(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イネの種子を2〜3日間吸水させる工程と、
前記吸水後、前記イネの種子における胚の出芽部に、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを付着させた創傷手段により傷をつける工程と、
を含む、イネのインプランタ形質転換法。
【請求項２】
前記出芽部が、胚の出芽部中央、胚の幼芽部分及び胚の中央部から成る群より選択されるものである、請求項１記載のイネのインプランタ形質転換法。
【請求項３】
前記傷が穿孔であることを特徴とする、請求項１又は２記載のイネのインプランタ形質転換法。
【請求項４】
接種するアグロバクテリウム・ツメファシエンスが、アグロバクテリウム・ツメファシエンスM21変異株、pIG121-Hmバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404菌及びプラスミドレスキュー用バイナリーベクター（pBI-Res）を有するLBA4404菌から成る群より選択されるものである、請求項１〜３のいずれか１項記載のイネのインプランタ形質転換法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによる植物のインプランタ（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ）形質転換法に関する。
【背景技術】  一般的な植物の形質転換法としては、（１）目的遺伝子をベクターに導入し、そのベクターを用い、目的遺伝子を植物ゲノム中に導入する方法（Ｒｈｏｄｅｓ  Ｃ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：２０４−２０７，１９８９；Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：７３６−７４０，１９９０；Ｃｈｒｉｔｏｕ  Ｐ．ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７−９６２，１９９１）及び（２）所望の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを物理的に細胞内へ導入して、植物が元来持つ遺伝子の修復機構を利用して、標的遺伝子を改変する方法（Ｂｅｅｔｈａｍ  Ｐ．Ｒ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６，８７７４−８７７８，１９９９）の２つの方法に大別される。（１）の方法において、目的遺伝子を含むベクターを植物細胞へ導入する技術としては、エレクトロポレーション法（Ｒｈｏｄｅｓ  Ｃ．Ａ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：２０４−２０７，１９８９）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法（Ｄａｔｔａ，Ｓ．Ｋ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：７３６−７４０，１９９０）、パーティクルガン法（Ｃｈｒｉｔｏｕ  Ｐ．ら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９５７−９６２，１９９１）等の物理的導入方法及びアグロバクテリウム形質転換法（特開昭５９−１４０８８５号公報）と呼ばれる生物学的な方法を挙げることができる。
アグロバクテリウム形質転換法は、植物病原細菌の一種であるアグロバクテリム菌が植物に感染すると、自らが持つＴｉプラスミドやＲｉプラスミド上に存在するＴ−ＤＮＡ領域を植物のゲノム中へ組み込む性質を利用する（Ｚｈｕ  Ｊ．ら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，３８８５−３８９５，２０００）。
従来、イネやトウモロコシ等の単子葉植物の形質転換法においては、上記で説明した物理的導入方法が使用されていた。一方、アグロバクテリウム形質転換法は、双子葉植物で多くの形質転換植物が作出されたにも拘らず、単子葉植物に適用することは難しいと考えられていた。この原因は、元来双子葉植物に感染するアグロバクテリウム菌の単子葉植物への感染率が低いことに起因した。しかしながら、その後の研究により、アグロバクテリウム形質転換法を用いて単子葉植物を形質転換することが可能となってきた。
単子葉植物のアグロバクテリウム形質転換法としては、バイナリーベクター法（特開昭６０−７００８０号公報）が挙げられる。さらに、このバイナリーベクター法は、（１）Ｔ−ＤＮＡからホルモン合成遺伝子が除去されたディスアーム型Ｔｉプラスミドを有する強病原性アグロバクテリウム菌（ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５等）とｐＢＩ１２１等のバイナリーベクターとの組み合わせを利用する方法（Ｋｌｅｅ  Ｈ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，５，４４６−４５１，２０００）及び（２）ディスアーム型Ｔｉプラスミドを有する中程度の病原性アグロバクテリウム菌（ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１１等）とｐＴＯＫ２３３等のスーパーバイナリーベクターとの組み合わせを利用する方法（国際公開第９４／００９７７号；Ｈｉｅｉ  Ｙ．ら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，２７１−２８２，１９９４）の２つの方法に大別される。（１）の方法においては、バイナリーベクターを担持することになるアグロバクテリウム菌に工夫を施す。強病原性のアグロバクテリウム・ツメファシエンスＡ２８１株は、宿主範囲が広く、他のアグロバクテリム菌よりも形質転換効率が高い。このアグロバクテリウム・ツメファシエンスＡ２８１株が有するＴｉプラスミドより作出されたディスアーム型Ｔｉプラスミドを担持するＥＨＡ系列のアグロバクテリウム菌（ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５）を利用する。これらのアグロバクテリウム菌を利用することでイネなどの単子葉植物の高効率の形質転換が可能となる。一方、（２）の方法においては、バイナリーベクターに工夫を施す。バイナリーベクターにｖｉｒＢやｖｉｒＧ等の病原性に関与する遺伝子を導入する。これらのバイナリーベクターを利用することで、アグロバクテリウム菌が強病原性菌でなくとも単子葉植物の高効率での形質転換が可能となる。
一方、例えばイネのアグロバクテリウム形質転換法においては、脱分化過程にあるか若しくは脱分化した培養細胞（Ｈｉｅｉ  Ｙ．ら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，２７１−２８２，１９９４）、種子から取り出された未熟胚（Ｈｉｅｉ  Ｙ．ら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，２７１−２８２，１９９４）、或いは籾殻除去後に人為的な操作を受けていない状態で培養された種子（特許文献１）にアグロバクテリウム菌を感染させる。さらに、日本型イネのアグロバクテリウム形質転換法（Ｈｉｅｉ  Ｙ．ら，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，６，２７１−２８２，１９９４）においては、胚由来カルスにアグロバクテリウム菌を感染させる。一方、インド型イネに関しては、培養方法をインド型イネに適したものにすることにより日本型イネと同様な方法でインド型イネを高効率で形質転換することが可能となったことが開示されている（特開平１０−１１７７７６号公報）。
また、別のイネの形質転換効率を高める方法も開示されている（特開２０００−３４２２５３号公報）。この方法によれば、形質転換効率の低い組み合わせであるアグロバクテリム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌とｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターとによる形質転換効率が２〜７倍程度高まったことが報告されている。
以上のようにイネに代表される単子葉植物のアグロバクテリウム形質転換法は、近年著しく進歩し、形質転換効率も飛躍的に高まって来た。しかしながら、このような形質転換法には以下の問題点がある。まず第一に、滅菌条件下での作業が必要なことである。第二は、長期間かかる点である。第三は、組織培養中に、体細胞突然変異（ソマクローナル変異）が頻繁に生じる点である。
【特許文献１】  特開２００１−２９０７５号公報
【発明の開示】
そこで、植物に広く適用でき、簡便で効率が高く、かつ体細胞突然変異等が生じない形質転換法が構築できれば、有用植物の育種に貢献でき、分子農業の発展に寄与することができる。
本発明は、より簡便でかつ効率的に行うことのできる植物のインプランタ形質転換法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、植物の種子における胚の出芽部の傷にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種することで、植物が効率良く形質転換されることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下を包含する。
（１）植物の種子における胚の出芽部の傷にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種することを特徴とする、植物のインプランタ形質転換法。
（２）植物の種子における胚の出芽部に、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを付着させた創傷手段により傷をつけることを特徴とする、植物のインプランタ形質転換法。
（３）前記植物が単子葉植物であることを特徴とする、（１）又は（２）記載の植物のインプランタ形質転換法。
（４）前記出芽部が、胚の出芽部中央、胚の幼芽部分及び胚の中央部から成る群より選択されるものである、（１）又は（２）記載の植物のインプランタ形質転換法。
（５）前記接種前に植物の種子を吸水させる工程を含む、（１）記載の植物のインプランタ形質転換法。
（６）前記創傷前に植物の種子を吸水させる工程を含む、（２）記載の植物のインプランタ形質転換法。
（７）吸水期間が、２〜３日間であることを特徴とする、（５）又は（６）記載の植物のインプランタ形質転換法。
（８）前記胚の出芽部に傷をつける工程を含む、（１）記載の植物のインプランタ形質転換法。
（９）前記傷が穿孔であることを特徴とする、（１）又は（２）記載の植物のインプランタ形質転換法。
（１０）接種するアグロバクテリウム・ツメファシエンスが、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌及びプラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するＬＢＡ４４０４菌から成る群より選択されるものである、（１）又は（２）記載の植物のインプランタ形質転換法。
（１１）前記接種がアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を塗布することである、（１）記載の植物のインプランタ形質転換法。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るインプランタ形質転換法においては、植物の種子を吸水させる工程、次に種子における胚の出芽部に傷をつける工程、傷にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種する工程が含まれる。
本発明に係るインプランタ形質転換法は、広く一般に種子を生じる植物に適用することができる。従って、本発明に係るインプランタ形質転換法の対象植物は、被子植物及び裸子植物を含む種子植物である。被子植物には、単子葉植物及び双子葉植物が含まれる。単子葉植物としては、いずれの種類であってもよいが、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、シバ、ソルガム、サトウキビ、バナナ及びパイナップルなどが挙げられる。また、双子葉植物としては、ダイズ、ワタ、タバコ、サトウダイコン、アズキ、ソバ、キュウリ、メロン、ナタネ、ダイコン、レタス、アルファルファ、エンドウ、サツマイモ及びジャガイモなどが挙げられる。
一方、裸子植物としては、マツ、スギ、イチョウ及びソテツなどを挙げられる。
本発明に係るインプランタ形質転換法では、まず植物の種子を吸水させる。吸水は、種子を水に浸種し、１５〜２０℃の温度でインキュベートすることにより行われる。この際、一度、水を交換してもよい。吸水期間は、例えば、イネやトウモロコシの場合には、吸水により種子の胚が白色を呈するまでの期間であればよく、好ましくは２〜３日間である。一方、例えばコムギの場合には、吸水期間は、胚部分の輪郭が明瞭になるまでの期間であればよく、好ましく２〜３日間である。この吸水工程により、種子を柔らくすることで胚の出芽部に傷をつけることができる。
次いで、上記で吸水させた種子における胚の出芽部に傷をつける。ここで、「出芽部」とは、出芽の際に芽が出現する部位を意味する。出芽部としては、例えば、胚の出芽部中央、胚の幼芽部分及び胚の中央部が挙げられる。なお、図１には、例としてイネの種子における胚２が模式的に示されている。傷は、接種するアグロバクテリウム・ツメファシエンスが感染できるものであればいずれのものでよいが、出芽部に穿設された穿孔または出芽部に切りつけられた切り口が挙げられる。図１には、イネの種子における胚２の出芽部内の穿設部位１が示されている。穿設するための器具としては、例えばφ０．７１ｍｍの針が挙げられる。また、穿孔の個数は出芽部あたり１〜２個であることが好ましい。さらに、穿孔の深さは１〜２．０ｍｍであることが好ましい。一方、切りつけるための器具としては、例えばメスおよびカッターなどの切断器具が挙げられる。
次いで、上記で得られた出芽部の傷にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種する。胚の出芽部の傷へのアグロバクテリウム・ツメファシエンスの接種方法は、出芽部の傷を通して分裂組織にアグロバクテリウム・ツメファシエンスが感染できるものであればいずれのものでよいが、針の先端、ピペット又は注射器などを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を出芽部の傷に直接注入する方法、アグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を浸した綿棒を用いて出芽部の傷に塗布する方法、並びにこれらの方法の組合せが挙げられる。
一方、種子における胚の出芽部に傷をつけた後にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種するのではなく、上記で吸水させた種子における胚の出芽部に、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを付着させた創傷手段により傷をつけてもよい。創傷手段としては、種子における胚の出芽部に傷をつけることができるものであればいずれのものであってよいが、例えばφ０．７１ｍｍの針などの穿設するための器具、ピペット、注射器、並びにメスおよびカッターなどの切断器具が挙げられる。例えば、創傷手段として針を用いる場合には、針の先端部にアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を付着させる。本工程により、胚の出芽部に傷をつけると同時にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを胚の出芽部に接種することができる。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液の調製方法は、以下の通りである。まずアグロバクテリウム・ツメファシエンスをカナマイシン、リファンピシン及びストレプトマイシンなどを含むＬＢ液体培地中で２８℃で１８時間振とう培養する。次いで培養液を遠心分離することでアグロバクテリウム・ツメファシエンスを回収し、水で洗浄する。さらに１．０ｘ１０８菌体／ｍｌの濃度となるようにアグロバクテリウム・ツメファシエンスを水に懸濁し、これをアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液とする。
一般に、アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を形成する。これは、感染の際に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス中のＴｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因するものである。そこで、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いて、外来遺伝子を植物ゲノムに組み込むためには、Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域中に植物ゲノム中に組み込みたい外来遺伝子を挿入する。次いでこのＴ−ＤＮＡ領域を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスを植物に感染させると、植物ゲノム中に該外来遺伝子を組込むことができる。外来遺伝子としては、いかなるタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子であっても良い。なお、目的遺伝子と選抜マーカー遺伝子の双方を外来遺伝子とした場合には、形質転換された植物における該選抜マーカー遺伝子の発現を指標として形質転換植物体を選抜することができる。選抜マーカー遺伝子としては、例えば、カナマイシン又はハイグロマイシンなどに対する抗生物質耐性遺伝子、蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子及び国際公開第０２／４４３８５号に開示された変異型アセト乳酸シンターゼ（以下、「ＡＬＳ」と呼ぶ）タンパク質をコードする遺伝子などが挙げられる。なお、国際公開第０２／４４３８５号に開示された変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子は、ピリミジニルカルボキシ系除草剤耐性を付与する。従って、該変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子を選抜マーカー遺伝子として使用した場合には、ｂｉｓｐｙｒｉｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ、ｐｙｒｉｔｈｉｏｂａｃ−ｓｏｄｉｕｍ、ｐｙｒｉｍｉｎｏｂａｃなどのピリミジニルカルボキシ系除草剤の存在下で形質転換された植物を生育させる。その結果、ピリミジニルカルボキシ系除草剤の存在下で生育できる植物には、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子が導入され、形質転換されたことが確認できる。また、変異型ＡＬＳタンパク質をコードする遺伝子が植物ゲノムに組み込まれたか否かは、植物体の表現形質の変化やゲノムサザーンハイブリダイゼーション或いはＰＣＲによって、これらの遺伝子のゲノム中への挿入を調べることでも確認することができる。
本発明に係るインプランタ形質転換法において、接種するアグロバクテリウム・ツメファシエンスとしては、植物に感染できる株であればいずれのものでよいが、例として、非病原性のアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌及びプラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌を挙げることができる。
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株は、中程度の病原性のアグロバクテリウム・ツメファシエンスＡ２０８株（Ｃ５８染色体，ノパリン型  Ｔ３７ｐＴｉ）をトランスポゾン５（Ｔｎ５）変異によって突然変異させることで得られる（Ｍａｊｕｍｄｅｒ  Ｐら，Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂｉｏｅｎｇ  ９０：３２８−３３１，２０００）。図２は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株のＴ−ＤＮＡ領域におけるＴｎ５の挿入部位の構造を示す。図２に示されるように、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株においては、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域にあるインドール酢酸（ＩＡＡ）生合成に関与するトリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子（以下、「ｉａａＭ遺伝子」と呼ぶ）にＴｎ５が挿入されている。アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株は、それ自身のＴ−ＤＮＡ領域を宿主染色体に組み込む能力を保持しているが、クラウンゴールを形成しない。なお、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株に外部からバイナリーベクターを導入できること及び導入されたバイナリーベクター上のＴ−ＤＮＡは植物のゲノムＤＮＡ内に挿入されることが証明されている（Ｍａｊｕｍｄｅｒ  Ｐら，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９０，３２８−３３０，２０００）。従って、外来遺伝子を組み込んだバイナリーベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株に導入し、この菌を用いて植物ゲノムに外来遺伝子を挿入することが可能である。
一方、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌は、ディスアーム型Ｔｉプラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌に、改変型ｐＢＩ１２１バイナリーベクター（ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター）を導入した菌である。図３は、ｐＩＧ１２１−ＨｍバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ領域の構造を示す。なお、図３中、ＣａＭＶ  ３５Ｓ−ＰｒｏはＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターであり、ＧＵＳはβ−グルクロニダーゼ遺伝子（以下、「ＧＵＳ遺伝子」と呼ぶ）であり、そしてＨｍｒは、ハイグロマイシン耐性遺伝子である。図３に示されるように、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターにおいては、Ｔ−ＤＮＡ中のＧＵＳ遺伝子にイントロンが挿入され、さらにハイグロマイシン耐性遺伝子が追加されている。
また、プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌は、上記アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌に、改変型ｐＢＩ１２１バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓバイナリーベクター；以下、「プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）」と呼ぶ）を導入した菌である。プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）はｐＢＩ１２１バイナリーベクターのβ−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ遺伝子）の部位を、ｐＢＲ３２２プラスミド由来の複製開始領域（ｏｒｉ）とアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ遺伝子）とを含むＤＮＡ断片で置換したバイナリーベクターである。本菌で植物を形質転換すると、作出された形質転換植物のゲノム中に挿入されたＴ−ＤＮＡに隣接する植物のゲノムＤＮＡを容易に回収（レスキュー）することができる。
図４は、プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）のＴ−ＤＮＡ領域の構造を示す。なお、図４中、ＬＢは、Ｔ−ＤＮＡ左境界配列で、ＲＢは右境界配列である。ＲＢとＬＢとの間のＤＮＡがＴ−ＤＮＡとして、植物ゲノムに挿入されることがわかっている。また、３５ＳｐはＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターであり、ｏｒｉはｐＢＲ３２２プラスミド由来の複製開始領域である。そして、Ｋｍｒはカナマイシン耐性遺伝子であり、Ａｍｐｒはアンピシリン耐性遺伝子である。図４に示されるように、プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）のＴ−ＤＮＡ領域においては、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、ｐＢＲ３２２プラスミド由来の複製開始領域及びアンピシリン耐性遺伝子が機能的に連結している。さらに、カナマイシン耐性遺伝子が含まれている。
次いで、上記のようにアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種した植物の種子（以下、「接種種子」と呼ぶ）を、各種植物に応じた条件下で植物体へ生育させる。
例えば、イネやトウモロコシの場合には、接種種子を、ビーカーやシャーレなどの中に敷いたろ紙上に置床する。次いでこれらのビーカーやシャーレなどを恒温器に入れ、暗所、２２℃で、例えばイネの場合には８〜９日間、トウモロコシの場合には２〜３日間インキュベートする。この処理の間に、アグロバクテリウム・ツメファシエンスが胚中の分裂組織へ感染する。上記の処理後の接種種子を播種し、植物体へと生育させることができる。
一方、例えば、コムギの場合には、接種種子を、バーミキュライト等を含有するビーカーやシャーレなどに置床する。次いで、これらのビーカーやシャーレなどを、１５℃〜２５℃で２日間インキュベートする。さらに、これらのビーカーやシャーレなどを、３℃〜５℃の冷蔵庫へ移し、２５日間保持する。当該低温処理は、バーナリゼーション（春化処理）と呼ばれる。当該バーナリゼーションの間に、葉は３ｃｍ〜５ｃｍに生育する。次いで、バーナリゼーション処理後、これらのビーカーやシャーレなどを冷蔵庫から取り出し、室温（１５℃〜２０℃）に馴化した後、植物体へと生育させることができる。
上記の操作により作出した形質転換植物体のゲノムに、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のＴ−ＤＮＡ領域が組み込まれたかどうかの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法等によって行うことができる。例えば、ＰＣＲ法の場合には、形質転換植物体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。次いで、ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ液等により染色し、そして１本のバンドとしてＰＣＲ産物を検出することにより、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のＴ−ＤＮＡ領域が組み込まれたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相にＰＣＲ産物を結合させ、蛍光または酵素反応等によりＰＣＲ産物を確認する方法を採用してもよい。
また、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌を、本発明に係るインプランタ形質転換法に使用した場合には、ｐＩＧ１２１−ＨｍバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡは植物ゲノムに取り込まれる。上述したように、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターは、Ｔ−ＤＮＡ領域内にハイグロマイシン耐性遺伝子を有する。そこで、ハイグロマイシンＢ耐性を指標として選抜することにより、植物が形質転換されたことを確認することができる。
さらに、プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌を本発明に係るインプランタ形質転換法に使用した場合には、Ｔ−ＤＮＡとそれに隣接する植物ゲノムＤＮＡ断片が連結した構造をもつプラスミドを回収（レスキュー）することにより、Ｔ−ＤＮＡが植物ゲノムに挿入されたこと、すなわち、植物が形質転換されたことを確認することができる。
図５は、プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を用いたプラスミドレスキューの方法を示す。ここで、「プラスミドレスキュー」とは、形質転換植物のゲノムに挿入されたＴ−ＤＮＡに隣接する植物ゲノムＤＮＡ断片を回収する方法である。図５に基づき、本法を説明する。本発明に係るインプランタ形質転換法に従って、プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌を用いてイネを形質転換する。生育した形質転換植物体においては、プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）中のＴ−ＤＮＡがイネゲノムＤＮＡに組み込まれる。形質転換植物体由来のゲノムＤＮＡを、Ｔ−ＤＮＡ領域内のｐＢＲ３２２領域に切断部位を有しない制限酵素（例えば、Ｓｐｈ  Ｉ）で消化した場合、消化したＤＮＡ断片中には、ｐＢＲ３２２プラスミド由来の複製開始領域（ｏｒｉ）及びアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）を含むＤＮＡ断片と、イネゲノムＤＮＡに組み込まれたＴ−ＤＮＡに隣接するイネゲノムＤＮＡ断片とが連結したＤＮＡ断片が含まれる。そこで、得られた消化物をセルフライゲーションして、環状化させた後、プラスミドとして大腸菌へ導入する。次に、上記構造をもつプラスミドで形質転換された大腸菌を、アンピシリン耐性を指標として選抜する。次いで、アンピシリン耐性大腸菌中のプラスミドを分離し、分離したプラスミドの配列を決定する。決定されたＴ−ＤＮＡに隣接するＤＮＡの塩基配列をＢｌａｓｔ  ｓｅａｒｃｈなどの相同性分析に供する。その結果、当該プラスミド中のＴ−ＤＮＡにイネのゲノムＤＮＡが連結した構造が含まれていることがわかれば、Ｔ−ＤＮＡがイネゲノム中に挿入されたことが確認される。
また、非形質転換植物体と比較した場合の形質転換植物体の表現形質（例えば形態）の変化を指標として形質転換を確認することができる。例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株を用いて形質転換したイネ形質転換植物体の表現形質の変化としては、以下のものが挙げられる。
（１）生育初期では、生育（分蘖及び草丈）が遅れ、生育中期になり追い越し、生育後期においては草丈がより高くなる。
（２）イネ形質転換植物体においては、葉片が上にむかって直立する傾向があり、一方、非形質転換植物体においては、葉片が開く傾向がある。
（３）穂の付き方においては、イネ形質転換植物体は２段につき、一方、非形質転換植物体では１段に付く。
また、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株を用いて形質転換したトウモロコシ形質転換植物体の表現形質の変化としては、以下のものが挙げられる。非形質転換植物体と比べ、
（１）生育初期では、草丈が高く、茎が太い。
（２）生育中期では、下葉が枯れ、生育も遅れる。
（３）生育後期では、草丈が低くなる。
（４）雌穂の絹糸の数がより少なくなる。
さらに、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株を用いて形質転換したコムギ形質転換植物体の表現形質の変化としては、例えば、非形質転換植物体と比べ、早く黄化することが挙げられる。
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株を用いた場合に、形質転換植物体が上記のような表現形質の変化を示す機構としては、以下のように推定される。アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株においては、唯−ｉａａＭ遺伝子だけが変異しており、Ｔ−ＤＮＡ領域に存在するサイトカイニン生合成に関わる遺伝子を含む全ての他の遺伝子は健全である。従って、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株によって作出された形質転換植物体は、高レベルのサイトカイニンを合成すると考えられる。これにより形質転換植物体中のホルモンバランスに支障をきたし、形質転換された植物は表現形質の変化を示すと考えられる。
一方、プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）やｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌を用いて形質転換したイネやコムギの表現形質は植物個体間に大きなばらつきが認められた。これは、Ｔ−ＤＮＡがゲノム中の種々の遺伝子座に無作為に挿入されることの反映と考えられる。これらの各植物個体（Ｔ０）の示すそれぞれの表現形質は次世代（Ｔ１）へ遺伝した。このことはこれらの植物において形質転換が起きていることを強く示唆している。
以上、説明した本発明に係るインプランタ形質転換法により、上記で説明した一般的な形質転換法の問題点を解決することできる。また、本発明に係るインプランタ形質転換法により所望の外来遺伝子を発現する形質転換植物体をより簡便でかつ効率的に得ることができる。
このように作出した植物のＴ０世代の形質転換植物体は稔性を示し、自家受粉させるか又は非形質転換植物体と交雑させることで、結実させることができる。このようにして、植物のＴ０世代の形質転換植物体の遺伝子型を継いだ次の世代の種子を多数、容易に得ることができる。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−３１５８２８号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、イネの種子における穿設部位１及び胚２を示す模式図である。
図２は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株のＴ−ＤＮＡ領域におけるＴｎ５の挿入部位の構造を示す。
図３は、ｐＩＧ１２１−ＨｍバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ領域の構造、並びに該Ｔ−ＤＮＡ領域におけるＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターとＧＵＳ遺伝子にまたがるＤＮＡ断片、及び該ＤＮＡ断片を増幅するｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。
図４は、プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）のＴ−ＤＮＡ領域の構造を示す。
図５は、プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を用いたプラスミドレスキューの方法を示す。
図６は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株を用いたインプランタ形質転換から６ヶ月後のイネ形質転換植物体（Ｔ０）及び非形質転換植物体（０世代）の写真を示す。
図７は、種子を播種して７日後のアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株で作出したイネ形質転換植物体（Ｔ１）及び非形質転換植物体（第１世代）の幼植物の写真を示す。
図８は、種子を播種して４８日後のアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株で作出したイネ形質転換植物体（Ｔ１）及び非形質転換植物体（第１世代）の写真を示す。
図９は、種子を播種して１４０日後のアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株で作出したイネ形質転換植物体（Ｔ１）及び非形質転換植物体（第１世代）の写真を示す。
図１０−１は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列、およびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。
図１０−２は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列、およびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。
図１０−３は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列、およびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。
図１０−４は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列、およびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。
図１０−５は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列、およびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。
図１０−６は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列、およびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。
図１０−７は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列、およびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。
図１０−８は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列、およびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。
図１０−９は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列、およびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。
図１０−１０は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列、およびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。
図１０−１１は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列、およびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。
図１０−１２は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列、およびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。
図１０−１３は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列、およびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。
図１１は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株により作出されたイネ形質転換植物体（Ｔ１）のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す。
図１２−１は、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列、およびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。
図１２−２は、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列、およびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。
図１２−３は、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列、およびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。
図１２−４は、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列、およびｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。
図１３は、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４株菌により作出されたイネ形質転換植物体（Ｔ０）のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す。
図１４は、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によって形質転換したイネ形質転換植物体（Ｔ１）由来のゲノムＤＮＡ断片に対するゲノミックサザーンハイブリダイゼーションの結果を示す。
図１５は、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によって形質転換したイネ形質転換植物体（Ｔ１）及び非形質転換植物体（第１世代）からそれぞれ得られた種子（Ｔ２及び第２世代）をバイグロマイシンＢ（２０ｐｐｍ）共存下で発芽させた際の吸水後６日目の写真を示す。
図１６は、プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によって形質転換されたイネ形質転換植物体（Ｔ０）のゲノムＤＮＡより回収されたプラスミド中のＴ−ＤＮＡに隣接するＤＮＡ（配列番号１５）の部分配列（第８番目〜第１４５番目）とデーターベース上でヒットした配列（アクセッション番号ＡＣ０８４７６４中の部分配列（第１番目〜第１３４番目）（配列番号１６））とのアライメントを示す。
図１７は、図１６のイネ形質転換植物体（Ｔ０）から得られた種子より生育させたイネ形質転換植物体（Ｔ１）及び非形質転換植物体（第１世代）の、種子を播種して９０日後の写真を示す。
図１８は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株を用いたインプランタ形質転換から３０日後のトウモロコシ形質転換植物体（Ｔ０）及び非形質転換植物体（０世代）の写真を示す。
図１９は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株で形質転換したトウモロコシ形質転換植物体（Ｔ１）の播種後８０日目の写真を示す。
図２０は、図１９に示すトウモロコシ形質転換植物体（Ｔ１）のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す。
図２１は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株又はｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターもしくはプラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によって形質転換したコムギ形質転換植物体（Ｔ０）及び非形質転換植物体（０世代）の、ポット移植後約４ヶ月の写真を示す。
図２２は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株又はｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターもしくはプラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によって形質転換したコムギ形質転換植物体（Ｔ１）及び非形質転換植物体（第１世代）の、播種後１１ヶ月後の写真を示す。
図２３は、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によって形質転換したコムギ形質転換植物体（Ｔ０）及び非形質転換植物体（０世代）からそれぞれ得られた種子（Ｔ１及び第１世代）をハイグロマイシンＢ（５０ｐｐｍ）共存下発芽させた際の吸水後９日目の写真を示す。
【符号の説明】
１  穿設部位
２  胚
【発明を実施するための最良の形態】
【実施例】  以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
［実施例１］アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株によるイネのインプランタ形質転換
（１）イネ（コシヒカリ）種子の準備
イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｖａｒ．Ｋｏｓｈｉｈｉｋａｒｉ）の種子（新籾）を水道水に浸種し、１５℃〜２０℃の温度で４８時間インキュベートした。この間に水を一度交換した。この処理により、種子が吸水することで、胚部分が白色を呈するようになった。この種子を以下の実験に使用した。
（２）アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の接種懸濁液の調製
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とリファンピシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中で２８℃で１８時間培養した。次いで菌体を遠心分離により回収し、水で洗浄した。洗浄後、１．０ｘ１０８菌体／ｍｌの濃度に菌体を水に懸濁し、これを接種懸濁液とした。
（３）アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株によるイネのインプランタ形質転換
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の接種懸濁液を針（φ０．７１ｍｍ）の先に付着させ、この針を用いて、上記のイネの種子における胚（長径約２ｍｍ）の出芽部中央を中心とする直径１ｍｍの円内に側面から１ヶ所、深さ１ｍｍ〜１．５ｍｍになるように穿設した（図１）。
次いでビーカーの中にバーミキュライトを少量入れ、その上にろ紙を敷き、水を注ぎ濡らした後、ビーカーを逆さまにして余分な水を切った。このろ紙の上に上記アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株を接種したイネの種子を置床して、アルミはくで蓋をした。これを２２℃の恒温器に入れて、暗所で９日間インキュベートした。９日間のインキュベート後、種子をクラフォラン（Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｍａｒｉｏｎ  Ｒｏｕｓｓｅｌ社製）の１０００ｐｐｍ水溶液に１時間浸漬した。次いでこの種子を洗浄しないでそのままハイポネックス１０００倍希釈液で湿らせたバーミキュライトを入れたポットへ移植し、約２５℃で１週間生育させた。
次に、イネ育苗用培土（（株）大塚産業）を入れた７号植木鉢を準備した。この鉢に上記のバーミキュライトポット中で生育したイネ幼苗を移植し、さらに生育させた（以下、「形質転換植物体（Ｔ０）」と呼ぶ）。
一方、対照として、水を針（φ０．７１ｍｍ）の先に付着させ、この針を用いて上記のようにイネの種子の胚（長径約２ｍｍ）の出芽部中央を中心とする直径１ｍｍの円内に側面から１ヶ所、深さ１ｍｍ〜１．５ｍｍになるように穿設し、形質転換植物体（Ｔ０）と同様に生育させた（以下、「非形質転換植物体（０（ゼロ）世代）」と呼ぶ）。
さらに、形質転換植物体（Ｔ０）及び非形質転換植物体（０世代）をそれぞれ自家受粉させ、結実させた。次いでそれぞれ形質転換植物体（Ｔ０）及び非形質転換植物体（０世代）から得られた種子を親世代（Ｔ０世代）と同様の生育条件下で栽培した。以下、それぞれの植物体を形質転換植物体（Ｔ１）及び非形質転換植物体（第１世代）と呼ぶ。
［実施例２］アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株によって形質転換したイネ形質転換植物体と非形質転換植物体との表現形質の差異
実施例１で作出した形質転換から６ヶ月後の形質転換植物体（Ｔ０）及び非形質転換植物体（０世代）の写真を図６に示す。また、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株を用いたイネのインプランタ形質転換効率を以下の表１に示す。
なお、形質転換は、上記で説明した表現形質（植物体の形態）の変化を指標として判定した。
0004754968.tif 000002
図６に示すように、形質転換植物体（Ｔ０）は健全に発芽し、成育の進行とともに草丈が非形質転換植物体（０世代）よりも大きくなるという形態変化を示した。また、表１から判るように、インプランタ形質転換に供した種子の約８０％が発芽した。また成長した形質転換植物体（Ｔ０）のほとんどが、上記で説明した表現形質（形態）の変化を示し、形質転換効率は約７０％であった。
また、種子を播種して７日後の形質転換植物体（Ｔ１）（（ａ）及び（ｂ）は、異なる形質転換植物体（Ｔ０）に由来する）及び非形質転換植物体（第１世代）の幼植物の写真を図７に示す。さらに、４８日後の形質転換植物体（Ｔ１）（（ａ）及び（ｂ）は、異なる形質転換植物体（Ｔ０）に由来する）及び非形質転換植物体（第１世代）の写真を図８に示す。また、１４０日後の形質転換植物体（Ｔ１）及び非形質転換植物体（第１世代）の写真を図９に示す。なお、図９中の矢印は、穂が付く位置を示す。
図７及び８に示すように、生育の初期においては、形質転換植物体（Ｔ１）の茎葉部及び根部の成長が非形質転換植物体（第１世代）よりも遅く、分げつも少なかった。根の発育が悪いのは導入されたＴ−ＤＮＡ中に含まれているサイトカイニン合成酵素遺伝子により植物体内のサイトカイニン量が増えたためだと考えられる。一方、図９に示すように、生育後期において、形質転換植物体（Ｔ１）は非形質転換植物体（第１世代）とは異なり穂が２段に付き、種子の収量（重量）が約１０％増加した。このように、形質転換植物体（Ｔ０）の表現形質は、次世代（Ｔ１）の形質転換植物体に遺伝した。
［実施例３］アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株によって形質転換したイネ形質転換植物体（Ｔ１）からのアグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴ−ＤＮＡ由来の遺伝子の検出
（１）イネ形質転換植物体（Ｔ１）からのゲノムＤＮＡの単離
Ｎｕｃｌｅｏｎ  Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  ＤＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて、製造元のプロトコールに従い、実施例１で作出した形質転換植物体（Ｔ１）の幼植物の茎頂にある若い葉からゲノムＤＮＡを抽出した。次いで抽出されたゲノムＤＮＡを、ＲＮａｓｅで３７℃、４５分間、その後プロテイナーゼＫで５５℃、１６時間処理した。次にゲノムＤＮＡ溶液をフェノール、フェノール／クロロホルム（１：１）溶液及びクロロホルムで抽出した。最後にゲノムＤＮＡに対してエタノール沈澱を行い、得られた沈澱を水１００μｌに溶解した。このように調製されたゲノムＤＮＡサンプルをアガロースゲルで電気泳動し、ＤＮＡの純度と量をチェックした。
（２）Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲによるアグロバクテリウム・ツメファシエンスＴ−ＤＮＡ由来の遺伝子の検出
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株においては、Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域に存在するｉａａＭ遺伝子の１，０５５番目と１，０５６番目の塩基の間にＴｎ５が挿入されている（図２）。従って、図１０−１〜図１０−１３及び配列番号１（アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列）に示すようにｉａａＭ遺伝子とＴｎ５にまたがるＤＮＡ断片（７６０ｂｐ）（この断片は本菌に固有の断片で、他の菌中には存在しない）を増幅するために、以下のｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲプライマーを設計した。
１回目のＰＣＲ用プライマー：
0004754968.tif 000003
２回目のＰＣＲ用プライマー：
0004754968.tif 000004
１回目のＰＣＲでは、上記のように調製したゲノムＤＮＡ（約１００ｎｇ）を、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ  ｄＮＴＰ、それぞれ０．２μＭの１回目のＰＣＲ用プライマー及び０．６３ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）からなる最終容量２５μｌの反応混合液に加えた。ＰＣＲは、最初９４℃で１分間の変性を行い、次いで９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で１分間（アニーリング）、及び７２℃で１分間（伸長）からなるサイクルを４０回繰り返し、その後７２℃で７分間の伸長を行った。
２回目のＰＣＲでは、１回目のＰＣＲ反応液２μｌを鋳型とし、２回目のＰＣＲ用プライマーを用いたこと以外は、１回目の条件と同様にしてＰＣＲを行った。２回目のＰＣＲ反応液１０μｌをアガロースゲル（１％）電気泳動に供し、臭化エチジウムで染色し、ＰＣＲ産物を確認した。また、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の全ＤＮＡを鋳型とし、上記の２回目のＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を陽性対照とした。
形質転換植物体（Ｔ１）のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を図１１に示した。図１１の各レーンは、以下の通りである。レーン１：ＤＮＡサイズマーカー、レーン２：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の全ＤＮＡ（陽性対照）、レーン３〜２４：それぞれ異なる形質転換植物体（Ｔ１）に由来するゲノムＤＮＡ。
図１１に示されるように、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株のＴｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域におけるＴｎ５とｉａａＭ遺伝子にまたがる本菌固有の７６０ｂｐのＤＮＡ断片が、形質転換植物体（Ｔ１）２２個体中１１個体に検出された。一方、非形質転換植物体（第１世代）からはこのＤＮＡ断片は検出されなかった。
これらの結果により、実施例２で示した形質転換植物体（Ｔ１）の表現形質の変化は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株に由来するＴｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域のイネゲノムへの挿入に起因すると考えられた。
［実施例４］ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によるイネのインプランタ形質転換
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の代わりにｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌を使用した以外は実施例１と同様の方法でイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｖａｒ．Ｋｏｓｈｉｈｉｋａｒｉ）の種子を形質転換し、植物体へ生育させた。なお、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌の接種懸濁液は、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）及びカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）並びにリファンピシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中で本菌を２８℃、１８時間培養して調製した。
［実施例５］ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によって形質転換したイネ形質転換植物体（Ｔ０）及びイネ形質転換植物体（Ｔ１）からのｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター由来の遺伝子の検出
（１）ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によって形質転換したイネ形質転換植物体（Ｔ０）からのｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター由来の遺伝子の検出
ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によって形質転換したイネ形質転換植物体（Ｔ０）は、非形質転換植物体（０世代）と比較して生育が抑制される個体や逆に草丈が大きくなる個体が出現し、表現形質が個体間で大きくばらついた。表現形質の変化とばらつきは、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター由来のＴ−ＤＮＡがイネゲノム中の種々の遺伝子座へ無作為に挿入され、遺伝子破壊やＴ−ＤＮＡ中に含まれる３５Ｓプロモーターによる下流遺伝子の発現の促進が起こったためであると考えられた。従って、この現象は高頻度でＴ−ＤＮＡがイネゲノムに挿入されていることを示唆していると考えられる。
植物の種子が成熟した時点ですでに胚部分には葉の原基が形成されている場合が多い。例えばイネの場合には、種子中に既に第３葉までの原基が形成されている（星川清親：解剖図説イネの生育、（社）農山魚村文化協会．昭和５０年１月１０日  第１刷発行）。それ故、本発明に係わるインプランタ形質転換法では、形質転換当代（Ｔ０）の植物体はキメラ状態になることが予想される。従って、Ｔ０世代の植物体の一部の組織細胞のゲノム分析の結果から、次世代（Ｔ１世代）のゲノムに外来遺伝子が導入されているかどうかを判定することはできない（生殖系列の細胞の染色体に挿入した外来遺伝子のみが次世代に伝達される）。しかしながら、アグロバクテリウム菌を接種した時点で、原基が未だ形成されていなかった第５葉以降の葉に外来遺伝子が導入されていることが確認できれば、頂芽の分裂細胞に外来遺伝子が導入されていると考えられ、高い確率で外来遺伝子が次世代に遺伝することが予想できる。
そこで、イネ形質転換植物体（Ｔ０）の第５葉以降の葉由来のＤＮＡを鋳型としたｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲによりｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター由来のＴ−ＤＮＡを確認し、形質転換効率を算出した。
ゲノムＤＮＡの単離方法及びｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲの条件は実施例３と同様であった。また、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを鋳型とし、上記の２回目のＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を陽性対照とした。なお、図３並びに図１２−１〜図１２−４及び配列番号６（ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列）に示すように、ｐＩＧ１２１−ＨｍのＴ−ＤＮＡ内のＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターとＧＵＳ遺伝子にまたがるＤＮＡ断片（６９２ｂｐ）を増幅するために、以下のｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲプライマーを設計した。
１回目のＰＣＲ用プライマー：
0004754968.tif 000005
２回目のＰＣＲ用プライマー：
0004754968.tif 000006
形質転換植物体（Ｔ０）のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を図１３に示す。図１３の各レーンは、以下の通りであった：レーン１：ＤＮＡサイズマーカー、レーン２及び３：ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター（陽性対照）、レーン４〜６：鋳型なし、レーン７〜１４：それぞれ異なる形質転換植物体（Ｔ０）に由来するゲノムＤＮＡ。
図１３に示すように、形質転換植物体（Ｔ０）の８個体のうち６個体において、ｐＩＧ１２１−ＨｍバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ内のＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターとＧＵＳ遺伝子にまたがるＤＮＡ断片（６９２ｂｐ）が検出された。従って、第５葉の形質転換効率は７５％（８個体中６個体）であったので、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌とｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターの組み合わせでもアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株と同程度の確率で形質転換が起きていると判断された。
（２）ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によって形質転換したイネ形質転換植物体（Ｔ１）からのｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター由来の遺伝子の検出
上記（１）でｐＩＧ１２１−ＨｍバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ内のＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターとＧＵＳ遺伝子にまたがるＤＮＡ断片が検出された形質転換植物体（Ｔ０）を、実施例１と同様の方法で自家受粉させ、結実させた。次いで、得られた種子から形質転換植物体（Ｔ１）を生育させた。
生育した形質転換植物体（Ｔ１）から実施例３と同様にしてゲノムＤＮＡを単離し、Ｐｓｔ  Ｉ／Ｈｉｎｄ  ＩＩＩで二重消化した後、アガロースゲル電気泳動に供した。次いで、常法によりＤＮＡを電気泳動後のアガロースゲルからＨｙｂｏｎｄＮ＋メンブラン（アマシャムバイオサイエンス社製）上にブロッティングした。
一方、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの約７００ｂｐに相当するＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した後、このＤＮＡ断片をＢｃａＢｅｓｔラベリングキット（タカラ社製）を用いて３２Ｐで標識し、プローブを作製した。
次いで、上記で作製したプローブを使用して、ＨｙｂｏｎｄＮ＋メンブラン上に転写されたゲノムＤＮＡ断片を、ゲノミックサザーンハイブリダイゼーションに供した。ゲノミックサザーンハイブリダイゼーションの結果を図１４に示す。なお、図１４において、アルファベットで示した各レーンは、各々別の形質転換植物体（Ｔ１）に由来するゲノムＤＮＡ断片である。さらに、図１４において、矢印の位置は、検出されたＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターのＤＮＡ断片を含むバンドである。
図１４に示されるように、明瞭なバンドを示す形質転換植物体（Ｔ１）が観察された。従って、形質転換植物体（Ｔ１）において、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター由来のＴ−ＤＮＡ領域がイネのゲノムＤＮＡ内に確かに挿入されていると判断された。
［実施例６］ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によって形質転換したイネ形質転換植物体（Ｔ２）のハイグロマイシン耐性の評価
ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターは、図３に示すように、Ｔ−ＤＮＡ領域内にハイグロマイシン耐性遺伝子を有する。そこで、イネ形質転換植物体（Ｔ２）の形質転換の確認を、ハイグロマイシン耐性を指標として行った。
実施例５（２）においてゲノミックサザーンハイブリダイゼーションで明瞭なバンドが観察された形質転換植物体（Ｔ１）を実施例１と同様の方法で自家受粉させ、結実させた。得られた種子を、２０ｐｐｍのハイグロマイシンＢを含む又は含まない水溶液中で生育させた（以下、「形質転換植物体（Ｔ２）」と呼ぶ）。
一方、対照として、実施例１と同様にして、非形質転換植物体（０世代）から自家受粉と結実を２回繰り返して作出した非形質転換植物体を形質転換植物体（Ｔ２）同様に生育させた（以下、「非形質転換植物体（第２世代）」と呼ぶ）。
吸水後６日目の形質転換植物体（Ｔ２）及び非形質転換植物体（第２世代）の写真を図１５に示す。
図１５に示すように、ハイグロマイシンＢ（２０ｐｐｍ）存在下において、非形質転換植物体（第２世代）と比べ、茎葉部の生育が健全な形質転換植物体（Ｔ２）が認められ、形質転換植物体（Ｔ２）は、ハイグロマシンＢに対して耐性を示すことがわかった。従って、イネゲノム内に挿入されたｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター由来のＴ−ＤＮＡ領域は後代に遺伝することが示された。
［実施例７］プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によるイネのインプランタ形質転換
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の代わりにプラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）（図４に示すＴ−ＤＮＡ領域の構造を有する）を有するＬＢＡ４４０４菌を使用した以外は実施例１と同様の方法でイネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ  ｖａｒ．Ｋｏｓｈｉｈｉｋａｒｉ）の種子を形質転換し、植物体へ生育させた（以下、「形質転換植物体（Ｔ０）」と呼ぶ）。なお、プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌の接種懸濁液は、実施例４に記載のｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌の接種懸濁液と同様の方法で調製した。
［実施例８］プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によって形質転換したイネ形質転換植物体（Ｔ０）からのプラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）由来の遺伝子の検出
実施例７で作出した形質転換植物体（Ｔ０）の止葉から実施例３と同様にしてゲノムＤＮＡを単離し、Ｓｐｈ  Ｉで消化した。
図５に示すように、形質転換によりプラスミドレスキュー用バイナリーベクターのＴ−ＤＮＡ領域がイネゲノムＤＮＡに組み込まれた場合には、上記で得られた消化物の中には、プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）中のｐＢＲ３２２プラスミド由来の複製開始領域（ｏｒｉ）及びアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒ）を含むＤＮＡ断片と、組み込まれたＴ−ＤＮＡに隣接するイネゲノムＤＮＡ断片とが連結したＤＮＡ断片が含まれるはずである。そこで、図５に従って、得られた消化物をセルフライゲーションして、環状化させた後、プラスミドとして大腸菌へ導入した。
形質転換した大腸菌を、アンピシリン含有培地で培養し、増殖させた。次いで、得られたアンピシリン耐性のコロニー中の大腸菌からプラスミドを単離した。
得られたプラスミドを鋳型にして、下記のｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行い、隣接イネゲノムＤＮＡ部分を増幅し、その塩基配列を決定した。
１回目のＰＣＲではＬ４１とＬ２７プライマーを使用した。
プライマーＬ４１（ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの配列に基づいて設計したセンスプライマー）：５’−ｇｃｇｔｃａｔｃｃｃｔｔａｃｇｔｃａｇｔ−３’（配列番号１１）
プライマーＬ２７（アンピシリン耐性遺伝子Ａｍｐｒの配列に基づいて設計したアンチセンスプライマー）：５’−ｃｔｇｔｇａｇａｔｃｃａｇｔｔｃｇａｔｇ−３’（配列番号１２）
１回目のＰＣＲでは、実施例３と同様な方法で、上記プライマーセットを用いＰＣＲを行った。但し、本実験のＰＣＲは最初９４℃で１分間の変性を行い、次いで、９４℃で３０秒間（変性）、５８℃で１分間（アニーリング）、および７２℃で２分間（伸長）からなるサイクルを４０回繰り返し、その後７２℃で５分間伸長した。
次の２回目のＰＣＲでは、１回目のＰＣＲ産物を鋳型とし、下記のプライマーセット（Ｌ−９／Ｌ２４）を用いたこと以外は、１回目の条件と同様にしてＰＣＲを行った。
プライマーＬ−９（ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの配列に基づいて設計したセンスプライマー）：５’−ｔｃｔｔｇａｔｇａｇａｃｃｔｇｃｔｇｃｇ−３’（配列番号１３）
プライマーＬ−２４（アンピシリン耐性遺伝子ＡｍｐｒとＴ−ＤＮＡ右境界配列との間の配列に基づいて設計したアンチセンスプライマー）：５’−ｔｇｇｃｃｇｔｃｇｔｔｔｔａｃａａｃｇｔ−３’（配列番号１４）
２回目のＰＣＲ産物を鋳型にし、上記プライマーＬ−９をシークエンスプライマーとして用いて、ＤＮＡ配列決定分析を行った。
次いで、決定したＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を相同性検索（ＢＬＡＳＴ  ｓｅａｒｃｈ）に供した。図１６に、ＰＣＲ産物（配列番号１５）の部分配列（第８番目〜第１４５番目）と、データベース上でヒットした配列（アクセッション番号ＡＣ０８４７６４中の部分配列（第１番目〜第１３４番目）（配列番号１６））とのアライメントを示す。なお、ＰＣＲ産物（配列番号１５）において、ｎは、ａ、ｃ、ｇ又はｔを表す（存在位置：３７、８３、１１２、１３６、１５０、１５２、１５７、１８０、１９７、２００、２０４、２１２、２１５及び２１６）。
図１６に示すように、相同性分析の結果、ＰＣＲ産物（配列番号１５）中の部分配列に対してイネ由来の配列（アクセッション番号ＡＣ０８４７６４）（配列番号１６）がヒットした。この結果から、イネ形質転換植物体（Ｔ０）のゲノムＤＮＡより回収されたプラスミド中のＴ−ＤＮＡに隣接してイネゲノムＤＮＡ断片が連結していたことが判明した。従って、プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）のＴ−ＤＮＡ領域がイネゲノムＤＮＡ中に挿入されていることが示された。
［実施例９］プラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によって形質転換したイネ形質転換植物体（Ｔ１）と非形質転換植物体（第１世代）との表現形質の差異
実施例８においてプラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）のＴ−ＤＮＡ領域の挿入が確認された一つの形質転換体（Ｔ０）を実施例１と同様の方法で自家受粉させ、結実させた。次いで、得られた種子から植物体を生育させた（以下、「形質転換植物体（Ｔ１）」と呼ぶ）。一方、対照として、実施例１と同様の方法で、非形質転換植物体（０世代）から自家受粉と結実を１回繰り返して作出した非形質転換植物体を形質転換植物体（Ｔ１）同様に生育させた（以下、「非形質転換植物体（第１世代）」と呼ぶ）。
種子を播種して、９０日後の形質転換植物体（Ｔ１）及び非形質転換植物体（第１世代）の写真を図１７に示す。
図１７に示すように、Ｔ０世代と同じように、非形質転換植物体（第１世代）と比較して、形質転換植物体（Ｔ１）は、草丈が高いという表現形質を示した。
［実施例１０］イネ形質転換植物体におけるアグロバクテリウム・ツメファシエンス残存の可能性の検証
イネ形質転換植物体（Ｔ０）及び形質転換植物体（Ｔ１）において、形質転換に用いたアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株或いはアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌が残存するか否かを検証した。
実施例３においてゲノムＤＮＡを抽出した時と同様にして、実施例１及び４で作出したイネ形質転換植物体（Ｔ０及びＴ１）の茎頂の若い葉をそれぞれ滅菌水中で無菌的に磨砕し、その磨砕液をカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とリファンピシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地上で２８℃で３日間培養した。その結果、Ｔ０とＴ１のいずれの形質転換植物体の磨砕液を塗布した培地上にもコロニーが全く見られなかった。この結果から、形質転換植物体（Ｔ０及びＴ１）には、形質転換に用いたアグロバクテリウム・ツメファシエンスは残存していないことが判明した。アグロバクテリウム菌は宿主植物の抵抗性反応により除去されたと推定される。
以上から、実施例３及び実施例５で検出されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株及びｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌のＴ−ＤＮＡ由来の遺伝子は、形質転換植物体（Ｔ０及びＴ１）の植物ゲノムに組み込まれたＴ−ＤＮＡに由来するものであることが判明した。
［実施例１１］アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株によるトウモロコシのインプランタ形質転換
（１）トウモロコシ（キャルコーン９０）種子の準備
トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ  ｖａｒ．Ｃａｌｃｏｒｎ）の種子を水道水で２〜３回洗い、種皮に付いている赤色の殺菌剤を洗い落とした。この種子を水道水中に浸漬して、２５℃の温度で３日間インキュベートした。この間に水を１回交換した。この処理により、種子が吸水して胚部分が白色を呈するようになった。この種子を以下の実験に使用した。
（２）アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の調製
実施例１と同様の方法でアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の接種懸濁液を調製した。
（３）アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株によるトウモロコシのインプランタ形質転換
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の接種懸濁液を針（φ０．７１ｍｍ）の先に付着させた。この針を用いて上記トウモロコシの種子における胚（長径約１ｃｍ）の幼芽部分（種子を、尖帽が下にくるように置いた場合、胚の中央部よりも上部に存在する）に上から２ヶ所、深さ１ｍｍ〜１．５ｍｍになるように穿設した後、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の接種懸濁液を浸した綿棒を用いて穿孔箇所にアグロバクテリウム菌を塗布した。
次いで、シャーレ中にろ紙を敷き、ろ紙を水で湿らせた。その上にアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株を接種したトウモロコシの種子を置床して、シャーレの蓋をした。これを２５℃の恒温器に入れて、暗所で２日間インキュベートした。
２日間のインキュベーション後、少し発根した種子をそのままバーミキュライトと赤玉土１：１混合培土（肥料としてＭａｇアンプＫ（ハイポネックス  ジャパン社製）を５ｇ添加）へ播種して、生育させた（以下「形質転換植物体（Ｔ０）」と呼ぶ）。
一方、対照として、いずれの処理も施さない種子、或いはアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の代わりにバイナリーベクターを有しないアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌を接種した種子を、形質転換植物体（Ｔ０）と同様に生育させた（以下、「非形質転換植物体（０世代）」と呼ぶ）。
さらに、トウモロコシは他殖性作物であるため、形質転換植物体（Ｔ０）とバイナリーベクターを有しないアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌を接種した非形質転換植物体（０世代）とを交雑させ、結実させることで得られた種子を親世代と同様の生育条件下で生育した（以下、「形質転換植物体（Ｔ１）」と呼ぶ）。一方、対照として、非形質転換植物体（０世代）と他の非形質転換植物体（０世代）とを交雑させ、結実させることで得られた種子を親世代と同様の生育条件下で生育した（以下、「非形質転換植物体（第１世代）」と呼ぶ）。
［実施例１２］アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株により形質転換したトウモロコシ形質転換植物体（Ｔ０）と非形質転換植物体（０世代）との表現形質の差異
形質転換から３０日後の形質転換植物体（Ｔ０）及び非形質転換植物体（０世代）の写真を図１８に示す。また、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株を用いたトウモロコシのインプランタ形質転換効率を以下の表２に示す。
なお、形質転換は、上記で説明した表現形質（形態）の変化を指標として判定した。
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図１８に示すように、形質転換植物体（Ｔ０）は、イネの場合とは対照的に、生育初期の段階では非形質転換植物体（０世代）よりも草丈が大きく茎が太くなった。また、表２から判るように表現形質（形態）の変化を指標とした形質転換効率は１００％であった。
また、種子を播種して８０日後のＴ１世代の形質転換植物体及び非形質転換植物体の写真を図１９に示す。なお、図１９中の植物体の写真は、以下の植物体を示す。（ａ）非形質転換植物体：非形質転換植物体（第１世代）、（ｂ）形質転換植物体（Ｔ１）：形質転換植物体（Ｔ０）と非形質転換植物体（０世代）とを交雑させた後、非形質転換植物体（０世代）から収穫した種子に由来する形質転換植物体（Ｔ１）、（ｃ）形質転換植物体（Ｔ１）：形質転換植物体（Ｔ０）と非形質転換植物体（０世代）とを交雑させた後、形質転換植物体（Ｔ０）から収穫した種子に由来する形質転換植物体（Ｔ１）。
図１９に示すように、生育後期にはイネとは対照的に形質転換植物体（Ｔ１）は、非形質転換植物体よりも草丈が低くなった。また、非形質転換植物体の場合には雄穂が出た後で雌穂が発達するが、形質転換植物体（Ｔ１）では発達の順序が逆であった。さらに、非形質転換植物体と比較して、形質転換植物体（Ｔ１）では下葉が早く枯れ、種子に付く絹糸が短くなっていた。このように、形質転換植物体（Ｔ０）の表現形質は、次世代（Ｔ１世代）の形質転換植物体に遺伝した。
［実施例１３］アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株によって形質転換されたトウモロコシ形質転換植物体（Ｔ１）からのアグロバクテリウム・ツメファシエンスＴ−ＤＮＡ由来の遺伝子の検出
ゲノムＤＮＡの単離及びｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲの方法は実施例３と同様であった。ゲノムＤＮＡは、実施例１１における形質転換植物体（Ｔ１）から調製した。
形質転換植物体（Ｔ１）のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を図２０に示した。図２０に示されるように、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株のＴｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域におけるＴｎ５とｉａａＭ遺伝子にまたがる本菌固有の７６０ｂｐのＤＮＡ断片が、形質転換植物体（Ｔ１）１２個体中８個体に検出された。なお、非形質転換植物体からはこのＤＮＡ断片は検出されなかった。
これらの結果により、実施例１２で示した形質転換植物体（Ｔ１）の表現形質は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株に由来するＴｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域のトウモロコシ染色体への挿入に起因すると考えられた。
［実施例１４］トウモロコシ形質転換植物体におけるアグロバクテリウム・ツメファシエンス残存の可能性の検証
トウモロコシ形質転換植物体（Ｔ０及びＴ１）において、形質転換に用いたアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株が残存するか否かを検証した。
実施例３においてゲノムＤＮＡを抽出した時と同様にして、実施例１１で作出した形質転換植物体（Ｔ０及びＴ１）の茎頂の若い葉を滅菌水中で無菌的にホモジナイズし、そのホモジネートをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とリファンピシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地上で、２８℃で３日間培養した。その結果、Ｔ０とＴ１のいずれの形質転換植物体のホモジネートを塗布した培地上にもコロニーは全く見られなかった。この結果から、形質転換植物体（Ｔ０及びＴ１）において、形質転換に用いたアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株は残存していないことが判明した。
以上から、実施例１３で検出されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株のＴ−ＤＮＡ由来の遺伝子は、形質転換植物体（Ｔ０及びＴ１）のゲノムに組み込まれたＴ−ＤＮＡに由来するものであることが判明した。
［実施例１５］アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株又はｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターもしくはプラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によるコムギのインプランタ形質転換
（１）コムギ（シラネコムギ）種子の準備
コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  Ｌ．ｖａｒ．Ｓｈｉｒａｎｅｋｏｍｕｇｉ）の種子を水道水に浸漬し、１５℃〜２０℃の温度で４０時間インキュベートした。この処理により種子が吸水して胚部分の輪郭が明瞭になる。この種子を以下の実験に使用した。
（２）アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株及びｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター又はプラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌の接種懸濁液の調製
実施例１と同様の方法で、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株及びｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター又はプラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌の接種懸濁液を調製した。
（３）アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株又はｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターもしくはプラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によるコムギのインプランタ形質転換
上記（２）で調製した３種のアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌の接種懸濁液を各々針（φ０．７１ｍｍ）の先に付着させ、この針を用いて上記（１）で吸水させたコムギの種子の胚部分（長径約２ｍｍ）の中央部に深さ１ｍｍ〜１．５ｍｍになるように上から１回穿設した。
次いでビーカーの中にバーミキュライトを少量入れて、水を注ぎ、濡らした。この上に上記３種のアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌を各々接種したコムギの種子を置床して、その上に乾燥しているバーミキュライトを薄く被せた後、ラップで蓋をして１５℃〜２０℃で２日間インキュベートした。２日間のインキュベーション後、３℃〜５℃の冷蔵庫へ上記ビーカーを移し、２５日間保持した（バーナリゼーション：この間に葉が３ｃｍ〜５ｃｍに伸びる）。バーナリゼーションの後、冷蔵庫から上記ビーカーを出して室温（１５℃〜２０℃）に馴化した後、バーミキュライトと赤玉土を１：１に混ぜた培養土を入れたポットに、植物体を移植して、ＭｇアンプＫ（ハイポネックスジャパン社製）を肥料として使用し、栽培した（以下、「形質転換植物体（Ｔ０）」と呼ぶ）。
一方、対照として、水を針（φ０．７１ｍｍ）の先に付着させ、この針を上記（１）で吸水させたコムギの種子の胚部分（長径約２ｍｍ）の中央部に深さ１ｍｍ〜１．５ｍｍになるように上から１回穿設し、形質転換植物体（Ｔ０）と同様に生育させた（以下、「非形質転換植物体（０世代）」と呼ぶ）。
［実施例１６］アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株又はｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターもしくはプラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によって形質転換したコムギ形質転換植物体と非形質転換植物体との表現形質の差異
ポットに移植してから約４ヶ月後の実施例１５で作出したコムギ形質転換植物体（Ｔ０）及び非形質転換植物体（０世代）の写真を図２１に示す。図２１に示す各ポットには、それぞれ１０個の形質転換植物体（Ｔ０）又は非形質転換植物体（０世代）が移植されている。
図２１に示すように、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株で形質転換された形質転換植物体（Ｔ０）は、ほぼ全てが非形質転換植物体（０世代）よりも早く黄化した。この表現形質の変化は、導入されたＴ−ＤＮＡ中に含まれているサイトカイニン合成酵素遺伝子により植物体内のサイトカイニン量が増えたためと推定された。従って、この結果は、高い効率で形質転換が起こっていることを示唆している。一方、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター又はプラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌で形質転換された形質転換植物体（Ｔ０）は、Ｔ０世代では明瞭な表現形質の変化が観察されなかった。
そこで、形質転換植物体（Ｔ０）及び非形質転換植物体（０世代）をそれぞれ自家受粉させ、結実させた。次いで、それぞれ形質転換植物体（Ｔ０）及び非形質転換植物体（０世代）から得られた種子を無作為に１０個ずつ選び、親世代（Ｔ０世代）と同様の生育条件下で栽培した（以下、それぞれ「形質転換植物体（Ｔ１）」及び「非形質転換植物体（第１世代）」と呼ぶ）。
播種後１１ヶ月後の形質転換植物体（Ｔ１）及び非形質転換植物体（第１世代）の写真を図２２に示す。図２２に示す各ポットには、それぞれ１０個の形質転換植物体（Ｔ１）又は非形質転換植物体（第１世代）が栽培されている。
図２２に示すように、各形質転換植物体（Ｔ１）は、非形質転換植物体（第１世代）よりも種子重量（収量）が少ないという表現形質を示した。
このように、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター又はプラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌で形質転換された形質転換植物体は、Ｔ１世代で表現形質の変化が観察された。従って、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター又はプラスミドレスキュー用バイナリーベクター（ｐＢＩ−Ｒｅｓ）を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌で形質転換された形質転換植物体についても形質転換が成功していることが示唆された。
［実施例１７］ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によって形質転換したコムギ形質転換植物体（Ｔ１）のハイグロマイシン耐性の評価
実施例１６と同様に、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌によって形質転換したコムギ形質転換植物体（Ｔ０）及び非形質転換植物体（０世代）をそれぞれ自家受粉させ、結実させた。次いで、それぞれ形質転換植物体（Ｔ０）及び非形質転換植物体（０世代）から得られた種子を５０ｐｐｍのハイグロマイシンＢを含む又は含まない水溶液中で生育させた。
吸水開始後９日目の植物体の形質転換植物（Ｔ１）及び非形質転換植物（第１世代）の写真を図２３に示す。
図２３に示すように、ハイグロマイシンＢ（５０ｐｐｍ）存在下で、非形質転換植物体（第１世代）と比べ、茎葉部の生育が健全な形質転換植物体（Ｔ１）が認められ、形質転換植物体（Ｔ１）は、ハイグロマシンＢに対して耐性を示すことがわかった。上述したように、ｐＩＧ１２１−ＨｍバイナリーベクターはＴ−ＤＮＡ領域内にハイグロマイシン耐性遺伝子を有する。従って、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＬＢＡ４４０４菌により導入されたＴ−ＤＮＡはコムギゲノム中に挿入されて、次世代に遺伝すると考えられた。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明により、植物の形質転換体をより簡便でかつ効率的に得られる植物のインプランタ形質転換法が提供される。本発明によれば、品種や種にとらわれずに、培養や再分化が困難なために形質転換が難しい植物を、低コストで高効率に形質転換することができる。従って、本発明により、経済上及び農業上付加価値を有する植物の作物を作出することができる。
【配列表フリーテキスト】  配列番号１は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列である。
配列番号２〜５及び７〜１４は、プライマーである。
配列番号６は、ｐＩＧ１２１−Ｈｍバイナリーベクター上のＴ−ＤＮＡ領域の塩基配列である。
配列番号１５は、ＰＣＲ産物である。
配列番号１５において、ｎは、ａ、ｃ、ｇ又はｔを表す（存在位置：３７、８３、１１２、１３６、１５０、１５２、１５７、１８０、１９７、２００、２０４、２１２、２１５及び２１６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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