(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示す塩基配列において１番目の塩基から６０９番目の塩基までの塩基配列からなる腫瘍特異的プロモーター。
【請求項２】
腫瘍特異的な遺伝子発現による癌の遺伝子治療に用いるための請求項１に記載の腫瘍特異的プロモーター。
【請求項３】
請求項１に記載の腫瘍特異的プロモーターの下流に薬剤代謝酵素遺伝子を連結したベクターであって、該薬剤代謝酵素は癌治療用プロドラッグを活性型に変換する、自殺遺伝子治療に用いるためのベクター。
【請求項４】
前記薬剤代謝酵素遺伝子と癌治療用プロドラッグとの組み合わせが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子とガンシクロビルもしくはアシクロビル、シトシンデアミナーゼ遺伝子と５−フルオロシトシン、水痘帯状疱疹ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子と６−メトキシプリンアラビノシド、E.coli gpt遺伝子と６−チオキサンチン、チトクロ−ム P450 2B1遺伝子とサイクロフォスファミド、ヒトデオキシシチジンキナーゼ遺伝子とサイトシンアラビノシド、E.coli UPRT遺伝子と５−フルオロウラシル、またはE.coli deoD遺伝子と６−メチルプリン-２'-デオキシリボヌクレオシドである請求項３記載のベクター。
【請求項５】
請求項１に記載の腫瘍特異的プロモーターを含むオンコリティックウイルスベクターであって、該オンコリティックウイルスが腫瘍細胞あるいは腫瘍組織で特異的に増殖するオンコリティックウイルスベクター。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、腫瘍細胞もしくは腫瘍組織において腫瘍特異的に外来遺伝子の発現を可能にする腫瘍特異的プロモーターに関する。更に詳細には、腫瘍細胞もしくは腫瘍組織において腫瘍特異的に高いプロモーター活性を発揮し、腫瘍特異的な遺伝子発現による癌の遺伝子治療、例えば、薬剤代謝酵素遺伝子と癌治療用プロドラッグとを組み合わせた自殺遺伝子治療、サイトカイン遺伝子などを癌細胞に導入して生体の免疫機能を高めて癌を治療する免疫遺伝子治療、腫瘍細胞のみを殺傷するオンコリティックウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ）を用いた癌の遺伝子治療などに広く利用することができる腫瘍特異的プロモーターに関する。
背景技術
近年、癌治療に関して外来遺伝子を細胞に導入して癌を治療する遺伝子治療が注目されている。癌に対する遺伝子治療としては、癌遺伝子の働きを抑制するか、もしくは失活した癌抑制遺伝子を活性化する、癌遺伝子・癌抑制遺伝子を標的とした遺伝子治療、本来ヒト細胞中に存在しない薬剤代謝酵素遺伝子を癌細胞に導入し、次いでその酵素で活性化される癌治療用プロドラッグを投与することにより薬剤代謝酵素遺伝子が導入された細胞のみを死滅させる自殺遺伝子治療、サイトカイン遺伝子などを細胞に導入してヒトが本来有する免疫機能を高めて癌を治療する免疫遺伝子治療、アデノウイルスの初期遺伝子であってアデノウイルスの増殖に必須の遺伝子であるＥ１ＡあるいはＥ１Ｂの上流に腫瘍特異的プロモーターを挿入して腫瘍細胞において特異的に増殖するオンコリイティックウイルスを構築してこのウイルスにより腫瘍細胞を特異的に殺傷する遺伝子治療などがある。
このような遺伝子治療においては、腫瘍細胞もしくは腫瘍組織において目的とする遺伝子を特異的に発現させることが、遺伝子治療の効率化および安全性の点から重要な意義を有しており、現在、遺伝子治療が直面する課題の一つである。この腫瘍特異的な遺伝子発現を可能にするには、導入遺伝子の発現を腫瘍特異的に制御するプロモーターを開発する必要がある。
腫瘍特異的なプロモーターとしては、α−フェトプロテインプロモーター、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーター、前立腺特異的抗原プロモーターなどが知られている。しかしながら、これらのプロモーターは、適用できる癌の範囲が限定されるため汎用性に欠け、またそのプロモーター活性も決して高いものではない。従って、これらのプロモーターを利用した遺伝子治療は、その適用範囲が極めて限定されたものになっている。
他方、新たなレチノイン酸応答性成長／分化因子として、奇形腫の細胞からヘパリン結合性の蛋白であるミッドカインが見出され、その遺伝子のクローニングがなされている（Ｋｏｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５１，１３１２−１３１８，１９８８）。その蛋白の生物学的機能は未だ十分に解明されていないが、多くのヒトの消化器癌（大腸癌、膵癌、肝癌等）、肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、脳腫瘍等で高頻度でかつ高発現が認められている（Ｔｓｕｔｕｉ，Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，１２８１−１２８５，１９９３；Ａｒｉｄｏｍｅ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８６，６５５−６６１，１９９５；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ，Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９，１１７１−１１７５，１９９６；Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，２５１５−２５１８，１９９６）。
ｃ−ｅｒｂＢ−２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）はＥＧＦレセプターファミリーに属しチロシンキナーゼ活性を有している。この遺伝子は正常の上皮細胞では、ごくわずかにその発現が認められるのみであるが、乳癌やその他食道癌、胃癌、卵巣癌等で高い発現が認められている（Ｓｌａｍｏｎ，ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，７０７−７１２，１９８９；Ｈｙｎｅｓ，ＮＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１９８，１６５−１８４，１９９４）。さらに、乳癌におけるこの遺伝子の高発現は、抗癌剤に対する抵抗性に関係し、予後不良因子であると報告されている（Ｈｙｎｅｓ，ＮＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１９８，１６５−１８４，１９９４）。
これらのミッドカイン遺伝子およびｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子のプロモーター領域についての研究もこれまで盛んに行われている。
即ち、ミッドカイン遺伝子の５’側上流領域の２．３ｋｂは、癌細胞において遺伝子の転写活性を惹起するプロモーターとして使用できること、また、薬剤代謝酵素遺伝子である単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼと癌治療用プロドラッグであるガンシクロビルとを組み合わせた自殺遺伝子治療用プロモーターとして使用できることが示されている（Ｍｉｙａｕｃｈｉ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，９０，４６９−４７５，１９９９；Ａｄａｃｈｉ，Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１，Ｓ２３８，２０００）。しかしながら、ミッドカイン遺伝子の５’側上流領域の２．３ｋｂは、その腫瘍特異性並びにそのプロモーター活性が十分に高いものではない。
また、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子のプロモーター領域の解析も行われてきたが、ヒト以外の動物種、乳癌以外の腫瘍細胞等を使用していた例が多いため、プロモーター領域の限定は、報告によって一定しなかった（Ｉｓｈｉｉ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４  ４３７４−４３７８，１９８７；Ｈｕｄｓｏｎ，ＬＧ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，４３８９−４３９３，１９９０；Ｈｏｌｌｙｗｏｏｄ，ＤＰ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１２，２３６９−２３７５，１９９３；Ｓｃｏｔｔ，ＧＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９，１９８４８−１９８５８，１９９４；Ｂｅｎｚ，ＣＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１５，１５１３−１５２５，１９９７；Ｇｒｏｏｔｅｃｌａｅｓ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５９，２５２７−２５３１，１９９９）。しかし、ＮＣＢ  Ｉ  ＧｅｎｅＢａｎｋに登録されているｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーター遺伝子（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＪＯ５２６４）の１２５９番目の塩基を転写開始点＋１として検討した場合、プロモーター活性は、−７００ｂｐ（−６６２／＋３８）領域あるいは−５３３ｂｐ（−４９５／＋３８）領域にあるという報告は多く、およそこの範囲にあることはこれまで理解されてきていた。また、−２１３／＋３８あるいは−８７／＋３８にプロモーター活性があるという報告もあるが、とりわけ腫瘍特異性についての検討はなされておらず、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子の一般的なプロモーター領域を腫瘍細胞を用いて検討したにすぎなかった。事実、自殺遺伝子の発現にｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーターを使用した報告はすべて５３３ｂｐ（−４６５／＋３８）領域かそれを含む長いプロモーター領域を使用している（Ｈａｒｒｉｓ，ＪＤ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１，１７０−１７５，１９９４；Ｒｉｎｇ，ＣＪＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，３，１０９４−１１０３，１９９６；Ｔａｋａｋｕｗａ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，８８，１６６−１７５，１９９７；Ｐａｎｄｈａ，ＨＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１７，２１８０−２１８９，１９９９）。また、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子の２５７ｂｐ（−２５６／＋１）領域が、癌に特異的なプロモーター活性を有するという報告もなされている（日本遺伝子治療学会講演要旨集、１９９９年７月１８日発行、９８頁；日本遺伝子治療学会講演要旨集、２０００年７月２８日発行、６５頁）。しかしながら、この領域も腫瘍特異性およびプロモーター活性が十分に高いものとはいえない。
従って、腫瘍特異性およびプロモーター活性が十分に高く、遺伝子治療に有効に用いることのできる腫瘍特異的プロモーターの開発が望まれている。
発明の開示
本発明者は、腫瘍特異性およびプロモーター活性が十分に高い腫瘍特異的プロモーターを得ることを目的として鋭意研究した結果、ミッドカイン遺伝子の５’側上流領域の２．３ｋｂ内の特定の部分配列をプロモーターとして用いることにより、また、ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子のプロモーター領域の特定の部分配列をプロモーターとして用いることにより、腫瘍特異性およびプロモーター活性が十分に高い腫瘍特異的プロモーターが得られ、遺伝子治療に有効に利用できることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、配列表の配列番号１に示す塩基配列において１〜５３９番目のいずれかの塩基から６０９番目の塩基までの塩基配列、あるいは配列番号９に示す塩基配列において１〜１２７番目のいずれかの塩基から２５１番目の塩基までの塩基配列を有する腫瘍特異的プロモーターである。
更に本発明は、配列表の配列番号１に示す塩基配列において１〜５３９番目のいずれかの塩基から６０９番目の塩基までの塩基配列、あるいは配列番号９に示す塩基配列において１〜１２７番目のいずれかの塩基から２５１番目の塩基までの塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、それらの塩基配列と同様のプロモーター機能を有する腫瘍特異的プロモーターである。
更に本発明は、腫瘍特異的な遺伝子発現による癌の遺伝子治療に用いるための上記腫瘍特異的プロモーターである。
更に本発明は、腫瘍特異的プロモーターの下流に薬剤代謝酵素遺伝子を連結したベクターと、当該薬剤代謝酵素により活性型に変換し得る癌治療用プロドラッグとを組み合わせた自殺遺伝子治療に用いるための上記腫瘍特異的プロモーターである。
更に本発明は、腫瘍特異的プロモーターを用いてウイルスを腫瘍細胞あるいは腫瘍組織で特異的に増殖するようにウイルス遺伝子を改変したオンコリティックウイルスによる癌の遺伝子治療に用いるための上記腫瘍特異的プロモーターである。
発明を実施するための最良の形態
本発明の腫瘍特異的プロモーターは、配列表の配列番号１に示す塩基配列において１〜５３９番目のいずれかの塩基から６０９番目の塩基までの塩基配列、あるいは配列番号９に示す塩基配列において１〜１２７番目のいずれかの塩基から２５１番目の塩基までの塩基配列を有するものである。また、本発明の腫瘍特異的プロモーターは、配列表の配列番号１に示す塩基配列において１〜５３９番目のいずれかの塩基から６０９番目の塩基までの塩基配列、あるいは配列番号９に示す塩基配列において１〜１２７番目のいずれかの塩基から２５１番目の塩基までの塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、それらの塩基配列と同様のプロモーター機能を有するものである。
配列番号１に示す１〜６０９番目までの塩基配列は、ミッドカイン遺伝子の５’フランキング領域におけるエクソン１の先頭の塩基配列を＋１とした場合（Ｕｅｈａｒａ，Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１１，５６３−５６７，１９９２）、−５５９から＋５０番目までの６０９ｂｐの塩基配列である。本発明の腫瘍特異的プロモーターは、配列番号１に示す塩基配列において１〜５３９番目のいずれかの塩基から６０９番目の塩基までの塩基配列からなる。後に記載する実施例に示されているように、本発明で意図する腫瘍特異的プロモーターとして機能するには、配列番号１の塩基配列において３’末端側の領域である５３９〜６０９番目までの塩基配列が少なくとも必須であることが明かにされた。従って、本発明の腫瘍特異的プロモーターは、配列番号１に示す塩基配列において１〜５３９番目のいずれかの塩基から６０９番目の塩基までの塩基配列からなるものである。ここで、配列番号１において、１、５３９および６０９番目の塩基は、ミッドカイン遺伝子の５’フランキング領域におけるエクソン１の先頭の塩基配列を＋１とした場合、それぞれ−５５９、−２１および＋５０番目の塩基に相当する。配列番号１に示す塩基配列において１〜５３９番目のいずれかの塩基から６０９番目の塩基までの塩基配列としては、１〜６０９番目までの塩基配列（配列番号１の塩基配列）、４１６〜６０９番目までの塩基配列（配列番号５の塩基配列）または２７５〜６０９番目までの塩基配列（配列番号４の塩基配列）が好ましい。
また、配列番号９に示す塩基配列において１〜１２７番目のいずれかの塩基から２５１番目の塩基までの塩基配列を有するものも、本発明の腫瘍特異的プロモーターである。後の実施例に示されているように、本発明で意図する腫瘍特異的プロモーターとして機能するには、配列番号９の塩基配列において３’末端側の領域である１２７〜２５１番目までの塩基配列が少なくとも必須であることが明かにされた。配列番号９に示す１〜２５１番目までの塩基配列は、ＮＣＢ  Ｉ  ＧｅｎｅＢａｎｋに登録されているｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーター遺伝子（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＪＯ５２６４）の１２５９番目の塩基を転写開始点＋１とした場合、−２１３から＋３８番目までの塩基配列に相当し、また配列番号９の１２７番目の塩基は−８７番目に相当する。
本発明では、上記したいずれかの塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、それと同様のプロモーター機能を有する塩基配列からなるものも、本発明の腫瘍特異的プロモーターである。ここでいうストリンジェントでハイブリダイズする塩基配列とは、例えば、６×ＳＳＰＥ、２×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌサケ精巣ＤＮＡを含む溶液中で６５℃、１２時間反応させる、という条件下でサザンハイブリダイゼーションを行うことにより、上記したいずれかの塩基配列を有するＤＮＡとハイブリダイズする塩基配列である。本発明の腫瘍特異的プロモーターは、このような条件でハイブリダイズする塩基配列であって、ハイブリダイズした対象の塩基配列と同様のプロモーター機能、即ち、同程度の腫瘍特異性と同程度のプロモーター活性を有するものである。このような塩基配列としては、対象の塩基配列と、例えば６５％以上、好ましくは７５％以上の相同性を有するものが挙げられる。
上記した本発明の腫瘍特異的プロモーターは、既に報告されているミッドカインゲノム遺伝子またはｃ−ｅｒｂＢ−２ゲノム遺伝子の配列情報に基づきＰＣＲ法を利用する周知の方法により得ることができる。これらの方法は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等の基本書に従い、当業者ならば容易に行うことができる。また、上記したストリジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有する本発明の腫瘍特異的なプロモーターは、例えば部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法、又は通常のハイブリダイゼーション法などにより容易に得ることができ、具体的には前記Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ等の基本書を参考にして行うことができる。
上記した配列番号１に示す塩基配列において１〜５３９番目の間に位置するいずれかの塩基から６０９番目の塩基までの塩基配列を有する本発明の腫瘍特異的プロモーターは、後に記載する実施例に明らかにされているように、ミッドカイン遺伝子の５’側上流領域の本発明のプロモーターの塩基配列を含む、より長い２．３ｋｂ及び１．０ｋｂのプロモーターに比べて、遥かに腫瘍特異性が高くかつプロモーター活性の高いものである。また、本発明の腫瘍特異的プロモーターは、生体内ではｐ５３癌抑制遺伝子の影響下にあり、正常細胞ではｐ５３遺伝子の機能が正常なため、本発明の腫瘍特異的プロモーターは作用せず、腫瘍化に伴ってｐ５３遺伝子の機能が消失し、本発明の腫瘍特異的プロモーターが作用する、という特徴的性質を有するものである。また、上記した配列番号９に示す塩基配列において１〜１２７番目のいずれかの塩基から２５１番目の塩基までの塩基配列を有する本発明の腫瘍特異的プロモーターも、この塩基配列を含むより長いｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子のプロモーター領域に比べて、遥かに腫瘍特異性が高く、特に乳癌に対して特異性が高く、かつプロモーター活性の高いものである。
本発明の腫瘍特異的プロモーターは、腫瘍特異的な遺伝子発現による癌の遺伝子治療、例えば、薬剤代謝酵素遺伝子と癌治療用プロドラッグとを組み合わせた自殺遺伝子治療、サイトカイン遺伝子などを癌細胞に導入して免疫機能を高めて癌を治療する免疫遺伝子治療などに利用することができる。
自殺遺伝子治療としては、薬剤代謝酵素遺伝子と癌治療用プロドラッグとの組み合わせが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子とガンシクロビルもしくはアシクロビル、シトシンデアミナーゼ遺伝子と５−フルオロシトシン、水痘帯状疱疹ウイルスシミジンキナーゼ遺伝子と６−メトキシプリアラビノシド、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇｐｔ遺伝子と６−チオキサンチン、チトクロームＰ４５０  ２Ｂ１遺伝子とサイクロフォスファミド、ヒトデオキシシチジンキナーゼ遺伝子とサイトシンアラビノシド、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＵＰＲＴ遺伝子と５−フルオロウラシル、またはＥ．ｃｏｌｉ  ｄｅｏＤ遺伝子と６−メチルプリン−２’−デオキシリボヌクレオシドの組み合わせなどの例が挙げられる。自殺遺伝子治療を実際に行うには、本発明の腫瘍特異的プロモーター及びその下流に薬剤代謝酵素遺伝子を発現可能なように組み込んだ発現ベクターを構築して、その発現ベクターを癌細胞に導入し、次いで癌治療用プロドラッグを投与することによって実施できる。ベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどの遺伝子導入に通常用いられるベクターが挙げられる。あるいは、本発明の腫瘍特異的プロモーター及びその下流に薬剤代謝酵素遺伝子を発現可能なように組み込んだプラスミドＤＮＡを、リポソームに封入して、あるいはポリリジン−ＤＮＡ−タンパク質複合体として、癌細胞に導入することもできる。遺伝子を導入するには、これらのベクター、リポソーム封入体等を静脈あるいは動脈内にあるいは直接腫瘍内部や腫瘍周囲に注入することによって行われる。この際、エレクトロポレーション法や超音波を併用することにより遺伝子導入効率を高めることも可能である。遺伝子導入後、癌治療用プロドラッグは、経口、静脈、動脈内投与等の通常の方法により投与される。
導入された遺伝子は、本発明の腫瘍特異的プロモーターの作用によって癌細胞内で特異的に薬剤代謝酵素が発現され、発現された薬剤代謝酵素により、癌細胞内において癌治療用プロドラッグは活性型の癌治療剤へ変換され、この変換された癌治療剤により癌細胞が選択的に死滅して自殺遺伝子治療が完了する。
このような自殺遺伝子治療の手法自体は既に公知であり、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子とガンシクロビルとの組み合わせは、脳腫瘍等で臨床応用されており（Ｏｌｄｆｉｅｌｄ，Ｅ  Ｈ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，４，３９−６９，１９９３）、またシトシンデアミナーゼ遺伝子と５−フルオロシトシンとの組み合わせも、大腸癌などに臨床応用の可能性が示唆されており（Ｈｕｂｅｒ，Ｂ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，４６１９−４６２６，１９９３）、これらの例が、本発明の遺伝子治療を実施する際に参照される。
本発明の腫瘍特異的プロモーターを利用した免疫遺伝子治療としては、インターフェロン、ＴＮＦα、インターロイキンなどのサイトカインをコードする遺伝子を、上記の自殺遺伝子治療と同様の方法で、本発明の腫瘍特異的プロモーターと共に発現ベクターに組み込み、あるいはリポソームに封入して、癌細胞に導入してサイトカインを発現させて、それによりヒトが本来有する生体防御機構である免疫応答を高めて癌を治療する方法が採用される。
本発明の腫瘍特異的プロモーターを用いたオンコリティックウイルスによる遺伝子治療としては、例えばアデノウイルスの増殖に必須の遺伝子である初期遺伝子Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂの上流に本発明の腫瘍特異的プロモーターを挿入するかあるいは初期遺伝子Ｅ１ＡまたはＥ１Ｂプロモーターと置換して、または単純ヘルペスウイルスの対応する初期遺伝子の上流に本発明の腫瘍特異的プロモーターを挿入するかあるいは初期遺伝子プロモーターと置換して、腫瘍細胞あるいは腫瘍組織で特異的に増殖し腫瘍細胞を殺傷するオンコリティックウイルスを構築し、このウイルスを投与することにより癌を治療する方法が挙げられる。このような遺伝子治療については、Ｈｅｉｓｅ，Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５，８４７−８５１，２０００などの文献が参照される。
また、本発明の腫瘍特異的プロモーターを利用して、癌遺伝子のアンチセンス遺伝子や正常型の癌抑制遺伝子を、腫瘍において特異的に発現させ、その結果、腫瘍の脱癌化（正常復帰）や細胞死（アポトーシス）、更には腫瘍細胞の抗癌剤感受性、放射線感受性の亢進を惹起することができる。
配列番号１に示す塩基配列において１〜５３９番目のいずれかの塩基から６０９番目の塩基までの塩基配列を有する本発明の腫瘍特異的プロモーターを利用した遺伝子治療は、特に、大腸癌、膵癌、肝癌等の消化器癌、肺癌、乳癌、神経芽細胞腫、脳腫瘍などの治療に有効である。また、配列番号９に示す塩基配列において１〜１２７番目のいずれかの塩基から２５１番目の塩基までの塩基配列を有する本発明の腫瘍特異的プロモーターを利用した遺伝子治療は、乳癌、食道癌、胃癌、卵巣癌などの治療に有効であり、特に乳癌の治療に有効である。
以下本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例の範囲に何ら限定されるものではない。
実施例１
ミッドカイン遺伝子から腫瘍特異的プロモーターの単離
ミッドカイン転写制御領域の解析用のベクターシステムを次のようにして得た。
ヒトミッドカインゲノム遺伝子２．３ｋｂを含むプラスミドｐｈｇＭＫ２．３Ｋ／ＣＡＴ（Ｐｅｄｒａｚａ，ＣＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１７，８４５−８４９，１９９５）を、Ｘｈｏ  ＩとＮｃｏ  Ｉ、あるいはＸｈｏ  ＩとＥｃｏ４７  ＩＩＩを用いて切断し、それぞれミッドカインゲノム遺伝子１．０ｋｂを含む４．０ｋｂと、ミッドカインゲノム遺伝子０．６ｋｂを含む３．４ｋｂのＤＮＡ断片を得た。これらの断片をＤＮＡリガーゼを用いて、環状のＤＮＡとした。その結果、配列表の配列番号３に示す塩基配列を有するヒトミッドカインゲノム遺伝子２．３ｋｂ（ＭＫ２．３）、配列番号２に示す塩基配列を有する同遺伝子１．０ｋｂ（ＭＫ１．０）、配列番号１に示す塩基配列を有する同遺伝子０．６ｋｂ（ＭＫ０．６）をそれぞれ含み、さらにその下流にＣＡＴ（クロラムフェニコール  アセチルトランスフェラーゼ）遺伝子を連結させたプラスミドが得られた。
実施例２
ミッドカイン遺伝子由来の腫瘍特異的プロモーターによる転写活性の検討
上記のプラスミド、あるいはＳＶ４０ウイルスのプロモーターを有するプラスミドｐＣＡＴ−Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、さらにいかなるプロモーターをも含まないプラスミドｐＣＡＴ−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、１０％牛胎児血清添加ＤＭＥＭ培養液（Ｓｉｇｍａ社）で培養している、肺癌細胞ＱＧ−５６、神経芽細胞腫ＮＧＰ、正常ヒト線維芽細胞ＭＲＣ−５に遺伝子導入を行なった。まず、これらの１０μｇのプラスミドとリポフェクチン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を混和後、室温で３０分放置しＤＮＡと脂質の複合体を形成させた。その後この複合体を牛胎児血清を除去したうえで、細胞と接触させた。８時間後に牛胎児血清添加培養液を加え、その後４０時間培養した後に遺伝子導入した細胞を超音波で破壊した。遠心後、その上清を用いて遺伝子導入による転写活性を、［１４Ｃ］−クロラムフェニコールとアセチルＣｏＡを用いた公知のＣＡＴアッセイ法（Ｇｏｒｍａｎ，ＣＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２，１０４４−１０５１，１９８２）で検討した。このとき、遺伝子導入の効率を標準化するため、１μｇのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｐＣＨ１１０，Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を同時に遺伝子導入し、β−ガラクトシダーゼ活性（Ｈｅｒｏｍｅｌ，Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３９，６５３−６６２，１９８４）を測定した。得られた結果を図１に示した。
図１に示した結果から判るように、ミッドカインゲノム遺伝子による転写活性は次ぎの通りであった。
（ａ）ＭＫ０．６を用いると、ＭＫ１．０、ＭＫ２．３を使用した場合より腫瘍細胞では強力であったが、正常細胞ではむしろ低下していた。
（ｂ）ＭＫ０．６を用いた場合、腫瘍細胞ではＳＶ４０ウイルスのプロモーターより強力であったが、正常細胞ではＳＶ４０ウイルスのプロモーターのほうがはるかに強力であった。
すなわち、ＭＫ０．６によるプロモーター活性は腫瘍に特異的であることが判明したが、ＭＫ２．３およびＭＫ１．０によるプロモーター活性の腫瘍特異性は弱いものであった。
実施例３
ミッドカイン遺伝子由来の腫瘍特異的プロモーターを利用した腫瘍特異的殺細 胞効果
（１）ミッドカイン遺伝子から得られるプロモーターの転写活性による殺細胞効果を検討するために、ＭＫ０．６、ＭＫ２．３の下流に自殺遺伝子である単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を連結し、このプラスミドを細胞に発現させ、プロドラックであるガンシクロビル（ＧＣＶ）を遺伝子導入細胞の培養液に添加した。このシステムによる殺細胞効果の測定法は、Ｍｏｏｌｔｅｎ，ＦＬ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１，２７９−２８７，１９９４に示されているとおりである。
まず、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＣＭＶプロモーターをＮｒｕ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を利用して除き、この部分にＭＫ２．３あるいはＭＫ０．６を挿入し、その後ＥｃｏＲ  Ｖ部位を利用して、ｐＭＫ（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ，２７，２２３−２３１，１９８１）よりＢｇｌ  ＩとＥｃｏ  ＲＩで切り出したＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を挿入した。そこで得られた、それぞれのプラスミド（ＭＫ２．３−ＴＫとＭＫ０．６−ＴＫ）を、正常細胞であるＭＲＣ−５あるいは、ｐ５３癌抑制遺伝子の機能を不活化させて不死化させたＭＲＣ−５細胞に、前述のようにリポフェクチンを用いて導入した。薬剤耐性マーカーで、ｐｃＤＮＡ３に含まれているＮｅｏ遺伝子の発現を利用するため、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で細胞を１０日間培養し、それぞれＭＫ２．３−ＴＫ，ＭＫ０．６−ＴＫが発現した細胞を樹立した。そこでこれらの細胞を、５００個／９６穴培養プレートにまき、各種の濃度のＧＣＶ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社製）の存在下で７日間培養した。細胞の生存割合についてはＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学社製）を用いて検討した。ＧＣＶ濃度０μｇ／ｍｌの場合の細胞の生存を１００％として、各実験群における生存をパーセント表示で図２Ａ及び図２Ｂに示した。
図２Ａに示した結果から判るように、正常細胞のＭＲＣ−５では、ＭＫ２．３プロモーターによってＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の転写が制御される場合は、ＧＣＶに対する感受性は親株の感受性と比較して５００倍高く、細胞は低濃度のＧＣＶで死滅したのに対して、ＭＫ０．６プロモーターによってＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の転写を制御させた場合は、ＧＣＶに対する感受性は親株の感受性と同一であった。
図２Ｂに示した結果から判るように、不死化細胞のＭＲＣ−５を用いた場合、ＭＫ２．３あるいはＭＫ０．６プロモーターのどちらの場合も、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子が発現し、遺伝子導入細胞は親株と比較して、ＧＣＶに対する感受性が親株の感受性に比較して、やはり１０００倍の向上した。
すなわち、ＭＫ２．３プロモーターを使用した場合、不死化した細胞や正常細胞でもＨＳＶ−ＴＫ遺伝子発現に伴う、殺細胞効果が生じたのに対して、ＭＫ０．６プロモーターを用いた場合、不死化した細胞にのみ、細胞傷害活性が惹起され、正常細胞に対しては殺細胞効果が出現しなかった。このことは、図１の結果でも見られるように、ＭＫ２．３プロモーターよりＭＫ０．６プロモーターのほうが、はるかに腫瘍に特異的であることを示している。
（２）つぎに、このＭＫ０．６プロモーターの腫瘍特異性を実際の腫瘍細胞と正常線維芽細胞を用いて検討した。ＭＫ０．６−ＴＫを前述のようにリポフェクチンを用いて各種の細胞に導入し、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で１０日間細胞を培養して、ＭＫ０．６−ＴＫ遺伝子が発現する細胞を得た。そこで、これらの遺伝子導入細胞を５００個／９６穴培養プレートにまき、各種の濃度のＧＣＶの存在下で７日間培養した。細胞の生存をＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８を使用して検討した。得られた結果を図３Ａ、図３Ｂ及び図３Ｃに示した。
図３Ａ及び図３Ｂに示した結果から判るように、腫瘍細胞であるＱＧ−５６、ＮＧＰでは、ＧＣＶに対する感受性が親株に比較してそれぞれ１０００倍以上向上した。これに対して、図３Ｃに示した結果から判るように、正常線維芽細胞であるＨＦＦではＧＣＶ感受性が親株と比較して、全く変化がなかった。すなわち、確かに、ＭＫ０．６プロモーターを使用した場合、腫瘍特異的な遺伝子発現が得られ、自殺遺伝子であるＨＳＶ−ＴＫとの連結により、ＧＣＶによる腫瘍特異的な殺細胞効果が得られることが判明した。また、現在サイトメガロウイルス感染症で臨床使用されているＧＣＶの最大血中濃度は１μｇ／ｍｌであり、本実験で示されたＧＣＶの殺細胞効果が得られる濃度０．１μｇ／ｍｌは、これを下回るため、ＭＫ０．６−ＴＫ発現によって極めて安全にかつ効果的な治療効果が得られることを示唆している。
実施例４
ミッドカイン遺伝子由来の腫瘍特異的プロモーターを利用したｉｎ  ｖｉｖｏ
抗腫瘍効果
前述のように、ＭＫ０．６−ＴＫをリポフェクチンを用いてＱＧ−５６細胞に遺伝子導入し、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で１０日間細胞を培養し、ＭＫ０．６−ＴＫ遺伝子が発現するＱＧ−５６細胞を得た。この遺伝子導入細胞ならび、親株の細胞を６週令雌のＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（日本ＳＬＣ社製）に１ｘ１０６個皮下に接種し、皮下腫瘍を形成せしめた。腫瘍体積が１００ｍｍ３に達したときに、３０ｍｇ／ｋｇのＧＣＶ、あるいは同量の生理的食塩水を５日間連日腹腔内投与を行なった。ＱＧ−５６細胞接種後の腫瘍体積の変化を計測し、得られた結果を図４Ａ及び図４Ｂに示した。
図４Ａに示した結果から判るように、ＧＣＶ投与群のうち、ＭＫ０．６−ＴＫ遺伝子が発現したＱＧ−５６腫瘍では、全７例の腫瘍が消失しその後全く再発しなかったのに対して、親株腫瘍は全く腫瘍の退縮はなく、腫瘍の増大は継続した。図４Ｂに示した結果から判るように、生理的食塩水投与群では、ＭＫ０．６−ＴＫ遺伝子発現腫瘍、親株腫瘍とも腫瘍の増大速度に変化はなかった。したがって、ＭＫ０．６プロモーターはＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の転写活性化を果たし、ＧＣＶ投与による腫瘍の完全な消失を可能にする転写活性を有していることが判明した。
実施例５
ミッドカインプロモーターの生物学的特性
固形腫瘍の少なくとも約５０％の症例においてｐ５３遺伝子の機能消失がみられており、腫瘍に正常ｐ５３遺伝子を強制発現させることにより、腫瘍増殖が停止する例があることが確認されている。そこで、ｐ５３遺伝子の機能消失させて不死化させたＭＲＣ−５細胞を用いて、ＭＫ０．６プロモーターの下流にレポーター遺伝子であるルシフェラーゼ遺伝子を連結させたプラスミドを導入し、正常ｐ５３遺伝子の発現下においての、ＭＫ０．６プロモーターの転写活性を検討した。
このために、実施例１で作成したＭＫ０．６−ＣＡＴプラスミドをＨｉｎｄ  ＩＩＩで切断し、得られたＭＫ０．６ｋｂ遺伝子をｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位に挿入した。また、サイトメガロウイルスのプロモーターの下流に正常ｐ５３遺伝子を連結させたプラスミド（Ｂａｋｅｒ，ＳＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，９１２−９１５，１９９０）（ＣＭＶ−ｐ５３）、さらにこのプラスミドをＢａｍＨ  Ｉで切断しインサートのｐ５３ｃＤＮＡをＣＭＶプロモーターと逆方向に連結したコントロールのプラスミド（ＣＭＶ−ｐ５３Ｒ）を作成して使用した。そこで、１０ｃｍ培養シャーレで培養した不死化ＭＲＣ−５細胞に、ＭＫ０．６−ルシフェラーゼ（３μｇ）と各量のＣＭＶ−ｐ５３プラスミド（０−１μｇ）、あるいはＭＫ０．６−ルシフェラーゼ（３μｇ）と各量のＣＭＶ−ｐ５３Ｒプラスミド（０−１μｇ）、をそれぞれリポフェクチンを用いて前述のように遺伝子導入を行なった。４８時間培養後、細胞をＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて破壊し、その中のＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼ活性を同キットの試薬を用いて測定した。遺伝子導入の効率を標準化するため、各遺伝子導入群に１μｇのｐＲＬ−ＴＫプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を含めておき、そのＴＫプロモーターによるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を測定し、それに基づいてＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼ活性を補正した。得られた結果を図５に示した。
図５に示した結果から判るように、ＣＭＶ−ｐ５３プラスミドの遺伝子導入量の増加にともなって、ＭＫ０．６プロモーター活性は低下したのに対して、コントロールのＣＭＶ−ｐ５３Ｒプラスミド遺伝子導入群では、ＭＫ０．６プロモーター活性は変化がなかった。すなわち、ＭＫ０．６プロモーターはｐ５３癌抑制遺伝子の影響下にあることが判明した。正常細胞ではｐ５３遺伝子の機能が正常なため、ＭＫ０．６プロモーターが作用せず、腫瘍化にともなって同遺伝子の機能消失がみられるため、ＭＫ０．６プロモーターが作用すると考えられる。
実施例６
ミッドカインプロモーターの最小領域の検討１
以上の実施例から明らかな通り、ヒトミッドカインゲノム遺伝子のプロモーター領域において、特に−５５９から＋５０（エクソン１の先頭の塩基配列を＋１とする）までの６０９ｂｐに腫瘍特異的なプロモーター領域が存在していることが判明した。この領域をさらに限定することを目的に、以下のにようにしてミッドカイン転写制御領域の解析用のベクターＤＮＡを得た。
ミッドカインゲノム遺伝子の情報をもとに、ＰＣＲ法を利用して、−２８５から＋５０の３３５ｂｐ領域（ＭＫ３３５ｂｐ）であって配列番号４の塩基配列を有するＤＮＡを合成し、塩基配列を確認後これをｐＣＲ２．１（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した。これよりＭＫ３３５ｂｐを切り出した後、ｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に連結させてプロモーター活性検出用のプラスミドを作製した。また、ＳＶ４０ウイルスのプロモーターを含むｐＧＬ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）と、同様に作成した６０９ｂｐのミッドカインプロモーター（ＭＫ０．６）を含むｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃを用いて、以下の方法でプロモーター活性を検討した。
１０％牛胎児血清添加ＤＭＥＭ培養液（Ｓｉｇｍａ社）で培養している、肺癌細胞ＱＧ−５６、ＰＣ−１、及びヒト乳癌細胞ＢＴ５４９に遺伝子導入を行なった。まず、１０μｇのこれらのプラスミドとリポフェクチン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を混和後、室温で３０分放置しＤＮＡと脂質の複合体を形成させた。その後この複合体を牛胎児血清を除去したうえで、細胞と接触させた。８時間後に牛胎児血清添加培養液を加え、その後４８時間培養した後に、遺伝子導入した細胞をＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて破壊し、その中のＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼ活性を同キットの試薬を用いて測定した。遺伝子導入の効率を標準化するため、各遺伝子導入群に１μｇのｐＲＬ−ＴＫプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を含めておき、そのＴＫプロモーターによるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を測定し、それに基づいてＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼ活性を補正した。
以上の結果を図６に示した。その結果、腫瘍細胞によって異なるが、ＭＫ３３５ｂｐのプロモーター活性はＭＫ０．６のそれとほぼ同様な活性を、腫瘍細胞において有していることが判明した。
実施例７
ミッドカインプロモーターの最小領域の検討２
ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）をＮｒｕ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化して、サイトメガロウイスルのプロモーターを除いたＤＮＡのＥｏｃ  ＲＩ部位に、Ｅｃｏ  ＲＩ消化にて上記のｐＣＲ２．１より切り出したＭＫ３３５ｂｐ断片を挿入した。ＰＣＲに使用したプライマーに含まれているＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位とｐｃＤＮＡ３上のＸｂａ  Ｉ部位を利用して、上記のＤＮＡ切断後その部位に、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩとＢａｍ  ＨＩ消化によってｐＣＨ１１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）より切り出したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を、平滑末端結合させた。その後、このＤＮＡをＫｐｎ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで消化後、Ｅｘｏｎｕｌｅａｓｅ  ＩＩＩにて経時的に消化した。これらのＤＮＡをアガロース電気泳動で全長の長さを確認後、ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅの存在下で環状ＤＮＡとした。そこで、ミッドカインゲノム領域の塩基配列を決定し、その領域が−１４４から＋５０の領域（ＭＫ１９４ｂｐ）であって配列番号５に示す塩基配列を有するＤＮＡと、−２０から＋５０の領域（ＭＫ７０ｂｐ）であって配列番号６に示す塩基配列を有するＤＮＡの下流にβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含んだＤＮＡを得た。
そこでこれらＤＮＡを、１０％牛胎児血清添加ＤＭＥＭ培養液（Ｓｉｇｍａ社）で培養している不死化ヒト線維芽細胞ＭＲＣ−５に、リポフェクチンを用いて遺伝子導入を行なった。４８時間後から、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で１０日間細胞を培養し、遺伝子導入ＭＲＣ−５細胞を得た。この細胞を、β−ガラクトシダーゼ遺伝子が発現した場合に青色を呈する公知の方法（Ｔｏｐｆ，Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，５，５０７−５１３，１９９８）で染色した。その結果を表１に示した。
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表１に示すように、ＭＫ３３５ｂｐ及びＭＫ１９４ｂｐをプロモーターとしたＤＮＡを導入した場合、青色に染色されたのに対して、ＭＫ７０ｂｐをプロモーターとしたＤＮＡを導入した場合は、全く染色されなかった。したがって、ミッドカインのゲノム遺伝子のなかでプロモーターの最小領域は−１４４から＋５０までの領域（１９４ｂｐ）内であって−２０から＋５０までの領域より長い領域に存在することが判明した。
実施例８
ｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーターによる転写活性の検討
ｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子の転写開始点を＋１として、−４９５から＋３８のゲノム領域（ｐ５３３）であって配列番号７に示す塩基配列を有するＤＮＡをＰＣＲ法を用いて増幅後、ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に組み込みＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。そこで、このＰＣＲ産物をｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）のＳｍａ  Ｉ部位に挿入したあと、ｃ−ｅｒｂＢ−２ゲノム遺伝子上に存在する制限酵素部位を利用してＢｌｎ  Ｉ／Ｓｍａ  Ｉ、Ｐｓｔ  Ｉ／Ｓｍａ  Ｉ、ＢｓｓＨ  ＩＩ／Ｓｍａ  Ｉで切断し、それぞれｃ−ｅｒｂＢ−２のゲノム領域、ｐ３４４（−３０６／＋３８）（配列番号８に示す塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐ２５１（−２１３／＋３８）（配列番号９に示す塩基配列を有するＤＮＡ）、ｐ１２４（−８６／＋３８）（配列番号１０に示す塩基配列を有するＤＮＡ）がＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼ遺伝子の上流に存在するプラスミドを作製した。ＳＶ４０ウイルスのプロモーターを有するプラスミドｐＧＬ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、さらにいかなるプロモーターをも含まないプラスミドｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、１０％牛胎児血清添加ＤＭＥＭ培養液（Ｓｉｇｍａ社）で培養している、ヒト乳癌細胞ＯＣＵＢＭ、ＭＣＦ７、ＢＴ５４９あるいは、正常ヒト線維芽細胞ＨＦＦ、ＭＲＣ−５、ヒト悪性黒色腫Ａ８７５、ヒト肺癌細胞ＱＧ−５６に遺伝子導入を行なった。まず、１０μｇのこれらのプラスミドとリポフェクチン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を混和後、室温で３０分放置しＤＮＡと脂質の複合体を形成させた。その後この複合体を牛胎児血清を除去したうえで、細胞と接触させた。８時間後に牛胎児血清添加培養液を加えた。４８時間の培養後、細胞をＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて破壊し、その中のＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼ活性を同キットの試薬を用いて測定した。遺伝子導入の効率を標準化するため、各遺伝子導入群に１μｇのｐＲＬ−ＴＫプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を含めておき、そのＴＫプロモーターによるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性を測定し、それに基づいてＦｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼ活性を補正した。その結果を図７ＡからＣに示した。
この結果から判明するようにｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーターは以下のようであった。
（ａ）ヒト乳癌細胞では、従来より遺伝子治療に使用されているｐ５３３プロモーターより、ｐ２５１プロモーターの方がその転写活性が強く、しかもｐ２５１プロモーター活性はＳＶ４０ウイルスのプロモーターより強力であった。一方、５’領域をさらに欠損させたｐ１２４プロモーターの転写活性は急激に減少した（図７Ａ）。このことから、プロモーター機能を発揮するためには、少なくともｐ１２４プロモーターよりも長い塩基配列を有する必要があることが分かった。（ｂ）ヒト線維芽細胞では、ｐ５３３及びｐ３４４プロモーター活性はＳＶ４０プロモーター活性より強い場合があるが、ｐ２５１プロモーターは、ｐ３４４プロモーターおよびｐ５３３プロモーターに比較してその転写活性は低値に留まり、ＳＶ４０よりも低い（図７Ｂ）。
（ｃ）ヒト悪性黒色腫細胞およびヒト肺癌細胞の場合、ｐ５１７、ｐ３４４、ｐ２５１およびｐ１２４のいずれのプロモーターも転写活性はＳＶ４０プロモーターより低い。ｐ２５１プロモーターの転写活性はｐ５３３プロモーターとほぼ同程度である（図７Ｃ）。すなわち、ｐ２５１のプロモーター活性はｐ５３３プロモーターに比較して乳癌細胞で転写活性が高く、正常細胞との比較から、従来のｐ５３３プロモーターより、有用なプロモーターであることが判明した。
実施例９
ｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーターを利用した乳癌特異的殺細胞効果
ｐ２５１プロモーターを用いた殺細胞効果を検討するために、このプロモーター領域の下流に自殺遺伝子であるＨＳＶ−ＴＫを連結し（ｐｒｏ２５１−ＴＫ）、このプラスミドを細胞に発現させ、プロドラックであるＧＣＶを遺伝子導入細胞の培養液に添加した。このシステムによる殺細胞効果の測定は、Ｍｏｏｌｔｅｎ，ＦＬ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１，ｐ２７９−２８７，１９９４に示されている方法に従って実施した。まず、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターをＮｒｕ  ＩとＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を利用して除き、この部分にｐ２５１プロモーターを挿入し、その後Ｅｃｏ  ＲＶ部位を利用して、ｐＭＫ（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２７，２２３−２３１，１９８１）よりＢｇｌ  ＩとＥｃｏ  ＲＩで切り出したＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を挿入した（ｐｒｏ２５１−ＴＫ）。また対照として、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を含まず、ｐ２５１プロモーターをｐｃＤＮＡ３に組み込んだプラスミド（ｐｒｏ２５１）、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子をｐｃＤＮＡ３に挿入しＣＭＶプロモーターによってＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を発現させうるプラスミド（ＣＭＶ−ＴＫ）も使用した。それぞれのプラスミド（ｐｒｏ２５１、ｐｒｏ２５１−ＴＫ、ＣＭＶ−ＴＫ）を、乳癌細胞であるＭＣＦ７あるいは非乳癌細胞であるＡ８７５に、リポフェクチンを用いて導入した。薬剤耐性マーカーで、ｐｃＤＮＡ３に含まれているＮｅｏ遺伝子の発現を利用するため、４００μｇのＧ４１８（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で細胞を１０日間培養し、それぞれの遺伝子発現細胞を樹立した。そこでこれらの細胞を、５００個／９６穴培養プレートにまき、各種の濃度のＧＣＶ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ社製）の存在下で７日間培養した。細胞の生存割合についてはＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学社製）を用いて検討した。ＧＣＶ濃度０μｇ／ｍｌの場合の細胞の生存を１００％として、各実験群における生存率をパーセント表示で示した（図８Ａ及びＢ）。その結果、以下のことが判明した。
（ａ）ＭＣＦ７細胞では、ｐ２５１プロモーターでＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を発現させた場合、ＣＭＶプロモーターで同遺伝子を発現させた場合よりＧＣＶに対する感受性が強く、親株と比較して感受性は極めて高く亢進していた（図８Ａ）。
（ｂ）Ａ８７５細胞では、ＣＭＶプロモーターを用いた場合、ＧＣＶに対する感受性は親株のそれと比較して亢進していたが、ｐ２５１プロモーターを用いた場合のＧＣＶ感受性は親株のそれに比較して極めて弱いものであった（図８Ｂ）。すなわち、ｐ２５１プロモーターを使用した場合、乳癌細胞では、強力なＣＭＶプロモーター以上の強い殺細胞効果が生じたのに対して、非乳癌細胞ではｐ２５１プロモーターによる効果は極めて低いものであった。
実施例１０
ｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーターを利用したｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果
上記実施例と同様にして、ｐｒｏ２５１あるいはｐｒｏ２５１−ＴＫをＭＣＦ７細胞に発現させた遺伝子導入細胞をＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに１ｘ１０６個接種し、皮下腫瘍を形成せしめた。腫瘍体積がおよそ１５０ｍｍ３に達したときに、３０ｍｇ／ｋｇのＧＣＶ、あるいは同量の生理的食塩水を５日間連日腹腔内投与を行なった。その結果、以下のことが明らかになった。
（ａ）ＧＣＶ投与群のうち、ｐｒｏ２５１−ＴＫ遺伝子が発現した腫瘍では、全７例の腫瘍が消失しその後全く再発しなかったのに対して、対照として使用したｐｒｏ２５１発現腫瘍は全く腫瘍の退縮はなく、腫瘍の増大は継続した（図９）。
（ｂ）ｐｒｏ２５１−ＴＫ遺伝子が発現した腫瘍においても生理的食塩水投与群では、腫瘍の増大速度はＧＣＶ投与のｐｒｏ２５１発現腫瘍と同じであった。したがって、ｐ２５１プロモーターはＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の転写活性化を果たし、ＧＣＶ投与による腫瘍の完全なる消失を可能にする転写活性を有していることが判明した。
産業上の利用の可能性
以上に詳細に述べた通り、ミッドカイン遺伝子の５’側上流領域から得られる６０９ｂｐの塩基配列、あるいはｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子のプロモーター領域内の２５１ｂｐの塩基配列からなる本発明の腫瘍特異的プロモーターは、高い腫瘍特異性及び高いプロモーター活性を有する。従って、本発明の腫瘍特異的プロモーターを用いることにより、極めて安全かつ効果的な遺伝子治療が可能となる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ミッドカイン遺伝子から得られるプロモーターのプロモーター活性を、ＣＡＴ活性に基づいて測定した結果を示すグラフである。
図２Ａは、ミッドカイン遺伝子から得られるプロモーターを含む遺伝子を導入した正常ヒト繊維芽細胞ＭＲＣ−５及びその親株細胞のガンシクロビルに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ感受性を測定した結果を示すグラフである。
図２Ｂは、ミッドカイン遺伝子から得られるプロモーターを含む遺伝子を導入した不死化ヒト繊維芽細胞ＭＲＣ−５及びその親株細胞のガンシクロビルに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ感受性を測定した結果を示すグラフである。
図３Ａは、ミッドカイン遺伝子から得られるプロモーターを含む遺伝子を導入した肺癌細胞ＱＧ−５６及びその親株細胞のガンシクロビルに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ感受性を測定した結果を示すグラフである。
図３Ｂは、ミッドカイン遺伝子から得られるプロモーターを含む遺伝子を導入した神経芽細胞腫ＮＧＰ細胞及びその親株細胞のガンシクロビルに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ感受性を測定した結果を示すグラフである。
図３Ｃは、ミッドカイン遺伝子から得られるプロモーターを含む遺伝子を導入した正常繊維芽細胞ＨＦＦ及びその親株細胞のガンシクロビルに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ感受性を測定した結果を示すグラフである。
図４Ａは、ミッドカイン遺伝子から得られるプロモーターを含む遺伝子を導入した肺癌細胞ＱＧ−５６及びその親株細胞のガンシクロビルに対するｉｎ  ｖｉｖｏ感受性を測定した結果を示すグラフである。
図４Ｂは、ミッドカイン遺伝子から得られるプロモーターを含む遺伝子を導入した肺癌細胞ＱＧ−５６及びその親株細胞の生理食塩水投与に対するｉｎ  ｖｉｖｏ感受性を測定した結果を示すグラフである。
図５は、ｐ５３癌抑制遺伝子発現によるミッドカイン遺伝子から得られるプロモーターへの影響を調べた結果を示すグラフである。
図６は、ミッドカイン遺伝子から得られるプロモーターのプロモーター活性をルシフェラーゼ活性の基づいて測定した結果を示すグラフで、ＳＶ４０のプロモーター活性（ｐＧＬ−Ｃｏｎｔｒｏｌによる）を１００％としている。
図７Ａは、ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子から得られるプロモーターのプロモーター活性をルシフェラーゼ活性に基づいて測定した結果を示すグラフである。使用細胞はすべてヒト乳癌細胞で、ＳＶ４０プロモーターによる活性（ｐＧＬ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ）を１００％としている。
図７Ｂは、ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子から得られるプロモーターのプロモーター活性をルシフェラーゼ活性に基づいて測定した結果を示すグラフである。使用細胞はすべてヒト正常線維芽細胞で、ＳＶ４０プロモーターによる活性（ｐＧＬ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ）を１００％としている。
図７Ｃは、ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子から得られるプロモーターのプロモーター活性をルシフェラーゼ活性に基づいて測定した結果を示すグラフである。使用細胞はヒト悪性黒色腫細胞およびヒト肺癌細胞で、ＳＶ４０プロモーターによる活性（ｐＧＬ２−Ｃｏｎｔｒｏｌ）を１００％としている。
図８Ａは、ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子から得られるプロモーター、あるいはサイトメガロウイルスプロモーターを含む遺伝子を導入したヒト乳癌細胞ＭＣＦ７、およびその親株のガンシクロビルに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏの感受性を測定した結果を示すグラフである。ガンシクロビル濃度が０の場合の生存率を１００％としている。
図８Ｂは、ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子から得られるプロモーター、あるいはサイトメガロウイルスプロモーターを含む遺伝子を導入したヒト悪性黒色腫Ａ８７５、およびその親株のガンシクロビルに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏの感受性を測定した結果を示すグラフである。ガンシクロビル濃度が０の場合の生存率を１００％としている。
図９は、ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２遺伝子から得られるプロモーターを含む遺伝子を導入したヒト乳癌細胞ＭＣＦ７の、ガンシクロビルあるいは生理的食塩水に対するｉｎ  ｖｉｖｏの感受性を測定した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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