(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養物であって、該細胞培養物は、以下：
（ａ）多能性中枢神経系（ＣＮＳ）神経幹細胞の増殖を誘導するためのヒト上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒト塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）およびヒト白血球阻害因子（ＬＩＦ）を含む培養培地；ならびに
（ｂ）該培養培地中に懸濁された、ヒト多能性ＣＮＳ神経幹細胞
を含み、ここで、
（ｉ）該ヒト多能性ＣＮＳ神経幹細胞の集団が、ネスティンに対して陽性として染色する細胞を含み；
（ｉｉ）分化誘導条件下で、該細胞が、ニューロン、星状細胞、またはオリゴデンドロサイトへと分化する子孫細胞を産生する、
細胞培養物。
【請求項２】
前記培養培地が、０〜５．０％の血清を含有する、請求項１に記載の細胞培養物。
【請求項３】
１０％よりも多いニューロンを有する分化したヒトＣＮＳ神経幹細胞の培養物を産生するための方法であって、ここで、存在するニューロンのうち、少なくとも２０％が、ＧＡＢＡ陽性であり、該方法が、以下：
（ａ）請求項１に記載の細胞培養物を増殖させる工程；および
（ｂ）該増殖した細胞を、分化誘導培養培地に接触させて、１０％を超えるニューロンを有する分化した細胞の培養物へと、該神経幹細胞をインビトロ分化することを誘導する工程であって、ここで、存在するニューロンのうち、少なくとも２０％が、ＧＡＢＡ陽性である、工程
を包含する、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の細胞培養物を分化条件に曝すことによって、分化した細胞を産生する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）該細胞培養物から１以上の増殖因子を取り出す工程；
（ｂ）該細胞が接着し得る基材を提供する工程；ならびに
（ｃ）１％血清およびイオン電荷の供給源を提供する工程
を包含する、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、ここで、工程（ｃ）が、ＰＤＧＦ、ＣＮＴＦ、ＩＧＦ−１、ＬＩＦ、フォルスコリン、Ｔ−３およびＮＴ−３を含む増殖因子の混合物を提供する工程をさらに包含する、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、ここで、工程（ｃ）において、規定培地が提供され、該規定培地が、標準規定培養培地、１％血清、ならびにＰＤＧＦ  Ａ／Ｂ、ＣＮＴＦ、ＩＧＦ−１、フォルスコリン、Ｔ３、ＬＩＦ、およびＮＴ−３を含む増殖因子の混合物を含む、方法。
【請求項７】
生物学的薬剤の効果を決定するための方法であって、該方法は、
請求項１〜２のいずれかに記載の細胞培養物または請求項３〜６のいずれかに記載の方法によって産生された分化細胞と、生物学的薬剤を接触させる工程を包含し、
該方法は、該生物学的薬剤が、該細胞の増殖、分化、または生存に対する効果を有するか否かを決定する工程を包含する、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、ここで、前記細胞が、ヒト中枢神経系（ＣＮＳ）神経幹細胞から誘導された分化細胞を含み、ここで、１０％を超える該分化した細胞が、ニューロンであり、かつ、ここで、存在するニューロンのうち少なくとも２０％が、ＧＡＢＡ陽性である、方法。
【請求項９】
前記細胞培養物は、少なくとも２０％のニューロンを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の細胞培養物における使用のための培養培地であって、該培地は、細胞生存量および細胞増殖有効量の成分を含み、該成分は、以下の（ａ）〜（ｆ）：
（ａ）標準規定基礎培地；
（ｂ）グルコースのような炭水化物源；
（ｃ）ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、またはＴｒｉｓのような緩衝剤；
（ｄ）インスリン、トランスフェリン、プロゲストロン、セレンおよびプトレスシンからなる群より選択される、ホルモン源；
（ｅ）ＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む、神経幹細胞の増殖を刺激する１以上の増殖因子；ならびに
（ｆ）白血球阻害因子（ＬＩＦ）
である、培養培地。
【請求項１１】
ＰＤＧＦ、ＮＧＦ、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１０に記載の培養培地。
【請求項１２】
ヘパリンをさらに含む、請求項１０に記載の培地。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のうちのいずれか１項に記載の培地であって、ここで、前記グルコースが、０．２％重量／体積（ｗ／ｖ）と１．０％重量／体積（ｗ／ｖ）との間の濃度で存在する、培地。
【請求項１４】
前培地のｐＨが、ｐＨ６とｐＨ８との間である、請求項１０〜１３のいずれかに記載の培地。
【請求項１５】
前記増殖因子が、０．２ｎｇ／ｍｌと２００ｎｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する、請求項１０〜１４のいずれかに記載の培地。
【請求項１６】
前記ＬＩＦが、０．１ｎｇ／ｍｌと５００ｎｇ／ｍｌとの間の濃度で存在する、請求項１０〜１５に記載の培地。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、ヒト中枢神経系幹細胞の単離、ならびにそれらを増殖、分化および移植するための方法および培地に関する。
【０００２】
（発明の背景）
中枢神経系（「ＣＮＳ」）の発達の間に、多能性前駆体細胞（神経幹細胞としても知られる）が増殖し、成体の脳を構成する細胞型へと最終的に分化する一過性分裂前駆体細胞を生じる。幹細胞（他の組織由来）は、古典的には、自己新生（すなわち、より多くの幹細胞を形成する）、増殖、および複数の異なる表現型系統へと分化する能力を有するとして規定されてきた。神経幹細胞の場合、これは、ニューロン、星状細胞および稀突起膠芽細胞を含む。例えば、ＰｏｔｔｅｎおよびＬｏｅｆｆｌｅｒ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１１０：１１０１、１９９０）は、幹細胞を、「ａ）増殖、ｂ）自己維持、ｃ）多数の分化した機能性子孫の産生、ｄ）損傷後の組織の再生、およびｅ）これらの選択肢の使用における可撓性を行い得る未分化の細胞」と規定する。
【０００３】
これらの神経幹細胞は、マウス、ラット、ブタおよびヒトを含む、いくつかの哺乳動物種から単離されている。例えば、ＷＯ９３／０１２７５、ＷＯ９４／０９１１９、ＷＯ９４／１０２９２、ＷＯ９４／１６７１８、およびＣａｔｔａｎｅｏら、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、４２、１６１〜１６６頁（１９９６）を参照のこと。これらは全て本明細書において参考として援用する。
【０００４】
ヒトＣＮＳ神経幹細胞は、その齧歯類ホモログと同様に、マイトジェン含有（代表的には、上皮増殖因子、または上皮増殖因子および塩基性線維芽細胞増殖因子）無血清培養培地中で維持される場合、懸濁培養中で増殖して「神経球」として知られる細胞の凝集体を形成する。先行技術において、ヒト神経幹細胞は、約３０日の倍化速度を有する。例えば、Ｃａｔｔａｎｅｏら、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、４２、１６１〜１６６頁（１９９６）を参照のこと。マイトジェンの除去および基材の提供の際に、この幹細胞は、ニューロン、星状細胞および稀突起膠芽細胞へと分化する。先行技術において、分化した細胞集団中の大部分の細胞は、星状細胞として同定されている、ニューロンはほとんど観察されていない（１０％未満）。
【０００５】
神経幹細胞培養の増殖速度を増加させる必要性が残存する。分化した細胞集団におけるニューロン数を増加させる必要性もまた残存する。さらに、宿主への移植の際に神経幹細胞移植片の生存度を改変する必要性も存在する。
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、新規のヒト中枢神経系幹細胞、ならびにそれらを増殖、分化および移植するための方法および培地を提供する。１つの実施態様において、本発明は、５〜１０日間の倍化速度を有する新規のヒト幹細胞、ならびヒト神経幹細胞の増殖の延長のための規定増殖培地を提供する。別の実施態様において、本発明は、ニューロン、稀突起膠芽細胞、星状細胞、またはそれらの組合せを富化させるためのヒト神経幹細胞の分化のための規定培地を提供する。本発明はまた、これまでは入手不可能であった多数のニューロンならびに星状細胞および稀突起膠芽細胞を提供するヒト神経幹細胞の分化した細胞集団を提供する。本発明はまた、宿主への移植に際し、移植片の生存度を改善する、神経幹細胞の移植のための新規の方法を提供する。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＣＮＳ神経幹細胞の単離、特徴付け、増殖、分化および移植に関する。
【０００８】
本願に記載されそして請求される本発明の神経幹細胞は、懸濁培養または付着培養において増殖され得る。本発明の神経幹細胞が神経球として増殖するとき、ヒトネスティン（ｎｅｓｔｉｎ）抗体が、未分化細胞を同定するためのマーカーとして使用され得る。この増殖性細胞は、ＧＦＡＰ染色およびβチューブリン染色をほとんど示さない（しかし、その球の中の細胞の多様性に起因して、いくらかの染色が存在し得る）。
【０００９】
分化したとき、その細胞のほとんどは、そのネスティン陽性免疫反応性を喪失する。特に、種々のニューロンまたはグリアタンパク質に対して特異的な抗体を使用して分化した細胞の表現型特性を同定し得る。ニューロンは、ニューロン特異的エノラーゼ（「ＮＳＥ」）、神経フィラメント、τ（タウ）、βチューブリンに対する抗体、または他の公知の神経マーカーを用いて同定され得る。星状細胞は、グリア原線維酸性タンパク質（「ＧＦＡＰ」）に対する抗体、または他の公知の星状細胞マーカーを用いて同定され得る。稀突起膠芽細胞は、ガラクトセレブロシド、Ｏ４、ミエリン塩基性タンパク質（「ＭＢＰ」）に対する抗体、または公知の稀突起膠芽細胞マーカーを用いて、同定され得る。グリア細胞は、一般的に、Ｍ２抗体のような抗体、または他の公知のグリアマーカーを用いて染色することによって同定され得る。
【００１０】
１つの実施態様において、本発明は、前脳から単離された新規ヒトＣＮＳ幹細胞を提供する。本発明者らは、ヒト前脳から４つの神経幹細胞株を単離した。これらはすべて、神経幹細胞特性を示す。すなわち、これらの細胞は、自己新生性であり、これらの細胞は、マイトジェン含有無血清培地中で長期間増殖し、そしてこれらの細胞は、分化したときに、ニューロン、星状細胞、稀突起膠芽細胞の細胞集団を含む。これらの細胞は、先行技術の間脳由来のヒト神経幹細胞とは対照的に、５〜１０日毎に倍化し得る。間脳由来のヒト神経幹細胞の報告された増殖速度は、およそ３０日毎に倍化する速度である。Ｃａｔｔａｎｅｏら、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、４２、１６１〜１６６頁（１９９６）を参照のこと。
【００１１】
任意の適切な組織供給源を使用して、本発明の神経幹細胞を誘導させ得る。神経幹細胞は、懸濁物中または付着基材上のいずれかで細胞を培養することによって、増殖および分化させるように誘導させ得る。例えば，米国特許第５，７５０，３７６号および同５，７５３，５０６号（これらは両方とも、その全体が本明細書において参考として援用される）、およびそこに記載される先行技術の培地を参照のこと。同種異系移植片および自己移植片の両方が移植目的について意図される。
【００１２】
本発明はまた、神経幹細胞の増殖のための新規の増殖培地を提供する。本明細書に提供されるのは、神経幹細胞の短期および長期の増殖のための無血清培養培地または血清涸渇培養培地である。
【００１３】
多数の無血清培養培地または血清涸渇培養培地が、一貫しない培養結果を導き得る、血清の所望されない効果に起因して開発されてきた。例えば、ＷＯ９５／００６３２号（本明細書において参考として援用される）、およびそこに記載される先行技術の培地を参照のこと。
【００１４】
本明細書において記載される新規の培地の開発の前には、神経幹細胞は、上皮増殖因子（「ＥＧＦ」）またはＥＧＦのアナログ（例えば、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）またはトランスフォーミング増殖因子α（「ＴＧＦ−α」））を増殖のためのマイトジェンとして含む無血清培地中で培養されてきた。例えば、ＷＯ９３／０１２７５、ＷＯ９４／１６７１８号を参照のこと。これら両方は、本明細書において参考として援用される。さらに、塩基性線維芽細胞増殖因子（「ｂＦＧＦ」）が、単独またはＥＧＦと組み合わせてのいずれかで、神経幹細胞の長期生存を増強するために用いられている。
【００１５】
本発明に従って改善された培地は、白血球阻害因子（「ＬＩＦ」）を含有し、神経幹細胞（特に、ヒト神経幹細胞）の増殖速度を顕著かつ予想外に増強する。
【００１６】
本発明者らは、ＬＩＦの存在および非存在下で、本明細書に記載された前脳由来幹細胞の増殖速度を比較した；予想外に、本発明者らは、ＬＩＦがほとんどすべての場合で細胞増殖の速度を劇的に増加させることを見い出した。
【００１７】
本発明に従う培地は、以下の成分の細胞生存および細胞増殖有効量を含有する：
（ａ）無血清（０〜０．４９％の血清を含有）または血清涸渇（０．５〜５．０％の血清を含有）である標準的な培養培地、これは、「規定」培養培地（例えば、Ｉｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（「ＩＭＤＭ」）、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭ、Ｆｉｓｃｈｅｒ培地、α培地、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ培地、Ｌ−１５、ＮＣＴＣ、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ＭＥＭおよびＭｃＣｏｙ培地）としても知られる；
（ｂ）グルコースのような適切な炭水化物源；
（ｃ）ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳまたはＴｒｉｓ、好ましくはＨＥＰＥＳのような緩衝剤；
（ｄ）インスリン、トランスフェリン、プロゲステロン、セレンおよびプトレシンのようなホルモン源の供給；
（ｅ）神経幹細胞の増殖を刺激する１以上の増殖因子、例えば、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＮＧＦ、ならびにそれらのアナログ、誘導体、および／または組合せ、好ましくは、ＥＧＦおよびｂＦＧＦの組合せ；
（ｆ）ＬＩＦ。
【００１８】
標準的な培養培地は、代表的に、細胞生存に必要とされる種々の必須成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、ビタミンなどを含む）を含有する。本発明者らは、ＤＭＥＭまたはＦ−１２を標準的な培養培地として好む。最も好ましくは、ＤＭＥＭおよびＦ−１２の５０／５０混合物である。両方の培地は、市販されている（ＤＭＥＭ−Ｇｉｂｃｏ  １２１００−０４６；Ｆ−１２  Ｇｉｂｃｏ  ２１７００−０７５）。予め混合した処方物もまた、市販されている（Ｎ２−Ｇｉｂｃｏ  １７５０２−０３０）。さらに、グルタミンを、好ましくは約２ｍＭで提供することが有利である。この培養培地にヘパリンを提供することもまた有利である。好ましくは、培養の条件は、可能な限り生理的に近くあるべきである。培養培地のｐＨは、代表的にはｐＨ６〜８、好ましくは約７、最も好ましくは約７．４である。細胞は、代表的に３０〜４０℃の間で、好ましくは、３２〜３８℃の間で、最も好ましくは３５〜３７℃の間で培養される。細胞は、好ましくは、５％ＣＯ2中で増殖させる。細胞は、好ましくは懸濁培養で増殖させる。
【００１９】
１つの例示的な実施態様において、この神経幹細胞培養は、以下の成分を、指示された濃度で含む。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
血清アルブミンもまた、本発明の培養培地に存在させ得るが、本発明の培地は、一般的に血清涸渇または無血清（好ましくは無血清）であり、化学的に充分規定されそして高度に純粋である（＞９５％）特定の血清成分（例えば、血清アルブミン）が含有され得る。
【００２２】
本明細書中に記載されるヒト神経幹細胞は、慣用手順に従って凍結保存され得る。本発明者らは、約１００万〜１０００万の細胞を、「凍結」培地中に凍結保存することを好む。「凍結」培地は、増殖培地（増殖因子マイトジェンが存在しない）、１０％  ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ３０５９）、および７．５％  ＤＭＳＯからなる。細胞は、遠心分離される。増殖培地を吸引除去し、そして凍結培地に置換する。細胞は、分離した細胞としてではなく球として緩和に再懸濁される。細胞は、例えば、容器を−８０℃に配置することによってゆっくりと凍結される。細胞は、３７℃浴中で旋回させることによって解凍し、新鮮な増殖培地中に再懸濁し、そして通常どおり増殖される。
【００２３】
別の実施態様において、本発明は、これまでは入手不可能であった多数のニューロンならびに星状細胞および稀突起膠芽細胞を含む分化した細胞培養物を提供する。先行技術において、代表的に、分化したヒト間脳由来神経幹細胞培養物は、ほとんどニューロンを形成しなかった（すなわち、５〜１０％未満）。この方法論に従って、本発明者らは、分化したヒト前脳由来の神経幹細胞培養物中で２０％〜３５％の間の（および他の場合にはより高い）ニューロン濃度を慣用的に達成した。これは、非常に有利である。なぜなら、ニューロン機能が損傷または喪失した、疾患の症候にある宿主への移植前にニューロン集団を富化することが可能であるからである。
【００２４】
さらに、本発明の方法に従って、本発明者らは、ＧＡＢＡ作用性ニューロンが非常に富化した、分化した神経幹細胞培養物を達成した。このようなＧＡＢＡ作用性ニューロン富化細胞培養物は、ハンチントン病または癲癇のような興奮毒性の神経変性障害の可能性のある治療において特に有利である。
【００２５】
神経幹細胞の増殖または分化のいずれかの間の細胞表現系を同定するために、種々の細胞表面または細胞内マーカーが使用され得る。
【００２６】
本発明の神経幹細胞が神経球として増殖するときに、本発明者らは、ヒトネスティン抗体をマーカーとして用いて未分化の細胞を同定することを意図する。この増殖中の細胞は、ＧＦＡＰ染色およびβチューブリン染色をほとんど示さないはずである（しかし、いくらかの染色は、球の中の細胞密度に起因して存在し得る）。
【００２７】
分化するとき、細胞のほとんどは、そのネスティン陽性免疫反応性を喪失する。特に、種々のニューロンまたはグリアタンパク質に対して特異的な抗体を使用して、分化した細胞の表現型特性を同定し得る。ニューロンは、ニューロン特異的エノラーゼ（「ＮＳＥ」）、神経フィラメント、τ（タウ）、βチューブリンに対する抗体、または他の公知の神経マーカーを用いて同定され得る。星状細胞は、グリア原線維酸性タンパク質（「ＧＦＡＰ」）に対する抗体、または他の公知の星状細胞マーカーを用いて同定され得る。稀突起膠芽細胞は、ガラクトセレブロシド、Ｏ４、ミエリン塩基性タンパク質（「ＭＢＰ」）に対する抗体、または公知の稀突起膠芽細胞マーカーを用いて、同定され得る。
【００２８】
細胞の表現型によって特徴的に産生される化合物を同定することによって、細胞表現形を同定することもまた可能である。例えば、アセチルコリン、ドパミン、エピネフリン、ノルエピネフリンなどのような神経伝達物質の産生によってニューロンを同定することが可能である。
【００２９】
これらのニューロンによって産生される特定の産物に従って、特定のニューロン表現型が同定され得る。例えば、ＧＡＢＡ作用性ニューロンは、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（「ＧＡＤ」）またはＧＡＢＡの産生によって同定され得る。ドパミン作用性ニューロンは、ドパデカルボキシラーゼ（「ＤＤＣ」）、ドパまたはチロシンヒドロキシラーゼ（「ＴＨ」）の産生によって同定され得る。コリン作用性ニューロンは、コリンアセチルトランスフェラーゼ（「ＣｈＡＴ］）の産生によって同定され得る。海馬ニューロンは、ＮｅｕＮを用いた染色によって同定され得る。特定のニューロン表現型を同定するために適切な任意の公知のマーカーが使用され得ることが理解される。
【００３０】
本明細書に記載のヒト神経幹細胞は、公知の方法論に従って、遺伝子的に操作または改変され得る。用語「遺伝子改変」とは、外因性ＤＮＡの意図的な導入による、細胞の安定なまたは一過性の遺伝型変化をいう。ＤＮＡは、合成または天然由来であり得、そして遺伝子、遺伝子の一部、または他の有用なＤＮＡ配列を含み得る。用語「遺伝子改変」は、天然のウイルス活性、天然の遺伝子組換えなどを介して生じるもののような、天然に生じる改変を含むことは意味しない。
【００３１】
目的の遺伝子（すなわち、生物学的に活性な分子をコードする遺伝子）は、標準的な技術を用いることによって適切な発現ベクターのクローニング部位へと挿入され得る。これらの技術は当業者に周知である。例えば、ＷＯ９４／１６７１８を参照のこと。これは、本明細書において参考として援用される。
【００３２】
次いで、目的の遺伝子を含む発現ベクターを使用して、所望の細胞株をトランスフェクトし得る。標準的なトランスフェクション技術、例えば、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、遺伝子銃、またはウイルストランスフェクションが、利用され得る。市販の哺乳動物トランスフェクションキットは、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから購入され得る。ヒトアデノウイルストランスフェクションは、Ｂｅｒｇら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１９２頁（１９９２）において記載されるように達成され得る。同様に、リポフェクトアミンに基づくトランスフェクションは、Ｃａｔｔａｎｅｏ、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．４２頁、１６１−６６（１９９６）において記載されるように達成され得る。
【００３３】
広汎で種々の宿主／発現ベクターの組み合わせを使用して、目的の生物学的に活性な分子をコードする遺伝子を発現させ得る。例えば、適切な細胞に基づく産物発現ベクターについて、米国特許第５，５４５，７２３号を参照のこと。これは、本明細書において参考として援用する。
【００３４】
生物学的に活性な分子の発現の増加は、当該分野で周知の増幅方法を用いて、トランスジーンコピー数を増加または増幅することによって達成され得る。このような増幅方法は、例えばＤＨＦＲ増幅（例えば、Ｋａｕｆｍａｎら、米国特許第４，４７０，４６１号）またはグルタミンシンセターゼ（「ＧＳ」）増幅（例えば、米国特許第５，１２２，４６４号および欧州公開出願ＥＰ３３８，８４１号を参照のこと）が挙げられる。これらの文献は全て、本明細書において参考として援用する。
【００３５】
別の実施態様において、この遺伝的に改変された神経幹細胞は、トランスジェニック動物に由来する。
【００３６】
神経幹細胞が生物学的に活性な物質の産生のために遺伝的に改変されている場合、その物質は好ましくは、ＣＮＳ障害の処置について有用である。本発明者らは、患者において治療的に有効な生物学的に活性な分子を分泌し得る、遺伝的に改変された神経幹細胞を意図する。本発明者はまた、移植された神経幹細胞に対する増殖または栄養効果を有する生物学的に活性な分子を産生することを意図する。本発明者らはさらに、神経細胞系統に向ってその細胞の分化を誘導させることを意図する。従って、この遺伝的に改変された神経幹細胞は、治療的価値を有する生物学的な薬剤の細胞に基づく送達を提供する。
【００３７】
本明細書に記載される神経幹細胞およびその分化した子孫は、公知の技術を用いて不死化または条件的不死化され得る。本発明者らは、幹細胞の条件的不死化を好み、そして最も好ましくは、それらの分化した子孫の条件的不死化を好む。意図される条件的不死化技術のうち、Ｔｅｔ条件的不死化（ＷＯ９６／３１２４２を参照のこと、本明細書において参考として援用される）、およびＭｘ−１条件的不死化（ＷＯ９６／０２６４６を参照のこと、本明細書において参考として援用される）である。
【００３８】
本発明はまた、神経幹細胞を分化させて、これまでは達成不可能であった程度にまでニューロンを富化した細胞培養物を得る方法を提供する。１つのプロトコルに従って、この増殖中の神経球を、増殖因子マイトジェンおよびＬＩＦの除去、および１％血清、基材およびイオン電荷源（例えば、ポリオルニチンまたは細胞外マトリクス成分でカバーされたガラスカバースリップ）の提供によって誘導して、分化する。この分化プロトコルについて好ましい基礎培地は、増殖因子マイトジェンおよびＬＩＦを除く他は、増殖培地と同じである。この分化プロトコルは、ニューロンが富化された細胞培養物を生成する。このプロトコルに従って、本発明者らは、分化したヒト前脳由来の神経幹細胞培養物において２０％〜３５％の間のニューロン濃度を慣用的に達成した。
【００３９】
第二のプロトコルに従って、増殖中の神経球を、増殖因子マイトジェンの除去、および１％血清、基材およびイオン電荷源（例えば、ポリオルニチンまたは細胞外マトリクス成分でカバーされたガラスカバースリップ）、ならびにＰＤＧＦ、ＣＮＴＦ、ＩＧＦ−１、ＬＩＦ、フォルスコリン、Ｔ−３およびＮＴ−３を含む増殖因子の混合物の提供によって誘導して、分化する。増殖因子のカクテルは、その神経球がその増殖培地から除去されるのと同時に添加され得るか、またはそのマイトジェンからの除去の前にその増殖培地に添加し得、そしてその細胞は、その混合物と予備インキュベートされ得る。このプロトコルは、ニューロンに非常に富み、そして稀突起膠芽細胞に富む細胞培養物を生成する。このプロトコルに従って、本発明者らは、分化した、ヒト前脳由来の神経幹細胞培養物が３５％を超えるニューロン濃度を慣用的に達成した。
【００４０】
ｂＦＧＦの増殖培地における存在は、予想外に、稀突起膠芽細胞分化能を阻害する。ｂＦＧＦは、稀突起膠芽細胞前駆体細胞株にとって栄養である。稀突起膠芽細胞は、ｂＦＧＦを含まない増殖培地中でＥＧＥおよびＬＩＦとともに継代される分化条件下で誘導される。
【００４１】
本発明のヒト幹細胞株は、薬物スクリーニング、診断、ゲノム学および移植についてを含む、多数の用途を有する。幹細胞は、本発明に記載される適切な培地を用いて誘導して、選択した神経細胞型へと分化され得る。試験される薬物は、発生阻害について試験するために、分化の前に添加され得るか、または神経細胞型特異的反応をモニターするために分化後に添加され得る。
【００４２】
本発明の細胞は、従来技術に従って患者に「裸のまま」、例えば、米国特許第５，０８２，６７０号および同５，６１８，５３１号に記載される（この各々は、本明細書において参考として援用される）ようにＣＮＳに、または身体中の任意の他の適切な部位に移植され得る。
【００４３】
１つの実施態様において、ヒト幹細胞は、ＣＮＳに直接移植される。実質および髄腔内部位が意図される。ＣＮＳにおける正確な位置は、疾患の状態に従って変動することが理解される。
【００４４】
移植された細胞は、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）で移植前に標識され得る。本発明者らは、種々の移植片において神経細胞マーカーおよびＢｒｄＵで二重染色した細胞が、ＢｒｄＵで染色した幹細胞の適切に分化した神経細胞型への分化を示すことを、種々の実験において観察した（実施例９を参照のこと）。ヒト前脳由来の神経幹細胞の海馬への移植は、ＮｅｕＮで優勢に染色されるがＧＡＢＡ陰性であるニューロンを産生した。ＮｅｕＮ抗体は、海馬のニューロンを染色することが公知である。ＧＡＢＡ作用性ニューロンは、これらの同じ細胞株が線条中に移植されたときに形成された。従って、移植された細胞は、成体脳および新生脳の両方において、環境的なカギに対して応答する。
【００４５】
本発明の１つの局面に従って、本明細書において、移植されたヒト神経幹細胞の生存度を改善するための方法論が提供される。特に、本発明者らは、移植された神経幹細胞が凝集するか、または移植前に神経球を形成する場合、分離した単一の細胞の懸濁物の移植と比較して、移植片の生存度が改善することを見い出した。本発明者らは、約１０〜５００μｍの直径、好ましくは４０〜５０μｍの直径の小さなサイズの神経球の移植を好む。あるいは、本発明者らは、神経球１つあたり約５〜１００、好ましくは５〜２０細胞を含む神経球を好む。本発明者らは、１μｌあたり約１０，０００〜１，０００，０００細胞、好ましくは、１μｌあたり２５，０００〜５００，０００細胞の密度で移植することを意図する。
【００４６】
この細胞はまた、以下を含む公知の被包技術に従って、被包され得、そしてこれを使用して生物学的に活性な分子を送達し得る：マイクロ被包（例えば、米国特許第４，３５２，８８３号；同４，３５３，８８８号、および５，０８４，３５０号を参照のこと、本明細書において参考として援用される）、（ｂ）マクロ被包（例えば、米国特許第５，２８４，７６１号、５，１５８，８８１号、４，９７６，８５９号および４，９６８，７３３号、ならびに公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ９２／１９１９５、ＷＯ９５／０５４５２を参照のこと、これらは各々のが参考として援用される）。
【００４７】
ヒト神経幹細胞が被包される場合、本発明者らは、米国特許第５，２８４，７６１号；５，１５８，８８１号；４，９７６，８５９号；４，９６８，７３３号；５，８００，８２８号および公開ＰＣＴ特許出願ＷＯ９５／０５４５２号（これらは各々が本明細書において参考として援用される）に記載されるようなマクロ被包を好む。このデバイスにおける細胞数は、変動し得る；好ましくは各デバイスは１０3〜１０9細胞、最も好ましくは１０5〜１０7の間の細胞を含む。多数のマクロ被包デバイスが患者に移植され得る；本発明者らは、１〜１０の間のデバイスを好む。
【００４８】
さらに、本発明者らはまた、被包デバイスと組み合わせたヒト幹細胞の「裸の」移植を意図する。ここで、この被包デバイスは、患者において治療的に有効である生物学的に活性な分子を分泌するか、またはそれは移植された神経幹細胞に対して増殖もしくは栄養効果を有する生物学的に活性な分子を生成するか、あるいはそれは特定の表現型系統へと神経幹細胞の分化を誘導する。
【００４９】
本発明の細胞および方法は、種々の神経変性疾患および他の障害の処置において有用であり得る。その細胞は宿主において罹患、損傷または欠損した組織を置換することが意図される。あるいは、移植された組織は、内因的に影響を受けた宿主組織の機能を増強し得る。移植された神経幹細胞はまた、治療的に有効な生物学的に活性な分子を提供するように遺伝子改変され得る。
【００５０】
興奮毒性は、癲癇、脳卒中、虚血およびハンチントン病、パーキンソン病およびアルツハイマー病のような神経変性疾患を含む種々の病理学的状態と関連付けられている。従って、神経幹細胞は、細胞損失およびこれらの障害に関連する行動異常を予防または置換するための１つの手段を提供し得る。神経幹細胞は、小脳運動失調において欠失した小脳ニューロンを置換し得、臨床的な結果は、医学の分野において公知の方法により容易に測定可能である。
【００５１】
ハンチントン病（ＨＤ）は、荒廃的な精神病および認識悪化を伴う間断なく進行する運動障害によって特徴付けられる、常染色体優性の神経変性疾患である。ＨＤは、新線条体の一貫しかつ重篤な萎縮症に関連し、これは、線条体の主要な出力ニューロンであるＧＡＢＡ作用性の中程度のサイズの突起性放射ニューロンの顕著な欠失に関連する。キノリン酸（ＱＡ）のような興奮毒性の線条体内への注入は、ＨＤに見られる選択性ニューロン脆弱性のパターンを模倣する。ＱＡ病変は、ＨＤに見られる主要な症状のうちである運動欠損および認識欠損を生じる。従って、ＱＡの線条体内注入は、ＨＤの有用なモデルとなっており、そしてＨＤに関連する神経解剖学的変化および行動変化を予防、減弱、または反転させることを目的とする新規の治療戦略を評価するのに役立ち得る。ＧＡＢＡ作用性ニューロンはハンチントン病において特徴的に欠損しているので、本発明者らは、本発明の方法に従って誘導されたＧＡＢＡ作用性ニューロンが富化した細胞培養物の移植による、ハンチントン病の処置を意図する。
【００５２】
癲癇はまた、興奮毒性と関連する。従って、本発明に従って誘導されたＧＡＢＡ作用性ニューロンは、癲癇に罹患する患者への移植について企図される。
【００５３】
本発明者らはまた、種々の脱髄性障害および髄鞘発育不全障害（例えば、ペリツェーウス−メルツバッハー病、多発性硬化症、種々の白質萎縮、外傷後脱髄および脳血管性（ＣＶＳ）傷害ならびに種々の神経炎およびニューロパシー（特に眼性））の処置における本発明の細胞の使用を企図する。本発明者らは、稀突起膠芽細胞または稀突起膠芽細胞前駆体もしくは子孫が富化された細胞培養物（例えば、本発明に従って調製および移植された培養物）を使用して、宿主における脱髄領域の再髄鞘形成を促進することを意図する。
【００５４】
本発明者らはまた、種々の急性および慢性の疼痛の処置において、ならびに特定の神経再生適用（例えば、脊髄損傷）のための本発明の細胞の使用を意図する。本発明者らはまた、眼における光受容器のスペアリング（ｓｐａｒｉｎｇ）または出芽における使用のためのヒト幹細胞の使用を意図する。
【００５５】
本発明の細胞および方法は、哺乳動物の宿主、レシピエント、患者被験体または個体において、好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトにおける使用を意図する。
【００５６】
以下の実施例は、例示の目的にのみ提供され、そして限定することは意図しない。
【００５７】
（実施例）
（実施例１：神経幹細胞を増殖させるための培地）
増殖培地を、以下の成分を指示された濃度で用いて調製した。
【００５８】
【表２】
0004848538.tif 000003
【００５９】
（実施例２：ヒトＣＮＳ神経幹細胞の単離）
ヒト胚性前脳由来のサンプル組織をスウェーデンで収集し、そして切片化し、そしてＨｕｄｄｉｎｊｅ  Ｓｊｕｋｈｕｓによる厚意によって提供された。ドナーからの血液サンプルを、ウイルス試験のために送った。切片化を、生理食塩水において行い、そして選択された組織を、増殖培地に直接入れた（実施例１に記載のように）。組織を分離するまで４℃で保存した。この組織を、標準的なガラスホモジナイザーを用いて、消化酵素を何ら存在させずに分離した。分離した細胞を計数し、そして増殖培地を含むフラスコに播種した。５〜７日後、そのフラスコの内容物を、１０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。その上清を吸引除去し、そしてそのペレットを２００μｌの増殖培地中に再懸濁した。その細胞クラスターを、Ｐ２００  ｐｉｐｅｔｍａｎを約１００回用いて破砕して、そのクラスターを崩してバラバラにした。細胞を、７５，０００〜１００，０００細胞／ｍｌで増幅培地中に再播種した。細胞を、使用するマイトジェンおよび播種密度に依存して、６〜２１日毎に継代する。代表的に、これらの細胞は、細胞増殖の指標であるＢｒｄＵを取り込む。Ｔ７５フラスコ培養（初期容量２０ｍｌ）について、細胞を、５ｍｌの増殖培地の添加により１週間に３回「給餌」する。本発明者らは、培養についてＮｕｎｃフラスコを好む。
【００６０】
（神経球を増殖させるためのネスティン染色）
本発明者らは、ネスティン（神経球の増殖の尺度）について、以下のように染色した。細胞を、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で２０分間固定した。細胞を、０．１Ｍ  ＰＢＳ，ｐＨ７．４で５分間２回洗浄した。細胞を、１００％ＥｔＯＨで２分間透過処理をした。次いで、この細胞を、０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間２回洗浄した。細胞調製物を、室温で１時間、０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４および０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ  Ｘ−１００）中に希釈した５％正常ヤギ血清（「ＮＧＳ」）中で室温で１時間緩やかに振盪させながらブロッキングした。細胞を、１％  ＮＧＳおよび１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に希釈したヒトネスティンに対する一次抗体（Ｄｒ．Ｌａｒｓ  Ｗａｈｌｂｅｒｇ、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ、Ｓｗｅｄｅｎ、１：５００で使用したウサギポリクローナル抗体）と、２時間室温でインキュベートした。次いで、調製物を、０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間２回で洗浄した。細胞を、１％  ＮＧＳおよび１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に希釈した二次抗体（１：１２８で使用するＧＡＭ／ＦＩＴＣのプール、Ｓｉｇｍａ  Ｆ−０２５７；１：８０で使用するＧＡＲ／ＴＲＩＴＣ、Ｓｉｇｍａ  Ｔ−５２６８）と、暗室で室温で３０分間インキュベートした。調製物を、暗室で０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間２回洗浄した。調製物を、マウント用媒体（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｈ−１０００）を用いて、表を下にしてスライド上にマウントし、そして４℃で保存した。
【００６１】
図１は、ヒト前脳由来の神経幹細胞の増殖中の球（ここでは、「神経球」と呼ぶ）の図を示す。本発明者らは、ＬＩＦが存在または非存在で、上記のように、増殖培地においてヒト前脳由来の神経幹細胞の４株の増殖を評価した。
【００６２】
図２に示すように、４株のうち３株（６．５Ｆｂｒ、９Ｆｂｒ、および１０．５Ｆｂｒ）において、ＬＩＦは、細胞増殖速度を有意に増加した。ＬＩＦの効果は、インビトロにおいて約６０日後に最も顕著であった。
【００６３】
本発明者らはまた、ヒト前脳由来の神経幹細胞の増殖速度に対するｂＦＧＦの効果を評価した。図３に示すように、ｂＦＧＦの存在下で、この幹細胞の増殖は有意に増強された。
【００６４】
（実施例３：ヒト神経幹細胞の分化）
第一の分化プロトコルにおいて、増殖中の神経球を、増殖因子マイトジェンおよびＬＩＦの除去、ならびに１％血清、基材およびイオン荷電の供給源（例えば、ポリオルニチンでカバーしたガラスカバースリップ）の提供によって分化するように誘導した。
【００６５】
ニューロン、星状細胞、および稀突起膠芽細胞についての染色プロトコルは以下のとおりであった。
【００６６】
（ニューロンについてのβチューブリン染色）
細胞を、４％パラホルムアルデヒドで室温にて２０分間固定した。細胞を、０．１Ｍ  ＰＢＳ，ｐＨ７．４で５分間２回洗浄した。細胞を、１００％ＥｔＯＨで２分間透過処理をした。次いで、この細胞を、０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間２回洗浄した。細胞調製物を、室温で１時間、０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に希釈した５％正常ヤギ血清（「ＮＧＳ」）中でブロッキングした。細胞を、１％  ＮＧＳ中に希釈したβチューブリンに対する一次抗体（Ｓｉｇｍａ  Ｔ−８６６０、マウスモノクローナル；１：１０００で使用した）と、２時間室温でインキュベートした。次いで、調製物を、０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間２回で洗浄した。細胞を、１％  ＮＧＳ中に希釈した二次抗体（１：１２８で使用するＧＡＭ／ＦＩＴＣのプール、Ｓｉｇｍａ  Ｆ−０２５７；１：８０で使用するＧＡＲ／ＴＲＩＴＣ、Ｓｉｇｍａ  Ｔ−５２６８）と、暗室で室温で３０分間インキュベートした。調製物を、暗室で０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間２回洗浄する。調製物を、マウント用媒体（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ、Ｈ−１０００）を用いて、表を下にしてスライド上にマウントし、そして４℃で保存する。
【００６７】
いくつかの場合、本発明者らはまた、ＤＡＰＩ（核染色）を用いて、以下のように染色する。上記のように調製したカバースリップを、ＤＡＰＩ溶液（１００％ＭｅＯＨ中に１：１０００に希釈する、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、＃２３６  ２７６）を用いて洗浄する。カバースリップを、ＤＡＰＩ溶液中に３７℃で１５分間インキュベートする。
【００６８】
（稀突起膠芽細胞についてのＯ４染色）
細胞を、４％パラホルムアルデヒドで室温にて１０分間固定した。細胞を、０．１Ｍ  ＰＢＳ，ｐＨ７．４で５分間３回洗浄した。細胞調製物を、室温で１時間、０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に希釈した５％正常ヤギ血清（「ＮＧＳ」）中でブロッキングした。細胞を、１％  ＮＧＳ中に希釈したＯ４に対する一次抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＃１５１８  ９２５、マウスモノクローナル；１：２５で使用した）と、２時間室温でインキュベートした。次いで、調製物を、０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間２回で洗浄した。細胞を、二次抗体とインキュベートし、そしてβチューブリンについて上記に記載したようにさらに処理した。
【００６９】
（星状細胞についてのＧＦＡＰ染色）
細胞を、４％パラホルムアルデヒドで室温にて２０分間固定した。細胞を、０．１Ｍ  ＰＢＳ，ｐＨ７．４で５分間２回洗浄した。細胞を、１００％ＥｔＯＨで２分間透過処理した。次いで、この細胞を、０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間２回洗浄した。細胞調製物を、室温で１時間、０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に希釈した５％正常ヤギ血清（「ＮＧＳ」）中でブロッキングした。細胞を、１％  ＮＧＳ中に希釈したＧＦＡＰに対する一次抗体（ＤＡＫＯ  Ｚ３３４、ウサギポリクローナル；１：５００で使用した）と、２時間室温でインキュベートした。次いで、調製物を、０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間２回で洗浄した。細胞を、二次抗体とインキュベートし、そしてβチューブリンについて上記に記載したようにさらに処理した。
【００７０】
この分化プロトコルは、以下のようにニューロンが富化された細胞培養物を産生した。
【００７１】
【表３】
0004848538.tif 000004
【００７２】
本発明者らはまた、培養物が加齢（すなわち、異なる継代において）するのに一致して、単一の細胞株が分化する能力を、上記の分化プロトコルを用いて評価した。そのデータは以下のとおりである。
【００７３】
【表４】
0004848538.tif 000005
【００７４】
本発明者らは、これらのデータから、細胞が、継代数または培養齢にかかわりなく再現性良く分化のパターンに従うと結論付ける。
【００７５】
（実施例４：ヒト神経幹細胞の分化）
第二の分化プロトコルにおいて、増殖中の神経球を、増殖因子マイトジェンおよびＬＩＦの除去、ならびに１％血清、基材（例えば、ガラスカバースリップまたは細胞外マトリクス成分）、イオン荷電の供給源（例えば、ポリオルニチン）ならびに、１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＤＧＦ  Ａ／Ｂ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＣＮＴＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ−１、１０μＭ  フォルスコリン、３０ｎｇ／ｍｌ  Ｔ３、１０ｎｇ／ｍｌ  ＬＩＦおよび１ｎｇ／ｍｌ  ＮＴ−３をを含む増殖因子の混合物の提供によって分化するように誘導した。この分化プロトコルは、高度にニューロンが富化され（すなわち、分化した細胞培養物の３５％を超える）、そして稀突起膠芽細胞が富化された細胞培養物を生成した。
【００７６】
（実施例５：ヒト神経幹細胞の分化）
第三の分化プロトコルにおいて、細胞懸濁物を、ｈｂＦＧＦ、ＥＧＦ，およびＬＩＦのカクテル中で最初に培養し、次いで２０ｎｇ／ｍＬ  ｈＥＧＦ（ＧＩＢＣＯ）および１０ｎｇ／ｍＬヒト白血病阻害因子（ＬＩＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含むがｈｂＦＧＦを含まないように変更した増殖培地に入れた。この細胞は、最初、ｈｂＦＧＦもまた含む培養物よりも有意に緩慢に増殖した（図３を参照のこと）。それにもかかわらず、この細胞は増殖を続け、２２回もの継代が行われた。幹細胞を増殖培地から取り出し、そして増殖因子カクテル（ｈＰＤＧＦ  Ａ／Ｂ、ｈＣＮＴＦ、ｈＧＦ−１、フォルスコリン、Ｔ３、およびｈＮＴ−３）を補充した分化培地中にポリオルニチンコートしたガラスカバースリップ上にプレートすることによって誘導して分化させた。驚くべきことに、ＧａｌＣ免疫反応性が、これらの分化した培養物において、実施例４に記載される増殖因子誘導プロトコルにおいて見られるＯ４陽性細胞の数を遥かに凌駕するレベルで見られた。
【００７７】
これゆえ、このプロトコルは、稀突起膠芽細胞の分化した細胞培養物富化を生成した。ニューロンは、時折みられたのみであり、小さな突起を有し、そして非常に未熟であるようであった。
【００７８】
（実施例６：遺伝子改変）
本発明者らは、本明細書に記載のように、ＷＯ９６／０２６４６に記載されるＭｘ−１系を用いてヒト神経幹細胞に由来する神経膠芽細胞株を条件的不死化させた。Ｍｘ−１系において、Ｍｘ−１プロモーターは、ＳＶ４０ラージＴ抗原の発現を駆動する。Ｍｘ−１プロモーターをインターフェロンによって誘導する。誘導された場合、ラージＴが発現され、そして静止細胞が増殖する。
【００７９】
ヒト神経膠芽細胞を、以下のようにヒト前脳神経幹細胞から誘導した。増殖中のヒト神経球を増殖培地から取り出し、そしてポリオルニチンプラスチック（２４ウェルプレート）上で、マイトジェンＥＧＦ、ｂＦＧＦおよびＬＩＦならびに０．５％ＦＢＳを有するＮ２混合物中でプレートした。０．５ｍｌのＮ２培地および１％  ＦＢＳを添加した。この細胞を一晩インキュベートした。次いで、この細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎリピドキット（リピド４および６）を用いて、ｐ３１８（ＳＶ４０ラージＴ抗原に作動可能に連結されたＭｘ−１プロモーターを含むプラスミド）でトランスフェクトした。このトランスフェクション溶液は、ｏｐｔｉＭＥＭ培地中に６μｌ／ｍｌの脂質および４μｌ／ｍｌ  ＤＮＡを含んだ。その細胞を、トランスフェクション溶液中で５時間インキュベートした。このトランスフェクション溶液を除去し、そして細胞を、Ｎ２および１％ＦＢＳおよび５００Ｕ／ｍｌ  Ａ／Ｄインターフェロン中にプレートした。この細胞に１週間に２回給餌した。１０週間後、細胞を、ラージＴ抗原発現についてアッセイした。この細胞は、この時点で強いＴ抗原染色を示した。図４が示すように、細胞数を、インターフェロンの非存在下よりもインターフェロンの存在下でより高かった。
【００８０】
ラージＴ発現を、以下のとおりに免疫細胞化学を用いてモニターした。細胞は、４％パラホルムアルデヒドを用いて室温で２０分間固定した。細胞を、０．１Ｍ  ＰＢＳ，ｐＨ７．４で５分間２回洗浄した。細胞を、１００％ＥｔＯＨで２分間透過処理をした。次いで、この細胞を、０．１  ＰＢＳで５分間２回洗浄した。細胞調製物を、室温で１時間、０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に希釈した５％正常ヤギ血清（「ＮＧＳ」）中でブロッキングした。細胞を、１％  ＮＧＳ中に希釈したラージＴ抗原に対する一次抗体（１：１０で使用した）と、２時間室温でインキュベートした。本発明者らは、ラージＴ抗原に対する抗体を、ＰＡＢ１４９細胞を培養し、そして馴化培地を得ることによって研究所内で調製した。次いで、調製物を、０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間２回で洗浄した。細胞を、１％  ＮＧＳ中に希釈した二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからのビオチン化したヤギ抗マウスを１：５００で、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  ＡＢＣマウスＩｇＧキット、ＰＫ−６１０２）と、室温で３０分間インキュベートした。調製物を、０．１Ｍ  ＰＢＳで５分間２回洗浄した。調製物を、０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に１：５００で希釈したＡＢＣ試薬中で３０分間室温でインキュベートする。細胞を、０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で５分間２回洗浄し、次いで０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．６中で５分間２回洗浄した。細胞を、ＤＡＢ（ニッケル増感剤）中で５分間室温でインキュベートする。ＤＡＢ溶液を除去し、そして細胞を３〜５回ｄＨ2Ｏで洗浄する。細胞を、５０％グリセロール／５０％０．１Ｍ  ＰＢＳ、ｐＨ７．４中に保存する。
【００８１】
（実施例７：被包）
次に、ヒト神経幹細胞が被包される場合、以下の手順が使用され得る。
【００８２】
中空繊維を外径７２０ｍおよび壁厚１００ｍ（ＡＫＺＯ−Ｎｏｂｅｌ  Ｗｕｅｐｐｅｒｔａｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）から製造する。これらの繊維は、米国特許第４，９７６，８５９号および同４，９６８，７３３号（これを、本明細書において参考として援用する）に記載される。この繊維を、その分子量カットオフについて選択し得る。本発明者らは、時折、約２８０ｋｄのＭＷＣＯ（分子量カットオフ）を有するＰＥＳ＃５メンブレンを使用する。他の研究において、本発明者らは、約９０ｋｄのＭＷＣＯを有するＰＥＳ＃８メンブレンを使用する。
【００８３】
このデバイスは、代表的に以下を備える：
１）ＡＫＺＯ  Ｎｏｂｅｌ  Ｆａｓｅｒ  ＡＧによって製造された、半透過性のポリエーテルスルホン中空繊維メンブレン
２）ハブメンブレンセグメント
３）光硬化メタクリレート（ＬＣＭ）樹脂先端；および
４シリコーンテザー。
【００８４】
使用される半透過性メンブレンは、代表的に、以下の特徴を有する。
【００８５】
内径：５００＋３０ｍ
壁厚：１００＋１５ｍ
破損強さ：１００＋１５ｃＮ
破損伸長：４４＋１０％
水圧透過性：６３＋８（ｍｌ／分  ｍ2  ｍｍＨｇ）
ｎＭＷＣＯ（デキストラン）：２８０＋２０ｋｄ。
【００８６】
このデバイスの成分は、市販されている。ＬＣＭグルーは、Ａｂｌｅｓｔｉｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）から入手可能である（Ｌｕｘｔｒａｋ  Ａｄｈｅｓｉｖｅｓ  ＬＣＭ２３およびＬＣＭ２４）。テザー材料は、Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｆａｂｒｉｃａｔｏｒｓ（Ｒｏｂｌｅｓ、ＣＡ）から入手可能である。テザー寸法は、０．７９ｍｍ外径×０．４３ｍｍ内径×長さ２０２ｍｍである。このデバイスの形態は以下のとおりである。内表面は、透過選択性のスキンを有する。この壁は開放性小胞発泡構造を有する。外表面は、開放性構造を有し、孔は外表面の３０＋５％を占める、１．５ｍまでである。
【００８７】
繊維材料をまず、５ｃｍ長の切片へと切断し、そして各セグメントの遠位末端を、光重合化したアクリル性グルー（ＬＣＭ−２５、ＩＣＩ）で封着する。エチレンオキシドでの滅菌および排気後、その繊維セグメントに、液体培地中またはヒドロゲルマトリクス（例えば、コラーゲン溶液（Ｚｙｄｅｒｍ（登録商標）、アルギナート、アガロースまたはキトサン）中の１０4〜１０7細胞の間の懸濁物を、Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジおよび２５ゲージ針を介して、付属の注入口を通して充填する。カプセルの近位端を、同じアクリル性グルーで封着する。ヒト研究に意図されるこのデバイスの容量は、約１５〜１８ｌである。
【００８８】
シリコーンテザー（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｓｉｌｉｃｏｎｅ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ、Ｔａｕｎｔｏｎ、ＭＡ）（内径６９０ｍ；外径１．２５ｍｍ）を、繊維の近位端の上に置き、そのデバイスの操作および取り出しを容易にさせる。
【００８９】
（実施例８：神経幹細胞の移植）
本発明者らは、ラット脳へヒト神経幹細胞を移植し、そして移植片生存度、組込み、移植片細胞の表現型の運命、ならびに損傷した動物における移植した細胞と関連する行動変化を評価した。
【００９０】
移植を、標準的な技術に従って実施した。成体ラットに、ペントバルビタールナトリウム（４５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔をかけた。そして、Ｋｏｐｆ定位装置に配置した。正中切開を、頭皮において行い、そして細胞の注入のために穴を開けた。ラットに、改変されていない、未分化のヒト神経幹細胞の移植物を、左線条体に、１０μｌＨａｍｉｌｔｏｎシリンジに装着したガラスキャピラリーを用いて与えた。各々の動物に、合計容量２μｌ中で合計約２５０，０００〜５００，０００細胞を与えた。細胞を、継代後１〜２日後に移植した。そして、細胞懸濁物を、５〜２０細胞の未分化の幹細胞クラスターから作製した。移植後、皮膚を縫合して閉じた。
【００９１】
動物の行動試験を行い、ついで組織学的分析のために屠殺した。
【００９２】
（実施例９：神経幹細胞の移植を用いるＥＧＦ脳室内送達）
約３００，０００神経幹細胞を、小さな神経球として、標準的な技術を用いて、側室脳近傍の成体ラット線条体へと移植した。同じ手術期間中に、ＥＧＦ（４００ｎｇ／日）またはビヒクルのいずれかを放出する浸透圧ミニポンプもまた、線条体に移植した、ラットに、ＥＧＦを、流速０．５μＬ／時で７日間にわたって与え、これにより各動物の側室脳に合計で２．８μｇのＥＧＦの送達をもたらした。移植したラットのサブセットを、ｉ．ｐ．シクロスポリン注射（１０ｍｇ／ｋｇ／日）によりさらに免疫抑制した。ポンプ注入の最後の１６時間の間、その動物に、ＢｒｄＵの注入（１２０ｍｇ／ｋｇ）を３時間毎に与えた。
【００９３】
移植後１週間で、その動物を４％パラホルムアルデヒドで灌流し、そして連続切片を３０μｍの厚さで凍結ミクロトーム上で切断した。脳切片を、星状細胞、稀突起膠芽細胞、ニューロンおよび未分化の前駆体細胞のマーカーについて染色した。最小限の移動は、ＥＧＦの非存在下で成体ＣＮＳにおいて示された。７日齢の動物の移植片の卓越した生存は、Ｍ２免疫反応性によって示されるように、ＥＧＦを与えたラットにおいて見られた。そして、ＥＧＦ処置した動物における移植片は、ビヒクル単独で処置した動物におけるよりもより大規模であった。さらに、宿主細胞の増殖は、ＥＧＦ処置の際に観察された。ＢｒｄＵ注射を屠殺前に与えた動物では、処置した脳室において分裂中の細胞数が増加したが、隣接する脳室では増加しないことが示された。
【００９４】
（実施例１０：脊髄空洞症の処置）
初代胎児性移植片を使用して、患者における脊髄損傷の周りに形成された空洞の痕跡を除去した。本発明に記載される神経幹細胞は、置換に適切である。なぜなら、構造的機能のみがこの細胞に必要であるからである。神経幹細胞を、損傷した患者の脊髄に移植して、空洞形成を予防する。結果を、好ましくはＭＲＩ画像化により測定する。臨床試験プロトコルは記載されており、そして記載される神経幹細胞を含むように容易に改変され得る。
【００９５】
（実施例１１：インビトロで増加したヒト神経幹細胞の子孫を使用した神経変性疾患の処置）
細胞を、慣用的な吸引中絶法に従って、８週齢のヒト胎児からの腹側中脳組織から得、これを、滅菌の収集装置に収集する。２×４×１ｍｍの組織片を、実施例２のように切片化しそして分離する。次いで、神経幹細胞を増殖する。神経幹細胞の子孫を、神経変性疾患を伴う、血液型が適合する宿主へと神経移植するために使用する。手術を、ＢＲＷコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）定位ガイドを用いて実施する。この患者を、静脈内に投与したミダゾラムでさらに（ｓｕｐｐｉｅｍｅｎｃｅａ）局所麻酔する。この患者をＣＴスキャンして、その移植片を与えた領域の座標を確立する。この注入カニューレは、１９ゲージの内部スタイレットを伴う１７ゲージステンレス鋼外側カニューレからなる。これを、脳内に正確な座標へと挿入し、次いで、これを取り出し、そして３０μｌの組織懸濁物を予備充填した１９ゲージの注入カニューレに置換する。その細胞をカニューレを取り除くときに３μｌ／分の速度でゆっくりと注入する。多重の定位針経路を、目的の領域中に、約４ｍｍ分離させて作製する。患者を、術後にＣＴスキャンにより、出血または浮腫について検査する。神経学的評価を、種々の術後の間隔で実施し、そしてＰＥＴスキャンをして移植した細胞の代謝活性を決定する。
【００９６】
（実施例１２：リン酸カルシウムトランスフェクションを用いた神経幹細胞の子孫の遺伝子改変）
神経幹細胞子孫を、実施例２に記載のように増殖する。次いで、その細胞を、リン酸カルシウムトランスフェクション技術を用いてトランスフェクトする。標準的なリン酸カルシウムトランスフェクションのために、その細胞を、単一細胞懸濁へと機械的に分離させ、そして５０％のコンフルエンスで組織培養処置したディッシュにプレートし（５０，０００〜７５，０００細胞／ｃｍ2）、そして一晩付着させる。
【００９７】
改変したリン酸カルシウムトランスフェクション手順を、以下のように実施する。滅菌ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中のＤＮＡ（１５〜２５μｇ）を、４４０μｌにＴＥを用いて希釈し、そして６０μｌの２Ｍ  ＣａＣｌ2（ｐＨを、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ緩衝液で５．８にする）をＤＮＡ／ＴＥ緩衝液に添加する。合計５００μｌの２×ＨｅＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝化生理食塩水；２７５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．４ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4、１２ｍＭ  デキストロース、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝剤粉末、ｐＨ６．９２）を滴下してこの混合物に加える。この混合物を、室温で２０分間放置する。この細胞を、手短に１×ＨｅＢＳで洗浄し、そして１ｍｌのリン酸カルシウム沈降ＤＮＡ溶液を各プレートに添加し、そしてその細胞を、３７℃で２０分間インキュベートする。このインキュベーション後、１０ｍｌの完全培地をこの細胞に添加し、そしてそのプレートをインキュベーターに（３７℃、９．５％ＣＯ2）、さらに３〜６時間配置する。このＤＮＡおよびその培地を、インキュベーション期間の末期に吸引除去により除去し、そしてその細胞を、完全増殖培地で３回洗浄し、次いでそのインキュベーターに戻す。
【００９８】
（実施例１３：神経幹細胞子孫の遺伝子改変）
実施例２のように増殖した細胞を、ＦＧＦ−２レセプターまたはＮＧＦレセプターについての遺伝子を含む発現ベクターでトランスフェクトする。その遺伝子を含むベクターＤＮＡを、０．１×ＴＥ（１ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に希釈して４０μｇ／ｍｌの濃度にする。２２μｌのこのＤＮＡを、使い捨ての滅菌５ｍｌプラスチックチューブ中の２５０μｌの２×ＨＢＳ（２８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  Ｎａ2ＨＰＯ4・２Ｈ2Ｏ、１２ｍＭ  デキストロース、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ）に添加する。３１μｌの２Ｍ  ＣａＣｌ2をゆっくりと添加し、そしてその混合物を、室温で３０分間インキュベートする。この３０分間のインキュベーションの間、この細胞を、８００ｇで５分間４℃で遠心分離する。この細胞を、２０容量の氷冷ＰＢＳ中に再懸濁し、そして１×１０7細胞のアリコートに分割し、これを再び遠心分離する。各細胞のアリコートを、１ｍｌのＤＮＡ−ＣａＣｌ2懸濁液に再懸濁し、そして２０分間室温でインキュベートする。次いで、この細胞を、増殖培地に希釈し、そして５〜７％ＣＯ2中で３７℃で６〜２４時間インキュベートする。この細胞を再び遠心分離し、ＰＢＳ中で洗浄し、そして１０ｍｌの増殖培地に４８時間戻す。
【００９９】
トランスフェクトされた神経幹細胞子孫を、ヒト患者に、実施例８または実施例１１に記載されるような手順を用いて移植するか、またはこれを、以下の実施例に記載されるような薬物スクリーニング手順のために使用する。
【０１００】
（実施例１４：多能性神経幹細胞および神経幹細胞子孫に対する効果についての薬物または他の生物学的薬剤のスクリーニング）
Ａ．ニューロンおよびグリア細胞の分化および生存に対するＢＤＮＦの効果
前駆体細胞を、実施例２に記載のように増殖させ、そして実施例４に記載のように分化させた。この細胞をプレートする時点で、ＢＤＮＦを１０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。インビトロ（ＤＩＶ）で３、７、１４、および２１日において、細胞を間接免疫細胞学のために処置した。ＢｒｄＵ標識を使用して、神経幹細胞の増殖をモニターした。ニューロン、稀突起膠芽細胞、および星状細胞に対するＢＤＮＦの効果を、ニューロン上に見出される抗原（ＭＡＰ−２、ＮＳＥ、ＮＦ）、稀突起膠芽細胞上に見出される抗原（Ｏ４、ＧａｌＣ、ＭＢＰ）、または星状細胞上に見出される抗原（ＧＦＡＰ）を認識する抗体を用いて培養物をプロービングすることによりアッセイした。細胞の生存度を、各時点での免疫反応性の細胞数を計数することにより決定し、そして形態学的な観察を行った。ＢＤＮＦは、コントロール条件下で観察された数に比べて、ニューロンの分化および生存度を有意に増加した。星状細胞および稀突起膠芽細胞の数は、コントロール値からは有意に異ならなかった。
【０１０１】
Ｂ．神経表現型の分化に対するＢＤＮＦの効果
パートＡに記載される方法に従ってＢＤＮＦで処理した細胞を、神経伝達物質または神経伝達物質の合成に関与する酵素を認識する抗体を用いてプロービングした。これらは、ＴＨ、ＣｈＡＴ，サブスタンスＰ、ＧＡＢＡ、ソマトスタチン、およびグルタミン酸を含んだ。コントロール条件およびＢＤＮＦ処置培養条件の両方において、試験したニューロンは、サブスタンスＰおよびＧＡＢＡの存在について陽性であった。数の増加とともに、ＢＤＮＦにおいて増殖したニューロンは、コントロールの例と比較した場合、神経突起伸長および分岐の劇的な増加を示した。
【０１０２】
Ｃ．増殖因子応答性細胞の同定
細胞を、実施例４に記載のように分化させ、そして１ＤＩＶにおいて、約１００ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦを添加した。ＢＤＮＦの添加後１、３、６、１２および２４時間に、この細胞を、固定し、そして二重標識免疫細胞学のために処理した。ニューロン（ＭＡＰ−２、ＮＳＥ、ＮＦ）、稀突起膠芽細胞（Ｏ４、ＧａｌＣ、ＭＢＰ）、または星状細胞（ＧＦＡＰ）を認識する抗体を、ｃ−ｆｏｓおよび／または他の前初期遺伝子を認識する抗体とともに用いた。ＢＤＮＦへの曝露は、ニューロン細胞におけるｃ−ｆｏｓの発現の選択的増加をもたらした。
【０１０３】
Ｄ．増殖および分化の間のマーカーおよび調節因子の発現に対するＢＤＮＦの効果
パートＡにおいて記載される方法に従って、ＢＤＮＦで処置した細胞を、調節因子、ＦＧＦ−Ｒ１または他のマーカーの発現の分析のために処置する。
【０１０４】
Ｅ．増殖因子が産生した幹細胞子孫の増殖、分化および生存に対するクロルプロマジンの効果
精神病の処置に広汎に使用される薬物であるクロルプロマジンを、１０ｎｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で、上記の実施例１４Ａ〜１４ＤにおけるＢＤＮＦの代わりに用いる。種々の濃度での、幹細胞増殖ならびに幹細胞子孫の分化および生存に対するこの薬物の効果をモニターする。分化したニューロンの遺伝子発現および電気生理学的特性における変化を決定する。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ヒト前脳組織由来の増殖性９ＦＢｒヒト神経幹細胞（継代数６）の球の代表例を示す。
【図２】  図２は、パネルＡは、（ａ）ＥＧＦ、ＦＧＦ、および白血病阻害因子（「ＬＩＦ」）を含む規定培地（黒菱形で示す）、ならびに（ｂ）ＬＩＦを含まない同じ培地（白菱形で示す）中で培養した６．５Ｆｂｒと称するヒト神経幹細胞株についての増殖曲線を示す。パネルＢは、（ａ）ＥＧＦ、ＦＧＦ、および白血病阻害因子（「ＬＩＦ」）を含む規定培地（黒菱形で示す）、ならびに（ｂ）ＬＩＦを含まない同じ培地（白菱形で示す）中で培養した９Ｆｂｒと称するヒト神経幹細胞株についての増殖曲線を示す。パネルＣは、（ａ）ＥＧＦ、ＦＧＦ、および白血病阻害因子（「ＬＩＦ」）を含む規定培地（黒菱形で示す）、ならびに（ｂ）ＬＩＦを含まない同じ培地（白菱形で示す）中で培養した９．５Ｆｂｒと称するヒト神経幹細胞株についての増殖曲線を示す。パネルＤは、（ａ）ＥＧＦ、ＦＧＦ、および白血病阻害因子（「ＬＩＦ」）を含む規定培地（黒菱形で示す）、ならびに（ｂ）ＬＩＦを含まない同じ培地（白菱形で示す）中で培養した１０．５Ｆｂｒと称するヒト神経幹細胞株についての増殖曲線を示す。
【図３】  図３は、（ａ）ＥＧＦおよび塩基性線維芽細胞増殖因子（「ｂＦＧＦ」）を含む規定培地（白菱形で示す）、ならびに（ｂ）ＥＧＦを含むがｂＦＧＦを含まない規定培地（黒菱形で示す）中で培養した９Ｆｂｒと称するヒト神経幹細胞株についての増殖曲線を示す。
【図４】  図４は、ヒト神経幹細胞株に由来する条件的不死化ヒト神経膠芽細胞株Ｍｘ−１についての細胞数対培養日数のグラフを示す。白四角は、インターフェロン存在下での増殖を示し、黒菱形は、インターフェロンの非存在下での増殖を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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