(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
球状の多孔質リン酸カルシウム系セラミックス粒子を容器に敷き詰め、敷き詰められた前記多孔質リン酸カルシウム系セラミックス粒子に接触する様に細胞を播種し、培養して得られる、細胞とセラミックス粒子を結合させたシート状の担体を複数枚形成した後、前記シート状の担体と生分解性材料シートを交互に積層させた状態で更に培養して得られる骨再生補綴物の製造方法。
【請求項２】
前記生分解性材料シートが、ＰＬＬＡ不織布である請求項１に記載の骨再生補綴物の製造方法。
【請求項３】
多孔質リン酸カルシウム系セラミックス粒子間隔が、２００μｍ以下である請求項１に記載の骨再生補綴物の製造方法。
【請求項４】
前記リン酸カルシウム系セラミックスが、ハイドロキシアパタイト、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウムから選ばれる請求項１に記載の骨再生補綴物の製造方法。
【請求項５】
前記球状の多孔質リン酸カルシウム系セラミックス粒子の径が１００〜５００μｍである請求項１に記載の骨再生補綴物の製造方法。
【請求項６】
多孔質リン酸カルシウム系セラミックス粒子に細胞を播種して培養する時間が、温度36〜37℃で、24〜72時間であり、積層状態で培養する時間が、温度37℃で、0.001〜1000時間である請求項１に記載の骨再生補綴物の製造方法。
【請求項７】
細胞は、骨髄由来細胞を含む幹細胞、成熟期細胞である骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の骨再生補綴物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、骨再生補綴物の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
1. 背景
大きな骨欠損を修復する方法として，以前は金属やセラミックスなどの材料で補強，または補填する方法が用いられていた。
【特許文献１】
例えば特開昭５６−１８８６４号公報の様な、表面にリン酸カルシウム被覆層を有するチタン、金などの金属インプラントが示される。
しかしこの方法には，自家骨が傷つく，炎症が起こる，若年者には用いられない，などの問題があった。そこで近年，骨髄又は骨膜由来の間葉系幹細胞を生体親和性の高い材料に播種し，欠損部に移植することで，骨の新生を促す治療法が用いられている。
【特許文献２】
特開昭58-58041号公報には、連続気孔を有するリン酸カルシウム化合物からなる海綿状多孔体にコラーゲンを含浸させた骨充填材が開示されているが、全てが異物であり十分な補綴能力を発揮するものには至っていない。
この治療法において，細胞を播種する足場である担体に求められる性質は以下の3点である。１．細胞を保持できる，２．新生骨に置換される，３．内部の細胞が壊死しない。ところが、新生骨への置換が進みにくい、内部の細胞が壊死を起こすなどの問題がある。血管が導入されにくいのもこの方法の問題点である。
【特許文献３】
特開平10-108575号公報
この文献には、球形の多孔質セラミックス粒子の製造方法が記載されており、当該粒子を用いた骨充填材が示されている。ビーズは生体親和性・細胞適合性に優れ，表面積が大きいため，より速やかに新生骨に置換されると考えられる。
しかし、顆粒状のビーズでは、補綴物としての、形態を形成するには、更に、型枠を用いる必要があり、取り扱いには、煩雑さが残るものである。移植部位からの脱けだすことも多い。
【０００３】
【本発明が解決しようとする課題】
目的
本発明は，内部まで細胞が存在し，壊死を起こさない細胞担体の開発を目的とし、細胞部位に効率良く栄養素が行き渡るような構造を検討した上で、その構造が応用性を持つための方法を検討した。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、多孔質セラミックス粒子（ビーズの一形態）を一層敷き詰めた状態で骨髄由来細胞を播種すると，細胞外マトリックスの接着力でシート状の組織である担体（ビーズシート）（図1）が形成可能であることを知見し、本発明に到達したものである。図１（a）は,実際のビーズシートをピンセットＰで持ち上げた図であり、図１（b）は,ビーズシートＢを側面から模式的にとらえた図である。図１（c）は、ビーズシートＢをピンセットで持ち上げたところを写真で示した図１（a）を線図により模式的に示した図である。図１で示すビーズシートＢの厚みＡは、おおよそ500μmであるが、一例であり、それ以上の厚さ又はそれ以下の厚さであっても良い場合もある。例えば、ビーズを細胞が完全に覆ってしまった状態で、厚みがあるシートを形成しても良い場合もある。
【０００５】
更に本発明者らは、担体内部の細胞の壊死を防ぐには，栄養の分散が必要であり，それを実現するうえでビーズシートのシート形状は有用である。これを用いて，ある程度の大きさを持ちながら，内部まで細胞が存在し壊死しない担体として「骨再生ユニット」を作製する。
即ち、細胞とビーズ状、粉末状、ブロック状、多孔質状、表面に凹凸を有する形態の連結用部材とを結合し、シート状の補綴物用、細胞培養用担体を得ると共に、新たな細胞培養方法を提案するに至った。表面に凹凸を有する形態とは、例えば、多孔質までとはいわないが、１乃至複数の窪みをもつ形態が例示される。多孔質状とは、少なくとも一つの孔を持つものを含む場合もあり、少なくとも細胞が、連結用部材の表面に付着的な状態を有する連結部材であれば、いかなるものでも良く、その形状も限られるものではない。
当該連結用部材は、多孔質粒子、少なくとも表面に凹凸のある粒子、ガラス粒子、生理活性物質、有機化合物質、無機化合物質から選ばれた１乃至複数のもので形成されればよく、単独の他、例えば、無機化合物質と有機化合物質の複合部材により形成されても良い。
【０００６】
本発明は、連結用部材を細胞によって連結する構成を一例として取り得るものであって、本発明における連結用部材としては、例えば無機化学物質の一つであるセラミックスが適当である。又当該連結用部材の比重は、おおよそ３程度が好ましい。又当該連結用部材としてビーズ状のものを選択した場合は、その粒径は１００〜５００μmが保形性等の点で好ましい場合もある。
その他有機化学物質であるポリ乳酸、ポリグリコール酸などの高分子樹脂、PRPのような生理活性物質、絹のような動物由来繊維等でも可能な場合もあり、特にこれら無機乃至有機物質に限定されない。
【０００７】
本発明におけるセラミックスは、生体親和性を有するものであれば良く、例えば、アルミナ、ジルコニア、リン酸カルシウム系化合物が示され、その中でも、リン酸カルシウム系セラミックスが生体親和性において、優れている点で、好ましく、より具体的には、ハイドロキシアパタイト、α−リン酸三カルシウム、β−リン酸三カルシウムが例示され、その中でも、難溶解性を有するβ−リン酸三カルシウムが細胞を培養する基材として長時間使用するためには優れている。有機化合物素材としては水酸基、カルボキシル基、アミノ基などの官能基がある樹脂素材が適当であるが、プラズマ処理などにより、カルボキシル基などの前記官能基を導入することができるため特に限定されない。生理活性物質としてはPRPなどの成長因子を含んだもの、コラーゲンのような生体素材、ガラスのような無機物でも細胞接着性のすぐれているものが適当である。
当該プラズマ処理によれば、非生分解性ポリマーによるシート部材を生分解性ポリマーによる部材で挟み込み、更に連結部材と、細胞よりなるビーズシートで挟み込み結合させるような、多層担体を形成する際有効である。
【０００８】
細胞を結合するための素材の大きさは、１00  〜500μｍが好ましく、空隙率は、10  〜40  ％が細胞との結合速度、等の点から好ましい。その製法は、特に限定されないが、例えばセラミックスの場合は、特開昭６２−３６０８３号公報に記載された手法や、特開平10-108575号公報に開示された手法が用いられる。
本発明で示される細胞は、骨髄由来細胞を含む幹細胞、ES細胞、さらに成熟期細胞としては骨芽細胞、破骨細胞、骨細胞（成長因子を含む場合もある）肝細胞、繊維芽細胞等の動物細胞、植物細胞等が例示されるが、これらに限るものではない。
これらの細胞は、生体に補綴する場合は、自家細胞が好ましいが、これに限らず、少なくとも、拒絶反応の程度が影響のないものであれば、良く、これら細胞は、１種類ではなく多数の種類を複合的に用いたものであっても良い場合もある。
本発明は、厚さをビーズ状、粒子状またはブロック状、表面に凹凸を有する形態、多孔質状の直径または高さとしたシート材、もしくは繊維状のものの繊維質の幅のシートを形成できるほか、当該シートの製法によれば、そのまま３次元細胞培養すらも可能とするのであり、細胞培養方法としても有用である。尚、連結用部材中に、血管誘導因子等を含浸させたものであっても良い。
【０００９】
培養方法例としては、次の行程が示される。
１．ビーズ（多孔質粒子）を敷き詰める。
その場合、粒子が隣接する程度、好ましくは〜200μｍの間隔に敷き詰められればよい。
２．次に目的とする細胞を播種する。
この播種は、例えば、敷き詰められたビーズに一様に接触する程度に行われる。
３．その状態で、その他培養するための成分培地、成長因子、血清などを添加し、温度36〜37℃で、時間24〜72時間培養する。
【００１０】
本発明では、細胞とセラミックス粒子を結合させたシート状にしたものにより、容積の大きな補綴物、を形成可能とするが、その積層する枚数としては、例えば、3〜6枚が好ましいがこれに限るものではない。
本発明では、複数の積層構成を形成する際は、例えばポリ乳酸等の高分子樹脂よりなるシート（厚み0.001〜10mm）を介在させて積層させる。
高分子シートを介して、当該ビーズシートを積層させる場合、分散させたビーズ上に細胞を播種した状態に高分子シートを乗せその上に上述した３つの工程に基づいてビーズと細胞の配列を形成する。所望の積層数までこれを繰り返した後、培養成分の添加により、温度37℃、時間0.001〜1000時間培養してもよい。好ましくは1日〜1週間が適当である。
本発明は、更に、当該担体内部に血管を導入する構成をとり得る。例えば、  b-FGF:basic fibroblast growth factor、a-FGF:acidic fibroblast growth factor、EGF、VEGF、IGF、TGF-β、Angiopoietin-1,2等の血管誘導因子を添加することや、血管内皮細胞など血管細胞を播種することで、担体内部に、セラミックス粒子の空隙を利用して導入することを可能とし、より実用化された生体移植用担体の製造を可能とする。
【００１１】
本発明は、複数のシートを積層する際、生理活性物質、生分解性素材、有機化合物、繊維状素材、細胞、細胞成長因子を含む機能層を設けることで、血管を誘導する誘導性により補綴後の生体結合性が高い補綴物或いは、細胞培養担体が得られるが、その際、機能層を設けた補綴物の製造方法の一例を示す。
最初、連結用部材と細胞の組み合わせよりなるシートを上述の製法に従って複数枚製造する。これら複数枚のシートを重ねた状態で、コラーゲン、  ポリ乳酸等の機能用材料を含む溶液に浸す。
すると、溶液中で個々のシートは、その縁部が湾曲しているため、シート間に隙間が生じているので、このシート間の間隙にコラーゲンが入り込み、機能性部材を介した担体、試験片が形成されるのである。
この製法によれば、特に機能層を重ねるための種々の工程（例えば、積層と乾燥を繰り返す工程）の必要が無く、簡単に積層部材を形成することができる。機能層は、その他の手法で介在させても良い場合もある。
又、当該溶液に、血管誘導因子等を含ませることで、容易に複合的な機能層を形成させることができる。
機能層には、細胞の為の栄養成分を含ませるほか、後述する成長因子等を含ませたものであってもよい。
更に本発明では、上述した血管内皮細胞等の血管誘導能を有する因子等を機能層に含ませることで、担体内部に血管が入り込み、細胞が壊死せず、新生骨への置換を促進させるなど生体組織として事実上同化した状態を形成することができる。
【００１２】
本発明の製造方法の一例を以下に示す
ビーズの作製
ビーズは、特開平10-108575号公報に記載された手法に基づき、β―リン酸三カルシウムを原料としたスラリーを液体窒素に滴下後、これを乾燥、焼成して多孔質状の粒子を得た。
（1）ビーズシートの作製方法
ビーズシートを利用するために，シートが形成される条件を明らかにし，安定した作製を可能にする作製方法を確立する必要があった。そこで，2cm×2cmの面積を持つウェルディッシュにビーズを敷き詰め，そこにそれぞれ１０6,１０7,１０8の細胞を播種し，シート化するかを調べた。また直径1cmの円形のウェルでも同様の実験を行った。
【００１３】
（2）骨細胞への分化
ビーズシートは骨髄由来細胞を用いて作製するが，これらの細胞の中にはまだどの組織の系統にも分化していない未分化の間葉系幹細胞が含まれていると考えられる。適当な成長因子を付加することで，この未分化の細胞に骨系の分化を促すような環境を与え，ビーズシートの変化を調べた。加えた成長因子を以下に示す。
100nM  dexamethasone
0．05mM  ascorbate 2-hosphate
10mM  β-glycerophosphate
【００１４】
（3）「骨再生ユニット」の作製・移植
ビーズシート（厚さビーズの粒径前後）とPLLA不織布（厚さ１cm）を交互に積層・接着し，培養した。PLLA不織布は生分解性材料であり，これをビーズシート間に挟むことで，栄養が運搬される隙間を持たせることができる。さらに生体内では，この隙間に血管の新生が期待できる。この点を検証するために，作製した骨再生ユニットをヌードマウス皮下に移植・回収し，染色によってその結果を調べた。
【００１５】
結果と考察
（1）ビーズシートの作製方法
形成条件を調べた結果，2cm×2cmのウェルに対して１０6の細胞を播種するのが適当であると分かった。また使用するビーズの径は150〜460μm，容器はチャンバースライドＣＤ（図2），培養日数は３日が適しているとわかり，この条件でビーズシートを作製した。チャンバースライドＣＤを用いて，シートＢを空気中に出さずにシャーレＳＲに移動する作製方法を確立し，ビーズシートＢの安定した作製が実現された。
【００１６】
（2）骨細胞への分化
成長因子を加えたことでビーズシートの強度は明らかに向上した。これをアリザリンレッド染色し，カルシウムＣを検出した（図3）。図３（a）は、写真図であり、図３（b）は、（a）の模式図である。これらの結果から，シート上の細胞が骨系に分化している可能性は高い。三週間の培養の結果では、骨分化の証拠であるアルカリフォスファターゼ染色で染色される事実を確認し、骨細胞への分化が行われていることを確認した。
【００１７】
（3）骨再生ユニット
染色の結果，骨再生ユニット中では移植から3週間の後でも内部まで細胞が生存していることが確認された（図４）。  図４（a）は、写真図であり、図4（b）は、（a）の模式図である。マウス皮下より回収したユニットの表面の様子から，材料の工夫などによって血管侵入する担体の作製は十分実現可能である。
【００１８】
【発明の効果】
結論
以上のように，連結部材と細胞からなるシートの作製方法を確立し，内部まで細胞が壊死しない担体の開発には成功した。これは血管侵入を前提とした担体という，新たな概念を導くものであり、長期間の使用に耐え得る補綴物、細胞培養基材及び簡易で、しかも効率的な３次元の細胞培養を実現する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例を示す図である
【図２】図１で示した実施例を説明するための図である
【図３】図１で示した実施例を説明するための図である
【図４】図１で示した実施例を説明するための図である
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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