(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミドルブルック7H9ブロス（M7H9-B培地）からなる基本培地に、L-アスパラギン水和物、カゼインペプトン、酵母エキス、オレイン酸、ヘミンを含むことを特徴とする、抗酸菌培養用液体培地である改変M7H9-B培地を、ビット培地上に重層させた、抗酸菌培養用の二相培地。
【請求項２】
改変M7H9-B培地に対してさらに抗菌剤を添加することを特徴とする、請求項1に記載の抗酸菌培養用の二相培地。
【請求項３】
抗菌剤がアンホテリシンBおよびシクロヘキシミドである、請求項2に記載の抗酸菌培養用の二相培地。
【請求項４】
コハク酸およびセチルピリジニウムクロライドを含む抗酸菌培養用サンプル前処理剤により処理されたサンプルに対して使用することができることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の二相培地。
【請求項５】
サンプルを請求項1〜4のいずれか1項に記載の二相培地上で培養する、抗酸菌培養方法。
【請求項６】
コハク酸およびセチルピリジニウムクロライドを含む抗酸菌培養用サンプル前処理剤により処理されたサンプルに対して使用することができることを特徴とする、請求項5に記載の抗酸菌培養方法。
【請求項７】
ミドルブルック7H9ブロス（M7H9-B培地）からなる基本培地に、L-アスパラギン水和物、カゼインペプトン、酵母エキス、オレイン酸、ヘミンを含むことを特徴とする、抗酸菌培養用液体培地である改変M7H9-B培地、およびビット培地を含む、抗酸菌培養キット。
【請求項８】
さらに抗菌剤を含む、請求項7に記載の抗酸菌培養キット。
【請求項９】
コハク酸およびセチルピリジニウムクロライドを含む抗酸菌培養用のサンプル前処理剤、および請求項7または8に記載の抗酸菌培養キットからなる、抗酸菌前処理-培養キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗酸菌を対象とする選択分離培養に関する。より具体的には、抗酸菌培養用液体培地である改変M7H9-B培地、当該改変M7H9-B培地を用いた液体−固型二相培地、およびそれらを使用する抗酸菌培養方法に関する。本発明はさらに、抗酸菌培養用のサンプル前処理剤および改変M7H9-B培地を含む、抗酸菌培養キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
結核菌の検査においては、分離培養法がしばしば用いられる。分離培養法は、サンプルからの抗酸菌の検出感度が高く、また分離した菌を用いて菌種の鑑別・同定や、薬剤耐性試験を行うことができるという特徴を有している。一般的には、分離培養法は、サンプルの前処理、処理サンプルの培地への接種、および成績判定の3つの工程から構成される。
【０００３】
近年の技術の進歩および検査業務の増加に伴って改訂された新結核菌検査指針2000（2000年4月）においては、従来の結核菌検査指針と比較して、検査期間の短縮および検査の精度の向上が要求されている。この新結核菌検査指針2000においては、従来からの直接塗抹法や小川法に代えて、サンプルの前処理にN-アセチル-L-システイン・NaOH（NALC-NaOH）を用いる方法により検査を行うこと、および検出感度の向上に加え迅速性を重視して、処理サンプル中からの初代分離に液体培地を使用することが推奨されている。
【０００４】
喀痰などのサンプルを用いる場合、抗酸菌以外の他の一般細菌がサンプル中に混入することは避けられない。サンプル中に抗酸菌以外の一般細菌が残存したまま、これらの前処理したサンプルを液体培地中で培養した場合には、混入した一般細菌も液体培地中で増殖するため、培地中で増殖した細菌群の中から、抗酸菌のみを区別することができないという、いわゆるコンタミネーションの問題が生じていた。また、そのようなコンタミネーションの有無を確認するため、かかる液体培地中における抗酸菌以外の一般細菌の有無を確認することを目的として、種々の染色法あるいは血液寒天培地などの使用による検出を行うこととすれば、かえって手間とコストがかかってしまうなどの不利益を生じることになる。従って、このサンプル中に含まれる他の一般細菌は、分離培養を行う前に、前処理をして予め死滅させておくことが望まれている。
【０００５】
このようなサンプルの前処理方法として、NaOH法、NALC-NaOH法、セチルピリジニウムクロライド（CPC）法などが知られている。
NaOH法は、抗酸菌が、他の一般細菌と比較してNaOHに対する抵抗性が強いという特徴を有していることに基づいて行われる前処理である。しかし、NaOHの濃度が高く、作用温度が高く、あるいは作用時間が長ければ、抗酸菌もNaOHにより死滅してしまう。このうち作用濃度および作用時間は、サンプルの粘性に依存して変化させることが一般的である。そのため、新結核菌検査指針2000においては、喀痰の場合には、粘液溶解剤であるNALCを加えて喀痰の消化を促進し、NaOHの抗酸菌に対する障害作用の軽減を図るNALC-NaOH法を推奨している。しかし、NALC-NaOH法でも、後述するCPC法と比較して、サンプル中の他の一般細菌の混入、いわゆるコンタミネーションの防止が完全ではないという欠点が存在していた。
【０００６】
これに対して、CPC法は、CPCが細菌に対する静菌効果を有していることを利用する方法であり、抗酸菌が、他の一般細菌と比較して、CPCに対する抵抗性が比較的強いという特徴に基づいて行われる前処理方法である。このサンプルの前処理のためのCPC法は、前述したように、NaOH法もしくはNALC-NaOH法による前処理と比較して、他の一般細菌の混入をより完全に防止することができるという利点を有している。従って、分離培養法についての前処理としては、CPC法による前処理が望まれる。
【０００７】
検出感度の向上および迅速性の観点から、新結核菌検査指針2000において使用することが推奨されている液体培地としては、ソートン培地（Sauton's medium）、デュボス培地（Dubos medium）、ミドルブルック7H9ブロス（Middlebrook 7H9 Broth：以下、M7H9-Bという。）といった培地が知られている。これらの液体培地においては、これまで利用されてきた小川培地などの固型培地と比較して、培養日数の短縮という目的を達成することが可能である。
【０００８】
これらから総合すると、抗酸菌の分離培養法において最も望ましい態様は、CPC法により前処理したサンプルを、上述したような液体培地中で増殖させる方法である。
【０００９】
抗酸菌は、CPCに対して他の一般細菌と比較して抵抗性があるとはいうものの、NaOHの場合と同様に、CPCに対して長時間曝露されることにより、他の一般細菌と同様に死滅することが知られている。従って、CPCにより前処理したサンプルを液体培地を使用して培養する場合には、CPCによる静菌効果を中和することができる培地を使用することが必要である。しかし、これまでに知られている液体培地の中には、CPCによる静菌効果を中和することができるものは知られていなかった。そのため、従来は、CPCにより前処理されたサンプルについては、CPCの静菌効果を中和することができる卵培地、例えば小川培地などの固型培地に接種しなければならないという欠点を有していた。
【００１０】
また、新結核菌検査指針2000の中では、M7H9-Bを用いた変法として、MGIT（Mycobacteria Growth Indicator Tube）法も推奨されている。この方法もまた、検査期間の短縮には非常に効果を発揮し、非放射性で、特殊な機器を必要とせず、かつ判定も容易であるなど利点が多い。しかし、当該液体培地中ではCPCの静菌効果を中和することができないため、基本的にはサンプルの前処理方法としてCPC法以外の方法を使用することしかできず、また試薬としてのコストが高いという問題点が存在している。
【００１１】
このような現状の下、現在の当該技術分野においては、サンプル中に存在する結核菌以外の一般細菌によるコンタミネーションをできるだけ効率よく防止し、従来の固型培地を用いた結核菌の分離・培養方法よりも結核菌の検出をより確実かつ短期間に行うため、前処理としてCPCを利用することができ、コストを抑えた液体培地を開発することが求められている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、液体培地において抗酸菌を培養する際に問題となるコンタミネーションを効果的に防止し、かつ抗酸菌を従来の検出効率と同等またはそれ以上の効率を維持しつつ検査期間を短縮することができる、抗酸菌培養用液体培地を提供することを目的とする。本発明はさらに、CPCを主成分として含む抗酸菌培養用サンプル前処理剤に適合するための固型培地と液体培地の組合せからなる抗酸菌培養用固型−液体二相培地を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、M7H9-B培地からなる基本培地に、ヘミン、L-アスパラギン水和物、カゼインペプトン、酵母エキス、オレイン酸を含むことを特徴とする、改変M7H9-B培地を提供する。本発明の改変M7H9-B培地は、さらに抗菌剤を添加して使用してもよい。本発明の改変M7H9-B培地は、従来のM7H9-B基本培地と比較して、大幅な抗酸菌検出能向上という従来にない効果を奏することができる。
【００１４】
ここで、改変M7H9-B培地中に含まれるヘミンは、イソニアジド（INH）耐性結核菌の分離向上のために培地中に添加する。また、改変M7H9-B培地中に含まれるL-アスパラギン水和物、カゼインペプトン、酵母エキス、オレイン酸は、抗酸菌発育支持能向上のために培地中に添加する。
【００１５】
前述したように、抗酸菌自体もCPCに長時間曝されることにより、死滅することが知られているため、長期間にわたる培養時においては、CPCによる静菌効果を中和することが必要となる。しかし、液体培地であるM7H9-B基本培地には、このようなCPCによる静菌効果を中和する作用が存在しない。一方、前述した全卵を基礎とした培地は、CPCによる静菌効果を中和する効果を有するが、液体培地のような効率的な抗酸菌の増殖を期待することができない。
【００１６】
そこで、本発明はまた、ビット培地上に、前述した改変M7H9-B培地を重層させた、抗酸菌培養用固型−液体二相培地（以下、単に二相培地という。）を提供する。本発明で使用するビット培地は、全卵を基礎とする固型培地である。本発明の前述した二相培地は、コハク酸およびCPCを含む抗酸菌培養用サンプル前処理剤により処理されたサンプルに対して使用することができることを特徴とする。M7H9-B培地に基づく改変M7H9-B培地を、全卵を基礎とするビット培地上に重層することにより、当該改変M7H9-B培地がビット培地と接触するため、改変M7H9-B培地中に含まれるサンプル前処理剤由来のCPCがビット培地の作用により中和され、かつ、改変M7H9-B培地中に抗酸菌を接種することができるので、当該改変M7H9-B培地中で効率のよい抗酸菌の培養を実現することができる。
【００１７】
本発明は、上記の二相培地を用いた抗酸菌の培養方法もまた提供する。この抗酸菌の培養方法では、上述したようなコハク酸およびCPCにより前処理されたサンプルを培養することができる。本発明の培養方法では、コハク酸およびCPCの処理を行う前に、サンプルの粘性を低下させる処理を行ってもよい。本発明においては、コハク酸およびCPCによる処理の後に遠心分離を行って、目的とする抗酸菌を沈殿・濃縮した後に培養することもできる。
【００１８】
本発明においては、さらに改変M7H9-B培地およびビット培地を含む抗酸菌培養キットを提供する。この抗酸菌培養キットは、さらに抗菌剤を含んでいてもよい。もしくは、本発明においては、コハク酸およびCPCを含む抗酸菌培養用サンプル前処理剤をさらに含む抗酸菌前処理−培養キットもまた提供する。この抗酸菌前処理−培養キットもまた、そのキット中にさらに抗菌剤を含んでいてもよい。
【００１９】
【発明の実施の形態】
抗酸菌培養用サンプル前処理剤およびそれを利用したサンプル前処理方法
本発明では、まず、サンプル中に存在する抗酸菌以外の一般細菌によるコンタミネーションを効果的に防止するため、抗酸菌培養用サンプル前処理剤（以下、単にサンプル前処理剤という。）による処理を行う。このサンプル前処理剤は、コハク酸および界面活性剤であるCPCを含むことを特徴とする。このサンプル前処理剤は、抗酸菌が、他の一般細菌と比較して、コハク酸およびCPCに対して抵抗性であるという特徴を利用して、他の一般細菌を死滅させることを目的としたものである。これにより、サンプル中の抗酸菌のみを選択的に回収することができる。このようなコハク酸およびCPCを使用するサンプルの前処理方法を、本明細書の以下において「コハク酸−CPC法」という。
【００２０】
しかし、前述したように、抗酸菌自体もCPCに長時間曝されることにより、死滅することから、CPCを用いてサンプルの前処理を行う場合には、他の一般細菌に対する静菌効果を発揮でき、かつ抗酸菌に対する静菌効果を発揮しないような条件下、例えばCPC濃度およびサンプル前処理剤反応時間などの条件下、において行うことが必要である。抗酸菌を死滅させることはないが、他の一般細菌は死滅させることができる程度のCPCの濃度は、0.01〜1.0％、より好ましくは0.01〜0.2％、最も好ましくは0.0375％である。また、サンプル中のコハク酸濃度は、5％であることが好ましい。例えば、コハク酸およびCPCを含むサンプル前処理剤は、以下の組成：
【００２１】
【表１】
0004668395.tif 000002
【００２２】
を有することができる。そして、当該サンプル前処理剤による処理時間は、好ましくは5〜60分間、より好ましくは15〜30分間、最も好ましくは20分間である。
本発明の分離培養方法では、上述したコハク酸−CPC法による処理を行う前に、サンプルの粘性を低下させることを目的とする処理を行ってもよい。サンプルの粘性を低下させることにより、サンプル中に混入する抗酸菌以外の一般細菌に対するサンプル前処理剤の静菌効果をより効率よく発揮することができる。サンプルの粘性を低下させる処理としては、セミアルカリプロテアーゼによる処理があげられるがこれには限定されない。サンプル前処理においてセミアルカリプロテアーゼを使用した場合、そのサンプル溶液中のセミアルカリプロテアーゼ濃度および処理時間は、サンプルの粘性に応じて当業者が適宜決定することができるが、通常、0.125〜1.0％、より好ましくは0.125〜0.5％、最も好ましくは0.25％の濃度、および1〜10分間、より好ましくは5〜10分間、最も好ましくは10分間である。
【００２３】
サンプル前処理剤による処理を行う前に、セミアルカリプロテアーゼ処理に加えて、NALC-NaOH処理を行ってもよい。このNALC-NaOH処理の手順は、新結核菌検査指針2000に記載されるNALC-NaOH法の手順に準じて行うことができる。このNALC-NaOH処理では、NALCの作用によりサンプルの粘性を低下させる効果を得られる他、NaOHの作用により一般細菌に対する静菌効果を得ることもできる。NALC-NaOHのサンプル溶液中濃度および処理時間は、サンプルの粘性、検体量に応じて当業者が適宜決定することができるが、通常、1〜5％、より好ましくは1〜3％、最も好ましくは1％の濃度で、そして10〜30分間、より好ましくは15〜20分間、最も好ましくは15分間である。
【００２４】
セミアルカリプロテアーゼ処理したサンプル、もしくはセミアルカリプロテアーゼ処理およびNALC-NaOH処理したサンプルは、遠心分離して目的とする抗酸菌を沈殿・濃縮した後にサンプル前処理剤による処理に供してもよい。遠心分離の条件は、抗酸菌が沈殿し、かつ抗酸菌を破壊しない程度の条件を当業者が適宜選択することができ、好ましくは、2000〜3000×gで10〜30分間、より好ましくは2000〜3000×gで15〜20分間、最も好ましくは3000×gで20分間である。サンプルの遠心分離を行う前に、リン酸緩衝液などの緩衝液を添加してもよい。
【００２５】
本発明の分離培養方法において処理するサンプルは、粘性が高く、抗酸菌以外の一般細菌が混入しているサンプル、例えば、喀痰、気管支ファイバー下擦過サンプル、気管支肺胞、胃内容物などが該当するが、これらに限定されない。
【００２６】
抗酸菌選択分離培地およびそれを利用した抗酸菌培養方法
サンプル前処理剤で処理したサンプルは、その後、通常の固型培地である2％小川培地、または後述する本発明の二相培地のいずれにも接種することができる。ここで2％小川培地とは、以下の組成：
【００２７】
【表２】
0004668395.tif 000003
【００２８】
を有する培地を、90℃で1時間かけて凝固滅菌し、固型化したものをいう。また、ビット培地とは、上記組成を有する2％小川培地に対して、さらにSTCを150 mg添加し、90℃で1時間かけて凝固滅菌し、固型化したものである。ここでSTCとは、2,3ジフェニル-5-チエニル-（2）-テトラゾリウムクロリドをいう。
【００２９】
本発明において使用するM7H9-B基本培地は、蒸留水1 Lあたり以下の組成を有する。
【００３０】
【表３】
0004668395.tif 000004
【００３１】
本発明は、上記M7H9-B培地を改良して大幅に抗酸菌検出能を向上した改変M7H9-B培地を提供する。本発明の改変M7H9-B培地は、上記M7H9-B培地に対して、さらに以下の組成：
【００３２】
【表４】
0004668395.tif 000005
【００３３】
を含むことを特徴とする。ここで、ヘミンは、イソニアジド（INH）耐性結核菌の分離向上のためにM7H9-B培地中に添加する。また、L-アスパラギン水和物、カゼインペプトン、酵母エキス、オレイン酸は、抗酸菌発育支持能向上のためにM7H9-B培地中に添加する。
【００３４】
本発明の改変M7H9-B培地には、さらに抗菌剤を添加して使用してもよい。本発明の改変M7H9-B培地に添加して使用することができる抗菌剤は、アンホテリシンB、シクロヘキシミド、ポリミキシンB、ナリジキシン酸、トリメトプリム、アズロシリンなどから選択することができる。より好ましくはアンホテリシンBおよびシクロヘキシミドを使用する。改変M7H9-B培地中に使用する抗菌剤の濃度は、当業者が適宜決定することができるが、本発明の場合、例えば、以下の組成：
【００３５】
【表５】
0004668395.tif 000006
【００３６】
の抗菌剤を使用する。
本発明の二相培地は、斜面状に固型化したビット培地上に、上述した改変M7H9-B培地または抗菌剤を含む改変M7H9-B培地を重層することにより作成する。ビット培地の培地量と改変M7H9-B培地の培地量は、後に添加するサンプル中のCPC量に応じて、当業者が適宜決定することができる。好ましい態様としては、例えば、試験管内で固型化された7 mlのビット培地に対して、3 mlの改変M7H9-B培地を重層し、そして、この二相培地に抗酸菌のサンプルを0.1 ml添加することができる。以下において、この方法を「二相培地法」と呼ぶ。
【００３７】
サンプルを接種した改変M7H9-B培地または二相培地は、キャップを閉めた状態で37℃にて培養する。培養日数は、接種後8週間を目安とする。
臨床検査の現場においては、当該改変M7H9-B培地もしくは二相培地におけるサンプルの培養と平行して、従来の固型培地による抗酸菌の培養を行ってもよい。
【００３８】
抗酸菌培養キットおよび抗酸菌前処理−培養キット
本発明においては、改変M7H9-B培地およびビット培地を組み合わせて、抗酸菌培養キットを提供することができる。この抗酸菌培養キットには、さらに抗菌剤を含んでもよい。改変M7H9-B培地は、例えば表３に記載した組成を有するM7H9-B基礎培地に表４に記載した成分をさらに加えた組成を有することができる。また抗菌剤は、当業者が適宜決定することができるが、例えば表５に記載の組成を有することができる。
【００３９】
本発明においては、また、コハク酸およびCPCを含むサンプル前処理剤、改変M7H9-B培地およびビット培地を含む、抗酸菌前処理−培養キットを提供する。サンプル前処理剤に含まれるコハク酸およびCPCの濃度は、当業者が適宜決定することができるが、例えば5％コハク酸および0.0375％CPCを含むサンプル前処理剤を使用することができる。
【００４０】
【実施例】
以下に、本発明のコハク酸−CPC法−二相培地法の効果を、従来から存在する他の方法と比較して説明する。これらの実施例は本発明を具体的に説明するためだけのものであり、本発明の範囲を限定することを意図しているものではない。
【００４１】
実施例１：サンプル前処理方法の検討
実施例１では、コハク酸−CPC法により前処理した場合の抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日数、および一般細菌汚染率について、他法との比較を行った。
【００４２】
本発明で使用するサンプル前処理法であるコハク酸−CPC法は、以下の手順に従って行われる。まず、喀痰サンプル（1 ml）に3倍量の0.25％セミアルカリプロテアーゼを添加し、十分に攪拌した後、室温（20〜25℃）において10分間反応させる。次いで、喀痰サンプルの2倍量のNALC-NaOHを添加し、十分に攪拌した後、室温（20〜25℃）において15分間反応させる。これに滅菌リン酸緩衝液（pH 6.8）を全量で50 mlとなるように添加してNaOHを中和した後、3000×gで20分間遠心分離し、抗酸菌を沈渣として回収する。この沈渣に5％のコハク酸と0.0375％のCPCとを含む0.5 mlのサンプル前処理剤を添加し、20分間反応させる。この前処理をしたサンプルを二相培地に接種し、抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日数および一般細菌汚染率を得た。
【００４３】
本実施例においては、二種類の比較対照を設定した。1つ目の比較対照として、前述の前処理と同様にコハク酸−CPC法により前処理したサンプルを、固型培地であるビット培地上に塗抹し、抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日数および一般細菌汚染率を得た。
【００４４】
また、2つ目の比較対照としては、新結核菌検査指針2000に基づき、NALC-NaOH法により前処理した喀痰を用いて、MGIT法により分離培養し、抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日数および一般細菌汚染率を得た。NALC-NaOH法は、具体的には、以下の手順に従って行われる。まず、喀痰サンプル（1 ml）に2倍量のNALC-NaOHを添加し、十分に攪拌した後、室温（20〜25℃）において15分間反応させる。これにリン酸緩衝液（pH 6.8）を全量で50 mlとなるように添加してNaOHを中和した後、3000×gで20分間遠心分離し、抗酸菌を沈渣として回収する。この沈渣を0.5 mlの滅菌リン酸緩衝液で再懸濁し、MGIT培地に0.5 mlを接種する。
【００４５】
MGIT法は、M7H9-B液体培地を含むMGIT試験管底部に設置されたシリコン中に、培地中の溶存酸素に対して感受性の蛍光化合物が包埋されており、液体培地中で抗酸菌の増殖に伴い活発な酸素消費が行われると、紫外線を照射した際に上記蛍光化合物が蛍光を発するという原理に基づく方法である。
【００４６】
塗抹陽性喀痰20サンプルを用いた抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日数および一般細菌汚染率の結果を以下の表に示す。
【００４７】
【表６】
0004668395.tif 000007
【００４８】
抗酸菌検出率（％）は、本発明の二相培地で培養した場合、他の対照方法により培養した場合と同様に、抗酸菌を検出することができることがわかった。
抗酸菌平均検出日数（日）は、抗酸菌の菌種によっても若干異なるが、コハク酸−CPC法により前処理したサンプルでは、NALC-NaOH法により前処理したサンプルと比較して、平均検出日数が長くなっていた。これは、コハク酸−CPC法におけるコハク酸およびCPCによる、抗酸菌の増殖抑制作用に基づいていると考えられる。
【００４９】
一般細菌汚染率については、NALC-NaOH法により前処理した場合には10％の汚染率であったが、コハク酸−CPC法によれば、汚染率は0％であった。
これらの結果から、本発明においては、サンプルに混入した一般細菌を死滅させるため、コハク酸およびCPCを包含するサンプル前処理剤を使用することとした。しかし、このコハク酸−CPC法および二相培地による本発明の培養方法によれば、抗酸菌平均検出日数が、NALC-NaOH法による前処理の後MGIT法により培養する従来から使用される培養方法よりも長くかかることから、サンプル前処理剤の構成成分のうち、抗酸菌の増殖に特に影響を与えると考えられるCPCの濃度を減少させるべく、以下に検討を加えた。
【００５０】
実施例２：サンプル前処理剤の改良
サンプル前処理剤は、コハク酸とCPCとを構成成分として含む。このうち、コハク酸については濃度を5％に設定し、種々の菌種に対する増殖抑制効果を検討した。CPCについては、特に抗酸菌の増殖に強い影響を与えることが考えられるため、種々の菌種毎に、107 CFU/mlの各細菌の増殖を抑制することができる最小CPC濃度を検討した。
【００５１】
本実施例でCPCおよびコハク酸による前処理の対象としたのは、喀痰中に存在する一般細菌のうち、以下のもの：
E. faecalis（ATCC19433、ATCC51299、ATCC29212）
S. aureus（ATCC29213）
S. pyogenes（ATCC19615）
E. coli（ATCC25922）
B. subtilis（ATCC6633）
P. aeruginosa（ATCC27853）
の8種類である。これらのそれぞれの細菌について、107 CFU/mlの細菌の増殖を抑制することができる最小CPC濃度および5％コハク酸による静菌効果を検討した。
【００５２】
コハク酸−CPC法の手順は、添加するサンプル前処理剤のうちCPCの濃度を除き、実施例１において記載した方法と同一の方法により行った。
【００５３】
【表７】
0004668395.tif 000008
【００５４】
P. aeruginosa（ATCC27853）以外の細菌は、0.002〜0.006％と非常に低いCPC濃度で増殖を抑制することができることが確認された。また、P. aeruginosa（ATCC27853）は、0.013％と他の菌種と比較して、増殖抑制のために高い濃度のCPCが必要とされるが、5％コハク酸の作用により増殖抑制をすることができることが明らかになった。
【００５５】
この結果、サンプル前処理剤による抗酸菌増殖抑制効果を低減するため、コハク酸と組み合わせることにより、サンプル前処理剤中のCPC濃度を下げることが可能であることがわかった。
【００５６】
実施例３：臨床材料からの抗酸菌の検出
本実施例においては、実際に臨床材料として集められた喀痰サンプルについて、本発明のコハク酸−CPC法により前処理した場合の抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日数、および一般細菌汚染率について、他法との比較を行った。
【００５７】
サンプルの前処理は、添加するサンプル前処理剤のうちCPCの濃度を除き、実施例１において記載した方法と同一の方法により行った。この前処理をしたサンプルを本発明の二相培地に接種し、それぞれのサンプルについて、抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日数および一般細菌汚染率を得た。
【００５８】
本実施例においては、三種類の比較対照を設定した。1つ目の比較対照として、コハク酸−CPC法により前処理したサンプルを、固型培地であるビット培地上に塗抹し、抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日数および一般細菌汚染率を得た。
【００５９】
また、2つ目の比較対照としては、実施例１に記載した方法と同一の方法により、NALC-NaOH法−MGIT法により抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日数および一般細菌汚染率を得た。
【００６０】
さらに、3つ目の比較対照として、NALC-NaOH法により前処理したサンプルを、固型培地であるビット培地上に塗抹し、抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日数および一般細菌汚染率を得た。
【００６１】
喀痰100サンプルを用いた抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日数および一般細菌汚染率の結果を以下の表に示す。
【００６２】
【表８】
0004668395.tif 000009
【００６３】
表８は、抗酸菌検出率について4種類の前処理方法−培養方法を対比した結果を示している。この結果、本発明の方法であるコハク酸−CPC法−二相培地法による培養が最も高い検出能を示すことが明らかになった。すなわち、塗抹の結果、陽性と判定された全てのサンプルについて、コハク酸−CPC法−二相培地法の培養方法で検出することができた。また、塗抹の結果、陰性と判定されたサンプル中からも、5サンプルの全てについて陽性の判定が得られた。
【００６４】
【表９】
0004668395.tif 000010
【００６５】
表９は、抗酸菌平均検出日数について4種類の前処理方法−培養方法を対比した結果を示している。この結果から、実施例１に記載したようにコハク酸−CPC法において使用するCPC濃度を検討した結果、本発明の方法であるコハク酸−CPC法−二相培地法による培養がMGIT法と同等の日数で抗酸菌を検出することができることが示された。
【００６６】
【表１０】
0004668395.tif 000011
【００６７】
表１０は、一般細菌汚染率について4種類の前処理方法−培養方法を対比した結果を示している。この結果から、コハク酸−CPC法で前処理することにより、NALC-NaOH法で前処理した場合と比較して、有意に一般細菌汚染率を低下させることができることが示された。
【００６８】
上記の抗酸菌検出率、抗酸菌平均検出日数および一般細菌汚染率の結果から、抗酸菌を検出するための対比した他法および従来からの塗抹により抗酸菌を検出する方法と比較した場合、本発明のコハク酸−CPC法−二相培地法による検出方法が優れていることが示された。
【００６９】
実施例４：分離された抗酸菌の同定
本実施例では、本発明のコハク酸−CPC法−二相培地法で培養されたサンプル中の抗酸菌について、培養後に菌種の同定に移行することが可能かどうかについて検討した。
【００７０】
本実施例においては、NALC-NaOH法−MGIT法により培養した抗酸菌を対照として使用した。
培養された抗酸菌の同定は、DNAプローブテストにより行った。DNAプローブテストは、抗酸菌中に存在するリボソームRNA（rRNA）を、このrRNAの配列に相補的な配列を有する標識DNAプローブを用いて検出する方法である。具体的なDNAプローブテストの手順は、新結核菌検査指針2000に記載された手順に従った。
【００７１】
DNAプローブテストの原理は次の通りである。抗酸菌が有するrRNAの遺伝子配列のうち、抗酸菌のそれぞれの菌種に特異的な配列部分が知られている。このような特異的な配列部分に対して相補的な配列を有するDNAプローブをアクリジニウムエステル（AE）で標識し、被検サンプルから抽出したrRNAとDNAプローブとの間でハイブリダイゼーションを行う。次いで、テトラホウ酸ナトリウムで加水分解することにより、未反応のDNAプローブのAE部分のみを特異的に分解・失活させる。その結果、AE部分はハイブリッド内部に取り込まれたもののみとなるため、AE部分からの化学発光を検出することにより抗酸菌由来のrRNAが存在していることを示すことができる。
【００７２】
コハク酸−CPC法−二相培地法により分離された抗酸菌株およびNALC-NaOH法−MGIT法により分離された抗酸菌株について、DNAプローブテストを行った結果を以下の表に示した。第1回のDNAプローブテストで同定できなかった株については、第2回目のDNAプローブテストを行い、同定を行った。
【００７３】
【表１１】
0004668395.tif 000012
【００７４】
この結果、第1回目のDNAプローブテストで、ほぼ全てのコハク酸−CPC法−二相培地法により分離された株の同定が可能であることがわかった。これは対照として使用したNALC-NaOH法-MGIT法により分離された株を同様にDNAプローブテストにより同定した場合と、同等またはそれ以上の効率であった。
【００７５】
【発明の効果】
本発明により、液体培地において抗酸菌を培養する際に問題となるコンタミネーションを効果的に防止し、かつ抗酸菌を従来の検出効率と同等またはそれ以上の効率を維持しつつ検査期間を短縮することができる、抗酸菌培養用液体培地を提供することができた。本発明により、さらに、CPCを主成分として含む抗酸菌培養用サンプル前処理剤に適合するための固型培地と液体培地の組合せからなる抗酸菌培養用固型−液体二相培地を提供することができた。