(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルカリ溶液中で改良された洗浄性能を有するα−アミラーゼであって、
（ａ）配列番号２の位置１−556に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は
（ｂ）エスシェリシア・コリDSM13001 (NN049489) に存在するプラスミドpAJ386中にクローン化された配列番号１に示されるα−アミラーゼ遺伝子によりコードされるポリペプチド、又は
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に定義されるポリペプチドと少なくとも90％の同一性を有するポリペプチド、
であるα−アミラーゼ。
【請求項２】
37℃で測定される場合、pH7.3での活性よりも少なくとも２倍高い、pH10.5での活性を有する、請求項１に記載のα−アミラーゼ。
【請求項３】
37℃で測定される場合、pH7.3での活性よりも少なくとも４倍高い、pH9.5での活性を有する、請求項１又は２に記載のα−アミラーゼ。
【請求項４】
37℃で測定される場合、9.5の最適pHを有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
【請求項５】
バチルスの株に由来する請求項１〜４のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
【請求項６】
前記バチルスの株がバチルスsp. NCIMB40916株である請求項５に記載のα−アミラーゼ。
【請求項７】
20％のSTPP、25％のNa2SO4、15％のNa2CO3、20％のLAS、5％のC12−C15アルコールエトキシレート、5％のNa2Si2O5、0.3％のNaClを含む、3g/lの試験洗浄剤の溶液におけるpH10.5及び６度のドイツ硬度で25℃での20分間のインキュベーションの後、その活性の90％以上を保持し、そして同じ溶液における30℃での20分間のインキュベーションの後、その活性の90％以下を保持する請求項１〜６のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
【請求項８】
SDS−PAGEにより決定される場合、55kDaの分子量を有する請求項１〜７のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
【請求項９】
等電点電気泳動により決定される場合、５の等電点を有する請求項１〜８のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
【請求項１０】
非ダスト化粒質物又は安定化された液体である洗浄添加剤の形で存在する請求項１〜９のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ。
【請求項１１】
請求項１〜10のいずれか１項に記載のαアミラーゼをコードするDNA。
【請求項１２】
請求項11に記載のDNAであって、
（ａ）配列番号１の位置94−1764に示されるDNA、
（ｂ）エスシェリシア・コリDSM13001 (NN049489) に存在するプラスミドpAJ386中にクローン化された配列番号１に示されるα−アミラーゼ遺伝子、又は
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）に定義されるDNAと少なくとも90％の同一性を有するDNA。
【請求項１３】
細菌に由来する、請求項11又は12に記載のDNA。
【請求項１４】
前記細菌がバチルスである、請求項13に記載のDNA。
【請求項１５】
前記バチルスがNCIMB40916株である請求項14に記載のDNA。
【請求項１６】
請求項11〜15のいずれか１項記載のDNAを含んで成る組換え発現ベクター。
【請求項１７】
請求項11〜15のいずれか１項に記載のDNA又は請求項16に記載の組換え発現ベクターにより形質転換された細胞。
【請求項１８】
原核細胞、又は前記DNAが起因する細胞である請求項17に記載の細胞。
【請求項１９】
前記原核細胞が細菌細胞である、請求項18に記載の細胞。
【請求項２０】
前記細菌細胞が、バチルス又はエスシェリシアに属する請求項19記載の細胞。
【請求項２１】
前記エスシェリシアがE.コリである、請求項20に記載の細胞。
【請求項２２】
請求項17〜21のいずれか１項記載の細胞を培養する工程を含んで成る、請求項１〜10のいずれか１項に記載のα−アミラーゼの生成方法。
【請求項２３】
バチルスの株NCIMB 40916を培養する工程を含んで成る請求項１〜10のいずれか１項に記載のα−アミラーゼの生成方法。
【請求項２４】
請求項１〜10のいずれか１項に記載のα−アミラーゼ及び界面活性剤を含んで成る洗浄剤組成物。
【請求項２５】
水溶液において8.5〜11のpHを有する請求項24記載の洗浄剤組成物。
【請求項２６】
前記pHが９〜10.5である、請求項25に記載の洗浄剤組成物。
【請求項２７】
洗濯洗浄剤である請求項24〜26のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、低温でアルカリ洗浄溶液において改良された洗浄性能を有するアミラーゼに関する。
【０００２】
発明の背景：
長年、α−アミラーゼ酵素は、種々の異なった目的、最も重要なことは、澱粉液化、織物糊抜き、製紙及びパルプ産業における澱粉変性、及び醸造及びベーキングのために使用されて来た。ますます重要になって来ているα−アミラーゼのさらなる使用は、アルカリ性pHでの洗浄剤による洗浄の間、澱粉染色の除去である。
【０００３】
市販のα−アミラーゼ製品の例は、Novo Nordisk A/S, Denmarkから入手できる、Termamyl（商標）, BAN（商標） 及びFungamyl（商標） である。他の市販源からのそれらの及び類似する製品は、典型的には、pH5〜pH7.5の範囲で、酸性〜中性pH最適性を有し、そしてそれらは、アルカリ性pHでの洗浄剤溶液において最適活性を示さない。
WO95/26397号は、pH8で最適活性を有する、バチルス株からのα−アミラーゼを開示する。WO96/23873号は、洗浄条件下で改良された性能を有するバチルス変異体アミラーゼを記載する。
【０００４】
アメリカ特許第5,147,796号は、α−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラナーゼを記載する。この特許の図2bは、pH8−8.5での最適アミラーゼ活性を示す。
M. Takagiなど., J. Ferment. Bioeng. Vol82, No.6, 557-559 (1996)は、バチルスsp.からの親アルカリ性α−アミラーゼ−プルラナーゼを記載する。この酵素は、pH9で最適アミラーゼ活性を有するが、しかしその活性はより高いpHで急速に低下し、そしてpH10での活性はpH7での活性よりも低い。
アルカリ性溶液、特に９〜11近くのpHでのアルカリ性洗浄剤溶液において改良された性能を有する新規α−アミラーゼを供給することが本発明の目的である。
【０００５】
発明の要約：
本発明は、
ａ）バチルスsp. NCIMB40916により生成されるポリペプチド、又は
ｂ）配列番号２の位置１−556に示されるようなアミノ酸配列に有するポリペプチド、又は
ｃ）エスシェリシア・コリDSM13001 (NN049489) に存在するプラスミド中にクローン化されたDNA配列のα−アミラーゼコード部分によりコードされるポリペプチド、又は
ｄ）i）前記（ａ）又は（ｂ）に定義されるポリペプチドと少なくとも60％相同性であるか、又は
ii) １又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入により前記ポリペプチド起因する、前記ポリペプチドの類似体であるα−アミラーゼを提供する。
【０００６】
もう１つの観点においては、本発明は、１又は複数の次の特徴を有するα−アミラーゼを提供する：
・37℃で測定される場合、pH7.3での活性よりも少なくとも２倍高い、pH10.5での活性；
・37℃で測定される場合、pH7.3での活性よりも少なくとも４倍高い、pH9.5での活性；
・37℃で測定される場合、約9.5の最適pH；
【０００７】
・20％のSTPP、25％のNa2SO4、15％のNa2CO3、20％のLAS、5％のC12−C15アルコールエトキシレート、5％のNa2Si2O5、0.3％のNaClを含む、3g/lの試験洗浄剤の溶液におけるpH10.5で25℃での20分間のインキュベーションの後、その活性の90％以上を保持し、そして同じ溶液における30℃での20分間のインキュベーションの後、その活性の90％以下を保持するするような熱安定性；
・SDS−PAGEにより決定される場合、約55kDaの分子量；
・等電点電気泳動により決定される場合、約５の等電点。
【０００８】
本発明はまた、α−アミラーゼをコードする単離されDNA配列を提供し、ここで前記α−アミラーゼは上記に記載されるα−アミラーゼであり、又は前記DNA配列は、
ａ）配列番号１の位置94−1764に示されているDNA配列、又は
ｂ）i)前記DNAと少なくとも60％相同であり、又は
ii)少なくとも55℃で前記DNA配列とハイブリダイズする、ａ）において定義されたDNAの類似体を含んで成る。
【０００９】
本発明の他の観点は、前記DNA配列を含んで成る組換え発現ベクター、及び前記DNA配列又は組換え発現ベクターにより形質転換された細胞を提供する。
本発明はまた、前記細胞、及び前記α−アミラーゼを含んで成る洗浄剤組成物を培養することによってα−アミラーゼを生成するための方法を提供する。
【００１０】
発明の特定の記載：
微生物源：
本発明のα−アミラーゼは、バチルスの株に由来することができる。好ましい株は、バチルスsp. NCIMB40916である。この株は、National Collection of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland, United Kingdomに、特許手続の目的のための微生物の寄託の国際的承認に基づくブダペスト条約下で発明者により、1998年１月28日に寄託された。プラスミドpJA386においてクローン化された配列番号１で示されるα−アミラーゼ遺伝子を含むNN049489と称するE.コリ株はまた、Deutshe Sammmlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig DEに、ブダペスト条約下で、1999年8月７日に寄託され、そして受託番号DSM13001が付与された。
【００１１】
α−アミラーゼの生成：
本発明のα−アミラーゼは、適切な栄養培地において、バチルスの適切なアミラーゼ生成株又は本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、そして前記培養培地からα−アミラーゼを回収することによって生成され得る。
細胞を培養するために使用される培地は、問題の宿主細胞を増殖し、そして本発明のα−アミラーゼの発現を得るために適切ないずれかの従来の培地であり得る。適切な培地は、市販されており、又は公開されているレセピー（例えば、American Type Culture Collection のカタログに記載されるような）に従って調製され得る。
【００１２】
宿主細胞から分泌されるα−アミラーゼは、遠心分離又は濾過により培地から細胞を分離し、そして塩、例えば硫酸アンモニウムによりタンパク質成分を沈殿し、続いてクロマトグラフィー方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又は同様のものを用いることを包含する良く知られている方法により培養培地から回収され得る。
【００１３】
α−アミラーゼの性質：
好ましいα−アミラーゼは、バチルスsp. NCIMB40916に由来する。それは、実施例に記載のようにして生成され得る。アミラーゼの十分な長さのアミノ酸配列及びそれをコードするDNAは、配列番号１及び２で示される。次の特徴が、本発明のアミラーゼ（NCIMB40916からの精製されたα−アミラーゼ）について見出された：
Novex、すなわち４−25％のグラジエントゲルを用いて、SDS−PAGEにより決定される場合、約55kDaの分子量。
約５のpIが，等電点電気泳動（Ampholine PAG, pH3.5-9.5）により決定された。
【００１４】
pH−活性曲線が図１に示され、ここでpH7.3での活性が100％として取られる。それは、特に種々のpH値に調節された50mMのBritten−Robinson緩衝液を用いてのPhadebesアッセイを用いて決定された。参照のために、２種の従来技術のバチルスアミラーゼ（B.リケニホルミス由来のTermamyl，及びWO95/26397号に従って生成されたSP722）のpHプロフィールが、同じ条件下で測定され、そしてまた図１に示される。図１は、本発明のアミラーゼがpH9.5で２種の従来のアミラーゼよりも約10倍高い活性を有することを示す。図１はまた、最適活性が約pH9.5であることを示す。
【００１５】
温度−活性曲線が、pH9.5に調節された50mMのBritten−Robinson緩衝液により種々の温度でPhadebasアッセイを用いて測定された。その結果は、図２に示される。本発明のアミラーゼが約55℃で最適活性を有することが、図２から見出される。
アミラーゼの安定性が、30分のインキュベーションの後、22, 37, 45, 55及び65℃でpH10.5（50mMのCAPS）で測定された。酵素が緩衝液において40NU/mlに希釈され、そして25mlのサンプルがそれぞれの温度でインキュベートされた。30分後、サンプルが氷上で急冷され、そして残留活性が決定された。本発明のアミラーゼ及び従来技術のアミラーゼ（SP722）の安定性プロフィールが図３に示される。
【００１６】
安定性が、pH10.5及び６°dH (German硬度、Ca：Mg＝２：１)での3g/lの上記A/Pモデル洗浄剤の溶液において、40NU/mlのアミラーゼをインキュベートすることによって試験された。インキュベーションの後、残留活性がpH7.3でPhadebasにより測定された。その結果は、25℃でのインキュベーションの後、95％の残留活性であり、そして30℃で87％の残留活性であった。
【００１７】
ポリペプチド及びDNA配列の相同性：
アミノ酸配列相同性が、第２配列からの第１配列の相違を示す２種の配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当業界において知られているコンピュータープログラムにより適切に決定され得る。従って、GCGバーション８で提供されるFASTA（Needleman, S. B. and Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453）が次の設定により使用され得る：Scoringマトリックス：GenRunData：Blosum 50. cmp,  使用される種々のPamfactor, Gap創造ペナルティー：12、Gap延長ペナルティー：２。
【００１８】
アミノ酸配列は、配列番号２の位置１−556に示されるアミン酸配列と、少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％又は少なくとも95％、さらにより特定には少なくとも97％又は少なくとも99％の同一性の程度を示す。
DNA配列相同性は、第２配列からの第１配列の派生を示す２種の配列間の同一性の程度として決定され得る。相同性は、当業界において知られているコンピュータープログラム、例えばGDGプログラムパッケージで供給されるGAPにより適切には決定され得る（上記に記載される）。従って、Gap GCGv8は、次のデフォールトパラメーターにより使用され得る：5.0のGAP創造ペナルティー、及び3.0のGAP延長ペナルティー。GAPは、一列整列を製造するためにNeedleman/Wunsch/Sellersの方法を使用する。
【００１９】
本発明のDNA構造体は、配列番号１の位置94−1764に示される核酸配列と、少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、特に少なくとも90％又は少なくとも95％、さらにより特定には少なくとも97％又は少なくとも99％の同一性の程度を示すDNA配列を含んで成る。
【００２０】
ハイブリダイゼーション：
ハイブリダイゼーションは、所定のDNA配列が配列番号１に対応するヌクレオチドプローブに類似することを示すために使用される。ハイブリダイゼーション条件は、下記に詳細に記載される。
【００２１】
ヌクレオチドプローブと相同DNA又はRNA配列との間のハイブリダイゼーションを決定するために適切な条件は、５×SSC（標準の塩水クエン酸塩）においてハイブリダイズするためにDNAフラグメント又はRNAを含むフィルターの10分間のプレソーキング、及び５×SSC（Sambrookなど., 1989）、５×Denhardt’s溶液（Sambrookなど., 1989）、0.5％のSDS及び100μg/mlの変性され、音波処理されたサケ精子DNA（Sambrookなど., 1989）の溶液におけるフィルターのプレハイブリダイゼーション、続いて、ランダムに感作された（Feinberg, A. P. and Vogelstcin, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13）、32P−dCTP−ラベルされた（比活性＞１×109cpm/μg）プローブを含む同じ溶液における約45℃での12時間のハイブリダイゼーションを包含する。
【００２２】
次に、フィルターは、２×SSC、0.5％SDSにおいて、少なくとも55℃、より好ましくは少なくとも60℃、より好ましくは少なくとも65℃、さらにより好ましくは少なくとも70℃、特に少なくとも75℃で、30分間、２度洗浄される。
オリゴヌクレオチドプローブがそれらの条件下でハイブリダイズする分子は、x−線フィルターを用いて検出される。
【００２３】
組換え発現ベクター：
本発明の発現ベクターは典型的には、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意には、リプレッサー遺伝子又は種々の活性化因子遺伝子をコードする制御配列を包含する。
本発明のα−アミラーゼをコードするDNA配列を担持する組換え発現ベクターは、組換えDNA方法に便利にはゆだねられ得るいずれかのベクターであり得、そしてそのベクターの選択はしばしば、それが導入される宿主細胞に依存する。従って、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわちその複製が染色体複製に無関係である、染色体実在物として存在するベクター、例えばプラスミド、バクテリオファージ又は染色体外要素、ミニクロモソーム又は人工染色体であり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色体と共に複製されるベクターであり得る。
【００２４】
ベクターにおいては、DNA配列は適切なプロモーター配列に操作可能的に結合されるべきである。プロモーターは、選択の宿主細胞において転写活性を示すいずれかのDNA配列であり得、そして宿主細胞に対して相同であるか又は異種であるタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。特に細菌宿主において本発明のα−アミラーゼをコードするDNA配列の転写を方向づけるための適切なプロモーターの例は、E.コリのlacオペロンのプロモーター、ストレプトミセス・コエリカラー  アガラーゼ遺伝子dagAプロモーター、バチルス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子（amyL）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモフィラス  アミラーゼ遺伝子（amyM）のプロモーター、バチルス・アミロリケファシエス  α−アミラーゼ（amyQ）のプロモーター、バチルス・サズチリスxylA及びxylB遺伝子のプロモーター、等である。
【００２５】
菌類宿主における転写に関しては、有用なプロモーターの例は、A.オリザエTAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロティナーゼ、A.ニガー中性α−アミラーゼ、A.ニガー酸安定性α−アミラーゼ、A.ニガーグルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、A.オリザエアルカリプロテアーゼ、A.オリザエ  トリオスリン酸イソメラーゼ、又はA.ニジュランス  アセトアミダーゼをコードする遺伝子に由来するそれらのプロモーターである。
【００２６】
本発明の発現ベクターはまた、適切な転写ターミネーター及び真核生物においては、本発明のα−アミラーゼをコードするDNA配列に操作可能的に連結されたポリアデニル化配列を含んで成る。終結及びポリアデニル化配列は、適切にはプロモーターと同じ源に由来することができる。
ベクターはさらに、問題の宿主細胞におけるベクターの複製を可能にするDNA配列を含んで成る。そのような配列の例は、プラスミドpUC19，pACYC177，pUB110, pE194, pAMB1及びpIJ702の複製の起点である。
【００２７】
ベクターはまた、選択マーカー、例えばその生成物が宿主細胞のおける欠陥を補足する遺伝子、例えばB．サズチリス又はB.リケニホルミスからのdal遺伝子、又は抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を付与する遺伝子を含んで成る。さらに、ベクターは、アスペルギラス選択マーカー、例えばamdS, argB, niaD及びsC、 ヒグロマイシン耐性を生ぜしめるマーカーを含んで成ることができ、又はその選択は、例えばWO91/17243号に記載されるように、同時形質転換により達成され得る。
【００２８】
細胞内発現はいくつかの観点において好都合であるが、例えば宿主細胞としてある細胞を用いる場合、一般的に、発現は細胞外であることが好ましい。
α−アミラーゼをコードし、そしてそれぞれ、プロモーター、ターミネーター及び他の要素を含む本発明のベクターを構成するために適切な方法は、当業者［例えば、Sambrookなど., (1989)］に良く知られている。
【００２９】
宿主細胞：
DNA構造体又は上記で定義されたような本発明の発現ベクターのいずれかを含んで成る本発明の細胞は、好都合には、本発明のα−アミラーゼの組換え生成において宿主細胞として使用される。細胞は、便利には、宿主染色体にDNA構造体（１又は複数のコピーにおいて）を組み込むことによって、アミラーゼをコードする本発明のDNA構造体により形質転換され得る。この組み込みは一般的に、DNA配列がたぶん、細胞において安定して維持されるので、好都合であると思われる。宿主染色体へのDNA構造体の組み込みは、従来の方法に従って、例えば相同又は異種組換えにより行われ得る。他方では、細胞は、異なった型の宿主細胞に関して上記に記載のようにして発現ベクターにより形質転換され得る。
【００３０】
本発明の細胞は、高等生物、例えば哺乳類又は昆虫の細胞であり得るが、しかし好ましくは、微生物細胞、例えば細菌又は菌類（例えば、酵母）細胞である。
培養に基づいて、本発明の酵素を生成することができる細菌宿主細胞の例は、次のものである；グラムー陽性細菌、例えばバチルス(Bacillus) 株、例えば、B.サブチリス(B. subcili)、B.リケニホルミス(B. licheniformis)、B.レンタン(B. lentus)、B.クラウジ(B. clausii)、B.ブレビス(B. brevis)、B.ステアロサーモフィラス(B. stearotheromophilus)、B.アルカロフィラス(B. alkalophilus)、B.アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、B.コアギランス(B. coaqulans)、B.シルキュランス(B. circulans)、B.ラウタス(B. lautus)、B.メガテリウム(B. megaterium)、又はB.スリンジエンシス(B. thuringiensis)の株、又はストレプトミセス(Streptomyses)、例えばS.リビダンス(S. lividans)又はS.ムリナス(S. murinus)の株、又はグラムー陰性細胞、例えばE.コリ。細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、接合により、又はそれ自体既知の態様（例えば、Sambrookなど.,前記）でコンピテント細胞を用いてもたらされ得る。
【００３１】
酵母生物は好ましくは、サッカロミセス又はシゾサッカロミセスの種、例えばサッカロミセス・セレビシアエから選択され得る。糸状菌は好都合には、アスペルギラスの種、例えばアスペルギラス・オリザエ又はアスペルギラス・ニガーに属する。細菌細胞は、プロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換、それ自体既知の態様での細胞壁の続く再生を包含する工程により形質転換され得る。アスペルギラス宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許第238023号に記載される。
【００３２】
産業上の用途：
アルカリpH値でのそれらの活性のために、本発明のα−アミラーゼは、種々の産業上の工程への使用のために十分に適切であり、特に前記酵素は洗浄剤、例えば洗濯及び硬質表面清浄洗剤組成物における成分として使用されるが、しかしそれはまた、澱粉からの甘味剤及びエタノールの生成においても有用である。従って、それは、従来の澱粉転換工程、例えばアメリカ特許第3,912,590号及びヨーロッパ特許公開第252,730号及び第63,909号に記載される液化及び糖化工程において使用され得る。
【００３３】
本発明のアルカリα−アミラーゼはまた、特に再パルプ化が７以上のpHで生じ、そしてアミラーゼが強化澱粉の分解を通して廃棄材料の砕解を促進できる場合、澱粉強化された故紙及び厚紙からのリグノセルロース材料、例えばパルプ、紙及び厚紙の製造にも使用され得る。本発明のα−アミラーゼは、澱粉被覆された印刷紙から紙製造用パルプを製造するための工程において特に有用である。前記方法は、WO95/14807号に記載のようにして行われ得、ここで前記方法は、
ａ）パルプを製造するために紙を砕解し、
ｂ）段階ａ）の前、その間又はその後、澱粉―分解酵素により処理し、そして
ｃ）段階ａ）及びｂ）の後、パルプからインキ粒子を分離する段階を含んで成る。
【００３４】
本発明のα−アミラーゼはまた、酵素的に変性された澱粉がアルカリ性充填剤、例えば炭酸カルシウム、カオリン及びクレーと共に紙製造において使用される場合、澱粉の変性において非常に有用である。本発明のアルカリα−アミラーゼにより、充填剤の存在下で澱粉を変性し、従ってより単純な統合された工程を可能にすることが可能になる。
【００３５】
本発明のα−アミラーゼはまた、織物糊抜きにおいて非常に有用である。織物加工産業においては、α−アミラーゼは、製織の間、よこ糸上で保護被膜として作用している澱粉含有糊剤の除去を促進するために糊抜き工程において助剤として従来使用される。製織の後、糊剤被膜の完全な除去は、布が精練され、漂白され、そして染色される続く工程において最適な結果を確保するために重要である。酵素による澱粉の分解は、それが繊維材料に対するいずれの有害な効果も包含しないので、好ましい。加工費用を低め、そしてミル処理量を高めるために、糊抜き工程は時々、精練及び漂白段階を組合される。
【００３６】
そのような場合、非酵素助剤、例えばアルカリ又は酸化剤は、従来のα−アミラーゼが高いpHレベル及び漂白剤と非常に適合できないので、典型的には、澱粉を分解するために使用される。澱粉サイズの非酵素分解は、使用されるかなりの凝集化学薬品のために、いくらかの繊維損傷を導く。従って、本発明のα−アミラーゼはアルカリ性溶液において改良された性能を有するので、それらのα−アミラーゼを使用することが所望される。α−アミラーゼは、セルロース含有布又は織物を糊抜きする場合、単独で又はセルラーゼと組合して使用され得る。
本発明のα−アミラーゼはまた、ビール製造工程において非常に有用であり；そのα−アミラーゼは典型的には、すり潰す工程の間に添加されるであろう。
【００３７】
洗浄剤組成物：
本発明によれば、α−アミラーゼは典型的には、洗浄剤組成物、例えば洗濯洗浄剤組成物の成分でのあり得る。それは、非ダスチング粒状物、安定化された液体又は保護された酵素の形で洗浄剤組成物に含まれ得る。非タスチング粒状物は、例えばアメリカ特許第4,106,991号及び第4,661,452号（両者とも、Novo Industri A/Sからの）に開示されるようにして生成され得、そして任意には、当業界において知られている方法により被覆され得る。
【００３８】
蝋質被膜材料の例は、1000〜20000の平均分子量を有するポリ（酸化エチレン）生成物（ポリエチレングリコール、PEG）；16〜50個の酸化エチレン単位を有するエトキシル化されたノニルフェノール；アルコールが12〜20個の炭素原子を含み、そして15〜80個の酸化エチレン単位が存在するエトキシルされた脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；及び脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリ−グリセリドである。
【００３９】
流動層技法による適用のために適切なフィルム−形成被膜材料の例は、イギリス特許第1483591号に与えられている。液体酵素調製物は、確立された方法に従って、ポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又は硼酸を添加することによって安定化され得る。他の酵素安定剤は、当業界において良く知られている。保護された酵素は、ヨーロッパ特許第238,216号に開示される方法に従って調製され得る。
【００４０】
本発明のα−アミラーゼの性質は、pH9.5〜10.5でのアルカリ洗浄剤への使用のために、及び20〜40度の低温での洗浄のために特に適切にする。
本発明の洗浄剤組成物は、いずれかの便利な形、例えば粉末、顆粒、ペースト又は液体として存在することができる。液体洗浄剤は、水性であり、典型的には、70％までの水及び0〜30％の有機溶媒を含み、又は非水性であり得る。
【００４１】
洗浄剤組成物は、１又は複数の界面活性剤を含んで成り、それらの個々は、アニオン性、カチオン性又は両性（両性イオン性）であり得る。洗浄剤は通常、0〜50％のアニオン性界面活性剤、例えば線状アルキルベンゼンスルホネート（LAS）、α−オレフィンスルホネート（AOS）、アルキルスルフェート（脂肪アルコールスルフェート）（AS）、アルコールエトキシスルフェート（AEOS又はAES）、第２アルカンスルホネート（SAS）、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニル琥珀酸又は石鹸を含むであろう。
【００４２】
それらはまた、0〜40％の非イオン界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート（AEO又はAE）、アルコールプロポキシレート、カルボキシル化されたアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化された脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えば、WO92/06154号に記載されるように）を含むことができる。
【００４３】
洗浄剤組成物はさらに、１又は複数の他の酵素、例えばプルラナーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ又はオキシダーゼ、例えばラッカーゼを含むことができる。
通常、洗浄剤は、１〜65％の洗浄剤ビルダー、又は錯化剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスフェート、シトレート、ニトリロ三酢酸（NTA）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミノ五酢酸（DTMPA）、アルキル−又はアルキレン琥珀酸、可溶性シリケート又は積層されたシリケート（例えば、HoechstからのSKS−６）を含む。
【００４４】
洗浄剤ビルダーは、リン含有及び非リン含有型に細分にされ得る。リン含有無機アルカリ洗浄剤ブルダーの例は、水溶性塩、特にアルカリ金属のピロホスフェート、オルトホスフェート、ポリホスフェート及びホスホネートを包含する。非リン含有無機ビルダーの例は、水溶性アルカリ金属カーボネート、ボレート、及びシリケート、並びに積層されたジシリケート及び種々の型の水不溶性結晶性又は非晶質アルミノシリケートを包含し、この中でゼオライトが最良に知られている代表物である。
【００４５】
適切な有機ビルダーの例は、アルカリ金属、アンモニウム又は置換されたアンモニウムのスクシネート、マロネート、脂肪酸マロネート、脂肪酸スルホネート、カルボキシメトキシスクシネート、ポリアセテート、カルボキシレート、ポリカルボキシレート、アミノポリカルボキシレート、及びポリアセチルカルボキシレートを包含する。洗浄剤はまた、ビルドされ得ず、すなわち洗浄剤ビルダーを実質的に有さない。
【００４６】
洗浄剤は、１又は複数のポリマーを含んで成る。そのポリマーの例は、カルボキシメチルセルロース（CMC）、ポリ（ビニルピロリドン）（PVP）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリ（ビニルアルコール）（PVA）、ポリカルボキシレート、例えばポリアクリレート、ポリマレエート、マレイン酸/アクリル酸のコポリマー及びラウリルメタクリレート/アクリル酸のコポリマーである。
洗浄剤組成物は、塩素/臭素型又は酸素型の漂白剤を含むことができる。漂白剤は被覆されても又は封入されても良い。
【００４７】
無機塩素/臭素型漂白剤の例は、リチウム、ナトリウム又はカルシウム次亜塩素酸塩又は次亜臭素酸塩、及び塩素化されたリン酸三ナトリウムである。有機塩素/臭素型漂白剤の例は、複素環式N−ブロモ及びN−クロロイミド、例えばトリクロロイソシアヌル酸、ジブロモイソシアヌル酸及びジクロロイソシアヌル酸、及び水可溶性カチオン、例えばカリウム及びナトリウムとのそれらの塩である。漂白システムはまた、例えばアミド、イミド又はスルホン型のペルオキシ酸を含んで成る。
【００４８】
酸素型漂白剤は、無機過酸塩、好ましくは漂白剤活性剤、又はペルオキシ酸化合物であり得る。無機過酸塩の例は、アルカリ金属の過硼酸塩（四水和物及び一水和物）、アルカリ金属の過炭酸塩、過珪酸塩及び過リン酸塩である。前記活性剤は、テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート（NOBS）であり得る。
【００４９】
本発明の洗浄剤組成物中の酵素は、従来の安定化剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸、又は硼酸誘導体、例えば芳香族ボレートエステルを用いて安定化され得、そして前記組成物は、例えばWO92/19709号及びWO92/19708号に記載のようにして配合され得る。本発明の酵素はまた、ヨーロッパ特許第0544777B1号に記載されるようなタンパク質型の可逆性酵素インヒビターを添加することによって安定され得る。
洗浄剤はまた、他の従来の洗浄剤成分、例えば布用コンディショナー、例えばクレー、解膠剤材料、発泡増進剤、発泡抑制剤、泡抑制剤、耐蝕剤、土壌−沈殿防止剤、抗−土壌−再付着剤、顔料、脱水剤、殺菌剤、光学的増白剤又は香料を含むことができる。
【００５０】
pH（使用濃度での水溶液において測定される）は通常、中性又はアルカリ性、たとえば７〜11の範囲であろう。
より特定には、本発明のα−アミラーゼは、WO96/23873号に記載される洗浄剤配合物のいずれかに導入され得る。
本発明のα−アミラーゼは、洗浄剤に通常使用される濃度で導入され得る。本発明の洗浄剤は組成物においては、α−アミラーゼは、洗浄流体1L当たり0.00001〜1mg（純粋な酵素タンパク質として計算される）のα−アミラーゼに対応する量で添加され得る。
本発明はさらに次の例により例示されるが、それらの本発明の範囲を制限するものではない。
【００５１】
実施例
宿主生物：
E.コリSJ2は、Didericheen, B., Wedsted, u., Hedegaard, L., Jensen, B.R., Sjoholm, C. (1990) Journal of Bacteriology, Vol. 172, No. 8, p. 4315-4321に記載される。
プラスミド：
遺伝子銀行ベクターは、引用により本明細書に組み込まれるWO94/19454号に開示されるpSJ1678であった。
遺伝子銀行ベクターpSJ1678は、引用により本明細書に組み込まれるWO94/19454号に開示される。
【００５２】
モデル洗浄剤：
A/P（Asia/Pacific）モデル洗浄剤は次の組成を有する：20％のSTPP（トリポリリン酸ナトリウム）、25％のNa2SO4、15％のNa2CO3、20％のLAS（線状アルキルベンゼンスルホネート、Nansa 80S）、５％のC12−C15のアルコールエトキシレート（Dobanol25−７）、５％のNa2Si2O5, 0.3%のNaCl。
【００５３】
例１．E.コリ中へのα−アミラーゼのクローニング
DNAを、Pitcher, D.G., Saunders, N, A., and Owen, R. J. (1989) Lett. Appl. Microbiol. 8, 157-156の方法により、バチルスsp. NCIMB40916から単離した。染色体DNAを、制限酵素Sau3AIにより部分的に消化した。そのフラグメントを、図４に示されるように、クローニングベクターpSJ1678のBamHI部位中にクローン化し、そしてE.コリSJ2を形質転換し、それにより、バチルスsp. NCIMB40916の遺伝子ライブラリーを創造した。
【００５４】
この遺伝子ライブラリーを、α−アミラーゼ活性についてスクリーンし、そしてα−アミラーゼ活性を示す株を、E.コリ株NN049489と命名し、これは、本発明のα−アミラーゼを含んで成る。この株を寄託し、そして受託番号DSM13001を得た。α−アミラーゼをコードするpJA368と称するプラスミドを有するE.コリ株NN049489を、DNA配列決定のために使用した。
【００５５】
例２．DNA及びα−アミラーゼの配列決定
プラスミドpJA386においてクローン化されたα−アミラーゼ遺伝子を、Taqデオキシ末端サイクル配列決定キット（Perkin Elmer, USA）、螢光ラベルされたターミネーター及びプライマーとしての適切なオリゴヌクレオチドを用いて、プライマーウォーキングによるDNA配列決定により特徴づけた。
配列データの分析を、Devereuxなど. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387-395に従って行った。その配列は、配列番号１に示されるDNA配列に対応する。α−アミラーゼ、例えばシグナルペプチド及び成熟α−アミラーゼの予測されるタンパク質配列は、配列番号２で提供される。推定されるN−末端配列は、タンパク質のN−末端での34個のアミノ酸を配列決定することによって確かめられた。
【００５６】
例３．α−アミラーゼの生成
プラスミドpJA386を有するE.コリNN049489（DSM13001）を、10μg/mlのクロラムフェニコールを含むLB−ブイヨンにおいて、37℃で250rpmで一晩にわたって培養した。細胞を、6000rpmでの15分間の遠心分離により、2.7Lの培養ブイヨンから収穫した。細胞内に位置するアミラーゼを、次の浸透ショック法を用いることによって細胞から開放した：
【００５７】
１）  細胞を再懸濁し、そして10mMのトリス−HCl、pH7.0（EKV−緩衝液）500mlにより洗浄し、続いて遠心分離した。
２）  細胞を、20％のスクロース、30mMのトリス−HCl、pH8、1mMのEDTAの溶液75mlに懸濁し、そしてリゾチームを添加し、5mg/mlの濃度にした。
３）  その溶液を、氷上で15分間インキュベートし、続いて遠心分離した。アミラーゼの大部分は現在、上清液に含まれた。
上清液を、１回の緩衝液交換を伴って、10LのEKV−緩衝液に対して一晩透析し、高濃度のスクロースを低めた。その溶液を、0.45μmの膜真空フィルターを通して濾過した。
【００５８】
酵素溶液を、EKV−緩衝液（pH７）により前もって平衡化されたPharmacia Q Sepharose カラムFF上に適用し、そしてカラムをEKV−緩衝液により洗浄した。結合されたタンパク質を、0−500mMの線状NaClのグラジエントを用いて、10カラム体積により溶離した。アミラーゼ含有画分プールし、そしてEKV−緩衝液に対して一晩、透析した。
次に、その溶液を、EKV−緩衝液（pH8）により前もって平衡化されたQ Sepharose カラムFF上に適用し、カラムをEKV−緩衝液により洗浄し、そしてアミラーゼを、0−500mMの線状NaClグラジエントを用いて、10カラム体積により溶離した。アミラーゼ含有画分をプールした。
【００５９】
１Mの硫酸アンモニウムを含むEKV−緩衝液（pH8）により前もって平衡化されたPhenyl Superose カラムを、１Mの濃度まで硫酸アンモニウムを添加された酵素溶液により充填した。結合されなかった材料を、硫酸アンモニウム緩衝液により洗浄し、そしてカラムを、1−0Mの硫酸アンモニウムの線状NaClグラジエントを用いて、20カラム体積により溶離した。アミラーゼ含有画分をプールした。
精製されたアミラーゼをSDS−PAGEにより分析し、そしてクーマシーブルによる染色後、わずか１つのバンドを得た。
【００６０】
例４．洗浄試験
洗浄性能を、本発明のα−アミラーゼを含む洗浄剤溶液により25℃で15分間、汚れた試験スワッチを洗浄することによって評価した。
使用される洗浄剤は、10.5のpHを有する3g/lでの上記A/Pモデル洗浄剤、又は約9.7のpHを有する3g/lでのMalaysiaからの市販の洗浄剤（ColgateからのFAB Total）であった。例３の精製されたアミラーゼを、下記に示される濃度で洗浄溶液に添加した。試験スワッチを、オレンジ−米澱粉により汚した（CFT, Center for Test Material, Holland から入手できるCS−28スワッチ）。
洗浄の後、スワッチを、460mmでの規約反射率を測定することによって評価した。結果は、ΔR＝α−アミラーゼにより洗浄されたスワッチの規約反射率−α−アミラーゼを有さない同じ条件下で洗浄されたスワッチの規約反射率として表した。
【００６１】
【表１】
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それらの結果は図５及び６に示される。結果は、本発明のα−アミラーゼが高いアルカリ性pH両洗浄剤において効果的であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、２種の従来技術のアミラーゼ（AP722及びTermamyl）に比較して、NCIMB40916からのアミラーゼのpH活性プロフィールを示す。
【図２】  図２は、NCIMB40916からのアミラーゼの温度活性プロフィールを示す。
【図３】  図３は、種々の温度でのインキュベーションの後、NCIMB40916からのアミラーゼの安定性を示す。
【図４】  図４は、例１に記載されるクローニングベクターpSJ1678を示す。
【図５】  図５は、例４に記載される洗浄試験の結果を示す。
【図６】  図６は、例４に記載される洗浄試験の結果を示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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