(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式(I)
【化１】
0004756620.tif 000009
［Ｘはハロゲン、Ｒ１、Ｒ２は水素または炭素数１〜５のアルキル基を示す。］
で示される４−ハロ−３−ヒドロキシニトリル類に、アースロバクター（Arthrobacter）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、カセオバクター（Caseobacter）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ノカルディア（Nocardia）属、アミコラトプシス（Amycolatopsis ）属及びロドコッカス（Rhodococcus）属の群から選択される少なくとも１種の微生物又は該処理物を接触させ、さらに６０〜１００℃の温度で加熱処理を行い、下記一般式（II）
【化２】
0004756620.tif 000010
［Ｒ１、Ｒ２は水素または炭素数１〜５個のアルキル基を示す。］
で示されるβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類を採取するβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は微生物によるβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類の製造方法に関する。β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類は、レジスト、医薬品、農薬などの合成原料として有用である。
【０００２】
【従来の技術】
β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類の化学的製造方法としては、例えば、グリシドールと一酸化炭素を高温高圧下で貴金属触媒を触媒として反応させる方法（米国特許第４，９６８，８１７号）、３−ブテン酸を白金触媒下で過酸化水素を作用させてエポキシ化したものを水和した後にラクトン化する方法（Angew.chem.,Int.Ed.Eng 994-1000(1966)）等が知られているが、何れも爆発等の危険性が高い方法である。また、Ｌ−アスコルビン酸又はＤ−イソアスコルビン酸を出発原料として用い、７工程を経て製造する方法（Synthesis 570-572 (1987)）、Ｌ−リンゴ酸から３工程で製造する方法（特開平6-172256号）等も知られているが、多工程の反応を経由するために操作が煩雑となり、収率の面でも決して望ましいものではない。
【０００３】
β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類の生物学的製造方法としては、シュードモナス属細菌を微生物触媒として、ethyl-4-chloro-3-hydroxybutyrateから(S)-3-hydroxy-γ-butyrolactoneを製造する方法（Tetrahedr.Asym. 11. 3109-3112 (1996)）やエンテロバクター属細菌を微生物触媒として、ｍethyl-4-chloro-3-hydroxybutyrateから(S)-3-hydroxy-γ-butyrolactoneが知られている。
しかし、いずれの方法も酵素の安定性、基質（例えばmethyl-4-chloro-3-hydroxybutyrate等）に対する酵素の耐性、生成物の光学純度に満足できるものではなかった。また、基質の調製について、煩雑な工程を経て調製する必要があり工業的に有利な方法とは言い難い。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、４−ハロ−３−ヒドロキシニトリル類を原料とした工程の短い、工業的に有利なβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類の製造方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、４−ハロ−３−ヒドロキシニトリル類を原料とし、該ニトリルに微生物菌体又は該処理物を接触させることによりβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類に変換することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち本発明は、(1) 一般式(I)
【化５】
0004756620.tif 000002
［Ｘはハロゲン、Ｒ１、Ｒ２は水素または炭素数１〜５のアルキル基を示す。］
で示される４−ハロ−３−ヒドロキシニトリル類に、アースロバクター（Arthrobacter）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、カセオバクター（Caseobacter）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ノカルディア（Nocardia）属、アミコラトプシス（Amycolatopsis ）属又はロドコッカス（Rhodococcus）属の群から選択される少なくとも１種の微生物又は該処理物を接触させて、下記一般式（II）
【化６】
0004756620.tif 000003
［Ｒ１、Ｒ２は水素または炭素数１〜５個のアルキル基を示す。］
で示されるβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類を採取するβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類の製造法、である。
【０００７】
本発明により、製造工程の短いβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類の製造方法を提供することができる。さらには、４−ハロ−３−ヒドロキシ酸類及び／又は４−ハロ−３−ヒドロキシアミド類による酵素の失活を回避でき、より高収率でβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類を得ることができる。
4-ハロ-3-ヒドロキシブチロニトリルに微生物を作用させて、対応するアミド体又はカルボン酸体へ変換することができることは、既に、本発明者の一部が見いだしていたが（特許2983695号及び特許3014171号公報参照）、前記反応で対応するラクトン体が生成することは、知られていなかった。
さらには、4-ハロ-3-ヒドロキシニトリル類から対応するアミド体を経由してβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類が製造できることは全く予想できなかったことである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明で用いられる微生物としては、一般式［１］
【化７】
0004756620.tif 000004
［Ｘはハロゲン、Ｒ１、Ｒ２は水素または炭素数１〜５のアルキル基を示す。］
で示されるニトリル類を一般式［２］
【化８】
0004756620.tif 000005
［Ｒ１、Ｒ２は水素または炭素数１〜５個のアルキル基を示す。］
で示されるβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類に変換できるものであればいずれの微生物も含まれる。例えば、アースロバクター（Arthrobacter）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、カセオバクター（Caseobacter）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属ノカルディア（Nocardia）属、アミコラトプシス（Amycolatopsis ）属またはロドコッカス（Rhodococcus）属に属する微生物、具体的には、アースロバクター  オキシダンス（Arthrobacter oxydans）IFO 12138、ブレビバクテリウム  ヘルボラム（Brevibacteriu helvolum）ATCC 11822、コリネバクテリウム  フラベシエンス（Corynebacterium flavescens）IAM 1642、コリネバクテリウム  ニトリロフィラス（Corynebacterium nitrilophilus）ATCC 21419、ノカルディア  ポリクロモゲネス（Nocardia polychromogenes）IFM 19、アミコラトプシス  ファスチディオーサ（Amycolatopsis fastidiosa）ATCC 31181、ロドコッカス  エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）IFO 12540、などが挙げられ、これらの微生物は、アメリカン  タイプカルチャー  コレクション（ATCC）、財団法人発行研究所（IFO）、千葉大学真核微生物研究センター（IFM）又は東京大学分子細胞生物学研究所（IAM）から容易に入手することができる。
また、経済産業省  産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所に寄託されているカセオバクター  sp. BC23（FERM P-11261）、ロドコッカス  ロドクロウス  J-1（FERM BP-1478）、シュードモナス  sp. BC15-2（FERM BP-3320）、Pseudomonas sp. SK31（FERM P-11310）、Pseudomonas sp. SK87（FERM P-11311）、シュードモナス  sp. SK13（FERM BP-3325）、Rhodococcus sp. SK70（FERM P-11304）、Rhodococcus sp. HR11（FERM P-11306）、Rhodococcus sp. SK49（FERM P-11303）などを挙げることもできる。
【０００９】
本発明で使用する微生物を培養するための培地組成としては、通常これらの微生物が生育し得るものならば何でも使用することができる。例えば、炭素源としてグルコース、フラクトース、シュークロース、マルトース等の糖類、酢酸、クエン酸などの有機酸類、エタノール、グリセロール等のアルコール類など、窒素源としてペプトン、肉エキス、酵母エキス、蛋白質加水分解物、アミノ酸等の一般天然窒素源の他に各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用でき、この他無期塩、微量金属類ビタミン等が必要に応じて適宜使用される。
この際、より高い酵素活性を誘導させるために、n-プロピオニトリル、n-ブチロニトリル、iso-ブチロニトリル、4-クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル、ベンジルシアニドなどの各種ニトリル化合物、n-プロピオアミド、ｎ-ブチルアミド、iso-ブチルアミドなどの各種アミド化合物、γ-ブチロラクタム、δ-バレロラクタム、ε-カプロラクタムなどのラクタム化合物などを培地に添加することも有効な場合がある。
上記微生物の培養は常法によればよく、例えばｐＨ４〜１０、温度１０〜４０℃の範囲にて好気的に１０〜１８０時間培養する。培養は、液体培養、固体培養のいずれで行うこともできる。
【００１０】
本発明において、微生物又は該処理物とは、前記の方法により培養して得た微生物の培養液又は遠心分離等により得た菌体、菌体破砕物、菌体抽出物、粗酵素、精製酵素をいう。また、これらの微生物又は該処理物をアクリルアミド、カラギーナン、アガロース等で固定化したもの、イオン交換樹脂等に吸着させたものでも良い。反応に使用する微生物又は該処理物は、反応様式により適宜選択される。
また、前記の微生物又は該処理物を使用し、４−ハロ−３−ヒドロキシニトリル類からβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類を得る方法としては、培養して得た微生物の培養液又は遠心分離等により得た菌体を適当な水性媒体と混合した菌体懸濁液を基質に添加する方法、菌体処理物（例えば菌体破砕物、菌体抽出物など）、常法により固定化した菌体、常法により精製した酵素、酵素固定化物等を基質に添加する方法、微生物の培養時に培地に基質を添加して培養と同時に反応を行う方法等が例示できる。
【００１１】
反応中の基質濃度は、特に限定するものでないが、０．１〜８０（Ｗ／Ｖ）％程度が好ましく、基質は反応液に一括して加えるか、又は分割して添加することも可能である。反応温度は特に限定するものではないが、ラクトン化反応がアミド体又はカルボン酸体を経由するため、基質ニトリル化合物が消費し尽くされるまでは、１〜６０℃にて行うことが好ましい。
【００１２】
また、高収率でラクトン化物を得るためには、基質ニトリル化合物が消費し尽くされた後、６０〜１００℃に加熱することが好ましい。
該加熱処理を行う際は、酵素反応後、培養液、菌体処理物等が混合した酵素反応溶液をそのまま、又は遠心分離等で菌体等を除去した溶液を使用し、実施することができる。反応ｐＨは特に限定するものではないが、反応の開始時においてｐＨ４〜１０の範囲で行うことが望ましい。反応時間は基質濃度、菌体濃度等によって変わるが、通常１〜１２０時間で終了するように条件を設定することが好ましい。
【００１３】
かくして反応液中に生成蓄積したβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類は、公知の方法を用いて採取および精製することができる。例えば、反応液から遠心分離などの方法を用いて菌体を除いた後、水を溜去して濃縮することによりβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類を得ることができる。また、蒸留によりさらに精製することもできる。
【００１４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１５】
〔実施例１〕
（1）  培地の調製および微生物の培養
培地Aの調製；
表１に示す組成の培地のpHを7.2に調整後、5mlずつ試験管に分注し、121℃で15分間オートクレーブで滅菌した。オートクレーブ後、メンブランフィルターで除菌した５質量％のイソブチロニトリルおよびイソブチルアミド水溶液を、0.1mlずつ添加し、培地Aとした。
【表１】
0004756620.tif 000006
【００１６】
培地Bの調製；
表２に示す組成の培地のpHを7.2に調整後、5mlずつ試験管に分注し、121℃で15分間オートクレーブで滅菌した。オートクレーブ後、メンブランフィルターで除菌した５質量％のプロピオニトリル水溶液を、0.1mlずつ添加し、培地Ｂとした。
【表２】
0004756620.tif 000007
【００１７】
表３に示す微生物を培地A又は培地Bに植菌し、30℃にて72時間振とう培養を行った。
【表３】
0004756620.tif 000008
【００１８】
(2)反応
上記の方法により培養して得た、表３記載の菌体を遠心分離により集菌し、50mMリン酸緩衝液（pH 7.2）1.5mlにて洗浄後、10重量%の4-クロロ-3-ヒドロキシブチロニトリル水溶液1mlを添加して、菌体を懸濁させ、30℃にて24時間反応させた。分析条件は、カラム：ジーエルサイエンス社製のイナートシルODS-3V（4.6mmID×25mm）、溶離液：0.1%リン酸水溶液、流速：1ml/min、カラム温度：40℃、検出:示差屈折検出器（日本分光社製）で行った。
反応液から遠心分離にて除菌した溶液を高速液体クロマトグラフィーにて分析したところ、全ての反応液において、β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの生成が認められた。
【００１９】
〔実施例２〕
グルコース10g/l、K2HPO40.5g/l、KH2PO40.5g/l、MgSO4・7H2O 0.5g/l、酵母エキス1g/l、ポリペプトン7.5g/lからなる培地（pH 7.2）10mlを試験管に入れて、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した後、ロドコッカス  ロドクロウス  J-1菌株を接種して、28℃で48時間振とう培養し、これを前培養液とした。
上記組成の培地に、尿素15g/l、CoCl210mg/lを加えた培地（pH 7.2）100mlを500ml容三角フラスコに入れて、121℃、15分間オートクレーブ滅菌した後、前培養液4mlを接種して、28℃で96時間振とう培養した。
【００２０】
上記の方法により培養して得た菌体を遠心分離にて集菌し、培養液と同量の50mMリン酸緩衝液（pH 7.7）で洗浄した後、10mlの同緩衝液に菌体を懸濁した。蒸留水6.75mlに4-クロロ-3-ヒドロキシブチロニトリル3gを加えて、上記菌体懸濁液0.25mlを添加して、30℃で1.5時間、次いで70℃で4時間処理した。
【００２１】
反応液から遠心分離にて除菌後、上清を実施例１と同様に高速液体クロマトグラフィーにて分析したところ、4-クロロ-3-ヒドロキシブチロニトリルは検出されず、β−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンの生成が認められた。
この反応液上清から酢酸エチルで抽出を行い、溶媒を減圧下溜去した後、残渣をIR、1H-NMRおよび13C-NMR分析を行い、生成物がβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンであることを確認した。
【００２２】
【発明の効果】
本発明によれば、４−ハロ−３−ヒドロキシニトリル類を原料とした工程の短い、経済性に優れたβ−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトン類の製造方法を提供することができる。