(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１文字のアミノ酸コードにしたがって、一般式（Ｉ）：
ＦeＧfＩＰＺＺＰＶＨＬＫＲ（ＸaＢ）（ＸbＢ）n（ＸcＢ）mＸdＧＡＬＬＭＧＬ   (I)
［式中、
Ｘは、Ｉ，Ｌ，Ｎｌｅ（ノルロイシン）からなる群から選ばれるアミノ酸であり；
Ｂは、Ｋ，Ｗ，Ｆ，Ｙ，オルニチンからなる群から選ばれるアミノ酸であり；
Ｚは、Ｓであり、かつ、炭素原子１２−２２個を含有するアシル基とエステルもしくはチオ−エステル結合を介して結合されていてもよいアミノ酸であり、
ａは、１〜１９からの整数であり；
ｂは、１〜１９からの整数であり；
ｃは、１〜２１からの整数であり；
ｄは、０〜２０からの整数であり；
ｅは、０もしくは１であり；
ｆは、０もしくは１であり；
ｎは、０もしくは１であり；
ｍは、０もしくは１であるが、
ただし、
ｎ＋ｍ＞０；
ｆ≧ｅ；かつ、
（ＸaＢ）（ＸbＢ）n（ＸcＢ）mＸdは、最大アミノ酸２２個をもつ配列であることを条件とする］
で示されるＳＰ−Ｃ類似体。
【請求項２】
（ＸaＢ）（ＸbＢ）n（ＸcＢ）mＸdがアミノ酸１０〜２２個をもつ配列であることを条件とする、請求項１記載のＳＰ−Ｃ類似体。
【請求項３】
式（Ｉａ）：
(Ia) ＦＧＩＰＳＳＰＶＨＬＫＲＸ4ＢＸ4ＢＸ4ＢＸＧＡＬＬＭＧＬ
で示される、請求項１記載のＳＰ−Ｃ類似体。
【請求項４】
式（Ｉｂ）：
(Ib) ＦＧＩＰＳＳＰＶＨＬＫＲＸ5ＢＸ5ＢＸ4ＧＡＬＬＭＧＬ
で示される、請求項１記載のＳＰ−Ｃ類似体。
【請求項５】
式（Ｉｃ）：
(Ic) ＦＧＩＰＳＳＰＶＨＬＫＲＸ4ＢＸ11ＧＡＬＬＭＧＬ
で示される、請求項１記載のＳＰ−Ｃ類似体。
【請求項６】
式（Ｉｄ）：
(Id) ＦＧＩＰＳＳＰＶＨＬＫＲＸ8ＢＸ7ＧＡＬＬＭＧＬ
で示される、請求項１記載のＳＰ−Ｃ類似体。
【請求項７】
式（Ｉｅ）：
(Ie) ＦＧＩＰＳＳＰＶＨＬＫＲＸ11ＢＸ4ＧＡＬＬＭＧＬ
で示される、請求項１記載のＳＰ−Ｃ類似体。
【請求項８】
Ｓｅｒ残基が、パルミトイル基によりアシル化されている、請求項１−７のいずれかに記載のＳＰ−Ｃ類似体。
【請求項９】
Ｂがリジンもしくはフェニルアラニンであり、そしてＸがロイシン、イソロイシンもしくはノルロイシンである、請求項１−８のいずれかに記載のＳＰ−Ｃ類似体。
【請求項１０】
【表１】
0004754073.tif 000010
からなる群から選ばれる、請求項９記載のＳＰ−Ｃ類似体。
【請求項１１】
脂質およびリン脂質との混合物の状態で請求項１−１０のいずれかに記載の少なくとも１種のＳＰ−Ｃ類似体を含んでなる合成サーファクタント。
【請求項１２】
脂質／リン脂質が、ＤＰＰＣ、ＰＧ、ＰＡを含有する、請求項１１記載の合成サーファクタント。
【請求項１３】
ＳＰ−Ｂもしくはその活性誘導体またはポリミキシンを、さらに含有する、請求項１１または１２記載の合成サーファクタント。
【請求項１４】
溶液、分散液、懸濁液、乾燥粉末の形態にある、請求項１１−１３のいずれかに記載の合成サーファクタント。
【請求項１５】
呼吸困難症候群において使用される合成サーファクタントの調製のための、請求項１−１０のいずれかに記載のＳＰ−Ｃ類似体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、表面活性をもつ新規な人工ペプチドを提供する。特に、本発明は、適当な脂質と組み合わされた場合、気−液界面における表面張力を低下させるのに特に効果的であるＳＰ−Ｃ類似体を提供する。
【０００２】
かくして、本発明のペプチドは、呼吸困難症候群（ＲＤＳ）、他のサーファクタント（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）欠乏症もしくは機能障害、関連する肺性疾患、例えば肺炎、気管支炎、喘息、胎便性呼吸症候群、そしてまた他の疾患、例えば漿液性中耳炎（グルーイアー（ｇｌｕｅ  ｅａｒ））の治療において有用な人工のサーファクタントを製造するために、脂質との組み合わせにおいて、そして場合によっては、ＳＰ−Ｂもしくはその活性類似体もしくはＳＰ−Ｂ代替物との組み合わせにおいて使用されてもよい。
【０００３】
発明の背景
肺胞表面上のサーファクタントは、肺胞内層の気−液界面における表面張力を低下して、末端呼気における虚脱から肺を防御する。サーファクタント欠乏症は、早産児では普通の障害であり、そして呼吸困難症候群（ＲＤＳ）を惹起するが、これは動物の肺から抽出される天然のサーファクタントにより効果的に治療することができる（Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ  Ｂ．（１９９２）Ｉｎ：Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｂ．，ｖａｎ  Ｇｏｌｄｅ，Ｌ．Ｍ．Ｇ．ａｎｄ  Ｂａｔｅｎｂｕｒｇ，Ｂ．（ｅｄｓ）Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ：Ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ｐｐ．５６１−５９２）。これらのサーファクタント調製物の主成分は、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）のようなリン脂質、および疎水性のサーファクタントタンパク質ＢおよびＣ（ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃ）である。Ｃ型（Ｃａ2+依存性）膠質性レシチンであり、そして宿主防御系において最初に作用すると考えられる親水性のサーファクタントタンパク質ＳＰ−ＡおよびＳＰ−Ｄは、使用される有機溶媒抽出操作のためにサーファクタント調製物中には通常は含まれない。
【０００４】
ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃは、サーファクタント量の約１−２％を構成するだけであるが、純粋な脂質調製物に比べて、なお、表面活性における劇的な改善を果たすことができる（Ｃｕｒｓｔｅｄｔ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６８，２５５−２６２；Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ａ．，Ｎｅｍｏｔｏ，Ｔ．ａｎｄ  Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｔ．（１９９４）Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ．Ｊａｐ．３６，６１３−６１８）。溶液におけるＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃの１次および２次構造ならびにＳＰ−Ｃの３次構造は、既に決定されている（４参照）。ＳＰ−Ｂは、鎖間ジスルフィド架橋により結合されたアミノ酸７９個の２つの同一ポリペプチド鎖からなる（Ｃｕｒｓｔｅｄｔ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，２９８５−２９８９；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｊ．，Ｃｕｒｓｔｅｄｔ，Ｔ．ａｎｄ  Ｊｏｅｒｎｖａｌｌ，Ｈ．（１９９１）Ｂｉｏｌｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０，６９１７−６９２１）。各モノマー鎖は、３個の鎖内ジスルフィド架橋、そして１つの極性と１つの非極性面を示す少なくとも４個の両親媒性ヘリックスをもち、これらをとおして、ＳＰ−Ｂは、２つの脂質二重層と相互作用し、そしてそれらを密接に接近させることができる（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６２，３２８−３３２）。ＳＰ−Ｃは、残基９−３４間にα−ヘリックスドメインをもつ３５個のアミノ酸残基からなるリポタンパク質である（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，６０１５−６０２３）。ヘリックスは、ほとんど、バリル残基からなり、そして脂質二重層中に埋没され、そして脂質アシル鎖と平行に配向されている（Ｖａｎｄｅｎｂｕｓｓｃｈｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０３，２０１−２０９）。２つのパルミトイル基は、ペプチドのＮ末端部分の位置５と６におけるシステイン残基に共有結合されている（Ｃｕｒｓｔｅｄｔ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，２９８５−２９８９）。位置１１と１２における２つの保存された正荷電の残基、アルギニンおよびリジンは、脂質膜の負荷電の頭部の基と多分相互作用して、その強固さを増強する。脂質−ペプチド相互作用の強固さは、Ｃ末端が小さいかまたは疎水性残基のみを含有するので、それに向かって減少し、この部分を、リン脂質二重層において潜在的に一層動きやすくしている。ＳＰ−Ｃは、極端に安定なポリ・バリルヘリックスを介して周囲の脂質の濃厚さと流動性に影響すると考えられる（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｕｒｓｔｅｄｔ，Ｔ．（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４，６７５−６９３）。
【０００５】
当該技術の状態
動物組織から得られたサーファクタント調製物は、それらの限られた量における利用性、ならびにそれらが感染性因子を含有し、そして免疫反応を誘起する可能性等の、一定の短所を示すので、通常は、合成脂質および疎水性タンパク質から人工のサーファクタントを創造する試みがなされている（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｕｒｓｔｅｄｔ，Ｔ．（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４，６７５−６９３；Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．（１９９６）Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ．８５，６４２−６４６）。
【０００６】
従来の研究では、合成ＳＰ−Ｃは、自然のペプチドを最適な表面活性について必要なα−ヘリックスコンホメーションのようには折り畳まず（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ．ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０７，５３５−５４１）、したがってサーファクタント脂質と適切に相互作用しないことが例証された。
【０００７】
結論として、合成ＳＰ−Ｃ類似体は、自然のペプチドのように折り畳まれず、そしてサーファクタント脂質と適切に相互作用しない。この問題を回避するために、いくつかの試みが行われ、例えば、α−ヘリックスコンホメーションを強く支持するＬｅｕにより自然のＳＰ−Ｃ中のすべてのヘリックスのＶａｌ残基を置換することによって配列を改変した。対応する膜貫通性類似体、ＳＰ−Ｃ（Ｌｅｕ）は、ＤＰＰＣ：ＰＧ：ＰＡ（６８：２２：９）（ｗ／ｗ／ｗ）と組み合わされた場合、気−液界面において良好な拡散を示した。しかしながら、周期的な（ｃｙｃｌｉｃ）表面圧縮の間の最大表面張力の値（γmax）は、自然のサーファクタントのそれよりも有意に高かった。さらにまた、多分ペプチドオリゴマーの形成によって、約２０ｍｇ／ｍｌより高い濃度の脂質−ペプチド混合液を調製することは不可能であった（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５，１１６−１２４）。他の研究者は、生物活性のある種々の長さのポリロイシンＳＰ−Ｃ類似体を合成した（Ｔａｋｅｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９，１５５０−１５５５）。後者の研究では、自己オリゴマー化も、または高い脂質濃度のサンプルを作成する際の問題も、いずれも報告されなかった。
【０００８】
種々の出版物は、天然のサーファクタントペプチドのペプチド性類似体を提供する問題を取り扱い、多数の異なる回答を出している。これらの刊行物の中で、Ｔｏｋｙｏ  Ｔａｎａｂｅの名におけるＷＯ９３  ２１２２５、ＥＰ７３３  ６４５、ＷＯ９６  １７８７２は、天然のＳＰ−Ｃのペプチド類似体を開示しており、これは、一般にはＮ末端部分の配列に関して自然のペプチドとは異なる。
Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの特許出願ＷＯ８９  ０６６５７およびＷＯ９２  ２２３１５は、交互に並んでいる疎水性および親水性アミノ酸残基をもつＳＰ−Ｂ類似体を開示している。他のものでは、ロイシンおよびリジン残基が交互に並んでいるペプチド（ＫＬ4）が特許請求されている。
【０００９】
Ｃｌｅｒｃｘ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２２９，４６５−７２，１９９５は、ブタのＳＰ−ＣのＮ末端に対応する種々の長さのペプチド、およびブタのＳＰ−Ｃとバクテリオロドプシンから得られたハイブリッドペプチドを開示している。
【００１０】
Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３０７，５３５；４１，１９９５は、いくつかのアミノ酸の置換による自然のブタＳＰ−Ｃとは異なる合成ペプチドを開示している。
【００１１】
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｂｙｋ  Ｇｕｌｄｅｎの名におけるＷＯ８９／０４３２６、およびＣａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−Ｓｃｉｏｓ  Ｎｏｖａの名におけるＷＯ９１／１８０１５は、天然のＳＰ−Ｃの２つのＣｙｓが２つのＳｅｒによって置換されている、最初のＮ末端配列を含有するＳＰ−Ｃ類似体を開示している。
【００１２】
発明の記述
次の特徴：ｉ）他の中性および疎水性残基によるＶａｌ残基の置換；ｉｉ）Ｓｅｒ残基によるＣｙｓ残基の置換；ｉｉｉ）嵩高いまたは極性の残基による幾つかの中性アミノ酸残基の置換：を合わせもつＳＰ−Ｃ類似体ペプチドは、表面張力低下のために特に好ましい性質を示すことが、ここに見い出された。特に、後者の特徴は、極性残基によって与えられた正電荷か、または嵩高い置換基によって与えられた立体障害の力で、自己オリゴマー化を回避させることが見い出された。
【００１３】
次の示すように、第１の態様によれば、本発明は、１文字のアミノ酸コードを用いて、次の一般式（Ｉ）：
FeGfIPZZPVHLKR(XaB)n(XbB)n(XcB)mXdGALLMGL      (I)
［式中、
Ｘは、Ｖ，Ｉ，Ｌ，Ｎｌｅ（ノルロイシン）からなる群から選ばれるアミノ酸であり；
Ｂは、オルニチン、Ｋ，Ｉ，Ｗ，Ｆ，Ｙ，Ｑ，Ｎからなる群から選ばれるアミノ酸であり；
Ｚは、ＳｅｒもしくはＣｙｓ残基が、結合された炭素原子１２−２２個を含有するアシル基と、エステルもしくはチオ−エステル結合を介して場合によっては、結合されていてもよいＳ，Ｃ，Ｆからなる群から選ばれるアミノ酸であり；
ａは、１〜１９からの整数であり、
ｂは、１〜１９からの整数であり、
ｃは、１〜２１からの整数であり、
ｄは、０〜２０からの整数であり、
ｅは、０もしくは１であり、
ｆは、０もしくは１であり、
ｎは、０もしくは１であり、
ｍは、０もしくは１であるが、
条件：
−  ｎ＋Ｍ＞０、
−  ｆ≧ｅ；
−  （ＸaＢ）n（ＸbＢ）n（ＸcＢ）mＸdは、最大アミノ酸２２個、好ましくは１０〜２２個をもつ配列であることを前提とする］
で示されるＳＰ−Ｃ類似体を提供する。
【００１４】
好適な式（Ｉ）のペプチドは、次の配列：
(Ia) ＦＧＩＰＳＳＰＶＨＬＫＲＸ4ＢＸ4ＢＸ4ＢＸＧＡＬＬＭＧＬ
(Ib) ＦＧＩＰＳＳＰＶＨＬＫＲＸ5ＢＸ5ＢＸ4ＧＡＬＬＭＧＬ
(Ic) ＦＧＩＰＳＳＰＶＨＬＫＲＸ4ＢＸ11ＧＡＬＬＭＧＬ
(Id) ＦＧＩＰＳＳＰＶＨＬＫＲＸ8ＢＸ7ＧＡＬＬＭＧＬ
(Ie) ＦＧＩＰＳＳＰＶＨＬＫＲＸ11ＢＸ4ＧＡＬＬＭＧＬ
をもつ。
【００１５】
配列（Ｉａ）−（Ｉｅ）において、Ｂ＝ＬｙｓもしくはＰｈｅおよびＸ＝Ｌｅｕ，ＩｌｅもしくはＮｌｅをもつ配列が好適である。
【００１６】
好適な実施態様によれば、式（Ｉａ）−（Ｉｆ）のペプチドは、それぞれ、次の配列：
【００１７】
【表２】
0004754073.tif 000002
【００１８】
をもつ。
【００１９】
本発明のより好適な実施態様では、Ｓｅｒ残基は、炭素原子１２−２２個を含有するアシル基と共有結合されている。
【００２０】
式（Ｉ）のペプチドは、合成法もしくは組み換え技術によって製造することができる。
【００２１】
慣用の合成法は、例えば、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，ｖｏｌ．１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９６５；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，１９９６；Ｂａｒａｍｙ  ＆  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，”Ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ；Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ”，ｖｏｌ．２，ｃｈａｐｔｅｒ  １，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８０において記述されている。該技術は、固相、溶液におけるペプチド合成、有機化学合成法またはそれらのすべての組み合わせを含む。
【００２２】
Ｓ−もしくはＯ−アシル化ペプチドは、好ましくは、Ｙｏｕｓｅｆｉ−Ｓａｌａｋｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９９，３４３，５５７−５６２に記述されるように、ニートのトリフルオロ酢酸中で塩化アシルによるアシル化されてないペプチドの処理によって合成される。合成および精製後、合成ペプチドは、次の「実施例」の節において報告されるように、生物化学的および生物物理学的に特徴付けられる。
【００２３】
表面張力を低下させることにおいて、本発明のペプチドの活性は、脂質およびリン脂質、ＳＰ−Ｂ、ＳＰ−Ｂの類似体もしくはＳＰ−Ｂの代替物との組み合わせにおいて評価された。特に、ペプチドは、ＳＰ−Ｂ、その活性類似体およびポリミキシンの有無において、ＤＰＰＣ（１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）／ＰＧ（ホスファチジルグリセロール）／ＰＡ（パルミチン酸）と組み合わせられた。
【００２４】
脈動性（ｐｕｌｓａｔｉｎｇ）−気泡表面活性試験の結果は、本発明による合成ペプチドが、周期的な表面圧縮の間の最小および最大表面張力（γminおよびγmax）を、天然起源からのサーファクタントを用いて得られるものに匹敵する値まで強力に減少することを、明らかに示す。
【００２５】
混合物ペプチド／脂質−リン脂質へのＳＰ−Ｂもしくはその活性類似体の添加は、特に好ましい結果を与えた。さらにまた、驚くべきことに、ポリミキシン、特にポリミキシンＢは、ＳＰ−Ｂの代替物として働き、そしてそれらの添加は、ＳＰ−Ｂにより達成されるものに匹敵する結果を与えることが見い出された。
【００２６】
第２の態様によれば、本発明は、脂質および／またはリン脂質、そして場合によってはＳＰ−Ｂ、その活性誘導体もしくはポリミキシンとが添加された状態で、１種以上の式（Ｉ）のペプチドを含んでなる合成サーファクタントを提供する。適当な脂質／リン脂質は、ホスファチジルコリン（好ましくはＤＰＰＣ）、ＰＧ，ＰＡ，トリアシルグリセロール、スフィンゴミエリンからなる群から選ばれてもよい。
【００２７】
本発明のさらに、より好適な実施態様では、パルミトイル鎖がＳｅｒ残基にＯ−共有結合されているペプチドを含有するサーファクタント混合物が使用されるべきである。参照ペプチド（ＳＰ−Ｃ（Ｌｅｕ））のジパルミトイル化された形態を含有するサーファクタント混合物は、捕らわれた（ｃａｐｔｉｖｅ）気泡系によって測定されるように、対応する非パルミトイル化ペプチドを含有する混合物に比較して、より高い表面膜の安定性と表面に関わる脂質リザーバー（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）の増大されたサイズを示すことが分かった。ジパルミトイル化ペプチドの５％を含有するサンプルでは、γｍｉｎは、１．５ｍＮ／ｍ以下であり、そして表面張力が一定の気泡容積において１０分以内に０．５ｍＮ／ｍ未満増強されたように、膜は非常に安定であった。これに対して、非パルミトイル化ペプチドに関するγｍｉｎは、ほぼ５ｍＮ／ｍであり、そして低い表面張力においてしばしば起きる起泡のクリッキング（ｃｌｉｃｋｉｎｇ）によって観察されるように、膜は、より低い安定性であった。さらに、非パルミトイル化ペプチドを含有するサンプルについてのサブフェイス・デプレッション（ｓｕｂｐｈａｓｅ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）後、ゼロ安定表面張力近くに達する能力は、わずかな吸着段階後に失われたが、これに対して、ジパルミトイル化ペプチドによっては、膜の品質は、１０膨張段階後でさえも劣化せず、そしてリザーバー材料の組み入れは、２つ以上の単層と同等であった。また、ジパルミトイル化ペプチドの改良された表面活性は、振動性気泡サーファクトメーター（ｓｕｒｆａｃｔｏｍｅｔｅｒ）によって例証された。さらに、アシル基の存在は、オリゴマーを形成する傾向をさらに低下させることが分かった。人工のサーファクタントの製造中、ペプチドのオリゴマー化が、２０ｍｇ／ｍｌより高い濃度における混合物の調製を妨げることが分かっているので、この発見は非常に重要である（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９８，２５５，１１６−１２４）。
【００２８】
合成のサーファクタントは、ペプチドおよび脂質の溶液もしくは懸濁液を混合することによって、そして混合物を続いて乾燥することによって調製できる。
【００２９】
この事象では、乾燥混合物は、サーファクタント欠乏症のための処置を必要とする被験者に対して、懸濁、分散されるか、またはそのままで投与されてもよい。
【００３０】
合成サーファクタントは、好ましくは、気管内に、またはエアゾルにより投与できる。後者の投与形態は、適当な不活性噴射剤とサーファクタントの小粒子の組み合わせを必要とするであろう。また、サーファクタントの安定な液剤／懸濁剤の噴霧化もしくはスプレーのような他の投与形態も、本発明の範囲内に含まれる。
【００３１】
さらなる態様によれば、本発明は、成人もしくは新生児期のサーファクタント欠乏症もしくは機能障害に関連する肺性疾患、例えば肺炎、気管支炎、喘息、胎便吸引症候群のあらゆる症例、そしてまた他の疾患、例えば漿液性中耳炎（グルーイアー）において使用されるサーファクタント剤の製造のための前記ペプチドの使用を提供する。
【００３２】
典型的には、サーファクタント剤は、しばしば早産児を冒す呼吸困難症候群の治療において、好ましくは、気管内投与により使用できる。
【００３３】
次の実施例は、より詳細に本発明を説明する。
【００３４】
実施例１
ペプチド合成および精製
ＳＰ−Ｃ、ＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）の類似体（図１）は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３０Ａ装置において、段階的固相技術およびｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル化学の使用によって合成された（Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．（１９８８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７，９５７−９８９）。樹脂−ペプチド結合の切断および側鎖の保護は、０℃で１．５時間、無水フッ化水素／メトキシベンゼン／ジメチルスルフィド、１０：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）中で実施された。保護基およびスカベンジャーが、ジエチルエーテルによる反復抽出によって除去され、そしてペプチドが、ジクロロメタン／トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）３：１（ｖ／ｖ）によって樹脂から続いて抽出され、その後ロータリーエバポレーターで処理された。粗ペプチド抽出物は、５％Ｈ2Ｏを含有するクロロホルム／メタノール１：１（ｖ／ｖ）中に濃度１００ｍｇ／ｍｌにおいて再溶解された。一定分量の１０ｍｇが、同じ溶媒においてＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−６０カラム（４０ｘ１ｃｍ）に適用された（Ｃｕｒｓｔｅｄｔ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６８，２５５−２６２）。画分２．５ｍｌが収集され、そして２１４および２８０ｎｍにおける吸光度が測定された。同定および定量はアミノ酸分析における遂行された。
【００３５】
アシル化では、精製ペプチド（典型的には約５ｍｇ）が乾燥され、蒸留ＴＦＡ（１００μｌ）中に溶解され、そして塩化アシル（ペプチドに比べて１０−２０当量）が添加された。１０分後、反応が８０％エタノール水溶液（１．９ｍｌ）を用いて停止される。アシルペプチドの精製は、塩化エチレン／メタノール１：４（ｖ／ｖ）中でＬｉｐｉｄｅｘ５０００におけるクロマトグラフィーの使用と、続く、６０％（水性）メタノール／０．１％ＴＦＡまたは７５％（水性）エタノール／０．１％ＴＦＡ中に流入する２−プロパノール／０．１％ＴＦＡの直線濃度勾配を用いてＣ１８カラム上での逆相ＨＰＬＣによって行われる。
【００３６】
実施例２
生物学的特徴付け
ペプチドの純度は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）（Ｐｈａｓｔ−ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって、そしてＣ１８カラムおよび６０％メタノール水溶液／０．１％ＴＦＡおよびイソプロパノール／０．１％ＴＦＡの直線勾配を用いる逆相高速度液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってチェックされた（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３２６，７９９−８０６）。
【００３７】
分子質量は、マトリックス−アシステッド（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ）レーザー  デソープション  イオニゼーション−タイム−オブ−フライト（ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析（Ｌａｓｅｒｍａｔ  ２０００，Ｆｉｎｎｉｇａｎ  ＭＡＴ）によって、血管作動性腸ペプチド（Ｍｒ  ３３２６．８）により校正されて決定された。
【００３８】
ペプチドの２次構造は、円二色性（ＣＤ）分光法（Ｊａｓｃｏ−７２０  Ｊａｓｃｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて研究された。トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）を用いて溶解後、スペクトルが、スキャン速度２０ｎｍ／ｍｉｎおよび解像度２データポイント／ｎｍを用いて２６０から１８４ｎｍまで記録された。残余モルエリプティーシー（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｍｏｌａｒ  ｅｌｌｉｐｔｉｃｙ）が計算され、そしてｋｄｅｇ  ｘ  ｃｍ2／ｄｍｏｌにおいて表された。２０８および２２２ｎｍにおけるモルエリプティシティー（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｔｉｅｓ）は、ヘリックス構造の含量を評価するために利用された（Ｂａｒｒｏｗ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２５，１０７５−１０９３）。
【００３９】
ＣＤ分光法を用いるＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）の２次構造研究は、α−ヘリックスのペプチドについて典型的なスペクトルを示し、そしてα−ヘリックス含量約７５％が、２０８ｎｍおよび２２２ｎｍ最小値から概算された。もしペプチドが純ＴＦＥ中に可溶化されるならば、２次構造は、１２％ＴＦＥまでのＨ2Ｏによる段階的希釈後には安定のまま留まった。
【００４０】
ＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ヘリックス部分においてＬｙｓを欠くＳＰ−Ｃ（Ｌｅｕ）がオリゴマーを形成するのに対して、自然のＳＰ−Ｃに類似する単一バンドを示した。２０ｍｇ／ｍｌより高い濃度において可溶化するのが困難であるＳＰ−Ｃ（Ｌｅｕ）／脂質混合物による本発明者らの経験（Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５，１１６−１２４）に反して、脂質濃度８０ｍｇ／ｍｌおよびポリペプチド／脂質比０．０３をもつＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）／脂質混合物を作成することが可能であった。
【００４１】
実施例３
ペプチド／脂質混合物の調製
ＤＰＰＣ、ＰＧおよびＰＡは、すべてＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入された。クロロホルム／メタノール９８：２（ｖ／ｖ）に溶解された脂質は、比率ＤＰＰＣ：ＰＧ：ＰＡ６８：２２：９（ｗ／ｗ／ｗ）またはＤＰＰＣ／ＰＧ７：３（ｗ／ｗ）において混合された。サーファクタント調製物は、全ポリペプチド／脂質重量比０−０．０５において、各脂質混合物に対して、ＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）単独またはＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）とＳＰ−Ｂを添加することによって調製された。混合物は、窒素下で蒸発され、そしてＮａＣｌ  １５０ｍｍｏｌ／ｌ中、またはＮａＣｌ  １４０ｍｍｏｌ／ｌとＣａＣｌ2２．０ｍｍｏｌ／ｌを含有するＨｅｐｅｓバッファーｐＨ６．９  １０ｍｍｏｌ／ｌ中に、脂質濃度１０−８０ｍｇ／ｍｌにおいて再懸濁された。繰り返される凍結および音波処理（５０Ｗ，４８ｋＨｚ）が、均質懸濁液が得られるまで実施された。若干の場合には、最終懸濁液は、４５℃で１次間インキュベートされた。
【００４２】
ＮａＣｌ  １５０ｍｍｏｌ／ｌ中に懸濁されたサーファクタント調製物は、ｐＨ３．５−５．５を有した。より低いｐＨ値３．５−４．５は、ＳＰ−Ｂを含有する調製物において観察された。自然のＳＰ−Ｂは、酸性化された有機溶媒を用いて精製されるので（Ｃｕｒｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６８，２５５−２６２）、少量の酸が調製物中に残っていてもよい。近似の生理学的ｐＨは、ＮａＣｌ  １４０ｍｍｏｌ／ｌとＣａＣｌ2  ２ｍｍｏｌ／ｌを含有するＨｅｐｅｓバッファーｐＨ６．９中にサーファクタント調製物を懸濁することによって得られた（表１）。緩衝化されてない生理食塩水中の対応する調製物に比較して、ＤＰＰＣ／ＰＧ７：３（ｗ／ｗ）が脂質混合物として使用された場合は、γmaxもしくはγminの変化はなかった。しかしながら、ＰＡが脂質混合物中に含まれた場合は、両γmaxおよびγminは、より高いｐＨにおいて増加した（表１および２）。
【００４３】
表１：生理学的食塩溶液における人工サーファクタントの調製物の表面の性質
測定は、サンプルの調製後または４５℃で１時間インキュベーション後、直接実施された。リン脂質濃度は、ＮａＣｌ  １５０ｍｍｏｌ／ｌ中１０ｍｇ／ｍｌであった。記録は、３７℃における振動性気泡サーファクトメーターにより種々の時間、５０％表面圧縮において、そして速度４０サイクル／ｍｉｎにおいて得られた。値は、３−５測定値の平均値（標準偏差）であった。略記は本文において定義された。
【００４４】
【表３】
0004754073.tif 000003
【００４５】
表２：バッファー塩溶液における人工サーファクタントの調製物の表面の性質
測定は、順に、ＮａＣｌ  １４０ｍｍｏｌ／ｌおよびＣａＣｌ2  ２．０ｍｍｏｌ／ｌを含有するＨｅｐｅｓバッファー（ｐＨ６．９）中、濃度１０ｍｇ／ｍｌにおいてリン脂質を含有するサンプルにおいて実施された。記録は、３７℃における振動性気泡サーファクトメーターにより種々の時間、５０％表面圧縮において、そして速度４０サイクル／ｍｉｎにおいて得られた。値は、３−５測定値の平均値（標準偏差）であった。略記は本文において定義された。
【００４６】
【表４】
0004754073.tif 000004
【００４７】
実施例４
ＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）およびポリミキシンＢを含むリン脂質混合物の調製
ＤＰＰＣおよびＰＧは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入された。クロロホルム／メタノール９８：２（ｖ／ｖ）に溶解されたリン脂質は、比率ＤＰＰＣ：ＰＧ７：３（ｗ／ｗ）において混合された。ＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）は、全ポリペプチド／リン脂質重量比０．０３において、リン脂質混合物に添加された。混合物は、窒素下で蒸発され、そしてＮａＣｌ  １４０ｍｍｏｌ／ｌおよびＣａＣｌ2２．０ｍｍｏｌ／ｌを含有するＨｅｐｅｓバッファーｐＨ６．９  １０ｍｍｏｌ／ｌ中に、またはポリミキシンＢ（ＰｘＢ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する同じバッファー中に、室温において再懸濁された。繰り返される凍結および音波処理（５０Ｗ，４８ｋＨｚ）が、均質懸濁液が得られるまで実施された。両調製物の最終リン脂質濃度は、１０ｍｇ／ｍｌであった。ＰｘＢの添加は両γmaxおよびγminを減少し、そして最適表面活性が得られた（表３）。
【００４８】
表３：ポリミキシンＢの有無における人工サーファクタントの表面の性質
記録は、３７℃における振動気泡サーファクトメーターにより種々の時間および速度４０サイクル／ｍｉｎにおける５０％表面圧縮において得られた。値は、５−１１測定値の平均値（ＳＤ）である。略記は本文において定義されている。
【００４９】
【表５】
0004754073.tif 000005
【００５０】
実施例５
生物物理学的特徴付け
表面拡散速度論が、Ｗｉｌｌｈｅｌｍｙ表面圧計（Ｂｉｅｇｌｅｒ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて約３４−３７℃において測定された。表面張力は、ひずみ計に接続され、そしてテフロン水槽中のＮａＣｌ  １５０ｍｍｏｌ／ｌの２０ｍｌの水相に１ｍｍ挿入された白金板を用いて１０分間モニターされた。懸濁液が、全量では脂質１ｍｇを小滴として、白金板から４ｃｍの水相上に添加された。
【００５１】
Ｗｉｌｌｈｅｌｍｙ表面圧計を用いて、ＤＰＰＣ／ＰＧ７：３（ｗ／ｗ）における３重量％ＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）の速度論的測定は、３秒後に表面張力２８ｍＮ／ｍをもつ急速な拡散を示した（図２）。拡散は、同じ脂質混合物における１重量％ＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）を用いると若干遅かった（データ未提示）。２重量％ＳＰ−Ｂの添加は、拡散速度または平衡表面張力を有意には変化させなかった（図２）。４５℃で１時間の混合物のインキュベーション後に、改善は観察されなかった（データ未提示）。同じような結果が、脂質混合物としてＤＰＰＣ：ＰＧ：ＰＡ，６８：２２：９（ｗ／ｗ／ｗ）を用いて得られた（データ未提示）。
【００５２】
動的表面張力は、脈動性起泡サーファクトメーター（Ｓｕｒｆａｃｔｏｍｅｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、起泡表面の５０％周期的圧縮の間３７℃において、そして頻度４０サイクル／ｍｉｎにおいて記録された。全測定は、５分間、脂質濃度１０ｍｇ／ｍｌにおいて行われた。起泡壁を横切る圧力勾配（ｇｒａｄｉｅｎｓ）が、一定の時間間隔で測定され、そして最小（γmin）および最大（γmax）起泡サイズにおける表面張力を算出するために使用された。
【００５３】
脈動性起泡サーファクトメーターにおいて、ＤＰＰＣ：ＰＧ：ＰＡ，６８：２２：９（ｗ／ｗ／ｗ）における３重量％ＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）は、最小起泡半径において、１ｍＮ／ｍ未満の表面張力（γmin）を生じたが、一方、γmin９−１４ｍＮ／ｍが、ＤＰＰＣ／ＰＧ，７：３（ｗ／ｗ）における３重量％ＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）を用いて観察された（表１）。最大起泡半径における表面張力（γmax）は、両場合において約４０ｍＮ／ｍであった。２重量％ＳＰ−Ｂの添加は、両脂質調製物についてγmax値３１−３３ｍＮ／ｍおよびγmin０−２ｍＮ／ｍを与えた。これらの値は、天然起源から単離されたサーファクタント調製物により得られた値に非常に類似している（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｇ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．２５，２３７−２４６）。４５℃で１時間の調製物のインキュベーションは、表面活性には有意な影響をもたなかった（表１）。ＳＰ−Ｂ量を、ＤＰＰＣ／ＰＧ，７：３（ｗ／ｗ）における３重量％ＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）において０．５重量％まで減少することは、γminを増大する傾向を示したが、その結果は、統計的な有意性には達しなかった（表１）。ＳＰ−Ｂとは対照的に、ＤＰＰＣ：ＰＧ：ＰＡ，６８：２２：９（ｗ／ｗ／ｗ）における３重量％ＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）に対して２重量％ＫＬ4（Ｃｏｃｈｒａｎｅ，Ｃ．Ｇ．ａｎｄ  Ｒｅｖａｋ，Ｓ．Ｄ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，５６６−５６８）の添加は、γmaxを低下せず、これは比較的高く４１−４２ｍＮ／ｍに留まっていた。
【００５４】
実施例６
ジパルミトイル化および非パルミトイル化参照ペプチドを含有する混合物間の比較
ＤＰＰＣ／ＰＧ／ＰＡ  ６８：２２：９  ｗ／ｗ／ｗから作られた各脂質混合物に対して、３％ｗ／ｗＳＰ−Ｃ（Ｌｅｕ）もしくはジパルミトイル化ＳＰ−Ｃ（Ｌｅｕ）を添加することによって作成された。混合物は、窒素下で蒸発され、そしてＮａＣｌ  １５０ｍｍｏｌ／ｌ中に脂質濃度１０ｍｇ／ｍｌにおいて再懸濁された。また、ＳＰ−Ｂ代替物が使用されたサンプルでは、ポリミキシンＢ１％ｗ／ｗが添加された。
【００５５】
ポリミキシンＢの有無においてジパルミトイル化ＳＰ−Ｃ（Ｌｅｕ）を含有する混合物は、５分におけるγmaxを、そしてより早期の時間間隔においてγminを低下することに、特に有意な改善を示した。
【００５６】
表４：表面の性質
混合物の表面張力は、脈動起泡サーファクトメーターを用いて得られた。平衡の２分後、記録は、種々の期間、３７℃で５０％表面圧縮において、そして速度４０サイクル／ｍｉｎにおいて得られた。
【００５７】
【表６】
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【００５８】
実施例７
イン・ビボでの測定
幼若な肺の機械的性質に及ぼすサーファクタント療法の効果が、妊娠２７日令の期前の新産ウサギ９匹において評価された。動物は、誕生時に気管切開され、そしてそれらの５匹は、前記比率においてポリミキシンＢの有無におけるＤＰＰＣ、ＰＧおよびＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）を含有する人工サーファクタント２．５ｍｌ／ｋｇ２回を気管カニューレを通して受けた。外因性サーファクタントの全リン脂質濃度は、４０ｍｇ／ｍｌであった。ネガティブ対照として使われた２匹の動物は、気管チューブによる物質を受けず、そしてポジティブ対照として使われた他の２匹は、４０ｍｇ／ｍｌに希釈された同用量の改変された天然サーファクタント（Ｃｕｒｏｓｕｒｆ，Ｃｈｉｅｓｉ  Ｆａｒｍａｃｅｕｔｉｃｉ  Ｓｐａ，Ｐａｒｍａ，Ｉｔａｌｙ）により処置された。１匹の動物は、用量２．５ｍｌ／ｋｇにおいて生理食塩水中ＤＰＰＣおよびＰＧの混合液（上記と同じ濃度）により処置された。全動物は、温度３０℃における肢体血量計ボックス中に維持され、そして頻度４０分および５０％吸気時間に設定されたＳｅｒｖｏ  Ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ  ９００Ｂ（Ｓｉｅｍｅｎｓ−Ｅｌｅｍａ，Ｓｏｌｎａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、１００％酸素により６０分間並行して換気された。呼吸量は、各血量計ボックスに接続された呼吸速度描写器（ｐｎｅｕｍｏｔａｃｈｙｇｒａｐｈ）により測定された。動物は、標準化された呼吸量８−１０ｍｌ／ｋｇにより、そしてポジティブな末端呼気圧（ＰＥＥＰ）なしで換気された。肺−胸郭屈従は、呼吸量とピークの吸気圧間の比として定義され、そしてｍｌ／ｃｍＨ2Ｏｋｇとして表された。
【００５９】
未処置の対照動物との比較において、コンプライアンス（ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）は、人工サーファクタントで処置された動物において、特にポリミキシンＢを含有するサーファクタントを受けている動物において有意に改善された。注目すべきことに、改善は、同用量の改変された天然のサーファクタントによる処置後に見られたものよりも優れていると思われる（図３）。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＳＰ−Ｃおよびその類似体のアミノ酸配列およびらせん回転表示
ヒトＳＰ−Ｃの配列は、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２３２，６１−６４から、そしてＳＰ−Ｃ（Ｌｅｕ）の配列は、Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５，１１６−１２４から採用した。ＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）は、ＳＰ−Ｃの１次構造に基づくが、位置１７を除く位置１６−２８のすべてのＶａｌ残基がＬｅｕ残基により置換され、Ｌｙｓ残基が、位置１７，２２および２７に導入されていて、そして位置５および６のパルミトイル化Ｃｙｓは、Ｓｅｒにより置換されている。
【図２】  合成サーファクタント調製物の表面の拡がり性
３重量％ＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）（黒い四角、実線）、および２重量％ＳＰ−Ｂの添加とともに３重量％ＳＰ−Ｃ（ＬＫＳ）（白い三角、点線）の拡散速度論。全調製物が、ＮａＣｌ  １５０ｍｍｏｌ／ｌ中ＤＰＰＣ／ＰＧ，７：３（ｗ／ｗ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度において試験された。記録は、Ｗｉｌｈｅｌｍｙバランスにより得られ、そして各データポイントは、３回の異なる記録の平均値である。
【図３】  イン・ビボの結果
早熟の新産ウサギ５匹（妊娠２７日令）における肺−胸郭コンプライアンスが、標準化された呼吸量８−１０ｍｌ／ｋｇにより、そしてポジティブな末端呼気圧（ＰＥＥＰ）なしで換気された。コンプライアンスは、処置された動物において有意に改善された。ポリミキシンＢ（ＰｘＢ）の添加は、人工サーファクタント調製物の効果を増強するように思われる。リン脂質の濃度は、すべてのサーファクタント調製物において同一、すなわち４０ｍｇ／ｍｌである。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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