(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
不飽和脂肪酸を有する脂質を、該脂質を内包する油滴小胞であってその膜が糖質、タンパク質及び脂質から構成されているものとして菌体外に分泌することを特徴とする微生物、モルチィエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）SAM2241（FERM BP-7272）。
【請求項２】
上記請求項１に記載の微生物を液体培地中で培養し、培養液から得られる、脂質を内包する油滴小胞であってその膜が糖質、タンパク質及び脂質から構成されているもの。
【請求項３】
不飽和脂肪酸を有する脂質を内包する請求項２に記載の油滴小胞。
【請求項４】
上記不飽和脂肪酸が、炭素数が18以上で二重結合数が２以上の不飽和脂肪酸である請求項３に記載の油滴小胞。
【請求項５】
上記油滴小胞が、水又は親水性物質に均一に分散することが可能な請求項２〜４のいずれか１項に記載の油滴小胞。
【請求項６】
上記油滴小胞が、小胞に内包される脂質を酸化に対して安定に保持するものである請求項２〜５のいずれか１項に記載の油滴小胞。
【請求項７】
上記油滴小胞が、遠心分離によって分離可能な請求項２〜６のいずれか１項に記載の油滴小胞。
【請求項８】
上記油滴小胞の直径が、平均0.2〜10μmである請求項２〜７のいずれか１項に記載の油滴小胞。
【請求項９】
上記油滴小胞に内包される脂質が、トリグリセリドを50％以上含有する脂質である請求項２〜８のいずれか１項に記載の油滴小胞。
【請求項１０】
上記請求項２〜９のいずれか１項に記載の油滴小胞を添加してなる食品、化粧品又は動物飼料。
【請求項１１】
油滴小胞を添加してなる食品が、機能性食品、栄養補助食品、未熟児用調製乳、乳児用調製乳、乳児用食品、妊産婦食品又は老人用食品である請求項10に記載の食品。
【請求項１２】
油滴小胞を添加してなる食品が、飲料である請求項10に記載の食品。
【請求項１３】
上記請求項１に記載の微生物を、液体培地中で培養し、培養液から脂質を内包する油滴小胞であってその膜が糖質、タンパク質及び脂質から構成されているものを採取することを特徴とする、油滴小胞の製造方法。
【請求項１４】
上記請求項１に記載の微生物を、液体培地中で連続的に培養し、培養液から連続的に脂質を内包する油滴小胞であってその膜が糖質、タンパク質及び脂質から構成されているものを採取することを特徴とする、油滴小胞の製造方法。
【請求項１５】
上記請求項１に記載の微生物を、液体培地中で培養し、培養液から脂質を内包する油滴小胞であってその膜が糖質、タンパク質及び脂質から構成されているものを採取し、該油滴小胞から脂肪酸を有する脂質を分離することを特徴とする、脂質の製造方法。
【請求項１６】
上記請求項１に記載の微生物を、液体培地中で培養し、培養液から脂質を内包する油滴小胞であってその膜が糖質、タンパク質及び脂質から構成されているものを採取し、該油滴小胞から脂肪酸を有する脂質を分離し、該脂質から不飽和脂肪酸を単離することを特徴とする、不飽和脂肪酸の製造方法。
【請求項１７】
上記請求項１に記載の微生物を、液体培地中で培養して、油滴小胞であってその膜が糖質、タンパク質及び脂質から構成されているものを生成せしめ、培養液から脂質を採取することを特徴とする、不飽和脂肪酸を有する脂質の製造方法。
【請求項１８】
上記請求項１に記載の微生物を、液体培地中で連続的に培養して、油滴小胞であってその膜が糖質、タンパク質及び脂質から構成されているものを生成せしめ、培養液から連続的に脂質を採取することを特徴とする、不飽和脂肪酸を有する脂質の製造方法。
【請求項１９】
透明液体培地を用い培養液が油滴小胞により白濁することを指標に、不飽和脂肪酸を有する脂質を菌体外に分泌する能力を有するモルチィエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）種微生物を選択することを特徴とするスクリーニング方法。
【請求項２０】
上記不飽和脂肪酸が、炭素数が18で二重結合数が３以上又は炭素数が20以上で二重結合数が２以上の脂肪酸である請求項19に記載のスクリーニング方法。
【請求項２１】
モルチィエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）SAM2241（FERM BP-7272）である微生物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、不飽和脂肪酸を有する脂質を小胞に内包して菌体外に分泌する特徴を有する微生物、または、炭素数が１８で二重結合数が３以上又は炭素数が２０以上で二重結合数が２以上である不飽和脂肪酸を有する脂質を菌体外に分泌する特徴を有する微生物、より具体的には不飽和脂肪酸を有する脂質を産生し菌体内に蓄積する能力を有する微生物に人為的処理を施して得られる、不飽和脂肪酸を有する脂質を小胞に内包して菌体外に分泌する特徴を有する微生物あるいは炭素数が１８で二重結合数が３以上又は炭素数が２０以上で二重結合数が２以上である不飽和脂肪酸を有する脂質を産生し菌体内に蓄積する能力を有する微生物に人為的処理を施して得られる、炭素数が１８で二重結合数が３以上又は炭素数が２０以上で二重結合数が２以上である不飽和脂肪酸を有する脂質を菌体外に分泌する特徴を有する微生物、および当該微生物を利用して効率的に不飽和脂肪酸を含有する脂質を製造する方法、ならびに当該微生物のスクリーニング方法、さらに不飽和脂肪酸を有する脂質を内包する油滴小胞およびこれを添加してなる食品、化粧品、動物飼料に関する。
背景技術
近年、高度不飽和脂肪酸の持つさまざまな生理活性が注目を集めるようになってきている。例えば、アラキドン酸は、子宮収縮・弛緩作用、血管拡張作用、血圧降下作用等の生理活性を有するプロスタグランジン、トロンボキサン、プロスタサイクリン、ロイコトリエン等の前駆体物質といわれているが、近年、特に乳幼児の発育に必要な成分として、ドコサヘキサエン酸とともに急速に研究が進められている。そして、アラキドン酸やドコサヘキサエン酸の他、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサペンタエン酸などの高度不飽和脂肪酸を含有する脂質を添加した各種の食品、化粧品及び動物飼料が注目を集め、一部これらの高度不飽和脂肪酸を添加した商品が上市されている。
これに伴って、これら高度不飽和脂肪酸を効率的に生産する方法についても精力的に研究されるようになっている。
例えば、アラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサペンタエン酸などの高度不飽和脂肪酸を産生する微生物として知られているモルティエレラ属、特にモルティエレラ亜属に属する微生物を用いて発酵法によりアラキドン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、γ−リノレン酸又はエイコサペンタエン酸を効率よく製造する方法が開発されている（特開昭６３−４４８９１、特開昭６３−１２２９０、特開昭６３−１４６９６、特開平５−９１８８７、特開昭６３−１４６９７）。さらにモルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物に変異処理を施して得られる、Δ１２不飽和化活性が低下又は欠失している変異株を用いてミード酸を製造する方法も知られている（特開平５−９１８８８）。
このように、高度不飽和脂肪酸を有する脂質を産生する微生物を用いた該脂質の製造が、高度不飽和脂肪酸の供給源として主流になりつつある。これらの微生物は、産生する高度不飽和脂肪酸を細胞膜の構成成分とするだけではなく、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とする油脂（トリグリセリド）として菌体内に蓄積するという特徴を持っている。そして、この菌体内に蓄積した油脂を利用することによって、高度不飽和脂肪酸の高い生産性が確保できるようになってきた。
この従来の製造方法の場合、１回の培養で得られる油脂の量は、培養で得られる微生物の菌体量と菌体当たりの油脂の産生量の積となり、より多くの油脂を生産するには、菌体量をいかに増やしかつ菌体当たりの油脂産生量をいかに増加させるかが課題であった。そしてこれまでの研究により、培養条件によってこの両方をある程度は増加させることができることが明らかになっているが、菌体量は培養装置の容積など物理的な要因によって、また、菌体当たりの油脂の量は用いる微生物の生理的な要因によって、各々一定の限界がある。
一方、微生物が産生し菌体内に蓄積した脂質を利用しようとする場合、微生物を培養した後に菌体を集め、これらをミル等によって処理し菌の細胞膜を破壊してから菌体内に蓄積した脂質を抽出することが必要である。
微生物が産生した物質を菌体内に蓄積させるのではなく、それを菌体外に分泌させることができれば、産生された物質が微生物に生理的な負荷を与えることは軽減され、微生物は産生物を作り続けることができる。また、微生物の産生物を単離、抽出する場合も、培養液からの抽出で済むため、処理が容易になるだけでなく、微生物を生かしたままで連続的に処理できるという利点がある。
こうしたことから、近年、菌体内に蓄積する油脂を菌体外に分泌する試みが福井作蔵らによりなされている（ＢＩＯ  ＩＮＤＵＳＴＲＹ  １２，３６−４６（１９９５））。福井作蔵らは化石燃料に代わる新規バイオ燃料を開発するために、微生物による油脂の分泌生産の研究を行い、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属酵母の育種により糖並びにｎ−アルカンを油脂に変換し菌体外に分泌することに成功している。そして、菌体外へ分泌したトリグリセリド（ＴＧ）の構成脂肪酸分子種はオレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、ステアリン酸であることを明らかにしている。ただしこの場合、ＴＧは直接、菌体外に分泌されるため、分泌されたＴＧが再び菌体内に取り込まれ、代謝されてしまう、という欠点がある。
しかし、炭素数が１８で二重結合数が３以上又は炭素数が２０以上で二重結合数が２以上の不飽和脂肪酸を有する脂質を産生する能力を有する微生物において、産生した脂質を菌体外に分泌する微生物あるいは不飽和脂肪酸を有する脂質を産生する能力を有する微生物において、産生した脂質を菌体外に分泌する際に、直接分泌するのではなく小胞に内包して分泌する微生物は全く知られていなかった。
また「微生物産生脂肪酸とその利用」鈴木修、フレグランスジャーナル１９８９（６）Ｐ６７−７５には、カビによるγ−リノレン酸生産の研究で、Ｍｕｃｏｒ属の培養培地に界面活性剤を加えて一部脂質を菌体外に漏出させることが報告されている。しかし、これは人為的に菌体の細胞膜を壊す処理を行って、菌体内に蓄積した脂質を漏出させる方法に関するものであって、菌自体による菌体内で生産した脂質を菌体外に分泌する能力を利用しようというものではない。
したがって、炭素数が１８で二重結合数が３以上又は炭素数が２０以上で二重結合数が２以上の不飽和脂肪酸を有する脂質を産生する能力を有する微生物において、産生した脂質を菌体外に分泌する特徴を有する微生物、あるいは不飽和脂肪酸を有する脂質を産生する能力を有する微生物において、産生した脂質を小胞に内包して菌体外に分泌する特徴を有する微生物を見出し、当該微生物を用いて不飽和脂肪酸を含有する脂質を効率よく製造する方法の開発が望まれている。
ところで、新たな能力を有する微生物を見出すためには、そうした能力を有する微生物の効率的なスクリーニングの方法の開発が欠かせない。上記の糖並びにｎ−アルカンを油脂に変換し菌体外に分泌するＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属酵母の育種の場合には、次のようなスクリーニング方法が採られている。即ち、寒天平板培地（ＹＰＤ培地など）に出現した酵母コロニーを、紫外線処理（１５ワット、距離３０ｃｍ、時間１５分）（この処理は、次の重層処理におけるコロニー細胞の分散を抑止するためのもので、変異誘導のための処理ではない）し、紫外線処理済みコロニー平板に、検定菌株数１０５個を含むＹＰＤ軟寒天培地を重層し、２８℃で２日間培養する。検定菌株にはそれぞれ飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の栄養要求性を有するＡ−１株とｏｌｅ−１株を用い、コロニーの周りに大きいハロ−（検定菌のマイクロコロニー環）を与えるコロニーを脂質分泌株として選抜する。脂肪分泌株の選択には、軟寒天培地にリパーゼを含ませたもの、含ませてないものの２つを用いる。
この方法は、重層処理が可能な酵母には適用できるが、重層処理が不可能な微生物のスクリーニングには用いることができないという大きな欠点がある。また、検定方法が煩雑になるという欠点もある。
従って、炭素数が１８で二重結合数が３以上又は炭素数が２０以上で二重結合数が２以上の不飽和脂肪酸を有する脂質を産生する能力を有する微生物において、産生した脂質を菌体外に分泌する特徴を有する微生物を見出すためには、当該微生物を簡便な方法で効率的にスクリーニングでき、かつ種々の微生物に適用可能なスクリーニング方法の開発が、また産生した脂質を菌体外に分泌する際に、小胞に内包して分泌するような微生物を見出すための新しいスクリーニング法の開発が望まれている。
発明の開示
従って本発明は、炭素数が１８で二重結合数が３以上又は炭素数が２０以上で二重結合数が２以上である不飽和脂肪酸を有する脂質を産生する能力を有する微生物において、産生した脂質を菌体外に分泌する特徴を有する微生物又は不飽和脂肪酸を産生する能力を有する微生物で、産生した脂質を小胞に内包して菌体外に分泌する特徴を有する微生物、および当該微生物を利用して効率的に当該脂質を製造する方法、ならびに当該微生物のスクリーニング方法を提供しようとするものである。本発明はまた、不飽和脂肪酸を有する脂質を内包する油滴小胞およびこれを添加してなる食品、化粧品、動物飼料を提供しようとするものである。
本発明者は、上記の目的を達成するために鋭意研究した結果、不飽和脂肪酸を有する脂質を産生し菌体内に蓄積する能力を有する微生物に人為的処理を施すことにより、産生した該脂質を小胞に内包して菌体外に分泌する能力を有する微生物を作出することができることを見出した。
また、人為的処理を施した微生物群や自然界から採取した微生物群から、目的とする能力を有する微生物を得るために、当業者であれば容易に実施できる次のような簡便なスクリーニング方法を見出した。即ち、一次スクリーニングとして、人為的処理が施された株又は自然界から採取した株を固体培地上で生育させた場合にコロニーの周りに油滴小胞（ｌｉｐｉｄ  ｂａｌｌ）が存在する菌株を選抜する。続いて二次スクリーニングとして、一次スクリーニングで選抜した株を透明な液体培地（４％グルコース、１％酵母エキス  ｐＨ６．０）中で２８℃で２日間振盪培養する。菌体内に脂質を蓄積する微生物であれば、培養中に培地が白濁することはないが、産生した脂質を菌体外に分泌していれば培地が白濁するため、脂質を菌体外に分泌する能力を有する微生物は、培養液の白濁の程度を目視で確認するだけで容易にスクリーニングすることができる。
そして、得られた微生物を利用して、当該脂質を内包する油滴小胞を効率的に菌体外に分泌させるためには、グルコース濃度を高めた培地及び／又はｐＨを高めた培地で培養すればよいことを見出した。
さらに、菌体外に分泌された油滴小胞が、遠心分離によって簡単に培養液から分離できること、また油滴小胞の中の脂質を単離するには、通常の有機溶媒を用いた抽出方法の他、遠心分離やクロマトグラフィー法が使えることを見出した。
さらにまた、培養液から分離した脂質を内包する油滴小胞は水又は親水性物質に分散しやすく、脂質を酸化に対して安定に保持するという特徴を持っているため、この油滴小胞を、そのまま食品や化粧品または動物飼料に添加すれば、これまでに無い特徴を持った不飽和脂肪酸を含有する食品や化粧品または動物飼料が得られることを見出し、本発明を完成した。
発明の実施の形態
本発明において、炭素数が１８で二重結合数が３以上又は炭素数が２０以上で二重結合数が２以上である不飽和脂肪酸とは、例えば、５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（アラキドン酸）、８，１１，１４−エイコサトリエン酸（ジホモ−γ−リノレン酸）、６，９，１２−オクタデカトリエン酸（γ−リノレン酸）、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸、８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸（ステアリドン酸）、９，１２，１５−オクタデカトリエン酸（α−リノレン酸）、４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、８，１１−エイコサジエン酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸（ミード酸）、７，１０，１３，１６−ドコサテトラエン酸、４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸等を挙げることができる。
本発明は、炭素数が１８で二重結合数が３以上又は炭素数が２０以上で二重結合数が２以上である不飽和脂肪酸を有する脂質を菌体外に分泌する特徴を有する微生物、又は不飽和脂肪酸を有する脂質を小胞に内包して菌体外に分泌する特徴を有する微生物を与える。さらに具体的には、炭素数が１８で二重結合数が３以上又は炭素数が２０以上で二重結合数が２以上である不飽和脂肪酸を有する脂質を産生し菌体内に蓄積する能力を有する微生物、又は不飽和脂肪酸を有する脂質を産生し菌体内に蓄積する能力を有する微生物に、人為的処理を施すことによって得られる、菌体内で産生した脂質を直接又は小胞に内包して菌体外に分泌することのできる微生物を与える。
ここで菌体内に不飽和脂肪酸を有する脂質を産生し菌体内に蓄積する能力を有する微生物とは、具体的には従来から知られているγ−リノレン酸生産能を有する微生物やアラキドン酸生産能を有する微生物、ＤＨＡ生産能を有する微生物、オメガ９系高度不飽和脂肪酸生産能を有する微生物等が挙げられ、アラキドン酸生産能を有する微生物としては、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、コニディオボラス（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）属、フィチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属、フィトフトラ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ）属、ペニシリューム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、クロドスポリューム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、フザリューム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ロードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、エントモフトラ（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａ）属、エキノスポランジウム（Ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）属、サプロレグニア（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ）属に属する微生物を挙げることができる。モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）亜属に属する微生物では、例えばモルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｌｏｎｇａｔａ）、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｘｉｇｕａ）、モルティエレラ・フィグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）、モルティエレラ・シュマッカリ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｃｈｍｕｃｋｅｒｉ）、モルティエレラ・ミヌティシマ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｍｉｎｕｔｉｓｓｉｍａ）等を挙げることができる。具体的にはモルティエレラ・エロンガタ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｅｌｏｎｇａｔａ）ＩＦＯ８５７０、モルティエレラ・エキシグア（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｅｘｉｇｕａ）ＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・フィグロフィラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）ＩＦＯ５９４１、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＩＦＯ８５６８、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８等の菌株を挙げることができる。
これらの菌株はいずれも、大阪市の財団法人醗酵研究所（ＩＦＯ）、及び米国のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ）及び、Ｃｅｎｔｒｒａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）からなんら制限なく入手することができる。また本発明者が土壌から分離した菌株モルティエレラ・エロンガタＳＡＭＯ２１９（微工研菌寄第８７０３号）（微工研条寄第１２３９号）を使用することもできる。これらのタイプカルチャーに属する菌株、あるいは自然界から分離した菌株をそのまま用いることができるが、増殖及び／又は単離を１回以上行うことによって得られる元の菌株とは性質の異なる自然突然変異株を用いることもできる。
また本発明において、上記不飽和脂肪酸生産能を有する微生物を用いて、例えば以下に記載する変異処理や遺伝子操作等によって得られる、Δ５不飽和化反応やΔ６不飽和化反応、Δ９不飽和化反応、Δ１２不飽和化反応、ω３系不飽和化反応、あるいは鎖長延長化反応等の少なくとも一つが増強、あるいは低下又は欠失した微生物を使用することができる。
上記微生物に施される人為的処理としては、変異処理や遺伝子操作、細胞融合等が挙げられる。変異処理としては、放射線（Ｘ線、ガンマー線、中性子線）照射や紫外線照射、高熱処理等を行ったり、また微生物を適当なバッファー中などに懸濁し、変異原を加えて一定時間インキュベート後、適当に希釈して寒天培地に植菌し、変異株のコロニーを得るといった一般的な突然変異操作を行うこともできる。
変異原としては、ナイトロジェンマスタード、メチルメタンサルホネート（ＭＭＳ）やＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）等のアルキル化剤、５−ブロモウラシル等の塩基類似体、マイトマイシンＣ等の抗生物質、６−メルカプトプリン等の塩基合成阻害剤、プロフラビン等の色素類、４−ニトロキノリン−Ｎ−オキシド等のある種の発がん剤、塩化マンガン、ホルムアルデヒド等の化合物を挙げることができる。また、使用する微生物は、生育菌体（菌糸）でも良いし、胞子でも良い。
遺伝子操作による場合には、通常の遺伝子組換え操作による手法が用いられる。
上記のように人為的処理を施した微生物群又は常法に従って自然界から採取した微生物群は、以下の方法により目的とする株を分離することができる。一次スクリーニングとして人為的処理が施された株又は自然界から採取した株を、固体培地上に塗布し、コロニーのまわりに油滴小胞（Ｌｉｐｉｄ  ｂａｌｌ）が存在することを目安に菌株を選択し、二次スクリーニングとして、一次スクリーニングで選択した菌株が菌体外に脂質を分泌するかどうかを液体培養で評価する。評価方法は、例えば、透明な液体培地（４％グルコース、１％酵母エキス  ｐＨ６．０）４ｍｌを試験管に入れ、１２０℃で２０分間殺菌した後、一次スクリーニングで選択した菌株を一白金耳植菌し、２８℃で２日間振盪培養する。
モルティエレラ属モルティエレラ亜属に属する微生物など菌体内に不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするトリグリセリドを蓄積しても菌体外にそれを分泌しない微生物は、前記液体培地で培養しても培地が濁ることはないが、産生した脂質を菌体外に分泌していれば培地が白濁することから、菌体外に脂質を分泌している菌は容易に確認することができる。しばらく、静置しても白濁した状態が変わらなければ脂質は油滴小胞として分泌されているが、脂質が直接、分泌されている場合にはしばらく静置すると脂質の層が培地上面に浮上するため両者を容易に判別できる。二次スクリーニングに使用する培地の成分は透明な液体培地とすることができるものであれば適宜選択することができ、培地組成も評価する微生物の生育に適した組成を適宜選択すれば良い。
なおこのようにして得られた株の中から、生育能や脂質生産能が親株と同様又はそれ以上の株を選択することが好ましい。また選抜にかける微生物又は目的によっては上記一次スクリーニングあるいは上記二次スクリーニングのどちらかだけでも、目的とする株を選抜することが可能であるが、両者を組み合わせることによって、より確実に選抜することができる。また上記２つのスクリーニング法を組み合わせて行う場合、上記一次スクリーニングが先であっても上記二次スクリーニングが先であってもよい。
上記の方法によって得られた株として、例えばアラキドン酸生産能を有するモルティエレラ・アルピナＩＦＯ８５６８から本発明者らが誘導した、菌体内で産生した脂質を小胞に内包して菌体外に分泌するモルティエレラ・アルピナＳＡＭ  ２２４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２７２）又はＳＡＭ  ２２４２を使用することができるが、この菌株に限定しているわけでなく、上記スクリーニング方法から本発明の菌体内で生産された脂質を菌体外に分泌する菌株は容易に得られ、それらをすべて使用することができる。
なお上記のスクリーニングによって得られる本発明の微生物はスフェロプラスト化又はプロトプラスト化が可能な微生物であり、本発明の微生物を用いて、細胞壁を完全に取り除いたプロトプラストや細胞壁の一部が残っているスフェロプラストを簡単に得ることができる。これは例えば変異処理に用いた親株には見られない性質であり、変異処理によって細胞壁の構造が変化して脆くなったためと考えられる。
上記のようにして得られた例えば菌体内で生産された脂質を小胞に内包して菌体外に分泌する菌株を用いて以下の方法により、油滴小胞又は脂質を得ることができる。まず上記本発明の微生物の培養において、本発明の微生物を培養する為には、その菌株の胞子、菌糸、又は予め培養して得られた前培養液を、液体培地に接種し培養する。
液体培地の場合に、炭素源としてはグルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセロール、マンニトール等の一般的に使用されているものが、いずれも使用できるが、これらに限られるものではない。窒素源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー、大豆タンパク、脱脂大豆、綿実カス等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源、ならびに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム等の無機窒素源を用いることができる。
この他必要に応じリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅等の無機塩及びビタミン等も微量栄養源として使用できる。これらの培地成分は微生物の生育を害しない濃度であれば特に制限はない。実用上一般に、炭素源は０．１〜４０重量％、好ましくは１〜２５重量％の濃度とするのが良い。さらに、炭素源を逐次添加すること及び／又は初発炭素源濃度を高くすることで菌体外への脂質分泌を促進することができる。又、初発の窒素源添加量は０．１〜１０重量％、好ましくは０．１〜６重量％とし、培養途中に窒素源を流加しても構わない。
培養温度は使用する微生物により異なるが、５〜４０℃、好ましくは２０〜３０℃とし、また２０〜３０℃にて培養して菌体を増殖せしめた後５〜２０℃にて培養を続けて不飽和脂肪酸を生産せしめることもできる。このような温度管理により、生成脂肪酸中の高度不飽和脂肪酸の生成量を上昇せしめることができる。培地のｐＨは４〜１０、好ましくは５〜９として通気攪拌培養、振盪培養、バイオリアクタによる連続培養又は静置培養を行う。なお、初発ｐＨを５〜９好ましくは６〜９、より好ましくは７〜９にすることで菌体外への脂質分泌を促進することができる。培養は通常２〜３０日間、好ましくは５〜２０日間、より好ましくは５〜１５日間行う。
本発明においては、培地中に目的とする不飽和脂肪酸の前駆体を添加して培養することにより、目的とする不飽和脂肪酸、例えば５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸（アラキドン酸）、８，１１，１４−エイコサトリエン酸（ジホモ−γ−リノレン酸）、６，９，１２−オクタデカトリエン酸（γ−リノレン酸）、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸、８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸（ステアリドン酸）、９，１２，１５−オクタデカトリエン酸（α−リノレン酸）、４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、８，１１−エイコサジエン酸、５，８，１１−エイコサトリエン酸（ミード酸）の産生を促進することもできる。
前駆体としては例えば、テトラデカン、ヘキサデカン、オクタデカン等の炭化水素、テトラデカン酸、ヘキサデカン酸、オクタデカン酸等の脂肪酸又はその塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩等）及びエステル、又は脂肪酸が構成成分として含まれる油脂（例えば、オリーブ油、ヤシ油、パーム油、亜麻仁油、魚油、微生物油脂）等を挙げることができるが、これらに限られるものではない。
また不飽和脂肪酸や該不飽和脂肪酸が構成成分として含まれる油脂（例えば魚油、微生物油脂）を、培地中に添加して培養することにより、本発明の微生物が、培地に添加した不飽和脂肪酸又は油脂を菌体内に取り込み、該不飽和脂肪酸を有する脂質を内包する油滴小胞として菌体外に分泌するため、使用する微生物が本来生産しない不飽和脂肪酸であっても、このような不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とする脂質を内包する油滴小胞を製造することが可能である。
上記前駆体を含むこれらの基質の総添加量は培地に対して０．００１〜１０重量％、好ましくは０．５〜１０重量％である。これらの基質は生産微生物を接種する前又はその直後に加えてもよく、又は培養を開始した後に加えてもよく、あるいは両時点で加えてもよい。培養開始後の添加は１回でもよく、又は複数回に分けて間欠的に添加してもよい。あるいは、連続的に添加することもできる。又、これらの基質を唯一の炭素源として培養してもよい。
上記のように本発明の微生物を培養することによって、不飽和脂肪酸を有する脂質が大量に菌体内で生産され、該脂質は直接又は小胞に内包されて油滴小胞として菌体外に分泌される。液体培地を使用した場合には、培養物から培養菌体を取り除いた培養液から、例えば、次のようにして油滴小胞又は脂質の採取を行う。
培養終了後、培養物から遠心分離及び濾過等の常用の固液分離手段により培養菌体を取り除き、脂質を内包する油滴小胞が分散している培地（培養液と言う）を得る。この培養液から、脂質を内包する油滴小胞は、凍結乾燥により培地成分をも含むものとして単離することもできるし、常法の遠心分離やカラム処理により培地成分を含まず油滴小胞のみを単離することもできる。例えば遠心分離機（ＴＯＭＹＲＬ−１０１）やスイングローター（ＴＳ−７）を使用し、最大遠心加速度１０００×ｇ以上、好ましくは１５００×ｇ以上で約１０分間、遠心することによって油滴小胞を分離することができる。
上記方法によって得られる油滴小胞は、糖質、蛋白質、脂質から構成されている。そして水分を除いた組成で表すと、糖質は０〜７０％、好ましくは２０〜６０％、蛋白質は０〜４０％、好ましくは１０〜３０％、脂質は２０〜１００％、好ましくは３０〜８０％からなる。しかしながら、これら糖質、蛋白質、脂質の割合は、培養条件により種々とりうることができ、この比率に限定されるわけではない。また、実際には水分も含まれる場合があることは当り前である。
本発明の油滴小胞は、直径が平均０．２〜１０μｍ、好ましくは２〜４μｍで、最も大きい小胞の直径が４０μｍ、好ましくは１０μｍである。また遠心分離にて分離することが可能で、例えば遠心分離機（ＴＯＭＹＲＬ−１０１）やスイングローター（ＴＳ−７）を使用し、最大遠心加速度１０００×ｇ以上、好ましくは１５００×ｇ以上で約１０分間、遠心することによって油滴小胞を分離することができる。さらに本発明の油滴小胞は、水又は親水性物質に分散しやすく、脂質を酸化に対して安定に保持するという性質を有する。
また油滴小胞中の脂質を採取するには、油滴小胞を分離する前の培養液から直接、又は培養液から分離した油滴小胞のいずれからでも行なえる。例えば培養液から分離した油滴小胞から抽出する場合、抽出方法としては従来行われている菌体から脂質を抽出する方法と同様にして実施することができる。すなわち油滴小胞を、窒素気流下で有機溶媒によって抽出処理する。有機溶媒としてはエーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホルム、ジクロロメタン、石油エーテル等を用いることができ、又メタノールと石油エーテルの交互抽出やクロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を用いた抽出によっても良好な結果を得ることができる。また、油滴小胞を分離する前の培養液から直接抽出する場合にも、同様の有機溶剤を用いることが出来るが、現実的には水と分離する溶剤を使うのが望ましく、また、食品用途を考えた場合にはヘキサンの使用が望ましい。抽出物から減圧下で有機溶媒を留去することにより、不飽和脂肪酸を含有する脂質が得られる。
上記のようにして得られた脂質中には、不飽和脂肪酸が、トリグリセリドやフォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルイノシトールなどに結合した状態で存在している。そして脂質は、グリセリド（トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド）、リン脂質、脂肪酸、糖脂質、ステロールエステルなどから構成され、脂質中のグリセリドは５０〜１００％、好ましくは７０〜１００％、リン脂質は０〜５０％、好ましくは０〜３０％、脂肪酸と糖脂質とステロールエステルは合わせて０〜３０％、好ましくは０〜１５％からなる。また脂質中のトリグリセリドは５０〜１００％、好ましくは７０〜１００％である。
例えばモルティエレラ亜属に属する微生物から誘導された本発明の微生物を用いて製造される不飽和脂肪酸を含有する脂質の油脂組成としては、中性脂質が７０〜１００重量％、極性脂質が０〜３０重量％であり、中性脂質の主な成分であるトリグリセリドは脂質中７０〜９９重量％である。不飽和脂肪酸の含量は用いる微生物や培養条件によって異なるが、例えば脂質中の、アラキドン酸含量は、全脂肪酸に対して１０重量％以上、好ましくは２０〜１００重量％、より好ましくは４０〜１００重量％である。またアラキドン酸ののトリグリセリド中の全脂肪酸に対しする割合は、１０重量％以上、好ましくは１５〜１００重量％、より好ましくは３５〜９０重量％である。しかしながら、本発明はモルティエレラ亜属の属する微生物が分泌する油滴小胞に限定しているわけでなく、産生される脂肪酸もアラキドン酸に限定しているわけではない。さらに、培地に添加した油脂を菌体に採り込ませた後、油滴小胞の油脂として分泌させることも可能であり、油滴小胞の油脂組成、目的とする脂肪酸の割合は千差万別であり、ある意味では自由に設計することができる。
油滴小胞又は培養液から採取した不飽和脂肪酸を有する脂質から、不飽和脂肪酸を含有するトリグリセリドを分離精製するには、常法に従って、例えば、脱酸法、脱ガム法、脱水法、水蒸気蒸留法、分子蒸留法、冷却分離法、カラムクロマトグラフィー法などにより行う。
不飽和脂肪酸を含有する脂質から、不飽和脂肪酸を分離するには、混合脂肪酸あるいは混合脂肪酸エステルの状態で、常法により、例えば、尿素付加法、冷却分離法、カラムクロマトグラフィー法などにより濃縮分離することにより行う。
本発明の油滴小胞は不飽和脂肪酸をトリグリセリドの形で豊富に含有しており、その用途に関しては特に制限はないが、例えば、食品、飲料、化粧品、医薬品動物飼料などの原料並びに添加物として使用することができる。そして、その使用目的、使用量に関して何ら制限を受けるものではない。
例えば、食品としては、一般食品の他、機能性食品、栄養補助食品、未熟児用調製乳、乳児用調製乳、乳児用食品、妊産婦食品又は老人用食品等を挙げることができる。本発明の油滴小胞は、水や親水性物質に対する分散性に優れているため、従来添加することが困難であった油脂を含まない食品、特に各種飲料に添加することが可能となる。また本発明の油滴小胞は、脂質を空気酸化に対して安定的に保持することができるため、従来の油脂を含む食品への添加も、より容易に行なえるようになる。油脂を含む食品例として、肉、魚、またはナッツ等の本来油脂を含む天然食品、スープ等の調理時に油脂を加える食品、ドーナッツ等の熱媒体として油脂を用いる食品、バター等の油脂食品、クッキー等の加工時に油脂を加える加工食品、あるいはハードビスケット等の加工仕上げ時に油脂を噴霧または塗布する食品等が挙げられる。さらに、機能性食品・医薬品の形態であっても構わなく、例えば、経腸栄養剤、粉末、顆粒、トローチ、内服液、懸濁液、乳濁液、シロップ、ドリンク剤等の加工形態であってもよい。
実施例
次に、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。しかし、本発明は、実施例に限定されるものではない。
実施例１．Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ  ＩＦＯ８５６８の変異処理による油滴小胞を菌体外に分泌する菌株の取得
モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＩＦＯ８５６８をＣｚａｐｅｋ寒天培地（０．２％  ＮａＮＯ３、０．１％  Ｋ２ＨＰＯ４、０．０５％  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０５％  ＫＣｌ、０．０１％  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３％シュークロース、２％寒天、ｐＨ６．０）３００ｍｌを含む大型スラント瓶に植菌し、２週間、２８℃で培養した。
培養後、大型スラント瓶にＴｗｅｅｎ８０を２滴加えた滅菌水５０ｍｌを加えてよく振り、４重のガーゼで濾過した。この操作を２回繰り返し、濾液を８０００ｘｇで１０分間遠心した。このようにして得られた胞子を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ｍａｌｅａｔｅ緩衝溶液（ｐＨ７．５）で１ｘ１０６／ｍｌになるように懸濁し、胞子液を調製した。
得られた胞子溶液１．０ｍｌに、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ｍａｌｅａｔｅ緩衝溶液（ｐＨ７．５）０．５ｍｌを加え、ＮＴＧ溶液（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン  ５ｍｇ／脱イオン水１ｍｌ）５００μｌを加えて、２８℃で１５分間インキュベートして変異処理を施した。１０％  Ｎａ２Ｓ２Ｏ３を３ｍｌ加えて、反応液を５５００ｘｇで１０分間遠心し、沈殿物（変異処理が施された胞子）を滅菌水３ｍｌで洗浄し、５５００ｘｇで１０分間遠心後、沈殿物に滅菌水を加えてＮＴＧ処理された胞子懸濁液とした。
ＮＴＧ処理された胞子懸濁液は、１０−３〜１０−４程度に希釈し、ＧＹ寒天プレート（１％グルコース、０．５％酵母エキス、０．００５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、１．５％寒天、ｐＨ６．０）に塗布した。２８℃で培養し、コロニーが出現したものの形態観察を行った結果、親株と生育形態の明らかに異なる菌株が得られた。親株を始めとする高度不飽和脂肪酸生産菌は、脂質を菌体内に蓄積するのでコロニー全体が菌糸で覆われるのに対して、今回得られた変異株はコロニーが油滴小胞（Ｌｉｐｉｄ  ｂａｌｌ）で覆われていた。
次いで、透明な液体培地（４％グルコース、１％酵母エキス  ｐＨ６．０）４ｍｌを試験管に入れ、１２０℃で２０分間殺菌した後、上記で得られた菌株を一白金耳植菌し、２８℃で２日間振盪培養したところ、培地は白濁した。この培地を１０分以上静置しても培地上面には脂質の層が見られなかった。従って脂質は油滴小胞として分泌されていると考えられる。
ＧＹ寒天プレート上の培養で得られたコロニーを覆っていた油滴小胞を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により脂質分析を行った。予め活性化したプレート（Ｍｅｒｃｋ  ５５５４、２００ｘ２００ｘ０．２５ｍｍ，ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ  ６０Ｆ−２５４，ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｓｈｅｅｔ）にサンプルとコントロール（リン脂質、トリグリセリド、脂肪酸）を塗布し、ｎ−ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝８０：２０：２（Ｖ／Ｖ／Ｖ）溶液で展開し、リンモリブデン酸（１０％  リンモリブデン酸エタノール溶液）とプリムリン（０．０１％  プリムリン８０％  アセトン溶液）を発色剤に使用した。なお、プリムリンについては、長波長（３６６ｎｍ）の紫外線下でバンド観察した。その結果、菌体外に認められた油滴小胞中の脂質の大部分がトリグリセリドであることが明らかとなった。
こうして、高度不飽和脂肪酸を構成脂肪酸とするトリグリセリドを主に内包する油滴小胞を菌体外に分泌する変異株モルティエレラ・アルピナＳＡＭ２２４１  ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２７２及びＳＡＭ２２４２が約３０００個のコロニーから得られた。
実施例２．油滴小胞を菌体外に分泌する菌Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ  ＳＡＭ２２４１を種々の培地で培養した場合の、菌体外に分泌された脂質の脂肪酸分析
培地Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，Ｆそれぞれ４ｍｌを試験管に入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。実施例１で得たモルティエレラ・アルピナＳＡＭ２２４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２７２）を培地に一白金耳植菌し、２８℃で２日間、その後１２℃で７日間振盪培養した。培養後、濾過により菌体と濾液に分別した。得られた濾液をネジ口試験管（１６．５ｍｍφ）に入れ、凍結乾燥した後、塩化メチレン１ｍｌ、無水メタノール−塩酸（１０％）２ｍｌを加え、５０℃で３時間処理することによってメチルエステル化し、ｎ−ヘキサン４ｍｌ、水１ｍｌを加えて、２回抽出し、抽出液の溶媒を遠心エバポレーター（４０℃、１時間）で留去した後、得られた脂肪酸メチルエステルをキャピラリーガスクロマトグラフィーで分析した。なお、メチルエステル化時に内部標準として０．２ｍｇ／ｍｌのｎ−ヘプタデカン酸（１７：０）を１．０ｍｌ加え、ＧＬＣの面積比より脂肪酸の定量を行った。
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結果を表１に示す。
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いずれの培地においても、不飽和脂肪酸を含有する脂質を菌体外に分泌することが認められた。さらに、培地Ａ〜Ｆで得られた菌体外に分泌された脂質の全脂質量並びにアラキドン酸量はグルコース濃度と正の相関が認められた。即ち、試験管当たりの全脂質量は、グルコース濃度が１％の場合は０．１８，０．６ｍｇ、グルコース濃度が２％の場合は０．５３，０．９６ｍｇ、グルコース濃度が５％の場合は２．１１ｍｇとなり、試験管当たりのアラキドン酸量は、グルコース濃度が１％の場合は０．０５，０．１５ｍｇ、グルコース濃度が２％の場合は０．１１，０．１９ｍｇ、グルコース濃度が５％の場合は０．６２ｍｇとなった。  また、変異株ＳＡＭ２２４２についても同様の傾向の結果が得られた。
実施例３．油滴小胞を菌体外に分泌する菌Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ  ＳＡＭ２２４１の１０Ｌジャーファーメンターによる通気撹拌培養におけるアラキドン酸の生産量
グルコース  ２％、大豆タンパク  １．５％、ＫＨ２ＰＯ４  ０．３％、Ｎａ２ＳＯ４  ０．１％、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．０５％、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．０５％、大豆油  ０．２％を含む培地（Ａ：ｐＨ５．０、Ｂ：ｐＨ６．０、Ｃ：ｐＨ７．０）５Ｌを１０Ｌジャーファーメンターに入れ、１２０℃で３０分間殺菌した。実施例１で得たモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＳＡＭ２２４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２７２）を植菌し、通気量１．０ｖｖｍ、培養温度２４℃で１０日間の通気撹拌培養を行った。なお、培養１日目に２．０％グルコース、培養２日目に１．５％グルコース、培養３，４日目に１．０％グルコース、培養５，６日目に０．５％グルコースを添加した。
サンプリングは毎日実施し、培養液を遠心及び／又は濾過により菌体と濾液（菌体外に分泌された油滴小胞が分散）に分け、菌体は１０５℃で２時間乾燥させ、得られた乾燥菌体２０ｍｇをネジ口試験管（１６．５ｍｍφ）に入れ、実施例２と同様にメチルエステル化を行った。また、濾液１ｍｌをネジ口試験管（１６．５ｍｍφ）に入れ、凍結乾燥後、実施例２と同様にメチルエステル化を行った。得られた脂肪酸メチルエステルをキャピラリーガスクロマトグラフィーで分析した。表２に培養９日目のアラキドン酸の生産量および含有率を示す。
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なお、カッコ内の数字は全脂肪酸に占めるアラキドン酸の割合を表す。
培地のｐＨの上昇に伴ってアラキドン酸含有脂質の菌体外への分泌が促進された。
実施例４．油滴小胞を菌体外に分泌する菌Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ  ＳＡＭ２２４１が分泌した油滴小胞の脂質分析
実施例３で得られた培地Ａ，Ｂ，Ｃで培養した培養９日目の培養濾液を、クロロホルム／メタノール／水（１：２：０．８）系によるＢｌｉｇｈｔ−Ｄｙｅｒ法により処理し、菌体外に分泌された油滴小胞から全脂質を抽出した。得られた全脂質は、中性脂質（トリグリセリド）と極性脂質（リン脂質）を含んでおり、抽出した全脂質をＳｅｐ−ｐａｋ  Ｓｉｌｉｃａカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ社製）にチャージし、クロロホルム溶出により中性脂質画分、メタノール溶出により極性脂質画分を溶出し、溶剤を留去した後、実施例２と同様にメチルエステル化を行い、得られた脂肪酸メチルエステルをキャピラリーガスクロマトグラフィーで分析した。トリグリセリドとリン脂質の結合する全脂肪酸の割合として、トリグリセリドとリン脂質の割合を算出した。結果、培地Ａ，Ｂ，Ｃのトリグリセリドの全脂質に占める割合は、それぞれ９５．３％，９７．７％，９６．２％であった。
実施例５．油滴小胞を菌体外に分泌する菌Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ  ＳＡＭ２２４１の１０Ｌバイオリアクターによる連続培養
セラミックフィルター２本を内臓した１０Ｌバイオリアクターに、グルコース２％、酵母エキス２％含有しｐＨを７に調整した培地５Ｌを調製し、実施例１で得たモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＳＡＭ２２４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２７２）を前培養した菌株を植菌して通気攪拌を行った。翌日さらに培地内グルコース濃度が３％増加するようにセラミックフィルターを通じてグルコース溶液を添加した。２日目にも同様に培地内グルコース濃度が３％増加するようにセラミックフィルターを通じてグルコース溶液を添加した。
３日目以降、５％グルコース、０．０５％酵母エキス溶液を約１０００ｍｌ／日の速度でセラミックフィルターを通じて連続的に流加した。そして約６００ｍｌ／日（液量が変動しないよう調整する）でセラミックフィルターから培養液を連続的に抜き出した。フィルターが菌体で目づまりするのを防ぐため、グルコース、酵母エキス溶液の供給と培地の抜き出しを適宜交互に入れ替えた。通気による水分の蒸発があるためジャー内液量はほぼ一定に保たれた。また、グルコースの流加濃度は抜き出すグルコース濃度により調節した。
この結果培養１０日間にわたって、アラキドン酸を含有したトリグリセリドを約１ｇ／Ｌ含有した培地（培養液）を連続的に取り出すことができた。
実施例６．培地に添加した油脂の微生物変換と、油滴小胞を菌体外に分泌する菌Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ  ＳＡＭ２２４１による油滴小胞への移行
グルコース１％および酵母エキス１％を含む培地（ｐＨ６．０）２ｍｌに亜麻仁油または魚油を２％添加し、１０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに入れ、１２０℃で２０分間殺菌した。実施例１で得たモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＳＡＭ２２４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７２７２）を培地に一白金耳接種し、レシプロシェーカー（１５０ｒｐｍ）により、２８℃で８日間培養した。濾過により濾液を回収し、凍結乾燥後、菌体外に分泌した脂質を、実施例２と同様にメチルエステル化を行い、得られた脂肪酸メチルエステルをキャピラリーガスクロマトグラフィーで分析した。
亜麻仁油を培地に添加した場合は、亜麻仁油の主要脂肪酸である９，１２，１５−オクタデカトリエン酸（α−リノレン酸）が、変異株の脂肪酸生合成系酵素の基質となり、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸（ステアリドン酸）、８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸に変換され、油滴小胞中の脂質に、６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸（ステアリドン酸）、８，１１，１４，１７−エイコサテトラエン酸、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸がそれぞれ２．４，３．３，８．１％含まれており、変換された脂肪酸がトリグリセリドの構成脂肪酸として菌体外に分泌することが確認できた。また、魚油を培地に添加した場合には、魚油の５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸や４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸が菌に取り込まれ、トリグリセリドの構成脂肪酸として菌体外に分泌することが、菌体外に分泌された油滴小胞中の脂質に５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸や４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸が８．１，１２．２％含まれていたことから確認できた。
実施例７．Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ  ＳＡＭ２２４１が菌体外に分泌する油滴小胞の成分分析
菌体外に分泌した油滴小胞の成分分析を行うために、実施例１で得たモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ）ＳＡＭ２２４１の胞子液をＧＹ寒天プレート（１％グルコース、０．５％酵母エキス、０．００５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、１．５％寒天、ｐＨ６．０）に塗布し、２８℃で４日間培養した。実施例１で示したのと同じように、コロニー全体が油滴小胞（Ｌｉｐｉｄ  ｂａｌｌ）で覆われていた。そこで、その小胞をネジ口試験管（１６．５ｍｍφ）に集めた。そして、クロロホルム２ｍｌとＫＣｌ溶液２ｍｌを加えて撹拌、抽出した。クロロホルム層には脂質が、ＫＣｌ溶液層には糖質及びタンパク質が移行し、常法にしたがって成分分析を行った結果、糖質：３８．１％、タンパク質：１８．２％、脂質：４３．７％であった。
実施例８．油滴小胞を使用した調製乳の調製
実施例３で得られた培養濾液を、遠心分離機（ＴＯＭＹ  ＲＬ−１０１）で１５００ｘｇの遠心により分離し、滅菌水で洗浄して、食用に適した油滴小胞を調製した。この油滴小胞を、粉乳１００ｇに０．９２ｇ添加することにより、油滴小胞を含む調製乳を調製した。得られた調製乳中のアラキドン酸の組成は、全脂肪酸の０．５％であり、これは母乳の組成に類似していた。
また、得られた調製乳を水に溶解した場合、水への分散性は極めて良好で、均一に分散し、油分が分離することはなかった。
実施例９．カプセル剤の調製
ゼラチン１００重量部及び食添グリセリン３５重量部に水を加え５０−６０℃で溶解し、粘度２００００ｃｐｓのゼラチン皮膜を調製した。次に実施例３で得た培養濾液から遠心により分離した油滴小胞から常法に従って脂質を抽出・精製した。そして、精製油９７％、ビタミンＥ油３％を混合し、内容物を調製した。これらを用いて、常法によりカプセル成型及び乾燥を行い、１粒あたり１８０ｍｇの内容物を含有するソフトカプセルを製造した。
実施例１０．油滴小胞を含む飲料の調製
オレンジジュース１０Ｌに、実施例８に示す方法で得た、食用に適した油滴小胞１０ｇを添加することにより、油滴小胞を含むジュースを調製した。