(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体ＤＮＡ上のゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の全てまたは一部に欠失、置換、挿入変異を有する、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ活性が低下または欠損したユビキノン−１０を生成する能力を有するRhodobacter属に属する微生物を培地に培養し、培養物中にユビキノン−１０を生成蓄積させ、該培養物から該ユビキノン−１０を採取することを特徴とするユビキノン−１０の製造方法。
【請求項２】
染色体ＤＮＡ上のゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の全てまたは一部に欠失、置換、挿入変異を有する、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ活性が低下または欠損したユビキノン−１０を生成する能力を有するRhodobacter属に属する微生物が、さらにデカプレニル２リン酸合成酵素活性の強化された性質、またはＰ−ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼ活性の強化された性質を有する微生物である、請求項１記載のユビキノン−１０の製造方法。
【請求項３】
ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が、配列番号６記載の塩基配列を含むＤＮＡである、請求項１または２記載の製造法。
【請求項４】
デカプレニル２リン酸合成酵素活性の強化が、Rhodobacter属に属する微生物由来のデカプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡを、ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物に導入することにより達成されることを特徴とする、請求項２記載の製造法。
【請求項５】
Rhodobacter属に属する微生物由来のデカプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡが、Rhodobacter sphaeroides由来のデカプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡである、請求項４記載の製造法。
【請求項６】
デカプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡである、請求項４記載の製造法。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）（ａ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル２リン酸合成酵素活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつデカプレニル２リン酸合成酵素活性を有するポリペプチド
【請求項７】
デカプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡである、請求項５記載の製造法。
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであり、かつデカプレニル２リン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
【請求項８】
Ｐ−ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼ活性の強化された性質が、Rhodobacter属に属する微生物由来のＰ−ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを、ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物に導入することにより得られる性質である、請求項２記載の製造法。
【請求項９】
Rhodobacter属に属する微生物由来のＰ−ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが、Rhodobacter sphaeroides由来のＰ−ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡである、請求項８記載の製造法。
【請求項１０】
Ｐ−ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡである、請求項８記載の製造法。
（ａ）配列番号４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）（ａ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１個から数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＰ−ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号４記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつＰ−ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド
【請求項１１】
Ｐ−ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡである、請求項９記載の製造法。
（ａ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｂ）配列番号３記載の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡであり、かつＰ−ヒドロキシ安息香酸-デカプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
【請求項１２】
Rhodobacter属に属する微生物が、Rhodobacter sphaeroidesまたはRhodobacter capsulatusに属する微生物である、請求項１または２記載の製造方法。
【請求項１３】
ＤＮＡをRhodobacter属に属する宿主微生物に導入する方法が、エレクトロポレーション法によるものである、請求項４または８記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、心臓病の症状改善や抗酸化機能物質として有用なユビキノン−１０の製造法、該製造法に有用なＤＮＡおよびポリペプチド、該製造に有用な微生物、微生物における新たな遺伝子発現、および微生物の新たな育種に関する。
背景技術
ユビキノンは２，３−ジメトキシ−５−メチル−６−ポリプレニル−１，４−ベンゾキノンの総称で、コエンザイムＱとも呼ばれる。ユビキノンは電子伝達系の構成成分として広く生物界に存在している。生物種によりユビキノンのポリプレニル側鎖長が異なり、ユビキノン−１〜１３までの同族体が天然に見出されている。主要な同族体はユビキノン−６〜１０であり、ヒトを含む哺乳動物の多くはユビキノン−１０を生合成している。
ユビキノン−１０は、心不全や他の虚血性心疾患の症状改善に有効であり、医薬品として認可されている。また、アドリアマイシンなどの抗がん剤の心臓副作用の軽減、歯周病の改善、運動負荷に対する骨格筋保護などにも有効との報告がある〔ビタミンの事典  日本ビタミン学会編（１９９６）〕。
近年、ユビキノンのエネルギー代謝賦活や抗酸化作用が注目され、欧米を中心に健康食品としての需要が拡大している。
現在、ユビキノン−１０は、合成法あるいは酵母や光合成細菌などの微生物からの抽出法で生産されているが、需要が増大していることからより効率的な生産法が求められている。
微生物を用いて特定の物質を蓄積生産させるために有効な手段の一つとして、目的物質へ至る生合成経路上の中間代謝産物が他の経路へ流れるのを遮断し、結果としてより多くの中間代謝産物が目的物質へ流れるようにする方法があげられる。
ユビキノンは構造上キノン骨格部分とポリプレニル側鎖部分に大別される。ポリプレニル側鎖はイソプレノイド化合物の一種で、炭素数５のイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）を基本骨格単位とし、それが複数個縮合して生合成される。  この反応を司る一連の酵素をプレニルトランスフェラーゼという。
プレニルトランスフェラーゼは多くの生物種で見出されており、例えば大腸菌では合成鎖長の異なるファルネシルトランスフェラーゼ〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０８，（６），９９５−１０００（１９９０）〕、オクタプレニルトランスフェラーゼ〔Ｊ．Ｂａｃ．，１７９，３０５８−３０６０（１９９７）〕、ウンデカプレニルトランスフェラーゼ〔Ｊ．Ｂａｃ．，１８１，４８３−４９２（１９９９）〕の３つの酵素の存在が確認され、いずれも遺伝子が同定されている。光合成細菌であるＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（以下、Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓと略す）では、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ｃｒｔＥ）が同定されている〔Ｊ．Ｂａｃ．，１７７，２０６４−２０７３（１９９５）〕。
ユビキノン側鎖を供給するプレニルトランスフェラーゼの出発基質はファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）と考えられるが、ＦＰＰは多くのイソプレノイド化合物生合成の出発基質になっている。
Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓの場合、ｃｒｔＥを介して生成するゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）から、著量のカロテノイドが蓄積することが知られている〔Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｖｏｌ．２  ＪＯＨＮ  ＷＩＬＬＹ＆ＳＯＮＳ（１９８３）〕。
シュードモナス属、およびロドトルラ属において、カロテノイド生産能を欠失することにより、ユビキノン−１０の蓄積量が増大することが報告されている（特開昭５７−６８７９２、特開昭５７−３９７９０）。
Ｒ． ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓでは、ｃｒｔＥ欠損によりカロテノイド生成能が消失することが既に知られているが、該欠損によりユビキノン−１０の菌体内蓄積量が変化するとの知見はない〔Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４  ９７７−９８９（１９９０）〕。
また、上記においては、カロテノイド生合成能変異株を取得する方法として、紫外線、Ｘ線、γ線などの放射線や、亜硝酸ソーダ、ニトロソグアニジン、エチルメチルスルホネートなどの化学物質を用いて変異処理を施した菌株から、色の変化した株を選択し、その中でカロテノイド生合成能の欠損している株を選択する方法が用いられている。
簡便に特定の酵素活性を欠損させる方法として、その酵素をコードする遺伝子に特異的に変異をかける方法も用いられている。これまでに種々の方法が知られているが、特に簡便でよく用いられる方法として、５’末端および３’末端が不完全な遺伝子を含むベクターを用い、染色体上の相同領域に組み込むことで遺伝子を破壊し、目的の酵素活性を失活させる方法や、遺伝子の一部または全ての欠損、置換、挿入によって機能を喪失している遺伝子を含むＤＮＡを用い、この欠失、置換、挿入を染色体上に移すことで遺伝子を破壊し、目的の酵素活性を欠損させる方法が知られている。
Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓなどの光合成細菌で部位特異的な変異を導入する方法としては、特定の大腸菌とベクターを用いて、接合伝達により目的の遺伝子を破壊する方法が知られている。しかし、限られたベクターしか用いることができないこと、接合後の大腸菌と光合成細菌との分離工程が煩雑であるといった難点がある。ベクターの種類に因らず広範囲に応用可能な部位特異的相同組換え手法の構築が望まれている。
微生物を用いて特定の物質を蓄積生産させるためのもう一つの有効手段として、生合成経路上の酵素遺伝子の発現を強化することがあげられる。
ユビキノン類の場合、キノン骨格部分は、シキミ酸経路で生合成されたコリスミ酸を経由して生合成されたｐ−ヒドロキシ安息香酸が出発基質となる。一方、ポリプレニル側鎖部分は、メバロン酸経路、または、最近明らかにされた非メバロン酸経路〔Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９５，５１７（１９９３）〕によって生合成されたＩＰＰが複数個縮合してできたポリプレニル２リン酸を出発基質とする。ｐ−ヒドロキシ安息香酸とポリプレニル２リン酸が、ｐ−ヒドロキシ安息香酸−ポリプレニルトランスフェラーゼ（ＥＣ．２．５．１．３９）の作用で４−ヒドロキシ−３−ポリプレニル安息香酸となり、これが種々の修飾を受け、ユビキノンとなる。
これら生合成経路上の酵素およびその遺伝子は、大腸菌や酵母で大方同定されている。これら遺伝子の全容は未だ解明されていないが、ユビキノン生合成経路上の酵素遺伝子を発現強化してユビキノン蓄積量を増大させた例がいくつか知られている。例えば、Ｚｈｕらは、大腸菌由来の各種ユビキノン生合成酵素遺伝子を、ｌａｃプロモーター下流に連結して大腸菌内で高発現させることで、ユビキノン蓄積量が増加することを示した〔Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７９，４９３（１９９５）〕。また、川向らは、光合成細菌Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓに大腸菌由来のｕｂｉＡおよびｕｂｉＣを導入し、嫌気培養することにより、ユビキノン−１０の生産性が向上することを示している（特開平８−１０７７８９）。
しかしながらユビキノン生合成における律速点がどこにあり、どのような調節をうけているのかは未解明である。
光合成細菌でユビキノン生合成系を強化するためには光合成細菌自身の酵素遺伝子を用いるのが最適と思われるが、光合成細菌のユビキノン生合成関連酵素遺伝子は殆ど知られていない。
光合成細菌でユビキノン生合成系を強化するためには、生合成経路上の律速点を特定し、律速点に関わる遺伝子を含めユビキノン生合成経路上の遺伝子を単離し、該遺伝子およびその周辺の塩基配列を決定することが重要である。
発明の開示
本発明の課題は、心臓病の症状改善や抗酸化機能物質として有用なユビキノン−１０の工業的に有用な製造法、該製造法に有用なＤＮＡおよびポリペプチド、該製造に有用な微生物、該微生物における遺伝子発現、および該微生物の育種法を提供することにある。
本発明者らは、ユビキノン−１０の工業的に有用な製造法について鋭意検討し、光合成細菌に属する微生物において、ユビキノン−１０生合成の向上に関わる遺伝子を見いだし本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下（１）〜（４１）に関する。
（１）  ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ活性の低下または欠損した性質、デカプレニル２リン酸合成酵素活性の強化された性質およびＰ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ活性の強化された性質からなる群より選ばれる１つ以上の性質を有する、ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にユビキノン−１０を生成蓄積させ、該培養物から該ユビキノン−１０を採取することを特徴とするユビキノン−１０の製造方法。
（２）  ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ活性の低下または欠損した性質が、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなり、かつゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ活性の低下または欠損したポリペプチドをコードするＤＮＡを、ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物に導入することにより得られる性質である、上記（１）の製造法。
本明細書において、塩基の欠失、置換もしくは付加は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。即ち、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ）、第二版〔サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッチ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年刊（以下、モレキュラー・クローニング第二版と略す）〕、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の方法に準じて実施することができる。
（３）  ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡである、上記（２）の製造法。
（４）  ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが、配列番号６記載の塩基配列を含むＤＮＡである、上記（２）の製造法。
（５）  デカプレニル２リン酸合成酵素活性の強化が、デカプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡを、ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物に導入することにより達成されることを特徴とする、上記（１）の製造法。
（６）  デカプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡが、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のデカプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡである、上記（５）の製造法。
（７）  デカプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡである、上記（５）の製造法；
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）（ａ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル２リン酸合成酵素活性を有するポリペプチド、および
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつデカプレニル２リン酸合成酵素活性を有するポリペプチド。
本明細書中の、アミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、上記塩基の欠失、置換もしくは付加と同様、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。欠失、置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、１個から数十個、特に１個から数個のアミノ酸であることが好ましい。
また、上記デカプレニル２リン酸合成酵素において、該酵素の活性保持するためには、該酵素の有するアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
本明細書において、相同性はＢＬＡＳＴ〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）〕やＦＡＳＴＡ〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）〕等の相同性解析プログラムを用いて計算することができる。
（８）  デカプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡが、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡである、上記（５）の製造法；
（ａ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ、および
（ｂ）（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつデカプレニル２リン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
本発明において、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、本発明のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ  塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌ  クエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第二版等に記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして、上記ＤＮＡにおいて具体的には、配列番号１で表される塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
（９）  Ｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ活性の強化された性質が、Ｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを、ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物に導入することにより得られる性質である、上記（１）の製造法。
（１０）  Ｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のＰ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡである、上記（９）の製造法。
（１１）  Ｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれるポリペプチドをコードするＤＮＡである、上記（９）の製造法；
（ａ）配列番号４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）（ａ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＰ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド、および
（ｃ）配列番号４記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＰ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド。
上記Ｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、該ポリペプチドの活性保持するためには、該ポリペプチドの有するアミノ酸配列と少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
（１２）  Ｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡである、上記（９）の製造法；
（ａ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ、および
（ｂ）（ａ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつＰ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして、上記ＤＮＡにおいては、具体的には配列番号３で表される塩基配列と少なくとも７０％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
（１３）  ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物および光合成細菌に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である、上記（１）、（２）、（５）または（９）に記載の製造方法。
（１４）  光合成細菌に属する微生物が、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｐｉｌａ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属およびＲｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である、上記（１３）の製造方法。
（１５）  Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属に属する微生物が、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓまたはＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓに属する微生物である、上記（１４）の製造方法。
（１６）  ＤＮＡをＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒに属する宿主微生物に導入する方法が、エレクトロポレーション法によるものである、上記（２）、（５）または（９）の製造法。
（１７）  Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のデカプレニル２リン酸合成酵素。
（１８）  以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれるポリペプチド。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）（ａ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつデカプレニル２リン酸合成酵素活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号２記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつデカプレニル２リン酸合成酵素活性を有するポリペプチド
（１９）  Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のＰ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ。
（２０）  以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれるポリペプチド。
（ａ）配列番号４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）（ａ）のポリペプチドの有するアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつＰ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号４記載のアミノ酸配列と６０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含み、かつＰ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチド
（２１）  以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれるＤＮＡ。
（ａ）上記（１７）または（１８）のポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつデカプレニル２リン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（２２）  以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）から選ばれるＤＮＡ。
（ａ）上記（１９）または（２０）のポリペプチドをコードするＤＮＡ
（ｂ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつＰ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
（２３）  上記（２１）または（２２）のＤＮＡをベクターに組み込んで得られる組換え体ＤＮＡ。
（２４）  ＤＮＡが、リボソームＲＮＡ遺伝子に存在するプロモーターの有する塩基配列からなるＤＮＡの下流に挿入されていることを特徴とする、上記（２３）の組換え体ＤＮＡ。
（２５）  リボソームＲＮＡ遺伝子が、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属に属する微生物由来のリボソームＲＮＡ遺伝子である、上記（２４）の組換え体ＤＮＡ。
（２６）  プロモーターの有する塩基配列からなるＤＮＡが、配列番号５記載の塩基配列を有するＤＮＡである、上記（２４）の組換え体ＤＮＡ。
（２７）  上記（２３）〜（２６）のいずれか一項に記載の組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体。
（２８）  形質転換体が、ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物である、上記（２７）の形質転換体。
（２９）  ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物、および光合成細菌に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である、上記（２８）の形質転換体。
（３０）  光合成細菌に属する微生物が、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｐｉｌａ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属およびＲｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である、上記（２９）の形質転換体。
（３１）  Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属に属する微生物が、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓまたはＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓに属する微生物である、上記（３０）の形質転換体。
（３２）  上記（２７）〜（３１）のいずれか一項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中にユビキノン−１０を生成蓄積させ、該培養物から該ユビキノン−１０を採取することを特徴とするユビキノン−１０の製造方法。
（３３）  リボソームＲＮＡ遺伝子に存在するプロモーターの有する塩基配列からなるＤＮＡの下流に、発現させたいポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入することを特徴とする、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させる方法。
（３４）  リボソームＲＮＡ遺伝子が、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属に属する微生物由来のリボソームＲＮＡ遺伝子である、上記（３３）の遺伝子を発現させる方法。
（３５）  プロモーターの有する塩基配列からなるＤＮＡが、配列番号５記載の塩基配列を有するＤＮＡである、上記（３４）の遺伝子を発現させる方法。
（３６）  発現を、ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物中で行わせることを特徴とする、上記（３３）〜（３５）のいずれか一項に記載の遺伝子を発現させる方法。
（３７）  ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物由来のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列において１以上の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列を有し、かつポリペプチドの活性の変化したポリペプチドをコードするＤＮＡを、ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物に、エレクトロポレーションによって導入することを特徴とする、ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物の変異株を作成する方法。
（３８）  ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物由来のポリペプチドをコードするＤＮＡが、配列番号６の塩基配列を有するＤＮＡである、上記（３７）記載の方法。
（３９）  ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物および光合成細菌に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である、上記（３６）〜（３８）のいずれか一項に記載の方法。
（４０）  光合成細菌に属する微生物が、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｐｉｌａ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属およびＲｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である、上記（３９）の方法。
（４１）  Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属に属する微生物が、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓまたはＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓに属する微生物である、上記（４０）の方法。
以下、本発明を詳細に説明する。
［１］  ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（ｃｒｔＥ）活性の低下または欠損した微生物の造成
本発明のｃｒｔＥ活性の低下または欠損した微生物を造成するための微生物としては、ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物であればいずれも用いることができ、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属に属する微生物、光合成細菌に属する微生物等をあげることができる。
光合成細菌に属する微生物としては、例えば、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｏｄｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｐｉｌａ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属等に属する微生物をあげることができ、具体的には、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ等をあげることができ、より具体的には、Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ＡＴＣＣ１７０２３やＲ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６７５をあげることができる。
ｃｒｔＥ活性の低下または欠損したユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物の造成するための方法としては、紫外線、Ｘ線、γ線などの放射線や、亜硝酸ソーダ、ニトロソグアニジン、エチルメチルスルホネートなどの化学物質を用いて、常法に従って変異処理し、寒天培地上で生育させた時のコロニーの色の変化した株よりｃｒｔＥ活性の低下または欠損した株を選択する方法をあげることができる。
具体的には、野生型株では、カロテノイドの蓄積による赤色のコロニーを形成するが、上記変異株においては、該コロニーの色調が遺伝子欠損部位に応じてピンク、黄色、薄紫色に変化するため、該コロニーの色調に基づき、目的の変異株を選択することができる。
また、ｃｒｔＥをコードする遺伝子に遺伝子工学的手法を用い特異的に変異を導入する方法を用いても目的の株を取得することができる。
以下に、ｃｒｔＥをコードする遺伝子に遺伝子工学的手法を用い特異的に変異を導入し、目的の株を取得する方法について詳述する。
（１）  ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物からの染色体ＤＮＡの抽出
ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物から、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１３，７８−８３（１９８８）やＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，７２６７（１９９０）等に記載の方法により、染色体ＤＮＡを抽出することができる。
（２）  ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物由来のｃｒｔＥ遺伝子を含むＤＮＡ断片の単離
Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓのｃｒｔＥを含むカロテノイド生合成関連酵素遺伝子クラスターは既に塩基配列が公開されており〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７７，２０６４−２０７３（１９９５）〕、該塩基配列情報に基づいて、ＤＮＡ合成機を用いた方法等によりプライマーＤＮＡを作製する。
該プライマーＤＮＡを用い、上記（１）で取得したユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物由来の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法でｃｒｔＥを含む任意のＤＮＡ断片を単離することができる。
ＰＣＲ反応に用いるセンスプライマーとしては、例えば配列番号７に示した配列があげられる。またアンチセンスプライマーとしては、例えば配列番号８に示した配列があげられる。このプライマーの組み合わせにより、ｃｒｔＥをコードするＯＲＦに加え、ｃｒｔＥ上流および下流の一部を含むｃｒｔＥ遺伝子全長を増幅することができる。
ＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴａｋａｒａ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）、ＴａＫａＲａ  ＬＡ−ＰＣＲＴＭ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）またはＥｘｐａｎｄＴＭ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ベーリンガー・マンハイム社製）等市販の酵素を用いることができ、またＰＣＲ反応には、Ｔａｋａｒａ  ＰＣＲ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（宝酒造社製）等を用いることができる。
ＰＣＲの条件として、２ｋｂ以下のＤＮＡ断片を増幅する場合には９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒〜１分間、７２℃で２分間からなる反応工程を１サイクルとして、２ｋｂを超えるＤＮＡ断片を増幅する場合には９８℃で２０秒間、６８℃で３分間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件等をあげることができる。
得られた増幅ＤＮＡ断片を、アガロース電気泳動等の手法を用いて分離する。  分離された増幅ＤＮＡ断片を、例えば、Ｍｅｒｍａｉｄ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ  １０１  Ｉｎｃ．ＣＡ．ＵＳＡ）等をもちいてアガロースゲルより抽出、精製する。
精製された該ＤＮＡを、例えば、ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、適当なベクター、例えばｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に連結する。
また、下記方法により、大腸菌で増幅可能な適切なベクターと連結することができる。
上記増幅ＤＮＡ断片と、大腸菌で増幅可能な適切なベクターを、上記プライマーで付与した制限酵素サイトを認識する制限酵素を用いて切断する。得られた切断ＤＮＡ断片を、各々アガロース電気泳動により分画、回収する。得られた両切断ＤＮＡ断片を常法に従って連結する。
上記方法により、ベクターと連結して得られたプラスミドを用いて、適当な宿主大腸菌、例えばＩＮＶαＦ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）やＤＨ５α（東洋紡社製）に形質転換する。
形質転換体は、ベクターの有する薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を添加した寒天培地、例えば、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを添加したＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養することで選択することができる。
得られた形質転換株より、目的とするＤＮＡを含有したプラスミドを、例えば、モレキュラー・クローニング第二版等に記載された方法により取得する。
取得されたプラスミドに含まれるＰＣＲ増幅断片部分の塩基配列は、例えばＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（パーキンエルマージャパン社製）および３７３Ａシーケンサー（パーキンエルマージャパン社製）を用いることで決定できる。
増幅された配列がｃｒｔＥを含んでいることは、該増幅配列の塩基配列と既知配列情報を比較することで確認することができる。
（３）ｃｒｔＥ活性の低下または欠損したユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物の取得
上記（２）で得られたｃｒｔＥをコードするＤＮＡまたはその塩基配列情報を基にして、ｃｒｔＥ活性の低下または欠損したユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物を取得することができる。
光合成細菌のｃｒｔＥ活性の低下または欠損は、染色体ＤＮＡ上に存在するｃｒｔＥ遺伝子の全てまたは一部に欠失、置換、挿入変異を起こさせることにより達成することができる。またｃｒｔＥ遺伝子の発現を抑制してもよい。
染色体上に存在するｃｒｔＥ遺伝子の全てまたは一部に欠失、置換、挿入変異を起こさせる方法としては、通常用いられるいかなる変異導入方法を用いることができる。
具体的には、以下の（ａ）および（ｂ）の方法をあげることができる。
（ａ）ｃｒｔＥ遺伝子の５’末および３’末を欠いたＤＮＡを含む環状ＤＮＡを目的とする株に導入し、導入した該ＤＮＡと対応する染色体ＤＮＡ上の相同領域との間で組換えを起こさせることで、染色体上の該遺伝子を不完全にする方法。
該方法において、５’末および３’末の欠失は、組換えを起こした株のｃｒｔＥ活性が減少または欠損するような欠失であれば、いかなる欠失であってもよい。また、５’末の欠失の代わりに、該遺伝子の転写に必要な領域の欠失、またはｃｒｔＥ蛋白質の翻訳に必要な領域の欠失を用いてもよい。
環状ＤＮＡとしては、組換え株の選択を容易にするために、薬剤耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を含み、かつ組換え株以外でのマーカー遺伝子の発現を押さえるために導入対象株での自立増幅能を持たないか、または温度感受性複製領域を有するプラスミドのようにある条件のもとで複製不能になる環状ＤＮＡが好ましい。環状ＤＮＡが導入対象株以外での複製能を保持していてもよい。
（ｂ）ｃｒｔＥ遺伝子の全てまたは一部に欠失、置換、挿入変異を起こした変異遺伝子をふくむＤＮＡを、目的とする株に導入し、欠失、置換、挿入変異を挟む２点において、対応する染色体上の相同領域との間で組換えを起こさせることで、染色体上の該遺伝子に欠失、置換、挿入変異を導入する方法。
該方法において、導入する変異遺伝子が有する欠失、置換、挿入変異は、染色体上の該遺伝子にこれらの変異が導入された株のｃｒｔＥ活性が低下または欠損するような変異であれば、いかなる変異であってもよい。
また、染色体上の該遺伝子にこれらの変異が導入された株のｃｒｔＥ活性が低下または欠損するような変異であれば、該遺伝子の転写に必要な領域またはｃｒｔＥ蛋白質の翻訳に必要な領域に欠失、置換、挿入が導入されたＤＮＡを用いることもできる。
該方法においても、組換え株の選択を容易にするために、該ＤＮＡを含む、上記（ａ）の性質を有する環状ＤＮＡを用いることが好ましい。
光合成細菌へのＤＮＡ断片導入法としては、接合伝達による方法、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１，７８４−７９１（１９８３）やＧｅｎｅ，１１８，１４５−１４６（１９９２）等に記載の方法をあげることができる。また、エレクトロポレーション法を用いることもできる。エレクトロポレーションは市販の装置、たとえば、Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  ＩＩ（バイオラッド社製）を用いることができる。
ｃｒｔＥ活性が低下もしくは欠失した株の選択は、同時に染色体に組み込まれた薬剤耐性遺伝子により発現する薬剤耐性をマーカーとして選択することができる。さらに、カロテノイド合成能が低下もしくは欠失して、コロニーの色調が変化した株を選択することで得ることができる。
ｃｒｔＥ遺伝子に変異が導入されていることは、上記（２）で単離した正常なｃｒｔＥ遺伝子を、上記ｃｒｔＥ活性が低下もしくは欠失した株に導入し、カロテノイド生合成能が回復するかどうかにより確認することができる。
［２］  ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物由来のデカプレニル２リン酸合成酵素遺伝子のクローニング
本発明のデカプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡは、ユビキノン−１０を生成する能力を有する、［１］に記載した微生物より、以下の方法で取得することができる。
（１）デカプレニル２リン酸合成酵素遺伝子の部分断片の単離
既知のポリプレニル２リン酸合成酵素のアミノ酸配列の相同性の高い部分を２つまたはそれ以上選択し、選択したアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むオリゴデオキシヌクレオチドをセンスプライマーとして、また選択したアミノ酸配列をコードする塩基配列の相補配列を含むオリゴデオキシヌクレオチドをアンチセンスプライマーとして、ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法を行うことで、該微生物由来のデカプレニル２リン酸合成酵素遺伝子の部分断片を含むＤＮＡを得ることができる。
既知のポリプレニル２リン酸合成酵素遺伝子の配列としては、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈｅｒｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３由来のポリプレニル２リン酸合成酵素遺伝子の配列をあげることができる。これらの配列は、公的機関のデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ、より入手することができる。
ＰＣＲ反応に用いるセンスプライマーとしては、例えば配列番号９に示した配列があげられる。また、アンチセンスプライマーとしては、例えば配列番号１０に示した配列があげられる。これらのオリゴデオキシヌクレオチドは通常用いられるＤＮＡ合成機によって合成することができる。
ＰＣＲ法に用いるＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばＴａｋａｒａ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造社製）等市販の酵素を用いることができ、またＰＣＲ反応には、Ｔａｋａｒａ  ＰＣＲ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ  ４８０（宝酒造社製）等を用いることができる。
ＰＣＲの条件としては、９４℃で４５秒間、３５℃で４５秒間、７２℃で１分間からなる反応工程を５回繰り返した後、９４℃で４５秒間、４５℃で４５秒間、７２℃で１分間のサイクルを３０回繰り返して行う条件をあげることができる。
増幅ＤＮＡ断片の分離、精製および適切なベクターとの連結、連結により得られた組換え体ＤＮＡを用いた形質転換および形質転換体の取得、取得された形質転換株から目的とするＤＮＡを含有したプラスミドＤＮＡの取得、および取得されたプラスミドＤＮＡに含まれるＰＣＲ増幅断片部分の塩基配列の決定は、［１］に記載の方法に準じて行うことができる。
増幅された配列がポリプレニル２リン酸合成酵素遺伝子を含んでいることは、該増幅配列の塩基配列と既知配列情報を比較することで確認することができる。
（２）  デカプレニル２リン酸合成酵素遺伝子の部分断片を用いた全長遺伝子の単離
ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物由来のデカプレニル２リン酸合成酵素遺伝子全体を含むＤＮＡ断片は、該遺伝子の部分配列をもつＤＮＡを用いて、ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物由来のゲノムライブラリーから、例えば、以下の方法で単離することができる。
ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物由来の染色体ＤＮＡを、［１］（１）に記載の方法に準じて抽出後、Ｓａｕ  ３ＡＩ等の適切な制限酵素で部分消化し、得られた消化ＤＮＡ断片を、シュークロース密度勾配超遠心分離等の常法を用いて分画する。
該分画により取得される大きさが３０〜４０ｋｂのＤＮＡ断片を、Ｂａｍ  ＨＩ等の適切な制限酵素で消化したコスミドベクター、例えばＳｕｐｅｒＣｏｓＩに連結してλファージにパッケージングする。
作製した組換えファージを用いて、常法（例えば、モレキュラー・クローニング第二版に記載の方法）に従い適当な宿主、例えば大腸菌ＤＨ５αを形質転換し、形質転換体を得ることで、染色体ＤＮＡライブラリーを作成する。
該形質転換体は、ベクターの有する薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を添加した寒天培地、例えば、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを添加したＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養することで選択することができる。
該形質転換体の保有するコスミドにおいて、ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物由来のデカプレニル２リン酸合成酵素遺伝子全体を含むＤＮＡ断片を有するコスミドは、下記ＤＮＡをプローブとして用いたサザンハイブリダイゼーションにより確認できる。
プローブに用いるＤＮＡは、［２］（１）で決定された塩基配列の全体またはその一部を含むＤＮＡおよびＤＩＧオリゴヌクレオチド・テイリングキット（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて作成することができる。該プローブおよびＤＩＧ  ＤＮＡ検出キット（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて目的のＤＮＡ断片を検出することができる。
また、上記形質転換体より抽出したコスミドを鋳型とし、先に決定されたデカプレニル２リン酸合成酵素遺伝子の部分配列を基にして設計されたセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いたＰＣＲ法による増幅断片の有無により、デカプレニル２リン酸合成酵素遺伝子全体を含むＤＮＡ断片を有するコスミドを確認することもできる。
デカプレニル２リン酸合成酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片は、該ＤＮＡ断片を有するコスミドを制限酵素消化後、アガロースゲル電気泳動等の方法により分画、回収することができる。
デカプレニル２リン酸合成酵素遺伝子を含んでいるＤＮＡ断片の大きさは、常法、例えばモレキュラークローニング第二版に記載の方法に従い、該遺伝子を含むＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、アガロースゲル電気泳動によって分画後、適当な膜上に転写固定し、上記ＤＩＧ標識ＤＮＡ断片をプローブとしたサザンハイブリダイゼーションを行うことで決定することができる。
アガロースゲルから回収したＤＮＡの精製は、例えば、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ  ＩＩ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ  １０１  Ｉｎｃ．ＣＡ．ＵＳＡ）を用いて行うことができる。
該精製されたＤＮＡを、例えばＬｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）等を用いて、適当なベクターを制限酵素消化したものと連結し、組換え体ＤＮＡを作製する。該組換え体ＤＮＡを用いて、例えばＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α等の大腸菌を形質転換し、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を得ることができる。該形質転換体が有するプラスミドＤＮＡは、常法に従い抽出することができる。
必要に応じて、常法、例えば、モレキュラー・クローニング第二版等に記載された方法に従い、該プラスミドＤＮＡを適当な制限酵素にて消化し、得られた制限酵素断片を、分画、精製した後、適当なベクターと連結することで、該プラスミドＤＮＡの制限酵素消化ＤＮＡ断片を有するプラスミドＤＮＡを得ることができる。
得られたプラスミドＤＮＡを用い、ＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（パーキンエルマージャパン社製）および３７３Ａシーケンサー（パーキンエルマージャパン社製）を用いて、全体もしくはその一部の塩基配列を決定することができる。
決定された塩基配列情報に基づき、市販の塩基配列解析ソフトウェア、例えばＧｅｎｅｔｙｘ  Ｍａｃ（ソフトウェアデベロップメント社製）等、を用いて、ＯＲＦおよびそのコードするアミノ酸配列を決定することができる。
決定されたアミノ酸配列を、既知のデカプレニル２リン酸合成酵素のアミノ酸配列と比較することによって、目的とするデカプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡであることを確認することができる。
上記方法により、取得されたデカプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡとして、例えば、配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、配列番号１に記載される塩基配列を持つＤＮＡをあげることができる。
本発明のＤＮＡとしては、上記で取得されるＤＮＡに加え、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつデカプレニル２リン酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも包含される。
［３］ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物由来のｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニング
本発明のｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡは、ユビキノン−１０を生成する能力を有する、［１］に記載した微生物より、ｐ−ヒドロキシ安息香酸オクタプレニルトランスフェラーゼ（ｕｂｉＡ）を欠損した大腸菌（以下、ｕｂｉＡ欠損株と略す）を用い、以下の方法で取得することができる。
ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物由来の染色体ＤＮＡを、［１］（１）に記載の方法に準じて抽出後、Ｓａｕ  ３ＡＩ等の適切な制限酵素で部分消化し、得られた消化ＤＮＡ断片を、シュークロース密度勾配超遠心分離等の常法を用いて分画する。
該分画により取得される大きさが２〜８ｋｂのＤＮＡ断片を、Ｂａｍ  ＨＩ等の適切な制限酵素で消化したプラスミドベクター、例えばｐＵＣ１９と連結することにより組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを用いて、常法（例えば、モレキュラー・クローニング第二版に記載の方法）に従い適当な宿主、例えば大腸菌ＤＨ５αを形質転換して形質転換体を得ることにより、染色体ＤＮＡライブラリーを作製することができる。
該形質転換体は、ベクターの有する薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を添加した寒天培地、例えば、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを添加したＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養することで選択することができる。
該形質転換体の保有するプラスミドを常法に従い抽出し、該プラスミドを用いｕｂｉＡ欠損株を形質転換する。
ｕｂｉＡ欠損株は、公的菌株保存機関である国立遺伝学研究所より入手可能である。ｕｂｉＡ欠損株は、グルコースを単一炭素源として生育可能であるが、コハク酸を単一炭素源とした場合には生育できない。従って、上記形質転換体より抽出したプラスミドがｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを含有していれば、該プラスミドを導入したｕｂｉＡ欠損株は、コハク酸を単一炭素源とした寒天培地上で生育可能になる。この生育を指標として、ｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを含有するプラスミドを選択することができる。
コハク酸を単一炭素源とした寒天培地上で生育可能なｕｂｉＡ欠損株の形質転換体から、該形質転換体が有するプラスミドＤＮＡを抽出し、ＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（パーキンエルマージャパン社製）および３７３Ａシーケンサー（パーキンエルマージャパン社製）等を用いた常法に従って、該プラスミドＤＮＡの塩基配列を決定する。
決定された塩基配列から、市販の塩基配列解析ソフトウェア、例えばＧｅｎｅｔｙｘ  Ｍａｃ（ソフトウェアデベロップメント社製）等を用いて、ＯＲＦおよびそのコードするアミノ酸配列を決定することができる。
決定されたアミノ酸配列を、既知のｐ−ヒドロキシ安息香酸−ポリプレニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と比較することによって、目的とするｐ−ヒドロキシ安息香酸−ポリプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡであることを確認することができる。
上記方法により、取得されたｐ−ヒドロキシ安息香酸−ポリプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡとして、例えば、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、配列番号３に記載される塩基配列を持つＤＮＡをあげることができる。
本発明のＤＮＡとしては、上記で取得されるＤＮＡに加え、配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつｐ−ヒドロキシ安息香酸−ポリプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡも包含される。
［４］  デカプレニル２リン酸合成酵素またはｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼの製造
本発明のポリペプチドは、モレキュラー・クローニング第２版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、本発明のデカプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。
本発明のデカプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡの全長ＤＮＡをもとにして、必要に応じて、該ポリペプチドをコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。
また、必要に応じて、本発明のポリペプチドをコードする部分の塩基配列を、宿主細胞の発現に最適なコドンとなるように塩基を置換したＤＮＡを調製する。該ＤＮＡは本発明のポリペプチドの効率的製造に有用である。
該ＤＮＡ断片、または全長遺伝子を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入する。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。
発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有してなる組換え体ＤＮＡは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成されたベクターであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−４００）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６７９８）より調製、特開昭６０−２２１０９１〕、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等をあげることができる。
プロモーターとしては、宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーターをあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
ユビキノン−１０を生産する能力のある微生物においては、リボソームＲＮＡ遺伝子に存在するプロモーターを用いることが好ましい。リボソームＲＮＡ遺伝子に存在するプロモーターとしてはＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属に属する微生物由来のリボソームＲＮＡ遺伝子に存在するプロモーターをあげることができ、具体的には、配列番号５記載の塩基配列を有するＤＮＡを含むプロモーターをあげることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明の組換え体ＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する微生物、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＧＩ６９８、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＴＢ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４２９７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ、Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ、Ａｎａｂａｅｎａ ｄｏｌｉｏｌｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｂｕｄｅｒｉ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉ���ｏｓｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｗａｒｍｉｎｇｉｉ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｅ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ａｎａｎａｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｏｄｅｓｉａｎｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ  ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｌａｓｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｉｎａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖｏｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、またはＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等をあげることができる。
プロモーターとしては、酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ  １プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ属、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）〕、スフェロプラスト法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）〕、酢酸リチウム法〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１５３，１６３（１９８３）〕、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８〔Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＧＥ１０３〔Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）〕、ｐＡＧＥ２１０等をあげることができる。
プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルの細胞であるＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
動物細胞への組換えベクターの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法〔Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）〕、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。
即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等をあげることができる。
バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）〕、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの卵巣細胞であるＨｉｇｈ  ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）〕等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合タンパク質発現等を行うことができる。
酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
以上のようにして得られる本発明の形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明のデカプレニル２リン酸合成活性またはｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、本発明のポリペプチドを製造することができる。
上記で得られた形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体である場合、該形質転換体を培養する培地として、該形質転換体が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、該形質転換体が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６時間〜７日間である。培養中のｐＨは３．０〜９．０に保持することが好ましい。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用いて行う。
また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）〕、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）〕、ダルベッコ改変ＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）〕、１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）〕等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で、１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該培養物より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
遺伝子の発現方法としては、直接発現以外に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されている方法等に準じて、分泌生産、融合ポリペプチド発現等を行うことができる。
本発明のポリペプチドの生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、使用する宿主細胞や、生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、該方法を選択することができる。
本発明のポリペプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法〔Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）〕、ロウらの方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）〕、または特開平５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該ポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明のポリペプチドの活性部位を含むポリペプチドの手前にシグナルペプチドを付加した形で発現させることにより、本発明のポリペプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。
さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明のポリペプチドを製造することもできる。
形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該ポリペプチドを生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。
動物個体を用いて本発明のポリペプチドを製造する方法としては、例えば公知の方法〔Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）〕に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明のポリペプチドを生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、該ポリペプチドを該動物中に生成・蓄積させ、該動物中より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを製造することができる。該動物中の生成・蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本発明のポリペプチドを製造する方法としては、例えば本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法〔組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，４５（１９９７）〕に準じて栽培し、該ポリペプチドを該植物中に生成・蓄積させ、該植物中より該ポリペプチドを採取することにより、該ポリペプチドを生産する方法があげられる。
本発明の形質転換体により製造されたデカプレニル２リン酸合成活性またはｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを単離精製するためには、通常の酵素の単離精製法を用いることができる。
例えば本発明のポリペプチドが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
また、該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後、破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてポリペプチドの不溶体を回収する。回収したポリペプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈または透析し、該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度を下げることにより、該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。該操作の後、上記と同様の単離精製法により該ポリペプチドの精製標品を得ることができる。
本発明のポリペプチド、あるいは該ポリペプチドに糖鎖の付加されたポリペプチド等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ポリペプチドあるいは該ポリペプチドの誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。
このようにして取得されるポリペプチドとして、例えば、デカプレニル２リン酸合成活性を有するポリペプチドに関しては配列番号２記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドを、ｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドに関しては配列番号４記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドををあげることができる。
本発明のポリペプチドとしては、上記で取得されるポリペプチドに加え、該ポリペプチドの有するアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、デカプレニル２リン酸合成活性を有するポリペプチドまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドも包含される。
また、本発明のポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
［５］ユビキノン−１０の製造
ユビキノン−１０の製造に用いる微生物としては、ｃｒｔＥ活性の低下または欠損した性質、デカプレニル２リン酸合成酵素活性の強化された性質およびＰ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ活性の強化された性質からなる群より選ばれる１つ以上の性質を有するユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物が好ましい。
ｃｒｔＥ活性の低下または欠損した性質を有するユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物としては、［１］で取得される微生物をあげることができる。
デカプレニル２リン酸合成酵素活性の強化された性質またはＰ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ活性の強化された性質を有する微生物は、［１］記載の変異導入法に準じて、ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物より取得することができる。また、［２］および［３］に記載の方法で取得されるデカプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡまたはＰ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡをユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物に、［４］に記載の方法に準じて導入することにより取得することができる。
また、上記の方法を組み合わせて、ｃｒｔＥ活性の低下または欠損した性質、デカプレニル２リン酸合成酵素活性の強化された性質およびＰ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ活性の強化された性質からなる群より選ばれる１つ以上の性質を有するユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物を取得することができる。
ユビキノン−１０は、ｃｒｔＥ活性の低下または欠損した性質、デカプレニル２リン酸合成酵素活性の強化された性質およびＰ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ活性の強化された性質からなる群より選ばれる１つ以上の性質を有する、ユビキノン−１０を生成する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中にユビキノン−１０を生成蓄積させ、該培養物から該ユビキノン−１０を採取することにより製造することができる。
培養は、［４］記載の培養方法に準じて行うことができる。培養中必要に応じて、ユビキノン−１０の生合成前駆体であるシキミ酸、コリスミ酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸などの芳香族化合物や、ＩＰＰ、ＦＰＰなどのイソプレノイド化合物を培地に添加してもよい。
培養液から、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等、通常の有機合成化学で用いられる採取方法を用いて、ユビキノン−１０を採取することができる。
採取されたユビキノン−１０は、１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル、１Ｈ−ＮＭＲスペクトル、マススペクトル、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、発色法等により確認および定量することができる。
［６］効率的な遺伝子発現
上記［４］のポリペプチドの製造法に記載されたリボソームＲＮＡ遺伝子に存在するプロモーターは、上記［４］のポリペプチドの製造法に有用なだけでなく、一般的なポリペプチドの製造法においても有用である。
該リボソームＲＮＡ遺伝子に存在するプロモーターの有する塩基配列からなるＤＮＡの下流に、発現を目的とするポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入することにより、効率的に該ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させることができ、該ポリペプチドを製造することができる。
リボソームＲＮＡ遺伝子としては、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ属に属する微生物由来のリボソームＲＮＡ遺伝子をあげることでる。
リボソームＲＮＡ遺伝子に存在するプロモーターとして、具体的には、配列番号５記載の塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下の実施例で示した遺伝子組換え実験は、特に言及しない限りモレキュラー・クローニング第二版に記載の方法（以下、常法と呼ぶ）を用いて行った。
発明を実施するための最良の形態
実施例１  ｃｒｔＥの低下または欠損した株の造成
（１）ｃｒｔＥをコードするＤＮＡを含むＤＮＡの取得
既に公開されているＲ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓのｃｒｔＥを含むカロテノイド生合成酵素遺伝子クラスター塩基配列〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７７，２０６４−２０７３（１９９５）〕を利用して、配列番号７または８で示される塩基配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドをＤＮＡ合成機を用いて合成した。該ＤＮＡをＰＣＲ反応のプライマーセットとして用いた。
Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ＫＹ４１１３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６７５）の染色体ＤＮＡを、ＬＢ培地〔１％  Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％  Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）、０．５％  ＮａＣｌ〕５０ｍｌを用い、一晩培養した後、菌体を回収した。
該菌体を一度凍結融解させた後、０．５ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含むバッファー〔５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、２０ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）〕１０ｍｌに懸濁し、３７℃で３時間インキュベートした。
該懸濁液にｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ（１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌ、１０％  ＳＤＳ  １００μｌ添加し、５０℃で３時間インキュベートした。室温に戻してフェノール・クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿させて染色体ＤＮＡを精製した。
該染色体ＤＮＡを鋳型に、配列番号７または８に示された塩基配列を有する、上記で合成したプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅をした。
ＰＣＲは、ＴａＫａＲａ  ＬＡ−Ｔａｑを用い、９８℃で２０秒間、６８℃で５分間からなる反応工程を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。
ＰＣＲにより増幅された、目的とする約２．５ｋｂのＤＮＡ断片を平滑処理、りん酸化処理したのち、プラスミドベクターｐＵＣ１９のＳｍａ  Ｉサイトに挿入し、組換えプラスミドを作製した。
該組換えプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡社製）を形質転換し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天培地に塗布し、形質転換株を取得した。
該形質転換体よりプラスミドを抽出し、該プラスミドのＳｍａ  Ｉサイトに挿入されているＤＮＡの塩基配列を決定した。
決定された塩基配列より、該ＤＮＡがｃｒｔＥの上流と下流のＯＲＦの一部を含んでいることを確認した。
該プラスミドをｐＵＣＲＴＥ−１と命名した。
ｐＵＣＲＴＥ−１の制限酵素部位の解析により、Ｂａｌ  ＩとＳｔｕ  ＩがｃｒｔＥの内部にのみ各々一個所存在しており、両制限酵素部位が約４５０ｂｐ離れていることが分かった。従ってこの約４５０ｂｐ領域を欠失させることにより、ｃｒｔＥのＧＧＰＰ合成活性を低下あるいは欠損させることが可能と考え、以下の実験を行った。
ｐＵＣＲＴＥ−１をＢａｌ  ＩとＳｔｕ  Ｉで二重消化し、アガロースゲル電気泳動で完全消化されていることを確認した後、約４．６ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてＤＮＡ断片を精製した。該精製したＤＮＡ断片を平滑処理・脱りん酸化処理をした。
ｃｒｔＥ欠損株の選択を容易にするため、得られたＤＮＡにカナマイシン耐性遺伝子を挿入したプラスミドを以下のように作製した。
Ｔｎ５由来のカナマイシン耐性遺伝子と、Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のｇｌｎＢプロモーター領域〔Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０，２１４３−２１５１（１９９４）〕をそれぞれＰＣＲで単離して連結し、平滑処理とりん酸化処理を施して、先に調製した４．６ｋｂ  ＤＮＡ断片と連結し、組換えプラスミドを作製した。
該組換えプラスミドを用いて、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換後、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天培地に塗布し、形質転換株を取得した。
該形質転換株よりプラスミドを抽出し、ｃｒｔＥの欠失部位にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されていることを確認した。
該プラスミドをｐＵ△ＣＲＴＥ−１と命名した。
（２）ＧＧＰＰ合成活性の低下または欠損した株の取得
上記（１）で取得したｐＵ△ＣＲＴＥ−１を、Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓＫＹ４１１３株に、以下の方法で導入した。
ＫＹ４１１３株を、ＬＢ液体培地に植菌し、対数増殖期まで培養した。培養後、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を、１０％  グリセロールおよび１ｍｍｏｌ／ｌ  ＨＥＰＥＳを含有する水溶液で２回洗浄し、培地成分を可能な限り除去した。
得られた洗浄菌体およびｐＵ△ＣＲＴＥ−１  １０μｇをエレクトロポレーション用の０．１ｃｍ幅キュベット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）に入れ、ジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用い、４００Ω、２５μＦ、１２．５ｋｖ／ｃｍの条件でエレクトロポレーションを行い、上記菌体にｐＵ△ＣＲＴＥ−１を導入した。
該菌体を、ＳＯＣ培地〔Ｂａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）２０ｇ、Ｂａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）５ｇ、５ｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ  ２ｍｌ、２ｍｏｌ／ｌ  ＫＣｌ  １．２５ｍｌを添加し、水で９９０ｍｌに調製した溶液をオートクレーブした後、該溶液に２ｍｏｌ／ｌグルコース溶液を１０ｍｌ添加した培地〕を用い、３０℃で３時間培養した。得られた培養液をカナマイシンを１０μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養した。
該培養により、コロニーが１８個形成され、うち、１１個は野生株と同様赤いカロテノイド色素を産生しており、７個はカロテノイド生産性を欠失していた。  各々のコロニーを培養後、染色体ＤＮＡを抽出して解析した。
カロテノイド生産性を失っていた７株は、染色体上のｃｒｔＥ遺伝子内にカナマイシン耐性遺伝子が挿入されていることが分かった。
即ち、エレクトロポレーションで導入されたｐＵ△ＣＲＴＥ−１が、カナマイシン耐性遺伝子の上流と下流の領域で、染色体の相同領域と２点交差し、挿入され、ｃｒｔＥ遺伝子が欠失してｃｒｔＥ遺伝子にコードされる酵素活性（ＧＧＰＰ合成活性）を失い、カロテノイドを産生出来なくなったと考えられた。
これらの株の染色体ＤＮＡには、ｐＵ△ＣＲＴＥ−１にあるアンピシリン耐性遺伝子は導入されておらず、ベクター由来のＤＮＡは染色体ＤＮＡに組み込まれていなかった。
カロテノイド生産性を保持していた１１株では、染色体上にアンピシリン耐性遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子の両方が確認されたため、１点交差でｐＵ△ＣＲＴＥ−１の配列が染色体ＤＮＡに挿入され、正常なｃｒｔＥを保持している株であることがわかった。
取得されたｃｒｔＥ欠損株をＫＹ４１１３△ｃｒｔＥ−１〜７株と命名した。  該ＫＹ４１１３△ｃｒｔＥ−１〜７株に、正常なｃｒｔＥ遺伝子を導入し、カロテノイド産生能が復帰することより、ｃｒｔＥ欠損株であることを確認した。即ち、広宿主域ベクターｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２，２３９２（１９９０）〕に正常なｃｒｔＥ遺伝子を挿入した組換えプラスミドを作成し、該プラスミドを該菌株に導入し、カロテノイド色素を産生することを確認した。
実施例２  ｃｒｔ欠損株によるユビキノン−１０の生産
実施例１で取得したＫＹ４１１３△ｃｒｔＥ−１〜７株を、種培地〔グルコース  ２％、ペプトン  １％、酵母エキス  １％、ＮａＣｌ  ０．５％（ｐＨ７．２、ＮａＯＨで調整）〕を５ｍｌ入れた試験管に一白金耳植菌し、３０℃で２４時間培養した。
得られた培養液０．５ｍｌを、ユビキノン−１０生産培地〔廃糖蜜  ４％、グルコース  ２．７％、コーンスチープリカー  ４％、硫酸アンモニウム  ０．８％、リン酸１カリウム  ０．０５％、リン酸２カリウム  ０．０５％、硫酸マグネシウム・７水和物  ０．０２５％、硫酸第一鉄・７水和物  ３ｍｇ／ｌ、チアミン  ８ｍｇ／ｌ、ニコチン酸  ８ｍｇ／ｌ、トレースエレメント（Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ  ８８ｍｇ／ｌ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ  ３７ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ８．８ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ２７０ｍｇ／ｌ、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ  ７．２ｍｇ／ｌ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ  ９７０ｍｇ／ｌを含む溶液）１ｍｌ／ｌを含む培地をｐＨ９に調整後、炭酸カルシウム  １％を添加してオートクレーブ滅菌したもの〕を５ｍｌ入れた試験管に添加し、３０℃で５日間振盪培養した。
培養終了後のブロス３００μｌに２−ブタノール３００μｌおよびガラスビーズ３００μｌを加え、マルチビーズショッカーＭＢ−２００（安井器械社製）で５分間菌体を破砕しつつ溶媒抽出した。
得られた抽出液を遠心分離し、２−ブタノール層を採取した。下記条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行うことにより、２−ブタノール層中のユビキノン−１０の生産量を算定した。
ＨＰＬＣ条件
装置：島津製作所製ＬＣ−１０Ａ
カラム：Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＯＤＳ−ＨＧ−５（野村化学）
移動相：メタノール：ｎ−ヘキサン＝８：２
流速  ：１ｍｌ／ｍｉｎ
測定波長：２７５ｎｍ
結果を第１表に示す。
0004668495.tif 000002
ユビキノン−１０の生成量は、コントロールのＫＹ４１１３株と比較し、ＫＹ４１１３△ｃｒｔＥ−１〜７株は有意に高かった。即ち、Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓのｃｒｔＥ活性を欠損させることにより、ユビキノン−１０の生産性を向上させることができることを初めて見出した。
また、欠損を導入したＤＮＡ断片を用いたエレクトロポレーション法による遺伝子破壊は、非常に優れた方法であることがわかった。
即ち、該方法においては、接合法で必要な特殊なベクターやホストを必要とせず、光合成細菌で自律複製できないベクター、例えば、ｐＵＣ１９等であれば全て利用でき、ＰＣＲ増幅断片などの直鎖状ＤＮＡも利用することができる。
本方法により、ｃｒｔＥ遺伝子産物を介してカロテノイドやバクテリオクロロフィル側鎖などへ流れていたＦＰＰが、ユビキノン生合成系へ流れることでユビキノン−１０蓄積量が増加したものと思われる。本発明で得られた変異株は、ｃｒｔＥ以外に変異が新たに導入されることがないため、親株と同等の生育および栄養要求性を有する。
実施例３  光合成細菌Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓのデカプレニル２リン酸合成酵素遺伝子（ＤＰＰＳ）のクローニング
本発明者らは、ユビキノン生合成系を強化することにより、効率的にユビキノン−１０を製造することができると考え、ユビキノン生合成系に関わる遺伝子の取得を試みた。
遺伝子として、最初にデカプレニル２リン酸合成酵素遺伝子（ＤＰＰＳ）に注目した。
ＤＰＰＳは、ｃｒｔＥ欠損で過剰になると予想されるＦＰＰをユビキノン生合成系へ効率よく引き込める可能性が高いため、ｃｒｔＥ欠損株に該ＤＰＰＳを導入した株は、ｃｒｔＥを欠損していない株に該ＤＰＰＳを導入した株よりも、ユビキノン−１０をより効率的に生産する可能性がある。
Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のデカプレニル２リン酸合成酵素遺伝子の取得には、ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ＰＣＲ法〔バイオ実験イラストレイテッド▲３▼秀潤社（１９９）〕を用いた。
他生物種由来の既知ポリプレニル２リン酸合成酵素遺伝子をＧｅｎｂａｎｋのＤＮＡデータベースより検索した。その結果Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｇ．ｓｕｂｏｘｙｄａｎｓ、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ、Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｓ．ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＰＣＣ６８０３等に該遺伝子の存在が確認された。これら配列を比較し、高度に保存されているアミノ酸配列を抽出した。抽出されたアミノ酸配列に対応する塩基配列をＲ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓのコドン使用頻度を考慮にいれて設計し、センスプライマーとして配列番号９に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片を、アンチセンスプライマーとして配列番号１０に記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をＤＮＡ合成機を用いて合成した。
Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ＫＹ４１１３株（ＦＥＲＭ  Ｐ−４６７５）の染色体ＤＮＡを鋳型として、上記プライマーと、ＥｘｐａｎｄＴＭ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用い、ＤＮＡＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（パーキンエルマージャパン社製）でＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、９４℃で４０秒間、６０℃で４０秒間、７２℃で４５秒間からなる反応工程を１サイクルとして、３５サイクル反応させる条件で行った。
ＰＣＲにより、約４００ｂｐの増幅断片を取得した。
該ＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、既知のポリプレニル２リン酸合成酵素と高い相同性があることを確認した。該ＤＮＡ断片を精製し、ＤＩＧ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いてＤＩＧ標識した。
Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ＫＹ４１１３株のデカプレニル２リン酸合成酵素遺伝子の全長を取得するため、ＫＹ４１１３株のゲノムライブラリーを下記方法で作製した。
ＫＹ４１１３株をＬＢ培地で一晩培養し、染色体ＤＮＡを抽出した。制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化してショ糖密度勾配超遠心法により４〜６ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。
該ＤＮＡ断片とＢａｍ  ＨＩ消化したベクターｐＵＣ１９をＬｉｇａｔｉｏｎ  Ｐａｃｋ（ニッポンジーン社製）を用いて連結し、組換えプラスミドを作製した。
得られた組換えプラスミドを用いて大腸菌ＤＨ５αを形質転換後、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートに塗布し、約１００００個の形質転換株を取得した。
上記方法で取得したＤＩＧ標識ＤＮＡ断片をプローブとして、該形質転換株に対してコロニーハイブリダイゼーション法によるスクリーニングを行い、ＤＩＧ標識ＤＮＡ断片とハイブリダイズする合計５つのコロニーを取得した。
該コロニー由来の菌株より、常法によりプラスミドを抽出し、制限酵素消化することにより、挿入ＤＮＡ断片の大きさを比較した。
上記５株の挿入ＤＮＡ断片の大きさは同じであり、該ＤＮＡ断片をシークエンスしたところ、共通の配列を有していた。
該配列には、他生物種のポリプレニル２リン酸合成酵素遺伝子と相同性の高い３３３アミノ酸をコードするＯＲＦが存在していた。
該塩基配列を配列番号１に、アミノ酸配列を配列番号２に示す。
実施例４  組換えＲ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓによるユビキノン−１０の生産
実施例３でクローン化されたＤＰＰＳ遺伝子を含む約４ｋｂのＤＮＡ断片を、広宿主域ベクターｐＥＧ４００と連結した組換えプラスミドを作成した。このプラスミドをｐＥＧＤＰＰＳ−１と命名した。
ｐＥＧＤＰＰＳ−１およびコントロールとしてｐＥＧ４００を、ＫＹ４１１３株と実施例１で取得したＫＹ４１１３△ｃｒｔＥ−１株に、エレクトロポレーション法で導入した。エレクトロポレーションはジーンパルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いて、４００Ω、２５μＦ、１２．５ｋｖ／ｃｍの条件で行った。
エレクトロポレーションを行った後、プラスミド導入菌体をＳＯＣ培地を用い、３０℃で３時間培養後、スペクチノマイシンを１００μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養した。
生育してきた形質転換株を培養し、得られた菌体よりプラスミドを抽出し、各々の株が導入したプラスミドを保持していることを確認した。
得られた該形質転換体を、ＫＹ４１１３／ｐＥＧＤＰＰＳ−１、ＫＹ４１１３／ｐＥＧ４００、ＫＹ４１１３△ｃｒｔＥ−１／ｐＥＧＤＰＰＳ−１およびＫＹ４１１３△ｃｒｔＥ−１／ｐＥＧ４００とそれぞれ命名した。
取得した形質転換体を、種培地にスペクチノマイシンを１００μｇ／ｍｌ加えたものを５ｍｌ入れた試験管に、それぞれ一白金耳ずつ植菌し、３０℃で２４時間培養した。
得られた培養液０．５ｍｌを、ユビキノン−１０生産培地にスペクチノマイシンを１００μｇ／ｍｌ加えたものを５ｍｌ入れた試験管にそれぞれ添加し、３０℃で５日間振盪培養した。
培養終了後の培養液から、実施例２に記載の方法に準じてユビキノン−１０を抽出し、ＨＰＬＣで定量分析することによりユビキノン−１０の生産量を算定した。
結果を第２表に示す。
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ユビキノン−１０の生成量は、コントロールのＫＹ４１１３／ｐＥＧ４００株と比較し、ＫＹ４１１３／ｐＥＧＤＰＰＳ−１株は有意に高かった。さらに、宿主にＫＹ４１１３△ｃｒｔＥ−１株を用いることによって、より高いユビキノン−１０生産性を示した。
以上のことより、ユビキノン−１０生合成において、デカプレニル２リン酸の合成が律速になっていること、ｃｒｔＥ遺伝子欠損によりデカプレニル２リン酸合成酵素の基質であるＦＰＰプールが増大することがわかった。
ＫＹ４１１３△ｃｒｔＥ−１／ｐＥＧＤＰＰＳ−１株において、他の組換え株では観察されない未知物質がＨＰＬＣ分析により検出されたため、該物質を単離精製して、吸収スペクトル解析、および、マススペクトル解析した。
解析の結果、該未知物質はユビキノン−１０生合成中間体であることが判明した。ＤＰＰＳの活性強化により、デカプレニル２リン酸の合成より下流の生合成に新たな律速ポイントが存在あるいは生じたものと推定された。これら知見は、我々が初めて見出したものである。
実施例５  高発現型プロモーターの探索
実施例４の結果より、ユビキノン−１０生合成においてデカプレニル２リン酸の合成が律速になっていることが判明したため、より強力なプロモーターを用いてＤＰＰＳを強発現させることができれば、ユビキノン−１０生産性が更に向上すると推定した。
ユビキノン−１０を生産する能力を有する微生物のプロモーターに関して、嫌気光合成培養条件で高発現するプロモーターに関する知見はあるが、好気従属栄養培養条件下での知見は殆ど無い。
嫌気光合成培養条件で高発現するプロモーターに関しては、Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ由来のグルタミン合成酵素遺伝子（ｇｌｎＢ）のプロモーターを用いて構築された組換えプラスミドを導入したＲ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの嫌気培養例が報告されている（特開平８−１０７７８９）。
該報告に基づき、Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のｇｌｎＢ遺伝子上流配列〔Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４０，２１４３−２１５１（１９９４）〕をＤＰＰＳをコードするＤＮＡの上流に連結させた組換えプラスミドｐＥＧｇｌｎＢ−ＤＰＰＳ−１を構築し、Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓＫＹ４１１３株に導入した株を作製したが、ユビキノン−１０生産性を向上させることはできなかった。
新たに、強力に発現するプロモーターを探索し、ｒＲＮＡのプロモーターに効果のあることを見いだした。
Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓではｒＲＮＡ遺伝子配列が既に公開されており、ｒｒｎＡ、ｒｒｎＢ、ｒｒｎＣの３種類が知られているため〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，７２６７−７２７７（１９９０）〕、該ｒＲＮＡ遺伝子上流配列を、以下の方法で、ＰＣＲクローニングした。
既知配列情報を基に、例えばｒｒｎＣ遺伝子の上流をクローニングするために、配列番号１１記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をセンスプライマーとして、配列番号１２記載の塩基配列を有するＤＮＡ断片をアンチセンスプライマーとして設計した。設計に際し、センスプライマーには制限酵素Ｘｂａ  Ｉサイトを、アンチセンスプライマーには制限酵素Ｋｐｎ  Ｉサイトを付加し、さらにアンチセンスプライマーには、リボソーム結合サイトをデザインした。
Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ＫＹ４１１３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６７５）の染色体ＤＮＡを鋳型として、上記プライマーと、ＥｘｐａｎｄＴＭ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ベーリンガー・マンハイム社製）を用い、ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（パーキンエルマージャパン社製）でＰＣＲを行った。
ＰＣＲは、９４℃で４０秒間、６０℃で４０秒間、７２℃で４５秒間からなる反応工程を１サイクルとして、３０サイクル反応させる条件で行った。
ＰＣＲにより約２００ｂｐの増幅断片を取得した。該ＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、目的のＤＮＡ断片であることを確認した。
該ＤＮＡ断片を、カナマイシン耐性遺伝子上流に連結して広宿主域ベクターｐＥＧ４００に挿入した組換えプラスミドを作成した。
Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ＫＹ４１１３株に該組換えプラスミドをエレクトロポレーション法で導入し、得られた株を、スペクチノマイシン１００μｇ／ｌ含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養して形質転換株を取得した。
該形質転換株をカナマイシンを含むＬＢ寒天培地で評価した。
コントロールのｐＥＧ４００を導入した形質転換株ではカナマイシン１０μｇ／ｌで生育しなかったが、ｒｒｎＣ上流のＤＮＡを有する組換えプラスミドを導入した形質転換株ではカナマイシン１００μｇ／ｌでも生育可能であったことより、取得したｒＲＮＡ上流配列が強いプロモーター活性を有することを確認した。該プロモータを用いて、以下の方法でＤＰＰＳ遺伝子の発現を試みた。
実施例３で確認されたＲ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のＤＰＰＳ遺伝子配列情報を基に、そのＯＲＦ部分をＰＣＲ増幅した。プライマーには、センスプライマーとして、制限酵素Ｋｐｎ  Ｉサイト（５’ｃｃｇｇｔａｃｃ  ３’）を配列番号１の１〜２４番の塩基配列を有するＤＮＡの５’末端に付加したＤＮＡ、アンチセンスプライマーとして、付加配列（５’ｃｃ  ３’）−制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩサイト（５’ｇａａｔｔｃ  ３’）−終始コドン（５’ｔｃａ  ３’）を、配列番号１の９７９〜９９０番の塩基配列の相補配列の５’末端に付加したＤＮＡを用いた。該プライマイーセットを用いて実施例３の方法に準じてＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲにより得られた増幅ＤＮＡ断片の両末端をＫｐｎ  ＩおよびＥｃｏ  ＲＩで消化後、常法により該ＤＮＡ断片を精製した。
上記でＰＣＲ増幅したプロモター領域のＤＮＡをＸｂａ  ＩとＫｐｎ  Ｉで消化して精製した。
上記２つのＤＮＡ断片を、広宿主域ベクターｐＥＧ４００のＸｂａ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＩ二重消化物に連結することで、組換えプラスミドを取得し、該組換えプラスミドに挿入したＤＮＡの塩基配列を決定し、目的とするｒｒｎＣ上流配列直下にＤＰＰＳ遺伝子が連結された組換えプラスミドであることを確認した。該組換えプラスミドをｐＥＧｒｒｎＣ−ＤＰＰＳ−１と命名した。
また、既に報告のあるｇｌｎＢ上流配列を用いてＤＰＰＳ遺伝子を発現させるようにしたプラスミドｐＥＧｇｌｎＢ−ＤＰＰＳ−１も同様に構築した。
実施例６  デカプレニル２リン酸合成酵素遺伝子高発現型プラスミドを有する形質転換株を用いたユビキノン−１０の生産
実施例５で構築した組換えプラスミドｐＥＧｒｒｎＣ−ＤＰＰＳ１およびコントロールとしてｐＥＧ４００、ｐＥＧＤＰＰＳ−１、ｐＥＧｇｌｎＢ−ＤＰＰＳ１を、ＫＹ４１１３株にエレクトロポレーション法で導入した。
該該プラスミドを導入した菌体を、ＳＯＣ培地を用い、３０℃で３時間培養した。得られた培養液をスペクチノマイシンを１００μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養した。
生育してきた形質転換株を培養して得られた菌体よりプラスミドを抽出し、各々導入したプラスミドを保持していることを確認した。
上記方法で取得された形質転換株をＫＹ４１１３／ｐＥＧｒｒｎＣ−ＤＰＰＳ１、ＫＹ４１１３／ｐＥＧ４００、ＫＹ４１１３／ｐＥＧＤＰＰＳ−１およびＫＹ４１１３／ｐＥＧｇｌｎＢ−ＤＰＰＳ１とそれぞれ命名した。
取得した形質転換株を、種培地にスペクチノマイシンを１００μｇ／ｍｌ加えたものを５ｍｌ入れた試験管に、それぞれ一白金耳植菌し、３０℃で２４時間培養した。
得られた培養液０．５ｍｌを、ユビキノン−１０生産培地にスペクチノマイシンを１００μｇ／ｍｌ加えたものを５ｍｌ入れた試験管に、それぞれ添加し、３０℃で５日間振盪培養した。
培養終了後のブロスから、実施例２に記載の方法に準じてユビキノン−１０を抽出し、ＨＰＬＣで定量分析することによりユビキノン−１０の生産量を算定した。
結果を第３表に示す。
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ユビキノン−１０の生成量が、ＫＹ４１１３／ｐＥＧｒｒｎＣ−ＤＰＰＳ−１で最も高かったことより、デカプレニル２リン酸合成酵素の発現を強化することにより、ユビキノン−１０生産性を非常に効率よく向上させることができることがわたった。また、ｒＲＮＡ由来のプロモーターは、これまで知られているｇｌｎＢプロモーターよりはるかに強力であり、ユビキノン−１０の製造に有用であることが判明した。
実施例７  Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来ｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング
Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６７５の染色体ＤＮＡを実施例１（１）の方法で取得し、取得された２００μｇの染色体ＤＮＡ２００μｇをＳａｕ  ３ＡＩで部分消化した。
得られた部分消化ＤＮＡ断片を、シュークロース密度勾配超遠心分離により分画し、大きさが２〜８ｋｂのＤＮＡ断片を、Ｂａｍ  ＨＩで消化したプラスミドベクターｐＵＣ１９に連結した。該連結産物を用いて常法に従い大腸菌ＤＨ５α株を形質転換して得られた菌体を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを添加したＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一晩培養して約５万個の形質転換株からなるゲノムライブラリーを作製した。
該ゲノムライブラリーを構成する形質転換株の保有するプラスミドを常法に従い抽出し、該プラスミドを用い、ｐ−ヒドロキシ安息香酸−オクタプレニルトランスフェラーゼ（ｕｂｉＡ）を欠損した株であるｕｂｉＡ欠損株を形質転換した。
得られた形質転換体を、コハク酸を単一炭素源としたＭ９最少寒天培地（Ｎａ２ＨＰＯ４  ６ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ３ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  １ｇ／ｌ、Ｂａｃｔｏ  Ａｇａｒ  １．８％を含む溶液をオートクレーブ後、別蒸したＭｇＳＯ４、ビタミンＢ１、コハク酸、メチオニンをそれぞれ１ｍｍｏｌ／ｌ、４ｍｇ、０．４％、５０ｍｇ添加した培地）に塗布し、培養した。  コハク酸を単一炭素源としたＭ９最少寒天培地で生育した形質転換株１株より、常法に従いプラスミドを抽出し、再度ｕｂｉＡ欠損株に導入して、該プラスミドによりｕｂｉＡ欠損株にコハク酸単一炭素源での生育能が付与されることを確認した。
該プラスミドに挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列を、３７３Ａシーケンサー（パーキンエルマージャパン社製）を用いて決定した。
決定された塩基配列をＧｅｎｅｔｙｘ  Ｍａｃ（ソフトウェアデベロップメント社製）で解析し、既知のｐ−ヒドロキシ安息香酸−ポリプレニルトランスフェラーゼのアミノ酸配列と相同性の高いポリペプチドをコードするＯＲＦが存在することを確認した。
実施例８  ｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼ遺伝子高発現型プラスミドを有する形質転換株によるユビキノン−１０の生産
実施例７で見出された配列情報を基にＰＣＲ用プライマーを設計した。その際、センスプライマーには制限酵素Ｋｐｎ  Ｉ、アンチセンスプライマーには制限酵素Ｅｃｏ  ＲＩ認識配列をそれぞれの５’末端に付加したプライマーを用いた。
Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ  ＫＹ４１１３株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４６７５）染色体ＤＮＡを鋳型として、ｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅した。
得られた増幅ＤＮＡ断片の両末端をＫｐｎ  ＩおよびＥｃｏ  ＲＩで消化して、常法によりＤＮＡ断片を精製した。
上記で取得したＤＮＡ断片、および実施例５で取得した、両端にＸｂａ  ＩおよびＫｐｎ  Ｉ認識配列を有するｒｒｎＣ由来のプロモータＤＮＡの２つのＤＮＡ断片を、広宿主域ベクターｐＥＧ４００のＸｂａ  Ｉ、Ｅｃｏ  ＲＩ二重消化物に連結し、組換えプラスミドを得た。
該組換えプラスミドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換して得られる形質転換株より、該形質転換株が保有するプラスミドを常法により抽出し、該プラスミドの挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。
該挿入ＤＮＡ断片の塩基配列を解析することにより、ｒｒｎＣ由来のプロモータの直下にｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡが連結されたプラスミドであることを確認した。該プラスミドをｐＥＧｒｒｎＣ−ｕｂｉＡ１と命名した。
同様の方法で、ＫＹ４１１３株由来のｇｌｎＢプロモーター下流にｐ−ヒドロキシ安息香酸−デカプレニルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡを連結させたプラスミドを構築し、該プラスミドをｐＥＧｇｌｎＢ−ｕｂｉＡ１と命名した。
構築したプラスミドｐＥＧｒｒｎＣ−ｕｂｉＡ１、ｐＥＧｇｌｎＢ−ｕｂｉＡ１およびコントロールとしてｐＥＧ４００を、ＫＹ４１１３株にエレクトロポレーション法で導入した。
プラスミドを導入した菌体を、ＳＯＣ培地を用い、３０℃で３時間培養した。得られた培養液をスペクチノマイシンを１００μｇ／ｍｌ含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で３日間培養した。
生育して来た形質転換株を培養して得られた菌体よりプラスミドを抽出し、各々導入したプラスミドを保持していることを確認した。
このようにして得られた形質転換株をＫＹ４１１３／ｐＥＧｒｒｎＣ−ｕｂｉＡ１、ＫＹ４１１３／ｐＥＧｇｌｎＢ−ｕｂｉＡ１、ＫＹ４１１３／ｐＥＧ４００とそれぞれ命名した。
取得した菌株を、種培地にスペクチノマイシンを１００μｇ／ｍｌ加えたものを５ｍｌ入れた試験管に、それぞれ一白金耳植菌し、３０℃で２４時間培養した。
得られた培養液０．５ｍｌを、ユビキノン−１０生産培地にスペクチノマイシンを１００μｇ／ｍｌ加えたものを５ｍｌ入れた試験管に、それぞれ添加し、３０℃で５日間振盪培養した。
培養終了後のブロスから、実施例２に記載の方法に準じてユビキノン−１０を抽出し、ＨＰＬＣで定量分析することによりユビキノン−１０の生産量を算定した。
結果を第４表に示す。
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ユビキノン−１０の生成量は、コントロールのＫＹ４１１３／ｐＥＧ４００株と比較し、ＫＹ４１１３／ｐＥＧｇｌｎＢ−ｕｂｉＡ１株およびＫＹ４１１３／ｐＥＧｒｒｎＣ−ｕｂｉＡ１株は有意に高かった。比較した形質転換株の中で、ＫＹ４１１３／ｐＥＧｒｒｎＣ−ｕｂｉＡ１株が最も高いユビキノン−１０生産性を示した。
産業上の利用可能性
本発明により、心臓病の症状改善や抗酸化機能物質として有用なユビキノン−１０の製造法、該製造法に有用なＤＮＡおよびポリペプチド、該製造に有用な微生物、該微生物における遺伝子発現法、および該微生物の育種法を提供することができる。
配列表フリーテキスト
配列番号７−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号８−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号９−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１０−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号１２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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