(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋梗塞の罹患危険性の判定方法であって、配列番号１に示すgalectin-2遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基がＣである場合は、心筋梗塞の発症の可能性が高く、Ｔである場合は心筋梗塞の発症の可能性が低いと判定する方法。
【請求項２】
配列番号１に示すgalectin-2遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、又はその相補配列にハイブリダイズすることができ、請求項１に記載の方法においてプローブとして用いるオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
請求項２に記載のオリゴヌクレチドの１種以上を含む、心筋梗塞診断用キット。
【請求項４】
配列番号１に示すgalectin-2遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基におけるＣ／Ｔの多型を検出することを含む、galectin-2の発現状態の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、galectin-2（ガレクチン−２）遺伝子に存在する遺伝子多型を検出することを含む炎症性疾患の診断方法、該方法に使用されるオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを含む炎症性疾患診断用キット、並びにそれらの利用に関する。
【背景技術】
ライフスタイルの変化及び新しい薬理学的アプローチにも関わらず、心筋梗塞を含む冠状動脈疾患は多くの国々において主要な死亡原因となっている（Breslow, J.L., Nature Med.3, 600-601, 1997;Braunwald, E., N.Engl.J.Med., 337, 1360-1369,1997）。従って、それらの発症における遺伝的及び環境的因子を同定することが強く望まれている。
共通の遺伝的変異は、糖尿病や高血圧症などの生活習慣病に罹患する危険性と顕著に関連していることが知られている（Risch, N., et al., Science, 273, 1516-1517, 1996; Collins, F.S., et al., Science, 278, 1580-1581, 1997; Lander, E.S., et al., Science, 274, 536-539, 1996)。多遺伝子性疾患の感受性遺伝子を同定するには、「連鎖」を利用する方法と、「関連」を利用する方法がある。連鎖解析では、疾患感受性遺伝子の座位と遺伝マーカー(主としてマイクロサテライト)の座位が連鎖しているかを検出する、すなわち遺伝子座位間の関係を調べるのに対して、関連解析では特定の遺伝マーカー（主として一塩基多型：ＳＮＰ）のどの型（アレル：対立遺伝子）が疾患と関連しているかを検出する、つまり対立遺伝子間の関係を調べる。従って、共通の変異をマーカーとして用いる関連解析は疾患関連遺伝子の局在に対する連鎖解析のよりもずっと強力といえる。一塩基多型（ＳＮＰｓ）は、疾患易罹患性や薬剤反応性に関連する遺伝子を探索する際の有用な多型マーカーとなる。ＳＮＰｓは、遺伝子産物の質や量に直接影響を与えたり、ある疾患や薬剤による重篤な副作用に対する危険性を増やすことがある。よって、多くのＳＮＰｓを探索することにより、疾患関連遺伝子の同定や薬剤による副作用を避ける診断方法の確立に寄与できることを期待される。
遺伝子変異と心筋梗塞との関係については、これまでヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の多型を分析して心筋梗塞の遺伝的要因を判定する方法（特開２００２−１３６２９１号公報）などがある。しかしながら、心筋梗塞と関連のある遺伝子変異の解明は未だ十分なものではない。
一方、現在までの所、哺乳類には１０種類のガレクチンが知られている。そのうちのgalectin-2はgalectin-1に対して４３％と高い相同性を示す。galectin-2はgalectin-1と同様、１４ｋＤａのサブユニット２つからなる非共有結合性の二量体を形成し、還元剤非存在下では自己凝集し、活性を失う。また、galectin-2はgalectin-1と比較して組織分布は狭い。galectin-1の場合、筋肉等の間充組織をはじめ様々な細胞系列に豊富に存在するが、galectin-2は正常成人組織の中では下部小腸を主とした上皮細胞に多く認められる。galectin-2の詳細な機能につてはまだ解明されていない（Trends in Glycoscience and Glycotechnology Vol.9, No.45, (1997) pp.87-93）。
【発明の概要】
本発明は、心筋梗塞等の炎症性疾患の発症進展に関与する新規な一塩基多型（ＳＮＰ）を同定することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、同定したＳＮＰを利用して、心筋梗塞等の炎症性疾患の診断法、又は炎症性疾患の治療薬の開発法を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、galectin-1およびgalectin-2遺伝子産物が心筋梗塞感受性遺伝子産物lymphotoxin-alpha（ＬＴＡ）に結合すること、並びにgalectin-2遺伝子内の新規一塩基多型（ＳＮＰ）が心筋梗塞の発症進展に関連していることを同定することにより本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、galectin-2遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。
好ましくは、galectin-2遺伝子に存在する少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。
さらに好ましくは、配列番号１に示すgalectin-2遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基におけるＣ／Ｔの多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。
好ましくは、炎症性疾患は心筋梗塞である。
本発明の別の側面によれば、配列番号１に示すgalectin-2遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、又はその相補配列にハイブリダイズすることができ、請求項１から４の何れかに記載の方法においてプローブとして用いるオリゴヌクレオチドが提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号１に示すgalectin-2遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基を含む連続する少なくとも１０塩基の配列、及び／又はその相補配列を増幅することができ、請求項１から４の何れかに記載の方法においてプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドが提供される。
好ましくは、プライマーはフォワードプライマー及び／又はリバースプライマーである。
本発明のさらに別の側面によれば、上記のいずれかに記載のオリゴヌクレチドの１種以上を含む、炎症性疾患診断用キットが提供される。好ましくは、炎症性疾患は心筋梗塞である。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号１に示すgalectin-2遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基におけるＣ／Ｔの多型を検出することを含む、galectin-2の発現状態の分析方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、候補物質の存在下で細胞内のgalectin-2遺伝子又はgalectin-1遺伝子の発現量を分析し、その発現量を変化させる物質を選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法が提供される。好ましくは、候補物質の存在下で細胞内のgalectin-2遺伝子又はgalectin-1遺伝子の発現量を分析し、その発現量を減少させる物質を選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、候補物質の存在下でリンホトキシン-α（ＬＴＡ）とgalectin-2遺伝子産物又はgalectin-1遺伝子産物との結合を測定し、該結合を阻害する物質を選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号１に示すgalectin-2遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基におけるＣ／Ｔの多型を含むgalectin-2遺伝子断片を細胞に導入し、該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することを含む、galectin-2の転写活性の測定方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号１に示すgalectin-2遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基におけるＣ／Ｔの多型を含むgalectin-2遺伝子断片を細胞に導入し、galectin-2の転写活性を阻害又は促進する候補物質の存在下で該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することを含む、galectin-2の転写活性を阻害又は促進する物質のスクリーニング方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記のスクリーニング方法により得られるgalectin-2の転写活性を阻害又は促進する物質が提供される。
本発明の方法で好ましくは、前記galectin-2遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する。さらに好ましくは、前記リポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である。
本発明のさらに別の側面によれば、配列番号１に示すgalectin-2遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基におけるＣ／Ｔの多型を含むgalectin-2遺伝子断片とgalectin-2の転写制御因子の存在が予想される試料とを接触させ、上記断片と転写制御因子との結合を検出することを含む、galectin-2の転写制御因子のスクリーニング方法が提供される。好ましくは、検出はゲルシフトアッセイにより行われる。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＬＴＡとgalectin-1及び-2とのインビトロでの結合を確認した実験の結果を示す。
図２は、galectin-2遺伝子のイントロン１の３２７９Ｃ＞ＴのＳＮＰが転写活性に与える影響を調べた結果を示す。
図３は、galectin-２と微小管との相互作用を調べた結果を示す。ａはＴＡＰのタグのgalectin-２と相互作用タンパク質の単離を示す。ｂは、内因性α−チューブリンとFlagのタグのついたgalectin-2又はLTAとの共免疫沈降の実験結果を示す。ｃは、U937細胞における内因性α−チューブリンと内因性galectin-2又はLTAとの共局在の実験結果を示す。
図４は、冠状動脈粥腫切除切片におけるgalectin-2とLTAの発現及び共局在を調べた結果を示す。ａは抗ヒトLTAで染色、ｂは抗ヒトgalectin-2で染色、ｃはモノクローナル抗ＳＭＣα−アクチンで染色、ｄはモノクローナル抗CD68で染色した。ｅは、抗LTA抗体及び抗galectin-2抗体で二重染色した。ｆは、抗ヒトLTAで染色した。
【発明を実施するための形態】
本発明では、galectin-1およびgalectin-2遺伝子産物が心筋梗塞等の炎症性疾患感受性遺伝子産物として知られているlymphotoxin-alpha（ＬＴＡ）（Ozaki K et al. Nature Genetics 32, 650-654, 2002）産物と結合することを同定した。さらに、galectin-2遺伝子内の新規一塩基多型（ＳＮＰ）を同定し、それぞれ約２０００人の心筋梗塞患者群とコントロール群についてＰＣＲ−ＤＮＡシークエンス法によりタイピングし、相関解析（カイ二乗検定など）を行った結果、この新規ＳＮＰの頻度が統計学的に有意に心筋梗塞患者で少ないことを見出した。さらにルシフェラーゼアッセイ法を用いた実験により、この新規ＳＮＰが実際に生物学的機能を有し、このgalectin-2遺伝子産物量の変化が心筋梗塞に限らず様々な炎症性疾患を引き起こすことを明らかにした。
上記の通り、本発明では、ＬＴＡタンパク質に結合する新たな分子としてgalectin-1およびgalectin-2タンパク質を同定した。さらにgalectin-2遺伝子内の新規ＳＮＰが生物学的な機能を有し、心筋梗塞等の疾患に関連することを同定した。従って、本発明により同定されたgalectin-2遺伝子の新規ＳＮＰを利用することにより、心筋梗塞等の炎症性疾患の新たな診断、予防法、治療薬の開発が可能になる。以下、本発明の実施の形態についてさらに具体的に説明する。
［１］  炎症性疾患の判定方法
本発明の方法は、炎症性疾患と関連性を示すgalectin-2遺伝子に存在する遺伝子多型、特には一塩基多型（ＳＮＰｓ）を検出することによって、炎症性疾患の発症の有無、あるいは炎症性疾患の発症の可能性を判定する方法である。
本発明において「galectin-2遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型（一塩基多型など）を検出する」とは、（ｉ）当該遺伝子多型（遺伝子側多型と称する）を直接検出すること、及び（ｉｉ）前記遺伝子の相補配列側に存在する遺伝子多型（相補側多型と称する）を検出し、その検出結果から遺伝子側多型を推定することの双方を指すものとする。ただし、遺伝子側の塩基と相補配列側の塩基とが完全に相補的な関係にあるとは限らないという理由から、遺伝子側多型を直接検出することがより好ましい。
galectin-2遺伝子に存在する遺伝子多型の好ましい具体例としては、配列番号１に示すgalectin-2遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基におけるＣ／Ｔの多型を挙げることができる。
本明細書において、配列番号１に示すgalectin-2遺伝子のイントロン１の塩基配列において３２７９番目の塩基は、配列番号２に示すgalectin-2遺伝子のゲノム配列の３４４９番目の塩基に相当する。
例えば、後記表１に示すように、配列番号１に示すgalectin-2遺伝子のイントロン１の塩基配列の３２７９番目の塩基がＣである場合（galectin-2  イントロン１  ３２７９Ｃ）は、炎症性疾患が発症している、あるいは発症の可能性が高いと判定できる。
これに対し、配列番号１に示すgalectin-2遺伝子のイントロン１の塩基配列の３２７９番目の塩基がＴである場合（galectin-2  イントロン１  ３２７９Ｔ）は、炎症性疾患が発症していない、あるいは発症の可能性が低いと判定できる。
本明細書において、疾患の「判定」とは疾患発症の有無の判断、疾患発症の可能性の判断（罹患危険性の予想）、疾患の遺伝的要因の解明などをいう。
また、疾患の「判定」は、上記の一塩基多型の検出法による結果と、所望により他の多型分析（ＶＮＴＲやＲＦＬＰ）及び／又は他の検査結果と合わせて行うこともできる。
また、本明細書において、「炎症性疾患」とは、炎症性病態との相関が知られている細胞接着因子やサイトカインの誘導が認められる疾患であれば特に限定はされないが、例えば慢性関節リウマチ、全身性エリマトーデス、炎症性腸炎、種々のアレルギー反応、細菌性ショック、心筋梗塞や脳卒中などの動脈硬化性疾患などが挙げられ、特には心筋梗塞が挙げられる。
（検出対象）
遺伝子多型の検出の対象は、ゲノムＤＮＡが好ましいが、場合によっては（つまり多型部位及びその隣接領域の配列がゲノムと同一または完全相補的になっている場合）ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡを使用することもできる。また、上記対象を採取する試料としては、任意の生物学的試料、例えば血液、骨髄液、精液、腹腔液、尿等の体液；肝臓等の組織細胞；毛髪等の体毛等が挙げられる。ゲノムＤＮＡ等は、これらの試料より常法に従い抽出、精製し、調製することができる。
（増幅）
遺伝子多型を検出するにあたっては、まず遺伝子多型を含む部分を増幅する。増幅は、例えばＰＣＲ法によって行われるが、他の公知の増幅方法、例えばＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法等で行ってもよい。
プライマーの選択は、例えば、配列番号１（又は配列番号３）に示される配列における、前記の一塩基多型部位を含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基、より好ましくは１０〜５０塩基の配列、及び／又はその相補配列を増幅するように行う。
プライマーは、前記の一塩基多型部位を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。
増幅のために用いるプライマーは、試料が一の対立遺伝子型の場合にのみ増幅されるようにフォワードプライマー又はリバースプライマーの一方が一塩基多型部位にハイブリダイズするように選択してもよい。プライマーは必要に応じて蛍光物質や放射性物質等により標識することができる。
（遺伝子多型の検出）
遺伝子多型の検出は、一の対立遺伝子型に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより行うことができる。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な手段により標識してもよい。プローブは、前記の一塩基多型部位を含み、被検試料とハイブリダイズし、採用する検出条件下に検出可能な程度の特異性を与えるものである限り何等限定はない。プローブとしては、例えば配列番号１（又は配列番号３）に示す配列における前記の一塩基多型部位を含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基の配列、より好ましくは１０〜５０塩基の配列、又はそれらの相補配列にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを用いることができる。また、一塩基多型部位がプローブのほぼ中心部に存在するようにオリゴヌクレオチドを選択するのが好ましい。該オリゴヌクレオチドは、プローブとして機能し得る限り、即ち、目的の対立遺伝子型の配列とハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の配列とはハイブリダイズしない条件下でハイブリダイズする限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。また、プローブには、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法による増幅に用いられる一本鎖プローブ（パドロックプローブ）のように、ゲノムＤＮＡとアニールし、環状になることによって上記のブロープの条件を満たすプローブが含まれる。
本発明に用いるハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子型を区別するのに十分な条件である。例えば、試料が一の対立遺伝子型の場合にはハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の場合にはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件である。ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）に記載の条件等が挙げられる。具体的には、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡを含む溶液中プローブとともに６５℃で一晩保温するという条件等が挙げられる。
プローブは、一端を基板に固定してＤＮＡチップとして用いることもできる。この場合、ＤＮＡチップには、一の対立遺伝子型に対応するプローブのみが固定されていても、両方の対立遺伝子型に対応するプローブが固定されていてもよい。
遺伝子多型の検出は、制限酵素断片長多型分析法（ＲＦＬＰ：Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）により行うこともできる。この方法では、一塩基多型部位がいずれの遺伝子型をとるかによって制限酵素により切断されるか否かが異なってくる制限酵素で試料核酸を消化し、消化物の断片の大きさを調べることにより、該制限酵素で試料核酸が切断されたか否かを調べ、それによって試料の多型を分析する。
遺伝子多型の検出は、増幅産物を直接配列決定することによって行ってもよい（ダイレクトシークエンシング法）。配列決定は、例えばジデオキシ法、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法等の公知の方法により行うことができる。
遺伝子多型の検出はまた、変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ：denaturing gradient gel electrophoresis）、一本鎖コンフォメーション多型解析（ＳＳＣＰ：single strand conformation polymorphism）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（allele- specific PCR）、ＡＳＯ（allele-specific oligonucleotide）によるハイブリダイーゼーション法、ミスマッチ部位の化学的切断（ＣＣＭ：chemical cleavage of mismatches）、ＨＥＴ（heteroduplex method）法、ＰＥＸ（primer extension）法、ＲＣＡ（rolling circle amplification）法等を用いることができる。
［２］  炎症性疾患診断用キット
前記のプライマー又はプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、これを含む炎症疾患診断用キットとして提供できる、キットは、上記遺伝子多型の分析法に使用される制限酵素、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、標識、緩衝液等を含んでいてもよい。
［３］  galectin-2の発現状態の分析方法
本発明によればまた、前記した一塩基多型を検出することによって、galectin-2の発現状態を分析することができる。
例えば、配列番号１に示すgalectin-2遺伝子のイントロン１の塩基配列の３２７９番目の塩基がＣである場合（galectin-2  イントロン１  ３２７９Ｃ）は、galectin-2の発現量が高いと判断できる。これに対し、配列番号１に示すgalectin-2遺伝子のイントロン１の塩基配列の３２７９番目の塩基がＴである場合（galectin-2  イントロン１  ３２７９Ｔ）である場合は、galectin-2の発現量が低いと判断できる。
［４］  炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法
本発明によれば、候補物質の存在下で細胞内のgalectin-2遺伝子又はgalectin-1遺伝子の発現量を分析し、その発現量を変化させる物質を選択することによって、炎症性疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。例えば、候補物質の存在下で細胞内のgalectin-2遺伝子又はgalectin-1遺伝子の発現量を分析し、その発現量を増大又は減少させる物質を選択することができ、特に好ましくはその発現量を減少させる物質を選択することができる。さらに本発明によれば、候補物質の存在下でリンホトキシン-α（ＬＴＡ）とgalectin-2遺伝子産物又はgalectin-1遺伝子産物との結合を測定し、該結合を阻害する物質を選択することによって、炎症性疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。
上記スクリーニングの一例としては、細胞と候補物質とを接触させる工程、細胞内におけるgalectin-2遺伝子又はgalectin-1遺伝子の発現量を分析する工程、及び候補物質の非存在下の条件と比較して当該遺伝子の発現量を変化させる候補物質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程により行うことができる。
候補物質としては任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリーでもよい。候補物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
［５］  galectin-2の転写活性の測定方法
本発明によればまた、前記した一塩基多型を含むgalectin-2遺伝子断片を細胞に導入し、該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することによってgalectin-2の転写活性を測定することができる。
本発明の好ましい態様によれば、前記galectin-2遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する。
例えば、一塩基多型がプロモーター部位に存在する場合は、その一塩基多型を含む遺伝子の下流にレポーター遺伝子を挿入した系を導入した細胞を培養し、レポーター活性を測定すれば、一塩基多型による転写効率に違いを測定することができる。
ここでリポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼなどの遺伝子が用いられる。
［６］  galectin-2の転写活性を阻害又は促進する物質のスクリーニング方法
本発明においては、前記した一塩基多型を含むgalectin-2遺伝子断片を細胞に導入し、galectin-2の転写活性を阻害又は促進する候補物質の存在下で該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することによってgalectin-2転写活性を阻害又は促進する物質をスクリーニングすることできる。
本発明の好ましい態様によれば、前記galectin-2遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する。
例えば、galectin-2の発現量が有意に高いことが認められる一塩基多型（例えば、galectin-2  イントロン１  ３２７９Ｃ）を有する遺伝子の下流にレポーター遺伝子を挿入した系を導入した細胞を候補物質の存在下又は非存在下の両方の場合について培養し、候補物質の存在下で培養を行った場合にレポーター活性が下がれば、その候補物質はgalectin-2転写活性阻害物質として選択することができる。
ここでリポーター遺伝子としては、上記に挙げた遺伝子が用いられる。
候補物質としては任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリーでもよい。候補物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。
上記のスクリーニング法により得られるgalectin-2の転写活性を阻害又は促進する物質もまた本発明の範囲内である。このようなgalectin-2の転写活性を阻害又は促進する物質は、心筋梗塞治療剤、抗炎症剤、免疫抑制剤などの各種薬剤の候補物質として有用である。
［７］ galectin-2の転写制御因子のスクリーニング方法
本発明においてはまた、前記した一塩基多型を含む遺伝子断片とgalectin-2の転写制御因子の存在が予想される試料を接触させ、上記断片と転写制御因子との結合を検出することによって、galectin-2の転写制御因子をスクリーニングすることもできる。前記の一塩基多型を含む遺伝子断片とgalectin-2の転写制御因子の存在が予想される物質との結合の検出は、ゲルシフト法（電気泳動移動度シフト解析：electrophoretic mobility shift assay, EMSA）、DNase I フットプリント法等によって行うことがきるが、ゲルシフト法が好ましい。ゲルシフト法では、タンパク質（転写制御因子）が結合すると、分子サイズが大きくなり電気泳動におけるＤＮＡの移動度が低下するので、３２Ｐで標識した遺伝子断片と転写制御因子を混ぜ、ゲル電気泳動にかける。オートラジオグラフィーでＤＮＡの位置を見ると、因子の結合したＤＮＡはゆっくり動くので、通常のバンドよりも遅れて移動するバンドとして検出される。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
（Ａ）方法・材料
（１）E.coli two hybrid system
BacterioMachTMTwo Hybrid System construction kit (Stratagene社製)を用いて行った。ライブラリー作製のための培養ヒト冠状動脈血管平滑筋細胞(HCASMC)は、BioWhittaker社より購入した。１×１０7個の細胞よりFastTrack 2.0 kit(invitrogen社)を用いてｍＲＮＡを調製し、５μgのHCASMC ｍＲＮＡを用い、添付プロトコールに従ってｃＤＮＡライブラリーを作製し、添付プロトコールに従ってTwo-hybridスクリーニングを施行した。
（２）リコンビナントgalectin-1、-2、-3及びＬＴＡの作製、免疫沈降によるＬＴＡとgalectinの結合確認
galectin-1、-2、-3は、全長をpET 28 vector system (Novagen社)で組み換え体を作製し、添付プロトコールに従って大腸菌で発現、精製した。また、ＬＴＡはpET29 system (Novagen社)により作製した。抗ＬＴＡ抗体（R&D system社）はHiTrap NHS-activated HP sepharose(Amersham社）に添付プロトコールに従って架橋した（抗ＬＴＡ抗体セファロース）。ＬＴＡ−galectinの結合実験は、10mlbinding buffer[10mM Tris/HCl (pH7.5), 150mM NaCl］中に５μｇのgalectin-1あるいはgalectin-2あるいはgalectin-3を加え、さらに１時間攪拌した。１６００回転で１０分間遠心し、上清を捨て、沈殿をwash buffer[10mM Tris/HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 0.1% NP-40]で３回洗浄し、５０μｌの５×SDS-sample buffer(125mM Tris/HCl, 4% SDS, 20% glycerol, 10% beta-mercaptoethanol, 0.04% bromophenol blue, pH6.8)で溶解しサンプルとした。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動後、ニトロセルロース膜に移し、抗Ｔ７抗体（Novagen社）を用いて、ＥＣＬ法（Amersham社）によりシグナルを検出した。COS7細胞(Riken cell bank)を用いた強制発現系によるLTAとgalectin-2の相互作用(結合)の確認では、pFLAG-CMV-5a vector(コスモバイオ社)にＬＴＡを、pCMV-Myc vector (Clontech社)にgalectin-2を組み換え体として導入し、COS7細胞にFuGene reagent(ロッシュ社)を用いてトランスフェクションした。３６時間後の細胞を回収、細胞タンパク抽出バッファ[10mM Tris/HCl, 150mM NaCl, 0.5% NP-40]によりタンパクを抽出した後、非特異的吸着を抑制するために、この抽出液に50μlのprotein A sepharose (Amersham社)を加え1時間攪拌し、１６００回転で１０分間遠心し、上清を免疫沈降のサンプルとした。サンプルに５μgの抗LTA抗体を加え１７℃で１時間攪拌後、protein A sepharose５０μlを加え１７℃で１時間攪拌し、１６００回転で１０分間遠心し、沈殿をwash buffer[10mM Tris/HCl (pH7.5), 150mM NaCl, 0.1% NP-40]で３回洗浄してサンプルとした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ニトロセルロース膜に移し、抗Ｍｙｃ−ｔａｇ抗体（SANTA CRUZ社）、抗ＦＬＡＧ−ｔａｇ抗体（SIGMA社）によりシグナルを検出した。
（３）galectin-2遺伝子内ＳＮＰｓと心筋梗塞との相関解析
心筋梗塞患者とコントロール群、そのＤＮＡの採取方法、ＤＮＡのシークエンス法、ＤＮＡタイピング法、相関解析の統計学的手法は既報に従っている（Ozaki K et al. Nature Genetics 32, 650-654, 2002）。galectin-1およびgalectin-2遺伝子領域のＳＮＰｓは、それぞれ１６人の心筋梗塞およびコントロールからのＤＮＡを用いたＰＣＲダイレクトシークエンス法により同定・発見した。
（４）ルシフェラーゼアッセイ法
galectin-2遺伝子の３１８８から３４０４までのｉｎｔｒｏｎ  １  ３２７９ＣあるいはＴのＳＮＰを含む領域をゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅しgalectin-2 promoter-pGL3-enhancerベクターのルシフェラーゼの下流にクローニングした。これらのプラスミド２μｇ及び１００ｍｇのｐＲＬ−ＴＫベクター（promega社；トランスフェクション効率を合わせるための内部標準ベクター）をＨｅＬａ細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク、ＪＣＲＢ９００４）およびＨｅｐＧ２細胞にFuGene reagentを用いてトランスフェクションした。２４時間後細胞を集め、ルシフェラーゼ活性を測定した。
（５）タンデムアフィニティー精製
タンデムアフィニティー精製は、Rigaut, G et al. Nature Biotechnol, 17, 1030-1032(1999)に記載の方法に準じて行った。His tag、TEV切断部位、及びS tagをTAPtag配列としてコードする融合カセットをｐＣＭＶ−Ｍｙｃベクター（シグマ社）中に構築した。このTAPベクターは、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下で哺乳動物細胞中に、カルボキシ末端にTAPタグを有しアミノ末端にMycタグのついた標的タンパク質を発現する。TAPベクターをＨｅＬａ細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク、ＪＣＲＢ９００４）に一過性にトランスフェクションした。標的タンパク質のバンドをAPRO Life ScienceのMALDI/TOF massスペクトル測定装置により分析した。
（６）共免疫沈降実験
内因性α−チューブリンとFlagのタグのついたgalectin-2又はLTAを用いて共免疫沈降実験を以下の通り行った。Flag又はSのタグのついたLTA、galectin-2、そしてlacZ（陰性対照）をHeLa細胞にFugeneを用いてトランスフェクションした。免疫沈降は、溶解緩衝液（20mM Tris pH7.5, 150mM NaCl, 0.1％ Nonident P-40）中で行った。トランスフェクションの２４時間後、細胞を溶解し、免疫沈降を抗-Flag tag M2アガロース（シグマ社）を用いて行った。HRP結合S-プロテイン（Novagen）、抗-Flag M2ペルオキシダーゼ結合体（Sigma）又はヒトαチューブリンに対するマウスモノクローナル抗体（Molecular Probes）、及びHRP結合抗マウスIgG抗体を用いて、免疫複合体を可視化した。
（７）共焦点顕微鏡分析
ポリクローナル抗ヒトgalectin-２抗血清を、大腸菌で合成した組み換えタンパク質を用いてウサギで作成した。この抗血清は、ウエスタンブロット分析によれば、構造が類似しているgalectin-1及びgalectin-3との交差反応性を示さなかった。ポリクローナル抗galectin-２抗血清、及びヤギ抗ヒトLTA  IgG（R&D  System）又はマウス抗ヒトαチューブリンモノクローナルIgM抗体を、Alexa二次抗体（Molecular Probes）と一緒に使用した。Ｕ９３７細胞（ヒューマンサイエンス研究資源バンク、ＪＣＲＢ９０２１）を、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）（２０ｎｇ／ｍｌ）で３０分間刺激し、固定した。その後、３％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水中で対応する一次抗体、そして対応するAlexa二次抗体と一緒にインキュベートした。
（８）免疫組織化学分析
組織試料は、１６名の心筋梗塞患者から方向性冠状動脈粥腫切除術により取得した。免疫組織化学分析は、ヤギ抗ヒトLTA IgG(R&D Systems)及びウサギポリクローナル抗ヒトgalectin-2抗体を用いて既報（Minami, M et al. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 21, 1796-1800 (2001)；及びShi, S.R., et al., Hum.Mutat. 15, 7-12 (2000)）の通り行った。隣接する切片の染色は、SMC-2アクチン及びCD68に対するヒト細胞型特異的モノクローナル抗体（DAKO）を用いて行った。二重標識した免疫組織化学分析としては、切片を先ず抗LTA抗体とインキュベートし、それからビオチン化ブタ抗ヤギIgG、そしてアビジン・ビオチン・ペルオキシダーゼ複合体とインキュベートし、３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（Vector Labs）で可視化した。続いて切片をウサギポリクローナル抗ヒトgalectin-2抗体とインキュベートし、そしてアルカリホスファターゼ結合ブタ抗ウサギIgGとインキュベートし、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスフェートおよびニトロブルーテトラゾリウムクロライド（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）基質系で可視化した。
（Ｂ）結果
（１）心筋梗塞感受性遺伝子産物ＬＴＡに結合するタンパク質の同定（スクリーニング）
ＬＴＡに結合する新規タンパクをスクリーニングするためにE.coli two hybrid-systemを利用し血管平滑筋細胞由来two hybrid-libraryより、ＬＴＡの結合候補タンパク質としてgalectin-1を同定した。
（２）ＬＴＡとgalectin-1，２のインビトロでの結合の確認
リコンビナントgalectin-1（Ｔ７ｔａｇをＮ末端側に結合）及びＬＴＡをそれぞれ個別に大腸菌で発現、精製後、抗ＬＴＡ抗体架橋セファロースとこれらを反応し、洗浄後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗Ｔ７抗体を用いたウエスタンブロット法によりgalectin-1を検出した（図１ａ）。
図１ａにおいて、レーン１では、galectin-1を抗ＬＴＡ抗体セファロースを用いて免疫沈降した（陰性コントロール）。レーン２では、galectin-1とＬＴＡとをインキュベートし、複合体を抗ＬＴＡ抗体セファロースを用いて免疫沈降した。レーン３では、１００ｎｇの組換えgalectin-1を陽性コントロールとして用いた。星印は、抗ＬＴＡ抗体セファロース中のイムノグロブリン（Ｉｇ）重鎖及び軽鎖に由来する非特異的バンドを示す。
また、galectin-1と高いホモロジーを有するgalectin-2および−３についても大腸菌よりリコンビナントプロテインを作製して、同様の手法によりＬＴＡとの結合を確認したところ、galectin-2もＬＴＡと結合することが明らかとなった（図１ｂ）。
図１ｂでは、ＬＴＡと共沈降したGalectinを、抗Ｔ７ｔａｇモノクローナル抗体と西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧを用いたウエスタンブロット分析により検出した。レーン１では、galectin−３とＬＴＡとをインキュベートし、抗ＬＴＡ抗体セファロースを用いて免疫沈降を行った。レーン２では、galectin-2とＬＴＡとをインキュベートし、複合体を抗ＬＴＡ抗体セファロースを用いて免疫沈降した。レーン３では、galectin-2を抗ＬＴＡ抗体セファロースを用いて免疫沈降した（陰性コントロール）。レーン４及び５では、１００ｎｇのgalectin−３（レーン４）又はgalectin-2（レーン５）を陽性コントロールとして用いた。星印は、抗ＬＴＡ抗体セファロース中のイムノグロブリン（Ｉｇ）重鎖及び軽鎖に由来する非特異的バンドを示す。
さらに、galectin-2については、ＬＴＡ  Ｔｈｒ２６及びＬＴＡ  Ａｓｎ２６（Ozaki K et al. Nature Genetics 32, 650-654, 2002）とのＣＯＳ７細胞（サル腎臓細胞株）への共強制発現系を用いた実験系により、その結合を培養細胞レベルでも確認した（図１ｃ）。
図１Ｃは、抗ＬＴＡ抗体を用いたＬＴＡとgalectin-2との共免疫沈降の結果を示す。ＣＯＳ７細胞にＭｙｃタグ付きgalectin-2プラスミド又はＦＬＡＧタグ付きＬＴＡプラスミド（Ｔｈｒ２６またはＡｓｎ２６）をトランスフェクションし、ライセートを調製し、プロテインＡセファロースと抗ＬＴＡ抗体とを使用して免疫沈降に供した。ＬＴＡと共沈したGalectin-2を、Ｍｙｃ（Galectin-2）又はＦＬＡＧ（ＬＴＡ）−抗モノクローナル抗体−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を使用したウエスタンブロット分析により検出した。レーン１及び２では、ＬＴＡ  ２６  Ｔｈｒ（レーン１）又はＬＴＡ  ２６  Ａｓｎ（レーン２）をトランスフェクションして沈降させた（ＬＴＡの陽性コントロール）。レーン３では、galectin-2をトランスフェクションして沈降させた（galectin-2の陽性コントロール）。レーン４及びレーン５では、galectin-2とＬＴＡ  ２６  Ｔｈｒ（レーン４）又はＬＴＡ  ２６  Ａｓｎ（レーン５）をコトランスフェクションし、共沈降させた。
（３）galectin-2遺伝子内一塩基多型と心筋梗塞との相関
galectin-1および−２がＬＴＡと結合することが明らかとなり、これらの遺伝子産物の機能変化がＬＴＡの機能変化に結びつき、心筋梗塞の感受性に関連している可能性が示唆されることから、これら遺伝子内の一塩基多型（ＳＮＰｓ）を新たに同定、発見し、そのＳＮＰｓを用いて、患者、コントロールそれぞれ約２３００例についてcase-control association studyを施行した。その結果、galectin-2遺伝子内ｉｎｔｒｏｎ  １  ３２７９番目Ｃ＞Ｔ新規ＳＮＰのminor homozygote (TT allele)が心筋梗塞患者で有意に少ない（χ２＝２５．３，Ｐ＝０．００００００５；ｏｄｄｓ  ｒａｔｉｏ＝１．６）ことを見出した（表１）（塩基番号は変異命名による：Dunnen J.T他、Hum.Mutation 15, 7-12,2000）。このことから、galectin-2  ｉｎｔｒｏｎ  １  ３２７９のＳＮＰが心筋梗塞にプロテクティブに働く因子と考えられ、galectin-2の機能変化が心筋梗塞に関連している可能性が示唆された。
0004668792.tif 000002
今回新たに同定したgalectin-2遺伝子のｉｎｔｒｏｎ  １の  ３２７９番目Ｃ＞Ｔの新規ＳＮＰの周辺の塩基配列（配列番号３：但し、配列番号３においてＹはＣ又はＴを示す）を以下に示す。
5’-CCCCCCCAGCTCTAGGGACGACCACACCCCCACCCAGTTCTGCCTGTCTCTCTCTGCGCC
TTTGACTCTGTTGGGTGGGGACAAGGCTCCCGGGCCTGCACCCTCCCGCAGCTCTCAGCA
TCCCTATTTGTCCAAGTGCACCCCTGACCCTGGACTTCCGAGTGCTTCTGCCCTGCAGCA
GCCCCCACCTCTATCCTTGGGGTTTGAGCTTTGCTGTTTCAGTCAGGCAGCCCCCAGGAG
CTGCAAGGGGAGTGTGGGTGCTTCTCTTAGTCCAGGCCCAGCTCCCCTATCCTGGCCTGA
CTGTTGCAGGGCTCGGGGTGTGGGCACAGGCTGCTGGCAGGAGGCAGGGAGCCATCTCCT
GATGCTTGGTGTTAGA[C/T]GTGTGTGTGCGCAGGGCACACGTCTGTGAGTGTCTGTGT
GGCGGGCACACCTGTCTTCTGTTTCTTGTTTGAGCCCCTTTTGGACTGTCCTCACTGGAT
AACCTCATCTCCCAGAGATAATGGTCTTTGTCAGTGAGAGACTGATTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTGAGACGGAGTCT-3’
［Ｃ／Ｔ］は、ｉｎｔｒｏｎ  １の  ３２７９番目Ｃ＞ＴのＳＮＰを示す。
下線を付したCTGCGCCTTTGACTCTGTTとTCTTTGTCAGTGAGAGACTGはＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒを示し、下線を付したCCTATCCTGGCCTGACTGTTはシークエンスプライマーを示す。
（４）galectin-2遺伝子ｉｎｔｒｏｎ  １  ３２７９のＳＮＰのgalectin-2遺伝子転写活性に与える影響
ｉｎｔｒｏｎ  １  ３２７９のＳＮＰのgalectin-2遺伝子転写活性に与える影響を測定するために、レポーター遺伝子アッセイ（ルシフェラーゼアッセイ）を施行した。galectin-2遺伝子のｉｎｔｒｏｎ  １  ３１８８から３４０４までのヌクレオチドよりなるＤＮＡフラグメントを、ｐＧＬ３−ｅｎｈａｎｃｅｒベクターのＳＶ４０エンハンサーの下流に、５’から３’の方向にクローニングし、レポーターベクターを作製した。これらのレポーターベクターをＨｅＬａ細胞およびＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクションし、２４時間後、Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega社）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図２(左図はＨｅＬａ細胞、右図はＨｅｐＧ２細胞での結果を示す)
に示す。
（５）galectin-2と微小管との相互作用
galectin-2によるLTA分泌の制御機構を調べるために、タンデムアフィニティー精製(TAP)システムを用いて、galectin-2と相互作用する細胞内分子を探索した。その結果、galectin-2-TAPタグを発現させた場合のみに検出できる２つの特異的なバンドを同定した（図３ａ）。MALDI/TOF massスペクトル分析により、これらの２つのバンドは、微小管の重要成分であα−及びβ−チューブリンに対応することが示された。Flagのタグをつけたgalectin-2を発現するプラスミドでトランスフェクションしたHeLa細胞を用いて、内因性のチューブリン及びgalectin-2が一緒に免疫沈降することを確認した（図３ｂ）。チューブリンはLTAとも一緒に免疫沈降した（図３ｂ）。二重免疫染色したU937細胞の共焦点顕微鏡分析像から、galectin-2及びα−チューブリンは、細胞質に発達した網状フィラメントネットワークとして一緒に局在化していた（図３ｃ）。この結果はgalectin-2が細胞内輸送に関与している可能性を示している。
（６）冠状動脈粥腫切除術による試料におけるgalectin-2とLTAの発現と共局在
galectin-2とLTAが、心筋梗塞の損傷（即ち、冠状動脈のアテローム硬化性損傷）で発現しているかどうか、そして発現している場合にはその発現部位を調べるために、抗LTA又は抗galectin-2抗体を用いて、冠状動脈粥腫切除試料について免疫組織化学染色分析を行った。図４ａ及びｂに示す通り、LTA及びgalectin-2についての免疫反応性が、アテローム斑の内膜細胞に検出され、そのうちの一部は紡錘体状、又は限定的に空胞化した丸い細胞質であった。隣接する切片を抗平滑筋細胞（SMC)α−アクチン又は抗CD68で免疫染色した結果、これらの細胞の大部分は平滑筋細胞であるか、平滑筋細胞由来の泡沫細胞であり、マクロファージも一部に見られた（図４ｃ及びｄ）。二重標識免疫組織化学分析により、LTAとgalectin-２の共発現が大部分の多形性の平滑筋細胞で見られた（図４ｅ）。対照的に、細胞質が僅かな繊維斑の萎縮性平滑筋細胞や、正常な内側の平滑筋細胞では、何れのタンパク質の発現も検出されなかった（図４ｆ）。これらの結果は、LTAとgalectin-２が、ヒトのアテローム硬化性斑の内膜の平滑筋細胞及びマクロファージでは共発現しているが、静止期又は正常な内側の平滑筋細胞では存在しないことを示している。
【産業上の利用可能性】
本発明により、心筋梗塞等の炎症性疾患の発症進展に関与する新規な一塩基多型（ＳＮＰ）が新たに同定された。本発明で同定されたＳＮＰを利用することにより、心筋梗塞等の炎症性疾患の診断法、又は炎症性疾患の治療薬の開発法を提供することが可能になる。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> RIKEN et al.
<120> Method for judging inflammatory diseases using single nucleotide polymorphism within galectin-2 gene
<130> A41618A
<160> 3
<210> 1
<211> 7967
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gtgaggacac tagccccctg ctgcctgccc cactctgttc atctttgtct ttgcctgggt 60
gggggctttt agggaaaacc attgctgtcc ctctctgggc ctcagtttcc ccatctgtgc 120
agcaaagaag ttggacagag gtcttttttt aaaaaacagc atcttgggcc aggcgtggtg 180
gctcctgctt gtaatcccag cactttggga ggccgaggct ggtggatcat ctgaggttgg 240
gagtttgaga ccagcctgac caacatggag aaaccccgtc tctactaaaa aaatacaaaa 300
ttggctaggc ctggtggcac atgcctgtaa tcccagctaa tggggaggct gaggcaggag 360
aatcacttgg acctgggagg cagaggttat ggtgagccga gattgtgcca ttgcactcca 420
gcctgggcaa caagagtgag actccatctc aaaacaacaa caacaataca gcatcttgct 480
ctgtcaccag gtggagtgca gtggtggcaa tcataactca ctacggactt gacctccttg 540
gcttaaatga tcctcccacc tcagcctctt gagtagctgg gaccccaggc actcactacc 600
acactggcta attttgtttg tttcttttct ttctcttttt tttttttttt ttgagatgga 660
gtctcgctct gttgcccagg ctggagtgca gtggcccgat ctcagctcac tgcaacctct 720
gctgcctggg ttcaagcaat tctctggtct cagcctccca agtagctggg attacaggta 780
tgtgtcacca cacctggcta attttttttt ttttgttgag atggagtttc tgttgcccag 840
gctggagtgc aatggcacga tctcggctca ccacaacttc cacctcccag gttcaagcga 900
ttctcctgcc tcagcctcct gagtagcagg gattacaggc atgggccacc acacccgatt 960
aattttgtat ttttagtaga gatggggttt ctccatgttg gtcaggctgg tcttgaactc 1020
ctgatctcag gtgatccacc tgccttggcc tcccaaagtg ctgggattac aggtgtgagc 1080
cactgctcct ggcctaattt ttgtattttt aaagtagaga cagggtttca ccatgttggt 1140
caggctgatc tcgaactcct gacctcaggt gatccgccca ccttggcctc ccaaagtgct 1200
gggattacag gtgtgagcca ccccacccag cttatttctt atttttcgta gagatgaggt 1260
ctcactatgt tgctcaggct gatatcaaac tcctgggttc aagggatcct cctgccttgg 1320
cctctcgaag tgctgagatt acaggtgtga gccactgtgc ctggcctcca ttgatcttta 1380
tagagataaa aaaaaatctc agcttgggca atatagtgag accttttctg ctacaggtgc 1440
atgccactac gctttgcctt aaaaaattag tgggggtagc ggcacactcc tcagccttgg 1500
gaggctgagg atcacttgag cccaggaggt cgaggctaca gtgagccgta attgcactac 1560
tgtactccag cctgggcaac agagtgagac cttgtctcat atacccacac acaaaaccca 1620
agtcttggag agcaaattgc ccaaggccac aagctgcaaa tcacaagggg ttgagtggat 1680
tcccactgag gtctctgatt cgttgattct acaccagact ctgccacagc tttactgtgt 1740
ggccttggcc aagtcactga ccgtctctga gccccagtct tccttacatc tgtggaaggg 1800
gatcacaggc tgcctcttct gaggattaga tggtgtattc attgcctagg gctgcaataa 1860
caaattacca ccaaattgtg ggtggcttca cacgatagac gtttgttctg tcttggtttt 1920
ggtgactaga aacctgaaac caaggtgcta cagggctacg ctcctgctga aggcgcaagg 1980
ggagggttct ttcttgcctc ttccagcttc tggtggctcc tcgcattcct tggcttgcat 2040
cactccaatc tctgcctcca acttcacgtg gactcctctg tgtgtctccg tctctgtgtc 2100
tatatttctc tcctcttatg agaacactgg tcgtattgga tttaggacca accctaaacc 2160
agtatgacct cttaactcga ttacatatgc aaaggaacta tttttaaata ggtcacattg 2220
aggctgggcg gggtggctca cccctgtaat cccagcactt tgggaggccg aggcaggcgg 2280
atcacttgag atcaggagtt caagaccagc ctggccaaca tggtgaaacc ctgtctgtac 2340
tgaaaataca aaaacaaaaa agaagaagaa gaagaaaaaa aaattagaca gatgttgtgg 2400
tgggcacccg taatcccagc tacttgggag gctgaggcag gagaatcggt tgaacccggg 2460
aggcagaggt tgcagtgagc cgagatcgag ccactgtact ccagcctagg tgacagagtg 2520
agacttcatc tcaaaaaaaa aaaaaaaggt cacattgaca ggttccaggt ggacatgaat 2580
tttcggggga cgctattcaa gtgcaggggg gatgcaggat gtgaatgtgc caggggtcct 2640
gcgtggaagg gtctatgccc tcatcaccct ctgcctctcg gggaggactg ctgtggccca 2700
cggactctcc ccaccttctc tttcctggtc atctcacctc tgccttttct ttcctctctc 2760
tccagctcca gaggccatat catccaaatc ccttatacga cagataaggg aaccaaggcc 2820
cagaaagggg ctaagctggc cccaggcccc tctgccaatt aggggcagag tcggcactag 2880
agtctgggcc cccaactccc caccccccca gctctaggga cgaccacacc cccacccagt 2940
tctgcctgtc tctctctgcg cctttgactc tgttgggtgg ggacaaggct cccgggcctg 3000
caccctcccg cagctctcag catccctatt tgtccaagtg cacccctgac cctggacttc 3060
cgagtgcttc tgccctgcag cagcccccac ctctatcctt ggggtttgag ctttgctgtt 3120
tcagtcaggc agcccccagg agctgcaagg ggagtgtggg tgcttctctt agtccaggcc 3180
cagctcccct atcctggcct gactgttgca gggctcgggg tgtgggcaca ggctgctggc 3240
aggaggcagg gagccatctc ctgatgcttg gtgttagacg tgtgtgtgcg cagggcacac 3300
gtctgtgagt gtctgtgtgg cgggcacacc tgtcttctgt ttcttgtttg agcccctttt 3360
ggactgtcct cactggataa cctcatctcc cagagataat ggtctttgtc agtgagagac 3420
tgattttttt tttttttttt ttttttttga gacggagtct cgctctgtcg cccaggctgg 3480
agtgcagtgg cgccatcttg gctcactgca agcaccgcct cccgggttca cgccattctc 3540
ctgcctcagc ctcccgagta gctgggacta caggcgcctg ccaccacgcc cggctaattt 3600
tttgtatttt tagtagagac agggtttcac cgtgttagcc aggatgatct cactctcctg 3660
acctcgtgat ccgcccccct cggcctccca aagtgctggg attacaggtg tgagccaccg 3720
cccctggcca gcaagagact gattttaatc ccgtctgtct ggctccaaaa tctggaccca 3780
accccgttgt gttaagcaaa gacatgggga gttaggtgtc cagcctccaa accccacttt 3840
ctctaaagca gggaggtttt gctcccagga gacaacggac cctgtctgga gacattcttg 3900
gttgtcaccg ctcaggggag ggtgtcactg acatccagtg ggtagaggcc aggaatactg 3960
ctcaacatcc tacaacacaa gagacagacc ccaacaaaga aatgcctgcc ccaaacgtcc 4020
agacggccaa ggctgagaag ctctggtctg agcagcctcc tgtctgacat gccgccgtca 4080
tggcccgctg tcctgggtta agcattgctg cctcctccag gcgtctctta taaaatgtac 4140
tgccaggccg ggcacagtgg cttacacctg taatcccaac actttgggag gccgaggtgg 4200
gaggatcctt tgagctcagg aggtcgaggc tggcctggac aacatagtga gaccccatct 4260
gaaaaaaaaa aaaatcagct gggccaggtg ggatgcctgt ggtccaggct acctgggggg 4320
ctgaggtggg aggattgctt gagcccaaga ggtcaaggct gtagtgagct ctgatcatat 4380
cactgcactc tagcctgggt gacagagcaa gacctttaaa aaaaaatgta ttaccggctg 4440
aggcaggagg accacttgag ggtcaggagt tccagagcag cctgggtaac atagcaaaac 4500
cctatctcta caaaaatttt aaaaattagc tgggcatggt ggcacacgtc tatagtcgta 4560
gctacttagg aggctgaggc aggagaatcg tttgagctca ggaggctatg aggctgcatg 4620
cagtgagtta taatcgtgct actgcactcc atcttgggtg acagagcaag accctgtctc 4680
aaaaaaaaaa aaaaaagaaa gaaaagaaaa aaaatgctgg gtgtggtatc tcacccctat 4740
aatcccagaa ctttgggagg cccagagggg aggatcactt gaggtcagga gttcgagacc 4800
aacctggcca aagtggtgaa accccgtctc tactaaaaat acaaagaaaa ttagctagat 4860
atggtggtgg gagcctgtaa tctcagtgac tcgggaggct gaggcaggat aattgcttga 4920
atctgggaag tggaggttgc agtgagccaa gattgcacca ctgcactcca gcatgggtga 4980
cagagtgaga ctccatctca acatctcaaa aaaaaaaaaa aaagaactta ctgcctgtgg 5040
aagagttgag caatacctaa caacctaccc ctacatgtga ccaaccagcg ggtcacttcc 5100
tcctctgcag agaggaggcg gctgccagcg agagggcact gagggtcctc ccatggccac 5160
tgcccccttg acttctggca aagtgcccca gtccaatgag ctcattcagg gcatctcaga 5220
tcatgctttt tctggaaata aaaagtcagt gagcagaact cccacaatgt aaaagtgtcc 5280
tcccataagt tgttctaaat ctttggtgcc tgttgcgtcc tggtcagacc aaccctcacc 5340
ctctggtcat agatgcgaaa actggtcttg ggtaatgagt tttttttttt tttttttttt 5400
agacagagtc ttgctctgtc gcctggcaca atctcggctc actgcaacct ccacctcctg 5460
ggttcaagcg attctcttgc ctcagcctcc caagtagctg ggacgacagg catgtgccac 5520
cacacccggc taatttttgt atttttaata gagacagggt ttctccatgt tggccaggcc 5580
agtctcaaac tcctgacctc aggtgatcca cccgactcag cctcccaaag tgctgggatt 5640
acaggcgtga gccaccgctc ccagccctgg gtaatgagct ttgaaaaccc agcttagaaa 5700
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aggccaggag tttgagacca gccacaccaa catggtgaaa ccttgtctct actaaaaatg 6000
caaaaattag gcatggtggt acatgcctgt agtcccagct actcgggagg ctgaggcagg 6060
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tattttattt tattttattt attattatta ttattattat tattattatt tttgagatgg 7140
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<210> 2
<211> 9821
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
gggagatgca ggcggggaga cacaaggtag aaggggcaaa gtcctcacct aggaccttga 60
gggagttaat gtgtaatatt ctaggatata agcttgacca cgagttgaga ccctgagcac 120
aggcctccag gagccgctgg gagctgccgc caggagctgt caccatgacg gtgaggacac 180
tagccccctg ctgcctgccc cactctgttc atctttgtct ttgcctgggt gggggctttt 240
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caagagtgag actccatctc aaaacaacaa caacaataca gcatcttgct ctgtcaccag 660
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ggcctaattt ttgtattttt aaagtagaga cagggtttca ccatgttggt caggctgatc 1320
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<213> Homo sapiens
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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