(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
"メラノーマ阻害活性"ＭＩＡの発現及び／又は機能活性を阻害することによって免疫細胞及び／又は免疫系を刺激すること、及び／又は腫瘍細胞の浸襲及び／又は転移を軽減することに用いるための分子であって、配列番号１から３のアンチセンス配列のいずれか一つを有する上記分子。
【請求項２】
前記分子が、ＭＩＡ ｍＲＮＡに完全に又は部分的に相補的な配列を合成し、ＭＩＡの阻害活性に対して試験することによって誘導されたものである、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
前記分子が、ウイルス性及び/又は非ウイルス性ベクターを含むDNA送達系にアニオン性脂質、カチオン性脂質、非カチオン性脂質及びそれらの混合物から成る群から選択される脂質と一緒に組み込まれたものである、請求項１又は２に記載の分子。
【請求項４】
前記分子が、一つ又はそれ以上の糖部分、塩基、及び／又は内部ヌクレオチド結合部位において、かつ／あるいは取り込み活性及び／又は阻害活性のエンハンサーに該分子をカップリングさせることによって改変されている、請求項１から３のいずれか１項に記載の分子。
【請求項５】
前記ＭＩＡの合成及び／又は機能を阻害する分子又は分子の組み合わせを含む組成物であって、
前記分子は、配列番号１から３のアンチセンス配列のいずれか一つを有するオリゴヌクレオチドから選択され、かつ
該組成物は、新生物、感染症及び／又は免疫不全障害の予防又は治療に用いるための組成物である、上記組成物。
【請求項６】
前記ＭＩＡの合成及び／又は機能の阻害剤を含む医薬であって、
前記阻害剤は、配列番号１から３のアンチセンス配列のいずれか一つを有するオリゴヌクレオチドから選択され、かつ
該医薬は、新生物、感染症及び／又は免疫不全障害の予防又は治療に用いるための医薬である、上記医薬。
【請求項７】
免疫刺激剤をさらに含む、請求項６に記載の医薬。
【請求項８】
請求項６または７に記載の医薬の調製のための、ＭＩＡの合成及び／又は機能を阻害する分子又は分子の組合せを含む組成物の使用であって、
前記分子は、配列番号１から３のアンチセンス配列のいずれか一つを有するオリゴヌクレオチドから選択される、上記使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
ポリペプチド“メラノーマ阻害活性”、ＭＩＡはメラノーマ腫瘍細胞の成長を阻害する因子として1989年発見された。ＭＩＡの抗増殖作用は他の腫瘍細胞及び末梢血単核球細胞においてもまた証明された。例えば、CANCER RES.49;5358-63, Bogdahanら(1989）はメラノーマ阻害活性（ＭＩＡ）と呼ばれる因子の非常に強い腫瘍細胞成長阻害効果を証明した。ＭＩＡ−Ｉ、ＭＩＡ-II、及びＭＩＡ−IIIと称する３つ活性画分のプールが同定された。腫瘍幹細胞コロニー形成は例えばＭＩＡ-IIによって驚くべきことに99.89％軽減された。
【０００２】
CANCER RES 50;6981-86, Weilbachら(1990）はさらに、ＭＩＡがＳ期及びＧ２区画内の細胞の停止を延長することによって細胞増殖を阻害することを証明した。
【０００３】
PROC.AACR 40;79, Jachimczakら(1994）はさらに、これらの観察を末梢血単核球細胞(PBMS）へ広げ、わずかな程度ではあるが、“IL-2刺激PBMS増殖が僅かだけＭＩＡの添加によって阻害された”ことを示した。
【０００４】
CANCER RES.54;5695-5701, Blesch ら(1994）は、131-アミノ酸前駆体で、107-アミノ酸の成熟タンパク質にプロセシングされるＭＩＡを同定した。この論文はＭＩＡが悪性メラノーマ細胞に対する強力な腫瘍細胞成長阻害剤として作用することを確証するものであり、さらにこの観察を他の神経外胚葉腫瘍に広げ、そしてＭＩＡが将来抗腫瘍治療物質として魅力的であるかもしれないと結論づけた。
【０００５】
議論となるデータがＭＩＡ発現とメラノーマ進展との関係について得られた。CANCER RES.57;3149-53, Bosserhoff ら(1997）及びANTICANのCER RES.19;2691-3, Bosserhoff ら(1997）は、ステージＩ及びIIのメラノーマＭＩＡレベルは13-23％上昇するが、ステージIII又はIV疾患においては100％上昇することを見出した。
【０００６】
対照的に、CANCER RES.55;6237-43, van Groningen ら(1995）は、非転移細胞株におけるMIA mRNA発現、及びMIA mRNA発現とメラノーマ転移における色素沈着との逆の関係を見出したが、特に、発現は高度に転移している細胞株では存在しないことを見出した。さらに、CLIN.CANCER RES.5;1099-105,Muhlbauer ら(1997)は、ＭＩＡ増幅は転移性疾患の臨床的段階づけ又は検出のための代用マーカーとしてほとんど価値がないようであると結論づけた。
【０００７】
驚くべきことに、上記の文献はＭＩＡがメラノーマ患者を治療するための治療剤としての可能性を有することを示唆する一方、対照的にＭＩＡが強力な免疫抑制因子であること、及びＭＩＡの発現及び/又は機能を阻害する薬剤は新生物及び免疫抑制の治療のための治療可能性を有することが今や見出された。
【０００８】
従って、本発明は、“メラノーマ阻害活性”ＭＩＡの発現及び／又は機能活性を阻害することによって免疫細胞及び／又は免疫系を刺激し、及び／又は腫瘍細胞の浸襲及び／又は転移を軽減するための方法に関する。
【０００９】
本発明によれば、前記免疫系の刺激は好ましくは下記のａ）からｍ）に挙げた標的細胞及び/又は標的病原体分子の発現を高めることと組み合わせて“メラノーマ阻害活性”ＭＩＡの発現及び／又は機能活性を阻害することによって；
あるいは下記のａ）からｍ）に挙げた分子の全部又は一部をコードするＤＮＡ及び/又はＲＮＡ、及び/又は下記のａ）からｍ）に挙げた分子内に含まれるポリペプチドを用いるワクチン接種によって；
生物の形質転換によって、及び/又は標的細胞及び/又は標的病原体を下記のａ）からｍ）に挙げた分子をコードする遺伝子で形質転換することによって；
生物に、及び/又は標的細胞及び/又は標的病原体に下記のａ）からｍ）に挙げた分子を適用することによって；
及び/又は下記のａ）からｍ）に挙げた分子を含む分子を用いて免疫反応を刺激し、及び/又は高め、及び/又はアップレギュレートし、及び/又は正に制御する分子の合成及び/又は機能を高めることによって達成され、
ここで、
ａ）は、リンホタクチン及び/又は免疫細胞誘発因子を含むケモカインを含む群から選択される分子を示し；
ｂ）は、アデノウイルス、パピローマウイルス、エプスタイン-バーウイルス、及びニューカッスル病ウイルス、ウシ-ポックス-ウイルスを含む非病原性のウイルスを含むウイルス、及び/又はウイルスの部分を含む群から選択される要素を示し；
ｃ）は、内在性及び/又は外来性のＭＨＣ−分子を含む群から選択される分子を示し；
ｄ）は、抗原処理に関与している分子を含む群から選択される分子を示し；
ｅ）は、抗原提示に関与している分子を含む群から選択される分子を示し；
ｆ）は、免疫細胞効果を媒介することに関与している分子を含む群から選択される分子を示し；
ｇ）は、免疫細胞障害効果を媒介することに関与している分子を含む群から選択される分子を示し；
ｈ）は、抗原輸送に関与している分子を含む群から選択される分子を示し；
ｉ）は、共−刺激性分子を含む群から選択される分子を示し；
ｊ）は、免疫細胞による認識及び／又は免疫細胞の細胞障害効果を高めるペプチドを含む群から選択される分子を示し；
ｋ）は、標的細胞中のタンパク質と、限定はされないが、メラノーマ細胞及び/又はメラニン形成細胞及び/又は乳房細胞及び/又は乳癌細胞に特異的な抗原を含む生物体にある他の細胞中のタンパク質との間で異なっている一つ又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチドを含む群から選択される分子を示し；
本発明によれば、ＭＩＡの合成及び/又は機能の阻害が群ｌ）の分子を用いることによって達成され、ここで、
ｌ）は、ｒａｓタンパク質アミノ、ｐ５３タンパク質、ＥＧＦ受容体タンパク質、融合ペプチド及び／又は融合タンパク質、網膜芽細胞腫タンパク質の一つ又はそれ以上の変異及び/又はアミノ酸置換を含むペプチド、一つ又はそれ以上の変異及び／又はアミノ酸置換、及び／又は遺伝子再配列及び／又は遺伝子転移によって引き起こされるアミノ酸置換を含むペプチド、オンコジーン及び／又はプロトオンコジーンによってコードされるタンパク質、抗−オンコジーン及び／又は腫瘍抑制遺伝子によってコードされるタンパク質の一つ又はそれ以上の変異及び／又はアミノ酸置換を含むペプチド、同じ生物体の他の細胞によって発現されるタンパク質と一つ又はそれ以上のアミノ酸だけ異なる標的細胞内のタンパク質に由来するペプチド、ウイルス性抗原に由来及び／又はウイルス性核酸によってコードされるペプチド、正常細胞に比べて標的細胞において過剰発現しているタンパク質に由来するペプチド、及びこれらの組み合わせであるｊ）のペプチドを含む群から選択される分子を示し；
ｍ）は腫瘍細胞抽出物及び／又は腫瘍細胞溶解物及び／又はアジュバンドを示す。
【００１０】
本発明の好ましい態様では、ＭＩＡの発現及び/又は機能活性の阻害が少なくとも一つの核酸分子、ペプチド、タンパク質、又は低分子量物質によって達成される。好ましくは、核酸分子はオリゴ−又はポリヌクレオチド分子、特にアンチセンス分子及び／又はリボザイムである。
【００１１】
効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを調製するための方法は当業者に知られている。好ましい方法は参照によって組み入れるWO 99/63975に開示されている。
【００１２】
ＭＩＡの合成及び/又は機能の阻害は好ましくは下記のアンチセンス配列を含む分子を用いることによって達成される。
【００１３】
MIA-2841-W   GTC AGG AAT CGG CAG  (配列番号１)
MIA-1278-W   CTT GGA GAA GAC ATA C  (配列番号２）
MIA-2842-W   TGC CTC CCC AGA AG  (配列番号３）
【００１４】
ならびに下記の配列（配列番号10−39）：
AGCCATGGAGATAG
CAGCCATGGAGATAG
ACAGCCATGGAGATAG
CACAGCCATGGAGATAG
CCACAGCCATGGAGAT
GCCATGGAGATAGG
AGCCATGGAGATAGG
CAGCCATGGAGATAGG
ACAGCCATGGAGATAGG
CATGGAGATAGGGT
CATGGAGATAGGGTG
CATGGAGATAGGGTGG
ATGGAGATAGGGTG
ATGGAGATAGGGTGG
ATGGAGATAGGGTGGC
ATGGAGATAGGGTGGCT
GGAGATAGGGTGGC
GGAGATAGGGTGGCT
GAAATAGCCCAGGC
GAAATAGCCCAGGCG
GAAATAGCCCAGGCGAG
GGAAATAGCCCAGG
GGAAATAGCCCAGGC
GTCTTCACATCGAC
GTCTTCACATCGACT
GTCTTCACATCGACTT
GTCTTCACATCGACTTT
GTCTTCACATCGACTTTG
GTCTTCACATCGACTTTG
CCATTTGTCTGTCTTCAC
又は少なくとも８つのヌクレオチドを有する該配列の部分。
【００１５】
さらにアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成するための方法は例えば同出願人のWO 98/33904に開示されている。
【００１６】
好ましくは、アンチセンス及び/又はリボザイム分子はMIA mRNAに対して全体的に又は部分的に相補的な配列を合成し、ＭＩＡの阻害活性に対して試験することによって誘導される。
【００１７】
本発明によれば、アンチセンス及び/又はリボザイム分子は例えばウイルス性及び/又は非ウイルス性ベクターを含むDNA送達系にアニオン性脂質、カチオン性脂質、非カチオン性脂質及びそれらの混合物から成る群から選択される脂質と一緒に組み込まれる。
【００１８】
本発明の好ましい態様では、核酸分子は隣接配列及び/又はベクター配列及び/又は核酸分子の発現及び/又は形質転換を高める配列を含む。本発明の更に好ましい態様では、核酸分子は一つ又はそれ以上のベクター及び/又はウイルス性配列及び/又はウイルス性ベクターの部分である。
【００１９】
本発明によれば、アンチセンス及び/又はリボザイム分子は一つ又はそれ以上の糖部分、塩基、及び/又は内部ヌクレオチド結合、ならびにリン酸部分において改変されていることが好ましい、例えば、オリゴヌクレオチド、リボザイム、及び/又は核酸の改変には、ホスホロチオエート（S-ODN）内部ヌクレオチド結合、メチルホスホネート内部ヌクレオチド結合、ホスホアミデート結合、ペプチド結合などの改変、糖の２’−Ｏ−アルキル改変、特にはメチル、エチル、プロピル、ブチルなどのアルキル改変、糖の２’−メトキシエトキシ改変及び／又は塩基の改変などを含む。種々の改変がオリゴ−又はポリヌクレオチドにおいて組み合わされる。
【００２０】
本発明のさらに好ましい態様によれば、オリゴヌクレオチド、リボザイム、及び/又は核酸は、葉酸、ホルモン、及びエストロゲン、プロゲステロン、コルチコステロイド、鉱質コルチコイドなどのステロイドホルモン、ペプチド、プロテオグリカン、糖脂質、リン脂質、ならびにこれらの誘導体に結合しているか又は混合されている。
【００２１】
ＭＩＡの発現及び／又は機能活性の阻害はまたペプチド又はタンパク質を用いて達成されうる。
【００２２】
本発明の方法に用いることができるペプチド及び／又はタンパク質は発現ライブラリーをスクリーニングし、ＭＩＡの発現及び／又は機能活性を阻害することに対してその発現産物を試験することによって得ることができる。
【００２３】
あるいは、合成ペプチド及び／又はタンパク質は無作為に合成されたペプチド及び／又はポリペプチドをＭＩＡの発現及び／又は機能活性を阻害することに対してスクリーニングすることによって得ることができる。
【００２４】
ＭＩＡに結合する好適なペプチドは例えば以下のペプチド（配列番号40−63）：
VPHIPPN
MPPTQVS
QMHPWPP
QPPFWQF
TPPQGLA
IPPYNTL
AVRPAPL
GAKPHPQ
QQLSPLP
GPPPSPV
LPLTPLP
【００２５】
QLNVNHQARADQ
TSASTRPELHYP
TFLPHQMHPWPP
VPHIPPNSMALT
RLTLLVLIMPAP
【００２６】
RKLPPRPRR
VLASQIATTPSP
TPLTKLPSVNHP
PPNSFSSAGGQRT
EQDSRQGQELTKKGL
【００２７】
ETTIVITWTPAPR
TSLLISWDAPAVT
NSLLVSWQPPRAR
ならびに上記ペプチド及びこれらのペプチドの類似体又は誘導体を含むタンパク質又はペプチドである。
【００２８】
EMBO J 20;340-349, Stollら(2001）は、ヒトＭＩＡの三次元構造を開示し、よってＭＩＡに結合する特異的ペプチドのコンピュータを利用した構築及び合成が可能となる。
【００２９】
本発明のさらなる態様によれば、ＭＩＡの発現及び／又は機能活性ならびにＭＩＡ遺伝子及び／又はMIA mRNAの発現の阻害は例えばコンビナトリアルケミストリーによって得られる低分子量の阻害剤を用い、ＭＩＡの発現及び／又は機能活性を阻害することに対してその産物を試験することによって達成される［Fernandes, P.B. in Curr.Opin.Chem.Biol.1998;2(5):597-803 Technological advances in high-throughput screening］。
【００３０】
ここで用いられる低分子量分子（小分子）は100個までの炭素原子をＮ，Ｓ，Ｏ，Ｐ等のさらなる原子と組み合わせて有する分子をいう。
【００３１】
好適な小分子はまたコンピュータを用いる方法を用いて同定することができる。コンピュータを用いる構築方法は例えばMurcko, M.A., Caron, P.R., Charifson, P.S.(1999)、Structure-based drug design, Annual Reports in Medical Chemistry，vol.34, Academic Press, San Diego, 1999に開示されている。
【００３２】
好適な化合物は例えば図１から４２において特定される構造１から４９２である。構造１から４２を下位構造として含む構造もまた本発明において有用である。構造１から４９２の部分及び／又は下位構造もまたそれらが少なくとも芳香族系及びアミド結合を含む限り、本発明に有用である。
【００３３】
本発明のさらなる態様では、ＭＩＡの発現及び／又は機能活性の阻害はＭＩＡに結合するアプタマー及び／又はスピーゲルマー（Spiegelmer）を含むDNA又はRNA誘導体を用いることによって達成される。
【００３４】
ＭＩＡの発現及び／又は機能活性の阻害はまた抗体、又はFab断片、単鎖抗体などの抗体断片、又はそれらの組み合わせによって達成される。これらの分子は抗体ライブラリーをスクリーニングし、ＭＩＡの発現及び／又は機能活性に対してその発現産物を試験することによって同定し、得ることができる。
【００３５】
上記の要素、分子又は物質のいずれかは免疫刺激剤、例えばサイトカイン、及び／又はインターロイキン−10の発現及び／又は機能の阻害剤、及び／又は形質転換成長因子β（TGF−β）、及び／又はプロスタグランジンB2、及び／又はプロスタグランジンE2に対する受容体、及び／又はVEGFの阻害剤と組み合わせることができる。
【００３６】
本発明はまたＭＩＡの発現及び／又は機能活性を阻害することのできる分子又は分子の組み合わせを含む医薬を製造するための組成物に関する。
【００３７】
ＭＩＡの発現及び／又は機能活性の阻害剤を含む医薬もまた本発明の主題である。本発明の医薬は免疫刺激剤と組み合わせることもできる。
【００３８】
上記の要素、分子、又は物質のいずれかは新生物、感染及び／又は免疫抑制疾患の予防又は治療のための医薬の調製に用いることができる。
【００３９】
好ましくは、ＭＩＡの発現及び／又は機能活性の阻害剤は、腫瘍又は他の病理学的に冒された部位又は器官に局所的に投与することも、全身に（例えば静脈内に又は皮下内に又は経口的に）投与することも両方できる。
【００４０】
本発明はまた“メラノーマ阻害活性”（ＭＩＡ）の発現及び／又は機能活性を阻害することによって免疫系を刺激する方法の使用と、病気の細胞又は病原体に対する免疫反応を高める方法及び／又は物質；標的細胞及び／又は標的病原体の免疫原性を高める方法及び/又は分子；及び/又はIL-1,IL-2,IK-4,IL-12,IL-18を含むインターロイキンなどのサイトカイン（該サイトカインはヒトを含む生物体に全身に投与されるか、例えばある領域、器官、器官の一部、体の区画に局所的に投与される）を含む免疫刺激性分子；及び/又は標的細胞又標的病原体におけるサイトカインの発現をそれらの発現を刺激することによって及び/又は発現系をこれらのサイトカインを発現できる標的細胞又は標的病原体に形質転換することによって向上させること；及び/又はヒトを含む生物に全身に投与されるか又は例えばある領域、器官、器官の一部、体の区画に局所的に投与されるケモカインなどのリンホタクチンを含む免疫細胞を誘引するケモカイン；及び/又は標的細胞又は標的病原体におけるケモカインの発現をそれらの発現を刺激することによって及び/又は発現系をこれらのケモカインを発現できる標的細胞又は標的病原体に形質転換することによって向上させること；及び/又は腫瘍細胞及び/又は病原体に見出されるが正常細胞には見出されないペプチド及び/又はＤＮＡ及び/又はＲＮＡ分子及び/又は他の抗原；及び/又は腫瘍細胞及び/又は病原体に見出されるが正常細胞には見出されないペプチド及び/又は抗原の発現を高めること；及び/又は細胞抽出物及び/又は細胞溶解物及び/又はアジュバンドの使用の組み合わせに関する。
【００４１】
本発明の方法は特に以下の治療に有用である。
１．固形腫瘍、例えば皮膚（メラノーマを含む）の癌、頭部及び頚部の癌、肉腫（骨肉腫及び軟骨肉腫を含む）、網膜芽細胞腫、乳癌、卵巣癌、小細胞気管支/肺癌腫、非小細胞気管支/肺癌腫、食道癌、直腸癌腫、結腸直腸癌腫、胃癌、小腸癌腫、肝臓癌腫、腎臓の癌腫、膵臓癌腫、胆嚢癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、中皮腫、前立腺癌腫、精巣癌腫、脳腫瘍
２．白血病、例えば骨髄性白血病（急性及び慢性）、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）、非ホジキン性リンパ腫、ホジキン性リンパ腫
３．変性疾患、例えば関節炎、軟骨及び骨の変性／損傷
４．免疫抑制疾患、例えばＨＩＶ感染、骨髄抑制性疾患、血管拡張性失調症、ディジョージ症候群、ブルトン病、先天性無ガンマグロブリン血症、複合免疫不全症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、代償性不全、白血病減少症
【００４２】
【実施例】
実施例１
自家抗神経膠腫LAK免疫反応は外来性MIAの添加によって強く阻害された。
MIAの細胞障害性Ｔ−リンパ球（CTL）及びリンホカイン活性化キラー細胞（LA細胞）に対する効果を調べるために、CARE−LASSアッセイを用いた（Lichtenfels, R., Biddison, W.E., Schulz, H., Vogt, A.B. and R.Martin）。CARE−LASS(clacein-release assay)は細胞障害性リンパ球活性を測定するための改良された蛍光ベースの試験系（J.Immunol.Meth., 172:227-239,1994)である。すなわち、神経膠腫細胞を採取し、5％FCS/PBS溶液中で洗浄し、5％FCS/PBSに10 Mio細胞/mlで再懸濁した。カルセイン（Calcein)-AMを最終濃度25μM（Molecular  Probes, 米国）で添加した。細胞を37℃にて30分間標識化し、5％FCS/PBSで2回洗浄し、1 Mio細胞/mlに調節し、96ウェルのＵ−型マイクロプレートに最終濃度0.1 Mio細胞/100μl/１ウェルとなるように添加した（Nunc, デンマーク）。MIA（f.c. 500ng/ml)とプレインキュベートしたエフェクター細胞の細胞障害活性を測定するために、ウェルに100μlのCTL及びLAK細胞をE：T比が1:10及び1:100で添加した。カルセインの自然遊離と全遊離を測定するために、ウェルに100μlの5％FCS/PBS又は100μlの溶解緩衝液（50nMホウ酸ナトリウム、0.1%Triton（登録商標）×100、pH9.0）をそれぞれ前もって添加した。プレートを37℃にて４時間インキュベートした後、上清（50μl）を新しいウェルに移し、自動化蛍光スキャナー（Titertek Fluoroskan II、ドイツ）を用いて測定した。細胞障害性は下記式により決定した：
（F/CTLアッセイ−F自然遊離／F全溶解−F自然遊離）×100＝％細胞障害性
【００４３】
結果：
MIAは悪性神経膠腫細胞株（HTZ-17,-234,−374,−375）に対する自家及び同種LAK細胞障害性をコントロールに比べて40％まで阻害した。
【００４４】
実施例２
さらに、MIA分泌性メラノーマ細胞におけるMIA合成の阻害は自家LAK及びCTL活性を高めた。
細胞障害性Ｔ−リンパ球（CTL）及びリンホカイン活性化キラー細胞（LAK細胞）に対するMIAの効果を調べるために、CARE−LASSアッセイを実施例１において上述したように用いた。
すなわち、メラノーマ細胞を採取し、5％FCS/PBS溶液中で洗浄し、5％FCS/PBSに10 Mio細胞/mlで再懸濁した。カルセイン（Calcein)-AMを最終濃度25μM（Molecular Probes, 米国）で添加した。細胞を37℃にて30分間標識化し、5％FCS/PBSで2回洗浄し、1 Mio細胞/mlに調節し、96ウェルのＵ−型マイクロプレートに最終濃度0.1 Mio細胞/100μl/１ウェルとなるように添加した（Nunc, デンマーク）。MIA−アンチセンスオリゴヌレクオチド（f.c.1-5μM)で前処理したエフェクター細胞の細胞障害活性を測定するために、ウェルに100μlのCTL及びLAK細胞をE：T比が1:10及び1:100で添加した。カルセインの自然遊離と全遊離を測定するために、ウェルに100μlの5％FCS/PBS又は100μlの溶解緩衝液（50nMホウ酸ナトリウム、0.1%Triton（登録商標）×100、pH9.0）をそれぞれ前もって添加した。プレートを37℃にて４時間インキュベートした後、上清（50μl）を新しいウェルに移し、自動化蛍光スキャナー（Titertek Fluoroskan II、ドイツ）を用いて測定した。細胞障害性は実施例１に記載した式によって決定した。
【００４５】
結果
特異的なホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒトMIA−分泌性細胞株（GI及びHW）の内在性MIA合成の阻害は、未処理のMIA産生メラノーマ細胞株に比べて自家LAK細胞障害性を20％まで高めた。
【００４６】
MIA発現を阻害する活性配列は以下のとおりである。
MIA-2841-W             GTC AGG AAT CGG CAG  (配列番号１）
MIA-1278-W             CTT GGA GAA GAC ATA C        (配列番号２）
MIA-2842-W             TGC CTC CCC AGA AG           (配列番号３）
【００４７】
MIA発現を阻害する活性が少ない又は無活性の配列は以下のとおりである。
MIA-2843-N               CAC TGG CAG TAG AAA TC       (配列番号４）
MIA-2844-N               GCT CAC TGG CAG TAG          (配列番号５）
MIA-0202-N               ATG GTC AGG AAT CG           (配列番号６）
MIA-1277-N               GAA TGG TCA GGA ATC G        (配列番号７）
MIA-2328-N               CAT CGT GGA CTG TG           (配列番号８）
【００４８】
実施例３
さらに、MIA分泌性メラノーマ細胞内でMIA活性を阻害するペプチドはまた自家LAK活性を30％まで高めた。
【００４９】
実施例４
特異的なホスホチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒトMIA分泌性メラノーマ、ならびに乳癌細胞株における内在性MIA合成の阻害は、その遊走活性、マトリクスへの付着性増加、腫瘍浸潤及び転移に対するMIA阻害剤の強い阻害効果の現れを減少させた。
【００５０】
実施例５
特異的なホスホチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドとIL-12,IL-4,IL-18及び／又はTGF−βに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの組み合わせによるヒトMIA分泌性メラノーマ細胞株（GI及びHW）における内在性MIA合成の阻害は、MIA産生腫瘍細胞株における特異的なホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド単独による内在性MIA合成の阻害と比較して増加した。
【００５１】
実施例６
アンチセンス配列（配列番号９）：
GGCAGGGCCAGCGGTAGGCTGAGCTCACTGGCAGTAGAAATCCCATTTGTCTGTCTTCACATCGACTTTGCCAGGTTTCAGGGTCTGGTCCTCTCGGACAATGCTACTGGGGAAATAGCCCAGGCGAGCAGCCAGATCTCCATAGTAATCTCCCTGAACGCTGCCTCCCCAGAAGAGCCGCCCACGGCCCTTCAGCTTGGAGAAGACATACACCACTTGGCCCCGGTGAATGGTCAGGAATCGGCAGTCGGGGGCCATGTAGTCCTGAAGGGCCACAGCCATGGAGATAGGGTGGCTGCACTCCTGGTCCGCACACAGCTTCCGGTCAGCCAGCTTGGGCATAGGACCACCCCTGACACCAGGTCCGGAGAAGGCAGACAGCAAGATGATGACACCAAGGCACACCAGGGACCGGGCCATCGTGGACTGTGAGCAAGAGAGTGAGCAAGGGGGTGCTGG
又はこの配列の部分をヒトMIA分泌性メラノーマならびに乳癌細胞株において発現する形質転換用ベクターによる内在性MIA合成の阻害は、重症複合免疫不全症マウス及びヌードマウスにおいて強く腫瘍浸潤及び転移を軽減した。
【００５２】
実施例７
腫瘍浸潤及び転移の阻害はMIAの阻害剤とVEGF又はTGF-βの阻害剤との併用によって向上した。
【図面の簡単な説明】
【図１】構造１及び２の化合物
【図２】構造３及び４の化合物
【図３】構造５及び６の化合物
【図４】構造７及び８の化合物
【図５】構造９及び１０の化合物
【図６】構造１１及び１２の化合物
【図７】構造１３及び１４の化合物
【図８】構造１５及び１６の化合物
【図９】構造１７及び１８の化合物
【図１０】構造１９及び２０の化合物
【図１１】構造２１及び２２の化合物
【図１２】構造２３及び２４の化合物
【図１３】構造２５及び２６の化合物
【図１４】構造２７及び２８の化合物
【図１５】構造２９及び３０の化合物
【図１６】構造３１及び３２の化合物
【図１７】構造３３及び３４の化合物
【図１８】構造３５及び３６の化合物
【図１９】構造３７及び３８の化合物
【図２０】構造３９及び４０の化合物
【図２１】構造４１及び４２の化合物
【図２２】構造４３及び４４の化合物
【図２３】構造４５及び４６の化合物
【図２４】構造４７及び４８の化合物
【図２５】構造４９及び５０の化合物
【図２６】構造５１及び５２の化合物
【図２７】構造５３及び５４の化合物
【図２８】構造５５及び５６の化合物
【図２９】構造５７及び５８の化合物
【図３０】構造５９及び６０の化合物
【図３１】構造６１及び６２の化合物
【図３２】構造６３及び６４の化合物
【図３３】構造６５及び６６の化合物
【図３４】構造６７及び６８の化合物
【図３５】構造６９及び７０の化合物
【図３６】構造７１及び７２の化合物
【図３７】構造７３及び７４の化合物
【図３８】構造７５及び７６の化合物
【図３９】構造７７及び７８の化合物
【図４０】構造７９及び８０の化合物
【図４１】構造８１及び８２の化合物
【図４２】構造８３及び８４の化合物
【図４３】構造８５及び８６の化合物
【図４４】構造８７及び８８の化合物
【図４５】構造８９及び９０の化合物
【図４６】構造９１及び９２の化合物
【図４７】構造９３及び９４の化合物
【図４８】構造９５及び９６の化合物
【図４９】構造９７及び９８の化合物
【図５０】構造９９及び１００の化合物
【図５１】構造１０１及び１０２の化合物
【図５２】構造１０３及び１０４の化合物
【図５３】構造１０５及び１０６の化合物
【図５４】構造１０７及び１０８の化合物
【図５５】構造１０９及び１１０の化合物
【図５６】構造１１１及び１１２の化合物
【図５７】構造１１３及び１１４の化合物
【図５８】構造１１５及び１１６の化合物
【図５９】構造１１７及び１１８の化合物
【図６０】構造１１９及び１２０の化合物
【図６１】構造１２１及び１２２の化合物
【図６２】構造１２３及び１２４の化合物
【図６３】構造１２５及び１２６の化合物
【図６４】構造１２７及び１２８の化合物
【図６５】構造１２９及び１３０の化合物
【図６６】構造１３１及び１３２の化合物
【図６７】構造１３３及び１３４の化合物
【図６８】構造１３５及び１３６の化合物
【図６９】構造１３７及び１３８の化合物
【図７０】構造１３９及び１４０の化合物
【図７１】構造１４１及び１４２の化合物
【図７２】構造１４３及び１４４の化合物
【図７３】構造１４５及び１４６の化合物
【図７４】構造１４７及び１４８の化合物
【図７５】構造１４９及び１５０の化合物
【図７６】構造１５１及び１５２の化合物
【図７７】構造１５３及び１５４の化合物
【図７８】構造１５５及び１５６の化合物
【図７９】構造１５７及び１５８の化合物
【図８０】構造１５９及び１６０の化合物
【図８１】構造１６１及び１６２の化合物
【図８２】構造１６３及び１６４の化合物
【図８３】構造１６５及び１６６の化合物
【図８４】構造１６７及び１６８の化合物
【図８５】構造１６９及び１７０の化合物
【図８６】構造１７１及び１７２の化合物
【図８７】構造１７３及び１７４の化合物
【図８８】構造１７５及び１７６の化合物
【図８９】構造１７７及び１７８の化合物
【図９０】構造１７９及び１８０の化合物
【図９１】構造１８１及び１８２の化合物
【図９２】構造１８３及び１８４の化合物
【図９３】構造１８５及び１８６の化合物
【図９４】構造１８７及び１８８の化合物
【図９５】構造１８９及び１９０の化合物
【図９６】構造１９１及び１９２の化合物
【図９７】構造１９３及び１９４の化合物
【図９８】構造１９５及び１９６の化合物
【図９９】構造１９７及び１９８の化合物
【図１００】構造１９９及び２００の化合物
【図１０１】構造２０１及び２０２の化合物
【図１０２】構造２０３及び２０４の化合物
【図１０３】構造２０５及び２０６の化合物
【図１０４】構造２０７及び２０８の化合物
【図１０５】構造２０９及び２１０の化合物
【図１０６】構造２１１及び２１２の化合物
【図１０７】構造２１３及び２１４の化合物
【図１０８】構造２１５及び２１６の化合物
【図１０９】構造２１７及び２１８の化合物
【図１１０】構造２１９及び２２０の化合物
【図１１１】構造２２１及び２２２の化合物
【図１１２】構造２２３及び２２４の化合物
【図１１３】構造２２５及び２２６の化合物
【図１１４】構造２２７及び２２８の化合物
【図１１５】構造２２９及び２３０の化合物
【図１１６】構造２３１及び２３２の化合物
【図１１７】構造２３３及び２３４の化合物
【図１１８】構造２３５及び２３６の化合物
【図１１９】構造２３７及び２３８の化合物
【図１２０】構造２３９及び２４０の化合物
【図１２１】構造２４１及び２４２の化合物
【図１２２】構造２４３及び２４４の化合物
【図１２３】構造２４５及び２４６の化合物
【図１２４】構造２４７及び２４８の化合物
【図１２５】構造２４９及び２５０の化合物
【図１２６】構造２５１及び２５２の化合物
【図１２７】構造２５３及び２５４の化合物
【図１２８】構造２５５及び２５６の化合物
【図１２９】構造２５７及び２５８の化合物
【図１３０】構造２５９及び２６０の化合物
【図１３１】構造２６１及び２６２の化合物
【図１３２】構造２６３及び２６４の化合物
【図１３３】構造２６５及び２６６の化合物
【図１３４】構造２６７及び２６８の化合物
【図１３５】構造２６９及び２７０の化合物
【図１３６】構造２７１及び２７２の化合物
【図１３７】構造２７３及び２７４の化合物
【図１３８】構造２７５及び２７６の化合物
【図１３９】構造２７７及び２７８の化合物
【図１４０】構造２７９及び２８０の化合物
【図１４１】構造２８１及び２８２の化合物
【図１４２】構造２８３及び２８４の化合物
【図１４３】構造２８５及び２８６の化合物
【図１４４】構造２８７及び２８８の化合物
【図１４５】構造２８９及び２９０の化合物
【図１４６】構造２９１及び２９２の化合物
【図１４７】構造２９３及び２９４の化合物
【図１４８】構造２９５及び２９６の化合物
【図１４９】構造２９７及び２９８の化合物
【図１５０】構造２９９及び３００の化合物
【図１５１】構造３０１及び３０２の化合物
【図１５２】構造３０３及び３０４の化合物
【図１５３】構造３０５及び３０６の化合物
【図１５４】構造３０７及び３０８の化合物
【図１５５】構造３０９及び３１０の化合物
【図１５６】構造３１１及び３１２の化合物
【図１５７】構造３１３及び３１４の化合物
【図１５８】構造３１５及び３１６の化合物
【図１５９】構造３１７及び３１８の化合物
【図１６０】構造３１９及び３２０の化合物
【図１６１】構造３２１及び３２２の化合物
【図１６２】構造３２３及び３２４の化合物
【図１６３】構造３２５及び３２６の化合物
【図１６４】構造３２７及び３２８の化合物
【図１６５】構造３２９及び３３０の化合物
【図１６６】構造３３１及び３３２の化合物
【図１６７】構造３３３及び３３４の化合物
【図１６８】構造３３５及び３３６の化合物
【図１６９】構造３３７及び３３８の化合物
【図１７０】構造３３９及び３４０の化合物
【図１７１】構造３４１及び３４２の化合物
【図１７２】構造３４３及び３４４の化合物
【図１７３】構造３４５及び３４６の化合物
【図１７４】構造３４７及び３４８の化合物
【図１７５】構造３４９及び３５０の化合物
【図１７６】構造３５１及び３５２の化合物
【図１７７】構造３５３及び３５４の化合物
【図１７８】構造３５５及び３５６の化合物
【図１７９】構造３５７及び３５８の化合物
【図１８０】構造３５９及び３６０の化合物
【図１８１】構造３６１及び３６２の化合物
【図１８２】構造３６３及び３６４の化合物
【図１８３】構造３６５及び３６６の化合物
【図１８４】構造３６７及び３６８の化合物
【図１８５】構造３６９及び３７０の化合物
【図１８６】構造３７１及び３７２の化合物
【図１８７】構造３７３及び３７４の化合物
【図１８８】構造３７５及び３７６の化合物
【図１８９】構造３７７及び３７８の化合物
【図１９０】構造３７９及び３８０の化合物
【図１９１】構造３８１及び３８２の化合物
【図１９２】構造３８３及び３８４の化合物
【図１９３】構造３８５及び３８６の化合物
【図１９４】構造３８７及び３８８の化合物
【図１９５】構造３８９及び３９０の化合物
【図１９６】構造３９１及び３９２の化合物
【図１９７】構造３９３及び３９４の化合物
【図１９８】構造３９５及び３９６の化合物
【図１９９】構造３９７及び３９８の化合物
【図２００】構造３９９及び４００の化合物
【図２０１】構造４０１及び４０２の化合物
【図２０２】構造４０３及び４０４の化合物
【図２０３】構造４０５及び４０６の化合物
【図２０４】構造４０７及び４０８の化合物
【図２０５】構造４０９及び４１０の化合物
【図２０６】構造４１１及び４１２の化合物
【図２０７】構造４１３及び４１４の化合物
【図２０８】構造４１５及び４１６の化合物
【図２０９】構造４１７及び４１８の化合物
【図２１０】構造４１９及び４２０の化合物
【図２１１】構造４２１及び４２２の化合物
【図２１２】構造４２３及び４２４の化合物
【図２１３】構造４２５及び４２６の化合物
【図２１４】構造４２７及び４２８の化合物
【図２１５】構造４２９及び４３０の化合物
【図２１６】構造４３１及び４３２の化合物
【図２１７】構造４３３及び４３４の化合物
【図２１８】構造４３５及び４３６の化合物
【図２１９】構造４３７及び４３８の化合物
【図２２０】構造４３９及び４４０の化合物
【図２２１】構造４４１及び４４２の化合物
【図２２２】構造４４３及び４４４の化合物
【図２２３】構造４４５及び４４６の化合物
【図２２４】構造４４７及び４４８の化合物
【図２２５】構造４４９及び４５０の化合物
【図２２６】構造４５１及び４５２の化合物
【図２２７】構造４５３及び４５４の化合物
【図２２８】構造４５５及び４５６の化合物
【図２２９】構造４５７及び４５８の化合物
【図２３０】構造４５９及び４６０の化合物
【図２３１】構造４６１及び４６２の化合物
【図２３２】構造４６３及び４６４の化合物
【図２３３】構造４６５及び４６６の化合物
【図２３４】構造４６７及び４６８の化合物
【図２３５】構造４６９及び４７０の化合物
【図２３６】構造４７１及び４７２の化合物
【図２３７】構造４７３及び４７４の化合物
【図２３８】構造４７５及び４７６の化合物
【図２３９】構造４７７及び４７８の化合物
【図２４０】構造４７９及び４８０の化合物
【図２４１】構造４８１及び４８２の化合物
【図２４２】構造４８３及び４８４の化合物
【図２４３】構造４８５及び４８６の化合物
【図２４４】構造４８７及び４８８の化合物
【図２４５】構造４８９及び４９０の化合物
【図２４６】構造４９１及び４９２の化合物
【図２４７】構造４９３及び４９４の化合物
【図２４８】構造４９５及び４９６の化合物
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【図１２２】
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【図１２３】
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【図１２４】
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【図１２５】
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【図１２６】
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【図１２７】
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【図１２８】
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【図１２９】
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【図１３０】
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【図１３１】
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【図１３２】
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【図１３３】
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【図１３４】
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【図１３５】
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【図１３６】
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【図１３７】
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【図１３８】
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【図１３９】
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