(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物培養装置であって、
基材と、
基材に付着してそれぞれ第１の対向面および第２の対向面を含む複数の液体保持ディスクと、
複数の各液体保持ディスクの第１の表面に隣接する反射体と、を含み、
選択された波長の電磁エネルギーがディスク通過後に反射体から反射されること、並びに接種媒体が除去可能に装置に付着されていることを特徴とする、微生物培養装置。
【請求項２】
複数の各ディスクが、アッセイ試薬、蛍光原指示薬、または増殖培地の１種以上を含むことを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
複数のディスクが少なくとも第１のディスクセットおよび第２のディスクセットを含み、各ディスクセットが均一サイズの複数のディスクを含み、さらに第１のディスクセット中のディスクが第２のディスクセット中のディスクよりも大きいことを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
少なくとも１つの標的微生物を検出する方法であって、
液体試験サンプル、及び請求項２に記載の装置を提供する工程と、
前記液体試験サンプルを接種媒体に装填する工程と、
前記接種媒体を前記複数のディスクに接触させる工程と、
励起エネルギーをディスクアッセイ装置に向ける工程と、
励起エネルギーに反応して標的微生物を含む複数の各ディスクから放出される信号エネルギーを検出する工程と、を含み、
信号エネルギーの少なくとも一部が反射体によって反射されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ディスクアッセイ装置、システム、および生物学的サンプルを培養してサンプル内に存在する微生物を検出および／または計数するための使用方法に関する。
【０００２】
微生物の検出および計数は、食品加工業（Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳ．ａｕｒｅｕｓなどの微生物による食品汚染を試験する）、医療産業（感染症または汚染について患者サンプルおよびその他の臨床サンプルを試験する）、環境試験産業、製薬工業、および化粧品工業をはじめとする多数の環境で実施される。
【０００３】
増殖ベースの微生物の検出および計数は、一般に液体栄養培地（最確数分析（ＭＰＮ））または半固体栄養培地（寒天ペトリ皿）のいずれかを使用して実施される。液体ＭＰＮ法を使用した計数は、典型的に当該サンプルの逐次１０倍希釈を、選択培地および化学指示薬を含有する試験管の反復セットに入れることによって達成される。試験管を高めた温度で培養し（２４〜４８時間）、続いて生物体の増殖を調べる。試験したサンプルの容積、ならびに各セットの陽性および陰性試験管数に基づく統計学式を使用して、最初のサンプル中に存在する生物体数を推定する。
【０００４】
ＭＰＮ分析を実施するこの方法は、いくつかの不都合を有する。それは、分析を実施するのに必要な複数の希釈およびピペット操作工程のために、労働集約的である。加えて、事実上、各希釈に対して約３〜５本の試験管の反復セットを使用することだけが実際的である。その結果、微生物濃度についてのＭＰＮ推定値の９５％信頼限界は非常に広い。例えば、試験管３本のＭＰＮ推定値２０の９５％信頼限界は７〜８９の範囲である。
【０００５】
上述の方法とは対照的に、サンプル中の生存微生物の直接的計数は、栄養培地を含有するゲル化剤を使用して画定された領域の上にサンプルを広げることによって達成できる。ゲル化剤（寒天）は培養（２４〜４８時間）中に生物体の拡散を防ぎ、元の生物体が付着された領域内にコロニーが生じる。しかしながら、隣接コロニーとの融合が計数を困難にする前に、栄養培地の特定領域内に収まりうるコロニー数には限界がある。このため、通常、各サンプルにつきいくつかの希釈を実施することが必要になる。加えて混合個体群内に存在する個々のタイプの微生物を同定するのに使用できる化学指示薬分子のクラスは、ゲル化培地に不溶性の生成物を生じるものに限定される。
【０００６】
これらの方法のいくつかでは、微生物の検出または計数は、例えば、励起（検出すべき微生物の存在によって指標物質が活性化される場合）に反応して指標物質によって放出される蛍光などの電磁信号を検出することによって決定される。励起は、例えば、レーザーからの電磁エネルギーの形態で提供されてもよい。公知のアッセイ装置の１つの潜在的問題は、励起のために使用される電磁エネルギーが、基材中に存在するその他の物質または装置のその他の部分も励起して、所望の指示薬によって放出されるのと類似した電磁信号を放出させるかもしれないことである。例えば、アッセイが指示薬と同一または類似の波長領域で螢光を発するポリマー基材上で形成される場合、基材によって比較的高いバックグラウンド電磁信号が生じ、信号対バックグラウンド比が低下する。より低い信号対バックグラウンド比は、所望の微生物の正確な検出または計数をより難しくする。
【０００７】
本発明は、微生物を検出および計数するための装置および方法を提供する。装置および方法は、基材に付着する複数のディスクと、各ディスクの１表面に隣接する反射体とを含み、選択された波長の電磁エネルギーがディスクを通過した後にそのエネルギーを反射する。反射体は、アッセイ装置での標的微生物の検出および／または計数精度を改善するのに有用かもしれない。ディスクアッセイ装置で標的微生物を検出および／または計数するシステムも提供される。
【０００８】
本発明の装置および方法の１つの利点は、各ディスクに隣接する反射体が、ディスクに向けられた励起エネルギーがディスクを通過した後に、それを反射してもよいことである。その結果、ディスクを通過する励起エネルギーの有効経路長は、励起エネルギーがディスク通過後に反射されないアッセイ装置と比べて２倍になる。その増大した経路長は、励起エネルギーの強度を効率的に増大することによって、微生物の検出および／または計数の精度を改善するかもしれない。
【０００９】
本発明の装置および方法のもう１つの潜在的利点は、標的微生物の検出および／または計数中に、反射体が信号対バックグラウンド比を改善するかもしれないことである。場合によっては、反射体は、好ましくは下にある基材への励起エネルギーの透過を減少させまたは防止する。別の場合には反射体は、例えば、励起エネルギーに反応して、指標物質によって放出される電磁信号エネルギーに類似した、例えば、基材からの電磁エネルギーの透過を減少させまたは防止する。どちらの場合も反射体があることで、アッセイ装置から放出される電磁信号エネルギーは、下にある基材または装置のその他の部分でなく、標的微生物の存在をより正確に示すかもしれない。
【００１０】
反射体が、ディスク内またはディスク上の標的微生物の存在の結果として生じた電磁信号エネルギーに対しても反射性であれば、信号対バックグラウンド比がさらに改善されるかもしれない。反射体が検出器の反対側のディスク面にあれば、反射体の方向に放出される電磁信号エネルギーの少なくとも一部が、検出器に向けて反射し返され、それによって放出される信号エネルギーの強度を潜在的に増大させるかもしれない。放出される信号エネルギー強度の増大は検出精度を改善し、場合によっては、より短い培養期間後の標的微生物の検出を可能にするかもしれない。
【００１１】
反射性壁を含む本発明の励起／検出システムに関して、１つの潜在的利点は、壁の反射能が試されるアッセイ装置の励起における均一性を改善するかもしれないことである。
【００１２】
一実施態様で、本発明は、基材と、基材に付着してそれぞれが第１および第２の対向面を有する複数の液体保持ディスクと、複数の各ディスクの第１の表面に隣接する反射体とを含み、選択された波長の電磁エネルギーがディスク通過後に反射体から反射される、微生物培養装置を提供する。
【００１３】
もう１つの態様では、本発明は、基材と、基材に付着してそれぞれが第１および第２の対向面を有する複数の液体保持ディスクと、複数の各ディスクの第１の表面に隣接する反射体とを含み、ディスクの少なくとも１つが増殖培地、指標物質、および標的微生物をさらに含む、ディスクアッセイ装置を提供する工程と、励起エネルギーをディスクアッセイ装置に向ける工程と、励起エネルギーに反応して標的微生物を含む複数の各ディスクから放出される信号エネルギーを検出する工程とを含み、信号エネルギーの少なくとも一部が反射体により反射される、少なくとも１つの標的微生物を検出する方法を提供する。
【００１４】
もう１つの態様では、本発明は、基材を提供する工程と、それぞれが第１および第２の対向面を有する複数の液体保持ディスクを基材上に配置する工程と、複数の各ディスクの第１の表面に隣接する反射体を提供する工程とを含み、選択された波長の電磁エネルギーがディスク通過後に反射体から反射される、ディスクアッセイ装置を製造する方法を提供する。
【００１５】
もう１つの態様では、本発明は、選択された波長の電磁励起エネルギーを放出する少なくとも１つの励起源と、その上に入射した電磁励起エネルギーの大部分を反射する少なくとも１つの壁を含む検出チャンバーと、検出チャンバー内に配置された、電磁励起エネルギーに反応してアッセイ装置から放出される電磁信号エネルギーを検出する検出器とを含む、ディスクアッセイ装置で標的微生物を検出するためのシステムを提供する。
【００１６】
以下の本発明の例証となる実施態様に関連して、本発明のこれらのおよびその他の特徴と利点について述べる。
【００１７】
本明細書において用語「微生物」は、細菌、マイコプラズマ、リケッチア、スピロヘータ、イースト、カビ、原生動物をはじめとするがこれらに限定されない全ての微視的生体および細胞、並びに、例えば単一細胞（培養された、あるいは組織または器官に直接由来する）または小さな細胞凝集塊などの真核細胞の微視的形態を含む。微生物は、細胞全体が直接検出される場合だけでなく、かかる細胞が、細胞断片、細胞由来生物学的分子、または細胞副産物の検出または定量化によるなど、間接的に検出される場合にも、検出されおよび／または計数される。
【００１８】
本発明は、標的微生物の検出および／または計数のための装置および方法を提供する。装置および方法は、基材に付着する複数のディスクと、各ディスクの１表面に隣接した、選択された波長の電磁エネルギーがディスクを通過した後にそのエネルギーを反射する反射体とを含む。反射体は、アッセイ装置での標的微生物の検出および／または計数の精度を改善するのに有用かもしれない。ディスクアッセイ装置で標的微生物を検出および／または計数するためのシステムも提供される。本発明のこれらの異なる態様の例証となる実施態様について、以下に述べる。
【００１９】
本発明のアッセイ装置および方法は、基材上の複数の液体保持ディスクを含む。本発明で「複数の各ディスク」と述べる場合は、その特徴を有さない１つ以上の他のディスクがアッセイ装置上に含まれてもよいと理解されるであろう。
【００２０】
いくつかのアッセイ装置の例は、１９９７年４月９日に出願された同一譲受人の同時係属中の米国特許出願第０８／８３８，３９７号（国際公開第ＷＯ９８／４５４０６号）、１９９７年に１２月２３日出願された同第０８／９９７，３３７号（国際公開第ＷＯ９９／３２６０１号）、および１９９９年３月９日に出願された同第０９／２６４，８０４号（代理人整理番号５４７２２ＵＳＡ１Ａ）で述べられている。
【００２１】
本発明の装置および方法の１つの特に有用な用途は、液体試験サンプル中の微生物の増殖ベースの検出および計数である。かかる増殖ベースの検出および計数は、微生物による汚染について、食品、環境、臨床、製薬、化粧品、およびその他のサンプルを試験するのに非常に重要である。本発明の方法および装置は、かかるサンプルの効率的で正確な、便利で費用効率の良い試験を可能にする。かかる微生物学的試験における本発明の方法および装置の１つの好ましい使用は、最確数（ＭＰＮ）分析にあるかもしれない。
【００２２】
図１および２に関して述べると、１つのアッセイ装置１０が図解されている。アッセイ装置１０の基材２０は、以下に述べるように基材２０に付着したディスク４０のための適切な支持体を提供する基材表面２２を画定する。例証となる実施態様に関して述べられる基材は概して平面フィルムであるが、基材表面がアッセイ装置で使用される複数のディスクにとって必要な支持体を提供できれば、基材２０は任意の適切な形状をとってもよい。ディスク４０以外のアッセイ装置１０の部分は、ディスク４０間の相互汚染を防止するのを助けるために比較的疎水性であることが好ましいかもしれない。
【００２３】
基材２０は、例えば、ポリマーフィルムまたはその他の適切な材料から製造できる。適切なポリマーとしては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリイミド、フルオロポリマー、ポリカーボネート、ポリウレタン、およびポリスチレンが挙げられが、これらに限定されるものではない。好ましくは、基材２０のために使用される材料は、標的微生物の増殖または検出を妨げるかもしれないいかなる化学物質も浸出させないであろう。基材２０は単一の均質な層として表現されているが、層でまたは他の状態で提供される２つ以上の異なる材料から形成されてもよい。あるいはまた、基材２０は同一材料の複数の層から形成されてもよい。
【００２４】
基材２０に付着するディスク４０は、例証となる実施態様では概して平面である第１および第２の対向面４２および４４を含む。一般に、基材２０に対面する表面４２は、ディスク４０が付着する基材表面の形状と相補的な形状を有するであろう。
【００２５】
ディスク４０は、概して円柱形状を有するものとして図解されているが、本発明に関して使用されるディスクは任意の適切な形状をとることができ、本発明は円柱形状のディスクに限定されない。例えば、ディスクは、円形、楕円形、四角形、もしくは多角形形状またはその他の適切な形状であってもよい。
【００２６】
ディスク４０は、好ましくは十分な距離によって基材表面２２で相互に離間され、培養中にディスク４０間の相互汚染が防止される。ディスク４０間の領域を本明細書ではランドエリア１４と称する。ディスク４０間の正確な間隔は、基材２０の疎水性、ディスク４０の親水性、培養サンプルの性質などをはじめとするが、これに限定されない、様々な要因に依存する。
【００２７】
ディスク４０は、図２で図解されるような接着剤５０をはじめとするが、これに限定されない、当技術分野で公知の種々の技術によって、基材２０に付着されてもよい。種々の材料、構造物などがディスク４０と基材２０との間に介在してもよいが、本発明の目的のためには、ディスク４０は基材２０に「付着する」として述べられる。例えば、接着剤５０がディスク４０と基材２０との間に介在する。好ましい接着剤としては、例えば、米国特許第５，４０９，８３８号で開示されているような非水溶性のイソオクチルアクリレート接着剤が挙げられる。接着剤５０は、単独で提供されてもよく、またはそれはスクリムもしくは、例えば、両面感圧接着テープ形態のその他の支持層上に提供されてもよい。
【００２８】
アッセイ装置１０はまた、ディスク４０の表面４２に隣接する反射体３０、および基材２０も含む。反射体３０は、選択された波長の電磁エネルギーがディスク４０を通過した後に、そのエネルギーを反射する。「反射する」（およびその語尾変化）とは、反射体３０が実質的に、電磁放射の選択された波長の透過を減少させるまたは防止することを意味する。好ましい実施態様では、反射体３０は、少なくともいくつかの選択された波長の実質的に全ての電磁放射を反射するであろう。透過の減少は、得られたアッセイ装置が提供する信号対バックグラウンド比を効率的に増大させるのに十分顕著であるべきである。
【００２９】
反射体３０は、場合によっては、選択された波長外の電磁エネルギーを透過してもよい。例えば、反射体３０は、反射体３０を通って基材２０へ励起エネルギーがほとんどまたは全く通過しないような十分に高い、励起エネルギー波長に対する不透過度を示してもよい。その結果、励起エネルギーが基材２０中の材料を励起することが実質的に妨げられる。
【００３０】
反射体３０が励起エネルギーおよび／または電磁信号エネルギーの波長の大部分または実質的に全てを反射することが好ましいかもしれない。反射体３０が励起エネルギーに対して反射性である場合、ディスク４０を通る励起エネルギーの有効経路長は、励起エネルギーが反射体３０から反射された後ディスク４０を通って再度反射し返されるので、事実上倍増されうる。
【００３１】
ディスク４０内または上に標的微生物が存在する結果として生じた電磁信号エネルギーに対して、反射体３０が反射性である場合、その時は基材２０の方向に放出される任意のかかる信号エネルギーを反射することができるので、ディスク４０の第２の表面４４の上に位置する検出器によって、放出される信号エネルギーを検出できる機会が増加する。
【００３２】
各ディスク４０の表面４２に隣接する反射体３０は、様々な異なる形態をとってもよい。しかしながら、いずれにせよ、標的微生物の増殖または検出を妨げるかもしれないいかなる化学物質も反射体３０が浸出させないことが好ましいかもしれない。
【００３３】
一実施態様では、各ディスク４０の表面４２に隣接する反射体３０は、選択された波長の電磁エネルギーを反射する反射層の形態で提供されてもよい。所望の電磁エネルギーを反射しさえすれば、反射層は任意の材料から構築されてもよい。例えば、反射層を金属層の形態で提供して、反射体３０を提供してもよい。金属層は、例えば、蒸着、スパッタリングなどの金属を基材に沈積させる任意の公知の技術によって形成されてもよい。あるいはまた、選択された波長の電磁エネルギーに対して十分な反射率を備えた金属層を提供するためのその他の任意の適切な技術を使用してもよい。例えば、金属層を金属含有マトリクスの形態で提供してもよい。
【００３４】
金属層は、１種以上の金属、１種以上の金属化合物、または１種以上の金属と１種以上の金属化合物との組合せを含んでもよい。金属層のための適切な金属の例としては、アルミニウム、チタン、クロム、スズ、金、鉄、白金、パラジウム、銀、およびそれらの２種以上の組合せが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また金属化合物を使用して金属層を形成してもよい。例えば、反射体３０を形成する金属層は、金属の代わりに、または金属に加えて、例えば、二酸化チタンなどの１種以上金属酸化物を含んでもよい。場合によっては、反射体３０の金属層が実質的に、１種以上の金属、１種以上の金属化合物、または１種以上の金属と１種以上の金属化合物との組合せから構成されることが好ましいかもしれない。
【００３５】
反射体３０の金属層のもう１つの代案は、１種以上のインクを含んでもよい。インクが、例えば、１００％固形分インクのような紫外線硬化性インクなどの硬化性インクの形態であることが好ましいかもしれない。所望の光の波長が反射しさえすれば、反射体３０で使用されるインクまたはインク群は、顔料、染料、合成樹脂、またはこれらの任意の組合せ、あるいはその他の材料を含んでもよい。インクが染料を含む場合、それらは好ましくは、選択された微生物の存在の検出を左右するアッセイ波長を妨げない波長で、非蛍光性または蛍光性である。
【００３６】
反射層を使用して、ディスク４０の表面４２に隣接する反射体３０が提供され、反射層が基材２０上に位置する場合、図１および２に図解されるように、反射層が実質的に基材表面２２と同一の広がりを持ってもよい。あるいはまた、反射層が基材２０の一部分のみに存在してもよい。しかしながら、少なくとも、各ディスク４０の表面４２に隣接する反射体３０が提供される。
【００３７】
図３Ａに関して述べると、反射体１３０がディスク１４０と基材１２０との間のみに位置するアッセイ装置１１０が図解されている。隣接するディスク１４０間のランドエリア１１４は、好ましくは実質的に反射体１３０を含まない。
【００３８】
図３Ａの実施態様において図解されるもう１つの特徴は、（図１および２の実施態様で見られるように）基材上でなく、ディスク１４０の表面１４２の直上にある反射体１３０の位置である。反射体１３０およびディスク１４０は、例えば、接着剤１５０または任意のその他の適切な技術を使用して、基材１２０に付着させてもよい。
【００３９】
図３Ｂに関して述べると、反射体１３０’が基材１２０’の反対側を向く表面１４４’に隣接して付着される、もう１つのアッセイ装置１１０’が図解されている。かかる実施態様では、ディスク１４０’は励起されて基材１２０’を通して読まれてもよく、反射体１３０’は好ましくはディスク１４０’の表面１４４’に向かって伝わる電磁信号エネルギーを表面１４２’および基材１２０’に向けて反射し返す。反射体１３０’も好ましくは、ディスク１４０’を通る励起エネルギーの有効経路長が増大できるように、その上に入射した励起エネルギーを反射する。この実施態様では、基材１２０’が、実質的に励起および／または検出を妨げない材料から構成されることも好ましいかもしれない。
【００４０】
本発明のアッセイ装置で使用される液体保持ディスクは、様々な材料から構築されてもよい。ディスクで使用される材料の少なくとも一部は比較的親水性であることが好ましいかもしれない。あるいはまた、ディスクの構造は、例えば、毛細管吸上力などによりディス内に液体を保持できるようなものであることが好ましいかもしれない。かかる構築物では、ディスクに使用される材料は、親水性であってもよいし、または親水性でなくてもよい。
【００４１】
ディスクに使用される材料は、線維状であってもよく、すなわち複数の繊維から形成されてもよく、その繊維は織布または不織布であって、ディスク材料を形成してもよい。ディスク材料としては、セルロース系材料、ポリオレフィン、ポリエステル、ポリアミドなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。適切なセルロース系材料としては、紙、木材パルプおよびレーヨンが挙げられ、セルロースエステルなどの化学的に変性されたセルロース系材料を含んでもよい。適切なポリオレフィンとしては、親水性ポリエチレンまたは親水性ポリプロピレン繊維が挙げられる。適切なポリアミドとしては、ナイロンが挙げられる。適切なポリエステルとしては、ポリ乳酸が挙げられる。
【００４２】
さらにディスクのために使用される材料は、電磁励起エネルギーおよび電磁信号エネルギーの双方の大部分を透過することが好ましいかもしれない。しかしながら、双方の形態のエネルギーは、ディスクを通過する際、特にディスクが繊維材料から形成されている場合には、いくらかの屈折またはその他の拡散に遭遇するかもしれない。
【００４３】
ディスクの厚さ（例えば、図２の表面４２と４４の間で測定されるような）は、様々な要因に基づいて異なってもよい。しかしながら、ディスクは少なくとも約０．１ｍｍ以上、より好ましくは少なくとも約０．３ｍｍ以上の厚さを有することが好ましいかもしれない。上限では、ディスクは約１ｍｍ以下、より好ましくは約０．８ｍｍ以下の厚さを有することが好ましいかもしれない。
【００４４】
上述のように、本発明のアッセイ装置で使用されるディスクは、好ましくは液体保持容量を有し、すなわち、それらはその中にまたはその上に沈積された一定量の液体を保持する。下限では、各ディスクは少なくとも約０．５μｌ、より好ましくは少なくとも約１μｌ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約２μｌの液体保持容量を有することが好ましいかもしれない。上限では、各ディスクは約１００μｌ以下、あるいはまた、約２５μｍｌ以下の液体保持容量を有することが好ましいかもしれない。１つの好ましいディスクの液体保持容量範囲は約１μｌ〜約２０μｌであるかもしれない。
【００４５】
アッセイ装置上のディスクの数は、サンプルサイズ、ディスクサイズなどをはじめとする様々な要因に依存して異なってもよい。下限では、装置は少なくとも約２個以上のディスク、より好ましくは少なくとも約１０個以上のディスク、そしてさらにより好ましくは約２５個以上のディスクを含むことが好ましいかもしれない。上限では、装置は約１０，０００個以下のディスク、より好ましくは約１，０００個以下のディスク、さらにより好ましくは約６００個以下のディスクを含むことが好ましいかもしれない。別の実施態様では、各アッセイ装置上に約１００〜約２００個のディスクを提供することが望ましいかもしれない。
【００４６】
アッセイ装置上のディスクの全てが液体保持容量において均一であることが好ましいかもしれない。ディスクの全てがアッセイ表面上で同一表面積を占有することも好ましいかもしれない。均一の液体保持容量およびサイズを呈するディスクを使用することによって、異なる容量および／またはサイズのディスクを呈する装置と比較して、培養結果およびこれらの結果の検出の双方の精度が改善されかもしれない。
【００４７】
液体容量およびサイズの双方が均一であるディスクを備えたかかる装置は、ＭＰＮ分析を使用する微生物濃度についての液体サンプル試験との関連で特に有用であるかもしれない。特定の規制上の要件により、試験方法が１〜５ｍｌのサンプル中の１個の微生物を検出できなければならないと決定されるかもしれない。かかるサンプルサイズは、食品加工産業において微生物学的試験にとっては標準的である。したがって、例えば、各ディスクが約２μｌの容量を有する５００個の液体保持ディスクを有するアッセイ装置は、１ｍｌのサンプルを試験するのに非常に有用である。２μｌの容量を有する液体保持ディスクは、本発明に係る検出できる信号の迅速な発現を可能にするかもしれず、約４００〜約６００個のディスクの使用は、十分に大きいデータポイント数を提供し、ＭＰＮ分析計算の信頼区間を実質的に改善するかもしれない。さらに、微生物について陽性である液体保持ディスク試験の手動計数を実施することも可能である。実質的に４００個を超える液体保持ディスクを有する装置の使用は、実際問題として、計器支援計数または自動計数を必要とするかもしれない。
【００４８】
代案の実施態様では、同一装置上で異なる液体保持容量のディスクを提供することが望ましいかもしれない。異なる容量に加えてまたはそれに代えて、アッセイ表面で異なる表面積を占有するディスクを提供することが望ましいかもしれない。しかしながら、多くの場合、異なる容量を備えたディスクはアッセイ表面で異なる表面積を占有する。
【００４９】
各セットが液体容量およびサイズの双方において均一であるディスクを備えた２つ以上のセットで、液体保持ディスクを提供することもさらに好ましいかもしれない。ディスクセットの容量およびサイズは好ましくは異なり、容量およびサイズが、異なるディスクセット毎に漸増変化することもさらに好ましいかもしれない。例えば、一実施態様では、アッセイ装置が全部で１００個のディスクを含み、５０個のディスクは約２０μｌの容積を有し、５０個のディスクは約２μｌの容積を有してもよい。
【００５０】
図４〜６で図解されるアッセイ装置２１０は、異なる液体保持容量および異なるサイズを有するディスク２４０ａおよび２４０ｂの２つのセットを含む。図４で図解されるように、より大きなディスク２４０ａがより小さいディスク２４０ｂを実質的に囲むことが好ましいかもしれない。より大きいディスク２４０ａは一般により小さいディスク２４０ｂとアッセイ表面外側縁２１２との間に。このようにディスクを配置することによって、より大きいディスク２４０ａは、より小さいディスク２４０ｂの領域に給湿する役割を果たし、ならびに加温培養中に生じるような、より小さいディスク２４０ｂを乾燥させるかもしれない気流から、より小さいディスク２４０ｂを部分的に遮蔽するので、より小さなディスク２４０ｂの乾燥が減少しまたは防止される。この利点を得るために、より小さいディスク２４０ｂそれ自身またはアッセイ表面外側縁２１２のどちらかに関して、より大きいディスク２４０ａがより小さいディスク２４０ｂを完全に取り囲むことは必要ではないかもしれない。
【００５１】
アッセイ装置２１０は任意の接種媒体２６０を含んでもよい。接種媒体２６０は、引き続くディスク２４０ａおよび２４０ｂの接種用サンプルを保持できる。可能な接種媒体２６０の例としては、吸収性パッド、熱成形プレート、リザーバなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
実施態様で図解される接種媒体２６０は、好ましくは媒体２６０がディスク２４０ａおよび２４０ｂに接触できるような様式で、アッセイ装置２１０に付着されてもよい。１つの好ましい方法は、接種媒体２６０をミシン目２６２に沿って付着させることである。この構成では、使用後単にミシン目２６２に沿って破ることによって、接種媒体２６０を装置２１０から除去してもよい。媒体２６０は、好ましくはその上にディスク２４０および２４０ｂが位置するアッセイ表面２１２の部分を実質的に覆う。
【００５３】
サンプルをディスクに分配するために、サンプルを最初に接種媒体２６０中に装填する。媒体２６０に装填した後、それをディスク２４０ａおよび２４０ｂに接触させる。サンプルは、好ましくは事実上同時にそして均一に生じるプロセスで、好ましくは媒体２６０からディスク２４０ａおよび２４０ｂ中へ移行する。
【００５４】
１つの実施態様では、接種媒体２６０は、その上に裏材２６６が付着した吸収性接種パッド２６４である。パッド２６４は、例えば、ディスク材料について上で列挙したものなど、任意の数の材料からできていてもよい。製造目的のためには、ディスク２４０ａおよび２４０ｂと同一の材料からパッド２６４を構築することが望ましいかもしれない。パッド２６４は、任意のサイズまたは形状であってもよい。好ましくは、パッド２６４は、ディスク２４０ａおよび２４０ｂに接触させてパッド２６４を置いた際にディスクの全てが確実に接種されるように、パッド２６４がディスク２４０ａおよび２４０ｂの全てを覆うように、ディスク２４０ａおよび２４０ｂが位置する領域を超えてアッセイ表面２１２を覆う。
【００５５】
裏材２６６は、ユーザーの手元に届いた形態で、好ましくは各装置２１０が接種媒体２６０を含むように装置２１０に付着してもよい。裏材２６６がミシン目２６２に沿って、脱着可能な様式で付着することが好ましいかもしれない。裏材２６６が比較的薄いこと、および標的微生物の増殖または検出を妨げるかもしれない化学物質をそれが浸出させないこともまた好ましい。製造目的のためには、裏材２６６は基材２２０と同じ材料または材料群から製造してもよい。
【００５６】
パッド２６４は、接着剤２６８を用いるなど、当技術分野で公知の任意の方法で裏材２６６に付着させてもよい。好ましくは、パッド２６４および裏材２６６は、化学物質の浸出をもたらさないような様式で付着する。
【００５７】
図４〜６では、アッセイ装置２１０と共に提供してもよい任意のカバーシート２１８も図解されている。カバーシート２１８は、ディスク２４０ａおよび２４０ｂを汚染から保護し、あるいは装置２１０へのサンプル添加後は、乾燥から保護する役割を果たしてもよい。カバーシート２１８は、いくつの材料から構築されてもよい。カバーシート２１８は、可撓性、カバーシート２１８を通して励起および／または検出が実施できる程度の透明度、増殖している微生物ならびに装置と共に使用されことになる励起および／または検出システムとの適合性（例えば、ルミネセンスもしくは蛍光、または検出を実質的に妨げる程度の不透明度を示さない）、そして化学安定性（すなわち、液体サンプルと接触した時に望ましくない化学物質を浸出させない）などの１つ以上特性を有することが好ましいかもしれない。
【００５８】
カバーシート２１８は、ディスク２４０ａおよび２４０ｂの実質的に全て、より好ましくはディスク２４０ａおよび２４０ｂの全てを覆うように、装置２１０に付着してもよい。カバーシート２１８およびアッセイ表面２１２は、カバーシート２１８がアッセイ表面２１２に接触してシールできるような大きさであることが好ましいかもしれない。この用途の目的上、「シール」とは、アッセイ表面２１２とカバーシート２１８との結合が気密であることを要さない。その代わり、カバーシート２１８は、単に基材２１２に重なって実質的に接触し、使用中の汚染およびディスク２４０ａおよび２４０ｂからの過度の蒸発を減少させまたは防止する。
【００５９】
１つの実施態様では、カバーシート２１８、基材２２０、および接種媒体２６０は全て、装置２１０の一端で相互に付着し、ヒンジ２１６を形成してもよい。この構成では、接種媒体２６０は好ましくはカバーシート２１８と基材２２０との間に付着してもよい。
【００６０】
別の実施態様では、ディスク２４０ａおよび２４０ｂの接種後に、カバーシート２１８をアッセイ装置２１０に追加してもよい。カバーシート２１８は、例えば接着剤などの任意の適切な技術によって付着してもよい。
【００６１】
本発明のアッセイ装置で使用されるディスクは、様々なアッセイ試薬を含んで、選択された微生物の増殖、検出、および／または計数を助けてもよい。１つのアッセイ試薬は、液体試験サンプルをディスク内に分配した際に所望の濃度を得るのに十分な量で、コーティングまたは別の沈積物として、液体保持ディスク内またはその上に提供されてもよい栄養増殖培地である。増殖培地によってその増殖が可能になるまたは差別化される特定群の微生物に対して、増殖培地が選択性を示すことが好ましいかもしれない。
【００６２】
例えば、栄養培地の溶液または懸濁液をディスク上に配置または分散させ、乾燥させて、ディスク上に栄養培地のコーティングまたは沈積物を生成させることによって、栄養増殖培地を提供してもよい。あるいはまた、増殖培地の構成要素は、接着剤または（当てはまる場合）ディスクを基材に付着する他の物質中に存在してもよい。ディスクの接種前における正確な位置にかかわりなく、増殖培地は、好ましくは究極的にディスク材料中に拡散して、（存在する場合）標的微生物の増殖を提供するような様式で提供される。
【００６３】
本発明のアッセイ装置のディスクは、ディスク上または中にその他のアッセイ試薬を含んでもよい。かかるアッセイ試薬としては、ゲル化剤、指標物質などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ゲル化剤は、増殖している微生物を「封入する」のを助けるかもしれない。水性液を添加するとゲルになる任意の吸水性の材料をはじめとする、かかるゲル化剤は当業者には公知である。
【００６４】
本発明に関連して有用な指標物質としては、増殖している微生物の存在下で信号を生じる任意の物質が挙げられる。いくつかの指標物質の例としては、色素産生、蛍光、蛍光原、ルミネセンス、電気化学およびその他の指示薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
本発明では、比較的低濃度で検出できるかもしれないことから、蛍光原指標物質が好ましいかもしれない。適切な蛍光原指標物質としては、４−メチルウンベリフェリルホスフェート、および４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコピラノシド、Ｌ−フェニルアラニン−７−アミド−４−メチルクマリンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。その他としては、酢酸４−メチルウンベリフェリルおよび硫酸４−メチルウンベリフェリルが挙げられる。
【００６６】
アッセイ試薬は、当業者には公知であるアッセイ試薬を固形基材上に固定化する多数の方法のいずれかによって、ディスク中に固定化できる。かかる方法としては、例えば、ディスク中でアッセイ試薬含有液を乾燥させる方法、並びに生体分子および別のアッセイ試薬を固形基材に非共有結合的に付着する他の方法が挙げられる。あるいはまた、当業者に周知の方法によって、アッセイ試薬をディスクに共有結合的に付着させる種々の方法を用いてもよい。本発明の利点は、液体保持ディスク中の水性生物学的サンプル液の閉込めによって、拡散が好ましくは減少または防止されるため、可溶性アッセイ試薬が使用できることである。
【００６７】
本発明のアッセイ装置および方法に関連して使用される液体試験サンプルは、任意の出所からの任意の当該サンプルであってもよい。サンプルは液体保持ディスクに直接分配させてもよく、またはサンプルはディスクへの分配前に希釈してもよい。サンプルの希釈が必要かどうかの判定は、サンプル源および材令などの様々な要因に依存し、かかる判定は当業者にとって日常的な事項である。
【００６８】
所望のアッセイ試薬を接種前にディスク中に提供することの代案として、例えば、増殖培地、指標物質、ゲル化剤などの１つ以上の所望のアッセイ試薬を液体試験サンプル自体の中に含めることが好ましいかもしれない。
【００６９】
種々の方法を用いて、液体試験サンプルを液体保持ディスクに分配してもよい。好ましい方法は、特定のアッセイ装置の構成にある程度依存するかもしれないが、１つ以上の方法を特定の装置に適用してもよい。サンプルは装置上に注いでもまたはピペットで入れてもよく、装置を傾けるまたは揺らすことによって、サンプルは液体保持ディスクへ広がる。あるいはまた、アッセイ装置またはアッセイ装置の一部をサンプルに浸すことができる。液体サンプルから取り出した後、液体は、親水性液体保持ディスク中に保持され、ディスク間の疎水性ランドエリアから実質的に排除される。
【００７０】
アッセイ装置の親水性液体保持ディスクへサンプルを分配した後、所望の用途次第で種々のアッセイを実施してもよい。微生物検出または計数のためには、微生物が少なくとも１回の細胞分裂サイクルを経るのに十分な時間、アッセイ装置を培養してもよい。これらの目的のためには、装置を一般に約２５℃〜約４５℃、より好ましくは約３０℃〜約３７℃で培養する。微生物検出のための培養時間は異なる。検出時間は、増殖速度およびサンプル中に存在する微生物数によっても異なる。これらを考慮して、計数のための検出時間は、わずか約１０時間であってもよい。この比較的短い培養時間は、典型的に約２４時間以上の培養時間を要する現行の検出方法と比べて、明確な利点である。
【００７１】
アッセイ装置の培養に続いて、ディスク中の（そしてひいては液体試験サンプル中の）微生物の存在または不在が検出される。検出の機序は、本方法で使用される指標物質のタイプに依存する。検出できる信号を提供できる任意の指標物質が使用できる。かかる指示薬としては、蛍光、色素産生、ルミネセンス、および電気化学指示薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない。色素産生またはルミネセンス指示薬を使用する場合、肉眼でまたは顕微鏡的にディスク中の微生物の存在または不在を視覚的に検出できる。指示薬は、コートされるかまたはその他の方法でディスク中に組み込まれる。
【００７２】
検出機序が、本発明の装置に含まれる金属層によって反射できる電磁信号エネルギーの放出を含むことが好ましいかもしれない。それに加えてまたは代案として、検出機序が、本発明のアッセイ装置に含まれる金属層によって下にある基材への到達から遮られる（そしてより好ましくは反射される）、電磁エネルギーによる励起に依存することも好ましいかもしれない。
【００７３】
蛍光指標物質を使用する場合、蛍光信号を検出するための装置および方法を検出のために用いてもよい。微生物を検出するための技術で公知の、電気化学変化を検出するためのシステムをはじめとする、多数の指標物質および信号検出システムがあり、任意のかかる物質またはシステムを本発明に従って使用してもよい。
【００７４】
液体サンプル中の微生物の検出は、液体試験サンプ中の微生物数の計数をさらに伴ってもよい。好ましい実施態様では、計数はＭＰＮを使用して実施される。当該微生物を含有する液体保持ディスクの数を測定したら、公知のＭＰＮ技術を使用してＭＰＮ計算を実施できる。必要であれば、例えば、公知の標準と比較した信号強度、またはディスク内容物のプレーティングなどの公知の技術を使用して、個々のディスク中の微生物の数を測定できる。有利なことに、本発明の方法では多数の液体保持ディスクを使用してもよいことから、（例えば、標準の試験管３本または試験管１０本のＭＰＮ方法と比べて）液体試験サンプルのＭＰＮ分析においてより狭い９５％信頼限界の間隔が可能になる。
【００７５】
単一装置中に多数の液体保持ディスクを製造してもよいことから、本発明の利点を保ちながら、複数の当該微生物の検出および計数において、単一装置を使用することが可能である。例えば、単一液体試験サンプルがＥ．ｃｏｌｉおよびＳ．ａｕｒｅｕｓの存在または濃度について試験できる。アッセイ装置の一部分は、これらの微生物の検出および計数のためのディスクを含有でき、他方第２のディスクセットは、もう１つの当該微生物の検出および計数に向けることができる。これは、例えば、微生物に特異的な栄養素および／または指標物質をそれぞれの液体保持ディスクセットに含めることによって達成される。あるいはまた、全ての液体保持ディスクは、複数の微生物の同時検出のためにデザインされたアッセイ試薬を含有できる。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは蛍光指標物質によって検出できる一方、同時に別の大腸菌群は、例えば、色素産生または別の指標物質によって検出される。
【００７６】
引き続く試験を実施してもよい。例えば、ディスクを装置から除去して試験管中へ移し、その上で増殖している特異的微生物を区別できる。
【００７７】
もう１つの実施態様では、複数のディスクセットを含むアッセイ装置の複数の液体保持ディスクに、液体試験サンプルのアリコートを分配できる。各セットは均一サイズのディスクを有し、装置は少なくとも２つのディスクセットを有する。例えば、アッセイ装置は、同一液体保持容量を有する特定レーン中に液体保持ディスクを備えた複数のレーンを含むことができる。この特徴によって、液体試験サンプルを単一アッセイ装置内で、異なる試験容積サイズに分配できるようになる。ＭＰＮではこの特徴は顕著な利点を提供し、高度に濃縮されたサンプルにおいて、系列希釈の必要なしに単一分配工程を単一装置中で使用して、適切な容積サイズを選択してＭＰＮ分析を実施してよい。
【００７８】
図７は、上述のアッセイ装置上のディスク中に存在する、選択された微生物の検出および／また計数に関連して使用できる一システムの模式図である。システムは、別のアッセイ装置と共に使用してもよいものと理解される。その用途と利点は、上述したように反射性ディスクアッセイ装置の使用に必ずしも限定されるものではない。
【００７９】
システム７０は検出チャンバー７４内に位置するアッセイ装置１０に、選択された波長の電磁励起エネルギーを供給する励起源７２を少なくとも１個、より好ましくは２個以上含む。検出チャンバー７４は、一形態では円柱の形状で提供される少なくとも１つの壁７６によって、大部分が画定されてもよい。検出チャンバー７４の形状が円柱がでない場合、それは複数の壁を含んでもよい。
【００８０】
励起源７２が、処理されるアッセイ装置１０に必要な励起波長で、十分なエネルギーを放出しさえすれば、励起源７２は任意の適切な形態をとってもよい。例えば、励起源７２は、いくつかの蛍光発生指標物質に有用かもしれない３６５ｎｍの波長を有する紫外光を放出してもよい。励起源７２は、干渉性のまたは非干渉性の電磁放射線を生じてもよい。
【００８１】
システム７０は、電磁励起エネルギーに反応して、アッセイ装置１０から放出される電磁信号エネルギーを検出するように配置された検出器７８も含む。検出器７８は、ＣＣＤカメラ、光ダイオードを含むがこれらに限定されない、電磁信号エネルギーを検出できる任意の適切な装置または装置群によって提供されてもよい。
【００８２】
検出チャンバー７４の壁７６は、その上に入射した電磁励起エネルギーの大部分を反射する材料から構築される。励起エネルギーを吸収または透過する代わりにそれを反射することによって、アッセイ装置に到達するエネルギーの量は増大する。もう１つの利点は、反射が励起強度の改善された均一性をもたらすかもしれないことである。壁７６が、その上に入射した電磁励起エネルギーの少なくとも約８０％（さらにより好ましくは少なくとも約９０％）を反射することが好ましいかもしれない（エネルギーが壁表面に直角な軸に沿って壁上に入射する場合）。場合によっては、かかるエネルギーの反射が検出器７８に到達するのを回避するために、壁７６が電磁信号エネルギーを反射しないことが望ましい。かかるエネルギーは、代わりに検出チャンバー７４に吸収されるかまたはそれを透過してもよい。
【００８３】
実施例
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために提供されるが、その範囲を限定するものと解釈されるべきではない。特に断りのない限り、全ての部および百分率は重量による。
【００８４】
実施例１：蒸着金属表面を有するディスク装置
蒸着金属表面を有し、液体試験サンプル中の微生物の検出および計数のために使用できる吸収性ディスクアッセイ装置をこの実施例で述べるようにして構築した。
【００８５】
イソオクチルアクリレート／アクリルアミド（９６／４重量比）感圧接着剤（ＰＳＡ）を用いて、吸収性不織セルロース系材料（製品グレード９０３、厚さ０．５２ｍｍ、１７９ｇ／ｍ２、ニューハンプシャー州キーンのＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ）のシートをポリエステルフィルム（Ｒｅｘａｍ「Ｄ」Ｌｉｎｅｒ、イリノイ州ウェストシカゴのＲｅｘａｍ  Ｒｅｌｅａｓｅ）にラミネートした。次に不織材料と接着剤層のみを切り抜く制御深度ダイを使用して、乾燥したラミネート中へ円形ディスク（８ｍｍ径）を切り抜いた。次にラミネートから非ディスク材料を除去して廃棄した。ピンセットでフィルムから４０個のディスクを慎重に剥がして、厚さ２ミル（０．０５ｍｍ）のポリエステルフィルムの１０５ｍｍ×１１５ｍｍシート（Ｇｒａｄｅ  ＮＡＴ  ２．０  ＰＥＴ  Ｓｉｌｏｘ  Ｈ６Ｇ／０、ニューヨーク州パーチェースのＡｋｒｏｓｉｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｐｅｒ）に移して、ディスク間がおよそ３〜５ｍｍの円形ディスク８×５個の配列を形成した。
【００８６】
次に両面テープで、二軸延伸ポリプロピレンフィルム（厚さ０．０４ｍｍ、３Ｍ  Ｃｏ．）の１０５ｍｍ×１１５ｍｍシートを底シートのディスク面の端に付着して装置のカバーシートとした。装置を平坦な台の上に置き、閉じたカバーシートに壁紙ローラーをかけて、ディスクを底シートに押さえつけた。得られたディスク装置１Ａは、蒸着金属表面がない比較装置であり、実施例２の蛍光信号評価のために使用した。
【００８７】
Ｇｒａｄｅ  ＮＡＴ  ２．０  ＰＥＴ  Ｓｉｌｏｘポリエステルフィルムの代わりに、ディスク付着面に推定７０〜１５０ｎｍのアルミニウム金属が蒸着した厚さ７ミル（０．１８ｍｍ）のポリエステルフィルム（ミネソタ州セントポールの３Ｍ  Ｃｏ．）で置き換えた以外は、ディスク装置１Ａについて述べたようにして、もう１つのディスク装置を調製した。蒸着金属表面を有する、得られた装置をディスク装置１Ｂとし、実施例２でディスク装置１Ａと比較した。
【００８８】
微生物の検出で使用するためのディスクアッセイ装置を次のようにして構築した。ラミネート加工に先だって、表１に列挙した増殖栄養素と指示薬化学品とを含有する水性ブロスで材料を飽和させ乾燥させた以外は、上述のようにして、吸収性不織セルロース系材料のシート（Ｄｅｘｔｅｒ  Ｇｒａｄｅ  １０２０１、厚さ０．４１５ｍｍ、４８．５ｇ／ｍ２、コネチカット州ウィンザーロックスのＤｅｘｔｅｒ  Ｎｏｎｗｏｖｅｎｓ）をポリエステルフィルム（Ｒｅｘａｍ「Ｄ」Ｌｉｎｅｒ）にラミネートした。次に不織材料と接着剤層のみを切り抜く制御深度ダイを使用して、乾燥したラミネート中へ円形ディスク（８ｍｍ径）を切り抜いた。次にラミネートから非ディスク材料を除去して廃棄した。滅菌ピンセットを使用して装置から１５個のディスクを剥がして、ポリエステルフィルム（厚さ０．１２ｍｍ、ミネソタ州セントポールの３Ｍ  Ｃｏ．）の１０５ｍｍ×１１５ｍｍ底シートに、ディスク間がおよそ１ｃｍの３×５個の分布型にディスクを移した。次に両面テープで、二軸延伸ポリプロピレンフィルム（厚さ０．０４ｍｍ、３Ｍ  Ｃｏ．）の１０５ｍｍｘ１１５ｍｍシートを底シートのディスク面の端に付着して、装置のカバーシートとした。装置を平坦な台の上に置き、閉じたカバーシートに壁紙ローラーをかけて、ディスクを底シートに押さえつけた。
【００８９】
得られたディスク装置、蒸着金属表面がない比較装置は、ディスク装置１Ｃと称され、実施例３で述べるように細菌の検出のために使用した。厚さ０．１２ｍｍのポリエステルフィルムの代わりに、上述のようにアルミニウム金属をディスク付着面に蒸着した厚さ７ミル（０．１８ｍｍ）ポリエステルフィルム（ミネソタ州セントポールの３Ｍ  Ｃｏ．）で置き換えた以外は、ディスク装置１Ｃについて述べたようにして、もう１つのディスク装置を調製した。ディスク装置１Ｄと称され、蒸着金属表面を有する、得られたディスク装置を実施例３でディスク装置１Ｃと比較した。実施例３で使用する前に、ディスク装置１Ｃおよび１Ｄの双方を約１０ｋＧｙのレベルでガンマ線照射した。
【００９０】
【表１】
0004748913.tif 000002
【００９１】
実施例２：ディスク装置からの蛍光信号の測定
この実施例の目的は、ディスク装置１Ａおよび１Ｂの不織材料中に存在する蛍光化合物から放出される蛍光信号の強度を測定して比較することにある。
【００９２】
ディスク装置１Ａ（金属表面なし）およびディスク装置１Ｂ（金属表面あり）の各不織ディスクに、トップフィルムを慎重に持ち上げて、０〜５００ｍモル／ｍｌの４−メチルウンベリフェロンを含有する溶液１５μｌを添加した。次にトップフィルムをそっと下ろして装置を閉じた。（４−メチルウンベリフェロンは、例えば、４−ウンベリフェリルホスフェートと微生物酵素ホスファターゼとの反応の最終生成物であることが注記される。この反応は、紫外光の下で螢光を発する４−メチルウンベリフェロンとして、細菌の存在を検出するのに有用である。）
【００９３】
特注設計の蛍光検出器によって、４−メチルウンベリフェロンの各濃度で、装置毎に４回測定した。ＣＣＤカメラの絞りは全ての測定で一定であり、露出時間は１０、２０、４０、および６０ミリ秒であった。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ｖ．５．０イメージ分析ソフトウェア（カリフォルニア州サンホセのＡｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、生の画像を分析した。楕円形のマーキーツールを使用して強制縦横比で、ディスクイメージの少なくとも７０〜８０％に近い各ディスク内の領域を選択した。選択された領域内で平均ピクセル蛍光を測定し、比較蛍光単位（ＲＦＵ）での結果を表２に報告する。
【００９４】
特注設計の蛍光検出器は、ＣＣＤカメラ（白黒ＣＣＤチップで構築された製品番号ＩＣＸ０８４ＡＫ、日本国のソニー）、紫外線照明（３６５ｎｍ）、反射性壁、およびディスク装置を保持できる平坦面から構成された。カメラがおよそ２０ｃｍの距離でディスクの方を向くように配置して、厚さ１ｍｍのフィルター（ＧＧ４２０、ドイツ国のＳｃｈｏｔｔ  Ｇｌａｓ）をカメラの前に配置した。カメラの両側に配置した２個の紫外線ランプ（製品番号ＢＦ３１６０ＵＶ１、カリフォルニア州パコイマのＪＫＬ  Ｃｏ．）によってディスクを照明した。厚さ１ｍｍのフィルター（ＵＧ１１、Ｓｃｈｏｔｔ  Ｇｌａｓ）をランプの前に配置した。検出器の壁は反射性であり、より均一なディスクの照明を提供するのを助けた。蛍光が生じると、カメラは得られた可視光を検出した。
【００９５】
【表２】
0004748913.tif 000003
【００９６】
表２中のデータは、ディスク装置１Ａ（蒸着金属表面なし）が、ディスク装置１Ｂ（蒸着金属表面あり）よりも高レベルの「バックグラウンド」蛍光を生じることを示す（０ミリモル／ｍｌの４−メチルウンベリフェロンで５１．５ＲＦＵ対３２．３ＲＦＵ）。データはまた、全てのレベルの４−メチルウンベリフェロン濃度で、ディスク装置Ｂがディスク装置Ａよりも高い信号対バックグラウンド比を生じることも示す。例えば、５００ミリモル／ｍｌの４−メチルウンベリフェロンでの信号／バックグラウンドレベルは、ディスク装置Ｂの３．１に対してディスク装置Ａでは１．５であった。蒸着金属表面を有するディスク装置の使用は、バックグラウンド蛍光の低下および蛍光信号対バックグラウンドレベルの増大という双方の利点を提供すると結論される。
【００９７】
実施例３：ディスク装置による細菌の検出
この実施例の目的は、ディスク装置１Ｃ（金属表面なし）およびディスク装置１Ｄ（金属表面あり）の不織材料中に存在する、増殖しているＥ．ｃｏｌｉ細菌から放出される蛍光信号の強度を測定し、比較することにある。
【００９８】
Ｅ．ｃｏｌｉ細菌の一夜培養物［（ＱＣ株Ｐ６）、トリプシン大豆ブロス（カンサス州レネクサのＲｅｍｅｌ，Ｉｎｃ．）中で一夜増殖］をＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄのリン酸緩衝液（カリフォルニア州サンタマリアのＨａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で希釈して、１０−３、１０−４、１０−５、および１０−６の希釈係数を得た。滅菌したＢｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄのリン酸緩衝液を陰性対照として使用した。これらの希釈係数は、それぞれ１ｍｌあたりおよそ１０５、１０４、１０３、および１０２個のコロニー形成単位の細胞密度に対応する。
【００９９】
ディスク装置１Ｃおよび１Ｄ（装置あたり２個のレプリカ）のトップフィルムを慎重に持ち上げて、各装置の各ディスクに１５μｌの各希釈液（各３個のレプリカ）または陰性対照溶液（３個のレプリカ）を接種した。トップフィルムをそっと下ろして装置を閉じ、水で濡らした紙タオルをそれぞれ含有する「ＧＬＡＤＬＯＣＫ  ＺＩＰＰＥＲ」保管バッグ（コネチカット州ダンベリーのＦｉｒｓｔ  Ｂｒａｎｄｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）中に封入した。密封バッグを３５℃の培養装置中に入れた。２４時間の培養後、実施例２で述べたように特注設計の検出器を使用して、装置の蛍光画像を得た。５ミリ秒の露出時間を使用し、ＣＣＤカメラの絞りは全画像で一定のままにした。
【０１００】
実施例２で述べたようにＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ｖ．５．０画像分析ソフトウェアを使用して、検出器からの生の画像を分析し、得られたデータを表３に示す。
【０１０１】
【表３】
0004748913.tif 000004
【０１０２】
表３中のデータは、ディスク装置１Ｄ（蒸着金属表面あり）が、全希釈レベルでディスク装置１Ｃ（蒸着金属表面なし）よりも高い信号対バックグラウンド比を生じることを示す。例えば、希釈係数１０−３では、ディスク装置Ｄの信号／バックグラウンドレベル５．４であったのに対して、ディスク装置Ｃでは３．１である。データはまた、各装置に対する信号ＲＦＵが、実質的にＥ．ｃｏｌｉの希釈に依存しないことも示す。この結果は２４時間の増殖期間によって説明され、その後はディスクの全てがほぼ同数の細菌を含有していたであろう。この実施例から、蒸着金属表面を有するディスク装置の使用は、蛍光信号対バックグラウンドレベルの増大という利点を提供すると、結論づけられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明に係るアッセイ装置の一実施態様の斜視図である。
【図２】  図１の線２−２に沿って切った、図１のアッセイ装置の拡大部分横断面図である。
【図３Ａ】  本発明に係る代案のアッセイ装置の横断面図である。
【図３Ｂ】  本発明に係る代案のアッセイ装置の横断面図である。
【図４】  本発明に係るもう１つのアッセイ装置の斜視図である。
【図５】  図４の線５−５に沿って切った、図４のアッセイ装置の横断面図である。
【図６】  図４のアッセイ装置の一部の拡大平面図である。
【図７】  本発明のアッセイ装置および方法に有用な励起／検出システムの概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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