(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトラムダ定常領域を有し、ＣＤ３抗原複合体に対し結合親和性を有する非グリコシル化ＩｇＧ１抗体であって、重鎖は、ＣＤＲとともに可変領域枠組み構造を有し、それは下記のアミノ酸配列からなるものであり、
0004629228.tif 000018
0004629228.tif 000019
0004629228.tif 000020
そして軽鎖は、下記のＣＤＲとともに可変領域枠組み構造を有し、
CDR1:         Thr Leu Ser Ser Gly Asn Ile Glu Asn Asn Tyr Val His
CDR2:         Asp Asp Asp Lys Arg Pro Asp
CDR3:         His Ser Tyr Val Ser Ser Phe Asn Val
ＣＤＲを含む軽鎖可変領域およびヒトラムダ定常領域は下記のアミノ酸配列、
0004629228.tif 000021
0004629228.tif 000022
0004629228.tif 000023
を有するという特徴を有する、上記抗体。
【請求項２】
定常領域重鎖の２９７位のアスパラギン残基が別のアミノ酸残基により置換されている、非グリコシル化型の請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
当該アスパラギン残基がアラニン残基に置換されている、非グリコシル化型の請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
抗体が、生理的に受容可能な希釈剤または担体を含む薬剤組成物の形であることを特徴とする、非グリコシル化型の請求項１ないし３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
治療に使用するための、非グリコシル化型の請求項１ないし４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
免疫抑制または癌の治療に使用するための医薬の製造のための、非グリコシル化型の請求項１ないし４のいずれか１項に記載の抗体の使用。
【請求項７】
請求項１ないし４のいずれか一つに記載の抗体をコードする組換え体核酸。
【請求項８】
配列番号１３のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項７に記載の組換え体核酸。
【請求項９】
配列番号１７のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項７または８に記載の組換え体核酸。
【請求項１０】
アミノ酸配列  配列番号２０のペプチドをコードすることを特徴とする、請求項７ないし９のいずれか一つに記載の組換え体核酸。
【請求項１１】
リーダーから定常領域方向に読むと、配列番号２５／ＣＤＲ／配列番号２６／ＣＤＲ／配列番号２７／ＣＤＲ／配列番号２８のアミノ酸配列をコードすることを特徴とする、請求項７ないし１０のいずれか一つに記載の組換え体核酸。
【請求項１２】
アミノ酸配列  配列番号１４をコードすることを特徴とする、請求項７ないし１１のいずれか一つに記載の組換え体核酸。
【請求項１３】
ＤＮＡであることを特徴とする、請求項７ないし１２のいずれか一つに記載の組換え体核酸。
【請求項１４】
請求項７ないし１３のいずれか一つに記載の組換え体核酸を含むことを特徴とする、タンパク質発現系。
【請求項１５】
請求項７ないし１３のいずれか一つに記載の核酸を組み入れたベクターを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の系。
【請求項１６】
重鎖および軽鎖をそれぞれコードする組換え体核酸の別々の構築物を含むことを特徴とする、請求項１４または１５に記載の系。
【請求項１７】
構築物が定常領域を伴う鎖をコードする、請求項１６に記載の系。
【請求項１８】
請求項１または２に記載の抗体を発現する原核生物細胞または真核生物細胞。
【請求項１９】
請求項７ないし１３のいずれか一つに記載の核酸を含むことを特徴とする、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
不死化ヒト細胞であることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の細胞。
【請求項２１】
請求項１８ないし２０のいずれか一つに記載の細胞を培養することを含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体を産生するための方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＣＤ３抗原複合体に対する新規抗体、これらの抗体を産生するためにコードするＤＮＡおよびＲＮＡ、これらを産生できるようなＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含む細胞系、およびこれらのＤＮＡ、ＲＮＡおよび／または細胞を使用してこれらの抗体を産生する方法に関する。
【０００２】
ヒトＣＤ３抗原は、Ｔ細胞の表面でＴ細胞受容体と非共有結合で会合する最少４本の不変ポリペプチド鎖より成り、一般に今ではＣＤ３抗原複合体と言われている。この複合体は、Ｔ細胞受容体による抗原認識に応答するＴ細胞活性化の方法に密接に関与している。すべてのＣＤ３モノクローナル抗体は、ＩＬ１（インターロイキン１）およびＩＬ２（インターロイキン２）のような２次増殖性刺激に対してＴ細胞を感作するのに、使うことができる。さらに、ある種のＣＤ３モノクローナル抗体は自身が、Ｔ細胞に対して分裂促進性である。この性質は、イソタイプ依存性で、ＣＤ３抗体Ｆｃドメインと補助細胞の表面上のＦｃ受容体との相互作用に由来する。
【０００３】
げっ歯動物のＣＤ３抗体は、抗原に対するＴ細胞応答を抑圧、促進、または再方向づけすることによって、免疫状態を操作するのに使われてきた。したがって、それらの抗体は、例えば腎臓、肝臓、および心臓の同種移植片の移植後の拒絶反応エピソードの治療のために、免疫抑制剤としてヒトの治療用に使える可能性が相当高い。
【０００４】
国際特許出願公開ＷＯ９２／０６１９３およびその対応出願（英国特許第２２４９３１０Ａ号，出願番号欧州特許第９１９１７１６９．４号，日本特許出願公開第５１６１１７／９１号および米国特許出願シリアル番号第０７／８６２５４３号；これらの内容は参考文献として本明細書に援用される）は、ＣＤ３抗体抗グロブリン応答問題を、その抗体の可変部遺伝子を再構成する、すなわち「ヒト化」すること、および関連するヒト定常ドメイン遺伝子と会合させ、発現させることにより、解決している。これにより、そのモノクローナル抗体の非ヒト含量は、抗グロブリン応答が起こらない程度に減少する。
【０００５】
国際特許出願公開ＷＯ９３／１９１９６およびその対応出願（例えば、欧州特許第０５８６６１７号，米国特許第５５８５０９７号および米国特許出願シリアル番号第０８／４７８６８４号；これらの内容は参考文献として本明細書中に援用される）は、一次投与量応答の問題を解決している。これらの文献は、ＩｇＧサブクラスの非グリコシル化ヒト化ＣＤ３抗体の使用を教示している。、これらの抗体は、意外にもその抗原結合特異性および免疫抑圧性質を保留しているものの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞分裂促進を誘導せず、ｉｎ  ｖｉｖｏで低レベルのサイトカイン放出を誘導するが、なお若干のＦｃ結合能を維持している。
【０００６】
これらのＣＤ３抗体の治療価値は高いが、細胞培養での産生が容易とはされていない。実際、トランスフェクトされた細胞系での増殖の悪さとともに、抗体の収量も低いことがわかっている。数年にわたる多大の努力にもかかわらず、達成できた最高の抗体濃度は約１０μｇ／ｍｌで、ＣＤ３抗体を発現する細胞の増殖は非常に遅かった。さらに、大規模産生に用いられたホローカートリッジシステム（ｈｏｌｌｏｗ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ）中では、これらの細胞は時間とともに産生を停止する（ｇｏ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）。
【０００７】
ＣＤ３抗体の前記発現に用いられたＣｅｌｌｔｅｃｈ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓのベクター系ＰＥＥ１２は、他のヒト化抗体の発現を約２００μｇ／ｍｌで日常的に行う。当初のラットハイブリドーマ細胞系（ＹＴＨ１２．５）は、細胞培養で比較的正常濃度として１００μｇ／ｍｌを発現しており、抗体生産性の低さはそのヒト化型と関連することを示している。トランスフェクション後に、細胞は増殖するより速く産生を停止したので、発現されたヒト化タンパク質群のうちの一つまたは一つより多くがそれらの細胞に有毒のようである。
【０００８】
このほど本発明者らは驚くべきことに、ラットＣＤ３軽鎖可変領域をヒトラムダ定常領域に連結し、これを、ヒト化ＣＤ３非グリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）重鎖を含むＰＥＥ１２中へクローニングして、抗ＣＤ３抗体のキメラ型をつくることによって、機能性非グリコシル化ＣＤ３抗体を培養細胞で６０から１００μｇ／ｍｌのレベルで発現するミエローマ細胞系を産生できることを、見出した。限界希釈クローニングを用いることによって、それらのクローンから、さらに高い、例えば１２０μｇ／ｍｌ程度の発現レベルを示し、大規模産生の長期培養でも細胞増殖に都合の悪い影響を全く与えず、安定な状態を保ついくつかのクローンを、選択できた。このように、本発明のキメラ抗体は、ラット由来の抗体に通常見られる抗グロブリン応答がなく、良好な生産性をもたらす。
【０００９】
したがって、本発明は、ＣＤ３抗原複合体に対し結合親和性を有するＩｇＧ抗体であって、重鎖は、配列番号２、配列番号４および配列番号６およびそれらの保存的に修飾された変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）のアミノ酸配列から選択された少なくとも一つのＣＤＲとともに可変領域枠組み構造を有し、そして軽鎖は、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２およびそれらの保存的に修飾された変異体のアミノ酸配列から選択された少なくとも一つのＣＤＲとともに可変領域枠組み構造を有し、
当該重鎖可変領域枠組み構造は配列がヒト型配列に対応し、当該軽鎖可変領域枠組み構造は、げっ歯動物型配列に特徴的な一つまたは一つより多くの特定のアミノ酸を含むことを特徴とする、前記抗体を提供する。
【００１０】
好ましくは軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域が完全にヒト型に相当する場合よりも強くその軽鎖および重鎖が会合するように、げっ歯動物型配列に特異的なアミノ酸を十分に含む。これは、便利には、その軽鎖可変領域がげっ歯動物、例えばラット、の配列に完全に対応するようにしてもよい。あるいは、ラット特有のアミノ酸をいくつかだけ、もしくは一つだけでも含ませることも可能である。
【００１１】
軽鎖可変領域配列でヒト型よりむしろげっ歯動物型である特定のアミノ酸は、本明細書中の配列表中の配列番号１４に示すものから選択される。その配列は、ラット枠組み構造に特有のすべての可能性のあるアミノ酸が、それぞれのＣＤＲ配列とともに、含まれている、好ましい軽鎖可変領域枠組み構造配列である。したがって、配列番号１４中のラット軽鎖可変枠組み構造領域に特徴的なアミノ酸は、Ｇｌｎ−１，Ａｌａ−２，Ｖａｌ−３，Ｖａｌ−４，Ａｌａ−７，Ａｓｎ−８，Ｔｈｒ−１２，Ｌｅｕ−１４，Ｓｅｒ−１６，Ｌｙｓ−１９，Ｌｅｕ−２０，Ｌｅｕ−３９，Ｔｙｒ−４０，Ｇｌｕ−４１，Ｓｅｒ−４４，Ｍｅｔ−４８，Ｔｙｒ−５０，Ｐｈｅ−７５，Ｈｉｓ−７９，Ａｓｎ−８０，Ｖａｌ−８１，Ａｌａ−８２，Ｉｌｅ−８３，Ｉｌｅ−８８  およびＰｈｅ−９０である。それぞれに対応するヒトアミノ酸は、Ａｓｐ−１，Ｐｈｅ−２，Ｍｅｔ−３，Ｌｅｕ−４，Ｐｒｏ−７，Ｈｉｓ−８，Ｇｌｕ−１２，Ｐｒｏ−１４，Ｌｙｓ−１５，Ｉｌｅ−１９，Ｉｌｅ−２０，Ｇｌｎ−３９，Ａｒｇ−４０，Ｐｒｏ−４１，Ａｌａ−４４，Ｖａｌ−４８，Ｐｈｅ−５０，Ｓｅｒ−７５，Ｓｅｒ−７９，Ｇｌｙ−８０，Ｌｅｕ−８１，Ｇｌｎ−８２，Ｔｈｒ−８３，Ａｓｐ−８８およびＴｙｒ−９０である。この後者のヒト配列は、欧州特許第０５８６６１７Ｂ号の第６頁およびそれに対応する米国特許出願に図示されている。
【００１２】
便利には、その重鎖可変領域枠組み構造はヒト型であり、そして軽鎖可変領域は、配列番号１４のラット型である前記指定のすべてのアミノ酸をもつ、げっ歯動物型のものである。しかしながら、先行技術の完全ヒト化型による相互作用よりも安定した軽・重鎖相互作用が達成できるだけ、げっ歯動物、例えばラットの配列が十分存在するならば、配列番号１４のこれらの位置のすべてではないが、一つまたは一つより多くはヒト型であってもよい。そのような相互作用は、好ましくは供給者（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）の指示にしたがって、その抗体がＰＥＥ１２細胞中で発現された場合、５０μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは１００μｇ／ｍｌ以上である。また、それらの細胞は、数週間の使用後でも有意な数が産生停止をしない（ｎｏｔ  ｇｏ  ｎｅｇｅｔｉｖｅ）ことが、好ましい。
【００１３】
本発明のすべての態様を過度の負担を伴わずに産生し、そしてＰＥＥ１２細胞からの発現量をスクリーニングできるように、ＰＣＲを用いた部位特異的突然変異誘発のような技術によって、これらさまざまな可変軽鎖の必要な産生が可能であることを、当業者は了解するはずである。
【００１４】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２のＣＤＲアミノ配列は、国際特許公開ＷＯ９３／１９１９６のＣＤＲ（ａ），ＣＤＲ（ｂ），ＣＤＲ（ｃ），ＣＤＲ（ｄ），ＣＤＲ（ｅ）およびＣＤＲ（ｆ）に対応し、それらのＣＤＲ自身も、以下それぞれＣＤＲ（ａ）からＣＤＲ（ｆ）として呼称うる場合がある。
【００１５】
好ましくは、重鎖および／または軽鎖各々は、配列番号２、配列番号４、配列番号６のＣＤＲ、並びに配列番号８、配列番号１０、配列番号１２のＣＤＲの三つすべてをそれぞれ有する。
【００１６】
好ましくは、抗体は非グリコシル化型である。非グリコシル化されているという用語は、その通常の使途では、本発明の抗体がグリコシル化されていないことを指すのに使われる。
【００１７】
その枠組み構造領域に関するヒト型という用語は、ヒト枠組み構造に十分類似しており、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）抗体中に存在する場合、ヒトで実質的に非免疫原性である枠組み構造を意味する。好ましくは、ヒト型枠組み構造を備えた重鎖をもつ本発明の抗体は、ＣＤ３抗原に対するげっ歯動物抗体親和性の６０から１４０％、より典型的には少なくとも８０から１００％の親和性を有する。ヒト化モノクローナル抗体の特性およびげっ歯動物モノクローナルからこれらをつくる方法は、米国特許第５５８５０８９号に開示されており、それらの内容は、その目的のために参考文献として本明細書に援用される。ヒト型重鎖可変領域とそのラット対応物との比較は、配列番号１６（ラット）を、配列番号２０のＮ末端にみられるその対応領域に比較することにより、行うことも可能である。配列番号１５は、配列番号１６をコードするＤＮＡのものである。したがって、ヒト型枠組み構造領域は、例えば配列番号２０のＮ−末端１１９個のアミノ酸の配列を、配列番号１６のものと異ならせる１３箇所の変化のうち、７または７以上を有しても良い。より好ましくは、ヒト型のすべてのアミノ酸が取り込まれることである。これらの変化は、例えば、これらの配列の５位、１８位、１９位、４２位、４９位、７５位、７７位、７８位、８８位、９３位、９７位、９８位および１１４位のいずれでもよい。
【００１８】
その枠組み構造領域に関するげっ歯動物型という用語は、げっ歯動物、例えばラットまたはマウスの抗体のものにアミノ酸配列が対応する枠組み構造を意味する。抗ＣＤ３抗体の場合、便宜的な枠組み構造アミノ酸はラット抗体のものである。
【００１９】
ＣＤ３抗原についてのさらなる論考は、ヒト白血球分化抗原に関する第１回国際ワークショップおよび会議の報告にみられ、ＣＤ３抗原に対して向けられた各種グリコシル化抗体の記載は、該シリーズのワークショップおよび会議の報告、特にＯｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓにより出版された第３回および第４回の報告にもみられる。その種の抗体の具体的な例として、Ｖａｎ  Ｌｌｅｒら、Ｅｕｒｏ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９８７，  １７：１５９９−１６０４，  Ａｌｅｇｒｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９９１，  １４０：  １１８４により記載された報告、およびＩｇＧ１抗体ＵＣＨＴ１およびその変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）に関する最終刊行物であるＳｍｉｔｈら、同誌、１９８６、１６：４７８による報告がある。
【００２０】
しかし、本発明の抗体の基礎として特に興味があるのは、抗体ＯＫＴ３およびＹＴＨ１２．５．１４．２に含まれるＣＤＲである。抗体ＯＫＴ３は、Ｃｈａｔｅｎａｕｄら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９１、５１：３３４およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  誌、１９８５、３１３：３３９、さらに欧州特許第００１８７９５号および米国特許第４，３６１，５３９号のような刊行物で論考されている。抗体ＹＴＨ１２．５．１４．２（以下、ＹＴＨ１２．５と記す）は、Ｃｌａｒｋら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １９８９，  １９：  ３８１−３８８のような刊行物で論考されており、再構成ＹＴＨ１２．５抗体は、欧州特許第０５０４３５０号およびその対応出願の米国特許出願シリアル番号第０８／３６２７８０号および米国特許第５５８５０９７号の主題であり、これらの出願は、当該抗体中に存在するＣＤＲについて詳細に記載している。米国特許出願シリアル番号第０８／３６２７８０号、米国特許第５５８５０９７号および米国特許第４３６１５３９号の内容は、参考文献として本明細書に援用される。
【００２１】
「保存的に修飾された変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）」という用語は、当該技術分野において周知であり、抗体・抗原親和性に実質的に影響しない変化を含む変異体を指す。この用語は、便利には米国特許第５３８０７１２号にみられるように定義され、その内容はその目的のために参考文献として本明細書に援用される。
【００２２】
ＣＤＲのうちで重鎖ＣＤＲ（ａ），重鎖ＣＤＲ（ｂ）および重鎖ＣＤＲ（ｃ）が最も重要である。本発明のそれらの抗体も定常ドメインを含むことを、当業者は了解するはずである。
【００２３】
それらＣＤＲ（ａ）、ＣＤＲ（ｂ）およびＣＤＲ（ｃ）は、重鎖中で順番に次の順序で配列している：すなわち、リーダーから定常ドメイン（Ｎ末端からＣ末端）方向に、ヒト枠組み構造領域１／（ａ）／ヒト枠組み構造領域２／（ｂ）／ヒト枠組み構造領域３／（ｃ）／ヒト枠組み構造領域４で、そしてれらＣＤＲ（ｄ），ＣＤＲ（ｅ）およびＣＤＲ（ｆ）は、軽鎖中で次の順序で配列している：すなわち、リーダーから定常ドメイン方向にげっ歯動物枠組み構造領域１／（ｄ）／  げっ歯動物枠組み構造領域２／（ｅ）／げっ歯動物枠組み構造領域３／（ｆ）／げっ歯動物枠組み構造領域４である。したがって、三つすべてが存在する場合、それらの重鎖ＣＤＲは、リーダーから定常ドメイン方向へ（ａ），  （ｂ），  （ｃ）の順序で配列し、またそれら軽鎖ＣＤＲは、リーダーから定常ドメイン方向へ（ｄ），  （ｅ），  （ｆ）の順序で配列していることが好ましい。そのげっ歯動物枠組み構造領域は、好ましくはラットのものである。
【００２４】
しかしながら、本発明の抗体は、本明細書に既に記載されたものとは極めて異なるＣＤＲを含むことも可能であり、また、たとえそうでなくても、ＣＤＲ（ａ）、ＣＤＲ（ｂ）、ＣＤＲ（ｃ）、およびＣＤＲ（ｄ），ＣＤＲ（ｅ）、ＣＤＲ（ｆ）のうちそれぞれ一つのみまたは二つを含む重鎖および特に軽鎖をもつこともあり得ることを認めるべきである。だが、本発明の抗体では、したがって上述の６種すべてのＣＤＲの存在が必ずしも必要なわけではないが、最も好ましい抗体では、６種すべてのＣＤＲが存在するのが最も通常である。
【００２５】
特に好ましい抗体は、したがって、配列番号２、配列番号４および配列番号６またはそれぞれの保存的に修飾された変異体のアミノ酸配列を含む三つのＣＤＲ（ａ），ＣＤＲ（ｂ）およびＣＤＲ（ｃ）を有するヒト型重鎖と、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２またはそれぞれの保存的に修飾された変異体のアミノ酸配列を含む三つのＣＤＲ（ｄ），ＣＤＲ（ｅ）およびＣＤＲ（ｆ）を有する軽鎖とをもち、それらの重鎖ＣＤＲはリーダー定常領域方向に（ａ），  （ｂ），  （ｃ）の順序で並び、またそれらの軽鎖ＣＤＲはリーダー定常領域方向に（ｄ），  （ｅ），  （ｆ）の順序で並んでいる、ものである。
【００２６】
本発明の第一の側面の好ましい型は、ヒトＣＤ３抗原に結合親和性を有する抗体、特に、非グリコシル化型の抗体であって、その抗体定常領域がヒト起源の一つであるかまたは由来し、特に、ラット軽鎖可変領域に付着したラムダ定常領域である、前記抗体を提供する。
【００２７】
一つの便利な可能性は、その抗体が、ＹＴＨ１２．５ハイブリドーマ中のアミノ酸配列、すなわち、配列番号１４のものに対応するラット軽鎖可変ドメイン枠組み構造領域をもつことであるが、その定常領域は、好ましくはなお、ヒト起源の一つであるはまたは由来し、例えば、ヒトラムダ定常領域とする、ことである。好ましいラットヒトキメラ軽鎖およびラムダ定常領域アミノ酸配列は、配列番号１８のものである。ＹＴＨ１２．５をコードする組換え核酸、例えばＤＮＡは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むが、一方、ラット軽鎖可変領域およびヒトラムダ定常領域をコードするものは、配列番号１７を含む。
【００２８】
ある種のヒト重鎖可変ドメイン枠組み構造配列には、それらの好ましいＣＤＲ配列を移植するのが好ましい。それは、それらのＣＤＲの三次元立体配座がそのような配列で、よりよく維持され、当該抗体は当該抗原に対する高レベルの結合親和性を保持するであろう。その重鎖可変（Ｖ）領域枠組み構造は、Ｂ細胞ハイブリドーマ細胞系１８／２（Ｈｕｍｉｎｇｈａｔ，  Ｄｅｒｓｉｍｏｎｉａｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １３９：２４９６−２５０１；国際特許出願公開ＷＯ９３／１９１９６号および米国特許出願シリアル番号第０８／４７８６８４）からのヒトＶＨＩＩＩ型遺伝子ＶＨ２６．Ｄ．Ｊ．によりコードされるものが好ましい。
【００２９】
本発明の第一の側面の好ましい形では、したがって、リーダーから定常領域方向で読むと、以下のアミノ酸配列、すなわち、
配列番号２１／ＣＤＲ／配列番号２２／ＣＤＲ／配列番号２３／ＣＤＲ／配列番号２４
［ここで、ＣＤＲは本明細書で既に定義されたＣＤＲ（ａ），ＣＤＲ（ｂ）またはＣＤＲ（ｃ）を示すＣＤＲ，その保存的に修飾された変異体、もしくは別のＣＤＲである］
を有するヒト可変ドメイン枠組み構造中に、ラット抗ＣＤ３抗体の重鎖の一つまたは一つより多くの好ましいＣＤＲが存在する。
【００３０】
同様に、リーダーから定常領域方向で読むと以下のアミノ酸配列、すなわち
配列番号２５／ＣＤＲ／配列番号２６／ＣＤＲ／配列番号２７／ＣＤＲ／配列番号２８
［ここで、ＣＤＲは本明細書で既に定義されたＣＤＲ（ｄ），ＣＤＲ（ｅ）またはＣＤＲ（ｆ）を示すＣＤＲ、その保存的に修飾された変異体、もしくは別のＣＤＲである］
を有するげっ歯動物可変ドメイン枠組み構造中にラットＣＤ３抗体の軽鎖の一つまたは一つより多くの好ましいＣＤＲが存在する。
【００３１】
３種すべての好ましい軽鎖ＣＤＲを含む非グリコシル化抗体では、その軽鎖可変領域は配列番号１４を含む：
それらの重および軽鎖定常領域は、抗体に対する所望の対象はＩｇＧ抗体であるが、異なるタイプの抗体に基づくことも可能である。しかしながら、げっ歯動物、例えばラットまたはマウス起源のもの、もしくはそれらに由来するものでもよいが、好ましくはヒト起源のものまたはそれらに由来するものである。上に記載のように、該軽鎖の場合、その定常領域は好ましくはラムダタイプで、該重鎖の場合、それは好ましくは、適切として非グリコシル化を果たすように修飾されたＩｇＧイソタイプ、特にＩｇＧ１である。
【００３２】
３種すべての好ましい重鎖ＣＤＲを含む非グリコシル化抗体では、その重鎖可変領域およびヒトＩｇＧ１  ＣＨ１−ヒンジ非グリコシル化ＣＨ２ＣＨ３は、配列番号２０を含み、配列番号１９のＤＮＡによりコードされる。
【００３３】
そのＩｇＧイソタイプのすべてのヒト定常領域は、２９７位のアスパラギン残基でグリコシル化されていることが知られているが、この位置は、アスパラギン297−Ｘ298−セリン299またはトレオニン299、ここでＸはプロリン以外のアミノ酸の残基、というＮグリコシル化モチーフの一部を構成している。本発明の抗体は、その定常領域でアスパラギン297とグリコシル化が不可能なもう一つのアミノ酸との置換によって、このように非グリコシル化されてもよい。他の任意のアミノ酸残基が潜在的に使用可能であるが、アラニンが最も好ましい。あるいは、アスパラギン２９７でのグリコシル化は、そのモチーフの他の残基の一つを変える、例えば、２９８残基をプロリンに、または２９９残基をセリンもしくはトレオニン以外のアミノ酸に置換することにより、阻止してもよい。この部位特異的突然変異誘発を実施するための技術は、当業者には周知のものであり、例えばＡｍｅｒｓｈａｍから商業的に入手可能な部位特異的突然変異誘発キットを用いて、例えば実行してもよい。以下に、その手順をさらに例示する。
【００３４】
あるＣＤＲ中の一つのアミノ酸を、同じような性質をもつもう一つのアミノ酸に置換する、例えば、グルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に置換することは、その置換または複数の置換が行われたペプチドまたはタンパク質の性質または構造を実質的に変えないこともあり得ることは、当該技術分野で周知である。したがって、本発明の非グリコシル化抗体は、好ましいＣＤＲを含むが、そのような置換もしくは複数の置換が、それらのＣＤＲの結合親和性および特異性を実質的に変えずに生じた特定のアミノ酸配列をもつような抗体を含む。あるいは、それらのＣＤＲのアミノ酸残基配列中に欠失をつくってもよいし、もしくはそれらの配列を、活性をなお保留しながら、ＮおよびＣ末端の片方または両方で伸長してもよい。
【００３５】
本発明の好ましい非グリコシル化抗体は、その抗原に対するアフィニティ（親和性）定数が１０5モル-1またはそれ以上、例えば１０12モル-1未満であるようなものである。異なる親和性のリガンドは異なる使用に適することがあり得るので、
例えば、１０6、１０7、または１０8モル-1またはそれ以上の親和性が場合によっては、適切であり得る。しかしながら、１０6から１０8モル-1の範囲の親和性をもつ抗体がしばしば適している。都合のよいことに、それらの抗体も、他の抗原には実質的な結合親和性を示さない。抗体の結合親和性および抗体特異性は、参考文献として本明細書に援用されている欧州特許第０５８６６１７号および米国特許出願シリアル番号第０８／４７８６８４号および米国特許第５５８５０９７号の実施例の項（実施例５−−−エフェクター細胞再ターゲッティングアッセイを参照）に記載されているようなアッセイ手順またはＥＬＩＳＡおよび他のイムノアッセイのような技術により、テストしてもよい。
【００３６】
本発明の抗体は、２本の同一軽鎖および２本の同一重鎖をもつことがあり得る「Ｙ」字型の立体配置をもつ非グリコシル化ＩｇＧ  ＣＤ３抗体で、そのため当該ＣＤ３抗原に親和性を有する各抗原結合部位を備えた二価抗体である。あるいは、本発明は、その抗体のそれらの腕の１本だけがＣＤ３抗原に対する結合親和性をもつ抗体にも、適用できる。その種の抗体はさまざまな形をとり得る。したがって、その抗体のもう１本の腕はＣＤ３以外の抗原に結合親和性をもつことがあり得るので、例えば米国特許第４，４７４，８９３号（参考文献として本明細書に援用される）および欧州特許出願第８７９０７１２３．１号および第８７９０７１２４．９号に記載されるように、その抗体は二重特異性抗体である。あるいはその抗体は結合親和性を示す腕を１本だけもつこともあり得るので、そのような抗体は「一価抗体」と言われる。
【００３７】
一価抗体（または抗体断片）は、多くの方法で調製可能である。ＧｌｅｎｎｉｅおよびＳｔｅｖｅｎｓｏｎ（Ｎａｔｕｒｅ，２９５：７１２−７１３，（１９８２））は、酵素消化により一価抗体を調製する方法を記載している。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎらは、酵素的に産生されたＦａｂ’およびＦｃ断片を化学的に架橋する一価抗体調製の第二の方法を記載している（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９））。これらの方法では、生じた一価抗体は、それらのＦａｂ'腕の１本を失っている。一価抗体を調製する第三の方法は、欧州特許第１３１４２４号に記載されている。この方法では、その抗体の「Ｙ」字型は維持されているが、二つのＦａｂ'ドメインの一つだけが抗原に結合する。これは、その一価抗体が関心の一つである生産物の混合を産生するために、その抗体の重鎖に組合わせる無関係な軽鎖をコードする遺伝子をハイブリドーマに導入することにより、達成される。
【００３８】
しかし、より好ましくは、本発明の一価非グリコシル化ＣＤ３抗体は次の方法で調製される。これは、適当な発現系、例えば下記に記載するような細胞系に、それらの重および軽鎖をコードする遺伝子類とともに、当該重鎖の可変領域ドメインおよび第一定常領域ドメインを欠く短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）重鎖をコードする遺伝子、すなわち、それらの各ドメインのエキソンを欠く遺伝子、の導入を含む。その結果、該細胞系により、（ａ）完全な二価の抗体である抗体、（ｂ）２本の短縮型重鎖（すなわち、Ｆｃ断片）のみから成る抗体断片および（ｃ）短縮型重鎖および、正常の重鎖と会合した軽鎖とから成る、ＣＤ３抗原に対し一価の抗体の断片の混合物が産生される。その種の抗体断片（ｃ）は、１本のＦａｂ’腕だけをもつので、一価である。この方法によるそのような形での一価抗体の産生は、多くの理由で好まれる。したがって、得られた抗体断片は、その細胞系により産生された抗体の混合物からの精製が、例えば、単純に分子量に基ついて分離可能なので、容易である。産生された一価抗体が、大きさおよび外見で二価抗体と同じような特徴をもつ欧州特許第１３１４２４号の方法の場合、それはできない。
【００３９】
さらに、その新しい方法による一価抗体断片の産生は、ずっと容易に制御が可能で、複雑な反応産生物の分離が必要な酵素消化／化学カップリング手順ほど危険ではない条件を使っている。、加えて、使われるその細胞系は、酵素消化／化学カップリング手順で要求されるような連続的な合成手順を必要とせず、一価抗体断片を連続産生する利点がある。
【００４０】
本発明の非グリコシル化抗体は天然には生ぜず、それらの非グリコシル化抗体は、多くの方法で合成的に一般には産生可能である。しかし、最も便利には、その抗体中に存在する重および軽鎖の定常および可変領域の適切な遺伝子構築物を、別々に得て、次いで適当な発現系へ挿入する。
【００４１】
所望される構造のリガンドの可変ドメインをコードする遺伝子を作って、便利には部位特異的突然変異誘発を受けた抗体の定常ドメインをコードする遺伝子に付着させてもよい。これらの定常遺伝子は、ハイブリドーマｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡから得て、その非グリコシル化定常領域をつくるために部位特異的突然変異誘発を受けさせてもよい。それらの可変領域をコードする遺伝子も、そこに含まれるＣＤＲ類の同定に使われる遺伝子合成技術により、得ることも可能である。そのＤＮＡのための適当なクローニングベクターにはさまざまなタイプがあり得る。
【００４２】
そのような遺伝子類はさまざまな方法によって調達が可能なことは、当業者には了解されるはずである。例えば、（ｉ）ＣＤ３抗原に対する一連のハイブリドーマを既知の方法で培養する、（ｉｉ）それらのハイブリドーマから、国際特許出願公開ＷＯ９２／０６１９３および国際特許出願公開ＷＯ９３／１９１９６およびそれらに対応する米国特許に述べられている手順、すなわち、ｍＲＮＡを抽出し、それをＰＣＲを用いてｃＤＮＡへ変換する、（ｉｉｉ）このｃＤＮＡを、ＣＤＲ相補的ＤＮＡ配列に対応する配列のオリゴヌクレオチドプローブで、スクリーニングする、（ｉｖ）ポジティブに同定されたすべてのハイブリドーマの配列を決定する、そして（ｖ）前記特許に述べられているヒト化技術により、そのラット配列を再構成する、ことが可能である。数種の、好ましくは、６種すべての好ましいＣＤＲの産生を可能にするためには、部位特異的突然変異誘発を採用して、ＤＮＡをコードする枠組み構造の対応箇所に所望のＤＮＡを挿入してもよい。
【００４３】
機能性ＣＤ３リガンドを産生するために、細胞システムの培養によりそれらの遺伝子を発現させることは最も便利には、適当な原核生物細胞システムまたは特に真核生物細胞システム、特に骨髄腫細胞系、例えば、ＹＢ２／３．０１／Ａｇ２０（以下、ＹＯと記す）ラット骨髄腫細胞、ＮＳＯ骨髄腫細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞のようなほ乳類不死化細胞系を（植物細胞の利用も興味はあるが）、各種抗体領域をコードするＤＮＡを含む発現ベクターとともに、形質転換し、次いでその形質転換細胞システムを培養して、所望の抗体を産生することにより果たされる。本発明に従うリガンドの製造に使うそのような一般的技術は、当業者には周知であり、またＳａｍｂｒｏｏｋ，  ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ  「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９（第２版）のような刊行物に記載されている。それらの技術はさらに、参考文献として本明細書に援用される国際特許出願公開ＷＯ９３／１９１９６および米国特許出願シリアル番号第０８／４７８６８４号にある実施例により具体的に説明されている。
【００４４】
本発明の第二の側面は、このように、ＣＤ３抗原に対する結合親和性を有する第一の側面に従う非グリコシル化ＩｇＧ抗体を調製するための方法であって、前記抗体の発現を実行するために、当該抗体を発現できる細胞を培養することを含む、前記方法を提供する。本発明の第三の側面はまた、本発明自体である非グリコシル化抗体を発現する細胞系を提供する。
【００４５】
そのような細胞系の中で好ましいのは、上述された好ましいＣＤＲをコードするＤＮＡ配列を含むものである。上述されたそれらのＣＤＲ（ａ）から（ｆ）をコードする一群のヌクレオチド配列は、それぞれ以下の（ａ）から（ｆ）に示すようなものであるが、遺伝暗号の縮重のため、それらのＣＤＲのアミノ酸配列をそのままコードしながらも、それらの配列に変動がありえることは、ご理解いただけるであろう。
【００４６】
（ａ）配列番号１；（ｂ）配列番号３；（ｃ）配列番号５；（ｄ）配列番号７；（ｅ）配列番号９；（ｆ）配列番号１１
そのような細胞系は、（１）一つまたは一つより多くの（ａ），（ｂ）および（ｃ）をもつヒト重鎖可変枠組み構造領域を発現するＤＮＡ、並びに（２）一つまたは一つより多くの（ｄ），（ｅ）および（ｆ）をもつげっ歯動物、例えばラット軽鎖可変枠組み構造領域を発現するＤＮＡを含む、より大きなＤＮＡ配列を特に含有するであろう。
【００４７】
そのようなＤＮＡの具体的な例は、上に論考されたヒトＩｇＧ  ＣＨ１−ヒンジ−非グリコシル化−ＣＨ２ＣＨ３に連結されたヒトＶＨ  ＩＩＩ型遺伝子ＶＨ２６．Ｄ．Ｊによりコードされる重鎖枠組み構造中に並んだＣＤＲ（ａ），（ｂ）および（ｃ）をコードする配列番号１９およびＹＴＨ１２．５ヒトラムダ定常領域キメラタンパク質によりコードされる軽鎖枠組み構造中に並んだＣＤＲ（ｄ），（ｅ）および（ｆ）をコードする配列番号１７である。
【００４８】
本発明のキメラ性一部ヒト化非グリコシル化抗体は、特に免疫抑制、免疫抑制が完全であるよりむしろ一時的で、そのためＴ細胞が完全には破壊されず、ＣＤ３抗原−ＴＣＲ複合体の抗体遮断により非機能性になっていることが、特段に望ましい移植組織拒絶の制御に特に治療価値がある。加えて、それらの非グリコシル化ＣＤ３抗体は、癌の治療のような他の分野、具体的には、治療剤の効果が、エフェクター細胞のＦｃ仲介による死滅またはＦｃ受容体所有細胞の非特異的死滅により、それぞれ危なくされる恐れがある（エフェクター細胞再ターゲティング用の）二重特異性抗体または抗体−毒素結合体の構築に可能性がある。
【００４９】
第四の側面ではしたがって、本発明は癌特にリンパ腫の患者を治療する方法または免疫抑制の目的、例えば、移植組織拒絶が起こり得る場合の処置方法を含むが、それには、本発明の第一の側面に従う非グリコシル化抗体の治療有効量を投与することを含む。
【００５０】
本発明の第一の側面の非グリコシル化抗体は、生理的に受容可能な希釈剤または担体とともに当該抗体を投与することによる、患者への投与を処方してもよい。それらの抗体は、無菌かつ発熱因子を含まない希釈剤または担体とともに注射可能な形態で、投与されるのが好ましい。参考までに述べると、抗体の適量は、ある期間、例えば１０日間にわたって、毎日約１−１０ｍｇの注射量であるが、初回用量応答がなければ、個々の患者の必要に応じて望ましければ、例えば１００ｍｇまでのより多量の抗体を投与することも可能であろう。獣医用でも同様なｇ／ｋｇ用量基準によっている。
【００５１】
本発明はここで、下記の非限定的な実施例、図面および配列表だけを参照に、例証として記載される。請求の範囲内に該当する本発明のさらなる実施態様は、これらの見方によって、当該技術分野の当業者には浮かぶであろう。
配列表
配列番号１は、ＣＤＲ（ａ）をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号２は、ＣＤＲ（ａ）のアミノ酸配列である。
配列番号３は、ＣＤＲ（ｂ）をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号４は、ＣＤＲ（ｂ）のアミノ酸配列である。
配列番号５は、ＣＤＲ（ｃ）をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号６は、ＣＤＲ（ｃ）のアミノ酸配列である。
配列番号７は、ＣＤＲ（ｄ）をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号８は、ＣＤＲ（ｄ）のアミノ酸配列である。
配列番号９は、ＣＤＲ（ｅ）をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号１０は、ＣＤＲ（ｅ）のアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ＣＤＲ（ｆ）をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号１２は、ＣＤＲ（ｆ）のアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ラット軽鎖可変領域をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号１４は、ラット軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号１５は、それぞれのＣＤＲを含むラット重鎖可変領域をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号１６は、それぞれのＣＤＲを含むラット重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号１７は、それぞれのＣＤＲおよびヒトラムダ定常領域をもつラット軽鎖可変領域をコードするＤＮＡの配列である。
配列番号１８は、それぞれのＣＤＲおよびヒトラムダ定常領域をもつラット軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号１９は、ＣＤＲおよびヒトＣＨ１−ヒンジ−非グリコシル化ＣＨ2ＣＨ3をもつ重鎖可変領域をコードするＤＮＡ配列である。
配列番号２０は、ＣＤＲおよびヒトＣＨ１−ヒンジ−非グリコシル化ＣＨ2ＣＨ3をもつ重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号２１から２４は、ＣＤＲをもたないヒト重鎖可変ドメイン枠組み構造のアミノ酸配列である。
配列番号２５から２８は、ＣＤＲをもたないラット軽鎖可変ドメイン枠組み構造のアミノ酸配列である。
配列番号２９および３０は、ラットＣＤ３軽鎖可変領域をＰＥＥ１２へクローニングするのに用いるプライマーのものである。
一般的方法論
ヒト化重鎖をもつＣＤ３特異的モノクローナル抗体を産生する一般的方法
ヒトＣＤ３抗原に特異的なラット抗体ＹＴＨ１２．５のＶ領域遺伝子のクローニングと再構成は、Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら、１９９１、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２１：２７１７および英国特許出願第９１２１１２６．８号およびその対応出願に記載されているように行う。ＹＴＨ１２．５は、ＣＤ３抗原複合体に特異的なＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体を分泌するラットハイブリドーマ細胞系であるが、その方法論は、同一のＣＤＲをもつＣＤ３特異的抗体を分泌する他の細胞にも適用できる（前掲の記述を参照）。
【００５２】
要するに、その方法論は、複製連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるＯｒｌａｎｄｉら、１９８９、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，  ８６：３８３３の方法に基づく。そのＶH遺伝子（重鎖可変領域遺伝子）は、オリゴヌクレオチドプライマーＶＨ１ＦＯＲおよびＶＨ１ＢＡＣＫ（前記援用特許類を参照）を用いて、クローン化される。それらのＰＣＲ生産物は、部位特異的突然変異誘発を６オリゴヌクレオチドプライマー類を用いて実行するベクターＭ１３−ＶＨＰＣＲ１中へ、連結される。そのＶL遺伝子（軽鎖可変領域遺伝子）は、公表済みのＶLｅ配列に基づいてデザインされたプライマーを用いて、クローン化された。当該遺伝子は、ヒトラムダ軽鎖定常領域とともに、ベクターＭ１３−ＶＫＰＣＲ中へ、クローン化される。このベクターにおいて、ＶL枠組み構造の突然変異誘発が５オリゴヌクレオチド類を用いて実行される。次に当該ヒト化ＶL遺伝子は、発現ベクターｐＨａＡｐｒ−１へ挿入される。
【００５３】
ベクターｐ３１６は、その中で再構成ＣＤ３ＶＨ遺伝子が、異なる免疫グロブリンＨ鎖定常領域遺伝子類と結合して、発現されることがあり得るように生成され、またこのベクターは、ｐＨａＡｐｒ−ｇｐｔベクターに基づいている（Ｇｕｎｎｉｎｇら、１９８７、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ，  ８５：７７１９−７７２３）。ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｔ）遺伝子およびＳＶ４０発現シグナル（ＰａｇｅおよびＳｙｄｅｎｈａｍ、１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：６４）をもつＤＮＡの１．６５Ｋｂ断片は、ｐＨａＡｐｒ−ｇｐｔの特有のクＥｃｏＲＩ部位へ挿入される。再構成ＣＤ３−ＶＨ遺伝子をコードする７００ｂｐ  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ  ＤＮＡは、次に、ａ  アクチンプロモターの下流で、そのコントロール下にあるベクターの多重クローニング部位へクローン化される。その所望のＨ鎖定常領域遺伝子（ゲノム立体配置で）は、次いで、該ＣＤ３−ＶＨ遺伝子の下流の特有のＢａｍＨ１制限酵素部位へ挿入も可能である。
【００５４】
非グリコシル化ヒトＩｇＧ１定常領域は、Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９８２、Ｃｅｌｌ，２９：６７１−６７９）により記載された野生型Ｇ１ｍ（１、１７）遺伝子から、下記のように得られる。その遺伝子は、２９７位のアミノ酸残基をアスパラギン残基からアラニン残基へ変異させるため部位特異的突然変異誘発が実行される（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＬＣキット）ベクターＭ１３  ｔｇ１３１へ、クローン化される。
【００５５】
Ａｓｐ−２９７のオリゴ糖は、すべての正常なヒトＩｇＧ抗体の特徴で（Ｋａｂａｔら、１９８７、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）、ＩｇＧ分子中の２本の重鎖のそれぞれは、アスパラギン残基のアミド基に結合された単分岐鎖炭水化物基をもっている（ＲａｄｅｍａｃｈｅｒおよびＤｗｅｋ，１９８４、Ｐｒｏｇ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ５：９５−１１２）。アラニンによるアスパラギンの置換は、抗体のグリコシル化を阻害する。
【００５６】
２．３Ｋｂ非グリコシル化ＩｇＧ１定常領域は、ＢａｍＨＩおよびＢｇＩＩＩを用いる二重消化により、Ｍ１３から切り出され、クローンｐ３２３を産生するために、ベクターｐ３１６のＢａｍＨＩ部位へ連結される。
【００５７】
ｄｈｆｒマイナスチャイニーズハムスター卵巣細胞のサブコンフルエントな単層をその重鎖遺伝子を含むベクターｐ３２３、並びに再構成ヒトｅ軽鎖（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら、１９９１、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２１：２７１７−２７２５）を含む第二ベクターｐ２７４で、共トランスフェクトする。トランスフェクション前に、両プラスミドＤＮＡは、制限酵素エンドヌクレアーゼＰｖｕＩを用いて線状化された。トランスフェクションは、ＤＯＴＭＡ試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、ドイツ）を用い、製造者の勧告に従って、行われる。
【００５８】
重および軽鎖トランスフェクタント（形質導入体）は、５％（ｖ／ｖ）透析ウシ胎児血清を含み、キサンチン／ヒポキサンチンを含まないＩＭＤＭ中で、選択される。
【００５９】
類似の野生型ヒトＩｇＧ１−ＣＤ３重鎖ベクターｐ２７８の産生は、別途記載されている（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅら、１９９１、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２１：２７１７−２７２５および英国特許第９１２１１２６．８号、参考文献として本明細書に援用される）。非変異体ヒトＩｇＧ２（ＦｌａｎａｇａｎおよびＲａｂｂｉｔｔｓ、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ３００：７０９−７１３）、ＩｇＧ３（Ｈｕｃｋら、１９８６、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．，  １４：１７７９−１７８９）、ＩｇＧ４（ＦｌａｎａｇａｎおよびＲａｂｂｉｔｔｓ、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７０９−７１３）、Ｅｐｓｉｌｏｎ（ＦｌａｎａｇａｎおよびＲａｂｂｉｔｔｓ、１９８２、ＥＭＢＯ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  １：６５５−６６０）およびＡｌｐｈａ−２（ＦｌａｎａｇａｎおよびＲａｂｂｉｔｔｓ、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ  ３００：７０９−７１３）定常領域遺伝子をもつＨ鎖発現ベクター（それぞれベクターｐ３１７，ｐ３１８，ｐ３２０，ｐ３２１およびｐ３２５）は、ベクターｐ３１６から由来する。これらのベクターを、軽鎖ベクターｐ２７４と結合させ、既述のようにｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞へ導入して、それぞれａ１，  ａ２，  ａ３，  ａ４，  ａ  およびａ−２イソタイプのＣＤ３抗体を分泌する細胞系を作った。ＣＤ３抗体を発現する細胞を、軟寒天のクローニングに２回かけ、次いで、回転びん培養へ拡大した。各細胞系の約４リットルの組織培養上清からの免疫グロブリンを、硫酸アンモニウム沈殿により濃縮し、ＰＢＳに対して徹底的に透析し、次いで以下のように定量する：
当該抗体は純粋でないので、ＣＤ３抗原結合能をもつ抗体の濃度を特異的に定量するためにデザインされた競合測定法を用いた。ヒトＴ細胞芽球を、ＣＤ３抗原の同じエピトープにキメラパネルとして結合する抗体であるＦＩＴＣ標識ＵＣＨＴ−１と、インキュベートする。使用するＦＩＴＣ試薬の濃度は、半飽和に予め定量しておく。非標識ＹＨＴ１２．５（高速液クロ純度）を、既知の開始濃度から滴定し、Ｔ細胞およびＵＣＨＴ−１  ＦＩＴＣを含むウエルに加えた。その非標識抗体は、その抗原結合部位に対する競合剤として働く。これは、それらの細胞をＦＡＣＳ分析により調べたときに見られる平均蛍光の減少として、検出される。したがって、未知の開始濃度からのキメラ抗体の滴定によって、平均蛍光を抗体希釈に対してプロットすれば、一連のシグモイド曲線が得られる。これらの曲線は、ＹＴＨ１２．５標準曲線と直接比較することが可能であり、相当する抗体を使ってもよい。
【００６０】
【実施例】
実施例１
ヒトＣＤ３抗原に特異的な非グリコシル化抗体であって、ＩｇＧ１定常領域に結合されたヒト重鎖可変枠組み構造およびヒトラムダ定常領域に結合されたラット軽鎖可変枠組み構造中に、ＹＴＨ１２．５ラット抗体由来のものに配列が対応するＣＤＲを含む、前記抗体の調製。
【００６１】
ＹＴＨ１２．５ＬＡＧ１の鎖消失変異体（ｃｈａｉｎ  ｌｏｓｓ  ｖａｒｉａｎｔ）を、ＣＤ３軽鎖を消失し、ラット重鎖のみを発現するものに選び、完全ヒト化非グリコシル化ＣＤ３重鎖中にトランスフェクトする目的に使用した。ヒト化ＩｇＧ１非グリコシル化ＣＤ３重鎖構築物をコードする１．４Ｋｂ  ＢａｍＨ１−Ｈｉｎｄ１１１  ＤＮＡ断片を、異なる選択マーカーを含む二つの異なる発現ベクター、ｐＨβＡｐｒ−１  ｇｐｔ  （Ｇｕｎｎｉｎｇら（１９８７）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．  ＵＳＡ  ８４：４８３１および８５：７７１９−７７２３）およびｐＯＸＣＤ５２ｎｅｏ  （Ｆｒｅｗｉｎ未発表）の多重クローニング部位へクローン化した。
【００６２】
ｐＯＸＣＤ５２ｎｅｏ発現ベクターは、高レベルの抗体産生をする強力な「ポリペプチド鎖伸長因子１」プロモーター（ＥＦ１）を使って、産生される（Ｓｈｉｇｅｋａｚｕ  Ｎａｇａｔａ  ＮＡＲ，  １８巻、１７号、５３２２ページ）。これは、ネオマイシン選択マーカーとともに、構築物中に配置される。またそのベクター中には、ＴＫプロモーターにより駆動される、Ｃａｍｐａｔｈ  ＣＤ５２表面発現性抗原に対するｃＤＮＡも含まれる（これらすべてのプロモーターおよびマーカーは、有効性のために、誰でも利用できるものである）。細胞表面でのＣＤ５２の発現は、ＣＤ５２抗体を用いる形質転換体の同定を可能にしている。
【００６３】
ＹＴＨ１２．５ＬＡＧ１は、次いで、電気穿孔法により二つのプラスミドと別々にトランスフェクトされ、またヘビートランスフェクタントが、５％ウシ胎児血清、ＭＰＡおよびｐＨβＡｐｒ−１ｇｐｔ用キサンチンを含むＩＭＤＭおよび５％ウシ胎児血清およびｐＯＸＣＤ５２ｎｅｏ用１ｍｇ／ｍｌＧ４１８を含むＩＭＤＭで、二、三週間にわたって検査用の生きたコロニーが増殖するまで、選択された。両トランスフェクションは、ＥＬＩＳＡを使ってヒトＩｇＧ１産生をスクリーニングしたところ、陽性クローンを生じていた。機能性ＣＤ３抗体を、ヒトＴ細胞系Ｊｕｒｋａｔ  （ＡＴＣＣ  ＴＩＢ  １５２  （Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３３：  １２３−１２８  （１９８４））に対する結合によりテストし、またＦＡＣＳ  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）  により分析したところ、両アッセイは３０および５０μｇ／ｍｌの間の抗体の収量を示した。
【００６４】
ｐＯＸＣＤ５２ｎｅｏベクターは、細胞表面マーカーＣＤ５２を利用して、抗体を産生するトランスフェクト細胞のモニタリングを可能にする。このマーカーを含む細胞だけが抗体を分泌するので、ＦＩＴＣに結合されたＣａｍｐａｔｈ  ＣＤ５２抗体を取ることにより、トランスフェクト細胞について、抗体を産生している細胞の百分率をＦＡＣＳによって分析し、またクローン状態を確認することが可能である。陰性の産生細胞は全く検出されず、抗体収量は５０μｇ／ｍｌのままで、細胞増殖も正常であった。
【００６５】
非グリコシル化ＣＤ３抗体のキメラ型は、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ発現ベクターＰＥＥ１２  （Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９参照）中へクローニングを可能にする制限酵素部位Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲ１を導入するプライマーを使って、ラットＣＤ３軽鎖可変領域をヒトラムダ定常領域へ結合させるためにＰＣＲアセンブリーを用いて、産生された。それらのプライマー配列は、本明細書中の配列表中の配列番号２９および配列番号３０である。
【００６６】
その最終構築物の配列を決定し、ヒト化ＣＤ３非グリコシル化重鎖を既に含むＰＥＥ１２中へクローン化し、さらにこれを、骨髄腫細胞系ＮＳＯ（ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ８５１１０５０３−ＧａｌｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９８１）  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ７３（Ｂ）：  ３−４６）  中へ電気穿孔法によりトランスフェクトした。得られたクローンは、ヒトＩｇＧ１およびヒトラムダ軽鎖に対するＥＬＩＳＡを用いて抗体産生について、またＦＡＣＳに基づいてヒトＴ細胞クローンＪｕｒｋａｔ細胞系に対する結合について、スクリーニングされた。そのＥＬＩＳＡでは、ヤギ抗ヒトＩｇＦｃ  （Ｓｉｇｍａ  Ｉ２１３６）を捕捉用抗体として、そしてビオチニル化ヒツジ抗ヒトＩｇＧ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＲＰＮ  １００３）またはビオチニル化ヤギ抗ヒトラムダ軽鎖（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＲＰＮ  １１８８）を検出用抗体として使用している（ＲｏｕｔｌｅｄｇｅらＥｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （１９９１）  ２１：  ２７１７−２７２５  参照）。
【００６７】
一回のトランスフェクション後、１６クローンが６０μｇ／ｍｌから１００μｇ／ｍｌを発現したが、これは、再構成非グリコシル化ＣＤ３による他のどのトランスフェクションよりはるかに多かった。これらのトランスフェクタントは、次いで、限界希釈クローニング法によりクローン化され、それらのいくつかは１２０μｇ／ｍｌへ改良した。それらは、長期培養および大規模抗体産生で安定しており、細胞増殖にも全く問題がなかった。
【００６８】
図１から４は、先行技術の、既に記載された完全ヒト化非グリコシル化抗ＣＤ３抗体と同じ能力で、それらの抗体がＣＤ３に結合できることを、具体的に示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、（欧州特許第０５８６６１７号、米国特許出願シリアル番号第０８／４７８６８４および米国特許第５５８５０９７号の）完全ヒト化非グリコシル化ＣＤ３、および、ラット軽鎖可変枠組み構造領域が採用されている本発明のキメラ抗体との、結合のＦＡＣＳアッセイのプロットを示す。軽鎖ＹＴＨ１２．５ＬＡＧ１だけは、重鎖と会合していないので、正常な結合を示していない。
【図２】  図２は、ｐＯＸＤ５２ｎｅｏベクターを用いて産生され、したがってそれらの表面にＣＤ５２抗原を発現する、二種のキメラトランスフェクタントの結合のＦＡＣＳアッセイのプロットを示す。これらは、トランスフェクタントがクローン集団かどうかをモニターする方法として、ｐＯＸＣＤ５２ｎｅｏの使用を具体的に説明している。ＴＦ１２．Ｌ／ＣＤ３Ａ．２７はＣＤ５２で染めると１ピークを有し、これはすべての細胞がＣＤ３抗体を産生していることを示す。一方、ＴＦ１２．５Ｌ／ＣＤ３Ａ．３４は２ピークを有し、これはＣＤ３抗体を産生しない負の細胞集団を示す。
【図３】  図３は、本発明のキメラおよび先行技術のヒト化非グリコシル化ＣＤ３に対する抗体収量の目安としてヒトＩｇＧ産生を比較した、ＥＬＩＳＡにおける希釈に対するＯＤ492のプロットを示す。トランスフェクション後３週間にテストしたＣＤ３上清は、本発明のキメラ抗体をコードするＤＮＡを含む細胞が、約１２０μｇ／ｍｌを産生し、また、完全ヒト化ＣＤ３を含む細胞が、１０μｇ／ｍｌ以下を産生することを示している。
【図４】  図４および５は、本発明のキメラ抗体および完全ヒト化ＣＤ３のジャーカット細胞に対する親和性の結合プロットを示す。既知濃度の１００μｇ／ｍｌから開始し、次いで１／２０希釈、以下１／２５６０希釈まで７回力価測定した。染色パターンは、親和性が同じであることを、証明している。
【図５】  図４および５は、本発明のキメラ抗体および完全ヒト化ＣＤ３のジャーカット細胞に対する親和性の結合プロットを示す。既知濃度の１００μｇ／ｍｌから開始し、次いで１／２０希釈、以下１／２５６０希釈まで７回力価測定した。染色パターンは、親和性が同じであることを、証明している。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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