(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子量５０〜２００ＫＤａの皮膚タンパク質コラーゲンを含有する画分及び／又はその分解物を配合することを特徴とする骨強化作用を賦与した医薬。
【請求項２】
皮膚タンパク質コラーゲンを含有する画分が、粉砕され、脱脂された皮膚真皮層の凍結乾燥物である請求項１記載の医薬。
【請求項３】
皮膚タンパク質コラーゲンを含有する画分が、皮膚タンパク質を酸又はアルカリで浸漬処理した画分である請求項１記載の医薬。
【請求項４】
皮膚タンパク質コラーゲンを含有する画分の分解物が、皮膚タンパク質コラーゲンを含有する画分をタンパク質分解酵素で加水分解して得られる分解物である請求項１記載の医薬。
【請求項５】
皮膚タンパク質コラーゲンを含有する画分の分解物が、皮膚タンパク質を酸又はアルカリで浸漬処理した画分をタンパク質分解酵素で加水分解して得られる分解物である請求項１記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、骨強化作用を賦与した医薬、飲食品及び飼料に関する。本発明の骨強化作用を賦与した医薬、飲食品及び飼料は、骨形成を促進して骨を強化する効果を有する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高齢化に伴い、骨折等の各種骨疾患が増加する傾向にある。骨組織においては、絶えず骨形成と骨吸収が営まれており、若い時には骨形成と骨吸収のバランスが保たれているが、加齢に伴い種々の原因でそのバランスが骨吸収に傾く (アンカップリング) 。そして、この状態が長期間続くと骨組織が脆くなり、骨折等の各種骨疾患を生じることになる。このアンカップリングを防止することができれば、骨折等の各種骨疾患を予防することができると考えられている。
【０００３】
従来より、アンカップリングを防止し、各種骨疾患を予防あるいは治療する方法として、(1) 食餌によるカルシウム補給、(2) 軽い運動、(3) 日光浴、(4) 薬物治療等が行われている。食餌によるカルシウム補給には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等のカルシウム塩や牛骨粉、卵殻、魚骨粉等の天然カルシウム剤が使用されているが、必ずしも経口摂取に適している素材であるとはいえない。軽い運動はジョギングや散歩等が良いとされるが、体が弱っている場合は軽い運動も厄介なものであり、まして寝たきりの老人では殆ど運動できない。日光浴は活性化ビタミンＤ3 の補給という点では良いとされているが、これだけでは不充分である。薬物投与には、１α−ヒドロキシビタミンＤ3 、カルシトニン製剤等が使用されており、骨粗鬆症の治療には有効であることが知られている。しかし、これらの物質は医薬そのものであり、食品素材として使用可能なものではない。
【０００４】
一方、動物の結合組織を構成する主要なタンパク質成分としてコラーゲンが知られており、哺乳類、特にヒトの身体の総タンパク質の30％近くをコラーゲンが占めている。このコラーゲンは、細胞マトリックスの蛋白質で、α鎖と呼ばれるポリペプチド鎖３本からなるヘリックス部位を有し、多分子複合体を形成する物質と定義できる。そして、コラーゲンは、プロテオグリカン、ファイブロネクチン、ラミニン等の糖タンパク質と共に細胞間マトリックスを形成し、多細胞生物において、細胞が集合体として組織となり機能を発揮するために必須の成分である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らは、食品素材として使用可能な骨強化作用を有する物質を得るために鋭意研究を進めてきたところ、皮膚タンパク質のコラーゲンを含有する画分に骨芽細胞増殖促進効果があることを見出した。また、このコラーゲンを含有する画分の分解物にも骨芽細胞増殖促進効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発明は、骨強化作用を有する医薬、飲食品及び飼料を提供することを課題とする。さらに具体的には、皮膚タンパク質のコラーゲンを含有する画分及び／又はその分解物を配合して骨強化作用を賦与した医薬、飲食品及び飼料を提供することを課題とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
すなわち、本発明は、分子量５０〜２００ＫＤａのコラーゲンを含有する画分及び／又はその分解物を配合して骨強化作用を賦与した医薬、飲食品又は飼料に関する。本発明では、医薬、飲食品、飼料に骨強化作用を賦与する目的でコラーゲンを含有する画分やその分解物が配合される。このコラーゲンを含有する画分は、皮膚から得られるタンパク質画分である。例えば、皮膚から調製する場合は、皮膚を脱毛して真皮層を切り出し、高速カッター等で組織を粉砕した後、有機溶媒で充分脱脂し、適宜、凍結乾燥等を行うことによりコラーゲンを含有する画分を得ることができる。また、このようにして得られるコラーゲンを含有する皮膚タンパク質画分を酸やアルカリで浸漬処理することにより、あるいは、コラーゲンを含有する皮膚タンパク質画分を酸やアルカリで浸漬処理して、コラーゲンの純度を高めることもできる。酸やアルカリでの処理は、塩酸、硝酸等の酸または水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリの５〜30％水溶液にこれらの画分を20〜50℃で 0.5〜３時間浸漬することによって行なう。浸漬後これらの画分を充分に水洗する。また熱水抽出によりこれらの画分を70〜80℃の温度の熱水でマイルドに処理することによって抽出を行なうことも可能である。
【０００７】
さらに、これらのコラーゲンを含有する画分をペプシン、トリプシン、キモトリプシン等のタンパク質分解酵素で加水分解し、溶解性を高めこれを使用することもできる。タンパク質分解酵素による分解は、前記の画分を粉砕して水に懸濁させ、タンパク質分解酵素の約１％程度の水溶液を加え、37℃で 0.5〜６時間加水分解を行なう。加水分解終了後加熱処理してタンパク質分解酵素を加熱失活させ、限外濾過等を行なって濾液を採取する。これらは50〜200kDa程度の加水分解物が望ましい。なお、コラーゲンが豊富に含まれている原料としては、ウシ、ブタ、トリ、ヒツジ、ウマ等の新鮮な皮膚を例示することができる。
【０００８】
次に、参考例及び試験例により、これらのコラーゲンを含有する画分及びその分解物の調製及び骨強化作用について説明する。
【参考例１】
ブタ皮10kgを脱毛して真皮層を切り出し、高速カッターで組織を粉砕した後、ヘキサン：エタノール(5:1) の溶媒で充分脱脂し、凍結乾燥してコラーゲンを含有する皮膚タンパク質画分（画分Ａ）1,354gを得た。この画分は、タンパク質を85％含有し、50〜200kDaの分子量分布を示した。
なお、タンパク質量は、Lowry 法(Lowry O.H.et al.(1951) J. Biol. Chem., 193, 265-275) により測定した。また、分子量分布は、SDS ポリアクリルアミド電気泳動により測定した (以下のタンパク質量及び分子量分布も同様の方法で測定した) 。
【０００９】
【参考例２】
参考例１で得られたコラーゲンを含有する皮膚タンパク質画分1,000gを５％濃度となるよう水に懸濁し、10％濃度となるよう塩酸で浸漬処理した後、充分に水洗し、さらに10％濃度となるよう水に懸濁して90℃で30分間熱処理し、凍結乾燥してコラーゲンを含有する皮膚タンパク質画分（画分Ｂ）620gを得た。なお、参考例１と同じ方法で測定したところ、この画分はタンパク質を93％含有し、50〜200kDaの分子量分布を示した。
【００１０】
【参考例３】
参考例２で得られたコラーゲンを含有する皮膚タンパク質画分300gを５％濃度となるよう水に懸濁し、１％濃度のパンクレアチン（シグマ製）を添加して37℃で２時間作用させた後、80℃で10分間加熱してパンクレアチンを失活させ、凍結乾燥してコラーゲンを含有する皮膚タンパク質画分の分解物（画分Ｃ）280gを得た。なお、参考例１と同じ方法で測定したところ、この画分はタンパク質を95％含有し、２〜50kDa の分子量分布を示した。
【００１１】
【参考例４】
ウシ骨粉10kgを10％濃度となるよう水に懸濁し、10％濃度となるよう塩酸処理して脱灰し、高速チョッパーで粉砕した後、さらに10％濃度となるよう塩酸で浸漬処理して脱灰した。そして、充分に水洗して凍結乾燥した後、粉砕機で粉砕してコラーゲンを含有する骨タンパク質画分（画分Ｄ）2,210gを得た。なお、参考例１と同じ方法で測定したところ、この画分はタンパク質を89％含有し、50〜150kDaの分子量分布を示した。
【００１２】
【参考例５】
参考例４で得られたコラーゲンを含有する骨タンパク質画分1,000gを５％濃度となるよう水に懸濁し、10％濃度となるよう水酸化ナトリウムで浸漬処理した後、充分に水洗してコラーゲンを含有する骨タンパク質画分（画分Ｅ）540gを得た。なお、参考例１と同じ方法で測定したところ、この画分はタンパク質を92％含有し、50〜150kDaの分子量分布を示した。
【００１３】
【参考例６】
参考例５で得られたコラーゲンを含有する骨タンパク質画分300gを５％濃度となるよう水に懸濁し、１％濃度のパンクレアチン（シグマ製）を添加して37℃で２時間作用させてた後、80℃で10分間加熱してパンクレアチンを失活させ、凍結乾燥してコラーゲンを含有する骨タンパク質画分の分解物（画分Ｆ）290gを得た。なお、参考例１と同じ方法で測定したところ、この画分はタンパク質を95％含有し、３〜70kDa の分子量分布を示した。
【００１４】
【試験例１】
参考例で得られた画分Ａ〜Ｆについて骨吸収防止作用を調べた。すなわち、生後10〜20日齢のＩＣＲ系マウスの長管骨を摘出し、軟組織を除去した後、５％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ溶液中で骨を機械的に細切し、破骨細胞を含む全骨髄細胞を得た。この細胞を象牙片の上に、約２×106 細胞を５％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ溶液をスポットした。２時間後、参考例で得られた画分Ａ〜Ｆをそれぞれ最終濃度10μg/mlとなるように加えた５％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ溶液を加え、５日間培養し、既存の破骨細胞の骨吸収活性を調べた。
【００１５】
骨吸収防止作用の評価は、培養後、象牙片上の細胞を剥がしてヘマトキシリン染色し、PIASLA-555により画像解析して骨吸収窩(pit) の面積を測定することにより行った。また、対照として、無添加のものを用い、無添加のものの骨吸収活性を 100％としたときのそれぞれの骨吸収活性 (％) で表した。その結果を表１に示す。
【００１６】
この結果、参考例で得られたコラーゲンを含有する画分である皮膚タンパク質画分や骨タンパク質画分の画分Ａ〜Ｆには骨吸収防止作用があることが判った。
【００１７】
【表１】
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【００１８】
【試験例２】
参考例で得られた画分Ａ〜Ｆについて、コラーゲン合成促進作用を調べた。すなわち、骨芽細胞MC3T3-E1細胞を10％牛胎児血清を含むα−ＭＥＭ培地(Flow Labolatories社製) で96穴プレートに２×104/mlの細胞数で播種した。次に、５％ＣＯ2 存在下、37℃で24時間培養し試験用培養細胞とした。そして、培地を牛胎児血清を含まないα−ＭＥＭ培地に交換し、参考例で得られた画分Ａ〜Ｆをそれぞれ最終濃度10μg/mlとなるよう培地に添加して、37℃で３日間培養した後、ハイドロキシプロリンを定量することにより合成されたコラーゲン量を求めた。なお、ハイドロキシプロリンの定量は、培養細胞の破砕液を6N塩酸で加水分解し、Woessnerの方法(Woessner,J.F., Arch Biochem. Biophys., vol.93, pp.440-447, 1961) に従い、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを用いることにより行った。その結果を図１に示す。
参考例で得られたコラーゲンを含有する画分である皮膚タンパク質画分や骨タンパク質画分の画分Ａ〜Ｆを添加して培養するとハイドロキシプロリン量が有意に増加しており、骨芽細胞のコラーゲン合成が促進されていることが判った。
【００１９】
【試験例３】
参考例で得られた画分Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦについて、動物実験により骨強化作用を調べた。
動物実験には６週齢のＳＤ系雌性ラットを用いた。１週間の予備飼育後、卵巣摘出手術を施し、その後、低カルシウム食で２ヶ月間飼育して骨粗鬆症モデルラットとし、動物実験に供した。このラットについては１群７匹ずつ、対照群、画分Ｂ 1.5％投与群(I群) 、画分Ｃ 1.5％投与群 (II群) 、画分Ｅ 1.5％投与群(III群) 、画分Ｆ 1.5％投与群 (IV群) に分け、それぞれ表２に示した組成の試験飼料で１ヶ月間飼育した。また、疑似手術を施し、卵巣を摘出していないシャムラット７匹（シャム群）についても同様の実験を行った。
なお、表中のミネラル混合物においてはカルシウム源として、炭酸カルシウムを使用した。
【００２０】
【表２】
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【００２１】
また、表３に示した組成の試験飼料をそれぞれ投与した画分Ｂ 1.5％＋乳由来カルシウム＋ビタミンＤ3 400IU 投与群(V群) 、画分Ｅ 1.5％＋乳由来カルシウム＋ビタミンＤ3 400IU 投与群 (VI群) 、画分Ｂ 0.2％投与群(VII群) 及び画分Ｂ 2.0％投与群 (VIII群) についても同様の実験を行った。
ミネラル混合物中のカルシウム源として、 VII群及びVIII群は炭酸カルシウムを使用し、 V群及びVI群は乳由来カルシウム (特開平6-125740号公報参照) を使用した。
なお、表２及び表３の各試験飼料については、窒素含量が同じとなるようカゼインで調整すると共に、試験飼料100g当たりカルシウム 400mg及びリン 300mgとなるよう配合した。
【００２２】
【表３】
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【００２３】
１ヶ月後、各実験群のラットの大腿骨を摘出し、破断特性測定装置 (レオメータ・マックス RX-1600型、アイテクノ製) で破断力を測定することにより骨強度を求めた。その結果を図２に示す。
この図で示されるように、参考例で得られたコラーゲンを含有する画分である皮膚タンパク質画分や骨タンパク質画分の画分Ｂ、Ｃ、Ｅ及びＦには有意な骨強化作用があることが判った。また、吸収性の良好な乳由来カルシウム及びビタミンＤ3 を併用することにより骨強化作用が増強することが判った。さらに、カルシウムとコラーゲンの比が 1:0.5〜5.0 において骨強度に差が見られることから、カルシウム１に対しコラーゲンを含有する画分を 0.5〜5.0 の割合で配合することが有効であることも判った。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明では、コラーゲンを含有する画分やその分解物を錠剤や粉末等の医薬に配合して骨強化作用を賦与することができるし、また、コラーゲンを含有する画分やその分解物を牛乳、ヨーグルト、アイスクリーム、乳飲料、コーヒー飲料、ジュース、ゼリー、麺、ビスケット、パン、ソーセージ等の飲食品に配合して骨強化作用を賦与することもできる。また、同様にこれらの画分やその分解物を飼料に配合すると骨強化作用を賦与することができる。
【００２５】
本発明では、成人の場合、コラーゲン、コラーゲンを含有する画分やその分解物を１日10〜2,500mg 経口摂取することにより骨強化作用が発揮されるので、この数値を考慮して医薬や飲食品にコラーゲンを含有する画分やその分解物を配合すれば良い。なお、皮膚タンパク質画分や骨タンパク質画分等のコラーゲンを含有する画分については、ラットによる急性毒性は認められなかった。
また、コラーゲンを含有する画分やその分解物を飼料に同程度の量配合して、家畜や家禽等の骨強化を図ることもできる。
【００２６】
次に実施例を示し、本発明を具体的に説明する。
【比較例１】
表４に示した配合で原料を混合した後、加圧成型して、骨強化作用を賦与した錠剤を製造した。
【００２７】
【表４】
────────────────────
含水結晶ブドウ糖      73.5（重量％）
参考例６の画分Ｆ      20.0
カルシウム             5.0
シュガーエステル       1.0
香料                   0.5
────────────────────
【００２８】
【実施例１】
表５に示した配合で原料を混合した後、容器に充填し、加熱滅菌して、骨強化作用を賦与した飲料を製造した。
【００２９】
【表５】
────────────────────
混合異性化糖          15.0（重量％）
果汁                  10.0
クエン酸               0.5
参考例１の画分Ａ       0.5
香料                   0.1
カルシウム             0.1
水                    73.8
────────────────────
【００３０】
【実施例２】
表６に示した配合で原料を混合し、ドウを作成して成型した後、焙焼して、骨強化作用を賦与したビスケットを製造した。
【００３１】
【表６】
─────────────────────
小麦粉                  50.0（重量％）
砂糖                    20.0
食塩                     0.5
マーガリン              12.5
卵                      12.1
水                       2.5
炭酸水素ナトリウム       0.1
重炭酸アンモニウム       0.2
炭酸カルシウム           0.5
参考例２の画分Ｂ         1.2
─────────────────────
【００３２】
【実施例３】
表７に示した配合で原料を混合した後、容器に充填し、加熱滅菌して、骨強化作用を賦与したゼリーを製造した。
【００３３】
【表７】
────────────────────
果糖                  20.0（重量％）
グラニュー糖          15.0
水飴                   5.0
寒天                   1.0
参考例１の画分Ａ       0.5
香料                   0.1
カルシウム             0.1
水                    58.3
────────────────────
【００３４】
【実施例４】
表８に示した配合で原料を混合した後、85℃で乳化して、骨強化作用を賦与したプロセスチーズを製造した。
【００３５】
【表８】
─────────────────────
ゴーダーチーズ          43.0（重量％）
テェダーチーズ          43.0
クエン酸ナトリウム       2.0
参考例２の画分Ｂ         0.5
乳由来カルシウム         1.0
水                      10.5
─────────────────────
【００３６】
【実施例５】
12重量％還元脱脂乳を90℃で20分間加熱殺菌した後、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)及びストレップトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus) をそれぞれ接種し、２種類のスターターカルチャーを得て両者を等量混合した。そして、表９に示した配合で原料を混合した後、発酵させて、骨強化作用を賦与したヨーグルトを製造した。
【００３７】
【表９】
──────────────────────
ヨーグルトミックス        96.5（重量％）
スターターカルチャー       3.0
参考例３の画分Ｃ           0.5
──────────────────────
【００３８】
【比較例２】
表１０に示した配合で原料を混合し、骨強化作用を賦与した乳児用調製粉乳を製造した。
【００３９】
【表１０】
────────────────────────
脱脂粉乳                      75.5（重量％）
ホエータンパク質濃縮物         2.4
乳糖                          13.5
ミネラル混合物                 0.3
水溶性ビタミン混合物           0.3
脂溶性ビタミンを含む脂肪       7.5
参考例６の画分Ｆ               0.5
────────────────────────
【００４０】
【実施例６】
表１１に示した配合で原料を混合し、骨強化作用を賦与したイヌ飼育用飼料（ドッグフード）を製造した。
【００４１】
【表１１】
────────────────────
大豆粕                12.0（重量％）
脱脂粉乳              14.0
大豆油                 4.0
コーン油               2.0
パーム油              28.0
トウモロコシ澱粉      15.0
小麦粉                 8.0
ふすま                 2.0
ビタミン混合物         9.0
ミネラル混合物         2.0
セルロース             3.0
参考例１の画分Ａ       1.0
────────────────────
【００４２】
【発明の効果】
本発明の皮膚タンパク質コラーゲンを含有する画分やその分解物を配合した医薬、飲食品及び飼料は、骨強化作用を有するので、これを経口的に投与すると骨粗鬆症等の各種骨疾患の予防や改善に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例２によるコラーゲン含有画分またはその分解物の骨芽細胞のコラーゲン合成促進作用を示す。
【図２】試験例３によるコラーゲン含有画分またはその分解物を経口投与したラットの大腿骨破断力を示す。
【図１】
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【図２】
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