(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の異なる結合補助体の非共有結合会合により構成される組成物であって、当該各結合補助体は頭部と尾部を有し、当該結合補助体はミセルを形成することができ、頭部は親水性であり、尾部は疎水性であり、非共有結合によってミセルを形成しており、当該結合補助体の尾部は疎水性凝集体を形成し、当該結合補助体が集合体内で移動可能であり、そのため、リガンドが存在する場合、少なくとも２個の頭部は各頭部単独よりも強くそのリガンドと相互作用し得るような適当な位置にある、リガンドと相互作用するための組成物。
【請求項２】
各結合補助体が、アミノ酸またはペプチド；ペプチドアナログ；モノまたはポリサッカライド；モノまたはポリヌクレオチド；ステロール；水溶性ビタミン；ポルフィリンまたはヘム核；金属イオンキレート；水溶性薬剤；ホルモン；および酵素基質から選択される頭部を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
各頭部がアミノ酸よりなる、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
各頭部が、アミノ酸よりなるペプチドよりなる、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
エピトープを形成する頭部の末端アミノ酸が、疎水性アミノ酸、ヒドロキシアミノ酸、酸性アミノ酸、アミドアミノ酸、塩基性アミノ酸および芳香族アミノ酸の少なくとも２個から選ばれたアミノ酸よりなる、請求項３又は請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
各尾部が、同一または異なり、直鎖または分枝鎖脂肪酸；少なくとも８個の炭素原子を有するアルコールまたはアルデヒド；脂質性アミノ酸アナログ；プロスタグランジン；ロイコトリエン；モノまたはジグリセリド；ステロール；スフィンゴシンまたはセラミド誘導体；およびこれら親油性基のシリコンまたはハロゲン置換誘導体から選択される親油性基よりなる、請求項１乃至請求項５から選択されるいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
各親油性基がＣ10-Ｃ14脂肪酸よりなる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
各結合補助体が、さらに、頭部と尾部を結合するスペーサー基を有する、請求項１乃至請求項７から選択されるいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
スペーサー基が親水性である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
スペーサー基が、アミノ酸、ヒドロキシ酸、糖またはポリエチレングリコールよりなる、請求項８または請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
薬物治療、予防または診断用である、請求項１乃至請求項１０から選択されるいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１乃至請求項１１から選択されるいずれか１項に記載の組成物を調製するための、頭部および尾部を有する結合補助体の使用。
【請求項１３】
頭部が、アミノ酸またはペプチド；ペプチドアナログ；モノまたはポリサッカライド；モノまたはポリヌクレオチド；ステロール；水溶性ビタミン；ポルフィリンまたはヘム核；金属イオンキレート；水溶性薬剤；ホルモン；および酵素基質から選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
頭部がアミノ酸よりなる、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
頭部が、アミノ酸よりなるペプチドよりなる、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
アミノ酸が、親水性アミノ酸、ヒドロキシアミノ酸、酸性アミノ酸、アミドアミノ酸、塩基性アミノ酸および芳香族アミノ酸から選択された末端アミノ酸よりなる、請求項１４または請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
尾部が、直鎖または分枝鎖脂肪酸；少なくとも８個の炭素原子を有するアルコールまたはアルデヒド；脂質性アミノ酸アナログ；プロスタグランジン；ロイコトリエン；モノまたはジグリセリド；ステロール；スフィンゴシンまたはセラミド誘導体；およびこれら親油性基のシリコンまたはハロゲン置換誘導体から選択される親油性基よりなる、請求項１２乃至請求項１６から選択されるいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
親油性基がＣ10-Ｃ14脂肪酸よりなる、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
結合補助体が、さらに頭部と尾部を結合するスペーサー基を有する、請求項１２乃至請求項１８から選択されるいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
スペーサー基が親水性である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
スペーサー基が、アミノ酸、ヒドロキシ酸、糖またはポリエチレングリコールよりなる、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
リガンドと相互作用する組成物の製造方法であって、
（ａ）複数の異なる結合補助体を提供する工程であって、当該各結合補助体が頭部と尾部よりなり、当該結合補助体はミセルを形成することができ、頭部は親水性であり、尾部は疎水性であり、非共有結合によってミセルを形成しており、工程；および
（ｂ）複数の結合補助体からその非共有結合会合を形成する工程であって、当該結合補助体の尾部が疎水的に凝集し、かつ、当該結合補助体が移動可能であって、そのため、リガンドの存在下で少なくとも２個の頭部が適当に位置して、各頭部単独よりも強くそのリガンドと相互作用し得るエピトープを形成する工程を含むことを特徴とする組成物の製造方法。
【請求項２３】
各結合補助体が、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項に記載されている、請求項２２に記載の製造方法。
【請求項２４】
複数の結合補助体を提供する工程が、
（i）頭部を配列することにより１組の結合補助体を選択する工程；
（ii）それらから非共有結合会合を形成する工程であって、尾部が疎水的に凝集することにより形成され、かつ、その中で結合補助体が移動可能であるような会合を形成する工程；
（iii）非共有結合会合とリガンドの間の十分な相互作用を分析評価する工程；
（iv）頭部の配列を変化させた１組の結合補助体を用いて工程（i）〜（iii）を随意に繰り返す工程；および
（v）工程（iii）で十分な相互作用を見出した場合、その組の結合補助体を工程（ａ）における複数の結合補助体として選択する工程
よりなる、請求項２２又は請求項２３に記載の製造方法。
【請求項２５】
頭部の配列において、（ｉ）少なくとも１個の末端アミノ酸が、疎水性アミノ酸、ヒドロキシアミノ酸、酸性アミノ酸およびアミドアミノ酸として分類されるアミノ酸由来であり；および（ii）その他の少なくとも２個の末端アミノ酸が、少なくとも１個の塩基性アミノ酸および少なくとも１個の芳香族アミノ酸、または少なくとも２個の塩基性アミノ酸若しくは芳香族アミノ酸よりなる、請求項２４に記載の製造方法。
【請求項２６】
工程（iv）中の工程（i）〜（iii）で用いられる変化させた頭部の配列において、少なくとも２個の末端アミノ酸が工程（i）〜（iii）で用いられたアミノ酸とは異なる、請求項２５に記載の製造方法。
【請求項２７】
頭部の配列において、（ｉ）少なくとも１個の末端アミノ酸が、疎水性アミノ酸、ヒドロキシアミノ酸、酸性アミノ酸およびアミドアミノ酸として分類されるアミノ酸由来である、請求項２４に記載の製造方法。
【請求項２８】
工程（iv）中の工程（i）〜（iii）で用いられる変化させた頭部の配列において、アミノ酸分類の一つを由来とする少なくとも１個の末端アミノ酸が、存在しないか、またはそれを荷電させたアミノ酸で置換されている、請求項２７に記載の製造方法。
【請求項２９】
リガンドと相互作用する分子の製造方法であって、
（１）請求項２３乃至請求項２８のいずれか１項に記載の方法により組成物を製造する工程；
（２）組成物中でリガンドに対するエピトープを形成する少なくとも２個の頭部を同定する工程；および
（３）分子が各頭部単独よりリガンドとより強く相互作用し得る様に、随意に１個以上のリンカー基で隔離された少なくとも２個の頭部の官能基を含む分子を製造する工程、
を含むことを特徴とする製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、リガンドと相互作用するための組成物、そのような組成物の製造方法、およびその組成物に基づく分子の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛋白質レセプターは通常、全蛋白質分子の小部分を構成するエピトープを介して、その標的リガンドと結合することが知られている。結合または相互作用を最大にするためには、エピトープの構造が、その必要な構成成分全てをごく近傍に含む結合部位を形成するように、厳密なコンフォーメーションに保たれる必要がある。結合部位のペプチドアナログを、結合部位を構成するアミノ酸のみで構築する試みは、多くの場合失敗に終わるが、その理由は、これらのペプチドは蛋白質レセプターと同等の生物活性を有しないことにある。これは、自由溶液中でのペプチドが、全蛋白質レセプターとは異なったコンフォーメーションをとるためである。加えて、蛋白質の結合部位は、蛋白質鎖の非隣接部分由来のオリゴペプチドで構築されるので、単離されたペプチドを自由溶液中で混合しても、活性結合部位が再構築されないことによる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
止むを得ず、結合部位エピトープを提供するために大きな全蛋白質を使用する場合、新しいレセプター特異的治療戦略を開発する上でいくつかの問題を生じる。その一つは、そのような大きな蛋白質は、容易に免疫反応を誘発し得ることである。第二の問題は、長いペプチド鎖は、消化管内腔中等に存在するエンドペプチダーゼの攻撃を受けやすいことである。最後に、そのような大きな蛋白質は製造、精製および安定な形で維持するためのコストがかかることが挙げられる。
【０００４】
そこで、本発明の目的は、これら従来技術の欠点を克服することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
第１の態様では、本発明はリガンドと相互作用するための組成物を提供するが、その組成物は複数の種々の結合補助体（コンジュゲート）の非共有結合会合により構成され、当該各結合補助体は頭部と尾部を有する。当該結合補助体の尾部は疎水性凝集体を形成し、また、当該結合補助体は集合体内でお互い自由に移動することができるので、リガンドが存在する場合には、（同一又は異なる）少なくとも２個の頭部が適当に位置することにより、各頭部単独よりも強くそのリガンドと相互作用し得るエピトープを形成する。頭部は典型的には親水性である。尾部は典型的には疎水性であり、例えば炭化水素鎖で構成される親油性、フルオロカーボン鎖で構成される親ハロゲン性（ハロフィリック）、またはシラン基を有するものである。
【０００６】
結合補助体を本発明に係る頭部と尾部で構築することにより、尾部が疎水的に凝集して、典型的にはミセル、ラメラ構造、リポソームまたは他の脂質構造等の超分子集合体を形成することができる。水層中にある場合、かかる超分子集合体中の結合補助体は、極めて密に凝集する。集合体中の結合補助体は、移動可能であるので、頭部は集合体中でいくつかの異なった位置をとることができる。従って、典型的には同一でない頭部が集合体中で自由に移動することができ、驚くべきことに、共同的に相互作用して頭部自体では生じない生物学的現象を誘発する。さらに予期せぬことであったが、種々の頭部の組み合わせで構成される集合体は、同種の頭部によるものでは起こりえないような生体反応を誘発し、また、生体レセプターと同様な結合効果を発揮できることが見出された。
【０００７】
上述した様に、これらの超分子集合体は粒状またはコロイド状に存在し、通常は図１Ａに示す様に、全ての頭部が粒子の中心から外向きに配向した数百のサブユニット（結合補助体）よりなる。結合補助体のそれぞれは、ブラウン運動過程により隣り合った結合補助体と自由に場所を変えることにより集合体内でその位置を変えることができ、その結果、集合体の全表面にわたって移動することができる。超分子集合体の他の形態は立方相であり、また、表面を覆われていることもある。
【０００８】
集合体内の各結合補助体は、アミノ酸またはペプチド；ペプチドアナログ；モノ、ジまたはポリサッカライド；モノ、ジまたはポリヌクレオチド；ステロール；アルカロイド；イソプレノイド；イノシトール誘導体；単一または融合芳香族分子；水溶性ビタミン；ポルフィリンまたはヘム核；フタロシアニン；金属イオンキレート；水溶性薬剤；ホルモン；または酵素基質等のような化学または生物学的に分類される組の一つかまたはいくつかの異なった組から選択される頭部を有している。
【０００９】
一つの好ましい実施態様では、各頭部は、ペプチド鎖の末端部分であるアミノ酸またはオリゴペプチドよりなる。組成物を生体内で使用する場合、免疫反応の誘発を避けるためにペプチドの長さを最小に保つことが望ましい。従って、ペプチドが６アミノ酸長を超えないことが好ましい。
【００１０】
使用するアミノ酸は天然アミノ酸、その置換誘導体、そのアナログ、およびそれらのＤ−型であり得る。
【００１１】
結合補助体の尾部は、全て同じであるか、または異なった尾部の混合物であり、夫々好ましくは直鎖、分枝鎖、環状、多環状、飽和または不飽和構造から選択される疎水性基よりなり、構造内において置換されていても置換されていなくてもよく、ヘテロ原子が含まれていても含まれていなくても良い。その例として、脂質性アミノ酸アナログ；プロスタグランジン；ロイコトリエン；モノまたはジグリセリド；ステロール；スフィンゴシンまたはセラミド誘導体；およびこの様な疎水性基のシリコンまたはハロゲン置換誘導体がある。尾部は、好ましくは６〜２４個の炭素原子を有し、更に好ましくは１０〜１４個の炭素原子を有する。結合補助体中には１つ以上の尾部が存在し得る。例えば、炭化水素側鎖を有する一つ以上の脂質性アミノ酸が各結合補助体の一部を形成し、頭部中の１つ以上のアミノ酸と結合している。
【００１２】
頭部を尾部に結合させるために、任意の化学的方法を使用し得る。例えば、頭部を非共有結合会合の表面に提示しやすくするため、各結合補助体は頭部と尾部を結合するスペーサー基をさらに有することが可能である。この様なスペーサー基は公知のものであり、例えばアミノ酸、ヒドロキシ酸、糖およびポリエチレングリコールを挙げることができる。
【００１３】
また別な態様では、本発明は上記に定義した組成物を、薬剤治療、予防または診断用のものとして提供する。
【００１４】
本発明の利点は、通常の生体レセプターと比べて、頭部を小さい結合補助体とすることにより強い特異的結合相互作用を達成し得ることである。例えば頭部がオリゴペプチドである場合、ペプチド鎖の長さは通常１０アミノ酸長を超えず、好ましくは６以下である。従って、本発明の組成物は、対応する蛋白質よりはるかに免疫原性が少ない。
【００１５】
本発明の態様によれば、本発明の組成物をリガンドと生体外で相互作用する様に形成するばかりでなく、適当な希釈剤、賦形剤、または適当な配送経路に適合するキャリアと随意に調合した組成物を生体内で使用することも可能である。
【００１６】
さらに別な態様では、本発明は、頭部と尾部でなる結合補助体を、上記組成物調製用に使用することを提供する。
【００１７】
さらに本発明は、リガンドと相互作用する組成物の製造法を提供するが、その方法は
（ａ）複数の種々の結合補助体を提供する工程であって、当該各結合補助体が頭部と尾部よりなる工程；および（ｂ）複数の結合補助体からその非共有結合会合を形成する工程であって、当該結合補助体の尾部が疎水的に凝集し、かつ、当該結合補助体が移動可能であって、そのため、リガンドの存在下で少なくとも２個の頭部が適当に位置して、各頭部単独よりも強くそのリガンドと相互作用し得るエピトープを形成する工程、を含む。各結合補助体は上述した定義によるものであることが好ましい。
【００１８】
脂質小胞を調製するために、機械的混合、高せん断力暴露、超音波処理、溶媒分散または界面活性剤との共溶解等を含む様々な既知の方法で、結合補助体を水相中に分散し得る。典型的には、それにより形成した非共有結合超分子会合は、混ぜ合わされた数種の異なった結合補助体で構成されると考えられる。表面性質を変化させ、結合補助体の分散を助け、結合補助体の非共有結合会合を安定化し、結合補助体の頭部の顕出を補助し、自由に移動し得る結合補助体により形成され会合内の頭部が適当に位置できるような小胞を構築するために、さらに脂質性材料を随意に添加し得る。
【００１９】
本発明による方法の重要な態様には、所望の生物活性を有する複数の結合補助体を同定する工程が含まれる。
【００２０】
好ましい態様では、この工程は、
（i）頭部を配列することにより１組の結合補助体を選択する工程；
（ii）それらから非共有結合会合を形成する工程であって、尾部が疎水的に凝集することにより形成され、かつ、その中で結合補助体が移動可能であるような会合を形成する工程；
（iii）非共有結合会合とリガンドの間の十分な相互作用を分析評価する工程；
（iv）頭部の配列を変化させた１組の結合補助体を用いて工程（i）〜（iii）を随意に繰り返す工程；および
（v）工程（iii）で十分な相互作用を見出した場合、その組の結合補助体を工程（ａ）における複数の結合補助体として選択する工程
よりなる。
【００２１】
「十分な相互作用」の分析評価の例には、抗体と抗原間の会合を検出するためのＥＬＩＳＡの原理を利用する方法等の結合分析を挙げることができる。生体外分析評価に適した他の方法には、環境感受性膜結合プローブの蛍光測定の変法、沈降反応、酵素活性の増進または阻害等が含まれる。細胞死分析、細胞増殖、アポトーシス、細胞間接触の阻害または刺激、サイトカインその他の可溶性生成物の分泌、特定のｍ−ＲＮＡの合成、細胞間小胞輸送、細胞信号プロセスの変化等の、生体外で培養した細胞の挙動を変化させる物質の活性に依存する分析も適当である。例えば、放射性ラベルを超分子集合体に取り込ませ、様々な経路によってその後の分布を調べる等の、動物またはヒト全体の生体内分析評価も行い得る。
【００２２】
本発明の方法により、コンビナトリアルアプローチを行うことができるが、当該方法では、それぞれがあらかじめ合成されたバンクから選択された結合補助体の組み合わせを含む、一定範囲内の種々の超分子集合体が調製される。適当な結合補助体の選択は、標的リガンドの既知の性質に基づいて行うか、または２個以上の頭部がリガンドに対するエピトープを形成すると思われる確率を増加させるため、単にきわめて広い範囲の頭部を使用することもできる。この様にして、前述した様なプローブとリガンド間の十分な相互作用に関する分析評価に続き、最も有効であることが分かった結合補助体の組み合わせについて、いくつかの頭部を添加するか、いくつかの頭部を除去するか、またはその双方を行い、得られたプローブの十分な相互作用を再度分析評価することにより、変化させ得る。このようにして最終的には、頭部の最も好適な組み合わせを同定し、組成物内で使用するために選択することが可能である。
【００２３】
従って、本発明は伝統的なコンビナトリアルケミストリーに対しきわめて明瞭な利点を有する。コンビナトリアルケミストリーでは、特定のレセプターに対する結合の最も好適な配列の同定を、アミノ酸等の種々の群を種々の順序により可能な限り組合わせて膨大な数の配列を合成し、それぞれの効果を試験することにより行わなければならない。このプロセスには時間がかかり、高価であり、異なった成分を繋ぎ合わせる際の化学的性質により制約される。対照的に、本発明は、ただ会合由来のエピトープを提供するために頭部が近接できるか否かに依存するのみである。１組の結合補助体が一度合成されると、それ以上の化学合成は必要なく、結合補助体を混合するだけで非共有結合会合による種々のプローブが形成される。
【００２４】
好ましい簡潔な実施態様では、本発明の方法は、スペーサーを介して脂質尾部と結合した単一末端アミノ酸を有する結合補助体を使用し、水性培地中で単に混合するだけでミセルを形成し、その中で種々のアミノ酸側鎖が多様な配置を取ることができるよう提示される。従って、アミノ酸が特定の順番、または特定の間隔と配向で存在する必要性がない。統計学的には、一定の割合の個々のアミノ酸のサブユニットが常に理想的な配置で会合すると考えられる。
【００２５】
ある配列では、各々の結合補助体は直線状の構造、即ち、Ｘ−スペーサー−スペーサー−脂質−脂質−を有すると思われる。ここでＸは、使用した各結合補助体毎に異なった単一アミノ酸を表す。
【００２６】
天然アミノ酸で構成されるエピトープを構築することを目指す場合、選択する頭部の数をさらに単純化することが可能である。それは、天然蛋白質性物質に見出されるアミノ酸残基を６つの基本的な分類に類別し、それぞれの分類に含まれるアミノ酸全てを使用するのではなく、その分類から選択される１個のアミノ酸を使用することにより達成されるが、その理由は、頭部の末端位置でアミノ酸の空間的柔軟性が増すからである。この方法により、あらかじめ合成される結合補助体バンクを構築するに必要なアミノ酸の全数、即ち、使用する頭部の全数をかなり減らすことができる。アミノ酸の主要な分類を以下の表１に示す。
【００２７】
【表１】
0004754136.tif 000002
【００２８】
いくつかの戦略が、アミノ酸を含有する結合補助体の活性な組み合わせを同定するために役立つ。
【００２９】
一つの実施態様では、限定された数の結合補助体を、一定範囲内での種々のプローブを作成するために用いる。各プローブは、超分子集合体の水性懸濁液であり、各集合体は選択された結合補助体の混合物よりなる。各プローブは、それぞれが以下に示すように別種の結合補助体を包含する結果、相互に異なるが、下に示された各文字は、末端アミノ酸が異なっている結合補助体を表す。
【００３０】
プローブ１  Ａ Ｂ Ｃ Ｄ
プローブ２  Ａ Ｂ Ｃ Ｅ
プローブ３  Ａ Ｂ Ｃ Ｆ
プローブ３  Ａ Ｂ Ｃ Ｇ
…………
…………
プローブＸ  Ａ Ｂ Ｃ Ｚ
各プローブは、それぞれ前に概説した十分な結合を評価するための生物分析評価で試験される。
【００３１】
第二の実施態様では、プローブ１を、バンク由来の多数の異なった結合補助体を含むように構築し、バンク中のどの頭部が生物的相互作用に不可欠であり、どの頭部が余分であるか調べるために、結合補助体を一つずつ順番に除去していったものの効果を比較する。このアプローチを以下に図示する。
【００３２】
プローブ１  Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ ．．．Ｚ
プローブ２  Ａ Ｃ Ｄ Ｅ ．．．Ｚ
プローブ３  Ａ Ｂ Ｄ Ｅ ．．．Ｚ
…………
プローブＸ  Ａ Ｂ Ｃ Ｄ Ｅ ．．．
前に概説した様な異なったアプローチの組み合わせを行うこともできる。
【００３３】
標的リガンドについて知見が、適当な出発配列を設計することの助けとなることがある。例えば、リガンドが塩基性であることが知られている場合、末端アミノ酸の遊離カルボキシル基が露出する形で結合補助体に酸性の性質を付与することは意味あることである。末端アミノ酸の隣に特定のアミノ酸をスペーサー基として用いてさらに機能性を導入することも、特異性を増す結果となる。例えば、既に短い既知の構造のオリゴペプチド配列が標的リガンドへの結合に関係していることが知られている場合、この様な配列を組成物を形成している結合補助体セット中に含まれる結合補助体に取り込んでもよい。
【００３４】
最後の態様では、本発明はリガンドと相互作用するための分子の製造法を提供する。その方法は上記で定義した方法の一つに従って組成物を製造する工程；組成物中でリガンドに対するエピトープを形成する少なくとも２個の頭部を同定する工程；および分子が各頭部単独よりリガンドとより強く相互作用し得る様に、随意に１個以上のリンカー基で隔離された少なくとも２個の頭部の官能基を含む分子を製造する工程よりなる。
【００３５】
本発明の組成物は、それ自体が、治療、予防または診断的手法により生体反応を誘発するために生体外または生体内系で有用であるが、場合によっては、上記組成物の構造に基づいて分子を製造することも可能である。リガンドに対するエピトープを形成する少なくとも２個の頭部の官能基を同定することにより、同一または類似のエピトープを含むような、組成物と類似の新規分子を製造し得る。例えば官能基の間隔を空けるために１つ以上のリンカー基を付けて、官能基を１本の線状オリゴペプチド中に組み込むことができる。
【００３６】
【発明の実施の形態】
ここで、本発明は、例示目的にのみ、後述の実施例及び添付図面を参照してさらに詳細に説明される。
【００３７】
図１を参照すると、本発明の組成物の断面１が、頭部２と尾部３が一緒になって結合補助体４を形成するミセルの形で示されている（図１Ａ）。標的リガンド５が組成物１に対して提示されている。結合補助体は移動可能であるので、再構成が起こり（図１Ｂ）、標的リガンド５に結合するよう頭部２が位置するようになる。図２を参照すると、本発明による組成物の断面が超分子集合体の形で示され、リガンドの集合体表面への結合が、短鎖ペプチドで構成される２個の結合補助体の非共有結合会合を経由して構築されるエピトープの形成により行われる（Ａ）。このエピトープは、（Ｂ）に示したような分離した個々の結合補助体のいずれかよりも、強くリガンドと相互作用することが可能である。アミノ酸以外の構造を含む頭部に対しても、同じ原理が適用される。
【００３８】
【実施例】
以下に示す実施例では、アミノ酸の表示については、標準的なアルファベット１文字表記法の規則を用いている。しかし、その文字が、その文字を意味する特定のアミノ酸がペプチド鎖中の末端位置を占めるような前述の結合補助体を示す場合もある。ここに記載する実施例では、脂質はペプチド結合で繋がった２個のアミノ酸よりなり、双方のアミノ酸はグリシンアナログであり、それぞれのアルファ水素が１２または１４炭素原子を含む線状炭化水素鎖で置換されている。頭部とスペーサー、およびスペーサーと脂質の間の結合は全てペプチド結合で行われている。頭部は遊離アミノ基を有し、脂質の遊離末端はＣＯＮＨ2基を有している。従って、各結合補助体の構造は、ＮＨ2−頭部−スペーサー−アミノ酸（Ｃ14側鎖）−アミノ酸（Ｃ12側鎖）−ＣＯＮＨ2である。
【００３９】
実施例１：マクロファージからのＴＮＦ分泌の刺激
１．各結合補助体Ｅ、Ｙ、Ｑ、ＳおよびＨ（セリン−グリシンスペーサーを経由して脂質に結合）を濃度５ｍｇ／ｍｌのメタノール／ジクロロメタン１：１溶液として調製した。
【００４０】
２．結合補助体の溶液を７ｍｌのガラスバイアルに等量ずつ分注し、次ページの実施例で示す様に、全てのバイアルを最終容積４００μｌ（固形分２ｍｇ）とした。再構築のために加えられた水の量を例示する様に相応に減らしたとき、使用できる有機溶剤の容積が不十分である場合、調整を後の段階で行った。
【００４１】
３．全てのバイアルの内容物を窒素気流中で乾燥し、少なくとも１ｍｂａｒの真空に凍結乾燥器中で終夜暴露した。
【００４２】
４．翌日、蒸留水を次ページの表２に示す容積で加え、全てのバイアル中の最終濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。バイアルにキャップをし、３７℃に暖め、溶液が透明になるまで超音波処理した。
【００４３】
５．次に、試料をＪ７７４Ａ−１細胞株線の細胞をプレートした２４ウエルクラスタープレート（５×１０4細胞／ｍｌ／ウエル）に入れた。容積１００μｌと１０μｌの試料を各ウエルに加え、細胞を５％ＣＯ2／空気中の雰囲気下３７℃で終夜インキュベートした。
【００４４】
６．翌日、各ウエルから５０μｌの上澄液を二回採取し、捕捉ＥＬＩＳＡ法でＴＮＦ濃度を測定した。得られた結果を以下の表３に示す。
【００４５】
【表２】
0004754136.tif 000003
【００４６】
【表３】
0004754136.tif 000004
【００４７】
全部ではないが、種々の頭部の組み合わせのいくつかは強い生体反応を誘発し、反応がこれらの特定の組み合わせに特異的であることを示していることが分かる。この例は、記載した結合補助体をコンビナトリアルアプローチに採用し、所望の生体反応を誘発する目的に対する有効な組み合わせを同定することができることの例証となる。
【００４８】
実施例２：マクロファージからのＴＮＦ分泌（結合補助体の混合物を含む超分子集合体と、単一結合補助体のみを含む超分子集合体との比較）
以下に記載するように、さらに脂質材料を加えるかまたは加えないで、試料を実施例１の記載に従って調製した。実施例１記載の実験で確認された有効性に従って、結合補助体Ｙ、ＳおよびＬの組み合わせを選択した。
【００４９】
ホスファチジルコリンを含むプローブを、燐脂質と結合補助体の重量比２：１で調製した。
【００５０】
オクチルグルコシドを含むプローブを、糖脂質と結合補助体の重量比１：１で調製した。
【００５１】
以下の表４に示す結果は、上澄の１８時間培養について行ったＴＮＦ ＥＬＩＳＡの４５０ｎｍにおける吸光度である。ウエル中の結合補助体の濃度は１０μｇ／ｍｌであった。
【００５２】
【表４】
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【００５３】
本実施例は、結合補助体の組み合わせが単独で存在する場合、または燐脂質または糖脂質等の他の脂質と組み合わせて存在する場合のいずれも生体反応を誘発し得ることを示す。また、効果を示すためには、全ての結合補助体が同じ超分子集合体上で組み合せで存在することが重要であり、同じ結合補助体が同時に提示されているが異なった超分子集合体上に分離されている場合は活性が見られなことも示している。このことは、細胞表面レセプターとの特異的結合に関与し得るエピトープを結合補助体の非共有結合会合で形成するためには、結合補助体が相互に近接して存在することが重要であることを示している。
【００５４】
実施例３：経口取り込みの促進
１．各結合補助体Ｌ、Ｓ、ＥおよびＱ（チロシン−グリシンスペーサーを経由して脂質へ結合しているもの）を濃度１０ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコール溶液として調製した。
２．７５μｌのオレイン酸14Ｃ−コレステロールエステル（３．７ＭＢｑ／ｍｌ）を４個の７ｍｌガラスネジ蓋バイアル中に分注し、窒素気流中で乾燥した。
３．（１）中の溶液各４００μｌを（２）のバイアルの一つに加え、室温で終夜振とうした。
４．結合補助体の溶液を７ｍｌガラスバイアル中に等量ずつ分注し、以下の表５に示す様に全てのバイアルで最終容積８０μｌ（固形分０．６ｍｇ）とした。
【００５５】
【表５】
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【００５６】
５．２ｍｌの蒸留水を振動回転しながら各バイアルに加えた。バイアルにキャップをし、２０分間超音波処理した。
６．この試料を液体窒素中で凍結し、終夜凍結乾燥した。
７．翌日、各バイアルを２ｍｌの水で再構成し、透明な分散液が得られるまで超音波処理した。
８．試料を、一匹当たり０．３ｍｌの投与量でＢａｌｂ／ｃ雌マウス（体重２０〜２５ｇ、グループあたりマウス４疋）に経口投与した。
９．投与後４５、９０および１８０分に、７５μｌのヘパリン化血液を尾静脈刺針で採血した。
１０．各試料を０．５ｍｌのＰＢＳ中に希釈、遠心分離し、０．４ｍｌの上澄液をシンチレーションバイアルに移し、そこへ２ｍｌのオプチフェーズハイセーフ３（Optiphase Hisafe 3, Wallac社製）を添加して混合した。
１１．試料中の活性をシンチレーションカウンター中で測定した。
【００５７】
取り込み率は、２ｍｌの血液容積に基づいて見積もったが、そのうち１ｍｌは血漿とした。
【００５８】
結果を以下の表６に示す。
【００５９】
【表６】
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【００６０】
全てではないが、種々の頭部の組み合せのいくつかは、経口経路による標識化合物の取り込みが促進することが分かり、反応が特定の組み合せに特異的であることを示している。本実施例は、記載された結合補助体が、リガンドを捕捉するように作用することが可能な有効な組み合せを同定するためのコンビナトリアルアプローチに使用し得ることを示している。
【００６１】
実施例４：ＥＬＩＳＡ Ｆｃ結合
１．１００μｇのヤギＩｇＧ（１ｍｌ／ｍｌ）を２０ｍｌのＰＢＳに加え、１００μｌを平底ミクロタイタープレートに入れた。
２．プレートを＋４℃で数日間インキュベートした。
３．各２ｍｇの結合補助体Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｌ、Ｓ、Ｅ、ＱおよびＲ（それぞれセリン−グリシンスペーサーを経由して脂質に結合している）をガラスバイアル中に秤量し、２００μｌのベンジルアルコールを加えて１０mg／ｍｌの各結合補助体の溶液を得た。
４．溶液を７ｍｌネジ蓋付きガラスバイアルに以下の表７の様に分注した。
【００６２】
【表７】
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【００６３】
５．各バイアルの内容を回転振動で十分に混合し、各バイアルに１．５ｍｌの蒸留水を加えた。
６．バイアルにキャップをし、５分間超音波処理して透明な分散液を得た。
７．工程（２）のプレートをＰＢＳ／０．０２％ツイーン（Tween）２０中で洗浄し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ（３００μｌ／ウエル）で１時間インキュベートしてブロックした。
８．プレートを先に述べた様に洗浄し、工程（６）の各バイアル中の試料１００μｌを列（１）〜（７）の行（１）に加えた。列（８）を対照ブランクとして残した。
９．列（１）のウエルから１００μｌを列（２）の同じ列の隣り合うウエルに移し混合、次いで１００μｌを次の列に移す等の操作を繰り返してプレート内で２倍希釈を行った。
１０．続いてプレートを＋４℃で終夜インキュベートした。
１１．翌日、プレートを前の様に洗浄し、１００μｌの市販セイヨウワサビペルオキシダーゼ−ＩｇＧコンジュゲート（ＰＢＳ中で１／１０００に希釈）を各ウエルに加え、４０分間室温でインキュベートした。
１２．プレートを再度洗浄し、１００μｌのペルオキシダーゼに対するＯＰＤ基質を各ウエルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。
１３．２０μｌの３Ｍ硫酸を各ウエルに加え、反応を停止した。
１４．各ウエルの吸光度をプレートリーダー上で４５０ｎｍで測定し、バックグラウンドの補正後、得られた結果を以下の表８の様に記録した。
【００６４】
【表８】
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【００６５】
試料２、３および４（すなわち、ＹＦＬ、ＹＷＬおよびＦＷＬの組み合せ）で結合が最大となっていることが分かる。
【００６６】
全部ではないが、種々の頭部の組み合わせのいくつかで強い結合相互作用が顕れることが分かり、反応がこれらの特定の組み合わせに特異的であることを示している。本実施例は、所望の結合相互作用を誘発する目的に対する有効な組み合わせを同定するために、記載された結合補助体をコンビナトリアルアプローチに用い得る方法を示すものである。
【００６７】
【発明の効果】
本発明に係る組成物は、リガンドと強く相互作用を示し、結合部位エピトープを提供するための従来の技術が有する問題点を克服するものである。また、本発明に係る組成物の製造方法は、従来の結合部位エピドープの製造技術が有するコスト面等の問題点を解決するものである。更に、本発明により、リガンドと強く相互作用する分子を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は超分子集合体の表面と、本発明によるこの様な組成物がどの様に標的リガンドに結合するかを模式的に示す。
【図２】  図２は、その頭部が短鎖線状ペプチドよりなり、かつ、２個の同一でない結合補助体で構成される超分子集合体の表面を模式的に示す。
【図１】
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【図２】
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