(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
えさ粒子が、水不溶性の粒状栄養素、その他の水不溶性栄養素、水溶性栄養素、リン脂質からなる生体膜および架橋マトリックス材料のマトリックスを含む、魚およびその他の水性生物の幼生または幼魚のための合成粒状えさであって、該リン脂質からなる生体膜は脂溶性成分を内部に含み、該リン脂質からなる生体膜の間に水溶性栄養素をパッキングし、該えさからのこれら水溶性栄養素の漏出を防ぐ／減少することを特徴とする、合成粒状えさ。
【請求項２】
該水溶性栄養素／成分は、タンパク質、加水分解タンパク質、アミノ酸、生理活性タンパク質／ペプチド、生理活性炭化水素、ビタミンおよびミネラルからなる群から選択される１以上であることを特徴とする、請求項１に記載のえさ。
【請求項３】
該脂溶性成分は、ビタミン、抗酸化剤、およびコレステロールからなる群から選択される１以上であることを特徴とする、請求項１または２に記載のえさ。
【請求項４】
えさの粒子が、水不溶性の粒状栄養素、その他の水不溶性栄養素、水溶性栄養素、およびリン脂質からなる生体膜を含むマトリックスを含んで形成され、
前記リン脂質からなる生体膜を前記水溶性栄養素の水溶液と混合することによって、前記水溶性栄養素を前記リン脂質からなる生体膜の間にパッキングし、
前記水不溶性の栄養素、脂溶性成分を含み、前記水溶性栄養素をパッキングした前記リン脂質からなる生体膜、さらなる栄養素、および水を含むマトリックスを混合し、ガスの供給下でノズルで粉砕し、次いで適切な溶液中で架橋することを特徴とする、魚およびその他の水性生物の幼生および幼魚のための合成粒状えさの製造方法。
【請求項５】
えさの粒子が、水不溶性の粒状栄養素、その他の水不溶性栄養素、水溶性栄養素、およびリン脂質からなる生体膜を含むマトリックスを含んで形成され、
脂溶性成分を含む前記リン脂質からなる生体膜を前記水溶性栄養素の水溶液と混合して、前記水溶性栄養素を前記リン脂質からなる生体膜の間にパッキングし、
前記水溶性栄養素をパッキングした前記リン脂質からなる生体膜の溶液を、えさ成分の残りと混合することを特徴とする、魚およびその他の水性生物の幼生および幼魚のための合成粒状えさの製造方法。
【請求項６】
該えさは凍結乾燥されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
該えさは、架橋された後、凍結乾燥されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、幼魚またはその他の海洋生物の幼魚のための合成粒状えさに関する。また本発明は、このえさの製造方法に関する。
【０００２】
昨今、サケの養殖が全国的および国際的に成功した産業になってきた理由の一つは、なかでも、この種は初期えさを容易に供給できることである。幼生段階における初期飼育および養殖が習得され、これは商業的な水産養殖において難関突破されてきた全ての他の種にも応用されている(Watanabe & Kiron 1994)。配合えさで初期飼育されるサケとは反対に、その他の関連する養殖される種の多くは、初期えさとしての生餌で飼育される。これは、シーバス（Dicentrarchus labrax）、ギルトヘッドシーブリーム（gilthead sea bream）(Sparus aurata)、ターボット(Scophtalmus maximus)、シタビラメ(Solea sp.)、タラ(Gadus morhua L.)およびアトランティックハリバット(Hippoglossus hippoglossus) (Person Le Ruyet et al., 1993)のような種に応用されている。オオカミウオ(Anarhichas lupus)は、配合えさで簡単に初期飼育される海洋種である(Moksness et al. 1989, Strand et al. 1995)。コイ(Cyprinus carpio)のような淡水種もまた、配合えさで初期飼育され得る。しかしながら、集中的な養殖においては、初期えさとして生餌(Kamler 1992)をえさにすることも、この種にとって推奨される。輪虫類およびアルテミアは、集中的な飼育において最も使用されている生餌の種類である(Naas et al 1992, Watanabe & Kiron 1994)。望ましい栄養構成を得るために、これらの種類は、幼魚／魚の幼生にえさとして与えられる前に栄養強化される。やや集中的なシステムにおいては、集められた天然生物プランクトン（natural animal plankton）が用いられ、えさが欠乏している時期はアルテミアを添加して用いられる(van der Meeren & Nass 1993, Nass et al. 1995)。
【０００３】
ダブロウスキ（Dabrowski）(1984)は、消化管の発達に基づき幼魚を３つのカテゴリーに分類している。グループ１は、最初のえさ供給時に機能的な胃を有する幼魚である（サケおよびオオカミウオ）。これらの種は、配合えさで初期飼育され得る。グループ２は、個体発生後期で胃が発達する幼生である（シーバス、ギルトヘッドシーブリーム、アトランティックハリバット、ターボット、シタビラメおよびタラ）。グループ３は、胃を発達させない魚である（コイ）。
初期えさとして配合えさを与えることによる問題点は、まず第一に、グループ２および３に関連している。
【０００４】
摂取されたえさの酵素的消化に関する幼魚の能力に対して、数々の試験がなされてきた(Hjelmeland et al. 1984, Lauff & Hofer 1984, Baragi & Lovell 1986, Pedersen et al 1990, Verreth et al. 1992)。配合えさで初期飼育することができない幼魚は胃を持たないという事実は、えさの選択、それらの腸における消化、および、腸壁を介して吸収するそれらの能力に関して、それらが特別な必要性を有し得ることを裏付けている。この延長において、幼魚における摂取されたえさの消化は、生餌中の酵素に依存するかどうか、および、どの程度依存するか、ということも論議されてきた(Dabrowski & Glokowski 1977 a,b,c, Dabrowska et al 1979, Lauff & Hofer 1984, Leger et al 1986, Tandler & Kolkovski 1991)。
【０００５】
幼生の初期飼育における栄養必要性を確立するために、それに関する知見は卵黄体（yolk body）（内部での栄養吸収）の組成および消費量の分析によって得られるであろう、ということが示唆されてきた。このアプローチによって、塩水魚の卵は成魚に比べてｎ−３系脂肪酸、リン脂質、遊離アミノ酸ならびに数種のビタミンおよびミネラルを多く含有しているということが示されている。このような分析手段によって、エネルギー転換における種間の差異が明らかになってきた(Ronnestad et al. 1992, Ronnestad & al. 1994, Ronnestad & Fyhn, 1993)。内部での栄養吸収に基づき、幼生は、卵黄包に油滴を持つ幼魚と、卵黄包に油滴を持たない幼魚とに分類される。ターボット、シタビラメ、シーバスおよびギルトヘッドシーブリームは、それらの卵黄包に油滴を持つが、タラおよびアトランティックハリバットは持たない。
【０００６】
幼魚の栄養必要性を確立するのに適用されてきたその他のアプローチとして、天然えさの化学組成の分析が挙げられる。この場合の主な焦点は、高レベルの不飽和脂肪酸、特にＥＰＡおよびＤＨＡ(２０：５  ｎ−３および２２：６  ｎ−３)(Sargent et al. 1989, van der Meeren et al. 1993)、ノープリウス期（nauplii）における高レベルのリン脂質(Sargent et al. 1989)、および、遊離アミノ酸の含有(Fyhn 1989)におかれている。
【０００７】
通常、栄養必要性は、用量／応答実験を行うことによって研究され、ここでえさの栄養素の内容は様々である。これまで、配合えさで幼生を生存させることに関する不十分なえさ技術で成功しないため、このアプローチはえさの強化によってのみ可能であった。現在のえさ技術においては、幼生が実際に受け入れる全ての栄養素の制御が可能なえさを提供できなかった。問題は、まず第一に、栄養がこのようなえさ粒子から漏れることに関係している。
【０００８】
国際的には、幼魚飼育用の配合えさを開発する相当な努力がなされてきているが、初期えさからの生餌のように良好な生存および成長をもたらす配合えさの開発はまだである(Watanabe & Kiron 1994)。一般的に、幼魚用のえさは、粒度が小さいため（体積に比例して表面は広くなる）水溶性の栄養素が漏出しがちである。初期えさの配合に関する問題は、水溶性栄養素の漏出に関して安定であり、かつ幼生にとって容易に消化できる粒子を製造することであった。えさをカプセル封入（表面を安定化する）しなければ、乾燥重量の３０〜５０％が無駄である(Urban-Jezierska et al. 1984, Kamler 1992)。このロスは、主要な水溶性成分（アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ビタミン、ミネラル）の「微細ダスト（fine dust）」（＜２０μｍ）および漏出で代表される。幼魚用初期えさのミクロカプセル封入方法がいくつか開発されている(Teshima et al. 1982)。これによって粒子の安定性は促進されるが、全ての方法における共通点は、えさ供給後のえさ粒子の水溶性成分が漏出することである。漏出可能な物質の８０％もの瞬間的な漏出（ＯＤ280、すなわち、アミノ酸、ペプチド、タンパク質）が、１００〜３００μｍの粒子において観察されている(Garatun-Tjeldsto 1993)。粒子があまりにも安定に（硬く）作られていても、幼魚にとって消化しにくい。
【０００９】
今後の産業規模の魚の養殖は、できるだけ早く、好ましくは初めから配合えさが用いられるという可能性を想定している、ということは、現今の商業者や調査員の間での共通見解である。これは、生餌技術に付随するいくつかの疑問の要因があるからである。その要因とは、病気の伝染、変わり易い栄養組成、年間を通じて変わり易いえさの供給、えさの養殖に関する適性、およびコストに関するものである。生餌の代替物として十分な幼生用配合えさがないことは、海洋種の魚に基づいた魚養殖業の発展を実質的に妨げている。従って、商業方針は、幼魚用配合えさの開発および製造における増えつつある努力に関する最良の根拠を形成している。
【００１０】
ミクロ粒子状のえさからの漏出を制御するために、本発明において、えさ中に架橋マトリックスおよびリン脂質／生体膜（phospholipids/biomembranes）を用いることに基づいた技術が開発されてきた。当該技術の開発は、幼魚の飼育用えさ粒子は最適なえさ生物（feed organism）の多くの実用的な品質や特徴が付与されるべきである、という考察に基づいている。それは、
１．溶解することなくより長時間水柱（water column）に浮かび続ける能力
２．幼生にそれを食べたいと思わせるような大きさ、味および外観
３．バランスのとれた栄養素の内容
４．栄養価が減少しないように、減少された／制御された水への漏出
５．えさの風味が増加するように、制御された水への漏出
６．魚の腸へ摂取された後の高い消化率
を含むべきである。
【００１１】
上述の問題を解決するために開発された配合えさ粒子は、請求項１に記載の特徴に従って、好ましくは水不溶性の栄養素を含むマトリックスからなるえさ粒子を特徴とし、該粒子はそれらのなかに埋め込まれたリン脂質／生体膜を含み、該生体膜は脂溶性成分を含みかつ好ましくは水溶性栄養素をパッキングする。
【００１２】
このことは以下の項目１〜１１で説明され得る。
【００１３】
１．えさの水溶性栄養成分および任意の水溶性添加物は、粒子中でリン脂質／生体膜にカプセル封入されて存在することにより、漏出が防がれる。
【００１４】
２．えさ中の生体膜の製造は、ヨーロッパ特許公報第０１５８４４１号（Ｂ１）に従ってなされ得る。
【００１５】
３．リン脂質で形成されかつそれらのなかに栄養素を含む生体膜は、腸中で迅速に溶解し、それらの内容を放出する。
【００１６】
４．それらの源により、リン脂質は、魚にとって主要な栄養素である海洋性脂肪酸を含み得る。
【００１７】
５．粒子は、マトリックス中に、水溶性物質を有するリン脂質をその他の栄養素と共に埋め込むことによって製造される。
【００１８】
６．風味を増すためにリン脂質によって粒子中にパックされた水溶性物質は、加水分解タンパク質である。
【００１９】
７．湿性えさ（wet feed）の粒子の大きさは、マトリックスの製造（噴霧）中に決定される。
【００２０】
８．乾燥えさの粒子の大きさは、粉砕中および篩い分け中に決定される。
【００２１】
９．えさの栄養素のほとんどは、マトリックス中で水不溶性材料として存在する。
【００２２】
１０．えさの架橋のための技術は、湿性えさの低い沈殿速度を確実にする。
【００２３】
１１．えさを架橋し続いて凍結乾燥するための技術は、乾燥えさの低い沈殿速度を確実にする。
【００２４】
幼魚またはその他の海洋および淡水生物の幼生用のえさを製造する方法は、水不溶性栄養素、脂溶性および水溶性栄養素を含むリン脂質／生体膜、さらなる栄養素および水を含むマトリックスが共に混合され、ガスの供給下でノズルまたはその類似物で粉砕され、次に適切な溶液中で架橋される点において主に優れている。
【００２５】
本発明のえさ粒子の特性、それらの製造、および該えさ粒子の応用例は、添付の図面を参照しながら以下で説明される。
【００２６】
図１は、カプセル封入された水溶性栄養素を有するリン脂質／生体膜の概略図である。
【００２７】
図２は、えさ粒子を製造する一般的な方法を説明している。
【００２８】
図３は、リン脂質を含む、および、含まないえさ粒子からの漏出を示す。
【００２９】
図４は、えさのインビトロにおける消化を示す。
【００３０】
図５は、えさのインビボにおける消化を示す。
【００３１】
図６は、パックされた加水分解タンパク質を含むえさ、および、加水分解タンパク質を含まないえさの摂取の比較研究を示す。
【００３２】
図７は、養殖システムにおいて、他のえさと比較した当該えさの沈殿速度を示す。
【００３３】
図８は、養殖システムにおける当該えさの沈殿速度を示す。
【００３４】
図１において、えさのリン脂質フラクションの、水溶性成分のえさ粒子中でのパッキングが示されている。白丸は、リン脂質／生体膜中でカプセル封入された水溶性成分を示す。親水性（黒丸）および疎水性部分を含むリン脂質／生体膜の一部も示されている。白四角は、組み入れられたリン脂質膜の脂溶性成分を示す。えさの水溶性フラクションは、供給後も維持されることが望ましく、水溶性フラクションの水溶液と後者とを混合することによって、リン脂質内へパッキングされる。これは、誘引剤（ペプチド／アミノ酸）のような加水分解タンパク質、生理活性タンパク質／ペプチド（酵素、プロバイオティクス（probiotics））、 生理活性炭化水素（プロバイオティクス）、水溶性ビタミンおよびミネラルの溶液であり得る。脂溶性成分は、リン脂質膜中に溶解し得る。それらは、改変された水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン、酸化防止剤、および、リン脂質膜を介した漏出を安定化／減少するための物質（例えば、コレステロール）であり得る。リン脂質中の脂肪酸の種類は源による。海洋性リン脂質（marine phospholipids）は、必須脂肪酸であるＥＰＡ（２０：５，ｎ−３）およびＤＨＡ（２２：６，ｎ−３）が豊富であり、それゆえにリン脂質は魚にとってこれら脂肪酸の源であり得る。タラの卵のリン脂質において、例えば、脂肪酸であるＥＰＡ／ＤＨＡの約５０％が１：２の割合である。リン脂質およびパックされた加水分解タンパク質の割合は、１００：１〜１：２の間において多様であり、最も一般的には２：１である。リン脂質および生理活性タンパク質／ペプチドの割合は、１００：１〜１：２の間において多様であり、最も一般的には１０：１である。リン脂質膜のリン脂質および脂溶性成分の割合は、１×１０6：１〜２：１の間である。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
上記表１は、えさの組成の例として、実験用えさの原料の組成を示している。１）マトリックス材料（表中においてａ．）（例えばアルジネート）を水中で溶解させる。２）次にえさの栄養素を、これらは水溶性ではないが（表中においてｆ．およびｇ．）、この溶液と混合する。３）パックされた水溶性要素（表中においてｂ．およびｃ．）を含むリン脂質溶液（表中においてｄ．およびｅ．）をこの溶液と混合する。えさのリン脂質およびその他の栄養素の割合は、１：１００〜１：３の間であり、最も一般的には１：１０であり得る。えさのマトリックス材料およびその他の栄養素の割合は、１：２００〜１：１０であり、最も一般的には１：５０であり得る。
【００３７】
図２は、えさ粒子の製造プロセスを概略的に示している。二価イオン溶液中、最も一般的にはＣａＣｌ2溶液中または直接海水中での粒子増殖（particle propagation）の後に、それはマトリックス材料にアルジネートを用いることによって架橋される。該粒子の大きさは、噴霧の手段およびこのプロセス中のノズルの大きさによって決定され得る。乾燥えさの製造の場合、えさは後で破砕され、望ましい大きさのフラクションに篩い分けされ得る。アルジネートマトリックスを架橋するためのＣａＣｌ2溶液の濃度は０．５Ｍ〜０．０５Ｍであり、最も一般的には０．２Ｍである。
【００３８】
【表２】
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【００３９】
上記表２は、ＣａＣｌ2中および海水中での架橋された粒子からの漏出を示している。漏出は、大豆由来のリン脂質の異なるフラクションと比較して示されている。表より、リン脂質の異なるフラクションは、パックされた水溶性タンパク質加水分解産物の漏出に関して、異なる特性をもつことがわかる。
【００４０】
【表３】
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【００４１】
上記表３は、海水中での再水分供給後の凍結乾燥粒子からの漏出を示している。ここでも、リン脂質の異なるフラクションの粒子間で比較して、漏出を示している。えさを凍結乾燥した後、異なるフラクションの水溶性タンパク質加水分解産物の漏出特性間で、かなりの変動もまた存在する。
【００４２】
図３は、時間と共にＯＤ280で示された、異なるえさからの相対的な漏出を示している。えさ１および２は共に、漏出を防ぐためにリン脂質が加えられたえさである。えさ１はリン脂質中にパックされた加水分解タンパク質を含み、一方えさ２は加水分解タンパク質を含まない。えさ３および４は共に、リン脂質を含まない。えさ３は加水分解タンパク質を含み、一方でえさ４は加水分解タンパク質を含まない。図より、リン脂質は粒子からの漏出を減少させることがわかる。えさ２および４からの漏出は、粒子マトリックスの特定のタンパク質である水溶性タンパク質の漏出を意味している。
【００４３】
図４は、えさのインビトロでの消化を示している。図より、この125Ｉ−ＢＳＡの場合、リン脂質を不安定化してパックされた栄養素を解離することは、胆汁酸塩（gall salts）の界面活性効果のようにみえる。パックされ、マークされたタンパク質の解離は、上澄み中から得られたｃｐｍ（計数毎分）として測定された。
【００４４】
図５は、タラの幼魚に供給されたえさのインビボにおける消化を示している（粒度＝１００μｍ）。タラの幼魚は非常に小さいため（乾燥重量＝４０μｇ、長さ＝４ｍｍ）えさの吸収量は空腹時のｃｐｍとして述べられている。すなわち、腸が空である魚中で見出される放射活性は、腸を介して消化および吸収されたものとして解釈される。相当する実験がサケ（１００ｇ）およびタラ（１０ｇ）に対してなされ、双方共に高カウントの形状が筋肉、血液および臓器（脾臓および腎臓）において見出された。従って、インビトロおよびインビボ実験からの結果により、魚は、リン脂質膜でパックされた栄養素を解離させて利用することができることが示されている。
【００４５】
図６は、パックされた加水分解タンパク質を含むおよび含まないえさの比較摂取を示している。実験は孵化後８〜１０日のタラの幼魚に対してなされた。えさの平均粒度は１００μｍであった。125Ｉでマークされた小さい（３μｍ）プラスチックボールを、消化されないえさ摂取用マーカーとして用いた。全てリン脂質を含み、二つのえさは、パックされた加水分解タンパク質（図中、加水分解タンパク質、および、加水分解タンパク質＋全タンパク質）を含み、一つは加水分解タンパク質（図において、全タンパク質）は添加されていなかった。この実験によって、パックされた加水分解タンパク質の誘引効果がはっきり示された。比較の成長実験もまた、パックされた加水分解タンパク質を含むおよび含まないえさに関してなされた。パックされた加水分解タンパク質を含むえさは、パックされた加水分解タンパク質を含まないえさよりより大きい成長をもたらした。
【００４６】
図７は、粒度が２５０μｍ＜ｄ＜３１５μｍの二つのえさに関して、沈殿速度を比較して示している。えさ１は本明細書に従って作られたえさである。比較されるえさは、顆粒えさ（ＮｏｒＡｑｕａ  ＡＳ）である。図より、えさ１は、えさ２より長く水柱中に残存しているようにみえる。実験は、幼魚に関する初期飼育実験で用いられるものに相当するわずかな上昇流がある小さい容器（４０リットル）中でなされた。
【００４７】
図８は、６０００リットルの養殖容器中の、粒度が１２５μｍ＜ｄ＜１８０μｍのえさ１（上述）の沈殿速度を示している。容器中の水について、幼魚の初期飼育によって用いられたものに相当する底流が設定された。最適の養育条件（pasturing conditions）であるように、リットル当り２０００〜３０００粒子の粒子濃度を維持することが望ましい。この実験において、乾燥えさ１０ｇが毎時添加された。システム中に魚はいないため、えさの摂取はなかった。最適のえさ濃度が容器中で維持され得るようにみえる。より短い時間間隔でえさを添加することによって、容器中のより安定した粒子濃度が達成され得る。同じ容器中でアルテミアを供給する場合、魚１００００匹に対して１日当たりアルテミア１２５ｇが消費される。１時間当り配合えさ１０ｇを供給すると、１日当り２４０ｇになる。それゆえに、上述したえさ技術によって、当該えさは、生餌と競えるような比重および沈殿速度を有することを確実にする。これらは、経済性および容器中の環境／汚濁に関する重要な要素である。その上、えさがしばらくの間安定しているため、低品質のえさは漏出により除去され、魚に与えられることはないだろう。生餌を容器中から除去することはより難しく、従って添加された後あまりにも長く容器中に留まりそのえさとしての品質が失われるだろう、という問題がある。配合えさで魚を養育する際、容器中のえさの濃度は、供給当たりの供給量を介する、および、供給の時間間隔による、非常に簡単な方法で制御され得る。
【００４８】
参考文献：
【００４９】
【化１】
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【００５０】
【化２】
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【００５１】
【化３】
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【００５２】
【化４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、カプセル封入された水溶性栄養素を有するリン脂質／生体膜の概略図である。
【図２】  図２は、えさ粒子を製造する一般的な方法を説明している。
【図３】  図３は、リン脂質を含む、および、含まないえさ粒子からの漏出を示す。
【図４】  図４は、えさのインビトロにおける消化を示す。
【図５】  図５は、えさのインビボにおける消化を示す。
【図６】  図６は、パックされた加水分解タンパク質を含むえさ、および、加水分解タンパク質を含まないえさの摂取の比較研究を示す。
【図７】  図７は、養殖システムにおいて、他のえさと比較した当該えさの沈殿速度を示す。
【図８】  図８は、養殖システムにおける当該えさの沈殿速度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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