(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エストロゲンを有効成分として含有し、
新生児期に投与され、
全身性エリテマトーデスの発病を抑制する
ことを特徴とした全身性エリテマトーデス発病抑制薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、例えば全身性エリテマトーデスの発病を抑制する全身性エリテマトーデス発病抑制薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、自己免疫疾患の代表として知られている全身性エリテマトーデス(Systemic Lupus Eryhtrmatosus:SLE)は、一卵性双生児での一致率が６３％程度であることから何らかの遺伝的素因を背景として、感染、性ホルモン、紫外線、薬物などの環境因子が加わって発病する多因子性疾患と考えられている。
【０００３】
そして、この全身性エリテマトーデスの病態は、種々の全身の臓器に対する自己抗体が産生され、皮膚、関節、腎、神経、心、血管、肺、腸管あるいは膀胱などに病変を生ずる。これらの自己抗体は、主に核および細胞成分の抗原を認識しており、それぞれの臓器を直接侵襲するか、もしくは血液中で免疫複合体を形成し組織へ沈着する。さらに、捕体系の活性化を促し組織の炎症、破壊を促すものと考えられている。
【０００４】
また、全身性エリテマトーデスの病態における主な自己抗体は、抗核抗体の一つである抗二本鎖DNA抗体(anti-double-stranded DNA antibody:anti-dsDNA Ab)とされ、診断や活動性の指標に非常に重要であるとともに免疫複合体により誘起された糸球体腎炎(ループス腎炎)は、致死に至る重篤な要因であり、病態の進行を左右する中心的な抗体である。
【０００５】
一方、人体の感受性遺伝子や、自己の体内に予め組み込まれている内在性レトロウイルス(Endogenous Retroviruses:ERV)の解析により全身性エリテマトーデスへの遺伝的素因の関連性が解明されつつあり、さらに、外来性のウイルスの解析により全身性エリテマトーデスへの環境因子の関連性が解明されつつあるが、未だ全身性エリテマトーデスの全貌は明らかにされていない。
【０００６】
そして、この全身性エリテマトーデスの治療としては、基本的に自己免疫疾患に共通しているが、対症療法を除く根本的治療においては、抗炎症および免疫抑制作用を期待して副腎皮質ホルモンであるプレドニゾロン(Predonisolone)などの副腎皮質ステロイドが多用され、特に病初期や重篤な症例では大量の使用が強いられている。さらには、副腎皮質ステロイド抵抗性の症例やこれによる副作用が出現した症例においてはシクロホスファミド(Cyclophosphamide)やアザチオプリン(Azathioprine)などの免疫抑制薬の投与が考慮される。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、既に発病している全身性エリテマトーデスを治療する場合には、上述した副腎皮質ステロイドや免疫抑制薬などを長期に亘って全身投与する必要性がある。この結果、再燃とともに間欠的な大量療法を強いられるとともに、投与する薬の減量により再発するおそれがあり、薬の減量または中止には及ばず一生涯薬を投与せざるを得なくなる。
【０００８】
よって、現行の治療法では、全身性エリテマトーデス患者は、副腎皮質ステロイドによる骨疎しょう症、骨頭無腐性壊死、消化性潰瘍、糖尿病、感染症あるいはうつ状態などや、免疫抑制薬による骨髄機能抑制、間質性肺炎、肝機能障事、腎機能障育あるいは感染症などの副作用の発現に生涯に亘って常時悩まされているとともに、全身性エリテマトーデスが発病する前に抑制して予防する方法が未だ知られていないという問題を有している。
【０００９】
本発明は、このような点に鑑みなされたもので、全身性エリテマトーデスの発病を抑制できる全身性エリテマトーデス発病抑制薬を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明の全身性エリテマトーデス発病抑制薬は、エストロゲンを有効成分として含有し、新生児期に投与され、全身性エリテマトーデスの発病を抑制するものである。
【００１１】
そして、エストロゲンを有効成分として含有し、新生児期に投与されることにより、エストロゲン刺激にて産生される病原抗原に対する免疫寛容を行うことができるので、このエストロゲン刺激による免疫寛容以降における全身性エリテマトーデスの発病を抑制できる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の一実施の形態の全身性エリテマトーデス発病抑制薬の構成を図面を参照して説明する。
【００１３】
まず、自己免疫疾患としての膠原病の中の代表的疾患である全身性エリテマトーデス(Systemic Lupus Eryhtrmatosus:SLE)は、思春期である若い女性に好発するとともに、一卵性双生児での一致率が６３％程度であることから何らかの遺伝的素因を背景として、感染、性ホルモン、紫外線、薬物などの環境因子が加わって発病する多因子性疾患と考えられている。
【００１４】
そして、この全身性エリテマトーデスの病態は、種々の全身の臓器に対する自己抗体が産生され、皮膚、関節、腎、神経、心、血管、肺、腸管あるいは膀胱などに病変を生ずる。これらの自己抗体は、主に核および細胞成分の抗原を認識しており、それぞれの臓器を直接侵襲するか、もしくは血液中で免疫複合体を形成し組織へ沈着する。さらに、捕体系の活性化を促し組織の炎症、破壊を促すものと考えられている。
【００１５】
また、全身性エリテマトーデスの病態における主な自己抗体は、抗核抗体の一つである抗二本鎖DNA抗体(anti-double-stranded DNA antibody:anti-dsDNA Ab)とされ、診断や活動性の指標に非常重要であるとともに免疫複合体により誘起された糸球体腎炎(ループス腎炎)は、致死に至る重篤な要因であり、病態の進行を左右する中心的な抗体である。
【００１６】
そして、この全身性エリテマトーデスの発病を抑制する全身性エリテマトーデス発病抑制薬である卵胞ホルモン製剤、例えば吉草酸エストラジオールは、卵胞ホルモンの総称であるエストロゲン(estrogen)が有効成分として含有されている。また、この全身性エリテマトーデス発病抑制薬は、この全身性エリテマトーデスが発病する前である出生早期に１回だけ投与される。
【００１７】
ここで、エストロゲンは、最も基本的な女性性ステロイドホルモンであり、内外性器の発育のみならず、中枢神経、代謝系、乳房などに対する性器外作用を有している。また、このエストロゲンとしては、エストロン(estrone)、エストラジオール(estradiol)、エストリオール(estriol)などが存在する。
【００１８】
なお、エストラジオールは、生理活性が最も高く、主として卵巣から産生され、卵胞発育に伴い特徴的な分泌パターンを示し、妊娠中に至っては胎盤性エストロゲンの一部として大量に分泌される。また、このエストラジオールは、性腺系の発育増殖をつかさどるほか、骨代謝に関与し、骨格の成長効果を持つとともに、妊娠時における胎盤機能の指標として、思春期、不妊症、更年期および閉経婦人における卵巣機能の評価として重要な意味を有する。
【００１９】
次に、上記一実施の形態の作用について実験例を参照して説明する。
【００２０】
(実験例)
動物モデルを用いて全身性エリテマトーデスに対するエストロゲン投与による発病抑制について実験した。
【００２１】
そして、全身性エリテマトーデスの動物モデルとしては、NZB(New Zealand black mice)/BINJおよびNZW(New Zealand white mice)/LacJに由来するNZB/NZW F1マウスが知られている。
【００２２】
このNZB/NZW F1雌マウスは、生後４週齢頃より抗二本鎖DNA抗体(anti-dsDNA Ab)の発現と高グロブリン血症(hyper-globrinemia)とが認められ、加齢とともに抗二本鎖DNA抗体価の上昇がみられ、自然発生的に免疫複合体に誘起された糸球体腎炎(immune complex-mediated glomerulonephritis)であるループス腎炎を起し生後約１０ヶ月以内に腎不全で死亡する経過をとる。このため、このNZB/NZW F1雌マウスの臨床経過は、ヒト全身性エリテマトーデスの臨床経過と非常に類似している。
【００２３】
そして、出生後２週間以内、より具体的には３日以内の雌のNZB/NZW F1マウスに、エストロゲンとしての17-β-エストラジオール(17E2)吉草酸塩であるペラニンデポー(Pelanin Depot:持田製薬株式会社製)を１回のみ投与して、蛋白尿、抗DNA抗体(anti-dsDNA Ab)の発現量、および生存率の経時的な観察を１８ヶ月に亘って３回ほど行った。
【００２４】
詳細な方法においては、このペラニンデポー(エストロゲン)を接種用にゴマ油(sesame oil:Sigma Chemical社製)で希釈し、２ng/ulに調整したものをマウスの体重に対し２００ng/gの割合で背部皮下投与を行った。エストロゲンの接種と同時にコントロールとして希釈に使ったゴマ油を同比率の量(volume)で背部皮下投与を行った。
【００２５】
そして、尿蛋白の判定量分析においてはテトラブロモフェノールブルー塗布尿検査スティック(tetrabromophenolblue coated urine analysis stick:テルモ社製)を用いて行った。
【００２６】
さらに、抗二本鎖DNA抗体(anti-dsDNA Ab)の抗体価測定は、酵素免疫測定法(ELISA法)にて行い、抗原には二本鎖の子牛胸腺DNA(Sigma Chemical社製)、二次抗体としてペルオキシダーゼ標織抗マウスIgG Fabフラグメント(Nordic Immunology Laboratories社製)、抗体価測定のためのスタンダードとして単クローン性マウス抗DNA抗体(CHEMICON International社製)を用いた。
【００２７】
そして、生殖が可能な８〜１０週齢のエストロゲンを投与した雌のNZB/NZW F1マウスにおいては、生殖器の成熟を病理組織学的に観察し、各臓器におけるエストロゲン受容体であるER-αmRNAの発現を、分子生物学的手法としてのRT−PCR(Riverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)法という遺伝子増幅法により評価して、エストロゲンに関与する機能の保持を確認した。
【００２８】
このとき、RNAの抽出においては、各臓器の組織を物理的にホモゲナイズした後、TRIZOL LS Reagent(GIBCO BRL社製)を用い試薬会社の実験方法に従って行った。抽出されたRNAは、エストロゲン受容体αの６から８までのエクソン領域をプライマーペア(センス[AGG GTG AAG AGT TTG TGT GC;1534-1543]およびアンチセンス[AGG AAT GTG CTG AAG TGG AG;1918to1937])を用いてワンステップRT−PCRキット(QIAGEN社製)で増幅した。同時に、各臓器において持続的に発現をしているマウス-グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(mouse glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase:mGAPDH)RNAを内部コントロールとし、Maxim Biotec社製のプライマーキットを用いて増幅した。
【００２９】
この結果、多くの場合、抗DNA抗体は、雌のNZB/NZW F1マウスで出生から約４週齢を過ぎると顕性化し、以降週齢を重ねる毎に抗体陽性率および陽性化後のそれぞれの量の増強が成熟するに連れて認められる。
【００３０】
このとき、生後３日以内にコントロールオイルを投与した雌のNZB/NZW F1マウスの２０匹の群であるコントロール群でもまた、同様の結果を得たが、エストラジオールを投与した２０匹の雌のエストロゲン投与群では、図２に示すように、抗体陽性率および陽性化後のその量の増強の抑制が有意に確認できた。
【００３１】
また、７週齢以降のコントロール群の雌のNZB/NZW F1マウスは、抗体量の増加に伴って順次死亡し、抗体価の低いものが生存する状態となり、それ故、マウスの数の変動による統計処理の信頼性の低下から提示してはいないが、雌のNZB/NZW F1マウスの抗体価の平均値は、エストロゲン投与群が雌のコントロール群を下回っていた。
【００３２】
さらに、図１に示すように、雌のコントロール群の生存率は、生後７ヶ月以降に低下し、１２ヶ月目には１０％以下に到達する。一方、エストロゲン投与群の生存率は、雌のコントロール群より４ヶ月遅い生後１１ヶ月以降に低下し、１８ヶ月に至っても５０％の生存率を維持した。なお、図１に示すバーは、雌のエストロゲン投与群およびコントロール群毎の匹数の平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
【００３３】
この結果、エストロゲンを投与した雌のNZB/NZW F1マウスの生存率は、明らかに雌のコントロール群に比べて高く、さらに、基本的に発病しない雄のコントロールマウスであるNZB/NZW F1マウスの自然生存率とほぼ同等もしくはそれ以上の結果が示された。また、全ての死亡したマウスにおいて腎機能障害の指標とされる蛋白尿に関しては、エストロゲン投与群およびコントロール群それぞれに共通して蛋白尿が２５０mg/dl以上になった後に３ヶ月以内に全て死亡している。
【００３４】
さらに、生殖可能週齢である８〜１０週齢の雌のNZB/NZW F1マウスにおける解剖では、エストロゲン投与群とコントロール群との間に、子宮および卵巣の重量に有意な差はなく、萎縮や異常形態は認められず、病理学的所見も同様であった。
【００３５】
また、NZB/NZW F1マウスの各臓器におけるエストロゲン受容体の発現は、RT-PCR法にて分析した結果、図３に示すように、脳内、肝臓および脾臓に強く、心臓、肺および子宮では検出限界以下であった。なお、図３に示すGAPDHは、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)である。
【００３６】
よって、エストロゲンが投与された雌のNZB/NZW F1マウスの各臓器におけるエストロゲン受容体のmRNA発現やエストロゲン関連組織での病理学的所見においてエストロゲン投与群とコントロール群に有意差が無かったことから、この治療は生体にホルモン動態的な変化を与えず安全である事が確認された。
【００３７】
上述したように、上記一実施の形態によれば、全身性エリテマトーデスの発病は、女性(雌)の思春期に最も多く、この発病の要因であるトリガーの一つとしてエストロゲンの関与が強く考えられている。一方、全身性エリテマトーデスの動物モデルである雄のNZB/NZW F1マウスにおいても、エストロゲンの投与による病気の増悪、去勢による発病の抑制などが報告されている。
【００３８】
ところが、これらエストロゲンの投与による病気の増悪、去勢による発病の抑制などは、ともに多因子性疾患と考えられており、病因が未だ明らかではない。遺伝子素因として感受性遺伝子の解明が進められているが、この感受性遺伝子が抗原として関与しているのか、あるいは免疫応答や免疫寛容の異常に関与しているのかは明らかではなく、また、環境因子でも強い疑い性のある物質や生物について同定されていない。
【００３９】
そこで、第二の遺伝的素因としてエストロゲンに誘発されるプロモータを持つ内在性レトロウイルスなどの何らかの遺伝子が体細胞遺伝子中に存在し、このエストロゲンに誘導された物質と、その固体の持つ生体内の構成成分が類似している可能性に着目して、思春期にエストロゲン産生量が増加し生後初めて認識される物質が産生された時、その物質に対する抗体が産生され生体内の自己構成成分と交叉反応を起こすことが病因の一つと仮定した。すなわち、出生直後に短期間エストロゲン刺激を行うことにより、病原物質を生体内で発現させ免疫寛容を行わせることを目的としている。
【００４０】
ここで、今回使用したエストロゲンの投与量は、ヒトにおける一般的使用量に順じており、１０分の１の２０ng/gでは有用な所見が得られなかったが、エストロゲン投与群がコントロール群と同様の過程をたどったことや、エストロゲンの投与により発病および病像の進行を抑制できることが明らかであったにも関わらず、全ての致死マウスにおいて死亡前、抗DNA抗体の抗体産生の増加や、蛋白尿の増加が認められたことは、さらに高濃度なエストロゲンを投与することが必要であることを示唆しており、濃度依存的に発病が抑制される可能性がある。
【００４１】
このことは、全身性エリテマトーデスの患者において発病する前にエストロゲンが産生されており、低濃度の持続的産生がなされ、月経にいたる思春期以降に周期的に高濃度のエストロゲンが産生されることにより発病したと考えれば理論的に一致する。
【００４２】
同様に、低濃度のエストロゲンが産生されている男性では全身性エリテマトーデスの発病率が低く、また、動物実験においては雄のNZB/NZW F1マウスに高濃度のエストロゲンを曝露することにより発病することも裏付けとすることができる。おそらく、一定濃度以上の異常なエストロゲンによりプロモータが刺激されて病因物質である抗原の産生が始まる可能性があると考えられる。
【００４３】
したがって、上述の実験では、全身性エリテマトーデスの動物モデルである雌のNZB/NZW F1マウスの出生早期に一度のエストロゲンの投与を行うことにより、基本的に発病しない雄のNZB/NZW F1マウスと同等の寿命を得ることができ、各臓器のエストロゲン受容体の発現および生殖機能へ異常を来さなかったことから、新生児への１回のエストロゲンの投与により、恒常性の維持に不可欠なエストロゲン受容体の発現を低下させることなく、生殖器の異常が発生することなく、成熟期以降の全身性エリテマトーデスの発病を抑制および防止できるとともに、進行の抑制が可能となり、生存率を上昇できると考えられる。
【００４４】
さらに、遺伝子解析が進むことにより原因遺伝子が解明され、出生前診断が可能となれば、全身性エリテマトーデスのさらに選択的な治療法が増える可能性がある。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、免疫寛容が可能な時期である新生児期におけるエストロゲンを有効成分として含有した全身性エリテマトーデス発病抑制薬の投与で、エストロゲン刺激にて産生される病原抗原に対する免疫寛容を行うことができるので、このエストロゲン刺激による免疫寛容以降における全身性エリテマトーデスの発病を抑制できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明の全身性エリテマトーデス発病抑制薬を投与した際の生存率を示すグラフである。
【図２】  同上全身性エリテマトーデス発病抑制薬を投与した際の抗DNA抗体の抗体価を示すグラフである。
【図３】  同上全身性エリテマトーデス発病抑制薬およびコントロールオイルを投与した際の各臓器の細胞内におけるmRNAの発現を示すデータである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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