(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）６−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素の遺伝子、セピアプテリン還元酵素の遺伝子およびＧＴＰシクロヒドラーゼＩ遺伝子で、宿主細胞である大腸菌、枯草菌または酵母を形質転換し、（ｂ）得られた形質転換細胞を培養することを特徴とするテトラヒドロビオプテリンの製造方法。
【請求項２】
形質転換を６−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素の遺伝子、セピアプテリン還元酵素の遺伝子およびＧＴＰシクロヒドラーゼＩ遺伝子を有する発現ベクターにより行うことを特徴とする請求項１に記載のテトラヒドロビオプテリンの製造方法。
【請求項３】
宿主細胞が、野生型細胞が有する内在性のＧＴＰシクロヒドラーゼＩ活性以上のＧＴＰシクロヒドラーゼＩ活性を有する変異型細胞であることを特徴とする請求項１または２に記載のテトラヒドロビオプテリンの製造方法。
【請求項４】
宿主細胞が、野生型細胞が有するＧＴＰ合成能以上のＧＴＰ合成能をもつ変異型細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のテトラヒドロビオプテリンの製造方法。
【請求項５】
宿主細胞が、野生型細胞が有する８−アザグアニン耐性以上の８−アザグアニン耐性をもつ変異型細胞であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載のテトラヒドロビオプテリンの製造方法。
【請求項６】
宿主細胞に導入するＧＴＰシクロヒドラーゼＩ遺伝子が、枯草菌由来のｍｔｒＡ遺伝子であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のテトラヒドロビオプテリンの製造方法。
【請求項７】
宿主細胞が、ＩＭＰデヒドロデナーゼおよびＧＭＰシンターゼをコードするｇｕａＢＡ遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞であることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載のテトラヒドロビオプテリンの製造方法。
【請求項８】
宿主細胞が、大腸菌である請求項１〜７のいずれか一項に記載のテトラヒドロビオプテリンの製造方法。
【請求項９】
宿主細胞が、メタノール資化酵母または分裂酵母である請求項１〜７のいずれか一項に記載のテトラヒドロビオプテリンの製造方法。
【請求項１０】
宿主細胞が、サッカロマイセス酵母である請求項１〜７のいずれか一項に記載のテトラヒドロビオプテリンの製造方法。
【請求項１１】
大腸菌、枯草菌または酵母に、６−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素の遺伝子、セピアプテリン還元酵素の遺伝子およびＧＴＰシクロヒドラーゼＩ遺伝子を導入した形質転換細胞。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、テトラヒドロビオプテリン生合成に関わる１つ以上の酵素の遺伝子を導入した形質転換細胞、およびそれを用いたビオプテリン類の製造方法に関する。
背景技術
本明細書においては、テトラヒドロビオプテリン（Ｌ−ｅｒｙｔｈｒｏ−５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｂｉｏｐｔｅｒｉｎ：以下、ＴＨＢＰと略す）、７，８−ジヒドロビオプテリン（Ｌ−ｅｒｙｔｈｒｏ−７，８−ｄｉｈｙｄｒｏｂｉｏｐｔｅｒｉｎ：以下ＤＨＢＰと略す）もしくはビオプテリン（Ｂｉｏｐｔｅｒｉｎ：ＢＰと略す）、またはこれらの任意の２以上の組み合わせを総称してビオプテリン類とする。
ＴＨＢＰは、動物において広く分布している生体物質であり、１９６３年にＫａｕｆｍａｎにより、ラット肝のフェニルアラニン水酸化酵素の補酵素であることが明らかにされた。その後、ＴＨＢＰはチロシン水酸化酵素およびトリプトファン水酸化酵素に対して共通に働く補酵素であることも明らかにされ、神経伝達物質の生合成に関わる重要な役割を果たすことが明らかとなった。また近年、一酸化窒素（ＮＯ）合成酵素の補酵素としての機能も見出され、多様な生体物質の生合成系酵素の補酵素となることが注目されている。ヒトにおいて、ＴＨＢＰの欠損は上記のアミノ酸水酸化酵素の活性低下をもたらし、異型高フェニルケトン尿症および異型高フェニルアラニン血症を引き起こすことが知られており、ＴＨＢＰはこの先天性代謝異常疾患の治療に塩酸サプロプテリンとして用いられている。
動物においてＴＨＢＰは、第１図に示すように、グアノシン３リン酸（以下、ＧＴＰと略す）から、ＧＴＰシクロヒドラーゼＩ（以下、ＧＣＨと略す）、６−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素（以下、ＰＴＰＳと略す）およびセピアプテリン還元酵素（以下、ＳＰＲと略す）の３段階の酵素反応により生合成されることが知られている。一方、動物以外では、ショウジョウバエ（Ｗｅｉｓｂｅｒｇ，Ｅ．Ｐ．ａｎｄ  Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｊ．Ｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１４５３−１４５８，１９９６）、カイコ（Ｉｉｎｏ，Ｔ．，Ｓａｗａｄａ，Ｈ．，Ｔｓｕｓｕｅ，Ｍ．ａｎｄ  Ｔａｋｉｋａｗａ，Ｓ．−Ｉ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２９７：１９１−１９９，１９９６）、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａおよびＰｈｙｃｏｍｙｃｅｓ  ｂｌａｋｅｓｌｅｅａｎｕｓなどの真核微生物（Ｍａｉｅｒ  Ｊ．，Ｎｉｎｎｅｍａｎｎ  Ｈ．Ｐｈｏｔｏｃｈａｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６１：４３−５３，１９９５）、ならびに原核微生物であるＮｏｃａｒｄｉａ  ｓｐ（Ｓｏｎ  ＪＫ，Ｒｏｓａｚｚａ  ＪＰ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：３６４４−３６４８，２０００）においてその存在が報告されている。このように、ＴＨＢＰの存在が報告されている生物の種類は多いが、特に微生物については進化上、動物とは大きく隔たりがあることから、微生物全般が有している生体物質ではないと考えられる。
ＴＨＢＰは、分子内に３つの不斉炭素を有するため化学合成が困難な化合物であり、その主な合成法としては、ラムノースやデオキシアラビノースを出発原料としてＬ−エリスロ−ビオプテリン（ＢＰ）を合成した後、これを化学的に不斉還元することにより合成する方法が知られている。しかし、これらの化学合成法は反応工程が多く、その反応工程の中には反応の収率が低いプロセスもある。また、出発原料であるラムノースやデオキシアラビノースが高価であることなどの問題点があり、操作性、収率、コスト面等において有利な製造方法とは言い難い。
これに対し鏡山らは、酵素反応によるＴＨＢＰ合成に取り組み、ＴＨＢＰ合成に関わる３種類の酵素をそれぞれ精製後、これら３種類の酵素を使用し、ＧＴＰおよびニコチンアミドジヌクレオチドリン酸還元型（以下、ＮＡＤＰＨと略す）を含んだ１つの反応槽の中でＴＨＢＰを合成させることに成功している（特開平４−８２８８８号）。しかし、この方法を用いて１ｋｇのＴＨＢＰを得るには、３．１２ｋｇのＧＴＰと９２ｋｇのＮＡＤＰＨが必要となる。これらの原料が非常に高価であること、また３種類の酵素の精製を含めた操作は非常に煩雑となることを考慮すると、該方法を用いたビオプテリン類の工業的生産は、コスト面および操作面において困難である。
一方、白石らはＣａｎｄｉｄａ属酵母（Ｃａｎｄｉｄａ  ｎｏｖｅｉｉｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ，Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｏｂｓｔａ等）や、いくつかのＭｕｃｏｒ属糸状菌（Ｍｕｃｏｒ  ｊａｖａｎｉｃｕｓ、Ｍｕｃｏｒ  ａｌｔｅｒｎｎｓ、Ｍｕｃｏｒ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ等）が、ＴＨＢＰの酸化物であるＬ−エリスロ−ビオプテリン（ＢＰ）を培地へ蓄積することを見出し、この性質を利用して培養液からＢＰを生産する方法を報告している（特開昭６１−９２９６、特公平５−３３９９０）。ＢＰは化学的な還元によりＴＨＢＰへの変換が可能であるため、微生物にＢＰを生産させた後ＴＨＢＰへと変換する方法は、高価なＧＴＰやＮＡＤＰＨを必要としない上、合成ステップが大幅に削減されることから、操作面においては工業上有利な製造方法であるといえる。しかし、いずれの菌株においても、ＢＰ生産量が低く、培養液１Ｌ当たりのＢＰ生産量は１ｍｇ以下であり、収率およびコスト面からは工業的に有利な製造方法とはいえない。
したがって、上記のように有用なＴＨＢＰは、従来工業的に有利な製造方法がないゆえに、研究対象となりにくく、また医薬等として一般に供給されにくいため、その有用性が必ずしも十分に生かされていない。また下記するＴＨＢＰの酸化物であるＤＨＢＰやＢＰなどのビオプテリン類にも、同等もしくはそれ以上の薬理作用が期待されながら、十分にその作用が解明されていない。
発明の開示
本発明の目的は、ビオプテリン類を、遺伝子工学的手法を用いて安価な原料から大量に、工業的に有利に生産する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、テトラヒドロビオプテリン生合成に関わることのできる１つ以上の酵素の遺伝子を導入した形質転換細胞、またはかかる形質転換細胞を作成するために用いるテトラヒドロビオプテリン生合成に関わることのできる１つ以上の酵素の遺伝子を有する発現ベクターを提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、テトラヒドロビオプテリンの生産に有利な、野生型細胞のＧＴＰ合成能以上のＧＴＰ合成能をもつ遺伝子組換え細胞などの変異型宿主細胞、または野生型細胞が有する内在性のＧＣＨ活性以上のＧＣＨ活性を有する変異型宿主細胞もしくは形質転換細胞を提供することにある。
本発明者らは、大量培養が可能な微生物などの宿主細胞にＴＨＢＰの生合成に関与する酵素の遺伝子を導入することで、本物質を安価でかつ大量に生合成させることを知見した。すなわち、ＴＨＢＰ生合成の出発物質であるＧＴＰは生物に普遍的に存在する生体物質であるため、動物あるいはそれ以外の生物が有するＴＨＢＰ生合成系酵素の遺伝子を遺伝子組換え技術により宿主細胞に導入することで、本来ＴＨＢＰの生産能力のない宿主細胞もＴＨＢＰを生産できるようになることを知見し、そのような形質転換細胞の作製を鋭意検討した。
しかし、その一方でＴＨＢＰの大量合成は宿主細胞にとって有害となることも考えられ、本方法によるＴＨＢＰの生産は困難であることも予測された。すなわち、ＴＨＢＰはプテリジン環を有する点で葉酸と構造が類似しているため、葉酸アナログの一種ともみなすことができる。実際に大腸菌のジヒドロ葉酸還元酵素は、ＴＨＢＰの酸化体である７，８−ジヒドロビオプテリン（ＤＨＢＰ）に作用し、ＤＨＢＰからＴＨＢＰへの変換を行えることが報告されている（渡辺ら、生化学、第５３巻第８号、ｐ１００８（１９８１））。葉酸は生体内において種々の炭素転移反応にあずかる補酵素であり細胞の生育に必須の物質であるため、ＴＨＢＰが細胞内で著量に合成された場合、葉酸が関与する酵素反応を阻害し、細胞の増殖阻害ひいては死滅を引き起こすことが予想された。
さらに、ＴＨＢＰ合成の中間物質である７，８−ジヒドロネオプテリン３リン酸から生成する７，８−ジヒドロネオプテリンはラジカルを形成すること（Ｏｅｔｔｌ，Ｋ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２６４：２６２−７，１９９９）、またはその酸化体であるネオプテリンは過酸化水素や亜硝酸と共存すると、過酸化水素や亜硝酸が有する細胞毒性をさらに増強することが報告されている（Ｗｅｄｅ，Ｉ．ら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ  Ｒｅｓ．１９９９  Ｎｏｖ；３１（５）：３８１−８）。従って、ＴＨＢＰを大量に生成させた場合、中間体として７，８−ジヒドロネオプテリン３リン酸が蓄積し、これが細胞内のフォスファターゼにより７，８−ジヒドロネオプテリンへと変換され、ラジカルを形成し細胞に傷害を与える可能性、および酸化されて生ずるネオプテリンが細胞内で発生する過酸化水素や亜硝酸と共存することにより、細胞毒性を示す可能性が考えられた。
さらにはＴＨＢＰの大量合成は基質であるＧＴＰと補酵素であるＮＡＤＰＨの細胞内プールを減少させ、増殖阻害を引き起こす可能性も懸念された。また、細胞内でＴＨＢＰの生合成に必要な酵素を高発現させた場合には細胞増殖阻害を起こすのではないかという問題も懸念された。さらに、細胞内で高生産されたＴＨＢＰが果たして効率よく培地へ移行するのか否かについては全く不明であった。
本発明者らはこのような宿主細胞への毒性も考慮し、ＴＨＢＰ合成に関わる酵素の遺伝子を、本来その合成能が無い大腸菌およびサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）酵母に導入し、ビオプテリン類生産能を調べた。その結果、作製されたこれらの形質転換細胞は懸念された増殖阻害を起こすことなく、ビオプテリン類を大量に生産し、培地中に該ビオプテリン類を効率よく移行させることができることを知見した。さらに検討を重ねて、ＴＨＢＰ合成に関わる酵素の遺伝子を導入した形質転換細胞によるビオプテリン類の生産が可能であることを知見した。
本発明者らは、さらに大腸菌を例にビオプテリン類の生産量を上昇させる検討を行った。まず始めに、ＴＨＢＰ合成の出発物質はＧＴＰであるので、野生型細胞が有するＧＴＰ合成能以上のＧＴＰ合成能を有する宿主細胞（以下、ＧＴＰ高合成能宿主細胞と略す。）の作製を検討した。
ＧＴＰはプリン化合物の一種であるため、プリン生合成経路の調節変異株をスクリーニングすることにより、ＧＴＰ合成能が増加した変異型宿主細胞の取得できることを知見した。このようなプリン合成の調節変異株は、枯草菌の場合、８−アザグアニンやデコイニンのようなプリンアナログに耐性を有する変異株の内から得ることができることが報告されているが（例えば、ＩｓｈｉｉおよびＳｈｉｉｏ、Ａｇｒｉｃ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，３６（９）：１５１１−１５２２，１９７２；Ｍａｔｓｕｉら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４３（８）：１７３９−１７４４，１９７９）、大腸菌において、これらのプリンアナログがＧＴＰ高合成能宿主細胞の取得に有効かどうかは明らかとなっていなかった。
本発明者らは、大腸菌においても８−アザグアニンやデコイニンのようなプリンアナログを用いたＧＴＰ高合成能宿主細胞の取得に成功した。さらに、かかるＧＴＰ合成能が増加したプリン合成の調節変異株を宿主細胞とした場合は、野生株を宿主細胞とした場合に対し約１０倍のビオプテリン類生産能を持ち、さらＤＨＢＰも著量産生されるという驚くべき知見を得た。
また、ＧＴＰ高合成能宿主細胞の作製方法として、イノシン酸からグアニル酸への変換を行うＩＭＰデヒドロゲナーゼおよびＧＭＰシンターゼをコードするｇｕａＢＡ遺伝子を細胞に導入し、当該両酵素の活性を上昇させることを検討した。その結果、上述したプリン合成の調節変異株である大腸菌にｇｕａＢＡ遺伝子を導入し、かかる遺伝子組換え細胞を宿主細胞とすることにより、ビオプテリン類の生産が上記プリン合成の調節変異株に比べさらに増加するという知見も得た。
本発明者らは、さらにビオプテリン類の生産性を高めるために鋭意検討した結果、ＴＨＢＰ合成に関わる酵素の遺伝子を宿主細胞に複数回導入し発現量を上げたところ、ビオプテリン類生産能が向上することを知見した。特に、ＴＨＢＰ合成の第１段階の反応を触媒する酵素であるＧＣＨ遺伝子を複数回宿主細胞に導入し、ＧＣＨの発現量を上げると、ビオプテリン類生産能が顕著に向上するという思いがけない知見を得た。
ＧＣＨ遺伝子を複数回宿主細胞に導入すると、ビオプテリン類生産能が顕著に向上するという上記知見に基づき、枯草菌のＧＣＨ遺伝子（ｍｔｒＡ遺伝子ともいう）を用いることを検討した結果、ビオプテリン類の生産量がさらに向上するという思いがけない知見も得た。
以上のように、本発明はＴＨＢＰ等のビオプテリン類の工業的に有利な製造方法、ならびにその製造に有用な形質転換細胞および宿主細胞を提供できる。
本発明者らは、さらに検討を重ねて、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、
（１）形質転換した細胞によりビオプテリン類を製造する方法であって、（ａ）テトラヒドロビオプテリン生合成に関わる酵素の遺伝子の少なくとも一つで宿主細胞を形質転換し、（ｂ）得られた形質転換細胞を培養してテトラヒドロビオプテリンを生産し、（ｃ）所望により、生産されたテトラヒドロビオプテリンを酸化し、（ｄ）生産されたテトラヒドロビオプテリン、ならびに該テトラヒドロビオプテリンが酸化されたジヒドロビオプテリンおよびビオプテリンからなる群から選ばれる１種以上のビオプテリン類を採取することを特徴とするビオプテリン類の製造方法、
（２）前記（１）に記載のビオプテリン類の製造方法において、培養液中またはその処理物中のビオプテリン類を酸化した後、ビオプテリンを採取することを特徴とする前記（１）に記載のビオプテリン類の製造方法、
（３）前記（１）または（２）に記載のビオプテリン類の製造方法において、採取したジヒドロビオプテリンおよび／またはビオプテリンを還元してテトラヒドロビオプテリンを製造することを特徴とする前記（１）または（２）に記載のビオプテリン類の製造方法、
（４）テトラヒドロビオプテリン生合成に関わる酵素が、ＧＴＰシクロヒドラーゼＩ、６−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素およびセピアプテリン還元酵素からなる群から選ばれる１〜３種類の酵素であることを特徴とする前記（１）〜（３）に記載のビオプテリン類の製造方法、
（５）形質転換を６−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素の遺伝子およびセピアプテリン還元酵素の遺伝子を有する発現ベクターにより行うことを特徴とする前記（１）〜（３）に記載のビオプテリン類の製造方法、
（６）宿主細胞が、野生型細胞が有する内在性のＧＴＰシクロヒドラーゼＩ活性以上のＧＴＰシクロヒドラーゼＩ活性を有する変異型細胞であることを特徴とする前記（５）に記載のビオプテリン類の製造方法、
（７）宿主細胞に導入するＧＴＰシクロヒドラーゼＩ遺伝子が、枯草菌由来のｍｔｒＡ遺伝子であることを特徴とする前記（４）に記載のビオプテリン類の製造方法、
（８）宿主細胞が、原核生物細胞である前記（１）〜（７）に記載のビオプテリン類の製造方法、
（９）原核生物が、大腸菌、枯草菌または放線菌である前記（８）に記載のビオプテリン類の製造方法、
（１０）宿主細胞が、真核生物細胞である前記（１）〜（７）に記載のビオプテリン類の製造方法、
（１１）真核生物が、酵母または糸状菌である前記（１０）に記載のビオプテリン類の製造方法、
（１２）酵母が、メタノール資化酵母または分裂酵母である前記（１１）に記載のビオプテリン類の製造方法、
（１３）酵母が、サッカロマイセス酵母である前記（１１）に記載のビオプテリン類の製造方法、
（１４）宿主細胞が、野生型細胞が有するＧＴＰ合成能以上のＧＴＰ合成能をもつ変異型細胞であることを特徴とする前記（１）〜（１３）に記載のビオプテリン類の製造方法、
（１５）宿主細胞が、野生型細胞が有する８−アザグアニン耐性以上の８−アザグアニン耐性をもつ変異型細胞であることを特徴とする前記（１４）に記載のビオプテリン類の製造方法、
（１６）宿主細胞が、ＩＭＰデヒドロデナーゼおよびＧＭＰシンターゼをコードするｇｕａＢＡ遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞であることを特徴とする前記（１４）または（１５）に記載のピオプテリン類の製造方法、
（１７）宿主細胞に、テトラヒドロビオプテリン生合成に関わる酵素の遺伝子を導入した前記（１）〜（１６）に記載のビオプテリン類の製造に用いる形質転換細胞、
（１８）宿主細胞が、野生型細胞が有するＧＴＰ合成能以上のＧＴＰ合成能をもつ変異型細胞であることを特徴とする前記（１７）に記載の形質転換細胞、
（１９）宿主細胞が、野生型細胞が有する８−アザグアニン耐性以上の８−アザグアニン耐性をもつ変異型細胞であることを特徴とする前記（１８）に記載の形質転換細胞、
（２０）宿主細胞が、ＩＭＰデヒドロデナーゼおよびＧＭＰシンターゼをコードするｇｕａＢＡ遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞であることを特徴とする前記（１８）または（１９）に記載の形質転換細胞、
（２１）宿主細胞が、野生型細胞が有する内在性のＧＴＰシクロヒドラーゼＩ活性以上のＧＴＰシクロヒドラーゼＩ活性を有する変異型細胞であって、該宿主細胞に６−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素の遺伝子およびセピアプテリン還元酵素の遺伝子を導入した前記（１８）に記載の形質転換細胞、および
（２２）宿主細胞に導入するＧＴＰシクロヒドラーゼＩ遺伝子が、枯草菌由来のｍｔｒＡ遺伝子であることを特徴とする前記（１７）〜（２１）に記載の形質転換細胞、
（２３）ＩＭＰデヒドロデナーゼおよびＧＭＰシンターゼをコードするｇｕａＢＡ遺伝子を宿主細胞に導入した形質転換細胞を用いることを特徴とする前記（１４）または（１５）に記載のビオプテリン類の製造方法、
（２４）宿主細胞にＩＭＰデヒドロデナーゼおよびＧＭＰシンターゼをコードするｇｕａＢＡ遺伝子を導入した前記（１８）または（１９）に記載の形質転換細胞、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
テトラヒドロビオプテリン生合成に関わることのできる酵素としては、第１図に示したようにグアノシン３リン酸シクロヒドラーゼＩ（ＧＣＨ）、６−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素（ＰＴＰＳ）およびセピアプテリン還元酵素（ＳＰＲ）等の酵素が挙げられる。
宿主細胞に導入する遺伝子は、前述した酵素をコードする遺伝子を含有するものであればいかなるものであってもよい。具体的には、第１０図に示した大腸菌由来のＧＣＨ遣伝子または第３１図に示した枯草菌由来のＧＣＨ遺伝子、第１１図および第３２図に示したラット由来のＰＴＰＳ遺伝子、および第１２図および第３３図に示したラット由来のＳＰＲ遺伝子を含むＤＮＡはもちろんのこと、該ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。当該ＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、第１０図〜第１２図および第３１図〜３３に示した塩基配列と約８０％以上、好ましくは約８５％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが挙げられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリーまたはキットを使用する場合、それらに添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。より好ましくは、ハイブリダイゼーションはハイストリンジェントな条件に従って行うことができる。ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ程度、好ましくは約１９〜２０ｍＭ程度で、温度が約５０〜７０℃程度、好ましくは約６０〜６５℃程度の条件をいう。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃程度の場合が最も好ましい。
宿主細胞に導入する際のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、細胞・組織由来のｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡのいずれでもよい。遺伝子導入に使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミドなどいずれであってもよい。また、ｃＤＮＡは前記した細胞・組織より全ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。また、さらに、自体公知のオリゴヌクレオチドの合成法に従って製造されたものを用いてもよい。具体的には、例えばフォスフォアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機ｍｏｄｅｌ  ３９２（パーキン・エルマー株式会社製）等のＤＮＡ合成機で化学合成する方法が挙げられる。
宿主細胞に導入する目的遺伝子を含むＤＮＡは、より具体的には、例えば以下のようにして得ることができる。
テトラヒドロビオプテリン生合成の第１ステップの反応を触媒する酵素であるＧＣＨについては、動物以外でも葉酸合成に関わる酵素として大腸菌および酵母菌など多くの宿主細胞に存在しているため、ＧＣＨをコードするＤＮＡは、（１）該ＤＮＡの部分塩基配列を有する合成ＤＮＡプライマーを用いて、ＰＣＲ法によって遺伝子ライブラリー等から目的とする遺伝子を含んだＤＮＡを増幅する方法、または（２）適当な遺伝子ライブラリーと、ＧＣＨの一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したもの（プローブ）とのハイブリダイゼーションによって選別する方法などによって容易に得ることができる。該方法は本発明において好適に用いることができ、中でも前者が好ましい。
ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行われる。また、市販のライブラリーやキットを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。ハイブリダイゼーションのプローブとして用いる部分塩基配列を有するＤＮＡは、自体公知のオリゴヌクレオチドの合成法に従って製造することもできる。
本発明においては、ＧＣＨ遺伝子として、大腸菌のＧＣＨ遺伝子（ｆｏｌＥ遺伝子ともいう）、酵母のＧＣＨ遺伝子（ＦＯＬ２遺伝子ともいう）または枯草菌のＧＣＨ遺伝子（ｍｔｒＡ遺伝子ともいう）を用いるのが好ましく、中でも枯草菌のＧＣＨ遺伝子を用いるのがより好ましい。
テトラヒドロビオプテリン生合成の第２ステップおよび第３ステップの反応を行うＰＴＰＳおよびＳＰＲをコードするＤＮＡを得るには、ラット肝よりｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行う方法が好ましい。該ｍＲＮＡを抽出するには、自体公知の方法を用いてよい。例えば、ＮＰ−４０、ＳＤＳ、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、デオキシコール酸などの界面活性剤を使用するか、ホモゲナイザーや凍結融解などの物理的方法を用いて、細胞を部分的あるいは完全に破壊した後、ｍＲＮＡを分離する。抽出の際にＲＮＡ分解酵素によるＲＮＡの分解を防ぐために、抽出液中にＲＮＡ分解酵素阻害物質、例えばヘパリン、ポリビニル硫酸、ベントナイト、マカロイド、ジエチルピロカーボネイトまたはバナジウム複合体などを添加しておくのが好ましい。また、ｐｏｌｙＡを含むｍＲＮＡの精製については、オリゴｄＴ−セルロースもしくはセファロース２Ｂを担体とするポリＵ−セファロースなどのアフィニティ・カラム・クロマトグラフィーあるいはバッチ法による精製法、ＳＤＧ遠心法による分画またはアガロースゲル電気泳動法等によって行うことができる。
かくして得られたＰＴＰＳおよびＳＰＲに対応するｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ画分よりｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡを合成する方法としては自体公知の方法を用いてよいが、例えば、先ず、ｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴをプライマーとして、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの存在下で逆転写酵素によりｍＲＮＡと相補的な一本鎖ＤＮＡを合成し、アルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡを分解、除去した後、今度は該一本鎖ｃＤＮＡを鋳型にして逆転写酵素あるいはＤＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成する方法が挙げられる。
こうして作成したｃＤＮＡライブラリーからＧＣＨ、ＰＴＰＳまたはＳＰＲ等のＴＨＢＰ合成に関わる酵素の遺伝子を含むｃＤＮＡを選択するためには、当該酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片をプローブとしたハイブリダイゼーション法が用いられる。ハイブリダイゼーションとしては、上記に記載した方法など自体公知の方法を用いてよい。選択されたｃＤＮＡがＧＣＨ、ＰＴＰＳまたはＳＰＲ等のＴＨＢＰ合成に関わる酵素をコードしているかどうかを調べるには、ｃＤＮＡを例えばエシェリヒア・コリまたはＣＯＳ細胞内で複製し得るベクターに組み込んで、そのベクターをエシェリヒア・コリまたはＣＯＳ細胞に導入し、酵素を発現させることによって行うことができる。
本発明に係る形質転換細胞とは、通常、上記ＴＨＢＰ合成に関わる少なくとも１種の酵素の遺伝子を、宿主細胞に導入することにより、ビオプテリン類を生産できるようになったものまたはビオプテリン類の生産能が向上したものをいう。
したがって、宿主細胞は、本来ビオプテリン類の生産能力のないものであってもよいし、ビオプテリン類の生産能力をある程度有するものであってもよい。すなわち、宿主細胞の中には、元来上記ＴＨＢＰ合成に関わる酵素のうち１〜３種いずれかの遺伝子を有し、該１〜３種の酵素を十分に発現する宿主細胞もある。そのような場合、その酵素に限っては、その酵素の遺伝子を宿主細胞に導入しなくてもよい。当然、ビオプテリン類生産能を高めるために導入してもよい。しかし、そうでない場合、すなわち上記酵素の遺伝子が存在しない場合は、その酵素の遺伝子を導入する必要が通常はあり、また該遺伝子は存在するが十分に酵素が発現しない場合は、その酵素の遺伝子を導入するのが好ましい。
宿主細胞としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌、アクチノマイセタレス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目菌などの原核生物であってもよいし、例えば、酵母、糸状菌、昆虫細胞、昆虫、動物細胞、植物細胞などの真核生物であってもよい。
エシェリヒア属菌の具体例としては、いわゆる大腸菌が挙げられ、そのなかでもエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０１，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ，（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）〕，１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．），４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕などが挙げられる。なかでも、本発明においては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＪＭ１０１を用いるが好ましい。
バチルス属菌としては、いわゆる枯草菌が挙げられ、そのなかでも例えば、バチルス・サチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１Ａ１株（ｔｒｐＣ２）（Ｆｕｊｉｔａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０：６５７１−６５８０，１９９８）、またはＭＩ１１４〔ジーン（Ｇｅｎｅ），２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕などが挙げられる。本発明においては、中でも前者を用いるのが好ましい。
アクチノマイセタレス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目菌としては、いわゆる放線菌が挙げられ、なかでもストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属などが挙げられる。ストレプトミセス属に属するものとして、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ  ３１３１などが挙げられる。
酵母としては、サッカロマイセス属酵母、メタノール資化酵母または分裂酵母を用いることが好ましい。メタノール資化酵母としてはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられ、また、分裂酵母としてはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｐｏｍｂｅが挙げられる。サッカロマイセス属酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＡ３１，サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが挙げられる。なかでも、本発明においてはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属酵母が好ましく、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＫＡ３１を用いることが好ましい。
糸状菌としては、例えば、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ、ヒュミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）およびトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などの種が挙げられる。
昆虫細胞としては、例えば、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが挙げられる。また、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ；ＢｍＮ細胞）なども用いられる。上記Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（ｉｎ  Ｖｉｖｏ），１３巻，２１３−２１７（１９７７））などが挙げられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが挙げられる（前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５））。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０細胞、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞、Ｓｐ−２細胞などが挙げられる。
植物細胞としては、タバコ細胞、ニンジン細胞等が挙げられる。
本発明に係る宿主細胞は、上記宿主細胞の野生型細胞が有するＧＴＰ合成能以上のＧＴＰ合成能をもつ変異型細胞を用いることができる。ＴＨＢＰ生合成の出発物質であるＧＴＰはプリン化合物の一種であるため、ＧＴＰ合成能が増加したプリン合成経路の調節変異型細胞を用いれば、出発物質であるＧＴＰの供給量が増加し、その結果ビオプテリン類の産生量も向上するからである。該プリン合成経路の調節変異型細胞を得るためには、公知の方法を用いてよい。例えば、プリンアナログを加えた培地で培養し、プリンアナログに耐性を有する突然変異株を選択する方法等が挙げられる。プリンアナログとしては自体公知の物質を用いてよいが、８−アザグアニンやデコイニン等が挙げられ、これらが好適に用いられる。具体的には、Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓの場合、該変異型細胞は８−アザグアニンやデコイニンのようなプリン類似体及びメチオニンスルホキシドのような他の拮抗体に耐性を有する突然変異株を得ることにより達成できることが報告されている（例えば、Ｉｓｈｉｉ及びＳｈｉｉｏ、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６：１５１１−１５２２，１９７２；Ｍａｔｓｕｉら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４３：１７３９−１７４４，１９７９）。
また、大腸菌の場合において、野生型細胞が有する８−アザグアニン耐性以上の８−アザグアニン耐性をもつ変異型細胞を得るための好ましい態様を以下に述べる。宿主細胞である大腸菌ＪＭ１０１株が約１００μｇ／ｍｌ以上の８−アザグアニン、約５００μｇ／ｍｌのデコイニンに対して感受性を持つため、約１００μｇ／ｍｌの８−アザグアニンまたは約５００μｇ／ｍｌのデコイニンを含む最少寒天培地を用いてＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−ニトロソグアニジン処理による変異処理を行った大腸菌ＪＭ１０１株をプレーティングし、それぞれの耐性株を得ることができる。
上記宿主細胞の野生型細胞が有するＧＴＰ合成能以上のＧＴＰ合成能をもつ宿主細胞を遺伝子工学的に作成することができる。すなわち、ＧＴＰ合成能を向上させる遺伝子、例えばＧＴＰ生合成系酵素の遺伝子を、野生型細胞または高ＧＴＰ合成能を有する変異型細胞などの変異型細胞に導入した遺伝子組換え細胞を宿主細胞として用いてもよい。ＧＴＰ合成能を向上させる遺伝子は、自体公知ものを用いてよい。該遺伝子として１種を野生型または変異型細胞に導入してもよいし、２種以上の遺伝子を野生型または変異型細胞に導入してもよい。具体的には、ＧＴＰ合成能が向上した遺伝子組換え細胞の作製方法として、例えば、イノシン酸からグアニル酸への変換を行うＩＭＰデヒドロゲナーゼおよびＧＭＰシンターゼをコードするｇｕａＢＡ遺伝子（Ｔｉｅｄｅｍａｎ，Ａ．Ａ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：８６７６−８６７９，１９８５およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：１３０３−１３１６，１９８５［ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ１０１０１］）を野生型または変異型細胞に導入する方法が挙げられる。野生型または変異型細胞にｇｕａＢＡ遺伝子などの遺伝子を導入する方法は、下記する方法など自体公知の方法を用いて容易に行うことができる。
本発明においては、ＴＨＢＰ合成に関わる少なくとも１種の酵素の遺伝子を上記宿主細胞に導入すればよい。すなわち、ＴＨＢＰ合成に関わる酵素の遺伝子全てを導入してもよいし、該酵素のうち一部の酵素の遺伝子のみを導入してもよい。具体的には、例えば、（ａ）ＧＣＨ、ＰＴＰＳおよびＳＰＲの遺伝子、（ｂ）ＧＣＨ、ＰＴＰＳおよびＳＰＲのうち任意の２種の遺伝子、（ｃ）ＧＣＨ、ＰＴＰＳおよびＳＰＲのうちいずれか１種の遺伝子を導入する場合が挙げられる。
また、同じ酵素の遺伝子を複数回導入して、発現量を上げるのもよい。特に、ＧＣＨ遺伝子は複数回導入するのが好ましく、ＧＣＨ遺伝子の由来は同一であっても異種であってもよい。
本発明における好ましい態様としては、ＧＣＨは葉酸合成に関わる酵素として大腸菌および酵母菌など多くの宿主細胞に存在しているため、ＰＴＰＳおよびＳＰＲの遺伝子を導入することが挙げられる。
また、他の好ましい態様としては、例えば光合成グラム陰性細菌ＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓにおいてはＧＣＨに加えてＰＴＰＳの存在も報告されており（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｗら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒ  １７６：１６９−１７６，１９９９）、このような宿主細胞においてはＳＰＲの遺伝子のみを導入することが挙げられる。
さらには、ビオプテリン類生産能を本来より有している細胞に対してもＴＨＢＰ合成に関わる酵素の遺伝子を導入することができる。こうすることで、酵素活性を高まり、ビオプテリン類生産能が高められるからである。
ＰＴＰＳおよびＳＰＲの２種の酵素の遺伝子を導入し、これを発現させ、一方ＧＣＨについては宿主細胞が有するものを用いて、ビオプテリン類を産生させようとする場合、宿主細胞としては、野生型細胞が有する内在性のＧＴＰシクロヒドラーゼＩ活性以上の酵素活性を有する変異型細胞を用いることが好ましい。
かかる変異型細胞を得るための方法としては、染色体に存在するＧＣＨ遺伝子のプロモーターの変異株を取得する方法や染色体中のＧＣＨ遺伝子の上流へ新たなプロモーターを導入する方法、またはＧＣＨの構造遺伝子の変異により、比活性が野生型細胞のものと比べて上昇したものへと改変する方法などが挙げられる。
上記宿主細胞にテトラヒドロビオプテリン生合成に関わることのできる酵素の遺伝子を導入する方法としては、自体公知の方法を用いてよい。かかる方法として、具体的には、例えば（ａ）該遺伝子を宿主細胞染色体に組み込む方法、または（ｂ）ベクターを用いてプラスミドとして細胞内に存在させる方法等が挙げられる。なかでも、効率よくＤＮＡを導入できるという観点からベクターを用いて行う方法が好ましい。
上記（ａ）本発明に係る上記酵素の遺伝子を宿主細胞染色体に組み込む方法としては、ガラス管の片方を細く引いて、その中にＤＮＡを入れ細胞に刺入し、電気泳動的に、または空気とか窒素ガスを送り込みその圧力で、ＤＮＡを導入するという方法が挙げられる。また、ＤＮＡを金または銀の極めて細かい粒子にまぶし、このＤＮＡの付着した粒子を火薬または高圧ガスで宿主細胞に打ち込みＤＮＡを導入するというパーティクルガン法も挙げられる。さらに、宿主細胞とＤＮＡを一つの容器に入れ電圧をかけることにより、宿主細胞に一過性の穿孔を起こさせ、ＤＮＡを取り込ませるというエレクトロポーレーション〔Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）１，８４１−８４５（１９８２）〕等も挙げられる。
ベクターを用いて本発明に係る遺伝子を宿主細胞に導入する方法としては、自体公知の方法を用いてよい。ベクターとしては、安定なｍＲＮＡを大量につくり、生じたｍＲＮＡが宿主細胞の中でも効率よく翻訳されるように作られている発現ベクターを用いるのが好ましい。また、複数の遺伝子を導入する場合は、同一の遺伝子であっても異なる遺伝子であっても、複製起点（ｏｒｉ）の異なるベクターを用いるのが望ましい。用いるベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１９，ｐＳＴＶ２８）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５，ｐＹＥＳ２）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが挙げられる。
発現ベクターには、本発明に係る酵素を発現させるため、または発現に有利となるように、通常は調節配列を含む。各々の調節配列はその酵素タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列に対してネイティブであっても外来性であってもよい。このような調節配列は、これらに限られないが、プロモーター、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、エンハンサー、シグナル配列、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）および転写ターミネーターを含む。なかでも調節配列としては、少なくともプロモーター、および転写ならびに翻訳終止シグナルを含むのが好ましい。
プロモーターとしては、宿主細胞により認識される塩基配列である適切なプロモーター配列であればいかなるものでもよい。宿主細胞がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、１ｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが挙げられる。中でも、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃプロモーターが好ましい。宿主細胞がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。宿主細胞がアクチノマイセタレス目菌である場合は、例えば抗生物質チオストレプトン誘導性のプロモーターであるｔｉｐＡ（Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，，１７１，１４５９）等が挙げられる。
宿主細胞が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＬプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーターなどが挙げられる。中でも、ＧＡＬプロモーターが好ましい。
宿主細胞が糸状菌である場合は、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロティナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）の中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーの酸安定α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガーもしくはアスペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）のリパーゼ、アスペルギルス・オリザエのアルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリザエのトリホスリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアセトアミダーゼまたはフサリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のトリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られるプロモーター（米国特許第４，２８８，６２７号、特表２０００−５０７１０２に記載）などが挙げられる。
宿主細胞が動物細胞である場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
宿主細胞が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが挙げられる。
宿主細胞が植物細胞である場合は、カリフラワー・モザイク・ウィルスの３５Ｓプロモーターなどが挙げられる。
転写ターミネーターとしては、転写を終結させるために宿主細胞により認識される配列であればよい。
例えば、動物細胞が宿主の場合は、ウィルス由来、各種哺乳動物および鳥類由来の各遺伝子の転写ターミネーター配列を用いることができ、具体的には、シミアンウィルスのＳＶ４０ターミネーターなどが用いられる。
宿主細胞が酵母である場合は、ＰＨＯ５ターミネーター、ＰＧＫターミネーター、ＧＡＬターミネーター、ＧＡＰターミネーター、ＡＤＨターミネーター、ＡＯＸ１ターミネーターなどが挙げられる。
宿主細胞が糸状菌である場合は、アスペルギルス・オリザエのＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニジュランスのアントラニレートシンターゼ、アスペルギルス・ニガーのα−グルコシダーゼまたはフサリウム・オキシスポルムのトリプシン様プロテアーゼをコードする遺伝子から得られるターミネーターが挙げられる。
発現ベクターにはタンパク質の分泌に係るシグナル配列も含み得る。
シグナル配列としては、導入する遺伝子のシグナル配列を用いることもできるし、異なる遺伝子のシグナル配列を用いることもできる。
異なる遺伝子のシグナル配列としては、宿主細胞がエシェリヒア属菌である場合はアルカリフォスファターゼ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主細胞がバチルス属菌である場合はα−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが挙げられる。
宿主細胞が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが挙げられる。
宿主細胞が糸状菌である場合は、アスペルギルス・オリザエＴＡＫＡアミラーゼ遺伝子、アスペルギルス・ニゲル中性アミラーゼ遺伝子、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロティナーゼ遺伝子、ヒュミコラ・ラヌギノサセルラーゼ遺伝子、またはリゾムコル・ミエヘイリパーゼ遺伝子からのシグナルペプチドをコードした塩基配列などが挙げられる。
宿主細胞が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
発現ベクターには、選択マーカーを含み得る。例えば、大腸菌や枯草菌などの原核生物では、各種の薬剤耐性遺伝子などを、酵母などの真核微生物では宿主の栄養要求性を相補する遺伝子などを選択マーカーとして用いることができる。より具体的には、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性遺伝子）、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性）、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子等が挙げられる。
発現ベクターには、本発明に係る酵素遺伝子の発現に有利である１または複数の因子、例えばアクティベーター（例えばトランス作用因子）、シャペロン、ＳＤ配列およびプロセッシングプロテアーゼをコードする１または複数の核酸配列も含み得る。
選択された宿主細胞内で機能的であるいずれかの因子も本発明に係る発現ベクターに用いることができる。
本発明において、公知の発現ベクターを用いてもよい。例えば大腸菌宿主細胞用としてＰＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ２等を挙げることができる。さらに、放線菌宿主細胞用としてｐＩＪ７０２、酵母宿主細胞用としてｐＮＪ１０５３などが挙げられる。また、植物細胞が宿主細胞の場合、例えば、ｐＢＩ１２１（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２，８７７１−８７２１（１９８４））等が挙げられる。また、シャトルベクターｐＤＧ１４８（Ｋａｒｍａｚｙｎ−Ｃａｍｐｅｌｌｉら，Ｃｅｌｌ，５２，６９７−７０４，１９８８）は、大腸菌および枯草菌に使用でき、本発明において好適に用いられる。
本発明に係る上記ＴＨＢＰ生合成に関わる酵素の遺伝子を含むｃＤＮＡなどを、上記ベクターに組み込む方法は、例えば、制限酵素で切断してＤＮＡリガーゼで結合するなどの自体公知の方法を用いてよい。上記ｃＤＮＡ等については、上記ベクターに組み込みやすいように、予めエキソヌクレアーゼ処理、化学合成ＤＮＡ断片の付加、ＰＣＲ法もしくはリンカーの結合による制限酵素切断部位の付加、二本鎖ｃＤＮＡやベクターＤＮＡの末端に連結可能な端末をつけるためにＧ，Ｃ−鎖を伸ばすなど各種処理を行ってもよい。
このようにして構築されたＴＨＢＰ合成に関わることのできる酵素の遺伝子を含有するベクターを、宿主細胞に導入することによって本発明に係る形質転換細胞を製造することができる。
該発現ベクターの宿主細胞へ導入して形質転換する方法としては、公知方法を用いてよい。エシェリヒア属菌等の原核生物が宿主細胞の場合、対数増殖期における細胞を回収後、よく知られているＣａＣｌ２法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．ａｎｄ  ｖａｎｄｅｒ  Ｅｂ，Ａ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２，４５６−４６７（１９７３））によって導入できる。形質転換反応液中にＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌを共存させれば形質転換効率は向上し得るので、本発明において共存させてもよい。また、宿主細胞のプロトプラスト調製後、形質転換させることも可能である。
用いる宿主細胞が真核生物の場合、ＤＮＡをリン酸カルシウム沈澱として感染させる方法、マイクロインジェクション法、赤血球細胞あるいはリポソームにプラスミドを包括して導入する方法、リゾフォスファチジルコリンのような試薬による細胞の処理法、またはウィルスベクターを用いる方法など通常の方法によって導入することができる。また、宿主細胞が酵母である場合は、酢酸リチウム法を用いることができる。
より具体的には、エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行うことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行うことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行うことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えばバイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行われる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行うことができる。
植物細胞を形質転換するには、例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚａｙｍｏｌ．，１１８，６２７−６４０（１９８６））、高速微粒子法［プラント・モレキュラー・バイオロジー（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），１１，４３３−４３９（１９８９）］、プロトプラスト法［ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１９，７９１−７９３（１９８６）］等に記載された方法に従って、本発明にかかる遺伝子を導入することにより行うことができる。
なお、動物細胞を用いて、本発明に係る酵素を安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記選択マーカーを指標にして形質転換細胞を選択し、さらに、このように選択マーカーを用いて得られた形質転換細胞に対して、繰り返しクローン選択を行うことにより本発明に係る酵素の高発現能を有する安定な形質転換細胞を得ることができる。
本発明においては、上記の形質転換細胞を、導入したＧＣＨ、ＰＴＰＳまたはＳＰＲ等のＴＨＢＰ合成に関わる酵素の遺伝子が発現可能な条件下で通常は培養を行う。培養に際しては、培養温度、培地ｐＨ、溶存酸素レベルを一定に制御することが好ましい。例えば培地ｐＨが低下する等により細胞の増殖が鈍くなるのを極力抑え、かつ増殖を促し、ひいては、より効率よくビオプテリン類を生産するため、上述のように培養条件を一定にするのが好ましいからである。
宿主細胞がエシェリヒア属菌、バチルス属菌またはアクチノマイセタレス目菌である形質転換細胞を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が好ましく、その中には該形質転換細胞の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有している培地が好ましい。炭素源としては、例えばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質など、無機物としては、例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、上記培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８程度が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、具体的には、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ１９７２〕などが挙げられるが、ＬＢ培地（実施例４参照）で前培養した後、ＮＵＣＡ培地（実施例４参照）で本培養するのが好ましい。ここに所望によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば３β−インドリルアクリル酸、クロラムフェニコールのような薬剤を加えることができる。また、誘導性のプロモーターを用いる場合には、誘導を起こす物質を培地に添加することが望ましい。例えば、ｌａｃプロモーターの場合はイソプロピルβ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、ＧＡＬプロモーターの場合はガラクトースを添加することが好ましい。培養は約１０〜５０℃程度で約３〜７２時間程度行うことが好ましく、所望により通気や撹拌を行うこともできる。
バチルス属菌の培養は、通常約３０〜４０℃で約６〜４０時間程度行い、所望により通気や撹拌を行うこともできる。培地は、公知の培地を用いることができる。具体的には、例えばＬＢ培地（実施例４参照）で前培養した後、ＮＵ培地（実施例１４参照）で本培養するのが好ましい。
宿主細胞がアクチノマイセタレス目菌である場合は、通常約２０〜４０℃で約２〜７日間程度行い、所望により通気や撹拌を行うこともできる。培地としては、ＧＰ培地（グリセロール０．４ｗｔ％、ペプトン０．１ｗｔ％、イースト・エキス０．４ｗｔ％、硫酸マグネシウム０．０５ｗｔ％、リン酸一カリウム０．２ｗｔ％、リン酸二ナトリウム０．５ｗｔ％、グリシン０．１ｗｔ％／１Ｌ）など公知の培地を用いることができる。
酵母を培養する際の培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。なかでも、ＳＤ−Ｕｒａ−培地（実施例５参照）が好ましい。培地のｐＨは約５〜８程度に調整するのが好ましい。培養は約２０℃〜４０℃程度で約２４〜８４時間程度行うことが好ましく、所望により通気や撹拌を行うことができる。
宿主細胞が糸状菌である場合も、自体公知の方法により培養できる。
宿主細胞が昆虫細胞または昆虫である形質転換細胞を培養する際、培地としては、例えば、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２））に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが挙げられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４程度に調整するのが好ましい。培養は約２７℃程度で約３〜５日間程度行うことが好ましく、所望により通気や撹拌を行うことができる。
動物細胞を培養する際の培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ  １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓ．）１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。培地のｐＨは約６〜８程度であるのが好ましい。培養は約３０℃〜４０℃程度で約１５〜７２時間程度行うのが好ましい。
植物細胞を培養する際の培地としては、例えば、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（ｗｈｉｔｅ）培地等が挙げられる。
以下に本発明に係るビオプテリン類の製造方法の好ましい態様を述べる。
大腸菌系のベクターとしてｐＳＴＶ２８を用い、ＧＣＨ、ＰＴＰＳ、ＳＰＲのそれぞれのｃＤＮＡをラクトースプロモーター下流に配したプラスミド、ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳを作製する。該プラスミドはＩＰＴＧによる誘導が可能な発現ベクターである。この発現ベクターを大腸菌ＪＭ１０１株に導入し、０．５ｍＭＩＰＴＧを含む培地で約４８時間培養を行う。これにより、ビオプテリン類を製造することができる。
また、ベクターとして酵母ｐＹＥＳ２を用い、ＧＣＨ、ＰＴＰＳ、ＳＰＲのそれぞれのｃＤＮＡをＧＡＬ１プロモーター下流に配したプラスミド、ｐＹＥＳ２−ＦＰＳを作製する。かかるプラスミドは、ガラクトースによる発現誘導が可能な発現ベクターである。この発現ベクターをＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母に導入し、ガラクトースによる誘導により各酵素遺伝子の発現を行う。これにより、ビオプテリン類を製造することができる。
また、本発明に係るビオプテリン類の製造方法として次のような態様も挙げられる。シャトルベクターｐＤＧ１４８（Ｋａｒｍａｚｙｎ−Ｃａｍｐｅｌｌｉら，Ｃｅｌｌ，５２，６９７−７０４，１９８８）を用い、ＧＣＨ、ＰＴＰＳおよびＳＰＲのそれぞれのｃＤＮＡをｓｐａｃプロモーターの下流に配したプラスミドｐＤＧ１４８ＭＰＳを作製する。該プラスミドは、ＩＰＴＧによる誘導が可能な枯草菌用の発現プラスミドである。この発現ベクターをＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １Ａ１株（ｔｒｐＣ２）に導入し、形質転換細胞を作製する。かかる形質転換細胞を約５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で約３時間前培養を行い、ついで、約１ｍＭのＩＰＴＧおよび約５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＮＵ培地で約２０時間、約３７℃で振盪培養する。これにより、ビオプテリン類を製造することができる。
また、上記シャトルベクターｐＤＧ１４８からｌａｃＩ遺伝子を欠失させることにより、ＩＰＴＧの有無に関わらず、ＧＣＨ、ＰＴＰＳおよびＳＰＲを恒常的に発現させることができる発現ベクターｐＤＧ１４８ＭＰＳΔＩを作成することができる。かかる発現ベクターは、本培養の際にＩＰＴＧが必要ないこと以外は上記と同様にして培養すればよい。
宿主細胞の中に元来存在するＧＴＰから、形質転換細胞内で発現したＧＣＨ、ＰＴＰＳまたはＳＰＲ等のＴＨＢＰ合成に関わることのできる酵素により、ＴＨＢＰが産生される。産出されたＴＨＢＰは、細胞内で、または細胞膜を通過して細胞外、例えば培養液などの培地中に排出されて、第２図に示すように酸化されてＤＨＢＰとなり、さらに酸化されてＢＰとなりえる（Ｔａｋｉｋａｗａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６１：２９５−３０２，１９８６）。すなわち、形質転換細胞の種類や例えば培養条件などの細胞外の環境などにより異なるため一概には言えないが、形質転換細胞内でＴＨＢＰのみが産出されるものもあるし、これの一部または全部が酸化されてＤＨＢＰもしくはＢＰまたはこれらの混合物となっている場合もある。さらに、形質転換細胞内で産出されたＴＨＢＰが細胞膜を通過して細胞外に排出される場合もある。その場合、培養液の組成により異なるため一概には言えないが、排出されたＴＨＢＰが培養液中でＤＨＢＰまたはＢＰに酸化されることもある。
本発明においては、培養液またはその培養上清等の処理物中のビオプテリン類を以下の方法で精製単離してもよい。また、所望により培養液またはその培養上清等の処理物に酸化剤を添加するなどして酸化したあと、ビオプテリン類を精製単離してもよい。ビオプテリン類の中でもＴＨＢＰは酸化されやすい物質であるので、培養液またはその培養上清等の処理物を酸化し、ＴＨＢＰまたはＤＨＢＰをＢＰに酸化した後、化学的により安定なＢＰを精製単離するのが好ましい。
培養液またはその培養上清等の処理物中のビオプテリン類を酸化させる方法は自体公知の方法を用いてよいが、培養液またはその培養上清等の処理物に公知の酸化剤を加えればよい。酸化剤としては、ヨウ化カリウムなどの過ヨウ素酸塩、二クロム酸カリウムもしくはナトリウム、過マンガン酸カリウム、ニトロソジスルホン酸カリウム、硝酸などが挙げられ、中でも、ヨウ化カリウムを用いるのが好ましい。
上記培養物から本発明にかかるビオプテリン類を分離精製するには、自体公知の方法を用いることができる。
具体的には、例えば、本発明にかかるビオプテリン類を形質転換細胞である培養菌体または細胞から抽出するに際して、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームもしくは凍結融解などの方法、またはそれらの方法の組み合わせによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過など自体公知の方法で形質転換細胞と培養上清とを分離し、培養上清を集め、本発明にかかるビオプテリン類の溶解液を得る方法などが適宜用い得る。
形質転換細胞内で産出されたＴＨＢＰが細胞膜を通過して細胞外に排出される場合は、形質転換細胞を破壊することなく、遠心分離やろ過など自体公知の方法で形質転換細胞と培養上清とを分離し、培養上清を集め、本発明にかかるビオプテリン類の溶解液を得る方法などが適宜用い得る。
このようにして得られた培養液または培養上清などの培養液の処理物に含まれる本発明にかかるビオプテリン類の精製は、自体公知の分離・精製方法を適切に組み合わせて行うことができる。
これらの公知の分離、精製方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法もしくはＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られる本発明にかかるビオプテリン類が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することもでき、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することもできる。
本発明におけるビオプテリン類の精製の好ましい態様としては、培養液を酸性条件の下、ヨウ化カリウム溶液により酸化してＢＰへと変換した後、沈殿操作、Ｄｏｗｅｘ  １ｘ８クロマトグラフィー、フロリジルクロマトグラフィーを経て、精製ＢＰを得る方法が挙げられる。
このようにして得られたビオプテリン類は、所望により公知手段を用いて、ＴＨＢＰへ変換可能である。例えば、ＢＰまたはＤＨＢＰは、化学的な水素付加反応によりＴＨＢＰへ変換できる。化学的な水素付加反応は自体公知の方法を用いてよく、例えば、水素化アルミニウムリチウム、水素化トリエチルホウ素リチウム、水素化ホウ素ナトリウム、ジボラン、アルキルジボランなどと反応させる方法、またはＲａｎｅｙ−Ｎｉ触媒による還元等の方法が挙げられる。これらの反応条件は公知の方法に従えばよい。また、還元条件によっては、ＢＰからＤＨＢＰを得ることもできる。
ＴＨＢＰは上述のように、各種酵素の補酵素であることが知られており、その薬理作用物質として期待されている物質である。また、ＤＨＢＰまたはＢＰは、かかるＴＨＢＰの供給体として有用であるばかりか、薬理作用を示す可能性もある有用物質である。
実施例
本発明の実施例を以下に示す。なお、以下の遺伝子工学または生物工学の基本操作については、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８２）、モレキュラー・クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  ｅｄ．）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９８９）、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．），ｖｏｌ  １９４（１９９１）、実験医学別冊・酵母による遺伝子実験法  羊土社（１９９４）等に記載された方法に従って行った。また、市販のキットを用いる場合には、添付されている使用説明書の指示に従った。
〔実施例１  ＧＣＨ遺伝子、ＰＴＰＳ遺伝子およびＳＰＲ遺伝子の取得〕
１．大腸菌由来のＧＣＨ（ＧＴＰシクロヒドラーゼＩ）遺伝子のクローニング
報告されている方法（生物工学実験書［培風館、ｐ９７−９８］）により、大腸菌（Ｗ３１１０株）からゲノムＤＮＡを抽出した。これを鋳型として、センスプライマーＰ１（配列番号１）及びアンチセンスプライマーＰ２（配列番号２）を用いて常法に従いＰＣＲを行い、ＧＣＨ遺伝子（ｆｏＩＥ）〔Ｋａｔｚｅｎｍｅｉｅｒ，Ｇ．ら，Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒ  ３７２：９９１−９９７，１９９１，［ＧｅｎＢａｎｋ  Ｘ６３９１０］〕を取得した。次に、得られたＧＣＨ遺伝子を含むＤＮＡを鋳型に、センスプライマーＰ３（配列番号３）及びアンチセンスプライマーＰ４（配列番号４）を用いたＰＣＲを行い、ＧＣＨ遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域に、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩの切断部位を付加した。このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで消化し、ｐＰｒｏＥＸ  ＨＴａベクター（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）のＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩ部位に導入し、ｐＰｒｏＥＸ−ＧＣＨを作製した。なお、ＰＣＲの条件、制限酵素処理およびライゲーション反応は常法に従った。
次にｐＰｒｏＥＸ−ＧＣＨにクローニングされた大腸菌ＧＣＨ遺伝子をプラスミドｐＳＴＶ２８（宝酒造）にクローニングするため、ｐＰｒｏＥＸ−ＧＣＨを鋳型にセンスプライマーＰ５（配列番号５）及びアンチセンスプライマーＰ６（配列番号６）を用いてＰＣＲを行い、５’側及び３’側の末端にそれぞれに制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ切断部位を有したＧＣＨ遺伝子を得た。得られたＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断後、ｐＳＴＶ２８のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ断片（３．０ｋｂ）（以下、ＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片またはＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ断片と表記することもある。他も同様である。）と連結し、大腸菌ＧＣＨ発現プラスミドｐＳＴＶ２８−ＧＣＨを得た（第３図）。ｐＳＴＶ２８−ＧＣＨに含まれるＧＣＨ遺伝子（ｆｏｌＥ）は大腸菌ラクトース（ｌａｃ）プロモーターにより転写され、発現したＧＣＨはアミノ末端にｐＳＴＶ２８由来の７アミノ酸（第１０図の下線部）が付加されたアミノ酸配列を持つ（第１０図）。
２．ラット由来のＰＴＰＳ（６−ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素）遺伝子のクローニング
ラットより摘出した肝臓をコラゲナーゼ処理して取得した肝細胞から、ＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いて全ＲＮＡを抽出した。ＤＮａｓｅＩ処理したラット肝全ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いたＲＴ−ＰＣＲに供し、ＰＴＰＳ遺伝子（Ｉｎｏｕｅ，Ｙ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２０７９１−２０７９６，１９９１：［ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＭ＿０１７２２０］）を含むｃＤＮＡを取得した。ここで、逆転写にはオリゴｄＴプライマーを用い、ＰＴＰＳ遺伝子を含む一本鎖ＤＮＡのＰＣＲによる増幅にはセンスプライマーＰ７（配列番号７）及びアンチセンスプライマーＰ８（配列番号８）を用いた。取得したＰＴＰＳ遺伝子を含むｃＤＮＡを鋳型に、センスプライマーＰ９（配列番号９）及びアンチセンスプライマーＰ１０（配列番号１０）を用いたＰＣＲを行い、ＰＴＰＳ遺伝子を含むｃＤＮＡの５’側及び３’側の非翻訳領域に、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩの切断部位を付加した。このＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩで消化し、ｐＰｒｏＥＸ  ＨＴｃベクター（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）のＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩ部位に挿入し、ｐＰｒｏＥＸ−ＰＴＰＳを作製した（第４図）。
次に、ｐＰｒｏＥＸ−ＰＴＰＳを鋳型にセンスプライマーＰ１１（配列番号１１）及びアンチセンスプライマーＰ１２（配列番号１２）を用いてＰＣＲを行い、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ切断部位を有したＰＴＰＳ遺伝子を得た。得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断後、ｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．，Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．Ｇｅｎｅ，３３：１０３−１１９，１９８５）のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ断片（２．７ｋｂ）と連結し，ラットＰＴＰＳ発現プラスミドｐＵＣ１８−ＰＴＰＳを得た（第４図）。ｐＵＣ１８−ＰＴＰＳに含まれるＰＴＰＳ遺伝子は大腸菌ｌａｃプロモーターにより転写され、発現したＰＴＰＳはアミノ末端にｐＵＣ１８由来の７アミノ酸（第１１図の下線部）が付加されたアミノ酸配列を持つ（第１１図）。
３．ラット由来のＳＰＲ（セピアプテリン還元酵素）遺伝子のクローニング
ＰＴＰＳ遺伝子を含むｃＤＮＡと同様の方法でＳＰＲ遺伝子（Ｃｉｔｒｏｎ，Ｂ．Ａ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６４３６−６４４０  １９９０，［ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ３６４１０］）を含むｃＤＮＡを取得した。ただし、ＳＰＲ遺伝子を含む一本鎖ＤＮＡのＰＣＲによる増幅にはセンスプライマーＰ１３（配列番号１３）及びアンチセンスプライマーＰ１４（配列番号１４）を用いた。ＳＰＲ遺伝子を含むｃＤＮＡを鋳型に、センスプライマーＰ１５（配列番号１５）及びアンチセンスプライマーＰ１６（配列番号１６）を用いたＰＣＲを行い、ＳＰＲ遺伝子を含むｃＤＮＡの５’側及び３’側の非翻訳領域に、それぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩの切断部位を付加した。このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩで消化し、ｐＰｒｏＥＸ  ＨＴｂベクター（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）のＢａｍＨＩ及びＳｐｅＩ部位に挿入し、ｐＰｒｏＥＸ−ＳＰＲを作製した（第５図）。
次に、ラットＳＰＲ遺伝子についてｐＰｒｏＥＸ−ＳＰＲを鋳型にセンスプライマーＰ１７（配列番号１７）及びアンチセンスプライマーＰ１８（配列番号１８）を用いてＰＣＲを行い、５’側及び３’側の末端にそれぞれに制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を有するＳＰＲ遺伝子を得た後、得られたＰＣＲ産物を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＵＣ１９（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．，Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．Ｇｅｎｅ，３３：１０３−１１９，１９８５）のＨｉｎｄＩＩＩ断片（２．７ｋｂ）と連結してラットＳＰＲ発現プラスミドｐＵＣ１９−ＳＰＲを作製した（第５図）。ｐＵＣ１９−ＳＰＲにコードされたＳＰＲ遺伝子についても大腸菌ｌａｃプロモーターにより転写され、発現したＳＰＲはアミノ末端にｐＵＣ１９由来の８アミノ酸（第１２図の下線部）が付加されたアミノ酸配列を持つ（第１２図）。
４．酵母由来のＧＣＨ遺伝子（ＦＯＬ２）のクローニング
ＦＯＬ２はＧＣＨのホモログである。酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，ＫＡ３１株）のゲノムＤＮＡを鋳型に、センスプライマーＰ２３（配列番号２３）及びアンチセンスプライマーＰ２４（配列番号２４）を用いてＰＣＲを行い、５’側及び３’側の非翻訳領域にそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ切断部位を有したＦＯＬ２遺伝子（Ｔｅｔｔｅｌｉｎ，Ｈ．らＮａｌｕｒｅ  ３８７：８１−８４，１９９７，［ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ＿００１１３９］）を含むＤＮＡを取得した。このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化し、ｐＹＥＳ２／ＣＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位に挿入し、ｐＹＥＳ２−ＦＯＬ２を作製した（第６図）。
〔実施例２  大腸菌用ビオプテリン類生産プラスミドｐＳＴＶ２８−ＧＰＳの作製〕
大腸菌のＴＨＢＰ合成酵素発現プラスミドであるｐＳＴＶ２８−ＧＰＳは以下の方法で作製した。まず実施例１に記載のｐＵＣ１８−ＰＴＰＳを鋳型にしてＰＣＲを行い、ｌａｃプロモーターからＰＴＰＳ遺伝子の終止コドンまでを含むＤＮＡを増幅した。ＰＣＲのプライマーを設計するに当たり、センスプライマーにＳａｌＩ部位を、アンチセンスプライマーにＢａｍＨＩ部位を設け、後のクローニングが容易になるようにした。それぞれのプライマーはセンスプライマーＰ１９（配列番号１９）、アンチセンスプライマーＰ２０（配列番号２０）の配列を持つ。得られたＰＣＲ産物はエタノール沈殿処理の後、ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解し、制限酵素ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで切断した。
次に、実施例１に記載のｐＵＣ１９−ＳＰＲを鋳型にしてＰＣＲを行い、ｌａｃプロモーターからＳＰＲ遺伝子の終結コドンまでを含むＤＮＡを増幅した。ＰＣＲのプライマーにはセンスプライマーにＢａｍＨＩ部位を、アンチセンスプライマーにＳｐｈＩ部位を設けた。それぞれのプライマーはセンスプライマーＰ２１（配列番号２１）、アンチセンスプライマーＰ２２（配列番号２２）の配列を持つ。得られたＰＣＲ産物はエタノール沈殿処理の後、ＴＥバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解し、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｐｈＩで切断した。
このようにして得られたＰＴＰＳ遺伝子を含むＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片およびＳＰＲ遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＳｐｈＩ断片をｐＳＴＶ２８−ＧＣＨのＸｈｏＩおよびＳｐｈＩ消化物（３．９ｋｂ）と連結させ、ｐＳＴＶ２８ＧＰＳを作製した（第７図）。ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳはＧＣＨ，ＰＴＰＳ，ＳＰＲ遺伝子（第１０図〜１２に記載）のそれぞれがｌａｃプロモーターにより転写される構造を有する。
〔実施例３  酵母用ビオプテリン類生産プラスミドｐＹＥＳ２−ＦＰＳの作製〕  ｐＵＣ１８−ＰＴＰＳを鋳型に、センスプライマーＰ２５（配列番号２５）及びアンチセンスプライマーＰ２６（配列番号２６）を用いてＰＣＲを行い、ＰＴＰＳ遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域にそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ切断部位を付加した。このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化し、ｐＹＥＳ２／ＣＴベクターのＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位に挿入し、ｐＹＥＳ２−ＰＴＰＳを作製した（第８図）。
続いて、ｐＵＣ１９−ＳＰＲを鋳型に、センスプライマーＰ２７（配列番号２７）及びアンチセンスプライマーＰ２８（配列番号２８）を用いてＰＣＲを行い、ＳＰＲ遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域にそれぞれ制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ切断部位を有したＳＰＲ遺伝子を含むｃＤＮＡを取得した。このＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで消化し、ｐＹＥＳ２／ＣＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位に挿入し、ｐＹＥＳ２−ＳＰＲを作製した（第８図）。
次に、ｐＹＥＳ２−ＰＴＰＳを鋳型に、センスプライマーＰ２９（配列番号２９）及びアンチセンスプライマーＰ３０（配列番号３０）を用いてＰＣＲを行い、ＰＴＰＳ遺伝子の上流にＳｐｈＩ切断部位を付加したＧＡＬ１プロモーター、及び下流にＳｐｅＩ切断部位を付加したＣＹＣ１転写終結シグナルを有するＤＮＡ断片を得た。なお、このＤＮＡ断片は使用したＤＮＡポリメラーゼ（ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ［宝酒造］）の性質から平滑末端となっている。５’末端をリン酸化した該ＤＮＡ断片を、ＳｐｅＩ消化後末端平滑化したｐＹＥＳ２−ＳＰＲに挿入し、ｐＹＥＳ２−ＰＳを作製した。続いてｐＹＥＳ２−ＦＯＬ２を鋳型に、センスプライマーＰ３１（配列番号３１）及びアンチセンスプライマーＰ３２（配列番号３２）を用いてＰＣＲを行い、ＦＯＬ２遺伝子の上流にＳｐｅＩ切断部位を付加したＧＡＬ１プロモーター、及び下流にＳｐｅＩ切断部位を付加したＣＹＣ１転写終結シグナルを有するＤＮＡ断片を得た。この断片をＳｐｅＩ消化後、ｐＹＥＳ２−ＰＳのＳｐｅＩ切断部位に挿入し、ｐＹＥＳ２−ＦＰＳを作製した。ｐＹＥＳ２−ＦＰＳにおいてはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＧＣＨ遺伝子、ラット由来ＰＴＰＳ遺伝子およびラット由来ＳＰＲ遺伝子がそれぞれＧＡＬ１プロモーターにより転写される構造を有しており、天然型酵素と同じアミノ酸配列を持つ酵素が発現する（第９図）。
〔実施例４  大腸菌によるビオプテリン類の生産〕
大腸菌ＪＭ１０１株を塩化カルシウム法（Ｍａｎｄｅｌ  ａｎｄ  Ｈｉｇａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３１５９−１６２  １９７０）によりｐＳＴＶ２８−ＧＰＳで形質転換しＪＭ１０１／ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳを得た後、これを培養してビオプテリン類の生産能を調べた。まず、ＬＢ培地で一晩培養したＪＭ１０１／ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳを前培養液とし、その５０μｌを０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を含むＮＵＣＡ培地３ｍＬに接種し、３７℃で４８時間培養した。なおＬＢ培地およびＮＵＣＡ培地は以下の組成から成る。［ＬＢ培地１Ｌ中の組成：１０ｇトリプトン、５ｇ酵母エキス、５ｇ  ＮａＣｌ］、［ＮＵＣＡ培地１Ｌ中の組成：２０ｇグリセロール、４ｇ酵母エキス，１０ｇカザミノ酸、４ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４、４ｇ  ＫＨ２ＰＯ４、２．７ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．２ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２ｇ  ＮＨ４Ｃｌ、２ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４０ｍｇ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４０ｍｇ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ  ＭｎＳＯ４・ｎＨ２Ｏ、１０ｍｇ  ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、４ｍｇ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、２ｍｇ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｍｇ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１ｍｇ  ＣｕＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、０．５ｍｇ  Ｈ３ＢＯ４、３０ｍｇクロラムフェニコール］
産生されたＴＨＢＰは水溶液で容易に酸化され、ＤＨＢＰおよびＢＰとなるため、ＪＭ１０１／ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳがＴＨＢＰを生産したかどうかについては培養液をヨード酸化し、ＢＰに変換して生産量を測定した。培養液を遠心分離し、菌体を除いた後、培養液に対して１０分の１量のヨウ化カリウム液（０．９％Ｉ２，１．８％ＫＩを含む１規定塩酸液）を添加し、遮光して１時間放置した。次にこの培養液を脱イオン水で２０倍希釈し、これを１０ｍＭナトリウムリン酸緩衝液で平衡化した４．６ｍｍｘ２５０ｍｍのＣ１８逆相カラム（ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ１８−ＡＲ，ナカライテスク）に流速０．８ｍＬ／分でインジェクトし、３５０ｎｍ励起、４４０ｎｍ蛍光検出器を用いてＢＰを定量した。その結果、培養上清にはＢＰ標準品およびＰ（プテリジン）標準品に一致するピークが検出され（第１３図）、ＪＭ１０１／ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳがビオプテリン類を生成したことが明らかとなった。ピークエリアより生産されたビオプテリン類の量を算出したところ、培養液１Ｌあたりの生産量は約２０ｍｇであった。
〔実施例５  酵母によるビオプテリン類の生産〕
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＫＡ３１株（ＭＡＴ  α  ｕｒａ３  ｌｅｕ２  ｈｉｓ３  ｔｒｐｌ）を酢酸リチウム法によりｐＹＥＳ２−ＦＰＳで形質転換した。ＳＤ−Ｕｒａ−培地により形質転換細胞を選択し、ＦＰＳ株を得た。〔ＳＤ−Ｕｒａ−培地１Ｌ中の組成：グルコース２０ｇ、Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ（アミノ酸・硫酸アンモニウム不含）１．７ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ、アデニン硫酸塩２０ｍｇ、Ａｒｇ  ２０ｍｇ、Ａｓｐ  １００ｍｇ、Ｇｌｕ  １００ｍｇ、Ｉｌｅ  ３０ｍｇ、Ｌｙｓ  ３０ｍｇ、Ｍｅｔ  ２０ｍｇ、Ｐｈｅ  ５０ｍｇ、Ｓｅｒ  ４００ｍｇ、Ｔｈｒ  ２００ｍｇ、Ｔｙｒ  ３０ｍｇ、Ｖａｌ  １５０ｍｇ、Ｈｉｓ  ２０ｍｇ、Ｌｅｕ  １００ｍｇ、Ｔｒｐ  ２０ｍｇ〕
また、同様にベクター（ｐＹＥＳ２／ＣＴ）による形質転換細胞をコントロール（Ｍｏｃｋ）として作製した。
得られた形質転換細胞をＯＤ６００ｎｍ＝０．４となるまで５ｍｌのＳＣＤ−Ｕｒａ−培地で培養した後、等量のＳＣＧａｌ−Ｕｒａ−培地に置換し発現誘導を行った。なお培養温度は３０℃とした。
ＳＣＤ−Ｕｒａ−培地１Ｌ中の組成；Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ（アミノ酸・硫酸アンモニウム不含）１．７ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ、カザミノ酸５ｇ、グルコース２０ｇ、アデニン硫酸塩２０ｍｇ、Ｔｒｐ  ２０ｍｇ
ＳＣＧａｌ−Ｕｒａ−培地１Ｌ中の組成；Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ（アミノ酸・硫酸アンモニウム不含）１．７ｇ、硫酸アンモニウム５ｇ、カザミノ酸５ｇ、ガラクトース２０ｇ、アデニン硫酸塩２０ｍｇ、Ｔｒｐ  ２０ｍｇ
発現誘導後２４時間以降で、ＦＰＳ株の培養液にプテリジン化合物に特徴的な黄色の着色が認められ、発現させた３種の酵素が菌体内で機能していることが外観より判った。
誘導後の菌体の増殖はＦＰＳ株、Ｍｏｃｋ株共に良好であった（第１４図）。ＴＨＢＰあるいはその酸化体の産生を確認するために、誘導後７２時間における培養上清を実施例４と同様に酸化処理し、ＨＰＬＣ分析及びＴＬＣ分析に供した。
なお、ＨＰＬＣ分析は実施例４と同様の方法で行った。ＴＬＣ分析については、薄層クロマトグラフ用シリカゲル薄層板（シリカゲル６０Ｆ２５４，層厚０．２５ｍｍ，１０ｃｍ×２０ｃｍ）を用い、展開溶媒としてクロロホルム・メタノール・酢酸・水混液（４５：１０：５：２）を使用した。薄層板にサンプルを２０μｌ、ＢＰ及びＰ標準品をそれぞれ１００ｎｇスポットし、風乾後傾斜上昇法により展開した。展開距離が約１２ｃｍとなった時点で展開を終了し、薄層板を風乾後、紫外線（主波長２５４ｎｍ）を照射し吸収スポットを検出した。
ＨＰＬＣ分析結果を第１５図に示す。ＦＰＳ株においてのみＢＰに相当するピークが認められ、ピークエリアの面積比から、ＦＰＳ株は誘導７２時間で０．７６μｇ／ｍｌのＢＰに相当するビオプテリン類を培養上清中に産生したことが判った。
第１６図に培養上清のＴＬＣ分析結果を示す。ＦＰＳ株の培養上清中にＢＰ標準品と同等の移動度を示すスポットが確認された。ＴＬＣ分析は、実施例５に記載したようにヨウ化カリウム液で酸化した培養上清２０μｌを分析して、ＢＰのスポットの紫外線吸収強度から培養上清２０μｌあたり１３．７μｇのＢＰを産生していることがわかったが、この値はＨＰＬＣ分析の結果から算出される培養上清１ｍｌあたり０．７６μｇの値と一致する。
〔実施例６  ビオプテリン類生産大腸菌の作製〕
ＴＨＢＰの前駆体であるＧＴＰを野生株よりも多量に生産できる宿主菌を作製するため、プリン合成の調節変異株を以下のようにして取得した。
まず２０，５０，１００，および５００μｇ／ｍｌの８−アザグアニンおよびデコイニンを含むＭ９最少寒天培地で大腸菌ＪＭ１０１に対するこれらの薬剤の感受性を調べたところ、１００μｇ／ｍｌ以上の８−アザグアニン、５００μｇ／ｍｌ以上のデコイニンに対して感受性を持つことが明らかとなった。
Ｍ９最少寒天培地の組成；グルコース２ｇ／Ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４  ６ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４  ３ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ  ０．５ｇ／Ｌ，ＮＨ４Ｃｌ  １ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４  ２ｍＭ，ＣａＣｌ２  ０．１ｍＭ，寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４
そこでＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−ニトロソグアニジンによる変異処理（Ｍｉｌｌｅｒ，１９７２，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を行った大腸菌ＪＭ１０１を、１００μｇ／ｍｌの８−アザグアニン、または５００μｇ／ｍｌのデコイニンを含有するＭ９最少寒天培地のプレートに播き、３７℃で培養して耐性変異株を得た。得られたそれぞれの耐性変異株より５０株ずつを選択し、塩化カルシウム法により発現プラスミドｐＳＴＶ２８−ＧＰＳを導入した。このようにして得られた株を先のＮＵＣＡ培地で４８時間培養し、それぞれの株のビオプテリン類の生産量を比較した。
その結果、８−アザグアニン耐性株の中から親株（ＪＭ１０１／ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳ）に対し、約１０倍のビオプテリン類生産能を持つＡＧ１４／ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳ株が得られた。すなわち大腸菌において８−アザグアニン耐性を付与することにより、ビオプテリン類生産能が上昇した株が取得できることが明らかとなった（第１表）。なお本菌株については、培養液にはＢＰに加えＤＨＢＰが検出され、生産されたＴＨＢＰの一部は自然酸化されＤＨＢＰまたはＢＰとして存在していることが明らかとなった（第１７図）。
〔実施例７  ジャーファーメンターを用いたビオプテリン類生産大腸菌の培養とＢＰの精製〕
ビオプテリン類生産菌ＡＧ１４／ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳ株について、３Ｌジャーファーメンターを用いた培養を行った。ジャーファーメンターの培地は０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを含む前述のＮＵＣＡ培地を用いた。まず、ＡＧ１４／ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳ株をＬＢ培地で一晩培養し、その１０ｍｌを、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを含む２ＬのＮＵＣＡ培地に接種し、３７℃で溶存酸素レベルを３０％に維持しながら培養した。培養初期に添加した２％グリセロールが枯渇した後は、８０％グリセロールを逐次添加して４８時間培養を行った。
培養液の一部についてＨＰＬＣ分析を行った。すなわち、生産されたＴＨＢＰを実施例４と同様にヨウ化カリウム液で酸化してＢＰに変換した後、ＨＰＬＣを用いた蛍光分析により分析した。ＨＰＬＣ分析は、実施例５と同様に行った。その結果、ピークエリアより算出されるＢＰの生産量から換算するに、培養４８時間で３５０ｍｇ／ＬのＴＨＢＰが生産されたことがわかった。
また、得られた培養液よりＢＰを得るため、上記培養液２００ｍｌを遠心分離して菌体を除去し、培養上清に１０分の１のヨウ化カリウム液（０．９％Ｉ２，１．８％ＫＩを含む１規定塩酸液）を添加してＢＰへの酸化を行った。その後、遮光して１時間放置し、５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加してｐＨ７．０に調整した。次に、本溶液を氷冷してＢＰを析出・沈殿させ、得られた沈殿物を遠心分離により回収し、これに純水を加えた後、塩酸でｐＨ２に調整し、沈殿を溶解させた。この液をＤｏｗｅｘ  １ｘ８カラム（１０ｍｍＸ１００ｍｍ）にチャージし、純水２０ｍｌで洗浄した後、０．５Ｍ  ＮａＣｌを用いて流速１ｍｌ／分で溶出させた。得られた溶出液は２ｍｌずつ採取し、８番目から１６番目の画分をプールした。次にこのプール画分の半量を０．５Ｍギ酸で平衡化したフロリジルカラム（１０ｍｍＸ１００ｍｍ）にチャージし、０．５Ｍギ酸２０ｍｌで洗浄した後、２Ｎ  ＨＣｌにより溶出させた。得られた溶出液は１．８ｍｌずつ採取し、４番目から１６番目の画分をプールした。これにより純度９８％のＢＰを２ｍｇ得た。
〔実施例８  培養条件の至適化とビオプテリン類生産量の上昇〕
実施例１７に記載の３Ｌジャーファーメンターを用いた培養において、培養温度、培地ｐＨ、溶存酸素レベルを一定に制御した培養を行った。各条件は、培養温度３７℃、ｐＨ６．５、溶存酸素レベル３０％とし、培地ｐＨは２８％アンモニア水の添加により、また溶存酸素レベルは攪拌回転数の上昇により制御した。炭素源であるグリセロールは、培養スタート時に２％を添加し、その枯渇後は８０％グリセロールを１０ｍｌ／時間の流速で連続的に添加した。その結果、ＨＰＬＣ分析のピークエリアより算出されるＢＰの生産量から換算するに、培養４８時間で２ｇ／ＬのＴＨＢＰが生産されたことがわかった。（第１８図）。
〔実施例９  ｇｕａＢＡ遺伝子の増幅効果によるビオプテリン類生産量の上昇〕
ＰＣＲにより大腸菌（Ｗ３１１０株）ゲノムＤＮＡよりｇｕａＢＡ遺伝子（Ｔｉｅｄｅｍａｎ，Ａ．Ａ．らＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：８６７６−８６７９，１９８５およびＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：１３０３−１３１６，１９８５［ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ１０１０１］）のクローニングを行った。大腸菌（Ｗ３１１０株）ゲノムＤＮＡは報告されている方法（生物工学実験書［培風館、ｐ９７−９８］）により調製した。センスプライマーＰ３３（配列番号３３）及びアンチセンスプライマーＰ３４（配列番号３４）を用いて常法に従いＰＣＲを行い、大腸菌ｇｕａＢＡ遺伝子を含有するＤＮＡを取得した。次に、得られたｇｕａＢＡ遺伝子をベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へサブクローニングし、ｐＣＲ２．１−ｇｕａＢＡを作製した。次にｐＣＲ２．１−ｇｕａＢＡをＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩで切断後、ｇｕａＢＡ遺伝子を含む３ｋｂの断片をｐＭＷ２１８（ニッポンジーン）のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ断片（３．９ｋｂ）と挿入してｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡを作製した（第１９図）。このプラスミドを塩化カルシウム法によりＡＧ１４／ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳ株に導入し、ＡＧ１４／（ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳ，ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡ）を作製した。形質転換株の選択および培養は、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含む培地で行った。作製された菌株を、実施例４に示した方法により培養し、ＨＰＬＣ分析のピークエリアより生産量を測定したところ５８０ｍｇ／ＬのＢＰが生産されたことがわかった（第１表）。
〔実施例１０  ＧＣＨの発現量増加によるビオプテリン類生産量の上昇〕
ｐＳＴＶ２８−ＧＣＨおよびｐＵＣ１８−ＰＴＰＳをＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで処理してｆｏｌＥ遺伝子およびラットＰＴＰＳ遺伝子を単離し、それぞれをｐＴＷＶ２２８（宝酒造）のマルチクローニング部位に存在するＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位に挿入して、ｐＴＷＶ２２８−ＧＣＨおよびｐＴＷＶ２２８−ＰＴＰＳを作製した。同様にｐＵＣ１９−ＳＰＲをＨｉｎｄＩＩＩで処理してラットＳＰＲ遺伝子を単離し、ｐＴＷＶ２２９（宝酒造）のマルチクローニング部位に存在するＨｉｎｄＩＩＩに挿入して、ｐＴＷＶ２２９−ＳＰＲを作製した。作製された３種のプラスミドのそれぞれをＡＧ１４／（ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳ，ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡ）株に導入し、実施例４に示した方法によりビオプテリン類生産量を測定した。形質転換株の選択および培養には、アンピシリン（２５μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含む培地で行った。
作製された各菌の生産量は、ＡＧ１４／（ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳ，ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡ，ｐＴＷＶ２２８−ＧＣＨ）が５２４ｍｇ／Ｌ、ＡＧ１４／（ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳ，ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡ，ｐＴＷＶ２２８−ＰＴＰＳ）が３３７ｍｇ／Ｌ，ＡＧ１４／（ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳ，ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡ，ｐＴＷＶ２２９−ＳＰＲ）が４６５ｍｇ／Ｌであった。またＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析では新たにプラスミドが導入されたことより、各酵素の発現量が上昇していることが確認された。
以上の結果より、ＴＨＢＰ生産に関わる３種の酵素遺伝子については、その発現量を増加させることでビオプテリン類生産量を改善でき、特にＧＣＨ遺伝子の発現量を増加させることでビオプテリン類生産量をさらに改善できることが判った。
〔実施例１１  枯草菌ＧＣＨ遺伝子（ｍｔｒＡ）の利用によるビオプテリン類生産の上昇〕
ＰＣＲにより枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １Ａ１株）ゲノムＤＮＡより枯草菌ＧＣＨ遺伝子であるｍｔｒＡ（Ｇｏｌｌｎｉｃｋ，Ｐ．らＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：８７２６−８７３０，１９９０，［ＧｅｎＢａｎｋ  Ｍ３７３２０］）のクローニングを行った。枯草菌ゲノムＤＮＡは報告されている方法（遺伝子発現実験マニュアル［講談社サイエンティフィク、ｐ３１−３３］）により調製した。センスプライマーＰ３５（配列番号３５）及びアンチセンスプライマーＰ３６（配列番号３６）を用いて常法に従いＰＣＲを行い、枯草菌ｍｔｒＡ遺伝子を含むＤＮＡを取得した。次に、得られたＰＣＲ産物を鋳型にして、センスプライマーＰ３７（配列番号３７）及びアンチセンスプライマーＰ３８（配列番号３８）を用いてもう一度ＰＣＲを行った後、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切断後、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ消化物と連結してｐＵＣ１８−ｍｔｒＡを作製した。
次にｐＵＣ１８−ｍｔｒＡよりｍｔｒＡ遺伝子をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで切り出し、これをｐＳＴＶ２８−ＧＰＳのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ消化物（３．０ｋｂ）およびｐＳＴＶ２８−ＧＰＳのＸｂａＩ−ＳｐｈＩ消化物（１．４ｋｂ）と連結してｐＳＴＶ２８−ＭＰＳを作製した（第２０図）。次に得られたｐＳＴＶ２８−ＭＰＳでＡＧ１４／ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡ株を形質転換し、ＡＧ１４／（ｐＳＴＶ２８−ＭＰＳ，ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡ）を作製し、実施例４に示した方法によりＴＨＢＰ生産量を測定した。なお培養は、カナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含む培地で行った。その結果、枯草菌のＧＣＨ遺伝子を有する株［ＡＧ１４／（ｐＳＴＶ２８−ＭＰＳ，ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡ）］は高いＴＨＢＰ生産量（７７０ｍｇ／Ｌ）を示し、枯草菌のＧＣＨ遺伝子（ｍｔｒＡ）を用いることで、ビオプテリン類生産量がさらに向上することが示された（第１表）。
0004817590.tif 000002
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〔実施例１２  ｇｕａＢＡ増幅株および枯草菌ＧＣＨ遺伝子導入株のジャーファーメンターによる培養〕
ｇｕａＢＡ増幅株であるＡＧ１４／（ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳ，ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡ）と枯草菌ＧＣＨ遺伝子導入株であるＡＧ１４／（ｐＳＴＶ２８−ＭＰＳ，ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡ）について、実施例７および８の方法に従い２Ｌスケールの培養を行った。その結果、培養４２時間においてＨＰＬＣ分析のピークエリアより算出されるＢＰが、ＡＧ１４／（ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳ，ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡ）では２．４ｇ／Ｌ、およびＡＧ１４／（ｐＳＴＶ２８−ＭＰＳ，ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡ）では４ｇ／Ｌ生産された（第２１図）。
［実施例１３  枯草菌用発現ベクターｐＤＧ１４８ＭＰＳおよびｐＤＧ１４８ＭＰＳΔＩの作製］
枯草菌用発現ベクターｐＤＧ１４８ＭＰＳおよびｐＤＧ１４８ＭＰＳΔＩは以下の手順により作製した
（１）ｐＵＣ１８ＳＤの作製（第２２図参照）
相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドＰ３９（配列番号３９）とＰ４０（配列番号４０）を、一方でＰ４１（配列番号４１）とＰ４２（配列番号４２）を混合して２本鎖のＤＮＡ断片を２つ作製した。それぞれの断片をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼにより各５’末端にリン酸基を付加する反応を行った後、ｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩのサイトにクローニングした。
得られたプラスミドｐＵＣ１８ＳＤのＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ間の約４５ｂｐの配列は、枯草菌の遺伝子発現に適したＳＤ配列（シャイン・ダルガーノ配列）、およびＭＳＮＩＴＮＳ（メチオニン−セリン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−アスパラギン−セリン）のアミノ酸配列で始まる翻訳開始領域をコードするＤＮＡ配列を含む。（Ｆｕｊｉｔａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０：６５７１−６５８０，１９９８）
（２）ｐＵＣ１８ΔＥの作製（第２３図参照）
ｐＵＣ１８をＥｃｏＲＩで完全に消化し、さらにＭｕｎｇ  Ｂｅａｎ  Ｎｕｃｌｅａｓｅを加え３７℃で１５分間インキュベートし、エタノール沈殿にて精製し、ライゲーション反応を行いｐＵＣ１８ΔＥを作製した。得られたプラスミドはＥｃｏＲＩで切断されないことを確認した。ＤＮＡシークエンシングによりＥｃｏＲＩの認識配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は５’−ＧＡＴＴ−３’に変化していることを確認した。
（３）ｐＵＣ１８ΔＥＳＤｍｔｒＡの作製（第２４図参照）
ｍｔｒＡ遺伝子のクローニングのため、枯草菌ゲノムＤＮＡを鋳型にＰ４３（配列番号４３）およびＰ４４（配列番号４４）を用いてＰＣＲを行い、次に増幅されたＤＮＡを鋳型にして、Ｐ４５（配列番号４５）およびＰ４６（配列番号４６）、Ｐ４５（配列番号４５）およびＰ４７（配列番号４７）を用いてＰＣＲを行い制限酵素部位を導入した。得られたＤＮＡ断片の末端をＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化後、ｐＵＣ１８ＳＤより調製したＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ  ＤＮＡ断片（ＳＤ配列）とｐＵＣ１８ΔＥ由来の２．６ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ  ＤＮＡ断片とを連結し、ｐＵＣ１８ΔＥＳＤｍｔｒＡを作製した。第３１図はｐＵＣ１８ΔＥＳＤｍｔｒＡ上にクローニングされたｍｔｒＡのＤＮＡ塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。なお、下線部はｍｔｒＡのアミノ末端に付加されるＣｃｐＡタンパク由来のアミノ酸配列（Ｆｕｊｉｔａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０：６５７１−６５８０，１９９８）を示す。
（４）ｐＵＣ１８ＳＤＰＴＰＳの作製（第２５図参照）
ｐＵＣ１８ＳＤを鋳型とし、プライマーＰ５０（配列番号５０）とＰ４８（配列番号４８）を用いてＰＣＲを行った後、得られたＤＮＡ断片の末端をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＳＤ配列を含むＤＮＡ断片を調製した。同様に、実施例１において第４図で示す工程で作製したｐＵＣ１８−ＰＴＰＳを鋳型としてプライマーＰ５０（配列番号５０）とＰ４９（配列番号４９）を用いてＰＴＰＳ遺伝子を含む０．４５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片を調製した。これらをｐＵＣ１８由来の２．６ｋｂ  ＸｂａＩ−ＳａｌＩＤＮＡ断片と連結しｐＵＣ１８ＳＤＰＴＰＳを作製した。第３２図はｐＵＣ１８ＳＤＰＴＰＳ上にクローニングされたＰＴＰＳのＤＮＡ塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。なお、下線部はＰＴＰＳのアミノ末端に付加されるＣｃｐＡタンパク由来のアミノ酸配列（Ｆｕｊｉｔａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０：６５７１−６５８０，１９９８）を示す。
（５）ｐＵＣ１８ΔＥＳＤＳＰＲの作製（第２６図参照）
ｐＵＣ１８ＳＤを鋳型とし、プライマーＰ５１（配列番号５１）とＰ５３（配列番号５３）を用いてＰＣＲを行った後、得られたＤＮＡ断片の末端をＳａｌＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＳＤ配列を含むＤＮＡ断片を調製した。同様に、実施例１において第５図で示す工程で作製したｐＵＣ１９−ＳＰＲを鋳型としてプライマーＰ５２（配列番号５２）とＰ５３（配列番号５３）を用いてＳＰＲ遺伝子を含む０．８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ断片を調製した。これらをｐＵＣ１８ΔＥ由来の２．６ｋｂ  ＳａｌＩ−ＳｐｈＩ  ＤＮＡ断片と連結しｐＵＣ１８ΔＥＳＤＳＰＲを作製した。第３３図はｐＵＣ１８ΔＥＳＤＳＰＲ上にクローニングされたＳＰＲのＤＮＡ塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。なお、下線部はＳＰＲのアミノ末端に付加されるＣｃｐＡタンパク由来のアミノ酸配列（Ｆｕｊｉｔａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０：６５７１−６５８０，１９９８）を示す。
（６）ｐＳＬ１１８０ＰＳの作製（第２７図参照）
上述のように第２５図で示す工程で作製したｐＵＣ１８ＳＤＰＴＰＳをＸｂａＩおよびＳａｌＩで消化し、０．５ｋｂの断片（ＳＤ配列＋ＰＴＰＳ）を調製した。次に、上述のように第２６図で示す工程で作製したｐＵＣ１８ΔＥＳＤＳＰＲをＳａｌＩおよびＳｐｈＩで消化し、０．８５ｋｂの断片（ＳＤ配列＋ＳＰＲ）を精製した。これらの断片をｐＳＬ１１８０のＸｂａＩ、ＳｐｈＩ消化物（３．４ｋｂ）と連結し、ｐＳＬ１１８０ＰＳを作製した。
（７）ｐＳＬＩＩ８０ＭＰＳの作製（第２８図参照）
上述のように第２４図で示す工程で作製したｐＵＣ１８ΔＥＳＤｍｔｒＡをＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化し、０．６３ｋｂ断片を調製し、これをｐＳＬ１１８０ＰＳのＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化して得られる４．７ｋｂ断片と連結してｐＳＬ１１８０ＭＰＳを作製した。
（８）枯草菌用発現ベクターｐＤＧ１４８ＭＰＳの作製（第２９図参照）
上述のように第２８図で示す工程で作製したｐＳＬ１１８０ＭＰＳをＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化し、ｍｔｒＡ、ＰＴＰＳ、ＳＰＲ遺伝子を順に配置された２．０ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。一方、大腸菌および枯草菌に使用できるシャトルベクターｐＤＧ１４８（Ｋａｒｍａｚｙｎ−Ｃａｍｐｅｌｌｉら，Ｃｅｌｌ，５２，６９７−７０４，１９８８）をＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｐｈＩで消化して８．２ｋｂのＤＮＡ断片を調製し、先の２．０ｋｂのＤＮＡ断片と連結して枯草菌用発現ベクターｐＤＧ１４８ＭＰＳを作製した。なお、第２９図において、Ｐｓｐａｃはｓｐａｃプロモーターを、ｌａｃＩはｌａｃＩ遺伝子を、ｌａｃＯはｌａｃＩタンパクによる発現調節領域を、Ｋｍはカナマイシン耐性遺伝子を、Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ｏｒｉはプラスミドの複製開始点を表す。
この発現ベクターｐＤＧ１４８ＭＰＳは、ｓｐａｃプロモーター（Ｐｓｐａｃ）の下流にｌａｃＯ配列を、またマルチクローニングサイトの下流に枯草菌内で発現が誘導されるｌａｃＩ遺伝子がコードされている。したがって枯草菌内ではｌａｃＩタンパクによりｓｐａｃプロモーターによる転写は抑制されている。しかしながら、培地中に誘導物質であるＩＰＴＧを添加することにより、ｓｐａｃプロモーターによる転写が活性化し、下流の遺伝子の発現が誘導される。ｍｔｒＡ、ＰＴＰＳ、ＳＰＲ遺伝子の上流にはそれぞれ枯草菌の遺伝子発現に適したＳＤ配列およびＭＳＮＩＴＮＳ（メチオニン−セリン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−アスパラギン−セリン）のアミノ酸配列で始まる翻訳開始領域をコードするＤＮＡ配列を配置してある。オペロン様に配置されたこれら３遺伝子はｓｐａｃプロモーターにより転写が誘導される。
（９）枯草菌用発現ベクターｐＤＧ１４８ＭＰＳΔＩの作製（第３０図参照）
上述のように第２８図で示す工程で作製したｐＳＬ１１８０ＭＰＳを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｍｔｒＡ、ＰＴＰＳ、ＳＰＲ遺伝子を順に配置した２．０ｋｂのＤＮＡ断片を調製した。これを、上述のｐＤＧ１４８のＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ消化物（６．９ｋｂ）と連結させ枯草菌用発現ベクターｐＤＧ１４８ＭＰＳΔＩを作製した。なお、第３０図において、Ｐｓｐａｃはｓｐａｃプロモーターを、ｌａｃＯはｌａｃＩタンパクによる発現調節領域を、Ｋｍはカナマイシン耐性遺伝子を、Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ｏｒｉはプラスミドの複製開始点を表す。
この発現ベクターｐＤＧ１４８ＭＰＳΔＩは、ｓｐａｃプロモーター（Ｐｓｐａｃ）の下流にｌａｃＯ配列を有しているが、ｐＤＧ１４８からｌａｃＩ遺伝子部分を欠失させているため、枯草菌内ではｓｐａｃプロモーターに対する抑制は生じない。したがって下流の遺伝子の発現は恒常的に誘導されている。ｍｔｒＡ、ＰＴＰＳ、ＳＰＲ遺伝子の上流にはそれぞれ枯草菌の遺伝子発現に適したＳＤ配列およびＭＳＮＩＴＮＳのアミノ酸配列で始まる翻訳開始領域をコードするＤＮＡ配列を配置してある。オペロン様に配置されたこれら３遺伝子はｓｐａｃプロモーターにより転写が誘導される。
［実施例１４  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓによるビオプテリン類の生産］
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １Ａ１株（ｔｒｐＣ２）（Ｆｕｊｉｔａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０：６５７１−６５８０，１９９８）を以下の方法によりｐＤＧ１４８ＭＰＳまたはｐＤＧ１４８ＭＰＳΔＩで形質転換した。形質転換に使用したｐＤＧ１４８ＭＰＳおよびｐＤＧ１４８ＭＰＳΔＩの各プラスミドは、大腸菌と枯草菌の両方に形質転換可能なシャトルベクターｐＤＧ１４８（Ｋａｒｍａｚｙｎ−Ｃａｍｐｅｌｌｉら，Ｃｅｌｌ，５２，６９７−７０４，１９８８）由来のベクターであり、大腸菌においてはアンピシリン耐性が、枯草菌においてはカナマイシン耐性が選択マーカーとして利用できる。
ＴＢＡＢＧプレートに枯草菌１Ａ１株をストリークし、１２時間の前培養を行った。［ＴＢＡＢＧプレート１Ｌ中の組成：トリプトン１０ｇ、Ｂｅｅｆ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ３ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、寒天末１５ｇ、グルコース１．８ｇ］
プレートから菌体をかきとり、２ｍｌのＣＩ培地に懸濁した。［ＣＩ培地の組成：（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．２％、Ｋ２ＨＰＯ４  １．４％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．６％、Ｎａ３Ｃｉｔｒａｔｅ・２Ｈ２Ｏ  ０．１％、ＭｇＳＯ４  ５ｍＭ、ｇｌｕｃｏｓｅ  ０．５％、カザミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）０．０２％、トリプトファン（ｔｒｐ）５０μｇ／ｍｌ］
得られた懸濁液をＯＤ６００ｎｍ＝０．０８になるようにＣＩ培地で希釈し、３７℃にて振盪培養を行った。培養中適宜ＯＤ６００ｎｍ値を測定し、増殖が定常期に入るのを確認した。
２．５ｍｌの培養液を遠心分離（２５００ｒｐｍ、１０分、室温（ＲＴ））し、集菌したものを５ｍｌのＣＩＩ培地に懸濁し、３０分程度振盪培養を行い、コンピテントセルとした。［ＣＩＩ培地の組成：（ＮＨ４）２ＳＯ４  ０．２％、Ｋ２ＨＰＯ４  １．４％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．６％、Ｎａ３Ｃｉｔｒａｔｅ・２Ｈ２Ｏ  ０．１％、ＭｇＳＯ４  ５ｍＭ、ｇｌｕｃｏｓｅ  ０．５％、カザミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）０．０１％、トリプトファン（ｔｒｐ）５μｇ／ｍｌ］
コンピテントセル１ｍｌに対し、ｒｅｃＡ＋株である大腸菌ＪＭ１０１株より調製したｐＤＧ１４８ＭＰＳあるいはｐＤＧ１４８ＭＰＳΔＩを１μｇ混合し、３７℃で２時間緩やかに振盪培養を行った。その後、培養液を５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＴＢＡＢＧプレートにストリークし、３７℃で約１２時間培養し、１Ａ１／ｐＤＧ１４８ＭＰＳ、１Ａ１／ｐＤＧ１４８ＭＰＳΔＩの各形質転換体を得た。
得られた各形質転換体コロニーを３ｍｌの５μｇ／ｍｌのカナマイシン（Ｋｍ）を含むＬＢ培地にて約３時間前培養を行った。その後、２％ｇｌｕｃｏｓｅ、１ｍＭ  ＩＰＴＧ、５μｇ／ｍｌ  Ｋｍを含むＮＵ培地（３．５ｍｌ）に接種し、２０時間振盪培養を３７℃において行った。同様に各株のコントロールとして枯草菌１Ａ１株についてもカナマイシンを含まない培地において同様の培養を行った。［ＮＵ培地の組成（１Ｌあたり）：酵母エキス  ４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４  ４ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４  ２．８ｇ、ＮＨ４Ｃｌ  ０．２ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２ｇ、ＦｅＳＯ４  ０．０４ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．０４ｇ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  ０．０１ｇ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．００４ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．００２ｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ  ０．００２ｇ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．００１ｇ、Ｈ３ＢＯ３  ０．０００５ｇ］
その結果、コントロールの株を含め全ての株において、ＯＤ６００ｎｍの値は１０−１２を示した。菌体の増殖は良好であり、形質転換およびＩＰＴＧ添加による発現誘導の影響は認められなかった。培養開始後２０時間における培養上清を実施例４に記載の方法で酸化処理し、ＨＰＬＣ分析に供した。
ＨＰＬＣ分析結果を第３４図に示す。プラスミドを導入していない１Ａ１株（右端）では標準品ＢＰの溶出位置にピークを認められなかったが、他２株（１Ａ１／ｐＤＧ１４８ＭＰＳ、１Ａ１／ｐＤＧ１４８ＭＰＳΔＩ）についてはＢＰ標準品の溶出位置にピークを認めることができ、作製した枯草菌がＢＰ生産能を有することが明らかとなった。ピークエリアの面積比から計算すると、ＢＰの生産量はいずれも約０．４５μｇ／ｍｌであった。
産業上の利用可能性
本発明は、薬理効果が期待されるビオプテリン類を、安価な培地原料をもとにし、大量に工業的に生産できるという効果を奏す。その結果、ビオプテリン類、特にその薬理作用についての研究を行いやすくなり、新規医薬の開発を促進することができる。
また、本発明は、ＴＨＢＰの酸化物であるＤＨＢＰおよびＢＰの生産が可能となるという効果を奏す。その結果、ビオプテリン類の代謝についての研究が行いやすくなる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、テトラヒドロビオプテリンの生合成経路を示す。
第２図は、テトラヒドロビオプテリンの酸化・分解経路を示す。
第３図は、ｐＳＴＶ２８−ＧＣＨの作製工程を示す。なお、ＰＣＲ（Ｐ１、Ｐ２）は、センスプライマーＰ１とアンチセンスプライマーＰ２を用いたＰＣＲを表す。ＰＣＲ（Ｐ３、Ｐ４）およびＰＣＲ（Ｐ５、Ｐ６）も同様である。Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を表し、Ｃｍはクロラムフェニコール耐性遺伝子を表す。また、ｔｒｃは、ｔｒｃプロモーターを表し、ｌａｃはｌａｃプロモーターを表す。
第４図は、ｐＵＣ１８−ＰＴＰＳの作製工程を示す。なお、ＰＣＲ（Ｐ７、Ｐ８）は、センスプライマーＰ７とアンチセンスプライマーＰ８を用いたＰＣＲを表す。ＰＣＲ（Ｐ９、Ｐ１０）およびＰＣＲ（Ｐ１１、Ｐ１２）も同様である。Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を表す。また、ｔｒｃは、ｔｒｃプロモーターを表し、ｌａｃはｌａｃプロモーターを表す。
第５図は、ｐＵＣ１９−ＰＴＰＳの作製工程を示す。なお、ＰＣＲ（Ｐ１３、Ｐ１４）は、センスプライマーＰ１３とアンチセンスプライマーＰ１４を用いたＰＣＲを表す。ＰＣＲ（Ｐ１５、Ｐ１６）およびＰＣＲ（Ｐ１７、Ｐ１８）も同様である。Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を表す。また、ｔｒｃは、ｔｒｃプロモーターを表し、ｌａｃはｌａｃプロモーターを表す。
第６図は、ｐＹＥＳ２−ＦＯＬ２の作製工程を示す。なお、ＰＣＲ（Ｐ２３、Ｐ２４）は、センスプライマーＰ２３とアンチセンスプライマーＰ２４を用いたＰＣＲを表す。Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を表し、ＵＲＡ３は酵母での選択マーカーを表す。ＰＧＡＬ１はＧＡＬ１プロモーターを表し、ＣＹＣ１  ＴＴはＣＹＣ１遺伝子の転写終結シグナルを表す。
第７図は、ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳの作製工程を示す。なお、ＰＣＲ（Ｐ１９、Ｐ２０）は、センスプライマーＰ１９とアンチセンスプライマーＰ２０を用いたＰＣＲを表す。ＰＣＲ（Ｐ２１、Ｐ２２）も同様である。Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を表し、Ｃｍはクロラムフェニコール耐性遺伝子を表す。また、ｌａｃはｌａｃプロモーターを表す。Ｏｒｉは複製起点を表す。
第８図は、ｐＹＥＳ２−ＰＴＰＳおよびｐＹＥＳ２−ＳＰＲの作製工程を示す。なお、ＰＣＲ（Ｐ２５、Ｐ２６）は、センスプライマーＰ２５とアンチセンスプライマーＰ２６を用いたＰＣＲを表す。ＰＣＲ（Ｐ２７、Ｐ２８）も同様である。Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を表し、ＵＲＡ３は酵母での選択マーカーとして用いたＵＲＡ３遺伝子を表す。ｌａｃはｌａｃプロモーターを表し、ＰＧＡＬ１はＧＡＬ１プロモーターを表し、ＣＹＣ１  ＴＴはＣＹＣ１遺伝子の転写終結シグナルを表す。
第９図は、ｐＹＥＳ２−ＦＰＳの作製工程を示す。なお、ＰＣＲ（Ｐ２９、Ｐ３０）は、センスプライマーＰ２９とアンチセンスプライマーＰ３０を用いたＰＣＲを表す。ＰＣＲ（Ｐ３１、Ｐ３２）も同様である。Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を表し、ＵＲＡ３は酵母での選択マーカーを表す。また、ＰＧＡＬ１はＧＡＬ１プロモーターを表し、ＣＹＣ１  ＴＴはＣＹＣ１遺伝子の転写終結シグナルを表す。
第１０図は、ｐＳＴＶ２８−ＧＣＨ上にクローニングされたＧＣＨのＤＮＡ塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。なお、下線部は、ＧＣＨのアミノ末端に付加されるｐＳＴＶ２８由来の配列を示す。
第１１図は、ｐＵＣ１８−ＰＴＰＳ上にクローニングされたＰＴＰＳのＤＮＡ塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。なお、下線部は、ＰＴＰＳのアミノ末端に付加されるｐＵＣ１８由来の配列を示す。
第１２図は、ｐＵＣ１９−ＳＰＲ上にクローニングされたＳＰＲのＤＮＡ塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。なお、下線部は、ＳＰＲのアミノ末端に付加されるｐＵＣ１９由来の配列を示す。
第１３図は、ビオプテリン類生産大腸菌ＪＭ１０１／ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳの培養上清のＣ１８逆相カラムによるＨＰＬＣ分析の結果を示す。
第１４図は、ビオプテリン類生産酵母（ＦＰＳ株）の増殖曲線を示す。
第１５図は、ビオプテリン類生産酵母（ＦＰＳ株）の培養上清のＣ１８逆相カラムによるＨＰＬＣ分析の結果を示す。
第１６図は、ビオプテリン類生産酵母（ＦＰＳ株）の培養上清のＴＬＣ分析の結果を示す。
第１７図は、ビオプテリン類生産大腸菌ＡＧ１４／ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳの培養上清のＣ１８逆相カラムによるＨＰＬＣ分析の結果を示す。
第１８図は、ビオプテリン類生産大腸菌ＡＧ１４／ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳの培養におけるＯＤ６６０およびＢＰ生産量ならびにＰ生産量の経時変化を示す。
第１９図は、ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡの作製工程を示す。なお、ＰＣＲ（Ｐ３３、Ｐ３４）は、センスプライマーＰ３３とアンチセンスプライマーＰ３４を用いたＰＣＲを表す。Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を表し、ｋｍはカナマイシン耐性遺伝子を表す。また、ｌａｃはｌａｃプロモーターを表す。
第２０図は、ｐＳＴＶ２８−ＭＰＳの作製工程を示す。なお、ＰＣＲ（Ｐ３５、Ｐ３６）は、センスプライマーＰ３５とアンチセンスプライマーＰ３６を用いたＰＣＲを表す。ＰＣＲ（Ｐ３７、Ｐ３８）も同様である。Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を表し、ｋｍはカナマイシン耐性遺伝子を表す。また、Ｏｒｉは複製起点を表す。
第２１図は、ＡＧ１４／（ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳ，ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡ）とＡＧ１４／（ｐＳＴＶ２８−ＭＰＳ，ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡ）の培養時のＯＤ６６０とＢＰ生産量の経時変化を示す。なお、■はＡＧ１４／（ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳ，ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡ）のＯＤ６６０の経時変化を示し、●はＡＧ１４／（ｐＳＴＶ２８−ＭＰＳ，ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡ）のＯＤ６６０の経時変化を示し、□はＡＧ１４／（ｐＳＴＶ２８−ＧＰＳ，ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡ）のＢＰ生産量の経時変化を示し、○はＡＧ１４／（ｐＳＴＶ２８−ＭＰＳ，ｐＭＷ２１８−ｇｕａＢＡ）のＢＰ生産量の経時変化を示す。
第２２図は、ｐＵＣ１８ＳＤの作製工程を示す。なお、Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を表す。また、ｌａｃはｌａｃプロモーターを表す。
第２３図は、ｐＵＣ１８ΔＥの作製工程を示す。なお、Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を表す。また、ｌａｃはｌａｃプロモーターを表す。
第２４図は、ｐＵＣ１８ΔＥＳＤｍｔｒＡの作製工程を示す。なお、ＰＣＲ（Ｐ４３、Ｐ４４）は、センスプライマーＰ４３とアンチセンスプライマーＰ４４を用いたＰＣＲを表す。ＰＣＲ（Ｐ４５、Ｐ４６）およびＰＣＲ（Ｐ４５、Ｐ４７）も同様である。Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ｍｔｒＡはｍｔｒＡ遺伝子を、ＳＤはＳＤ配列および翻訳開始領域をコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子を表す。また、ｌａｃはｌａｃプロモーターを表す。
第２５図は、ｐＵＣ１８ＳＤＰＴＰＳの作製工程を示す。なお、ＰＣＲ（Ｐ５０、Ｐ４８）は、センスプライマーＰ５０とアンチセンスプライマーＰ４８を用いたＰＣＲを表す。ＰＣＲ（Ｐ５０、Ｐ４９）も同様である。Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ＰＴＰＳはＰＴＰＳ遺伝子を、ＳＤはＳＤ配列および翻訳開始領域をコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子を表す。また、ｌａｃはｌａｃプロモーターを表す。
第２６図は、ｐＵＣ１８ΔＥＳＤＳＰＲの作製工程を示す。なお、ＰＣＲ（Ｐ５３、Ｐ５１）は、センスプライマーＰ５３とアンチセンスプライマーＰ５１を用いたＰＣＲを表す。ＰＣＲ（Ｐ５３、Ｐ５２）も同様である。Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ＳＰＲはＳＰＲ遺伝子を、ＳＤはＳＤ配列および翻訳開始領域をコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子を表す。また、ｌａｃはｌａｃプロモーターを表す。
第２７図は、ｐＳＬ１１８０ＰＳの作製工程を示す。なお、Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ＰＴＰＳはＰＴＰＳ遺伝子を、ＳＰＲはＳＰＲ遺伝子を、ＳＤはＳＤ配列および翻訳開始領域をコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子を表す。また、ｌａｃはｌａｃプロモーターを表す。
第２８図は、ｐＳＬ１１８０ＭＰＳの作製工程を示す。なお、Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ＰＴＰＳはＰＴＰＳ遺伝子を、ＳＰＲはＳＰＲ遺伝子を、ｍｔｒＡはｍｔｒＡ遺伝子を、ＳＤはＳＤ配列および翻訳開始領域をコードするＤＮＡ配列を含む遺伝子を表す。また、ｌａｃはｌａｃプロモーターを表す。
第２９図は、ｐＤＧ１４８ＭＰＳの作製工程を示す。なお、Ｋｍはカナマイシン耐性遺伝子を、Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ＰＴＰＳはＰＴＰＳ遺伝子を、ＳＰＲはＳＰＲ遺伝子を、ｍｔｒＡはｍｔｒＡ遺伝子を表す。Ｐｓｐａｃはｓｐａｃプロモーターを、ｌａｃＯはｌａｃＯ遺伝子を、ｌａｃＩはｌａｃＩ遺伝子を表す。Ｏｒｉは複製起点を表す。
第３０図は、ｐＤＧ１４８ＭＰＳΔＩの作製工程を示す。なお、Ｋｍはカナマイシン耐性遺伝子を、Ａｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ＰＴＰＳはＰＴＰＳ遺伝子を、ＳＰＲはＳＰＲ遺伝子を、ｍｔｒＡはｍｔｒＡ遺伝子を表す。Ｐｓｐａｃはｓｐａｃプロモーターを、ｌａｃＯはｌａｃＯ遺伝子を、ｌａｃＩはｌａｃＩ遺伝子を表す。Ｏｒｉは複製起点を表す。
第３１図は、ｐＵＣ１８ΔＥＳＤｍｔｒＡ上にクローニングされたｍｔｒＡのＤＮＡ塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。なお、下線部はｍｔｒＡのアミノ末端に付加されるＣｃｐＡタンパク由来のアミノ酸配列（Ｆｕｊｉｔａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０：６５７１−６５８０，１９９８）およびそれに対応する塩基配列を示す。
第３２図は、ｐＵＣ１８ＳＤＰＴＰＳ上にクローニングされたＰＴＰＳのＤＮＡ塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。なお、下線部はＰＴＰＳのアミノ末端に付加されるＣｃｐＡタンパク由来のアミノ酸配列（Ｆｕｊｉｔａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０：６５７１−６５８０，１９９８）およびそれに対応する塩基配列を示す。
第３３図は、ｐＵＣ１８ΔＥＳＤＳＰＲ上にクローニングされたＳＰＲのＤＮＡ塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。なお、下線部はＳＰＲのアミノ末端に付加されるＣｃｐＡタンパク由来のアミノ酸配列（Ｆｕｊｉｔａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０：６５７１−６５８０，１９９８）およびそれに対応する塩基配列を示す。
第３４図は、本発明に係る形質転換細胞である１Ａ１／ｐＤＧ１４８ＭＰＳおよび１Ａ１／ｐＤＧ１４８ＭＰＳΔＩ、ならびに比較例としてのＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １Ａ１株の培養上清のＨＰＬＣによる分析結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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