(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
in situにおいて組織から低分子量(「LMW」)ペプチドを分離する方法であって、以下のステップ：
a)  上記組織を均質化し；
b)  上記均質化された組織を有機溶剤と混合して完全に湿ったスラリーを形成し；
c)  上記スラリーを静置するかまたは攪拌して上記均質化された組織内のタンパク質をin situにおいて変性させ；
d)  上記均質化された組織から上記有機溶剤を取り除き；
e)  ステップd)の有機溶剤処理された均質化された組織を、十分な量の水または水性溶液と混合してペプチドを抽出し；
f)  ステップe)の均質化された組織の残渣から液体抽出物を分離して上記組織から取り出された低分子量ペプチド画分を含む水性溶液を得る、
を含む前記方法。
【請求項２】
ステップa)を受ける前に、前ステップにおいて前記組織を乾燥させる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記組織を凍結乾燥する、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
ステップb)の有機溶剤がエタノールである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
ステップb)の有機溶剤が70％エタノールである、請求項1または4に記載の方法。
【請求項６】
ステップb)の有機溶剤が、50％〜80％エタノールの濃度をもつエタノールである、請求項1または4に記載の方法。
【請求項７】
ステップb)の有機溶剤が、60％〜70％エタノールの濃度をもつエタノールである、請求項1または4に記載の方法。
【請求項８】
ステップb)の有機溶剤が、エタノールの量に対して30％の総含水率を提供するように前記均質化した組織に加えられる無水エタノールである、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
ステップc)において、前記スラリーが、少なくとも1時間静置されるか、または攪拌される、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
ステップc)において、前記スラリーが3時間以上静置されるか、または攪拌される、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記スラリーが、１０℃〜３０℃で静置または攪拌される、請求項9または10に記載の方法。
【請求項１２】
ステップd)の溶剤処理した組織をステップe)を受ける前に完全に乾燥させる追加のステップd1)を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
ステップd)またはd1)の有機溶剤処理した組織を、1時間、水または水性溶液と混合する、請求項1または12に記載の方法。
【請求項１４】
前記混合が、１０℃〜３０℃で実施される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
ステップe）の組織残渣からの液体抽出物の収率を改善するために、ステップe)〜f)を1回以上繰り返す追加のステップg)を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
ステップf)またはg)からの液体抽出物を乾燥させて低分子量ペプチド抽出物を得る、請求項1または15に記載の方法。
【請求項１７】
請求項1に記載の方法によって得られた分離された低分子量ペプチド混合物であって、前記組織が、シカ幼角である、前記混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は改良された抽出方法に関する。特に、本発明は、動物の組織からの低分子量ペプチドを分離する改良された抽出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
健康食品および生物医学の市場において、高レベルの増殖因子および他の低分子量ポリペプチドを含む動物性産物の抽出物に対して高まる需要が存在する。この需要は、高い生物活性と、多くの場合、組織または他の原料物質中に存在する巨大タンパク質と比べて小さいポリペプチドのより大きな可溶性と安定性に起因する。特に、低分子量ペプチドと増殖因子抽出物には、それらを医療品(例えば、創傷治癒)、栄養補助食品、化粧品および細胞増殖媒体の成分を含む多数の様々な用途にふさわしくする特性がある。
【０００３】
動物組織の水性抽出の種々の標準法が開発されて、そしてタンパク質の分離のために広く使用された、Scopes R.K.(1987年)。一般に、水性抽出は、水もしくは塩水溶液、またはバッファーの存在下、例えば、超音波または(ブレンダーによる)機械的な破砕といった細胞を壊すためのいくつかの方法を使用することを意味する。抽出系のpHは、特定の標的タンパク質(例えば、膜結合酵素)の溶解度を高めるために、操作されることもあり、または界面活性剤および他の添加剤が使用される。しかし、一般に最初の全タンパク質抽出物は、広範囲の分子量をもつタンパク質を含むであろう。そして、前記全タンパク質抽出物中の増殖因子と他の低分子量ポリペプチドの選択的な濃縮のために、さらなる処理ステップが必要とされる。
【０００４】
低分子量ペプチドを濃縮した増殖因子濃縮組織抽出物の市販品は、混合物からの望ましくない高分子量タンパク質の除去のための実用的な、コスト的に効率の高い方法を使用できることが必要である。増殖因子の潜在的な濃縮を伴う組織抽出物および他の動物性材料(例えば、血液、ミルク、初乳)の分別のための工業規模で適用できる従来の方法は、以下の：
・限外濾過、
・ゲル濾過クロマトグラフィー(GFC)（別名、サイズ排除クロマトグラフィー）、
・他のクロマトグラフィー分別システム(例えば、イオン交換、疎水性相互作用、親和性)
・多相系における液相分配
・水混和性有機溶剤(エタノール、アセトン)を使った水性溶液から(すなわち、液相から)の沈殿、一般に、上記有機溶剤は氷冷であり、変性効果を高めるために非混和性有機溶剤(クロロホルム)の追加を伴うこともある、Scopes R.K.(1987年)、
・中性塩またはアミノ酸による塩析、
を含む。
【０００５】
しかし、ほとんどの例で、これらの方法は、増殖因子および他のペプチドの濃縮よりむしろ、酵素と他の中程度に大きなタンパク質を分離するために使用された。例えば、冷エタノールを使った沈殿は、血漿からのアルブミンおよび他のタンパク質の調製のための伝統的なコーン分別法の原理である。
その結果、これらの方法は、増殖因子および他の低分子量ポリペプチドの一般的な濃縮に関して問題点を持っているか、そうでなければ、十分に好適ではない。
【０００６】
限外濾過もGFCも、高価な資本投資を必要として、汚染に敏感であり、そして後者は所望の低分子量フラクションの希釈をもたらす。他のクロマトグラフィー分別システムは、同様に稼動するのに高価であり、高または低分子量の画分を分離するよりむしろ、特定のペプチドを精製するために使用される傾向がある。
【０００７】
多相系における液相分配(例えば、曇点抽出および水性二相系)は、そのタンパク質が水性環境全体に保持されるので、不安定なタンパク質(例えば、酵素)が所望の産物である場合に特に利用されるものである、Skopes R.K.(1987年)、Tani H.ほか(1997年)。これは、前記分子の生物活性の保持を援助する。前記方法の問題点は、所望の産物が、取り除かれなければならないたくさんの界面活性剤、塩および/または水溶性重合体の存在下で得られることである。これは、方法の経費を増加させて、多くの場合、限外濾過といった追加ステップの使用を必要とする。
【０００８】
他の残りの方法も、同様に全てがポリペプチド溶液から取り除かれなくてはならないたくさんの他の化学物質(有機溶剤、アミノ酸、または塩)の添加に終わる。追加の処理ステップの必要による高い費用と同様に、これらは、大量の可燃性および/または有毒な溶剤の使用といった場合に、安全問題を持ち込むかもしれない。そのような溶剤の安全な取り扱いと、最終的な除去は、特別に設計されて、そして一般に非常に高価な処理施設および装置の使用を必要とする。
【０００９】
本願明細書に引用されたあらゆる特許または特許出願を含む全ての参考文献が、本明細書中に援用される。いずれかの参考文献が先行技術を構成するという自認は成されない。参考文献についての論議は、その著者たちが何を主張するかを提示し、そして当該出願人たちが引用された文書の正確度と適切さを厳密に調べる権利を留保する。多数の先行技術の刊行物が本明細書中に引用されるが、この参考文献はこれらの文書のいずれかが当該技術分野の、ニュージーランドの、またはあらゆる諸外国の一般常識の一部を形成するという自認を構成しないことははっきりと理解される。
【００１０】
法域が変わる中で、用語『含む』は、排他的または包括的な意味のいずれかに属すると考えられると認識される。本願明細書の目的のために、そして別段の注意がない限り、用語『含む』は、包括的な意味を持つべきである−すなわち、それは、それが直接的に参照する列挙された成分だけではなく、他の特定されていない成分または要素も意味すると受け取られる。用語『含まれた』または『含む』が方法または方法の1以上のステップに関して使用される場合、この根拠が同様に使用される。
【００１１】
前述の問題に対処すること、または少なくとも大衆に有用な選択肢を提供することが本発明の目的である。
本発明のよりたくさんの側面および利点が、例としてだけ与えられる以降の説明から明らかになる。
【発明の開示】
【００１２】
低分子量ペプチドが着目のペプチドである場合、組織抽出物からのより大きなタンパク質の除去のためのこれらの様々な方法の欠点が、当該発明者たちが新規の選択肢を検討するように導く。すなわち、水性抽出前の、組織内のin situでの変性による、有機溶剤(好ましくはエタノール)による、より高分子量画分のタンパク質の最初の溶解の防止。有機溶剤による固体組織の処理が前もって使用されたが、続く水性抽出物における低分子量ポリペプチドの濃度を高めるよりむしろ具体的に言えば組織の脱脂および脱水のためのものであった(Scopes, R.K. (1987), Betzing, H. et al (1975))。その結果、LMWペプチドのさらなる分離が必要とされる。
【００１３】
本発明の1つの側面によると、以下のステップ：
a)  上記組織を均質化し；
b)  上記均質化組織を有機溶剤と混合して、完全に湿ったスラリーを形成させ；
c)  上記スラリーを静置するかまたは攪拌して、組織内のin situにてタンパク質を変性させ；
d)  上記組織から上記有機溶剤を除去し；
e)  ステップd)の有機溶剤処理した組織を十分な量の水または水性溶液と混合して、上記ペプチドを抽出し；そして
f)   ステップe)の組織残渣から液体抽出物を分離して、上記組織から取り出された低分子量ペプチド画分を含む水性溶液を得る、
を含む、組織のin situから低分子量(「LMW」)ペプチドを分離する方法を提供する。
【００１４】
本願明細書全体にわたって、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、互換的に使用され、そして1以上のアミノ酸の少なくとも1つの鎖を含む分子を表す。
【００１５】
用語「分離された」は、低分子ペプチドが抽出される組織内の高分子量ペプチドまたは他の望ましくない物質から実質的に分離されたか、または精製されたことを意味する。
本願明細書全体にわたって、用語「低分子量ペプチド」または「LMWペプチド」は、実質的に10,000ダルトン以下の見かけ上の分子量をもつペプチドを表す。
本願明細書全体にわたって、本明細書中に使用されるように、用語「見かけ上の分子量」は、ゲル濾過クロマトグラフィーによって測定されるペプチドの分子量を表す。
【００１６】
本願明細書全体にわたって、本明細書中に使用されるように、用語「全タンパク質抽出物」は、その抽出物に含まれるタンパク質の分子量を制御する試みなしに、例えば背景技術の論議においてこれに先立ち詳述されたような標準的な先行技術の水性抽出技術を使って準備される組織抽出物を表す。
【００１７】
本願明細書全体にわたって、用語「攪拌する」またはこの用語の文法上の変化型は、混合効果を達成するための攪拌、振盪、または超音波による照射方法を表す。
【００１８】
他の水溶性(非ペプチド)成分(「NPCs」)が本発明の方法を使って準備されたLMWペプチドと一緒に同様に分離されうることは、当業者によって認識されるはずである。いくつかの例において、これらのNPCsは、LMWペプチドと一緒に、またはそれらの代わりに抽出方法の実質的には所望の構成要素であるかもしれない。
【００１９】
組織は、そこからLMWペプチドを抽出することが望まれるいずれかの動物組織か、(乾燥させた血液、ミルク、または初乳を含むが、しかしそれに限定されない)他の実質的に個体の動物性産物であるかもしれない。
【００２０】
一般に、細かく分裂するように、組織は超音波または機械的な破砕によって均質化されうる。例えば、組織は、乳鉢と乳棒、ブレンダー、ミル、またはいずれか他の適当な装置によって均質化されうる。しかし、この一覧は制限するものとしてみなされるべきではない。
【００２１】
一般に、組織は、均質化するより前に、場合によりまず組織の均質化または保存を助けるために乾燥させる前ステップを受けうる。
組織は、組織内の着目のLMWペプチドの特性に影響を与えることなく、そこから水を取り除くことができるいずれかの方法によって乾燥されうる。
好ましい態様において、あらゆる熱感受性増殖因子に影響しないように、組織は凍結乾燥されうる。
【００２２】
有機溶剤は、着目のLMWペプチドの特性に影響しないいずれかの有機溶剤であるかもしれない。
いくつかの態様において、有機溶剤は、アセトン、アセトニトリル、メタノール、プロパン-1-オール、プロパン-2-オールであるかもしれないが、この一覧が限定するものとしてみなされるべきでない。
【００２３】
好ましい態様において、有機溶剤は、その抗菌性の活性および低い中毒性により、エタノールであるかもしれない。最も好ましくは、乾燥組織の場合に70％のエタノールが使用されうる。
【００２４】
本発明の抽出方法が新鮮な組織に関して使用される態様において、エタノールの量に対して、約30％の全水分含量を提供するために十分な無水エタノールが加えられうる。場合により、完全に湿ったゆるいスラリーを作製するために必要とされれば、この水分含量が達成された時点で、さらに70％エタノールが加えられることができる。
【００２５】
エタノールのより高いまたはより低い濃度が場合により使用されうる一方で：エタノールの最大抗菌活性が70％のエタノールの好ましい濃度で生じることが当業者によって理解される。
参照の容易さのために、ここでは単に有機溶剤はただエタノールであるといわれるだけであろう。
【００２６】
本願明細書全体にわたって、用語「完全に湿った（fully-wetted）」は、自由流動性スラリーを製造するために細かく分けられた固体への十分な液体の添加を表す。
本明細書中に使用される場合、用語「液相」は、加工作業がもっぱら液体によって実施されるように、通常固体の材料(例えば、タンパク質)の溶液の使用を表す。
本願明細書全体にわたって、用語「室温」は、周囲を取り囲む環境の温度を意味するものとして、実質的に10〜30℃の範囲にある。
【００２７】
一般に、完全に湿ったスラリーは、静置したままにされるか、または室温にて少なくとも実質的に1時間攪拌される。最も好ましくは、完全に湿ったスラリーは、静置したままにされるか、または室温で少なくとも実質的3時間以上攪拌される。しかし、LMWペプチドの生物活性を維持するために必要ならば、（すなわち、周囲の環境のそれより低い)より低い温度でのこのステップの実施は、当該方法によって排除されるものではない。好ましい態様において、組織からの可溶性成分のより能率的な抽出をもたらすことが当業者によって合理的に見込まれる場合、攪拌は、ただスラリーを静置することを上回る好ましいことである。
【００２８】
完全に湿ったスラリーが静置したままにされる期間は、組織内のin situで受けるべきタンパク質の変性を可能にするのに十分でなくてはならないことは当業者によって認識される。同様に、前記スラリーの微生物の添加を減らすためでもある。完全に湿ったスラリーが静置された後に、エタノールが種々の異なるやり方で取り除かれる。
【００２９】
いくつかの態様において、エタノールは濾過、遠心分離、または他の物理的な手段によって取り除かれうる。しかし、このやり方のエタノール除去は最終水性溶液中のLMWペプチドのより低い収率をもたらすかもしれないことが認識されるべきである。有機溶剤中への疎水性またはLMWペプチドの一部の溶解が生じるかもしれない。
【００３０】
このように、好ましい態様において、エタノールは、真空下、有機溶剤の直接的な留去によって取り除かれうる。最も好ましくは、前記留去は、温度は熱感受性増殖因子の保護の目的である実質的に30℃未満を維持するように、温和な加温だけを使って達成されうる。
【００３１】
エタノールが取り除かれた時点で、エタノール処理組織は、例えば凍結乾燥器などによって高真空下で乾かされうる。この段階での組織の保存を容易にするために、あるいは収率、または残りの方法ステップf)もしくは方法ステップg)（この後者のステップは以下で詳述される）の最終的な水ベースの抽出によって得られるLMWペプチドの組成物に影響する微量の有機溶剤の可能性を減らすために、微量の有機溶剤を取り除くことが望まれる場合にこの任意のステップが推奨される。
【００３２】
本明細書中に使用される場合、用語「水性溶液」は、そこに使用された溶剤が水である溶液を表し、そして塩水溶液または緩衝水溶液を含む。
【００３３】
いくつかの好ましい態様において、追加のステップd1)があるかもしれない、ここで、ステップd)の溶剤処理組織がステップe)を受ける前に完全に乾かされうる。
【００３４】
ステップd)またはd1)のエタノール処理組織は、水、または(これだけに制限されることなく、リン酸バッファー、クエン酸バッファー、酢酸バッファー、trisバッファーまたは希釈塩化ナトリウム溶液を含む）好適な塩水溶液または緩衝液と混合されうる。得られた混合物は、好ましくは、実質的に1時間攪拌されるべきである。増殖因子の保護のために、これが低温―すなわち、室温以下で再び実施されるべきである。
【００３５】
液体抽出物が種々の異なる方法によってステップe)のエタノール処理組織から分離されることが想定される。
【００３６】
例えば、液体抽出物は、以下の方法：
・  デカンテーション；
・  遠心分離；
・  濾過；または
・  当業者に明白な他の好適な方法、
によって分離される(すなわち、固体残渣から分離される）。
【００３７】
最も好ましくは、液体抽出物は、遠心分離、細密濾過、またはいずれかの他の好適な浄化方法によって浄化されうる。
【００３８】
いくつかの好ましい態様において、追加ステップg)が存在するかもしれない、ここで、ステップe）の組織残渣からの液体抽出物の収率を改良するために、ステップe)からf)までが、1回以上繰り返されうる。
【００３９】
低分子量ペプチドの溶液がステップf)またはg)から得られた時点で、保存またはさらなる処理(例えば、製剤製造)の目的で、液体抽出物が場合により乾かされうる。
好ましい態様において、ステップf)またはg)からの液体抽出物は、低分子量ペプチドを得るために多分乾かされる。
最も好ましくは、ステップf)またはg)からの低分子量ペプチド溶液の乾燥は、着目の低分子量ペプチドの特性に依存して他の乾燥手段が可能であるが、凍結乾燥によって達成されうる。
【００４０】
さらなる側面において、本発明は、前記方法によって得られた低分子ペプチドの分離された混合物を同様に提供する。
さらに他の側面において、本発明は、組織から低分子量ペプチドを分離するための抽出方法の一部として組織内のin situにおいてタンパク質を変性させるための有機溶剤の使用を提供する。
【００４１】
このように、本発明のin situ LMW抽出方法の好ましい態様は、以下のもの：
1．  現在の抽出方法を使って達成されるものより高いLMWペプチド濃度を提供するための分離されたLMWペプチド抽出物を得る簡易な方法を提供する。
2．  特にLMWペプチドの分離を狙う方法を提供する。
3．  大量の高価な、または危険な試薬の使用を最小限にする方法を提供する、
を含みうる先行技術の抽出方法を上回る多数の利点を持っているかもしれない。
本発明を実施するための最良の形態
【実施例】
【００４２】
LMW in situ抽出方法―加熱乾燥および凍結乾燥したシカ幼角（deer velvet）
伝統的に（加熱）乾燥された枝角の中間部分由来の細かくしたシカ幼角粉末(5.00 g)を、500 mlのBuchi蒸発フラスコ中に量りとった。十分な70％エタノール(〜30 ml)を加えて、流動性のあるスラリーを作製し、そしてその混合物を電磁攪拌機によって室温(20℃)で1時間攪拌した。そして溶剤を、30℃の水浴を用いてBuchi Rotavaporを使ったロータリー・エバポレーターによって除去した。微量の残留溶剤を、オイル・ポンプ(Edwards)の使用によって高真空下で1時間除去した。脱イオン水(100 ml)を乾燥残渣に加えて、その混合物を電磁攪拌機によって室温(20℃)で3時間攪拌した。グラスファイバー濾紙(Whatman GF/A)を通した濾過後に、濾液を14,600 g、4℃で30分間遠心分離した。その上清をガラス瓶に静かに移し、そしてキャビネット型凍結乾燥器(Cuddon)中でシェル冷凍レ(shell frozeh)、そして凍結乾燥して、茶色のわずかに「粘着性の」固体としてシカ幼角のLMW抽出物(0.297 g、5.9％の収率)を提供する。得られたLMW抽出物のIGF-1含量は0.32 μg/gと計測された―表1を参照のこと。
【００４３】
凍結乾燥された枝角由来の細かくしたシカ幼角粉末(5.00 g)の複合物を用いて前記抽出方法を繰り返した。LMW抽出物(0.312 g、6.2％）を、自由流動性の茶色の固体として得た。得られたLMW抽出物のIGF-1含量は、3.4 μg/gと計測された―表1を参照のこと。
【００４４】
【表１】
0004741471.tif 000002
【００４５】
抽出条件の比較に使用した小規模のLMW in situ抽出方法
正確に計量した量(500 mg)の組織(シカ幼角、シカ胎盤、ヒツジ肝臓)または凍結乾燥されたシカ血液を、テフロン（登録商標）を内張りしたふたが付いたガラス管に加えた。十分な有機溶剤を加えて固形物質に対して必要とされる比率(v/w)を提供し、そしてその混合物を、室温(20℃)で必要とされている期間、Vibramaxミキサー(IKA)で攪拌した。ほとんどの場合、そして特に明記しない限り、3 mlの溶剤を加え(6:1の比、v/w)、そして混合を3時間実施した。その後、有機溶剤の大部分を真空遠心分離機(Heto)を使って取り除き、そして残りの微量の有機溶剤を凍結乾燥器(FTS)を使って高真空下で除去した。
【００４６】
有機溶剤処理した試験物質に10 mlの水性バッファーを加えた。ほとんどの場合、そして特に明記されない限り、使用したバッファーは、0.05 Mのリン酸バッファー(pH6.9)だった。その混合物を室温(20℃)で1時間、Vibramaxミキサー(IKA)で攪拌し、そして4℃にて15分間、2,000 gで遠心分離した。その上清をきれいな管に移し、そして4℃にて15分間、40,000 gで遠心分離した。そして、完全に浄化した上清を、(以下に詳述される)GFCによるか、または増殖因子に関する分析前にきれいな管に分注した。いくつかの実験で、5.0 mlのアリコートを、抽出物収率の定量のために、真空オーブンを使って前もって計量された管中で完全に乾燥させもした。
【００４７】
ほとんどの実験で、先に詳述したとおり、有機溶剤での前処理なしに、試験材料を水性バッファーで同様に抽出した。これらの標本は、溶剤前処理による高分子量タンパク質の除去の効率を測定するための対照サンプルとしての役目を果たした。
【００４８】
低分子量抽出物の分析
低分子量抽出物を、溶出のための0.3 Mの塩化ナトリウムおよび0.05％のアジ化ナトリウムを含む0.05 Mのリン酸バッファー(pH6.9)、または0.05 Mの重炭酸アンモニウムのいずれかを使用した、Superose 12HR 10/30カラム(Amersham Biosciences)によるGFCによって分析した。固形抽出物サンプルを、リン酸バッファー中に約5mg/ mlの濃度で溶かし、各々の溶液の10 μlを前記カラム上に注入し、そして0.75 ml/分の流量で溶出した。小規模なLMW in situ抽出方法を使って準備した抽出物溶液を、直接注入し(10 μl)、そして類似の条件下で抽出した。タンパク質を280 nmのUV吸収測定法によって検出した。
【００４９】
Superose 12カラムの分子量校正を、前述の条件下、既知の分子量の既知のタンパク質の標準混合物の分離によって実施した。そして、校正曲線を、保持時間に対してタンパク質分子量の対数をプロットすることによって構築した。溶出されたタンパク質ピークの見かけ上の分子量を、校正曲線を使った補間法によって測定した。
【００５０】
抽出物中の低分子量タンパク質と高分子量タンパク質の割合の比較のために、Turbochrom 4.1(PE Nelson)を使って自動化データ処理方法を開発した。その方法は、リン酸を使って溶出されるサンプルのクロマトグラムにおいて、20.5分未満の保持期間をもつピークの全て(約8,000ダルトンより大きな分子量をもつタンパク質による、「高分子量」ピーク)の面積と、20.5分超の保持期間をもつそれら(約8,000ダルトン未満の分子量をもつタンパク質による、「低分子量」ピーク)を総計した。重炭酸アンモニウムで溶出されたサンプルに関して、高分子量ピークと低分子量ピークの間の等分は18.5分の保持期間で実施した。
【００５１】
先行技術−GFC分析のためのシカ幼角全タンパク質抽出物の準備
凍結乾燥したシカ幼角粉末(0.1 g)を、ボルテックス・ミキサーの使用によって0.05 Mのリン酸バッファー(pH6.9、3 ml)と混ぜた。5分間、2,000 gでの遠心分離の後に、その混合物を20℃にて1時間、超音波清浄バス(Crest Ultrasonics)中で超音波処理した。このように準備した全タンパク質抽出物を、4℃にて15分間、12,700 gでの遠心分離によって浄化した。そして、その上清をGFCによって直接的に分析した−図1a）を参照のこと。前記全タンパク質抽出手法は、Scopes, R.K.(1987年)に概略が説明されるタンパク質の抽出のための先行技術の方法に基づいた。
【００５２】
先行技術−GFC分析のための液相中のシカ幼角全タンパク質抽出物からのエタノールによる高分子量タンパク質の沈殿
シカ幼角の全タンパク質抽出物を、室温にて3時間、脱イオン水(100 ml)中で乾燥したシカ幼角粉末(10 g)を緩やかに振盪することによって準備した。その混合物を、15分間2,100 gで遠心分離し、そしてその上清を2番目の遠心分離瓶中に静かに移した。水性抽出物を浄化するためにこれを15分間、21,000 gで遠心分離し、そしてそれを4℃に冷やした。一定に攪拌しながら、100％冷エタノール(3容)を、徐々に加えた。沈殿したタンパク質を取り除くために、その曇った混合物を4℃にて30分間、21,000 gで遠心分離した。そして、GFCによる分析前に、その上清をBuchiロータリー・エバポレーターによって蒸発乾固した−図2を参照のこと。前記全タンパク質抽出手法は、Scope, R.K.(1987年)に概略が説明されたタンパク質の抽出のための先行技術の方法に基づいた。
【００５３】
IGF-1分析
サンプルを、ヒトIGF-1のために放射性免疫測定を使ったEndolab(Canterbury Health Laboratories)によってインシュリン様増殖因子1(IGF-1)について分析した。前記アッセイは、凍結乾燥した抽出物サンプルに関して0.39 μg/gのED50と0.02 μg/gの検出限界があった。抽出物溶液に関して当該アッセイの、ED50は50 μg/Lであり、検出限界は4.1 μg/Lだった。
【００５４】
IGF-2分析
抽出物溶液のサンプルを、ヒトIGF-2のための放射性免疫測定を使ったEndolab(Canterbury Health Laboratories)によってインシュリン様増殖因子2(IGF-2)に関して分析した。アッセイには、1132 μg/LのED50と32 μg/Lの検出限界があった。
【００５５】
EGF様活性分析
抽出物溶液サンプルを、放射性レセプターアッセイを使って上皮成長因子様(EGF様)活性について分析した。前記アッセイは、培養中のA431細胞(類表皮腫癌細胞株)のそのレセプターから放射性ラベル・マウスEGF(Amersham)を外すサンプル中の物質の能力を計測する。他の増殖因子がEGFレセプターに結合するかもしれないので、全てを含めた活性をEGF様活性として計測する。
【００５６】
TGFβ1分析
サンプルを、Emax（登録商標）免疫学的測定法システム(Promega Corporation)を使ってトランスフォーミング増殖因子β1(TGFβ1)について分析した。前記アッセイは、TGFに特異的であり(TGFβ2との交差感受性≦1.6％、そしてTGFβ3との交差感受性≦0.7％)、そして32 μg/mlの検出限界を持っていた。
【００５７】
TGFβ2分析
サンプルを、Emax（登録商標）免疫学的測定法システム(Promega Corporation)を使ってトランスフォーミング増殖因子β2(TGFβ2)について分析した。前記アッセイは、TGFに特異的であり(TGFβ1およびTGFβ3との交差感受性≦3％)、そして(固体試料の0.32 μg/gに相当する)32 μg/mlの検出限界を持っていた。
【００５８】
結果
IGF-1とTGFβ2
新しい抽出方法を使って凍結乾燥および/または熱処理したシカ幼角粉末から準備した低分子量抽出物(すなわち新しい方法)のIGF-1含量とTGFβ2含量の間の比較を上記表1に示す。各々の場合において、新しい方法によって準備したLMW抽出物が、それらが準備されたシカ幼角粉末において計測されたものよりも高濃度の免疫応答性IGF-1およびTGFβ2を有した。
【００５９】
本発明の新しい方法を使って準備されたシカ幼角低分子量抽出物の分子量分布
70％エタノールにより前処理された（すなわち、新しい方法を使って準備された)シカ幼角粉末の水抽出物のゲル濾過特性が、図1の未処理の幼角粉末の同程度の抽出物と比較される。図1(1)から分かるように、10,000ダルトンより大きな見かけ上の分子量を持つタンパク質は、非高温にてシカ幼角から得られた水ベースの全タンパク質抽出物の大部分を含む。比較において、本質的にこれらの高分子量タンパク質の全てが、新しいエタノール前処置方法を使って準備した低分子量抽出物中に存在しない(図1(b))。
【００６０】
LMWペプチドを分離するための標準的な水性シカ幼角抽出物からの高分子量タンパク質の沈殿を液相で実施した。この方法は、この標準的な先行技術タンパク質化学技術によって除去したタンパク質の重量分布を本発明の新しい方法のそれと比較するために与えられた。図2で示されるように、幼角全タンパク質抽出物の水性溶液に対する3:1の比のエタノールの追加は、10,000ダルトンを超える分子量をもつタンパク質の本質的に完全な除去を同様にもたらした。図1および2の2つのGFCクロマトグラムの間の緊密な類似が、本発明の新しい抽出方法において、液相においてそれがするように、エタノールは(組織のin situで)同じスペクトルの高分子量タンパク質を不溶性にさせる。
【００６１】
本発明の新しい方法で使用されるエタノール濃度の効果
6:1(v/w)の比率の30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％エタノールにおよる3時間の前処理に続く、または前処理なしに0.05 Mのリン酸バッファー(pH6.9)により抽出された凍結乾燥したシカ幼角サンプルのゲル濾過クロマトグラフィー特性を図3に示す。この図は、低濃度(30％、40％)、および高濃度（90％)のエタノールで、高分子量タンパク質の除去が、中程度の濃度(50〜80％)でのものより効果的ではないことを証明する。
【００６２】
図4で示されるように、低分子量タンパク質であることによる総結合ピーク面積の割合は、約60〜70％のエタノールで最大値に達する。エタノール濃度が30％から90％に増やされる時、置換基タンパク質の結合濃度に比例している低分子量ピークの絶対面積（V.secで表される）は、わずかに減少する。対照的に、エタノール濃度が30から50％に増やされる時に、鋭く減少する高分子量ピークの絶対面積(V.secで表される)は、50〜80％のエタノールの範囲で低いレベルで安定していて、そして90％のエタノールを使って準備したサンプルにおいて再びわずかに増加する。
【００６３】
本発明の新しい方法におけるエタノールによるインキュベーション時間の効果
前述の実験を、3時間の前処理の代わりに、バッファー抽出前に様々なエタノール濃度での幼角の一晩(16.5時間)の前処理を使って繰り返した。図5を図3と比較することでわかるように、延ばされた前処置の期間は、抽出物溶液のゲル濾過クロマトグラフィー特性の非常にわずかな変化のみに終わった。最も明白な変化は、3時間の前処理期間を使って準備したサンプルと比較して、17分より前にクロマトグラフィー・カラムから溶出する高分子量タンパク質のより効果的な除去である。
【００６４】
低分子量タンパク質と高分子量タンパク質の割合に対する70％のエタノールでのインキュベーション時間の変化の結果を図6に示す。低分子量タンパク質の（V.secによる）絶対ピーク面積は、30分〜16時間超(一晩)のインキュベーション期間で本質的に一定のままだったが、しかし、割合として、これらのピークは時間と共にわずかに増えた。これは、高分子量タンパク質の絶対ピーク面積(V.sec)の緩やかな付帯的な減少のためであって、延ばしたエタノール・インキュベーション時間によるこれらのタンパク質のより能率的な除去による。
【００６５】
本発明の新しい方法において使用したエタノールの比率の効果
図7は、抽出した凍結乾燥したシカ幼角組織の量に対して2:1〜10:1(v/w)の、新しい方法で使用される70％エタノールの比率を変えることの効果を示す。最終抽出物の低分子量ピークと高い分子量ピークの割合は範囲全体にわたって中程度に一定のままであるが、しかし、絶対ピーク面積は徐々に減少する。前記効果は、低分子量タンパク質によるピーク面積で最も大きいが、エタノール対組織の比率を増やすほどこれらのタンパク質の収率の削減を示す。
【００６６】
本発明の新しい方法で使用した有機溶剤の効果
図8は、得られるリン酸バッファー抽出物のタンパク質特性に対する、凍結乾燥したシカ幼角の前処理のための70％エタノール代わりに、70％アセトニトリル、70％アセトン、70％プロパン-2-オール、または70％メタノールを使用することの効果を比較する。非常に類似した範囲の高分子タンパク質が抽出物の各々で欠けており、各々の溶剤が新しい方法に有効であることを示している。
【００６７】
本発明の新しい方法で使用した水性バッファーの効果
図9は、得られた抽出物のタンパク質特性に対する、水性抽出のための0.05 Mのリン酸バッファー(pH6.9)の代わりに、水、0.05 Mの塩化ナトリウム、0.05 Mのクエン酸塩バッファー(pH4.1)、0.05 Mの酢酸バッファー(pH4.9)、0.05 Mのtrisバッファー(pH7.8)、または0.05 Mの炭酸バッファー(pH10.0)を使用する効果を比較する。非常に類似した範囲のタンパク質が(水、塩化ナトリウム、またはtrisもしくはリン酸バッファーを使って)中性近くのpHで準備した抽出物中に存在する。しかし、よりわずかな高分子量タンパク質しか(クエン酸または酢酸バッファーを使った)低pHにて準備した抽出物中には存在せず、一方で、(炭酸バッファーを使用して)より高いpHにて準備した抽出物中、より広範囲の高分子量タンパク質がタンパク質特性において明白である。
【００６８】
上述の抽出物の収率および各々の増殖因子含量を表2で以下に示す。各々の場合において、収率は、加えた塩の含量に関して補正後の抽出物の乾燥重量として計算され、そして凍結乾燥したシカ幼角粉末の開始重量の百分率として表した。これらは水性抽出媒体のpHによって変化したが、全ての抽出物が測定可能なレベルの増殖因子を含んでいた。EGF様活性は、(クエン酸または酢酸バッファーを使用して)低pHまたは(炭酸バッファーを使用して)高pHで準備された抽出物で特に高かった。
【００６９】
【表２】
0004741471.tif 000003
【００７０】
シカ幼角以外の材料での新しい方法の使用
6:1(v/w)の比率の30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％エタノールによる3時間の前処理に続く、または前処理なしに、0.05 Mのリン酸バッファー(pH6.9)で抽出した凍結乾燥したシカ胎盤、凍結乾燥したシカ血液、そして凍結乾燥したヒツジ肝臓サンプルのゲル濾過クロマトグラフィー特性を、それぞれ図10、11、および12に示す。これらは、凍結乾燥したシカ幼角枝角と同じように、ある範囲のエタノール濃度(特に、70％エタノール)による前処理が、これらの材料から準備した水性抽出物中の高分子量タンパク質の割合を減らすのに有効であることを証明する。
【００７１】
6:1(v/w)の比率の70％エタノールによる3時間の前処理に続く、ヒツジ肝臓の水性抽出のために使用したバッファーの効果を図13に示す。シカ幼角についてのように、水性抽出が(クエン酸または酢酸バッファーを使って)酸性のpHで実施される場合に、ヒツジ肝臓から明らかなように、高分子タンパク質の抽出が最も少ない。
よって、新しい方法はシカ幼角以外の組織および材料に適用できることが示される。
【００７２】
新しい方法における冷凍したシカ幼角組織の使用
図14は、凍結乾燥した幼角から準備した類似した抽出物のそれと比較した、新しい抽出方法を使って刻んだ冷凍シカ幼角組織サンプルから準備したLMW抽出物のゲル濾過特性を示す。本質的に、高分子量タンパク質は冷凍サンプルからの抽出物のタンパク質特性において明らかではない。これは、新しい方法が乾燥組織からのそれと同じように、冷凍組織由来の水性抽出物中の高分子量タンパク質の割合を大幅に減らすことを証明する。
【００７３】
論議
我々は、有機溶剤(エタノール)で前処理した組織から準備した水性抽出物中のタンパク質の分子量分布が、寒中、溶剤の追加によって標準全タンパク質抽出物の水溶液からの高分子量タンパク質の沈殿の後で得られたものと類似していることを示した。
【００７４】
新しい方法は、エタノール、アセトニトリル、アセトン、メタノール、およびプロパン-2-オールの使用によって例証されたが、しかし（これだけに制限されることなく、プロパン-1-オール、ブタン-1-オールを含む）他の溶剤が使用できることが当然見込まれる。
【００７５】
液相に関する前記新しい方法の主要な利点は、以下の：
・  より少ない有機溶剤しか使用しない；そして
・  組織抽出物の希釈を引き起こさない、
である。
【００７６】
これは、可燃性溶剤の使用に関係する危険性を軽減し、そして同様に液体の取り扱いの問題も軽減する。さらに、沈殿させたタンパク質を取り除くための別個の清浄ステップの必要性が、新しい方法によって取り除かれる。代わりに、高分子量タンパク質が、組織内のin situにおいて単に不溶化される。そして、水性条件下の続く抽出が、低分子量タンパク質とペプチドだけの可溶化をもたらす。
【００７７】
前記新しい方法における有機溶剤としてのエタノールの好ましい使用のための主な理由は、(特に、70％の濃度での)その抗菌活性のためである。これは、水性抽出直前の組織原料の細菌の積み込みを減らす望ましい効果をもつ。
【００７８】
シカ幼角のLMW抽出物中の高レベルのIGF-1、IGF-2、TGFβ1、TGFβ2、およびEGF様活性は、増殖因子活性が新しい抽出方法によって維持されることを示す。よって、他の増殖因子のレベルがエタノールによる前処理に続く組織の抽出により同様に濃縮されるであろうと期待することは妥当である。
【００７９】
新しい方法を、シカ幼角、シカ胎盤、シカ血液、およびヒツジ肝臓の使用によって例証した。同じように、これら以外の組織のタンパク質が、続く水性抽出における低分子量画分の濃縮を提供するために、エタノールの前処理方法によって同じように不溶化されることができると仮定することは妥当である。
【００８０】
前記新しい方法における乾燥および冷凍の両方のシカ幼角組織の使用を例証した。同じように、他の組織が、乾燥または非乾燥（すなわち、冷凍または新鮮な)状態のいずれかで前記新しい方法に利用されることができると仮定することは妥当である。
【００８１】
本発明の側面は、ほんの一例として記載され、そして添付の請求項に記載のとおりその範囲から逸脱することなく修飾および追加がそれに対してなされうることは認識されるべきである。
【００８２】
【化１】
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【００８３】
本発明のよりさらなる側面は、例としてのみ与えられ、そしてそこに添付の図面に関する以下の説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】(a)は、シカ幼角全タンパク質抽出物のゲル濾過クロマトグラフィー特性を示す。(b)は、本発明の新しいin situ抽出方法を使用して準備したシカ幼角LMW抽出物を示し、そして近似の分子量スケールが各々のクロマトグラムの下に与えられる。
【図２】液相に冷エタノールを加えることによる、シカ幼角全タンパク質抽出物からの高分子量タンパク質の沈殿によって準備したLMW抽出物。
【図３】新しいin situ抽出方法を使用して、そして(3時間実施した)前処理のインキュベーション・ステップにおけるエタノール濃度を変えて、準備したシカ幼角LMW抽出物のゲル濾過クロマトグラフィー特性を示す。
【図４】新しいin situ抽出方法を使って、そして(3時間実施した)前処理のインキュベーション・ステップにおけるエタノール濃度を変えて、準備したシカ幼角LMW抽出物中のLMWタンパク質とHMWタンパク質の割合を示すグラフを示す。
【図５】新しいin situ抽出方法を使って、そして(16.5時間実施した)前処理のインキュベーション・ステップにおけるエタノール濃度を変えて、準備したシカ幼角LMW抽出物のゲル濾過クロマトグラフィー特性を示す。
【図６】新しいin situ抽出方法を使って、そして前処理のインキュベーション・ステップにおける70％のエタノールでのインキュベーションの期間を変えて、準備したシカ幼角LMW抽出物のLMWタンパク質とHMWタンパク質の割合を示すグラフを示す。
【図７】新しいin situ抽出方法を使って、そして前処理のインキュベーション・ステップにおける70％のエタノール対シカ幼角組織の比を変えて、準備したシカ幼角LMW抽出物のLMWタンパク質およびHMWの割合を示すグラフを示す。
【図８】新しいin situ抽出方法を使って、そして前処理のインキュベーション・ステップにおける有機溶剤を変えて、準備したシカ幼角LMW抽出物のゲル濾過クロマトグラフィー特性を示す。
【図９】新しいin situ抽出方法を使って、そして水性抽出ステップにおいて使用されるバッファーを変えて、準備したシカ幼角LMW抽出物のゲル濾過クロマトグラフィー特性を示す。
【図１０】新しいin situ抽出方法を使って、そして前処理のインキュベーション・ステップにおけるエタノール濃度を変えて、準備したシカ胎盤LMW抽出物のゲル濾過クロマトグラフィー特性を示す。
【図１１】新しいin situ抽出方法を使って、そして前処理のインキュベーション・ステップにおけるエタノール濃度を変えて、準備したシカ血液LMW抽出物のゲル濾過クロマトグラフィー特性を示す。
【図１２】新しいin situ抽出方法を使って、そして前処理のインキュベーション・ステップにおいてエタノール濃度を変えて、準備したヒツジ肝臓LMW抽出物のゲル濾過クロマトグラフィー特性を示す。
【図１３】新しいin situ抽出方法を使って、そして水性抽出ステップのために使用されるバッファーを変えて、準備したヒツジ肝臓LMW抽出物のゲル濾過クロマトグラフィー特性を示す。
【図１４】凍結乾燥シカ幼角組織から準備した類似した抽出物と比較した、新しいin situ抽出方法を使って冷凍シカ幼角組織から準備したLMW抽出物のゲル濾過クロマトグラフィー特性を示す。
【図１】
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【図２】
0004741471.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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