(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を含み、薬物を再設計するために、該薬物またはその断片、合成中間体、代謝産物もしくはプロドラッグと、前記薬物の標的となるタンパク質以外の非標的タンパク質と、の相互作用を評価する方法：
ｉ）前記薬物を決定し、該薬物またはその断片、合成中間体、代謝産物もしくはプロドラッグを呈示する捕獲化合物を調製すること、ここで、前記捕獲化合物は以下の式Ｉを有する：
【化１】
0004741458.tif 000049
Ｘは、タンパク質と共有結合するように選択され、タンパク質と接触した後に、共有結合のために光による活性化を必要とする反応性官能基であり、
Ｙは、前記薬物またはその断片、合成中間体、代謝産物もしくはプロドラッグであり、
Ｑは、ビオチン、（Ｈｉｓ）６、ＢＯＤＩＰＹ（４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン）、オリゴヌクレオチド、抗体、免疫毒素結合体、接着ペプチド、レクチン、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、活性化デキストランおよびペプチドからなる群より選択される選別官能基であり、
Ｚは、Ｙ、ＸおよびＱが存在する上記式Ｉに示した三官能部分であり、
ｍは１であり、
ｎは１である、
ｉｉ）タンパク質混合物を含むサンプルと前記捕獲化合物とを接触させ、前記サンプル中のＹと相互作用するタンパク質の捕獲を行うこと、ここで前記接触は、前記捕獲化合物とＹと相互作用するタンパク質との相互作用が平衡に達するまで十分な時間行う、
ｉｉｉ）前記接触後、前記捕獲化合物中のＸを光により活性化して、Ｙと相互作用するタンパク質と、Ｘと、の間に共有結合を形成させ、Ｙと相互作用するタンパク質の捕獲を行うこと、および
ｉｖ）捕獲したタンパク質を分離および同定し、それによって前記薬物またはその断片、合成中間体、代謝産物もしくはプロドラッグと相互作用する前記サンプル中の非標的タンパク質を同定すること、ここで前記分離は、固体支持体の表面に固定されたＱのレシピエント分子と、Ｑとの結合により行う、
ここで、前記薬物の再設計は、前記薬物またはその断片、合成中間体、代謝産物もしくはプロドラッグと、前記非標的タンパク質との相互作用を消失させる、または減少させることによって行う。
【請求項２】
Ｘが、アジドまたはジアジリンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｙが、Ｙ上の種々の結合点を介し異なる向きでＺに連結する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
Ｙとして、再設計した薬物またはその断片、合成中間体、代謝産物もしくはプロドラッグを用い、前記工程ｉ）〜ｉｖ）を繰り返し行う、請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記捕獲したタンパク質を、質量スペクトル分析により同定する、請求項１−４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
質量分析計形式が、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、連続またはパルスエレクトロスプレー（ＥＳ）イオン化、イオンスプレー、サーモスプレーまたはマッシブクラスター衝撃質量分析計であり、
検出形式が、直線型飛行時間型（ＴＯＦ）、反射飛行時間型、シングル四重極、多重四重極、シングル磁場型、多重磁場型、フーリエ変換、イオンサイクロトン共鳴（ＩＣＲ）、またはイオントラップである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、生物学的サンプルである体組織もしくは体液または細胞溶解物を含む、請求項１−６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
Ｙが、
【化２】
0004741458.tif 000050
【化３】
0004741458.tif 000051
【化４】
0004741458.tif 000052
【化５】
0004741458.tif 000053
【化６】
0004741458.tif 000054
【化７】
0004741458.tif 000055
【化８】
0004741458.tif 000056
【化９】
0004741458.tif 000057
【化１０】
0004741458.tif 000058
【化１１】
0004741458.tif 000059
【化１２】
0004741458.tif 000060
【化１３】
0004741458.tif 000061
【化１４】
0004741458.tif 000062
【化１５】
0004741458.tif 000063
【化１６】
0004741458.tif 000064
【化１７】
0004741458.tif 000065
【化１８】
0004741458.tif 000066
【化１９】
0004741458.tif 000067
【化２０】
0004741458.tif 000068
【化２１】
0004741458.tif 000069
【化２２】
0004741458.tif 000070
【化２３】
0004741458.tif 000071
【化２４】
0004741458.tif 000072
【化２５】
0004741458.tif 000073
【化２６】
0004741458.tif 000074
【化２７】
0004741458.tif 000075
【化２８】
0004741458.tif 000076
【化２９】
0004741458.tif 000077
【化３０】
0004741458.tif 000078
【化３１】
0004741458.tif 000079
【化３２】
0004741458.tif 000080
【化３３】
0004741458.tif 000081
【化３４】
0004741458.tif 000082
【化３５】
0004741458.tif 000083
【化３６】
0004741458.tif 000084
【化３７】
0004741458.tif 000085
【化３８】
0004741458.tif 000086
【化３９】
0004741458.tif 000087
【化４０】
0004741458.tif 000088
【化４１】
0004741458.tif 000089
【化４２】
0004741458.tif 000090
【化４３】
0004741458.tif 000091
【化４４】
0004741458.tif 000092
【化４５】
0004741458.tif 000093
【化４６】
0004741458.tif 000094
【化４７】
0004741458.tif 000095
【化４８】
0004741458.tif 000096
【化４９】
0004741458.tif 000097
【化５０】
0004741458.tif 000098
【化５１】
0004741458.tif 000099
【化５２】
0004741458.tif 000100
【化５３】
0004741458.tif 000101
【化５４】
0004741458.tif 000102
【化５５】
0004741458.tif 000103
【化５６】
0004741458.tif 000104
【化５７】
0004741458.tif 000105
【化５８】
0004741458.tif 000106
【化５９】
0004741458.tif 000107
【化６０】
0004741458.tif 000108
【化６１】
0004741458.tif 000109
【化６２】
0004741458.tif 000110
【化６３】
0004741458.tif 000111
【化６４】
0004741458.tif 000112
【化６５】
0004741458.tif 000113
【化６６】
0004741458.tif 000114
【化６７】
0004741458.tif 000115
【化６８】
0004741458.tif 000116
【化６９】
0004741458.tif 000117
【化７０】
0004741458.tif 000118
【化７１】
0004741458.tif 000119
【化７２】
0004741458.tif 000120
【化７３】
0004741458.tif 000121
【化７４】
0004741458.tif 000122
【化７５】
0004741458.tif 000123
【化７６】
0004741458.tif 000124
【化７７】
0004741458.tif 000125
【化７８】
0004741458.tif 000126
【化７９】
0004741458.tif 000127
【化８０】
0004741458.tif 000128
【化８１】
0004741458.tif 000129
【化８２】
0004741458.tif 000130
【化８３】
0004741458.tif 000131
【化８４】
0004741458.tif 000132
【化８５】
0004741458.tif 000133
【化８６】
0004741458.tif 000134
【化８７】
0004741458.tif 000135
上記薬物またはその合成中間体もしくは断片から選択される、請求項１−７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
Ｙが、トログリタゾン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、メトトレキサート、アトルバスタチン、セレコキシブ、レフェコキシブおよびセリバスタチンからなる群より選択される、請求項１−８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｑがビオチンである、請求項１−９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｚが、側鎖に官能基を有するアミノ酸である、請求項１−１０の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本明細書では生体分子を特異的かつ選択的に分析するための化合物およびその化合物の使用方法が提供される。詳細には、化合物および方法はプロテオームの分析に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ゲノム科学は、この戦略を用いて、正常および疾病患者集団または集団間の相違を含む、定義された表現型に関連して集団を層別化できるであろうという最初の予想には達していない。ゲノム情報は、所定の疾病、薬剤副作用または他の標的表現型との個体集団を層別化するには十分でない場合がある。細胞の代謝活性は、ｍＲＮＡによっては果たされず、むしろ翻訳されたタンパク質ならびにアルキル化、グリコシル化およびリン酸化産物のような翻訳後修飾された産物によって行われる。
【０００３】
種々のタンパク質スポットのパターン（構造変化）または強度の変化を同定するには、複合タンパク質混合物を二次元（２Ｄ）ゲル電気泳動およびそれに続く画像処理によって分析する。二次元ゲル電気泳動は煩雑で間違いが生じやすい再現性の低い方法であり、効率的に自動化することができない。このゲル技術では膜タンパク質を効率的に分析することができない。さらに２Ｄゲルの分解能は混合物中に存在するすべてのタンパク質のプロフィールを分析するには不十分である。
【０００４】
タンパク質は、細胞の重要な構造的および機能的機構を形成し、今日、上市されているほぼすべての薬物が相互作用する分子である。それ故、タンパク質は薬物の標的である。更には、薬物が相互作用し副作用を引き起こす「非標的」タンパク質の同定は特に判りにくい。多くの薬物の副作用は、標的および非標的タンパク質を含む作用機構をより理解することで少なくなり得ると考えられる。
【０００５】
そのため、
（ａ）副作用を生ずるような当たり（ｈｉｔ）を取り除くことによるｈｉｔ−ｔｏ−ｄｒｕｇ選択工程を加速させること、および
（ｂ）薬物−標的および薬物−非標的の相互作用の知識に基づき薬物の化学的構造を再設計し、望ましくない相互作用を少なくするかまたは取り除くこと
により薬物開発の期間を短縮し、コストを少なくする必要がある。
【０００６】
産業レベルへのスケールアップをし得るプロテオームの分析技術を開発する必要もある。この技術は下記の特性：高い精度、再現性および順応性をもち、ハイスループットとなり、自動化可能であり、そして費用効率がよい。それ故、自動化プロトコールおよびそのシステムを用い天然の立体構造のタンパク質および他の生体分子の厳密な調査および同定を行い得る技術を開発する必要がある。特に、生理学的条件下の疎水性タンパク質の同定および特性解析のためのストラテジーおよび技術を開発する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本明細書ではプロテオームをハイスループット形式で工業レベルで分析するための方法、捕獲化合物（本明細書では捕獲剤とも呼ぶ）、およびその収集物を提供する。この方法、捕獲化合物および収集物により、生体分子の複合混合物を選別することができる。さらに、それらにより、疾病状態などの特定の表現型を予測するかまたはその指標であるタンパク質構造を同定することができ、それによってランダムＳＮＰ分析、発現プロファイリングおよびタンパク質分析法の必要性がなくなる。捕獲化合物、収集物および方法は種々の異なる捕獲剤を提供することによって複合混合物を選別する。さらに、それらを使用して、特定の疾病状態のマーカーとして作用する構造「エピトープ」を同定すること、特定の表現型に関連して個体集団を層別化すること、分子の機能の基礎をなすタンパク質をより詳細に理解すること、および薬剤開発のための標的を提供することができる。標的タンパク質についての理解が増せば、より効率のよい治療薬の設計が可能となる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書で提供する捕獲化合物、収集物および方法はまた、生理学的条件で医薬品と相互作用する、本明細書に定義のような、薬物の標的および非標的である、受容体タンパク質および酵素（これらに限らない）を含む生体分子をスクリーニングすることができる。生体分子のスクリーニングは、医薬品または薬物の断片、代謝物または薬物合成における合成中間体の作用機構の理解を促進し、それにより、より標的特異的な薬物の設計に寄与する。その方法はまた、医薬品と相互作用し、それにより、副作用および他の望ましくない治療効果を生ずる、受容体および酵素（これらに限らない）を含むタンパク質のような非標的生体分子の同定に供される。１つの実施態様では、薬物または薬物の断片、代謝物または薬物合成における合成中間体による、捕獲化合物への種々の結合を用い、薬物または薬物の断片、代謝物または薬物合成における合成中間体のどの官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ）が標的および非標的生体分子と相互作用するかを決定する。次いで、１つの実施態様では、非標的の官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ）は薬物から除去され、その結果、より僅かな副作用が見られる薬物に改善される。他の実施態様では、薬物は捕獲化合物中に含まれており、該薬物と相互作用するタンパク質が単離され、同定され、該タンパク質は機能と関係し、該薬物は再設計され非標的タンパク質との相互作用が減少するかまたは無くなる。該方法は、望ましい場合には、再設計された薬物において繰り返される。
【０００９】
本明細書で提供する、捕獲化合物、化合物の収集物、および単一でまたは収集物で化合物を用いる方法が設計され、生体分子を捕獲し、分離し、分析する。その生体分子には、以下に限らないが、生物ポリマーおよび高分子を含む生体分子の混合物、各タンパク質または膜タンパク質を含むタンパク質のような個々の生体分子が含まれる。
【００１０】
本明細書で提供する化合物の収集物は、複数、一般的に少なくとも２、３、典型的には少なくとも１０、５０、１００、１０００以上の種々の捕獲化合物を含む。その化合物および収集物は、三次元立体配置を保存する条件下で、収集物中の捕獲化合物と混合物成分との相互作用により生体分子の混合物の精査が可能となるように設計する。
収集物の各メンバーは、
１）混合物中のすべてより少ないものとの、疎水性条件を含む生理学的条件下で、混合物の複雑度および多様性によって、典型的に約５〜２０種以上の構成要素生体分子との結合が不可逆であるか安定であるように、共有結合で結合し、
２）形態学的特性に基づいて生体分子間を識別するように設計する。さらに、捕獲化合物は一般に、一本鎖オリゴヌクレオチドまたは部分的な一本鎖オリゴヌクレオチドなどの基を含み、これによって捕獲化合物の各セットの分離が可能となる。
【００１１】
捕獲化合物および収集物は種々の方法に用いるが、特に、生物ポリマー、生物学的サンプル由来の混合物中の構成要素である生体分子を評価するために設計される。
【００１２】
捕獲化合物は、これによって共有または高結合親和性（高Ｋａ）結合を達成する化学反応基Ｘ（本明細書では官能基または官能性とも呼ぶ）および３個の他の基（本明細書では官能基または官能性とも呼ぶ）のうちの少なくとも１個を含む。他の基は、生体分子の反応性官能基との相互作用を調節する選択性官能基Ｙ、収集物の構成要素をアドレス指定する選別官能基Ｑ、および細胞膜の疎水条件をはじめとする種々の生理学的条件などの選択された条件下で捕獲化合物の溶解性を高めることなどによって、捕獲化合物の溶解性を変更する溶解性官能基Ｗの中から選択される。したがって、例えば、膜タンパク質を標的とする場合には、収集物中の捕獲化合物は、そのような環境における溶解性を高めるか提供する溶解性官能基を含むように設計される。
【００１３】
例えば、反応基（反応性官能基）としては、ヒドロキシル、アミン、アミド、スルフィドおよびカルボン酸基などのタンパク質表面の官能基と特異的に反応するかもしくは相互作用する基、または抗体、レクチン、もしくは受容体特異的リガンドなどの特定の表面領域を認識する基、または酵素の活性部位と相互作用する基が挙げられる。当業者であれば、この相互作用を達成するように官能基のライブラリーから選択することができる。この相互作用は高度に反応特異的であるが、これらの化合物は、表面の利用可能な官能基数にしたがって、同一タンパク質分子内で複数回反応することができる。反応条件を変えることによって、異なる反応性を有する表面の利用可能な官能基の同定が可能であり、それによって、個々のタンパク質を混合物から分離するために用いられる１以上の高度に反応性である部位の同定が可能となる。利用可能な技術では得られる反応混合物中の種は分離されない。本明細書で提供される収集物および化合物は、反応基と生体分子の結合を改変する、第２の官能基、選択基によってその問題を解決する。
【００１４】
選択性官能基は、種々の基、ならびに第２の官能基の幾何的間隔、一本鎖の保護されていないか、または適切に保護されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を含む。例えば、選択性官能基は標的タンパク質と非共有結合的に相互作用して反応性官能基の特異性または結合を改変する。そのような官能基としては、特定の大きさのタンパク質、疎水性化合物またはタンパク質（例えば、ＰＥＧ）を立体的に妨害することができる化学基および生体分子、疎水性化合物またはタンパク質（例えば、極性芳香族、脂質、糖脂質、ホスホトリエステル、オリゴ糖）、正または負に帯電した基、既定の二次または三次構造を生じる基または生体分子が挙げられる。
【００１５】
捕獲化合物はまた、各捕獲化合物をその構造によって分離またはアドレス指定するための選別官能基を含むことができる。選別官能基は、例えば、一本鎖の（または部分的に一本鎖の）保護されていないか、または適切に保護されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体であり得、通常、少なくとも約５個〜最大２５、３５、５０、１００個のヌクレオチド、あるいは任意の所望の数のヌクレオチド（またはその類似体）を含み、順序が変わっている配列領域と、必要に応じて隣接配列を含む。そのようなブロックの各々は、多数の配列並べ替えを有し、隣接する保存領域配列を含む場合も含まない場合もあり、塩基相補的な一本鎖核酸分子または核酸類似体とハイブリダイズできる。選別官能基はまた、バーコード、特に、機械によって読み取り可能なバーコード、その色によって選別され得る小さな着色ビーズなどのカラーコード標識をはじめとするコードなどの標識、高周波数タグまたは他の電子標識または化学標識であってもよい。結合した生体分子の個別の分析を可能にするために、捕獲化合物の各セットの選別を可能にするあらゆる官能性が考慮される。
【００１６】
捕獲化合物は収集物として、通常、すべての官能性が異なる種々の化合物のセットの収集物として提供される。生物ポリマーの複合混合物の選別のためには、収集物は多様な捕獲化合物メンバーを含み、その結果、例えば、それらを整列させると、アレイの各位置が０〜１００、一般に、５〜５０および望ましくは１〜２０、通常５〜２０種の、種々の生体分子をアレイの各位置に含む。
【００１７】
１つの実施形態の実施においては、捕獲化合物の収集物を生体分子混合物と接触させ、結合した分子を、例えば、質量分析を用い、次いで、必要に応じて、整列後に少量のタンパク質を同定するための蛍光タギングなどのタギングを行って評価する。他の実施形態では、単一の捕獲化合物を１種または複数の生体分子と接触させ、結合した分子を評価する。
【００１８】
１種または複数の捕獲化合物の、タンパク質の混合物を含むがこれに限定されない生体分子の混合物への曝露前、その間またはその後に、これらの化合物のオリゴヌクレオチド部分またはその類似体を固定化したオリゴヌクレオチド（単数または複数）またはその類似体（単数または複数）の相補鎖にハイブリダイズさせて、例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計などの質量分析、比色分析、蛍光または化学発光タギングによる、タンパク質などの結合した生体分子の分離、単離およびその後の分析を可能にするか、あるいはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析をはじめとする質量分析による分解能の向上を可能にする。
【００１９】
分析用サンプルとしてはあらゆる生体分子が挙げられ、特に、限定されるものではないが、天然および合成供給源をはじめとするタンパク質混合物などのタンパク質含有サンプルが挙げられる。タンパク質は単離された染色体、遺伝子、ｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーからの翻訳によって調製することができる。タンパク質は細胞および他の供給源から単離することもできる。特定の実施形態では、本明細書で提供される捕獲化合物は、同一のタンパク質の異なる翻訳後修飾（すなわち、リン酸化パターン（例えば、発癌遺伝子）、グリコシル化および他の翻訳後修飾）を選択的に捕獲するよう設計される。
【００２０】
収集物を用いる他の方法も提供される。一方法では、収集物または１以上のメンバー捕獲化合物を、タンパク質の種々のコンホメーション間で識別するために用い、例えば、診断などのための表現型による同定に用いることもできる。例えば、アミロイド症などの、コンホメーションが変化したタンパク質が関与している疾病である、タンパク質凝集の疾病では、収集物によって疾病関与型のタンパク質と正常タンパク質とを識別できるので、サンプルにおいて疾病を診断することができる。
【００２１】
図面の簡単な説明
図１は、タンパク質の混合物のハイブリダイゼーション、分離および質量スペクトル分析を示す図である。
【００２２】
図２は、本明細書で提供される装置の１つの実施形態を示す模式図を提供する図である。
【００２３】
図３ａ〜３ｈｈｈｈは、本明細書で提供される捕獲試薬に用いる例示的な選択性官能基を提供する図である。
【００２４】
図４ａ〜４ｆは、生体分子捕獲アッセイの概略図ならびに例示的な捕獲化合物およびタンパク質を用いた結果を示す図である。
【００２５】
図５は、捕獲化合物の選択性官能基における、バイアスのかかったおよびバイアスのかかっていない選択基の例示的な特徴を示す。
【００２６】
図６は、捕獲化合物を用いるタンパク質同定のための例示的なプロトコールを示す。
【００２７】
図７は、タンパク質捕獲に含まれる工程および捕獲化合物を用いる同定の概略図を示す。その図は、捕獲化合物が、タンパク質の混合物を含むサンプルと混合されることを示す。選択性官能基（例えば、薬物）との親和性を有するタンパク質は、選択性官能基と平衡となり得る。次いで、該捕獲化合物は活性化され（例えば、ｈυにより）、短命であり、親和性のあるタンパク質を共有結合的に捕獲するラジカルを形成する。該捕獲化合物が、選択性官能基とタンパク質との平衡のために非常に近接していなかった場合には、他のタンパク質は捕獲されない。その捕獲されたタンパク質はビオチンで単離され、質量分析を用い同定される。
【００２８】
図８は、捕獲化合物を用いる選択的タンパク質捕獲を示す。スルホンアミドを含む捕獲化合物ＡおよびＢはカルボニックアンヒドラーゼと相互作用する。（文献によると、そのＣＡＩＩイソ型のＫｄは〜１０ｎＭであり、ＣＡＩでは〜１ｕＭである（その両方の値は活性アッセイを用い独立に確認した）。精製したタンパク質を用いると、親和性および捕獲効率はＣａｒｂｏｎｉｃ  ＩＩで最も高くなり、ＣＡＩでは低くなり、他の精製し試験したタンパク質は無視される。
【００２９】
図９は、捕獲化合物Ｂの既知リガンドに対するタンパク質イソ型の相対的結合強度示す。
【００３０】
図１０は、捕獲化合物Ａを用いる、複雑なタンパク質混合物由来のカルボニックアンヒドラーゼの単離を示す。ＣＡＩＩを、ヒト腎臓細胞系ＨＥＫ２９３由来のＦＰＬＣ精製タンパク質混合物中にドープした。ドープしたＣＡＩＩを、アビジン被覆化（ＳｏｆｔＬｉｎｋ）樹脂を用い他のタンパク質すべてから取り出した。他のタンパク質は破棄し、更なる分析用に用意した精製タンパク質を得た。
【００３１】
図１１は、捕獲化合物Ａを用いる、かなり複雑なタンパク質混合物由来のカルボニックアンヒドラーゼの単離を示す。ＣＡＩＩを、ヒト腎臓細胞系ＨＥＫ２９３由来のサイトソル抽出物すべてにドープした。ドープしたＣＡＩＩを、アビジン被覆化（ＳｏｆｔＬｉｎｋ）樹脂を用い他のタンパク質すべてから取り出した。他のタンパク質を破棄し、更なる分析用に用意した精製タンパク質を得た。
【００３２】
図１２は、溶解した赤血球由来のカルボニックアンヒドラーゼの捕獲および単離を示す。図の上部のスペクトルは、溶解した赤血球（精製なし）の直接のＭＡＬＤＩを示し、他のすべてのタンパク質よりも非常に過剰であるヘモグロビンのシグナルが見られ得る。αおよびβ鎖に関してシグナルが見られ、また非特異的なダイマーに関してシグナルが見られる（〜３０キロダルトン）。図の下部のスペクトルは、カルボニックアンヒドラーゼと親和性を有するスルホンアミド薬物を含む捕獲化合物  Ａを、溶解した赤血球と混合した後に、入手した。該捕獲化合物は、カルボニックアンヒドラーゼ  イソ型ＩおよびＩＩを共有結合的に捕獲する。２−３対数過剰（２−３  ｌｏｇ  ｅｘｃｅｓｓ）であるほぼすべてのヘモグロビンを含む、共有結合的に捕獲されていない他のすべてのタンパク質をＭＡＬＤＩ分析前に洗い流した。ゲルがなく、クロマトグラフィーによる浄化が、このスペクトルを得るために必要である。ＣＡＩＩピークの強度はＣＡＩよりも高く（ＲＢＣにおいて、より高く、〜１００ｘである）、それは、スルホンアミド薬物がＣＡＩＩに対しより親和性が高いからである。
【００３３】
図１３は、事前に細胞を溶解することのない、赤血球由来のカルボニックアンヒドラーゼの直接の捕獲を示す。
【００３４】
図１４は、カルボニックアンヒドラーゼを含む非ビオチニル化タンパク質が過剰にあるときの、赤血球ライゼート由来のカルボニックアンヒドラーゼの捕獲を示す。
【００３５】
図１５は、非常に高濃度の捕獲化合物Ａを用いる、より低い親和性を有するタンパク質の捕獲を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
詳細な説明
Ａ．定義
本明細書において用語に複数の定義が存在する場合には、この節における定義が優先する。
【００３７】
本明細書においてオリゴヌクレオチドとは、リン酸ジエステル結合によって結合されている最大約２０、約５０または約１００個のヌクレオチドの直鎖配列を意味する。この長さよりも長いものには、ポリヌクレオチドという用語を使用する。
【００３８】
本明細書においてオリゴヌクレオチド類似体とは、最大約２０、約５０または約１００個のヌクレオチド類似体の直鎖配列、またはリン酸ジエステル結合以外の「主鎖」結合、例えば、リン酸トリエステル結合、ホスホルアミデート結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネートジエステル結合、チオエステル結合またはペプチド結合（ペプチド核酸）によって結合している最大約２０、約５０または約１００個までのヌクレオチドの直鎖配列を意味する。
【００３９】
本明細書においてプロテオームとは、細胞内に存在するすべてのタンパク質を意味する。
【００４０】
本明細書において生体分子とは、自然界に見ることができるあらゆる化合物またはその誘導体である。生体分子としては、限定されるものではないが、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、ステロイド、オリゴ糖および単糖が挙げられる。
【００４１】
本明細書においてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦとは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計を指す。
【００４２】
本明細書において「調整された」または「調整」とは、タンパク質に関連して用いる場合に、ポリペプチドプチドが、タンパク質のフラグメンテーションの尤度を最小にするよう、またはタンパク質もしくは構成要素アミノ酸の質量分析の分解能を高めるよう修飾されていることを意味する。タンパク質の質量分析の分解能は、質量分析を実施する前にタンパク質を調整することによって高めてもよい。調整は質量分析の前のどの段階で実施してもよく、１つの実施形態では、タンパク質を固定化する間に実施する。タンパク質は、例えば、陽イオン交換物質または陰イオン交換物質で処理することによって調整することができ、これはタンパク質の荷電不均一性を低下させ、それによって、集団中の種々のタンパク質と結合している陽イオン（または陰イオン）数の不均一性によるピークの広がりをなくすことができる。１つの実施形態では、イオン交換によって、Ｈ＋およびアンモニウムイオンを除くすべての陽イオンの除去が行われる。ポリペプチドプチドをアルキルヨーダイド、ヨードアセトアミド、ヨードエタノールまたは２，３−エポキシ−１−プロパノ−ルなどのアルキル化剤と接触させることにより、例えば、タンパク質中でのジスルフィド結合の形成を防ぐことができる。同様に、塩化トリアルキルシリルを用いて、荷電アミノ酸側鎖を無電荷の誘導体へ変換することもできる。
【００４３】
本明細書において、捕獲効率は、ＨＰＬＣ分析により測定したときの、捕獲した生体分子のピーク面積／（捕獲した生体分子のピーク面積＋捕獲していない生体分子のピーク面積）である。
【００４４】
本明細書において薬剤とは、治療薬としてもしくは治療薬を設計するためのリード化合物として用いるための候補であるか、または既知の医薬品であるあらゆる化合物を指す。そのような化合物は、有機小分子、ペプチド、ペプチドミメティックス、アンチセンス分子、抗体、抗体の断片、または組換え抗体をはじめとする小分子であり得る。特に注目されるものは、特異的結合特性を有し、その結果、それらを選択基として使用できるか、または捕獲化合物の選別のために、支持体上の標的と結合するか、選別官能基が薬剤標的である場合に、固体支持体に連結されている選別官能基のいずれかとして使用できる「薬剤」である。
【００４５】
本明細書において薬物代謝産物とは、体内の代謝後の薬物の変換で形成される任意の化合物を指し、この化合物は、親薬物（ｐａｒｅｎｔ  ｄｒｕｇ）よりも活性が大または小であり得る種々の分子となる。
【００４６】
本明細書において薬物の断片とは、薬物の一部または一部分である分子を指す。
【００４７】
本明細書において薬物である合成中間体は、薬物の化学合成における中間体として使用される化合物である。
【００４８】
本明細書において単数の用語「ａ」は単数または複数である。
【００４９】
本明細書において「薬物の標的」は、その薬物がインビボで相互作用し、相互作用により望ましい治療効果を発揮する、受容体および酵素を含み、それらに限定されないタンパク質である。
【００５０】
本明細書において「薬物の非標的」は、その薬物がインビボで相互作用することを目的としない、受容体および酵素を含み、それらに限定されないタンパク質などである。薬物と薬物の非標的との相互作用は、副作用のような望ましくない治療効果を生じ得る。
【００５１】
本明細書において「核酸」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）ならびにＲＮＡもしくはＤＮＡいずれかの類似体もしくは誘導体などの一本鎖および／または二本鎖ポリヌクレオチドを指す。「核酸」にはまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡなどの核酸の類似体および他のそのような類似体および誘導体またはそれらの組み合わせも含まれる。
【００５２】
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、および例えば、ヌクレオチド類似体またはホスホジエステル結合以外の「主鎖」結合、例えば、ホスホトリエステル結合、ホスホルアミデート結合、メチルホスホネートジエステル結合、ホスホロチオエート結合、チオエステル結合またはペプチド結合（ペプチド核酸）を含むＤＮＡまたはＲＮＡ誘導体をはじめとする少なくとも２個の連結しているヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を含むオリゴマーまたはポリマーを指す。「オリゴヌクレオチド」もまた、本明細書では「ポリヌクレオチド」と本質的に同義に用いるが、当業者は、オリゴヌクレオチド、例えば、ＰＣＲプライマーを、一般に、約５０〜１００個未満のヌクレオチドの長さであると認識する。
【００５３】
本明細書において、質量分析計で分析される生体分子に関して「質量改変」とは、質量スペクトル分析によって検出することができる既定された増分で、得られる分子の分子量を変更する、成分原子または基の変化を含むことを指す。
【００５４】
本明細書において「ポリペプチド」とは、少なくとも２個のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を意味し、これには、質量が改変されたアミノ酸およびアミノ酸アナログが含まれる。これらはペプチド結合によって連結されているもの、および改変されたペプチド結合を行うことができるものであり得る。「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書では本質的に同義に用いるが、当業者は、ペプチドが、一般に、約５０〜１００個より少ないアミノ酸残基を含み、タンパク質は天然の供給源から得られることが多く、例えば、翻訳後修飾を含み得ると認識する。
【００５５】
本明細書において「結合した」とは、通常、イオンおよび／または共有結合をはじめとする化学的相互作用による安定な結合を指す。結合手段の中には、ストレプトアビジンまたはアビジンとビオチン相互作用、疎水性相互作用、磁性相互作用（例えば、Ｄｙｎａｌ，  Ｉｎｃ．Ｇｒｅａｔ  Ｎｅｃｋ，  Ｎ．Ｙ．およびＯｓｌｏ  Ｎｏｒｗａｙによって販売されているストレプトアビジンコーティングした磁性ビーズであるＤＹＮＡＢＥＡＤＳなどの官能基をもたせた磁性ビーズを用いる）、２つの極性面間またはオリゴ／ポリエチレングリコール間の「湿潤」会合などの極性相互作用、アミド結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合などの、または架橋剤による共有結合の形成、および酸不安定性または光切断可能なリンカーによるものがある。
【００５６】
本明細書において「サンプル」とは、検出される物質を含有する組成物を指す。目的上、サンプルとは、生体分子を含み得るいずれのものも指す。
【００５７】
したがって、サンプルは生物学的サンプル（例えば、生物（例えば、ヒト、動物、植物、細菌、真菌、原生生物、ウイルス）由来の供給源から得られたいずれかの物質）を含む。生物学的サンプルは固体物質（例えば、組織、細胞ペレットおよび組織診、死体の組織）および体液（例えば、尿、血液、唾液、羊水および口洗浄液（頬側細胞を含む））をはじめ、いずれの形態であってもよい。
【００５８】
本明細書において「固体支持体」とは、気体でなく液体でもない、表面を有する物質を意味する。したがって、固体支持体は、例えば、ガラス、シリコン、金属、プラスチックまたは複合材料から構築された平坦な表面であってもよく、シリカゲル、制御された細孔性ガラス、磁性またはセルロースビーズなどのビーズの形態であってもよく、コンビナトリアル合成または分析に適したピンのアレイといったピンであってもよい。
【００５９】
本明細書において収集物とは、２以上のメンバー、通常、３、５、１０、５０、１００、５００、１０００以上のメンバーの組み合わせを指す。特に、収集物とは、本明細書で提供される捕獲化合物のそのような組み合わせを指す。
【００６０】
本明細書においてアレイとは、３以上のメンバーを含む、捕獲化合物などの要素の収集物を指す。アドレス可能なアレイとは、アレイのメンバーが、通常、固相支持体上の位置によって、また識別子または検出可能標識によって同定可能なものである。したがって、一般に、アレイのメンバーは固相表面の別個の同定可能な位置に固定されている。複数の化合物が支持体と、通常は、選別官能基の支持体表面の基または化合物との結合によって、例えば、シリコンチップまたは他の表面などの支持体表面のアレイ（すなわち、２以上のパターン）と連結されている。アドレス指定は各メンバーを高周波（ＲＦ）タグなどで電子工学的に標識することによって、カラーコードビーズまたは他のそのように識別可能なカラーコード標識を用いることによって、および分子量によって達成すればよい。アドレス指定のためのこれらの標識は選別官能基「Ｑ」として働く。したがって、一般に、アレイのメンバーを、固相表面の別個の同定可能な位置に固定化するか、あるいは同定可能な標識に直接もしくは間接的に連結させるか、別の方法で結合させる、例えば、微粒子または他の粒状支持体（本明細書ではビーズと呼ぶ）に取り付け、そして溶液に懸濁するかまたは表面上に広げる。
【００６１】
本明細書において「基質」とは、その上にサンプルおよび／またはマトリックスを付着させる不溶性支持体を指す。支持体は実質的にどのような不溶性または固体物質から調製されていてもよい。例えば、シリカゲル、ガラス（例えば、細孔性ガラス（ＣＰＧ））、ナイロン、Ｗａｎｇ樹脂、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂、エピクロロヒドリンで架橋されたデキストラン（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標））、アガロース（例えば、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標））、セルロース、磁性ビーズ、Ｄｙｎａビーズ、金属表面（例えば、鋼鉄、金、銀、アルミニウム、シリコンおよび銅）、プラスチック材料（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリエステル、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ））。１つの実施形態では、平坦な表面としてサンプルを受容、含有または結合するための親水性位置の周囲に疎水性領域を含むものを含む。
【００６２】
支持体は粒子であってもよいし、またはマイクロタイターディッシュもしくはウェル、スライドガラス、シリコンチップ、ニトロセルロースシート、ナイロンメッシュ、または他のそのような物質などの連続表面の形態であってもよい。粒子状の場合には、通常、粒子の少なくとも一方向の寸法は５〜１０ｍｍの範囲またはそれより小さい。本明細書でまとめて「ビーズ」と呼ぶそのような粒子は、必ずしもそうではないが、球形であることが多い。しかし、「ビーズ」については、マトリックの形状を制約するものではなく、ランダムな形、ニードル、ファイバーおよび細長いものをはじめ、どのような形であってもよい。「ビーズ」、特に、液相中で用いるのに十分に小さいものである微粒子も考慮される。「ビーズ」は、さらなる構成要素が本明細書の方法および分析を干渉しない限りは、磁石を用いる分離のための、磁性または常磁性粒子などのさらなる構成要素を含み得る（例えば、Ｄｙｎａ  ビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）参照）。
【００６３】
「相補鎖」とは本明細書では「補体」と同じ意味で用いられる。核酸鎖の補体はコード鎖の補体または非コード鎖の補体であり得る。
【００６４】
本明細書において、本明細書に挙げる種々のアミノ酸配列中に存在する「アミノ酸」はその十分に公知の三文字または一文字略語によって特定される。種々のＤＮＡ断片中に存在するヌクレオチドは、当技術分野で慣例的に用いられる標準的な一文字表記で示す。
【００６５】
式によって本明細書で示されるすべてのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシ末端への慣習的な方向で左から右向きであることに注意。さらに、「アミノ酸残基」とは改変されたアミノ酸および普通は存在しないアミノ酸を含むよう広く定義される。さらに、アミノ酸残基配列の先頭と最後のダッシュ記号は１個以上のアミノ酸残基のさらなる配列との、またはＮＨ２などのアミノ末端基との、またはＣＯＯＨなどのカルボキシル末端基とのペプチド結合を示すことに注意。
【００６６】
本明細書において切断可能な結合または部分とは、特定の条件下で、化学的に、酵素によってまたは光分解によって切断されるかまたは切断することができる結合または部分を指す。本明細書において、特に断りのない限り、そのような結合はＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析の条件下で、ＵＶまたはＩＲレーザーなどによって切断することができる。
【００６７】
本明細書において「選択的に切断することができる」部分とは、目的の化合物の他の部分の組成に影響を及ぼしたり変更したりすることなく選択的に切断され得る部分である。例えば、本明細書に提供される化合物の切断可能部分Ｌは、化学的切断、酵素的切断、光分解的切断または他の手段によって、タンパク質をはじめとする結合している生体分子の組成（例えば、化学組成）に影響を及ぼしたり変更したりすることなく切断され得るものである。「切断できない」部分とは、目的の化合物の他の部分の組成に影響を及ぼしたり変更したりすることなく選択的に切断することができないものである。
【００６８】
本明細書において高親和性での結合とは、少なくとも１０９の、一般に、１０１０、１０１１リットル／１モル以上の会合定数Ｋａまたは１０１０、１０１１、１０１２以上のＫｅｑを有する結合を指す。本明細書における目的上、反応基によって形成される高親和性結合は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析で用いられるレーザー（ＵＶおよびＩＲ）に対して安定なものである。
【００６９】
本明細書において「アルキル」、「アルケニル」および「アルキニル」は、特に断りのない限り、１〜２０個の炭素、または１〜１６個の炭素を含み、直鎖または分枝炭素鎖である。アルケニル炭素鎖は２〜２０個の炭素であり、特定の実施形態では、１〜８の二重結合を含む。１〜１６個の炭素のアルケニル炭素鎖は、特定の実施形態では、１〜５の二重結合を含む。アルキニル炭素鎖は２〜２０個の炭素であり、１つの実施形態では、１〜８の三重結合を含む。２〜１６個の炭素のアルキニル炭素鎖は、特定の実施形態では、１〜５の三重結合を含む。アルキル、アルケニルおよびアルキニル基の例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｔ−ペンチルおよびイソヘキシルを含む。アルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、特に断りのない限り、同一であっても異なっていてもよいアルキル基置換基をはじめとする１以上の基で必要に応じて置換することができる。
【００７０】
本明細書において「低級アルキル」、「低級アルケニル」および「低級アルキニル」とは、約６個未満の炭素を含む炭素鎖を指す。
【００７１】
本明細書において「アルケ（キ）ニル」とは、少なくとも１つの二重結合と少なくとも１つの三重結合を含むアルキル基を指す。
【００７２】
本明細書において「アルキル基置換基」としては、限定されるものではないが、ハロ、ハロ低級アルキルを含むハロアルキル、アリール、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、アラルキルオキシ、アラルキルチオ、カルボキシアルコキシカルボニル、オキソおよびシクロアルキルが挙げられる。
【００７３】
本明細書において「アリール」とは、５〜２０個の炭素原子を含む芳香族基を指し、単環、多環または縮合環系であってもよい。アリール基としては、限定されるものではないが、フェニル、ナフチル、ビフェニル、フルオレニルおよび非置換であってもよく、また１以上の置換基で置換されていてもよい他の基を挙げることができる。
【００７４】
本明細書において「アリール」とはまた、限定されるものではないが、アリールオキシ、アリールチオ、アリールカルボニルおよびアリールアミノ基をはじめとするアリールを含有している基を指す。
【００７５】
本明細書において「アリール基置換基」としては、限定されるものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、１〜３を含む１以上のハロ、ハロアルキルおよびアルキルから選択される置換基で必要に応じて置換されたヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、１〜２個の二重結合を含むアルケニル、１〜２個の三重結合を含むアルキニル、アルケ（キ）ニル基、ハロ、シュードハロ、シアノ、ヒドロキシ、ハロ低級アルキル、特にトリフルオロメチルを含むハロアルキルおよびポリハロアルキル、ホルミル、アルキルカルボニル、１〜３を含む１以上の、ハロ、ハロアルキルおよびアルキルから選択される置換基で必要に応じて置換されたアリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ジアリールアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニル、アルコキシ、アリールオキシ、ペルフルオロアルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールアルコキシ、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アリールアミノアルキル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアリールアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、アジド、ニトロ、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、ペルフルオロアルキルチオ、チオシアノ、イソチオシアノ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、アミノスルホニル、アルキルアミノスルホニル、ジアルキルアミノスルホニルおよびアリールアミノスルホニルが挙げられる。
【００７６】
本明細書において「アラルキル」とは、アルキルの水素原子のうちの１個がアリール基で置換されているアルキル基を指す。
【００７７】
本明細書において「ヘテロアラルキル」とは、アルキルの水素原子のうちの１個がヘテロアリール基で置換されているアルキル基を指す。
【００７８】
本明細書において「シクロアルキル」とは、飽和単環または多環式環系を指し、１つの実施形態では、３〜１０個の炭素原子、または３〜６個の炭素原子からなり、シクロアルケニルおよびシクロアルキニルとは、それぞれ少なくとも１つの二重結合および少なくとも１つの三重結合を含む単環または多環式環系を指す。シクロアルケニルおよびシクロアルキニル基は、１つの実施形態では、３〜１０個の炭素原子を含み、シクロアルケニル基は、他の実施形態で４〜７個の炭素原子を含み、シクロアルキニル基は、他の実施形態で８〜１０個の炭素原子を含む場合もある。シクロアルキル、シクロアルケニルおよびシクロアルキニル基の環系は１つの環または縮合、架橋またはスピロ結合様式で結合されていていもよい２以上の環からなっていてもよく、また必要に応じて１以上のアルキル基置換基で置換されていてもよい。「シクロアルケ（キ）ニル」とは、少なくとも１つの二重結合および少なくとも１つの三重結合を含むシクロアルキル基を指す。
【００７９】
本明細書において「ヘテロアリール」とは、単環または多環式環系を指し、１つの実施形態では、環系の１個以上の、または１〜３個の原子が、炭素以外の元素、例えば、窒素、酸素および硫黄原子であるヘテロ原子である、約５〜約１５員からなる。ヘテロアリールは、必要に応じて、１〜３個を含む１個以上のアリール基置換基で置換していてもよい。ヘテロアリール基は、必要に応じて、ベンゼン環に縮合させることもできる。例示的なヘテロアリール基としては、限定されるものではないが、ピロール、ポルフィリン、フラン、チオフェン、セレノフェン、ピラゾール、イミダゾール、トリアゾール、テトラゾール、オキサゾール、オキサジアゾール、チアゾール、チアジアゾール、インドール、カルバゾール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インダゾール、ベンズイミダゾール、ベンゾトリアゾール、ベンゾキサトリアゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾセレノゾール、ベンゾチアジアゾール、ベンゾセレナジアゾール、プリン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ピラジン、トリアジン、キノリン、アクリジン、イソキノリン、シノリン、フタラジン、キナゾリン、キノキサリン、フェナジン、フェナントロリン、イミダジニル、ピロリジニル、ピリミジニル、テトラゾリル、チエニル、ピリジル、ピロリル、Ｎ−メチルピロリル、キノリニルおよびイソキノリニルが挙げられる。
【００８０】
本明細書において「ヘテロアリール」とはまた、限定されるものではないが、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、ヘテロアリールカルボニルおよびヘテロアリールアミノをはじめとするヘテロアリールを含有している基をも指す。
【００８１】
本明細書において「複素環」とは、単環または多環式環系を指し、１つの実施形態では、１〜３個を含む１個以上の環系の原子が、炭素以外の元素、例えば、窒素、酸素および硫黄原子であるヘテロ原子である、３〜１０員からなり、別の実施形態では、５〜６員をはじめ、４〜７員からなる。複素環は、必要に応じて、１個以上、または１〜３個のアリール基置換基で置換されていてもよい。特定の実施形態では、複素環基の置換基としては、ヒドロキシ、アミノ、１〜４個の炭素原子を含有するアルコキシ、トリフルオロメチルなどのトリハロメチルをはじめとするハロ低級アルキル、およびハロゲンが挙げられる。本明細書において複素環とは、ヘテロアリールについての言及も含み得る。
【００８２】
本明細書においてアルキル、アルコキシ、カルボニルなどの名称は、当業者に一般に理解されるように用いられる。例えば、本明細書においてアルキルとは、直鎖もしくは分枝鎖であり得るか、または環状部分を含むかもしくは環状であり得る１個以上の炭素を含む飽和炭素鎖を指す。
【００８３】
任意の所定の置換基の数に特に断りのない限り（例えば、「ハロアルキル」）、１個以上の置換基が存在し得る。例えば、「ハロアルキル」は１個以上の同一または異なるハロゲンを含み得る。別の例として、「Ｃ１−３アルコキシフェニル」とは、１、２または３個の炭素を含有する、１個以上の同一または異なるアルコキシ基を含み得る。
【００８４】
カルボキシのような名づけられた置換基またはＷなどの記号によって表される置換基が別個に括弧内に含まれており、さらに括弧の外側の数値を示す下付き文字を含まず、括弧内にはない置換基に続く場合、例えば、「Ｃ１−４アルキル（Ｗ）（カルボキシ）」では、「Ｗ」および「カルボキシ」は各々はＣ１−４アルキルに直接連結されている。
【００８５】
本明細書において「ハロゲン」または「ハライド」とは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩを指す。
【００８６】
本明細書においてシュードハライドとは、ハライドと実質的に同様に挙動する化合物である。そのような化合物はハライド（ＸがＣｌまたはＢｒなどのハロゲンであるＸ−）と同様に用いることができ、そして同様に処理することができる。シュードハライドとしては、限定されるものではないが、シアニド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、セレノシアネート、トリフルオロメトキシおよびアジドが挙げられる。
【００８７】
本明細書において「ハロアルキル」とは、１個以上の水素原子が、ハロゲンと置換されている低級アルキルラジカルを指す。
【００８８】
本明細書において「ハロアルコキシ」とは、Ｒがハロアルキル基であるＲＯ−を指す。
【００８９】
本明細書において「スルフィニル」または「チオニル」とは、−Ｓ（Ｏ）−を指す。本明細書において「スルホニル」または「スルフリル」とは、−Ｓ（Ｏ）２−を指す。本明細書において「スルホ」とは、−Ｓ（Ｏ）２Ｏ−を指す。
【００９０】
本明細書において「カルボキシ」とは、二価のラジカル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−を指す。
【００９１】
本明細書において「アミノカルボニル」とは、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２−を指す。
【００９２】
本明細書において「アルキルアミノカルボニル」とは、Ｒが水素または低級アルキルをはじめとするアルキルである−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲを指す。
【００９３】
本明細書において「ジアルキルアミノカルボニル」とは、本明細書においてＲ’およびＲが水素または低級アルキルをはじめとするアルキルから独立に選択される−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒを指す。
【００９４】
本明細書において「カルボキサミド」とは、次式−ＮＲ’ＣＯＲの基を指す。
【００９５】
本明細書において「ジアリールアミノカルボニル」とは、ＲおよびＲ’がフェニルなどの低級アリールをはじめとするアリールから独立に選択される−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’を指す。
【００９６】
本明細書において「アラルキルアミノカルボニル」とは、ＲおよびＲ’のうちの一方がフェニルなどの低級アリールをはじめとするアリールであり、かつ、ＲおよびＲ’のうちのもう一方が低級アルキルをはじめとするアルキルである−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’を指す。
【００９７】
本明細書において「アリールアミノカルボニル」とは、Ｒがフェニルなどの低級アリールをはじめとするアリールである−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲを指す。
【００９８】
本明細書において「アルコキシカルボニル」とは、Ｒが低級アルキルをはじめとするアルキルである−Ｃ（Ｏ）ＯＲを指す。
【００９９】
本明細書において「アリールオキシカルボニル」とは、Ｒがフェニルなどの低級アリールをはじめとするアリールである−Ｃ（Ｏ）ＯＲを指す。
【０１００】
本明細書において「アルコキシ」および「アルキルチオ」とは、Ｒが低級アルキルをはじめとするアルキルであるＲＯ−およびＲＳ−を指す。
【０１０１】
本明細書において「アリールオキシ」および「アリールチオ」とは、Ｒがフェニルなどの低級アリールをはじめとするアリールであるＲＯ−およびＲＳ−を指す。
【０１０２】
本明細書において「アルキレン」とは、直鎖、分枝鎖または環を指し、１つの実施形態では、直鎖または分枝鎖の、二価の脂肪族炭化水素基を指し、特定の実施形態では１から約２０個の炭素原子を含み、他の実施形態では、低級アルキレンをはじめとする１〜１２個の炭素を含む。アルキレン基は、必要に応じて１個以上の「アルキル基置換基」で置換されていてもよい。アルキレン基には、必要に応じて１個以上の酸素、硫黄または置換もしくは非置換窒素原子が挿入されていてもよく、ここで、窒素置換基は先に記載されたようなアルキルである。例示的なアルキレン基としては、メチレン（ＣＨ２）、エチレン（ＣＨ２ＣＨ２）、プロピレン（−（ＣＨ２）３）、シクロへキシレン（Ｃ６Ｈ１０）、メチレンジオキシ（ＯＣＨ２Ｏ）およびエチレンジオキシ（Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ）が挙げられる。「低級アルキレン」とは、１〜６個の炭素を含むアルキレン基を指す。特定の実施形態では、アルキレン基は１〜３個の炭素原子のアルキレンをはじめとする低級アルキレンである。
【０１０３】
本明細書において「アルケニレン」とは、直鎖、分枝鎖または環を指し、１つの実施形態では、直鎖または分枝鎖の、脂肪族炭化水素基を指し、特定の実施形態では２から約２０個の炭素原子と少なくとも１つの二重結合を含み、他の実施形態では、低級アルケニレンをはじめとする１〜１２個の炭素を含む。アルケニレン基は、必要に応じて１個以上の「アルキル基置換基」で置換されていてもよい。アルケニレン基には、必要に応じて、１個以上の酸素、硫黄または置換もしくは非置換窒素原子が挿入されていてもよく、ここで、窒素置換基は先に記載されたようなアルキルである。例示的なアルケニレン基としては、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−およびＣＨ＝ＣＨＣＨ２が挙げられる。「低級アルケニレン」とは、２〜６個の炭素を含むアルケニレン基を指す。特定の実施形態では、アルケニレン基は３〜４個の炭素原子のアルケニレンをはじめとする低級アルケニレンである。
【０１０４】
本明細書において「アルキニレン」とは、直鎖、分枝鎖または環を指し、１つの実施形態では、直鎖または分枝鎖の、二価の脂肪族炭化水素基を指し、特定の実施形態では、２から約２０個の炭素原子と少なくとも１つの三重結合を含み、他の実施形態では、低級アルキニレンをはじめとする１〜１２個の炭素を含む。アルキニレン基は、必要に応じて１個以上の「アルキル基置換基」で置換されていてもよい。アルキニレン基には、必要に応じて１個以上の酸素、硫黄または置換もしくは非置換窒素原子が挿入されていてもよく、ここで、窒素置換基は先に記載されたようなアルキルである。例示的なアルキニレン基としては、−Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ−、Ｃ≡ＣおよびＣ≡ＣＣＨ２が挙げられる。「低級アルキニレン」とは、２〜６個の炭素を含むアルキニレン基を指す。特定の実施形態では、アルキニレン基は３〜４個の炭素原子のアルキニレンをはじめとする低級アルキニレンである。
【０１０５】
本明細書において「アルケ（キ）ニレン」とは、直鎖、分枝鎖または環を指し、１つの実施形態では、直鎖または分枝鎖の、二価の脂肪族炭化水素基を指し、特定の実施形態では、２から約２０個の炭素原子と少なくとも１つの三重結合と少なくとも１つの二重結合を含み、他の実施形態では、低級アルケ（キ）ニレンをはじめとする１〜１２個の炭素原子を含む。アルケ（キ）ニレン基は、必要に応じて１個以上の「アルキル基置換基」で置換されていてもよい。アルキニレン基には、必要に応じて、１個以上の酸素、硫黄または置換もしくは非置換窒素原子が挿入されていてもよく、ここで、窒素置換基は先に記載されたようなアルキルである。例示的なアルケ（キ）ニレン基としては、−Ｃ＝Ｃ−（ＣＨ２）ｎＣ≡Ｃ−（ここで、ｎは１または２である）が挙げられる。「低級アルケ（キ）ニレン」とは、最大６個の炭素を含むアルケ（キ）ニレン基を指す。特定の実施形態では、アルケ（キ）ニレン基は４個の炭素原子のアルケ（キ）ニレンをはじめとする低級アルケ（キ）ニレンである。
【０１０６】
本明細書において「アリーレン」とは、単環式または多環式を指し、１つの実施形態では、単環式の、二価の芳香族基を指し、特定の実施形態では、５から約２０個の炭素原子と少なくとも１つの芳香族環を含み、他の実施形態では、低級アリーレンを含む５〜２０個の炭素を含む。アリーレン基は、必要に応じて１個以上の「アルキル基置換基」で置換されていてもよい。アリーレン基の周囲には、必要に応じて、１個以上の酸素、硫黄または置換もしくは非置換窒素原子が挿入されていてもよく、ここで、窒素置換基は先に記載されたようなアルキルである。例示的なアリーレン基としては、１，２−、１，３−および１，４−フェニレンが挙げられる。「低級アリーレン」とは、５または６個の炭素を含むアリーレン基を指す。特定の実施形態では、アリーレン基は低級アリーレンである。
【０１０７】
本明細書において「ヘテロアリーレン」とは、二価の単環式または多環式環系を指し、１つの実施形態では、環系の１個以上または１〜３個の原子が、炭素以外の元素、例えば、窒素、酸素および硫黄原子であるヘテロ原子である、約５〜約１５員からなる。ヘテロアリーレン基は、必要に応じて、１個以上、または１〜３個のアリール基置換基で置換されていてもよい。
【０１０８】
本明細書において「アルキリデン」とは、二重結合の形成により別の基の１つの原子に連結されている、＝ＣＲ’Ｒ’’などの二価の基を指す。例示的なアルキリデン基には、メチリデン（＝ＣＨ２）およびエチリデン（＝ＣＨＣＨ３）がある。本明細書において「アラルキリデン」とは、Ｒ’またはＲ’’のいずれかがアリール基であるアルキリデン基を指す。
【０１０９】
本明細書において「アミド」とは、二価の基Ｃ（Ｏ）ＮＨを指す。「チオアミド」とは、二価の基Ｃ（Ｓ）ＮＨを指す。「オキシアミド」とは、二価の基ＯＣ（Ｏ）ＮＨを指す。「チアアミド」とは、二価の基ＳＣ（Ｏ）ＮＨを指す。「ジチアアミド」とは、二価の基ＳＣ（Ｓ）ＮＨを指す。「ウレイド」とは、二価の基ＨＮＣ（Ｏ）ＮＨを指す。「チオウレイド」とは、二価の基ＨＮＣ（Ｓ）ＮＨを指す。
【０１１０】
本明細書において「セミカルバジド」とは、ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＮＨを指す。「カルバゼート」とは、二価の基ＯＣ（Ｏ）ＮＨＮＨを指す。「イソチオカルバゼート」とは、二価の基ＳＣ（Ｏ）ＮＨＮＨを指す。「チオカルバゼート」とは、二価の基ＯＣ（Ｓ）ＮＨＮＨを指す。「スルホニルヒドラジド」とは、基ＳＯ２ＮＨＮＨを指す。「ヒドラジド」とは、二価の基Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨを指す。「アゾ」とは、二価の基Ｎ＝Ｎを指す。「ヒドラジニル」とは、二価の基ＮＨＮＨを指す。
【０１１１】
本明細書において、フェニルまたはピリジルなどのいずれかの特定の基が明記されている場合には、これは、その基が非置換であるか、または置換されているということを意味する。置換基としては、特に断りのない限り、ハロ、ハロ低級アルキル、および低級アルキルがある。
【０１１２】
本明細書において、高次構造が変更されているタンパク質病（またはタンパク質凝集の疾病）とは、疾病に関連しているコンホメーションを有するタンパク質またはポリペプチドが関係している疾病を指す。本明細書に提供される方法および収集物により、検出される疾病と関連している配座異性体の検出が可能となる。２以上の異なるコンホメーションを示し、そのうちの少なくとも１つのコンホメーションが高次構造が変更されたタンパク質である、タンパク質が関係している疾病としては、限定されるものではないが、アミロイド病、および当業者に公知であり、以下に示す他の神経変性疾患が挙げられる。
【０１１３】
Ｂ．  捕獲化合物の収集物
【０１１４】
以下により詳細に記載するように、本明細書で提供する化合物は多機能的な合成小分子であり、それは、特有の表面特徴に基づき、タンパク質を選択し、共有結合（「捕獲」）し、単離し得る。該化合物の溶解性は化学合成過程で修飾され得、それにより、水溶解性（サイトソル的）または不溶性（膜）タンパク質混合物が分析され得る。その化合物は３つの重要な官能基を用いる：（１）反応性官能基；（２）選択性官能基；および（３）選別官能基。
【０１１５】
図５に示すように、選択性官能基は、例えば、酵素の活性部位または受容体のリガンド結合部位において（例えば、非標的同定のための「バイアスのかかったアプローチ」）、または結合部位の外側の表面親和性モチーフ（ＳＡＭ）において（例えば、標的発見のための「バイアスのかからないアプローチ」）、タンパク質との非共有結合的相互作用を介し相互作用する。バイアスのかかった選択性基は、複合混合物から特定タンパク質の単離を可能とする。１つの実施態様では、選択性官能基は副作用を生ずることが知られる薬物（またはその代謝物）であり、それは、タンパク質に接近可能な分子の種々の部分を形成するべく幾つかの異なる方向で結合している。バイアスのかかっていない選択性官能基は、タンパク質表面との親和性相互作用を基礎とする化学的特徴を用いる。バイアスのかかっていない選択性官能基はバイアスのかかっているものよりも特異性が低い傾向があり、それは、タンパク質のより広範のセットと相互作用するように設計されているためである。バイアスのかかっていない捕獲化合物を使用し、正常細胞と病的細胞との間の全体的タンパク質プロファイルの相違についてスクリーニングするには、プロテオーム中のタンパク質の大部分とセットとして相互作用する捕獲化合物のライブラリーの開発が必要となる。このアプローチは、薬物分子の影響により生ずるタンパク質プロファイルの相違のモニタリング、または健康細胞および疾患細胞との間のその相違に基づく新規の可能性ある薬物の標的または生体マーカーを発見することを可能とする。
【０１１６】
１つの実施態様では、反応性官能基は、選択されたタンパク質を共有結合的に「捕獲する」かまたはそれと結合する。選択性官能基は、エサとしての役割をし、その一方、反応性官能基は釣針としての役割をする。このように捕獲されたタンパク質は、下流の精製および分析工程で残ることができるであろう。用いる反応性官能基は、特定のタンパク質側鎖と化学的に反応（例えば、ＮＨＳはリジンアミノ官能基との結合を形成する）するか、または共有結合の形成（例えば、ナイトレン（ｎｉｔｒｅｎｅ）ラジカルを形成するアジドのような光活性化部分）前に活性化ステップ（すなわち、光）を必要とする。
【０１１７】
他の実施態様では、選別（取り出す（ｐｕｌｌ−ｏｕｔ））作用物は、固体支持体（例えば、磁性ビーズ、ＤＮＡチップ）を用い、複雑な細胞性環境から特定のタンパク質を単離し、その後、構造的および機能的特性解析を可能とする。
【０１１８】
他の実施態様では、分析工程（図７）は簡単であり、自動化に非常に適用しやすい。第一に、目的の細胞由来のタンパク質混合物を、タンパク質の天然構造の特徴を保持する緩衝液条件で捕獲化合物と共にインキュベートする。選択性官能基は可逆的に相互作用し、親和性を有するタンパク質と平衡となる。次いで、反応性官能基は、親和性のあるタンパク質に化合物を可逆的に結合する共有結合を形成する。我々のデータは、タンパク質と捕獲化合物との間の親和性が高くなればなるほど、共有結合的に捕獲した割合が高くなることを示している。次に、共有結合的に捕獲したタンパク質は、固体支持体上で単離し、捕獲されていない細胞性成分およびタンパク質を洗い流した。選択された選別官能基がビオチンならば、アビジンまたはストレプトアビジンビーズを固体支持体として使用する。質量分析（ＭＳ）を用い、捕獲したタンパク質を検出する。
【０１１９】
特定の実施態様では、そのスピードおよび精度（０．０１％−０．１０％で測定されるＭｒ）、分離能（非常に小さな構造変化により質量シフトが生ずる）および複合化能（多くのタンパク質が同時にスキャンされる）により、ＭＳはタンパク質同定に使用する。この最初の質量スペクトルは、捕獲したすべてのタンパク質の分子量を提供する。それぞれの同一性は、通常の方法により決定し得る（例えば、消化および分析またはペプチドフラグメントおよびゲノム／プロテオームデータベースサーチ）。捕獲化合物の使用により、研究者は、更なる分析が可能となり、タンパク質の特性解析が可能となる。それは、他のすべてのものから物理的に単離されているためである（例えば、質量スペクトル同定、またはビーズから取り除いた後のｘ−線結晶）。そうするために、タンパク質は、固体支持体（例えば、アビジン／ストレプトアビジンビーズを用いるならば、ビオチンによるビーズの処理により捕獲したタンパク質が置換される）から洗浄されるか、または組み込まれた光切断可能なリンカー、または酵素学的もしくは化学的に切断可能なリンカーを使用し、それにより、固体支持体から捕獲した精製タンパク質を放出する。
【０１２０】
本収集物は、翻訳後修飾されたタンパク質を含むプロテオームおよび他の生体分子の分析のためのトップダウン全体論的アプローチを可能にする。核酸およびゲノム（ボトムアップ）ではなく、タンパク質および他の生体分子パターンがこれらの収集物を用いる分析の出発点である。本収集物を用いて、生物学的サンプルなどのサンプルの生体分子構成要素を評価すること、病状などの特定の表現型に特異的な構成要素を同定すること、構造的機能、生化学経路および作用機構を同定することができる。有用な本収集物および方法により、生体分子の不偏的分析が可能となる。本収集物は、生体分子の複合混合物（すなわち、５０、１００、５００、１０００、２０００種以上の混合物）の構成要素が、減少した数、通常、複雑性が１０％、５０％、またはそれ以上減少した別個の位置に、またはアレイ中の位置当たり約１〜５０種の異なる生体分子に選別されるのを可能にし、その結果、各スポットの構成要素を質量スペクトル分析だけで、または他の分析と組み合わせ分析することができる。表現型分析の場合などの一部の実施形態においては、細胞などの出発サンプルの均一性が重要である。均一性を提供するためには、病変対健常などの、同一個体由来の種々の表現型の細胞を比較する。これを実施する方法を本明細書中で提供する。
【０１２１】
収集物中の化合物の構造によって、収集物を使用して、タンパク質の翻訳後プロセシングに由来する変化などの構造変化を検出することが可能であり、また収集物を使用して、シグナル伝達、イオンチャンネル、リガンド相互作用の受容体および細胞間相互作用などのほとんどの基礎的なプロセスに関与している膜タンパク質の変化を検出することもできる。細胞が罹患すると、変形などの疾病に伴う変化が、多くの場合は膜タンパク質に生じる。
【０１２２】
収集物はメンバー捕獲化合物のセットを含む。一般に、各セットのメンバーは少なくとも１つ、通常、２つまたは３つの官能基が他のセットのメンバーと異なっている。したがって、例えば、化合物が反応性官能基、選択性官能基および選別官能基を含む場合には、各セットは少なくとも選別官能基が、典型的には、少なくとも選別官能基と選択性官能基が、通常、３種すべての官能基が異なる。選択された環境におけるアッセイを可能にするよう選択される、溶解性官能基が存在する場合には、それは化合物間で異なっていてもよいし、またはすべてのセットの間で同一であってもよい。
【０１２３】
本方法を実施する際は、収集物をサンプルまたは部分精製もしくは精製したその構成要素と接触させて、生体分子と収集物中の捕獲化合物とを結合させる。捕獲化合物は、接触させる前に固体支持体に結合させたもののようなアドレス可能なアレイ中にあってもよいし、またはサンプルと接触させた後に整列させることもできる。得られるアレイを、必要に応じてプロテアーゼなどの、結合しているポリマーを特異的に切断する試薬で処理し、そして分析、特に質量スペクトル分析に付して、各位置に結合した生体分子の構成要素を同定する。ひと度、目的のタンパク質またはその一部などの生体分子の分子量を決定すれば、生体分子を同定することができる。同定方法としては、データベース、例えば、プロテアーゼ断片およびその分子量を含むタンパク質データベースとの分子量の比較が挙げられる。
【０１２４】
捕獲化合物は、必要な分離および分析の特異性（分析される混合物の複雑性によって異なる）にしたがって、反応性、選択性および分離性を付与する官能基を含む。一般に、本明細書に提供される化合物は、：生物ポリマーと共有結合によって結合する反応性官能基；非共有的相互作用によって反応性官能基の特異性を高める選択性官能基；化合物が捕獲化合物の構造にしたがってアドレス指定される（整列させられるかもしくは別の方法で分離される）ことを可能にする選別官能基；および反応が実施される環境によって化合物の溶解性を変更するよう選択する際、条件が生理学的条件をシミュレートするのを可能にする溶解性官能基から選択される官能基（官能基）を含む。一般に、共有結合によってタンパク質またはその一部などと特異的に相互作用する反応基である反応性官能基と、他の官能基である選択性官能基は、反応性官能基の特異性を高めるように変更する。一般に、反応性官能基は共有結合によって特定の生体分子上の基、例えば、タンパク質表面のアミン基と相互作用する。反応性官能基は生体分子と相互作用して、共有結合を形成する。分析条件としては、限定されるものではないが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計などの質量分光光度計による分析が挙げられる。選択性官能基は非共有的相互作用によって反応性官能基と相互作用することができる種類の生体分子に影響を及ぼす。選択性官能基は特定の基の特異性を変化させ、一般的には、反応性官能基が反応する基の数を減少させる。１つの目標は１つの位置に結合されるタンパク質または生体分子数を減少させることであり、その結果、タンパク質が質量分析などによって分離され得る。
【０１２５】
本明細書に提供される捕獲化合物の中には、少なくとも２つのセット：一方は水溶液中での反応用のもの（例えば、親水性生体分子との反応のためのもの）および他方は有機溶媒（例えば、クロロホルム）中での反応のためのもの（例えば、疎水性生体分子との反応のためのもの）に分類することができる。したがって、特定の実施形態では、本明細書に提供される化合物は、親水性および疎水性タンパク質を識別し、両クラスのタンパク質の分析が可能となる。
【０１２６】
Ｃ．  捕獲化合物
捕獲化合物（捕獲剤とも呼ぶ）を提供する。捕獲化合物は１以上の反応性官能基「Ｘ」と、必要に応じて少なくとも選択性官能基「Ｙ」および／または選別官能基「Ｑ」およびまた、必要に応じて１以上の溶解性官能基「Ｗ」を提示するコア「Ｚ」含む。分子には、さらに、切断可能なリンカーおよび他の官能基も含まれる。官能基がコアまたは足場上に提示される特定の様式が設計選択の重大事であるが、得られる分子が生体分子、特にタンパク質を十分な特異性で、かつ、共有結合か十分な安定性もしくは親和性の結合のいずれかで捕獲し、ＭＡＬＤＩ質量スペクトル分析をはじめとする質量分析計などによる分析を可能にし、その結果、結合した生体分子の少なくとも一部が結合したままにする（一般に、１０９、１０１０、１０１１、リットル／モル以上の結合親和性、または１０９、１０１０、１０１１、１０１２以上のＫｅｑ）という特性を有するよう選択される。
【０１２７】
反応性官能基Ｘは、共有結合を形成する任意のものであるように選択する。選択性官能基Ｙは、反応性結合部位の周囲のタンパク質のトポロジーを「捉えて」反応性官能基が相互作用する基の環境を選択する。
【０１２８】
Ｑは整列させることなどによって、捕獲化合物の各セットを他のものから分離するための手段を提供すればどのようなものであってもよい選別官能基であり、これにはビオチン、一般的には、整列させられている表面のアビジンと結合するスペーサー（またはその逆）、オリゴヌクレオチドアレイと結合するためのオリゴヌクレオチドなどの基が挙げられ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析などの質量スペクトル分析に耐えられる十分な親和性で結合する同族結合パートナーを有する任意の分子を選択すればよい。いずれの収集物についても、種々の異なる選別基を使用することができ、捕獲化合物の各セットは他のセットと比べて独特のＱを有するべきである。さらに、ＲＦタグ、蛍光タグ、カラーコードタグまたはビーズ、バーコードまたは他のシンボロジー標識されたタグなどの標識、および他のそのような標識によって選別することができる標識手段を用いることもできる。例えば、捕獲化合物またはＸ、Ｙ、Ｚ、Ｗ官能基は、ＲＦタグまたは着色タグと連結されて表面上に存在することもできる。これらは反応後に容易に選別でき、その結果、各セットを個別に分析して結合した生体分子を同定することができる。したがって、収集物は種々の選別基を有している捕獲化合物を含むことができる。
【０１２９】
溶解性官能基、Ｗは収集物の捕獲化合物構成要素の特性の変更を可能にする。例えば、Ｗを捕獲化合物が特定の反応媒体もしくは疎水性環境などの環境において可溶性であるか、またはそうでないように選択し、それによって膜構成要素との反応を可能にすることができる。収集物は捕獲化合物セットを含み、そのセットの各々はＱが異なり、ＸおよびＹの少なくとも一方もしくは両方が異なっている。
【０１３０】
選別官能基は選択的に切断されてその除去が可能となり得る。
【０１３１】
それぞれの官能性についてのさらに詳細な説明および議論、ならびに限定するものではない例示的な実施形態を以下に続ける。
【０１３２】
１．  Ｚ、コア
一般に、すべての化合物は、炭素などの１個の原子であっても、官能基を提示するための官能基を含む。本明細書における特定の実施形態では、本明細書に提供される方法に用いる捕獲化合物に関しては、Ｚは、限定されるものではないがタンパク質をはじめとする生体分子の化学構造を変更することなく、生体分子の質量スペクトル分析をはじめとする分析の前またはその間に切断することができる部分である。
【０１３３】
Ｚは３つの官能基を含有する三官能性部分であり、これらの各官能基は他の２つの官能基の存在下で選択的に各々誘導され得る。非限定的なその三官能基部分の例には、側鎖に官能基を有するアミノ酸（例えば、チロシン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、トレオニン、セリンなど）が含まれる。そのアミノ酸には、天然および非天然のアミノ酸が含まれる。
【０１３４】
例えば、一部の実施形態においては、本明細書に提供される方法は、アドレス可能な形式で提示されているタンパク質の質量スペクトル分析のステップを含む。特定の実施形態では、次いで、化合物を、捕獲化合物のオリゴヌクレオチド部分またはオリゴヌクレオチド類似体部分（Ｑ、選別官能基）と相補的である一本鎖部分（または一本鎖となり得る部分）を含む一本鎖オリゴヌクレオチドのアレイと結合させる。これらの実施形態では、Ｚは（ｉ）本明細書に提供される化合物との、生体分子、例えば、タンパク質との反応に必要な反応条件に対して安定であり、（ｉｉ）Ｑ部分との一本鎖オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに必要な条件に対して安定であり、かつ、（ｉｉｉ）生体分子の分析の前またはその間に切断可能である基であるように選択することができる。
【０１３５】
別の実施形態では、官能基が連結されているＺは、Ｑ、Ｘ、Ｗおよび／またはＹとともに細胞膜の脂質二重層に溶解させて、ＸおよびＹ官能基によって細胞膜タンパク質の内部と接触するように設計することができる。この実施形態では、支持体が、細胞膜内のタンパク質をはじめとする膜タンパク質およびオルガネラタンパク質などのタンパク質を捕獲する。捕獲化合物および官能基は、得られる捕獲化合物が選択された生理学的条件下で機能するように選択することができる。したがって、Ｚ、Ｑ、Ｘ、Ｗおよび／またはＹを選択することによって、細胞膜および他の生物学的膜を模倣する表面および支持体の設計が可能となる。
【０１３６】
一部の実施形態においては、膜タンパク質の構造を維持する１つの方法として、支持体の表面にリポソームおよび他のミセルの形成に使用される脂質二重層が与えられ、これによって表面上に脂質二重層が作成される。これは支持体が「Ｚ」官能基であり、他の官能基がそれに連結されている場合に、または化合物がＱ基を介して、例えば、二本鎖オリゴヌクレオチドによって支持体に連結されている場合に用いることができる。得られる固定化された捕獲化合物は脂質被膜でコーディングしてもよいしその中に溶解させてもよい。結果として、本明細書に提供される化合物および収集物を、人工膜とすることができ、多孔性支持体上で自己組織化して極薄有機膜を形成することがる両親媒性デンドリマーまたは多分岐ブロック共重合体の合成による、一定の空隙寸法および膜厚を有する膜の制御合成のためには、デンドリマーポリマー化学を用いてもよい。１つの実施形態では、有機膜は直鎖状ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）ブロックの一方の末端と結合しているポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーからなる直鎖状樹状ジブロック共重合体からなる。
【０１３７】
Ｚは質量スペクトル分析の条件下で切断できる
そのような１つの実施形態では、ＺはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計に用いられるレーザーによって切断される光切断が可能な基である。別の実施形態では、Ｚはハイブリダイズされるなどによって整列させられた化合物−生体分子結合体への質量スペクトル分析のためのマトリックスの適用の際に、または分析の前に蒸気または液体の形態の酸（例えば、トリフルオロ酢酸または塩酸）に曝露することによって切断される酸不安定性基である。この実施形態では、マトリックスがアレイの空間的完全性を維持し、このことによってアレイのアドレス可能な分析が可能となる。
【０１３８】
Ｚは質量スペクトル分析の条件下で切断できない
特定の実施形態では、本明細書で提供する方法に用いる捕獲化合物は生体分子の、限定されるものではないが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量スペクトルなどの質量分析計をはじめとする分析に用いられる条件下で切断されないＺ部分を含む。これらの実施形態の捕獲化合物は、例えば、その混合物中の生体分子を同定するための、タンパク質−タンパク質をはじめとする生体分子−生体分子相互作用を調べるための、およびタンパク質−薬剤またはタンパク質−薬剤候補をはじめとする生体分子−小分子相互作用を決定するための本明細書で提供する方法に用いることができる。これらの実施形態では、Ｚ基は分析のために必ずしも切断されるわけではない。
【０１３９】
したがって、上記のように、Ｚは実質的には結合（選択性および反応性官能基）および溶解性官能基および選別官能基を提示するコアとなるどのような部分であってもよい。
【０１４０】
ａ．  多価または二価のＺ部分
１つの実施形態では、Ｚは、切断できるか切断できない多価または二価の基であり、一般に、５０以下の、または２０未満のメンバーを含み、直鎖または分枝鎖アルキレン、直鎖または分枝鎖アルケニレン、直鎖または分枝鎖アルキニレン、直鎖または分枝鎖アルキレンオキシ、直鎖または分枝鎖アルキレンチオ、直鎖または分枝鎖アルキレンカルボニル、直鎖または分枝鎖アルキレンアミノ、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、シクロアルキニレン、シクロアルキレンオキシ、シクロアルキレンチオ、シクロアルキレンカルボニル、シクロアルキレンアミノ、ヘテロシクリレン、アリーレン、アリーレンオキシ、アリーレンチオ、アリーレンカルボニル、アリーレンアミノ、ヘテロアリーレン、ヘテロアリーレンオキシ、ヘテロアリーレンチオ、ヘテロアリーレンカルボニル、ヘテロアリーレンアミノ、オキシ、チオ、カルボニル、カルボニルオキシ、エステル、アミノ、アミド、ホスフィノ、ホスフィンオキシド、ホスホルアミダート、ホスフィンアミダート、スルホンアミド、スルホニル、スルホキシド、カルバマート、ウレイドおよびこれらの組み合わせから選択され、必要に応じて、１、２、３または４個を含む１個以上の、本明細書の別の場所に記載したＹから選択される置換基で各々独立に置換されていてもよい。
【０１４１】
他の実施形態では、Ｚは直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖アルケニル、直鎖または分枝鎖アルキニル、（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄ、Ｏ、Ｓ、（ＣＨ２）ｄ、（ＣＨ２）ｄＯ、（ＣＨ２）ｄＳ、＞Ｎ（Ｒ１５）、（Ｓ（Ｏ）ｕ）、（Ｓ（Ｏ）２）ｗ、＞Ｃ（Ｏ）、（Ｃ（Ｏ））ｗ、（Ｃ（Ｓ（Ｏ）ｕ））ｗ、（Ｃ（Ｏ）Ｏ）ｗ、（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄＯ、（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄＳ（Ｏ）ｕ、Ｏ（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄ、Ｓ（Ｏ）ｕ（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄ、（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄＯ（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄ、（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄＳ（Ｏ）ｕ（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄ、Ｎ（Ｒ１５）（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄ、（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄＮ  Ｒ１５、（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄＮ（Ｒ１５）（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄ、−（ＣＨ２）ｄＣ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ２）ｄ−、−（ＣＨ２）ｄＣ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ２）ｄＣ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ２）ｄ−、（Ｓ（Ｒ１５）（Ｏｕ）ｗ、（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄ、（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄＯ（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄ、（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄ（Ｃ（Ｏ）Ｏ）ｗ（ＣＲ１５）２）ｄ）、（Ｃ（Ｏ）Ｏ）ｗ（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄ、（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄ（Ｃ（Ｏ）Ｏ）ｗ、（Ｃ（Ｓ）（Ｒ１５）ｗ、（Ｃ（Ｏ））ｗ（ＣＲ１５２）ｄ、（ＣＲ１５）ｄ（Ｃ（Ｏ））ｗ（ＣＲ１５）ｄ、（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄ（Ｃ（Ｏ））ｗ、Ｎ（Ｒ１５）（Ｃ（Ｒ１５）２）ｗ、ＯＣ（Ｒ１５）２Ｃ（Ｏ）、Ｏ（Ｒ１５）２Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１５）、（Ｃ（Ｒ１５）２）ｗＮ（Ｒ１５）（Ｃ（Ｒ１５）２）ｗ、（Ｃ（Ｒ１５）２）ｗＮ（Ｒ１５）、＞Ｐ（Ｏ）ｖ（Ｒ１５）ｘ、＞Ｒ（Ｏ）ｕ（Ｒ１５）３、＞Ｐ（Ｏ）ｕ（Ｃ（Ｒ１５）２）ｄ、＞Ｓｉ（Ｒ１５）２、およびこれらの基のいずれかの組み合わせから選択される、多価または二価の切断可能であるか、または切断できない基であり、
式中、ｕ、ｖおよびｘは各々独立に０〜５であり、
各ｄは独立に１〜２０または１〜１２または１〜６または１〜３の整数であり、
各ｗは独立に１〜６または１〜３または１〜２から選択される整数であり、そして
各Ｒ１５は独立に直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖アルケニル、直鎖または分枝鎖アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、ヘテロシクリル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルケニル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキニル、アリール、直鎖または分枝鎖アリールアルキル、直鎖または分枝鎖アリールアルケニル、直鎖または分枝鎖アリールアルキニル、ヘテロアリール、直鎖または分枝鎖ヘテロアリールアルキル、直鎖または分枝鎖へテロアリールアルケニル、直鎖または分枝鎖へテロアリールアルキニル、ハロ、直鎖または分枝鎖ハロアルキル、シュードハロ、アジド、シアノ、ニトロ、ＯＲ６０、ＮＲ６０Ｒ６１、ＣＯＯＲ６０、Ｃ（Ｏ）Ｒ６０、Ｃ（Ｏ）ＮＲ６０Ｒ６１、Ｓ（Ｏ）ｑＲ６０、Ｓ（Ｏ）ｑＯＲ６０、Ｓ（Ｏ）ｑＮＲ６０Ｒ６１、ＮＲ６０Ｃ（Ｏ）Ｒ６１、ＮＲ６０Ｃ（Ｏ）ＮＲ６０Ｒ６１、ＮＲ６０Ｓ（Ｏ）ｑＲ６０、ＳｉＲ６０Ｒ６１Ｒ６２、Ｐ（Ｒ６０）２、Ｐ（Ｏ）（Ｒ６０）２、Ｐ（ＯＲ６０）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ６０）２、Ｐ（Ｏ）（ＯＲ６０）（Ｒ６１）およびＰ（Ｏ）ＮＲ６０Ｒ６１から選択される一価の基であり、
ｑは０〜２の整数であり、
Ｒ６０、Ｒ６１、Ｒ６２は各々独立に水素、直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖アルケニル、直鎖または分枝鎖アルキニル、アリール、直鎖または分枝鎖アラルキル、直鎖または分枝鎖アラルケニル、直鎖または分枝鎖アラルキニル、ヘテロアリール、直鎖または分枝鎖へテロアラルキル、直鎖または分枝鎖へテロアラルケニル、直鎖または分枝鎖へテロアラルキニル、ヘテロシクリル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルケニルまたは直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキニルである。
【０１４２】
他の実施形態では、Ｚは以下の基：アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、＞Ｃ（Ｒ１５）２、Ｃ（Ｒ１５）＝Ｃ（Ｒ１５）、＞Ｃ＝Ｃ（Ｒ２３）（Ｒ２４）、＞Ｃ（Ｒ２３）（Ｒ２４）、Ｃ≡Ｃ、Ｏ、＞Ｓ（Ａ）ｕ、＞Ｐ（Ｄ）ｖ（Ｒ１５）、＞Ｐ（Ｄ）ｖ（ＥＲ１５）、＞Ｎ（Ｒ１５）、＞Ｎ＋（Ｒ２３）（Ｒ２４）、＞Ｓｉ（Ｒ１５）２または＞Ｃ（Ｅ）のいずれかの組み合わせを含む切断可能であるか、または切断できない多価または二価の基であり（式中、ｕは０、１または２であり、ｖは０、１、２または３であり、ＡはＯまたはＮＲ１５であり、ＤはＳまたはＯであり、ＥはＳ、ＯまたはＮＲ１５である）、その群はどの順序で組み合わせてもよく、
各Ｒ１５は水素およびＶＲ１８からなる群から独立に選択される一価の基であり、
各Ｖは独立に以下の群：直接結合、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキレン、＞Ｃ（Ｒ１７）２、Ｃ（Ｒ１７）＝Ｃ（Ｒ１７）、＞Ｃ＝Ｃ（Ｒ２３）（Ｒ２４）、＞Ｃ（Ｒ２３）（Ｒ２４）、Ｃ≡Ｃ、Ｏ、＞Ｓ（Ａ）ｕ、＞Ｐ（Ｄ）ｖ（Ｒ１７）、＞Ｐ（Ｄ）ｖ（ＥＲ１７）、＞Ｎ（Ｒ１７）、＞Ｎ（ＣＯＲ１７）、＞Ｎ＋（Ｒ２３）（Ｒ２４）、＞Ｓｉ（Ｒ１７）２および＞Ｃ（Ｅ）のいずれかの組み合わせを有する二価の基であり（式中、ｕは０、１または２であり、ｖは０、１、２または３であり、ＡはＯまたはＮＲ１７であり、ＤはＳまたはＯであり、ＥはＳ、ＯまたはＮＲ１７である）、その群はどの順序で組み合わせてもよく、
Ｒ１７およびＲ１８は各々独立に水素、ハロ、シュードハロ、シアノ、アジド、ニトロ、ＳｉＲ２７Ｒ２８Ｒ２５、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシおよびＮＲ１９Ｒ２０からなる群から選択され、
Ｒ１９およびＲ２０は各々独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキルおよびヘテロシクリルから選択され、
Ｒ２３およびＲ２４は以下の（ｉ）または（ｉｉ）から選択され、
（ｉ）Ｒ２３およびＲ２４は独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールからなる群から選択されるか、または
（ｉｉ）Ｒ２３およびＲ２４はともにアルキレン、アルケニレンまたはシクロアルキレンを形成し、
Ｒ２５、Ｒ２７およびＲ２８は各々独立に水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシおよびＮＲ１９Ｒ２０から選択される一価の基であり、
Ｒ１５、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２７およびＲ２８は、Ｚ２から各々独立に選択される１以上の置換基で置換されていてもよく、Ｚ２はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヒドロキシ、Ｓ（Ｏ）ｈＲ３５（ここで、ｈは０、１または２である）、ＮＲ３５Ｒ３６、ＣＯＯＲ３５、ＣＯＲ３５、ＣＯＮＲ３５Ｒ３６、ＯＣ（Ｏ）ＮＲ３５Ｒ３６、Ｎ（Ｒ３５）Ｃ（Ｏ）Ｒ３６、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロシクリルオキシ、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアラルキル、  ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシ、アルコキシカルボニル、カルバモイル、チオカルバモイル、アルコキシカルボニル、カルボキシアリール、ハロ、シュードハロ、ハロアルキルおよびカルボキサミドから選択され、
Ｒ３５およびＲ３６は各々独立に水素、ハロ、シュードハロ、シアノ、アジド、ニトロ、トリアルキルシリル、ジアルキルアリールシリル、アルキルジアリールシリル、トリアリールシリル、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、アリール、アラルキル、アラルケニル、アラルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニル、ヘテロアラルキニル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ、ヘテロアラルコキシ、アミノ、アミド、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アルキルアリールアミノ、ジアリールアミノおよびアリールアミノの中から選択される。
【０１４３】
本明細書における特定の実施形態では、化合物は、Ｚが生体分子の、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析などの質量スペクトル分析の前またはその間に切断可能であるという条件で選択される。
【０１４４】
特定の実施形態では、Ｚは本明細書に開示された二価部分から少なくとも１個の水素がないものから選択される少なくとも三価部分である。本明細書に提供された収集物中の捕獲化合物は種々の結合価を有するコアＺを含む。捕獲化合物の中にはＺが少なくとも三価であるものもある。
【０１４５】
（ｉ）切断可能な多価のＺ部分
１つの実施形態では、Ｚは切断可能な多価または二価部分であり、かつ、次式：（Ｓ１）ｔＭ（Ｒ１５）ａ（Ｓ２）ｂＬを有し、
式中、Ｓ１およびＳ２はスペーサー部分であり、ｔおよびｂは各々独立に０または１であり、Ｍは２以上の結合点（すなわち、二価以上の結合価）、特定の実施形態では、２〜６の結合点（すなわち、二価〜六価）、他の実施形態では２、３、４または５の結合点（すなわち、二価、三価、四価または五価）を含む中心部分であり、Ｒ１５は上記のとおりであり、ａは０〜４、特定の実施形態では、０、１または２であり、Ｌはタンパク質などの生体分子の化学構造を変更することなく、生体分子の、質量スペクトル分析をはじめとする分析の前またはその間に切断可能な結合である。
【０１４６】
（ａ）  Ｍ
特定の実施形態では、Ｍはアルキレン、フェニレン、ビフェニレンまたは多価または二価のヘテロ二官能性トリチル誘導体である。Ｍは非置換であるか、または各々独立にＲ１５から選択される１〜４個の基で置換されている。
【０１４７】
他の実施形態では、Ｍは（ＣＨ２）ｒ、（ＣＨ２Ｏ）ｒ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ、（ＮＨ（ＣＨ２）ｒＣ（＝Ｏ））ｓ、（ＮＨＣＨ（Ｒ５２）Ｃ（＝Ｏ））ｒ、（Ｏ（ＣＨ）ｒＣ（＝Ｏ））ｓ、
【化１】
0004741458.tif 000002
｛式中、Ｒ１５は上記で定義した通りであり、ｒおよびｓは各々独立に１〜１０の整数であり、Ｒ５２は天然または非天然のα−アミノ酸の側鎖であり、ｚは１〜４の整数である｝から選択される。ある実施態様では、ｎ１、ｎ２、ｎ３は各々独立に０〜４の整数である。他の実施態様では、ｎ１、ｎ２およびｎ３は、ｎ１＋ｎ２＋ｎ３≠０となるように選択される。他の実施態様では、ｎ１、ｎ２およびｎ３は１〜３である。他の実施態様では、ｎ１およびｎ２は０である。他の実施態様では、ｎ３は２である。１つの実施形態では、ｚは１である。
【０１４８】
他の実施形態では、Ｍは、
【化２】
0004741458.tif 000003
直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖アルケニル、直鎖または分枝鎖アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、直鎖または分枝鎖アラルキル、直鎖または分枝鎖アラルケニル、直鎖または分枝鎖アラルキニル、直鎖または分枝鎖へテロアラルキル、直鎖または分枝鎖へテロアラルケニル、直鎖または分枝鎖へテロアラルキニル、直鎖または分枝鎖シクロアルキルアルキル、直鎖または分枝鎖シクロアルキルアルケニル、直鎖または分枝鎖シクロアルキルアルキニル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルケニルまたは直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキニルである。
【０１４９】
（ｂ）  Ｓ１およびＳ２
必要に応じて、スペーサー領域Ｓ１および／またはＳ２は、例えば、大きな生体分子の表面との反応における立体障害を減少させるため、および／または、選別を容易にするために、化合物の中心部分Ｍ（Ｚに連結されている）の片側または両側に存在させることができる。これらは、通常、捕獲化合物の、および／または捕獲化合物／生体分子複合体の所望の官能特性を変更することなく、間隔を提供するあらゆる基であることができる。当業者は、本明細書の開示内容を考慮して、適切なスペーサーを容易に選択することができる。例示的なスペーサーを以下に示す。
【０１５０】
実施形態については、例えば、生体分子および選別官能基が低度の立体障害を有する場合には、スペーサーが任意選択される。他の実施態様では、該スペーサー基は、選択性官能基（例えば、薬物）が標的または非標的タンパク質の結合ポケットに到達するように選択される。スペーサー基は疎水性または親水性であり得る；その長さは効率的な選別または選択または捕獲を行うために変え得る；それは硬くてもよい（例えば、トランスオレフィン）。そのスペーサー基は、分析する生体分子の混合物の性質（疎水性／親水性、大きさなど）に基づき選択され得る。
【０１５１】
Ｓ２が必要でない場合には、切断可能な結合Ｌの反応性は１以上の置換している官能基（例えば、Ｍ上のＲ１５）によって影響され得る。切断可能な結合Ｌの安定性を調節するために、電子的（例えば、メソメリー、誘導）および／または立体効果を用いることができる。
【０１５２】
特定の実施形態では、Ｓ１およびＳ２は各々独立に（ＣＨ２）ｒ、（ＣＨ２Ｏ）、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ、（ＮＨ（ＣＨ２）ｒＣ（＝Ｏ））ｓ、（ＮＨＣＨ（Ｒ５２）Ｃ（＝Ｏ））ｓ、（Ｏ（ＣＨ）ｒＣ（＝Ｏ））ｓ、
【化３】
0004741458.tif 000004
｛式中、Ｒ１５は上記のように選択され、ｒおよびｓは各々独立に１〜１０の整数であり、Ｒ５２は天然α−アミノ酸の側鎖であり、ｙは０〜４の整数である｝から選択される。１つの実施形態では、ｙは０または１である。
【０１５３】
特定の実施形態では、Ｒ１５は−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＲ５１、−ＳＨ、−ＳＲ５１、−ＮＨ２、−ＮＨＲ５１、−ＮＲ５１２、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−ＳＯ３Ｈ、−ＰＯ２４、ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２または−Ｃ（ＣＨ３）３であり、式中、Ｒ５１は直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖アルケニル、直鎖または分枝鎖アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、直鎖または分枝鎖アラルキル、直鎖または分枝鎖アラルケニル、直鎖または分枝鎖アラルキニル、直鎖または分枝鎖へテロアラルキル、直鎖または分枝鎖へテロアラルケニル、直鎖または分枝鎖へテロアラルキニル、直鎖または分枝鎖シクロアルキルアルキル、直鎖または分枝鎖シクロアルキルアルケニル、直鎖または分枝鎖シクロアルキルアルキニル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルケニル、あるいは直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキニルである。
【０１５４】
（ｃ）  Ｌ
特定の実施形態では、切断可能な基Ｌをタンパク質などの生体分子の分析の前またはその間のいずれかで切断する。分析は質量スペクトル分析、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析を含み得る。切断可能な基Ｌは、基が、生体分子への結合および選別、例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドＱ部分の相補鎖とのハイブリダイゼーションおよびハイブリッドの洗浄の間は安定であるが、限定されるものではないが、質量スペクトル分析、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析をはじめとする生体分子の分析条件下での切断に敏感であるよう選択する。特定の実施形態では、切断可能な基Ｌは、化合物（ここで、ＸはＳＨである）の、タンパク質の表面のシステイン残基のチオール側鎖との反応によって生じたジスルフィド部分であり得る。得られるジスルフィド結合は、限定されるものではないが、ジチオスレイトールおよび２−メルカプトエタノールでの処理をはじめとする種々の還元条件下で切断され得る。
【０１５５】
別の実施形態では、Ｌは、質量分析の前またはその間のいずれかに適切な波長のＵＶ光での短時間処理によって切断され得る光切断可能な基である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の際にレーザービームの作用によって切断され得る結合をはじめとする光切断可能な基を用いることができる。例えば、トリチルエーテルまたはベンジル基をはじめとするオルトニトロ置換アラルキルは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の際のレーザー誘起結合切断に敏感である。他の有用な光切断可能な基としては、限定されるものではないが、ｏ−ニトロベンジル、フェナシルおよびニトロフェニルスルフェニル基が挙げられる。
【０１５６】
本明細書で用いる他の光切断可能な基としては、国際特許出願公開番号ＷＯ９８／２０１６６に開示されているものを挙げることができる。１つの実施形態では、光切断可能な基は次式Ｉを有し、
【化４】
0004741458.tif 000005
式中、Ｒ２０はωＯアルキレンであり、Ｒ２１は水素、アルキル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニルおよびカルボキシから選択され、ｔは０〜３であり、Ｒ５０はアルキル、アルコキシ、アリールまたはアリールオキシである。１つの実施形態では、Ｑは（Ｓ１）ｔＭ（Ｒ１５）ａ（Ｓ２）ｂを介してＲ２０と結合しており、目的の生体分子は酸素の反応性誘導体（例えば、Ｘ）によってＲ２１ＣＨＯ部分上に捕獲される。
【０１５７】
別の実施形態では、光切断可能な基は次式ＩＩを有し：
【化５】
0004741458.tif 000006
式中、Ｒ２０はωＯアルキレンまたはアルキレンであり、Ｒ２１は水素、アルキル、アリール、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニルおよびカルボキシから選択され、Ｘ２０は水素、アルキルまたはＯＲ２１である。１つの実施形態では、Ｑは（Ｓ１）ｔＭ（Ｒ１５）ａ（Ｓ２）ｂを介してＲ２０と結合しており、目的の生体分子は酸素の反応性誘導体（例えば、Ｘ）によってＲ２１ＣＨＯ部分上に捕獲される。
【０１５８】
さらなる実施形態では、Ｒ２０はＯ（ＣＨ２）３またはメチレンであり、Ｒ２１は水素、メチルおよびカルボキシから選択され、Ｘ２０は水素、メチルまたはＯＲ２１である。別の実施形態では、Ｒ２１はメチルであり、Ｘ２０は水素である。特定の実施形態においては、Ｒ２０はメチレンであり、Ｒ２１はメチルであり、Ｘ２０は３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロポキシである。
【０１５９】
別の実施形態では、光切断可能な基は次式ＩＩＩを有し：
【化６】
0004741458.tif 000007
式中、Ｒ２はωＯアルキレンＯおよびωＯアルキレンであり、かつ、非置換であるかまたはアルキレン鎖が１個以上のアルキル基で置換されており、ｃおよびｅは各々独立に０〜４であり、Ｒ７０およびＲ７１は各々独立にアルキル、アルコキシ、アリールまたはアリールオキシである。特定の実施形態では、Ｒ２はωＯアルキレンであり、かつ、アルキレン鎖がメチル基で置換されている。１つの実施形態では、Ｑは（Ｓ１）ｔＭ（Ｒ１５）ａ（Ｓ２）ｂを介してＲ２と結合しており、目的の生体分子は酸素の反応性誘導体（例えば、Ｘ）によってＡｒ２ＣＨＯ部分上に捕獲される。
【０１６０】
さらなる実施形態では、Ｒ２は３Ｏ（ＣＨ２）３Ｏ、４Ｏ（ＣＨ２）４、３Ｏ（ＣＨ２）３、２ＯＣＨ２ＣＨ２、ＯＣＨ２、
【化７】
0004741458.tif 000008
から選択される。
【０１６１】
他の実施形態では、ｃおよびｅは０である。
【０１６２】
他の切断可能な基Ｌとしては、弱酸〜強酸に曝露されると陽イオンを形成することによって結合切断が促進される酸感受性基を挙げることができる。これらの酸不安定基については、基Ｌの切断は、質量スペクトル分析をはじめとする分析の前またはその間のいずれかで、マトリックス分子の酸度によって、またはトリフルオロ酢酸の蒸気などの酸でアレイを短時間処理することによって達成することができる。トリチル基の酢酸またはトリフルオロ酢酸への曝露によって、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析の前またはその間のいずれかでエーテル結合の切断が生じる。
【０１６３】
捕獲化合物−生体分子アレイは、切断を行うために、限定されるものではないが、臭化シアンをはじめ化学的に、または限定されるものではないが、生体分子がタンパク質である実施形態においては、トリプシン、キモトリプシン、エキソペプチダーゼ（例えば、アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼ）試薬をはじめ酵素的に処理することができる。後者については、消化が定量的である場合には、１つを除いてすべてのペプチド断片はハイブリダイズしたままである。アレイから脱離させた後にタンパク質を同定および特性決定するには、部分消化も有利であり得る。切断したタンパク質／ペプチド断片を脱着させ、分析し、そのそれぞれの分子量によって特性決定する。
【０１６４】
本明細書における特定の実施形態では、ＬはＳＳ、ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲ５１）ＮＨ、ＯＣ（＝Ｏ）｛式中、Ｒ５１は上記で定義した通り｝から選択される。特定の実施形態では、Ｒ５１は直鎖または分枝鎖アルキル、直鎖または分枝鎖アルケニル、直鎖または分枝鎖アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、ヘテロシクリル、直鎖または分枝鎖アラルキル、直鎖または分枝鎖アラルケニル、直鎖または分枝鎖アラルキニル、直鎖または分枝鎖ヘテロアラルキル、直鎖または分枝鎖ヘテロアラルケニル、直鎖または分枝鎖ヘテロアラルキニル、直鎖または分枝鎖シクロアルキルアルキル、直鎖または分枝鎖シクロアルキルアルケニル、直鎖または分枝鎖シクロアルキルアルキニル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキル、直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルケニル、あるいは直鎖または分枝鎖ヘテロシクリルアルキニルである。
【０１６５】
（ｉｉ）切断できない二価のＺ部分
別の実施形態では、Ｚは切断できない二価部分であり、式：（Ｓ１）ｔＭ（Ｒ１５）ａ（Ｓ２）ｂを有する。式中、Ｓ１、Ｍ、Ｒ１５、Ｓ２、ｔ、ａおよびｂは上記で定義した通りである。
【０１６６】
ｃ．  Ｚは不溶性支持体または基質である
他の実施形態では、Ｚは、表面が官能基（Ｘ、Ｙ、Ｑおよび必要に応じてＷ）を提示するような、シリコンまたは他の「ビーズ」または微粒子などの粒状の固体支持体または固体表面などの不溶性支持体または基質であってもよい。これらの実施形態では、Ｚはその１つまたは複数の（通常は１〜１００個、一般的には１〜１０個）Ｘ部分と、場合によっては少なくとも１個のＱおよび／またはＹ部分、ならびに必要に応じて１個以上のＷ部分とも結合している。これらの実施形態では、Ｚは、その表面に１０〜１００、１０００、百万、またはそれ以上の官能性部分（基）を含む場合もある。例えば、捕獲化合物は、その上に基が提示されている、シリコン粒子またはアガロースまたは他の粒子であってもよい。以下で論じるように、さらに、脂質二重層または、例えば、リポソームを作製するために用いられる他の脂質などの疎水性物質でコーティングしてもよい。そのような実施形態では、疎水性表面および必要に応じて疎水性Ｗ基を有する得られた粒子を、細胞膜環境および他の細胞内環境をプローブする方法に用いる。細胞を穏やかに溶解させることによって、細胞内区画およびオルガネラを露出させ、こういった疎水性捕獲化合物をそれらと反応させ、そして結合した生体分子を、例えば、質量分析によって評価することができ、あるいは、区画およびオルガネラの内容物を放出するようにさらに処理して、この捕獲化合物または他の捕獲化合物と反応させることもできる。
【０１６７】
Ｚが不溶性支持体である実施形態では、不溶性支持体または基質部分Ｚは、例えば、ガラス、シリコン、金属、プラスチックまたは複合材料から構築された平坦な表面、あるいは他の適切な表面をベースにしたものであってもよいし、あるいはシリカゲル、細孔性ガラス、磁性またはセルロースビーズなどの「ビーズ」または粒子の形態であってもよいしあるいは、コンビナトリアル合成もしくは分析に適したピンのアレイをはじめとするピンであってもよい。基質は実質的に全ての不溶性または固体物質から加工することができる。固体支持体は、限定されるものではないが、ビーズ、キャピラリー、プレート、メンブラン、ウエハー、コーム、ピン、ピットを備えたウエハー、ピットまたはナノリットルウェルのアレイならびに当業者に公知の他の形状および形態を含む、所望されるあらゆる形態であってよい。支持体としては、別個の位置でサンプルを受容または結合するよう設計された平坦な表面が挙げられる。
【０１６８】
１つの実施形態では、固体支持体または基質Ｚは、限定されるものではないが、ポリマー、磁性、着色、Ｒｆタグをつけたものおよび他のそのようなビーズをはじめとする「ビーズ」（すなわち、通常、その最大直径が２００μｍ未満または５０μｍ未満の範囲の粒子）である。ビーズは、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンもしくはテフロン（登録商標）をはじめとする疎水性材料、または限定されるものではないが、セルロース、エピクロロヒドリンで架橋されたデキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド、シリカゲルおよび細孔性ガラスビーズもしくはビーズをはじめとする親水性材料から製造されていてもよい。これらの種類の捕獲化合物を懸濁状態で液相で反応させ、反応媒体から遠沈させるかまたは別の方法で取り出し、そして得られた複合体を質量分析などによって分析することができる。これらは、固体支持体上の別個の位置に結合するＱ官能基を用いて選別してもよいし、あるいはこれらは、アドレス指定を可能にするための、高周波タグまたは着色標識またはバーコードまたはその表面にインプリントされた他のコードなどの標識を含んでいてもよい。これらは、「Ｑ」官能基として働く標識にしたがって選別し、次いで質量分析計によって分析することができる。
【０１６９】
さらなる実施形態において、またはＺが切断可能な結合Ｌである実施形態については、不溶性支持体または基質Ｚ部分は、必要に応じて、スペーサー基Ｓ１および／またはＳ２を含むことができる。Ｓ１、Ｓ２および／またはＬ部分は不溶性支持体または基質の表面に結合させる。
【０１７０】
これらの実施形態では、分析される生体分子の密度、ひいては続く分析のシグナル強度は、Ｚが二価の基である実施形態と比べて高まっている。特定の実施形態では、一本鎖オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体である選別官能基Ｑと相補的な、一本鎖オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の適切なアレイを、本明細書に提供する方法に用いる。
【０１７１】
ｄ．  質量改変Ｚ部分
Ｚが切断可能な部分である実施形態をはじめとする他の実施形態では、Ｚは質量改変タグを含む。特定の実施形態では、質量改変タグを切断可能なリンカーＬに結合させる。１つの実施形態では、質量が改変されたＺ部分は式：（Ｓ１）ｔＭ（Ｒ１５）ａ（Ｓ２）ｂＬＴを有する。ここで、Ｓ１、ｔ、Ｍ、Ｒ１５、ａ、Ｓ２、ｂおよびＬは上記のように選択され、Ｔは質量改変タグである。本明細書で用いる質量改変タグとして、限定されるものではないが、式Ｘ１Ｒ１０で表される基が挙げられる。ここで、Ｘ１はＯ、ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｙＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｙＣ（Ｏ）Ｏ、ＮＨＣ（Ｓ）ＮＨ、ＯＰ（Ｏ−アルキル）Ｏ、ＯＳＯ２Ｏ、ＯＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｓ、Ｓ、ＮＨおよび
【化８】
0004741458.tif 000009
などの二価の基であり、Ｒ１０は（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｚＣＨ２ＣＨ２Ｏ、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｚＣＨ２ＣＨ２Ｏアルキレン、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、（ＣＨ２）ｚＣＨ２Ｏ、（ＣＨ２）ｚＣＨ２Ｏアルキレン、（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｚＣＨ２ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２Ｏ、Ｓｉ（Ｒ１２）（Ｒ１３）、ＣＨＦおよびＣＦ２をはじめとする二価の基であり、ｙは１〜２０の整数であり、ｚは０〜２００の整数であり、Ｒ１１はαアミノ酸の側鎖であり、Ｒ１２およびＲ１３は各々独立にアルキル、アリールおよびアラルキルから選択される。
【０１７２】
他の実施形態では、Ｘ１Ｒ１０はＳＳ、Ｓ、（ＮＨ（ＣＨ２）ｙＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｙＣ（Ｏ））ｚＮＨ（ＣＨ２）ｙＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｙＣ（Ｏ）Ｏ、（ＮＨ（ＣＨ２）ｙＣ（Ｏ））ｚＮＨ（ＣＨ２）ｙＣ（Ｏ）Ｏ、（ＮＨＣＨ（Ｒ１１）Ｃ（Ｏ））ｚＮＨＣＨ（Ｒ１１）Ｃ（Ｏ）Ｏおよび（Ｏ（ＣＨ２）ｙＣ（Ｏ））ｚＮＨ（ＣＨ２）ｙＣ（Ｏ）Ｏから選択される。
【０１７３】
上記の実施形態では、Ｒ１０がオリゴ−／ポリエチレングリコール誘導体である場合には、質量改変増分は４４であり、すなわち、ｚを０から４まで変化させることによって、５つの種々に質量を改変された種を作成する、したがって、４５（ｚ＝０）、８９（ｚ＝１）、１３３（ｚ＝２）、１７７（ｚ＝３）および２２１（ｚ＝４）の質量ユニットを化合物に付加することができる。オリゴ／ポリエチレングリコールはまた、低級アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチルなどによってモノアルキル化することもできる。
【０１７４】
他の質量改変タグとしては、限定されるものではないが、ＣＨＦ、ＣＦ２、Ｓｉ（ＣＨ３）２、Ｓｉ（ＣＨ３）（Ｃ２Ｈ５）およびＳｉ（Ｃ２Ｈ５）２が挙げられる。他の実施形態では、質量改変タグとしては、ホモまたはヘテロペプチドを含む。５７の質量増分を有している質量改変種を作製する限定的ではない例はオリゴグリシンであり、これは、例えば、７４（ｙ＝１、ｚ＝０）、１３１（ｙ＝１、ｚ＝２）、１８８（ｙ＝１、ｚ＝３）または２４５（ｙ＝１、ｚ＝４）の質量改変を生じる。オリゴアミドもまた使用することができ、例えば、７４（ｙ＝１、ｚ＝０）、８８（ｙ＝２、ｚ＝０）、１０２（ｙ＝３、ｚ＝０）、１１６（ｙ＝４、ｚ＝０）などの質量改変が得られる。当業者であれば、予め決定された方法で本明細書中に提供する化合物に対して多種の質量改変を導入するためには、本明細書で例示したものの他にも多数の可能性があるということを理解するであろう。
【０１７５】
他の実施形態では、Ｒ１５および／またはＳ２に、質量改変タグとなるように、Ｘ１Ｒ１０ＨまたはＸ１Ｒ１０アルキル（ここで、Ｘ１およびＲ１０は上記で定義した通りである）を用いて官能性を持たせることもできる。
【０１７６】
２．  反応性官能基「Ｘ」
反応性官能基（「Ｘ」）は、その表面に翻訳後に付加された基をはじめとする官能基を含むタンパク質に対して、共有結合する能力を化合物に付与する。更なる基には、活性化されるまで、タンパク質のような生体分子との反応に対し不活性である基が含まれる。その基には光活性化可能な基が含まれ、以下に限らないが、アジドおよびジアジリン基が含まれる。
【０１７７】
本明細書で提供する化合物において、Ｘは、アミノ酸側鎖もしくは酵素（タンパク質）の活性部位をはじめとするタンパク質の表面、または脂質および多糖をはじめとする他の生体分子の官能基と結合するかまたは相互作用する部分である。
【０１７８】
したがって、例えば、Ｘはタンパク質の表面上の官能基と反応するかまたは相互作用して共有結合または高親和性を有する非共有結合を形成する基である。タンパク質との相互作用のために、Ｘには種々の官能基を広く選択できる。例えばＸは、タンパク質の表面のアミノ酸残基との反応で求核試薬または求電子試薬のいずれかとして作用して共有結合を形成することができる。アミノ酸側鎖と共有結合する例示的な試薬としては、限定されるものではないが、光反応基、Ｄｉｅｌｓ  Ａｌｄｅｒ対（すなわち、一方の側のジエンと他方の側の単一の二重結合）をはじめとするヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、アミドおよびチオール部分の保護基が挙げられる。
【０１７９】
Ｘの反応性はコア（すなわち、特にＳ２が存在しない場合には上記の式中のＭ）にある１以上の選択性官能基Ｙの影響を受け得る。
【０１８０】
以下で論じるＹ官能基は、Ｘの反応性および得られたＸ−生体分子結合の安定性を調節する電子的（例えば、メソメリー、誘導）および／または立体効果のために用いる。これらの実施形態では、タンパク質混合物は、Ｘの電子または立体特性を変化させ、したがってＸの生体分子との反応の選択性を高めるＹによる調節により、反応させそして分析することができる。
【０１８１】
特定の実施形態では、ＸはＣ（＝Ｏ）ＯＰｈｐＮＯ２、Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ６Ｆ５またはＣ（＝Ｏ）Ｏ（Ｎスクシンイミジル）などの活性エステル、限定するものではないが、ＯＣＨ２Ｉ、ＯＣＨ２Ｂｒ、ＯＣＨ２Ｃｌ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｉ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＢｒおよびＣ（Ｏ）ＣＨ２Ｃｌをはじめとするα−ハロエーテルまたはα−ハロカルボニル基などの活性ハロ部分、マレイミド（システインについて）、金または水銀（システインまたはメチオニンについて）をはじめとする金属錯体、エクスポキシドもしくはイソチオシアネート（アルギニンまたはリジンについて）などのアミノ酸側鎖特異的官能基、限定されるものではないが、遷移状態類似体をはじめとする酵素の活性部位に結合する試薬、例えばリン酸化ペプチドに対する、抗体、ファージディスプレイライブラリーなどの抗原、ハプテン、ビオチン、アビジン、またはストレプトアビジンである。
【０１８２】
特定の実施態様ではＸはＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルであるか、または
【化９】
0004741458.tif 000010
である。
【０１８３】
他の実施態様では、Ｘは光活性化可能な基である。これらの実施態様では、捕獲化合物は選択性官能基を含み、例えば、平衡に到達するまで生体分子の混合物と相互作用し得る。次いで、Ｘ基が、適当な波長の光にさらされることにより活性化され、これによって、次いでＸ基は生体分子の表面基と反応し、それを捕獲する。１つの実施態様では、光活性化可能な基はフェニルアジドのようなアリールアジドである。光にさらされた後、生ずるナイトレンは例えばチロシンの側鎖と反応し、タンパク質を捕獲するだろう。他の実施態様では、光活性化可能な基は３−トリフルオロメチルジアジリンのようなジアジリン基である。
【０１８４】
他の実施態様では、反応性官能基Ｘは、スペーサーＳを介して中心コアＺに連結する。スペーサーは、間隔をあけるために提供される任意の基であり得るが、典型的に、捕獲化合物および／または捕獲化合物／生体分子複合体の望ましい機能性を変化させることはない。スペーサーと連結する反応性官能基Ｘは中心コアＺから延び、タンパク質のような生体分子の表面の活性部位に到達し得る。本明細書の開示を考慮すれば当業者ならば容易に適当なスペーサーを選択し得る。
【０１８５】
特定の実施態様では、Ｓは（ＣＨ２）ｒ、（ＣＨ２Ｏ）、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ、（ＮＨ（ＣＨ２）ｒＣ（＝Ｏ））ｓ、（Ｏ（ＣＨ）ｒＣ（＝Ｏ））ｓ、−（（ＣＨ２）ｒ１−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ２）ｓ−および−（Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）ｒ）ｓ−  から選択され、ここで、ｒ、ｒ１、ｒ２およびｓはそれぞれ独立した１から１０の整数である。
【０１８６】
３．  選択性官能基「Ｙ」
選択性官能基（「Ｙ」）は、反応性官能基が結合する基の数を減少させることによって反応性官能基を調節するように働く。選択性官能基は、反応基の選択性を高め、その結果、選択性官能基が存在しない場合よりも少数の種々の生体分子に結合するか、またはそれが存在しない場合よりも大きな親和性で生体分子に結合する。本明細書で提供する捕獲化合物において、Ｙは、達成されるべき目標にしたがって、広い範囲で変化させることが可能である。選択性官能基は、化合物が、それが分子の一部である場合には、それが存在しない場合よりも少数の種々の生体分子に結合するかまたは（反応性官能基を介して）それと反応するような化合物、および／または、化合物がより大きな特異性およびより高い親和性で結合する化合物である。選択性官能基は化合物に直接結合することができるか、あるいは、ＣＨ２ＣＯ２またはＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ（ここで、ｎは１〜１２、または１〜６、または２〜４の整数である）などのリンカーを介して結合することができる。例示的な選択性官能基については、例えば、図３ａ〜３ｈｈｈｈおよび以下の議論を参照。特定の実施態様では、リンカーは、選択性官能基が標的または非標的タンパク質の結合ポケットに到達し得るように選択される。他の実施態様では、選択性官能基はキラル基であり、それによって、生体分子の立体選択的捕獲を可能とする。
【０１８７】
例えば、特定の実施形態では、ＹはＡＴＰ類似体およびインヒビター、ペプチドおよびペプチド類似体、単離されたかまたはペプチド内アミノ酸の活性化エステルから選択する。
【０１８８】
別の実施形態では、Ｙは小分子部分、天然産物、タンパク質アゴニストまたはアンタゴニスト、ペプチドである（図３ａ〜３ｈｈｈｈ参照）。別の実施形態では、Ｙは親水性化合物または疎水性化合物（例えば、脂質、糖脂質、ホスホトリエステル、オリゴ糖）、正または負電荷を有する基、小分子、医薬品化合物または既定の二次または三次構造を生じる生体分子である。
【０１８９】
特定の実施態様では、Ｙは酵素インヒビター、酵素アゴニストまたはアンタゴニスト、医薬品または薬物の断片、プロドラッグまたは薬物代謝産物であり、それは、捕獲化合物またはその収集物の選択性を修飾し、それによって生体分子またはその混合物（特異的受容体を含むがこれに限らない）と相互作用し、共有結合を形成する。１つの実施態様では、捕獲化合物／その収集物は選択性官能基を有し、それは、ｃｏｘ−２インヒビターであり、生体分子の混合物は、他の生体分子中にｃｏｘ受容体を含む。
【０１９０】
特定の実施態様では、選択性官能基は以下に示す医薬品または薬物の断片から選択され、ここで、中心コアに対する例示的な医薬品の結合を以下に示す。他の実施態様では、選択性官能基は薬物、薬物の断片、薬物代謝産物、または薬物合成中間体である。
【０１９１】
医薬品または薬物の断片は、種々の結合点を介して別の向きで中心コアＺに結合され得、それにより、捕獲化合物の選択性を修飾する。薬物／薬物の断片による中心コアへの結合は当業者に既知の方法により行い得る。幾つかの例示的な医薬品の、種々の点における、中心コアＺへの結合を以下に開示する。
【０１９２】
他の実施態様では、本明細書で提供する捕獲化合物には、選択性官能基が薬物、薬物の断片、薬物代謝産物またはプロドラッグであるようなものが含まれる。これらの実施態様では、捕獲化合物はまた、本明細書の他の部分で定義のように、反応性官能基を含む。更なる実施態様では、捕獲化合物はまた、本明細書の他の部分で定義のように、選別官能基を含む。
【０１９３】
特定の実施態様では、薬物、薬物の断片、薬物代謝産物またはプロドラッグ選択性官能基を含む捕獲化合物は、アミノ酸コアを含む。
【０１９４】
他の実施態様では、アミノ酸コアは第三の官能基の結合のための官能基を側鎖に保有するアミノ酸であり得る。アミノ酸コアには、以下に限らないが、セリン、トレオニン、リジン、チロシンおよびシステインが含まれる。これらの実施態様では、捕獲化合物は反応性官能基、選別官能基および選択性官能基を含み、それは、アミノ酸のアミノ、カルボキシおよび側鎖官能基と結合する。
【０１９５】
１つの実施態様では、コアはチロシンであり、捕獲化合物は以下の式を有する：
【化１０】
0004741458.tif 000011
式中、“ｄｒｕｇ”は薬物、薬物の断片、薬物代謝産物またはプロドラッグを指す。
【０１９６】
１つの実施態様では、薬物はＬＩＰＩＴＯＲ（登録商標）（アトルバスタチンカルシウム）であり、捕獲化合物は以下の式を有する：
【化１１】
0004741458.tif 000012
他の実施態様では、薬物はＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）（セレコキシブ）であり、捕獲化合物は以下の式を有する：
【化１２】
0004741458.tif 000013
【化１３】
0004741458.tif 000014
他の実施態様では、薬物はＶＩＯＸＸ（登録商標）（ｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）であり、捕獲化合物は以下の式を有する：
【化１４】
0004741458.tif 000015
他の実施態様では、薬物はＢＡＹＣＯＬ（登録商標）（セリバスタチン  ナトリウム）であり、捕獲化合物は以下の式を有する：
【化１５】
0004741458.tif 000016
他の実施態様では、薬物はメトトレキサートであり、捕獲化合物は以下の式を有する：
【化１６】
0004741458.tif 000017
【０１９７】
例示的な選択性官能基としては、限定されるものではないが、インスリンのような受容体および他の受容体に結合するリガンド（例えば、以下のリガンドの表を参照）、シクロデキストリン、酵素基質、脂質構造、プロスタグランジン、抗生物質、ステロイド、治療薬、酵素阻害剤、遷移状態類似体、生体分子表面に結合する特異的ペプチド、例えば、接着ペプチド、レクチン（例えば、マンノース型、ラクトース型）、ペプチドミメティックス、スタチン、タンパク質精製およびアフィニティークロマトグラフィーに用いられる、色素および他の化合物および部分などの官能基が挙げられる。例えば、図３ａ〜３ｈｈｈｈおよび以下のペプチドリガンドの表を参照。
【表１】
0004741458.tif 000018
【表２】
0004741458.tif 000019
【表３】
0004741458.tif 000020
【表４】
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【表５】
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【０１９８】
４．  選別官能基「Ｑ」
本明細書で提供される化合物は、化合物が２−Ｄアレイにおける捕獲などによってアドレス指定されることを可能にする選別官能基（「Ｑ」）を含むことができる。特定の実施態様では、選別官能基は、サンプル中の生体分子（例えば、標的および非標的タンパク質）と相互作用しないように選択される。選別官能基とは、化合物を適切な結合条件下で固体支持体、例えば、ビーズ、チップに連結させた相補的なオリゴヌクレオチドのアレイ上に浴びせると、そのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするオリゴヌクレオチドタグのような「タグ」である。捕獲化合物の実体はアレイ中のその位置によって知ることができる。他の選別官能基は、分離することができるカラーコードまたはバーコードをつけたビーズとしてなど、光学的にコードしてもよいし、電子タグをつけたマイクロリアクター支持体またはバーコードをつけた支持体を提供することによるなど電子工学的にタグをつけてもよいし、あるいは物理的にアドレス指定可能なアレイに代えて使用できる化学タグまたは着色タグまたは他のそのようなアドレス指定法であってもよい。選別官能基は、分析、特に、ＭＡＬＤＩをはじめとする質量スペクトル分析に適切な物理的アレイまたは他のアドレス指定可能な分離法が可能となるように選択する。
【０１９９】
本明細書で提供される化合物中に用いるための他の選別官能基としては、ビオチン、（Ｈｉｓ）６、ＢＯＤＩＰＹ（４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン）、オリゴヌクレオチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、抗体、免疫毒素結合体、接着ペプチド、レクチン、リポソーム、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、活性化デキストランおよびペプチドが挙げられる。１つの実施形態では、選別官能基は、固体支持体上の相補オリゴヌクレオチドの一本鎖領域とのハイブリダイゼーションを可能にするオリゴヌクレオチド、特に、一本鎖のオリゴヌクレオチドまたは部分的に一本鎖であるオリゴヌクレオチドのいずれかである。
【０２００】
本明細書に提供される捕獲化合物の１つの実施形態では、Ｑは、塩基相補的な一本鎖核酸分子とハイブリダイズできる、最大５０単位からなる、一本鎖の保護されていないかまたは適切に保護されているオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体（例えば、ＰＮＡ）である。特定の実施形態では、Ｑは約５〜約１０、１５、２５、３０、３５、４０、４５または５０単位を含む。
【０２０１】
タンパク質混合物は、本明細書で提供される化合物とは異なる疎水性（溶解性）を有することができる。特定の実施形態では、本明細書で提供される化合物の官能基Ｘとタンパク質表面との間での高い反応率を達成するために、反応を溶液中で実施する。他の実施形態では、反応を固体／液体または液体／液体界面で行う。特定の実施形態では、本明細書で提供される化合物の溶解特性はＱ部分によって支配されている。これらの実施形態では、Ｑの構造の変化によって種々の溶解性が提供される。例えば、タンパク質混合物が極めて水溶性である場合には、Ｑは天然のホスホジエステル結合を含むことができ、生体分子混合物が極めて疎水性（脂質、糖脂質、膜タンパク質、リポタンパク質）である場合には、Ｑのホスホジエステル結合をホスホトリエステルとして保護することができ、あるいはこれらの結合はメチルホスホネートジエステルまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）であってもよい。生体分子混合物が中程度の疎水性のものである場合には、例えば、ホスホチオエートジエステル結合を用いて溶解性を得る。中程度の溶解性はまた、ホスホジエステルをホスホトリエステル結合と混合することによっても得ることができる。当業者であれば、この目的を達するための他の手段を容易に想定でき、これらとしては、限定されるものでないが、本明細書の他の場所に記載したようなＺへの置換基の付加、またはＺへの、限定されるものではないが、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンもしくはテフロン（登録商標）をはじめとする疎水性であるビーズ、または限定されるものではないが、セルロース、エピクロロヒドリンで架橋されたデキストラン、アガロース、レクチン、接着ポリペプチドおよびポリアクリルアミドをはじめとする親水性であるビーズの使用が挙げられる。
【０２０２】
化合物の溶解性を変化させることができる柔軟性は本方法全体の大きな利点である。対照的に、２Ｄゲル電気泳動は水溶性タンパク質の分析のみに有用であり、その結果、細胞膜中にあるものなど全細胞タンパク質の約３０〜３５％はこの方法では分析できない。限定されるものではいが、組織特異的細胞−細胞接触、シグナル伝達、イオンチャンネルおよび受容体に関与するものをはじめとする多数のタンパク質は細胞膜中に局在するので、このことは２Ｄゲル電気泳動の厳しい限界である。
【０２０３】
１つの実施形態では、本明細書で提供される化合物を、限定されるものではないが、タンパク質をはじめとする生体分子と反応させるかまたは複合体を形成させた後、化合物をハイブリダイゼーション条件下で、平坦な支持体、ビーズまたはマイクロタイタープレート上で空間的に分離された相補配列のセットと接触させる。
【０２０４】
特定の実施形態では、Ｑは支持体上の相補オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのために、少なくとも部分的に一本鎖であるかまたは一本鎖となり得る領域を含む、一価のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体の基である。Ｑは式
Ｎ１ｍＢｉＮ２ｎ
を有する場合がある。式中、Ｎ１およびＮ２は保存された配列の領域であり、Ｂは配列並べ替えの領域であり、ｍ、ｉおよびｎはそれぞれＮ１、ＢおよびＮ２の単位数であり、ｍ、ｎおよびｉの合計は、相補核酸配列とハイブリダイズして安定なハイブリッドを形成できる単位数である。したがって、Ｂが一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡである実施形態では、配列並べ替えの数は４ｉと等しい。１つの実施形態では、ｍ、ｎおよびｉの合計は約５〜約１０、１５、２５、３０、３５、４０、４５または５０である。特定の実施形態では、ｍおよびｎは各々独立に０〜約４８であるか、または各々独立に約１〜約２５または約１〜約１０もしくは１５、または約１〜約５である。他の実施形態では、ｉは約２〜約２５であるか、または約３〜約１２であるか、または約３〜約５、６、７もしくは８である。
【０２０５】
化合物（Ｎ１ｍＢｉＮ２ｎ）のオリゴヌクレオチド部分またはオリゴヌクレオチド類似体部分は、結合および配列認識に最適な大きさとするために変更することができる。配列並べ替え領域Ｂの多様性は、タンパク質混合物の複雑性が低い場合には、相対的に低いものであり得る。混合物の複雑性が高い場合には、配列領域Ｂはすべての種を分離するのに十分な分離能を提供するためには、多様性が高くなければならない。隣接する保存領域Ｎ１ｍおよびＮ２ｎについては、効率的で安定なハイブリッド形成を提供するのに十分な長さであることのみが必要とされる。しかし、これらの領域の設計には柔軟性があり、Ｎ１ｍおよびＮ２ｎは同一の長さで同一の配列であるもの、同一の長さで異なる配列のもの、または異なる長さで異なる配列のものであることもできる。特定の実施形態では、Ｂが安定なハイブリッド形成を提供するのに十分な長さであるものを含むことにより、Ｎ１ｍおよびＮ２ｎは存在しない。これらの実施形態では、化合物のオリゴヌクレオチド部分、または化合物のオリゴヌクレオチド類似体部分は次式Ｎ１ｍＢｉ、またはＢｉＮ２ｎまたはＢｉを有する。
【０２０６】
１つの例示的な実施形態では（例えば、実施例１．ａを参照）、Ｂは１１量体のオリゴヌクレオチド配列内にはめ込まれているトリヌクレオチド配列を有し、ここで、Ｎ１ｍおよびＮ２ｎテトラヌクレオチド配列は隣接している同一（保存）領域を提供する。Ｎ１ｍＢｉＮ２ｎのこの配置により、各化合物が同一の反応性官能基Ｘを保有している６４種の異なる化合物が得られる。さらなる例示的な実施形態では（例えば、実施例１．ｃを参照）、Ｂは２３量体のオリゴヌクレオチド配列内にはめ込まれているオクタヌクレオチドを有し、ここで、Ｎ１ｍおよびＮ２ｎオリゴヌクレオチド配列は隣接しているが同一でないオクタヌクレオチド配列を提供する。Ｎ１ｍＢｉＮ２ｎのこの配置により、各々が同一の反応性官能基Ｘを保有しており、ヒトプロテオームの推定複雑性（例えば、３０，０００〜３５，０００種の異なるタンパク質）を超える、６５，５３６種の異なる化合物が得られる。特定の実施形態では、ミスマッチを減少させるために、最良のハイブリダイゼーション特性を有するオリゴヌクレオチドとして、タンパク質混合物の複雑性について過度の並べ替えを含むＢの使用を分析に用いることもできる。
【０２０７】
５．  溶解性官能基「Ｗ」
本明細書で提供される化合物は、所望の溶解性、例えば、疎水性環境または親水性環境における溶解性を付与して、膜などの生理学的環境において生体分子をプローブすることを可能にする溶解性官能基Ｗを含むことができる。本明細書で提供される化合物において用いるための例示的な溶解性官能基としては、ポリエチレングリコール、スルフェート、ポリスルフェート、ホスフェート、スルホネート、ポリスルホネート、カルボヒドレート、デキストリン、ポリホスフェート、ポリカルボン酸、トリエタノールアミン、アルコール、水溶性ポリマー、アルキルおよびアリールカルボン酸塩、ならびにグリコールが挙げられる。
【０２０８】
第四級アンモニウム塩（すなわち、ベタイン、コリン、スフィンゴミエリン、テトラメチル（またはテトラブチル）アルキルアンモニウム塩）などの両親媒性化合物、陽イオン性、イオン性および中性テンシド（ｔｅｎｓｉｄｅ）を溶解性官能基Ｗとして使用することができる場合もある。
【０２０９】
他の実施形態では、Ｗはまた、必要に応じて、タンパク質混合物と反応させた際に、均質な溶液を生じるように化合物の溶解性を調節するために使用することができる。特定の実施形態では、Ｗは化合物をより水溶性にするために用いることができる極性官能基のスルホネートである。他の実施形態では、Ｗは低級アルキル（例えば、ｔ−ブチル、ｔ−アミル、イソアミル、イソプロピル、ｎ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、イソヘキシル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｉｓｏ−ブチルおよびｎ−アミル）またはフェニルまたはナフチルといったアリール基をはじめとする疎水性基である。
【０２１０】
６．  例示的な実施形態
【０２１１】
ａ．  例示的な実施形態１
１つの実施形態では、本明細書で提供される方法に用いるための化合物は次式：
ＱＺＸまたはＱ−Ｚ−Ｙ
を有する。式中、Ｑは、塩基相補的一本鎖核酸分子とハイブリダイズできる、最大５０単位からなる、一本鎖の、保護されていないかまたは適切に保護されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））であり、Ｚは、限定されるものではないが、タンパク質をはじめとする生体分子の構造を変化させることなく、質量スペクトル分析をはじめとする生体分子の分析の前またはその間に切断可能である部分であり、Ｘは、タンパク質の表面上の官能基と相互作用および／または反応して、共有結合または質量スペクトル分析、特にＭＡＬＤＩ分析の条件下で安定である結合を形成する官能基であり、そしてＹは、標的タンパク質と非共有的に相互作用する官能基を導入することによって特有の選択性を与えることにより、相互作用および／または反応する官能基である。
【０２１２】
ｃ．  例示的な実施形態３
別の実施形態では、本明細書で提供される方法に用いるための化合物は式：
【化１７】
0004741458.tif 000023
を有する。式中、Ｑは、既知の化合物と特異的に非共有的に結合し強固に結合した捕獲化合物を生じることができる、化合物である選別官能基であり、
Ｚは、タンパク質の構造を変化させることなく、質量スペクトル分析をはじめとする生体分子の分析の前またはその間に切断可能である部分であり、
Ｘは、タンパク質の表面上の官能基と相互作用および／または反応して、共有結合を形成する官能基であり、そして
Ｙは、標的タンパク質と非共有的に相互作用する官能基を導入することによって特有の選択性を与えることにより、相互作用および／または反応する官能基である。
【０２１３】
ｄ．  例示的な実施形態４
別の実施形態では、本明細書で提供される方法に用いるための化合物は式：
【化１８】
0004741458.tif 000024
またはＱ−Ｚ−（Ｘ）ｍまたはＱ−Ｚ−（Ｙ）ｎ
を有する。式中、Ｑ、Ｚ、ＸおよびＹは上記で定義した通りであり、ｍは１〜１００、１つの実施形態では１〜１０、別の実施形態では１〜３、４または５の整数であり、ｎは１〜１００、１つの実施形態では１〜１０、別の実施形態では１〜３、４または５の整数である。
【０２１４】
ｅ．  例示的な実施形態５
他の実施形態では、Ｘは医薬品である。これらの実施形態の化合物は、医薬品に結合する、限定されるものではないがタンパク質をはじめとする生体分子を捕獲することによる薬剤スクリーニングに用いることができる。医薬品への結合を妨害する生体分子中の突然変異を同定し、それにより可能性ある薬剤耐性機構が決定される。
【０２１５】
ｆ．  他の実施形態
特定の実施形態では、本明細書で提供される化合物は式：
Ｎ１ｍＢｉＮ２ｎ（Ｓ１）ｔＭ（Ｒ１５）ａ（Ｓ２）ｂＬＸ
を有する。式中、Ｎ１、Ｂ、Ｎ２、Ｓ１、Ｍ、Ｓ２、Ｌ、Ｘ、ｍ、ｉ、ｎ、ｔ、ａおよびｂは上記で定義した通りである。さらなる実施形態では、本明細書で提供する方法に用いるための化合物は質量改変タグを含み、式：
Ｎ１ｍＢｉＮ２ｎ（Ｓ１）ｔＭ（Ｒ１５）ａ（Ｓ２）ｂＬＴＸ
を有する。式中、Ｎ１、Ｂ、Ｎ２、Ｓ１、Ｍ、Ｓ２、Ｌ、Ｔ、Ｘ、ｍ、ｉ、ｎ、ｔ、ａおよびｂは上記で定義した通りである。
【０２１６】
他の実施形態では、Ｚが切断可能なリンカーではないものを含むことによって、本明細書で提供される化合物は式：
Ｎ１ｍＢｉＮ２ｎ（Ｓ１）ｔＭ（Ｒ１５）ａ（Ｓ２）ｂＸ
を有する。式中、Ｎ１、Ｂ、Ｎ２、Ｓ１、Ｍ、Ｓ２、Ｘ、ｍ、ｉ、ｎ、ｔ、ａおよびｂは上記で定義した通りである。
【０２１７】
別の実施形態では、本明細書で提供される捕獲化合物は式：
【化１９】
0004741458.tif 000025
を有する。式中、Ｌ、Ｍ、Ｘ、ＹおよびＱは上記で定義した通りである。別の実施形態では、ｎ１、ｎ２およびｎ３は、ｎ１、ｎ２およびｎ３がすべて０とならないように選択される。
【０２１８】
別の実施形態では、本明細書で提供される捕獲化合物は式：
【化２０】
0004741458.tif 000026
を有する。式中、Ｘ、Ｙ、ＱおよびＳ１は上記で定義した通りである。
【０２１９】
別の実施形態では、本明細書で提供される捕獲化合物は式：
【化２１】
0004741458.tif 000027
を有する。式中、Ｑ、Ｙ、ＸおよびＳ１は上記で定義した通りである。
【０２２０】
別の実施形態では、本明細書で提供される捕獲化合物は式：
【化２２】
0004741458.tif 000028
を有する。式中、Ｘ、Ｙ、ＱおよびＷは上記で定義した通りである。
【０２２１】
別の実施形態では、本明細書で提供される方法に用いるための捕獲化合物は式：
【化２３】
0004741458.tif 000029
を有する。式中、Ｘ、Ｙ、ＱおよびＷは上記のように選択され、Ｒは置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換シクロアルキル、置換もしくは非置換シクロアルキルアルキル、または置換もしくは非置換アラルキルである。別の実施形態では、Ｒはシクロヘキシル、シクロヘキシル−（ＣＨ２）ｎ、イソプロピルおよびフェニル−（ＣＨ２）ｎから選択され、ここで、ｎは１、２または３である。上記の式で示されるように、Ｒは必要に応じてＷで置換される。
【０２２２】
他の実施形態では、本明細書で提供される方法に用いるための化合物には
【化２４】
0004741458.tif 000030
が含まれる。
【０２２３】
これらの実施形態に含まれるの特定の化合物は、この式に含まれる変数が上記で列挙された基のすべての組み合わせにより生じるものであり、すべてのものがＱ基を含むことができる。本明細書では、これらの特定の化合物の各々は本明細書の開示内容の範囲内にあるものとする。
【０２２４】
Ｄ．  捕獲化合物の調製
【０２２５】
例示的な捕獲化合物の調製を以下に記載する。任意の捕獲化合物または類似の捕獲化合物を、以下の一般的に論ずる方法にしたがって、または適切な出発材料を選択することによって多少変更した方法によって、または当業者に公知の方法によって合成することができる。
【０２２６】
一般的には、捕獲化合物は中心部分Ｚから出発して調製することができる。特定の実施形態では、Ｚは（Ｓ１）ｔＭ（Ｒ１５）ａ（Ｓ２）ｂＬである。これらの実施形態では、捕獲化合物は（例えば、１個以上のＲ１５基で）適切に置換されたＭ基から出発して調製することができる。Ｍ（Ｒ１５）ａは、必要に応じて、Ｓ１および／またはＳ２と場合によって結合させ、続いて切断可能なリンカーＬと連結させる。あるいは、Ｌ基は、必要に応じてＳ２と結合させ、続いてＭ（Ｒ１５）ａさらに必要に応じてＳ１と反応させる。次いで、このＺ基をそのＳ１または（Ｍ（Ｒ１５）ａ）末端で誘導体化して、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体Ｑとのカップリングのための官能基（例えば、ホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）、Ｈ−ホスホネートまたはリン酸トリエステル基）を持たせる。Ｑ基は一般的には、Ｘ部分の導入の際の競合反応を避けるために塩基がＮ保護される。１つの実施形態では、Ｚ基をオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドＱのすべての可能性ある並べ替え（例えば、４ｉの並べ替え（ここで、ｉはＢ中のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体の数））を含む混合物と反応させる。次いで、得られたＱＺ捕獲化合物または捕獲化合物類をＬ末端を介して、生体分子、例えば、タンパク質との反応のためのＸ基を保持するよう誘導体化する。必要に応じて、Ｑ部分のＮ保護基を除去する。あるいは、Ｎ保護基は、タンパク質をはじめとする生体分子との捕獲化合物の反応後に除去することができる。Ｚが不溶性支持体または基質、例えば、ビーズである実施形態を含む他の実施形態では、ＱをＺ上で合成することができる。さらなる実施形態では、Ｑを標準的な固層技術によって予め合成し、次いでＭに連結させる。あるいは、ＱをＭ部分の上にで段階的に合成することもできる。
【０２２７】
アルカリ不安定性および光切断可能なリンカーを含む、本明細書で提供される捕獲化合物の合成の実施例を以下に提供する。当業者であれば、本明細書に提示された方法に日常的に行われる変更を加えることによって、または当業者に公知の他の方法によって、開示するもの意外の捕獲化合物を調製することができるであろう。
【０２２８】
他の実施態様では、本明細書で提供する捕獲化合物を以下に示す方法により調製する。端的に、シスチンとビオチン−リンカー部分との反応により、アミノ官能性の誘導を生ずる。生ずる化合物とＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび例えばジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）との反応により、対応するジ−ＮＨＳエステルが形成される。ジスルフィド結合の還元、その後の薬物−リンカー部分との反応により、２当量の望ましい捕獲化合物が形成される。
【化２５】
0004741458.tif 000031
【０２２９】
例示的な光活性化可能な捕獲化合物は以下の方法により調製し得る：
【化２６】
0004741458.tif 000032
【化２７】
0004741458.tif 000033
【化２８】
0004741458.tif 000034
【０２３０】
他の光活性化可能な捕獲化合物は以下のように調製し得る：
【化２９】
0004741458.tif 000035
【０２３１】
Ｅ．  化合物の使用方法
本明細書で提供される捕獲化合物は、タンパク質混合物の構成要素の分析、定量、精製および／または同定に用いることができる。これらは、薬剤候補を同定するための小分子のライブラリーのスクリーニングに用いることが可能であり、またこれらは、生体分子−生体分子相互作用を評価するため、ならびに生体分子複合体および中間体（例えば、生化学経路の中にあるものおよび他の生物学的中間体）を同定するために用いることもできる。
【０２３２】
分析プロセスを開始するために、生体分子の混合物を入手するかまたは準備する。次いで、これらを、必要に応じて、標準的な手順にしたがって予備精製または部分精製してもよい。生体分子は標準的な方法を用いてサンプルから単離する。図４ａは、捕獲化合物が生体分子に結合しており、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析される、例示的な捕獲アッセイを示す。
【０２３３】
１．  一般法
本明細書で提供される収集物には、収集物を混合物と接触させて混合物中の分子を共有結合させることによって、分子、特に生体分子の混合物の複雑性を低下させることをはじめ、広範な種々の用途がある。捕獲化合物は、接触の前、その間またはその後のいずれかに選別官能基によって整列させることができる。接触および整列の後、アレイの位置は各々、混合物中の分子のサブセットを含んでいる。次いで、アレイを、例えば質量スペクトル計を用いて分析することができる。
【０２３４】
例えば、タンパク質は、細胞溶解とそれに続く、例えば、沈殿法（例えば、硫酸アンモニウム）または核酸および炭水化物（必要に応じて）の酵素的分解のいずれかにより、体液および／または組織から単離し、そして低分子量物質を分子篩によって除去する。タンパク質はまた発現ライブラリーから得ることもできる。タンパク質混合物のアリコートを捕獲化合物の収集物と反応させ、一般的には、収集物のメンバーは異なる官能基、例えば、異なる反応性および／または選択性を有し、選択されたＸの反応性または反応性官能基および選択性官能基によって混合物を別個のタンパク質ファミリーに分離する。選別官能基Ｑについて選択される多様性（相違数）は、タンパク質の標的混合物の複雑性によって異なる。したがって、例えば、ＸおよびＹ、溶解性官能基が異なっており、かつ、Ｑがオリゴヌクレオチドである化合物セットがある場合には、得られるアレイ中に十分な数の位置を提供し、その結果、最終的にアレイ上の各「スポット」が特定の捕獲化合物に結合した約５〜５０種程度の生体分子を有するために適切な長さのＢを選択する。必ずしもそうではないが、一般的には、特定の「Ｑ」を含むすべての捕獲化合物は同じであり、その結果、得られるアレイ上の各「スポット」が同様の捕獲化合物を含む。しかし、複数の異なる捕獲化合物が同じＱ官能基を含むことができる実施形態もある。
【０２３５】
記載したように、アレイは、固体支持体上の２−Ｄアレイだけでなく、着色ビーズまたはビーズ上のＲＦタグまたは化学タグまたはコードを用いてタグをつけることなどによって、アドレス指定可能であるか、メンバーを同定することができるあらゆる収集物を含む。「スポット」はアレイ上の位置であり、捕獲化合物がその「Ｑ」官能基によって選別される収集物は分離されている。
【０２３６】
特定の実施形態では、分析は混合物を完全に分析するために必要な可能な限り最少の数の反応を用いて実施する。したがって、このような実施形態では、Ｑの多様性の選択および異なる反応性のＸおよびＸ／Ｙ基の数の選択が、分析される生体分子混合物の複雑性の関数となる。Ｂの多様性ならびにＸおよび／またはＸ／Ｙ基の数を最小にすることで、最小の複雑性を有する混合物の完全な分析が可能となる。
【０２３７】
複合混合物からのタンパク質の分離は、収集物の異なるメンバーに結合した化合物−タンパク質産物によって達成される。捕獲化合物−タンパク質産物を含む上清を、支持体上のオリゴヌクレオチドなどのレシピエント分子に結合させたかまたは別の方法で標識もしくはアドレス指定した支持体と接触させて、ハイブリダイゼーションなどによって相補オリゴヌクレオチドのアレイに結合させる。１つの実施形態では、選択したＮ１ｍＢｉＮ２ｎオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体と相補的であるオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体のアレイを空間的に別個の位置に有している平坦な固体支持体を、捕獲化合物−生体分子産物とハイブリダイズさせる。
【０２３８】
Ｚが不溶性支持体または基質、例えば、ビーズである実施形態では、化合物−タンパク質産物のアドレス指定可能なアレイへの分離は、マイクロウェルもしくはマイクロタイタープレートのアレイ、または他の微小容器アレイに選別することによって、あるいは同定可能なタグで標識することによって行い得る。マイクロウェルまたはマイクロタイタープレート、または微小容器は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体Ｑと相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を含むことができる。
【０２３９】
化合物とタンパク質を反応または複合体形成させた後、過剰な化合物のすべてを、「捕獲剤」として作用するよう設計された試薬を加えることによって除去し得る。例えば、選択したＸと反応させたものと同一または類似の官能基を有するビオチニル化した小分子を、過剰な化合物のすべてと反応させる。この混合物を磁性ビーズに結合させたストレプトアビジンに曝露することにより、過剰の化合物を除去し得る。
【０２４０】
化合物−タンパク質産物の相補配列へのハイブリダイゼーションは、標準的な条件（例えば、種々のハイブリッドのＴｍ値を平衡化するためのカオトロピック塩の存在下で）にしたがって行う。ハイブリダイズしていない全ての物質を洗い流し、ハイブリダイズした物質を分析し得る。
【０２４１】
さらなる実施形態では、本明細書の方法は、化合物との反応後の生体分子の選別を達成するために、Ｑ基が並べ替えられている、本明細書で提供される化合物の混合物を用いる。化合物のこれらの混合物は、特定の実施形態では、Ｑにおける４ｉ（ここで、ｉはＱのＢ部分に含まれるヌクレオチドまたはその類似体の数）の並べ替え（例えば、ｉ＝８については６５，５３６種の並べ替え）のうちの異なるＸ試薬のサブセット（例えば、６４または２５６または１０２４）を含む。サブセットを分析される生体分子混合物のアリコートと個別に反応させると、結合体混合物が得られ、これは例えば、マイクロタイタープレート形式で並べることができる（例えば、９６、３８４、１５３６など）。化合物混合物のこれらのサブセットを用いる分析により、分析前の生体分子のさらなる選別を提供する。
【０２４２】
分析するタンパク質を、化合物との反応の前（または後）でハイブリダイゼーションの前に蛍光標識すると、これらの標識したタンパク質をアレイ上で検出することも可能である。この方法によれば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計を用いてアレイ全体をスキャンする前にハイブリッドを保持している位置を検出することができ、アレイを分析する時間が最小となる。様々な種類の質量分析計（例えば、直線型または反射型、遅延引き出しの有無、ＴＯＦ、Ｑ−ＴＯＦ型または種々の波長のレーザーおよびｘｙサンプルステージを備えるフーリエ変換分析装置）を適用してタンパク質を分析することができる。
【０２４３】
本明細書に用いる質量分析形式としては、限定されるものではないが、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、連続またはパルスエレクトロスプレー（ＥＳ）イオン化、イオンスプレー、サーモスプレーまたはマッシブクラスター衝撃質量分析計、および直線型飛行時間型（ＴＯＦ）、反射飛行時間型、シングル四重極、多重四重極、シングル磁場型、多重磁場型、フーリエ変換、イオンサイクロトン共鳴（ＩＣＲ）、イオントラップなどの検出形式、ならびにそれらの組み合わせ、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦが挙げられる。例えば、ＥＳには、水または揮発性バッファー中に溶解させたサンプルを、連続的にまたは断続的にのいずれかで大気圧イオン化インターフェース（ＡＰＩ）に注入し、次いで、四重極によって質量を分析する。ＥＳ質量分析計を用いて得ることができる複数のイオンピークの作成により、質量決定の精度を高めることができる。ＭＳ／ＭＳ四重極構成を用いれば、特異的な構造についてのなおさらに詳細な情報を得ることができる。
【０２４４】
ＭＡＬＤＩ質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）では、種々の質量分析装置、例えば、質量分析の技術分野では公知である、シングルまたはトリプル四重極モード（ＭＳ／ＭＳ）での磁場／磁気偏向機器、フーリエ変換および直交飛行時間型（Ｏ−ＴＯＦ）をはじめとする飛行時間型（ＴＯＦ）を用いることができる。脱離／イオン化プロセスには、多数のマトリック／レーザーの組み合わせを用いることができる。また、イオントラップおよびリフレクトロン構成も用いることができる。
【０２４５】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは、生体分子がマトリックス中に取り込まれていることが必要である。これは、固体（すなわち、結晶）マトリックス中に混合されたポリペプチドおよび核酸に対して行われている。マトリックスはレーザー照射を吸収するよう選択する。これらの方法では、レーザー、例えば、ＵＶまたはＩＲレーザーを用いて、プローブチップまたは他の適切な支持体上で結晶化している生体分子／マトリックス混合物に当て、これにより、生体分子の脱離およびイオン化を達成する。さらにＭＡＬＤＩ−ＭＳは、ポリペプチド、グリセロールおよび他の液体をマトリックスとして実施されている。
【０２４６】
タンパク質−タンパク質相互作用およびタンパク質−小分子（例えば、薬剤）相互作用は、化合物−タンパク質アレイを目的の分子の混合物と接触させることによって調べることができる。この場合には、切断可能な結合Ｌを含まない化合物またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ条件下で安定である結合Ｌを含む化合物を用いる。その後の質量分析計でのアレイのスキャンにより、タンパク質アレイのハイブリダイズしたタンパク質が目的のタンパク質または小分子混合物と効果的に相互作用していることを証明する。
【０２４７】
Ｚが切断可能な結合を含むものをはじめとする上記の実施形態では、化合物は質量改変タグを含むことができる。これらの実施形態では、質量改変タグは、タンパク質をはじめとする生体分子の構造の相違（例えば、リン酸化または脱リン酸化などの側鎖修飾）および／または発現レベルを分析するために用いる。１つの実施形態では、質量改変タグの有無だけが異なっている（または適切な質量相違のある２種の質量タグを含む）２種の化合物（または同一の順序のＢ部分を含む２セットの化合物）を用いる。一方の化合物（または１セットの化合物）を「健常」組織と反応させ、質量の改変された化合物（単数または複数）を、それ以外は同一条件下で「疾病」組織と反応させる。２つの反応物をプールし、二連の様式で分析する。質量相違により、疾病組織において構造が変化しているかまたは異なる量で発現されるタンパク質が明らかとなる。別個の反応に３種以上の質量改変タグを用い、疾病進行の種々の段階の間の相違を追跡するための（すなわち、時点１で質量改変タグ１、時点２で質量改変タグ２、など）、または腫瘍サンプルなどの疾病組織の種々の組織切片を分析するための多重分析のためにプールすることもできる。
【０２４８】
本明細書で提供される化合物との生体分子、例えば、タンパク質混合物との反応の選択性はまた、反応を速度支配下で実施することによって、および種々の時間間隔でアリコートを回収することによって達成できる。あるいは、種々の並行反応を行うことができ（例えば、すべて、Ｑ基のＢ部分が異なっている）、さらに種々の化学量論比を用いて実施するか、または種々の時間間隔で停止させ、別々に分析するかのいずれかを行うこともできる。
【０２４９】
本明細書で提供される捕獲化合物が発光または比色基を保有している実施形態では、分析前に固定化された化合物−生体分子結合体を不溶性支持体上で観察することができる。結合体の観察により、どこで結合体がハイブリダイズしているかについての情報（その後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析などのための）が提供される。選択した試薬を用いる特定の実施形態では、分光光度により識別することができる色素を用いることによって、別個の実験（例えば、健常対疾病、時点１対時点２など）から所定のタンパク質の量を求めることができる。
【０２５０】
本明細書で提供される方法に用いるための化合物が水または水性バッファーに不溶性であるか低溶解性である実施形態では、バッファーに有機溶媒を加えて溶解性を向上させる。１つの実施形態では、バッファー：有機溶媒の比は生体分子の変性が起こらないような比である。別の実施形態では、用いる有機溶媒としては、限定されるものではないが、アセトニトリル、ホルムアミドおよびピリジンが挙げられる。別の実施形態では、バッファー：有機溶媒の比は約４：１である。
【０２５１】
２．  表現型分析
捕獲の収集物は、プロテオームおよび他の生体分子を分析するためのトップダウン全体論的アプローチを可能にする。上記のように、有用な収集物および方法は生体分子を分析するための不偏的（ｕｎｂｉａｓｅｄ）方法を提供するが、これは本方法が必ずしも特定のクラスの標的を評価するのではない。同定される変化としては、一次配列および翻訳後修飾をはじめとする修飾と関連している構造変化が挙げられる。さらに、捕獲化合物は、疎水条件での反応のために設計することもできる溶解性官能基を含むことができるので、膜結合型および膜会合型分子、特に、タンパク質の分析が可能となる。
【０２５２】
プロテオーム分析に関する問題は、標的表現型とは無関係な遺伝的変異、性別、年齢、代謝状態、標的組織の細胞の複合混合物および細胞周期段階に起因する変化などの相違によるプロテオーム変化から生じる。したがって、組織および細胞の生体分子構成要素の中から変化、例えば、疾病に関係している変化を同定または検出するためには、サンプルの均一性が重要となり得る。均一性を提供するには、同一個体由来の疾病対健常などの種々の表現型を有する細胞を比較する。結果として、生体分子のパターンの相違は、個体間の相違に起因するのではなく表現型の相違に起因するものであると考えることができる。したがって、サンプルは単一の個体から得ることができ、種々の表現型、例えば、健常対疾病のおよびレスポンダー対ノンレスポンダーを有する細胞を分離する。さらに、バックグランド相違をさらに減少させるために、細胞を同調化するか、またはある代謝段階で凍結させることもできる。
【０２５３】
したがって、捕獲化合物の収集物は、表現型特異的タンパク質もしくはその修飾、または他の表現型特異的生体分子およびそのパターンを同定するために用いることもできる。これは同等細胞についてある表現型を有する細胞または組織由来の生体分子サンプルを、別の表現型を有する細胞または組織由来の生体分子サンプルと比較することによって行うことができる。同一個体および細胞種由来の細胞の表現型を比較する。特に、一次細胞、一次細胞培養物および／または同調化した細胞を比較する。細胞由来の生体分子の、収集物の捕獲化合物メンバーに対する結合パターンを同定し、疾病または健常状態または他の表現型のサインまたはプロフィールとして用いることもできる。特定の結合したタンパク質などの生体分子を同定することもでき、特定のタンパク質またはその構造などの新規疾病関連マーカーを同定することもできる。
【０２５４】
比較のための表現型としては、限定されるものではないが、以下を挙げる：
１）疾病に関係しているか疾病のマーカーである、タンパク質または他の生体分子を同定するための、病変対健常細胞または組織由来のサンプル、
２）応答を示す生体分子を同定するための、薬剤レスポンダーおよびノンレスポンダー（すなわち、悪性メラノーマ患者の２０〜３０％に関してはαインターフェロンに応答するが、他は応答しない）由来のサンプル、
３）応答と関連している生体分子または応答のマーカーを同定するための、薬剤または環境条件に対する毒性プロフィールを有する細胞または組織由来のサンプル、および
４）応答または表現型と関連しているか、またはそのマーカーであるタンパク質などの生体分子を同定するための、いずれかの条件に曝されたかまたはいずれか表現型を示す細胞または組織由来のサンプル。
【０２５５】
一般的には、各表現型のサンプルは、細胞が本質的に適合しており、いずれの変化も細胞の供給源ではなく表現型による変化を反映しているよう、同一の生物、例えば、同一の哺乳類から得る。サンプルは一次細胞（または組織）から得ることもできる。すべての例において、表現型に関係している生体分子の同定を可能にするために、サンプルは曝露または処理前または健常な病変していない組織のいずれかである同一個体から得ることもできる。
【０２５６】
細胞は特定の表現型の同定、次いでそれに基づく細胞の分離を可能にする任意の適切な方法によって分離することができる。例えば、生存している細胞を回収するパニングまたはネガティブパンニング（望まない細胞を捕獲し所望する細胞を上清中に残す）などの任意の方法を用いることができる。これらの方法としては、限定されるものではないが、以下を挙げる：
１）フローサイトメトリー、
２）特異的捕獲、
３）望まない細胞を捕獲し、標的細胞を上清中に残し、生存している細胞を分析のために回収するネガティブパニング、および
４）Ｌａｓｅｒ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ（ＬＣＭ）（Ａｒｃｔｕｒｕｓ，  Ｉｎｃ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）。
【０２５７】
したがって、選別基準としては、限定されるものではないが、膜電位、イオン流出、酵素活性、細胞表面マーカー、疾病マーカーおよび表現型に基づく個体からの細胞の分離を可能にする他のそのような基準が挙げられる。
【０２５８】
３．  低量タンパク質の分析
重要な疾病関連マーカーおよび標的が、質量分析計によって検出されない可能性がある低量タンパク質である場合もある。確実に検出するために、第１の捕獲化合物提示実験を行うことができる。得られた捕獲されたタンパク質のアレイを、光を発する、すなわちアレイ上のより多くのタンパク質を可視的にする蛍光色素などの非選択性色素と反応させる。色素はタンパク質量の半定量的推定値を提供し得る。色素によって検出された種々のタンパク質の数を決定し、次いで、質量スペクトル分析によって検出された数と比較することができる。色素を用いた場合により多くのタンパク質が検出される場合には、質量スペクトル分析によって低量タンパク質を検出および同定できるように、より多数の出発細胞を用いて実験を繰り返すことができる。
【０２５９】
例えば、ハウスキーピングタンパク質、例えば、アクチンおよび他のそのようなタンパク質は多量で存在しており、低量タンパク質をマスクしている可能性がある。捕獲化合物または他の精製化合物は、収集物を混合物の構成要素を評価するために用いる前に、多量タンパク質または生体分子を混合物から捕獲または除去するよう選択または設計される。多量タンパク質を除去した後、低量タンパク質は効果的なより高い濃度を有し、検出することができる。したがって、これらの方法は２段階：生体分子混合物の多量構成要素、例えば、アクチンを捕獲する第１段階を含む。
【０２６０】
また、上記で論じたように、捕獲化合物を、ゆっくりと溶解させたかまたは別の方法であるいはオルガネラおよび内膜に到達できるよう処理した細胞中の無傷のオルガネラと完全なまま相互作用させ、その後にそれを破壊するようにＷを適切に選択することなどによって、設計することができる。次いで、オルガネラタンパク質および他の生体分子をそれらの三次元構造を保つ環境下で捕獲するために、脂質二重層またはミセルコーティングなどの人工膜を含むことができるものなど、捕獲したオルガネラを破壊することができる。これらの捕獲したタンパク質を分析することができる。このことにより捕獲化合物が、その天然の三次構造の状態の捕獲されたタンパク質および他の生体分子と相互作用することが可能となる。
【０２６１】
４．  疾病の指標としてのタンパク質コンホメーションのモニタリング
収集物および／またはそのメンバーは、タンパク質の特異的な配座異性体を検出または識別するために用いることができる。したがって、例えば、タンパク質の特定のコンホメーションが疾病と（または健常状態と）関係している場合には、収集物またはそのメンバーは、収集物中の捕獲化合物との結合パターンに基づいて１つの配座異性体を検出または識別することができる。したがって、収集物および／またはそのメンバーを、疾病に関係しているタンパク質またはポリペプチドが疾病に関係しているコンホメーションを有する、高次構造が変化しているタンパク質病（またはタンパク質凝集の疾病）を検出するために用いることができる。本明細書に提供される方法および収集物により、検出される疾病に関係している配座異性体の検出が可能となる。これらの疾病としては、限定されるものではないが、アミロイド病および神経変性疾病が挙げられる。他の疾病、および２以上の異なるコンホメーションを示し、そのうちの少なくとも１種のコンホメーションが疾病に関係している関連タンパク質としては、以下の表に示されるものが挙げられる。
【表６】
0004741458.tif 000036
【０２６２】
本収集物を配座異性体の混合物と接触させることもでき、それぞれの型に結合するかまたはそれを保持するメンバーを同定し、そのようにして、パターンをそれぞれの配座異性体と関連付けることができる。あるいは、１種の配座異性体、例えば、疾病と関係している配座異性体とのみ結合するものを同定することができ、１種以上のそのような捕獲化合物からなる小収集物を疾病の診断試薬として用いることができる。
【０２６３】
５．  小分子の同定および生体分子−生体分子相互作用の研究
生体分子、例えば、タンパク質を、固定化した捕獲化合物との共有的または非共有的相互作用を用いて選別する。次いで、収集物、例えば、細胞溶解物由来のものなどの生体分子に結合した捕獲化合物のアレイを、薬剤候補のライブラリーまたは他の混合物をスクリーニングするために、あるいは結合した生体分子に結合するものを探すために生体分子の混合物をさらにスクリーニングするために用いることができる。捕獲生体分子−生体分子複合体または生体分子−薬剤候補複合体を分析して、生化学経路を同定すること、また候補薬剤を用いて標的を同定することもできる。
【０２６４】
例えば、タンパク質−タンパク質またはタンパク質−生体分子相互作用を試験化合物（通常は、有機小分子、ペプチド、ペプチドミメティックス、アンチセンス分子またはｄｓＲＮＡ、抗体、抗体の断片、組換えおよび合成抗体ならびにそれらの断片、ならびに薬剤候補またはリード化合物として働き得る他のそのような化合物をはじめとする小分子）に曝露する。結合した小分子を質量分析計または他の分析方法によって同定する。
【０２６５】
６．  非標的生体分子の同定
多くの医薬品が、生理学的条件下、薬物の非標的生体分子と、薬物、薬物の断片、薬物代謝産物またはプロドラッグとの相互作用から生じ得る副作用を有する。
【０２６６】
例えば、アスピリンは、非標的のＣｏｘ−１  受容体と反応し、胃腸内の毒性、潰瘍、出血、胃の孔、肝臓壊死、肝不全、腎臓壊死、およびあるいは発作および心臓発作のような副作用を生ずる。選択性Ｃｏｘ−２インヒビター、Ｃｏｘ−２インヒビターなど、４−〔５−（４−メチルフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾール−１−イル〕ベンゼンスルホンアミド（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標））または４−（４−（メチルスルホニル）フェニル）−３−フェニル−２（５Ｈ）−フラノンなどは、非標的生体分子と薬物との相互作用の結果であり得る副作用を有する。他の例のように、チアゾリジンジオン（ｔｈａｉｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ）（ＴＤＺ）クラスの抗糖尿病性薬物はＰＰＡＲ−γアクチベーターである。ＰＰＡＲ−γタンパク質は、グルコースおよび脂質の代謝に含まれる遺伝子の調節に重要な受容体である。ＴＤＺは、血糖（グルコース）が適当に代謝されない糖尿患者に処方する。しかし、ＴＤＺではまた、ＰＰＡＲ−α、トリグリセリドの合成経路に含まれる同様の構造を有するタンパク質と相互作用することも知られ、心臓血管疾患と関係することも知られている。ＴＤＺリズリンは肝臓毒性のため市場から回収され、最近、ＡｃｔｏｓおよびＡｖａｎｄｉａは心臓血管性の副作用があることがＭａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃの研究で報告された。
【０２６７】
薬物代謝産物もまた毒性の原因となり得る。薬物代謝に応答する幾つかの酵素系がある。１つのそのような重要な系は、主に肝臓に位置するシトクロムＰ４５０ファミリーである。これらのタンパク質は、（通常、脂肪親和性の）薬物分子に官能基を結合させることにより、機能する。その後、これらの官能基は、代謝物の部分（例えば、グルクロン酸化、硫酸化など）に他の酵素を結合させることができ、それによって、それらは水溶性となり、それ故、排泄を促進する。代謝異常に関与する酵素の多形相または代謝産物が、不可逆的にシトクロムｐ４５０（自殺阻止）を不活性化し、その排泄を妥協して処理し、可能性として肝臓に毒性が蓄積するならば、毒性が生じ得る。例えば、腎臓、肺、または心臓において代謝するこれらの代謝系の存在により、同様の薬物毒性がそれらの臓器で観察され得る。
【０２６８】
本明細書で提供するその捕獲化合物／収集物を用い、受容体および酵素（これらに限らず）を含む医薬品／薬物の断片、薬物代謝産物またはプロドラッグと相互作用する薬物の非標的生体分子を同定し得る。薬物相互作用するタンパク質の同定および特性解析はまた、予測できない別の薬理学的な利点を導き得る。予測できない他の生物学的経路において、薬物の標的が発見され、それにより、他の疾患を治療する薬物の適用が可能となることがある。ある疾患に対しては効能のない（または毒性がきつすぎる）失敗の薬物は、他の疾患に対しては大ヒット商品となるかもしれない。
【０２６９】
１つの実施態様では、捕獲化合物／収集物は、選択性官能基および適当な反応性および選別官能基として医薬品／薬物の断片、薬物代謝産物またはプロドラッグを含むように設計する。本明細書で提供する方法では、その捕獲化合物／収集物は、受容体タンパク質（これに限らない）を含む、薬物の標的および非標的の生体分子の混合物と相互作用することができる。次いで、捕獲した生体分子が分析され、薬物の標的および非標的生体分子を同定する。薬物の非標的生体分子のスクリーニングおよび同定は、医薬品の副作用理解の助けとなり、薬物構造を修飾してその副作用を排除または最小化する一方、効力は維持することができる。本明細書で提供する方法および収集物に使用し得る例示的な薬物分子は、本明細書の他の部分でも開示しており、そして、以下を含むが、これらに限らない：アトルバスタチンカルシウム、セレコキシブ、コキシブ（ｒｅｆｅｃｏｘｉｂ）およびセリバスタチンナトリウム。
【０２７０】
一旦、タンパク質が、薬物と相互作用すると同定されると、多くのタンパク質の機能に注釈を付けている公のデータベースで検索し、その構造が、観察されている副作用または治療反応と関連するようであるかどうか決定する。タンパク質の機能が不明の場合には、バイオインフォマティクスおよび機能的ゲノムツールを利用できる。これらには、配列アライメント、薬理作用団、相同モデルおよびタンパク質モチーフ相関を含むインシリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）アプローチ（バイオインフォマティクス）；肝臓ミクロソーム代謝経路（例えば、Ｐ４５０）、ｃＤＮＡ−発現酵素、酵母経路に対するシグナル経路およびバック−マッピング、刺激および取り出したタンパク質のタンパク質／タンパク質  相互作用を含むインビトロアプローチ；天然の多形性、ノックアウト／ノックイン、フローサイトメトリー、薬物の治療活性（すなわち、治療プロファイルおよび実験的な毒性、および予測遺伝子型決定および予測表現型決定を含むインビボアプローチが含まれる。細胞に基づくアッセイおよびリボザイムに基づくノックイン／ノックアウト技術と関連する上記アプローチを用い、上記同定した何れのタンパク質が治療または毒性効果と関連するか決定し得る。
【０２７１】
７．  薬物の再設計
殆どの薬物開発プロジェクトの重要な目的は、良好（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）な治療結果をもたらす薬物とその標的との相互作用を最大限とし、その一方、他のタンパク質との相互作用を最小限とすることである。目的とする標的以外のタンパク質との相互作用は、副作用を生ずる細胞性イベントのカスケードを誘発する。本明細書で提供するのは、目的の標的と相互作用するが他の相互作用は最小限とする薬物の設計が可能な方法である。ここで、捕獲化合物の選択性官能基は、薬物分子またはその代謝物のうちの１つであり、それは、化学的に関連する異なる向きで結合する。上記の手順後、薬物と相互作用するタンパク質（標的および非標的）およびそのそれぞれの推定機能が同定され、治療または副作用関連経路に含まれる可能性のあるすべての細胞型についてスクリーニングする。以前に患者で観察された薬物の治療効果および副作用の知識は、どの捕獲タンパク質が望ましい治療効果を生じ、どれがその副作用に関与するかについての仮定の形成を容易にする。
【０２７２】
これらの方法を用い、薬物の化学的構造を反復して最適化するか、設計し直すことができ、それは、望ましい標的タンパク質相互作用を維持するかまたは促進し、非標的相互作用を生ずる構造的特徴を排除しつつ行う。このプロセスは臨床前試験で行うことができるため、コストおよび時間の飛躍的な節約を行うことができる。その結果は、種々のおよび特許性のある新規化学物質（ＮＣＥ）であり、それは、臨床試験に再導入され得る。臨床試験時間の短縮が予想される。なぜなら、関連する親薬物分子からの効力データが既に利用可能であるからであり、ＮＣＥは、臨床試験プロセスに入る前に副作用の低減化の最適化を構造的に行うことができるからである。臨床試験の成功率の増加は、薬物開発の時間および特にコストを削減に非常に効果がある。
【０２７３】
これらの方法を用い、分析を行い、薬物と相互作用するすべてのタンパク質のセットを同定し、下流域の細胞性（機能性）アッセイを用い、どのタンパク質相互作用が副作用に最も応答するようであるかを確認する。薬物化合物は、タンパク質との相互作用を維持する、疾患分野で試験されたすべての薬物由来のデータを考慮して再設計し、良好な治療効果を生ずるが他のタンパク質相互作用を最小限とする。
【０２７４】
これらの方法を用い研究され得る例示的な疾患には、以下が含まれる：
（１）糖尿病
糖尿病およびその主な危険要因の肥満は、今後十年間、欧米人が直面する、増大する健康危機となろう。リズリン（Ｒｅｚｕｌｉｎ）（トログリタゾン（Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ））は市場から回収され、ＭＫ−７６７は、最近、フェーズＩＩＩ試験から撤退し、他の薬物（例えば、アクトス（Ａｃｔｏｓ）、アバンディア（Ａｖａｎｄｉａ））の販売は、全部、副作用のために、障害となっている。
【０２７５】
（２）心臓血管
ほぼ１００万人のアメリカ人が、血流中のコレステロールのレベルの上昇が原因の動脈の閉塞により、毎年、心臓血管疾患で、心臓発作および発作ではより多くが死亡している。しかし、Ｌｉｐｉｔｏｒを含むスタチンの処方の割合は副作用に影響される：これらの薬物を服用する患者に、肝臓の損傷といった毒性の効果が生じていないことを医師が監視すべきである。
【０２７６】
（３）関節炎／疼痛／炎症
胃腸およびある場合には冠状動脈での副作用の報告が、抗−炎症性ＣＯＸ−２インヒビター、ビオックスおよびセレブレックスの販売を制限している。なぜなら、多くの医師が、イブプロフェンのような遙かに効果の低い薬物を軽い炎症徴候に処方することを除き、患者により安全な策を講じるように進めるためである。
【０２７７】
Ｆ．  システム
さらなる実施形態では、本明細書に記載された化合物および方法を、以下の処理ステップを標準化し、自動化する総合的なシステムの中に位置付けられるよう設計する：
・細胞溶解物からのタンパク質の単離をはじめとする、生体分子の生物学的供給源からの単離（溶解、酵素消化、沈殿、洗浄）
・必要に応じて、低分子量物質の除去
・必要に応じて、生体分子混合物、例えば、タンパク質混合物のアリコート作製
・生体分子混合物、例えば、タンパク質混合物の、本明細書で提供する種々の化学反応性（Ｘ）および配列多様性（Ｂ）の化合物との反応（このステップは生体分子混合物のアリコートを用いて並行して実施することができる）
・必要に応じて、過剰の化合物の除去
・化合物−生体分子結合体、例えば、化合物−タンパク質結合体の、化合物のＱ部分に相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体とのハイブリダイゼーション；一本鎖オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は必要に応じてアレイ形式で提示されていてもよいし、必要に応じて不溶性支持体上に固定化されていてもよい
・必要に応じて、続いて、タンパク質アレイの化学的または酵素的処理
・限定されるものではないが、（ｉ）マトリックスの脱離、および（ｉｉ）アレイ質量分析計（較正および定量のための内部分子量標準、例えば、オンチップ分子量標準を含むかまたは含まない）を用いるスポット毎（ｓｐｏｔ−ｂｙ−ｓｐｏｔ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析というステップを含む、生体分子アレイの分析。
【０２７８】
さらなる実施形態では、本明細書に記載された化合物および方法を、以下の処理ステップを標準化し、自動化する総合的なシステムの中に位置付けられるよう設計する：
細胞溶解物からのタンパク質の単離をはじめとする、生体分子の生物学的供給源からの単離（溶解、酵素消化、沈殿、洗浄）
必要に応じて、低分子量物質の除去
必要に応じて、生体分子混合物、例えば、タンパク質混合物のアリコート作製
生体分子混合物、例えば、タンパク質混合物の、本明細書で提供する種々の化学反応性（Ｘ）および配列多様性（Ｂ）の化合物との反応（このステップは生体分子混合物のアリコートを用いて並行して実施することができる）
必要に応じて、過剰の化合物の除去
タンパク質アレイの化学的または酵素的処理
続いて、化合物−生体分子結合体、例えば、化合物−タンパク質結合体の、化合物のＱ部分に相補的である一本鎖オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体とのハイブリダイゼーション；一本鎖オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は必要に応じてアレイ形式で提示されていてもよいし、必要に応じて不溶性支持体上に固定化されていてもよい
限定されるものではないが、（ｉ）マトリックスの脱離、および（ｉｉ）アレイ質量分析計（較正および定量のための内部分子量標準、例えば、オンチップ分子量標準を含むかまたは含まない）を用いるスポット毎（ｓｐｏｔ−ｂｙ−ｓｐｏｔ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析というステップを含む、生体分子アレイの分析。
【０２７９】
このシステムは本明細書で提供される収集物、必要に応じてはそのような収集物のアレイ、サンプル調製および機器分析のプロセスを制御するための、および得られたデータを分析するためのソフトウェア、ならびに生体分子の分析のための質量分析計のような機器を含む。このシステムはタンパク質混合物が少なくとも部分的に分離されるような、他の装置、例えば、液体クロマトグラフィー装置も含む。溶出液をアリコートの連続系列で、例えば、マイクロタイタープレート中に回収し、それぞれのアリコートを提供される捕獲化合物と反応させる。
【０２８０】
複合反応では、各ウェルのアリコートを同時に、例えば、各々Ｘが異なっており（すなわち、アミノ、チオール、レクチン特異的官能基）、特異的かつ識別可能な選択性部分Ｙを含み、Ｑ基が異なっている、本明細書で提供される１種以上の捕獲化合物と反応させることができる。水性または有機性媒体中でクロマトグラフィーを行うことができる。得られた反応混合物をプールし、直接分析する。あるいは、その後、質量スペクトル分析をはじめとする分析の前に、二次反応または分子相互作用研究を実施する。
【０２８１】
本明細書で提供されるシステムは、ｘｙステージ上のピペッティングロボットなどのアセンブリラインを含むことができ、試薬供給／洗浄モジュールが中心分離装置ならびに分析およびデータ解釈のための末端の質量分析計と接続されている。このシステムは、例えば、以下をはじめとする処理ステップを実施するようにプログラムすることができる（例えば、図２参照）。
【０２８２】
１）細胞培養物（または組織サンプル）を、１、２・・・ｉ個のウェルを有するマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中に準備する。各ウェルに、細胞の溶解のための溶液を加えて、タンパク質を遊離させる。一部の実施形態では、適切な洗浄ステップ、ならびに、核酸および他の非タンパク質成分を消化するための酵素を添加するステップが含まれる。さらなる実施形態では、通常のＭＴＰの代わりに、ウェルの底部にフィルタープレートを備えたＭＴＰを用いる。細胞細片を濾過または遠心分離のいずれかによって除去する。適切な分離処理のためのコンディショニング溶液を添加し、各ウェル由来の物質を別々に分離装置に入れる。
【０２８３】
２）分離には電荷、分子の大きさ決定、吸着、イオン交換および分子排除原理などの種々の分離原理を活用する。サンプルの大きさによって、適切な寸法のもの、例えば、マイクロボア高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる。特定の実施形態では連続フロープロセスを用い、流出液をＭＴＰ１、２・・・ｎ中に連続的にアリコートとする。
【０２８４】
３）プロテオーム試薬との反応。次いで、各ＭＴＰを、オリゴヌクレオチド配列部分（すなわち、Ｑ）のみか、または／かつ、タンパク質と反応する官能基（すなわちＸ）の化学的性質が異なっている、１、２・・・ｍ種の試薬を含有しているプロテオーム試薬ステーションに移す。１種の組織サンプルに由来する１以上のＭＴＰが存在する場合には、それぞれのＭＴＰ１、２・・・ｎの同一ウェル、すなわち、ウェルＡ１に試薬１を加え、試薬２をウェルＡ２というように加える。ＭＴＰが９６ウェルを有する（ｉ＝９６）実施形態では、９６種の種々のプロテオーム試薬（すなわち、９６種の種々の本明細書で提供される化合物ｍ＝１〜９６）を、相互汚染を防ぐためにプロテオーム試薬ステーションから９６の異なるノズルを通して供給する。
【０２８５】
４）プールする：過剰のプロテオーム試薬を不活化し、１種の同一組織サンプルに属する各ウェル由来のアリコートをプールし、残存する物質を、無傷のタンパク質の構造（および必要に応じてコンホメーション）を保存する条件で保存して、その後の実験のマスターＭＴＰとして用いる。
【０２８６】
５）プールしたサンプル中の過剰のプロテオーム試薬を、例えば、磁性ビーズを用いるビオチン／ストレプトアビジン系を用いて除去し、次いで、上清を濃縮し、ハイブリダイゼーションのためにコンディショニングする。
【０２８７】
６）オリゴヌクレオチドチップへのトランスファー。ハイブリダイズしていない物質および他の低分子量物質を除去するための洗浄ステップの後、マトリックスを加える。あるいは、マトリックス添加の前に、例えば、トリプシンまたは／およびキモトリプシンでの消化を行う。酵素および消化産物を洗い流した後、マトリックスを加える。
【０２８８】
７）チップの質量分析計への移動。１つの実施形態では、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を実施する。タンパク質分析に適切な他の質量分析構成を適用することもできる。質量分析計はｘｙステージを有しており、それにより分析のためのスポットの各位置上をラスターする。プロテオーム試薬は試薬部分のほとんど（オリゴヌクレオチドチップアレイとハイブリダイズする部分を含む）が、質量分析の前またはその間に切断され、したがってスペクトルの低分子量領域で検出される、これにより質量スペクトルにおいてペプチド（酵素消化の場合には）またはタンパク質分子量シグナルからうまく分離されるように設計することができる。
【０２８９】
８）最後に、分子量シグナルは、ノイズ減少、バックグラウンド減算および他のそのような処理ステップのために処理することができる。得られたデータを保存し、解釈することができる。タンパク質（または酵素消化後に得られたペプチド）の分子量値をヒトＤＮＡ配列情報およびタンパク質コード領域から導かれたタンパク質配列情報と関連付ける。利用できるデータベースとの相互関係によって、タンパク質およびその機能が既に知られているかどうかが明らかになる。機能が未知である場合には、その機能およびそれに続いて、健常な個体においてまたは疾病を患う個体の疾病経路においてどこでその代謝的役割を果たすかという生化学的経路内での位置を解明するために、標準的な方法を用いて既知のＤＮＡ配列からタンパク質を十分な規模で発現させることができる。
【０２９０】
所定の組織サンプル内の種々のタンパク質由来のアリコートを含むマスタープレートが保存されており、利用可能であるので、その後の実験はここで予め選んだ方法で実施することができる。例えば、標的確認のためのタンパク質−タンパク質（生体分子）相互作用研究のために、または／および薬剤候補選抜のために小分子のコンビナトリアルライブラリーとの相互作用を研究するために、タンパク質をチップ表面に提示する。
【０２９１】
Ｇ．  バイオインフォマティクス
化合物−タンパク質種の質量スペクトル分析のような分析により得られた生データをバックグラウンド減算、ノイズ減少、分子量較正およびピークリファインメント（例えば、ピーク積分）によって処理する。切断されたタンパク質または消化産物の分子量値を解釈し、既存のタンパク質データベースと比較して当該タンパク質が既に知られているかどうか、またそうである場合には、どんな修飾が存在するか（グリコシル化されているかグリコシル化されていないか、リン酸化されているかリン酸化されていないかなど）を決定する。化合物の１つのセットに属する実験の種々のセットを構成し、比較し、解釈する。
【実施例】
【０２９２】
市販等級の溶媒および試薬を、特記しない限りは精製せずに用いた。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータは溶媒としてＣＤＣｌ３を用いて５００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光光度計から得た。質量スペクトルデータはエレクトロスプレー法を用いて分析した。
【０２９３】
実施例１
Ｎ１ｍＢｉＮ２ｎの実施例
ａ．  同一の四量体としてのＮ１およびＮ２、三量体としてのＢ
Ｎ１＝Ｎ２、ｍ＝ｎ＝４、ｉ＝３、Ｂ＝６４通りの配列並べ替え
【化３０】
0004741458.tif 000037
【化３１】
0004741458.tif 000038
【０２９４】
ｂ．  同一でない四量体としてのＮ１およびＮ２、四量体としてのＢ
Ｎ１±Ｎ２、ｍ＝ｎ＝４、ｉ＝４、Ｂ＝２５６通りの配列並べ替え
【化３２】
0004741458.tif 000039
【０２９５】
ｃ．  七量体としてのＮ１、八量体としてのＮ２、八量体としてのＢ
Ｎ１±Ｎ２、ｍ＝７、ｎ＝８、ｉ＝８、Ｂ＝６５，５３６通りの配列並べ替え
【化３３】
0004741458.tif 000040
【０２９６】
実施例２
ＤＮＡアレイ上でのタンパク質の分離
Ｎ１ｍＢｉＮ２ｎ（Ｓ１）ｔＭ（Ｒ１５）ａ（Ｓ２）ｂＬＸタンパク質（ここで、Ｂは三量体）、
ｍ＝ｎ＝４、ｉ＝３、ｔ＝ｂ＝１、下線を引いた配列はＮ１およびＮ２である
【化３４】
0004741458.tif 000041
【０２９７】
実施例３
ドープしたカルボニックアンヒドラーゼＩＩを伴うＨＥＫ２９３細胞性画分からの標的タンパク質の捕獲およびプルダウン（ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）
【０２９８】
必要な物質：
２０  ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  緩衝液、ｐＨ  ７．２．
２００μｌ  ２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２を加え、凍結乾燥化カルボニックアンヒドラーゼＩＩ（Ｓｉｇｍａ）を元に戻す。エッペンドルフ（登録商標）チューブに移す。ワーキングストックの濃度を算出し（以下のプロトコール参照）、同じ緩衝液を用いストックを作成し、マスターストックを作成する。マスターストックを長期保存のため凍結させる。
【０２９９】
ＨＥＫ２９３細胞性画分をＦＰＬＣ分画し、塩勾配により複数画分を回収する。
【０３００】
１０ｍＭ  ＤＭＳＯストック中に捕獲化合物を溶解する。メタノール中の捕獲化合物Ａのワーキングストックを作成する。毎週新しいストックを作成し、氷上でアルミホイルで遮光して保持する。
【０３０１】
スピンカラム（約５００μｌベッド体積）に通す。ごく少量、２０μｌおよび１００  μｌまでのサンプルを扱う。
【０３０２】
Ｓｏｆｔ−Ｌｉｎｋ（アビジン）樹脂：．樹脂を、３ｘ１ｍｌ（１００μｌ樹脂アリコートの場合）の２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．２で洗浄する。プルダウン実験で用いる樹脂の量と一致させるため、洗浄の最後に、固体／液体の比を正確に維持するように注意すべきである。
【０３０３】
プルダウン用の洗浄緩衝液：Ｈｅｐｅｓ／ＮａＣｌ／ＴＸ１００／ＥＤＴＡ／ＤＴＴ．  最初の４つの成分を有する緩衝液ストックを正確な濃度およびｐＨで最初に作成し、次いで、別々に１Ｍ  ＤＴＴストックを作成し、そして使用するまで少量のアリコートで凍結する。プルダウン実験の洗浄手順（工程Ｈ）の直前にＤＴＴストックチューブを融解し、必要な最終物にＤＴＴストックを加える。各プルダウンチューブには、〜１ｍｌの洗浄緩衝液が必要である。
Ｓｉｇｍａ  ｍａｓｓ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｗａｔｅｒ
【０３０４】
実験プロトコール：
Ａ．  反応プレート上のウェルに、２５μｌＦＴ２９３、ｘμｌのカルボニックアンヒドラーゼＩＩストック、ｙμｌの化合物ストック溶液、および２５−ｘ−ｙμｌの２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．２をピペットする。５０μｌの反応ではｙの値は２．５μｌ以内とする。混合物中のＦＴ画分を最終混合物で２倍に希釈する。Ｓ１００では、３倍を超える希釈を必要とする。特定の実施態様では、５０μｌ反応のＳ１００では１５μｌを用い、従って、緩衝液体積を変える。
【０３０５】
Ｂ．  それら３つを３回ピペットアップおよびダウンを行うことにより完全に混合する。
【０３０６】
Ｃ．  反応混合物を暗室にて３０分間、インキュベートする
【０３０７】
Ｄ．  そのインキュベーション後、光反応を行う。高輝度で広帯域の写真用フラッシュランプ（Ａｌｉｅｎ  ＢｅｅｓのＢ１６００）によるフラッシュでマイクロタイタープレートが過剰に加熱されないように注意しなければならない。合計〜２０−４０ショットを用いる。
【０３０８】
Ｅ．  光反応後のサンプルのスピンカラム処理は、約１μＭの捕獲化合物を有する混合物には必要がない。１０μＭを超える化合物を用いる反応の場合、結合前のスピンカラム処理によりプルダウンの標的シグナルが改善し得る。
【０３０９】
Ｆ．  捕獲したタンパク質を、ビオチン／アビジンを用い単離する。上記のようにＳｏｆｔ−Ｌｉｎｋ樹脂を洗浄する；ビオチンでは事前に処理しない。結合およびプルダウン、それぞれの場合、ストリップ上の１つのＰＣＲチューブ中へ、上部で完全に樹脂および液体を混合した後に樹脂のスラリー５μｌを加え、次いで、光反応またはスピンカラムの後に反応混合物２０μｌを加える。内容物の放出前にチューブの下部にチップが確実にあるように注意すべきであり、ピペットマンチップはチューブの内側の壁、特に上部部分にふれないようにすべきである。３０分間、室温で結合チューブを回転させる。
【０３１０】
Ｇ．  ２分間、遠心分離でチューブをスピンする。上清を注意深く取り去る。可能な限り樹脂を全く喪失することなく液体を取り出すように努めるべきである。
【０３１１】
Ｈ．  ２００μｌの洗浄緩衝液を各チューブに加え、４分間同じ設定で回転させる。その工程の間、樹脂および液体が十分に混合するようにする。
【０３１２】
Ｉ．  スピンし、工程Ｇに記載のように上清を取り除く。
【０３１３】
Ｊ．  洗浄緩衝液による４回の洗浄の後、水を置換し、更に４回洗浄を行う。水での最後の洗浄後、完全に上清を取り去り、上部に水２μｌを加える。
【０３１４】
Ｋ．  樹脂および水を十分に混合し、１μｌをマスプレートスポットに乗せ、１または２分間、風を当て、スポットを少し乾燥させ（完全に乾燥させない）、マトリックス１μｌを加え、４回ピペットアップおよびダウンする。
【０３１５】
Ｌ．  ＳＤＳ−ＰＡＧＥがサンプルに必要なものであるなら、銀染色（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｉｌｖｅｒ  Ｑｕｅｓｔ  ｋｉｔ）を用い、プルダウンのタンパク質を検出し得る。通常、半分のプルダウン樹脂が、この目的のために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液で溶出する。
【０３１６】
実施例４
結合強度の決定（解離定数）
このアプローチは、光分解は、共有結合架橋に対する活性化により、非常に早い時間スケールで生ずるという観察に基づいている（ナノ秒からミリ秒、光活性化部分に依存）。それ故、平衡での酵素−基質複合混合物のスナップショットを生ずる光分解を用いることが考えられ得る。共有結合的に架橋した酵素−基質の量は、平衡での酵素−結合基質（捕獲化合物）の量に直接比例する。最も重要なことに、開始酵素の僅かな量ぐらいのこの量は、プルダウン工程後にｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ  Ｍａｌｄｉ  Ｍａｃｈｉｎｅを用いることにより、非常に容易で信頼のある測定が可能となる。
【０３１７】
平衡分析
分析の始めは解離定数の定義である。
Ｋｄ＝〔Ｓ〕〔Ｅ〕／〔ＳＥ〕
式中、〔Ｓ〕、〔Ｅ〕および〔ＳＥ〕は、遊離基質、遊離酵素および基質−酵素複合体のそれぞれの濃度である。この等式をより有用にするために、以下のようなより直ちに測定可能である変数を用いる等式で書き換えることができる：
〔Ｓ０〕＝基質の初期濃度
〔Ｅ０〕＝酵素の初期濃度
【０３１８】
それ故、以下の等式が得られる。
Ｋｄ＝（〔Ｓ０〕−〔ＳＥ〕）（〔Ｅ０〕−〔ＳＥ〕）／〔ＳＥ〕．
【０３１９】
これは、Ｋｄ、Ｓ０およびＥ０の単純な関数として複合体の濃度が得られる単純な二次方程式である。
【０３２０】
〔ＳＥ〕＝１／２（Ｓ０＋Ｅ０＋Ｋｄ−Ｓｑｒｔ（（Ｓ０＋Ｅ０＋Ｋｄ）＊＊２−４Ｓ０Ｅ０））
基質濃度が複合体濃度よりも遙かに高くなる、すなわち、（〔Ｓ０〕＞＞〔ＳＥ〕）という仮定により等式を更に単純化し得る。この場合、以下のように単純化する。
〔ＳＥ〕＝Ｅ０／（１＋Ｋｄ／〔Ｓ０〕）
【０３２１】
光分解後
中心となる仮定は、光分解工程が非常に迅速な工程であり、そのため、共有結合的に架橋した基質酵素複合体が平衡にある複合体の量と直接比例するというものである。すなわち、我々は平衡濃度のスナップショットを実際にとっているのである。
【０３２２】
αを共有結合的架橋複合体への結合複合体の変換効率とすると、共有結合的架橋複合体の濃度は、α〔ＳＥ〕となる。
【０３２３】
プルダウン後
基質がビオチニル化化合物であるならば、プルダウン実験で、共有結合的に捕獲した複合体が単離されるだろう。プルダウン効率をβとする。Ｍａｌｄｉ内のこの複合体のピーク面積、Ａにより、プルダウン複合体の直接の測定濃度が得られる。
Ａ＝β＊α＊Ｅ０／（１＋Ｋｄ／〔Ｓ０〕）
【０３２４】
完全Ｋｄ測定
上記等式から、Ａと基質の初期濃度との間には非常に単純な関係がある：
ｌｎ（Ａ）＝ｌｎ（β）＋ｌｎ（α）＋ｌｎ（Ｅ０）−ｌｎ（１＋Ｋｄ／〔Ｓ０〕）
【０３２５】
更に、Ｋｄ＜＜〔Ｓ０〕と仮定すると、最終的に以下の等式が得られる。
ｌｎ（Ａ）＝ｌｎ（β）＋ｌｎ（α）＋ｌｎ（Ｅ０）−Ｋｄ／〔Ｓ０〕
【０３２６】
そのため、１／〔Ｓ０〕に対してｌｎ（Ａ）をプロットすることにより、直線近似の勾配からＫｄを得ることができる。
【０３２７】
Ｎ．Ｂ．外部標準が、〔Ｓ０〕の種々の値を有するサンプルから取得したスペクトルの正規化に必要となるかもしれない。
【０３２８】
Ｋｄ差測定
外部標準の使用ができず、または望ましくない場合、Ｋｄの差を測定することもできる。捕獲され、プルダウンされ、およびマススペクトルされる２種の酵素があると想定する。非常に選択的な化合物の場合、光分解およびプルダウン効率も非常に似ていると見なされるのは理にかなっている。その解離定数がＫｄ１およびＫｄ２であるとすると、それぞれ、初期酵素濃度はＥ０１およびＥ０２であり、それぞれのＭａｌｄｉピーク面積はＡ１およびＡ２である。以下の等式が得られる。
ｌｎ（Ａ１／Ａ２）＝ｌｎ（Ｅ０１／Ｅ０２）−（Ｋｄ１−Ｋｄ２）／〔Ｓ０〕．
【０３２９】
このため、１／〔Ｓ０〕に対し、相対面積の自然対数をプロットすることにより、解離定数の差、（Ｋｄ１−Ｋｄ２）が、直線近似の勾配から直接決定され得る。この分析の魅力的な特徴は、相対面積を扱うため、種々のスペクトルからの面積を正規化する必要がないことである。
【０３３０】
実施例５
経口血糖降下薬／抗糖尿病薬：
チアゾリジンジオン（グリタゾン（Ｇｌｉｔａｚｏｎｅ））：トログリタゾン（リズリン（商標））ロシグリタゾン（アバンディア（商標））およびピオグリタゾン（Ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）（アクトス（商標））
Ｉ．開発および薬理学
トログリタゾン（リズリン（商標））は、上市された最初のチアゾリジンジオンであり、インスリンを受けている、また、単剤療法として受けているインスリン−耐性患者の治療に適応された。トログリタゾンは、肝障害への関与から市場から回収されるまで、用いられていた。しかし、２つの新しい「グリタゾン」が近年認可され、これらの薬物は特にインスリン耐性を標的とする。これら新しいグリタゾン、それぞれはまた、副作用を有している。
【化３５】
0004741458.tif 000042
【０３３１】
チアゾリジンジオンは、作用についてはインスリンの存在に依存する。しかし、それらは、インスリン分泌に影響を与えない。チアゾリジンジオンは選択性が高く、多数のインスリン応答遺伝子の転写を調節するペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）γの強力なアゴニストである。ＰＰＡＲ受容体は、脂肪組織、骨格筋および肝臓のようなインスリン作用の、鍵となる標的組織内で発見され得る。ＰＰＡＲ−γ受容体の作用は、グルコース生成、輸送、および利用の制御に含まれるインスリン−応答遺伝子の転写物を調節する。例えば、これら受容体の刺激は、ＧＬＵＴ１およびＧＬＵＴ４受容体の産生を増大し得る。更に、ＰＰＡＲ−γ応答遺伝子はまた、脂肪酸代謝の調節の役割をもする。経口用のスルホニル尿素とは異なり、ロシグリタゾンは、インスリン分泌を刺激する以外にインスリンに対する組織感度を促進する。また、このメカニズムに基づくと、これらの薬物では、その作用を十分に発揮するのに（そのため、その可能性を評価するのに）数週間かかり得る。
【０３３２】
前臨床研究では、これらの薬物は、肝臓グルコース排出が減少し、骨格筋のインスリン−依存グルコース処理を増大することが示された。糖尿病の動物モデルでは、これらの薬物は、ＮＩＤＤＭのようなインスリン耐性状態に特徴的な高血糖症、高インスリン血およびトリグリセリド過剰血を減少する。
【０３３３】
ＩＩ．副作用：
最小限の低血糖症：今日、低血糖症は、比較的少数のグリタゾン−治療患者で観察された。グリタゾンと組み合わせる積極的なインスリン投薬は、更なるＨｂＡ１ｃの減少と関係するが、低血糖症のリスクの増大とも関係する。
【０３３４】
トログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）とは対照的に、薬物誘導性肝細胞毒性の証明は、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）またはロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）の臨床試験では示されていなかった。しかし、ＦＤＡは、グリタゾン治療の開始より、治療一年目の間、２ヶ月おきに肝機能のモニタリングを推奨している。患者はまた、吐き気、嘔吐、腹痛、疲労、食欲不振、暗色尿、または黄疸のような肝機能異常を示唆する徴候および症状をモニターすることをアドバイスされるべきである。
【０３３５】
浮腫、低血糖症、知覚異常、およびクレアチニンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）の上昇が、幾人かのピオグリタゾン−治療患者で生じた。ヘモグロビンおよびヘマトクリットの減少もまた観察された。
【０３３６】
チアゾリジンジオンは、前糖尿病者と糖尿病患者の両方でインスリン耐性を減少する薬理学的化合物である。チアゾリジンジオンはＰＰＡＲ−γ２のリガンドである。ＰＰＡＲ−γ２は、含脂肪細胞、腸、およびマクロファージにおいて優性的に発現する。低レベルの発現がまた、筋細胞で生じ得る証明が幾つかある。ＰＰＡＲ−γ  受容体は、多くの遺伝子の発現を調整する転写因子である。インスリン感受性におけるチアゾリジンジオンの効果が、ＰＰＡＲ−γ２−依存遺伝子の発現の変化を介すると考えられる。
【０３３７】
上記考察のように、抗糖尿病薬としてのチアドリジンジオン（ｔｈｉａｄｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ）は明らかに毒性および望ましくない副作用を示す。チアゾリジンジオン（グリタゾン）：トログリタゾン（リズリン（商標））ロシグリタゾン（アバンディア（商標））およびピオグリタゾン（アクトス（商標））は「捕獲化合物（ＣＣ）」に結合するだろう。ＣＣ−チアゾリジンジオンは、腎臓、肝臓、膵臓、結腸上皮および筋細胞と共にインキュベートされる。リズリン、アバンディアおよびアクトスはＰＰＡＲ−γ、ＰＰＡＲ−αおよび非標的タンパク質を捕獲する。これら３つの薬物は、異なる代謝および薬物動力学を有しており、それ故、それらは、種々の非標的タンパク質を捕獲すると予測される。上記考察のように、チアゾリジンジオンの抗糖尿病性作用は、ＰＰＡＲ−γ  タンパク質に結合することにより生ずる。チアゾリジンジオンの構造活性相関（ＳＡＲ）および結晶構造およびチアゾリジンジオンと共に共結晶したＰＰＡＲ−αは文献中で知られている。
【０３３８】
チアゾリジンジオンの望ましくなく、毒性の副作用は、ＰＰＡＲ−α  および  非標的タンパク質との相互作用に起因し得る。ＣＣＭＳのＴｏｘＰｒｏ応用を用い、各薬物に結合するすべてのタンパク質、およびそれら各々の結合定数を同定する。ＣＣＭＳ技術による非標的タンパク質の同定の後、反復工程によりチアゾリジンジオンを化学的に再設計し、ＰＰＡＲ−αおよび非標的タンパク質への結合を阻止しつつ、標的タンパク質ＰＰＡＲ−γとの相互作用を保持する。
【０３３９】
リズリン：
リズリンは、以下に示すように捕獲化合物に結合する：
【化３６】
0004741458.tif 000043
リズリンは、肝臓でｐ−ヒドロキシグルコースおよび硫酸塩複合体に代謝される。それにより構造ＩＩが考えられる。
【０３４０】
リズリン捕獲化合物構造ＩおよびＩＩを腎臓、肝臓、膵臓、結腸上皮、および筋細胞と共にインキュベートする。標的タンパク質ＰＰＡＲ−γおよび非標的タンパク質ＰＰＡＲ−αおよびタンパク質Ａ、ＢおよびＣを捕獲する。
【０３４１】
アバンディアおよびその代謝産物：
アバンディアは、以下に示すように捕獲化合物に結合する：
【化３７】
0004741458.tif 000044
【０３４２】
アバンディアは芳香族性ヒドロキシ代謝物に代謝される。それ故、２つの可能性ある代謝物が、以下に示すように捕獲化合物に結合する：
【化３８】
0004741458.tif 000045
【化３９】
0004741458.tif 000046
【０３４３】
捕獲化合物に結合するアバンディアおよびその代謝物を、腎臓、肝臓、膵臓、結腸上皮、および筋細胞と共にインキュベートする。標的タンパク質ＰＰＡＲ−γおよび非標的タンパク質ＰＰＡＲ−αおよびタンパク質Ａ、ＢおよびＣが捕獲される。
【０３４４】
アクトスおよびその代謝物：
アクトスは、以下に示すように捕獲化合物に結合する：
【化４０】
0004741458.tif 000047
【０３４５】
アクトスの可能な代謝産物は、以下に示すように捕獲化合物に結合する：
【化４１】
0004741458.tif 000048
【０３４６】
捕獲化合物に結合するアクトスおよびその代謝物は、腎臓、肝臓、膵臓、結腸上皮、および筋細胞と共にインキュベートする。標的タンパク質ＰＰＡＲ−γおよび非標的タンパク質ＰＰＡＲ−αおよびタンパク質Ａ、ＢおよびＣを捕獲する。
【図面の簡単な説明】
【０３４７】
【図１】タンパク質の混合物のハイブリダイゼーション、分離および質量スペクトル分析を示す図である。
【図２】本明細書で提供される装置の１つの実施形態を示す模式図を提供する図である。
【図３ａ−３ｈｈｈｈ】本明細書で提供される捕獲試薬に用いる例示的な選択性官能基を提供する図である。
【図４ａ−４ｆ】生体分子捕獲アッセイの概略図ならびに例示的な捕獲化合物およびタンパク質を用いた結果を示す図である。
【図５】捕獲化合物の選択性官能基における、バイアスのかかったおよびバイアスのかかっていない選択基の例示的な特徴を示す。
【図６】捕獲化合物を用いるタンパク質同定のための例示的なプロトコールを示す。
【図７】タンパク質捕獲に含まれる工程および捕獲化合物を用いる同定の概略図を示す。
【図８】捕獲化合物を用いる選択的タンパク質捕獲を示す。
【図９】捕獲化合物Ｂの既知リガンドに対するタンパク質イソ型の相対的結合強度示す。
【図１０】捕獲化合物Ａを用いる、複雑なタンパク質混合物由来のカルボニックアンヒドラーゼの単離を示す。
【図１１】捕獲化合物Ａを用いる、かなり複雑なタンパク質混合物由来のカルボニックアンヒドラーゼの単離を示す。
【図１２】溶解した赤血球由来のカルボニックアンヒドラーゼの捕獲および単離を示す。
【図１３】事前に細胞を溶解することのない、赤血球由来のカルボニックアンヒドラーゼの直接の捕獲を示す。
【図１４】カルボニックアンヒドラーゼを含む非ビオチニル化タンパク質が過剰にあるときの、赤血球ライゼート由来のカルボニックアンヒドラーゼの捕獲を示す。
【図１５】非常に高濃度の捕獲化合物Ａを用いる、より低い親和性を有するタンパク質の捕獲を示す。
【図１】
0004741458.tif 000136
【図２】
0004741458.tif 000137
【図３ａ】
0004741458.tif 000138
【図３ｂ】
0004741458.tif 000139
【図３ｃ】
0004741458.tif 000140
【図３ｄ】
0004741458.tif 000141
【図３ｅ】
0004741458.tif 000142
【図３ｆ】
0004741458.tif 000143
【図３ｇ】
0004741458.tif 000144
【図３ｈ】
0004741458.tif 000145
【図３ｉ】
0004741458.tif 000146
【図３ｊ】
0004741458.tif 000147
【図３ｋ】
0004741458.tif 000148
【図３ｌ】
0004741458.tif 000149
【図３ｍ】
0004741458.tif 000150
【図３ｎ】
0004741458.tif 000151
【図３ｏ】
0004741458.tif 000152
【図３ｐ】
0004741458.tif 000153
【図３ｑ】
0004741458.tif 000154
【図３ｒ】
0004741458.tif 000155
【図３ｓ】
0004741458.tif 000156
【図３ｔ】
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【図３ｕ】
0004741458.tif 000158
【図３ｖ】
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【図３ｗ】
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【図３ｘ】
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【図３ｙ】
0004741458.tif 000162
【図３ｚ】
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【図３ａａ】
0004741458.tif 000164
【図３ｂｂ】
0004741458.tif 000165
【図３ｃｃ】
0004741458.tif 000166
【図３ｄｄ】
0004741458.tif 000167
【図３ｅｅ】
0004741458.tif 000168
【図３ｆｆ】
0004741458.tif 000169
【図３ｇｇ】
0004741458.tif 000170
【図３ｈｈ】
0004741458.tif 000171
【図３ｉｉ】
0004741458.tif 000172
【図３ｊｊ】
0004741458.tif 000173
【図３ｋｋ】
0004741458.tif 000174
【図３ｌｌ】
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【図３ｍｍ】
0004741458.tif 000176
【図３ｎｎ】
0004741458.tif 000177
【図３ｏｏ】
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【図３ｐｐ】
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【図３ｑｑ】
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【図３ｒｒ】
0004741458.tif 000181
【図３ｓｓ】
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【図３ｔｔ】
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【図３ｕｕ】
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【図３ｖｖ】
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【図３ｗｗ】
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【図３ｘｘ】
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【図３ｙｙ】
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【図３ｚｚ】
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【図３ａａａ】
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【図３ｂｂｂ】
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【図３ｃｃｃ】
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【図３ｄｄｄ】
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【図３ｅｅｅ】
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【図３ｆｆｆ】
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【図３ｇｇｇ】
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【図３ｈｈｈ】
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【図３ｉｉｉ】
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【図３ｊｊｊ】
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【図３ｋｋｋ】
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【図３ｌｌｌ】
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【図３ｍｍｍ】
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【図３ｎｎｎ】
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【図３ｏｏｏ】
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【図３ｐｐｐ】
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【図３ｑｑｑ】
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【図３ｒｒｒ】
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【図３ｓｓｓ】
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【図３ｔｔｔ】
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【図３ｕｕｕ】
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【図３ｖｖｖ】
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【図３ｗｗｗ】
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【図３ｘｘｘ】
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【図３ｙｙｙ】
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【図３ｚｚｚ】
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【図３ａａａａ】
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【図３ｂｂｂｂ】
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【図３ｃｃｃｃ】
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【図３ｄｄｄｄ】
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【図３ｅｅｅｅ】
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【図３ｆｆｆｆ】
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【図３ｇｇｇｇ】
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【図３ｈｈｈｈ】
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【図４ａ】
0004741458.tif 000224
【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0004741458.tif 000233
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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