(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１に示す配列、又は
（ｂ）配列番号１に示す配列と少なくとも９５％の同一性を有し、かつＨ-Ａｌａ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ、Ｈ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ及びＨ-Ａｒｇ-Ｐｒｏ-ｐＮＡのいずれか一つにおいてプロリンに隣接するペプチド結合Ｃ末端を加水分解することができる配列を含んでなるペプチド。
【請求項２】
ペプチドのアスパラギン残基が炭水化物分子に連結していない、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ペプチドが細胞の細胞表面膜上に発現しない、請求項１又は２に記載のペプチド。
【請求項４】
さらなるアミノ酸配列と連結した配列番号１に示すアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質であって、Ｈ-Ａｌａ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ、Ｈ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ及びＨ-Ａｒｇ-Ｐｒｏ-ｐＮＡのいずれか一つにおいてプロリンに隣接するペプチド結合Ｃ末端を加水分解することができる融合タンパク質。
【請求項５】
さらなるアミノ酸配列がＧＳＴ、Ｖ５エピトープ及びＨｉｓ標識からなる群より選択される、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
請求項１に記載のペプチドによる基質開裂を阻害することができる分子を特定する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のペプチドを分子と接触させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の請求項１に記載のペプチドと、請求項１に記載のペプチドが開裂することができる基質とを、請求項１に記載のペプチドによる基質開裂に充分な条件下で接触させる工程と、
（ｃ）請求項１に記載のペプチドが開裂しない基質を検出し、分子が請求項１に記載のペプチドによる基質開裂を阻害することができることを特定する工程とを含んでなる方法。
【請求項７】
特異的に請求項１に記載のペプチドによる基質開裂を阻害することができる分子を特定する方法であって、
（ａ）請求項１に記載のペプチド及びさらなるプロテアーゼを分子と接触させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）の請求項１に記載のペプチド及びさらなるプロテアーゼと、請求項１に記載のペプチド及びさらなるプロテアーゼが開裂することができる基質とを、請求項１に記載のペプチド及びさらなるプロテアーゼによる基質開裂に充分な条件下で接触させる工程と、
（ｃ）請求項１に記載のペプチドは開裂しないが、さらなるプロテアーゼが開裂する基質を検出し、分子が請求項１に記載のペプチドによる基質開裂を特異的に阻害することができることを特定する工程とを含んでなる方法。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチドの触媒活性を低減又は阻害する方法であって、請求項１に記載のペプチドを請求項１に記載のペプチドの触媒活性の阻害剤と接触させる工程を含んでなる方法。
【請求項９】
基質と請求項１に記載のペプチドとを、請求項１に記載のペプチドによる基質開裂に充分な条件下で接触させる工程を含んでなる、基質の開裂方法。
【請求項１０】
活性化Ｔ細胞を検出する方法であって、Ｔ細胞の請求項１に記載のペプチドの遺伝子発現のレベルを測定する工程を含んでなる方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のペプチドの遺伝子発現のレベルが、細胞内の請求項１に記載のペプチドのＲＮＡの量を検出することにより検出される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
（ａ）配列番号１に示す配列をコードし、又は
（ｂ）配列番号２に示す配列からなり、又は
（ｃ）配列番号２に示す配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列であって、Ｈ-Ａｌａ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ、Ｈ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ及びＨ-Ａｒｇ-Ｐｒｏ-ｐＮＡのいずれか一つにおいてプロリンに隣接するペプチド結合Ｃ末端を加水分解することができるタンパク質をコードする配列からなる核酸分子。
【請求項１３】
ヒト染色体１５上のバンドｑ２２に位置する遺伝子にハイブリダイズすることができる、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
５’又は３’非翻訳領域を含まない、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１５】
請求項１２に記載の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターを含んでなる細胞。
【請求項１７】
請求項１、２又は４に記載のペプチドに結合することができる抗体。
【請求項１８】
ハイブリドーマ細胞により製造される、請求項１７記載の抗体。
【請求項１９】
請求項１８に記載の抗体を作成することができるハイブリドーマ細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ジペプチジルペプチダーゼ、それをコードする核酸分子、及びペプチダーゼの使用に関する。
【０００２】
発明の背景
ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）ＩＶ様遺伝子ファミリーは、関連するタンパク質構造及び機能を有する分子ファミリーである（１〜３）。遺伝子ファミリーには、以下の分子、すなわちＤＰＰＩＶ（ＣＤ２６）、ジペプチジルアミノペプチダーゼ様タンパク質（ＤＰＰ６）及び繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）が含まれる（１、２、４、５）。別の可能性のあるメンバーとしては、ＤＰＰＩＶ-βがある（６）。
【０００３】
ＤＰＰＩＶ様遺伝子ファミリーの分子はセリンプロテアーゼであって、ペプチダーゼファミリーＳ９ｂのメンバーであり、プロピルエンドペプチダーゼ（Ｓ９ａ）及びアシルアミノアシルペプチダーゼ（Ｓ９ｃ）と共に、プロピルオリゴペプチダーゼファミリーに含まれる（５、７）。
【０００４】
ＤＰＰＩＶ及びＦＡＰの両者は、類似するポストプロリンジペプチジルアミノペプチダーゼ活性を有するが、ＤＰＰＩＶと異なりＦＡＰはゼラチナーゼ活性も有する（８、９）。
【０００５】
ＤＰＰＩＶ基質としては、ＲＡＮＴＥＳ、エオタキシン（ｅｏｔａｘｉｎ）、マクロファージ由来ケモカイン及びストロマ細胞由来因子１等のケモカイン、グルカゴン及びグルカゴン様ペプチダーゼ１及び２等の成長因子、ニューロペプチドＹ及び基質Ｐ等のニューロペプチド、及び血管活性ペプチドが挙げられる（１０〜１２）。
【０００６】
ＤＰＰＩＶ及びＦＡＰは非触媒活性も有し、ＤＰＰＩＶはアデノシンデアミナーゼを結合し、そしてＦＡＰはα３β１及びα５β１インテグリンに結合する（１３〜１４）。
【０００７】
前記活性の観点において、ＤＰＰＩＶ様ファミリーメンバーは、サイトカイン、ニューロペプチド、成長因子及びケモカインの代謝を含む、ペプチドを含むプロリンの腸及び腎臓内輸送、細胞接着、ペプチド代謝、及び免疫学的過程、特にはＴ細胞刺激における役割を有する可能性がある（３、１１、１２）。
【０００８】
その結果、ＤＰＰＩＶ様ファミリーメンバーは、例えば腫瘍成長及び生物学、糖尿病ＩＩ型、肝硬変、自己免疫、移植片拒絶及びＨＩＶ感染といった病気の病理に関与する可能性がある（３、１５〜１８）。
【０００９】
ＤＰＰＩＶの阻害剤は、動物モデルのｉｎ  ｖｉｖｏで関節炎を抑え、心臓同種移植片生存を延長することを示した（１９，２０）。いくつかのＤＰＰＩＶ阻害剤は、ＨＩＶ感染を阻害することが報告されている（２１）。ＤＰＰＩＶ阻害剤は下痢、成長ホルモン欠乏、非インシュリン依存性糖尿病におけるグルコースレベルの低下並びにグルコース不耐、粘膜再生を高めることに関する他の疾患を含む他の治療的応用に有用であり、かつ免疫抑制剤としても有用であろう（３、２１〜２４）。
【００１０】
ＤＰＰＩＶ様遺伝子ファミリーのメンバーを特定することが必要であり、これにより特別なファミリーメンバーについて特異性を有する阻害剤を特定し、そして病気の治療目的でそれを投与することができる。代替的には、特定したメンバーそれ自身が病気の治療にとって有用となるかもしれない。
【００１１】
発明の概要
本発明は、前記特定の必要性に取り組み、第１の観点では配列番号１に示すアミノ酸配列を含んでなるペプチドを提供する。
【００１２】
このペプチドは、以下の化合物、すなわちＨ-Ａｌａ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ、Ｈ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ及びＨ-Ａｒｇ-Ｐｒｏ-ｐＮＡについて基質特異性を有する。従って、これらの化合物のそれぞれにおけるプロリンへのペプチド結合Ｃ末端を加水分解できるので、プロピルオリゴペプチダーゼ及びジペプチジルペプチダーゼである。
【００１３】
ペプチドはヒトＤＰＰＩＶと相同であり、かつ重要なことにＤＰＰＩＶと配列番号１の配列間の特定は、触媒三つ組み残基及びＤＰＰＩＶ酵素活性にとって本質的なβプロペラドメインの２個のグルタミン酸塩残基を含むＤＰＰＩＶ領域に観察される。アミノ酸配列ホモロジーの観察により、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するペプチドは、ＤＰＰＩＶ様遺伝子ファミリーのメンバーであることがわかる。従って、ペプチドを暫定的にＤＰＰＩＶＬ１と名付け、本明細書中ではＤＰＰ８と称し、記載する。
【００１４】
ヒトＤＰＰＩＶアミノ酸配列の以下の配列、すなわち（ｉ）Ｔｙｒ６２７ＧｌｙＴｒｐＳｅｒＴｙｒＧｌｙＧｌｙＴｙｒＶａｌ、（ｉｉ）Ａｌａ７０７ＡｓｐＡｓｐＡｓｎＶａｌＨｉｓＰｈｅ、（ｉｉｉ）Ｇｌｕ７３８ＡｓｐＨｉｓＧｌｙＩｌｅＡｌａＧｌｎ、及び（ｉｖ）Ｔｙｒ２０１ＶａｌＴｙｒＧｌｕＧｌｕＧｌｕＶａｌはＤＰＰＩＶの触媒活性にとって重要である（２５〜２８）。本明細書中に記載するように、ＤＰＰ８の以下の配列、すなわちＨｉｓ７３６ＧｌｙＴｒｐＳｅｒＴｙｒＧｌｙＧｌｙＴｙｒＬｅｕ、Ｌｅｕ８１６ＡｓｐＧｌｕＡｓｎＶａｌＨｉｓＰｈｅＡｌａ、Ｇｌｕ８４７ＡｒｇＨｉｓＳｅｒＩｌｅＡｒｇ及びＰｈｅ２５５ＶａｌＬｅｕＧｌｎＧｌｕＧｌｕＰｈｅと、前記（ｉ）乃至（ｉｖ）の配列とのそれぞれのアラインメントは、ＤＰＰ８のこれらの配列がＤＰＰ８の触媒活性を与えるようであると示唆する。このように、第２の観点では、本発明は以下のアミノ酸配列、すなわちＨｉｓ７３６ＧｌｙＴｒｐＳｅｒＴｙｒＧｌｙＧｌｙＴｙｒＬｅｕ、Ｌｅｕ８１６ＡｓｐＧｌｕＡｓｎＶａｌＨｉｓＰｈｅＡｌａＨｉｓ、Ｇｌｕ８４７ＡｒｇＨｉｓＳｅｒＩｌｅＡｒｇ及びＰｈｅ２５５ＶａｌＬｅｕＧｌｎＧｌｕＧｌｕＰｈｅを含んでなるペプチドであって、配列番号１に示す配列の基質特異性を有するペプチドを提供する。
【００１５】
また本明細書中に記載する、多重配列アラインメントを用いると、ＤＰＰ８がＣ．ｅｌｅｇａｎｓタンパク質と５５％のアミノ酸類似性及び３２％のアミノ酸同一性を有することが観察される。さらに本明細書中に示すように、ＤＰＰ８をコードする核酸分子はヒト以外の種に由来するＤＰＰ８配列と特異的にハイブリダイズすることができる。これらのデータを合わせると、ＤＰＰ８はヒト以外の種で発現されることが示唆する。このように第３の観点では、本発明は配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも６０％のアミノ酸同一性を有し、かつ配列番号１に示す配列の基質特異性を有するペプチドを提供する。好ましくは、アミノ酸同一性は７５％である。より好ましくは、アミノ酸同一性は９５％である。アミノ酸同一性は、本明細書中にさらに記載するようなＧＡＰソフトウェア（ＧＣＧバージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、マディソン、ＷＩ、米国）を用いて計算する。典型的には、ヒト以外のＤＰＰ８は以下の配列、すなわち
Ｈｉｓ７３６ＧｌｙＴｒｐＳｅｒＴｙｒＧｌｙＧｌｙＴｙｒＬｅｕ、
Ｌｅｕ８１６ＡｓｐＧｌｕＡｓｎＶａｌＨｉｓＰｈｅＡｌａＨｉｓ、Ｇｌｕ８４７ＡｒｇＨｉｓＳｅｒＩｌｅＡｒｇ及びＰｈｅ２５５ＶａｌＬｅｕＧｌｎＧｌｕＧｌｕＰｈｅを含んでなる。
【００１６】
ＤＰＰＩＶとＤＰＰ８アミノ酸配列との間のホモロジーに鑑みて期待されることは、これらの配列が類似する三次構造を有するであろうということである。これは、ＤＰＰ８の三次構造がＤＰＰＩＶの７ブレードのβプロペラドメイン及びα／β加水分解酵素ドメインを含む可能性があることを意味する。ＤＰＰ８におけるこれらの構造はβプロペラ、Ｇｌｙ１８０〜Ａｓｐ６０６、α／β加水分解酵素、Ｓｅｒ６０７〜Ｉｌｅ８８２及びＡｒｇ３９〜Ｇｌｎ１７９の領域の約７０〜１００残基を含んでなる領域により与えられる可能性がある。βプロペラドメインがプロピルオリゴペプチダーゼのα／β加水分解酵素ドメインにおける触媒三つ組みにより媒介されるタンパク質分解を制御することが知られるように、（２９）ＤＰＰ８の切りつめ型を製造することができ、これは配列番号１に示す配列の基質特異性を有し、ＤＰＰ８の触媒特異性を与える前記に参照する領域（Ｈｉｓ７３６ＧｌｙＴｒｐＳｅｒＴｙｒＧｌｙＧｌｙＴｙｒＬｅｕ、Ｌｅｕ８１６ＡｓｐＧｌｕＡｓｎＶａｌＨｉｓＰｈｅＡｌａＨｉｓ、Ｇｌｕ８４７ＡｒｇＨｉｓＳｅｒＩｌｅＡｒｇ及びＰｈｅ２５５ＶａｌＬｅｕＧｌｎＧｌｕＧｌｕＰｈｅ）を含んでなることが期待される。調製されるであろうＤＰＰ８の切りつめ型の例としては、βプロペラドメイン及びα／β加水分解酵素ドメインを与える領域が共にスプライスされているものが挙げられる。切りつめ型の他の例としては、ＤＰＰ８ｍＲＮＡのスプライス変型によりコードされるものが挙げられる。このように本明細書中に記載するように、ＤＰＰ８の生物化学的特徴はＤＰＰ８が８８２個のアミノ酸からなり、かつ約１００ｋＤａの分子量を有することを示し、配列番号１に示す基質特異性を有するＤＰＰ８の切りつめ型は標準的な技術を用いて調製するとよいことが認識される（３０、３１）。このように第４の観点では、本発明は配列番号１に示す配列の基質特異性を有する、配列番号１に示す配列のフラグメントを提供する。好ましくは、フラグメントは配列番号３、５又は７に示すアミノ酸配列を有する。
【００１７】
本明細書中に記載するように、配列番号１に示す配列はＮ連結グリコシル化についての共通配列を含まない。従って、ＤＰＰ８はＮ連結グリコシル化と関連することはない可能性がある。これに関して、ＤＰＰ８はＮ連結グリコシル化についての６〜９共通配列を含む他のＤＰＰＩＶ様遺伝子ファミリーメンバーと区別される。このように一実施形態では、本発明の第１の観点のペプチドにおけるアスパラギン残基は炭水化物分子に連結しない。
【００１８】
本明細書中に記載するＤＰＰ８発現の分析により、ＤＰＰ８が細胞質タンパク質として発現される可能性があることを示す。従って、ＤＰＰ８の発現は細胞質膜上又は言い換えれば細胞表面膜に発現される他のＤＰＰＩＶ様遺伝子ファミリーメンバーとは区別される。このように別の実施形態では、本発明の第１の観点のペプチドは細胞の細胞表面膜上に発現しない。
【００１９】
ＤＰＰ８は融合し、又は言い換えればさらなるアミノ酸配列に結合して配列番号１に示す配列の基質特異性を有する融合タンパク質を形成してもよいことが認識される。融合タンパク質の例を本明細書に記載し、これはさらなるアミノ酸配列、すなわちＶ５エピトープ及びＨｉｓ標識をコードするアミノ酸配列からなる「標識」配列に連結する配列番号１に示す配列を含んでなる。ＤＰＰ８と連結してもよい別のさらなるアミノ酸配列の例は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ドメインである（３０）。さらなるアミノ酸配列の別の例はＣＤ８αの部分である（８）。このように一観点では、本発明はさらなるアミノ酸配列と連結した配列番号１に示すアミノ酸配列を含んでなる融合タンパク質であって、配列番号１に示す配列の基質特異性を有する融合タンパク質を提供する。
【００２０】
本発明の第１の観点のペプチドは、ポリペプチドがＤＰＰ８の基質特性を有するようなポリペプチドに含まれてもよいとも認識される。ポリペプチドは、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ応用で用いる場合にＤＰＰ８のプロテアーゼ感受性を変えるために有用であろう。この観点において有用であろうポリペプチドの例は、アルブミンである。このように別の実施形態において、第１の観点のペプチドはＤＰＰ８の基質特異性を有するポリペプチドに含まれる。
【００２１】
前記のように、ＤＰＰ８の単離及び特徴付けが、ＤＰＰ８触媒活性の阻害剤特定にとって必要であり、これは病気の治療にとって有用であるかもしれない。本明細書に記載する、ＤＰＰ８触媒活性の阻害剤の特定方法は、ＤＰＰＩＶ及びセリンプロテアーゼ、亜鉛及び擬似ペプチド、Ａｌａ-Ｐｒｏ-Ｇｌｙ及びＬｙｓ-Ｐｒｏ、しかし金属プロテアーゼの阻害剤ではない、アスパルチルプロテアーゼ又はシステイニルプロテアーゼの種々の阻害剤がＤＰＰ８触媒活性を阻害することを特定した。従って、第５の観点では、本発明はＤＰＰ８による基質開裂を阻害することができる分子を特定する方法であって、
（ａ）ＤＰＰ８と分子とを接触させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）のＤＰＰ８を、ＤＰＰ８が開裂できる基質と、ＤＰＰ８による基質開裂に充分な条件下で接触させる工程と、
（ｃ）ＤＰＰ８が開裂しない基質を検出し、分子がＤＰＰ８による基質開裂を阻害することができることを特定する工程とを含んでなる方法を提供する。
【００２２】
ＤＰＰ８の阻害剤は、本明細書中に記載するようにＤＰＰＩＶ及び他のセリンプロテアーゼを阻害するかもしれないとはいえ、ＤＰＰ８アミノ酸配列と最も近く関連する分子（すなわち、ＤＰＰＩＶ）とのアラインメントは、ＤＰＰ８アミノ酸が特に基質特異性をコントロールする領域で特殊であることを表すことが認識される。従って、ＤＰＰ８触媒活性を特異的に阻害し、ＤＰＰＩＶ様遺伝子ファミリーメンバー又は他のセリンプロテアーゼの触媒活性を阻害しない阻害剤を特定することが可能であろうと期待される。このように第６の観点では、本発明は特異的にＤＰＰ８による基質開裂を阻害することができる分子を特定する方法であって、
（ａ）ＤＰＰ８及びさらなるプロテアーゼと分子とを接触させる工程と、
（ｂ）工程（ａ）のＤＰＰ８及びさらなるプロテアーゼと、ＤＰＰ８及びさらなるプロテアーゼが開裂できる基質とを、ＤＰＰ８及びさらなるプロテアーゼによる基質開裂に充分な条件下で接触させる工程と、
（ｃ）ＤＰＰ８が開裂しないが、さらなるプロテアーゼが開裂する基質を検出し、分子がＤＰＰ８による基質開裂を特異的に阻害することができることを特定する工程とを含んでなる方法を提供する。
【００２３】
第７の観点では、本発明はＤＰＰ８の触媒活性を低減又は阻害する方法であって、ＤＰＰ８とＤＰＰ８触媒活性の阻害剤とを接触させる工程を含んでなる方法を提供する。ＤＰＰ８触媒活性を阻害するＤＰＰＩＶ触媒活性の種々の阻害剤を本明細書中に示し、ＤＰＰＩＶの他の阻害剤がＤＰＰ８触媒活性を阻害するために有用であるかもしれないことを認識する。第７の観点における使用にとって適切な阻害剤の例は、（２１、２２、２３）に記載されている。ＤＰＰ８触媒活性を阻害するために有用な他の阻害剤は、本発明の第５又は第６の観点の方法により特定することができ、これらの方法は本明細書中に例示する。
【００２４】
一実施形態では、ＤＰＰ８触媒活性の阻害剤をほ乳類へ投与することによりＤＰＰ８の触媒活性をほ乳類において低減又は阻害する。これらの阻害剤を用いてｉｎ  ｖｉｖｏでＤＰＰＩＶ触媒活性を低減又は阻害し、従ってｉｎ  ｖｉｖｏでＤＰＰ８触媒活性を阻害するために用いることができると認識される。この目的に有用な阻害剤の例を以下に例示する（２１、３２〜３４）。
【００２５】
好ましくは、ほ乳類のＤＰＰ８の触媒活性を、ほ乳類の病気の治療目的で、ほ乳類において低減又は阻害する。ＤＰＰ８触媒活性の阻害剤により治療されるであろう病気は、ＤＰＰＩＶ様遺伝子ファミリーメンバーが関連するものであり（３、１０、１１、１７、２１、３６）、例えば腫瘍形成、糖尿病ＩＩ型、肝硬変、自己免疫、移植片拒絶及びＨＩＶ感染が挙げられる。
【００２６】
好ましくは、本発明の第７の観点における使用のための阻害剤はプロリンに隣接するペプチド結合Ｃ末端の開裂を阻害するものである。本明細書中に記載するように、これらの阻害剤の例としては、４-（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオライド、アプロチニン、ベンズアミジン／ＨＣｌ、Ａｌａ-Ｐｒｏ-Ｇｌｙ、Ｈ-Ｌｙｓ-Ｐｒｏ-ＯＨ  ＨＣｌ塩及び例えば硫酸亜鉛又は塩酸亜鉛といった亜鉛イオンが挙げられる。より好ましくは、阻害剤は特異的にＤＰＰ８触媒活性を阻害し、例えばＤＰＰＩＶ又はＦＡＰといった他のセリンプロテアーゼの触媒活性を阻害しないものである。
【００２７】
第８の観点では、本発明は基質をＤＰＰ８と、ＤＰＰ８による開裂にとって充分な条件下接触させ、基質を開裂することを含んでなる基質の開裂方法を提供する。本方法により開裂され得る分子の例は、Ｈ-Ａｌａ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ、Ｈ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ及びＨ-Ａｒｇ-Ｐｒｏ-ｐＮＡである。基質の開裂にとって充分な条件は本明細書中に記載する。ＲＡＮＴＥＳ、エオタキシン、マクロファージ由来ケモカイン、ストロマ細胞由来因子１、グルカゴン及びグルカゴン様ペプチド１及び２、ニューロペプチドＹ、物質Ｐ及び血管活性ペプチドといったＤＰＰＩＶにより開裂される分子は、ＤＰＰ８によっても開裂されるようである（１１、１２）。一実施形態では、基質は基質のプロリンに隣接するペプチド結合Ｃ末端を開裂することにより開裂される。ＤＰＰ８が開裂する分子は、Ｐ１位置にＰｒｏの代わりにＡｌａ、又はＴｒｐ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ又はＬｅｕを有するであろう（１１、１２）。
【００２８】
本明細書中に記載するように、ＤＰＰ８遺伝子発現は刺激したリンパ球又はリンパ球細胞系においてアップレギュレートされ、これはＤＰＰ８がＴ細胞共刺激及び増殖において機能的役割を有するかもしれないことを示唆する。従って、ＤＰＰ８遺伝子発現の測定がＴ細胞活性化を検出するのに有用であることが認識される。このように第９の観点では、本発明は活性Ｔ細胞を検出する方法であって、Ｔ細胞におけるＤＰＰ８遺伝子発現のレベルを検出する工程を含んでなる方法を提供する。一実施態様では、ＤＰＰ８遺伝子発現のレベルは、本明細書中に記載するように細胞内ＤＰＰ８ｍＲＮＡの量を測定することにより検出される。
【００２９】
本発明者らは、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする核酸分子の配列を特徴付けた。このように第１０の観点では、本発明は配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。
【００３０】
第１１の観点では、本発明は配列番号２に示す配列からなる核酸分子を提供する。
【００３１】
本明細書中に記載するように、長さ２．６〜３．１ｋｂのオープンリーディングフレームを有するＤＰＰ８ＲＮＡの少なくとも３つのスプライス変型が観察される。フレームシフト突然変異又は終結シグナルがこれらのスプライス変型の配列では観察されないので、また２個のスプライス変型のコード配列は触媒活性に関連するアミノ酸配列をコードする配列を含むので、スプライス変型によりコードされるペプチドのいくつかはＤＰＰ８の基質特異性を有するであろうと認識される。このように実施形態では、核酸分子は長さ約２．６〜３．１ｋｂであり、配列番号１に示す配列の基質特異性を有するペプチドをコードする配列番号１に示す配列のフラグメントである。好ましくは、核酸分子は配列番号４、６及び８のいずれかに示す配列を有する。
【００３２】
第１２の観点では、本発明は、厳密な条件下で配列番号２に示す配列からなる核酸分子にハイブリダイズすることができ、かつ配列番号１に示す配列の基質特異性を有するペプチドをコードする核酸分子を提供する。本明細書中に記載するノーザンブロット分析に示されるように、ＤＰＰ８ｍＲＮＡは３７℃での２×ＳＳＣ／１．０％ＳＤＳにおける洗浄後又は５０℃での０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでの洗浄後、配列番号２に示す配列に特異的にハイブリダイズする。「厳密な条件」とは、核酸分子を２×ＳＳＣ／１．０％ＳＤＳにさらす条件をいう。好ましくは、核酸分子は高く厳密な条件下で配列番号２に示す配列からなる分子にハイブリダイズすることができる。「高く厳密な条件」とは、核酸分子を５０℃で０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにさらす条件をいう。
【００３３】
本明細書中に記載するように、本発明者らはＤＰＰ８をコードする遺伝子がヒト染色体１５上のバンドｑ２２に位置すると考える。ＤＰＰ８遺伝子の位置は、染色体２の、バンド２ｑ２４．３及び２ｑ２３に、又は染色体７に位置する他のプロピルオリゴペプチダーゼをコードする遺伝子とは区別される。このように実施形態では、核酸分子はヒト染色体１５のバンドｑ２２に位置する遺伝子にハイブリダイズすることができるものである。
【００３４】
配列番号１に示すアミノ酸配列をコードし、又は配列番号２に示す配列を含んでなる核酸分子は、標準的技術を用いて翻訳される配列のフラグメントを製造することにより作成されるであろうと認識される（３０、３１）。
【００３５】
このように実施形態では、核酸分子は５’又は３’非翻訳配列を含まない。
【００３６】
第１３の観点では、本発明は本発明の第１０の観点の核酸分子を含んでなるベクターを提供する。一実施形態では、ベクターはＣＯＳ-７細胞、ＣＨＯ細胞又は２９３Ｔ細胞、又はＥ．ｃｏｌｉで複製することができる。別の実施態様では、ベクターはλＴｒｉｐｌｅＥｘ、ｐＴｒｉｐｌｅＥｘ、ｐＧＥＭ-ＴＥａｓｙベクター、ｐＳｅｃＴａｇ２Ｈｙｇｒｏ、ｐｅｔ１５ｂ、ｐＥＥ１４．ＨＣＭＶ．ｇｓ及びｐＣＤＮＡ３．１／Ｖ５／Ｈｉｓからなる群より選択される。
【００３７】
第１４の観点では、本発明は本発明の第１３の観点のベクターを含んでなる細胞を提供する。一実施形態では、細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉはＭＣ１０６１、ＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＢＬ２１ＤＥ３、ｐＬｙｓＳである。別の実施形態では、細胞はＣＯＳ-７、ＣＯＳ-１、２９３Ｔ又はＣＨＯ細胞である。
【００３８】
第１５の観点では、本発明は本発明の第１の観点のペプチドを作成する方法であって、本発明の第１４の観点に従って細胞を細胞によるペプチド発現にとって充分な条件下で維持することを含んでなる方法を提供する。発現にとって充分な条件は本明細書中に記載する。一実施形態では、本方法はさらにペプチドを単離する工程を含んでなる。
【００３９】
第１６の観点では、本発明は第１５の観点の方法により製造されるペプチドを提供する。
【００４０】
第１７の観点では、本発明は第１の観点のペプチド及び薬学的に許容し得る担体を含んでなる組成物を提供する。
【００４１】
第１８の観点では、本発明は本発明の第１の観点に従うペプチドを結合することができる抗体を提供する。抗体は、主体を標準的技術に従って精製ＤＰＰ８又はそのフラグメントで免疫化することにより調製することができる（３５）。本明細書中に記載するように、一時的にトランスフェクションしたＤＰＰ８＋細胞で免疫化することにより抗体を作成した。抗体はＤＰＰ８の活性を阻害するため、又はＤＰＰ８の遺伝子発現増大を検出するために、活性化Ｔ細胞を特定する目的で有用である。一実施形態では、本発明の第８の観点の抗体をハイブリドーマ細胞により製造する。
第１９の観点では、本発明は第１９の観点の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を提供する。
【００４２】
図面の簡単な説明
図１は全長ＤＰＰ８ｃＤＮＡを単離するためのクローニングストラテジー及び観察されるＤＰＰ８の代替的スプライシング変型を示す。３つのスプライス変型の説明は、一つのスプライス変型によるセリン認識部位（Ｔ８）の欠失を含むことを示す。
図２はヒトＤＰＰ８のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。ヌクレオチド及び予測される一文字コードアミノ酸配列を示す。この配列は、推定膜スパニングドメイン（疎水性プロットにより導かれる）又は有効Ｎ連結グリコシル化部位がない。Ｓｅｒ-Ａｓｐ-Ｈｉｓ触媒三つ組みを形成する推定セリン認識部位及びアスパラギン酸及びヒスチジンにマークする。正しい余白で塩基対を番号付けする。
図３はＤＰＰ８の導かれたアミノ酸残基配列とＤＰＰ８のＣ．ｅｌｅｇａｎｓホモログ及びヒトＤＰＰＩＶとのアラインメントを示す。アミノ酸残基を正しい余白で番号付けする。３つ全てのタンパク質で同一のアミノ酸残基を囲む。アスタリスクは、推定触媒三つ組み残基及びＤＰＰＩＶ酵素活性にとって本質的なβプロペラドメインの２個のグルタミン酸塩をマークする。灰色の陰は、これらのタンパク質のα／β加水分解酵素ドメインを印す。線で結びつけた黒塗りの三角は、代替的にスプライスした転写物、ｓｔＰＢＭＣｄｙ３-３-１０（実線）、Ｔ８（ダッシュ線）及びＴ２１（実線）の開始及び終結を示す。ＧＣＧのＰＩＬＥＵＰプログラムを用いて、アラインメントを構築した。
図４はＤＰＰ８発現のノーザンブロット分析を示す。レーン当たり２μｇのポリＡ＋ＲＮＡを含むヒト多重組織ノーザンブロット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を３２Ｐ標識ＤＰＰ８プローブと６８℃でハイブリダイズし、高いストリンジェンシーで洗浄した。オートラジオグラフを１日間−７０℃でＢＩＯＭＡＸ  ＭＳスクリーンと共に放射した。分子質量マーカーを各ラジオグラムの左側の塩基対に示す。図４ａの、ポリＡ＋ＲＮＡのＭａｓｔｅｒＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）ブロットを６５℃で３２Ｐ標識ＤＰＰ８プローブとハイブリダイズし、高いストリンジェンシーで洗浄した。オートラジオグラフを３日間−７０℃でＢＩＯＭＡＸ  ＭＳスクリーンと共に放射した。ＤＰＰ８ｍＲＮＡを調べた組織全てにおいて検出した。
図５はヒトＤＰＰ８の染色体位置を示す。ビオチニル化ＤＰＰ８ｃＤＮＡプローブと共にＦＩＳＨを示す中期である。通常の雄性染色体をＤＡＰＩで染色した。染色体１５上のハイブリダイゼーション部位を矢印で示す。
図６はトランスフェクションした細胞系のウェスタンブロット分析を示す。安定細胞系のライセートの分析である。ＤＰＰ８タンパク質はＤＰＰ８／Ｖ５／Ｈｉｓ安定細胞系には見られるが、ＤＰＰ４又はベクターのみの安定細胞系では見られなかった。タンパク質の電気泳動による移動は、試料を煮沸しても変わらなかった。より大きく移動したバンドは、おそらくインタクトなＤＰＰ８の産物を破壊した。
図７はＤＰＰ８酵素活性を示す。（Ａ）ＤＰＰ８酵素活性のｐＨ依存性、（Ｂ）ＤＰＰ８及びＤＰＰＩＶ酵素速度論である。分当たりの吸光度の平均＋／−ＳＤを、１００を乗じて示す。曲線の当てはめは、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ-Ｍｅｎｔｅｎの速度論を仮定した。
図８はＤＰＰ８発現のＲＴ-ＰＣＲ分析を示す。代替的スプライシングが含まれないヒトＤＰＰ８の部分、Ｖａｌ４１６〜Ｇｌｙ６７９（各ゲルのトップ）又はグリセルアルデヒド-３-ホスホネートデヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）（各ゲルのボトム）に特異的なプライマーを用いたＰＣＲ増幅である。（Ａ）トップゲル、レーン１〜５は５人の主体からの刺激していないＰＢＭＣｃＤＮＡ由来のＰＣＲ産物を含む。ボトムゲル、レーン６〜１１は６人の主体からのＯＫＴ３刺激ＰＢＭＣｃＤＮＡ由来のＰＣＲ産物を含む。（Ｂ）ＰＣＲ産物は示したようにリンパ細胞系、肝臓又は胎盤由来のｃＤＮＡからのものである。ネガティブコントロール増幅は、反応混合物、酵素を含み、ｃＤＮＡ鋳型を含んでいなかった。各ＰＣＲは３５サイクル実施した。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色した。各ゲルの左レーンは、サイズマーカーとしてＨａｅＩＩＩで消化したＰＵＣ１９を含む。
図９はマウスＤＰＰ８発現のノーザンブロット分析を示す。全ＲＮＡのレーン当たり１０μｇを含むマウスノーザンブロットを、３２Ｐ標識ヒトＤＰＰ８プローブと６０℃でハイブリダイズし、低いストリンジェンシーで洗浄した。オートラジオグラフを３日間−７０℃でＢＩＯＭＡＸ  ＭＳスクリーンを用いて放射した。
【００４３】
実施例
一般
クローニングに用いた制限酵素及び他の酵素はＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｒｏｃｈｅから入手した。特に記載した以外は、標準的分子生物学技術を用いた（３１）。
【００４４】
ＥＳＴクローン（ＧＥＮＢＡＮＫＴＭ受け入れ番号ＡＡ４１７７８７）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。このクローンのＤＮＡ挿入を、ＳＵＰＡＭＡＣ（Ｓｙｄｎｅｙ、オーストラリア国）で自動配列決定を用いて両鎖について配列決定した。
【００４５】
細胞培養及びＲＮＡ調製
ヒト末梢血液単球（ＰＢＭＣ）を、健康なドナーから得た血液のＦｉｃｏｌｌ-Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン国）により単離した。ＰＢＭＣを、２ｍＭ  Ｌ-グルタミンを加えたＡＩＭ-Ｖ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、米国）でインキュベートし、１μｇ．ｍＬ-１フィトヘマグルチニン（Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）又は１００ｎｇ．ｍＬ-１ＯＫＴ３（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ、ＦＬ、米国）を用いて７２時間刺激した。ヒト細胞系Ｊｕｒｋａｔ、ＣＣＲＦ-ＣＥＭ、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ及びＨｅｐＧ２を、１０％仔ウシ血清及び２ｍＭＬ-グルタミンを加えたダルベッコの修飾イーグル培地（Ｔｒａｃｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＮＳＷ、オーストラリア国）で密集となるまで成長させた。
【００４６】
肝臓及び胎盤ＲＮＡを、前述のように（３７）スナップ凍結ヒト組織から調製した。しかしながら、ＲＮＡはＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、独国）を用いてＰＢＭＣ及び細胞系から調製した。
【００４７】
バイオインフォマティクス
ＢＬＡＳＴプログラム（３８）及び全ての多重配列アラインメントを、Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＡＮＧＩＳ、Ｓｙｄｎｅｙ、ＮＳＷ、オーストラリア国）により実施した。タンパク質の多重配列アラインメントについては、ＰＩＬＥＵＰ（ＧＣＧバージョン８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）を用いた。
【００４８】
ＢＬＡＳＴサーチを、疑問の配列として鋳型ヒトＤＰＰＩＶ（ＧｅｎＢａｎｋＴＭ受け入れ番号Ｘ６０７０８）及びＦＡＰ（受け入れ番号Ｕ０９２７８）ヌクレオチド配列を用いて公表されている配列標識（ＥＳＴ）データベースについて実施した。ＥＳＴクローン（受け入れ番号ＡＡ４１７７８７）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。このクローンのＤＮＡ挿入を、ＳＵＰＡＭＡＣ（Ｓｙｄｎｅｙ、ＮＳＷ、オーストラリア国）で自動配列決定を用いて両鎖について配列決定した。ＤＰＰＩＶとのそのホモロジーのために、この新規遺伝子はジペプチジルペプチダーゼ８（ＤＰＰ８）と名付けた。
【００４９】
ＤＰＰ８クローニング
ＥＳＴＡＡ４１７７８７を用いて、ＥＳＴＡＡ４１７７８７からのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのフォワード（ｃａａ  ａｔａ  ｇａａ  ａｔｔ  ｇａｃ  ｇａｔ  ｃａｇ  ｇｔｇ）及びリバース（ｔｃｔ  ｔｇａ  ａｇｇ  ｔａｇ  ｔｇｃ  ａａａ  ａｇａ  ｔｇｃ）ＤＰＰ８プライマーを設計した。ＰＣＲ条件は、以下の：９４℃で５分間後、９４℃で１分間、５５℃で３０秒間及び７０℃で１分間を３５サイクルとした。この４８４ｂｐＰＣＲ産物をゲル精製し、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ、英国）を用いて３２Ｐ−α標識し、かつ製造者の指示に従ってドットに固定した５０人の大人及び子供の組織由来のポリＡ＋を含むＭａｓｔｅｒ  ＲＮＡブロット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、米国）にハイブリダイズさせた。このＭａｓｔｅｒ  ＲＮＡブロットを、ｍＲＮＡ組織発現比較のためにＤＰＰ４を用いてもプローブした。
【００５０】
フォワード及びリバースＤＰＰ８プライマーをＰＣＲに用いて、ライブラリー中のＤＰＰ８ｃＤＮＡの存在についてヒト胎盤λＳＴＲＥＴＣＨ  ＰＬＵＳ  ライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、米国）をスクリーンした。次に、ライブラリーを標準的分子生物学技術（３０、３１）によりスクリーンした。最初のスクリーニング後、２３クローンを第２クローニングのために選択し、その後２２個を陽性として残した。三次スクリーンのために、λＴｒｉｐｌｅＥｘに含まれるクローンをｐＴｒｉｐｌＥｘプラスミドに変換し、そしてＢＭ２５．８Ｅ．ｃｏｌｉ受容菌に形質転換した。プレートにまいた菌をスクリーンし、２２個全てのクローンがポジティブであることを確認した。これらのクローンのうちの２個、Ｔ８及びＴ２１をさらなる研究のために選択した。
【００５１】
５’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端のラピッド増幅）
５’ＲＡＣＥバージョン２．０キット（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、キットの指示に記載された通りに活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）及び胎盤ＲＮＡについて適用した。Ｔ８ＤＮＡ配列を用いてＧＳＰ１（ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＣＴＴ  ＣＡＧ  ＣＡＴ  ＣＡＡ  ＴＣ）及びＧＳＰ２（ＣＴＴ  ＡＡＡ  ＡＧＴ  ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＡＧＧ  ＡＴＴ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＡＣＣ）を設計した。５’ＲＡＣＥ  ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ-Ｔ  Ｅａｓｙ（登録商標）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）にクローニングし、プライマーウォーキングにより配列決定した。
【００５２】
ＲＡＣＥ産物の同一性の確認
逆転写酵素ＰＣＲを、ＤＰＰ８-ｐｒ２３（ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＡＧＡ  ＴＧＣ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＴＧＧ）及びＤＰＰ８-ｐｒ１９ｒ（ＴＣＣ  ＧＴＧ  ＴＡＴ  ＣＣＴ  ＧＴＡ  ＴＣＡ  ＴＡＧ  ＡＡＧ）を用いてＡＴＣ  ＲＮＡについて実施し、ＲＡＣＥ産物とＥＳＴ及びライブラリークローンとの間の結合にわたってスパンした。２つのゲル精製産物ＡＴＣｄ３-２-１（１６０３ｂｐ）及びＡＴＣ３-３-１０（１０７７ｂｐ）を、ｐＧＥＭ-Ｔ  Ｅａｓｙ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）にクローニングし、配列決定した。
【００５３】
ＤＰＰ８ｃＤＮＡのｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５／Ｈｉｓ発現ベクターへのサブクローニング
ＡＴＣ  ＲＡＣＥ産物、ＡＴＣｄ３-２-１（１６０３ｂｐ）結合フラグメント及びライブラリークローンＴ２１を共に結合し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５／Ｈｉｓ  Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、オランダ王国）にクローニングし、８８２アミノ酸のオープンリーディングフレームを有する３．１ｋｂのＤＰＰ８ｃＤＮＡを形成した。第１構築物を３つの連続するクローニング工程を用いて作成した。まず、Ｔ２１（ＤＰＰ８ｃＤＮＡについての３'ＤＰＰ８、終結コドン及び３’非翻訳領域を含む）のＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩフラグメントを、ＥｃｏＲＶ／ＸｂａＩで消化したベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５／Ｈｉｓに連結した。次に、ＡＴＣｄ３-２-１のＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶで消化したこの構築物に加えた。最後に、ＲＡＣＥ産物をＥｃｏＲＩで切断し、前の構築物のＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、完全な３．１ｋｂ  ＤＰＰ８ｃＤＮＡを形成した。この構築物ｐｃＤＮＡ３．１-ＤＰＰ８は、検出可能な標識のないタンパク質を発現した。さらに、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５／Ｈｉｓ  Ｖ５のＤＰＰ８発現構築物にある終結コドンを遺伝子的にＰＣＲを用いて変え、ベクターに含まれるＶ５及びＨｉｓ標識を有するＣ末端融合を作成した。この構築物をｐｃＤＮＡ３．１-ＤＰＰ８／Ｖ５／Ｈｉｓと名付けた。ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５／Ｈｉｓにサブクローニングした全ての発現構築物を、全配列分析により検証した。
【００５４】
ノーザンブロットによるＤＰＰ８遺伝子発現
２μｇのポリＡ＋ＲＮＡを含むヒト多重組織ノーザンブロット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）を、３０分間６８℃でＥｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ溶液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）において予備ハイブリダイズした。ＤＰＰ８  ４８４ｂｐ産物及び５’ＲＡＣＥ  ＡＴＣ産物の両者を、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）及び（３２Ｐ）ｄＣＴＰ（ＮＥＮ  Ｄｕｐｏｎｔ）を用いて放射標識した。取り込まれなかった標識をＮＩＣＫカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて除去し、変性したプローブを２時間６８℃でＥｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ溶液中にインキュベートした。洗浄を高いストリンジェンシーで実施し、ブロットをＢＩＯＭＡＸ  ＭＳスクリーンを用いて−７０℃で一晩ＢＩＯＭＡＸ  ＭＳフィルムに放射した。
【００５５】
ノーザンブロットによるマウスでのＤＰＰ８遺伝子発現
レーン当たり１０μｇの全肝臓ＲＮＡを含むノーザンブロットを、標準的な方法（３１）を用いて作成した。ＲＮＡはＣ５７Ｂ１６及びＢａｌｂ／ｃの２系統の雄性及び雌性マウスから導いた。ノーザンブロットを１時間６０℃でＥｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ溶液（ＣＬＯＮＴＥＣＨ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、米国）において予備ハイブリダイズした。２．４ｋｂのヒトＤＰＰ８ｃＤＮＡ（ＰＣＲ産物）を、Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）及び（３２Ｐ）ｄＣＴＰ（ＮＥＮ  Ｄｕｐｏｎｔ）を用いて放射標識した。取り込まれなかった標識をＮＩＣＫカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて除去し、変性したプローブを一晩６０℃でＥｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ溶液中にブロットと共にインキュベートした。洗浄を低いストリンジェンシー（２×ＳＳＣ／０．０５％ＳＤＳで１時間３７℃の後、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで３０分間４０℃）で実施し、ブロットをＢＩＯＭＡＸ  ＭＳスクリーンを用いて−７０℃で３日間ＢＩＯＭＡＸ  ＭＳフィルムに放射した。
【００５６】
ｒｔＰＣＲを用いたマウス肝臓におけるＤＰＰ８の発現
マウス肝臓ＲＮＡを、前述のように（４２）ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ酵素キット（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて逆転写した。ｃＤＮＡを４に対し１希釈し、−７０℃でアリコートに保存した。フォワードプライマーとしてマウスＤＰＰ８-ｐｒ１Ｆ（ａｔｇ  ａｔｔ  ａｃｃ  ａｃｃ  ｃａｇ  ｇａａ  ｇｃｇ）及びリバースプライマーとしてマウスＤＰＰ８-ｐｒ２Ｒ（ａｔｃ  ｔｃｃ  ｇａｃ  ａｔｃ  ｔｔｇ  ａａａ  ｇｔｇ  ａｃｃ）を用いたＰＣＲを用いて、マウスＤＰＰ８ｍＲＮＡを検出した。
【００５７】
希釈したｃＤＮＡ１μｌを、０．２ｍＭｄＮＴＰ、５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、１×Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲ緩衝液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）１μｌ及び各プライマー１００ｎｇを含むＰＣＲ反応物５０μｌにおいて増幅した。ＰＣＲは９５℃で１分間の最初の工程を含み、ＴａｑＳｔａｒｔ抗体を不活化した。この後９５℃で３０秒間、６８℃で１分間の変性、さらに６８℃で１分間の最終工程を行った。増幅産物を、ＰＣＲ反応物１０μｌの３：１Ｎｕｓｉｅｖｅゲル（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）プラス臭化エチジウム０．５μｇ／ｍｌのＴＡＥ緩衝液（０．０４Ｍ酢酸Ｔｒｉｓ、０．００１ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）上での電気泳動により分析した。次に、ゲルを標準的技術（３１）を用いてサザンブロットした。サザンブロットを６０℃で２時間、前記のように調製した２．４ｋｂのヒトＤＰＰ８ｃＤＮＡプローブと共にハイブリダイズした。洗浄を低いストリンジェンシー（２×ＳＳＣ／０．０５％ＳＤＳで１時間３７℃の後、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで４０分間５０℃）で実施した。ブロットを室温で３０分間ＸＡＲ５コダックフィルムに放射した。
【００５８】
ＲＴ-ＰＣＲによるＤＰＰ８発現
逆転写酵素ＰＣＲを、ＴＥＤプライマーＤＰＰ８／ｐｒ３（ＧＣＡ  ＣＴＡ  ＣＣＴ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＣＣＴ  ＴＧＧ）及びＤＰＰ８／ｐｒ２０Ｒ（ＴＡＴ  ＧＧＴ  ＡＴＴ  ＧＣＴ  ＧＧＧ  ＴＣＴ  ＣＴＣ  ＡＧＧ）を用いてヒトＡＴＣ  ＲＮＡ、ヒト胎盤ＲＮＡ及びヒト肝臓ＲＮＡについて実施し、２９３ｂｐの産物を得た。
【００５９】
トランスフェクション、ウェスタンブロット、免疫細胞化学、細胞化学及びフローサイトメトリー
サル腎臓線維芽細胞（ＣＯＳ-７）細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＣＲＬ-１６５１）を前述のように（３９）増殖させ、トランスフェクションさせた。安定な細胞系を作成するために、トランスフェクション後２４時間の始まりにＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８、Ｇｉｂｃｏ-ＢＲＬ）を培地に加えた。前述のように（４０、９）、ＣＯＳ細胞抽出物を音波処理後、分画遠心法及びＳＤＳ／ＰＡＧＥ（１０％ゲル）前に煮沸するでもなく減少させることもなく、ニトロセルロースに移すことにより調製した。Ｖ５エピトープと融合したＤＰＰ８の存在を、抗Ｖ５ｍＡｂ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）を用いて検出した。ＣＯＳ細胞の単層を抗Ｖ５ｍＡｂで染色する前に冷エタノールで固定した（３９、４１、９）。いくつかの単層を４％パラホルムアルデヒドで固定し、かつ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００を浸透させ（３５）、次にそれぞれＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ４８８及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、米国）に複合した標識Ｇｏｌｇｉ装置に対するコムギ生殖凝集素を用いて、及び標識ＤＰＰ８に対するヤギ抗マウスＩｇＧを用いて二重染色した。フローサイトメトリー及びＬｅｉｃａ  ＴＣＳ-ＮＴ共焦点顕微鏡を用いた走査型共焦点顕微鏡は、前述している（３９、９）。
【００６０】
組換えＤＰＰ８／Ｖ５／Ｈｉｓ及びＤＰＰＩＶ／Ｖ５／Ｈｉｓの精製
各タンパク質を発現している細胞（１×１０７）を、自然の緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭＮａＣｌ）で音波処理し、次に２０分間室温で７００ＵＤＮＡｓｅで処理した。ＤＰＰＩＶは細胞表面で発現するので、１％ＴｒｉｔｏｎＸ-１００を用いてＤＰＰＩＶ／Ｖ５／Ｈｉｓを可溶性とした。不溶性の材料を遠心分離により除去した。上清を１ｍＬＴａｌｏｎ（登録商標）金属アフィニティー樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて製造者の指示に従ってバッチ／比重フロー操作のためにインキュベートした。樹脂を３００ｍＭＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウムを用いて洗浄し、かつタンパク質を１５０ｍＭイミダゾールを含有する同じ緩衝液を用いて溶出した。酵素活性を用いて、溶出した画分をモニターした。
【００６１】
酵素アッセイ
前述のように（１）、酵素アッセイを実施した。１×１０４の音波処理したＣＯＳ-７細胞由来の浄化細胞抽出物又は１×１０５細胞由来の精製タンパク質を、特に記載した以外は、３０分間３７℃で７０μｌリン酸緩衝液ｐＨ７．４において基質とインキュベートした。特異的なＤＰＰＩＶ基質、Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-スルホン酸トルエン、Ｈ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-ｐ-ニトロアニリド（ＮＡ）／ＨＣｌ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）及びＧｌｙ-Ｐｒｏ-７-アミノ-４-トリフルオロメチルクーマリン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）を試験した。試験した他の基質は、Ｂａｃｈｅｍ（スイス国）から入手したＨ-Ａｌａ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ／ＨＣｌ、Ｈ-Ａｒｇ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ酢酸塩、Ｈ-Ｌｙｓ-Ａｌａ-ｐＮＡ．２ＨＣｌ、Ｈ-Ａｓｐ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ、Ｈ-Ａｌａ-Ａｌａ-ｐＮＡ／ＨＣｌ、Ｈ-Ａｌａ-Ａｌａ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ／ＨＣｌ、Ｈ-Ａｌａ-Ａｌａ-Ｐｈｅ-ｐＮＡ、スクシニル-Ａｌａ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ、Ｈ-Ａｌａ-Ｐｈｅ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ及びＺ-Ａｌａ-Ｐｒｏ-ｐ-ＮＡであった。Ｈ-Ａｌａ-Ｐｒｏ-４-メトキシβＮＡ／ＨＣｌ、Ｚ-Ｌｙｓ-Ｐｒｏ-４-メトキシβＮＡ蟻酸塩、Ｈ-Ｌｙｓ-Ｐｒｏ-４-メトキシβＮＡ／ＨＣｌ、Ｚ-Ａｌａ-Ｐｒｏ-４-メトキシβＮＡ、Ｈ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-βＮＡ及びＨ-Ｈｉｓ-Ｓｅｒ-４-メトキシβＮＡ酢酸塩（Ｂａｃｈｅｍ）を、固定していないトランスフェクションした細胞を染色するその能力について試験した。全ての阻害剤を（表２を参照）基質の添加前に、１５分間リン酸緩衝液ｐＨ７．４において各精製酵素と共にインキュベートした。精製ＤＰＰ８については１ｍＭＨ-Ａｌａ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ基質を及び精製ＤＰＰＩＶについては１ｍＭＨ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ基質を添加した後、試料を６０分間３７℃でインキュベートした。全ての酵素アッセイは、三連で実施した。
【００６２】
蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析によるＤＰＰ８の染色体位置決定
ＤＰＰ８を、２つの異なるプローブＤＰＰ８ＥＳＴ及びＴ８クローンを用いて位置決定した。プローブをビオチン-Ｃ１４-ｄＡＴＰを用いてニックトランスレーションし、２つの正常な雄性中期に対し１０ｎｇ／μｌの最終濃度でｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイズした。ＦＩＳＨ法を修飾したが、これは染色体を分析前にヨウ化プロピジウム（対比染色として）及びＤＡＰＩ（染色体特定のために）の両者を用いて分析の前に染色するという以前に記載されたものである（３７）。中期調製物の像をＣｙｔｏ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｕｌｔｒａイメージコレクション及び増大システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ）を用いて冷却したＣＣＤカメラにより捉えた。ＦＩＳＨシグナル及びＤＡＰＩバンドパターンを、図調整のために合わせた。
【００６３】
ヒトリンパ球及び細胞系におけるＤＰＰ８の発現
ＲＮＡ（１μｇ）を、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ酵素キット（Ｇｉｂｃｏ-ＢＲＬ）を用いて以前に記載されているように（４２）逆転写した。フォワードプライマーとしてＤＰＰ８-ｐｒ１８（ＣＴＧＴＧＡＣＧＣＣＡＣＴＡＡＴＴＡＴＣＴＡＴＧ）及びリバースプライマーとしてＤＰＰ８-ｐｒ２６Ｒ（ＣＣＴＡＧＡＧＡＧＧＣＴＡＧＧＧＴＡＴＴＣＡＡＧ）を用いたＰＣＲを用いて、全長ＤＰＰ８ｍＲＮＡを検出した。グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）コントロールプライマーセットは、Ｇ３ＰＤＨｆｏｒ（ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ）及びＧ３ＰＤＨｒｅｖ（ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ）であり、４７０ｂｐの産物を得た。
【００６４】
ｃＤＮＡ（１：４希釈、１μｇ）を、０．２ｍＭｄＮＴＰ、０．１２５ｕｎｉｔ  Ａｍｐｌｉｔａｑ  Ｇｏｌｄ酵素（Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ）、１×緩衝液ＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ-Ｅｌｍｅｒ）、１．５ｍＭＭｇＣｌ２及び１００ｎｇｍＬ-１各プライマーを含有するＰＣＲ混合物２５μＬで増幅した。３５サイクルのＰＣＲを以下のように、９４℃で１分間の変性、５５℃で３０秒間のプライマーアニーリング、及び７２℃で１分間の伸長工程で実施した。増幅産物を、３：１Ｎｕｓｉｅｖｅゲル（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、米国）プラス０．５μｇｍＬ-１臭化エチジウム上でＴｒｉｓ／酢酸塩／ＥＤＴＡ緩衝液（０．０４ＭＴｒｉｓ／酢酸塩、０．００１ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）における１５μＬＰＣＲ混合物の電気泳動により分析した。
【００６５】
抗ペプチド抗体
方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（３６）に記載されている通りにした。２つのペプチドをソフトウェアＭａｃＶｅｃｔｏｒを用いて選択し、抗原性を予測した。２つのペプチドをカスタム合成し（Ａｕｓｐｅｐ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）、かつジフテリア毒素に複合した（Ａｕｓｐｅｐ、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）。ウサギを両ペプチドを用いて免疫化し、時間ゼロ及び各注射後に血清を採取した（ＩＭＶＳ、Ａｄｅｌａｉｄｅ）。
【００６６】
用いた２つのペプチドは、
ペプチド名：ＴＥＤＤＡ-Ｎ
配列：ＣＴＧＹＴＥＲＹＭＧＨＰＤＱＮＥＱＧ-ＮＨ２
（これはアミノ酸７７３〜７８９プラスＮ末端にＣｙｓを有する）
【００６７】
ペプチド名：ＴＥＤＤＲ-Ｃ
配列：ＧＫＰＹＤＬＱＩＹＰＱＥＲＨＳＣ-ＮＨ２
（これはアミノ酸８３６〜８５０プラスＣ末端にＣｙｓを有する）
であった。
【００６８】
これらの配列をＤＰＰ８のＣ末端からとった。
【００６９】
ＤＰＰ８に対するモノクローナル抗体
抗体製造については標準的な方法を用いた（３５）。マウスを、ｐｃＤＮＡ３ベクターに入れたＤＰＰ８ｃＤＮＡで一時的にトランスフェクションした２×１０７ＣＯＳ-７（アフリカングリーンサル腎臓）生細胞で免疫化した。最終免疫化は、ｐＥＥ１４ベクターに入れたＤＰＰ８ｃＤＮＡで安定にトランスフェクションしたＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を用いた。脾臓細胞を標準的な融合パートナー、Ｘ６３Ａｇ８骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリドーマ培養の上清を、ネガティブコントロールとしてトランスフェクションしていないＣＨＯ細胞を用いて、ＤＰＰ８トランスフェクションＣＨＯ細胞系の単層についてのイムノペルオキシダーゼ組織化学により試験した。抗体活性のあったハイブリドーマをクローニングした。
【００７０】
結果
ＤＰＰ８の分子クローニング及び配列分析
ＡＴＣＣ  ＥＳＴ  ＡＡ４１７７８７の挿入は長さ７９５ｂｐで、５２７ｂｐのコード配列、ＴＡＡ終結コドン及び２５８ｂｐの３’非コード配列を含んでいた（図１）。
【００７１】
Ｍａｓｔｅｒ  ＲＮＡブロットのハイブリダイゼーションでは、ＥＳＴＡＡ４１７７８７を含んでなる遺伝子が至るところで組織発現し、精巣及び胎盤で発現レベルが高いことを示した。この発現パターンに基づき、胎盤ｃＤＮＡライブラリーを、フォワード及びリバースＤＰＰ８プライマーにより製造した４８４ｂｐのＰＣＲ産物を用いてスクリーニングした。配列ホモロジー分析では、２３クローンのうち２つだけがＥＳＴＡＡ４１７７８７の配列に加えて５’配列を含むことを示した。これらのｃＤＮＡクローンをＴ８及びＴ２１とし、それらはそれぞれ１６６９ｂｐ及び１１９７ｂｐであった（図１）。さらに、ＥＳＴＡＡ４１７７８７に対するこれらの配列の比較では、Ｔ８ｃＤＮＡは１５３ｂｐ（５１アミノ酸）領域を欠き、これはＴ２１ｃＤＮＡ及びＥＳＴＡＡ４１７７８７に存在することを示した。この欠失は、Ｔ８ｃＤＮＡの触媒セリン（ＧＷＳＹＧＧ）を欠くという結果となるであろう。他に特徴付けた多くのクローンは、不完全なスプライシングの結果として恐らくはイントロン配列である関係のない配列を含んでいる可能性がある。
【００７２】
５’ＲＡＣＥ技術を、ＡＴＣ  ＲＮＡ及び胎盤ＲＮＡの両者について用い、ＤＰＰ８遺伝子の５’末端を得た。活性Ｔ細胞ＲＮＡから得たＲＡＣＥ産物は胎盤ＲＮＡから得たものより０．２ｋｂ大きかったが、それ以外は同一であった（図１）。Ｋｏｚａｋ配列内の最初のメチオニンは、活性Ｔ細胞ＲＡＣＥ産物の５’末端から２１４ｂｐのところに見いだされた。この５’２１１ｂｐの領域は７０．５％のＧＣリッチであり、多数の有効なプロモーター及びエンハンサーエレメント（Ｓｐ１、Ａｐ１及びＥＴＦ部位）を含んでおり、このことからＤＰＰ８遺伝子の５'フランキング領域であると導かれた。ＤＰＰ８の５'末端として５'ＲＡＣＥ産物の特定を確認するために、ＲＴ-ＰＣＲを実施し、ＲＡＣＥ産物とＴ８ｃＤＮＡライブラリークローンとの間の複合にわたってスパンした。ＡＴＣ  ＲＮＡについてのＲＴ-ＰＣＲは、２つのクローンＡＴＣｄ３-２-１及びＡＴＣ３-３-１０を産生した（図１）。Ｔ８及びＴ２１に比べて、両クローンはＴ８のスプライス部位へ直ぐに隣接する１４４ｂｐ（４８アミノ酸）の付加挿入領域を有していた。この付加挿入領域の配列ホモロジー分析により、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓホモログ及びＤＰＰ４の両者において相同な領域を見出した。これは明らかに、Ｔ８及びＴ２１ライブラリークローンがＤＰＰ８のスプライス変型を表すことを示した。より小さいクローンＡＴＣ３-３-１０も、１７５アミノ酸の欠失という結果になる５'末端での５１６ｂｐ欠失を含むので、ＤＰＰ８の別のスプライス変型を表すことがわかった。
【００７３】
全長ＤＰＰ８クローンを、より大きいＲＡＣＥ産物、ＡＴＣ３-２-１及びＴ２１ライブラリークローンを用いて作成した。これにより、さらなる配列分析及びＤＰＰ８機能調査のための、８８２アミノ酸のオープンリーディングフレームを有する３．１ｋｂの推定ＤＰＰ８ｃＤＮＡ（５’及び３'非翻訳領域）を産生した。この８８２の推定ＤＰＰ８タンパク質にはＮ連結グリコシル化部位がなく、またＫｙｔｅ-Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ疎水性分析ではＤＰＰ４、ＦＡＰ及びＤＰＰ６とは違って貫膜ドメインを欠いていることを示した。このように、ＤＰＰ８は細胞質タンパク質である可能性がある（図２）。予測したＤＰＰ８タンパク質は、ヒトＤＰＰ４と５１％のアミノ酸類似性及び２７％のアミノ酸同一性を有し、これらのタンパク質のＣ末端は最もホモロジーを示した（図３）。
【００７４】
Ｍａｓｔｅｒ  ＲＮＡ及びノーザンブロットにより決定したＤＰＰ８の組織分布
ｍａｓｔｅｒ  ＲＮＡブロットを、前述のようにフォワード及びリバースＤＰＰ８プライマーにより製造した４８４ｎｔのＰＣＲ産物を用いてプローブした。ＤＰＰ８のｍＲＮＡ組織発現は、全てのヒト成人及び子供組織の至る所にあった。同様の至る所にある発現パターンが、プローブとしてＤＰＰ４ｃＤＮＡを用いても観察された（データは示さず）。しかしながら可視的評価によると、各遺伝子特異的プローブを用いた発現の最高レベルは、異なる組織にあった。ＤＰＰ８プローブを用いた最強のシグナルは精巣にあり、次が胎盤であるのに対して、ＤＰＰ４プローブを用いた最強のシグナルは唾液腺及び前立腺にあり、次が胎盤であった（データは示さず）。プローブはブロットについてのいずれのネガティブコントロールにも結合していなかった。
【００７５】
ノーザンブロット分析を、異なるヒト組織由来のｍＲＮＡについて実施した（図４）。２つのＤＰＰ８特異的プローブは、調べた組織全てにおいて転写物の存在を示した。ＤＰＰ８メッセージのおおよその予想サイズと一致するサイズ約３．０ｋｂの転写物は、精巣においてのみ検出された。しかしながら、それぞれ８．０及び５．０ｋｂの２つの転写物は、精巣、脾臓、末梢血液白血球及び卵巣においては高レベルで、前立腺、小腸及び結腸粘膜においては中レベルで、胸腺においては低レベルで存在していた。多重組織ノーザンブロットも放射標識したヒトβアクチンプローブを用いてプローブし、そして共通の２．０ｋｂの転写物が全ての組織において見られた（図４）。
【００７６】
ノーザンブロット及びｒｔＰＣＲにより決定したマウスにおけるＤＰＰ８発現
ヒトＤＰＰ８ｃＤＭＡ配列を、マウス由来肝臓ＲＮＡを用いてクロスハイブリダイズした。マウス肝臓由来の全ＲＮＡを含有するノーザンブロットをヒトＤＰＰ８プローブにハイブリダイズし、ＤＰＰ８ｍＲＮＡがマウス肝臓で発現することを示した（図９Ａ）。マウスＤＰＰ８の２つのｍＲＮＡ転写物が存在していた。これはヒトＤＰＰ８について観察されたものと類似のパターンである。これらの転写物は恐らく異なる長さのマウスＤＰＰ８遺伝子の５'及び３'非翻訳領域を示す。マウス肝臓におけるＤＰＰ８ｍＲＮＡの存在も、ｒｔ-ＰＣＲを用いて実証した。試験したプライマーは、５３７ｂｐのＰＣＲ産物を産生した。この産物のサザンブロットにより、マウスＤＰＰ８がヒトＤＰＰ８とクロスハイブリダイズすることを確認した（図９Ｂ）。
【００７７】
ＤＰＰ８の発現及び機能活性
ＤＰＰ８タンパク質の機能を評価するために、３．１ｋｂの全長ＤＰＰ８ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１Ａ／Ｖ５／Ｈｉｓ発現ベクターのＸｂａＩ部位にクローニングし、２つの構築物を製造した。第１構築物、ｐｃＤＮＡ３．１-ＤＰＰ８はそれ自身についてのＤＰＰ８タンパク質を発現した一方で、第２構築物、ｐｃＤＮＡ３．１-ＤＰＰ８／Ｖ５／Ｈｉｓはタンパク質発現の分析を容易にするためのＤＰＰ８のＣ末端に融合したＶ５エピトープ及びＨｉｓ標識を有するタンパク質を発現した。ほ乳類発現構築物を安定にＣＯＳ-７細胞にトランスフェクションし、細胞の音波処理を調製した。アミノ酸配列から予測される分子量と一致して、１００ｋＤａモノマーを安定なＤＰＰ８／Ｖ５／Ｈｉｓ発現細胞のウェスタンブロッティングにより検出した（図６）。抗Ｖ５ｍＡｂを用いると、ＤＰＰ８／Ｖ５／Ｈｉｓタンパク質が細胞質画分に検出されたが、エタノール固定した安定なＤＰＰ８／Ｖ５／Ｈｉｓ発現ＣＯＳ細胞の表面上には検出されなかった。
【００７８】
ＤＰＰ８はジペプチジルペプチダーゼ
ＤＰＰＩＶとＤＰＰ８との間の配列ホモロジーは機能的類似性を示唆したので、ＤＰＰ８トランスフェクションした細胞の細胞ライセートをプロリン特異的ペプチダーゼ活性について調べた。Ｖ５／Ｈｉｓ標識を用いて又は用いずにＣＯＳ-７細胞で発現したＤＰＰＩＶをポジティブコントロールとし、そしてネガティブコントロールはベクターのみをトランスフェクションしたＣＯＳ-７細胞を含んだ。ＤＰＰ８トランスフェクションしたＣＯＳ-７細胞の抽出物はＨ-Ａｌａ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ及びＨ-Ａｒｇ-Ｐｒｏ-ｐＮＡを加水分解したが、Ｈ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ、Ｈ-Ｇｌｙ-Ａｒｇ-ｐＮＡ、Ｈ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-スルホン酸トルエン又はＨ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-７-アミノ-４-トリフルオロメチルクーマリンを加水分解せず、前記レベルはトランスフェクションしていないＣＯＳ-７細胞により示した（データは示さず）。ＤＰＰ８酵素活性の最適ｐＨは７．４であり（図５Ａ）、ＤＰＰＩＶ酵素活性の最適ｐＨ７．８と類似していた（４３、４４）。ＤＰＰ８はｐＨ６．３以下ではほとんど活性を示さず、これはリソソーム／エンドソーム／画分の酵素ではないことを示唆する。細胞単層について試験した全ての基質のうち、Ａｌａ-Ｐｒｏ-４ＭβＮＡ／ＨＣｌのみがＤＰＰ８トランスフェクションしたＣＯＳ細胞及びＣＨＯ細胞を染色した（データは示さず）。
【００７９】
精製した組換えＤＰＰ８／Ｖ５／Ｈｉｓ及び精製した組換えＤＰＰＩＶ／Ｖ５／Ｈｉｓの両者が、Ｈ-Ａｌａ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ、Ｇ-Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ及びＨ-Ａｒｇ-Ｐｒｏ-ｐＮＡを加水分解した。メラノーマ細胞のＤＰＰＩＶトランスフェクションの効果と同様に（１８）、ＤＰＰ８でのトランスフェクションは、恐らくジペプチダーゼ、トリペプチダーゼ及びエンドペプチダーゼ活性の増大を引き起こす。実際、本発明者らの結果は、ＤＰＰ８をトランスフェクションしたＣＯＳ-７細胞は、精製組換えＤＰＰ８とは違って、基質Ｈ-Ａｌａ-Ａｌａ-Ｐｒｏ-ｐＮＡを用いるとトリペプチジルペプチダーゼ活性を、及び基質Ｚ-Ａｌａ-Ｐｒｏ-ｐＮＡを用いるとエンドペプチダーゼ活性を表すことを示した（データは示さず）。これをさらに調べ、そしてトリペプチジルペプチダーゼ基質Ｈ-Ａｌａ-Ａｌａ-Ｐｈｅ-ｐＮＡ若しくはＨ-Ａｌａ-Ｐｈｅ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ（４５）、又はプロピルエンドペプチダーゼ基質Ｚ-Ａｌａ-Ｐｒｏ-ｐＮＡ若しくはスクシニル-Ａｌａ-Ｐｒｏ-ｐＮＡのいずれも精製ＤＰＰ８により開裂しなかった。本発明者らのデータは明確に、ＤＰＰ８がジペプチジルペプチダーゼであり、そしてトリペプチジルペプチダーゼ又はエンドペプチダーゼ活性を欠くことを実証する。
【００８０】
ＤＰＰ８の触媒メカニズムの性質をさらに種々の阻害剤を用いて調べた。ＤＰＰ８酵素活性はセリンプロテアーゼ阻害剤により有効に阻害され、金属プロテアーゼ、アスパルチルプロテアーゼ及びシステインプロテアーゼの阻害剤に対しては感受性がなかった。ＤＰＰ８酵素活性は、ＤＰＰＩＶ酵素活性を完全に阻害する亜鉛（４６）によっては有効に阻害された。ペプチドＡｌａ-Ｐｒｏ-Ｇｌｙ及びＬｙｓ-ＰｒｏはＤＰＰ８基質を擬似し、恐らくＤＰＰ８を競合して阻害した。
【００８１】
ＤＰＰ８の染色体位置決定
２つのプローブ、ＥＳＴＡＡ４１７７８７及び胎盤ライブラリー由来のＴ８クローンをＦＩＳＨ分析に用いた。第１の正常な雄性の第１７中期を、蛍光シグナルについて調べた。これらの中期全てが、１５バンドｑ２２の染色分体両者又は一方にシグナルを示した（図５）。これらの中期に、全部で２つの非特異的なバックグラウンドのドットが観察された。同様の結果が、第２の正常な雄性の１５中期に対するプローブのハイブリダイゼーションから得られた（データは示さず）。
【００８２】
ＲＴ-ＰＣＲによるＤＰＰ８遺伝子発現の分析
ＤＰＰＩＶはほとんどのリンパ球及びリンパ球細胞系により発現されるが、活性リンパ球ではアップレギュレートされる（４７、４１、４８、４９）。ＤＰＰ８の種々のスプライス変型は機能的タンパク質をコードしないかもしれないので、ＰＣＲを設計して全長配列を含むｍＲＮＡのみを検出した（図１）。３５サイクルで、予想サイズ（７８３ｂｐ）の増幅産物を容易にＯＫＴ刺激ＰＢＭＣに観察したが（６人中６人の主体、図８）、ほとんどの主体由来の刺激していないＰＢＭＣには観察されず（５人中４人、図８Ａ）、刺激していないＰＢＭＣよりも活性Ｔ細胞ではより多くのＤＰＰ８ｍＲＮＡが発現されることを示唆する。同様のＲＴ-ＰＣＲデータが、フィトヘマグルチニンで刺激したＰＢＭＣから得られた（データは示さず）。さらに、ＤＰＰ８ｍＲＮＡは調べた全てのＢ及びＴ細胞系において、並びに肝臓及び胎盤の両者において発現された（図８Ｂ）。
【００８３】
抗ペプチド抗体
２匹のウサギの血清を、ペプチド被覆ウェルでＥＬＩＳＡにより試験した。両血清が両ペプチドを結合した一方で、予備免疫化血清試料は特異的結合を示さなかった。細胞系、ＤＰＰ８ｃＤＮＡでトランスフェクションした細胞系及び活性ヒトリンパ球の抽出物についてのウェスタンブロットは、２つのＤＰＰ８ペプチドに対するウサギ抗血清が１００ｋＤａバンドを結合し、これはＤＰＰ８のサイズであることを示した（データは示さず）。
【表１】
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【表２】
0004748908.tif 000003
【００８４】
考察
ＤＰＰ８と名付けた新規ヒトＤＰＰＩＶ関連ポストプロリンペプチダーゼのクローニング、組換え体発現、生化学及び組織発現を記載する。ＤＰＰ８はジペプチジルアミノペプチダーゼを示したが、トリペプチジルペプチダーゼ又はエンドペプチダーゼ活性は示さなかった。ＤＰＰＩＶのように、ＤＰＰ８は活性Ｔ細胞で有効なｍＲＮＡ発現を示すことがわかった。ＤＰＰ８はＰＥＰの特徴ではあるが、ＤＰＰＩＶ、ＦＡＰ又はＤＰＰ６の特徴ではないモノマーの、非グリコシル化、可溶性、細胞質タンパク質であることが、本発明者らによる配列及び位置決定データにより明確に示された。ＤＰＰ８酵素活性は中性ｐＨが最適であり、酸性リソソーム／エンドソーム画分では活性ではないことを示唆した。
【００８５】
ＤＰＰＩＶとのホモロジーにより、ＤＰＰ８はＤＰＰＩＶ様遺伝子ファミリーのメンバー、プロピルオリゴペプチダーゼファミリーＳ９ｂのメンバー及び酵素ＳＣ族のメンバーである。電荷リレー系をポテンシャルに形成するＤＰＰ８の残基は、Ｓｅｒ７３９、Ａｓｐ８１７及びＨｉｓ８４９である（図２）。ＤＰＰ８のジペプチジルペプチダーゼ活性及び精製ＤＰＰ８による検出可能なトリペプチジルペプチダーゼ又はエンドペプチダーゼ活性がないことは、さらにＳ９ｂにおけるその配置を指示する。さらにＤＰＰ８基質特異性は、構造的に関連するペプチダーゼＤＰＰＩＶ及びＦＡＰのものからは区別することができない。
【００８６】
ヒトリンパ球におけるＤＰＰＩＶの役割は、酵素阻害剤を用いて詳細に研究されている（４９、５０〜５４）。ＤＰＰＩＶ特異的阻害剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＮＡ合成及びサイトカイン製造の両者を抑制する（４８、４９、５２）。さらにＤＰＰＩＶ特異的阻害剤はヒトリンパ球におけるホルボールミリステートアセテート誘導チロシンリン酸化を低減し、さらにリンパ球活性化におけるＤＰＰＩＶ酵素活性のための役割を示唆する（５４）。ｉｖ  ｖｉｖｏでは、ＤＰＰＩＶの阻害剤は動物モデルにおける関節炎を抑制し（２０）、そして心臓同種移植片生存を延長する（５５）。ＤＰＰ８のＤＰＰＩＶ基質開裂能は、ＤＰＰＩＶ阻害剤がＤＰＰ８も阻害し、阻害剤についての研究はさらに説明を必要とするであろうことを示す。実際、ＤＰＰ８はＤＰＰＩＶに割り当てられている生理的機能のいくつかについて応答し得る。
【００８７】
ＦＡＰ及びＤＰＰＩＶは完全な膜糖タンパク質であり、触媒活性についてのダイマー化を要求する（９、５６、５７）。反対に、ＤＰＰ８及びＰＥＰはモノマーとして触媒的に活性である非グリコシル化細胞質ゾルタンパク質であり（５８）、Ｐｒｏ-Ｘａａ結合を開裂する（４３、５９）。しかしながら、ＰＥＰの基質特異性はＤＰＰ８とは異なる。ＰＥＰは遊離αアミンがプロリンに対してＮ末端にある場合に開裂しないエンドペプチダーゼである（例えば、Ｈ-Ａｌａ-Ｐｒｏを開裂しない）。最近、本発明者らはＤＰＰＩＶの三次構造が７ブレードβプロペラドメイン及びα／β加水分解酵素ドメインを有するという点でＰＥＰのものと類似であるということを提案した（３、３９、１）。ＤＰＰ８とＤＰＰＩＶとの間の有効な配列同一性は、ＤＰＰ８とＤＰＰＩＶの三次構造が類似するということを示す。しかしながら、ＤＰＰ８はＤＰＰＩＶより１１０アミノ酸多く含み、それにより第８プロペラブレードなどの三次構造の追加的エレメントを有することができるであろう。
【００８８】
ＤＰＰ８、ＤＰＰＩＶ及びＦＡＰの間の受け継いだ関係は、その染色体位置決定に反映される。ＤＰＰＩＶ及びＦＡＰが両者ともそれぞれ染色体２、２ｑ２４．３（６０）及び２ｑ２３（６１）の長いアームに位置した一方で、ＤＰＰ８は１５ｑ２２に位置していた。関連遺伝子ＤＰＰ６及びＰＥＰは、それぞれ染色体７（６２）及び６ｑ２２に位置していた（６３）。
【００８９】
２つのヒトの病気の座が、１５ｑ２２にマップされた。これらの座は常染色体劣性難聴の座（６４）及びＢａｒｄｅｔ-Ｂｉｅｄｌ症候群、タイプ４の型（６５）である。Ｂａｒｄｅｔ-Ｂｉｅｄｌ症候群の臨床的兆候は、肥満及び糖尿である。アトラクチン（６６）及びＤＰＰＩＶは、それぞれ肥満（６７）及び糖尿（２２、６８、１５）に役割を担い、それらの基質特異性はＤＰＰ８のものと重複するので、ＤＰＰ８はＢａｒｄｅｔ-Ｂｉｅｄｌ症候群に関与するかもしれない。
【００９０】
ＤＰＰＩＶはＴ細胞の表面上に発現し、ＣＤ２６という共刺激分子である（３）。ＣＤ２６-ネガティブ細胞系は残りのＤＰＰＩＶ酵素活性を有し、ＰＢＭＣはＡｌａ-Ｐｒｏ基質に対して非ＤＰＰＩＶ誘導活性を有し（６９）、ＤＰＰＩＶ様活性をともなう他のペプチダーゼの存在を示す。ＤＰＰＩＶ-βはＤＰＰＩＶに類似するペプチダーゼ活性を示すが、７０〜８０ｋＤａの細胞表面糖タンパク質であり（７０）、従ってＤＰＰ８とは異なる。
【００９１】
本発明者らが発見したＤＰＰ８の３つのスプライス変型の生物学的重要性は未知である。これらのスプライス変型のいずれも、フレームシフト又は未成熟タンパク質終結の結果ではない（図１）。スプライス変型のうち２つは予測される触媒三つ組み残基の全てを含み、こうしてペプチダーゼ活性を有するタンパク質を有効に製造する。ＦＡＰｍＲＮＡの代替的なスプライス型も観察されている（７１、７２）。スプライス変型の発現は活性タンパク質のレベルを制御するために用いられることが考えられる。ＤＰＰ８ノーザンブロットは、多数の異なるサイズの転写物を示した。ＤＰＰ８のスプライス変型の予測されるサイズは２．６〜３．１ｋｂの範囲であり、ノーザンブロットで調べた多くの組織に見られた大きい転写物はそれぞれ８．５ｋｂ及び５．０ｋｂであった。同様に、ＤＰＰＩＶ様遺伝子ファミリーの２つの他のメンバー、ＤＰＰＩＶ及びＤＰＰ６は、ｃＤＮＡサイズよりずっと大きいノーザンブロットにおけるｍＲＮＡ転写物を示す（６０、６１）。ＤＰＰ８ｍＲＮＡについての主要な転写物及びそのスプライス変型は５ｋｂバンド内にある一方で、８．５ｋｂ転写物はさらなる５’及び３’非翻訳配列を含むのであろうと提案する。ＤＰＰ８はノーザン分析により至る所にｍＲＮＡ発現パターンを有する点でＤＰＰＩＶに類似するようである一方で、活性Ｔ細胞ではアップレギュレートされる。ＤＰＰ８とＤＰＰＩＶとの間の類似性は、ＤＰＰ８がＤＰＰＩＶのようにＴ細胞共刺激及び増殖において役割を担うということを示唆する。ＤＰＰ８特異的抗体又は阻害剤の開発は、この分野の研究を促進するであろう。
【００９２】
要約すると、本発明者らはＤＰＰＩＶ及びＦＡＰに対して構造的及び機能的類似性を有する新規ヒトジペプチジルアミノペプチダーゼＤＰＰ８を特定し、かつ特徴付けた。ＤＰＰＩＶについて、特に免疫系において示唆される多くの多様な生物学的役割及び腫瘍成長及び肝臓の病気におけるＦＡＰの役割と共に、これらの系におけるＤＰＰＩＶ様遺伝子ファミリーのこの新規メンバーの役割を調べることは興味深いことであろう。この新規タンパク質の理解並びに阻害剤及び生理学的基質の解明におけるさらなる研究は、この遺伝子ファミリーの各メンバーの特異的機能の特定を助けるであろう。
【参考文献】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  全長ＤＰＰ８ｃＤＮＡを単離するためのクローニングストラテジー及び観察されるＤＰＰ８の代替的スプライシング変型を示す。
【図２】  ヒトＤＰＰ８のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。ヌクレオチド及び予測される一文字コードアミノ酸配列を示す。
【図３】  ＤＰＰ８の導かれたアミノ酸残基配列とＤＰＰ８のＣ．ｅｌｅｇａｎｓホモログ及びヒトＤＰＰＩＶとのアラインメントを示す。
【図４】  ＤＰＰ８発現のノーザンブロット分析を示す。
【図５】  ヒトＤＰＰ８の染色体位置を示す。
【図６】  トランスフェクションした細胞系のウェスタンブロット分析を示す。
【図７】  ＤＰＰ８酵素活性を示す。
【図８】  ＤＰＰ８発現のＲＴ-ＰＣＲ分析を示す。
【図９】  マウスＤＰＰ８発現のノーザンブロット分析を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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