(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株の培養において、気泡形成を減少させるための方法であって、以下の工程を含むことを特徴とする方法：
宿主のＨＦＢＩおよび／またはＨＦＢＩＩの培養中における産生が、改変を行わないものと比較し、少なくとも５０％減少するように遺伝学的改変を行う工程；及び
上記宿主を適当な培養条件で培養する工程。
【請求項２】
請求項１の方法であって、遺伝学的改変がヒドロフォビンをコードするＤＮＡ配列の遺伝学的改変を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１の方法であって、遺伝学的改変がヒドロフォビンをコードするＤＮＡ配列の調節領域の改変を含むことを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項２の方法であって、遺伝学的改変がヒドロフォビンをコードするＤＮＡ配列のふかつか不活性化を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４の方法であって、遺伝学的改変がヒドロフォビンをコードするＤＮＡ配列の欠失を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
宿主としてのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株であって、そのＨＦＢＩおよび／またはＨＦＢＩＩの培養中における産生が、改変を行わないものと比較し、少なくとも５０％減少するように遺伝学的改変されていることを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株。
【請求項７】
請求項６のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株であって、目的物の産生の能力が増強されていることを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株。
【請求項８】
請求項６または７のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株であって、目的物の産生が可能となるよう遺伝的改変されていることを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株。
【請求項９】
請求項６から８のいずれか１項に記載されているＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株であって、目的物がタンパク質または代謝産物またはバイオマスであることを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株。
【請求項１０】
請求項６から９のいずれか１項に記載のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株であって、目的物が遺伝子組換え体であることを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株。
【請求項１１】
請求項６から１０のいずれか１項に記載のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株であって、目的物がヒドロフォビンと融合した分子として産生することができるよう遺伝的改変がされていることを特徴とするＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株。
【請求項１２】
目的物をより多く産生する方法であって、以下の工程を含む方法：
請求項６から１１のいずれか１項に記載のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株を培養する工程；及び、
培養液から産生物を回収する工程。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、特許請求の範囲における請求項１の前提部分に記載の培養中における気泡形成を減少させるための新規な方法、請求項１２の前提部分に記載の方法によって産生した産生物、請求項１５の前提部分に記載の培養中の気泡形成を減少させた新規な産生宿主菌株に関する。さらに本発明は、請求項３４の前提部分に記載のより多量の目的の産生物を産生させるための方法に関する。
【０００２】
研究用容器中または小規模なもしくは大規模なバイオリアクタ中の液体生育培地で微生物を培養するとき、一般的な特徴は泡が形成することである。このことは、特に通気型バイオリアクタにおいて問題となる。すなわち、これら微生物は通常、発酵培養菌と呼ばれるからである。生化学的には「発酵」という語は、嫌気性代謝による酵母菌中でエタノールが生成するプロセスのことである。個々の選択した微生物についての現代の無菌液内「発酵」は、細胞の塊、酵素および抗体などのタンパク質、および抗生物質、アミノ酸および有機酸などの他の代謝産物を産生するために使用される。発酵の分野で使用される主な微生物は真菌、特に線状の真菌および酵母菌、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．などの細菌である。
【０００３】
発酵容器は、典型的には、その容量のわずか７０〜８０％が液体で満たされており、そのタンクの上の部分は気体の空間で占められている。液体の通気および液体の撹拌による作用が組み合わさって液体表面上に気泡の発生が促進され、標準的にはあらゆる通気発酵ブロス気泡の形成が促進され、このことが大きな気体空間が必要とされる原因である。気泡は気体塊がブロスからヘッドスペースに移動するのを妨げ、気泡は容器から追い出され、壊れた気泡が発酵槽に再び入るとき系を汚染してしまう。このことは、なんらかの気泡を制御する方法が発酵装置中に常に含まれていなければならないことを意味する。商業的な発酵用に最も一般的に使用される２つの方法は、機械的な気泡破砕機の使用および／または消泡剤の添加である。
【０００４】
機械的な気泡破砕機は、遠心分離用パルプインペラーと設計が非常に良く似た高速インペラーである。気泡はインペラー中に引き込まれ、そこで強力な機械的な力によって破壊される。これは繊細な生物には適していない。インペラーはそれ自身のシャフト上に取り付けなければならず、メインの撹拌機と独立して駆動させなければならない。これには別個の撹拌機シールが必要であり、汚染源および他の問題の潜在的な源となる。また、機械的な気泡破砕機は相当な資金の支出ともなる。
【０００５】
化学的な消泡剤は、気泡の表面張力の性質を変えることによって、気泡を破壊する。通常は追加の容器から自動的に、滅菌した消泡剤を発酵槽にポンプで送る。消泡剤の添加が、汚染の危険につながる可能性もある。なぜなら、ポリマー性の水を含まない液体剤は滅菌するのが困難であるからである。消泡剤の選択は発酵作用との適合性だけでなく、ダウンストリームプロセシングにおける生成物回収、濃度および精製との適合性に基づいても行うことができない。たとえば、特にシリコンをベースとする消泡剤は非常に低い濃度であっても、あるタイプの膜フィルタを介して透過性の流動を大幅に減らすことができる。疎水性消泡剤は疎水性の限外濾過膜に結合し、透過性の流動を低下させ、膜のみかけの分子量のカットオフを大幅に変えることができる。
【０００６】
発酵において使用される第１の消泡剤は、シリコーンをベースとする流体である。ごく最近、たとえば長鎖の脂肪酸のエステルを有するエチレンおよびプロピレンオキシドなどのポリマー類からなる化学的構造を有する、油をベースとする消泡剤が一般的に使用されている。すべての消泡剤には「曇り点」があり、これを超えると本質的に水に溶けない。消泡剤の機能的性質は、曇り点を超える温度で働く。したがって、消泡剤の曇り点は発酵の温度未満でなければならない。しかしながら、たとえば膜による濾過は曇り点未満の温度で行われなければならず、したがって消泡剤は水溶性であり、したがって濾過手順に対する影響は最小限であるはずである。消泡剤は非常にさまざまな曇り点で利用可能である。
【０００７】
大部分の消泡剤は、その疎水性のために滅菌するのが困難である。消泡剤は相当な資金の支出ともなる。優れた消泡調節システムはオプションも含み、気泡の形成がシステムを圧倒し発酵槽が空になる危険があるときは、空気の流れおよび撹拌速度を自動的に減少させなければならない。過度の気泡形成のために発酵槽が空になる場合、ドライブシステムへのダメージを避けるためにこのことが必要である。
【０００８】
発酵ブロスの外側および内側の両方で空気が充填した気泡を破壊するその機能のために、消泡剤は酸素透過速度を大幅に低下させる。対照的に洗浄剤は、通常酸素透過速度を増大させる。消泡剤および洗浄剤が同時に存在するとき、これらは補正効果を発揮する。消泡剤の添加によって酸素透過速度が低下すると、一定の攪拌および通気速度で溶存酸素レベルが低下することになる。消泡剤は表面張力を低下させ、容積質量透過係数（ｋＬａ）値を減少させる結果となる。これによって通気および撹拌を増大させることが必要となり、代わりに気泡形成が促進され、消泡剤のさらなる添加の必要性が増し、消泡剤によって生み出される問題がさらに増大する。気泡形成および撹拌／通気のポジティブなフィードバック効果は、多くの商業的発酵プロセスにおける主たる問題点である。さらなる実際上の欠点は、消泡剤のポリマー成分による目詰まりのためにプローブの感度が低下し老化が加速されることである。
【０００９】
工業的な発酵において使用される産生培地は不溶性ポリマーを含むことが多い。これら不溶性の培地成分の存在によって、発酵中の気泡形成の問題が非常に悪化する。培養中に生ずる気泡は培地からの未使用固形粒子と結びついて、強力な物理的性質および望ましくない高度な持続性を有する複合気泡を形成する。この気泡−固体集合体は容器の側面に、および下部の支持体と独立した発酵槽のヘッドスペース中の他の鋼構造物に付着したままで残存する傾向があり、ブロス層と気泡層とは接触しなくなる。したがって、発酵材料へ消泡剤を添加しても、二次的な気泡構造を分解するのに成功することはない。したがって上部の気泡層と消泡プローブの先端とが接触した後は、その後消泡剤を自動的に添加することによっても気泡層を破壊することはない。この場合、添加容器が空になるまで消泡剤の添加が無限に続く可能性があるし、またそういうことが多い。消泡剤の添加を続けても、集合体気泡層は発酵槽のヘッドスペース中で上昇し続け、最終的には排出ラインに入りアウトレットフィルタを塞いでしまう。代わりにこれによってブロスを介した空気の通過が妨げられ、溶存酸素がゼロに減少し、生成方法に悪影響を及ぼす。この全体のサイクルは、わずか１〜２時間という短時間に起こる可能性がある。
【００１０】
酸素透過速度は微生物の種類、その形態および濃度によって影響を受ける。より複雑な形態の種は、酸素透過速度の低下につながる（ペレット対フィラメント、ペレットは酸素要求量および取り込み量が非常に高いわけではないが最大酸素透過速度は明らかに高い）。菌糸体濃縮物（偽可塑性のカビ）の濃度が高いために粘度が増大すると、酸素透過速度が低下することになる。
【００１１】
菌糸体の形態は、プロセスの生産性および動態にも影響を与える。小さなペレットが所望の生成物を産生するのに最適である場合もあるが、一方で他の場合は線状の生育が最適であることが分かっている。形態はダウンストリームプロセシングおよび培養液の濾過特性にも影響を与える。なぜなら大きな粒子は、たとえば真空ドラム濾過において分離するのが容易だからである。通常ペレットの形での生育は、拡散的な菌糸体の生育の場合よりも清澄性が高く粘度が低い隙間の培養流体につながる。
【００１２】
発酵中の気泡形成によって引き起こされる課題があるために、気泡形成を妨げるか、または抑えるための新しい方法に対する要求は非常に高い。
【００１３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ菌株の細菌中でサーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）を産生することに関する、従来技術の刊行物がいくつかある。ＥＰ５７６０５０には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中のｓｆｐ遺伝子の単離および特徴付けが記載されており、この遺伝子はリポペプチドサーファクチンを産生するためのタンパク質をコードする。サーファクチンは特異的なタンパク質であり、脂質部分がタンパク質部分に共有結合している。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓからのサーファクチンの気泡形成特性についてはＲａｚａｆｉｎｄｒａｌａｍｂｏ他（１９９６）において論じられており、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのサーファクチンネガティブの表現型はＤ’ｓｏｕｚａ他（１９９３）において論じられている。ＷＯ９８／２２５９８では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞を改変して低レベルのサーファクチンを産生することを提案している。この改変によって、気泡形成が減少する結果となることが報告されている。しかしながら、これらの刊行物はＢａｃｉｌｌｕｓのサーファクチンに限られていた。
【００１４】
ＷＯ９６／４１８８２では、食品産業のために食用の真菌からのヒドロホビン（ｈｙｄｒｏｆｏｂｉｎ）の産生を提案している。この刊行物はヒドロホビンの過剰な発現について記載しているが、気泡形成の問題については論じていない。
【００１５】
（概要）
従来技術に関する問題点を取り除いて、さまざまな種類の微生物の培養中の気泡形成によって引き起こされる課題の解決策を提供することは、本発明の目的の一つである。本発明は気泡形成に伴う問題を解決するための完全に新しい方法を提供し、これが結果として消泡剤を使用する必要性を最小限にするかまたはその必要性を失くす。
【００１６】
本発明は詳細には、微生物の培養中の気泡形成に関係があるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの生成を失くすかまたは減少させるための方法を提供する。この方法は、気泡形成に関係があるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは生成することがない、または本質的に減少した量でしかこれらを生成しない、所望の微生物を遺伝学的に改変することからなる。これらのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、微生物の培養中に生成される気泡から回収可能である。微生物は酵母菌、真菌、細菌、植物細胞および動物細胞からなる群から選択される。これらの微生物は、所望のタンパク質、ポリペプチド、代謝産物またはバイオマスなどの関連の生成物を産生する際に使用される産生菌株であることが好ましい。典型的にはこれらの菌株は遺伝学的に改質されており、効率的な方法でこれらの生成物を産生する。
【００１７】
本発明の目的の一つは、微生物の培養中における気泡形成のレベルを低下させるための方法であり、この方法は以下のステップを含む。
【００１８】
微生物が微生物の培養中の気泡形成に関係があるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを実質量産生しないように、微生物を改質または改変するステップ、および
適切な培養条件下で微生物を培養するステップ。
より詳細には、この方法は、特許請求の範囲の請求項１の特徴部分で述べたことに主に特徴がある。
【００１９】
微生物の「改変」は「遺伝学的改変」であることが好ましく、これは気泡形成に関係があるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするＤＮＡ配列の少なくとも１つ、またはその一部分が発現および／または分泌されないように改変されることを意味する。遺伝学的改変は、所望のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするＤＮＡ配列の調節領域を対象とするさまざまな方法、または突然変異誘発または欠失などのような、ＤＮＡ配列を不活性化させることができるさまざまな方法からなり、すなわち遺伝学的改変は、気泡形成に関係があるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの生成を調節するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を対象とするさまざまな方法からなる。本発明の遺伝学的改変は、所望のＤＮＡ配列または気泡形成に関係があるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの配列を不活性化させることによって行うことが好ましい。遺伝学的改変は、所望のＤＮＡ配列または配列を欠失させることによって行うことがより好ましい。これは、欠失が気泡形成に関係があるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの効果を減少させるためのための最も強力な技術だからである。
【００２０】
培養中の気泡形成に関係がある分子は、微生物の培養中に生成される気泡から、またはそれらの調節タンパク質から回収可能である、さまざまなタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである。このような分子は、気泡形成の原因である気泡形成タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの調節をするタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む。これらは、気泡を形成する、すなわち気泡形成の原因であるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドであることが好ましい。このようなタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドは、疎水性または両親媒性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、ヒドロフォビン（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎ）、または両親媒性表面活性分子を含む。気泡形成に関係があるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドはヒドロフォビンであることが好ましい。ヒドロフォビンは、真菌の最も豊富に生成されるタンパク質である。ヒドロフォビンの存在に関してこれまで研究されてきた真菌はすべて、１つまたはそれ以上のヒドロフォビンを産生することが示されている。
【００２１】
多くの微生物産生宿主は気泡形成するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを培養中に生成することが知られているので、本発明を適用してさまざまな異なる種類の微生物を培養する際に生じうる気泡の問題を解決することができる。
【００２２】
本発明の１つの好ましい実施形態によれば、微生物は真菌である。さらに好ましくは、その真菌はＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａである。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態によれば、生産されることがなくまたは生産を減少した、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａからのヒドロフォビンである。
【００２４】
本発明の１つの非常に好ましい実施形態によれば、ヒドロフォビンはヒドロフォビンＩ（ＨＦＢＩ）またはヒドロフォビンＩＩ（ＨＦＢＩＩ）である。本発明は、必要量のＨＦＢＩおよび／またはＨＦＢＩＩを生成しないように、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株を遺伝学的に改変することを含む。ヒドロフォビンＩ（ＨＦＢＩ）またはヒドロフォビンＩＩ（ＨＦＢＩＩ）またはこの両方をコードするＤＮＡ配列は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株中で不活性化されることが好ましい。
本発明の他の好ましい実施形態によれば、微生物は真菌に属する。宿主菌株は、培養中の気泡形成に関係があるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを生産する任意の細菌性宿主であってよい。宿主菌株はＥ．ｃｏｌｉであるか、またはＢａｃｉｌｌｕｓ属またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属に属することが好ましい。
【００２５】
本発明の他の目的は新規な産生宿主菌株であり、この産生宿主菌株は、未改変の産生宿主菌株を培養するとき、気泡形成に関係があるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを実質量産生しないように遺伝学的に改変されている。
【００２６】
より詳細には、請求項１５の特徴部分で述べたことにこの産生宿主菌株は主に特徴がある。
【００２７】
本発明の他の目的は、請求項１２の特徴部分で述べた本発明の方法によって培養される微生物によって産生される産生物である。この産生物は任意の天然または組換えタンパク質、ペプチド、代謝産物、抗生物質、溶融タンパク質または細胞自体であってもよい。生成物は組換えタンパク質であることが好ましい。
【００２８】
本発明において、少なくとも１つの疎水性または両親媒性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを産生しないように改変した産生宿主は、より多量の目的の産生物を産生する能力があることも分かっている。この特徴は培養中においても見ることができ、この場合培養中における気泡形成に本質的な減少はない。
【００２９】
したがって本発明の他の目的は、請求項２４の特徴部分で特定するような、少なくとも１つの疎水性または両親媒性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを実質量産生しないように遺伝学的に改変した産生宿主菌株である。
【００３０】
さらに本発明の一つの目的は、請求項３４の特徴部分で述べるような、より多量の目的の産物を産生するための方法である。
【００３１】
本発明は、さまざまな利点を提供する。微生物の培養中に気泡がほとんど形成しないかまたは実質的にまったく形成しないとき、消泡剤はまったく必要とされないかまたはごく低レベルしか必要とされない。これによって、結果としてダウンストリームプロセシングが大幅に容易になる。
【００３２】
本発明に従って改変された微生物の培養によって、過剰な気泡形成はまったく生じないか、または実質的に減少する。したがって、産生物の損失量が小さいときは、収率が高くなる。
【００３３】
１つの明白な利点は、滅菌するのが困難である消泡剤を加える必要がないとき、汚染の危険性が大幅に低下することでもある。なぜなら、生育培地はバイオリアクタシステムの表面またはその他の潜在的に非無菌状態の領域とは接触しないからである。
【００３４】
本発明によれば、培養培地が発酵槽表面、電極、インペラーなどへ接触するのは少ないはずである。したがって発酵槽中では細胞の塊はより均質に分布する。加えて、電極の誤作動が減少し、そのことにより発酵の制御性が改善される。
【００３５】
本発明の結果として、全体的な生産性が改善されるはずである。１つまたはいくつかの次のパラメータ：産生物／タンパク質分泌比、特異的生産性／タンパク質比（タンパク質／バイオマス）または生産性／発酵比（発酵槽中では液体が多い）は、本発明によって改変していない培養物における比と比較して高いはずである。
【００３６】
驚くべきことに、可溶性タンパク質の量、すなわち産生宿主から分泌されるタンパク質の量は培養中に増加する。可溶性タンパク質の量は、本発明によって改変していない宿主によって産生されるタンパク質の量の少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍、さらに好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは１０倍であってよい。本発明において、実質量の両親媒性または疎水性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、好ましくはヒドロフォビンを産生しないように遺伝学的に微生物を改変することによって、宿主の産生レベルが増大する可能性があるという注目に値する発見がされた。本発明によれば、微生物宿主は好ましくは、少なくとも１つの両親媒性または疎水性タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド、好ましくはヒドロフォビンを産生しないように改変されるべきである。本発明中で開示する遺伝学的改変は、改変型微生物の産生レベルを改善するために使用することができる。他のタンパク質の生産が増大したことは、実施例８で示す。
【００３７】
気泡形成を減少し得るという効果は一定の培養中では明らかであるが、通気や培地またはその他のパラメータによっては、かかる気泡形成が減少することが気づかれないままである可能性も時にはある。他のタンパク質を多量に産生すると気泡形成が引き起こされる可能性があるので、もしもこれらの菌株中で他のタンパク質の産生が増大するとしたら、疎水性または両親媒性タンパク質の産生が減少させるという減少効果が隠され、明確に測定することができない可能性がある。
【００３８】
１つの他の利点は、形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を変化させることにより生産性がより良くなったことである。１つまたはそれ以上のヒドロフォビン遺伝子を不活性化させることによって、線状またはペレット形成生育間における菌株の形態を調節することが可能である。
【００３９】
不溶性成分を含む培養培地上で微生物を培養するとき、本発明は特に有利である。消泡剤は、微生物代謝および未使用固形粒子によって生成されるタンパク質性気泡から形成される、複合気泡を効率よく分解することができない。本発明によれば、気泡はまったく形成されないか、またはごく少量しか気泡が形成されないので、したがって培養を妨げる非分解性の二次構造の気泡は存在しない。目的の産生物、特に目的のタンパク質を産生するために産生宿主を培養するとき、本発明は特に有利である。
【００４０】
（発明の詳細な説明）
ここでは培養という語は、実験容器中でまたは大規模に微生物の細胞を生育させるために使用される任意の方法を意味する。本発明は通気および／または撹拌するバイオリアクタ培養に用いると非常に有用である。
【００４１】
生育／培養培地は、用いる微生物に従って選択するべきである。微生物の最適な生育および／または所望の産物の最適な生産を達成するために、栄養分、通気およびｐＨ条件は微生物にとって最適でなければならない。培養培地は、培養中の気泡形成に関係があるタンパク質またはポリペプチドの産生を誘導しないかまたは妨げる培地を選んでもよい。産物は細胞を含む培養培地でもいいし、細胞あるいは培地から、好ましくは培養培地から回収できる。
【００４２】
ここでは発酵という語は、任意のバイオリアクタ培養を意味し、その中で通気および／または撹拌が使用される培養が好ましい。発酵槽は普通の発酵槽であることが好ましいが、本発明はエアリフトなど他のタイプの発酵槽にも適用できる。
【００４３】
ここでは微生物という語は、細菌、酵母、真菌、植物および動物細胞を意味する。本発明は真菌または細菌に、より好ましくは真菌に適用することが好ましい。
【００４４】
本発明の真菌性宿主菌株はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐｐ．、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｓｐｐ．、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ  ｇｅｏｄｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐｐ．、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．を含む。
【００４５】
本発明の細菌性宿主菌株はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．などのＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｐ．およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを含む。
【００４６】
ここでは生産宿主菌株とは所望の産物を効率的に産生するよう選択されるかまたは遺伝学的に改変されて、産業上の用途にも有用である任意の微生物を意味する。宿主菌株は、目的の産物を効率的に産生するために遺伝子技術手段によって改変された組換え菌株であることが好ましい。
【００４７】
遺伝学的改変という語は組換えＤＮＡ技術または遺伝子技術、細胞融合およびハイブリダイゼーション、突然変異誘発、誘導多核、接合、形質導入、形質転換および遺伝性物質の細胞内への注入を含む。
【００４８】
改変されていない微生物を培養する際の気泡形成に関与しているタンパク質またはペプチドを気泡形成に必要な量作らないように微生物を遺伝的に改変するには、さまざまな遺伝学的方法によって、気泡形成に関係がある少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドをコードしているＤＮＡ配列を改変して発現または分泌させないようにする、あるいは、気泡形成性のタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドの産生や気泡形成性タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドをコードしているＤＮＡ配列を調節している調節タンパク質をコードしているＤＮＡ配列を遺伝的に改変するなどである。さらに遺伝的改変は、気泡形成に関係があるタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドをコードしている遺伝子の調節領域を遺伝学的に改変することもふくむ。本発明の好ましい実施形態では、気泡形成タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドをコードしているＤＮＡ配列を不活化する。不活化は当分野でよく知られている任意の適切な従来法すなわち分子生物学的方法でできる。改変は部位特異的突然変異導入法または欠失などの組換えＤＮＡ技法によって行うことが好ましい。選んだタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドをコードしているＤＮＡ配列を欠失させることによって、不活性化を行うことが最も好ましい。
【００４９】
前述の方法は、両親媒性または疎水性のタンパク質またはポリペプチドまたはペプチド（好ましくはヒドロフォビン）を産生しないように微生物を改変することにより目的とする産物の産生量を増加させるために使用してもよい。これらの両親媒性または疎水性タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドは、微生物の宿主の細胞壁中に見出されるものであることが好ましい。
【００５０】
培養産物とは、所望のタンパク質や、ポリペプチド、ペプチド、代謝産物または菌体であってよい。
【００５１】
ここでは気泡形成に関係があるタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドとは、微生物の培養中の気泡形成に関係があり、微生物の培養中に形成される気泡から回収できる分子ならばいかなるものでもよい。このグループは気泡形成性のタンパク質またはポリペプチドまたはペプチド、および気泡形成性のタンパク質またはペプチドの産生を調節するタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドを含む。このグループは疎水性または両親媒性タンパク質またはポリペプチドまたはペプチド、ヒドロフォビン、疎水性または両親媒性表面活性分子およびタンパク質を含むことが好ましい。気泡形成に関係があるタンパク質またはペプチドはヒドロフォビン(hydrophobin)またはヒドロフォビン様分子であることが好ましい。
【００５２】
培養中の気泡形成の原因となる分子の例は、疎水性、両親媒性のタンパク質またはペプチドである。ヒドロフォビンは最近糸状菌から発見された興味深い物理化学的性質を有する両親媒性の分泌タンパク質である（Ｗｅｓｓｅｌｓ、１９９４；ＷｏｓｔｅｎおよびＷｅｓｓｅｌｓ、１９９７；ＫｅｒｓｈａｗおよびＴａｌｂｏｔ、１９９８）。最初にこれらはＤＮＡレベルで記載され（ＳｃｈｕｒｅｎおよびＷｅｓｓｅｌｓ、１９９０）その後菌の表面と環境の間の相互作用に働くタンパク質であることがわかった。「ヒドロフォビン」という語は最初は任意の疎水性物質を表すために使用されていたが、Ｗｅｓｓｅｌｓはこれらのタンパク質をヒドロフォビンと命名した（Ｗｅｓｓｅｌｓ他、１９９１ａ，ｂ）。ヒドロフォビンは最も豊富に産生される真菌のタンパク質であり、研究されている真菌はすべて１つまたは複数のヒドロフォビンを産生している。これらはたとえば細胞壁、分生胞子、子実体または培養培地から量こそ違え回収することができる。
【００５３】
このタンパク質独自の特徴の１つは、その適度な疎水性である。通常これらは小さなタンパク質であり、約７０〜１６０個のアミノ酸中には６〜１０個、通常は８個のシステイン残基が保存されたパターンで含まれている。この８個のシステイン残基（Ｃｙｓ）はＸ２〜３８−Ｃｙｓ−Ｘ５〜９−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｘ１１〜３９−Ｃｙｓ−Ｘ８〜２３−Ｃｙｓ−Ｘ５〜９−Ｃｙｓ−ＣｙｓＸ６〜１８−Ｃｙｓ−Ｘ２〜１３という保存された間隔を有し、この中でＸは任意の他のアミノ酸を意味する。しかしながら、たとえばプロリンが豊富なまたはアスパラギン／グリシンの繰り返しを有する１つまたは数個のヒドロフォビン領域を有するマルチモジュラータンパク質も、８個未満のシステイン残基を含むヒドロフォビンも解明されている（Ｌｏｒａ他、１９９４；Ｌｏｒａ他、１９９５；ＡｒｎｔｚおよびＴｕｄｚｙｎｓｋｉ、１９９７；ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ他、１９９９）。
【００５４】
ヒドロフォビンは、そのヒドロパシープロファイルおよび物理化学的性質に基づいて２つのクラスに分類されている（Ｗｅｓｓｅｌｓ、１９９４）。クラスＩのヒドロフォビンは非常に不溶性の集合体を形成するが、クラスＩＩのヒドロフォビン集合体は安定性が低く、たとえば６０％エタノールおよび２％ＳＤＳ中で溶ける。しかしながら、ヒドロフォビンによってはおそらくこれら２つのクラスの間の性質を示す。ヒドロフォビンに関する３０以上の遺伝子が公開されているが（ＷｏｓｔｅｎおよびＷｅｓｓｅｌｓ、１９９７）、タンパク質で単離され研究されているのはわずか数個である。今日あるほとんどのタンパク質データはＳｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｃｏｍｍｕｎｅのＳＣ３（クラスＩ）、Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ  ｕｌｍｉのセラト−ウルミン(cerato-ulmin)およびＣｒｙｐｏｎｅｃｔｒｉａ  ｐａｒａｓｔｉｔｉｃａのクリパリン(cryparin)（クラスＩＩ）のヒドロフォビンに関するものである。他に単離されたヒドロフォビンとしては少なくともＳ．ｃｏｍｍｕｎｅのＳＣ４、Ａｇａｒｉｃｕｓ  ｂｉｓｐｏｒｕｓのＡＢＨ１およびＡＢＨ２およびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａのＥＡＳがある。
【００５５】
ヒドロフォビンの最も独特な特徴は、それらが親水性／疎水性界面において自己集合することである。親水性の細胞壁と疎水性環境（空気、油、老廃物）の間の界面において自己集合することによって、新生構造は両親媒性の膜で覆われる。細胞表面が親水性から疎水性になることにより、気生菌糸の形成が可能になり、風による胞子の分布が助長され、子実体内部の通気チャンネルが維持され、菌糸の接着および表面の疎水性のシグナリングを仲介する。ヒドロフォビンは、気生菌糸を耐水性および撥水性にする。さらにヒドロフォビンは、複雑な菌糸同士の相互作用に関わる。
【００５６】
ヒドロフォビンは、細胞壁／空気または液体界面においてだけでなく、親水性細胞壁と疎水性の固体の間の界面においても集合する。ヒドロフォビンは、真菌の菌糸と疎水性表面とを強固に接着する（Ｗｏｓｔｅｎ他、１９９４ａ）。菌糸の固体表面への接着は、ヒドロフォビン膜の両親媒的な性質によるものである（すなわち、それぞれの側が２つの表面のどちらかと相互作用する）。
【００５７】
ヒドロフォビンは、液体−空気界面においても集合する。Ｓ．ｃｏｍｍｕｎｅのＳＣ３、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓのＣＯＨ１、Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓのＡＢＨ３、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｏｓｔｒｅａｔｕｓのＰＯＨ２およびＰＯＨ３などのいくつかのヒドロフォビンは、培地中に分泌される（Ｗｏｓｔｅｎ他、１９９９）。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａおよびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍなどの糸状菌は両親媒性タンパク質、おそらくはヒドロフォビンを培地中に産生する（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ他、１９９３、Ｗｅｓｓｅｌｓ、１９９７）。
【００５８】
ヒドロフォビンはモノマーとして分泌されるが、ヒドロフォビンが空気−水界面または疎水性表面との界面で出会うと、凝集して１つの大きなポリマー複合体になる。形成されるこの薄膜は一方の側が疎水性であり、もう一方の側は親水性である。ＳＣ３の集合体、およびセラト−ウルミンおよびクリパリンの集合体（Ｗｅｓｓｅｌｓ、１９９７）は、気体−液体または油−液体界面で形成され、これによって空気の泡または水中の油滴を安定化させる。精製ＳＣ３ヒドロフォビンが両親媒性層に自己集合するのも、親水性と疎水性の表面上で起こる（Ｗｏｓｔｅｎ他、１９９３；Ｗｏｓｔｅｎ他、１９９４ｂ）。このフィルムは表面に非常に強く接着し、たとえば熱した洗浄剤によっても壊れない。親水性表面上の層の疎水性側は、テフロンの性質と同様の性質を示す（Ｗｅｓｓｅｌｓ、１９９４）。ＳＣ３ヒドロフォビンを含む溶液を撹拌することによって、タンパク質のモノマーが１０ｎｍの小桿状のヒドロフォビン凝集体を形成する。これらの構造は、真菌の気生構造の表面上で見られる構造と類似している。
【００５９】
水の表面張力を低下させるいくつかのバイオサーファクタント（ｂｉｏｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）が、文献中で知られている（ＷｏｓｔｅｎおよびＷｅｓｓｅｌｓ、１９９７）。一般にタンパク質の表面活性は低いが、ヒドロフォビンは表面活性分子に属し、それらの界面活性能力は糖脂質、リポペプチド／リポタンパク質、リン脂質、中性脂質および脂肪酸などの従来のバイオサーファクタントと少なくとも同等である（ＷｏｓｔｅｎおよびＷｅｓｓｅｌｓ、１９９７）。実際ＳＣ３ヒドロフォビンは、これまで知られている最も強力なバイオサーファクタントである。ＳＣ３ヒドロフォビンは、５０μｇ／ｍｌの濃度において水の表面張力を２４ｍＪｍ２に低下させる。しかしながら他のバイオサーファクタントとは違って、ヒドロフォビンの表面活性は脂質分子に依存せず、アミノ酸配列のみによって引き起こされることが明らかである。ＳＣ３のグリカン部分は主にタンパク質の親水性部分に存在し、タンパク質のこの部分の親水性におそらく貢献している。しかしながら、大部分のヒドロフォビンはグリコシル化されておらず、これらの中でリポタンパク質であると報告されているものはない。さらにヒドロフォビンの表面活性は、拡散制限界面吸着ではなく、両親媒性フィルムに集合する際の分子のコンフォーメーション変化によるようである（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｇｔ他、１９９６、ＷｏｓｔｅｎおよびＷｅｓｓｅｌｓ、１９９７）。ＳＣ３ヒドロフォビンと同様に、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＨＦＢＩおよびＨＦＢＩＩヒドロフォビンも水の表面張力を低下させることが示されている（我々の未公開データによる）。表面張力が低下すると気体の泡がより安定化するので、ヒドロフォビンおよび他の両親媒性ポリペプチドは気泡を安定化させる。
【００６０】
ヒドロフォビン様分子は、その性質がさまざまである。たとえば、すべてのヒドロフォビンが小桿体形成能力があるわけではなく（クラスＩＩのあるもの）、あるいは安定した凝集体を形成する傾向が弱いものもある（Ｒｕｓｓｏ他、１９８２；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ他、１９９２）。真菌の両親媒性タンパク質の他のグループは撥水剤(repellent)である（ＫｅｒｓｈａｗおよびＴａｌｂｏｔ、１９９８）。したがって、気泡形成の原因となる他のタイプのタンパク質およびポリペプチドは、ヒドロフォビンの特徴をいくらか持つに過ぎないこともある。このような例は、ＳａｐＢおよびストレプトファクチンであり、これらはそれぞれＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｒおよびＳ．ｔｅｎｄａｅによって培養培地内に分泌される表面活性ペプチドである（Ｗｉｌｌｅｙ他、１９９１、Ｒｉｃｈｔｅｒ他、１９９８）。
【００６１】
ヒドロフォビンの２Ｄおよび３Ｄ構造、および自己集合時に起こる変化についてはほとんど知られていない。しかしながら両方のヒドロフォビンクラス共に、２つのジスルフィド架橋によって安定化する２つの領域を含むと推測される（ＷｏｓｔｅｎおよびＷｅｓｓｅｌｓ、１９９７）。
【００６２】
ヒドロフォビンおよび他の疎水性／両親媒性タンパク質およびポリペプチドをみつけて不活性化するための戦略は当分野でよく知られており、ハイブリダイゼーション法によるゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングなどの技法があり、このスクリーニングはタンパク質／ペプチドをコードしている領域中の保存領域に基づいて設計されている同種／異種ＤＮＡ断片およびオリゴヌクレオチドを使用する。しかしながら、ヒドロフォビンの配列の多様性は、配列の相同性に基づくヒドロフォビン様遺伝子の単離が困難であろうことを意味する。異種ハイブリダイゼーションを使用し、核酸の類似性を利用してヒドロフォビン遺伝子を単離したという報告は少ししかない（たとえばＭｕｎｏｚ他、１９９７）。
【００６３】
しかしながら、対応する遺伝子の単離のために精製したタンパク質を利用するいくつかの技法は当業者に知られている。気泡形成に関係があるタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドを精製した後、たとえば精製したタンパク質に対する抗体を使用する発現ライブラリーのスクリーニング、またはＮ末端または内部のタンパク質配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドを使用するゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲクローニングまたはスクリーニングなどの、適切な技法を使用して対応する遺伝子を単離する。
【００６４】
気泡形成に関係があるタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドは、それらの諸性質に基づいて精製することができる。これらは菌株の培養中にできる気泡から回収するか、あるいは培地を通気して泡立たせてできる気泡から回収することができる。さらに気泡形成に関係があるタンパク質またはポリペプチドおよびペプチドは、培養培地の凍結によって生じる凝集体から回収することができる。タンパク質またはポリペプチドまたはペプチド（本発明によればそれらの産生を妨げることは有用である）は、ヒドロフォビンについて示されているように菌の細胞、細胞抽出液または培養培地を２層システム（ＡＴＰＳ）に加え、疎水性相材料をふくむ相に析出したタンパク質を回収することによっても得ることができる（Ｈｙｙｔｉａ他、１９９９）。
【００６５】
本発明によれば微生物菌株は、改変されていない微生物の宿主の培養中の気泡形成に関係がある少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドを基本量産生しないように遺伝的に改変されている。ここで基本量をつくらないとは、改変されていない親の宿主菌株と比較して、宿主菌株が少なくとも５０％減の両親媒性タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドを産生する、好ましくは６０〜８０％減、最も好ましくは８０〜１００％減の両親媒性タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドを産生することを意味する。
【００６６】
培養中の気泡形成のレベルを低下させるとは、ここでは改変されていない親の宿主菌株と比較して、気泡形成が少なくとも３０％、好ましくは４０〜８０％、最も好ましくは８０〜１００％減少することを意味する。
【００６７】
気泡形成の減少によって、消泡剤が節約され発酵作業容量が増大する結果となる。消泡剤の節約は少なくとも３０％、好ましくは４０〜８０％、最も好ましくは８０〜１００％である。発酵作業容量の増大は少なくとも５％、好ましくは１０〜２０％である。
【００６８】
目的の産物を産生する能力の向上とは、ここでは少なくとも１つの両親媒性または疎水性タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドを基本量産生しないように改変された産生宿主が、本発明によって改変されていない宿主よりも、少なくとも１．２倍、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍、さらに好ましくは少なくとも５倍、最も好ましくは１０倍多量の産物を産生する能力があることを意味する。産物は培養から、細胞からまたは培養培地から回収することができ、培養培地から回収されることが好ましい。
【００６９】
欠失ベクターとは、ここではマーカー遺伝子およびいわゆる隣接領域をコードしているＤＮＡ配列を含むベクターを意味し、このベクターは所望の遺伝子を産生宿主のゲノムから欠失させ、それをマーカー遺伝子に置き換えることができる。マーカー遺伝子はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓからのａｍｄ  Ｓ、Ｅ．ｃｏｌｉからのｈｐｈ、または任意の他の領域または文献中で知られている優性または栄養要求性選択マーカーであってよい。ベクターはｐＣＵシリーズからのクローニングベクター、または任意の他の一般的に利用されるクローニングベクターであってよい。欠失カセット（選択したマーカー遺伝子および隣接領域をコードしているＤＮＡ配列を含む）は制限酵素によってベクターのゲノムから取り出すことができる。
【００７０】
本発明は、真菌の宿主菌株中のヒドロフォビンをコードしている１つまたは複数のＤＮＡ配列を不活性化させることによって、本発明を例示した。１つのヒドロフォビンをコードしているＤＮＡ配列の不活性化しただけで、気泡形成に大きく影響を与えた。
【００７１】
詳細には、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのゲノムからのｈｆｂ１および／またはｈｆｂ２遺伝子の欠失によって、本発明を例示した。これらの遺伝子のクローニングおよび単離、対応するタンパク質ＨＦＢＩおよびＨＦＢＩＩの精製は、Ｎａｋａｒｉ−Ｓｅｔａｌａの博士論文（Ｎａｋａｒｉ−Ｓｅｔａｌａ、Ｔ．、ＶＴＴ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ２５４、Ｅｓｐｏｏ  １９９５）（Ｎａｋａｒｉ−Ｓｅｔａｌａ他、１９９６；Ｎａｋａｒｉ−Ｓｅｔａｌａ他、１９９７）に記載されている。博士論文では、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのＨＦＢＩおよびＨＦＢＩＩが基質への接着に働いている、または胞子の疎水性に寄与していることが推測されたが、これらのタンパク質の生物学的役割は、本発明以前には多くは知られていない。それゆえ本発明中で示すような、発酵中の気泡形成におけるその重大な役割は驚くべき特徴であった。本発明では、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのゲノム中において、ヒドロホビン(hydrofobin)をコードしている遺伝子の１つが欠失することによって、改変されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ宿主の発酵中の気泡形成が著しく減少する結果となることを示した。
【００７２】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのゲノムからのｈｆｂ１およびｈｆｂ２遺伝子を欠失させるために、これらの遺伝子の欠失体を含むベクターを構築した。ベクター中でｈｆｂ１遺伝子をａｍｄＳ遺伝子に置き換え、ベクター中でｈｆｂ２遺伝子をヒグロマイシンＢをコードしているＥ．ｃｏｌｉのｈｐｈ遺伝子に置き換えた。クローニングベクターは、ｐＵＣシリーズ、ｐＵＣ１８のベクターの１つであった。
【００７３】
実施例２に記載する当分野で知られている形質転換方法によって、異なるＴ．ｒｅｅｓｅｉ菌株（ＱＭ９４１４およびＲｕｔ−Ｃ−３０）を欠失ベクターで形質転換し、得られた形質転換体中でｈｆｂ遺伝子が除去されていることを確認した。ｈｆｂ１、ｈｆｂ２、または両方の欠失体を有するこの形質転換体を、撹拌フラスコ中で異なる生育培地（炭素源としてグルコース、ソルビトールおよびラクトースを有する）中で培養した。その結果、ｈｆｂ１、ｈｆｂ２、または両方の遺伝子は、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ菌株の酵素の産生に対して悪影響を与えることはないことが示された。親のＴ．ｒｅｅｓｅｉ菌株よりも、酵素産生がさらに良くなった場合もあった。
【００７４】
ｈｆｂ１遺伝子欠失の結果として、撹拌フラスコ培養中のグルコースで生育させたΔｈｆｂ１菌糸は細胞壁がコントロールの菌糸よりも薄く見え、菌株は培養中に大きなペレットを形成した。形質転換体の生育は培養の中期に幾分か悪くなったが、欠失菌株は培養の後期の段階で宿主菌株においついた。撹拌液体培養においてラクトースで生育するとき、ｈｆｂ２の遺伝子の欠失が形質転換体の形態に対して影響を与えることはなく、形質転換体と宿主菌株の間で生育の違いは検出されなかった。
【００７５】
そのゲノム中にｈｆｂ２の欠失体を有するように改変したＴ．ｒｅｅｓｅｉ  Ｒｕｔ  Ｃ３０菌株も、発酵槽中ラクトースおよびセルロースで生育させた。消泡剤の消費、ｐＨ、生育およびタンパク質および酵素産生を監視した。その結果から、１つのヒドロフォビン遺伝子の欠失によって気泡形成が大幅に減少することが明らかに示された。Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  Ｒｕｔ−Ｃ３０を不溶性セルロース高分子を含む培地で、セルロースを栄養源として培養したとき特に、多量のかなり安定した気泡が形成され、したがって消泡剤の消費が増大した。ラクトースで形質転換体を培養したときはいかなる消泡剤も使用せず、セルロースでは、培養中に必要とされた消泡剤の量はコントロール培養の量のわずか１２％であった。消泡剤の消費が減少することには、いくつかの良い効果がある。主な利点は、後処理が非常に容易になることである。
【００７６】
試験した条件において、ｈｆｂ２の遺伝子の欠失が形質転換体菌株の生育に対して重大な影響を与えることはなかった。ｈｆｂ２の遺伝子の欠失が形質転換体による細胞外タンパク質および酵素産生に明らかな悪影響を与えることもなかった。
【００７７】
それどころか少なくとも１つの欠失を有する形質転換体菌株の１つでは、すべての分泌タンパク質の産生が増大した。欠失のない菌株と比較して、タンパク質およびプロテアーゼ量によって測定されるバイオマス当たりのタンパク質の産生は大幅に増大した。
【００７８】
ここではまたタンパク質産物の生産の例として、ヒドロフォビン様タンパク質を含む融合分子タンパク質の産生を示した。気泡形成に関係があるタンパク質またはポリペプチドをつくらないように産生宿主菌株を改変し、この宿主を形質転換して、両親媒性タンパク質と目的の分子を含む融合分子をつくらせ、水性２層システム（ＡＴＰＳ）で精製した。以下の実施例は本発明を例示するためのものであり、いかなる方法においても本発明を制限すると解釈すべきではない。
【００７９】
（実施例）
実施例１
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉのゲノムからのｈｆｂ１および／またはｈｆｂ２遺伝子を欠失させるためのベクターの構築
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのゲノムからｈｆｂ１（配列番号１、図１）遺伝子を欠失させるために、ｈｆｂ１をコードしている領域がＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのアセトアミダーゼをコードするａｍｄＳ遺伝子で置き換えられたプラスミドを構築した。ｈｆｂ１コードする領域およびその隣接領域を含む約５．８ｋｂのＳａｌＩ断片を保持しているプラスミドｐＥＡ１０（Ｎａｋａｒｉ−Ｓｅｔａｌａ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９６）２３５：２４８−２５５）を、ＭｕｎＩを用いて消化しＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑にした。ｈｆｂ１のコード領域およびいその隣接領域を含む約９５０ｂｐのＭｕｎＩ断片を欠失した結果として生じたベクター断片をアガロースゲルから精製し、ＳｐｈＩおよびＸｂａＩを用いてｐ３ＳＲ２（Ｈｙｎｅｓ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：１４３０−１４３９；Ｔｉｌｂｕｒｎ他、Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：２０５−２２１）から切り離した３．２ｋｂのａｍｄＳ断片に連結させ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑にした。得られたプラスミドはｐＴＮＳ２４（図３）である。このプラスミドは、それぞれ約２．７ｋｂおよび２ｋｂであるｈｆｂ１の５’および３’非コード領域を有するａｍｄＳ遺伝子を含む欠失カセットを保持している。欠失カセットはＳａｌＩを用いてベクターから切り離すことができる。
【００８０】
Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのゲノムからｈｆｂ２（配列番号２、図２）遺伝子を除去するために、ｈｆｂ２コード領域がヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼをコードするＥ．ｃｏｌｉのｈｐｈ遺伝子で置き換えられたプラスミドを構築した。ｈｆｂ２遺伝子の１．２ｋｂ５’隣接領域を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩを用いてプラスミドｐＴＳＮ８（Ｎａｋａｒｉ−Ｓｅｔａｌａ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）２４８：４１５−４２３）から切り離し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑にし、アガロースゲルから精製した。ＸｈｏＩを用いて切断したｐＡＲＯ２１（Ｐｅｎｔｔｉｌａ他、Ｐａｔｅｎｔ  ａｐｐｌ．ＦＩ９９０６６７）に精製した断片を連結させ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑にし、結果としてｐＴＮＳ２６を生成した。ｐＡＲＯ２１は本質的にｐＲＬＭｅｘ３０（Ｍａｃｈ他、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ（１９９４）６：５６７−５７０）と同じであり、７３０ｂｐのｐｋｉｌプロモーターおよびＴ．ｒｅｅｓｅｉの１ｋｂのｃｂｈ２ターミネーター配列に操作可能に結合しているＥ．ｃｏｌｉのｈｐｈ遺伝子を保持している。ｈｆｂ２の３’隣接領域を欠失カセットに導入するために、ｐＴＮＳ２６をＥｃｏＲＶを用いて切断し、ＳＡＰ（シュリンプアルカリホスファターゼ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて処理し、ｐＴＮＳ８から切り離した１．７ｋｂのＥｃｏＲＶ  ｈｆｂ２  ３’隣接領域断片に連結させた。結果として生じたプラスミドｐＴＮＳ２７（図４）においては、ｈｐｈ２遺伝子の５’および３’非コード領域は共に、ｈｐｈ発現カセットに同じ方向を向いて隣接している。欠失カセットはＳｐｈＩおよびＳｐｅＩを用いてベクターから切り離すことができる。
【００８１】
実施例２
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａの形質転換およびΔｈｆｂクローンの精製
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ菌株ＱＭ９４１４（ＶＴＴ−Ｄ−７４０７５）、Ｒｕｔ−Ｃ３０（ＶＴＴ−Ｄ−８６２７１）およびＱＭ９４１４Δｈｆｂ１（ＶＴＴ−Ｄ−９９７２４）を、３〜１３μｇのプラスミドｐＴＮＳ２４およびｐＴＮＳ２７または適切な制限酵素でこれらから切り離した欠失カセットを使用してほぼ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ他、Ｇｅｎｅ（１９８７）６１：１５５−１６４）に記載されるように形質転換させた。
【００８２】
得られたＡｍｄ＋およびＨｙｇ＋形質転換体を、それぞれアセタミドおよびヒグロマイシンを含むプレート上に３度線条接種した（Ｐｅｎｔｔｉｌａ他、Ｇｅｎｅ（１９８７）６１：１５５−１６４）。その後、Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）上で生育した形質転換体から、胞子の懸濁液を作成した。
【００８３】
ゲノムからｈｐｈ遺伝子が除去されたことを確認するために、サザン分析を行った。Ｅａｓｙ−ＤＮＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを単離するために、混合Ａｍｄ＋およびＨｙｇ＋形質転換体を、３％グルコースおよび０．２％ペプトンを含む最小培地上で培養した（Ｐｅｎｔｔｉｌａ他、Ｇｅｎｅ（１９８７）６１：１５５−１６４）。約２μｇのＤＮＡを、Δｈｆｂ１の形質転換体の場合はＰｖｕＩを用いて切断し、Δｈｆｂ２の形質転換体の場合はＮｃｏＩを用いて切断した。ｈｐｈ１およびｈｐｈ２遺伝子および隣接領域を含む約５．８ｋｂおよび３．８ｋｂのゲノム断片でのサザンハイブリダイゼーションを行った。宿主菌株中では、プローブを用いたハイブリダイゼーションは、両方の場合において、１つの大きなシグナルを生じ、一方、形質転換体中では、ｈｐｈ遺伝子が適切に欠失している場合は２つの小さなシグナルが得られる。
【００８４】
サザン分析に基づいてｈｐｈ遺伝子が欠失しているクローンの胞子の懸濁液を精製して、選択プレート（アセタミドまたはヒグロマイシンのいずれかを含む）上で１つの胞子培養物にした。前と同様にサザン分析を繰り返して、純粋なΔｈｆｂクローンを選択した。
【００８５】
さらなる研究のために使用したＴ．ｒｅｅｓｅｉ菌株はＶＴＴ−Ｄ−９９７２４およびＶＴＴ−Ｄ−９９７２３（ＱＭ９４１４Δｈｆｂ１）、ＶＴＴ−Ｄ−９９７２６（ＱＭ９４１４Δｈｆｂ２）、ＶＴＴ−Ｄ−９９７２５（ＱＭ９４１４Δｈｆｂ１Δｈｆｂ２）およびＶＴＴ−Ｄ−９９６７６（Ｒｕｔ−Ｃ３０Δｈｆｂ２）である。
【００８６】
実施例３
グルコース、ソルビトールおよびラクトース上でのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ＱＭ９４１４Δｈｆｂ１、Δｈｆｂ２およびΔｈｆｂ１Δｈｆｂ２菌株の酵素産生
菌株ＶＴＴ−Ｄ−９９７２４（Δｈｆｂ１）、ＶＴＴ−Ｄ−９９７２６（Δｈｆｂ２）、ＶＴＴ−Ｄ−９９７２５（Δｈｆｂ１Δｈｆｂ２）およびこれらの宿主菌株ＶＴＴ−Ｄ−７４０７５（ＱＭ９４１４）を、振盪フラスコ中において２８℃で３〜７日間、ペプトン２％および２％炭素源としてｉ）グルコース、ｉｉ）ソルビトールまたはｉｉｉ）ラクトースを補ったＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ最小培地（Ｐｅｎｔｔｉｌａ他、１９８７）５０ｍｌ中で培養した。出発ｐＨはｐＨ４．８であった。培養培地サンプルを３つの培養から採取した。分泌されたすべてのタンパク質を、Ｌｏｗｒｙ他、１９５１の方法によって分析した。エンドグルカナーゼおよびエンドキシラナーゼ活性を、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ、Ｆｌｕｋａ５４２９０）およびバーチキシラン（ＸＹＬ、Ｒｏｔｈ７５００）をそれぞれ基質として使用して、ＩＵＰＡＣ標準方法およびＢａｉｌｅｙ他（１９９２）に従って測定した。５μｌの培養濾過液を１％スキムミルクを含む１．５％寒天プレート（ｐＨ５）上に点在させ、サンプル中のプロテアーゼ活性によるかさのサイズを評価することによって、プロテアーゼ活性を半定量的に判定した。
【００８７】
活性測定から得た、分泌されたすべてのタンパク質当たりの酵素活性として計算した値を以下の表に示す。これらの数字によって、ｈｆｂ遺伝子の欠失による悪影響はなく、グリカナーゼおよびプロテアナーゼ（その発現が異なる調節機構の下にある２グループの酵素）の産生に良い影響を与える場合もあることが示される。培養末期の培養ブロスのｐＨ値によって、同じ培養培地上では菌株はすべてほぼ同じ成長段階にあることが示される。同じ培地上の異なる菌株間では、細胞マスの形態および量の明らかな違いは視覚的に見られなかった。
【００８８】
【表１】
0004685305.tif 000002
【００８９】
実施例４
グルコース上でのＴ．ｒｅｅｓｅｉＱＭ９４１４Δｈｆｂ１菌株の生育および形態
２つの独立した形質転換体に由来する菌株ＶＴＴ−Ｄ−９９７２４（Δｈｆｂ１）およびＶＴＴ−Ｄ−９９７２６（Δｈｆｂ１）、およびこれらの宿主菌株ＶＴＴ−Ｄ−７４０７５（ＱＭ９４１４）も、振盪フラスコ中において２８℃で５日間、ｐＨ６に緩衝し３％グルコースを補ったＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ最小培地（Ｐｅｎｔｔｉｌａ他、１９８７）２５０ｍｌ中で培養した。菌糸の乾燥重量を測定することによって、さらに異なる時点における培養培地のｐＨ値から定性的に菌株の生育を調べた。
【００９０】
ｈｆｂ１遺伝子の欠失の結果、菌糸の乾燥重量（図１０）およびｐＨ（図１１）から見ることができるように、グルコース上で生育するためのＴ．ｒｅｅｓｅｉの能力が振盪液体培養において阻害された。グルコース培養中の菌糸の出現を光顕微鏡を用いて監視して、欠失菌株の形態を研究した。おそらく、細胞壁中にＨＦＢＩタンパク質が欠けているために、Δｈｆｂ１菌糸は対照の菌糸よりも薄く見え、菌株は培養中に大きなペレットも形成した。しかしながら、培養中に、欠失菌株ＶＴＴ−Ｄ−９９７２３がバイオマス産生の点で宿主菌株に達するということに注目すべきである。
【００９１】
実施例５
振盪フラスコ中のラクトース上でのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  Ｒｕｔ−Ｃ３０  Δｈｆｂ２菌株の培養
菌株ＶＴＴ−Ｄ−９９６７６（Δｈｆｂ２）およびその宿主菌株ＶＴＴ−Ｄ−８６２７１（Ｒｕｔ−Ｃ３０）を、振盪フラスコ中において２８℃で３日間、ｐＨ６に緩衝し０．２％ペプトンおよび２％ラクトース（ラクトース供給による）を補ったＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ最小培地（Ｐｅｎｔｔｉｌａ他、１９８７）２５０ｍｌ中で培養した。生育およびタンパク質産生の分析のために、２および３日目にフラスコからサンプルを採取した。菌糸の乾燥重量を測定することによって定量的に、さらに培養培地のｐＨ値から定性的に成長を分析した。図１２に見られるように、これらの測定に基づいて形質転換体と宿主菌株の間で成長の違いは検出されなかった。さらに、形質転換菌株の形態は宿主菌株のそれと同様であった。
【００９２】
それぞれＩＵＰＡＣ標準方法およびＴｉｌｂｅｕｒｇｈ他（１９８８）に従って測定した、分泌されたエンドグルカナーゼ（ＨＥＣ）およびセルバイオヒドロラーゼ（ＭＵＬ）の産生レベルを以下の表に示す。これらの結果によって、対照菌株からのｈｆｂ２遺伝子の欠失は酵素生成に対して悪影響を及ぼさないことが明らかに示される。
【００９３】
【表２】
0004685305.tif 000003
【００９４】
実施例６
発酵槽中のラクトース上でのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  Ｒｕｔ−Ｃ３０  Δｈｆｂ２菌株の培養
ある種の菌株について（ただしすべてではない）、最新のセルロース産生培地は、炭素源および酵素誘導物質としてラクトースをベースとすることができる。対照の菌株Ｒｕｔ−Ｃ３０はラクトース上で効率的にセルラーゼを産生するが、一方、菌株ＱＭ９４１４は産生しない。
【００９５】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  Ｒｕｔ−Ｃ３０およびそのΔｈｆｂ２形質転換体ＶＴＴ−Ｄ−９９６７６（Ｄ−６７６）を、１５リットルの実験用発酵槽中のラクトースをベースとする培地上で培養した。この培地はラクトース（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ、ｐｒｏｄｕｃｔ３３４１１）４０ｇ／ｌ、ペプトン（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ、０１１８−１７）４．０ｇ／ｌ、酵母菌抽出液（Ｄｉｆｃｏ、０１２７−１７）１．０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４４．０ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４２．８ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ０．６ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ０．８ｇ／ｌ（別々に滅菌した）および微量の溶液（Ｍａｎｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｗｅｂｅｒ  １９６９）２．０ｍｌ／ｌを含んでいた。インシトゥーで滅菌する前には（１２３℃／２０分）、消泡剤は加えなかった。培養条件は温度２９℃、撹拌６００ｒｐｍ、通気１０ｌｍｉｎ−１、ｐＨ４．０〜５．０であった。
【００９６】
これらの培養中の完全に可溶性である培地上では、バイオマスの乾燥重量の分析およびラクトースの消費によって、生育を監視することが可能であった。２つの培養における成長パラメーターの比較を図８ＡおよびＢに示す。この結果によって、対照菌株からのｈｆｂ２遺伝子の欠失は生育に対して影響を及ぼさないことが明らかに示された。いずれの菌株についても、気泡形成は培地上では大きな問題ではなかった。菌株Ｒｕｔ−Ｃ３０については消泡剤の消費は１０ｍｌ／１５リットルであり、一方、菌株Ｄ−６７６の培養中、消泡剤は消費されなかった。
【００９７】
この培養の対において、Δｈｆｂ２菌株によるセルラーゼ生成は、対照菌株Ｒｕｔ−Ｃ３０よりも幾分少なかった（以下の表）。しかしながら、ラクトースをベースとする培地上でのセルラーゼ産生に関する経験によって、それぞれの産生菌株について別々に方法条件の最適化を行わなければならないことが示されている。適切な菌株特異的ｐＨおよび／または温度の調整によって、ラクトース分子のグルコースおよびガラクトースへの開裂による初期の異化生成物抑制の影響を避けなければならない。
【００９８】
表：１５リットルの実験用発酵槽中のラクトース培地上でのＴ．ｒｅｅｓｅｉ  Ｒｕｔ  Ｃ３０およびそのΔｈｆｂ２形質転換体ＶＴＴ−Ｄ−９９６７６の培養における可溶性タンパク質、セルラーゼ（ＨＥＣ、ＦＰＵ、ＩＵＰＡＣ標準方法）の産生、および消泡剤（Ｓｔｒｕｋｔｏｌ  Ｊ６３３）の全体的な消費。
【表３】
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【００９９】
実施例７
発酵槽中のセルロース上でのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  Ｒｕｔ−Ｃ３０  Δｈｆｂ２菌株の培養
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  Ｒｕｔ−Ｃ３０およびそのΔｈｆｂ２形質転換体ＶＴＴ−Ｄ−９９６７６（Ｄ−６７６）を、１５リットルの実験用発酵槽中のセルローススペントグレイン培地上で培養した。この培地はＳｏｌｋａ  ｆｏｌｃセルロース４０ｇ／ｌ、蒸留粕２０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４５ｇ／ｌ、および（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ／ｌを含んでいた。消泡剤（Ｓｔｒｕｋｔｏｌ  Ｊ６３３、Ｓｃｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ｓｅｉｌａｃｈｅｒ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）５ｍｌという標準的な用量を培地に加えて、インシトゥー滅菌（１２３℃／２０分）中の気泡形成を防止した。培養条件は温度２９℃、撹拌６００ｒｐｍ、通気１０ｌｍｉｎ−１、ｐＨ４．０〜５．０であった。
【０１００】
固体をベースとする培地上でバイオマス産生に関する成長または基質の消費を測定することはできなかったが、セルラーゼ（ＨＥＣ；ＥＰＵ）および可溶性タンパク質（Ｌｏｗｒｙ他、１９５１）の産生曲線は、対照および形質転換菌株による産生と非常に似通った速度およびレベルを示した（図９ＡおよびＢ）。ブロスのｐＨの曲線も、発育相の順序の表示として図中に示されている：遅滞相および初期発育中の不定的または増大的な傾向、主発育相中のｐＨの低下、および最終的に二次的な代謝／飢餓中の増大傾向。培養中に測定したセルラーゼおよびキシラーゼ活性の産生レベルを下の表に示す。これらの結果によって、対照菌株からのｈｆｂ２遺伝子の欠失は酵素生成に対して負の影響を及ぼさないことが明らかに示される。この比較において使用した酵素基質すべての不均質な性質のために、分析結果の典型的な変動は、ＨＥＣおよびＸＹＬについては±１０％、ＦＰＵについては少なくとも１５〜２０％の範囲である。
【０１０１】
表：１５リットルの実験用発酵槽中のセルローススペントグレイン培地上でのＴ．ｒｅｅｓｅｉ  Ｒｕｔ  Ｃ３０およびそのΔｈｆｂ２形質転換体ＶＴＴ−Ｄ−９９６７６の培養における可溶性タンパク質、セルラーゼ（ＨＥＣ、ＦＰＵ、ＩＵＰＡＣ標準方法）およびキシラーゼ（ＸＹＬ、Ｂａｉｌｅｙ他、１９９２）の産生、および消泡剤（Ｓｔｒｕｋｔｏｌ  Ｊ６３３）の全体的な消費。
【表４】
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【０１０２】
２つの培養間の主な際だった違いは消泡剤の消費にあった。菌株Ｒｕｔ  Ｃ３０での対照培養ではＳｔｒｕｋｔｏｌの消費は５０ｍｌ／１５リットルであったが、一方、菌株Ｄ−６７６の場合はわずか６．０ｍｌが消費された。後者の培養ではわずか１度だけ（実験のまさに終期に）気泡形成されたことが明らかである。おそらくこの気泡形成は酵素タンパク質の培地への分泌の結果であり、ＨＦＢＩＩの存在または不存在とは明らかに無関係であった。消泡剤の必要量のほぼ１０倍の違いは、産業規模のダウンストリームプロセシング（膜濾過および可能なクロマトグラフィ精製による酵素濃縮）に関して重大な影響を与えるはずである。
【０１０３】
実施例８
発酵槽中のグルコース上でのΔｈｆｂ１Δｈｆｂ２  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ＱＭ９４１４菌株の培養
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ菌株ＱＭ９４１４（ＶＴＴ−Ｄ−７４０７５）およびそのΔｈｆｂ１Δｈｆｂ２形質転換体ＶＴＴ−Ｄ−９９７２５を、１５リットルの実験用発酵槽中のグルコースをベースとする培地上で培養した。この培地はグルコース４０ｇ／ｌ、ペプトン（Ｄｉｆｃｏ、ＵＳＡ、０１１８−１７）４．０ｇ／ｌ、酵母菌抽出液（Ｄｉｆｃｏ、０１２７−１７）１．０ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４４．０ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４２．８ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ０．６ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ０．８ｇ／ｌ（別々に滅菌した）および微量の溶液（Ｍａｎｄｅｌｓ  ａｎｄ  Ｗｅｂｅｒ  １９６９）２．０ｍｌ  ｌ−１を含んでいた。インシトゥー滅菌する前には（１２３℃／２０分）、培地に消泡剤を加えなかった。培養条件は温度２９℃、撹拌６００ｒｐｍ、通気１０ｌｍｉｎ−１、ｐＨ４．０〜５．０であった。形態、バイオマスの乾燥重量、ｐＨ、酸素および消泡剤の消費および細胞外タンパク質の産生（Ｌｏｗｒｙ他、１９５１）およびプロテアーゼ活性を、Ａｚｕｒｉｎｅカゼイン加水分解に基づく方法（Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ  ＡＫ  ｋｉｔ  Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を使用して培養中に分析した。
【０１０４】
バイオマス産生および基質消費に基づく生育は、対照および形質転換菌株の生育と非常に似通っていることを示した（図１３ＡおよびＢ）。菌株間で形態の顕著な違いは検出されなかった。全可溶性タンパク質の産生、およびプロテアーゼ活性のレベルをより具体的な分泌型性の一例として以下の表に示す。２つの菌株間の主な違いは、全分泌タンパク質の生成であった。非改質型菌株ＱＭ９４１４に関する培養において、０．０６２ｇ／ｌのタンパク質が測定され、一方、改質型菌株ＶＴＴ−Ｄ−９９７２５は０．３９０ｇ／ｌの可溶性タンパク質を産生した。したがって、タンパク質およびプロテアーゼの量によって測定されるバイオマス当たりのタンパク質の産生は大幅に増大した。
【０１０５】
表：、１５リットルの実験用発酵槽中のグルコース培地上でのＴ．ｒｅｅｓｅｉ  ＱＭ９４１４およびそのΔｈｆｂ１Δｈｆｂ２形質転換体ＶＴＴ−Ｄ−９９７２５の培養の終期におけるバイオマス、可溶性タンパク質およびプロテアーゼの生成
【表５】
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【０１０６】
実施例９
ＡＴＰＳ中の融合タンパク質の分配を改善するための、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ  Δｈｆｂ２菌株におけるＥＧＩｃｏｒｅ−ＨＦＢＩ融合タンパク質の産生
ＥＧＩｃｏｒｅ−ＨＦＢＩ融合タンパク質の構築のために、Ｓｅｒ−２３からストップコドンまでのｈｆｂ１コード領域を、以下のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。５’プライマーはＡＣＴ  ＡＣＡ  ＣＧＧ  ＡＧＧ  ＡＧＣ  ＴＣＧ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＴＣＧ  ＡＧＣ  ＡＧＣ  ＣＣＧ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＡＣＧ  ＣＡＧ  ＡＧＣ  ＡＡＣ  ＧＧＣ  ＡＡＣ  ＧＧＣ（配列番号３）であり、３’プライマーはＴＣＧ  ＴＡＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＡＧＣ  ＡＣＣ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＧＧＴ（配列番号４）である。５’プライマー中の太字の配列はＥＧＩ中のアミノ酸４１０〜４２５をコードしており、下線を引いたＧＡＧＣＴＣはＳａｃＩ部位である。２６０ｂｐのＰＣＲ断片をアガロースゲルから精製し、ｐＰＣＲＩＩ  Ｔ／Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結させ、その結果ｐＭＱ１１１が生じた。
【０１０７】
次のステップでは、ｃｂｈ１プロモーターおよびターミネーター配列の調節下で、ＥＧＩｃｏｒｅ−ＨＦＢＩ融合タンパク質を産生するためにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ発現ベクターを構築した。構築体のバックボーンとして使用した発現ベクターはｐＰＬＥ３であり（Ｎａｋａｒｉ他（１９９４）ＷＯ９４／０４６７３）、これはｐＵＣ１８のバックボーンを含み、ＥｃｏＲＩ部位に挿入されたｃｂｈ１プロモーターを保持している。ｃｂｈ１プロモーターは完全長ｅｇｌ１  ｃＤＮＡをコードしている配列、およびｃｂｈ１転写ターミネーターに動作可能に結合している。ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩを用いてプラスミドｐＭＱ１１１を消化し、ｈｆｂ１配列を含む２６０ｂｐの断片を、ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化したｐＰＬＥ３に連結させた。その結果生じたプラスミドｐＭＱ１１３（図５）はＥＧＩｃｏｒｅのコード配列を保持しており、これはｃｂｈ１プロモーターおよびターミネーター配列の調節下で、それ自体のリンカー領域を介してＨＦＢＩに結合している。
【０１０８】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ菌株ＱＭ９４１４  Δｈｆｂ２（ＶＴＴ−Ｄ−９９７２６）を、１０μｇのプラスミドｐＭＱ１１３、およびアセタミダーゼをコードするためのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのａｍｄＳ遺伝子（Ｈｙｎｅｓ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：１４３０−１４３９；Ｔｉｌｂｕｒｎ他、Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：２０５−２２１）を含む３μｇの選択プラスミドｐＴＯＣ２０２を使用して、本質的にＰｅｎｔｔｉｌａ他のＧｅｎｅ（１９８７）６１：１５５−１６４に記載されるように形質転換させた。
【０１０９】
得られたＡｍｄ＋形質転換体を、アセタミドを含むプレート上に２度線条接種した（Ｐｅｎｔｔｉｌａ他、Ｇｅｎｅ（１９８７）６１：１５５−１６４）。その後Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）上で生育した形質転換体から、胞子懸濁液を作成した。振とうフラスコからのＥＧＩおよびＨＦＢＩ特異抗体を用いたスロットブロッティングまたはウエスタン分析、またはＳｏｌｋａ  ｆｌｏｃセルロースおよび／またはスペントグレインおよび／または乳清の混合物を補った最小培地において行ったミクロタイタープレート培養によって、ＥＧＩｃｏｒｅ−ＨＦＢＩ融合タンパク質の産生を試験した。融合タンパク質を産生するクローンの胞子懸濁液を精製して、選択プレート（アセタミドを含む）上で単一胞子培養体にした。最良の産生菌を決定するために、前記したように精製したクローンから、融合タンパク質の産生を再び分析する。
【０１１０】
ポリオキシエチレン洗浄剤Ｃ１２−１８ＥＯ５（Ａｇｒｉｍｕｌ  ＮＲＥ１２０５、Ｈｅｎｋｅｌ）を使用する、ＡＴＰＳ中のＥＧＩｃｏｒｅ−ＨＦＢＩ融合タンパク質の分配実験用に、この実験で得られる最良の産生菌株およびコントロール菌株としての菌株ＶＴＴ−Ｄ−９８６９１（ＥＧＩｃｏｒｅ−ＨＦＢＩを産生するＱＭ９４１４菌株）、ＶＴＴ−Ｄ−７４０７５（ＱＭ９４１４）およびＶＴＴ−Ｄ−９９７２６（ＱＭ９４１４  Δｈｆｂ２）を、振とうフラスコ中において２８℃で５〜６日間、３％Ｓｏｌｋａ  ｆｌｏｃセルロースおよび１％スペントグレインを補ったＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ最小培地（Ｐｅｎｔｔｉｌａ他、１９８７）５０〜２５０ｍｌ容量中で培養した。
【０１１１】
１０ｍｌの目盛りつきチューブ中で、上澄み（遠心分離または濾過によって分離したバイオマス）についての分配実験を行った。最初に洗浄剤をチューブに加え、次いでチューブを培養上澄みで１０ｍｌに充填した。チューブ中の洗浄剤の量は、洗浄剤の重量％で計算する。オーバーヘッド振とう器中で完全に混合させた後、一定温度の水浴中での重力による沈殿、または一定温度での遠心分離によって分離を起こさせる。通常この分離は３０℃で行い、使用する洗浄剤の標準的な量は２〜５％（ｗ／ｖ）である。分離した後、軽相と重相の容量比を記録し、融合タンパク質の濃縮因子をそこから計算する。軽相および重相からも、分析用のサンプルを採取する。
【０１１２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用し、次にＣｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０（Ｓｉｇｍａ）を用いる融合タンパク質の可視化またはウエスタンブロッティングによって、２層分離を定性的に分析する。ＥＧＩｃｏｒｅ−ＨＦＢＩ融合タンパク質および抗ウサギＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に接合したアルカリホスファターゼを検出するために、ウエスタン分析においてポリクローナル抗ＨＦＢＩ抗体を使用する。ＮＢＴ（ニトロブルーテトラゾリウム）（Ｐｒｏｍｅｇａ）との接合で使用したＢＣＩＰ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート）を使用して、アルカリホスファターゼ活性を比色定量的に検出する。
【０１１３】
基質として４−メチルウムベリフェリル−β−Ｄ−セロビオサイド（ＭＵＣ）（Ｓｉｇｍａ  Ｍ６０１８）を使用して、ＥＧＩ活性を検出する（Ｖａｎ  Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ  Ｈ．ａｎｄ  Ｃａｅｙｓｓｅｎｓ  Ｍ．、１９８５；Ｖａｎ  Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ他、１９８２）。ＥＧＩはβ−グリコシド結合を加水分解し、蛍光性４−メチルウムベリフェロンを遊離し、３６０励起フィルタおよび４５５ｎｍ放出フィルタを備えたフルオロメーターを使用して、これらを測定することができる。ＣＢＨＩも基質を加水分解し、それはセロビオースの添加によって阻害される（Ｃ−７２５２、Ｓｉｇｍａ）。ＥＧＩを含む液体を適当な希釈液に加えて、酢酸ナトリウム緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ５）、ＭＵＣ  ０．６ｍＭおよびセロビオース４．６ｍＭを含む緩衝液とする。この混合物を５０℃に加熱する。２％Ｎａ２ＣＯ３、ｐＨ１０を使用して、１０分後に反応を停止させる。阻害剤セロビオースを添加せずにＥＧＩと同じアッセイを使用して、精製されたＣＢＨＩを検出する。
【０１１４】
それぞれ上部および底部相において測定した濃度または活性の比として、分配係数Ｋを定義する。
収率Ｙは以下のように定義する。
【数１】
0004685305.tif 000007
【０１１５】
上式でＹＴは上部相の収率であり、ＶＢおよびＶＴはそれぞれ上部および底部相の容量である。これに従って底部相の収率を求めることができる。
【０１１６】
質量の収支、たとえば加えたタンパク質すべての回収を、完全性について常にチェックして、人為的に収率が高いわけではないことを確認する（たとえば底部相におけるタンパク質の可能な不活性化）。通常この値は全体の酵素活性（ＥＧＩ重量＋ＥＧＩ融合）に基づいて計算されるので、融合体の分離については値が低めに評価される。
【０１１７】
実施例１０
ＡＴＰＳ中の精製用のＴ．ｒｅｅｓｅｉ  Δｈｆｂ２菌株中のＨＦＢＩ単鎖抗体融合タンパク質の産生
Ｎ末端がＴ．ｒｅｅｓｅｉ  ＨＦＢＩタンパク質、Ｃ末端が分子量小さなジアリールアルキルトリアゾールの誘導体を認識する単鎖抗体（ＥＮＡ５ＳＣＦＶ）からなる融合タンパク質を産生する、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ菌株を構築する。水性２相システムを使用して、融合体を精製する。
【０１１８】
ジアリールアルキルトリアゾール抗原に対して立体異性特異的なＦａｂフラグメントのクローニング用に、Ｐｒｏｍｅｇａの抽出プロトコルを使用して、抗原によって免疫性を与えたマウスの脾臓細胞から得たハイブリドーマセルラインから全ＲＮＡを単離した。ＱｉａｇｅｎのＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ  ｐｏｌｙＡ＋精製キットを使用してｍＲＮＡ断片を精製し、ＰｒｏｍｅｇａのＡＭＶ逆転写酵素システムによってｃＤＮＡ合成を行った。次いでそれぞれの抗体グループ、９つの重鎖および４つの軽鎖に特異的なプライマー混合物を使用して、ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅にかけた（Ｋａｂａｔ他、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２に従って）。製造者の指示に従ってＤｙｎａｚｙｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）および標準条件を使用して重合を行った。増幅の後、発現ベクターｐＴＩ８（Ｔａｋｋｉｎｅｎ他、１９９１）中に存在するｌａｃＩｑリプレッサーによって調節されるｔａｃプロモーターの下で、ディシストロニックオペロンとして重鎖および軽鎖をクローン化した。分泌用に、Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａのペクテートリアーゼのＰｅｌＢシグナル配列（Ｔａｋｋｉｎｅｎ他、１９９１）を重鎖および軽鎖の両方に連結させた。６個のヒスチジンタグを軽鎖のＣ末端に加えた。その結果生じたプラスミドはｐＥＮＡ５−Ｈｉｓである。
【０１１９】
ＥＮＡ５ＳＣＦＶ単鎖抗体の構築のために、鋳型としてｐＥＮＡ５−Ｈｉｓを使用して、重鎖および軽鎖のさまざまなドメインをＰＣＲによって増幅させた。増幅したフラグメントをｐＫＫｔａｃベクター（Ｔａｋｋｉｎｅｎ他、１９９１）にクローン化し、その結果ｐＥＮＡ５ＳＣＦＶが生じた。ｐＥＮＡ５ＳＣＦＶベクターは、重鎖および軽鎖のさまざまなドメインからなるＥＮＡ５ＳＣＦＶ単鎖抗体についてのコード領域を保持しており、これらはグリシンセリンリンカー（Ｈｕｓｔｏｎ他１９８８および１９９１）およびＣ末端の６個のヒスチジンタグを介して連結されている。単鎖抗体の転写および分泌は、それぞれｔａｃプロモーターおよびｐｅｌＢシグナル配列（Ｔａｋｋｉｎｅｎ他、１９９１）の調節下にある。
【０１２０】
ＨＦＢＩ−ＥＮＡ５ＳＣＦＶ融合タンパク質の構築のために、ＮｃｏＩおよびＸｂａＩを用いてｐＥＮＡ５ＳＣＦＶを消化した。ｅｎａ５ｓｃｆｖ遺伝子およびヒスチジンテール（６個のヒスチジン）を含むフラグメントをｐＴＮＳ２９に平滑末端クローン化し、その結果ｐＴＨ１が生じた（図６）。ｃｂｈ１プロモーターおよびターミネーター配列の調節下において、ｐＴＮＳ２９ベクターは、リンカー配列（ＰｒｏＧｌｙＡｌａＳｅｒＴｈｒＳｅｒＴｈｒＧｌｙＭｅｔＧｌｙＰｒｏＧｌｙＧｌｙ）（配列番号５）に従う、Ｔ．ｒｅｅｓｅｉのｈｆｂ１コード領域を保持している。
【０１２１】
リンカーペプチド中にトロンビン開裂部位を有するＨＦＢＩ−ＥＮＡ５ＳＣＦＶ融合タンパク質の構築のために、前述のｅｎａ５ｓｃｆｖコード領域（Ａｌａ−２３からストップコドンまで）およびトロンビン開裂部位（ＧｌｙＴｈｒＬｅｕＶａｌＰｒｏＡｒｇＧｌｙＰｒｏＡｌａＧｌｕＶａｌＡｓｎＬｅｕＶａｌ）（配列番号６）を含むペプチドリンカーを、鋳型としてｐＥＮＡ５ＳＣＦＶおよび５’プライマーとしてＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＣＴＣ  ＧＴＣ  ＣＣＴ  ＣＧＣ  ＧＧＴ  ＣＣＣ  ＧＣＣ  ＧＡＡ  ＧＴＧ  ＡＡＣ  ＣＴＧ  ＧＴＧ（配列番号７）、３’プライマーとしてＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＣＡ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＡＡＣ  ＣＣＣ  ＧＴＴ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  Ｇ（配列番号８）を使用して、ＰＣＲによって増幅させた。５’プライマー中の太字の配列は、ＥＮＡ５ＳＣＦＶの第１の６個のＮ末端残基をコードしている。イタリックの配列はトロンビン開裂部位であり、下線を引いたＧＧＴおよびＡＣＣはＡｓｐ７１８部位である。３’プライマー中の太字の配列は、ＥＮＡ５ＳＣＦＶの６個のＣ末端残基をコードしており、下線を引いたＣＡＴＡＴＧはＮｄｅＩ部位である。７９０ｂｐのＰＣＲ断片をアガロースゲルから精製し、ｐＴＮＳ２９に連結させ、その結果ｐＴＨ２が生じた（図７）。
【０１２２】
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ菌株ＶＴＴ−Ｄ−９９７２６（ＱＭ９４１４  Δｈｆｂ２）を、１０μｇのプラスミドｐＴＨ１およびｐＴＨ２および選択プラスミドとして２μｇのｐＴＯＣ２０２を使用して、本質的にＰｅｎｔｔｉｌａ他のＧｅｎｅ（１９８７）６１：１５５−１６４に記載されるように共形質転換させた。得られたＡｍｄ＋形質転換体を、アセタミドを含むプレート上に２度線条接種した。その後Ｐｏｔａｔｏ  Ｄｅｘｔｒｏｓｅ  ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）上で生育した形質転換体から、胞子懸濁液を作成した。
【０１２３】
３％ラクトースまたはＳｏｌｋａ  ｆｌｏｃｋセルロースおよびスペントグレインを補った最小培地において行った、振とうフラスコ培養からＨＦＢＩ特異抗体およびヒス−テールに対する抗体を用いたウエスタン分析によって、２つのＨＦＢＩ−ＥＮＡ５ＳＣＦＶ融合タンパク質の産生を試験した。
【０１２４】
ポリオキシエチレン洗浄剤Ｃ１２〜１８ＥＯ５（Ａｇｒｉｍｕｌ  ＮＲＥ１２０５、Ｈｅｎｋｅｌ）を使用する、ＡＴＰＳ中のＨＦＢＩ−ＥＮＡ５融合タンパク質の分配実験を、この実験において得られる最良の産生菌株およびコントロール菌株ＶＴＴ−Ｄ−９９７２６（ＱＭ９４１４  Δｈｆｂ２）の上澄みについて、実施例９に記載したのと同様に実施し分析した。
【０１２５】
【外１】
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【外２】
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【外３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  （イントロンも）エンコードするタンパク質および隣接配列（サブクローン化したフランキング配列すべてを配列決定したわけではない）を含む、２８６８ｂｐのｈｆｂ１のゲノム配列（配列番号１）を示す図である。ｈｆｂ１の遺伝子配列には下線を引いた。マーカー遺伝子のクローニング用に使用するＭｕｎＩ制限部位は、目立たせ下線を引いた。
【図２Ａ】  （イントロンも）エンコードするタンパク質および隣接配列を含む、３５８５ｂｐのｈｆｂ２のゲノム配列（配列番号２）を示す図である。ｈｆｂ２の遺伝子配列には下線を引いた。マーカー遺伝子のクローニング用に使用するＢｇｌＩおよびＥｃｏＲＶ制限部位は、目立たせ下線を引いた。クローニングベクターのポリリンカー配列はイタリックで示し、クローニング目的で使用するポリリンカー内の制限部位には下線を引いた。
【図２Ｂ】  図２Ａに続いてゲノム配列（配列番号２）を示す図である。
【図３】  プラスミドｐＴＮＳ２４を示す図である。
【図４】  プラスミドｐＴＮＳ２７を示す図である。
【図５】  プラスミドｐＭＱ１１３を示す図である。
【図６】  プラスミドｐＴＨ１を示す図である。
【図７】  プラスミドｐＴＨ２を示す図である。
【図８Ａ】  発酵槽中でのラクトース上での培養におけるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株の生育パラメータを示す図である（ＤＯ＝溶存酸素）。
【図８Ｂ】  発酵槽中でのラクトース上での培養におけるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株の生育パラメータを示す図である（ＤＯ＝溶存酸素）。
【図９Ａ】  発酵槽中でのセルロース培地上での培養における可溶性タンパク質の産生を示す図である。
【図９Ｂ】  発酵槽中でのセルロース培地上での培養における可溶性タンパク質の産生を示す図である。
【図１０】  撹拌フラスコ培養中のグルコース培地上での菌株ＶＴＴ−Ｄ−７４０７５、ＶＴＴ−Ｄ−９９７２４およびＶＴＴ−Ｄ−９９７２３のバイオマス産生を示す図である。
【図１１】  撹拌フラスコ培養中のグルコース培地上での菌株ＶＴＴ−Ｄ−７４０７５、ＶＴＴ−Ｄ−９９７２４およびＶＴＴ−Ｄ−９９７２３の生育を、培養中のｐＨの変化として表したことを示す図である。
【図１２】  撹拌フラスコ培養中のラクトース培地上での菌株ＶＴＴ−Ｄ−８６２７１およびＶＴＴ−Ｄ−９９６７６の生育を、バイオマス産生およびｐＨによって表したことを示す図である。
【図１３Ａ】    発酵槽中でのグルコース上での培養におけるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株の生育パラメータを示す図である。
【図１３Ｂ】    発酵槽中でのグルコース上での培養におけるＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ菌株の生育パラメータを示す図である。
【配列表】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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