(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボン酸（ａ）とヒドロキシ化合物（ｂ）とのジエステル化により得られる安定なジエステルであって、
（ａ）が、式（ＨＯＯＣ−ＣＨ2−）2−Ｎ−Ａ−Ｎ−（−ＣＨ2ＣＯＯＨ）2（式中、Ａは、−ＣＲ＝ＣＲ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＲ’＝ＣＲ’−（ここで、基Ｒ−ＲとＲ’−Ｒ’対の各々は、結合した−Ｃ＝Ｃ−残基とともに、フラン、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、１，２，３−トリアゾール、オキサゾール、イソキサゾール、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，５−オキサジアゾール、チアゾール、イソチアゾール、１，２，３−チアジアゾール、１，２，５−チアジアゾール、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、１，２，３−トリアジン、１，２−オキサジン、１，３−オキサジン、１，４−オキサジン、１，２−チアジン、１，３−チアジン及び１，４−チアジンからなる群から選択される芳香環もしくは複素環を形成し、Ｒ−Ｒにより形成される環はＲ’−Ｒ’−により形成される環と同じか又は異なる）である）を有する、２価金属イオンの薬剤学的に許容されるキレート化剤であり、
（ｂ）が、直鎖若しくは分岐鎖の、飽和もしくは不飽和のアルコール、アミノアルカノール、及びアリールアルカノールからなる群から選択される薬剤学的に許容されるアルコールである、
上記ジエステル又はその薬剤学的に許容される塩。
【請求項２】
基Ｒ−ＲとＲ’−Ｒ’対の各々は、結合した−Ｃ＝Ｃ−残基とともに、ベンゼン環を形成する、請求項１記載のジエステル。
【請求項３】
一般式Ｉ：
【化１】
0004668411.tif 000010
（式中、芳香環上の置換基はオルト位にあり；Ｘは、ＣnＨ2n+1（ｎ＝１〜１０）、ＣnＨ2n+1（ＯＣＨ2ＣＨ2）m（ｎ＝１〜２０、ｍ＝１〜６）、（ＣnＨ2n+1）2Ｎ（ＣＨ2）m（ｎ＝１〜６、ｍ＝１〜６）及びベンジル−ＣＨ2からなる群から選択され；そしてＭは、生理学的に許容される陽イオンである）の化合物。
【請求項４】
Ｘが、ＣnＨ2n+1（ＯＣＨ2ＣＨ2）m（ｎ＝１〜２０、ｍ＝１〜３）である、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
Ｘが、Ｃ2Ｈ5、Ｃ3Ｈ7、ｉ−Ｃ3Ｈ7、Ｃ4Ｈ9、Ｃ7Ｈ15、Ｃ8Ｈ17、ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ2Ｈ5ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ3Ｈ7ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ4Ｈ9ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ7Ｈ15ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ8Ｈ17ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ10Ｈ21ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ16Ｈ33ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ18Ｈ37ＯＣＨ2ＣＨ2、ＣＨ3（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ｃ2Ｈ5（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ｃ4Ｈ9（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ｃ6Ｈ13（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ｃ7Ｈ15（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ｃ8Ｈ17（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ｃ10Ｈ21（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、ＣＨ3（ＯＣＨ2ＣＨ2）3、（ＣＨ3）2ＮＣＨ2ＣＨ2及びＣ7Ｈ15（ＯＣＨ2ＣＨ2）3からなる群から選択される、請求項３記載の化合物。
【請求項６】
Ｘが、Ｃ2Ｈ5、Ｃ3Ｈ7、Ｃ4Ｈ9、Ｃ7Ｈ15、Ｃ8Ｈ17、Ｃ8Ｈ17ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ10Ｈ21ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ16Ｈ33ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ18Ｈ37ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ8Ｈ17（ＯＣＨ2ＣＨ2）2及びＣ10Ｈ21（ＯＣＨ2ＣＨ2）2からなる群から選択される、請求項５記載の化合物。
【請求項７】
ＸがＣ8Ｈ17である、請求項５記載の化合物。
【請求項８】
ＸがＣ8Ｈ17ＯＣＨ2ＣＨ2である、請求項５記載の化合物。
【請求項９】
請求項１若しくは２に記載のジエステル又は請求項３〜８のいずれか１項に記載の化合物を活性成分として、並びに薬剤学的に許容される希釈剤又は担体を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
活性成分として一般式Ｉ
【化２】
0004668411.tif 000011
［式中、芳香環上の置換基はオルト位にあり；Ｘは、ＣnＨ2n+1（ｎ＝１〜１０）、ＣnＨ2n+1（ＯＣＨ2ＣＨ2）m（ｎ＝１〜２０、ｍ＝１〜６）、（ＣnＨ2n+1）2Ｎ（ＣＨ2）m（ｎ＝１〜６、ｍ＝１〜６）及びベンジル−ＣＨ2からなる群から選択され；そしてＭは、生理学的に許容される陽イオンである］の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項１１】
Ｘが、Ｃ2Ｈ5、Ｃ3Ｈ7、Ｃ4Ｈ9、Ｃ7Ｈ15、Ｃ8Ｈ17、Ｃ8Ｈ17ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ10Ｈ21ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ16Ｈ33ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ18Ｈ37ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ8Ｈ17（ＯＣＨ2ＣＨ2）2及びＣ10Ｈ21（ＯＣＨ2ＣＨ2）2からなる群から選択される、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ＸがＣ8Ｈ17である、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＸがＣ8Ｈ17ＯＣＨ2ＣＨ2である、請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１４】
Ｃａ++、Ｃｄ++、Ｃｏ++、Ｃｕ++、Ｆｅ++、Ｈｇ++、Ｍｇ++、Ｍｎ++、Ｐｂ++、及びＺｎ++イオンからなる群から選択される過剰の２価金属イオンに関連する疾患又は障害の治療のための、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
非経口又は経口投与用の請求項１４記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記疾患又は障害が、脳及び心虚血、卒中、心筋梗塞、心不整脈、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、急性炎症、尿失禁、前立腺肥大、筋肉けいれん、動脈高血圧、喘息及び過敏性腸症候群からなる群から選択される増加したレベルの細胞内Ｃａ++イオンに関連する疾患又は障害である、請求項１４記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、キレート化剤の親油性ジエステル、これらの物質の合成法、これらの医薬組成物、及び２価金属イオンの異常レベル、特に細胞内Ｃａ++イオンの増加したレベルに関連する症状又は疾患の治療におけるこれらの使用に関する。さらに詳しくは本発明は、２価金属イオンキレート化剤の安定な親油性誘導体である、ＢＡＰＴＡとして本明細書に記載の１，２−ビス−（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸のジエステルに関する。
【０００２】
（発明の背景）
カルシウム、マンガン、マグネシウム、銅、亜鉛、及び第一鉄イオンのような金属イオンは、タンパク質構造、酵素活性、及び細胞シグナル伝達を制御することにより、生物系で重要な役割を果たす。脳及び心虚血、卒中、心筋梗塞、てんかん、慢性神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）、及び急性炎症を含む種々の疾患又は病的状態は、異常に上昇した細胞内カルシウムレベルの現象に関連すると考えられている。尿失禁、前立腺肥大、筋肉けいれん、動脈高血圧、喘息及び過敏性腸症候群のような神経及び筋肉活動亢進に関連する他の疾患はすべて細胞内２価イオン（例えば、カルシウム及び亜鉛）の上昇レベルと関連付けられている。
【０００３】
細胞内カルシウムは、細胞が経験する初期の傷害に関係なく、細胞死滅の重要な決定因子である。これは、標的細胞のリンパ球及びキラー細胞介在傷害、移植中の臓器傷害、及び虚血性傷害を含む他のタイプの組織傷害に関与しているかも知れない。カルシウムチャンネルブロッカー又は細胞膜透過型カルシウムキレート化剤は、組織傷害を防御するか又は組織傷害を低下させることが示唆されている。
【０００４】
虚血中に起きる細胞傷害は、Ｃａ2+イオンの流入及び／又は細胞内放出に２次的に起き得る（チョイ（Choi）、Trends Neurosci., 1988, 11, 465-469；シエスジョ（Siesjo）とスミス（Smith）、Arzneimittelforschung, 1991, 41, 288-292）。同様にカルシウム流入は、てんかん発作の発生において重要な役割を果たすようである。細胞内カルシウムのかなりの部分が細胞内貯蔵に由来するが、最近の研究は、カルシウム流入ブロッカーが抗けいれん活性を有する可能性があることを示唆している（例えば、メイヤー（Meyer）、Brain Res. Rev. 14, 227-24３を参照）。
【０００５】
従って、細胞内貯蔵からのカルシウムの病的放出又は細胞へのカルシウムの有害な流入に起因する可能性のある、細胞内カルシウムの病的蓄積を防止又は治療するために、いくつかの薬理学的方策が開発されている。
【０００６】
カルシウム関連疾患の治療に現在有用な又は将来有用であると思われる薬剤にはカルシウムチャンネルブロッカー、（ii）細胞内カルシウム貯蔵部位の変更によりカルシウムバランスに影響を与える薬剤、及び（iii）細胞内カルシウムキレート化剤がある。臨床の場で使用されているカルシウムチャンネルブロッカーには、ベラパミル（Verapamil）、ニフェジピン（Nifedipine）及びジルチアゼム（Diltiazem）がある。このような化合物の使用に関連する大きな毒性には、過度の血管拡張、負の変力性、洞結節速度の低下、及びＡ−Ｖ結節伝導障害がある。カルシウム動員及び／又は滞留に影響を与える薬剤（例えばカルシウムチャネルブロッカー）は、比較的狭い特異性を示す。
【０００７】
最も親和力が高く最も選択性が高いカルシウムキレート化剤の中には、１，２−ビス−（２−アミノフェノキシエタン）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）の種々の誘導体があり、これはもともとチエン（Tsien）（Biochem. 19, 2396, 1980）により報告された。例えば米国特許第４，６０３，２０９号、４，８４９，３６２号、５，０４９，６７３号及び５，４５３，５１７号に、ＢＡＰＴＡの種々の蛍光性及び他の反応性誘導体が開示されている。これらの開示された誘導体のいずれも、キレート化剤の安定なジエスルではない。
【０００８】
哺乳動物細胞への傷害を低下させるためのカルシウムキレート化剤の使用は、国際特許公報ＷＯ９４／０８５７３号に開示されており、これは、臨床的必要性のあるプロドラッグとしてカルシウムキレート化剤の細胞膜透過性エステルの使用を記載している。Ｃａ++及び他の２価金属イオンの利用可能な細胞膜透過性キレート化剤には、アセトキシメチルエステル、例えばエチレングリコールビス２−アミノエチルエーテルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸アセトキシメチルエステル（ＥＧＴＡ−ＡＭ）、エチレンジアミン四酢酸アセトキシメチルエステル（ＥＤＴＡ−ＡＭ）、及び１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸アセトキシメチルエステル（ＢＡＰＴＡ−ＡＭ）が含まれる。これらの既知の錯体分子は、遍在するエステラーゼにより消化されるプロドラッグであり、従って細胞内間隙でキレート化剤の活性化を引き起こす。すなわち、これらの化合物のエステラーゼ感受性により、生理的条件下では循環中の遊離ＢＡＰＴＡの高レベルを生じ、標的部位では薬剤の効力は低くなる。従って例えばＢＡＰＴＡ−ＡＭは、比較的高い治療用量で使用する必要があり、これは毒性を引き起こす。
【０００９】
（発明の概要）
本発明の１つの面において、キレート化剤の新規の安定な親油性ジエステルが提供される。すなわち本発明は、ヒドロキシ化合物（ｂ）を有する安定なジエステル化カルボン酸（ａ）であって、
（ａ）が、式（ＨＯＯＣ−ＣＨ2−）2−Ｎ−Ａ−Ｎ−（−ＣＨ2ＣＯＯＨ）2（式中、Ａは、２つの記載の窒素原子間の直接鎖の結合中に、２〜４個の酸素原子により中断されていてもよい連続鎖中に２〜８個の炭素原子を含有する飽和もしくは不飽和、脂肪族、芳香族又は複素環結合ラジカルであるが、ただし、２つの記載の窒素原子に直接結合した鎖のメンバーは酸素原子ではない）を有する、２価金属イオンのための薬剤学的に許容されるキレート化剤であり、
（ｂ）は、直鎖もしくは分岐鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アミノアルキル、及び置換もしくは非置換アリールアルキルラジカルからなる群から選択される薬剤学的に許容されるアルコールである、
上記ジエステル化カルボン酸及び該ジエステル化カルボン酸の薬剤学的に許容される塩が提供される。
【００１０】
本発明の好適な実施態様において、キレート化剤のジエステルであるエチレン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、エチレン−１，２−ジオール−ビス−（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、及び特に１，２−ビス−（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸のジエステルが提供される。
【００１１】
本発明のさらに好適な実施態様において、一般式Ｉ：
【化４】
0004668411.tif 000002
［式中、芳香環上の置換基はオルト位にあり；Ｘは、ＣnＨ2n+1（ｎ＝１〜１０）、ＣnＨ2n+1（ＯＣＨ2ＣＨ2）m（ｎ＝１〜２０、ｍ＝１〜６）、（ＣnＨ2n+1）2Ｎ（ＣＨ2）m（ｎ＝１〜６、ｍ＝１〜６）、及び置換もしくは非置換ＡｒＣＨ2からなる群から選択され；そしてＭは、任意の生理学的に許容される陽イオンである］で示されるジエステルが提供される。
【００１２】
本発明の現在好適な化合物は、Ｘが、Ｃ2Ｈ5、Ｃ3Ｈ7、ｉ−Ｃ3Ｈ7、Ｃ4Ｈ9、Ｃ7Ｈ15、Ｃ8Ｈ17、ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ2Ｈ5ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ3Ｈ7ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ4Ｈ9ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ7Ｈ15ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ8Ｈ17ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ10Ｈ21ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ16Ｈ33ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ18Ｈ37ＯＣＨ2ＣＨ2、ＣＨ3（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ｃ2Ｈ5（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ｃ4Ｈ9（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ｃ6Ｈ13（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ｃ7Ｈ15（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ｃ8Ｈ17（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ｃ10Ｈ21（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、ＣＨ3（ＯＣＨ2ＣＨ2）3、（ＣＨ3）2ＮＣＨ2ＣＨ2及びＣ7Ｈ15（ＯＣＨ2ＣＨ2）3からなる群から選択される一般式Ｉの化合物である。
【００１３】
より好適な化合物は、Ｘが、Ｃ2Ｈ5、Ｃ3Ｈ7、Ｃ4Ｈ9、Ｃ7Ｈ15、Ｃ8Ｈ17、Ｃ8Ｈ17ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ10Ｈ21ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ16Ｈ33ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ18Ｈ37ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ8Ｈ17（ＯＣＨ2ＣＨ2）2及びＣ10Ｈ21（ＯＣＨ2ＣＨ2）2からなる群から選択される、一般式Ｉの化合物である。
【００１４】
本発明のいくつかの薬学的実施態様について、最も好適な化合物は、ＸがＣ8Ｈ17又はＣ8Ｈ17ＯＣＨ2ＣＨ2である、一般式Ｉの化合物である。
【００１５】
本発明の別の面において、活性成分として本発明のキレート化剤の安定な親油性ジエステルと、薬剤学的に許容される希釈剤又は担体とを含んでなる医薬組成物が提供される。この医薬組成物は、液体又は固体投与型でもよく、経口的、非経口的、又は鼻内に投与してもよい。
【００１６】
本発明のキレート化剤の親油性ジエステルは、金属イオン関連疾患（例えば、マンガン、マグネシウム、銅、亜鉛、鉄、カドミウム、水銀、コバルト、及び特にカルシウムイオンの異常レベルに関連する疾患）の治療又は予防に有用である。すなわち別の面において本発明は、２価金属イオンのための薬剤学的に許容されるキレート化剤の安定な親油性ジエステルの治療上有効量を、治療の必要な患者に投与することを含んでなる、過剰の２価金属イオンに関連する疾患又は障害の治療方法を提供する。特に本発明は、過剰の細胞内Ｃａ++イオンに関連する疾患又は障害（例えば、脳及び心虚血、卒中、心筋梗塞、てんかん、アルツハイマー病、パーキンソン病、急性炎症、尿失禁、前立腺肥大、筋肉けいれん、動脈高血圧、喘息及び過敏性腸症候群）の治療方法を提供する。この方法は、本発明のキレート化剤の薬剤学的に許容されるジエステルの治療上有効量を、治療の必要な固体に投与することを含む。本発明の化合物はまた、直視下心手術のような医学的処置に有用である。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明によると、２価金属イオンのキレート化剤の安定なジエステルである化合物が提供される。この２価金属イオンには、これらに限定されないが、マンガン、マグネシウム、銅、コバルト、カドミウム、水銀、及び鉛、より好ましくは亜鉛と第一鉄イオン、及び最も好ましくはカルシウムイオンが含まれる。
【００１８】
本明細書及び請求の範囲において、用語「キレート化剤」は、当該分野で公知の２価金属イオンをキレート化することができる任意の分子を意味する。用語「安定な」は、実質的に純粋な型で単離するのに充分に強固な任意の分子を示す。
【００１９】
本発明のジエステルは、誘導体化されていない親化合物に比較したオクタノール／水分配係数の増加による測定を含む従来法により測定される、キレート化剤の親油性誘導体である。
【００２０】
本発明の１つの面において、ヒドロキシ化合物（ｂ）を有する安定なジエステル化カルボン酸（ａ）であって、
（ａ）が、式（ＨＯＯＣ−ＣＨ2−）2−Ｎ−Ａ−Ｎ−（−ＣＨ2ＣＯＯＨ）2（式中、Ａは、２つの記載の窒素原子間の直接鎖の結合中に、２〜４個の酸素原子により中断されていてもよい連続鎖中に２〜８個の炭素原子を含有する飽和もしくは不飽和、脂肪族、芳香族又は複素環結合ラジカルであるが、ただし、２つの記載の窒素原子に直接結合した鎖のメンバーは酸素原子ではない）を有する、２価金属イオンのための薬剤学的に許容されるキレート化剤であり、
（ｂ）は、直鎖もしくは分岐鎖の、飽和もしくは不飽和のアルキル、アミノアルキル、及び置換もしくは非置換アリールアルキルラジカルからなる群から選択される薬剤学的に許容されるアルコールである、
上記ジエステル化カルボン酸及び該ジエステル化カルボン酸の薬剤学的に許容される塩が提供される。
【００２１】
本発明の１つの実施態様において、結合ラジカルＡは、−（ＣＨ2ＣＨ2）m−（ここでｍ＝１〜４であり、窒素に結合していない炭素原子の２〜４個は酸素原子で置換されてよい）及び−ＣＲ＝ＣＲ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＲ’＝ＣＲ’−（ラジカルＲ−ＲとＲ’−Ｒ’の対の各々は、結合した−Ｃ＝Ｃ−残基とともに、５又は６個の環原子を含む芳香環又は複素環を形成し、Ｒ−Ｒにより形成される環は、Ｒ’−Ｒ’により形成される環と同じか又は異なる）からなる群から選択される。
【００２２】
本発明の具体的な実施態様において、結合ラジカルＡは、−ＣＨ2ＣＨ2−及び−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−から選択されるか、又は−ＣＲ＝ＣＲ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＲ’＝ＣＲ’−（ここで、ラジカルＲ−ＲとＲ’−Ｒ’の対の各々は、結合した−Ｃ＝Ｃ−残基とともに、フラン、チオフェン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール、１，２，３−トリアゾール、オキサゾール、イソキサゾール、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，５−オキサジアゾール、チアゾール、イソチアゾール、１，２，３−チアジアゾール、１，２，５−チアジアゾール、ベンゼン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、１，２，３−トリアジン、１，２，４−トリアジン、ならびに１，２−、１，３−、及び１，４−オキサジン類及び−チアジン類からなる群から選択される芳香環もしくは複素環を形成し、Ｒ−Ｒにより形成される環はＲ’−Ｒ’−により形成される環と同じか又は異なる）でもよい。
【００２３】
好適な実施態様において、結合ラジカルＡは、−ＣＲ＝ＣＲ−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−ＣＲ’＝ＣＲ’−［ここで、ラジカルＲ−ＲとＲ’−Ｒ’対の各々は、結合した−Ｃ＝Ｃ−残基とともに、非置換及び置換ベンゼン環（ここで、置換ベンゼン環は、飽和もしくは不飽和Ｃ1-4−アルキル、飽和もしくは不飽和Ｃ1-4−アルコキシ、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、及びＣＦ3からなる群から選択される１〜４個の置換基又は−Ｏ−（ＣＨ2）n−Ｏ−でありｎ＝１〜３である単一の２価置換基を含有する）から選択される同じか又は異なる環を形成する］である。
【００２４】
薬剤に取り込まれるカルシウムキレート化剤は、エチレン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、エチレン−１，２−ジオール−ビス−（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、及び特に１，２−ビス−（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸から選択されることが現在好適である。
【００２５】
本発明の最も好適な化合物は、一般式Ｉ：
【化５】
0004668411.tif 000003
［式中、芳香環上の置換基はオルト位にあり；Ｘは、ＣnＨ2n+1（ｎ＝１〜１０）、ＣnＨ2n+1（ＯＣＨ2ＣＨ2）m（ｎ＝１〜２０、ｍ＝１〜６）、（ＣnＨ2n+1）2Ｎ（ＣＨ2）m（ｎ＝１〜６、ｍ＝１〜６）及び置換もしくは非置換ＡｒＣＨ2からなる群から選択され；そしてＭは、任意の生理学的に許容される陽イオンである］の化合物である。
【００２６】
特に好適な実施態様において本発明のジエステルは、上記で定義した一般式Ｉの化合物であり、ここでＸは、Ｃ2Ｈ5、Ｃ3Ｈ7、ｉ−Ｃ3Ｈ7、Ｃ4Ｈ9、Ｃ7Ｈ15、Ｃ8Ｈ17、ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ2Ｈ5ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ3Ｈ7ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ4Ｈ9ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ7Ｈ15ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ8Ｈ17ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ10Ｈ21ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ16Ｈ33ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ18Ｈ37ＯＣＨ2ＣＨ2、ＣＨ3（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ｃ2Ｈ5（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ｃ4Ｈ9（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ｃ6Ｈ13（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ｃ7Ｈ15（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ｃ8Ｈ17（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ｃ10Ｈ21（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、ＣＨ3（ＯＣＨ2ＣＨ2）3、（ＣＨ3）2ＮＣＨ2ＣＨ2及びＣ7Ｈ15（ＯＣＨ2ＣＨ2）3からなる群から選択される。
【００２７】
より好ましくはＸは、Ｃ2Ｈ5、Ｃ3Ｈ7、Ｃ4Ｈ9、Ｃ7Ｈ15、Ｃ8Ｈ17、Ｃ8Ｈ17ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ10Ｈ21ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ16Ｈ33ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ18Ｈ37ＯＣＨ2ＣＨ2、Ｃ8Ｈ17（ＯＣＨ2ＣＨ2）2及びＣ10Ｈ21（ＯＣＨ2ＣＨ2）2からなる群から選択される。
【００２８】
最も好ましくは、ＸはＣ8Ｈ17又はＣ8Ｈ17ＯＣＨ2ＣＨ2である。
【００２９】
別の好適な実施態様において本発明の組成物は、２価金属イオンの薬剤学的に許容されるキレート化剤と、エチレングリコールのモノアルキルもしくはモノアルキルエーテルとのコンジュゲートを含む。現在好適なエチレングリコールには、モノ−、ジ−及びトリ−エチレングリコールが含まれる。また、テトラ−、ペンタ−又はヘキサ−エチレングリコールを使用することも可能であるが、これらの化合物は、その吸湿性のために特別な反応条件を必要とするであろう。
【００３０】
予想外にも、１，２−ビス−（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸のジエステル（本明細書において、ＢＡＰＴＡ−ジエステル又はＤＰ−ＢＡＰＴＡと呼ぶ）は、このカルシウムキレート化剤の他の誘導体と比較して、治療的応用を大きく改善されることが見いだされた。
【００３１】
新規ＢＡＰＴＡ−ジエステルの親油性は、親化合物より大きいことは明らかであり、これらの活性の上昇は、これらが細胞の原形質膜内に保持されるか又は他の細胞膜画分又はその近傍に保持され、従って細胞機能の調節能力が上昇するという事実によるかも知れない。キレート化剤のこれらのジエステルは、細胞膜の近傍を標的とすることが可能である。正確な作用機序に関係なく、これらのジエステルは、治療プロフィールの向上を有することが開示される。
【００３２】
本発明において、ジエステルの親油性は、ＢＡＰＴＡ分子のカルボキシル基に結合した残基、及び非エステル化カルボキシル基（上記で定義した式ＩでそれぞれＸとＭと記載される）上の対イオンに依存することが示される。
【００３３】
ジエステル化合物の親油性は、Ｘ中の脂肪族族鎖の長さに大きく依存し、７原子まではＸ中の炭素の数が増加するに従い劇的に上昇する。Ｃ7より長い脂肪族族鎖については、加えられる炭素１原子あたりの上昇は小さい。一般にＸ位のモノ−、ジ−又はトリ−エチレングリコールは、化合物の親油性を上昇させる。従って異なるエステル化Ｘ基の選択は、本発明の指定の化合物の生物活性の微調整に有用である。選択された対イオンもまた、特定のジエステルの親油性に関して考慮されるべきである。例えば表１に示すように、Ｎａ塩に対してＣａ塩においてオクタノール分配のさらなる上昇が観察される。
【００３４】
ある特定の組成物について適当な好適なアルコール及び対イオンの選択は、コンジュゲートの目的とする治療用途に依存し、本発明の原理に従って当業者により最適化され得る。
【００３５】
当業者は、２価金属イオン（特にカルシウムイオン）の異常レベルに関連する症状及び疾患に本発明の概念が如何に応用されるか理解し、その結果本発明の組成物が、金属イオンキレート化剤であるが最適化された薬剤活性を有する活性化合物のジエステルを含むことが、理解できるであろう。
【００３６】
細胞膜の傷害を引き起こす多くの事象（例えば、細胞障害性化学物質、物理的刺激及び感染性物質）は、虚血傷害に似た症状に最終的に至るカスケードを誘発することができる（ロビンズ（Robbins）ら著、Pathological Basis for Disease, 1984, p. 10, ダブリュー・ビー・ソンダーズ社（W.B. Saunders Co.））。本発明は、細胞内に又は原形質膜又はその近傍に２価金属イオンキレート化剤を導入することにより、これらの状況にある細胞を防御するのに有用であろう。
【００３７】
本発明の化合物は、直視下心手術や、高レベルの２価金属イオン（特にカルシウム）に関連する医学的症状の治療に有用である。これらの症状には、これらに限定されないが、脳及び心虚血、卒中、心筋梗塞、てんかん、慢性神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）、急性炎症、ならびに神経及び筋肉活動亢進に関連する疾患（例えば、尿失禁、前立腺肥大、筋肉けいれん、動脈高血圧、喘息及び過敏性腸症候群）がある。
【００３８】
本発明の種々のジエステルは、異常な細胞内カルシウムレベルに関係する疾患の実験モデルで試験された。これらの実験モデルには、虚血、心不整脈、及びてんかんのインビトロ及びインビボ系モデルが含まれていた。ＢＡＰＴＡ−ジエステルは、これらのすべてのモデル系で顕著な防御活性があることが証明された。
【００３９】
種々の傷害（例えば、心筋細胞中のグルタマート毒性及び無酸素症誘導性ニューロン細胞死滅及びウワバイン誘導性毒性）後の、細胞機能のパラメータ、酵素活性及び生存をインビトロでモニターすることにより、本発明の試験したＢＡＰＴＡ−ジエステルの防御作用をフォローした。
【００４０】
スナネズミ（Ｍｏｎｇｏｌｉａｎ  Ｇｅｒｂｉｌｓ）において誘導した全前脳虚血及びウィスターラットにおいて誘導したてんかんの動物モデル系は、インビボモデル系を表わす。
【００４１】
我々の実験室で合成したＢＡＰＴＡの異なるジエステルは、神経防御性、抗てんかん性及び心防御性化合物として特に有効であることが証明された。
【００４２】
ＢＡＰＴＡ−ジエステルの神経防御作用
本発明のＢＡＰＴＡ−ジエステルは、培養した皮質ニューロンにおけるグルタマート毒性及び無酸素症誘導性細胞死滅に対して防御性であった。ＤＰ−ＢＡＰＴＡを、グルタマート又は無酸素症傷害の期間の１時間前に添加した時及び同期間の少なくとも１時間後まで添加した時の両方で、薬剤の防御作用は明らかであった。
【００４３】
虚血モデル
両側の総頸動脈閉塞によりスナネズミ中で、全前脳虚血を誘導した。その結果、顕微鏡による形態データ（組織病理的分析）、改変された細胞の機能（ＮＳＥ酵素活性）及び動物全体の動作（生存データ）から判断すると、脳傷害が明らかであった。ジオクチル−ＢＡＰＴＡ（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−６０）及びジ（オクチル−エチレングリコール）−ＢＡＰＴＡ（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９）は両方、ニューロン傷害の予防に有用であった。試験したＢＡＰＴＡ−ジエステルは、動物の生存時間を２〜３倍延長させた。
【００４４】
ＢＡＰＴＡ−ジエステルの有利な防御作用は、局所的及び全体的脳虚血傷害の両方の防御に現れると理解されるべきである。
【００４５】
てんかんモデル
てんかんは、脳の電気的活動の異常により引き起こされる神経機能の慢性的で、再発性の、発作性変化を特徴とする一群の疾患である。神経機能不全エピソードは、発作と呼ばれ、部分的又は局所的発作、全身性発作、及びてんかん重積状態に分類される。ヒトにおけるてんかんの主要な原因は、遺伝的素因、頭部外傷、脳腫瘍、脳血管事故及び代謝障害である。
【００４６】
てんかんエピソードは、患者の日常生活において大きな不快と悪化を引き起こし、多くの場合生命に危険を及ぼし死に至ることもある。最も一般的に使用される抗てんかん薬は、過去２０〜３０年間利用されており、それらの全てがそれぞれ毒性の問題に関連する限界を有する。現在知られているすべての抗てんかん薬や治療（手術を含む）を用いても、大部分のてんかん患者において発作を完全に防止することができない。てんかん重積状態を示す患者において問題は深刻であり、約３０％の死亡率を有する。従って、副作用が最小限であり、安全で有効な薬剤に対する大きなニーズがある。
【００４７】
ＢＡＰＴＡ−ジエステルの防御作用を評価するための本研究で使用した動物モデル系は、ピロカルピンにより誘導されるラットの充分確立された実験てんかんである（ツルスキ・ダブリュー・エー（Truski W.A.）、イー・エー・カバルヒエロ（E.A. Cavalhiero）、エム・シュワルツ（M. Schwarz, ）、エス・ジェイ・クズクズワー（S.J. Czuczwar）、ゼット・クレインロック（Z. Kleinrok）及びエル・ツルスキ（L. Turski）（１９８３）、ラットのピロカルピンにより引き起こされる辺縁発作：行動、脳波及び神経病理的研究、Behavioral Brain Research 9, 315-335）。
【００４８】
ジ（オクチル−エチレングリコール）−ＢＡＰＴＡ（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９）は、動物モデル系における全身性発作とてんかん重積状態を防止することができ、死亡率を低下させることができた。
【００４９】
心防御作用
心室細動（ＶＦ）は、心筋梗塞と心臓手術の最も危険な合併症である。これは、電気的除細動器を使用して、うまく処理されている。しかし電気ショックの間に、バイパスや他の種類の移植物への傷害の危険がある。従って心臓手術の分野におけるＶＦの問題を解決するための薬理学的アプローチが好ましい。しかし既知の抗不整脈剤のほとんどは、細動除去器のエネルギー要求を増大するため、この目的のために臨床薬理学は満足できる薬剤を持たない。薬理学的アプローチは、虚血に関連する機能性房室ブロックの治療のために好ましい。
【００５０】
ジエチル−ＢＡＰＴＡ（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−２３）は、ウワバイン毒性エピソードを経た培養心筋細胞における遅延後脱分極をなくすことが証明された。すなわちこれは、１）ＶＦ又は心室不整頻脈（ＶＴ）の予防、及び２）改変された伝導度の治療のために、診療室において有用である。上記目的のために、多くの抗不整脈剤がうまく使用されている。しかしこれらの各々は好ましくない副作用（不整脈進行作用、低血圧、陰性変力作用）を有する。ＢＡＰＴＡのジエステルの作用機序は、現在のところ不明である。しかし従来の抗不整脈薬剤の間では現象学的に類似するところはない。既知の抗細動薬は、いずれも心臓伝導度を改善することができない。既知の抗細動薬のこれらの欠点は、新しいクラスの抗細動薬（これは胸部外科にとって特に有用である）としてのＢＡＰＴＡのジエステルの有用性を示すまだ実現されていない医学的ニーズを示している。
【００５１】
試験したモデル系のいくつかにおいてＢＡＰＴＡジエステルは、治癒モード及び予防モードの両方で治療作用を示すことが証明され、従って予防及び治癒目的で傷害の前又は後にいずれかに投与してもよい。
【００５２】
従って本発明のＢＡＰＴＡ−ジエステル薬剤は、過剰の２価金属イオン、特に過剰の細胞内Ｃａ++イオンに関連する種々の病的プロセスを治療又は予防するために有用である。このような病的プロセスは、例えば脳外傷、卒中、虚血及び梗塞のような外傷事象において誘導されるもの又はてんかん、パーキンソン病及びアルツハイマー病のような慢性疾患である。さらにカルシウム依存性活動亢進又はイオン平衡異常が関与する他の疾患（例えば、急性炎症、尿失禁、前立腺肥大、筋肉けいれん、動脈高血圧、喘息及び過敏性腸症候群）はすべて、ＢＡＰＴＡ−ジエステル薬による治療の恩恵を受け得る。この薬剤はまた、予定される手術（直視下心手術及びバイパス手術等）間の正常に近いイオンホメオスタシスの維持に応用される。
【００５３】
活性成分としてキレート化剤のジエステルを含む医薬組成物は、当該分野で公知の薬剤学的に許容される希釈剤又は担体をさらに含有する。これらの組成物は、適当な投与経路の必要に応じて、任意の適当な製剤（特に限定されないが、液剤、懸濁剤、エアゾル剤、ミセル剤、エマルジョン、ミクロエマルジョン、錠剤など）に調製してもよい。
【００５４】
適当な投与経路のいずれもが、本発明に包含され、特に限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、鼻内、直腸内、又は他の既知の経路が含まれる。好適な実施態様において、本発明の医薬組成物は、静脈内、経口、又は筋肉内投与される。本発明の組成物の投与量範囲は、所望の防御作用を生じるのに充分な大きさの用量である。投与される用量は、受容者の年令、性別、健康、体重、及び併用療法（もしあれば）、治療の頻度、並びに所望の作用に依存するであろう。投与法及び投与手段は、担当医師又は他の当業者により決定されるであろう。
【００５５】
既知の化合物であるＢＡＰＴＡ−ＡＭは、カルシウムレベルの上昇が関与しているとされている種々の病的プロセス中で有効な細胞防御活性を有することが証明されている（チミアンスキー（Tymianski）ら著、Neuron 11, 221-235, 1993；チミアンスキー（Tymianski）ら著、J. Cerebral Blood Flow and Metabolism、 14, 911-923, 1994；アブデル−ハミド（Abdel-Hamid）とチミアンスキー（Tymianski）、J. Neuroscience, 17, 3538-3553）。しかし、カルシウムホメオスタシスへの無制限の介入は、重大な安全性の問題を引き起こし、臨床的応用の可能性を明らかに限定する。本明細書に開示される新規ジエステルは、細胞内カルシウムホメオスタシスには影響を与えない点で、その活性においてより選択的であり、従ってＢＡＰＴＡの従来既知の誘導体より安全であるようである。
【００５６】
例
Ａ．化学例：
例１：アルキルのＢＡＰＴＡジエステル及びその塩の合成
１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）のジエステルの二ナトリウム又はカルシウム塩の合成を、以下の３工程で行った：
【００５７】
工程１．ＢＡＰＴＡの無水物の調製：
【化６】
0004668411.tif 000004
【００５８】
工程２．ＢＡＰＴＡジエステルの調製：
【化７】
0004668411.tif 000005
追加の好適な実施態様により、有利にはＲはまた、ＣnＨ2n+1（ここで、ｎ＝１〜１０）及びＣnＨ2n+1（ＯＣＨ2ＣＨ2）m（ここで、ｎ＝１〜２０、ｍ＝１〜６）であってもよい。
【００５９】
工程３．ＢＡＰＴＡのジエステルの二ナトリウム又はカルシウム塩の調製：
【化８】
0004668411.tif 000006
【００６０】
工程１．ＢＡＰＴＡ無水物の調製
ＢＡＰＴＡ（２４ｇ、０．０５mol）、ピリジン（８ｇ、０．１mol）及び無水酢酸（９５ml、１．０mol）を、逆流冷却器（水冷式）とマグネティックスターラーを取り付けた丸底１つ首フラスコ（５００ml）に導入する。反応混合物を、マグネティックスターラーで激しく撹拌しながら９０℃で５時間加熱する。次に温度を５０℃まで下げて、この温度で１０時間加熱を続ける。１０時間経過後、反応混合物を室温に冷却して、沈殿物を濾過して取り出す。次に沈殿物を、酢酸エチル（各洗浄液５０ml）で４回、及びエーテル（各洗浄液６０ml）で２回洗浄する。沈殿物を、真空下で５０℃で６〜８時間乾燥する。生成物は、ＢＡＰＴＡ無水物である。収率８０％（１７．６ｇ）。白色の固体。融点１４８〜１４９℃。
【００６１】
分析：ＴＬＣ。本化合物は分析の過程で分解した。
1Ｈ  ＮＭＲ（Ｃ6Ｄ5ＮＯ2）、δ（ppm）：４．４０（ｓ，８Ｈ）、４．４７（ｓ，４Ｈ）及び６．８５〜７．０１（ｍ，８Ｈ）。
ＩＲ：１７６２．９cm-1（ｓ）、
１８２０．７cm-1（ｓ）。
元素分析。Ｃ22Ｈ20Ｏ8Ｎ2。計算値：Ｃ  ６０．００％、Ｈ  ４．５４％、Ｎ  ６．２６％。実測値：Ｃ  ５９．６０％、Ｈ  ４．６６％、Ｎ  ６．２０％。
【００６２】
工程２．ＢＡＰＴＡのアルキル又はアリールジエステルの調製
工程１のＢＡＰＴＡ無水物（１０ｇ、０．０２３Mol）と対応する無水アルコール（３００ml）とを、アルゴン雰囲気下で逆流冷却器及びマグネティックスターラーを取り付けた丸底１つ口フラスコに導入する。混合物を、９０℃（メチル及びエチルジエステルでは７０℃）の油浴中で激しく撹拌しながら加熱する。６時間後、アルコールの半分が反応混合物から蒸留される（高分子アルコールは真空下で蒸留される）。得られた混合物を０℃に冷却し、この温度で５〜８時間保持する。沈殿物を、真空下で濾過（ガラスフィルターＮ４）して溶液から分離し、約４０mlのエタノールで３〜４回洗浄し、次いで酢酸エチル（各１００ml）で３回及び最後にジエチルエーテル（各１５０ml）で３回洗浄する。生成物を真空下で８時間乾燥する。
【００６３】
合成されるＢＡＰＴＡのジエステルの化学的／物理的特定は、本明細書に後述する：
【００６４】
ＢＡＰＴＡのエチルジエステル。収率９０％（１１ｇ）。白色の粉末。融点１６１〜１６２℃。ＴＬＣ分析。アルミニウムシート上のシリカゲル６０。溶離液は、クロロホルムと、メタノールと水（８０：２０：１．５  ｖ／ｖ）との混合物である。検出のためにクロマトグラムを、指示薬スプレーにより噴霧し、次に３５０〜４００℃で炭化させる。指示薬スプレーの組成は、４−メトキシベンズアルデヒド（１０ml）、エタノール（２００ml）、９８％  Ｈ2ＳＯ4（１０ml）及び氷酢酸（２ml）である。スポット１個。Ｒf  ０．３。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）、δ（ppm）：１．０５〜１．１１（ｔ，６Ｈ）、３．９１〜４．００（ｄｄ，４Ｈ）、４．０５（ｓ，４Ｈ）、４．１４（ｓ，４Ｈ）、４．２７（ｓ，４Ｈ）、６．８３〜６．９６（ｍ，８Ｈ）。
元素分析。Ｃ26Ｈ32Ｏ10Ｎ2。計算値：Ｃ  ５８．６４％、Ｈ  ６．０３％、Ｎ  ５．２６％。実測値：Ｃ  ５８．００％、Ｈ  ６．００％、Ｎ  ５．０９％。
【００６５】
ＢＡＰＴＡのプロピルジエステル。収率９０％（１１．５ｇ）。白色の粉末。融点１８７℃。ＴＬＣ分析。ＢＡＰＴＡのジエチルエステルとジプロピルエステルの分析条件は、同様である。スポット１個。Ｒf  ０．３５。
1Ｈ  ＮＭＲ［（ＣＤ3）2ＳＯ］、δ（ppm）：０．７１〜０．７７（ｔ，６Ｈ）、１．３８〜１．４７（ｍ，４Ｈ）、３．８０〜３．８５（ｔ，４Ｈ）、４．００（ｓ，４Ｈ）、４．１３（ｓ，４Ｈ）、４．２０（ｓ，４Ｈ）、６．７０〜６．９６（ｍ，８Ｈ）。
元素分析。Ｃ28Ｈ36Ｏ10Ｎ2。計算値：Ｃ  ６０．００％、Ｈ  ６．４３％、Ｎ  ５．００％。実測値：Ｃ  ６０．２５％、Ｈ  ６．７７％、Ｎ  ５．０８％。
【００６６】
ＢＡＰＴＡのイソプロピルジエステル。収率８０％（１０．２ｇ）。白色の粉末。融点１８１〜１８２℃。ＴＬＣ分析。アルミニウムシート上のシリカゲル６０Ｆ254。溶離液：クロロホルム：メタノール（６５：３０、ｖ／ｖ）。検出のためにクロマトグラムを、指示薬スプレーにより噴霧し、次に３５０〜４００℃で炭化させる。指示薬スプレーの組成は、４−メトキシベンズアルデヒド（１０ml）、エタノール（２００ml）、９８％硫酸（１０ml）及び氷酢酸（２ml）である。スポット１個。Ｒf  ０．７２。
1Ｈ  ＮＭＲ［（ＣＤ3）2ＳＯ］、δ（ppm）：１．０７〜１．０９（ｄ，１２Ｈ）、４．００（ｓ，４Ｈ）、４．０８（ｓ，４Ｈ）、４．２２（ｓ，４Ｈ）、４．７８〜４．８５（ｍ，２Ｈ）、６．７１〜６．９８（ｍ，８Ｈ）。
元素分析。Ｃ28Ｈ36Ｏ10Ｎ2。計算値：Ｃ  ６０．００％、Ｈ  ６．４３％、Ｎ  ５．００％。実測値：Ｃ  ５９．７８％、Ｈ  ６．５０％、Ｎ  ５．００％。
【００６７】
ＢＡＰＴＡのブチルジエステル。収率９０％（１２．１ｇ）。白色の粉末。融点１８３℃。ＴＬＣ分析。ＢＡＰＴＡのジエチルエステルとジブチルエステルの分析条件は、同様である。スポット１個。Ｒf  ０．４２。
1Ｈ  ＮＭＲ［（ＣＤ3）2ＳＯ］、δ（ppm）：０．７４〜０．８０（ｔ，６Ｈ）、１．０９〜１．１８（ｍ，４Ｈ）、１．３３〜１．３９（ｍ，４Ｈ）、３．８０〜３．８６（ｔ，４Ｈ）、３．９８（ｓ，４Ｈ）、４．１０（ｓ，４Ｈ）、４．１７（ｓ，４Ｈ）、６．６９〜６．９２（ｍ，８Ｈ）。
元素分析。Ｃ30Ｈ40Ｏ10Ｎ2。計算値：Ｃ  ６１．２２％、Ｈ  ６．８０％、Ｎ  ４．７６％。実測値：Ｃ  ６１．５４％、Ｈ  ７．１０％、Ｎ  ５．０３％。
【００６８】
ＢＡＰＴＡのヘプチルジエステル。収率７０％（１０．８ｇ）。白色の粉末。融点１４６〜１４７℃。ＴＬＣ分析。ＢＡＰＴＡのエチルジエステルとヘプチルジエステルの分析条件は、同様である。スポット１個。Ｒf  ０．５０。
1Ｈ  ＮＭＲ［（ＣＤ3）2ＳＯ］、δ（ppm）：０．７９〜０．８４（ｔ，６Ｈ）、１．０８〜１．１７（ｂｒｏａｄ  ｓ，１６Ｈ）、１．３４〜１．４３（ｍ，４Ｈ）、３．７９〜３．８７（ｔ，４Ｈ）、３．９８（ｓ，４Ｈ）、４．１３（ｓ，４Ｈ）、４．１７（ｓ，４Ｈ）、６．６７〜６．９２（ｍ，８Ｈ）。
元素分析。Ｃ36Ｈ52Ｏ10Ｎ2。計算値：Ｃ  ６４．２９％、Ｈ  ７．７４％、Ｎ  ４．１６％。実測値：Ｃ  ６４．３７％、Ｈ  ７．８２％、Ｎ  ３．８８％。
【００６９】
ＢＡＰＴＡのオクチルジエステル。収率７０％（１１．３ｇ）。白色の粉末。融点１５５℃。ＴＬＣ分析。ＢＡＰＴＡのジエチルエステルとジオクチルエステルの分析条件は、同様である。スポット１個。Ｒf  ０．５５。
1Ｈ  ＮＭＲ［（ＣＤ3）2ＳＯ］、δ（ppm）：０．８１〜０．８６（ｔ，６Ｈ）、１．１９〜１．２３（ｂｒｏａｄ  ｓ，２０Ｈ）、１．２９〜１．３４（ｍ，４Ｈ）、３．８３〜３．８７（ｍ，４Ｈ）、３．９８（ｓ，４Ｈ）、４．１１（ｓ，４Ｈ）、４．１９（ｓ，４Ｈ）、６．８０〜６．８４（ｍ，８Ｈ）。
元素分析。Ｃ38Ｈ56Ｏ10Ｎ2。計算値：Ｃ  ６５．１４％、Ｈ  ８．００％、Ｎ  ４．００％。実測値：Ｃ  ６４．９１％、Ｈ  ８．２０％、Ｎ  ３．７６％。
【００７０】
ＢＡＰＴＡのベンジルジエステル。収率７０％（１０．６ｇ）。白色の粉末。融点１６１〜１６３℃。ＴＬＣ分析。ＢＡＰＴＡのエチルジエステルとベンジルジエステルの分析条件は、同様である。スポット１個。Ｒf  ０．６４（ベンジルジエステルを、ジメチルホルムアミド中の溶液でＴＬＣプレート上にプロットする）。
1Ｈ  ＮＭＲ［（ＣＤ3）2ＳＯ］、δ（ppm）：４．０２（ｓ，４Ｈ）、４．１８〜４．１９（ｄ，８Ｈ）、４．９７（ｓ，４Ｈ）、６．７３〜６．９４（ｍ，８Ｈ）、７．２２〜７．３２（ｍ，１０Ｈ）。
元素分析。Ｃ36Ｈ36Ｏ10Ｎ2。計算値：Ｃ  ６５．８５％、Ｈ  ５．４９％、Ｎ  ４．２７％。実測値：Ｃ  ６５．５６％、Ｈ  ５．８３％、Ｎ  ４．１２％。
【００７１】
ＢＡＰＴＡの２−（ジメチルアミノ）エチルジエステル。収率７０％（９．９５ｇ）。白色の粉末。融点１２６〜１２７℃。ＴＬＣ分析。アルミニウムシート上のシリカゲル６０Ｆ254。溶離液：クロロホルム：メタノール：水（６０：４０：２、ｖ／ｖ）。スポット１個。Ｒf  ０．２。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）、δ（ppm）：２．５７（ｓ，１２Ｈ）、２．６０〜２．６３（ｔ，４Ｈ）、３．６０（ｓ，４Ｈ）、３．７５〜３．７８（ｔ，４Ｈ）、４．０６（ｓ，４Ｈ）、０．１１（ｓ，４Ｈ）、６．６８〜６．８５（ｍ，８Ｈ）。
元素分析。Ｃ30Ｈ42Ｏ10Ｎ4。計算値：Ｃ  ５８．２５％、Ｈ  ６．８０％、Ｎ  ９．０６％。実測値：Ｃ  ５７．９４％、Ｈ  ６．９０％、Ｎ  ８．９７％。
【００７２】
工程３ａ．ＢＡＰＴＡのジエステルのナトリウム塩の調製
ＢＡＰＴＡの対応するアルキルジエステル（０．０１９Mol）を、マグネティックスターラーを取り付けた三角フラスコ（５００ml）に導入する。約２５０mlのメタノールと水との混合物（１：１、ｖ／ｖ）をそのエステルに加える。エステルは溶液に溶解しないため、この混合物を激しく撹拌する。水中のＮａＨＣＯ3（０．０３８mol、３．１９ｇ）の濃溶液又はＭｅＯＮａ（０．０３８mol）の濃溶液を撹拌中の混合物に加えると、５〜８時間後混合物は透明になる。これは、アルキルジエステルが二ナトリウム塩に変換されることを示している。メタノールと水を真空下で留去する。得られた塩を、エタノールとジエチルエーテルとの共沸蒸留により乾燥する。最後に、塩を真空下（５〜６mmHg）で８時間乾燥する。
【００７３】
ＢＡＰＴＡのエチルジエステル、二ナトリウム塩。白色の粉末。収率９５％（１０．４ｇ）。
元素分析。Ｃ26Ｈ30Ｏ10Ｎ2Ｎａ2。計算値：Ｃ  ５４．１６％、Ｈ  ５．２１％、Ｎ  ４．８６％、Ｎａ  ７．９８％。実測値：Ｃ  ５４．１０％、Ｈ  ５．２７％、Ｎ  ４．６５％、Ｎａ  ８．１０％。
【００７４】
ＢＡＰＴＡのプロピルジエステル、二ナトリウム塩。白色の粉末。収率９５％（１０．９ｇ）。
元素分析。Ｃ28Ｈ36Ｏ10Ｎ2Ｎａ2。計算値：Ｃ  ５５．６３％、Ｈ  ５．６３％、Ｎ  ４．６３％、Ｎａ  ７．６１％。実測値：Ｃ  ５４．７６％、Ｈ  ６．１３％、Ｎ  ４．４６％、Ｎａ  ６．７３％。
【００７５】
ＢＡＰＴＡのブチルジエステル、二ナトリウム塩。白色の粉末。収率９５％（１１．２ｇ）。
元素分析。Ｃ30Ｈ38Ｏ10Ｎ2Ｎａ2。計算値：Ｃ  ５６．９６％、Ｈ  ６．０１％、Ｎ  ４．４３％、Ｎａ  ７．２８％。実測値：Ｃ  ５６．５０％、Ｈ  ６．００％、Ｎ  ４．２０％、Ｎａ  ７．３０％。
【００７６】
ＢＡＰＴＡのヘプチルジエステル、二ナトリウム塩。白色の粉末。収率９０％（１０．３ｇ）。
元素分析。Ｃ36Ｈ50Ｏ10Ｎ2Ｎａ2。計算値：Ｃ  ６０．３３％、Ｈ  ６．９８％、Ｎ  ３．９１％、Ｎａ  ６．４２％。実測値：Ｃ  ５９．８８％、Ｈ  ７．４９％、Ｎ  ４．１２％、Ｎａ  ６．７６％。
【００７７】
ＢＡＰＴＡのオクチルジエステル、二ナトリウム塩。白色の粉末。収率９０％（１５．７ｇ）。
元素分析。Ｃ38Ｈ54Ｏ10Ｎ2Ｎａ2。計算値：Ｃ  ６１．２９％、Ｈ  ７．２６％、Ｎ  ３．７６％、Ｎａ  ６．１６％。実測値：Ｃ  ６０．９０％、Ｈ  ７．８１％、Ｎ  ３．２６％、Ｎａ  ６．５２％。
【００７８】
工程３ｂ．ＢＡＰＴＡのジエステルのカルシウム塩の調製
ＢＡＰＴＡの対応するジエステル（１ｇ）を、１Ｌのエタノールと水との混合物（７０：３０、ｖ／ｖ）に溶解する。等モルのＣａ（ＯＨ）2をこの溶液に加える。得られた混合物をマグネティックスターラーにより室温で２４時間撹拌する。次にＢＡＰＴＡのエチル、プロピル及びブチルジエステルの塩のためには、溶液をワットマン（Whatmann）濾紙Ｎ１により濾過し、真空下（２０〜３０mmHg）で蒸発乾固する。沈殿物を、ジエチルエーテル（各１回分は１００ml）により３回洗浄し、真空下（２〜３mmHg）で室温で６時間乾燥する。
【００７９】
ＢＡＰＴＡのヘプチル及びオクチルジエステルのカルシウム塩のためには、エタノール溶液を蒸発乾固する。沈殿物を０．８Ｌのエタノールに溶解する。得られた混合物を、ワットマン濾紙Ｎ１により濾過し、次にエタノールを真空下（２０〜２５mmHg）で蒸発させる。沈殿物を、ジエチルエーテル（各１回分は１００ml）により３回洗浄し、真空下（２〜３mmHg）で室温で６〜７時間乾燥する。
【００８０】
ＢＡＰＴＡのエチルジエステル、カルシウム塩。白色の粉末。収率９０％（０．９６ｇ）。
Ｃ26Ｈ30Ｎ2Ｏ10Ｃａ。計算値：Ｃ  ５４．７０％、Ｈ  ５．２６％、Ｎ  ４．９１％、Ｃａ  ７．０１％。実測値：Ｃ  ５４．３２％、Ｈ  ５．４０％、Ｎ  ４．８１％、Ｃａ  ６．８１％。
【００８１】
ＢＡＰＴＡのプロピルジエステル、カルシウム塩。白色の粉末。収率９０％（０．９８ｇ）。
Ｃ28Ｈ34Ｎ2Ｏ10Ｃａ。計算値：Ｃ  ５６．１９％、Ｈ  ５．６８％、Ｎ  ４．６８％、Ｃａ  ６．６９％。実測値：Ｃ  ５６．２２％、Ｈ  ５．８８％、Ｎ  ４．５１％、Ｃａ  ６．５１％。
【００８２】
ＢＡＰＴＡのブチルジエステル、カルシウム塩。白色の粉末。収率９０％（０．９０ｇ）。
Ｃ30Ｈ38Ｎ2Ｏ10Ｃａ。計算値：Ｃ  ５７．５０％、Ｈ  ６．０７％、Ｎ  ４．４７％、Ｃａ  ６．３９％。実測値：Ｃ  ５７．１８％、Ｈ  ６．２４％、Ｎ  ４．２８％、Ｃａ  ６．１１％。
【００８３】
ＢＡＰＴＡのヘプチルジエステル、カルシウム塩。白色の粉末。収率８０％（０．８５ｇ）。
Ｃ36Ｈ50Ｎ2Ｏ10Ｃａ。計算値：Ｃ  ６１．７１％、Ｈ  ７．１４％、Ｎ  ４．００％、Ｃａ  ５．７１％。実測値：Ｃ  ６１．４４％、Ｈ  ７．２４％、Ｎ  ４．１８％、Ｃａ  ６．３１％。
【００８４】
ＢＡＰＴＡのオクチルジエステル、カルシウム塩。白色の粉末。収率８０％（０．８３ｇ）。
Ｃ38Ｈ54Ｎ2Ｏ10Ｃａ。計算値：Ｃ  ６１．７９％、Ｈ  ７．３２％、Ｎ  ３．７９％、Ｃａ  ５．４２％。実測値：Ｃ  ６１．９４％、Ｈ  ７．１４％、Ｎ  ４．００％、Ｃａ  ５．３１％。
【００８５】
例２：モノ−、ジ−及びトリエチレングリコールのアルキルエーテルのＢＡＰＴＡジエステルとその塩の合成
これらの塩の合成の手順は、ＢＡＰＴＡのアルキルジエステルの塩の調製の手順と同様な４工程法である。
【００８６】
工程１．ＢＡＰＴＡ無水物の調製
ＢＡＰＴＡ無水物を入手するこの第１工程は、例１に上述のＢＡＰＴＡのアルキルジエステルを合成するための手順の工程１と同一である。
【００８７】
工程２．モノ−、ジ−及びトリエチレングリコールのモノアルキルエーテルの合成
モノ−、ジ−及びトリエチレングリコールのモノアルキルエーテルの合成は、以下のスキームにより行われる：
【化９】
0004668411.tif 000007
【００８８】
約０．８〜０．９ｇのナトリウム（各片の直径が５〜８mmである場合は切って小片にする）をアルゴン雰囲気下で、逆流冷却器とマグネティックスターラーを取り付けた２つ口丸底フラスコ（２５０ml）に導入する。エチレングリコール（３５ml、０．６２Mol）を、これもアルゴン下でナトリウムに加えて、激しく撹拌しながら７０℃の油浴中でフラスコを加熱する。大部分のナトリウムが溶解したら、ナトリウムの残り（典型的なナトリウムの量は３．９ｇ、０．１７Mol）を１片ずつ反応混合物に加える。ナトリウム溶解は、反応速度の増大と共に反応混合物の温度の増大を伴うことに留意すべきである。爆発を回避するために、反応が充分制御されるように、ナトリウムをゆっくり加えることが必要である。全てのナトリウムが溶解後、テトラヒドロフラン（６０ml）中の対応する臭化アルキル（２１．５ｇ、０．１２Mol）の溶液を含む滴下ロートで反応フラスコに加える。滴下ロートからの溶液を、１滴ずつ反応フラスコに導入する。反応混合物の温度を７０℃に保持する。ただちに臭化ナトリウムの沈殿物が出現し、反応の経過中にその量が増大する。１６時間後反応混合物を室温に冷却して、約１５０mlの水を有機溶液に加える。生成物を、酢酸エチル（各４０ml）により２回抽出する。合わせた酢酸エチル溶液を水で洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥する。酢酸エチル中の生成物の黄色の溶液を、活性炭と一緒に加熱することにより脱色する。無色の溶液を濾過し炭素から分離して、溶媒を蒸発させる。得られた生成物を真空下で蒸留し、その物理的及び化学的性状について分析する。
【００８９】
エチレングリコールのモノヘプチルエーテル。無色の液体。沸点９５℃／１mmHg。収率７０％（１３．４ｇ）。
ＴＬＣ分析。アルミニウムシート上のシリカゲル６０Ｆ254。溶離液：酢酸エチル：ｎ−ヘキサン（２：１、ｖ／ｖ）。指示薬：４−メトキシベンズアルデヒド（１０ml）、エタノール（２００ml）、９８％硫酸（１０ml）及び氷酢酸（２ml）。検出のためにクロマトグラムを、指示薬スプレーにより噴霧し、次に３５０℃で炭化させる。スポット１個。Ｒf  ０．８。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）、δ（ppm）：０．８４〜０．９０（ｔ，３Ｈ）、１．２７〜１．３３（ｂｒｏａｄ  ｓ，８Ｈ）、１．５５〜１．６１（ｍ，２Ｈ）、２．２５〜２．３０（ｔ，１Ｈ，ＯＨ基のシグナル、その位置は可変）、３．４３〜３．５４（ｍ，４Ｈ）、３．６９〜３．７５（ｍ，２Ｈ）。
【００９０】
ジエチレングリコールのヘプチルエーテル。無色の液体。沸点１００℃／１mmHg。収率７０％（１７．１ｇ）。
ＴＬＣ分析。モノ−及びジエチレングリコールのヘプチルエーテルの分析条件は、同様である。スポット１個。Ｒf  ０．４。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）、δ（ppm）：０．８４〜０．９０（ｔ，３Ｈ）、１．２７〜１．３２（ｂｒｏａｄ  ｓ，８Ｈ）、１．５５〜１．６１（ｍ，２Ｈ）、２．７１（ｔ，１Ｈ，ＯＨ基のシグナル）、３．４５〜３．４８（ｔ，２Ｈ）、３．５８〜３．７５（ｍ，８Ｈ）。
【００９１】
トリエチレングリコールのヘプチルエーテル。無色の液体。沸点１０７℃／１mmHg。収率７０％（２０．８ｇ）。
ＴＬＣ分析。モノ−及びトリエチレングリコールのモノヘプチルエーテルの分析条件は、同様である。スポット１個。Ｒf  ０．３。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）、δ（ppm）：０．８４〜０．９０（ｔ，３Ｈ）、１．２６〜１．２９（ｂｒｏａｄ  ｓ，８Ｈ）、１．５４〜１．５７（ｍ，２Ｈ）、２．７２（ｔ，１Ｈ，ＯＨ基のシグナル）、３．４１〜３．４７（ｔ，２Ｈ）、３．５８〜３．７４（ｍ，１２Ｈ）。
【００９２】
オクチルモノエチレングリコール。無色の液体。沸点６０℃／０．５mmHg。収率８５％。
ＴＬＣ分析。エチレングリコールのジオクチルエーテルの分析条件は、上記と同じである。スポット１個。Ｒf  ０．７。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）、δ（ppm）：０．８３〜０．８９（ｔ，３Ｈ）、１．２５〜１．２７（ｂｒｏａｄ  ｓ，１０Ｈ）、１．５４〜１．５７（ｍ，２Ｈ）、２．３９（ｔ，１Ｈ）、３．４１〜３．５２（ｍ，４Ｈ）、３．６７〜３．７３（ｍ，４Ｈ）。
【００９３】
工程３．モノ−、ジ−及びトリエチレングリコールのモノアルキルエーテルのＢＡＰＴＡジエステルの合成
工程１のＢＡＰＴＡ無水物（１．５ｇ、０．００３４Mol）と工程２のモノ−、ジ−又はトリエチルグリコールの対応するモノアルキルエーテル（１０〜１２ml）をアルゴン雰囲気下で、逆流冷却器とマグネティックスターラーを取り付けた丸底１つ口フラスコ（５０ml）に導入する。混合物を、１１５〜１２０℃の油浴中で激しく撹拌しながら加熱する。１〜１．５時間後、混合物は透明になる。反応が完了するまで、加熱をさらに１．５時間続ける。次にフラスコを室温に冷却して、約１００mlの石油エーテル（沸点６０〜８０℃）を加える。生成した沈殿物を遠心分離により抽出して、石油エーテル（各洗浄液４０ml）で３回洗浄する。固体生成物を真空下で５時間乾燥して、下記化合物について例示されるように、生成物の性状を確認するために分析する：
【００９４】
メチルエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル。白色の粉末。融点１５１〜１５２℃。収率９０％（１．８１ｇ）。
ＴＬＣ分析。アルミニウムシート上のシリカゲル６０Ｆ254。溶離液は、クロロホルム：メタノール（１：１  ｖ／ｖ）である。検出のためにクロマトグラムを、指示薬スプレーにより噴霧し、次に１００〜１５０℃で炭化させる。指示薬スプレーの組成は、４−メトキシベンズアルデヒド（１０ml）、エタノール（２００ml）、９８％硫酸（１０ml）及び氷酢酸（２ml）である。スポット１個。Ｒf  ０．１４。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3ＯＤ）、δ（ppm）：３．３３（ｓ，６Ｈ）、３．４７〜３．５１（ｔ，４Ｈ）、３．６６（ｓ，４Ｈ）、３．８５（ｓ，４Ｈ）、４．０２〜４．０６（ｔ，４Ｈ）、４．３５（ｓ，４Ｈ）、７．０２〜７．１１（ｍ，８Ｈ）。
元素分析。Ｃ28Ｈ36Ｏ12Ｎ2。計算値：Ｃ  ５６．７６％、Ｈ  ６．０８％、Ｎ  ４．７３％。実測値：Ｃ  ５６．３８％、Ｈ  ６．３９％、Ｎ  ４．７２％。
【００９５】
ヘプチルエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル。白色の粉末。融点１１１〜１１２℃。収率９０％（２．３２ｇ）。
ＴＬＣ分析。メチルエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステルとヘプチルエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステルのＴＬＣ分析条件は、同じである。スポット１個。Ｒf  ０．４。
1Ｈ  ＮＭＲ［（ＣＤ3）2ＳＯ］、δ（ppm）：０．８１〜０．８６（ｔ，６Ｈ）、１．２２（ｂｒｏａｄ  ｓ，１６Ｈ）、１．４２（ｍ，４Ｈ）、３．２７〜３．３２（ｍ，４Ｈ）、３．３７〜３．４０（ｍ，４Ｈ）、３．９６〜３．９９（ｍ，８Ｈ）、４．１２（ｓ，２Ｈ）、４．１９（ｓ，２Ｈ）、６．７３〜６．９２（ｍ，８Ｈ）。
元素分析。Ｃ40Ｈ60Ｏ12Ｎ2。計算値：Ｃ  ６３．１６％、Ｈ  ７．９０％、Ｎ  ３．６８％。実測値：Ｃ  ６３．３０％、Ｈ  ８．４４％、Ｎ  ３．７６％。
【００９６】
オクチルエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル。白色の粉末。融点１２１〜１２２℃。収率８０％（１．４ｇ）。
ＴＬＣ分析。アルミニウムシート上のシリカゲル６０。溶離液は、クロロホルム：メタノール（１：１  ｖ／ｖ）である。検出のためにクロマトグラムを、指示薬スプレーにより噴霧し、次に１００〜１５０℃で炭化させる。指示薬スプレーの組成は、４−メトキシベンズアルデヒド（１０ml）、エタノール（２００ml）、９８％硫酸（１０ml）及び氷酢酸（２ml）である。スポット１個。Ｒf  ０．４５。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ3Ｃｌ）、δ（ppm）：０．８４〜０．８９（ｔ，６Ｈ）、１．２６（ｂｒｏａｄ  ｓ，２０Ｈ）、１．５１〜１．５７（ｍ，４Ｈ）、３．３７〜３．４２（ｔ，４Ｈ）、３．５３〜３．５６（ｍ，４Ｈ）、３．９６（ｓ，４Ｈ）、４．０３（ｓ，４Ｈ）、４．１７〜４．２１（ｍ，４Ｈ）、４．３７（ｓ，４Ｈ）、６．８７〜６．９４（ｍ，４Ｈ）、７．０３〜７．０９（ｍ，４Ｈ）。
元素分析。Ｃ42Ｈ64Ｎ2Ｏ12。計算値：Ｃ  ６３．９６％、Ｈ  ８．１２％、Ｎ  ３．５５％。実測値：Ｃ  ６３．５７％、Ｈ  ８．１１％、Ｎ  ３．５３％。
【００９７】
ヘプチルジエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル。白色の粉末。融点９５〜９６℃。収率８５％（２．５ｇ）。
ＴＬＣ分析。メチルエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステルとヘプチルジエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステルの分析条件は、同じである。スポット１個。Ｒf  ０．４０。
1Ｈ  ＮＭＲ［（ＣＤ3）2ＳＯ］、δ（ppm）：０．８１〜０．８６（ｔ，６Ｈ）、１．２３（ｂｒｏａｄ  ｓ，１６Ｈ）、１．４５（ｍ，４Ｈ）、３．３０〜３．３５（ｍ，８Ｈ）、３．４０〜３．４６（ｍ，１２Ｈ）、３．９７〜３．９９（ｍ，８Ｈ）、４．１３（ｓ，４Ｈ）、４．１９（ｓ，４Ｈ）、６．７４〜６．９２（ｍ，８Ｈ）、１２．３７（ｓ，２Ｈ）。
元素分析。Ｃ44Ｈ68Ｏ14Ｎ2。計算値：Ｃ  ６２．２６％、Ｈ  ８．０２％、Ｎ  ３．３０％。実測値：Ｃ  ６．４７％、Ｈ  ８．４２％、Ｎ  ３．４０％。
【００９８】
ヘプチルトリエチレングリコールのＢＡＰＴＡエステル。白色の粉末。融点６３〜６５℃。収率８５％（２．７ｇ）。
ＴＬＣ分析。ヘプチルトリエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステルとメチルエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステルの分析条件は、同じである。スポット１個。Ｒf  ０．４０。
1Ｈ  ＮＭＲ［（ＣＤ3）2ＳＯ］、δ（ppm）：０．８１〜０．８７（ｔ，６Ｈ）、１．２３（ｂｒｏａｄ  ｓ，１６Ｈ）、１．４５（ｍ，４Ｈ）、３．３１〜３．３６（ｍ，４Ｈ）、３．４２〜３．４８（ｍ，２０Ｈ）、３．９７〜３．９９（ｍ，８Ｈ）、４．１３（ｓ，４Ｈ）、４．１９（ｓ，４Ｈ）、６．７４〜６．９２（ｍ，８Ｈ）、１２．３８（ｓ，２Ｈ）。
【００９９】
工程４ａ．モノ−、ジ−又はトリエチレングリコールのモノアルキルエーテルのＢＡＰＴＡジエステルの二ナトリウム塩の調製
モノ−、ジ−又はトリエチレングリコールのモノアルキルエーテルの対応するＢＡＰＴＡジエステル（０．００２５Mol）をメタノール（１．０ｇのＢＡＰＴＡジエステルを溶解するのに約１０mlのアルコールが必要である）に溶解して、得られた溶液を、マグネティックスターラーを取り付けた三角フラスコ（５０ml）に導入する。重炭酸ナトリウムの水溶液（２ml中０．００５Mol）をＢＡＰＴＡジエステルのメタノール溶液に加え、混合物を室温で２時間撹拌する。次に溶媒を真空下（３０mmHg）で蒸発させる。得られた沈殿物をエタノールとの共沸蒸留により３回及びジエチルエーテルとの共沸蒸留により２回乾燥する。最後に、得られた生成物をヘキサンで洗浄して、真空下で乾燥する。
【０１００】
メチルモノエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル、二ナトリウム塩。白色の固体。吸湿性。収率９５％（１．５ｇ）。
元素分析。Ｃ28Ｈ34Ｏ12Ｎ2Ｎａ2。計算値：Ｃ  ５２．８０％、Ｈ  ５．３５％、Ｎ  ４．４０％、Ｎａ  ７．２３％。実測値：Ｃ  ５２．２０％、Ｈ  ５．５９％、Ｎ  ４．４９％、Ｎａ  ７．３０％。
【０１０１】
ヘプチルモノエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル、二ナトリウム塩。白色の固体。吸湿性。収率９５％（１．９ｇ）。
元素分析。Ｃ40Ｈ58Ｏ12Ｎ2Ｎａ2。計算値：Ｃ  ５９．７０％、Ｈ  ７．２１％、Ｎ  ３．４８％、Ｎａ  ５．７２％。実測値：Ｃ  ５９．６０％、Ｈ  ７．７５％、Ｎ  ３．５１％、Ｎａ  ５．５１％。
【０１０２】
ヘプチルジエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル、二ナトリウム塩。白色の固体。吸湿性。収率９５％（２．１ｇ）。
元素分析。Ｃ44Ｈ66Ｏ14Ｎ2Ｎａ2。計算値：Ｃ  ５９．１９％、Ｈ  ７．４０％、Ｎ  ３．１４％、Ｎａ  ５．１６％。実測値：Ｃ  ５８．５５％、Ｈ  ７．４３％、Ｎ  ３．４６％、Ｎａ  ５．４９％。
【０１０３】
ヘプチルトリエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル、二ナトリウム塩。白色のロウ状物。非常に吸湿性が高い。収率９０％（２．２ｇ）。
元素分析。Ｃ48Ｈ74Ｏ16Ｎ2Ｎａ2。計算値：Ｃ  ５８．７７％、Ｈ  ７．５５％、Ｎ  ２．８６％、Ｎａ  ４．６９％。実測値：Ｃ  ５７．９８％、Ｈ  ８．０３％、Ｎ  ２．９４％、Ｎａ  ４．６４％。
【０１０４】
オクチルエチレングリコールのＢＡＰＴＡジエステル、二ナトリウム塩。白色の固体。収率８０％。
ＴＬＣ分析。アルミニウムシート上のシリカゲル６０。溶離液は、クロロホルム：メタノール（１：１、ｖ／ｖ）である。検出のためにクロマトグラムを、指示薬スプレーにより噴霧し、次に１００〜１５０℃で炭化させる。指示薬スプレーの組成は、４−メトキシベンズアルデヒド（１０ml）、エタノール（２００ml）、９８％硫酸（１０ml）及び氷酢酸（２ml）である。スポット１個。Ｒf  ０．４５。
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）、δ（ppm）：０．８４〜０．８９（ｔ，６Ｈ）、１．２６（ｂｒｏａｄ  ｓ，２０Ｈ）、１．５１〜１．５７（ｍ，４Ｈ）、３．３７〜３．４２（ｔ，４Ｈ）、３．５３〜３．５６（ｍ，４Ｈ）、３．９６（ｓ，４Ｈ）、４．０３（ｓ，４Ｈ）、４．１７〜４．２１（ｍ，４Ｈ）、４．３７（ｓ，４Ｈ）、６．８７〜６．９４（ｍ，４Ｈ）、７．０３〜７．０９（ｍ，４Ｈ）。
元素分析。Ｃ42Ｈ64Ｎ2Ｏ12。計算値：Ｃ  ６３．９６％、Ｈ  ８．１２％、Ｎ  ３．５５％。実測値：Ｃ  ６３．５７％、Ｈ  ８．１１％、Ｎ  ３．５３％。
【０１０５】
工程４ｂ．モノ−、ジ−又はトリエチレングリコールのモノアルキルエーテルのＢＡＰＴＡジエステルのカルシウム塩の調製。
ＢＡＰＴＡのモノ−、ジ−又はトリエチレングリコールジエステルの対応するモノアルキルエーテル（０．００２５Mol）を２５０mlのメタノールに溶解する。約３〜５mlの水をこの溶液に加える。得られた溶液を、マグネティックスターラーを取り付けた三角フラスコ（３００ml）に導入する。ＣａＨ2（０．００２５Mol）の粉末を、激しく撹拌しながらこの溶液に加える。撹拌を、室温で３時間続ける。３時間後、混合物を濾紙（ワットマンＮ１）で濾過し、得られた溶液から真空下（１０〜１５mmHg）で溶媒を蒸発させる。沈殿物を、エタノール（各回２５〜３０ml）との共沸蒸留により３回、及びジエチルエーテルとの共沸蒸留により２回乾燥する。最後に、生成物をヘキサンで洗浄して、真空下（５mmHg）で室温で５時間乾燥する。
【０１０６】
ＢＡＰＴＡのメチルモノエチレングリコールジエステル、カルシウム塩。白色の粉末。収率９０％（１．４２ｇ）。Ｃ28Ｈ34Ｎ2Ｏ12Ｃａ。計算値：Ｃ  ５３．３３％、Ｈ  ５．４０％、Ｎ  ４．４４％、Ｃａ  ６．３５％。実測値：Ｃ  ５３．７４％、Ｈ  ５．７８％、Ｎ  ４．４３％、Ｃａ  ５．９０％。
【０１０７】
ＢＡＰＴＡのヘプチルモノエチレングリコールジエステル、カルシウム塩。白色の粉末。収率９０％（１．７９ｇ）。Ｃ40Ｈ58Ｎ2Ｏ12Ｃａ。計算値：Ｃ  ６０．１５％、Ｈ  ７．２７％、Ｎ  ３．５１％、Ｃａ  ５．０１％。実測値：Ｃ  ６０．３２％、Ｈ  ７．６３％、Ｎ  ３．５４％、Ｃａ  ４．５９％。
【０１０８】
ＢＡＰＴＡのオクチルモノエチレングリコールジエステル、カルシウム塩。白色の粉末。収率９０％（１．８１ｇ）。Ｃ42Ｈ62Ｎ2Ｏ12Ｃａ。計算値：Ｃ  ６１．０１％、Ｈ  ７．５０％、Ｎ  ３．３８％、Ｃａ  ４．８４％。実測値：Ｃ  ６１．００％、Ｈ  ７．８２％、Ｎ  ３．５４％、Ｃａ  ４．８８％。
【０１０９】
ＢＡＰＴＡのヘプチルジエチレングリコールジエステル、カルシウム塩。白色の固体。収率８０％（１．７７ｇ）。Ｃ44Ｈ66Ｎ2Ｏ14Ｃａ。計算値：Ｃ  ５９．５９％、Ｈ  ７．４４％、Ｎ  ３．１６％、Ｃａ  ４．５１％。実測値：Ｃ  ５９．６１％、Ｈ  ７．７９％、Ｎ  ３．１５％、Ｃａ  ４．０４％。
【０１１０】
ＢＡＰＴＡのメチルトリエチレングリコールジエステル、カルシウム塩。白色の固体。収率８０％（１．６１ｇ）。Ｃ36Ｈ50Ｎ2Ｏ16Ｃａ。計算値：Ｃ  ５３．６０％、Ｈ  ６．２０％、Ｎ  ３．４７％、Ｃａ  ４．９６％。実測値：Ｃ  ５３．９５％、Ｈ  ６．３３％、Ｎ  ３．２０％、Ｃａ  ４．７３％。
【０１１１】
例３：ＢＡＰＴＡジエステル塩のインビトロ親油性測定
本発明のいくつかのＢＡＰＴＡジエステル塩の親油性値を、有機溶液対水溶液へのこれらの化合物の溶解度を比較することにより試験した。有機溶液及び水溶液として、それぞれオクタノールと生理食塩水を使用した。分配係数（Ｐc）、すなわち有機相と水性相の間の分配比を、一般式Ｉ：
【化１０】
0004668411.tif 000008
［式中、芳香環上の置換基は、オルト位にあり；Ｘは、ＣnＨ2n+1（ｎ＝２〜８）又はＣnＨ2n+1（ＯＣＨ2ＣＨ2）m（ｍ＝１〜３、ｎ＝１〜１８）であり、そしてＭは、記載のようにＮａ+又はＣａ++を表す］のいくつかの具体的なＢＡＰＴＡジエステル塩について測定した。
【０１１２】
計算されるＬｏｇＰcとしての結果を、表１に示す。
【表１】
0004668411.tif 000009
【０１１３】
ＢＡＰＴＡの新規ジエステルの大部分は、未変性ＢＡＰＴＡよりも親油性が有意に高いことが理解されるであろう。興味深いことに、分配係数は対イオンの選択によっても影響される。一般に、ＢＡＰＴＡジエステルのカルシウム塩は、その対応するナトリウム塩よりも親油性が高い。
【０１１４】
例４：Ｃａ++、Ｆｅ++及びＺｎ++イオンの水／オクタノール分配に及ぼすＢＡＰＴＡジエステルのインビトロ作用
水性及び疎水性環境における本発明の新規なＢＡＰＴＡジエステルのキレート化活性を調べて、３つの異なる二価金属イオン：Ｆｅ++、Ｚｎ++及びＣａ++に及ぼすＢＡＰＴＡのジオクチル−エチレングリコールエステル（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ９９、二ナトリウム塩）の作用によりここに証明する。
【０１１５】
このセットの実験において使用される親水性／疎水性系は、１５mlオクタノールと１５ml食塩水（ｐＨ＝６．５）とからなる。ＤＰ−ＢＡＰＴＡ９９をオクタノール溶液に溶解して、次にこの相を食塩水と混合した。異なる実験におけるＤＰ−ＢＡＰＴＡ濃度は、図１Ａ〜Ｃの各点について示されるように、Ｃａ2+での実験では２．１×１０-6〜５．５×１０-4M/L、及びＺｎ2+又はＦｅ2+での実験では５．４×１０-6〜１．４×１０-3M/Lに変化させた。対応する金属イオンを、以下の濃度：ＦｅＣｌ2  ２×１０-3M/L、ＺｎＣｌ2  １０-4M/L、ＣａＣｌ2  ２×１０-3M/Lの塩化物として水溶液に加えた。
【０１１６】
オクタノールと緩衝液相を混合して、室温で１時間ボルテックス撹拌し、次に４０００rpmで１０分間遠心分離することにより、混合物を２相に分離した。
【０１１７】
水及びオクタノール試料について異なる分析法を使用した：
ｉ）水試料はメルク（Merk）のＩＣＰ標準物質に対して分析した。ＣａとＺｎを、誘導結合プラズマ原子放出分光分析により試験溶液中で測定した。標準的交差流ネブライザーと固定ＥＯＰトーチを有する、ＩＣＰ−ＡＥＳのスペクトロ（Spectro）（クレーヴェ（Kleve）、ドイツ）からのモデル「スペクトロフレーム・モデュラＥ（Spectroflame Modula E）」を使用した。出力レベルは、１．２kW、冷媒流−１５  ｌ／分、補助流０．５  ｌ／分及びネブライザー流−０．５  ｌ／分であった。
【０１１８】
ii）ガラス管中の各２mlのオクタノール試料を、加熱ブロックに移した。オクタノールの蒸発は、１５０℃での加熱と窒素による連続フラッシングとの組合せにより行った。残渣を２mlの濃硝酸に溶解して、次に１２０℃で１時間加熱した。次に管が室温まで冷却してから、最終容量１０mlになるまで脱イオン水を加えた。
【０１１９】
ＢＡＰＴＡのジオクチル−エチレングリコールエステルは、親分子のＢＡＰＴＡのナトリウム塩よりも１０，０００倍親油性が高く、ここでオクタノールに代表される有機溶媒に好適に可溶性である。
【０１２０】
さらに図１Ａ〜Ｃに示すように、ＢＡＰＴＡジエステルは、水からオクタノールへの金属イオンの移動、及びこれらのイオンの有機相への蓄積を仲介する（一方、ＢＡＰＴＡは仲介しない）。ＢＡＰＴＡジエステルのこの選択的キレート化作用は、水からオクタノールへのＺｎ++イオンの移動については１０μMという低い薬剤濃度で明らかであり、対応するＣａ++及びＦｅ++イオンの移動については２５０〜５００μM薬剤で明らかとなる。
【０１２１】
Ｂ．ＢＡＰＴＡのジエステルの生物学的評価
本発明のキレート化剤の新規なジエステルを、異常カルシウムレベルが関与する傷害を受けている培養細胞又は臓器に及ぼすこれらの保護作用に関して、種々の生物学的モデル系において試験した。インビトロ（組織培養細胞；脳ホモジネート）及びインビボ（スナネズミ（Mongolian Gerbils）及びウィスター（Wistar）ラット）で行った実験の結果を、本明細書中に後述する：
【０１２２】
例５：細胞内Ｃａ++濃度に及ぼすＢＡＰＴＡジエステルの作用（インビトロ試験）
細胞内Ｃａ++濃度に及ぼす２つの異なるＢＡＰＴＡ−ジエステルのキレート化作用を、ラット海馬の培養ニューロン細胞においてインビトロで試験して、蛍光を記録によりフォローした。
【０１２３】
細胞培養。ラット海馬の初代分離培養物をＥ１９胎児から調製して、１３mmカバーガラス上で１０４週間成長させた。簡単に述べると、１０％ウマ血清と１０％ウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭ中に細胞を培養して、１週後これを１０％ウマ血清を含有するＤＭＥＭで置換した。培養５日後に開始して５−フルオロ−２’−デオキシウリジンと３日間インキュベートして、グリア増殖をブロックした。Ｃａ2+iイメージングのために、カバーガラスを記録培地で洗浄して、０．２％（ｗ／ｖ）プルロニック酸（pluronic acid）（Ｆ１２７）の存在下で１〜１．５時間振盪しながら、３μmフルオ−３／ＡＭ（Fluo-3/AM）（分子プローブ（Molecular probes））と共に室温でインキュベートした。次に培養物を記録培地中で少なくとも１時間洗浄して、次の１〜３時間の間使用した。
【０１２４】
溶液と薬剤。記録培地は以下を含有した：１２９mM  ＮａＣｌ、４mM  ＫＣｌ、１mM  ＭｇＣｌ2、２mM  ＣａＣｌ2、４．２mMグルコース及び１０mMヘペス。ｐＨは、ＮａＯＨで７．４に調整して、浸透圧をショ糖の添加により３２０mOsmに調整した。ＢＡＰＴＡ−ジエステルジエチル−ＢＡＰＴＡ（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ２３）又はジオクチル−エチレングリコール−ＢＡＰＴＡ（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ９９）両方とも二ナトリウム塩を、使用前に凍結ストックから記録培地中で調製した。各実験において示されるＢＡＰＴＡ−ジエステルを、先端直径２μmの圧力ピペットで０．１mMの最終濃度で充填して、細胞から約５０μmに配置した。薬剤を、０．５〜５秒間隔の圧力パルスでピペットにより適用した。
【０１２５】
イメージング。色素フルオ−３／ＡＭ（Fluo-3/AM）（分子プローブ（Molecular probes））の添加後、カバーガラスを共焦点レーザー走査顕微鏡（ライカ（Leica）、ハイデルベルク、ドイツ）中に置いて、室温で３〜５ml/分の速度で１μMテトロドトキシン（ＴＴＸ）を含む記録培地を注いだ。共焦点レーザー走査顕微鏡には、４８８nmの波長で励起するためのアルゴン−イオンレーザーが取り付けてある。レーザー光を、光力学的損傷を回避するために公称強度の１〜３％まで減少させた。６３×水浸対物レンズにより２５６×２５６ピクセルの画像をとった。細胞の完全な三次元再構築は、必要に応じて細胞を通して撮った１５〜２０個の連続０．５〜１．０μm光学切片から作成した。蛍光強度は、ライカ（Leica）分析ソフトウェアとアドビ・フォトショップ（Adobe Photoshop）（アドビシステムズ（Adobe Systems））を使用して定量した。フルオ−３（Fluo-3）蛍光の変化を、正味の蛍光を前処理蛍光で割って標準化した（ΔＦ／Ｆ）。
【０１２６】
２．４mM  Ｃａ++を含有するＤＭＥＭ培地で増殖した海馬ニューロン細胞を、ビヒクルすなわち記録培地（図２、フレーム１、２）、又はＤＰ−ＢＡＰＴＡ２３（図２、フレーム３〜１１）のいずれかで処理した。薬剤（９秒パルスに１mM）の添加は、処理細胞中に記録される蛍光の減少に反映される、細胞内カルシウムレベルの低下を誘導した。Ｃａ++濃度のこの一時的な減少は、次に薬剤が細胞から洗浄されて７〜８秒以内には完全に回復した（図２、フレーム１２〜２０を参照のこと）。同じ量の薬剤を短時間適用すると、同じ細胞でより短時間の小さい蛍光の減少が誘導された（データは示していない）。
【０１２７】
細胞膜非透過性薬剤である、親薬剤の四ナトリウム塩ＢＡＰＴＡ−Ｎａ4を同じ濃度でラット海馬の培養ニューロンの表面に適用すると、細胞内Ｃａ2+の微々たる上昇しか促進しないことに注目することは重要である（データは示していない）。
【０１２８】
図３では、カリウム誘導による細胞内Ｃａ2+濃度の上昇に及ぼすＢＡＰＴＡジエステルの作用が証明される。
【０１２９】
海馬ニューロン細胞を上述のように増殖させて、アスタリスク（＊）で示す時点で４０ミリ秒のＫ+パルス（１００mM  ＫＣｌを含有するピペットから適用）に暴露させた。対照条件下では、このような各Ｋ+パルスは、細胞内Ｃａ2+濃度の３〜４倍の増大を引き起こし、蛍光シグナルの一過性増大として記録された。
【０１３０】
次に細胞を、０．１、１．０又は１０．０μg/mlのジオクチル−エチレングリコール−ＢＡＰＴＡ（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ９９）で各記録期間の前の５分間灌流した。図３に示す結果は、５個の個別の海馬ニューロン細胞の平均蛍光変化をグラフで表したものである。
【０１３１】
図３に示すように、ＢＡＰＴＡジエステルは、細胞内カルシウムイオン濃度のカリウム誘導性上昇を減衰させ、そしてこの効果は濃度依存的に達成される。
【０１３２】
例６：Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性に及ぼすＢＡＰＴＡ−ジエステルの作用
フェルナンデス（Fernandes）ら（Neurochem Int. 28:497-500, 1996）は、ピロカルピン注射により誘導される実験的てんかんの間の、ラット海馬における酵素Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの活性を研究した。この研究により、てんかんの急性期及び沈黙期の間は酵素活性が低下し、慢性期の間は上昇する（正常レベルまでは上昇しない）ことが見い出された。これらの結果から考えられる結論は、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性の変化は、ピロカルピン注射により誘導される脳損傷に続く特発性及び再発性発作の出現に関与するということである。
【０１３３】
ピロカルピン誘導性発作は、いくつかのタイプのヒトてんかんとその進展のモデルであると考えられる。細胞外Ｋ+レベルの上昇をもたらす酵素Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼの活性の低下は、てんかん症状とその進展に対する要因になりうることが、提唱されている。
【０１３４】
従って、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性に及ぼすＢＡＰＴＡ−ジエステルの作用を、異なる濃度のジエチル−ＢＡＰＴＡ（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ２７、二ナトリウム塩）で処理したマウス脳ホモジネート中で試験した。試験したＢＡＰＴＡ−ジエステルの濃度は、１０-7〜１０2μg/mlの範囲とした。
【０１３５】
マウス脳ホモジネートの調製。オスのＣＤ−１マウス（１０〜２１日齢）を急速断頭術により屠殺した。頭蓋を開き、脳を取り出して２つに切った。皮質を単離し、ナトリウムリンゲル緩衝液（Ringer's buffer）に入れ、氷冷ＰＢＳで３回洗浄して氷上で保持した。ポリトロン（Polytron）を使用して、氷上で１４０００rpmで４×３０秒間脳組織をホモジナイズした。均質化緩衝液は、２５０mMショ糖；１mM  ＥＧＴＡ；２０mM  ヘペス−トリス、ｐＨ７．４、及びプロテアーゼインヒビターＰＭＳＦを含有していた。
【０１３６】
ホモジネートを、ソルバル（Sorval）冷却遠心分離機中で２７０００ｇで３０分間遠心分離した。膜画分を回収して、均質化緩衝液に再懸濁した。新たなＤＰ−ＢＡＰＴＡ２７を、各実験用に１mg/mlストック溶液から希釈して、所定の最終濃度でＡＴＰアーゼ反応培地に加えた。
【０１３７】
Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ測定法。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼは、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼインヒビターであるウワバイン（３mM）の非存在下及び存在下で、前述されているように測定した（ノルビー，ジェイ（Norby J）、ジー・カップルド（G. Coupled）(1988) Ｎａ+／Ｋ+−ＡＴＰアーゼ活性の測定法。Methods in Enzymology 156: 116-119）。タンパク質含量は、すでに記述されているようにバイオラッド−ブラッドフォード（Bio Rad-Bradford）測定法（ブラッドフォード，エム(Bradford, M.）(1978)タンパク質測定法。Ann. Biochem. 72: 248-257）を使用して測定した。
【０１３８】
図４に示すように、ＤＰ−ＢＡＰＴＡ２７は、マウス大脳皮質におけるＮａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼ活性を用量依存的に増大させたため、生理条件下では細胞外Ｋ+の低いレベルをもたらすと考えられた。
【０１３９】
例７：細胞性心臓機能に及ぼすＢＡＰＴＡ−ジエステルの効果
ジエチル−ＢＡＰＴＡ（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−２３）の心臓防御効力を、培養心筋細胞における膜活動電位に及ぼすこの薬剤の効果を調べることにより評価した。
【０１４０】
成体モルモット（３５０〜４００ｇ）から酵素的解離法（アイセンバーグ，ジー（Isenberg G.）とクロックナー，ユー（Klockner U.）(1982) Pflugers Arch: 395, 6-18）により心室筋細胞を入手した。細胞を、０．５ml記録浴中で倒立顕微鏡（ニコン（Nikon）、ダイアフォト−ＴＭＤ（DIAPHOT-TMD）、東京、日本）の載物台に載せた。浴をタイロード（Tyrode's）溶液（１４０mM  ＮａＣｌ、４mM  ＫＣｌ、１．８mM  ＣａＣｌ2、１mM  ＭｇＣｌ2、１０mMグルコース及び５mMヘペス、ｐＨ７．４）で１〜２ml/分の速度で注いだ。筋細胞を、０．２Hzで刺激して、室温（２４〜２５℃）で試験した。パッチ電極をガラス製マイクロピペットから調製し、それは１２０mM  Ｋ−アスパルタート、２０mM  ＫＣｌ、３．５mM  ＭｇＣｌ2、２０mM  ＫＨ2ＰＯ4、３mM  Ｎａ2ＡＴＰ、１０mMグルコース及び１mM  ＥＧＴＡ、ｐＨ７．４を含有するピペット溶液で充填された時に２〜４MΩの先端抵抗を有した。活動電位は、以前に記述されている（フェルゼン（Felzen）ら, 1995, Pflungers Arch: 427, 422-431；フェルゼン（Felzen）ら, 1996, Circ. Res. 78, 253-261）ように、アクソン（Axon）２００Ａ（アクソン・インストルメンツ社（Axon Instruments, Inc.）、フォスターシティー、カリホルニア州、米国）により、モルモットの心室筋細胞から記録した。
【０１４１】
１０-11〜１０-14mol/LのＤＰ−ＢＡＰＴＡ２３が、培養心筋細胞の静止電位を低下（８mV）させかつその活動電位期間を短縮することにより、過分極を誘導することが見い出された（結果は示していない）。
【０１４２】
図５は、ウワバインと１０-10mg/ml  ＤＰ−ＢＡＰＴＡ２３と共に３５分（トレース５）インキュベートした刺激筋細胞から測定した膜電位に比較して、１０-6Ｍウワバインの非存在下（トレース１、対照細胞）又は存在下で６分（トレース２）、１０分（トレース３）及び１３分（トレース４）インキュベートした刺激筋細胞の膜電位測定値を示す。
【０１４３】
図５から明らかなように、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼインヒビターであるウワバインとの１３分間のインキュベーションにより、心筋細胞で脱分極後遅延（ＤＡＤ）が誘導された（トレース４上の矢印でマーク）。ウワバイン毒性を特徴づけるこの応答は、ＤＰ−ＢＡＰＴＡ２３により打ち消された（トレース５）。
【０１４４】
例８：グルタミン酸誘導性ニューロン細胞死に及ぼすＢＡＰＴＡジエステルの作用
本発明のＢＡＰＴＡジエステルの神経防御可能性を、グルタマート毒性のインビトロモデル系において評価した。
【０１４５】
ラット由来の新生児皮質ニューロンを２４ウェルプレートで培養して、サトラー（Sattler）ら（J. Cereb Blood Flow Metab, 17, 456 (1997)）に記述されているように組織培養で増殖させた。
【０１４６】
細胞を、０．５ml/ウェルの対照溶液（Control Solution）で１回洗浄して、すべての血清タンパク質を除去した。対照溶液は、１２１mM  ＮａＣｌ、５mM  ＫＣｌ、１０mM  ヘペス酸、７mM  ヘペス−Ｎａ塩、１mM  Ｎａ−ピルビン酸塩、１．８mM  ＣａＣｌ、３mM  ＮａＨＣＯ3、０．０１mM  グリシン、２０mM  Ｄ−グルコース、ｐＨ７．４（シグマ（Sigma））を含有した。
【０１４７】
ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−２３を最初にＤＭＳＯに溶解し、さらに対照溶液に希釈して３００、１００、３０、１０及び３μMの濃度にした。細胞に加えるＤＭＳＯの量は、１％を超えるべきではない。培養ニューロン細胞に、試験ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−２３（０．５ml/ウェル）を添加して、加湿チャンバー中で３７℃で１時間インキュベートした。次にプレート中の培地を吸引して、新たな対照溶液で置換し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。１mg/mlストック溶液からヨウ化プロピジウム（Propidium Iodide）（ＰＩ）（モレキュラープローブ社（Molecular probes Inc.）、カタログ番号Ｐ−１３０４）を５０ug/mlの最終濃度で各ウェルに加え、ベースライン蛍光を読みとった。次に各実験で記載するように、細胞を、３００mMのＬ−グルタマート（シグマ（Sigma））で室温で１時間、ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−２３の非存在下又は種々の濃度での存在下で処理した。
【０１４８】
グルタマート傷害の前に細胞をＢＡＰＴＡ−ジエステルで処理した場合のプロトコールでは、薬剤は傷害期間にわたって培地中に存在した（図６）。他の場合には、ＤＰ−ＢＡＰＴＡを、グルタマート傷害の後のみに、記載の時点において加えた（図７を参照のこと）。
【０１４９】
グルタマートを全く含まない対照溶液を、化合物単独により引き起こされる毒性のレベルをチェックするために、試験ＢＡＰＴＡ−ジエステルを含有する対照ウェルに加えた。
【０１５０】
傷害後、グルタマートを含む培地を除去して、グルタマートを含まないがＰＩ（５０ug/ml）を含有する同じ培地に変更した。ＰＩ蛍光測定は、１時間間隔で２４時間行った。
【０１５１】
バックグラウンドを差し引いた蛍光測定値を、１mM  ＮＭＤＡに１時間暴露した同一の培養物からのＰＩ蛍光測定値に対して標準化した。細胞死を、サイトフルオーIIマルチ（Cytofluor II Multi）−ウェルプレートスキャナー（パーセプティブ・バイオシステムズ（PerSeptive Biosystems））での蛍光読み取りによりモニターした。グルタミン酸傷害によって、２４時間以内に１００％近くのニューロン細胞死が生じた。
【０１５２】
死細胞の部分は、以下の通り計算した：
死の部分  ＝  （Ｆt−Ｆ0）／ＦNMDA
［ここで、Ｆt＝ｔ時点のＰＩ蛍光であり、Ｆ0＝０時点の初期ＰＩ蛍光であり、そしてＦNMDA＝同じ切開及び１mM  Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルタート（ＮＭＤＡ）に６０分暴露した後の２４時間後の同一の切開及び培養（plating）からの同一の培養物のバックグラウンドを差し引いたＰＩ蛍光である］。
【０１５３】
図６に示すようにＤＰ−ＢＡＰＴＡ−２３は、グルタマート誘導性ニューロン細胞死を用量依存的に減少させた。この防御作用は、３０μMという低いＢＡＰＴＡ−ジエステル濃度でも明らかである。
【０１５４】
さらに、この神経防御作用は、ＤＰ−ＢＡＰＴＡ（１００μM）を、グルタミン酸傷害の１時間前（図６）にＧｌｕと一緒に加えたとき、又は６０分後まで（図７を参照のこと）加えたときに証明された。
【０１５５】
例９：ＢＡＰＴＡ−ジエステルの神経防御作用−全前脳虚血モデル
本発明のＢＡＰＴＡジエステルの神経保護可能性を、さらにスナネズミ（Mongolian Gerbils）における全前脳虚血モデル系で検討した。
【０１５６】
動物。オスのスナネズミ（Mongolian Gerbils）６０〜７０ｇ（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Charles River Laboratories）、米国）を試験に使用した。
【０１５７】
虚血の誘導。麻酔チャンバー（３０％酸素、７０％亜酸化窒素）中でスナネズミにハロタン（４％）で麻酔を誘導して、３０％酸素と７０％亜酸化窒素中の１％ハロタンでフェースマスクを用いて維持した。虚血誘導のために、両方の総頸動脈を頸部正中切開により単離して、動脈クリップを用いて示されるように１０又は２０分間一時的に閉塞した。クリップが用いられている時、大脳虚血の全期間にわたり、麻酔はハロタンなしに３０％酸素と７０％亜酸化窒素だけで維持された。直腸内プローブで追跡された直腸内温度を、保温ランプと加熱パッドを用いて虚血期間を通して３７〜３７．５℃に維持した。試験ＢＡＰＴＡジエステルは、適用するときは必ず特定の実験それぞれにおいて示されるような時点と用量で、腹腔内経由による非経口的投与又は経口投与のいずれかで動物に投与した。対照動物は、ＰＡＢＴＡジエステル化合物の代わりに、ビヒクル単独、すなわち０．９％  ＮａＣｌ溶液で処理した。
【０１５８】
生存試験。２０分間の全前脳虚血の後の動物の生存は、虚血の１０日後までモニターした。
【０１５９】
統計。統計解析は、スチューデントのｔ検定（Student's t-test）をボンフェローニ（Bonferroni）補正と共に使用して、有意性のレベルをｐ＜０．０５で、実施した。
【０１６０】
ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）アッセイ。血液試料を、スナネズミの眼窩洞から、１０分間の大脳虚血の２４及び７２時間後に採った。血液試料を、３０００rpmで５分間遠心分離して、血清（上清画分）を得た。血清中のＮＳＥ活性は、ＮＳＥキット（ファーマトープ社（Pharmatope Ltd.）、イスラエル）を使用してラジオイムノアッセイにより求めた。
【０１６１】
ニューロン損傷を予防する際の試験ＢＡＰＴＡ−ジエステルの効力を評価するために、血清中のニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）の酵素活性を使用した。実験的全虚血では、これらの実験条件下で存在する遅延ニューロン細胞死に対応する虚血に続く２〜１９２時間、ＮＳＥレベルが血清中で上昇することが見出だされた。よって、ＮＳＥはニューロン損傷の程度の定量マーカーとして有用であろう。
【０１６２】
図８、９及び１０では、本発明の２つのＢＡＰＴＡジエステルである、ジオクチル−ＢＡＰＴＡ（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−６０、二ナトリウム塩）とジオクチル−エチレングリコール−ＢＡＰＴＡ（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９、二ナトリウム塩）について、そのニューロン防御効果を試験した実験の結果を要約する。異なる治療プログラム及び薬剤の投与経路を、スナネズミの全前脳虚血のモデル系において検討した。フォローしたパラメーターは、（ｉ）ニューロン細胞死の指標として動物血清中のニューロン特異的エノラーゼの活性（図８と９）及び（ii）動物の生存率（図１０）とした。
【０１６３】
図８に示されるように、再灌流の開始直後（ｔ＝０）又は再灌流の開始から３時間後（ｔ＝３）に、虚血スナネズミに腹腔内投与したＤＰ−ＢＡＰＴＡ−６０（灰色のバー）又はＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９（黒色のバー）のいずれかの５μg/kgの単回投与は、ニューロン損傷を防止した。これらの結果は、ＤＰ−ＢＡＰＴＡ薬剤が、治療と予防の両方のモードで作用することを示している。
【０１６４】
図９は、２つのスキーム（（ａ）再灌流の開始の４時間前に０．５mg/kg投与し、次に再灌流の開始時にさらに０．５mg/kgの投与、及び（ｂ）虚血後３日間毎日０．５mg/kg）で経口投与されたＤＰ−ＢＡＰＴＡ９９の神経防御効果を示す。全大脳虚血の２４時間及び７２時間後に測定した血清中のＮＳＥ活性の有意な減少により証明されるように、両方の治療プログラムで、ＤＰ−ＢＡＰＴＡ９９は、強力な防御効果を示した。
【０１６５】
別の実験では、ＢＡＰＴＡ−ジエステルの防御効果を、上述のように、２０分の全前脳虚血に付したスナネズミの生存時間をモニターすることにより評価した。試験動物（各グループＮ＝１５）に、再灌流の開始時に１０μg/kgのＤＰ−ＢＡＰＴＡ−６０又はＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９のいずれかを単回で腹腔内投与した。対照動物（Ｎ＝３０）にはビヒクル溶液を投与した。
【０１６６】
図１０に示すように、ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−６０とＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９の両方とも、動物の生存をそれぞれ２倍と３倍延長した。
【０１６７】
結論として、ＢＡＰＴＡジエステルは、虚血により引き起こされる神経損傷に対する防御において、治療と予防の両方のモードで有効であること、及び薬剤の投与のために非経口ならびに経口経路が実践的であることが証明された。
【０１６８】
ジオクチル−ＢＡＰＴＡの二ナトリウム塩とカルシウム塩の両方が、その神経防御能力において等しく有効であったことは重要である。これに対して、このモデル系では、ジオクチル−エチレングリコール−ＢＡＰＴＡ（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９）のナトリウム塩は、この分子のカルシウム塩に比較して、はるかに顕著な神経防御活性を示した。
【０１６９】
例１０：ＢＡＰＴＡ−ジエステルの神経防御効果の組織病理学的分析
ＢＡＰＴＡ−ジエステルの神経保護活性をさらに確立するために、ＢＡＰＴＡ−ジエステルの非存在下又は存在下で、全前脳虚血の誘導に付した動物の脳試料について詳細な半定量的顕微鏡病理学的分析を実施した。
【０１７０】
現在最も神経保護的に強力な本発明の２つのＢＡＰＴＡ−ジエステル、すなわち、ジオクチル−ＢＡＰＴＡ（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ６０）とジオクチル−エチレングリコール−ＢＡＰＴＡ（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ９９）（両方とも二ナトリウム塩）を試験した。
【０１７１】
スナネズミ（Mongolian Gerbils）３９匹を、例９に記載した方法に従って誘導した１０分の全前脳虚血に付した。動物を以下の通り処理した３グループに分割した：
グループＩ：スナネズミ１３匹；虚血直後５μgのＤＰ−ＢＡＰＴＡ６０／kg体重を腹腔内注射により単回投与。
グループII：スナネズミ１１匹；虚血直後５μgのＤＰ−ＢＡＰＴＡ９９／kg体重を腹腔内注射により単回投与。
グループIII：スナネズミ１５匹；ビヒクル、すなわち生理食塩水を注射した対照動物。
【０１７２】
虚血の３日後、動物をケタミンとキシラジン（ksilazyne）で再度麻酔し、その脳を外科的に取り出し、ＰＢＳ中の４％ホルマリン中に７日間貯蔵した。７μm厚のスライドを背側海馬の領域からとり、顕微鏡検査のためにヘマトキシリンとエオシンで染色した。
【０１７３】
海馬のＣＡ−１、ＣＡ−２、ＣＡ−３及び歯状回サブフィールドを、３つのサブ領域（内側、中央部及び外側）に分割して評価した。次に各区画からの生細胞の全数を計測して、ニューロン損傷を推定した。脳損傷評価のために使用した任意のスケールは、５段階を含む：０−正常組織、損傷なし；１−最小の損傷、ニューロンの約２０％未満の壊死；２−軽い損傷、ニューロンの約４０％未満の壊死；３−中等度の損傷、ニューロンの約６０％未満の壊死；そして４−著しい損傷、８０％を超えるニューロンが死んでいる。
【０１７４】
図１１に示すように、ＤＰ−ＢＡＰＴＡ９９は、海馬のＣＡ−２、ＣＡ−３及び歯状回領域において有意な神経防御効果を示している。ＤＰ−ＢＡＰＴＡ６０もまた、ＤＰ−ＢＡＰＴＡ９９より程度は少ないが、同じ領域における虚血誘導性のニューロン損傷を低下させるのに有効であることが見い出された。
【０１７５】
例１１：ＢＡＰＴＡ−ジエステルの抗てんかん効果（インビボモデル）
ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９の抗てんかん活性を、発作がピロカルピン（４００mg/kg）により誘導されるウィスター（Wistar）ラットの動物モデルでフォローした。
【０１７６】
この実験には、体重約３５０ｇのウィスターラットを使用した。図１２Ａ〜Ｂに示す異なる濃度のＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９を、ピロカルピンの注射の１時間前に腹腔内注射した。ピロカルピンの末梢ムスカリン作用を低下させるために、ピロカルピン（４００mg/kg、腹腔内）の３０分前にメチルスコポラミン（１mg/kg）を皮下注射した。
【０１７７】
ピロカルピンの注射後数分以内に、動物は眼の周囲からのポルフィン（porfin）の放出、慢性の咀嚼、点頭、ミオクローヌス痙動、及び激しい震えを示す。これらは、ラシーヌ（Racine）のスケールの段階１〜２に相当する、辺縁系発作の全段階である。次に動物は、通常前肢ドラミング活動を含む段階３に移行する。通常２０分以内に、動物は全身発作の徴候を示す。これは、後肢立ち、又は同時前肢クローヌス活動を伴う後肢立ちと落下及び全身性間代性発作を含む。通常３０分以内に、ラットはてんかん重積持続状態になる。この状態は、本質的に辺縁系であり、間代発作の短時間の発現により中断される。てんかん重積持続状態は、自発的に停止しない発作である。ラットモデルでは、これは、５分以上続くことを意味する。動物が３時間てんかん重積持続状態になった後（その状態のものだけ）、発作を１０mg/kgジアゼパンとフェニトイン（６０mg/kg）の腹腔内投与により停止させた。高用量ピロカルピンモデルによる症状持続期間中の死亡率は、通常約３０〜５０％である。
【０１７８】
図１２に示すように、ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９は、辺縁系発作に効果がないが、全身性発作を予防することができ、そして集団の約半分でてんかん重積持続状態を予防する。さらにこの薬剤は、てんかん重積持続状態の３時間の間に起きる死亡率を減少させる。
【０１７９】
すなわち、ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９は、発作の拡大（全身化）を予防することができると結論できる。
【０１８０】
本発明は具体的に記述されているが、当業者であれば、多くの改変や修飾を行うことができることを理解できるであろう。したがって、本発明は具体的に記載されている実施態様に限定して解釈してはならず、むしろ本発明の範囲、精神及び概念は、以下に続く請求の範囲を参照することにより容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
本発明は、図面とともに以下の詳細な説明からより完全に理解されるであろう。
【図１】  図１Ａ〜Ｃは、異なる濃度のＢＡＰＴＡのジオクチルエチレングリコールエステル（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９、四角）又はＢＡＰＴＡ（三角）のいずれかの存在下での、水溶液（白い記号）とオクタノール溶液（黒い記号）中の、３つの２価金属イオン（ａ）Ｆｅ++、（ｂ）Ｚｎ++及び（ｃ）Ｃａ++の濃度変化を示す。
【図２】  図２は、色素Ｆｌｕｏ−３／ＡＭの蛍光でモニターした時の、培養海馬ニューロン中の細胞内Ｃａ++に及ぼすＢＡＰＴＡのジエチルエステル（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−２３）の影響を示す。
【図３】  図３は、５つの培養海馬ニューロンからの色素Ｆｌｕｏ−３／ＡＭの平均蛍光変化（ΔＦ／Ｆ）のグラフであり、細胞内Ｃａ++濃度のカリウム誘導性増加に及ぼす異なる濃度のＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９（０．１μg/ml、１μg/ml及び１０μg/ml）の影響を示す。アスタリスク（＊）はＫ+パルスを表わす。
【図４】  図４は、異なる濃度のＢＡＰＴＡのジエチルエステル（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−２７）の存在下での、マウス皮質ホモジネート中で測定したＮａ／Ｋ−ＡＴＰａｓｅ活性（薬剤の無い対照の％として）を示す。
【図５】  図５は、以下のようにプレインキュベートした刺激培養心筋細胞中の膜活動電位を示す：１−対照、添加無し；２−ウワバイン  １０-6Ｍ、６分；３−ウワバイン  １０-6Ｍ、１０分；４−ウワバイン  １０-6Ｍ、１３分；５−ウワバイン  １０-6Ｍ＋ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−２３  １０-10mg/ml、３５分。
【図６】  図６は、グルタマート傷害、１時間前における、ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９の存在下でのグルタマート誘導性細胞死滅を示す。
【図７】  図７は、グルタマート傷害後、記載の異なる時間における、ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９の存在下でのグルタマート誘導性細胞死滅を示す。
【図８】  図８は、処理の関数としての全前脳虚血後２４時間のスナネズミ（Mongolian gerbil）の血清中で測定したニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）活性を示す。ｔ＝０とｔ＝＋３ｈは、ＢＡＰＴＡのジオクチルエステル（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−６０、灰色のバー）とＢＡＰＴＡのジオクチルエチレングリコールエステル（ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９、黒いバー）を腹腔内投与した時の、再潅流の開始に対する時間を示す。
【図９】  図９Ａ〜Ｂは、全前脳虚血後２４時間及び７２時間のスナネズミの血清中で測定したニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）活性を示す。ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９（黒いバー）は、２つのスキームで経口投与した：（Ａ）再潅流の開始前４時間目に０．５mg/kg、次に再潅流の開始時にさらに０．５mg/kg、（Ｂ）虚血後３日間毎日０．５mg/kg。ビヒクル溶液で処理した対照動物のＮＳＥ活性は、白い棒で示す。
【図１０】  図１０は、全前脳虚血の２０分後のスナネズミの生存時間（時間）を示す。動物には、ビヒクル溶液（白いバー）又は１０μg/kgのＤＰ−ＢＡＰＴＡ−６０（灰色のバー）又はＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９（黒いバー）を、再潅流の開始時に腹腔内に単回投与した。
【図１１】  図１１は、ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−６０（灰色のバー）、ＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９（黒いバー）又は食塩水（ビヒクル、白いバー）で処理したスナネズミの海馬の異なる領域（ＣＡ−１、ＣＡ−１、ＣＡ−３及び歯状回）における、虚血誘導性脳傷害の組織病理的解析（０＝正常；１＝最小；２＝軽い；３＝中等度；４＝著しい）を示す。
【図１２】  図１２は、ウィスターラット動物モデルにおける、異なる濃度のＤＰ−ＢＡＰＴＡ−９９の抗てんかん防御効果（％）を示し、ここでてんかんはピロカルピン（Pilocarpine）４００mg/kgで誘導した。モニターしたてんかん症状は、辺縁発作（白色）；全身発作（薄灰色）；Ｌ−ＳＥ（黒い灰色）及び生存（黒）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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