(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（３）又は（４）のポリペプチド。
（３）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（４）（３）のポリペプチドのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転移を有するアミノ酸配列からなり、かつグリコサミノグリカンのグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
下記（３）又は（４）のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（３）配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
（４）（３）のポリペプチドのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転移を有するアミノ酸配列からなり、かつグリコサミノグリカンのグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項３】
下記（ｅ）〜（ｆ）のいずれかのＤＮＡであって、該ＤＮＡがコードするポリペプチドがグリコサミノグリカンのグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するＤＮＡ。
（ｅ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｆ）配列番号３の塩基番号１５乃至１５１４の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｇ）（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡが有する塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ。（ｈ）（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト由来のＤＮＡ。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は硫酸基転移酵素及びそれをコードするＤＮＡに関するものである。より詳しくは、硫酸基受容体グリコサミノグリカンに含まれるグルコサミン残基の６位水酸基を選択的に硫酸化する６−Ｏ−硫酸基転移酵素のポリペプチドおよびそれをコードするＤＮＡに関するものである。
背景技術
ヘパリン及びヘパラン硫酸は、ヘキスロン酸（ＨｅｘＡ）残基（Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＡ）又はＬ−イズロン酸（ＩｄｏＡ）残基）とＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）残基の二糖の繰り返し構造（４ＧｌｃＡβ１／ＩｄｏＡα１→４ＧｌｃＮＡｃα１→）を基本骨格（ヘパリン骨格）とし、基本的にはそのヘキスロン酸残基の２位水酸基の一部及びＮ−アセチルグルコサミン残基の２位アミノ基又は６位水酸基の一部に硫酸基が置換しているグリコサミノグリカンである。
グリコサミノグリカンに硫酸基を転移する酵素（グリコサミノグリカン硫酸基転移酵素）の遺伝子がクローニングされることにより、硫酸基を有するグリコサミノグリカン（硫酸化グリコサミノグリカン）の生合成についての情報を得るのに十分な量の該酵素を容易に得ることが可能となり、硫酸化グリコサミノグリカンの構造と機能の関係を研究する上で有用なアプローチが提供されると考えられる。硫酸化グリコサミノグリカンの生合成、その中でもヘパリン及びヘパラン硫酸の生合成には多くの硫酸化のプロセスがあることが知られており（木幡陽、箱守仙一郎、永井克孝編、グリコテクノロジー▲５▼、５７（１９９４）、講談社サイエンティフィク発行）、この硫酸化には様々なグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素が関与しているものと考えられる。ヘパリン又はヘパラン硫酸に硫酸基を転移するグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素としては、Ｎ−アセチルグルコサミン残基の脱Ｎ−アセチル化及び硫酸基転移を触媒するヘパラン硫酸Ｎ−硫酸基転移酵素（以下「ＨＳＮＳＴ」と略記することもある）、ヘキスロン酸残基の２位水酸基に硫酸基を転移するヘパラン硫酸２−Ｏ−硫酸基転移酵素（以下「ＨＳ２ＳＴ」と略記することもある）、及び、Ｎ−硫酸化グルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移するヘパラン硫酸６−Ｏ−硫酸基転移酵素（以下「ＨＳ６ＳＴ」と略記することもある）が単離されており、これらの硫酸基転移酵素にはｃＤＮＡのクローニングがなされているものもある。
本発明者らは、硫酸基供与体である３’−ホスホアデノシン５’−ホスホ硫酸から、硫酸基受容体であるヘパラン硫酸に含まれるＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を選択的に転移するＨＳ６ＳＴを、チャイニーズハムスター、マウス及びヒト由来の培養細胞から既に精製し（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，４１７２−４１７９（１９９５））、該酵素のクローニングを完了し（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，９２０８−９２１３（１９９８））、マウスでは更に２種のそのアイソフォームのクローニングに成功した（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，２８５９−２８６８（２０００））。
発明の開示
ヘパラン硫酸に含まれるＮ−硫酸化グルコサミン残基の６位の水酸基に選択的に硫酸基を転移する公知のＨＳ６ＳＴは、ＣＤＳＮＳ（完全脱硫酸化Ｎ再硫酸化）ヘパリンに対して強い酵素活性を示すが、ＣＤＳＮＡｃ（完全脱硫酸化Ｎアセチル化）ヘパリンなどのグルコサミン残基のアミノ基に硫酸基を実質的に有しない糖鎖への硫酸基転移活性は非常に弱いため、当該酵素を用いたヘパリン骨格構造の修飾には制限があり、多種の修飾体を効率的に得るためには、基質特異性の異なる硫酸基転移酵素が必要であることが判明した。従って、本発明の目的は、ヘパリン骨格のグルコサミン残基の６位の水酸基を選択的に硫酸化する新規なグリコサミノグリカン硫酸基転移酵素であって、ＣＤＳＮＡｃヘパリンに対しても十分に作用を示す特徴を有する酵素を提供することにある。
本発明者らは、上記ＨＳ６ＳＴのマウスのアイソフォームの一つ（以下ｍＨＳ６ＳＴ２）のＤＮＡの塩基配列に基づいて、ヒトのｃＤＮＡから対応するヒトの酵素のＤＮＡを鋭意検索した結果、驚くべきことにｍＨＳ６ＳＴ２と相同性の高い対応するヒトのアイソフォーム（以下ｈＨＳ６ＳＴ２）の他にｍＨＳ６ＳＴ２とは基質特異性が異り、このｈＨＳ６ＳＴ２と相同性を有する酵素が発現していることを発見し、該酵素が、公知の硫酸基転移酵素とは異なる性質を有することを確認し、本発明を完成した。
すなわち本発明の要旨は以下の通りである。
（１）  グリコサミノグリカンのグリコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する活性を有するグリコサミノグリカン６−Ｏ−硫酸基転移酵素であって、基質に対する相対活性比が、完全脱硫酸化Ｎアセチル化（ＣＤＳＮＡｃ）ヘパリン／完全脱硫酸化Ｎ再硫酸化（ＣＤＳＮＳ）ヘパリン≧０．０５であり、構成アミノ酸から算出した分子量が５３，０００〜５８，０００ダルトンである酵素。
（２）  グリコサミノグリカンのグリコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する活性を有するグリコサミノグリカン６−Ｏ−硫酸基転移酵素であって、基質に対する相対活性比が、Ｎ硫酸化（ＮＳ）ヘパロサン／完全脱硫酸化Ｎ再硫酸化（ＣＤＳＮＳ）ヘパリン≧１．９０であり、構成アミノ酸から算出した分子量が５３，０００〜５８，０００ダルトンである酵素。
（３）  グリコサミノグリカンのグリコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する活性を有するグリコサミノグリカン６−Ｏ−硫酸基転移酵素であって、配列番号２記載のアミノ酸配列を有するか、該配列において１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを有する酵素。
（４）  ポリペプチドの分子量が５３，０００〜５８，０００ダルトンである（３）記載の酵素。
（５）  基質に対する相対活性比が、Ｎ硫酸化（ＮＳ）ヘパロサン／完全脱硫酸化Ｎ再硫酸化（ＣＤＳＮＳ）ヘパリン≧１．９０である（３）又は（４）記載の酵素。
（６）  下記▲１▼又は▲２▼のポリペプチド。
▲１▼配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
▲２▼▲１▼記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を有するアミノ酸配列からなり、かつ▲１▼のポリペプチドと同一の抗原性を有するか、又はグリコサミノグリカンのグリコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
（７）  配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつグリコサミノグリカンのグリコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するとともに、基質に対する相対活性比が、Ｎ硫酸化（ＮＳ）ヘパロサン／完全脱硫酸化Ｎ再硫酸化（ＣＤＳＮＳ）ヘパリン≧１．９０である酵素活性を有するポリペプチド。
（８）  （１）乃至（５）記載の酵素のポリペプチド又は（６）若しくは（７）記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
（９）  下記▲１▼又は▲２▼のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
▲１▼配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
▲２▼▲１▼のポリペプチドのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を有するアミノ酸配列からなり、かつ▲１▼のポリペプチドと同一の抗原性を有するか、又はグリコサミノグリカンのグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
（１０）  下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡであって、該ＤＮＡがコードするポリペプチドがグリコサミノグリカンのグリコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するＤＮＡ。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１の塩基配列の塩基番号２乃至１３８１の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡが有する塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（１１）  コードするポリペプチドの基質に対する相対活性比がＮ硫酸化（ＮＳ）ヘパロサン／完全脱硫酸化Ｎ再硫酸化（ＣＤＳＮＳ）ヘパリン≧１．９０である（１０）記載のＤＮＡ。
（１２）  （８）乃至（１１）のいずれか一項に記載のＤＮＡを有する組換えベクター。
（１３）  （１２）記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
（１４）  （１３）記載の形質転換体を培養し、培養物から（１）又は（２）記載の酵素を単離することを特徴とする、（１）乃至（５）のいずれか１項に記載の酵素の製造方法。
（１５）  下記▲３▼又は▲４▼のポリペプチド。
▲３▼配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
▲４▼▲３▼のポリペプチドのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を有するアミノ酸配列からなり、かつグリコサミノグリカンのグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するか又は▲３▼のポリペプチドと同一の抗原性を有するポリペプチド。
（１６）  下記▲３▼又は▲４▼のポリペプチドをコードするＤＮＡ。
▲３▼配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
▲４▼▲３▼のポリペプチドのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を有するアミノ酸配列からなり、かつグリコサミノグリカンのグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するか又は▲３▼のポリペプチドと同一の抗原性を有するポリペプチド。
（１７）  下記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかのＤＮＡ。
（ｅ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｆ）配列番号３の塩基番号１５乃至１５１４の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｇ）（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡが有する塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｈ）（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト由来のＤＮＡ。
（１８）  （６）、（７）又は（１５）に記載のポリペプチドの発現量と組織の腫瘍の有無とを関連づけることを特徴とする、組織の腫瘍化の検出方法。
（１９）  （１０）又は（１７）に記載のＤＮＡの転写により生じるｍＲＮＡの量と組織の腫瘍の有無とを関連づけることを特徴とする、組織の腫瘍化の検出方法。
発明を実施するための最良の形態
以下に、本発明の実施の形態を説明する。
＜１＞本発明酵素
本発明酵素は、グリコサミノグリカンのグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移するグルコサミン６−Ｏ−硫酸基転移酵素であり、少なくとも下記性質（１）〜（４）のうちのいずれかを有する。
（１）基質に対する相対活性比が、完全脱硫酸化Ｎアセチル化（ＣＤＳＮＡｃ）ヘパリン／完全脱硫酸化Ｎ再硫酸化（ＣＤＳＮＳ）ヘパリン≧０．０５である。
（２）構成アミノ酸から算出した分子量が５３，０００〜５８，０００ダルトンである。
（３）基質に対する相対活性比が、Ｎ硫酸化（ＮＳ）ヘパロサン／完全脱硫酸化Ｎ再硫酸化（ＣＤＳＮＳ）ヘパリン≧１．９０である。
（４）配列番号２記載のアミノ酸配列を有するか、該配列において１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドを有する。
本発明酵素は、通常には、本発明酵素は下記の理化学的性質を有する。
▲１▼作用：
硫酸基供与体から、硫酸基受容体に含まれるグルコサミン残基の６位水酸基へ硫酸基を選択的に転移する。
▲２▼基質特異性：
ヘパラン硫酸、ＣＤＳＮＳヘパリン（Ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  Ｄｅｓｕｌｆａｔｅｄ，Ｎ−ｓｕｌｆａｔｅｄ  Ｈｅｐａｒｉｎ：完全脱硫酸化後、Ｎ−再硫酸化ヘパリン）、ＣＤＳＮＡｃヘパリン（Ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ  Ｄｅｓｕｌｆａｔｅｄ，Ｎ−Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  Ｈｅｐａｒｉｎ：完全脱硫酸化後、グルコサミン残基をＮ−アセチル化したヘパリン）、Ｎ−硫酸化（ＮＳ）ヘパロサン、及び、ヘパリンのグルコサミン残基の６位水酸基には硫酸基を転移するが、コンドロイチン硫酸Ａ及びコンドロイチン硫酸Ｃには硫酸基を転移しない。ＮＤＳＮＡｃヘパリンに対する硫酸基転移活性が、ＣＤＳＮＳヘパリンに対する硫酸基転移活性と比して５％以上、好ましくは６％以上、より好ましくは７％以上を示す。すなわち、ＣＤＳＮＡｃヘパリンに対する硫酸基転移活性のＣＤＳＮＳヘパリンに対する硫酸基転移活性に対する比（ＣＤＳＮＡｃヘパリン／ＣＤＳＮＳヘパリン）が０．０５以上、好ましくは０．０６以上、より好ましくは０．０７以上を示す。また、ＮＳヘパロサンに対する硫酸基転移活性が、ＣＤＳＮＳヘパリンに対する硫酸基転移活性と比して、１９０％以上、好ましくは２００％以上、すなわちＮＳヘパロサンに対する硫酸基転移活性のＣＤＳＮＳヘパリンに対する硫酸基転移活性に対する比（ＮＳヘパロサン／ＣＤＳＮＳヘパリン）が１．９０以上、より好ましくは２．００以上を示す。
▲３▼分子量：
酵素を構成するポリペプチドの分子量の計算値（アミノ酸配列から算出した値）が、５３０００Ｄａ以上５８０００Ｄａ以下。
上記の理化学的性質は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，４１７２−４１７９（１９９５）に記載の方法に従って測定することができる。
本発明酵素は上述の性質を有している限り、いずれの哺乳動物由来であってもよいが、特にヒト由来であることが好ましい。
本発明酵素における硫酸基供与体としては好適には活性硫酸（３’−ホスホアデノシン５’−ホスホ硫酸；以下「ＰＡＰＳ」とも記載する）が挙げられる。
本発明酵素としては、そのポリペプチドが配列番号２記載のアミノ酸配列からなるものが好ましいが、配列番号２記載のアミノ酸配列に、一又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を含んでいても、そのアミノ酸配列からなるポリペプチドを有する酵素が少なくとも上記▲１▼の作用と基質特異性を有している限り、本発明酵素に含まれる。上記ポリペプチドにおける数個とは、それを構成するアミノ酸数のうち１０％以下の個数を指称する。
当業者であれば前記活性測定法に従って目的とする酵素活性の有無を確認することによって、該活性を実質的に害さない１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を容易に選択することができる。
本発明酵素は、更に以下の性質を有することが好ましい。すなわち、マウスＥＨＳ腫瘍由来のヘパラン硫酸のグルコサミン残基の６位水酸基に対する硫酸基の転移活性が、後述の実施例記載の活性測定法によって測定した場合、ＣＤＳＮＳヘパリンに対する活性の１．０倍以上、好ましくは１．０５倍以上、特に好ましくは１．３倍以上である。また、本発明酵素はヘキスロン酸には実質的に硫酸基を転移しない。
＜２＞本発明ＤＮＡ１及びそれがコードするポリペプチド
本発明ＤＮＡ１は前記＜１＞の本発明酵素のポリペプチドをコードするＤＮＡである。
本発明ＤＮＡ１としては、具体的にはｈＨＳ６ＳＴ２ｖのポリペプチドである配列番号２のアミノ酸配列の全てをコードする塩基配列を有するＤＮＡ及び配列番号２のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは転位したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一の抗原性を有するか、又はグリコサミノグリカンに含まれるグルコサミン残基の６位の水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有し、ＣＤＳＮＡｃヘパリン／ＣＤＳＮＳヘパリンが０．０５以上、好ましくは０．０６以上であるポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ、ＣＤＳＮＡｃヘパリン／ＣＤＳＮＳヘパリンが０．０７以上のポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡが最も好ましいがこれに限定はされない。
また、本発明ＤＮＡ１は、好ましくはＮＳヘパロサン／ＣＤＳＮＳヘパリンが１．９０以上、より好ましくは２．００以上であるポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡである。
すなわち、該ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを含む酵素が、上記した本発明酵素の理化学的性質を有している限り、限定されるものではないが、具体的には配列番号１に記載された塩基配列からなるＤＮＡ、配列番号１の塩基配列の塩基番号２乃至１３８１（コード領域）の塩基配列を有するＤＮＡ、及びこれらのＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。また、本発明ＤＮＡ１としては、前記例示の塩基配列を有するＤＮＡに対して相補的な塩基配列を有するＤＮＡ及びＲＮＡも例示され、また更にＤＮＡは一本鎖であっても二本鎖であってもよく、上記塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を有する限り、限定はされない。また、本発明ＤＮＡ１は、翻訳前に除かれるイントロンの配列を含んでいてもよい。
上述のストリンジェントな条件下とは、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）緩衝液）、５×デンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、変性サケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌ存在下、４２℃の条件下及びこれと実質的に同一の条件下などが例示される。すなわちストリンジェントな条件とは、通常の遺伝子のハイブリダイゼーションに用いられる条件であり、ノザン・ブロッティング法、サザン・ブロッティング法、核酸のハイブリダイゼーションを用いたスクリーニング等に使用される条件であれば、ここにいう「ストリンジェントな条件下」に包含される。
上述の１つ以上のアミノ酸の、アミノ酸配列中の置換、欠失、挿入又は転位を起こすＤＮＡの塩基配列中の塩基の置換、欠失、挿入又は転位は、例えば、両末端に制限酵素切断末端を持ち、変異点の両側を含む配列を合成し、未変異のＤＮＡが有する塩基配列の相当する部分と入れ換えることにより、ＤＮＡに導入することができる。また、部位特異的変異法（Ｋｒｅｍｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｆｒｉｔｓ，Ｈ．Ｊ．，Ｍｅｔｈ．Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３５０（１９８７）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４，３６７（１９８７））などの方法によっても、ＤＮＡに塩基の置換、欠失、挿入又は転位を導入することができる。
尚、遺伝暗号の縮重による異なった塩基配列を有するＤＮＡも本発明ＤＮＡ１に包含されることは、当業者であれば容易に理解されるところである。
本発明ＤＮＡ１は好ましくは、配列番号１の塩基配列の塩基番号２乃至１３８１の塩基配列に対し、遺伝子解析用コンピュータプログラムＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウェア開発社製）を用いて算出して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する。
また、本発明ＤＮＡ１は、脳の他に主として精巣、卵巣、腎臓で少なくとも発現しており、更に膵臓や下垂体でも若干量発現しているＤＮＡであることが好ましい。
＜３＞本発明ＤＮＡ１の調製法
本発明ＤＮＡ１は、ｍＨＳ６ＳＴ２或いはそれに対応するヒトのＥＳＴ等の塩基配列を基に作成したプライマーを用いてｃＤＮＡからＰＣＲ法（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション法：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）等によって増幅することで調製することができる。また、本発明によって開示された本発明ＤＮＡ１の塩基配列に基づき、人工的に合成して調製することが可能であり、また本発明ＤＮＡ１の塩基配列に基づき、人工的にプライマーを調製して、当該プライマーを使用することで、当業者であれば、ヒト由来のｃＤＮＡライブラリーや、全ＲＮＡから調製することが可能である。更に、他の哺乳動物由来のｃＤＮＡライブラリーや全ＲＮＡから、上述のプライマーを使用することで、上述の他の哺乳動物に存在する、対応する酵素をコードするＤＮＡを得ることも可能である。
本発明ＤＮＡ１は、特に以下の工程からなるクローニングにより製造することも可能である。
（１）マウスＨＳ６ＳＴ２及びヒトのＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔａｇ）を用いたプライマーの調製
（２）（１）で調製されたプライマーを用いたｃＤＮＡのＰＣＲ法による増幅
（３）ＰＣＲ産物の回収とクローニング
スクリーニングによって、通常には、本発明の完全長ｃＤＮＡを選択する。
しかし、本発明ＤＮＡ１の製造方法はこれに限定されるものではなく、上記ＰＣＲ法や、他の公知のｃＤＮＡクローニングの手法によっても本発明ＤＮＡ１を製造することができる。
以下に、マウス由来のＨＳ６ＳＴ２（ｍＨＳ６ＳＴ２）のｃＤＮＡ（Ｊ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，２８５９−２８６８（２０００））を利用した本発明ＤＮＡの製造方法の一例を具体的に記載する。
（１）マウスＨＳ６ＳＴ２（ｍＨＳ６ＳＴ２）及びヒトのＥＳＴを用いたプライマーの調製
ＰＣＲ用のプライマーの作成は、通常の方法と同様にして行えばよいが、ヒトのＨＳ６ＳＴ２ｖのｃＤＮＡの増幅を行うためのプライマーは、ヒト由来のＤＮＡの塩基配列を用いることが好ましい。従って、ｍＨＳ６ＳＴ２のｃＤＮＡを用いてＥＳＴデータベースから対応するヒトのＥＳＴを検索し、その配列からプライマーを作成する方が好ましい。そのようなプライマーの作成に使用することが可能なＥＳＴの例としては、例えばＧｅｎＢａｎｋのｄｂＥＳＴに登録された受け入れ番号ＡＬ０４９６７９のもの等が挙げられる。５’プライマー及び３’プライマーは、必ずしもヒトのＤＮＡの塩基配列を基に作成しなければならないわけではない。例えば一方をｍＨＳ６ＳＴ２のｃＤＮＡの塩基配列を基に作成し、もう一方をヒトのＥＳＴの塩基配列を基に作成してもよい。そのようなプライマーの例としては例えば配列番号５及び配列番号６の塩基配列を有するプライマーが例示される。
（２）ｃＤＮＡのＰＣＲ法による増幅
上記で調製したプライマーを使用して、細胞から調製したｃＤＮＡをＰＣＲ法により増幅する。
ｃＤＮＡは常法に従って調製することができ、また市販のｃＤＮＡライブラリーを使用することも可能である。ｃＤＮＡは、例えば下記の方法により調製することが可能である。
すなわち培養細胞や組織から採取した細胞から、全ＲＮＡを例えばグアニジンチオシアネート／ＣｓＣｌ法（Ｋｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｓ．，（１９９１）ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．１４，Ｕｎｉｔ  ４．２，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）等の方法で得ることができる。材料は、ＨＳ６ＳＴ２ｖのｍＲＮＡを発現している材料であれば限定はされない。
このようにして得られた全ＲＮＡから、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、オリゴｄＴ（Ｏｌｉｇｏ−（ｄＴ））セルロースカラムクロマトグラフィー等によって精製し、更にランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いた逆転写ＰＣＲ法を行うことにより、ｃＤＮＡを調製することができる。
上記ｃＤＮＡとしては、市販のｃＤＮＡを用いることが操作の簡便さの面からも好ましい。
上記のｃＤＮＡを上述のプライマーを用いてＰＣＲ法により増幅することで、ＨＳ６ＳＴ２ｖのｃＤＮＡが特異的に増幅される。ＰＣＲ法は例えば下記の方法で行うことができる。
すなわち、ｃＤＮＡライブラリーを含む水溶液３μｌを９５℃で３分間加熱処理し、すぐに氷冷してｃＤＮＡを変性させる。変性させたｃＤＮＡに蒸留水を加えて０℃で２０分以上静置し、上述のプライマーを添加する。それに逆転写反応液、４種類のデオキシヌクレオチド三リン酸、及びＡｍｐｌｉＴａｑポリメラーゼを加える。増幅反応は、例えば変性反応を９４℃で３０秒、アニーリングを５５℃で３０秒、伸長反応を７２℃で２分とし、３５回行う。その後、更に１５分間伸長反応を行う。しかし、ＰＣＲ法の上記繰り返し数や、温度などの条件は適宜調整することも可能である。
また、ｃＤＮＡの調製は市販のｃＤＮＡ合成用キットを用いるのが便利である。例えばＴａｑ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）などを例示することができる。また、例えばＴｉｍｅＳａｖｅｒ  ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロジー社製）を用いると、ｃＤＮＡの合成に加え、ｃＤＮＡをクローニングベクターに連結することもできる。
このような方法で増幅されたＤＮＡを、例えばアガロースゲル電気泳動などの分子量による分離手段によって解析すると、ＨＳ６ＳＴ２ｖ（約１３６０ｂｐ）及びＨＳ６ＳＴ２（約１５００ｂｐ）が増幅されている。
（３）ＰＣＲ産物の回収とクローニング
ＰＣＲ法により増幅されたｃＤＮＡのうち、約１３６０ｂｐのＰＣＲ産物を常法によって回収する。例えば、ゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を分子量毎に振り分けた場合には、Ｊｅｔｓｏｒｂ等のゲルからＤＮＡを取り出す方法を用いることができる。
回収したＰＣＲ産物を常法に従ってＰＣＲ産物に制限酵素領域を接続し、これをクローニングベクターに結合して宿主細菌細胞中に導入（トランスフェクション）する。
用いる宿主細菌細胞は、用いるクローニングベクターにより選択する必要があるが、通常は大腸菌（エシェリキア・コリ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ））を宿主とするクローニングベクターと大腸菌との組み合わせが頻用されている。しかし、これに限定はされない。トランスフェクションは通常、組換ＤＮＡと３０ｍＭ塩化カルシウムの存在下で細胞膜の透過性を変化させた大腸菌とを混合することにより行われる。λｇｔ１１のようなλファージベクターの場合、組換えＤＮＡを直接塩化カルシウム処理した大腸菌に導入もできるが、予め試験管中でファージ外殻に入れて（ｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージングという）、大腸菌に効率よく感染させる方法が一般に使用されており、市販されているパッケージング用のキット（Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ：ストラタジーン社製など）を用いてパッケージングを行うこともできる。
パッケージングした組換えＤＮＡを大腸菌にトランスフェクションするが、用いるクローニングベクターやプラスミドベクターによって用いる大腸菌株を選択する必要がある。すなわち、抗生物質耐性遺伝子を含むクローニングベクターを用いる場合は、大腸菌に抗生物質への耐性があってはならず、また、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）等の遺伝子を含むクローニングベクターを用いる場合には、β−ガラクトシダーゼ活性を有しない大腸菌を選択する必要がある。
このことは、組換えＤＮＡがトランスフェクションされた大腸菌をスクリーニングするために必要なことである。例えばλｇｔ１１クローニングベクターを用いる場合、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｙ１０８８等の大腸菌株を選択すればよい。またプラスミドベクターとしてブルースクリプトを用いた場合は、宿主細菌細胞（指示菌）としてＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９等を用いることが可能であり、宿主細菌細胞と共に軟寒天培地に懸濁し、寒天培地上に重層してプラークを形成させればよい。ＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドを保持するファージプラークは、β−ガラクトシダーゼ活性を発現しないので、容易に選択することができる。
上述の選択されたクローンから、導入したベクター又はプラスミドを常法に従って調製し、更に適当な制限酵素により切断することで本発明ＤＮＡ１を得ることができる。得られたｃＤＮＡ断片は、そのまま、或いは適当なプラスミドにサブクローニングして、塩基配列を決定する。
そのようにして得られた本発明ＤＮＡ１の塩基配列の一例を配列番号１、それがコードするアミノ酸配列を配列番号２にそれぞれ記載する。
＜４＞本発明酵素製造法
本発明酵素製造法は、本発明ＤＮＡ１を利用した酵素のポリペプチド又は酵素の製造方法である。
上記本発明ＤＮＡ１でトランスフェクションされた細胞を培養し、本発明酵素を培地中に生成蓄積させ、その培養物からポリペプチド又はそれを含む酵素を単離することによって、ポリペプチド又はそれを含む酵素を製造することができる。
公知の発現ベクターに本発明ＤＮＡ１を挿入して組換えプラスミドを構築し、この組換えプラスミドを用いてトランスフェクションを行うことによって本発明ＤＮＡ１でトランスフェクションされた細胞（形質転換体）を得ることができる。尚、本発明は、本発明ＤＮＡ１を含む組換えプラスミドすなわち組換えベクター、及び、本発明ＤＮＡ１が導入されており、且つ本発明ＤＮＡ１が発現可能で、本発明酵素又はそのポリペプチドの製造に使用できる形質転換体（例えば上記組換えベクターで形質転換した形質転換体）を提供するものである。
細胞としては大腸菌などの原核細胞や、ほ乳類細胞などの真核細胞が例示される。大腸菌などの原核細胞を用いた場合は、本発明ＤＮＡ１の発現によって生じる酵素のポリペプチドに糖鎖の付加が起こらないため、本発明酵素のポリペプチドを得ることが可能であり（得られたポリペプチドは抗体を製造するために特に有用である）、またほ乳類細胞などの真核細胞を用いた際は、上記ポリペプチドに糖鎖の付加がなされ、本発明酵素が製造される。
本発明方法においては、タンパク質の製造に通常用いられる宿主−ベクター系を使用することができ、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７など）、３ＬＬ−ＨＫ４６細胞などのほ乳類由来の培養細胞と、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＭＥ１８Ｓ、ｐＣＸＮ２、ｐＣＥＶ１８等のほ乳類細胞用の発現ベクターとの組み合わせを採用することが好ましいが、特に限定はされず、ほ乳類由来でない細胞と、その細胞で発現しうる発現ベクターとの組み合わせを利用しても製造することができる。培地や培養条件は、用いる宿主すなわち細胞にあわせて適宜選択される。
本発明ＤＮＡによって上述のポリペプチド及び他のポリペプチドとの融合ペプチドを発現させることも可能である。
上記融合ポリペプチドを発現する組換えプラスミドの構築方法の具体例としては以下の方法が挙げられる。すなわち、本発明ＤＮＡ１と同一読み出し領域にプロテインＡ等のタンパク質を含み、且つ複数のタンパク質の遺伝子を同一読み出し領域に有するように本発明ＤＮＡを挿入して発現プラスミドベクター（例えばｐＧＩＲ２０１ｐｒｏｔＡ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１３９４−１４０１，１９９４，ｐｃＤＮＡＩ−Ａ：Ｊ．ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，３２１５−３２２１，１９９９など）を構築することができ、この発現プラスミドベクターを宿主細胞に導入することで融合ポリペプチドを製造することができる。また、上述の発現プラスミドベクターから、融合タンパク質をコードするＤＮＡ断片を制限酵素により切り出して、上記と同様の操作により他の発現プラスミドベクターに連結させて宿主細胞に導入することも可能である。
培養物からの本発明酵素の採取は、公知のポリペプチドの精製方法によって行うことができる。具体的には例えば、上記酵素の基質などを結合したセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。融合ポリペプチドとして発現させた場合は、上記アフィニティーカラムの他、本発明酵素と融合したポリペプチドに対し親和性の高い物質（例えば抗体など）を結合したアフィニティークロマトグラフィー等に宿主細胞の培養物を付することによって精製することができる。更に、融合ポリペプチド中の本発明酵素と、他のタンパク質のポリペプチドとの間に、例えば特定のタンパク質分解酵素によって認識されて切断されるアミノ酸配列を有するリンカーを予め組み込んでおくことにより、融合ポリペプチドを切断して、本発明酵素を得ることが可能である。上記タンパク質分解酵素とそれが認識する特定の配列の組み合わせとしては、例えばプロインスリンの合成時に働くシグナルペプチダーゼとインスリンのシグナルペプチドの組み合わせなどが挙げられる。なお、上記の培養物には、培地及び培養した細胞が包含される。
＜５＞本発明ＤＮＡ２及びそれがコードするポリペプチド
本発明ＤＮＡ２は、ヒト由来のＨＳ６ＳＴ２（ｈＨＳ６ＳＴ２）のポリペプチドをコードするＤＮＡである。具体的には、本発明ＤＮＡ２は下記▲３▼又は▲４▼記載のポリペプチドをコードするＤＮＡである。
▲３▼配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
▲４▼▲３▼のポリペプチドのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を有するアミノ酸配列からなり、かつ硫酸基供与体から硫酸基受容体に含まれるグリコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有する又は▲３▼のポリペプチドと同一の抗原性を有するポリペプチド。
本発明ＤＮＡ２は、配列番号３の塩基配列又はその塩基配列の塩基番号１５乃至１５１４（コード領域）の塩基配列からなるＤＮＡの他、前記ＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト由来のＤＮＡも包含される。
また、本発明ＤＮＡ２には、配列番号４記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする配列番号３の塩基番号１５乃至１５１４の塩基配列を含むＤＮＡの他に、ｈＨＳ６ＳＴ２のＤＮＡの個体変異、一塩基多型（ＳＮＰ）などによる変異ＤＮＡも含まれる。
本発明ＤＮＡ２としては前記のＤＮＡが有する塩基配列に対して相補的な塩基配列を有するＤＮＡ及びＲＮＡも例示され、また更にＤＮＡは二本鎖であっても一本鎖であっても構わず、また上記塩基配列又はそれに相補的な塩基配列を有する限り本発明ＤＮＡ２に包含される。また、本発明ＤＮＡ２は、翻訳前に除かれるイントロンの配列を含んでいてもよい。
本発明ＤＮＡ２における数個とは上述したものと同様である。また、上述の酵素活性や抗原性は、当業者であれば上記本発明酵素又は本発明ＤＮＡ１で記載した方法を用いて常法により測定し、酵素活性や抗原性を有するポリペプチドを有する本発明ＤＮＡ２を選択することが可能である。
本発明ＤＮＡ２は好ましくは、配列番号３の塩基配列の塩基番号１５乃至１５１４の塩基配列に対し、遺伝子解析用コンピュータプログラムＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウェア開発社製）を用いて算出して９５％以上の相同性を有する塩基配列を有する。
尚、本発明ＤＮＡ２は、脳において強く発現しているが、精巣や卵巣、腎臓においては実質的に強い発現が観察されないＤＮＡである。
＜６＞本発明ＤＮＡ２の調製法
本発明ＤＮＡ２は、上述の＜４＞本発明ＤＮＡ１の調製法における方法において、ＰＣＲ法による産物から約１３６０ｂｐのバンドではなく、約１５００ｂｐのバンドを回収することで、調製することが可能である。
そのようにして調製された本発明ＤＮＡ２の一例の塩基配列を配列番号３、それがコードするアミノ酸配列を配列番号４に記載する。
このようにして得られた本発明ＤＮＡ２は、上記＜３＞と同様の手法を用いて組換えベクターに導入して、組換え宿主細胞を調製し、その培養物からヒト由来のＨＳ６ＳＴ２を発現させることも可能である。
尚、このように調製されたヒト由来のＨＳ６ＳＴ２は、本発明ＤＮＡ１から同様に調製されたヒト由来のＨＳ６ＳＴ２ｖと比して、１．２倍以上、好ましくは１．５倍以上の硫酸化クラスター（二糖分析においてΔｄｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓ：２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコースとして検出される構造）形成能を有する。
＜７＞本発明腫瘍検出法
本発明腫瘍検出法は、ｈＨＳ６ＳＴ２及び／又はｈＨＳ６ＳＴ２ｖのポリペプチドの発現量、好ましくは腫瘍組織と周辺組織との間のｈＨＳ６ＳＴ２及び／又はｈＨＳ６ＳＴ２ｖのポリペプチドの発現量の相違と、組織細胞の腫瘍の有無とを関連づけることを特徴とする腫瘍（組織の腫瘍化）の検出法である。特にｈＨＳ６ＳＴ２及びｈＨＳ６ＳＴ２ｖのポリペプチドの合計発現量の、健常細胞との相違を測定することが好ましい。
発現量の測定は、ポリペプチド量を直接に測定してもよいし、ｍＲＮＡの量の測定などにより間接的に測定してもよい。ｍＲＮＡの量は逆転写によりｃＤＮＡに変換して測定してもよい。
ポリペプチドの量を測定する場合には、測定されるポリペプチドは、通常には、下記（１）〜（３）のポリペプチドである。
（１）下記▲１▼又は▲２▼のポリペプチド。
▲１▼配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
▲２▼▲１▼記載のポリペプチドのアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を有するアミノ酸配列からなり、かつ▲１▼のポリペプチドと同一の抗原性を有するか、又はグリコサミノグリカンのグリコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するポリペプチド。
（２）配列番号２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、かつグリコサミノグリカンのグリコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するとともに、基質に対する相対活性比が、Ｎ硫酸化（ＮＳ）ヘパロサン／完全脱硫酸化Ｎ再硫酸化（ＣＤＳＮＳ）ヘパリン≧１．９０である酵素活性を有するポリペプチド。
（３）下記▲３▼又は▲４▼のポリペプチド。
▲３▼配列番号４のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
▲４▼▲３▼のポリペプチドのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は転位を有するアミノ酸配列からなり、かつグリコサミノグリカンのグルコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するか又は▲３▼のポリペプチドと同一の抗原性を有するポリペプチド。
ｍＲＮＡの量を測定する場合には、測定されるｍＲＮＡは、通常には、下記（１）または（２）のＤＮＡが転写されたものである。
（１）下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかのＤＮＡであって、該ＤＮＡがコードするポリペプチドがグリコサミノグリカンのグリコサミン残基の６位水酸基に硫酸基を転移する酵素活性を有するＤＮＡ。
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１の塩基配列の塩基番号２乃至１３８１の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡが有する塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｄ）（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（２）下記（ｅ）〜（ｈ）のいずれかのＤＮＡ。
（ｅ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｆ）配列番号３の塩基番号１５乃至１５１４の塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｇ）（ｅ）又は（ｆ）のＤＮＡが有する塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｈ）（ｅ）、（ｆ）又は（ｇ）のＤＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト由来のＤＮＡ。
本発明の態様としては、例えば生検などによって得られた腫瘍を含む可能性が高い組織とその周辺の健常組織とを採取し、常法に従ってｃＤＮＡを調製し、例えば配列番号３の塩基番号１５から１５１４の塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして用いるハイブリダイゼーション法によりｈＨＳ６ＳＴ２及びｈＨＳ６ＳＴ２ｖの発現量を比較し、その比較の結果と腫瘍の有無とを結びつけて、腫瘍の有無を検出することが挙げられる。
例えば脳、小腸、腎臓及び軟組織においては、検体組織が健常組織と比して、ｈＨＳ６ＳＴ２及びｈＨＳ６ＳＴ２ｖのポリペプチドの発現量が低下している場合に、該組織には腫瘍が存在するとし、また、肺の腺組織、大腸及び副腎においては検体組織が健常組織と比して、ｈＨＳ６ＳＴ２及びｈＨＳ６ＳＴ２ｖのポリペプチドの発現量が増加している場合に、該組織には腫瘍が存在するとすることができる。
実施例
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１  本発明ＤＮＡの調製
（１）プライマーの調製及びＤＮＡの増幅
マウス由来のＨＳ６ＳＴ２（ｍＨＳ６ＳＴ２）のアミノ酸配列（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，２８５９−２８６８（２０００））を使用して、ＧｅｎＢａｎｋのｄｂＥＳＴを検索し、コードされるアミノ酸配列が相同性を有するヒトの対応するＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＬ０４９６７９）を発見した。ｍＨＳ６ＳＴをコードする塩基配列（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５，２８５９−２８６８（２０００））の、翻訳開始部位を１位としたときの（−１４）〜（６）までの塩基配列からなるプライマー（Ｐｒ１：配列番号５）及びＧｅｎＢａｎｋ受け入れ番号ＡＬ０４９６７９の塩基配列の塩基番号１４８１〜１５００に相補的な塩基配列からなるプライマー（Ｐｒ２：配列番号６）を合成し、ストラタジーン社製のヒト脳ｃＤＮＡを鋳型として、Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＰＣＲ法によりＤＮＡの増幅を行った。ＰＣＲ法の条件は、変性反応が９４℃で３０秒、アニーリングは５５℃で３０秒、伸長反応は７２℃で２分とし、３５サイクル行った。その後、更に１５分間伸長反応を行った。この操作によって生じた増幅物質をアガロースゲル電気泳動により解析すると、増幅された約１３６０ｂｐ及び約１５００ｂｐの二本のＤＮＡのバンドが検出された。
（２）ＰＣＲ産物のサブクローニング及び塩基配列の決定
上記ゲルより各々のバンドに存在するＤＮＡをＪｅｔｓｏｒｂ（ゲノメッド（Ｇｅｎｏｍｅｄ）社製）を使って回収した。増幅されたＤＮＡの塩基配列は、回収したＤＮＡから直接決定した。塩基配列はＳｅｑｕｅｎａｓｅバージョン２．０を含むｄＧＴＰ／ｄｅａｚａＧＴＰキット（Ｕ．Ｓ．バイオケミカル（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）社製）を使用して決定した。塩基配列はコンピュータプログラムＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣにより編集、解析した。これらのＰＣＲ産物はそれぞれオープンリーディングフレームを有していることが明らかとなった。決定された塩基配列をそれぞれ配列番号１及び３に、それらのオープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列を配列番号２及び４に示す。
大きいＰＣＲ産物はｍＨＳ６ＳＴと９８％の相同性を有するｈＨＳ６ＳＴ２のｃＤＮＡであることが明らかとなり（本発明ＤＮＡ２）、小さいＰＣＲ産物は、ｈＨＳ６ＳＴ２のｃＤＮＡの中間に存在する１１７塩基対を欠いた塩基配列を有しており、これはｈＨＳ６ＳＴ２のバリアント（ｈＨＳ６ＳＴ２ｖ）であることが明かとなった（本発明ＤＮＡ１）。ｈＨＳ６ＳＴ２ｖにおいて欠失したｈＨＳ６ＳＴ２に存在する１１７塩基対は、ｍＨＳ６ＳＴ２の第２エクソン及び第３エクソンに相当する塩基配列であることが、ｍＨＳ６ＳＴ２のゲノムＤＮＡのエクソン・イントロン解析の結果と比較することで判明した。
ｈＨＳ６ＳＴ２、ｈＨＳ６ＳＴ２ｖ及びｍＨＳ６ＳＴ２のポリペプチドの比較を表１に示す。相同性は、ｍＨＳ６ＳＴ２を基準にして、遺伝子解析用コンピュータプログラムＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウェア開発社製）を用いて算出した。
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実施例２  本発明酵素の調製
（１）本発明酵素の発現のためのプラスミドの調製
ｈＨＳ６ＳＴ２ｖのｃＤＮＡを発現させるために、発現ベクターにｃＤＮＡ断片を挿入し、組換プラスミドを構築した。単離したｈＨＳ６ＳＴ２ｖのｃＤＮＡを哺乳動物の発現ベクターであるｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２（イーストマン  コダック社製）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位に導入した組換プラスミドであるｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ｈＨＳ６ＳＴ２ｖを構築した。このプラスミドは酵素などの活性を有しないタグとしての配列であるＦＬＡＧとｈＨＳ６ＳＴ２ｖの融合タンパク質を発現するように構築されている。
（２）ＣＯＳ−７細胞中でのｈＨＳ６ＳＴ２ｖのｃＤＮＡのトランジェント（一過性）な発現
ｈＨＳ６ＳＴ２ｖのｃＤＮＡの発現の宿主にはＣＯＳ−７細胞を用いた。ＣＯＳ−７細胞を、５０ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清を含む３ｍｌのダルベッコの調製イーグル培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に懸濁して、上記で製造した発現ベクターをＤＥＡＥ−デキストラン法（Ａｒｕｆｆｏ，Ａ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９２，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １４，Ｕｎｉｔ  １６．１３．１−１６．１３．７，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ／Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）によりトランスフェクトした後、３７℃の条件下で培養を行った。
ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ｈＨＳ６ＳＴ２ｖをトランスフェクトした細胞を６７時間培養し、この細胞からＨａｂｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｈａｂｕｃｈｉ，Ｏ．，ａｎｄ  Ｋｉｍａｔａ，Ｋ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，４１７２−４１７９に記載の方法に従って細胞抽出液を調製した。この細胞抽出液より、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、ｈＨＳ６ＳＴ２ｖを精製、単離して、基質特異性を検討した（表２）。活性の測定方法は、Ｈａｂｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｈａｂｕｃｈｉ，Ｏ．，ａｎｄ  Ｋｉｍａｔａ，Ｋ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，４１７２−４１７９及びＫｏｂａｙａｓｈｉ，Ｍ．，Ｈａｂｕｃｈｉ，Ｈ．，Ｈａｂｕｃｈｉ，Ｏ．，Ｓａｉｔｏ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｋｉｍａｔａ，Ｋ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，７６４５−７６５３に記載の方法に従い、種々の硫酸基受容体を基質として用いて、それぞれに対する酵素活性を測定することによって行った。結果は、ＣＤＳＮＳヘパリンに対する活性を１００としたときの相対値で示す。比較の対照として、ｍＨＳ６ＳＴ２を上述のｈＨＳ６ＳＴ２ｖと同様に導入したｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２（ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ｍＨＳ６ＳＴ２）をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞、及びｈＨＳ６ＳＴ２を同様に導入したｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２（ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２ｈＨＳ６ＳＴ２）をトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞を用いて、上述と同様の精製法を用いて単離したｍＨＳ６ＳＴ２及びｈＨＳ６ＳＴ２を使用した。
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ｈＨＳ６ＳＴ２ｖは、ｍＨＳ６ＳＴ２と比較して、ＮＳヘパロサン、ヘパリン、及びＣＤＳＮＡｃヘパリンに対する硫酸基転移酵素活性が高いことが明かとなった。
ブタ動脈由来のヘパラン硫酸を、２５ｎｍｏｌのウロン酸を含むように秤量し、５０ｐｍｏｌの放射能標識活性硫酸（［３５Ｓ］ＰＡＰＳ）とｈＨＳ６ＳＴ２（ｈＨＳ６ＳＴ２のｃＤＮＡを用いて上記ｈＨＳ６ＳＴ２ｖと同様に調製したもの）、ｈＨＳ６ＳＴ２ｖ、又は比較用の対象としてのＨＳ６ＳＴ１（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７０（１９９５），ｐｐ．４１７２−４１７９）を０．３５Ｕ（ＣＤＳＮＳヘパリンを０．３５ｐｍｏｌ／ｍｉｎで硫酸化する量）添加して、２０℃で１時間反応を行った。煮沸して酵素を失活させた後、コンドロイチン硫酸Ａ（ＣＳＡ：生化学工業株式会社製）を添加し、未反応の［３５Ｓ］ＰＡＰＳをエタノール沈殿法によって除いた。ここでＨＳ６ＳＴ２で修飾したヘパラン硫酸をＨＳ２、ＨＳ６ＳＴ２ｖで修飾したヘパラン硫酸をＨＳ２ｖ、ＨＳ６ＳＴ１で修飾したヘパラン硫酸をＨＳ１とした。
ＨＳ２、ＨＳ２ｖ、及びＨＳ１をヘパリン分解酵素による消化と高速液体クロマトグラフィーを組み合わせて分画した。すなわち、被検物質１．０μｇを、２ｍＭ酢酸カルシウムを含む２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ７．０）２５μｌに溶解して、各１．５ｍＵのヘパリチナーゼ及びヘパリチナーゼＩならびに０．１５ｍＵのヘパリチナーゼＩＩ（全て生化学工業株式会社製）を加えて３７℃で１時間反応させた。
この反応液をＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて以下の条件で分析した。シリカ系アミノカラム（ＹＭＣ社製、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ−ＩＩカラムφ４．０×２５０ｍｍ）を使用し、羽渕らの方法（Ｈａｂｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８５，ｐｐ．８０５−８１３）に従い、流速１．２ｍｌ／分で、リン酸二水素ナトリウムを用いた濃度勾配法（２５０ｍＭ→５４０ｍＭ）で溶出し、２３２ｎｍでの吸光度を測定し、１６分から４３分までの画分を回収し、その後、各画分の放射能をシンチレーションカウンターにより測定した（図１）。図中、ΔＤｉＨＳ−６Ｓは２−アセトアミド−２−デオキシ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース、ΔＤｉＨＳ−ＮＳは２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−Ｄ−グルコース、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（６，Ｎ）Ｓは２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコース、ΔＤｉＨＳ−ｄｉ（Ｎ，Ｕ）Ｓは２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−Ｄ−グルコース、ΔＤｉＨＳ−ｔｒｉ（Ｕ，６，Ｎ）Ｓは２−デオキシ−２−スルファミノ−４−Ｏ−（４−デオキシ−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ｔｈｒｅｏ−ｈｅｘ−４−エノピラノシルウロン酸）−６−Ｏ−スルホ−Ｄ−グルコースを示す。上記シンチレーションカウンターのカウント数より、６位に硫酸基を有するＮ−アセチルグルコサミン残基のピーク（１９分のピーク）により標準化した、２−Ｏ−硫酸化ウロン酸と６，Ｎ−硫酸化グルコサミンとが結合した構造を有する不飽和二糖（Δｄｉ−（Ｎ，６，Ｕ）ｔｒｉＳ）のピーク（硫酸化クラスターの形成能を示す）によりｈＨＳ６ＳＴ２、ｈＨＳ６ＳＴ２ｖ、及びｈＨＳ６ＳＴ１を比較した（図２）。その結果、ｈＨＳ６ＳＴ２ｖはｈＨＳ６ＳＴ２及びｈＨＳ６ＳＴ１の中間程度の硫酸化クラスター形成能を有することが明かとなった。
実施例３  腫瘍におけるＨＳ６ＳＴ２発現の観察
バイオチェーン（Ｂｉｏ  Ｃｈａｉｎ）社製のヒト腫瘍組織の全ＲＮＡドットブロット膜を使用し、ＨＳ６ＳＴ２の発現を、ｈＨＳ６ＳＴ２のコード領域の塩基配列部分（配列番号３の塩基配列の塩基番号１５〜１５１４）とのハイブリダイゼーション法（発現ハイブリダイゼーション法）により解析した（図３）。ブロット膜上の組織の配置は表３の通りである。なお、用いた条件では、ｈＨＳ６ＳＴ２及びｈＨＳ６ＳＴ２ｖのトータルの発現量が検出される。
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その結果、脳、小腸、腎臓及び軟組織の腫瘍部位においては、周辺の健常組織と比して、ｈＨＳ６ＳＴ２及びｈＨＳ６ＳＴ２ｖの発現量が明らかに低下していることが明らかとなり、肺の腺組織、大腸及び副腎の腫瘍部位においては上昇していることが明らかとなった。これらの結果から、脳、小腸、腎臓及び軟組織においては、検体組織において健常組織よりもｈＨＳ６ＳＴ２及びｈＨＳ６ＳＴ２ｖの発現量が減少している場合に、そして肺の腺組織、大腸及び副腎においては検体組織において健常組織と比してｈＨＳ６ＳＴ２及びｈＨＳ６ＳＴ２ｖの発現量が増加している際にそれぞれの組織の腫瘍の有無を検出することができる可能性が示唆された。
上記と同様に、バイオチェーン（Ｂｉｏ  Ｃｈａｉｎ）社製のヒト健常組織の全ＲＮＡドットブロット膜を使用し、ＨＳ６ＳＴ２及びＨＳ６ＳＴ２ｖの発現を、ｈＨＳ６ＳＴ２のコード領域の塩基配列部分の一部（配列番号３の塩基配列の塩基番号１５〜１５１４）、ＨＳ６ＳＴ２の発現をｈＨＳ６ＳＴ２のコード領域の塩基配列部分（配列番号３の塩基配列の塩基番号５２５〜６４４）とのハイブリダイゼーション法（発現ハイブリダイゼーション法）により解析した（図４）。ブロット膜上の組織の配置は表４の通りである。
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その結果、ｈＨＳ６ＳＴ２及びｈＨＳ６ＳＴ２ｖは中枢神経（脳及びその付属器官）、精巣、卵巣、腎臓、胎盤で強く発現していることが明かとなった（図４左）。また、ｈＨＳ６ＳＴ２は特に脳の広域において強く発現していることが判明した（図４右）。
産業上の利用の可能性
本発明によれば、ヒト由来の硫酸基転移酵素の新規アイソフォーム及びそれをコードするＤＮＡが提供される。また、このアイソフォームの発現量に基づいて組織の腫瘍化を検出できる。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１は、ヒトＨＳ６ＳＴのアイソフォームｈＨＳ６ＳＴ２、ｈＨＳ６ＳＴ２ｖ及びｈＨＳ６ＳＴ１を用いて修飾したヘパラン硫酸をヘパリン分解酵素により消化し、高速液体クロマトグラフィーにより分画した結果を示す。Ａ：ｈＨＳ６ＳＴ１、Ｂ：ｈＨＳ６ＳＴ２、Ｃ：ｈＨＳ６ＳＴ２ｖ。
図２は、図１の結果に基づいて硫酸化クラスター形成能に関してｈＨＳ６ＳＴ２、ｈＨＳ６ＳＴ２ｖ及びｈＨＳ６ＳＴ１を比較した結果を示す。
図３は、ヒト腫瘍組織の全ＲＮＡドットブロット膜を使用して、ｈＨＳ６ＳＴ２の発現をハイブリダイゼーション法により解析した結果を示す写真である。
図４は、ヒト健常組織の全ＲＮＡドットブロット膜を使用して、ｈＨＳ６ＳＴ２及びｈＨＳ６ＳＴ２ｖ、または、ｈＨＳ６ＳＴ２の発現をハイブリダイゼーション法により解析した結果を示す写真である。左：ｈＨＳ６ＳＴ２及びｈＨＳ６ＳＴ２ｖ、右：ｈＨＳ６ＳＴ２。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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