(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体由来試料に含まれる遺伝子包含体中もしくは生体由来試料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法において、プレヒーティングを伴う核酸合成を行う前に、生体由来試料を添加した遺伝子増幅反応液を、プライマー付加による核酸を合成する耐熱酵素の熱安定性が保たれる温度である７０℃〜９０℃で５〜２０分熱処理を行うことを特徴とする核酸合成法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は核酸合成法、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction ：以下ＰＣＲと略す）法による核酸合成法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＣＲ法は、ＤＮＡ鎖の１本鎖への解離、ＤＮＡ鎖の中の特定の領域をはさんだプライマーの結合、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を繰り返すことによって、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅できる方法である。ＰＣＲ法は、マリス氏らの発明である特開昭６１−２７４６９７号公報に述べられている。
ＰＣＲ法は種々の試料中の核酸の高感度分析法として使用可能で、特に動物体液由来の試料中の核酸の分析法に使用できる。従って、ＰＣＲ法は感染症や遺伝病やガンの診断等に利用される。さらに、ＰＣＲ法は移植や親子鑑定の際のＤＮＡタイピングの検査にも適した方法である。これらの場合末梢血液が検査対象に選ばれる場合が多い。
【０００３】
ＰＣＲ法の１つの欠点は色素、たんぱく、糖類あるいは未知の夾雑物が反応を阻害することである。すなわち、代表的な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるThermus aquaticus 由来のＴａｑＤＮＡポリメラーゼをはじめ、多くのＤＮＡポリメラーゼは、微量の体液由来の夾雑物がＰＣＲ反応液中に混在しても、ＰＣＲが強く阻害されることが広く知られている。
【０００４】
そこで、ＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅に先立って、被験物から細胞、細菌、ウィルス等（以下、遺伝子包含体と称する）を分離し、次に、その遺伝子包含体から核酸を抽出する過程が必要となる。その方法としては、酵素、界面活性剤、カオトロピック剤等により遺伝子包含体を分解し、その後、フェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、遺伝子包含体の分解物から核酸を抽出する方法が従来より使用されている。
【０００５】
最近では核酸抽出の過程において、イオン交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズあるいはタンパク凝集作用を有する試薬等が使用されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらの方法を用いて試料中の核酸の精製を行っても、不純物の完全な除去は困難であり、かつ試料中の核酸の回収量が一定しない場合も多く、このため引き続く核酸合成が、とりわけ試料中の目的とする核酸の含量が少ない場合には、うまくできない場合もある。また、これら精製法は操作が煩雑で時間を要し、また操作中のコンタミネーションの機会が高い。
【０００７】
従って、これらの問題点を解決するためには、より簡便で、かつ効果的な試料前処理法が望まれる。
【０００８】
我々は以前、ＰＣＲ反応液中のｐＨを上昇させること（特願平8ー238112号）または、ＰＣＲ反応液中にポリアミンを添加すること（特願平6ー146500号）により、試料中の遺伝子包含体もしくは試料そのものと遺伝子増幅反応液を混合し、ＰＣＲを行うことが可能であることを見いだした。しかし、この方法を用いた場合においても、試料中の遺伝子包含体もしくは試料そのものの種類によっては、ＰＣＲ阻害物質の作用を抑制しきれず、試料中のＤＮＡを効率よく増幅させることができない場合があることが見いだされた。
【０００９】
そこで、本発明は、更に改良を加え、試料の種類に関係なく、ＰＣＲ阻害物質の作用を抑制して、試料中のＤＮＡを効率よく増幅させる新規な方法を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記課題を解決するため、生体由来試料に含まれる遺伝子包含体中もしくは生体由来試料中の目的とする遺伝子を増幅する核酸合成法において、プレヒーティングを伴う核酸合成を行う前に、生体由来試料を添加した遺伝子増幅反応液を、プライマー付加による核酸を合成する耐熱酵素の熱安定性が保たれる温度である７０℃〜９０℃で５〜２０分熱処理を行うことを特徴とする。
【００１１】
本発明において、試料は生体由来試料中の遺伝子包含体もしくは生体由来試料そのものをいい、生体由来試料とは、動植物組織、体液、排泄物等をいい、遺伝子包含体とは、細胞、細菌、ウィルス等をいう。体液には血液、唾液、髄液、尿、乳が含まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１２】
遺伝子増幅反応液は、通常、ｐＨ緩衝液並びにＭｇＣｌ2 、ＫＣｌ等の塩類、プライマー、デオキシリボヌクレオチド類及び耐熱酵素を含むものである。また、上記の塩類は適宜他の塩類に変更して使用されている。また、ゼラチン、アルブミン等のタンパク、ジメチルスルホキシド、界面活性剤等種々の物質が添加される場合がある。
【００１３】
ｐＨ緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンと塩酸、硝酸、硫酸等の鉱酸の組合せであり、鉱酸の中で望ましいものは塩酸である。また、トリシン、ＣＡＰＳＯ（3ーNーCyclohexylamino −2 −hydroxypropanesulfonic acid ）あるいはＣＨＥＳ（2ー（Cyclohexylamino ）ethanesulfonic acid ）と苛性ソーダ、苛性カリとの組み合わせによるｐＨ緩衝液等種々のｐＨ緩衝液が使用され得る。ｐＨ調整された緩衝液は、遺伝子増幅反応液の中で１０ｍＭから１００ｍＭの間の濃度で使用される。
【００１４】
プライマーは、核酸と増幅用試薬等の存在下に合成の開始点として働くオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖であることが望ましいが、二本鎖も使用できる。もし、プライマーが二本鎖の場合には、増幅反応に先立って一本鎖にすることが望ましい。プライマーは、公知の方法により合成することができるし、また、生物界から単離することもできる。
【００１５】
耐熱酵素は、プライマー付加による核酸を合成する酵素、あるいはかような化学合成系を意味する。適切な耐熱酵素としては、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｅ．coliのＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ.litoralisＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼそして逆転写酵素などがあるが、これらにのみ限定されるものではない。
【００１６】
遺伝子増幅反応液のｐＨは、２５℃の温度条件下で８．１以上、好ましくは８．１〜９．５である。更に好ましくは、例えば血液から分離した白血球で直接ＰＣＲを行う場合は、ｐＨ９．０付近、赤血球の溶血等の前処理を施すことなく、血液試料でＰＣＲを行う場合には、ｐＨ８．８付近、唾液試料より直接ＰＣＲを行う場合には、ｐＨ９．４付近とすることがよい。
【００１７】
また、本発明では、遺伝子増幅反応液にポリアミンを添加してもよい。ポリアミンとは、第１級もしくは第２級アミノ基を二つ以上もつ炭化水素の総称で、具体的には、例えばエチレンジアミン、トリメチレンジアミン、スペルミン、スペルミジン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、1、4ービス(3ー アミノプロピル）ー ピぺラジン、1ー（2ーアミノエチル）ピペラジン等が挙げられる。ポリアミンの添加量は、ポリアミンの種類や試料の種類、濃度等により異なるが、通常遺伝子増幅反応液中１０〜０．０１ｍＭ程度、好ましくは２〜０．５ｍＭ程度が良い。
【００１８】
耐熱酵素の熱安定性が保たれる温度とは、前記耐熱酵素の活性が保持される温度で、好ましくは７０〜９０℃、更に好ましくは７２〜９０℃である。加熱時間は、熱処理温度にもよるが、５〜２０分、好ましくは５〜１５分である。
【００１９】
なお、本発明で“核酸合成を行う前”とは、試料に遺伝子増幅反応液を添加する前、後のいずれも指すが、遺伝子増幅反応液の添加後の方が好ましい。
【００２０】
また、本発明の核酸合成法（ＰＣＲ）の手順は、核酸合成を行う前に熱処理を行う以外、通常の方法と変わらない。
【００２１】
【実施例】
（実験例１）
ＰＣＲ反応液（47.5μｌ）に抗凝固剤（EDTA-2K またはHeparin-Na）で処理したヒト血液を2.5 μｌ添加し、60℃、72℃または80℃で熱処理を行った後、ＰＣＲを行った。ＰＣＲのプライマーはＨＬＡ−ＤＰ遺伝子領域内に位置するplus鎖の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（Ｐ１）及びminus 鎖の塩基配列をもつオリゴヌクレオチド（Ｐ２）であり、配列は次の通りである。この２種類のプライマーを用いたＰＣＲの結果、280bp の増幅産物を得ることができる。
【００２２】
Ｐ１：５’ＴＣＣＣＣＧＣＡＧＡＧＡＡＴＴＡＣ３’
Ｐ２：５’ＣＡＣＴＣＡＣＣＴＣＧＧＣＧＣ３’
ＰＣＲ反応液には、pH8.9 に調節した10mM Tris-HCl, 35mM KCl,1.5mM MgCl2 , 200 μM のdATP,dCTP,dGTP及びdTTP, 1.0 μM のprimer, 1.25units/50μl のTaq DNA ポリメラーゼ（TaKaRa Taq: Takara shuzo, Kyoto, Japan）反応液を用いた。
【００２３】
ＰＣＲは、９４℃、４分３０秒のプレヒーティングの後、９４℃  ３０秒間、５８℃  １分間、７２℃  １分間の条件で４０サイクル、最後に７２℃  ７分間のポリメライゼーションを行った。ＰＣＲ終了後、反応液５μｌを用いて、２．５％アガロースを含む、０．５μｇ/ ｍｌ臭化エチジウム添加ＴＡＥ（40mM Tris-acetate, 1mM EDTA, pH8.0) 液中で電気泳動を行い検出した。
【００２４】
抗凝固剤処理ヒト血液（2 サンプル）を直接添加したＰＣＲ反応液を、ＰＣＲ前に各種温度で15分間熱処理を行い、ＰＣＲを行ったときの増幅産物の電気泳動図を図１に示す。図中Ａ１またはＡ２はHeparin-Na処理血、Ｂ１またはＢ２はEDTA-2K 処理血（１、２はサンプルナンバー）を示し、１は６０℃、２は７２℃、３は８０℃の温度でＰＣＲ前に熱処理を行った時、４は熱処理を行わなかった時のＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示している。また、Ｍはサイズマーカー（HincIIで切断した250ng のφ X174-RF DNA）を示している。
【００２５】
結果、６０℃の熱処理を行った場合では熱処理を行わなかった場合に比べて、１例において、若干のＰＣＲ増幅産物の増量が認められたにすぎなかった（Ａ２−1 vs  Ａ２−4 ）。一方、７２℃と８０℃の熱処理では、熱処理を行わなかった時と比べて、多量の特異的なＰＣＲ増幅産物が認められた。
【００２６】
（実験例２）
本例は、実験例１で最も増幅効率の良かった熱処理温度８０℃とさらに高い９０℃で、５分、１５分、３０分間熱処理を行った後、ＰＣＲを行った実験である。試料は実験例１で使用したＡ１およびＢ１血液を用いた。また用いたＰＣＲ反応液の組成およびＰＣＲの条件、ＰＣＲ後の電気泳動の条件は実験例１と同様である。
【００２７】
種々の温度、時間で熱処理を行い、ＰＣＲを行ったときのＰＣＲ産物の電気泳動図を図２に示した。図中Ｉは８０℃、IIは９０℃の熱処理温度を示し、１は１５分、２は１０分、３は５分の熱処理を、４は熱処理を行わなかった時のＰＣＲ産物の電気泳動の結果を示している。
【００２８】
結果、Heparin-Na  処理血（Ａ１）を用いた場合には、熱処理を行わなかった場合において、ＰＣＲ増幅産物が検出出来なかった（Ａ１−4 ）が、熱処理を行った場合、80℃、90℃いずれの温度で５〜15分いずれの時間熱処理した場合においても、明瞭なＰＣＲ産物が検出できた。一方、EDTA-2K 処理血（Ｂ１）を用いた場合には、熱処理を行わなかった場合（Ｂ１−4 ）に比べ、熱処理を行った場合、いずれの温度、いずれの時間で熱処理した場合においてもＰＣＲ増幅産物の増量が認められた。
【００２９】
【発明の効果】
本発明により、核酸の分離・精製の過程を経ずに、血液等のＰＣＲ阻害物質を多く含んだ試料から、直接、目的のＤＮＡを効率よく増幅することが可能となった。また、本発明により、簡便、迅速に核酸合成の操作を行えるようになり、コンタミネーションの機会の軽減が可能となった。
【００３０】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：１７
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
アンチセンス：Ｎｏ
配列：  ＴＣＣＣＣＧＣＡＧＡＧＡＡＴＴＡＣ
【００３１】
配列番号：２
配列の長さ：１５
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸  合成ＤＮＡ
アンチセンス：Ｎｏ
配列：  ＣＡＣＴＣＡＣＣＴＣＧＧＣＧＣ
【図面の簡単な説明】
【図１】抗凝固剤処理ヒト血液（2 サンプル）を直接添加したＰＣＲ反応液を、ＰＣＲ前に各種温度で15分間熱処理を行い、ＰＣＲを行ったときの増幅産物の電気泳動図
【図２】種々の温度、時間で熱処理を行い、ＰＣＲを行ったときのＰＣＲ産物の電気泳動図
【図１】
0004629167.tif 000002
【図２】
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