(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを用い、更にカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを含む酵素的測定試薬であって、フェロシアン化物及びコレステロールエステラーゼを含む前記酵素的測定試薬に、鉄イオンには配位するが、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンには配位しないキレート剤を含有させることを特徴とする、試料に依存する非特異的発色の抑制方法。
【請求項２】
前記の試料に依存する非特異的発色が、試料の鉄イオンとの結合能に依存する非特異的発色である、請求項１記載の試料に依存する非特異的発色の抑制方法。
【請求項３】
前記の試料に依存する非特異的発色が、試料の不飽和鉄結合能に依存する非特異的発色である、請求項１記載の試料に依存する非特異的発色の抑制方法。
【請求項４】
前記キレート剤が、グルコン酸、酒石酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、又はサリチル酸よりなる群から選択される少なくとも一つの物質である、請求項１〜３に記載の試料に依存する非特異的発色の抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素的測定試薬を用いた試料中の特定成分の測定における、試料に依存する非特異的発色の抑制方法に関するものである。
本発明は、特に、化学、生命科学、分析化学及び臨床検査等の分野において有用なものである。
【背景技術】
【０００２】
血液、尿などの生体試料中に含まれる特定成分を測定することは、疾病の診断において大変有用なものであり、臨床検査においては酵素学的測定法が普及し、様々な測定方法が開発されている。このような方法としては、例えば、酸化酵素を用いて、特定成分から直接又は間接的に、酸化性物質である過酸化水素を生成させ、これをペルオキシダーゼ及び被酸化性発色試薬と混合、接触させて発色系に導き、酸化縮合反応により被酸化性発色試薬から生成した色素を光学的に測定することにより生成した過酸化水素の測定を行い、これにより生体試料中に含まれる特定成分を測定する方法を挙げることができる。
例えば、コレステロール、尿酸、及びブドウ糖等の測定に、それぞれコレステロールオキシダーゼ、ウリカーゼ、及びグルコースオキシダーゼ等の酸化酵素を働かせて過酸化水素を生成させ、この生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ及び被酸化性発色試薬と混合、接触させて発色系に導き、酸化縮合反応により被酸化性発色試薬から生成した色素を光学的に測定することにより測定し、これより各特定成分を正確に測定することができる。
また、このような測定方法は、１ステップ法あるいは２ステップ法で行なわれており、前者は測定試薬成分が全部一緒になった１試薬系であり、後者は測定試薬成分を２つに分けた２試薬系を使う。
【０００３】
従来、この方法に用いられる被酸化性発色試薬としては、主にフェノール又はその誘導体あるいはアニリン誘導体等の水素供与体である色原体と、その縮合対象物として、４−アミノアンチピリン等のカップラーとを組み合わせたものが用いられてきた。しかしながら、これらの被酸化性発色試薬は、生体試料中のビリルビンの影響を受け易いことも知られている（例えば、非特許文献１参照。）。
また、この生体試料中のビリルビンの影響を回避する方法としては、測定試薬中にフェロシアン化物を含有させる方法が一般的に使用されている（例えば、非特許文献２参照。）。
【０００４】
更に、これら従来の酵素的測定試薬を使用して生体試料中に含まれる特定成分の測定を行う場合、他の試薬中に含まれる金属イオンや、自動分析装置のステンレス合金に由来する金属イオンが測定試薬に混入することによって、被酸化性発色試薬である色原体及びカップラーの酸化縮合反応が促進され、非特異的発色が生じることにより、正確な測定が行えないということが知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特開昭５８−１４１７９７号公報
【非特許文献１】臨床化学  ８巻，１号，６３〜７２頁，１９８０年
【非特許文献２】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６巻，２号，２２７〜２３１頁，１９８０年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これら従来の酵素的測定試薬を使用して生体試料中に含まれる特定成分の測定を行う場合、約３％の出現頻度で、通常よりも高い測定値が得られる場合があった。
本発明者が、検討を行った結果、酵素的測定試薬中の被酸化性発色試薬が非特異的に発色することにより、測定値に正の誤差を生じさせてしまい、測定値が高くなる場合があることを見出した。また、この正の誤差には、酵素的測定試薬中のフェロシアン化物が関与していることが判明した。更に、非特異的な発色が起こる生体試料は、全て不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）が低値であることを本発明者が初めて見出した。
【０００６】
よって、本発明の課題は、１試薬系又は２試薬系の酵素的測定試薬であり、ビリルビンの影響回避のためにこの酵素的測定試薬中にフェロシアン化物を含有させた酵素的測定試薬において、ＵＩＢＣが低値の生体試料を測定した場合でも、非特異的な発色が起こるのを防ぎ、誤差のない正確な測定を行うことができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、上記の問題点の解決を目指して鋭意検討を行った結果、色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを用いる酵素的測定試薬であって、第１の金属イオン又はこれを含有する物質を含む前記酵素的測定試薬に、キレート剤を含有させることにより、前記被酸化性発色試薬が非特異的な発色を起こさず、試料に依存するこの非特異的発色を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の発明を提供する。
（１）色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを用い、更にカルシウムイオン及び／又はマグネシウムイオンを含む酵素的測定試薬であって、フェロシアン化物及びコレステロールエステラーゼを含む前記酵素的測定試薬に、鉄イオンには配位するが、カルシウムイオン及びマグネシウムイオンには配位しないキレート剤を含有させることを特徴とする、試料に依存する非特異的発色の抑制方法。
【０００９】
（２）前記の試料に依存する非特異的発色が、試料の鉄イオンとの結合能に依存する非特異的発色である、前記（１）記載の試料に依存する非特異的発色の抑制方法。
【００１０】
（３）前記の試料に依存する非特異的発色が試料の不飽和鉄結合能に依存する非特異的発色である、前記（１）記載の試料に依存する非特異的発色の抑制方法。
【００１３】
（４）前記キレート剤が、グルコン酸、酒石酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、又はサリチル酸よりなる群から選択される少なくとも一つの物質である、前記（１）〜（３）に記載の試料に依存する非特異的発色の抑制方法。
【発明の効果】
【００２１】
本発明の試料に依存する非特異的発色の抑制方法では、色原体及びカップラーからなる被酸化性発色試薬並びに酸化酵素及びペルオキシダーゼを用いる酵素的測定試薬であって、ビリルビンの影響回避のためにこの酵素的測定試薬にフェロシアン化物を含有させた酵素的測定試薬にキレート剤を含有させることにより、試料に依存する非特異的発色を防ぎ、誤差のない正確な測定を行うことができるようになった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
被酸化性発色試薬
本発明において用いられる被酸化性発色試薬とは、酸化酵素の作用により生成した過酸化水素を測定することにより特定成分を測定する場合に、ペルオキシダーゼの作用により過酸化水素と酸化縮合させ色素を生成させるための、色原体とカップラーの組み合わせからなる試薬のことをいう。
【００２３】
色原体とは、酸化縮合の反応時に水素を放出する水素供与体のことをいい、ペルオキシダーゼの作用により酸化され、後記の４−アミノアンチピリン等のカップラーとともに酸化縮合し色素を生成するものであれば特に限定されず、例えば、フェノール若しくはその誘導体、又はアニリン誘導体等を挙げることができる。
【００２４】
ここで、フェノールの誘導体としては、例えば、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、若しくは２，４，６−トリクロロフェノール、又はこれらの塩等を挙げることができる。
【００２５】
また、アニリン誘導体としては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＰＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン（ＣＥＭＢ）、若しくはＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メトキシアニリン（ＣＥＭＯ）、又はこれらの塩等を挙げることができる。
【００２６】
また、色原体の濃度は、特に限定されないが、試料と酵素的測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．０５〜２０ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．１〜５ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。
【００２７】
カップラーとは、ペルオキシダーゼの作用により酸化され、前記の色原体とともに酸化縮合し色素を生成するものであれば特に限定されず、例えば、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、フェニレンジアミン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等を挙げることができる。
なお、本発明においては、カップラーが４−アミノアンチピリンであることが好ましい。
また、カップラーの濃度は、特に限定されないが、試料と酵素的測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．０５〜１０ｍＭの範囲にあることが好ましく、０．１〜５ｍＭの範囲が特に好ましい。
【００２８】
酸化酵素
本発明において、酸化酵素とは、特定成分から直接又は間接的に、酸化性物質である過酸化水素を生成させる反応を触媒する物質をいう。
ここで、酸化酵素としては、例えば、コレステロールオキシダーゼ、ウリカーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、又はピルビン酸オキシダーゼ等を挙げることができる。
また、本発明において、酸化酵素の濃度は、特に限定されないが、試料と酵素的測定試薬を混合した後の測定反応液中において、７〜８００単位／Ｌの範囲にあることが好ましい。
【００２９】
ペルオキシダーゼ
本発明において、ペルオキシダーゼとしては、いずれの由来のものも使用でき、例えば、ヒト若しくはウシなどの動物由来のもの、西洋ワサビなどの植物由来のもの、細菌若しくはカビなどの微生物由来のもの等を挙げることができる。
なお、このペルオキシダーゼとしては、微生物等のペルオキシダーゼの遺伝子を大腸菌等の微生物等に組み込む遺伝子組み換え技術により調製したもの、又は遺伝子の改変等により性質を改良した微生物等から調製したペルオキシダーゼ等も含まれる。
また、ペルオキシダーゼの濃度は、特に限定されないが、試料と酵素的測定試薬を混合した後の測定反応液中において、２０単位／Ｌ以上であることが好ましい。
【００３０】
第１の金属イオン又はこれを含有する物質
本発明においては、酵素的測定試薬は、第１の金属イオン又はこれを含有する物質を含むものである。
そして、前記第１の金属イオン又はこれを含有する物質は、前記被酸化性発色試薬である色原体及びカップラーの酸化縮合反応を促進し、非特異的発色を生じさせるものである。
ここで、第１の金属イオンとしては、例えば、二価又は三価の鉄イオン等を挙げることができる。
また、第１の金属イオンとしての鉄イオンを含有する物質としては、例えば、フェロシアン化物等を挙げることができる。このフェロシアン化物としては、例えば、フェロシアン化カリウム、フェロシアン化ナトリウム等を挙げることができる。
【００３１】
キレート剤
本発明においては、酵素的測定試薬にキレート剤を含有させることを特徴とする。本発明においては、このキレート剤を酵素的測定試薬に含有させることにより、試料の第１の金属イオン又はこれを含有する物質との結合能に依存する非特異的発色を防ぎ、誤差のない正確な測定を行うことが可能となる。
【００３２】
すなわち、本発明者は、フェロシアン化物中の鉄イオンが、被酸化性発色試薬である色原体及びカップラーの酸化縮合反応を促進することにより、酵素的測定試薬中の被酸化性発色試薬が非特異的に発色し、測定値に正誤差を生じさせてしまうことを初めて見出した。
更に、この非特異的発色が、不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）が低値である生体試料で起こることも見出した。
【００３３】
すなわち、フェロシアン化物中の鉄イオンが酵素的測定試薬中又は測定反応液中に遊離した場合、通常のＵＩＢＣ値の試料では、試料中に含まれていたトランスフェリンが、この遊離した鉄イオンを捕獲するため、色原体及びカップラーの酸化縮合反応の促進は起こらない。これに対して、ＵＩＢＣが低値である試料では、試料中のトランスフェリンの鉄イオンに対する結合能が飽和状態であるため、この鉄イオンが試料由来のトランスフェリンに捕獲されず遊離のままとなり、色原体及びカップラーの酸化縮合反応を促進し、非特異的発色を生じさせてしまうことが推察される。
以上のことから、本発明においては、このフェロシアン化物中の鉄イオンに配位するキレート剤を酵素的測定試薬に含有させることにより鉄イオンを捕獲し、これにより、ＵＩＢＣが低値である試料においても、色原体及びカップラーの酸化縮合反応が起こらず、非特異的発色を抑制することが可能となった。
【００３４】
本発明において、キレート剤は、第１の金属イオン又はこれを含有する物質に配位することができる物質である。このようなキレート剤としては、例えば、有機化合物、無機化合物、蛋白質、ペプチド、又は薬剤等を挙げることができる。
ここで、有機化合物しては、例えば、グルコン酸、エチレンジアミン四酢酸〔ＥＤＴＡ〕、エチレンジアミン二プロピオン酸〔ＥＤＤＰ〕、ビス（アミノフェニル）エチレングリコール四酢酸〔ＢＡＰＴＡ〕、クエン酸、コハク酸、酒石酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン〔トリシン〕、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン〔ビシン〕、サリチル酸、Ｎ-（２-アセトアミド）イミノ二酢酸〔ＡＤＡ〕、シュウ酸、若しくはグリシルグリシン又はその塩等を挙げることができる。
また、無機化合物としては、例えば、チオ硫酸、若しくはチオシアン酸又はその塩等を挙げることができる。
更に、蛋白質としては、例えばトランスフェリン等を挙げることができる。
また、ペプチドとしては、例えば、メタロチオネイン等を挙げることができる。
薬剤としては、例えば、デフェロキサミン等を挙げることができる。
【００３５】
また、キレート剤の濃度は、酵素的測定試薬中に含まれる第１の金属イオンの全てと配位できる濃度であれば特に限定されないが、試料と酵素的測定試薬を混合した後の測定反応液中において、０．１μＭ〜２００ｍＭが好ましく、０．０７５〜５０ｍＭの範囲にあることが特に好ましい。
【００３６】
また、本発明の試料に依存する非特異的発色の抑制方法は、酸化酵素を用いる従来より公知の１試薬系又は２試薬系の酵素的測定試薬、例えば、特定成分に酸化酵素を作用させて直接又は間接的に過酸化水素を生成させ、得られた過酸化水素を、ペルオキシダーゼ及び被酸化性発色試薬と混合し、生成した色素を測定する従来公知の酵素的測定試薬に、前記したキレート剤の少なくとも１種類を含有させることによって実施することができる。
更に、本発明は、被酸化性発色試薬と第１の金属イオン又はこれを含有する物質とを含む酵素的測定試薬であれば、いずれのものにおいても実施することができる。
なお、このキレート剤は１種類だけを用いてもよいし、又は複数種類のものを同時に用いてもよい。
【００３７】
第２の金属イオン又はこれを含有する物質
本発明における酵素的測定試薬においては、前記の第１の金属イオン又はこれを含有する物質とは異なる、第２の金属イオン又はこれを含有する物質が含まれていてもよい。
この第２の金属イオン又はこれを含有する物質としては、例えば、酵素的測定試薬に含まれる試薬成分を安定化及び／又は活性化させるもの等を挙げることができる。
より具体的には、これらの第２の金属イオンとして、例えば、カルシウムイオン又はマグネシウムイオン等を挙げることができる。
なお、本発明は、前記した試薬成分に加えて、第２の金属イオン又はこれを含有する物質を含む酵素的測定試薬において好適である。
【００３８】
すなわち、本発明者は、フェロシアン化物中の鉄イオンが、被酸化性発色試薬である色原体及びカップラーの酸化縮合反応を促進することにより、酵素的測定試薬中の被酸化性発色試薬が非特異的に発色し、測定値に正誤差を生じさせてしまうことを見出し、フェロシアン化物中の鉄イオンにキレート剤を配位させることにより、非特異的発色が抑制できることを見出した。
【００３９】
しかしながら、例えば、微生物由来のコレステロールエステラーゼのように、カルシウムイオン（第２の金属イオン）によって安定化及び／又は活性化される酵素等を使用する酵素的測定試薬の場合、酵素的測定試薬中にカルシウムイオン（第２の金属イオン）を含有させることが必要となる。この場合、フェロシアン化物中の鉄イオンを配位する目的で添加したキレート剤がカルシウムイオンをも配位してしまい、コレステロールエステラーゼが不安定化されてしまう。
【００４０】
このような場合には、フェロシアン化物中の鉄イオン（第１の金属イオン）には配位するが、カルシウムイオン（第２の金属イオン）には配位しない（又は配位しにくい）キレート剤を選択することで、フェロシアン化物（第１の金属イオン又はこれを含有する物質）と被酸化性発色試薬による非特異的発色を抑制するということと、酵素等の試薬成分の安定化には悪影響を及ぼさないということを両立させることが可能となる。
【００４１】
すなわち、第１の金属イオン又はこれを含有する物質には配位するが、第２の金属イオン又はこれを含有する物質には配位しないキレート剤を選択することにより、第１の金属イオンと被酸化性発色試薬による非特異的発色を抑制し、かつ第２の金属イオンによる酵素的測定試薬に含まれる試薬成分の安定化及び／又は活性化作用等は妨げないことができる。
【００４２】
ここで、第１の金属イオン又はこれを含有する物質には配位するが、第２の金属イオン又はこれを含有する物質には配位しないキレート剤としては、例えば、グルコン酸、酒石酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン〔トリシン〕、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン〔ビシン〕、又はサリチル酸等を挙げることができる。
【００４３】
（７）  第２の金属イオン又はこれを含有する物質により安定化及び／又は活性化される試薬成分
本発明における、第２の金属イオン又はこれを含有する物質により安定化及び／又は活性化される試薬成分であるが、例えば、カルシウムイオン又はこれを含有する物質により安定化及び／又は活性化される試薬成分としては、コレステロールエステラーゼ又はホスホリパーゼ等を挙げることができる。
また、例えば、マグネシウムイオン又はこれを含有する物質により安定化及び／又は活性化される試薬成分としては、例えば、リポプロテインリパーゼ等を挙げることができる。
なお、本発明においては、第２の金属イオン又はこれを含有する物質により安定化及び／又は活性化される試薬成分が、コレステロールエステラーゼであることが好ましい。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこの実施例により限定されるものではない。
【００４５】
〔実施例１〕
（本発明による非特異的発色の抑制効果の確認−１）
試料の不飽和鉄結合能に依存して非特異的発色が生じること、及びキレート剤であるグルコン酸ナトリウムを酵素的測定試薬に含有させることによりこの非特異的発色が抑制できることを確かめた。
【００４６】
１．  酵素的測定試薬の調製
（１）  本発明・第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．９（２０℃）に調整して、キレート剤であるグルコン酸ナトリウムを含有する総コレステロール測定用酵素的測定試薬の第１試薬（本発明・第１試薬）を調製した。
グッド緩衝剤（埼京化成）    １００ｍＭ
４−アミノアンチピリン（第一化学）    ０．１１ｇ／Ｌ
フェロシアン化カリウム（国産化学）    ３１μＭ
塩化カルシウム（国産化学）            ２ｍＭ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡績）５００単位／Ｌ
グルコン酸ナトリウム（東京化成）      ２３ｍＭ
【００４７】
（２）  従来・第１試薬の調製
グルコン酸ナトリウムを含有しないこと以外は組成が上記（１）の本発明・第１試薬と同じである、キレート剤を含有しない総コレステロール測定用酵素的測定試薬の第１試薬（従来・第１試薬）を調製した。
【００４８】
（３）  第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを８．５（２０℃）に調整し、総コレステロール測定用酵素的測定試薬の第２試薬を調製した。
グッド緩衝剤（埼京化成）  ２０ｍＭ
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−３，５−ジメトキシアニリン［ＨＤＡＯＳ］（埼京化成）  ２ｍＭ
ペルオキシダーゼ（東洋紡績）  ８０００単位／Ｌ
コレステロールオキシダーゼ（天野製薬）  １３２０単位／Ｌ
【００４９】
２．  試料
４３種類のヒト血清試料（試料番号：１〜４３）を用意した。
【００５０】
３．  試料中の総コレステロール濃度の測定
（１）  前記の各ヒト血清試料中の総コレステロール濃度の測定は、日立製作所社製７１７０Ｓ形自動分析装置にて行い、前記２のヒト血清試料の２μＬに前記１の（１）で調製した本発明・第１試薬１５０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた後、前記１の（３）で調製した第２試薬５０μＬを添加し、３７℃で５分間反応させた。
第１試薬添加後４分３０秒目（１６ポイント目）と第２試薬添加後５分１７秒目（３４ポイント目）の主波長６００ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける吸光度を測定し、その差を求めた。
そして、総コレステロール濃度が既知（２００ｍｇ／ｄＬ）の試料〔標準液〕について、前記の通り測定を行い、この標準液の測定値（吸光度差）と前記のヒト血清試料の測定値（吸光度差）を比較することにより、前記のヒト血清試料中の総コレステロール濃度を求めた。
これを４３種類のヒト血清試料全てについて行った。
（２）  前記１の（１）で調製した本発明・第１試薬に代えて前記１の（２）で調製した従来・第１試薬を用いること以外は、上記（１）の記載の通りに操作を行い、４３種類のヒト血清試料についてそれぞれ総コレステロール濃度を求めた。
（３）  前記２の４３種類のヒト血清試料のそれぞれについて、不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）の値を求めた。
前記試料の不飽和鉄結合能の測定は、市販の不飽和鉄結合能測定試薬「クイックオートネオ  ＵＩＢＣ」（シノテスト社）を用いて、日立製作所社製７１７０Ｓ形自動分析装置により行った。
なお、この７１７０Ｓ形自動分析装置における測定は、前記試薬の製造元であるシノテスト社が顧客及び販売店に案内、公表している所定の方法（パラメータ）に従い行った。
【００５１】
４．  測定結果
（１）  ４３種類のヒト血清試料の測定結果である、「従来・第１試薬を用いた場合の総コレステロール濃度」、「本発明・第１試薬を用いた場合の総コレステロール濃度」、「従来・第１試薬を用いた場合の総コレステロール濃度から本発明・第１試薬を用いた場合の総コレステロール濃度を差し引いた値」、及び「不飽和鉄結合能値」を表１に示した。
【００５２】
【表１】
0004691627.tif 000002
【００５３】
この表より、以下のことが分かる。
不飽和鉄結合能が低くない試料（試料番号：１〜２０）においては、「従来・第１試薬を用いた場合の総コレステロール濃度から本発明・第１試薬を用いた場合の総コレステロール濃度を差し引いた値」は、ほとんどゼロである。
【００５４】
しかしながら、不飽和鉄結合能が低い試料（試料番号：２１〜４３）においては、「従来・第１試薬を用いた場合の総コレステロール濃度から本発明・第１試薬を用いた場合の総コレステロール濃度を差し引いた値」は２．５ｍｇ／ｄＬ〜８．４ｍｇ／ｄＬの数値となり、「従来・第１試薬を用いた場合の総コレステロール濃度」（測定値）に正の誤差が生じていることが分かる。
【００５５】
つまり、不飽和鉄結合能が低くない試料では正の誤差が生じておらず、すなわち非特異的発色が生じておらず、これに対して、不飽和鉄結合能が低い試料では正の誤差が生じており、すなわち非特異的発色が生じていることが分かる。
【００５６】
そして、キレート剤であるグルコン酸ナトリウムを含有する酵素的測定試薬を用いた場合には、この試料の不飽和鉄結合能に依存する非特異的発色を抑制できることが分かる。
すなわち、酵素的測定試薬にキレート剤を含有させることにより、このキレート剤が非特異的発色の元であるフェロシアン化カリウムの鉄イオン（第１の金属イオン）に配位して、これにより鉄イオンが色原体とカップラーの酸化縮合反応を促進することを妨げ、その結果、非特異的な発色が生じるのを抑制できることが確かめられた。
【００５７】
（２）  不飽和鉄結合能が低くない試料（試料番号：１〜２０）において、「本発明・第１試薬を用いた場合の総コレステロール濃度」をｘに、「従来・第１試薬を用いた場合の総コレステロール濃度」をｙに取ったときの回帰式は、ｙ＝０．９９７ｘ＋０．６５７（相関係数：１．０００）となり、従来・第１試薬を用いた場合と本発明・第１試薬を用いた場合とで、試料の総コレステロール濃度測定値に差はなく、非特異的な発色が生じていないことがこれからも分かる。
【００５８】
（３）  不飽和鉄結合能が低い試料（試料番号：２１〜４３）において、「本発明・第１試薬を用いた場合の総コレステロール濃度」をｘに、「従来・第１試薬を用いた場合の総コレステロール濃度」をｙに取ったときの回帰式は、ｙ＝１．００９ｘ＋３．８７９（相関係数：０．９９９）となり、従来・第１試薬を用いた場合の試料の総コレステロール濃度測定値は、本発明・第１試薬を用いた場合よりも、約３．９ｍｇ／ｄＬ高値となっており、非特異的な発色が生じていることがこれからも分かる。
【００５９】
〔参考例〕
（試料の不飽和鉄結合能に依存する非特異的発色の出現頻度の確認）
３，１１９種類のヒト血清試料を測定して、試料の不飽和鉄結合能に依存する非特異的発色の出現頻度を確かめた。
【００６０】
１．  酵素的測定試薬
（１）  本発明・第１試薬
前記実施例１の１の（１）の本発明・第１試薬を、本参考例の本発明・第１試薬として用いた。
【００６１】
（２）  従来・第１試薬
前記実施例１の１の（２）の従来・第１試薬を、本参考例の従来・第１試薬として用いた。
【００６２】
（３）  第２試薬
前記実施例１の１の（３）の第２試薬を、本参考例の第２試薬として用いた。
【００６３】
２．  試料
３，１１９種類のヒト血清試料を用意した。
【００６４】
３．  試料中の総コレステロール濃度の測定
前記２の３，１１９種類のヒト血清試料について、前記実施例１の３の（１）、（２）及び（３）の記載の通りに測定を行い、「従来・第１試薬を用いた場合の総コレステロール濃度」、「本発明・第１試薬を用いた場合の総コレステロール濃度」、及び「不飽和鉄結合能値」を求めた。
【００６５】
４．  測定結果
３，１１９種類のヒト血清試料の測定結果を図１に示した。
なお、この図において、横軸は「不飽和鉄結合能値」（μｇ／ｄＬ）を表し、縦軸は「従来・第１試薬を用いた場合の総コレステロール濃度から本発明・第１試薬を用いた場合の総コレステロール濃度を差し引いた値」（ｍｇ／ｄＬ）を表す。
【００６６】
この図からも、不飽和鉄結合能が低い試料においては、総コレステロール濃度測定値に正の誤差が生じており、非特異的な発色が生じていることが分かる。
なお、この３，１１９種類のヒト血清試料のうち、非特異的発色が生じていると判断できたものは計１０９試料あり、その出現頻度は約３．５％であった。
【００６７】
〔実施例２〕
（本発明による非特異的発色の抑制効果の確認−２）
本発明において、各種のキレート剤を酵素的測定試薬に含有させた場合の非特異的発色の抑制効果を確かめた。
【００６８】
１．  酵素的測定試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように、更に表２に記載した９種類のキレート剤をそれぞれ表２に記載した濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを６．９又は６．５（２０℃）に調整し、表２に記載したキレート剤をそれぞれ含有する（又は含有しない）２９種類の総コレステロール測定用酵素的測定試薬の第１試薬を調製した。
グッド緩衝剤（埼京化成）    １００ｍＭ
４−アミノアンチピリン（第一化学）    ０．１１ｇ／Ｌ
フェロシアン化カリウム（国産化学）    ３１μＭ
塩化カルシウム（国産化学）            ２ｍＭ
コレステロールエステラーゼ（東洋紡績）５００単位／Ｌ
【００６９】
（２）  第２試薬の調製
下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨを８．５（２０℃）に調整し、総コレステロール測定用酵素的測定試薬の第２試薬を調製した。（なお、非特異的な発色のみを測定するため、通常含有させるコレステロールオキシダーゼは含有させなかった。）
グッド緩衝剤（埼京化成）  ２０ｍＭ
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−３，５−ジメトキシアニリン［ＨＤＡＯＳ］（埼京化成）  ２ｍＭ
ペルオキシダーゼ（東洋紡績）  ８０００単位／Ｌ
【００７０】
２．  試料
（１）精製水試料
精製水を試料として用意した。
（２）ヒト血清試料
多人数の健常者の血清を混合したものを試料として用意した。
（３）低ＵＩＢＣ試料
上記（２）のヒト血清試料に鉄イオンを添加し、このヒト血清試料中のトランスフェリンに鉄イオンを結合させ、不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）が低いヒト血清試料を実験的に調製した。
【００７１】
３．  非特異的発色の測定
前記の各酵素的測定試薬における非特異的な発色の測定は、日立製作所社製７１７０Ｓ形自動分析装置にて行い、前記２の各試料の２μＬに各々前記１の（１）で調製した第１試薬１５０μＬを添加して、混和後３７℃で５分間反応させた後、前記１の（２）で調製した第２試薬５０μＬを添加し、３７℃で５分間反応させた。
第１試薬添加後４分３０秒目（１６ポイント目）と第２試薬添加後５分１７秒目（３４ポイント目）の主波長６００ｎｍ及び副波長７００ｎｍにおける吸光度を測定し、その差を求めた。
そして、総コレステロール濃度が既知（２００ｍｇ／ｄＬ）の試料〔標準液〕について、前記の通り測定を行い、この標準液の測定値（吸光度差）と前記のヒト血清試料及び低ＵＩＢＣ試料の測定値（吸光度差）をそれぞれ比較することにより、前記のヒト血清試料及び低ＵＩＢＣ試料の測定値（吸光度差）について総コレステロール濃度に換算した値を各々求めた。
【００７２】
４．  測定結果
以上の測定結果を表２に示した。
なお、この表において、精製水試料における値は得られた吸光度差であり、ヒト血清試料及び低ＵＩＢＣ試料における値は前記の通り測定値（吸光度差）を総コレステロール濃度に換算した値である。
【００７３】
【表２】
0004691627.tif 000003
【００７４】
この表２から次のことが分かる。
キレート剤を含有していない第１試薬（ｐＨ６．９）でのヒト血清試料における総コレステロール濃度換算値は０．３ｍｇ／ｄＬであるが、このヒト血清試料に鉄イオンを添加した低ＵＩＢＣ試料における総コレステロール濃度換算値は７．１ｍｇ／ｄＬであり、このヒト血清試料の不飽和鉄結合能の低下により、このキレート剤を含有していない第１試薬を用いた測定では非特異的な発色が生じていることが分かる。
【００７５】
これに対して、キレート剤であるグルコン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ二ナトリウム、クエン酸、トリシン、ビシン、ＥＤＤＰ、酒石酸、サリチル酸、又はＡＤＡをそれぞれ含有する第１試薬（ｐＨ６．９）を用いた測定では、低ＵＩＢＣ試料においても非特異的な発色が抑制できていることが分かる。
【００７６】
以上のことより、本発明のキレート剤を含有させた酵素的測定試薬においては、このキレート剤がフェロシアン化カリウムの鉄イオン（第１の金属イオン）に配位することにより、この鉄イオンが色原体とカプラーの酸化縮合反応を促進することを妨げることができ、その結果、試料の不飽和鉄結合能に依存する非特異的な発色を抑制することが可能となり、正確な測定値を得ることができることが確かめられた。
【００７７】
〔実施例３〕
（キレート剤のコレステロールエステラーゼ活性に対する影響の確認−１）
本発明において、酵素的測定試薬に含有させたキレート剤のコレステロールエステラーゼに対する影響を確かめた。
【００７８】
１．  酵素的測定試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
２３ｍＭのグルコン酸ナトリウムに代えて、表３に記載の９種類のキレート剤それぞれを表に記載した濃度で含有すること（又は含有しないこと）以外は、実施例１の１の（１）の本発明・第１試薬と同様にして、２８種類の第１試薬をそれぞれ調製した。
【００７９】
（２）  第２試薬の調製
前記実施例１の１の（３）で調製した第２試薬をそのまま使用した。
【００８０】
２．  第１試薬及び第２試薬の保存
上記１の（１）で調製した２８種類の第１試薬及び上記１の（２）で調製した第２試薬を１０℃で３６日間保存した。
【００８１】
３．  コレステロールエステラーゼ活性値の測定
保存開始時及び保存７日後、並びに３６日後に、２８種類の第１試薬の各々のコレステロールエステラーゼの活性値（吸光度）を測定した。
なお、コレステロールエステラーゼ活性値（吸光度）の測定は、東洋紡績社酵素製品カタログ「ＴＯＹＯＢＯ  ＥＮＺＹＭＥＳ」（２００２年７月１日発行）の第５４頁に記載されたコレステロールエステラーゼの活性測定方法に従って行った。
そして、保存７日後及び３６日後の吸光度（コレステロールエステラーゼ活性値）をそれぞれ、キレート剤無添加第１試薬の保存開始時の吸光度（コレステロールエステラーゼ活性値）で除して１００を乗ずることにより、保存７日後及び３６日後のコレステロールエステラーゼ活性の残存率（％）をそれぞれ算出した。
【００８２】
４．  測定結果
コレステロールエステラーゼ活性値の測定結果を表３に示した。
なお、この表で、カッコ内の数値は、前記の通りに算出した保存後のコレステロールエステラーゼ活性の残存率（％）を示す。
【００８３】
【表３】
0004691627.tif 000004
【００８４】
表３から明らかなように、第１試薬にＥＤＴＡ二ナトリウムを含有させた場合には、試薬の保存開始時（０日）から、コレステロールエステラーゼの活性値（吸光度）が低下していることが分かる。
【００８５】
すなわち、ＥＤＴＡ二ナトリウム濃度が３ｍＭ、１５ｍＭ、３０ｍＭの場合のコレステロールエステラーゼ活性の残存率は、保存開始時のコレステロールエステラーゼの活性値（吸光度）を１００％とした場合に、保存開始時で各々６７．５％、３１．６％、２７．０％となっており、７日後では各々４５．１％、１８．８％、１５．５％であり、３６日後では各々２６．１％、９．５％、７．９％に低下していることが分かる。
また、第１試薬にクエン酸又はＡＤＡを含有させた場合も、濃度や保存日数による差はあるものの保存開始時のコレステロールエステラーゼの活性値（吸光度）を１００％とした場合に、最低７０％台まで低下していることが分かる。
【００８６】
これに対して、グルコン酸ナトリウム、トリシン、ビシン、コハク酸、酒石酸、又はサリチル酸を第１試薬に含有させた場合には、コレステロールエステラーゼ活性の残存率は、濃度や保存日数による差はあるものの、ほとんど低下していない。
【００８７】
これらの結果から、ＥＤＴＡ二ナトリウム、クエン酸、又はＡＤＡはコレステロールエステラーゼの活性を低下させてしまうが、グルコン酸ナトリウム、トリシン、ビシン、コハク酸、酒石酸、又はサリチル酸はコレステロールエステラーゼの活性に悪影響を及ぼしていないことが分かる。
【００８８】
以上の結果、並びに実施例１及び実施例２の結果より、フェロシアン化物中の鉄イオン（第１の金属イオン）には配位するが、カルシウムイオン（第２の金属イオン）には配位しない（又は配位しにくい）キレート剤を選択することにより、フェロシアン化物中の鉄イオン（第１の金属イオン）が色原体とカプラーの酸化縮合反応を促進することを防いで非特異的な発色が生じるのを抑制し、かつカルシウムイオン（第２の金属イオン）によるコレステロールエステラーゼ（酵素的測定試薬に含まれる試薬成分）の安定化には悪影響を及ぼさないことが確かめられた。
【００８９】
〔実施例４〕
（キレート剤のコレステロールエステラーゼ活性に対する影響の確認−２）
本発明において、酵素的測定試薬に含有させたキレート剤のコレステロールエステラーゼに対する影響を確かめた。
【００９０】
１．  酵素的測定試薬の調製
（１）  第１試薬の調製
２３ｍＭのグルコン酸ナトリウムに代えて、表４に記載の１１種類のキレート剤それぞれを表に記載した濃度で含有すること（又は含有しないこと）こと以外は、実施例１の１の（１）の本発明・第１試薬と同様にして、３３種類の第１試薬をそれぞれ調製した。
【００９１】
（２）  第２試薬の調製
前記実施例１の１の（３）で調製した第２試薬をそのまま使用した。
【００９２】
２．  第１試薬及び第２試薬の保存
上記１の（１）で調製した３３種類の第１試薬及び上記１の（２）で調製した第２試薬を１０℃で３６日間保存した。
【００９３】
３．  コレステロールエステラーゼ活性値の測定
保存開始時及び保存７日後、並びに３６日後に、３３種類の第１試薬の各々のコレステロールエステラーゼ活性値（吸光度）を実施例３と同様の方法で測定した。
【００９４】
４．  測定結果
コレステロールエステラーゼ活性値の測定結果を表４に示した。
なお、この表で、カッコ内の数値は、実施例３の３の記載と同様にして算出した保存後のコレステロールエステラーゼ活性の残存率（％）を示す。
【００９５】
【表４】
0004691627.tif 000005
【００９６】
表４から明らかなように、第１試薬にＥＤＴＡ二ナトリウム、クエン酸、ＡＤＡ、ＥＤＤＰ、又はＢＡＰＴＡを含有させた場合には、試薬の保存開始時（０日）から、コレステロールエステラーゼの活性値（吸光度）が低下していることが分かる。
【００９７】
すなわち、第１試薬にＥＤＴＡ二ナトリウム、クエン酸、ＡＤＡ、ＥＤＤＰ、又はＢＡＰＴＡを含有させた場合には、コレステロールエステラーゼ活性の残存率は、キレート剤の濃度が高い場合には大きく低下していることが分かる。
【００９８】
これに対して、グルコン酸ナトリウム、トリシン、ビシン、コハク酸、酒石酸、又はサリチル酸を第１試薬に含有させた場合には、コレステロールエステラーゼ活性の残存率は、濃度や保存日数による差はあるものの、ほとんど低下していない。
【００９９】
これらの結果から、ＥＤＴＡ二ナトリウム、クエン酸、ＡＤＡ、ＥＤＤＰ、又はＢＡＰＴＡはコレステロールエステラーゼの活性を低下させてしまうが、グルコン酸ナトリウム、トリシン、ビシン、コハク酸、酒石酸、又はサリチル酸はコレステロールエステラーゼの活性に悪影響を及ぼしていないことが分かる。
【０１００】
以上の結果、及び実施例１〜実施例３の結果より、フェロシアン化物中の鉄イオン（第１の金属イオン）には配位するが、カルシウムイオン（第２の金属イオン）には配位しない（又は配位しにくい）キレート剤を選択することにより、フェロシアン化物中の鉄イオン（第１の金属イオン）が色原体とカプラーの酸化縮合反応を促進することを防いで非特異的な発色が生じるのを抑制し、かつカルシウムイオン（第２の金属イオン）によるコレステロールエステラーゼ（酵素的測定試薬に含まれる試薬成分）の安定化には悪影響を及ぼさないことが確かめられた。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】試料の不飽和鉄結合能に依存する非特異的発色の出現頻度を確認した図である。
【図１】
0004691627.tif 000006