(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の抗凝血性を有するムコ多糖類と第４級オニウムのイオン性複合体から成る脂溶化ムコ多糖と、ポリウレタンとから成る組成物である抗菌性抗血栓性材料を基材表面にコーティングする際に、テトラヒドロフラン／アセトンの重量比が５／１〜１／２からなる混合溶媒をコーティング溶媒として用いることを特徴とする抗菌性抗血栓性材料のコーティング方法。
【請求項２】
少なくとも１種の抗凝血性を有するムコ多糖類がヘパリンである請求項１記載の抗菌性抗血栓性材料のコーティング方法。
【請求項３】
第４級オニウムが下記化１の構造を有する第４級ホスホニウムである請求項１または２記載の抗菌性抗血栓性材料のコーティング方法。
【化１】
0004691745.tif 000004
（式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 は炭素数１〜１２のアルキル基、または炭素数６〜１２のアリール基、または炭素数７〜２０のアラルキル基、Ｒ4 は炭素数１〜２５のアルキル基で、それぞれ同じでも異なっていてもよい。）
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、基材表面に抗菌性抗血栓性材料をコーティングする方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
加工性、弾性、可撓性に優れた人工材料は、近年医療用材料として広く利用されるようになってきているが、人工腎臓、人工肺、補助循環装置、人工血管等の人工臓器や、注射器、血液バッグ、心臓カテーテル等のディスポーザブル製品として今後益々利用が拡大することが予想される。これらの医用材料としては、充分な機械的強度や耐久性に加えて、生体に対する安全性、特に血液と接触した場合に血液が凝固しないこと、すなわち抗血栓性が要求される。
【０００３】
また、高栄養輸液カテーテル（以下ＩＶＨカテーテルと略記する）など、長期間体内に留置する必要のある医用デバイスでは、生体−材料界面からの感染が問題であった。血液と材料の接触によって生成した血栓に菌が繁殖し、これが体内に入り込んで感染を引き起こす。したがって、このような医用デバイスに使用される材料には抗血栓性と抗菌性を同時に持つことが必要である。このような抗菌性抗血栓性素材への要望に応えるべく、例えば特開平９−１７６３７９、特開平９−１８７５０１、特開平９−１８７５０２等、我々は既にいくつかの特許を出願している。
【０００４】
種々の医用デバイスに抗血栓性を付与するのに従来から試みられている方法のひとつとして抗血栓性を有するポリマーをコーティングするという手法がある。例えば特公平６−５７２４７ではコーティング表面に基材の露出を防止し、かつ薄層にコーティングする方法として、コーティング溶媒に基材に対する良溶媒と非溶媒を用いる手法が開示されている。
【０００５】
基材へのポリマーをコーティングする場合、基材とコーティングポリマーの接着性を向上させるため基材の良溶媒を使用するのが従来の一般的な方法であるが、この方法では基材の溶解によってコーティング表面に基材が露出してしまう可能性があり、これを避けるためコーティング層を厚くする必要があった。特公平６−５７２４７においては基材の非溶媒をコーティング溶液に加えることで上記の問題を解決している。
【０００６】
しかしながらこの方法は基材の溶解を回避し、コーティング層の厚みを薄くしてもなお基材が表面に露出しない技術について検討されたものであり、コーティング材の成分のひとつである有機高分子材料の非溶媒もしくは貧溶媒を加えることで抗血栓性、抗菌性を改善する本発明とは一線を画する。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
我々は上記従来技術の欠点を解決し、簡便性、汎用性に加え長期間の抗血栓性を発揮すると同時に、抗菌活性をも発揮することが可能な抗菌性抗血栓性材料に関して前記の通り既にいくつかの特許を出願しているが、基材へのコーティングが容易で優れた抗菌性、抗血栓性を発揮することが可能なコーティング方法について鋭意研究した結果、本発明に至った。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は下記のものである。
▲１▼  少なくとも１種の抗凝血性を有するムコ多糖類と第４級オニウムのイオン性複合体から成る脂溶化ムコ多糖と、有機高分子材料とから成る組成物である抗菌性抗血栓性材料を基材表面にコーティングする際に、該脂溶化ムコ多糖および該有機高分子材料の良溶媒と、該有機高分子材料の非溶媒もしくは貧溶媒との混合溶媒をコーティング溶媒として用いることを特徴とする抗菌性抗血栓性材料のコーティング方法。
▲２▼  少なくとも１種の抗凝血性を有するムコ多糖類がヘパリンである上記▲１▼記載の抗菌性抗血栓性材料のコーティング方法。
▲３▼  第４級オニウムが下記化２の構造を有する第４級ホスホニウムである上記▲１▼または▲２▼記載の抗菌性抗血栓性材料のコーティング方法。
【化２】
0004691745.tif 000002
（式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 は炭素数１〜１２のアルキル基、または炭素数６〜１２のアリール基、または炭素数７〜２０のアラルキル基、Ｒ4 は炭素数１〜２５のアルキル基で、それぞれ同じでも異なっていてもよい。）
【０００９】
本発明の抗血栓性抗菌性医用材料の必須成分である第４級オニウムは、前記化２の構造を有することを特徴としているが、この第４級ホスホニウムは１種類だけ使用しても、何種類かを同時に使用してもよい。第４級ホスホニウムのリン原子に結合する４つの炭化水素鎖のうち、ひとつは炭素数１〜２５、好ましくは３〜２０、さらに好ましくは６〜２０のアルキル基である。他の３つの炭化水素鎖は、炭素数１〜１２、好ましくは１〜８のアルキル基、または炭素数６〜１２、好ましくは６〜１０のアリール基、または炭素数７〜２０、好ましくは７〜１２のアラルキル基である。
【００１０】
第４級ホスホニウムとしては具体的に、トリブチルラウリルホスホニウム、トリブチルミリスチルホスホニウム、トリブチルセチルホスホニウム、トリブチルステアリルホスホニウム、トリフェニルラウリルホスホニウム、トリフェニルミリスチルホスホニウム、トリフェニルセチルホスホニウム、トリフェニルステアリルホスホニウム、ベンジルジメチルラウリルホスホニウム、ベンジルジメチルミリスチルホスホニウム、ベンジルジメチルセチルホスホニウム、ベンジルジメチルステアリルホスホニウムなどが例示されるが、化１によって示される構造の化合物であれば、これらに限定されない。
【００１１】
本発明の抗血栓性抗菌性医用材料は抗凝血作用を有するムコ多糖類の使用を必須としているが、このムコ多糖類としてはヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸等が挙げられ、なかでもヘパリンが特に好ましい。
【００１２】
抗凝血作用を有するムコ多糖類と第４級ホスホニウムとのイオン性複合体を得る方法は特に限定されないが、例えば、ムコ多糖類の弱酸性緩衝液溶液もしくは分散液と、第４級ホスホニウム塩の弱酸性緩衝液溶液もしくは分散液を混合し、得られた沈澱を回収、凍結乾燥する方法などが挙げられる。この際の緩衝液に使用される溶質としては、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸が好ましく、特に好ましくは２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（以下ＭＥＳと略記する）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（以下ＰＩＰＥＳと略記する）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（以下ＭＯＰＳと略記する）である。
【００１３】
本発明においては、抗凝血作用を有するムコ多糖類と第４級オニウムのイオン性複合体と、有機高分子材料とから成る組成物をコーティングすることが特徴である。脂溶化ムコ多糖のブレンドによって材料表面が不活性化すると同時に、一部は有機高分子材料から徐放することよって抗血栓性、抗菌性が発揮されるものと考えられる。本発明の抗血栓性抗菌性医用材料では、有機高分子材料と脂溶化ムコ多糖の親和性により脂溶化ムコ多糖の徐放が制御され、長期間の溶出後も非常に優れた抗血栓性を維持することが可能である。さらに、脂溶化剤として機能する第４級オニウムの効果によって、抗血栓性と同時に抗菌性をも材料に導入することが可能である。
【００１４】
脂溶化ムコ多糖を有機高分子材料にブレンドする際の添加量は、特に制限されるものではないが、有機高分子材料１００重量部に対して脂溶化ムコ多糖を好ましくは０．１重量部〜５０重量部、さらに好ましくは１重量部〜３０重量部程度の量で添加するのが推奨される（以下、有機高分子材料１００重量部に対して添加剤１重量部を加えた場合、添加剤添加量は１ｐｈｒと表現する）。
【００１５】
有機高分子材料の組成や、合成方法に関しては特に制限されないが、例えばポリ塩化ビニル（以下ＰＶＣと略記する）や、ポリウレタン、ポリウレタンウレアが利用され得る。特に、親水性セグメントが適度に伸び、しなやかな構造を有するセグメント化ポリエーテルウレタン（ウレア）が好ましい。これは第一に医用材料として要求される加工性、弾性、可撓性等の機械的特性を満足するためであり、第二に抗血栓性、抗菌性の発揮に有利だからである。詳細な機構は明かではないが、重付加反応体の化学構造に柔軟性が有る場合には脂溶化ムコ多糖のモービリティが向上し、より活性を発揮しやすいコンフォメーションを取りながら材料−生体成分界面に滲出するためであろうと考えられる。
【００１６】
本発明は、脂溶化ムコ多糖と有機高分子材料とから成る組成物である抗菌性抗血栓性材料を基材表面にコーティングする方法に関する。この基材となる他の構造体の素材としては特に限定されるものではなく、ポリエーテルウレタン、ポリウレタン、ポリウレタンウレア、ＰＶＣ、ポリ塩化ビニリデン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート等、従来より使用されている材質、また、将来使用されるであろう材質が広く利用できる。また、既存、および新規の材質からなる血液透析膜、血漿分離膜、吸着剤等の血液処理剤に抗血栓性を付与する目的で導入することも可能である。
【００１７】
本発明の抗菌性抗血栓性材料のコーティング方法は、脂溶化ムコ多糖と有機高分子材料とから成る組成物である抗菌性抗血栓性材料を基材表面にコーティングする際に、該脂溶化ムコ多糖および該有機高分子材料の良溶媒（以下単に良溶媒と略記する）と、該有機高分子材料の非溶媒もしくは貧溶媒（以下単に貧溶媒と略記する）との混合溶媒をコーティング溶媒として用いることが特徴である。
【００１８】
本発明に使用される良溶媒は脂溶化ムコ多糖の原料となる第４級ホスホニウムや有機高分子材料によって適宜選択する必要があるが、有機高分子材料がポリウレタンの場合はテトラヒドロフラン（以下ＴＨＦと略記する）、高分子材料がＰＶＣの場合にはジオキサン、ＴＨＦなどが好ましい。
【００１９】
また貧溶媒は、有機高分子材料を溶解させないものであればすべて使用できるが、脂溶化ムコ多糖の良溶媒であることが好ましく、メタノール、エタノール、アセトンなどが好ましい。
【００２０】
良溶媒と貧溶媒の好ましい混合比は、良溶媒、貧溶媒、有機高分子材料および基材の種類により異なる。例えば、有機高分子材料がポリウレタン、基材がポリウレタンの場合には良溶媒としてＴＨＦ、貧溶媒としてメタノールもしくはアセトンを１０：１〜１：３、好ましくは５：１〜１：２の重量比で混合した溶媒を使用するのが好ましい。貧溶媒添加量がこれより多い場合には良溶媒−貧溶媒の混合溶媒に対する有機高分子材料の溶解性が十分でなくコーティングが困難になってしまい、好ましくない。また、貧溶媒添加量がこれより少ない場合には長期にわたる抗菌性、抗血栓性が得られにくくなってしまう。
【００２１】
コーティング溶媒として良溶媒−貧溶媒の混合溶媒を利用することで長期にわたる抗菌性、抗血栓性が実現される詳細な機構については明らかではないが、コーティング、乾燥のプロセスにおいて、脂溶化ムコ多糖の有機高分子材料中における分布が最適化され、長期にわたって適当量が徐放されやすくなるものと推定される。
【００２２】
コーティング溶液は、まず脂溶化ムコ多糖と有機高分子材料を良溶媒に溶解し、貧溶媒を加えて調製するのが好ましいが、良溶媒と貧溶媒の混合溶媒に脂溶化ムコ多糖と有機高分子材料を溶解してコーティング溶液としてもよい。コーティング溶液中の固形分濃度は、０．０１〜３０重量％、好ましくは０．１〜１５重量％である。
【００２３】
基材へのコーティング方法については特に限定されないが、塗布法、スプレー法、ディップ法等が例示される。
【００２４】
【発明の実施の形態】
このようにして、本発明の抗菌性抗血栓性材料のコーティング方法が実施される。詳細な機構は明かではないが、本発明によってコーティングされた抗菌性抗血栓性材料は生体成分との接触初期段階ではもちろん、接触が長期にわたった後も良好な抗凝血性が維持できる。また、第４級ホスホニウムの効果によって抗血栓性と同時に抗菌性をも導入することができる。
このような利点を活かして、本発明の抗菌性抗血栓性材料のコーティング方法は、各種の医療用器具あるいは機器類に広く適用できる。具体的には、血液透析膜や血漿分離膜、血液中老廃物の吸着用コーティング剤に抗菌性、抗血栓性が付与できる。また、人工肺用の膜素材（血液と酸素の隔壁）や人工心肺におけるシート肺のシート材料、大動脈バルーン、血液バッグ、カテーテル、カニューレ、シャント、血液回路等広範な分野に用いられ得る。また、抗菌性を同時に付与できる特長を利用し、従来生体−材料界面からの感染が問題であったＩＶＨなどに適用することも特に好ましい。
【００２５】
以下、実施例を用いて本発明を説明する。
〈実施例１〉
ヘパリンナトリウム塩１０．００ｇをイオン交換水に溶解させ、全量で１００ｍｌとした。塩化トリ−ｎ−ブチルラウリルホスホニウム（以下ＴＢＬＰ・Ｃｌと略記する）１６．７６ｇをイオン交換水に溶解させ、全量で１６８ｍｌとした。双方の溶液を氷冷下で混合し、そのまま４℃で１５時間静置して懸濁液を得た。この懸濁液を３３００ｒｐｍで遠心沈降させて沈殿を回収し、さらに蒸留水を加え懸濁させた後遠心分離によって沈殿を洗浄する操作を３回繰り返し、その後沈殿を乾燥させてＴＢＬＰ・Ｃｌとヘパリンの複合体（以下ＴＢＬＰ−Ｈｅｐと略記する）を得た。このＴＢＬＰ−Ｈｅｐはベンゼン、ＤＭＦ、ＴＨＦ、クロロホルム等の有機溶媒に可溶であった。
【００２６】
市販脂肪族系ポリウレタン（Ｔｅｃｏｆｌｅｘ（商品名）ＥＧ８０Ａ、以下Ｔｅｃｏと略記する）１４ｇと上記で得たＴＢＬＰ−Ｈｅｐ２．８ｇにＴＨＦ１２７．６８ｇを加えて一様な溶液とした。この溶液にアセトン１９１．５２ｇを加えてコーティング溶液Ａを得た。コーティング溶液Ａは固形分濃度５重量％、良溶媒／貧溶媒重量比２／３、有機高分子材料に対する脂溶化ムコ多糖添加量２０ｐｈｒである。
【００２７】
外径１８Ｇのポリウレタン製チューブを上記で得たコーティング溶液Ａに浸漬して引き揚げ、乾燥させることによってコーティングチューブＡを得た。
【００２８】
コーティングチューブＡの抗菌性を以下の方法で評価した。なお、一連の操作は全て無菌的に行った。
ブロース液（滅菌生理食塩水で５０倍希釈）により、およそ１×１０7 個／ｍｌの濃度とした黄色ブドウ球菌液（以下この菌液を菌原液と呼ぶ）を調製した。この菌原液の濃度は、次のように測定した。菌原液を１０4 倍に希釈した後１００μｌを普通寒天板にまき、２４時間後に形成された緑膿菌のコロニー数を計測した。このコロニー数をＮ個とすると、菌原液の濃度Ｃは
Ｃ＝１０4 ×Ｎ／０．１＝１０5 ×Ｎ［個／ｍｌ］
と示される。
この菌原液１００μｌをブロース液（滅菌生理食塩液で４０倍希釈）で希釈して全量で４０ｍｌに調製した（以下この液を浸漬原液と呼ぶ）。浸漬原液に、ＥＯＧ滅菌したコーティングチューブＡ４０ｃｍ分を適当な長さに切断して浸漬し、３７℃で２４時間培養した。培養後、浸漬原液を滅菌生理食塩水で１０倍系列で１０4 倍まで希釈した（以下１０n 倍希釈液と略記する）。それぞれの希釈液１００μｌを普通寒天培地上にき、２４時間後普通寒天板上に形成された黄色ブドウ球菌のコロニー数が３０ないし３００個のプレートについて計測した。計測して得られたコロニー数をＮn 個とすると、コーティングチューブＡとの接触後の菌数Ｎa は次の式で与えられる。
Ｎa ＝４０×１０n ×Ｎn ／０．１
コーティングチューブＡと接触する前の菌原液の濃度は前記Ｃの通りであり、使用した原液量は１００μｌであるから、コーティングチューブＡ接触前の菌数Ｎb は次式で示される。
Ｎb ＝１０4 Ｎ
浸漬原液４０ｍｌ中での４０ｃｍ分のコーティングチューブとの接触によるＮb →Ｎa の個数変化を表１に示した。接触によって菌数が減少するということはコーティングチューブの抗菌性が発揮されていることを示す。
【００２９】
コーティングチューブＡを使用しｉｎ  ｖｉｖｏで抗血栓性を評価した。実験方法は次の通りである。
ペントバルビタール麻酔下でウサギ（日本白色種、オス、２．５〜３．０ｋｇ）の大腿静脈を剥離して、末梢側を糸で結紮し、糸から２〜３ｃｍのところを血管鉗子でクランプした。結紮部分の中枢側を眼下剪刀で血管径の１／４〜１／３切り、そこから試料であるコーティングチューブを１５ｃｍ、中枢側に向かって挿入した。挿入位置から１ｃｍほどのところで、血管外に出ているコーティングチューブの端部を縫いつけ、コーティングチューブが流されるのを防止した。切開部分を縫合し、抗生物質を投与して、以後試料を取り出すまで２週間にわたって飼育した。
２週間後、ヘパリン加ペントバルビタールで麻酔下、正中切開を施し、腹部大動脈より適当なチューブを用いて脱血してウサギを犠死させた後、コーティングチューブを挿入した部分の血管を切断した。血管を切開してコーティングチューブと血管内部を写真に撮るとともに、目視で観察し５段階評価を行った。結果は表１に示した。
【００３０】
【表１】
0004691745.tif 000003
【００３１】
表１におけるｉｎ  ｖｉｖｏ抗血栓性の５段階評価とは次の通りである。ａ：血小板凝集、血栓生成、フィブリン生成いずれも観察されない。ｂ：フィブリン生成または血小板凝集は見られるが血栓生成は観察されない。ｃ：フィブリン生成または血小板凝集が見られ血栓生成がわずかに観察される。ｄ：フィブリン生成または血小板凝集が見られ血栓生成がかなり観察される。ｅ：フィブリン生成または血小板凝集が見られ大量の血栓生成が観察される。
【００３２】
〈実施例２〉
実施例１で得たコーティングチューブＡをクエン酸加牛血漿に浸漬し、３７℃の振盪恒温槽で２週間にわたって溶出を行った。クエン酸加牛血漿は一日おきに交換した。以下、溶出後のコーティングチューブをコーティングチューブＡ’と呼ぶ。コーティングチューブＡと同様の方法でコーティングチューブＡ’での抗菌性について評価を行った。結果は表１に示した。
【００３３】
〈比較例１〉
Ｔｅｃｏ１４ｇ、実施例１で得た得たＴＢＬＰ−Ｈｅｐ２．８ｇにＴＨＦ３１９．２０ｇを加えて一様な溶液とし、コーティング溶液Ｂを得た。コーティング溶液Ｂは固形分濃度５重量％、良溶媒／貧溶媒重量比１／０、有機高分子材料に対する脂溶化ムコ多糖添加量２０ｐｈｒである。
【００３４】
外径１８Ｇのポリウレタン製チューブを上記で得たコーティング溶液Ｂに浸漬して引き揚げ、乾燥させることによってコーティングチューブＢを得た。コーティングチューブＢは乾燥することで全長の収縮が確認された。
【００３５】
実施例１のコーティングチューブＡと同様の方法でコーティングチューブＢでの抗菌性とｉｎ  ｖｉｖｏ抗血栓性について評価を行った。結果は表１に示した。
【００３６】
〈比較例２〉
実施例２と同様の方法でコーティングチューブＢの血漿溶出を行った。溶出後のコーティングチューブをコーティングチューブＢ’と呼ぶ。コーティングチューブＡと同様の方法でコーティングチューブＢ’での抗菌性について評価を行った。結果は表１に示した。
【００３７】
〈比較例３〉
コーティングを行わない外径１８Ｇのポリウレタン製チューブをチューブＣとし、実施例１のコーティングチューブＡと同様の方法でチューブＣでの抗菌性とｉｎ  ｖｉｖｏ抗血栓性について評価を行った。結果は表１に示した。
【００３８】
〈比較例４〉
実施例２と同様の方法でチューブＣの血漿溶出を行った。溶出後のチューブをチューブＣ’と呼ぶ。コーティングチューブＡと同様の方法でチューブＣ’での抗菌性について評価を行った。結果は表１に示した。
【００３９】
表１に示した結果からわかるように、本発明の抗菌性抗血栓性材料のコーティング方法で調製したコーティングカテーテルは優れた抗血栓性、抗菌性を示しており、溶出後も性能が維持されている。
コーティング溶媒を良溶媒であるＴＨＦのみにした場合、血漿溶出による抗菌性の低下が見られる。
【００４０】
【発明の効果】
本発明の抗菌性抗血栓性材料のコーティング方法は、優れた抗血栓性、抗菌性を付与することが可能であり、その性能は長期間の溶出操作後も維持される。また、本発明の抗菌性抗血栓性材料のコーティング方法より、既存の構造体に簡便に抗血栓性、抗菌性を付与することができ、医療用材料の抗血栓化、抗菌化を行う方法として優れた適性を有している。