(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式IV
【化１】
0004801307.tif 000027
［式中、
Ｒ1は、糖基であり、
Ｒ2は、−ＣＯＯＨまたは−ＣＨ2−Ｏ−(Ｒ7)mであり、ここでＲ7は糖基であり、
Ｒ3は、エポキシド含有基、C1〜C6−アルキル基およびC2〜C6−アルケニル基から選択され、ここで上記のアルキル基およびアルケニル基は、場合により少なくとも一つのＯＨ基で置換されており；
ｍおよびｎは、それぞれ独立して１および２から選択され；
糖（Ｒ1／Ｒ7）は単糖類（ｎ＝１）または二つの単糖類がグリコシド結合で結合した二糖類（ｎ＝２）であり、単糖類はヘキソースである］
で示される化合物、その全ての立体化学の形態、およびこれらの形態の任意の割合の混合物、ならびにそれらの生理学上許容され得る塩。
【請求項２】
Ｒ7がアミノ糖である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ7が次の式
【化２】
0004801307.tif 000028
を有する、請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
ｎが２である、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ1がアミノ糖である、請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ1が次の式
【化３】
0004801307.tif 000029
を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ3が次の基
【化４】
0004801307.tif 000030
から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
式（ＩＡ）
【化５】
0004801307.tif 000031
で示される請求項１記載の化合物、その全ての立体化学の形態、およびこれらの形態の任意の割合の混合物、ならびにそれらの生理学上許容され得る塩。
【請求項９】
式（ＩＢ）
【化６】
0004801307.tif 000032
で示される請求項１記載の化合物、その全ての立体化学の形態、およびこれらの形態の任意の割合の混合物、ならびにそれらの生理学上許容され得る塩。
【請求項１０】
式（ＩＥ）
【化７】
0004801307.tif 000033
で示される請求項１記載の化合物、その全ての立体化学の形態、およびこれらの形態の任意の割合の混合物、ならびにそれらの生理学上許容され得る塩。
【請求項１１】
放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959（DSM 12931）、またはその変異体または突然変異体の一つを、培地中好適な条件下で少なくとも一つの式（Ｉ）に示される化合物が培地中に存在するまで培養し、次いでその化合物を単離して得られる、請求項１〜１０のいずれかに記載の式（Ｉ）に示される化合物。
【請求項１２】
単離された化合物がさらに生理学上許容され得る塩に変換される、請求項１１記載の化合物。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の少なくとも一つの式（Ｉ）に示される化合物、または生理学上許容され得る塩、およびそれらの許容され得る担体からなる組成物。
【請求項１４】
許容され得る担体が製薬上許容され得る担体である、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
微生物放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959（DSM 12931）、またはその変異体もしくは突然変異体の一つを、培地中好適な条件で、少なくとも一つの式（Ｉ）に示される化合物が培地中に存在するまで培養し、次いでその化合物を単離することを含む、請求項１〜１０のいずれか一つに記載の式（Ｉ）に示される化合物を少なくとも一つ、またはそれらの生理学上許容され得る塩の製造方法。
【請求項１６】
単離された化合物が、さらに生理学上許容され得る塩に変換されるものである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
温度１８〜３５℃、ｐＨ６〜８である好気的条件で培養が実施される、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも一つの二重鎖の核酸の転写の阻害に用いる、請求項１〜１２のいずれか一つに記載の式（Ｉ）に示される化合物、またはその生理学的に許容され得る塩。
【請求項１９】
細胞増殖抑制剤製造のための、請求項１〜１２のいずれかに記載の式（Ｉ）に示される化合物、または生理学上許容され得る塩の使用。
【請求項２０】
結腸癌治療用医薬を製造するための、請求項１〜１２のいずれかに記載の式（Ｉ）に示される化合物、またはその生理学上許容され得る塩の使用。
【請求項２１】
乳癌治療用医薬の製造のための、請求項１〜１２のいずれか一つに記載の式（Ｉ）に示される化合物、またはその生理学上許容され得る塩の使用。
【請求項２２】
肺癌治療用医薬の製造のための、請求項１〜１２のいずれか一つに記載の式（Ｉ）に示される化合物、またはその生理学上許容され得る塩の使用。
【請求項２３】
前立腺癌治療用医薬の製造のための、請求項１〜１２のいずれか一つに記載の式（Ｉ）に示される化合物、またはその生理学上許容され得る塩の使用。
【請求項２４】
白血病治療用医薬の製造のための、請求項１〜１２のいずれか一つに記載の式（Ｉ）に示される化合物、またはその生理学上許容され得る塩の使用。
【請求項２５】
微生物感染の治療用医薬の製造のための、請求項１〜１２のいずれか一つに記載の式（Ｉ）に示される化合物、またはその生理学上許容され得る塩の使用。
【請求項２６】
放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959（DSM 12931）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、次の式Ｉ
【化８】
0004801307.tif 000002
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ8、Ｒ10およびｎは、下記のように定義される］に示される新規化合物に関する。式Ｉに示される化合物は転写酵素を阻害し、細胞増殖抑制作用を有し、特に癌の治療に好適である。式Ｉに示される化合物は、培地中放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959、DSM 12931の培養により得ることができる。また、本発明は、式Ｉの化合物の製造方法、悪性疾患、および転写酵素の阻害によって治療され得る疾患の治療用医薬の製造のための化合物の使用、および少なくとも一つの式Ｉに示される化合物からなる製剤に関する。
【０００２】
癌は、多くの場合に致死的であって、内在性細胞の制御し得ない増殖によって通常引き起こされる、ヒトおよび動物の疾患である。癌は、悪性腫瘍（悪性疾患）、腫瘍（腫瘍または癌種）の形成、または白血球細胞の悪性変性および異常な成熟（白血病）に対して使用される用語である。癌または腫瘍細胞は、一般的に、内在性細胞の形質転換によって形成される。癌細胞の悪性疾患は、癌細胞の自律的増殖（即ち癌細胞が、無制限に増殖し、器官系に統合せずに、組織を破壊しながら浸潤する能力）それ自体を示すものである。悪性疾患の確実な徴候は、造血性およびリンパ性腫瘍細胞の拡散の後に、腫瘍から離れて転移が形成されることである。ヒトの死因で最も多いものの一つが癌であり、それ故に、悪性変性疾患の治療および処置のための方法および薬剤として非常に需要がある。
【０００３】
腫瘍を外科的に除去するための革新的なアプローチに加えて、悪性腫瘍の治療のための選択は、Ｘ線、α線、β線、γ線による放射線療法、免疫療法および化学療法が含まれる。現在まで、免疫療法の使用には限界があった。腫瘍の化学療法とは、腫瘍および通常局部外科的処置または放射線照射の後も残存する腫瘍細胞の治療のための細胞毒（細胞増殖抑制剤）を投与する意味と理解される。これらの物質は、腫瘍組織が急速に成長するような、分裂中の細胞が高率に存在する組織が、感度良く反応するように、細胞分裂の特定の過程で特異的に介入する。使用される剤は、例えば、シクロホスファミド（The Merｃｋ index、第12版、第463頁）のような、アルキル化化合物、代謝拮抗物質、例えばメトトレキセート（The Merck index,12版、第1025頁）、アルカロイド、例えばビンクリスチン（The Merck index,12版、第1074頁）および抗生物質、例えばダウノマイシン（The Merck index、第12版、第479頁）、およびアドリアマイシン（The Merck index、第12版、第581-582頁）である。しかし、副作用が甚だしいので、これら全ての薬剤は、多くの場合において、患者の死を遅延できても予防できないという顕著な欠点を有する。さらに変性した（癌）細胞は、使用された薬剤に耐性になる。即ちこの場合には、慣用の医薬はもはや細胞増殖抑制作用を全く有さないが、その副作用のために毒性を有するのである。さらに、細胞増殖抑制剤の併用および／または逐次使用は、個々の細胞増殖抑制剤（単独療法）の作用に勝ることが分かっており、それ故に複合化学療法において考えられる副作用は非加成的であり得る。これら全ての理由により、新規の化学療法が緊急に必要であり、このように世界中で研究されている。
【０００４】
驚くべきことに、微生物の一菌株である放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959、DSM 12931により、かなり低濃度でも細胞増殖を阻害する、新規な高い効能を有する細胞増殖抑制剤を製造し得ることが見出された。今後、この新規化合物をプルラフラビン（pulraflavin）と称呼することにし、それらはプルラフラビン誘導体と共に、本発明の特許請求の範囲の部分を構成する。プルラフラビンは抗生物質であり、ｐ−キノイド環骨格および様々な糖構造からなる。プルラフラビンは、核酸の二重鎖を架橋することによって転写を阻害し、また適当な場合には、さらにアルキル化を起こす。この環構造はプルラフラビンの一部として、S. Kondo等によってJournal of Antibiotics, volume 30, pages 1143-1145, 1977に最初に報告された。後に、この環骨格は、多数の抗生物質中で発見された；プルラマイシンおよびネオプルラマイシンに加えて、サプトマイシン（N.Abe et al. J. Antibiotics, 46, 1536-1549, 1993）、アンキノマイシン（Y. Sato et al. J. Antibiotics 42, 149, 1989）、カイダマイシン（N. Kanda et al. J. Antibiotics, 24, 599, 1971）、ヘダマイシン（U. Sequin et al. Tetrahedron, 34, 761, 1978）およびアルトロマイシン（G. M. Brill et al. J. Antibiotics, 43, 229-273, 1990）といった化合物が、構造的な類縁化合物として報告されている。先行技術の物質は、不十分な効能、高い毒性および／または所望されない副作用といったそれ自体の明らかな欠点を有することがよくある。
【０００５】
従って、本発明は、式（Ｉ）
【化９】
0004801307.tif 000003
［式中、
Ｒ1は、糖基であり、
Ｒ2は、−ＣＯＯＨまたは−ＣＨ2−Ｏ−(Ｒ7)mであり、ここでＲ7は糖基であり、そして、
Ｒ3は、エポキシド含有基、C1〜C6−アルキル基およびC2〜C6−アルケニル基から選択され、ここで場合により、前記アルキル基およびアルケニル基は少なくとも一つのＯＨ基で置換されており、
Ｒ5は、Ｈ、C1〜C6−アルキル、C2〜C6−アルケニルおよびC2〜C6−アルキニルから選択され、
Ｒ4、Ｒ6、Ｒ8およびＲ10は、相互に独立して、Ｈ、C1〜C6−アルキル、C2〜C6−アルケニル、C2〜C6−アルキニル、−Ｘ2Ｈおよび−Ｘ2Ｒ12から選択されるか、または、
Ｒ4およびＲ6は一緒になって、および／または、Ｒ8およびＲ10は一緒になって、＝Ｘ2であり、
Ｘ2は、Ｏ、ＮＨ、Ｎ−C2〜C6−アルキル、Ｎ−C2〜C6−アルケニル、Ｎ−C2〜C6−アルキニルまたはＳであり、
Ｒ12は、C1〜C6−アルキル、C2〜C6−アルケニル、C2〜C6−アルキニル、アリールまたはアシルであり、さらに
ｍおよびｎは、互いに独立して、１または２である］
で示される化合物（全ての立体化学的な形態の化合物、およびそれらの形態の任意の割合の混合物）、およびそれらの生理学的に許容され得る塩に関する。
【０００６】
式（Ｉ）において、
C1〜C6−アルキルは、１〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝状のアルキル、例えば、メチル、エチル、イソプロピル、tert−ブチルおよびヘキシルである。
C2〜C6−アルケニルは、２〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝状のアルケニル、例えばアリール、クロチルおよびペンテニルである。
C1〜C6−アルキニルは、２〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝状のアルキル、例えば、プロピニル、ブチニルおよびペンチニルである。
【０００７】
アリールは、芳香族環構造、例えば、フェニル、ベンジルまたは１−または２−ナフチルである。アリールは場合により、例えばハロゲン（例：塩素、臭素、フッ素）、１〜４個の炭素原子を有するアルキル基によって、水酸基によって、１〜４個の炭素原子を有するアルコキシ（例：メトキシ）によって、および／またはトリフルオロメチルによって置換されることができる。
【０００８】
アシルは、脂肪族または芳香族アシル基であることができる。脂肪酸アシルは、１〜７個の炭素原子、好ましくは１〜４個の炭素原子（例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ヘキサノイル、アクリロイル、クロトノイル、プロピオロイル）を有し、ここでさらにハロゲン（例えば塩素、臭素、フッ素）、アミノによって、および／または１〜４個の炭素原子を有するアルキルアミノ、（例えば、メチル−またはエチルアミノ基）によって置換されることができる。芳香族アシルは、例えば、ベンゾイルまたはナフトリルであることができ、また、ここでさらに、例えばハロゲン（例：塩素、臭素、フッ素）によって、１〜４個の炭素原子を有するアルキル（例：メチル）によって、水酸基によって、アミノ基（例：エチルアミノ）によって、または１〜７個の炭素原子を有する、例えば１〜４個の炭素原子を有するアルコキシル基（例：メトキシ）によって置換される。
【０００９】
糖（Ｒ1／Ｒ7）は、単糖類（ｎ＝１）または二糖類（ｎ＝２）であって、ここで二つの単糖類がグリコシド結合で結合している。単糖類は、ヘキソース（Ｃ6Ｈ12Ｏ6）、例えばアルドヘキソース、例えばＤ−（＋）−グルコース、Ｄ−（＋）−マンノースまたはＤ−（＋）−がラクトースであることができる。単糖類は、一−、二−または三−置換されて、互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨ(アルキル）、Ｎ(アルキル)2、アルキルおよびアルコキシであって、単糖類のＨおよび／またはＯＨは、場合により置換基によって置換される。本明細書中で使用される用語「糖」はアミノ糖を含む。アミノ糖は下記のように単糖類または二糖類の少なくとも一つのＯＨ−またはＨ−基が、ＮＨ2、ＮＨ(アルキル）またはＮ(アルキル)2のようなアミノ基によって置換される単糖類または二糖類である。
【００１０】
ある実施態様においては、ｍは１である。
Ｒ7は、式（II）
【化１０】
0004801307.tif 000004
［式中、Ｒ13、Ｒ14、Ｒ16、Ｒ18、Ｒ20、Ｒ22、Ｒ24、Ｒ26およびＲ28は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨアルキル、Ｎ(アルキル)2およびアルコキシから選択され、ここでアルキルおよびアルコキシは１〜４個の炭素原子を有する］
に示されるアミノ糖であることができる。
【００１１】
C1〜C4−アルキルの例は、例えばメチル、エチル、プロピル、イソブチルおよびブチル、特にメチルであり、そしてC1〜C4−アルコキシの例には、例えばメトキシ、エトキシ、イソプロピルまたはブトキシ、特にメトキシである。
【００１２】
Ｒ7は、式（IIＡ）
【化１１】
0004801307.tif 000005
に示されるアミノ糖であることができる。
また、Ｒ1はアミノ糖であることができる。一つの実施態様として、ｎは２である。
【００１３】
Ｒ1は、式（III）
【化１２】
0004801307.tif 000006
［式中、Ｒ30乃至Ｒ60は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ2、ＮＨアルキル、Ｎ(アルキル)2またはＯ−アルキルであって、ここでアルキルは、C1〜C4−基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソブチルおよびブチル、特にメチルであり、およびＯ−アルキルは、C1〜C4−アルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、イソプロポキシまたはブトキシ、特にメトキシである］
に示される基であることができる。
【００１４】
一つの実施態様におけるＲ1は、式（IIIＡ）を有する。
【化１３】
0004801307.tif 000007
【００１５】
Ｒ3はエポキシド含有基であることができる。エポキシド含有基は、２〜１２個の炭素原子、例えば２〜６個の炭素原子を有する直鎖または分枝状アルキル基またはアルケニル基であることができ、ここで一つまたは二つのエポキシド環は（オキシラン）からなる。可能な例は：
【化１４】
0004801307.tif 000008
である。
【００１６】
エポキシド含有基以外は、Ｒ3は、１〜１２個の炭素原子、例えば１〜６個の炭素原子（例えばメチル、エチル、イソプロポキシ、tert−ブチル、ヘキシル、およびまた、例えばオクチル、ドデシル）を有する直鎖または分枝状アルキル、または２〜１２個の炭素原子、例えば２〜６個の炭素原子、例えばアリル、クロチル、ペンテニル、およびまたドデセニルを有する直鎖または分枝状アルケニルであることができ、ここでこれらのアルキル基またはアルケニル基はまた、例えば水酸基によって、一−または多−置換、例えば二または三−置換されることができる。
【００１７】
従って、本発明は、式（ＩＡ）
【化１５】
0004801307.tif 000009
に示されるプルラフラビンＡ、
【００１８】
式（ＩＢ）
【化１６】
0004801307.tif 000010
に示されるプルラフラビンＢ、および
【００１９】
式（ＩＥ）
【化１７】
0004801307.tif 000011
に示されるプルラフラビンＥ
［式中、ヘキソースＩは、２,６−ジデオキシアルドヘキソース；
ヘキソースIIは、２,３,６−トリデオキシ−３−ジメチルアミノヘキソース；および
ヘキソースIIIは、２,３,６−トリデオキシ−３−アミノ−３−メチルアルドヘキソースである］
（その全ての立体化学的形態およびこれらの形態の任意の割合の混合物）およびそれらの生理学的に許容され得る塩に関するものである。
【００２０】
一つの実施態様においては、本化合物は、式（ＩＡ）、（ＩＢ）および（ＩＥ）から選択され、式中
ヘキソースＩは、オリオースであり、
ヘキソースIIは、ロドサミンであり、
ヘキソースIIIは、３−エピ−バンコサミン
である。
【００２１】
本発明によれば、式Ｉに示される化合物は、式（ＩＡ）、（ＩＢ）および／または（ＩＥ）に示されるプルラフラビンの少なくとも一つが培地中に存在するまで、好適な条件の培地中で放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959、 DSM 12931、またはそれの変異体または突然変異体を培養することにより、例えば発酵することにより、得ることができる。次いで、プルラフラビンは、培地から単離され、精製され、適当な場合には化学的誘導体に、および／または、それらの生理学上許容し得る塩に変換することができる。
【００２２】
さらに、本発明は、培地中好適な条件で、式（ＩＡ）、（ＩＢ）および／または（ＩＥ）に示されるプルラフラビンの少なくとも一つが培地中に存在するまで、放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959、DSM 12931、またはそれの変異体または突然変異体を培養し（例えば発酵することにより）、培地から少なくとも一つのプルラフラビンを単離し、次いで適当な場合には、化学的誘導体および／または生理学的に許容し得る塩に変換することからなる式Ｉに示される化合物の製造方法に関する。
【００２３】
菌株HAG 003959、DSM 12931、それの突然変異体および／または変異体は、一つの実施態様であって、少なくとも一つの新規なプルラフラビンが培地中に存在するまで、少なくとも一つの炭素原子の源、および少なくとも一つの窒素原子の源、および市販の無機塩からなる栄養溶液（培地とも称呼される）中で培養し；次いでプルラフラビンを培養培地中から単離してもよく、さらに適当な場合には、個々の活性成分に分離してもよい。
培養は好気条件下で実施される。温度１８〜３５℃、ｐＨ６〜８で培養を実施することができる。
【００２４】
文献には、キノンの化学的誘導体化のための多数の反応が報告されてきた。従って、本化合物のキノン誘導体化は、それ自体知られた化学反応を用いて実施されることができる。本発明化合物をヒドロキノン体へ還元することは、例えば水素を用いて、または水素化アルミニウムまたは水素化ホウ素のような金属水素化物を用いて、触媒的に達成され得る。さらに好適な実施例は、ヒドロキシアミンを用いた、またはそれの誘導体を用いたキノンのオキシムへの変換であり、これらのオキシムはさらにそれらの部分を化学的に転換することができる。
【００２５】
さらに、本発明は、式（IV）
【化１８】
0004801307.tif 000012
［式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびｎは、上記のように定義される］を有する化合物（全ての立体化学的形態、およびこれらの形態の任意の割合の混合物）、およびそれの生理学的に許容され得る塩に関する。
【００２６】
式（IVＡ）、（IVＢ）および（IVＥ）に示されるプルラフラビン誘導体（以下に示す）は、それぞれ式（ＩＡ）、（ＩＢ）および（ＩＥ）に示されるプルラフラビンから誘導され、それらはまた、本発明の部分を形成する。
【００２７】
さらに本発明は、全ての立体化学的形態およびこれらの形態の任意の割合の混合物としての、式（IVＡ）に示される化合物：
【化１９】
0004801307.tif 000013
式（IVＢ）に示される化合物：
【化２０】
0004801307.tif 000014
および、式（IVＥ）に示される化合物：
【化２１】
0004801307.tif 000015
ならびにそれらの生理学的に許容され得る塩に関する。
【００２８】
以下、本発明を詳細に説明する。例えば少なくとも一つの実施態様を記載する。
本発明に関するプルラフラビンは、放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959、DSM 12931によって一つの実施態様によって製造される。放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959、DSM 12931は、ベージュ赤色の菌糸を有し、放線菌に典型的な分生子柄によって同定されることができる。
【００２９】
微生物放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959、DSM 12931の分類学的試験によって、次の菌株測定結果を得た。即ち、ガスクロマトグラフィーによる診断上重要な脂肪酸分析によって：
Anteiso 15：0 脂肪酸
Iso 16：0 脂肪酸（イソパルミチン酸）
Iso 17：0 脂肪酸（イソマルガリン酸）
Anteiso 17：0 脂肪酸（アンテイソマルガリン酸）および
cis［9］ 18：1 脂肪酸（オレイン酸）（低濃度の他の脂肪酸に加えて）
の高い割合を示した。
【００３０】
この脂肪酸組成プロフィールの結果、放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959（DSM 12931）は、分類学上Saccharothrix属に属しているものとされる。
1999年7月16日のブタペスト条約に基づく規則によって、Deutschen Sammlung von Mikroorganism und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D38124 Braunschweig, Germanyに、この微生物の単離株を下記の番号で寄託した：放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959、DSM 12931。
【００３１】
放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959、DSM 12931のこの菌株の代わりに、また本発明によってプルラフラビンの少なくとも一つの化合物を合成するそれの突然変異体および変異体も使用することができる。このような突然変異体は、物理的方法、例えば放射線照射（例：紫外線またはＸ線）、または化学的変異誘発物質、例えば、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（ＭＯＢ）またはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）を用いて、生産することができる。
【００３２】
本発明の製造方法は、実験室規模（ミリリットルからリットルの範囲）または工業的規模（立方メートル規模）の発酵に使用されることができる。他に指示されなければ、パーセンテージは全て重量に基づいている。液体の場合には、混合の割合は他に記載がなければ容量に基づくものとする。
【００３３】
一つの実施態様において、好気的発酵のための炭素原子の源は、同化可能な炭化水素および糖アルコール、例えばグルコース、ラクトース、スクロースまたはＤ−マンニトール、および炭化水素を含有する天然物、例えば麦芽エキスである。培養のための好適な窒素原子の源は、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質およびそれらの分解生成物、例えばペプトンまたはトリプトン、さらに肉エキス、酵母エキス、トウモロコシ、小麦、マメ、大豆または綿のような種子の粉末、アルコール生成物の蒸留残留物、ミートミールまたは酵母エキス、アンモニウム塩および硝酸塩である。栄養溶液に含まれる無機塩は、例えばアルカリ金属またはアルカリ土類金属、鉄、銅、コバルトおよびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩またはリン酸塩であることができる。
【００３４】
本発明のプルラフラビンの形成は、約０.１〜５％、例えば０.３〜２％のグルコース、および０.２〜５％、例えば０.５〜３％の大豆粉、および０.０５〜２％、例えば０.２〜１.０ｇ／Ｌのコーンスティープ、および０.０５〜１.０ｇ／Ｌ、例えば０.１〜０.５％の炭酸カルシウム、および０.０５〜１.０ｇ／Ｌ、例えば０.１〜１.０ｇ／Ｌの塩化ナトリウムからなる培地で進行する。パーセンテージは全ての培養培地の重量に基づいている。
【００３５】
培地において、放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959、DSM 12931は、プルラフラビンの混合物を生成する。培地の組成によって、本発明のプルラフラビンのうち少なくとも一つの割合を変えることもできる。さらに、培地の組成によって、一つまたはそれ以上のプルラフラビンは、微生物によって、または検出限界以下の量で、全く製造されないように、各プルラフラビンの合成を制御することができる。
【００３６】
一つの実施態様において、培養物は検出可能な一つのプルラフラビンを包含している。別の実施態様においては、プルラフラビンＡ、ＢまたはＥが形成される。
プルラフラビンＡ、ＢおよびＥ（それぞれ式（ＩＡ）、（ＩＢ）および（ＩＥ）に示される化合物）に加えて、それぞれにグリコシル化されているという点で、式（ＩＡ）、（ＩＢ）および（ＩＥ）に示される化合物とは異なる、他の類縁化合物もまた放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959、DSM 12931の培地中に形成される。このように、副生成物として分子量９７４Daである別のプルラフラビン（プルラフラビンＣ）および分子量６９２.７７、Ｃ37Ｈ44Ｎ2Ｏ11のプルラフラビンＡの分解生成物が検出された。後者の化合物において、酸性条件下においては、ヘキソースＩが欠けており、２,６−ジデオキシアルドヘキソースはプルラフラビンＡから加水分解して開裂し除去され得る。
【００３７】
微生物は好気的な培養、即ち、例えば振とうフラスコまたは培養タンク中で振とうまたは攪拌しながら深部培養され、適当な場合には、空気または酸素の導入によって好気的に培養される。約１８〜３５℃、例えば２７〜３０℃を含む、約２５〜３２℃の温度で実施される。ｐＨは一般的にｐＨ６〜８、例えば６.５〜７．５の範囲である。このような条件においては、微生物は一般的に２４〜３００時間にわたって、例えば３６〜１４０時間培養される。
【００３８】
培養は好都合にいくつかの段階、即ち、少なくとも一つの前培養が液体栄養培地で最初に製造され、次いで実際の生産培地である本培養に、例えば容量比１：１０で接種される。前培養は、例えば菌糸を栄養溶液に接種し、約３６〜１２０時間、例えば４８〜９６時間培養させることにより得られる。菌糸は、例えばその菌株を約３〜４０日間、例えば４〜１０日間、固体または液体の栄養培地、例えば麦芽−酵母寒天またはオートミール寒天中で培養することによって得ることができる。
【００３９】
発酵の進行は、培養物のｐＨまたは菌糸の容量によって、さらにまたクロマトグラフィーの方法、例えば薄層クロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーまたは生理活性を試験することによって、モニターすることができる。本発明のプルラフラビンは、菌糸中および培養濾液中の両方において見出され得る。下記の単離方法は、本発明のプルラフラビンの精製、例えばプルラフラビンＡ、ＢおよびＥの精製に一般的に役立つものである。
【００４０】
培養培地からの本発明のフルラフラビンの単離および／または精製は、天然生成物の化学的、物理学的および生物学的な特徴を考慮して、既知の方法によって実施される。薄層クロマトグラフィー、例えばクロロホルム／メタノール／氷酢酸／水の混合物（例えば８：１：１：０.２）を移動相として用いたシリカゲル上、またはＨＰＬＣを使用することができる。薄層クロマトグラフィー分離において、検出は、例えば染色剤（例えばα−ナフトール／硫酸）を用いて実施され、ここで形成される物質の量は、便宜上、検量溶液と比較される。
【００４１】
本発明によれば、プルラフラビンは、菌糸または培地から単離することができる。一般的に、最初に菌糸を慣用の方法によって培養培地から単離し、次いでプルラフラビンは、場合により水混和性有機溶媒を用いて細胞物質から抽出される。有機溶媒相は、本発明のプルラフラビンを含有し、適当な場合には、それらは減圧濃縮され、さらに下記のように精製される。
【００４２】
適当ならば、培養濾液は、菌糸抽出物の濃縮液と合一し、好適な水不混和性有機溶媒（例えばｎ−ブタノール）で抽出される。次に、有機相が分離されて、適当な場合には、減圧濃縮される。価値ある生成物を脱脂するために、濃縮物は、本発明のプルラフラビンが難溶性である非極性溶媒（例えばヘキサン、石油エーテル、ジエチルエーテル）によって希釈され得る。これによってプルラフラビンが沈殿し、親油性の不純物は溶解したままであり、慣用の固相−液相分離によって除去される。沈殿物は、単離されるべき全てのプルラフラビンを含有し、水／メタノールの最初の容量の１／３０に溶解する。沈殿物を完全に溶解し凍結乾燥する。凍結乾燥物は、以下、粗製物と称呼されるが、０.５〜５０％のプルラフラビンからなり、さらに単離のために使用される。
【００４３】
本発明の一つまたはそれ以上のプルラフラビンのさらなる精製は、適当な物質上、例えば分子篩上、例えばシリカゲル、アルミナのような順相担体、イオン交換体上または吸着樹脂上、および／または逆相媒質（ＲＰ）上のクロマトグラフィーによって実施される。このクロマトグラフィーによって、プルラフラビンが分離される。プルラフラビンのクロマトグラフィーは水性緩衝液または水性溶媒および有機溶媒の混合物を使用して実施される。
【００４４】
水性溶媒または有機溶媒の混合物とは、溶媒の１０〜８０％、例えば４０〜６０％溶媒の範囲の濃度で、全ての水−混和性有機溶媒（例えば、メタノール、プロパノールおよびアセトニトリル）、または有機溶媒と混和可能な他の全ての水性緩衝液を意味するものと理解される。使用される緩衝液は、上記のものと同じであってよい。
【００４５】
異なる極性に基づいたプルラフラビンの分離は、逆相クロマトグラフィー、例えばMCI(R)（Mitsubishi,Japanの吸着樹脂）またはAmberlite XAD(R)（TOSOHAAS）、さらに疎水性物質、例えば、RP-8相またはRP-18相によって実施され得る。さらに、分離は、順相クロマトグラフィー、例えばシリカゲル、アルミナおよびそれの同等物によって実施され得る。
【００４６】
プルラフラビンのクロマトグラフィーは、緩衝溶液または酸性水性溶液またはアルコールまたは他の水−混和性有機溶媒と水性溶液との混合物を用いて実施される。使用される有機溶媒は、プロパノールおよびアセトニトリルであることができる。
【００４７】
緩衝溶液または酸性水性溶液は、例えば、水、リン酸緩衝液、酢酸アンモニウム、１mM〜０.５Ｍ濃度のクエン酸緩衝液、およびギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸または、例えば、０.０１〜３％、例えば０.１％の範囲の濃度の当業者に知られた市販の全ての酸を意味するものと理解される。
【００４８】
クロマトグラフィーは、１００％水性緩衝液で開始し、１００％溶媒で終了する勾配を用いて実施されることができる；例えば、２−プロパノールまたはアセトニトリルを使用する１０〜５０％の範囲の直線勾配で実施され得る。
また、ゲルクロマトグラフィーまたは疎水相上クロマトグラフィーを実施することもできる。
ゲルクロマトグラフィーは、ポリアクリルアミドまたは混合ポリマーゲル、例えば、Biogel-P2(R)（Biorad）、Fractgel TSK HW 40(R)（Merck, Germany or Toso Haas, USA）またはSephadex(R)（Pharmacia, Uppsala, Sweden）上で実施される。
上記のクロマトグラフィーの順は、逆にすることができる。
【００４９】
さらに、プルラフラビンの非常に有効な精製工程は、結晶化である。プルラフラビンは、有機溶媒中の溶液から、有機溶媒と水との混合物から結晶化する。結晶化はそれ自体知られた方法で、例えば飽和プルラフラビン溶液の濃縮または冷却によって実施されることができる。
本発明のプルラフラビンは固相で、またｐＨ３〜８、例えばｐＨ４〜６を有する溶液中で安定であり、それ故に慣用の医薬製剤に組み込まれることができる。
【００５０】
式（Ｉ）に示されるプルラフラビンおよびそこから得られる化学的誘導体は、当業者に知られた方法によって、対応する生理学的に許容され得る塩に変換されることができる。
式（Ｉ）に示される化合物の生理学的に許容され得る塩は、例えばRemington's Pharmaceutical Science（第17版、第1418頁（1985））に記載されるように、それらの有機塩および無機塩の両方の意味として理解されることができる。物理的および化学的な安定性および溶解度に基づき、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩およびアンモニウム塩は、特に、酸性群の可能な実施態様である；塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩またはカルボン酸塩またはスルホン酸塩、例えば、酢酸、クエン酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸およびｐ−トルエンスルホン酸は、特に、塩基性群の可能な実施態様である。
【００５１】
さらに本発明は、式（Ｉ）に示される化合物の明白な化学的同等物（ここではまた「誘導体」とも称される）を包含し、これは、僅かに化学的に異なるか、即ち、同じ活性を有するか、または穏やかな条件で本発明の化合物に変換されることができるものである。言及される同等物には、例えば、本発明化合物のエステルおよびエーテル、複合体および還元生成物もまた含まれる。
【００５２】
エステルおよびエーテル誘導体および還元生成物は、文献、例えば、“Advanced Organic Synthesis” 4th edition, J. March, John Wiley & Sons, 1992に記載されている方法によって製造され得る。式（Ｉ）に示される化合物のカルボキシル基（式ＩＥ、式IVＥ）および水酸基は、例えばエステル基またはエーテル基に変換される。このようなエステルは、例えば（C1〜C4）アルキルエステルが含まれる。このようなエーテルには、例えば水酸基のアセタールまたはケタールが含まれる。
【００５３】
式（Ｉ）に示される化合物の安定な錯体は、生理学的に許容され得る無機陽イオン、例えばカルシウムまたはマグネシウム陽イオンで形成され得る。
本発明は、式（Ｉ）に示される化合物の立体化学的な形態の全てを包含する。式（ＩＡ）、（ＩＢ）および（ＩＥ）に示される化合物の不斉中心は、各々の場合、互いに独立して、Ｓ配置またはＲ配置をとることができる。エポキシド含有基のオキシランは、いずれの位置もとることができる；例えば、炭素原子２′および３′を組み込むオキシランである。本発明には、可能な全てのエナンチオマーおよびジアステレオマー、および少なくとも二つの立体異性体の混合物、例えばエナンチオマーおよび／またはジアステレオマーの混合物を、任意の比率で含む。このように、本発明は左旋性および右旋性の鏡像異性体の両方としてのＲおよびＳ配置、ラセミ体の形態、および二つのエナンチオマーを任意の比率で混合する混合物の形態で、エナンチオマー的に純粋な形態のエナンチオマーを提供する。シス／トランス異性体の場合には、本発明はシス型およびトランス型およびそれらの形態を任意の比率で混合した混合物を提供する。
【００５４】
それらの有用な薬理学的性質のために、本発明の化合物は、ヒト用医薬および／または動物用医薬としての使用に適当である。それらは抗菌活性、さらに抗真菌作用、即ち抗かび性（植物病原菌を含む）、抗原虫性および抗寄生虫性の特性を有する。
【００５５】
本発明の化合物は、癌性疾患に、例えば化学療法剤として使用され得る。それらの細胞増殖抑制の特性、例えばその強力な抗腫瘍活性、および抗菌作用のために、それらは例えば、動物およびヒトの悪性変性のための細胞増殖抑制剤として使用されることができる。
【００５６】
慣用の薬剤に耐性を発現した腫瘍細胞の場合には、新規な薬剤のみが治療上適切な効果を有する。このように、本発明の式（Ｉ）に示されるプルラフラビンおよびそれの誘導体は、これらの問題となる細胞型に対して強力な優れた活性を有する。
【００５７】
また、本発明は、本発明のプルラフラビンおよび／またはそれらの誘導体の少なくとも一つを含む製剤に関する。プルラフラビンは、少なくとも一つの適当な助剤または賦形剤との混合物として使用され得る。ヒトに使用される賦形剤は、全ての製薬上許容され得る賦形剤および／または助剤であることができる。
また、本発明は、製薬上適当で生理学的に許容され得る賦形剤および、適切な場合には、さらにその他の適当な活性化合物、添加剤または助剤を用いて、少なくとも一つの本発明の化合物を適当な投与形態にすることからなる、本発明の製剤の製造方法に関する。
【００５８】
本発明の製剤は一般には、経口、局所または非経口で投与されるが、直腸投与もまた可能である。適当な固形または液状製剤形態は、例えば顆粒剤、粉剤、錠剤、被覆錠剤、（マイクロ）カプセル剤、坐剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、エアゾル剤、適剤またはアンプル形態の注射剤、および活性化合物の徐放性製剤であり、それらの製剤の賦形剤および添加物および／または助剤中に、例えば崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤（swelling agent）、滑剤（gliant）、滑沢剤、着香剤、甘味料または溶解補助剤が通常使用される。列挙され得る繁用される賦形剤または助剤は、例えば、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、乳糖、マンニトールおよび他の糖、タルク、乳汁タンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロースおよびそれの誘導体、動物性油または植物性油、ポリエチレングリコールおよび溶媒、例えば、滅菌水、アルコール、グリセロールおよび多価アルコールである。
【００５９】
適当な場合には、放出を遅延させるため、または比較的長時間にわたって放出を延ばすために、例えば粒子状の活性化合物を、適当なポリマー、ワックスまたはその同等物に被覆または埋め込むことによって、用量単位は経口投与用にマイクロカプセル化されることができる。
【００６０】
本製剤は、用量単位で製造および投与されることができ、各単位は活性成分として、本発明のプルラフラビンのうち少なくとも一つの化合物および／またはそれの化学的誘導体の特定の用量を含む。錠剤、カプセル剤および坐剤のような固体用量単位の場合には、この用量は約２００mg／日までであることができるが、約０.１〜１００mg／日であってよく、アンプル形態の注射剤の場合には、約２００mg／日までであることができるが、約０.１〜１００mg／日であってよい。
【００６１】
投与される１日量は、哺乳類の患者の体重、年齢、性別および状態に依存する。しかし、より多い１日量、またはより少ない１日量が指示されてもよい。１日量は単一用量単位の形態で、または幾つかのより小さな用量単位の形態で一回で投与されるか、または予定の間隔で分割された用量の形態で数回で投与されるかのいずれかである。
【００６２】
さらに、本発明は、次の実施例に説明されるものである。パーセンテージは体重に基づくものである。液体の場合には、混合比率は他に記載がなければ、容量に基づくものである。
次の実施例は本発明を説明するものであり、本発明の特許請求の範囲を制限するものではない。
【００６３】
【実施例】
実施例１
放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959、DSM 12931のグリセロール培養物の調製
滅菌済３００ml三角フラスコ中１００mlの栄養溶液（麦芽エキス２.０％、酵母エキス０.２％、グルコース１.０％、（ＮＨ4)2ＨＰＯ4 ０.０５％、ｐＨ６.０）に、菌株放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959、DSM 12931を接種し、回転式シェーカーで２８℃、１８０rpmで７日間インキュベートした。次に、１.５mlのこの培養物を１.５mlの９９％グリセロールで希釈し、−２０℃で保存した。
【００６４】
実施例２
三角フラスコでの放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959、DSM 12931の培養物または前培養物の調製
１００mlの下記の栄養溶液［１５ｇのグルコース／Ｌ、１５ｇの大豆粉（soya meal）／Ｌ、５ｇのコーンスティープ／Ｌ、２ｇのＣａＣＯ3／Ｌおよび５ｇのＮａＣｌ／Ｌ]を含む滅菌済３００ml三角フラスコに、斜面培養用チューブ（同じ栄養溶液、但し２％寒天添加）で培養した培養物または１mlのグリセロール培養物（実施例１参照）を接種し、シェーカーで１８０rpmおよび３０℃でインキュベートした。本発明のプルラフラビンのうち少なくとも一つの最大生成量は、約１２０時間後に達した。１０Ｌおよび２００Ｌの培養タンクの接種用には、同じ栄養溶液からの４８〜９８時間後の深部培養物（接種の量は約１０％）で十分である。
【００６５】
実施例３
プルラフラビンの製造
９Ｌの培養タンクを次の条件で操作した：
栄養培地：１５ｇのグルコース／Ｌ；
１５ｇの大豆粉／Ｌ；
５ｇのコーンスティープ、液体／Ｌ；
２ｇのＣａＣＯ3／Ｌ；
５ｇのＮａＣｌ／Ｌ；
ｐＨ７.０（滅菌前）
工程に要する時間：９２時間
インキュベーション温度：２８℃
攪拌速度：３００rpm
通気速度：５Ｌ／分
場合により、エタノール性ポリオール溶液を繰り返し添加することによって、泡の形成を抑制できた。約７０〜９６時間後に生産量が最大に達した。
【００６６】
実施例４
放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959、DSM 12931の培養液からのプルフラビン混合物の単離
放線菌目（Actinomycetales）種HAG 003959、DSM 12931の発酵の後、実施例３（９０リットル）から得られた、培養タンクの培養液を、約２％の濾過助剤（例えば、Celite(R)）の添加で濾過し、次いで原料となる細胞（０.６リットル）を、３リットルのメタノールで抽出した。活性化合物を含むメタノール性溶液を、濾過することにより菌糸体と分離し減圧濃縮した。濃縮物を培養濾液（７リットル）と共に、調製済の０.４リットルの(R)MCl GEL、CHP20Pカラムに適用した。溶出は、０.１％酢酸水溶液−０.１％酢酸−２−プロパノール溶液の勾配を用いて実施した。カラム流出物（column flow-through）(１.２リットル／時間)は、フラクション（各０.２５リットル）に分けて集められ、プルフラビン含有フラクション（２０〜２３）をプールした。減圧濃縮および凍結乾燥によって１.４ｇの茶色粉末を得た。
【００６７】
実施例５
ゲルクロマトグラフィーによるプルラフラビン成分の濃厚化
実施例４から得られた１.４ｇの生成物を、Fractogel(R)TSK HW-40sで充填した捕集容量３.９リットル（幅×高さ＝１０cm×５０cm）のカラムに適用した。移動相である水／アセトニトリル（１：１）を流速５０ml／分でカラムに流入させ、カラム流出液をフラクション（６５ml）ごとに集めた。プルラフラビンは、主にフラクション１３〜１６に存在した。それらをプールし減圧で溶媒を除去した。１３０mgのプルラフラビン混合物を得た。
【００６８】
実施例６
逆相RP-18によるプルラフラビン成分の分離
１２２ml（１.２５cm(ID) ×２５cm H）の捕集容量を有する分取ＨＰＬＣカラムを、(R)Nucleosil 100-7 C18 HDで充填し、実施例５から得られた１３０mgのプルラフラビン混合物を適用した。溶出は１０％アセトニトリルおよび０.１Ｍ酢酸アンモニウム水溶液を用いて実施した。カラム流出液は５０ml／分であり、各５０ml容量のフラクションに分けて採集された。フラクション６はプルラフラビンＥからなり、プルラフラビンＣはフラクション１２〜１７に存在し、プルラフラビンＢはフラクション２５〜２７に存在し、プルラフラビンＡはフラクション３５〜３７に存在した。減圧濃縮および凍結乾燥後、下記の量が得られた：
プルラフラビンＡ：22mg、ESI+MS：823Da（M+H）+、
プルラフラビンＢ：18mg、ESI+MS：841Da（M+H）+、
プルラフラビンＣ：11mg、ESI+MS：974Da（M+H）+、
プルラフラビンＤ：5mg、ESI+MS：712Da（M+H）+。
【００６９】
実施例７
プルラフラビンＡの最終精製およびトリフルオロ酢酸塩形態への変換
実施例６から得られたフラクション３５〜３７を、凍結乾燥後（２２mg）、１０％アセトニトリル水溶液に溶解し、トリフルオロ酢酸でｐＨ２.８に調節し、250／10 LiChrospher RP-18e（５μm）(R)カラムに適用した。溶出は１１〜２２％のアセトニトリル中の０.０５％水性トリフルオロ酢酸を用いて実施した。減圧濃縮および凍結乾燥した後、１８mgのプルラフラビンＡ−トリフルオロ酢酸塩を得た。
【００７０】
実施例８
プルラフラビンＡの同定
性状：極性有機溶媒に可溶であるが、水には難溶である深黄色物質。その酸付加塩は水溶性である。化合物は中性および弱酸性媒質で安定であるが、アルカリ性および強酸性領域においては不安定である。
最大ＵＶ：水／アセトニトリル（８：２）、ｐＨ２中で214、243、270（Sh）、290（Sh）、426nmであり、水／アセトニトリル（６：４）、ｐＨ７中で214、243、270（Sh）、290（Sh）および426nm
IRバンド：3424、1680、1600、1464、1427、1300、1203、1131、1066、1009、801、721cm-1
高分解能マススペクトメトリーによって下記の分子量が（M+H)+ に対して得られた：823.370631 Da、プルラフラビンＡの実験式Ｃ43Ｈ54Ｎ2Ｏ14に対応した。エレクトロスプレーイオン化（ESI、＋）により、MS／MSフラグメンテーションによって、下記のイオンが得られる：823、693、680、550、480、390、320、144および131Da。
NMRシグナル：表１参照。
【００７１】
【表１】
0004801307.tif 000016
【００７２】
【表２】
0004801307.tif 000017
【００７３】
アルドヘキソースIIIについては、観察されたＮＯＥはキラル中心である１’、３’、４’、５’において相対立体化学ＳＲＳＳまたはＲＳＲＲと一致した（Ｈ−III参照）。これはバンコサミンのＣ−３エピマーに相当する。
Ｈ−III．ヘキソースIIIの相対立体化学
【化２２】
0004801307.tif 000018
【００７４】
ヘキソースIIで観察されたＮＯＥの効果は、キラル中心である１''、３''、４''、５'’に関する相対立体化学ＲＳＳＲまたはＳＲＲＲを支持するものである（Ｈ−II参照）。
Ｈ−II．ヘキソースIIの相対立体化学
【化２３】
0004801307.tif 000019
【００７５】
不斉炭素原子である１'''、３'''、４'''、５'''に対する同一の相対立体化学（ＲＳＳＳ、ＳＲＲＲ）は、ヘキソースＩで検出されたＮＯＥに一致した（Ｈ−Ｉ参照）。
Ｈ−Ｉ．ヘキソースＩの相対立体化学
【化２４】
0004801307.tif 000020
【００７６】
実施例９
プルラフラビンＢの同定
性状：極性有機溶媒に可溶であるが、水には難溶である深黄色の物質。その酸付加塩は水溶性である。化合物は中性および弱酸性媒質で安定であるが、アルカリ性においては不安定である。
最大ＵＶ：水／アセトニトリル（８：２）、ｐＨ２中で214、243、270（Sh）、290（Sh）、426nm、水／アセトニトリル（６：４）、ｐＨ７中で214、243、270（Sh）、290（Sh）および426nm。
プルラフラビンＢは実験式Ｃ43Ｈ56Ｎ2Ｏ15を有し、分子量は840.9Daであった。
NMRシグナル：表２参照
【００７７】
【表３】
0004801307.tif 000021
【００７８】
【表４】
0004801307.tif 000022
【００７９】
実施例１０
プルラフラビンＥの最終精製
実施例６から得られたフラクション６は凍結乾燥後（５mg）、１０％アセトニトリル水溶液に溶解し、トリフルオロ酢酸でｐＨ２.８に調節し、250／10 LiChrospher RP-18e (R)（５μm）カラムに適用した。溶出は０.０５％の水性トリフルオロ酢酸を用いた１１〜２２％のアセトニトリルの勾配で実施された。減圧濃縮および凍結乾燥後、２.７mgのプルラフラビンＥ−トリフルオロ酢酸塩を得た。
【００８０】
実施例１１
プルラフラビンＥの同定
性状：  極性溶媒に可溶であるが、水に難溶である深黄色物質。その酸付加塩は水溶性である。本化合物は、中性および弱酸性媒質において安定であるが、アルカリ性および強酸性領域においては不安定である。
最大ＵＶ：水／アセトニトリル（８：２）、ｐＨ２中で213、244、270（Sh）、290（Sh）、426nm、水／アセトニトリル（６：４）、ｐＨ７中で213、244、270（Sh）、290（Sh）および426nm。
次の分子量はマススペクトロメトリーによって（Ｍ+Ｈ)＋に対して得られた。即ち、プルラフラビンＥに対する実験式Ｃ36Ｈ41ＮＯ14に対応する712Daである。
ＮＭＲシグナル：表３参照
【００８１】
【表５】
0004801307.tif 000023
【００８２】
【表６】
0004801307.tif 000024
【００８３】
実施例１２
（ａ）細胞増殖抑制作用試験
細胞増殖抑制作用を測定するために、微生物寄託機関 American Type Culture Collectionから得られたＡＴＣＣ ＣＲＬ-1548, Jo No.223および228 ラット肝臓癌細胞が用いられた。この菌株は、“MEM (EAGLE) with Glutamax”培地［GIBCO BRL No.4109-028］と１０％ウシ胎児血清［ＧＩＢＣＯ BRL No.10270-106］および１０μlのペニシリン−ストレプトマイシン［ＧＩＢＣＯ BRL No.15140-114］／mlで維持された。９６−ウェルマイクロタイタープレート［Greiner, No.15140-114］が使用された。各ウェルを最初に１４０μlの培養用栄養溶液で満たし、各々に215,000細胞を接種した。次にプレートを３７℃、５％ＣＯ2で２０〜２４時間インキュベートした。プルラフラビンを100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.7813、0.3906、0.195、0.094、0.047および0μMの濃度で一連の希釈物を予め調製し、次いで対応する順番にピペットで加えた。さらに５％ＣＯ2雰囲気下３７℃で２２時間インキュベーションした後に、次いで液体培地を吸引した。残存する細胞を１００μlのRPMI 1640［GIBCO BRL No.32404-014］／ウェルおよび２０μlのCell Titer 96 Aqueous［PROMEGA No.G5430］／ウェルで染色した。５９０nmにおける光吸収は、上記のように、添加直後および２時間のインキュベーションの後に測定された。細胞増殖抑制作用は光吸収における変化から計算された。
プルラフラビンＡに対するIC50＝＜５０nM；
プルラフラビンＢに対するIC50＝＜５０nM。
【００８４】
（ｂ）腫瘍細胞系から選ばれたプルラフラビンおよびフラボピリドールの抗増殖作用
水溶性であるテトラゾリウム塩であるＭＴＴは、活性ミトコンドリアに存在する脱水素酵素によってテトラゾリウム環が開裂して分解すると、不溶性の紫色のホルマザンに変換される。死滅細胞はこの変化を起こさない。この方法は、強力な化学療法の化合物の活性を測定する目的で増殖を定量するのに使用した。
全ての細胞は、１０％の熱で不活化されたウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum）、ペニシリン／ストレプトマイシンを含み、さらにＬ−グルタミンを補填された、RPMI 1640（Life Technologies, Gaitherburg, MD）で保存された。細胞は96−ウェル組織培養プレートに次の密度で平板培養された：
胸        2500細胞／ウェル
前立腺    2500細胞／ウェル
結腸      1000細胞／ウェル
肺        1000細胞／ウェル
細胞を３７℃、５％ＣＯ2で一晩接着させた。プルラフラビンＡは、本化合物を以下のような終濃度で培養培地に希釈した：50.0、16.67、5.56、1.85、0.617、0.206、0.069、0.023μM。
フラボピリドールを、2.0、0.667、0.222、0.074、0.025、0.008、0.003、0.001μMに希釈した。
両方の化合物について全ての濃度で３回試験した。細胞は新しい培地で洗浄し、化合物を細胞に最終容量１００μlで添加した。
細胞プラス化合物を、約７２時間、５％ＣＯ2、３７℃でインキュベートした。所望される時点で、２５μlのＭＴＴ（ＨＢＳＳ中１０mg／ml）を各ウェルに添加した。プレートを２〜４時間３７℃でインキュベートした。ＭＴＴおよび培地を除去し、２００μlのＤＭＳＯを各ウェルに添加した。読取は５７０nmで実施した。その結果は以下のとおりである：
【００８５】
細  胞 プルラフラビンＡ IC50 フラボピリドール IC50
胸                ＜２３ｎＭ                  ９０ｎＭ
前立腺              １０ｎＭ                  ８０ｎＭ
結腸                ０.３５ｎＭ               ３０ｎＭ
肺                  ３.０ｎＭ                 ９０ｎＭ
【００８６】
軟寒天アッセイで、プルラフラビンＡおよびフラボピリドールを、白血病細胞に対して試験した。IC50の結果は６０nM（プルフラビンＡ）および０.５、０.６μＭ（フラボピリドール）であった。
【００８７】
0004801307.tif 000025
【００８８】
0004801307.tif 000026