(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の何れかのアミノ酸配列からなり、Δ１１不飽和活性およびΔ１０，１２不飽和活性を有する脂肪酸不飽和化酵素を脂肪酸に作用させることによりΔ１１不飽和化反応及びΔ１０，１２不飽和化反応を行うことを含む、不飽和脂肪酸の製造方法。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、脂肪酸に対してΔ１１不飽和活性およびΔ１０，１２不飽和活性を有するアミノ酸配列；
【請求項２】
下記の何れかのアミノ酸配列からなり、Δ１１不飽和活性およびΔ１０，１２不飽和活性を有する脂肪酸不飽和化酵素をΔ１１不飽和脂肪酸に作用させることによりΔ１０，１２不飽和化反応を行うことを含む、Δ１０、１２共役不飽和脂肪酸の製造方法。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列からなり、脂肪酸に対してΔ１１不飽和活性およびΔ１０，１２不飽和活性を有するアミノ酸配列；
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪酸不飽和化酵素、その製造方法、及びそれを用いた不飽和脂肪酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの蛾類(昆虫綱：鱗翅目)は、性フェロモン(種特有の匂い成分の混合物)を放出して、同種交尾相手を惹きつける(非特許文献１)。これらのメス蛾により生成される性フェロモン成分の主なクラスは、腹部フェロモン腺細胞において新たに合成される、飽和C16またはC18脂肪酸中間体から誘導される酸化官能基(アルデヒド、アルコール、または酢酸エステル)を含む直鎖C10-C18不飽和脂肪族化合物の特徴を有している(非特許文献２)。
【０００３】
過去20年間にわたる研究から、このクラスのフェロモン成分の生合成経路についての一般的スキームが確立されており、それによれば、脂肪酸中間体が、不飽和化反応および炭素鎖短縮反応の組合せ、その後のカルボニル炭素の還元的修飾を経て、最終成分に段階的に変換される(非特許文献３)。この生合成経路では、様々な組合せの炭素鎖短縮反応及び部位・立体特異的不飽和化反応が、鱗翅目における多数の種特異的フェロモン成分の生成に著しく寄与している。炭素鎖短縮反応で使用される酵素は未だ同定されていないが、様々な蛾種のフェロモン腺中で発現される不飽和化酵素についてはこれまでの研究から、異なる部位および立体特異性を有する多様な不飽和化酵素が独特のフェロモン成分の生成に関与していることが明らかになっている(非特許文献４)。
【０００４】
生物から最初に化学的に同定されたフェロモンとして知られるボンビコール、即ち、(E,Z)-10,12-ヘキサデカジエン-1-オールは、家蚕Bombyx moriにより生成される主要な性フェロモン成分である(非特許文献１及び５)。中間体パルミテート(16：アシル)からのボンビコールの生合成は単純な過程であり、炭素鎖短縮およびヒドロキシ基修飾の両方に必要な反応が関与せず、３つの連続した生化学反応(すなわち、Ｚ11-不飽和、（Ｅ，Ｚ）−10,12-不飽和化、および脂肪酸アシル還元)が必要となる(非特許文献２及び６)。これらの反応のうち、本発明者らは最近、フェロモン腺脂肪酸アシルレダクターゼ(pgFAR)と名付けた脂肪酸アシル基還元に関与する酵素の性質を明らかにした(非特許文献７)。しかしながら、下記の２つの不飽和反応に関与する不飽和化酵素は未だ同定されていない。第１の不飽和反応は、多くの蛾種のフェロモン生合成において使用されるように、Z11-16：脂肪酸-生成Δ11-不飽和化酵素によって触媒される一般的な反応であり、第２の不飽和反応は、Δ11-モノエンC16中間体中の二重結合のアリル位における２つの水素原子の1,4脱離を介して共役ジエン系を生成する独特な反応である(非特許文献２)。
【０００５】
【非特許文献１】Tamaki, Y. (1985) Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry, and Pharmacology, eds. Kerkut, G. A. & Gilbert, L. I. (Pergamon, New York), 9, pp. 145-191.
【非特許文献２】Bjostad, L. B., Wolf, W. A. & Roelofs, W. L. (1987) Pheromone Biochemistry, eds. Prestwich, G. D. & Blomquist, G. J. (Academic, Orlando), pp.77-120.
【非特許文献３】Tillman, J. A., Seybold, S. J., Jurenka, R. A. & Blomquist, G. J. (1999) Insect Biochem. Molec. Biol. 29, 481-514.
【非特許文献４】Roelofs, W. L., Liu, W., Hao, G., Jiao, H., Rooney, A. P. & Linn, C. E. Jr. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 13621-13626.
【非特許文献５】Butenandt, A., Beckman, R., Stamm, D. & Hecker, E. (1959) Z. Naturforsch. B14, 283-284.
【非特許文献６】Ando, T., Hase, R., Arima, R., & Uchiyama, M. (1988) Agric. Biol. Chem. 52, 473-478.
【非特許文献７】Moto, K., Yoshiga, T., Yamamoto, M., Takahashi, S., Okano, K., Ando, T., Nakata, T., & Matsumoto, S. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 9156-9161.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記の通り、カイコガ(Bombyx mori)性フェロモンであるボンビコール（(E,Z)-10,12-ヘキサデカジエン-1-オール）の生合成過程では、連続した２段階の脂肪酸不飽和化反応、即ち、palmitateを基質としたΔ11およびΔ10，12不飽和化が起こる。本発明は、この反応に関わる脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を解析して、酵素としての性質を明らかにすることを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために、カイコガ(Bombyx mori)の近交系であるp50から新規desatの単離を試みた結果、カイコガフェロモン腺特異的に発現しているp50 desat1を同定した。そこで、p50 desat1を昆虫細胞で発現させたところ、ボンビコール生合成の中間体（Z11−16）および前駆体（E10,Z12-16）の脂肪酸が生成したことから、p50 desat1がコードする脂肪酸不飽和化酵素は、Δ11およびΔ11，12不飽和化の両活性を併せ持つことが判明した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
【０００８】
即ち、本発明によれば、下記の何れかのアミノ酸配列を有し、Δ１１不飽和活性およびΔ１０，１２不飽和活性を有する脂肪酸不飽和化酵素が提供される。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、脂肪酸に対してΔ１１不飽和活性およびΔ１０，１２不飽和活性を有するアミノ酸配列；
【０００９】
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子又は上記遺伝子を含む組み換えベクターを有する形質転換体を培養し、培養物から請求項１に記載の脂肪酸不飽和化酵素を採取することを含む、本発明の脂肪酸不飽和化酵素の製造方法が提供される。
【００１０】
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の脂肪酸不飽和化酵素を脂肪酸に作用させることによりΔ１１不飽和化反応及びΔ１０，１２不飽和化反応を行うことを含む、不飽和脂肪酸の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の脂肪酸不飽和化酵素をΔ１１不飽和脂肪酸に作用させることによりΔ１０，１２不飽和化反応を行うことを含む、Δ１０、１２共役不飽和脂肪酸の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
鱗翅目昆虫（ガ類）の性フェロモン腺の多くは炭素数１０〜１８の直鎖脂肪族化合物で、一つの官能基（アルコール、アルデヒド、アセテートエステル）を持つ。これらフェロモン成分は種特異的で異なる化合物であり、２００１年の時点で５１０種のガの性フェロモンが同定されているが、脂肪酸不飽和化酵素はその種特異性を作り出す上で重要な役割を果たしている。本発明で用いたカイコガDesat1は、多鱗翅目昆虫で既知のZ11不飽和化活性のほかに、これまで報告例のないZ11コンジュガーゼ活性を有する新規脂肪酸不飽和化酵素である。本発明の酵素を利用することにより、性フェロモン生合成のみならず、他の脂肪酸不飽和化の新しいメカニズムの解明および酵素活性を利用した新たな応用が期待できる。
【００１２】
また、共役脂肪酸は昆虫性フェロモン前駆体以外にも、特定の植物種子や反芻動物の胃に存在する。近年、共役リノレン酸がその摂取により抗ガン作用や抗肥満作用を示すことが報告され、より薬理的効果の高い新規共役脂肪酸の探索が行われるなど、医療品、食品などの分野で特に注目を集めている。本発明の酵素を利用することにより、新規共役脂肪酸の創製が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
（１）本発明の酵素
本発明者らは、カイコガ(Bombyx mori)の近交系であるp50より新規desatの単離を試みた結果、カイコガフェロモン腺特異的に発現しているp50 desat1を同定した。取得したp50 desat1遺伝子のアミノ酸配列と塩基配列を配列表の配列番号１及び２に示す。
【００１４】
即ち、本発明の酵素は、下記の何れかのアミノ酸配列を有し、Δ１１不飽和活性およびΔ１０，１２不飽和活性を有する脂肪酸不飽和化酵素である。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列；又は
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、脂肪酸に対してΔ１１不飽和活性およびΔ１０，１２不飽和活性を有するアミノ酸配列；
【００１５】
本発明において、Δ１１不飽和活性とは、基質となる脂肪酸の１１位の単結合を不飽和化して二重結合を生成する活性を意味し、Δ１０，１２不飽和活性とは、１１位の二重結合を不飽和化して、Δ１０，１２に共役二重結合を生成する活性を意味する。
本発明の酵素は、上記したΔ１１不飽和活性とΔ１０，１２不飽和活性とを併有していることを特徴とする。
【００１６】
本発明の遺伝子及びその相同遺伝子は、例えば、ガ類などの昆虫、具体的には、カイコガ(Bombyx mori)、ヨトウガ（Mamestra brassicae）、ハスモンヨトウ（Spodoptera litura）、イラクサギンウワバ（Trichoplusia ni）、タバコガ類（Helicoverpa zea, Helicoverpa armigera, Heliothis virescens）、タバコスズメガ（Manduca sexta）などから単離することができる。
【００１７】
本明細書で言う「１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は特には限定されないが、例えば、１から２０個、好ましくは１から１０個、より好ましくは１から７個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
【００１８】
アミノ酸置換の例としては、類似した性質を有するアミノ酸同士で置換を行う保存的置換が好ましい。類似した性質を有するアミノ酸の組み合わせとしては、例えば、以下のグループが挙げられる。（グリシン、アラニン）（バリン、イソロイシン、ロイシン）（アスパラギン酸、グルタミン酸）（アスパラギン、グルタミン）（セリン、トレオニン）（リジン、アルギニン）（フェニルアラニン、チロシン）。アミノ酸の置換は、上記グループ内のアミノ酸同士での置換が好ましい。
【００１９】
本発明の酵素をコードする遺伝子の取得方法は特に限定されない。本明細書中の配列表の配列番号１及び２に記載したアミノ酸配列及び塩基配列の情報に基づいて適当なブローブやプライマーを調製し、それらを用いてガ類などの昆虫（例えば、カイコガ(Bombyx mori)など）のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより本発明の遺伝子を単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、本発明の遺伝子を発現している細胞から常法により作製することができる。
【００２０】
ＰＣＲ法により本発明の遺伝子を取得することもできる。上記した昆虫由来の染色体ＤＮＡライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号２に記載した塩基配列を増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒〜１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を1サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができる。次いで、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることができる。
【００２１】
上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２２】
また、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有し、本発明の脂肪酸不飽和化酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子については、配列番号１及び２に記載のアミノ酸配列および塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
【００２３】
例えば、配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２４】
本発明の脂肪酸不飽和化酵素は、基質である脂肪酸に作用すると、不飽和化反応を触媒し、対応する不飽和脂肪酸を生成する。上記方法による不飽和脂肪酸の製造方法も本発明の範囲内に含まれる。また、本発明の脂肪酸不飽和化酵素は、酵素剤として試薬の形態で使用することもできる。
【００２５】
本発明の脂肪酸不飽和化酵素の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換えタンパク質でもよい。
組み換えタンパク質を作製する場合には、先ず、上記に記載した当該脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子（ＤＮＡ）を取得する。このＤＮＡを適当な発現系に導入することにより、本発明の酵素を産生することができる。
【００２６】
（２）本発明の脂肪酸不飽和化酵素の製造方法
上記（１）に記載した本発明の脂肪酸不飽和化酵素をコードする遺伝子又は上記遺伝子を含む組み換えベクターを有する形質転換体を培養し、培養物から本発明の脂肪酸不飽和化酵素を採取することにより、本発明の脂肪酸不飽和化酵素を製造することができる。
【００２７】
上記において、本発明の酵素をコードする遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
【００２８】
好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００２９】
細菌細胞で作動可能なプロモータとしては、バチルス・ステアロテルモフィルス・マルトジェニック・アミラーゼ遺伝子(Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase gene)、バチルス・リケニホルミスαアミラーゼ遺伝子(Bacillus licheniformis alpha-amylase gene)、バチルス・アミロリケファチエンス・BANアミラーゼ遺伝子(Bacillus amyloliquefaciens BAN amylase gene)、バチルス・サブチリス・アルカリプロテアーゼ遺伝子(Bacillus Ｓubtilis alkaline protease gene)もしくはバチルス・プミルス・キシロシダーゼ遺伝子(Bacillus pumilus xylosldase gene)のプロモータ、またはファージ・ラムダのＰR若しくはＰLプロモータ、大腸菌の lac、trp若しくはtacプロモータなどが挙げられる。
【００３０】
哺乳動物細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＳＶ４０プロモータ、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ、またはアデノウイルス２主後期プロモータなどがある。昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。酵母宿主細胞で作動可能なプロモータの例としては、酵母解糖系遺伝子由来のプロモータ、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータ、ＴＰＩ１プロモータ、ＡＤＨ2-4cプロモータなどが挙げられる。糸状菌細胞で作動可能なプロモータの例としては、ＡＤＨ３プロモータまたはｔｐｉＡプロモータなどがある。
【００３１】
また、本発明の遺伝子は必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル(例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの)、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。本発明の組み換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。
【００３２】
本発明の組み換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン若しくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の遺伝子、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。
本発明の遺伝子又は組み換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。
本発明の遺伝子または組み換えベクターを導入される宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現できれば任意の細胞でよく、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。
【００３３】
細菌細胞の例としては、バチルスまたはストレプトマイセス等のグラム陽性菌又は大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
哺乳類細胞の例としては、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＬ細胞またはＣＨＯ細胞等が挙げられる。哺乳類細胞を形質転換し、該細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法も公知であり、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等を用いることができる。
【００３４】
酵母細胞の例としては、サッカロマイセスまたはシゾサッカロマイセスに属する細胞が挙げられ、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevis1ae)またはサッカロマイセス・クルイベリ(Ｓaccharomyces kluyveri)等が挙げられる。酵母宿主への組み換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロブラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。
【００３５】
他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス、ニューロスポラ、フザリウム、またはトリコデルマに属する細胞である。宿主細胞として糸状菌を用いる場合、ＤＮＡ構築物を宿主染色体に組み込んで組換え宿主細胞を得ることにより形質転換を行うことができる。ＤＮＡ構築物の宿主染色体への組み込みは、公知の方法に従い、例えば相同組換えまたは異種組換えにより行うことができる。
【００３６】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる（例えば、Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manua1；及びカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Bio/Technology, 6, 47(1988)等に記載）。
【００３７】
バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
【００３８】
上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、本発明の酵素タンパク質を単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。
例えば、本発明の酵素タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。
【００３９】
（３）本発明の脂肪酸不飽和化酵素の利用
本発明の脂肪酸不飽和化酵素を基質としての脂肪酸に作用させることにより不飽和化反応を行い、これにより不飽和脂肪酸を製造することができる。ここで基質として用いることができる脂肪酸としては、炭素数１４〜１８の直鎖脂肪酸が好ましい。具体的には、テトラデカン酸、ペンタデカン酸、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、ヘプタデカン酸、オクタデカン酸（ステアリン酸）などが挙げられ、特に好ましくはヘキサデカン酸（パルミチン酸）である。なお、本発明では、本発明の脂肪酸不飽和化酵素をΔ１１不飽和脂肪酸に作用させることによりΔ１０，１２不飽和化反応を行うことによってΔ１０、１２共役不飽和脂肪酸を製造することもできる。さらにまた、本発明の酵素を用いた不飽和脂肪酸の製造方法としては、本発明の酵素が、Δｎ（ｎは二以上の整数）の不飽和化を行う活性と、それに引き続きΔｎ-１、ｎ+１の不飽和化（共役不飽和化）を行う活性とを有することから、上記以外の脂肪酸を基質として用いて、所望の共役不飽和脂肪酸を製造することもできる。基質としては、飽和脂肪酸を使用してもよいし、Δｎ不飽和脂肪酸を使用してもよい。
【００４０】
本発明の脂肪酸不飽和化酵素を利用して脂肪酸の不飽和化反応を行うことにより、例えば、各種の生理活性（例えば、抗ガン作用や抗肥満活性など）を有することが期待される不飽和脂肪酸を製造することが可能になる。このような不飽和脂肪酸は、医薬品、健康食品などの分野で産業上広く使用することができる。
以下の実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
（Ａ）材料および方法
（１）昆虫
B.moriを、25℃にて、16:8(L：D)の下、人工飼料で既報の通り生育させた(Fonagy, A., Matsumoto, S., Uchiumi, K., Orikasa, C. & Mitsui, T. (1992) J. Pesticide Sci. 17, 47-54)。
【００４２】
（２）cDNAクローニング
フェロモン生成中にフェロモン腺で発現するB.mori不飽和化酵素遺伝子を同定するために、羽化直後のB.moriの近交系p50からフェロモン腺を得た(Yoshiga, T., Okano, K., Mita, K., Shimada, T. & Matsumoto, S. (2000) Gene 246, 339-345)。最も量の多い不飽和化酵素遺伝子desatlについて、既報の(Moto, K., Yoshiga, T., Yamamoto, M., Takahashi, S., Okano, K., Ando, T., Nakata, T., & Matsumoto, S. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 9156-9161)p50フェロモン腺cDNAライブラリーを、desatlの519-bp DNA断片をプローブとして、ECL direct nucleic acid labeling and detection system(Amersham Biosciences)を使用してスクリーニングした。プローブとして使用した519-bp DNA断片を、交雑種Shuko×Ryuhakuからクローニングした2,029-bp B.mori desatl cDNAから設計したプライマーセット5'-CTAAATTACTAAAATGCCTCC-3'（配列番号３）および5'-AAATATCTGACATGTCAAGGC-3'（配列番号４）を用いて増幅した(Yoshiga, T., Okano, K., Mita, K., Shimada, T. & Matsumoto, S. (2000) Gene 246, 339-345)。pBluescriptベクターへのサブクローニング後、陽性クローンのインサートを、ABI PRISM 377XL DNAシーケンサー(Applied Biosystems)で、BigDye Terminator Cycleシークンシングキットv1.1(Applied Biosystems)を使用して、製造元の指示書に従って配列決定した。
【００４３】
（３）RT-PCR
B.moriの羽化直後のメス蛾から得た様々な組織由来の全RNA(各１μg)を、TRIzol試薬(Invitrogen)で調製し、RNA PCRキットVer.2.1(Takara Bio, Otsu, Japan)を用いて逆転写した。RT-PCRは、LA Taqポリメラーゼ(Takara Bio)を使用して行い、その条件は最初に94℃で３分間インキュベートし、次いで、94℃で１分間、55℃で１分間および68℃で30秒間を20サイクル行った。使用した遺伝子特異的プライマーセットは、desatl用として、5'-CGAGATCCTGTTGATGGTC-3'（配列番号５）および5'-ATGCATTTGCCATGCCAC-3'（配列番号６）を使用した。PCR産物を、２％アガロースゲル上で分析し、臭化エチジウムで可視化した。
【００４４】
（４）組換えバキュロウイルスの構築
ポリヘドリンプロモーターの下流にp50 desat1の330-アミノ酸のORFを含むpFASTBac-desat1と命名したプラスミドを、pFastBacTM1ベクター(Invitrogen)を用いて作製した。pFASTBac-desat1の構築のために、一対の遺伝子特異的プライマー、すなわち、5'-AAAGAATTCAAAAAATGCCTCCTAATTCAG-3'(EcoRI部位を含む)（配列番号７）および5'-AAAGGTACCTCAATTCATTCCATTTGGTCG-3'(KpnI部位を含む)（配列番号８）を設計した。PCRは、KOD-Plus-(Toyobo, Osaka)を使用して行い、その条件は最初に94℃にて２分間インキュベートし、次いで94℃で15秒間、45℃で30秒間および68℃で72秒間を25サイクルとした。PCR産物を、KpnIおよびEcoRI(Takara Bio)で二重消化し、アガロースゲル電気泳動で分離し、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)でアガロースゲルから精製した。精製したDNAを、KpnIおよびEcoRIで予め消化した線状pFastBacTM1ベクターにライゲートし、配列決定した。発現カセットpFASTBac-desat1を、DH10Bacコンピテント細胞(Invitrogen)中のバキュロウイルスゲノム(バクミドDNA)に、Tn7部位特異的転位(transposition)により、Bac-to-Bac発現系(Invitrogen)用の製造元の指示書に従って導入した。得られた組換えバクミドDNAを、Wizard Plus SV Minipreps DNA精製系(Promega)で精製し、リポフェクチン試薬(Invitrogen)を使用してSf9細胞(Invitrogen)にトランスフェクトした。27℃にて４日間インキュベーションした後、得られた組換えバキュロウイルス（desat1-AcNPVと命名）をプラーク純化し、Sf9細胞中で増殖させた。対照組換えバキュロウイルスであるBac1-AcNPVも、pFastBacTM1を使用して同様に調製した。ウイルス価を、通常のプラークアッセイにより測定した。
【００４５】
（５）機能アッセイ
細胞培養皿(150 mm×25 mm)中のSf9細胞(1.4×107細胞)を、desat1-AcNPVまたはBac1-AcNPVで、感染多重度(MOI)10として感染させ、10％熱不活化FBS(Sigma)を補充した20 mlのIPL41培地(Invitrogen)中でインキュベートした。27℃で４日間インキュベーションした後、50 mlチューブで200×ｇで５分間、Beckman CS-6KR遠心分離機で遠心することにより細胞を回収した。細胞ペレットを、2mlのPBSで懸濁し、11 mlパイレックス管(Iwaki)に移した。細胞懸濁液を、2 mlのn-ヘキサン、次に2 mlのクロロホルム/メタノール(2：1)で抽出した。蒸発後、混合した抽出物を、0.2 mlの0.5 N KOH/メタノール中で室温にて２時間、アルカリメタノリシスし、次いで、0.8 mlの蒸留水および0.1 mlの1N HClを添加して中和した。1 ml n-ヘキサンで３回抽出した後、得られた脂肪酸メチルエステルを50μlまで濃縮し、HP5973シリーズ質量分析機に連結したHP-5キャピラリーカラム(内径0.25 mm×30 m、Agilent, Germany)を備えたHewlett Packard 6890ガスクロマトグラフを使用して、1μlのアリコートをGC/MSにより分析した。オーブン温度勾配は、50℃で１分間、次いで10℃/分で160℃まで、最後に４℃/分で220℃まで昇温させた状態で５分間維持するようプログラミングした。
【００４６】
基質として使用した遊離脂肪酸は、D3-パルミチン酸(ヘキサデカン酸-16,16,16,-D3酸,D3-16：酸)(Isotec)、(Z)-11-パルミチン酸(Z11-16：酸)( Moto, K., Yoshiga, T., Yamamoto, M., Takahashi, S., Okano, K., Ando, T., Nakata, T., & Matsumoto, S. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 9156-9161)である。n-ヘキサンに溶解させたこれらの基質を、インキュベーションバイアルに添加し、インキュベーション前に溶剤を蒸発させた。不飽和脂肪酸メチルエステルの二重結合位置を、モノエン酸についてはジメチルジスルフィド(DMDS)付加物(Buser, H. R., Arn, H., Guerin, P. & Rauscher, S. (1983) Anal. Chem. 55, 818-822.)、または共役ジエン酸については4-メチル-1,2,4-トリアゾリン-3,5-ジオン(MTAD)付加物(Young, D. C., Vouros, P., and Holick, M. F.. (1990) J. Chromatogr. 522, 295-302；及びMcElfresh, J. S. & Millar, J. G. (1999) J. Chem. Ecol. 25, 687-709)のMS分析により検証した。オーブン温度勾配は、50℃にて1分間、次いで10℃/分で240℃まで、そして最後に４℃/分で320℃まで昇温させた状態で５分間維持するようプログラミングした。GCにおいてE10,E12-16:MeおよびE10,Z12-16:Meは、合成標準(standard)の保持時間に基づき評価した(Moto, K., Yoshiga, T., Yamamoto, M., Takahashi, S., Okano, K., Ando, T., Nakata, T., & Matsumoto, S. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 9156-9161)。
【００４７】
（Ｂ）結果
（１）B.moriのフェロモン腺脂肪族アシル不飽和化酵素をコードするcDNAクローン
Bombyx moriの発現配列タグ(EST)データベースからアシル-CoA不飽和化酵素ホモログ(desat1-3)をコードする遺伝子を既に取得されていた(Yoshiga, T., Okano, K., Mita, K., Shimada, T. & Matsumoto, S. (2000) Gene 246, 339-345)。遺伝子desat1およびdesat2(GenBank受託番号AF157627およびAF182405)は、フェロモン腺中で特異的に発現することが示されていたが、これらは、B.moriのヘテロ接合体に由来する対立遺伝子であると考えられた(ハイブリッド系、Shuko×Ryuhaku)。本発明ではこのような曖昧さを無くすために、B.moriの近交系であるp50を使用し、フェロモン生成の間にフェロモン腺において発現されるアシル-CoA不飽和化酵素遺伝子をクローニングおよび同定した。まず、p50フェロモン腺cDNAライブラリーからdesat1 cDNAを、ハイブリッド株Shuko×Ryuhakuの2,029-bp B.mori desat1 cDNAから調製した519-bp断片をプローブとして使用してクローニングした(Yoshiga, T., Okano, K., Mita, K., Shimada, T. & Matsumoto, S. (2000) Gene 246, 339-345)。クローニングしたp50 desat1の完全長cDNAの長さは、2,019塩基であり（配列番号２）、ORFは330アミノ酸（配列番号１）をコードしており、これは、Shuko×Ryuhaku desat1タンパク質の105番目のアミノ酸残基において１アミノ酸の置換(Iの代わりにL)を有し、Helicoverpa zea(GenBank受託番号AF272342)およびTrichoplusia ni(GenBank受託番号AF035375)由来の公知のZ11不飽和化酵素に対してそれぞれ70％および64％の同一性を示した。ゲノムサザンブロット分析により、desat1がp50ゲノムにおいて単一コピーであることが確認された。
【００４８】
（２）RT-PCRを使用した不飽和化酵素の転写産物の検出
本発明の不飽和化酵素（p50 desat1）の遺伝子転写産物のレベルを調べるために、羽化直後のメス蛾からB.moriフェロモン腺を調製し、転写産物を、遺伝子特異的プライマーを使用したRT-PCRにより分析した結果を図１に示す。図１の結果から分かるように、p50 desat1は、フェロモン腺中で多量に特異的に発現している一方、全頭、飛翔筋、マルピーギ管、精巣および卵巣では発現は検出されなかった(図１)。
【００４９】
（３）Bac-to-Bacバキュロウイルス発現系におけるB.mori Desat 1の機能的アッセイ
RT-PCRによる不飽和化酵素遺伝子転写産物の分析結果から、desat1が、フェロモン生成の間にフェロモン腺中で活発に発現される唯一の不飽和化酵素遺伝子であることが示された。B.mori Desat1の不飽和化酵素活性を調べるために、Desat1-AcNPVおよびBac1-AcNPVと命名した組換えバキュロウイルスを構築した。Desat1-AcNPVは、desat1の330アミノ酸のORFを含み、ポリヘドリンプロモーターの制御下でB.mori Desat 1タンパク質を発現するが、Bac1-AcNPVは発現しない。組換えウイルスによる感染、および27℃で４日間インキュベーションした後、感染したSf9細胞から脂肪アシル化合物を抽出し、これをアルカリメタノリシスにより脂肪酸メチルエステル(FAME)に変換し、GC/MSにより分析した。Bac1-AcNPVでの対照実験では、感染細胞は、いくつかのバックグラウンドFAME(Z9-16:Me、C16:Me、Z9-18:Me、Z11-18:Me、およびC18:Me)を示した(図２Ａ)。対照的に、Desat1-AcNPVに感染した細胞は、C16-およびC18-不飽和FAMEの領域においてさらなるピークを生じ(図２Ｂ)、B.mori desat1遺伝子が機能的に発現されたことを示した。この実験では、Z11-16:Meが新たに生成されたFAMEにおいて優先的に生成され、B.mori Desat1がZ11-不飽和化酵素活性を有し、従ってボンビコール生合成におけるC16:アシルからの第１の不飽和反応に関与することが示された。興味深いことに、Desat1-AcNPVで感染した細胞が、モノエンZ11-16:Me以外に、３つの異なるC16ジエンを同時に生成したことも判明した(図２Ｂ)。MSによるMTAD付加物についてのこれらのジエンの構造解明、および合成化合物との比較から、これらが共役ジエン異性体であることを確認した(主要生産物E10,Z12-16:MeおよびE10,E12-16:Me、及びΔ9,11-16:Me)。これらの共役ジエンが生成することから、Δ9,11-16:Meは、B.mori Desat1のZ11-不飽和化酵素活性による豊富な代謝Z9-16:アシルから簡単に生成されると考えられる。対照的に、E10,Z12-16:MEおよびE10,E12-16:Me(5:1比、図２Ｂ)は興味深かった。なぜなら、E10,Z12-16:アシルはボンビコールの直前の前駆体であり、ボンビコール生合成の２段階目の不飽和化においてZ11-16:アシルから産生されることが証明されているからである(Ando, T., Hase, R., Arima, R., & Uchiyama, M. (1988) Agric. Biol. Chem. 52, 473-478)。また、B.moriのメスは、通常主要フェロモン成分であるE10,Z12-16:OHに加え、そのボンビコールとは５：１の割合でマイナー成分であるE10,Z12-16:OHを産生する（Kasang, G.& Schneider D. (1987) naturwissenschaften 65, 337-338）。このように新たに生じたE10,Z12-16:アシルもまたZ11-16:アシルに由来するそのマイナー成分E10,Z12-16:OHの直前の前駆体であると考えられる。従って、これらの結果は、B.mori Desat1が、ボンビコール生合成における２つの連続不飽和反応に関与する、Z11不飽和化およびΔ10,12共役化の両方の活性を有する特有の不飽和化酵素であることを示している。
【００５０】
鎖伸長反応が昆虫細胞Sf21に存在することが報告されている(Liu, W., Jiao, H., Murray, N. C., O'Connor, M. & Roelofs, W. L. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 620-624)。これはまた、Sf9細胞でも同様である。なぜなら、対照Sf9細胞は、通常でないZ11-18:Meを生成し(図２Ａ)、これは豊富な代謝Z9-16:アシル由来の伸長生成物である可能性が高いからである。さらに、Z11-16:酸を培地に添加した場合、対照細胞は、大量のΔ13-18:Meを生成した(図２Ｃ)。この事実と、D3-16:酸を使用した以下の実験とから、本発明者らのSf9系が実際に強力な鎖伸長活性を有することを確認し、これは、Δ13-18:Meおよび他のC18-FAMEジエン(Δ12.14-18:Me異性体と同定)が、Desat1-AcNPVに感染したSf9細胞で生成されたかを説明づけるものである(図２Ｂ)。
【００５１】
B.mori Desat1によるC16-FAMEモノ-およびジエンの生成をさらに調べるために、Desat1-AcNPVに感染したSf9細胞中の重水素標識化脂肪酸の変換を分析した。D3-C16:酸をインキュベーション培地に添加した場合、D3-Z11-16:Me、ならびに３つの重水素化(deuteriated)ジエン(D3-E10,Z12-16:Me、E10,E12-16:Me、およびΔ9,11-16:Me)が生成した(図３)。この結果は、これらの不飽和C16-FAMEが全て、取り込まれたD3-16:酸から誘導されたことを裏付けている。同様に、D3-Δ13-18:Meおよび２種類のD3-Δ12,14-18:Me異性体の生成も、これらの不飽和C18-FAMEが、取り込まれたD3-16:酸から誘導され、従って、これらは鎖伸長後に、対応するC16-FAMEから誘導された生成物であることを裏付けている。共役ジエンFAMEは、Z11-16:酸の存在下でBac1-AcNPVに感染したSf9細胞により生成されなかったため(図２Ｃ)、これらの結果とD3-16:酸を使用した実験の結果とから、共役ジエンであるE10,Z12-16:MeおよびE10,E12-16:Meが、C16:酸から、モノエン中間体Z11-16:アシルを介して、B.mori Desat1の作用によってのみ生成されることが示された。以上の結果から、B.mori Desat1が、Z11-不飽和およびΔ10,12-共役化の両方の活性を有する二機能性の不飽和化酵素であり、ボンビコールの生合成経路における２つの連続する不飽和反応に関与する酵素であることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、B.mori成体組織中のp50 desat1 転写産物のRT-PCR分析の結果を示す。１、フェロモン腺；２、頭；３、飛翔筋；４、マルピーギ管；５、精巣；６、卵；Ｍ、サイズマーカー。
【図２】図２は、組換えAcNPV感染Sf9細胞中の脂肪酸をメチルエステル化後、全イオン電流(TIC)によりGC/MSで分析を行った結果を示す。(ＡおよびＣ)Bac1-AcNPV感染Sf9細胞。(Ｂ)desat1-AcNPV感染Sf9細胞。感染したSf9細胞を、Z11-16:酸の不在下(ＡおよびＢ)または存在下(Ｃ)でインキュベートした。
【図３】図３は、Desat1-AcNPV感染Sf9細胞抽出物中の脂肪酸をメチルエステル化後、TICおよび質量クロマトグラフィーによりGC/MS分析で分析を行った結果を示す。Bac1-AcNPV（Ａ−Ｃ）あるいはDesat1-AcNPV（Ｄ−Ｆ）で感染したSf9細胞を、0.1 mM D3-パルミチン酸の存在下でインキュベーションした。m/z269は、D3-ジエン16:メチルエステルの[M]+に対応する。m/z271は、D3-モノエン16:メチルエステルの[M]+に対応する。m/z273は、D3-16:メチルエステルの[M]+に対応する。m/z297は、D3-ジエン18:メチルエステルの[M]+に対応する。m/z299は、D3-モノエン18:メチルエステルの[M]+に対応する。m/z301は、D3-18:メチルエステルの[M]+に対応する。
【図２】
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【図３】
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【図１】
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【配列表】
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