(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴＧＦ−β中に存在するプロテアーゼ切断部位を特異的に認識することができる、ヒトＴＧＦ−βのＬＡＰ断片に対する抗体であって、以下の何れかの抗体。
（ａ）プロテアーゼ切断部位が５８番目のアルギニン残基と５９番目のロイシン残基の間であり、５９番目のロイシン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
（ｂ）プロテアーゼ切断部位が５８番目のアルギニン残基と５９番目のロイシン残基の間であり、５８番目のアルギニン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
（ｃ）プロテアーゼ切断部位が５６番目のリジン残基と５７番目のロイシン残基の間であり、５７番目のロイシン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
（ｄ）プロテアーゼ切断部位が５６番目のリジン残基と５７番目のロイシン残基の間であり、５６番目のリジン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
（ｅ）プロテアーゼ切断部位が７９番目のアラニン残基と８０番目のロイシン残基の間であり、８０番目のロイシン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
（ｆ）プロテアーゼ切断部位が７９番目のアラニン残基と８０番目のロイシン残基の間であり、７９番目のアラニン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
（ｇ）プロテアーゼ切断部位が８５番目のアルギニン残基と８６番目のアスパラギン酸残基の間であり、８６番目のアスパラギン酸残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
（ｈ）プロテアーゼ切断部位が８５番目のアルギニン残基と８６番目のアスパラギン酸残基の間であり、８５番目のアルギニン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
（ｉ）プロテアーゼ切断部位が１０６番目のリジン残基と１０７番目のグルタミン酸残基の間であり、１０７番目のグルタミン酸残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
（ｊ）プロテアーゼ切断部位が１０６番目のリジン残基と１０７番目のグルタミン酸残基の間であり、１０６番目のリジン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
（ｋ）プロテアーゼ切断部位が７６番目のアラニン残基と７７番目のバリン残基の間であり、７７番目のバリン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；又は
（ｌ）プロテアーゼ切断部位が７６番目のアラニン残基と７７番目のバリン残基の間であり、７６番目のアラニン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体：
【請求項２】
ポリクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
請求項１から３の何れかに記載の抗体を含む、ＴＧＦ−βに起因する硬化性疾患の診断薬。
【請求項５】
ＴＧＦ−βに起因する硬化性疾患が、肝炎である、請求項４に記載の診断薬。
【請求項６】
請求項１から３の何れかに記載の抗体を用いて、試料又は組織中のヒトＴＧＦ−β１ならびにヒトTGF-β２およびヒトTGF-β３の活性化反応を検出又は測定する方法。
【請求項７】
請求項１から３の何れかに記載の抗体を用いて試料又は組織中のヒトＴＧＦ−β１ならびにヒトTGF-β２およびヒトTGF-β３の活性化反応を検出又は測定することを含む、ＴＧＦ−βに起因する硬化性疾患の検出方法。
【請求項８】
ＴＧＦ−βに起因する硬化性疾患が、肝炎である、請求項７に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＴＧＦ−β活性化制御領域の切断面を認識する抗体、及びその利用に関する。
【背景技術】  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）−βは、間葉系細胞の細胞外マトリックス産生を強力に促すとともに上皮系細胞の増殖を抑制することにより、肝線維化／肝硬変、動脈硬化、肺線維症、強皮症、腎不全などの硬化性疾患の病態を形成する一方、免疫担当細胞の働きを抑制するなど、多彩な生物活性を示す分子量２５ｋＤのホモダイマー多機能性サイトカインである。ＴＧＦ−βに対する中和抗体を用いた動物モデルにおける検討から、ＴＧＦ−βの働きを抑制することによって硬化性疾患を予防・治療できることがわかってきた。例えば、プロテアーゼ阻害剤を用いたＴＧＦ−β活性化反応の抑制による肝線維化／肝硬変の予防・治療についてはＯｋｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２０：１８７８４−１８００，２００１に記載されている。また、プロテアーゼ抗体を用いたＴＧＦ−β活性化反応の抑制による肝再生促進についてはＡｋｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２３：３５２−３６４，２００２に記載されている。さらに、ＴＧＦ−β活性化反応に関する総説としては、近藤ほか  日本血栓止血学会誌  １４（３）：２１０−２１９，２００３及びＡｎｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１６：２１７−２２４，２００３が挙げられる。
しかし、例えば、プロテアーゼの過剰産生を抑制することにより肺組織が分解され肺気腫に陥るのを防いだり、癌細胞の増殖を抑制するなど、ＴＧＦ−βは生体にとって大切な働きもしている。また、ＴＧＦ−βには殆ど同じ生物活性を示すβ１からβ３までのアイソフォームが存在する。したがって、病態、組織、アイソフォーム特異的なＴＧＦ−β生成反応を検出して、これを抑制することにより、病態形成時に異常産生される特定のＴＧＦ−βアイソフォームの生成のみを抑え病気の治療や予後の診断に役立てる技術が望まれていた。しかし、従来報告されている技術では特異的生成反応を検出することは困難であった。
また、各ＴＧＦ−βアイソフォーム特異的抗体（Ｒ＆Ｄ社製、又はＳａｎｔ  Ｃｒｕｚ社製）もしくは遺伝子プローブ（Ｂｉｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９６：４４７−４５５，１９９５）を用いて、病態形成動物モデルやヒト患部においてどのＴＧＦ−βアイソフォームが産生されるかを検出する技術は開発されていたが、病態、組織、アイソフォーム特異的ＴＧＦ−β生成反応を検出する方法ではなかったので、特異的治療・予防法の開発には繋がらなかった。
【発明の開示】
ＴＧＦ−βが病態、組織、アイソフォーム特異的に活性化され、肝臓においてはプロテアーゼのプラスミンや血漿カリクレインによって切断活性化されるので、これらのプロテアーゼの活性を低分子合成プロテアーゼ阻害剤（小野  ＦＯＹ）や抗体（特願２００２−０５７２５３号）を用いて阻害することによって、病気を防ぐことができる可能性が動物モデルで示されているが、ヒトでも同じことが起きているか、またどの活性化反応が起こっているかを検出する技術は確立されていなかった。
本発明は、病態、組織又はアイソフォームに特異的な活性型ＴＧＦ−β生成反応を検出することができる抗体を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、上記抗体を用いてＴＧＦ−β生成反応を検出する方法を提供することを解決すべき課題とした。本発明はさらに、上記抗体を用いて肝線維化／肝硬変、動脈硬化、肺線維症、強皮症、腎不全などの硬化性疾患を始めとするＴＧＦ−β関連疾患の特異的診断法を開発することを解決すべき課題とした。
本発明では、ＴＧＦ−βが病態、組織、アイソフォーム特異的に活性化されることに着目し、活性型ＴＧＦ−β生成に伴い生じる断片に特異的な抗体を提供することにより上記課題を解決した。
即ち、本発明によれば、ヒトＴＧＦ−β中に存在するプロテアーゼ切断部位切断面を特異的に認識することができる、ヒトＴＧＦ−βのＬＡＰ断片に対する抗体が提供される。
好ましくは、本発明によれば、ヒトＴＧＦ−β１中の５１番目のアミノ酸残基グリシンから１１０番目のアミノ酸残基アルギニンまでの領域ならびにヒトＴＧＦ−β２およびヒトＴＧＦ−β３の当該領域に存在するプロテアーゼ切断部位を特異的に認識することができる、ヒトＴＧＦ−β１ならびにヒトＴＧＦ−β２およびヒトＴＧＦ−β３のＬＡＰ断片に対する抗体が提供される。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体でもよいし、モノクローナル抗体でもよい。
本発明の抗体の具体例としては以下の抗体が挙げられる。
プロテアーゼ切断部位が５８番目のアルギニン残基と５９番目のロイシン残基の間であり、５９番目のロイシン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
プロテアーゼ切断部位が５８番目のアルギニン残基と５９番目のロイシン残基の間であり、５８番目のアルギニン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
プロテアーゼ切断部位が５６番目のリジン残基と５７番目のロイシン残基の間であり、５７番目のロイシン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
プロテアーゼ切断部位が５６番目のリジン残基と５７番目のロイシン残基の間であり、５６番目のリジン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
プロテアーゼ切断部位が７９番目のアラニン残基と８０番目のロイシン残基の間であり、８０番目のロイシン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
プロテアーゼ切断部位が７９番目のアラニン残基と８０番目のロイシン残基の間であり、７９番目のアラニン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
プロテアーゼ切断部位が８５番目のアルギニン残基と８６番目のアスパラギン酸残基の間であり、８６番目のアスパラギン酸残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；プロテアーゼ切断部位が８５番目のアルギニン残基と８６番目のアスパラギン酸残基の間であり、８５番目のアルギニン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
プロテアーゼ切断部位が１０６番目のリジン残基と１０７番目のグルタミン酸残基の間であり、１０７番目のグルタミン酸残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
プロテアーゼ切断部位が１０６番目のリジン残基と１０７番目のグルタミン酸残基の間であり、１０６番目のリジン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
プロテアーゼ切断部位が７６番目のアラニン残基と７７番目のバリン残基の間であり、７７番目のバリン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；並びに、
プロテアーゼ切断部位が７６番目のアラニン残基と７７番目のバリン残基の間であり、７６番目のアラニン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体。
本発明の別の側面によれば、上記した本発明の抗体を含む、硬化性疾患を始めとするＴＧＦ−β関連疾患の診断薬が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の抗体を用いて、試料又は組織中のヒトＴＧＦ−β１ならびにヒトＴＧＦ−β２およびヒトＴＧＦ−β３の活性化反応を検出又は測定する方法が提供される。本発明のさらに別の側面によれば、上記した本発明の抗体を用いて試料又は組織中のヒトＴＧＦ−β１ならびにヒトＴＧＦ−β２およびヒトＴＧＦ−β３の活性化反応を検出又は測定することを含む、硬化性疾患の診断方法が提供される。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＴＧＦ−β活性化機構とその制御の概要を示す。
Ａ：ＴＧＦ−βの合成・分泌を高める因子、要因
ＴＧＦ−β、ビタミンＡ、抗エストロゲン、ブレオマイシン、
デキサメサゾン、ウイルス感染、リンパ球活性化、骨折、肝線維化、
心筋梗塞、肝障害
Ｂ：細胞外基質からＴＧＦ−βを放出させる因子
エラスターゼ、チマーゼ、プラスミン、トロンビン
Ｃ：ＴＧＦ−βの活性化を起こす因子
酸、アルカリ、熱、変性剤。活性酸素種（ＲＯＳ）、
エンドグリコシダーゼ、トロンボスポンジン、セリンプロテアーゼ、
インテグリン、マトリックスメタロプロテアーゼ
Ｄ：細胞にＴＧＦ−β活性化を起こす因子、要因
混合培養、ビタミンＡ、ビタミンＤ、抗エストロゲン、ブレオマイシン、
デキサメサゾン、リポ多糖、ＩｇＧ、インターフェロン、癌化
Ｅ：ＴＧＦ−β受容体の発現を高める因子、要因
ビタミンＡ、肝線維化
Ｆ：ＴＧＦ−β受容体の発現を減らす因子、要因
癌化、細胞外マトリックス
図２は、組織・アイソフォーム特異的ＴＧＦ−β活性化反応を示す。新たに作製した血漿カリクレイン切断部位Ｃ末断面認識抗体により認識されるＬＡＰ断片は、ＬＴＢＰを介して細胞外マトリックスにより多く残っていることが予想される
図３は、硬化性疾患の病態形成におけるプロテアーゼによるＴＧＦ−β活性化を示す。肝硬変・肝再生不全に加えて、動脈硬化、肺線維症、強皮症、腎不全などの硬化症疾患においても、それぞれの病態に特異的なプロテアーゼによりＴＧＦ−βが活性化されている。
図４は、硬化性疾患の病態形成におけるプロテアーゼによるＴＧＦ−β活性化を示す。右図には、硬化症疾患の患者からの組織で、プロテアーゼにより生成したＬＡＰ分解物を検出した結果を示す。
図５は、各種プロテアーゼによるＬＡＰβ１の限定分解の結果とヒトＴＧＦ−β１のアミノ酸配列と塩基配列を示す。
図６は、実施例で作製したＬＡＰペプチド抗体の力価をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す。
Ａ：抗体力価チェックＥＬＩＳＡ（２１７２−ＰＬＮ  Ｃ−ｔｅｒ  ５６Ｌｙｓ  Ａｂ）
Ｂ：抗体力価チェックＥＬＩＳＡ（Ｒａｂｂｉｔ  Ｙ−ＰＬＮ  Ｎ−ｔｅｒ  ５７Ｌｅｕ  Ａｂ）
図７は、実施例で作製したＬＡＰペプチド抗体の力価をＥＬＩＳＡで測定した結果を示す。
Ａ：抗体力価チェックＥＬＩＳＡ（２１７３−ＰＬＫＮ  Ｃ−ｔｅｒ  ５８Ａｒｇ  Ａｂ）
Ｂ：抗体力価チェックＥＬＩＳＡ（Ｒａｂｂｉｔ  Ｋ−ＰＬＫ  Ｎ−ｔｅｒ  ５９Ｌｅｕ  Ａｂ）
図８は、ＬＡＰペプチド抗体を用いたウエスタンブロット分析の結果を示す。
Ａ：ＰＬＮ  Ｎ−ｔｅｒ  ５７Ｌｅｕ  Ａｂ  （１／８００）
Ｂ：ＰＬＫ  Ｎ−ｔｅｒ  ５９Ｌｅｕ  Ａｂ  （１／８００）
図９は、肝再生不全動物モデルの肝臓組織染色像を示す。
図１０は、劇症肝炎で死亡した患者の肝臓切片の染色像を示す。
図１１は、Ｂ型肝炎で死亡した患者の肝臓切片の染色像を示す
図１２は、実施例に述べた標準物質を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  ＴＧＦ−βは、硬化性疾患の病態形成を担ったり、免疫担当細胞の働きを抑制する一方、プロテアーゼの過剰産生を抑制することによって肺組織が分解され肺気腫に陥るのを防いだりしたり癌細胞の増殖を抑制するなど、多彩な生物活性を示す分子量２５ｋＤのホモダイマー多機能性サイトカインである。ＴＧＦ−βは受容体に結合できない分子量約３００ｋＤの不活性な潜在型として産生され、標的細胞表面やその周囲で活性化されて受容体に結合できる活性型となり、始めてその作用を発揮できるようになる（図１）。分子量２５ｋＤの活性型ＴＧＦ−β１は、３９１個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質（アミノ酸配列を配列表の配列番号１に記載し、塩基配列を配列番号２に記載する）としてつくられた後、ゴルジにおいてフューリン様プロテアーゼの働きで２７９Ａｒｇと２８０Ａｌａの間が切断され、カルボキシル末端側の１１２個のアミノ酸からなる部分がジスルフィド結合によって２量体化することにより生成する。ＴＧＦ−β２と−β３も同じ構造で、Ａｒｇ−Ａｌａ配列は共通している。切られた残りのアミノ末端側の部分はＬＡＰ（ｌａｔｅｎｃｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ）とよばれ、やはり２量体化し（分子量７５ｋＤ）、活性型ＴＧＦ−βから切り離された後も非共有結合でＴＧＦ−βをトラップして潜在型ＴＧＦ−β小複合体（ｓｍａｌｌ  ｌａｔｅｎｔ  ＴＧＦ−β  ｃｏｍｐｌｅｘ；ＳＬＣ）を形成し、活性型ＴＧＦ−βを受容体に結合できない構造、すなわち潜在型に留めている。さらに多くの場合、ＬＡＰダイマーの端にはＬＴＢＰ（ｌａｔｅｎｔ  ＴＧＦ−β  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）という別の遺伝子から作られる分子量約２００ｋＤのタンパク質が結合して潜在型ＴＧＦ−β大複合体（Ｌａｒｇｅ  ｌａｔｅｎｔ  ＴＧＦ−β  ｃｏｍｐｌｅｘ；ＬＬＣ）を形成する。ＴＧＦ−β２と−β３も同様の構造をとっている（図２）。ＬＴＢＰは細胞外マトリックスタンパク質の１種であるフィブリリンと構造が似ており、ＬＬＣはこの部分を介して細胞外マトリックスにプールされている（図１及び図２）。
ＴＧＦ−βの活性化は、なんらかの方法でＬＡＰと活性型ＴＧＦ−β間の会合を妨げることによってＬＬＣにトラップされている活性型ＴＧＦ−βを解離、放出する反応であり、マトリックスからＬＬＣが放出されたのちに標的細胞表面やその近傍において起こる（図１）。生理的なＴＧＦ−β活性化反応には、トロンボスポンジンやインテグリンと結合することによってＬＡＰの構造が変化し活性型ＴＧＦ−βを放出する接着活性化反応と、プロテアーゼによってＬＡＰが限定分解され、保持していた活性型ＴＧＦ−βを放出する切断活性化反応とが知られている（図２）。本発明者らは、合成低分子プロテアーゼ阻害剤や特異抗体を用いてプラスミンや血漿カリクレインなどのセリンプロテアーゼを阻害するとＴＧＦ−β活性化反応が阻害され、病態形成を抑制できることから、肝線維化・肝硬変の病態形成過程ではプラスミンを介するＴＧＦ−β活性化が、肝再生不全の病態形成過程では血漿カリクレインによるＴＧＦ−β活性化が起こっていることを動物モデルで証明した（図３）。
ＴＧＦ−βは体中のいろいろな組織に存在するが、その活性化機構は組織や組織の状態によって異なる。例えば、肺や膵臓においてはトロンボスポンジン１が働き、炎症を起こした肺や皮膚においてはインテグリンαＶβ、肝臓（特に障害肝）においてはセリンプロテアーゼが働く。また、マトリックスメタロプロテインナーゼ（ＭＭＰ）は癌や皮膚で働くということが報告されている。このように、活性化は組織特異的なＴＧＦ−β調節機構とみなすことができる。さらに、活性化はいつどこでどのアイソフォームが働くかアイソフォームの特異性を規定する。哺乳類においてはＴＧＦ−β１，−β２，−β３の３つのアイソフォームが産生されるが、活性型の部分はいずれも１１２個のアミノ酸のポリペプチドによる２量体構造を持ち、７１〜８２％という高いホモロジーを有することからほとんど同じような生理活性を発現する。これに対して、ＬＡＰ部分のホモロジーは３４〜３５％と低いことから、アイソフォームによって活性化の機構は異なる。すなわち、ＴＧＦ−β活性化はアイソフォーム特異性を決める翻訳後調節機構であると考えられる。例えば、ＴＧＦ−β１と−β３はＬＡＰ部分にＲＧＤ配列を持つが、ＴＧＦ−β２にはそれが無い。よって、インテグリンが結合して活性化するのは、ＴＧＦ−β１と−β３である。逆に、ＭＭＰ−９はＴＧＦ−β２に主に働くことが報告されている。病態に応じて異なる酵素が働くことによって特定のアイソフォームが生成することが予想される（図２）。
本発明者らは、プラスミンと血漿カリクレインによる切断活性化サイトを決定したところ、プラスミンは潜在型ＴＧＦ−βの５６Ｌｙｓ−５７Ｌｅｕの間を、血漿カリクレインは５８Ａｒｇ−５９Ｌｅｕの間を特異的に切断し似たような構造変化を引き起こしてＴＧＦ−βを活性化させることがわかった。次に、これらのプロテアーゼによって断片化された潜在型ＴＧＦ−βを特異的に検出するプロテアーゼ断片化ＴＧＦ−β抗体の作製を試みたところ、５７Ｌｅｕと５９Ｌｅｕの各々の切断面を認識する抗体の作製に成功した。５９Ｌｅｕ切断面を認識する抗体は活性化反応を受けていない（切断されていない）インタクトなＬＡＰは認識せず、血漿カリクレインによって切断されたＬＡＰを特異的に強く認識した。さらに、この抗体によって肝再生不全動物モデルや劇症肝炎で亡くなった患者肝組織切片が染色されることから、ヒトの病態形成時にプロテアーゼによるＴＧＦ−β活性化反応が起こっていることを示すことに初めて成功し、劇症肝炎時の肝再生不全には血漿カリクレインに対する特異的阻害剤や抗体が有効に働く可能性を強く示唆した（図４）。次に、ＭＭＰ３による切断部位を決定したところ、ＭＭＰ３は潜在型ＴＧＦ−βの７９Ａｌａ−８０Ｌｅｕの間を特異的に切断しＴＧＦ−βを活性化させることを見出した。
本発明においては、各種プロテアーゼによって切断され活性化を引き起こす領域（５１Ｇｌｙ−１１０Ａｒｇ）をＴＧＦ−β活性化制御領域と定義し、ここに存在する各々のプロテアーゼ切断サイトを認識する特異抗体を作製することによって、活性型ＴＧＦ−βやインタクトなＬＡＰに対する抗体を用いた従来の技術では困難であった病態、組織、アイソフォームによって異なるそれぞれの切断活性化反応によるＴＧＦ−β生成反応を特異的に検出する技術を確立した。同様なストラテジーを用いて他のプロテアーゼによる切断活性化反応、さらにはトロンボスポンジンやインテグリンによる接着活性化反応を検出する抗体を作製することができる。
上記の通り、本発明の抗体はヒトＴＧＦ−β１ならびにヒトＴＧＦ−β２およびヒトＴＧＦ−β３のＬＡＰ断片に対する抗体であって、特に、ヒトＴＧＦ−β１中の５１番目のアミノ酸残基グリシンから１１０番目のアミノ酸残基アルギニンまでの領域ならびにヒトＴＧＦ−β２およびヒトＴＧＦ−β３の当該領域に存在するプロテアーゼ切断部位を特異的に認識することができることを特徴とする。
本発明の抗体の具体例としては、プロテアーゼ切断部位が５８番目のアルギニン残基と５９番目のロイシン残基の間であり、５９番目のロイシン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；プロテアーゼ切断部位が５８番目のアルギニン残基と５９番目のロイシン残基の間であり、５８番目のアルギニン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；プロテアーゼ切断部位が５６番目のリジン残基と５７番目のロイシン残基の間であり、５７番目のロイシン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；プロテアーゼ切断部位が５６番目のリジン残基と５７番目のロイシン残基の間であり、５６番目のリジン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；プロテアーゼ切断部位が７９番目のアラニン残基と８０番目のロイシン残基の間であり、８０番目のロイシン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；プロテアーゼ切断部位が７９番目のアラニン残基と８０番目のロイシン残基の間であり、７９番目のアラニン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；プロテアーゼ切断部位が８５番目のアルギニン残基と８６番目のアスパラギン酸残基の間であり、８６番目のアスパラギン酸残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；プロテアーゼ切断部位が８５番目のアルギニン残基と８６番目のアスパラギン酸残基の間であり、８５番目のアルギニン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；プロテアーゼ切断部位が１０６番目のリジン残基と１０７番目のグルタミン酸残基の間であり、１０７番目のグルタミン酸残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；プロテアーゼ切断部位が１０６番目のリジン残基と１０７番目のグルタミン酸残基の間であり、１０６番目のリジン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；プロテアーゼ切断部位が７６番目のアラニン残基と７７番目のバリン残基の間であり、７７番目のバリン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；並びに、プロテアーゼ切断部位が７６番目のアラニン残基と７７番目のバリン残基の間であり、７６番目のアラニン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体が挙げられる。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の何れでもよい。本発明の抗体の作製は定法により行なうことができる。
例えば、活性型ヒトＴＧＦ−β１に対するポリクローナル抗体は、上記したようなプロテアーゼ切断部位のアミノ酸から始まるＣ末側ＬＡＰβ１配列（例えば、１０アミノ酸残基）の最後にシステイン残基を付与したペプチド、もしくは上記したようなプロテアーゼ切断部位で終わるＮ末側ＬＡＰβ１配列（例えば、１０アミノ酸残基）の最初にシステイン残基を付与したペプチドを抗原として哺乳動物を免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離・精製することにより得ることができる。例えば、マウス、ハムスター、モルモット、ニワトリ、ラット、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ等の哺乳動物を免疫することができる。免疫感作の方法としては、当業者に公知の通常の免疫感作の方法を用いて、例えば抗原を１回以上投与することにより行うことができる。
抗原投与は、例えば、７から３０日、特に１２から１６日間隔で２〜１４回投与することができる。投与量は１回につき、例えば抗原約０．０５から２ｍｇ程度を目安とすることができる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、腹膜腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与等を適宜選択することができるが、静脈内、腹膜腔内もしくは皮下に注射することにより投与することが好ましい。また、抗原は適当な緩衝液、例えば完全フロイントアジュバント、ＲＡＳ〔ＭＰＬ（Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａ）＋ＴＤＭ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ  Ｄｉｃｏｒｙｎｏｍｙｃｏｌａｔｅ）＋ＣＷＳ（Ｃｅｌｌ  Ｗａｌｌ  Ｓｋｅｌｅｔｏｎ）アジュバントシステム〕、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュバントを含有する適当な緩衝液に溶解して用いることができるが、投与経路や条件等によっては、上記したアジュバントは使用しない場合もある。ここでアジュバントとは抗原とともに投与したとき、非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。
免疫感作した哺乳動物を０．５から４ケ月間飼育した後、該哺乳動物の血清を耳静脈等から少量サンプリングし、抗体価を測定することができる。抗体価が上昇してきたら、状況に応じて抗原の投与を適当回数実施する。例えば１０μｇ〜１０００μｇの抗原を用いて追加免疫を行なうことができる。最後の投与から１〜２ケ月後に免疫感作した哺乳動物から通常の方法により血液を採取して、該血液を、例えば遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって分離・精製することにより、ポリクローナル抗血清として、本発明のポリクローナル抗体を得ることができる。なお血清は、たとえば、５６℃で３０分間処理することによって補体系を不活性化してもよい。
また、本発明の抗体がモノクローナル抗体の場合、該モノクローナル抗体のグロブリンタイプは特に限定されず、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等が挙げられる。また、本発明のモノクローナル抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体でもよい。
本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株は特に制限されないが、例えば、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合によりハイブリドーマとして得ることができる。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、以下のような細胞融合法によって得ることができる。
抗体産生細胞としては、免疫された動物からの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂリンパ球等を使用する。抗原としては、ポリクローナル抗体の場合と同様のペプチドを使用することができる。免疫される動物としてはマウス、ラット等が使用され、これらの動物への抗原の投与は常法に従って行う。例えば完全フロインドアジュバント、不完全フロインドアジュバントなどのアジュバントと抗原ペプチドとの懸濁液もしくは乳化液を調製し、これを動物の静脈、皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物を免疫化する。免疫化した動物から抗体産生細胞として例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とをそれ自体公知の方法（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６  ４９５（１９７５））により融合することにより、ハイブリドーマを作製することができる。
細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、例えばマウスではＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１株、Ｓｐ２／０株などが挙げられる。細胞融合を行なうに際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイルスなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドーマの選抜にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地を常法に従って使用することができる。細胞融合により得られたハイブリドーマは限界希釈法等によりクローニングすることができる。更に、酵素免疫測定法等によりスクリーニングを行なうことにより、活性型ヒトＴＧＦ−β１生成に伴い生じるＬＡＰ断片を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する細胞株を得ることができる。
このようにして得られたハイブリドーマから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。培養上清もしくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。例えば、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。
また、上記したような各種抗体の断片も本発明の範囲内である。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等が挙げられる。
本発明の抗体は標識抗体として使用することもできる。標識抗体を作製することにより、ヒトＴＧＦ−β１ならびにヒトＴＧＦ−β２およびヒトＴＧＦ−β３の活性化反応の検出や測定を簡便に行うことができる。抗体の標識の種類及び標識方法は当業者に知られているものから適宜選択することができる。
標識として酵素を使用する場合には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、炭酸アンヒドラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、リゾチーム、マレートデヒドロゲナーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ等を標識として使用することができる。これらの酵素を本発明の抗体又はその断片（Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント等）に標識する方法としては、酵素の糖鎖を過ヨウ素酸で酸化し、生成したアルデヒド基に該抗体などのアミノ酸を結合させる方法や、酵素にマレイミド基あるいはピリジルスルフィド基等を導入し、該抗体のＦａｂ’フラグメントに存在するチオール基と結合させる方法等を挙げることができる。
標識として酵素を使用する場合、試験試料と標識抗体とをインキュベートした後、遊離した標識抗体を洗浄して除去してから、上記の標識酵素の基質を作用させて発色等で反応を測定することによって標識抗体を検出することができる。例えば、ペルオキシダーゼで標識される場合には、基質として過酸化水素、発色試薬としてジアミノベンジジンまたはＯ−フェニレンジアミンと組み合わさって褐色または黄色を生じる。グルコースオキシダーゼで標識される場合には、基質として、たとえば２，２’−アシド−ジ−（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）等を用いる。
標識として蛍光色素を使用する場合には、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）又はＴＲＩＴＣ（テトラメチルローダミンＢイソチオシアネート）等の蛍光色素で本発明の抗体又はその断片を標識することができる。本発明の抗体又はその断片と蛍光色素との結合は常法によって行うことができる。
標識として呈色標識物質を使用する場合には、例えば、コロイド金属および着色ラテックスなどを標識として使用できる。コロイド金属の代表例としては、金ゾル、銀ゾル、セレンゾル、テルルゾルおよび白金ゾルなどのそれぞれの分散粒子である金属コロイド粒子を挙げることができる。コロイド金属の粒子の大きさは、通常は、直径３〜６０ｎｍ程度とされる。また、着色ラテックスの代表例としては、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラッテクスなどの合成ラテックスを挙げることができる。ラテックスとして天然ゴムラテックスのような天然ラッテクスを使用することができる。着色ラテックスの大きさは、直径数十ｎｍ〜数百ｎｍ程度から選択することができる。これらの呈色標識物質は市販品をそのまま使用することができるが、場合によりさらに加工し、または、それ自体公知の方法で製造することもできる。
本発明の抗体又はその断片と呈色標識物質との結合は常法によって行うことができる。例えば、呈色標識物質が金ゾルの分散粒子である金コロイド粒子の場合には、通常は、抗体と金ゾルとを室温下で混合することによって両者を物理的に結合することが可能である。
なお、標識としては、上記以外にもアフィニティー標識（例えば、ビオチン等）、又は、同位体標識（例えば、１２５Ｉ等）等を使用することもできる。
本発明の標識抗体を用いた酵素抗体法、免疫組織染色法、免疫ブロット法、直接蛍光抗体法又は間接蛍光抗体法等の分析は当業者に周知の方法で行なうことができ、その実験条件も当業者ならば適宜選択することができる。
本発明の抗体を用いることにより、生体試料又は組織中において、ヒトＴＧＦ−β１ならびにヒトＴＧＦ−β２およびヒトＴＧＦ−β３の活性化反応を検出又は測定することができ、これにより硬化性疾患を始めとするＴＧＦ−β関連疾患を診断することができる。このようなヒトＴＧＦ−β１ならびにヒトＴＧＦ−β２およびヒトＴＧＦ−β３の活性化反応を検出又は測定する方法並びに硬化性疾患を始めとするＴＧＦ−β関連疾患の診断方法も本発明の範囲内である。
本発明の抗体は、生体内におけるヒトＴＧＦ−β１ならびにヒトＴＧＦ−β２およびヒトＴＧＦ−β３の活性化反応を検出又は測定することができ、これにより硬化性疾患を始めとするＴＧＦ−β関連疾患を診断することができる。即ち、本発明の抗体は、活性型ヒトＴＧＦ−β１ならびにヒトＴＧＦ−β２およびヒトＴＧＦ−β３に起因する硬化性疾患（例えば、肝線維化／肝硬変、動脈硬化、肺線維症、強皮症、腎不全など）を始めとするＴＧＦ−β関連疾患の診断薬として有用である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】  先ず、実施例の全体の概要を説明する。ヒト組換えＬＡＰβ１を各種プロテアーゼ；ヒト血漿カリクレイン（ＰＬＫ）、ヒト血液由来プラスミン、ヒト組換えマトリックスメタロプロテアーゼ３（ＭＭＰ３）で切断したのち各切断部位アミノ酸配列を決定した。切断部位を含むペプチドを合成し、抗原ペプチドを作製した。抗原ペプチドの切断面と反対側に付与したシステイン残基のチオール基を利用して代表的キャリアータンパク質であるＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ  Ｌｙｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）に結合させた抗原ペプチドをウサギに免疫し、初回免疫４週間後から抗血清を回収し、目的の抗体が産生されていることをＥＬＩＳＡにより評価した。抗体力価の上昇が安定してきたところで、抗原ペプチドを固定したセファロース樹脂を用いて特異的ペプチド抗体を精製した。さらに、このペプチド抗体よりペプチド配列認識抗体を除去し、目的物である切断部位断面認識抗体（ＬＡＰβ１のプロテアーゼにより切断される部位を特異的に認識する抗体）を得た。得られた切断部位断面認識抗体の特異性をウエスタンブロットにて確認した。また、肝再生不全動物モデル、劇症肝炎による死亡患者の肝組織切片における染色性を評価した。
［実施例１］：各種プロテアーゼによるＬＡＰβ１の限定分解
ヒト組換えＬＡＰβ１（Ｒ＆Ｄ社）８００ｎｇを総量２７μｌのＰＢＳバッファー中にて終濃度２２２．２μｇ／ｍｌのヒト血漿カリクレイン（シグマ社）、終濃度１１１．１μｇ／ｍｌのヒト血液由来プラスミン（ＰＬＮ）（シグマ社）、並びに終濃度６μｇ／ｍｌのヒト組換えマトリックスメタロプロテアーゼ３（ＭＭＰ３）（Ａｌｅｘｉｓ社）と３７℃、０−３０分インキュベーションし、１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離したのちに、和光純薬の銀染色キットを用いて分解を確認した。
［実施例２］：限定分解部位の決定−ＴＧＦ−β活性化制御領域の発見
各種プロテアーゼによって限定分解したＬＡＰβ１断片（２００−４００ｎｇ）をＬａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ  ２２７，６８０（１９７９））の方法に従いＳＤＳ−１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、ゲル上のタンパク質をＰＶＤＦ（ポリビニデンジフルオリド）膜に電気泳動転写後、ＣＢＢ（クマシーブルーＲ２５０）色素で可視化した。可視化されたＰＶＤＦ膜状のタンパク質バンドを切り取り、微量パルス液相プロテインシークエンサー（Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９４ｃＬＣ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｙｔｅｍｓ社製）の反応層に入れ、標準のプログラムにてエドマン分解を行い、各サイクルでＮ末端より順番に切り出されるＰＴＨ（フェニルチオヒダントイン）−アミノ酸をクロマトグラフィーの溶出時間より同定した。このようにして限定分解された各断片のＮ末端１０残基のシークエンスを決定することにより各限定分解部位を決定したところ、プラスミンは潜在型ＴＧＦ−βの５６Ｌｙｓ−５７Ｌｅｕの間を、血漿カリクレインは５８Ａｒｇ−５９Ｌｅｕの間を、さらにＭＭＰ３は７９Ａｌａ−８０Ｌｅｕの間を特異的に切断し、似たような構造変化を引き起こすことでＴＧＦ−βを活性化させることがわかった（図５）。さらに長時間インキュベーションすると、プラスミンは８５Ａｒｇ−８６Ａｓｐの間、１０６Ｌｙｓ−１０７Ｇｌｕの間を順次切断した。このように各種プロテアーゼによって切断され活性化を引き起こす領域（５１Ｇｌｙ−１１０Ａｒｇ）をＴＧＦ−β活性化制御領域と定義した。
［実施例３］：抗原ペプチドの作製
上記で決定した切断部位のアミノ酸から始まるＣ末側ＬＡＰβ１配列（１０アミノ酸残基）の最後にシステイン残基を付与したペプチド、もしくは切断部位で終わるＮ末側ＬＡＰβ１配列（１０アミノ酸残基）の最初にシステイン残基を付与したペプチドを固相合成のＦｍｏｃ法（合成機；島津製作所ＰＳＳＭ−８）にて合成した。脱保護剤はエタンジチオール／チオアニソール／トリフルオロ酢酸を用いた。合成ペプチドに対し抗原性を付与するためにキャリア蛋白質としてヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ；ＫＬＨ）（シグマ社製）を結合させた。ＫＬＨに含まれるアミノ基をｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ＭＢＳ）で修飾したものを作り、これにシステイン残基を含む合成ペプチドを反応させて、両者を共有結合させた。ヘモシアニン２０ｍｇを溶かした１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ７．２、１．２５ｍｌに０．３ｍｇ／μｌＭＢＳジメチルホルムアミド溶液１０μｌを滴下し室温で３０分攪拌して両者を結合させる。沈殿物を遠心して取り除いた上清をセファデックスＧ２５ゲルろ過カラムにかけ５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ６．０で流して未反応のＭＢＳとＭＢＳ結合ＫＬＨとを分取した。ＭＢＳ結合ＫＬＨ分画はＣＢＢで同定し１００μｇずつ使用した。０．５ｍｌの蒸留水に溶かした合成ペプチド１ｍｇとＭＢＳ結合ＫＬＨ溶液半量の０．２Ｍリン酸ナトリウムバッファー，ｐＨ７．４を加えて室温で３時間振とうし、ＭＢＳのＮＨＳエステルを介してＫＬＨを各ペプチドのシステイン残基と結合させた。
［実施例４］：ウサギへの免疫・採血
ウサギ（雌、約２ｋｇ、ニュージーランドホワイト、北山ラベス）を購入後１週間隔離し環境に慣れさせた。免疫前採血（１０ｍｌ）したのちに、合成ペプチド１００μｇを含むＫＬＨ−ペプチド抗原溶液と、ＲＩＢＩ社の完全アジュバンド１００μｌとを金属製接続管を通して均一にしたエマルジョンをウサギの背中へ数十箇所に分けて免疫した。初回免疫４週間後から、一週間毎に１０ｍｌずつ採血と追加免疫を１４週間まで繰り返し、心臓より全採血した。採血は、左右交互の耳動脈より行い、抗血液凝固剤として１／１０量の３．８％クエン酸ナトリウム溶液を用いた。採血した血液を４℃、３０分、１０，０００ｒｐｍで遠心して血球成分を取り除いて血漿を得た。これに終濃度１０ｍＭ塩化カルシウム溶液を加えて４℃、オーバーナイト静置して固め、凝固成分を遠心（４℃、１５分、１０，０００ｒｐｍ）で取り除いて抗血清を回収した。
［実施例５］：抗体産生の確認
各抗血清中の抗体力価の推移はＢＳＡを結合させた各種抗原ペプチドを用いたＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏ−ｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）にて測定した。ＢＳＡ結合ペプチドは、抗原に用いたＫＬＨ結合ペプチドと同じ方法で作製した。これを５０ｍＭ炭酸バッファー，ｐＨ９．６で４μｇ／ｍｌに希釈したものを１００μｌずつ９６穴イムノプレート（ヌンク社製）の各穴に入れ４℃、オーバーナイトでインキュベーションしてプレートをＢＳＡ結合ペプチドでコートし、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄したのちに、各抗血清をＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で薄めた希釈系列を調製し、これを１００μｌずつ加えて３７℃で２時間インキュベーションする。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄したのちに、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製、７，５００倍ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈）を１００μｌずつ加えて再度３７℃で２時間インキュベーションする。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄したのちに１ｍｇ／ｍｌ  ｐ−ニトロフェニルリン酸塩含有ジエタノールアミンバッファーを２００μｌずつ加えて３７℃で１時間インキュベーションしたのちに黄色の発色程度を４０５ｎｍの吸光度を測定することにより決定した。
図６および図７に、プラスミン（ＰＬＮ）切断部位（５６Ｌｙｓ−５７Ｌｅｕ）のＣ末断面（５６Ｌｙｓ）抗体（図６のＡ）とＮ末断面（５７Ｌｅｕ）抗体（図６のＢ）、並びに血漿カリクレイン（ＰＬＫ）切断部位（５８Ａｒｇ−５９Ｌｅｕ）のＣ末断面（５８Ａｒｇ）抗体（図７のＡ）とＮ末断面（５９Ｌｅｕ）抗体（図７のＢ）のデータを示す。４回目免疫後から抗体力価の上昇がみられ、それ以降、高い抗体力価が保持された。
［実施例６］：特異的ペプチド抗体の精製
抗原ペプチドを固定したセファロース樹脂を作製し、これに吸着させることにより抗血清中に含まれるペプチド抗体を精製した。蒸留水で膨潤したエポキシ活性化セファロース樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）５０％スラリー１ｍｌと各種抗原ペプチド１ｍｇを結合バッファー（５０ｍＭ炭酸バッファー，ｐＨ８）４ｍｌ中にて４５℃、オーバーナイトで反応させ、セファロース樹脂に抗原ペプチドを結合させた。０．１Ｍモノエタノールアミン含有５０ｍＭトリス塩酸バッファー，ｐＨ８中にて４５℃、オーバーナイトでインキュベーションして未反応の官能基をブロックした後に、０．５Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍ酢酸バッファー，ｐＨ４と０．５Ｍ塩化ナトリウム含有結合バッファーにて交互に３回ずつ洗浄して抗原ペプチドを固定したセファロース樹脂を作製した。ペプチド固定セファロース樹脂１ｍｌと回収した抗血清５ｍｌとを４℃、オーバーナイトで撹拌して抗血清中に含まれるペプチド抗体を樹脂に結合させたのちに、ＴＢＳバッファー（０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む２０ｍＭトリス塩酸バッファー，ｐＨ７．５）、洗浄バッファー（１Ｍ塩化ナトリウム、１％トライトンＸ−１００を含む２０ｍＭトリス塩酸バッファー，ｐＨ７．５）、ＴＢＳバッファー、０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄したのちにグリシンバッファーｐＨ２．５中に溶出した。このとき抗体を即座に中性にするために、回収分画には予め溶出体積の１／２０の１Ｍトリスバッファーを入れておく。得られた抗体の濃度はＢＣＡアッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ）により決定した。
［実施例７］：切断部位断面認識抗体の精製（ペプチド配列認識抗体の除去）
上記セファロース樹脂に固定化したペプチドの切断面末端をアセチル化してブロックした樹脂を作製し、これを詰めたカラムにペプチド抗体を通すことにより、ペプチド配列認識抗体を除去して切断面認識抗体のみを精製した。アセチル化は、アセチルイミダゾール０．１２ｇ／４ｍｌジメチルホルムアミド中にてペプチド固定セファロース樹脂を室温にて５分を２回撹拌して行い、ジメチルホルムアミドで洗浄後スピンカラムに詰め（カラムボリューム１ｍｌ）、これに上術のように精製したペプチド抗体１００μｇを通してペプチド配列認識抗体を除去し、非吸着分画を回収し切断部位断面認識抗体とした。抗体のタンパク濃度はＢＣＡアッセイにより決定した。
［実施例８］：切断部位断面認識抗体の認識特異性の確認
上記で得られた切断部位断面認識抗体の認識特異性をウェスタンブロット解析にて確認した。図８のＡに、プラスミン切断部位（５６Ｌｙｓ−５７Ｌｅｕ）のＮ末断面（５７Ｌｅｕ）認識抗体を用いた結果を示す。図８のＢに、血漿カリクレイン切断部位（５８Ａｒｇ−５９Ｌｅｕ）のＮ末断面（５９Ｌｅｕ）認識抗体を用いた結果を示す。
図８では、プロテアーゼ処理していないヒト組換えＬＡＰβ１、終濃度２２２．２μｇ／ｍｌの血漿カリクレインで３７℃、３０分インキュベーションして切断したＬＡＰβ１、終濃度１１１．１μｇ／ｍｌのプラスミンで３７℃、１０分インキュベーションして切断したＬＡＰβ１、各８００ｎｇを１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離したのちに、ＰＶＤＦ（ポリビニデンジフルオリド）膜に電気泳動転写した。膜上のタンパク質のウェスタンブロット解析は、プラスミン切断部位Ｎ末断面認識ウサギ抗体または血漿カリクレイン切断部位Ｎ末断面認識ウサギ抗体（終濃度３．２５μｇ／ｍｌ）とホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（最終１：１，５００希釈）の組み合わせを用いて、既報の方法に従って行った（Ｏｋｕｎｏ  Ｍ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００１；１２０：１７８４−１８００）。バンドはＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）ＥＣＬ  ｓｙｓｔｅｍで検出した。
血漿カリクレイン切断部位Ｎ末断面（５９Ｌｅｕ）認識抗体は、活性化反応を受けていない（切断されていない）インタクトなＬＡＰβ１をほとんど認識せず（レーン１）、血漿カリクレイン（ＰＬＫ）よって切断されたＬＡＰβ１断片のみ強く認識し（レーン２）、血漿カリクレイン切断部位（５８Ａｒｇ−５９Ｌｅｕの間）より２残基前の５６Ｌｙｓ−５７Ｌｅｕで切断されたプラスミン（ＰＬＮ）切断ＬＡＰβ１断片を弱く認識した（レーン３）。この結果は、血漿カリクレイン切断部位Ｎ末断面認識抗体は、血漿カリクレインによって断片化された潜在型ＴＧＦ−βの切断面を特異的に検出する抗体であることを示している。
［実施例９］：肝再生不全動物モデルにおける有用性の確認
血漿カリクレイン切断部位Ｎ末断面認識抗体の組織免疫染色における有用性を評価するために、血漿カリクレインによるＴＧＦ−β活性化反応が病態形成の原因であることがわかっている内毒素（ＬＰＳ）前投与による部分肝切除後の肝再生不全マウスモデル（Ａｋｉｔａほか、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １２３：３５２−３６４，２００２）を作製し抗体の染色性を試した（図９）。
Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス（５週齢、日本クレア，東京，日本）を１週間隔離し、無作為に各１０匹に分けたマウスに、５０μｌの生理食塩水（５００ｎｇ／ｇ体重のＬＰＳ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ０１１１：Ｂ４、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を含むもの、又は含まないもの）を腹腔内注射し、２４時間後に偽手術もしくはＨｉｇｇｉｎｓおよびＡｎｄｅｒｓｏｎの方法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＧＭ他、Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  １９３１；１２：１８６−２０２）に従って６７％部分肝切除手術を施し、手術４８時間後にエーテル麻酔下で下大静脈から失血させて屠殺した。肝臓を素早く取り出し、１０％緩衝ホルマリン［ホルマリン（３７％パラホルムアルデヒド３％エタノール水溶液）をＰＢＳで１０倍希釈したもの］にて４℃、２４時間固定したのちに、アルコール系列で脱水し，キシロールで置換した後、自動包埋装置を用いてパラフィンに入れ，型に固めて肝組織パラフィン包埋ブロックを作製した。ミクロトームを用いて肝組織パラフィン包埋ブロックから薄さ５μｍの切片を作製し、免疫組織染色に用いた。キシレン１０分２回にてパラフィンを除去した後，１００％，７０％，５０％エタノール各１回でリンスし，水洗後風乾してＤＡＫＯ  Ｐｅｎ（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）にて切片周囲にサークルを描き，さらに数分風乾後、無水エタノール：３％過酸化水素水＝９：１混合液に浸して内在性パーオキシダーゼ活性のブロッキングを行った。その後に、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣ  ｅｌｉｔｅ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて染色、発色を行った。キット付属のブロッキング溶液とインキュベーションしたのちに、一次抗体（マウス抗ＴＧＦ−βモノクローナル抗体（図９の上段）もしくは血漿カリクレイン切断部位Ｎ末断面認識抗体（図９の中段）；１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に最終濃度１３μｇ／ｍｌ）と一緒に加湿チャンバー内で４℃で一晩インキュベートした。同一ウサギの免疫前抗体を対照として用いた（図９の下段）。ＰＢＳで洗浄後、使用説明書に従ってビオチン化二次抗体、アビジンＤＨ−ビオチン化パーオキシダーゼ混合液と順次反応させ切片を染色した。ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライドを用いて発色させ、ヘマトキシリンを用いて核の対比染色を行った。軽く水でリンスしたのち，風乾させ，５０％，７０％，１００％エタノール各１回でリンスし、キシレン１０分１回にて透徹し，非水溶性封入剤にて封入して顕微鏡観察に用いた。
生理的食塩水投与偽手術を施したコントロール群ではいずれの抗体によっても染色性は認められなかった（図９の左側）。生理的食塩水投与部分肝切除手術群、ＬＰＳ投与偽手術でも同様にほとんど染色性は認められなかった。これに対して、ＬＰＳ投与部分肝切除手術群においては、ＴＧＦ−β抗体によって類洞周囲の星細胞を中心とした顕著な染色像とその周囲の肝細胞にうっすらとした染色像（図９の右側上段パネル）が認められ、血漿カリクレイン切断部位Ｎ末断面認識抗体においても類洞周囲を中心とした染色像が認められた（図９の右側中段パネル）。免疫前抗体では特異的な染色像は得られなかった（図９の右側下段パネル）。この結果は、ＬＰＳ投与部分肝切除手術群において起こった血漿カリクレイン依存ＴＧＦ−β活性化反応の結果生じた活性型ＴＧＦ−βとＬＡＰ断片とがそれぞれの抗体で認識されたことを示している。すなわち、血漿カリクレイン切断部位Ｎ末断面認識抗体によってＬＰＳ投与部分肝切除手術群において血漿カリクレイン依存ＴＧＦ−β活性化反応が起こったことを表しており、動物モデルにおける有効性が示された。
［実施例１０］：ヒト病変肝における有用性の確認１
さらに、血漿カリクレイン切断部位Ｎ末断面認識抗体によって劇症肝炎で死亡した患者肝組織切片が染色されること（図１０）から、ヒトの病態形成時にプロテアーゼによるＴＧＦ−β活性化反応が起こっていることを示すことに成功した。
１０％緩衝ホルマリン固定，パラフィン包埋した患者肝組織から切片（２．５μｍ）を作製し，キシレン２０分４回にて脱パラフィン後，エタノール２回，９０％，８０％，７０％エタノール各１回でリンスし，水洗後風乾してＤＡＫＯ  Ｐｅｎ（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）にて切片周囲にサークルを描き，さらに３０分風乾後、切片に一次抗体（免疫前抗体（図１０の左側パネル）もしくは血漿カリクレイン切断部位Ｎ末断面認識抗体（図１０の右側パネル））を最終濃度１３μｇ／ｍｌにて室温１時間湿箱中で反応させた。ＰＢＳにて１回リンス後さらに３０分洗浄したのちに、二次抗体（Ｂｉｏｔｉｎ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｓｗｉｎｅ  ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ））１０μｇ／ｍｌにて室温１時間反応させた。ＰＢＳにて１回リンス後さらに３０分洗浄したのちに、Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔ  ＡＢＣ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）にて室温で４０分反応させた。ＰＢＳにて１回リンス後さらに３０分洗浄したのちに、添付書に従い調製したＮｅｗ  Ｆｕｃｈｓｉｎ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を反応させ陰性コントロール（図１０の左側パネル）に淡くバックグウンドの染まりが出るまで発色した。軽く水でリンスしたのち，風乾させ，キシレン１０分３回にて透徹し，非水溶性封入剤にて封入して顕微鏡観察に用いた。
免疫前抗体（図１０の左側パネル）に比べて血漿カリクレイン切断部位Ｎ末断面認識抗体（図１０の右側パネル）では、線維に埋もれながらも僅かに細胞構造を保っている肝細胞が淡く染色されるとともに、特に星細胞と思われる幾つかの細胞が赤く染まっていることが観察された（矢印）。この結果は、患者さんの病態形成時に血漿カリクレインによるＴＧＦ−β活性化反応が起こっていることを示しており、劇症肝炎時の肝再生不全には血漿カリクレインに対する特異的阻害剤や抗体が有効に働く可能性を強く示唆している。
［実施例１１］：ヒト病変肝における有用性の確認２
Ｂ型肝炎で死亡した患者肝組織切片を染色したところ、血漿カリクレイン切断部位Ｃ末切断面認識抗体を用いた場合と比較して、血漿カリクレイン切断部位Ｎ末切断面認識抗体を用いた場合により明確な染色像を得ることができた（図１１）。
Ｂ型肝炎で死亡した患者肝組織から１０％緩衝ホルマリン固定，パラフィン包埋した切片（２．５μｍ）を作製し，キシレン２０分４回にて脱パラフィン後，エタノール２回，９０％，８０％，７０％エタノール各１回でリンスし，水洗後風乾してＤＡＫＯ  Ｐｅｎ（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）にて切片周囲にサークルを描き，さらに３０分風乾後、切片に一次抗体として血漿カリクレイン切断部位Ｃ末断面認識抗体（５８番目のアルギニンを認識する抗体）（図１１の左側上パネル）、血漿カリクレイン切断部位Ｎ末断面認識抗体（５９番目のロイシンを認識する抗体）（図１１のまん中上パネル）、無免疫ウサギ抗体を最終濃度１３μｇ／ｍｌ、または活性型ＴＧＦ−β認識マウスモノクロナル抗体（図１１の右側上パネル）、もしくは無免疫マウス抗体を最終濃度１μｇ／ｍｌにて室温１時間湿箱中で反応させた。ＰＢＳにて１回リンス後さらに３０分洗浄したのちに、二次抗体（Ｂｉｏｔｉｎ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｓｗｉｎｅ  ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）もしくは、Ｂｉｏｔｉｎ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｓｗｉｎｅ  ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２  ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ））１０μｇ／ｍｌにて室温１時間反応させた。ＰＢＳにて１回リンス後さらに３０分洗浄したのちに、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｓｔｒｅｐｔ  ＡＢＣ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）にて室温で４０分反応させた。ＰＢＳにて１回リンス後さらに３０分洗浄したのちに、添付書に従い調製したＤＡＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＤＡＫＯ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を反応させ陰性コントロール（図１１の下段パネル）に淡くバックグウンドの染まりが出るまで発色した。軽く水でリンスしたのち，風乾させ，キシレン１０分３回にて透徹し，非水溶性封入剤にて封入して顕微鏡観察に用いた。
免疫前抗体（下段パネル）に比べて血漿カリクレイン切断部位Ｃ末断面認識抗体（図１１の上図まん中）では、星細胞を中心とした染色が見られるが、血漿カリクレイン切断部位Ｎ末断面認識抗体（図１１の上図左）では、Ｃ末断面認識抗体（図１１の上図まん中）に比べて、より明確な染色像を得ることができた。活性型ＴＧＦ−β認識マウスモノクロナル抗体（図１１の上図右）でも、Ｃ末断面認識抗体（図１１の上図まん中）と同様の染色像を得ることができたが、バックグランドはやや高かった（図１１の下図右）。この結果は、病態形成時に血漿カリクレインによるＴＧＦ−β活性化反応が起こっていることを明確に示しており、Ｂ型肝炎肝炎時の肝再生不全には血漿カリクレインに対する特異的阻害剤や抗体が有効に働く可能性を強く示唆している。
［実施例１２］：ＭＭＰ２及びＭＭＰ９ではＬＡＰの特異的切断は起こらないことの確認
ヒト組換えＬＡＰβ１（Ｒ＆Ｄ社）８００ｎｇを総量２７μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７−２００ｍＭ  ＮａＣｌ−１μＭ  ＺｎＣｌ２−５ｍＭ  ＣａＣｌ２−０．０５％Ｂｒｉｊ  ３５−０．０５％ＮａＮ３）中にて終濃度１３．３μｇ／ｍｌのヒトマトリックスメタロプロテアーゼ２（ＭＭＰ２）（Ａｌｅｘｉｓ社）、もしくは終濃度１３．３μｇ／ｍｌのヒトマトリックスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ９）（Ａｌｅｘｉｓ社）と３７℃、３０分インキュベーションし、１２．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離したのちに、和光純薬の銀染色キットを用いて染色したが、ＬＡＰの分解は確認できなかった。この時用いたＭＭＰ２とＭＭＰ９は、潜在型のものを購入し、上記５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー中にて終濃度２ｍＭの４−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌｍｅｒｃｕｒｉｃ  ａｃｅｔａｔｅ（ＡＰＭＡ）と３７℃、１時間インキュベーションすることによって活性化した後に実験に供した。ＡＰＭＡ処理によりＭＭＰ２とＭＭＰ９が活性型になっていることは、１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファー（１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５−１００ｍＭ  ＮａＣｌ−１０ｍＭ  ＣａＣｌ２−０．０５％Ｂｒｉｊ  ３５）中にて蛍光合成基質ＭＯＣＡｃ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａ２ｐｒ（Ｄｎｐ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−ＮＨ２（ペプチド研究所製）を用いた活性測定（Ｅｘ  ２８０ｎｍ−Ｅｍ  ３６０ｎｍ；Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ：Ｃ．Ｇ．Ｋｎｉｇｈｔ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２９６：２６３，１９９２）を行い確認した。
［実施例１３］：サンドイッチＥＬＩＺＡ法による断片化ＬＡＰの検出
サンドイッチＥＬＩＺＡ法は情報（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．５５３−６１２，１９８８）に従って行った。すなわち、市販の抗ヒトＬＡＰモノクロナル抗体（Ｒ＆Ｄ社製）をイムノプレート（Ｎｕｎｃ社製）１ウエル当たり１μｇ（２０μｇ／ｍｌ  ｏｆ  ＰＢＳを５０μｌ）添加し、４℃で一晩インキュベーションすることによってコートした。ＰＢＳで２回洗浄した後に、ブロッキング溶液（３％ウシ血清アルブミン−０．０２％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ）２００μｌと４℃でもう一晩インキュベーションすることによってブロッキングを行なった。ＰＢＳで２回洗浄した後に、１ウエル当たり０，１２５，２５０，５００，１，０００，２，０００ｎｇの市販ヒトＬＡＰβ１（Ｒ＆Ｄ社製）ブロッキング溶液希釈系列、ヒト血漿カリクレイン（Ｓｉｇｍａ社製）処理（３７℃，４０分インキュベーション）ヒトＬＡＰβ１（Ｒ＆Ｄ社製）ブロッキング溶液希釈系列、もしくはプラスミン（Ｓｉｇｍａ社製）処理（３７℃，４０分インキュベーション）ヒトＬＡＰβ１（Ｒ＆Ｄ社製）ブロッキング溶液希釈系列各５０μｌを加え、３７℃で２時間反応させた。ＰＢＳで４回洗浄後、血漿カリクレイン切断部位Ｃ末断面認識抗体もしくは免疫前抗体２５μｇ／ｍｌ  ＰＢＳ溶液を各ウエルに４０μｌずつ入れて室温で２時間シェーキングしながら反応させた。ＰＢＳで４回洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗ウサギ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ社製、７，５００倍ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で希釈）を１００μｌずつ加えて３７℃で２時間インキュベーションした。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄したのちに１ｍｇ／ｍｌ  ｐ−ニトロフェニルリン酸塩含有ジエタノールアミンバッファーを２００μｌずつ加えて３７℃で１時間インキュベーションしたのちに黄色の発色程度を４０５ｎｍの吸光度を測定することにより決定した。その結果、断片化ＬＡＰを検出できることが確認された（図１２）。
【産業上の利用可能性】  本発明においては、ＴＧＦ−β活性化制御領域に存在する各々のプロテアーゼ切断部位を認識する特異抗体を作製することによって、従来の技術では困難であった病態、組織、アイソフォーム特異的ＴＧＦ−β生成反応（活性化反応）を検出することが可能になった。さらに、検出された各々の活性化反応を特異的に阻害する合成低分子阻害剤や抗体を用いて異常ＴＧＦ−β生成反応のみを抑える新規治療法の診断、並びに予後の診断に役立つことが期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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