(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表において配列番号２又は４で表されたアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項２】
配列表の配列番号２又は４で表されたアミノ酸配列において、１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を有し、且つ、細胞内において発現したとき、Ｎａ＋駆動型Ｃｌ−／ＨＣＯ３−エクスチェンジャーの機能を有することを特徴とする、タンパク質。
【請求項３】
該Ｎａ＋駆動型Ｃｌ−／ＨＣＯ３−エクスチェンジャーが、細胞外重炭酸イオン及び細胞内Ｃｌ−に依存性に、細胞外から該細胞内へナトリウムイオンを取り込み且つ該細胞内の塩素イオンを細胞外へ輸送する機能を有することによって特徴づけられるものである、請求項２のタンパク質。
【請求項４】
請求項１ないし３の何れかのタンパク質に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体。
【請求項５】
配列番号４で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体。
【請求項６】
配列表において配列番号１又は３で示された塩基配列を有するＤＮＡ。
【請求項７】
配列表において配列番号１で示された塩基配列における第６７番目から第３３３０番目までの塩基よりなる配列を有するＤＮＡ。
【請求項８】
配列表において配列番号３で示された塩基配列のうち第８３番目から第３３４６番目までの塩基よりなる配列を有するＤＮＡ。
【請求項９】
配列表において配列番号１で示された塩基配列における第６７番目から第３３３０番目までの塩基よりなる配列を有するＤＮＡにおいて１個若しくは２個以上の塩基が欠失、置換、付加又は挿入された塩基配列を有するＤＮＡであって、（１）配列表において配列番号２で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質又は（２）該アミノ酸配列において１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し細胞内において発現したときＮａ＋駆動型Ｃｌ−／ＨＣＯ３−エクスチェンジャーの機能を有することを特徴とするタンパク質をコードするものである、ＤＮＡ。
【請求項１０】
配列表において配列番号３で示された塩基配列における第８３番目から第３３４６番目までの塩基よりなる配列を有するＤＮＡにおいて１個若しくは２個以上の塩基が欠失、置換、付加又は挿入された塩基配列を有するＤＮＡであって、（１）配列表において配列番号４で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質又は（２）該アミノ酸配列において１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し細胞内において発現したときＮａ＋駆動型Ｃｌ−／ＨＣＯ３−エクスチェンジャーの機能を有することを特徴とするタンパク質をコードするものである、ＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項６ないし１０の何れかのＤＮＡを導入してＮａ＋駆動型Ｃｌ−／ＨＣＯ３−エクスチェンジャーの機能を有するタンパク質を発現させたものである、形質転換細胞。
【請求項１２】
請求項１１の形質転換細胞と候補化合物とを接触させ、Ｎａ＋駆動型Ｃｌ−／ＨＣＯ３−エクスチェンジャーの機能を測定し、得られた測定結果を、該細胞に該候補化合物を接触させずにＮａ＋駆動型Ｃｌ−／ＨＣＯ３−エクスチェンジャーの機能を測定して得られる結果と比較することにより、該候補化合物による該機能の亢進又は抑制の有無を判別することを特徴とする、Ｎａ＋駆動型Ｃｌ−／ＨＣＯ３−エクスチェンジャーに対するアゴニスト及びアンタゴニストの選別方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞内ｐＨの制御に関与するタンパク質の一つであるＮａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーであるマウスタンパク質に関する。より詳しくは、本発明は、Ｎａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャータンパク質、該タンパク質を発現させた異種細胞、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該タンパク質に対する抗体、及びＮａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーに対するアゴニスト及びアンタゴニストを選別するための方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の刺激に対応した細胞内ｐＨ（ｐＨi）の制御は、多くの細胞機能において極めて重要なものである。重炭酸イオン輸送体のあるファミリーは、動物細胞内において生理的条件下での主要な細胞内ｐＨレギュレーターである。重炭酸イオン（ＨＣＯ3-）輸送体は、機能的に４つのグループに分けられる [Boron, W.F. et al., J. Exp. Biol., 200:263-268(1997)]。すなわち、Ｎａ+非依存性Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャー（アニオンエクスチェンジャー（ＡＥ）とも呼ばれる）、Ｎａ+−ＨＣＯ3-共輸送体（ＮＢＣ）、Ｋ+−ＨＣＯ3-共輸送体、及びＮａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーである。３種のＡＥと３種のＮＢＣがクローンされて機能的に特徴決定されているが、Ｋ+−ＨＣＯ3-共輸送体及びＮａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーについては、まだ知られていない。
【０００３】
Ｎａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーは、最初に無脊椎動物のニューロンにおいて発見され、その後、脊椎動物の脳、血管内皮細胞、精子、腎臓及び膵β細胞を含むニューロン及び非ニューロン細胞において見出された。Ｎａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーは、細胞内のＣｌ-と引き替えに細胞外のＮａ+及びＨＣＯ3-を細胞内に輸送する細胞内ｐＨレギュレーターであり、細胞のアルカリ化において重要な役割を演じている。
【０００４】
膵β細胞において、グルコースは、インスリン分泌において生理学的に最も重要なレギュレーターである。グルコース代謝は膵β細胞において、細胞内pHの上昇を誘導する。このグルコース誘導性の細胞内pH上昇が主としてＮａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーによって引き起こされることが示されている [Pace, C.S. et al., J. Membrane Biol., 73:39-43(1983)]。
【０００５】
このように、Ｎａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーは、種々の細胞における重要な細胞内ｐＨレギュレーターであるが、その分子的基礎は知られてない。Ｎａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーの分子構造及び機能の解析は、膵β細胞のインスリン分泌機能の解析のみならず、糖尿病治療薬の開発のためのスクリーニング、及び分子構造を利用した薬物設計に有用である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
このような背景のもと、本発明は、Ｎａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーをクローンし、そのＤＮＡを取得して塩基配列を決定し、これを発現させた異種細胞を提供すると共に、Ｎａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーの構造及び機能を決定することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、配列表において配列番号２又は４で表されたアミノ酸配列を有する、Ｎａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーであるタンパク質を提供する。
【０００８】
本発明は更に、配列表の配列番号２又は４で表されたアミノ酸配列において、１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列を有し、且つ、細胞内において発現したとき、Ｎａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーの機能を有することを特徴とする、タンパク質をも提供する。
【０００９】
本発明は更に、上記タンパク質であって、該Ｎａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーが、細胞外重炭酸イオン及び細胞内Ｃｌ-に依存性に、細胞外から該細胞内へナトリウムイオンを取り込み且つ該細胞内の塩素イオンを細胞外へ輸送する機能を有することによって特徴づけられるものであるタンパク質をも提供する。
【００１０】
本発明は更に、上記タンパク質を発現させた異種細胞をも提供する。該異種細胞の例としては、アフリカツメガエル卵母細胞、ＨＥＫ293細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。異種細胞にＮａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーを発現させるには、Ｎａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーをコードするＤＮＡによるトランスフェクションによってもよく、また、Ｎａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーに対応したｃＲＮＡの導入によってもよい。
【００１１】
本発明は更に、上記タンパク質に対する抗体をも提供する。該抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。
【００１２】
本発明は更に、上記蛋白質を発現させた異種細胞と候補化合物とを接触させ、Ｎａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーの機能を測定し、得られた測定結果を、該細胞に該候補化合物を接触させずにＮａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーの機能を測定して得られる結果と比較することにより、該候補化合物による該機能の亢進又は抑制の有無を判別することを特徴とする、Ｎａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーに対するアゴニスト及びアンタゴニストの選別方法をも提供する。
【００１３】
更に本発明は、配列表において配列番号１又は３で示された塩基配列を有するＤＮＡ、並びに、配列表において配列番号１で示された塩基配列における第６７番目から第３３３０番目までの塩基よりなる配列を有するＤＮＡ、及び、配列表において配列番号３で示された塩基配列のうち第８３番目から第３３４６番目までの塩基よりなる配列を有するＤＮＡをも提供する。
【００１４】
更に本発明は、配列表において配列番号１で示された塩基配列における第６７番目から第３３３０番目までの塩基よりなる配列を有するＤＮＡにおいて１個若しくは２個以上の塩基が欠失、置換、付加又は挿入された塩基配列を有するＤＮＡであって、（１）配列表において配列番号２で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質又は（２）該アミノ酸配列において１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し細胞内において発現したときＮａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーの機能を有することを特徴とするタンパク質をコードするものである、ＤＮＡをも提供する。
【００１５】
なおも更に本発明は、配列表において配列番号３で示された塩基配列における第８３番目から第３３４６番目までの塩基よりなる配列を有するＤＮＡにおいて１個若しくは２個以上の塩基が欠失、置換、付加又は挿入された塩基配列を有するＤＮＡであって、（１）配列表において配列番号４で示されたアミノ酸配列を有するタンパク質又は（２）該アミノ酸配列において１個若しくは２個以上のアミノ酸が欠失、置換、付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有し細胞内において発現したときＮａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーの機能を有することを特徴とするタンパク質をコードするものである、ＤＮＡをも提供する。
【００１６】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質を発現させた異種細胞は、例えばアフリカツメガエル卵母細胞やＨＥＫ293細胞であってよいが、マウス以外のその他の種々の細胞であってもよく、目的に応じて適宜選択すればよい。異種細胞に本発明のタンパク質を発現させるには、当業者に周知の手段を用ることができる。
【００１７】
本明細書において、「１個又は２個以上のアミノ酸が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列」における「１個又は２個以上」とは、通常は、１個ないし１０個、特に好ましくは１個ないし数個（例えば３、４個）である。
【００１８】
また本発明において、「１個又は２個以上の塩基が欠失、置換、付加又は挿入された塩基配列を有するＤＮＡ」における「１個又は複数」の塩基とは、通常は１個ないし１０個、特に好ましくは１個ないし数個（例えば 3、4個）である。
【００１９】
そのようなＤＮＡの及びそれがコードするタンパク質の変異体の作製は、組換えＤＮＡ技術により容易に行うことができる。すなわち、最初に種々の化学的及び酵素的方法を用いてＤＮＡのクローン断片に変異を生じさせることができ、得られた変異型のＤＮＡにつきＤＮＡ配列分析を行い、利点を持つ特定の変異体を選び出す。この方法で種々の変異体を、その表現型に関係なく、システマティックに作製することができる。一般に用いられる変異型クローンの作製方法は、以下の通りである。
【００２０】
１．オリゴヌクレオチドを用いて直接にＤＮＡ配列に置換、欠損、挿入、付加を起こさせることができる。この方法によれば、ＤＮＡの小さな領域に多くの変異を起こさせることが可能である。
２．より長いオリゴヌクレオチドを用いて所望の遺伝子の合成が可能である。
３．部位特異的変異作製法 (Region-specific Mutagenesis) を用いて、大きなＤＮＡ領域 (1〜3 kb) に所望の変異体を作製可能である。
４．ＤＮＡのリンカースキャニング変異体作製法 (Linker-scanning Mutagenesis) は相対的に小さなＤＮＡ領域 (4-10 bp) にクラスター点変異を作製するのに適した方法である。
５．PCRも、直接的な変異体作製法として利用できる。
［参考文献： Current protocols in molecular biology. 3 vols.Edited by Ausubel F.M. et al., John Wiley & Sons, Inc., Current Protocols., Vol.1,Chapter 8: Mutagensis of clonedＤＮＡ, pages 8.0.1-8.5.10］。
【００２１】
これらの方法で得られた種々の変異型を含む所望の遺伝子を発現することの可能なプラスミドやベクターの作製方法も、当業者に周知である。すなわち、制限酵素とリガーゼとの組合わせを用いて、所望の遺伝子を含んだＤＮＡを発現ベクターＤＮＡに挿入することにより、所望の遺伝子を含んだ組換えプラスミドを容易に構築することができる。得られた組換えプラスミドを種々の細胞に導入することにより細胞をトランスフェクトし、形質転換細胞を作製することができる。細胞としては、大腸菌などの原核細胞から、酵母や昆虫、植物や動物細胞も利用することができる。
［参考文献： Vectors essential data.  Gacesa P. and Ramji D.P.166 pages. BIOSScientific Publishers Limited 1994., John Wiley & Sons in association with BIOS  Scientific Publishers Ltd.  Expression vectors, pages 9-12.］
【００２２】
宿主細胞への組換えプラスミドの導入は、塩化カルシウム法やエレクトロポレーション法により行うことができる。塩化カルシウム法は効率的なトランスホーメイションを与え、特別な装置を必要としない。より高い効率を求めるならば、エレクトロポレーションが用いられるべきである。
［参考文献： Current protocols in molecular biology.3 vols. Edited by Ausubel F.M.et al., John Wiley & Sons,Inc., Current Protocols.Vol.1,unit 1.8: Introduction of plasmid DNA into cells, pages 1.8.1-1.8.10］
【００２３】
動物細胞系で通常行われるトランスフェクションには、一過性のものと安定で永久的なものとの２通りが知られている。一過性のトランスフェクションでは、形質転換細胞を1〜4日間培養してトランスフェクトした遺伝子を転写、複製し、細胞を回収してＤＮＡ分析を行う。代わりに、多くの研究では、トランスフェクト遺伝子を染色体遺伝子に組み込む安定型の形質転換系を作製している。トランスフェクション法としては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム触媒法などが用いられる。
［参考文献： Current protocols in molecular biology. 3 vols. Edited by Ausubel F.M.et al., John Wiley & Son,Inc., Current Protocols.  Vol.1, Chapter 9: Introduction of DNA into mammalian cells, pages 9.0.1-9.17.3.］
【００２４】
本発明のＮａ＋駆動型Ｃｌ−／ＨＣＯ３−エクスチェンジャータンパク質及びその断片や相同体に対するポリクローナルやモノクローナル抗体の作製も、当該分野において周知の技術を用いて容易に行うことができる。
【００２５】
本発明のＮａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャータンパク質に対するｍｇレベルのモノクローナル抗体の一般的作製法は、次の通りである。すなわち、抗原タンパク質をマウスに接種して免疫し、十分な抗体タイターを示すマウスから脾臓を除去する。脾臓細胞を分離して脾臓Ｂ細胞を選択し、Ｂ細胞起源の骨髄腫細胞に融合し、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を構築し、ハイブリドーマ細胞から分泌されたモノクローナル抗体を、細胞培養液からアイニティーカラム、イオン交換法、ゲルろ過法等を用いて精製する。また、一般的な方法で本発明物質のポリクローナル抗体をも製造できる。すなわち、免疫動物としては兎、馬、マウス、モルモットなどを用い、当業者に既知の種々のスケジュールで抗原タンパク質を接種して免疫し、採血した血清から免疫グロブリンＧなどを単離する。
［参考文献： Current protocols in mlecular biology. 3 vols. Edited by Ausuel F.M.et al.  John Wiley & Sons,Inc.,  Current Protocols. Vol.2, chapter 11: Immunology, pages 11.0.1-11.16.13］
【００２６】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明が該実施例に限定されることは意図しない。
【００２７】
Ｎａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーの構造及び機能的役割を決定するため、本発明者等は、マウスのインスリン分泌細胞株ＭＩＮ６ ｃＤＮＡライブラリーよりＮａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャー（ＮＣＢＥと命名）をクローンした。Ｎａ+駆動型塩素イオン（Ｃｌ-）／重炭酸イオン（ＨＣＯ3-）エクスチェンジャー（ＮＣＢＥと命名）の一次構造、組織分布、及び機能的特徴決定を以下に示す。
【００２８】
マウスのＮＣＢＥタンパク質（配列番号２）は、1,088個のアミノ酸よりなり、ヒトの筋肉、網膜及び腎臓のナトリウム重炭酸イオン共輸送体と、それぞれ65％、65%及び41％のアミノ酸同一性を有することが明らかとなった。このタンパク質は、10個の推定の膜貫通領域を有し、アニオンエクスチェンジャー及びナトリウムイオン重炭酸イオン共輸送体に特徴的な、保存された4,4−ジイソチオシアノスチルベン−2,2−ジスルホン酸（ＤＩＤＳ）結合モチーフを有する。ＮＣＢＥ ｍＲＮＡは、脳及びマウスのインスリノーマ細胞株ＭＩＮ６において高レベルで発現され、下垂体、精巣、腎臓、及び回腸においては低レベルで発現される。アフリカツメガエル卵母細胞及びHEK293細胞におけるＮＣＢＥタンパク質発現の機能的解析により、該タンパク質が、細胞内のＣｌ-と引き替えに細胞外のＮａ+及びＨＣＯ3-を細胞内に輸送して細胞内ｐＨの上昇を引き起こすことが明らかとなった。こうして本発明者等は、ＮＣＢＥが、天然の細胞において細胞内ｐＨを制御しているＮａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーであるとの結論に達した。
【００２９】
ヒトのＮＣＢＥについても同定するため、次に、こうして得られたマウスＮａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーのｃＤＮＡの部分配列（2,746 bp）をＰＣＲ法により増幅した。増幅には、センスプライマーとして配列表の配列番号１に示した塩基配列中の第250〜270位の塩基配列よりなるＤＮＡを用い、アンチセンスプライマーとしては、配列表の配列番号１に示した塩基配列の第2976〜2995位の塩基より配列に対して相補的な塩基配列よりなるＤＮＡを用いた。ＰＣＲ条件は次の通りとした。
【００３０】
初期変性：  94℃、２分
増幅（20サイクル）
・変性：      94℃、15秒
・アニーリング：  60℃、30秒
・延長：      72℃、２分
最終延長：  72℃、７分
【００３１】
得られたＰＣＲ産物を32Ｐ−ｄＣＴＰを用いてニックトランスレーション法によて標識し、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（Clontech社）から約100万個のファージをスクリーニングした。得られた４つの陽性ファージクローンについて、そのＤＮＡをEcoRIで消化しアガロース電気泳動によりバンドを切り出し、該当するＤＮＡを抽出することにより、それぞれ挿入断片を得た。別に、pGEM7Z（Promega社）をEcoRIで消化し、アルカリホスファターゼ処理した。これに、陽性ファージから得られた挿入断片をそれぞれライゲートすることによりサブクローニングした。ABI社製310オートシークエンサーを用いてそれぞれの挿入断片の塩基配列を決定し、得られた塩基配列より、ヒトＮＣＢＥタンパク質に対応するｃＤＮＡの塩基配列を決定した（配列表において配列番号３に示す）。またこの結果に基づき、ヒトＮＣＢＥタンパク質を配列決定した（配列表において配列番号４に示す）。
【００３２】
これらの実験の方法及び結果を、マウスのＮＣＢＥについて行った操作及び結果を中心に、以下説明する。
【００３３】
〔材料及び方法〕
＜ｃＤＮＡクローニング及びＲＮＡブロット分析＞
ヒト腎臓ＮＢＣ ｃＤＮＡ [Burnham, C.E., et al., J. Biol. Chem., 272:19111-19114(1997)] の部分的ｃＤＮＡ断片を、ヒト腎臓ｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲにより増幅した。用いたセンスプライマー及びアンチセンスプライマーは、5-tttggagaaaacccctggt-3 (nt 2232-2250)（配列番号５）及び5-tgacatcatccaggaagctg-3 (nt 2912-2931)（配列番号６）であった。ＰＣＲは、次の条件で40サイクル行った。すなわち、サーマルサイクラーGeneAmp PCR システム 9600（PE Applied Biosystems, Foster, CA）中において、変性：94℃１５秒間、アニーリング：60℃30秒間、延長：72℃45秒間である。700 bpのＰＣＲ産物を、プローブとして、先に記載した低ストリンジェント条件下 [Fukumoto, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5434-5438(1988)] にＭＩＮ６ ｃＤＮＡライブラリー [Inagaki, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2679-2683(1994)] のスクリーニングにかけた。陽性のクローンをpGEM-3Zベクター（Promega, Madison, WI）にサブクローンし、ABI PRISMTM377 ＤＮＡ シーケンサー (PE Applied Biosystems)を用いて両方向に配列決定した。
【００３４】
＜ＲＮＡブロット分析＞
ＲＮＡブロット分析は、種々の組織及び細胞からの10μｇの全ＲＮＡを用いて行った。これらのＲＮＡをホルムアルデヒドで変性し、１％アガロースゲルで電気泳動し、ナイロン膜上に転写した。先に記述した標準的な条件下 [Wang, C-Z. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 220:196-202(1996)] に、ブロットをＮＣＢＥ ｃＤＮＡでプローブした。オートラジオグラフィーに先だって、ブロットを0.1×ＳＳＣ及び0.1％ＳＤＳで室温にて１時間洗浄し、次いで50℃にて１時間洗浄した。
【００３５】
＜逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）＞
単離したマウス膵島より、TRIZOL試薬（Life Technologies, Inc., Rockville, MD）で全ＲＮＡを調製した。第一鎖のｃＤＮＡ（10ｎｇ）は、SuperscriptTMII逆転写酵素（Life Technologies）を用いてランダムプライマーにより作った。ＰＣＲは、Expand High Fidelity PCR システム (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)により、標準条件下で20μｌの反応量で約１ｎｇの鋳型ＤＮＡを用いて行った。用いたセンスプライマー及びアンチセンスプライマーは、5-gtcatgttagaccaacaggt-3 (nt 4283-4302)（配列番号７）及び5-gttgtaatagcgacactc-3 (nt 4911-4928)（配列番号８）であった。産物を１％アガロースゲルに溶解させ、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【００３６】
＜アフリカツメガエル（Xenopus Laevis）卵母細胞におけるＮＣＢＥの機能的分析＞
pSD5中のＮＣＢＥのコード配列を、FspIによる消化によって直鎖化し、先に記述したように [Wang, C-Z. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 220:196-202(1996)] SP6 ＲＮＡポリメラーゼによりin vitro転写を行った。脱濾胞した卵母細胞にＮＣＢＥ ｃＲＮＡ（50ｎｌ、0.5μｇ／μｌ）又は水を注入し、１×ＭＢＳ培地（88ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化カリウム、0.8ｍＭ塩化マグネシウム、0.4ｍＭ塩化カルシウム、0.3ｍＭ硝酸カルシウム、2.4ｍＭ炭酸水素ナトリウム、及び7.5ｍＭトリス、ｐＨ7.4）中で試験まで３〜５日、18℃にてインキュベートした。標準溶液（100ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭ塩化カルシウム、及び８ｍＭ炭酸水素ナトリウム、ｐＨ7.4）中で卵母細胞を１時間、18℃にてプレインキュベートした。
【００３７】
細胞外Ｎａ+濃度への依存性の試験のために、次いで卵母細胞を、1ｍＭ、10ｍＭ、30ｍＭまたは100ｍＭのＮａ+溶液の1.4ｍｌ中で、1.5％ＣＯ2を通しつつｐＨ7.4で、0.074ＭＢｑの22Ｎａ+（NENTM Life Science Products, Boston, MA）と共にインキュベートした。各々の溶液において、標準溶液中のＮａ+を等モルの塩素で置き換えた。10μｌの部分量を、後で22Ｎａ+比活性を定量するために、インキュベーション溶液から採取した。15分後、1ｍＭ、10ｍＭ、30ｍＭ又は100ｍＭのＮａ+含有のｐＨ7.4の氷冷溶液でそれぞれ３回洗浄することによって22Ｎａ+取り込みを停止させ、そして卵母細胞を0.5ｍｌの５％ＳＤＳ中に溶かし、4.5ｍｌの水性計数シンチラント（Aqueous Counting Scintillant : Amersham Pharmacia Biotech）を加えた。22Ｎａ+の取り込みは、Ｃｌ-不含の１ｍＭ、10ｍＭ、30ｍＭ又は100ｍＭのＮａ+溶液（ｐＨ7.4）中で行った。細胞外Ｃｌ-は、等モルのグルコン酸で置き換え、細胞外Ｎａ+は、等モルのＮ−メチル−Ｄ−グルカミン（ＮＭＧ）で置き換えた。15分間の22Ｎａ+取り込みはまた、300μＭの4,4−ジイソチオシアノスチルベン−2,2−ジスルホン酸（ＤＩＤＳ、Sigma）（標準溶液中のアニオン輸送体の阻害剤である）の存在下又は非存在下にも行った。
【００３８】
細胞外重炭酸イオン濃度への依存性の研究のためには、22Ｎａ+取り込み実験を0.074ＭＢｑの22Ｎａ+を含有する1ｍＭ、３ｍＭ、10ｍＭ又は30ｍＭの重炭酸イオン溶液中、で1.5％ＣＯ2を通しつつ、18℃、ｐＨ7.4で行った。これらの溶液は、２ｍＭの塩化カリウム、１ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭの塩化カルシウムを含有しｐＨ7.4であり、１ｍＭ重炭酸イオン溶液用には107ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭの重炭酸ナトリウムを、３ｍＭの重炭酸イオン溶液用には105ｍＭの塩化ナトリウム及び３ｍＭの重炭酸ナトリウムを、10ｍＭの重炭酸イオン用には、98ｍＭの塩化ナトリウム及び10ｍＭの重炭酸ナトリウム、30ｍＭ重炭酸イオン溶液用には78ｍＭの塩化ナトリウム及び30ｍＭの重炭酸ナトリウムを含有した。
【００３９】
36Ｃｌ-流出実験のためには、細胞内Ｃｌ-を枯渇させるためにＣｌ-不含溶液中で、又はＣｌ-含有標準溶液中で、卵母細胞を１時間プレインキュベートした。卵母細胞を0.074ＭＢｑの36Ｃｌ-含有溶液（NENTM Life Science Products）中で、18℃にて１時間、1.5％ＣＯ2を通しつつインキュベートした。それぞれ対応する溶液で３回、卵母細胞を手早く洗浄し、次いで1.5％のＣＯ2を通しているｐＨ7.4の各Ｃｌ-不含溶液1.5ｍｌ中へ移した。10μｌの部分量を、後で36Ｃｌ-比活性を測定するために、インキュベーション溶液から採取した。36Ｃｌ-活性は、0, 5, 15, 25及び35分に測定した。残存する細胞内36Ｃｌ-を測定するために、卵母細胞を上記のように処理した。各時間点からの培地の一部をカウントし、流出量を決定するために値を合計した。36Ｃｌ-流出は、全細胞36Ｃｌ-放出に対するパーセントとして表した。22Ｎａ+及び36Ｃｌ-の測定は、βシンチレーションカウンター（Aloka, Japan）によって行った。
【００４０】
ＨＥＫ293細胞内のＮＣＢＥの機能的分析
ＨＥＫ293細胞を、カバーグラスを含んだ3.5ｃｍ径のペトリ皿あたり３×105個の密度に播き、10％胎仔牛血清、ストレプトマイシン（60.5μｇ／ｍｌ）及びペニシリン（100μｇ／ｍｌ）を補充したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、高グルコース）中、37℃にて、95％空気及び５％ＣＯ2の加湿条件下に培養した。メーカーのマニュアルに従い、Lipofectamin及びLipofectamin Plus及びOpti-MEM I試薬（Life Technologies, Gaithersburg, MD）を用いて、pcDNA3.1ベクター（Invitrogen, Groningen, the Netherlands）中に組み込んだ全長ＮＣＢＥ ｃＤＮＡの１μｇで、細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの48〜72時間後、細胞を検討した。細胞内ｐＨの変化は、2,7−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（6）−カルボキシフルオレッセイン、アセトキシメチルエステル（BCECF-AM, Molecular Probes, Eugene, OR） [Burnham, C.E., et al., J. Biol. Chem., 272:19111-19114(1997)] を用いてモニターした。ＨＥＫ293細胞に１時間１μＭ BCECF-AMを加え、コンピュータ化した画像処理装置（490ｎｍ／450ｎｍ；520〜560ｎｍ発光）（Argus-50; 浜松ホトニクス）を用い二重励起波長法により細胞内ｐＨの変化をモニターした。細胞内ｐＨの差を、試験溶液の切り替えの前と10分後との間における細胞内ｐＨの差として評価した。細胞内ｐＨの較正曲線は、ＫＣｌ／ニゲリシン法 [Thomas, J.A. et al., Biochemistry 18:2210-2218(1979)] を用いて作った。全ての実験において、初めに、細胞を、Ｎａ+含有の各試験溶液に切り替える前の５分間、40ｍＭ塩化アンモニウム含有溶液によるＮＨ4+−プレパルスで酸性化した [Burnham, C.E., et al., J. Biol. Chem., 272:19111-19114(1997)]。
【００４１】
細胞内酸性化からの細胞内ｐＨ回復（ΔｐＨi）のＮａ+依存性を評価するために、Ｎａ+不含溶液(115ｍＭ塩化テトラメチルアンモニウム（TMA-Cl）、25ｍＭ重炭酸カリウム、0.8ｍＭリン酸水素カリウム、0.2ｍＭリン酸二水素カリウム、１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、10ｍＭ ＨＥＰＥＳ)、及びＮａ+含有溶液（Ｎａ+不含溶液中のTMA-Cl及び重炭酸カリウムを、90ｍＭ塩化ナトリウム、25ｍＭ塩化カリウム及び25ｍＭ重炭酸ナトリウムで置換）を用いた。
【００４２】
重炭酸イオン依存性を試験するために、重炭酸イオン及びＮａ+不含溶液（115ｍＭ TMA-Cl、0.8ｍＭリン酸水素カリウム、0.2ｍＭリン酸二水素カリウム、１ｍＭ塩化カルシウム、１ｍＭ塩化マグネシウム、10ｍＭ ＨＥＰＥＳ）、及び重炭酸イオン不含Ｎａ+含有溶液（重炭酸イオン及びＮａ+不含溶液中のTMA-Clを90ｍＭの塩化ナトリウム及び25ｍＭの塩化カリウムで置換）を用いた。
【００４３】
Ｃｌ-依存性を測定するために、Ｃｌ-及びＮａ+不含溶液（25ｍＭ重炭酸カリウム、0.8ｍＭリン酸水素カリウム、0.2ｍＭリン酸二水素カリウム、10ｍＭ ＨＥＰＥＳ、115ｍＭ ＮＭＧ―グルコネート）及びＣｌ-不含Ｎａ+含有溶液（ＮＭＧ−グルコネートを115ｍＭのグルコン酸ナトリウムで置換）を用い、結果を比較した。
【００４４】
全ての溶液は、95％Ｏ2及びＣＯ2を通し、ｐＨ7.4に調整した。各溶液の浸透圧は、ショ糖により調節した。アッセイは37℃にて行った。
【００４５】
統計解析
結果は、平均±ＳＥ（平均偏差）として表した。実験間の統計的有意差は、Students ｔ テストにより判定した。
【００４６】
〔結果及び考察〕
ＮＣＢＥは、Ｎａ+−ＨＣＯ3-輸送体に構造的に関連している。
ヒト腎臓のＮａ+−ＨＣＯ3-共輸送体（ＮＢＣ）の部分をプローブとして用いてＭＩＮ６ ｃＤＮＡをスクリーニングすることにより、上記の通り、Ｎａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャー（ＮＣＢＥ）をコードするｃＤＮＡをクローンした。得られた塩基配列（ＮＣＢＥ）を配列表の配列番号１に示す。この5,385ｂｐの複合体ヌクレオチド配列は、atg の上流にあるインフレーム（in-frame）の停止シグナルに続くオープンリーディングフレーム（推定分子量122ｋＤａを有する、配列番号１に示した1,088個のアミノ酸よりなるタンパク質をコードする）を含んでいる。疎水性分析は、該アミノ酸配列において、推定の膜貫通領域（ＴＭ１−ＴＭ１０）が、それぞれ次の部位にあることを示している。
ＴＭ１：  アミノ酸４７９〜４９９
ＴＭ２：  アミノ酸５１４〜５３４
ＴＭ３：  アミノ酸５６４〜５８４
ＴＭ４：  アミノ酸６９３〜７１３
ＴＭ５：  アミノ酸７３３〜７５３
ＴＭ６：  アミノ酸７８０〜８００
ＴＭ７：  アミノ酸８２６〜８４６
ＴＭ８：  アミノ酸８８２〜９０１
ＴＭ９：  アミノ酸９０５〜９２４
ＴＭ１０：  アミノ酸９７２〜９９２
該アミノ酸配列において、３個の潜在的Ｎ−結合グリコシレーション部位が、第３（ＴＭ３）及び第４（ＴＭ４）貫通領域の間の細胞外ループに存在する（Ａｓｎ-647、Ａｓｎ-657、Ａｓｎ-667）。推定的ＤＩＤＳ結合モチーフは、アミノ酸８１５〜８１８にある。
【００４７】
ＮＣＢＥと他のＮＢＣとの間でのアミノ酸配列の比較は、ＮＣＢＥが、ヒトの筋肉のＮＢＣ [Pushkin, A. et al., J. Biol. Chem., 274:16569-16575(1999)]、ヒトの網膜のＮＢＣ [Ishibashi, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 24:535-538(1998)]、及びヒトの腎臓のＮＢＣ [Burnham, C.E., et al., J. Biol. Chem., 272:19111-19114(1997)] と、それぞれ65％、65％及び41％のアミノ酸同一性を有することを示し、このことは、ＮＣＢＥが新規の重炭酸イオン輸送体の一つであることを示すものである。この推定の膜貫通領域のアミノ酸配列及びＤＩＤＳ結合モチーフLys Leu Lys Lys（残基815〜818）がＮＣＢＥにおいてよく保存されている一方、細胞内アミノ及びカルボキシル末端並びに第３及び第４の膜貫通領域の間にある大きな細胞外ループは、かなり異なっている。
【００４８】
ＮＣＢＥは、脳及びインスリン分泌クローナル膵β細胞において高レベルに発現される。
ＲＮＡブロット分析は、5.5ｋｂのＮＣＢＥ ｍＲＮＡが、脳及びインスリン分泌細胞株であるＭＩＮ６細胞において高レベルに発現され、そして下垂体、精巣、腎臓及び回腸において低レベルに発現されることを明らかにした（図１、ａ）。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＮＣＢＥがまた、膵島においても発現されることを示している（図１，ｂ）。
【００４９】
図において、ａは、ラット組織及びホルモン分泌細胞株における、ＮＣＢＥ ｍＲＮＡのＲＮＡブロット分析の結果を表しており、ハイブリダイズした転写物のサイズが示されている。ｂは、マウス膵島のＮＣＢＥ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる検出の結果を表しており、ＤＮＡ長マーカー及びＲＴ−ＰＣＲ産物が、レーン１及び２にそれぞれ示されている。
【００５０】
ＮＣＢＥは、細胞内ｐＨを制御するＮａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーである。
本発明等は、アフリカツメガエル卵母細胞の系を用いて、ＮＣＢＥの機能的性質を検討した。ｃＲＮＡ又は対象としての水の注入後、22Ｎａ+の取り込み及び36Ｃｌ-流出を３〜５日にわたって測定した。卵母細胞を酸性化するために1.5％ＣＯ2でバブリングしつつ、本発明者等は、22Ｎａ+取り込みに対する細胞外Ｎａ+濃度の影響につき先ず検討した。結果を図３に示す。
【００５１】
図３は、  22Ｎａ+取り込み（nmol／卵母細胞／時）と細胞外Ｎａ+濃度との関係を表している。図において、■及び●は、ＮＣＢＥ ｃＲＮＡを注入した細胞についての結果を表し、□及び○は、水を注入した細胞についての結果を表す。■及び□は、細胞外Ｃｌ-含有溶液中における結果を表し、●及び○は、細胞外Ｃｌ-不含溶液中における結果を表す。データは、２つの独立した実験からの７〜16個の卵母細胞の平均±ＳＥ（平均偏差）を表す。  *及び†（ｐ＜0.05）は、水を注入された細胞外Ｃｌ-不含の、それぞれ10ｍＭ、30ｍＭ及び100ｍＭ Ｎａ+溶液中との対比による統計学的有意差の有無を示す。
【００５２】
図２に示したように、22Ｎａ+の取り込みの増加は、細胞外Ｎａ+濃度に依存しており、そしてＮＣＢＥ ｃＲＮＡ注入卵母細胞において、生理学的Ｎａ+濃度範囲にわたって直線的パターンを示した。水を注入された卵母細胞では、22Ｎａ+の取り込みに何の増加も見られなかった。Ｃｌ-含有及びＣｌ-不含の溶液中でのＮａ+の取り込みの比較は、細胞外Ｃｌ-の不存在下におけるより細胞外Ｃｌ-の存在下における方がＮａ+の取り込みが有意に高いことを示した（図２）。これらの結果は、ＮＣＢＥが細胞外のＮａ+を細胞内へ輸送すること、及び細胞外のＣｌ-がＮＣＢＥの活性の促進に関与していることを示している。
【００５３】
本発明者等は、次に、22Ｎａ+の取り込みに対する細胞外重炭酸イオンの効果を検討した。結果を図３に示す。データは、２つの独立した実験からの11〜16個の卵母細胞の平均±ＳＥ（平均偏差）。*（ｐ＜0.05）は、水注入との対比を示す。図より明らかなように、細胞外重炭酸イオンの増加は、ＮＣＢＥ ｃＲＮＡ注入卵母細胞において濃度依存的にＮａ+取り込みを有意に増大させた一方、水を注入した卵母細胞は、Ｎａ+取り込みにおいてそのような変化を何も示さず、このことは、細胞内へのＮａ+輸送に細胞外重炭酸イオンが必要であることを示している。
【００５４】
Ｃｌ-が細胞内へ又は細胞から外へＮＣＢＥによって輸送されるか否かをみるため、本発明等は、アフリカツメガエル卵母細胞からの36Ｃｌ-流出につき検討した。水を注入した卵母細胞では卵母細胞への36Ｃｌ-の流入は検出されなかったことから、本発明等は、ＮＣＢＥ ｃＲＮＡ注入卵母細胞からの36Ｃｌ-の流出についてのみ分析した。ＮＣＢＥ ｃＲＮＡ注入卵母細胞からの０〜35分にかけての36Ｃｌ-の流出率（％）の測定を、Ｃｌ-不含溶液でのプレインキュベーションによって細胞内Ｃｌ-を枯渇させた状態と、Ｃｌ-含有溶液でのプレインキュベーションにより細胞内Ｃｌ-が存在する状態とにおいて、行った。結果を図４に示す。図において、●は、細胞内Ｃｌ-非枯渇条件下（Ｃｌ-含有溶液でプレインキュベーション）の細胞についての結果を表し、▲は、細胞内Ｃｌ-枯渇条件下（Ｃｌ-不含溶液でプレインキュベーション）の細胞についての結果を表す。データは、３つの独立した実験からの16〜17個の卵母細胞の平均±ＳＥ（平均偏差）を表す。*（ｐ＜0.05）は、５，15、25及び35分における細胞内Ｃｌ-枯渇との対比を示す。
【００５５】
これら異なった条件下における36Ｃｌ-の流出の比較は、ＮＣＢＥが細胞内Ｃｌ-を細胞外へ輸送することを示す。総合すると、これらの結果は、ＮＣＢＥが細胞外のＮａ+及び重炭酸イオンを細胞内のＣｌ-と交換することを明らかにしている。
【００５６】
本発明等はまた、アニオン輸送体阻害剤であるＤＩＤＳの22Ｎａ+の取り込みに対する影響をも検討した。すなわち、0.3ｍＭのＤＩＤＳの存在下又は不存在下において発現を評価した。結果を図５に示す。データは、３つの独立した実験からの21〜22個の卵母細胞の平均及びＳＥ（平均偏差）として表されている。*（ｐ＜0.05）は、ｃＲＮＡ＋ＤＩＤＳとの対比を示す。
【００５７】
ＮＣＢＥ ｃＲＮＡを注入した卵母細胞における22Ｎａ+の取り込みは、ＤＩＤＳの不存在下では31.4±2.1 nmol／卵母細胞／時（ｎ＝21）であり、300μＭのＤＩＤＳの存在下では6.0±0.7 nmol／卵母細胞／時（ｎ＝14）であった。水を注入した卵母細胞における取り込みは、ＤＩＤＳの不存在下及び存在下において、それぞれ、1.6±0.3（ｎ＝22）及び2.1±0.4（ｎ＝19）nmol／卵母細胞／時であった。こうして、ＮＣＢＥによる22Ｎａ+の取り込みは、ＤＩＤＳによって部分的に阻害された（図５）。
【００５８】
細胞内ｐＨの制御におけるＮＣＢＥの役割を明らかにするため、ＮＣＢＥで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ293細胞において、種々の条件下での細胞内ｐＨ変化を測定した。実験は何れも、ＮＨ4+−プレパルスにより細胞内ｐＨを酸性化した条件で行った。細胞内ｐＨが細胞外Ｎａ+に依存性であるか否かを判定するため、細胞の環境をＮａ+不含溶液からＮａ+含有溶液へと変化させた。結果を図６に示す。図６は、対照（非トランスフェクト）細胞、及び300μＭのＤＩＤＳの有無によるＮＣＢＥトランスフェクト細胞の追跡の結果を示すグラフである。細胞の環境は、Ｎａ+不含溶液からＮａ+含有溶液へと変更されている。
【００５９】
図に見られるように、Ｎａ+／Ｈ+エクスチェンジャーに対する特異的阻害剤である１ｍＭの５−（Ｎ−エチル−Ｎ−イソプロピルアミロライド（ＥＩＰＡ）の存在下に、細胞内ｐＨの迅速な回復（ΔｐＨi）が、ＮＣＢＥでトランスフェクトした細胞においてのみ観察された〔ΔｐＨiは、ＮＣＢＥでトランスフェクトした細胞では0.239±0.028（ｎ＝97）であり、対照では0.003±0.015（ｎ＝70）であった。ｐ＜0.05〕（図６）。この細胞内ｐＨの回復は、300μＭのＤＩＤＳにより部分的に阻害された〔ΔｐＨiは、0.023±0.042（ｎ＝89）であった。ｐ＜0.05〕。
【００６０】
この細胞内ｐＨの変化が重炭酸イオン依存性であるか否かを判定するため、１ｍＭのＥＩＰＡの存在下において、ＮＣＢＥトランスフェクト細胞の環境を、ＨＣＯ3-不含且つＮａ+不含の溶液から、ＨＣＯ3-不含だがＮａ+は含有する溶液に切り替えた。しかしながら、図７に示されるように、細胞内ｐＨの回復は検出されなかった〔ΔｐＨiは、0.002±0.014（ｎ＝71）〕。
【００６１】
最後に、本発明等は、Ｃｌ-依存性についても試験した。実験を通して、ＮＣＢＥトランスフェクト細胞をＣｌ-不含溶液中に（細胞内Ｃｌ-枯渇条件下に）維持した。この条件下で、細胞の環境を、Ｎａ+不含溶液からＮａ+含有溶液へと変更した。１ｍＭのＥＩＰＡの存在下では、図８に示されるように、細胞内ｐＨの回復は検出されなかった〔ΔｐＨiは、0.067±0.012（ｎ＝95）〕。
【００６２】
これらの結果は、細胞内酸性化からの細胞内ｐＨの回復は、細胞外のＮａ+、ＨＣＯ3-、及び細胞内Ｃｌ-の存在下においてのみ検出されることを示している。
【００６３】
アフリカツメガエル卵母細胞及びＨＥＫ293細胞において異種で発現されたＮＣＢＥの機能的研究は、ＮＣＢＥが、細胞内Ｃｌ-と引き替えに細胞外のＮａ+及びＨＣＯ3-を輸送することによって、急性の細胞内酸性化から細胞内ｐＨを回復させることを示している（図３及び図４）。ＮＣＢＥは、これまでに報告されているアニオンエクスチェンジャー及びＮａ+−ＨＣＯ3-共輸送体からは機能的に別個である。なぜならば、１）アフリカツメガエル卵母細胞において発現されたＮＣＢＥは、細胞内Ｃｌ-に依存性のＮａ+取り込み増加を示し、２）Ｃｌ-を外側へと輸送する能力を示し、更には、３）ＨＥＫ239細胞において発現されたＮＣＢＥは、細胞外Ｎａ+、ＨＣＯ3-及び細胞内Ｃｌ-に依存して細胞内ｐＨを高めるからである。これらの性質は、天然の細胞において記述されたＮａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーの性質と同様である。従って、クローンされたこのＮＣＢＥは、Ｎａ+駆動型Ｃｌ-／ＨＣＯ3-エクスチェンジャーである。
【００６４】
ＮＣＢＥについて考え得る生理学的重要性
インスリン分泌細胞株ＭＩＮ６及び膵島におけるＮＣＢＥ ｍＲＮＡの発現は、その生理学的重要性を意味している。グルコース誘導性のインスリン分泌は、膵島β細胞において細胞内ｐＨの上昇を伴うことが示されている。幾つかの細胞内ｐＨレギュレーターが膵β細胞に存在することが示唆されているが、それらのレギュレーターの分子的基礎は知られていない。ＮＣＢＥは、一次構造及び機能的性質が決定された初めての細胞内ｐＨ制御エクスチェンジャーである。ＮＣＢＥは、グルコース代謝により酸性化した膵β細胞の細胞内ｐＨの回復プロセスに寄与していると思われる。ＮＣＢＥ ｍＲＮＡは精巣にも存在するが、その発現レベルは低い。細胞内ｐＨは、精子の受精能獲得（capacitation）を含む多くの精子機能を制御していることが示されている。精子の受精能獲得は、細胞内ｐＨの上昇をもたらし、これは機能的な、Ｎａ+、Ｃｌ-、及びＨＣＯ3-依存性の酸流出経路を必要とすることから、ＮＣＢＥは、精子の受精能獲得に参画している可能性がある。ＮＣＢＥ ｍＲＮＡはまた、脳においても高レベルで発現されている。生理学的研究によればＮＣＢＥは、海馬のニューロン及び星状細胞に存在するかも知れないが、そのような細胞におけるその生理学的重要性は現在のところ不明である。
【００６５】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ラット組織及びホルモン分泌細胞株における、ＮＣＢＥ ｍＲＮＡのＲＮＡブロット分析（ａ）及びマウス膵島のＮＣＢＥ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる検出（ｂ）の結果をそれぞれ示す。
【図２】  22Ｎａ+取り込みに対する細胞外Ｎａ+濃度の影響を示すグラフ。
【図３】  22Ｎａ+取り込みに対する細胞外ＨＣＯ3-濃度の影響を示すグラフ。
【図４】  36Ｃｌ-流出に対する細胞内Ｃｌ-の影響を示すグラフ。
【図５】  22Ｎａ+取り込みに対するＤＩＤＳの影響を示すグラフ。
【図６】  対照（非トランスフェクト）細胞、及び300μＭのＤＩＤＳの有無による細胞内ｐＨの変化を示すグラフ。
【図７】  ＨＣＯ3-不含条件において、環境をＮａ+不含溶液からＮａ+含有溶液へと変更したときの細胞内ｐＨの変化を示すグラフ。
【図８】  Ｃｌ-不含条件において環境を、Ｎａ+不含溶液からＮａ+含有溶液へと変更したときの細胞内ｐＨの変化を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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