝酒造) を用いた。ＰＣＲ反応液は、添付のバッファーに対し、ＭｇＣｌ２を１．０ｍＭ、ＭｎＣｌ２を０．５ｍＭ、ｄＮＰＴ Mixtureを０．２５ｍＭとなるように添加し、これに各プライマーをそれぞれ、２ｐｍｏｌ／１０μｌ、テンプレートＤＮＡを１０ｐｇ／１０μｌとなるように加えた。反応の温度条件は９２℃を３０秒、５０℃を３０秒、７２℃を９０秒とし、このサイクルを３０回繰り返すことで、mangrin coreにランダムな変異が導入されたＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をXba1及びXho1で切断し、これをあらかじめXba1及びXho1で切断したベクター (pBluescript SK) にクローニングした。これをＳＯＬＲに導入し、４５０ｍＭのＮａＣｌを含む寒天培地上での生育を指標とした選抜を行い、塩基配列に変異が生じているにもかかわらず、耐塩性向上活性が維持、もしくは強化された変異mangrin coreを選抜した。得られたクローン一部について塩基配列の決定し、スポットテストにて耐塩性向上活性を評価した。その結果、図９に示すように、２クローン（ｃ−５２，ｃ−８０）の塩基配列に変異が生じていることが明らかになった。このうち、ｃ−８０はアミノ酸配列に変異が生じており、これがmangrin core の耐塩性強化機能を高める要因になっていると考えられた。また、塩ストレス耐性強化機能の比較を示す図１０からも明らかなように、環境ストレス耐性遺伝子の機能向上にも利用できることがわかった。
【００６６】
【発明の効果】
本発明は、各種生物の環境ストレスに対する耐性を強化する有効な手段になる。特に環境ストレス耐性が強化された植物はこれまで生育が困難であった塩害土壌、寒冷地、砂漠、海洋での生育が促進され、これにより、農地の拡大による農産物生産の増加が期待できる。また、環境ストレス耐性が強化された植物は、緑地環境の増大や砂漠緑化につながると同時に、地球規模においてＣＯ２濃度の増大による地球温暖化現象の抑制に貢献するものである。
【００６７】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】 ｍａｎｇ１を導入された大腸菌（ＳＯＬＲ）の耐塩性を検出した結果を示す。検出は、コロニー形成を指標に行なった。対照としてベクターのみ（pBluescript SK）を用いた。２つの塩（ＮａＣｌ）濃度で検定を行なった。
【図２】  ｍａｎｇ１の各種部分配列を導入された大腸菌（ＳＯＬＲ）の耐塩性を検出した結果を示す。検出は、コロニー形成を指標に行なった。対照としてベクターのみ（pBluescript SK）を用いた。２つの塩（ＮａＣｌ）濃度で検定を行なった。カッコ内に示した数値はアミノ酸番号を示し、「＊」はコード領域および非コード領域を含んだｍａｎｇ１のｃＤＮＡを指す。
【図３】  ｍａｎｇ１を導入された酵母の高塩条件下における生育を経時的に計測した結果を示す図である。検出は細胞濃度を指標に行なった。対照としてベクターのみ（ｐＹＥＳ２）を用いた。２つの塩（ＮａＣｌ）濃度で検定を行なった。
【図４】  ｍａｎｇ１を導入されたタバコ培養細胞の高塩条件下における生育を検出した結果を示す図である。検出は湿重量を指標に行なった。対照としてベクターのみ（ＧＵＳ）を用いた。３つの塩（ＮａＣｌ）濃度で検定を行なった。
【図５】  ｍａｎｇ１を導入されたタバコ植物体の高塩条件（１５０ｍＭのＮａＣｌ）下における生育を検出した結果を示す図である。Ａ，Ｃは、対照としてベクターのみ（ＧＵＳ）を導入したタバコ、Ｂ，Ｄは、ｍａｎｇ１を導入したタバコを示す。
【図６】  ｍａｎｇ１を導入された大腸菌（ＳＯＬＲ）の熱ストレス耐性を検討した結果を示す。熱ストレス耐性は４０℃培養における生育曲線を指標に評価した。対照としてベクターのみ（pBluescript SK）を導入したＳＯＬＲを用いた。
【図７】  ｍａｎｇ１を導入された大腸菌（ＳＯＬＲ）の浸透圧耐性を検討した結果を示す。浸透圧耐性は８００ｍＭのソルビトールを含む２ＹＴ寒天培地上における生育を指標に評価した。対照としてベクターのみ（pBluescript SK）を導入したＳＯＬＲを用いた。
【図８】ｍａｎｇ１を導入された大腸菌（ＳＯＬＲ）の凍結ストレス耐性を検討した結果を示す。凍結ストレス耐性は凍結融解処理を施した菌体の２ＹＴ寒天培地上における生育で評価した。対照としてベクターのみ（pBluescript SK）を導入したＳＯＬＲを用いた。
【図９】ｍａｎｇ１最小機能領域と考えられる領域 (mang1 core) 、及びそれに変異を導入したクローンの塩基配列、アミノ酸配列を示す。塩基配列、及びアミノ酸配列中における反転文字は変異があった箇所を示す。
【図１０】ｍａｎｇ１最小機能領域と考えられる領域及びそれに変異を導入したクローンの８５ｍＭ、３５０ｍＭ、５００ｍＭのＮａＣｌを含む寒天培地上における生育結果を示す。対照としてベクターのみ（pBluescript SK）を導入したＳＯＬＲを用いた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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