(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロドコッカス・エスピーKN-14株（受託番号FERM P-18195）。
【請求項２】
ロドコッカス・エスピーKN-45株（受託番号FERM P-18197）。
【請求項３】
ロドコッカス・エスピーKN-46株（受託番号FERM P-18196）。
【請求項４】
請求項１乃至３のいずれか１項に記載の菌株で、揮発性芳香族炭化水素により汚染された環境を浄化することを特徴とする環境の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は揮発性芳香族炭化水素分解能を有する微生物及びそれを用いた環境の浄化方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
石油による土壌や海洋、大気等の環境汚染は、近年特に増大している。石油成分は生物に対する毒性を有するため、製油工場からの漏出、タンカー座礁等により環境中へ石油が流出すると、人間のみならず、動物や魚、鳥、海草、貝類等の生物に対して悪影響を及ぼす。特に、石油成分の中でもベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレンに代表される揮発性芳香族炭化水素類は毒性が高く、また、揮発性を有するゆえに大気から拡散するとともに、若干の水溶性を有するために、地下水からの拡散の危険性もあり、大きな問題となっている。また、塗料工場等から排出される排水には原材料として使用される揮発性芳香族炭化水素類が多量に含有されており、その処理も大きな問題となっている。
【０００３】
実際の汚染環境における処理現場では、これまで、揮発性芳香族炭化水素を機械的に揮発させ、回収する方法が主として用いられてきたが、コストが高い、あるいは回収された炭化水素を何らかの方法で再度処理しなければならない等の問題点があり、有効な手段ではなかった。これに対して、近年、微生物を利用した環境修復、いわゆるバイオレメディエーションの適用が論じられるようになってきた。しかし、バイオレメディエーションの過程で増殖する菌の種類や、中間代謝物の安全性等不明な点が多く、実施にはなかなか到らないのが現状である。特に、オルト-キシレンは他の揮発性芳香族炭化水素類に比較して分解が難しいため、分解菌が単離された例は非常に少なく、また、分解能も低い。このため、バイオレメディエーションあるいは排水処理の過程で高い揮発性芳香族炭化水素分解能を有する微生物の開発が待たれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、揮発性芳香族炭化水素分解能を有する微生物を利用し、揮発性芳香族炭化水素により汚染された環境を迅速に浄化する手段を提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため、小規模なバイオレメディエーション実験を行い、この時の細菌相の変化とオルト-キシレンの分解を解析した結果、オルト-キシレンが分解されるときに菌数の増加する菌株を見いだし、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、揮発性芳香族炭化水素分解能を有するロドコッカス属に属する微生物である。
【０００７】
また、本発明は、上記微生物で、揮発性芳香族炭化水素により汚染された環境を浄化することを特徴とする環境の浄化方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００９】
本発明の微生物は、ロドコッカス（Rhodococcus）属に属し、揮発性芳香族炭化水素を分解する能力を有するものである。本発明の微生物には、揮発性芳香族炭化水素、例えば、オルト−キシレンを単一炭素源として分解することのできる微生物が含まれる。このような微生物としては、本発明者により単離されたKN-14株、KN-45株、KN-46株などを例示することができる。
【００１０】
これらの菌株は、オルト-キシレンにより汚染された土壌からオルト-キシレン分解能を持つ微生物を単離すると同時に、土壌中で優占化していると考えられる微生物をDGGE法を用いることにより遺伝子レベルで解析し、DGGE法で得られた遺伝子配列と99％以上の相同性を持つ微生物を単離された微生物から選抜することで得られた新規な菌株である。
【００１１】
これらの菌株の16S rRNAをコードするDNAの塩基配列の一部を決定し、NCBIのプログラム BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)により同定を行った。その結果、これらの菌株は、ロドコッカス属に属することが判明した。しかし、ロドコッカスに属する公知の菌株とはオルト-キシレン分解能において異なる性質を示すことから、これらの菌株を新菌種と認め、ロドコッカス・エスピーKN-14株（Rhodococcus sp. KN-14株）、ロドコッカス・エスピーKN-45株（Rhodococcus sp. KN-45株）、ロドコッカス・エスピーKN-46株（Rhodococcus sp. KN-46株）と命名した。
【００１２】
ロドコッカス・エスピーKN-14株（以下、「KN-14株」という）、ロドコッカス・エスピーKN-45株（以下、「KN-45株」という）、及びロドコッカス・エスピーKN-46株（以下、「KN-46株」という）は、産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に以下の受託番号で寄託されている。
【００１３】
ロドコッカス・エスピーKN-14株：FERM P-18195（寄託日：平成13年2月2日、識別表示：Rhodococcus sp. KN-14）
ロドコッカス・エスピーKN-45株：FERM P-18197（寄託日：平成13年2月2日、識別表示：Rhodococcus sp. KN-45）
ロドコッカス・エスピーKN-46株：FERM P-18196（寄託日：平成13年2月2日、識別表示：Rhodococcus sp. KN-46）
KN-14株、KN-45株、及びKN-46株の菌学的性質を以下に示す。
A.  形態学的性質
形態的にはKN-14株、KN-45株、KN-46株ともにほぼ共通であり、細胞の形は糸状性である。また、1/10TSA培地（Tryptic Soy Broth w/o Dextrose（Difco社製）  2.75g/L、グルコース  0.25g/L）を用いて寒天プレートにより培養した場合、コロニーの色は培養初期はクリーム色であるが、培養後期にはピンク色に変化し、コロニーの透明度はない。さらに、基質特異性は表１のとおりである。
【００１４】
【表１】
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B.  16S rRNAに対応するDNA（以下、「16S rRNA遺伝子」という）及びジャイレースサブユニットをコードするDNA（以下、「gyrB遺伝子」という）の塩基配列  KN-14株、KN-45株、KN-46株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３に示す。また、KN-14株、KN-45株、KN-46株のgyrB遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列番号４、配列番号５、配列番号６に示す。
【００１５】
なお、塩基配列の決定は、Current Protocols in Molecular Biology (eds.)（ Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, N.Y.（1987） ） に準じて行った。DNAのシーケンスはautomated DNA sequencer (ABI 377; Perkin Elmer, Inc., USA)を用いて行った。
【００１６】
本発明の微生物には、KN-14株、KN-45株、KN-46株のほか、これらの菌株と一定の類似性を示す微生物も含まれる。一定の類似性を示す微生物とは、例えば、微生物の分類に利用されている16S rRNA遺伝子やgyrB遺伝子の塩基配列が、上記３菌株と類似している微生物をいう。具体的には、16S rRNA遺伝子の塩基配列が配列番号１、配列番号２、又は配列番号３に記載の塩基配列と90％以上、好ましくは97％以上相同である微生物やgyrB遺伝子の塩基配列が配列番号４、配列番号５、又は配列番号６に記載の塩基配列と73％以上、好ましくは85％以上相同である微生物が、上記菌株と一定の類似性を示す微生物に含まれる。
【００１７】
このような上記菌株と一定の類似性を示す微生物は、揮発性芳香族炭化水素により汚染された土壌などから配列番号１〜６に記載の塩基配列を指標として単離してくることができる。
【００１８】
本発明の微生物を増殖させるには、通常の培養法が挙げられる。培養は、好気的条件で行うことが好ましく、有機物、無機塩、窒素源、その他栄養源を含む1/10TSA培地等に本発明の微生物を接種し、例えば振とう培養法、通気撹拌培養法などにより培養を行う。
【００１９】
上記培養における温度条件は、使用する微生物の生育温度の範囲、好ましくは最適生育温度の範囲に設定する。例えば20〜30℃、好ましくは25℃に設定することができる。なお、培地のpHは、6.5〜7.5の範囲に設定すればよい。
【００２０】
無機塩として培地に添加する物質としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、その他必要に応じて微量金属塩が挙げられる。また、窒素源としては、本発明の微生物が資化し得るものであればよく、例えば、ペプトン、カシトン、尿素、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、各種アミノ酸などが挙げられる。これらの窒素源は１種でもよく、２種以上を適宜組み合わせても良い。さらに、本発明の微生物の増殖を促進するための栄養源として、ビタミン、酵母エキス、麦芽エキスなどを適量添加しても良い。
【００２１】
培養時間は、栄養源の量や種類により異なるが、通常１日以上、好ましくは2〜3日間である。
【００２２】
本発明の微生物は、揮発性芳香族炭化水素に汚染された環境の浄化に利用することができる。ここでいう「環境」には、土壌、海洋、大気のほか、排水なども含まれる。環境の浄化は、上記条件で培養した微生物の培養液、あるいは、微生物を凍結乾燥処理した乾燥粉末を汚染環境に散布することにより行われる。この際、乾燥粉末と増殖を補助する無機塩類を混合・造粒し、粉末状及び顆粒状等に製剤化したものを汚染環境に散布しても良い。処理に用いる微生物の量は、土壌及び海水の汚染状況等に応じ、任意に定めることができるが、通常、汚染土壌1m3あるいは汚染海域100m2に培養液であれば1L、乾燥菌体であれば5g程度である。また、汚染された大気の浄化は、上記培養液あるいは乾燥菌体を固定化担体を設置した気体の浄化装置に添加し、これに汚染大気を通気することで行う。さらに、汚染された排水の浄化は、同じく上記培養液あるいは乾燥菌体を汚染排水と混合し、好気条件で1〜7日程度培養することで行う。
【００２３】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
100mlの茶褐色ガラスバイアルに土壌（岩手県釜石市の畑地より採取）7g、表２に示した無機塩培地2mlを添加し、テフロンコートされたブチルゴム栓により密封した。さらに、オルト-キシレン濃度が水中で200μLとなるようにオルト-キシレンを添加し、20℃で1日間振とうした後、KN-14株を植菌し、20℃にて10日間培養を行った。培養期間中、適宜、バイアル中の気相部から気体を少量回収し、これを直接GCにより解析を行い、バイアル内の水相におけるオルト-キシレン濃度を測定することで、初期添加濃度に対する残存率を計算した。その結果を図１に示す。図１に示すように、土壌のみでは分解に約10日間必要であるが、KN-14株を植菌した系では植菌から約2日で100％分解することができ、本発明の微生物を用いることにより、迅速なオルト-キシレン分解を行うことができることが分かる。
【００２４】
【表２】
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【本発明の効果】
本発明は、揮発性芳香族炭化水素分解能を有する新規な微生物を提供する。この微生物によりオルト-キシレン等の揮発性芳香族炭化水素で汚染された環境を効率的に浄化処理することができる。
【００２５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の微生物を添加した場合と添加しなかった場合のオルト-キシレン残存率の経時的変化を示す図である。
【図１】
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