(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
毎日の投与によって糖尿病の対象における創傷治癒を改善するための医薬組成物であって、後生的グリケーション終末産物（advanced glycation endproduct）受容体の細胞外ドメインであるポリペプチドの治療学的に有効な量を含む医薬組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬組成物であって、当該医薬組成物が外傷内、腹腔内、筋肉内または静脈投与；注入；リポソームを介した輸送；または局所、鼻腔、口腔、肛門、眼または耳からの輸送による投与のためのものである医薬組成物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の医薬組成物であって、前記治療学的に有効な量が、当該対象の体重ｋｇ当たり１０ｎｇから５００，０００ｎｇである医薬組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の医薬組成物であって、前記治療学的に有効な量が、当該対象の体重ｋｇ当たり２００ｎｇから２００，０００ｎｇである医薬組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の医薬組成物であって、前記治療学的に有効な量が、当該対象の体重ｋｇ当たり１５０ｎｇから２００，０００ｎｇである医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
本明細書に開示されている発明は、保健社会福祉省、国立衛生研究所のグラント第HL21006号及び第AG00603号下に、合衆国政府の補助によってなされた。従って、合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。本願は、1996年11月22日に出願された米国出願第08/755,235号の優先権を主張する。
発明の背景
本願を通じて、著者及び日付によって様々な参照文献が参照される。これらの文献の完全なリストは、本明細書の末尾、請求の範囲の直前にアルファベット順で掲載されている。当業者に公知である本分野の状況をより完全に記述するために、これらの文献の開示内容全体を本願明細書に参照文献として取り込む。
創傷が治癒しにくいことは、糖尿病における重大な問題であり、死亡率増加の原因となっている（Reynolds,1985；Galloway及びShuman,1963；並びにPearl及びKanat,1988）。創傷治癒における修補的応答は、炎症エフェクター細胞による創傷の浸潤を含む、多くの態様で協働する複数の細胞要素によって統合される。これに続いて、繊維芽細胞要素は、炎症性エフェクター細胞とともに、抗細菌機構を与え、壊死した組織の除去、及び新しい結合組織の堆積を促進する。グルコース代謝の基本的疾患は、これらの複雑且つ相互的な防御プロセスを擾乱するのかもしれない。従来の研究は、糖尿病患者の創傷治癒における細胞の機能不全には、好中球機能の不全（Bagdadeら、1978；Nolanら、1978；及びMowat及びBaum、1971）、炎症性細胞による傷への浸潤の遅延（Greenhalghら、1990、及びFaheyら、1991）、コラーゲン産生の減少（Goodson及びHunt、1977、Goodson及びHunt、1986）、及び塩基性繊維芽細胞増殖因子（Giardinoら、1994）のような内在性成長因子の活性の減少が含まれ、これらは、肉芽組織の形成及び創傷の閉鎖がより遅くなることに対する基礎を与え得るかもしれない。
発明の概要
本発明は、糖尿病患者における糖尿病の症状を治療する方法であって、任意のAGE（advanced glycation endproduct）受容体へのAGEの結合を阻害する物質を患者に治療的量投与して、患者の糖尿病の症状を治療することを具備する方法提供する。
図面の簡単な記述
図１．遺伝的に糖尿病のdb+/db+マウスにおける、sRAGEの創傷治癒に対する影響。db+/db+マウス、又は対照、ヘテロ接合db+/m+マウスの背中に、全厚1.5×1.5cmの創傷を作り、TEGADERM▲Ｒ▼で被覆した。手術から３日後に開始して、７日間毎日、TEGADERM▲Ｒ▼の下に直接PBSを用いるか、又はsRAGE（200ng）で糖尿病の創傷を処置した。創傷領域の上にガラススライドを置くことによって、21日にわたり、ベースラインで創傷領域を測定し、創傷領域を追跡調査し、閉鎖した創傷のパーセンテージを時間の関数として計算するために、該情報をコンピュータに入力した。左の軸が、創傷閉鎖のパーセントを表している。
図２．遺伝的に糖尿病のdb+/db+マウスへのsRAGEの投与は、創傷治癒を改善する：用量−応答研究。上述のように創傷を作り、３日から９日までsRAGE（2,000、200、又は20ng／日の何れか）又はPBSで処置した。10日目に、創傷領域を測定し、上述のように最初の創傷領域と比較した。結果は、PBSで処置されたマウス（図では、１と定義されている）と比較した創傷治癒の増加倍数をパーセントで表してある。全ての統計学的分析は、異なる用量のsRAGEの存在下での創傷治癒とPBSによる糖尿病性創傷の治癒との比較を示している。
図３Ａ及び図3B．糖尿病（db+/db+）マウスの創傷中のAGE免疫反応性エピトープ。糖尿病マウス（db+/db+マウス；図3A）及び非糖尿病マウス（db+/m+；図3B）の背中に作った全厚1.5×1.5cmの創傷を切り出して、固定し、アフィニティー精製した抗AGEIgGで切片を染色した。倍率：200×。
発明の詳細な記述
本発明は、糖尿病患者における糖尿病の症状を治療する方法であって、治療的有効量のsRAGEを患者に投与して、患者の糖尿病の症状を治療することを具備する方法を提供する。前記症状には、異常な創傷治癒、心臓発作の症候、発作の症候、末梢血管疾患の症候、切断（amputation）、腎疾患の症候、腎不全、失明、神経障害、炎症、又はインポテンスが包含され得る。
本発明は、糖尿病患者における糖尿病の症状を治療する方法であって、任意のAGE受容体へのAGEの結合を阻害する物質を患者に治療的有効量投与して、患者の糖尿病の症状を治療することを具備する方法も提供する。本発明の該方法において、該物質には、ポリペプチド、ペプチド類似物（peptidomimetic）、有機分子、炭水化物、脂質、抗体、又は核酸が含まれ得る。本発明の該方法において、ポリペプチドには、AGEポリペプチド又はその一部、AGEポリペプチド受容体又はその一部、可溶性AGEポリペプチド受容体又はその一部が含まれ得る。本発明の該方法において、抗体には、抗RAGE抗体又は抗RAGE F（ab’）2断片が含まれ得る。本発明の該方法において、治療的に有効な量には、約200〜200,000ng/日/kg体重、又は約50〜500,000ng/日/kg体重の用量が含まれ得る。
本発明は、糖尿病患者の創傷治癒を改善する方法であって、あるAGE受容体へのAGEの結合を阻害する物質を患者に、十分な量、十分な期間にわたって治療的有効量投与して、患者の創傷治癒を改善することを具備する方法を提供する。
本発明の該方法において、該物質には、ポリペプチド、ペプチド類似物、有機分子、炭水化物、脂質、抗体、核酸が含まれ得る。本発明の該方法において、ポリペプチドには、AGEポリペプチド又はその一部、AGEポリペプチド受容体又はその一部、可溶性AGEポリペプチド受容体又はその一部が含まれ得る。
本発明のある実施態様では、投与には、創傷の日付近から創傷後10日付近まで毎日投与することが含まれる。本発明において、十分な量には、約10〜500,000ng/日/kg体重、又は約150〜200,000ng/日/kg体重の用量が含まれ得る。
本発明は、糖尿病患者における糖尿病の症状を治療する方法であって、任意のAGE受容体へのAGEの結合を阻害する物質を患者に治療的有効量投与して、患者の糖尿病の症状を治療することを具備する方法を提供する。
本発明の方法において、該物質は、ポリペプチド、ペプチド類似物、有機分子、炭水化物、脂質、抗体、又は核酸であり得る。ポリペプチドの場合には、AGEポリペプチド又はその一部、AGEポリペプチド受容体又はその一部、可溶性AGEポリペプチド受容体又はその一部、例えば可溶性RAGE、又は組換えポリペプチドが含まれ得る。ポリペプチドは、化学的合成され、又は標準的な組換えDNA法によって生産し得る。抗体の場合には、抗体は、抗RAGE抗体又は抗RAGE F（ab’）2断片であり得る。
本発明の方法において、治療し得る前記症状には、異常な創傷治癒、胸部の痛みのような心臓発作に関連する症候、発作に関連する症候、末梢血管疾患、切断、腎疾患、腎不全、失明、神経障害、炎症、又はインポテンスが包含される。
該方法を用いられる患者は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、又はサルであり得る。
前記物質の投与は、外傷内、腹腔内、筋肉内、又は静脈内投与によって；注入によって実施することができ、又はリポソームを介した輸送；又は局所、鼻腔、口腔、肛門、眼、又は耳からの輸送が含まれ得る。
本方法の実施において、投与には、毎日、毎週、毎月、又は毎時間の投与が含まれ得、正確な回数は、患者の年齢及び状態、投与すべき量、患者中での物質の半減期、投与したい患者の部位等のような様々な変動要因に依存する。
本発明の方法に関して、「治療的有効量の」には、患者のサイズ及び体重、患者の年齢、症状の重篤さ、創傷の表面積、物質の効力、物質の輸送法、及び患者における該症状の病歴を考慮した用量が含まれ得る。当業者であれば、このような因子に基づいた正確な投与量及び正確な投与回数を容易に決定できるであろう。例えば、治療的有効量は、約200〜200,000ng/日/kg体重の用量であり得る。これに関して、創傷を負った糖尿病マウスに、毎日（3〜9日目）、24μgを腹腔内投与すると、創傷治癒が非常に改善されることが示された。これに関して、投薬は、単回投与として投与してもよく、又一定の時間にわたって連続的に投与してもよい。
本発明は、糖尿病患者の創傷治癒を改善する方法であって、AGEの結合を阻害する物質を患者に治療的有効量投与して、患者の創傷治癒を改善することを具備する方法も提供する。
本発明は、患者の炎症を改善する方法であって、任意のAGE受容体へのAGEの結合を阻害する物質を治療的有効量投与して、患者の炎症症状を治療することを具備する方法を提供する。
本発明の該方法において、該物質は、ポリペプチド、ペプチド類似物、有機分子、炭水化物、脂質、抗体、又は核酸であり得る。ポリペプチドの場合には、ポリペプチドは、AGEポリペプチド又はその一部、AGEポリペプチド受容体又はその一部、可溶性AGEポリペプチド受容体又はその一部、又は組換えポリペプチドであり得る。ポリペプチドは、化学的合成され、又は標準的な組換えDNA法によって生産し得る。抗体の場合には、抗体は、抗RAGE抗体又は抗RAGE F（ab’）2断片であり得る。
可溶性RAGEが糖尿病の創傷治癒を改善し得る他の方法が存在するかもしれない。可溶性RAGEは、少なくとも部分的には、AGEを結合して細胞のRAGEを活性化するそれらの能力を妨害することとは無関係な抗炎症効果のような他の効果を有し得る。
該物質の投与は、外傷内、腹腔内、筋肉内、又は静脈内投与によって；注入によって、又はリポソームを介した輸送によって、；又は局所、鼻腔、口腔、肛門、眼、若しくは耳からの輸送によって実施し得る。
請求の範囲に記載された本発明のある実施態様では、投与には、創傷の日付近から創傷後10日付近まで毎日投与することが含まれ得る。
本発明の別の実施態様では、十分な量には、約200〜200,000ng/日/kg体重の用量が含まれ得る。
本発明は、糖尿病患者における創傷治癒を改善する方法であって、治療的量の物質を患者に投与して、患者の創傷治癒を改善することを具備する方法も提供する。創傷治癒を改善する機構は、生化学的なものであり得、又は競合的なものであり得る。
本明細書で用いる、「AGE」とは、後生的グリケーション終末産物（advanced glycation endproduct）を意味し；「RAGE」とは、AGE受容体（receptor for an advanced glycation endproduct）を意味し；「sRAGE」とは、RAGEポリペプチドの三分の二に当たる細胞外部分等の、AGE受容体の可溶性型を意味する。
本発明の方法の実施において、「治療的有効量」とは、任意のAGE受容体へのAGEの結合を阻害し得る量である。従って、有効量は、治療を受ける患者、治療される症状に応じて変動する。本発明の目的に対して、投与法には、皮膚、皮下、静脈内、非経口、経口、局所、又はエアロゾルによる投与が含まれるが、これらに限定されない。
（例えば、125Iで放射線標識するか、又はビオチン化された）検出可能なマーカー物質を会合させることによって、本発明の物質の一部を標識すると、固体状組織及び血液、脳脊髄液、若しくは尿のような液体サンプル中に存在するこのような物質又はその受容を有する細胞又はその誘導体の検出及び定量に有用な試薬が得られる。
創傷治癒を改善するために患者に化合物及び医薬を投与することは、糖尿病に伴う症状を改善するための必要性が長い間感じられていたので、本分野において公知である。参照文献として以下の文献を本明細書に取り込む：米国特許第5,561,116号、プロポリス成分を含有する固形産物、並びにその調製及び使用；米国特許第4,971,954号、リボース架橋されたコラーゲンベースのマトリックス；米国特許第5,567,417号、ヘパリナーゼを用いて血管新生を阻害する方法；米国特許第5,565,428号、IGF-1の投与法。哺乳動物内での最大生物学的応答を刺激する期間、哺乳動物に治療的有効量のIGF-1を投与することを具備する、哺乳動物内でのその生物学的活性を維持するためにインスリン様成長因子Ｉを哺乳動物に投与することが開示されている。’428特許は、ある期間にわたる投与、並びに哺乳動物に所望の生物学的応答を達成又は維持させるために必要な期間、反復投与及び断続的に投与することも開示している。このように、治療的量のペプチド又はタンパク質の投与法は、当業者に公知である。米国特許第5,561,137号、チオヘテロ環マクロラクタム免疫モジュレーター；米国特許第5,561,110号、糖尿病の併発症及び病理の治療法；米国特許第5,547,672号、加速された創傷治癒；米国特許第5,532,227号、非抗菌性の化学的に修飾されたテトラサイクリンを含むテトラサイクリンは、糖尿病期間中に、種々のタイプのコラーゲン及び他のタンパク質の過剰なグリコシル化を抑制する；米国特許第5,527,772号、ペプチドを用いた細胞増殖及び分化の調節；米国特許第5,468,737号、アロエから得られる多糖の全身投与によって加速された創傷治癒；米国特許第5,395,398号、防腐、治癒の伝播、並びに創傷及び慢性皮膚潰瘍の鎮痛用微小電気装置；米国特許第5,378,475号、継続的放出薬物輸送装置；米国特許第5,246,708号、デオキシリボヌクレオチドを用いて創傷治癒を促進する方法；米国特許第5,532,227号、非抗菌性の化学的に修飾されたテトラサイクリンを含むテトラサイクリンは、糖尿病期間中に、種々のタイプのコラーゲン及び他のタンパク質の過剰なグリコシル化を抑制する。当業者に公知である本技術分野の状態をより完全に記載するために、本明細書で参照した文献の開示内容全体を参照文献として本願に取り込む。
投与すると、化合物は循環系から迅速に消滅することが多く、それ故相対的に短寿命の薬学的活性を生じせしめ得る。従って、治療的効力を維持するために、相対的に大量の生物活性化合物をしばしば投与することが必要とされるかもしれない。ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールとプリポロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、又はポリプロリンのような水溶性ポリマーを共有結合で付着させることによって修飾した化合物は、対応する非修飾の化合物に比べて、静脈内注射後に血中で実質的により長い半減期を示すことが知られている（Abuchowskiら、1981；Newmarkら、1982；及びKatreら、1987）。このような修飾は、水溶液中での化合物の溶解度も増加させ、凝集を除去し、化合物の物理的及び化学的安定性を増大せしめ、化合物の免疫原性及び反応性を大きく抑制するかもしれない。その結果、非修飾の化合物に比べて少ない頻度で、又は低用量で、このようなポリマー−化合物の付加物を投与することによって、所望のインビボ生物学的活性が達成され得る。
PEGは哺乳動物の中で極めて低い毒性を有するので（Carpenterら、1971）、化合物にポリエチレングリコール（PEG）を付着させることは、特に有用である。例えば、アデノシンデアミナーゼのPEG付加物は、重症複合免疫不全症の治療のために、ヒトに使用することがアメリカで承認された。PEGの抱合によって与えられる第二の利点は、異種性化合物の免疫原性及び抗原性を効率的に減少することである。例えば、ヒトタンパク質のPEG付加物は、重症な免疫応答を引き起こすリスクなしに、他の哺乳動物種の病気を治療するのに有用であり得る。患者の創傷治癒を改善し得る本発明の化合物は、該化合物又は該化合物を産生し得る細胞に対する宿主の免疫応答を減少又は阻害するために、ミクロカプセル装置に入れて輸送し得る。本発明の化合物は、リポソームのような膜でミクロカプセル化して輸送してもよい。
PEGのようなポリマーは、アミノ末端のアミノ酸のαアミノ基、リシン側鎖のεアミノ基、システイン側鎖のスルフヒドリル基、アスパラギン酸及びグルタミン酸側鎖のカルボキシル基、カルボキシ末端アミノ酸のαカルボキシル基、チロシン側鎖のようなタンパク質中に存在する一以上の反応性アミノ酸残基、又はあるアスパラギン、セリン、若しくはスレオニン残基に付着したグリコシル鎖の活性化された誘導体に簡便に付着させ得る。
タンパク質と直接反応するのに適した多くの活性化された形態のPEGが記載されている。タンパク質のアミノ基と反応させるのに有用なPEG試薬には、カルボン酸又はカルボネート誘導体の活性エステル、特に脱離基がN-ヒドロキシスクシンイミド、p-ニトロフェノール、イミダゾール、又は1-ヒドロキシ-2-ニトロベンゼン-4-スルフォネートであるものが含まれる。マレイミド又はハロアセチル基を含有するPEG誘導体は、タンパク質の遊離スルフヒドリル基を修飾するのに有用な試薬である。同様に、アミノヒドラジン又はヒドラジド基を含有するPEG試薬は、タンパク質中の炭水化物基の過ヨウ素酸酸化によって生じたアルデヒドとの反応に有用である。
本発明は、十分な量、十分な期間にわたって、AGEの受容体へのAGEの結合を阻害して、患者の糖尿病の慢性症状を治療することができる物質を治療的量具備するキットも提供する。キットは、患者が自宅又は診療所から離れてこのような治療を容易に受けられるように予め用量及び時間が調節された形態でsRAGE又はその一部を含有する組成物を含み得る。
以下の実験の詳細の部で、本発明を説明する。これらの部は、本発明の理解を助けるために記載されたものであって、如何なる意味においても、その後に続く請求の範囲に明記された本発明を限定することを意図したものではなく、またそのように解してはならない。
実験の詳細
例１：可溶性AGE受容体（sRAGE）を用いた治療による、糖尿病マウスにおける創傷治癒の改善
糖尿病での不完全な創傷治癒は、術後期間、外傷後、及び皮膚損傷の修復時における重要な死因であり続けている。AGEは、非酵素的なタンパク質／脂質のグリケーション／酸化の結果である。糖尿病患者の組織でAGEの形成及び蓄積が加速されることは、ある状況では、二次的な併発症の発症と関連する。AGEがホメオスタシスプロセスを擾乱する重要な手段は、それらと細胞の結合部位との相互作用による。これらの中で最も明らかとなっているのは、AGE受容体すなわちRAGEであり、これは、内皮、単球、及び平滑筋細胞、並びに糸球体間質細胞及び神経細胞によって発現されている免疫グロブリンスーパーファミリー分子である。RAGEがAGEを捕捉すると、内皮の活性化、接着分子の発現、凝固促進特性の増大、及び障壁機能の減弱；及び単球の擾乱を引き起こして、細胞の動き及び活性化を変化させて、炎症性サイトカインの発現をもたらす。RAGEを有する細胞、特に内皮細胞及び単核貪食細胞とAGEの相互作用は、慢性的な細胞の活性化を促進することによって、肉芽組織及び新しい結合組織の形成により反映する至適な創傷治癒を妨げるのかもしれない。本明細書のデータは、この考え方と一致している：糖尿病マウスの副次目的創傷モデル（secondary intention wound model）を用いると、可溶性RAGE（該受容体の細胞外ドメイン）の投与後に、創傷の閉鎖が増強される。これらの実験は、長年の目標及び長い間感じられてきた必要性に寄与し、糖尿病併発症の発症におけるAGEの細胞性相互作用の寄与に理解を与える
糖尿病で創傷が治癒しにくいのは、土台をなしている血管の不十分さという可能性に加えて、宿主の炎症−修補応答における基礎的な欠陥が現れたものと思われる。巨大分子がアルドース糖へ接触すると、非酵素的グリケーション及び酸化がもたらされ（Baynes,1991；Sell及びMoniier,1989；Rudermanら,；1992；及びVlassaraら、1994）、まず可逆的な初期グリケーション付加物、シッフ塩基、及びアマドリ産物が形成される。さらに複雑な分子の再編成が起こった後、不可逆的なAGEが生じる。後者は、蛍光、架橋を形成する傾向、反応性酸素中間物（ROI；reactive oxygen intermediate）の生成、及び細胞の受容体（最も特性が明確になっているのはAGE受容体、すなわちRAGEである（Schmidtら、1992；Neeperら、1992；及びSchmidtら、1994a））との相互作用によって特徴づけられる異なる構造物の集合である。糖尿病の組織に蓄積したAGEは、二つの一般的な機序：組織の構造に対する影響を介して、続いて架橋の形成及び血漿タンパク質の捕捉によって直接的に、並びに内皮細胞、単核貪食細胞のようなホメオスタシスに重要な細胞要素との相互作用及び病態生理学的に適切な刺激への宿主の応答によって間接的に、終末器官の機能に影響を与える。
研究は、分子の三分の二に当たる細胞外部分である可溶性すなわちsRAGEは、循環しているAGEと細胞表面との相互作用を阻害し得るようであるということを示唆してきた（Schmidtら、1994b）。例えば、該研究室で開発された典型的なリガンドである放射線ラベルされたAGEアルブミンの培養内皮細胞又は末梢血由来の単核貪食細胞への結合は、存在するsRAGEの用量が増加すると阻害された。インビボでは、静脈内投与後の正常マウスの循環からの放射線ラベルされたAGEアルブミンのクリアランスは、sRAGEによる処置を施すと遅延した。これらの知見を外挿して、創傷治癒のセッティングを試みた。これらの研究の最終目標は、創傷に対する宿主応答のセッティングにおけるAGE-RAGE相互作用の役割を評価することであった。
糖尿病における不十分な創傷治癒に対するAGE-RAGE相互作用の寄与を評価するために、糖尿病の創傷治癒応答を正常な動物と比較し、RAGEのブロックが糖尿病での創傷の閉鎖を改善するかどうかを決定した。これらの研究で、可溶性RAGEの投与によって、遺伝的に糖尿病であるマウスの創傷治癒が改善されることが明らかとなった。これらのデータは、RAGEのブロックが、糖尿病の創傷治癒及び腎臓、網膜、神経、心臓血管、脳血管、及び末梢血管疾患のような糖尿病の他の併発症における干渉の標的たり得ることを意味しているかもしれないという仮定を支持する。糖尿病患者には、血管形成術後に再狭窄及び局所的な問題の増加がみられ、可溶性RAGEが、バルーン／ステントの傷害後における再狭窄を減少させるという利点があり得ることを示唆する。
物質と方法
マウスの糖尿病モデル  ホモ接合マウスにグルコース代謝及び肥満の異常をもたらす常染色体性劣性形質（第４番染色体）によるインシュリン抵抗性／高血糖糖尿病の遺伝学的モデル（db+/db+マウス）を用いた。ヘテロ接合のマウス（db+/+m）では、これらの異常が生じないので、対照として用いる（Coleman,1982、Wyse及びDulin,1970）。糖尿病動物は、高血糖（3月齢までに、グルコース＞400mg/dL）であり、創傷の回復が悪いことを含めたヒトの併発症に類似した異常を示す。ホモ接合マウスの寿命は、6〜8ヶ月である。８週齢までにはAGEが存在するようになるので、マウスが８週齢になったときに創傷研究を開始する。
創傷治癒のモデル  潰瘍領域中の皮膚の崩壊後の臨床状態を部分的に刺激する（stimulate）ので、糖尿病での創傷治癒を分析するために、副次目的創傷モデルを用いた（Greenhalghら、1990）。全厚1.5×1.5cmの創傷をマウスの背中に作り、続いてTEGADERM（透明なプラスチックに封入）で被覆した。滅菌したガラススライドを該領域上に置き、創傷の縁をトレースすることによって、最初の創傷面積を測定した。続いて、コンピュータープログラム（NIH Image 157）を用いることによって、該面積を決定した。創傷サイズの連続測定は、第3、5、7、10、14、及び17日目に行った。該データは、以前の研究と一致しており（Greenhalghら、1990）、特に創傷を作ってから最初の2〜3週以内に、糖尿病マウスで創傷回復の有意な遅延を示した。分析のために、各群の動物を17日目に屠殺した。研究は、マウスが8〜10週齢に達したときに開始した。ある実験では、マウスには、最初の創傷作出操作から3〜9日目にわたって、TEGADERMの下に、可溶性RAGE（分子の三分の二に当たる細胞外部分）による処置を施した。
AGEを検出するための免疫組織化学
創傷作出操作の時点で、1.5×1.5cmの創傷を切り出し、ホルマリン（10％）で固定した後、アフィニティー精製した抗AGE IgGを用いた免疫組織化学のための処理を行った（Miyataら、1996）。
結果
糖尿病の創傷治癒におけるRAGEの役割を理解するために、db+/db+マウス又はdb+/m+マウスの背中に1.5×1.5cmの創傷を作った。まず、様々な治療法を受けるマウスの群間で、最初の創傷面積に統計的に有意な差がないことを確定した。3〜9日目に毎日、TEGADERMの下からsRAGE（200ng/日）を投与すると、糖尿病マウスで観察される創傷治癒が、ビークルで処置した糖尿病マウスと比べて（PBS；p<0.05；図1）、有意に増大した。さらに、sRAGEで処置した糖尿病マウスで観察された治癒は、対照、ビークルで処置したdb+/m+マウスで観察されたものと同程度であった（差は、統計学的に有意でなかった）。（図１）
これらの知見が受容体を介した機構によるという仮定と一致して、用量−応答研究は、2000ng／日のsRAGEを投与したときの糖尿病の創傷治癒は、200ng／日の用量を毎日投与したときと比べて増大しないことが明らかとなった（差は、有意でなかった；図2）。しかし、本明細書で記載した糖尿病マウスでの研究と一致して、200又は2,000ng／日のsRAGE（3〜9日目に投与）の何れかによる処置は、創傷を作出してから10日後に、最終的な創傷面積を測定したときに、PBSでこれらのマウスを処置した場合に比べて、有意に勝っていた（図２）。しかし、20ng／日の用量のsRAGE（毎日）は、sRAGEを投与した糖尿病マウスとビークルを投与した糖尿病マウスとの間で、創傷治癒に有意な差はなかった（図2）。
糖尿病の創傷にAGE免疫反応性物質が豊富であるかどうかを決定するために、アフィニティー精製した抗AGE IgGを用いて、糖尿病マウスvs対照マウスの免疫組織化学を行った。これらの研究は、非糖尿病対照動物（図3B）に比べて、糖尿病マウスの創傷組織（図3A）には、AGE反応性物質が有意に増加していることを実証した。
考察
これらの研究の結果は、創傷のような糖尿病組織では、AGEの堆積／形成が増加していることを示している。このようなAGEは、それらの細胞性受容体であるRAGEと相互作用すると、炎症的な環境を継続的に作り出し、そこでは治癒及び強力なエフェクター細胞及びメディエーターの静止が著しく遅延する。AGE-RAGE相互作用の妨害は、治癒の加速をもたらすかもしれないと仮定された。これらの研究では、可溶性RAGEを局所的に投与すると、用量依存的な態様で、糖尿病の創傷治癒を改善することが実証された。sRAGEの投与の効力に潜在する特異的な機序が重要である。sRAGEの投与は、炎症、血管新生、及び／又は新しい肉芽組織、特にコラーゲンの形成及び沈着のような生理的な創傷治癒における多数の重要なステップのうち任意の一つを改善している可能性がある。
これらのデータを合わせれば、糖尿病で観察されるようなAGEに富んだ環境では、AGE−細胞性RAGE間の相互作用を妨害すると、糖尿病の慢性的な併発症の改善がもたらされるかもしれないということを示唆する。血管構造の内皮細胞及び平滑筋、糸球体間質細胞、ある種の網膜の神経及び血管細胞、並びに中枢及び末梢両神経系のある種の神経細胞、並びに他の細胞内でRAGEが発現されているとすれば、細胞性RAGEのブロックは、改善されなければ心臓発作、発作、末梢血管疾患、手足の切断、腎臓病／腎疾患、失明、インポテンス、及び神経傷害を引き起こすであろう糖尿病の併発症を改善せしめるかもしれない。RAGEは、単球及びマクロファージ中に見出されており、治療的介入が可能かもしれない他の細胞種の中に存在するかもしれない。本研究は、sRAGEの投与（又は他の形態のRAGEのブロック；組換えsRAGE、RAGEをベースとしたペプチド、抗RAGEIgG若しくは抗RAGE F（ab’）2）が、該慢性的衰弱性疾患における新しい形態の治療的介入を与えるかもしれないというコンセプトを支持している。
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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