(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（ｉ）で表されるカルノジン酸：
【化１】
0004629822.tif 000011
および／または以下の式（ｉｉ）で表されるカルノソール：
【化２】
0004629822.tif 000012
を有効成分として含有する、神経成長因子合成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は神経成長因子を促進合成するための組成物（以下、神経成長因子合成促進剤という）に関し、より詳細には、アルツハイマー型痴呆症、脳虚血病態などの神経変性疾患の治療において、神経成長因子を効率良く合成することのできる神経成長因子合成促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高齢化社会への移行に伴って老年型痴呆症が増加する傾向にある。これは非常に大きな社会問題となってきている。老年型痴呆症の原因となる疾患は数多く知られている。これらは、脳器質性障害による痴呆、脳以外の臓器疾患に付随した痴呆、およびストレスによる身体疾患に起因する痴呆に大別される。特に、その原因の大半を占める脳器質性障害による痴呆は、原因の違いにより脳血管性痴呆症とアルツハイマー型痴呆症とに分類される。
【０００３】
現在、脳血管性痴呆症に対しては、脳血管拡張薬などがある程度の効果を示すことが知られている。しかし、アルツハイマー型痴呆症に対しては、その発症原因が今なお不明であり、未だ発症を含めその進行を阻止するに適切な薬物療法も治療法も知られていない。そのため、脳器質性障害による痴呆、特にアルツハイマー型痴呆症に対して有用な医薬の開発が所望されている。
【０００４】
近年は、神経細胞から分泌される神経成長因子（ＮＧＦ）などの神経栄養因子が神経変性疾患に対して優れた効果を示すことが見出され、注目を集めている。ＮＧＦは、神経組織の成長および機能維持にとって重要かつ必要な因子である。ＮＧＦは、末梢神経における知覚および交感神経の、ならびに中枢神経における大細胞性コリン作動性ニューロンの、成熟、分化、および生命維持に不可欠であり、脳損傷時の神経細胞の変性を防ぐという作用を示す。これにより、生体内においてＮＧＦレベルを上昇させることは、アルツハイマー型痴呆症および脳血管性痴呆症のような中枢機能障害、精髄障害、末梢神経損傷、糖尿病性神経障害、ならびに筋萎縮変性側索硬化症のような抹消機能障害の治療に有用であると考えられる。
【０００５】
しかし、ＮＧＦは、モノマーでは１３０００またはダイマーでは２６０００もの分子量を有するタンパク質であり、血液脳関門を通過することができない。そのため、例えば、中枢機能障害の治療を目的とした場合には、脳室内投与が必要となる。さらに、ＮＧＦの大量調製も困難である。このようにＮＧＦ自体の使用には多くの問題がある。結果として、一般に、ＮＧＦ自体を臨床で用いることは非常に困難である。
【０００６】
ＮＧＦを投与する代わりに、生体内でＮＧＦの合成を促進させる物質（神経成長因子合成促進剤）を投与する手法も知られている。例えば、Ｙ．Ｆｕｒｕｋａｗａら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、第２０８巻（１９８６）、２５８は、神経成長因子合成促進剤としてカテコールアミン（エピネフリン、ノルエピネフリンおよびドーパミン）を使用することを開示している。
【０００７】
しかし、これらの化合物でなる神経成長因子合成促進剤はホルモン物質である。そのため、投与によって生体内におけるホルモンの量的バランスを崩すという問題がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題の解決を課題とするものであり、その目的とするところは、生体内のホルモンの量的バランスを崩すというような副作用を伴うことなく、生体内にてＮＧＦを効率的に合成し得る神経成長因子合成促進剤を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ローズマリー抽出物および／またはセージ抽出物を有効成分として含有する、神経成長因子合成促進剤である。
【００１０】
好適な実施態様においては、上記ローズマリー抽出物および／または上記セージ抽出物は、ローズマリーおよび／またはセージをエタノール、または水とエタノールとの混合溶媒で抽出した抽出物である。
【００１１】
本発明はまた、神経成長因子合成促進剤を製造するための方法であって、ローズマリーおよび／またはセージを、８０（ｖ／ｖ）％以上１００（ｖ／ｖ）％未満のエタノール濃度を有する水溶液またはエタノールに浸漬して、第一抽出物を得る工程；および該第一抽出物に、エタノール濃度が４０（ｖ／ｖ）％以下になるように水を添加することにより神経成長因子合成促進作用を有する成分を析出させる工程；を包含する、方法である。
【００１２】
さらに本発明はまた、以下の式（ｉ）で表されるカルノジン酸：
【化３】
0004629822.tif 000002
および／または以下の式（ｉｉ）で表されるカルノソール：
【化４】
0004629822.tif 000003
を有効成分として含有する、神経成長因子合成促進剤である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明の第一の神経成長因子合成促進剤は、ローズマリー抽出物またはセージ抽出物を含有する。本発明に用いられるローズマリー抽出物およびセージ抽出物は、ローズマリー（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  Ｌ．）およびセージ（Ｓａｌｖｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ  Ｌ．）から得られる。ローズマリーおよびセージは、古来より西洋ハーブとして薬用、香料用、料理用などの広範な用途に使用される安全性の高い植物である。本発明においては、ローズマリー抽出物とセージ抽出物とを混合して用いてもよい。
【００１４】
上記ローズマリー抽出物またはセージ抽出物は、神経成長因子合成促進剤中に有効成分として含有される。実質的に有効成分となる上記抽出物の含有量は、神経成長因子合成促進剤を１００重量％とした場合、０．０００１重量％〜１００重量％、好ましくは０．１重量％〜１００重量％である。抽出物の含有量が０．０００１重量％未満では、ＮＧＦを充分に産生することができない。
【００１５】
ローズマリー抽出物またはセージ抽出物は、例えば、以下のようにして得ることができる：
まず、ローズマリーまたはセージの全草が抽出溶媒中に浸漬されるか、または抽出溶媒とともに加熱還流される。使用される抽出溶媒の種類は特に限定されない。使用され得る抽出溶媒の例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、アセトン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、エーテル類、クロロホルム、およびジクロロメタンのような有機溶媒ならびに水が挙げられる。これら抽出溶媒は単独または組合せて用いられる。本発明においては、メタノール、エタノール、酢酸エチルまたはこれら溶媒と水との組合わせが好ましく、毒性が低いという生体内における安全性を考慮すれば、エタノール、または水とエタノールとの混合溶媒がさらに好ましい。
【００１６】
さらに、上記ローズマリー抽出物およびセージ抽出物はそれぞれ以下のようにして得ることが好ましい：
まず、ローズマリーおよび／またはセージは、８０（ｖ／ｖ）％以上１００（ｖ／ｖ）％未満、より好ましくは９０（ｖ／ｖ）％以上１００（ｖ／ｖ）％未満のエタノール濃度を有する水溶液またはエタノールに浸漬して、第一抽出物を得る。
【００１７】
第一抽出物を得るための、抽出温度および抽出時間は特に限定されず、当業者により適切な条件に設定される。代表的には、約２０℃〜約５０℃および約２４時間〜約７２時間の各条件が設定される。
【００１８】
次いで、この第一抽出物に４０（ｖ／ｖ）％以下、好ましくは３０（ｖ／ｖ）％以下のエタノール濃度になるように水が添加される。これによりローズマリー抽出物および／またはセージ抽出物から、神経成長因子合成促進作用を有する成分を析出させることができる。また上記第一抽出物を２倍から２０倍に濃縮した後に水を添加して、当該神経成長因子合成促進剤であるローズマリー抽出物および／またはセージ抽出物を析出させても良い。
【００１９】
第一抽出物からローズマリー抽出物および／またはセージ抽出物を得るための、析出温度および析出時間も特に限定されず、当業者により適切な条件に設定される。代表的には、約０℃〜約２５℃および約１６時間〜約４８時間の各条件が設定される。
【００２０】
このように複数段階にわたり特定濃度になるようにエタノールまたは水を添加し、濾過などの処理を行うことにより、後述する式（ｉ）のカルノジン酸および式（ｉｉ）のカルノソールを多く含有する抽出物を得ることができる。このような抽出方法を用いて得た抽出物を使用することにより、ＮＧＦ産生能は飛躍的に向上する。
【００２１】
上記のように抽出を行った後、ローズマリーまたはセージを含有する液は、当業者に周知の手法により、濾過と濃縮とが行われる。これにより本発明に用いられるローズマリー抽出物およびセージ抽出物を得ることができる。
【００２２】
本発明の第一の神経成長因子合成促進剤は、食品、医薬品などの適切な形態に加工される。また、本発明の第一の神経成長因子合成促進剤は経口投与または非経口投与のいずれに使用されてもよい。
【００２３】
食品に加工される場合、上記ローズマリー抽出物および／またはセージ抽出物と適切な材料とが混合される。この適切な材料は、一般に食品用材料として使用され得るものである。例としては、米、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、スイートポテト、大豆、昆布、ワカメ、テングサなどの粉類；水飴；乳糖；グルコース；果糖；スクロース；マンニトール；ならびにこれらの組合わせが挙げられる。さらに、香辛料、着色料、甘味料、食用油、ビタミンなどを添加してもよい。これら適切な材料および添加剤は単独または組合せて使用される。またさらに、必要に応じて水を添加して所望の形状に加工してもよい。
【００２４】
医薬品に加工される場合、上記ローズマリー抽出物および／またはセージ抽出物と添加剤とが混合される。添加剤の例としては、界面活性剤、賦形剤、着色料、保存料、コーティング助剤ならびにこれらの組合せが挙げられる。これら添加剤は、通常の医薬品製造における添加剤であれば特に限定されず、より具体的な例としては、ラクトース、デキストリン、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ソルビトール、結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、およびこれらの組合せが挙げられる。さらに、香味料、甘味料などを添加してもよい。またさらに、必要に応じて他の薬剤を添加してもよい。
【００２５】
投与剤形も特に限定されず、日本薬局方に従って適切な剤形に製造される。具体的には、経口投与を目的とする場合は、カプセル剤、錠剤、粉剤、除放剤などの剤形に製造される。非経口投与を目的とする場合は、注射剤、輸液剤などの剤形に製造される。
【００２６】
上記適切な材料および添加剤の含有量は、特に限定されず、上記ローズマリー抽出物および／またはセージ抽出物の含有量に合わせて調製され得る。
【００２７】
本発明の第二の神経成長因子合成促進剤は、以下の式（ｉ）で表されるカルノジン酸：
【化５】
0004629822.tif 000004
または以下の式（ｉｉ）で表されるカルノソール：
【化６】
0004629822.tif 000005
を含有する。本発明においては、上記式（ｉ）のカルノジン酸と上記（ｉｉ）のカルノソールとを混合して用いてもよい。
【００２８】
上記式（ｉ）のカルノジン酸または（ｉｉ）のカルノソールは、神経成長因子合成促進剤中に有効成分として含有される。実質的に有効成分となる上記抽出物の含有量は、神経成長因子合成促進剤を１００重量％とした場合、０．００００１重量％〜１００重量％、好ましくは０．００１重量％〜１００重量％である。抽出物の含有量が０．００００１重量％未満では、ＮＧＦ産生を十分に促進させることができない。
【００２９】
上記式（ｉ）のカルノジン酸または式（ｉｉ）のカルノソールは、化学合成することも可能であるが、通常は植物抽出物、好ましくは上記ローズマリー抽出物またはセージ抽出物からの単離により得ることができる。代表的には、式（ｉ）のカルノジン酸または式（ｉｉ）のカルノソールは、上記ローズマリー抽出物またはセージ抽出物から、カラムクロマトグラフィーにより夾雑物が取り除かれる。これにより得られた物質は、１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲなどの周知の手段により式（ｉ）のカルノジン酸または式（ｉｉ）のカルノソールであると当業者に容易に同定され得る。
【００３０】
本発明の第二の神経成長因子合成促進剤もまた、上記第一の神経成長因子合成促進剤と同様に、食品、医薬品などの適切な形態に加工され、経口投与または非経口投与のいずれにも使用することができる。
【００３１】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示す。本発明は、これら実施例に何ら限定されるものではない。
【００３２】
＜実施例１＞
ローズマリーの全草（６０ｇ）を９０％エタノール水溶液（３００ｍｌ）に浸漬し、４０℃で４８時間抽出を行った。得られた溶液を１００ｍｌにまで濃縮した。濃縮後、抽出物を濾過して不溶物を除去した。ろ液に精製水２００ｍｌを添加し、４℃にて一晩放置した。次いで、再び濾過を行って、不溶物であるローズマリー抽出物（乾燥重量３．５ｇ）を得た。このローズマリー抽出物単独を神経成長因子合成促進剤とした。
【００３３】
ヒト由来ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ細胞株（Ｔ９８Ｇ細胞）を、牛胎児血清（１０％：ＧＩＢＣＯ社製）、ピルビン酸ナトリウム（×１：ＧＩＢＣＯ社製）および非必須アミノ酸（×１：ＧＩＢＣＯ社製）を含むＭＥＭ培地に、細胞数が２×１０４個／穴（平底９６ウェルプレート：ＣＯＲＮＩＮＧ社製）となるように播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）で３日間培養した。次いで、この培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（５ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンを含有）に交換した。この培地を３日置きに交換しながらさらに６日間培養を行った。
【００３４】
培地を除去した後、上記より得た神経成長因子合成促進剤を５μｇ／ｍｌの割合で含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（５ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンを含有；５０μｌ／穴）を、添加して、さらに４日間培養を行った。培養終了後、上澄を採取して試料溶液とした。
【００３５】
他方、９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製）の各穴に、１μｇ／ｍｌの抗ＮＧＦ抗体（プロメガ社製）溶液を５０μｌずつ分注し、４℃にて一晩放置した。プレートをＰＢＳ（−）（日水製薬製）で洗浄した後、１％牛血清アルブミン（シグマ社製）溶液を１００μｌずつ分注し、室温にて４時間放置してブロッキングを行った。次いで、プレートをＰＢＳ（−）で洗浄した後、上記試料溶液を各穴に５０μｌずつ分注した。室温で一時間反応させた後、プレートをＰＢＳ（−）で洗浄した。
【００３６】
次いで、β−ガラクトシダーゼ標識抗ＮＧＦ抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｍｍｈｅｉｍ社製）溶液０．４ユニット／ｍｌをプレートの各穴に５０μｌずつ分注し、さらに室温で一時間反応させた。プレートをＰＢＳ（−）で洗浄した後、０．５ｍｇ／ｍｌの４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシド溶液をプレートの各穴に２００μｌずつ分注し、室温にて一晩反応させた。生成した４−メチルウンベリフェロンの蛍光強度を蛍光プレートリーダーで測定し、標準溶液（ヒトβＮＧＦ：ＰＥＰＲＯ  ＴＥＣＨ  ＥＣ社製）より得た標準曲線を用いて試料溶液中に含まれるＮＧＦの含有量を算出した。結果を表１に示す。
【００３７】
＜実施例２＞
実施例１の、神経成長因子合成促進剤を５μｇ／ｍｌの割合で含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地の代わりに、１０μｇ／ｍｌの割合で含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（５ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンを含有；５０μｌ／穴）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして試料溶液中に含まれるＮＧＦの含有量を算出した。
結果を表１に示す。
【００３８】
＜比較例１＞
実施例１の、神経成長因子合成促進剤を５μｇ／ｍｌの割合で含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地の代わりに、神経成長因子合成促進剤を含有しないＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（５ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンを含有；５０μｌ／穴）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして試料溶液中に含まれるＮＧＦの含有量を算出した。結果を表１に示す。
【００３９】
＜実施例３＞
セージの全草（６０ｇ）をエタノール（３００ｍｌ）に浸漬し、室温で一晩放置した。次いで、得られた溶液を１００ｍｌにまで濃縮した。濃縮した抽出物を濾過して不溶物を除去した。ろ液に精製水６００ｍｌを添加し、４℃にて一晩放置した。次いで、再び濾過を行って、不溶物であるセージ抽出物（乾燥重量４ｇ）を得た。このセージ抽出物単独を神経成長因子合成促進剤として使用したこと以外は、実施例１と同様にして試料溶液中に含まれるＮＧＦの含有量を算出した。結果を表２に示す。
【００４０】
＜実施例４＞
実施例３の、神経成長因子合成促進剤を５μｇ／ｍｌの割合で含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地の代わりに、１０μｇ／ｍｌの割合で含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（５ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンを含有；５０μｌ／穴）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして試料溶液中に含まれるＮＧＦの含有量を算出した。
結果を表２に示す。
【００４１】
＜比較例２＞
実施例３の、神経成長因子合成促進剤を５μｇ／ｍｌの割合で含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地の代わりに、神経成長因子合成促進剤を含有しないＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（５ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンを含有；５０μｌ／穴）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして試料溶液中に含まれるＮＧＦの含有量を算出した。結果を表２に示す。
【００４２】
【表１】
0004629822.tif 000006
【００４３】
【表２】
0004629822.tif 000007
【００４４】
表１および２に示されるように、本発明の神経成長因子合成促進剤を含有する系（実施例１〜４）では、含有しない系（比較例１および２）と比較して、試料溶液中のＮＧＦ含有量が増加していることがわかる。また、使用される神経成長因子合成促進剤の濃度が高いほど、ＮＧＦが産生される量も増大する傾向にあることがわかる。
【００４５】
＜実施例５＞
ローズマリーの全草（５ｋｇ）をエタノール（２０Ｌ）に浸漬し、４０℃で７２時間抽出を行った。得られた溶液を１Ｌにまで濃縮した。濃縮後、抽出物を濾過して不溶物を除去した。ろ液に精製水２Ｌを添加し、このときに生じた析出物１０５ｇを濾取した。この析出物を酢酸エチルに溶解し、シリカゲルクロマトグラフィー（展開溶媒；酢酸エチル：ヘキサン＝１：４（容量比））で精製して、ヘキサン中で再結晶することにより淡黄色の結晶１（１．５ｇ）および白色の結晶２（８００ｍｇ）を得た。結晶１および２の１３Ｃ−ＮＭＲおよび１Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、それぞれ表３および４に記載の通りであった。
【００４６】
【表３】
0004629822.tif 000008
【００４７】
【表４】
0004629822.tif 000009
【００４８】
このことから結晶１は上記式（ｉ）で表されるカルノジン酸であり、かつ結晶２は上記式（ｉｉ）で表されるカルノソールであることがわかった。
【００４９】
上記で得た式（ｉ）で表されるカルノジン酸単独を神経成長因子合成促進剤とした。次いで、実施例１の、神経成長因子合成促進剤を５μｇ／ｍｌの割合で含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地の代わりに、上記式（ｉ）のカルノジン酸（神経成長因子合成促進剤）を２０μＭの濃度で含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（５ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンを含有；５０μｌ／穴）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして試料溶液中に含まれるＮＧＦの含有量を算出した。結果を表５に示す。
【００５０】
＜実施例６＞
実施例５と同様にして式（ｉ）で表されるカルノジン酸を得、この式（ｉ）で表されるカルノジン酸単独を神経成長因子合成促進剤とした。次いで、実施例１の、神経成長因子合成促進剤を５μｇ／ｍｌの割合で含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地の代わりに、式（ｉ）のカルノジン酸（神経成長因子合成促進剤）を１００μＭの濃度で含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（５ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンを含有；５０μｌ／穴）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして試料溶液中に含まれるＮＧＦの含有量を算出した。結果を表５に示す。
【００５１】
＜実施例７＞
実施例５と同様にして式（ｉｉ）で表されるカルノソールを得、この式（ｉｉ）で表されるカルノソール単独を神経成長因子合成促進剤とした。次いで、実施例１の、神経成長因子合成促進剤を５μｇ／ｍｌの割合で含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地の代わりに、上記式（ｉｉ）のカルノソール（神経成長因子合成促進剤）を２０μＭの濃度で含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（５ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンを含有；５０μｌ／穴）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして試料溶液中に含まれるＮＧＦの含有量を算出した。結果を表５に示す。
【００５２】
＜実施例８＞
実施例５と同様にして式（ｉｉ）で表されるカルノソールを得、この式（ｉｉ）で表されるカルノソール単独を神経成長因子合成促進剤とした。次いで、実施例１の、神経成長因子合成促進剤を５μｇ／ｍｌの割合で含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地の代わりに、式（ｉｉ）のカルノソール（神経成長因子合成促進剤）を１００μＭの濃度で含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（５ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンを含有；５０μｌ／穴）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして試料溶液中に含まれるＮＧＦの含有量を算出した。結果を表５に示す。
【００５３】
＜比較例３＞
実施例５の、式（ｉ）で表されるカルノジン酸を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地の代わりに、神経成長因子合成促進剤を含有しないＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（５ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミンを含有；５０μｌ／穴）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして試料溶液中に含まれるＮＧＦの含有量を算出した。結果を表５に示す。
【００５４】
【表５】
0004629822.tif 000010
【００５５】
表５に示されるように、本発明においては、式（ｉ）のカルノジン酸（実施例５および６）および式（ｉｉ）のカルノソール（実施例７および８）のいずれを用いた系であっても、含有しない系（比較例３）と比較して、試料溶液中のＮＧＦ含有量が増加していることがわかる。また、本発明の神経成長因子合成促進剤に使用される有効成分の濃度が高いほど、ＮＧＦが産生される量も増大する傾向にあることがわかる。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によれば、ＮＧＦの合成を効率的に促進することができる。本発明の神経成長因子合成促進剤は、生体内のホルモンの量的バランスを崩すというような副作用を伴うことがなく、生体内において極めて安全にＮＧＦの産生を増強させることができる。このＮＧＦの増加により、アルツハイマー型痴呆症、脳虚血病態などの神経変性疾患に対する予防および治療が期待される。