(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドの質量分析により得られたペプチドの質量情報及び/又はペプチドの修飾情報を基に、ペプチドに関するデータベースを検索することにより推定されたアミノ酸配列を検定する方法であって、
（１）  前記推定したアミノ酸配列及び/又はペプチドの修飾情報から、ペプチドの同位体比の理論値を算出する工程と、
（２）  前記ペプチドの質量情報から、ペプチドの同位体比の測定値を測定する工程と、
（３）  前記理論値と前記測定値とを比較し、前記理論値と前記測定値との差異から、推定されたアミノ酸配列の妥当性を評価する工程と、
を含む、推定されたアミノ酸配列の検定方法。
【請求項２】
（４）前記妥当性の評価に基づき、前記推定されたアミノ酸配列が正しいか否かを判断する工程を、あるいは、前記妥当性を反映したパラメータの値に基づいて、前記推定されたアミノ酸配列から１又は複数のアミノ酸配列を選択する工程を、さらに含む請求項１に記載の検定方法。
【請求項３】
前記選択工程は、前記パラメータが所定の値以上であるアミノ酸配列を前記推定されたアミノ酸配列から選択する、請求項２に記載の検定方法。
【請求項４】
質量分析装置と、演算部を有するコンピュータとを備え、前記質量分析装置にて得られたペプチドの質量情報及び/又はペプチドの修飾情報を基に、ペプチドに関するデータベースを検索することにより推定されたアミノ酸配列を検定する装置であって、
前記演算部は、前記ペプチドの質量情報及び/又はペプチドの修飾情報を受けた後に、
（ａ）前記推定したアミノ酸配列及び/又はペプチドの修飾情報から、ペプチドの同位体比の理論値を算出する算出手段と、
（ｂ）前記ペプチドの質量情報から、ペプチドの同位体比の測定値を測定する測定手段と、
（ｃ）前記理論値と前記測定値とを比較し、前記理論値と前記測定値との差異から、前記演算部が推定したアミノ酸配列の妥当性を評価する評価手段と、を備える検定装置。
【請求項５】
（ｄ）前記妥当性の評価に基づき、前記演算部は前記推定されたアミノ酸配列が正しいか否かを判断する判断手段をさらに備える、あるいは、前記推定されたアミノ酸配列の妥当性を反映したパラメータの値を計算される計算手段をさらに備え、前記パラメータに基づいて、前記推定されたアミノ酸配列から１又は複数のアミノ酸配列を選択する、請求項５に記載の検定装置。
【請求項６】
前記選択は、前記パラメータが所定の値以上であるアミノ酸配列を前記推定されたアミノ酸配列から選択する、請求項５に記載の検定装置。
【請求項７】
ペプチドの質量分析により得られたペプチドの質量情報及び/又はペプチドの修飾情報を受けるコンピュータに、ペプチドに関するデータベースを検索することにより推定されたアミノ酸配列を検定させるためのプログラムであって、
（i）コンピュータが備える演算部へ前記ペプチドの質量情報及び/又はペプチドの修飾情報を入力する工程と、
（ii）前記演算部が、前記推定したアミノ酸配列及び/又はペプチドの修飾情報から、ペプチドの同位体比の理論値を算出する工程と、
（iii）前記演算部が、前記ペプチドの質量情報から、ペプチドの同位体比の測定値を測定する工程と、
（iv）前記理論値と前記測定値とを比較し、前記理論値と前記測定値との差異から、前記演算部が推定したアミノ酸配列の妥当性を評価する工程と、
を実行するプログラム。
【請求項８】
（v）前記妥当性の評価に基づき、前記演算部が前記推定されたアミノ酸配列が正しいか否かを判断する工程を、あるいは、前記推定されたアミノ酸配列の妥当性を反映したパラメータの値に基づいて、前記推定されたアミノ酸配列から１又は複数のアミノ酸配列を選択する工程を、さらに含む請求項７に記載のプログラム。
【請求項９】
前記選択は、前記パラメータが所定の値以上であるアミノ酸配列を前記推定されたアミノ酸配列から選択する、請求項８に記載のプログラム。
【請求項１０】
請求項７ないし９のうち何れか一項に記載のプログラムを格納したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドの質量分析から推定されたアミノ酸配列の妥当性を評価する検定方法に係り、より詳細には、ペプチドの同位体比の理論値と、ペプチドの同位体比の測定値とを比較して、推定されたアミノ酸配列の妥当性を評価する検定方法、検定装置および前記方法を実行するプログラム、並びに該プログラムを格納した記録媒体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子の塩基配列が網羅的に解析され、蛋白質及び核酸のデータベースが拡充されたことにより、ペプチド配列が完全に決定できなくても、部分的な質量分析（以下、単に「MS」ともいう。）の解析情報を基に、データベースからマッチするペプチド配列を探し出すことが可能となった。【０００３】
このデータベース検索法には大別して２つの方法がある。１つはペプチドマスフィンガープリンティング法（PMF法、たとえば、非特許文献１参照）である。タンパク質をトリプシン消化などの切断特異性が明らかな方法での処理の後、そのペプチド群の質量をMSで測定し、一方、データベース中のタンパク質についてもin  silicoで同様の処理を行い、測定データと理論データとの一致度を検索することにより、タンパク質の同定を行うものである。この方法の問題点は、その真のタンパク質を偽ヒットタンパク質群から見分けるためにはある程度の数のペプチドが必要なことである。また、PMF法では、一般的には混合物の場合は適用が困難であるし、検索の特異性を高めるためには測定されるペプチド質量に高い精度が要求される。さらに、PMF法では、ペプチド質量が変わってしまう翻訳後修飾には、基本的には対応できないなどの問題点がある。【０００４】
もう一つの方法は、タンデムマススペクトルを用いる方法である。MSに導入されたペプチドはMSの内部での衝突解離によりフラグメント化されるが、その際に得られるスペクトル（MSMSスペクトル、タンデムマススペクトル、フラグメントスペクトル、またはCIDスペクトル）からペプチドのアミノ酸配列の部分情報が得られるので、データベース中のタンパク質から得られる情報を検索することにより同定を行うものである（たとえば、非特許文献２ないし４参照）。本方法では１つのペプチドだけでも十分に検索特異性があるので混合物での測定や網羅的解析に向いている。また、その特異性の高さからゲノムに対して直接検索をすることも可能であるし、翻訳後修飾にも対応可能である。【０００５】
しかしながら、前述のいずれの方法でも哺乳類の組織や細胞といった非常に多種類の蛋白質が存在する場合、検索エンジンから出力されるタンパク質リストから、偽ヒットを完全に取り除くのは容易ではなく、同定のためのクライテリアを工夫しても10〜30%程度の偽ヒットタンパク質が常に混在しており、ペプチド同定のための付加的な情報が求められている。【０００６】
さらに、データベースを用いずにMSMSスペクトルやペプチドシークエンサーから得られる情報だけから配列を決定するde  novoシークエンシングにおいても、付加的な情報は、決定された配列の妥当性を検定するのに大きな役割を果たすことが期待される。【０００７】
非特許文献１：  M.  Mann,  P.  Hojrup,  P.  Roepstorff,  Biol  Mass  Spectrom  22  (1993)  338.
非特許文献２：  J.K.  Eng,  A.L.  McCormack,  I.  Yates,  John  R.,  Journal  of  the  American  Society  for  Mass Spectrometry  5  (1994)  976.
非特許文献３：  M.  Mann,  M.  Wilm,  Anal  Chem  66  (1994)  4390.
非特許文献４：  D.N.  Perkins,  D.J.  Pappin,  D.M.  Creasy,  J.S.  Cottrell,
Electrophoresis  20  (1999)  3551.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで、本発明は上記の事情に鑑み、MSを用いてペプチドのアミノ酸配列を決定し同定する際に、同定エンジンから出力される候補リスト中のアミノ酸配列が正しいか否かを検定するための、付加的な情報をMSから得ることを本発明の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、MSから得られる付加的な情報のうち、ペプチドの同位体比に着目した。ペプチドを構成する元素の同位体比は、地球上では普遍的に一定である。同定エンジンから出力されるアミノ酸配列から、当該ペプチドを構成する元素の組成比が計算でき、元素の組成比から各元素の同位体比を基にペプチドの同位体比が計算できる。もし計算された同位体比が、MSにより実測された同位体比と一致すれば、出力されたアミノ酸配列は正しいことが評価されると考えた。【００１０】
本発明の第一の態様では、ペプチドの質量分析により得られたペプチドの質量情報及び/又はペプチドの修飾情報を基に、ペプチドに関するデータベースを検索することにより推定されたアミノ酸配列を検定する方法であって、（１）前記推定したアミノ酸配列及び/又はペプチドの修飾情報から、ペプチドの同位体比の理論値を算出する工程と、（２）前記ペプチドの質量情報から、ペプチドの同位体比の測定値を測定する工程と、（３）前記理論値と前記測定値とを比較し、前記理論値と前記測定値との差異から、推定されたアミノ酸配列の妥当性を評価する工程と、を含む推定されたアミノ酸配列の検定方法を提供する。【００１１】
本発明に係る検定方法の好ましい態様によれば、（４）前記妥当性の評価に基づき、前記推定されたアミノ酸配列が正しいか否かを判断する工程を、あるいは、前記妥当性を反映したパラメータの値に基づいて、前記推定されたアミノ酸配列から１又は複数のアミノ酸配列を選択する工程をさらに含む。【００１２】
本発明に係る検定方法の好ましい態様によれば、前記選択工程は、前記パラメータが所定の値以上であるアミノ酸配列を前記推定されたアミノ酸配列から選択する。【００１３】
また、本発明の第二の態様では、質量分析装置と、演算部を有するコンピュータとを備え、前記質量分析装置にて得られたペプチドの質量情報及び/又はペプチドの修飾情報を基に、ペプチドに関するデータベースを検索することにより推定されたアミノ酸配列を検定する装置であって、前記演算部は、前記ペプチドの質量情報及び/又はペプチドの修飾情報を受けた後に、（ａ）前記推定したアミノ酸配列及び/又はペプチドの修飾情報から、ペプチドの同位体比の理論値を算出する算出手段と、（ｂ）前記ペプチドの質量情報から、ペプチドの同位体比の測定値を測定する測定手段と、（ｃ）前記理論値と前記測定値とを比較し、前記理論値と前記測定値との差異から、前記演算部が推定したアミノ酸配列の妥当性を評価する評価手段と、を備える検定装置を提供する。【００１４】
本発明に係る検定装置の好ましい態様によれば、（ｄ）前記妥当性の評価に基づき、前記演算部は前記推定されたアミノ酸配列が正しいか否かを判断する判断手段をさらに備える、あるいは、前記推定されたアミノ酸配列の妥当性を反映したパラメータの値を計算される計算手段をさらに備え、前記パラメータに基づいて、前記推定されたアミノ酸配列から１又は複数のアミノ酸配列を選択する。【００１５】
本発明に係る検定装置の好ましい態様によれば、前記選択は、前記パラメータが所定の値以上であるアミノ酸配列を前記推定されたアミノ酸配列から選択する。【００１６】
さらに、本発明の第三の態様では、ペプチドの質量分析により得られたペプチドの質量情報及び/又はペプチドの修飾情報を受けるコンピュータに、ペプチドに関するデータベースを検索することにより推定されたアミノ酸配列を検定させるためのプログラムであって、（i）コンピュータが備える演算部へ前記ペプチドの質量情報及び/又はペプチドの修飾情報を入力する工程と、（ii）前記演算部が、前記推定したアミノ酸配列及び/又はペプチドの修飾情報から、ペプチドの同位体比の理論値を算出する工程と、（iii）前記演算部が、前記ペプチドの質量情報から、ペプチドの同位体比の測定値を測定する工程と、（iv）前記理論値と前記測定値とを比較し、前記理論値と前記測定値との差異から、前記演算部が推定したアミノ酸配列の妥当性を評価する工程とを実行するプログラムを提供する。【００１７】
本発明に係るプログラムの好ましい態様によれば、（v）前記妥当性の評価に基づき、前記演算部が前記推定されたアミノ酸配列が正しいか否かを判断する工程を、あるいは、前記推定されたアミノ酸配列の妥当性を反映したパラメータの値に基づいて、前記推定されたアミノ酸配列から１又は複数のアミノ酸配列を選択する工程を、さらに含む。【００１８】
本発明に係るプログラムの好ましい態様によれば、前記選択は、前記パラメータが所定の値以上であるアミノ酸配列を前記推定されたアミノ酸配列から選択する。【００１９】
さらにまた、本発明の第四の態様では、前述の第三の態様によるプログラムを格納したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。【００２０】
なお、本発明に係るプログラムは、本発明による検定方法の各工程をコンピュータにて実行させるものであるが、CD-ROM、磁気ディスク、半導体メモリなどの各種記録媒体を通じてコンピュータにインストールまたはダウンロードすることが可能である。【００２１】
また、本発明で用いる用語「ペプチドの質量情報」とは、質量分析により得られるペプチドのM/Zの値を含む、質量分析により得られる情報をいう。さらに、本発明で用いる用語「ペプチドの修飾情報」とは、生体内で、あるいはペプチド調製中にペプチドに加えられる修飾に関する情報をいうが、無修飾のペプチド情報をも含む。生体内で加えられる修飾には、リン酸化、糖鎖の付加、脂肪酸の付加等が挙げられ、ペプチド調製中に加えられる修飾には、酵素消化、還元、アセチル化等が挙げられる。さらにまた、本発明で用いる用語「ペプチドの質量情報を、ペプチドに関するデータベースと検索することにより推定されたアミノ酸配列」とは、PMF法やMSMS処理により推定されるアミノ酸配列をいう。ここで、「ペプチドに関するデータベース」には、タンパ質データベースまたは核酸データベースを指し、タンパク質データベースとしてはNCBInrデータベース等が、核酸データベースとしては、GenBankデータベース等が挙げられる。また、「推定されるアミノ酸配列」には、修飾されたアミノ酸、たとえばリン酸化、糖鎖の付加、脂肪酸の付加等がされたアミノ酸が含まれていてもよい。
【発明の効果】
【００２２】
本発明により、MSにより得られた質量情報あるいはアミノ酸配列情報を基に、データベース検索を行って推定されたアミノ酸配列が正しいか否かを評価するにあたり、MSスペクトルの同位体比という付加的な情報を用い、その推定アミノ酸配列の妥当性の検定方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形態で実施することができる。【００２４】
本発明により検定されるアミノ酸配列は、PMF法により得られたペプチドの質量情報からデータベースを検索する方法（非特許文献１）、及びタンデムマススペクトルから得られたペプチドのアミノ酸配列情報からデータベースを検索する方法（非特許文献２〜４）により推定されたアミノ酸配列である。【００２５】
なお、MSによる測定の結果から得られたデータを用いてペプチドを同定する方法は、得られたデータを市販のソフトフェア、たとえば、SonarMSMS（Genomic  solution社）およびデータベース、たとえば、NCBInr（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、IPI、
Sport等のデータベースを使用することにより解析し、自動同定が可能である。MSによる測定データを用いて、ペプチドのアミノ酸配列を推定することは当業者にとって容易である（Nat  Genet.  1998:  20,  46-50;  J  Cell  Biol.  1998:  141,  967-977;  J  Cell  Biol.  2000:  148,  635-651;  Nature.  2002:  415,  141-147;  Nature.  2002:  415,  180-183;  Curr  Opin  Cell  Biol.  2003:  15,  199-205;
Curr  Opin  Cell  Biol.  2003:  7,  21-27参照）。【００２６】
以下に、推定されるアミノ酸配列を検定する方法について、詳しく記載する。
１．推定されるペプチド配列から、ペプチドの同位体比を計算する工程
ペプチドの構成元素は、アミノ酸の構成元素より容易に計算される。ペプチドの同位体比は、構成元素より安定同位体天然存在比とその質量数を基に算出できる（J.A.  Yergey,  Int.  J.  Mass  Spectrom.  Ion  Phys.  52  (1983)  337.）。1H,  2H,  12C,  13C,  14N,  15N,  16O,  17O,  18O,  32S,  33S,  34S,  36Sの天然存在比を用いると、全ての構成元素が最も軽い質量数の元素である１番目の同位体ピークの構成比は、下記式１のX0の係数として、構成元素のうちの一つが質量数の多い同位体と置き換わった２番目の同位体ピークの構成比は、下記式のX1の係数として、以下、n個が質量数の多い同位体と置き換わったn+1番目の同位体ピークの構成比は、下記式のXnの係数として計算される。なお、各元素の天然存在比は、たとえば、J.A.  Yergey,  Int.  J.  Mass  Spectrom.  Ion  Phys.  52  (1983)  337.のTable  3（347頁）に記載されている（表１参照）。【００２７】
【表１】
0004614960.tif 000002
【００２８】
【数１】
0004614960.tif 000003
【００２９】
具体的には、1番目の同位体ピークの構成比及び2番目の同位体ピークの構成比は、下記の通り、式１のX0・X1の係数として算出できる。【００３０】
【数２】
0004614960.tif 000004
【００３１】
同様に、3番目の同位体ピークの構成比も、式１のX2の係数として算出することができ、それ以下の構成比もX3・X4…として同様に算出することができる。また、リン（P）、その他の元素を含むペプチドについても、式１にP、その他元素の項を付け加えることにより同様に計算できる。場合によっては、特定のアミノ酸を安定同位体で標識することも許される。この場合には、標識されたアミノ酸について、安定同位体天然存在比に代えて標識アミノ酸の同位体存在比を用いて、ペプチドの同位体比を計算する。標識は培養液に安定同位体標識アミノ酸を加えて代謝的に標識しても、ペプチドを安定同位体標識化合物により化学的に修飾してもよい。【００３２】
２．ペプチドの同位体比を測定する工程
ペプチドの同位体比の測定値は、ペプチドのMSスペクトルから測定される。MSからは、図１に示すようなスペクトルが得られるが、最初の質量最小のピークが全ての構成元素が最も軽い質量数の元素で構成されるペプチドであり、2番目のピークが構成元素のうちの一つが、質量数が１つ多い同位体と置き換わったペプチドである。同位体比は、それぞれのピークの最大値（ピークの高さ）又はピーク面積から得ることができる。場合によっては、MSスペクトルの測定値から誤差を取り除く操作をすることも許される。たとえば、LCMSなどのように、同一ペプチドのスペクトルがクロマトグラフィーの溶出時間に従って経時的に複数得られている場合、対応するピークの高さ又は面積を平均化して同位体比測定値とすることも許される。また、各ピーク高さ（面積）の差をとることにより、バックグラウンドの影響を除き、その後、比を取ってもよい。このような操作は、液体クロマトグラフィーのピークから定量値を得る際に通常行われるものであって、それら方法をMSスペクトルのピークに対して応用することも許される。【００３３】
３．同位体比の理論値と測定値を比較し、アミノ酸配列の妥当性を評価する工程
前記１．から得られた理論値と前記２．で得られる測定値を比較して、推定されたアミノ酸配列が正しいか否かを評価する。同位体比の測定値と理論値を標準化し、その値が揃っていれば推定されたアミノ酸配列が正しいと判断され、揃っていなければ誤っていると判断される。標準化の方法としては、たとえば、1番目のピークに対する比率をとる方法、最も高いピークに対する比率をとる方法、または全体を1とした時の存在比率として表す方法が挙げられる。また、上記標準化した値をグラフとして表示し、揃っていれば推定されたアミノ酸配列が正しいと判断され、揃っていなければ誤っていると判断してもよい。たとえば、後述する実施例の図２及び３は正しい配列と判断され、他方、後述する実施例の図４は誤った配列であると判断される。【００３４】
本発明において、推定されたアミノ酸配列が正しいか否かの評価は、得られた理論値と測定値に統計的な処理を施して判断することが望ましい。統計的な処理としては、特に限定されないが、理論値に対して測定値を直線回帰する方法等が挙げられる。直線回帰は、たとえば、Microsoft  ExcelのLINEST関数により計算できる。理論値と測定値を示す点が回帰直線に近ければ正しい配列であると判断され、離れていれば誤っていると判断される。また、理論値と測定値の間の相関係数が高ければ、好ましくは0.98以上、更に好ましくは0.99以上であれば推定されたアミノ酸配列が正しいと判断され、低ければ、好ましくは0.98以下であれば誤っていると判断される。統計的な手段は上記方法に限られず、たとえば、標準化した理論値と測定値の間の誤差をχ二乗検定するなどの方法により検定を行ってもよい。【００３５】
これらの検定の結果は、アミノ酸配列を推定するときの正しさの指標、たとえば、データベース検索エンジン（たとえば、マスコット）のスコアの同定判定の閾値などと共に総合的に判断して、推定されたアミノ酸配列が一つの場合には、その推定アミノ酸配列が妥当なものであるか、また、推定されたアミノ酸配列が複数ある場合には、当該推定されたアミノ酸配列から１又は複数の妥当なアミノ酸配列の選択が正しいか否かの評価を行うことができる。また、データベース中のアミノ酸配列に対して同位体比による評価を行い、候補アミノ酸配列を推定するためのパラメータとして使用することも可能である。【００３６】
本発明に係る検定方法について説明する。図５は、質量分析装置による質量分析後、本発明に係る検定方法のスキームを示す。本発明に係る検定方法は、まず、ペプチドの質量分析の結果であるペプチドの質量情報及び／又はペプチドの修飾情報や推定された１又は複数のアミノ酸配列が入力される（図５の工程Ｓ１１参照）。この場合、入力される側は、後述する本発明に係る検定装置を構成する解析装置である。そして、このアミノ酸配列は、前述のように各種のデータベースを検索することにより推定されることは当業者には容易に理解できる。このアミノ酸配列から、ペプチドを構成する構成元素とその元素の数が判明する。【００３７】
次いで、工程Ｓ１２にて、推定されたアミノ酸配列の情報及び/又はペプチドの修飾情報、特にアミノ酸の構成元素に関する情報に基づいて、前述のペプチドの同位体比を計算する方法からペプチドの同位体比の理論値を算出する。一方、工程Ｓ１３では、実際に測定されたペプチドの質量情報からペプチドの同位体比の測定値を求める。【００３８】
以上のように、同位体比の理論値および測定値の値から、かかる値の差異を評価する（工程Ｓ１４参照）。この場合、差異を評価する基準としては、直線回帰における相関係数やχ二乗検定等のパラメータを基準とすることができる。そして、その評価基準の結果から、所定の基準値に照らして、工程Ｓ１５にて推定されたアミノ酸配列が正しいか否かを判断する。この判断の際、前述の統計的処理を行うこともできる。【００３９】
具体的には、統計的処理の結果から、アミノ酸配列の妥当性を反映したパラメータ、たとえば、相関係数や回帰直線の相関係数の値から判断することができる。推定されたアミノ酸配列が一つのとき、前記パラメータの値が所定の値以上である場合、当該推定が妥当であると判断される。一方、前記パラメータの値が所定の値以下である場合には、当該推定は正しくないと判断される。この所定の値は予め設定することにより、推定されたアミノ酸配列の妥当性の評価・判断を容易に行うことができる。【００４０】
さらに、推定されたアミノ酸配列が複数あるとき、前記アミノ酸配列の妥当性を反映したパラメータの値が所定の値以上である、１又は複数のアミノ酸配列を、前記推定されたアミノ酸配列から選択することができる。このようにして、推定されたアミノ酸配列が１又は複数ある場合、その妥当性を反映したパラメータの値から、推定アミノ酸配列の正誤を評価することが可能となる。【００４１】
図６は、本発明による検定方法に係るプログラムを、コンピュータにて実行させる検定装置の機能ブロック図を示す。なお、図６では、本発明に関連する部分のみを概念的に示し、マイクロコンピュータから構成される。【００４２】
本発明に係る検定装置１０は、概略的には、質量分析装置２０と、その質量分析装置２０にて得られた質量分析に関するデータを処理・加工する解析装置３０とを備える。そして、検定装置１０は、ネットワーク５０を介して通信可能も接続した、アミノ酸配列決定用の外部分析プログラム（不図示）を提供する外部装置４０を、さらに備える。なお、図５に示すネットワーク５０は、解析装置３０と外部装置４０とを相互に接続する機能を有し、たとえば、インターネット等である。本発明にて用いられる質量分析装置２０は、特に限定されるものではなく、市販の質量分析装置であればよい。そして、前記質量分析装置２０は、それ自体に該装置にて測定して得られた結果を保存するデータ保存部２５を備えていてもよい。また、本発明に用いられる質量分析装置２０は、それ自体に装置を制御する制御部や入出力部を備えるものであってもよく、さらに、ネットワーク５０を通じて外部装置４０と接続していてもよい。図５に例示する外部装置４０は、ネットワーク５０を介して、質量分析に関する情報を解析する解析装置３０と相互に接続され、利用者に対してアミノ酸配列情報等に関する外部データベースやホモロジー検索等の外部分析プログラムを実行するウェッブサイトを提供する機能を具有する。【００４３】
ここで、外部装置４０は、ＷＥＢサーバやＡＳＰサーバ等として構成してもよく、そのハードウェア構成は、一般に市販されるワークステーション、パーソナルコンピュータ等の情報処理装置及びその付属装置により構成してもよい。また、外部装置４０の各機能は、外部装置部のハードウェア構成中のＣＰＵ、ディスク装置、メモリ装置、入力装置、出力装置、通信制御装置等およびそれらを制御するプログラム等により実現される。本発明では、前記外部装置部としてNCBInr等のデータベースを利用することができる。【００４４】
図６に示す解析装置３０は、概略的には、質量分析装置２０の全体を統括的に制御するＣＰＵ等の演算部６０、通信回線等に接続されるルータ等の通信装置（不図示）に接続される通信制御インターフェース部７０、質量分析装置２０、およびディスプレイやプリンター等の出力装置９０に接続される入出力制御インターフェース部８０、および各種のデータベースを格納する記憶部１００を備えて構成される。各部は任意の通信路を介して通信可能に接続される。さらに、本発明による解析装置３０は、ルータ等の通信装置及び専用線等の有線又は無線の通信回線を介して、ネットワークに通信可能に接続されている。記憶部１００に格納される各種のデータベース（質量分析データやアミノ酸配列データ等）は、固定ディスク装置等のストレージ手段であり、ファイルやデータ等を格納する。前記記憶部１００の各構成要素のうち、質量分析データは、質量分析装置２０にて得られたペプチドの質量情報等である。また、アミノ酸配列データは、質量分析装置にて得られた質量分析スペクトルの解析結果としてのアミノ酸配列データや、インターネットを経由してアクセス可能な外部のアミノ酸配列データであってもよい。さらに、これらのデータベースをコピーしたり、オリジナルの配列情報を格納したり、さらに独自の識別番号を付与し作成したインハウスデータであってもよい。【００４５】
演算部６０は、本発明に係る解析方法を実行するプログラムを格納し、前記解析装置３０を、ひいては検定装置１０の全体を制御する装置である。前記演算部６０は、ＯＳ（operating  system）等の制御プログラム、各種の処理手順等を規定したプログラム、および所要データを格納するための内部メモリ（不図示）を有し、これらのプログラム等により、種々の処理を実行するための情報処理を行う。なお、本発明に係る検定方法を実行するプログラムは、前記記憶部１００に格納されていてもよい。【００４６】
図７は、本発明に係る検定方法を実行するプログラムを、概念的に表すフローチャートである。工程Ｓ２１にて、演算部６０は、質量分析装置２０にて得られたペプチドの質量情報及び／又は修飾情報、あるいはかかる情報を、ペプチドに関するデータベースと検索することにより推定された、１又は複数のアミノ酸配列、たとえば、通信制御インターフェース部を介したインターネット５０を通じて、外部のデータベース、たとえば、NCBInrデータベースと照合させながら、MS/MS処理により推定されたアミノ酸配列に関する情報を取得する。そして、必要に応じて、この取得した質量分析データを記憶部１００に保存するが、その際に、後述する解析の便宜のため、データ検索を容易にするように、各質量分析データに、スキャン番号等の識別番号を付与してもよい。一方で、本発明に係る検定装置１０の演算部６０が、質量分析装置２０にて得られたペプチドの質量情報及び/又修飾情報を取得した後、演算部６０にて、外部のデータベースと照合させながら、MS/MS処理により推定されたアミノ酸配列に関する情報を取得してもよい。【００４７】
工程Ｓ２２に示すように、取得した推定アミノ酸配列及び/又はペプチドの修飾情報から当該ペプチドの同位体比の理論値を算出する。この理論値とは、ペプチドのアミノ酸配列からペプチドの構成元素が求まり、この構成元素より安定同位体天然存在比とその質量数から算出される値である。他方、工程Ｓ２３において、前記ペプチドの質量情報から、ペプチドの同位体比の実際に測定された測定値を求める。【００４８】
次いで、工程Ｓ２４において前記理論値と前記測定値との差異を求め、当該差異の値から、ペプチドの推定されたアミノ酸配列の妥当性を評価する（工程Ｓ２５参照）。この妥当性の評価は、得られた理論値と測定値に統計的な処理を施して判断することが望ましい。統計的な処理としては、理論値に対して測定値を直線回帰する方法等が挙げられる。そして、推定されたアミノ酸配列が一つの場合には、この理論値と測定値が略一致したとき、たとえば、妥当性を反映したパラメータである、直線回帰における相関係数の値が0.98以上のとき、より好ましくは0.99以上のときは、推定されたアミノ酸は正しい配列であると判明する。【００４９】
一方、推定されたアミノ酸配列が複数ある場合、推定アミノ酸配列が正しいか否かの判断は、前記パラメータの値が所定の値以上である１又は複数のアミノ酸配列を、推定されたアミノ酸配列から選択することにより行うことができる。【００５０】
そして、推定アミノ酸配列が正しいか否かの判断は、妥当性を反映したパラメータ、好ましくは直線回帰における相関係数の値が所望の値以上である、０、１又は複数のアミノ酸配列を推定されたアミノ酸配列から選択することにより行うことができる。ここで、０とは推定アミノ酸配列中に正しいと判断されたアミノ酸配列は含まれていなかったことを意味する。また、前記パラメータが直線回帰における相関係数の場合、所望の値として、０．９８以上の値、好ましくは０．９９以上の値を設定することができる。【００５１】
その後、必要に応じ、演算部で解析されたパラメータの値等のデータをディスプレイ若しくはプリンター等の出力装置９０に表示若しくは印字することができる。【００５２】
図８は、本発明に用いる演算部６０の詳細な構成を示す機能ブロック図である。前述のように、図７で説明した本発明に係る検定方法を実行するための演算部６０は、質量分析装置２０にて得られたペプチドの質量情報を、入出力制御インターフェース部８０を通じて受け取る。本発明の演算部６０は、算出手段６２と、測定手段６４と、評価手段６６と、判断手段６９又は計算手段６８とを備える。前記算出手段６２は、外部のデータベースにて推定されたアミノ酸配列及び／又はペプチドの修飾情報から、ペプチドの同位体比の理論値を算出する。一方、前記測定手段６４は質量分析装置２０からのペプチドの質量情報からペプチドの同位体比の測定値を測定する。そして、前記算出手段６２と前記測定手段６４にて得られた同位体比の理論値および測定値を基づいて、前記評価手段６６では理論値と測定値の差異を見積もる。この評価手段６６では、理論値と測定値との乖離を見積もるものである。この乖離は、推定されたアミノ酸配列の妥当性を反映したパラメータにより見積もることができる。そして、前記評価手段６６は、このパラメータの値を計算する計算手段６８を備え、推定アミノ酸配列の妥当性を評価する。【００５３】
さらに、計算手段６８における結果を踏まえ、判断手段６９では、推定されたアミノ酸配列が正しいか否かの判断を行う。これは、同位体比の理論値と測定値の間の乖離の値から、統計的に有意な差がない場合には推定されたアミノ酸配列は正しいと判断される一方で、統計的に有意な差がある場合には推定されたアミノ酸配列は正しくないと判断される。具体的には、計算手段６８の結果であるパラメータの値から、同位体比の理論値と測定値との間に乖離が観測された場合には、たとえば、パラメータの所定の値として、直線回帰における相関係数の値が0.98以下の場合、推定されたアミノ酸配列は正しくないと判断できる。【００５４】
本発明に用いる演算部６０は、解析装置３０に配置された構成で説明したが、必要に応じて、質量分析装置２０に配置された構成でも、本発明に係る検定方法を実施することはできる。
【実施例】
【００５５】
本発明を以下の実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。本発明の記載に基づき、種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に包含される。【００５６】
以下に、MSから得られたアミノ酸配列情報を基にデータベース検索を行い、推定されたアミノ酸配列を同位体の存在比により検定した具体例を示す。【００５７】
サンプルとして、マウスの全脳を摘出し凍結保存した。テフロンRホモジナイザーにてホモジナイズし、500  x  g  5分間の遠心分離により未破壊の細胞、核などを除去した。次に、その上清を100,000  x  g  1時間の遠心分離することにより可溶性画分を調製した。タンパク質量を測定したところ、3.12mg/mLであった。これを分画したサンプルとした。【００５８】
続いて、各分画したサンプルにつき2mLずつ（1mLチューブ2本ずつ）につき以下の操作を行った。尿素（Bio-Rad社Cat.  No.  161-0731）を加えて8Mとし、1mLあたり
3mgのディチオスレイトール（和光純薬Cat.  No.  045-08974:  DTT）を加えた0.5M  Tris緩衝液（pH  8.3,  Sigma社製）500μLを各分画したサンプルに加え、37度で3時間インキュベーションしてタンパク質中のシステイン残基を還元した。その後、尿素を加えて8Mとし、8mgのアクリルアミド(Bio-Rad社製Cat.  No.  161-0107)を加えた0.5M  Tris緩衝液(pH  8.3)  500μLを、各分画したサンプル加えて室温で3時間インキュベーションしてシステイン残基をアルキル化した。そこに8mgのDTTを加えることで過剰のアクリルアミドを失活させた。分子量1万カットの透析チューブSnakeSkin（ピアス社、Cat.  No.  68100）を使い、1000倍量の10mMの炭酸水素アンモニウム緩衝液により、4℃にて、1昼夜透析して還元アルキル化試薬を除去し、当該分画したサンプルをSpeedVacにて凍結乾燥した。【００５９】
この各分画したサンプルを8Mの尿素を含む0.2％ベータ・オクチルグルコシド水溶液200μLで再溶解し、50mMの炭酸水素アンモニウムで5倍に希釈し、計1mLとした。タンパク質量0.3mgに対して100μLのトリプシン（プロメガ社製、Cat.  No.  V5111）を加えて37℃にて24時間消化を行った。消化したサンプルに50μLのアンモニア水と0.5mLの超純水を加えて2万Gで1分間遠心し、上清をアニオン交換カラム（Mini-Q  PC  3.2/3:  Amersham  Biosciences  Cat.  No.  17-0686-01）に注入した。HPLC条件は、流速が毎分0.2mL、UV検出波長が235nm  &  280nmとした。移動相Aが25mMのアンモニアに5 ％アセトニトリル、移動相Bが1Mの酢酸アンモニウムでpH  8.6に5％アセトニトリルとし、グラディエントは、最初5分間が100％移動相Aで、その後40分かけて移動相濃度を直線的に40％まで増加させ、その後15分間で移動相Bを100％として5分間流した。1分毎に分画し、カラムから溶出してくるフラクションを、TFAを加えることにより酸性とした。27分から30分までの分画試料を選び、あらかじめアセトニトリルで洗浄後0.l％  TFA水でコンディショニングしておいたStageTip  C18(自家製、J.
Rappsilber,  Y.  Ishihama,  M.  Mann,  Anal  Chem  75  (2003)  663)にアプライし、続いて5％アセトニトリルを含む0.1％  TFA水  20μLで3回洗浄、5μLの70％アセトニトリルを含む0.1％  TFA  水で溶出することにより脱塩した。Speedvacで溶媒を揮発させ、5μLの5％アセトニトリルを含む0.1％  TFA水で再溶解した。【００６０】
次に、このHPLCにより分離したサンプルをLC（C18  column）／MS（Applied  
Biosystems／MDS-Sciex  QSTAR  Pulsar  i）で測定を行った。このときの条件は、HPLC側としてはC18シリカゲル（ReproSil-Pur  120  C18-AQ,  3μm）を充填した自家製のエレクトロスプレー一体型カラム（Y.  Ishihama,  J.  Rappsilber,  J.S.  Andersen,  M.  Mann,  J  Chromatogr  A  979  (2002)  233.）0.1  x  150mmに移動相Aとして0.5％酢酸水、移動相Bとして80％アセトニトリルを含む0.5％酢酸水を用いて、初期B濃度を5％として、最初の5分間で移動相Bを直線的に10％、次の60分間で直線的に30％、その後5分間で直線的に100％とし、その後移動相Bを100％にして10分間維持、その後移動相Bを5％として30分後に次のサンプルを注入した。装置には島津製作所のLC-10AシリーズのROMをミクロ対応として、また、ミキシングチャンバーとしては付属の島津製作所製を外してバルコ社のTコネクターを採用した。流速としては、
Flow-splitting方式を採用し、カラムには約毎分200〜400nLの流速となるように調整した。サンプルをCTC社のオートサンプラーPALによって3μL注入し、サンプルを一度インジェクターのサンプルループに注入した後に分析カラムに送り込んだ。Protana社製XYZステージを装備したApplied  Biosystems/MDS-Sciex社のQSTAR  Pulsar  iに日京テクノス社に特注したカラムホルダーを装着し、エレクトロスプレー一体型カラムの位置を任意に調整できるようにした。ESI電圧として2.4kVをカラムのポンプ側のバルコ社製金属コネクターを通して印加した。測定は、Information  dependent  acquisitionモードで、1秒間のSurveyスキャンの後、最大4つのMSMSスキャン（各1.5秒）を行った。MSMS  modeからSurvey  scan  へのスイッチは１スペクトルとした。【００６１】
得られたデータについては、Mascot  (Matrixscience社)およびNCBInrデータベース用いてタンパク質の自動同定を行った。出力された結果の中から、表１に記載する３つのペプチドを選択して同位体比による検定を行った。【００６２】
【表２】
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【００６３】
マスコットスコアの同定判定の閾値（95 %）は37であるので、No.1及び2のペプチドは正しく同定されており、No.3のペプチドは正しく同定されていないと考えられる。これら３つのペプチドの分子式より、同位体比の理論値をQSTARの測定ソフトウェアであるAnalyst  QS  (Applied  Biosystems/MDS-Sciex)の付属機能（Tools/Calculators/
Isotope  Distribution）を用いて算出した。また、同位体比の測定値をAnalyst  QSのピークインテグレーション機能を用いて各同位体のピーク高さ（強度）及び面積を求め、理論値と比較した。No.1〜3のペプチドについての結果を、それぞれ、図２〜４に示した。【００６４】
マスコットスコアから正しく同定されていると考えられるNo.1及び2のペプチドでは、同位体比の理論値と測定値が良く一致するのに対し、正しく同定されていないと考えられるNo. 3のペプチドでは、理論値と測定値の乖離が見られた。【００６５】
同位体比の理論値及び測定値（ピーク高さ及びピーク面積）をMicrosoft  Excelの
LINEST関数を用いて直線回帰した。正しく同定されていると考えられるNo.1及び2のペプチドでは、相関係数（R2）が0.99以上と高い相関を示したのに対し、正しく同定されていないと考えられるNo.3のペプチドでは相関係数が0.97となり、理論値と測定値の間で相関を取ることにより、推定アミノ酸配列の妥当性を検定できることが明らかとなった。【００６６】
次に、同位体比の実測値を用いて、データベース中の全ペプチドの同位体比と比較し、候補ペプチド群を選択する場合の実施例について説明する。図２のスペクトルが得られた場合について、同位体比の実測値をデータベース中の当該分子量の全ペプチドの同位体比と比較し、候補ペプチド群を選択した。図２スペクトル中のペプチド同位体のピーク間のm/zの差より、荷電数は３であり、従ってペプチドの質量数の実測値は2328.9である。International  protein  index  (IPI)  database
(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/IPI/current/ipi.MOUSE.fasta.gz)のJuly 1, 2004 versionのMOUSEタンパク質（40,981個）を用いてin  silicoでトリプシン消化し、得られたペプチドから5残基以上で配列がユニークなものは753,926個であった。図２から得られた同位体比（実測値）を、このペプチド群の同位体比（理論値）に対し回帰し、その時の回帰直線の相関係数を算出した。図９は、質量数が近傍（2328.9
‐1Da、2328.9Da、2328.9＋1Da）のペプチド群についての結果を示す。【００６７】
相関係数のクライテリアは測定装置、条件によって変動するが、推定されたアミノ酸配列の妥当性を反映したパラメータである係数を0.99以上とした場合には、質量数から選ばれた候補ペプチド360個から、同位体比により160個に絞り込まれた。この絞り込まれた配列に、図９中に△で示されたマスコットにより正しい配列として選ばれた候補配列が含まれていたことが判明した。【００６８】
同様に、図４のスペクトルが得られた場合、上記と同様、同位体比の実測値を
753,926個のペプチドの理論同位体比に対して回帰分析し、その回帰直線の相関係数を調べた。図１０は、ペプチドの質量数939.39の近傍（プラスマイナス1Da）についてのデータを示す。マスコットによる候補配列は、図１０中にて△で示した。相関係数のクライテリアを0.99以上とした場合、候補ペプチドは1203個から362個に絞り込むことが可能であり、マスコットにより誤っているとされた配列は、候補ペプチド群から除外することが可能であった（図１０参照）。【００６９】
ペプチドがトリプシン消化により生成したペプチドであるという情報を基に、同位体比から候補ペプチドを絞り込むこと、つまり、推定されたアミノ酸配列から複数のアミノ酸配列を選択することが可能であり、絞り込まれた配列はマスコットによる正誤判定と矛盾しないものであった。同位体比は、候補ペプチドの絞り込みの新たなパラメータとして使用可能であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明によれば、プロテオーム技術においてペプチドを同定するにあたり、MSにより得られた質量情報あるいはアミノ酸配列情報を基に、データベース検索を行って推定されたアミノ酸配列が正しいか否かの評価を、MSスペクトルから得られる同位体比という付加的な情報を用いることが可能となり、ペプチドの同定をより精度高く行うことができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】代表的なペプチドの質量分析スペクトルの一例を示す。
【図２】本発明の一の実施例における、ペプチドのMSスペクトルからの同位体比の測定値および推定されたアミノ酸配列から計算される理論値と、その測定値および理論値との相関関係を示す図である。（Ａ）はMSスペクトルのピーク高さにおける関係を示し、（Ｂ）は測定値および理論値との相関関係を示す。
【図３】本発明の別の実施例における、ペプチドのMSスペクトルからの同位体比の測定値および推定されたアミノ酸配列から計算される理論値と、その測定値および理論値との相関関係を示す図である。（Ａ）はMSスペクトルのピーク高さにおける関係を示し、（Ｂ）は測定値および理論値との相関関係を示す
【図４】本発明のさらに別の実施例における、ペプチドのMSスペクトルからの同位体比の測定値および推定されたアミノ酸配列から計算される理論値と、その測定値および理論値との相関関係を示す図である。（Ａ）はMSスペクトルのピーク高さにおける関係を示し、（Ｂ）は測定値および理論値との相関関係を示す
【図５】図５は、質量分析装置による質量分析後、本発明に係る検定方法のスキームを示す。
【図６】図６は、本発明による検定方法に係るプログラムを、コンピュータにて実行させる検定装置の機能ブロック図を示す。
【図７】図７は、本発明に係る検定方法を実行するプログラムを、概念的に表すフローチャートである。
【図８】図８は、本発明に用いる演算部の詳細な構成を示す機能ブロック図である。
【図９】図９は、本発明の実施例において、質量数が近傍（2328.9‐1Da、2328.9Da、2328.9＋1Da）のペプチド群についての相関係数の結果を示す。
【図１０】図１０は、本発明の実施例において、ペプチドの質量数939.39の近傍（プラスマイナス1Da）についての相関係数の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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