(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体を刺激するか、または受容体の活性な受容体状態の活性を減少させる化合物として候補化合物を直接同定するための方法であって、該受容体は、オーファン受容体であり、該方法は、以下の工程：
（ａ）該候補化合物を構成的に活性化されるオーファン受容体と接触させる工程；および（ｂ）該接触された受容体における該化合物の効能を測定することにより、該化合物が、該受容体を刺激するか、または該受容体の活性状態の活性を減少させるかどうかを決定する工程
を包含し、該オーファン受容体がＧタンパク質共役細胞表面オーファン受容体であり；そして、該オーファン受容体の第３細胞内ループが、以下の配列：
Ｘ１ＢＢＨｙＸ２
を含み、ここで、Ｘ１はアミノ酸であり；Ｂは塩基性アミノ酸であり；Ｈｙは疎水性アミノ酸であり、そしてＸ２はアミノ酸である、方法。
【請求項２】
前記候補化合物が前記受容体の活性状態の活性を減少させると直接同定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オーファン受容体が内因性の構成的に活性化されるオーファン受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記オーファン受容体が非内因性の構成的に活性化されるオーファン受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
Ｘ１がグリシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｘ１がアラニンである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ｘ１がリシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ｈｙがアラニンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｘ２がリシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ｘ２がアルギニンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｘ２がグルタミン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記オーファン受容体の第２細胞内ループが、以下の配列：
ＸＲＹ
を含み、ここでＸはＤ以外のアミノ酸であり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
上記配列Ｘ１ＢＢＨｙＸ２が内因性の配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
上記配列Ｘ１ＢＢＨｙＸ２が非内因性の配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
上記配列ＸＲＹが内因性の配列である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
上記配列ＸＲＹが非内因性の配列である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｃ）前記化合物が、薬学的組成物として処方される工程をさらに包含する、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項１８】
受容体を刺激するか、または受容体の活性な受容体状態の活性を減少させる化合物として候補化合物を直接同定するための方法であって、該受容体が、非内因性の構成的に活性化されるＧタンパク質共役細胞表面オーファン受容体であり、該方法は以下の工程：
（ａ）該候補化合物を、非内因性の構成的に活性化されるＧタンパク質共役細胞表面オーファン受容体と接触させる工程；および
（ｂ）該接触された受容体における該化合物の効能を測定することにより、該化合物が該受容体を刺激するか、または該受容体の活性状態の活性を減少させるかどうかを決定する工程：
を包含し、該オーファン受容体の第３細胞内ループが、以下の配列：
Ｘ１ＢＢＨｙＸ２
を含み、ここで、Ｘ１はアミノ酸であり；Ｂは塩基性アミノ酸であり；Ｈｙは疎水性アミノ酸であり、そしてＸ２はアミノ酸である、方法。
【請求項１９】
前記候補化合物が前記受容体の活性状態の活性を減少させると直接同定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｃ）前記化合物が、薬学的組成物として処方される工程をさらに包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
受容体を刺激するか、または受容体の活性な受容体状態の活性を減少させる化合物として候補化合物を直接同定するための方法であって、該受容体が、内因性の構成的に活性化されるＧタンパク質共役細胞表面オーファン受容体であり、該方法は、以下の工程：
（ａ）該候補化合物を、内因性の構成的に活性化されるＧタンパク質共役細胞表面オーファン受容体と接触させる工程；および
（ｂ）該接触された受容体における該化合物の効能を測定することにより、該化合物が、該受容体を刺激するか、または該受容体の活性状態の活性を減少させるかどうかを決定する工程
を包含し、該オーファン受容体の第３細胞内ループが、以下の配列：
Ｘ１ＢＢＨｙＸ２
を含み、ここで、Ｘ１はアミノ酸であり；Ｂは塩基性アミノ酸であり；Ｈｙは疎水性アミノ酸であり、そしてＸ２はアミノ酸である、方法。
【請求項２２】
前記候補化合物が前記受容体の活性状態の活性を減少させると直接同定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｃ）前記化合物が、薬学的組成物として処方される工程をさらに包含する、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
オーファンＧタンパク質共役受容体を刺激する化合物、またはオーファンＧタンパク質共役受容体の活性な状態を減少させるように作用する化合物として候補化合物を直接同定するためのインビトロでの方法であって、該オーファンＧタンパク質共役受容体は、該受容体を非内因性の構成的に活性化されるオーファンＧタンパク質共役受容体とするようにアミノ酸配列中に変異を含み、該方法は、以下の工程：
（ａ）該候補化合物を該非内因性の構成的に活性化されるオーファンＧタンパク質共役受容体と接触させる工程であって、該オーファンＧタンパク質共役受容体が哺乳動物細胞において発現される、工程；および
（ｂ）該化合物が受容体機能を阻害または刺激する能力を測定することにより、該候補化合物が該オーファンＧタンパク質共役受容体を刺激する化合物であるか、または該オーファンＧタンパク質共役受容体の活性な状態を減少させるように作用する化合物であるかどうかを決定する工程
を包含し、該オーファン受容体の第３細胞内ループが、以下の配列：
Ｘ１ＢＢＨｙＸ２
を含み、ここで、Ｘ１はアミノ酸であり；Ｂは塩基性アミノ酸であり；Ｈｙは疎水性アミノ酸であり、そしてＸ２はアミノ酸である、方法。
【請求項２５】
前記変異が単一のアミノ酸変異を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記変異が突然変異カセットを用いて生成される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物が前記受容体に対するインバースアゴニストであると決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
Ｘ１がグリシンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
Ｘ１がアラニンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
Ｘ１がリシンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
Ｈｙがアラニンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
Ｘ２がリシンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
Ｘ２がアルギニンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
Ｘ２がグルタミン酸である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
前記オーファンＧタンパク質共役受容体の第２細胞内ループが、以下の配列：
ＸＲＹ
を含み、ここでＸはＤ以外のアミノ酸であり得る、請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記配列Ｘ１ＢＢＨｙＸ２が内因性の配列である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
前記配列Ｘ１ＢＢＨｙＸ２が非内因性の配列である、請求項２４に記載の方法。
【請求項３８】
前記配列ＸＲＹが内因性の配列である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記配列ＸＲＹが非内因性の配列である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記化合物が受容体機能を阻害または刺激する能力が、前記候補化合物が前記構成的に活性化されるオーファンＧタンパク質共役受容体と接触された際のｃＡＭＰレベルの変化を測定することによって検出される、請求項２４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記化合物が受容体機能を阻害または刺激する能力が、［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合の測定によって検出される、請求項２４〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
工程（ｃ）前記化合物が、薬学的組成物として処方される工程をさらに包含する請求項２４〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、1998年10月13日に出願された米国特許出願第09/170,496号の一部継続出願であり、これは引用により全部、本明細書に編入する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、多細胞生物および細胞機能の調節における細胞間の情報伝達、そしてより詳細には遺伝的突然変異、翻訳後修飾または他のいくつかのプロセスの結果として構成的に活性化される膜受容体の調節を取り扱う。
関連分野の記載
細胞表面受容体
細胞は孤立して存在していない。特に分化した組織をもつ多細胞生物では、細胞間の情報伝達は全生体の統合および機能を調和させるために必要である。一般にこの情報伝達はかなりの距離にわたって起こらなければならない。細胞間の情報転送機能は、任意の情報系に関して２つの一般的基準を満たさなければならない：１）情報は、その意図する目的地を変えずに到達できなければならない；そして２）情報はその情報が作用を及ぼすレシピンントにのみ送達され、そして検出されるべきである。このような２つのうちのいずれかが失敗すると、意味のないノイズが系に導入される。初期の1905年にLangleyは、細胞は化合物シグナルを合成そして放出し、このシグナルはこのようなシグナルのみに応答するにようし特別に設計された受信細胞上に位置する分子より検出されることにより情報伝達を行うという概念を導入した。
【０００３】
動物では、３種類のシグナルがシグナル伝達および受信細胞間の距離に基づき区別される。遠く離れた細胞群に到達するためには、内分泌のシグナル伝達には通常、内分泌器官によるホルモンの血流への放出が関与する。免疫系も幾分離れて位置する他の細胞にシグナルとして役立つことができる抗体を生産する。標的細胞がシグナル伝達細胞に近い場合、神経伝達または神経筋伝達のようにパラ分泌シグナル伝達には隣接細胞にのみ影響を及ぼすシグナル伝達物質を含む。最終的に、幾つかの細胞はそれらが放出した細胞に応答する。この自己シグナル伝達をオートクリンシグナリング（autocrine signalling）と称する。
【０００４】
多細胞生物により採用されている種々のシグナル分子（ホルモン、イオン、神経伝達物質、免疫分子）にもかかわらず、それぞれに進化した細胞のシグナル受信装置は、構造および操作において驚くほど類似している。各シグナル伝達分子は、受信細胞の形質膜に埋め込まれ、そして広がった大きな高分子タンパク質またはタンパク質の集成体から成る特異的受容体により認識される。シグナル伝達分子を認識する受容体の一部は、細胞の細胞外表面またはその上にある。膜に埋め込まれたタンパク質受容体の一部は、一般に疎水性側鎖基を含むアミノ酸残基から成る。一般に受容体の一部が細胞内空間に広がり、そこで細胞の化学現象と接触する。
【０００５】
受容体は特異的な細胞外シグナルを受信し、そしてその存在を細胞膜をわたって伝達するように作用して細胞内の生物化学反応を活性化させる。どのようにこの情報が細胞膜をわたって転送されるかは未だに正確には明らかにされていない。しかし積み重ねられた証拠に基づき、シグナル分子が受容体の様々な三−次元的形状（立体配置）を安定化し、この形状の差異が次に細胞内の部分で変換（transducing）タンパク質との相互作用を引き起こし、このタンパク質がさらに細胞内の生物化学活性に参加すると考えられている。このさらなる活性は、「第２メッセンジャー」系と命名され、そして典型的には3',5'-サイクリックAMP(CAMP)、3',5'-サイクリックGMP(CGMP)、1,2-ジアシルグリセロール、インシトール 1,4,5-三リン酸およびCa2+を含む。このような第２メッセンジャーは、続いて１以上の酵素系を活性化する。
【０００６】
この細胞内相互作用の正確な性質は、受容体の種類に大変依存している。異なる細胞上に存在する同じ受容体は異なる変換タンパク質を連結して異なる効果を生じることができる。相そうじて、同じ細胞上の異なる受容体が同じ細胞性の応答を生じることもできる。シグナル伝達物質が受容体の特定の部位に結合して立体配置の変化を誘導するという事実から、それらは一般にリガンドと呼ばれている。
【０００７】
多種類の受容体が哺乳動物に存在し、そしてそれらは遺伝的および化学的構造およびそれらが相互作用する第２メッセンジャーに基づき分化していることが知られている。４つの主要な受容体群がある：１）Ｇ−タンパク質共役受容体；２）チロシンキナーゼ受容体；３）リガンド−依存性イオンチャンネル；および４）免疫認識受容体。このような群は、それらが適切なリガンドに暴露された時のそれらの反応の迅速性に基づき、２種類に分類することができる。リガンド−依存性イオンチャンネルは、活性化されるとミリ秒の応答を有する。他の群に属する受容体は、さらに第２メッセンジャー経路が活性化されなければならないので、より遅い反応を媒介する。
【０００８】
受容体を調査する伝統的な生物化学的方法には、受容体を活性化する内因性または天然のリガンドを最初に同定することに努める手順があり、そしてそれに未だに従っている。時には内因性のリガンドが知られていたか、または神経伝達物質のような場合は容易に推定された。他の場合は受容体の種々の組織中の生理学的分布に基づき、知識に基づく推測により正しいリガンドが導かれた。どのような発見の様式でも、受容体を研究するために今日までに報告されたすべての方法は、１例を除き、ほとんどが内因性リガンドの最初の同定に依存している。唯一の例外はモルホリンのような化合物が受容体に結合することが知られている場合であり、そして放射性同位体で標識し、そして次に受容体を研究するために使用した。これは内因性性のリガンド、例えばオピエート受容体のエンケファリン、エンドルフィンまたはダイノルフィンペプチド無しで行うことができる。この場合は、放射活性化合物を使用して受容体を同定し、そして内因性リガンド（１つまたは複数）の発見および同定を助けるために役立つかもしれない。
【０００９】
いったん内因性リガンドが同定されれば、受容体の挙動を調査し、またはモディファイするために使用できる化合物（薬剤）に関する調査が典型的には行われる。このような調査、Ｇタンパク質で共役した（および他の種類の受容体）薬剤候補を同定するためのケミカルライブラリースクリーニング法は、リガンドを最初に幾つかの様式（例えば放射性同位体を用いて）標識して検出を可能とし、そしてインビトロの発現系で標的受容体に「結合」させるために使用するリガンドに基づくアッセイに依存する。次いで化合物は、受容体部位から標識したリガンドを置き換える分子を同定するために、標的受容体をわたってスクリーニングされる。標識したリガンドを置き換える分子は、アゴニストまたアンタゴニストの可能性があり（すなわち、受容体刺激物またはインヒビター）、そして薬剤発見のための化学的出発点として役立つ。追補“Ａ”中に掲げるのは、リガンドに基づいた受容体スクリーニングアッセイを使用して見いだされた薬剤および他の非ペプチド化合物の例である。リガンドに基づいたスクリーニングアッセイのパラダイムは十分に確立しているので、主要な企業はスクリーニングサービスを提供する事業を進めてきた。１つの会社から利用可能なアッセイの広範囲の能力範囲の例を、追補”Ｂ”に示す。
【００１０】
しかし現在まで、膨大な努力にもかかわらず、分子クローニングにより同定された新規受容体の内因性リガンドの同定は、たいへんな時間を要し、しかもほとんどの部分が実を結ばない努力であることが証明された。その内因性リガンドが未知のままであるこのような受容体は、一般に「オーファン受容体」と分類されている。定義により、このオーファン受容体は受容体を研究するために使用することができる内因性または合成の既知のリガンドをもたない。この理由からリガンドに基づくスクリーニングアッセイの開発および引き続きこのような受容体に対するケミカルスクリーニングは可能ではない。これはこの重要な種類の受容体の小分子薬剤の発見を大変妨げてきた。ヒトゲノムプロジェクトが進むにつれて、近い将来、さらなる受容体の遺伝子配列が同定され、そしてそのような知識がヒトの疾患の原因であるさらなる受容体の発見を導くと予測される。さらにたとえ疾患状態との直接的関連が示されても、このような受容体の内因性リガンドに関する知識は無いので、このような受容体がオーファン受容体と分類される可能性は大きい。たとえ内因性のリガンドの知識がなくても、そのような受容体の状態をモディファイする（疾患の状況に応じて活性化または不活性化するために）化合物を同定するための方法を見いだすことが極めて重要であることは明らかである。しかしそのような方法は従来技術においては知られていない。
【００１１】
Ｇタンパク質-共役受容体
上記に挙げた４種の受容体の中で、Ｇタンパク質共役受容体は最も数が多い。Ｇタンパク質共役受容体は、受容体が活性化する細胞内タンパク質セグメントがGDP(グアノシン二リン酸)に結合するという事実により識別される。Ｇタンパク質が受容体により活性化された後、結合したGDPはGTP（グアノシン三リン酸)に転換され、そしてＧタンパク質はさらなる酵素活性を媒介する。異なるＧタンパク質は異なる細胞内活性を媒介する。活性化するリガンド、第２メッセンジャーＧタンパク質系およびアミノ酸配列における差異にもかかわらず、Ｇタンパク質共役受容体は共通する構造モティーフを分け合う。すべてのこのような受容体は、各々が膜に広がる７つのアルファ（“α"）ヘリックスを形成する22から24個の間の疎水性アミノ酸の７つの配列を有する。膜貫通ヘリックスは、膜の細胞外側上の第４および第５膜貫通ヘリックスの間により大きなループを有するアミノ酸鎖により連結されている。親水性アミノ酸から主に成る別のより大きなループは、膜の細胞内側上で膜貫通ヘリックス５および６を連結する。受容体のカルボキシ末端は細胞内に存在し、アミノ末端は細胞外空間にある。ヘリックス５および６を連結するループならびにカルボキシ末端は、Ｇタンパク質と相互反応すると考えられている。Ｇタンパク質−共役受容体の一般構造は、図１に示す。
【００１２】
ヒトのゲノム内には、推定される全2000遺伝子が１種類の受容体をコードすると考えられている。現在まで、活性化するリガンドが既知であるわずか約100個のＧタンパク質共役受容体の遺伝子配列が同定された。しかし活性化するリガンドが未知である約100個の他のＧタンパク質共役受容体に関する配列が同定され、そしてクローン化された。これらはオーファンＧタンパク質共役受容体を表す。
【００１３】
生理学的条件下で、Ｇタンパク質−共役受容体は細胞膜中で２つの異なる状態または立体配置：「不活性」状態および「活性」状態の間の平衡状態で存在する。図２に概略的に示すように、不活性状態の受容体は、細胞内伝達（第２メッセンジャー）経路につながることはできず、そして生物応答を生じない。受容体の立体配置を活性状態に変えることにより伝達経路につながり、そして生物応答を細胞中で生じることが可能になる。受容体に特異的なアゴニスト リガンドは、受容体を活性状態に安定化することにより伝達経路との連結を促し、生物応答を生じることができる。
【００１４】
以下に大変詳細に記載するように、過去数年にわたる最近の知見では、受容体が内因性リガンドまたは外因性アゴニストリガンドとの結合以外の手段によっても、活性な立体配置に安定化される得ることが示された。そのような他の手段には限定するわけではないが、受容体のアミノ酸配列の修飾が含まれる。このような他の手段は効果的に（リガンド無しで）、受容体へのリガンドの結合の安定化効果を刺激して受容体を活性状態に保つ。そのようなリガンド非依存的手段による安定化は、「構成的な受容体の活性化」と呼ばれる。例えば、Ｇq-ホスホリパーゼGタンパク質共役α1βアドレノセプターおよびＧs-アデニルシクラーゼ共役β2アドレナリン受容体の第３細胞質ループのカルボキシ末端中のアミノ酸の短い相同的配列の交換は、双方の受容体において完全にアゴニストが刺激する天然の受容体に匹敵する細胞内の活性化レベルを促進する。等しく重要であることは、構成的に活性化される受容体が正常なアゴニストに関して天然の受容体よりも大変大きい親和性を持ち、同時にそれらのアンタゴニストに対する親和性が増大しなかったという点である。実際に、活性が変動する幾つかの既知のアゴニスト（天然の受容体に対して）を調査した時、アゴニストの初期の活性が大きいほど、構成的に活性化される受容体に関するその親和性の増加が大きいことが分かった。
【００１５】
受容体の構成的活性化をもたらす４つの主な方法が同定された。第１の方法には特異的部位での受容体のアミノ酸配列における分子改変が関与する。このような変化は受容体に立体配置的変化を誘導し、構成的な活性化をもたらす。第２の方法には抗−ペプチド抗体を用いて、細胞外空間に伸びる受容体の部分まで受容体を刺激することが関与する。抗体は機能的にリガンドの結合を刺激し、そして構成的な活性化を誘導するようである。第３の方法にはインおよびインビトロ系での受容体の過剰発現が関与する。そのような系では、一回でより多くの受容体が活性状態になる。最後に第４の方法には受容体の活性状態と共役する原因となるＧタンパク質（１つまたは複数）の過剰発現が関与する。より高濃度の変換Ｇタンパク質の存在が、受容体の平衡を活性状態へとシフトさせる。
【００１６】
受容体の構成的活性化を理解することの重要性は、かなりの数のヒトの疾患および重篤な医学的症状が遺伝的突然変異の結果として自然に発生した構成的に活性化される受容体に関連するという最近の知見によりさらに強調された。疾患と関係する構成的に活性化される受容体に加えて、疾患とは無関係な幾つかのさらなる構成的に活性化される受容体が知られている。図３のチャートは、既知の構成的に活性化される受容体の幾つかを掲げ、そして；１）関連疾患；２）構成的な活性化の性質（配列の修飾、抗体、過剰発現）；３）活性化修飾の位置；４）活性化修飾の性質；および５）引用した参考文献を示す。図３に示す各受容体に関する参照文献は、追補“Ｃ”に提供する。
【００１７】
図３に示す構成的に活性化される受容体および受容体で同定された分子変化のまとめは、構成的活性化の基本的要件の幾つかを明らかに証明している。以下に説明するように、構成的活性化のこのような形態の幾つかは疾患状態で自然に発生するが、他の形態は研究室のみで観察される。
【００１８】
甲状腺機能亢進症（バセドウ病：Craves' disease）：バセドウ病は、甲状腺中のチロトロピン刺激ホルモン（TSH）受容体の構成的活性化と関連し、甲状腺中毒症を引き起こす甲状腺ホルモンの大きく増大した循環レベルをもたらすことが知られている。多くの場合でこの構成的活性は、チロトロピン受容体に対して自然に存在する自己抗体の作用の刺激作用から生じるが、場合によっては自然に存在する受容体中の遺伝子改変も構成的な活性化を引き起こす場合がある（Parma et al.,1993;Duprez et al.,1994)。バセドウ病の従来の処置は、外科的切除または放射性ヨウ素を使用した甲状腺の破壊あるいは抗甲状腺性薬剤(主にメチモザール)を使用した甲状腺ホルモン合成の抑制のいずれかに依存している。両方の処置が理想的ではないと示され；外科的手術または放射性ヨウ素の処置後には患者は継続的な甲状腺ホルモンの代替療法を必要とし、一方、抗甲状腺性薬剤を用いた処置では、処置後１または２年間に50〜70％の再発率がついてまわる。
【００１９】
男性の性的早熟：これは通常、常染色体の優性遺伝疾患であるが、散発的にも起こり得る（Kosugi et al.,1995)。罹患した男性はしばしば４歳までに男性化の兆候を示し、結果として身長が低くなる。この疾患において低い血清ゴナドトロピンは性腺の機能亢進を意味し、黄体形成ホルモン（LH）受容体の過剰活性を示唆していた。罹患した数人の児童の員の遺伝子分析では、アスパラギン578からグリシンまたはチロシンへの自然な突然変異が構成的に活性なLH受容体を生産することが明らかになった。興味深いことには、チロシン突然変異が１歳までの性的早熟患者で同定され、グリシン突然変異より大きな構成的活性を表すことが分かった。これは性的早熟の重篤度が構成的なLH受容体活性の程度と直接関連することを示唆している。
【００２０】
ヤンセン病（Jansen's disease）：ヤンセン型の骨幹端コンドロプラシアは、異常な骨形成により引き起こされるヒトの小人症の状態であり、そして副甲状腺−非依存的な高カルシウム血症および低リン酸血症が伴う。突然変異（223のヒスチジンがアルギニンへ突然変異した）を活性化すると、罹患した個体において副甲状腺受容体の構成的活性化を引き起こすことが分かった。このリガンド−非依存的な活性化は、この疾患において異常な軟骨内の骨形成を導き、そして副甲状腺受容体が正常な成長−板軟骨細胞の増殖および分化に重要な役割を果たすことを示唆している（Parfitt wt al.,1996)。
【００２１】
色素性網膜症：ヒトの眼球中の４種の視覚色素、ロドプシン（杆状の光受容体）および青、緑および赤の網膜錐体オプシンは、すべて構造が関連している。すべてのＧ-タンパク質共役受容体のように、それらは膜貫通ドメイン７で網膜に共有結合した７回膜貫通ドメインを有する。色素性網膜炎(RP)は、進行性の光受容体変性および失明を特徴とする。RPの状態の個人で同定されたリシン296（網膜の付着部位）からグルタミンまたはメチオニンへ変えるミスセンス突然変異は、構成的なロドプシン活性化によると考えられた。網膜結合の損失は、ロドプシンの膜貫通ヘリックスにおける抑制的拘束を解き、そして光−非依存的活性化を引き起こすと考えられる（Spiegel et al.,1995)。
【００２２】
副甲状腺低下症：カルシウム感知（CaS)受容体は主に副甲状腺組織に見いだされるが、腎臓、脳および他の幾つかの器官にも見いだされる。副甲状腺細胞中のCaS受容体の活性化は、副甲状腺のホルモン分泌を抑制し、そして腎臓管では受容体の活性化はカルシウムの再吸収の抑制を導く。この受容体の突然変異を構成的に活性化することは、常染色体−優性副甲状腺低下症の状態と関連する（Lavlie et al.,1996)。これは低カルシウム血症および比較的低い副甲状腺ホルモンレベルが特徴である。受容体の突然変異した形態は正常な受容体と比較して細胞外カルシウムに対する感受性の増加を現し、受容体が副甲状腺ホルモン分泌を正常値以下の細胞外カルシウム濃度に抑制することを引き起こす。
【００２３】
カポジ肉腫：カポジ肉腫はヒト免疫不全ウイルス（HIV)に感染した個体、および多くはないがHIVに非感染の個体に共通して発生する癌である。長い間、この疾患は感染源により引き起こされると推測されてきたが、わずか数カ月前に感染源が単離され、そしてヒトガンマヘルペスウイルスであると同定された。このウイルスはガン性の細胞増殖を引き起こし、そしてカポジ肉腫および数種のリンパ腫中で高いレベルで見いだされる構成的に活性なＧタンパク質受容体を生産することが示された（Arvanitikis et al.,1997)。このウイルスに関連するＧタンパク質共役受容体の構成的活性化は、腫瘍濃度発生に直接関連するようである。
【００２４】
神経精神疾患：Ｇタンパク質共役受容体の認められた薬理学的特徴は、任意の部位での受容体の過剰発現が構成的な活性化を導くことができる点である。この効果のメカニズムは完全には理解さていないが、細胞膜中で「活性」な立体配置で存在する受容体が正常な比率よりも高いことに関連しているかもしれない。この効果は２つの神経精神疾患に大変関連している。
【００２５】
精神分裂病：精神分裂病の生物学的基礎は未知のままであるが、脳でドパミンの効果を遮断する効果的な抗精神病薬の能力は、ドパミン系の過剰活性が関係していることを示唆している。これに関して、１つのドパミン受容体、D4が精神分裂病の患者の脳で正常レベルよりも600％上昇することが見いだされた。これはD4受容体がこの疾患では構成的に活性であり得ることを示唆している。クロザピンのようなドパミンD4受容体のリガンドアンタゴニストは、臨床的に効果的な抗精神病薬である。
【００２６】
大うつ病：臨床的に鬱を解くためにセロトニン作用性機能を調節する薬剤の能力には、疾患の病理におけるセロトニン系が関与していた。大うつ病の患者では、5-HT2A受容体が気分の制御に関与することが知られている脳の領域である前頭皮質で過剰に生産されることが分かった。この受容体の過剰生産が脳のこの領域での構成的活性の原因のようであり、そしてこの病態生理学に寄与するかもしれない。この受容体の病態生理学的関連性は、現在の抗うつ剤に反応するうつ病患者が、薬剤処置後に5-HT2A受容体数の減少を現すことを示すデータによりさらに強まる。薬剤処置に反応しなかった患者は、5-HT2A受容体数に変化がないことが示された。
【００２７】
チロシンキナーゼ受容体
すべてが７回膜貫通モチーフを共有するＧタンパク質共役受容体とは異なり、チロシンキナーゼ受容体はわずかな類似性をもちつつ広い範囲の構造を示す。Ｇタンパク質共役受容体のように、リガンド結合部位は細胞外空間に伸び、そして細胞内空間に伸びる膜貫通部分と連結する。１つの延長されたタンパク質分子からなるというよりは、チロシンキナーゼ受容体は典型的には７つの独立したサブユニットから成り、リガンド結合サブユニットは膜貫通サブユニットとは異なる。受容体チロシンキナーゼのスーパーファミリーは、クラスI、II、IIIおよびIVと分類される４種の受容体サブクラスに分けられる。サブクラスの特徴的な構造上の形状はそれぞれ、単量体のサブクラスI受容体の細胞外ドメイン内の２つのシステイン-リッチ反復配列、サブクラスII受容体の小さいシステイン−リッチ配列を持つジスルフィド結合したヘテロ四量体α2β2構造、およびサブクラスIIIおよびIV受容体の細胞外ドメイン内の５つまたは３つの免疫グロブリン様−反復を含む。このような受容体の作用様式も、Ｇタンパク質共役受容体とは大いに異なる。活性化状態では、受容体自体（または少なくとも細胞内延長部で）が酵素的に活性となる。活性化された受容体は最初に、細胞内空間に伸びる受容体セクション上に位置する自身のチロシン残基の幾つかを自己リン酸化することができる。この自己−リン酸化は続いて受容体／酵素が標的とする細胞内タンパク質中のチロシン残基をリン酸化する能力を強化する。Ｇタンパク質のように特定の種類のタンパク質がリン酸化の標的として役立つことはない。このような差異にもかかわらず、チロシンキナーゼ受容体も不活性および活性状態で存在することが判明し、そして活性状態ではリガンドもチロシンキナーゼ受容体を安定化するようである。活性状態でのみこのような受容体は酵素的となる。チロシンキナーゼ受容体の構成的に活性な形態も同定された。Ｇタンパク質共役受容体と同様に、今では多数の疾患がチロシンキナーゼ受容体の構成的活性化によりもたらされることが示された。
【００２８】
１つは不活性そしてもう１つは活性の少なくとも２つの状態の存在、そして伝達経路との共役は、受容体に共通する組織化原理であると思われる。唯一の変異はイオンチャンネル受容体により与えられ、ここで活性状態は伝達経路と共役していないが、関連するイオンが通過するために開いた孔を与える。チロシンキナーゼ受容体およびイオンチャンネル受容体の構成的に活性な形態と関連する疾患を以下の表２に説明する：
【００２９】
【表１】
0004685241.tif 000002
【００３０】
繊維芽細胞増殖因子２：繊維芽細胞増殖因子受容体（FGFR)は、リガンドが活性化する、膜に広がるチロシンキナーゼのファミリーである。数種のヒトFGFR遺伝子において突然変異は骨の成長および発達のある種の疾患に関係することが確認された。ヒトのFGFRで見いだされたシステイン332からチロシンへの突然変異が受容体のリガンド-非依存的な構成的活性化をもたらし、そしてクルーゾン症候群(Crouzon syndrome)を導くことが報告された(Neilson et al.,1995)。アフリカツメガエル卵母細胞で発現された突然変異受容体タンパク質の分析では、これが共有ホモ二量体を形成し、FGFには結合せず、そしてチロシンリン酸化の増加を示す。このような結果は突然変異した受容体(FGFR-2CS)が分子間ジスルフィド結合を形成し、受容体の二量体化およびクルーゾン症候群の病因の原因となるリガント−非依存的な活性化をもたらすことを示唆している。
【００３１】
繊維芽細胞増殖因子３：軟骨無形成症は、常染色体優性形質である小人症のもっともよくある状態であり、長骨の軟骨成長板の成熟に欠失をもたらす。これはリガンド−非依存的構成的活性化をもたらすFGF-3受容体の膜貫通ドメインにおけるグリシンからアルギニンへの置換により、リガンド−非依存的な構成的活性化をもたらすことが示された(Webster & Donoghue,1996)。このドメインの配列は：
ＶＹＡＧＩＬＳＹＲＶＧＦＦＬＦＩＬＶＶＡＡＶＴＬＣ
である。ＧからＲへの置換は、FGF-3受容体の膜貫通ドメインの輪郭に示される。
【００３２】
ｃ-kit受容体：ｃ-kit 原ガン遺伝子は、血小板由来増殖因子（PDGF）およびコロニー刺激因子（CSF-1）と同じ受容体チロシンキナーゼファミリーの一員である受容体をコードする。ｃ-kitのリガントは遺伝子的ににマウス染色体10上のsteel(Sl)座にマップされ、そして幹細胞因子（SCF）、マスト細胞増殖因子、kitリガンドまたはSl因子として様々に命名されている。試験された様々な白血病細胞の中でも（Kuriu et al.,1991;Ikeda et al.,1991;Furitsu et al.,1993)、KITはHMC-1ヒト マスト細胞系でリガンド-非依存的様式で構成的に活性化された(Furitsu et al.,1993)。HMC-1細胞中のｃ-kit遺伝子の配列分析では２つの点突然変異、傍膜(juxtamembrane)ドメイン中のV560からG560への突然変異、およびホスホトランスフェラーゼドメイン中のD816からV816への突然変異を示した。またFMA3細胞中で構成的な活性化を導くc-Kit受容体中に独特の突然変異が報告された(Tsujimura et al.,1996)。この突然変異は傍膜ドメインで573から579のコドンでTQLPYDHをコードする21塩基対の枠内欠失をもたらした。
【００３３】
Met遺伝子(HGF)：ヒト MET原ガン遺伝子は肝細胞増殖因子／散乱(scatter)因子のチロシンキナーゼ受容体をコードする。METはもとは化学的発癌物質を用いた細胞系の処置後にインビトロで活性化されたヒトのガン遺伝子として記載された(Cooper et al.,1984)。続いてMET原ガン遺伝子は上皮起源の有意な数のヒト腫瘍細胞で増幅され、そして／または過剰発現されることが見いだされた（Di Renzo et al.,1991 & 1992；Prat et al.,1991；Liu et al.,1992；Natali et al.,1993)。さらに完全長のMET cDNAのトランスフェクションによりオートクリン回路の樹立で形質転換を誘導することができることが報告された(Rong et al.,1993)。この受容体の構成的活性化の構造的要件が報告された（Zhen et al.,1994）。
【００３４】
エリトロポエチン受容体（EPO-R)：エリトロポエチン受容体（EPO-R)はサイトカイン受容体スーパーファミリーの一員である。アルギニン129からシステインへ転換する(R129C)細胞質ドメインに１アミノ酸の変化を有するEPO-Rの構成的に活性な形態が単離された。このシステイン置換はリガンド−非依存的活性化を導くジスルフィド−結合の二量体化を強化すると考えられている（Watowich et al.,1992)。またEPOとは別に、EPO-Rはフレンド脾臓フォーカス形成ウイルス(SFFV)によっても活性化され得ることが示された。このようにEPO-Rは、多くの増殖因子およびガン遺伝子に反応して活性化される（Showers et al.,1992)。
【００３５】
Erb-2遺伝子産物：erb-2/neu遺伝子の過剰発現が、しばしばヒトのガンで検出される。NIH3T3細胞で過剰発現されると、正常なerb-2産物であるgp185erb-2は、強力（potent）な形質転換能ならびに外から付加されたリガンドの不在で構成的に上昇したチロシンキナーゼ活性レベルを示す（Lonardo et al.,1990)。erb-2遺伝子は上皮増殖因子受容体（EGFR）に相同的な配列を有する。erb-2遺伝子およびEGFRの発現は、ヒトのガンの病因と関連してきた。それらの増幅および過剰発現は高い頻度で乳房および卵巣の腺ガン（Slamon et al.,1989)、そして偏平上皮細胞ガン腫および膠芽腫で検出された（Xu et al.,1984;Hendler & Ozanne,1985;Libermann et al.,1985)。
【００３６】
ErbB-3遺伝子産物：推定されるヒトのerbB-3遺伝子産物は、上皮増殖因子（EGFR）およびerb-2に緊密に関連しており、これらはモデル系およびヒトの新生物でのガン遺伝子として意味をもっていた。gp180erbB-3の本来の触媒的機能は、それがインビトロで自己リン酸化する能力により示された（Kraus et al.,1993)。このような知見とgp180erbB-3が12のヒト乳房腫瘍細胞系のうちの４つで検出されたことと合わせると、幾つかのヒトの悪性腫瘍の病因における構成的に活性なerbB-3産物を意味している。
【００３７】
インスリン受容体：インスリン受容体の構造および機能は、妖精症の２人の姉妹で研究された。母系の対立遺伝子はエキソン３の３塩基対が欠失し、α-サブユニット中にN281の損失を生じた（Desbios-Mouthon et al.,1996)。この突然変異した受容体はインスリン結合を損ない、そして自己リン酸化およびチロシンキナーゼ活性のインビボおよびインビトロでの構成的活性化を現した。このインスリン受容体の前活性化状態の結果として、細胞はグリコーゲンおよびDNA合成のインスリン刺激に対して脱感作された。このような知見はインスリン受容体α-サブユニットのN281が、細胞内キナーゼ活性に勝る細胞外α-サブユニットにより発揮される抑制的拘束において、重要な役割を果たすことを強く示唆している。
【００３８】
C-Mp1トロンボポエチン受容体：C-Mp1、トロンボポエチンの受容体は、ヘモポイエチン／サイトカイン受容体スーパーファミリーに属する。c-Mp1受容体の二量体界面中の特異的アミノ酸残基へのシステイン残基の置換が構成的な活性化を誘導したことが示された（Alexander et al.,1995)。ヘモポイエチン受容体の活性化に関する循環メカニズム（recurring mechanism）は、受容体サブユニットのオリゴマー化による機能的複合体の形成である。成長ホルモン因子内で細胞外アミノ酸のクラスターは、リガンドが誘導するホモ二量体を安定化する二量体の界面ドメインを形成する。システインの類似の領域での残基への置換が、EPO-非依存的な受容体活性化をジスルフィド-連結ホモ二量体化を介して引き起こすので、このドメインはエリトロポイエチン(EPO)受容体に機能的に保存されるようである。c-Mp1受容体中での置換は、多数のホモロガスな受容体に見いだされるものと同じ二量体界面ドメインでなされた。このような結果はTPO-刺激Mp1活性化の正常なプロセスが受容体のホモ二量体化を通して起こることを意味している。突然変異Mp1受容体を発現する細胞は、移植マウスにおいて腫瘍形成性であった。すなわちv-mplのように、そのウイルスの対(counterpart)であるmpl遺伝子の突然変異した形態はガン形成性である。
【００３９】
RON 遺伝子産物：Ronチロシンキナーゼはそのスーパーファミリー(MetおよびSea)の員と、細胞の解離、運動性および細胞外マトリックスの侵入（散乱）の制御を分け合う。Metは肝細胞増殖因子受容体であり、そしてRONとの相同性を共有する。RONはマクロファージ刺激タンパク質(MSP)のヒト受容体である。ヒトの胃ガン細胞系（KATO-III）において、165kDaの非開裂一本鎖タンパク質(デルタ-RON)の異常な蓄積が見いだされた。この分子は、ベータ(“β")鎖細胞外ドメイン中の49アミノ酸の枠内欠失により、完全長のRON mRNAからとは異なる転写産物によりコードされている(Collesi et al.,1996)。突然変異した受容体は奇数のシステイン残基を含むので、ジスルフィド連結細胞内オリゴマー化により構成的に活性化される。完全なサイズのRONのオリゴマー化および構成的なチロシンのリン酸化は、カセット エキソンによりコードされる領域中の1つのシステイン残基の部位特異的突然変異誘発法により得られ、自然に突然変異するアイソホームの発生を模する。RONの細胞内活性化にインビトロでの侵襲性の獲得が続き、悪性化への進行に構成的に活性なRON受容体の役割を示唆している。
【００４０】
STAT 5：STAT 5はジクナルトランスジューサーおよび転写のアクチベーターである。GM-CSF（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子）のようなサイトカインにより正常な骨髄細胞中で一時的に活性化されるSTAT 5タンパク質は、慢性骨髄性白血病患者に由来する細胞系で構成的に活性化された(Weber-Nordt et al.,1996)。STAT 5はまた、CML-特異的BCR-ABLガン遺伝子により急性に形質転換された初代マウス骨髄細胞中でも活性化されたが、セリンキナーゼガン遺伝子v-MOSによっては活性化されなかった。このような知見はBCR-ABLによる造血性形質転換におけるSTAT 5の役割を示唆している(Gouilleux-Gruart et al.,1996)。
【００４１】
上皮ナトリウムチャンネル：上皮ナトリウムチャンネル中の突然変異は、非遺伝性の塩−感受性高血圧症、リデル病（Liddle disease）を引き起こす（Schild et al.,1995;Hansson et al.,1996)。この突然変異は、チャンネルのベータサブユニットに未成熟な停止コドンを導入し、コードされるタンパク質のほとんどすべてのＣ−末端の欠失をもたらす。アフリカツメガエル卵母細胞中での突然変異体α-サブユニットと野生型アルファおよびガンマサブユニットとの同時発現(coexpression)では、野生型のチャンネルに比べて巨視的なアミロライド−感受性ナトリウム電流においておよそ３倍の上昇をもたらした。
【００４２】
ウイルスガン遺伝子：
c-kit受容体：他の多くの受容体チロシンキナーゼのように、c-kit原ガン遺伝子は最初にHZTネコ 肉腫ウイルスのゲノムに存在するレトロウイルス ガン遺伝子(v-kit)として同定され、KITが特に構造的な改変によりガン遺伝子タンパク質として強力に機能することを示唆している。
【００４３】
C-Mp1トロンボポエチン受容体：上記の章において、c-Mp1 TPO 受容体に対するウイルスの対があることを記載している。
定義：
受容体を中心に展開する技術文献では、受容体に様々な効果を有するリガンドについて多数の用語をあてはめた。明瞭性および一貫性を目的として、以下の定義を本特許明細書を通じて使用する。ある程度、このような定義はこのような用語に関する他の定義と矛盾するが、以下の定義に統制する：
アゴニストとは、それらが受容体に結合した時に細胞内の応答を活性化するか、またはGTPが膜に結合することを強化する物質を意味する。
【００４４】
本明細書で使用するアミノ酸の略号は、追補“Ｄ”で説明する。
【００４５】
部分的アゴニストとは、それらが受容体に結合した時にアゴニストよりも低い程度／広がり（degree/extent)で細胞内の応答を活性化するか、またはアゴニストよりも少ない程度／広がりでGTPが膜に結合することを強化する物質を意味する。
【００４６】
アンタゴニストとは、アゴニストと同じ部位で受容体に競合的に結合するが、受容体の活性形態により始まる細胞内応答を活性化せず、そしてこれによりアゴニストまたは部分的アゴニストによる細胞内応答を阻害することができる物質を意味する。アンタゴニストはアゴニストまたは部分的アゴニストの存在下でベースラインの細胞内応答を消すことはない。
【００４７】
候補化合物とは、スクリーニング技法を分析できる分子（例えば限定するわけではないが、化学化合物）を意味する。好ましくは「候補化合物」という句は、間接的な同定法によりこれまでに決定されたような、受容体に対するインバースアゴニスト、アゴニストまたはアンタゴニストから成る群から選択される化合物であると公に知られていた化合物を含まず（間接的に同定された化合物）；より好ましくはこれまでに少なくとも１つの哺乳動物に治療効果を有するとこれまでに決定されている間接的に同定された化合物を含まず；そして最も好ましくは、ヒトに治療的利用性を有するとこれまでに間接的に同定された化合物を含まない。
【００４８】
化合物効能とは、受容体結合親和性に反して化合物が受容体の機能を阻害または刺激する能力の測定を意味する。化合物効能を検出するための最も好適な手段は、本明細書の実施例でさらに開示するように[35S]GTPγS結合の測定を介する。
【００４９】
構成的に活性化される受容体とは、構成的な受容体活性化に供される受容体を意味する。構成的に活性化される受容体は内因性または非内因性でよい。
【００５０】
構成的な受容体活性化とは、受容体とその内因性リガンドまたはそれらの化学的均等物との結合以外の手段による受容体の活性状態の安定化を意味する。
【００５１】
接触または接触するとは、インビトロ系またはインビボ系のいずれかであっても少なくとも２つの部分を一緒にすることを意味する。
【００５２】
「候補化合物」という句と関連して、直接的に同定するまたは直接的に同定したとは、構成的に活性化される受容体に対する、好ましくは構成的に活性化されるオーファン受容体、そして最も好ましくは構成的に活性化されるＧタンパク質−共役細胞表面オーファン受容体に対する候補化合物をスクリーニングし、そしてそのような化合物の化合物効能を評価することを意味する。この句はどのような状況であっても「間接的に同定する」または「間接的に同定した」という句に包含されるか、または包含するとは解釈されないか、または理解されない。
【００５３】
内因性とは、哺乳動物が自然に生産する物質を意味する。
【００５４】
用語「受容体」と関連して内因性とは、例えば限定するわけではないが哺乳動物（例えば限定するわけではないがヒト）またはウイルスにより自然に生産されることを意味する。対照的にこれに関連して非−内因性という用語は、哺乳動物（例えば限定するわけではないがヒト）またはウイルスにより自然には生産されないことを意味する。例えば、そして限定するわけではないが、その内因性の形態で構成的に活性ではない受容体は、操作して構成的に活性になった時、最も好ましくは「非−内因性の構成的に活性化された受容体」と本明細書で称する。両方の用語は「インビボ」および「インビトロ」系の両方を説明するために使用することができる。例えば、そして限定するわけではないがスクリーニング法において、内因性または非内因性受容体はインビトロスクリーニング系に関するものでよい。更なる例として、そして限定するわけではないが、哺乳動物のゲノムが非内因性の構成的に活性化される受容体を含むように操作された場合、インビボ系の手段による候補化合物のスクリーニングを実現できる。
【００５５】
間接的に同定する、または間接的に同定されるとは、内因性受容体に特異的な内因性リガンドの同定、リガンド−受容体相互作用を妨害および／または競合するものを決定するための受容体に対する候補化合物のスクリーニング、および活性化受容体に関連する少なくとも１つの第２メッセンジャー経路で影響を及ぼす化合物の効能を評価することが関与する薬剤発見法に対する従来の取り組みを意味する。
【００５６】
用語「応答」に関連して阻害または阻害するとは、化合物の不在とは反対に、化合物の存在下で応答が下がる、または防止されることを意味する。
【００５７】
インバースアゴニストとは、受容体の内因性形態または受容体の構成的に活性化された形態のいずれかに結合し、そして受容体の活性化形態により開始されるベースラインの細胞内応答をアゴニストまたは部分的アゴニストの不在で観察される活性の正常ベースレベル未満に阻害するか、あるいは膜に対するGTPの結合を下げる物質を意味する。好ましくはベースラインの細胞内応答は、インバースアゴニストの不在でのベースライン応答と比較して、インバースアゴニストの存在で少なくとも30％まで、より好ましくは少なくとも50％まで、そして最も好ましくは少なくとも75％まで阻害される。
【００５８】
リガンドは、内因性の、自然に存在する受容体に特異的な内因性の自然に存在する分子を意味する。
【００５９】
オーファン受容体は、その受容体に特異的な内因性リガンドが同定されていないか、または未知である内因性の受容体を意味する。
【００６０】
医薬組成物は、少なくとも１つの有効成分を含んで成る組成物を意味し、これにより組成物は哺乳動物（例えば、そして限定するわけではないがヒト）中で具体的な、効能のある成果について調査することが可能である。当業者はその必要性に基づき有効成分が望ましい効果のある成果を有するかどうかを決定するための適切な技法を理解し、そして考えるだろう。
【００６１】
非オーファン受容体とは、内因性の自然に存在するリガンドに特異的な内因性の自然に存在する分子を意味し、ここでリガンドの受容体への結合が細胞内のシグナル伝達経路を活性化する。
【００６２】
用語「応答」と関連して刺激または刺激するとは、応答が化合物の不在に反して、化合物の存在で上昇することを意味する。
【００６３】
【表２】
0004685241.tif 000003
【００６４】
【表３】
0004685241.tif 000004
【００６５】
【表４】
0004685241.tif 000005
【００６６】
【表５】
0004685241.tif 000006
【００６７】
【表６】
0004685241.tif 000007
【００６８】
発明の簡単な要約
本明細書に開示するのは、構成的に活性化されるオーファン受容体、そしてより好ましくは構成的に活性化されるＧタンパク質−共役細胞表面オーファン受容体に対するインバースアゴニスト、部分的アゴニストまたはアゴニスト（最も好ましくはインバースアゴニスト）としての候補化合物を直接同定するための方法である。このような受容体は内因性または非内因性であることができる。開示する方法を使用することにより、そのような受容体に対して特異的な内因性リガンドに関する事前の知識無しに受容体に対するインバースアゴニスト、部分的アゴニストまたはアゴニスト（最も好ましくはインバースアゴニスト）として候補化合物を直接同定することを可能とする。さらに開示する方法を使用して、そのような直接的に同定された候補化合物を含んで成る医薬組成物の開発を可能とする。
【００６９】
本明細書に記載する本発明のさらなる理解および正しい認識は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【００７０】
好適な態様の説明
現代の分子生物学において、重要な進歩はしばしば典型的に受け入れられた物の見方から外れ、そして新た展望で再び状況を調べる時に生じた。多くはそのような状況になった場合、考察を演繹するためのすべての情報はそろっていたが、その特定の人によることを除き真価は認められなかった。この状況の２つの顕著な例は、RNAからDNAへの逆の情報の流れ、およびPCRとして知られているDNAの増幅技法の発見である。遺伝子情報をDNAからRNAへ移す初めての発見において、RNAからDNAへの遺伝子情報の転移を禁止するものは何もなかった。DNAからの情報の流れに従う結果が大変精密でしかも成功したので、DNAからRNAへのパターンが確立したモデルとなり、そしてこの伝統的なモデルから外れ、そして逆方向の情報の流れについて何が必要かを問い直して初めてRNAを運ぶウイルスが遺伝子情報を感染細胞のDNAに組み込むことができると認識された。本明細書に開示する本発明はちょうどそのような見方の独特な転換から生じている。
【００７１】
前述の１つの例外を除き、受容体の従来の研究は、発見が進んで受容体に影響を及ぼし得るアンタゴニストおよび他の分子を見いだすことができる前に、内因性のリガンドを最初に同定しなければならないという前提から（歴史的に基づく）常に進んできた。たとえアンタゴニストが最初に知られても、調査は直ちに自然なリガンドを探すことに広がった。受容体の調査において、この思考様式は構成的に活性化される受容体が見いだされた後でも繰り返された。これまでに認識されていなかったことは、受容体のアゴニスト、部分的アゴニストおよびインバースアゴニストを見いだすために最も有用であるのは受容体の活性状態であるということである。すでに要約したものを含め、過度に活性な受容体から生じる疾患の治療薬において望まれるのは、受容体の活性状態を下げるように作用する化合物であり、正常なリガンドに対してアンタゴニストである薬剤である必要はない。これは活性受容体状態の活性を低下させる化合物（薬剤）が、内因性リガンドと同じ部位に結合する必要はないからである。すなわち本発明の方法により教示するように、治療用化合物の調査はリガンドに非依存的な活性状態に対する化合物をスクリーニングすることから始めるべきである。この調査は次に活性状態の受容体に対するインバースアゴニストに関する。したがって構成的に活性な受容体が最も好ましい。本発明の取り組みのさらなる特徴は、内因性の受容体に対するインバースアゴニストを直接的に同定できることである。
【００７２】
内因性のまたは非内因性の構成的に活性化される受容体に対する候補化合物をスクリーニングすることは、オーファンまたは既知の細胞表面受容体で作用する候補化合物の直接的同定を、受容体リガンドの事前の知識または使用を必要とすることなく可能とする。本発明のこの方法の特徴は、ヒト ゲノムプロジェクトにより同定されるオーファン受容体に関して特に極めて重要である。このように本方法は広範なオーファン受容体で薬剤発見を加速するために有用である。２％のヒト ゲノムがＧタンパク質共役受容体をコードすると予想され(約2000の異なるタンパク質）、その大部分がオーファン受容体である。本発明の方法は受容体のこの大きなファミリーで、並びに本明細書に記載する他の種類の受容体で作用する新規薬剤を同定するために、これまでに開示されていない手段を提供する。
【００７３】
オーファン受容体に関する現存する、および新たに生まれる遺伝子情報を利用する本方法の能力に加えて、本明細書に開示する方法を使用して既知の受容体で開発される薬剤は、従来のスクリーニングを使用して開発された薬剤よりも顕著な治療的利点を保有する。リガンドに基づくスクリーニングは、受容体に関するリガンドの作用を「拮抗する」ように作用し、そしてこれによりリガンドが誘導する受容体の活性化を防止する化合物を同定するだけである。そのような化合物またはアンタゴニストは、リガンド−非依存的な受容体活性化および続く細胞応答を遮断しない。一方、本発明の方法を使用して開発された薬剤は、最も好ましくはリガンド−依存的およびリガンド−非依存的な受容体活性化の両方を遮断する。本発明の技法により同定される薬剤の特性は、従来のアンタゴニストが一般的にそのような活性を遮断しないので、構成的に活性なＧタンパク質共役受容体に関連する増加する数の疾患（図３）に大変実際的な意味をもつ。
【００７４】
本発明を際立たせる基本的考察は、受容体活性に影響を及ぼす先導化合物を直接同定するために使用することができるのは、受容体の構成的に活性化された形態であるという認識である。構成的に活性化される受容体により引き起こされる疾患の場合には、構成的に活性化された受容体に対する低分子のインバースアゴニストが、それ自体で有力な治療薬である。任意の受容体の場合、しかし特にオーファン受容体の場合には、同様なさらなるアゴニストおよび内因性リガンドの発見は、受容体がそのようなアゴニストに対して強化された応答を表すので、構成的に活性化される受容体を使用して有意に増加する。オーファン受容体に対するインバースアゴニストも直接同定することができる。オーファン受容体の生物学的機能の調査は、オーファン受容体に対するアゴニストおよびインバースアゴニストの両方が利用できる時に大いに簡略化されるだろう。本質的に本発明の方法は、内因性リガンドの知識を必要とせずに、受容体機能のモジュレーターを見いだす手段を提供する。この能力は従来技術に相当するものがない。
【００７５】
本明細書に記載する本発明の利用は、構成的に活性化される受容体を得ることまたは生成することに依存する。ここ数年に起こった遺伝子操作および工学の科学に於ける偉大な進歩により、わずか数年前には当該技術分野の高度な熟練者を必要とした遺伝子の同定、構築および発現の基本技術を今では日常的に利用することができる。所望のアミノ酸配列を有するタンパク質を生産するように細胞を支配するDNAの遺伝子配列を改変するための遺伝子分野の技術者には、日常的な方法は今では周知である。改変したDNAを細胞に導入し、そして細胞が改変したDNAにより特定される改変したタンパク質を発現するように誘導する方法も十分確立されている。このような技法を記載する確立された技術文献は、Sambrook Fritsch and Maniatis 1984,モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning,A Laboratory Manual)である。
【００７６】
上記のように、幾つかの疾患と関連する構成的に活性化される受容体の配列が知られており、そして多くのこのような配列のコードする遺伝子材料を利用することができる。遺伝子材料が利用できない場合、疾患状態が同一である構成的に活性化される受容体を、野生型の構成的に活性化される受容体に見いだされるものと同じ構成的に活性化される突然変異を導入することにより生成することができる。しかしさらに多くの既知の受容体が疾患状態とは未だに関係せず、そしてオーファン受容体には定義により既知の機能がない。このような受容体には、構成的な活性化を最初に誘導する必要がある。以下に説明する“Ａ”章では、受容体を構成的に活性化するための多数の取り組みを説明する。このような取り組みは、観察された自然に発生する活性化パターンの詳細な分析および合成に基づく。本発明の開示に基づき、このような取り組みは当業者に実験を行うことなく選択する機会、および当業者の必要性に応じて所定の受容体の構成的な活性化形を導く１以上の取り組みを提供するので、所定の受容体に関して１つの最も好適な取り組みといのは無い。
【００７７】
以下に説明する“Ｂ”章では、構成的に活性化された受容体を適切なインビトロ発現系（哺乳動物または非哺乳動物）にトランスフェクトすることを開示する。上記のように、標準的なトランスフェクション技法が当該技術分野では周知であり、それを用いてこの工程を行う。(Chidiac et al.,1994)。構成的に活性な受容体の成功裏のトランスフェクションは、常に適当な試験により確認され、そしてそのような１試験を説明する。
【００７８】
以下に説明する“Ｃ”章では、発現系でトランスフェクトされた受容体の構成的な活性の確認を開示する。受容体が媒介する細胞応答を検出するために、様々な第２メッセンジャースクリーニングアッセイを採用することができる。主に選択されるアッセイは受容体の種類、および受容体が活性化する第２経路に依存する。例えば幾つかのＧタンパク質共役受容体について、アデニル酸シクラーゼ活性化系が適当なアッセイを提供するだろう。他のＧタンパク質共役受容体については、ホスホリパーゼＣ結合アッセイが適当だろう。チロシンキナーゼおよび他の受容体に関する適当なアッセイは、当業者が利用でき、そして既知である。好適なアッセイを以下にまとめる。構成的に活性化された受容体活性のアッセイは、受容体活性の機能を証明するだけでなく、その活性レベルがいつ減少または増加するかを直接測定する手段を提供する。すなわちインバースアゴニストである化合物は、観察される活性の基準レベルを下げ、一方、アゴニストである化合物はベースラインより高く活性レベルを上げると予想される。
【００７９】
インビトロ発現系で構成的に活性化される受容体は、したがってスクリーニングアッセイの基礎を形成し、これにより候補化合物を直接同定することができる。試薬として発現した構成的に活性化された受容体系を使用することにより、候補化合物を試薬系に適用し、そしてアッセイ系を使用して構成的に活性化された受容体に作用する化合物を直接同定することができる。本発明の方法は受容体に対する内因性のリガンドに関する事前の知識が無くても、受容体活性の調節に関して薬理学的に効果がある化合物を見いだすための主な問題を解決する。
【００８０】
いったん；１）オーファン受容体に対するインバースアゴニストが本発明の方法により同定でき；２）そしてそのようなインバースアゴニストが受容体が関連する疾患を処置するための薬剤発見プログラムにおける先導化合物として理想的な化合物であると認められれば、疾患の処置に関して従来技術では不可能であった調査がこの知識により可能となる。例えば病んだ、および正常な組織サンプルの両方を受容体の存在についてスキャンニングすることは今、単に学術的な過程ではなく、すなわち内因性リガンドを同定する様式に沿って追求することになるだろう。定義によればオーファン受容体に関する内因性のリガンドは知られていないので、組織スキャンは、広い範囲の健康な、または病んだ組織にわたり行うことができる。そのような組織スキャンは、今では既知の化合物がモジュレートする具体的な受容体を疾患と関連させる好適な第１段階を提供する。受容体のDNA配列は、組織サンプル中で受容体の発現をRT-PCR同定するためのプローブを作成するために使用することができる。病んだ組織中の受容体の存在、または正常な組織に比べて病んだ組織中の高濃度の受容体の存在は、その疾患との相関を同定するために好ましくは強力に利用することができる。受容体はこの技法により器官の領域に十分均等に局在化され得る。受容体が局在する具体的な組織の既知の機能に基づき、受容体の推定上の機能的役割を予測することができる。
【００８１】
本発明の技法の知識で今、行うことができる成果のある調査の種類のさらなる例は、具体的な受容体とDNA相同性により同定された受容体の疾患の種類との同定および関連である。第１受容体中にて突然変異が生成する活性化は、相同的な受容体でも活性化を生じるかもしれない。すなわち好ましくは既知のコンピューターによるデータベースを使用することにより、既知の受容体の配列は関連受容体のファミリーを得るために効果的に利用することができる。正常および病んだ組織サンプルは、次にこのような受容体の相同体の位置を解明するためにスクリーニングすることができる。インバースアゴニストもこのような相同的受容体について本発明の技法により同定することができるので、それらの組織種類中での同定および分布は、新規薬剤を開発するための別の取り組みを提供する。この取り組みは内因性リガンドが既知である受容体およびオーファン受容体の両方の受容体に使用することができるが、本発明の技法により可能となる当該技術分野における主な進歩は、オーファン受容体に関連する疾患のための候補化合物を直接同定するための能力である。この能力は薬剤発見に全く新たな範例をつくる。
【００８２】
上記にまとめた工程は以下に十分に強調して詳細に記載し、関連分野の当業者が本発明の方法を実施できるようにする。説明を目的として、以下の検討は２種類の主な受容体、Ｇタンパク質共役受容体およびチロシンキナーゼ受容体を中心にすすめるが、本発明の方法は他の種類の受容体にも等しく十分に使用できると理解するべきである。
【００８３】
以下は好適な取り組みを明瞭にすることを目的とし、そして本明細書に開示する本発明を限定すると解釈され、理解されることはない。以下の工程の順序は説明の効率のためであり、そしてそれにより工程を行う様式を限定せず、例えば当業者は本特許の開示を読んだ後、都合により異なる順序に工程を合わせることを望むかもしれない。
I．非内因性の構成的に活性化される標的受容体の形態
Ａ．標的受容体の分子改変
１．非内因性の構成的に活性化されるＧタンパク質共役受容体
構成的に活性化される受容体は、標的受容体中の１アミノ酸を突然変異させることにより、またはアミノ酸の選択した範囲（streches)を置換することにより（「突然変異カセット(mutational cassette)と呼ぶ）、受容体中に作成することができる。これに関して、Ｇタンパク質共役受容体（rexceptor)(GPCR)中に特定の同定された領域（および１つのアミノ酸位置）があり、これは説明するデータとして本明細書中では示すが、構成的に活性な形態の受容体を生成する。
【００８４】
ａ．突然変異カセット
（１）第２細胞外（E2)および第３細胞内（I3)ループのカセット
多数のＧタンパク質共役受容体がアミノ酸突然変異が起こった後、または受容体配列を作り変えた後に構成的に活性になることが報告されている。このような突然変異に重要な位置は、第２細胞外および第３細胞内ループである。以下に開示するのは、幾つかの突然変異カセットであり、これらは観察された突然変異に基づくアミノ酸の短いセグメントから成り、これは構成的な活性をオーファンＧタンパク質共役受容体に工作するために使用する。各カセットは受容体（１つ／複数）と関連して検討され、それからこれが同定された。
【００８５】
（ａ）β-アドレナリン受容体
Ｇタンパク質共役受容体のアドレナリン受容体(adrenoreceptor)の種類に属すると判明した受容体は、第３細胞質ループ（アミノ酸264-272、以下を参照にされたい）のＣ-末端部分を覆う短い突然変異カセットにより構成的に活性化され得る。このカセットの置換は、Gs-およびGi-共役アデニル酸シクラーゼ結合およびGq-共役ホスホイノシトール結合受容体を構成的に活性化することができた（Lefkowritz et al.,1993を参照にされたい)。この突然変異カセットは、一連のオーファンＧタンパク質-共役受容体を活性化するために使用する。
【００８６】
活性化突然変異カセット：(264-271) ＦＣＳＲＥＫＫＡＡ
第３細胞内ループのための活性化突然変異カセット：
RVFQEAKRQLQKIDKSEGRFHVQNLSQVEQDGRTGHGLRRSSKFCSREKKAAKT
より短いカセットに加えて、アミノ酸264-272に対応するこの受容体のより短いカセット（上記を参照にされたい）を含有する第３細胞内ループ全体も、本発明の実施に使用する。このように本発明の１態様では、このようなカセットに対応するcDNA配列を、より短い配列またはより長い配列のいずれかでＧタンパク質-共役受容体の第３細胞内ループ中で作り変える。
【００８７】
（ｂ）α１Ｂアドレナリン受容体
α１Ｂアドレナリン受容体の細胞内領域中の突然変異は、受容体を構成的に活性化し、アゴニストの不在でＧタンパク質の共役をもたらすことが示された。
【００８８】
突然変異カセット：ＳＲＥＫＫＡＸＫＴＬ、ここでＸはＡ以外のアミノ酸である。最も好ましくはＸはＥであり、最大の構成的な活性化はＸの代わりにＥである時に得られる。
（Kjelsberg et al.,1992を参照にされたい)
全第３細胞内ループの突然変異カセットは：
RVYIVAKRTTKNLEAGVMKEMSNSKELTLRIHSKNFHEDTLSSTKAKGHNPRSSI
AVKLFKFSREKKAXKTLであり、ここでＸはＡ以外のアミノ酸である。最も好ましくはＸはＥであり、最大の構成的な活性化はＸの代わりにＥである時に得られる。
【００８９】
このように本発明の別の態様では、このカセットに対応するcDNA配列（Ｘでの変異を含む）を、Ｇタンパク質-共役受容体の第３細胞内ループ中で作り変える。（第３細胞内ループの配列に関しては、Schwinin et al.,1995を参照にされたい）。
【００９０】
（ｃ）ＡＣＣＡ（アデニル酸シクラーゼの構成的アクチベーター）
最近、Eggerick et al.,1995は、ACCAまたはアデニル酸シクラーゼの構成的アクチベーターと呼ばれる、アデニル酸シクラーゼを構成的に活性化するオーファンＧタンパク質-共役受容体の分子クローニングを報告した。脳中に豊富な転写物が見いだされ、一方、精巣、卵巣および目で検出された量は少なかった。本発明の方法はこの受容体で作用するインバースアゴニストを見いだすために応用することができる。さらにこの受容体の第２細胞外または第３細胞内ループのいずれかに対応する突然変異カセットは、本発明の実施において他のオーファン受容体を構成的に活性化するための用途を有する。２つのそのようなカセットを以下に説明する：
第２細胞外ループ突然変異カセット：CLDGLTTCGVVYPLSKNHLVVL
全第３細胞内ループ配列：CRIVCRHAQQLALQRHLLPASHYVATRKG
本発明の別の態様では、このようなアミノ酸配列に対応するcDNAを使用して、多様なオーファン受容体の第２細胞外および第３細胞内ループを構成的に活性なものと置き換える。受容体の膜貫通セグメントに対応する膜貫通突然変異カセットも、本発明の実施に有用である。
【００９１】
（ｄ）セロトニン受容体
セロトニン5-HT2A受容体において、システイン322のＫ、ＥまたはＲへの突然変異は、構成的な活性化をもたらす。さらに、5-HT2c15受容体中のS321のＦまたはＫへの突然変異は活性化をもたらす。
【００９２】
(ｅ）チロトロピン受容体
チロトロピン受容体遺伝子の第３細胞内ループ中の生殖細胞系突然変異は、受容体の構成的活性化により毒性の腺腫を導く（Duprez et al.,1994)。この突然変異に基づくカセットを以下に説明する。
【００９３】
YITVRNPQYNPGDKGTKIIKR D619G;A623I
またParma et alは、同じ位置であるがＤからＣへ突然変異した第３ループ中の別の活性化突然変異を報告した（Parma et al.,1993)。この突然変異に基づくカセットを以下に説明する:
YITVRNPQYNPGDKCTKIIKR D619C;A623I
このように本発明の別の態様では、このようなカセットを使用して他のＧタンパク質共役受容体を活性化する。
【００９４】
（ｆ）RDC8アデノシンA2受容体
RDC8受容体は、アデノシンA2受容体の構成的に活性な形態をコードする(Maenhaut et al.,1990)。この受容体の第２細胞外および第３細胞内ループに対応する突然変異カセットを、他の受容体に導入して本発明の実施のための構成的に活性化される受容体を提供する。
【００９５】
（ｇ）副甲状腺ホルモン（PTH)受容体
PTH受容体の構成的に活性な形態は、ヤンセン病(Jansen's disease)、短い四肢の小人症のまれな形態を引き起こすことが示された（Parfitt et al.,1996)。構成的に活性化される形態はT410Pの突然変異を有する。さらに別の突然変異、H223Rがこの疾患を生じることが示された。このようにこれらの突然変異を含有する突然変異カセットは、本発明のさらなる態様において他の受容体を活性化する。
【００９６】
（ｈ）ムスカリン受容体
m2ムスカリン受容体上の４つのアミノ酸モテーフ（VTIL)(V385、T386、L389およびL390に対応する)は、Ｇi/O共役特異性およびＧi/O活性化に必須であることが報告された。この領域中の構造変化には、細胞質に向かう膜貫通VIの相対的移動が関与しているかもしれないという仮定を試験するために、一連の突然変異体ｍ２ムスカリン受容体がLiu et al.により作成され、ここで１〜４個のさらなるアラニン残基をL390直後の膜貫通VIに挿入した（Liu et al.1996)。仮定に一致して、Ｃ-末端からL390へのさらなるアラニン突然変異を含むすべての突然変異体m2受容体は構成的に活性であった。
第３細胞内ループのｍ２カルボキシ末端領域は以下の通りである：
ALITRTVKK              A390後の１、２、３または４アラニン残基
の挿入は、構成的活性化をもたらす。
【００９７】
このように、本発明のさらなる態様において、他のＧタンパク質共役受容体との配列整列により、この部位でのアラニンの挿入はＧタンパク質共役受容体を構成的に活性化するために使用する。
【００９８】
（２）膜貫通カセット
（ａ）チロトロピン刺激ホルモン（TSH）受容体
チロトロピン刺激ホルモン（TSH）受容体遺伝子における生殖細胞系の突然変異は、非-自己免疫性の常染色体優性甲状腺機能亢進症を引き起こす（Duprez et al.1994）。非-自己免疫性の常染色体優性甲状腺機能亢進症(毒性の甲状腺過形成)がある２つの大きな血統の影響を受けた員のTSH受容体遺伝子中の２つの異なる突然変異は、第３（V509A)および第７(C672Y)膜貫通セグメント中の残基が関与することが報告された。このように本発明のさらなる態様では、以下に説明するこれらのチロトロピン受容体の突然変異を含有する第３および第７膜貫通ドメインに対応する突然変異カセットを、他の受容体の第３および第７膜貫通領域と置き換えてそれらを構成的に活性化するために使用する。
【００９９】
第３膜貫通突然変異カセット： NTAGFFTVFASELSAYTLTVITLE V509A
第７膜貫通突然変異カセット： ILLVLFYPLNSYANPFLYAIFTKA C672Y
（ｂ）ヒスタミン H1-受容体
ヒスタミン H1-受容体中、膜貫通３中のD116が構成的活性化に重要であることが報告された（Ter lack et al.,1995)。アミン作用性Ｇタンパク質-共役受容体中に高度に保存されているD116は、一般にアゴニストおよびアンタゴニスと結合のための主な付着点と思われている。本発明のさらなる態様として、この部位の点突然変異を使用して他の受容体を構成的に活性化する。
【０１００】
（ｃ）黄体形成ホルモン受容体
黄体形成ホルモン(LH)受容体の多数の自然な突然変異は、家族性の男性の性的早熟を引き起こすことが示された(Kosugi et al.,1995)。１つの突然変異には膜貫通ヘリックス６中でD578のＧへの置換が関与する。すなわちLH受容体のＧ置換した膜貫通ヘリックス６は、他の受容体を構成的に活性化するために他の受容体の膜貫通６の置換に有用であると思われる。膜貫通ヘリックス６の細胞質末端でM571からＩへ、およびT557からＩへ対応する他の突然変異も、構成的な活性化をもたらす。このような両突然変異カセットを本発明のさらなる態様に使用して、Ｇタンパク質-共役受容体を構成的に活性化する。
【０１０１】
（ｄ）ウイルス ガン遺伝子-ヒト ヘルペスウイルス ＧＰＣＲ
ヒトのヘルペスウイルス８は、カポジ肉腫、リンパ腫および他の悪性腫瘍の進行の原因であると考えられている構成的に活性なＧタンパク質-共役受容体をコードすることが示された（Arvanitikis et al.,1997)。第２細胞外、第２細胞内または第３細胞内ループに対応するこの受容体からの突然変異カセットは、本発明のさらなる態様において、Ｇタンパク質-共役受容体の活性化に有用な道具を提供するだろう。この受容体の膜貫通セグメントも有用である。
【０１０２】
ｂ．カルボキシ末端テイルの切断
多数の自然に存在するプロスタグランジンＥ受容体EP3サブタイプの代替的に(alternatively)スプライスされた形態が、Ｃ-末端テイルの切断により構成的に活性化される(Hasegawa et al.,1996)。このような切断された受容体はリガンドの不在でGiを構成的に活性化する。
【０１０３】
さらに、代謝共役型グルタミン酸受容体（mGluR)は、ほとんどの他のＧタンパク質共役受容体と比較して配列相同性を共有せず、そして異なる構造的特徴を示す。特に、ホスホリパーゼＣ(PCL)-共役mGluRの幾つかアイソホーム(mGluR1a、mGluR5aおよびmGluR5)は驚くほど長いカルボキシ末端細胞内ドメインを有するが、スプライス変異体mGluRbおよびmGluR1cは大変短いカルボキシ末端を有する。mGluR1bおよびmGluR1cの短い形態の発現は、基準のイノシトールホスフェート生産を改質しなかった。（Prezeau et al.,1996を参照にされたい)。対照的に、mGluR1aの同様レベルの発現で、基準のイノシトールホスフェート形成に２倍の上昇がもたらされた。これらのデータから代謝共役型グルタミン酸受容体の場合については、長いカルボキシ末端ドメインがＧタンパク質に共役し易いことを示唆している。このように本発明の別の態様では、Ｇ-タンパク質共役受容体がカルボキシ末端ドメインの適切な修飾（切断または延長）により構成的に活性化される。
【０１０４】
ｃ．点突然変異
上記に掲げた多くの突然変異カセットでは、１つのアミノ酸の変化が構成的な活性化をもたらした。このように第２細胞外、第２細胞内および第３細胞内ループ中および７回膜貫通Ｇタンパク質-共役受容体の膜貫通ドメイン中の点突然変異も、これらの受容体を構成的に活性化するために使用する。
【０１０５】
定量的な取り組を使用して、高度に保存されたＸＲＹ(ここでＸは通常、ＥまたはＤのいずれかである）配列に属するD142がα1B-アドレナリン受容体の活性化プロセスにおける役割を調べるために使用した。この活性化プロセスはD142のプロトン化状態に依存した。α1B-アドレナリン受容体のD142をすべての可能な19アミノ酸に突然変異させ、そして受容体の突然変異体をそれらが構成的活性化を誘導する能力について試験した。α1B-アドレナリン受容体突然変異体中に生じたD142のすべての19置換が様々なレベルの構成的活性を現し、D142T突然変異体が最高レベルを生じた（Scheer et al.,1997)。このように第２細胞内ループ中で高度に保存されたＸＲＹ配列中でのすべてのアミノ酸を使用したＸに関する点突然変異は、本発明のさらなる態様においてＧタンパク質-共役受容体を活性化するために使用する汎用的なカセット突然変異である。
【０１０６】
ｄ．汎用的な突然変異配列
膜貫通セクション６に隣接する第３細胞内ループのＣ末端領域が、Ｇタンパク質共役に重要であることが示された。α1β-アドレナリン受容体では、アラニン293の他の任意の19アミノ酸への置換が構成的活性化を生じた。グルタミン酸またはリシンのいずれかによる置換は最高レベルの構成的活性化をもたらした。そのカセットは以下の通りである：
ＥＫＫＡＡ（α1β-アドレナリン受容体では293位でＡが置換される)
この位置の重要性はさらに、この部位で行ったすべての突然変異のアミノ酸配列の整列の突然変異のデータベースの分析により実証され、そしてそれは構成的な活性化をもたらした。
【０１０７】
受容体の構成的活性化をもたらすα1β-アドレナリン受容体の293位に対応するアミノ酸置換のリストは以下の通りである：
（１）α1β-アドレナリン受容体 A293Ｘ、ここでＸはすべての残りのアミノ酸である（Kjelsberg et al.1992）。
（２）アルファ 2A-アドレナリン受容体 T373（Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｋ、Ｆ）（Ren et al.1993）。
（３）ベータ 2A-アドレナリン受容体 L272（Ａ、Ｉ、Ｔ）（Pei et al.1994）。
（４）LH/CG 受容体 A568V（Lantronico et al.1995)。
（５）TSH 受容体 A623I（Parma et al.1993)。
（６）セロトニン 5HT2A C322K(Casey et al.1996)。
（７）セロトニン 5HT2C S312K/F(Barker et al.1994:Herrick-Davis,1996)。
（８）血小板−活性化因子受容体 L231R（Parent et al.1996)。
（９）ムスカリン  m2 受容体（T386A)(Blin et al.1995)。
【０１０８】
このように、この位置でのアミノ酸の任意の他のアミノ酸への変化が構成的活性化に良いようであるが、塩基性または酸性アミノ酸または異なる側鎖を持つ他の疎水性アミノ酸への変化が好ましい。
【０１０９】
４つのアミノ酸のα1βアドレナリン受容体配列を調査すると、以下のように別の重要な位置が２つの塩基性残基の前の酸性グルタミン酸残基となるようである：
ＥＫＫＡＡ
この位置に並ぶアミノ酸の突然変異も、以下に掲げる多種類の受容体にわたり構成的な活性化をもたらす：
（１）ベータ2-アドレナリン受容体 E268G（O'Dowd et al.1988）。
（２）ムスカリン M1 受容体 E360A（Hogger et al.1995）。
（３）LH/CGR 受容体 D564G（Laue et al.1995)。
（４）TSH 受容体 D619(G)（Parma et al.1993）。
【０１１０】
ＥＫＫＡＡにより表されるアミノ酸モチーフは、実際にすべてのＧタンパク質共役受容体にある程度保存されている。例えば二重の塩基性ＫＫは、ＸＫまたはＲＲまたはＫＲまたはＲＫ（ここでＸ＝任意の他のアミノ酸）に置き換えることができる。
【０１１１】
様々な異なる種類のＧタンパク質-共役受容体にわたるこのような整列の考察に基づき、Ｇタンパク質共役受容体を構成的に活性化するために一般的用途を有する全体的な突然変異挿入カセットを開示する。異なるＧタンパク質-共役受容体間の長さの差異により、カセット挿入の位置番号(アミノ酸番号)は変動するだろう。しかし挿入の位置は「位置的（positional)」であり、すなわち挿入の位置は第３細胞内ループおよび膜貫通セクション６の合流点(junction)である。
このカセットは：
Ｘ1ＢＢＨｙＸ2
である。
【０１１２】
ここでＸ1は任意のアミノ酸、好ましくはＧ、ＡまたはＫであることができる；ここでＢは塩基性アミノ酸である；Ｈｙは疎水性アミノ酸、好ましくはＡである；Ｘ2は任意のアミノ酸、好ましくはＫ、Ｒ、Ｅまたは側鎖の位置に元の疎水性アミノ酸とは異なる側鎖を有する疎水性アミノ酸である。本発明のさらなる態様として、この汎用性の突然変異カセットがＧタンパク質共役受容体を構成的に活性化するために、第３細胞内ループおよび膜貫通セクション６の合流点で最も好ましく利用される。
２．チロシンキナーゼ受容体
ａ．一般法
以下に説明する多数の方法を、本発明のさらなる態様でチロシンキナーゼ受容体を構成的に活性化するために使用する。内因性のガン遺伝子（例えばsrc遺伝子産物)で細胞を形質転換することは、細胞内のリン酸化およびIGF-I受容体の活性化をもたらした。またこのような受容体のキナーゼドメイン中の点突然変異も、構成的な活性化を導いた。すなわち１つのチロシンキナーゼ受容体からもう１方（これは活性ではない）に構成的に活性なキナーゼドメインを移すことにより、その受容体の構成的な活性化をもたらすと考えられる。
【０１１３】
多くのチロシンキナーゼ受容体には活性になるために二量体化が必要である。このような受容体の膜貫通領域の周辺での点突然変異は、リガンド−非依存的な二量体化および細胞活性化を導くことが示された。これは特に繊維芽細胞増殖因子２受容体のC332からYへの突然変異による構成的活性化が、分子間ジスルフィド結合の形成により受容体の二量体化の上昇を導き（Neilson et al.1995)、これは次にクルーゾン症候群(Crouzon syndrome)をもたらすことに特に関連している。このようにこの領域中のチロシンキナーゼ受容体の突然変異、特にシステイン残基での突然変異は他の受容体の構成的活性化をもたらし、そしてそのような突然変異は本発明のさらなる態様として使用する。
【０１１４】
突然変異的欠失の分析から、インスリン受容体の細胞外α-サブユニットは細胞内キナーゼ活性に阻害効果を発揮すると考えられる。インスリン受容体αサブユニット中のN281の欠失は、細胞内キナーゼ活性に及ぼすα-サブユニットの阻害効果の除去によると考えられる構成的活性化をもたらした(Desbois et al.1996)。インスリンと構造的に類似するチロシンキナーゼ受容体中の同様の欠失を、本発明のさらなる態様で使用する。
【０１１５】
肝細胞増殖因子のチロシンキナーゼ受容体をコードするmet遺伝子は、ヒトのガンの有意な断片中に発現する強力な有害ガン遺伝子である。膜貫通領域の直下で切断された細胞質ドメインは、構成的活性化を獲得することが示された（Zhen et al.1994)。このように、このような受容体チロシンキナーゼの細胞外領域は、細胞内キナーゼドメインが活性となるための能力に及ぼす阻害効果を維持しているようである。すなわち、このような受容体の細胞外領域中の点突然変異は、本発明の別の態様で使用して、上記のインスリン受容体に関して示したような細胞内キナーゼドメインに及ぼす阻害効果を除去する。
【０１１６】
さらにRONチロシンキナーゼの自然に存在するスプライスされた変異体が、活性的活性化をもたらすことが示された（Collsei et al.1996)。この転写物は、β-鎖細胞外ドメイン中の49アミノ酸の枠内欠失により完全長のタンパク質とは異なっている。すなわち、関連するチロシンキナーゼ受容体中のより小さいサイズの欠失は、このような受容体を構成的に活性化するための方法として本発明の別の態様で使用する。同様に、c-kit受容体中に自然に存在する点突然変異は、傍膜（juxtamembrane)ドメイン中に７つのアミノ酸の欠失を生じ、これは構成的な活性化をもたらした（Tsujimura et al.1996)。TQLPYDHの傍膜配列は、マウスCSF-1受容体およびα-PDGF受容体にも存在することが分かった。すなわちこのような受容体および他の相同的な受容体中のこの配列の欠失は、本発明の実施においてこのようなチロシンキナーゼを構成的に活性化するために使用する。
【０１１７】
ｂ．細胞外結合ドメイン
受容体のオリゴマー化は、増殖因子受容体間で広く生じる現象である。この現象は立体配置的な変化を誘導して受容体−受容体相互作用を生じるEGFのような単量体リガンドにより誘導されるか、または隣接受容体の二量体化を媒介するPDGFおよびCSF-1のような二価のリガンドにより誘導され得る。オリゴマー化した増殖因子受容体は、上昇したタンパク質チロシンキナーゼ活性および強化されたリガンド結合親和性を保有する。すなわち強化されたオリゴマー化により構成的活性化を目的とする本発明のさらなる態様で、チロシンキナーゼ受容体ファミリーの細胞外ドメインが開発される。これは分子間ジスルフィド結合を形成するために、奇数のシステインを残す細胞外ドメインからの１以上のシステイン残基を欠失する欠失カセットを使用することにより達成され、オリゴマー化および受容体活性化をもたらす。このメカニズムの効能は、RON受容体で例示される。RON遺伝子産物の突然変異した形態は、β-鎖細胞外ドメイン中の49アミノ酸の枠内欠失により完全長のRON mRNAとは異なる転写物によりコードされている（Collesi et al.1996)。突然変異した受容体は偶数ではないシステイン残基を含むので、ジスルフィド結合した細胞内オリゴマー化により構成的に活性化される。突然変異したRON受容体は、膜貫通ドメインの短いセグメントをコードする174bpの真のカセットエキソンの代替的スプライシングにより形成される。これは３つのシステイン残基の損失を生じ、ジスルフィド交換により今、ホモ二量体化することができる奇数のシステイン残基を残す。
【０１１８】
ｃ．膜貫通ドメイン＆突然変異カセット
受容体チロシンキナーゼフィミリーのすべての員は、1つの広がっている膜貫通ドメインを有する。このフィミリーに共通する特徴は、受容体を構成的に活性化するために開発することができる。この取り組の効能の１例は、活性化されたNeu(E664)によるインスリン受容体膜貫通ドメインの置換が、インスリン−非依存的受容体の二量体化および活性化をもたらすという観察により提供される（Yamada et al.1992:Cheatham et al.1993)。このように本発明の別の態様では、突然変異した膜貫通カセットが受容体のチロシンキナーゼファミリーのサブクラスにわたり移されて、他のサブクラスの受容体を活性化する。
【０１１９】
さらに繊維芽細胞増殖因子３受容体（FGFR3)の膜貫通ドメイン中の点突然変異が、構成的な活性化をもたらした。軟骨無形成症は最も多い小人症の遺伝形である。これは繊維芽細胞増殖因子３受容体の膜貫通ドメイン中のＧからＲへの置換から生じることが示された。より重要であるのは、Neu受容体チロシンキナーゼの膜貫通ドメインを野生型および突然変異体FGFR3の膜貫通ドメインで置換することにより、FGHFR3中のR380突然変異がキメラ受容体のキナーゼおよび形質転換活性の両方を活性化することを示す。Ｅ、Ｄおよび程度は低いがＱ、ＨおよびＫを含め、水素結合の形成に参加することができる側鎖を持つ残基は、活性化するR380突然変異と置換することができた。の
突然変異の膜貫通カセット（FGF3R:G380R)は次の通りである：
VYAGILSYRVGFFLFILVVAAVTLC
または
VYAGILSYXGFFLFILVVAAVTLC (ここでＸ＝Ｅ、Ｄ、Ｑ、ＨまたはＫ）
また、V664からＥへの突然変異は、Neu受容体チロシンキナーゼのガン遺伝子活性を提供することが示された。
【０１２０】
さらなる突然変異膜貫通カセット（Neu/erb-2受容体)は：
VTFIIATVEGVLLFLILVVVVGILI
下線を引いた配列は、多くの受容体チロシンキナーゼ膜貫通ドメインで見いだされるモチーフである（Stemberg et al.1990)。このような突然変異は受容体の二量体化を媒介することができると考えられる。この膜貫通−媒介二量体化のモデルと合致するのは、インスリン受容体膜貫通ドメインを活性化Neu（E664）により置換すると、インスリン-非依存的な受容体の二量体化および活性化を生じることという考察である（Yamada et al.1992;Cheatham et al.1993)。本発明のさらなる態様として、示したようなキメラ受容体が作成され、そしてさらなる態様では膜貫通突然変異カセットを導入して他のチロシンキナーゼ受容体を活性化する。
【０１２１】
ｄ．傍膜ドメイン（The juxtamembrane domain）
受容体チロシンキナーゼの膜貫通ドメインは、細胞質の触媒ドメインから受容体サブクラス間で分岐している(divergent）が同じサブクラスの員の間で保存されている傍膜配列により分離されている。多数の証拠によりこのドメインが、受容体トランスモジュレーション（transmodulation）と命名されたヘテロロガスな刺激により受容体機能のモジュレーションに関与することを示唆されている。例えばPDGFまたはボンベシン受容体のそれらの個々のリガンドによる活性化は、１つの細胞中で高い親和性のEGF結合部位の完全な破壊を導く。この効果は傍膜ドメイン中の残基のリン酸化により誘発される。すなわち、チロシンキナーゼ受容体はそれらを傍膜ドメイン中の残基のリン酸化により負に調節しているようである。このドメインの重要性はさらに傍膜ドメインで７個のアミノ酸の欠失により、c-kit受容体を構成的に活性化する能力により示される(Tsujimura et al.1996)。欠失したセグメントはTQLPYDH(コドン573〜579)に対応した。興味深いことには７個のアミノ酸配列が、マウス、ラット、ネコ、ウシ、ヒトおよびニワトリのKITすべてに広く保存されている点である。さらに７個のアミノ酸配列中の４個のアミノ酸配列QLPYが、KITおよびPFGFのようなII型チロシンキナーゼ受容体に全部保存されている。したがって、恐らくKITの欠失領域はIII型チロシンキナーゼの構造および機能に重要な役割を持つのだろう。このドメイン、特にY569もリガンドが誘導する受容体のインターナリゼーションに関与するかもしれないと考えられる(Myles et al.1994)。このように本発明のさらなる態様として、この傍膜ドメイン近くの欠失突然変異を利用してこのドメインの負のオーバーライディング効果を取り除き、様々な既知のおよびオーファン受容体チロシンキナーゼを構成的に活性化する。
【０１２２】
ｅ．カルボキシ末端テイル
カルボキシ末端テイル配列は、すべての既知の受容体チロシンキナーゼの間で最も分岐している。EGF受容体のカルボキシ末端テイルは、タンパク質チロシンキナーゼ領域の基質結合部位と相互作用し、そしてその外因性基質との相互作用する能力をモジュレートするために、十分な長さおよび柔軟性を有する。このモデルと合致して、改変した自己リン酸化部位を持つ突然変異体EGF受容体を発現している細胞は、マイトジェン的に応答して同様レベルの野生型の受容体を発現している細胞よりもEGFの用量を下げる。カルボキシ末端テイル中の欠失は、形質転換に類似の効果を及ぼし：その欠失はガン遺伝子の能力を強化し、そして宿主範囲を広げたが、主なガン遺伝子の損傷は与えなかった。他の細胞系中およびCSF-1のような他の受容体における同様の実験は、このカルボキシ末端テイル配列が受容体チロシンキナーゼシグナル伝達機能に負の制御を現すことを支持する。このようにカルボキシ末端欠失カセットは、さらなる本発明の態様においてチロシンキナーゼ受容体を構成的に活性化するために使用する。
Ｂ．標的受容体の抗-ペプチド抗体刺激
１．Ｇ-タンパク質-共役受容体
Ｇ-タンパク質-共役受容体の細胞外ループ内の特定部位に対する抗体は、恐らくリガンドの結合を機能的に刺激する抗体の能力により構成的な活性化を誘導することが示された。Allaおよび共同研究者は、ブラジキニンB2受容体の細胞外ループ２のN-末端部分に対する抗体がリガンド無しで細胞内の応答を増加させる能力を記載した（Alla  et al.1996を参照にされたい）。このように、細胞外ループのN-末端部分に対する合成ペプチドに対して生じた抗体は、Ｇタンパク質-共役受容体を構成的に活性化するために使用する。そのような抗体は例えば、標準的な技法を使用してウサギで生成し、そしてアフィニティクロマトグラフィーにより精製することができる。
２．チロシンキナーゼ受容体
erB2/Her2受容体の細胞外領域に対して生じた抗体は、胸部ガン細胞の表面で発現した時にHer2、Her3およびHer4受容体を含め、180−185kDaのタンパク質のチロシンリン酸化を強力に誘導する。興味深いことには、この抗体はHer3またはHer4と交差反応しない。このようにチロシンキナーゼ受容体のこの部分に対して生じた抗体は、本発明のさらなる態様としてさらに構成的に活性化される受容体を作成するために使用する。
Ｃ．受容体およびＧタンパク質の過剰発現
１．Ｇ-タンパク質-共役受容体
７回膜貫通Ｇタンパク質-共役受容体の過剰発現は、構成的な活性化をもたらすことが示された。ヒトの２−アドレナリン受容体のアゴニスト-非依存的特性が、Sf9細胞中でバキュロウイルス発現系で研究された(Chidiac et al.1994)。cAMP生産の増加は、発現した受容体の数に比例した。すなわちこのような受容体のバキュロウイルス系での過剰発現は、構成的な活性化を導く。したがって本発明のさらなる態様として、Ｇタンパク質-共役受容体を構成的に活性化する１方法では、大量の受容体を哺乳動物および昆虫細胞中で発現する。
２．Ｇタンパク質
すでに記載したように、Ｇタンパク質-共役受容体は不活性状態とＧタンパク質が媒介する伝達経路と共役する活性状態との間の平衡状態で存在している。この２つの状態の間の移動には立体配置的な変化が関与し（この変化についてはほとんど知られていない）、この受容体の内因性のリガンド（アゴニスト）が活性な立体配置を安定化し、これにより平衡を活性状態にシフトさせる。平衡状態である任意の系と同様に、この平衡は平衡の１成分を供給または取り除く外部の力により一方または他方に優先的にシフトさせることができる。Ｇタンパク質-共役受容体に関して、この平衡は平衡に参加することができる受容体の活性な形態および非Ｇタンパク質結合形態の濃度を下げることにより、活性状態にシフトさせることができる。この効果はm1、m3およびm5ムスカリン受容体で証明された（Burstein et al.1995)。受容体が結合するＧタンパク質の濃度を上げると平衡がシフトするので、活性状態の受容体の比率が増す。Ｇタンパク質は好ましくはプロミスカスＧタンパク質である；すなわち広い範囲の受容体の種類（例えばＧ15）と共役するＧタンパク質である。この構成的な活性化形態は分岐したＧタンパク質-共役受容体に応用して、本発明のさらなる態様として構成的に活性化される受容体を生成する。
３．チロシンキナーゼ受容体
erb-2産物の過剰発現は、構成的な活性化によりもたらされる（Lonardo et al.1990)。すなわち本発明のさらなる態様では、チロシンキナーゼ受容体の過剰発現もこのような受容体を構成的に活性化する方法として使用する。
II．構成的に活性な受容体のインビトロ発現系へのトランスフェクション
すでに述べたように、内因性の構成的に活性化される受容体が利用できない場合の状況では、いったん受容体をコードする遺伝子配列の操作を通して受容体の構成的に活性な形態を作成し、本発明の次の工程では特定の受容体タンパク質を生産する発現系にコード配列を配置する。発現系の成功のための試験として、および細胞性の受容体効果を探す前に、受容体が正しく発現することを確認することが望ましい。
Ａ．標準技法
受容体のcDNAを培養した哺乳動物細胞中に導入するために、当該技術分野において多数の方法を利用することができ、そして周知であり、それらには以下を含む：リン酸カルシウムまたはDEAE-デキストラン-媒介トランスフェクション、ポリブレントランスフェクション、プロトプラスト融合、電気穿孔、リポソームおよび細胞核への直接的注入。最も広く使用されている方法は、その高い効率からリン酸カルシウム法である。簡単に説明すると、この方法には以下を含む：トリプシン処理により指数的に成長した細胞を回収し、そして細胞を適当な血清含有培地中にて１×105〜２×105細胞／培養皿の密度で再度プレートにまく。NIH-3T3、HeLa S3、COSおよびCHO等を含め多種類の細胞を使用することができる。培養は次に37℃で５〜７％CO2雰囲気中で20〜24時間インキューベーションする。リン酸カルシウム-DNA共沈殿を各細胞の単層について調製し：受容体cDNAは約40μg/mlの濃度で0.1M Tris EDTAバッファーに溶解し、この混合物の220μlを250μlの2× HEPES-緩衝塩と無菌プラッチック試験管中（例えばFalcon 2509）で混合し、そして全部で31μlの２M 塩化ナトリウムを30秒にわたり加える。この混合物を室温で30分間インキューベーションし、そして次に細胞単層上の培地に移す。トランスフェクトした細胞を37℃で５〜７％CO2雰囲気中で24時間インキューベーションする。次に培地および沈殿を吸引により取り出し、細胞層をリン酸緩衝塩で１回洗浄し、そして５mlの予め暖めた完全成長培地を加えた後、細胞をさらに37℃で24時間インキューベーションする。細胞は次に安定な形質転換体を単離するために、適当な選択培地に再度まく。モレキュラークローニング ア ラボラトリーマニュアル（Molecular Cloning.A Laboratory Manual）：第３巻、16.30、Sambrook,Fritsch and Maniatis編集、1989は、当該技術分野の標準的な参考書であるが、このおよびトランスフェクションの他の方法を詳細に説明している。
Ｂ．構成的に活性化される受容体のリン酸化アッセイを用いた確認
受容体のリン酸化は、活性化された受容体だけが受容体キナーゼの基質であることから、発現系中の構成的活性を測定する第１手段として使用する。この方法はβアドレナリン受容体の活性化状態を測定するために使用された（Samama et al.1993)。簡単に説明すると、精製した受容体の調製物を30℃で20分間、β-アドレナリン受容体(30nM)と20mM Tris.HCl、pH8.0、２mM EDTA、10mM MgCl、１mMジチオスレイトール、100μM[γ-32P]ATP(〜2000cpm/pmol)中で、関連する薬剤の不在および存在下でインキューベーションする（オーファン受容体については、構成的に活性および非活性な受容体間の基準リン酸化レベル間の差異を使用する）。適当な時期に反応は等容量の２×SDS サンプル添加バッファー(８％ SDS、25mM Tris.HCl、pH6.5，10％グリセロール、５％メルカプトエタノールおよび0.005％ブロモフェノールブルー）で止め、そして次に10％ SDS-ポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。リン酸化の化学量論は、次に受容体バンドを切り出し、そしてPhosphoImagerを使用して計数する。III．化合物効能を検出するための第２メッセンジャーアッセイの使用
いったん構成的に活性化される受容体の発現および活性が確認されたら、候補化合物の受容体に対する化合物効能を研究するために、受容体が指令する（receptor-directed)細胞応答を検出する方法が最も好適である。当業者には周知である幾つかのアッセイを、わずかに変更して使用することができる。本明細書に開示する発明は、当業者が構成的に活性化される受容体に対する多数の候補化合物（例えばケミカルライブラリー）をスクリーニングすることを可能とするので、アッセイ法を高処理量のスクリーニングにすることが特に有利である。使用するさまざまなアッセイ法の例を以下に説明する。このような例は本発明の方法に使用できるアッセイの種類を具体的に説明する（そして、限定しない）と考えるべきである。異なる受容体の種類には異なるアッセイが必要であり、そして所定の受容体には１つのアッセイが他のアッセイよりもより適切となり得る。このような選択は当業者により実験を行うことなく容易に決定され、そして十分に認識されしかも理解される。
Ａ．Ｇタンパク質-共役受容体
１．ＧＴＰ膜結合 ＆ ＧＴＰａｓｅ活性
［35S]GTPγSが、リガンドの不在または存在下でＧタンパク質の膜への共役を監視するために使用できることが報告された（Traynor and Nahorski,1995)。このアッセイは受容体を発現した膜について行う。簡単に説明すると、膜（100〜200μgタンパク質)を、［35S]GTPγS(80pM)、GDP(３M)および低分子薬剤(10〜20μM)を含有する結合バッファー（20mM HEPES、pH7.4、100mM NaClおよび10mM MgCl.6H2O)とインキューベーションする。このアッセイを行うために報告された容量は１mlであったが、0.3〜１mlの容量範囲が有用である。これを30℃で60分間インキューベーションする。結合したおよび遊離の［35S]GTPγSは、次にGF/Bフィルターを通す吸引濾過により分離し、そして液体シンチレーョン計数により定量することができる。インバースアゴニストはそれらがシンチレーョンシグナルを低下させる能力により検出される。
ａ．シンチレーョン近位アッセイ(scintilation proximity assay）のためのＧＴＰ膜結合
高処理量のスクリーニングアッセイは、シンチレーョン近似アッセイを使用して受容体へのGTP結合を測定するために使用することができる。ウェルをシンチラントでコートしたフラッシュ(Flash)プレートまたはシンチストリップ(scintistrip)を使用することができる。この結合アッセイは上記のように行うことができる。しかし膜をウェルの底まで遠心すると、第３細胞内ループ上に結合した［35S]GTPγSはシンチラントに近くなり、これはシグナルを生じるので、好ましくは結合したおよび「遊離」の［35S]GTPγSの分離が必要である。
【０１２３】
別のアッセイを行う様式は、発現した受容体を含有する膜フラッシュプレート上にを固定することである。簡単に説明すると、プレートをポリリシンでコートする。正に荷電したポリリシンは負に荷電したリン酸基に結合し、そして膜を固定する。結合した［35S]GTPγSを次にシンチラントに近付け、そしてシンチラントを活性化し、シグナルを生成する。次にこのアッセイを使用してシグナルを阻害する化学化合物（これはインバースアゴニストである）を検出することができる。
【０１２４】
アッセイを行うための別の様式は、ConAを使用して膜を固定することである。ほとんどの７回膜貫通受容体は受容体の細胞外領域に発現した糖基を含む。ConAは膜の細胞外側に発現した糖基に結合し、そして膜を固定する。次に結合した［35S]GTPγSを前記のようにシンチレーョン近位により検出する。
ｂ．ＧＴＰａｓｅ活性
GTPase活性も、発現した受容体を含有する膜を[γ35P]GTPとインキューベーションすることにより測定することができる。放出された[γ35P]Piを次にシンチレーョン計数により上清中に検出する(Hasegawa et al.1996)。インバースアゴニストは、それらがシグナルを低下させる能力により、そしてアゴニストはそれらがシグナルを上昇させる能力により検出される。
２．アデニル酸シクラーゼおよびサイクリックＡＭＰ（cAMP)アッセイ
アデニル酸シクラーゼアッセイは、構成的に活性な受容体と相互作用する薬剤の効能を評価するために使用することができる。簡単に説明すると、反応媒質はホスホクレアチン５mM；クレアチンキナーゼ 10U/ml；BSA 0.04％；Tris HCl 50mM Ph 7.4；MgCl2 ５mM；EDTA 0.25mM；RO20-1724 0.12mM；ATP 0.1mM；GTP 0.1mM [γ-35P]ATP 1.5〜2.5μCi/試験管；シュクロース；終濃度 65mMを含む。アッセイは膜懸濁物（〜50から75μgタンパク質／試験管）を加えることにより開始し、そしてアッセイ混合物を31℃で１時間インキューベーションする（Maenhaut et al.1990 & Salamon et al.1974を参照にされたい)。細胞内および細胞外cAMPは、標準的なcAMPラジオイムノアッセイを使用して、または標準的な技術法に従いcAMP結合タンパク質を使用することにより測定することができる。
３．全細胞第２メッセンジャーレポーター系
遺伝子上のプロモーターは、特定の遺伝子がコードするタンパク質の発現を駆動する。サイクリックAMPは、cAMP-応答性DNA結合タンパク質または転写因子(CREB)（これは次にcAMP応答配列と呼ばれる特異的部位でプロモーターに結合し、、そして遺伝子の発現を駆動する）の結合を促進することにより遺伝子発現を駆動する。レポーター系は、レポーター遺伝子の前に多くのcAMP応答配列を含有するプロモーターを有するように構築され、レポーター系は例えばβ-ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼであることができる。このように活性化された受容体はcAMPの蓄積を引き起こし（もし受容体が刺激Ｇ-タンパク質に共役するならば)、これは次に遺伝子およびレポータータンパク質の発現を活性化する。β-ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼのようなレポータータンパク質は、標準的な生化学アッセイを使用して検出することができる(Chen et al.1995)。このようにcAMP-レポーター構築物を有した安定な細胞系が構築される。活性化された受容体は次にレポーター遺伝子の発現を活性化する細胞系にトランスフェクトされる。このアッセイ系は次に化学物ライブラリーからの低分子の存在下で使用して、受容体との相互作用によりレポーター遺伝子の発現を阻害する化学物を見いだすために使用し、本発明の方法により同定されるそのようなインヒビターはインバースアゴニストである。
４．カルシウム感受性色素を使用した細胞内カルシウムの検出
細胞表面上の受容体の活性化は、細胞内の「遊離」カルシウムレベルの上昇を導くことが多い。この細胞内カルシウムの上昇は、fura 2のようなカルシウム-感受性色素を使用して全細胞アッセイで検出することができる。この化学化合物によるシグナルの減少はインバースアゴニスト活性を示す。
５．初期遺伝子の誘導
初期遺伝子誘導および発現は、受容体活性化の下流の出来事である。c-fosおよびCREBのような転写因子の活性化および発現は、薬剤による受容体活性化および阻害をモニタリングするための手段として使用する。発現したCREBおよびc-fosは、抗CREBおよびc-fos抗体により検出することができる。このような抗体はさらに標準的方法（例えば通例のペルオキシダーゼ検出法を使用した抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体）によりさらに検出することができ、化学化合物によるシグナルの減少はインバースアゴニスト活性を示す。
６．細胞増殖
Ｇタンパク質共役受容体およびチロシンキナーゼ受容体の活性化は、しばしば細胞の増殖をもたらす。細胞が増殖する能力は、DNAの[3H]チミジン取り込みにより測定することができる。この増殖を阻害する化学化合物は、チミジン取り込みの減少により検出することができる。ブロモ-デオキシウリジン（BRDU）のDNAへの取り込みも、細胞の増殖および受容体の活性化の尺度として使用することができる。取り込まれたBRDUはシンチレーション計数により、または抗-BRDU抗体により周知の方法に従い検出して化合物が誘導した効果を検出することができる。
Ｂ．チロシンキナーゼ受容体
上記のC.1.c.、C.1.dおよびC.1.e章に記載したような全細胞の第２メッセンジャーレポーター系およびカルシウム感受性色素を使用する細胞内カルシウム検出法も、チロシンキナーゼ活性に使用することができる。
IV．構成的に活性化された受容体系を用いた候補化合物のスクリーニング
本発明の方法は、最も好ましくは大きな化学品ライブラリーの高処理スクリーニング(HTS)の現代的な技法に十分に適している。一般に、有力な薬剤候補を求める時、望まれることは高い生物学的利用率を有する化合物である。最近の組み合わせ化学合成における進歩で、生物学的利用率の要件を満たす可能性を持つ低分子有機化合物の大きなライブラリーが作られた。いったん本発明の方法が知られ、そしてその真価が認識されれば、大量の構成的に活性化される受容体発現系を製造し、そしてアッセイするための技術が存在するので、化学品ライブラリーまたはペプチドライブラリーのような高処理量のスクリーニング（例えば96ウェルプレートの形式で)が簡単となる。したがって本発明の方法の応用は有用な治療用化合物を見いだすための簡単な様式として大変有用である。そのようなアッセイおよびスクリーニングをどのように行うかを説明する幾つかの例を一般的な取り組みで説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
Ａ．ｃＡＭＰに関するシンチレーション近位アッセイ（SPA)
構成的に活性なＧ-タンパク質共役受容体は、シンチレーション近位アッセイによりcAMPの形成を測定することにより高処理量の様式でスクリーニングする。これを行う１つの方法は、抗-CAMP抗体をシンチラントがコートされたシンチレーション近位ビーズに連結することである。すなわち、放射標識CAMPがビーズに付いている抗-cAMP抗体に結合した時、これはシンチラントに近付き、シンチラントを活性化する。通例の結合アッセイとは異なり、このアッセイはシグナルが溶液中の分子の近位により純粋に検出されるので、結合および「遊離」cAMPの分離が必要ではない。このままでこのアッセイは、構成的に活性なＧ-タンパク質共役受容体に対する低分子インバースアゴニストの高処理量薬剤スクリーニングのための手段を提供する。
【０１２５】
このアッセイをどのように行うかの１例は次の通りである：簡単に説明すると、目的とする受容体を発現している膜（５〜10gの全タンパク質)を、0.12mM ATP、１〜２×106cpm／(アッセイ試験管)の[γ32P]ATP、0.10mM cAMP、53μM GTP、2.7mM ホスホ(エノール)ピルビン酸、1.0IUのミオキナーゼ、0.2IUのピルビン酸キナーゼ、４μg/ml ベンズアミジン、２μg/ml 大豆 トリプンシ インヒビター、２μ/ml ロイペプチンおよび変動する濃度の試験化合物を全容量50〜300μlでインキューベーションする。次にサンプルを37℃で15または30分間インキューベーションし、そして反応は0.3mM cAMP、20,000cpmの[3H]cAMPおよび0.4mM ATPを含有する0.5〜１mlの冷却溶液の添加により停止する(Chidiac et al.1994）。構成的に活性な受容体は[32P]cAMPの形成を促進し、これは次にシンチレーションビーズに連結された抗-cAMP抗体により特異的に捕捉される。これはシンチレーション計数後にシグナルを生じる。受容体でインバースアゴニスト活性を有する任意の化合物は、形成された[32P]cAMPの量を減少させ、これは次にシンチレーション計数後に減少として測定される。これまではDowex ゲルクロマトグラフィーによる測定のために、[32P]cAMPを分離することに労力がかかった。このシンチレーション近位アッセイは事前の分離技法を必要とせずにcAMPの迅速な検出を可能とし、このアッセイを構成的に活性な既知のおよびオーファンＧタンパク質-共役受容体に対するインバースアゴニストに関する化合物ライブラリーの高処理量スクリーニングに適合させる。
【０１２６】
このアッセイの別の適合は、抗cAMP抗体の代わりにcAMP-依存的結合タンパク質による[32P]cAMPの捕捉である。この使用のためにcAMP-依存的プロテインキナーゼをシグマケミカルズ社(Sigma Chemicals Co.)(セントルイス、モンタナ州）から得ることができる。簡単に説明すると、ブタの心臓から精製したcAMP-依存的プロテインキナーゼを、シンチレーションビーズに結合させる。形成された[32P]cAMPは、SPAビーズにカップルしているcAMP-依存的プロテインキナーゼにより捕捉され得る。アマーシャム社（Amersham）はシンチレーション近位によりcAMPを測定するための市販のキット（Hortaon & Baxendale,1995)を製造しており、これは本発明の実施に使用できる。
【０１２７】
上記方法の別の代替法は、受容体系により生成される非標識cAMPの量を測定するための競合的結合アッセイとして、シンチレーション近位アッセイを使用することである。簡単に説明すると、標識[32P]cAMPを含まないことを除き条件は同様である。構成的に活性な受容体はcAMPを生成する。このcAMPは次に、ごく少量の放射標識cAMPの存在下でcAMPシンチレーション近位アッセイにより測定することができる。このようにより多くのcAMPがサンプル中に存在すれば、より多くの非標識cAMPがシンチレーションビーズ上の抗体またはcAMP結合タンパク質により結合され、そしてより少ない量の放射標識cAMPがビーズの近位に残りシグナルを与える。次にサンプルをcAMPの標準曲線に対して読んで、どのくらいの量のcAMPが生成されたかを予想することができる。
Ｂ．酵素-結合イムノアッセイによるｃＡＭＰの測定
構成的に活性な受容体により形成され、放出されたcAMPは酵素-結合イムノアッセイにより検出することもできる（Horton & Baxendale,1995)。
Ｃ．ｃＡＭＰ-依存的プロテインキナーゼＡによるｃＡＭＰの測定
プロテインキナーゼＡは、リン酸化基質のコ-ファクターとしてcAMPを利用する。すなわちcAMPの形成は、cAMP-依存的プロテインキナーゼＡがカゼインのような基質をリン酸化する能力をモニタリングすることによっても検出することができる。
【０１２８】
[γ-32P]ATP＋カゼインは、プロテインキナーゼＡおよびcAMPの存在下で[32P]カゼインおよびADPに転換される。リン酸化されたカゼインをフィルターディスクで単離し、そして結合した32Pを測定することができる。プロテインキナーゼＡ酵素はより多くのcAMPが存在するほど活性となり、基質カゼインのリン酸化の程度を大きくする。生成されたcAMPの量は、既知のcAMP濃度の標準曲線と比較して予想することができる。このアッセイは基質、例えばカゼインをSPAビーズに連結することにより、シンチレーション近位に適合させることもできる。このように、より多くの[32P]カゼインが生成されれば、より多くのシグナルがビーズの近位で検出され、これを標準曲線に対してcAMPの濃度を算出するために使用することができる。
Ｄ．ＲＡＳシンチレーション近位アッセイ
Rasガン遺伝子はMW 21,000のグアニンヌクレオチド結合タンパク質をコードする。このタンパク質はシグナル伝達経路で分子スイッチとして作用する。そのGDP形態では不活性であるが、GTP形態ではシグナルを送る１以上のエフェクター分子と相互作用する。Rasガン遺伝子は多くのヒトのガンと関連してきた。さらにチロシンキナーゼ受容体およびＧタンパク質-共役受容体の両方がRasシグナル伝達経路を利用すると示された(Sharif et al.1994）。シンチレーション近位を使用して、Rasとネオフィブロミン(NF1)と呼ばれる別のエフェクター分子との相互作用を測定するアッセイが記載された（Skinner et al.1994）。このように発現したチロシンキナーゼおよびＧタンパク質-共役受容体の両方を有する膜抽出物が、この系で組換えRasタンパク質を活性化するために使用される。Rasは放射標識[3H]-GTP(これはGTP-再生系の存在下で交換したヌクレオチドにより生成され得る)に結合した時に活性化される。次に放射標識Rasをグルタチオン S-トランスフェラーゼと融合したNF1、抗GSTおよびプロテインＡ-コートSPAビーズと混合した時、SPAシグナルが得られる。このようにRasが構成的に活性な受容体により活性化されると、より多くの[3H]-GTPがRasに結合し、そしてそのようにより多くRasがNF1と複合体を形成し、これはSPAシグナルを生じる。このように本発明の方法に従い、低分子のインバースアゴニストがこのシグナルの減少により検出される。
【０１２９】
発ガン性Rasタンパク質、例えばL-61RasはRas GAP(別のエフェクター分子)に結合するが、それらのGTPase活性は刺激されない(通常、GAPへの結合でGTPはGDPに加水分解される)。これは明らかに構成的なマイトジェン的または形質転換シグナルを生じる。このように発ガン性Rasは、GTPレベルを測定するために高親和性GTP結合タンパク質として使用される。例えばＧタンパク質の構成的に活性な受容体への共役により加水分解されるGTPの量は、Rasの結合により測定される。これをどうように行うかの１例は、Rasの発ガン形をSPAビーズにカップルさせることである。構成的に活性な受容体により加水分解される放射標識GTPが多いほど、SPAビーズにカップルしたRasによる結合は少ない。すなわち構成的に活性な受容体が多いほど、より少ないSPAが検出される。このようにこの系では、低分子アゴニストがＧタンパク質共役受容体系のGTPase活性を妨げるので、低分子インバースアゴニストはSPAシグナルの上昇により検出される。すなわち発ガン性Ras結合タンパク質を利用するシンチレーション近位アッセイは、Ｇ-タンパク質共役受容体によるGTP加水分解の指数を測定するために使用し、低分子インバースアゴニストに関する高処理量スクリーニングのための手段を提供する。
V．発明の好適な用途
本発明はヒトの疾患の処置に大変重要な治療分子の発見を有意に加速する。本発明の最も重要な特徴は、受容体についての内因性または合成リガンドに関する事前の知識無しに受容体機能のモジュレーターが同定できることである。これはオーファン受容体には特に重要であり、そして本発明の方法はオーファン受容体を用いた使用に特に適している。オーファン受容体については内因性のリガンドが知られていないだけでなく、構成的に活性な突然変異は通常は同定されなかった。化合物ライブラリーの適切な高処理量スクリーニングにより、受容体アゴニストおよびインバースアゴニストの両方の同定が可能となる。
【０１３０】
本発明の方法がオーファン受容体に関して現存する、およびこれから得られる遺伝子情報を利用する能力に加え、既知の受容体でこの技法を使用して開発された薬剤は、従来のリガンドに基づくスクリーニングを使用して開発した薬剤に優る顕著な治療的利点を有する。リガンドに基づくスクリーニングは、受容体に対するリガンドの作用を「拮抗する」だけであり、そしてこれによりリガンドが誘導する受容体の活性化を妨げる。そのような化合物、すなわちアンタゴニストは、リガンド-非依存的な受容体活性化および続く細胞応答を遮断しない。一方本発明を使用して同定された構成的に活性化された受容体で作用するインバースアゴニスト薬剤は、リガンド-依存的およびリガンド-非依存的な受容体活性化の両方を遮断する。発明の方法により同定された化合物(薬剤)の特性は、従来のアンタゴニストがそのような活性を阻害しないので、構成的に活性なＧタンパク質共役受容体に関連する増加する数の疾患（表１）に実際的な意味をもつ。
【０１３１】
記載したように本発明の方法を使用して見いだされたインバースアゴニストは、受容体の構成的な活性化が特徴である種々の疾患および障害の処置のための治療薬としての用途を有する。本明細書に記載した方法の日常的な応用により、当業者は実験を行わずに、最も好ましくは要求されるアゴニスト活性を有する候補化合物を、当業者に既知である方法により構築された化学的に多様な化合物ライブラリーの通例の高処理量スクリーニングを使用することにより、直接同定することを可能とする。このように、そのようなインバースアゴニストは本明細書に記載した方法を使用することにより直接同定されるが、これは例えば最初に内因性のリガンドの同定を必要とする従来の方法のような他の方法では直ちに同定することはできなかった。そのような直接同定されたインバースアゴニストは、受容体の構成的活性化を特徴とする障害または疾患の処置に有用である。本発明の化合物を医薬組成物として投与するための適切な方法は、投薬用量および調剤を含め、当業者には明らかであろう。投与様式、投薬用量およびそのような医薬組成物の調剤は、処置する医薬的症状ならびに患者の一般的健康状態に依存し、このような因子は技術者の権限（purview）の範囲内である。
【０１３２】
例えばバセドウ病（Graves's disease）については、候補化合物は甲状腺中で構成的に活性化なTSH受容体を直接遮断する候補化合物を本発明で直接同定することができ、これにより外科的切除または放射性ヨウ素の破壊の必要性を無くすか、または減らす。すなわち、新規かつより効果的な治療法の基礎が提供される。男性の性的早熟では、早熟の重症度は、構成的なLH受容体活性の程度に直接依存しているようである。本発明の方法は構成的に活性なLH受容体に対するインバースアゴニストの直接的同定に直接応用することが可能である。本発明は本明細書中ですでに検討した構成的に活性化される受容体の疾患の処置のためのインバースアゴニストである化合物を、直接同定するための同様な取り組みを提供する。
【０１３３】
本発明の別の重要な応用は、カポジ肉腫中にガン性の細胞増殖を引き起こし、およびHIV感染個体にしばしば見られるガンマヘルペスウイルスが伝染する構成的に活性なＧタンパク質-共役受容体に対するインバースアゴニストの同定であろう。伝染した受容体に関する内因性のリガンドは未知であるため、これはオーファン受容体に対するインバースアゴニストを同定するための方法を提供する本発明の用途の例である。カポジ肉腫は、アゴニストまたはたとえアンタゴニストの知識を用いてもガンが引き起こす活性化受容体を逆転させる化合物が得られない良い例である。しかし本発明の方法は正に必要とされる化合物、インバースアゴニストをスクリーニングするために設計されている。
【０１３４】
構成的に活性化される受容体が関係する２つの特記すべき神経精神病は、精神分裂病（ドパミンD4受容体の過剰発現)および大うつ病(セロトニン5-HT2A受容体の過剰発現)である。活性受容体に対するインバースアゴニストは、有利な処置に有望である。本発明の方法と同じインバースアゴニストを同定する取り組みを、構成的に活性なチロシンキナーゼ疾患に関連する受容体、ならびに他の種類の受容体で使用する。より多くのオーファン受容体の機能が知られるようになれば、このような受容体の構成的に活性化された形態と関連するヒトの疾患のより多くの原因が分かるようになるとさらに期待される。
【０１３５】
本発明の方法は既知の薬剤が既知のおよびオーファン受容体に対するインバースアゴニストとしての活性を現すことができるかどうかを決定するために、既知の薬剤をスクリーニングするためにも有用であることは明らかである。加えて、上記の受容体を構成的に活性化する方法は、構成的に活性化される受容体を発現するトランスジェニックおよび／または遺伝子−標的化（gene-targeted)動物の作出に使用するための受容体を活性化するために使用する。このような非ヒト動物は、受容体の生理学的機能を決定するために（オーファン受容体の場合）、および受容体として作用する任意の化合物の生理学的効果を見いだし、そして特徴つける両方のために、改変した受容体の機能の生理学的効果を測定するために使用する。本発明の開示のそのようなさらなる応用は、本発明の教示および範囲の中にあると考える。
【０１３６】
本発明の種々の態様は、異なる構成的に活性化される受容体、異なる発現系および異なるアッセイから成るだろう。当業者はどの受容体をどの発現系およびアッセイ系と使用するかを理解している。すべては本発明の教示の範囲内にあると考える。さらに当業者は、本明細書で説明する具体的な実施例に対する種々の修飾、付加、置換および変更が、本発明の精神から逸脱することなく行えることを認識し、したがって本発明の範囲内であると考える。
【０１３７】
【実施例】
実施例１
整列および点突然変異により非内因性の構成的に活性化されるヒトの
セロトニン 5-HT2cＧタンパク質-共役受容体
1990年にCotecchia et al.は、ハムスターのα1B-アドレナリン受容体が膜貫通ドメインに近い第３細胞内ループにあるアミノ酸293の突然変異により構成的に活性化され得ることを示した。続いてすでに記載したKjelsberg et al.は、293位ですべての可能な19個のアミノ酸置換が異なる程度で構成的な活性化を与えることを示した。最近、Teitlerは、ラットのセロトニン 5-HT2Aおよび5-HT2c受容体がこのような受容体中でα1B-アドレナリン受容体中の293位に類似するアミノ酸位が突然変異すれば構成的に活性化され得ることを示した（5HT2Aの322および5-HT2cの312）。ヒトのセロトニン5-HT2Aおよび5-HT2c受容体の配列は知られているが、今日までヒトの受容体が構成的に活性化され得ることを示す報告はなかった。
【０１３８】
ヒトの5-HT2cセロトニン受容体は今、ヒトのセロトニン5-HT2c受容体中の類似位置（310）でセリンからリシンへ突然変異させることにより構成的に活性化された(S310K)。ヒトの5-HT2c受容体の構成的活性化を確認するために幾つかの方法が使用された。構成的活性化の１つの表示は、構成的に活性化された受容体が自然な受容体よりも内因性のリガンドに対して高親和性を有することである。図４は突然変異した5-HT2c受容体がセロトニンに対して自然な受容体よりも強化された親和性を有することを示している。構成的活性化の別の表示は、内因性リガンドの不在下で第２メッセンジャー経路において観察される強化された活性である。図５は突然変異した受容体が内因性受容体に比べて強化された細胞内のイノシトールトリホスフェートの蓄積を生じることを示す。最後に図６では、5-HT2c受容体の構成的活性化が突然変異した受容体の強化された[35S]GTPγSの結合により示されている。
【０１３９】
実施例２
ＧＴＰ膜結合シンチレーション近位アッセイおよび
構成的に活性化された受容体の同定におけるその使用
Ｇタンパク質-共役受容体がその活性化状態である時、リガンド結合または構成的な活性化のいずれかの結果として、受容体は膜タンパク質(Ｇタンパク質と呼ばれている)に結合し、そしてGTPからＧタンパク質への結合を刺激する。三量体のＧタンパク質-受容体複合体はGTPaseとして作用し、そしてGTPをGDPへゆっくりと加水分解し、この時点で受容体は通常、不活性化されている。しかし構成的に活性化された受容体はGTPをGDPへ交換し続ける。非加水分解性GTP同族体である[35S]GTPγSを利用して、構成的に活性化される受容体を発現している膜に対する[35S]GTPγSの強化された結合を示すことができる。[35S]GTPγS結合を測定するアッセイは、突然変異したヒトのセロトニン5-HT2c受容体の構成的な活性化の確認を示す。構成的な活性化を測定するために[35S]GTPγSを使用することの利点は次の通りである：（ａ）Ｇタンパク質-共役受容体に遺伝的に応用することが可能である；（ｂ）細胞内カスケードに影響を及ぼすピック-アップ分子となることが少ない膜表面での近位である。
【０１４０】
このアッセイはＧタンパク質共役受容体が関連する受容体を発現している膜への[35S]GTPγSの結合を刺激する能力を利用する。したがってこのアッセイは既知の、オーファンおよび構成的に活性化されるＧタンパク質共役受容体に対する候補化合物をスクリーニングするための直接的同定法で使用することができる。このアッセイは汎用的であり、そしてすべてのＧタンパク質共役受容体での薬剤発見に応用を有する。
【０１４１】
図７は、COS細胞中で発現した自然なヒトの5-HT2c受容体を発現している膜に対する[35S]GTPγSの結合をモニタリングするためのシンチレーション近位アッセイの利用性を示す。簡単に説明すると、アッセイは0.3nM[35S]GTPγSおよび12.5μgの膜タンパク質および１MのGDPを含む20mM HEPES pH7.4結合バッファー中で30分間インキューベーションする。次に小麦胚芽アグルチニンビーズ（25μl;アマーシャム)を加え、そして混合物をさらに室温で30分間インキューベーションする。次に試験管を室温で＠1500Xgにて５分間遠心し、そして次にシンチレーションカウンターで計数する。図７から分かるように、内因性のリガンドとして5-HT2A受容体を活性化するセロトニンは、濃度依存的様式で膜への[35S]GTPγSの結合を刺激した。刺激された結合は30μMのミアンセリン（古典的な5-HT2Aアンタゴニストと考えられる化合物であるが、インバースアゴニストであることも知られている）により完全に阻害された。しかしこのアッセイは、膜へのアゴニストが誘導する[35S]GTPγSの結合を測定し、そして受容体の構成的な活性を測定するために日常的に使用することができる。しかし小麦胚芽アグルチニンの現在の経費がこれを妨げるかもしれない。
【０１４２】
経費的には低いが同等に応用できる代替法が確認され、これも大規模のスクリーニングの必要性に合う。Flash プレートおよびWallac(商標)シンチストリップを使用して、高処理量の[35S]GTPγS結合アッセイを構成することができる。さらにこの技法を使用することにより、アッセイは[35S]GTPγS結合を介した効能のモニタリングと同じ時に、トリチウム化したリガンドの受容体への結合を同時にモニタリングするために使用することができる。これはワラック(Wallac)のベーターカウンターがトリチウムおよび35Ｓ標識プローブの両方を見るために、エネルギーウインドを切り替えることができるからである。このアッセイは受容体の活性化で生じる他の種類の膜の活性化の結果を検出するためにも使用することができる。例えばこのアッセイを使用して種々の受容体（Ｇタンパク質共役およびチロシンキナーゼ受容体の両方）の32Ｐリン酸化をモニタリングすることができる。膜をウェルの底に遠心する時、結合した[35S]GTPγSまたは32Ｐリン酸化受容体はウェルにコートされたシンチラントを活性化する。Scinti（商標）ストリップ（ウァラック）をこの原理を示すために使用した。さらにこのアッセイは放射活性的に標識したリガンドを使用して受容体へのリガンドの結合を測定する用途もある。類似の様式で、放射性標識した結合リガンドをウェルの底に遠心し、シンチストリップ標識を放射性標識したリガンドの近くにくると、活性化および検出が得られる。
【０１４３】
[35S]GTPγSアッセイは、受容体の従来の第２メッセンジャーアッセイで得られるものと相等しい結果をもたらす。図８に示すように、セロトニンはヒトの5-HT2c受容体への[35S]GTPγSの結合を刺激する一方、ミアンセリンはこの反応を阻害する。さらにミアンセリンは部分的なインバースアゴニストとして作用し、そして自然なヒトの5-HT2c受容体を発現している膜への[35S]GTPγSの基準となる構成的結合を阻害する。予想どおり、[35S]GTPγを交換するためのGDPは存在しないので、GDPの不在でアゴニスト反応はない（データは示さず)。自然な5-HT2c受容体の反応を示すためにこのアッセイ系は効果的であるだけでなく、他の受容体の構成的活性化の測定にも効果的である。図９は、対照ベーターのみを発現している293T細胞から調製された膜、自然なヒトの5-HT2c受容体またはS310Kの構成的に活性な突然変異体であるヒトの5-HT2c受容体に対する[35S]GTPγSの結合の強化を示している。このアッセイに使用した全タンパク質濃度は、各受容体に関する[35S]GTPγS結合の全量に影響を及ぼす。図９から分かるように、CMVでトランスフェクトした、および構成的に活性な突然変異体受容体の間のc.p.m.の差異は、10μg/ウェルで約1000c.p.m.から75μg/ウェルタンパク質濃度で約6〜8000c.p.m.へ上昇した。S310Kの突然変異体受容体が最高レベルの構成的活性化を示し、次に野生型受容体も基準より高い強化された[35S]GTPγS結合を示した。この証明は自然なヒトの5-HT2c受容体が5HT刺激無しで細胞内のIP3を蓄積する能力（図５）、および自然な5-HT2c受容体が高い自然な基準活性を有することを述べている報告されたデータと一致している。このようにヒトの5-HT2c受容体のS310K突然変異は、構成的な活性が膜界面での近位[35S]GTPγS結合の結果により測定可能であることを明らかに証明している。セロトニンの刺激で、内因性および非内因性(S310K)受容体はより多くの[35S]GTPγSへ結合することを刺激される。
【０１４４】
実施例３
LVIP.2OZc細胞でのGa14受容体アッセイおよび
活性受容体を同定するためのその使用
多数のGa14結合部位を含有するβ-ガラクトシダーゼ受容体を生成するために、BglII／HindIIIフラグメントをソマトスタチンプロモーターを含有するプラスミド1.4(5XGal)CATから取り出し［Leonard,J.et al.(1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:6247-6251]、そしてpβgal-Basic（プロメガ：Promega）にクローン化した。BglII／HindIIIフラグメントは、最小ソマトスタチンプロモーター（転写開始部位に対して-71bpから+50bp）の変異体を含み、ここでcAMP応答配列のコアの4bp(-46から-43)が酵母転写因子Ga14の認識配列の５コピーと置き換えられた。このレポーターをGa14-CREB融合タンパク質をコードする発現プラスミドでコ-トランスフェクト(co-transfected)すると、cAMPシグナル伝達経路を増す薬剤に対して高度に反応性となる。
【０１４５】
VIP.2OZcは、cAMP応答性VIPプロモーターの制御下でレポーター遺伝子-ガラクトシダーゼを用いて安定にトランスフェクトされた細胞系である（Konig et al.Molecular and Cellular Neuroscience 1991,2,331-337)。ここでこの細胞系を使用して細胞内のcAMPの蓄積を間接的に測定した。約２百万個の細胞がトランスフェクションの前日に６cmのプレートにまかれた。各受容体についてDNA(５μg)を、200μg/mlのDEAEデキストランおよび100μMのクロロキンを含有する2.5mlの無血清DMEMと混合し、そしてすすいだ細胞単層に加えた。CO2インキューベーター中で90分間インキューベーションした後、トランスフェクション培地を取り除いた。細胞を無血清培地で洗浄し、そして新しい完全培地を補充した。トランスフェクションから24時間後、細胞を96-ウェルプレートにウェルあたり50〜100Ｋの密度で再度まき、そして-ガラクトシダーゼ活性をトランスフェクションから48〜72時間にアッセイした。化合物は細胞に一晩暴露した後に試験した。
【０１４６】
アッセイバッファーは、100mMのリン酸ナトリウム、2mM MgSO4、0.1mM MnCl2、pH8.0を含む。細胞をPBSで洗浄し、そして0.1Xアッセイバッファーから成る25μl/ウェルの低張溶解バッファーを加えた。10分後、0.5％ Triton X-100および40mM β-メルカプトエタノールを含有する100μlのアッセイバッファーを各ウェルに加え、そして室温でのインキューベーションを10分間続行した。アッセイバッファー中に５mg/mlのクロロフェノール レッド-β-ガラクトピラノシド(CPRG)を含む基質溶液を25μl/ウェルで加え、そしてプレートを37℃で30分間インキューベーションした後、595nmでの吸収をプレートリーダーで測定した。
【０１４７】
実施例４
内因性の構成的に活性化されるオーファン受容体、それらの相同体、
組織分布およびそれらに対するインバースアゴニストの直接的同定
本明細書に開示する方法の威力は、GPR3を使用して以下のように具体的に説明する。GPR3は、内因性の状態で構成的に活性化されることが知られているＧタンパク質共役オーファン受容体である（Eggerickx,D.et al.(1995))。
【０１４８】
図１０を参照にして、そして実施例２の[35S]GTPγS結合アッセイ系を使用して、対照に比較して高い活性を有するGPR3受容体を決定した；この高くなった活性は、データが全細胞調製物に反して膜調製物から得られたのでオートクリン泌刺激の結果ではない。GPR3は構成的に活性化される受容体であるだけでなく、その活性のレベルは、図１１に示すような[35S]GTPγS結合アッセイ系を使用した突然変異したヒトの5-HT2A受容体のレベルに匹敵する（75μg/ウェルの膜タンパク質［すなわちGPR3を発現している293T細胞]を、12nMの[35S]GTPγSおよび１μMのGDPとインキューベーションした)。
【０１４９】
GPR3が構成的に活性化される受容体であることを確認した後、薬剤同定に対する「ドグマ」的な取り組みから最初の重要な逸脱（divergence）を使用した−この逸脱は本発明の結果としてのみ可能である。市販されているプログラムであるDNA Starを使用して利用可能なＧタンパク質-共役データバンク(GeneBank)の相同性の調査により、２つの高度に相同的な受容体、GPR6およびGPR12（図１２を参照にされたい）を同定した：このような受容体は両方ともオーファン受容体である。これら受容体の配列はすでに「知られている」が（すなわち、それらはデータべースから利用可能である）、これらの２つの受容体がそれらの内因性の形態で構成的に活性化されることは知られていなかった（図１３）。さらに、リガンドが知られていなかったので、これまでそのような受容体について薬剤発見プログラムでの使用を調査する理由がなかった。このように薬剤発見に対するドグマ的取り組みでは、GPR3、GPR6およびGPR12間にせいぜいわずかな興味で、すなわち恐らくはちぐはぐな相同性が見いだされたことだろう。
【０１５０】
GPR3の２つのオーファン相同体、すなわちGPR6およびGPR12の発見後に、薬剤発見に対してドグマ的取り組みからの重要な第２の逸脱を使用した−ここでも、この逸脱は本発明の結果のみから可能である。組織サンプルをこのようなオーファン受容体の発現について、以下のプライマーを使用して比較RT-PCRにより調査した：
ＧＰＲ３：
5′-CTGGTCCTGCACTTTGCTGC-3′
5′-AGCATCACATAGGTCCGTGTCAC-3′
このようなプライマーは、194bpフラグメントを増幅する。
ＧＰＲ６：
5′-ACCAGAAAGGGTGTGGGTACACTG-3′
5′-GGAACGAAAGGGCACTTTGG-3′
このようなプライマーは、249bpフラグメントを増幅する。
ＧＰＲ12：
5′-GCTGCCTCGGGATTATTTAG-3′
5′-GCCTATTAGCAGGAACATGGGTG-3′
このようなプライマーは、220bpフラグメントを増幅する。
【０１５１】
各プライマー対がその各々の標的を同じ至適アニーリング温度で増幅するように、このようなアンプリコンは重複しないように、すなわちそれらの間に配列類似性が無く、しかも類似のＴｍを有するように設計した。これにより多反応において１つのプライマー対からのアンプリコンが他のプライマーのアニーリング標的として作用する機会が消され、したがって他のプライマー対との妨害の機会が減る。
【０１５２】
全RNAは、TRIzol(商標)試薬(ギブコ(Gibco)/BRL)を使用して製造元の指示に従い組織サンプル(ヒト)から抽出した。cDNAは、２mgの全RNAおよびFirst-Strand(TM) cDNA合成キット(ファルマシア:Pharmacia)を使用して生成した。cDNAサンプルを1:3にH2O中で希釈し、そして比較PCRを[32P]dCTPの存在下で記載されているように(Jensen,J.et al.(1986) J.Biol.Chem.271;187490、行った。すべての反応に300bpフラグメントを増幅するSP-1特異的プライマーを含み、内部対照として役立てた。上記に概説したプライマーを使用して、定めたPCR条件下（１サイクル：95℃、５分；23サイクル：95℃、30秒、58℃、30秒、72℃、１分；１サイクル 72℃、10分）にて、一貫した信頼性のある、しかも定量的に正しい結果を得た。さらに選択したプライマー対が複合した（multiplexed）時に互いに妨害しなかったことを決定した。PCR産物は変性ゲル電気泳動(７M 尿素、５％ポリアクリルアミドゲル（Long Ranger(商標)溶液、ATバイオケミカル(Biochemical)、0.6XTBE)により視覚化し、そして次にオートラジオグラフィーにかけた。
【０１５３】
図１４Ａ、１４Ｂおよび１４Ｃは、GPR3、GPR6およびGPR12のヒトの組織中の分布を示す。この情報はそのような組織に関連する疾患状態を評価すること、ならびにそのような発現が優勢なそのような組織中の具体的領域の決定を可能とし、すなわちそのような受容体の発現と特定の疾患状態との相関を可能とする。これは次にそのような受容体の内因性リガンドを理解し、または知る必要無しにそのような受容体に影響を及ぼす化合物の直接的同定を可能とする。さらにスクリーニングでは、RT-PCR分析により示されるように、対照と比べてGPR3が大変高いレベルでヒトの癲癇組織（組織源：側頭皮質）で発現することが明らかである（図１５）。ここでもドグマ的な取り組みの下では、せいぜい本発明までそのような情報はおそらく興味としてちぐはぐなデータを出した考えられるので、そのような実験を行うための合理的な発奮材料にはならなかったであろう。
【０１５４】
すなわち３種の構成的に活性化されるオーファン受容体に対する内因性リガンドの知識が無くても、本発明はこのようなオーファン受容体に対する、最も好ましくは逆アゴニスを直接同定するための候補化合物をスクリーニングするための合理的基礎を可能とし、そして提供する。
【０１５５】
β-ガラクトシダーゼ系を使用して(上記実施例３を参照にされたい）、720種の候補化合物（トリポス社:Tripos Inc.)をGPR6受容体に対してスクリーニングし、そして74種の候補化合物をGPR3受容体に対してスクリーニングした。このような化合物を細胞上で一晩インキューベーションした。これらの中で２種の化合物がGPR3受容体に対するインバースアゴニストとして直接同定され（P44およびP45、図１６）、そして13種がGPR6受容体に対するインバースアゴニストとして直接同定された(P3、P13、P15、P18、P20、P32、P33、P36、P55、P66、P67、P69およびP70、図１７）。
【０１５６】
このデータは本発明が内因性のリガンドが未知の受容体に対するインバースアゴニストの直接的同定を効果的かつ効率的に可能とする位置にあることを示している。この技術により、特定の疾患と具体的な組織中のオーファン受容体の分布とを相関させること、および／またはそのような受容体の存在を相関させることにより、そのような疾患のための医薬組成物（１つまたは複数）の開発に対する合理的取り組みを可能とする。
【０１５７】
本明細書中で引用した各特許、特許出願および公報は、追補を含め引用により全部、本明細書に引用する。
【０１５８】
当業者は本発明の精神から逸脱することなく本発明の好適な態様の多数の変更および修飾を行うことができると考えるだろう。すべてのそのような変更態様も本発明の範囲内にあるものとする。
【０１５９】
【表７】
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【０１６０】
【表８】
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【０１６１】
【表９】
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【０１６２】
【表１０】
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【０１６３】
【表１１】
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【０１６４】
【表１２】
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【０１６５】
【表１３】
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【０１６６】
【表１４】
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【０１６７】
【表１５】
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【０１６８】
【表１６】
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【０１６９】
【表１７】
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【０１７０】
【表１８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  膜貫通ヘリックス、細胞内ループおよび細胞外ループに割り当てた数字を含む、Ｇタンパク質共役受容体の一般構造を表す。
【図２】  典型的なＧタンパク質共役受容体に関する活性および不活性な２つの状態、ならびに活性状態の第２メッセンジャー伝達経路とのつながりを概略的に表す。
【図３】  既知の構成的に活性な受容体の幾つかを、１）関連する疾患；２）構成的な活性化の性質（配列の修飾、抗体、過剰発現）；３）活性化修飾の位置；４）活性化修飾の性質；および５）引用文献と一緒に表す。
【図４】  3H-LSDの自然な、および構成的に活性な5-HT2c受容体との結合に比べて、セロトニンに対する構成的に活性なヒトの5-HT2c受容体の上昇した親和性を、その増大した能力により示す図表である。
【図５】  内因性の5-HT2c受容体および対照のみでトランスフェクトした細胞に比べて、（非−内因性の）ヒト 5-HT2c(S310K)突然変異体受容体が、COS細胞中でイノシトール トリスホスフェートの強化された細胞内蓄積を表す図表である。
【図６】  75μg/ウェル膜タンパク質で、対照ベクター単独でトランスフェクトしたものと比較して、内因性および非内因性の(S310K) 5-HT2c受容体でトランスフェクトした293T細胞から調製した膜への[35S]GTPγSの強化された結合を表す図表である。放射標識した[35S]GTPγSの濃度は1.2nMで一定に保ち、そしてGDP濃度は１μMで一定に保った。このアッセイはワァラック シンチストリップ中の96-ウェル形式で行った。
【図７】  セロトニンに反応して内因性の5-HT2c受容体を発現しているCOS細胞から調製した膜への[35S]GTPγSの強化された結合、および小麦胚芽アグルチニンシンチレーション近位ビーズを使用したミアンセリンによる阻害を表す図表である。[35S]GTPγSの濃度は0.3nMで一定に保ち、そしてGDP濃度は１μMで一定に保った。膜タンパク質の濃度は12.5μgであった。
【図８】  293T細胞中で非内因性(S310K)の構成的に活性な5-HT2c受容体を発現している膜への[35S]GTPγSの結合のセロトニン刺激、およびワラック シンチストリップ上で30μMのミアンセリンによる阻害を表す図表である。
【図９】  10μMのセロトニンの不在下(A)および存在下(A)で対照ベクター単独でトランスフェクトした細胞と比較して、内因性および非内因性の(S310K) 5-HT2c受容体でトランスフェクトした293T細胞から調製した膜中で、[35S]GTPγS結合に及ぼすタンパク質濃度の効果を示す図表である。放射標識した[35S]GTPγSの濃度は0.3nMで一定に保ち、そしてGDP濃度は１μMで一定に保った。このアッセイはワァラック シンチストリップ中の96-ウェル形式で行った。
【図１０】  75μg/ウェル膜タンパク質で、対照ベクター単独でトランスフェクトしたものと比較してオーファン受容体GPR3でトランスフェクトした293T細胞から調製した膜への[35S]GTPγSの強化された結合を表す図表である。放射標識した[35S]GTPγSの濃度は1.2nMで一定に保ち、そしてGDP濃度は１μMで一定に保った。このアッセイはワァラック シンチストリップ中の96-ウェル形式で行った。
【図１１】  37.5(A)および75(B)μg/ウェルの膜タンパク質で、内因性の5-HT2c受容体、非内因性の構成的に活性な5-HT2c受容体、オーファン受容体GPR3および対照ベクター単独でトランスフェクトした293T細胞から調製した膜中の結合に及ぼす[35S]GTPγSの効果を表す図表である。GDP濃度は１μMで一定に保った。このアッセイはワァラック シンチストリップ中の96-ウェル形式で行った。
【図１２】  オーファン受容体GPR3、GPR6およびGPR12のアミノ酸配列を表す。
【図１３】  Konigの手順に従い、VIP細胞中のCRE駆動レポーター系からβ-ガラクトシダーゼの発現を誘導するオーファン受容体GPR3、GPR6およびGPR12の強化された能力により、オーファン受容体GPR3、GPR6およびGPR12は構成的に活性であることが確認されたことを示す図表である（実施例３を参照にされたい）。
【図１４】  RT-PCRにより決定された幾つかの正常なヒトの組織にわたりGPR3(A)、GPR6(B)およびGPR12(C)オーファン受容体の発現の相対的分布を表す。略号：Ocx＝後頭皮質；Hypoth＝視床下部；Tex＝側頭皮質；Fcx＝前頭皮質。
【図１５】  RT-PCRにより調査した正常および癲癇のヒトの脳組織でのGPR3受容体の発現を表す。対照サンプルは左に、そして癲癇サンプルは右である。
【図１６】  オーファンＧタンパク質-共役受容体であるGPR3で候補化合物をスクリーニングした後の平面プロファイルを表す。ウェルＰ４４およびＰ４５はインバースアゴニストである。
【図１７】  オーファンＧタンパク質-共役受容体であるGPR6で候補化合物をスクリーニングした後の平面プロファイルを表す。ウェルＰ３、Ｐ１３、Ｐ１５、Ｐ１８、Ｐ２０、Ｐ３２、Ｐ３３、Ｐ３６、Ｐ３５、Ｐ５５、Ｐ６６、Ｐ６７、Ｐ６９およびＰ７０はインバースアゴニストである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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