(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンドロイチナーゼＡＢＣを含有する、一酸化窒素産生抑制試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はコンドロイチナーゼの新規な用途に関する。より詳細には、コンドロイチナーゼを含有する窒素酸化物産生抑制剤、細胞・組織障害の防止又は抑制剤、および抗炎症剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
コンドロイチナーゼは、コンドロイチン硫酸（以下、「ＣＳ」ともいう）の分解を触媒する酵素である。コンドロイチナーゼには種々の種類が知られており、例えばコンドロイチナーゼＡＢＣ(chondroitinase ABC)〔EC 4.2.2.4〕は、哺乳動物軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ａ、鮫軟骨由来のコンドロイチン硫酸Ｃおよび哺乳動物皮膚由来のコンドロイチン硫酸Ｂ（デルマタン硫酸）の分解を強力に触媒し、ヒアルロン酸（以下「ＨＡ」ともいう）の分解を弱く触媒する酵素である。
【０００３】
一方、椎間板ヘルニアは、椎間板内の髄核の突出等に起因する疾患であり、突出した髄核が付近の神経を刺激するために、腰痛等の症状が現れる。
近年、コンドロイチナーゼを椎間板に投与して突出した髄核を融解して椎間板ヘルニアを治療する方法が試みられている〔米国特許4696816号明細書、Clinical Orthopaedics, 253,301-308(1990)〕。
【０００４】
Ｓｐｉｎｅ（１９９７年）第２２巻、第１０６５−１０７３頁には、椎間板の変性やヘルニアに一酸化窒素（ＮＯ）が関与している旨が記載されている。ＮＯは炎症のメディエーターの一種であり、細胞・組織の障害に関与することが知られている。
【０００５】
しかしコンドロイチナーゼが窒素酸化物の産生を抑制すること等については知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、コンドロイチナーゼ、特にコンドロイチナーゼＡＢＣの新規な用途、具体的には、窒素酸化物に起因する細胞・組織障害を防止ないし抑制する作用、又は抗炎症作用を利用した医薬を提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、コンドロイチナーゼを含有する窒素酸化物産生抑制剤（以下、「本発明抑制剤」ともいう）、本発明抑制剤からなる医薬（以下、「本発明医薬」ともいう）、コンドロイチナーゼを含有する細胞・組織障害の防止又は抑制剤（以下、「本発明防止剤」ともいう）およびコンドロイチナーゼを含有する抗炎症剤（以下、「本発明抗炎症剤」ともいう）を提供するに至った。
【０００８】
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）コンドロイチナーゼを含有する、窒素酸化物産生抑制剤。
（２）コンドロイチナーゼが、コンドロイチナーゼＡＢＣである、（１）に記載の抑制剤。
（３）（１）又は（２）に記載の抑制剤からなる医薬。
（４）椎間板または脊髄硬膜外腔投与用の（３）に記載の医薬。
（５）コンドロイチナーゼを含有する、細胞・組織障害の防止又は抑制剤。
（６）コンドロイチナーゼを含有する、抗炎症剤。
【０００９】
【発明の実施の形態】
＜1＞本発明抑制剤に用いるコンドロイチナーゼ
本発明抑制剤に用いることができるコンドロイチナーゼは、ＣＳを分解する酵素である限りにおいて特に限定されるものではない。コンドロイチナーゼとして、具体的には、コンドロイチナーゼＡＢＣ（Proteus vulgaris由来；特開平６−１５３９４７号公報、T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, S. Suzuki,J. Biol. Chem., 243, 1523(1968)、S. Suzuki, H. Saito, T. Yamagata, K. Anno, N. Seno, Y. Kawai, T. Furuhashi, J. Biol. Chem., 243, 1543(1968))、コンドロイチナーゼＡＣ(Flavobacterium heparinum由来；T. Yamagata, H. Saito, O. Habuchi, S. Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523(1968))、コンドロイチナーゼＡＣII(Arthrobacter aurescens由来；K. Hiyama, S. Okada, J. Biol.Chem.,250, 1824 (1975)、K. Hiyama, S. Okada, J. Biochem.(Tokyo), 80, 1201(1976))、コンドロイチナーゼＡＣIII(Flavobacterium sp. Hp102由来；宮園博文、菊池博、吉田圭一、森川清志、徳安清親、生化学、61、1023(1989))、コンドロイチナーゼＢ(Flavobacterium heparinum由来；Y. M. Michelacci, C. P.Dietrich, Biochem. Biophys. Res. Commun.,56, 973(1974)、Y. M. Michelacci, C. P. Dietrich, Biochem. J., 151, 121(1975)、前山賢一、多和田明、上野暁子、吉田圭一、生化学、57, 1189(1985))、コンドロイチナーゼＣ(Flavobacterium sp. Hp102由来；宮園博文、菊池博、吉田圭一、森川清志、徳安清親、生化学、61、1023(1989))等が知られており、これらのコンドロイチナーゼのいずれをも用いることができる。また、特開平９−１６８３８４号公報に記載されているヒト由来のコンドロイチン硫酸分解酵素や、コンドロイチン硫酸ＡＢＣエキソリアーゼ(chondroitin sulfate ABC exolyase； A. Hamai, N. Hashimoto, H. Mochizuki, F. Kato, Y. Makiguchi, K. Horie and S. Suzuki, J. Biol. Chem.,272, 9123-9130(1997))等のコンドロイチナーゼも、本発明抑制剤に用いることができる。
【００１０】
これらの各種コンドロイチナーゼはあくまで例示であり、本発明抑制剤で用いることができるコンドロイチナーゼはこれらに限定されるものではない。なお、本発明抑制剤において用いるコンドロイチナーゼは、１種類のコンドロイチナーゼであってもよく、あるいは複数種のコンドロイチナーゼの組み合わせであってもよく、本明細書において単に「コンドロイチナーゼ」といった場合には、これら両方の意味を包含する。
【００１１】
本発明抑制剤に用いるコンドロイチナーゼとして、コンドロイチナーゼＡＢＣを用いることが極めて好ましい。また、コンドロイチナーゼＡＢＣの中でも、特に、Proteus vulgaris由来のコンドロイチナーゼＡＢＣを用いることが好ましい。
【００１２】
ここでコンドロイチナーゼの由来とは、当該コンドロイチナーゼをコードする遺伝子を元来保有する生物を起源とすることをいう。従って、例えばProteus vulgaris由来のコンドロイチナーゼＡＢＣとは、Proteus vulgarisが元来保有する遺伝子によって産生されるコンドロイチナーゼＡＢＣを意味する。よって、Proteus vulgaris由来のコンドロイチナーゼＡＢＣには、Proteus vulgaris自体により産生されるものはもちろん、Proteus vulgarisから取得されたコンドロイチナーゼＡＢＣ遺伝子を利用して他の細胞で産生させたもの等も含まれる。
【００１３】
本発明抑制剤に用いるコンドロイチナーゼの純度は特に限定されず、使用の目的等に応じて適宜選択することができる。例えば、本発明抑制剤を後述の「本発明医薬」とする場合や、「本発明防止剤」または「本発明抗炎症剤」とする場合には、用いるコンドロイチナーゼは、医薬として使用できる程度に精製され、医薬として混入が許されない物質を実質的に含まない酵素であることが好ましい。
【００１４】
例えば本発明抑制剤に用いるコンドロイチナーゼは、300U/mg蛋白以上の比活性を有する精製されたコンドロイチナーゼであることが好ましく、300U/mg蛋白以上の比活性を有し、エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量が検出限界以下である精製されたコンドロイチナーゼがより好ましく、このような特性をもつ精製されたコンドロイチナーゼＡＢＣが特に好ましい。
【００１５】
なお、本明細書においてコンドロイチナーゼの１Ｕ(単位)は、至適ｐＨおよび至適温度付近の条件において、ＣＳから１分間に１マイクロモルの反応生成物を遊離させる酵素量である。念のため、以下に各種コンドロイチナーゼの１Ｕの定義を示す。
【００１６】
コンドロイチナーゼＡＢＣの１Ｕとは、pH8.0、37℃で１分間にコンドロイチン 6-硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。またコンドロイチナーゼＡＣ(Flavobacterium heparinum由来)の１Ｕとは、pH7.3、37℃で１分間にコンドロイチン 6-硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。
【００１７】
また、コンドロイチナーゼＡＣII(Arthrobacter aurescens由来)の１Ｕとは、pH6.0、37℃で１分間にコンドロイチン 6-硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖を遊離させる酵素量と定義される。
【００１８】
また、コンドロイチナーゼＢ(Flavobacterium heparinum由来)の１Ｕとは、pH8.0、30℃で１分間にデルマタン硫酸から１マイクロモルのヘキスロン酸残基に相当するUV吸収物質を遊離させる酵素量と定義される。
【００１９】
例えば、比活性が300U/mg蛋白以上であるコンドロイチナーゼＡＢＣを使用することにより、本発明抑制剤を本発明医薬（後述）として生体内に投与した際にも目的部位のプロテオグリカン（ＣＳやＨＡを含む）を効率的に分解することができ、かつ、窒素酸化物産生を効果的に抑制することができる。このようなコンドロイチナーゼＡＢＣは、例えば、特開平６−１５３９４７号公報に記載の方法で得ることができる。
【００２０】
＜２＞本発明抑制剤の形態等
本発明抑制剤は、上記のようなコンドロイチナーゼを、窒素酸化物の産生を抑制するために有効な量含有する。ここで「窒素酸化物の産生を抑制するために有効な量」とは、窒素酸化物の産生の抑制を検知可能な程度とすることができる量を意味する。この量は、用いるコンドロイチナーゼの種類、窒素酸化物産生の抑制を企図する細胞や組織等（以下、単に「組織等」という）の種類や状態、組織等が由来する哺乳動物の種類や症状等によっても異なるものであり、当業者が適宜決定することができるが、例えばコンドロイチナーゼとしてコンドロイチナーゼＡＢＣを用い、健常なウサギから摘出した椎間板組織において窒素酸化物の産生を抑制せしめる場合には、当該組織を０．０１〜１０００Ｕ/ｍｌ程度の酵素溶液に接触させることによって、窒素酸化物の産生を抑制することができる。
【００２１】
例えば、１回の投与に用いられる本発明抑制剤中のコンドロイチナーゼＡＢＣの具体的含量としては５Ｕ以上が例示され、５〜４００Ｕ程度がより好ましく、５〜２００Ｕ程度がさらに好ましい。
【００２２】
本発明抑制剤は、コンドロイチナーゼ以外に、さらに医薬的あるいは試薬的に許容される担体を含有していてもよい。
このような担体としては、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、着色剤、崩壊剤、緩衝剤、等張化剤、保存剤、無痛化剤等、通常医薬あるいは試薬に用いられる成分が例示され、使用の目的や、本発明抑制剤の形態（剤型等）に応じて適宜選択することができる。例えば本発明抑制剤は、溶液状態、凍結状態、乾燥形態のいずれの形態であってもよいが、保存安定性等の面では乾燥形態、特に凍結乾燥形態が好ましい。
【００２３】
本発明抑制剤中に含有させることができる担体としては、特開平１１−２３６３３６号公報に記載されているものを採用することが好ましい。本発明抑制剤の調製は、コンドロイチナーゼと所望の担体を用い、製剤学的に公知の方法により行なうことができる。
【００２４】
＜３＞本発明抑制剤の使用方法等
本発明抑制剤は、組織等の窒素酸化物の産生抑制を目的として使用することができる。かかる使用目的が意図される限りにおいて、本発明抑制剤の具体的な用途は限定されず、試薬用途・医薬用途のいずれにも使用することができる。また具体的な用途に応じて、使用方法等を適宜決定することができる。
【００２５】
本発明抑制剤による産生抑制の対象となる窒素酸化物も特に限定されないが、一酸化窒素（ＮＯ）、これが酸素と反応して生成するＮＯ2等が挙げられる。また本明細書における「窒素酸化物」という用語は、窒素酸化物の酸化物、還元物、イオン化物等も包含する。例えば、ＮＯ2から生成するＮＯ2-やＮＯ3-、ＮＯがスーパーオキシドと反応して生成するＯＮＯＯ-、ＮＯが還元されて生成するＮＯ-や、酸化されて生成するＮＯ+等も、本明細書における「窒素酸化物」に包含される。窒素酸化物の中でも、ＮＯが抑制の対象として好ましい。
【００２６】
試薬用途として使用する場合には、例えば、生体から分離された組織等に本発明抑制剤を接触させ、窒素酸化物の産生を抑制せしめることができる。また医薬用途として使用する場合については、後述の「本発明医薬」、「本発明防止剤および本発明抗炎症剤」において詳細に説明する。
【００２７】
＜４＞本発明医薬
本発明医薬は本発明抑制剤からなる医薬であり、本発明抑制剤を医薬用途に応用したものである。本発明医薬は、本発明抑制剤の医薬用途への使用が意図される限りにおいて、その具体的な使用方法等も限定されず、具体的な目的に応じて適宜決定することができる。
【００２８】
本明細書中で「医薬」とは、医療に用いられる薬品を意味する。従って、医療に用いられる薬品である限りにおいては、名称の如何にかかわらず、ここでいう「医薬」に包含される。
【００２９】
本発明医薬は、窒素酸化物の産生の抑制が望まれる組織等に投与することにより、本発明医薬に含有されるコンドロイチナーゼの作用が発揮され、当該組織及び周辺組織における窒素酸化物の産生を抑制することができる。
【００３０】
本発明医薬は、ヒトを含む哺乳類全般に投与することができるが、ヒトに投与されるものであることが特に好ましい。
本発明医薬が投与される組織等は、窒素酸化物の産生抑制を所望する組織である限りにおいて特に限定されないが、細胞・組織障害の防止や抗炎症作用が望まれる組織であることが好ましく、窒素酸化物の産生抑制による細胞・組織障害防止・抑制作用や抗炎症作用に加えて、コンドロイチナーゼ本来の作用によるＣＳ及び/又はＨＡの分解が望まれる組織であることが好ましい。
【００３１】
このような組織等として好ましいのは、椎間板ヘルニアに罹患した哺乳動物の椎間板組織、あるいは硬膜外遊走型椎間板ヘルニアや経靭帯性脱出型椎間板ヘルニア等の、突出や遊離等によって髄核が脊髄硬膜外に存在するタイプの椎間板ヘルニアに罹患した哺乳動物の脊髄硬膜外腔である。従って本発明医薬は、椎間板又は脊髄硬膜外腔投与用とすることが好ましい。
【００３２】
すなわち、本発明医薬をこのような椎間板組織等に投与することにより、コンドロイチナーゼ本来の作用によって髄核中のＣＳやＨＡが分解され、髄核中のＣＳ量、ＨＡ量およびこれらによって保持されていた水分量が減少し、その結果として髄核自体の体積を減ずることができる。のみならず、コンドロイチナーゼによる窒素酸化物の産生抑制作用により、細胞・組織の障害を防止又は抑制でき、また炎症を抑制することができる。この結果、突出した髄核による神経への刺激を速やかに除去できるとともに、細胞・組織のダメージを抑制することができ、腰痛等の椎間板ヘルニアの諸症状を効果的に改善することができる。
【００３３】
従って本発明医薬は、椎間板ヘルニアの処置（症状の改善、悪化防止、治療等）のために用いられるものであることが好ましい。
このような本発明医薬は、コンドロイチナーゼを含有する注射用製剤として主に使用される。本発明医薬を溶液状態の注射用製剤として提供する場合には、溶液状態の本発明医薬を、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器に充填・密封し、そのまま流通させあるいは保存し、注射剤として投与に供することができる。また凍結状態の注射用製剤として提供する場合には、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器中に凍結状態の本発明医薬を密封状態で保持させて、流通させあるいは保存し、投与前に融解させて注射剤として投与に供することができる。また、本発明医薬を乾燥形態の注射用製剤として提供する場合には、アンプル、バイアル、注射用シリンジ等の適当な容器中に乾燥状態の本発明医薬を密封状態で保持させて、流通させあるいは保存し、投与前に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液またはソルビトール水溶液等で溶解し、注射剤として投与に供することができる。乾燥形態の本発明医薬は、溶解用の溶媒とセットで提供してもよい。このような種々の形態の注射用製剤の中でも、乾燥形態、特に凍結乾燥形態のものが好ましい。すなわち、本発明医薬は注射用凍結乾燥製剤の形態であることが特に好ましい。
【００３４】
本発明医薬の投与量は、用いるコンドロイチナーゼの種類、投与される哺乳動物の種類や症状等、投与対象となる組織等の種類やその状態等によって個別に設定されるべきものであり、特に限定されないが、例えばコンドロイチナーゼとしてコンドロイチナーゼＡＢＣを用い、成人の椎間板ヘルニア症患者の椎間板１箇所に投与する場合、１回あたりコンドロイチナーゼＡＢＣの量として概ね０．１〜２００Ｕ程度、好ましくは０．５〜１００Ｕ程度、特に好ましくは０．５〜５０Ｕ程度を投与することができる。
【００３５】
＜５＞本発明防止剤および本発明抗炎症剤
本発明防止剤は、コンドロイチナーゼを含有する細胞・組織障害の防止又は抑制剤である。また本発明抗炎症剤は、コンドロイチナーゼを含有する抗炎症剤である。
【００３６】
これらの剤は、コンドロイチナーゼの窒素酸化物産生抑制作用を、細胞・組織障害の防止又は抑制剤および抗炎症剤に応用したものである。すなわち、ＮＯ等の窒素酸化物が細胞・組織の障害に関与していること、およびＮＯが炎症のメディエーターの一種であることが知られていることから、コンドロイチナーゼによる窒素酸化物の産生抑制作用を通じて、細胞・組織障害を防止又は抑制でき、炎症を抑制することができる。
【００３７】
本発明防止剤および抗炎症剤についての形態、投与量等の他の説明は、前記「本発明医薬」と同じである。
【００３８】
【実施例】
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかしながら、これらにより本発明の技術的範囲が限定されるべきものではない。
【００３９】
以下の実施例では、炎症メディエーターの一種であるＮＯの産生に対するコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｃ−ＡＢＣ）の効果をインビトロで検討した。
【００４０】
Ｃ−ＡＢＣがインビボで椎間板内注射されると、椎間板細胞は、周囲のマトリックス内でのＣＳの分解という変化によって活性化されることが知られている（Clin Orthop, 253, 301-308(1990)）。以下の実施例では、培養組織中の細胞を活性化してよりインビボに近い細胞状態を再現するための刺激剤として、ＩＬ−１を用いた。
【００４１】
＜１＞椎間板組織の培養
（１）組織の調製
新鮮な線維輪を、６匹の雌の日本白ウサギ（３．８〜４．４Ｋｇ）の腰椎椎間板（Ｌ１−Ｌ２およびＬ５−Ｌ６間）から切開して得た。各ウサギから得た椎間板組織は、異なる群に割り当てた。各群それぞれ６つの線維輪を用いた。２５ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸および１０％のウシ胎児血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（日水製薬、東京、日本）を、完全培地として用いた。各組織を生理的食塩水で洗浄し、完全培地（２ｍｌ）で満たされた12ウェルのカルチャープレートの各ウェルに入れた。
【００４２】
（２）培養手順
用意された組織は、３７℃で５％ ＣＯ2ガス中で、培地を毎日交換する４日間の予備培養、および３日間の連続培養からなる７日間の培養を行った。高純度精製医薬品グレードのＣ−ＡＢＣ（生化学工業株式会社製；比活性３８０Ｕ／ｍｇ蛋白、エンドトキシンを実質的に含まず、核酸、プロテアーゼ含量は検出限界以下）、および市販の組み換えヒトインターロイキン−１ｂ（ＩＬ−１ｂ）（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ、米国）を、培地への添加物として使用した。各組織は、１日目は完全培地のみで培養した。以下に示すＣ−ＡＢＣ群およびＩＬ−１＋ＡＢＣ群においては、２〜４日目に２０Ｕ／ｍｌの濃度でＣ−ＡＢＣを添加した。
【００４３】
続いて、各組織をリン酸緩衝生理食塩水および上記血清フリー培地ですすいだ。培地を、何も含まない（コントロール群）、２０Ｕ／ｍｌ濃度のＣ−ＡＢＣを含む（Ｃ−ＡＢＣ群）、１０ｎｇ／ｍｌ濃度のＩＬ−１を含む（ＩＬ−１群）、または１０ｎｇ／ｍｌ濃度のＩＬ−１および２０Ｕ／ｍｌ濃度のＣ−ＡＢＣを含む（ＩＬ−１＋Ｃ−ＡＢＣ群）無血清培地に交換した。さらに、各組織を７２時間培養した後、培地および組織を採収した。
【００４４】
＜２＞採収した組織の乾燥重量の統計学的分析
採収した組織を凍結乾燥し、乾燥重量を測定した。ダンネットの多重比較検定（Dunnett's multiple comparison test）を用いて、コントロール群および他の群との間の統計学的分析を行った。
【００４５】
結果を表１に示す。各群間で統計学的な有意差はなかった。したがって、一酸化窒素（ＮＯ）の値を乾燥重量によって標準化して差し支えない。
【００４６】
【表１】
0004833430.tif 000002
【００４７】
＜３＞炎症メディエーター（ＮＯ）の産生抑制
ＮＯ産生は、市販のキット（（株）同仁化学研究所、熊本、日本）を用いて検定した。ＮＯ産生は、その安定な酸化産物である亜硝酸（ＮＯ2-）の濃度として決定した。すなわち、培地を限外濾過し、これを２，３−ジアミノナフタレンおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７．５）で２０分、室温でインキュベートした。反応をＮａＯＨで停止し、亜硝酸と２，３−ジアミノナフタレンとの反応により得られた蛍光産物を、マイクロプレートフルオロメーター（Fluoroskan II、ラボシステムズ、ヘルシンキ、フィンランド）を用いて、９６−ブラックウェルマイクロプレートで測定した。培地中の亜硝酸濃度は、標準曲線から検量した。
【００４８】
各群の平均値および標準誤差を図１に示す。なお、図１中の＊＊は、ＩＬ−１群に対してｐ＜０．０１（スチューデントのｔ−検定）で有意差があることを示す。ＮＯ産生はＩＬ−１によって強く誘導された。Ｃ−ＡＢＣ処理（ＩＬ−１＋Ｃ−ＡＢＣ群）により、ＮＯ産生は減少し、ＮＯの産生量はＩＬ−１群よりも有意に低かった。
【００４９】
（３）結果
以上のように、Ｃ−ＡＢＣが炎症メディエーターの一種であるＮＯの産生を抑制することが明らかにされた。このようなＣ−ＡＢＣによるＮＯの減少は、椎間板細胞の障害を抑制すると考えられる。
【００５０】
【発明の効果】
本発明により、窒素酸化物産生抑制剤が提供される。本発明の窒素酸化物産生抑制剤は、試薬として、又は椎間板若しくは脊髄硬膜外腔投与用の医薬、具体的には例えば椎間板ヘルニアの処置用の医薬として有用である。
また、本発明により、細胞・組織障害の防止又は抑制剤、及び抗炎症剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  線維輪組織による一酸化窒素（ＮＯ）産生を示す図である。ＮＯ産生量を培地中の亜硝酸量として検出した。
【図１】
0004833430.tif 000003