(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の１６４番目の塩基の多型である、レプチン受容体遺伝子上に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて心筋梗塞を検査する方法。
【請求項２】
さらに、配列番号２の３７７番目の塩基の多型である、ガレクチン−２遺伝子上に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果を合わせて検査する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
配列番号１の塩基配列の１６４番目の塩基を含む１５塩基以上の配列、又はその相補配列を有する心筋梗塞検査用プローブ。
【請求項４】
配列番号１の塩基配列の１６４番目の塩基を含む配列を有するDNAを増幅することのできるプライマーであって、該塩基の３０〜１００塩基上流の１５塩基以上の配列、又は該塩基の３０〜１００塩基下流の領域に相補的な１５塩基以上の配列を有する心筋梗塞検査用プライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は心筋梗塞などの炎症性疾患の検査方法及び炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ライフスタイルの変化に伴って、炎症性疾患、特に心筋梗塞などの冠動脈疾患の死亡リスクが増加している（非特許文献１又は２参照）。したがって、これらの疾患について早期に発症リスクを判定する方法の開発が望まれている。【０００３】
心筋梗塞などの冠動脈疾患は遺伝的素因によって発症する可能性が提唱され、遺伝子変異の有無によって、心筋梗塞を判定する方法がいくつか知られている。例えば、プロスタサイクリン合成酵素遺伝子の多型を分析して心筋梗塞の発症リスクを判定する方法が知られている（特許文献１参照）。しかしながら、より正確に判定するためには、さらなる判定法の開発が求められていた。【０００４】
レプチン受容体は、摂食量やエネルギー消費量の調節等に関与するレプチンのシグナル伝達を媒介する一回膜貫通型受容体である（非特許文献３参照）。レプチン受容体をコードする遺伝子のいくつかの部位における多型が肥満などの代謝疾患に関連することが知られていた（２２３番目のQをRに置換する多型、非特許文献４参照）。しかしながら、レプチン受容体遺伝子の多型と心筋梗塞等の炎症性疾患との関連については知られていなかった。【０００５】
ガレクチンはガラクトースに結合性を示すタンパク質であるが、哺乳類では現在、１０種類のガレクチンが知られている。その中で、ガレクチン−２は１４ｋＤａのサブユニットからなる非共有結合性のホモダイマーを形成し、還元剤非存在下では自己凝集し活性を失うことが知られている。また、ガレクチン−２の発現は正常成人組織中では下部小腸を主とした上皮細胞に多く認められることが知られているが、その詳細な生理機能については知られていなかった（非特許文献５参照）。
【特許文献１】特開２００２−１３６２９１号公報
【非特許文献１】Nature Medicine, 1997, vol.3, p600-601
【非特許文献２】New England Journal of Medicine, 1997, vol.337, p1360-1369
【非特許文献３】Cell, 1995, vol.83, p1263-1271
【非特許文献４】Hum Genet., 2001, vol.108(3), p233-236
【非特許文献５】Trends in Glycoscience and Glycotechnology, 1997, vol.9, No.45, p87-93
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、心筋梗塞等の炎症性疾患の発症リスクや発症の有無を正確に検査する方法を提供することを課題とする。本発明はまた、心筋梗塞等の炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、レプチン受容体遺伝子の一塩基多型が心筋梗塞に関連することを見出した。さらに、レプチン受容体がガレクチン−２と特異的な相互作用を示すことから、両者の相互作用を変化させる物質をスクリーニングすることで心筋梗塞等の炎症性疾患の治療薬が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）レプチン受容体遺伝子上に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて炎症性疾患を検査する方法。
（２）レプチン受容体遺伝子上に存在する一塩基多型が配列番号１の１６４番目の塩基に相当する塩基の多型である、（１）の方法。
（３）  さらにガレクチン−２遺伝子上に存在する一塩基多型を分析し、該分析結果を合わせて検査する、（１）の方法。
（４）ガレクチン−２遺伝子上に存在する一塩基多型が配列番号２の３７７番目の塩基の多型である、（３）の方法。
（５）  炎症性疾患が心筋梗塞である（１）〜（４）のいずれかの方法。
（６）  配列番号１の塩基配列の１６４番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する炎症性疾患検査用プローブ。
（７）  配列番号１の塩基配列の１６４番目の塩基を含む配列を有するDNAを増幅することのできる炎症性疾患検査用プライマー。
（８）  レプチン受容体およびガレクチン−２を含むスクリーニング系に医薬候補物質を添加する工程、レプチン受容体とガレクチン−２との相互作用を測定する工程、及び前記相互作用を変化させる物質を選択する工程を含む、炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】抗Ｍｙｃ抗体又は抗ＦＬＡＧ抗体を用いた免疫沈降の結果を示す図（写真）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
＜１＞本発明の検査方法
本発明の検査方法は、レプチン受容体遺伝子上に存在する炎症性疾患に関連する一塩基多型を分析し、該分析に基づいて炎症性疾患を検査する方法である。炎症性疾患としては、炎症との相関が知られている細胞接着因子やサイトカインの誘導が認められる疾患であれば特に限定されないが、例えば、慢性関節リウマチ、全身性エリマトーデス、炎症性腸炎、種々のアレルギー疾患、細菌性ショック、または心筋梗塞や脳卒中などの冠動脈疾患などが挙げられ、特には心筋梗塞が挙げられる。なお、本発明において、「検査」とは炎症性疾患の発症リスクの検査や発症の有無の検査を含む。【００１１】
レプチン受容体遺伝子としては、ヒトレプチン受容体遺伝子が好ましく、例えば、National Center for Biotechnology Information（NCBI）にNT_032977に登録された配列を有する遺伝子を挙げることができる。ただし、該遺伝子は人種の違いなどによって炎症性疾患に関連する塩基以外の塩基において置換や欠失等が存在する可能性があるため、上記配列の遺伝子に限定されない。【００１２】
炎症性疾患に関連するレプチン受容体遺伝子の一塩基多型は特に制限されないが、好ましくはプロモーター領域の−９７８番目の塩基の多型が挙げられる。なお、−９７８番目とは転写開始点から数えた番号である。−９７８番目の塩基を含む配列としては、例えば、配列番号１の配列が挙げられ、−９７８番目の塩基は、配列番号１の１６４番目の塩基に相当する。
ヒト染色体上のレプチン受容体遺伝子においては、この塩基がA（アデニン）又はG（グアニン）となる多型が存在する。このような塩基の多型を解析することにより、炎症性疾患を検査することができる。
ここで、「相当する」とは、ヒトレプチン受容体遺伝子上の上記配列を有する領域中の該当塩基を意味し、仮に、人種の違いなどによって上記配列がSNP以外の位置で若干変化したとしても、その中の該当塩基を解析することも含む。また、レプチン受容体遺伝子近傍あるいは該遺伝子内の、上記多型と連鎖不平衡の関係にある塩基多型を解析することも含む。
なお、レプチン受容体遺伝子の配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。【００１３】
レプチン受容体遺伝子の一塩基多型の解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されないが、例えば、血液、尿等の体液サンプル、粘膜細胞などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。一塩基多型の解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離し、これを用いて解析することが好ましい。【００１４】
レプチン受容体遺伝子の一塩基多型の解析は、通常の一塩基多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、PCR、ハイブリダイゼーションなどが挙げられるが、これらに限定されない。【００１５】
シークエンスは通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側 数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンスを行う場合、あらかじめ多型を含む断片をPCRなどによって増幅しておくことが好ましい。【００１６】
また、PCRによる増幅の有無を調べることによって解析することができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してPCRを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。【００１７】
また、多型を含むDNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、PCR-SSCP（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．  １９９２  Ｊａｎ  １；  １２（１）：  １３９−１４６．）が挙げられる。具体的には、まず、レプチン受容体遺伝子の多型部位を含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。【００１８】
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。【００１９】
次に、上記のような方法によって解析した多型に基いて、炎症性疾患について検査を行う。例えば、−９７８位の塩基の多型に基いて判定する場合は、該塩基がＡの場合、炎症性疾患の発症リスクが高い、炎症性疾患に罹患している可能性が高いなどと判定することができる。また、対立遺伝子の多型を含めて考慮してもよく、例えば、遺伝子型がAAアレルの場合に、GGアレルと比べて炎症性疾患の発症リスクが高い、炎症性疾患に罹患している可能性が高いなどと判定することができる。【００２０】
本発明の判定法においては、レプチン受容体遺伝子の多型に加え、他の遺伝子の多型を
解析し、それらの遺伝子の多型の組合わせに基いて炎症性疾患の判定を行ってもよい。他の遺伝子としては、ガレクチン−２遺伝子が挙げられる。ガレクチン−２遺伝子の配列としては、NCBIにNT_011520に登録されている配列を挙げることができ、ガレクチン−２遺伝子の多型としては、イントロン１の３２７９番目の塩基の多型を挙げることができる。この塩基は、配列番号２の３７７番目の塩基に相当する。ヒトガレクチン−２遺伝子では該塩基がC/Tとなる多型が存在する。そして、この位置の遺伝子型がTTの場合に比べて、CCの場合に炎症性疾患のリスクが高い。したがって、例えば、レプチン受容体遺伝子の−９７８位の多型がAAであり、ガレクチン−２遺伝子の多型がCCの場合に特に炎症性疾患の発症リスクが高い、炎症性疾患に罹患している可能性が高いなどと判定することができる。
さらに、本発明の検査方法においては心筋梗塞との関連が知られているリンホトキシンα遺伝子の多型（Nat Genet. 2002 Dec;32 (4):650-4. 2002：ＷＯ２００４／０１５１００）を組合わせて検査することもできる。
【００２１】
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明はまた、炎症性疾患を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、配列番号１の塩基配列の１６４番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有するプローブが挙げられる。また、プライマーとしては、配列番号１の塩基配列の１６４番目の塩基の多型を判別することのできるプライマー、例えば、配列番号１の塩基配列の１６４番目の塩基を含む配列を有するDNAを増幅することのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーやプローブの長さは特に制限されないが、例えば、１０〜１００塩基のオリゴヌクレオチドが好ましく、１５〜５０塩基のオリゴヌクレオチドがより好ましい。
上記多型部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは30〜100塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは30〜100塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。PCRによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。
なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、PCR用のポリメラーゼやバッファーを含むものであってもよい。【００２２】
また、本発明の検査用試薬は、ガレクチン−２遺伝子の多型を解析するためのプライマーやプローブをさらに含むものであってもよい。このようなプローブとしては、配列番号２の塩基配列の３７７番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有するプローブが挙げられ、プライマーとしては、配列番号２の塩基配列の３７７番目の塩基を含む配列を有するDNAを増幅することのできるプライマーが挙げられる。【００２３】
＜３＞スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、レプチン受容体およびガレクチン−２を含むスクリーニング系に医薬候補物質を添加する工程、レプチン受容体とガレクチン−２との相互作用を測定する工程、及び前記相互作用を変化させる物質を選択する工程を含む、炎症性疾患治療薬のスクリーニング方法である。【００２４】
レプチン受容体及びガレクチン−２は、いずれもその遺伝子上の多型が心筋梗塞などの炎症性疾患に関連を示し、かつ、これらのタンパク質は生体内で特異的に相互作用しているため、これらの相互作用を変化させる物質は炎症性疾患に対する医薬の候補物質になりうる。【００２５】
医薬候補物質としては特に制限はなく、例えば、低分子合成化合物であってもよいし、天然物に含まれる化合物であってもよい。また、ペプチドであってもよい。スクリーニングには個々の被検物質を用いてもよいが、これらの物質を含む化合物ライブラリーを用いてもよい。候補物質の中からレプチン受容体とガレクチン−２の相互作用を変化させるものを選択することにより、炎症性疾患の治療薬を得ることができる。ここで、「変化」とは相互作用を阻害すること、および相互作用を強化することを含む。【００２６】
レプチン受容体およびガレクチン−２を含むスクリーニング系とは、これらの両タンパク質を含むスクリーニング系を意味し、インビトロの系であってもよいし、細胞系であってもよい。上記スクリーニング系はこれらのタンパク質が直接添加される系であってもよいし、遺伝子から転写されたｍＲＮＡが翻訳されることによりこれらのタンパク質が含まれるようになった系であってもよい。【００２７】
インビトロのスクリーニング系として具体的には、以下に示すような、レプチン受容体タンパク質およびガレクチン−２タンパク質を用いたプルダウンアッセイや表面プラズモン共鳴現象を利用した検出法などが挙げられる。【００２８】
インビトロのスクリーニング系に用いられるレプチン受容体タンパク質およびガレクチン−２タンパク質は組換えタンパク質であっても、天然由来の蛋白質であってもよい。さらに、化学合成したものであってもよい。タンパク質の由来に制限はなく、ヒトおよび他の動物を含む真核生物由来の蛋白質を用いることができるが、好ましくは、ヒト由来のタンパク質が用いられる。ヒト由来のレプチン受容体タンパク質としては、配列番号４のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。また、ガレクチン−２との結合性を保持する限りにおいて、配列番号４のアミノ酸配列において一または数個のアミノ酸が置換・欠失・付加された配列を有するものであってもよい。一方、ヒト由来のガレクチン−２タンパク質としては、配列番号６のアミノ酸配列を有するものが挙げられる。また、レプチン受容体との結合性を保持する限りにおいて、配列番号６のアミノ酸配列において位置または数個のアミノ酸が置換・欠失・付加された配列を有するものであってもよい。なお、上記数個とは、好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜２０個、特に好ましくは２〜１０個である。【００２９】
また、タンパク質は結合部位を含む部分ペプチドを使用してもよい。レプチン受容体は分子量が大きく発現が必ずしも容易でないため、ガレクチン−２との結合に関与する細胞外ドメイン（配列番号４の８６４〜１１６５番目）を用いてもよい。または他のペプチドとの融合タンパク質を用いてもよい。融合させるペプチドとしては、例えば、プルダウンアッセイや精製に使用できるGST、Hisタグ、Sタグなどのペプチドタグが挙げられる。【００３０】
組換えによりタンパク質を得るためには、例えば、配列番号３（レプチン受容体）や配列番号５（ガレクチン−２）の塩基配列を有するDNAを大腸菌や動物細胞などに導入して組換えタンパク質を発現させ、該タンパク質を精製することによって得ることができる。なお、必ずしも精製されたタンパク質を用いる必要はなく、粗精製物や細胞抽出物を相互作用の検出に使用してもよい。上記ＤＮＡを大腸菌に導入するためのベクターとしてはpETベクター（Novagen社）やpGEXベクター（Amersham Pharmacia社）などが挙げられ、動物細胞に導入するためのベクターとしては、pcDNAベクター（Invitrogen社）などが挙げられる。【００３１】
インビトロの系として、プルダウンアッセイを行う場合は、レプチン受容体タンパク質とガレクチン−２タンパク質とをインビトロでインキュベートし、一方のタンパク質に対する抗体、またはこのタンパク質が融合タンパク質の場合、融合するペプチドタグに対する抗体やアフィニティカラム等で複合体を回収したのち、該タンパク質に結合する他方のタンパク質を検出することにより、両タンパク質の相互作用を評価することができる。この系に被検物質を添加し、相互作用に影響を与える物質を選択することによってスクリーニングを行うことができる。プルダウンアッセイにおいては、一方のタンパク質を放射性同位体やビオチン等の標識物質で標識し、それを利用して検出してもよい。【００３２】
さらに、インビトロのスクリーニング系として、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用する系を挙げることもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは、タンパク質間の相互作用 を微量の蛋白質試料を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることによりレプチン受容体およびガレクチン−２の結合を評価することが可能である。さらに、コンビナトリアルケミストリーを利用したハイスループットスクリーニング（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６，２７３  ｐ４５８−６４、Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３８４  ｐ１１−１３）などにより本発明のスクリーニング を行うことも可能である。
さらに、その他のスクリーニング系として、蛍光によって検出する系を用いることもできる（Fluorescence Resonance Energy Transfer（FRET））。【００３３】
また、細胞系でスクリーニングを行うこともできる。例えば、免疫沈降を用いる方法を挙げることができる。すなわち、レプチン受容体とガレクチン−２とを発現する細胞を培養し、細胞を回収後、一方のタンパク質に対する抗体等で複合体を回収したのち、他方のタンパク質を、そのタンパク質に対する抗体等を用いて検出することにより、両者のタンパク質の相互作用を検出でき、また、該相互作用に与える被検物質の影響を評価することができる。この場合において、両タンパク質は細胞が内因的に発現するタンパク質であってもよいが、どちらかまたは両方のタンパク質を外来的に細胞で発現させることもできる。用いる細胞としては、CHO細胞やCOS細胞などを挙げることができるが、これらに限定されない。
動物細胞内で蛋白質を外来的に発現させる場合、例えば、上述したようなレプチン受容体および／またはガレクチン−２をコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ（Clontech），ｐｃＤＮＡ  Ｉ（Invitrogen）などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで当該遺伝子を発現させることができる。なお、これらのタンパク質はＭｙｃタグやＦｌａｇタグなどのペプチドタグとの融合タンパク質として発現させてもよい。【００３４】
細胞を用いたスクリーニング系としては、さらに、酵母または動物細胞などを用いた２ハイブリッド法が挙げられる。
酵母２−ハイブリッド法においては、レプチン受容体またはガレクチン−２のどちらか一方のタンパク質またはその部分ペプチドを、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域等と融合させた融合タンパク質を発現するベクター、そして他方のタンパク質またはその部分ペプチドをＶＰ１６またはＧＡＬ４等の転写活性化領域と融合させた融合タンパク質を発現するベクターを構築し、これらを、レポーター遺伝子をコードするベクターと共に酵母細胞に導入して、被検物質を含む試料の存在下でレポーター活性を指標に化合物のアッセイを行う。レプチン受容体タンパク質とガレクチン−２タンパク質との相互作用によりレポーター遺伝子の発現が誘導されるが、被検化合物により両者のタンパク質の相互作用が阻害されると、レポーター遺伝子の発現が抑制される。レポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、GFP遺伝子等が挙げられるが、これらに制限されない。２ハイブリッド法によるスクリーニングは、酵母の他、哺乳動物細胞などを使って行うこともできる。
２ハイブリッド法によるスクリーニングは例えば、「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ  Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもクロンテック社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ」（ストラタジーン社製））などを使用して行うことができる。
【実施例】
【００３５】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。【００３６】
（１）一塩基多型の解析
心筋梗塞患者及び非心筋梗塞患者（コントロール）それぞれについて、レプチン受容体遺伝子の一塩基多型を解析した。具体的には、被検者の血液から単離した染色体DNAを鋳型に、配列番号７および８のプライマーを使用してPCRを行い、得られた増幅産物について配列番号９のプライマーを用いて多型部位のシークエンス解析を行った。シークエンス解析には、Applied Biosystems社のABI3700キャピラリーシークエンサーを用いた。なお、解析された心筋梗塞患者は、（i）３０分以上の胸部圧迫感、痛み、胸苦しさなどの病歴を持つ、（ii）少なくとも１の標準誘導又は２の胸部誘導において0.1mVより大きいSTセグメントの上昇を示す、（iii）血清クレアチンキナーゼ濃度が標準値の2倍以上に上昇する、の3つの条件（Nat Genet. 2002 Dec;32 (4):650-4. 2002）のうち2つ以上を満たすことによって心筋梗塞であると診断された平均年齢６３歳の２６３８人であり、非心筋梗塞患者は心筋梗塞と診断されなかった平均年齢５１歳の２４９９人であった。解析結果を表１に示す。【００３７】
【表１】
0004801596.tif 000002
【００３８】
その結果、レプチン受容体遺伝子のプロモーター領域 -978 番目にＡ／Ｇの多型が存在し、心筋梗塞患者ではMajor homozygote (AA allele)が有意に多い (c2=8.4, P=0.0039; odds ratio=1.18)ことがわかった(Table. 1)。すなわち、AAアレルを持つヒトでは、１．２倍心筋梗塞になりやすく、これは統計学的に1000回テストを行っても、４回誤りがあるかないかに等しいほどの有意差であった。【００３９】
次に、上記の心筋梗塞患者及び非心筋梗塞患者について、配列番号１０および１１のプライマーを用いてガレクチン−２遺伝子を増幅し、得られた増幅産物を用いて配列番号１２のプライマーによりガレクチン−２遺伝子上の一塩基多型を解析した。その結果、イントロン１の３２７９番目にＣ／Ｔの多型が存在し、心筋梗塞患者でＣＣ型が有意に多いことがわかった。心筋梗塞患者及び非心筋梗塞患者（コントロール）のガレクチン−２遺伝子の多型とレプチン受容体遺伝子の多型の割合について表２にまとめた。【００４０】
【表２】
0004801596.tif 000003
【００４１】
その結果、レプチン受容体遺伝子内プロモーター領域 -978 番目A>G SNPのMajor homozygote (AA allele)が心筋梗塞患者で有意に多い (χ2=8.4, P=0.0039; odds ratio=1.18)ことを見出した (表1)。
この表に基いて、ガレクチン−２遺伝子の多型とレプチン受容体遺伝子の多型を組合わせて心筋梗塞との相関を算出した。その結果、ガレクチン−２遺伝子の遺伝子型がTTであり、レプチン受容体遺伝子の遺伝子型がAGまたはGGである場合に、それ以外の場合に比べて有意に心筋梗塞患者が少ないことがわかった（Odds ratio=1.89 (95% c. i.=1.38-2.60), p=0.000069）。
【００４２】
（２）タンデムアフィニティクロマトグラフィー（Nature Biotechnology, 1999, 17, 1030-1032）によるガレクチン−２と相互作用するタンパク質の単離
２−１．Myc-His-TEV-TAP発現ベクターの構築
（i）pET40b vector (Novagen)へのTEV プロテアーゼ切断部位の挿入
TEV プロテアーゼ切断部位をコードする塩基配列およびMluI, ScaIの制限酵素切断配列を有するオリゴヌクレオチド（センス鎖：配列番号１３，アンチセンス鎖：配列番号１４）を合成し，アニーリングさせた。次に、pET40b vectorをMluI, ScaI制限酵素（タカラバイオ）にて処理し，アガロースゲルにて精製し，上記でアニーリングさせた２本鎖DNAを連結した。この操作によってHis tag-TEV site-S tag が連結された。【００４３】
(ii) His tag-TEV site-S tagのpCMV-Myc vector (Clontech) への挿入
上記操作により組み込まれたpET40b内のHis tag-TEV site-S tag配列を、制限酵素SalI, KpnI配列を付加したPCR primer(配列番号１５及び１６)によりPCR増幅した。増幅されたフラグメントをSalI, KpnI処理した後，同様にSalI, KpnI処理したpCMV-Myc vectorに連結することによりMyc-His-TEV-TAP発現ベクターを構築した。【００４４】
（iii）ガレクチン-2のMyc-His-TEV-TAP発現ベクターへの挿入
それぞれSfiI, SalI siteが付加されたガレクチン−２増幅用primer(配列番号１７または１８)を用い，ヒト肺cDNA (Clontech)をテンプレートとして，ガレクチン-2をPCR増幅した。増幅されたフラグメントをSfiI, SalI処理し、同様にSfiI, SalI処理したMyc-His-TEV-TAP発現ベクターに挿入することにより、Myc tag-galectin-2-His tag-TEVsite-S tag発現ベクターを構築した（以下、ｇａｌｅｃｔｉｎ−ＴＡＰベクターとも呼ぶ）。【００４５】
２−２．ｇａｌｅｃｔｉｎ−ＴＡＰベクターの細胞への導入とガレクチン−２結合タンパク質の同定
このｇａｌｅｃｔｉｎ−ＴＡＰベクターまたはＴＡＰのみ（ネガティブコントロール）を、Ｆｕｇｅｎｅ試薬（ロシュ）を用いて、１５０ｍｍディッシュ中のＨｅＬａ細胞に一過的にトランスフェクションした。その後、complete protease inhibitor tablet（ロシュ）（１個／２０ｍL）及び５μｇ／ｍＬのＭＧ−１３２（Calbiochem）を含み、S-protein bind/wash buffer（Novagen）で１０倍に希釈したprotein extraction reagent（Clontech）を用いて、細胞を氷上で溶解した。抽出物を４℃で１２−１８時間、S-protein agarose（Novagen）とともにインキュベートしてS-tag結合タンパク質の精製を行った。
次に、agaroseをS-protein bind/wash bufferで３回、TEV protease cleavage buffer（10mM Tris-HCl pH8.0, 150mM NaCl, 0.1% Nonidet P-40, 0.5mM EDTA, 1mM DTT）で１回洗浄した。その後、１００ＵのＴＥＶプロテアーゼ（Invitrogen）と１７℃で時間インキュベートすることにより、ＴＡＰ−融合タンパク質（ガレクチン−２）を切断した。タンパク質はＰＢＳで透析し、TALON affinity purification system（Clontech）を用いてさらに精製を行った。得られたタンパク質複合体についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、simply blue（Invitrogen）で染色した。タンパク質のバンドについて、MALDI/TOF mass spectrometryによってアミノ酸配列を決定した（APRO Life Science）。【００４６】
その結果、レプチン受容体の細胞外ドメインの配列を同定することができた。これにより、レプチン受容体がガレクチン−２に結合することがわかった。【００４７】
（３）レプチン受容体とガレクチン−２の相互作用の確認
３−１．ＦＬＡＧタグ融合レプチン受容体細胞内ドメイン（ＬＲＩＤ−ＦＬＡＧ）の構築
SalI, KpnI site 配列がそれぞれ付加されたレプチンレセプター細胞内ドメイン (LRID)に特異的なprimer(配列番号１９および２０)を用い、ヒト肝臓cDNA (Clontech)をテンプレートとして、PCRを行った。増幅されたフラグメントをSalI, KpnI 処理し，同様にSalI, KpnI処理したpFLAG-CMV5a vector (SIGMA)に連結して、ＦＬＡＧタグ融合レプチン受容体細胞内ドメイン発現ベクターを得た。【００４８】
３−２．Ｍｙｃタグ融合ガレクチン−２（ｇａｌｅｃｔｉｎ−Ｍｙｃ）の構築
EcoRI, XhoI siteがそれぞれ付加されたgalectin-2に特異的なprimer (配列番号２１及び２２)を用い、ヒト肝臓cDNA (Clontech)をテンプレートとし，PCRを行った。増幅されたフラグメントをEcoRI, XhoI処理し，同様にEcoRI, XhoI処理したpCMV-Myc vector (Clontech)に連結して、Ｍｙｃタグ融合ガレクチン−２発現ベクターを得た。【００４９】
ｇａｌｅｃｔｉｎ−２−FLAG発現ベクター及びＬＲＩＤ−Myc発現ベクターをＦｕｇｅｎｅを用いてＣＯＳ７細胞（Health Science Research Resources Bank; JCRB9127）に一過的にトランスフェクションした。２４時間後、細胞をｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（20mM Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl., 0.1% Nonidet P-40）を用いて不溶性のｄｅｂｒｉｓが沈殿しない程度に１時間以上溶解した。抗ＦＬＡＧタグＭ２アガロース（Sigma）を用いて４℃で１２−１８時間免疫沈降を行った。沈降物をｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄した後、抗Ｍｙｃ抗体（Santa Cruz）又は抗Myc抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（Sigma）を用いて可視化した。なお、対照としてガレクチン−１を用いた実験も行った。結果を図１に示す。FLAG抗体を用いて免疫沈降（IP）を行い、得られた沈降物についてmyc抗体でウエスタンブロット（WB）を行った結果、ガレクチン−１−ＦＬＡＧではＬＲＩＤ−mycを共沈降できなかったのに対し、ガレクチン−２−ＦＬＡＧによってＬＲＩＤ−Ｍｙｃを共沈降することができた。これにより、レプチン受容体とガレクチン−２が特異的に相互作用していることが明らかになった。
【産業上の利用の可能性】
【００５０】
本発明の判定方法によれば心筋梗塞等の炎症性疾患を早期に発見することができ、診断分野等において有用である。また、本発明のスクリーニング方法によれば、心筋梗塞等の炎症性疾患に対する新規医薬を得ることができ、医薬分野等において有用である。
【図１】
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【配列表】
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