(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨または軟骨細胞及び組織の成長及び鉱物化を促進する薬剤の調製用の、クレアチン、クレアチン一水和物、クレアチンピルビン酸塩、シクロクレアチン、ホモクレアチンもしくはホモシクロクレアチンならびにその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項２】
前記薬剤を骨または軟骨の病気の治療処置用に用いられ、若しくは前記骨または軟骨の病気の予防処置用に用いることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記薬剤を骨または軟骨細胞及び組織の成長及び鉱物化の促進用に用いることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記薬剤を骨の折片または骨の欠陥の保存的または手術的治療用に用いることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記薬剤を前記骨折片または骨欠陥に適用される骨または軟骨移植の中に混合することを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記薬剤を前記骨または軟骨の欠陥の組織工学用にデザインされた骨芽細胞、軟骨細胞または間葉の幹細胞の三次元構造中に混合することを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項７】
健康な個人または特殊な患者から得られた骨または軟骨形成細胞を前記薬剤の存在下に培養して、同じ特殊な患者の骨または軟骨の欠陥を有する特定の部位に対して連続工程で移すことができる三次元細胞集合体を形成することを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項８】
前記薬剤を骨移植物の受容及び骨の集積を改善するために用いることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記骨移植物がエンドプロテーゼであることを特徴とする請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記骨または軟骨細胞及び組織の成長及び鉱物化を促進する薬剤の調製用の、クレアチン、クレアチン一水和物、クレアチンピルビン酸塩、シクロクレアチン、ホモクレアチンもしくはホモシクロクレアチンならびにその薬学的に許容される塩のうち、クレアチン、クレアチンピルビン酸塩、シクロクレアチン、ホモクレアチンまたはホモシクロクレアチンからなるグループから選ばれることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１１】
請求項１〜１０の一つに記載の使用であって、前記薬剤はホルモンとの組み合わせで投与され、該ホルモンは下記の群から選ばれることを特徴とする：
ａ）甲状腺ホルモン、
ｂ）インシュリン、
ｃ）性ステロイド（エストロゲン、アンドロゲン、テストステロン）、
ｄ）プロスタグランジン、
ｅ）グルココルチコイド。
【請求項１２】
請求項１１に記載の使用であって、前記薬剤は、副甲状腺ホルモンの間欠的投与との組み合わせで投与されることを特徴とする。
【請求項１３】
請求項１〜１２の一つに記載の使用であって、前記薬剤はビタミンとの組み合わせで投与され、該ビタミンは下記の群から選ばれることを特徴とする：
ａ）１，２５（ＯＨ）２ビタミンＤ３、及びビタミンＤの同族体又は代謝産物、
ｂ）ビタミンＣ／アスコルビン酸塩。
【請求項１４】
請求項１〜１３の一つに記載の使用であって、前記薬剤は成長因子との組み合わせで投与され、該成長因子は下記の群から選ばれることを特徴とする：
ａ）インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、
ｂ）形質転換成長因子ｂ系統群（ＴＧＦ−ｂ）、
ｃ）骨形態発生蛋白質（ＢＭＰ）、
ｄ）塩基性の線繊芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、
ｅ）血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、
ｆ）表皮成長因子（ＥＧＦ）。
【請求項１５】
請求項１〜１４の一つに記載の使用であって、前記薬剤はサイトカインとの組み合わせで投与され、該サイトカインは下記の群から選ばれることを特徴とする：
ａ）インターロイキン（ＩＬ）、
ｂ）インターフェロン、
ｃ）白血病性貧血抑制因子（ＬＩＦ）。
【請求項１６】
請求項１〜１５の一つに記載の使用であって、前記薬剤はマトリックス蛋白質との組み合わせで投与され、該蛋白質は下記の群から選ばれることを特徴とする：
Ａ）コラーゲン、
Ｂ）ヒアルロナン。
【請求項１７】
請求項１〜１６の一つに記載の使用であって、前記薬剤は血清蛋白質との組み合わせで投与され、該血清蛋白質は下記の群から選ばれることを特徴とする：
ａ）アルブミン
ｂ）アルファ−２ＨＳ糖蛋白質。
【請求項１８】
請求項１〜１７の一つに記載の使用であって、前記薬剤は酵素との組み合わせで投与され、該酵素は下記の群から選ばれることを特徴とする：
ａ）金属結合蛋白分解酵素、
ｂ）コラゲナーゼ、
ｃ）ゼラチナーゼ、
ｄ）ストロメリシン、
ｅ）プラスミノーゲン活性化物質、
ｆ）システイン蛋白質分解酵素、
ｇ）アスパラギン酸蛋白質分解酵素。
【請求項１９】
請求項１〜１８の一つに記載の使用であって、前記薬剤はカルシウム塩、骨食（ｂｏｎｅ  ｍｅａｌ）又はハイドロキシアパタイトとの組み合わせで投与されることを特徴とする。
【請求項２０】
請求項１〜１９の一つに記載の使用であって、前記薬剤はフッ化物塩との組み合わせで投与されることを特徴とする。
【請求項２１】
請求項１〜２０の一つに記載の使用であって、前記薬剤はペプチドとの組み合わせで投与され、該ペプチドは下記の群から選ばれることを特徴とする：
ａ）アミリン、
ｂ）バソアクティブ剤、
ｃ）神経ペプチド。
【請求項２２】
請求項１〜２１の一つに記載の使用であって、前記薬剤は抗酸化剤との組み合わせで投与され、該抗酸化剤は下記の群から選ばれることを特徴とする：
ａ）システイン、
ｂ）Ｎ−アセチル−システイン、
ｃ）グルタチオン、
ｄ）ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ又はＥ。
【請求項２３】
請求項１〜２２の一つに記載の使用であって、前記薬剤は下記の群から選ばれる物質との組み合わせで投与されることを特徴とする：
ａ）トランスフェリン、
ｂ）セレン、
ｃ）ホウ素、
ｄ）シリコン、
ｅ）酸化窒素。
【請求項２４】
前記骨細胞が、骨芽細胞、骨膜細胞、間質の骨髄細胞、筋肉組織の付随体細胞及び間葉の幹細胞からなるグループから選ばれることを特徴とする請求項１から２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
前記軟骨細胞が、軟骨芽細胞、軟骨吸収細胞及び間葉の幹細胞からなるグループから選ばれることを特徴とする請求項１から２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
前記骨または軟骨細胞を単層、微小質量培養としてまたは三次元の生物分解性の骨格において培養することを特徴とする請求項６から２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
前記三次元細胞集合体が接種されたスポンジ、泡または膜の構造を有することを特徴とする請求項７又は１０から２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
培養媒体中での前記クレアチン化合物の濃度が１０から２０ミリモルの範囲であることを特徴とする請求項７又は１０から２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
前記培養媒体が０．１％から５．０％の胎児の子牛の血清を含有することを特徴とする請求項７又は１０から２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
前記培養媒体が１０から２５０マイクログラムのアスコルビン酸または薬学的に許容されるアスコルビン酸塩の等価な量を含有することを特徴とする請求項７又は１０から２９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３１】
前記細胞培養が２，０００から１００，０００細胞で開始されることを特徴とする請求項７又は１０から３０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３２】
請求項１〜３１の一つに記載の使用であって、前記薬剤は実質的にジヒドロトリアジンを含まないことを特徴とする。
【請求項３３】
請求項１〜３２の一つに記載の使用であって、前記薬剤は実質的にジシアノジアミドを含まないことを特徴とする。
【請求項３４】
請求項１〜３３の一つに記載の使用であって、前記薬剤はクレアチンの天然分解生成物としてのクレアチニンを実質的に含まないことを特徴とする。
【請求項３５】
請求項１〜６又は９〜３４の一つに記載の使用であって、前記薬剤を人間の患者に対して一日当り１．４〜２８５ｍｇ投与することを特徴とする。
【請求項３６】
前記薬剤が軟骨の退行性の病気の治療用に用いられることを特徴とする請求項１から３５のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、請求項１の前程項部に一致したクレアチン化合物の使用、請求項４０の前程項部に一致した骨または軟骨組織に欠陥を有する動物または人間の治癒を加速する方法、請求項４１の予備特徴付け部に一致した骨または軟骨組織の欠陥治療に有用な組成物および請求項４３の予備特徴付け部に一致したクレアチンキナーゼの使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
クレアチン化合物は、前記骨または軟骨欠陥の組織工学の為に設計された骨芽細胞、軟骨細胞または間葉の茎細胞の三次元構造物へ組み入れることができる。  更にクレアチン化合物は、骨インプラントの受け入れの改良と骨の統合に用いることができる。
【０００３】
クレアチンは人間の体で自然に生ずる化合物であり、哺乳類の脳と他の刺激に敏感な組織、例えば骨格の筋肉、心臓と網膜に見出される。これのホスホリル化した形状、クレアチンリン酸塩もまた同じ器官に見出され、クレアチンを基質として用いたクレアチンキナーゼ反応の生成物である。クレアチンとクレアチンリン酸塩は比較的容易に合成でき、哺乳類に毒性がないと信じられている。
【０００４】
神経系の病気治療用のクレアチンとその類似物は、既にＷＯ−Ａ−９６／１４０６３  AVICENA GROUP INC.に記載されており（米国優先権出願連続番号０８／３３６，３８８）、この開示をここで本特許出願に加える。
【０００５】
しかしながら、どこにも骨と軟骨の細胞または組織の治療の為に、クレアチンまたはクレアチン化合物の使用することは、健康なおよび病気の骨と軟骨の治療に関して、明確に開示または主張されてない。
【０００６】
請求項に述べた本発明は、治療薬としてのクレアチンキナーゼおよびクレアチン化合物（これはクレアチンキナーゼ／リン酸クレアチン系の構造的なまたは機能的な成分の一つ以上を調整する）の新しい用途を提供する。より具体的に、本発明は以下の方法を提供する。
ａ）骨または軟骨の病気の治療
（例えば骨粗鬆症、骨の関節炎または歯周炎）；
ｂ）骨または軟骨の細胞と組織の成長または鉱物化の促進；
ｃ）骨折または骨欠陥の保存的または手術的治療；
ｄ）骨若しくは軟骨の骨折または欠陥への骨または軟骨植皮片の適用；
ｅ）クレアチンの存在での骨または軟骨形成細胞（健康な個体または特定の
患者から得た）の体外培養による組織工学、これにより三次元細胞集合を
形成し、この集合は、次の段階で同一の特定患者の骨または軟骨の欠陥を
有する特定の位置へ移植できる；
ｆ）クレアチンキナーゼを出し過ぎる前記細胞をつくり、従ってクレアチンと
共に、ｅ項で概要を述べたように患者へ再移植するための前記細胞と組織
の生理学的機能を改良し、刺激しおよび安定化するための、クレアチン
キナーゼのＤＮＡコード化を用いたトランスフェクションによる骨と軟骨
の細胞の代謝工学。
【０００７】
クレアチンの全てのこれらの応用において、クレアチン（Ｃｒ）の重要な機能はエネルギー源および細胞エネルギー代謝の調節器、並びに代謝応力に対して細胞保護剤として働くこれ自身の能力である。さらにくわえて、クレアチンは驚いたことに細胞の死またはアポプトシスの初期段階へ保護効果を及ぼす事を示した。これらの効果は全てクレアチンキナーゼにより仲介される。
【０００８】
骨と軟骨細胞へのクレアチン化合物の驚くべき効果は、骨折並びに人工インプラントの受け入れおよび結合を含む、外傷または手術により引き起こされる骨または軟骨組織での傷治癒工程の迅速化と改良である。クレアチン化合物による治療は病気の患者への治療法、健康な人達への予防法並びに年とった人達への老人医学であることができる。様々なクレアチン化合物を本発明に関連して用いることができ、特にクレアチン、クレアチンリン酸塩、クレアチンピルビン酸塩およびシクロクレアチンの群から選ばれた物である。
【０００９】
クレアチン化合物は、薬理学的に受け入れられる塩、または補薬若しくは骨および／または軟骨細胞を治療するのに効果的な他の薬剤との組み合わせの形状であることができる。本発明で役に立つ化合物は、クレアチンキナーゼ系を調節するクレアチン化合物である。
【００１０】
本発明はまた、薬学的に受け入れられる担体との組み合わせのクレアチン化合物を含む薬学的な組成物を提供する。このような化合物は、例えば以下に開示されている：
"Principles of Tissue Engineering, Chapter19: Biodegradable Polymers for Tissue Engineering, J.M.Pachence and J. Kohn, 1997, Pag. 274-293；および
"Der Orthopade, Bone replacement materials, J.M.Rueger, 2-1998, pag. 73-79；
これらの開示をここで本特許出願に加える。
【００１１】
本発明に係る組成物は、粒の形状でまたは持続発散配合で、口頭で投与できる。持続発散とは、組成物が長期間にわたり一様な速度で患者へ生物学的に役立つようになる配合を意味する。このような組成物はこの技術分野で公知である。
【００１２】
哺乳類でのＣｒ生物合成の主な方法は、腎臓での酢酸グアニジンメチルトランスフェラーゼの形成、血液を通ってのその輸送、肝臓でのＣｒへのこれのメチル化を含む。肝臓から出て、再び血液を通って運ばれたＣｒは、次にクレアチン輸送たんぱく質を経てＣｒを必要とする組織により取り上げられるだろう。哺乳類の細胞が培養されたとき、クレアチンは添加した血清に存在する量でのみ利用でき、この血清は０．０５〜０．１０ｍＭのＣｒを含む。
【００１３】
酵素クレアチンキナーゼ（ＣＫ）は細胞のエネルギー代謝で主要な役割を演じ、この細胞は間欠的に高く、変動するエネルギー要求を有する。ＣＫイソエンチームは主に骨格と心臓の筋肉で主に見出されるが、しかしまた精子の中（脊椎動物とうにの精子）、電気魚の発電器官の電気細胞、網膜の光受容細胞と目のレンズ、脳（小脳の神経膠と神経の細胞、小脳の糸球体構造、神経単位）、子宮と胎盤、腸の刷子縁上皮細胞と内皮細胞、腎臓と直腸塩腺、脂肪組織、すい臓、胸腺、甲状腺と肝臓、軟骨と骨、マクロファージ、血小板、並びにある悪性の腫瘍と癌の細胞にも見出される。
【００１４】
ＣＫに触媒される反応、ホスホリル基のホスホクレアチン（ＰＣｒ）からＡＤＰへの可逆転移、は分子ＡＴＰを運ぶ重要な細胞エネルギーの再生を許す。細胞は多数の異なったＣＫイソ形状を含み、これは細胞の中で均一に分布しない。これらはイソ形状に特有の様式で区画化されており、二つのイソ形状Ｍ−ＣＫとＢ−ＣＫはサイトゾルであり、イソ形状Ｍｉａ−ＣＫとＭｉｂ−ＣＫの二つは明確に糸粒体である。これらのさまざまなイソ形状は、高エネルギーリン酸塩生産（解糖と酸性のホスホリル化により）の場所をエネルギー消費の場所（ATPases）へ結合する、複雑なエネルギー緩衝と輸送系を構成すると考えられている。
【００１５】
糸粒体状ＣＫイソ形状（Ｍｉ−ＣＫ）は、全内部膜の外表面に沿って、また内部と外部の膜が極めて接近している場所に位置している。これらの後者の場所で、Ｍｉ−ＣＫは内部糸粒体的に生産されたＡＴＰを、ＰＣｒを発生するのに直接用いることができ、このＰＣｒはサイトゾルへ運ばれ、ここでこれが容易に拡散できる、エネルギー貯蔵の代謝物質として役に立つ。二量体状であるサイトゾル的なＣＫイソ形状に比べて、Ｍｉ−ＣＫは非常に左右対称な、立方体状の八量体（Schnyder et al. 1991）を形成し、これは脂質の膜の周辺に結びつくことができる。最も重要なのは、Ｍｉ−ＣＫが内部と外部の糸粒体膜の間に接触場所形成を媒介できることであり、加えてＭｉ−ＣＫは内部膜を横切ったＡＴＰ／ＡＤＰ交互輸送を触媒する、アデニンヌクレオチド輸送器により酸化的ホスホリル化へ機能的に結びつく。正味のＰＣｒ生産は、外部ＡＴＰ再生系とＡＴＰたまり場の存在においても、特別な糸粒体状のＣｒの添加により刺激できる。
軟骨中のクレアチンとホスホクレアチン
静止したおよび肥大した軟骨は両者ともＰＣｒを含む。しかしながら、ＰＣｒの分布は軟骨の異なった部分で変化する。静止している軟骨中のＣｒ含量が最も高い。他の領域は似たようなＣｒ量を有する。一方、ＰＣｒの最も高い含量は、静止しているおよび肥大した軟骨の濃度の低い、軟骨の増殖性の地域に見出される。石灰化した軟骨において、ＰＣｒは検出できない。実験的研究は、ＰＣｒの外部からの添加が、器官での軟骨の鉱物化と細胞の培養を促進する事を示している。飼育した胎児のひよこの大腿骨骨端の軟骨基質中のカルシウムの沈積は、２０％の馬の血清を有するひよこ胎児の抽出物中、０．１ｍＭのＰＣｒとＣｒの全く精製してない調製品の添加により加速される。微小塊培養における分化するひよこの肢の芽の間葉の細胞の鉱物化は、１および２ｍＭのＡＴＰまたは２ｍＭのＰＣｒの添加により促進される。形成された鉱物化した軟骨基質は、生体中におけるものと同様の物であった。ＡＴＰまたはＰＣｒの添加は、無機リン酸塩を補った培養に比較したとき、細胞増殖の速度、基質合成の速度、平均結晶子長さまたは鉱物沈積速度は変らない。４ｍＭの無機リン酸塩（Ｐｉ）、１から２ｍＭのＡＴＰまたは２ｍＭのＰＣｒの存在で培養した細胞の超微細構造は、１４日と２１日で同様である。肥大したおよび変質した軟骨を含む小節内に、分化した軟骨細胞がある。小節の端で、ＩＩ型コラーゲン、プロテオグリカンおよび基質小疱を含む軟骨の基質は、分化してない細胞とＩ型コラーゲンに取り囲まれている。ＡＴＰ、ＰＣｒまたはＰｉは、確かに微小塊の端あたりでの鉱物対基質との比を増加するが、軟骨小節の中央ではそうならない（鉱物対基質の比は低い）。Ｐｉ、ＡＴＰまたはＰＣｒによる鉱物化の形式に差はない。
【００１６】
ベータグアンジノプロピオネート（ＧＰＡ）で飼育したラットによるＣｒ吸収の減少は、ラットの骨端成長板の目立った異常となる。石灰化した軟骨の領域は広く、骨幹端へ伸びている。肥大性の軟骨細胞は、空胞がありおよび貧弱に柱状となっており並びに鉱物化はより豊富でなく、また横の隔壁で発生する。小脈幹侵入は貧弱である。骨の形成の減少がある。ＧＰＡは、培養した軟骨細胞において、プロ−ａＩＩ型とＸ型コラーゲンの合成を妨げる。
骨の中のクレアチンとホスホクレアチン
ＰＣｒは、ＳａＯＳ−２細胞中でアルカリ性のホスファターゼの活動を増加する。飼育した胎児のひよこの大腿骨の骨幹中の周辺軟骨の骨形成は、２０％の馬の血清を有するひよこの胎児抽出物へ０．１ｍＭでＰＣｒとＣｒ調製品の添加により加速される。
【００１７】
軟骨中のクレアチンキナーゼ
ＣＫ活動のレベルは、骨端と肋骨での軟骨細胞の成熟に関係付けられる。静止している・増殖する軟骨から肥大性の軟骨（６倍）、石灰化した軟骨地帯（１７倍）へのＣＫ活動に増加がある。静止している、増殖する軟骨において、支配的なＣＫのイソ形式はＭＭである。Ｍ−ＣＫは、骨格筋肉中の物の１／３から１／５（160,000ｎｇ／ｍｇたんぱく質）であり、この量は年齢に依存してない。肥大した軟骨において、ＭＢ−ＣＫとＢＢ−ＣＫのイソ形状が主流であり、Ｂ−ＣＫが骨格筋肉より３０〜４７倍み高く（６０ｎｇ／ｍｇたんぱく質）、Ｂ−ＣＫは年齢を重ねると著しい減少を示す。
【００１８】
ＣＫ活動は、基質合成と軟骨内の成長軟骨の鉱物化に必要のように見え、肥大を経験した培養中の軟骨細胞はＣＫ活動の増加を示す。ＣＫ活動は青春期近辺の年齢のラットの軟骨で頂点に達する。
【００１９】
軟骨中でのＣＫ活動は、正常なラットとビタミンＤ欠乏ラットの成長ホルモン（ＧＨ）、インシュリンに似た成長因子１（ＩＧＦ−Ｉ）、ビタミンＤの代謝産物［２４Ｒ，２５（ＯＨ）2Ｄ3］により、ＰＨＴ、甲状腺ホルモンの抗プロテアーゼ変異体（ＰＴＨ）、正常なラットと卵巣摘出をしたラット中の１７ｂ−エストラジオールにより刺激される。ＢＢ−ＣＫ活動の刺激はＤＮＡ合成での同様な増加が続く。
くる病にかかった軟骨ではＣＫの輪郭は同様であるが、肥大性のおよびまた石灰化した軟骨での値は正常な軟骨でより低い。
【００２０】
骨中のクレアチンキナーゼ
胎児のにわとりの骨の中に、多少のＭＢとＭＭ−ＣＫ活動に加えてＢＢ−ＣＫがある。初期の顔面の発育中、顔面の工程に目立った嫌気性の代謝があり、ＢＢ−ＣＫは第９胎児日から、およびＭＢ−ＣＫとＭＭ−ＣＫは発育第１０〜１５日目に存在する。ラットの筋肉中へのＢＭＰの移植による他給栄養の骨形成中に生産された骨の量は、Ｓ−１００ｂ蛋白、Ｂ−ＣＫ、ヒアルロン酸およびコンドロイチン硫酸並びにＡＬＰの活動の水準とほとんど同様な関係を示す。Ｂ−ＣＫ圧搾は、骨芽細胞の分化中の転写および転写後の機構により調整される。膜ポンプの活動の高まりおよび細胞骨格での変化は、細胞外の基質の形成と鉱物化に関係している。
【００２１】
軟骨と同様に骨では、ＢＢ−ＣＫはまたＩＧＦ−Ｉ；１，２５（ＯＨ）2Ｄ3；ＰＴＨ；ＰＴＨの抗プロテーゼ変異体；ＰＧＥ2；１７ｂ−エストラジオール（Ｅ2）により試験管中でと生体中の両方で実験的に増加する。更に、１７ｂ−エストラジオールとテストステロンによる骨細胞エネルギー代謝の刺激は、母乳意外になれた若いラットの骨幹の骨に示されるが、骨端の軟骨で示されないように性に特有の物である。Ｅ2は、ＲＯＳ１７／２．８、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ1細胞と胎児ラットの頭蓋冠細胞中で、生体中におけるおよび試験管中でのＣＫ活動において７０〜２００％の増加並びにラット骨端の軟骨細胞での４０％増加を引き起こす。Ｅ2の刺激は投与量と時間に依存する。卵巣摘出の手術後１から４週間の間のラットは、注入後２４時間でＥ2によるＣＫの刺激を示した。ＣＫの基底のおよび刺激した活動の両方は、子宮でより骨幹と骨端で活発である。生体中のＥ2および試験管中の軟骨芽細胞と骨芽細胞の効果は、これ自身高い濃度で刺激効果を示す、抗エストローゲンタモキシフェンの高い水準により阻止される。さらに、去勢は、ステロイドホルモンに対する骨幹の骨の性特有反応がなくなる原因となる。ＣＫ活動は、青春期近辺年齢ラットの骨幹の骨と軟骨でピークとなる。常染色体が支配的なＩＩ型大理石骨病の患者は、ＢＢ−ＣＫの高まった水準を有しているが、しかし他の硬化する骨の病気の患者はこのようなＢＢ−ＣＫでの高まりを示さない。
【００２２】
成人の人間（７０ｋｇ）へ対する化学的に純粋なクレアチン一水和物の日ごとの投与量は、一日当たり０．１から２０．０ｇの範囲であり、好ましくは最初の８から１４日間一日当たり４回４〜６ｇの負荷時期を有しおよび別の三ヶ月間一日当たり２〜４ｇの維持投与で、この後一ヶ月の補足計画の中断を有する。
生物的有用性を改良する為に、化学的に純粋なクレアチン一水和物は、マルトデキストリンおよび／またはブドウ糖と他の物のような糖質と混合できる。
【００２３】
本発明を特徴付ける様々な新規性の特徴は、特に本明細書の形成部へ添付した請求項に指摘される。本発明の良好な理解、その操作の有利さとその使用により達成される特定の目的の為に、添付の図面が参照されるべきであり、この中の実施例と記載事項は本発明の好ましい実施態様の説明と記載である。
【００２４】
実験研究の目的
クレアチン（Ｃｒ）とベータ−グアニジノプロピオン酸（ＧＰＡ；細胞へのＣｒ摂取のＣｒ類似物および競合物）の、試験菅中の骨芽細胞と軟骨細胞の分化の効果が決定された。調査したパラメーターは、生活力（ニュートラルレッドの物理的吸収と代謝活動に基づく）、組織化学ＡＬＰ活動および鉱物化の程度、並びにＴＥＭ微細構造である。
【００２５】
方法
細胞培養
この分離技術は、骨芽細胞の骨から下層上への移動する能力に基づく。壁と前部の頭蓋冠（哺乳動物当たり４）は、生存６日のＩｃｏｍＩｂｍラットから無菌で体外移植された。頭蓋冠は、カルシウムおよびマグネシウム無し（ＴＢＳＳ）の、タイロード（Tyrode's）平衡塩溶液中へ置かれた。骨膜は、ＴＢＳＳへ溶解した（４０頭蓋冠／２０ミリリットル）、０．０５％トリプシンと０．０２％コラゲナーゼＡ（０．７６Ｕ／ｍｇ）により酵素的に除去した。頭蓋冠は３７℃のウオーターバス中で７０分間振とうした。これらはＴＢＳＳで洗浄され、次にＢＧＪbフィットン−ジャクソン変形（Fitton-Jackson modification）培養媒体中の５ミリリットルの０．０２％コラゲナーゼＡ（０．７６Ｕ／ｍｇ）を含む６０ｍｍ培養皿へ移され、４時間培養器中へ置かれた。その後頭蓋冠は、１０％胎児の牛の血清（ＦＣＳ）で補足した培養媒体Ｂにより洗浄した。頭蓋冠は６０ｍｍの培養皿へ移された（一皿当たり４前部と４壁部）。１０％のＦＣＳと５０μｇ／ミリリットルのアスコルビン酸塩で補足した成長媒体は、４８時間毎に完全に交換した。培養は３週間続けた。
【００２６】
３週間後移動した細胞を収穫した。皿をＴＢＳＳと５ミリリットルの０．０５％トリプシンを含むＴＢＳＳで洗浄し、０．０２％コラゲナーゼＡ（０．７６Ｕ／ｍｇ）を添加した。１時間後培養器中で、皿を１０％ＦＣＳで補足した培養媒体ＢＧＪbにより洗浄した。頭蓋幹と細胞を含む皿を血清含有媒体ＢＧＪbですすいだ。得られた細胞は４０μｍナイロン網の目を通してろ過し、骨の破片と細胞の凝集物を除いた。懸濁した細胞は５分間６００ｇで遠心分離した。細胞の小球は媒体ＢＧＪbを含む血清で再度懸濁し、遠心分離した。再懸濁した細胞の成育の可能性は、０．４％トリパンブルーの「染料排除」により試験し、細胞は血球計で計数した。接種密度は単層に対し２・１０5／１０ｃｍ2、微小塊に対し２・１０5／３０マイクロリットルであった。微小塊培養は、２ミリリットルの成長媒体添加の前に、培養器中で１時間保存した。
【００２７】
器官の培養
骨膜を有する頭蓋冠
壁と前部の頭蓋冠（哺乳類あたり４個）を生存６日のＩｃｏＩｂｍラットから無菌で体外へ移植した。頭蓋冠をＴＢＳＳで十分に洗浄し、次に血清なしかまたは１０％のＦＣＳのどちらかで、５０μｇ／ミリリットルアスコルビン酸塩で補足した成長媒体ＢＧＪbを含む培養皿（皿当たり４個の前部と４個の壁）へ移した。媒体は４８時間毎に完全に交換した。培養は３週間継続され、次に組織学的評価をした。
【００２８】
「裸にした」頭蓋冠
骨膜は、ＴＢＳＳ（４０頭蓋冠／２０ミリリットル）中に溶解した０．０５％トリプシンと０．０２％コラゲナーゼＡ（０．７６Ｕ／ｍｇ）で酵素的に取り除いた。頭蓋冠は、３７℃のウオーターバス中で７０分間振とうした。これらをＴＢＳＳで洗浄した。頭蓋冠は次に、５ミリリットルの培養媒体ＢＧＪｂ中の０．０２％コラゲナーゼＡ（０．７６Ｕ／ｍｇ）を含む、６０ｍｍ培養皿（皿当たり４０頭蓋冠）へ移され、培養器中に４時間置かれた。その後頭蓋冠を１０％ＦＣＳで補足した培養媒体ＢＧＪbにより洗浄した。頭蓋冠を６０ｍｍ培養皿へ移した（皿あたり４個の前部と４個の壁部）。５０μｇ／ミリリットルのアスコルビン酸塩で補足した培養媒体ＢＧＪbを血清無しまたは１０％ＦＣＳと共にのどちらかで用い、４８時間毎に完全に交換した。ＦＣＳの効果を研究する為に、培養は３週間続けられ、次に組織学的評価をした。
【００２９】
頭蓋冠の骨再生能力を研究する為に、これらは１０％ＦＣＳを有する成長媒体へ、６、９、１２および１５週間の長期培養として保存した。３週間毎に、これらの頭蓋冠は新しい培養皿へ移された。終了点で、頭蓋冠は組織学的評価をした。
【００３０】
胎児の長骨
ラットは妊娠の第１７〜１８日目で犠牲にされた。胎児は子宮から無菌で取り出され、大腿は立体顕微鏡下で無菌のＴＢＳＳ中へ注意深く切り離された。原基痕跡の器官培養は１０ｃｍ2のプラスチック培養皿中で行った。ナイロンの網目を有するテフロンの担体が皿に取り付けられ、体外移植組織が浮かんだままになっており、最適なガスの交換と栄養の状態を確実にしている。それぞれの哺乳類からの右と左の大腿骨は、無作為に実験用またはコントロール用に割り当てられた。コントロールグループは、５０μｇ／ミリリットルのアスコルビン酸塩を有する３ミリリットルのＢ中に保存した。実験グループにおいて、成長媒体は１０ｍＭのＣｒ、２０ｍＭのＣｒ、１ｍＭのＧＰＡ、５ｍＭのＧＰＡまたは１０ｍＭのＧＰＡのいずれかで補足した。成長媒体は１０日目まで二日目毎に更新した。培養は３７．５℃で、５％ＣＯ2雰囲気で行った。１０日目に個々の大腿骨の湿潤重量をミクロ天秤で測定した。それぞれの実験の大腿骨の結果は、それの副行のコントロールに関連して表した。組織学的な評価の為に、大腿骨は４％のホルムアルデヒド中に固定し、脱水し、メチルメタアクリレート中へ埋めた。６μｍの切片を、ペンタクロームモバット（Pentachrome-Movat）により染色した。
【００３１】
培養条件
全ての培養は３７℃で、５％ＣＯ2、９５％空気の湿った雰囲気中に保たれた。
全ての培養媒体は、５０μｍ／ミリリットルのアスコルビン酸塩で補足した。コラーゲンの型を分析する為に、６０μｍ／ミリリットルのベータアミノプロピオニトリル（ｂｅｔａ−ＡＰＮ）を培養媒体へ添加した。細胞分離と接種の間、平板培養効果を増す為に、アスコルビン酸塩は用いなかった。抗生物質およびベータグリセロリン酸は添加しなかった。媒体は４８時間毎に完全に交換した（６０ｍｍ培養皿は５ミリリットル；３５ｍｍ培養皿は２ミリリットル）。
【００３２】
形態学
アルカリ性ホスタファーゼ活動（組織化学的に）
細胞を、Sigma technical Bulletin no. 85Lに記載されているように、アルカリ性ホスタファーゼに対して組織化学的に染色した。
【００３３】
原理
ゆるやかに固定細胞を、ナフトールＡＳ−ＭＸを含む容液中で培養した。ホスファターゼ活動の結果として、ナフトールＡＳ−ＭＸが遊離され、直ちにジアゾニウム塩と結合し、ホスファターゼ活動の場所で不溶の青の色素を形成した。
【００３４】
溶液
−  固定液
２容積のクエン酸塩緩衝液；１：５０希薄クエン酸塩濃縮物
３容積のアセトン
−  染色液
磁気撹拌器上で、１カプセルのファーストブルーの内容物を４８ミリ
リットルの蒸留水へ溶解する。
使用直前に２ミリリットルのナフトールＡＳ−ＭＸ溶液を添加する。
【００３５】
手順
１．ＴＢＳＳ中で３回洗浄
２．２０℃で５分間固定
３．蒸留水で三回洗浄
４．室温（ＲＴ）で暗所中にて３０分染色
５．蒸留水で三回洗浄
【００３６】
鉱質化
原理
石灰化したマトリクスを検出する最も特異的な方法は、フォンコッサ［von Kossa］反応である。銀染色はある有機酸に凝集したリン酸カルシウムの存在を示す。構造的細部は暗凝結により完全に覆い隠される。石灰化された組織成分は、それらのミネラル含有量にかかわりなく、種々の覆いによりライトブラウンからディープブラックへと薄黒くなる。
【００３７】
溶液
−  硝酸銀
希釈水中５％のＡｇＮＯ3
−  ピロガロール
希釈水中１％
−  チオ硫酸ナトリウム
希釈水中１％のＮａ2Ｓ2Ｏ3５Ｈ2Ｏ
【００３８】
手順
１．４％のホルムアルデヒド中の固定              ３０分
２．希釈水中の洗浄                              ３回
３．硝酸銀                                      暗所３０分
４．希釈水による洗浄                            ５回
５．ピロガロール                                ５分
６．希釈水による洗浄                            ５回
７．チオ硫酸ナトリウム                          １０分
８．希釈水による洗浄                            ５回
【００３９】
ＴＥＭ調整
原理
電子顕微鏡中で標本を超高真空に晒す。従って、組織が凝固し且つ重金属で染色されてコントラストを与えることになり、そして極めて密集した資料のみが電子を反射して画像を形成する。組織は、切片化の前および／または後で重金属（ウラン、鉛）に飽和する。電子は組織中をそれ程深く貫通しないので、ウルトラミクロトーム上でガラスもしくはダイアモンドナイフにより極薄切片（５０〜１００ｎｍ）に切断する必要がある。超薄切断のため標本を脱水して、重合した単量体樹脂を含浸する必要がある。
化学固定には大抵グルタルアルデヒドが使用される。これは隣接する蛋白を共有結合する。脂質（特に細胞膜）を安定化するため、凝固後にオスミウムテトロキシドが使用される。コントラストを向上するため組織を一纏めにして酢酸ウランで処理し、続いて切片を酢酸ウランおよびクエン酸鉛で染色する。
【００４０】
溶液
−  ０．２Ｍのカコジル酸塩バッファｐＨ７．４
ストックＡ    ２５ｍｌ
ストックＢ    １．３５ｍｌ
希釈水１００ｍｌ添加
ストックＡ    １０．７ｇのカコジル酸ナトリウム塩トリヒドレート
２５０ｍｌ希釈水
ストックＢ    ０．２ＭのＨＣｌ
−  固定
２５％のグルタルアルデヒド（ＥＭ勾配）      ２ｍｌ
０．２Ｍのカコジル酸塩バッファｐＨ７．４    １０ｍｌ
希釈水２０ｍｌ添加
−  固定後  ０．１Ｍのカコジル酸塩バッファｐＨ７．４中１％ＯｓＯ4
１ｖｏｌ．  ２％のＯｓＯ4
１ｖｏｌ．  ０．２Ｍのカコジル酸塩バッファｐＨ７．４
２％のＯｓＯ４
ガラス瓶破砕
希釈水添加
超音波処理５分間
０．４５ｍｍフィルター（Millex）を通して濾過
暗所４℃で保存
−  ２％の水性酢酸ウラン
【００４１】
手順
１．２０℃で固定                                          ３０分
２．０．１Ｍのカコジル酸塩バッファｐＨ７．４でリンス      ３×３０秒
３．固定後４℃                                            １時間
４．希釈水中でリンス                                      ３×３０秒
５．室温で酢酸ウラン                                      １時間
６．等級付けした一連のエタノール中で脱水：
７．７０％、８０％、９０％、１００％、１００％、１００％  各５分
８．ＬＲ  ホワイト（重合化学）［LR White （polysciences)］２時間未満
９．６０℃で重合                                          一晩
【００４２】
超薄切片
原理
ＬＫＢ  ＩＩＩミクロトーム上でガラスナイフまたはドラッカーダイアモンドナイフで超薄切片が切断され、ホルムバール(Formvar)でコートした銅グリッド上に置き、そして重金属で染色した。
【００４３】
溶液
−  ５％の酢酸ウラン
１ｇ／２０ｍｌ
−  レイノルズに準じたクエン酸鉛
Ｐｂ（ＮＯ3）2        ０．６７ｇ
クエン酸ナトリウム    ０．８８ｇトリクエン酸ナトリウムジヒドレート
１５ｍｌ希釈水
１５分間静かに撹拌。
【００４４】
１規定ＮａＯＨを４ｍｌ添加、白色沈殿の溶解
希釈水を２５ｍｌまで満たす
希釈水を添加し２５ｍｌにする
使用前に（硬化した）ワットマン番号５０を通し両溶液を濾過する。
【００４５】
手順
全ての溶液をパラフィルム上に滴下するように配置した。個々のグリッドを小滴上に配置し、切断面を下にして浮かした。固体ＮａＯＨペレットを同一チャンバー内でプラスチック皿に入れて空気からＣＯ2を吸収し、鉛塩の二酸化炭素による析出を防いだ。染色溶液と固体ＮａＯＨペレットはいずれも蓋で覆った。
１．希釈水
２．５％の酢酸ウラン１０分
３．希釈水                  ２回
４．クエン酸鉛              １０分
５．Ｍ  ＮａＯＨ            ３×３０秒
６．希釈水                  ２回
７．ピンセットの先の間のフィルター紙で残った少量の水を取り除き、ワットマン番号５０のフィルター紙で切断面を上にしてグリッドを乾燥する。グリッドが乾いたら、保管ボックスにいれて使用準備した。
ＪＥＯＬＪＥＭ１００ＣＸ透過電子顕微鏡を１００ｋｖで操作して切片を試験した。2000、5000、20000または33000倍に標準拡大してコダックＥＭ４３０３フィルムに顕微鏡写真を撮った。写真をマルチグレード紙に印刷した。
【００４６】
細胞生存能力（ＭＴＴ）
分析には、ビョーリンゲル［B hringer］’細胞増殖キットＩ（ＭＴＴ）’を用いたが、我々はＭＴＴ結晶を溶解するのに異なる溶媒を使用した。
【００４７】
原理
最初に、モスマン［Mosmann］，１９８３は、細胞成長／細胞死の判定に伴う一般原理として、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼによるテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）の着色ホルマザンへの転化によって示されると述べた。そして、その濃度は分光光度測定される。
【００４８】
手順
１．ビョーリンゲルからのＭＴＴストック（５ｍｇ／ｍｌ無菌ＰＢＳ中）を完全増殖培地で１１０倍に希釈し無菌フィルターにかけた。
２．細胞を２ｍｌ／１０ｃｍ2のＭＴＴ溶液中、３７℃で３時間インキュベートした。
３．上澄み液を丁寧に取り除いた。
４．４ｍｌ／１０ｃｍ2のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加した。
５．結晶が完全に溶解するまで皿を撹拌器上に置いた。
６．上澄み液（３アリコート／皿）の吸光度は、５５０ｎｍ対ＤＭＳＯであった。
コメント
もし、吸光度が１より高ければ、サンプルをＤＭＳＯで希釈した。
【００４９】
細胞生存能力（ニュートラルレッド、ＮＲ）
（リンドル等  １９９４）に記載される方法を用いた。
原理
ＮＲのリソソームへの捕捉は細胞の代謝状態に依存しない。
【００５０】
溶液
−  ０．５ｍｇニュートラルレッド／増殖培地、少なくとも２時間３７℃まで
暖め、無菌フィルターにかける
−  抽出バッファ
１％酢酸中５０％エタノール
【００５１】
手順
１．２ｍｌ／１０ｃｍ2  ＮＲ溶液中、３７℃で３時間、細胞をインキュベートした。
２．上澄み液を取り除き、
３．結晶が存在しなくなる迄、少なくとも３回ＰＢＳで洗浄した。
４．４ｍｌ／１０ｃｍ2抽出バッファーの添加。
５．上澄み液（３アリコート／皿）の吸光度は抽出バッファーに対して５４０ｎｍを示した。
６．吸光度が１より高い場合は、サンプルを抽出バッファーで希釈した。
【００５２】
統計
中間値および標準偏差は、ｎ回の単独試験から構成した。単独試験の値は、同じ皿の３アリコートの平均値から得た。処理の違いを比較するため異なるモデルの分析を評価した。
【００５３】
一対の方法として試験を実行するにあたり、ブロックを試験するものとして動物について報告するモデルを検討した。主な効果および相互作用効果を分散比検定により試験した。
【００５４】
‘最小二乗法’の計算を行い、該モデルの他の変数を調査する平均中間値を得た。最小二乗法はターキィ［Tukey］の多段階試験と比較した。
残差のＱＱ−プロットおよびターキィ−アンスコーム［Tukey-Anscombe］プロット（残差×予測）を分析し正規分布予測についてチェックした。
【００５５】
結果
単層細胞培養
細胞生存能力および代謝活性
細胞生存能力に関して、全ての組において、主に小瘤の端および表面の細胞並びにそれらの間の細胞をニュートラルレッド（ＮＲ）染色した。トリパンブルーで染色したところ、小瘤間の細胞／マトリクスおよび小瘤自体が染色された。
【００５６】
ＮＲ捕捉における予備試験の定量データは、ＣｒおよびＧＰＡグループは２週目でコントロールグループと同様の結果となることを示した。ＭＴＴ反応により計測された代謝活性に関して、Ｃｒグループはコントロールと比べた場合微かに活性化するが、５Ｍまたは１０ｍＭのＧＰＡグループはコントロールよりも低い値であり、これら特定の濃度において幾らかＧＰＡの阻害を示した。１ｍＭのＧＰＡグループはコントロールと同様であった。３週目では、全ての試験グループはコントロールよりもＮＲ捕捉が低かった。ＣｒはＭＴＴ反応を活性化し、そして１ｍＭまたは５ｍＭのＧＰＡはコントロールよりも低い値であった。１０ｍＭのＧＰＡはコントロールに匹敵するものであった。これらの結果は、Ｃｒが細胞の代謝に活性化効果をもち、ＧＰＡが細胞のミトコンドリア活性に幾らかの阻害作用をもつことを示していた。
【００５７】
クレアチングループのみを使用して、細胞の生存能力および代謝活性を定量するのに更に試験を行った。ＮＲ捕捉の統計分析（図１）は、小さいながらも示差的な相互作用効果の存在を示した（ｐ＜0.05）。これは、クレアチン処理の効果が異なる時点で類似していないこと意味した。１週目のコントロールグループのＮＲ捕捉は２および３週目のそれよりも明らかに低かった（ｐ＜0.03、夫々ｐ＜0.0002）。３週目における１０ｍＭのＣｒグループのＮＲ捕捉は、１週目のそれ（ｐ＜0.02）と比較して明らかに高かった。１および２週目において、グループ間には明確な差異はなかった。３週目においてコントロールグループは明らかに（ｐ＜0.008）２０ｍＭのＣｒグループよりも高かった。培養中のコントロールグループのＮＲ捕捉の増加は、細胞数の増加があったことを示した。コントロールグループと１０ｍＭのＣｒの相違は、重大なものではなかった。このことは、この特定の濃度においてクレアチンの有毒な効果が存在しないことを示した。これは、（コントロールグループと比較した場合明らかにＮＲ捕捉が減少した）２０ｍＭのＣｒとは対照的であった。これは細胞の分裂増殖に対する、ある有害効果を示した。
【００５８】
細胞の代謝活性（図２）に関しては、クレアチンは培養中の骨芽細胞にある影響を及ぼした。１週目において全てのグループは同様であった。２週目では、コントロールグループは、１０ｍＭのＣｒおよび２０ｍＭのＣｒ（ｐ＜0.015、各々ｐ＜0.0025）よりも明らかに低かった。３週目において、１０ｍＭのＣｒおよび２０ｍＭのＣｒはいずれも、コントロールグループ（ｐ＜0.001）よりも明らかに高かった。これらのデータは、一般的にクレアチンが第２週目以降に代謝活性を促進することを示した。
【００５９】
形態
１週間後、全グループの細胞は、ＡＬＰ陽性細胞を備えた単一層を形成した。幾つかの細胞は、実際に高いＡＬＰ活性を有していた。２週間後、全グループが幾つかの小さな鉱化小塊を形成した。３週間後、ＡＬＰ活性用の全体着色が、全グループで類似した。
【００６０】
さらに大きい拡大図では、対照標準グループおよびＣｒ（クレアチン）グループと比較して、ＧＰＡグループは、ＡＬＰ活性の異なる着色パターンを示した。前記小塊周辺の細胞密度は、対照標準グループおよびＣｒグループのものより低かった。
【００６１】
３週間経過時の鉱化小塊は、２週間経過時のものに比べて、大きさおよび数が増した。全ての実験グループは、対照標準グループよりも高い鉱化作用を示した。ＧＰＡグループの石灰化パターンは、鉱化作用が小塊に限定されずかつ対照標準グループおよびＣｒグループよりも多くの単一細胞が石灰化を示すという点で、対照標準グループおよびＣｒグループと異なる。
【００６２】
培養皿の中心面積（１２３ｍｍ2）の画像分析によって石灰化の量をはかる更なる実験において、ＧＰＡ処理細胞はさらに評価されることなくクレアチングループのみを対照標準グループと比較した。統計分析は、２週間経過時において、２０ｍＭのＣｒグループの石灰化面積（図３）が対照標準グループのそれ（ｐ＜0.02）より著しく大きいことを示した。３週間経過時において、１０ｍＭのＣｒグループは対照標準グループよりも多くの鉱化作用を有しており、一方で、２０ｍＭのＣｒグループはそれほど効果的ではなかったが、各グループ間に著しい違いはなかった。
【００６３】
ＴＥＭ単一層
１％ＦＣＳにおける対照標準グループの超微細構造は、１０％ＦＣＳに維持した細胞と類似していた。
【００６４】
超微細構造は、対照標準グループ、１０ｍＭのＣｒグループ、２０ｍＭのＣｒグループ、１ｍＭのＧＰＡグループおよび５ｍＭのＧＰＡグループの間で明白な違いがないことを示した。
【００６５】
全てのグループに、コラーゲン生成および鉱化作用が存在した。細胞の細胞質は、充分に発達したｒＥＲ、ゴルジ領域、ミトコンドリア、小胞、微小繊維などの骨芽細胞の代表的な特徴を備えていた。細胞は、互いに密に接触している多くの細胞突起（cell processes）を有していた。たくさんのコラーゲン生成が存在した。コラーゲン原繊維は、膜ひだ（membrane folds）に存在した。この原繊維の直径は、ある程度一定であった。鉱化作用の領域では、個々の原繊維は、より大きな一群と合体するように思われる。
【００６６】
鉱化作用パターンは、全てのグループで類似していた。最下細胞層において、高密度針状構造が存在した。鉱化作用最前面では、コラーゲン原繊維周囲で同じ物質が観測され、プラズマ膜と厳密に同格であった。鉱化された斑点がコラーゲン基質に存在した。多く石灰化した領域では、基質の細部はもはや目に見えなかった。
【００６７】
微小塊細胞培養（micromass cell culture）
１週間及び２週間経過時のＮＲ摂取は、全てのグループで類似していた。３週間経過時、２０ｍＭのＣｒグループは、対照標準グループおよび１０ｍＭのＣｒグループよりも著しく低いＮＲ摂取（ｐ＜0.005、それぞれｐ＜0.003）を有していた。
【００６８】
１週間、２週間および３週間経過時のミトコンドリア活性（ＭＴＴ変換）は、全てのグループにおいて類似していた。しかしながら、１０ｍＭおよび２０ｍＭ濃度のＣｒグループは、１週間経過時よりも２週間経過時のほうが著しく激しいＭＴＴ反応を有していた（ｐ＜0.02、それぞれｐ＜0.006）。３週間経過時、２０ｍＭのＣｒグループは、２週間経過時よりも著しく低いＭＴＴ変換を有していた（ｐ＜0.015）。
【００６９】
鉱化された領域（図４）に関しては、２週間経過時において、１０ｍＭおよび２０ｍＭ濃度のクレアチングループは、対照標準グループよりも著しく多くの鉱化作用（ｐ＜0.00025）を有していた。３週間経過時、１０ｍＭおよび２０ｍＭ濃度のクレアチングループの鉱化された領域は、対照標準グループのそれよりも著しく大きかった（ｐ＜0.0035、それぞれｐ＜0.03）。さらに、対照標準グループおよび１０ｍＭのクレアチングループは、２週間経過時よりも３週間経過時の方が著しく高い鉱化作用を示した（ｐ＜0.0005、それぞれｐ＜0.0015）。
【００７０】
器官培養
大腿骨
対照標準グループ（図５）は、１０ｍＭのＣｒグループ（ｐ＜0.005）、２０ｍＭのＣｒグループ（ｐ＜0.001）、５ｍＭのＧＰＡグループ（ｐ＜0.0005）および１０ｍＭのＧＰＡグループ（ｐ＜0.015）よりも著しく小さい湿潤重量を有していた。
【００７１】
実験データの評価
単一層培養物において、ＮＲ摂取に関するクレアチンの小さいが著しい相互作用効果が存在した。これは、クレアチンを用いた処理の効果が、異なる時点において類似しないことを意味した。対照標準グループにおいて、培養中にＮＲ摂取の著しい増加があった。これは細胞数の増加に起因する。１週間及び２週間経過時では、グループ間に目立った違いはなかった。しかしながら、３週間経過時の、１０ｍＭのクレアチンのＮＲ摂取に対する影響は、１週間経過時のそれに比べて著しかった。３週間経過時、２０ｍＭのＣｒグループは対照標準グループよりも著しく小さかった。これは幾つかの毒性作用を示しており、このことは細胞の増殖が縮小する結果になった。これは１０ｍＭのＣｒグループでは観察されず、このことは対照標準グループでも同様であった。
【００７２】
これは、１０ｍＭという特定濃度ではクレアチンの毒性作用がないことを示していた。微小塊培養物では、１週間及び２週間経過時のＮＲ摂取は、全てのグループにおいて類似していた。しかしながら、３週間経過時、２０ｍＭのＣｒグループのそれは、対照標準グループや１０ｍＭのＣｒグループよりも著しく低かった。単一層培養物とは対照的に、培養中、ＮＲ摂取は減少しなかった。このことは、微小塊培養物において、細胞が、最初に植え付けられた細胞滴から移りつつあり、その結果細胞数がゆっくりと増加しているという事実によって説明できる。
【００７３】
単一層培養物骨芽細胞の新陳代謝活性に関する結果は、第２週目以降、１０ｍＭおよび２０ｍＭ両濃度のクレアチンによるこれら細胞の著しい刺激を示している。微小塊培養物において、ＭＴＴ変換増加は、Ｃｒグループにおいてのみ１週間経過時のそれに比べて２週間経過時の方が著しかった。このことは、微小塊培養物が単一層培養物とは違った作用をすることを示している。これは驚くことではない。なぜなら、微小塊培養物において細胞は、とても早い細胞−細胞接触を行い、その結果単一層培養物よりも早く分化作用が始まり、この作用では細胞が先ず増殖して細胞−細胞接触を成す。それにもかかわらず、１週間経過時に比べて２週間経過時に、早期鉱化作用で微小塊培養物の新陳代謝活性を、Ｃｒが著しく刺激した。
【００７４】
全てのグループにおいて、ＮＲが主に細胞の端部、前記小塊の最上面およびこれらの間に着色した。トリパン青を用いた全グループにおける着色は、小塊の細胞のみならず培養皿の底にある細胞も着色することを示した。これは着色の人為構造に起因しているかまたは着色した細胞の細胞膜が実際に損傷を受けているかのどちらかである。
【００７５】
この人為構造の可能性に関しては、トリパン青はまた細胞外たんぱく質も着色する。損傷を受けた細胞膜の存在の印は、単一層培養物のＴＥＭ超微細構造研究から得られた。培養皿表面付近の幾つかの細胞は、細胞質中に電子密集の針状物質を有していた。鉱化小塊の下部細胞が、他の全ての細胞層を通る拡散による十分な栄養または酸素を得ていないということがあり得る。細胞が生きていることがとても重要である。なぜなら生きている細胞のみが、鉱物堆積を調節したり栄養失調の石灰化を防ぐことができるからである。死んだ細胞が存在すると、鉱化作用が増大し得る。
【００７６】
２週間後、全てのグループは、３週間後に大きさと数が増加する幾つかの小さな鉱化小塊を形成した。石灰化はまた、単一細胞でも観察された。２週間後および３週間後の平均値は、対照標準グループよりもＣｒグループの方が高かった。微小塊培養物において、Ｃｒグループは対照標準グループよりも著しく多くの鉱化作用を有していた。従って、Ｃｒグループは、培養物における骨芽細胞の新陳代謝活性を増大させることで、鉱化小塊の形成を高めた。組織鉱化作用中にＰＣｒ交替率の上昇があることが示唆される。なぜなら石灰化した軟骨のクレアチン燐酸濃度は低く、この領域のキナーゼの活性が高いからである。さらに、軟骨のエネルギー新陳代謝は、骨格成長の形態形成に影響を及ぼし得る。
【００７７】
鉱化細胞が大量のエネルギーを要求するという証拠がある。分化骨細胞は、エネルギー新陳代謝の増加した速度を表わす凝縮クリスタを備えたミトコンドリアを有している。これらミトコンドリアは、特に分化段階に豊富にあり、培養が成熟するにつれて衰退する。鉱化作用は、極度の低酸素症または高酸素症よりもむしろエネルギー新陳代謝の最適レベルと関連していると考えられている。
【００７８】
一定のミトコンドリア活性を有する増大した糖分解は、増エネルギー新陳代謝度と増大したＡＴＰ生成という結果になる。このＡＴＰ入手可能性の増大で、骨芽細胞が高いｐＨにさらされる場合に骨芽細胞がさらに多くのコラーゲンを合成する。骨および軟骨の形成中、増大する細胞分化は、ＡＴＰアーゼの及び乳酸塩脱水素酵素の、リンゴ酸塩脱水素酵素のおよびグルコース−６−リン酸脱水素酵素の、高められた活性を伴っている。
【００７９】
最大活性は、基質堆積の始まりにおいて観察され、骨芽細胞の形質転換中に骨細胞を成熟させる酵素活性の低下および軟骨細胞の肥大における酵素活性の低下が後に続く。骨芽細胞において検出される、組織化学のＡＴＰアーゼ活性は、新陳代謝活性およびこれら細胞の生存力に近似する。骨細胞および軟骨細胞におけるＡＴＰアーゼ活性は、骨格筋肉、血管および骨髄におけるそれよりもはるかに小さい。破骨細胞は強いＡＴＰアーゼ活性を示し、強度に関して骨芽細胞、骨軟骨細胞そして最後に骨細胞がこの活性に続く。
【００８０】
このように決定された軟骨細胞活性は、一般的に骨芽細胞活性よりも弱い。通常、ピーク活性が５週間にいたるまで観察されながら、若い細胞区画は、年数を経た動物の細胞区画よりも大きな活性を示した。齢が増えて機能的要求が減るにつれて、関節の軟骨細胞を除いてＡＴＰアーゼ活性は減少する。
【００８１】
糖分解の抑制が、媒体（Ｐｉ  ０．５ｍＭ−３．０ｍＭおよび１．８ｍＭ  Ｃａ2+）において［Ｃａ×Ｐｉ］という広い範囲にわたって、コラーゲン合成の縮小および小児胚子（chick embryos）の脛骨における過剰鉱化の両方を引き起こす。さらに、グルタミンが存在せずに、もっと多くの細胞壊死が存在する。グルタミンはａ−ケトグルタル酸塩で、くえん酸サイクルに入り、そして生合成の先駆物質およびＮＡＤＨを提供する。ＮＡＤＨは酸化的リン酸化に入りＡＴＰをもたらす。ＡＴＰ生成と関連したＮＡＤ従属酵素の活性抑制が軟骨形成を害し、肢短縮（limb shortening）を生じる。
【００８２】
ＧＰＡ、細胞へのＣｒ侵入の拮抗的阻害剤、は、細胞の新陳代謝および細胞の生存力の両方に不都合な影響を及ぼすように思われるが、鉱化作用は増大する。このことは、細胞死が鉱化作用にもなるという事実によって説明できる。クレアチン処理細胞の新陳代謝活性が一般的に対照標準グループに比べて高いので、同じパラメータはＧＰＡグループにおいて低く、クレアチン処理グループの増大した鉱化作用は骨芽細胞の新陳代謝刺激に起因すると結論づけられ、一方でＧＰＡ処理細胞の増大した鉱化作用は主に細胞死に起因すると結論づけられる。成長板軟骨は、ＧＰＡ投与によって課せられた新陳代謝応力に順応できず、生体内でおよび生体外で、乱れた軟骨内骨形成を生じることが示されている。
【００８３】
石灰化した領域は広く、骨幹端にまで広がる。肥大性軟骨細胞は空胞があり不完全に柱状であり、鉱化作用はそれ程多くなくそして横方向隔膜にも生じる。組織の脈管侵入は乏しい。骨様形成の縮小がある。ＧＰＡは、培養された軟骨細胞におけるＩＩ基型およびＸ基型コラーゲン前駆物質の合成を妨げる。ＧＰＡ存在下、長期間の外囲いのない培養において、総ＣＫ活性は変化しないが、ＣＫイソ酵素プロフィールは乱される。ＢＢ−ＣＫの活性は長骨において抑制されるが、頭蓋冠のイソ酵素分布は影響されない。通常の胚のような軟骨は、ほとんど同等のＭＭ−ＣＫとＢＢ−ＣＫの割合を含んでいる。胚のような頭蓋冠および骨は主にＢＢ−ＣＫを表している。
【００８４】
ラットやマウスにＧＰＡを投与すると、段々に心臓および骨格筋肉のＣｒ濃度およびＰＣｒ濃度が減少し、主にミトコンドリアに影響を与える著しい形態変化に至る。独特の結晶性ミトコンドリア内含有物を備えた拡大された棒形状ミトコンドリアの母集団は、生体外で大人のラットの心筋細胞（cardiomyocytes）に現れる。この現象は、細胞培養媒体にＣｒ（クレアチン）を追加した場合、十分に可逆である。非常に整ったミトコンドリア内含有物の様相は、低い細胞内総Ｃｒ含有量と相互に関係がある。免疫蛍光検査法および免疫電気顕微鏡検査法は、これら含有物がＭｉ−ＣＫに関して濃厚にされることを示している。
【００８５】
ＧＰＡ処理骨芽細胞において、ミトコンドリアは対照標準グループおよびＣｒグループと類似していた。その結果、骨芽細胞はＧＰＡに対して筋肉細胞とは異なって反応する。ＧＰＡは、脳のＣｒ含有量やＰＣｒ含有量に対して、比較のできるほどにそれほど影響は与えないことが示されている。
【００８６】
ひらめ筋ミトコンドリアは、対照標準グループに比べて４倍のＭｉ−ＣＫタンパク質増加および３倍のアデニンヌクレオチド転流（translocator）タンパク質増加を示す。
【００８７】
結論
クレアチンは、クレアチンキナーゼの作用や、クレアチン又はホスホクレアチンによって調節を受ける他の酵素（例えばＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ）の作用を通じて、単層培養中の細胞の代謝活性を上げることにより培養中の骨芽（造骨）細胞の石灰化を促進する。微小質量（マイクロマス）培養細胞中では、クレアチンは石灰化を増進したが、代謝活性は対照と類似していた。しかしながら、２週間目のＭＴＴ転化率は１週間と比べてクレアチン群において顕著に増加した。クレアチンはこの細胞培養モデルの細胞の分化プロセスに対しおそらく何らかの影響を及ぼしたものと見られる。小結節形成そして続く石灰化の間に、細胞は多量の化学エネルギーを必要とする。マトリックスコラーゲン及びプロテオグリカンの生合成、並びに／又は細胞の増殖が進んだ。クレアチンは、外部エネルギー源として、増殖培地中のｐＨを下げないという利点があり、よってコラーゲン合成及び解糖の阻害を防ぐことができる。
【００８８】
クレアチンはまた、器官培養中の胚芽大腿骨（図５）の湿重量を増加させる。これは骨のみならず軟骨細胞もまた、外部クレアチン供給から恩恵を受けていることを示している。マトリックスコラーゲン及びプロテオグリカンの生合成、並びに／又は細胞の増殖は促進される。
【００８９】
クレアチンは従って、人間及び動物用の食品添加物やサプリメントとして適用でき、骨折や骨の傷の整形外科手術及び外傷の後の回復をサポートすることができる。
クレアチンはまた、骨粗鬆症に悩む患者の骨芽細胞の代謝を促す能力を秘めている。また、関節炎等の退行性軟骨病の治療もクレアチンによってサポートされる。
【００９０】
大きな骨の傷の治療は外科医にとって今だ大変な仕事である。大きな骨の傷を抱える患者は、腸骨稜から傷への骨の移植により又は仮骨伸延若しくは部分移送を適用することにより治療することができる。これらの処置は全て患者にとって非常に痛みを伴い、加えて骨移植の量は限られている。組織工学を用いればこの問題を解決できる。骨形成細胞（骨芽細胞、間充織幹細胞、骨膜細胞、間質骨髄細胞又は筋肉のサテライト細胞）並びに健康な人の又は患者自身からの軟骨芽細胞を、単層、微小質量培養細胞として、又は３次元の生分解性骨格中、クレアチンの存在下で培養する。時間的に後の時点で、骨若しくは軟骨の細胞又は細胞を接種したスポンジ、泡若しくは膜を、患者の傷に移入する。この手法の最も重要な工程は、細胞培養の作業である。細胞が生体外で生き抜き、増殖しそして分化することが基本となる。従って、培養条件を最適にする必要がある。この意味で、クレアチンの培地へのサプリメントとしての添加は有益である。
【００９１】
骨及び軟骨の細胞はクレアチンキナーゼを発現するが、これは筋肉及び脳細胞に比べて比較的低いレベルにも拘らず、驚くべきは、クレアチンキナーゼをクレアチン補強と共に過剰発現させると、増殖力、代謝安定性及び種々の有害因子（例えば軟骨及び骨細胞の毒、熱、代謝的過剰負荷など）に対する抵抗力が増したことである。よって、健康な人又は治療すべき患者から除去した骨形成細胞（骨芽細胞、骨膜細胞、間質骨髄細胞又は筋肉のサテライト細胞）及び軟骨形成細胞（軟骨芽細胞）を、細胞培養に供し、これにイソ型クレアチンキナーゼ（サイトゾル筋肉型ＭＭ−ＣＫ、サイトゾルユビキチン脳型ＢＢ−ＣＫ若しくはヘテロダイマーのＭＢ−ＣＫハイブリッド酵素、又は筋節−若しくはユビキチンミトコンドリアＭｉ−ＣＫ又はこれらの組合せのいずれか）をコードする相補ＤＮＡを移入する。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ＣＫイソ酵素のｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）により、ＲＴ−ポリメラーゼ−連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、又はそれぞれのＣＫイソ酵素に対応する適当なプライマーを用いる他の方法により、得ることができる。
【００９２】
イソ型クレアチンキナーゼ用のｃＤＮＡのエンコードのための遺伝子転移の方法には、可能な移入技術の全て並びに将来は社会の共有財産として利用できる新たに開発された技術が含まれ、例えば細胞のマイクロインジェクションによる移入、微小球衝撃又はＤＮＡ沈殿物移入、並びに様々なウイルス、ウイルス性及び非ウイルス性のベクター若しくはプラスミド（単一複写及びマルチ複写のプラスミド）、コスミド又は人工染色体による移入が挙げられる。クレアチンキナーゼの発現は弱又は強組織特異的プロモータの制御下で行われる。元々備わっている選択マーカー（例えば抗生物質、毒又はその他に対する抵抗力）により、移入を受けた細胞を選択することができ、これら細胞は次に上記のように１〜２０ｍＭのクレアチンの存在下で拡張し培養する。
【００９３】
クレアチンキナーゼｃＤＮＡが移入され、イソ型クレアチンキナーゼを過剰発現するようになった軟骨又は骨細胞は、次に選択培地上で選択にかけ、そして単層、マイクロマス培養細胞として又は３次元の生分解性骨格若しくは組織スポンジにおいて拡張し培養することにより（上述の様に）、生体外で遺伝子工学的な軟骨及び骨の前駆組織が形成され、これらは軟骨及び／又は骨の傷の領域内に移植することができる。例えば、そのような移入済軟骨細胞を関節炎にかかった関節内に注射し、増殖及び新たな軟骨細胞由来細胞外マトリックスを生産することにより、傷の領域を再び密にしてこの関節内の軟骨退行性傷を修復することができる。同様に、移入を受けた骨形成細胞を骨損傷の領域内に再移植し、患者内において骨の塊の再生と成長を開始することができる。
【００９４】
クレアチンキナーゼ及びクレアチン／ホスホクレアチンは軟骨及び骨の組織の発生及び維持に重要な役割を果たすので、このような組織は、遺伝子工学的操作を受けてクレアチンキナーゼを過剰発現しかつ外部的に加えたクレアチン又はクレアチン同族体によって補強され、クレアチンを経口的及び／又は局所的に補給した患者の軟骨及び／又は骨の損傷領域内に移植した後はより良く成長する。軟骨及び骨の細胞へのクレアチンキナーゼの遺伝子工学的処理とクレアチン補強の併用により、これら細胞の増殖、成長及び特定機能、例えば細胞外軟骨−又は骨−特異的マトリックスの形成性、が向上する。この代謝工学的操作とそれに続くクレアチン補強は、軟骨及び骨の形成、治療及び修復並びに石灰化にとって有益である。
【００９５】
培地中のクレアチン化合物の濃度は、好ましくは１０から２０ｍＭの範囲である。培地は典型的には０．１％から５．０％、好ましくは０．５％から２％の胎児の子牛の血清を含有する。更に、培地は１０から２５０μｇ、好ましくは２５から１００μｇのアスコルビン酸又は薬学的に許容されるアスコルビン酸塩の等価量を含有する。細胞の培養は2,000から100,000個の細胞、好ましくは10,000から50,000個の細胞により開始する。
【００９６】
本発明の好ましい態様において、クレアチン化合物はホルモンとの組み合わせで投与され、該ホルモンは好ましくは副甲状腺ホルモン関連蛋白質、甲状腺ホルモン、インシュリン、性ステロイド（エストロゲン、アンドロゲン、テストステロン）、プロスタグランジン、又はグルココルチコイドの群から選ばれる。
【００９７】
更なる好ましい態様において、クレアチン化合物は、副甲状腺ホルモンの間欠的投与との組み合わせで投与され、好ましくは１，２５（ＯＨ）2ビタミンＤ3及びビタミンＤ、カルシトニン、エストロゲン又はビスホスホネートの同族体又は代謝産物との組み合わせで投与される。
【００９８】
更なる好ましい態様には、クレアチン化合物のビタミンとの組み合わせ投与が含まれ、該ビタミンは好ましくは１，２５（ＯＨ）2ビタミンＤ3及びビタミンＤの、ビタミンＣ／アスコルビン酸塩の又は樹脂類似物の同族体又は代謝産物の群から選ばれる。
【００９９】
更なる好ましい態様には、クレアチン化合物の成長因子との組み合わせ投与が含まれ、該成長因子は好ましくはインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、形質転換成長因子ｂ系統群（ＴＧＦ−ｂ）、骨形態発生蛋白質（ＢＭＰ）、塩基性の線繊芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、又は表皮成長因子（ＥＧＦ）の群から選ばれる。
【０１００】
更なる好ましい態様には、クレアチン化合物のサイトカインとの組み合わせ投与が含まれ、該サイトカインは好ましくはインターロイキン（ＩＬ）、インターフェロン、又は白血病性貧血抑制因子（ＬＩＦ）の群から選ばれる。
【０１０１】
更なる好ましい態様には、クレアチン化合物のマトリックス蛋白質との組み合わせ投与が含まれ、該蛋白質は好ましくはコラーゲン、糖蛋白質、ヒアルロナン、又はプロテオグリカンの群から選ばれる。
【０１０２】
糖蛋白質として下記の群：
ａ）アルカリ性ホスファターゼ、
ｂ）オステオネクチン（ＯＮ）、
ｃ）ガンマ−カルボキシグルタミン酸含有蛋白質、好ましくはマトリックスｇｌａ蛋白質又はオステオカルシン若しくは骨ｇｌａ蛋白質（ＯＣ）、
ｄ）アルギニン−グリシン−アスパラギン含有蛋白質、好ましくはトロンスポンジン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、フィブリリン、オステオアドヘリン、シアロ蛋白質（オステオポンティン又は骨シアロ蛋白質ＢＳＰ）
から選ばれたものが特に有用であることが分かった。
【０１０３】
プロテオグリカンとして下記の群：
ａ）アグレカン、
ｂ）ヴァーシカン、
ｃ）ビグリカン、
ｄ）デコリン
から選ばれたものが特に有用であることが分かった。
【０１０４】
更なる好ましい態様において、クレアチン化合物は血清蛋白質との組み合わせで投与され、該血清蛋白質は好ましくはアルブミン又はアルファ−２ＨＳ糖蛋白質の群から選ばれる。
【０１０５】
更なる好ましい態様には、クレアチン化合物の酵素との組み合わせ投与が含まれ、該酵素は好ましくは金属結合蛋白分解酵素、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメリシン、プラスミノーゲン活性化物質、システイン蛋白質分解酵素又はアスパラギン酸蛋白質分解酵素の群から選ばれる。
更なる好ましい態様には、クレアチン化合物の、カルシウム塩、骨食又はハイドロキシアパタイトとの組み合わせ投与が含まれる。
【０１０６】
更なる好ましい態様には、クレアチン化合物の、フッ化物塩との組み合わせ投与、好ましくはフッ化ナトリウム又はフルオロリン酸−ナトリウムとの組み合わせ投与が含まれる。
【０１０７】
更なる好ましい態様には、クレアチン化合物のペプチドとの組み合わせ投与が含まれ、該ペプチドは好ましくはアミリン、バソアクティブ剤又は神経ペプチドの群から選ばれる。
【０１０８】
更なる好ましい態様には、クレアチン化合物の抗酸化剤との組み合わせ投与が含まれ、該抗酸化剤は好ましくはシステイン、Ｎ−アセチル−システイン、グルタチオン又はビタミンＡ、Ｃ、Ｄ若しくはＥの群から選ばれる。
【０１０９】
更なる好ましい態様には、クレアチン化合物の、トランスフェリン、セレン、ホウ素、シリコン、又は酸化窒素の群から選ばれる物質との組み合わせ投与が含まれる。
【０１１０】
本発明の好ましい態様において、前記薬剤は実質的にジヒドロトリアジンを含まない。ジヒドロトリアジンは市販されているクレアチンの毒性不純物であり、患者に悪影響を及ぼすことが分かった。同じ理由により、前記薬剤は実質的にジシアノジアミド（これも市販クレアチンの毒性不純物である）を含まないべきである。更に、クレアチンの自然分解生成物としてクレアチニンを実質的に含まない薬剤に有利である。
本発明に係る薬剤は、人間の患者に対して好ましくは一日当り１．４〜２８５ｍｇ投与する。
【０１１１】
本発明の好ましい態様において、該クレアチン化合物はクレアチン、クレアチンリン酸、クレアチンピルビン酸、シクロクレアチン、ホモクレアチン又はホモシクロクレアチンの群から選ばれる。
本発明の更に好ましい態様において、該クレアチン同族体は下記一般式：
【式２】
0004778143.tif 000002
及びその薬学的に許容される塩を有し、式中：
（ａ）Ｙは−ＣＯ2Ｈ、−ＮＨＯＨ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＳＯ2Ｊ及び−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（ＯＪ）からなる群から選ばれ、ここでＪは水素、Ｃ1−Ｃ6の直鎖アルキル、Ｃ3−Ｃ6の分枝アルキル、Ｃ2−Ｃ6の直鎖アルケニル、Ｃ3−Ｃ6の分枝アルケニル及びアリールからなる群から選ばれる；
（ｂ）ＡはＣ、ＣＨ、Ｃ1−Ｃ5のアルキル、Ｃ2−Ｃ5のアルケニル、Ｃ2−Ｃ5のアルキニル、及びＣ1−Ｃ5のアルコイル鎖からなる群から選ばれ、各々は下記群から独立に選ばれる０〜２個の置換基を有する：
（１）Ｋ、ここでＫはＣ1−Ｃ6の直鎖アルキル、Ｃ2−Ｃ6の直鎖アルケニル、Ｃ1−Ｃ6の直鎖アルコイル、Ｃ3−Ｃ6の分枝アルキル、Ｃ3−Ｃ6の分枝アルケニル、Ｃ4−Ｃ6の分枝アルコイルからなる群から選ばれ、Ｋはブロモ、クロロ、エポキシ及びアセトキシからなる群から独立に選ばれる０〜２個の置換基を有する；
（２）１〜２の環の炭素環及び１〜２の環のヘテロ環からなる群から選ばれるアリール基、このアリール基は−ＣＨ2Ｌ及び−ＣＯＣＨ2Ｌからなる群から独立に選ばれる０〜２個の置換基を含み、ここでＬはブロモ、クロロ、エポキシ及びアセトキシからなる群から独立に選ばれる；及び
（３）−ＮＨ−Ｍ、ここでＭは水素、Ｃ1−Ｃ4のアルキル、Ｃ2−Ｃ4のアルケニル、Ｃ1−Ｃ4のアルコイル、Ｃ3−Ｃ4の分枝アルキル、Ｃ3−Ｃ4の分枝アルケニル、及びＣ4−Ｃ6の分枝アルコイルからなる群から選ばれる；
（ｃ）ＸはＮＲ1、ＣＨＲ1、ＣＲ1、Ｏ及びＳからなる群から選ばれ、ここでＲ１は下記群から選ばれる：
（１）水素；
（２）Ｋ、ここでＫはＣ1−Ｃ6の直鎖アルキル、Ｃ2−Ｃ6の直鎖アルケニル、Ｃ1−Ｃ6の直鎖アルコイル、Ｃ3−Ｃ6の分枝アルキル、Ｃ3−Ｃ6の分枝アルケニル、及びＣ4−Ｃ6の分枝アルコイルからなる群から選ばれ、Ｋはブロモ、クロロ、エポキシ及びアセトキシからなる群から独立に選ばれる０〜２個の置換基を有する；
（３）１〜２の環の炭素環及び１〜２の環のヘテロ環からなる群から選ばれるアリール基、このアリール基は−ＣＨ２Ｌ及び−ＣＯＣＨ２Ｌからなる群から独立に選ばれる０〜２個の置換基を含み、ここでＬはブロモ、クロロ、エポキシ及びアセトキシからなる群から独立に選ばれる；
（４）オメガ−メチル炭素を介して結合したＣ5−Ｃ9のアルファ−アミノ−オメガ−メチル−オメガ−アデノシル−カルボン酸；
（５）オメガ−メチル炭素を介して結合したＣ5−Ｃ9のアルファ−アミノ−オメガ−アザ−オメガ−メチル−オメガ−アデノシルカルボン酸；及び
（６）Ｃ5−Ｃ9のアルファ−アミノ−オメガ−チア−オメガ−メチル−オメガ−アデノシルカルボン酸、ここでＡ及びＸは一重又は二重結合により結合している；
（ｄ）Ｚ1及びＺ2は＝Ｏ、−ＮＨＲ2、−ＣＨ2Ｒ2、−ＮＲ2ＯＨからなる群から独立に選ばれ；ここでＺ1及びＺ2は両方共が＝Ｏではなく、そしてＲ2は下記群から選ばれる：
（１）水素；
（２）Ｋ、ここでＫはＣ1−Ｃ6の直鎖アルキル、Ｃ2−Ｃ6の直鎖アルケニル、Ｃ1−Ｃ6の直鎖アルコイル、Ｃ3−Ｃ6の分枝アルキル、Ｃ3−Ｃ6の分枝アルケニル、及びＣ4−Ｃ6の分枝アルコイルからなる群から選ばれ、Ｋはブロモ、クロロ、エポキシ及びアセトキシからなる群から独立に選ばれる０〜２個の置換基を有する；
（３）１〜２の環の炭素環及び１〜２の環のヘテロ環からなる群から選ばれるアリール基、このアリール基は−ＣＨ2Ｌ及び−ＣＯＣＨ2Ｌからなる群から独立に選ばれる０〜２個の置換基を含み、ここでＬはブロモ、クロロ、エポキシ及びアセトキシからなる群から独立に選ばれる；
（４）オメガ−炭素を介して結合したＣ4−Ｃ8のアルファ−アミノ−カルボン酸；
（５）Ｂ、ここでＢは−ＣＯ2Ｈ、−ＮＨＯＨ、−ＮＯ2、−ＳＯ3Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＳＯ2Ｊ及び−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（ＯＪ）からなる群から選ばれ、ここでＪは水素Ｃ1−Ｃ6の直鎖アルキル、Ｃ3−Ｃ6の分枝アルキル、Ｃ2−Ｃ6の直鎖アルケニル、Ｃ3−Ｃ6の分枝アルケニル及びアリールからなる群から選ばれ；ここでＢは任意にＣ1−Ｃ2のアルキル、Ｃ２のアルケニル及びＣ1−Ｃ2のアルコイルからなる群から選ばれる連結基を介して窒素と結合している；
（６）−Ｄ−Ｅ、ここでＤはＣ1−Ｃ3の直鎖アルキル、Ｃ3の分枝アルキル、Ｃ2−Ｃ3の直鎖アルケニル、Ｃ3の分枝アルケニル、Ｃ1−Ｃ3の直鎖アルコイル、及びアリールからなる群から選ばれ；そしてＥは下記からなる群から選ばれる：−（ＰＯ3）ｎＮＭＰ、ここでｎは０〜２でありＮＭＰは５’−リン酸、３’−リン酸又は塩基の芳香環を介して結合したリボヌクレオチド一リン酸である；−［Ｐ（＝Ｏ）（ＯＣＨ3）（Ｏ）］ｍ−Ｑ、ここでｍは０〜３でありＱはリボース又は塩基の芳香環を介して結合したリボヌクレオシドである；−［Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（ＣＨ2）］ｍ−Ｑ、ここでｍは０〜３でありＱはリボース又は塩基の芳香環を介して結合したリボヌクレオシドである；及びアリール基、この基はＣｌ、Ｂｒ、エポキシ、アセトキシ、−ＯＧ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｇ及び−ＣＯ2Ｇからなる群から独立に選ばれる０〜３個の置換基を有し、ここでＧはＣ1−Ｃ6の直鎖アルキル、Ｃ2−Ｃ6の直鎖アルケニル、Ｃ1−Ｃ6の直鎖アルコイル、Ｃ3−Ｃ6の分枝アルキル、Ｃ1−Ｃ6の分枝アルケニル、Ｃ4−Ｃ6の分枝アルコイルからなる群から独立に選ばれる；そしてＥはどの点でＤと結合していても良く、そしてもしＤがアルキル又はアルケニルであればＤは一端又は両端でアミド結合により結合していても良い；及び
（７）−Ｅ、ここでＥは下記からなる群から選ばれる：−（ＰＯ3）ｎＮＭＰ、ここでｎは０〜２でありＮＭＰは５’−リン酸、３’−リン酸又は塩基の芳香環を介して結合したリボヌクレオチド一リン酸である；−Ｐ（Ｐ（＝Ｏ）（ＯＣＨ3）（Ｏ））ｍ−Ｑ、ここでｍは０〜３でありＱはリボース又は塩基の芳香環を介して結合したリボヌクレオシドである；−［Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（ＣＨ2）］ｍ−Ｑ、ここでｍは０〜３でありＱはリボース又は塩基の芳香環を介して結合したリボヌクレオシドである；及びアリール基、この基はＣｌ、Ｂｒ、エポキシ、アセトキシ、−ＯＧ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｇ及び−ＣＯ2Ｇからなる群から独立に選ばれる０〜３個の置換基を有し、ここでＧはＣ1−Ｃ6の直鎖アルキル、Ｃ2−Ｃ6の直鎖アルケニル、Ｃ1−Ｃ6の直鎖アルコイル、Ｃ3−Ｃ6の分枝アルキル、Ｃ3−Ｃ6の分枝アルケニル、Ｃ4−Ｃ6の分枝アルコイルからなる群から独立に選ばれる；そしてもしＥがアリールであれば、Ｅはアミド結合により結合していても良い；
（ｅ）もしＲ1及び少なくとも一つのＲ2基が存在すれば、Ｒ1はＲ2基に対して一重又は二重結合により結合して５〜７員環を形成していても良く；
（ｆ）もし二つのＲ２基が存在すれば、これらは一重又は二重結合により結合して５〜７員環を形成していても良く；そして
（ｇ）もしＲ１が存在しかつＺ1又はＺ2が−ＮＨＲ2、−ＣＨ2Ｒ2及び−ＮＲ2ＯＨからなる群から選ばれたものであれば、Ｒ1はＺ1又はＺ2のいずれかの炭素又は窒素に対して一重又は二重結合により結合して４〜７員環を形成していても良い。
【０１１２】
従属請求項に特徴を記した様々な変形例や好ましい態様も、骨及び／又は軟骨に対して刺激作用を及ぼした。
以上の記述及び図面は本発明の好ましい態様を示すものであり、本発明の真意及び範囲から逸脱することなく様々な変更及び変形をさせても良いことは当業者にとって明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】  媒質中にクレアチン無し（コントロール）と１０ｍＭまたは２０ｍＭのどちらかの存在で、１、２および３週間における単層骨芽細胞培養の生活力（ＮＲ）を示すグラフである。最小二乗法は±１．９６の標準誤差を示す。
【図２】  媒質中にクレアチン無し（コントロール）と１０ｍＭまたは２０ｍＭのどちらかの存在で、１、２および３週間における単層骨芽細胞培養の代謝活動を示すグラフである。最小二乗法は±１．９６の標準誤差を示す。
【図３】  媒質中にクレアチン無し（コントロール）と１０ｍＭまたは２０ｍＭのどちらかの存在で、２および３週間における単層骨芽細胞培養の鉱物化を示すグラフである。最小二乗法は±１．９６の標準誤差を示す。
【図４】  媒質中にクレアチン無し（コントロール）と１０ｍＭまたは２０ｍＭのどちらかの存在で、２および３週間における微小塊骨芽細胞培養の鉱物化を示すグラフである。最小二乗法は±１．９６の標準誤差を示す。
【図５】  １０ｍＭまたは２０ｍＭのクレアチンありおよび無しでの、三週間の器官培養での胎児ラットの大腿骨の湿潤重量を示すグラフである。最小二乗法は±１．９６の標準誤差を示す。
【図１】
0004778143.tif 000003
【図２】
0004778143.tif 000004
【図３】
0004778143.tif 000005
【図４】
0004778143.tif 000006
【図５】
0004778143.tif 000007