(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ポリペプチド生成の助けとなる培地中でバチルス細胞であって、（ｉ）前記ポリペプチドをコードする核酸配列の単一コピーに操作可能に連結した、「‐３５」領域について配列ＴＴＧＡＣＡを、そして「‐１０」領域について配列ＴＡＴＡＡＴを有する「コンセンサス」プロモーターと、（ｉｉ）上記コンセンサス・プロモーターの下流に、かつ、上記ポリペプチドをコードする核酸配列の上流に位置するｃｒｙＩＩＩＡ  ｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列とを含む核酸構築物を含む前記バチルス細胞を、培養し；そして（ｂ）上記培養培地から上記ポリペプチドを単離する、
を含む、ポリペプチドの製法。
【請求項２】
前記コンセンサス・プロモーターを任意のバクテリア・プロモーターから得る、請求項１に記載の製法。
【請求項３】
前記「コンセンサス」プロモーターをバチルス・プロモーターから得る、請求項２に記載の製法。
【請求項４】
前記コンセンサス・プロモーターを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃオペロン、ストレプトミセス・コエリコラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）アガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子（ａｐｒＨ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のアルカリ性プロテアーゼ遺伝子（サブチリシン  Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ遺伝子）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＥ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の麦芽生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルス・アミロリックエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の亜種のテネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）ＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子（ｃｒｙＩＩＩＡ、配列番号１）またはそれらの部分、あるいは原核βラクタマーゼ遺伝子のｓｐｏ１細菌ファージプロモーターから得られたプロモーターから得る、請求項２に記載の製法。
【請求項５】
前記「コンセンサス」プロモーターをバチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）から得る、請求項２に記載の製法。
【請求項６】
前記「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターが配列番号３または配列番号４の核酸配列からなる、請求項５に記載の製法。
【請求項７】
前記バチルス細胞が前記核酸構築物の１以上のコピーを含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製法。
【請求項８】
前記バチルス細胞が前記核酸構築物の単一のコピーを含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製法。
【請求項９】
前記核酸構築物が選択マーカー遺伝子をさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１０】
前記バチルス細胞が選択マーカー遺伝子を含有しない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１１】
前記核酸配列が前記バチルス細胞にとって異種のポリペプチドをコードする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、ホルモンまたはその変異体、酵素、受容体またはその部分、抗体またはその部分、あるいはリポーターである、請求項１〜１１のいずれかに記載の製法。
【請求項１３】
前記酵素が、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素、あるいは合成酵素である、請求項１２に記載の製法。
【請求項１４】
前記酵素が、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、炭水化物分解酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン・グリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、αガラクトシダーゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、αグルコシダーゼ、βグルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、酸化酵素、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、ＲＮＡ分解酵素、トランスグルタミナーゼ、あるいはキシラナーゼである、請求項１２に記載の製法。
【請求項１５】
前記核酸配列がバチルス細胞の染色体内に包含される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１６】
前記核酸配列が染色体外要素上に包含される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１７】
前記バチルス宿主細胞が、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｉｕｍ）、バチルス・プミラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、あるいはバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の細胞である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の製法。
【請求項１８】
前記バチルス細胞がバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞である、請求項１７に記載の製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
発明の分野：
本発明は、桿菌細胞中でポリペプチドを産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術の説明：バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ；桿菌）は、天然および組換えタンパク質を産生するための宿主細胞体系として十分に確立されている。しかしながら、タンパク質の発現を増加させる望ましい形質を備えた桿菌宿主細胞は、業務用には必ずしも最も望ましい特性を有していない可能性がある。
通常、桿菌細胞に含有される遺伝子の最高の発現は、今問題にしている遺伝子と、増幅可能で選択可能の標識遺伝子、例えば抗生物質耐性標識とを操作可能に連結した単一型プロモーターを含有する発現カセットを、染色体中で増幅することにより達成される。増幅は、染色体中で発現カセットおよび選択可能な標識の多重コピーを産生させることになる。
【０００３】
しかしながら、この方法には付随する不利点がある。例えば単一型プロモーターにより推進された遺伝子を増幅することによりｍＲＮＡの飽和レベルが達成できない可能性がある。また、細胞の染色体中における発現カセットおよび選択可能の標識遺伝子の多重コピーの生成が不安定である可能性がある。さらに、その上発現カセットを喪失することなしには選択可能の標識遺伝子の除去が技術的に実現できない可能性がある。
【０００４】
Ｉｃｈｉｋａｗａ等（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，１１１：２１９〜２２４，１９９３）は、成熟したコレラ毒素Ｂを符号化する遺伝子の発現を仲介する多重型プロモーターを備えた発現／分泌ベクターを含有するＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ中におけるコレラ毒素Ｂの細胞外産生について記述している。
【０００５】
ＡｇａｉｓｓｅおよびＬｅｒｅｃｌｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１３：９７〜１０７，１９９４）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓのｃｒｙＩＩＩＡ毒素遺伝子の完全な発現に携わったプロモーター領域の構造および機能の分析について記述している。国際特許公開第９４／２５６１２号は、プロモーターの下流、かつ遺伝子の発現を増加させるｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子の解読配列の上流のｍＲＮＡスタビライザー領域について開示している。
【０００６】
Ｈｕｅ等（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７：３４６５〜３４７１，１９９５）は、５′末端に存在した場合に幾つかの非相同ＲＮＡ配列を安定化させ、またＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中において下流の解読配列の発現を数倍に増加させる５′ｍＲＮＡスタビライザー配列について記述している。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の目的は、桿菌株中でポリペプチドを産生するための改良された方法を提供することである。
（発明の概要）
本発明は、（ａ）ポリペプチド生成の助けとなる培地中で桿菌宿主細胞を培養することであって、その桿菌細胞が、（ｉ）タンデム（縦列）プロモーターの各プロモーター配列がポリペプチドを符号化する核酸配列と操作可能に連結している縦列プロモーター、また別法として（ｉｉ）縦列プロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上流に位置したｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を備える核酸構築物を含む、培養することと、（ｂ）培養培地からポリペプチドを単離することを含む、ポリペプチドの生成方法に関する。
【０００８】
また本発明は、（ｉ）縦列プロモーターの各プロモーター配列がポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結している縦列プロモーター、また別法として（ｉｉ）縦列プロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上流に位置したｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を備える核酸構築物を含む桿菌細胞に関する。
【０００９】
また本発明は、（ａ）ポリペプチド生成の助けとなる培地中で桿菌宿主細胞を培養することであって、その桿菌細胞が、（ｉ）ポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結している「‐３５」領域に対してＴＴＧＡＣＡ、「‐１０」領域に対してＴＡＴＡＡＴを有する「コンセンサス」プロモーター、および（ｉｉ）「コンセンサス」プロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上流に位置したｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を備える核酸構築物を含む、培養することと、（ｂ）培養培地からポリペプチドを単離することを含む、ポリペプチドの生成方法に関する。
【００１０】
また本発明は、（ｉ）ポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結している「‐３５」領域に対してＴＴＧＡＣＡ、「‐１０」領域に対してＴＡＴＡＡＴを有する「コンセンサス」プロモーター、および（ｉｉ）「コンセンサス」プロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上流に位置したｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を備える核酸構築物を含む桿菌細胞に関する。
【００１１】
また本発明は、（ａ）ポリペプチドの生成の助けとなる培地中で桿菌宿主細胞を培養することであって、その桿菌細胞が、「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターと操作可能に連結しているポリペプチドを符号化する核酸配列を含む、培養することと、（ｂ）培養培地からポリペプチドを単離することを含む、ポリペプチドの生成方法に関する。
【００１２】
また本発明は、（ｉ）縦列プロモーターの各プロモーター配列がポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結している「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーター、および（ｉｉ）「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上流に位置したｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を備える核酸構築物を含む桿菌細胞に関する。
【００１３】
また本発明は、桿菌細胞の選択可能な標識のない変異体の生成方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ｃｒｙＩＩＩＡプロモーターおよびｃｒｙＩＩＩＡプロセシング／安定化配列の地図を示す図である。
【図２】縦列プロモーターおよびｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を含有する様々な構築物を図式的に示す図である。
【図３】ｐＤＧ２６８ＭＣＳの制限酵素地図を示す図である。
【図４】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図５】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図６】ｐＨＰ１３ａｍｐ−ＭＣＳの制限酵素地図を示す図である。
【図７】ｐＳＸ２２２の制限酵素地図を示す図である。
【図８】ｐＨＰ１３ａｍｐ−ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図９】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒamyL／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図１０】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒamyQ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図１１】ｐＵＣ１８−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ｃｒｙＩＩＩＡの制限酵素地図を示す図である。
【図１２】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図１３】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図１４】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒamyL／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図１５】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−ＰｒamyL／ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図１６】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−ＰｒamyL／ＰｒcryIIIA／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図１７】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−ＰｒamyQ／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図１８】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒamyQ／ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図１９】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−ＰｒamyQ／ＰｒcryIIIA／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図２０】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−ｌｏｎｇ  ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図２１】「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターを含有する核酸配列を示す図である。
【図２２】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒshort¨consensus¨amyQ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図２３】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒshort¨consensus¨amyQdimer／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図２４】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔ−Ｐｒshort¨consensus¨amyQ／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図２５】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−Ｐｒshort¨consensus¨amyQ／ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図２６】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−Ｐｒshort¨consensus¨amyQ／ｌｏｎｇ  ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図２７】ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ¨short¨amyQ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図２８】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−Ｐｒ¨short¨amyQ dimer／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【図２９】ｐＤＧ２６８ＭＣＳΔｎｅｏ−Ｐｒ¨short¨amyQ dimer／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの制限酵素地図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
最初の実施形態において本発明は、（ａ）ポリペプチド生成の助けとなる培地中で桿菌宿主細胞を培養することであって、その桿菌細胞が、（ｉ）縦列プロモーターの各プロモーター配列がポリペプチドを符号化する核酸配列と操作可能に連結している縦列プロモーター、また別法として（ｉｉ）縦列プロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上流に位置したｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を備える核酸構築物を含む、培養することと、（ｂ）培養培地からポリペプチドを単離することを含む、ポリペプチドの生成方法に関する。
【００１６】
二番目の実施形態において本発明は、（ａ）ポリペプチド生成の助けとなる培地中で桿菌宿主細胞を培養することであって、その桿菌細胞が、（ｉ）ポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結している「コンセンサス」プロモーター、および（ｉｉ）「コンセンサス」プロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上流に位置したｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を備える核酸構築物を含む、培養することと、（ｂ）培養培地からポリペプチドを単離することを含む、ポリペプチドの生成方法に関する。
【００１７】
三番目の実施形態において本発明は、（ａ）ポリペプチドの生成の助けとなる培地中で桿菌細胞を培養することであって、その桿菌細胞が「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターと操作可能に連結しているポリペプチドを符号化する核酸配列を含む、培養することと、（ｂ）培養培地からポリペプチドを単離することを含む、ポリペプチドの生成方法に関する。
【００１８】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡ重合酵素の結合に携わった核酸配列として定義される。本明細書において「縦列プロモーター」とは、その各々が解読配列と操作可能に連結し、ｍＲＮＡ中への解読配列の転写を仲介する２つ以上のプロモーター配列として定義される。本明細書において「操作可能に連結した」とは、制御配列、例えばプロモーター配列が、制御配列が解読配列により符号化されたポリペプチドの生成を方向づけるように、解読配列に対する位置に適正に配置されている構成として定義される。本明細書において「解読配列」とは、適正な制御配列の制御の下に置かれたとき、ｍＲＮＡ中に転写され、ポリペプチドに翻訳される核酸配列として定義される。解読配列の境界は、通常ｍＲＮＡの５′末端にある読み取り枠のちょうど上流に位置したリポソーム結合部位、およびｍＲＮＡの３′末端にある読み取り枠のちょうど下流に位置した転写ターミネーター配列により決定される。解読配列には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成、合成、および組換えの核酸配列を含めることができるがこれには限定されない。本明細書において「核酸構築物」とは、天然起源の遺伝子から単離するか、さもなければ天然には存在しない形に組み合わせられ、並べられた核酸のセグメントを含有するように修飾された一本鎖または二本鎖いずれかの核酸分子として定義される。核酸構築物という用語は、核酸構築物が解読配列の発現にとって必要な全ての制御配列を含有するとき、発現カセットという用語と同意語である。
【００１９】
縦列プロモーターの各プロモーター配列は、変異、切端、および雑種プロモーターを含む選抜された桿菌細胞中で転写活性を示す任意の核酸配列であってもよく、また桿菌細胞にとって相同または非相同いずれかの遺伝子を符号化する細胞外または細胞内ポリペプチドから得ることもできる。各プロモーター配列は、ポリペプチドを符号化する核酸配列にとって固有のものでも異質のものでもよく、また桿菌細胞にとって固有のものでも異質のものでもよい。これらのプロモーター配列は、同一のプロモーター配列でも、または異なるプロモーター配列でもよい。
【００２０】
好ましい実施形態において、プロモーター配列は細菌の供給源から得ることができる。より好ましい実施形態において、プロモーター配列は、桿菌株、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、またはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、あるいはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ株、例えばＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｕｒｉｎｕｓなどのグラム陽性細菌から得ることができ、あるいはグラム陰性細菌、例えば大腸菌またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種から得ることもできる。
【００２１】
本発明の方法において核酸配列の転写を目的とする好適なプロモーターの例には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃのオペロンから得られたプロモーターがある。別の例には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）のプロモーターがある。別の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子（ａｐｒＨ）のプロモーターがある。別の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子（スブチリシン  Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ遺伝子）のプロモーターがある。別の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）のプロモーターがある。別の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＥ）のプロモーターがある。別の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーターがある。別の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの麦芽性アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーターがある。別の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）のプロモーターがある。別の例には、「‐３５」領域に対して配列ＴＴＧＡＣＡ、「‐１０」領域に対してＴＡＴＡＡＴを有する「コンセンサス」プロモーターがある。別の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）のプロモーターがある。別の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙＬＡおよびｘｙＬＢ遺伝子のプロモーターがある。別の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの亜種のｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ  ＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子（ｃｒｙＩＩＩＡ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）、またはその部分のプロモーターがある。別の例には、原核βラクタマーゼ遺伝子（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ等の論文、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，７５：３７２７〜３７３１，１９７８）のプロモーターがある。別の例には、ｓｐｏｌ細菌ファージプロモーターのプロモーターがある。別の例には、ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ等の論文、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，８０：２１〜２５，１９８３）がある。さらに別のプロモーターが、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，２４２：７４〜９４，１９８０，「Ｕｓｅｆｕｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ」およびＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ、およびＭａｎｉａｔｕｓ編のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【００２２】
縦列プロモーターの２つ以上のプロモーター配列が、同時に核酸配列の転写を促進させる可能性がある。別法として、縦列プロモーターの１または複数のプロモーター配列が、桿菌細胞の増殖の異なる段階で核酸配列の転写を促進させる可能性がある。
好ましい実施形態において、縦列プロモーターは、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのαアミラーゼ遺伝子のａｍｙＱを含有する。別の好ましい実施形態において、縦列プロモーターは、少なくとも「‐３５」領域に対して配列ＴＴＧＡＣＡ、「‐１０」領域に対してＴＡＴＡＡＴを有する「コンセンサス」プロモーターを含有する。別の好ましい実施形態において、縦列プロモーターは、少なくともＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのαアミラーゼ遺伝子のａｍｙＬプロモーターを含有する。別の好ましい実施形態において、縦列プロモーターは、少なくともｃｒｙＩＩＩＡプロモーターまたはその部分（ＡｇａｉｓｓｅおよびＬｅｒｅｃｌｕｓの論文，ｓｕｐｒａ）を含有する。
【００２３】
より好ましい実施形態において、縦列プロモーターは、少なくともａｍｙＬプロモーターおよびｃｒｙＩＩＩＡプロモーターを含有する。別のより好ましい実施形態において、縦列プロモーターは、少なくともａｍｙＱプロモーターおよびｃｒｙＩＩＩＡプロモーターを含有する。別のより好ましい実施形態において、縦列プロモーターは、「‐３５」領域に対して配列ＴＴＧＡＣＡ、「‐１０」領域に対してＴＡＴＡＡＴを有する「コンセンサス」プロモーター、およびｃｒｙＩＩＩＡプロモーターを少なくとも含有する。別のより好ましい実施形態において、縦列プロモーターは、ａｍｙＬプロモーターの少なくとも２つのコピーを含有する。別のより好ましい実施形態において、縦列プロモーターは、ａｍｙＱプロモーターの少なくとも２つのコピーを含有する。別のより好ましい実施形態において、縦列プロモーターは、「‐３５」領域に対して配列ＴＴＧＡＣＡ、「‐１０」領域に対してＴＡＴＡＡＴを有する「コンセンサス」プロモーターの少なくとも２つのコピーを含有する。別のより好ましい実施形態において、縦列プロモーターは、ｃｒｙＩＩＩＡプロモーターの少なくとも２つのコピーを含有する。
【００２４】
「コンセンサス」プロモーターの構築は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ用の増殖性「シグマＡ型」プロモーターの「‐１０」および「‐３５」領域に対して確立されたコンセンサス配列に、より完全に合致するプロモーターを創り出す部位特異的変異誘発により達成することができる（Ｖｏｓｋｕｉｌ等の論文、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１７：２７１〜２７９，１９９５）。「‐３５」領域に対するコンセンサス配列はＴＴＧＡＣＡであり、「‐１０」領域に対してはＴＡＴＡＡＴである。コンセンサスプロモーターは、桿菌宿主細胞中で機能することのできる任意のプロモーターから得ることができる。
【００２５】
好ましい実施形態において、「コンセンサス」プロモーターは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃのオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子（ａｐｒＨ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのアルカリ性プロテアーゼ遺伝子（スブチリシン  Ｃａｒｌｓｂｅｒｇ遺伝子）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの麦芽性アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙＬＡおよびｘｙＬＢ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの亜種のｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ  ＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子（ｃｒｙＩＩＩＡ、配列番号１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１))、またはその部分、または原核βラクタマーゼ遺伝子のｓｐｏｌ細菌ファージプロモーターから得られたプロモーターから得られる。
【００２６】
より好ましい実施形態において、「コンセンサス」プロモーターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのαアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）から得られる。最も好ましい実施形態において、「コンセンサス」プロモーターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のヌクレオチド１から１８５に含有された「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターである。別の最も好ましい実施形態において、「コンセンサス」プロモーターは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４のヌクレオチド８６から１８５に含有された短い「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターである。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３の「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターは、野生型ａｍｙＱプロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）を含有する核酸配列の下記の変異、すなわち‐３５領域（転写始動部位を基準にして）の位置１３５および１３６でそれぞれＴからＡ、およびＴからＣへ、また‐１０領域のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２の位置１５６でＡからＴへの変化を含む。「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）は、図２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）に示すように、さらに‐３５領域の約２０塩基対上流の位置１１６でＴからＡへの変化を含む。この変化は、それが重要な‐１０および‐３５領域から十分遮断されているので、プロモーターの機能に有害な影響をおよぼさないことは明らかである。
【００２７】
本明細書で「ｍＲＮＡプロセシング／安定化配列」とは、各プロモーター配列から合成された全てのｍＲＮＡが処理されて写しの５′末端にスタビライザー配列を備えたｍＲＮＡの写しを産生することができるように、１または複数の各プロモーター配列の各々が操作可能に連結している、１または複数のプロモーター配列の下流、かつ解読配列の上流に位置する配列として定義される。ｍＲＮＡの写しの５′末端にこのようなスタビライザー配列が存在すると、それらの半減期を増大させる（ＡｇａｉｓｓｅおよびＬｅｒｅｃｌｕｓの論文、ｓｕｐｒａ，１９９４、およびＨｕｅ等の論文、ｓｕｐｒａ，１９９５）。ｍＲＮＡプロセシング／安定化配列は、細菌性１６ＳリボソームＲＮＡの３′末端に対して相補関係にある。好ましい実施形態において、ｍＲＮＡプロセシング／安定化配列は、写しの５′末端にスタビライザー配列を備えた本質的に単一サイズの写しを生ずる。
【００２８】
より好ましい実施形態において、ｍＲＮＡプロセシング／安定化配列は、国際特許公開第９４／２５６１２号、ならびにＡｇａｉｓｓｅおよびＬｅｒｅｃｌｕｓの論文、ｓｕｐｒａ，１９９４に開示されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡプロセシング／安定化配列、またはｍＲＮＡプロセシング／安定化機能を保持するその部分である。別のより好ましい実施形態において、ｍＲＮＡプロセシング／安定化配列は、Ｈｕｅ等の論文、ｓｕｐｒａ，１９９５に記述されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＳＰ８２のｍＲＮＡプロセシング／安定化配列、またはｍＲＮＡプロセシング／安定化機能を保持するその部分である。
【００２９】
ｃｒｙＩＩＩＡプロモーターおよびそのｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を本発明の方法に使用する場合は、国際特許公開第９４／２５６１２号ならびにＡｇａｉｓｓｅおよびＬｅｒｅｃｌｕｓの論文、ｓｕｐｒａ，１９９４に開示された、ヌクレオチド−６３５から−２２（図１）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）、あるいはプロモーターおよびｍＲＮＡプロセシング／安定化機能を保持するその部分により表わされる配列を含有するＤＮＡ断片を用いることができる。ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡプロセシング／安定化配列がヌクレオチド−５５１から−２２の範囲内に含有されるのに対し、ｃｒｙＩＩＩＡプロモーターはヌクレオチド−６３５から−５５２により表わされる。好ましい実施形態において、ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡプロセシング／安定化配列はヌクレオチド−５６８から−２２を備える断片中に含有される。別の好ましい実施形態において、ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡプロセシング／安定化配列は、ヌクレオチド−３６７から−２１を備える断片中に含有される。さらに、様々な縦列プロモーターおよびｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡプロセシング／安定化配列の組み合わせを構築するために、ｃｒｙＩＩＩＡプロモーターのみ、またはｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡプロセシング／安定化配列のみを含有するＤＮＡ断片を、当業界でよく知られた方法を用いて調製することができる。この実施形態において、好ましくはｃｒｙＩＩＩＡプロモーターおよびそのｍＲＮＡプロセシング／安定化配列は、今問題にしている遺伝子の縦列プロモーターを構築するもう一方のプロモーター配列の下流、かつ解読配列の上流に配置される。縦列プロモーターおよびｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を含有する様々な構築物を図２に示す。
【００３０】
桿菌細胞は核酸構築物の１または複数のコピーを含有してもよい。好ましい実施形態において、桿菌細胞は核酸構築物の単一コピーを含有する。
さらに、核酸構築物は形質転換された細胞の選択を容易にする１または複数の選択可能な標識を含有することができる。選択可能な標識は、その生成物が生物致死剤耐性、重金属に対する抵抗性、栄養要求株に対するプロトトロピーなどを備えている遺伝子である。細菌性で選択可能な標識の例には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、あるいはアンピシリン、カナマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリン耐性など抗生物質耐性を授ける標識がある。さらに、選択は、選択可能な標識が別のベクター上にある共形質転換、例えば国際特許公開第９‐１０９１２９号の記載により達成することができる。
【００３１】
本発明の特別の利点は、選択可能な標識遺伝子のない桿菌細胞を産生することができる、すなわち桿菌細胞中に核酸構築物を導入した後、桿菌細胞から選択可能な標識遺伝子の欠失を引き起こして細胞標識をなくすことができることである。ポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーを含有する核酸構築物は、選択可能な標識遺伝子の除去が規制または環境上の理由で好ましいこのような標識のない桿菌細胞の生成を可能にする。
【００３２】
遺伝子の欠失または置換の技術は、選択可能な標識遺伝子の完全な欠失のために用いることができる。このような方法において、選択可能な標識遺伝子の欠失は、選択可能な標識遺伝子と隣接する５′および３′領域を接触して含有するように構築されたプラスミドを用いる相同性の組換えにより達成することができる。隣接する５′および３′領域は、プラスミドが細胞中に定着するようになる許容温度で第二の選択可能な標識と共同して、温度に敏感なプラスミド、例えばｐＥ１９４上で桿菌細胞に導入することができる。次いで細胞を非許容温度に移し、相同性フランキング領域の一つが染色体に組込まれたプラスミドを有する細胞を選択した。プラスミド組込みのための選択は、第二の選択可能な標識を選択することにより行なわれた。組込み後、第二の相同性フランキング領域における組換え事象は、選択することなく数世代の間、細胞を許容温度に移すことによりシミュレートされる。細胞を塗布して単一コロニーを得、コロニーの選択可能な両標識の喪失を試験する（例えば、Ａ．Ｌ．Ｓｏｎｎｅｓｈｅｉｎ、Ｊ．Ａ．Ｈｏｃｈ、およびＲ．Ｌｏｓｉｃｋ編「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ」，Ｃｈａｐｔｅｒ４２，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９３の中のＰｉｒｅｇｏ，１９９３の論文を参照されたい）。
【００３３】
ポリペプチドは、桿菌細胞にとって固有のものでも異種のものでもよい。本明細書における用語「ポリペプチド」は、特異な長さの符号化した生成物を参照することを意味するもではなく、したがってペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質を包含する。また、ポリペプチドは天然起源の対立性のまたは設計された変異型のポリペプチドであってもよい。
【００３４】
好ましくは、ポリペプチドは、ホルモンまたはその変異体、酵素、受容体またはその部分、抗体またはその部分、またはリポーターである。より好ましい実施形態においてポリペプチドは酸化還元酵素である。別のより好ましい実施形態においてポリペプチドは転移酵素である。別のより好ましい実施形態においてポリペプチドは加水分解酵素である。別のより好ましい実施形態においてポリペプチドは脱離酵素である。別のより好ましい実施形態においてポリペプチドは異性化酵素である。別のより好ましい実施形態においてポリペプチドは合成酵素である。さらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはアミノペプチダーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはアミラーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドは炭水化物分解酵素である。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはカルボキシペプチダーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態において、ポリペプチドはカタラーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはセルラーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはキチナーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはクチナーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはデオキシリボヌクレアーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはエステラーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはαガラクトシダーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはβガラクトシダーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはグルコアミラーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはαグルコシダーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはβグルコシダーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはインベルターゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはラッカーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはリパーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはマンノシダーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはムタナーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドは酸化酵素である。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはペクチン分解酵素である。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはペルオキシダーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはフィターゼである。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはポリフェノールオキシダーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態において、ポリペプチドはタンパク質分解酵素である。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはＲＮＡ分解酵素である。別のさらに一層好ましい実施形態においてポリペプチドはトランスグルタミナーゼである。別のさらに一層好ましい実施形態���おいてポリペプチドはキシラナーゼである。
【００３５】
最も好ましい実施形態においてポリペプチドはセリンプロテアーゼ、例えばスブチリシンである。別の最も好ましい実施形態においてポリペプチドは麦芽性アミラーゼである。別の最も好ましい実施形態においてポリペプチドはプルラナーゼである。
また本発明の方法は、桿菌細胞に固有のポリペプチドの組換え生成物に用いることができる。また本発明は、用語「非相同性ポリペプチド」の範囲内に、そのような発現が桿菌細胞にとって固有のものでない遺伝因子の使用を含む程度まで、または宿主細胞に通常は起こらない形で機能するように処理された固有の因子の使用を含む程度までこのような固有のポリペプチドの組換え生成物を包含する。
【００３６】
また本発明の方法において、非相同性ポリペプチドは、別のポリペプチドがポリペプチドまたはその断片のＮ末端またはＣ末端で融合されている、融合または混成ポリペプチドを含んでもよい。融合ポリペプチドは、一つのポリペプチドを符号化する核酸配列（またはその部分）を、別のポリペプチドを符号化する核酸配列（またはその部分）に融合することにより産生される。融合ポリペプチドを産生する技術は当業界で知られており、この技術には、それらがフレーム中にあり、かつ融合ポリペプチドの発現が同一のプロモーターおよびターミネーターの制御下にあるように、ポリペプチドを符号化する解読配列を結合することが含まれる。混成ポリペプチドは、少なくとも２つの異なるポリペプチドから得られる部分的または完全なポリペプチド配列の組み合わせを含んでもよく、その１つまたは複数が桿菌細胞にとって非相同のものであってもよい。
【００３７】
縦列または「コンセンサス」プロモーターを含む桿菌細胞の構築物、あるいは今問題にしているポリペプチドを符号化する核酸配列に操作可能に連結したｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列は、修飾された配列をベクター中に挿入し、相同性の組換えにより桿菌細胞の染色体中にベクターを導入するか、あるいは染色体外自己複製因子、例えばプラスミドとして桿菌細胞中にベクターを導入して、プロモーター、また別法としてｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列を核酸配列に操作可能に連結させる、当業界ではよく知られた方法を用いてポリペプチドを符号化する単離された核酸配列を修飾することにより達成することができる。しかしながら、核酸配列はまた当業界でよく知られた方法を用いて桿菌細胞中で生体内処理することができることも理解されるはずである。
【００３８】
本発明の方法において、今問題にしているポリペプチドを符号化する核酸配列は桿菌細胞に固有のものでも異質のものでもよい。非相同性のポリペプチドを符号化する異質の核酸配列は、任意の原核、真核、またはその他の供給源、例えばアルキバクテリアから得ることができる。好ましい実施形態において、核酸配列はグラム陰性またはグラム陽性細菌細胞などの細菌株から得られる。より好ましい実施形態において、ポリペプチドを符号化する核酸配列は桿菌細胞から得られる。本発明の目的に対して本明細書で所与の供給源と関係して用いられる用語「から得られる」とは、ポリペプチドが供給源により、または供給源由来の遺伝子が挿入されている細胞により産生されることを意味する。
【００３９】
ポリペプチドを符号化する核酸配列の単離またはクローン化に用いられる技術は当業界でよく知られており、例えばゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの調製、またはその組み合わせがある。そのようなゲノムＤＮＡ由来の核酸配列のクローニングは、例えば共同の構造的特徴を備えたクローン化されたＤＮＡ断片を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング、あるいはよく知られた重合酵素の連鎖反応（ＰＣＲ）を用いることにより行なうことができる。例えば、Ｉｎｎｉｓ等の「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。合成酵素連鎖反応（ＬＣＲ）、結合型活性化転写（ＬＡＴ）、および核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）などその他の核酸増幅手順を用いることもできる。クローニング手順には、ポリペプチドを符号化する核酸配列を備える所望の核酸断片の切り出しおよび単離、ベクター分子中への断片の挿入、およびそこで核酸配列のクローンが複製されることになる桿菌細胞への組換えベクターの組込みがある。核酸配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成起源の、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００４０】
次いで、今問題にしているポリペプチドを符号化する単離された核酸配列を処理して、核酸配列を、制御配列に適合する条件下で桿菌細胞中に解読配列の発現を方向づける１または複数の付加的制御配列だけでなく、縦列または「コンセンサス」プロモーターに、また別法としてｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列に操作可能に連結することにより核酸構築物を産生することができる。発現には、これには限定されないが転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含むポリペプチド生成に含まれる任意のステップが含まれると考えられるであろう。クローニング法を利用する核酸配列の修飾技術は、当業界でよく知られている。
【００４１】
本明細書の用語「制御配列」とは、核酸配列の解読配列の発現にとって必要または有益な全ての成分を含むものと定義する。各制御配列は、ポリペプチドを符号化する核酸配列に固有のものでも異質のものでもよい。前述の縦列または「コンセンサス」プロモーターに加えて、このような制御配列には先導部位、シグナル配列、および転写ターミネーターが含まれるがこれらには限定されない。制御配列は、ポリペプチドを符号化する核酸配列の解読領域と制御配列の連結反応を容易にする特異的な制限部位を導入する目的でリンカーを備えることができる。
【００４２】
また制御配列は適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終結させるために桿菌細胞により認識される配列であってもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドを符号化する核酸配列の３′末端と操作可能に連結している。本発明においては桿菌細胞の選択に役立つ任意のターミネーターを用いることができる。
【００４３】
また制御配列は適切な先導部位配列、すなわち桿菌細胞による翻訳にとって重要なｍＲＮＡの非翻訳領域であってもよい。先導部位配列は、ポリペプチドを符号化する核酸配列の５′末端と操作可能に連結している。桿菌細胞の選択に役立つ任意の先導部位配列を本発明において用いることができる。
また制御配列は、細胞の分泌経路の中に発現されたポリペプチドを方向づけるポリペプチドのアミノ末端に連結したアミノ酸配列をコード化するシグナルペプチド解読領域であってもよい。シグナルペプチド解読領域はポリペプチドに固有のものでもよく、また異質の供給源から得ることもできる。核酸配列の解読配列の５′末端は、分泌されたポリペプチドを符号化する解読領域のセグメントと翻訳の読み枠中で自然に連結したシグナルペプチド解読領域を先天的に含有してもよい。別法として、解読配列の５′末端は、分泌されたポリペプチドを符号化する解読領域の部分にとって異質のシグナルペプチド解読領域を含有してもよい。異質のシグナルペプチド解読領域は、解読配列が通常シグナルペプチド解読領域を含有しないところで必要となる可能性がある。別法として、異質のシグナルペプチド解読領域は、通常解読領域に付随している固有のシグナルペプチド解読領域と比べてポリペプチドの分泌を向上させるために、固有のシグナルペプチド解読領域と簡単に置換することができる。シグナルペプチド解読領域は、桿菌種由来のアミラーゼまたはプロテアーゼから得ることができる。しかしながら本発明においては、発現したポリペプチドを選択した桿菌細胞の分泌経路の中に方向づけることができる任意のシグナルペプチド解読領域を用いることができる。
【００４４】
桿菌細胞にとって有効なシグナルペプチド解読領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣＩＢ  １１８３７麦芽性アミラーゼ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαアミラーゼ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのスブチリシン遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓのβラクタマーゼ遺伝子、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの中性プロテアーゼ遺伝子（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡ遺伝子から得られたシグナルペプチド解読領域である。さらに、シグナルペプチドについては、ＳｉｍｏｎｅｎおよびＰａｌｖａの論文、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５７‐１０９〜１３７，１９９３に記述されている。
【００４５】
本発明の方法において、今問題にしているポリペプチドをコード（符号化）する核酸配列、縦列または「コンセンサス」プロモーター、また別法としてｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列、および転写と翻訳の終止シグナルを備える組換え発現ベクターを、ポリペプチドの組換え生成に用いることができる。前述の様々な核酸および制御配列を合わせて接合して、そこでポリペプチドを符号化する核酸配列の挿入または置換を可能にするための１または複数の都合のよい制限部位を含む組換え発現ベクターを産生することができる。別法として、核酸配列は、核酸配列または配列を備える核酸構築物を発現用の適正なベクター中に挿入することにより発現させてもよい。発現ベクターの創出において、解読配列は、解読配列が縦列または「コンセンサス」プロモーター、また別法としてｍＲＮＡプロセッシング／安定化配列、ならびに発現用の、ことによると分泌用の任意のその他の適正な制御配列と操作可能に連結するようにベクター中に位置する。
【００４６】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に従わせるのに都合のよい、また桿菌細胞中に導入したとき核酸配列の発現を引き起こすことが可能な任意のベクターであってよい。ベクターの選択は、一般にベクターが導入される桿菌細胞とベクターとの適合性に左右されるはずである。ベクターは鎖状プラスミドでも閉環状プラスミドでもよい。ベクターは、自己複製ベクター、すなわちその複製が染色体の複製とは独立の染色体外の実体、例えばプラスミド、染色体外因子、ミニクロモソーム、または人工染色体として存在するベクターであってもよい。ベクターは自己複製を保証する任意の手段を含有することができる。別法として、ベクターは、桿菌細胞中に導入されたときゲノム中に組込まれ、またそれが組込まれる染色体と共に複製されるものであってもよい。ベクター系は、単一ベクターまたはプラスミド、あるいは２つ以上のベクターまたはプラスミド、あるいはトランスポゾンであってもよい。
【００４７】
「導入」とは、ベクターが染色体の成分として、または自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、核酸配列を備えるベクターを桿菌細胞中に導入することを意味する。組込みは、細胞中では核酸配列がより安定に維持されやすいので、通常有利であると考えられる。染色体中へのベクターの組込みは、相同性の組換え、非相同性の組換え、または転位により起こる。
【００４８】
桿菌細胞中への発現ベクターの導入は、例えば、感応細胞（例えばＹｏｕｎｇおよびＳｐｉｚｉｚｉｎの論文、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ８１：８２３〜８２９，１９６１、またはＤｕｂｎａｕおよびＤａｖｉｄｏｆｆ−Ａｂｅｌｓｏｎの論文、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５６：２０９〜２２１，１９７１を参照されたい）、エレクトロポレーション（例えばＳｈｉｇｅｋａｗａおよびＤｏｗｅｒの論文、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：７４２〜７５１，１９８８を参照されたい）、または共役（例えばＫｏｅｈｌｅｒおよびＴｈｏｒｎｅの論文、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １６９：５２７１〜５２７８，１９８７を参照されたい）を用いる原形質体の形質転換（例えばＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎの論文、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６８：１１１〜１１５，１９７９を参照されたい）により行なうことができる。
【００４９】
組込みにとってベクターは、ポリペプチドを符号化する核酸配列、またはベクターを相同性の組換えによりゲノム中に安定して組み込むためのベクターの任意の他の因子に依拠する可能性がある。ベクターは、桿菌細胞のゲノム中への相同性の組換えによる組込みを方向づけるために付加的な核酸配列を含有してもよい。付加的な核酸配列は、ベクターが染色体中の正確な位置において桿菌細胞のゲノム中に組込まれることを可能にする。正確な位置における組込みの可能性を増すために、組込み因子は、好ましくは塩基対１００から１，５００のような十分な数の核酸、より好ましくは塩基対４００から１，５００、最も好ましくは塩基対８００から１，５００の核酸を含むべきであり、これらは相同性の組換えの可能性を高めるために対応する標的配列と高度に相同性である。組込み因子は、桿菌細胞のゲノム中の標的配列と相同性の任意の配列であってよい。さらに組込み因子は、非符号化または符号化核酸配列であってもよい。
【００５０】
自己複製のためには、ベクターはさらにベクターが問題の桿菌細胞中で自律的に複製することを可能にするｏｒｉ領域を有してもよい。細菌性のｏｒｉ領域の例には、大腸菌中で複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹ１７７、およびｐＡＣＹＣ１８４、ならび桿菌中で複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、およびｐＡＭβ１がある。複製開始点は、桿菌細胞中でその機能を温度に敏感にするために変異を有するものであってもよい（例えばＥｈｒｌｉｃｈの論文、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ７５：１４３３，１９７８を参照されたい）。
【００５１】
組換え発現ベクターを構築するために前述の因子を結合するのに用いた手順は、当業技術者にはよく知られている（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等の論文、ｓｕｐｒａ，１９８９を参照されたい）。
本発明の方法において、桿菌細胞は野生型桿菌細胞またはその変異体であってもよい。さらに、桿菌細胞は好アルカリ性または好熱性の桿菌であってもよい。好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞である。別の好ましい実施形態において桿菌細胞はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ細胞である。
【００５２】
本発明の方法において、桿菌細胞は、例えば相同性のポリペプチドを符号化する核酸配列を備える組換え細胞であってもよい。
細胞は、当業界で知られた方法を用いてポリペプチドの生成に適した栄養培地中で培養される。例えば細胞は、適切な培地で、かつポリペプチドの発現および／または単離を可能にする条件下で、実験室的または工業的発酵槽における振とうフラスコ培養、小規模または大規模発酵（連続、バッチ、流加、または固体発酵）により培養することができる。培養は、当業界で知られた手順を用いて、炭素と窒素の供給源および無機塩類を含む適切な栄養培地中で行なわれる。適切な培地は営利目的の製造業者から入手でき、あるいは出版物に掲載された組成（例えば「Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ」のカタログ中）に従って調製することができる。分泌されたポリペプチドは培地から直接回収することができる。
【００５３】
ポリペプチドは、当業界で知られたポリペプチドに特有の方法を用いて検出することができる。これらの検出法には、特異抗体、酵素生成物の形成、酵素基質の消滅、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥの使用を含むことができる。例えば、酵素検定をポリペプチドの活動度の決定に用いることができる。ポリペプチドの活動度の決定手順が多くの酵素に対して当業界で知られている。
【００５４】
本発明の方法において、同一の生成条件下で培養した場合、桿菌細胞の生成は、ポリペプチドを符号化する核酸と操作可能に連結した縦列または「コンセンサス」プロモーターの唯一つのプロモーター配列を含有する桿菌細胞と比較して、好ましくは少なくとも約２５％を超え、より好ましくは少なくとも約５０％を超え、より好ましくは少なくとも約７５％を超え、より好ましくは少なくとも約１００％を超え、さらにより好ましくは少なくとも約２００％を超え、最も好ましくは少なくとも約３００％を超え、さらに最も好ましくは少なくとも約４００％を超える。
【００５５】
得られたポリペプチドは当業界で知られた方法により単離することができる。例えばポリペプチドは、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿を含む通常の手順により栄養培地から単離することができるがこれには限定されない。次いで単離されたポリペプチドは、これには限定されないがクロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、疎水、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動操作（例えば分取等電点電気泳動）、示差溶解度（例えば硫安沈殿）、または抽出（例えばＪ．‐Ｃ．ＪａｎｓｏｎおよびＬａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ編、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい）を含む当業界で知られた様々な手順によりさらに精製することができる。
【００５６】
また本発明は、縦列プロモーターの各プロモーター配列が、ポリペプチドを符号化する核酸配列の、また別法として縦列プロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上流に位置するｍＲＮＡプロセシング／安定化配列の単一コピーに操作可能に連結している縦列プロモーターを備える桿菌細胞に関する。好ましい実施形態において、桿菌細胞は選択可能な標識遺伝子がない。
【００５７】
また本発明は、（ｉ）ポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結した縦列または「コンセンサス」プロモーター、および（ｉｉ）「コンセンサス」プロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上流に位置するｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を備える核酸構築物を含む桿菌細胞に関する。
【００５８】
また本発明は、ポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結した「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターの１または複数のコピーを備える核酸構築物を含む桿菌宿主細胞に関する。
また本発明は、（ｉ）縦列プロモーターの各プロモーター配列がポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結している縦列プロモーター、また別法として（ｉｉ）縦列プロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上流に位置するｍＲＮＡプロセシング／安定化配列も備える核酸構築物を桿菌細胞中に導入することを含む、桿菌宿主細胞を得る方法に関する。
【００５９】
また本発明は、（ｉ）ポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結している「コンセンサス」プロモーター、および（ｉｉ）「コンセンサス」プロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上流に位置するｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を備える核酸構築物を桿菌細胞中に導入することを含む、桿菌宿主細胞を得る方法に関する。
【００６０】
また本発明は、ポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結した「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターの１または複数のコピーを備える核酸構築物を桿菌細胞中に導入することを含む、桿菌宿主細胞を得る方法に関する。
また本発明は、桿菌細胞の選択可能な標識遺伝子の欠失を引き起こすことを含む、桿菌細胞の選択可能な標識のない変異物を産生する方法であって、その桿菌細胞が、（ｉ）縦列プロモーターの各プロモーター配列がポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結している縦列プロモーター、また別法として（ｉｉ）縦列プロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上流に位置するｍＲＮＡプロセシング／安定化配列も備える核酸構築物を含む、方法に関する。
【００６１】
また本発明は、桿菌細胞の選択可能な標識遺伝子の欠失を引き起こすことを含む、桿菌細胞の選択可能な標識のない変異物を産生する方法であって、その桿菌細胞が、（ｉ）ポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結した「コンセンサス」プロモーター、および（ｉｉ）「コンセンサス」プロモーターの下流、かつポリペプチドを符号化する核酸配列の上流に位置するｍＲＮＡプロセシング／安定化配列を備える核酸構築物を含む、方法に関する。
【００６２】
また本発明は、桿菌細胞の選択可能な標識遺伝子の欠失を引き起こすことを含む、桿菌細胞の選択可能な標識のない変異物を産生する方法であって、その桿菌細胞が、ポリペプチドを符号化する核酸配列の単一コピーと操作可能に連結した「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターの１または複数のコピー備える核酸構築物を含む、方法に関する。
【００６３】
また本発明は、本発明の方法により産生したこのような選択可能な標識のない桿菌変異体に関する。
また本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に含まれた「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターを備える単離した核酸配列に関する。
【００６４】
さらに本発明を下記の実施例により説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものと受け取られるべきではない。
【実施例】
【００６５】
（実施例）
細菌株：  
大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＪＭ１０１、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓＰＬ１８０１ｓｐｏＩＩＥ：：Ｔｎ９１７（ａｍｙＥ，ａｐｒ，ｎｐｒ）。
【００６６】
プライマーおよびオリゴ：  
全てのプライマーおよびオリゴは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３９４  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）により合成された。
実施例１：プラスミドｐＤＧ２６８ＭＣＳの構築：
ｐＤＧ２６８（Ａｎｔｏｎｉｅｗｓｋｉ等の論文、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７２：８６〜９３，１９９０）をＴｔｈ１１１ＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、消化物を４５ｍＭのトリス−ホウ酸塩／１ｍＭのＥＤＴＡ（ＴＢＥ）を有する０．７％のアガロースゲルを用いて電気泳動にかけた。約６０２０ｂｐの最大のプラスミド断片がゲルから切り出し、ＤＮＡがＱｉａｑｕｉｃｋのＤＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｔｗｏｒｔｈ，ＣＡ）を用いて製造業者の手引書に従って回収した。次いで、回収されたＤＮＡを下記に示した合成ポリリンカーと結合させて特別なＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩ部位をプラスミド中に導入した。
【００６７】
【化１】
0004629783.tif 000002
【００６８】
大腸菌ＤＨ５αを連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。プラスミドＤＮＡをＳａｍｂｒｏｏｋ等の論文、ｓｕｐｒａ，１９８９に従って精製し、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩで消化して、これらの部位および上記に暗に示されているポリリンカーを含有したプラスミドを同定した（ｐＤＧ２６８はこれら２つの制限部位を含まない）。制限部位を二つとも含有し、これに加えてｐＤＧ２６８のｌａｃＺ遺伝子を合成ポリリンカーで置換した結果としてｐＤＧ２６８よりも約３．０ｋｂ小さい幾つかのプラスミドが同定された。このようなプラスミドの１つを選択し、ｐＤＧ２６８ＭＣＳ（ＭＣＳは多重クローニング部位を指す）と呼称した（図３）。
【００６９】
実施例２：ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの構築：
ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶは、それらの３′末端にＳａｃＩ部位を含有するように設計されたプロモーター断片のスワッピングを容易にするために、実施例１のｐＤＧ２６８ＭＣＳにおいてＳａｃＩ部位の欠失を引き起こすように構築された。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（実施例９および図１２を参照されたい）をＳｎａＢＩおよびＮｒｕＩ（両制限部位ともベクターのＳａｃＩ部位に隣接する）で消化し、結合させ、大腸菌ＤＨ５α中で形質転換させた。アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。プラスミドＤＮＡを幾つかの形質転換細胞から精製し、実施例１の記載に従って回収した。プラスミドＤＮＡをＳａｃＩで消化して、ベクター配列中に位置したＳａｃＩ部位の欠失が引き起こされた、すなわちｃｒｙＩＩＩＡプロモーターの下流でＳａｃＩ部位により一度だけ切断されたプラスミドを同定した。このようなプラスミドを同定し、ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△‐ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶと呼称した（図４）。
【００７０】
実施例３：ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの構築：
ｐＤＧ２６８ＭＣＳまたはｐＤＧ２６８ＭＣＳ△誘導体中に含有された発現カセットの桿菌細胞の染色体中への導入は、染色体中への導入が二重乗換え（望ましい）対単一乗換え事象の結果であるかどうかを識別する方法がないので、ＰＣＲ分析により確かめなければならない。この問題を軽減するために、ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶは、相同性のａｍｙＥの「前面」およびａｍｙＥの「背後」領域の外側にネオマイシンに対する抵抗性を授ける抗生物質耐性標識を含有するように構築された。二重乗換えがＣｍr、Ｎｅｏs形質転換細胞をもたらすのに対して、単一乗換えは、ＰＣＲよりもむしろ薬剤耐性をスクリーニングすることにより所望の二重乗換え事象の同定を可能にするＣｍr、Ｎｅｏr形質転換細胞をもたらす。
【００７１】
ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶは、まずＢａｌＩで実施例２のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶを消化し、子ウシの腸のアルカリ性ホスファターゼで処理することにより構築された。プラスミドｐＢＥＳＴ５０１（Ｉｔａｙａ等の論文、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７：４４１０，１９８９）は、ＰｓｔＩおよびＮｏｔＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼＩで処理してブラントエンドを生じさせ、実施例１の記載に従ってアガロースゲル精製してネオマイシン耐性標識を宿す断片を単離した。ゲル精製した断片およびＢａｌＩで消化したプラスミドを合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α中で形質転換させた。アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。選択した形質転換細胞を、１ｍｌ当たりネオマイシン５０μｇを追加したＬＢプレート上にパッチ形成してネオマイシン耐性形質転換細胞を同定した。プラスミドＤＮＡは、小数のネオマイシン耐性形質転換細胞から実施例１の記載に従って精製し、４ｋｂの範囲の２個の断片を産生するＢｇｌＩＩ（ネオマイシン耐性標識と共に導入された追加のＢｇｌＩＩ部位により２回切断する）および約８ｋｂの断片を産生するＢａｍＨＩ（ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）プロテアーゼ遺伝子の下流で１回切断すると予想される）で消化した。このようなプラスミドは同定し、ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶと呼称した（図５）。
【００７２】
実施例４：ｐＨＰ１３ａｍｐＭＣＳの構築：
ｐＨＰ１３（Ｈａｉｍａ等の論文、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０９：３３５〜３４２，１９８７）の変異体であるｐＨＰ１３ａｍｐは、ｐＵＣ９をＡａｔＩＩで消化し、クレノウ断片およびデオキシリボヌクレオチドでブラント化し、次いでＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより構築された。より大きな２．２ｋｂ断片をＱｉａｅｘのキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）でゲル精製した。ｐＨＰ１３をＨｐａＩ（エリスロマイシン耐性遺伝子の内部で切断する）で消化し、ブラント化し、次いでＨｉｎｄＩＩＩで消化した。次いで、ｐＨＰ１３から放出された、より大きな３．０ｋｂ断片を、ｐＵＣ９の複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子を含有する２．１ｋｂのｐＵＣ９断片と結合させた。連結反応混合物を大腸菌ＤＨ５α中で形質転換した。アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。プラスミドＤＮＡを実施例１の記載に従って幾つかの形質転換細胞から精製した。ｐＨＰ１３ａｍｐと呼称されるプラスミドが形質転換細胞の一つから回収された。
【００７３】
プラスミドｐＨＰ１３ａｍｐをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、また下記のポリリンカ‐１００ｐモルを５０ｍＭのＮａＣｌ‐１０ｍＭのトリスｐＨ７．５、および１ｍＭのＥＤＴＡ中でアニールし、５分間沸騰させ、２時間かけてゆっくり室温まで冷却することにより創出した新しいＭＣＳで、ｐＵＣ９ＭＣＳを置換した。
【００７４】
【化２】
0004629783.tif 000003
【００７５】
大腸菌ＤＨ５αを連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。プラスミドＤＮＡを実施例１の記載に従って幾つかの形質転換細胞から精製し、ＮｏｔＩおよびＳａｃＩで消化した。これらの酵素で切断されたプラスミドは合成ポリリンカーを含んでいる。このようなプラスミドの一つを同定し、ｐＨＰ１３ａｍｐ−ＭＣＳと呼称した（図６）。さらに、このプラスミドを、ポリリンカー領域を介するＤＮＡシークエンシングにより検証した。ＤＮＡシークエンシングは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｏｄｅｌ  ３７３Ａ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて製造業者の手引書に従って行なわれた。
【００７６】
実施例５：セリンプロテアーゼ遺伝子ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）の単離：
桿菌セリンプロテアーゼ（ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を符号化する遺伝子（以後ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子と呼ぶ）を、鋳型ＤＮＡとしてプラスミドｐＳＸ２２２（図７、米国特許第５，６２１，０８９号）および下記の２つのプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行なった（制限部位には下線が引かれている）。
【００７７】
【化３】
0004629783.tif 000004
【００７８】
増幅反応液（１００μｌ）の成分は、５０ｎｇのｐＳＸ２２２、各５０ｐモルのプライマー、１ＸのＴａｑＤＮＡ重合酵素緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに２．５単位のＴａｑＤＮＡ重合酵素（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）からなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイクル、９５℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクル、および７２℃で５分間の最終サイクルである。
【００７９】
約１２３０ｂｐのＰＣＲ生成物が、製造業者の手引書に従って、ｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に直接サブクローン化した。遺伝子の配列を、遺伝子特異プライマーを用いて実施例４の記述に従ってＤＮＡシークエンシングにより検証した。検証されたらプラスミドをＢａｍＨＩで消化し、クレノウ断片で充填し、ＡｐａＩで消化し、次いでＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子を宿す断片をＡｐａＩ、すなわちｐＨＰ１３ａｍｐＭＣＳのＥｃｉ１３６ＩＩ部位に結合させた。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＨＰ１３ａｍｐ−ＳＡＶ（図８）と呼称されるプラスミドを形質転換細胞の１つから単離し、構造特異的プライマーを用いて実施例４の記述に従ってＤＮＡシークエンシングにより検証した。ＢａｍＨＩ部位がこの連結反応の結果として再生した。
【００８０】
実施例６：ａｍｙＬプロモーター−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
米国特許第５，６９８，４１５号に記載されたＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  αアミラーゼ（ＴＥＲＭＡＭＹＬ（商標）、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を符号化するａｍｙＬ遺伝子のプロモーターを、鋳型ＤＮＡとしてプラスミドｐＰＬ１７５９（米国特許第５，６９８，４１５号）、下記の２つのプライマー（制限部位には下線が引かれている）、およびＰＣＲキットＧＥＮＥＡＭＰ（商標）ＸＬ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）を用いて、製造業者の手引書に従って、ＰＣＲ増幅を行なった。
【００８１】
【化４】
0004629783.tif 000005
【００８２】
増幅反応液（１００μｌ）の成分は、５０ｎｇのｐＰＬ１７５９、各５０ｐモルのプライマー、１ＸのＴａｑＤＮＡ重合酵素緩衝液、各２．５μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに１．０単位のＴａｑ重合酵素からなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイクル、９５℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクル、および７２℃で５分間の最終サイクルである。
【００８３】
ａｍｙＬプロモーターを含む約６２０ｂｐのＰＣＲ生成物をＥｃｌ１３６ＩＩで消化したｐＵＣ１１８と結合させた。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＵＣ１１８−ＰｒamyLと呼称されるプラスミドを、５−ブロモ−４−クロロ−３−イノドリル（ｉｎｄｌｙｌ）−ａ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の存在下で白色を呈するアンピシリン耐性形質転換細胞から精製し，Ｍ１３／ｐＵＣシークエンシングプライマーおよびａｍｙＬ特異プライマーを用いて、実施例４の記述に従ってＤＮＡシークエンシングにより検証した。
【００８４】
実施例５のｐＨＰ１３ａｍｐ−ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＳａｃＩで消化し、実施例１の記述に従ってゲル電気泳動により精製した。ａｍｙＬプロモーターを担持するｐＵＣ１１８−ＰｒamyLの約６２０ｂｐのＳｆｉＩ−ＳａｃＩ断片を、実施例１の記述に従ってゲル電気泳動により単離し、ＳｆｉＩ／ＳａｃＩで消化したｐＨＰ１３ａｍｐ−ＳＡＶに結合した。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＨＰ１３ａｍｐ−ＰｒamyL／ＳＡＶと呼称されるプラスミドを、アンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製した。
【００８５】
ｐＨＰ１３ａｍｐ−ＰｒamyL／ＳＡＶを、ＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＰｒamyL／ＳＡＶカセットを担持する約１８４０ｂｐの断片を、実施例１の記述に従って精製した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳを、ＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、実施例１の記述に従って精製し、ＰｒamyL／ＳＡＶ  ＳｆｉＩ／ＢａｍＨＩ断片と結合させた。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒamyL／ＳＡＶ（図９）と呼称されるプラスミドを、アンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製した。
【００８６】
実施例７：ａｍｙＱプロモーター−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓのαアミラーゼ（ＢＡＮ（商標）、Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ，Ｂａｇｓｖａｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を符号化するａｍｙＬ遺伝子のプロモーターを、鋳型ＤＮＡとしてプラスミドｐＳＸ２２２および下記のプライマー（制限部位には下線が引かれている）を用いて、ＰＣＲ増幅を行なった。
【００８７】
【化５】
0004629783.tif 000006
【００８８】
増幅反応液（１００μｌ）の成分は、５０ｎｇのｐＳＸ２２２、各５０ｐモルのプライマー、１ＸのＴａｑＤＮＡ重合酵素緩衝液、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに２．５単位のＴａｑ重合酵素からなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイクル、９５℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクル、および７２℃で５分間の最終サイクルである。
【００８９】
約１８５ｂｐのＰＣＲ生成物を、製造業者の手引書に従ってｐＣＲＩＩベクター中に直接サブクローン化し、ｐＣＲＩＩ−ＰｒamyQを産生する実施例４の記述に従ってＤＮＡシークエンシングにより検証された。ａｍｙＱプロモーターを担持するｐＣＲＩＩ−ＰｒamyQの約１８５ｂｐのＳｆｉＩ−ＳａｃＩ断片を、実施例１の記述に従ってゲル電気泳動により単離し、ＳｆｉＩ／ＳａｃＩで消化したｐＨＰ１３ａｍｐ−ＳＡＶ（実施例５）に結合した。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＨＰ１３ａｍｐ−ＰｒamyQ／ＳＡＶと呼称されるプラスミドを、アンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製した。
【００９０】
ｐＨＰ１３ａｍｐ−ＰｒamyQ／ＳＡＶを、ＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＰｒamyQ／ＳＡＶ発現カセットを担持する約１４００ｂｐの断片を、実施例１の記述に従って精製した。次いでＳｆｉＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ＳｆｉＩ−ＢａｍＨＩで消化したｐＤＧ２６８ＭＣＳ（実施例６）中に結合させた。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒamyQ／ＳＡＶ（図１０）と呼称されるプラスミドを、アンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製した。
【００９１】
実施例８：ｐＵＣ１８−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔｂ／ｃｒｙＩＩＩＡの構築：
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの亜種のｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの鞘翔目結晶タンパク質ＣｒｙＩＩＩＡを符号化するＣｒｙＩＩＩＡ遺伝子のプロモーターを、Ｐｉｔｃｈｅｒ等の論文、Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８：１５１〜１５６，１９８９に従って単離した、国際特許公開第９５／０２６９５号に記載のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの亜種のｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ株ＮＢ１２５由来の染色体ＤＮＡから下記のプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行なった。
【００９２】
【化６】
0004629783.tif 000007
【００９３】
増幅反応液（１００μｌ）の成分は、５０ｎｇのＮＢ１２５染色体ＤＮＡ、各５０ｐモルのプライマー、１ＸのＰｆｕ重合酵素緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに１．０単位のＰｆｕ重合酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）からなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイクル、９５℃で１分間、５０℃で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクル、および７２℃で５分間の最終サイクルである。
【００９４】
約１０００ｂｐのＰＣＲ生成物をＳｍａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＵＣ１８のＳｍａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位中に結合させた。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＵＣ１８−ＰｒcryIIIAと呼称されるプラスミドを、アンピシリン耐性形質転換細胞の１つから単離した。
【００９５】
プラスミドｐＵＣ１１８−ＰｒcryIIIA（国際特許公開第９５／０２６９５号）をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子およびｍＲＮＡ安定化配列を宿す約３０００ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ断片を実施例１の記載に従ってゲル精製した。断片をｐＵＣ１８−ＰｒcryIIIAのＨｉｎｄＩＩＩ部位に結合させた。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＵＣ１８−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ｃｒｙＩＩＩＡ（図１１）と呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから単離した。プラスミドをＥｃｏＲＩで消化することによって断片の配向が正しいことを確認した。
【００９６】
実施例９：ｃｒｙＩＩＩＡプロモーター−ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡスタビライザー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
ｃｒｙＩＩＩＡ遺伝子の配列を安定化させるプロモーターおよびｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡを、ＤＮＡの鋳型として実施例８のプラスミドのｐＵＣ１８−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ｃｒｙＩＩＩＡおよび下記の２つのプライマー（制限部位には下線が引かれている）を用いてＰＣＲ増幅を行なった。
【００９７】
【化７】
0004629783.tif 000008
【００９８】
増幅反応液（１００μｌ）の成分は、５０ｎｇのｐＵＣ１８−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ、各５０ｐモルのプライマー、１ＸのＴａｑ重合酵素緩衝液、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに１．０単位のＴａｑ重合酵素からなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイクル、９５℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクル、および７２℃で５分間の最終サイクルである。
【００９９】
約６３０ｂｐのＰＣＲ生成物を、ｐＣＲＩＩベクター中で製造業者の手引書に従ってクローン化してプラスミドｐＣＲＩＩ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂを産生し、これをＭ１３シークエンシングプライマーおよびｃｒｙＩＩＩＡ特異プライマーを用いて実施例４の記載に従って検証した。
ｍＲＮＡスタビライザー配列を備えたｃｒｙＩＩＩＡプロモーター（ＰｒcryIIIA）を担持するｐＣＲＩＩ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂの約６３０ｂｐのＳｆｉＩ−ＳａｃＩ断片を、実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離し、ＳｆｉＩ／ＳａｃＩで消化したｐＨ１３ａｍｐ−ＳＡＶ（実施例５）に結合させた。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（図１２）と呼称されるプラスミドを、アンピシリン耐性形質転換細胞の１つから単離した。
【０１００】
実施例１０：ｃｒｙＩＩＩＡプロモーター−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
ｐＤＧ２６８△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ＳＡＶを下記に従って構築した。ＤｒａＩＩＩ部位からｃｒｙＩＩＩＡ転写始動部位の６ヌクレオチド下流までの範囲にある実施例３のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの約１６４０ｂｐの断片を、ＤＮＡの鋳型としてプラスミドｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶおよび下記の２つのプライマー（制限部位には下線が引かれている）を用いてＰＣＲ増幅を行なった。
【０１０１】
【化８】
0004629783.tif 000009
【０１０２】
増幅反応液（５０μｌ）の成分は、５０ｎｇのｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ、各５０ｐモルのプライマー、１ＸのＴａｑ重合酵素緩衝液、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに１．２５単位のＤＮＡ重合酵素Ａｍｐｌｉｔａｑ（商標）Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）からなる。増幅条件は、９５℃で９分間の１サイクル、９５℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクル、および７２℃で３分間の最終サイクルである。ＰＣＲ生成物は、ＴＯＰＯ−ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて製造業者の手引書に従って直接ｐＣＲ２．１中にクローン化してｐＣＲ２．１−ＤｒａＩＩＩ／ＰｒcryIIIAを産生し、これは実施例４の記載に従ってＤＮＡシークエンシングにより検証された。
【０１０３】
実施例１２のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒamyL／ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＤｒａＩＩＩおよびＳａｃＩで消化して、ＰｒamyL／ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ縦列プロモーターおよびベクター部分を除去し、約６４４０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。ｐＣＲ２．１−ＤｒａＩＩＩ／ＰｒcryIIIAの約１６４０ｂｐのＤｒａＩＩＩ／ＳａｃＩ断片を単離し、ＤｒａＩＩＩ／ＳａｃＩで切断されたベクターと結合させた。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ＳＡＶ（図１３）と呼称されるプラスミドを、アンピシリン耐性形質転換細胞の１つから単離した。
【０１０４】
実施例１１：ａｍｙＬプロモーター−ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡスタビライザー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
ｃｒｙＩＩＩのＡｍＲＮＡスタビライザー配列を、ＤＮＡの鋳型として実施例８のプラスミドｐＵＣ１８−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ｃｒｙＩＩＩＡおよび下記の２つプライマー（ＳａｃＩ制限部位には下線が引かれている）、すなわち
【０１０５】
【化９】
0004629783.tif 000010
【０１０６】
を用いてＰＣＲ増幅を行なった。
増幅反応液（１００μｌ）の成分は、５０ｎｇのｐＵＣ１８−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ｃｒｙＩＩＩＡ、各５０ｐモルのプライマー、１ＸのＴａｑ重合酵素緩衝液、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに２．５単位のＴａｑ重合酵素からなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイクル、９５℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクル、および７２℃で５分間の最終サイクルである。約３６０ｂｐのＰＣＲ生成物をｐＣＲＩＩベクター中に製造業者の手引書に従ってサブクローン化し、構造特異的プライマーを用いて実施例４の記載に従ってＤＮＡシークエンシングにより確証した。
【０１０７】
得られたｐＣＲＩＩ−ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂと呼称されるプラスミドをＳａｃＩで消化し、ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡスタビライザー配列を宿す断片を実施例１の記載に従ってアガロースゲル電気泳動により精製した。実施例６のプラスミドｐＨＰ１３ａｍｐ−ＰｒamyL／ＳＡＶをＳａｃＩで消化し、子ウシの腸のアルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理して５′リン酸基を除去した。次いで、スタビライザー配列およびＣＩＰ処理プラスミドを含有する精製された断片を合わせて結合させた。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。プラスミドＤＮＡを幾つかの形質転換細胞から単離し、ＳａｃＩで消化してｍＲＮＡスタビライザー配列を含有するものを同定した。それらが同定されたら、プラスミドＤＮＡをＸｍｎＩで消化することにより断片の配向を決定した。正しく配向したｃｒｙＩＩＩＡ安定化配列を含有するプラスミドを同定し、ｐＨＰ１３ａｍｐ−ＰｒamyL／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶと呼称した。
【０１０８】
ｐＨＰ１３ａｍｐ−ＰｒamyL／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、発現カセットを宿す断片をｐＤＧ２６８−ＭＣＳのＳｆｉＩ−ＢａｍＨＩ部位に結合させてｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒamyL／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（図１４）を産生した。
実施例１２：縦列ａｍｙＬ−ｃｒｙＩＩＩＡプロモーター−ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡスタビライザー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
実施例３のプラスミドｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳｆｉＩで消化し、Ｔ４  重合酵素Ｉでブラントエンド化し、次いでＤｒａＩＩＩで消化した。消化物をアガロースゲル電気泳動により分離し、約７０１０ｂｐのベクター断片をゲルから切り出し、ＤＮＡを実施例１の記載に従って抽出した。
【０１０９】
実施例６のｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒamyL／ＳＡＶをＥｃｌ１３６ＩＩおよびＤｒａＩＩＩで消化した。消化物をアガロースゲル電気泳動により分離し、約２１５０ｂｐのプロモーター断片をゲルから切り出し、ＤＮＡを実施例１の記載に従って抽出した。
精製したＤＮＡを合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α中で形質転換させた。アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒamyL／ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（図１５）と呼称されるプラスミドを、アンピシリン耐性形質転換細胞の１つから単離し、ＮｃｏＩによる消化と、続くアガロースゲル電気泳動により検証した。
【０１１０】
実施例１３：縦列ａｍｙＬ−ｃｒｙＩＩＩＡプロモーター−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
実施例１０のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ＳＡＶをＰａｃＩおよびＤｒａＩＩＩで消化し、約６４５０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。ＰｒamyLおよびＰｒcryIIIAを担持する実施例１２のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒamyL／ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの約２２３０ｂｐのＰａｃＩ−ＤｒａＩＩＩ断片を、実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離し、ベクター断片と結合させた。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒamyL／ＰｒcryIIIA／ＳＡＶ（図１６）と呼称されるプラスミドを、アンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製した。
【０１１１】
実施例１４：ａｍｙＱプロモーター−ｃｒｙＩＩＩＡスタビライザー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
実施例７のｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒamyQ／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＰｒamyQ／ＳＡＶカセットを担持する約１４００ｂｐを実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。実施例３のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、約６７８０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。精製した断片を合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒamyQ／ＳＡＶ（図１６）と呼称されるプラスミドを、アンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、ＮｃｏＩによる消化と、続くアガロースゲル電気泳動により検証した。
【０１１２】
ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒamyQ／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶを、まずｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒamyQ／ＳＡＶをＳａｃＩで消化し、子ウシの腸のアルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＰ）で処理して５′のリン酸基を除去することにより構築した。ｃｒｙＩＩＩＡ先導部位を担持する実施例１１のｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒamyL／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶの約３６０ｂｐのＳａｃＩ断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により精製し、ＳａｃＩで切断し、脱リン酸したｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒamyQ／ＳＡＶと結合させた。
【０１１３】
大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。プラスミドＤＮＡを幾つかの形質転換細胞から単離し、ＳａｃＩで消化してスタビライザー配列を含むものを同定した。それらが同定されたら、プラスミドＤＮＡをＸｍｎＩで消化することにより断片の配向を決定した。正しく配向したｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡ安定化配列を含有するプラスミドを同定し、ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒamyQ／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（図１７）と呼称した。
【０１１４】
実施例１５：縦列ａｍｙＱ−ｃｒｙＩＩＩＡプロモーター−ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡスタビライザー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
実施例９のプラスミドｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳｆｉＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼＩでブラントエンド化し、次いでＤｒａＩＩＩで消化した。消化物をアガロースゲル電気泳動にかけ、約６３６０ｂｐのベクター断片をゲルから切り出し、ＤＮＡを実施例１の記載に従って抽出した。
【０１１５】
実施例７のプラスミドｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒamyQ／ＳＡＶをＳａｃＩで消化し、Ｔ４重合酵素Ｉでブラントエンド化し、ＤｒａＩＩＩで消化した。消化物をアガロースゲル電気泳動にかけ、約１７１０ｂｐのプロモーター断片をゲルから切り出し、ＤＮＡを実施例１の記載に従って抽出した。
精製したＤＮＡを合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α細胞中で形質転換した。アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒamyQ／ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（図１８）と呼称されるプラスミドを、アンピシリン耐性形質転換細胞の１つから単離した。プラスミド構造をＳａｃＩによる消化と、続くゲル電気泳動とにより検証した。
【０１１６】
実施例１６：縦列ａｍｙＱ−ｃｒｙＩＩＩＡプロモーター−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
実施例１０のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ＳＡＶをＰａｃＩおよびＤｒａＩＩＩで消化し、約６４５０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。ＰｒamyQおよびＰｒcryIIIAを担持するｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒamyQ／ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（実施例１５）の約１７９０ｂｐのＰａｃＩ−ＤｒａＩＩＩ断片を、実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離し、ベクター断片と結合させた。大腸菌ＤＨ５αをこの連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒamyQ／ＰｒcryIIIA／ＳＡＶ（図１９）と呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから単離した。
【０１１７】
実施例１７：ｃｒｙＩＩＩＡスタビライザー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶを下記のとおり構築した。すなわち、実施例３のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳｆｉＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡ重合酵素で処理して３′の張出し部を除去した。次いでプラスミドをＡｓｐ７１８で消化した。消化物をアガロースゲル電気泳動にかけ、約７５４０ｂｐのＡｓｐ７１８／ブラント化ＳｆｉＩベクター断片をゲルから切り出し、ＤＮＡを実施例１の記載に従って抽出した。
【０１１８】
ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡ重合酵素およびｄＮＴＰで処理して陥凹した３′末端を充填した。次いでプラスミドをＡｓｐ７１８で消化した。消化物を、アガロースゲル電気泳動および端を切り取ったｃｒｙＩＩＩＡプロモーター（「‐１０」領域のみ）を含有する約９２０ｂｐの断片により分離し、下流のｃｒｙＩＩＩＡ安定化配列をゲルから切り出し、ＤＮＡを実施例１の記載に従って抽出した。
【０１１９】
精製したＤＮＡを合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α細胞中で形質転換させた。アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（図２０）と呼称されるプラスミドを形質転換細胞の１つから精製した。
【０１２０】
実施例１８：「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターの構築：
下記の２つのオリゴヌクレオチドを合わせてアニールし、クレノウ断片で延長してａｍｙＱプロモーターの‐１０および‐３５領域中に変異（＊）を含有する６８ｂｐの二重鎖断片を発生させた（太字で強調されている）。
【０１２１】
【化１０】
0004629783.tif 000011
【０１２２】
ａｍｙＱプロモーターの１３７ｂｐの上流領域を有する第二の二重鎖断片を、下記をプライマーに用いてＰＣＲにより発生させた。
【０１２３】
【化１１】
0004629783.tif 000012
【０１２４】
次いで、両二重鎖ＤＮＡ断片を伝統的なＳＯＥ法（ＳＯＥのオーバーラップ部は下線が引かれ、ラベルが付されている）により一緒に融合させて「コンセンサス」ａｍｙＱ  と呼称されるａｍｙＱプロモーターの変異バージョンを発生させた。完全な長さの断片を得るためにＳＯＥ反応に用いたプライマーは、５′−ＧＧＣＣＴＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＣＡ−３′および５′−ＧＡＧＣＴＣＡＴＴＴＴＣＴＴＡＴＡＣＡＡＡＴＴＡＴＡＴ−３′であった。
【０１２５】
増幅ＳＯＥ液（５０μｌ）の成分は、５０ｎｇの６８ｂｐのＳＯＥ断片および５０ｎｇの１３７ｂｐのＳＯＥ断片、１ＸのＴａｑ重合酵素緩衝液、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに２．５単位のＴａｑ重合酵素からなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイクル、９５℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクル、および７２℃で５分間の最終サイクルであった；上記３サイクルの後、上記２つのプライマーの各々５０ｐモルを、残りの２７サイクルの間に添加して、１８５ｂｐのプロモーター断片を増幅した。
【０１２６】
約１８５ｂｐのＰＣＲ生成物を、製造業者の手引書に従ってｐＣＲＩＩベクター中で直接サブクローン化し、前進および復帰Ｍ１３シークエンシングプライマーを用いてｐＣＲＩＩ−Ｐｒ¨consesus¨amyQを産生し、実施例４の記載に従ってＤＮＡシークエンシングにより検証した。
フランキング制限部位を含む全ａｍｙＱプロモーターの配列を図２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）に示した。次の変異、すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２の‐３５領域における位置１３５および１３６でそれぞれＴからＡおよびＴからＣ（転写始動部位に関して）、および‐１０領域における位置１５６でＴからＡへの変換が、野生型ａｍｙＱプロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）を含有する核酸配列中に導入されて「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３）を生成した。また、図２１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４）に示すようにＴからＡへの変換が‐３５領域の約２０塩基対上流の位置１１６で偶然なされた。この変換は、重要な‐１０および‐３５領域から十分遮断されているのでプロモーターの機能に有害な影響を与えなかった。
【０１２７】
実施例１９：短い「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーター−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
短い「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターを、ｐＣＲＩＩ−Ｐｒ¨consesus¨amyQ（実施例１８）から下記のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち
【０１２８】
【化１２】
0004629783.tif 000013
【０１２９】
を用いてＰＣＲ増幅した。
増幅反応液（１００μｌ）の成分は、５０ｎｇのｐＣＲＩＩ−Ｐｒ¨consesus¨amyQ、各５０ｐモルのプライマー、１ＸのＴａｑ重合酵素緩衝液、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに‐１０単位のＴａｑ重合酵素からなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイクル、９５℃で１分間、５０℃で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクルであった。最終サイクルは７２℃で５分間である。
【０１３０】
約１００ｂｐのＰＣＲ生成物を製造業者の手引書に従ってｐＣＲＩＩベクター中でクローン化し、前進および復帰Ｍ１３シークエンシングプライマーを用いてプラスミドｐＣＲＩＩ−Ｐｒshort¨consesus¨amyQを産生し、それをＤＮＡシークエンシングにより実施例４の記載に従って検証した。
Ｐｒshort¨consesus¨amyQをＳｆｉＩおよびＳａｃＩで消化し、プロモーターを担持する約１００ｂｐの断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。実施例５のｐＨＰ１３ａｍｐ−ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＳａｃＩで消化し、約６４３０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。精製物を合わせて結合させ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＰＬ１８０１ｓｐｏＩＩＥ：：Ｔｎ９１７をこの連結反応混合物で形質転換し、クロラムフェニコール耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりクロラムフェニコール５μｇを追加したＴＢＡＢプレート上で選択した。ｐＨＰ１３ａｍｐ−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ＳＡＶと呼称されるプラスミドをクロラムフェニコール耐性形質転換細胞の１つから精製した。
【０１３１】
ｐＨＰ１３ａｍｐ−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ＳＡＶカセットを担持する約１３３０ｂｐの断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。実施例１のｐＤＧ２６８ＭＣＳをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、約６０４０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。精製した断片を合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５αを連結反応物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ＳＡＶ（図２２）と呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、ＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩによる消化と、それに続くゲル電気泳動により検証した。
【０１３２】
実施例２０：短い「コンセンサス」ａｍｙＱの二量体プロモーター−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
実施例１９のｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ＳＡＶをＳｆｉＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡ重合酵素で処理してブラントエンドを生じさせ、ＤｒａＩＩＩで消化した。約５８３０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。またｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ＳＡＶをＥｃｌ１３６ＩＩおよびＤｒａＩＩＩで消化し、Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ＳＡＶを担持する約１６４０ｂｐの断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。精製した断片を合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α細胞中で形質転換させた。アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ dimer／ＳＡＶ（図２３）と呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、構造特異的プライマーを用いて実施例４の記載に従ってＤＮＡシークエンシングにより検証した。
【０１３３】
実施例２１：短い「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーター−ｃｒｙＩＩＩＡスタビライザー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
実施例２のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、約５３９０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。ｐＨＰ１３ａｍｐ−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ＳＡＶを担持する約１３３０ｂｐの断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。精製した断片を合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５αを連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ＳＡＶと呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、ＮｃｏＩによる消化と、それに続くゲル電気泳動により検証した。
【０１３４】
ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ＳＡＶをＳａｃＩで消化し、子ウシの腸のアルカリ性ホスファターゼで処理して５′のリン酸基を除去した。実施例１１のｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒamyL／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳａｃＩで消化し、ｃｒｙＩＩＩＡスタビライザーを担持する約３５０ｂｐの断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ＳＡＶおよびスタビライザー断片を結合させ、大腸菌ＤＨ５αを連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（図２４）と呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、構造特異的プライマーを用いて実施例４の記載に従ってＤＮＡシークエンシングにより検証した。
【０１３５】
実施例２２：縦列の短い「コンセンサス」ａｍｙＱ−ｃｒｙＩＩＩＡプロモーター−ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡスタビライザー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
実施例３のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化した。約６７８０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化した。約１３００ｂｐの発現カセット断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。精製した断片を合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α細胞中で形質転換させた。アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ＳＡＶと呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、ＮｃｏＩによる消化と、それに続くゲル電気泳動により検証した。
【０１３６】
実施例３のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳｆｉＩで消化し、クレノウ断片で処理してブラントエンドを生じさせ、ＤｒａＩＩＩで消化した。約７０６０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ＳＡＶをＥｃｌ１３６ＩＩおよびＤｒａＩＩＩで消化し、短い「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターを担持する約１５４０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。精製した断片を合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α細胞中で形質転換させた。アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（図２５）と呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、ＮｃｏＩによる消化と、それに続くゲル電気泳動により検証した。
【０１３７】
実施例２３：短い「コンセンサス」ａｍｙＱの三量体プロモーター−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
実施例２０のｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ dimer／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ dimer／ＳＡＶカセットを担持する約１２３０ｂｐの断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。実施例３のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、約６７５０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。精製した断片を合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α細胞中を連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ dimer／ＳＡＶと呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、ＮｃｏＩによる消化と、それに続くゲル電気泳動により検証した。
【０１３８】
実施例２３のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ＳＡＶをＥｃｌ１３６ＩＩおよびＢａｍＨＩで消化し、約６８４０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ¨short consesus amyQ¨dimer／ＳＡＶをＳｆｉＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡ重合酵素で処理してブラントエンドを生じさせ、ＢａｍＨＩで消化した。Ｐｒ¨short consesus amyQ¨dimer／ＳＡＶカセットを担持する約１２３０ｂｐの断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。精製した断片を合わせて結合させ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＰＬ１８０１  ｓｐｏＩＩＥ：：Ｔｎ９１７を連結反応混合物で形質転換し、クロラムフェニコール耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン５μｇを追加したＴＢＡＢプレート上で選択した。Ｐｒshort¨consesus¨amyQ trimer／ＳＡＶを含有するクロラムフェニコール耐性のネオマイシン感受性成分を単離した。
【０１３９】
ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮの細菌性ＤＮＡ分離実験計画書（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）を用いてこの成分から単離し、短い「コンセンサス」ａｍｙＱの三量体プロモーターを担持する断片を、下記のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち
【０１４０】
【化１３】
0004629783.tif 000014
【０１４１】
を用いてゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅させた。
増幅反応液（１００μｌ）の成分は、５０ｎｇの６８ｂｐのゲノムＤＮＡ、５０ｐモルの各プライマー、１ＸのＴａｑ重合酵素緩衝液、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに１．０単位のＴａｑ重合酵素からなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイクル、９５℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクル、および７２℃で５分間の最終サイクルである。
【０１４２】
約１０７８ｂｐのＰＣＲ生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）を用いて精製し、短い「コンセンサス」ａｍｙＱの三量体プロモーターの配列を、構造特異的プライマーを用いる実施例４の記載に従ってＰＣＲ生成物のＤＮＡシークエンシングにより検証した。
【０１４３】
実施例２４：短い「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーター−長いｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡスタビライザー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
実施例９のｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡ重合酵素およびｄＮＴＰで処理してブラントエンドを生じさせ、Ａｓｐ７１８で消化した。長いｃｒｙＩＩＩＡスタビライザーおよびＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子解読領域部分を担持する約９１３ｂｐの断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。実施例２３のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／ＳＡＶをＥｃｌ１３６ＩＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、約７７００ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。精製した断片を合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α細胞中で形質転換した。アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒshort¨consesus¨amyQ／長いｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（図２６）と呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、構造特異的プライマーを用いて実施例４の記載に従ってＤＮＡシークエンシングにより検証した。
【０１４４】
実施例２５：「短い」ａｍｙＱの二量体プロモーター−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
「短い」ａｍｙＱプロモーターを下記のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち
【０１４５】
【化１４】
0004629783.tif 000015
【０１４６】
を用いてｐＣＲＩＩ−ＰｒamyQ（実施例７）からＰＣＲ増幅を行なった。
増幅反応液（１００μｌ）の成分は、５０ｎｇのｐＣＲＩＩ−ＰｒamyQ、５０ｐモルの各プライマー、１ＸのＴａｑ重合酵素緩衝液、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ、ならびに１．０単位のＴａｑ重合酵素からなる。増幅条件は、９５℃で３分間の１サイクル、９５℃で１分間、５５℃で１分間、および７２℃で１．５分間の各３０サイクル、および７２℃で５分間の最終サイクルである。
【０１４７】
約１００ｂｐのＰＣＲ生成物を製造業者の手引書に従ってｐＣＲＩＩベクター中でクローン化し、前進および復帰Ｍ１３シークエンシングプライマーを用いてプラスミドｐＣＲＩＩ−Ｐｒ¨short¨amyQを産生し、それをＤＮＡシークエンシングにより実施例４の記載に従って検証した。次に、このプラスミドをＳｆｉＩおよびＳａｃＩで消化し、約１００ｂｐのプロモーター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。実施例６のｐＨＰ１３ａｍｐ−ＰｒamyL／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＳａｃＩで消化し、約６４００ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。次いでこれら２つの断片を合わせて結合させ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８△４細胞（国際特許公開第９８／２２５９８号）中で形質転換した。クロラムフェニコール耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりクロラムフェニコール５μｇを追加したＴＢＡＢプレート上で選択し、形質転換細胞のコロニーの周囲にハローを形成させることによりＳＡＶＩＮＡＳＥが発現するクローンを同定するために２％の乾燥乳を含むＴＢＡＢ寒天を被せた。ｐＨＰ１３ａｍｐ−Ｐｒ¨short¨amyQ／ＳＡＶと呼称されるプラスミドをクロラムフェニコール耐性の、ハローを形成する形質転換細胞の１つから精製し、ＰｖｕＩＩによる消化と、これに続くゲル電気泳動により検証した。次に、このプラスミドをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、約１３００ｂｐの発現カセットの断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。実施例４のｐＤＧ２６８ＭＣＳをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化した。次いで２つの断片を合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α細胞中で形質転換させた。アンピシリン耐性形質転換細胞を１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ¨short¨amyQ／ＳＡＶ（図２７）と呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、ＮｃｏＩによる消化と、それに続くゲル電気泳動により検証した。
【０１４８】
ｐＤＧ２６８ＭＣＳ−Ｐｒ¨short¨amyQ／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｐｒ¨short¨amyQ／ＳＡＶ発現カセットを担持する約１３３０ｂｐの断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。実施例３のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−ＰｒcryIIIA／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳｆｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、約６７５０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。精製した断片を合わせて結合させ、大腸菌ＤＨ５α細胞中で形質転換させた。アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ¨short¨amyQ／ＳＡＶと呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、ＮｃｏＩによる消化と、それに続くゲル電気泳動により検証した。
【０１４９】
ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ¨short¨amyQ／ＳＡＶをＳｆｉＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡ重合酵素で処理してブラントエンドを生じさせ、ＤｒａＩＩＩで消化した。約６５３０ｂｐのベクター断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。また、ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ¨short¨amyQ／ＳＡＶをＤｒａＩＩＩおよびＥｃｌ１３６ＩＩで消化し、「短い」ａｍｙＱプロモーターを実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。精製した断片を結合させ、大腸菌ＤＨ５αを連結反応混合物で形質転換させ、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ¨short¨amyQ dimer／ＳＡＶ（図２８）と呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、構造特異的プライマーを用いて実施例４の記載に従ってＤＮＡシークエンシングにより検証した。
【０１５０】
実施例２６：「短い」ａｍｙＱの二量体プロモーター−ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡスタビライザー−ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットの構築：
実施例２５のｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ¨short¨amyQ dimer／ＳＡＶをＳａｃＩで消化し、子ウシの腸のアルカリ性ホスファターゼで処理して５′のリン酸基を除去した。実施例１１のｐＤＧ２６８ＭＣＳ−ＰｒamyL／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶをＳａｃＩで消化し、ｃｒｙＩＩＩＡスタビライザーを担持する約３５０ｂｐの断片を実施例１の記載に従ってゲル電気泳動により単離した。ｃｒｙＩＩＩＡスタビライザー断片を、ＳａｃＩで切断したｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ¨short¨amyQ dimer／ＳＡＶに結合させた。大腸菌ＤＨ５αを連結反応混合物で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換細胞を、１ｍｌ当たりアンピシリン１００μｇを追加したＬＢプレート上で選択した。ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏ−Ｐｒ¨short¨amyQ dimer／ｃｒｙＩＩＩＡｓｔａｂ／ＳＡＶ（図２９）と呼称されるプラスミドをアンピシリン耐性形質転換細胞の１つから精製し、構造特異的プライマーを用いて実施例４の記載に従ってＤＮＡシークエンシングにより検証した。
【０１５１】
実施例２７：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＰＬ１８０１  ｓｐｏＩＩＥ：：Ｔｎ９１７成分中のＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットのコピー数：
ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）遺伝子発現カセットを、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ株ＰＬ１８０１  ｓｐｏＩＩＥ：：Ｔｎ９１７のａｍｙＥ坐中に各々組込んだ。特に、発現カセットを含有するｐＤＧ２６８ＭＣＳ誘導体をＳｃａＩで消化してプラスミドを線状にした。線状プラスミドＤＮＡ１μｇが、クロラムフェニコール耐性に対して応答能のあるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ  ＰＬ１８０１  ｓｐｏＩＩＥ：：Ｔｎ９１７の形質転換を起こすために用いられた。
【０１５２】
全ての形質転換細胞が、二重乗換えの結果としてａｍｙＥ坐中に発現カセットの単一コピーを含有するべきである。これは、アンピシリン耐性遺伝子（ｐＤＧ２６８ＭＣＳまたはｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ベースのプラスミドから誘導された成分中の）の不在を示すための染色体ＤＮＡ上のＤＮＡドットブロット分析により、またはネオマイシン感受性（ｐＤＧ２６８ＭＣＳ△ｎｅｏベースのプラスミドから誘導された組み込み体内）により確認された。
【０１５３】
ゲノムＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮの細菌性ＤＮＡ分離実験計画書を用いてＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ成分から分離した。ドットブロット分析用には、ゲノムＤＮＡ約３μｇを、総体積１０μｌ中４００ｍＭのＮａＯＨ‐１０ｍＭのＥＤＴＡにより室温で１０分間培養して変性した。変性したＤＮＡ１μｌによってＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍのプラスに帯電させたナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）上に斑点を付け、ＵＶ  ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（商標）２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いたＵＶ架橋により固定した。膜は、ＧＥＮＩＵＳ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ、Ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いてアンピシリン耐性遺伝子ｂｌａ専用のＤＮＡプローブで探査された。ブロットは、検出試薬ＡＴＴＯＰＨＯＳ（商標）（Ａｍｅｅｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）を用いて、ＧＥＮＩＵＳの実験計画書に従って開発された。プローブは、光学的スキャナーＳＴＯＲＭ（商標）８６０およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔのソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて検出された。プローブがゲノムＤＮＡと結合不能であることはｂｌａ遺伝子の不在を示し、それは二重乗換えによるプラスミドの挿入を立証した。
【０１５４】
ｂｌａプローブは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＰＣＲ  ＤＩＧ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いてジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰでＰＣＲ断片を標識することにより創出された。ＰＣＲは、ＤＮＡ重合酵素Ａｍｐｌｉｔａｑ（商標）Ｇｏｌｄおよび熱循環器Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（商標）４０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、９５℃で９分、９５℃、５５℃、および７２℃で各１分の３０サイクル、および７２℃で３分の温度プロファイルにより行なった。プローブは下記のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち
【０１５５】
【化１５】
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【０１５６】
を用いてｐＵＣ１１８から増幅された。
形質転換細胞がＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）発現カセットの単一コピーを含有することが確認されたならば、各発現カセットの単一コピー成分を振とうフラスコ分析により分析した。
実施例２８：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＰＬ１８０１  ｓｐｏＩＩＥ：：Ｔｎ９１７中のＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）の発現：
実施例１９に記載した各発現カセットの単一コピー成分を、ＬＢブロス１ｍｌ中、３７℃で中間対数期まで増殖させた。次いで、中間対数期の各培養物を１０％のスクロース、４％の大豆粉、１％のＮａ2  ＰＯ4・１２Ｈ2Ｏ、０．５％のＣａＣＯ3、および０．０１％のプルロン酸からなるＰＳ−１培地５０ｍｌ中で培養した。培養物を３７℃で５日間激しく振とうした。分割量１ｍｌを３、４、および５日目に取り除き、１２，０００Ｘｇで２分間遠心分離し、各上澄み液０．５ｍｌを全試料が採取されるまで−２０℃で凍結させた。次いで凍結した試料を解凍し、下記の実験計画を用いてＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）の活性を検定し、相対的な収率を決定した。
【０１５７】
ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）の活性の検定は、基質としてカゼイン・フルオレセイン・イソチオシアネートを用いて行なった。カゼイン・フルオレセイン・イソチオシアネートの原液は、Ｔｗｉｎｉｎｇの論文、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １４３：３０〜３４，１９８４に従って調製され、５０ｍＭのトリス−ＣｌｐＨ７．２緩衝液１００ｍｌ当たりカゼインフルオレセインイソチオシアネート０．５ｍｇを含有した。検定反応は、適当量の０．２５Ｍのホウ酸塩ｐＨ９．０緩衝液で希釈した酵素試料１０μｌに対して０．２５Ｍのホウ酸塩ｐＨ９．０緩衝液を１：１ｖ／ｖで混合した原液４０μｌを添加することにより開始させた。反応物を３７℃で１０分間培養し、次いで５％のトリクロロ酢酸１５０μｌを加えることにより冷却した。冷却した反応物を低温室中に１０分間置き、次いで最高速度で２分間遠心分離した。上澄み液の分割量１０μｌを、０．５Ｍのホウ酸塩ｐＨ９．０緩衝液２ｍｌを含有する試験管に移し、よく混合した。この溶液の分割量２００μｌを黒い「Ｕ」底の９６ウェルプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｔａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）に移し、蛍光を、蛍光光度計Ｆｌｕｏｒｏｌｉｔｅ‐１０００（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｔａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）を使用して基準設定値１１７６でチャンネル３およびランプ電圧４．１Ｖを用いて測定した。ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）の活性は、１ｍｌ当たり１．８〜９．０  ＮＰＵ（Ｎｏｖｏ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｕｎｉｔ）の範囲にあるＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）標準（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ，Ｂａｓｖａｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）により作成した標準曲線を参照して計算された。標準の活性は、要求に応じてＮｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ  Ａ／Ｓ，Ｂａｓｖａｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋから入手可能なＮｏｖｏ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  ＡＦ  ２２０／１−ＧＢに従って決定される。
【０１５８】
結果を表１に示す。ａｍｙＱ、ａｍｙＬ、およびｃｒｙＩＩＩＡプロモーター（スタビライザー配列のない）のＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）検定の結果に基づく強度は、全てほぼ等しい。ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡスタビライザー配列がこれらのプロモーターの下流に置かれた場合、これらの活性はかなり増加した（発現レベルにおいて少なくとも１．７倍の増加）。しかしながら、ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡスタビライザー配列が縦列プロモーターの下流に含まれた場合、活性は、単一型プロモーター単独よりも４倍を超えて高く、ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡスタビライザー配列が含まれた単一型プロモーターよりも２倍を超えて高い。ｃｒｙＩＩＩＡのｍＲＮＡスタビライザー配列がプロモーターなしで用いられた場合、ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）の発現はきわめて低く、スタビライザー配列の増進効果がスタビライザー配列内のプロモーターの活性のせいではないことを示した。したがって、ｃｒｙＩＩＩＡプロモーターの上流にａｍｙＱまたはａｍｙＬプロモーターなどのプロモーターおよびそのｍＲＮＡ安定化配列を配置することによって、任意の単一型プロモーター単独よりもかるかに優れた縦列プロモーターを創出することができる。
【０１５９】
また、より強いプロモーター、すなわち「コンセンサス」ａｍｙＱおよび「短いコンセンサス」ａｍｙＱプロモーターにするために本明細書に記載のようにａｍｙＱプロモーターなどのプロモーターを修飾することによって、より高レベルの遺伝子の発現を得ることが可能であることをこの結果は示した。これらのプロモーターは両者とも、それらが導き出された野生型ａｍｙＱプロモーターよりも約４倍強い。さらに、より高レベルの発現を、「短いコンセンサス」プロモーターの下流にｃｒｙＩＩＩＡの長いｍＲＮＡスタビライザー配列を配置することにより得ることができた。この特殊な組み合わせは、ｍＲＮＡの飽和レベルおよびＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）の発現の最大レベル、すなわち十分に増幅された株に匹敵するレベル（野生型ａｍｙＱプロモーター単独の６倍を超える増加）をもたらす。
【０１６０】
さらに結果は、より高いレベルの発現が「頭から尾まで」の方式で単一型プロモーターの２つ以上のコピーを組合わせることにより得られることを示した。これは、単一の短い「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーター、二量体の短い「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーター、および三量体の短い「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターから得られた発現レベルを比較することによりはっきりと例示される。ＳＡＶＩＮＡＳＥ（商標）の発現レベルは、モノマーのプロモーターと比較して後者の２つはそれぞれ１．５倍および１．８倍高かった。
【０１６１】
全体の結果は、下記の方法を用いて単一コピーの転写を増加することができることを示した。すなわちｃｒｙＩＩＩＡプロモーターの上流にａｍｙＱおよびａｍｙＬプロモーターなどのプロモーターおよびそのｍＲＮＡ安定化配列を配置することによる縦列プロモーターの創出、ｃｒｙＩＩＩＡ  ｍＲＮＡ安定化配列による「コンセンサス」ａｍｙＱプロモーターの創出、および短い「コンセンサス」ａｍｙＱ二量体および三量体プロモーターなどの単一型プロモーターの縦列コピーの創出である。これら全ての方法は、ａｍｙＱおよびａｍｙＬなどの単一型プロモーターを用いて得られたレベルと比較した場合、著しく高レベルの遺伝子の発現につながる。
【０１６２】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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