(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト由来造血前駆細胞又は成熟造血細胞が移植された新生児NOD/SCID/IL2rg-nullマウスであって、当該ヒト由来の免疫担当細胞及び当該免疫担当細胞由来の生理活性物質を産生することができ、かつ、抗原刺激により該抗原に特異的なヒト由来IgGを産生することができる、前記マウス。
【請求項２】
請求項１記載のマウスを飼育してなるマウス。
【請求項３】
造血前駆細胞が骨髄由来、臍帯血由来又は末梢血由来の細胞である請求項１又は２記載のマウス。
【請求項４】
免疫担当細胞が、B細胞、T細胞、樹状細胞、NK細胞及びNKT細胞からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１又は２記載のマウス。
【請求項５】
生理活性物質がサイトカイン及び/又は免疫グロブリンである請求項１又は２記載のマウス。
【請求項６】
免疫グロブリンが、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgEからなる群から選択されるいずれかのものである請求項５記載のマウス。
【請求項７】
免疫グロブリンが、IgG、IgM、IgA及びIgDを含むものである請求項５記載のマウス。
【請求項８】
ヒト由来造血前駆細胞又は成熟造血細胞を新生児NOD/SCID/IL2rg-nullマウスに移植することを特徴とする、当該ヒト由来の免疫担当細胞及び当該免疫担当細胞由来の生理活性物質を産生することができ、かつ、抗原刺激により該抗原に特異的なヒト由来IgGを産生することができるマウスの作製方法。
【請求項９】
造血前駆細胞が骨髄由来、臍帯血由来又は末梢血由来の細胞である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
免疫担当細胞が、B細胞、T細胞、樹状細胞、NK細胞及びNKT細胞からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項８記載の方法。
【請求項１１】
生理活性物質がサイトカイン及び/又は免疫グロブリンである請求項８記載の方法。
【請求項１２】
免疫グロブリンが、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgEからなる群から選択されるいずれかのものである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
免疫グロブリンが、IgG、IgM、IgA及びIgDを含むものである請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか1項に記載のマウスから免疫担当細胞を回収し、当該免疫担当細胞を抗原又は刺激物質の存在下で培養し、得られる培養物からヒト由来抗体を採取することを特徴とする前記抗体の製造方法。
【請求項１５】
免疫担当細胞が、B細胞、T細胞、樹状細胞、NK細胞及びNKT細胞からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜７のいずれか1項に記載のマウスを抗原又は刺激物質で免疫し、得られるマウスから当該ヒト由来抗体を採取することを特徴とする前記抗体の製造方法。
【請求項１７】
抗体の採取源が血漿又は血清である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか1項に記載のマウスに、細菌、ウイルス、腫瘍細胞及び腫瘍抗原ペプチドからなる群から選択されるいずれかのものが投与された疾患モデルマウス。
【請求項１９】
疾患が感染症である請求項１８記載のマウス。
【請求項２０】
被験物質を、請求項１〜７、１８及び１９のいずれか1項に記載のマウスに投与して、被験物質の有効性を評価することを特徴とする、免疫関連医薬のスクリーニング方法。
【請求項２１】
免疫関連医薬がワクチンである請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜７のいずれか1項に記載のマウスから免疫担当細胞を回収することを特徴とする前記免疫担当細胞の製造方法。
【請求項２３】
請求項１８記載のマウスから免疫担当細胞を回収することを特徴とする前記免疫担当細胞の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ヒトリンパ系細胞と抗原提示細胞など免疫応答に必須なる種々の細胞の生体内増殖、及びヒト免疫系の再構築の技術に関する。
【背景技術】  ヒト幹細胞に関する研究は、生体内で測定することが重要であることから、免疫不全げっ歯類、又はヒツジ胎仔（Ｆｌａｋｅ，Ａ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，１９８６．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：７７６−７７８．）を用いた異種動物間移植に基づいて行われている。Ｓｃｉｄ−ｈｕアッセイは、ＭｃＣｕｎｅらにより１９８８年に報告されており（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１６３２−１６３９（１９８８））、このアッセイはヒト細胞をＣＢ１７／ＳＣＩＤマウスで検出した最初の例である。その後、ヒト造血細胞を移植するためのレシピエントとして、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（Ｐｆｌｕｍｉｏ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，１９９６．Ｂｌｏｏｄ  ８８：３７３１−３７４０．）、ＮＯＤ／ＲＡＧ−１ｎｕｌｌ（Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２０００．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６４：２４９６−２５０７．）、ｂｅｉｇｅ／ｎｕｄｅ／ｓｃｉｄ（Ｄａｏ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ｎｏｌｔａ．１９９８．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １：２５７−２６４．）又はＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２Ｍｎｕｌｌ（Ｋｏｌｌｅｔ，Ｏ．ｅｔ．ａｌ．，２０００．Ｂｌｏｏｄ  ９５：３１０２−３１０５．）等の免疫不全マウスが多く用いられている。
しかしながら、異種動物間の幹細胞移植のレシピエントとして使用されるマウスは、８〜１２週齢の成体マウスであることがほとんどである。また、通常の成体ＳＣＩＤマウスを用いた場合において移植片を長期間維持させるには外来性サイトカインの投与が必要となり、Ｔ細胞を前駆細胞から分化させることが困難である（Ｉｔｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００２．Ｂｌｏｏｄ  １００：３１７５−３１８２．）。
【発明の開示】
本発明は、ヒト免疫系を異種動物宿主に構築させ、免疫反応を自然又は人為的に起こすことにより、必要とされるヒト免疫細胞、特に抗原特異的なＴ細胞、Ｂ細胞や、免疫グロブリン、サイトカイン等を産生させることを目的とする。
本発明者は上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、免疫不全動物に造血前駆細胞又は成熟造血細胞を移植することにより上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
（１）ヒト由来造血前駆細胞又は成熟造血細胞が移植された幼若な（胎児から新生児を経て生殖年令に達するまでを含む）免疫不全哺乳動物（ヒトを除く）であって、当該ヒト由来の免疫担当細胞、及び／又は当該免疫担当細胞由来の生理活性物質を産生することができる前記動物である。また、本発明は、上記幼若な免疫不全哺乳動物（ヒトを除く）を飼育してなる免疫不全哺乳動物又はその子孫である。
上記幼若な免疫不全哺乳動物としては、例えば新生児免疫不全哺乳動物又は胎児免疫不全哺乳動物が挙げられる。
また、上記造血前駆細胞としては、骨髄由来、臍帯血由来、動員（Ｇ−ＣＳＦ）末梢血、ＥＳ細胞由来中肺葉系細胞又は末梢血由来の細胞例示することができる。これらの細胞は、例えば、ＣＤ３４陽性のもの（例えばＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、ｃ−ｋｉｔ＋細胞あるいはＣＤ３−、ＣＤ４−、ＣＤ８−及びＣＤ３４＋細胞のもの）が挙げられる。また、免疫担当細胞としてはＢ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞からなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。これら免疫担当細胞は、末梢血からレシピエントを殺すことなく採取可能であり、より多数の細胞、又は前記免疫担当細胞由来の生理活性物質（例えば免疫グロブリン、サイトカイン等）を精製する場合に、骨髄、脾臓、胸腺、リンパ節などを細胞源として利用することが可能である。免疫不全哺乳動物は免疫不全マウスであることが好ましい。上記の免疫グロブリンは、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥなどの全てのアイソタイプが含まれる。
（２）さらに、本発明は、ヒト由来造血前駆細胞又は成熟造血細胞を幼若な免疫不全哺乳動物（ヒトを除く）に移植することを特徴とする、当該ヒト由来の免疫担当細胞、及び／又は当該免疫担当細胞由来の生理活性物質を産生することができる動物又はその子孫の作製方法である。幼若な免疫不全哺乳動物としては、例えば新生児免疫不全哺乳動物又は胎児免疫不全哺乳動物が挙げられる。また、造血前駆細胞としては、骨髄由来、臍帯血由来、動員（Ｇ−ＣＳＦ）末梢血、ＥＳ細胞由来中肺葉系細胞又は末梢血由来の細胞を例示することができる。これらの細胞は、例えば、ＣＤ３４陽性のもの（例えばＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、ｃ−ｋｉｔ＋細胞あるいはＣＤ３−、ＣＤ４−、ＣＤ８−及びＣＤ３４＋細胞のもの）が挙げられる。免疫担当細胞としては、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞からなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。また、生理活性物質としては、例えばサイトカイン及び／又は免疫グロブリンが挙げられる。上記の免疫グロブリンは、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥなどの全てのアイソタイプが含まれる。免疫不全哺乳動物は免疫不全マウスであることが好ましい。
（３）さらに、本発明は、前記免疫不全哺乳動物又はその子孫から免疫担当細胞を回収し、当該免疫担当細胞を抗原又は適切な刺激物質の存在下で培養し、得られる培養物からヒト由来抗体を採取することを特徴とする前記抗体の製造方法である。免疫担当細胞としては、Ｂ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞からなる群から選ばれる少なくとも１つが挙げられる。
（４）さらに、本発明は、前記免疫不全哺乳動物又はその子孫を抗原又は刺激物質で免疫し、得られる免疫動物から当該ヒト由来抗体を採取することを特徴とする前記抗体の製造方法である。抗体の採取源としては、例えば血漿又は血清が挙げられる。
（５）また、本発明は、前記免疫不全哺乳動物又はその子孫に、細菌、ウイルス、腫瘍細胞及び腫瘍抗原ペプチドからなる群から選択されるいずれかのものが投与された疾患モデル動物又はその子孫である。上記疾患には、感染症を挙げることができる。
（６）本発明は、被験物質を、前記免疫不全哺乳動物若しくはその子孫又は前記感染症動物若しくはその子孫に投与して、被験物質の有効性を評価することを特徴とする、免疫関連医薬のスクリーニング方法である。免疫関連医薬には、ワクチン、抗ウイルス薬や抗生剤も含まれる。また、前記方法は、本発明のヒト抗体に対する免疫応答及びアレルギーに対する安全性確認（特に前臨床試験段階）において有用である。
（７）本発明は、前記免疫不全哺乳動物又はその子孫から免疫担当細胞を回収することを特徴とする前記免疫担当細胞の製造方法である。
（８）本発明は、前記免疫不全哺乳動物又はその子孫から回収された免疫担当細胞である。
（９）本発明は（８）記載の免疫担当細胞を含むワクチンである。
（１０）本発明は、前記疾患モデル動物又はその子孫から免疫担当細胞を回収することを特徴とする前記免疫担当細胞の製造方法である。
（１１）本発明は、前記疾患モデル動物又はその子孫から回収された免疫担当細胞である。
（１２）本発明は（１１）記載の免疫担当細胞を含むワクチンである。
（１３）本発明は、前記疾患モデル動物又はその子孫から回収されたヒト由来抗体である。
（１４）本発明は、前記免疫担当細胞を抗原又は刺激物質の存在下で培養した培養物から採取されたヒト由来抗体である。
（１５）本発明は、疾患モデル動物又はその子孫から回収されたヒト由来抗体である。
（１６）本発明は、（１５）記載のヒト由来抗体を含むワクチンである。
【図面の簡単な説明】  図１Ａは、レシピエントマウスにおけるヒトＢ細胞系（ＣＤ１９＋細胞）の再構築を示す図である。
図１Ｂは、レシピエントマウスに各種ヒト免疫グロブリンの発現を示す図である。
図２は、ＯＶＡ特異的ＩｇＭのＥＬＩＳＡの結果を示す図である。
図３は、レシピエントマウスの骨髄、脾臓及び末梢血におけるヒトＴ細胞系の再構築を示す図である。
図４は、リンパ系組織のＦＩＳＨ解析及び免疫組織学的解析の結果を示す図である。
図５は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌマウスの骨髄（ＢＭ）におけるヒト赤血球構成物の同定を示す図である。
図６は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌマウスのＢＭ及び脾臓におけるヒトＢ細胞発生を示す図である。
図７は、ＣＤ１９＋Ｂ系細胞におけるヒト免疫グロブリンの発現を示す図である。
図８は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌマウスにおけるヒトＴ細胞の発生を示す図である。
図９は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌマウスの脾臓におけるヒト樹状細胞の存在を示す図である。
図１０は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌマウスの腸管における粘膜免疫の発生を示す図である。
図１１は、卵白アルブミンによる免疫に続くＩｇＧ＋細胞の誘導を示す図である。
図１２は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌマウスで産生したヒトＴ細胞によって介される同種異型標的細胞に対する細胞毒性を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
本発明はヒト造血系細胞を異種哺乳動物の生体内で分化、増殖させ、異種哺乳動物においてヒト免疫系を再構築させようとして完成されたものである。具体的には、ヒト由来の造血前駆細胞を宿主である幼若な免疫不全哺乳動物（例えばＳＣＩＤマウス）に移植し、当該宿主内でヒト由来細胞を分化及び増殖させることを特徴とするものである。すなわち、ヒト免疫系及び造血系を免疫不全動物の体内を利用して構築するシステムを利用して、ヒト抗体の産生及び腫瘍又はウイルス抗原特異的ワクチンの開発に応用することが可能である。
１．幼若な免疫不全哺乳動物
本発明において、ヒト由来の造血前駆細胞を移植するためのレシピエントとして使用される動物は、ヒトを除く免疫不全哺乳動物である。本発明において「幼若な」動物とは、胎児から新生児を経て生殖年令に達するまでを含み、好ましくは、胎児及び生後７日以内、より好ましくは生後２日以内の新生児である。幼若な免疫不全哺乳動物をレシピエントとして用いると、個体の成長に伴ってヒト免疫担当細胞も効率的に増殖するため、本発明では幼若な個体を用いることが好ましい。
哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、羊、ミニブタ、ブタ、サルなどが挙げられる。モデル動物が豊富であり、系統が確立されている点で免疫不全マウスであることが好ましい。免疫不全マウスとは、Ｔ細胞及びＢ細胞の生産能を欠く重症複合免疫不全マウス（ＳＣＩＤマウス）を意味し、特に、ＮＫ細胞の活性を持たないＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２ミクログロブリンノックアウトマウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２Ｍ）やＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ｃｏｍｍｏｎ  γ−ｃｈａｉｎノックアウトマウスが好ましい。このＳＣＩＤマウスの幼若な個体を使うと、マウス生体内にヒト由来免疫細胞及び造血細胞を高率に産生させることができる。上記ＳＣＩＤマウスは市販されており（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、当業者であれば容易に入手することが可能である。
２．細胞の調製及び移植
移植の対象となる造血前駆細胞は、例えば臍帯血、骨髄、末梢血、動員（Ｇ−ＣＳＦ）末梢血、ＥＳ細胞由来中肺葉系細胞から得ることができるが、臍帯血が好ましい。
臍帯血（ＣＢ）細胞は、臨床検体（例えば臨床検査等が済んで細胞数の問題や家族歴の問題から廃棄の対象となった検体）を日本赤十字センター臍帯血バンクから得ることが可能である。また、骨髄細胞は、骨髄バンクから得ることも、骨髄穿刺によって採取された細胞、又はそのうち廃棄の対象となる細胞から得ることもできる。末梢血は、一般的血液検査に使用するために採取した血液又はその廃棄対象血液を使用することができる。また、末梢血中の幹細胞集団をより効率良く取るには、Ｇ−ＣＳＦにより骨髄中の幹細胞を動員させたあとに採取することも可能である。
次に、単核細胞（ＭＮＣｓ）を密度勾配遠心により上記細胞から単離する。
本発明において移植に使用される細胞は、例えばＣＤ３４陽性（ＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、ｃ−ｋｉｔ＋細胞）を表す細胞、すなわち造血前駆細胞又は成熟造血細胞である。ＣＤ３４＋細胞は、試料を抗ヒトＣＤ３４ミクロビーズとともにインキュベートすることにより得ることができる。
上記造血前駆細胞源となる試料中には、造血前駆細胞のほかにＴ細胞に分化した細胞が含まれている。そこで、そのようなＴ細胞を除去するために、Ｔ細胞マーカーに対する抗体を反応させることもできる。例えば、ＭＮＣｓをマウス抗ヒトＣＤ３、ＣＤ４及び／又はＣＤ８抗体とともにインキュベートする。これを洗浄後、細胞をヒツジ抗マウス免疫磁気ビーズとともにインキュベートし、未結合の細胞を回収する。ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８はいずれもＴ細胞のマーカー（表面抗原）であるため、これらの抗原に対する抗体を用いて上記処理を行うことにより、Ｔ細胞が除去される。このようにして得られる前駆細胞の細胞表面抗原は、ＣＤ３陰性（ＣＤ３−）、ＣＤ４陰性（ＣＤ４−）、ＣＤ８陰性（ＣＤ８−）である。次に、Ｔ細胞を除去した試料を抗ヒトＣＤ３４ミクロビーズとともにインキュベートする。この操作により、ＣＤ３４＋を表す造血前駆細胞を得ることができる。そして、濃縮されたＣＤ３４＋細胞の純度が好ましくは９０％以上となるように、細胞を磁気カラムにかける。
成熟造血細胞は、造血幹細胞および造血前駆細胞などの増殖能力を利用して、特にサイトカインなどの助けを必要とすることなく得ることができる。ただし、Ｇ−ＣＳＦ、Ｓｔｅｅｌ  ｆａｃｔｏｒ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＥＰＯなどのサイトカインを投与することで、特定の分画を効率良く得ることも可能である。
本発明の動物は、レシピエント動物を予め放射線全身照射した後、所定の量に調製した造血前駆細胞又は成熟造血細胞をレシピエント動物（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２Ｍ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌマウス等）に移植することにより得ることができる。移植する細胞数は、動物の種類に応じて適宜定めることができる。例えば、ＳＣＩＤマウスをレシピエントとした場合において、造血細胞を移植するときは１匹あたり少なくとも１×１０３個であり、上限は特に限定されるものではない。好ましくは、１×１０３個〜１×１０７個の細胞を使用することができる。多数の細胞により、より高率なヒト細胞の分化が期待できる。
移植は、静脈経由が好ましいが、腹腔、心腔内、肝臓内移植であってもよい。静脈経由で移植する場合は、顔面静脈、尾静脈などから細胞を注入する。この場合、２６〜３０ゲージ（Ｇ）の注射針（例えば２９Ｇ）を用いればよい。例えば、Ｔ細胞が除去された１×１０５個のＣＢ細胞（ＣＤ３−ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ３４＋）を静脈注射により、予め１００ｃＧｙの全身照射を受けた幼若なＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２Ｍマウス、又はＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄマウスに移植するのが望ましい。
細胞の移植後、無菌管理を十分に行いながら飼育する。「無菌管理」とは、感染症などの病原微生物や抗原物質を含まないように管理することを意味し、いわゆるＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）レベルの無菌室での飼育、放射線照射した餌（又は低分子化した餌）を給餌すること、あるいは滅菌水を与えることをいう。マウスの場合は、２週〜１６週、好ましくは３〜４週の間、上記無菌管理下で飼育すれば、免疫細胞の回収又は免疫に用いることができる。本発明においては、このような飼育された動物も提供される。このような本発明の動物には、その子孫も含まれる。子孫は、無菌環境が維持される限り、通常の交配により得ることができる。
上記の通り得られた「ヒト型化動物」の体内はドナー（ヒト）由来の免疫系が確立されており、ヒト由来の免疫担当細胞などを回収することができる。本発明において、「免疫担当細胞」（免疫細胞ともいう）とは、免疫応答を成立させる細胞を意味し、抗体産生細胞又は造血細胞、具体的にはＢ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞などが挙げられる。
免疫担当細胞は、全身免疫、粘膜免疫（後述）のみならず、各組織においても宿主及びその組織を守るという役目を担っている。例えば、皮膚であれば、Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ細胞が抗原提示を行って、真皮において動員されるＴ細胞、Ｂ細胞が機能する。肝臓においては、Ｋｕｐｐｆｅｒ細胞が貪職能力を有している。また、神経系では、Ｍｉｃｒｏｇｌｉａ細胞が、神経変性を予防するべく、不要な物質を貪食する。従って、本発明において、各組織における免疫担当細胞についても、ヒト免疫系を構築している。
これらのヒト由来細胞のレシピエント由来の細胞に対する比率は、造血細胞については５〜９０％、好ましくは２０〜９０％であり、抗体産生細胞については２〜８０％、好ましくは１０〜８０％である。
上記免疫担当細胞は、ドナーであるヒト由来の細胞であり、これらの細胞から各種生理活性物質が産生される。単球や樹状細胞などが、主な抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）として機能する。生理活性物質としては、例えばサイトカイン、免疫グロブリンなどが挙げられる。サイトカインは、各種の血球細胞の増殖と分化を制御するタンパク質性の生理活性物質であり、インターロイキン（ＩＬ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ケモカインなどを例示することができる。これらサイトカインの異常な分泌や制御の調節破綻が各種病態と密接に関連していることが近年示唆されている。また、これらの産生減少は重症感染症に対して一種の免疫不全状態を呈する可能性が高い。また、免疫グロブリン（Ｉｇ）は、抗体の機能及び構造をもつタンパク質であり、アイソタイプにはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥがある。本発明の免疫グロブリンには、全てのアイソタイプが含まれる。ＩｇＧ及びＩｇＡについては、それらのサブクラス（それぞれＧ１〜Ｇ４、Ａ１〜Ａ２）も存在し、上記免疫グロブリンに含まれる。
Ｂ細胞は表面または細胞内にＩｇ受容体を発現するリンパ球であり、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤなどの免疫グロブリン、あるいはＩＬ−６などのサイトカインを産生する。Ｔ細胞は、免疫応答に関与するリンパ球であって胸腺で分化、成熟する細胞であり、ＩＬ−２〜ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１６などを産生する。樹状細胞は、免疫応答の開始時に補助細胞（アクセサリー細胞）として働く樹状突起をもった細胞であり、クラスＩＩ主要組織適合（ＭＨＣ）抗原を発現してヘルパーＴ細胞への抗原提示細胞として機能する。ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞は、ウイルス感染細胞や腫瘍細胞などに対し、ＭＨＣ抗原に拘束されずに細胞傷害活性を示す細胞である。ＮＫＴ（ナチュラルキラーＴ）細胞は、Ｔ細胞受容体及びＮＫ細胞マーカー（例えばＣＤ１６、ＣＤ５６）を併せ持つ細胞であり、糖脂質であるαガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）の刺激によりＩＦＮ−γやＩＬ−４を産生する。
３．キメラ現象の確認及び抗体及びワクチンの産生
ヒト由来細胞がレシピエント動物において発現していることの確認は、レシピエント動物の末梢血、骨髄細胞、その他免疫組織を採取して、これらがヒト由来のものであることを確認すればよい。
例えば、レシピエントを免疫不全マウスとした場合は、移植後３週から３箇月の間に、末梢血は眼窩後叢から、骨髄細胞は大腿骨と脛骨から採取する。また、脾臓、リンパ節及び胸腺を切除後、細片化し、分離した細胞をメッシュフィルターに通して単一細胞懸濁液を得る。これらの細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ又はＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いたヒトＣＤ４５（白血球共通抗原、造血系細胞の主要膜糖タンパク質）の発現解析により、ドナー由来の造血細胞であることを同定する。マウス抗ヒト抗体等により染色することも可能である。
また、本発明の動物は、ドナーであるヒト由来の免疫系が確立されている。特に、マウスの場合、骨髄、脾臓、リンパ節、末梢血、胸腺はほぼ１００％に近いヒト細胞で置換されている（以下、このようなマウスを本発明においては「ヒト型化マウス」とも呼ぶ）。従って、免疫担当細胞であるＢ細胞（抗体産生細胞）、Ｂ細胞を高率に含む脾臓細胞等を抗原又は適当な刺激物質で刺激することにより、ヒト由来抗体を産生させることができる。例えば、本発明の免疫担当細胞を細菌、ウイルス、腫瘍（腫瘍細胞、抗原ペプチド等を含む）の存在下で培養することによりヒト由来抗体の産生を促すことができる。抗体の産生能の測定は、Ｂ細胞の表面抗原はＣＤ１９陽性（ＣＤ１９＋）を表すため、ＣＤ１９＋細胞におけるＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＡの発現をセルソーター等により解析する。
さらに、本発明の動物を所定の抗原又は適当な刺激物質で免疫し、得られる免疫細胞から抗体を採取することにより、ドナー（ヒト）由来の抗原特異的抗体を得ることができる。例えば、本発明の動物又はその子孫に細菌、ウイルス、腫瘍（腫瘍細胞、抗原ペプチド等を含む）を投与することにより、あるいは、本発明の動物又はその子孫から得た組織又は細胞を細菌、ウイルス、腫瘍（腫瘍細胞、抗原ペプチド等を含む）の存在下で培養することにより、ヒト由来抗体の産生を促し、また、ワクチンを開発することができる。前記の刺激によりパルス（刺激）された樹状細胞は、Ｔ細胞を効率よく誘導できることが知られている。従って、生体内でパルスした樹状細胞を選択して、ワクチンとして応用することも可能である。
抗原又は適当な刺激物質の動物１匹当たりの投与量は、マウスの場合、１０μｇ〜１ｍｇであり、アジュバントの有無によって適宜調節する。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ）、水酸化アルミニウム等が挙げられる。
抗原又は適当な刺激物質の種類は特に限定されるものではなく、タンパク質、ペプチド、レクチンなどが挙げられる。
投与部位は静脈内、皮下、足（ｆｏｏｄ  ｐａｄ）又は腹腔内である。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは１〜２週間間隔で、１〜３回の免疫を行う。そして、最終免疫後約一週間から二週間後に血清又は血漿中の抗体価を測定し、抗血清又は抗血漿を得る。抗体価の測定は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ；ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ；ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）等により行うことができる。
抗血清又は抗血漿から抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜選択して、又はこれらを組み合わせることにより抗体を精製することができる。
大動物、特に免疫不全ブタをレシピエントとして用いると、抗体産生において量的な利点がある。当該大動物としては、例えばＩＬ７Ｒ、ＩＬ２Ｒ  ｃｏｍｍｏｎ  ｇａｍｍａ  ｃｈａｉｎ、Ｊａｋ／Ｓｔａｔ，ＲＡＧ−１、ＲＡＧ−２などをノックアウトして作製された免疫不全動物が挙げられる。
一方、質の高いワクチンの開発には、レシピエントに小動物を用いることが望ましい。小動物では、さまざまなペプチドや抗原などが、ヒト免疫系を有する本発明の動物の生体内でどの程度有効な抗腫瘍効果を有するのか、あるいはペプチド認識効率を有するのかを容易に判定することができる。また、本発明者が開発した白血病細胞の生体内評価システムを用いれば、開発したワクチンや樹状細胞、あるいはＴ細胞が、生体内で増殖した白血病細胞などの腫瘍細胞に、どの程度有効であるかも評価することが可能である。
従って、本発明は、被験物質を本発明の動物（幼若個体、生体、子孫、モデル動物を含む）に投与して、被験物質の有効性を評価することを特徴とする免疫関連医薬のスクリーニング方法を提供する。「免疫関連医薬」は例えば抗体医薬、ワクチン（ペプチドや樹状細胞など）が代表的なものであり、抗ウイルス薬や抗生剤などの感染症に対する薬剤も含む。さらに、サイトカイン療法を含む液性因子も広く含む。免疫関連医薬の投与量及び投与方法については、体表面積、体重及び性別を基準として設定することが可能であり、特に静脈内、骨髄内、腹腔、肝臓、皮下などが主たる投与経路である。免疫関連医薬の対象疾患は極めて広く、例えば、腫瘍性疾患、自己免疫疾患、ウイルス性疾患、真菌性疾患、神経性疾患、寄生性疾患、難病、バクテリア性疾患、ミコバクテリウム疾患、関節リウマチやＳＬＥなどの膠原病、白血病やリンパ衆などの造血器悪性疾患、固形腫瘍、良性の造血器および固形腫瘍性疾患、花粉症、アレルギー、アトピー、エイズなどが挙げられる。
また、当該方法は、本発明のヒト抗体に対する免疫応答及びアレルギーに対する安全性確認（特に前臨床試験段階）において有用である。
本発明の動物またはその子孫は、粘膜免疫、消化管免疫、気道免疫もヒト免疫系で構築されている。ここで、粘膜免疫とは、特にＩｇＡなどの分泌型の免疫グロブリンを産生し、粘膜固有のリンパ小節やパイエル板などのＴ細胞を多数含む組織などにおける免疫をさす。消化管免疫とは、経口摂取により体内に取り込まれる細菌などの抗原に対して、不要なもの又は体に有害となるものを排除するシステム全般をさす。また、気道免疫とは、消化管免疫と同様に分泌型の免疫グロブリンを産生し、気道（鼻腔から気管支、肺胞）を経て侵入する外来性抗原に対する免疫応答全般を含むものである。
本発明のヒト型化動物における粘膜免疫系を利用すると、経口ワクチン開発、消化管感染症の解明、食物アレルギー病態の解明、アレルギー薬開発等を行うことができ、当該免疫系の応用範囲は極めて広いものである。例えば、経口ワクチンには、古典的にはポリオに対するものがよく知られているが、致死的な食中毒を引き起こすＯ１５７やコレラ、赤痢などの感染症に対するものが望まれる。本発明の疾患モデル動物若しくはその子孫のから回収される体液（主に血清）若しくは細胞、又は本発明の免疫担当細胞を上記ワクチンとして用いることができる。
また、クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症成長疾患は、免疫系の異常が原因とも言われている。従って、本発明の動物、方法、抗体、ワクチン等を用いたこれらの病態解明、幹細胞移植やＴ細胞注入などによる新規治療法の開発なども今後応用できる。
また、本発明の動物又はその子孫は疾患モデル動物（特に感染症モデル動物、腫瘍モデル動物）として用いることができる。その中でも、特にウイルス感染症モデル動物として期待される。特にウイルスは、種特異的であるために、ヒトのＨＩＶ，ＨＳＶなど現在臨床上重要と思われているウイルスはマウスに感染しない。従って、これまではマウスヘルペス、マウスレトロウイルスなど同じ系統のウイルスを用いて感染実験を行うのみで、ＨＩＶを直接用いることができないことが問題であった。本発明のモデル動物は、ヒトの免疫系を保有するために、疾患モデルは、細菌、真菌、ウイルスをマウスに感染させることで作製することができる。本発明の疾患モデルは、抗原をμｇ〜ｍｇ単位において、様々な量を投与することで得ることができる。投与経路は、前述したとおり、静脈、骨髄、肝臓、腹腔、皮下などを例示することができる。抗原については、細菌、真菌、ウイルスの他、ＯＶＡだけではなく、タンパク、ペプチド、細胞などをふくむ。
例えば、本発明者はすでに、ＨＩＶ，ＨＴＬＶ−１などのウイルスの生体内での観察において、彼等が宿主とするヒトＣＤ４陽性細胞が、マウス体内で、例えば幹細胞から分化し、成熟Ｔ細胞が直接生着することを効率に確認している。従って、上記のウイルスを含めた数々の臨床上問題となるウイルスの感染実験に用いることが期待される。
４．その他のキメラ現象の試験
（１）組織学的解析
レシピエントマウスを解剖後、組織を固定化又は凍結する。パラホルムアルデヒド固定化組織は、段階的な濃度のアルコールを用いて脱水し、パラフィンに埋め込むことが好ましい。ミクロトーム又はクライオスタット等を用いて切片を作製し、それぞれの切片について、通常の免疫組織染色を行うことができる。
（２）蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）法
ＦＩＳＨ法とは、染色体の遺伝子座位を決める周知技術であり、蛍光物質などにて標識した一本鎖プローブＤＮＡを染色体ＤＮＡの相補性部位でハイブリダイズさせ、特異的に求める細胞などの部位を顕微鏡下で同定するというものである。
【実施例】  以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕  免疫不全マウスへのヒト造血細胞の移植
臍帯血（ＣＢ）細胞を日本赤十字センター臍帯血バンクから得た。書面によるインフォームドコンセントを得た後に、廃棄対象となった臍帯血からＣＢ細胞を採取した。単核細胞（ＭＮＣｓ）を、密度勾配（リンパ球分離培地、ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を用いて３７０×ｇ、３０分間の遠心によりＣＢから単離した。ＭＮＣｓをマウス抗ヒトＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８抗体（ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）とともに、４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞をヒツジ抗マウス免疫磁気ビーズ（ＤＹＮＡＬ）とともに４℃で３０分間インキュベートし、未結合の細胞を回収した。ＣＤ３４＋集団を単離するために、Ｔ細胞除去試料を、抗ヒトＣＤ３４ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに４０分間インキュベートした（製造者プロトコールにしたがった。）。細胞を磁気カラムに２回通した結果、濃縮されたＣＤ３４＋細胞の純度は９０％以上となった。
上記のように調製したＣＢ細胞（ＣＤ３−ＣＤ４−ＣＤ８−ＣＤ３４＋、１×１０５個）を、予め１００ｃＧｙの全身照射を受けた新生児ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２Ｍマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に静脈注射により移植し、ヒト由来免疫細胞を初めとするヒト免疫系が構築されたマウスを作製した。
〔実施例２〕  マウス生体内におけるヒト由来Ｂ系細胞の解析
マウス生体内におけるヒトリンパ細胞の再構築の有無を調べるため、ヒトＣＤ４５＋細胞であってＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）の移植レベルについて、多重造血組織解析を行った。
移植後、飼育３箇月目のレシピエントマウスの骨髄（ＢＭ）、脾臓、末梢血（ＰＢ）、リンパ節（ＬＮ）の中にヒト由来Ｂ系細胞が存在するか否かを解析した。ＢＭ、脾臓、ＰＢ、ＬＮをＦＩＴＣ結合免疫グロブリン及びＰＥ結合ＣＤ１９で染色した。
結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。図１Ａにおいて、ａはＢＭ、ｂは脾臓、ｃはＰＢ、ｄはＬＮから採取した細胞のフローサイトメトリーである。各リンパ組織において、高レベルのヒトＣＤ４５＋ＣＤ１９＋細胞が同定された。図１Ａのａ〜ｄに示す各数値（それぞれ６４．６，２３．６，５０．１，４４．６）は、各組織から採取した細胞全体の中に占めるＣＤ４５＋ＣＤ１９＋細胞の比率（％）を示す。
また、図１Ｂの１６枚のパネルにおいて、１段目（ｅ）、２段目（ｆ）、３段目（ｇ）、４段目（ｈ）のパネルは、それぞれＢＭ、脾臓、ＰＢ、ＬＮ由来の造血細胞を、ＦＩＴＣ−結合ＩｇＭ（１列目）、ＩｇＤ（２列目）、ＩｇＧ（３列目）、ＩｇＡ（４列目）及びＰＥ−結合ＣＤ１９抗体により染色したときの結果を示す。各パネル内の数値は、ＣＤ１９＋細胞の中の免疫グロブリンの各クラスを発現する細胞の比率（％）を示す。例えばｅの１列目の９０．１は、ＩｇＭを発現する骨髄由来細胞の比率である。
これらの結果から、ＢＭ、脾臓、ＰＢ、ＬＮの各組織において、ヒト由来免疫グロブリンが高率に発現していることが示された。
次に、マウスにおいて生着したヒトリンパ系細胞の抗原特異性応答を調べるため、実施例１で作製したマウスを１００μｇの卵白アルブミン（ＯＶＡ）で免疫し、ＯＶＡ−特異的ＩｇＭ及びＩｇＧの存在をＥＬＩＳＡにより解析した。レシピエントマウスの血漿を１０倍（ＩｇＭ解析用）又は３倍（ＩｇＧ解析用）に希釈し、各サンプルについて吸光度を測定した。また、レシピエントマウスからＢ細胞を採取し、ＲＰＭＩ／ＦＣＳ（ウシ胎児血清）／Ｐｏｋｅｗｅｅｄ  ｍｉｔｏｇｅｎ培地で５日培養した。その後培養上清中の免疫グロブリンをＥＬＩＳＡにより測定した。陰性対照として、ヒト血清中の免疫グロブリンを測定した。
結果を図２に示す。図２においてパネルａはＩｇＭ、パネルｂはＩｇＧについての結果である。グラフは、左から血漿、培養上清、陰性対照１（ヒト血清）、陰性対照２（陰性対照１の血清の１／１０量）を示す。図２より、抗原特異的ＩｇＭ及びＩｇＧが高率に産生されていることが示された。
〔実施例３〕  Ｂ系細胞の分化と成熟化
レシピエントマウスの末梢血（ＰＢ）、骨髄（ＢＭ）及び脾臓からセルソーターによりヒトＣＤ１９＋細胞（Ｂ細胞）を採取し、Ｂ細胞によるＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＡの発現を調べた。ＣＤ１９＋細胞におけるＩｇＭ／ＩｇＤの表面発現はＰＢでは９０．０％／５４．０％、ＢＭでは１９．７％／３．４％、脾臓では５９．０％／２２．７％であった。
脾臓細胞をさらにヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）を用いて試験管内で５日間培養した。また、１００μｇ／ｍｌのＯＶＡで免疫したレシピエントマウスも作製した。続いて、培養上清及び血漿中へのヒト免疫グロブリンの分泌をＥＬＩＳＡを用いて調べた（表１）。ＰＷＭを用いた５日間培養の培地（上清）は、１１４ｎｇ／ｍｌ〜１９．８μｇ／ｍｌのＩｇＭ、２．６〜４７．６ｎｇ／ｍｌのＩｇＧ、及び１．９〜５．７ｎｇ／ｍｌのＩｇＡを含んでいた（表１）。
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レシピエントマウスから採取した血漿は、１７．２〜２２５μｇ／ｍｌのＩｇＭ、４．１〜８２３ｎｇ／ｍｌのＩｇＧ、及び９．４〜５５３ｎｇ／ｍｌのＩｇＡを含んでいた。
表１に示す通り、レシピエントマウスをＯＶＡで免疫した場合、ヒトＢ細胞は、ＯＶＡ特異的ＩｇＭを含めて、多量のＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡを分泌した。従って、本実施例において、新生児ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／Ｂ２Ｍマウスにおいて産生されるヒトＢ細胞は、成熟してヒト由来ＩｇＭ及びＩｇＤを産生し、さらに抗原特異的かっヒト由来のＩｇＭ、ＩｇＧ及びＩｇＡを産生する機能を有することが示された。
これらの知見から、本発明のマウスにより得られるＢ細胞は、ヒト抗体産生細胞として使用するに止まらず、重症感染症の病原微生物や腫瘍に対するヒト免疫グロブリン（モノクローナル抗体）を産生するため極めて有用であることが示された。
〔実施例４〕  マウス生体内におけるヒト由来Ｔ系細胞の解析
本実施例では、レシピエントマウスのＢＭ、脾臓及びＰＢにおけるヒトＴ細胞の存在（ＣＤ４５及びＣＤ３）についてフローサイトメトリー解析を行なった。
結果を図３に示す。図３ａ〜ｃの各パネルはそれぞれＢＭ（ａ）、脾臓（ｂ）、ＰＢ（ｃ）の解析結果である。Ｔ細胞は、Ｂ細胞と比較して少数ではあるが分化しており、レシピエントへの移植後３箇月目のＣＤ３＋細胞は、ＢＭで０．１７％、脾臓で１．４４％、ＰＢで１．８％であった。
ＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋表現型を特徴とする抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）は、ＢＭで１．０９％（図３ｄ）であった。なお、胸腺において、ＣＤ１９＋ＩｇＭ＋のＢ細胞が同定された（図３ｅ）。
〔実施例５〕  リンパ系組織のＦＩＳＨ解析と免疫蛍光分析
ｉｎ  ｓｉｔｕでのヒトリンパ細胞の分布を調べるために、レシピエントマウスに由来する脾臓を用いて、ヒト及びマウス染色体について二重ＦＩＳＨ解析を行なった。ＦＩＳＨは、常法に従った（Ｖｙｓｉｓ）。サンプル解析には、レーザースキャニング共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ：Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いた。
ヒトＸ染色体プローブを用いた実験から、ＦＡＣＳ分析の結果に矛盾しない高頻度のヒト細胞が得られた。ヒト及びマウスＸ染色体を用いた二重ＦＩＳＨ分析から、マウス起源の間質細胞も、脾臓に存在することが明らかとなった（図４）。
ヒト細胞は、緑色のシグナル（ヒトＸ染色体）として同定された（図４ａ）。レシピエントマウス由来の脾臓細胞の一部は、マウス抗ヒトＣＤ３で赤色に染色された（図４ｃ）。図４ｂはパネルａとｂを重ね合わせた図であり、青く染まっている箇所は核を示す。
レシピエントマウスは、移植前にはいずれの成熟リンパ細胞も欠いているが、ヒトＣＢ由来Ｔ細胞除去ＣＤ３４＋細胞を移植することにより、マウス内でヒト由来リンパ系組織をうまく再構築することができた。
また、組織標本について免疫組識染色を行なった。マウスから採取した脾臓組識の免疫組織染色の結果を図４ｄ及びｅに示す。大多数の脾臓細胞は、抗ヒトＩｇＭ陽性（ｄ）、抗ヒトＩｇＤ陽性（ｅ）に赤く染色され、極めて高率にヒト由来脾臓細胞が生着していることが示された。さらに、脾臓組織をマウス抗ヒトＣＤ３で染色した結果、脾臓の一部が抗ヒトＣＤ３で陽性（赤色）に染色された（図４ｆ）。そして、濾胞樹状細胞に対する特異抗体を用いて免疫染色を行うことにより、ヒトＡＰＣｓの存在も確認することができた（図４ｇ）。
〔実施例６〕  異種宿主におけるヒト細胞の多細胞系再構築
本実施例は、造血細胞によって再構築される「ヒト型化マウス」を開発することを目的とした。ヒトＣＢ造血幹細胞／前駆体細胞のレシピエントには、新生児ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌ（ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩＬ２ｒｇｔｍ１Ｗｊ１／Ｓｚ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用い、当該マウスへのヒト造血幹細胞の移植は実施例１に記載の方法とほぼ同様の方法で行った。臍帯血（ＣＢ）細胞は日本赤十字センター臍帯血バンクから得た。書面によるインフォームドコンセントを得た後に、廃棄対象となった臍帯血からＣＢ細胞を採取した。マウス抗ヒトＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ５６及びグリコホリンＡモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて単核細胞（ＭＮＣｓ）からＬｉｎ（ｌｉｎｅａｇｅ−ａｎｔｉｇｅｎ）陽性細胞を除いた。ＣＤ３４＋造血幹細胞集団を高純度で単離するために、単核細胞を抗ヒトＣＤ３４ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに１０℃で３０分間インキュベートし（製造者プロトコールにしたがった。）、細胞を磁気カラムに２回通した。その結果、濃縮されたＣＤ３４＋細胞の純度は９５％以上となり、ＣＤ１９＋細胞及びＣＤ３＋細胞の割合は０．１％以下となった。上記のように調製したＬｉｎ−ＣＤ３４＋細胞（１×１０５個）を静脈注射により移植する前に、予め新生ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌマウス及びＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２ｍｎｕｌｌマウスに１００ｃＧｙの全身照射を施した。
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌマウスは、成熟Ｂ及びＴ細胞が完全に欠損していることに加えて、ＮＫ細胞の活性レベルが著しく低いために、当該マウスをレシピエントに用いる場合には、異種細胞を拒絶する危険性を低下させることができる。また、新生児は免疫的に未成熟であるため、新生児レシピエントが成長する間に、ヒト幹細胞は定着し、そこから分化した造血系の細胞を得ることができる。実際、１×１０５個のＬｉｎ−ＣＤ３４＋細胞は、レシピエントマウスのＢＭに効率的に移植され、１次または２次リンパ臓器において多細胞系統の分化した細胞を生じさせた。
実施例２と同様に、移植後３ヶ月目のレシピエントマウス生体内におけるヒト由来Ｂ系細胞を解析した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｉｎｓｏｎ）を用いてヒトＣＤ４５とその系列マーカー（ｌｉｎｅａｇｅ  ｍａｒｋｅｒ）の発現を解析した。その結果、レシピエントマウスの造血系において、全てのヒト造血系構成要素を含んでいた。レシピエントマウスのＢＭでは、ヒトＧＰＡ＋赤血球は９．５±６．２％（ｎ＝５）、ヒトＣＤ４１＋巨核球は１．６４±０．４２％（ｎ＝５）の頻度で存在した（図５Ａ）。
また、ヒトＣＢ由来Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋細胞は、ＢＭ内でＣＤ３３＋脊髄細胞、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、及びＣＤ３＋Ｔ細胞を産生した（それぞれ図５Ｂ〜Ｄ）。
このＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌマウスの優位性を評価するために、既存のマウスの系統の中で最も移植効率のよいと考えられているＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２ｍｎｕｌｌマウス（ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／β２ｍｎｕｌｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）と移植レベルについて比較した。１×１０５個のＬｉｎ−ＣＤ３４＋由来のヒトＣＢ細胞をＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２ｍｎｕｌｌマウスに、又はＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒ−γｃｎｕｌｌマウスに移植した。そして、移植３ヶ月後のレシピエントマウスのＢＭ、脾臓、及び末梢血（ＰＢ）におけるヒトＣＤ４５＋細胞の移植レベルを解析した。
その結果、ＰＢでは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌマウス（６８．９±１１．６％、ｎ＝５）はＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２ｍｎｕｌｌマウス（１２．４±５．９％、ｎ＝５）に比べてヒト細胞の移植レベルが有意に高く、ヒト成熟赤血球（図５Ｅ）及び血小板（図５Ｆ）の両方が、ヒト白血球と共に確認された。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌマウスはＢＭ（７２．９±９．８％、ｎ＝５）及び脾臓（５４．５±８．０％、ｎ＝５）においても高率の移植レベルを示した（表２）。
ＢＭ、脾臓と同じく末梢血においてもヒト細胞が循環するために、特に外因性の抗原またはサイトカインで刺激される場合に、ヒト細胞の遊走や流動を解析することが可能である。
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〔実施例７〕  ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌにおけるヒト免疫系の分化
実施例６により、レシピエントマウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒ−γｃｎｕｌｌマウス）の免疫系において、ヒトＢ細胞、Ｔ細胞及び樹状細胞の存在を確認できた。Ｂ細胞発生の各段階、つまり、ＣＤ１９＋ＣＤ２０ｂｉ成熟Ｂ細胞（図６Ａ、Ｄ）、ＣＤ１０＋ＣＤ１９＋未成熟Ｂ細胞（図６Ｂ、Ｅ）及びＣＤ３４＋ＣＤ１９＋ｐｒｏ−Ｂ細胞（図６Ｃ、Ｆ）は、移植されたマウスのＢＭ（図６Ａ−Ｃ）及び脾臓の両方で確認できた（図６Ｄ−Ｆ）。
続いて、移植後３月におけるヒト免疫グロブリンの各アイソタイプの発現を、ＢＭ、末梢血（ＰＢ）及び脾臓（ＳＰ）由来のヒトＣＤ１９＋細胞において調査した。
結果を図７に示す。各ドットプロット中の数字は、細胞由来を示す各マーカー別の抗体と各免疫グロブリンクラスの抗体とに両陽性を示した細胞の割合（％）を示す。図７は、リンパ組織で分化するＣＤ１９＋Ｂ系細胞において免疫グロブリンが発現することは、当該リンパ組織がヒト免疫系に変化したことを示している。そして、ＢＭにおいてはＢ前駆細胞が保たれ発現し、末梢血（ＰＢ）では成熟ＩｇＭ＋及びＩｇＤ＋Ｂ細胞が産生された（図７）。ＢＭ及び脾臓においてヒトＩｇＡ＋Ｂ細胞が存在することは、ヒト細胞によって粘膜免疫系が再構築されることを示している。
次に、上記Ｂ細胞の機能を調べるために、レシピエントの血清に含まれるヒト免疫グロブリンの産生量をＥＬＩＳＡ法により定量した。ヒトＣＢ由来Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋細胞の移植３月後のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２ｍｎｕｌｌマウス及びＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌマウスを用いて、血清中のヒトＩｇＭ及びＩｇＧ抗体産生量をＥＬＩＳＡにより解析した。
その結果、検査した全てのレシピエントの血清においてヒトＩｇＭ（６００±１９７μｇ／ｍｌ、ｎ＝３）及びヒトＩｇＧ（２５６．７±７６．４μｇ／ｍｌ、ｎ＝３）が存在した。従って、本実施例により、ヒト免疫グロブリンが効果的に産生することを確認することができた（表３）。
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移植された前記のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／β２ｍｎｕｌｌマウス及びＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌマウスにおける免疫グロブリン産生レベルの大きな違いは、レシピエントの血清中のヒトＩｇＧクラス抗体量においてみられる。すなわち、効果的なクラススイッチが、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌレシピエントマウスにおけるヒト免疫系への変化よって調節されていることを示すものである。
次に、異種宿主におけるヒトＴ細胞の発生を解析した。胸腺（図８Ａ）及び脾臓（図８Ｂ）におけるヒトＴ細胞の発生をフローサイトメトリーで解析した。
結果を図８に示す。胸腺では未成熟ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞が８８．１％を占めたのに対し（Ａ）、２次リンパ組織である脾臓ではＣＤ４＋ＣＤ８−またはＣＤ４−ＣＤ８＋といった一重陽性ヒトＴ細胞が大部分を占めた（Ｂ）。
さらに、免疫蛍光試験によって移植されたＴ細胞を同定した。胸腺におけるＴ細胞を抗ヒトＣＤ４抗体（図８Ｃ）及び抗ヒトＣＤ８抗体（図８Ｄ）で染色した。パラホルムアルデヒドで固定した切片を、温めたクエン酸バッファーで処置し、抗体で免疫染色した。検出はレーザースキャニング共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０Ｍｅｔａ：Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を用いた。図８Ｅは、図８ＣとＤとの重ね合わせ像であり、これにより、胸腺細胞の大部分はＣＤ４とＣＤ８の２重陽性であることが示された。一方、脾臓を抗ヒトＣＤ４抗体（緑）と抗ヒトＣＤ８（赤）で染色すると、ＣＤ４またはＣＤ８一重陽性のＴ細胞が優性であった（図８Ｆ）。
以上の結果より、免疫染色によって、レシピエントの胸腺においてＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８＋ヒトＴ細胞が組織的構造を形成していることが明らかとなった。脾臓のような２次リンパ組織では、一重陽性Ｔ細胞は１．３９±０．６１（ｎ＝５，０．９４−２．４３）ＣＤ４／ＣＤ８比で存在した。上記結果は、ヒトＣＢ−幹細胞／前駆体細胞由来Ｔ細胞が成熟及び増殖刺激を受けることを示しており、このことは、ヒト生体におけるものと同一であることを意味する。
抗原に対する免疫応答が最適に変化するには、樹状細胞又は単核細胞が抗原提示細胞として機能することが必要である。そこで、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒ−γｃｎｕｌマウスの脾臓におけるヒト樹状細胞の存在を検討した。
結果を図９に示す。図９Ａには、脾臓におけるＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋細胞の存在をフローサイトメトリーで示した。図９Ｂは、抗ヒトＣＤ１１ｃ抗体による免疫染色により、ヒト樹状細胞が予想された形態学的特徴を保持していることを示した図である。図９Ａより、ＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞は１．３２±０．５４％（ｎ＝６）の頻度でＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌレシピエントマウスの脾臓に存在することが示された。また、ヒトＣＤ１１ｃで免疫染色することによって、移植されたヒト樹状細胞はマウス臓器における形態学的特徴を有することが示された（図９Ｂ）。レシピエントの脾臓において、ヒトＣＤ１９＋細胞及びＣＤ３＋細胞により組織化された構造が形成することに伴い（図９Ｃ及びＤ）、異種リンパ組織においてヒト免疫系が機能的に再構築することが、ヒト樹状細胞の存在によって示された。
以上の結果から、免疫系において必要不可欠な３つの要素であるヒト由来Ｔ細胞、Ｂ細胞及び抗原提示細胞は、異種宿主（マウス）において適切な成熟を伴ってＣＢ  Ｌｉｎ−ＣＤ３４＋細胞から高率に分化することが示された。
〔実施例８〕  ヒト粘膜免疫の再構築
胃腸管系の組織は、外因性の抗原に対する粘膜免疫による宿主防御を支える主要な部位である。本発明者は、レシピエントマウスのＢＭ及び脾臓においてＩｇＡ＋Ｂ系細胞の存在することを確認したことから、異種宿主の消化管においてヒト免疫細胞が存在するかを調べた。胃から直腸にかけての消化管をマウスから摘出し、ＰＢＳで染色した後、３％パラホルムアルデヒドで１時間室温で固定した。パラフィン包埋サンプルを５μｍにスライスし、免疫染色に用いた。免疫蛍光試験はレーザースキャニング共焦点顕微鏡を用いた。
結果を図１０に示す。図１０は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌマウスの消化管における粘膜免疫の発生を示している。図１０Ａ及びＢは、ＤＡＰＩによる核染色とともに、抗ヒトＣＤ３抗体（Ａ、緑）及び抗ヒトＩｇＡ抗体（Ｂ、赤）で免疫染色することによって、レシピエントマウスの腸管標本においてヒト粘膜免疫が存在することを示す。図１０Ｃは、絨毛の輪郭をＤＩＣイメージングによって明らかにした図である。図１０Ｄは、Ａ、Ｂ及びＣの像を重ね合わせたものである。図１０Ａ〜Ｄから、免疫蛍光試験によって、レシピエントマウスの腸管絨毛にヒトＩｇＡ＋Ｂ細胞及びヒトＣＤ３＋Ｔ細胞が共に含まれていることが示された。つまり、この結果は、粘膜免疫がヒトＬｉｎ−ＣＤ３４＋幹細胞／前駆細胞によって再構築されたことを示している。加えて、移植マウスの回腸の漿膜下で節構造が認められた（図１０Ｅ）。
Ｐｅｙｅｒ’ｓパッチ様構造を、抗ヒトＩｇＡ（赤）、及び抗ヒトＣＤ３（緑）抗体で染色すると、上皮下ドームにおいてヒトＴ細胞を豊富に含んでいることが明らかとなった（図１０Ｆ）。以上のように、マウス腸間膜リンパ節もヒト細胞によって著しく再構築されていた。したがって、本発明のモデルは、胃腸管におけるヒト粘膜免疫系の役割を解析するための実験動物として有用である。
〔実施例９〕  移植されたＢ細胞による抗原特異的免疫グロブリンの産生
ヒト免疫系の組織的な応答を調べるために、そしてｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗原特異的なヒト抗体の産生を調べるために、移植３月後に３匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌレシピエントマウスに２回卵白アルブミン（１００μｇ、ｓｉｇｍａ）で免疫した。卵白アルブミンは、１００μｇの水酸化アルミニウム（ｓｉｇｍａ）で乳化させて用いた。当該免疫後のフローサイトメトリーによって解析した結果、２回免疫後２週間経たレシピエントマウスのＢＭにおいて、ヒトＣＤ３８＋ＩｇＧ＋細胞が効果的に誘導されていることが示された（図１１）。図１１Ａ及びＢは卵白アルブミン免疫前及び後におけるレシピエントマウスのＢＭ細胞を、フローサイトメトリーによってヒトＩｇＧ＋細胞の存在によって分析した図である。
次に、免疫化レシピエントマウスの血清を用いて、卵白アルブミン特異的なヒトＩｇＭ及びＩｇＧの産生を測定した。上記の３匹の免疫化マウス、即ちＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌレシピエントマウスを卵白アルブミンで免疫した２週間後に、レシピエントマウスの血清を採取し、卵白アルブミン特異的なヒトＩｇＭ及びＩｇＧの存在をＥＬＩＳＡ法によって解析した。ヤギ抗ヒトＩｇＭ及びＩｇＧ抗体は、Ｂｅｔｈｙｌから購入し、これらはマウス抗ヒトＩｇＭ及びＩｇＧ抗体とクロス反応しないことを確認した後に用いた。免疫をしていないＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２ｒｇ−ｎｕｌｌレシピエントマウス由来の血清を、非特異的ＩｇＭ及びＩｇＧ対照として用いた。卵白アルブミン特異的なヒトＩｇＭ及びＩｇＧ抗体を解析するために、９６マルチウェルプレートの底に、１００μｇ／ｍｌ濃度の卵白アルブミンをプレーティングしてＥＬＩＳＡ法に用いた。
その結果、ＥＬＩＳＡによって、ヒトＩｇＭ（図１１Ｃ白カラム）及びＩｇＧ（図１１Ｃ黒カラム）の光学濃度（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ）は、免疫化レシピエント（Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）の血清では非免疫化レシピエント（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して非常に高いことが示された。また、ヒト細胞のキメラ化が高いレベルであることも示された（図１１）。卵白アルブミンがＴ依存性抗原であることを考慮すると、ヒト免疫系特性に変化したヒト樹状細胞、Ｔ細胞及びＢ細胞は、異種宿主レシピエントマウスにおいて抗原特異的なヒトＩｇＭ及びＩｇＧの産生をするために調和して機能したものであると考えられる。
〔実施例１０〕  アロ抗原特異的なヒトＴ細胞の存在
本実施例は、異種宿主のリンパ組織中のＬｉｎ−ＣＤ２４＋ＣＢ細胞から分化したヒトＴ細胞の、アロ抗原特異的な機能を明らかにしたものである。
ヒトＴ細胞をレシピエントの脾臓から単離した後、アロ抗原（ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ）特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞株及びＣＤ８＋Ｔ細胞株を分化した。ＣＤ４＋Ｔ細胞株及びＣＤ８＋Ｔ細胞株の両者を同種異型（ａｌｌｏｇｅｎｉｃ）の標的細胞（ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ、ＴＡＫ−ＬＣＬ）と共培養し、同種異型標的細胞に対する細胞毒性を調べるために、５１Ｃｒ遊離アッセイを行った。
さまざまな細胞数のエフェクター細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ）と、１×１０４個の５１Ｃｒ標識同種異型標的細胞を、丸底マイクロタイターウェルにて１０％熱非働化ウシ胎児血清を添加した０．２ｍＬのＲＰＭＩ１６４０中で培養した。標的細胞は、メディウムのみのウェル、及びメディウムに１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の入ったウェルにも添加し、それぞれの遊離量は、５１Ｃｒの自発的な遊離及び５１Ｃｒの最大遊離の値として後の計算で用いた。５時間後上清０．１ｍＬをそれぞれのウェルから回収し、以下の計算式から特異的な５１Ｃｒ遊離量を求めた。
（特異的な５１Ｃｒ遊離量）（％）＝（実測値（ｃｐｍ）−自発遊離値（ｃｐｍ））／（最大遊離値（ｃｐｍ）−自発遊離値（ｃｐｍ））×１００
ＨＬＡ拘束を決定するために、標的細胞を抗ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃモノクローナル抗体（ｗ６／３２）（ＡＴＣＣ）又はＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗体（Ｌ２４３）（ＡＴＣＣ）と３０分間プレインキュベートし、その後、エフェクターＴリンパ球で共培養した。それぞれの細胞毒性アッセイは、少なくとも２回行った。
ＫＩＮ−ＬＣＬは、同種異型の標的細胞と、いずれのＨＬＡタイプをも共有せず、陰性対照として用いた（図１２、ＫＩＮ−ＬＣＬ、（×））。
また、エフェクター細胞と標的細胞のＨＬＡタイプは以下のとおりである。Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ｓｐｌｅｅｎ，ＨＬＡ−Ａ２４／３３，Ｂ４４／５２，Ｃｗ１２／ｗ１４，ＤＲＢ１＊１３０２／＊１５０２１，ＴＡＫ−ＬＣＬ，ＨＬＡ−Ａ２４／２６，Ｂ６２／−，Ｃｗ４／ｗ９，ＤＲＢ１＊０４０５／＊０９０１，ＫＩＮ−ＬＣＬ，ＨＬＡ−Ａ０１／３０，Ｂ１３／１７，Ｃｗ６／−，ＤＲＢ１＊０７０１／＊０７０１．
結果を図１２に示す。図１２Ａ〜Ｃは、３つのＣＤ４＋Ｔ細胞株それぞれの、刺激細胞濃度（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ／Ｔａｒｇｅｔ  ｒａｔｉｏ）依存的な細胞毒性（％Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を示す。ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞株による細胞毒性は、標的細胞として用いた同種異型ＬＣＬ（ＴＡＫ−ＬＣＬ）に対して細胞毒性を示した（図１２、ｎｏｎｅ、（◆））。異種環境で産生されたヒトＴ細胞のＭＨＣ拘束を調べるために、抗ＨＬＡクラスＩ抗体（ａｎｔｉ−ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ）及び抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（ａｎｔｉ−ＨＬＡ−ＤＲ）を用いて、ヒトＴ細胞による細胞毒性の阻害アッセイを行った。その結果、細胞毒性はＨＬＡ−ＤＲ抗体（図１２、ａｎｔｉ−ＨＬＡ−ＤＲ、（▲））によって阻害されたが、ＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体（図１２、ａｎｔｉ−ＨＬＡ−ｃｌａｓｓ  Ｉ、（■））では阻害されなかった。このことは、細胞毒性はＨＬＡクラスＩＩで拘束されることを示している。
図１２Ｄ〜Ｆは、３つのＣＤ８＋Ｔ細胞株それぞれの、刺激細胞濃度依存的な細胞毒性を示す。ＣＤ８＋Ｔによる細胞毒性は、ＨＬＡクラスＩモノクローナル抗体によって阻害されたが、ＨＬＡ−ＤＲ抗体では阻害されなかった。このことは、通常の環境下で産生したＣＤ８＋ＣＴＬによって介されるのと同様に、異種環境下で産生したＣＤ８＋Ｔ細胞によって介される細胞毒性は、ＨＬＡクラスＩ抗体によって拘束されることを示している。
【産業上の利用可能性】  本発明により、新生児免疫不全動物を用いたヒト由来免疫担当細胞の製造方法を提供することができる。本発明の新生児免疫不全動物は、その体内にヒト由来の免疫系を構築することができるため、リンパ系組織の機能解析及びＢ細胞を用いたヒト由来抗体の作製に有用である。
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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