(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列
からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドと結合することを特徴とする抗体。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４】
下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかであることを特徴とする請求項３に記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかであることを特徴とする請求項３に記載のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の第６８位から第１４９８位からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列の第６８位から第１４９８位からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列の第６８位から第１４９８位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３から５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを用いることを特徴とする請求項１に記載のポリペプチドの生産方法。
【請求項８】
請求項３から５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項９】
脂肪酸組成が改変されていることを特徴とする請求項８に記載の形質転換体。
【請求項１０】
植物もしくはその子孫、またはこれら由来の組織であることを特徴とする請求項８または９に記載の形質転換体。
【請求項１１】
上記植物がタバコまたはイネであることを特徴とする請求項１０に記載の形質転換体。
【請求項１２】
請求項８から１１のいずれか１項に記載の形質転換体を用いることを特徴とする請求項１に係るポリペプチドの生産方法。
【請求項１３】
請求項８から１１のいずれか１項に記載の形質転換体を用いることを特徴とする脂肪酸
の生産方法。
【請求項１４】
請求項６に記載のベクターを含有することを特徴とする細胞。
【請求項１５】
イネ、タバコまたは酵母の細胞であることを特徴とする請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の細胞を用いることを特徴とする請求項１に係るポリペプチドの生産方法。
【請求項１７】
請求項１４または１５に記載の細胞を用いることを特徴とする脂肪酸の生産方法。
【請求項１８】
上記脂肪酸は、ピノレン酸またはコニフェロン酸であることを特徴とする請求項１３または１７に記載の脂肪酸の生産方法。
【請求項１９】
請求項３から５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが基板上に固定化されていることを特徴とする検出器具。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドが基板上に固定化されていることを特徴とする検出器具。
【請求項２１】
請求項２に記載の抗体が基板上に固定化されていることを特徴とする検出器具。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有し、ピノレン酸等の脂肪酸の合成反応を触媒するポリペプチド、およびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびにそれらの代表的利用に関するものである。
【背景技術】  リノール酸は、動脈硬化症の予防に有効であり、血清コレステロール値を低下させる作用を有する脂肪酸である。リノール酸は、特定種の微生物、植物または動物において見出される。しかし、高等動物は、リノール酸を合成する不飽和化酵素を有していないので、食物（植物性食品）からリノール酸を摂取しなければならない。
リノール酸は体内でアラキドン酸を経由して生理活性物質であるプロスタグランジンに代謝される。近年、卵やレバーなどの高リノール酸含有食品の摂取量が増加している。しかし、リノール酸を大量に摂取すると、プロスタグランジンの合成バランスが崩れ、アレルギー疾患などを引き起こす可能性が指摘されている。
リノール酸から合成されるピノレン酸は、一分子中に３個の二重結合を有する炭素数１８のΔ５不飽和化脂肪酸である（１８：３Δ５，９，１２）。ピノレン酸は、ヒトにおいてはアラキドン酸にまで代謝されることがないので、摂取によるプロスタグランジン代謝への影響が少ないと考えられている。また、ピノレン酸は、抗コレステロール作用を有する（例えば、Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．７２，ｐ７７５，１９９４［非特許文献１］参照）。このような知見に基づいて、リノール酸ではなくピノレン酸を含む食用油が健康食品として多く販売されている。さらに、脂肪酸は洗剤や生分解性プラスティックの原料にもなるので、ピノレン酸は、工業製品の原料としても注目されている。
ピノレン酸は、マツなどの裸子植物に含まれており、主にマツの種子から抽出精製されている（例えば、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０４，ｐ２３４，２００２［非特許文献２］参照）。しかし、マツ由来のピノレン酸は生産コストが高いこと、および／または森林資源としてのマツの供給量に限界があることなどの問題点が指摘されている。
ピノレン酸は、リノール酸からΔ５不飽和化反応によって生合成されると考えられている（例えば、非特許文献２参照）。この反応は、Δ５脂肪酸不飽和化酵素（以下、「Δ５不飽和化酵素」と略記する）によって触媒される。これまでに単離および同定されたΔ５不飽和化酵素の多くは、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、２０：３Δ８，１１，１４）をアラキドン酸（ＡＡ、２０：４Δ５，８，１１，１４）に、またはエイコサテトラエン酸（ＥＴＡ、２０：４Δ８，１１，１４，１７）をエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ、２０：４Δ５，８，１１，１４，１７）に変換するΔ５不飽和化反応に関与する。これらの酵素は、基質脂肪酸が有する二重結合のいずれよりもカルボキシ基に近い位置に新たな二重結合を導入することから、ｆｒｏｎｔ−ｅｎｄ型不飽和化酵素と呼ばれている（例えば、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．２，ｐ１２３，１９９９［非特許文献３］参照）。
ＡＡ・ＥＰＡなど炭素数２０の高度不飽和脂肪酸の生合成を主に行うΔ５不飽和化酵素遺伝子は、糸状菌（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ、Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓ  ｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ）、ケイ藻（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ラット、ヒト、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）、ゼニゴケ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）などから単離されており、いずれもＮ末端にシトクロムｂ５ドメインを有する（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，ｐ１９０５５，１９９８［非特許文献４］、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，ｐ２９３６０，１９９８［非特許文献５］、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９，ｐ４１０５，２００２［非特許文献６］、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４３９，ｐ２１５，１９９８［非特許文献７］、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３９１，ｐ８，２００１［非特許文献８］、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，ｐ３７３３５，１９９９［非特許文献９］、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，ｐ３５１１５，２００３［非特許文献１０］、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．ｈｔｔｐ：／／ｉｐｓａｐｐ００８．ｋｌｕｗｅｒｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ／ＩＰＳ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｅｘｔ／ｘ／Ｊ／５０８２／Ｉ／１２４／Ａ／４／ｔｙｐｅ／ＰＤＦ／ａｒｔｉｃｌｅ．ｈｔｍ［非特許文献１１］、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，ｐ３１５６１，２００１［非特許文献１２］、Ｌｉｐｉｄｓ  ３７，ｐ８６３，２００２［非特許文献１３］参照、ただしヒメツリガネゴケのΔ５不飽和化酵素遺伝子は配列未公開）。また、炭素数１６〜２０の飽和脂肪酸あるいはモノエン酸の不飽和化に関与するΔ５不飽和化酵素遺伝子が、細胞性粘菌のキイロタマホコリカビ、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、油糧植物のメドウフォームから単離されている（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６５，８０９，２００２［非特許文献１４］、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７，１８１３−１８１８，２０００［非特許文献１５］、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８５，３２２８−３２３１，２００３［非特許文献１６］、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２４，２４３−２５１，２０００［非特許文献１７］参照）。
【発明の開示】
ピノレン酸は、分子内に二重結合を複数有するという独特な物性を持つため、生産コストを低減することができれば工業原料用途（フィルム、生分解性プラスティック、機能性繊維、潤滑油、または洗剤のような工業製品の原料）にも利用可能となる。しかし、上述のように、ピノレン酸の生産はマツ種子からの抽出により行われているので、ピノレン酸は大量生産ができず生産コストが高いこと、およびピノレン酸の供給源であるマツが森林資源として限られていること等の問題点を有している。遺伝子組換え技術などを用いてピノレン酸を大量生産できるようになれば、ピノレン酸を多目的原材料として低コストで用いることができる。
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、ピノレン酸の合成に関与するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入した遺伝子組換え生物によりピノレン酸を生産することにより、低コストであり、かつ環境に低負荷なピノレン酸生産プロセスを実現することにある。
本発明に係るポリペプチドは、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドであって、（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなることを特徴としている。
上記構成によれば、本発明に係るポリペプチドは、Δ５不飽和脂肪酸合成反応を触媒することができる。
また、本発明に係る抗体は、上記ポリペプチドと結合することを特徴としている。
上記構成によれば、本発明に係る抗体は、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドを発現する生物体またはその組織もしくは細胞を同定することができる。
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリペプチドをコードすることを特徴としている。
また、本発明に係るポリヌクレオチドは、下記の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、
のいずれかであることが好ましい。
さらに、本発明に係るポリヌクレオチドは、下記の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の第６８位から第１４９８位からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列の第６８位から第１４９８位からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列の第６８位から第１４９８位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、
のいずれかであることが好ましい。
上記構成によれば、形質転換体または細胞においてΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドを合成するために、上記ポリヌクレオチドを使用することができる。
また、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドのフラグメントであることを特徴としている。
また、本発明に係るオリゴヌクレオチドは、配列番号５または６に示される塩基配列からなることが好ましい。
上記構成によれば、上記オリゴヌクレオチドは、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーションプローブまたは当該ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することができる。さらに、上記オリゴヌクレオチドを用いれば、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドを発現する生物体またはその組織もしくは細胞を同定することができる。なおさらに、上記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用して、上記生物体またはその組織もしくは細胞におけるΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドの発現を制御することができる。
また、本発明に係るベクターは、上記ポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。
上記構成によれば、上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入してΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドを発現させたり、無細胞タンパク質合成系を用いてΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドを合成することができる。
また、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを用いることが好ましい。
また、本発明に係る形質転換体は、上記ポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。
本発明に係る形質転換体において、脂肪酸組成が改変されていることが好ましい。
また、上記形質転換体は、生物もしくはその子孫、またはこれら由来の組織であることが好ましい。
また、上記生物は、植物もしくはその子孫、またはこれら由来の組織であることが好ましい。
さらに、上記生物はリノレン酸を含む生物であれば、生物種を問わず、本遺伝子を導入することでピノレン酸を生産できる。植物としては、たとえば、タバコまたはイネまたはトマトをあげることができるがこれらに限定されるものではない。
また、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、上記形質転換体を用いることを特徴としている。
上記構成によれば、Δ５脂肪酸不飽和化反応を触媒するポリペプチドを低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することが可能となる。
また、本発明に係る脂肪酸の生産方法は、上記形質転換体を用いることを特徴としている。
上記脂肪酸は、ピノレン酸またはコニフェロン酸であることが好ましい。
また、本発明に係る細胞は、上記ベクターを含有することを特徴としている。
上記細胞は、イネ、タバコ、トマトまたは酵母の細胞であることが好ましい。
上記構成によれば、Δ５脂肪酸不飽和化反応を触媒するポリペプチドを低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供する細胞を提供することができる。
また、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、上記細胞を用いることを特徴としている。
上記構成によれば、Δ５脂肪酸不飽和化反応を触媒するポリペプチドを容易に生産することが可能となる。
また、本発明に係る脂肪酸の生産方法は、上記細胞を用いることを特徴としている。
また、本発明に係る食品または工業製品は、上記脂肪酸生産方法により得られたピノレン酸またはコニフェロン酸を含むことを特徴としている。
また、本発明に係る検出器具は、上記ポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドが基板上に固定化されていることを特徴としている。
上記構成によれば、上記ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出して、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドを発現する生物を容易に検出することができる。
また、本発明に係る検出器具は、上記ポリペプチドが基板上に固定化されていることを特徴としている。
上記構成によれば、上記ポリペプチドと相互作用する物質を検出して、上記ポリペプチドのΔ５脂肪酸不飽和化活性を調節する物質を容易に検出することができる。
また、本発明に係る検出器具は、上記抗体が基板上に固定化されていることを特徴としている。
上記構成によれば、上記抗体と結合する抗原を検出して、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドを容易に検出することができる。
本発明に係るポリペプチドは、植物などの生物に内在性のリノール酸をΔ５不飽和化する反応を触媒することができるので、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入された形質転換体または細胞を用いれば、低コストかつ環境に対して低負荷な生産プロセスでピノレン酸等の脂肪酸の大量調製が可能になる。さらに本発明は、ピノレン酸を大量調製することによって安価な食品または工業製品を提供することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの脂肪酸メチルエステルのＧＣ分析結果を示す図である。
図２は、ＣｒＤＥＳ５のノザン解析結果を示す図である。
図３は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉΔ５不飽和化酵素（ＣｒＤＥＳ５）のアミノ酸配列を糸状菌Ｍ．ａｌｐｉｎａ（ＭａＤＥＳ５）、ゼニゴケＭ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（ＭｐＤＥＳ５）、ケイ藻Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ（ＰｔＤＥＳ５）のΔ５不飽和化酵素のアミノ酸配列と整列して比較した図である。
図４は、ｐＰＩＣＺＡ−ＣｒＤＥＳ５を導入したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの脂肪酸プロファイル（ａ）、空ベクターを導入したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの脂肪酸プロファイル（ｂ）、ピノレン酸標品のピーク（ｃ）を示す図である。
図５は、図４におけるＣｒＤＥＳ５不飽和化酵素の反応産物であるピロリジン誘導体を質量スペクトルにより分析した結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明に係るΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこれらの利用について詳述する。
（１）ポリペプチド
本発明者らは、クラミドモナスから単離したポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、リノール酸およびα−リノレン酸を主な基質にする新規Δ５不飽和化酵素であることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明に係るポリペプチドは、新規Δ５不飽和化酵素であり、メタノール資化性酵母中で非常に高い効率（約８０％）で、リノール酸をΔ５不飽和化してピノレン酸を生成した。
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
本発明は、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドを提供する。一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体でありかつΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドである。
変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の活性を有するか否かを容易に決定し得る。
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチド活性を変化させない。
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
本発明に係るポリペプチドは、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなるポリペプチドである。
上記「１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加された」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異ポリペプチド作製法により置換、欠失、挿入、もしくは付加できる程度の数（好ましくは１〜１０個、より好ましくは１〜７個、さらに好ましくは１〜数個（例、５個）、最も好ましくは１〜２個）のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加（あるいはこれらの組合せ）されていることを意味する。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
なお、本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
また、本発明に係るポリペプチドは、後述する本発明に係るポリヌクレオチド（本発明に係るポリペプチドをコードする遺伝子）を宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製された場合であってもよい。また、本発明に係るポリペプチドは、化学合成されたものであってもよい。
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。
本実施形態に係るポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）にＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４（１９８９）（本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７（１９８４）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合される本実施形態に係るポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。
別の実施形態において、本発明に係るポリペブチドは、下記で詳述されるように組換え生成されても、化学合成されてもよい。
組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行なうことができる。
合成ペプチドは、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で調製されそして特徴付けられたＨＡ１ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３１−５１３５（１９８５）。この「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、さらにＨｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出、５１３４）。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。
下記に詳細に記載するように、本発明に係るポリペプチドは、リノール酸をΔ５不飽和化してピノレン酸を生成するための方法およびキットにおいて有用である。
本発明者らは、本発明に係るポリペプチドが、リノール酸だけでなくα−リノレン酸をΔ５不飽和化してコニフェロン酸を生成すること（例えば、収率６０％）を見出した。
α−リノレン酸は、一分子中に３個の二重結合を有する炭素数１８の不飽和脂肪酸であり（１８：３Δ９，１２，１５）、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を経由してプロスタグランジンの前駆体となる。高等動物は、リノール酸と同様にα−リノレン酸を合成することができず、食物（植物性食品）からα−リノレン酸を摂取する。α−リノレン酸がΔ５不飽和化されて生成するコニフェロン酸について、その有用性はまだ報告されてない。
さらに、本発明者らは、本発明に係るポリペプチドが、リノール酸および／またはα−リノレン酸をΔ５不飽和化するだけでなく、炭素数２０のジエン酸（２０：２Δ１１，１４）およびトリエン酸（２０：３Δ１１，１４，１７）をそれぞれΔ７不飽和化する活性を有することも見出した。
このように、本発明に係るポリペプチドは、リノール酸および／またはα−リノレン酸をΔ５不飽和化するだけでなく、炭素数２０のジエン酸（２０：２Δ１１，１４）およびトリエン酸（２０：３Δ１１，１４，１７）をそれぞれΔ７不飽和化する活性を有する。このような活性を有する本発明に係るポリペプチドを用いてピノレン酸のみを選択的に生産させる場合、本発明に係るポリペプチドを発現させる植物種としてリノール酸含有量が多く、α−リノレン酸が少ないものを選択すればよい。このような脂肪酸組成をもつ植物油として米油が挙げられ、イネが有望なピノレン酸生産のための対象植物となると考えられる。この他に代表的な油糧作物として、ダイズ、ナタネ、ゴマ、ヤシ、ワタなどが挙げられる。また、植物の細胞膜や種子の貯蔵脂質にはリノール酸は広く存在するため、油糧植物以外の植物、たとえば、イネ、オオムギ、小麦、ジャガイモ、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、アルファルファ、ルーピン、アマ、インゲンマメ、レタス、ダイコン、トウモロコシ、カリフラワー、バラ、キク、カーネーション、金魚草、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ等が挙げられる。
例えばイネの形質転換方法としては、公知文献（モデル植物の実験プロトコール、秀潤社、１９９６年）に記載の方法を用いることができる。
このように、本発明に係るポリペプチドは、少なくとも、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでいればよいといえる。すなわち、配列番号２に示されるアミノ酸配列と特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とからなるポリペプチドも本発明に含まれることに留意すべきである。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列および当該任意のアミノ酸配列は、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。
また、本発明に係るポリペプチドは、当該ポリペプチドがリノール酸をΔ５不飽和化する活性以外にα−リノレン酸をΔ５不飽和化する活性および炭素数２０のジエン酸またはトリエン酸をΔ７不飽和化する活性を有しているので、当該ポリペプチドの用途としてリノール酸をΔ５不飽和化してピノレン酸を生成することのみに限定されるべきではない。
つまり、本発明の目的は、ＡＡ・ＥＰＡ生合成には寄与せず、もっぱらリノール酸あるいはＡＬＡをΔ５不飽和化する活性を有するポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるリノール酸をΔ５不飽和化する活性を有するポリペプチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
（２）ポリヌクレオチド
本発明は、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有する本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号２４に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号２４の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、例えば、ヌクレオチドが、２〜１００個（例えば、数個ないし数十個）結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化合合成されてもよい。
本発明に係るポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも１２ｎｔ（ヌクレオチド）、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図される。少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントによって、例えば、配列番号２に示される塩基配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号２に示される塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号２に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０  Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｄｒ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ  ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。
また本発明に係るポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。
本発明はさらに、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異体に関する。変異体は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
このような変異体としては、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１または複数個の塩基が欠失、置換、または付加した変異体が挙げられる。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的もしくは非保存的なアミノ酸欠失、置換、または付加を生成し得る。
本発明はさらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドを提供する。
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、かつ
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１個もしくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
のいずれかであることが好ましい。
他の実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、
のいずれかであることが好ましい。
なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。
上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。ハイブリダイゼーションの条件としては、従来公知の条件を好適に用いることができ、特に限定しないが、例えば、４２℃、６×ＳＳＰＥ、５０％ホルムアミド、１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ  サケ精子ＤＮＡ、５×デンハルト液（ただし、１×ＳＳＰＥ；０．１８Ｍ  塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．７、１ｍＭ  ＥＤＴＡ。５×デンハルト液；０．１％  牛血清アルブミン、０．１％  フィコール、０．１％  ポリビニルピロリドン）が挙げられる。
さらに他の実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、以下の（ａ）または（ｂ）：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列の第６８位から第１４９８位からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）以下の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１に示される塩基配列の第６８位から第１４９８位からなるポリヌクレオチド；もしくは
（ｉｉ）配列番号１に示される塩基配列の第６８位から第１４９８位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド、
のいずれかであることが好ましい。
別の実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドのフラグメントであるオリゴヌクレオチドであることが好ましく、最も好ましくは、配列番号５または６に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。アンチセンスＲＮＡ技術は、標的遺伝子に対して相補的なＲＮＡ転写体を生成するキメラ遺伝子の導入を基本原理とする。その結果として得られる表現型は、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少である。本発明に係るオリゴヌクレオチドを導入することによって、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドの含量を低下させることにより植物中のピノレン酸含量を低下させることができる。ＤＮＡには例えばクローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡやゲノムＤＮＡなどが含まれる。さらに、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法として、公知の技術により、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離し、クローニングする方法が挙げられる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製し、ゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすればよい。このようなプローブとしては、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするプローブであれば、いずれの配列および／または長さのものを用いてもよい。
あるいは、本発明に係るポリヌクレオチドを取得する方法として、ＰＣＲ等の増幅手段を用いる方法を挙げることができる。例えば、本発明におけるポリヌクレオチドのｃＤＮＡのうち、５’側および３’側の配列（またはその相補配列）の中からそれぞれプライマーを調製し、これらプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等を鋳型にしてＰＣＲ等を行い、両プライマー間に挟まれるＤＮＡ領域を増幅することで、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得できる。
本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、リノール酸およびα−リノレン酸に加えて、ピノレン酸およびコニフェロン酸を含む生物材料であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。ピノレン酸はリノール酸からΔ５不飽和化反応によって生成されると考えられ、コニフェロン酸はα−リノレン酸からΔ５不飽和化反応によって生成されると考えられるので、これらの脂肪酸を含む生物材料であれば、ピノレン酸およびコニフェロン酸の合成反応を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得することができる。後述する実施例においては、クラミドモナス目に属する（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）を用いているが、これに限定されるものではない。
また上述したように、本発明に係るポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドがリノール酸をΔ５不飽和化する活性以外にα−リノレン酸をΔ５不飽和化する活性および炭素鎖２０のジエン酸またはトリエン酸をΔ７不飽和化する活性を有しているので、本発明に係るポリヌクレオチドの用途としてリノール酸をΔ５不飽和化してピノレン酸を生成することのみに限定されるべきではない。
つまり、本発明の目的は、リノール酸をΔ５不飽和化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるリノール酸をΔ５不飽和化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
（３）抗体
本発明は、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびこれらのＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）を意味し、例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体、抗イディオタイプ抗体およびヒト化抗体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明に係る抗体は、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドを発現する生物材料を選択するに有用であり得る。
「抗体」は、種々の公知の方法（例えば、ＨａｒＬｏｗら、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）」、岩崎ら、「単クローン抗体  ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ、講談社（１９９１）」）に従えば作製することができる。
ペプチド抗体は、当該分野に周知の方法によって作製される。例えば、Ｃｈｏｗ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：９１０−９１４；およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２３４７−２３５４（１９８５）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。一般には、動物は遊離ペプチドで免疫化され得る；しかし、抗ペプチド抗体力価はペプチドを高分子キャリア（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイド）にカップリングすることにより追加免疫され得る。例えば、システインを含有するペプチドは、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）のようなリンカーを使用してキャリアにカップリングされ得、一方、他のペプチドは、グルタルアルデヒドのようなより一般的な連結剤を使用してキャリアにカップリングされ得る。ウサギ、ラット、およびマウスのような動物は、遊離またはキャリアーカップリングペプチドのいずれかで、例えば、約１００μｇのペプチドまたはキャリアタンパク質およびＦｒｅｕｎｄのアジュバントを含むエマルジョンの腹腔内および／または皮内注射により免疫化される。いくつかの追加免疫注射が、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを使用してＥＬＩＳＡアッセイにより検出され得る有用な力価の抗ペプチド抗体を提供するために、例えば、約２週間の間隔で必要とされ得る。免疫化動物からの血清における抗ペプチド抗体の力価は、抗ペプチド抗体の選択により、例えば、当該分野で周知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出により増加され得る。
本明細書中で使用される場合、用語「Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体」は、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチド抗原に特異的に結合し得る完全な抗体分子および抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは完全な抗体のＦｃ部分を欠いており、循環によってさらに迅速に除去され、そして完全な抗体の非特異的組織結合をほとんど有し得ない（Ｗａｈｌら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６−３２５（１９８３）（本明細書中に参考として援用される））。従って、これらのフラグメントが好ましい。
さらに、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドのペプチド抗原に結合し得るさらなる抗体が、抗イディオタイプ抗体の使用を通じて二工程手順で産生され得る。このような方法は、抗体それ自体が抗原であるという事実を使用し、従って、二次抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法に従って、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体は、動物（好ましくは、マウス）を免疫するために使用される。次いで、このような動物の脾細胞はハイブリドーマ細胞を産生するために使用され、そしてハイブリドーマ細胞は、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体に結合する能力がΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチド抗原によってブロックされ得る抗体を産生するクローンを同定するためにスクリーニングされる。このような抗体は、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、そしてさらなるΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドと特異的に結合する抗体の形成を誘導するために動物を免疫するために使用され得る。
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに本発明に係る抗体の他のフラグメントは、本明細書中で開示される方法に従って使用され得ることが、明らかである。このようなフラグメントは、代表的には、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生じる）のような酵素を使用するタンパク質分解による切断によって産生される。あるいは、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチド結合フラグメントは、組換えＤＮＡ技術の適用または合成化学によって産生され得る。
このように、本発明に係る抗体は、少なくとも、本発明に係るΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドを認識する抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を備えていればよいといえる。すなわち、本発明に係るΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドを認識する抗体フラグメントと、異なる抗体分子のＦｃフラグメントとからなる免疫グロブリンも本発明に含まれることに留意すべきである。
つまり、本発明の目的は、本発明に係るΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドを認識する抗体を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の免疫グロブリンの種類（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭ）、キメラ抗体作製方法、ペプチド抗原作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得される抗体も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
（４）本発明に係るポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの利用
（４−１）ベクター
本発明は、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドを生成するために使用されるベクターを提供する。本発明に係るベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターを適宜選択すればよい。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択マーカーを含む。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明に係るポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種およびベクター作製方法を用いて取得したベクターも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
（４−２）形質転換体または細胞
本発明は、上述したΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体または細胞を提供する。ここで「形質転換体」とは、組織または器官だけでなく、生物個体を含むことを意味する。
形質転換体または細胞の作製方法（生産方法）は特に限定されるものではないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法を挙げることができる。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物を挙げることができる。
本発明に係る形質転換体または細胞は、天然に有する脂肪酸とはその組成が改変されていることを特徴とする。本発明に係る形質転換体または細胞は、植物もしくはその子孫、またはこれら由来の組織であることが好ましく、イネ、またはタバコであることが特に好ましい。
本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む植物形質転換体は、当該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該遺伝子が発現し得るように植物中に導入することにより得ることができる。
組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明に係るポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクター、または外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。
植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知である。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著，植物遺伝子操作マニュアル，１９９０，２７−３１ｐｐ，講談社サイエンティフィック，東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、６７、３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎら、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞または植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター（ｐＢＩ１２１またはｐＰＺＰ２０２など）を使用することができる。
また、遺伝子を直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。遺伝子銃を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物または試料によって異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。
遺伝子が導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターを遺伝子銃、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
本発明に係るポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体がいったん得られれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、本発明に係るポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。
用いる植物としては、特に限定されないが、例えばタバコを好適に用いることができる。タバコは、ペチュニアなどとともに、形質転換が容易な代表的植物であり、細胞壁を取り除いた細胞の１個（プロトプラスト）から、植物１個体への再生が可能である。この再生された植物１個体は、多細胞に由来する１個体とは異なりキメラ状に陥らないため、形質転換体の作製を効率よく行うことができる。
タバコの形質転換に好ましい方法としては、リーフディスク法が挙げられる。この方法は、操作が容易であり、かつ１枚の葉切片からいくつもの独立した形質転換体を得ることができる方法である。形質転換の方法はたとえば「新生物化学実験の手引き３  核酸の分離・分析と遺伝子実験法  化学同人  １９９６年」に記載されている。
具体的には、無菌的に育てたタバコの葉から、無菌シャーレ上でリーフディスクを切り出し、切り出したリーフディスクをＮＢ培地にて前培養する。次に、前培養したリーフディスクをアグロバクテリウムの感染菌液に浸して共存培養し、リーフディスクをカルベニシリンとカナマイシンとを補充したＮＢ培地に埋め込み、リーフディスクからカルスが形成されてシュートができるまで継代した後、シュートを得る。シュートが生長して茎葉部の区別が明確になった時点で、茎から切り取って抗生物質およびホルモンを含まないＭＳ培地に移す。切り取ったシュートから根が生じた後に、これを温室で育てる。シュートをホルモン含有培地に移して発根を促すと同時に、このシュートから葉を一部切り出してきてカルベニシリンおよびカナマイシンを補充した検定培地に移植する。移植の約１０日後に、葉がカルス化しているものはカナマイシン耐性個体とみなして回収し、褐変化してしまったものはカナマイシン感受性個体とみなして破棄する。
このようにして得た形質転換植物を用いれば、当該植物体内でピノレン酸またはコニフェロン酸を生産するため、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスでピノレン酸またはコニフェロン酸を生産することができる。
一般に、植物で異種生物の遺伝子を発現させる場合、その遺伝子がどの程度良好に植物中で機能するかは、転写、翻訳、その後の修飾などの段階があるため、予想をすることは困難である。しかし、高等植物では一般的な脂肪酸であるリノール酸からγ−リノレン酸を合成させるためにたった１つのΔ６不飽和化酵素コード遺伝子を導入するだけで良く、γ−リノレン酸合成能を付与した高等植物の作出成功例がいくつも報告されている。たとえば、ルリジシャ（ｂｏｒａｇｅ）のΔ６不飽和化酵素遺伝子をタバコで発現させた例（ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４、４２１１、１９９７）、ｅｔｈｉｕｍのΔ６不飽和化酵素遺伝子をタバコで発現させた例（Ｌｉｐｉｄｓ，３７、４１２、２００２）、糸状菌のＰｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅのΔ６不飽和化酵素遺伝子をタバコで発現させた例（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２９、３５４、２００２）などである。ピノレン酸もまたリノール酸からたった１つのΔ５不飽和化酵素により合成されるため、本明細書中の記載に従えば、当業者は、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入すれば、高等植物にピノレン酸合成能を付与することができることを、容易に理解する。
多くの植物の形質転換方法は既に報告されている。形質転換可能な植物としては、例えば、ダイズ、ナタネ、ゴマ、ヤシ、ワタ、イネ、オオムギ、小麦、ジャガイモ、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、アルファルファ、ルーピン、アマ、インゲンマメ、レタス、ダイコン、トウモロコシ、カリフラワー、バラ、キク、カーネーション、金魚草、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ等を挙げることができる。
イネ形質転換体を作製する一実施形態を以下に記載する。
本発明に係るポリヌクレオチドをハイグロマイシン耐性遺伝子を含有するバイナリーベクターｐＰＺＰ２０２に導入し、形質転換ベクターを構築する。本発明に係るポリヌクレオチドは、プロモーターＣａＭＶ３５Ｓとインフレームで作動可能に連結される。
得られた形質転換ベクターを用いて、エレクトロポーレーションにより、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンおよびハイグロマイシンの選択下でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＥＨＡ１０１株を形質転換する。得られたアグロバクテリウム株は、使用するまで凍結保存する。
野生型の種子から穎を除き玄米とし、これを７０％エタノールで３分間殺菌し、殺菌蒸留水で３回洗浄した後、さらに５０％の次亜塩酸ナトリウム溶液で３０分間殺菌し、そして殺菌蒸留水で５回洗浄する。この玄米を、３０ｇ／ｌスクロース、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２．８ｇ／ｌのプロリン、２．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを添加し、４．０ｇ／ｌのゲルライトで固化させたＮ６培地（Ｃｈｕら、１９７５、Ｓｃｉ．Ｓｉｎｉｃａ、１８、６５９−６６８）を含むカルス誘導培地上に置く。なお、培地ｐＨはオートクレーブ前にｐＨ５．８に調整する。玄米を、２８℃で４週間明所で生育させ、約５ｍｍの大きさのカルスを得る。このカルスをアグロバクテリウム感染に用いる。
グリセロール中で凍結保存した上記のアグロバクテリウムを、２０ｍｇ／ｌのカナマシイン、５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシン、１００ｍｇ／ｌのスペクノマイシンを含みｐＨ７．２に調整し、１５ｇ／ｌの寒天で固化したＡＢ培地（Ｃｈｉｌｔｏｎら、１９７４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７１、３６７２−３６７６）上で暗所で２８℃３日間の培養を行う。アグロバクテリウム菌体を集め、１０ｍｇ／ｌのアセトンシリンゴン（Ｈｉｅｉら、１９９４、Ｐｌａｎｔ  Ｊ．、６、２７１−２８２）を含む液体ＡＡＭ培地（Ｈｉｅｉら、１９９４）に懸濁する。得られた懸濁液の中に上記のカルスを２分間浸漬した後、殺菌したペーパータオルで余分の水分を除き、これを１０ｍｇ／ｌアセトンシリンゴンを含む上記のカルス誘導培地に置き、暗所で２８℃、３日間の共存培養を行い、アグロバクテリウムを感染させる。得られた感染カルスを殺菌蒸留水で１０回洗浄し、最後に５００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含む殺菌蒸留水で１回洗浄した後、殺菌したペーパータオルで余分の水分を除く。このカルスを１０ｍｇ／ｌアセトンシリンゴン、５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、３００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含む上記のカルス誘導培地で２８℃、２週間の培養を行い、さらに５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、１００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含むカルス誘導培地で４週間の培養を行う。ハイグロマイシン耐性カルスを選択し、３０ｇ／ｌのスクロース、３０ｇ／ｌのソルビトール、２ｇ／ｌのカザミノ酸、２．２ｍｇ／ｌのカイネチン、１．０ｍｇ／ｌのＮＡＡ、１００ｍｇ／ｌのカルベニシリン、５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンおよび４ｇ／ｌのゲルライトを含むｐＨ５．８のＭＳ基礎培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、１９６２、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．、１５、４７３−４９７）を含む再生培地に移す。
このようにして得られる形質転換体は、ハイグロマイシンを含む再生培地で容易に再生し、土壌に移して栽培することができる。
このように、本発明に係る形質転換体または細胞は、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されていればよいといえる。すなわち、組換え発現ベクター以外の手段によって生成された形質転換体または細胞も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
また上述したように、本発明に係るポリペプチドは、当該ポリペプチドがリノール酸をΔ５不飽和化する活性以外にα−リノレン酸をΔ５不飽和化する活性および炭素鎖２０のジエン酸またはトリエン酸をΔ７不飽和化する活性を有しているので、本発明に係る形質転換体または細胞の用途としてリノール酸をΔ５不飽和化してピノレン酸を生成することのみに限定されるべきではない。
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする形質転換体または細胞を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法を用いて取得した形質転換体または細胞も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
（４−３）ポリペプチドの生産方法
本発明は、本発明に係るポリペプチドを生産する方法を提供する。
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いることを特徴とする。
本実施形態の１つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを無細胞タンパク質合成系に用いることが好ましい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットを用いればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。
本実施形態の他の局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明に係るポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。
本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを天然に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製することを特徴とする。本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上述した抗体またはオリゴヌクレオチドを用いて本発明に係るポリペプチドを天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することが好ましい。また、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上述したポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。
さらに他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを化学合成することを特徴とする。当業者は、本明細書中に記載される本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、本発明に係るポリペプチドを化学合成できることを、容易に理解する。
以上のように、本発明に係るポリペプチドを生産する方法によって取得されるポリペプチドは、天然に存在する変異ポリペプチドであっても、人為的に作製された変異ポリペプチドであってもよい。
変異ポリペプチドを作製する方法についても、特に限定されるものではない。例えば、部位特異的変異誘発法（例えば、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ  １５２，２７１−２７５（１９９５）参照）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異ポリペプチドを作製する方法、またはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異ポリペプチド作製法を用いることによって、変異ポリペプチドを作製することができる。変異ポリペプチドの作製には市販のキットを利用してもよい。
このように、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、少なくとも、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列、またはΔ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよいといえる。
つまり、本発明の目的は、Δ５脂肪酸不飽和化活性を有するポリペプチドの生産方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
（４−４）脂肪酸生産方法
本発明は、本発明に係るポリペプチドを発現する生物体または細胞を用いて脂肪酸を生産する方法を提供する。上記生物体は、天然の未改変生物体であっても組換え発現系を用いた形質転換体であってもよい。
一実施形態において、本発明に係る脂肪酸生産方法は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された生物体またはその組織を用いて脂肪酸を生産することを特徴とする。好ましくは、上記生物体は、酵母または植物である。
本実施形態の好ましい局面において、本発明に係る脂肪酸生産方法は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを酵母または植物に導入する工程を包含する。ポリヌクレオチドを酵母または植物に導入する工程としては、上述した種々の遺伝子導入方法を用いればよい。本実施形態のこの局面において、上記酵母または植物は形質転換される前に産生した脂肪酸と形質転換後に産生する脂肪酸との間でその組成が異なる。具体的には、上記酵母または植物から得られる脂肪酸は、ピノレン酸および／またはコニフェロン酸の含有率が増加する。本実施形態のこの局面に係る脂肪酸生産方法は、上記酵母または植物から脂肪酸を抽出する工程をさらに包含することが好ましい。
例えば、上述のようにピノレン酸の含量が増加した本発明に係る形質転換植物から抽出した脂肪酸を含む植物油は、ピノレン酸の含量が高い食品として提供される。また、抽出した脂肪酸に限らず、上記形質転換植物体の種子、果実、切穂、塊茎、および／または塊根等もまた、ピノレン酸を多く含む食品として提供される。脂肪酸組成を改変する対象は特に限定されるものではなく、植物以外にも動物、細菌、または酵母等のあらゆる生物を対象とすることが可能である。
他の実施形態において、本発明に係る脂肪酸生産方法は、本発明に係るポリペプチドを天然に発現する酵母または植物に、本発明に係るオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして導入する工程を包含する。オリゴヌクレオチドを酵母または植物に導入する工程としては、上述したアンチセンスＲＮＡ技術を用いればよい。本実施形態に係る脂肪酸生産方法は、上述した抗体またはオリゴヌクレオチドを用いて本発明に係るポリペプチドを天然に発現する酵母または植物を同定する工程をさらに包含することが好ましい。本実施形態のこの局面に係る脂肪酸生産方法は、上記酵母または植物から脂肪酸を抽出する工程をさらに包含することが好ましい。
本実施形態において、上記酵母または植物は上記オリゴヌクレオチドを導入される前に産生した脂肪酸と導入後に産生する脂肪酸との間でその組成が異なる。具体的には、上記酵母または植物から得られる脂肪酸は、天然に産生するピノレン酸および／またはコニフェロン酸の含有率が減少する。
このように、本発明に係る脂肪酸の生産方法は、少なくとも、本発明に係るポリペプチドを発現する生物体を用いればよいといえる。
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドによって脂肪酸の組成が改変された生物体に基づく脂肪酸生産方法を提供することにあるのであって、上記生物体として動物、植物または種々の細胞を用いる生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
（４−５）食品および工業製品
本発明は、上述の脂肪酸生産方法により得られた脂肪酸を用いて製造される食品および工業製品を提供する。本項で記載する食品は、上述した形質転換植物体の種子、果実、切穂、塊茎、および／または塊根であっても、上述した形質転換植物体から抽出された脂肪酸を用いて製造された食品（例えば、調理用植物油）であってもよい。
ピノレン酸は、分子内に二重結合を複数有するという独特な物性に基づいて、工業製品（例えば、フィルム、生分解性プラスティック、機能性繊維、潤滑油、または洗剤のような工業製品）の原料に利用され得る。これまで、ピノレン酸の生産はマツ種子からの抽出により行われているので、ピノレン酸は大量生産ができず生産コストが高いこと、およびピノレン酸の供給源であるマツが森林資源として限られていること等の問題点を有していたが、本発明に従えば、ピノレン酸を低コストで大量生産できる。
（４−６）検出器具
本発明は、種々の検出器具を提供する。本発明に係る検出器具は、本発明に係るポリヌクレオチドもしくはフラグメントが基板上に固定化されたもの、または、本発明に係るポリペプチドもしくは抗体が基板上に固定化されたものであり、種々の条件下において、本発明に係るポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現パターンの検出・測定などに利用することができる。
一実施形態において、本発明に係る検出器具は、本発明に係るポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドが基板上に固定化されていることを特徴とする。本実施形態の好ましい局面において、本実施形態に係る検出器具は、いわゆるＤＮＡチップである。本明細書中で使用される場合、用語「ＤＮＡチップ」とは、合成したオリゴヌクレオチドを基板上に固定化した合成型ＤＮＡチップを意味するが、これに限定されず、ＰＣＲ産物などのｃＤＮＡを基板上に固定化した貼付け型ＤＮＡマイクロアレイもまた包含する。ＤＮＡチップとしては、例えば、本発明の遺伝子と特異的にハイブリダイズするプローブ（すなわち、本発明に係るオリゴヌクレオチド）を基板（担体）上に固定化したＤＮＡチップが挙げられる。
プローブとして用いる配列は、ｃＤＮＡ配列の中から特徴的な配列を特定する公知の方法（例えば、ＳＡＧＥ法（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ法）（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１２６８，１９９７；Ｃｅｌｌ  ８８：２４３，１９９７；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４，１９９５；Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：３００，１９９７；米国特許第５，６９５，９３７号）等が挙げられるがこれらに限定されない）によって決定することができる。
なお、ＤＮＡチップの製造には、公知の方法を採用すればよい。例えば、オリゴヌクレオチドとして、合成オリゴヌクレオチドを使用する場合には、フィトリオグラフィー技術と固相法ＤＮＡ合成技術との組み合わせにより、基板上でオリゴヌクレオチドを合成すればよい。一方、オリゴヌクレオチドとしてｃＤＮＡを用いる場合は、アレイ機を用いて基板上に張り付ければよい。
また、一般的なＤＮＡチップと同様、パーフェクトマッチプローブ（オリゴヌクレオチド）と、該パーフェクトマッチプローブにおいて一塩基置換されたミスマッチプローブとを配置してポリヌクレオチドの検出精度をより向上させてもよい。さらに、異なるポリヌクレオチドを並行して検出するために、複数種のオリゴヌクレオチドを同一の基板上に固定化してＤＮＡチップを構成してもよい。
本実施形態に係る検出器具に用いる基板の材質としては、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを安定して固定化することができるものであればよい。上記した基板以外には、例えば、ポリカーボネートやプラスティックなどの合成樹脂、ガラス等を挙げることができるが、これらに限定されない。基板の形態も特に限定されないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。本実施形態の好ましい局面において、本実施形態に係る検出器具は、種々の生物またはその組織もしくは細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーを標的サンプルとする検出に用いられる。
他の実施形態において、本発明に係る検出器具は、本発明に係るポリペプチドまたは抗体が基板上に固定化されていることを特徴とする。本実施形態の好ましい局面において、本実施形態に係る検出器具は、いわゆるプロテインチップである。
本明細書中で使用される場合、用語「基板」は、目的物（例えば、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質）を担持することのできる物質が意図され、用語「支持体」と交換可能に使用される。好ましい基板（支持体）としては、ビーズ（例えば、ポリスチレンビーズ）、固相（例えば、ガラスチューブ、試薬ストリップ、ポリスチレン製のマイクロタイタープレートまたはアミノ基結合型のマイクロタイタープレート）などが挙げられるが、これらに限定されない。目的物をこれらの基板に固定化する方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：５１９−５２０（１９９２）（本明細書中に参考として援用される）に記載される。
本実施形態に係る検出器具に用いる基板の材質としては、ポリペプチドまたは抗体を安定して固定化することができるものであればよい。上記した基板以外には、例えば、ポリカーボネートやプラスティックなどの合成樹脂、ガラス等を挙げることができるが、これらに限定されない。基板の形態も特に限定されないが、例えば、板状、フィルム状等の基板を好適に用いることができる。
上記の方法以外のポリペプチドまたは抗体を基板上に固定化する方法としては、例えば、ニトロセルロース膜やＰＤＶＦ膜にポリペプチドや抗体をドットブロットの要領でスポットする物理吸着法、または、ポリペプチドや抗体の変性を軽減するために、スライドガラス上にポリアクリルアミドのパッドを接合して、これにポリペプチドや抗体をスポットする方法が挙げられる。さらに、ポリペプチドや抗体を基板表面に吸着させるだけでなく、強固に結合させるため、アルデヒド修飾ガラスを利用した方法（Ｇ．ＭａｃＢｅａｔｈ，Ｓ．Ｌ．Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９，１７６０（２０００））を用いることもできる。また、基板上でのポリペプチドの配向を揃えて固定化する方法としては、オリゴヒスチジンタグを介して、ニッケル錯体で表面修飾した基板へ固定化する方法（Ｈ．Ｚｈｕ，Ｍ．Ｂｉｌｇｉｎ，Ｒ．Ｂａｎｇｈａｍ，Ｄ．Ｈａｌｌ，Ａ．Ｃａｓａｍａｙｏｒ，Ｐ．Ｂｅｒｔｏｎｅ，Ｎ．Ｌａｎ，Ｒ．Ｊａｎｓｅｎ，Ｓ．Ｂｉｄｌｉｎｇｍａｉｅｒ，Ｔ．Ｈｏｕｆｅｋ，Ｔ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ａ．Ｄｅａｎ，Ｍ．Ｇｅｒｓｔｅｉｎ，Ｍ．Ｓｎｙｄｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９３，２１０１（２００１））を用いることができる。
本実施形態の好ましい局面において、本実施形態に係る検出器具は、種々の生物またはその組織もしくは細胞からの抽出液を標的サンプルとする検出に用いられる。
このように、本発明に係る検出器具は、少なくとも、本発明に係るポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、または本発明に係るポリペプチドもしくは当該ポリペプチドと結合する抗体が支持体上に固定化されていればよいといえる。また、本発明に係る検出器具は、本発明に係るポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、または本発明に係るポリペプチドもしくは当該ポリペプチドと結合する抗体が固定化されている基板を備えていればよいといえる。すなわち、これらの支持体（基板を含む）以外の構成部材を備える場合も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドまたは本発明に係るポリヌクレオチド、あるいは本発明に係る抗体に結合するポリペプチドを検出する器具を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々の支持体の種類、固定化方法に存するのではない。したがって、上記支持体以外の構成部材を包含する検出器具も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。
【実施例】  本実施例において使用する手順は、他で言及しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載されている方法に従った。
［実施例１：クラミドモナス（Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）の脂肪酸組成］
図１は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの脂肪酸メチルエステルのＧＣ分析結果を示す。この脂肪酸を、標品のメチルエステル化体の記録時間（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）、およびこれら標品のピロリジン誘導体の質量スペクトルと比較することによって同定した。ＧＣ−ＭＳ分析の結果は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉは１６：０、１６：１Δ７、１６：３Δ７，１０，１３、１６：４Δ４，７，１０，１３、１８：０、１８：１Δ９、１８：１Δ１１、リノール酸（ＬＡ、１８：２Δ９，１２）、およびα−リノレン酸（ＡＬＡ、１８：３Δ９，１２，１５）に加えて、ピノレン酸（ＰＡ、１８：３Δ５，９，１２）およびコニフェロン酸（ＣＡ、１８：４Δ５，９，１２，１５）を含むことを示す。γ−リノレン酸（ＧＬＡ、１８：３Δ６，９，１２）およびステアリドン酸（ＳＴＡ、１８：４Δ６，９，１２，１５）のようなΔ６不飽和化されたＣ１８脂肪酸、またはＣ１８以上の不飽和脂肪酸は、検出されなかった（図１および表１参照）。表１の各値は、３回の独立した実験における平均±標準偏差を示している。ＰＡおよびＣＡの全脂肪酸に対する含有率は、それぞれ７．７％および１．７％であった。本発明により、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉがピノレン酸を含むことが初めて明らかとなった。
【表１】
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［実施例２：クラミドモナス脂肪酸不飽和化酵素ポリヌクレオチドＣｒＤＥＳ５の単離］
Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉのＥＳＴデータベースから、脂肪酸不飽和化酵素をコードすると予想されるｃＤＮＡクローンを見出した。当該ｃＤＮＡクローンＬＣＬ００７ｇ０１は、３．２ｋｂのインサート配列を有し、４７６アミノ酸残基をコードする１４３１ｂｐのＯＲＦを含んだ。このｃＤＮＡをＣｒＤＥＳ５と名付けた。図２は、ＣｒＤＥＳ５のノザン解析結果を示す。総ＲＮＡをＣ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉの細胞から抽出し、３２ＰでラベルしたＣｒＤＥＳ５のＯＲＦのＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた。検出された転写産物のサイズをレーンの右側に記載した。クローニングした断片の長さは、ノザン解析の結果と一致した（図２参照）。
図３は、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉΔ５不飽和化酵素（ＣｒＤＥＳ５）のアミノ酸配列を、糸状菌Ｍ．ａｌｐｉｎａ（ＭａＤＥＳ５）、ゼニゴケＭ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（ＭｐＤＥＳ５）、ケイ藻Ｐ．ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ（ＰｔＤＥＳ５）のΔ５不飽和化酵素のアミノ酸配列と比較したアラインメントを示す。シトクロムｂ５ドメインを破線で囲み、シトクロムｂ５スーパーファミリーにおいて高度に保存されている８つのアミノ酸残基に、星印を付した。３つのヒスチジンボックスを四角で囲んだ。３つめのヒスチジンボックスに保存されているグルタミン残基に三角を付した。表中の点で表した残基はＣｒＤＥＳ５の配列と同一の残基を、ダッシュはアラインメントギャップを示す。これらの配列のＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．は、ＡＦ０５４８２４（ＭａＤＥＳ５）、ＡＹ５８３４６５（ＭｐＤＥＳ５）、ＡＹ０８２３９２（ＰｔＤＥＳ５）である。ＣｒＤＥＳ５のＯＲＦによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を、既知の不飽和化酵素と比較した。ＣｒＤＥＳ５ポリペプチドは、糸状菌Ｍ．ａｌｐｉｎａのΔ５不飽和化酵素と最も高い相同性（２１％）を示した（図３参照）。他のｆｒｏｎｔ−ｅｎｄ型不飽和化酵素と同様に、ＣｒＤＥＳ５ポリペプチドにおいても、電子供与体として機能するＮ末端のシトクロムｂ５ドメイン、および３つのヒスチジン・ボックスが保存されていた。さらにＣｒＤＥＳ５ポリペプチドのシトクロムｂ５ドメインでは、図３に星印で示す８アミノ酸残基が、シトクロムｂ５スーパーファミリー間で保存されているアミノ酸と一致した（Ｄｏｍｅｒｇｕｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐ４１０５，２００２参照）。またＣｒＤＥＳ５ポリペプチドは、他のｆｒｏｎｔ−ｅｎｄ型不飽和化酵素と同じく、３番目のヒスチジン・ボックス内に高度に保存されたグルタミン残基が存在する（図３に逆三角形で示す）。以上のことから、ＣｒＤＥＳ５ポリペプチドはＰＵＦＡ（多価不飽和脂肪酸）生合成において働くｆｒｏｎｔ−ｅｎｄ型不飽和化酵素であることが示唆された。
［実施例３：クラミドモナス不飽和化酵素ポリヌクレオチドＣｒＤＥＳ５の機能解析］
ＣｒＤＥＳ５のＯＲＦをメタノール誘導性５’ＡＯＸ１プロモーターと作動可能に連結したベクターｐＰＩＣＺＡ（ゼオシン耐性ポリヌクレオチド、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて、メタノール資化性酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおいてＣｒＤＥＳ５ポリペプチドを発現させた。この細胞の脂肪酸組成を指標としてＣｒＤＥＳ５ポリペプチドの酵素活性を測定した。
まず、ＣｒＤＥＳ５のＯＲＦを、以下のプライマーを用いて増幅した。なお、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは１８：１Δ９、ＬＡ、ＡＬＡの合成能を有する。
（ＣｒＤＥＳ５のＯＲＦ増幅用プライマー）
ＣｒＤＥＳ５−０１Ｆ：５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＡＡＴＡＴＧＴＧＣＡＧＧＣＣＴＡＣＣＧ（配列番号３）
ＣｒＤＥＳ５−０２Ｒ：５’−ＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＧＣＣＡＧＣＴＴＧＣＧＣＧＣＣ（配列番号４）。
これらのプライマーは、下線を付したＥｃｏＲＩ認識配列を含む。また、ＰＣＲ反応を、製造者の推奨する方法に従って、０．５ＵのＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ製）を用いて反応液量２０μｌで行った。ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間保持後、９４℃で１分間、５７℃で１分間、７２℃で１分間の反応を２５サイクル繰り返し、その後４℃に冷却した。
得られたＯＲＦ断片をＥｃｏＲＩで消化した後にゲル精製し、メタノール資化性酵母Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの発現ベクターｐＰＩＣＺＡ内のＥｃｏＲＩ部位に連結した。この構築物を、ｐＰＩＣＺＡ−ＣｒＤＥＳ５と名付けた。
Ｐｉｃｈｉａ  ＥａｓｙＣｏｍｐ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いて、この発現構築物ｐＰＩＣＺＡ−ＣｒＤＥＳ５およびコントロールベクターｐＰＩＣＺＡで、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＰＰＹ１を形質転換した。ＣｒＤＥＳ５のＯＲＦを発現させるために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ  Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔの推奨する方法に従って、各形質転換体を１．０％グリセロールのみを炭素源とする最小培地中でＯＤ（６００ｎｍ）が０．５になるまで培養した後、０．５％メタノールのみを炭素源とする最小培地中で３０℃、３日間、飽和状態になるまで培養した。各々の形質転換体細胞の脂肪酸組成を、ＧＣ−ＭＳを用いてＫａｊｉｋａｗａら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７  ｐ６０５，（２００３）に記載される方法に従って測定した。
その結果、ＣｒＤＥＳ５のＯＲＦを発現する形質転換体において、コントロールでは見られない３つの新規なピーク（Ａ、Ｂ、Ｃ）が検出された（表２および図４参照）。
表２は、ｐＰＩＣＺＡ−ＣｒＤＥＳ５またはコントロールベクターｐＰＩＣＺＡで形質転換したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの脂肪酸組成を示したものである。表中、「ＮＤ」はデータを検出し得なかったことを示す。また、表中の各値は、３回の独立した実験における平均±標準偏差を示す。
【表２】
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図４（ａ）は、ｐＰＩＣＺＡ−ＣｒＤＥＳ５で形質転換したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの脂肪酸プロファイルを示し、図４（ｂ）は、コントロールベクターｐＰＩＣＺＡで形質転換したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの脂肪酸プロファイルを示す。図４（ｃ）は、ピノレン酸標品のピークを示す。
ピークＢは、ピノレン酸標品と同じ記録時間に検出された（図４参照）。ｐＰＩＣＺＡ−ＣｒＤＥＳ５またはコントロールベクターｐＰＩＣＺＡで形質転換したＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓの脂肪酸のピロリジン誘導体を、ＧＣ−ＭＳを用いて解析した（図５参照）。標品と比較することによって、新規ピークＡ、ＢおよびＣは、それぞれタキソール酸（ＴＡ、１８：２Δ５，９）、ピノレン酸（ＰＡ、１８：３Δ５，９，１２）およびコニフェロン酸（ＣＡ、１８：２Δ５，９，１２，１５）であることが示された。
Ａのマススペクトルにおいて、ｍ／ｚ＝３３３のイオンピークは、ＴＡピロリジン誘導体の分子イオンピークを示す。ｍ／ｚ＝１８０の特徴的なフラグメントイオンピークは、Δ５およびΔ９の２つの二重結合の存在によって、その間にある７位と８位の炭素間での切断により生じたと考えられる。また、Δ５およびΔ９の二重結合は、それぞれｍ／ｚ＝１４０と１５２および１９４と２０６の１２ａ．ｍ．ｕ．ずつ離れたフラグメントイオンピークからも確認することができる。
Ｂのマススペクトルにおいて、ｍ／ｚ＝３３１のイオンピークは、ＰＡピロリジン誘導体の分子イオンピークを示し、切断パターンはＰＡ標品のパターンと同一であった。ｍ／ｚ＝１４０、１５２、１８０、１９４、２０６のフラグメントイオンピークは、ＴＡピロリジン誘導体の場合と同様に、Δ５およびΔ９の２つの二重結合を示す。さらに、ｍ／ｚ＝２３４および２４６のフラグメントイオンピークは、１２位の二重結合を示す。
Ｃのマススペクトルにおいて、ｍ／ｚ＝３２９のイオンピークは、ＣＡピロリジン誘導体の分子イオンピークを示す。ｍ／ｚ＝１４０、１５２、１８０、１９４、２０６、２３４、および２４６の切断に起因するイオンピークは、ＴＡおよびＰＡピロリジン誘導体の場合と同様に、Δ５、Δ９およびΔ１２の３つの二重結合を示す。さらに、ｍ／ｚ＝２７４および２８６の２つのフラグメントイオンピークは、１５位の二重結合を示す。
これらの結果から、ＣｒＤＥＳ５ポリペプチドは、１８：１Δ９、ＬＡ、ＡＬＡに対してΔ５不飽和化活性を示すことが明らかになった。
［実施例４：ＣｒＤＥＳ５ポリペプチドの基質特異性］
ＣｒＤＥＳ５ポリペプチドの脂肪酸基質特異性を、ｐＰＩＣＺＡ−ＣｒＤＥＳ５で形質転換した酵母株に各種脂肪酸基質を添加することによって調べた（表３参照）。各脂肪酸に対するＣｒＤＥＳ５ポリペプチドの不飽和化効率（変換率（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｒａｔｅ））を、次の式を用いて算出した。
変換率＝１００×（生成物％）／（基質％＋生成物％）
その結果、ＬＡに対して最も高いΔ５不飽和化活性（７９．２％）が見られた。ＡＬＡに対して、比較的高いΔ５不飽和化活性（６０．０％）を示したが、１８：１Δ９に対してはわずかな活性（１．０％）しか検出されなかった。一方、Ｃ１６脂肪酸、１８：１Δ１１、１８：２Δ８Ｅ，１２、１８：２Δ９，１１Ｅ、ジホモ−γ−リノレン酸（ＤＧＬＡ、２０：３Δ８，１１，１４）、エイコサテトラエン酸（ＥＴＡ、２０：４Δ８，１１，１４，１７）に対するΔ５不飽和化活性は検出されなかった。
同様に、ジホモリノレン酸（２０：２Δ１１，１４）および２０：３Δ１１，１４，１７に対する活性を測定したところ、ジホモピノレン酸（２０：３Δ７，１１，１４）と２０：４Δ７，１１，１４，１７がそれぞれ生成した。したがって、本遺伝子は炭素数２０のジエン酸とトリエン酸のΔ７位を不飽和化する活性もコードしていることが明らかとなった。
【表３】
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［実施例５：ＣｒＤＥＳ５ポリヌクレオチドをタバコに導入するためのベクターの構築］
タバコにおいて、ＣｒＤＥＳ５ポリヌクレオチドを発現させるために、以下の手順により、発現構築物を作製した。まず、ＣｒＤＥＳ５ポリヌクレオチドを含むコンストラクトｐ３５Ｓ−ＣｒＤＥＳ５からＸｂａＩによりＣｒＤＥＳ５のＯＲＦを含むＤＮＡ断片を切り出し、両末端を平滑化処理し、ＣｒＤＥＳ５ＯＲＦ断片を得た。
また、構成的発現用のバイナリーベクターとしてｐＳＰＢ１７６の一部を改変して利用した。ｐＳＰＢ１７６はｐＢＩＮＰＬＵＳをもとに、エンハンサー配列を繰り返したカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ（Ｅｌ２３５Ｓ）プロモーター（Ｍｉｔｓｕｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．１９９６，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，４９）をＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩとを用いて挿入し、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）ターミネーターをＳａｌＩとＥｃｏＲＩとを用いて挿入したベクターであり、ＢａｍＨＩとＳａｌＩ部位によって挟まれたΔＧＵＳのＯＲＦが挿入されている。
次に、ｐＳＰＢ１７６をＢａｍＨＩとＳａｌＩで消化し、ベクター側の直鎖状ＤＮＡを回収し、ΔＧＵＳのＯＲＦを除去した。さらに平滑化処理をおこなった直鎖状ベクターの平滑化部位に、平滑化ＣｒＤＥＳ５ＯＲＦ断片を挿入することによりｐＳＰＢ２３９８を作製し、ＣｒＤＥＳ５の構成的発現用バイナリーベクターとした。このプラスミド上でＣｒＤＥＳ５ポリヌクレオチドは構成的プロモーターの制御下にある。
本明細書において、ピノレン酸の生成を例に本発明を説明したが、本発明に係るポリペプチドは、当該ポリペプチドがリノール酸をΔ５不飽和化してピノレン酸を生成する活性以外にα−リノレン酸をΔ５不飽和化する活性およびジエン酸またはトリエン酸をΔ７不飽和化する活性を有しているので、本発明に係るポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド、ならびにこれらの利用としてリノール酸をΔ５不飽和化してピノレン酸を生成することのみに限定されないことを、当業者は容易に理解する。
［実施例６：ＣｒＤＥＳ５ポリヌクレオチドのタバコにおける発現とピノレン酸およびコニフェロン酸の生産］
引き続いて、公知の方法（Ｐｌａｎｔ  Ｊ．５，８１，１９９４）に基づきｐＳＰＢ２３９８を用いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（菌株：Ａｇｌ０，Ｌａｚｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，９６３）を形質転換した。次に、このｐＳＰＢ２３９８を有する形質転換体Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを用い、タバコリーフディスク法（下西ら、新・生物化学実験のてびき３．化学同人（１２２〜１２４頁））によりタバコの形質転換を行った。
得られた組換えタバコの葉からＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔｍｉｎｉＫｉｔ（キアゲン社）を用いてＲＮＡを抽出した。スーパースクリプト  ファーストストランドシステム（インビトロジェン社）を用いて、このＲＮＡから合成したｃＤＮＡを鋳型に、合成オリゴヌクレオチドＣｒＤＥＳ５Ｆ  ５´−ＴＧＴＣＣＣＡＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＧＡＣ−３’（配列番号７）およびＮｏｓＲ  ５´−ＡＣＣＧＧＣＡＡＣＡＧＧＡＴＴＣＡＡＴＣ−３’（配列番号８）をプライマーとしてＲＴ−ＰＣＲを行い、ＣｒＤＥＳ５ポリヌクレオチドが発現している系統を選択した。
形質転換タバコの葉の脂肪酸組成分析は実施例１に記載した方法で行った。分析値を表４に示した。数値は脂肪酸組成を百分率で表し、ピノレン酸とコニフェロン酸とについては両者の合計値も併記した。例えば、形質転換タバコ系統Ｎ２３９８−１では、宿主（ｃｏｎｔｒｏｌ）では全く検出されないピノレン酸、コニフェロン酸が総脂肪酸の１９．５２％、２１．４％に達した。以上の結果は、クラミドモナスの遺伝子が、高等植物でも良好に機能し、本来ピノレン酸、コニフェロン酸を生産しない植物に、これらを生産できる能力を付与できることを示している。
【表４】
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本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】  以上のように、本発明に係るポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、ピノレン酸および／またはコニフェロン酸の生産に有用である。また、本発明に係るポリヌクレオチドを発現可能に導入した形質転換体または細胞は、食品分野、各種工業分野において、ピノレン酸および／またはコニフェロン酸、あるいはこれらを用いる製品を生産する上で、極めて有用である。また、特に、上記形質転換体が植物体である場合、植物体自体を食品として用いることができるので農業分野等において非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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