(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３で示されるアミノ酸配列を含んでなるＮ．ＢｓｔＮＢＩ制限エンドヌクレアーゼをコードしている単離ＤＮＡ。
【請求項２】
ＤＮＡが配列番号：２で示される塩基配列を含んでなる、請求項１に記載の単離ＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の単離ＤＮＡを含んでなる、組換えベクター。
【請求項４】
請求項３に記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換細胞。
【請求項５】
ＡＴＣＣ受理番号ＰＴＡ−１９２５株である請求項４に記載の形質転換細胞。
【請求項６】
Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ制限エンドヌクレアーゼの発現に適している条件下で請求項４又は５に記載の形質転換細胞を培養することを含んでなるＮ．ＢｓｔＮＢＩ制限エンドヌクレアーゼを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ切断（ニッキング）エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードしている組換えＤＮＡ、並びに該組換えＤＮＡからＮ．ＢｓｔＮＢＩ切断エンドヌクレアーゼの産生に関する。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ切断エンドヌクレアーゼは元々バシラス・ステアロテルモフィラス（Bacillus stearothermophilus）から単離される。これは簡単な非対称配列、５’−ＧＡＧＴＣ−３’を認識し、そしてその認識部位の３’−末端から４塩基離れて、１本のＤＮＡ鎖（ストランド）だけを解裂する。
【０００２】
本発明はまた、ストランド置換増幅適用（ＳＤＡ）における切断エンドヌクレアーゼの使用にも関する。更に詳細には、本発明は、このような増幅を修飾（特に、α−チオホスフェート置換）ヌクレオチドの使用に関する技術的な制限から解放することに関する。
【０００３】
（背景技術）
制限エンドヌクレアーゼは特定のＤＮＡ配列を認識しそして解裂する酵素である。通常は、対応するＤＮＡメチルトランスフェラーゼが存在しており、そしてこれは内在性宿主ＤＮＡをメチル化し、そしてそれ故或る種の制限エンドヌクレアーゼの消化から保護する。制限エンドヌクレアーゼは３つのグループ：タイプＩ、ＩＩ及びＩＩＩに分類することができる。２００を超える種々の特異性を有する３０００種より多い制限エンドヌクレアーゼが細菌から単離されている（Roberts及びMacelis、Nucleic Acids Res. 26:338-350 (1998))。タイプＩＩ及びタイプＩＩｓ制限酵素はＤＮＡを特定の位置で解裂するので、遺伝子工学や分子クローニングで有用である。
【０００４】
殆どの制限エンドヌクレアーゼは、２本のＤＮＡ鎖の２個のホスホジエステル結合を加水分解することによってＤＮＡ基質の二本鎖解裂を触媒する（Heitman、Genetic Engineering 15:57-107 (1993)）。例えば、タイプＩＩの酵素、例えばＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＶはパリンドローム配列を認識し、そしてこの認識配列内の両方のストランドを対称的に解裂する。タイプＩＩｓのエンドヌクレアーゼは非対称ＤＮＡ配列を認識し、そしてこの認識配列外で両方のＤＮＡ鎖を解裂する。
【０００５】
文献中には、１本のＤＮＡ鎖しか切断せず、そしてそれ故ＤＮＡ分子内にニックを導入するタンパク質が幾つか存在している。これらのタンパク質の大部分はＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復及び他のＤＮＡ関連代謝に関与している（Kornberg及びBaker、ＤＮＡ複製。第２版。W. H. Freemann and Company、ニューヨーク、（１９９２年））。例えば、バクテリオファージｆＩのｇｐＩＩタンパク質は複製起点の非常に複雑な配列を認識しそしてそれと結合する。これはローリングサークル複製を開始するプラス鎖内にニックを導入するので、これはまた、プラス鎖を環化して一本鎖環状ファージＤＮＡを産生することにも関与する。（Geider等、J. Biol. Chem. 257:6488-6493 (1982)；Higashitani等、J. Mol. Biol. 237:388-400 (1994)）。もう１つの例は、大腸菌内でＤＮＡミスマッチ修復に関与しているＭｕｔＨタンパク質である。ＭｕｔＨはミスマッチと結合している近くのＭｕｔＳとｄａｍメチル化部位（ＧＡＴＣ）で結合し、そしてそこでタンパク質コンプレックスを形成する。ＭｕｔＬタンパク質はこの相互作用を促進し、そしてこれは、非メチル化ＧＡＴＣ部位の５’−末端でＭｕｔＨによる一本鎖解裂を誘発する。その後、エキソヌクレアーゼによってニックが翻訳されてミスマッチヌクレオチドが除去される（Modrich、J. Biol. Chem. 264:6597-6600 (1989)）。
【０００６】
上記した切断酵素は、これらが通常は長く複雑な配列を認識しそして通常は他のタンパク質と会合して、製造が困難なタンパク質コンプレックスを形成するという事実により、実験室内でのＤＮＡ操作にはあまり有用でない。それ故、これらの切断タンパク質はいずれも商業的に入手できない。最近、本発明者は好熱菌バシラス・ステアロテルモフィラスから、Ｎ．ＢｓｔＳＥＩ（Abdurashitov等、Mol. Biol. (Mosk) 30:1261-1267 (1996)）のアイソシゾマーである切断タンパク質、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩを発見した。ｇｐＩＩやＭｕｔＨとは異なって、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩは制限エンドヌクレアーゼと同様に振る舞う。これは簡単な非対称配列、５’−ＧＡＧＴＣ−３’を認識し、そしてその認識部位の３’−末端から４塩基離れて、１本のＤＮＡ鎖だけを解裂する（図１Ａ）。
【０００７】
Ｎ．ＢｓｔＮＢＩは制限エンドヌクレアーゼと一層同様に作用するので、ＤＮＡ工学で有用であろう。例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩを使用して特定の位置にニックを含有するＤＮＡ基質を産生させることができる。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩを使用して、ギャップ、長い張出し部又は他の構造を有するＤＮＡを産生させることもできる。ニック又はギャップを含有するＤＮＡ鋳型はＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復及び他のＤＮＡ関連主題の研究で研究者にとって有用な基質である（Kornberg及びBaker、ＤＮＡ複製。第２版。W. H. Freeman and Company、ニューヨーク（１９９２年））。切断エンドヌクレアーゼの潜在的な適用は、等温ＤＮＡ増幅技術であるストランド置換増幅（ＳＤＡ）における使用である。ＳＤＡはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の代替法を提供し、そしてこれは３０分で１０６倍の増幅に達することができ、熱環化はない（Walker等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396 (1992)）。ＳＤＡは制限酵素を使用してＤＮＡにニックを入れ、そしてＤＮＡポリメラーゼを使用してこのニックの３’−ＯＨ末端を延長して下流のＤＮＡ鎖を置換する（Walker等、（１９９２年））。ＳＤＡアッセイは簡単で（温度環化しないで、６０℃でのインキューベーションだけ）且つ非常に迅速な（１５分ほどの短時間の）検出方法を提供し、そしてこれを使用してウイルス又は細菌ＤＮＡを検出することができる。ＳＤＡは、結核菌やトラコーマ・クラミジアのような感染性作用物を検出する診断方法として導入されつつある（Walker及びLinn、Clin. Chem. 42:1604-1608 (1996); Spears等、Anal. Biochem. 247:130-137 (1997)）。
【０００８】
ＳＤＡが有効に働くためには、制限酵素によってニックをＤＮＡ鋳型中に導入しなければならない。殆どの制限エンドヌクレアーゼは二本鎖解裂を作る。それ故、修飾されたα−チオデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰαＳ）をＤＮＡ内に組み入れて、エンドヌクレアーゼがプライマー領域内にある非修飾ストランドだけを解裂するようにしなければならない（Walker等、１９９２年）。これらのα−チオデオキシヌクレオチドは通常のｄＮＴＰｓ（Pharmacia）より８倍高価であり、そして通常のデオキシヌクレオチドと比較して、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼでは良好に組み入れられない（J. Aliotta、L. Higgins及びH. Kong、未発表所見）。
【０００９】
或いは、本発明によって、切断エンドヌクレアーゼをＳＤＡで使用した場合、ＤＮＡ鋳型内にニックが自然的に導入されることが見出された。それ故、切断エンドヌクレアーゼを使用しているときには、ＳＤＡ反応にｄＮＴＰαＳはもはや必要でない。この考え方を試験し、そしてその結果は本発明者の予測と一致した。例えば、標的ＤＮＡを切断エンドヌクレアーゼＮ．ＢｓｔＮＢＩ、ｄＮＴＰｓ及びＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの存在下で増幅することができる。他の切断エンドヌクレアーゼを使用することもできる。２本のストランドを順次解裂する制限エンドヌクレアーゼを使用して、ニック形成中間体を蓄積することさえできる。
【００１０】
遺伝子工学技術の出現と共に、今や、遺伝子をクローン化しそしてそれらの遺伝子がコード化しているタンパク質を、慣用の精製技術で得ることができる量より大量に産生することができる。タイプＩＩの制限−修飾系はクローン化されつつあり、頻度は増大中である。最初にクローン化された系は制限エンドヌクレアーゼクローンを同定するか又は選択する手段としてバクテリオファージ感染を使用した（ＥｃｏＲＩＩ：Kosykh等、Molec. Gen. Genet 178:717-719 (1980)；ＨｈａＩＩ：Mann等、Gene 3:97-112 (1978)；ＰｓｔＩ：Walder等、Proc. Nat. Acad. Sci. 78:1503-1507 (1981)）。細菌内に制限−修飾系が存在すると、細菌のバクテリオファージによる感染を妨げることができるので、クローン化された制限−修飾遺伝子を有する細胞は、原則として、ファージに暴露されたライブラリーから生存細胞として選択的に単離することができる。しかしながら、この方法は限定された価値しか有していないことが見出されている。詳細には、クローン化された制限−修飾遺伝子が常に選択的な生存を与えるほど十分なファージ耐性を明示するわけではないことが見出された。
【００１１】
もう１つのクローニング手法は最初プラスミド保持として特徴付けられた系を大腸菌のクローニングプラスミド内に伝達することに係わっている（ＥｃｏＲＶ：Bougueleret等、Nucl. Acids Res. 12:3659-3676 (1984)；ＰａｅＲ７：Gingeras及びBrooks、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:402-406 (1983)；Theriault及びRoy、Gene 19:355-359 (1982)；ＰｖｕＩＩ：Blumenthal等、J. Bacteriol. 164:501-509 (1985)）。
【００１２】
益々増加する数の系をクローン化するために使用されている更なる手法は活性のメチラーゼ遺伝子の選択に関係している（米国特許第５，２００，３３３号及びＢｓｕＲＩ：Kiss等、Nucl. Acids Res. 13:6403-6421 (1985)参照）。制限及び修飾遺伝子はしばしば近接して結合されているので、これら両遺伝子はしばしば同時にクローン化することができる。しかしながら、この選択は必ずしも完全な制限系を産生せず、その代わり、メチラーゼ遺伝子だけを産生する（ＢｓｐＲＩ：Szomolanyi等、Gene 10:219-225 (1980)；ＢｃｎＩ：Janulaitis等、Gene 20:197-204 (1982)；ＢｓｕＲＩ：Kiss及びBaldauf、Gene 21:111-119 (1983)；並びにＭｓｐＩ：Walder等、J. Biol. Chem. 258:1235-1241 (1983)）。
【００１３】
メチラーゼ及びエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローン化するもう１つの方法はＤＮＡ損傷に対する比色アッセイに基づいている（米国特許第５，４９２，８２３号参照）。メチラーゼをスクリーニングするとき、プラスミドライブラリーをＡＰ１−２００のような宿主大腸菌株内に形質転換する。メチラーゼの発現は、ＭｃｒＡ＋、ＭｃｒＢＣ＋、又はＭｒｒ＋である大腸菌株内でＳＯＳ応答を誘発するであろう。ＡＰ１−２００株はＭｃｒ及びＭｒｒ系に関して温度感受性であり、そして大腸菌の損傷誘発性ｄｉｎＤ座位に融合したｌａｃ−Ｚ遺伝子を含んでいる。メチラーゼ又はエンドヌクレアーゼ遺伝子をコードしている組換えプラスミドの検出はｌａｃＺ遺伝子の制限温度での誘発に基づいている。メチラーゼ遺伝子をコードしている形質転換体は、Ｘ−ｇａｌを含有するＬＢ寒天プレート上で青色コロニーとして検出される。（Piekarowicz等、Nucleic Acids Res. 19:1831-1835 (1991)及びPiekarowicz等、J. Bacteriology 173:150-155 (1991)）。同様に、大腸菌株ＥＲ１９９２はｄｉｎＤ１−ＬａｃＺ融合を含有しているがメチル化依存性制限系ＭｃｒＡ、ＭｃｒＢＣ及びＭｒｒを欠いている。この系（「エンド−ブルー」方法と呼ばれる）では、エンドヌクレアーゼが宿主細胞ＤＮＡを損傷し、ＳＯＳ応答を誘発するとき、エンドヌクレアーゼ遺伝子はそのコグネイトメチラーゼの非存在下で検出することができる。ＳＯＳ誘発細胞はＸ−ｇａｌを補充したＬＢ寒天プレート上で濃い青色のコロニーを形成する。（Fomenkov等、Nucleic Acids Res. 22:2399-2403 (1994)）。
【００１４】
ときには、直接的なメチラーゼ選択方法では種々の障害によってメチラーゼ（及び／又はエンドヌクレアーゼ）クローンが産生されないことがある（例えば、Lunnen等、Gene 74(1):25-32 (1988)参照）。制限−修飾遺伝子のクローニングに対する１つの潜在的な障害は、修飾によって未だ保護されていない宿主内にエンドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようと試みることに存する。メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子が単一クローンとして一緒に導入される場合、エンドヌクレアーゼが宿主ＤＮＡを解裂する機会を有する前に、メチラーゼは宿主ＤＮＡを保護的に修飾しなければならない。それ故、ときには、これらの遺伝子を順次、即ち、最初にメチラーゼを、次いでエンドヌクレアーゼをクローン化することしかできないであろう（米国特許第５，３２０，９５７号参照）。
【００１５】
制限−修飾系のクローニングに対するもう１つの障害は、大腸菌の株のなかにはシトシン又はアデニン修飾に対して不利益に反応する株があるという発見に存している；これらの株はメチル化シトシン（Raleigh及びWilson、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:9070-9074 (1986)）又はメチル化アデニン（Heitman及びModel、J. Bacteriology 196:3243-3250 (1987)；Raleigh等、Genetics 122:279-296 (1989)；Waite-Rees等、J. Bacteriology 173:5207-5219 (1991)）を含有するＤＮＡを破壊する系を有している。シトシン特異的又はアデニン特異的メチラーゼ遺伝子は、これら自体でも、そしてまたこれらの対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子と一緒にであっても上記株内に容易にクローン化することはできない。この問題を回避するためには、これらの系が欠失している大腸菌の突然変異株（ＭｃｒＡ−、及びＭｃｒＢ−、及びＭｒｒ−）を使用しなければならない。
【００１６】
更なる潜在的な困難は、制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子のなかには、供給元生物と大腸菌の転写機構における差異、例えばプロモーター及びリボソーム結合部位における差異によって大腸菌内では発現できないものがあるということである。メチラーゼ選択技術は、メチラーゼが大腸菌内で十分良好に発現して、この遺伝子を有するプラスミドの少なくとも幾つかを十分に保護することを必要とする。
【００１７】
精製制限エンドヌクレアーゼ、そして程度はより少ないが修飾メチラーゼは実験室で遺伝子を特徴付ける有用な手段であるので、これらの酵素を豊富に合成する組換えＤＮＡ技術によって細菌株を得るという商業的な動機が存在する。このような株は、商業的に有用な量で産生する手段を提供するだけでなく、精製の労務を単純化するので、有用であろう。
【００１８】
（発明の開示）
複数の方法の特有な組合せを使用して、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を直接クローン化しそしてこの遺伝子をＰｌｅＩメチラーゼで予め修飾された大腸菌株内で発現させた。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を直接クローン化するために、Ｎ−末端アミノ酸配列と、高度に精製された天然Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ制限エンドヌクレアーゼの一続きの内部アミノ酸配列の両方を決定した。縮重プライマーを上記アミノ酸配列に基づいて設計し、そしてＰＣＲ技術を使用して、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼタンパク質をコードしているＤＮＡ遺伝子の断片を増幅した。ＰＣＲ産生物の配列を決定し、そしてその情報を使用して逆ＰＣＲ反応用のプライマーを設計した。逆ＰＣＲによる染色体歩行によって、エンドヌクレアーゼ読み取り枠、ｎ．ｂｓｔＮＢＩＲを推定した。逆ＰＣＲを継続することによって、読み取り枠はエンドヌクレアーゼ遺伝子に近接していることが見出された。ＢＬＡＳＴ解析によってこの遺伝子がアデニンメチラーゼ（ｎ．ｂｓｔＮＢＩＭ）をコードしていることが示唆された。
【００１９】
Ｎ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を低コピーＴ７発現ベクター、ｐＨＫＴ７中にクローン化し、そしてｐＨＫＵＶ５−ＰｌｅＩメチラーゼクローンによって予め修飾されていた大腸菌宿主内に形質転換した。この組換え大腸菌株（ＮＥＢ＃１２３９）は、細胞１グラム当たり約４×１０７単位のＮ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼを産生する。
【００２０】
本発明はまた、新規なＤＮＡ増幅方法にも関する。ストランド置換増幅においてα−チオｄＮＴＰｓのような修飾ヌクレオチドの非存在下でＮ．ＢｓｔＮＢＩのような切断エンドヌクレアーゼを使用する方法を開示する。
【００２１】
他のヌクレアーゼを巧みに処理して産生された４種の更なる酵素で介在される非修飾ストランド置換増幅の更なる例も開示する。ニック形成中間体を有する制限エンドヌクレアーゼで介在される非修飾ストランド置換増幅の例を開示する。最後に、このような切断エンドヌクレアーゼを構築する手法を開示する。
（発明の詳細な説明）
【００２２】
本発明の１つの実施態様に従って、部位特異的な切断酵素を同定しそして創製する方法を記載し、そしてα−チオヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドの非存在下でこれら酵素をＳＤＡに適用することの適切性を証明する。
【００２３】
当業者であれば、ＳＤＡで使用するためには、１個のニックを所望のプライミング部位の位置に導入できるように、切断酵素はその活性に配列特異性を有していなければならないことがわかるであろう。慣用的に適用されるＳＤＡでは、配列特異的な切断活性は２つの因子：即ち、使用される制限エンドヌクレアーゼの配列特異性及び修飾された（例えば、α−チオホスフェート置換、ホウ素置換（α−ホウ素化）ｄＮＴＰｓ又はシトシン−５ ｄＮＴＰ）ヌクレオチドを使用することによって強化されたストランド特異性、から誘導される。この方法はコストを高め（修飾ヌクレオチドが高価なため）そして合成できるアンプリコンの長さを短くする（ポリメラーゼによる組み入れが少ないため）。
【００２４】
本発明においては、適切な解裂特異性が他の一般的な方法でも可能になり得ることが示される。４つの異なる方法で得られた上記酵素の５つの例を本発明で開示する。
【００２５】
１つの好ましい実施態様では、配列特異性とストランド特異性の両方が元の宿主内で見出されるように酵素で得られ、そしてこれはＮ．ＢｓｔＮＢＩで例証されている。
【００２６】
バシラス・ステアロテルモフィラス３３Ｍ（ＮＥＢ ＃９２８、New England Biolabs, Inc.、マサチューセッツ州ベバリー）から得られるＮ．ＢｓｔＮＢＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニングは骨の折れることであることがわかった。メチラーゼ選択戦略を試み、そして１つのメチラーゼ発現クローンを単離した。しかしながら、フランキングＯＲＦ（複数）はＮ．ＢｓｔＮＢＩ切断酵素をコードしていなかった。これはオーファンメチラーゼ、即ち、コグネイトエンドヌクレアーゼ遺伝子と結合していないメチラーゼであることが判明した。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ切断エンドヌクレアーゼを好んでクローン化しそして大腸菌内で発現させる方法を本明細書に記載する：
【００２７】
１．  Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ制限エンドヌクレアーゼのほぼ均質になるまでの精製並びにＮ−末端及び内部アミノ酸配列の決定。
９個のクロマトグラフィーカラムを使用してＮ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼタンパク質を精製した。これらカラムにはＸＫ５０／１４迅速流Ｐ−セルカラム、ＨＲ１６／１０ソース（Source）（商標）１５Ｑ、５個のＨＲ １６／１０ヘパリン−ＴＳＫ−ガードゲル（Guardgel）カラム、ＨＲ１０／１０ソース（商標）１５Ｑカラム及びリソース（Resource）（商標）１５Ｓが含まれていた。この精製によって、クーマシーブルー染色後にＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲル上で概ね７２ｋＤａに１つのタンパク質バンドが得られた。自動シーケンサーでの上記精製タンパク質の逐次分解によってＮ−末端の３１個のアミノ酸残基が決定された。その内部タンパク質配列を決定するために、７２ｋＤａのＮ．ＢｓｔＮＢＩタンパク質の臭化シアン消化後に６ｋＤａのポリペプチドフラグメントを得た。この６ｋＤａの最初の１３個のアミノ酸残基を決定した。この１３個のアミノ酸配列はＮ−末端の３１個のアミノ酸残基の配列と異なっており、これが内部Ｎ．ＢｓｔＮＢＩタンパク質配列であることを示唆していた。
【００２８】
２．  Ｎ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の断片の増幅及び引き続いてのクローニング。
縮重プライマーはＮ−末端及び内部アミノ酸配列の両方に基づいて設計した。これらのプライマーを使用してエンドヌクレアーゼ遺伝子の５’末端をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産生物をプラスミドｐＣＡＢ１６中にクローン化し、そして配列を決定した。次いで、このクローン化ＤＮＡから推定されるアミノ酸配列をＮ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列と比較して、概ね１．４ｋｂのＰＣＲフラグメントを同定した。
【００２９】
３．  Ｎ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子を単離するために逆ＰＣＲによる染色体歩行。
全Ｎ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子並びにその対応するＤＮＡメチラーゼ遺伝子をクローン化するために、逆ＰＣＲ技術を採用して元の１．４ｋｂのエンドヌクレアーゼ遺伝子フラグメント近傍のＤＮＡを増幅した（Ochman等、Genetics 120:621 (1988)；Triglia等、Nucl. Acids Res. 16:8186 (1988)並びにSilver及びKeerikatte、J. Cell. Biochem. (Suppl.) 13E:306、抄録番号ＷＨ２３９（１９８９年））。合計で２ラウンドの逆ＰＣＲを実施した。その時点でエンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの読み取り枠（ＯＲＦ）を同定した（図１Ｂ）。
【００３０】
エンドヌクレアーゼ遺伝子（ｎ．ｂｓｔＮＢＩＲ）は、推定分子量７０，３６８ダルトンを有する６０４個アミノ酸のタンパク質をコードしている１８１５ｂｐのＯＲＦであることが判明した（図２）。これは、天然のバシラス・ステアロテルモフィラス３３Ｍから精製されたＮ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼの観察された分子量と一致していた。このエンドヌクレアーゼ遺伝子の近くに、９０６ｂｐのＯＲＦ、ｎ．ｂｓｔＮＢＩＭが見出された。これはエンドヌクレアーゼに関して収束的態様で方向付けられていた（図１Ｂ）。ｎ．ｂｓｔＮＢＩＭ遺伝子から推定されるタンパク質配列は他のアデニンメチラーゼと顕著な配列類似性を共有している（図３）。
【００３１】
４．  ｐＨＫＵＶ５及びｐＨＫＴ７プラスミドを使用したＮ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現。
制限−修飾系をクローニングする２段階方法は米国特許第５，３２０，９５７号に記載されている。最初の段階は、認識配列を予め修飾して対応するエンドヌクレアーゼ消化から宿主細胞を保護することである。これは、メチラーゼ遺伝子を宿主細胞内に導入しそしてそこでその遺伝子を発現させることによって達成される。２番目の段階には、予め修飾された宿主細胞内へのエンドヌクレアーゼ遺伝子の導入及び引き続いてのエンドヌクレアーゼ産生が含まれる
【００３２】
ｐｌｅＩＭ遺伝子（図４）をプラスミドｐＨＫＵＶ５（図５）中にクローン化し、そして大腸菌細胞内に形質転換した。その結果、大腸菌細胞はｐＨＫＵＶ５−ｐｌｅＩＭで修飾された。この場合には、ＰｌｅＩとＮ．ＢｓｔＮＢＩが同じ認識配列を共有しているので、宿主細胞を予め修飾するためにＰｌｅＩメチラーゼ（ｐｌｅＩＭ）を使用した。
【００３３】
エンドヌクレアーゼ遺伝子、ｎ．ｂｓｔＮＢＩＲをｐＨＫＴ７（図６）中にクローン化し、そしてその後ｐＨＫＵＶ５−ｐｌｅＩＭを含有する大腸菌ＥＲ２５６６内に導入した。培養物を中間対数期まで増殖させ、そしてその後ＩＰＴＧを０．４ｍＭの最終濃度になるまで添加して誘導した。組換えＮ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼの収量は細胞１グラム当たり４×１０７単位である。
【００３４】
他の実施態様では、ＳＤＡに適切な解裂特異性は二本鎖解裂活性を有する酵素の突然変異的改変によって可能になる。好ましい実施態様では、配列特異性は、慣用のＳＤＡと同様に制限酵素の特異性によって与えられるが、ストランド特異性は、１つの精製酵素が特異的な配列を認識しそして１本のストランドにだけ特異的にニックを入れるように、突然変異によって酵素内に巧みに処理される。ストランド特異性（切断活性）を得るために３つの異なる手法が考案されておりそして例証されている。これらは各々、α−チオヌクレオチドの非存在下でＳＤＡの実施を可能にする。これらの手法は以下に記載する。
【００３５】
１．  切断酵素内に巧みに処理するのに適切な標的酵素の同定
配列特異的な制限エンドヌクレアーゼは当該技術分野で周知の方法で同定することができ、そして上記したように、これらをクローニングする多数の手法が考案されている。本発明では、配列特異的な切断エンドヌクレアーゼを創製するのに好ましい出発物質である２つのサブクラスの制限エンドヌクレアーゼを同定することができる。これらは以下でサブクラスＡ及びサブクラスＢと称する。これらクラスの１つに関して、特異的にニックを入れる突然変異体を得る手法は２つのサブセットに分けられ、そしてサブクラスＡ１及びサブクラスＡ２と称する。サブクラスＡで記載されている突然変異体の単離及び特徴付けは、本明細書と同時に出願された米国出願番号            中で詳細に開示されており、そして本明細書で概略する。サブクラスＢ酵素の突然変異体の単離及び特徴付けは本明細書で詳細に記載する。
【００３６】
これら酵素のクラスは共に、ＲＥＢＡＳＥ（ｈｔｔｐ：／／ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｒｅｂａｓｅ．ｃｈａｒｔｓ．ｈｔｍｌ 「タイプＩｉｓ酵素」リンク；Roberts及びMarcelis、Nucleic Acids Res. 29:368-269 (2001)）中にタイプＩＩＳエンドヌクレアーゼとして表示されているもののなかに見出される。これらは、認識部位が非対称であるものとして、制限エンドヌクレアーゼのなかで同定することができる。
【００３７】
しかしながら、詳細には、サブクラスＡに属する酵素はしばしば「タイプＩＩＳ」エンドヌクレアーゼと称される（Szybalski、Gene 100:13-26 (1991)）。これらの酵素は非対称配列を認識し、そしてＤＮＡを認識配列外で且つ該配列の１方の側で解裂する。試験されているこれらの例は各々、Ｃ−末端配列に非特異的な解裂部分と０個又はそれより多くのアミノ酸によって結合したＮ−末端配列に特異的なＤＮＡ結合部分を含んでいる。
【００３８】
サブクラスＢに属する酵素はしばしば「タイプＩＩＴ」エンドヌクレアーゼ（Kessler等、Gene 47:1-153 (1986)；Stankevicius等、Nucleic Acids Res. 26:1084-1091 (1998)）、或いは「タイプＩＩＱ」エンドヌクレアーゼ（Degtyarev等、Nucleic Acids Res. 18:5807-5810 (1990)；Degtyarev等、Nucleic Acids Res. 28:e56 (2000)）と称される。これらの酵素も非対称配列を認識するが、これらは認識配列内でＤＮＡを解裂する。
【００３９】
制限エンドヌクレアーゼの認識部位を同定しそして特徴付ける方法は当該技術分野で良く知られている。加えて、これらのグループや他のグループに属する既知の酵素のリストはｈｔｔｐ：／／ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍのＲＥＢＡＳＥから得ることができる。
【００４０】
２．  サブクラスＡから切断突然変異体の創製
試験したサブクラスＡの酵素はＦｏｋＩ、ＭｌｙＩ、ＰｌｅＩ及びＡｌｗＩであった。このサブクラスの酵素はストランド解裂に関して対称的に作用すると考えられる。２つの同一のタンパク質分子のＣ−末端ドメインは、ＤＮＡ解裂中に一時的に相互に作用してホモ二量体を形成すると考えられる。
【００４１】
本発明で開示されている酵素のうち２つは、２つの方法のうちの１つの方法でサブクラスＡの酵素から誘導された。１つの好ましい実施態様（方法Ａ１）では、２本のＤＮＡ鎖のうち１本の解裂は、エンドヌクレアーゼ遺伝子内部の、二本鎖解裂に必要な二量体化界面をコードしている領域の突然変異によって抑制され、その結果１本の解裂だけが生起する。この突然変異は、二量体化に必要な特別の残基の個々の又は一緒の改変を含むことができる。
【００４２】
他の好ましい実施態様（方法Ａ２）では、２本のストランドのうち１本の解裂は、二量体化界面を含有するエンドヌクレアーゼの領域を二量体化欠損であることが知られているエンドヌクレアーゼから得られる対応する領域で置換することによって抑制された。この領域は、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ、即ち、上記した本発明のエンドヌクレアーゼをコードしている遺伝子のような遺伝子の或る部分から得ることができるか、又はこの二量体化機能を含有する他の天然生起若しくは巧みに処理された遺伝子から得ることができる。
【００４３】
３．  サブクラスＢから得られる切断突然変異体の創製
本発明で開示されている４番目及び５番目の切断エンドヌクレアーゼは酵素ＢｂｖＣＩ、即ちサブクラスＢの１つのメンバーから誘導された。サブクラスＢの酵素はストランド解裂に関して非対称的に作用すると考えられる。これらは機能的にヘテロ二量体であり、換言すると、２つの異なるサブユニット又はドメインを含んでおり、そしてそれらは各々、自身の触媒部位を有していると考えられる。活性の酵素では、これら２つのサブユニット又はドメインは相互に作用してＤＮＡ認識を一緒になって達成し、そして二本鎖解裂を触媒する。試験した４つのサブクラスＢ酵素 −ＡｃｉＩ、ＢｓｒＢＩ，ＢｓｓＳＩ及びＢｂｖＣＩ− のうち、ＢｂｖＣＩだけが２つの異なるタンパク質サブユニットを含んでいた。他の３つの酵素は単一のタンパク質であり、そしてこれらは各々２つの異なるドメインを含んでいると本発明者は推定する。原則として、切断突然変異体は、いずれの種類の酵素からも作製することができるが、ＢｂｖＣＩのような、結合しているよりはむしろ別々のサブユニットを含んでいる酵素を使用して作製する方がより直接的である。
【００４４】
Ａ．  サブクラスＢのヘテロ二量体酵素の同定
このサブクラスのヘテロ二量体メンバーは２つの方法：即ち、元の生物若しくはクローン化した制限系を含有する組換え宿主から精製されたエンドヌクレアーゼを分析するか、又はクローン化した制限系の配列を分析して認識することができる。前者の場合には、精製されたエンドヌクレアーゼは、通常、種々の位置に移動する２つのタンパク質構成成分の存在を明らかにするＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動で特徴付けることができる。配列が異なっている２つのサブユニットや異なる遺伝子の産生物がＳＤＳ−ＰＡＧＥではやはり同じ移動度で移動するということが当てはまる可能性がある。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から誘導される見かけ上の分子量はゲルろ過分析から誘導される見かけ上の分子量の半分であるので、上記の状況は認識されよう。更に、精製エンドヌクレアーゼのＮ−末端アミノ酸配列分析は、見かけ上１つのバンド中で、各配列決定サイクルで２つの異なるアミノ酸の存在を明らかにするであろう。これらの特性を決定する方法は当該技術分野で良く知られており、そして例えば、タンパク質分析における現行のプロトコル（Current Protocols in Protein Analysis）（８．３、１０．１及び１１．１０項；Coligan, F. E.、Dunn, B. M.、Ploegh, H. L.、Speicher, D. W.及びWingfield, P. T. タンパク質科学における現行のプロトコル（Current Protocols in Protein Science）、John Wiley and Sons (1997)）中に開示されている。
【００４５】
後者の分析では、本発明に従う制限系は４個までの読み取り枠を含有しており、２つはメチルトランスフェラーゼ（非対称部位の各ストランド用のもの）をコードしており、そして２つは制限エンドヌクレアーゼのサブユニットをコードしている。メチルトランスフェラーゼをコードしている読み取り枠は、マロン（Malone）等（J. Mol. Biol. 253:618〜632 (1995)）による配列分析で認識される可能性がある。更なる読み取り枠が存在する可能性もあり、そしてこれらには遺伝子発現の調節に係わるもの（例えば、Ｃタンパク質）、及びメチル化シトシンの脱アミノ化から生じる損傷の修復に係わるもの（例えば、Ｖｓｒタンパク質）が含まれる。
【００４６】
Ｂ．  配列分析で同定された酵素のヘテロ二量体特性の証明。
エンドヌクレアーゼのサブユニットをコードしている遺伝子は、メチルトランスフェラーゼ遺伝子が１つのプラスミド上にあり、そしてブルックス（Brooks）等（米国特許５，３２０，９５７）中に開示されているように、候補エンドヌクレアーゼ遺伝子が１個又はそれより多くの更なるプラスミド上にある発現クローンを創製することによって証明することができる。メチルトランスフェラーゼプラスミド（単数又は複数）だけを有している発現宿主は細胞内のＤＮＡを、エンドヌクレアーゼの作用に対して抵抗性にするが、エンドヌクレアーゼ活性は発現しないであろう。更なるプラスミド（単数又は複数）上にエンドヌクレアーゼ遺伝子を加えると、組換え宿主の粗製抽出物中でエンドヌクレアーゼ活性を発現するであろう。或る状況下では、ＷＯ ９９／１１８２１に開示されているように、メチルトランスフェラーゼ遺伝子の非存在下でエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現が可能であと思われる。
【００４７】
エンドヌクレアーゼ活性用の両読み取り枠の要件は、（ｉ）２個の読み取り枠が各々、例えば、各読み取り枠を別個の適合性プラスミド上に配置するか、又は別々に誘導できる（例えば、ラクトース又はアラビノースによって誘導可能な）プロモーターの制御下に各読み取り枠を配置することによって、別々に発現することができる発現クローンを創製し、そしてその後、１個の読み取り枠しか存在しないか若しくは１個の読み取り枠しか発現されないときのエンドヌクレアーゼの発現について試験することによって証明することができる。エンドヌクレアーゼ活性は、両読み取り枠が発現されたときにだけ得られよう。各々が別々に読み取り枠を発現している２つの組換え宿主から得られる抽出物を混合して活性を再構築することも可能である。或いは、両読み取り枠の要件は、（ｉｉ）各候補読み取り枠に欠失又は挿入突然変異を別々に創製し、続いて、得られた組換え宿主のエンドヌクレアーゼ活性を評価して証明することができる。サブクラスＢの酵素では、エンドヌクレアーゼの発現には両野生型読み取り枠が必要であろう。
【００４８】
Ｃ．  ヘテロ二量体サブクラスＢ酵素から切断酵素への変換。
適当なサブクラスＢエンドヌクレアーゼが一度同定されると、本発明に関係のある切断酵素誘導体は、いずれかのサブユニット内の解裂用活性部位を不活性化することによって得られ、酵素のその後の適切な組み立てには干渉しない。酵素内の適当な突然変異は、活性部位を含んでいるか又はその化学的性質若しくは構成に影響を与えるアミノ酸の突然変異変化を個々に又は組み合わせて作り；そしてその後各突然変異体によって産生される酵素の切断活性を評価することによって創製することができる。この努力の程度は、幾つかの異なっているが関係のある酵素内に保持されている領域に焦点を当てることによって小さくすることができる。
【００４９】
１つの好ましい実施態様では、改変は次の段階によって導入される：
１．  このクラスの酵素の幾つかのメンバーを整列させて保存領域を同定する。５つの遺伝子の概念上の翻訳を使用した：ＢｂｖＣＩ−１、ＢｂｖＣＩ−２と称されるＢｂｖＣＩの２つのサブユニット、並びに関係のあるパリンドローム部位を認識する３つの慣用のホモ二量体タイプＩＩエンドヌクレアーゼ：Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｌｐＩ及びＤｄｅＩ。これらの遺伝子は別個の保存ブロックに一定の相同性を示す。１つの保存ブロックは配列ＥＸＫを含有していた。このモチーフは恐らく解裂用の活性部位であると判断された。改変によって解裂は駄目になると予想されるが、他のサブユニットが解裂し得るコンフォーメーション的に天然のコンプレックスの組み立ては依然として可能である。これらは分析用の好ましい部位と判断された。
【００５０】
２．  カセット突然変異誘発による好ましい領域内での突然変異発生。このプロセスは次の段階を含んでいた：
ａ）  逆ＰＣＲ用の２つの突然変異誘発プライマー、即ち、各遺伝子ｂｂｖＣＩ−１及びｂｂｖＣＩ−２に対して１個を設計する。これらの突然変異誘発プライマーは、ＥＸＫモチーフをコードしているヌクレオチドが２０％のランダムヌクレオチドと８０％のコレクトヌクレオチドを９つの位置の各々に含んでいるように設計された。各突然変異誘発プライマーでは、ＥＸＫモチーフをコードしている領域の側面にはそれぞれの遺伝子のユニーク配列があった：
【００５１】
ｂ）  ｉ）ｂｂｖＣＩ−１用の１つの突然変異誘発プライマー及びこの突然変異誘発プライマーから反対方向で且つその５’側の直ぐ近くに方向付けられたユニークプライマー；並びにｉｉ）ｂｂｖＣＩ−２用の１つの突然変異誘発プライマー及びこの突然変異誘発プライマーから反対方向で且つその５’側の直ぐ近くに方向付けられたユニークプライマーを別個の反応で使用して、プラスミドベクター全体が増幅されるように、突然変異誘発ＰＣＲ（分子クローニング（Molecular Cloning）、実験室マニュアル（A Laboratory Manual）、Sambrook, J.及びRussel D. W.、Cold Spring Harbor Laboratory、８．８１〜８．９５頁（２００１年））を実施し；
【００５２】
ｃ）  ＰＣＲ産生物を結合して集団環状分子を形成し；
【００５３】
ｄ）  ｂｂｖＣＩ−１及びｂｂｖＣＩ−２を標的とする２つの突然変異誘発集団で別個に適当な宿主（両メチルトランスフェラーゼを発現する）を形質転換して選択プレート上でコロニーを得；そして
【００５４】
ｅ）  単離された各集団のメンバーに関して、以下の段階によって粗製抽出物中の解裂活性について試験する：
ｉ）    候補コロニーの培養物を増殖させ；
ｉｉ）  上記培養物を遠心分離して細胞ペレットを得；
ｉｉｉ）上記培養物を溶解緩衝液に再懸濁し；
ｉｖ）  再懸濁された培養物を溶解しそしてこれらを遠心分離で清明化し；
ｖ）    清明化した抽出物の分別物を取り出して、基質プラスミドＤＮＡ及び消化緩衝液を含有する試験管をアッセイし；
ｖｉ）  アッセイ試験管をインキュベートして、酵素誘発性解裂を生じさせ；
そして
ｖｉｉ）  高解像ゲル電気泳動でプラスミドＤＮＡ産生物を分離しそして解裂が生起していないか、一本鎖解裂又は二本鎖解裂が生起しているのかどうかを評価する。
【００５５】
理想的には、基質ＤＮＡは解裂用の２つ又はそれより多くの良好に分離された部位を含有するプラスミドである。このような状況下では、不活性酵素を含有する抽出物は種々の形態のプラスミドの移動性を実質的に改変しない。野生型酵素を含有する抽出物は超コイル状、直鎖状及び開環状形態のプラスミドを駄目にし、そして２つの（又はそれより多くの）直鎖状フラグメントをそれらの場所で産生する。そして切断酵素を含有する抽出物は超コイル状のプラスミド形態を駄目にし、これを開環状形態に変換するが、直鎖状形態には影響を与えない。
【００５６】
３．  代替的な方法でニックを入れると思われる突然変異体を試験して、これら変異体がこの活性を有していることを確認する。このような方法には、ニックが入った部位を通しての配列決定及び各々が２つのサブユニットのうち１つの活性を欠いている相補的突然変異体による逐次的な切断が含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】
最も好ましくは、候補酵素は１番目の方法で試験され、そしてこの方法は次の段階を含んでいる：
ａ）  解裂用の少なくとも１つの部位を含有しているＤＮＡを精製又は半精製酵素と共にインキュベートし；
ｂ）  このＤＮＡを精製し；
ｃ）  これを、上記部位を横切って両方向でＤＮＡの配列を決定するための基質として使用する。
【００５８】
切断が支持され、そしてそのとき１つの方向の配列はその部位を横切って継続し（即ち、鋳型ストランドは継続し）、一方他の方向の配列はその部位で突然終了する（即ち、他のストランドはニックによって中断される）。
【００５９】
２番目の方法では、種々のストランドにニックを入れると考えられる突然変異体の抽出物を一緒に混合し、そしてこの混合物を二本鎖解裂活性についてアッセイする。酵素だけでは二本鎖解裂を触媒しないが、この混合物は、先ず１つの酵素で１本のストランドに対して、次いでもう１つの酵素で相補的ストランドに対してダブル切断する結果としてか、又は各酵素の非突然変異サブユニットを再結合して完全に野生型の酵素を産生することによって上記解裂を触媒し得るであろう。
【００６０】
このようにして、ＢｂｖＣＩ−１及びＢｂｖＣＩ−２で１本のストランドの解裂を可能にする突然変異が同定されたが、ＢｂｖＣＩ部位では他の突然変異は同定されなかった。これらはＢｂｖＣＩ−１−３７及びＢｂｖＣＩ−２−１２と呼称される。非修飾ＳＤＡにおけるこれら酵素の使用は以下で例証する。
【００６１】
もう１つの実施態様では、ＳＤＡ用の適切な解裂特異性は二本鎖解裂活性を有する酵素を使用することによって可能になるが、その際解裂は連続する２段階で生起するので、少量のニック形成中間体が二本鎖解裂の途中で観察される。
【００６２】
ニック形成中間体を蓄積するような酵素は次の段階によって同定することができる：
ａ）エンドヌクレアーゼ用の１つ又はそれより多くの部位を有する二本鎖環状基質分子（典型的にはプラスミド）を形成し；
ｂ）せいぜい２０％の基質分子が二本鎖解裂事象を被るように、上記基質を少量のエンドヌクレアーゼと共にか又は短時間インキュベートし；
ｃ）これらのＤＮＡ産生物を高解像ゲル電気泳動で分離し；そして
ｄ）解裂が生起していないのか、一本鎖解裂又は二本鎖解裂が生起しているのかどうかを評価する。
【００６３】
解裂が生起していない場合、臭化エチジウムのようなインターカレート剤を含有する適当な電気泳動系中で、基質分子は同じ大きさの直鎖状ＤＮＡより速く移動するであろう；一本鎖解裂が生起している場合、基質分子は同じ大きさの直鎖状ＤＮＡより僅かに遅く移動するであろう；二本鎖解裂が１回生起している場合、基質分子はその大きさの直鎖状ＤＮＡと同じ位置に移動するであろう。
【００６４】
このような酵素で形成されたニック形成中間体は実施例６で例証されているようにＳＤＡを支援することができる。
【００６５】
以下の実施例は、実施することが現在好ましい本発明の実施態様を更に説明するために示されている。これらの実施例は説明であり、そして本発明は、上記特許請求の範囲で示されていることを除いて、これら実施例に制限されると考えるべきでないことが理解されよう。
【００６６】
上記又は以下で引用される参照文献は本明細書で参照として組み入れる。
【００６７】
（実施例）
実施例１
Ｎ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼの精製及びそのタンパク質配列の決定
１．  バシラス・ステアロテルモフィラス３３Ｍから得られるＮ．ＢｓｔＮＢＩ制限エンドヌクレアーゼのほぼ均質になるまでの精製：
バシラス・ステアロテルモフィラス３３Ｍ細胞は４５℃で増殖させた。これらの細胞を、２０時間増殖させた後遠心分離して採取し、そして使用するまで−７０℃で貯蔵した。細胞１７７ｇを４℃で一夜解凍し、そしてその後、１００ｍＭのＮａＣｌを補充した緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＫＰＯ４、７ｍＭ ＢＭＥ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５％グリセロール、ｐＨ６．９）５３０ｍｌ中に再度懸濁した。これらの細胞をマントン・ガウリン（Manton-Gaulin）ホモジナイザーで破壊した。最初のパス後にプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｐ３４６５；Sigma、ミズーリー州セントルイス）２５ｍｌを加えた。抽出物を４℃で１０分間、１４，０００ｒｐｍで遠心分離した。
【００６８】
以下の方法は全て氷上又は４℃で実施した。上澄みは、緩衝液Ａ．１（１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＫＰＯ４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、７ｍＭ β−メルカプトエタノール及び５％グリセロール、ｐＨ６．９）で平衡化した２７５ｍｌのＸＫ ５０／１４ 迅速流ホスホセルロースカラム（Whatman International Ltd.、英国ケント）に入れた。このカラムを２×容量の緩衝液Ａ．１、続いて緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＫＰＯ４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、７ｍＭ β−メルカプトエタノール及び５％グリセロール、ｐＨ６．９）中１００ｍＭ ＮａＣｌから１Ｍ ＮａＣｌまでの１０×直線勾配で洗浄した。２５ｍｌフラクションを集めた。フラクションは、１×Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ緩衝液（１５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ジチオトレイトール、１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ８．０）中５５℃でＴ７ ＤＮＡを使用して、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ制限活性をアッセイした。制限酵素活性のピークは概ね２００ｍＭのＮａＣｌでカラムから溶出することが見られた。
【００６９】
活性フラクション、３９〜５７をプールし（４７５ｍｌ）、そして緩衝液Ｂ（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、７ｍＭ β−メルカプトエタノール及び５％グリセロール、ｐＨ８．０）を補充した１００ｍＭ ＮａＣｌで透析した。次いで、透析したプールを緩衝液Ｂで５０ｍＭ ＮａＣｌの最終濃度にまで希釈した。濁った沈殿物が形成されたが、これを大きなローター中１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して回転させた。次いで、清明になった溶液を、緩衝液Ｂ．１（５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、７ｍＭ β−メルカプトエタノール及び５％グリセロール、ｐＨ８．０）中で平衡化した２２ｍｌの ＨＲ １６／１０ ソース（商標）１５Ｑ（Pharmacia Biotech、ニュージャージー州ピスカッタウエイ）カラムに適用した。このカラムを２×容量の緩衝液Ｂ１、続いて緩衝液Ｂ中５０ｍＭ ＮａＣｌから８００ｍＭ ＮａＣｌまでの１０×直線勾配で洗浄した。１０ｍｌフラクションを集めた。フラクションは上記したようにしてＮ．ＢｓｔＮＢＩ活性をアッセイした。制限酵素活性は大部分カラム中を流出した。しかしながら、概ね１１０ｍＭのＮａＣｌで溶出したフラクション６〜１０はかなり多くの活性を有していたのでプールし（５０ｍｌ）、そして緩衝液Ｂ中で５０ｍＭ ＮａＣｌにまで希釈した。これらはその後、２番目のヘパリンカラムに入れた。
【００７０】
ソースＱ流出及び洗浄液を合わせ、そして緩衝液Ｂ．２（１００ｍＭ ＮａＣｌを有する緩衝液Ｂ）で平衡化していた２３ｍｌのＨＲ １６／１０ ヘパリンＴＳＫ−ガードゲル５ＰＷ（２０μｍ）カラム（TosoHaas、ペンシルベニア州モンゴメリービル）に入れた。このカラムを２×容量の緩衝液Ｂ．２で洗浄し、そしてその後、緩衝液Ｂ中１００ｍＭ ＮａＣｌから１Ｍ ＮａＣｌまでの１０×直線勾配を実施した。７ｍｌフラクションを集めた。フラクションは上記したようにしてＮ．ＢｓｔＮＢＩ活性をアッセイした。活性は、概ね５５０ｍＭのＮａＣｌで溶出したフラクション中に見られた。フラクション３６〜３９をプールし（２８ｍｌ）、そして緩衝液Ｂで５０ｍＭ ＮａＣｌにまで希釈した。
【００７１】
次いで、２番目のＨＲ １６／１０ ヘパリンＴＳＫ−ガードゲルを実施したが、ソースＱの希釈フラクション６〜１０を使用した。条件は全て、１０×勾配の代わりに２０×勾配を実施したことだけを除いて、１番目のヘパリンカラムと同一であった。活性は概ね５５０ｍＭのＮａＣｌで溶出したフラクション中で見られた。フラクション３６〜３８をプールし（２１ｍｌ）、そして緩衝液Ｂで５０ｍＭ ＮａＣｌにまで希釈した。
【００７２】
次いで、このプールを１番目のヘパリンカラムからプールしそして希釈したフラクションと合わせ、そして緩衝液Ｂ．１で平衡化していた８ｍｌのＨＲ １０／１０ ソース（商標）１５Ｑカラムに入れた。このカラムを２×容量の緩衝液Ｂ．１で洗浄し、そしてその後、緩衝液Ｂ中５０ｍＭ ＮａＣｌから８００ｍＭ ＮａＣｌまでの１５×直線勾配を実施した。３ｍｌフラクションを集めた。フラクションは上記のようにしてＮ．ＢｓｔＮＢＩ活性をアッセイした。活性の大部分は流出した。しかしながら、活性は幾分、最初の１４フラクション中で検出された。流出及び洗浄液をプールし、そしてその後、フラクション１〜１４を流出及び洗浄液から分けてプールした（４２ｍｌ）。１〜１４のプールを緩衝液Ｂ中で５０ｍＭ ＮａＣｌにまで希釈した。流出及び洗浄プールは３番目のヘパリンカラム（上記と同じタイプ）に流した。２０×勾配は緩衝液Ｂ中５０ｍＭから１ＭまでのＮａＣｌで実施した。４ｍｌフラクションを集めた。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩは概ね５９０ｍＭのＮａＣｌで溶出した。フラクション２４〜２６をプールし（１２ｍｌ）、そして緩衝液Ａ中で５０ｍＭ ＮａＣｌにまで希釈した。
【００７３】
同時に、ＨＲ １０／１０ ソース（商標）１５Ｑからプールしそして希釈したフラクション１〜１４を４番目のヘパリンカラム（上記と同じタイプ）に入れた。２０×勾配は緩衝液Ｂ中５０ｍＭから１ＭまでのＮａＣｌで実施した。４ｍｌフラクションを集めた。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩは概ね５９０ｍＭのＮａＣｌで溶出した。フラクション２４〜２６をプールし（１２ｍｌ）、そして緩衝液Ａ中で５０ｍＭ ＮａＣｌにまで希釈した。
【００７４】
３番目及び４番目のヘパリンカラムからプールしそして希釈したフラクションを合わせ、そして５番目のヘパリンカラム（上記と同じタイプ）に流した。今回は、ヘパリンカラムはトリス−ＨＣｌ緩衝液とは対照的にリン酸緩衝液中で実施したことに注目されたい。希釈したプールを緩衝液Ａ．２（緩衝液Ａ＋５０ｍＭ ＮａＣｌ）で予め平衡化していたＨＲ １６／１０ ヘパリン−ＴＳＫ−ガードゲルカラムに入れた。このカラムを２×容量の緩衝液Ａ．２、続いて緩衝液Ａ中５０ｍＭ ＮａＣｌから１Ｍ ＮａＣｌまでの２０×直線勾配で洗浄した。３ｍｌフラクションを集めた。フラクションはＮ．ＢｓｔＮＢＩ活性をアッセイした。酵素活性のピークは概ね６３０ｍＭのＮａＣｌで溶出した。フラクション３４〜３６をプールし（９ｍｌ）、そして緩衝液Ａ中で５０ｍＭ ＮａＣｌにまで希釈した。
【００７５】
希釈したプールを、緩衝液Ａ．２で予め平衡化していた１ｍｌのリソース（商標）１５Ｓ（Pharmacia Biotech、ニュージャージー州ピスカッタウエイ）前充填カラムに入れた。このカラムを２×容量の緩衝液Ａ．２で、続いて、緩衝液Ａ中５０ｍＭから１ＭまでのＮａＣｌの２０×直線勾配で洗浄した。１ｍｌフラクションを集めた。活性の大部分はフラクション１３〜１９（７ｍｌ）中に見られ、最大活性はフラクション１５中にあった。溶出用の見かけ上の塩は７５０ｍＭ ＮａＣｌであった；しかし、タンパク質がカラムに析出したので、これは「真の」溶出塩濃度ではない。
【００７６】
Ｎ．ＢｓｔＮＢＩは概ね８０％の均質にまで精製された。２０μＬのピークフラクション（１３〜１８）をＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲル上に置き、そして電気泳動に付した。このゲルをクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、そしてＮ．ＢｓｔＮＢＩ制限エンドヌクレアーゼ活性に相当する概ね７２ｋＤａの目立ったバンドが観察された。
【００７７】
２．  Ｎ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼのＮ−末端及び内部タンパク質配列の決定
記載されているようにして調製したＮ．ＢｓｔＮＢＩ制限エンドヌクレアーゼを電気泳動に付し、そして以前に記載された（Looney等、Gene 80:193-208 (1989））ようにして修正されたマツダイラ（Matsudaira）（Matsudaira、J. Biol. Chem. 262:10035-10038 (1987)）の方法に従ってエレクトロブロットした。この膜をクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、そして概ね７２ｋＤａ及び６ｋＤａのタンパク質バンドを切り取り、そしてパーキン−エルマー・コーポレーション（Perkin-Elmer Corporation）の応用バイオシステムズ部（Applied BioSystems Division）（カリフォルニア州フォスターシティ）のモデル（Model）４０７Ａガス相タンパク質シーケンサーで連続分解に付した（Waite-Rees等、J. Bacteriol. 173:5207-5219 (1991)）。７２ｋＤａタンパク質バンドの最初の３１残基はＭ−Ａ−Ｋ−Ｋ−Ｖ−Ｎ−Ｗ−Ｙ−Ｖ−Ｓ−Ｃ−Ｓ−Ｐ−Ｗ−Ｓ−Ｐ−Ｅ−Ｋ−Ｉ−Ｑ−Ｐ−Ｅ−Ｌ−Ｋ−Ｖ−Ｌ−Ａ−Ｎ−Ｆ−Ｅ−Ｇ（配列番号：１０）に相当し、そして該タンパク質の６ｋＤａの内部片のＮ−末端から得られるアミノ酸配列はＭ−Ｘ−Ｉ−Ｐ−Ｙ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ａ−Ｄ−Ｌ−Ｇ（配列番号：１１）であった。
【００７８】
実施例２
Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ制限−修飾遺伝子のクローニング
１．  バシラス・ステアロテルモフィラス３３Ｍから得られるゲノムＤＮＡの精製
バシラス・ステアロテルモフィラス３３ＭのゲノムＤＮＡを調製するために、細胞６．７ｇを２０ｍｌの２５％スクロース、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０中に再度懸濁し、そして溶液が均質になるまで混合した。０．２５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０ｍｌ＋新たに調製した０．２５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８．０）中１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム６ｍｌを加え、そしてこの溶液を氷上で２時間インキュベートした。次いで、溶解ミックス（１％トリトン−Ｘ１００、５０ｍＭトリス、６２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）２４ｍｌ及び１０％ＳＤＳ ５ｍｌを加え、そしてこの溶液を静かに混合した。この溶液を１容量の平衡化したフェノール／クロロホルム（５０：５０、ｖ／ｖ）で抽出し、そして水性相を回収した。次いで、この水性溶液は４Ｌの１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡに対して４℃で一夜透析した。透析した溶液をＲＮアーゼＡ（１００μｇ／ｍｌ）を使用して３７℃で１時間消化した。ＤＮＡは１／１０容量の５Ｍ ＮａＣｌ及び０．５５容量の２−プロパノールを添加して析出させ、そしてガラス棒に巻き付けた。残りの溶液は１２，０００ＲＰＭで３０分間回転させ、そしてその後上澄みを廃棄した。巻き付けたＤＮＡ及び遠心分離したＤＮＡペレットを風乾し、そして合計３．５ｍｌのＴＥ（１０ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解した。最終濃度は概ね１００μｇ／ｍｌであり、そしてこのＤＮＡを４℃で貯蔵した。
【００７９】
２．  Ｎ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の５’領域のｐＣＡＢ１６中へのクローニング
ｐＣＡＢ１６は、このベクターを以下に記載する条件下、３７℃で１時間インキュベートすることによってＢｓａＡＩで消化した。
１２０μｌのｐＣＡＢ１６（６〜１２μｇ）
１０μｌのＢｓａＡＩ（５０Ｕ）
４０μｌの１０×ＮＥＢ緩衝液＃３
２３０μｌのｄＨ２Ｏ
【００８０】
この反応のＢｓａＡＩは７５℃で１５分間インキュベートして熱で殺した。次いで、このベクターは、消化されたベクター１００μｌ（２μｇ）を１００ｍＭ ＭｇＣｌ２中１単位のシュリンプアルカリホスファターゼと共に３７℃で１時間インキュベートすることによって脱リン酸化した。
【００８１】
縮重プライマーは、それぞれＮ．ＢｓｔＮＢＩ Ｎ−末端タンパク質配列及び内部タンパク質配列から誘導される次のアミノ酸配列：１）Ｍ−Ａ−Ｋ−Ｋ−Ｖ−Ｎ−Ｗ−Ｙ（配列番号：１２）及び２）Ｙ−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ａ−Ｄ（配列番号：１３）に基づいて設計した。これらは、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の５’末端でＤＮＡと収束的態様でハイブリッド形成するように設計した。
【００８２】
プライマー１    ５’−ＴＧＧＣＮＡＡＲＡＡＲＧＴＮＡＡＹＴＧＧＴＡ−３’
（配列番号：１４）
プライマー２    ５’−ＴＣＮＧＣＲＡＡＲＴＣＹＴＣＲＴＡ−３’
（配列番号：１５）
これらのプライマーを合成し、そして各プライマーは、プライマー２μｇをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ２０単位、１０×Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液４μｌ及び１０ｍＭ ＡＴＰ ４μｌと共に４０μｌの反応容量中３７℃で３０分間インキュベートしてキナーゼ処理した。このキナーゼは、反応物を６５℃で１０分間インキュベートして熱不活性化した。
【００８３】
産生物の増幅で上首尾であった反応では、反応ミックスは：
１０μｌの１０×ＮＥＢサーモポル（ThermoPol）緩衝液
１０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ溶液
１．５μｌのキナーゼ処理プライマー１（７５ｎｇ）
１．５μｌのキナーゼ処理プライマー２（７５ｎｇ）
１μｌの精製細菌ＤＮＡ鋳型（１００ｎｇ）
７２μｌのｄＨ２Ｏ
２μｌの（４単位）のヴェント（Vent）（登録商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ
を組み合わせて作製された。
【００８４】
ＰＣＲ増幅条件は：９５℃で３０秒間、４５℃で１分間及び７２℃で１分間の３２サイクルであった。この反応物をＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭトリス−アセテート、ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中１％の低融解温度アガロースゲル（NuSieve Agarose、FMC BioProducts、メリーランド州ロックランド）で電気泳動にかけた。概ね１．４ｋｂのＤＮＡバンドを切り取り、そしてこのゲルスライスを一夜冷凍した。このアガロースプラグは、β−アガラーゼ２μｌ（２単位）を添加しそして４０℃で１時間インキュベートすることによってβ−アガラーゼで消化した。この反応物を冷凍し、そしてその後解凍しそして短時間マイクロ遠心分離して、非消化アガロース片を除去した。残っている水性層はエタノール沈殿させ、そして最終精製ＤＮＡペレットを再度懸濁して５ｎｇ／μｌにした。次いで、結合は次のもの：
１μｌの調製されたｐＣＡＢ１６（５０ｎｇ）
２０．５μｌのＰＣＲ産生物（１００ｎｇ）
２．５μｌの１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液
１μｌの濃縮Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（２０００単位）
を３７℃で組み合わせることによって実施した。
【００８５】
この反応物を３７℃で１時間インキュベートし、そしてその後水と氷を満たした氷バケツ中の冷却装置に入れた。この反応物をこのまま一夜インキュベートした。この一夜結合反応物１０μｌはコンピテントＥＲ２５０２細胞１００μｌ中に、ＤＮＡと細胞を一緒に組み合わせそして氷上で１０分間、続いて４２℃で４５秒間インキュベートすることによって形質転換した。全容量をアンピシリンＬＢプレートに播きそして３７℃で一夜インキュベートした。増殖したコロニーは、キアゲン・キアプレプ・スピン・プラスミド・キット（Qiagen QIAprep Spin Plasmid Kit）を使用してプラスミドＤＮＡを精製しそしてＡｓｅＩで消化してＰＣＲ産生物がベクター中にクローン化されているかどうかを見ることによって正しいプラスミド構築物について調査した。
４μｌのミニプレプ（miniprep）
１．５μｌの１０×ＮＥＢ＃３
０．５μｌのＡｓｅＩ
９μｌのｄＨ２Ｏ
【００８６】
上記反応物を３７℃で１時間インキュベートした。正しいサイズの挿入物を含有するミニプレプの配列を決定した。このＤＮＡ配列は６つの読み取り枠で翻訳され、推定アミノ酸配列がＮ．ＢｓｔＮＢＩタンパク質のＮ−末端配列に対応しているかどうかを調べた。
【００８７】
３．  逆ＰＣＲによる染色体歩行でＮ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼ及びメチラーゼ遺伝子の単離
Ａ．  ゲノムＤＮＡの調製 − ２連続逆ＰＣＲ反応のために２つの鋳型；ＨｉｎｃＩＩ及びＳｓｐＩを調製した。ＨｉｎｃＩＩの場合には、１．５μｇの細菌ＤＮＡを、５０μｌの反応容量中で０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度になるまでＢＳＡを補充した１×ＮＥ緩衝液３中５０単位のＨｉｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。ＳｓｐＩの場合には、１．５μｇの細菌ＤＮＡを、５０μｌの反応容量中で１×ＮＥ緩衝液ＳｓｐＩ中２５単位のＳｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。反応物は共に最適温度で１時間インキュベートした。これらの消化物は、消化反応物１３μｌを１％アガロースゲル上で実施して確認した。次いで、残っている反応物を６５℃で２０分間インキュベートして熱で殺した。次いで、環化は残存３７μｌ（約１μｇ）を５００μｌの反応容量中３０００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用して１×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液中、１６℃で一夜インキュベートして達成された。次いで、この環化結合反応物の一部を引き続く逆ＰＣＲ反応用の鋳型として使用した。
【００８８】
Ｂ．  ＨｉｎｃＩＩ逆ＰＣＲ − 逆ＰＣＲプライマーは、ｐＣＡＢ１６中にクローン化されたＮ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子片のＤＮＡ配列に基づいて合成した：
５’−ＣＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＧＴＴＧＴＴ−３’
（２２１−８５）                    （配列番号：１６）
５’−ＴＴＡＣＡＡＣＣＡＧＴＴＡＣＴＣＡＴＧＣＣＧＣＡＧ−３’
（２２１−８６）                    （配列番号：１７）
【００８９】
逆ＰＣＲは、プライマー２２１−８５及び２２１−８６並びに上記ＨｉｎｃＩＩ ＤＮＡ鋳型を使用して実施した。概ね６５０塩基対の産生物が産生された。この産生物をゲル精製し、そして３０μｌのｄＨ２Ｏに再度懸濁した。次いで、このＰＣＲ産生物は、ＡＢＩ３７３自動配列決定システムを製造者の指示に従って使用して配列を決定した。上記のＰＣＲプライマーは配列決定プライマーとして使用した。ＨｉｎｃＩＩ逆ＰＣＲ産生物はＮ．ＢｓｔＮＢＩ ＯＲＦの概ね４１０の新規ｂｐを含有していた。
【００９０】
Ｃ．  ＳｓｐＩ逆ＰＣＲ反応 − ＨｉｎｃＩＩ逆ＰＣＲ産生物から読み取られた配列と相補的な２つの逆ＰＣＲプライマーを合成し（以下参照）、そして第２の逆ＰＣＲ反応を実施した。鋳型調製、逆ＰＣＲ、精製及びＤＮＡ配列決定は全て、ＨｉｎｃＩＩ結合と対照的なＳｓｐＩ結合を使用して鋳型を創製したことを除いて上記と同じようにして実施した。概ね２．２ＫｂのＰＣＲ産生物が産生され、そして配列が決定された。このデータによって、残りのエンドヌクレアーゼＯＲＦ配列及びｎ．ｂｓｔＮＢＩＭ ＤＮＡ配列が明らかになった。
５’−ＧＡＧＴＧＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＴＡＣＴＣＡＡ−３’
（２２２−１４５）                  （配列番号：１８）
５’−ＴＡＴＡＧＴＴＧＴＴＣＧＡＴＡＴＡＡＴＧＡＧＡＣＣＡＴ−３’
（２２２−１４６）                  （配列番号：１９）
【００９１】
実施例３
Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ制限エンドヌクレアーゼの発現
１．  適合性ベクターでのＰｌｅＩメチラーゼのクローニング
ＰｌｅＩメチラーゼ遺伝子（ＰｌｅＩＭ）は、この遺伝子を発現ベクター、ｐＨＫＵＶ５中の強力なＵＶ５プロモーター（図５）のすぐ下流に挿入することによって発現された。これを達成するために、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、ＤＮＡ配列データを利用して合成した。前進オリゴヌクレオチドプライマーはクローニングを促進するためのＰｓｔＩ部位、ｌａｃＺタンパク質の翻訳を終了させるためにｌａｃＺ遺伝子を有するフレーム内の終結コドン、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）及びハイブリッド形成のためシュードモナス・レモイグネイ（Pseudomonas lemoignei）ＤＮＡと相補的な２５ヌクレオチドを含有していた：
５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＧＴＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＴＡＧＴＴＡＡＡＴＡＴＡＧＡＧ−３’
（２１２−１８０）                    （配列番号：２０）
【００９２】
逆進プライマーはＰｌｅＩ遺伝子の３’末端でシュードモナス・レモイグネイＤＮＡとハイブリッドを形成するように設計された。これはクローニングを促進するためにＢａｍＨＩ制限部位を含有していた。
５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＴＡＡＴＴＴＧＣＡＡＣＡＡＣＴＡＴＡＴＧ−３’
（２１２−１７５）                    （配列番号：２１）
【００９３】
これら２つのプライマーを使用し、次のもの：
１０μｌの１０×ヴェント（登録商標）サーモポル緩衝液
１０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰｓ
４μｌ（３００ｎｇ）のシュードモナス・レモイグネイゲノムＤＮＡ
１μｌのプライマー２１２−１８０（７５ｎｇ）
１μｌのプライマー２１２−１７５（７５ｎｇ）
７２μｌのｄＨ２Ｏ
１μｌ（０．１単位）のディープ・ヴェント（Deep Vent）（登録商標）ポリメラーゼ
１μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５単位）
を組み合わせ、そして９４℃で５分間、５０℃で１分間、及び７２℃で２分間の２５サイクルで増幅して、ゲノムシュードモナス・レモイグネイＤＮＡから得られるｐｌｅＩＭ遺伝子を増幅した。増幅産生物は、プロメガ・ウィザード・ＰＣＲ・プレプ・キット（Promega Wizard PCR Prep Kit）（ウィスコンシン州マジソン）を使用して精製した。５００ｎｇのｐＨＫＵＶ５ベクター及び残っているＰＣＲ産生物（約２μｇ）は共に、２０単位のＢａｍＨＩ及び２０単位のＰｓｔＩを使用し、１×ＮＥＢ ＢａｍＨＩ緩衝液中０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを補充し、６０μｌの反応物で、この反応物を３７℃で１時間インキュベートして消化した。この消化物を、ＴＡＥ緩衝液中１％の低融解温度ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲル上で移動させた。ＰＣＲ及びベクターＤＮＡバンドをゲルから切り取った。プラスミドゲルスライスはβ−アガラーゼを使用して４０℃で１時間処理した。次いでこれを冷凍し、そして解凍して残っている固形ゲル片はマイクロ遠心分離機を使用して素早く回転させた。上澄みをエタノール沈殿させ、そして最終ＤＮＡペレットを水に再度懸濁した。このＤＮＡ濃度はアガロースゲル上での視覚検査によって測定した。ベクターがゲル精製されたようには、メチラーゼＰＣＲはゲル精製されなかった。メチラーゼＰＣＲ産生物を含有するゲルプラグを結合反応で直接使用した。ｐＨＫＵＶ５とｐｌｅＩＭの結合は次のもの：
５μｌの調製ｐＨＫＵＶ５（１００ｎｇ）
５μｌのメチラーゼＰＣＲ産生物（１００ｎｇ）
１μｌのβ−アガラーゼ（１単位）
５μｌの１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液
１μｌの濃縮Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（２０００単位）
３３μｌのｄＨ２Ｏ
を組み合わせることによって達成された。
【００９４】
この反応物を３７℃で１時間インキュベートし、そして１０μｌの結合反応物を大腸菌株ＥＲ２５０２中に形質転換させた。個々のコロニーを単離し、そしてメチラーゼ遺伝子が実際にベクター中にクローン化されていることを確実にするために、ミニプレプをクローニング酵素で消化して分析した：
３μｌのミニプレプ
１．５μｌの１０×ＢａｍＨＩ緩衝液
１．５μｌの１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
０．７５μｌのＰｓｔＩ（１５単位）
０．７５μｌのＢａｍＨＩ（１５単位）
７．５μｌのｄＨ２Ｏ
上記消化物を３７℃で１時間インキュベートした。
【００９５】
次いで、正しい構築物であるミニプレプをＰｌｅＩで消化してメチラーゼ保護についてチェックした：
３μｌのミニプレプ
１．５μｌの１０×ＮＥ緩衝液１
１．５μｌの１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
１μｌのＰｌｅＩ（１単位）
８μｌのｄＨ２Ｏ
【００９６】
上記消化物を３７℃で１時間インキュベートした。ＰｌｅＩ消化に耐性のクローン１μｌは、塩化カルシウムコンピテント細胞を作る目的でＥＲ２５６６細胞中に形質転換した。
【００９７】
２．  Ｎ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング及び発現
Ｎ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ｎ．ｂｓｔＮＢＩＲ）はこの遺伝子を発現ベクター、ｐＨＫＴ７中の強力で誘導可能なＴ７プロモーター及び保存されたリボソーム結合部位（ＲＢＳ）のすぐ下流に挿入することによって発現された。これを達成するために２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、ＤＮＡ配列データを利用して合成した。前進オリゴヌクレオチドプライマーはクローニングを促進するためにＢａｍＨＩ部位を、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン、そしてハイブリッド形成のためにバシラス・ステアロテルモフィラス３３Ｍ ＤＮＡと相補的な２４ヌクレオチドを含有していた：５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＴＡＡＴＧＧＣＴＡＡＡＡＡＡＧＴＴＡＡＴＴＧＧＴＡＴ−３’
（２２３−１３８）                    （配列番号：２２）
【００９８】
逆進プライマーはｎ．ｂｓｔＮＢＩＭ遺伝子の３’末端でバシラス・ステアロテルモフィラス３３Ｍ ＤＮＡとハイブリッドを形成するように設計された。これはクローニングを促進するためにＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有していた。
５’−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＡＡＣＣＴＴＡＣＣＴＣＣＴＴＧＴＣＡＡＣ−３’
（２２３−１３９）                    （配列番号：２３）
【００９９】
これら２つのプライマーを使用し、次のもの：
１５μｌの１０×Ｔａｑ ＰＣＲ緩衝液（１．５ｍＭのＭｇ＋＋を含有する）
１．５μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰｓ
３μｌ（２４０ｎｇ）のバシラス・ステアロテルモフィラス３３ＭゲノムＤＮＡ１．５μｌのプライマー２２３−１３８（１１２．５ｎｇ）
１．５μｌのプライマー２２３−１３９（１１２．５ｎｇ）
１１１μｌのｄＨ２Ｏ
１．５μｌ（０．０７５単位）のディープ・ヴェント（登録商標）ポリメラーゼ１．５μｌのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（７．５単位）
を組み合わせ、そして９４℃で３０秒間、５０℃で１分間、及び７２℃で２分間の２５サイクルで増幅して、バシラス・ステアロテルモフィラス３３ＭゲノムＤＮＡから得られるｎ．ｂｓｔＮＢＩＭ遺伝子を増幅した。増幅産生物は、キアゲンＰＣＲ精製キットを使用して精製した。１μｇのｐＨＫＴ７ベクター及び残っているＰＣＲ産生物（約２μｇ）は共に、２０単位のＢａｍＨＩ及び２０単位のＨｉｎｄＩＩＩを使用し、１×ＮＥＢ ＢａｍＨＩ緩衝液中で０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを補充して消化した。この反応物を３７℃で１時間インキュベートした。この消化物を、ＴＡＥ緩衝液中１％の低融点ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲル上で移動させた。ＰＣＲ及びベクターＤＮＡバンド（それぞれ、概ね１．８Ｋｂ及び３．５Ｋｂ）をゲルから切り取り、そしてこのゲルスライスを６５℃で１０分間インキュベートした。温度を３７℃に下げ、そしてゲルスライスを結合した。ｐＨＫＴ７とｎ．ｂｓｔＮＢＩＭの結合は次のもの：
５μｌの調製ｐＨＫＴ７ゲルスライス（５０ｎｇ）
５μｌのエンドヌクレアーゼＰＣＲ産生物ゲルスライス（１００ｎｇ）
２．５μｌの１０×Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液
１．５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（６００単位）
１μｌのβ−アガラーゼ（１単位）
１０μｌのｄＨ２Ｏ
を３７℃で組み合わせることによって行われた。
【０１００】
この反応物を３７℃で１時間、そしてその後２５℃で更に１時間インキュベートした。１０μｌの結合反応物を、ＰｌｅＩメチラーゼ遺伝子で予め修飾した大腸菌株ＥＲ２５６６中に形質転換させた。形質転換体を分析し、そしてこれらは全てｎ．ｂｓｔＮＢＩＭ遺伝子を含有していた。このプラスミド構築物、ｐＨＫＴ７−ｎ．ｂｓｔＮＢＩＭはＮ．ＢｓｔＮＢＩエンドヌクレアーゼを産生するために選択した。ｐＨＫＴ７−ｎ．ｂｓｔＮＢＩＲ及びｐＨＫＵＶ５−ＰｌｅＩＭプラスミドを共に含有する大腸菌株はＮＥＢ＃１２３９と呼称した。ＮＥＢ＃１２３９株から得られる組換え体Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの収量は概ね４×１０７単位／細胞（ｇ）であった。
【０１０１】
３．  大腸菌ＥＲ２５６６ ＮＥＢ＃１２３９から組換え体Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ制限エンドヌクレアーゼの産生
大腸菌ＥＲ２５６６ ＮＥＢ＃１２３９はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）と共にＬ−ブロス培地を含有する発酵器中で中間対数期まで増殖させた。培養物は、０．４ｍＭの最終濃度になるまでＩＰＴＧを添加して誘導し、そして１６時間増殖を継続させた。細胞を遠心分離して採取し、そして−７０℃で貯蔵した。
【０１０２】
大腸菌ＮＥＢ＃１２３９からＮ．ＢｓｔＮＢＩ制限エンドヌクレアーゼの精製は、上記実施例１に概略しているように、標準的なタンパク質精製技術、例えば、アフィニティークロマトグラフィー又はイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせて達成することができる。この精製から得られるＮ．ＢｓｔＮＢＩ制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、そして非特異的なエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ夾雑を有していない。
【０１０３】
ｐＨＫＵＶ５−ＰｌｅＩＭ及びｐＨＫＴ７−ｎ．ｂｓｔＮＢＩＲプラスミドを共に含有する大腸菌ＥＲ２５６６ ＮＥＢ＃１２３９の試料はブタペスト条約の条件に基づいて、２０００年５月２６日に米国菌培養収集所に寄託され、そしてＡＴＣＣ受理番号ＰＴＡ−１９２５で受領された。
【０１０４】
実施例４
Ｎ．ＢｓｔＮＢＩを使用する非修飾ストランド置換増幅
ストランド置換増幅（ＳＤＡ）が有効に働くためには、制限酵素でニックをＤＮＡ鋳型中に導入しなければならない。
殆どの制限エンドヌクレアーゼは二本鎖解裂を作るので、α−チオｄＮＴＰｓをＳＤＡで使用しなければならない。本発明者は非−チオＳＤＡで切断エンドヌクレアーゼＮ．ＢｓｔＮＢＩを試験し、そして標的ＤＮＡが上首尾に増幅され得ることを見出した。以下はＮ．ＢｓｔＮＢＩによる非−チオＳＤＡについての詳細なプロトコルである。
【０１０５】
１．  ミックスＡ（下記）をプラスチック製の１．５ｍｌ試験管中、４℃で調製する：
試薬ストック                          最終濃度              ４０μｌ容量２５０ｍＭ ＫＰＯ４（ｐＨ７．５）    ３５ｍＭ ＫＰＯ４          ７μｌ
２Ｍ ＫＣｌ                         １００ｍＭ                ２．５μｌ
４ｍＭの各ｄＮＴＰミックス          ２００μＭの各ｄＮＴＰ    ２．５μｌ
１００ｍＭ ＤＴＴ                   １ｍＭ                    ０．５μｌ
１０μＭ プライマー４０             ０．８μＭ                ４μｌ
１０μＭ プライマー４１             ０．８μＭ                ４μｌ
２．５μＭ バンププライマー１       ０．０５μＭ              １μｌ
２．５μＭ バンププライマー２       ０．０５μＭ              １μｌ
５０ｎｇ／μｌのＤＮＡ鋳型          １ｎｇ／μｌ              １μｌ
Ｈ２Ｏ                                                   １６．５μｌ
【０１０６】
２．  １００℃で２分間変性させ；５５℃で３分間インキュベートしてプライマーをアニーリングさせる。これら２つの温度でのインキュベーションが生じている間に、別のプラスチック製の１．５ｍｌ試験管にミックスＢ（下記）を調製し、そして５５℃で少なくとも３０秒間プレインキュベートする。
試薬ストック                          最終濃度              １０μｌ容量
１０×ＮＥ緩衝液２                    １×                    ５．０μｌ
１０ｍｇ／ｍｌの精製ＢＳＡ            １００μｇ／ｍｌ        ０．５μｌ
５０ｍＭ ＭｇＣｌ２                    ２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２    ２．５μｌ
１０単位／μｌのＮ．ＢｓｔＮＢＩ      ５０μｌ当たり５単位    ０．５μｌ
２０単位／μｌのＢｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌ  ５０μｌ当たり１０単位  ０．５μｌ
Ｈ２Ｏ                                                         １μｌ
【０１０７】
３．  ミックスＡをＢに添加し；５５℃で２０〜６０分間インキュベーションを継続し、所望の場合、種々の時間点で１０〜２０μｌ容量を取り出し；０．２％のＳＤＳ（最終濃度）を含有する染料を添加して停止させる。
【０１０８】
４．  高割合アガロースゲルでのゲル電気泳動によって分析する。このアガロースゲル上に特異的な陽性バンドが観察された（図７、レーン１＝分子量標準；レーン２＝１６０ｂｐのバンド）。
【０１０９】
５．  プライマーの説明（これらは全て、ｐＵＣ１９のポリリンカー領域の側面に位置している）。
プライマー４０：５’−ＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＧＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ−３’            （配列番号：２４）
プライマー４１：５’−ＣＧＡＴＴＣＣＧＣＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＧＡＧＧＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡ−３’        （配列番号：２５）
バンププライマー＃１：５’−ＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴ−３’
（配列番号：２６）
バンププライマー＃２：５’−ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣ−３’
（配列番号：２７）
【０１１０】
６．  ＤＮＡ鋳型の説明：
鋳型は、ＳｐｈＩ部位を含有する短いＤＮＡデュプレックスをｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングし、そしてプラスミドｐＵＣ１９−ＳｐｈＩを産生させることによって構築された。ラムダＤＮＡをＮｌａＩＩＩで消化し、そしてＳｐｈＩで予め消化したプラスミドｐＵＣ１９−ＳｐｈＩ中に結合した。ＳＤＡで１６０ｂｐのＤＮＡを産生させるために使用されたＤＮＡ鋳型はＰＣＲでスクリーニングされた。
【０１１１】
実施例５
５種の切断酵素：Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎ．ＭｌｙＩ、Ｎ．ＡｌｗＩ、ＢｂｖＣＩ ＃２−１２及び＃１−３５によるＳＤＡ増幅
ストランド置換増幅（ＳＤＡ）が有効に働くためには、制限酵素でニックをＤＮＡ鋳型中に導入しなければならない。
殆どの制限エンドヌクレアーゼは二本鎖解裂を作るので、ＳＤＡではα−チオｄＮＴＰｓを使用しなければならない。本発明者は非修飾ＳＤＡで切断エンドヌクレアーゼＮ．ＢｓｔＮＢＩを試験し、そして標的ＤＮＡが上首尾に増幅され得ることを見出した。以下はＮ．ＢｓｔＮＢＩによる非修飾ＳＤＡについての詳細なプロトコルである。Ｎ．ＭｌｙＩ、Ｎ．ＡｌｗＩ、ＢｂｖＣＩ ＃２−１２及び＃１−３５非修飾ＳＤＡでは、使用した酵素の量、ＫＣｌ及びＭｇ濃度、アッセイ温度、前進及び逆進プライマー並びにプラスミド鋳型ＤＮＡをプレカットするために使用される酵素に関して上記プロトコルを修正した。基本的なＮ．ＢｓｔＮＢＩ非修飾ＳＤＡプロトコルのこれら修正はこの実施例のパート４に示す。
【０１１２】
Ｎ．ＢｓｔＮＢＩでの非修飾ＳＤＡプロトコル（表示した他の酵素では修正される）
１．  ミックスＡ（下記）をプラスチック製の１．５ｍｌ試験管中、４℃で調製する：
試薬ストック                          最終濃度              ３５μｌ容量
２５０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）  ３５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）  ７μｌ
Ｈ２Ｏ                              容量になるまで          １０．５μｌ
２Ｍ ＫＣｌ                        １００ｍＭ                ２．５μｌ
４ｍＭの各ｄＮＴＰミックス         ４００μＭの各ｄＮＴＰ    ５μｌ
１０ｍＭ ＤＴＴ                    １ｍＭ                    ５μｌ
１０μＭのｆｗプライマー３３       ０．２μＭ                １μｌ
１０μＭのｒｖプライマー３４       ０．２μＭ                １μｌ
２．５μＭのｆｗバンププライマー   ０．０５μＭ              １μｌ
２．５μＭのｒｖバンププライマー   ０．０５μＭ              １μｌ
５０ｎｇ／μｌのプレカット         反応物５０μｌ当たり      １μｌ
ｐＵＣＡＨ２６＊                 ５０ｎｇ
【０１１３】
２．  １００℃で２分間変性させ；５３℃で３分間インキュベートしてプライマーをアニーリングさせる。これら２つの温度でのインキュベーションが生じている間に、別のプラスチック製の１．５ｍｌ試験管にミックスＢ（下記）を調製し、そして５５℃で３０秒間プレインキュベートする。
試薬ストック                    最終濃度                    １５μｌ
Ｈ２Ｏ                           容量になるまで              ３．５μｌ
１×ＮＥ緩衝液２                ５０μｌのｒｘｎ容量        ５．０μｌ
当たり５μｌ
１０ｍｇ／ｍｌの精製ＢＳＡ      １００μｇ／ｍｌ            ０．５μｌ
１００ｍＭ ＭｇＣｌ２            １０ｍＭ ＭｇＣｌ２          ５．０μｌ
１０単位／μｌの                ５０μｌの反応物当たり      ０．５μｌ
Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ              ５単位
２０単位／μｌの                ５０μｌの反応物当たり      ０．５μｌ
Ｂｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌ          １０単位
【０１１４】
３．  ミックスＡをＢに添加し；５３℃で２５分間インキュベーションを継続する。０．２％のＳＤＳ（最終濃度）を含有する停止染料を２０μｌの上記反応物容量に添加する。
【０１１５】
４．  他の切断酵素での上記プロトコルの修正；それぞれに応じて、添加する水の容量を調整。
【０１１６】
【表１】
0004817587.tif 000002
【０１１７】
５．  １．５〜１．８％アガロース又はポリアクリルアミドゲルでのゲル電気泳動によって分析する。特異的な１３０〜１１０ｂｐの産生物が１．８％アガロースゲル上で観察された。（図８）。
【０１１８】
６．  プライマーの説明（これらは全て、ｐＵＣ１９のポリリンカー領域の側面に位置している）。
５種の全ての切断酵素で使用したバンププライマー：
バンプ前進プライマー：
５’−ＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴ−３’    （配列番号：２６）
バンプ逆進プライマー：
５’−ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣ−３’    （配列番号：２７）
切断酵素に特異的なプライマー：
Ｎ．ＢｓｔＮＢ Ｉ及びＮ．Ｍｌｙ Ｉプライマー：
Ｐ３３前進：
５’−ＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＡＴＧＣＧＡＧＴＣＡＴＧＴＴＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ−３’              （配列番号：２８）
Ｐ３４逆進：
５’−ＣＧＡＴＴＣＣＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＴＣＡＣＴＴＴＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡ−３’          （配列番号：２９）
Ｎ．Ａｌｗ Ｉプライマー：
Ｐ４７前進：
５’−ＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＡＴＧＣＧＧＡＴＣＡＴＧＴＴＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ−３’            （配列番号：３０）
Ｐ４８逆進：
５’−ＣＧＡＴＴＣＣＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＡＣＴＴＴＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡ−３’          （配列番号：３１）
ＢｂｖＣ Ｉ、＃１−３５プライマー：
Ｐ４９前進：
５’−ＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＡＴＡＴＧＴＡＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ−３’        （配列番号：３２）
Ｐ５０逆進：
５’−ＣＧＡＴＴＣＣＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＡＴＣＣＣＴＣＡＧＣＴＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡ−３’        （配列番号：３３）
ＢｂｖＣＩ、＃２−１２プライマー：
Ｐ５１前進：
５’−ＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＡＴＡＴＧＴＡＴＣＧＣＧＣＴＧＡＧＧＴＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ−３’            （配列番号：３４）
Ｐ５２逆進：
５’−ＣＧＡＴＴＣＣＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡ−３’        （配列番号：３５）
【０１１９】
７．  ＤＮＡ鋳型の説明：
鋳型は、ＳｐｈＩ部位を含有する短いＤＮＡデュプレックスをｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＵＣ１９−ＳｐｈＩを産生させることによって構築した。λＤＮＡをＮｌａＩＩＩで消化し、そしてＳｐｈＩで予め消化したプラスミドｐＵＣ１９−ＳｐｈＩ中に結合した。ベクターバックボーン中への種々の大きさの挿入物を選択した後、ＳＤＡプロトコルで使用できるプラスミドの１つのファミリーを選択して、種々の産生物長を生じさせた。この実施例で使用した特異的な鋳型、ｐＵＣＡＨ２６は１３０〜１１０ｂｐの産生物長（ＳＤＡにおける切断前又は後の産生物長）を生じさせる。
【０１２０】
実施例６
強力な切断中間体を有する制限エンドヌクレアーゼ、例えばＢｓｒＦＩによるＳＤＡ増幅
ストランド置換増幅（ＳＤＡ）が有効に働くためには、制限酵素でニックをＤＮＡ鋳型中に導入しなければならない。殆どの制限エンドヌクレアーゼは二本鎖解裂を作るので、α−チオｄＮＴＰｓのような修飾ヌクレオチドをＳＤＡで使用しなければならない。本発明者は非修飾ＳＤＡで切断エンドヌクレアーゼＮ．ＢｓｔＮＢＩを試験し、そして標的ＤＮＡが上首尾に増幅され得ることを見出した（実施例４）。もう１つの手法は強力な切断中間体を有する制限エンドヌクレアーゼを使用する。このような酵素は、超コイル状プラスミド基質が提供されたとき、ＤＮＡ基質の線状化（両ストランドの切断）前に、ニック形成環状ＤＮＡ中間体（１本のストランド切断）の蓄積を示す。本発明者は多様な熱安定制限エンドヌクレアーゼを、これらが超コイル状プラスミド基質から切断中間体を産生する能力を時間の関数として試験し、そしてこれら酵素の１つ、ＢｓｒＦＩを使用してＳＤＡプロトコルを開発した。ＢｓｒＦＩ制限エンドヌクレアーゼは、線状化産生物より１０倍高いニック形成中間体ＤＮＡ産生物値を時間の関数として蓄積する。
【０１２１】
強力な切断中間体を有する制限酵素、ＢｓｒＦＩを使用する非−チオＳＤＡプロトコル
１．  ミックスＡをプラスチック製のエッペンドルフ管中で調製する：
試薬ストック                        最終濃度              ３５μｌ容量
２５０ｍＭ ＫＰＯ４（ｐＨ７）    ３５ｍＭ ＫＰＯ４（ｐＨ７）    ７μｌ
Ｈ２０                             容量になるまで        １８〜１３μｌ
５００ｍＭ ＫＣｌ                 ０〜５０ｍＭ              ０〜５μｌ
４ｍＭの各ｄＮＴＰミックス        ４００μＭの各ｄＮＴＰ     ５μｌ
１０μＭの前進プライマー           ０．２μＭ                １μｌ
１０μＭの逆進プライマー           ０．２μＭ                １μｌ
２．５μＭのバンププライマー       ０．０５μＭ              １μｌ
２．５μＭのバンププライマー       ０．０５μＭ              １μｌ
５０ｎｇ／μｌのＢｓｒＦＩ         反応物５０μｌ当たり      １μｌ
プレカットＤＮＡプラスミド鋳型      ５０ｎｇ
【０１２２】
２．  １００℃で２分間変性させ；５５℃で３分間インキュベートしてプライマーをアニーリングさせる。これら２つの温度でのインキュベーションが生じている間に、別のプラスチック製の１．５ｍｌ試験管にミックスＢ（下記）を調製し、そして５５℃で３０秒間プレインキュベートする。
試薬ストック                          最終濃度                １５μｌ
Ｈ２０                              容量になるまで            ５．５μｌ
１×ＮＥ緩衝液２                    ５０μｌのｒｘｎ容量      ５．０μｌ
当たり５μｌ
１０ｍｇ／ｍｌの精製ＢＳＡ          １００μｇ／ｍｌ          ０．５μｌ
５０ｍＭ ＭｇＣｌ２                  ２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２     ２．５μｌ
２０単位／μｌのＢｓｒＦ Ｉ        反応物５０μｌ当たり      ０．５μｌ
１０単位
１０単位／μｌのＢｓｔ             反応物５０μｌ当たり      １．０μｌ
ＤＮＡ Ｐｏｌ                      １０単位
【０１２３】
３．  ミックスＡをＢに添加し；５５℃で２０〜６０分間インキュベーションを継続する。０．２％のＳＤＳ（最終濃度）を含有する停止染料を２０μｌの上記反応物容量に添加して反応を停止させる。
【０１２４】
４．  １．５〜１．８％アガロース又はポリアクリルアミドゲルでのゲル電気泳動によって分析する。特異的な１４０〜５００ｂｐの産生物が１．８％アガロースゲル上で観察された。（７項参照）
【０１２５】
５．  プライマーの説明（これらは全て、ｐＵＣ１９のポリリンカー領域の側面に位置している）。
バンププライマー：
バンプ前進プライマー：
５’−ＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴ−３’    （配列番号：２６）
バンプ逆進プライマー：
５’−ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣ−３’    （配列番号：２７）
ＢｓｒＦＩに特異的なプライマー：
Ｐ１３前進：
５’−ＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＡＴＧＣＡＴＧＴＡＣＣＧＧＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ−３’              （配列番号：３６）
Ｐ１４逆進：
５’−ＣＧＡＴＴＣＣＧＣＴＣＣＡＧＡＣＴＴＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡ−３’          （配列番号：３７）
【０１２６】
６．  ＤＮＡ鋳型の説明：
鋳型はｐＵＣ１９修飾プラスミドの１つのファミリーであった。内在性の単一のＢｓｏＢＩ及びＢａｍＨＩ部位を切断して除去し、そしてその後ｐＲＫ２２を形成させるように反応物を満たした（ＢａｍＨＩ部位の除去はこのプロジェクトに関係がなかった）。他の関係がある構築物はＭｓｐＩ−ｐＢＲ３２２フラグメントをｐＲＫ２２ポリリンカーのＡｃｃＩ部位に挿入して作製された。これは、ＳＤＡ中に増殖されたＤＮＡの領域に種々の長さの挿入物を含有する関係プラスミドの１つのファミリーを産生した。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１Ａは、認識配列（配列番号：１）及びＮ．ＢｓｔＮＢＩ切断エンドヌクレアーゼの解裂部位を示す。Ｎ．ＢｓｔＮＢＩは簡単な非対称配列、５’−ＧＡＧＴＣ−３’を認識し、そしてその認識部位の３’−末端から４塩基離れて、１本のＤＮＡ鎖だけを解裂し、そしてこれは矢印で示されている。
図１Ｂは、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ制限−修飾系の遺伝子構成を示しており、その際ｎ．ｂｓｔＮＢＩＲ（Ｒ）はＮ．ＢｓｔＮＢＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子でありそしてｎ．ｂｓｔＮＢＩＭ（Ｍ）はＮ．ＢｓｔＮＢＩ修飾メチルトランスフェラーゼ遺伝子である。
【図２】  ｎ．ｂｓｔＮＢＩＲ遺伝子のＤＮＡ配列及びそのコードされるアミノ酸配列を示す（配列番号：２及び配列番号：３）。
【図３】  ｎ．ｂｓｔＮＢＩＭ遺伝子のＤＮＡ配列及びそのコードされるアミノ酸配列を示す（配列番号：４及び配列番号：５）。
【図４】  ｐｌｅＩＭ遺伝子のＤＮＡ配列及びそのコードされるアミノ酸配列を示す（配列番号：６及び配列番号：７）。
【図５】  ｐＨＫＵＶ５のクローニングベクターを示す（配列番号：８）。
【図６】  ｐＨＫＴ７のクローニングベクターを示す（配列番号：９）。
【図７】  切断酵素Ｎ．ＢｓｔＮＢＩを使用した非修飾ストランド置換増幅の結果を示す。レーン１は分子量標準品を示し、そしてレーン２はＮ．ＢｓｔＮＢＩによるＳＤＡから産生された１６０ｂｐのＤＮＡフラグメントを示し、そしてこれは矢印で示されている。
【図８】  ５種の切断酵素を使用して重複試料で実施した非修飾ストランド置換増幅の結果を示す。レーン１及び１２は分子量マーカーレーンである（１００ｂｐラダー）。レーン２及び３、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩ；レーン４及び５、Ｎ．ＡｌｗＩ；レーン６及び７、Ｎ．ＭｌｙＩ；レーン８及び９、Ｎ．ＢｂｖＣＩ−１−３５；レーン１０及び１１、ＢｂｖＣＩ−２−１２。矢印は予想される１００〜１２０ｂｐの生成物バンドの位置を示す。
【図９】  ２段階で解裂する酵素、ＢｓｒＦＩを使用した非修飾ストランド置換増幅の結果を示す。パネルＡ、実施例６に記載されているＳＤＡ反応；レーン１、ＤＮＡ基質無し、出現産生物無し；レーン２、ＢｓｒＦＩ無し、出現産生物無し；レーン３、完全な反応、１５０ｂｐのアンプリコン出現。Ｍ＝サイズ標準マーカー、φＸ１７４のＨａｅＩＩＩ消化物；パネルＢ；実施例６に記載されているＳＤＡ反応、但し、ＤＮＡ基質が異なっているため異なる大きさのアンプリコンが得られている：レーン１、１５０ｂｐの産生物；レーン２ − １９０ｂｐの産生物；レーン３ − ３３０ｂｐの産生物；レーン４ − ４３０ｂｐの産生物；レーン５ − ５００ｂｐの産生物。Ｍ＝サイズ標準マーカー、φＸ１７４のＨａｅＩＩＩ消化物。
【配列表】
0004817587.tif 000003
0004817587.tif 000004
0004817587.tif 000005
0004817587.tif 000006
0004817587.tif 000007
0004817587.tif 000008
0004817587.tif 000009
0004817587.tif 000010
0004817587.tif 000011
0004817587.tif 000012
0004817587.tif 000013
0004817587.tif 000014
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0004817587.tif 000019
0004817587.tif 000020
0004817587.tif 000021
0004817587.tif 000022
【図１】
0004817587.tif 000023
【図２】
0004817587.tif 000024
0004817587.tif 000025
0004817587.tif 000026
【図３】
0004817587.tif 000027
0004817587.tif 000028
【図４】
0004817587.tif 000029
0004817587.tif 000030
【図５】
0004817587.tif 000031
【図６】
0004817587.tif 000032
【図７】
0004817587.tif 000033
【図８】
0004817587.tif 000034
【図９】
0004817587.tif 000035