(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ３ｂフラグメントまたはマンノース結合蛋白質と、該Ｃ３ｂフラグメントまたはマンノース結合蛋白質の、Ｃ末端に融合された、ＧＰＩ部分またはマウスＩｇＧ３の膜貫通領域と、からなる人工的なオプソニンが形質導入された、抗原を含む細胞を含む、哺乳動物に前記選択された抗原への免疫反応を誘導するための組成物であって、
前記人工的なオプソニンは、抗原提示細胞である第一細胞に結合する第一末端と、前記抗原を含む細胞である第二細胞に結合する第二末端とを含み、前記第二末端は前記第一末端とは異種性であり、
前記抗原提示細胞は、単球、マクロファージ、単球細胞系統、および樹状細胞から選択される、
免疫反応を誘導するための組成物。
【請求項２】
第一および第二末端を含む人工的なオプソニンが、生得的なオプソニンの抗原提示細胞結合ドメインを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
第一および第二末端を含む前記人工的なオプソニンが、前記抗原提示細胞によって、前記選択された抗原を含む前記細胞の食作用を刺激できる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記選択された抗原を含む前記第二細胞が、更に、第一および第二末端を含む前記人工的なオプソニンをコードする核酸を含み、第一および第二末端を含む前記人工的なオプソニンを発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
第一および第二末端を含む前記人工的なオプソニンが、前記選択された抗原を含む前記細胞に対し外因性である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記選択された抗原を含む前記第二細胞が分裂できない、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記選択された抗原を含む前記第二細胞が、病原性細胞である請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記選択された抗原を含む前記第二細胞が、悪性腫瘍細胞である請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記選択された抗原を含む前記第二細胞が、Ｔ細胞である請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記選択された抗原を含む前記第二細胞が、自己反応性Ｔ細胞である請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物がサイトカインを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記サイトカインが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびケモカインからなる群より選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物がワクチンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ワクチンが弱毒ワクチンである、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、免疫系に関し、特に、抗原に対する免疫応答を調節する組成物と方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オプソニンは、抗原と抗原提示細胞（APC）の両方に、同時に結合ないし接着することによって、抗原の結合、包含、およびインターナリゼーションがAPCによってより効率的に行われるように、抗原とAPCとの間の結合因子として作用することのできる分子である。このことは、APCがT細胞に抗原を提示するため、免疫応答の発生を促進するものと考えられている。天然のオプソニンは、外来抗原に対する第一線の防御と、個々の個体発生の過程で多様化することのない抗原認識レパートリーとを提供する先天性免疫系（先天性オプソニン）に属するものと、または、例えば、免疫グロブリンなど、個々の個体発生にわたって多様化する、抗原特異的な分子のレパートリーに基づいた後期防御機構を提供する後天性免疫系に属するものに分類することができる。
【０００３】
オプソニンファミリーには、補体成分C3およびC4の断片、コレクチン、および免疫グロブリンが含まれる。別のオプソニンには、フィブロネクチン、アルファ-2-マクログロブリン（a2m）、およびC反応性蛋白質（CRP）が含まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
抗原提示細胞による、抗原の取り込みを向上させ、改良されたワクチンを得るための組成物と方法とを提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、オプソニン強化細胞、すなわち、1)組換え核酸からオプソニンを発現するように改変され、2）内生的なオプソニンが、より高いレベルで発現されるように改変され、または、3）外来性のオプソニンと混合されている細胞が、患者に投与されたとき、その細胞に含まれるかもしくは接着している選択された抗原に対する、受容者での免疫反応を調節できるという発見に、少なくとも、一部は、基づいている。
【０００６】
したがって、本発明は、選択された抗原を、哺乳動物にワクチン接種する方法を包含し、この方法は、オプソニン強化細胞を含むワクチン組成物を哺乳動物に投与することを備え、このオプソニン強化細胞は、選択された抗原と、オプソニンをコードする核酸を含み、オプソニンをコードする核酸を発現させるものである。
【０００７】
また、本発明は、選択された抗原を、哺乳動物にワクチン接種する方法を包含するが、この方法は、オプソニン強化細胞を含むワクチン組成物を、哺乳動物に投与することを含むが、このオプソニン強化細胞は、選択された抗原を含み、外来性のオプソニンと混合されている。
【０００８】
好ましくは、外来性のオプソニンは、人工的なオプソニンである。
【０００９】
また、本発明は選択された抗原を、哺乳動物にワクチン接種する方法を包含するが、この方法は、選択された抗原がAPCによるインターナリゼーションに十分な時間、選択された抗原とオプソニンとを含むオプソニン強化細胞にインビトロでAPCを接触させることと、接触させたAPCを哺乳動物に投与することを含む。
【００１０】
好ましくは、このオプソニン強化細胞は、選択された抗原と、オプソニンをコードする核酸とを含む。このオプソニンは、外来性のオプソニン、および/または人工的なオプソニンであることが好ましい。
【００１１】
好ましくは、本発明の方法と組成物において、オプソニン強化細胞は、実質的に、インビトロでは分裂できない。「実質的に、インビトロでは分裂できない」とは、オプソニン強化細胞が、細胞分裂が抑制されるような処理を受けていない同一の細胞と較べて、約50％よりも低い速度で分裂することを意味する。
【００１２】
また、ワクチン組成物は、弱毒化されていて、そのために、細胞が病原性をもつ形態で惹き起こす病気の原因とならないようになっていることが好ましい。
【００１３】
好ましくは、オプソニンは、C3bのアルファ鎖の一つであるか、または、マンノース結合蛋白質である。
【００１４】
好ましくは、抗原は、悪性の腫瘍細胞などの病原性細胞である。
【００１５】
本発明は、また、選択された抗原、および、オプソニンをコードしている組換え核酸を含む病原性細胞を包含するが、この細胞は、コードされているオプソニンを発現し、このオプソニンは、フィブロネクチン、補体成分C1q、C1qA鎖、C1qB鎖、C1qC鎖、補体断片C3b、C3bi、C3d、C3dg、およびC4b、マンノース結合蛋白質、コングルチニン、界面活性蛋白質AおよびD、アルファ-2-マクログロブリン、および免疫グロブリン、および人工的なオプソニンからなるグループより選択される。
【００１６】
好ましくは、病原性細胞は、悪性の腫瘍細胞である。
【００１７】
病原性細胞は、病原性細菌、病原性真菌、病原性ウイルス、病原性寄生生物の細胞からなるグループより選択されることが好ましい。本発明が、オプソニン強化された細菌性の病原体を含む場合には、投与される細胞は、細胞に結合したオプソニンを含むことが好ましい。
【００１８】
本発明は、また、オプソニンをコードする組換え核酸、および抗原をコードする組換え核酸を含み、発現する宿主細胞も包含する。
【００１９】
好ましくは、この宿主細胞は、オプソニン、および抗原に対する担体として作用することのできる宿主細胞であるため、有核細胞でも原核細胞でもよい。本発明のこの局面においては、宿主細胞は、病原性を持たなくてもよいが、核酸が、その中に人工的に導入されている細胞であろう。このような細胞には、滑液細胞などの分化した間葉細胞を含む線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、内皮細胞、白血球、腫瘍細胞、細菌細胞、真菌細胞、寄生生物細胞が含まれるが、これらに限定はされない。
【００２０】
本発明は、また、人工的なオプソニンと混合された細胞を含む組成物を包含する。
【００２１】
好ましくは、この細胞は、病原性細胞である。
【００２２】
本発明は、また、オプソニンと混合された細胞を含む組成物を包含するが、この細胞は、実質的に、インビトロでは分裂できない。
【００２３】
好ましくは、この細胞は、病原性細胞である。
【００２４】
好ましくは、この組成物は、実質的に、培養培地を含まない。本明細書で用いられるとき、「培養培地」とは、細胞培養に用いられる、ウシ胎児血清などの動物血清を、少なくとも2％含む培地をいう。
【００２５】
本発明は、また、先天性オプソニンと混合された異種抗原を含む細胞を含む組成物を包含するが、この細胞は、実質的に、インビトロでは分裂できない。
【００２６】
好ましくは、この組成物は、実質的に培養培地を含まない。
【００２７】
本発明は、また外来の人工的なオプソニンで、例えば、コレクチンオプソニンのレクチン部位と、抗原を含む細胞の表面にある糖質との間に起こる相互作用のように、共有結合によるか、または、レセプター−リガンド結合反応によって細胞に結合することができる人工オプソニンと混合された異種抗原を含む細胞を含む組成物を包含する。
【００２８】
好ましくは、この細胞は、哺乳動物宿主の中では分裂できない。
【００２９】
本発明は、また、本質的に細胞とオプソニンからなる組成物を包含する。
【００３０】
好ましくは、この組成物は、さらに、生理学的に適合性のある緩衝液を含み、そして、さらに、細胞によって発現されるサイトカインを含む。
【００３１】
本発明は、また、本質的に細胞とオプソニンからなる組成物を包含するが、この細胞は、実質的に、インビトロでは分裂できない。
【００３２】
好ましくは、この組成物は、さらに、生理学的に適合性のある緩衝液を含む。
【００３３】
本発明の組成物は、また、細胞によって、好ましく発現されるサイトカインを含む。
【００３４】
本発明は、また、オプソニン強化細胞と、薬学的に許容される担体とを含むワクチン組成物を包含する。
【００３５】
本発明は、また、第一と第二の末端とを含むキメラ蛋白質をコードする核酸を包含するが、ここで、このキメラ蛋白質は、オプソニンに由来するAPC結合配列（部分または領域）を含む第一の末端によって、APCである第一の細胞に結合し、第二の末端によって、選択された抗原を含む第二の細胞に結合する。
【００３６】
好ましくは、この核酸はGPI修飾シグナル配列である。
【００３７】
また、融合蛋白質は、膜貫通配列を含んでいることが好ましい。
【００３８】
本発明は、また、天然のオプソニンのAPC結合部分と、細胞表面に結合する異種由来の部分とを含む、人工的なオプソニンを包含する。
【００３９】
好ましくは、この細胞表面に結合する異種由来部分は、GPI部分に含まれている脂質である。脂質を含むオプソニンは、脂質部分を細胞膜への脂質部分のインターカレーションによって、細胞に接着することができる。
【００４０】
本明細書で用いられるとき、「ワクチン接種する」という語は、選択された抗原に対する免疫応答を、この応答が、オプソニン強化細胞でないという以外はあらゆる面で同一である対応する細胞を投与して得られる応答に較べて、より効率的に、より迅速に、より高度に、および/または、より容易に誘導されるように調節することを意味する。
【００４１】
「免疫応答を調節する」という語は、選択された抗原に対する免疫応答の刺激/活性化を意味するか、または、選択された抗原に対する免疫応答の抑制、除去、または減衰を意味する。
【００４２】
「病原性」細胞とは、例えば、腫瘍細胞、自己反応性T細胞、病原性細菌、病原性真菌、または病原性寄生体などの、オプソニンを発現せず、病気の原因となりうる細胞である。本発明の目的にとって、病原性ウイルスは病原性細胞である。病原性細胞は、病原性細菌、真菌、寄生体、またはウイルスの弱毒化、不活性化、または殺菌によって改変することができる。
【００４３】
「外来性オプソニン」または「抗原」とは、細胞から導入されるか、または、細胞の外側に生成されるオプソニンを意味する。
【００４４】
「内生オプソニン」または「抗原」とは、細胞の中で、自然に発現するか、もしくは存在するオプソニンまたは抗原を意味する。
【００４５】
「異種オプソニン」または「抗原」とは、細胞の中で、自然には発現もしくは存在しないオプソニンまたは抗原を意味する。
【００４６】
オプソニン強化細胞のオプソニンは、細胞質の、表面の、または分泌される分子として発現される。しかし、オプソニンは、表面の、または分泌される分子として発現されるのが好ましい。
【００４７】
オプソニンと抗原とは同じでないことが好ましい。
【００４８】
もう一つの好ましい態様において、オプソニンは、膜貫通セグメントをもつ組換えオプソニンである。
【００４９】
もう一つの好ましい態様において、オプソニンは、人工的なオプソニンで、脂質を含む。さらに、別の好ましい態様において、この脂質は、グリコシルホスファチジルイノシトール部分によって、オプソニンと連結する。さらに、好ましい態様において、例えば、コレクチンなどのオプソニンは、非共有的に細胞に結合することができる。このような結合を促進するために、例えば、グリコシルトランスフェラーゼまたはグリコシダーゼで処理することによって、細胞を加工することができる。
【００５０】
例えば、C3bが、CD46によって不活性化されるように、細胞に含まれている分子によって、オプソニンを不活性化することができるときには、例えば、抗体などの不活性化因子の阻害因子も組成物に含まれる。
【００５１】
好ましくは、オプソニン強化細胞は、GM-CSF、IL12、IL10、IL14、またはケモカインなどのサイトカインと混合されているか、または、サイトカインをコードする遺伝子で形質転換されている。
【００５２】
本明細書で用いられるとき、「オプソニン」という語は、抗原を含む細胞と抗原提示細胞（APC）との両方に、同時に結合ないし接着することによって、APCによる、抗原を含む細胞の、より効率的な結合、包含、およびインターナリゼーションが行われるようにするために、抗原とAPCとの間の連結ないし結合因子（アダプター）として作用することができる、天然および非天然の分子を意味する。本発明に記載された、有用なオプソニンの定義に含まれるのは、非天然のオプソニンでは、天然のオプソニンに結合できるレセプターによって、APCに結合するものである。
【００５３】
本明細書で用いられるとき、「オプソニン」という語は、処理ステップのいくつかにおける、少なくとも一つの産物が、抗原を含む細胞とAPCとの両方に、同時に結合ないし接着していることによって、APCによる、他の抗原を含む細胞の、より効率的な結合、包含、およびインターナリゼーションが行われるようにするための連結ないし結合因子として作用することができるように処理することができる分子も意味する。オプソニンは、多鎖オプソニンのどのようなポリペプチド鎖であってもよい。
【００５４】
本発明の方法および組成物において有用なオプソニンの例には、以下のものが含まれる。すなわち、フィブロネクチン、補体成分C1q（これの成分のポリペプチド鎖A、BおよびCのいずれかを含む）、C3bやC4bなどの補体断片、マンノース結合蛋白質、コングルチニン、界面活性蛋白質AおよびD、C-反応性蛋白質（CRP）、アルファ-2-マクログロブリン、および、例えば、免疫グロブリンのFc部位などの免疫グロブリン。
【００５５】
「先天性オプソニン」とは、先天性免疫系のオプソニンであり、当技術分野においては、先天性免疫系の分泌ポリペプチド分子として知られており、また、抗原とAPCの表面とに同時に結合するものと考えられている。したがって、これらは、「架橋」として作用することができ、また、この特性によって、APCによる抗原のインターナリゼーションを促進すると考えられている。オプソニンが抗原に結合する様式はオプソニンによって異なり、共有的であったり、非共有的であったりする。一般的に、先天性オプソニンの抗原結合部分は、同じ種の構成メンバー間では比較的変異がなく、個体の発生過程において多様化を行なわないという点で、免疫グロブリンの抗原結合部分とは異なっている。
【００５６】
天然のAPC結合部分を含む分子は、APC結合部分が細胞外空間に存在するように、細胞に安定的に結合ないし接着させることのできる部分を含んでいれば、そのオプソニンが天然の抗原結合部位を含んでいてもいなくても、オプソニンと見做されるであろう。
【００５７】
「人工のオプソニン」には、本明細書において説明されるとき、細胞膜結合部分が、オプソニンの天然の抗原結合部位に置換されている分子、または、オプソニンの天然の抗原結合部位を修飾したり除去することなしに、細胞膜結合部分がオプソニンに結合している分子が含まれる。
【００５８】
人工オプソニンの「細胞膜結合部分」、すなわち、そこを介して、分子が細胞に安定的に結合することができる部分には、クロスリンク部分、膜貫通配列、および脂質部分が含まれるが、これらに限定はされない。好ましい態様において、脂質部分は、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）部分によって、人工オプソニンに結合している。本発明の別の好ましい態様において、細胞膜結合部分は、オプソニンの抗原結合末端で、オプソニン、または、抗原結合部位がトランケートされたオプソニンに結合している。別の好ましい態様においては、人工オプソニンは、APCに結合することのできる免疫グロブリンのイディオタイプ部位を含む。
【００５９】
オプソニンは、貪食作用を開始するレセプターに結合すること、および、非クロノタイプ的であって、例えば、クロノタイプレセプターのように、細胞による変化がないことが好ましい。非クロノタイプレセプターは、先天性免疫に関与する細胞の上に存在し、例えば、非−イディオタイプレセプターが含まれる。このようなレセプターの例には、CR1、CR2、CR3、CR4、およびC1qレセプター、C1qレセプターの成分を含むレセプター、コレクチンレセプター、a2mに対するレセプター、CRPに対するレセプター、および、免疫グロブリンに対するFcレセプターが含まれる。
【００６０】
本明細書で用いられるとき、「抗原」という語は、抗原の受容者の中で、液性および/または細胞性免疫応答を開始することのできる分子を意味する。抗原は、例えば、単純な中間代謝物、糖、脂質、およびホルモン、また、複合糖質、リン脂質、核酸および蛋白質のような高分子など、どのようなタイプの生物学的分子でもよい。抗原の一般的な分類には、ウイルス性抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、原生動物ならびにその他の寄生生物性抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患に関係する抗原、アレルギーならびに移植拒絶、およびその他の抗原などが含まれるが、これらに限定はされない。
【００６１】
本発明のオプソニン強化細胞は、例えば、ヒトにおいて、細胞の中に含まれている抗原に対する免疫応答を調節するために用いることができる。この細胞は、哺乳動物、好ましくはヒトに投与され、抗原提示細胞によって取り込まれる（すなわち、摂取されるか、貪食される）。または、細胞を、貪食が可能な条件下で、インビトロで、抗原提示細胞と接触させる。
【００６２】
本明細書で用いられるとき、「抗原提示細胞」または「APC」とは、抗原を摂取して、T細胞に提示する細胞を意味する。これらの細胞には、貪食白血球、マクロファージ、および樹状細胞、Bリンパ細胞、および内皮細胞が含まれる。
【００６３】
本発明のワクチン組成物は、例えば、ヒトなどの哺乳動物における免疫応答を調節するために用いることができる。
【００６４】
本発明の細胞は、また、免疫応答を調節できることが分かっている、サイトカインや細胞表面分子などの非オプソニン分子と組み合わせて投与することができる。
【００６５】
本発明は、また、その細胞が、インビボで、一つ以上のオプソニンを発現するようにされているトランスジェニック動物に関する。
【００６６】
（説明）
本発明は、細胞がオプソニンを発現させることができる、または、オプソニンをより高いレベルで発現させることができるという発見に、少なくとも、部分的には基づいている。オプソニンの発現をもたらしているか、または、オプソニンと混合されている細胞（本明細書において、「オプソニン強化細胞」と呼ばれる）は、被験者に投与されると、受容者における、抗原、または細胞に含まれるか接着している抗原に対する免疫応答を調節することができる。
【００６７】
本発明による、有用なオプソニン
上記で定義されているように、「オプソニン」は、抗原と、例えば、貪食白血球（単球およびマクロファージを含む）、樹状細胞（例えば、皮膚のランゲルハンス細胞）、Bリンパ球、および、ヒトにおいては、内皮細胞などの抗原提示細胞（APC）との両方に結合する、天然および非天然の分子、または、いくつかの処理ステップにおける少なくとも一つの産物が、抗原と、例えば貪食白血球、樹状細胞、Bリンパ球、およびヒトにおいては、内皮細胞などの抗原提示細胞（APC）との両方に結合できるように処理されうる分子を意味する。
【００６８】
作用のメカニズムのいずれとも結合することなく、オプソニン部位は、抗原の、より効率的な結合、包含、およびインターナリゼーションを行なわせるための、抗原とAPCとの間の連結ないし結合因子として作用するため、オプソニン強化細胞は、本発明によって有利な効果を提供すると考えられる。さらに、オプソニン自体は、抗原とともにインターナリゼーションされる。「インターナリゼーション」とは、分子が、細胞の細胞質、または、細胞質の中にある分画の中に運ばれるように、細胞が、その分子を取り込むことを意味する。
【００６９】
好ましいオプソニンは、齧歯類のものではないオプソニンで、例えば、霊長類、例えば、ヒトのオプソニンである。本発明によって有用なオプソニンは、本明細書で説明されているような、先天性免疫に関与する細胞上のレセプターなどのAPC（例えば、貪食白血球、例えば、マクロファージ、その他貪食作用系の細胞）上のレセプターに結合する。
【００７０】
オプソニンのセットの中には、構造的にも、機能的にも似ていると見做すことができるものがある。例えば、あるファミリーは、補体成分C3とC4の断片を含む。これら2つの成分は、高度に構造的に相同的であり、各々が分子内に、ペプチド（それぞれ、C3aまたはC4a）が本来の分子から蛋白分解的に切断されると破壊されるチオエステル結合をもっている。チオエステルの破壊によって、抗原とエステル結合を形成することができる化学的構造を利用することが可能になる。このエステル結合が存在するC3部分、すなわち、非C3a部分は、C3bと名付けられており、また、C4bは、C4の切断の類似産物である。C3bは、さらに、第Ｉ因子などの蛋白質によって蛋白質分解され、これもエステル結合によって抗原に結合したままになっているC3biおよびC3dなどの断片が得られる。
【００７１】
4つの構造的に独特な蛋白質が、C3および/またはC4の生物学的に活性で、膜に結合した断片に対する、高親和性レセプターとして機能することが知られている。CR1は、C3のC3b断片と、C4のC4b断片にとって、主要なレセプターである。これは、他の細胞型の中でもとりわけ、単球上、および、単球由来のAPC上で発現されている。CR2は、C3dとして知られる、C3の断片に対する主要レセプターであり、例えば、単球系譜の細胞上ではなく、例えば、成熟Bリンパ球上で発現されている。Bリンパ球上でのCR2の主な役割は、それらに連結した抗原と協働して、B細胞を直接に同時刺激することだと考えられている。
【００７２】
CR3は、主に、好中球と単球によって発現されており、FDC、クッパー細胞、およびNK細胞上でも発現されている。CR3は、C3biに対して主要な特異性をもつ、C3断片のレセプターである。CR3は、貪食作用などの作用過程での、接着相互作用と膜の再編成とに必要とされる細胞骨格形成の重要なオーガナイザーであると提案されている。
【００７３】
CR4は、ベータ2インテグリンファミリーの一員で、そのアルファ鎖は、CR3およびLFA-1のアルファ鎖に構造的に類似している。それの主要な生理学的なリガンドはC3d、およびC3dgであると考えられているが、その生物学的活性については、CR3ほどには、よく分かってはいない。
【００７４】
先天性オプソニンファミリーのこの他の例は、補体成分C1q、マンノース結合蛋白質、界面活性蛋白質AおよびD、およびコングルチニンを含む、コラーゲンのC型レクチンのグループであるコレクチンである。各分子は、抗原に結合することができるレクチン部位、および、貪食単球細胞上のレセプターで、全部、または一部が、C1qレセプターに一致するレセプターを含むレセプターに結合することができるコラーゲン部位を含む（Neponucenoら、Immunity 6: 119-29; Tennerら、Immunity 3: 485-93; Guanら、J Immunol 152: 4005-16; Geertsmaら、Am J Physiol 267: L578-84; Miyamuraら、Biochem J 300: 237-42; Malhotraら、J Exp Med 172: 955-9; Malhotraら、Biochem J 293: 15-19）。最もよく知られているコレクチンは、翻訳後に、一部は、ヒドロキシプロリン残基とヒドロキシリジン残基の共有的クロスリンクによって集合させられて、ある場合にはホモメリックであり、またある場合にはヘテロメリックである複数のポリペプチド鎖を含む。コレクチンは、例えば、Pikaarら、J Infect Dis 172: 481-9; Alvarez-Dominguezら、Infection & Immunity 61: 3664-72; Kuhlmanら、J Exp Med 169: 1733-45; およびGreertsmaら、前掲、において、オプソニンであることが明らかにされている。
【００７５】
本発明によって有用な、その他の先天性オプソニンには、C-反応性蛋白質（CRP）、アルファ-2マクログロブリン、およびフィブロネクチンがある。CRPは、ペントラキシン（pentraxin）分子ファミリーの一員で、単球系譜の細胞上のレセプターに結合するため、オプソニンであることが分かった（TeboとMortenson, lJ Immunol 144:231-8; Holzerら、J Immunol 133: 1424-30）。C3およびC4のように、アルファ-2マクログロブリンは、この分子が蛋白質分解を受けると破壊される内部チオエステル結合を含んでいる。このような破壊によって、この分子が抗原に結合できるようになり、アルファ-2マクログロブリンのAPCへの結合は、抱合体の吸収を促進する。フィブロネクチンは、アルファ5ベータ1インテグリンに結合し、また、さまざまな抗原に結合することができ、それがオプソニンとして機能できるようにしている（Cosio,J Lab Clin Med 103: 613-9; Czop and Austen J Immunol 129: 2678-81）。
【００７６】
免疫グロブリン（抗体）は、可変部領域によって、抗原に結合し、定常部領域によって、APCに結合することによって、オプソニンとして機能することができる。典型的には、免疫グロブリンは、互いに共有結合していて、それぞれが、1本の軽鎖に結合している2本の重鎖を含む。これらのヘテロ四量体は、さらに、IgMの五量体のような、より高次の構造に組み立てられることができる。重鎖および軽鎖の両方の可変部領域が、抗原結合部位の構造に寄与するが、一方、APC結合部位は、重鎖の定常部領域に位置している。免疫グロブリンに対するAPCレセプターには、IgA、IgG、IgE、およびIgMのそれぞれに対する、Fcα、Fcγ、Fcε、およびFcμが含まれる。
【００７７】
多細胞の真核生物によって自然に発現されるオプソニンは分泌される。この特徴によって、オプソニンは、接着分子とは区別される。天然のAPC結合部分を含む非天然の分子は、APC結合部分が細胞外空間に位置するように、細胞に安定的に結合ないし接着させることのできる部分を含んでいれば、その分子が天然の抗原の抗原結合部分を含んでいてもいなくても、オプソニンと見做されるであろう。細胞に安定的に結合させることのできる部分には、クロスリンク部分、膜貫通配列、および脂質部分が含まれる。これらの配列、または部分を含む蛋白質の調製は、当業者によってよく知られている。
【００７８】
「オプソニンのAPC結合部分」とは、キメラ分子に含まれたとき、そのキメラ分子が生理学的条件下でAPC上に発現されているレセプターに、少なくとも、ナノモル程度の親和性をもって結合できるようにさせるオプソニンの配列、または部位である。
【００７９】
APC結合部分を含む、オプソニンの断片の例は多数ある。このような断片は、APC結合機能を保持する限り、どのような長さでもよく、例えば、約40アミノ酸、100アミノ酸、150アミノ酸、500アミノ酸、800アミノ酸、または3000アミノ酸の長さであってもよい。例えば、Las Holtetらは、1994, FEBS Lett 344: 242で、高い親和性をもって、a2mレセプターに結合する、ヒトa2mのカルボキシ末端側断片（val 1299- ala 1451）を説明している。ヒトa2mのアミノ酸1314-1451を含む断片とラットのa2mの相当部位とは、本来のa2mの1-2％aの親和性ではあるが、a2mレセプターに結合する（Van Leuvenら、1986, J Biol Chem 261: 11369; Enghildら、1989, Biochemistry 28: 1406; Salbesenら、1992, FEBS Lett 313: 198; Sottrup-Jensenら、1986, FEBS Lett 205: 20）。
【００８０】
BechererとLambris, 1988, J Biol Chem 263: 14586は、CR1に結合するC3bの断片、例えば、C3c、エステラーゼ処理によって生成されC3bアルファ鎖のN末端を含むC3の断片、および、C3bアルファ鎖のN末端の42アミノ酸を含む合成ペプチドについて説明している。C3における、CR3に対する結合配列についても説明されている（Wrightら、1987, PNAS 84: 4235）。
【００８１】
ペプシン分解によって得られたN-末端断片である、C1qの「コラーゲン軸（collagene stalk）」は、C1qレセプターに結合する（Reid, 1981, Methods Enzymol 80: 16; Malhortaら、1993,Biochem J 293: 15）。また、Malhortaら、同上、は、コングルチニンのAPC結合部分が、それのN末端の55アミノ酸に含まれていることの証拠を提供している。Ezekowitz（米国特許第5,270,199号）は、'199特許の図2の塩基配列370-438からなる、ヒトのマンノース結合蛋白質の推定APC結合部位を提供している。さらに、コングルチニンとの相同性によって、'199特許で開示されているエクソン1は、APC1部分を含むかもしれない。
【００８２】
IgGのAPC結合部分は、CanfieldとMorrison, 1991, J Exp Med 173: 1483-91; Lundら、1991, J Immunol 147: 2657-62; およびSarmayら、1992, Mol Immunol, 29: 633-9で説明されているように、234−237残基を含む、CH2部位、および、ヒンジ領域下部を含む。
【００８３】
本発明の組成物および方法で用いることのできるオプソニンの例には、フィブロネクチン（例えば、GenBank登録番号X02761、K00799、K02273、X82402、X00307、X00739）、CRP（例えば、GenBank登録番号X17496、M11880、M11881、M11882）、C1qなどの補体成分（例えば、GenBank登録番号X66295、M22531、X03084、X58861、およびSwiss-Prot登録番号P02747、P02745）、C3bやC4bなどの補体断片（例えば、GenBank登録番号K02782、K02765）、マンノース結合蛋白質（例えば、GenBank登録番号S42292、S42294、X15422）、コングルチニン（例えば、GenBank登録番号X71774）、アルファ-2-マクログロブリン（例えば、GenBank登録番号M93246、M11313）、および、界面活性蛋白質A（例えば、GenBank登録番号M68519、S48768）ならびにD（例えば、GenBank登録番号L40156、X65018、S38981）、免疫グロブリン、および、生物種間における、それらの相同体が含まれる。
【表１】
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【００８４】
本発明によるオプソニン性の判定
ある天然のオプソニンが、以下のアッセイ法の一つ以上にしたがって、オプソニン性をもつと判定され、また、それが分泌性の分子であれば、その天然のオプソニンは、本発明にしたがって有用であると見做される。
【００８５】
アッセイ法１
O'RearとRossが、免疫学の最新プロトコール（Current  Protocols in Immunology, 1994, John Wiley & Sons, pp. 13.4.5-9）で説明しているように、オプソニン性のアッセイ法の一つにおいて、生理学的な条件下で起きる結合によって、候補オプソニン分子に結合したSRBCが得られる。候補オプソニンが天然のものである生物から採ったAPCを、1％（w/v）BSAのコーン（Cohn）画分入りの氷冷HBSS中に4×10６／ｍｌになるよう懸濁する。候補オプソニンが、Ｃ３の断片のときには、ＡＰＣは直前に採血した、培養していないの末梢血単球である。候補オプソニンに結合したSRBC、または対照用SRBC（前者と同じであるが、候補オプソニンに結合していないもの）を、同じ溶液に、2×10８/mlで懸濁する。100μlのSRBC懸濁液と、100μlのAPC懸濁液を、10×75 mmのプラスチック製試験管の中で混合する。この試験管を、40 rpm、37℃で、2〜20分間回転させる。この懸濁液の小滴をスライドに載せ、カバーガラスを掛けて、5〜10分間放置する。カバーガラスの圧力で、余分な溶液を取り除くことができて、そして、例えば、透明のマニュキア液などで、カバーグラスをスライドにシールすることができる。顕微鏡でこのスライドを調べ、4個以上のSRBCに接着しているように見えるAPCの割合を決定する。もし、この割合が50％以上で、4×10４までの候補オプソニン分子/SRBCがあるときには、この候補オプソニンは、オプソニンでありうる。
【００８６】
アッセイ法２（プロテアーゼによって活性化される候補オプソニン）
候補オプソニンまたは放射性標識された候補オプソニンを、1.5〜3倍モル過剰のプロテアーゼ（0.05 Mのトリエタノールアミン-0.1 M NaCl, pH 8, 室温で一晩）で処理する。このアッセイ法においては、プロテアーゼを抗原として使うことができるし、別の抗原を過剰量加えることもできる。結合実験の前に、候補オプソニンと抗原の複合体を、HBSSに対して透析する（4℃）。
【００８７】
候補オプソニン-抗原複合体の単球への結合は、1.0 Mまでの濃度の標識リガンドを、(1.5-4.0)×10６単球とともに、200μl容量で氷上でインキュベートして測定される。放射性標識されたリガンドの非特異的な結合を、100倍モル過剰の標識した候補オプソニン-抗原複合体存在下で測定する。結合していないリガンドを、細胞と細胞に結合したリガンドとから、ガラス繊維フィルター上で急速に真空濾過して分離する。実験は、エンドサイトーシスによって混乱が起こる可能性を避けるために、氷上で行なう。解析と、非線形曲線適合（non-linear curve fit）によって、細胞当りの結合定数と部位数を決定する。候補オプソニン-抗原複合体の単球の結合部位に対する親和性が、少なくとも、ナノモルの範囲にあれば、この候補オプソニンにはオプソニンである。
【００８８】
アッセイ法３
第I部
候補オプソニンが、P.カリニ（P. carinii）の表面に結合するか否かを直接評価するために、免疫電子顕微鏡法を行なう。表面に結合した候補オプソニンを保護するために、1 mMカルシウム入りのTBSを用いて、瀕死の感染ラットの気管支肺胞洗浄液（BAL）から、P.カリニを分離する。分離された生物を、過ヨウ素酸−リジン−パラホルムアルデヒド緩衝液中で固定化し、ローアクリル（Lowacryl）マウンティング媒材（カリフォルニア州レディングのテッド・ペラ社（Ted Pella, Inc., Redding CA））に包埋する。超薄片が得られたら、通常のヤギ血清（2％）で１時間ブロックしてから、ウサギの抗候補オプソニンまたは非免疫ウサギIgG（25μg/ml）のどちらかと一晩インキュベートする。洗浄した後、この切片を、さらに、15 nMの金コロイドを結合したヤギおよびウサギのIgGとインキュベートする（イリノイ州アーリントンハイツのアマーシャム社（Amersham Corp., Arlington Heights, IL)）。切片を再び洗浄して、透過式電子顕微鏡（モデル6400：マサチューセッツ州ピーボディのJEOL USA社 (JEOL USA, Inc., Peabody, MA）上で調べる。
【００８９】
第II部
SP-Dに対する抗体の存在下もしくは不在下で、または、精製したSP-Dを加えて、培養した肺胞マクロファージへのP.カリニの接着を、以下のようにして定量する。肺胞マクロファージへのP.カリニの接着を、５１Cr標識した生物によって測定する。表面に結合した候補オプソニンが失われるのを防ぐため、1 mMカルシウム入りのTBSを用いて、感染ラットからP.カリニを分離する。この生物を、20％FCSと200μCiの５１Cr-クロム酸ナトリウム（ニューイングランドニュクリア社( New England Nuclear)）を含む、2 mlのDMEの中で、37℃で8時間インキュベートして放射性標識する。健康なラットから正常な肺胞マクロファージを洗い出して、マクロファージを確実に付着するために、予め、正常なラットIgGでコート（100μg/ml×60分）されている組織培養皿（1×10５細胞数/ ウエル）の中にプレートする。1時間後、マクロファージを、HBSSで穏やかに洗浄し、非付着細胞を除去する。この洗浄の後、>95％のマクロファージが付着している。表面に結合した候補オプソニンを含む５１Cr-P.カリニ（1×10６）を、マクロファージに加え、37℃で、さらに1時間インキュベートする。続いて、非付着のP.カリニを洗浄によって除去する。付着したP.カリニを含むマクロファージの単層を、1 N NaOHで可溶化して、定量する。P.カリニの付着は、付着率＝(A/A+B)×100で定義されるが、ここで、A＝単層に結合している５１Cr-P.カリニ、およびB＝付着していない５１Cr-P.カリニである。培養液中で、肺胞マクロファージ肺細胞へのP.カリニの付着に対する、候補オプソニンの効果を評価するために、候補オプソニンに対して作製したウサギのポリクローナル抗体（100μg/ml）を存在させるか、または存在させないで、P.カリニの付着アッセイを行なう。
【００９０】
候補オプソニンのP.カリニへの結合が、第I部で明らかであるか、また、第II部で、付着％が、抗-候補オプソニンの存在下で、統計的な有意性P<0.05をもって減少すれば、この候補オプソニンは、オプソニンである。
【００９１】
アッセイ法４
細菌と付着単球との結合を、以下のようにして測定する。修正PBS中、および用いられた全ての緩衝液中の内毒素レベルを、リムルス法（Limulus assay）によって測定して、50 pg/mlより低くする。37℃に2時間かけて、修正PBS中の、5×10３の単球が、テラサキ（Terasaki）プレートのウエルに付着するようにさせる。PBSで3回洗浄して、非付着細胞を除去してから、10〜50マイクログラム/mlの候補オプソニンが入っているか、入っていない0.5 mlの緩衝液に、5×10４のFITC-標識した細菌を加える。細菌対単球の比は、10:1から50:1が用いられる。遮光下、37℃で30分間インキュベートした後、温かいPBSで5回洗浄して、付着していない細菌を除去する。アッセイは、4回反復して行われ、各ウエル毎に、≧100単球と結合している細菌の数を、×400の倍率を用いて、蛍光顕微鏡下で数える。結果は、100個の単球に結合した細菌の数で表す。候補オプソニン入りのときの数が、候補オプソニン入りでないときの数の、少なくとも2倍であるとき、候補オプソニンはオプソニンである。
【００９２】
アッセイ法５
第I部
1 ml当り、約1×10７から6×10７個の細菌を、10 mcg/mlの１２５I-候補オプソニンとともに、全量0.7 mlのPBSアリコート中でインキュベートし（0℃で、20分間）、反応混合液の100μlを、150μlのオイルクッション（60％ジブチルフタル酸、40％ジオクチルフタル酸［ニューヨーク州ロチェスターのイーストマンコダック社(Eastman Kodak Co., Rochester, N.Y.］）の上に重ね、この混合液を遠心分離する（10,000×g、60秒間、4℃）。チューブの先端の細胞沈殿物を含む部分を、モーツアルト剃刀の刃で切り、放射活性を計測する。
【００９３】
第II部
96ウエルの組織培養プレート（マサチューセッツ州ケンブリッジのコスター社(Costar, Cambridge, Mass.）に、1 ml当り、2×10５細胞で、使用する前の晩に、APCをプレートする。各ウエル当り2×10６細菌を、100 mcg/mlの候補オプソニンを入れた、または、入れていない培養プレートに加える。次に、このプレートを、1,000×gで7分間遠心分離する。37℃で15分間、細菌を取り込ませた後、冷やしたPBSで数回洗浄して、取り込まれなかった細菌を除去する。次に、45分間で細胞外の細菌を殺す量の抗生物質を加えたRPMI 1640中で、それらをインキュベートする（37℃で45分間）。このインキュベート時間が終了した時を時間0と考える。ハンクス（Hank's）の平衡化生理食塩溶液で、単層を3回洗浄し、同量のRPMI 1640（R0）を加える。凍結融解を何度か繰り返して細胞を破砕する。各ウエル毎に、24時間培養した後、血液寒天培地（コロンビア血液寒天 (Columbia blood agar) ：カリフォルニア州サンノゼにあるベクトン・ディキンソン社( Becton Dickinson, San Jose, Calif.）上で、生き残った細菌の数（CFU）を定量的プレート計数により決定する。それぞれの結果を、3回の決定値の平均として出す。
【００９４】
第I部で、候補オプソニンで処理した細菌の沈殿物が>75KCPMで、この取り込みが、非標識の候補オプソニンによって阻害することができ、また、第II部で、候補オプソニンを入れたCFUが、入れてないCFUよりも大きかったら（P< 0.05）、候補オプソニンは、オプソニンであるかもしれない。
【００９５】
アッセイ法６
10７の細菌を含む、200μlのGHBSS（ハンクスの平衡化塩類溶液）＋10 mmolのCaCl２を含む0.1％のゼラチンを調製する。そして、この細菌を、20-100μg/mlの候補オプソニンとともに、4℃でインキュベートする。競合阻害因子の存在下、または不存在下で、結合アッセイを行なう。30分間インキュベートした後、GHBSS+10 mmol CaCl２中で、1,300 gで3分間微量遠心することにより、室温で５回洗浄する。その後、1:1,000のウサギ抗-候補オプソニン抗血清を、細菌とともに、1時間、PBS+5％FCSと10 mmol CaCl２の中でインキュベートする。それからGHBSS+10 mmol CaCl２と0.05％トゥーン（Tween）20の中で３回洗浄する。抗血清の細菌への結合を、ローダミンを結合したヤギ抗-ウサギIgGの1:1,000希釈液によって検出する（ニューヨーク州オレンジバーグにあるフィッシャー製薬会社 (FisherPharmaceuticals, Orangeburg, NY）。インキュベートした後、GHBSS+10 mmol CaCl２と0.05％トゥーン（Tween）20で5回洗浄し、スライドガラスに塗抹し、風乾させる。その後、100％の氷冷メタノールで5分間固定する。陰性対照には、候補オプソニンなしと、第一段階の抗体なしというものが含まれる。アッセイを3回反復して、蛍光顕微鏡で広範囲に調べる。
【００９６】
第II部
放射性標識細菌の細胞との結合
10７個の放射性標識した細菌を、200μlのGHBSS+10 mmol CaCl２で再懸濁して、2μg/mlから40μg/mlの範囲の候補オプソニンとともに、または候補オプソニンを入れずに、30分間インキュベートする。そして、この細菌を、室温で、3回、GHBSS+10mmol CaCl２で、1,300 gで微量遠心して3分間洗浄し、、50μlのGHBSSに再懸濁して、10６オーダーのAPCを含む１−mlの懸濁液（GHBSS）に加える。この細菌とAPCを、37℃で20分間、ゆっくり振とうした後、微量遠心機中、82 gで、示差（differential）遠心分離を用いて、5回洗浄して、付着していない細菌を除去する。最後の洗浄の前に、各サンプルからアリコートを採って、ラブテク（Labtek）スライド上でプレートし、細胞を10分間付着させ、メタノールで固定して、ギムザで染色し、光学顕微鏡でスコアをとる。ラブテク（Labtek）スライド上にプレートした細胞のスコアをとるためには、少なくとも400個の細胞を数える。貪食指数は、100 PMN当りの接着、または摂取された粒子の数を表している。次に、上記のものを含む細胞沈殿物と、放射性標識された細胞とを、100μlのPBS+0.5％トリトンX-100に溶解して、シンチレーション・カウンターで放射活性を測定する。第I部で、候補オプソニンの、細菌への特異的な結合が明らかであり、また、第II部で、細菌の特異的な取り込みが、cpmで、候補オプソニン入りのときに、候補オプソニンなしのときよりも3倍以上大きければ、候補オプソニンは、オプソニンであるかもしれない。
【００９７】
アッセイ法７
第I部
L. ドノバニ・プロマスティゴーテス（L. donovani promastigotes）への結合を調べるために、5×10５個の寄生体/mlで培養を始める。9日目までの定期的な時点で、寄生体画分の数を数え、洗浄して、1％BSA、0.5 mM Ca２＋, 0.05％NaN３, トリス緩衝生理食塩溶液（TBS）（10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, pH 8.0）（希釈剤）に、2×10５/mlになるよう再懸濁する。そして、EDTAを抜いた希釈剤中に、70μlの5μg/ml放射標識化C反応性蛋白質（CRP）（0.12μCi/μg）が含まれ、150μlのジノニルフタル酸/ジブチルフタル酸（40:60 v/v）オイル混合液の層の上層になって入っている試験管にこの懸濁液50μlを加える。寄生体を、1時間インキュベートしてから、遠心分離で油層を介して分離し、細胞沈殿物を取り出し、ガンマ計測によって、結合したCRPを検出する。各アッセイを3回反復する。プロマスティゴーテスへのCRP結合の濃度依存性も、0.045μCi/μgの活性と、60μg /mlから0.015μg /mlまでの2倍連続希釈を用いて、上述のようにして測定する。
【００９８】
第II部
APCをプレートから取り出して、24穴組織培養皿に入れたカバーグラス上に、1×10６細胞/ウエルになるようにプレートする。加湿インキュベーター中、37℃で、10％PCS、1mMグルタミン、200 U/mlペニシリン、および、200μg /mlのストレプトマイシンを添加したRPMI 1640（ライフ・テクノロジー社（Life Technologies））中で、細胞をインキュベートする。24時間後、非付着細胞を除去して、残った細胞を6日後に使用する。プロマスティゴーテスを、RPMI 1640中30μg /mlのCRPとともに、またはCRPなしで、1時間インキュベートしてから、10６/ ウエルのAPC培養液を加える前に3回洗浄する。プロマスティゴーテスを、１時間APCに感染させてから、細胞を洗浄し、メタノールで固定して、計測する前にギムザで染色する（英国ドーセット州プールにあるBDH社）。感染したAPCの割合と、寄生体の数/100個のマクロファージを、4回反復培養したものから決定する。
【００９９】
第I部で、候補オプソニンの寄生体に対する親和性が、少なくともナノモルの範囲にあり、また、第II部で、取り込まれた寄生体数/100個のAPCが、候補オプソニン入りのときに、候補オプソニンなしのときよりも、少なくとも2倍であるときには、候補オプソニンはオプソニンでありうる。
【０１００】
アッセイ法８
第I部
5％ウシ胎児血清と、候補オプソニンとを含む、［３５S］メチオニン標識した培地の一部（0.5 ml）を、0.1 mlまたは0.2 mlの10％微生物懸濁液とともに、室温で30分間インキュベートする。調べられる微生物には、例えば、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、枯草菌（Bacillus subtilis）、黄色ブドウ球菌（Staphyrococcus aureus）、大腸菌（Escherichia coli）、およびパン酵母（Saccharomyces cerevisiae）が含まれよう。結合した蛋白質を、2％SDSと0.1 Mジチオスレイトールを含む緩衝液中で煮沸して分離し、5％SDSゲル上で解析する。
【０１０１】
第II部
固定した細菌（0.1 ml; 容量にして10％；１ミリリットル当り10１０）を、［３H］チミジンで標識して、候補オプソニンを欠乏しているか、欠乏していない0.1 mlの血清とともにインキュベートする。PBSで洗浄した後、細菌を、1×10７のオーダーのAPCとともに、二価の陽イオンを含むPBS中に、最終濃度0.9 mlでインキュベートする。さらにエンドサイトーシスが起こるのを防ぐために、N-エチルマレイミド（2 mM）を含む氷冷PBSに、間隔をおいて、0.2 mlづつ移して、細胞を洗浄する（10秒間で約100 g）。
【０１０２】
第I部において、候補オプソニンに一致するバンドが見え、また、第II部で、6-10分間インキュベートした後のCPMが、血清を抜いていないサンプルの方が、血清を抜いたサンプルよりも、少なくとも3倍高いときには、候補オプソニンはオプソニンでありうる。
【０１０３】
アッセイ法3、5、6、7、8の第I部の結果よりも、そのアッセイ法の抗原に、ナノモルの範囲内の親和性をもって結合できるのであれば、アッセイ法の第II部を満足させる候補オプソニンの方がオプソニンでありうる。
【０１０４】
アッセイ法９
少なくとも1.2×10４分子/細胞のC3断片でコートされたSRBCを、O'RearとRossが、免疫学の最新プロトコール（Current  Protocols in Immunology, 1994, John Wiley & Sons, pp. 13.4.5-9）で説明しているところに従って調製する。10％ウシ胎児血清を含むRPMI中、2×10５細胞/mlの単球250μlを、ガラス製の8穴の組織培養皿の各ウエルに加え、37℃、5％CO２で3時間インキュベートする。単球を、HBSSで2回洗浄し、1.5×10８/mlのDVBS２＋で、50μlのSRBCを各ウエルに加える。このプレートを、50 gで5分間遠心分離してから、37℃、5％CO２で3時間インキュベートする。ウェルを、HBSSで2回洗浄し、0.5％グルタルアルデヒドで固定して、ギムザ染色液で染色する。光学顕微鏡で判定して、少なくとも一つのSRBCによって、>40％の単球がロゼット形成していたら、その候補は、オプソニンでありうる。
【０１０５】
脂質を含む人工オプソニン
例えば、長鎖脂肪酸などの脂質が、例えば、ポリペプチドなどの分子に付着すると、この複合体は、細胞と混合されると、原形質膜と安定的に結合するようになる（Nagarajanら、1995, J Immnol Methods 184: 241-51；McHughら、1995, PNAS 92: 8059-63；van der Bergら、1995, J Cell Biol, 131:669-77）。これは、脂質が、膜にインターカレートすることによって起こると考えられている。脂質結合ポリペプチドを産生する便利な方法は、GPI部分の翻訳後付加を指令するシグナル配列を一部でコードしている塩基配列を、適当な宿主細胞の中で発現させることを含んでいる。組換えDNA技術を用いて、異種性のGPIシグナル配列に結合した蛋白質をコードする核酸を構築することによって、本来はGPIに結合していない蛋白質を、GPIに結合している蛋白質として発現させることができる。この目的にとって有用なGPIシグナル配列をコードする塩基配列には、例えば、崩壊促進因子（decay accelerating factor）（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「22」をコードする配列；Carasら、米国特許第5,109,113号で開示されているシグナル配列をコードする配列）；ブレビカン（brevican）（例えば、Genbank登録番号X86406の1982-2047番目の塩基）、メソテリン（mesothelin）（例えば、Genbank登録番号U40434の1858-1983番目の塩基）、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）抗原2（例えば、NCBI Entrez蛋白質データベース登録番号1256444の172-294番目のアミノ酸をコードしている配列、Zhuら、1996, Gene 181:121-5）、アセチルコリンエステラーゼ（Duvalら、1992, EMBO J 11:3255-61で説明されている「HC」ペプチドををコードしている配列；（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「19」をコードする配列））、ヒト葉酸レセプターアルファ、およびベータ（例えば、NCBI Entrez蛋白質データベース登録番号182416の230-257番目のアミノ酸、または、NCBI Entrez蛋白質データベース登録番号1655592の228-255番目のアミノ酸をコードしている配列、YanとRatnam、1995, Biochemstry 34:14594-600）、5'ヌクレオチダーゼ（例えば、NCBI Entrez蛋白質データベース登録番号404502の547-570番目、または547-574番目のアミノ酸をコードしている配列、Furukawaら、1994,Biochem Biophys Acta 1190:273-8；（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, BiochemBiophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「５」または「６」をコードする配列）、CD59（例えば、Genbank登録番号U48255の393-473番目によってコードされる；BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「20」をコードする配列；Powellら、1997, J Immunol 158:1692-1702の図2の74-101番目のアミノ酸をコードしている配列）、T-カドヘリン（例えば、KollerとRansht、1996, J Biol Chem 271:30061-7によって説明されている、ニワトリのTカドヘリンのC末端の76アミノ酸をコードしている配列）、アミノペプチダーゼP（例えば、NCBI Entrez蛋白質データベース登録番号1517942の649-673番目のアミノ酸をコードしている配列、Hydeら、1996, Biochem J 319:197-201）、カルボキシペプチダーゼM、CD16B、Thy 1 、カルボニックアンヒドラーゼIV（例えば、NCBI Entrez蛋白質データベース登録番号179791の284-312番目のアミノ酸をコードしている配列、Okuyamaら、1995, Arch Biochem Biophys 320:315-22）、胎盤アルカリホスファターゼ（例えば、NCBI Entrez蛋白質データベース登録番号178464の498-529番目のアミノ酸をコードして���る配列、Odaら、1994, Biochem J 301:577-83）、ニューロン糖蛋白質F3、癌胎児性抗原（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「28」をコードする配列）、MRC-OX45（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「2」をコードする配列）、RT 6.2（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「3」をコードする配列）、D.ディスコイデウム（discoideum）のプレスポア特異的抗原（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「4」をコードする配列）、ミクロソーマルジペプチダーゼ（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「8」をコードする配列）、CAMPATH-1（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「9」をコードする配列）、T.ブルース（T. brucei）PARP（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「10」をコードする配列）、T.ブルース（T. brucei）VSG Mit 118a（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「11」をコードする配列）、T.ブルース（T. brucei）VSG Mit 117a（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「12」をコードする配列）、T.ブルース（T. brucei）VSG MITat 1.1000BC（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「13」をコードする配列）、T.ブルース（T. brucei）VSG MITat 1.5b（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「14」をコードする配列）、T.ブルース（T. brucei）VSG ILTat 1.1（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「15」をコードする配列）、T.ブルース（T. brucei）VSG TxTat 1（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996,Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「16」をコードする配列）、T.ブルース（T. brucei）VSG Mit 221（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「17」をコードする配列）、プリオン蛋白質（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「18」をコードする配列）、ウロキナーゼレセプター（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996,Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「21」をコードする配列）、T. コンゴレンス（T. congolense）VSG YNat 1.1（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「23」をコードする配列）、S. セレビシアエ（S. cerevisiae）GAS-1（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「24」をコードする配列）、Thy-1（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「25」または「26」をコードする配列）、L.メジャー（major）PSP（例えば、BuchtとHjalmarsson, 1996, Biochem Biophys Acta 1292:223-32の表1のアミノ酸配列「29」をコードする配列）、D.ディスコイデウム（discoideum）接触部位A糖蛋白質（例えば、Barthら, 1996, Biochem J 317:533-40で説明されているC末端25アミノ酸配列をコードしている配列）、CD24、および合成配列（例えば、Coyneら, 1993, J Biol Chem 268:6689-93で説明されている）によって含まれるシグナル配列が含まれる。
【０１０６】
本発明によるGPI結合オプソニンの結合の判定
本発明の一つの態様において、オプソニンは、脂質をもち、それにより、脂質基が細胞の原形質膜の中にインターカレートすることによって、オプソニンが細胞に結合できるようにするGPI、またはGPIの一部を含むように作られている。ほぼ従来からのGPIからなる、これらのGPI部分について、当業者は、このような部分が、オプソニンを細胞膜に結合させるか否かを容易に判定することができる。以下のアッセイ法は、GPI結合オプソニンが、細胞に結合することができるか否かを判定するのに有用である。
【０１０７】
取り込みを定量するために、まず、GPI結合オプソニンを、１２５Iで標識する。セファデックスG-25（Sephadex G-25）カラムに、1 mlのPBS中の、0.1 mgの適当な蛋白質を入れて、さらに、20-30 mlのPBSを入れる。2mCiのNa[１２５I]と、PBS中10μMのラクトペルオキシダーゼ20μlとを、2 mlの、PBS中1 mg/mlの適当な蛋白質に加える。0.025 Mリン酸緩衝液、pH 7.4中、0.03％過酸化水素4μlを撹拌しながら、蛋白質溶液に加える。過酸化水素の添加を、1分間隔で、さらに3回繰り返す。PBS中15nMのNaIを、1 ml加える。この溶液を、セファデックスカラムに入れて、20 mlのPBSで溶出する。ガイガーカウンターで、溶出液をモニターし、標識蛋白質を含む、放射活性の最初のピークを集める。ガンマ計測によって、比活性を決定する（100％回収されると仮定する）。蛋白質溶液を、40μg/mlになるように希釈して、上述の原形質膜への取り込み実験に用いる。洗浄した後、1μlの細胞アリコートのガンマ計測を行なう。結合が、GPI部分によるか否かを判定するために、細胞を、B.チューリンゲニエンシス（B. thuringiensis）のホスファチジルイノシトール特異的なホスフォリパーゼC（シグマ社（Sigma））とともに、37℃で、3時間インキュベートし、遠心分離して、計測する前に洗浄する。これによって、GPI結合蛋白質が、細胞表面から分離する。
【０１０８】
本発明により有用な抗原
1．ウイルス抗原
ウイルス抗原の例には、gag、pol、およびenv遺伝子の遺伝子産物、Nef蛋白質、逆転写酵素、および、その他のHIV構成成分などの、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）抗原に由来するレトロウイルス抗原などのレトロウイルス抗原；B型肝炎ウイルスのS、M、およびL蛋白質、B型肝炎ウイルスのプレS抗原、および、その他の肝炎（例えば、A、BおよびC型肝炎）の、C型肝炎ウイルスRNAのようなウイルス構成成分などの肝炎ウイルス抗原；ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、および、その他のインフルエンザウィルス構成成分などのインフルエンザウィルス抗原；麻疹ウイルスの融合蛋白質やその他の麻疹ウイルス構成成分などの麻疹ウイル抗原；E1およびE2蛋白質、および、その他の風疹ウイルス構成成分などの風疹ウイルス抗原；VP7sc、および、その他のロタウイルス構成成分などのロタウイルス抗原；エンベロープ糖蛋白質B、および、その他のサイトメガロウイルス抗原構成成分などのサイトメガロウイルス抗原；呼吸器多核質（respiratory syncytical）ウイルス融合蛋白質、ＲＳＶ融合蛋白質、M2蛋白質、および、その他の呼吸器多核質ウイルス構成成分などの呼吸器多核質ウイルス抗原；極早期蛋白質、糖蛋白質D、および、その他の単純ヘルペスウイルス抗原構成成分などの単純ヘルペスウイルス抗原；gpI、gpII、および、その他の水痘帯状疱疹ウイルス抗原構成成分などの水痘帯状疱疹ウイルス抗原；E、M-E、M-E-NS  1、NS 1、NS 1-NS2A、80％E蛋白質、および、その他の日本脳炎ウイルス抗原構成成分などの日本脳炎ウイルス抗原；狂犬病糖蛋白質、狂犬病核蛋白質、および、その他の狂犬病ウイルス抗原構成成分などの狂犬病ウイルス抗原が含まれるが、これらに限定はされない。ウイルス抗原のさらに別の例に関しては、基礎ウイルス学（Fundamental Virology）第二版、Fields, B.N.およびKnipe, D.M. (Raven Press, New York, 1991)を参照のこと。
【０１０９】
2．細菌抗原
本発明の組成物および方法で用いることのできる細菌抗原には、百日咳毒素、繊維状ヘマグルチニン、ペルタクチン（pertactin）、FIM2、FIM3、アデニル酸シクラーゼ、および、その他の百日咳菌抗原構成成分などの百日咳菌抗原；ジフテリア毒素、またはトキソイド、および、その他のジフテリア菌抗原構成成分などのジフテリア菌抗原；破傷風毒素またはトキソイド、および、その他の破傷風菌抗原構成成分などの破傷風菌抗原；M蛋白質、および、その他の連鎖球菌抗原構成成分などの連鎖球菌抗原；リポ多糖および、その他のグラム陰性菌抗原構成成分などのグラム陰性杆菌抗原；ミコール酸、ヒートショック蛋白質65（HSP65）、30 kDa主要分泌蛋白質、85A抗原、および、その他の結核菌抗原構成成分などの結核菌抗原；ヘリコバクター・ピロリ菌抗原構成成分；ニューモリシン（pneumolysin）、肺炎球菌の莢膜多糖、および、その他の肺炎球菌抗原構成成分などの肺炎球菌抗原；莢膜多糖、および、その他のインフルエンザ菌抗原構成成分などのインフルエンザ菌抗原；炭疽病防御抗原、および、その他の炭疽病抗原構成成分などの炭疽病抗原；ロンプス（romps）、および、その他のリケッチア菌抗原構成成分などのリケッチア菌抗原が含まれるが、これらに限定はされない。また、本明細書で説明されている細菌抗原に含まれるのは、この他の細菌性、マイコバクテリア性、マイコプラズマ性、リケッチア性、またはクラミジア性抗原である。
【０１１０】
3．真菌抗原
本発明の組成物および方法で用いることのできる真菌性抗原には、カンジダ菌抗原構成成分；ヒートショック蛋白質60（HSP60）、およびその他のヒストプラスマ菌抗原構成成分などのヒストプラスマ菌抗原；莢膜多糖、および、その他のクリプトコックス菌抗原構成成分などのクリプトコックス菌抗原；球状体抗原、および、その他のコクシジオイデス菌抗原構成成分などのコクシジオイデス菌抗原；および、トリコフィチン、および、その他のコクシジオイデス菌抗原構成成分などの白癬菌抗原が含まれるが、これらに限定はされない。
【０１１１】
4．寄生生物抗原
原生生物、およびその他の寄生生物抗原には、メロゾイト表面抗原、スポロゾイト表面抗原、サーカムスポロゾイト抗原、生殖母細胞/配偶子表面抗原、血液期抗原pf155/RESA、およびその他のマラリア原虫抗原構成成分などの、熱帯熱マラリア原虫抗原；SAG-1、p30、およびその他のトキソプラズマ抗原構成成分などのトキソプラズマ抗原；グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、パラミオシン、およびその他の住血吸虫抗原構成成分などの住血吸虫抗原；gp63、リポホスフォグリカン、ならびに、その関連蛋白質、およびその他のリーシュマニア抗原構成成分などの、リーシュマニア主要抗原、およびその他のリーシュマニア主要抗原、および、；および、75-77 kDa抗原、56 kDa抗原、およびその他のトリパノゾーマ抗原構成成分などの、トリパノゾーマクルーズ抗原が含まれるが、これらに限定はされない。
【０１１２】
5．腫瘍抗原
本発明の組成物および方法で用いることのできる腫瘍抗原には、テロメラーゼ、P-糖蛋白質などの多剤耐性蛋白質；MAGE-1、アルファ-フェトプロテイン、癌胎児性抗原、変異p53、パピローマウイルス抗原、ガングリオシド、または、その他、メラノーマ、もしくはその他の腫瘍細胞の糖質含有成分が含まれるが、これらに限定はされない。本発明では、あらゆる型の腫瘍細胞に由来する抗原を、本明細書で説明している組成物および方法に用いることができる。
【０１１３】
6．自己免疫に関係する抗原
自己免疫疾患、アレルギー、および移植片拒絶に関する抗原を、本発明の組成物および方法で用いることができる。例えば、以下の自己免疫疾患ないし障害の一つ以上に関係する抗原を、本発明において用いることができる。すなわち、糖尿病、関節炎（慢性関節リューマチ、若年性関節炎、変形性関節症、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎、および湿疹性皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群、シェーグレン症候群の二期症である乾性角結膜炎、円形脱毛症、節足動物に噛まれたことに反応したアレルギー反応、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、乾性角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚性エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、らい逆転反応（leprosy reversal reaction）、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性知覚神経性聴力喪失、再生不良性貧血、赤芽球ろう、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活性肝炎、スティーヴェンズ-ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーブス眼症、サルコイドーシス、胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、および間隙性肺線維症。自己免疫疾患に関係する抗原の例には、グルタミン酸デカルボキシラーゼ65（GAD 65）、本来のDNA、ミエリン塩基性蛋白質、ミエリンプロテオリピド蛋白質、アセチルコリンレセプター成分、チログロブリン、および甲状腺刺激ホルモン（TSH）レセプターが含まれる。アレルギーに関係する抗原の例には、スギ花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ライグラス花粉抗原などの花粉抗原、ダストのもとであるダニ抗原、およびネコ抗原などの動物由来の抗原、組織適合性抗原、および、ペニシリンや、その他の治療薬が含まれる。移植片拒絶に関係する抗原の例には、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓、および神経移植片成分などの、移植片受容者に移植される移植片の抗原成分が含まれる。抗原は、自己免疫疾患を治療する上で有用な、改変ペプチドリガンドでもよい。
【０１１４】
本発明の組成物および方法で用いることのできる、その他の抗原の例には、黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、テストステロン、成長ホルモン、プロラクチン、およびその他のホルモン、コカインおよびヘロインのような嗜癖性薬剤、抗レプチンレセプター抗体の、Fabを含む部位などの、抗原レセプターのイディオタイプ断片が含まれる。
【０１１５】
本発明による、組換え核酸を含む細胞の調製
本明細書に教示されているように、当技術分野において周知の従来からの方法を用いて、細胞を形質転換する。宿主細胞の形質転換に適した方法は、Sambrookら、（分子クローニング：実験マニュアル、第二版、Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)）および、その他の実験マニュアルから見つけることができる。オプソニンをコードしている核酸分子を導入する方法の、別の例は、下に説明されている。本発明の方法にしたがって、例えば、オプソニンおよび/または抗原をコードしている、導入された核酸分子を含む細胞を、そのまま、例えば、ワクチン組成物の形で、被験者に（抗原として）投与することができる。
【０１１６】
Ａ．細胞への裸の核酸の導入
1．DEAE-デキストラン媒介による形質転換：核酸とDEAE-デキストランの混合液を作り、この混合液を細胞とインキュベートすることによって、裸の核酸を細胞の中に導入することができる。核酸の取り込み量を増加させるために、ジメチルスルフォキシドまたはクロロキンによるショックステップを加えることができる。DEAE-デキストラン形質転換法は、インビトロでの細胞の改変にしか応用することができないため、細胞の中に、一過的に核酸を導入するために用いることはできるが、安定して形質転換された細胞を作出するのには適当ではない。したがって、この方法は、短期的に遺伝子産物を産生させるために用いることができるが、長期にわたる遺伝子産物の産生には勧められない方法である。DEAE-デキストラン媒介による形質転換に関するプロトコルは、分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）、Ausubel F.M.ら（編）、グリーン・バプリッシング・アソシエイツ（Greene Publising Associates）、(1989)、9.2節、および、分子クローニング：実験マニュアル、第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition）、Sambrookら、コールドスプリングハーバー研究所出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、(1989)、16.41-16.46節、または、この他の一般的な実験マニュアルに書かれている。
【０１１７】
2．エレクトロポレーション：適当な緩衝液中で細胞と核酸を一緒にインキュベートし、細胞に高電圧の電気パルスを与えることによって、裸の核酸を細胞の中に導入することもできる。エレクトロポレーションによって、核酸が細胞の中に導入される効率は、用いられる電場、電気パルスの強さ、温度、核酸の立体的配位と濃度、および培地のイオン組成によって影響を受ける。エレクトロポレーションを用いて、非常にさまざまなタイプの細胞を安定的に（または、一過的に）形質転換することができ、インビトロでの細胞の改変にのみ用いることができる。細胞のエレクトロポレーションに関するプロトコルは、分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）、Ausubel F.M.ら（編）、グリーン・バプリッシング・アソシエイツ（Greene Publising Associates）、(1989)、9.3節、および、分子クローニング：実験マニュアル、第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition）、Sambrookら、コールドスプリングハーバー研究所出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、(1989)、16.54-16.55節、または、この他の一般的な実験マニュアルに書かれている。
【０１１８】
3．リポソーム媒介による形質転換（「リポフェクション」）：核酸と、陽イオン性脂質を含むリポソームとを混合することによって、裸の核酸を細胞の中に導入することができる。そして、核酸/リポソーム複合体を、細胞とともにインキュベートする。リポソーム媒介による形質転換を用いて、培養液中の細胞を、インビトロで、安定的に（一過的に）形質転換することができる。プロトコルは、分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）、Ausubel F.M.ら（編）、グリーン・バプリッシング・アソシエイツ（Greene Publising Associates）、(1989)、9.4節、および、その他の一般的な実験マニュアルに書かれている。さらに、リポソームを用いて、インビボでの遺伝子輸送を行なうことができる。例えば、Nicolauら、(1987)Meth. Enz. 149:157-176; WangとHuang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855; Brighamら、(1989) Am. J. Med. Sci. 298:278; および、Gould-Fogeriteら、(1989) Gene 84:429-438。
【０１１９】
4．直接注入：核酸を直接、細胞に注入することによって、核酸を細胞の中に導入することができる。細胞をインビトロで培養したものに対し、マイクロインジェクションによって導入することができる。細胞の一個一個にマイクロインジェクションを行なうため、この方法は、非常に多数の細胞を改変するときには、非常に手がかかる。しかし、マイクロインジェクションが特別の方法となるのは、遺伝子導入動物を作製するときである（下で詳細に考察する）。この場合には、核酸が、受精卵の中に安定して導入され、その後、動物までに育てることができる。この結果作出された動物は、卵母細胞に導入された核酸をもっている。直接注入法は、また、インビボで、裸の核酸を細胞の中に導入するためにも用いられている（例えば、Acsadiら、(1991) Nature 332:815-818; Wolffら、(1990) Science 247:1465-1468を参照のこと）。インビボで、細胞の中にDNAを注入するための輸送装置（例えば、「ジーン・ガン」）を用いることができる。このような装置は購入可能である（例えば、バイオラド（BioRad）社から）。
【０１２０】
5．レセプターが媒介するDNAの取り込み：核酸を、細胞表面レセプターに対するリガンドに結合している、ポリリジンなどの陽イオンと複合化させることによって、細胞の中に、裸の核酸を導入することもできる（例えば、Wu, G.とWu, C.H. (1988) J. Biol. Chem. 263:14621; Wilsonら、(1992) J. Biol. Chem. 267:963-967; および米国特許第5,166,320号を参照のこと）。核酸-リガンド複合体のレセプターへの結合は、レセプターが媒介するエンドサイトーシスによる核酸の取り込みを促進する。核酸-リガンド複合体の標的となるレセプターには、トランスフェリンレセプターとアシアロ糖蛋白質レセプターが含まれる。自然にエンドソームを破壊し、それによって、細胞質の中に物質を放出することのできる、アデノウイルスのカプシドに結合した核酸-リガンド複合体を、細胞内のリソソームによる複合体の分解を避けるために用いることができる（例えば、Curielら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8850; Crisitianoら、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2122-2126を参照のこと）。レセプターが媒介する核酸の取り込みは、インビボでも、インビトロでも、細胞の中に核酸を導入するために用いることができるということに加えて、目的の標的細胞上で選択的に発現されているレセプターに結合するリガンドを用いることによって、核酸に特定の細胞型を狙わせることができるという特徴をもつ。
【０１２１】
一般的に、（例えば、上記の形質転換技術の一つによって）培養中の細胞の中に、裸の核酸を導入すると、ほんの僅かな細胞画分のみ（10５個のうち約1個）が、典型的には、ゲノムの中に、形質転換された核酸を組み込む（すなわち、核酸は、細胞の中で、エピソーム的に保持される）。したがって、外来の核酸を取り込んだ細胞を同定するためには、選抜マーカーをコードする核酸を、目的の核酸とともに、細胞の中に形質転換させるのが便利である。好ましい選抜マーカーには、G418、ヒグロマイシン、およびメトトレキセートなどの薬剤に対する抵抗性を付与するものが含まれる。選抜マーカーは、目的の遺伝子と同じプラスミドに導入してもよいし、別のプラスミドに導入してもよい。
【０１２２】
B．ウイルスが媒介する遺伝子移行
遺伝子産物をコードする核酸を細胞の中に導入するための好ましい方法は、遺伝子産物をコードする、例えば、cDNAなどの核酸をもつウイルスベクターの利用によるものである。ウイルスベクターによる細胞の感染には、細胞の大部分が核酸を受容するという利点があり、これによって、核酸を受容した細胞の選抜を行なう必要を回避することができる。さらに、ウイルスベクターの中にコードされている分子、例えば、ウイルスベクターに含まれるcDNAは、ウイルスベクターの核酸を取り込んだ細胞の中で効率的に発現されるため、ウイルスベクターシステムは、インビトロでも、インビボでも用いることができる。
【０１２３】
1．レトロウイルス：欠損レトロウイルスは、遺伝子治療を目的とした遺伝子導入に用いるために、充分に特徴が分かっている（総説としては、Miller, A.D. (1990) Blood 76:271を参照のこと）。目的の遺伝子産物をコードする核酸を、レトロウイルスのゲノムに挿入させた組換えレトロウイルスを構築することができる。さらに、レトロウイルスゲノムの一部を除去して、レトロウイルスの複製を欠損させることができる。そして、複製欠損レトロウイルスを、標準的な技術により、ヘルパーウイルスを使用して、標的細胞の感染に用いることのできるウイルス粒子にパッケージする。組換えレトロウイルスを作出し、インビトロ、またはインビボで、そのようなウイルスによって、細胞を感染させるためのプロトコルは、分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）、Ausubel F.M.ら（編）、グリーン・バプリッシング・アソシエイツ（Greene Publising Associates）、(1989)、9.10-9.14節、および、その他の一般的な実験マニュアルに書かれている。適当なレトロウィルスには当業者似よく知られているＰＬＪ、ＰＺＩＰ、ＰＷＥおよびＰＥＭが含まれる。適当なパッケージングウイルス系統には、_Crip、_Cre、_2、および_Amが含まれる。レトロウイルスを用いて、上皮細胞、内皮細胞、リンパ細胞、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞などの多くの異なった細胞型の中に、インビトロ、および/またはインビボで、さまざまな遺伝子が導入されている（例えば、Eglitisら、Science (1985) Science 230:1395-1398; DanosとMulligan、(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464; Wilsonら、(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018; Armentanoら、(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145; Huberら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043; Ferryら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381; Chowdhuryら、(1991) Science 254:1802-1805; van Beusechemら、(1992) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 89:7640-7644; Kayら、(1992) Human Gene Therapy 3:641-647; Daiら、(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895; Hwuら、(1993) J. Immunol. 150:4104-115; 米国特許第4,868,116号; 米国特許第4,980,286号; PCT出願国際公開公報第89/07136号; PCT出願国際公開公報第89/02468号; PCT出願国際公開公報第89/05345号;およびPCT出願国際公開公報第92/07573号を参照のこと）。レトロウイルスのゲノム（および、それに挿入された外来の核酸）が、宿主ゲノムの中に組み込まれ、細胞の中に核酸を安定して導入するためには、標的細胞が分裂することが必要である。したがって、標的細胞の複製を刺激する必要がある。
【０１２４】
2．アデノウイルス：目的の遺伝子産物をコードし、発現させるが、正常な溶菌ウイルス生活環における複製能力に関しては不活性化されているように、アデノウイルスのゲノムを操作することができる。例えば、Berknerら、(1988) Bio Techniques6:616; Rosenfeldら、(1991)  Science  252:431-434; およびRosenfeldら、(1992)Cell 68:143-155を参照のこと。アデノウイルス株Ad型5 dl324、または、その他のアデノウイルス株（例えば、Adz、Ad3、Ad7など）に由来する、適当なアデノウイルスベクターが、当業者によく知られている。効率的な遺伝子輸送手段となるために、細胞分裂を必要とせず、気道上皮（Rosenfeldら、(1992) 前記）、内皮細胞（Lemarchandら、(1992)  Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482-6386）、肝細胞（HerzとGerard、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2812-2816）、および筋細胞（Quantinら、(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584）を含む、広い範囲の多様な細胞型に用いることができるという点で、組換えアデノウイルスが好都合である。さらに、導入されたアデノウイルスの核酸（および、そこに含まれる外来DNA）は、宿主細胞のゲノムの中には組み込まれず、エピソーマルに留まり、それによって、導入された核酸が宿主ゲノムの中に組み込まれた場合（例えば、レトロウイルスDNA）に、挿入突然変異の結果として起こる可能性のある問題が回避される。さらに、他の遺伝子輸送ベクターに較べて、外来DNAに対する、アデノウイルスゲノムの搭載能力は大きい（8キロベースまで）（Berknerら、前掲；Haj-AhmandとGraham (1986) J. Virol. 57:267）。現在用いられている複製欠損アデノウイルスベクターのほとんどは、ウイルスのE1およびE3遺伝子の全部または一部を欠失してるが、アデノウイルスの遺伝物質のほぼ80％を保持している。
【０１２５】
3．アデノ関連ウイルス：アデノ関連ウイルス（AAV）は、効率的な複製と生産的な生活環を行なうためにヘルパーウイルスとして、アデノウイルスやヘルペスウイルスなど、別のウイルスを必要とする、天然の欠損ウイルスである。（総説として、Muzyczkaら、(1992) Curr. Topics in Micro. and Immunol. (1992) 158: 97-129）。また、それは、そのDNAを非分裂細胞の中に組み込んで、高い頻度で安定した組み込みを示すウイルスの一つでもある（例えば、Flotteら、(1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356; Samulskiら、(1989) J. Virol. 63:3822-3828; および、McLaughlinら、(1989) J. Virol. 62:1963-1973を参照のこと）。300塩基対までのAAVを含むベクターが、パッケージされて、組み込むことができる。外来核酸が入り込めるの余裕は、約4.5 kbまでに制限されている。Tratschinら、(1985) Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260で説明されているようなAVVベクターを用いて、細胞の中に、核酸を導入することができる。AAVベクターを用いて、さまざまな核酸が、異なった細胞型の中に導入されている（例えば、Hermonatら、(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschinら、(1985) Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisfordら、(1988) Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschinら、(1984) J. Virol. 51:611-619; およびFlotteら、(1993) J. Biol. Chem. 268:3781-3790）。
【０１２６】
当技術分野において、日常的に用いられる標準的な方法によって、特定の発現ベクター系と、細胞の中に核酸を導入する方法の有効性を評価することができる。例えば、フィルターハイブリダイゼーション技術（例えば、サザンブロッティング）によって、細胞の中に導入された核酸を検出することができ、例えば、ノザンブロッティング、RNaseプロテクション、または逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応（RI-PCR）によって、導入された核酸の転写によって産生されるRNAを検出することができる。適当なアッセイ法、例えば、特異的抗体などによる、産生された蛋白質の免疫学的検出法、または、酵素アッセイ法などの、遺伝子産物の機能活性を検出するための機能アッセイ法によって、遺伝子産物を検出することができる。細胞によって発現される、目的の遺伝子産物を容易に測定できない場合には、まず、調節因子に結合させたレポーター遺伝子と、使用すべきベクターとを用いて、発現系を最適化させることができる。レポーター遺伝子は、容易に検出できる遺伝子産物をコードしているため、系の有効性を評価するために利用することができる。当技術分野において使用される、標準的なレポーター遺伝子には、ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、およびヒト成長ホルモンが含まれる。
【０１２７】
本発明による、オプソニンと混合された細胞の調製
本発明は、また、オプソニンと混合された細胞の調製も意図している。したがって、細胞が、すでに、例えば、腫瘍細胞抗原（内生的に発現される抗原でも、異種抗原でもよい）などの抗原を発現していて、上記で定義されたようにして、オプソニンと混合されていれば、この調製物は、本発明による「オプソニン強化細胞」と見做される。この混合液において、調製物は、従来の生理的塩類緩衝液の中に、1 μg-100 μg/mlの蛋白質（オプソニン）と混合した約10４-10８個の細胞からなる。
【０１２８】
発明が、オプソニンと混合した細胞の調製物を含むときには、まず、常法にしたがって、オプソニンを調製してから、細胞と混合する。オプソニンは、宿主細胞系統、または菌株の形質転換による組換えDNA技術と、組換え蛋白質の分離によって、オプソニンを調製することができる。
【０１２９】
培養中の真核生物の宿主細胞などのような、本発明の宿主細胞を用いて、本発明のポリペプチドを産生（すなわち発現）することができる。例えば、形質転換された宿主細胞（その中には、本発明のポリペプチドをコードしている組換え発現ベクターが導入されている）を、適当な培地の中で培養して、ポリペプチドを産生させ、培地または宿主細胞から単離することができる。
【０１３０】
CaPO4によって媒介される形質転換：核酸とリン酸カルシウムを含む沈殿物を形成させることによって、細胞の中に、裸の核酸を導入することができる。例えば、HEPESで緩衝化した生理食塩溶液を、塩化カルシウムと核酸とを含む溶液と混合しｍ沈殿を形成し、次いで、沈殿と細胞とをインキュベートする。一定の細胞による核酸の取り込み量を増加させるために、グリセロールまたはジメチルスルホキシドによるショックステップを加えることができる。CaPO4が媒介する形質転換法を用いて、細胞を安定的に（または、一過的に）形質転換することができ、インビトロでの細胞の改変にのみ応用することができる。CaPO4媒介による形質転換に関するプロトコルは、分子生物学の最新プロトコル（Current Protocolsin Molecular Biology）、Ausubel F.M.ら（編）、グリーン・バプリッシング・アソシエイツ（Greene Publising Associates）、(1989)、9.1節、および、分子クローニング：実験マニュアル、第２版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Edition）、Sambrookら、コールドスプリングハーバー研究所出版（Cold Spring Harbor Laboratory Press）、(1989)、16.32-16.40節、または、この他の一般的な実験マニュアルに書かれている。
【０１３１】
本発明によって、免疫応答が調節されるか否かの判定
本発明によるオプソニン強化細胞は、哺乳動物、好ましくは、ヒトにおける、抗原、または細胞に含まれる抗原に対する免疫を調節するのに有用である。細胞が投与されると、抗原提示細胞によって取り込まれる（すなわち、摂取または貪食される）。あるいは、細胞を、貪食作用が起きる条件下で、抗原提示細胞に接触させる。
【０１３２】
「免疫応答」とは、免疫系を含む、選択された応答を刺激/活性化すること、または、選択された応答を、抑制、除去、もしくは減衰させることを意味する。したがって、免疫応答を調節することは、所望の応答が、オプソニン強化細胞でない以外、あらゆる点で同一の細胞に、同じ方法で投与されたときよりも、より効率的に、より迅速に、より大きな程度、および/または、より簡単に誘導されることを意味する。被験者における免疫応答が異なれば、異なった方法で調節されるかもしれない。例えば、液性免疫が選択的に減衰される一方で、細胞性免疫が選択的に促進されるかもしれない、逆もまた同じである。
【０１３３】
以下の、インビトロとインビボのアッセイ法は、本発明によって、免疫応答が調節されるか否かを決定するために有用である。下で詳細に説明されている、このアッセイ法は、抗原に対する細胞性または液性免疫応答の刺激、または抑制を測定するものである。以下のアッセイ法で言及されている抗原は代表的なものである。以下のアッセイ法の一つ以上を、そのアッセイ法を抗原に適応させて用いて、本発明によって有用な選択された抗原に対する免疫応答を測定することができる。
【０１３４】
I．貪食作用の上昇の検出
以下のアッセイ法は、オプソニン強化細胞が、抗原提示細胞による貪食作用を刺激するか否かを判定するために用いることができる。
【０１３５】
添加FCSなしのRPIM中、37℃で30分間付着させた単球を用いて、貪食作用を調べる。羊の赤血球を、候補オプソニン、または、その前駆体とともに、このような分子が平均して300個以上は、各赤血球に付着しないような条件の下でインキュベートする。前駆体が用いられるときには、付着させた赤血球をさらに処理して、全ての前駆体を実際の候補分子に変換させる（例えば、Carloら、J. Immunol. 123:523-8 (1979)を参照のこと）。新鮮な単球を、被験者から分離し、これらの細胞5×10４-1×10５個を、1％BSA入りのRPMI培地、0.25-0.5 mlに懸濁する。このアリコートを、組織培養用ウェルに入れ、37℃で30分間インキュベートする。過剰量の付着赤血球でこの単球が覆われ、1.2×10８細胞/mlに懸濁されているこのプレートを、50 gで5分間遠心分離し、37℃で30分間インキュベートする。付着細胞を固定、染色して、光学顕微鏡下で調べる前に、氷冷した溶解用緩衝液を用いて、低張の溶解ステップを2回行なって、摂取されなかった材料を取り除く。1個以上の標的細胞を摂取している単球100個の百分率を決定して、貪食作用を定量し、摂取されたEの全数量/単球100個（PI）を記録する。本発明による、貪食作用の刺激は、貪食指数が40か、それ以上あるときに示される。
【０１３６】
II．免疫応答の増幅には、通常、正常なときは静止状態にあるリンパ細胞の、特定の亜集団の増殖が含まれる。
【０１３７】
増殖アッセイ法は、臨床試験において、以下のように応用される：（1）マイトジェンまたは抗-CD3抗体のようなポリクローナル増殖シグナルに応答する能力として表される、T細胞またはB細胞の免疫学的なコンピテンスの全体的な評価。増殖に問題があるのは、基本的な細胞性免疫欠損を示していよう。低い増殖は、慢性疾患の非特異的な二次的効果として、よく見られる。（2）特異的な抗原に対する各人の応答の評価。ここで、応答が低いのは、一般または特異的な免疫学的欠陥があることを示している。（3）混合リンパ球反応（MLR）によるMHC適合性の判定。
【０１３８】
さらに、増殖アッセイ法は、リンホカイン産生を評価し、シグナル誘導を調べ、TまたはB細胞に関する、増殖因子要求性を評価するために有用である。ここで概略する方法は、DNAへの[３H]チミジンの取り込みを測定するものであるが、これは、細胞数の変化で測定すると、大抵、細胞増殖によく相関している。イオノマイシンにホルボールミリステートアセテート（PMA）を加えたものなどの化学的活性剤によるときのように、活性化刺激が毒性のとき、活性化後に新しいDNA合成が一斉に起きても、生存細胞の正味の増加を伴わず、実際、細胞数の減少が見られるであろう。この例において、DNAへの[３H]チミジンの取り込みは、細胞数の評価というよりは、最初の細胞刺激を示すものである。さらに、[３H]チミジンの取り込みは、個々の細胞ではなく、細胞集団についての情報を提供する。この種の情報を必要とする実験のために、フローサイトメトリーなど、別の方法を用いることができる。
【０１３９】
抗原誘導されたT細胞増殖のためのアッセイ法
このプロトコルは、特異的な抗原、破傷風トキソイドに応答したT細胞の増殖を調べるために設計されたものである。これを修正して、どのような蛋白質、または多糖類の抗原に応答したT細胞の増殖を調べることができる。材料：（T細胞懸濁液、自己抗原提示細胞懸濁液（非T細胞）、破傷風トキソイド溶液（コンノート社（Connaght）、または、マサチューセッツ州立研究所））。（1）T細胞を数え、完全RPIM-10 ABで、1×10６細胞/mlに調整する。（2）一方向MLRプロトコルの第二ステップとして、抗原提示細胞を、マイトマイシンCで処理する（または、2500 radで照射する）。抗原提示細胞の濃度を2×10５細胞/mlに調整する。抗原提示細胞は自己非Ｔ細胞または自己単球／マクロファージである。（3）ウエルに100 μlのT細胞懸濁液と、50 μlの抗原提示細胞集団を加え、分注する直前に混合する。（4）最終濃度が、0、1、5、10および20 μg/mlになるように、50 μlの破傷風トキソイド溶液を加える。各希釈液について、3個のウエルを用意する。（5）加湿した37℃、5％CO２インキュベーターの中で6日間インキュベートする。（6）[３H]チミジンで標識し、補助プロトコルに述べられているようにして回収する。
【０１４０】
リンホカインに依存した細胞増殖のためのアッセイ法
このプロトコルは、リンパ球集団の、リンホカインに依存した増殖、この場合は、IL-4に依存したB細胞の増殖を測定するものである。材料：（扁桃B細胞懸濁液、セファロースビーズ（バイオラド社）にクロスリンクした抗IgM、完全RPIM-10中の10,000 U/mlのヒトｒIL-4（ジンザイム（Genzyme）社））。（1）扁桃B細胞の数を数え、完全RPIM-10で、1×10６細胞/mlに調整する。（2）各ウエルの中に、100 μlの扁桃B細胞を分注する。各実験条件に対して３つのウェルを準備する。（3）10,000 U/mlのｒIL-4溶液を、1:10、1:100、および1:1000に希釈する。適当なウエルに、20 μlの保存液、または希釈液を加えて、1000 U/ml、100 U/ml、10 U/mlになるようにする。ｒＩＬ−４を加えない対照ウェルを含める。（4）適当なウエルの中に、抗IgMビーズをピペットで分注する。
【０１４１】
パイロット実験で最適なビーズ濃度を決める。各実験では、最適な用量に「括弧」を付けて、いくつかのビーズ濃度を含ませるのが最善である。扁桃B細胞とIL-4希釈液だけを入れたウエル、抗IgMビーズのみを入れたウエル、培養培地だけを入れたウエル、および、IL-4と抗IgMビーズの希釈液のあらゆる組合せを入れたウエルを用意する。（5）必要ならば、各ウエルの容量を、RPIM-10で200 μlに増加させる。（6）加湿した37℃、5％CO２インキュベーターの中で5日間培養する。（7）[３H]チミジンで標識し、補助プロトコルに述べられているようにして回収する。
【０１４２】
[３H]チミジン標識化、および細胞培養物の回収
このプロトコルは、[３H]チミジン取り込むアッセイ法を完了するために、上記のプロトコルと関連して用いられる。（1）培養を終了する前の決められた時間に（大抵は、6時間、または18時間前に）、各培養液に、20 μlの50 μCi/mlの[３H]チミジンを加える（1.0 μCi）。（2）取り込まれなかった[３H]チミジンを洗い流しながら、細胞を吸引し、細胞を溶解し、DNAを濾紙の上に移行させる自動マルチウェル回収器を用いて細胞培養物を回収する。微量滴定用プレートの各列を、10回ずつ、注入、吸引を繰り返して、細胞の完全な移行と、取り込まれなかった[３H]チミジンの完全な除去を確実にする。100％エタノールで各濾紙片を洗浄して、乾燥しやすくする。シンチレーション用バイアル瓶に移す。半自動化回収器では、各ウエル当りの濾紙断片を、シンチレーション用バイアル瓶に移す。手作業による移行では、照明の下で濾紙を乾燥させ、ピンセットでシンチレーション用バイアル瓶に移す。各バイアルに、シンチレーション溶液を加える。（3）標準偏差が2％より小さくなるまで、シンチレーションカウンターで、サンプルを計測する。バックグランド用培養液と、各実験条件について、cpmの平均値を計算する。反復培養においては、変動は20％より少ないはずである。
【０１４３】
III．インビトロでの抗体反応の誘導と測定
蛋白質または多糖類抗原によるインビボでの免疫の後、抗体反応を起こす、ヒトの免疫系の能力は、BおよびT細胞という免疫系の両方の武器の全体的な完全性を、意味深くも表している。このように、インビボで免疫した後に、抗体反応を測定することは、さまざまな後天的ならびに先天的免疫疾患における、また、免疫系に影響する別の症状をもつ宿主における免疫機能の適切な試験である。以下の手順は、インビボで免疫と、その後の免疫反応を、ELISA法を用いて測定するためのものである。
【０１４４】
NIP-およびHRPO-標識した抗体を用いた、サイトカインに関する免疫酵素アッセイ法
このプロトコルは、サイトカインが、微量滴定用プレートに結合した被覆抗体によって固定されている、外来性の非競合的な免疫アッセイ法を用いる、サイトカインに関する免疫酵素アッセイ法を説明している。非結合物を洗い流してから、ハプテン  ニトロヨードフェニル（NIP）で標識した、異なった抗サイトカイン抗体を用いて検出を行なう。これは、次に、抗-NIP抗体のホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRPO）結合体によって検出され、発色基質ABTSによって発色する。この非競合的な免疫アッセイ法において、免疫アッセイシグナル（A４０５）は、サンプル中に存在するサイトカインの量に正比例する関数である。抗体は、免疫学の最新プロトコル（Current Protocols in Immunology）、1995、6.20.2-6.20.10で説明されているところに従って、調製される。
【０１４５】
コートアッセイプレート。（1）マルチチャンネルピペッターを用いて、適当な希釈率の、100 μl被覆抗体を、使用するアッセイプレートの全てのウエルの中に移し入れる。（2）微量滴定用プレートシーラー、またはパラフィルムで、プレートを覆い、37℃で2時間インキュベートする。調製用プレートの中に、サンプルと標準とを調製する。（3）測定する各サンプル（または、順化培地のアリコート）を、等量の免疫アッセイ用希釈剤で希釈する。（4）測定する各希釈サンプルを、1 mlか、それより少量を、分離型スピン-X（Spin-X）微量濾過装置の上部チャンバーに、ピペットで入れる。10,000 rpmで5分間微量遠心して、下部チャンバーに集められた濾過物を保存する。（5）65 μlの各希釈サンプルを、調製用プレート（すなわち、分離した96ウェル微量滴定用プレート）の適当なウエルに加える。（6）サイトカイン標準のアリコートを室温で溶かして、よく混ざっていることを確認する。ピペットで、130 μlを、標準曲線上で最も高い濃度を表す、調製用プレートのウエルの中に入れる。このウエルから65 μlを次のウエルに移して、段階的な1:1の希釈を行ない続け、標準曲線上に表された各濃度が、調製用プレートの適当なウエルに位置するようにする。（7）較正液のアリコートを室温で溶かす（用いる場合）。等量の免疫アッセイ希釈液で希釈してから、65μlの希釈した較正液をピペットで、適当なウエル、または、適当なプレートのウエルに入れる。
【０１４６】
被覆抗体とインキュベートする。（8）インキュベーターから、被覆したプレートを取り出す。1×洗浄用緩衝液を満たした2リットルビーカーに浸してから、流しの上で逆さまにして、液体を振り落とす。さらに2回繰り返してから、ペーパータオルの上で水分をたたき落として乾かす。（9）調製用プレートの各ウエルから、アッセイ用のプレートの対応するウエルに、マルチチャンネルピペッターで、50 μlの溶液を移す。（10）微量滴定用プレートシーラー、またはパラフィルムで、プレートを覆い、室温で2時間インキュベートする。
【０１４７】
検出用抗体とインキュベートする。（11）目的のサイトカインに特異的な、NIP-標識した検出抗体を、検出用緩衝液で、1 μg/mlまで希釈する。（12）ステップ8におけるように、アッセイ用プレートを洗浄する。（13）使用しない外壁も含めて、アッセイ用プレートの全てのウエルに、ステップ11で得られた希釈検出用抗体を75 μl加える。（14）微量滴定用プレートシーラー、またはパラフィルムで、再びプレートを覆い、室温で1時間インキュベートする。
【０１４８】
HRPO結合抗-NIP抗体とインキュベートする。（15）HRPO結合抗-NIP Mabを検出用緩衝液に1:3000に希釈する。（16）ステップ8におけるように、アッセイ用プレートを洗浄する。（17）アッセイ用プレートの全てのウエルに、ステップ15で得られた希釈HRPO結合抗-NIP抗体を75 μl加える。（18）微量滴定用プレートシーラー、またはパラフィルムで、再びプレートを覆い、室温で1時間インキュベートする。
【０１４９】
発色基質とインキュベートする。（19）ステップ8におけるように、アッセイ用プレートを洗浄する。（20）アッセイ用プレートの全てのウエルに、100 μlのABTS基質反応溶液を加える。プレートを覆って、発色が、望ましいレベルに達するまで（一般的には、標準液の最高濃度を含むウエルのA４０５が、1.5と2の間になるまで）、室温でインキュベートする。このプロトコルは、普通、30分から60分後に読み取ることが可能なアッセイを作出している。
【０１５０】
プレートの読み取りと解析データ。（21）コンピュータのインターフェイスをもつ微量プレート読み取り器を用いて、単一波長方式では405 nmで、二重波長方式では405と650 nmで、全てのウエルの吸光度を測定する。（22）曲線適合ソフトウエアを用いて、第1度（直線）、第2度（二次曲線）もしくは4パラメータ（非直線）の数学的な関数によって説明される曲線に、標準データに適合させる。（23）未知のサイトカインサンプルから得られた吸光度のデータを、標準曲線に適合させ、サイトカイン濃度を適合させる。
【０１５１】
IV．インビボで抗体反応を誘導すると、免役系の全体的な完全性を評価する方法が提供される。ここに示すプロトコルにおいて、安全であり、入手可能であることから、ジフテリアと破傷風のトキソイドは、代表的な蛋白質抗原として用いられており、肺炎球菌の多糖は、代表的な多糖抗原として用いられている。しかし、これらの抗原で誘導される応答は、過去のワクチン接種や自然暴露による、二次的応答である可能性があることに留意すべきである。一次応答を得るためには、キーホール・リムペットのヘモシアニンのような、普通にはない抗原を用いるべきである。
【０１５２】
抗原を、ここにあるような、筋肉内、または皮下経由で投与すると、「全身的な」免疫応答が誘導されて、血流中の抗体の測定値が最も適正になる。しかし、ときには、「局所的な」、または、粘膜性の免疫応答に関心のあるときがある。この場合には、呼吸器のリンパ組織を刺激するには、鼻腔内から、または、胃腸のリンパ組織を刺激するには、口から抗原を投与し、抗体の内容について、血液ではなく、気管支洗浄液、または腸液を測定する。さらに、所的/粘膜応答の刺激に、より適している抗原が用いられる（すなわち、呼吸器応答には、インフルエンザウイルス抗原、および、胃腸の応答には、コレラ毒素）。
【０１５３】
インビボの抗体反応を測定するときに、蛋白質と多糖抗原の両方に対する反応を決定することが重要である。というのは、これらの抗原は、免疫系の異なった成分を刺激するからである。この点に関して、蛋白質抗原に対する主要な抗体反応は、IgG1とIgG3のサブクラス抗体を含むが、一方、多糖に対する主要な抗体反応は、IgG2のサブクラス抗体を含む。
【０１５４】
インビボでの免疫後に得られた材料における抗体反応を測定するために、さまざまな免疫アッセイ法が用いられている。これらの中では、ELISAアッセイ法が、安定した、容易に測定可能な、再現性のある、安全な結果を出すために、おそらく、最も有用であろう。
【０１５５】
蛋白質/多糖抗原に対する、インビボで抗体反応の誘導
このプロトコルにおいて、抗原は、筋肉内、または皮下経由で投与され、反応を測定するために、血清が集められる。（1）免疫前の血液サンプルを採り、血液を凝固させて、遠心分離によって、血塊から血清を分離する。この血清は、適当にラベルを付けたプラスチックチューブに入れて、-20℃から-70℃に保存する。（2）0.5 mlのトキソイド混合液を、静脈に注射しないよう気をつけて、適当に準備された筋肉内部位（三角筋または腿）に注射する。（3）0.5 mlの多価肺炎球菌ワクチンを、静脈に注射しないように気をつけて、適当に準備された皮下部位に注射する。（4）免疫後の血液サンプルを、望ましい間隔、通常は、1、2、および3週間の間隔で採る。血清を分離して、-20℃から-70℃に保存する。（5）すべての血清サンプルを集めたら、ELISAを用いて、抗体存在下で、サンプルを測定する。
【０１５６】
ELISAは、破傷風、ジフテリアの追加免疫、および多価肺炎球菌の多糖ワクチンによって、ワクチン接種された、個人から得た血清中の蛋白質および多糖抗体を含む、さまざまな抗原に対する、インビボでの抗体反応を測定するための、迅速で、感度が高く、再現性があり、非放射性の方法を提供する。破傷風、ジフテリア、および多価肺炎球菌多糖型I、II、およびIIIに特異的なアッセイ法が、免疫学の最新プロトコル（Current Protocols in Immunology）、1995、第6巻と7巻に詳述されている。
【０１５７】
腫瘍拒絶を用いたアッセイ法
免疫調節に関する、別のアッセイ法は、10４-10８個のオーダーの照射されたオプソニン強化腫瘍細胞を、免疫応答性のある動物にワクチンを接種し、10４-10８個のオーダーの生きた野生型の腫瘍細胞で（いかなる時間的な順序でも）攻撃誘発する。これらの動物で、それらの生残りと、腫瘍の開始とが、同じパラメータを用いて、オプソニン強化細胞の代わりに、照射された非オプソニン強化腫瘍細胞によって、ワクチンを接種された動物のそれと異なっていれば、免疫調節が起こったのである。例えば、試験グループの少なくとも10％の動物が、対照グループの平均生存期間より、100％長く生きていたら、この試験結果は陽性である。別の例としては、試験動物の20％において、腫瘍が開始するのが、対照動物における平均開始時期よりも、50％遅くなるかもしれない。
【０１５８】
（用途）
本発明を適用することができる腫瘍
本発明は、下記：黒色腫、扁平上皮細胞腫、基底細胞癌、星状細胞腫（アストロサイトーマ）、神経ごう腫（グリオーマ）、多形性神経ごう芽腫、髄膜腫、脳室上衣腫、神経鞘腫（シュワン鞘腫）、神経芽細胞腫、網膜芽腫、髄膜腫、グロムス腫瘍、例えば、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、骨液膜細胞肉腫、線維肉腫、紡錘細胞腫瘍、血管肉腫、原始神経外胚葉細胞腫瘍およびカポシ肉腫を包含する肉腫、リンパ腫、急性および慢性白血病、頭および首の腫瘍、鼻咽頭癌、咽頭癌、喉頭癌、甲状腺癌、上皮小体癌、胸腺腫、食道癌、胃癌、小腸癌、結腸および直腸癌、中皮腫、例えば、腺癌、扁平上皮細胞癌、気管支肺胞癌および小細胞腫瘍を包含する肺癌、膵臓癌、島（islet）または非島（non-islet）細胞腫瘍、乳癌、心臓粘液腫、下垂体腫瘍、カルチノイド腫（類癌腫）、肝腫瘍、胆管癌、肝芽腫、腎細胞癌、腎芽細胞腫、ウィルム腫瘍、副腎癌、褐色細胞腫、生殖細胞腫瘍、絨毛癌、卵巣癌、精巣癌、精上皮腫、子宮内膜腫瘍、前立腺癌、精嚢癌、膣腫瘍、陰茎癌、胞状奇胎、胆嚢癌および膀胱癌を、非制限的に含む腫瘍の治療を意図している。
【０１５９】
本発明によるトランスジェニック動物
本明細書に記載される強化（engineerd）オプソニンをコードする核酸分子を使用して非ヒトトランスジェニック動物を作出することができ、その様なトランスジェニック動物の細胞を単離して、動物またはヒトの予防接種において、ワクチン製剤に使用することができる。
【０１６０】
例えば、１つの実施態様においては、核酸分子が、受精卵母細胞または胚性幹細胞に導入される。次に、そのような細胞を用いて、内生核酸分子が変更されたゲノムまたは相同的組換え動物に、本発明のポリペプチドをコードする外来核酸分子が導入された非ヒトトランスジェニック動物を作出することができる。そのような動物は、本発明の分子の機能および／または活性の研究、並びに本発明の分子の活性のモジュレーターの同定および／または評価に有用である。本明細書に記載される「トランスジェニック動物」とは、動物の細胞の１つまたはそれ以上がトランスジーンを含む非ヒト動物であり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはマウスである。トランスジーンは、トランスジェニック動物がそこから発生した細胞のゲノムに導入され、成長した動物のゲノムにとどまり、それによって、トランスジェニック動物の１つまたはそれ以上の細胞種または組織中に、コードされた遺伝子産物を発現させる外来核酸である。
【０１６１】
本発明のトランスジェニック動物は、本明細書に開示されているポリペプチドをコードする核酸分子を、例えばマイクロインジェクションによって、受精卵母細胞の雄前核に導入し、卵母細胞を偽妊娠雌仮親動物（foster animal）中で成長させることによって、作出することができる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルも、トランスジーンに含んで、トランスジーンの発現効率を高めることができる。組織特異性調節配列を、機能的にトランスジーンに結合させて、本発明のポリペプチドの発現を特定細胞に指向させることができる。胚操作およびマイクロインジェクションによって、トランスジェニック動物、特にマウスのような動物を発生させる方法は、当分野において一般的であり、例えば、Lederらによる米国特許第４，７３６，８６６号および第４，８７０，００９号、Wagnerらによる米国特許第４，８７３，１９１号、並びにHogan,B.,Manipulation the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)に開示されている。同様の方法が、他のトランスジェニック動物の作出に使用されている。トランスジェニック創始者（founder）動物は、本発明の核酸分子の存在、例えば、それのゲノム中のトランスジーンおよび/または動物の組織または細胞中のトランスジーンｍＲＮＡの発現に基づいて、同定することができる。次に、トランスジェニック創始者動物を、トランスジーンを有する追加動物を育種するのにも使用することができる。さらに、本発明のポリペプチドをコードするトランスジーンを有するトランスジェニック動物を、他のトランスジーンを有する他のトランスジーン動物に育てることができる。
【実施例】
【０１６２】
本発明をさらに制限するものであると理解すべきではない下記実施例によって、本発明をさらに説明する。
【０１６３】
オプソニン強化、オプソニン発現細胞の製造
（実施例１）
マウスＣ３ｂのアルファ鎖を発現するマウス腫瘍細胞を含むオプソニン強化細胞を、下記のようにして得た。
【０１６４】
Genbank K02782のヌクレオチド2304-2324に対応する上流プライマーおよびK02782のnt5027-5050に相補的な下流プライマーを用い、５'ＢｃｌＩエクステンションを組み込んで、ネズミＣ３ｂのアルファ鎖をコードする配列を、マウス肝臓ｃＤＮＡからＰＣＲによってクローニングした。産物をＢｃｌＩで消化した。Ｃ３ｂａ'遺伝子の５'平滑末端がベクターの平滑上流自由末端に付着し、およびＣ３ｂａ'の３'付着末端がアニーリングされ、ベクターの下流自由末端において相補的な付着ＢｃｌＩオーバーハンドに付着するように、ポリペプチド分泌配列をコードする配列を組み込むようにして哺乳動物発現プラスミドＳＦＧ（Dranoffら、1993,Proc.Nat.Aca.Sci.90(8)3539）に、遺伝子を連結した。
【０１６５】
いくつかの実験に関しては、ＳＦＧ−Ｃ３ｂａ'プラスミドを用いて、塩化カルシウム法によって、両栄養性一過性レトロウイルス産生細胞（amphotrophic transient retroviral producer cells）（Bing cells,Pearら、1993,Proc.Nat.Acad.Sci.90(16)8392)）をトランスフェクトした。前記Pearらによる文献に記載の方法によって、これらの細胞からの上澄みを用いて、Ｃ３ｂ遺伝子をマウスＢ１６黒色腫細胞に導入した。これらのＢ１６細胞を、インビボ試験のために充分な数が得られるまで、培養基中で増殖させた。
【０１６６】
（実施例２）
他の実験に関しては、ＳＦＧ−Ｃ３ｂａ'プラスミドを、選択マーカーｐＳＶneoと共に、Ｂ１６黒色腫またはＣＭＳ−５線維肉腫中へ直接的にコエレクトロポレーションを行った。これらの細胞を、ワクチンとして使用するために選択し、増殖させた。
【０１６７】
（実施例３）
他の実験に関しては、Genbank S42292のnt124-138に対応する上流プライマーおよびS42292のnt817-840に相補的な下流プライマーを用い、５'ＢｇｌＩＩエクステンションを組み込んで、ネズミマンノース結合蛋白質Ａ遺伝子を、マウス肝臓ｃＤＮＡから増幅した。この産物をＢｇｌＩＩで消化し、平滑上流ＮｃｏＩおよび付着下流ＢａｍＨＩ末端（ＢｇｌＩＩオーバーハングと適合性である）で、ＳＦＧプラスミドに連結した。プラスミドを、ｐｓｉ−ＣＲＩＰ両栄養性レトロウイルス産生細胞中へｐＳＶneoと共にコエレクトロポレーションを行い、クローンを選別し、増殖させた。これらの細胞からの上澄みを用いて、ＭＢＰ−Ａ遺伝子をＢ１６細胞に伝達した。
【０１６８】
オプソニン強化細胞を使用する予防接種およびオプソニン強化細胞の有効性の立証
（実施例４）
１つの実験においては、ＧＭ−ＣＳＦを形質導入されたＢ１６細胞の能力、野生種Ｂ１６黒色腫に対する治療ワクチンとして機能する能力を、これらの細胞および前記のＣ３ｂａ'形質導入細胞の混合物の能力と比較した。
【０１６９】
９匹のＣ５７Ｂｌ/６マウスを各々、０.５ｍＬのＨＢＳＳに懸濁した１×１０６の生存野生種Ｂ１６細胞で攻撃誘発した（細胞を首部分に皮下注射した）。７日後、５匹のマウスに、腹部において、０.５ｍＬのＨＢＢＳ中の５×１０５照射ＧＭ−ＣＳＦ形質導入Ｂ１６細胞（Dranoffらの前記文献）を用いて皮下的にワクチン投与し、４匹に、２.５×１０５の照射ＧＭ−ＣＳＦ形質導入細胞と２.５×１０５の照射Ｃ３ｂａ'形質導入細胞との混合物を用いてワクチン投与した。結果は以下の通りであった。ＧＭ−ＣＳＦのみを接種された５匹全部が、攻撃誘発から９日目に腫瘍を発現した。混合ワクチンを接種したマウスのうち、１匹が９日目、１匹が１２日目、１匹が５１日目に腫瘍を発現し、１匹が１８０日目までに腫瘍を発現しなかった。ＧＭ−ＣＳＦ群のマウスは１匹も２０日目を過ぎて生存しなかったが、混合群は全て少なくとも３０日目まで生存した。
【０１７０】
これらの実験において、各マウスは、腫瘍が巨大になった場合に、およびそうなった時に、犠牲にされた。このことは幾分、主観的評価にかかわるが、犠牲時の腫瘍の大きさに関して一貫性があるようにする良心的試みがなされた。例えば、腫瘍が体重の１５〜２０％を越えると見られたとき、または歩行が冒されているときに、マウスが犠牲にされた。
【０１７１】
（実施例５）
他の実験においては、野生種Ｂ１６細胞の、腫瘍形成に対する予防的ワクチンとして機能する能力を、Ｃ３ｂａ'を形質導入されたＢ１６細胞の能力と比較した。５匹のＣ５７ＢＬ/６マウスに、腹部において、５×１０５照射野生種細胞を用いて皮下的にワクチン投与し、および５匹に５×１０５照射Ｃ３ｂａ'形質導入細胞を用いてワクチン投与した。７日後、全てのマウスを、１×１０６の生存野生種細胞を用いて、首において皮下的に攻撃誘発した。野生種群における腫瘍の開始は、攻撃後１１日目（２匹）、１２日目、および１５日目（２匹）であった。Ｃ３ｂａ'群における開始は、１２日目、１５日目、２９日目、３８日目および３９日目であった。野生種群のマウスの生存期間は１７日、１９日（２匹）、２０日および２２日であり、Ｃ３ｂａ'処置マウスの生存期間は、それよりも顕著に長く、即ち１９日、２２日、３７日、５４日および６１日であることを結果が示した。
【０１７２】
（実施例６）
他の実験においては、Ｃ３ｂａ'形質導入ＣＭＳ−５細胞の治療的有効性を評価した。Ｂａｌｂ/ｃマウスを、５×１０５野生種ＣＭＳ−５細胞を用いて、首において皮下的に攻撃誘発した。６日後、５匹のマウスを、腹部において、１×１０６野生種ＣＭＳ−５細胞を用いて、皮下的にワクチン投与し、５匹を１×１０６Ｃ３ｂａ'形質導入細胞を用いて、５匹を５×１０５野生種細胞と５×１０５ＧＭ−ＣＳＦ形質導入細胞（Dranoffらの前記文献）との混合物を用いて、並びに１０匹を５×１０５Ｃ３ｂａ'形質導入細胞と５×１０５ＧＭ−ＣＳＦ形質導入細胞との混合物を用いて、ワクチン投与した。全てのワクチン投与細胞が照射された。野生種群は、１１日目、１４日目（３匹）および１５日目に腫瘍を発現し、２６日目、３９日目（３匹）および４３日目まで生存した。３匹のＣ３ｂａ'群のマウスは、１１日目に腫瘍を発現し、１９日目および２６日目（２匹）まで生存した。しかし、４匹目は、有意に進行しない小さい腫瘍を１６日目に発現させ、このマウスは実験終了後である６０日経過後でさえも犠牲にする必要がなかった。５匹目は、実験が終了したときに、腫瘍を発現していなかった。野生種/ＧＭ−ＣＳＦ群のマウスの５匹全部が、１１日目に腫瘍を発現した。この中の２匹は１９日目まで生存し、３匹は２６日目まで生存した。Ｃ３ｂａ'/ＧＭ−ＣＳＦ群のマウスは、１１日目（５匹）、１２日目（２匹）、１５日目（２匹）および４３日目に腫瘍を発現した。それらは２６日目（５匹）、３９日目（２匹）、および４８日目（１匹）まで生存し、２匹の腫瘍は有意に進行しなかった。後者の２匹は、少なくとも６０日目まで犠牲にする必要がなかった。
【０１７３】
（実施例７）
他の実験においては、Ｃ３ｂａ'トランスフェクトＣＭＳ−５細胞を、予防的ワクチンとして、ワクチン投与細胞の数と攻撃誘発細胞の数との間の大きな差について試験した。Ｂａｌｂ/ｃマウスを、腹部において、２×１０５照射野生種（５匹）またはＣ３ｂａ'トランスフェクト（１０匹）細胞を用いて、皮下的にワクチン投与するか、またはワクチン投与しなかった（５匹）。７日後、全てのマウスを、２×１０７の生存野生種ＣＭＳ−５細胞を用いて、首において皮下的に攻撃誘発した。ワクチンを投与していない群および野生種群の全てのマウスが、９日目に腫瘍を発現し、１５日目まで生存した。Ｃ３ｂａ'群においては、１匹のマウスが少なくとも６０日目まで腫瘍を発現せず、一方、８匹が９日目に、および１匹が１７日目に腫瘍を発現した。腫瘍を発現したマウスは、１５日目（４匹）、１７日目（２匹）、２４日目（２匹）および３３日目まで生存した。
【０１７４】
（実施例８）
他の実験においては、マンノース結合蛋白質Ａ遺伝子を形質導入されたＢ１６細胞を、予防的ワクチンとして試験した。Ｃ５７ＢＬ/６マウスを、腹部において、５×１０５照射野生種Ｂ１６細胞（５匹）または５×１０５照射ＭＢＰ−形質導入細胞を用いて、皮下的にワクチン投与した。７日後、これらのマウスおよび５匹のワクチンを投与されなかったマウスを、１×１０６の生の野生種Ｂ１６細胞を用いて、首において皮下的に攻撃誘発した。ワクチン投与しなかった群は、９日目（４匹）および１２日目に腫瘍を発現し、１３日目、１６日目（３匹）および１８日目まで生存した。野生種群においては、９日目、１０日目、１２日目（２匹）および１３日目に腫瘍が発現し、全てのマウスが１８日目まで生存した。ＭＢＰ群においては、腫瘍の発現が、１０日目（２匹）、１３日目（３匹）、１６日目（２匹）、１８日目、２１日目、および２８日目であり、生存は、１７日目、１８日目（４匹）、２４日目（２匹）、２８日目（２匹）および４０日目までであった。
【０１７５】
人工オプソニンの製造
（実施例９）
１つの実施例においては、Genbank K02782のヌクレオチド2304-2324＋５'「ＡＴＧ」に対応する上流プライマー、および天然の停止コドンを省略したK02782のnt5027-5050に相補的な下流プライマーを用いて、補体Ｃ３のＣ３ｂ断片のアルファ鎖を、マウス肝臓ｃＤＮＡから、ＲＣＲ（変性６０秒/９４℃、アニーリング６０秒/５７℃、エクステンション２.５分/７２℃）によって増幅する。Genbank X16863のヌクレオチド621-646に対応し、Ｃ３ｂａ'アンチセンスストランドの５'末端に相補的な１２塩基を５'末端に含有する上流プライマー、およびX16863のヌクレオチド715-735を相補的であり、適切な制限部位を有する下流エクステンションを組み込んだ下流プライマーを用いて、ヒトＣＤ１６ＢのＧＰＩ修飾シグナル配列を、ＰＣＲ（変性６０秒/９４℃、アニーリング６０秒/５７℃、エクステンション４５秒/７２℃）によってクローン化する。両産物を、アガロースゲル電気泳動（Ｃ３ｂａ'に関して０.８％アガロース、ＣＤ１６Ｂ  ＧＰＩ−ｍｓに関して１.２％）によって単離し、ガラスビーズを用いて切り出したアガロースバンドから溶離し、吸光分光分析によって定量する。２つの増幅配列を、オーバーラップＰＣＲ法を用いて、フレーム内に互いに融合させる。要約すると、等モル量の２つの断片を、過剰量の上流Ｃ３ｂプライマーおよび下流ＣＤ１６Ｂプライマーと共に、ＰＣＲ反応に使用する（変性６０秒/９４℃、アニーリング９０秒/５０℃、エクステンション２.７５分/７２℃）。
【０１７６】
（実施例１０）
他の実施例においては、Genbank S42292のnt124-148に対応する上流プライマー、およびS42292のnt814-837に相補的な下流プライマーを用いて、ネズミマンノース結合蛋白質Ａ遺伝子を、マウス肝臓ｃＤＮＡから増幅する。Genbank U40434のヌクレオチド1786-1805に対応し、ＭＢＰのアンチセンスストランドの５'末端に相補的な１２塩基を５'末端に含有する上流プライマー、およびU40434のヌクレオチド1961-1986に相補的で、適切な制限部位を有する下流エクステンションを組み込んだ下流プライマーを用いて、ヒト・メソセリン（mesothelin）のＧＰＩ修飾シグナル配列を、ＰＣＲ（変性６０秒/９４℃、アニーリング６０秒/５７℃、エクステンション４５秒/７２℃）によって、ヒト中皮腫（mesothelioma）ｃＤＮＣからクローン化した。両産物を、アガロースゲル電気泳動（ＭＢＰに関して１％アガロース、メソセリンＧＰＩ−ｍｓに関して１.２％）によって単離し、ガラスビーズを用いて切り出したアガロースバンドから溶離し、吸光分光分析によって定量する。２つの増幅配列を、オーバーラップＰＣＲ法を用いて、フレーム内に互いに融合させる。要約すると、等モル量の２つの断片を、過剰量の上流ＭＢＰプライマーおよび下流メソセリンプライマーと共に、ＰＣＲ反応に使用する。
【０１７７】
（実施例１１）
他の実施例においては、Ｃ３ｂのＡＰＣ結合成分を含む膜貫通人工オプソニンを製造する。Genbank K02782のヌクレオチド2304-2324＋５'「ＡＴＧ」に対応する上流プライマー、およびK02782のnt2429-2453に相補的な下流プライマーを用いて、ネズミ補体Ｃ３のＣ３ｂ断片の部分を、マウス肝臓ｃＤＮＡから、ＰＣＲによって増幅する。Genbank V01526のヌクレオチド100-125に対応し、Ｃ３ｂ断片のアンチセンスストランドの５'末端に相補的な１２塩基を５'末端に含有する上流プライマー、およびV001526のヌクレオチド823-846に相補的で、下流停止コドンと適切な制限部位を有するエクステンションを組み込んだ下流プライマーを用いて、マウス脾臓ｃＤＮＡから、マウスＩｇＧ３の膜貫通領域を増幅する。両産物を、アガロースゲル電気泳動（両方に関して１.２％アガロース）によって単離し、ガラスビーズを用いて切り出したアガロースバンドから溶離し、吸光分光分析によって定量する。２つの増幅配列を、オーバーラップＰＣＲ法を用いて、フレーム内に互いに融合させる。要約すると、等モル量の２つの断片を、過剰量の上流Ｃ３ｂプライマーおよび下流ＩｇＧ３プライマーと共に、ＰＣＲ反応に使用する。
【０１７８】
前記産物を、適切な発現ベクター中にクローン化し、必要であれば上流分泌シグナルを組み込み、適切な細胞、例えば昆虫細胞中に発現させることができる。
【０１７９】
オプソニン強化細胞の製造のための人工オプソニンの使用
（実施例１２）
人工オプソニンをコードする核酸を前記のようにして細胞中に導入することによって、オプソニン強化細胞を製造することができる。ＧＰＩ結合人工オプソニンを使用して、下記手順（McHughらの前記文献）によって、オプソニン強化細胞を製造することもできる。細胞を適切な緩衝液、例えばＨＢＳＳまたは燐酸緩衝塩水に、１×１０５〜１×１０８細胞/ｍＬのオーダーの濃度において懸濁させる。ＧＰＩ結合オプソニンを１０〜２００μｇ/ｍＬのオーダーで加え、混合物を３７℃で２時間インキュベートする。使用前に、細胞を緩衝液中で３回洗浄する。
【０１８０】
投与量、投与方法、および医薬製剤
本発明は、哺乳動物における選択された抗原に対する免疫応答を調節する方法を包含し、該方法は、治療量のオプソニン強化細胞を哺乳動物に投与するか、または、治療量の細胞、例えば、オプソニン強化細胞をインターナリゼーションした抗原提示細胞に単離Ｔリンパ球を接触させることによって、抗原に対してエクスビボで感受性にされたＴリンパ球を投与する、ことを含んで成る方法である。
【０１８１】
本明細書に記載される細胞は、溶液または懸濁液のどちらかの注射可能な物質として製造することができ；感染前に、液状の溶液中または懸濁液中に好適な固体形態で製造することもできる。製剤を乳化することもでき、または細胞をリポソーム封入することもできる。免疫原有効成分が、医薬的に許容されかつ有効成分と適合性である担体と、混合されることも多い。「医薬的に許容される担体」という語は、それを投与される対象に、アレルギー反応を起こさないか、または他の悪い影響を与えない担体を意味する。好適な医薬的に許容される担体は、例えば、水、生理食塩水、燐酸緩衝塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せのうちの、１種またはそれ以上を包含する。さらに、所望であれば、ワクチンは、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および/またはワクチンの有効性を高めるアジュバントのような補助物質を少量で含有することができる。有効なアジュバントの例は、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（thr-ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７、nor−ＭＤＰと称される）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１'−２'−ジパルミトイル−sn−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）エチルアミン（ＣＯＰ）１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称される）、および、２％スクアレン/ツィーン８０エマルジョン中のバクテリアから抽出される３成分、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含有するＲＩＢＩを包含するが、それらに限定されるわけではない。アジュバントの他の例は、ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、フロインド完全および不完全アジュバント、並びにＱｕｉｌＡを包含する。さらに、リンホカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）のような免疫調節剤、またはポリＩ：Ｃのような合成ＩＦＮ−γ誘導剤を、本明細書に記載のアジュバントと組み合わせて使用することもできる。
【０１８２】
本発明の細胞は、例えば、皮下または筋肉内に、注射によって非経口投与することができる。他の投与形態に好適な追加的製剤は、坐薬、ある場合には、経口製剤またはエアゾールとして用いるのに好適な製剤を包含する。経口製剤の場合には、アジュバントを使用するＴ細胞サブセットの操作、抗原パッケージング、または個々のサイトカインの種々の製剤への添加は、最適化された免疫応答を有する向上した経口ワクチンを生じることができる。坐薬に関しては、従来の結合剤および担体を含むことができ、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含むことができ、そのような坐薬は、有効成分を０.５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲で含有する混合物から形成することができる。経口製剤は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム塩、セルロース、炭酸マグネシウムなどの、通常使用される賦形剤を含有する。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、持続放出製剤または散剤の形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の有効成分含有する。
【０１８３】
本発明のオプソニン強化細胞は、中性または塩形態のワクチン組成物に製剤化することができる。医薬的に許容される塩は、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基から形成される）を含み、塩酸または燐酸のような無機酸を用いて、または酢酸、蓚酸、酒石酸、マレイン酸などの有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第２鉄（ferric hydroides）のような無機塩基から、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から、誘導することもできる。
【０１８４】
そのようなワクチン組成物のどのような細胞成分も、このような組成物に含有するために、ワクチンの細胞の弱毒化または不活性化を含む処置にかけることができ、そのような処置は、例えば、細胞分裂を阻害することができるイオン化放射線への曝露、またはシクロホスファミド、サイトカラシンＤ、またはコルヒチンのような抗増殖剤、あるいは固定を伴うかまたは伴わない死滅を包含する。
【０１８５】
オプソニン強化細胞は、投与製剤に適合する方法において、並びに、予防的および/または治療的に有効な量において、投与される。投与される量は、治療される対象に依存し、例えば、抗体を合成する対象の免疫系の能力、および所望される保護の程度に依存する。好適な用量範囲は、数百マイクログラム有効成分／ワクチンのオーダーであり、好ましい範囲は約０.１μｇ〜１０００μｇ、例えば約１μｇ〜３００μｇ、好ましくは１０μｇ〜５０μｇの範囲である。初期投与および追加抗原の好適な投与計画も変化しうるが、初期投与、それに引き続く接種または他の投与を特徴とする。投与に必要とされる有効成分の厳密な量は、医師の判断に依存し、対象ごとに特定される。本発明のオプソニン強化細胞の治療的有効量が特に、投与計画、投与される抗原の単位用量、細胞が他の治療剤との組み合せて投与されるか否か、患者の免疫状態および健康状態、並びに特定の核酸分子またはオプソニン/抗原複合体の治療的活性に依存することは、当業者に明らかである。
【０１８６】
細胞は、単一投与計画において、好ましくは多投与計画において投与することができる。多投与計画は、予防接種の初期過程が１〜１０の分離投与を含み、続いて、免疫応答を維持または強化するために必要な時間間隔を開けて他の投与が行われ、例えば第二回目の用量のために１〜４ヶ月開け、必要であれば数ヶ月後に次の投与が行われる。１〜５年、通常は３年の間隔を開けた定期的追加免疫は、予防的免疫の所望の水準を維持するのに望ましい。免疫化過程に続いて、ＥＳＡＴ６またはＳＴ−ＣＦと共に培養される末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）の生体外増殖アッセイを行うことができ、および感作リンパ球から放出されるＩＦＮ−γのレベルを測定することができる。アッセイは、ラジオヌクレオチド、酵素、蛍光標識などの通常の標識を用いて行うことができる。これらの方法は当業者に既知であり、参照として本明細書に組み込まれる米国特許第３，７９１，９３２号、第４，１７４，３８４号、および第３，９４９，０６４号に開示されている。
【０１８７】
他の実施態様
前記実施例は、本発明の構成および実施において、本願発明者によって実施され、考案された実験を例示している。これらの実験は、本発明の実施分野を知らせ、およびその有用性を立証するという両方の役割を果たす技術の開示を含むと考えられる。本明細書に開示されている技術および実施態様は、一般に多くの同等の方法および技術を用いて同様の結果が得られるいう点において、単に好ましい具体例に過ぎないということが、当業者に理解されるであろう。
【０１８８】
前記に記載されている全ての文献は、前記に記載されている程度に、１つまたはそれ以上の実施態様の実施に重要な組成物および/または方法に対する基礎を与える程度に、あるいはそれらを可能にする程度に、特に参照として本明細書に組み込まれている。