(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍、急性及び慢性炎症疾患、自己免疫疾患、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症並びに緑内障からなる群より選択される疾患を治療するための、ＫＤＲ受容体と結合しないヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）変異体を含み、薬剤として許容されるアジュバントをさらに含む、免疫抗原性組成物。
【請求項２】
腫瘍、急性及び慢性炎症疾患、自己免疫疾患、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症並びに緑内障からなる群より選択される疾患を治療するための、アミノ末端から最初の３つの細胞外ドメインに対応するヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質断片を含み、薬剤として許容されるアジュバントをさらに含む、免疫抗原性組成物。
【請求項３】
腫瘍、急性及び慢性炎症疾患、自己免疫疾患、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症並びに緑内障からなる群より選択される疾患を治療するための、膜貫通及び細胞質ドメインに対応するヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質断片を含み、薬剤として許容されるアジュバントをさらに含む、免疫抗原性組成物。
【請求項４】
腫瘍、急性及び慢性炎症疾患、自己免疫疾患、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症並びに緑内障からなる群より選択される疾患を治療するための、請求項１又は２に記載のＫＤＲ受容体と結合しないヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）変異体又はアミノ末端から最初の３つの細胞外ドメインに対応するヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質断片を単一タンパク質の形で含み、薬剤として許容されるアジュバントをさらに含んでいてもよい、免疫抗原性組成物。
【請求項５】
腫瘍、急性及び慢性炎症疾患、自己免疫疾患、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症並びに緑内障からなる群より選択される疾患を治療するための、ｐ６４Ｋタンパク質の存在下で投与される又はｐ６４Ｋタンパク質に共有結合的に会合した請求項１又は２に記載のＫＤＲ受容体と結合しないヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）変異体又はアミノ末端から最初の３つの細胞外ドメインに対応するヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質断片を単一タンパク質の形で含み、薬剤として許容されるアジュバントをさらに含んでいてもよい、免疫抗原性組成物。
【請求項６】
腫瘍、急性及び慢性炎症疾患、自己免疫疾患、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症並びに緑内障からなる群より選択される疾患を治療するための、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜由来のＶＳＳＰの存在下で投与される又は髄膜炎菌の外膜由来のＶＳＳＰに会合した請求項１又は２に記載のＫＤＲ受容体と結合しないヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）変異体又はアミノ末端から最初の３つの細胞外ドメインに対応するヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質断片を単一タンパク質の形で含み、薬剤として許容されるアジュバントをさらに含んでいてもよい、免疫抗原性組成物。
【請求項７】
腫瘍、急性及び慢性炎症疾患、自己免疫疾患、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症並びに緑内障からなる群より選択される疾患を治療するための、請求項１又は３に記載のＫＤＲ受容体と結合しないヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）変異体又は膜貫通及び細胞質ドメインに対応するヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質断片を単一タンパク質の形で含み、薬剤として許容されるアジュバントをさらに含んでいてもよい、免疫抗原性組成物。
【請求項８】
腫瘍、急性及び慢性炎症疾患、自己免疫疾患、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症並びに緑内障からなる群より選択される疾患を治療するための、ｐ６４Ｋタンパク質の存在下で投与される又はｐ６４Ｋタンパク質に共有結合的に会合した請求項１又は３に記載のＫＤＲ受容体と結合しないヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）変異体又は膜貫通及び細胞質ドメインに対応するヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質断片を単一タンパク質の形で含み、薬剤として許容されるアジュバントをさらに含んでいてもよい、免疫抗原性組成物。
【請求項９】
腫瘍、急性及び慢性炎症疾患、自己免疫疾患、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症並びに緑内障からなる群より選択される疾患を治療するための、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜由来のＶＳＳＰの存在下で投与される又は髄膜炎菌の外膜由来のＶＳＳＰに会合した請求項１又は３に記載のＫＤＲ受容体と結合しないヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）変異体又は膜貫通及び細胞質ドメインに対応するヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質断片を単一タンパク質の形で含み、薬剤として許容されるアジュバントをさらに含んでいてもよい、免疫抗原性組成物。
【請求項１０】
腫瘍、急性及び慢性炎症疾患、自己免疫疾患、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症並びに緑内障からなる群より選択される疾患を治療するための、ＫＤＲ受容体と結合しないヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）変異体をコードするオリゴヌクレオチドを含む、免疫抗原性組成物。
【請求項１１】
腫瘍、急性及び慢性炎症疾患、自己免疫疾患、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症並びに緑内障からなる群より選択される疾患を治療するための、アミノ末端から最初の３つの細胞外ドメインに対応するヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質断片をコードするオリゴヌクレオチドを含み、薬剤として許容されるアジュバントをさらに含む、免疫抗原性組成物。
【請求項１２】
腫瘍、急性及び慢性炎症疾患、自己免疫疾患、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症並びに緑内障からなる群より選択される疾患を治療するための、膜貫通及び細胞質ドメインに対応するヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質断片をコードするオリゴヌクレオチドを含み、薬剤として許容されるアジュバントをさらに含む、免疫抗原性組成物。
【請求項１３】
腫瘍、急性及び慢性炎症疾患、自己免疫疾患、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症並びに緑内障からなる群より選択される疾患を治療するための、請求項１０又は１１に記載のＫＤＲ受容体と結合しないヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）変異体をコードするオリゴヌクレオチド又はアミノ末端から最初の３つの細胞外ドメインに対応するヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質断片をコードするオリゴヌクレオチドを単一又はバイシストロン性ベクターの形で含み、薬剤として許容されるアジュバントをさらに含んでいてもよい、免疫抗原性組成物。
【請求項１４】
腫瘍、急性及び慢性炎症疾患、自己免疫疾患、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症並びに緑内障からなる群より選択される疾患を治療するための、ｐ６４Ｋタンパク質の存在下で投与される又はｐ６４Ｋタンパク質に共有結合的に会合した請求項１０又は１１に記載のＫＤＲ受容体と結合しないヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）変異体をコードするオリゴヌクレオチド又はアミノ末端から最初の３つの細胞外ドメインに対応するヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質断片をコードするオリゴヌクレオチドを単一又はバイシストロン性ベクターの形で含み、薬剤として許容されるアジュバントをさらに含んでいてもよい、免疫抗原性組成物。
【請求項１５】
腫瘍、急性及び慢性炎症疾患、自己免疫疾患、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症並びに緑内障からなる群より選択される疾患を治療するための、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜由来のＶＳＳＰの存在下で投与される請求項１０又は１１に記載のＫＤＲ受容体と結合しないヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）変異体をコードするオリゴヌクレオチド又はアミノ末端から最初の３つの細胞外ドメインに対応するヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質断片をコードするオリゴヌクレオチドを単一又はバイシストロン性ベクターの形で含み、薬剤として許容されるアジュバントをさらに含んでいてもよい、免疫抗原性組成物。
【請求項１６】
腫瘍、急性及び慢性炎症疾患、自己免疫疾患、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症並びに緑内障からなる群より選択される疾患を治療するための、請求項１０又は１２に記載のＫＤＲ受容体と結合しないヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）変異体をコードするオリゴヌクレオチド又は膜貫通及び細胞質ドメインに対応するヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質断片をコードするオリゴヌクレオチドを単一又はバイシストロン性ベクターの形で含み、薬剤として許容されるアジュバントをさらに含んでいてもよい、免疫抗原性組成物。
【請求項１７】
腫瘍、急性及び慢性炎症疾患、自己免疫疾患、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症並びに緑内障からなる群より選択される疾患を治療するための、ｐ６４Ｋタンパク質の存在下で投与される又はｐ６４Ｋタンパク質に共有結合的に会合した請求項１０又は１２に記載のＫＤＲ受容体と結合しないヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）変異体をコードするオリゴヌクレオチド又は膜貫通及び細胞質ドメインに対応するヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質断片をコードするオリゴヌクレオチドを単一又はバイシストロン性ベクターの形で含み、薬剤として許容されるアジュバントをさらに含んでいてもよい、免疫抗原性組成物。
【請求項１８】
腫瘍、急性及び慢性炎症疾患、自己免疫疾患、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症並びに緑内障からなる群より選択される疾患を治療するための、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜由来のＶＳＳＰの存在下で投与される請求項１０又は１２に記載のＫＤＲ受容体と結合しないヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）変異体をコードするオリゴヌクレオチド又は膜貫通及び細胞質ドメインに対応するヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質断片をコードするオリゴヌクレオチドを単一又はバイシストロン性ベクターの形で含み、薬剤として許容されるアジュバントをさらに含んでいてもよい、免疫抗原性組成物。
【請求項１９】
アジュバントが、Ｂ型肝炎コア抗原の組換え粒子、Ｃ型肝炎コア抗原の組換え粒子、ＯＰＣタンパク質、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のｐ６４Ｋタンパク質及びＶＳＳＰ由来の髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜からなる群より選択される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の免疫抗原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学及び製薬工業の分野、特に血管新生に関連する分子を標的として用いる能動免疫に関する。
【背景技術】
【０００２】
元からある血管から新たな血管を形成する過程は、血管新生と呼ばれる。この事象は、前血管新生因子及び抗血管新生因子の平衡を介して幅広く調節されている。その過程が前血管新生因子の誘導及び異常な形態での新たな血管の形成に関連するとされている疾患には、（ａ）癌（原発腫瘍とそれらの転移の双方）、（ｂ）喘息、呼吸困難、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化症、及び組織浮腫などの急性及び慢性炎症過程、（ｃ）肝炎、及びカポジ肉腫のような感染症起源の疾患、（ｄ）糖尿病、乾癬、関節リウマチ、甲状腺炎のような自己免疫疾患、並びに（ｅ）糖尿病性及び新生児網膜症、臓器移植拒絶反応、黄斑変性症、血管新生緑内障、血管腫、及び血管線維腫のような他の疾患及び状態がある（Ｃａｒｍｅｌｌｉｅｔ  Ｐ．及びＪａｉｎ  ＲＫ．、Ｎａｔｕｒｅ、４０７巻、２４９ページ、２０００年；Ｋｕｗａｎｏ  Ｍ、他、Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ、４０巻、５６５ページ、２００１年）。これらの症例の多くにとって魅力的な可能性のある治療手段は、血管の異常形成を刺激する前血管新生因子の活性を、それらの中和若しくはそれらの受容体の中和を介し、又はそれらを産生する源を除去することによって阻害することに基づくと思われる。
【０００３】
血管内皮増殖因子は、新たな血管の形成を特異的かつ直接的に誘導する分子の一ファミリーである（Ｌｅｕｎｇ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻、１３０６ページ、１９８９年；Ｋｌａｇｓｂｕｒｎ  Ｍ、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、３３巻、２１７ページ、１９９１年）。このファミリーには、血管内皮増殖因子ＶＰＦ／ＶＥＧＦ（現在ＶＥＧＦ−Ａと呼ばれる）としても知られる血管透過性因子、胎盤増殖因子ＰＩＧＦ、血小板由来増殖因子ＰＤＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦ−Ｂ、並びにＶＥＧＦ−Ａと構造的及び機能的に関連し、ＶＥＧＦ−Ｂ／ＶＲＦ、ＶＥＧＦ−Ｃ／ＶＲＰ、ＶＥＧＤ−Ｄ／ＦＩＧＦ、及びＶＥＧＦ−Ｅと命名された他の４種類の新たな分子が含まれる（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ  Ｂ他、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ、１３巻、２５７６ページ、１９９６年；Ｊｏｕｋｏｖ  Ｖ他、ＥＭＢＯ  Ｊ、１５巻、２９０ページ、１９９６年；Ｙａｍａｄａ  Ｙ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、４２巻、４８３ページ、１９９７年；Ｏｇａｗａ  Ｓ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７３巻、３１２７３ページ、１９９８年）。
【０００４】
ＶＥＧＦ−Ａは、２個の２３−ｋＤＡサブユニットから形成されるホモ二量体の糖タンパク質であり（Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ、他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｕｎ、１６５巻、１９８ページ、１９８９年）、同一ＲＮＡの差次的スプライシングに由来する５種類の単量体アイソフォームが存在する。これらには、細胞膜に付着したままの２種類のアイソフォーム（ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６）、及び可溶性の３種類（ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、及びＶＥＧＦ１６５）が含まれる。ＶＥＧＦ１６５は、ＶＥＧＦ１８９が優位を占める（Ｎｅｕｆｅｌｄ  Ｇ他、Ｃａｎｃ  Ｍｅｔ  Ｒｅｖ、１５巻、１５３ページ、１９９５年）肺及び心臓を除いては哺乳類組織中に最も豊富にあるアイソフォームであり、胎盤では、ＶＥＧＦ１２１発現が主流である（Ｓｈｉｂｕｙａ  ＭＡ他、Ａｄｖ  Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ、６７巻、２８１ページ、１９９５年）。
【０００５】
ＶＥＧＦ−Ａは、このファミリーのうちで最も研究されかつ特徴付けられたタンパク質であり、その変化は、多数の疾患において記述されている。その過剰発現は、様々な起源及び局在化の腫瘍、及びそれらの転移（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  Ｊ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５９巻、１５９２ページ、１９９９年）、潰瘍性大腸炎及びクローン病のような慢性炎症過程（Ｋａｎａｚａｗａ  Ｓ、他、Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｅｎｔｅｒｏｌ、９６巻、８２２ページ、２００１年）、乾癬（Ｄｅｔｍａｒ  Ｍ、他、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１８０巻、１１４１ページ、１９９４年）、呼吸困難（Ｔｈｉｃｋｅｔｔ  ＤＲ他、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、１６４巻、１６０１ページ、２００１年）、アテローム性動脈硬化症（Ｃｅｌｌｅｔｔｉ  ＦＬ他、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、７巻、４２５ページ、２００１年；Ｃｏｕｆｆｉｎｈａｌ  Ｔ他、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１５０巻、１６５３ページ、１９９７年）、子宮内膜症（ＭｃＬａｒｅｎ  Ｊ、Ｈｕｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｕｐｄａｔｅ、６巻、４５ページ、２００年）、喘息（Ｈｏｓｈｉｎｏ  Ｍ、他、Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０７巻、２９５ページ、２００１年）、関節リウマチ及び変形性関節症（Ｐｕｆｅ  Ｔ他、Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、２８巻、１４８２ページ、２００１年）、甲状腺炎（Ｎａｇｕｒａ  Ｓ他、Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ、３２巻、１０ページ、２００１年）、糖尿病性及び新生児網膜症（Ｍｕｒａｔａ  Ｔ他、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ、７４巻、８１９ページ、１９９６年；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ＪＤ、Ｐａｅｄｉａｔｒ  Ｄｒｕｇｓ、３巻、２６３ページ、２００１年）、黄斑変性症及び緑内障（Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ他、Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ、８０巻、３６３ページ、１９９６年；Ｔｒｉｐａｔｈｉ  ＲＣ他、Ｏｐｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、１０５巻、２３２ページ、１９９８年）、組織浮腫（Ｋａｎｅｒ  ＲＪ他、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２２巻、６４０ページ、２０００年；Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ、Ｅｎｄｏｃｉｒｎｏｌ  Ｒｅｖ、１３巻、１８ページ、１９９２年）、肥満症（Ｔｏｎｅｌｌｏ  Ｃ他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、４４２巻、１６７ページ、１９９９年）、血管腫（Ｗｉｚｉｇｍａｎｎ  Ｓ  及びＰｌａｔｅ  ＫＨ、Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ、１１巻、１０４９ページ、１９９６年）、炎症性関節症患者の滑液（Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ  ＭＪ他、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１９巻、１８２ページ、２０００年）に関連し、移植拒絶反応（Ｖａｓｉｒ  Ｂ、他、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、７１巻、９２４ページ、２００１年）に関連している。腫瘍の特定の場合には、ＶＥＧＦ−Ａの３種類の基本的アイソフォーム１２１、１６５、及び１８９を発現する細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでより速やかに増殖する細胞であり、一方、最終段階では、大部分の腫瘍は、発現をＶＥＧＦ１６５アイソフォームに限定するか、それが存在しない場合には、相加的には程遠いが、腫瘍血管網を強化する協同作用を証明する１２１及び１８９の組合せに限定する（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  Ｊ、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２０巻、７２８２ページ、２０００年）。
【０００６】
１９９１年に記載のＰＩＧＦは、そのホモ二量体の形態で内皮増殖を誘導することができない（Ｍａｇｌｉｏｎｅ  Ｄ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８８巻、９２６７ページ、１９９１年；ＤｉＳａｌｖｏ  Ｊ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７０巻、７７１７ページ、１９９５年）。ＰＩＧＦのアップレギュレーション、及びＶＥＧＦＲ−１を介して伝達されるシグナルのアップレギュレーションにより、内皮細胞は、特定の病理に関連する血管新生表現型への変化の間にＶＥＧＦに対する応答を増幅する（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  Ｐ他、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、７巻、５７５ページ、２００１年）。ＰＩＧＦ発現は、ヒト髄膜腫及び神経膠腫の血管新に関連付けられている（Ｎｏｍｕｒａ  Ｍ他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ、４０巻、１２３ページ、１９９８年）。この分子は、ＶＥＧＦ１６５とヘテロ二量体を形成して前血管新生活性を持ち、それらの過剰発現は、一部の腫瘍細胞系の馴化培地において記述されており（Ｃａｏ  Ｙ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７１巻、３１５４ページ、１９９６年）、一般的に、関節リウマチの進化及び原発性炎症性関節症に関連付けられている（Ｂｏｔｔｏｍｌｅｙ  ＭＪ他、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１９巻、１８２ページ、２０００年）。
【０００７】
あまり研究されていないＶＥＧＦファミリーの残りのメンバーの過剰発現も、多くの病理に関連している。ＶＥＧＦ−Ｂは、乳房、卵巣、及び腎臓の腫瘍、並びに黒色腫及び線維肉腫に関連付けられている（Ｓｏｗｔｅｒ  ＨＭ、他、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７７巻、６０７ページ、１９９７年；Ｓａｌｖｅｎ  Ｐ、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１５３巻、１０３ページ、１９９８年；Ｇｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＳＰ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６１巻、３２０６ページ、２００１年）。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＶＥＧＦ−Ｂ１６７アイソフォームの差次的発現は、様々な起源の腫瘍細胞において報告されている（Ｌｉ  Ｘ、他、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ、１９巻、４９ページ、２００１年）。ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄは、リンパ管形成の制御に関与し（Ｊｏｕｋｏｖ  Ｖ．他、ＥＭＢＯ  Ｊ、１５巻、２９０ページ、１９９６年）、ＶＥＧＦ−Ｃ過剰発現は、組織浮腫、乳房、肺、頭頸部、食道、及び胃の腫瘍、リンパ腫、前立腺癌、並びに転移結節に関連している（Ｋａｊｉｔａ  Ｔ、他、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、８５巻、２５５ページ、２００１年；Ｋｉｔａｄｉ  Ｙ、他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、９３巻、６６２ページ、２００１年；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  Ｉ、他、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、８５巻、９３ページ、２００１年；Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｊ、他、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ、６６巻、１５９ページ、２００１年；Ｕｅｄａ  Ｍ、他、Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ、８２巻、１６２ページ、２００１年；Ｓａｌｖｅｎ  Ｐ、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１５３巻、１０３ページ、１９９８年；Ｏ−Ｃｈａｒｏｅｎｒａｔ  Ｐ他、Ｃａｎｃｅｒ、９２巻、５５６ページ、２００１年）。ＶＥＧＦ−Ｄの場合、腫瘍細胞によるその過剰発現は、腫瘍におけるリンパ管脈管構造のｉｎ  ｖｉｖｏにおける増加及びリンパ節における転移の増加に関連している（Ｓｔａｃｋｅｒ  ＳＡ、他、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、７巻、１８６ページ、２００１年；Ｍａｒｃｏｎｃｉｎｉ  Ｌ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６巻、９６７１ページ、１９９９年）。
【０００８】
ＶＥＧＦファミリーの分子によって誘導される内皮細胞機能に対する変化は、これまでのところＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１）、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ１）、及びＶＥＧＦＲ３（Ｆｌｔ４）が含まれるチロシンキナーゼ型クラス３の細胞受容体との結合によって媒介される（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ  Ａ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７８巻、２０７７ページ、１９９３年）。Ｎ末端ドメイン２は、リガンドに対する結合を担うとして同定され、細胞質ドメインのリン酸化及びシグナルの伝達を助ける（Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ  Ｔ他、ＥＭＢＯ、１５巻、４９１９ページ、１９９６年）。
【０００９】
ＶＥＧＦＲ１に関して同定されたリガンドには、親和性の減少順にＶＥＧＦ−Ａ、ＰＩＧＦ、及びＶＥＧＦ−Ｂが含まれる（Ｓｈｉｂｕｙａ  Ｍ、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、３３巻、４０９ページ、２００１年）。内皮細胞において、この受容体は、循環ＶＥＧＦを捕捉する（Ｇｉｌｌｅ  Ｈ他、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９巻、４０６４ページ、２０００年）。造血系の細胞において発現されるＶＥＧＦＲ１に対するＶＥＧＦ−Ａの結合は、樹状細胞の前駆体、並びにＢリンパ球及びＴリンパ球における転写因子ＮＦκＢの活性化に著しく影響する。この最後の相互作用は、樹状細胞成熟及びＴリンパ球の分画が減少する好ましくない免疫学的平衡のｉｎ  ｖｉｖｏにおける確立、すなわち免疫抑制患者、特に癌患者で観察される現象に関連している（Ｄｉｋｏｖ  ＭＭ他、Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ、６１巻、２０１５ページ、２００１年；Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  Ｄ他、Ｂｌｏｏｄ、９２巻、４１５０ページ、１９９８年）。ＶＥＧＦＲ１の過剰発現は、乾癬、子宮体癌及び肝細胞癌に関連付けられている（Ｄｅｔｍａｒ  Ｍ、他、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ、１８０巻、１１４１ページ、１９９４年；Ｎｇ  ＩＯ、Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｏｌ、１１６巻、８３８ページ、２００１年；Ｙｏｋｏｙａｍａ  Ｙ他、Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ、７７巻、４１３ページ、２０００年）。
【００１０】
ＶＥＧＦＲ２受容体（ＫＤＲ／Ｆｌｋ１）は、ＶＥＧＦ−Ａの生物学的作用を媒介し、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＢＥＧＦ−Ｄとも結合する。この受容体は、活性化された内皮上、及び分泌されたＶＥＧＦにより自己分泌経路を確立する腫瘍起源の一部の細胞系において差次的に発現される。そのリガンドの過剰発現に関連する前述の病理に関与するだけでなく、ＶＥＧＦＲ２の過剰発現は、子宮体癌の進行（Ｇｉａｔｒｏｍａｎｏｌａｋｉ  Ａ他、Ｃａｎｃｅｒ、９２巻、２５６９ページ、２００１年）、悪性中皮腫（Ｓｔｒｉｚｚｉ  Ｌ他、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１９３巻、４６８ページ、２００１年）、星細胞の新生物（Ｃａｒｒｏｌｌ  ＲＳ他、Ｃａｎｃｅｒ、８６巻、１３３５ページ、１９９９年）、原発性乳癌（Ｋｒａｎｚ  Ａ他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、８４巻、２９３ページ、１９９９年）、腸型胃癌（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｙ他、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、２巻、１６７９ページ、１９９６年）、多形神経膠芽腫、退形成乏突起神経膠腫、及び壊死性上衣腫（Ｃｈａｎ  ＡＳ他、Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ、２２巻、８１６ページ、１９９８年）に関連付けられている。ＫＤＲの過剰発現も、常染色体性疾患ＶＨＬ及び血管芽細胞腫（Ｗｉｚｉｇｍａｎｎ−Ｖｏｏｓ  Ｓ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５５巻、１３５８ページ、１９９５年）、糖尿病性網膜症の進行（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ  Ｔ、Ｊｐｎ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、４４巻、３２３ページ、２０００年）、及びＦｌｔ−１過剰発現と相まって遅延型過敏反応（Ｂｒｏｗｎ  ＬＦ他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５４巻、２８０１ページ、１９９５年）に関連付けられている。
【００１１】
ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄによって媒介されるリンパ管新生は、リンパ管内皮において発現されるＦＬＴ４受容体すなわちＶＥＧＦＲ３に対するそれらの結合によりもたらされる。場合によっては、リガンドの過剰発現が存在しない場合であっても、受容体の過剰発現は、糖尿病性網膜症（Ｓｍｉｔｈ  Ｇ、Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、８３巻（４号）、４８６〜９４ページ、１９９９年４月）、慢性炎症及び潰瘍（Ｐａａｖｏｎｅｎ  Ｋ他、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１５６巻、１４９９ページ、２０００年）、リンパ節における転移の確立及び乳癌の進行（Ｇｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ＳＰ、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６巻、４２７８ページ、２０００年；Ｖａｌｔｏｌａ  Ｒ他、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１５４巻、１３８１ページ、１９９９年）を含む一群の病態の過程における有害な予後に関連付けられ、鼻咽頭腫瘍及び扁平口腔癌腫（Ｓａａｒｉｓｔｏ  Ａ他、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１５７巻、７ページ、２０００年；Ｍｏｒｉｙａｍａ  Ｍ他、Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ、３３巻、３６９ページ、１９９７年）に関連付けられている。さらに、ＶＥＧＦＲ３の過剰発現は、カポジ肉腫、Ｄａｂｓｋａ型血管内皮腫及び皮膚リンパ管腫症の高感度マーカーである（Ｆｏｌｐｅ  Ａｌ他、Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ、１３巻、１８０ページ、２０００年；Ｌｙｍｂｏｕｓｓａｋｉ  Ａ他、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１５３巻、３９５ページ、１９９８年）。
【００１２】
最近、ＶＥＧＦに関して同定された２種類の受容体がＮＲＰ１及びＮＲＰ２と命名された。これらは、ニューロフィリンファミリー（ＮＲＰ）に属し、ＶＥＧＦファミリー、ＶＥＧＦ−Ａ１４５、ＶＥＧＦ−Ａ１６５、ＶＥＧＦ−Ａ１６７及びＰＩＧＦ１のタンパク質の一部の特異的アイソフォームに対する補助受容体としての役割を果たし、それらの分裂促進能を増加させる。ＮＲＰ１の発現は、前立腺癌の攻撃性のマーカーとなっており、黒色腫における血管新生の増加、及び乳癌におけるアポトーシス回避事象に関連付けられている（Ｌａｔｉｌ  Ａ他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、８９巻、１６７ページ、２０００年；Ｌａｃａｌ  ＰＭ、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ、１１５巻、１０００ページ、２０００年；Ｂａｃｈｅｌｄｅｒ  ＲＥ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６１巻、５７３６ページ、２００１年）。ＮＲＰ１、ＫＤＲ、及びＶＥＧＦ−Ａ１６５の協調的過剰発現は、糖尿病性網膜症症例及び関節リウマチにおける線維血管性増殖に関連付けられている（Ｉｓｈｉｄａ  Ｓ、他、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ、４１巻、１６４９ページ、２０００年；Ｉｋｅｄａ  Ｍ他、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ、１９１巻、４２６ページ、２０００年）。ＮＲＰ２は、骨肉腫において過剰発現され、血管新生及び腫瘍増殖を促進する（Ｈａｎｄａ  Ａ他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ、１７巻、２９１ページ、２０００年）。
【００１３】
血管新生阻害に基づく、特に癌治療における治療戦略の大部分は、（１）ＶＥＧＦ又はＫＤＲ受容体を遮断するモノクローナル抗体、（２）ネオバスタット及びプリノマスタット（Ｐｒｉｎｏｍａｓｔａｔ）のようなメタロプロテイナーゼ阻害薬、（３）サリドマイド、スラミン、トロポニンＩ、並びにＩＦＮ−α及びネオバスタットのようなＶＥＧＦ阻害薬、（４）ＳＵ５４１６、ＦＴＫ７８７及びＳＵ６６６８のようなＶＥＧＦ受容体の遮断薬、（５）エンドスタチン及びＣＡ４−Ｐのような腫瘍内皮アポトーシスの誘発剤、並びに（６）ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ受容体発現を減少させるリボザイム（アンジオザイム（Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ））を用いる臨床試験の過程においてＶＥＧＦファミリー及びそれらの受容体の分子を遮断することに基づいている。ヒトＶＥＧＦ並びにその受容体ＫＤＲ及びＦｌｔ−１とそれらのマウス相同体との高い相同性（それぞれ、約９０％、８１％、及び８９％）によって、多くの動物モデルをごく普通に用い、この系を対象とする抗血管新生化合物の前臨床効果が評価される（Ｈｉｃｋｌｉｎ  ＤＪ他、ＤＤＴ、６巻、５１７ページ、２００１年）。
【００１４】
ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲに対する抗体の受動的投与は、ヒトにおける様々な臨床相において首尾よくテストされる（Ｈｉｃｋｌｉｎ  ＤＪ他、ＤＤＴ、６巻、５１７ページ、２００１年）。抗ＶＥＧＦヒト化モノクローナル抗体Ａ．４．６．１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｓｃｉｓｃｏ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ）は、大腸、乳房、腎臓、及び肺の腫瘍を治療するための第ＩＩＩ相臨床試験中である（Ｋｉｍ、ＫＪ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻、８４１ページ、１９９３年；Ｂｏｅｒｓｉｇ  Ｃ、Ｒ＆Ｄ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ、７巻、４４ページ、２００１年１０月）。特に、ＫＤＲ受容体の場合には、この受容体のＮ末端細胞外ドメインを認識し、白血病性ヒト細胞の増殖及び遊走を阻害し、異種移植マウスの生存率を高めるモノクローナル抗体が開発されている（ＩＭＣ−１Ｃ１１、ＩｍＣｌｏｎｅ）。現在、大腸癌転移の患者においてその効果が検討されている（Ｄｉａｓ  Ｓ他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１０６巻、５１１ページ、２０００年）。前述の治験では、これらのモノクローナル抗体の投与に付随する有害作用のないことが立証されている。
【００１５】
上記にもかかわらず、新血管新生の妨害のために用いられたことのない治療様式は、特異的活性免疫療法（ＳＡＩ）である。癌のＳＡＩでは、ペプチド、タンパク質又はＤＮＡのような抗原を、適切なアジュバントと混ぜて用いる。ＳＡＩ手順は、ＭＣＨＩ及びＭＨＣＩＩとの関連において専門的提示細胞としての樹状細胞機能に関連する体液型（Ｂリンパ球の活性化）と細胞型（Ｔヘルパー、及び細胞傷害性リンパ球並びにナチュラルキラー細胞の活性化）の双方の免疫応答の刺激を追い求めている（Ｂｙｓｔｒｙｎ  ＪＣ、Ｍｅｄｓｃａｐｅ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、４巻、１ページ、２００１年；Ｐａｒｋｅｒ、ＫＣ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５２巻、１６３ページ、１９９４年；Ｎｅｓｔｌｅ  ＦＯ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７巻、７６１ページ、２００１年；Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ  ＪＭ、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５０巻、５０７ページ、１９９９年）。
【００１６】
ＳＡＩは、特に腫瘍学において魅力的な応用例がある実験的及び臨床的研究の急成長分野であり、ＳＡＩの手順に基づく６０を超える進行中の臨床試験が報告されており、現在、モノクローナル抗体の使用に基づく臨床試験を上回っている。癌の特定の場合には、ＳＡＩのための免疫原として使用される抗原は、それらの生理学的関連性及び腫瘍の表現型ドリフトの過程において置き換えられる難易度（Ｂｏｄｅｙ  Ｂ他、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０巻、２６６５ページ、２０００年）、並びに腫瘍組織の増殖及び進化との高い特異的関連性の理由から選択される。
【００１７】
また、ＳＡＩを用いて癌を治療する戦略は、様々な腫瘍タイプにおいて発現される抗原を識別し、何が同一のワクチン調製物による適応症数を増やし得るかを考慮することが好ましい。これらの例は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２−ｎｅｕ、ヒトテロメラーゼ、及びガングリオシドである（Ｇｒｅｅｎｅｒ  Ｍ．、Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  Ｔｏｄａｙ、６巻、２５７ページ、２０００年；Ｒｉｃｅ  Ｊ、他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６７巻、１５５８ページ、２００１年；Ｃａｒｒ  Ａ他、Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ、１１巻、２１９ページ、２００１年；Ｍｕｒｒａｙ  ＪＬ、他、Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、２７巻、７１ページ、２０００年）。
【００１８】
ヒト腫瘍において、ＶＥＧＦは、腫瘍区画において過剰発現され（Ｆｅｒｒａｒａ、Ｎ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３７巻、１ページ、１９９９年）、高レベルなＶＥＧＦ及びその受容体は、腫瘍関連脈管構造において立証されている（Ｂｒｅｋｋｅｎ  ＲＡ、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、７４巻、１７３ページ、２００１年）。形質転換細胞の刺激に反応して、間質細胞もＶＥＧＦを産生し、その結果、腫瘍細胞が除去された場合、ＶＥＧＦレベルは患者において持続する。ＶＥＧＦ及びその受容体の存在は、前立腺、子宮頸管、及び乳房の腫瘍の場合における予後及びステージングの確立にとって実用的価値を有する（Ｇｅｏｒｇｅ  ＤＪ他、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、７巻、１９３２ページ、２００１年；Ｄｏｂｂｓ  ＳＰ他、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、７６巻、１４１０ページ、１９９７年；Ｃａｌｌａｇｙ  Ｇ他、Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｍｏｒｐｈｏｌ、８巻、１０４ページ、２０００年）。一方、ＶＥＧＦも、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α及びＴＧＦ−β（Ｏｈｍ  ＪＥ及びＣａｒｂｏｎｅ  ＤＰ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ、２３巻、２６３ページ、２００１年）のような他のサイトカインと一緒になって、癌患者を特徴付ける免疫抑制に関与すると思われる可溶性因子のグループに入る（Ｓｔａｖｅｌｅｙ  Ｋ、他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９５巻、１１７８ページ、１９９８年；Ｌｅｅ  ＫＨ、他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６１巻、４１８３ページ、１９９８年）。この免疫抑制作用は、Ｆｌｔ１受容体に対する結合に関連しているように見える（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  Ｄ他、Ｂｌｏｏｄ、９２巻、４１５０ページ、１９９８年）。
【００１９】
本発明は、ＶＥＧＦファミリー及びそれらの受容体の分子を用いる実験腫瘍におけるＳＡＩの手順について記載する。得られる抗腫瘍効果は、少なくとも４種類の異なる機序、すなわち（ａ）細胞傷害性リンパ球による、ＶＥＧＦを産生する癌及び間質細胞の直接的破壊、（ｂ）抗体を介する循環ＶＥＧＦの捕捉又は中和によって腫瘍関連血管の内皮細胞に損傷を与えること、（ｃ）抗体を決定する細胞傷害性リンパ球又は補体による、ＶＥＧＦ受容体を発現する内皮細胞の直接的破壊、（ｄ）循環ＶＥＧＦの捕捉又は中和の結果としての局所免疫応答の活性化、及びその結果として生じる免疫抑制作用の除去に基づくと考えられるが、それらの可能な組合せを排除するものではない。
【００２０】
これらの処置を用い、転移の出現を減少又は回避させ、他の抗腫瘍剤と併用し、又は併用せずに、第一選択又は第二選択療法として原発腫瘍を縮小又は除去できることが理想的である。
【００２１】
ＶＥＧＦファミリー及びそれらの受容体を対象とする活性免疫化は、とりわけ急性及び慢性炎症過程（喘息、呼吸困難、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化症、組織浮腫）、感染性疾患（肝炎、カポジ肉腫）、自己免疫疾患（糖尿病、乾癬、関節リウマチ、甲状腺炎、滑膜炎）、糖尿病性及び新生児網膜症、臓器移植拒絶反応、黄斑変性症、血管新生緑内障、血管腫、及び血管線維腫の単一療法又は併用療法において効率的であると考えられる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明によれば、ＶＥＧＦファミリーのタンパク質、それらの受容体、補助受容体又はそれらの断片、並びにそれらのポリペプチド変異体をコードするオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ投与は、抗血管新生及び抗腫瘍効果を持つ細胞性及び体液性免疫応答を誘導する。
【００２３】
本発明のポリペプチド的性質の目的免疫原、並びにそれらの断片は、自然源から単離するか合成又は組換えＤＮＡ技術によって得ることができる。また、これらのポリペプチドは、ｐ６４Ｋ（Ｒ．Ｓｉｌｖａ他、ＵＳ５２８６４８４及びＥＰ０４７４３１３）のような認められたアジュバント活性を有するタンパク質と融合させて生成するか、ポリペプチドを個々に取得した後でタンパク質に共有結合させることができる。
【００２４】
これらの場合における他の利用可能な戦略は、免疫刺激調製物の一部であるＯＭＰ１、この特定の場合にはＶＳＳＰ（Ｒ．Ｐｅｒｅｚ他、ＵＳ５７８８９８５及び６１４９９２１）のような細菌タンパク質において露出した、又は露出していないループの一部として、天然ポリペプチド、その突然変異又は組換え変異体、及びそれらの断片を取得することである。さらに、ウイルス粒子の表面に露出し（ＨｂｓＡｇ、パルボウイルスのＶＰ２など）、免疫応答の誘導を専門とする細胞又は臓器を標的とする特異的ペプチド（ＣＴＬＡ４、ＩｇのＦｃセグメントなど）、又はＶＰ２２のような体内分布を高めることができるタンパク質と結合しているポリペプチド免疫原を得ることが可能である。
【００２５】
本発明の目的タンパク質の主要な自然源は、主に胎盤、活性化内皮細胞、及び腫瘍細胞において発現される。これらの細胞又は組織のｍＲＮＡを用い、知られている方法によって相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得る。抽出ＲＮＡは、選択された抗原に対応するｃＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介する増幅のためのテンプレートして使用される。いずれの場合も、用いるプライマーは、ベクターの特徴に従って設計され、ｃＤＮＡは、既報の目的タンパク質配列に挿入される。或いは、ＰＣＲによって増幅され、本発明において使用される最大の抗原である受容体の場合には、２個以上の重複断片においてコーディング領域が増幅されることが好ましい。これらの断片には、その断片で始まり、無傷なＤＮＡを構築するのに使用される共通の連結部位が含まれる。
【００２６】
目的抗原のクローニングのための別法は、ヒト内皮、又は同一起源の腫瘍に由来する市販のＤＮＡライブラリーからの選択である。場合によっては、特にＶＥＧＦファミリーについて、ワクチン接種によって生じる血管新生誘導事象を避けるため、本発明の目的抗原の一部を変異させることが望ましい場合がある。これらの変異は、文献中に既述の受容体結合部位において行われることが好ましい。このために、望ましい分子の両末端を包含するプライマーを設計し、ＰＣＲ産物をテンプレートとして使用し、変異分子を得る。これらの変異体は、生物活性を欠くが、選択された抗原の免疫原性を再び生み出す。
【００２７】
前述の方法によって得られるｃＤＮＡ分子は、ウイルス、プラスミド、細菌の人工染色体、又は類似物である適切なベクター中で投与される。ベクターは、標的細胞における遺伝子の十分な発現に必要な要素、並びにその性質に従って宿主細胞系において産生させることができる残りの要素を運ぶ。本発明のＤＮＡ分子は、１種類又は複数の核酸（ｃＤＮＡ、ｇＤＮＡ、合成又は半合成ＤＮＡ、又は類似物）によって構成され、標的細胞において転写又は翻訳された場合（適切な場合）に治療上／ワクチンとしての価値がある生成物を産生する１種類又は複数の目的遺伝子を含むことができる。
【００２８】
一般に、本発明によるワクチン治療製品の遺伝子は、標的細胞又は生物体（哺乳類）において機能し、目的産物のｍＲＮＡの終了及びポリアデニル化に必要なシグナルを含み、その発現を可能にする３’末端領域の転写プロモーターの制御下にある。プロモーターは、遺伝子の天然プロモーター、又は標的細胞において転写的に活性な異種プロモーターであってもよい。プロモーターは、真核生物由来又はウイルス起源であってもよい。真核生物のプロモーターの中では、特異的であろうがなかろうが、誘発性であろうがなかろうが、強く又は弱く遺伝子転写を刺激又は抑制する任意のプロモーター又は誘導配列を使用することが可能である。さらに、プロモーター領域を、活性因子又は誘導原配列の挿入によって修飾し、当該遺伝子の組織特異的又は支配的発現を可能にすることができる。
【００２９】
さらに、目的遺伝子は、細胞内局在化のためのシグナル配列を、その細胞局在化又は分泌が、その配列が発現される細胞において、又は他の場所で一旦合成されると修飾することができるような形で含むことができる。また、免疫組織に特異的なリガンドに特異的に結合する領域をコードし、応答が生み出される部位を対象として治療／ワクチン効果が得られる配列を含むことができる。
【００３０】
さらに、目的遺伝子の先に、ｍＲＮＡ複製機構のためのコーディング配列を、ｍＲＮＡが標的細胞において増幅され、前記遺伝子の発現を増加させ、それによって本発明の治療／ワクチン効果を高めるような形で置くことができる。当該複製機構は、アルファウイルス起源（Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ  Ｓ．、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ、１巻、１７７ページ、２００１年）、より具体的にはシンドビス若しくはセムリキウイルス、又は類似物由来であってもよい。特定の場合、目的遺伝子は、本発明による分子が一旦内部移行されると、標的細胞においてそのｍＲＮＡの増幅を可能にするサブゲノムプロモーターの転写制御下にある。さらに、ＤＮＡベクターは、哺乳類細胞における本発明の目的分子の複製を可能にする配列を含むことができる。このことは、発現レベル及び／又は治療／ワクチン効果の増加を可能にする（Ｃｏｌｌｉｎｇｓ  Ａ．、Ｖａｃｃｉｎｅ、１８巻、４６０１ページ、１９９９年）。
【００３１】
ＤＮＡベクターは、プラスミドＤＮＡ精製のための標準的技法を用いて精製することができる。これらの技法には、臭化エチジウムの存在下、塩化セシウム密度勾配による精製の方法、或いは、イオン交換カラム又はＤＮＡ分子を分離するためのその他の交換体若しくは方法の使用法が含まれる（Ｆｅｒｒｅｉｒａ  ＧＮ、他、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１８巻、３８０ページ、２０００年）。
【００３２】
本発明には、プラスミドＤＮＡベクター、好ましくはヒトにおけるＤＮＡ免疫化及び遺伝子療法のためのコンパクトベクターのＰＡＥＣファミリーのプラスミドＤＮＡベクターの使用法が含まれる（Ｈｅｒｒｅｒａ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕ．、２７９巻、５４８ページ、２０００年）。このファミリーは、ベクターｐＡＥＣ−Ｋ６（アクセス番号ＡＪ２７８７１２）、ｐＡＥＣ−Ｍ７（アクセス番号ＡＪ２７８７１３）、ｐＡＥＣ−Δ２（アクセス番号ＡＪ２７８７１４）、ｐＡＥＣ−ＳＰＥ（アクセス番号ＡＪ２７８７１５）及びｐＡＥＣ−ＳＰＴ（アクセス番号ＡＪ２７８７１６）を含む。これらのベクターは、ヒト細胞を含む哺乳類細胞における目的産物、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における複製ユニットの発現にとって不可欠な要素のみを含む。転写ユニットは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期プロモーター、目的産物を挿入するための多目的マルチクローニング部位、及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来の転写終結及びポリアデニル化のための配列によって形成される。複製ユニットにおいて、ベクターは、高いコピー数及び目的プラスミドを有する細菌の選択を確実にするため、カナマイシン耐性（Ｔｎ９０３）の遺伝子、及びｐＵＣ１９複製起点（ＣｏｌＥ１）を含む。
【００３３】
さらに、本発明には、プラスミドＤＮＡベクター、好ましくはヒトにおけるＤＮＡ免疫化のためのコンパクトベクターのＰＭＡＥファミリーのプラスミドＤＮＡベクターの使用法が含まれる。これらは、ＰＡＥＣ系列と同一の細菌における機能的要素、並びにＣＭＶ前初期プロモーター及びマルチクローニング部位を含む。さらに、ウサギβ−グロビンに由来する転写終結及びポリアデニル化のための合成イントロン及び合成配列を有する。後者に類似する配列により、クローン遺伝子のより高い発現レベルを得ることが可能であることが報告されている（Ｎｏｒｍａｎ  ＪＡ他、Ｖａｃｃｉｎｅ、１５巻、８０１ページ、１９９７年）。さらに、この系列のベクターには、マウスとヒトの双方で先天性免疫系を刺激し、その結果として、目的分子に対する体液性及び細胞性応答が活性化される免疫刺激配列（ＣｐＧモチーフ）の連続的反復が含まれる（Ｋｒｉｅｇ  ＡＭ、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９巻、６１８ページ、２００１年）。
【００３４】
組換えウイルス（とりわけ、アデノウイルス、アデノ随伴、ワクシニア、水痘ウイルス、カナリア痘ウイルス）による免疫化は、宿主において強力な細胞傷害性細胞反応を生み出す。組み込み配列を有する組換えウイルスベクターに目的配列を導入するため、各ウイルスタイプに特有のプロモーターを使用する。また、この戦略は本発明の範囲に含まれ、水痘ウイルス及びｐＦＰ６７ｘｇｐｔベクターを使用することが好ましい。ｐＦＰ６７ｘｇｐｔベクターを使用し、水痘ウイルスＦＰ９の１１．２ｋＢ  ＢａｍＨＩの断片のうちオープンリーディングフレーム６と７の間に合成的性質の強力な初期／後期プロモーターの下で遺伝子をクローニングする。また、このプラスミドは、組換えウイルスを識別するために使用されるワクシニアプロモーターｐ７．５Ｋによって制御されるＥｃｏｇｐｔを含む。本発明の他の代替法は、ＶＥＧＦファミリー並びにそれらの受容体及び／又は補助受容体のタンパク質による免疫化からなる。既述のようにして得られるｃＤＮＡ分子を、自動配列決定の従来法によってそれらの配列を確認した後で、抗原のタンパク質変異体を得るため、ウイルス、酵母、ファージ、植物、又は優れた細胞における発現のためにベクター中にクローニングする。発現のためのいくつかのベクターが報告されており、組換えタンパク質を得るために使用されている。これらのベクターは、少なくとも、発現されるＤＮＡ又は断片の配列と動作可能に連結された発現を制御する配列を含む。発現の制御に有用な配列の例は、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、及びｔｒｃ系、ラムダファージのプロモーター領域及び主要オペレーター、表面タンパク質ｆｄのコントローラ領域、酵母の解糖プロモーター（例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ）、酵母酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、接合アルファ因子のための酵母プロモーター、及びポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、シミアンウイルス由来のプロモーター（例えば、ＳＶ４０の初期／後期プロモーター）、並びに原核及び真核細胞、それらのウイルスにおいて遺伝子の発現を調節する他の知られている配列、及びそれらの組合せである。
【００３５】
これらのベクターを複製するため、及び本発明の目的組換えタンパク質を得るために使用される宿主には、原核及び真核細胞が含まれる。原核生物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＨＩ、ＭＲＣＩ、ＨＢ１０１、Ｗ３１１０、ＳＧ−９３６、Ｘ１７７６、Ｘ２２８２、ＤＨ５ａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｉｃｅｓ）などを含む。真核細胞には、とりわけ酵母及び真菌、昆虫、動物細胞（例えば、ＣＯＳ−７及びＣＨＯ）、ヒト、及び植物細胞、及び組織培養物が含まれる。適切な培地において最適な系における発現の後、知られている手順によってポリペプチド又はペプチドを単離することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
アジュバントの使用法
特定の動物モデルにおいて裸のＤＮＡ又はタンパク質のワクチン接種が有効であることが判明した場合であっても、腫瘍又は自己免疫疾患に冒されている患者は、本発明によって提案される治療戦略への挑戦を示す。免疫応答を助けるため、ＤＮＡ又はタンパク質ワクチンを、無機塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム）のような既述の免疫増強物質；サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１８）、分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ１５４、ＭＨＣタイプＩのインバリアント鎖、ＬＦＡ３）のような免疫刺激薬；サポニン（例えば、ＱＳ２１）、ＭＤＰ誘導体、ＣｐＧオリゴ、ＬＰＳ、ＭＰＬ及びポリホスファゼン；エマルジョン（例えば、フロイント、ＳＡＦ、ＭＦ５９）、リポソーム、ビロゾーム、免疫刺激複合体、補助キレート剤（ｃｏ−ｃｈｅｌａｔｏｒ）のような脂質粒子；ＰＬＧ微小粒子、ポロキサマーのような、ウイルスタイプ（例えば、ＨＢｃＡｇ、ＨＣｃＡｇ、ＨＢｓＡｇ）、及び細菌タイプ（すなわち、ＶＳＳＰ、ＯＰＣ）の微小粒子アジュバント；並びに、易熱性エンテロトキシン（ＬＴ）、コレラ毒素、及び変異体毒素（例えば、ＬＴＫ６３及びＬＴＲ７２）のような粘膜アジュバント、微小粒子及び重合リポソームと混合することができる。ＤＮＡワクチン接種の場合には、目的抗原の発現は、バイシストロン性ベクター上で、いくつかの既述の免疫増強物質分子と混合できると思われる。
【００３７】
実施例中に詳述する実験的状況は、非共有結合的にＤＮＡをいくつかの記載粒子と結合させ得ること、及びこれらの混合物を使用すると、最適濃度が減少し、高用量の裸のＤＮＡについての記載に類似した抗腫瘍応答が得られることを示している。
【００３８】
哺乳類への投与
治療への応用例については、本発明のワクチン調製物は、以下の経路、とりわけ粘膜、皮下、筋肉内、腹膜、リンパ管内、局所から、及び吸入により、薬剤として許容可能な投与量で哺乳類、好ましくはヒトに投与される。これらは、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、骨髄、脾臓、胸腺、心臓、リンパ節、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、膀胱、胃、腸、精巣、卵巣、直腸、眼、腺、及び結合組織を含む組織の間質空間に投与することができる。オリゴヌクレオチド伝達のためのベクターの場合、それらの発現は、体性分化細胞を対象とすることが好ましいが、皮膚の線維芽細胞及び血液の多能性細胞のような非分化又は低分化細胞を対象とすることができる。
【００３９】
免疫原の投与量は、毒性も治療効果もない、薬剤として許容される媒体中で投与することができる。これらの媒体の例には、イオン交換体、アルミナ、アルミニウムエステアレート（ｅｓｔｈｅａｒａｔｅｓ）、レクチン、アルブミンのような絹のタンパク質、リン酸塩のような緩衝溶液、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物起源の飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、又は硫酸プロタミンのような電解質、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース及びポリエチレングリコールに基づく物質が含まれる。本発明では、ワクチン調製物の賦形剤としてリン酸緩衝液を使用することが好ましい。
【００４０】
タンパク質及びペプチドを使用する場合、アジュバントのように振る舞う担体として知られている分子に共有結合的又は非共有結合的にコンジュゲートさせることができる。これらの分子には、ＫＬＨ、ｐ６４Ｋ、ＯＰＣ（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ  Ａ他、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９巻、３６９２ページ、２００１年）、及びＶＳＳＰがある。裸のＤＮＡ、ウイルスベクター、及びタンパク質免疫原の組合せも、本発明の範囲に含まれる代替法である。有利には、プラスミドＤＮＡ投与は、ワクチン調製物中に１種類又は複数の目的分子との製剤の生成を可能にする。したがって、本発明による分子は、様々なタイプのベクター（ＤＮＡ、タンパク質、ウイルスベクターによる誘導再刺激の変異体）を組み合わせることによりワクチンスケジュールで投与することができる
【００４１】
ＤＮＡベクターを患者に直接投与するか、これらのベクターによりｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで宿主細胞を改変することができる。この最後の戦略は、部位特異的組換えによる挿入、又はベクター発現を特定の細胞に向ける全身性形質転換による免疫化と組み合わせることができる。さらに、ＤＮＡベクターの細菌宿主をｉｎ  ｖｉｖｏにおける伝達の媒体として使用することができる。
【００４２】
このように、本発明による遺伝子を運ぶ分子は、裸のＤＮＡの形で、又は様々なベクター、すなわち化学的／生化学的／生物学的、天然／合成又は組換えベクターと組み合わせて使用することができる。これらの分子は、カチオン性ペプチド、コンパクト化（ｃｏｍｐａｃｔｉｎｇ）分子（例えば、ＰＥＧ、ＰＥＩ）、核局在化ペプチド（ＮＬＰ）などと結合又は組み合わせることができる。また、これらの分子は、ＤＮＡ沈殿物を生成することができるカチオンと一緒に、膜融合物に予め分子が添加され、脂質的性質の合成ベクターではカチオン性ポリマー（例えば、ＤＯＧＳ又はＤＯＴＭＡ）によって生成されるリポソーム調製物の一部として投与することができる。ＤＮＡベクターの投与のためには、ＤＮＡをコンパクト化し生成する複合体の輸送を媒介するキメラタンパク質、及び特異的細胞によるその選択的エンドサイトーシスも使用することができる。本発明による治療／ワクチン遺伝子を運ぶＤＮＡ分子は、パーティクルボンバードメント、エレクトロポレーション（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏ）のような物理的伝達方法を用い、又は局所塗布、微粒子化による吸入などによりｉｎ  ｖｉｖｏで直接的に細胞への遺伝伝達のために使用することができる。生きているベクターには、アデノウイルス粒子又は本発明による分子が産生されたのと同一の宿主が含まれる。
【００４３】
使用されるポリペプチド及び／又はオリゴヌクレオチドの投与量は、様々なパラメータに従い、特に免疫源として投与される遺伝子又はタンパク質、投与の経路、治療すべき症状、治療の期間、及びオリゴヌクレオチドを用いる場合には免疫化に使用するベクターに応じて確立することができる。以下の実施例に記載のものとは異なる投与スケジュール又は投与経路の変更は、本発明の原則又は指針から離れることなく、良好な応答を得るための免疫化スキームの最適化を達成することが可能である。
【００４４】
治療目的使用
本発明は、受動免疫療法を上回る利点を有し、標的として同一の分子を用いる臨床試験の進んだ段階にある。モノクローナル抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ）の投与による免疫の受動伝達に比較して、タンパク質又はオリゴヌクレオチドによる免疫化は、抗体の内因性産生と、さらには特異的な細胞傷害性ＣＤ８＋リンパ球の増殖及び拡大を誘導するという利点を有する。
【００４５】
本発明が、ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦＲ系の遮断を対象とする治療戦略を上回る利点を有する理由は、主に、それらの治療戦略が、循環ＶＥＧＦのレベルを低下させるかＫＤＲを遮断するに過ぎないからである。記載の効果を達成することに加え、提案される戦略は、ＶＥＧＦの供給源（すなわち、腫瘍細胞及び関連間質）及び／又はそれらの受容体を発現する細胞（腫瘍内皮及び一部の腫瘍細胞）も破壊する。この領域で行われたこれまでの研究は、観察された効果の主要な構成要素として体液性応答について既述しているに過ぎない。本発明の範囲を特定の機序に限定しようとするものではないが、実施例は、ワクチン組成物が、体液性特異的応答の他に、体液性応答と協調するＣＤ８＋細胞性応答を誘発することができること、さらに腫瘍との関連で、双方の組合せが、実施例９において観察される抗腫瘍効果を得ることに関連していることを示している。
【００４６】
細胞傷害性細胞性応答が、表１及び２に載っているペプチドのいくつかの認識によって媒介されることが可能である。これらの中には、ＶＥＧＦファミリー、その受容体及び補助受容体における選択された標的を対象とする細胞性応答に関連すると思われるいくつかのペプチドセグメントが現れる。この情報は、ＮＩＨ及びＨｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ、及びｗｗｗ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ＭＨＣＳｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍ）からの公共データベースに対し、それぞれＢＩＭＡＳ及びＳＹＦＰＨＥＩＴＩソフトウエアを用いるコンピュータ解析により得られる。マークされたペプチド及び目的抗原に由来する他の配列は、単剤又は併用治療として、及びアジュバント能のある分子の一部であろうがなかろうが、既述の症状の活性免疫療法として使用できるであろう。また、これらのペプチドは、ワクチン目的でオリゴヌクレオチド変異体中で使用することができる。
【００４７】
血管新生及びこの事象に関連する病態を阻害する方法は、有効量の本発明に記載のいくつかのＤＮＡ又はタンパク質分子をいずれかの経路によって前述のいくつかの免疫増強物質又はアジュバントを用いて哺乳類に投与することを含む。この哺乳類は、ヒトであることが好ましい。
【００４８】
血管新生の非可逆的かつ無秩序な増加は、幅広い疾患のグループに関連付けられている。ＶＥＧＦファミリー、その受容体及び補助受容体を含む系は、前述したようにこれらの病態の多くで過剰発現される。このように、本発明が提案する治療戦略は、（ａ）癌（原発腫瘍とそれらの転移の双方）、（ｂ）喘息、呼吸困難、子宮内膜症、アテローム性動脈硬化症、及び組織浮腫などの急性及び慢性炎症過程、（ｃ）肝炎、及びカポジ肉腫のような感染症起源の疾患、（ｄ）糖尿病、乾癬、関節リウマチ、甲状腺炎のような自己免疫疾患、並びに（ｅ）糖尿病性及び新生児網膜症、臓器移植拒絶反応、黄斑変性症、血管新生緑内障、血管腫、及び血管線維腫などの他の疾患及び状態の治療に有効である。
【００４９】
癌の場合は特に、本発明が提案する免疫原のワクチン接種は、癌腫、肉腫及び血管が新生した腫瘍の治療に有効である。提案戦略で治療することができる腫瘍のいくつかの例には、類表皮腫瘍、頭頸部の扁平上皮腫瘍のような扁平上皮腫瘍、並びに結腸直腸、前立腺、乳房、肺（小細胞及び非小細胞を含む）、膵臓、甲状腺、卵巣、及び肝臓の腫瘍が含まれる。これらの方法は、カポジ肉腫、中枢神経系腫瘍形成（神経芽細胞腫、毛細血管腫、髄膜腫及び脳転移）、黒色腫、腎及び胃腸癌腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫及び平滑筋肉腫のような他のタイプの腫瘍の治療にも有効である。
【００５０】
具体的に、免疫原としてのＶＥＧＦ−Ａ及び／又はそれらの受容体ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２の使用は、様々な起源及び局在化の腫瘍、及びそれらの転移、血管腫、子宮内膜症、潰瘍性大腸炎及びクローン病のような慢性炎症過程、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ及び変形性関節症、炎症性関節症、乾癬、呼吸困難、喘息、甲状腺炎、糖尿病性及び新生児網膜症、黄斑変性症、及び緑内障、常染色体性ＶＨＬ疾患、肥満症、並びにいくつかの臓器移植の拒絶反応の治療に有用である。一方、ＰＩＧＦに対する応答は、関節リウマチの場合に、及び一般に原発性炎症性関節症の治療において有用である。
【００５１】
ＶＥＧＦ−Ｂの場合、免疫原としてのその使用は、乳房、卵巣及び腎臓の腫瘍の場合に、並びに黒色腫及び線維肉腫に有用である。ＶＥＧＦ−Ｃ及びその受容体ＶＥＧＦＲ−３の使用は、組織浮腫、糖尿病性網膜症、慢性炎症、潰瘍、並びに乳房、肺、頭頸部、食道、及び胃の腫瘍、リンパ腫、及び前立腺、転移結節及びカポジ肉腫、Ｄａｂｓｋａ型血管内皮腫及び皮膚リンパ管腫症の治療に有用である。ＶＥＧＦ−Ｄのワクチン接種は、具体的にリンパ節転移の治療に使用することができる。
【００５２】
哺乳類のワクチン接種におけるＮＲＰ１及びＮＲＰ２補助受容体の使用は、特に、前立腺癌における線維血管性増殖、黒色腫、骨肉腫、乳癌転移、糖尿病性網膜症、及び関節リウマチの治療に有用である。
【００５３】
抗体の投与による受動免疫療法に基づく研究は、ＶＥＧＦ−Ａに対する抗体とＫＤＲの併用は、同系腫瘍のモデルにおいてより有効であることを示した。したがって、本発明において提案される２種類以上の免疫原の使用は、血管新生及び腫瘍増殖を阻害するための特に効率的な治療を提供する。これらの免疫原は、個々に、又は既述の経路によるバイシストロン性ベクターを用いペアで投与することができる。さらに、本発明のワクチン組成物は、一緒に、又は連続して、治療中の状態にとって利益をもたらす薬物又は化学療法剤と共に使用することができる。
【００５４】
後述の結果は、抗血管新生及び抗腫瘍応答は、体液性及び細胞性応答の協調によって媒介されることを立証している。特に、ＶＥＧＦ及びその受容体は、樹状細胞の成熟の過程に関与し、Ｂ及びＴリンパ球前駆体に作用する。実施例１０は、提案する治療戦略が、血清中のＶＥＧＦのレベルを低下させる他に、Ｂ及びＴリンパ球の比率、及び成熟樹状細胞の正常化にも寄与していることを立証している。この効果は、ＭＨＣ  Ｉとの関連で腫瘍抗原の提示を助け、免疫原ばかりでなく、腫瘍との関連では他の腫瘍関連、腫瘍特異的、及び過剰発現抗原を対象とする免疫抗腫瘍効果の質及び強度を改善する。
【００５５】
【表１】
0004741800.tif 000002
【００５６】
【表２】
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【実施例１】
【００５７】
抗原のクローニング及び一過性発現。
ヒトＶＥＧＦ、そのアイソフォーム及び機能的変異体
ＶＥＧＦアイソフォームは、ＣａＳｋｉ細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５５０）のｍＲＮＡの前回の分離から得られたｃＤＮＡをテンプレートとして用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を適用し、製造業者の使用説明書に従い（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、プライマー配列番号１及び配列番号２を使用してクローニングした。ＶＥＧＦアイソフォーム１２１、１６５及び１８９の増幅産物に対応するバンドを２％アガロースゲルから抽出した。エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩによるバンド消化の後、ＶＥＧＦアイソフォームからのｃＤＮＡを精製し、ＰＡＥＣΔ２ベクター（ＣＩＧＢの所有ベクター）中に独立にクローニングした。得られたプラスミドを配列決定し、クローン化アイソフォームについてＥＭＢＬ（ｗｗｗ．ｅｍｂｌ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｄｅ）によって報告されているアミノ酸に関して変異が無いと判定した。続いて、ＶＥＧＦアイソフォームに対応するｃＤＮＡを、５個の免疫刺激性ＣｐＧ部位の存在によってｐＡＥＣΔ２とはとりわけ特徴が異なるｐＭＡＥ５Δ５上のＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＶにクローニングした。
【００５８】
ＫＤＲ受容体と結合しないＶＥＧＦ変異体（ＶＥＧＦＫＤＲ（−））からのｃＤＮＡは、Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒ  Ｇ他（Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒ  Ｇ他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２７３巻、１１１１５ページ、１９９８年）により記載されたように、前にクローニングしたＶＥＧＦ１２１アイソフォームの直接変異誘発によって得た。
【００５９】
変異体は、以下のプライマーを用いるＰＣＲにより生成させた。
（Ａ）５’末端断片（３１５ｂｐ）の増幅：配列番号３及び配列番号４の配列を有するプライマーを使用
（Ｂ）３’末端断片（９３ｂｐ）の増幅：配列番号５及び配列番号６の配列を有するプライマーを使用
【００６０】
このように増幅した断片を述べるように精製し、配列番号７及び配列番号８の配列に対応するプライマーを用いるフュージョンＰＣＲ用のテンプレートとして等モル濃度で使用した。変異を含む得られたｃＤＮＡをＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化し、精製し、ｐＡＥＣΔ２ベクター中にクローニングした。導入された変異を配列決定法によりチェックし、ＶＥＧＦＫＤＲ（−）に対応するＤＮＡを、ｐＭＡＥ５Δ５中のＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＶにサブクローニングすると、ｐＭＡＥ５Δ５  ＶＥＧＦＫＤＲ（−）が得られた。
【００６１】
トランスフェクションと動物のワクチン接種の双方で使用されるプラスミドは、Ｗｈａｌｅｎ  Ｒ他（Ｗｈａｌｅｎ  ＲＧ及びＤａｖｉｓ  ＨＬ、Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、７５巻、１ページ、１９９５年）によって記載されているように内毒素が含まれている条件で精製した。手短に言うと、製造業者の使用説明書に従い、ＱＩＡＧＥＮ  Ｅｎｄｏ−ｆｒｅｅシステムを用いてＤＮＡを精製し、そのＤＮＡをさらに第二の沈殿にかけた。最後に、ＤＮＡを、内毒素を含まないＰＢＳ（ＳＩＧＭＡ、ＵＳＡ）に溶かし、最終濃度を４ｍｇ／ｍＬとした。
【００６２】
１．２  ヒトＶＥＧＦ受容体（ＫＤＲ／Ｆｌｋ１）
ＶＥＧＦのＫＤＲ受容体の細胞外ドメイン（ＫＤＲ１〜３）並びにこの受容体の膜貫通及び細胞内ドメイン（ＫＤＲ  ＴＣ）をコードするｃＤＮＡは、内皮細胞系ＨＵＶＥＣ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃ、ＵＳＡ）のｍＲＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲから取得し、ヒトＶＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ）及びヘパリン（Ｓｉｇｍａ）で処理した。
【００６３】
細胞外ドメイン１から３の場合、使用するプライマーは、配列番号９及び配列番号１０の配列に相当する。増幅断片（９４３ｂｐ）のエンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩによる消化の後、ＫＤＲの１〜３ドメインをコードするｃＤＮＡを精製し、ｐＡＥＣΔ２ベクター中にクローニングした。対応するＤＮＡの配列決定により、制限分析が陽性のクローンを確認した。次いで、ＫＤＲ１〜３に対応するＤＮＡを、既述のｐＭＡＥ５Δ５中のＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＶにサブクローニングした（ｐＭＡＥ５Δ５  ＫＤＲ１〜３）。
【００６４】
受容体の膜貫通及びサイトゾル領域のクローニングのため、二段階戦略を設計した。第一のセグメントの挿入のため、配列番号１１及び配列番号１２に対応するプライマーを使用した。この７４７ｂｐセグメントのＸｂａＩ／ＢｇＩＩＩ消化の後、予め同一酵素により消化したｐＭＡＥ５ベクター中に産物をクローニングし、プラスミドＰＭＡＥ５  ＫＤＲ７４７を得た。配列番号１３及び配列番号１４の配列に対応するプライマーを用いて増幅した残りの１０９１ｂｐのカルボキシ末端断片を挿入するため、このプラスミドをＢｇＩＩＩ／ＮｏｔＩにより消化した。ＤＮＡ配列決定により制限分析が陽性のクローンを確認し、ｐＭＡＥ５  ＫＤＲ  Ｃと命名した。
【００６５】
１．２．１  ウイルスベクターにおけるＫＤＲの膜貫通及びサイトゾル領域のクローニング
水痘ウイルス上のＶＥＧＦ受容体（ＫＤＲ）の膜貫通及びサイトゾル領域のクローニングのため、配列番号１５及び配列番号１６の配列に対応するプライマーを使用した。この９５３ｂｐセグメントをＳｔｕＩ／ＳｍａＩ酵素により消化した後、予め同一酵素により消化したｐＦＰ６７ｘｇｐｔベクター中にクローニングした。ＳｍａＩ／ＢａｍＨＩにより消化したこの同一ベクターにおいて、残りの９１９ｂｐを挿入し、配列番号１７及び配列番号１８の配列に対応するプライマーを用いて元のｃＤＮＡから増幅した。ＤＮＡ配列決定により制限分析が陽性のクローンを確認し、ｐＦＰ６７ｘｇｐｔ  ＫＤＲ  Ｃと命名した。
【００６６】
水痘ウイルス（ＦＷＰＶ）は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を２％添加したＤＭＥＭ培地中、トリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）の中で複製した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＵＳＡ）を用い、弱毒株ＦＰ９に予め感染させたＣＥＦにｐＦＰ６７ｘｇｐｔ  ＫＤＲ  Ｃをトランスフェクトした。２４時間後、新鮮な培地を加え、細胞をさらに３〜４日間培養した。その後、細胞を３回凍結解凍した。Ｅｃｏｇｐｔ酵素をコードする遺伝子を発現する組換えウイルスを、ミコフェノール酸（２５μｇ／ｍＬ）、キサンチン（２５０μｇ／ｍＬ）、及びヒポキサンチン（１５μｇ／ｍＬ）（ＭＸＨ）により選択培地中で精製した。組換えウイルスにおける遺伝子の正しい封入は、ＰＣＲによってチェックした。組換えウイルスをＦＰＫＤＲｇｐｔと命名し、非組換え体を陰性対照ＦＰとして使用した。
【実施例２】
【００６７】
抗原のｉｎ  ｖｉｖｏ発現
ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてタンパク質を発現させるための構築物の能力を確認するため、これらを、Ｃ５７ＢＬ６マウス（１群３匹）の大腿四頭筋に注射した。
１．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１（１０及び５０μｇ／マウス）
２．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１６５（１０及び５０μｇ／マウス）
３．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１８９（１０及び５０μｇ／マウス）
４．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦＫＤＲ（−）（１０及び５０μｇ／マウス）
５．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５Δ５−ＫＤＲ１〜３（１０及び５０μｇ／マウス）
６．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５  ＫＤＲ  Ｃ（１０及び５０μｇ／マウス）
７．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたＦＰＫＤＲｇｐｔ（２．５＊１０７ｃｆｕ）
８．ＰＢＳｐＨ７．２（陰性対照）
【００６８】
注射４８時間後に動物を犠牲にし、注射した筋肉を無傷で摘出した。プロテアーゼ阻害剤及び非イオン性界面活性剤の存在下に筋肉組織の一部をホモジナイズした。タンパク質抽出物中のＶＥＧＦの存在は、記載手順に従い、すべてのヒトＶＥＧＦアイソフォームを認識するポリクローナル抗体（ｓｃ−１５２Ｇ）を用いるドットブロット及びウエスタンブロットにより分析した。ＲＮＡは、ＴＲＩ−Ｒｅａｇｅｎｔ（ＳＩＧＭＡ）を用いて残りの筋肉組織から抽出した。各実験状況から合計２０μｇのＲＮＡを、ホルムアルデヒドを含有する１％アガロースゲルの電気泳動にかけた。ＲＮＡをナイロンフィルタ（ＨＹＢＯＮＤ）に写し、すべてのＶＥＧＦアイソフォームを認識するＡＴＰ３２で標識したＶＥＧＦ１２１アイソフォームのｃＤＮＡ、又は同様に標識したＫＤＲのｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。いずれの場合にも、フィルタは、構成遺伝子であるグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対応するｃＤＮＡと再びハイブリダイズさせた。ヒトＶＥＧＦに対応するすべての分析構築物バンド及びＫＤＲ受容体のクローン化断片を同定した。
【実施例３】
【００６９】
ＶＥＧＦ受容体であるＫＤＲの遺伝子断片を含むプラスミドのワクチン接種を用いるｉｎ  ｖｉｖｏの予防実験。
１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスのグループに、以下の変異体をワクチン接種するか、接種しなかった。
１．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５Δ５−ＫＤＲ  １〜３（１、１０、５０及び１００μｇ／マウス）
２．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５  ＫＤＲ  Ｃ（１、１０、５０及び１００μｇ／マウス）
３．ＦＰＫＤＲｇｐｔ（２．５＊１０７ｃｆｕ）
４．ＰＢＳｐＨ７．２（陰性対照）
５．ＦＰ（２．５＊１０７ｃｆｕ）（陰性対照グループ３）
【００７０】
どの場合においても、全容積５０μｌの左後足への筋肉内注射（ｉｍ．）により、マウスを免疫化した。１５日後、最初の免疫化方式を用いてすべての動物を再免疫化した。最後の免疫化から３０日後、すべての動物の右腹部へのＢ１６−Ｆ１０黒色腫（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−６４７５）の細胞１０４個の皮下（ｓｃ．）注射により、腫瘍チャレンジを展開した。腫瘍増殖は、動物が死亡し始めるまで週３回の測定でモニターした。
【００７１】
ｐＭＡＥ５Δ５−ＫＤＲ  １〜３プラスミドにより免疫化されたマウスでは、ＤＮＡ５０及び１００μｇ／マウスの投与量において腫瘍サイズの減少は明らかであり、陰性対照に対して有意に低値であった（表３）。３３日目の生存率分析は、非免疫化マウス（グループＰＢＳｐＨ７．２）に対し、マウス１匹当たり前記ＤＮＡ投与量５０及び１００μｇにより免疫化された動物について、このパラメータの有意な増加（陰性対照に対して）を示した。ｐＭＡＥ５  ＫＤＲ  Ｃの場合（表３）、使用した４種類の投与量において腫瘍体積の有意な減少が観察され、１００から１０μｇ／動物の投与量で生存率が増加した。ウイルスベクターの使用は、それぞれの陰性対照（挿入ＦＰｇｐｔを含まないベクターにより免疫化されたマウスのグループ）と比較すれば、ＦＰＫＤＲｇｐｔ構築物に使用した条件で容積を減少させ、生存率を増加させた（表３）。
【００７２】
【表３】
0004741800.tif 000004
注：腫瘍体積は、各グループの動物に対して行われた測定値の平均値±標準偏差（ＳＤ）のように報告する。統計比較は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニの事後テストを用いて行った。生存率の場合、報告する統計的有意性は、指示日において対照グループに対して各グループを比較するログランク検定を用いて得た。統計的有意性は、ｎｓ、ｐ≦０．０５有意でない；＊、ｐ≦０．０５；＊＊、ｐ≦０．０１；及び＊＊＊、ｐ≦０．００１のように表示する。
【実施例４】
【００７３】
ＶＥＧＦアイソフォーム、及び変異体を含むプラスミドのワクチン接種を用いるｉｎ  ｖｉｖｏの予防実験。
１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスのグループに、以下の変異体をワクチン接種するか、接種しなかった。
１．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＡＥＣΔ２−ＶＥＧＦ１２１（１、１０、５０及び１００μｇ／マウス）
２．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１（１、１０、５０及び１００μｇ／マウス）
３．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１６５（１、１０、５０及び１００μｇ／マウス）
４．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１８９（１、１０、５０及び１００μｇ／マウス）
５．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦＫＤＲ（−）（１、１０、５０及び１００μｇ／マウス）
６．ＰＢＳｐＨ７．２（陰性対照）
【００７４】
どの場合においても、全容積５０μｌの左後足へのｉｍ．注射により、マウスを免疫化した。１５日後、最初の免疫化方式を用いてすべての動物を再免疫化した。最後の免疫化から３０日後、すべての動物の右腹部へのＢ１６−Ｆ１０黒色腫（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−６４７５）の細胞１０４個の皮下（ｓｃ．）注射により、腫瘍チャレンジを展開した。腫瘍の増殖は、動物が死亡し始めるまで週３回の測定でモニターした。
【００７５】
１００μｇ／動物で免疫化されたマウスの場合にｐＡＥＣ系列における裸のＤＮＡ変異体に関して、陰性対照に対する腫瘍増殖の減少が観察された（表４）。ＶＥＧＦアイソフォームとは無関係に、５個のＣｐＧ部位を有するｐＭＡＥ５Δ５系列のベクターに含まれる変異体では、ＤＮＡ１０、５０、又は１００μｇの投与量で免疫化されたマウスのグループにおいて陰性対照に比べ腫瘍サイズが有意に減少した。変異した変異体ｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦＫＤＲ（−）を用いた場合には、ｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１について用いたのと同様な投与量において腫瘍サイズの有意な減少が得られた。
【００７６】
４３日目の生存率分析は、変異体ｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１、ｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１６５、ｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１８９、及びｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦＫＤＲ（−）により免疫化された動物の、動物一匹当たり５０及び１００μｇの投与量における（陰性対照に対する）有意な増加を示した（表４）。
【００７７】
【表４】
0004741800.tif 000005
注：腫瘍体積は、各グループの動物に対して行われた測定値の平均値±標準偏差（ＳＤ）のように報告する。統計的比較は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニの事後テストを用いて行った。生存率の場合、報告する統計的有意性は、指示日において対照グループに対して各グループを比較するログランク検定を用いて得た。統計的有意性は、ｎｓ、ｐ≦０．０５有意でない；＊、ｐ≦０．０５；＊＊、ｐ≦０．０１；及び＊＊＊、ｐ≦０．００１のように表示する。
【実施例５】
【００７８】
コラーゲン誘発関節炎のモデルにおけるｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１及びｐＭＡＥ５Δ５−ＫＤＲ１〜３による免疫化を介するｉｎ  ｖｉｖｏの予防実験。
２０匹のマウスのグループに、以下の変異体をワクチン接種するか、接種しなかった。
１．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１（ＤＮＡ５０μｇ／マウス）
２．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５Δ５−ＫＤＲ１〜３（ＤＮＡ５０μｇ／マウス）
３．ＰＢＳｐＨ７．２（陰性対照）
【００７９】
すべての場合において、免疫化（０日目）は、全容積５０μｌの左後足へのｉｍ．経路によった。１５日後、最初の免疫化方式を用いてすべての動物を再免疫化した。
【００８０】
５日目に、Ｃａｍｐｂｅｌｌ他（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＩＫ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３０巻、１５６８ページ、２０００年）による既述のモデルであるトリＩＩ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ）による免疫化により、自己免疫性関節炎の誘発を開始した。この免疫化を２６日目に繰り返した。各マウスの四肢は、各肢について、検査における紅斑（１）、炎症（２）、又は関節硬直（３）の徴候の存在により０から３までの区切りを定め、最大値が１２である関節炎指数に従って毎日評価した。マウスは、誘発から２３日後に関節炎発症の臨床症状を示し始め、５０日目の発生率が最も高かった。表５は、異なる実験グループの動物における関節炎発生率の分析を示している。４０及び５５日目には、対照グループに比べ、ワクチン接種グループ（１及び２）において関節炎発生率の有意な低下が観察された。
【００８１】
【表５】
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【実施例６】
【００８２】
ワクチン接種のｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗血管新生効果
１５匹のマウスのグループに、以下の変異体をワクチン接種するか、接種しなかった。
１．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１（ＤＮＡ５０μｇ／マウス）
２．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５Δ５−ＫＤＲ１〜３（ＤＮＡ５０μｇ／マウス）
３．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５  ＫＤＲ  Ｃ（ＤＮＡ５０μｇ／マウス）
４．ＰＢＳｐＨ７．２（陰性対照）
【００８３】
どの場合においても、全容積５０μｌの左後足へのｉｍ．注射により、Ｃ５７ＢＩ／６マウスを免疫化した。１５日後、最初の免疫化方式を用いてすべての動物を再免疫化した。最後の免疫化から３０日後、Ｃｏｕｇｈｌｉｎ  ＭＣ他（Ｃｏｕｇｈｌｉｎ  ＭＣ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０１巻、１４４１ページ、１９９８年）により記載されているマトリゲルを用い、ｉｎ  ｖｉｖｏの血管新生を動物において評価した。予めワクチン接種した動物を５匹のグループに分け、
１．ＶＥＧＦ５０ｎｇ／ｍＬ、ヘパリン５０Ｕ／ｍＬ
２．１０５個のＢ１６−Ｆ１０黒色腫の細胞
３．ＰＢＳ
を含有する５００μｌのマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＵＳＡ）を、腹部中間線に皮下注射した。
【００８４】
６日後、動物を犠牲にし、マトリゲルプラグを摘出した。プラグ中のヘモグロビン含量を、製造業者の使用説明書（Ｄｒａｂｌｉｎの試薬キット；Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、ＵＳＡ）に従って分析した。ＶＥＧＦ又はその受容体ＫＤＲをコードするプラスミドによる免疫化は、ＶＥＧＦ誘発性血管新生、並びにより複雑な系である腫瘍細胞によって誘発される血管新生を有意に（ｐ＜０．００１）阻害する。
【実施例７】
【００８５】
様々なアジュバント剤に対するｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１の非共有結合性結合に基づく免疫原の取得。
既報の様々な免疫刺激剤を用い、後述の方法に従ってｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１構築物と混ぜた。髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜からのＯｐｃタンパク質を、Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ他（Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ  Ａ他、Ｖａｃｃｉｎｅ、６７巻、７５１ページ、１９９７年）の報告に従って精製した。ｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１５０μｇ／ｍＬを、酸性ｐＨにおいて緩やかに振盪しながらＯｐｃ１０μｇ／ｍＬに加えた。得られた複合体は、エンドフリーＰＢＳｐＨ７．２（Ｓｉｇｍａ）中で一夜、広範に透析した。Ｏｐｃタンパク質−プラスミドＤＮＡ会合（Ｏｐｃ−ｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１）のレベルは、１％アガロースゲルを用いるＤＮＡ可視化によってチェックした。５０％を超えるプラスミドＤＮＡがＯｐｃタンパク質と会合した。
【００８６】
Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙより提供される髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の外膜タンパク質（ＯＭＰＣ）の複合体に由来する極めて小さな粒子（ＶＳＳＰ）（Ｒ．Ｐｅｒｅｚ他、米国特許出願第５７８８９８５号及び第６１４９９２１号）を、目的プラスミドＤＮＡとの組合せに使用した。ＶＳＳＰ（１ｍｇ）を、一夜緩やかに撹拌しながらｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１５ｍｇと共にインキュベートした。得られた材料は、エンドフリーＰＢＳｐＨ７．２（Ｓｉｇｍａ）中で広範に透析した。ＶＳＳＰ−プラスミドＤＮＡ会合（ＶＳＳＰ−ｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１）のレベルは、１％アガロースゲルを用いるＤＮＡ可視化によってチェックした。５０％を超えるプラスミドＤＮＡがＶＳＳＰ粒子と会合した。
【００８７】
Ｃ型肝炎及びＢ型肝炎のコア粒子（ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅｄ）抗原（ＨＣｃＡＧ及びＨＢｃＡｇ）は、既報（Ｌｏｒｅｎｚｏ  ＬＪ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２８１巻、９６２ページ、２００１年）に従って生成した。抗原１ｍｇをプラスミド５ｍｇと混ぜて一夜インキュベートした。ＨＣｃＡＧ又はＨＢｃＡｇ−プラスミドＤＮＡ会合（それぞれ、ＨＣｃＡｇ−ｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１及びＨＢｃＡｇ−ｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１）のレベルは、１％アガロースゲルを用いるＤＮＡ可視化によってチェックした。いずれの場合にも、５０％を超えるＤＮＡが抗原性粒子と会合した。
【実施例８】
【００８８】
ｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１構築物及び免疫応答アジュバントによるｉｎ  ｖｉｖｏ予防の実験。
１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群に、以下の変異体をワクチン接種するか、接種しなかった。
１．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１（ＤＮＡ１、１０及び５０μｇ／マウス）
２．Ｏｐｃ−ｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１（ＤＮＡ１、１０及び５０μｇ／マウス）
３．ＶＳＳＰ−ｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１（ＤＮＡ１、１０及び５０μｇ／マウス）
４．ＨＢｃＡｇ−ｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１（ＤＮＡ１、１０及び５０μｇ／マウス）
５．ＨＣｃＡｇ−ｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１（ＤＮＡ１、１０及び５０μｇ／マウス）
６．ＰＢＳｐＨ７．２（グループ１の陰性対照）
７．Ｏｐｃ（グループ２の陰性対照）
８．ＶＳＳＰ（グループ３の陰性対照）
９．ＨＢｃＡｇ（グループ４の陰性対照）
１０．ＨＣｃＡｇ（グループ５の陰性対照）
【００８９】
免疫化手順、並びに腫瘍チャレンジ及び腫瘍体積測定は、これまでの実施例に記載と同様に行った。ＤＮＡ１０μｇ／マウス以上の投与量のワクチン変異体は、それぞれの陰性対照に比べて腫瘍増殖を低下させた（表６）。それぞれの対照に比べて有意に優れた生存率は、免疫増強媒体としてＯｐｃ、ＶＳＳＰ、ＨＣｃＡｇ及びＨＢｃＡｇと会合している、又は会合していないＶＥＧＦ遺伝子により免疫化された動物について観察された。媒体を有する変異体はすべて、１０μｇ／マウスから始まる投与量においてそれぞれの対照に対して有意に優れた生存率を示し、一方、ベクターｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１を有する裸のＤＮＡ変異体は、５０μｇ／マウスの投与量において陰性対照と有意に異なる結果を与えた（表６）。
【００９０】
【表６】
0004741800.tif 000007
注：腫瘍体積は、各グループの動物に対して行われた測定値の平均値±標準偏差（ＳＤ）のように報告する。統計比較は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニの事後テストを用いて行った。生存率の場合、報告する統計的有意性は、指示日において対照グループに対して各グループを比較するログランク検定を用いて得た。統計的有意性は、ｎｓ、ｐ≦０．０５有意でない；＊、ｐ≦０．０５；＊＊、ｐ≦０．０１；及び＊＊＊、ｐ≦０．００１のように表示する。
【実施例９】
【００９１】
ＶＥＧＦをタンパク質の形で用いるｉｎ  ｖｉｖｏの予防実験。
１０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群に、以下の変異体をワクチン接種するか、接種しなかった。
完全及び不完全フロイントアジュバントを含むＶＥＧＦ１６５（２０μｇ／マウス）
完全及び不完全フロイントアジュバント（陰性対照）
【００９２】
純度が９７％を超えるＶＥＧＦ１６５抗原を商業ソース（ＳＩＧＭＡ）から入手した。マウスは、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）を用いて腹腔内経路によって免疫化し、１５及び３０日目には不完全フロイントアジュバントを用いて同一経路により再免疫化した。腫瘍チャレンジ、及び腫瘍体積の測定は、前の実施例の記載と同様に行った。
【００９３】
対照の非免疫化グループに比べ、ＶＥＧＦ免疫化グループでは腫瘍体積の有意な減少及び生存率の増加が観察された。この効果は、ＶＥＧＦ  ＤＮＡを用いた前の実験に見られた効果と同様であった。
【実施例１０】
【００９４】
重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）のＣ５７ＢＬ／６マウスにおける免疫防御伝達のｉｎ  ｖｉｖｏ実験。
実施例５に記載の手順を用い、ｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１ＤＮＡ５０μｇ／マウスの投与量でＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫化し、又はしなかった。最初の免疫化から４５日後にマウスを犠牲にした。これらのマウスのＣＤ８＋、ＣＤ４＋及びＢリンパ球は、製造業者の使用説明書に従い、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、ＵＳＡ）を用いて分離した。
【００９５】
１０匹の６週齢Ｃ５７ＢＬ／６ＳＣＩＤマウスのグループを、前に摘出したリンパ球の以下の組合せで再構成した。
グループ１：ｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１ＤＮＡにより免疫化されたマウスからのＣＤ８＋Ｔリンパ球及びＣＤ４＋Ｔリンパ球。Ｂリンパ球は再構成しなかった。
グループ２：免疫化マウスからのＢリンパ球及びＣＤ４＋Ｔリンパ球、及び非免疫化マウスからのＣＤ８＋Ｔリンパ球。
グループ３：実験の陽性対照としての、免疫化マウスからのＢリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球及びＣＤ４＋Ｔリンパ球。
グループ４：実験の陰性対照としての、非免疫化マウスからのＢリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球及びＣＤ４＋Ｔリンパ球。
【００９６】
再構成したＳＣＩＤマウスに、１０４個のＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞を皮下チャレンジした。腫瘍の増殖は、動物が死亡し始めるまで週３回の測定によりモニターした。抗ＶＥＧＦ抗体レベルは、実験用ＥＬＩＳＡにより分析した。ＶＥＧＦ１６５（Ｓｉｇｍａ）の０．５μｇ／ｍｌ溶液と共に、９６ウエルプレートを一夜インキュベートした。ウエルをＰＢＳ−ＢＳＡ１％（ＢＤＨ、ＵＫ）溶液でブロックし、その後、動物血清の段階希釈液と共にインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．０５％で洗浄後、市販のポリクローナル抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ、Ａ０１６８）を加えた。市販の基質オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ、Ｓｉｇｍａ）の存在下にシグナルを増幅した。
【００９７】
表７は、腫瘍チャレンジを受けたマウスのグループの腫瘍体積（２４日目）及び生存率（４０日目）の結果を示している。再構成後１５日目に始まり、グループ１〜３の動物は、非免疫化マウスからのリンパ球により再構成されたグループ４に比べ、腫瘍サイズの減少を経験した。したがって、免疫化マウスにおいて免疫系を刺激し、腫瘍サイズを減少させる効果は、グループ１に抗ＶＥＧＦ抗体が存在しないことから、細胞傷害性型ＣＴＬの最後の一つである体液性及び細胞性応答に関連している。しかしながら、使用した実験条件では、残りのグループに比べ、グループ３（免疫化マウスのＢ及びＴリンパ球）において生存率が増加したに過ぎなかった（表７）。ＣＴＬ型応答のＢ又はＴが存在しない部分的に再構成した動物（それぞれ、グループ１及び２）では、生存率は、陰性対照と異ならなかった。これらの結果は、体液性及び細胞性応答の組合せは（表４）、腫瘍チャレンジを受けたマウスの生存率を延ばすことができる有効な応答を可能にする相乗効果を有することを立証している。
【００９８】
【表７】
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注：ドナーマウスは、マウス１匹当たりｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ  ＤＮＡ５０μｇの投与量で免疫化するか、又はしなかった。腫瘍体積は、各グループの動物に対して行われた測定値の平均値±標準偏差（ＳＤ）のように報告する。統計比較は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニの事後テストを用いて行った。生存率の場合、報告する統計的有意性は、指示日において対照グループに対して各グループを比較するログランク検定を用いて得た。統計的有意性は、ｎｓ、ｐ≦０．０５有意でない；＊、ｐ≦０．０５；＊＊、ｐ≦０．０１；及び＊＊＊、ｐ≦０．００１のように表示する。
【実施例１１】
【００９９】
免疫応答を介する循環（ｃｉｒｃｕｌａｎｔ）ＶＥＧＦの枯渇による免疫回復の証明。
１５匹のＣ５７ＢＬ／６雌性マウスのグループに以下の変異体をｉｍ．経路によって注射した。
１．ＰＢＳｐＨ７．２に溶かしたｐＭＡＥ５Δ５−ＶＥＧＦ１２１（５０μｇ／マウス）
２．ＰＢＳｐＨ７．２
【０１００】
いずれの場合においても、全容積５０μｌの左後足への筋肉内注射（ｉｍ．）により、マウスを免疫化した。１５日後、最初の免疫化方式を用いてすべての動物を再免疫化した。最後の免疫化から３０日後、各グループから無作為に選択した５匹の動物を犠牲にし、免疫化動物及び対照動物の免疫状態、並びに臓器及び組織に対するワクチン接種の毒性を巨視的及び組織学的評価によって分析した。
【０１０１】
各グループの残りの動物には、右腹部へ１０４個の黒色腫Ｂ１６−Ｆ１０細胞を皮下（ｓｃ．）注射した。腫瘍細胞注射から１５及び３０日後、グループ当たり５匹のマウスを犠牲にし、既述のように評価した。
【０１０２】
評価したいずれの動物にも巨視的レベルで毒性事象は認められず、組織病理学的分析は、最後の免疫化から３０日後に検査したいずれの臓器にも損傷を示さない。免疫学的評価は、（１）血清におけるマウスＶＥＧＦレベルの評価；（２）Ｔ及びＢリンパ球の細胞含量、並びに脾臓、上腕腋窩及び鼠径リンパ節における樹状細胞の成熟度とした。
【０１０３】
未処置動物の血清におけるマウスＶＥＧＦのレベル（マウスＶＥＧＦ用のＲ＆Ｄキット）の分析は、腫瘍への曝露時間の増加につれて、経時的な腫瘍サイズの増加に伴って、ＶＥＧＦレベルが血清中で増加することを示した。ヒトＶＥＧＦに対して免疫化したグループでは、マウスＶＥＧＦレベルの有意な低下（ｐ＜０．００１ＡＮＯＶＡ、事後テストボンフェローニ）が検出され、腫瘍チャレンジ後３０日を過ぎても持続した。
【０１０４】
各時点で犠牲にした動物の免疫系の状態は、Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ他（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  Ｄ他、Ｂｌｏｏｄ、９２巻、４１５０ページ、１９９８年）の報告に従い、リンパ節及び脾臓に存在する細胞集団の比率の検討により分析した。これらの検討のため、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）及びフィコエリトリン（ＰＥ）で標識した、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ８６（Ｂ７−２）分子を認識する市販のモノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）を用いる細胞集団の可視化を可能にした。
【０１０５】
得られた結果を表８に示す。
【０１０６】
【表８】
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注：どの場合においても、値は、定量した細胞の合計に対する陽性細胞の割合を示す。
【０１０７】
免疫化から３０日後の動物におけるリンパ系細胞集団及び樹状細胞の成熟の分析は、ＶＥＧＦ  ＤＮＡによるワクチン接種は、動物の免疫状態にいかなる変化も引き起こさないことを示している。しかしながら、腫瘍移植から３０日後、非ワクチン接種動物は、リンパ節と脾臓の双方で、腫瘍チャレンジ前の比に対してＴリンパ球／Ｂリンパ球比（ＣＤ３／ＣＤ１９）の減少を示す。さらに、脾臓においては特に、リンパ系細胞数の有意な減少が認められる。これらの動物では、リンパ節と脾臓の双方における成熟樹状細胞数の減少も観察される。ＶＥＧＦ  ＤＮＡをワクチン接種したマウスのグループでは、すべてのパラメータの有意な回復が認められ、このグループの動物において観察された血清中のＶＥＧＦレベルの低下と相関していると思われる。
【配列表】
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