(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）で表されるヘパリン誘導体又はその塩。
一般式（１）
【化１】
0004754137.tif 000005
（式中、Ｒは炭素数４〜３７の分岐を有することもあるアルキル基、炭素数４〜３７のシクロアルキル基、炭素数４〜３７の分岐を有することもあるアルケニル基、炭素数６〜１４のアリール基あるいは炭素数８〜２０のアラルキル基を示し；Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ互いに同一でなく、一方は水素であり、他方は−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＮＨＣＯＣＨ３及び−ＮＨＳＯ３Ｈの中から選択される基を表し；Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ互いに同一でなく、一方は水素であり、他方は−ＯＨ、−ＯＳＯ３Ｈ及びヘパリン残基から選択される基を表し；Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ互いに同一でなく、一方は水素であり、他方は−ＯＨ、−ＯＳＯ３Ｈ及びヘパリン残基から選択される基を表し（ただし、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６のいずれか１つのみがヘパリン残基である。）；Ｒ７は−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＯＳＯ３Ｈ又は−ＣＯＯＨを表し；Ｌ１は−ＣＯＮＨＲを表す）
【請求項２】
Ｒが炭素数４〜３７の分岐を有することもあるアルキル基である請求項１記載のヘパリン誘導体またはその塩。
【請求項３】
Ｒが炭素数１２〜３７の直鎖アルキル基である請求項１又は２記載のヘパリン誘導体またはその塩。
【請求項４】
Ｒが炭素数１２〜２５の直鎖アルキル基である請求項１から３いずれか１項記載のヘパリン誘導体またはその塩。
【請求項５】
Ｒが炭素数１２〜１８の直鎖アルキル基である請求項１から４いずれか１項記載のヘパリン誘導体またはその塩。
【請求項６】
Ｒが炭素数１８の直鎖アルキル基である請求項１から５いずれか１項記載のヘパリン誘導体またはその塩。
【請求項７】
ヘパリンの還元末端糖部分をラクトンとし、そのカルボニル基とＲ−ＮＨ２（Ｒは前記と同意義である）で示される一級アミンをアミド結合させた請求項１から６いずれか１項記載のヘパリン誘導体またはその塩。
【請求項８】
請求項１から７いずれか１項記載のヘパリン誘導体またはその塩を有効成分とする医薬。
【請求項９】
平滑筋細胞増殖抑制剤である請求項８に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、グリコサミノグリカン誘導体及び該グリコサミノグリカン誘導体を有効成分とする薬剤、特に平滑筋細胞増殖抑制剤、抗血栓剤に関し、さらには種々の不溶性基材に充分な抗血栓性を付与できる処理剤、並びに該グリコサミノグリカン誘導体を不溶性基材の表面に吸着してなる医用材料に関する。
背景技術
血栓の生成は、医療上大きな問題である。例えば、血栓の生成は、血液と直接接触する医療用機器や、動脈硬化、血管再生術後の再狭窄において重要な問題となる。
近年、医療用機器材料として加工性、強度、弾性、耐久性をそなえた人工材料が広く利用されてきている。こうした材料を人工心臓、人工肺、人工血管等の血液と接触する機器に適用する場合には、血液との接触部位において血液凝固を起こさないこと、即ち抗血栓性の付与が最大の課題になる。
従来より、この課題の解決の為種々の抗血栓性表面処理が考案されてきている。それらは、１）ヘパリン等の生理活性物質の表面固定化、２）多層系高分子表面加工、親水性高分子による表面加工、３）材料表面の不活化、に大別出来る。
上記技術の内２）、３）については長期的に血液等の体液と接触した場合には材料表面にタンパク質が吸着して生体膜類似表面を形成して安定した抗血栓性を得ることが可能である。しかし、血液と接触した初期の段階にあってはヘパリン投与等の他の抗凝固処置を併用すること無しに、充分な抗血栓性を得ることは困難であり、また、細流部では初期の血栓生成により閉塞してしまうという問題も解決出来ない。又、複雑な構造を持つ医療機器、例えば人工心臓の弁接着部位、或いは複数の医療機器を組み合わせて使用するシステムの接合部に血栓を生じやすく、この問題を解決する方法として十分なものは無い。また、人工肺等繰り返し使用を前提とする機器では血液との接触により表層に付着したタンパク質の除去に多くの労力を要する。
又、１）の方法では（Ａ）材料中のカチオン性基にヘパリンをイオン結合させる方法、（Ｂ）材料とヘパリンを直接共有結合させる方法、（Ｃ）リン脂質やコレステロールなどの脂質を共有結合することによって脂溶化したヘパリンで材料表面を被覆する方法がある（特開平４−８０２０１、特開平４−８０２０２、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９０，２９，５１８８−５１９４）。
これらの方法のうち、（Ａ）の方法は、使用する人工材料にカチオン性基を導入する必要があり、人工材料の材質が制限され、かつ通常の使用条件下においてヘパリンが脱離しやすく長期間の使用により、抗血栓性が低下する傾向にある。
（Ｂ）の方法では、（Ａ）と同様に人工材料に使用する材質が制限される上、ヘパリンの共有結合により人工材料の機械的強度が低下する場合がある。又、ヘパリンの材料への固定化によりヘパリンの抗凝固作用が低下してしまうという欠点もある。
（Ｃ）の方法では、脂質がミセルを形成し、ヘパリンの抗血栓作用が低下することがある。また、脂質部分の表層への露出により、血栓の生成をむしろ促進する場合や、脂質結合によりヘパリンのコンフォメーションが変化し充分な抗血栓性を発揮しない場合がある、といった問題点が残り、充分な汎用性があるとは言い難い。
従って、従来の抗血栓表面処理された人工材料では、充分な抗血栓性を付与できない等の改善すべき問題があった。
一方、従来の動脈硬化の治療法としては、危険因子の一つである高脂血症の改善薬としてＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬による療法が一般的である。しかしながらこの療法の結果得られるＬＤＬ−コレステロールの低下は、虚血性心疾患の死亡率を低下させるものの、これまでの疫学調査の結果からは冠動脈狭窄の改善は数％であるとされている（医学のあゆみ  Ｖｏｌ．１８８，Ｎｏ．１２，１９９９．３．２０，ｐ１０６９）。
従って、動脈硬化による冠動脈狭窄の治療法としては、むしろ経皮的冠動脈形成術（以下ＰＴＣＡとも称する）等による血管再建術が効果的であるとされている。しかし、この療法においては術後数ケ月以降に３０〜５０％の頻度で再狭窄が発生することが知られている。
動脈硬化や、ＰＴＣＡ等の血管再建術後の再狭窄においては、血小板凝集、血液凝固が最初の段階とされている。血管内皮細胞は元来抗血栓活性を有しており、病的な血栓形成を未然に防いでいる。しかし、ＰＴＣＡ等の血管内皮細胞の抗血栓作用を凌駕する刺激、破綻が加わると血栓形成を引き起こす。更に、この血栓形成に至る場合のトロンビン生成や活性化血小板因子からのＰＤＧＦ−β等の血管作動性物質の放出により、血管壁平滑筋細胞が増殖し、結果として動脈の狭窄を招く。
従って、動脈硬化の治療や、動脈狭窄の防止の点で、血栓の生成を防止することや血管壁平滑筋細胞の増殖を防止することは重要な手段となる。
実際、再狭窄予防の手段として、現在までに抗血栓剤（ヘパリン、ワーファリンなど）、平滑筋細胞増殖抑制作用を有する薬剤（ＡＣＥ阻害剤、ＰＤＧＦ拮抗薬、コルヒチンなど）、血管拡張剤（カルシウム拮抗薬など）等の数多くの薬剤の再狭窄予防効果が試されたが、未だに有効性の確立された薬剤はない（Ｍｅｂｉｏ，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．２，ｐ９１）。
ドイツ国公開特許公報、ＤＥ４２１７９１６Ａ１号公報には、特定の構造で表されるヘパリナミン（Ｈｅｐａｒｉｎａｍｉｎ）が記載されている。しかしながら、この公報記載のヘパリナミンの抗血液凝固作用は充分とはいえず、平滑筋細胞の増殖抑制等の効果については記載も示唆もない。
このように、従来の抗血栓表面処理された人工材料では、充分な抗血栓性を付与できない等の改善すべき問題があった。また、動脈硬化の治療や、動脈狭窄の防止の点で、臨床上明確な有用性を示す抗血栓剤や平滑筋細胞増殖抑制剤はなかった。
従って、本発明の目的は、上記従来技術の欠点を解決し、血液と接触する複雑な構造を持つ医療機器やシステム全体に、抗血栓性表面処理を行うことが可能であり、また動脈硬化症患者に投与することにより血管平滑筋細胞の増殖を抑制し、冠動脈等の血管の狭窄又は閉塞を防止することができるグリコサミノグリカン誘導体またはその塩を提供することである。
本発明の他の目的は、動脈硬化の治療や動脈の狭窄又は閉塞の防止の点で、臨床上明確な有用性を示す医薬、特に抗血栓剤や平滑筋細胞増殖抑制剤を提供することである。
本発明の更なる目的は、充分な抗血栓性を長期間不溶性基材表面に付与できる抗血栓性表面処理剤を提供することである。
本発明の更なる目的は、充分な抗血栓性等の作用を長期間保持した医用材料を提供することである。
発明の開示
本発明は、抗血液凝固（抗血栓）活性及び平滑筋細胞増殖抑制活性を持つ、特定の構造のグリコサミノグリカン誘導体またはその塩、それを含む医薬、特に平滑筋細胞増殖抑制剤、抗血栓剤に関し、さらには抗血栓性表面処理剤、医用材料に関する。
以下に、本発明の構成を示す。
（１）  グリコサミノグリカンの還元末端糖部分にＲ−ＮＨ２（Ｒは炭素数４〜３７の分岐を有することもあるアルキル基、炭素数４〜３７のシクロアルキル基、炭素数４〜３７の分岐を有することもあるアルケニル基、炭素数６〜１４のアリール基あるいは炭素数８〜２０のアラルキル基を示す）で示される一級アミンを共有結合させたことを特徴とするグリコサミノグリカン誘導体またはその塩。
（２）  下記一般式（１）で表される上記（１）に記載のグリコサミノグリカン誘導体またはその塩。
一般式（１）
0004754137.tif 000002
（式中Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ互いに同一でなく、一方は水素であり、他方は−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＳＯ３Ｈ、−ＮＨＣＯＣＨ３及び−ＮＨＳＯ３Ｈの中から選択される基を表し；Ｒ３、Ｒ４はそれぞれ互いに同一でなく、一方は水素であり、他方は−ＯＨ、−ＯＳＯ３Ｈ及びＧＡＧ残基から選択される基を表し；Ｒ５、Ｒ６はそれぞれ互いに同一でなく、一方は水素であり、他方は−ＯＨ、−ＯＳＯ３Ｈ及びＧＡＧ残基から選択される基を表し（ただし、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６のいずれか１つのみがＧＡＧ残基である。）；Ｒ７は−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＯＳＯ２Ｈ又は−ＣＯＯＨを表し；ＧＡＧ残基はヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸及びこれらの修飾体からなる群から選択されるグリコサミノグリカンの残基を表し；Ｌ１は−ＣＯＮＨＲ又は−ＣＨ２ＮＨＲを表し；Ｒは前記と同意義である。尚、上記において−ＯＳＯ３Ｈ、−ＣＯＯＨはそれぞれ−ＯＳＯ３−、−ＣＯＯ−も包含する）
（３）  Ｌ１が−ＣＯＮＨＲ（Ｒは前記と同意義である）である前記（２）記載のグリコサミノグリカン誘導体またはその塩。
（４）  Ｒが炭素数４〜３７の分岐を有することもあるアルキル基である前記（１）又は（２）記載のグリコサミノグリカン誘導体またはその塩。
（５）  グリコサミノグリカンの還元末端糖部分をラクトンとし、そのカルボニル基とＲ−ＮＨ２（Ｒは前記と同意義である）で示される一級アミンをアミド結合させた前記（１）記載のグリコサミノグリカン誘導体またはその塩。
（６）  グリコサミノグリカンが、ヘパリンまたはヘパラン硫酸である前記（１）から（５）いずれか１項記載のグリコサミノグリカン誘導体またはその塩。
（７）  前記（１）から（６）いずれか１項記載のグリコサミノグリカン誘導体またはその塩を有効成分とする医薬。
（８）  平滑筋細胞増殖抑制剤である前記（７）に記載の医薬。
（９）  抗血栓剤である前記（７）に記載の医薬。
（１０）  前記（１）から（６）いずれか１項記載のグリコサミノグリカン誘導体またはその塩を有効成分として含有することを特徴する抗血栓性表面処理剤。
（１１）  前記（１）から（６）のいずれか１項記載のグリコサミノグリカン誘導体またはその塩を不溶性基材の表面に吸着してなる医用材料。
（１２）  前記（１）から（６）いずれか１項記載のグリコサミノグリカン誘導体またはその塩を蛍光物質で標識した蛍光標識グリコサミノグリカン誘導体またはその塩。
（１３）  蛍光物質が、フルオレセイン、ダンシル、フルオレスカミン、ローダミンＢ、テトラメチルローダミン及びイソインドール誘導体からなる群から選択される蛍光プローブを有する化合物である上記（１２）に記載の蛍光標識グリコサミノグリカン誘導体またはその塩。
本発明において、グリコサミノグリカンまたはその塩（以下ＧＡＧと略称することもある。）としてはヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸或いはケラタン硫酸またはその修飾体あるいは、それらの塩を用いることができ、好ましくはヘパリン、ヘパラン硫酸或いはデルマタン硫酸またはその修飾体あるいは、それらの塩であり、より好ましくはヘパリン或いはヘパラン硫酸またはその修飾体あるいは、それらの塩である。
これらのＧＡＧは、生体組織から分離されたものでも、酵素的、微生物的或いは化学的に合成されたものでもよい。またそれらＧＡＧを酵素的、微生物的、化学的あるいは物理的に低分子化したものであっても、あるいはそれらＧＡＧに硫酸化、アシル化、脱硫酸化あるいは脱アセチル化等の酵素的、微生物的あるいは化学的処理をほどこしたものであっても良く、本発明においてはこれらを修飾体と定義する。これらＧＡＧにおける塩としては、薬学的に許容される塩が好ましく、例えばナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩等の無機塩基との塩、またはジエタノールアミン塩、シクロヘキシルアミン塩、アミノ酸塩等の有機塩基との塩のうち薬学的に許容されるものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明に用いられる低分子化されたＧＡＧの製造方法としては、例えば亜硝酸分解法、過ヨウ素酸酸化分解法、ラジカル誘導による酸化還元分解法、加硫酸分解法、酵素分解法等がある。一例としてヘパリンあるいはヘパラン硫酸を亜硝酸により低分子化する場合には、原料を０．０１〜１Ｍ、好ましくは０．０５〜０．５Ｍの亜硝酸ナトリウム溶液に０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解し、これに０．１〜０．３ｖｏｌ／ｖｏｌ％の氷酢酸を加え、５〜５０℃、好ましくは１０〜３０℃の温度で１〜２４時間攪拌することにより得られる。また、他の製造方法としてヘパリンあるいはヘパラン硫酸を分解酵素により低分子化する場合には、例えばｐＨ７．０〜７．４の原料水溶液にヘパリン又はヘパラン硫酸に対し２０〜１０００単位／ｍｇのヘパリナーゼ又はヘパリチナーゼＩＩを加え、２０〜４０℃で１〜２４時間反応させることによっても得られる。
一方、デルマタン硫酸を分解酵素により低分子化する場合には、例えばデルマタン硫酸の０．１〜１０％水溶液を適当な緩衝液（トリス、酢酸、リン酸等の緩衝液）によりｐＨ７．０〜８．０に調整し、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＢ又はこれらの酵素の混合物をデルマタン硫酸に対し１０〜１０００単位／ｇ加え、１５℃〜４０℃で１時間〜２４時間反応することにより得られる。
ＧＡＧの重量平均分子量（以下、単に分子量という）は、通常ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸の場合約１０００〜１２万であり、ヒアルロン酸の場合約１０００〜１０００万であるが、本発明に使用するＧＡＧの分子量はこれに限定されない。また、上記のような低分子化したＧＡＧの分子量は、通常約１０００〜１００００である。
ＧＡＧとしては市販のものを用いることもできる。ヘパリンとしては、和光純薬（株）製ヘパリンナトリウム塩（ブタ腸粘膜由来、分子量１８０００）、バイオファー社製ヘパリンナトリウム塩（ブタ小腸由来、分子量１３０００〜１１０００）、ＳＰＬ社製ヘパリンナトリウム塩（ブタ小腸由来、分子量１３０００〜１５０００）、生化学工業（株）製ヘパリン化学修飾キット等が挙げられる。
ヘパラン硫酸としては、シグマ社製牛腸粘膜由来ヘパラン硫酸（分子量約７５００）、生化学工業（株）製ヘパラン硫酸ナトリウム塩（ウシ腎臓由来）、生化学工業（株）製ヘパラン硫酸化学修飾キット等が挙げられる。
コンドロイチン硫酸としては、生化学工業（株）製である、コンドロイチンナトリウム塩、コンドロイチン硫酸Ａナトリウム塩（チョウザメ脊索由来）、コンドロイチン硫酸Ａナトリウム塩（クジラ軟骨由来）、コンドロイチン硫酸Ａナトリウム塩ＳＳＧ（クジラ軟骨由来）（分子量：２５０００〜５００００）、コンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）ナトリウム塩（ブタ皮由来、分子量１１０００〜２５０００）、コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム塩ＳＧ（サメ軟骨由来）、コンドロイチン硫酸Ｃナトリウム塩ＳＳＧ（サメ軟骨由来、分子量：４００００〜８００００）、コンドロイチン硫酸Ｄナトリウム塩（サメ軟骨由来）、コンドロイチン硫酸Ｅナトリウム塩（イカ軟骨由来）等が挙げられる。
ヒアルロン酸としては、生化学工業（株）製である、ヒアルロン酸ナトリウム塩（ブタ皮由来、分子量４００００〜６００００）、ヒアルロン酸ナトリウム塩（ヒト臍帯由来、分子量８０〜１２０×１０４）、ヒアルロン酸ナトリウム塩（鶏冠由来、分子量６０〜１２０×１０４）、ヒアルロン酸カリウム塩（ヒト臍帯由来）、ヒアルロン酸カリウム（ヒト臍帯由来）等が挙げられる。
ケラタン硫酸としては、生化学工業（株）製ケラタン硫酸ナトリウム塩（ウシ角膜由来）等が挙げられる。
ＧＡＧと共有結合させるＲ−ＮＨ２で示される一級アミンにおいて、Ｒとしては、直鎖状又は分岐を有する炭素数４〜３７のアルキル基、炭素数４〜３７のシクロアルキル基、直鎖状又は分岐を有する炭素数４〜３７のアルケニル基、炭素数６〜１４のアリール基または炭素数８〜２０のアラルキル基が挙げられる。
炭素数４〜３７のアルキル基またはシクロアルキル基としては、ｎ，ｉあるいはｔ−ブチル基、ｎ，ｉあるいはｔ−ペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、１−ボルニル基、１−あるいは２−アダマンチル基、１−アダマンチルメチル基、１−アダマンチルエチル基、２−ヘキシルシクロペンチル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、シクロドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ヘプタドデシル基、オクタデシル基等が挙げられる。
炭素数４〜３７のアルケニル基としては、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基、コレステリル基、ゲラニル基、リナロイル基、シトロネリル基、オレイル基等が挙げられる。
炭素数６〜１４のアリール基または炭素数８〜２０のアラルキル基としては、フェニル基、トリル基、ナフチル基、ベンジル基、１−あるいは２−インダニル基、トリフェニルメチル基等が挙げられる。
これらのアルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アリール基あるいアラルキル基には更に置換基を有していてもよい。そのような更なる置換基としては、水酸基、カルボキシル基、フェニル基、アルキル基等が挙げられる。本発明においては、上記アルキル基、シクロアルキル基、アルケニル基、アリール基あるいアラルキル基は無置換であるほうが本発明の効果をより顕著にする点で好ましく、特に抗血栓剤にＧＡＧ誘導体を用いる場合にはそれらは無置換のほうがよい。
Ｒのより好ましい例は、
0004754137.tif 000003
である（ｋは、２〜３５の整数を表し、ｍ、ｎは互いに独立である２〜１６の整数を表す）。
Ｒとしては、好ましくは炭素数４〜３７の分岐を有することもあるアルキル基、より好ましくは炭素数１２〜３７の直鎖アルキル基、更に好ましくは炭素数１２〜２５の直鎖アルキル基が挙げられ、特に炭素数１２〜１８の直鎖アルキル基が好ましい。
Ｒ−ＮＨ２で示される一級アミンをグリコサミノグリカンの還元末端糖部分に共有結合させる方法としては、例えば特開平３−２８４６９８号、特開平４−８０２０１号公報に記載されているような公知の方法を１級アミンとの反応に適するように改変して適宜採用することができる。以下に、具体的な方法として第１あるいは第２の方法を記載する。
第１は、グリコサミノグリカンの還元末端糖部分をラクトンとし、そのカルボニル基とＲ−ＮＨ２で示される一級アミンをアミド結合させる方法である。具体的には、例えばＧＡＧを適当な水性溶媒（例えば水、リン酸緩衝液）に溶解後、ＧＡＧ１モルに対して２〜１００当量、好ましくは５〜１５当量のヨウ素、臭素あるいは塩素（好ましくはヨウ素）を加え、Ｍ（ＯＨ）ｘで示される金属水酸化物（Ｍはカリウムのようなアルカリ金属、ｘは１〜３の整数）の水／メタノール溶液でｐＨを８〜１４に調整し、０〜１００℃、好ましくは１０〜３０℃で酸化反応させる。このようにして生成した酸化生成物を、強酸性陽イオン交換樹脂、例えばダウエックス５０（商品名；室町化学社製）、アンバーライトＩＲ１２０（商品名；オルガノ社製）および／または塩酸、硫酸等の無機酸、酢酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸あるいはこれらの酸の酸無水物で処理することにより、ＧＡＧの還元末端糖部分が特異的にラクトン化された化合物を得ることができる。このように還元末端が酸化されラクトン構造となったＧＡＧを適当な溶媒（水、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキサイド等）に溶解後、Ｒ−ＮＨ２で示される一級アミンの適当な有機溶媒（クロロホルム、メタノール等）溶液を添加し、５〜１００℃、好ましくは３０〜６０℃の温度で、トリ−ｎ−ブチルアミン等の塩基触媒の存在下において反応させることにより、ラクトンのアミノリシスが起こり、アミド結合（一般式（１）においてＬ１が−ＣＯＮＨＲである場合）が形成され目的化合物を得ることができる。
上記方法の一例として、ＧＡＧとしてヘパリン或いはヘパラン硫酸を用いた場合の反応式を以下に示す。
0004754137.tif 000004
第２はＧＡＧの還元末端糖のアルデヒドにＲ−ＮＨ２のアミノ基を作用させ生じたシッフ塩基を還元剤を用いて還元することにより、アミノアルキル基の形で共有結合を形成させる方法である。具体的にはＧＡＧを適当な溶媒（水、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキサイド、メタノール等）に溶解後、Ｒ−ＮＨ２で示される一級アミンを加え、通常０〜１００℃、好ましくは５〜６０℃で反応させることにより、シッフ塩基が形成される。この反応時又は反応終了後に適当な還元剤（水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等）を２〜１００当量、好ましくは５〜２０当量添加することによりシッフ塩基を還元し、アミノアルキル結合（一般式（１）においてＬ１が−ＣＨ２ＮＨＲである場合）を形成させ目的化合物を得ることができる。
これらＧＡＧ誘導体における塩としては、上述のＧＡＧの塩で記載した例と同様のものが挙げられる。
この様にして還元末端糖部分に特定の一級アミンを共有結合したＧＡＧ又はその塩（本発明において単に「ＧＡＧ誘導体」と略記することもある）は、そのコンフォメーションが維持されるためＧＡＧが本来持つ活性を損なうことなく発現できるばかりでなく、ＧＡＧとそれに結合した置換基Ｒが相互作用し、遊離のＧＡＧが殆ど付着しないようなプラスチックプレート等の不溶性基材あるいは細胞膜に、該ＧＡＧ誘導体が適正に付着でき、また、生体組織に対するＧＡＧの生理活性（特に平滑筋細胞増殖抑制作用や抗血栓作用）が増強されるものと考えられる。
上記ＧＡＧ誘導体としては、前記一般式（１）で示される還元末端糖が開環した構造のものが好ましい。一般式（１）においても、Ｒ、ＧＡＧの好ましい例は前記と同じである。一般式（１）において、Ｒ１〜Ｒ７の好ましいものとしては、式で示された構造がヘパリン又はヘパラン硫酸の還元末端糖のＮ−アセチルグルコサミン又はＮ−スルホグルコサミンに由来する残基である場合、具体的には、Ｒ１としては水素原子、Ｒ２としては−ＮＨ２、−ＮＨＳＯ３−又は−ＮＨＣＯＣＨ３、Ｒ３としては水素原子、Ｒ４としては水酸基、Ｒ５としては水素原子、Ｒ６としてはＧＡＧ残基、Ｒ７としては−ＣＨ２ＳＯ３−又はＣＨ２ＯＨである。
また、Ｒ１〜Ｒ７の別の好ましいものとしては、式で示された構造がヘパリン又はヘパラン硫酸の還元末端糖のグルクロン酸又はイズロン酸に由来する残基である場合、具体的には、Ｒ１としては水素原子、Ｒ２としては−ＯＳＯ３−又は−ＯＨ、Ｒ３としては水素原子、Ｒ４としては水酸基、Ｒ５としては水素原子、Ｒ６としてはＧＡＧ残基、Ｒ７としては−ＣＯＯ−である。
Ｒ３〜Ｒ６のうちいずれか１つのみがＧＡＧ残基を表し、好ましくはＲ５もしくはＲ６がＧＡＧ残基である。また、一般式において、Ｌ１が−ＣＯＮＨＲであることが、本発明の効果がより顕著になり、且つ生体に対して安全性が高まる点で好ましい。このＬ１が−ＣＯＮＨＲである場合には、ＧＡＧ誘導体の製造方法として上記第１の方法が好ましい。
本発明の抗血栓性表面処理剤は、溶液、ペースト、粉末等のいずれの状態であってもよく、後述のような不溶性基材表面に該処理剤を接触塗布、噴霧、含浸あるいは該基材を処理剤中に浸漬、浸潤させて基材表面にＧＡＧ誘導体を吸着させることにより、医療用機器、医療用具等に充分な抗血栓性を付与することができ、また必要に応じ容易に除去可能である。ここで「吸着」とは、ＧＡＧ誘導体と不溶性基材との物理的又は化学的相互作用により、ＧＡＧ誘導体が該基材の表面に結合して洗浄等によって容易に遊離しなくなる状態をいい、典型的には疎水結合が例示される。なお、ＧＡＧ誘導体を不溶性基材に結合させる方法は、上記「吸着」に限定されず、例えば該基材の官能基とＧＡＧ誘導体のアミノ基が直接に、あるいはスペーサーを介して共有結合、イオン結合等化学結合させる方法であってもよい。
本発明の処理剤は、ＧＡＧ誘導体のみ含まれても良いし、ＧＡＧ誘導体以外に他の添加剤も使用でき、例えば、溶剤、安定化剤、抗菌剤、抗黴剤、界面活性剤、バインダー樹脂、ｐＨ調整剤等が挙げられる。本発明の処理剤に使用することができる溶剤としては、水、生理食塩水、塩化カリウム、塩化リチウム、硫酸マグネシウム等の塩溶液、緩衝液（トリス、酢酸、リン酸緩衝液等）、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の有機溶媒の単独又は混液等が挙げられる。
本発明の処理剤中のＧＡＧ誘導体の含有量としては、液剤の場合には、０．０１ｗ／ｖ％〜１０ｗ／ｖ％が好ましく、より好ましくは０．１ｗ／ｖ％〜５ｗ／ｖ％である。
本発明の処理剤が固体、顆粒剤の場合は、上記溶剤に溶解して不溶性基材の処理に使用するので、ＧＡＧ誘導体が安定な状態であれば、ＧＡＧ誘導体の含有量等の具体的態様は限定されない。
医療用機器、医療用具としては、具体的には下記のような不溶性基材からなる人工心臓、人工肺、人工血管、カテーテル、人工透析器等のシステム等が挙げられる。尚、不溶性基材の材質は表面が疎水性のものが好ましいが、ＧＡＧ誘導体が結合する限り限定されない。
人工心臓用不溶性基材としてはポリウレタン、シリコーンゴム等が挙げられ、人工肺用不溶性基材としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられ、人工血管用不溶性基材としてはポリエチレンテレフタレート、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。また、ポリ塩化ビニル、セグメント化ポリウレタン、ポリ（メタクリル酸メチル）、セルロースなどの汎用性高分子材料で作られている医療用機器、医療用具にも適用できる。
本発明において、上記のような不溶性基材にＧＡＧ誘導体を吸着させる方法としては、好ましくはＧＡＧ誘導体の溶液（上記の液状の処理剤）を該基材に接触させて吸着させる方法が挙げられ、具体的には上記の液状の処理剤中に１〜１０時間程不溶性基材を浸潤／浸漬させる方法が簡便でよい。なお、不溶性基材へのＧＡＧ誘導体の吸着量としては、所定の抗血栓性が得られればいずれの量でもよいが、例えば１〜３ｎｇ／ｃｍ２が挙げられる。また、他の結合方法としては、前記のとおり、ＧＡＧ誘導体を不溶性基材の表面に化学的に結合させる方法が挙げられる。
本発明において、上記のように不溶性基材表面に吸着されたＧＡＧ誘導体を、更に水洗処理することが好ましい。これにより、不溶性基材表面においてＧＡＧ誘導体が単分子層を形成し、表面が平滑となり、血液と接触する基材表面にＧＡＧ分子が均一に整列するため、抗血栓性等のＧＡＧ誘導体の生理学的又は生化学的作用が一層高まる。ここで、水洗処理とは、水あるいは水性溶媒を用いて、不溶性基材表面にＧＡＧ誘導体の均一な層を形成して抗血栓性等の生理学的又は生化学的な効果が付与される程度に洗浄すること、より詳しくは水あるいは水性溶媒を１ｃｍ／ｓｅｃ程度の低速で一定時間（例えば１分間）流すか、又は不溶性基材を水又は水性溶媒中に一定時間（例えば５分〜１０分間）浸漬することにより行うことができる。
一方、本発明においては不溶性基材表面に吸着されたＧＡＧ誘導体を必要により任意に除去することができる。その除去方法としては、アルコールあるいはアルコールを含む溶液により該表面を処理することにより実施することができる。
ここで、アルコールあるいはアルコールを含む溶液としては、メチルアルコール、エチルアルコール、あるいはそれらを５０％以上含む水溶液が挙げられる。具体的には、これらの溶液に上記ＧＡＧ誘導体が吸着された不溶性基材を一定時間（例えば５分間〜２時間）浸漬、浸潤させることにより除去することができる。
このようなアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アラルキル基、アリール基等の疎水性基が結合した糖類と不溶性基材との吸着は、一般に疎水結合による。本発明のＧＡＧ誘導体は還元末端にのみ特定の疎水性基を持つため、還元末端の１点でのみ不溶性基材と結合する。こうした結合の場合にはＧＡＧ誘導体同士もアグリゲーションを起こし、重層したＧＡＧ誘導体の皮膜を形成する場合もあるが、水、塩溶液等の適当な溶媒で洗浄することにより重層したＧＡＧ誘導体を洗い流し単分子膜とすることが可能である。このようにして得られた、還元末端でのみ不溶性基材と結合したＧＡＧ誘導体単分子膜においては血液等の水溶液中でＧＡＧ部分が自由なコンフォメーションをとることができ、その結果ＧＡＧの持つ本来の活性が損なわれることなくそのまま維持され、従ってトロンビン、アンチトロンビンＩＩＩとも容易に結合し、血栓の生成を抑制することができる。
本発明の医用材料はＧＡＧ誘導体又はその塩を不溶性基材の表面に吸着させたものである。このような医用材料は前記の医療用機器、医療用具等の材料として使用できる。本発明の医用材料は、特に抗血栓性医用材料として有用である。
本発明の医用材料の好ましい態様は、不溶性基材がポリエチレンテレフタレートであり、上記のようなＧＡＧ誘導体が吸着した表面（無洗浄あるいは水洗浄）の水後退接触角が５０°以下である医用材料である。
本発明の医用材料の他の好ましい態様は、不溶性基材がポリ塩化ビニルであり、上記のようなＧＡＧ誘導体が吸着した表面（無洗浄あるいは水洗浄）の水後退接触角が８０°以下である医用材料である。
これらの好ましい態様とすることで、本発明の効果がより顕著になる。
ここで、水後退接触角は、当該技術分野において材料表面の疎水性−親水性を示す周知慣用の物性であり、例えばＳ．Ｃ．  Ｉｓｒａｅｌ  ら：ＡＣＳ  Ｐｏｌｙｍ．Ｐｒｅｐｒ．３０，  ３２８（１９８９）に記載された公知の方法にしたがって測定することができる。
本発明のＧＡＧ誘導体は、医薬、特に平滑筋細胞増殖抑制剤、抗血栓剤として有用である。具体的には、ＧＡＧ誘導体の有効量を動脈硬化症患者等、本医薬により治療又は予防を必要とする対象に投与することにより、血栓の生成を防止するとともに、血管内壁の平滑筋細胞の増殖をも抑制し、冠動脈狭窄を防止することができる。更に血管再建術後の再狭窄防止、動脈硬化の防止にも適用できる。
本発明において、本発明のＧＡＧ誘導体を抗血栓剤、抗血栓性表面処理剤、又は抗血栓性の医用材料として用いる場合には、上記ＧＡＧ誘導体のＲとしては、炭素数１２以上の直鎖アルキル基が抗血栓性が一層向上する点で好ましく、更に上記共有結合がアミド結合である場合が生体安全性が高まる点で好ましい。
本発明において、本発明のＧＡＧ誘導体を平滑筋細胞増殖抑制剤として用いる場合には、上記ＧＡＧ誘導体のグリコサミノグリカンとしては、上述の低分子化された、ヘパリン、ヘパラン硫酸又はデルマタン硫酸である場合が好ましい。これにより、平滑筋細胞増殖抑制効果を一層向上させることができる。
本発明の医薬、特に平滑筋細胞増殖抑制剤又は抗血栓剤は、ＧＡＧ誘導体を経口的あるいは非経口的に投与（静脈内、筋肉内、皮下など組織内投与（注射）、経腸投与、経皮投与等）するための医薬品として、液体製剤、固体製剤、半固体製剤など任意の剤形に製剤化することが可能であり、任意の投与方法で患者に投与される。
該製剤は、ＧＡＧ誘導体に通常任意の薬学的に許容される製剤補助剤を加えることにより常法に従って製造される。さらに公知の技術により持続性製剤とすることも可能である。
本発明の薬剤を動脈硬化症等の患者の治療に使用する場合、筋肉注射、静脈注射、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。
ＧＡＧ誘導体は、多くは水溶性であり、容易に液体製剤を製造することができる。注射剤等の液体製剤を製造するには、ＧＡＧ誘導体を必要に応じてｐＨ調整剤（塩酸、水酸化ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど）、等張化剤（塩化ナトリウム、ブドウ糖など）とともに注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、さらにマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空下に凍結乾燥し、用時溶解型の注射剤としてもよい。また、ＧＡＧ誘導体に、乳化剤（レシチン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油など）を加えて水中で乳化させ、注射用乳剤とすることもできる。
また、ＧＡＧ誘導体と賦形剤（乳糖、デンプン、結晶セルロースなど）、結合剤（白糖、ヒドロキシプロピルセルロースなど）、崩壊剤（カルボキシメチルセルロースなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルクなど）などの製剤補助剤を用いて、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤等の経口投与用の固形製剤、あるいはＧＡＧ誘導体に甘味剤（白糖、ソルビトールなど）、水、精油、エタノールなどを加えてシロップ剤などの経口投与用の液状製剤とすることもできる。
直腸投与剤は、ＧＡＧ誘導体に、カカオ脂肪酸のモノ、ジ又はトリグリセリド、ポリエチレングリコール等の坐剤用基剤を加えた後、加温して溶融し、これを型に流し込んで冷却するか、あるいはＧＡＧ誘導体をポリエチレングリコール、大豆油等に溶解した後、ゼラチン膜で被覆して得ることができる。
さらにＧＡＧ誘導体を、白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコール等に加えて軟膏剤とするか、必要に応じ加温し、混練して皮膚用外用剤とすることができる。テープ剤は、ＧＡＧ誘導体に、ロジン、アクリル酸エステル重合体等の粘着剤を混練し、これを不織布等に展延して得ることができる。
吸入剤は、例えば薬学的に許容される不活性ガス等の噴射剤に、ＧＡＧ誘導体を溶解又は分散し、これを耐圧容器に充填して得ることができる。
上記薬剤中のＧＡＧ誘導体の含量は、剤形、投与方法、投与回数等によって変動するが、通常、注射剤の場合は０．１〜１０重量％程度、経口投与用製剤の場合は１〜８０重量％程度、外用剤の場合は０．１〜１０重量％程度である。
ＧＡＧ誘導体の投与量は、患者の年齢、症状、体重、投与方法によって異なり、一概には特定できないが、組織内投与（注射）の場合は１日量１〜１，０００ｍｇを１回もしくは数回に分けて投与することが好ましい。
通常ヘパリンのマウス（雄、雌）に対する急性毒性試験による５０％致死量（ＬＤ５０）は、経口投与で５０００ｍｇ／ｋｇ以上、皮膚又は腹腔内投与で２５００ｍｇ／ｋｇ以上、静注で１０００ｍｇ／ｋｇ以上であることが知られており、現在医薬品（抗血液凝固剤）として一般に使用されているので、その安全性は既に裏付けられている。したがって、ＧＡＧとしてヘパリンを使用して合成し、その生理活性を担う部分がヘパリンである本発明のＧＡＧ誘導体も、ヘパリンと同等の安全性を有するものと思われる。
本発明の蛍光標識グリコサミノグリカン誘導体又はその塩は、上記ＧＡＧ誘導体を蛍光物質で標識したものである。この蛍光標識ＧＡＧ誘導体は、不溶性基材表面に吸着したＧＡＧ誘導体の分布を分析したり、生体内に投与されたＧＡＧ誘導体の滞留性、吸着状態、分布等を調べたりするための分析用試薬、診断薬等として有用である。
ここで、蛍光標識ＧＡＧ誘導体は、蛍光物質とＧＡＧ誘導体を溶液中で攪拌しつつ反応させ、必要により精製を行い得ることができる。ここで、反応温度としては通常室温（５〜３５℃）で、反応時間としては通常１時間〜３０時間が挙げられる。
蛍光物質としては、ＧＡＧ誘導体と容易に反応するものを挙げることができるが、具体的にはフルオレセイン、ダンシル、フルオレスカミン、ローダミンＢ、テトラメチルローダミン、イソインドール誘導体から選択される蛍光プローブをもつ化合物、より具体的には、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、フルオレセインイソチオシアネート、ダンシルクロリド、ダンシルフルオリド、フルオレスカミン、ローダミンＢイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ｏ−フタルアルデヒド等が挙げられる。
また、ＧＡＧ誘導体への蛍光物質の導入量としては、ＧＡＧ誘導体１分子あたり１〜１５が好ましく、より好ましくは１〜１０であり、更に好ましくは１〜３である。この導入量の確認は、ホウ酸緩衝液中でのＵＶ／ＶＩＳスペクトルにより算出できる。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明を実施例により更に詳説するが、本発明の目的を越えない限りこれに限定されるものではない。
〔合成例１〕  オクタデシル化ヘパリンの製造
ヘパリンナトリウム塩（和光純薬製、ブタ腸粘膜由来、分子量１８０００）１ｇを水（１００ｍｌ）に溶解後、ヨウ素（２０ｍｇ）、メタノール（１０ｍｌ）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）（３２５ｍｇ）の水（１０ｍｌ）溶液、及び０．１Ｎ水酸化カリウム（ＫＯＨ）溶液（１０ｍｌ）を加え室温で６時間撹拌した。反応液にＤｏｗｅｘ５０（３ｇ）を加え室温で１時間撹拌後、減圧下溶媒を除去後Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（以下ＤＭＦ、５０ｍｌ）を加え溶媒除去した。
樹脂を濾別後トリ−ｎ−ブチルアミン（０．５５ｍｌ）及びオクタデシルアミン（１ｍｍｏｌ）を加えて室温で１２時間撹拌した。減圧下６０℃で２５ｍｌまで溶媒除去し、水（５ｍｌ）、飽和酢酸ナトリウム溶液（２ｍｌ）、エタノール（３００ｍｌ）を加え生じた沈澱を濾取し、ブチルセルロファイン（生化学工業（株）製）カラムにより精製し、目的とする化合物（以下Ｃ−１８アルキル化ヘパリンと記載することもある）を白色粉状物質（７８ｍｇ）として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）；δ２．００（ｑ，ＮＨＣＯＣＨ３）、
１．３０（ｄ，ＣＯＮＨ（ＣＨ２）１７ＣＨ３）
１３Ｃ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）；１７６．２（ＩｄｏＡ  Ｃ−６）、１０１．４（ＩｄｏＡ  Ｃ−１）、
９９．０（ＧｌｃＮＡｃ  Ｃ−１）
なお、上記方法においてヘパリンナトリウム塩に代えてヘパラン硫酸（生化学工業（株）製）を用いる以外は、上記と同様の方法でＣ−１８アルキル化ヘパラン硫酸を合成した。
〔合成例２〕  ドデシル化ヘパリンの製造
オクタデシルアミン（１ｍｍｏｌ）にかえてドデシルアミン（１ｍｍｏｌ）を用いた他は合成例１と同様の反応を行い、ブチルセルロファインカラムにより精製し、目的とする化合物（以下Ｃ−１２アルキル化ヘパリンと記載することもある）を白色粉状物質（５０ｍｇ）として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）；δ２．００（ｑ，ＮＨＣＯＣＨ３）、
１．３０（ｔ，ＣＯＮＨ（ＣＨ２）１１ＣＨ３）
１３Ｃ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）、１７６．３（ＩｄｏＡ  Ｃ−６）、１０１．４（ＩｄｏＡ  Ｃ−１）、
９９．０（ＧｌｃＮＡｃ  Ｃ−１）
〔合成例３〕  オクチル化ヘパリンの製造
オクタデシルアミン（１ｍｍｏｌ）にかえてオクチルアミン（１ｍｍｏｌ）を用いた他は合成例１と同様の反応を行い、ブチルセルロファインカラムにより精製し、目的とする化合物（以下Ｃ−８アルキル化ヘパリンと記載することもある）を白色粉状物質（３５ｍｇ）として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）；δ２．００（ｑ，ＮＨＣＯＣＨ３）、
１．３０（ｔ，ＣＯＮＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３）
１３Ｃ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）；１７６．５（ＩｄｏＡ  Ｃ−６）、１０１．５（ＩｄｏＡ  Ｃ−１）、
９８．５（ＧｌｃＮＡｃ  Ｃ−１）
〔合成例４〕  ブチル化ヘパリンの製造
オクタデシルアミン（１ｍｍｏｌ）にかえてｎ−ブチルアミン（１ｍｍｏｌ）を用いた他は合成例１と同様の反応を行い、ブチルセルロファインカラムにより精製し、目的とする化合物（以下Ｃ−４アルキル化ヘパリンと記載することもある）を白色粉状物質（２８ｍｇ）として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）；δ２．００（ｑ，ＮＨＣＯＣＨ３）、
１．３０（ｔ，ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３ＣＨ３）
１３Ｃ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）；１７６．１（ＩｄｏＡ  Ｃ−６）、１０１．４（ＩｄｏＡ  Ｃ−１）、
９８．５（Ｇｌｃ−ＮＡｃ  Ｃ−１）
〔合成例５〕  プロピル化ヘパリンの製造
オクタデシルアミン（１ｍｍｏｌ）にかえてプロピルアミン（１ｍｍｏｌ）を用いた他は合成例１と同様の反応を行い、ブチルセルロファインカラムにより精製し、目的とする化合物（以下Ｃ−３アルキル化ヘパリンと記載することもある）を白色粉状物質（２０ｍｇ）として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）；δ２．００（ｑ，ＮＨＣＯＣＨ３）、
１．３０（ｔ，ＣＯＮＨ（ＣＨ２）２ＣＨ３）
１３Ｃ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）；１７６．１（ＩｄｏＡ  Ｃ−６）、１０１．２（ＩｄｏＡ  Ｃ−１）、
９９．０（Ｇｌｃ−ＮＡｃ  Ｃ−１）
〔合成例６〕  ウンデシル化ヘパリンの製造
オクタデシルアミン（１ｍｍｏｌ）にかえてウンデシルアミン（１ｍｍｏｌ）を用いた他は合成例１と同様の反応を行い、ブチルセルロファインカラムにより精製し、目的とする化合物（以下Ｃ−１１アルキル化ヘパリンと記載することもある）を白色粉状物質（６０ｍｇ）として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）；δ２．００（ｑ，ＮＨＣＯＣＨ３）、
１．３０（ｔ，ＣＯＮＨ（ＣＨ２）１０ＣＨ３）
１３Ｃ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）；１７６．３（ＩｄｏＡ  Ｃ−６）、１０１．４（ＩｄｏＡ  Ｃ−１）、
９９．１（Ｇｌｃ−ＮＡｃ  Ｃ−１）
〔合成例７〕  オクタデシル化ヘパリンの製造
ヘパリンナトリウム塩（４．０ｇ、分子量１２，０００）を水（８０．０ｍｌ）に溶解し、イオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ×８［Ｈ＋］、室町化学）処理後、溶出液の透析および凍結乾燥によりヘパリン（３．８ｇ）を得た。
ヨウ素（０．８ｇ、６．３×１０−３ｍｏｌ）に２０％メタノール水溶液（１００ｍｌ）を加えた溶液を、水（２．０ｍｌ）に溶解したヘパリン（３．８ｇ、３．２×１０−４ｍｏｌ）に加え、室温で１２時間撹拌を行った。反応液を４％ＫＯＨエタノール溶液（２００ｍｌ）に加え析出した白色沈澱を濾取後、残渣を水に溶解させ透析し、内液をイオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ×８［Ｈ＋］）処理することにより酸性条件下によるラクトン形成を行った。
溶出液の凍結乾燥より得られたラクトン化ヘパリン（１５０ｍｇ、１．３×１０−５ｍｏｌ）を、ｎ−トリ−ブチルアミン（０．１ｍｌ）を用いてアミン塩とした後、ＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解させ、クロロホルムに溶解させたオクタデシルアミン（３３．７ｍｇ、１．３×１０−４ｍｏｌ）を滴下し、反応温度８０℃で１２時間撹拌を行った。反応液を濃縮し水に溶解させ、イオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ×８［Ｈ＋］）処理により脱アミンを行い、溶出液の透析・凍結乾燥を行った。得られた粉末をクロロホルムにより洗浄し、未反応のオクタデシルアミンの除去を行った。残渣を水に溶解させ凍結乾燥を行い、オクタデシル化ヘパリン（１３４．８ｍｇ、１．１×１０−５ｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）；δ２．００（ｑ，ＮＨＣＯＣＨ３）、
１．３０（ｄ，ＣＯＮＨ（ＣＨ２）１７ＣＨ３）
１３Ｃ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）；１７６．２（ＩｄｏＡ  Ｃ−６）、１０１．４（ＩｄｏＡ  Ｃ−１）、
９９．０（ＧｌｃＮＡｃ  Ｃ−１）
〔合成例８〕  ドデシル化ヘパリンの製造
オクタデシルアミンに代えて、ドデシルアミン（２２．９ｍｇ、１．３×１０−４ｍｏｌ）を用いた他は、合成例７と同様な反応及び精製を行い、Ｃ−１２アルキル化ヘパリン（１２６．３ｍｇ、１．１×１０−５ｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）；δ２．００（ｑ，ＮＨＣＯＣＨ３）、
１．３０（ｔ，ＣＯＮＨ（ＣＨ２）１１ＣＨ３）
１３Ｃ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）、１７６．３（ＩｄｏＡ  Ｃ−６）、１０１．４（ＩｄｏＡ  Ｃ−１）、
９９．０（ＧｌｃＮＡｃ  Ｃ−１）
〔合成例９〕  オクチル化ヘパリンの製造
ｎ−オクチルアミン（０．１ｍｌ、６．０×１０−４ｍｏｌ）と上記で得られたラクトン化ヘパリン（１００ｍｇ、８．３×１０−６ｍｏｌ）をＤＭＦ（５．０ｍｌ）に溶解させた。この混合溶液を反応温度８０℃で１２時間撹拌を行った。反応液を濃縮し水に溶解させ、イオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ５０Ｗ×８［Ｈ＋］）処理により脱アミンを行い、溶出液の透析・凍結乾燥を行い、オクチル化ヘパリン（８８．８ｍｇ、７．４×１０−５ｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）；δ２．００（ｑ，ＮＨＣＯＣＨ３）、
１．３０（ｔ，ＣＯＮＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３）
１３Ｃ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）；１７６．５（ＩｄｏＡ  Ｃ−６）、１０１．５（ＩｄｏＡ  Ｃ−１）、
９８．５（ＧｌｃＮＡｃ  Ｃ−１）
〔合成例１０〕  ブチル化ヘパリンの製造
ｎ−オクチルアミンに代えて、ｎ−ブチルアミン（０．１ｍｌ、１．８×１０−３ｍｏｌ）を用いた他は、合成例９と同様な反応及び精製を行い、ブチル化ヘパリン（１０８．８ｍｇ、９．１×１０−５ｍｏｌ）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）；δ２．００（ｑ，ＮＨＣＯＣＨ３）、
１．３０（ｔ，ＣＯＮＨ（ＣＨ２）３ＣＨ３）
１３Ｃ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ，ｐｐｍ）；１７６．１（ＩｄｏＡ  Ｃ−６）、１０１．４（ＩｄｏＡ  Ｃ−１）、
９８．５（Ｇｌｃ−ＮＡｃ  Ｃ−１）
〔合成例１１〕  蛍光標識ヘパリン（ＤＴＡＦ−Ｈｅｐ）の製造（参考例）
ヘパリン（Ｈｅｐ）ナトリウム塩（１９８．６ｕｎｉｔ／ｍｇ、１００ｍｇ）を、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ（−））ｐＨ１０（６０ｍｌ）に溶解させ、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｉｓｌｅ  ｄ’Ａｂｅａｕ，Ｆｒａｎｃｅ）（１００ｍｇ）を加えて２４時間撹拌を行った。透析（Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｉｚｅ  ３６）による精製を行いＤＴＡＦ−Ｈｅｐを得た（１３０．６ｍｇ）。
このＤＴＡＦ−Ｈｅｐについてヘパリンナトリウム１分子当たりのＤＴＡＦの導入量を、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１８）中でＵＶ／ＶＩＳスペクトルにより算出した結果、ヘパリン（平均分子量１２０００とする）１分子当たりの導入量は、２．７個であった。
〔合成例１２〕  蛍光標識Ｃ−１８アルキル化ヘパリン（ＤＴＡＦ−Ｈｅｐ−Ｃ１８）の合成
合成例７で得たオクタデシル化ヘパリン（１００ｍｇ）を、ＰＢＳ（−）ｐＨ１０（６０ｍｌ）に溶解させ、ＤＴＡＦ（５０ｍｇ）を加えて２４時間撹拌を行った。透析（Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｍｂｒａｎｃｅ  Ｓｉｚｅ  ３６）による精製を行いＤＴＡＦ−Ｈｅｐ−Ｃ１８（１２６．０ｍｇ）を得た。
このＤＴＡＦ−Ｈｅｐ−Ｃ１８についてＣ−１８アルキル化ヘパリン１分子当たりのＤＴＡＦの導入量を、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１８）中で、ＵＶ／ＶＩＳスペクトルにより算出した結果、Ｃ−１８アルキル化ヘパリン（平均分子量１２０００とする）１分子あたりの導入量は、２．７個であった。
〔合成例１３〕  蛍光標識Ｃ−４アルキル化ヘパリン（ＤＴＡＦ−Ｈｅｐ−Ｃ４）の合成
オクタデシル化ヘパリンに代えて、合成例１０で得たブチル化ヘパリン（１００ｍｇ）を用いるほかは、合成例１２と同様に合成及び精製を行い、ＤＴＡＦ−Ｈｅｐ−Ｃ４（１２６．０ｍｇ）を得た。
このＤＴＡＦ−Ｈｅｐ−Ｃ４についてＣ−４アルキル化ヘパリン１分子当たりのＤＴＡＦの導入量を、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１８）中で、ＵＶ／ＶＩＳスペクトルにより算出した結果、Ｃ−４アルキル化ヘパリン（平均分子量１２０００とする）１分子あたりの導入量は、２．７個であった。
〔実施例１〕  本発明のＧＡＧ誘導体のフィルムコーティング
上記合成例１〜３で合成された本発明の各ヘパリン誘導体又はヘパラン硫酸誘導体の１％（ｗ／ｖ）水溶液にポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）フィルムを３時間浸潤後、各洗浄段階（１：無洗浄、２：水洗浄、３：３０％エタノール洗浄、あるいは４：７０％エタノール洗浄）を行ない（２〜４の洗浄は、各溶液に５分間浸漬することにより行なった）、それぞれの吸着量をＥＳＣＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、化学分析の為の電子分光法）により測定した。結果を図１に示した。ヘパリン誘導体又はヘパラン硫酸誘導体にのみ含まれる原子である窒素及びイオウに着目し、窒素及びイオウ結合性炭素と炭素結合性炭素の比を求め吸着量の指標とした。図１において縦軸に示したＮ／Ｃ、Ｓ／Ｃはそれぞれ窒素結合性炭素／炭素結合性炭素、イオウ結合性炭素／炭素結合性炭素の比を表す。横軸の１、２、３、４はＰＥＴフィルムを各誘導体溶液に浸潤した後の洗浄段階を表し、１は無洗浄、２は水洗浄、３は３０％エタノール洗浄、４は７０％エタノール洗浄後の状態を示す。
［ＰＶＣフィルムの作成］
テトラヒドロフラン２０ｍｌに溶解したＰＶＣ  １ｇを１０ｍｌずつシャーレ（φ９ｃｍ）に流し込み、グローボックス内で乾燥を行った。２時間後フィルムを取りだし１２時間減圧乾燥を行った。
Ｃ−１８アルキル化ヘパリン水溶液（１ｍｇ／ｍｌ）に上記ＰＶＣフィルムを浸漬した。３時間後、ＰＶＣフィルムを取り出し、上記と同様に１〜４の各洗浄段階を行った。
〔実施例２〕  接触角の測定
実施例１で得られたそれぞれのコーティングフィルムについて水小滴との接触角の測定を行った。島津製作所製ＥＳＣＡ７５０によりＭｇ陽極（Ｍｇ  Ｋα  ｒａｄｉａｔｉｏｎ）を用い室温、２×１０−７Ｔｏｒｒ（８ｋＶ，２０ｍＡ）で測定し、得られた結果は図２及び図３に示した。図２及び図３において縦軸は水との接触角を表し、横軸に示した数値は図１と同じく洗浄段階を表し、０は未処理ＰＥＴ表面を示し、１は無洗浄、２は水洗浄、３は３０％エタノール洗浄、４は７０％エタノール洗浄（洗浄は実施例１と同様に行なった）後の状態を表す。
また、上記において、ＰＥＴフィルムに変えて上記のポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）フィルムを使用し水小滴との接触角の測定を行った。それぞれの洗浄段階における水との接触角の測定を上記と同様に行った。その結果を図４に示す。
〔実施例３〕  走査型電子顕微鏡による粘着血小板の形態観察
合成例１〜３で得られた各誘導体をコーティングしたＰＥＴプレートを上記と同様に水洗浄し、これにダルベッコのリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄した血小板溶液（２５０００個／μｌ）を注入し、３７℃で３０分間インキュベートした。これを１．２５％グルタルアルデヒドで細胞を固定し、凍結乾燥後、走査型電子顕微鏡により観察した。その結果は図５に示す。
〔実施例４〕  細胞培養
平滑筋細胞はウサギ大動脈よりコラゲナーゼ及びエラスターゼを用いて調製し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）に１５％牛胎児血清（ＦＢＳ，Ｇｉｂｃｏ  Ｌａｂ．Ｉｎｃ．）、５０ＩＵペニシリン、５０μ／ｍｌストレプトマイシン（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂ．，Ｉｒｖｉｎｅ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）及び２．５μｇアンフォテリシンＢ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ＩＮＣ．，Ａｕｒｏｒａ  Ｏｈｉｏ）を加えた培地により、５％ＣＯ２中加湿条件下で培養した。
細胞増殖アッセイ
上記平滑筋細胞を２４ウェルクラスタープレート（住友ベークライト（株））中のＤＭＥＭ無血清培地に播種（５×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）した。３日間培養後リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ、日水製薬製）で洗浄し、その後上記ＤＭＥＭ血清添加培地の培養液に置換し、ヘパリン、各濃度のＣ−１８アルキル化ヘパリンをそれぞれに添加後５日間培養し、細胞数を測定し、無添加群（コントロール）における細胞数と比較した。
細胞数の測定にはＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（（株）同仁化学研究所製）を用い、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
ヘパリン及びＣ−１８アルキル化ヘパリンを添加後５日間培養時の平滑筋細胞増殖抑制効果を図６に、ヘパリン及びＣ−１８アルキル化ヘパリン５００μｇ／ｍｌ添加後の経時的抑制効果を図７に示した。図６において縦軸は４５０ｎｍのＯＤで示した平滑筋細胞密度を表し、横軸はヘパリン、Ｃ−１８アルキル化ヘパリンの添加濃度を示す。図７において各棒グラフで白抜きは無添加群（コントロール）、斜線はヘパリン５００μｇ／ｍｌ添加群、黒塗りはＣ−１８アルキル化ヘパリン５００μｇ／ｍｌ添加群を表し、横軸の数値は培養日数、縦軸は４５０ｎｍのＯＤで示した平滑筋細胞密度を表す。
比較のため、上記合成例５で得られたＣ−３アルキル化ヘパリンと本発明のヘパリン誘導体（Ｃ−１２アルキル化ヘパリン、Ｃ−１８アルキル化ヘパリン）の５００μｇ／ｍｌ添加時の平滑筋細胞増殖抑制効果を上記と同様に評価し、その結果を図８に示した。図８においては、縦軸は４５０ｎｍのＯＤで示した平滑筋細胞密度を表す。
〔実施例５〕  平滑筋細胞におけるＧＡＧ誘導体の吸着分布
円形のガラス板（１５ｍｍφ、松浪硝子工業株式会社、大阪）を２４穴プレート（Ｉｗａｋｉ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｂａ，Ｊａｐａｎ）の底に入れ、ステンレス製リングで固定し、各ウエルごとに平滑筋細胞（実施例４の「細胞培養」のところで述べたものと同様の細胞を用いた）浮遊液（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を１ｍｌづつ播種した。インキュベーター（３７℃、９５％ａｉｒ、５％ＣＯ２）内で１２時間培養し細胞接着後、上清を蛍光標識を行ったアルキル化ヘパリン（合成例１２で合成したＤＴＡＦ−Ｈｅｐ−Ｃ１８）を含む培養液（１００〜５００μｇ／ｍｌ）と交換した。所定時間（５日）後、ＰＢＳ（−）により３回洗浄し、１０％中性ホルマリン溶液で固定後、励起波長４８８ｎｍにて共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で観察を行い、細胞内部へのＣ−１８アルキル化ヘパリンの分布を調べた。
〔実施例６〕  ＧＡＧ誘導体存在下における平滑筋細胞の接着
トリプシン処理して得た平滑筋細胞（実施例４の「細胞培養」のところで述べたものと同様の細胞を用いた）浮遊液にＣ−１８アルキル化ヘパリンを最終濃度５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌとなるように添加し、調製したアルキル化ヘパリン−浮遊細胞混合培養液（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を３７℃で３０分間インキュベートした。ガラス板を２４穴プレートの底に入れ、ステンレス製リングで固定し、各ウエルごとに上記各平滑筋細胞混合培養液（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を１ｍｌづつ播種した。インキュベーター（３７℃、９５％ａｉｒ、５％ＣＯ２）内で２４時間培養後、位相差顕微鏡により観察し、写真撮影した。この写真より１ｍｍ２あたりの細胞接着数を求めた（ｎ＝３）。また、対照としてヘパリンを最終濃度２００μｇ／ｍｌとなるように平滑筋細胞浮遊液に添加し、上記と同様に培養し、細胞接着数を求めた。その結果を図９に示す。
図９は、Ｃ−１８アルキル化ヘパリンの濃度（横軸）と細胞接着数（縦軸）の関係を示した（ｎ＝３）。ヘパリン及びＣ−１８アルキル化ヘパリンを含まない培養液をコントロールとした。
〔実施例７〕  アルキル化ヘパリンで細胞修飾した平滑筋細胞あるいは線維芽細胞表面のトロンビン捕捉能
円形のガラス板（１５ｍｍφ、松浪硝子工業株式会社、大阪）を２４穴プレート（Ｉｗａｋｉ  Ｇｌａｓｓ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｃｈｉｂａ，Ｊａｐａｎ）の底に入れ、ステンレス製リングで固定し、各ウエルごとに上記と同様の平滑筋細胞浮遊液（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を１ｍｌづつ播種した。インキュベーター（３７℃、９５％ａｉｒ、５％ＣＯ２）内で１２時間培養し細胞接着後、上清をヘパリン又はＣ−１８アルキル化ヘパリンを含む培養液（１００〜５００μｇ／ｍｌ）と交換した。３０分後、ＰＢＳ（−）により３回洗浄し、１０％中性ホルマリン溶液で固定した。
以下の操作においてバッファーにはＰＢＳ（−）を用いた。ただし、Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔのみ０．１Ｍ  Ｔｒｉ−ＨＣｌバッファーを用いた。試薬との作用温度は４℃で、また、作用時間は３０分とし、各操作後，ＰＢＳ（−）による洗浄を行った。
上記ホルマリン固定した表面を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，ＵＳＡ）でブロッキング後、アンチトロンビンＩＩＩ溶液（１ｕｎｉｔ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，ＵＳＡ）を作用させ、続いてトロンビン溶液（１０ｕｎｉｔ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，ＵＳＡ）を作用させ、基材上でヘパリンあるいはＣ−１８アルキル化ヘパリン−アンチトロンビンＩＩＩ−トロンビン複合体を形成した。
Ｖａｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ−ＡＰ  ｓｈｅｅｐ  ＩｇＧ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）を用いて上記複合体を検出した。手順は、キットに従って行った。ヒツジＩｇＧ（ｓｈｅｅｐ  ＩｇＧ）でブロッキング後、複合体のトロンビンに一次抗体である抗ヒトトロンビン抗体（Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ、１．００ｍｇ／ｍｌ，ｓｈｅｅｐ  ＩｇＧ，Ｈｅａｍａｔｏｌｏｇｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）を作用させ、二次抗体としてビオチン標識ＩｇＧ、続いてアビジンを介してアルカリホスファターゼで標識した。次に、Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）を作用させ発色し、共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡（励起波長５４３ｎｍ）で観察を行った。コントロールとしてヘパリン及びＣ−１８アルキル化ヘパリンのいずれも無添加の培養液を用いた。この結果を図１０に示す。（ｎ＝３）
上記において、平滑筋細胞の代わりに、繊維芽細胞浮遊液（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を用いた以外は、上記と同様に、アルキル化ヘパリンで細胞修飾した繊維芽細胞表面のトロンビン捕捉能を調べた。この結果を図１１に示す。（ｎ＝３）
図１０、図１１において、コントロールの場合の細胞１つあたりの蛍光強度を１とした時の細胞表面の相対蛍光強度で示した。
〔実施例８〕  アルキル化ヘパリン吸着表面におけるトロンビン捕捉能
上記合成例１〜４で合成された本発明の各ヘパリン誘導体の１％（ｗ／ｖ）水溶液にＰＥＴフィルムを３時間浸潤して得られた各フィルムを用い、ＰＥＴに吸着したアルキル鎖長の異なるアルキル化ヘパリン（Ｃ−４、Ｃ−８、Ｃ−１２、Ｃ−１８の各アルキル化ヘパリン）とアンチトロンビンＩＩＩ及びトロンビンとの２分子あるいは３分子複合体形成能を、上記と同様に、発色基質を使って共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡により測定した。その結果を図１２に示す。
〔実施例９〕  ＰＴＣＡ用多機能バルーンカテーテルを使用したアルキル化ヘパリンの局所送達及び蓄積
血液を灌流し続けながらバルーン部位を膨張し、薬物を注入させることができる多機能ＰＴＣＡ（経皮的冠動脈形成術）カテーテルを使用して蛍光標識したアルキル化ヘパリンを血管局所に送達し、傷害血管壁での蓄積を検証した。さらに、蛍光標識したアルキル化ヘパリンとヘパリンを、同一のイヌの左右の総頚動脈にそれぞれ送達し、２４時間後に蓄積の程度を比較検討した。
即ち、雑種成犬２頭を使用し、左右の総頚動脈を多機能ＰＴＣＡカテーテルを用いて動脈壁を擦過し、血管壁障害モデルを作成した。それぞれ合成例１２及び１１で合成した蛍光標識したＣ−１８アルキル化ヘパリン（１０ｍｇ）とヘパリン（１０ｍｇ）をそれぞれ２０ｍｌの血清を含まないＤＭＥＭに溶解し、多機能ＰＴＣＡカテーテルを用いて動脈壁局所へ２０分かけて送達した。送達２４時間後、２頭（総頸動脈４本；ヘパリン２本、Ｃ−１８アルキル化ヘパリン２本）の総頚動脈を摘出して、凍結下で薄膜切片を作成し、血管壁局所へのフルオレセインの蓄積を蛍光顕微鏡で観察した。その結果を図１３（蛍光顕微鏡写真を基に作成した模式図）及び図１４（ＮＩＨイメージ分析により、厚さ１００μｍまでに残存する蛍光強度を数値化したもの）に示す。
〔結果〕
図１に示したＥＳＣＡの結果より、プラスチックプレートを本発明のヘパリン誘導体水溶液に浸潤することにより、本発明のヘパリン誘導体が有効に付着することが示された。又この被覆層を水洗しても一定量の本発明のヘパリン誘導体が残存することも明らかである。ここで、上記Ｒが炭素数８以上、更に炭素数１２以上の基であることが好ましいことが判る。この被覆膜が３０％エタノールにより少量脱落し、７０％エタノール洗浄によって完全に洗浄可能であることも明らかである。このことはこの本発明のＧＡＧ誘導体がプラスチックの様な不溶性材料の表面にコントロールされた状態で被覆可能であることを証明している。
又図２、図３及び図４に示した接触角の測定結果で本発明のヘパリン誘導体コーティング後の接触角が未処理プラスチック板に比し減少していることは、未処理プラスチックに比べ水濡れ性が向上していることを示しており、生体適合性が向上していることを示している。又水洗後の前進角と後退角の差が無洗浄のものに比べ減少しているのはプラスチック板表層がよりなめらかになっていることを示し、より一様な被覆膜を形成したことを示し、より抗血栓性を発現することを示している。
即ち、本発明のヘパリン誘導体の水溶液に浸漬すると、その基材表面に多層吸着が起こる。乾燥により、最上層の空気界面ではアルキル鎖等の疎水性基の濃縮のために疎水性表面を形成する。この表面を水洗浄すると、大部分の多層部分が脱離し、疎水性基が基材表面へ疎水吸着し、ヘパリン分子が水界面に露出するといった、単分子状に界面吸着した構造（単層）（ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を形成すると考えられる。しかし、この表面はエタノール水溶液で洗浄することにより脱着した。これは、エタノールによる疎水性雰囲気の増大により、アルキル基等の置換基／基材間の疎水結合が弱まったためと考えられる。
浸潤後の水洗によりこのように一様で平滑な被覆膜を形成せしめることが可能であるのは本発明のＧＡＧ誘導体の特徴といえる。
更に図５に示した粘着血小板の形態観察において無処理ＰＥＴ表面に付着している血小板は数が多いばかりでなく擬足を出し激しく伸展しているのに対し、本発明のヘパリン誘導体をコートした表面に粘着した血小板は数も少なく殆ど球形を保っており、血小板の活性化を著しく抑制していることが示された。ここで、上記Ｒが炭素数１２以上であることが好ましいことが判る。
又、図６に示した如く本発明のヘパリン誘導体は用量依存的に平滑筋細胞の増殖を抑制し４００μｇ／ｍｌ以上の濃度で完全に増殖を抑制した。又４００μｇ／ｍｌ以上の濃度で対照とした５００μｇ／ｍｌのヘパリンに対し有意に増殖を抑制した。また、本発明のヘパリン誘導体は、３００μｇ／ｍｌの濃度で対照とした５００μｇ／ｍｌのヘパリンと同等の活性があるので、低濃度で平滑筋増殖抑制効果があることも判る。
更に増殖抑制効果の経時的変化を示した図７においては、本発明のヘパリン誘導体とヘパリンとの差はより顕著でヘパリン添加群においては経時的に細胞密度が上昇し、増殖し続けるのに対し、本発明のヘパリン誘導体添加群では５日目まで完全に増殖が抑制された。
また、図８に示した如く、炭素数３のアルキルを有するヘパリン誘導体においては、増殖抑制効果はヘパリンに比べむしろ劣る結果を示しているのに対して、Ｃ−１２アルキル化ヘパリン誘導体においてはヘパリンよりもその効果が優れ、Ｃ−１８アルキル化ヘパリン誘導体においては著しく優れた平滑筋細胞増殖抑制効果を示している。
実施例５において細胞の断面をスキャンした結果、添加後１時間では細胞の周りに蛍光が観察されたが、６時間経過すると、細胞質まで蛍光が観察され、細胞内にアルキル化ヘパリンが分布していることが判った。
これは、本発明のＧＡＧ誘導体が、ｌｉｐｉｄ−ｒｉｃｈ（疎水性）の細胞外マトリックスを通って細胞内に吸着し、入り込むことを示唆しており、生体に投与した際の高い滞留性を裏付けており、細胞の機能に直接影響を与えていると考えられる。
図９に示すように、アルキル化ヘパリンの濃度が５０μｇ／ｍｌ付近から細胞接着数は減少し、２００μｇ／ｍｌで細胞の接着は完全に抑制された。このことからアルキル化ヘパリンはヘパリンに比し平滑筋細胞の増殖を著しく抑制することが示唆された。
図１０、図１１を見ると、本発明のヘパリン誘導体は、ヘパリンと比べて、平滑筋細胞あるいは線維芽細胞上でのトロンビン捕捉能が高いことが判る。
更に、図１２に示すように、アルキル鎖長の増大とともに蛍光強度は増大し、アルキル鎖長Ｃ１８およびＣ１２のアルキル化ヘパリンが、高い吸着安定性及びトロンビン捕捉性を有していることが判った。図１２においては、未処理のＰＥＴ表面の蛍光強度を１とし、それぞれの相対蛍光強度を示した。相対蛍光強度は、ヘパリンＣ４、Ｃ８、Ｃ１２、Ｃ１８の順に増大していることから、アルキル化ヘパリンはアルキル鎖が増大するにつれて強いトロンビン捕捉能を示すことが考えられた。
一方、バルーン擦過により作成した血管壁障害モデルに多機能ＰＴＣＡカテーテルを用いて蛍光標識したヘパリンを局所送達するとヘパリンは血管局所に送達直後、中膜まで一様に浸透し、１部は２４時間後まで残存することが報告されている（Ｊｐｎ  Ｊ  Ａｒｔｉｆ  Ｏｒｇａｎｓ  １９９８；２７；６４１−６）。図１３、１４を見ると、アルキル化ヘパリンはアルキル鎖を有することでヘパリンと比べ細胞膜に対する吸着能が著しく高く、血管中膜のより深い部分まで蓄積することが示されている。
具体的には、蛍光顕微鏡写真を基に作成した模式図である図１３を見ると、アルキル化ヘパリンは送達した血管全てにかつ内膜側の全周囲にわたり螢光発光が認められ、創部特異的に付着していることが判った。これに対しヘパリンは、内膜の一部に蛍光発光を認めたのみである。ＮＩＨイメージを使用した輝度の評価（図１４）では、アルキル化ヘパリンがヘパリンに比べ輝度が高く、中膜のより深い場所まで蓄積されていた。
従って、アルキル化ヘパリンは、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でも送達２４時間後まで血管局所に十分蓄積しており、ヘパリンと比べてアルキル化ヘパリンは血管中膜のより深い部分まで蓄積することが実験的に証明された。
産業上の利用可能性
本発明のＧＡＧ誘導体は、ヒトを含む温血動物に投与することにより血管内皮に付着して滞留し、動脈硬化、血管再建術後の再狭窄防止に必要な血栓の生成の抑制効果や平滑筋細胞の増殖抑制効果を臨床上有用なレベルで期待することができる。更に本発明のＧＡＧ誘導体を用い、医療用機器用、医療用具用等の人工材料の表面を容易に被覆し、該医療用機器、医療用具等に充分な抗血栓性を長期間付与することができる。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のヘパリン誘導体被覆ＰＥＴ表面のＥＳＣＡ測定結果を示す図である。
図２、図３、図４は、本発明のヘパリン誘導体被覆ＰＥＴ表面の水接触角の測定結果を示す図である。
図５は、本発明のヘパリン誘導体コーティングＰＥＴを水洗浄後、ＰＢＳで洗浄された血小板の懸濁液中で３７℃３０分間インキュベート後の走査型電子顕微鏡写真を基に作成した模式図である。
図６は、ヘパリン及び本発明のヘパリン誘導体の添加濃度別の平滑筋細胞増殖抑制効果を示す図である。
図７は、ヘパリン及び本発明のヘパリン誘導体５００μｇ／ｍｌ添加時の経時的な平滑筋細胞増殖抑制効果を示す図である。
図８は、ヘパリン及びヘパリン誘導体５００μｇ／ｍｌ添加後５日間培養時の平滑筋細胞増殖抑制効果を示す図である。
図９は、ヘパリン及びヘパリン誘導体存在下での平滑筋細胞のガラス表面に対する接着性を示す図である。
図１０、図１１は、それぞれ平滑筋細胞又は線維芽細胞を培養する際、培養液にヘパリン又はヘパリン誘導体を添加したときのトロンビン捕捉能を示す図である。
図１２は、ガラス表面に結合した、種々のアルキル鎖長のアルキル化ヘパリンのトロンビン捕捉能を示す図である。
図１３、図１４は、傷害血管壁（ｉｎ  ｖｉｖｏ）におけるヘパリン及びヘパリン誘導体の蓄積の程度を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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