(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるＬ鎖発現用ベクター、および、
配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるＨ鎖発現用ベクターを用いて動物由来細胞を形質転換する工程を含むことを特徴とするニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法。
【請求項２】
上記動物由来細胞が、ＣＨＯ細胞であることを特徴とする請求項１に記載のニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法。
【請求項３】
上記Ｌ鎖発現用ベクターおよび／またはＨ鎖発現用ベクターが精製用タグを有することを特徴とする請求項１または２に記載のニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法。
【請求項４】
配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子が挿入されてなり、ニワトリ型抗体のＬ鎖を発現させるために用いられるＬ鎖発現用ベクター、および、
配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子が挿入されてなり、ニワトリ型抗体のＨ鎖を発現させるために用いられるＨ鎖発現用ベクターからなる、ニワトリ型モノクローナル抗体生産用のベクターセット。
【請求項５】
上記Ｌ鎖発現用ベクターおよびＨ鎖発現用ベクターが精製用タグを有することを特徴とする請求項４に記載の、ニワトリ型モノクローナル抗体生産用のベクターセット。
【請求項６】
配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせであり、ニワトリ型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子を増幅するために用いられるＬ鎖用プライマーセット、および、
配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせであり、ニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子を増幅するために用いられるＨ鎖用プライマーセットからなる、ニワトリ型モノクローナル抗体生産用のプライマーセット。
【請求項７】
ニワトリ型モノクローナル抗体を生産するために用いられる、動物由来の形質転換細胞であって、以下の（ａ）または（ｂ）のＬ鎖発現用ベクターが導入され、かつ以下の（ｃ）または（ｄ）のＨ鎖発現用ベクターが導入されていることを特徴とする、動物由来の形質転換細胞。
(ａ)ニワトリ型抗体のＬ鎖を発現させるために用いられる発現用ベクターであって、
配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるＬ鎖発現用ベクター。
（ｂ）上記(ａ)に記載のＬ鎖発現用ベクターであって、精製用タグを有するベクター。
（ｃ）ニワトリ型抗体のＨ鎖を発現させるために用いられる発現用ベクターであって、
配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと、
配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるＨ鎖発現用ベクター。
（ｄ）上記（ｃ）に記載のＨ鎖発現用ベクターであって、精製用タグを有するベクター。
【請求項８】
上記動物由来の形質転換細胞がＣＨＯ細胞であることを特徴とする、請求項７に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニワトリ型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子およびＨ鎖をコードする遺伝子が導入された宿主細胞、特に動物細胞を用いたニワトリ型モノクローナル抗体を生産方法、および当該生産方法によって生産されるニワトリ型モノクローナル抗体に関するものである。
【０００２】
また上記生産方法に用いられるニワトリ型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子を増幅するために用いられるプライマーセット、および該遺伝子が挿入されニワトリ型抗体のＬ鎖を発現するために用いられる発現用ベクターに関する。さらには、上記生産方法に用いられるニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子を増幅するために用いられるプライマーセット、および該遺伝子が挿入されニワトリ型抗体のＨ鎖を発現するために用いられる発現用ベクター、該発現用ベクターが導入されてなる形質転換細胞に関する。
【背景技術】
【０００３】
モノクローナル抗体（単クローナル抗体）は、抗原の特定部分だけを認識する単一の抗体のことである。かかるモノクローナル抗体は、抗原に対する特異性が非常に高く、その特異性を利用してタンパク質工学をはじめとするバイオサイエンス研究のツール・特定物質の検出用試薬等広範に利用されている。特に近年においては、各種疾病の治療薬・診断薬としての用途が注目され、その一部が実用化に至っている。モノクローナル抗体およびその生産技術については、マウス型・ラット型・ヒト型をはじめとする哺乳類動物を中心に開発が進められているが、それ以外のモノクローナル抗体（鳥類型モノクローナル抗体）の開発、および生産を行なった例は少ない。
【０００４】
ところで、本発明者等は哺乳類動物型以外の抗体としてニワトリ型の抗体に着目し研究を行なってきた。ニワトリは系統発生学的には哺乳類動物よりも下等であるが、哺乳類動物と同様に精緻な免疫システムを備えている動物である。特に哺乳類動物と系統発生学的に離れているため、多くの哺乳類動物で保存されているタンパク質に対して特異的抗体を作成するのに有用である。すなわちマウスやラットを用いて作製が困難なタンパク質（抗原）に対する特異的抗体が、ニワトリでは作製可能であるということである。例えば、ヒトの癌マーカーとなる抗原であるＮ−グリコリルノイラミン酸（以下ＮｅｕＧｃと称する）は、ヒトを除くほとんどの哺乳類動物に存在しているため、マウス・ラット等では抗体を作製することはできないが、ニワトリをはじめとする鳥類ではＮｅｕＧｃが存在しないために抗体を作製することが可能である。また、クロイツフェルト・ヤコブ病や狂牛病の病原体となるプリオンタンパク質（以下ＰｒＰと称する）は、哺乳類動物間で９０％以上の相同性が有るため哺乳類動物では抗体を作製することは困難であるが、哺乳類動物とニワトリ間の相同性は３０％台であるため、ニワトリにおいてその抗体の作製は可能である。事実、本発明者等は、細胞融合法によって上記ＮｅｕＧｃ、ＰｒＰに対するニワトリ型モノクローナル抗体の作成に成功している。
【０００５】
現在ニワトリ型抗体、特にニワトリ型モノクローナル抗体の作製方法としては、細胞融合法（非特許文献１および非特許文献２参照）、およびファージディスプレイ法（非特許文献３、非特許文献４、および特許文献１参照）が既に確立されている。
【０００６】
またその他のニワトリ型抗体のメリットとしては、哺乳類動物型の抗体との交叉反応性が無いため、ニワトリ型モノクローナル抗体と哺乳類動物型モノクローナル抗体を用いることによって、非特異的反応のない高感度抗原検出系を確立することが可能なことである。
【非特許文献１】Asaoka, H. Nishinaka, S., Wakamiya, N., Matsuda, H., Murata, M., 1992. Two chicken monoclonal antibodies specific for heterophil Hanganutziu-Deicher antigens. Immunol. Lett. 32, 91-96.
【非特許文献２】Matsuda, H., Mitsuda, h., Nakamura, N., Furusawa, S., Mohri, S., Kitamoto, T., 1999. A chicken monoclonal antibody with specificity for the N-terminal of human prion protein . FEMS Imunol. Med. Microbiol. 23, 189-194
【非特許文献３】Yamanaka, H. I., Inoue, T., Lkeda-tanaka, O., 1996. Chicken monoclonal antibody isolated by a phage display system. J. Immunol. 157, 1156-1162.
【非特許文献４】Nakamura, N., Shimokawa, M., Miyamoto, K., Hojyo, S., Horiuchi, H., Furusawa, S., Matsuda, H.,2003. Two expression vectors for the phage-displayed chicken monoclonal antibody. J. Immunol. Methods 280, 157-164.
【特許文献１】特開２００３−９８６９号公報（公開日：平成１５（２００３）年１月１４日）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、上記細胞融合法によるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法は、その抗体生産能が低いこと、および生産された抗体の精製方法が確立されていないという問題点が有る。一方上記ファージディスプレイ法によるニワトリモノクローナル抗体の生産方法は、生産された抗体の構造が正常抗体と異なっているため、抗原との反応性が低いということ、および発現用ベクターの構造からファージディスプレイ抗体しか生産できないという問題点がある。したがって上記従来のニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法は、実用性の面において満足できるものとはなっていなかった。
【０００８】
またニワトリ型の抗体分子は哺乳類動物型ＩｇＧより分子量が大きく、これを有効利用するためには、不必要なアミノ酸領域を削除あるいは改変する必要がある。
【０００９】
そこで本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ニワトリ型モノクローナル抗体の効率的生産方法の確立、さらには不必要なアミノ酸領域を削除した構造改変ニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法の確立、および当該生産方法によって生産されたニワトリ型モノクローナル抗体、並びに当該生産方法に用いられる発現用ベクター、およびプライマーセットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意検討を行なった。その結果、抗ＰｒＰニワトリ型モノクローナル抗体（ＨＵＣ２−１３）産生ハイブリドーマからクローニングしたＨＵＣ２−１３のＬ鎖をコードする遺伝子、および同Ｈ鎖をコードする遺伝子をＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、当該ＣＨＯ細胞を培養することによって完全長の抗ＰｒＰニワトリ型モノクローナル抗体（以下Ｆｕｌｌ−ＰｒＰ抗体と称する）を大量生産することができることを発見した。
【００１１】
さらに本発明者等は、同様の方法によってＨ鎖のカルボキシル末端（Ｃ末端）側から７アミノ酸欠失させた構造改変抗ＰｒＰモノクローナル抗体（以下Δ７ａａ−ＰｒＰ抗体と称する）・ＣＨ２領域のシステイン残基を残して５５アミノ酸残基を欠失させた構造改変抗ＰｒＰモノクローナル抗体（以下ΔＣＨ２−ＰｒＰ抗体と称する）・ＣＨ３領域とＣＨ４領域をともに欠失させた構造改変抗ＰｒＰモノクローナル抗体（以下ΔＦｃ−ＰｒＰ抗体と称する）を生産することに成功した。また上記生産方法により生産したＦｕｌｌ−ＰｒＰ抗体・Δ７ａａ−ＰｒＰ抗体・ΔＣＨ２−ＰｒＰ抗体・ΔＦｃ−ＰｒＰ抗体は、いずれも抗原（ＰｒＰ）に対する確かな反応性を有していた。
【００１２】
本発明は、上記検討結果に基づき完成したものである。
【００１３】
すなわち本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法は、上記課題を解決するために、ニワトリ型抗体のＬ鎖のリーダー配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、ニワトリ型抗体のＬ鎖の定常領域をコードする遺伝子の塩基配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとの組み合わせであるＬ鎖用プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるＬ鎖発現用ベクター、および、ニワトリ型抗体のＨ鎖のリーダー配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、ニワトリ型抗体のＨ鎖の定常領域をコードする遺伝子の塩基配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドからなるプライマーとの組み合わせであるＨ鎖用プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるＨ鎖発現用ベクターとを宿主細胞に形質転換する工程を含むことを特徴としている。
【００１４】
ニワトリをはじめとする鳥類の抗体遺伝子の多様性獲得機構は哺乳類動物のそれと異なっており、抗体の多様性を決定する機能的Ｖ遺伝子は、Ｈ鎖、Ｌ鎖ともに一つである。したがってニワトリ型モノクローナル抗体のＨ鎖をコードする遺伝子（以下、Ｈ鎖遺伝子と称する）、あるいはＬ鎖をコードする遺伝子（以下、Ｌ鎖遺伝子と称する）において、塩基配列が不変であるリーダー配列、および定常領域上の塩基配列を元にプライマーを設計し、当該プライマーを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行なえば、種々のニワトリ型モノクローナル抗体のＬ鎖遺伝子、Ｈ鎖遺伝子を一対のプライマーによって増幅することができる。
【００１５】
上記増幅反応により取得したＬ鎖遺伝子が挿入されているＬ鎖発現用ベクター、およびＨ鎖遺伝子が挿入されているＨ鎖発現用ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することによって、ニワトリ型モノクローナル抗体生産用形質転換細胞が調製できる。さらに上記形質転換細胞を培養することによって、ニワトリ型モノクローナル抗体を生産することができる。
【００１６】
また本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法は、上記課題を解決するために、ニワトリ型抗体のＬ鎖のリーダー配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、ニワトリ型抗体のＬ鎖の定常領域をコードする遺伝子の塩基配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとの組み合わせであるＬ鎖用プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるＬ鎖発現用ベクター、および、ニワトリ型抗体のＨ鎖のリーダー配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ４領域、またはＣＨ３領域、またはＣＨ２領域をコードする遺伝子の塩基配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドからなるプライマーとの組み合わせであるＨ鎖用プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるＨ鎖発現用ベクターとを宿主細胞に形質転換する工程を含むことを特徴としている。
【００１７】
上記Ｌ鎖用プライマーセットは、Ｌ鎖遺伝子において塩基配列が不変であるリーダー配列、および定常領域上の塩基配列を元にプライマーを設計している。上述の通り、ニワトリを始めとする鳥類においては、当該プライマーを用いてＰＣＲ等の増幅反応を行なうことで、種々のニワトリ型モノクローナル抗体のＬ鎖遺伝子を増幅することができる。
【００１８】
また上記Ｈ鎖用プライマーセットによれば、上記と同様に種々のニワトリ型モノクローナル抗体のＨ鎖遺伝子を増幅することができる。さらには、プライマーの設定位置（ＣＨ４領域、またはＣＨ３領域、またはＣＨ２領域）によって、種々のサイズのＨ鎖遺伝子を増幅することができる。後述する実施例に示すごとく、ＣＨ４領域およびＣＨ３領域を欠損させた抗体であっても抗原に対するの結合活性を有していた。またＣＨ２領域のシステイン残基を残してその一部を欠損させた抗体であっても、抗原に対する結合活性を有していた。よって、上記のプライマーを用いて増幅される一部が欠損したＨ鎖遺伝子であっても、最終的に生産する抗体の活性に問題が生じることはない。
【００１９】
上記増幅反応により取得したＬ鎖遺伝子が挿入されているＬ鎖発現用ベクター、およびＨ鎖遺伝子が挿入されているＨ鎖発現用ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することによって、ニワトリ型モノクローナル抗体生産用形質転換細胞が調製できる。さらに上記形質転換細胞を培養することによって、種々のニワトリ型モノクローナル抗体を生産することができる。
【００２０】
また本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法は、上記課題を解決するために、上記ニワトリ型抗体のＬ鎖のリーダー配列が、配列番号１９に示される塩基配列を有するものであってもよい。
【００２１】
配列番号１９に示す塩基配列は、ニワトリ型抗体のＬ鎖のリーダー配列（以下、Ｌ鎖リーダー配列と称する）の塩基配列の一例である。Ｌ鎖用プライマーの塩基配列は、当該塩基配列情報を元に設計すればよい。ただし、ニワトリ型抗体のＬ鎖リーダー配列の塩基配列は、リーダー配列として機能するものであれば上記配列番号１９に示す塩基配列に限られるものではなく、配列番号１９に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記Ｌ鎖リーダー配列の相補配列であってもよい。
【００２２】
また本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法は、上記ニワトリ型抗体のＬ鎖の定常領域をコードする遺伝子が、配列番号２０に示される塩基配列を有することを特徴とするものであってもよい。
【００２３】
配列番号２０に示す塩基配列は、ニワトリ型抗体のＬ鎖の定常領域をコードする遺伝子（以下、ＣＬ遺伝子と称する）の塩基配列の一例である。Ｌ鎖用プライマーの塩基配列は、当該塩基配列情報を元にを設計すればよい。ただし、ニワトリ型抗体のＬ鎖の定常領域をコードする遺伝子の塩基配列は、ニワトリ型抗体のＬ鎖の定常領域をコードするものであれば上記配列番号２０に示す塩基配列に限られるものではなく、ニワトリ型抗体のＬ鎖の定常領域をコードするものであれば配列番号２０に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記ＣＬ遺伝子の相補配列であってもよい。
【００２４】
また本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法は、上記ニワトリ型抗体のＨ鎖のリーダー配列が、配列番号２１に示される塩基配列を有することを特徴とするものであってもよい。
【００２５】
配列番号２１に示す塩基配列は、ニワトリ型抗体のＨ鎖のリーダー配列（以下Ｈ鎖リーダー配列と称する）をコードする遺伝子の塩基配列の一例である。Ｈ鎖用プライマーの塩基配列は、当該塩基配列情報を元に設計すればよい。ただし、ニワトリ型抗体のＨ鎖のリーダー配列の塩基配列は、リーダー配列として機能するものであれば上記配列番号２１に示す塩基配列に限られるものではなく、配列番号２１に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記Ｈ鎖リーダー配列の相補配列であってもよい。
【００２６】
また本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法は、上記ニワトリ型抗体のＨ鎖の定常領域をコードする遺伝子が、配列番号２２に示される塩基配列を有することを特徴とするものであってもよい。
【００２７】
配列番号２２に示す塩基配列は、ニワトリ型抗体のＨ鎖の定常領域をコードする遺伝子（以下、ＣＨ遺伝子と称する）の塩基配列の一例である。Ｈ鎖用プライマーの塩基配列は、当該塩基配列情報を元にを設計すればよい。ただし、ニワトリ型抗体のＨ鎖の定常領域をコードする遺伝子の塩基配列は、ニワトリ型抗体のＨ鎖の定常領域をコードするものであれば上記配列番号２２に示す塩基配列に限られるものではなく、配列番号２２に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記ＣＨ鎖遺伝子の相補配列であってもよい。
【００２８】
また本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法は、上記ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ４領域をコードする遺伝子が配列番号２３に示される塩基配列を有し、上記ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ３領域をコードする遺伝子が配列番号２４に示される塩基配列を有し、上記ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ２領域をコードする遺伝子が配列番号２５に示される塩基配列を有することを特徴とするものであってもよい。
【００２９】
配列番号２３に示す塩基配列は、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ４領域をコードする遺伝子（以下、ＣＨ４遺伝子と称する）の塩基配列の一例である。また配列番号２４に示す塩基配列は、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ３領域をコードする遺伝子（ＣＨ３遺伝子と称する）の塩基配列の一例である。また配列番号２５に示す塩基配列は、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ２領域をコードする遺伝子（以下、ＣＨ２遺伝子と称する）の塩基配列の一例である。Ｈ鎖用プライマーの塩基配列は、上記塩基配列情報を元にを設計すればよい。ただし、ＣＨ４遺伝子の塩基配列は、上記配列番号２３に示す塩基配列に限られるものではなく、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ４領域をコードするものであれば配列番号２３に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記ＣＨ４遺伝子の相補配列であってもよい。
【００３０】
また、ＣＨ３遺伝子の塩基配列についても、上記配列番号２４に示す塩基配列に限られるものではなく、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ３領域をコードするものであれば配列番号２４に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記ＣＨ３遺伝子の相補配列であってもよい。
【００３１】
また、ＣＨ２遺伝子の塩基配列についても、上記配列番号２５に示す塩基配列に限られるものではなく、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ２領域をコードするものであれば配列番号２５に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記ＣＨ２遺伝子の相補配列であってもよい。
【００３２】
また本発明のかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法は、配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるＬ鎖発現用ベクターと、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるＨ鎖発現用ベクターとを用いて宿主細胞を形質転換する工程を含むことを特徴としている。
【００３３】
上記構成にかかる第一プライマーセットによれば、Ｌ鎖遺伝子を増幅することができる。また第二プライマーセットによれば、完全長のニワトリ型抗体のＨ鎖遺伝子を増幅することができる。上記増幅反応によって得られたニワトリ型抗体のＬ鎖遺伝子が挿入されているＬ鎖発現用ベクター、およびＨ鎖遺伝子が挿入されているＨ鎖発現用ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することによってニワトリ型モノクローナル抗体生産用形質転換細胞が調製できる。さらに上記形質転換細胞を培養することによって、完全長ニワトリ型モノクローナル抗体を生産することができる。なお、ニワトリをはじめとする鳥類の抗体遺伝子の多様性獲得機構は哺乳類動物のそれと異なっており、抗体の多様性を決定する機能的Ｖ遺伝子が一つであるため、上記第一プライマーセットおよび第二プライマーセットによって、種々の抗原に対するニワトリ型抗体のＬ鎖遺伝子およびＨ鎖遺伝子を増幅することが可能である。
【００３４】
ただし、上記配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４に示される各プライマーの塩基配列は、目的の遺伝子を増幅することができるものであれば当該塩基配列に限られるのもではなく、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記それぞれの塩基配列の相補配列であってもよい。
【００３５】
また本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法は、配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるＬ鎖発現用ベクターと、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第三プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるＨ鎖発現用ベクターとを用いて宿主細胞を形質転換する工程を含むことを特徴としている。
【００３６】
上記構成にかかる第一プライマーセットによれば、ニワトリ型抗体のＬ鎖遺伝子を増幅することができる。また第三プライマーセットによれば、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣ末端側から７アミノ酸欠失するようにデザインされた遺伝子を増幅することができる。上記増幅反応によって得られたニワトリ型抗体のＬ鎖遺伝子が挿入されているＬ鎖発現用ベクター、およびＨ鎖遺伝子が挿入されているＨ鎖発現用ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することによってニワトリ型モノクローナル抗体生産用形質転換細胞が調製できる。さらに上記形質転換細胞を培養することによって、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣ末端側から７アミノ酸欠失した構造改変ニワトリ型モノクローナル抗体を生産することができる。なお前述と同様の理由により、上記第一プライマーセットおよび第三プライマーセットによって、種々の抗原に対するニワトリ型抗体のＬ鎖遺伝子およびＨ鎖遺伝子を増幅することが可能である。
【００３７】
ただし、上記配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４に示される各プライマーの塩基配列は、目的の遺伝子を増幅することができるものであれば当該塩基配列に限られるのもではなく、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記それぞれの塩基配列の相補配列であってもよい。
【００３８】
また本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法は、配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるＬ鎖発現用ベクターと、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第四プライマーセットを用いて増幅されるＤＮＡ断片と、配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第五プライマーセットを用いて増幅されるＤＮＡ断片とを混合し、さらに配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるＨ鎖発現用ベクターとを用いて宿主細胞を形質転換する工程を含むことを特徴としている。
【００３９】
上記構成にかかる第一プライマーセットによれば、ニワトリ型抗体のＬ鎖遺伝子を増幅することができる。また配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第四プライマーセットを用いて増幅されるＤＮＡ断片と、配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第五プライマーセットを用いて増幅されるＤＮＡ断片とを混合し、さらに配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅すれば、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ２領域のシステイン残基を残して５５アミノ酸残基を欠失するようにデザインされた遺伝子を増幅することができる。上記増幅反応によって得られたニワトリ型抗体のＬ鎖遺伝子が挿入されているＬ鎖発現用ベクター、およびＨ鎖遺伝子が挿入されているＨ鎖発現用ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することによってニワトリ型モノクローナル抗体生産用形質転換細胞が調製できる。さらに上記形質転換細胞を培養することによって、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ２領域のシステイン残基を残して５５アミノ酸残基を欠失した構造改変ニワトリ型モノクローナル抗体を生産することができる。なお前述と同様の理由により、上記第一プライマーセット、第二プライマーセット、第四プライマーセット、および第五プライマーセットによって、種々の抗原に対するニワトリ型抗体のＬ鎖遺伝子およびＨ鎖遺伝子を増幅することが可能である。
【００４０】
ただし、上記配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号６または配列番号７に示される各プライマーの塩基配列は、目的の遺伝子を増幅することができるものであれば当該塩基配列に限られるのもではなく、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号４または配列番号６または配列番号７に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記それぞれの塩基配列の相補配列であってもよい。
【００４１】
また本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法は、配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるＬ鎖発現用ベクターと、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第六プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子が挿入されてなるＨ鎖発現用ベクターとを用いて宿主細胞を形質転換する工程を含むことを特徴としている。
【００４２】
上記構成にかかる第一プライマーセットによれば、ニワトリ型抗体のＬ鎖遺伝子を増幅することができる。また第六プライマーセットによれば、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ３領域とＣＨ４領域をともに欠失するようにデザインされた遺伝子を増幅することができる。上記増幅反応によって得られたニワトリ型抗体のＬ鎖遺伝子が挿入されているＬ鎖発現用ベクター、およびＨ鎖遺伝子が挿入されているＨ鎖発現用ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することによってニワトリ型モノクローナル抗体生産用形質転換細胞が調製できる。さらに上記形質転換細胞を培養することによって、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ３領域とＣＨ４領域をともに欠失した構造改変ニワトリ型モノクローナル抗体を生産することができる。なお前述と同様の理由により、上記第一プライマーセットおよび第六プライマーセットによって、種々の抗原に対するニワトリ型抗体のＬ鎖遺伝子およびＨ鎖遺伝子を増幅することが可能である。
【００４３】
ただし、上記配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号８に示される各プライマーの塩基配列は、目的の遺伝子を増幅することができるものであれば当該塩基配列に限られるのもではなく、配列番号１または配列番号２または配列番号３または配列番号８に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記それぞれの塩基配列の相補配列であってもよい。
【００４４】
また本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法は、上記構成に加えてさらに宿主細胞が、動物由来細胞であることを特徴としている。当該構成とすることで、ニワトリ型モノクローナル抗体を好適に生産することができる。
【００４５】
さらに本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法は、上記構成に加えてさらに動物由来細胞が、ＣＨＯ細胞であることを特徴としている。ＣＨＯ細胞は、浮遊培養が可能であり、世代時間が短く増殖能力が高いために、ニワトリ型モノクローナル抗体をさらに効率良く生産することができる。
【００４６】
また本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法は、上記構成に加えてさらに、Ｌ鎖発現用ベクターおよび／またはＨ鎖発現用ベクターが精製用タグを有することを特徴としている。当該構成とすることで、ニワトリ型モノクローナル抗体生産用形質転換細胞の培養液から目的とするニワトリ型モノクローナル抗体を容易に精製することが可能となり、より簡便にニワトリ型モノクローナル抗体を生産することができる。
【００４７】
一方、本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体は、上記いずれかに記載の本発明かかるニワトリ型抗体の生産方法を用いて生産されることを特徴としている。それゆえ、本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体は、完全長ニワトリ型モノクローナル抗体（以下、適宜Ｆｕｌｌ抗体と称する）、またはＨ鎖のＣ末端側から７アミノ酸欠失した構造改変ニワトリ型モノクローナル抗体（以下、適宜Δ７ａａ抗体と称する）、またはＣＨ２領域のシステイン残基を残して５５アミノ酸残基を欠失した構造改変ニワトリ型モノクローナル抗体（以下、適宜ΔＣＨ２抗体と称する）、またはＣＨ３領域とＣＨ４領域をともに欠失させた構造改変ニワトリ型モノクローナル抗体（以下、適宜ΔＦｃ抗体と称する）等、種々の態様を有する。
【００４８】
一方、本発明にかかるＬ鎖発現用ベクターは、ニワトリ型抗体のＬ鎖を発現させるために用いられる発現用ベクターであって、ニワトリ型抗体のＬ鎖のリーダー配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、ニワトリ型抗体のＬ鎖の定常領域をコードする遺伝子の塩基配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとの組み合わせであるＬ鎖用プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子が挿入されている。
【００４９】
上記構成によれば、当該Ｌ鎖発現用ベクターが導入された形質転換細胞においてニワトリ型抗体のＬ鎖を生産させることが可能となる。
【００５０】
また本発明にかかるＬ鎖発現用ベクターは、上記ニワトリ型抗体のＬ鎖のリーダー配列が、配列番号１９に示される塩基配列を有するものであってもよい。
【００５１】
配列番号１９に示す塩基配列は、Ｌ鎖リーダー配列の塩基配列の一例である。Ｌ鎖用プライマーの塩基配列は、当該塩基配列情報を元に設計すればよい。ただし、ニワトリ型抗体のＬ鎖リーダー配列の塩基配列は、リーダー配列として機能するものであれば上記配列番号１９に示す塩基配列に限られるものではなく、配列番号１９に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記Ｌ鎖リーダー配列の相補配列であってもよい。
【００５２】
また本発明にかかるＬ鎖発現用ベクターは、上記ニワトリ型抗体のＬ鎖の定常領域をコードする遺伝子が、配列番号２０に示される塩基配列を有するものであってもよい。
【００５３】
配列番号２０に示す塩基配列は、ＣＬ遺伝子の塩基配列の一例である。Ｌ鎖用プライマーの塩基配列は、当該塩基配列情報を元にを設計すればよい。ただし、ＣＬ遺伝子の塩基配列は、ニワトリ型抗体のＬ鎖の定常領域をコードするものであれば上記配列番号２０に示す塩基配列に限られるものではなく、配列番号２０に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記ＣＬ遺伝子の相補配列であってもよい。
【００５４】
また、本発明にかかるＬ鎖発現用ベクターは、ニワトリ型抗体のＬ鎖を発現させるために用いられる発現用ベクターであって、配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第一プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子が挿入されていることを特徴としている。上記構成によれば、当該発現用ベクターが導入された形質転換細胞においてニワトリ型抗体のＬ鎖を生産させることが可能となる。
【００５５】
なお上記配列番号１または配列番号２に示される各プライマーの塩基配列は、目的の遺伝子を増幅することができるものであれば、当該塩基配列に限られるのもではなく、配列番号１または配列番号２に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記それぞれの塩基配列の相補配列であってもよい。
【００５６】
また本発明にかかるＬ鎖発現用ベクターは、精製用タグを有するものであってもよい。当該構成とすることで、ニワトリ型モノクローナル抗体生産用形質転換細胞の培養液から目的とするニワトリ型モノクローナル抗体を容易に精製することが可能となり、より簡便にニワトリ型モノクローナル抗体を生産することができる。
【００５７】
また本発明にかかるＨ鎖発現用ベクターは、ニワトリ型抗体のＨ鎖を発現させるために用いられる発現用ベクターであって、ニワトリ型抗体のＨ鎖のリーダー配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、ニワトリ型抗体のＨ鎖の定常領域をコードする遺伝子の塩基配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドからなるプライマーとの組み合わせであるＨ鎖用プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子が挿入されている。
【００５８】
上記構成によれば、当該Ｈ鎖発現用ベクターが導入された形質転換細胞においてニワトリ型抗体のＨ鎖を生産させることが可能となる。
【００５９】
また本発明にかかるＨ鎖発現用ベクターは、ニワトリ型抗体のＨ鎖を発現させるために用いられる発現用ベクターであって、ニワトリ型抗体のＨ鎖のリーダー配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ４領域、またはＣＨ３領域、またはＣＨ２領域をコードする遺伝子の塩基配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドからなるプライマーとの組み合わせであるＨ鎖用プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子が挿入されている。
【００６０】
上記構成によれば、当該Ｈ鎖発現用ベクターが導入された形質転換細胞においてニワトリ型抗体のＨ鎖を生産させることが可能となる。さらには、プライマーの設定位置（ＣＨ４領域、またはＣＨ３領域、またはＣＨ２領域）によって、種々のサイズのニワトリ型抗体のＨ鎖を生産することができる。
【００６１】
また本発明にかかるＨ鎖発現ベクターは、上記ニワトリ型抗体のＨ鎖のリーダー配列が、配列番号２１に示される塩基配列を有するものであってもよい。
【００６２】
配列番号２１に示す塩基配列は、ニワトリ型抗体のＨ鎖リーダー配列をコードする遺伝子の塩基配列の一例である。Ｈ鎖用プライマーの塩基配列は、当該塩基配列情報を元に設計すればよい。ただし、ニワトリ型抗体のＨ鎖リーダー配列の塩基配列は、リーダー配列として機能するものであれば上記配列番号２１に示す塩基配列に限られるものではなく、配列番号２１に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記Ｈ鎖リーダー配列の相補配列であってもよい。
【００６３】
また本発明にかかるＨ鎖発現ベクターは、上記ニワトリ型抗体のＨ鎖の定常領域をコードする遺伝子が、配列番号２２に示される塩基配列を有するものであってもよい。
【００６４】
配列番号２２に示す塩基配列は、ニワトリ型抗体のＣＨ遺伝子の塩基配列の一例である。Ｈ鎖用プライマーの塩基配列は、当該塩基配列情報を元にを設計すればよい。ただし、ニワトリ型抗体のＨ鎖の定常領域をコードする遺伝子の塩基配列は、ニワトリ型抗体のＨ鎖の定常領域をコードするものであれば上記配列番号２２に示す塩基配列に限られるものではなく、配列番号２２に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記ＣＨ鎖遺伝子の相補配列であってもよい。
【００６５】
また本発明にかかるＨ鎖発現ベクターは、上記ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ４領域をコードする遺伝子が配列番号２３に示される塩基配列を有し、上記ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ３領域をコードする遺伝子が配列番号２４に示される塩基配列を有し、上記ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ２領域をコードする遺伝子が配列番号２５に示される塩基配列を有するものであってもよい。
【００６６】
配列番号２３に示す塩基配列は、ニワトリ型抗体のＣＨ４遺伝子の塩基配列の一例である。また配列番号２４に示す塩基配列は、ニワトリ型抗体のＣＨ３遺伝子の塩基配列の一例である。また配列番号２５に示す塩基配列は、ニワトリ型抗体のＣＨ２遺伝子の塩基配列の一例である。Ｈ鎖用プライマーの塩基配列は、上記塩基配列情報を元にを設計すればよい。ただし、ＣＨ４遺伝子の塩基配列は、ニワトリ型抗体のＣＨ４領域をコードするものであれば上記配列番号２３に示す塩基配列に限られるものではなく、配列番号２３に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記ＣＨ４遺伝子の相補配列であってもよい。
【００６７】
また、ＣＨ３遺伝子の塩基配列についても、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ３領域をコードするものであれば上記配列番号２４に示す塩基配列に限られるものではなく、配列番号２４に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記ＣＨ３遺伝子の相補配列であってもよい。
【００６８】
また、ＣＨ２遺伝子の塩基配列についても、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ２領域をコードするものであれば上記配列番号２５に示す塩基配列に限られるものではなく、配列番号２５に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記ＣＨ２遺伝子の相補配列であってもよい。
【００６９】
また、本発明にかかるＨ鎖発現用ベクターは、ニワトリ型抗体のＨ鎖を発現させるために用いられる発現用ベクターであって、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子が挿入されていることを特徴としている。上記構成によれば、当該発現用ベクターが導入された形質転換細胞において完全長ニワトリ型抗体Ｈ鎖を生産させることが可能となる。
【００７０】
なお上記配列番号３または配列番号４に示される各プライマーの塩基配列は、目的の遺伝子を増幅することができるものであれば当該塩基配列に限られるのもではなく、配列番号３または配列番号４に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記それぞれの塩基配列の相補配列であってもよい。
【００７１】
また、本発明にかかるＨ鎖発現用ベクターは、ニワトリ型抗体のＨ鎖を発現させるために用いられる発現用ベクターであって、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第三プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子が挿入されていることを特徴としている。上記構成によれば、当該発現用ベクターが導入された形質転換細胞においてＣ末端側から７アミノ酸欠失したニワトリ型抗体Ｈ鎖を生産させることが可能となる。
【００７２】
なお上記配列番号３または配列番号５に示される各プライマーの塩基配列は、目的の遺伝子を増幅することができるものであれば当該塩基配列に限られるのもではなく、配列番号３または配列番号５に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記それぞれの塩基配列の相補配列であってもよい。
【００７３】
また本発明にかかるＨ鎖発現用ベクターは、ニワトリ型抗体のＨ鎖を発現させるために用いられる発現用ベクターであって、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第四プライマーセットを用いて増幅されるＤＮＡ断片と、配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第五プライマーセットを用いて増幅されるＤＮＡ断片とを混合し、さらに配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第二プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子が挿入されていることを特徴としている。上記構成によれば、当該発現用ベクターが導入された形質転換細胞においてＣＨ２領域のシステイン残基を残して５５アミノ酸残基を欠失したニワトリ型抗体Ｈ鎖を生産させることが可能となる。
【００７４】
ただし、上記配列番号３または配列番号４または配列番号６または配列番号７に示される各プライマーの塩基配列は、目的の遺伝子を増幅することができるものであれば当該塩基配列に限られるのもではなく、配列番号３または配列番号４または配列番号６または配列番号７に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記それぞれの塩基配列の相補配列であってもよい。
【００７５】
また本発明にかかるＨ鎖発現用ベクターは、ニワトリ型抗体のＨ鎖を発現させるために用いられる発現用ベクターであって、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである第六プライマーセットを用いて増幅されるニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子が挿入されていることを特徴としている。上記構成によれば、当該発現用ベクターが導入された形質転換細胞においてＣＨ３領域とＣＨ４領域をともに欠失したニワトリ型抗体Ｈ鎖を生産させることが可能となる。
【００７６】
なお上記配列番号３または配列番号８に示される各プライマーの塩基配列は、目的の遺伝子を増幅することができるものであれば当該塩基配列に限られるのもではなく、配列番号３または配列番号８に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記それぞれの塩基配列の相補配列であってもよい。
【００７７】
また本発明にかかるＨ鎖発現用ベクターは、さらに上記発現用ベクターが精製用タグを有することを特徴としている。当該構成とすることで、ニワトリ型モノクローナル抗体生産用形質転換細胞の培養液から目的とするニワトリ型モノクローナル抗体を容易に精製することが可能となり、より簡便にニワトリ型モノクローナル抗体を生産することができる。
【００７８】
一方、本発明にかかる形質転換細胞は、ニワトリ型モノクローナル抗体を生産するために用いられる形質転換細胞であって、上記ニワトリ抗体のＬ鎖発現用ベクターが導入され、かつ上記Ｈ鎖発現用ベクターが導入されていることを特徴としている。
【００７９】
上記構成によれば、Ｆｕｌｌ抗体、またはΔ７ａａ抗体、またはΔＣＨ２抗体、またはΔＦｃ抗体等、種々の態様のニワトリ型モノクローナル抗体を効率良く生産することが可能となる。
【００８０】
一方、本発明にかかるＨ鎖用プライマーセットは、ニワトリ型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子を増幅するために用いられるプライマーセットであって、ニワトリ型抗体のＬ鎖のリーダー配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、ニワトリ型抗体のＬ鎖の定常領域をコードする遺伝子の塩基配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドを含むプライマーとの組み合わせからなることを特徴としている。上記構成によれば、ＰＣＲ等の増幅反応によって、種々の抗原に対するニワトリ型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子を増幅することができる。
【００８１】
また本発明にかかるＬ鎖用プライマーセットは、上記ニワトリ型抗体のＬ鎖のリーダー配列が、配列番号１９に示される塩基配列を有するものであってもよい。
【００８２】
配列番号１９に示す塩基配列は、Ｌ鎖リーダー配列の塩基配列の一例である。Ｌ鎖用プライマーの塩基配列は、当該塩基配列情報を元に設計すればよい。ただし、ニワトリ型抗体のＬ鎖リーダー配列の塩基配列は、リーダー配列として機能するものであれば上記配列番号１９に示す塩基配列に限られるものではなく、配列番号１９に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記Ｌ鎖リーダー配列の相補配列であってもよい。
【００８３】
また本発明にかかるＬ鎖用プライマーセットは、上記ニワトリ型抗体のＬ鎖の定常領域をコードする遺伝子が、配列番号２０に示される塩基配列を有するものであってもよい。
【００８４】
配列番号２０に示す塩基配列は、ＣＬ遺伝子の塩基配列の一例である。Ｌ鎖用プライマーの塩基配列は、ニワトリ型抗体のＬ鎖の定常領域をコードする当該塩基配列情報を元にを設計すればよい。ただし、ＣＬ遺伝子の塩基配列は、ニワトリ型抗体のＬ鎖の定常領域をコードするものであれば上記配列番号２０に示す塩基配列に限られるものではなく、配列番号２０に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記ＣＬ遺伝子の相補配列であってもよい。
【００８５】
一方本発明にかかるＬ鎖用プライマーセットは、ニワトリ型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子を増幅するために用いられる、配列番号１に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号２に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである。上記構成によれば、ＰＣＲ等の増幅反応によって、種々の抗原に対するニワトリ型抗体のＬ鎖をコードする遺伝子を増幅することができる。
【００８６】
なお上記配列番号１または配列番号２に示される各プライマーの塩基配列は、目的の遺伝子を増幅することができるものであれば、当該塩基配列に限られるのもではなく、配列番号１または配列番号２に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記それぞれの塩基配列の相補配列であってもよい。
【００８７】
一方、本発明にかかるＨ鎖用プライマーセットは、ニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子を増幅するために用いられるプライマーセットであって、ニワトリ型抗体のＨ鎖のリーダー配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、ニワトリ型抗体のＨ鎖の定常領域をコードする遺伝子の塩基配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドからなるプライマーとの組み合わせであることを特徴としている。
【００８８】
上記構成によれば、ＰＣＲ等の増幅反応によって、種々抗原に対するニワトリ型抗体Ｈ鎖をコードする遺伝子を増幅することができる。
【００８９】
また本発明にかかるＨ鎖プライマーセットは、ニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子を増幅するために用いられるプライマーセットであって、ニワトリ型抗体のＨ鎖のリーダー配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドを含むプライマーと、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ４領域、またはＣＨ３領域、またはＣＨ２領域をコードする遺伝子の塩基配列から選択され、連続する少なくとも１５塩基以上のオリゴヌクレオチドからなるプライマーとの組み合わせであることを特徴としている。
【００９０】
また上記Ｈ鎖用プライマーセットによれば、上記と同様に種々のニワトリ型モノクローナル抗体のＨ鎖遺伝子を増幅することができる。さらには、プライマーの設定位置（ＣＨ４領域、またはＣＨ３領域、またはＣＨ２領域）によって、種々のサイズのＨ鎖遺伝子を増幅することができる。
【００９１】
また本発明にかかるＨ鎖用プライマーセットは、上記ニワトリ型抗体のＨ鎖のリーダー配列が、配列番号２１に示される塩基配列を有するものであってもよい。
【００９２】
配列番号２１に示す塩基配列は、ニワトリ型抗体のＨ鎖リーダー配列の一例である。Ｈ鎖用プライマーの塩基配列は、当該塩基配列情報を元に設計すればよい。ただし、ニワトリ型抗体のＨ鎖リーダー配列の塩基配列は、リーダー配列として機能するものであれば上記配列番号２１に示す塩基配列に限られるものではなく、配列番号２１に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記Ｈ鎖リーダー配列の相補配列であってもよい。
【００９３】
また本発明にかかるＨ鎖用プライマーセットは、上記ニワトリ型抗体のＨ鎖の定常領域をコードする遺伝子が、配列番号２２に示される塩基配列を有するものであってもよい。
【００９４】
配列番号２２に示す塩基配列は、ニワトリ型抗体のＣＨ遺伝子の塩基配列の一例である。Ｈ鎖用プライマーの塩基配列は、当該塩基配列情報を元に設計すればよい。ただし、ニワトリ型抗体のＣＨ遺伝子の塩基配列は、ニワトリ型抗体のＨ鎖の定常領域をコードするものであれば上記配列番号２２に示す塩基配列に限られるものではなく、配列番号２２に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記Ｈ鎖リーダー配列の相補配列であってもよい。
【００９５】
また本発明にかかるＨ鎖用プライマーセットは、上記ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ４領域をコードする遺伝子が配列番号２３に示される塩基配列を有し、上記ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ３領域をコードする遺伝子が配列番号２４に示される塩基配列を有し、上記ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ２領域をコードする遺伝子が配列番号２５に示される塩基配列を有するものであってもよい。
【００９６】
配列番号２３に示す塩基配列は、ニワトリ型抗体のＣＨ４遺伝子の塩基配列の一例である。また配列番号２４に示す塩基配列は、ニワトリ型抗体のＣＨ３遺伝子の塩基配列の一例である。また配列番号２５に示す塩基配列は、ニワトリ型抗体のＣＨ２遺伝子の塩基配列の一例である。Ｈ鎖用プライマーの塩基配列は、上記塩基配列情報を元にを設計すればよい。ただし、ＣＨ４遺伝子の塩基配列は、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ４領域をコードするものであれば上記配列番号２３に示す塩基配列に限られるものではなく、配列番号２３に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記ＣＨ４遺伝子の相補配列であってもよい。
【００９７】
また、ＣＨ３遺伝子の塩基配列についても、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ３領域をコードするものであれば上記配列番号２４に示す塩基配列に限られるものではなく、配列番号２４に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記ＣＨ３遺伝子の相補配列であってもよい。
【００９８】
また、ＣＨ２遺伝子の塩基配列についても、ニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ２領域をコードするものであれば上記配列番号２５に示す塩基配列に限られるものではなく、配列番号２５に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記ＣＨ２遺伝子の相補配列であってもよい。
【００９９】
また本発明にかかるＨ鎖用プライマーセットは、ニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子を増幅するために用いられる、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである。上記構成によれば、ＰＣＲ等の増幅反応によって、種々抗原に対する完全長ニワトリ型抗体Ｈ鎖をコードする遺伝子を増幅することができる。
【０１００】
なお上記配列番号３または配列番号４に示される各プライマーの塩基配列は、目的の遺伝子を増幅することができるものであれば当該塩基配列に限られるのもではなく、配列番号３または配列番号４に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記それぞれの塩基配列の相補配列であってもよい。
【０１０１】
また本発明にかかるＨ鎖用プライマーセットは、ニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子を増幅するために用いられる、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである。上記構成によれば、ＰＣＲ等の増幅反応によって、種々の抗原に対するニワトリ型抗体のＨ鎖のＣ末端側から７アミノ酸欠失するようにデザインされた遺伝子を増幅することができる。
【０１０２】
なお上記配列番号３または配列番号５に示される各プライマーの塩基配列は、目的の遺伝子を増幅することができるものであれば当該塩基配列に限られるのもではなく、配列番号３または配列番号５に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記それぞれの塩基配列の相補配列であってもよい。
【０１０３】
また本発明にかかるプライマーセットは、ニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子を増幅するために用いられる、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーと、配列番号４に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである。上記構成によれば、ＰＣＲ等の増幅反応によって、種々のニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ２領域のシステイン残基を残して５５アミノ酸残基を欠失するようにデザインされた遺伝子を増幅することができる
なお、上記配列番号３または配列番号４または配列番号６または配列番号７に示される各プライマーの塩基配列は、目的の遺伝子を増幅することができるものであれば当該塩基配列に限られるのもではなく、配列番号３または配列番号４または配列番号６または配列番号７に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記それぞれの塩基配列の相補配列であってもよい。
【０１０４】
また本発明にかかるプライマーセットは、ニワトリ型抗体のＨ鎖をコードする遺伝子を増幅するために用いられる、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである。上記構成によれば、ＰＣＲ等の増幅反応によって、種々の抗原に対するニワトリ型抗体のＨ鎖のＣＨ３領域とＣＨ４領域をともに欠失するようにデザインされた遺伝子を増幅することができる。
【０１０５】
なお上記配列番号３または配列番号８に示される各プライマーの塩基配列は、目的の遺伝子を増幅することができるものであれば当該塩基配列に限られるのもではなく、配列番号３または配列番号８に示される塩基配列のうち、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記それぞれの塩基配列の相補配列であってもよい。
【発明の効果】
【０１０６】
ニワトリ型モノクローナル抗体は、マウス・ラット等の哺乳類動物において抗体作製困難な抗原に対する抗体とすることが可能なこと、哺乳類動物型抗体と交叉反応性が無いこと等メリットが多いにも関わらず、これまで効率的な生産方法が確立されていなかったために開発・実用化が滞っていた。
【０１０７】
本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法等によれば、種々の抗原に対するニワトリ型モノクローナル抗体を、ＣＨＯ細胞等で効率良く大量生産することが可能となる。また、必要に応じてＨ鎖のＣ末端側から７アミノ酸欠失した構造改変ニワトリ型モノクローナル抗体・ＣＨ２領域のシステイン残基を残して５５アミノ酸残基を欠失した構造改変ニワトリ型モノクローナル抗体・ＣＨ３領域とＣＨ４領域をともに欠失させた構造改変ニワトリ型モノクローナル抗体も生産が可能である。
【０１０８】
それゆえ、非特異的反応のない高感度抗原検出系の確立することが可能となる。さらには、当該高感度抗原検出系を用いた各種疾患の診断薬、診断方法を提供することができるという効果を奏する。加えて、本発明にかかるモノクローナル抗体の生産方法の技術をヒト型抗体へ応用することによって、各種疾患の治療薬の提供が可能となるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０９】
本発明の実施の一形態について説明すれば、以下の通りである。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【０１１０】
＜ニワトリ型抗体（モノクローナル抗体）＞
本発明において生産する「ニワトリ型抗体」とは、ニワトリが有する免疫機能によって、抗原に対してニワトリが生産する抗体（ＩｇＭ，ＩｇＧ，ＩｇＡ）のことである。そのうち特に抗原の特定部分だけを認識する単一の抗体のことを「ニワトリ型モノクローナル抗体」という。後の説明において単に「ニワトリ型抗体」と記せばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体両方を含む意味であり、「ニワトリ型モノクローナル抗体」と記せばモノクローナル抗体のみを含む意味である。ただし、本発明においては「ニワトリ型抗体（モノクローナル抗体）」とは、ニワトリ自身が生産する天然抗体と同様の構造を有する抗体であればよく、例えばニワトリ以外の宿主細胞にニワトリ型抗体をコードする遺伝子を導入して得られた形質転換細胞によって生産される抗体、公知のファイージディスプレイ法により生産される抗体をも含む意味である。また抗体の一部のアミノ酸が欠失・置換されたものであってよく、またアミノ酸が付加されたもの（構造改変ニワトリ型抗体（モノクローナル抗体））であってもよい。ニワトリ型抗体分子は、哺乳類動物型抗体（ＩｇＧ）より分子量が大きいため、用途如何によっては不要なアミノ酸を欠失させた構造改変ニワトリ型抗体（モノクローナル抗体）が好ましい場合があるからである。
【０１１１】
＜ニワトリ型モノクローナル抗体（Ｌ鎖、Ｈ鎖）をコードする遺伝子の取得＞
本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法（以下本生産方法と称する）は、ターゲットとなるニワトリ型モノクローナル抗体をコードする遺伝子を任意の発現用ベクターによって宿主細胞に導入し、当該導入によって得られた形質転換細胞を培養することによってターゲットのニワトリ型抗体を生産する方法である。したがって、まずターゲットとなるニワトリ型モノクローナル抗体をコードする遺伝子を取得する必要がある。抗体分子はＬ鎖とＨ鎖が会合した２組のペプチドで構成されているため、Ｌ鎖をコードする遺伝子（Ｌ鎖遺伝子）とＨ鎖をコードする遺伝子（Ｈ鎖遺伝子）のそれぞれが必要となる。上記遺伝子の取得方法については特に限定されるものではないが、簡便かつ迅速に大量の遺伝子を取得できるという理由で公知のＰＣＲ法等の増幅反応を用いて取得することが好適である。本生産方法においては、特にＰＣＲ法等の増幅反応により、Ｌ鎖遺伝子およびＨ鎖遺伝子を取得している。
【０１１２】
＜Ｌ鎖用プライマー、Ｈ鎖用プライマー＞
かかるＰＣＲ法は、目的遺伝子の塩基配列情報から設計したセンスプライマー（フォアードプライマー）およびアンチセンスプライマー（リバースプライマー）のセットを用いて、ゲノムＤＮＡ等を鋳型として目的遺伝子を増幅する。したがって本生産方法を行なうためには、まず目的の遺伝子（Ｌ鎖遺伝子、Ｈ鎖遺伝子）を増幅するためのプライマーを設計する必要がある。なおＬ鎖遺伝子を増幅するためのプライマーをＬ鎖プライマー、該セットをＬ鎖プライマーセットといい、Ｈ鎖遺伝子を増幅するためのプライマーをＨ鎖プライマー、該セットをＨ鎖プライマーセットという。
【０１１３】
プライマー配列は、公知のニワトリ型モノクローナル抗体の配列情報を元に設計すればよい。またそのニワトリ型抗体が認識する抗原は、特に限定されるものではない。本発明におけるプライマー配列は、種々の抗体遺伝子において高度に保存されている領域に設計することに意義があるからである。上記高度に保存されている領域に設計されたプライマーを用いることによって、種々の抗原を認識するモノクローナル抗体を増幅することができるのである。
【０１１４】
例えば、本発明者らが作製した抗ＰｒＰニワトリ型モノクローナル抗体の塩基配列情報を元にプライマー配列を設計すればよい。そのプライマー配列は、germline（生殖細胞系列）より設計しており、その塩基配列情報は、Ｌ鎖 gene bank Accession No.Ｍ２４４０３、Ｈ鎖 gene bank Accession No.Ｍ３０３１９およびＸ０７１７４により入手可能である。プライマーの設計には公知のソフトウエアを用いればよく、例えばOLIGO 4.05 Primer Analysis Software (National Bioscience) を用いることが可能である。
【０１１５】
プライマーを設計する位置は、既述のごとく種々の抗原に対するニワトリ型モノクローナル抗体に高度に保存されている塩基配列上、換言すれば、種々のニワトリ型モノクローナル抗体に共通する塩基配列上に設計すればよい。
【０１１６】
より具体的には、ニワトリ型モノクローナル抗体のＬ鎖、およびＨ鎖の可変領域（以下、Ｖ領域と称する）のリーダー配列、並びに定常領域をコードする遺伝子（以下、定常領域遺伝子という）の塩基配列から選択され、連続するオリゴオリゴヌクレオチドをプライマーとすればよい。上記リーダー配列、定常領域遺伝子は、種々のニワトリ型モノクローナル抗体において共通する塩基配列を有する領域だからである。ここで「リーダー配列」とは、分泌タンパク質のアミノ酸末端ドメインをコードする配列である。
【０１１７】
上記ニワトリ型モノクローナル抗体のＬ鎖のリーダー配列は、例えば配列番号１９に示される塩基配列を有するものが挙げられ、同Ｌ鎖の定常領域遺伝子の塩基配列は、例えば配列番号２０に示される塩基配列を有するものが挙げられる。またニワトリ型モノクローナル抗体のＨ鎖のリーダー配列は、例えば配列番号２１に示される塩基配列を有するものが挙げられ、同Ｈ鎖の定常領域遺伝子の塩基配列は、例えば配列番号２２に示されるものが挙げられる。なお、上記の各リーダー配列、定常領域遺伝子の塩基配列は、目的の領域をコードするものであれば配列番号に挙げたものに限定されるものではなく、１ないし数個の塩基が欠失、置換、付加されたものであってもよい。
【０１１８】
ところで、Ｌ鎖の定常領域のＣ末端に存在するシステイン残基は、Ｈ鎖とＬ鎖がジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）により会合して抗体分子を形成するために必要なアミノ酸である。したがって、上記Ｌ鎖の定常領域のＣ末端に存在するシステイン残基を増幅可能な位置にプライマーを設計しておくことが好ましいといえる。
【０１１９】
またニワトリ型抗体のＨ鎖の定常領域は、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、およびＣＨ４領域で構成されている。ニワトリ型モノクローナル抗体のＨ鎖を増幅するために用いられるプライマーは、上記ＣＨ１領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、ＣＨ４領域をコードする遺伝子のいずれの領域に設計してもよいが、ＣＨ４領域、ＣＨ３領域、ＣＨ２領域上に設計することが好ましい。抗体分子は、Ｈ鎖２分子とＬ鎖２分子がＳ−Ｓ結合により会合することによって構成されている。よって抗体分子を形成するためには、上記Ｓ−Ｓ結合を行なう領域が必要である。ＣＨ１領域には、Ｌ鎖とＨ鎖とがＳ−Ｓ結合を行なう領域が含まれており、ＣＨ２領域にはＨ鎖同士がＳ−Ｓ結合を行なう領域が含まれている。したがって、抗体分子を形成するためには、少なくともＣＨ２領域のうちＳ−Ｓ結合を行なう領域、およびＣＨ１領域が必要であるといえる。
【０１２０】
それゆえ上述のごとく、プライマーは少なくとも上記必要な領域を増幅可能な位置に設計されていることが好ましい。より具体的にはＣＨ４領域、ＣＨ３領域、ＣＨ２領域上に設計することが好ましいといえる。ＣＨ４領域、ＣＨ３領域上においてプライマーを設計する場合には特にその位置については限定的ではないが、ＣＨ２領域上にプライマーを設計する場合においては、Ｓ−Ｓ結合を行なう領域を増幅可能な位置にプライマーを設計することが必要であるといえる。
【０１２１】
上記ニワトリ型モノクローナル抗体のＨ鎖のＣＨ４遺伝子の塩基配列は、例えば配列番号２３に示される塩基配列を有するものが挙げられ、同ＣＨ３遺伝子の塩基配列は、例えば配列番号２４に示される塩基配列を有するものが挙げられ、同ＣＨ４遺伝子の塩基配列は、例えば配列番号２５に示されるものが挙げられる。なお、上記遺伝子の塩基配列は、上記目的の領域をコードするものであれば配列番号に挙げたものに限定されるものではなく、上記目的の領域をコードするものであれば１ないし数個の塩基が欠失、置換、付加されたものであってもよい。
【０１２２】
なおプライマーを設計する長さについては、目的のＬ鎖遺伝子またはＨ鎖遺伝子が増幅することができる長さであれば特に限定されるものではないが、Ｌ鎖遺伝子の場合１５塩基以上が好ましく、２０塩基以上がさらに好ましい。また、Ｈ鎖遺伝子の場合１５塩基以上が好ましく、２０塩基以上がさらに好ましく、２５塩基以上最も好ましい。上記好ましい範囲以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用すると、非特異的なアニーリングが起こりやすくなり、目的以外のＤＮＡが増幅される可能性が高くなるからである。特にＨ鎖を増幅する際には、増幅するサイズが大きいために、長いプライマーを用いることが好ましい。一方、プライマーの長さの上限値については、Ｌ鎖遺伝子の場合、４０塩基以下が好ましく、３０塩基以下がさらに好ましい。またＨ鎖遺伝子の場合、４０塩基以下が好ましく、３５塩基以下がさらに好ましい。プライマーは長ければ長いほど、非特異的なアニーリングを防止することができるために好ましいが、プライマー配列内で結合して２次構造を作ってしまうことや、コスト、時間、労力等においてデメリットがあるために、上記好ましい半以下の長さのプライマーとすることが好ましいといえる。
【０１２３】
また各プライマーには、発現ベクターに導入する際に必要な制限酵素認識配列を付加して設計されていることが好ましい。発現ベクターの構築をより簡便に行なうことができるからである。なお、上記制限酵素認識配列を付加する際には、フレームシフトが起こらないように留意すべきことは言うまでもない。
【０１２４】
以下に上記の点をふまえて設計した各種プライマーの一例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１２５】
Ｌ鎖用プライマーの一例としては、完全長のＬ鎖遺伝子を増幅することが可能なプライマーのセット（第一プライマーセット）が挙げられる。第一プライマーセットは、ＡＴＡＴＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＣＣＴＣＴＣＣＴ（配列番号１）に示される塩基配列を有するプライマーと、ＴＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＣＡＣＴＣＧＧＡＣＣＴＣＴＴＣＡＧ（配列番号２）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである。配列番号１に示されるプライマーは、Ｌ鎖遺伝子のリーダー配列上に設計されたプライマーであり、さらにベクターに挿入するために使用する制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列（ＡＡＧＣＴＴ）が付加されている。また配列番号２に示されるプライマーは、Ｌ鎖遺伝子の定常領域上に設計されたプライマーであり、同じく制限酵素ＸｂａＩ認識配列（ＴＣＴＡＧＡ）が付加されている。付加する制限酵素認識配列は、特に限定されるものではなく、目的とするＬ鎖遺伝子内にその制限酵素サイトが存在しないこと、およびその制限酵素サイトが発現ベクターのクローニングサイトとして利用可能であること等の観点から適宜選択の上利用が可能である。例えば、pcDNA3.1/myc-His(A)(Invitrogen社)を発現ベクターに用いる場合、ＢａｍＨＩ認識配列、ＥｃｏＲＩ認識配列をＬ鎖用プライマーに付加することが可能である。
【０１２６】
図２にＨＵＣ２−１３のｍＲＮＡを鋳型とし、上記第一プライマーセットを用いてＰＣＲを行なった増幅産物（Ｌ鎖遺伝子）のＨｉｎｄIII認識配列〜ＸｂａI認識配列間の塩基配列（配列番号９）、およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。同図中塩基配列に下線（実線）を引いたものがＨｉｎｄＩＩＩ認識配列であり、同図中白抜き四角で囲った部分が、配列番号１に示される塩基配列を有するプライマー配列（後半一部）である。また下線（破線）を引いたものがＸｂａＩ認識配列であり、同図中影つき四角で囲った部分が、配列番号２に示される塩基配列を有するプライマー配列の相補配列（後半一部）である。
【０１２７】
ここで図中２重下線を引いた箇所がＬ鎖遺伝子におけるＶ領域（ＶＬ領域）であり、矢印線を引いた部分がリーダー配列（Leader sequence）である。また同図中に示す塩基配列の３８２位〜６９６位の領域は、Ｌ鎖遺伝子における定常領域（ＣＬ領域）である。また同図中、塩基配列の両端に示したＨｉｎｄIIIおよびＸｂａIは、ベクターにクローニングする際に用いる制限酵素認識部位を示している。さらに同図中ＣＬ１は、ＣＬ１の開始点を示し、それ以降３’端方向はＣＬ１領域であることを示している。
【０１２８】
図２に示されるとおり第一プライマーセットは、リーダー配列およびＣＬ領域上に設定されている。これは、リーダー配列およびＣＬ領域の塩基配列は、あらゆる抗原に対するニワトリ型抗体において同じ配列が保存されているためである。換言すれば、ＶＬ領域は抗原に応じて変化する配列であるのに対して、リーダー配列およびＣＬ領域の塩基配列は不変だからである。したがってその領域にプライマーを設定しておけば、あらゆる抗原に対するニワトリ型モノクローナル抗体のＬ鎖遺伝子を増幅することが可能だといえる。ただしこのことは、ニワトリをはじめとする鳥類が持つ独特の抗体遺伝子の多様性獲得メカニズムによって成り立つ。哺乳類動物の抗体遺伝子の多様性は、Ｖ領域に存在するＶ遺伝子群とＪ遺伝子群の中からそれぞれ１つずつのＶ遺伝子およびＪ遺伝子が再編成されることによって獲得している。したがって、抗体ごとにＶ領域におけるＶ遺伝子が異なるため、１つのプライマーを設計するだけではあらゆる抗原に対する抗体遺伝子を増幅することができない。つまりあらゆる抗原に対する抗体遺伝子を増幅するためには複数のプライマーを設計し、それらを増幅に用いなければならないということである。一方鳥類の抗体遺伝子の多様性は、Ｖ領域に存在する１つのＶ遺伝子および１つのＪ遺伝子が再編成され、さらにＶ遺伝子の一部が、多数存在する偽遺伝子と遺伝子変換することによって獲得している。したがって、鳥類のＶ領域をコードする遺伝子は、たった１つのＶ遺伝子およびＪ遺伝子組み合わせからなる。よってそのＶ領域をコードする塩基配列の中に塩基配列が不変な領域、つまり上記リーダー配列が存在することとなる。つまりそのリーダー配列内にプライマーを設計すれば、そのプライマーと定常領域側に設計したプライマーの組み合わせによってあらゆる抗原に対するニワトリ型モノクローナル抗体が増幅することができるということである。これは、本生産方法が完成した大きな理由の一つである。なお上記抗体の多様性獲得機構は、Ｌ鎖およびＨ鎖において共通のメカニズムである。
【０１２９】
次にＨ鎖用プライマーの一例としては、完全長のＨ鎖遺伝子を増幅することが可能なプライマーのセット（第二プライマーセット）が挙げられる。上記第二プライマーセットは、完全長のＨ鎖遺伝子を増幅するために用いられるプライマーセットであり、ＴＴＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＡＣＴＣＧＴＣＴＣＣ（配列番号３）に示される塩基配列を有するプライマーと、ＴＴＡＣＣＧＧＴＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである。配列番号３に示されるプライマーは、Ｌ鎖遺伝子のリーダー配列上に設計されたプライマーであり、さらにベクターに挿入するために使用する制限酵素ＫｐｎＩ認識配列（ＧＧＴＡＣＣ）が付加されている。また配列番号４に示されるプライマーは、Ｈ鎖遺伝子の定常領域上に設計されたプライマーであり、同じく制限酵素ＰｉｎＡＩ認識配列（ＡＣＣＧＧＴ）が付加されている。付加する制限酵素認識配列は、特に限定されるものではなく、目的とするＨ鎖遺伝子内にその制限酵素サイトが存在しないこと、およびその制限酵素サイトが発現ベクターのクローニングサイトとして利用可能であること等の観点から適宜選択の上利用が可能である。例えば、発現ベクターとしてpcDNA4/myc-His(A)(Invitrogen社)を用いる場合、ＸｂａＩ認識配列をＨ鎖用プライマーに付加することが可能である。
【０１３０】
図３にＨＵＣ２−１３のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型とし、上記第二プライマーセットを用いてＰＣＲを行なった増幅産物（Ｈ鎖遺伝子）のＫｐｎI認識配列〜ＰｉｎＡＩ認識配列間の塩基配列（配列番号１１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。同図中塩基配列に下線（実線）を引いたものがＫｐｎＩ認識配列であり、同図中白抜き四角で囲った部分が、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマー配列（後半一部）である。また下線（破線）を引いたものがＰｉｎＡＩ認識配列であり、同図中影つき四角で囲った部分が、配列番号４に示される塩基配列を有するプライマー配列の相補配列（後半一部）である。
【０１３１】
ここで図中２重下線を引いた箇所がＨ鎖遺伝子におけるＶ領域（ＶＨ領域）であり、矢印線を引いた部分がリーダー配列（Leader sequence）である。また同図中に示す塩基配列の４５４位以降の領域は、Ｈ鎖遺伝子における定常領域（ＣＨ領域）である。特に同図中に示す塩基配列の４５４位〜７６８位の領域はＣＨ１領域を示し、７６９位〜１０５０位の領域はＣＨ２領域を示し、１０５１位〜１３７７位の領域はＣＨ３領域を示し、１３７８位〜１７３１位はＣＨ４領域を示している。
【０１３２】
また同図中、塩基配列の両端に示したＫｐｎIおよびＰｉｎＡIは、ベクターにクローニングする際に用いる制限酵素認識部位を示している。さらに同図中ＣＨ１・ＣＨ２・ＣＨ３・ＣＨ４は、各々ＣＨ１領域・ＣＨ２領域・ＣＨ３領域・ＣＨ４領域の開始点を示し、それ以降３’端方向はＣＨ１領域・ＣＨ２領域・ＣＨ３領域・ＣＨ４領域であることを示している。
【０１３３】
図３に示されるとおり第二プライマーセットは、リーダー配列およびＣＨ領域上に設定されており、この組み合わせによってあらゆる抗原に対するニワトリ型モノクローナル抗体の完全長のＨ鎖遺伝子を増幅することができる。
【０１３４】
また、Ｈ鎖用プライマーの他の例として、Ｈ鎖のＣ末端側から７アミノ酸欠失するようにデザインされたＨ鎖遺伝子を増幅することが可能なプライマーのセット（第三プライマーセット）が挙げられる。上記第三プライマーセットは、Ｈ鎖のＣ末端側から７アミノ酸欠失するようにデザインされたＨ鎖遺伝子を増幅するために用いられるプライマーセットであり、ＴＴＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＡＣＴＣＧＴＣＴＣＣ（配列番号３）に示される塩基配列を有するプライマーと、ＴＴＡＣＣＧＧＴＧＣＧＣＴＧＧＣＴＧＡＡＧＣＧＣＡＴＧ（配列番号５）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである。配列番号３に示されるプライマーは、Ｈ鎖遺伝子のリーダー配列上に設計されたプライマーであり、さらにベクターに挿入するために使用する制限酵素ＫｐｎＩ認識配列（ＧＧＴＡＣＣ）が付加されている。また配列番号５に示されるプライマーは、Ｈ鎖遺伝子の定常領域上に設計されたプライマーであり、同じく制限酵素ＰｉｎＡＩ認識配列（ＡＣＣＧＧＴ）が付加されている。付加する制限酵素認識配列は、特に限定されるものではなく、目的とするＨ鎖遺伝子内にその制限酵素サイトが存在しないこと、およびその制限酵素サイトが発現ベクターのクローニングサイトとして利用可能であること等の観点から適宜選択の上利用が可能である。例えば、例えば、発現ベクターとしてpcDNA4/myc-His(A)(Invitrogen社)を用いる場合、ＸｂａＩ認識配列をＨ鎖用プライマーに付加することが可能である。
【０１３５】
図４にＨＵＣ２−１３のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型とし、上記第二プライマーセットを用いてＰＣＲを行なった増幅産物（Ｈ鎖遺伝子）のＫｐｎI認識配列〜ＰｉｎＡＩ認識配列間の塩基配列（配列番号１３）およびアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。同図中塩基配列に下線（実線）を引いたものがＫｐｎＩ認識配列であり、同図中白抜き四角で囲った部分が、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマー配列（後半一部）である。また下線（破線）を引いたものがＰｉｎＡＩ認識配列であり、同図中影つき四角で囲った部分が、配列番号５に示される塩基配列を有するプライマー配列の相補配列（後半一部）である。
【０１３６】
ここで図中２重下線を引いた箇所がＨ鎖遺伝子におけるＶ領域（ＶＨ領域）であり、矢印線を引いた部分がリーダー配列（Leader sequence）である。またＶＨ領域以外の領域はＨ鎖遺伝子における定常領域（ＣＨ領域）である。また同図中に示す塩基配列の４５４位以降の領域は、Ｈ鎖遺伝子における定常領域（ＣＨ領域）である。特に同図中に示す塩基配列の４５４位〜７６８位の領域はＣＨ１領域を示し、７６９位〜１０５０位の領域はＣＨ２領域を示し、１０５１位〜１３７７位の領域はＣＨ３領域を示し、１３７８位〜１７０７位はＣＨ４領域を示している。
【０１３７】
また同図中、塩基配列の両端に示したＫｐｎIおよびＰｉｎＡIは、ベクターにクローニングする際に用いる制限酵素認識部位を示している。さらに同図中ＣＨ１・ＣＨ２・ＣＨ３・ＣＨ４は、各々ＣＨ１領域・ＣＨ２領域・ＣＨ３領域・ＣＨ４領域の開始点を示し、それ以降３’端方向はＣＨ１領域・ＣＨ２領域・ＣＨ３領域・ＣＨ４領域であることを示している。
【０１３８】
図４に示されるとおり第三プライマーセットは、リーダー配列およびＣＨ領域上に設定されており、この組み合わせによってあらゆる抗原に対するニワトリ型モノクローナル抗体のＨ鎖のＣ末端側から７アミノ酸欠失するようにデザインされたＨ鎖遺伝子を増幅することができる。
【０１３９】
また、Ｈ鎖用プライマーの他の例として、Ｈ鎖のＣＨ２領域のシステイン残基を残して５５アミノ酸残基を欠失するようにデザインされたＨ鎖遺伝子を増幅することが可能なプライマーセット（第二プライマーセット、第四プライマーセット、第五プライマーセット）が挙げられる。上記第四プライマーセットは、ＴＴＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＡＣＴＣＧＴＣＴＣＣ（配列番号３）に示される塩基配列を有するプライマーと、ＣＡＡＡＣＡＣＡＡＣＡＧＣＴＣＣＡＣＣ（配列番号７）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせであり、上記第五プライマーセットは、ＧＴＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＴＧＴＴＴＧＡＧＣＴＧＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣ（配列番号６）に示される塩基配列を有するプライマーと、ＴＴＡＣＣＧＧＴＴＴＴＡＣＣＡＧＣＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＡＧ（配列番号４）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである。第四プライマーセットを用いて増幅されるＤＮＡ断片と、第五プライマーセットを用いて増幅されるＤＮＡ断片とを混合し、さらに第二プライマーセットを用いて増幅することによって、Ｈ鎖のＣＨ２領域のシステイン残基を残して５５アミノ酸残基を欠失するようにデザインされたＨ鎖遺伝子を増幅することができる。
【０１４０】
図５にＨＵＣ２−１３のｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡを鋳型とし、上記要領でＰＣＲを行なった増幅産物（Ｈ鎖遺伝子）のＫｐｎI認識配列〜ＰｉｎＡＩ認識配列間の塩基配列（配列番号１５）およびアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。同図中塩基配列に下線（実線）を引いたものがＫｐｎＩ認識配列であり、同図中白抜き四角で囲った部分が、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマー配列（後半一部）である。また下線（破線）を引いたものがＰｉｎＡＩ認識配列であり、同図中影つき四角で囲った部分が、配列番号４に示される塩基配列を有するプライマー配列の相補配列（後半一部）である。また特に図示していないが、配列番号６示される塩基配列を有するプライマーは、同図中に示す塩基配列の８０５位〜８４１位に設定されており、配列番号７に示される塩基配列を有するプライマーは、同図中に示す塩基配列の８０４位〜８２２位に設定されている。
【０１４１】
ここで図中２重下線を引いた箇所がＨ鎖遺伝子におけるＶ領域（ＶＨ領域）であり、矢印線を引いた部分がリーダー配列（Leader sequence）である。また同図中に示す塩基配列の４５４位〜１５６６位の領域は、定常領域（ＣＨ領域）である。特に同図中に示す塩基配列の４５４位〜７６８位の領域はＣＨ１領域を示し、７６９位〜８８５位の領域はＣＨ２領域を示し、８８６位〜１２１２位の領域はＣＨ３領域を示し、１２１３位〜１５６６位はＣＨ４領域を示している。
【０１４２】
また同図中、塩基配列の両端に示したＫｐｎIおよびＰｉｎＡIは、ベクターにクローニングする際に用いる制限酵素認識部位を示している。さらに同図中ＣＨ１・ＣＨ２・ＣＨ３・ＣＨ４は、各々ＣＨ１領域・ＣＨ２領域・ＣＨ３領域・ＣＨ４領域の開始点を示し、それ以降３’端方向はＣＨ１領域・ＣＨ２領域・ＣＨ３領域・ＣＨ４領域であることを示している。
【０１４３】
第四プライマーセットおよび第五プライマーセットおよび第六プライマーセットは、リーダー配列およびＣＨ領域上に設定されており、これらの組み合わせによってあらゆる抗原に対するニワトリ型モノクローナル抗体のＨ鎖のＣＨ２領域のシステイン残基を残して５５アミノ酸残基を欠失するようにデザインされたＨ鎖遺伝子を増幅することができる。
【０１４４】
また、Ｈ鎖用プライマーの他の例として、Ｈ鎖のＣＨ３領域とＣＨ４領域をともに欠失するようにデザインされたＨ鎖遺伝子を増幅することが可能なプライマーセット（第六プライマーセット）が挙げられる。上記第六プライマーセットは、Ｈ鎖のＣＨ３領域とＣＨ４領域をともに欠失するようにデザインされたＨ鎖遺伝子を増幅するために用いられるプライマーセットであり、ＴＴＧＧＴＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＣＣＣＡＣＴＣＧＴＣＴＣＣ（配列番号３）に示される塩基配列を有するプライマーと、ＴＴＡＣＣＧＧＴＣＧＧＧＣＡＴＣＣＣＴＴＧＡＣＧＴＧ（配列番号８）に示される塩基配列を有するプライマーとの組み合わせである。配列番号３に示されるプライマーは、Ｌ鎖遺伝子のリーダー配列上に設計されたプライマーであり、さらにベクターに挿入するために使用する制限酵素ＫｐｎＩ認識配列（ＧＧＴＡＣＣ）が付加されている。また配列番号８に示されるプライマーは、Ｈ鎖遺伝子の定常領域上に設計されたプライマーであり、同じく制限酵素ＰｉｎＡＩ認識配列（ＡＣＣＧＧＴ）が付加されている。付加する制限酵素認識配列は、特に限定されるものではなく、目的とするＨ鎖遺伝子内にその制限酵素サイトが存在しないこと、およびその制限酵素サイトが発現ベクターのクローニングサイトとして利用可能であること等の観点から適宜選択の上利用が可能である。
【０１４５】
図６にＨＵＣ２−１３のｍＲＮＡを鋳型とし、上記第二プライマーセットを用いてＰＣＲを行なった増幅産物（Ｈ鎖遺伝子）のＫｐｎI認識配列〜ＰｉｎＡＩ認識配列間の塩基配列（配列番号１７）およびアミノ酸配列（配列番号１８）を示す。同図中塩基配列に下線（実線）を引いたものがＫｐｎＩ認識配列であり、同図中白抜き四角で囲った部分が、配列番号３に示される塩基配列を有するプライマー配列（後半一部）である。また下線（破線）を引いたものがＰｉｎＡＩ認識配列であり、同図中影つき四角で囲った部分が、配列番号８に示される塩基配列を有するプライマーの相補配列（後半一部）である。
【０１４６】
ここで図中２重下線を引いた箇所がＨ鎖遺伝子におけるＶ領域（ＶＨ領域）であり、矢印線を引いた部分がリーダー配列（Leader sequence）である。また同図中に示す塩基配列の４５４位以降の領域は、Ｈ鎖遺伝子における定常領域（ＣＨ領域）である。特に同図中に示す塩基配列の４５４位〜７６８位の領域はＣＨ１領域を示し、７６９位〜１０５０位の領域はＣＨ２領域を示している。
【０１４７】
また同図中、塩基配列の両端に示したＫｐｎIおよびＰｉｎＡIは、ベクターにクローニングする際に用いる制限酵素認識部位を示している。さらに同図中ＣＨ１およびＣＨ２は、各々ＣＨ１領域およびＣＨ２領域の開始点を示し、それ以降３’端方向はＣＨ１領域およびＣＨ２領域であることを示している。
【０１４８】
図６に示されるとおり第六プライマーセットは、リーダー配列およびＣＨ領域上に設定されており、この組み合わせによってあらゆる抗原に対するニワトリ型モノクローナル抗体のＨ鎖のＣＨ３領域とＣＨ４領域をともに欠失するようにデザインされたＨ鎖遺伝子を増幅することができる。
【０１４９】
なお、上記各プライマーの配列は、目的の遺伝子を増幅することができるものであれば上記各配列番号に示す塩基配列に限定されるものではなく、１もしくは数個の塩基が欠失、置換、付加された塩基配列であってもよい。また上記それぞれの塩基配列の相補配列であってもよい。
【０１５０】
次に上記各プライマーセットを用いたニワトリ型モノクローナル抗体のＬ鎖遺伝子およびＨ鎖遺伝子の増幅方法について説明する。遺伝子の増幅方法は、ＰＣＲ法およびその改変法を用いて行なえばよく、その反応条件についても特に限定されるものではない。ただし、Ｈ鎖遺伝子については増幅されにくい場合が多い。本発明者らの鋭意検討によれば、後述する実施例において使用したGC bufferＩ（タカラバイオ社製）、TAKARA LA Taq polymerase（タカラバイオ社製）が最も好ましい組み合わせであるという結果を得ている。また、Ｈ鎖遺伝子は増幅量についても少ない場合が多く、かかる場合には、少なくとも２回以上増幅反応を行なえばよいということも確認している。なお上記GCブッファーＩは、増幅領域がGCリッチ、あるいは強固な２次構造をとる場合に好適なバッファーとして知られている。
一方鋳型ＤＮＡは、例えば所望の抗原に対するニワトリ型モノクローナル抗体産生ハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、公知の方法（例えばOligo-dTプライマー法等）によりｃＤＮＡを合成し、それを鋳型とすればよい。
【０１５１】
＜Ｌ鎖発現用ベクターおよびＨ鎖発現用ベクターの構築＞
上記説示した方法によって取得したＬ鎖遺伝子およびＨ鎖遺伝子を宿主細胞に導入し、該細胞内でＬ鎖およびＨ鎖を発現させるためのベクター（以下Ｌ鎖発現用ベクターおよびＨ鎖発現用ベクターと称する）、およびそれらの構築方法について説明する。
【０１５２】
Ｌ鎖発現用ベクターまたはＨ鎖発現用ベクターは、ニワトリ型モノクローナル抗体のＬ鎖またはＨ鎖を宿主細胞内で発現させることができるものであれば特にその構成等は限定されるものではなく、環状ベクターであってもよいし、リニア形状であってもよい。したがって基本的には取得したＬ鎖遺伝子またはＨ鎖遺伝子をプロモーターの下流に制御可能に連結して構築すればよい。使用するプロモーターの種類も特に限定されるものではなく、宿主細胞内において機能するものであればよい。例えば、動物由来細胞用としては、ＳＶ４０やウシ・パピローマ・ウイルス（ＢＰＶ）プロモーターやヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）等が挙げられる。またその他上記Ｌ鎖発現用ベクターまたはＨ鎖発現用ベクターには、プロモーター以外の種々のＤＮＡセグメントが含まれていてもよい。ＤＮＡセグメントとしては、例えば遺伝子導入のマーカーとなる薬剤耐性遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子・ゼオシン耐性遺伝子等）、ターミネーター、精製用タグ（ヒスチジンタグ等）を付加する配列を挙げることができる。また導入する宿主細胞に好適な市販ベクターを用いてもよい。後述する実施例においては、pcDNA3.1/myc-His(A)(Invitrogen社)、およびpcDNA4/myc-His(A)(Invitrogen社)をベースとして用い、Ｌ鎖発現用ベクター、およびＨ鎖発現用ベクターを構築している。そのほかpEF1/myc-His(Invitrogen社)、pSecTag2/Hygro(Invitrogen社)が公知のベクターとして利用可能である。
【０１５３】
各発現用ベクターの構築方法は、特に限定されるのではなく、必要な遺伝子配列を通常の遺伝子工学的手法を用いて連結すればよい。またＰＣＲによって取得したＬ鎖遺伝子またはＨ鎖遺伝子をサブクローニングすることなく上記各発現用ベクターを構築してもよいし、サブクローニング用ベクター、例えばｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ を用いて大腸菌等にサブクローニングを行なった後に上記各発現用ベクターを構築してもよい。
【０１５４】
＜Ｌ鎖発現用ベクターおよびＨ鎖発現用ベクターの宿主細胞の形質転換＞
上記Ｌ鎖発現用ベクターおよびＨ鎖発現用ベクターを用いて、宿主細胞の形質転換を行なう。なお抗体分子はＬ鎖およびＨ鎖がＳ−Ｓ結合によって形成される複合体（Ｌ鎖―Ｈ鎖複合体）が２分子結合した２量体である。したがって宿主細胞には、Ｌ鎖遺伝子およびＨ鎖遺伝子の両者を導入する必要がある。
【０１５５】
上記具体例として挙げた各プライマーセットで増幅したＬ鎖遺伝子、Ｈ鎖遺伝子を用いることによって、以下のＬ鎖遺伝子発現用ベクター、及びＨ鎖遺伝子発現用ベクターを構築し、Ｌ鎖発現用ベクターおよびＨ鎖発現用ベクターを適宜組み合わせ、同一の宿主を形質転換すればよい。Ｌ鎖発現用ベクターの一例としては、完全長のＬ鎖遺伝子を用いて構築した完全長のＬ鎖発現用ベクターがあり、Ｈ鎖発現用ベクターの一例としては、完全長のＨ鎖遺伝子（ＦｕｌｌＨ鎖遺伝子）を用いて構築したＨ鎖発現用ベクター（ＦｕｌｌＨ鎖発現用ベクター）、およびＣ末端側から７アミノ酸欠失するようにデザインされたＨ鎖遺伝子（Δ７ａａＨ鎖遺伝子）を用いて構築したＨ鎖発現用ベクター（Δ７ａａＨ鎖発現用ベクター）、またはＣＨ２領域のシステイン残基を残して５５アミノ酸残基を欠失するようにデザインされたＨ鎖遺伝子（ΔＣＨ２Ｈ鎖遺伝子）を用いて構築されたＨ鎖発現用ベクター（ΔＣＨ２Ｈ鎖発現用ベクター）、またはＣＨ３領域とＣＨ４領域をともに欠失するようにデザインされたＨ鎖遺伝子（ΔＦｃＨ鎖遺伝子）を用いて構築されたＨ鎖発現用ベクター（ΔＦｃＨ鎖発現用ベクター）がある。
【０１５６】
Ｌ鎖発現用ベクターおよびＦｕｌｌＨ鎖発現用ベクターを用いて、Ｌ鎖遺伝子およびＦｕｌｌＨ鎖遺伝子を宿主細胞に導入すれば、完全長ニワトリ型モノクローナル抗体（Ｆｕｌｌ抗体）を生産することができる。また、Ｌ鎖発現用ベクターおよびΔ７ａａＨ鎖発現用ベクターを用いて、Ｌ鎖遺伝子およびΔ７ａａＨ鎖遺伝子を宿主細胞に導入すれば、Ｈ鎖のＣ末端側から７アミノ酸欠失した構造改変ニワトリ型モノクローナル抗体（Δ７ａａ抗体）を生産することができる。また、Ｌ鎖発現用ベクターおよびΔＣＨ２Ｈ鎖発現用ベクターを用いて、Ｌ鎖遺伝子およびΔＣＨ２Ｈ鎖遺伝子を宿主細胞に導入すれば、ＣＨ２領域のシステイン残基を残して５５アミノ酸残基を欠失した構造改変ニワトリ型モノクローナル抗体（ΔＣＨ２抗体）を生産することができる。さらに、Ｌ鎖発現用ベクターおよびΔＦｃＨ鎖発現用ベクター用いて、Ｌ鎖遺伝子およびΔＦｃＨ鎖遺伝子を宿主細胞に導入すれば、ＣＨ３領域とＣＨ４領域をともに欠失させた構造改変ニワトリ型モノクローナル抗体（ΔＦｃ抗体）を生産することができる。図１に各モノクローナル抗体の構造の模式図を示す。
【０１５７】
なお形質転換を行なう宿主細胞については、特に限定されるものではなく、上記で構築した各発現用ベクターに応じた宿主を選択して用いればよい。すなわち宿主細胞は、動物由来細胞であっても、植物由来細胞であってもよい。また動物由来細胞、植物由来細胞とは、細胞、組織、並びに器官も含む意味である。特にニワトリ型モノクローナル抗体の大量生産を目的としている本発明においては、免疫システムを有する動物由来の細胞であることが好ましく、液体培地等で培養可能な細胞（培養細胞）が好ましい。動物由来培養細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）・ＨｅＬａ細胞・メラノーマ細胞・マウス３Ｔ３細胞等が挙げられ、植物由来培養細胞の例としては、タバコＢＹ２細胞等が挙げられる。後述する実施例においては、宿主細胞にＣＨＯ細胞を用いている。これは、当該細胞が浮遊培養が可能であること、世代時間が１２時間と短く、増殖能力が高いためにニワトリ型モノクローナル抗体の大量生産に好適であるという理由による。
【０１５８】
一方形質転換方法についても特に限定されるものではなく、宿主細胞・発現用ベクターに好適な方法を選択して用いればよい。例えば、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム法、プロトプラスト／スフェロプラスト法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また特に植物由来細胞への一般的な形質転換法としては、アグロバクテリウムを用いた形質転換法（アグロバクテリウム法）を挙げることができる。ただしＬ鎖遺伝子およびＨ鎖遺伝子が、宿主細胞のゲノムに組み込まれることが好ましい。抗体遺伝子がゲノムに組み込まれることにより、細胞分裂後の娘細胞にもベクターの構成に含まれる遺伝子を確実に伝達することが可能となり、ニワトリ型モノクローナル抗体の生産効率を維持することが可能となるからである。
【０１５９】
またＬ鎖遺伝子およびＨ鎖遺伝子が宿主細胞に導入されたか否かを確認する方法は、特に限定されるものではなく、公知の各種の方法を用いることができる。具体的には、各種マーカーを用いればよい。例えば、宿主細胞中で欠失している遺伝子をマーカーとして用い、このマーカーと組み換え植物ウイルス遺伝子とを含むプラスミド等を発現用ベクターとして宿主細胞に導入する。これによってマーカー遺伝子の発現から本発明の遺伝子の導入を確認することができる。例えば後述する実施例においては、ＣＨＯ細胞を形質転換しており、薬剤耐性マーカー（ネオマイシン耐性遺伝子・ゼオシン耐性遺伝子）を用いてＣＨＯ細胞を形質転換しており、ネオマイシンおよびゼオシンを含有する培地中で、形質転換候補細胞株を培養することにより、生育してきた細胞株を形質転換体として選抜することが可能となる。その他のマーカーとしては、ピューロマイシン耐性マーカー、ブレオマイシン耐性マーカー、ＸＧＰＲＴ遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子等が動物細胞の選抜には有効であり、ビアラホス耐性マーカー、カナマイシン耐性マーカー等が植物細胞の選抜に有効である。その他、宿主細胞から調製したゲノムＤＮＡを鋳型とし、導入したタンパク質（転写因子）の遺伝子全長を特異的に増幅するいわゆるジェノミックＰＣＲ法を挙げることができる。この方法によって、目的タンパク質（転写因子）をコードする遺伝子が増幅されてくることを電気泳動法等によって確認できれば、該遺伝子の導入を確認することができる。
【０１６０】
＜形質転換細胞の培養（ニワトリ型モノクローナル抗体の生産）＞
次に上記で取得した形質転換細胞を用いてニワトリ型モノクローナル抗体の生産を行なう。より具体的には、上記形質転換細胞を培養し、その培養物から目的のニワトリ型モノクローナル抗体を精製すればよい。ここで形質転細胞の培養方法・培養条件等は、該形質転換細胞の培養に好適な方法を用いればよく、特に限定されるものではない。例えば動物細胞を培養する場合は、浮遊培養法・担体付着培養法・ホローファイバー培養法等が好適である。特に浮遊培養法は、適応できる細胞がリンパ系の細胞等に限られるが、ジャーファーメンターを利用することができ、スケールアップが容易であるためより好ましい。後述する実施例において採用した形質転換ＣＨＯ細胞は、既に述べたとおり浮遊培養が可能な細胞である。また動物細胞を培養する際の培地としては、限定されるわけではないが、アミノ酸、ビタミン類、ブドウ糖、塩類に、血清が加えられている場合がある。その他、緩衝液として重炭酸／炭酸ガス系緩衝液が用いられており、培養器として、ＣＯ2インキュベーターが利用可能である。またｐＨのモニター用にフェノールレッドを添加する場合がある。培養条件は、一般的には３７℃で培養するが、細胞株によっては、２８℃、４０℃の場合がある。なお後述する実施例においては、形質転換ＣＨＯ細胞の培養には、１０％  fetal bovine serum (ＦＢＳ) を含むＦ１２ media (GIBCO BRL社) を用いて、５％ ＣＯ2、３７℃の条件で３日間培養を行なっている。
【０１６１】
一方植物細胞を培養する際の培地としては、限定されるものではないが、無機塩類、炭素源、ビタミン類、アミノ酸が加えられている場合がある。さらに、ココナツミルクや酵母エキスを加えて成長を促進させる場合がある。その他、オーキシンとサイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン等の植物ホルモンを添加する場合がある。また培養条件であるが、光、温度、通気の有無等を培養する細胞に応じて最適なものを採用すればよい。
【０１６２】
次に目的のニワトリ型モノクローナル抗体の調製方法および精製方法について説明する。Ｌ鎖遺伝子およびＨ鎖遺伝子が導入された形質転換細胞は、細胞内で目的のニワトリ型モノクローナル抗体のＬ鎖およびＨ鎖を生産する。生産されたＬ鎖およびＨ鎖は細胞内でＳ−Ｓ結合によりＬ鎖−Ｈ鎖複合体を形成し、さらにＬ鎖−Ｈ鎖複合体の２量体が形成されることによって抗体分子となる。このとき生産された抗体分子は、培養液に分泌されるか、または細胞内に蓄積する。なお生産された抗体分子が分泌されるか細胞内に蓄積するかは形質転換体細胞の種類・培養方法等によって決まる。前者のごとく生産されたニワトリ型モノクローナル抗体分子が培養液中に分泌される場合には、培養液上清を遠心分離・ろ過等によって調製し、ニワトリ型モノクローナル抗体すればよい。一方、細胞内にニワトリ型モノクローナル抗体が蓄積する場合には、細胞を、ガラスビーズ等を用いた公知の細胞破砕方法により細胞を破砕し、該細胞破砕物よりニワトリ型モノクローナル抗体を取得すればよい。
【０１６３】
なお必要に応じて上記方法によって取得したニワトリ型モノクローナル抗体を、アフィニティークロマトグラフィーや精製用のレジンを用いる方法によって精製を行なってもよい。上記精製を行うことによって、プロテアーゼや抗原抗体反応を阻害する夾雑物を除去することができ、取得したニワトリ型モノクローナル抗体を高感度微量抗原検出系により好適に用いることができる。後述する実施例においては、生産されるニワトリ型モノクローナル抗体Ｈ鎖のＣ末端にヒスチジンタグが付加されるように設計してある。ヒスチジンはニッケルに吸着する性質を有するため、ニッケルカラムを用いることによって目的のニワトリ型モノクローナル抗体を簡単に精製することができる。
【０１６４】
＜本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体＞
本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体は、上記説示した本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法によって生産されたものであり、例えば、Ｆｕｌｌ抗体、Δ７ａａ抗体、ΔＣＨ２抗体、ΔＦｃ抗体が挙げられる。Ｆｕｌｌ抗体に加えて、構造改変ニワトリ型モノクローナル抗体（Δ７ａａ抗体、ΔＣＨ２抗体、ΔＦｃ抗体）を生産する理由は、ニワトリ型抗体分子は、哺乳類動物型抗体（ＩｇＧ）より分子量が大きいため、用途如何によっては不要なアミノ酸を欠失させるが好ましい場合があるからである。例えば、分子を小さくすることにより、細胞膜を通過することができ、膜内の抗原に関しても検出することができるようになる。
【０１６５】
ニワトリ型モノクローナル抗体は、マウス・ラット等の哺乳類動物では抗体を作製することができない抗原に対する抗体とすることに加え、哺乳類動物型の抗体との交叉反応性が無いため、ニワトリ型モノクローナル抗体と哺乳類動物型モノクローナル抗体を用いることによって、非特異的反応のない高感度抗原検出系を確立することが可能となる。さらには、当該高感度抗原検出系を用いた各種疾患の診断薬、診断方法に応用することができる。加えて、本発明にかかるモノクローナル抗体の生産方法の技術をヒト型抗体へ応用することによって、各種疾患の治療薬の提供が可能となる。
【０１６６】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【実施例】
【０１６７】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【０１６８】
（実施例１：抗ＰｒＰニワトリ型モノクローナル抗体の生産）
一例としてヒトプリオンタンパク質（ＰｒＰ）に対するニワトリ型モノクローナル抗体の生産を行なった。
【０１６９】
〔Ｌ鎖遺伝子およびＨ鎖遺伝子の調製〕
Ｌ鎖遺伝子およびＨ鎖遺伝子は、抗ＰｒＰニワトリモノクローナル抗体から合成したｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によって調製した。より具体的には以下のようにした。
【０１７０】
本発明者等が細胞融合法を用いて作製した抗ＰｒＰニワトリモノクローナル抗体（ＨＵＣ２−１３）よりＲＮＡを抽出し、Oligo-dTプライマー法により鋳型となるｃＤＮＡを合成した。
【０１７１】
一方ＰＣＲに用いるプライマーセットは、増幅する遺伝子に応じて使用した。具体的には、完全長のＬ鎖遺伝子を増幅することが可能なプライマーのセットは第一プライマーセットであり、完全長のＨ鎖遺伝子（ＦｕｌｌＨ鎖遺伝子）を増幅することが可能なプライマーのセットは第二プライマーセットであり、Ｈ鎖のＣ末端側から７アミノ酸欠失するようにデザインされたＨ鎖遺伝子（Δ７ａａＨ鎖遺伝子）を増幅することが可能なプライマーのセットは第三プライマーセットであり、Ｈ鎖のＣＨ２領域のシステイン残基を残して５５アミノ酸残基を欠失するようにデザインされたＨ鎖遺伝子（ΔＣＨ２Ｈ鎖遺伝子）を増幅することが可能なプライマーセットは、第二プライマーセットと第四プライマーセットと第五プライマーセットであり、Ｈ鎖のＣＨ３領域とＣＨ４領域をともに欠失するようにデザインされたＨ鎖遺伝子（ΔＦｃＨ鎖遺伝子）を増幅することが可能なプライマーセットは第六プライマーセットである。なおプライマーの設計は、ＨＵＣ２−１３の塩基配列情報より、Ｌ鎖遺伝子増幅用プライマーおよびＨ鎖遺伝子増幅用プライマーをOLIGO 4.05 Primer Analysis Software (National Bioscience) を用いて設計した。
【０１７２】
ここで、ΔＣＨ２Ｈ鎖遺伝子は、第四プライマーセットを用いて増幅されるＤＮＡ断片と、第五プライマーセットを用いて増幅されるＤＮＡ断片とを混合し、さらに第二プライマーセットを用いて増幅することによって調製する。
【０１７３】
次にＰＣＲの反応条件について説明する。Ｌ鎖遺伝子の増幅の反応液の組成は、１０×KOD plus buffer ５μｌ、２．０ｍＭ dNTP ５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ4 ３．２μｌ、各１０μＭ Primer ２．５μｌ、KOD pulus DNA polymerase（東洋紡社製）１μｌ、ｃＤＮＡ １μｌ、Ｈ2Ｏ ２９．８μｌとした。また反応はサーマルサイクラー（エムジェイジャパン株式会社；モデル名PTC- １００）を用いて行なった。その反応条件は、９４℃２分を１回、（９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃１分）を３０回、４℃一定とした。
【０１７４】
一方、Ｈ鎖遺伝子の増幅は２度行なった。Ｈ鎖は鎖長が長く、目的の増幅産物を得るためには、増幅を２度行なう必要があったからである。１度目の反応液の組成は、２×GC bufferＩ ２５μｌ、２．５ｍＭ dNTP ８μｌ、各１０μＭ Primer １μｌ、TAKARA LA Taq polymerase(タカラバイオ社製) ０．５μｌ、ｃＤＮＡ １μｌ、Ｈ2Ｏ １３．５μｌとした。また反応はサーマルサイクラー（エムジェイジャパン株式会社；モデル名PTC-１００）を用いて行ない。その反応条件は、９４℃２分を１回、（９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃２分）を３０回、７２℃５分を１回、４℃一定とした。
【０１７５】
増幅されたＰＣＲ断片を回収した後、それをテンプレートとしてもう一度ＰＣＲを行なった。２度目の増幅の反応液の組成は、１０×KOD plus buffer ５μｌ、２．０ｍＭ dNTP ５μｌ、２５ｍＭ ＭｇＳＯ4 ３．２μｌ、各１０μＭ Primer ２．５μｌ、KOD pulus DNA polymerase（東洋紡社製）１μｌ、ＰＣＲ断片 ０．５μｌ、Ｈ2Ｏ ３０．３μｌとした。また反応はサーマルサイクラー（エムジェイジャパン株式会社；モデル名PTC- １００）を用いて行ない。その反応条件は、９４℃２分を１回、（９４℃１５秒、６０℃３０秒、６８℃２分）を３０回、４℃一定とした。
【０１７６】
〔Ｌ鎖発現用ベクターおよびＨ鎖発現用ベクターの構築〕
Ｌ鎖発現用ベクターおよびＨ鎖発現用ベクターの構築方法の概略図を図７に示す。なお図７（ａ）がＬ鎖発現用ベクターの構築方法であり、図７（ｂ）がＨ鎖発現用ベクター（ＦｕｌｌＨ鎖発現用ベクター）の構築方法である。
【０１７７】
Ｌ鎖遺伝子を増幅したＰＣＲ断片は、ｐＵＣ１９のＨｉｎｄIII−ＸｂａIサイトに挿入しｐＵＣＬ−２を構築した。ｐＵＣＬ−２は、抗体遺伝子の塩基配列を確認した後、制限酵素ＨｉｎｄIII、ＸｂａIで消化し、その制限消化断片をpcDNA3.1/myc-His(A)（Invitrogen社）に挿入してｐｃＣＫＬ−１を構築した。このｐｃＣＫＬ−１は、ネオマイシン耐性遺伝子，ＣＭＶ（human cytomegalovirus：ヒトメガロウイルス）プロモーター，ＢＧＨ（bovine growth hormone：ウシ成長ホルモン）ポリＡシグナルを有する。なお上記制限酵素消化は、１０×M buffer ３μｌ、ＤＮＡ１０μｌ、ＨｉｎｄIII（New England Biolabs 社製）１μl、ＸｂａI（New England Biolabs 社製）１μｌ、Ｈ2Ｏ １５μlの反応液組成で、３７℃・６時間反応を行なった。
【０１７８】
一方、Ｈ鎖発現用ベクターは、ＦｕｌｌＨ鎖発現用ベクター、Δ７ａａＨ鎖発現用ベクター、ΔＣＨ２Ｈ鎖発現用ベクター、ΔＦｃＨ鎖発現用ベクターの4種類をそれぞれ構築した。その一例としてＦｕｌｌＨ鎖発現用ベクターの構築例を挙げて説明する。なお他の３つのベクターについても同様にして構築した。
【０１７９】
ＦｕｌｌＨ鎖遺伝子増幅したＰＣＲ断片を、pBluescript II SK(＋)のＫｐｎI−ＨｉｎｃIIサイトに挿入してｐＢＳＨＦ−２を構築した。ｐＢＳＨＦ−２は抗体遺伝子の塩基配列を確認した後、制限酵素ＫｐｎI，ＰｉｎＡIで消化、その制限酵素消化断片をpcDNA4/myc-His(A)（Invitrogen社）に挿入してｐｃＣＫＨ−１を構築した。このｐｃＣＫＨ−１はゼオシン耐性遺伝子，ＣＭＶプロモーター，ＢＧＨポリＡシグナルを有する。また、Ｃ末端にヒスチジンタグが付くように構築した。
【０１８０】
なお上記制限酵素消化は、以下のとおりに行なった。ＰＣＲ断片の切断は、１０×L buffer ３μｌ、ＤＮＡ１５μｌ、ＫｐｎI（New England Biolabs 社製）１μl、Ｈ2Ｏ １１μlの反応液組成で、３７℃・６時間反応を行なった。PBluescript SK(+)の切断は、１０×M buffer ２μｌ、ＤＮＡ５μｌ、ＨｉｎｃII (New England Biolabs 社製)１μl、ＫｐｎI（New England Biolabs 社製）１μl、Ｈ2Ｏ１２μlの反応液組成で、３７℃・６時間反応を行なった。一方、ｐＢＳＨＦ−２およびpcDNA4/myc-His(A)の切断は、まず１０×B buffer ３μｌ、ＤＮＡ １２μｌ、ＰｉｎＡI（Roche）１μl、Ｈ2Ｏ２４μlの反応液組成で、３７℃・４時間反応を行なった。反応後、エタノール沈殿を行ない、Ｈ2Ｏ １７μlに溶解した。該ＤＮＡ溶液に１０×L buffer２μｌ、ＫｐｎI（New England Biolabs 社製）１μlを加え、３７℃・４時間反応を行なった。
【０１８１】
〔抗ＰｒＰニワトリ型モノクローナル抗体生産ＣＨＯ細胞の取得〕
約２×１０5のＣＨＯ細胞（（財）ヒューマンサイエンス振興財団）に、Ｌ鎖発現用ベクター（ｐｃＣＫＬ−１）およびＨ鎖発現用ベクター（ｐｃＣＫＨ−１）各２．５μｇをPlyFect Transfection Reagent （Qiagen社）を用いてトランスフェクションを行なった。トランスフェクションの方法については、操作マニュアルにしたがって行なった。
【０１８２】
トランスフェクション開始から４８時間後、４００μg／ｍｌ Geneticin（Sigma社）と２００μｇ／ｍｌ Zeocine（Invitrogen社）を用いて上記薬剤耐性細胞をセレクトした。さらに上記薬剤耐性細胞を、１０％ fetal bovine serum（ＦＢＳ）を含むＦ１２ media (GIBCO BRL社) を用いて、５％ ＣＯ2、３７℃の条件で３日間培養を行なった。当該培養にて得られた培養液上清について、後述するＥＬＩＳＡ法によって、最終的に抗ＰｒＰニワトリ型モノクローナル抗体生産ＣＨＯ細胞を選抜した。なお、Ｆｕｌｌ−ＰｒＰ抗体・Δ７ａａ−ＰｒＰ抗体・ΔＣＨ２−ＰｒＰ抗体・ΔＦｃ−ＰｒＰ抗体それぞれについて抗ＰｒＰニワトリ型モノクローナル抗体生産ＣＨＯ細胞を取得した。なお以下それぞれの細胞をＦｕｌｌ−ＰｒＰ抗体生産ＣＨＯ細胞・Δ７ａａ−ＰｒＰ抗体生産ＣＨＯ細胞・ΔＣＨ２−ＰｒＰ抗体生産ＣＨＯ細胞・ΔＦｃ−ＰｒＰ抗体生産ＣＨＯ細胞と称する。
【０１８３】
〔ＥＬＩＳＡ法〕
各抗ＰｒＰニワトリ型モノクローナル抗体生産ＣＨＯ細胞を上記培養条件にて培養を行なった。細胞数約１×１０6／ｐｌａｔｅにそろえ、３日間培養した。当該培養液上清について、抗原に対する反応性をＥＬＩＳＡ法によって調べた。
【０１８４】
ＥＬＩＳＡプレートに抗原ヒトプリオンタンパク質２５−４９残基ペプチド（Ｈ２５）を４℃、一晩の条件で固相化した。２５％ Block Ace （雪印乳業社製）入りＰＢＳで、３７℃・１時間でブロッキングを行なった。洗浄後、各細胞培養液上清を加えて３７℃・１時間インキュベートした。さらに洗浄後、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ニワトリIgG(H+L)（Kirekegaard and Perry Laboratories 製）を加え、３７℃・１時間インキュベートした。洗浄後、o-フェニレンジアミンを用いて発色し、４９０ｎｍの吸収を測定した。表１にその結果を示す。
【０１８５】
【表１】
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【０１８６】
よって取得したＦｕｌｌ−ＰｒＰ抗体生産ＣＨＯ細胞・Δ７ａａ−ＰｒＰ抗体生産ＣＨＯ細胞・ΔＣＨ２−ＰｒＰ抗体生産ＣＨＯ細胞・ΔＦｃ−ＰｒＰ抗体生産ＣＨＯ細胞が生産する抗体全てについて、確かな抗原に対する反応性があった。
【０１８７】
上記の結果から、ニワトリ型モノクローナル抗体が抗体として機能するためには、Ｈ鎖は必ずしも全長である必要はないこと、またＣＨ４領域及びＣＨ３領域についても必ず有している必要はないこと、さらにはＬ鎖とＨ鎖のＳ−Ｓ結合に必要な領域およびＨ鎖同士のＳ−Ｓ結合に必要な領域（ＣＨ２領域のシステイン残基）を少なくとも有していれば抗体として機能するということがわかった。
【０１８８】
〔ウエスタンブロット法による抗体タンパク質の検出〕
上記ＥＬＩＳＡ法で用いた同様の培養液上清にサンプルバッファーを加え，１０分間煮沸し、７．５％ゲルにてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。泳動終了後、ウエットタイプブロッターを用い、Immuno-Blot PVDF membrane（Bio-RAD社製）へ転写した。転写後、５％スキムミルクおよび０．０５％ Tween 20 を含むＰＢＳでブロッキングを行なった。洗浄後、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ニワトリIgG Fab fragment（Bethyl社製）と室温で１時間反応させた。反応終了後、ECL plus（Amersham Pharmacia社）を用いて発色させた。そのシグナルは、イメージアナライザー（富士フィルム社製）により解析した。
【０１８９】
その電気泳動図を図８に示す。図８は左端レーンからＦｕｌｌ−ＰｒＰ抗体・Δ７ａａ−ＰｒＰ抗体・ΔＣＨ２−ＰｒＰ抗体・ΔＦｃ−ＰｒＰ抗体の結果を示す。還元剤であるβ−メルカプトエタノールをサンプルバッファーに加えていないため、Ｓ−Ｓ結合が切断されない。したがって、各抗体生産ＣＨＯ細胞が生産する抗体が、２量体を形成しているのかどうかを調査することができる。表２に塩基配列から推定されるアミノ酸配列により計算した各抗体の推定分子量（ｋDa）を示した。
【０１９０】
【表２】
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【０１９１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の分子量は推定分子量より大きくなる。これは糖鎖修飾が行われるためである（Ｆｕｌｌ−ＰｒＰ抗体・Δ７ａａ−ＰｒＰ抗体で６ヶ所，ΔＣＨ２−ＰｒＰ抗体・ΔＦｃ−ＰｒＰ抗体で４ヶ所）。これらの結果から、すべての抗体がＨ２Ｌ２（図８中矢印で示す）の２量体を形成していると考えられた。しかしながら、Ｆｕｌｌ−ＰｒＰ抗体とΔＦｃ−ＰｒＰ抗体においては、ＨＬの単量体（図８中矢印で示す）が存在していた。
【０１９２】
〔Ｆｕｌｌ−ＰｒＰ抗体生産量の検討〕
Ｆｕｌｌ−ＰｒＰ抗体生産ＣＨＯ細胞の該抗体の生産量をＥＬＩＳＡ法によりにより測定し、ＨＵＣ２−１３のそれと比較した。
【０１９３】
Ｆｕｌｌ−ＰｒＰ抗体生産ＣＨＯ細胞とＨＵＣ２−１３産生ハイブリドーマを、１×１０6 cells／plateにそろえ、２４時間培養後の培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法に用いた。
【０１９４】
ＥＬＩＳＡ法は、マウスモノクローナル抗体抗ニワトリIgG (H) 1γをプレートに固相化した。それ以外については上述と同様の方法を用いた。検出は、アルカリフォスファターゼ標識抗ニワトリIgG light chain を用いた。P-ニトロフェニルフォスフェートを用いて発色させ，４０５ｎｍの吸収を測定した。標準抗体として、精製卵黄抗体を用いた。
【０１９５】
Ｆｕｌｌ−ＰｒＰ抗体生産ＣＨＯ細胞の結果は１５μg／１×１０6cells／２４ｈであるのに対してＨＵＣ２−１３産生ハイブリドーマの場合は、１μg／１×１０6cells／２４ｈであった。この結果から、Ｆｕｌｌ−ＰｒＰ抗体生産ＣＨＯ細胞はＨＵＣ２−１３産生ハイブリドーマに比して１５倍の多く抗体を発現していることが分かった。すなわち本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法によれば、目的の抗体を高生産することができるということがわかった。
【０１９６】
（実施例２：抗ＰｒＰニワトリ型モノクローナル抗体の精製）
上記実施例１において、ＨＬの単量体が見られたＦｕｌｌ−ＰｒＰ抗体とΔＦｃ−ＰｒＰ抗体について、ニッケルカラムによる精製を行なった。ニッケルカラムによる精製は、生産した各ニワトリ型モノクローナル抗体Ｈ鎖のＣ末端にヒスチジンタグを付加しているために行なうことができる。方法は以下のとおりにした。
【０１９７】
Ｆｕｌｌ−ＰｒＰ抗体生産ＣＨＯ細胞およびΔＦｃ−ＰｒＰ抗体生産ＣＨＯ細胞を１０％ ＦＢＳ添加Ｆ１２ media にて培養後、無血清のＦ１２ media に交換し、３〜４日培養を行なった。その培養液上清を回収し、ろ過により死細胞を除いた。その試料と、purification buffer（50 mM Na-phosphate pH 7.5, 0.5 M NaCl）で平衡化したProBond resin（Invitrogen社製ニッケルレジン）とを混合し、遠心分離によりレジンに吸着しなかったものを除いた。その後、１０ｍＭ イミダゾールを含むpurification bufferで洗浄を行なった。抗体の溶出は、１００ｍＭまたは２００ｍＭのイミダゾールを含むpurification bufferを用いて行なった。溶出画分について非還元条件下および還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。バンドの検出は、クマシー染色により行なった。その結果を図９に示す。
【０１９８】
図９は、左端レーンから順にＦｕｌｌ−ＰｒＰ抗体（非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ΔＦｃ−ＰｒＰ抗体（非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、Ｆｕｌｌ−ＰｒＰ抗体（還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ΔＦｃ−ＰｒＰ抗体（還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の結果を示した。また図中に各抗体のＨ鎖、Ｌ鎖を矢印にて示した。
【０１９９】
ニッケルレジンを使用することにより、Ｆｕｌｌ−ＰｒＰ抗体、ΔＦｃ−ＰｒＰ抗体ともほぼ精製することができた。さらに、還元状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なうと、Ｈ鎖とＬ鎖に分離することができた。なおＬ鎖は２本検出されたが、これは高分子のバンドが、糖鎖修飾を受けたもの、低分子のバンドが糖鎖修飾を受けてないものである。このようなＬ鎖が２つ検出されることは，ニワトリのモノクローナル抗体や，卵黄抗体でも認めらる現象である。
【０２００】
以上の結果より本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法で生産した抗体は、簡単な操作で精製が可能であるということがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０２０１】
本発明にかかるニワトリ型モノクローナル抗体の生産方法等によれば、種々の抗原に対する完全長ニワトリ型モノクローナル抗体を、ＣＨＯ細胞等で効率良く大量生産することが可能となる。また、必要に応じてＨ鎖のＣ末端側から７アミノ酸欠失した構造改変ニワトリ型モノクローナル抗体・ＣＨ２領域のシステイン残基を残して５５アミノ酸残基を欠失した構造改変ニワトリ型モノクローナル抗体・ＣＨ３領域とＣＨ４領域をともに欠失させた構造改変ニワトリ型モノクローナル抗体も生産が可能である。
【０２０２】
それゆえ、非特異的反応のない高感度抗原検出系の確立することが可能となる。さらには、当該高感度抗原検出系を用いた各種疾患の診断薬、診断方法、並びに食品、化学薬品等の品質検査方法を提供することができるという効果を奏する。加えて、本発明にかかるモノクローナル抗体の生産方法の技術をヒト型抗体へ応用することによって、各種疾患の治療薬の提供が可能となるという効果を奏する。
【０２０３】
よって本発明は、医薬品工業、食品工業、化学工業をはじめとする広範な分野で有効に利用できる。さらには、本発明にかかる形質転換体に導入されたベクター、宿主細胞等をニワトリ型モノクローナル抗体の生産キットとして市販することも可能となるので、実験・研究用の試薬産業等にも応用することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】各モノクローナル抗体（Ｆｕｌｌ抗体・Δ７ａａ抗体・ΔＣＨ２抗体・ΔＦｃ抗体）の構造を示す模式図である。
【図２】ＨＵＣ２−１３のｍＲＮＡを鋳型とし、上記第一プライマーセットを用いてＰＣＲを行なった増幅産物（Ｌ鎖遺伝子）のＨｉｎｄIII認識配列〜ＸｂａI認識配列間の塩基配列（配列番号９）、およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示す図である。
【図３】ＨＵＣ２−１３のｍＲＮＡを鋳型とし、上記第二プライマーセットを用いてＰＣＲを行なった増幅産物（Ｈ鎖遺伝子）のＫｐｎI認識配列〜ＰｉｎＡＩ認識配列間の塩基配列（配列番号１１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）を示す図である。
【図４】ＨＵＣ２−１３のｍＲＮＡを鋳型とし、上記第二プライマーセットを用いてＰＣＲを行なった増幅産物（Ｈ鎖遺伝子）のＫｐｎI認識配列〜ＰｉｎＡＩ認識配列間の塩基配列（配列番号１３）およびアミノ酸配列（配列番号１４）を示す図である。
【図５】ＨＵＣ２−１３のｍＲＮＡを鋳型とし、上記要領でＰＣＲを行なった増幅産物（Ｈ鎖遺伝子）のＫｐｎI認識配列〜ＰｉｎＡＩ認識配列間の塩基配列（配列番号１５）およびアミノ酸配列（配列番号１６）を示す図である。
【図６】ＨＵＣ２−１３のｍＲＮＡを鋳型とし、上記第二プライマーセットを用いてＰＣＲを行なった増幅産物（Ｈ鎖遺伝子）のＫｐｎI認識配列〜ＰｉｎＡＩ認識配列間の塩基配列（配列番号１７）およびアミノ酸配列（配列番号１８）を示す図である。
【図７】（ａ）はＬ鎖発現用ベクターの構築方法を示す概略図であり、（ｂ）はＨ鎖発現用ベクターの構築方法を示す概略図である。
【図８】実施例１においてＦｕｌｌ−ＰｒＰ抗体・Δ７ａａ−ＰｒＰ抗体・ΔＣＨ２−ＰｒＰ抗体・ΔＦｃ−ＰｒＰ抗体をウエスタンブロット法によって検出した結果を示す図である。
【図９】実施例２においてＦｕｌｌ−ＰｒＰ抗体とΔＦｃ−ＰｒＰ抗体について、ニッケルカラムによる精製を行なった結果を示す電気泳動図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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