(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ鎖とＢ鎖を含み、該Ｂ鎖はヒトトロンビンＢ鎖のアミノ酸配列において２０５番目のセリンがアラニンまたはグリシンに置換され、かつ４３番目のヒスチジンがアラニンまたはセリンに置換されたアミノ酸配列を含む、ヒトトロンビン誘導体であって、
２０５番目のセリンがアラニンまたはグリシンに置換され、かつ４３番目のヒスチジンがアラニンまたはセリンに置換される前の配列が、配列番号２のアミノ酸番号５０〜３０８、または配列番号２のアミノ酸番号５０〜３０８において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されたアミノ酸配列であり、
０．１ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．４の５０ｍＭトリス塩酸中でトロンビン基質と３７℃で３時間反応させたときに該ヒトトロンビン誘導体によって分解される該トロンビン基質の割合が検出限界以下である、ヒトトロンビン誘導体。
【請求項２】
Ａ鎖とＢ鎖を含み、該Ｂ鎖はヒトトロンビンＢ鎖のアミノ酸配列において２０５番目のセリンがアラニンまたはグリシンに置換され、かつ４３番目のヒスチジンがアラニンまたはセリンに置換されたアミノ酸配列を含む、ヒトトロンビン誘導体であって、
２０５番目のセリンがアラニンまたはグリシンに置換され、かつ４３番目のヒスチジンがアラニンまたはセリンに置換される前の配列が、配列番号２のアミノ酸番号５０〜３０８、または配列番号２のアミノ酸番号５０〜３０８において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されたアミノ酸配列であり、
（１）０．１ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．４の５０ｍＭトリス塩酸中でトロンビン基質と３７℃で３時間反応させたときに該ヒトトロンビン誘導体によって分解される該トロンビン基質の割合が検出限界以下であり、
（２）ヒルジンＣ末端ペプチド固定化ゲルとの結合能を保持している、ヒトトロンビン誘導体。
【請求項３】
さらに、ヘパリン結合能を保持している、請求項２記載のヒトトロンビン誘導体。
【請求項４】
トロンビン基質が血液凝固第１３因子である、請求項１〜３のいずれか１項記載のヒトト
ロンビン誘導体。
【請求項５】
トロンビン基質がフィブリノゲンである、請求項１〜３のいずれか１項記載のヒトトロンビン誘導体。
【請求項６】
トロンビン基質がＳ２２３８である、請求項１〜３のいずれか１項記載のヒトトロンビン誘導体。
【請求項７】
前記Ｂ鎖が、さらにヒトトロンビンＢ鎖の２４番目のグルタミン、６５番目のリシン、および７７番目のリシンから選ばれた１種またはそれ以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項記載のヒトトロンビン誘導体。
【請求項８】
前記Ｂ鎖が、さらにヒトトロンビンＢ鎖の９８番目のアルギニン、２４５番目のアルギニン、２４８番目のリシン、および２５２番目のリシンから選ばれた１種またはそれ以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項記載のヒトトロンビン誘導体。
【請求項９】
活性化部分トロンボプラスチン時間延長効果、修飾トロンビン惹起血小板凝集抑制効果、およびリストセチン惹起血小板凝集抑制効果が向上している、請求項７または８記載のヒトトロンビン誘導体。
【請求項１０】
カルボキシル基が修飾された請求項１〜９の何れか１項記載のヒトトロンビン誘導体。
【請求項１１】
アミノ酸のエステル、ポリエチレングリコール、アミノ基を有するポリエチレングリコールおよび／またはカルボジイミドによってカルボキシル基が修飾された請求項１０記載のヒトトロンビン誘導体。
【請求項１２】
少なくともＢ鎖２５番目のグルタミン酸のカルボキシル基が修飾された請求項１０記載のヒトトロンビン誘導体。
【請求項１３】
ＰＡＲ１活性化抑制効果およびリストセチン惹起血小板凝集抑制効果を有する、請求項９記載のヒトトロンビン誘導体。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項記載のヒトトロンビン誘導体をコードするＤＮＡ。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項記載のヒトトロンビン誘導体を含有する医薬組成物。
【請求項１６】
抗血栓剤、血小板凝集抑制剤、血小板粘着抑制剤または内因系血液凝固抑制剤である請求項１５記載の医薬組成物。
【請求項１７】
トロンビンレセプター活性化抑制剤である請求項１５記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロンビン誘導体、およびそれを含有する医薬組成物、特に抗血栓剤、抗炎症剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
トロンビンは、血小板凝集反応や炎症反応などを担う、トリプシンと非常に相同性の高いトリプシン様のセリンプロテアーゼである。例えば、非特許文献１には、トロンビンが、基質であるトロンビンレセプターを活性化することによって血小板凝集反応、血管内皮細胞活性化、炎症反応を起こすことが記載されている。【０００３】
トロンビンの生理的作用に関しては以下の様な報告がなされている。非特許文献２（日本血栓止血学会誌  第１０巻（１９９９）  ２、３号）には、トロンビンの主だった血液凝固に関連する基質認識に、エクソサイトI領域が重要な働きをすることが記載されている。非特許文献３（Biochemical J.(2001)354.309-313）には、トロンビン基質蛋白質（以下「トロンビン基質」ということがある）結合能を有する不活性化トロンビンであるアンヒドロトロンビンが、野生型トロンビン同様にエクソサイトI結合能のトロンビン基質に高い結合能を持つことが記載されている。さらに非特許文献３には、ベンズアミジン等の活性中心へ立体障害となる物質の添加によりAHTの結合能が失われることが記載されている。非特許文献４（ヴォート生化学  上巻  １９９６年  ｐ３３１−３４０  東京化学同人）には、トロンビンなどのセリンプロテアーゼは、活性中心にセリン、ヒスチジン、アスパラギン酸を有しており、この３つのアミノ酸のチャージリレーシステムによりプロテアーゼ活性が発現され、セリンプロテアーゼのミカエリス複合体から4面複合体への進展にはグリシン１９３（１９３はキモトリプシノゲンにおけるアミノ酸の位置、トロンビンではB鎖  ２０３位のグリシンにあたる）が関与していることが記載されている。【０００４】
これらをもとに、抗血栓剤等の開発のために、様々なトロンビンの修飾・改変が試みられている。特許文献１（国際公開第０１／０３７４０号パンフレット）には、セリンプロテアーゼと競争してセリンプロテアーゼの基質に結合することによって、該セリンプロテアーゼと該基質との反応を抑制する物質(以下「反応抑制物質」と言うことがある)を含有するセリンプロテアーゼ抑制剤が開示されている。さらに該文献には、このセリンプロテアーゼ抑制剤は、抗血栓剤（血栓形成抑制剤）として有効であることが記載されている。該文献には、該反応抑制物質の具体例として、セリンプロテアーゼであるトロンビンとフェニルメチルスルフォニルフルオリド（以下「ＰＭＳＦ」と言うことがある）などの阻害剤とを反応させ、活性部位に存在するセリンをデヒドロアラニンに転換すること（以下「アンヒドロ化」と言うことがある）により、セリンプロテアーゼ活性が著しく低下したトロンビン誘導体（アンヒドロトロンビン、以下、「AHT」ということがある）が開示されている。【０００５】
また、特許文献２（国際公開第０２／０７７０３１号パンフレット）には、アンヒドロトロンビン（AHT）のカルボキシル基とイミドとを反応させ、AHTを化学的に修飾したAHT誘導体（以下「Ｍ−ＡＨＴ」と言うことがある）が開示されている。Ｍ−ＡＨＴは、血液中に大量に存在するフィブリノゲン（以下「Ｆｂｇｎ」ということがある）への結合能が選択的に低く、AHTに較べて活性化部分トロンボプラスチン時間（以下「ＡＰＴＴ」ということがある）延長効果を増加させることができ、高い抗血栓効果を有する。【０００６】
一方で、アミノ酸が置換されたトロンビン誘導体の研究も行われている。トロンビンの遺伝子組換えにより活性中心のアミノ酸が置換された組換え体について、従来下記のように幾つかの検討がなされてきた。例えば、非特許文献５（Experimental cell research 219, 650-656(1995)）には、活性中心セリンをアラニンに置換したトロンビン誘導体が白血球に及ぼす影響について記載されている。さらに、非特許文献５には、このトロンビン誘導体は酵素活性が失われている旨記載されている。【０００７】
非特許文献６（Biochimica et Biophyscia Acta 1451(1999) 173-186）には、トロンビンＢ鎖  ２０３グリシンをアラニンに置換したトロンビン誘導体、活性中心セリンをアラニン又はスレオニンに置換したトロンビン誘導体、活性中心ヒスチジンをアスパラギンに置換したトロンビン誘導体、さらには、活性中心アスパラギン酸をアスパラギンに置換したトロンビン誘導体が記載されている。この非特許文献６には、これらのトロンビン誘導体の酵素活性について、活性中心セリンをスレオニンに置換したトロンビン誘導体、活性中心ヒスチジンをアスパラギンに置換したトロンビン誘導体、活性中心アスパラギン酸をアスパラギンに置換したトロンビン誘導体は、その酵素活性が野生型トロンビンに比較して数千から数万分の１に低下していること、トロンビンＢ鎖２０３グリシンをアラニンに置換したトロンビン誘導体及び活性中心セリンをアラニンに置換したトロンビン誘導体は、その酵素活性が完全に失われたことが記載されている。
しかしながら、非特許文献５および６に記載のトロンビン誘導体は、各文献に記載されている測定法では検出不能なレベルの酵素活性（トロンビン基質分解活性）が残存していること、トロンビン基質結合能が著しく低下していること、あるいは、血中に多量に存在するＦｂｇｎに高い結合能を有することなどにより、抗血栓、抗炎症剤としての十分な機能を有するとは言い難い。【０００８】
特許文献３（特表平０９−５０９０４５号公報）、非特許文献７（J.Biol.Chem Vol.275, 39827-39830）、非特許文献８（J.Biol.Chem Vol.279,26387-26394）、非特許文献９（J.Biol.Chem Vol.277,27581-27584）には、アミノ酸を置換することにより、酵素活性（トロンビン基質分解活性）と抗血液凝固効果とを有するトロンビン誘導体が記載されている。それらのトロンビン誘導体は、トロンボモデュリン（以下「ＴＭ」ということがある）への結合能が保持または増強され、且つＦｂｇｎ分解能が著しく低下しており、ＴＭに特異的に結合しプロテインCを活性化することにより抗血栓効果を示すトロンビン誘導体である。【０００９】
特許文献４（特表平１１−５０７５４２号公報）には、活性中心のアミノ酸が置換され、さらに抗血栓剤としてヒルジンC末端ペプチドを患者に投与して、出血等の問題が発生した際、そのヒルジンC末端ペプチドの抗凝固活性を中和することを目的としたプロトロンビン誘導体が開示されている。
特許文献５および６には、活性中心セリンがアラニンに置換されたトロンビン誘導体、及び活性中心セリンがアラニンに、かつ活性中心アスパラギン酸がアスパラギンに置換されたトロンビン誘導体が、洗浄血小板懸濁液中におけるトロンビンによるトロンビンレセプターへの刺激を抑制した事が記載されている。
しかしながら、これらのトロンビン誘導体は、血液中に多量に存在するＦｂｇｎと強い結合能を有する。これらのトロンビン誘導体を血中に投与した場合、その殆どがＦｂｇｎに結合することから、抗トロンビンレセプター効果を得るためには多量投与が不可避であることから、これらのトロンビン誘導体を血液中で抗トロンビンレセプター剤（抗血小板剤）として使用することは実質的には不可能であった（本明細書実験例３参照）。
【特許文献１】国際公開第０１／０３７４０号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０２／０７７０３１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９５／１３３８５号パンフレット
【特許文献４】国際公開第９６／４１８６８号パンフレット
【特許文献５】国際公開第９２／１４７５０号パンフレット
【特許文献６】米国特許第５，２５６，７６６号明細書
【非特許文献１】J. Biol.Chem. 261(1986)15928-15933
【非特許文献２】日本血栓止血学会誌  第１０巻  ２，３号（１９９９）
【非特許文献３】Biochemical J.(2001)354.309-313
【非特許文献４】ヴォート生化学  上巻  １９９６年  ｐ３３１−３４０  東京化学同人
【非特許文献５】Experimental cell research 219, 650-656(1995)
【非特許文献６】Biochimica et Biophyscia Acta 1451(1999) 173-186
【非特許文献７】J.Biol.Chem Vol.275, 39827-39830
【非特許文献８】J.Biol.Chem Vol.279,26387-26394
【非特許文献９】J.Biol.Chem Vol.277,27581-27584
【発明の開示】
【００１０】
ＡＨＴやＭ−ＡＨＴのように化学的手法により得られたトロンビン誘導体は、抗血栓効果や抗炎症効果を有しているが、化学的手法を用いているため残存するセリンプロテアーゼ活性にばらつきがあった。また、ＡＨＴへ変換する際には、アルカリ処理、再生処理等の多工程が必要であり、回収率も５０から６０％であった。ＡＨＴおよびＭ−ＡＨＴにおいては、微量に存在する残存酵素活性（トロンビン基質分解活性）が、その抗凝固能を低下させる場合があった。特にＡＨＴにおいてその傾向が強い。
【００１１】
また、前述のトロンビンの活性中心アミノ酸を置換したトロンビン誘導体は、抗血栓、抗炎症剤としての十分な機能を有しているとは言い難いものであった。理由として、これらのトロンビン誘導体は、抗血栓、抗炎症剤として用いる目的において、実質的なトロンビン基質分解活性を有するか、あるいは、アミノ酸の置換による影響で主にエクソサイトIの構造が変化することにより、トロンビン基質結合能が著しく低下していることなどが考えられる。
例えば非特許文献６（Biochimica et Biophyscia Acta 1451(1999) 173-186）において、トロンビンＢ鎖２０３グリシンをアラニンに置換したトロンビン誘導体は、トロンビン基質分解活性が完全に喪失したと報告されている。しかしながら、このトロンビン誘導体には、抗血栓、抗炎症剤として用いる目的において、実質的なトロンビン基質分解活性が残存していた。さらに、非特許文献６に記載の、トロンビンB鎖２０３グリシン、活性中心ヒスチジン、及びアスパラギン酸の置換は、トロンビン基質分解活性をより低下させるものの、その組み合わせによってはエクソサイトIの構造変化を招き、トロンビン基質結合能が損なわれる場合があった。
【００１２】
一方、実際の医療の実態に目を移すと、日本人の３大死因は１位癌(30％)、２位心疾患(15％)、３位脳血管障害(13％)であり、全体の約６割を占める。心疾患の大半は心筋梗塞、狭心症といった冠状動脈疾患であり、心臓及び脳を合算した血管障害は、現状で癌と同程度の死因であるが、今後一層の増加傾向にあり、効果的治療薬の開発は大きな社会的要請である。また、脳梗塞は死を免れた場合でも後遺症が残るケースが多く、多大な介護、医療費の負担が社会的問題となっている。
【００１３】
心筋梗塞、狭心症、脳梗塞等の血栓症は複数の要因が複合的に起因している。図４８に示されるように実際の心筋梗塞における血栓においては白色血栓に続き血流に対し中流に混合血栓、下流に赤色血栓がそれぞれ観察される事が報告されている。
【００１４】
脳、心臓における血管障害の大部分は血栓症である。その主な原因は、血流の異常、凝固成分の異常、血管内皮の異常であるが、実際には、それらが複合的に起因して血栓症を誘発する。その全てに関与し、血栓形成に中心的役割を担うのが凝固酵素のトロンビンである。トロンビンは凝固カスケードの最終段階でフィブリン凝集塊を作ると同時に、XI、V、VIII因子を活性化して凝固カスケードを加速する。また、血小板及び血管内皮上のレセプターであるＰＡＲ１を介して、血小板凝集と内皮細胞活性化を引き起こす。内皮細胞の活性化は血管壁の凝固亢進を引き起こし、更に負の連鎖によって血栓形成が進むことが報告されている。実際の動脈血栓の病理解剖では、ほとんどのケースで白色、混合、赤色血栓が観察されることからも抗血栓治療には凝固、血小板の複合的な抑制が重要であることが分かる。それにも拘わらず、既存の抗血栓剤はすべて抗凝固剤または抗血小板剤に分類され、別々の薬剤による治療がなされている。
上記状況を考慮して、（i）凝固の活性化と促進、（ii）血小板の凝集と粘着、および（iii）血管内皮細胞の活性化機能を効果的に抑制する抗血栓剤、抗炎症剤として使用可能な抗血栓剤の開発が望まれている。
【００１５】
本発明者は以下のことを見出した。すなわち、
トロンビンB鎖の２０５番目のセリン、２０３番目のグリシン、９９番目のアスパラギン酸、および４３番目のヒスチジンから選ばれた１種以上のアミノ酸が置換されたトロンビン誘導体であって、実質的にトロンビン基質を分解しないレベルにトロンビン基質分解活性が低下しており、且つ活性中心アミノ酸の置換が、置換前のトロンビンが有するエクソサイトＩおよびエクソサイトIIの構造を損なうものではないトロンビン誘導体は、AHT同様のAPTT延長を主効果とした抗血栓症効果が得られること、さらに、そのＡＰＴＴ延長効果はトロンビン残存活性に起因したインキュベーションの影響を受けることなく確実にＡＰＴＴが延長されるものであることを見出した（実験例２１参照）。さらに、該トロンビン誘導体が血栓形成に重要な作用をするトロンビン基質に対しより特異的な結合能を有しているものであれば、より確実にAHT以上の抗血栓効果、抗炎症効果が得られることを見出した。
【００１６】
さらに活性中心アミノ酸以外のアミノ酸を置換することにより、血中に多量に存在するＦｂｇｎとの結合能が、トロンビンレセプター又は血液凝固第8因子（以下、「ＦＶＩＩＩ」と呼ぶことがある）との結合能に比べ相対的に低下し、より少ない投与量によって良好な抗血栓効果を得ることができることを見出した。さらに、この活性中心アミノ酸以外のアミノ酸の置換により、高いAPTT延長効果を持つが抗血小板効果は低いタイプのトロンビン誘導体や、高いAPTT延長効果と高い抗血小板効果（但しPAR1阻害効果のみ）を有するタイプのトロンビン誘導体など、効果の発現態様が異なるトロンビン誘導体が得られることを見出した。
【００１７】
この活性中心アミノ酸以外のさらなるアミノ酸の置換により、本発明のトロンビン誘導体が持つ抗血栓効果が損なわれることなく、該トロンビン誘導体のＴＭとの結合能が特異的に低下するものがあることを見出した。活性中心アミノ酸以外のアミノ酸が置換された本発明のトロンビン誘導体は、生体に投与しても、ＴＭ上におけるトロンビンによるプロテインCの活性化を抑制しない。すなわち、活性中心アミノ酸以外のアミノ酸が置換された本発明のトロンビン誘導体は、トロンビンの本来有する抗血栓能を阻害しない。
【００１８】
さらに、本発明のトロンビン誘導体のカルボキシル基を、特許文献２（国際公開第０２／０７７０３１号パンフレット）に記載の方法によりカルボキシル基を修飾すれば、単にＡＰＴＴを延長するのみならず、アミノ酸の置換に依存して抗血小板効果、特にPAR1活性化及びリストセチン惹起血小板凝集抑制効果をも付加、制御し得ることを見出した。具体的には、非常に高いAPTT延長効果と高い抗血小板効果とを有するトロンビン誘導体、中程度のAPTT延長効果と強い抗血小板効果とを有する誘導体など薬効のバランスを制御したトロンビン誘導体を得ることができる。すなわち、本発明のトロンビン誘導体のカルボキシル基をカルボキシル基の修飾することにより、種々の血栓症に適応しうる抗血液凝固効果、抗血小板効果を持ったトロンビン誘導体を得ることが可能となる。
本発明者はこれらの知見に基づいて本発明を完成させた。
【００１９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
１．＜活性中心アミノ酸の置換＞
（１）Ａ鎖とＢ鎖を含み、該Ｂ鎖はトロンビンＢ鎖のアミノ酸配列において２０５番目のセリン、２０３番目のグリシン、９９番目のアスパラギン酸、および４３番目のヒスチジンから選ばれた１種又はそれ以上の活性中心アミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有する、トロンビン誘導体であって、
１）０．１ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．４の５０ｍＭトリス塩酸中でトロンビン基質と３７℃で３時間反応させたときに該トロンビン誘導体によって分解される該トロンビン基質の割合が１０％以下であり、
２）エクソサイトＩの構造を保持している、トロンビン誘導体。
（２）Ａ鎖とＢ鎖を含み、該Ｂ鎖はトロンビンＢ鎖のアミノ酸配列において２０５番目のセリン、２０３番目のグリシン、９９番目のアスパラギン酸、および４３番目のヒスチジンから選ばれた１種又はそれ以上の活性中心アミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有する、トロンビン誘導体であって、
１）０．１ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．４の５０ｍＭトリス塩酸中でトロンビン基質と３７℃で３時間反応させたときに該トロンビン誘導体によって分解される該トロンビン基質の割合が１０％以下であり、
２）ヒルジンＣ末端ペプチド固定化ゲルとの結合能を保持している、トロンビン誘導体。
（３）さらに、ヘパリン結合能を保持している、（２）のトロンビン誘導体。
（４）トロンビン基質が血液凝固第１３因子である、（１）または（２）のトロンビン誘導体。
（５）トロンビン基質がフィブリノゲンである、（１）または（２）のトロンビン誘導体。
（６）活性中心アミノ酸の置換が、トロンビンＢ鎖の２０５番目のセリン、２０３番目のグリシン、９９番目のアスパラギン酸、および４３番目のヒスチジンから選ばれた２種又はそれ以上のアミノ酸の置換である、（１）〜（５）のいずれかのトロンビン誘導体。
（７）活性中心アミノ酸の置換が、２０５番目のセリンの置換を含む、（１）〜（６）のいずれかのトロンビン誘導体。
（８）活性中心アミノ酸の置換が、２０５番目のセリンおよび４３番目のヒスチジンの置換を含む、（１）〜（７）のいずれかのトロンビン誘導体。
（９）４３番目のヒスチジンが、アラニンまたはセリンに置換された、（８）のトロンビン誘導体。
（１０）２０５番目のセリンがアラニン、スレオニン、またはグリシンに置換された、（６）〜（９）の何れかのトロンビン誘導体。
（１１）２０５番目のセリンがアラニンに置換された、（６）〜（９）の何れかのトロンビン誘導体。
（１２）２０５番目のセリンおよび４３番目のヒスチジンがアラニンに置換された、（８）のトロンビン誘導体。
（１３）血液凝固第８因子結合能がアンヒドロトロンビンの１０％以上である（１）〜（１２）の何れかのトロンビン誘導体。
（１４）血液凝固第８因子結合能がアンヒドロトロンビンの８０％以上である（１）〜（１２）の何れかのトロンビン誘導体。
（１５）該トロンビン誘導体の血液凝固第８因子結合能（VIIIA）とフィブリノゲン結合能（FA）との比VIIIA／FAが、アンヒドロトロンビンの血液凝固第８因子結合能（VIIIａ）とフィブリノゲン結合能（Fａ）との比VIIIａ／Fａの１．１倍以上である、（１）〜（１４）の何れかのトロンビン誘導体。
（１６）該トロンビン誘導体の血液凝固第８因子結合能（VIIIA）とフィブリノゲン結合能（FA）との比VIIIA／FAが、アンヒドロトロンビンの血液凝固第８因子結合能（VIIIａ）とフィブリノゲン結合能（Fａ）との比VIIIａ／Fａの１．２倍以上である、（１）〜（１４）の何れかのトロンビン誘導体。
（１７）該トロンビン誘導体の活性化部分トロンボプラスチン時間が、アンヒドロトロンビンの１．１倍以上である、（１）〜（１２）の何れかのトロンビン誘導体。
（１８）活性中心アミノ酸のアミノ酸の置換によって、フィブリノゲン結合能が１０％以上低下し、活性化部分トロンボプラスチン時間が１．１倍以上に延長された（１）〜（１２）のいずれかのトロンビン誘導体。
（１９）Ａ鎖とＢ鎖を含み、該Ｂ鎖はトロンビンＢ鎖のアミノ酸配列において２０５番目のセリン、並びに２０３番目のグリシン、９９番目のアスパラギン酸及び４３番目のヒスチジンから選ばれた１種又はそれ以上のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有する、トロンビン誘導体。
（２０）Ａ鎖とＢ鎖を含み、該Ｂ鎖はトロンビンＢ鎖のアミノ酸配列において２０５番目のセリン及び４３番目のヒスチジンが置換されたアミノ酸配列を有する、トロンビン誘導体。
２．＜活性中心アミノ酸以外のアミノ酸の置換＞
（２１）前記Ｂ鎖が、さらに前記活性中心アミノ酸以外のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有する、（１）〜（２０）のいずれかのトロンビン誘導体。
（２２）活性中心アミノ酸以外のアミノ酸が、トロンビンのエクソサイトI領域のアミノ酸である、（２１）のトロンビン誘導体。
（２３）トロンビンのエクソサイトI領域のアミノ酸が塩基性アミノ酸である（２２）のトロンビン誘導体。
（２４）トロンビンのエクソサイトI領域のアミノ酸が、トロンビンＢ鎖の２４番目のグルタミン、６５番目のリシン、および７７番目のリシンから選ばれた１種またはそれ以上のアミノ酸である、（２２）のトロンビン誘導体。
（２５）該トロンビン誘導体の、血液凝固第８因子結合能（VIIIA）とフィブリノゲン結合能（FA）との比VIIIA／FAが、該活性中心アミノ酸以外のアミノ酸が置換される以前のトロンビン誘導体の、血液凝固第８因子結合能（VIIIａ）とフィブリノゲン結合能（Fａ）との比VIIIａ／Fａの１．１倍以上である、（２１）〜（２４）の何れかのトロンビン誘導体。
（２６）該トロンビン誘導体の、血液凝固第８因子結合能（VIIIA）とフィブリノゲン結合能（FA）との比VIIIA／FAが、該活性中心アミノ酸以外のアミノ酸が置換される以前のトロンビン誘導体の、血液凝固第８因子結合能（VIIIａ）とフィブリノゲン結合能（Fａ）との比VIIIａ／Fａの１．５倍以上である、（２１）〜（２４）の何れかのトロンビン誘導体。
（２７）APTT延長効果、トロンビンレセプター活性化抑制効果、リストセチン惹起血小板凝集抑制効果のいずれかを有し、且つ該活性中心アミノ酸以外のアミノ酸が置換される以前のトロンビン誘導体に比べてトロンボモジュリン結合能が低下した、（２１）〜（２４）の何れかのトロンビン誘導体。
（２８）APTT延長効果、トロンビンレセプター活性化抑制効果、リストセチン惹起血小板凝集抑制効果のいずれかを有し、且つ該活性中心アミノ酸以外のアミノ酸が置換される以前のトロンビン誘導体に比べてトロンボモジュリン結合能が１０％以上低下した、（２１）〜（２４）の何れかのトロンビン誘導体。
（２９）該トロンビン誘導体の、血液凝固第８因子結合能（VIIIA）とトロンボモジュリン結合能（ＴＭA）との比VIIIA／ＴＭAが、該活性中心アミノ酸以外のアミノ酸が置換される以前のトロンビン誘導体の、血液凝固第８因子結合能（VIIIａ）とトロンボモジュリン結合能（ＴＭａ）との比VIIIａ／ＴＭａの１．１倍以上である、（２１）〜（２４）の何れかのトロンビン誘導体。
（３０）該トロンビン誘導体の、血液凝固第８因子結合能（VIIIA）とトロンボモジュリン結合能（ＴＭA）との比VIIIA／ＴＭAが、該活性中心アミノ酸以外のアミノ酸が置換される以前のトロンビン誘導体の、血液凝固第８因子結合能（VIIIａ）とトロンボモジュリン結合能（ＴＭａ）との比VIIIａ／ＴＭａの１．５倍以上である、（２１）〜（２４）の何れかのトロンビン誘導体。
（３１）活性中心アミノ酸以外のアミノ酸がトロンビンのエクソサイトII領域のアミノ酸であり、抗血栓能を有しつつヘパリン結合能が低下した、（２１）のトロンビン誘導体。
（３２）トロンビンのエクソサイトII領域のアミノ酸が、トロンビンＢ鎖の９８番目のアルギニン、２４５番目のアルギニン、２４８番目のリシン、および２５２番目のリシンから選ばれた１種またはそれ以上のアミノ酸である（３１）のトロンビン誘導体。
（３３）前記トロンビン誘導体のヘパリン結合能が、該活性中心以外のアミノ酸が置換される以前のトロンビンの９０％以下である、（３１）または（３２）のトロンビン誘導体。
（３４）活性化部分トロンボプラスチン時間延長効果、修飾トロンビン惹起血小板凝集抑制効果、リストセチン惹起血小板凝集抑制効果から選ばれる一種又はそれ以上の抗血栓効果が向上している、（２１）〜（３３）の何れかのトロンビン誘導体。
（３５）前記トロンビン誘導体の活性化部分トロンボプラスチン時間がアンヒドロトロンビンの１．１倍以上である、（２１）〜（３３）の何れかのトロンビン誘導体。
（３６）前記トロンビン誘導体の活性化部分トロンボプラスチン時間が、該活性中心以外のアミノ酸が置換される以前のトロンビンの１．５倍以上であり、かつ、トロンボモジュリン結合能が、該活性中心以外のアミノ酸が置換される以前のトロンビンの５０％以下に低下した、（３１）または（３２）のトロンビン誘導体。
（３７）トロンビンＢ鎖のアミノ酸配列がヒト野生型トロンビンのＢ鎖のアミノ酸配列である、（１）〜（３６）のいずれかのトロンビン誘導体。
（３８）ヒト野生型トロンビンＢ鎖のアミノ酸配列が配列番号２の５０〜３０８位のアミノ酸配列である、（３７）のトロンビン誘導体。
３．＜トロンビン修飾体＞
（３９）カルボキシル基が修飾された（１）〜（３８）の何れかのトロンビン誘導体。
（４０）アミノ酸のエステルによってカルボキシル基が修飾された（３９）のトロンビン誘導体。
（４１）ポリエチレングリコールによってカルボキシル基が修飾された（３９）のトロンビン誘導体。
（４２）アミノ基を有するポリエチレングリコールによってカルボキシル基が修飾された（３９）のトロンビン誘導体。
（４３）前記ポリエチレングリコールが分子量１０００以下のポリエチレングリコールである、（４１）または（４２）のトロンビン誘導体。
（４４）カルボキシル基がカルボジイミドによって修飾された（３９）のトロンビン誘導体。
（４５）１分子当たり少なくとも３箇所以上のカルボキシル基が修飾された（３９）のトロンビン誘導体。
（４６）１分子当たり２５箇所以下のカルボキシル基が修飾された（３９）のトロンビン誘導体。
（４７）少なくともＢ鎖２５番目のグルタミン酸のカルボキシル基が修飾された（３９）のトロンビン誘導体。
（４８）ＰＡＲ１活性化抑制効果および／またはリストセチン惹起血小板凝集抑制効果を有する、（１）〜（４７）の何れかのトロンビン誘導体。
４．＜DNA、用途＞
（４９）（１）〜（３８）のいずれかのトロンビン誘導体をコードするＤＮＡ。
（５０）（１）〜（４８）のいずれかのトロンビン誘導体を含有する医薬組成物。
（５１）抗血栓剤である（５０）の医薬組成物。
（５２）抗炎症剤である（５０）の医薬組成物。
（５３）血小板凝集抑制剤である（５０）の医薬組成物。
（５４）血小板粘着抑制剤である（５０）の医薬組成物。
（５５）内因系血液凝固抑制剤である（５０）の医薬組成物。
（５６）トロンビンレセプター活性化抑制剤である（５０）の医薬組成物。
（５７）抗血液凝固作用と抗血小板作用の両方を有する（５０）の医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】５ｍｇ/ｍｌリストセチンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、カルボキシル基修飾203A205Gトロンビン（37μg/ml）の抗血小板効果を示す図。009がコントロールを、010がカルボキシル基修飾203A205Gトロンビンを示す。縦軸が透過率（％）、横軸が時間（分）を示す（図２−１２、１５，２１−２２、２５−３５も同じ）。
【図２】1μｇ/ｍｌＭ−トロンビン（カルボキシル基修飾トロンビン）で血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、カルボキシル基修飾203A205Gトロンビン（37μg/ml）の抗血小板効果を示す図。002がコントロールを、001がカルボキシル基修飾203A205Gトロンビンを示す。
【図３】５ｍｇ/ｍｌリストセチンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、205A43Aトロンビン（30μg/ml）の抗血小板効果を示す図。079がコントロールを、080が205A43Aトロンビンを示す。
【図４】1μｇ/ｍｌＭ−トロンビンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、205A43Aトロンビン（30μg/ml）の抗血小板効果を示す図。083がコントロールを、084が205A43Aトロンビンを示す。
【図５】５ｍｇ/ｍｌリストセチンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、カルボキシル基修飾205A43Aトロンビン（30μg/ml）の抗血小板効果を示す図。056がコントロールを、055がカルボキシル基修飾205A43Aトロンビンを示す。
【図６】５ｍｇ/ｍｌリストセチンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、カルボキシル基修飾205A43Aトロンビン（15μg/ml）の抗血小板効果を示す図。042がコントロールを、041がカルボキシル基修飾205A43Aトロンビンを示す。
【図７】５ｍｇ/ｍｌリストセチンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、カルボキシル基修飾205A43Aトロンビン（7.5μg/ml）の抗血小板効果を示す図。058がコントロールを、057がカルボキシル基修飾205A43Aトロンビンを示す。
【図８】1μｇ/mlＭ−トロンビンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、カルボキシル基修飾205A43Aトロンビン（30μg/ml）の抗血小板効果を示す図。064がコントロールを、063がカルボキシル基修飾205A43Aトロンビンを示す。
【図９】1μｇ/ｍｌＭ−トロンビンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、カルボキシル基修飾205A43Aトロンビン（15μg/ml）の抗血小板効果を示す図。067がコントロールを、066がカルボキシル基修飾205A43Aトロンビンを示す。
【図１０】1μｇ/ｍｌＭ−トロンビンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、カルボキシル基修飾205A43Aトロンビン（7.5μg/ml）の抗血小板効果を示す図。070がコントロールを、069がカルボキシル基修飾205A43Aトロンビンを示す。
【図１１】５ｍｇ/ｍｌリストセチンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、203A205Gトロンビン（80μg/ml）の抗血小板効果を示す図。104がコントロールを、095が203A205Gトロンビンを示す。
【図１２】1μｇ/ｍｌＭ−トロンビンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、203A205Gトロンビン（80μg/ml）の抗血小板効果を示す図。097がコントロールを、098が203A205Gトロンビンを示す。
【図１３】203A205GトロンビンのＦｂｇｎ及びFVIIIへの結合特異性を示す図。破線が1.0×10-7MのＦｂｇｎ、実線が1.0×10-7MのFVIIIを示す。
【図１４】AHTのＦｂｇｎ及びFVIIIへの結合特異性を示す図。破線が1.0×10-7MのＦｂｇｎ、実線が1.0×10-7MのFVIIIを示す。
【図１５】1μｇ/ｍｌＭ−トロンビンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、205A43Aトロンビン（007；3.26μM、008；0.81μM）の抗血小板効果を示す図。009がコントロールを示す。
【図１６】205A43Aトロンビン誘導体のＦｂｇｎ及びFVIIIへの結合特異性を示す図。破線が1.0×10-7MのＦｂｇｎ、実線が1.0×10-7MのFVIIIを示す。
【図１７】205A43Sトロンビン誘導体のＦｂｇｎ及びFVIIIへの結合特異性を示す図。破線が1.0×10-7MのＦｂｇｎ、実線が1.0×10-7MのFVIIIを示す。
【図１８】24E205A43AトロンビンのＦｂｇｎ及びFVIIIへの結合特異性を示す図。破線が1.0×10-7MのＦｂｇｎ、実線が1.0×10-7MのFVIIIを示す。
【図１９】205A43Aトロンビン及び24E205A43AトロンビンのＴＭ結合能を示す図。Dが205A43Aトロンビン、Eが24E205A43Aトロンビンを示す。
【図２０】203Aトロンビンのトロンビン基質分解活性を示す電気泳動の図（写真）。１は分子量マーカー、２，５は空のレーン、３はFXIIIのみ、４はFXIII＋203Aトロンビンを示す。また、レーン６〜１０はFXIIIに203Aトロンビンを加えてそれぞれ0,0.5,1,3,6時間反応させたものを示す。
【図２１】1μｇ/ｍｌＭ−トロンビンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、カルボキシル基修飾205Aトロンビン（100μg/ml）の抗血小板効果を示す図。016がコントロールを、015がカルボキシル基修飾205Aトロンビンを示す。
【図２２】５ｍｇ/ｍｌリストセチンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、カルボキシル基修飾205Aトロンビン（100μg/ml）の抗血小板効果を示す図。003がコントロールを、004がカルボキシル基修飾205Aトロンビンを示す。
【図２３】205Aトロンビン誘導体のＦｂｇｎ及びFVIIIへの結合特異性を示す図。破線が1.0×10-7MのＦｂｇｎ、実線が1.0×10-7MのFVIIIを示す。
【図２４】205A203Aトロンビン誘導体のＦｂｇｎ及びFVIIIへの結合特異性を示す図。破線が1.0×10-7MのＦｂｇｎ、実線が1.0×10-7MのFVIIIを示す。
【図２５】５ｍｇ/ｍｌリストセチンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、カルボキシル基修飾77E203A205Gトロンビン（50μg/ml）の抗血小板効果を示す図。001がコントロールを、002がカルボキシル基修飾77E203A205Gトロンビンを示す。
【図２６】1μｇ/ｍｌＭ−トロンビンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、カルボキシル基修飾77E203A205Gトロンビン（50μg/ml）の抗血小板効果を示す図。014がコントロールを、013がカルボキシル基修飾77E203A205Gトロンビンを示す。
【図２７】1μｇ/ｍｌＭ−トロンビンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、77E205A43Aトロンビン（100μg/ml）の抗血小板効果を示す図。019がコントロールを、020が77E205A43Aトロンビンを示す。
【図２８】５ｍｇ/ｍｌリストセチンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、カルボキシル基修飾77E205A43Aトロンビン（30μg/ml）の抗血小板効果を示す図。005がコントロールを、006がカルボキシル基修飾77E205A43Aトロンビンを示す。
【図２９】1μｇ/ｍｌＭ−トロンビンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、65A205A43Aトロンビン（100μg/ml）の抗血小板効果を示す図。020がコントロールを、019が65A205A43Aトロンビンを示す。
【図３０】1μｇ/ｍｌＭ−トロンビンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、65A205A43Aトロンビン（25または50μg/ml）の抗血小板効果を示す図。021が25μg/mlを、022が50μg/mlを示す。
【図３１】1μｇ/ｍｌＭ−トロンビンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、65A205A43Aトロンビン（10μg/ml）の抗血小板効果を示す図。023がコントロールを、024が65A205A43Aを示す。
【図３２】1μｇ/ｍｌＭ−トロンビンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、カルボキシル基修飾65A205A43Aトロンビン（36μg/ml）の抗血小板効果を示す図。038がコントロールを、033がカルボキシル基修飾65A205A43Aトロンビンを示す。
【図３３】1μｇ/ｍｌＭ−トロンビンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、カルボキシル基修飾65A205A43Aトロンビン（9又は18μg/ml）の抗血小板効果を示す図。035が18μg/mlを、036が9μg/mlを示す。
【図３４】1μｇ/ｍｌＭ−トロンビンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、カルボキシル基修飾65A205A43Aトロンビン（4.5μg/ml）の抗血小板効果を示す図。
【図３５】５ｍｇ/ｍｌリストセチンで血小板凝集を惹起したＰＲＰに対する、カルボキシル基修飾65A205A43Aトロンビン（36μg/ml）の抗血小板効果を示す図。041がコントロールを、042がカルボキシル基修飾65A205A43Aトロンビンを示す。
【図３６】65A205A43Aトロンビン誘導体のＦｂｇｎ及びFVIIIへの結合特異性を示す図。破線が1.0×10-7MのＦｂｇｎ、実線が1.0×10-7MのFVIIIを示す。
【図３７】65A205A43AトロンビンのＴＭ結合能を示す図。
【図３８】205A43AトロンビンのヒルジンC末端ペプチドカラムによる精製過程の電気泳動パターンを示す図（写真）。非還元でSDS-PAGEを行いCBB染色を行った。レーン１、２は標準トロンビン；レーン３はアプライ前のフラクション；レーン４は素通りフラクション；レーン５〜１０は溶出フラクションを示す。
【図３９】205AトロンビンのヒルジンC末端ペプチドカラムによる精製過程の電気泳動パターンを示す図（写真）。非還元でSDS-PAGEを行いCBB染色を行った。レーン１〜３は標準トロンビン；レーン４はアプライ前のフラクション；レーン５は素通りフラクション；レーン６〜１１は溶出フラクションを示す。
【図４０】205Aトロンビンのトロンビン基質分解活性を示す電気泳動図（写真）。レーン１はマーカー；レーン２，５はサンプルなし；レーン３はFXIIIのみ；レーン４はFXIII＋トロンビン；レーン６〜１０は205Aトロンビンでそれぞれ０,１，３，６，２４時間反応させたFXIII。
【図４１】203A205Gトロンビンのトロンビン基質分解活性を示す電気泳動図（写真）。レーン１はマーカー；レーン２はFXIIIのみ；レーン３はFXIII＋トロンビン；レーン４〜８は203A205Gトロンビンでそれぞれ０,１，３，６，２４時間反応させたFXIII。
【図４２】各誘導体のトロンビン基質分解活性を示す電気泳動図（写真）。レーン１はマーカー；レーン３はFXIIIのみ；レーン２，４はFXIII＋トロンビン；レーン５〜７は205Gトロンビンでそれぞれ０,１，３時間反応させたFXIII；レーン８，９は205A43Aトロンビンでそれぞれ０,３時間反応させたFXIII；レーン１０，１１は203A205Gトロンビンでそれぞれ０,３時間反応させたFXIII。
【図４３】各誘導体のトロンビン基質分解活性を示す電気泳動図（写真）。レーン１はマーカー；レーン２はFXIIIのみ；レーン３はFXIII＋トロンビン；レーン４〜８は203A205Aトロンビンでそれぞれ０,１,３,６,２４時間反応させたFXIII；レーン９〜１３は203A205A99Nトロンビンでそれぞれ０,１,３,６,２４時間反応させたFXIII。
【図４４】205VトロンビンのヒルジンC末端ペプチドカラムによる精製過程の電気泳動パターンを示す図（写真）。SS結合を還元しSDS-PAGEを行い抗人トロンビンポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロットにてバンドを確認した。レーン１はマーカー；レーン２，３は標準トロンビン；レーン４はアプライ前のフラクション；レーン５は素通りフラクション；レーン６は溶出フラクションを示す。
【図４５】205DトロンビンのヒルジンC末端ペプチドカラムによる精製過程の電気泳動パターンを示す図（写真）。SS結合を還元しSDS-PAGEを行い抗人トロンビンポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロットにてバンドを確認した。レーン１はマーカー；レーン２，３はそれぞれ標準トロンビン；レーン４はアプライ前のフラクション；レーン５は素通りフラクション；レーン６は溶出フラクションを示す。
【図４６】1μｇ/ｍｌＭ−トロンビンの血小板凝集効果に対する抗PAR１抗体の効果を示す図。００２が1μｇ/ｍｌＭ−トロンビンを、００１が1μｇ/ｍｌＭ−トロンビン＋抗PAR１抗体を示す。
【図４７】19A205A43Aトロンビン誘導体のＦｂｇｎ及びFVIIIへの結合特異性を示す図。破線が1.0×10-7MのＦｂｇｎ、実線が1.0×10-7MのFVIIIを示す。
【図４８】動脈血栓の成長を示す模式図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．＜トロンビン＞
本発明に用いるトロンビン誘導体は、A鎖とB鎖を含み、該B鎖において特定のアミノ酸が置換されたトロンビン誘導体である。本発明に用いるトロンビン誘導体は、生体内において、A鎖及びB鎖がS-S結合によって架橋された立体構造をとることができるものであれば特に制限されない。A鎖及びB鎖はトロンビン前駆体タンパク質がプロセシングされて生じるため、本発明のトロンビン誘導体をプレトロンビンやプロトロンビンなどの前駆体タンパク質の形で生体に投与し、生体内でプロセシングされて前記立体構造をとるようにしてもよい。また、A鎖及びB鎖を遺伝子組換えや化学合成などで別々に製造し、それらをインビトロでS-S結合させてもよいし、それらを別々に投与し、生体内で前記のA鎖及びB鎖がS-S結合によって架橋された立体構造をとるようにしてもよい。
ここで、A鎖とは、野生型ヒトトロンビンでいえば、配列番号２のアミノ酸番号１〜４９に相当する領域であり、B鎖とは、野生型ヒトトロンビンでいえば、配列番号２のアミノ酸番号５０〜３０８に相当する領域である。
ヒトトロンビンにおいてはA鎖N末端の１３アミノ酸残基は自己分解により切り離される。よってA鎖はN末端から１３アミノ酸残基（例えば、配列番号２のアミノ酸番号１〜１３の残基）が切り離された配列でも良い。さらに、生体内で前記の立体構造をとることのできるプロトロンビンやプレトロンビンなどのトロンビン前駆体蛋白質も本発明のトロンビン誘導体に含まれる。なお、野生型ヒトプロトロンビンのアミノ酸配列は、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔのデータベースにアクセション番号Ｐ００７３４として開示されている。
本発明で得られるトロンビン誘導体はプロトロンビン体にて生体内に投与されることも可能である。その場合、血栓部位にて抗血栓効果を持ったトロンビンに活性化を受け、血栓形成箇所にて抗血栓効果を発揮し、生体内にてより部位特異的な抗血栓効果が得られる。【００２２】
２．＜トロンビン基質分解活性＞
本発明のトロンビン誘導体は、０．１ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．４の５０ｍＭトリス塩酸中で、血液凝固第13因子（ＦＸIII）、フィブリノゲン（Ｆｂｇｎ）、Ｓ２２３８などの合成基質（シグマ社より入手可）、トロンビンレセプター、プロテインCなどのトロンビン基質と、本発明のトロンビン誘導体とを３７℃で３時間反応させたときに分解されるトロンビン基質の割合が１０％以下となるものである。トロンビン基質分解活性がこの範囲であれば、生体への投与後、本トロンビン誘導体が代謝されるまでの間の本トロンビン誘導体によるトロンビン基質の活性化は問題にならないものと考えられる。上記トロンビン基質のうちＦＸIIIは、熱に比較的安定であり、さらに電気泳動で確認しやすいことから、本発明において好ましく用いられる。トロンビン誘導体はFXIIIに対しモル比にて１：１またはそれ以上の濃度で分解を測定することが好ましい。
トロンビンでは基質FXIIIにおいては電気泳動で活性化されたバンドを、フィブリノゲンにおいては微量のフィブリン塊の有無を確認することで基質分解能の有無を確認できる
なお、このトロンビン基質分解活性活性測定方法によれば、非特許文献６（Biochimica et Biophyscia Acta 1451(1999) 173-186）において完全に活性を失っていると報告されているB鎖２０３番目グリシンをアラニンに置換した誘導体に、依然としてトロンビン基質分解活性が残存していることが判る。【００２３】
本発明で得られるトロンビン誘導体は特許文献３（特表平09-509045）、非特許文献７（J.Biol.Chem Vol.275, 39827-39830）、非特許文献８（J.Biol.Chem Vol.279,26387-26394）、非特許文献９（J.Biol.Chem Vol.277,27581-27584）に開示されるトロンビン誘導体とは異なる抗血栓作用機構を有する。すなわち、これらの文献に開示されるトロンビン誘導体は、ＴＭ特異性が保持又は向上しており、優先的にプロテインCを活性化することで抗血栓効果を発揮する。これに対し、本発明のトロンビン誘導体はプロテインCを含むトロンビン基質活性化能がない。本発明のトロンビン誘導体は、より特異的に血栓形成に重要なトロンビン基質と、それを活性化すること無しに結合し、血液中に存在するトロンビンによるこれらトロンビン基質の活性化を抑制することによって抗血栓効果を発揮する。反対に本発明のトロンビン誘導体は生体内のトロンビンのＴＭ結合を阻害しないことが望ましく、ＴＭ結合能は低下している事が望ましい。【００２４】
３．＜アミノ酸の置換およびカルボキシル基の修飾＞
本願第１の発明は、トロンビンのB鎖の２０５番目のセリン、２０３番目のグリシン、９９番目のアスパラギン酸、および４３番目のヒスチジンから選ばれた１種以上のアミノ酸（活性中心アミノ酸）が置換されたトロンビン誘導体であって、（１）０．１ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．４の５０ｍＭトリス塩酸中でトロンビン基質と３７℃で３時間反応させたときに分解される該トロンビン基質の割合が１０％以下であり、（２）エクソサイトＩの構造が保持されているトロンビン誘導体である。この第１の発明は、この構成をとることにより、アンヒドロトロンビン（AHT）同等かそれ以上の活性化部分トロンボプラスチン時間（APTT）延長を主効果とした抗血栓症効果を発現する。そして、そのAPTT延長効果はインキュベーションの影響を受けることなく確実にAPTTが延長されるものである。【００２５】
本願第２の発明は、さらに活性中心アミノ酸以外のアミノ酸が置換されたトロンビン誘導体である。このトロンビン誘導体は、血中に多量に存在するＦｂｇｎとの結合能を低下させることで抗血栓能が向上した誘導体である。Fbgnとの結合能が低下することで、ターゲットとなる血液凝固を促進するトロンビン基質に効率的に結合しその活性化を阻害することが出来る。
血液凝固を促進するトロンビン基質としてFV、FVIII、FXI、トロンビンレセプター（PAR１）及びPAR４等が挙げられる。さらには、より効率的に抗血栓能を向上するためにトロンビンレセプターまたはFVIIIをより特異的に阻害することがより好ましい。
即ちより好ましい本発明のトロンビン誘導体はFbgnとの結合能がトロンビンレセプターまたはＦＶＩＩＩとの結合能に比べ相対的に低く、より少ない投与量によって良好な抗血栓効果を得ることができるものである。さらに、この活性中心アミノ酸以外のさらなるアミノ酸の置換は、第１の発明のトロンビン誘導体が持つ抗血栓効果を喪失することなく、ＴＭとの結合能を特異的に低下させる。
さらに、第２の発明によれば、高いAPTT延長効果を持つが抗血小板効果は低いタイプのトロンビン誘導体や、高いAPTT延長効果と高い抗血小効果（但しPAR1阻害効果のみ）を有するタイプのトロンビン誘導体など、効果の発現態様が異なるトロンビン誘導体が得られる。
このような活性中心アミノ酸以外のアミノ酸としては、Ｂ鎖の２４番目のグルタミン、６５番目のリシン、および７７番目のリシンなどのエクソサイトI領域のアミノ酸、Ｂ鎖の９８番目のアルギニン、２４５番目のアルギニン、２４８番目のリジン、および２５２番目のリシンなどのエクソサイトII領域のアミノ酸、Ｂ鎖１９７番目アルギニン及びＢ鎖１９番目のフェニルアラニン等の両エクソサイトに属さない領域などが挙げられる。【００２６】
本願第３の発明は、第１の発明または第２の発明のトロンビン誘導体のカルボキシル基を、特許文献２（国際公開第０２／０７７０３１号パンフレット）に記載の方法によりカルボキシル基の修飾したトロンビン誘導体である。このトロンビン誘導体は、単にＡＰＴＴを延長するのみならず、アミノ酸の置換に依存して抗血小板効果、特にPAR1活性化およびリストセチン惹起血小板凝集抑制効果をも付加、制御し得る。具体的には、非常に強いAPTT延長効果と強い抗血小板効果とを有するトロンビン誘導体、中程度のAPTT延長効果と強い抗血小板効果とを有する誘導体などを得ることができる。すなわち、第３の発明によれば、種々の血栓症に適応しうる抗血液凝固効果、抗血小板効果を持ったトロンビン誘導体を得ることが可能となる。
以下、アミノ酸の置換の影響、意味合いを理解しやすくする為、活性中心アミノ酸の置換（第１の発明）、活性中心アミノ酸以外のアミノ酸の置換（第２の発明）、カルボキシル基の修飾（第３の発明）に分けて説明する。【００２７】
なお、本発明のトロンビン誘導体は、発明の効果を損なわない範囲であれば、B鎖（配列番号２のアミノ酸番号５０〜３０８）において、上記特定のアミノ酸に加えて、さらに、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されたアミノ酸配列を有するトロンビン誘導体であってもよい。なお、ここで数個とは、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個を意味する。また、本発明のトロンビン誘導体は、A鎖（配列番号２のアミノ酸番号１〜４９）においても、１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加されたアミノ酸配列を有するトロンビン誘導体であってもよい。ここで数個とは、２〜１０個、好ましくは２〜５個、より好ましくは２〜３個を意味する。
また、本発明のトロンビン誘導体は、０．１ＭのＮａＣｌを含むｐＨ７．４の５０ｍＭトリス塩酸中でトロンビン基質と３７℃で３時間反応させたときに分解される該トロンビン基質の割合が１０％以下であり、エクソサイトＩの構造が保持される限りにおいて、A鎖は配列番号２のアミノ酸番号１〜４９の配列、B鎖は配列番号２のアミノ酸番号５０〜３０８に対して、それぞれ一定以上の相同性を有する範囲で、上記アミノ酸以外の位置においてさらに、置換、欠失、挿入、付加等の改変がされたものであってもよい。ここで、一定以上の相同性とは、８０％以上、好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を意味する。【００２８】
本発明のトロンビン誘導体は、部位特異的変異導入法により各誘導体をコードするDNAを作製し、該DNAをベクターなどに組み込んで哺乳動物細胞などで発現させることによって得られる。このようなDNAは前述のようにA鎖及びB鎖の両方をコードするものであってもよいし、各鎖をそれぞれ発現させてもよい。部位特異的変異導入法は特に限定されるものではないが、例えば、市販のQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）などを用いて行っても良い。また、化学合成によってトロンビン誘導体を得ることもできる。【００２９】
３−１．＜活性中心アミノ酸の置換；以下、第１の発明とも呼ぶ＞
本発明のトロンビン誘導体は、トロンビンＢ鎖２０５番目のセリン（Ｂ鎖２０５；配列番号２の２５４番目のセリンに相当するセリン）、２０３番目のグリシン（Ｂ鎖２０３；配列番号２の２５２番目のグリシンに相当するグリシン）、４３番目のヒスチジン（Ｂ鎖４３；配列番号２の９２番目のヒスチジンに相当するヒスチジン）、９９番目のアスパラギン酸（Ｂ鎖９９；配列番号２の１４８番目のアスパラギン酸に相当するアスパラギン酸）から選ばれた１種以上のアミノ酸（活性中心アミノ酸）が置換されたトロンビン誘導体である。【００３０】
なお、本明細書中において、Ｂ鎖２０５、Ｂ鎖２０３等は、Ｂ鎖の１番目のアミノ酸（例えば、配列番号２のアミノ酸番号５０のイソロイシン）から数えたアミノ酸番号を示している。なお、上記のような置換アミノ酸の位置はアミノ酸の欠失、挿入、付加などによって位置が前後することがある。例えば、Ｎ末端部に１つのアミノ酸残基が挿入されれば本来２０５番目のセリン残基は２０６番目となるが、そのような２０５番目のセリン残基に相当するセリン残基も、本発明において２０５番目のセリン残基と呼ぶこととする。【００３１】
本発明のトロンビン誘導体が本発明の効果を発現するものであるためには、活性中心アミノ酸の置換後においても、置換前のトロンビンのエクソサイトＩの構造が維持されている必要がある。
トロンビンのエクソサイトＩは、多くの血栓形成作用、炎症作用を持ったトロンビン基質への結合に最も重要な役割を果たす必須の領域として報告されている（Journal of Biological Chemistry 1989Vol 264 8692-8698）。ヒルジンC末端ペプチドはこのエクソサイトＩに対し特異的に結合することが知られている（Journal of Biological Chemistry 1991 Vol 266 23633-23636）。特に、血小板活性化を通じて血栓形成に重要な働きを持つトロンビンレセプターは、ヒルジンC末端領域に高い相同性を持ちエクソサイトＩに強固に結合する事が報告されている。よってヒルジンC末端ペプチドに対する結合能を失っているものはエクソサイトＩの構造が破壊されトロンビンレセプターをはじめとする多くのトロンビン基質への結合能を失っているものと考えられる。したがって、本発明においては、エクソサイトＩの構造が維持されているか否かの第一段階のスクリーニングとしてヒルジンC末端ペプチド（例えば、配列番号３）に対する結合能が維持されているか否かによって判断する。【００３２】
ヒルジンC末端ペプチドとの結合能が維持されているか否かは、後述の実施例に示したように、ヒルジンC末端ペプチド固定化ゲルへのトロンビン誘導体の結合割合を測定することによって行うことができる。
本発明のトロンビン誘導体は、ヒルジンC末端ペプチドに対する結合能が保持されているものが好ましく、例えば、ヒルジンC末端ペプチド固定化ゲルと反応させたときに、反応系に加えた本発明のトロンビン誘導体の全量のうちの10％以上、好ましくは50％以上がヒルジンC末端ペプチド固定化ゲルに結合するものが好ましい。【００３３】
なお、トロンビン誘導体のヒルジンC末端ペプチド固定化ゲルへの結合割合の測定は、あくまでも活性中心アミノ酸の置換の前後においてエクソサイトＩの構造が維持されているか否かの確認のために行うものである。したがって、第２の発明において、さらに活性中心アミノ酸以外のアミノ酸の置換を行った場合には、エクソサイトＩの構造が維持されている場合であっても、その更なるアミノ酸の置換により、FVIII結合能を保持し、かつヒルジンC末端ペプチド固定化ゲルとの結合能が喪失、あるいは著しく低下している場合もあり得る。【００３４】
さらに、本発明のトロンビン誘導体は、活性中心アミノ酸の置換によって、ヘパリン結合能を喪失しないものが好ましい。活性中心アミノ酸の置換前のトロンビンのヘパリン結合能に対し、８０％以上のヘパリン結合能を保持しているものがより好ましい。トロンビンの立体構造において活性中心はへパリン結合部位（エクソサイトII）とは離れた領域に存在する。すなわち活性中心アミノ酸の置換によってへパリン結合能が喪失するということは、その活性中心アミノ酸の置換が、トロンビン分子全体の構造異常を引き起こし、それによって活性中心から離れた位置に存在するへパリン結合領域の構造が壊れたことを意味する。分子全体の構造異常はトロンビン基質への結合能の低下を意味する。【００３５】
本発明において、活性中心アミノ酸の置換は、好ましくはトロンビンＢ鎖の２０５番目のセリン、２０３番目のグリシン、９９番目のアスパラギン酸、および４３番目のヒスチジンから選ばれた２種以上のアミノ酸の置換であり、より好ましくは少なくとも２０５番目のセリンが置換されたものであり、特に好ましくは少なくとも２０５番目のセリンおよび４３番目のヒスチジンが置換されたものである。【００３６】
Ｂ鎖２０３番目のグリシンは、アラニン、セリン、スレオニンのいずれかに置換されていることが好ましい。９９のアスパラギン酸は、アスパラギンに置換されていることが好ましい。４３のヒスチジンは、アラニンまたはセリンまたはアスパラギンに置換されていることが好ましい。【００３７】
Ｂ鎖２０５番目のセリンは、アラニン、スレオニン、またはグリシンに置換されることが好ましく、その中でもアラニンへの置換が特に好ましい。その場合には、エクソサイトＩの構造が損なわれにくい。【００３８】
活性中心アミノ酸の置換が、２０５番目のセリンおよび４３番目のヒスチジンの置換である場合、２０５番目のセリンがアラニン、グリシンまたはスレオニンに、４３番目のヒスチジンがアラニン又はセリンに置換された誘導体であることが好ましく、２０５番目のセリンおよび４３番目のヒスチジンがいずれもアラニンに置換された誘導体が特に好ましい。【００３９】
以下、第１の発明における活性中心アミノ酸の置換について、具体例をもって説明する。
活性中心アミノ酸の置換が、トロンビンＢ鎖の２０５番目のセリン、２０３番目のグリシン、９９番目のアスパラギン酸、および４３番目のヒスチジンから選ばれた２種以上のアミノ酸の置換である場合、置換を受ける２種以上のアミノ酸（置換部位）の組合せ、さらには、置換相手となるアミノ酸の種類により、トロンビン基質結合能や抗血栓効果に違いが出ることがある。一例として、下記トロンビン誘導体１〜７を挙げて説明する。【００４０】
【表１】
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【００４１】
トロンビン誘導体１：置換部位がＢ鎖２０５番目のセリンと９９番目のアスパラギン酸であり、セリンをアラニンに置換し、アスパラギン酸をアスパラギンに置換したトロンビン誘導体（配列番号２２のアミノ酸番号４４〜３５１の配列）。
トロンビン誘導体２：置換部位がＢ鎖２０５番目のセリンと４３番目のヒスチジンであり、セリンをアラニンに置換し、ヒスチジンをアラニンに置換したトロンビン誘導体（配列番号２６のアミノ酸番号４４〜３５１の配列）。
トロンビン誘導体３：置換部位がＢ鎖２０５番目のセリンと２０３番目のグリシンであり、セリンをグリシンに置換し、グリシンをアラニンに置換したトロンビン誘導体（配列番号８のアミノ酸番号４４〜３５１の配列）。
トロンビン誘導体４：置換部位がＢ鎖２０５番目のセリンと２０３番目のグリシンであり、セリンおよびグリシンをアラニンに置換したトロンビン誘導体（配列番号２４のアミノ酸番号４４〜３５１の配列）。
トロンビン誘導体５：置換部位がＢ鎖２０５番目のセリン、２０３番目のグリシン、および９９番目のアスパラギン酸であり、セリンおよびグリシンをアラニンに置換し、アスパラギン酸をアスパラギンに置換したトロンビン誘導体（配列番号１４のアミノ酸番号４４〜３５１の配列）。
トロンビン誘導体６：置換部位がＢ鎖２０５番目のセリン、４３番目のヒスチジンであり、セリンをグリシンに置換し、ヒスチジンをアラニンに置換したトロンビン誘導体（配列番号３４のアミノ酸番号４４〜３５１の配列）。
トロンビン誘導体７：置換部位がＢ鎖２０５番目のセリン、４３番目のヒスチジンであり、セリンをアラニンに置換し、ヒスチジンをセリンに置換したトロンビン誘導体（配列番号３６のアミノ酸番号４４〜３５１の配列）。【００４２】
トロンビン誘導体１〜７は何れも、ヒルジンＣ末端ペプチド固定化ゲルへの結合能を保持していたが、トロンビン誘導体４および５は、ヒト野生型トロンビンに比べ、ヘパリンゲルへの結合能が低下していた。【００４３】
トロンビン誘導体１〜７は何れもAPTT延長を主とした抗血栓効果を有するものであり、その効果の序列は下記の通りであった。
トロンビン誘導体２≧トロンビン誘導体６、７＞トロンビン誘導体１、３＞＞トロンビン誘導体４、５【００４４】
トロンビン誘導体２，６，７は、後述のカルボキシル基修飾の有無に関わらず非常に高い抗血栓効果がみられた。また、トロンビン誘導体２にみられる抗血栓効果は、凝固カスケードに対し特異的に作用するものであり、特にAPTTを良く延長した。さらに、トロンビン誘導体２のカルボキシル基を修飾したトロンビン誘導体は抗血小板能が付与あるいは増強され、凝固カスケード抑制、血小板凝集抑制、および血小板粘着抑制作用を有していた。【００４５】
トロンビン誘導体２および４は、共に２０５番目のセリンをアラニンに置換したものであるが、前述のようにその抗血栓効果には大きな違いが見られた。トロンビン誘導体３および４も、共に２０３番目のグリシンをアラニンに置換したものであるが、やはりその抗血栓効果には前述のような違いが見られた。【００４６】
トロンビン誘導体１、３はそのままではそれほど強い抗血栓効果は示さないものの、そのカルボキシル基を後述のように修飾することにより、その基質特異性を変化させるか、または活性中心アミノ酸以外のアミノ酸（例えばB鎖７７番目のリシン）を置換し、Ｆｂｇｎへの結合能を特異的に低下させ、相対的にＦＶＩＩＩに対する特異性を向上させる事により、強いAPTT延長効果、血小板凝集抑制効果の一方または両方を示すようになる。具体的には、カルボキシル基の修飾の場合はAPTT延長と抗血小板効果（凝集と粘着）が得られ、B鎖７７番目のアミノ酸置換の場合はAPTT延長効果のみ有するトロンビン誘導体が得られる。【００４７】
一方、トロンビン誘導体４、５においては、カルボキシル基の修飾を行った場合でも、またB鎖７７番目のアミノ酸を置換した場合であっても抗血栓効果は弱かった。トロンビン誘導体６、７はトロンビン誘導体２に近い抗血栓効果を示した。【００４８】
本発明、公知技術を問わず、トロンビンB鎖２０５番目のセリン、２０３番目のグリシン、９９番目のアスパラギン酸、および４３番目のヒスチジンのいずれかを置換して得られるトロンビン誘導体は、以下のように分類される。
A．２０５番目のセリンおよび４３番目のヒスチジンを置換することによって得られるトロンビン誘導体のように、カルボキシル基の修飾および／またはＦｂｇｎへの結合能を低下させるための活性中心アミノ酸以外のアミノ酸の置換を行わずとも、強いAPTT延長効果を主とした抗血栓効果を有するトロンビン誘導体。
B．２０３番目のグリシン、９９番目のアスパラギン酸から選ばれた１種と、２０５番目のセリンを置換することによって得られるトロンビン誘導体のように、そのままではそれほど強い抗血栓効果を示さないが、カルボキシル基の修飾および／またはＦｂｇｎへの結合能を低下させるための活性中心アミノ酸以外のアミノ酸の置換によって高い抗血栓効果を示すトロンビン誘導体。
C．トロンビン基質分解活性は喪失しているものの、カルボキシル基の修飾および／またはＦｂｇｎ結合能を低下させるアミノ酸の置換によっても高い抗血栓効果を示さないトロンビン誘導体。
D．抗血栓効果を示すものの、残存活性を有しているため、抗血栓剤としては使用できないトロンビン誘導体。【００４９】
Aのグループに関してＦｂｇｎ、FVIIIに対する結合能を確認したところ、いずれもＦVＩＩＩ結合能が向上していることが分かった。よって高いAPTT延長効果は、活性中心アミノ酸の置換の組み合わせによってトロンビン基質分解活性が喪失されるとともに、ＦVＩＩＩ結合能が相対的、特異的に向上（Ｆｂｇｎが相対的に低下）したことに起因すると考えられる。それらのトロンビン誘導体は、カルボキシル基の修飾無しに、そのＦｂｇｎ結合能の低下により弱い抗血小板効果も確認された。また、その効果はPAR1活性化抑制効果であり、リストセチン惹起血小板凝集抑制効果を伴わないものであった。【００５０】
活性中心アミノ酸の置換によるＦＶＩＩＩ結合能の相対的、特異的な向上の程度は、前述のとおり具体的な置換の組合せにより決定されるものである。基本的に血液凝固反応を促進するトロンビン基質に対し結合能を保持しつつ、Fbgn結合能を低下させることにより本発明のトロンビン誘導体の抗血栓能は向上する。さらに得られるトロンビン誘導体のFVIII結合能（VIIIA）とFｂｇｎ結合能（FA）との比VIIIA／FAが、AHTのFVIII結合能（VIIIａ）とAHTのFｂｇｎ結合能（Fａ）との比VIIIａ／Fａの、１．１倍以上であれば、高い抗血栓効果が得られ、１．２倍以上であれば、非常に高い抗血栓効果が得られる。
上記活性中心アミノ酸が置換されたトロンビン誘導体は、FVIII結合能がアンヒドロトロンビンに対して１０％以上保持されたもの好ましく、80％以上保持されたものがよりこのましい。
上記活性中心アミノ酸が置換されたトロンビン誘導体は、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）がアンヒドロトロンビン（ＡＨＴ）の１．１倍以上である誘導体が好ましい。
また、活性中心アミノ酸の置換の組み合わせにおいて、Ｆｂｇｎ結合能、FVIII結合能等の相対的、特異的な変化以外に、FVIIIに対する結合能そのものにも違いが起こる。前述のトロンビン誘導体２、６、７はAHT同等の高いFVIII結合能を示した。一方、その他のトロンビン誘導体においてはFVIII結合能そのものも低下していた。すなわちAのグループはFVIIIに対し高い結合能を有し、かつＦｂｇｎに対するFVIII結合能の比が高まった２重の効果により高い抗血栓効果を有する。
本発明のトロンビン誘導体は、活性中心アミノ酸のアミノ酸の置換によってFbgn結合能が１０％以上低下し、それによりAPTT延長効果が１．１倍以上増加したものがさらに好ましい。【００５１】
トロンビンの活性中心部位と、ヒルジンC末端ペプチド、へパリンの結合部位であるエクソサイトＩ、およびエクソサイトIIは、立体構造上距離が離れている。このようなトロンビンの立体構造を勘案すると、例示した活性中心アミノ酸の置換の組み合わせによりへパリン結合能が低下したトロンビン誘導体、および活性中心アミノ酸の置換によってヒルジンC末端ペプチド固定化ゲルへの結合能が低下したトロンビン誘導体は、活性中心アミノ酸の無理な（構造上負荷のかかる）置換によって分子全体のフォールディング異常、構造に異常が起こり、ひいてはエクソサイトＩ構造やエクソサイトII構造にも異常が起こったと考えられる。そのため、トロンビン基質結合能の低下が起こり抗血栓効果の低下が起こったと推測される。【００５２】
３−２．＜活性中心アミノ酸以外のアミノ酸の置換；以下、第２の発明とも呼ぶ＞
第１の発明の抗血栓効果をさらに向上させる目的で、活性中心アミノ酸以外のアミノ酸、特にエクソサイトＩおよび／またはエクソサイトII領域上のアミノ酸のさらなる置換を行ったトロンビン誘導体の説明を以下に行う。この活性中心アミノ酸以外のアミノ酸の置換によってヒルジンＣ末端ペプチド固定化ゲルやへパリンへの結合能が低下する場合もあるが、これはこれらの領域アミノ酸の直接的な置換の結果であり、活性中心のアミノ酸の置換での蛋白全体の構造異常に基づく結合能の低下とは異なるものである。【００５３】
本願第２の発明のトロンビン誘導体は、血中に多量に存在するＦｂｇｎとの結合能を低下させることでさらに抗血栓能を向上させた誘導体である。
Fbgnとの結合能が低下することで、ターゲットとなる血液凝固を促進するトロンビン基質に効率的に結合しその活性化を阻害することが出来る。
血液凝固を促進するトロンビン基質としてFV、FVIII、FXI、トロンビンレセプター（PAR１）及びPAR４等が挙げられる。さらには、より効率的に抗血栓能を向上するためにトロンビンレセプターまたはFVIIIをより特異的に阻害することがより好ましい。
即ち本発明のトロンビン誘導体はFbgnとの結合性がトロンビンレセプターまたはＦＶＩＩＩとの結合能に比べ相対的に低く、より少ない投与量によって良好な抗血栓効果を得ることができるものである。さらに、第２の発明であれば、第１の発明のトロンビン誘導体が持つ抗血栓効果を著しく損なうことなく、ＴＭとの結合能を特異的に低下させることができる。このように本発明においては、ＴＭ結合能を選択的に低下させることで、本発明のトロンビン誘導体が生体内に投与された場合であっても、ＴＭと結合しトロンビンのプロテインC活性化を抑制することはない。
TMは基質ではないためトロンビンの活性中心とは相互作用しない、この為、第１の発明によってTM結合能を特異的に低下させることは困難である。また  第１の発明によって高めた抗血栓能にさらに第２の発明を加えることにより、さらに抗血栓効果を高める、基質特異性を持たせる等の特徴づけすることが出来る。【００５４】
第２の発明のトロンビン誘導体は、Ｆｂｇｎとの結合能が低下しているものであることが好ましい。さらにはトロンビンレセプターやＦＶＩＩＩとの結合能に比べ相対的に低いものであることがより好ましい。具体的には、FVIII結合能（VIIIA）とFｂｇｎ結合能（FA）との比VIIIA／FAが、活性中心アミノ酸以外のアミノ酸が置換される以前のトロンビン誘導体のFVIII結合能（VIIIａ）とFｂｇｎ結合能（Fａ）との比VIIIａ／Fａの１．１倍以上であることが好ましく、１．５倍以上であることがより好ましい。【００５５】
さらに、第２の発明のトロンビン誘導体は、ＴＭとの結合能が特異的に低下したものであることが好ましい。具体的には、FVIII結合能（VIIIA）とＴＭ結合能（ＴＭA）との比VIIIA／ＴＭAが、活性中心アミノ酸以外のアミノ酸が置換される以前のトロンビン誘導体のFVIII結合能（VIIIａ）とＴＭ結合能（ＴＭａ）との比VIIIａ／ＴＭａの１．１倍以上であることが好ましく、１．５倍以上であることがさらに好ましい。【００５６】
さらに、第２の発明によれば、高いAPTT延長効果を持つが抗血小板効果は低いタイプのトロンビン誘導体や、高いAPTT延長効果と高い抗血小効果（但しPAR1阻害効果のみ）を有するタイプのトロンビン誘導体など、効果の発現態様が異なるトロンビン誘導体が得られる。【００５７】
活性中心以外のアミノ酸の置換は、前述の効果が得られるのであれば特に限定されるものではないが、具体的にはエクソサイトＩやエクソサイトII領域上のアミノ酸の置換及びその他のトロンビン誘導体上におけるフィブリノゲン、ＴＭとの相互作用領域をあげることができる。
トロンビンのエクソサイトＩ領域とは、ヒルジンのC末端領域と特異的に相互作用する塩基性に富むアミノ酸領域として知られ、Ｆｂｇｎ、トロンビンレセプター、TM等と相互作用する重要な領域として知られる（E. Di Cera  Thrombin Interactions  Chest, 2003; 124(90030): 11-17）。本発明においては、そのうちの塩基性アミノ酸から選ばれた１種以上が置換されていることが好ましく、より好ましくは、トロンビンＢ鎖の２４番目のグルタミン（Ｂ鎖２４；配列番号２の７３番目のグルタミン）、６５番目のリシン、および７７番目のリシン（Ｂ鎖７７；配列番号２の１２６番目のリシンに相当するリシン）から選ばれた１種以上が置換されることである。７７番目のリシン、２４番目のグルタミン、番目の６５リシンを置換するアミノ酸は特に限定されるものではないが、アラニン、セリン、スレオニン、グルタミン酸またはグルタミンであることが好ましい。【００５８】
エクソサイトII領域とは、主にへパリンと相互作用する塩基性に富むアミノ酸領域として知られる。（E. Di Cera  Thrombin Interactions  Chest, 2003; 124(90030): 11-17）本発明においては、そのうちの塩基性アミノ酸から選ばれた１種以上が置換されていることが好ましく、より好ましくは、トロンビンＢ鎖の９８番目のアルギニン（配列番号２の１４７番目のアルギニンに相当するアルギニン）、２４５番目のアルギニン（配列番号２の２９４番目のアルギニンに相当するアルギニン）、２４８番目のリシン（配列番号２の２９７番目のリシンに相当するリシン）、および２５２番目のリシン（配列番号２の３０１番目のリシンに相当するリシン）から選ばれた１種以上が置換されることである。９８番目のアルギニン、２４５番目のアルギニン、２４８番目のリシン、２５２番目のリシンを置換するアミノ酸はアラニン等が挙げられるが、目的の誘導体が得られる限り特に限定されるものではない。【００５９】
へパリン結合能の低下に関して、そのへパリン結合能の低下がへパリン結合領域（エクソサイトII等）以外の領域、例えば活性中心アミノ酸の置換によって引き起こされる場合、その置換によってトロンビン誘導体全体の分子構造、ひいてはエクソサイトIIの立体構造に歪み等の悪影響が与えられ、へパリン結合能が低下したと推察される。
一方、実際に生体内に投与する場合、活性中心アミノ酸を本発明で開示されるような最適な組み合わせで置換した上で、目的に応じ、活性中心アミノ酸以外のアミノ酸として、積極的にエクソサイトIIに位置するアミノ酸、例えばB鎖９８番目のアルギニン、B鎖２４５番目アルギニン、B鎖２４８番目リジンをアラニン等の他のアミノ酸に置換することによってヘパリン結合能を低下させたトロンビン誘導体を得ることも可能である。へパリン結合能を低下させた誘導体を用いることで血管内皮細胞上のへパラン硫酸等への結合能が低下し血中循環量の向上が期待される。
このような、活性中心アミノ酸に加えてエクソサイトII領域にアミノ酸置換が導入されたトロンビン誘導体は、ヘパリンゲルへの結合能が、エクソサイトII領域アミノ酸が置換される前のトロンビンの９０％以下であることが好ましい。
このようなトロンビン誘導体としては、２０５番目のセリン、４３番目のヒスチジン及び６５番目のリシンをアラニンに置換し、さらに、２４５番目のアルギニンをアラニンに置換したトロンビン誘導体（配列番号５４のアミノ酸番号４４〜３５１の配列）、２０５番目のセリン、４３番目のヒスチジン及び６５番目のリシンをアラニンに置換し、さらに、２４８番目のリシンをアラニンに置換したトロンビン誘導体（配列番号５６のアミノ酸番号４４〜３５１の配列）などが挙げられる。これらの誘導体は、APTT延長効果を有し且つエクソサイトII上のアミノ酸の置換によってヘパリン親和性がヒト野生型トロンビンに比較し低下している。【００６０】
また、ＷＯ２００２／００４００８、ＷＯ２００２／００７７４８には、トロンビンがＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ（トロンビンB鎖の１９７から２００位：配列番号２の246〜249に相当する領域）の領域を通じ、PARへの水解非依存的に種々の細胞に対し増殖的なシグナルを入れる事、及びＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａの全てがこのシグナル経路に必須であることが記載されている。本発明で得られる誘導体においては、細胞増殖シグナルは不必要であるため、その他のアミノ酸としてＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ配列のいずれかのアミノ酸を置換してもよい。たとえば、実験例２５記載のＢ鎖１９７アルギニン（配列番号２の246番目のアルギニンに相当するアルギニン）、２０５セリン及び４３ヒスチジンをそれぞれアラニンに置換した誘導体（配列番号４８のアミノ酸番号４４〜３５１の配列）は、２０５セリン及び４３ヒスチジンをそれぞれアラニンに置換した誘導体に比較し高いAPTT延長能を有していた。本誘導体はＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ配列に起因した細胞シグナル能を欠失している事が予測される。
また、Ｂ鎖１９番目のフェニルアラニン（配列番号２の68番目のフェニルアラニンに相当するフェニルアラニン）を置換してもよい。このようなトロンビン誘導体としては、２０５番目のセリン、４３番目のヒスチジン及び１９番目のフェニルアラニンをアラニンに置換したトロンビン誘導体（配列番号５８のアミノ酸番号４４〜３５１の配列）があげられる。【００６１】
本件第2の発明のトロンビン誘導体は、活性中心以外のアミノ酸の置換により、活性化部分トロンボプラスチン時間が１．５倍以上に延長され、且つトロンボモジュリン結合能が５０％以下に低下したものがさらに好ましい。
本件第2の発明のトロンビン誘導体は、APTT延長効果、修飾トロンビン惹起血小板凝集抑制効果、リストセチン惹起血小板凝集抑制効果のうち少なくともいずれか一種以上の抗血栓効果が向上している誘導体がさらに好ましい。【００６２】
以下、第２の発明における活性中心アミノ酸以外のアミノ酸の置換について、具体例をもって説明する。
具体例１：第１の発明の具体的説明に際して例示したトロンビン誘導体３（２０３番目のグリシンをアラニンに、２０５番目のセリンをグリシンに置換したトロンビン誘導体）のAPTT延長効果は高いものではなかった。これに対し、トロンビン誘導体３で行われた活性中心アミノ酸の置換のほかに、７７番目のリシンのグルタミン酸への置換を行ったトロンビン誘導体（配列番号２８のアミノ酸番号４４〜３５１の配列）は、Fbgn結合能が低下する、さらには、ＦＶＩＩＩ結合能がＦｂｇｎ結合能に対し相対的に向上し、高いAPTT延長効果を示す。【００６３】
具体例２：第１の発明の具体的説明に際して例示したトロンビン誘導体２（２０５番目のセリンをアラニンに、４３番目のヒスチジンをアラニンに置換したトロンビン誘導体）は、高いAPTT延長効果を示した。トロンビン誘導体２で行われた活性中心アミノ酸の置換のほかに、７７番目のリシンのグルタミン酸、アラニン又はセリンへの置換を行ったトロンビン誘導体（配列番号３８、４４又は５０のアミノ酸番号４４〜３５１の配列）は、さらに強いAPTT延長抑制効果を示す。すなわち活性中心アミノ酸の置換によるトロンビン基質への結合特異性の変化と、さらに活性中心アミノ酸以外のアミノ酸の置換によるトロンビン基質への結合特異性の変化とが相乗効果となって薬効の強さに影響したものと思われる。【００６４】
具体例３：トロンビン誘導体２で行われた活性中心アミノ酸の置換のほかに、２４番目のグルタミンをグルタミン酸に置換したトロンビン誘導体（配列番号４０のアミノ酸番号４４〜３５１の配列）は、APTT延長効果を有し、且つTM結合能が著しく低下した。【００６５】
具体例４：トロンビン誘導体２で行われた活性中心アミノ酸の置換のほかに、６５番目のリシンをアラニンに置換した誘導体（配列番号４６のアミノ酸番号４４〜３５１の配列）は、APTT延長効果が増幅し、更にＴＭ結合能が低下するという二重の効果がみられた。エクソサイトI上の６５番目リシンをアラニンに置換することで、ヒルジンゲルへの結合能の若干の低下が認められたが、FVIII結合能は保持され且つFbgnに対するFVIII特異性は向上した。【００６６】
具体例５：トロンビン誘導体２で行われた活性中心アミノ酸の置換のほかに、６５番目のリシン及び７７番目のリシンをアラニンに置換した誘導体（配列番号５２のアミノ酸番号４４〜３５１の配列）は、2ヶ所のアミノ酸の置換による相乗効果が非常に高いAPTT延長効果がみられた。【００６７】
具体例６：トロンビン誘導体２で行われた活性中心アミノ酸の置換のほかに、６５番目のリシン及び２４５番目のアルギニンをアラニンに置換した誘導体（配列番号５４のアミノ酸番号４４〜３５１の配列）は抗血栓能を有しつつヘパリン結合能の低下が見られた。
このように活性中心アミノ酸の置換に加え、それ以外のアミノ酸、特に、エクソサイトＩ領域やエクソサイトII領域のアミノ酸を置換することで種々の特徴を有するトロンビン誘導体が得られる。【００６８】
３−３．カルボキシル基の修飾  ＜第３の発明＞
本件第１及び第２の発明のトロンビン誘導体のカルボキシル基を、特許文献２（国際公開第０２／０７７０３１号パンフレット）に記載の方法によりカルボキシル基を修飾すれば、Ｆｂｇｎに対する結合能が低下し、トロンビンレセプターなどのトロンビン基質に対する選択性が増すことから、より少量で抗血栓効果を達成することができる。
また、単にＡＰＴＴを延長するのみならず、アミノ酸の置換に依存して抗血小板効果、特にPAR1活性化及びリストセチン惹起血小板凝集抑制効果（GPIｂαとｖWFの相互作用による）をも付加、制御し得る。具体的には、非常に強いAPTT延長効果と強い抗血小板効果とを有するトロンビン誘導体、中程度のAPTT延長効果と強い抗血小板効果とを有する誘導体などを得ることができる。すなわち、本発明のトロンビン誘導体のカルボキシル基をカルボキシル基の修飾することにより、種々の血栓症に適応しうる抗血液凝固効果、抗血小板効果を持ったトロンビン誘導体を得ることが可能となる。【００６９】
本発明のトロンビン誘導体のカルボキシル基を、特許文献２（国際公開第０２／０７７０３１号パンフレット）に記載の方法によりカルボキシル基の修飾する場合、カルボキシル基の修飾はカルボジイミドを用いて行うことが好ましい。【００７０】
本発明のトロンビン誘導体のカルボキシル基はアミノ基を有する化合物によって修飾することができる。アミノ基を有する化合物は特に制限されないが、アミノ酸のエステル、側鎖にアミノ基を有するポリエチレングリコールなどが好ましい。アミノ酸のエステルとしてはグリシンエチルエステルなどが挙げられる。アミノ基を有する化合物を用いる修飾も国際公開０２／０７７０３１号パンフレットに記載の方法に基づいて行うことができる。一方、本発明のトロンビン誘導体をポリエチレングリコールと反応させることによって、そのカルボキシル基を修飾してもよい。なお、ポリエチレングリコールまたはアミノ基を有するポリエチレングリコールを用いる場合、ポリエチレングリコール部分の分子量は１０００以下であることが好ましい。【００７１】
なお、カルボキシル基の修飾を行う場合、その効果はその修飾個数によっても影響を受ける。  下記修飾体１から５に記載される効果を得るためには、３箇所以上のカルボキシル基が修飾される事が望ましい。修飾されるカルボキシル基の数が３以上であれば、カルボキシル基の修飾によって付加される効果が明確に得られる。また、修飾されるカルボキシル基は２５箇所以下であることが望ましい。修飾されるカルボキシル基の数が２５以下であれば、同様にカルボキシル基の修飾によって付加される効果が明確に得られると共に  修飾による回収率の低下が起き難い。但しトロンビン誘導体表面のアミノ酸置換によってカルボキシル基を導入、削除して得られるトロンビン誘導体に関しては、その置換によるカルボキシル基の増加、減少は含まれない。
さらに修飾個数によって多様な効果を持った誘導体が得られる。例えば後述の修飾体１の修飾箇所を８または５箇所に減らすことで、非常に高いAPTT延長効果と中から低度の抗血小板効果を持った誘導体が得られる。【００７２】
本発明においては、カルボキシル基を修飾する場合、少なくともB鎖２５番目のグルタミン酸のカルボキシル基が修飾されたものであることが好ましい。本発明のカルボキシル基が修飾されたトロンビン誘導体は、血小板のリストセチン凝集抑制能が向上したトロンビン誘導体及び／または血小板のGPIｂα拮抗能を有するトロンビン誘導体であることが好ましい。【００７３】
抗血栓効果を高めるために活性中心アミノ酸以外のアミノ酸の置換を行った場合に得られる効果、および、カルボキシル基の修飾を行った場合に得られる効果は、置換するアミノ酸の組み合わせなどによって大きく異なる。疾患及び病態などに応じて、また目的に応じてアミノ酸置換のみを導入したトロンビン誘導体、およびそれにカルボキシル基の修飾を組み合わせたトロンビン誘導体を用いることができる。
即ち、深部静脈血栓症等の静脈における血栓症においては、血液凝固を抑制する薬が一般に用いられるため、各トロンビン誘導体及びそのカルボキシル基修飾体の中から高いAPTT延長効果を持つトロンビン誘導体を用いることが望ましい。
一方、心筋梗塞、不安定狭心症等の動脈系の血栓症においては血小板凝集を抑制する薬が一般に用いられるため、高い血小板凝集抑制効果を持ったトロンビン誘導体が望まれる。その中よりAPTT延長効果の異なるトロンビン誘導体は出血など副作用の状況等に応じて選択がなされるべきである。
また、粥状硬化部位におけるプラ−クの破錠にともなう、血栓症においては血小板と共に凝固系の抑制も重要であることが報告されており（血栓症、南江堂）血小板、凝固双方の抑制が効果的である。このような凝固、血小板両方に作用する薬剤は現在市販されておらず、本発明は全く新たな治療剤を提供しうる。【００７４】
以下に、活性中心アミノ酸の置換および活性中心アミノ酸以外のアミノ酸の置換と、カルボキシル基修飾との関係について具体例を挙げて説明する。以下の具体例は水溶性カルボジイミドを縮合剤として用い、且つ修飾をグリシンエチルエステルによって行い約15個のカルボキシル基が修飾された誘導体である。
修飾体１：２０５番目のセリンをアラニンに、かつ４３番目のヒスチジンをアラニンに置換したトロンビン誘導体は、カルボキシル基の修飾を行わずとも、非常に高いAPTT延長効果を有している。このトロンビン誘導体にカルボキシル基修飾を行ったトロンビン誘導体は、カルボキシル基の修飾によりAPTT延長効果がある程度増幅するのみならず、血小板に対するリストセチン惹起血小板凝集抑制効果、M−トロンビン惹起血小板凝集抑制効果が高く、抗血液凝固、抗血小板能共に非常に高い効果を示す。【００７５】
修飾体２：２０５番目のセリンをグリシンに、２０３番目のグリシンをアラニンに置換した誘導体は、カルボキシル基の修飾前には  APTT延長効果、抗血小板効果は高くないものであるが、カルボキシル基の修飾を行うことで、APTT延長効果、抗血栓効果が高まり中程度のAPTT抑制効果と高い抗血小板効果を持ち合わせたトロンビン誘導体となる。【００７６】
修飾体３：２０５番目のセリンをアラニンに、２０３番目のグリシンをアラニンに置換したトロンビン誘導体は、APTT延長効果は高くなかった。このトロンビン誘導体のカルボキシル基を修飾してもAPTT延長効果の増幅は顕著には見られなかった。【００７７】
修飾体４：２０５番目のセリンをグリシンに、２０３番目のグリシンをアラニンに、７７番目のリシンをグルタミン酸に置換したトロンビン誘導体は、APTT延長効果を持つが、抗血小板効果は非常に弱いものである。このトロンビン誘導体のカルボキシル基修飾を行った場合には、APTT延長効果のさらなる増加は殆ど見られないが、抗血小板効果は顕著に増幅された。ただし、カルボキシル基の修飾により、その回収率は５０％以下と著しく低下した。【００７８】
修飾体５：２０５番目のセリンをアラニンに置換した誘導体は、比較的弱いAPTT延長効果を持つが抗血小板効果は非常に弱いものであった。このトロンビン誘導体にカルボキシル基修飾を行った場合には、APTT延長効果の大幅な増幅は見られないが、抗血小板効果は（PAR1及びリストセチン両方の経路に対し）顕著に増幅された。【００７９】
修飾体６：２０５番目のセリンをアラニンに、４３番目のヒスチジンをアラニンに、６５番目のリシンをアラニンに置換した誘導体は、強いAPTT延長効果と共に強いPAR1経路の血小板凝集抑制効果を有している。一方、リストセチン惹起血小板凝集抑制効果は有していなかった。このトロンビン誘導体にカルボキシル基修飾を行った場合は、APTT延長効果が若干増強し、M-トロンビン惹起血小板凝集効果も若干増強し、リストセチン惹起血小板凝集抑制効果が新たに付与された。また、修飾体４にみられた回収率の大きな低下はおきなかった。【００８０】
なお、GPIｂαのみ抑制する誘導体の場合は活性中心が閉塞する事によってトロンビン基質分解活性及びトロンビン基質結合能が低下したPPACK-トロンビン（Phe-Pro-Arg配列がクロロメチルケトン修飾されたもの）を修飾したトロンビン誘導体を用いることが出来る。但しその場合もＴＭに対し結合能を低下させる本明細書記載のアミノ酸の置換を施すことによりより有効な効果を発揮する。【００８１】
本発明の各種トロンビン誘導体は、目的によって使い分ける事が可能である。例えば、前出のトロンビン誘導体２は、静脈内におけるフィブリン血栓（赤色血栓）に対し効果的であることが予測され、トロンビン誘導体２のカルボキシル基修飾体は、動脈内の血小板血栓（白色血栓）に対しても効果的である事が予想される。
あるいはカルボキシル基の修飾を行わない前述の２０５番目のセリンがアラニンに、４３番目のヒスチジンがアラニンに、かつ７７番目のリシンがグルタミン酸に置換されたトロンビン誘導体も静脈内血栓に対しては有効と考えられる。
又、動脈内での血小板血栓においてもその疾患において出血が問題になる場合には、トロンビン誘導体２のカルボキシル基修飾体よりも、APTT延長効果の低いトロンビン誘導体３のカルボキシル基修飾体の方が望ましい。これらは疾患の患者に対するリスクと出血のリスクを考慮して選択することができる。【００８２】
４．本発明の用途、ほか
本発明はまた、上述のトロンビン誘導体をコードするＤＮＡを提供する。このようなＤＮＡとしては、例えば、配列番号７、１３、２１、２３、２５、２７、３３、３５、３７または３９の塩基番号１３０〜１０５６の塩基配列を含むトロンビン誘導体前駆体をコードするＤＮＡなどを例示することができる。これらのDNAはコードするアミノ酸配列が変化しないようにコドンを変化させたものでもよい。さらに、上述のような特定のアミノ酸が置換され、目的の活性を有するトロンビン誘導体をコードする限りにおいて、配列番号７、１３、２１、２３、２５、２７、３３、３５、３７または３９の塩基番号１３０〜１０５６の塩基配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするものであってもよい。ここで、ストリンジェントな条件としては、例えば、通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC, 0.1%SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC, 0.1%SDS、特に好ましくは65℃、0.1×SSC, 0.1%SDSに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
なお、本発明のＤＮＡはトロンビン誘導体前駆体をコードするものに限定されず、Ａ鎖をコードするＤＮＡとＢ鎖をコードするＤＮＡを別々に用意したような場合でも本発明のＤＮＡに含まれる。【００８３】
本発明のトロンビン誘導体は抗血栓効果を有している。この作用は、例えば、実施例に示すような血漿のAPTT測定や全血凝固時間測定、血小板凝集能抑制効果によって確認することができる。なお、本発明では、抗血小板効果確認の中でＭ−トロンビン惹起血小板凝集抑制効果を用いて評価している。
Ｍ−トロンビンがPRP（多血小板血漿：platelet rich plasma）中において血小板凝集を惹起すること、及びその血小板凝集惹起は抗PAR1抗体（ATAP2  コスモバイオ社）によって完全に阻害されることから、Ｍ−トロンビンはトロンビンレセプター（PAR1）を介して血小板を活性化すると考えられる。したがって、本発明で得られる誘導体のＭ−トロンビン惹起血小板凝集を阻害する効果はトロンビンレセプター活性化阻害効果に基づくと考えられる。【００８４】
本発明のトロンビン誘導体は、上記置換に加えて、さらに、ナトリウム結合部位が置換されたトロンビン誘導体であってもよい。ナトリウム結合部位とはBiochemistry 1992年,31巻,p11721-11730に開示された部位をいう。この中ではＢ鎖２３２又はＢ鎖２３４のアスパラギン酸（配列番号２の２８１又は２８３番目のアスパラギン酸に相当するアスパラギン酸）が好ましい。これらのアスパラギン酸は両方が置換されてもよい。また、これらのアスパラギン酸は、アラニンもしくはアスパラギンに置換されることが好ましい。【００８５】
本発明のトロンビン誘導体を製剤学的に許容される製剤担体と組み合わせることにより、医薬組成物として使用することができる。ここで、医薬組成物として好ましくは、抗血栓治療薬、抗炎症剤、血小板凝集抑制剤、血小板粘着抑制剤、血小板GPIｂ拮抗剤、トロンビンレセプター活性化抑制剤などを挙げることができる。上記製剤担体は製剤学的に許容されるものであれば特に制限されないが、通常の薬剤に汎用される注射剤用溶剤、安定剤、希釈剤、界面活性剤等を使用できる。本発明の医薬組成物の投与単位形態は特に限定されず、治療目的に応じて適宜選択できる。例えば、注射剤等を例示できる。本発明の医薬組成物の投与量は、症状などに応じて適宜選択される。
【実施例】
【００８６】
以下実験例を用いて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はその趣旨を超えない限り、この実験例の範囲には限定されない。【００８７】
＜１＞トロンビン基質分解活性の測定
方法Ａ：合成基質Ｓ２２３８（シグマ社）を基質とし、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８）、３７℃における４０５ｎｍの吸光度の増加による測定を行った。
被験サンプル（ヒト野生型トロンビンまたはトロンビン誘導体）の５０ｍＭ  トリス塩酸  0.1M NaCl溶液（pH7.4）、ヒト野生型トロンビンの場合の濃度は１μｇ/ml、トロンビン誘導体の場合の濃度は２００μg/ml）と、合成基質Ｓ２２３８の５０ｍＭ  トリス塩酸  0.1M NaCl溶液（pH7.4）を、２００μｌずつエッペンチューブに加え、37℃、１２時間インキュベーションした。反応停止は50％酢酸  ２００μlを添加して行った。
なお、合成基質Ｓ２２３８の５０ｍＭ  トリス塩酸  0.1M NaCl溶液（pH7.4）と、５０ｍＭ  トリス塩酸  0.1M NaCl（pH7.4）を、２００μｌずつエッペンチューブに加え、37℃、１２時間インキュベーションしたものをコントロールとした。
１２時間インキュベーションした後のコントロールの吸光度は、インキュベーション前に比べて０．００５増加した。被験サンプルの１２時間インキュベーション終了後の吸光度の増加が、インキュベーション前の吸光度に比べて０．０５以下の場合は測定限界以下であると判定した。
方法Ａにおいて活性が認められないレベルに活性が低下したトロンビンに関しては、さらに以下の方法Ｂ又はC又はDいずれかの活性測定を行った。【００８８】
方法Ｂ：FXIIIとしてフィブロガミンP（アベンティス  ファーマ）を用いた。３ｍｌのフィブロガミンP  ２５０単位を５０ｍM  EDTA、0.1M NaCl（pH7.4）に透析した溶液50μｌに対し、被験サンプル0.1mg/ml（トロンビン誘導体）のPBS溶液（pH7.4）１００μｌをエッペンチューブに加え、37℃、３時間インキュベーションした後、SDS-PAGEによってFXIIIの活性化の有無を確認した。目視で分解産物が確認される場合にSDSPAGEを−SH条件下で行いFXIIIのA鎖及び活性化A鎖のバンドの濃さをライトキャプチャー（アトー株式会社）を用い解析比較した。【００８９】
方法C: 50mM  トリス塩酸  0.1M NaCl（pH7.4）に溶解した4ｍｇ/ｍｌ  Ｆｂｇｎ溶液２００μｌに、0.2mg/mlに調整された被験サンプル（トロンビン誘導体）を１００μｌ添加し良く混和したのち、37℃、3時間のインキュベーションを行った。3時間後のクロット形成の有無を目視によって判断した。【００９０】
方法D：50mM  トリス塩酸  0.1M NaCl pH7.4に溶解した0.1mg/ml トロンビンレセプター細胞外ドメインペプチド（配列番号４）溶液２００μｌに、０．３mg/mlに調整された被験サンプル（トロンビン誘導体）を１００μｌ添加し  良く混和したのち、37℃  3時間のインキュベーションを行った。５０％酢酸  200μlを添加して反応を停止した後、SDS-PAGEによってトロンビンレセプターの活性化の有無を確認した。目視で分解産物が確認される場合にSDSPAGEを−SH条件下で行いトロンビンレセプターの分解産物のバンドの濃さをライトキャプチャー（アトー株式会社）を用い解析比較した。【００９１】
＜２＞基質結合能の測定法
方法Ｅ：ヒルジンC末端ペプチド（配列番号３）への結合能の確認
（１）ヒルジンC末端ペプチドゲルの作製
ヒルジンC末端ペプチド１０ｍｇを0.1M  NaHCO3緩衝液に溶解し、同緩衝液に置換したNHS活性化セルロファイン（チッソ社）１０ｍｌを加え混和し30分間  25℃にて攪拌した。
ここに１Ｍトリス塩酸  pH8 ２５℃  ２０ｍｌを加え更に３０分間  攪拌しヒルジンC末端ペプチド固定化ゲルを得た。同ゲルを５０ｍM トリス塩酸  0.15M NaCl（pH7.4）25℃で平衡化した後、0.1M  NaHCO3緩衝液で透析した各トロンビン誘導体を添加し  ３０ｍｌの0.1M  NaHCO3緩衝液で洗浄した。
（２）ヒルジンC末端ペプチド（配列番号３）への結合能の確認  ヒト野生型トロンビンもしくはトロンビン誘導体を含有する分画の２ｍｌを、５０ｍMトリス塩酸  ０．１５M NaCl（pH8）4℃に平衡化したヒルジンC末端ペプチドカラム１０ｍｌに添加し、３０ｍｌの５０ｍM トリス塩酸緩衝液で洗浄後、５０ｍM トリス塩酸１M NaCl  ３M 尿素（pH8）で溶出した。抗ヒトトロンビン抗体を用いたウェスタンブロッティングにより素通り分画、および溶出分画のトロンビンを確認した。なお、本発明では、ヒルジンＣ末端ペプチド固定化ゲルへの結合割合が、カラムに添加した被験サンプルの５０％以下であるトロンビン誘導体は、基質結合能を喪失していると判断した。
＜３＞ヘパリン結合能の確認法
方法F：ヒト野生型トロンビンもしくはトロンビン誘導体５ｍｌを50mM NaHCO3 /50mM NaCl溶液で平衡化したＨＩ−ＴＲＡＰ  ＨＥＰＡＲＩＮカラム(アマシャム・ファルマシア社)に添加し１５mlの50mM NaHCO3 /50mM NaCl溶液で洗浄した後バッファーA：50mM NaHCO3  /50mM NaClバッファーB：50mM NaHCO3  /1M NaCl を用い流速  0.5ml/min 100分間で  B０％  からB１００％ へのグラジエント溶出を行った。
ヒト野生型トロンビンはA５０％（0.5M  NaCl）が溶出のピークになった。本条件下  ヒト野生型トロンビンに比較し８０％  A４０％以下の塩濃度で溶出されたトロンビン誘導体はヘパリン結合能が低下していると判断した。【００９２】
方法Ｆ：バイオセンサー（IAsys日製産業）を用いたトロンビン誘導体のトロンビンレセプター結合能の測定
（１）トロンビン誘導体固定化キュベットの作製
被験サンプル（トロンビン誘導体）  １０ｍM  リン酸バッファー（pH7.7）を、NHS活性化CMデキストランキュベット（日製産業社）10分間  25℃で撹拌することにより、被験サンプル（トロンビン誘導体）をNHS活性化CMデキストランキュベットに固定し、トロン
ビン誘導体固定化キュベットを得た。引き続き１M エタノールアミン（pH８）を0.2ml加えブロッキング処理を行った。
（２）1000、500、200、100、50、25、10nMに調整した  トロンビンレセプター細胞外ドメインペプチド（配列番号４）の50mM  リン酸緩衝液  0.15M NaCl 溶液（pH7.4）0.1mlを、（１）で得られたトロンビン誘導体固定化キュベットに加え結合曲線を解析した。
解析はFAST  fit（日製産業）を用い同社マニュアルに順じて行った。【００９３】
＜３＞APTT測定方法
本実施例において方法に関し特に指定が無い限り、APTTの測定は下記の方法にて行った。
標準血漿（国際試薬社）とサンプルを混和し、総量の２５％のAPTT試薬（国際試薬社）を加え３７℃  ５分インキュベーションを行う。５分後  ０．１M  CaCl2を8μMになるように添加し、カルシウム添加から凝固までの時間を測定する。【００９４】
＜４＞AHTの合成
本実施例中のAHTは下記の実験方法によって得たものを使用した。
４−１：AHTの合成
ヒト野生型トロンビン60mgを100μM PIPES pH6.5   50mlに溶解しAPMSF(WAKO社)１０ｍｇを加え10分攪拌した。つづいて溶解サンプルを氷水で冷却し、１Ｎ NaOH を6ml加え、10分間反応させた後（氷水中で反応）、５M NaCl 14mlとグリセロール 70mlを加え攪拌し、１Ｍ PIPES(pH6.5)にてpＨ８.0へ調整した。さらに、0.1M NaHCO3 - 0.5M NaCl  560ml 中へ、調整サンプルを滴下希釈し、0.1Ｍ NaHCO3 - 0.5M NaClにて透析を行った。引き続き透析サンプルを、8,000rpm 5min.  遠心沈殿除去後、サンプルを最終100mlへ濃縮した。
アンチトロンビン（Anti-Thrombin、AT） 50単位/ml １ml にヘパリン１０ｍｇを加えたものを濃縮後のサンプルに加え、50mM NaHCO3 - 0.3M NaClに透析する。その後、8,000rpm 5min.  遠心沈殿除去した。【００９５】
４−２：AHTの精製
50mM NaHCO3にて平衡化したベンズアミジン・セファロース（Benzamidine-Sepharose）50mlにAで得られたサンプル50ｍｌを添加し（流速２ml/min）、50mM NaHCO3 - 0.1M NaClにて洗浄後、0.1Mベンズアミジン（Benzamidine ）- 50mM NaHCO3 - 0.1M NaClにて溶出した。BCAにて蛋白の確認をし、AHT蛋白の含まれる画分を、50mM NaHCO3にて平衡化したヘパリン・セファロース（Heparine-Sepharose）に添加し（流速２ml/min）その後、1mM PIPES - 0.1M NaCl pH6.5にて洗浄し、ベンズアミジン（benzamidine）除去後、1mM PIPES−1M NaCl pH6.5にてAHTを溶出させた。溶出画分に、APMSFを１０ｍｇ添加し、1mM PIPES−0.1M NaCl pH6.5に透析した。
【００９６】
４−３：2回目ベンズアミジン精製
つづいて再度カラム添加直前に、サンプルにAPMSFを１ｍｇ加え、1mM PIPES pH6.5にて平衡化したベンズアミジン・セファロース（Benzamidine-Sepharose）カラムに添加した。1mM PIPES - 0.1M NaCl pH6.5にて洗浄後、0.1Mベンズアミジン（Benzamidine） - 1mM PIPES−0.1M NaCl pH 6.5にて溶出し、１mM PIPES pH6.5にて平衡化したヘパリン・セファロース（Heparine-Sepharose）にAHT画分を添加し、1mM PIPES - 0.1M NaCl pH6.5にて洗浄後、1mM PIPES - 1M NaCl pH6.5にて溶出させた。
【００９７】
４−４：3回目ベンズアミジン精製
得られたサンプルにAPMSFを１０ｍｇ添加し、1mM PIPES - 0.1M NaCl pH6.5にて透析後、2回目ベンズアミジン精製同様の操作にてAHTを精製し、へパリン溶出AHTに再度１ｍｇのAPMSFを添加した。約３０ｍｇのAHTが回収された。【００９８】
４−５：ＡＰＴＴの測定方法
50μg/ml及び25μg/mlに調整したAHT及びトロンビン変異体PBS溶液（PBS；137mM NaCl, 2.68mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.47mM KH2PO4（pH7.4）100μｌを標準血漿（国際試薬社）100μｌと混合し、APTT試薬（国際試薬社）50μｌを添加し３７℃で５分インキュベーションを行った後０．１M  CaCl2 を２２μｌ加えカルシウム添加から凝固（フィブリン塊が析出する）までの時間をそれぞれ測定した。コントロールとしてPBSのみを同様に添加した標準血漿を用い同様の方法にてAPTTを測定した。
以下実験例においてもインキュベーション、APTT試薬、カルシウム溶液の添加、APTTの測定は同様の方法で行った。
なお、各種トロンビン誘導体におけるAPTT延長能は、50μg/ml及び25μg/mlの少なくともいずれか一方の濃度において比較対象（AHTなど）に対してAPTTが増加している場合をAPTT延長能の向上と判断した。例えば50μg/ml及び25μg/mlの少なくともいずれか片方の濃度において、APTTが比較対象に対して１．１倍以上に上昇している場合を、APTT延長効果が１．１倍以上に向上していると判断した。【００９９】
４−６：AHTのAPTTの測定
50μg/ml及び25μg/mlのAhT（PBS；137mM NaCl, 2.68mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.47mM KH2PO4（pH7.4）100μｌを標準血漿（国際試薬社）100μｌと混合し、APTT試薬（国際試薬社）50μｌを添加し３７℃で５分インキュベーションを行った後０．１M  CaCl2 を２２μｌ加えカルシウム添加から凝固（フィブリン塊が析出する）までの時間をそれぞれ測定した。AhT溶液の代わりにPBSのみを同様に添加した標準血漿をコントロールとして測定した結果それぞれ
コントロール：  46.5秒
AHT  50μｇ/ｍｌ：  63.5秒（1.36倍）
25μｇ/ｍｌ：  58.5秒（1.25倍）
となった。【０１００】
[実験例１]
（１）ヒト野生型トロンビンの発現
ヒト野生型トロンビンのＡ鎖及びＢ鎖を含むDNA（配列番号５）をベクターに挿入しCHO細胞にトランスフェクションし、プレトロンビン生産細胞を得た。
なお、配列番号６で示されるヒト野生型プレトロンビンの配列は、アミノ酸番号１〜４３がシグナル配列、４４〜９２がＡ鎖であり、９３〜３５１がＢ鎖である。
プレトロンビン生産細胞をCD-CHO培地２リットルで１０日間培養した。得られたプレトロンビン生産細胞の培養液２リットルを２０リットルの１０ｍM PIPES緩衝液（pH7）4℃に6時間ずつ2回透析したのち、CMセルロファイン（チッソ社）５００ｍｌに添加し、１０ｍM PIPES緩衝液（pH7）１リットルにて洗浄した。次に、１０ｍM PIPES緩衝液（pH7）0〜1M,NaClの直線的濃度勾配にて溶出を行った。溶出液を各２５ｍｌずつの分画に分け、それぞれを抗ヒトトロンビンポリクローナル抗体（コスモバイオ社）を用いたウェスタンブロッティングによって確認したところ、ヒト野生型トロンビンは約０．４Ｍで溶出された。【０１０１】
（２）ヒト野生型トロンビンのエカリンによる活性化及び活性化ヒト野生型トロンビンのヒルジンC末端ペプチド結合能の確認
得られたヒト野生型トロンビンを５ｍｇ含む分画約１００ｍｌを２リットルの５０ｍM トリス塩酸緩衝液、０．１５M NaCl,  ５ｍM、CaCl2（pH8）溶液に透析した後  エカリン(シグマ社)１００unitsを加え  37℃  24時間インキュベーションした。エカリン処理後の一部を用い方法E記載のヒルジンC末端ペプチド結合実験を行ったところ、素通り分画にはトロンビンは確認できず、溶出分画にトロンビンのバンドが確認された。【０１０２】
（３）ヒト野生型トロンビンの精製
次にヒルジンC末端ペプチド結合実験に使用した残りのエカリン活性化後のトロンビンを含む溶液９８ｍｌを、５０ｍM トリス塩酸緩衝液、０．１M NaCl（pH8）で平衡化した硫酸化セルロファインカラム（チッソ社）２００ｍｌに添加し、同緩衝液２００ｍｌで同カラムを洗浄した後、５０ｍM トリス塩酸緩衝液、１M NaCl（pH8）にて溶出した。さらに溶出液を５０ｍM トリス塩酸緩衝液、０．１M NaCl（pH8）に透析し  同緩衝液で平衡化されたヒルジンC末端ペプチドカラム（ヒルジンC末端ペプチドを２００ｍｇ、NHS活性化セルロファイン（チッソ社）を３０ｍｌとした以外は、前述の「方法Ｅ：ヒルジンC末端ペプチド（配列番号３）への結合能の確認」に記載の方法に準じて作製した）３０ｍｌに添加した。５０ｍM トリス塩酸緩衝液１５０ｍｌで該ヒルジンC末端ペプチドカラムを洗浄した後、５０ｍM トリス塩酸緩衝液、１M NaCl 4M グアニジン塩酸（pH8）にて溶出し、SDS-PAGE上ほぼ純化されたヒルジン結合能のヒト野生型トロンビン  約５ｍｇを得た。【０１０３】
（４）カルボキシル基修飾トロンビン（M-トロンビン）の合成
5mlの５０ｍＭリン酸緩衝液0.5M NaCl（pH6.5）に溶解した1mgヒト野生型トロンビンを0.25M  グリシンエチルエステル  0.5M NaCl（pH6.5）に4℃で3時間透析した後、これに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、和光純薬)をその濃度が20mg/mlになるように添加し、２５℃にて１時間インキュベーションし、ヒト野生型トロンビンのカルボキシル基を修飾した。残存カルボジイミドは終濃度0.5Mになるようにグリシンを添加し反応を終了させた。質量分析の結果分子量約１４００増加しており約15個のカルボキシル基が修飾されていた。【０１０４】
（５）PRPを用いた修飾トロンビンの血小板凝集惹起及び抗PAR１抗体（ATAP２  コスモバイオ社）の抑制効果の評価
採血直後のクエン酸添加全血10mlを、800rpmで15分遠心し、上澄みよりPRP2mlを得た。さらに2800rpmで10分遠心分離することによりPPPを得た。
PRP140μｌに対し100μｌのPBSを加え  1μｇ/ｍｌの修飾トロンビン/PBS溶液を３５μｌ添加し透過率の経時変化を記録した。結果を図４６の００２に示す。
採血直後のクエン酸添加全血10mlを、800rpmで15分遠心し、上澄みよりPRP2mlを得た。さらに2800rpmで10分遠心分離することによりPPPを得た。
PRP140μｌに対し50μｇ/ｍｌのPAR1抗体/PBS溶液を100μｌ加え  1μｇ/ｍｌの修飾トロンビンのPBS溶液を３５μｌ添加し透過率の経時変化を記録した。結果を図４６の００１に示す。
以上の結果より修飾トロンビンは血小板凝集を惹起し、且つ修飾トロンビンによる血小板凝集はPAR1抗体によって完全に抑制された。このことより修飾トロンビンはPAR１活性化によって血小板凝集を惹起していることが示された。【０１０５】
[実験例２]
（１）B鎖203グリシンをアラニンにB鎖205セリンをグリシンに置換したトロンビン誘導体（以下203A205Gトロンビン）の発現
203A205GトロンビンのDNAに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。203A205Gトロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号７に示す。
203A205Gトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にはバンドは確認されず、溶出ピークにトロンビン同様のバンドが確認された。引き続き実験例１の（３）の方法に準じて硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。SDS-PAGE上でほぼ純化された203A205Gトロンビンが約５ｍｇ得られた。
次いで方法Fに従いヘパリンゲルへの結合能を測定したところ野生型ヒトトロンビンと同等の溶出位置（A50%）にて溶出された。【０１０６】
（２）203Ａ205Ｇトロンビンの基質分解活性測定
（１）で得られた203A205Gトロンビンのトロンビン基質分解活性を、前述の方法Ａに従って測定した結果、インキュベーション後の吸光度の有意な増加はみられなかった。
さらに、203A205Gトロンビンのトロンビン基質分解活性を、前述の方法Ｂに従って測定した結果を図４１に示す。3時間インキュベーション後のサンプル（レーン６）にFXIIIのA鎖活性化産物のバンドは確認されなかった。さらに、203A205Gトロンビンのトロンビン基質分解活性を、前述の方法Cに従って測定した結果、クロット形成は確認されなかった。【０１０７】
（３）203A205Gトロンビンのトロンビンレセプターへの結合能の確認
（１）で得られた203Ａ205Ｇトロンビンのトロンビンレセプターへの結合能を、前述の方法Ｆに従って測定した。203Ａ205Ｇトロンビンのトロンビンレセプターの解離定数は3.2μMであった。【０１０８】
（４）203A205GトロンビンのＡＰＴＴの測定
50μg/mlの203A205Gトロンビン（PBS；137mM NaCl, 2.68mM KCl, 8.1mM Na2HPO4, 1.47mM KH2PO4（pH7.4）100μｌを標準血漿（国際試薬社）100μｌと混合し、APTTを測定した。PBSのみを同様に添加した標準血漿をコントロールとして測定したところ、コントロールが44秒、203A205Gトロンビンでは48秒であり1.09倍に延長した。【０１０９】
（５）PRP（多血小板血漿：platelet rich plasma）を用いた203A205Gトロンビンの抗血小板効果の評価
評価１：採血直後のクエン酸添加全血10mlを、800rpmで15分遠心し、上澄みよりPRP2mlを得た。さらに2500rpmで10分遠心分離することによりPPP（乏血小板血漿：platelet poor plasma）を得た。１００μｌ添加した場合に203A205Gトロンビンの終濃度が８０μｇ／ｍｌとなるように濃度が調整された、203A205Gトロンビンの５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl（pH7.4）溶液１００μｌをPRP130μｌに添加し、血小板凝集惹起物質として５ｍｇ/mlリストセチン５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl（pH7.4）溶液35μｌを添加した。コントロールとして、PRP130μｌに、５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl、ｐH７．４  100μｌを添加し透過率の経時変化を記録した。なお、透過率（波長７００ｎｍ）の測定はEASY TRACER ET-800 （東京光電株式会社）を用いて行った。結果を図１１に示す。なお、縦軸の透過率は血小板凝集能と正の相関を示す値である。
評価２：血小板凝集惹起物質として1μｇ/mlＭ−トロンビン（ヒト野生型）  ５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl（pH7.4）溶液を用いた以外は、評価（１）の方法に準じて実験を行った。コントロールとして、PRP130μｌに、５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl（pH7.4）100μｌを添加し透過率の経時変化を記録した。なお、透過率の測定はEASY TRACER ET-800 （東京光電株式会社）を用いて行った。結果を図１２に示す。
図１１、１２より、８０μｇ/mlの濃度の203A205Gトロンビンを添加しても血小板凝集の有意な抑制効果は得られない結果が得られた。【０１１０】
（６）ＩＡｓｙｓを用いたトロンビン基質結合能比較実験
203A205Gトロンビン誘導体またはAHTの0.1mg/mlの10mM リン酸緩衝液（pH7.4）溶液を、それぞれNHS活性化CMデキストランキュベット（日製産業社）に添加し、10分間、25℃で撹拌することにより、被験サンプル（トロンビン誘導体）をNHS活性化CMデキストランキュベットに固定し、203A205GトロンビンまたはAHT固定化キュベットを得た。（各キュベットに203A205Gトロンビンは4100arc、 AHTは2400arcそれぞれ結合した。）引き続き１M エタノールアミン（pH8）を0.2ml加えブロッキング処理を行った。203A205GキュベットまたはAHTキュベットにそれぞれ100nMのＦｂｇｎ及びFVIIIを添加しそれぞれの結合曲線をモニターした。結果を図１３と図１４に示す。
図１４よりAHTキュベットにはＦｂｇｎとFVIIIがほぼ同程度結合しているのに対し、図１３より203A205GキュベットにはFVIIIの方がＦｂｇｎより少ない結合が確認された。構造変化を最小にするため単純に２０５番目のセリンをデヒドロアラニンに変換する事で得られたAHTに比較し、203A205Gトロンビンは低いFVIII結合能を有していることが分かった。また、AHTに対し203A205Gトロンビンは固相化量との比で換算にFVIII結合が約１１％に低下していた。そのため203A205GトロンビンはAPTT延長効果が低いものと考えられた。【０１１１】
（７）カルボキシル基修飾203A205GトロンビンのＡＰＴＴ及びプロトロンビン時間（PT）の測定
5mlの５０ｍＭリン酸緩衝液  0.5M NaCl（pH6.5）に溶解した1mgの203A205Gトロンビンを0.25M  グリシンエチルエステル  0.5M NaCl（pH6.5）に4℃で3時間透析した後、これに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、和光純薬)をその濃度が20mg/mlになるように添加し、２５℃にて１時間インキュベーションし、203A205Gトロンビンのカルボキシル基を修飾した。残存カルボジイミドは終濃度0.5Mになるようにグリシンを添加し反応を終了させた。質量分析の結果分子量約１４００増加しており約15個のカルボキシル基が修飾されていた。【０１１２】
評価１：APTT測定１
修飾された203A205Gトロンビン500μgを、5mM PIPES緩衝液  0.15M NaCl（pH7.4）１ｍｌに溶解したもの50μlを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１０の割合となるように添加し、APTTを測定した。5mM PIPES緩衝液  0.15M NaCl（pH7.4）を、標準血漿（国際試薬社）に１：１０（容量比）となるように添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは38秒であったのに対し、カルボキシル基修飾203A205GトロンビンのAPTTは65秒であった。
評価２：APTT測定２
修飾された203A205Gトロンビン50μgを、１ｍｌのPBSに溶解したもの100μlを、標準血漿（国際試薬社）１００μｌに添加し、APTTを測定した。PBSを標準血漿（国際試薬社）に同様に添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは44秒であったのに対し、カルボキシル基修飾203A205GトロンビンのAPTTは85秒であった。【０１１３】
評価３：PTの測定
修飾された203A205Gトロンビン500μgを、5mM PIPES緩衝液  0.15M NaCl（pH7.4）１ｍｌに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１０の割合となるように添加し、PTを測定した。5mM PIPES緩衝液  0.15M NaCl（pH7.4）を、標準血漿（国際試薬社）に１：１０（容量比）となるように添加したものをコントロールとし、PTを測定した。なお、PT試薬にはSIGMA社のTHROMBOPLASTIN WITH CALSIUMを使用した。その結果、コントロールのPTは20秒であったのに対しカルボキシル基修飾203A205GトロンビンのPTは21秒であった。【０１１４】
（８）PRP（多血小板血漿：platelet rich plasma）を用いたカルボキシル基修飾203A205Gトロンビンの抗血小板効果の評価
評価１：採血直後のクエン酸添加全血10mlを、800rpｍで15分遠心し、上澄みよりPRP2mlを得た。さらに2800rpmで10分遠心分離することによりPPP（乏血小板血漿：platelet poor plasma）を得た。１００μｌ添加した場合にカルボキシル基修飾203A205Gトロンビンの終濃度が３７μｇ／ｍｌとなるように濃度が調整された、カルボキシル基修飾203A205Gトロンビンの５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl（pH7.4）溶液１００μｌをPRP130μｌに添加し、血小板凝集惹起物質として５ｍｇ/mlリストセチン５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl（pH7.4）溶液35μｌを添加した。コントロールとして、PRP130μｌに、５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl（pH7.4）100μｌを添加し透過率の経時変化を記録した。なお、透過率（波長７００ｎｍ）の測定はEASY TRACER ET-800 （東京光電株式会社）を用いて行った。結果を図１に示す。なお、縦軸の透過率は血小板凝集能と正の相関を示す値である。
評価２：血小板凝集惹起物質として1μｇ/mlＭ−トロンビン（ヒト野生型）５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl（pH7.4）溶液を用いた以外は、評価１の方法に準じて実験を行った。コントロールとして、PRP130μｌに、５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl（pH7.4）  100μｌを添加し透過率の経時変化を記録した。なお、透過率の測定はEASY TRACER ET-800 （東京光電株式会社）を用いて行った。結果を図２に示す。
図１、図２より、カルボキシル基修飾203A205Gトロンビンを用いることによって血小板凝集が低下したことから、該トロンビン誘導体はリストセチン惹起血小板凝集及び修飾トロンビン惹起血小板凝集において抗血小板効果を示すことがわかった。【０１１５】
以上の結果から、203A205Gトロンビンは、活性が検出限界以下に低下しているが、基質への結合能は保持していることがわかった。また、APTTの結果および血小板凝集抑制実験の結果から、203A205Gトロンビンは80μｇ/mlにおいては十分な抗血栓効果、抗血小板効果を有していなかったが、約15個のカルボキシル基が修飾を受けたカルボキシル基修飾203A205Gトロンビンは低濃度においても十分な抗血栓効果、抗血小板効果を有していることがわかった。
また、IAsysを用いた基質結合能比較実験より203A205GトロンビンはFVIII結合能が低く、また結合力もAHTに比較し固定化蛋白対比では１１％程に低下しているため高いAPTT延長効果が無いことが推測される。カルボキシル基の修飾を行った203A205Gトロンビンは実験例１２記載の205A43Aトロンビン同等のAPTT延長効果であったが、血小板凝集抑制効果においては205A43Aトロンビンに比較し同等の効果を示した。カルボキシル基の修飾を行った205A43Aトロンビンと比較した場合、カルボキシル基の修飾を行った203A205G トロンビンはAPTT延長効果は弱いものも血小板凝集抑制効果は同等に強い性質を示した。【０１１６】
（９）203A205Gトロンビンのカルボキシル基修飾個数と抗血栓効果の関係の評価
（９）−１．修飾個数１から１０個のカルボキシル基修飾203A205G誘導体の作製
5mlの５０ｍＭリン酸緩衝液  0.5M NaCl（pH6.5）に溶解した1mg 203A205Gトロンビンを0.25M  グリシンエチルエステル  0.5M NaCl（pH6.5）に4℃で3時間透析した後、これに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide、和光純薬）を終濃度が２ｍｇ〜２０ｍｇ／ｍｌになるように加え、２５℃にて６０分〜120分インキュベーションを行い、203A205Gトロンビンの2個〜28個のカルボキシル基を修飾したカルボキシル基修飾トロンビン誘導体1〜５を得た。【０１１７】
（９）−２．PBSに透析したカルボキシル基修飾トロンビン誘導体1〜５のAPTT延長効果
修飾された203A205Gトロンビン50μgを、１ｍｌのPBSに溶解したもの100μlを、標準血漿（国際試薬社）１００μｌに添加し、APTTを測定した。PBSを標準血漿（国際試薬社）に同様に添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。
結果を以下に示す。
203A205Gトロンビン                    約０個修飾    APTT  ４７秒
カルボキシル基修飾トロンビン誘導体１  約１個修飾    APTT  ４８秒
カルボキシル基修飾トロンビン誘導体２  約３個修飾    APTT  ５６秒
カルボキシル基修飾トロンビン誘導体３  約５個修飾    APTT  ６１秒
カルボキシル基修飾トロンビン誘導体４  約１０個修飾  APTT  ７７秒
カルボキシル基修飾トロンビン誘導体５  約２６個修飾  APTT  ６０秒
以上よりEDCを用いた203A205Gトロンビンにおいて３個以上のカルボキシル基修飾によって顕著なAPTT延長効果が確認された。カルボキシル基修飾トロンビン誘導体１〜４における修飾前後における回収率は７５％以上であった。２６個修飾された誘導体においてはAPTT延長効果は見られるものの、凝集がおき、回収率が４０％と低く過度なカルボキシル基修飾による回収率の低下が起こることが分かった。【０１１８】
[実験例３]
（１）B鎖205セリンをアラニンに置換したトロンビン（以下205Ａトロンビン）の発現
205AトロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。205Aトロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号９に示す。
205Aトロンビンを実験例１の（１）の方法に準じて発現させた。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にはバンドは確認されなかった。溶出ピークにトロンビン同様のバンドが確認された。引き続き実験例１の（３）の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上  ほぼ純化された205Aトロンビンが約６ｍｇ得られた。205AトロンビンのヒルジンC末端固定化ペプチドによる精製結果の電気泳動を図３９に示す。レーン５の素通りには205Aトロンビンのバンドは確認されず溶出フラクションに純化された205Aトロンビンのバンドが確認される。
上記の結果より205AトロンビンがヒルジンC末端ペプチド固定化ゲル結合能を有していることが示された。
次いで方法Fに従いヘパリンゲルへの結合能を測定したところ野生型ヒトトロンビンと同等の溶出位置（A50%）にて溶出された。【０１１９】
（２）205Aトロンビンの基質分解活性測定
（１）で得られた205Aトロンビンのトロンビン基質分解活性を前述の方法Ｂに従って測定した結果を図４０に示す。レーン８に示されるように3時間後においても活性化されたFXIIIのA鎖は確認されなかった。【０１２０】
（３）205AトロンビンのＡＰＴＴの測定
205Ａトロンビン500μgを、PBS  １ｍｌに溶解した溶液100μｌを、標準血漿（国際試
薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１で添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは55秒であったのに対し、205AトロンビンのAPTTは９５秒であった。
205Ａトロンビン50μgを、PBS  １ｍｌに溶解した溶液100μｌを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１で添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは４１秒であったのに対し、205AトロンビンのAPTTは６２秒であった。【０１２１】
さらに、1mg/5mlの205Aトロンビン／５０ｍＭリン酸緩衝液  0.5M NaCl（pH6.5）を0.25M  グリシンエチルエステル  0.5M NaCl（pH6.5）に4℃で3時間透析した後  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(和光純薬)）を、その濃度が20mg/mlになるように添加し、２５℃にて１時間インキュベーションし、205Aトロンビンのカルボキシル基を修飾した。約８０％の修飾誘導体が可溶化状態で得られた。
カルボキシル基修飾205Ａトロンビン50μgを、PBS  １ｍｌに溶解した溶液100μｌを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１で添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは４２秒であったのに対し、カルボキシル基修飾205AトロンビンのAPTTは７９秒であった。【０１２２】
（４）プロトロンビン時間（PT）の測定
205Aトロンビン及びカルボキシル基修飾205Aトロンビン50μgを、PBS１ｍｌに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）にそれぞれ容量比で１：１の割合となるように添加し、PTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１（容量比）となるように添加したものをコントロールとし、PTを測定した。なお、PT試薬にはSIGMA社のTHROMBOPLASTIN WITH CALSIUMを使用した。その結果、コントロールのPTは2１秒であったのに対し205Aトロンビンは21秒、カルボキシル基修飾205AトロンビンのPTは20秒でありいずれもPTの延長効果は示さなかった。【０１２３】
（５）PRP（多血小板血漿：platelet rich plasma）を用いた205Aトロンビンの抗血小板
機能の評価
評価１：採血直後のクエン酸添加全血10mlを、800rpmで15分遠心し、上澄みよりPRP2mlを得た。さらに2800rpmで10分遠心分離することによりPPP（乏血小板血漿：platelet poor plasma）を得た。１００μｌ添加した場合に205Aトロンビンの終濃度が70μｇ／ｍｌとなるように濃度が調整された、205Aトロンビンの５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl（pH7.4）溶液１００μｌをPRP130μｌに添加し、血小板凝集惹起物質として５ｍｇ/mlリストセチン５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl（pH7.4）溶液35μｌを添加した。コントロールとして、PRP130μｌに、５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl、pH7.4  100μｌを添加し透過率の経時変化を記録した。なお、透過率（波長７００ｎｍ）の測定はEASY TRACER ET-800 （東京光電株式会社）を用いて行った。しかしながら本実験で70μｇ/mlにおいて血小板凝集抑制効果は確認されなかった。
評価２：血小板凝集惹起物質として1μｇ/mlＭ−トロンビン（ヒト野生型）  ５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl（pH7.4）溶液を用いた以外は、評価（１）の方法に準じて実験を行った。コントロールとして、PRP130μｌに、５ｍM  リン酸緩衝液0.15M  NaCl（pH7.4）100μｌを添加し透過率の経時変化を記録した。なお、透過率の測定はEASY TRACER ET-800 （東京光電株式会社）を用いて行った。しかしながら本実験で70μｇ/mlにおいては血小板凝集抑制効果は確認されなかった。
以上より、205Aトロンビンは弱いAPTT延長効果が確認された。しかしながら抗血小板効果は確認されなかった。特許文献４において示されるように血漿を含まない培地の環境下においては205Aトロンビンはトロンビンレセプター活性化抑制能を示すが、血漿中においては抗血小板剤として実質使用できるレベルのトロンビンレセプター活性化能は有さない事が示された。【０１２４】
（６）PRPを用いたカルボキシル基修飾205Aトロンビンの抗血小板効果の評価
評価１：採血直後のクエン酸添加全血10mlを、800rpmで15分遠心し、上澄みよりPRP2mlを得た。さらに2800rpmで10分遠心分離することによりPPPを得た。１００μｌ添加した場合にカルボキシル基修飾205Aトロンビンの終濃度が、100μｇ／ｍｌになるように濃度が調製された、カルボキシル基修飾205AトロンビンのPBS溶液を、１００μｌずつPRP130μｌに添加し、惹起物質として（i）1μｇ/mlＭ−トロンビンPBS溶液、（ii）５ｍｇ/mlリストセチン  PBS溶液35μｌを添加した。コントロールとして、PRP130μｌに、５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl、pH7.4  100μｌを添加し血小板凝集抑制実験を行った。(i)(ii)の結果を図２１，２２に示す。【０１２５】
（７）205AトロンビンのＦｂｇｎ及びFVIIIへの結合能の比較
205Aトロンビン約0.1mg/mlの濃度の10mM リン酸緩衝液（pH7.7）溶液を、それぞれNHS活性化CMデキストランキュベット（日製産業社）に添加し、10分間、25℃で撹拌することにより、被験サンプル（トロンビン誘導体）をNHS活性化CMデキストランキュベットに固定し、205Aトロンビン固定化キュベットを得た。（約６００arc固相化）引き続き１M エタノールアミン（pH8）を0.2ml加えブロッキング処理を行った。
205Aトロンビンキュベットに100nMのＦｂｇｎ及びFVIIIを添加しそれぞれの結合曲線をモニターした。結果を図２３に示す。図２３より205AトロンビンはFVIII特異性が増していたがFVIII結合シグナルそのものが相対的にAHT（図１４）に比較し４０％程度にまで低下した。この為、205Aトロンビンはそれほど強い抗血栓能を示さなかったと考えられる。また、205Aトロンビンはカルボキシル基を修飾することでAPTT延長効果を増し、且つＭ−トロンビン惹起血小板凝集、リストセチン惹起血小板凝集両方に対し抑制効果を示した。
【０１２６】
[実験例４]
（１）B鎖205セリンをスレオニンに置換したトロンビン（以下205Tトロンビン）の発現
205TトロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。205Tトロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１１に示す。
205Tトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現させた。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にはバンドは確認されず、溶出ピークにトロンビン同様のバンドが確認された。引き続き実験例１の（３）の方法に準じて硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上  ほぼ純化された205Tトロンビンが約５ｍｇ得られた。【０１２７】
（２）205Tトロンビンの基質分解活性測定
（１）で得られた205Tトロンビンのトロンビン基質分解活性を、前述の方法Ａに従って測定した結果、205Tトロンビンの基質分解活性は、ヒト野生型トロンビンに比較し約２．５ｘ１０-4の活性であった。
さらにトロンビンのトロンビン基質分解活性を、前述の方法Ｂに従って測定した結果、ほぼ全てのＦXIIIのA鎖は野生型トロンビン同様の活性化を受け、分解されたＦXIIIのバンドが確認された。以上より、205Tトロンビンは活性が残存していることがわかった。【０１２８】
[実験例５]
（１）B鎖203グリシンをアラニンにB鎖205セリンをアラニンにB鎖99アスパラギン酸をアスパラギンに置換したトロンビン（203A205A99Nトロンビン）の発現
203A205A99NトロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。203A205A99Nトロンビン塩基配列を配列番号１３に示す。
203A205A99Nトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にはバンドは確認されず、溶出ピークにトロンビン同様のバンドが確認された。引き続き実験例１の（３）の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された203A205A99Nトロンビンが約5ｍｇ得られた。
次いで方法Fに従いヘパリンゲルへの結合能を測定したところA  ４０%にて溶出されヘパリンゲルへの親和性の低下が確認された。【０１２９】
（２）203A205A99Nトロンビンの基質分解活性測定
（１）で得られた203Ａ205A99Nトロンビンのトロンビン基質分解活性を、前述の方法Ａに従って測定した結果、インキュベーション後の吸光度の増加はみられなかった。
さらに、203A205A99Nトロンビンのトロンビン基質分解活性を、前述の方法Ｂに従って測定した結果、FXIIIのA鎖活性化産物のバンドは確認されなかった。【０１３０】
（３）203A205A99Nトロンビン添加血液のAPTTの測定
203A205A99Nトロンビン100μgを5mM PIPES緩衝液  0.15M NaCl（pH7.4）１ｍｌに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。5mM PIPES緩衝液  0.15M NaCl（pH7.4）を、標準血漿（国際試薬社）に容量比１：１の割合となるように添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは55秒であったのに対し、203A205A99NトロンビンのAPTTは６０秒であった。以上より、203A205A99Nトロンビンはヒルジンゲルへの結合能を有し且つ、活性が十分に低下しているものも十分な抗血栓効果を有していないことがわかった。【０１３１】
[実験例６]
（１）B鎖205セリンをバリンに置換したトロンビン（以下205Vトロンビン）の発現
205VトロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。205Vトロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１５に示す。
205Vトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認した。結果を図４４（SS結合還元下におけるウェスタンブロットの図）に示す。素通り分画にほぼすべてのトロンビンのバンドが現われ、溶出ピークにはトロンビンのバンドが確認されなかった。これにより、205Vトロンビンは活性中心のアミノ酸の置換により基質結合能が低下していることがわかった。アプライ前サンプルで標準トロンビンの分子量より上に現れているバンドはエカリンによってA,B鎖に活性化（切断）されなかったトロンビンであり、エカリンに対する感受性も著しく低下していることも確認された。【０１３２】
[実験例７]
（１）B鎖205セリンをアスパラギン酸に置換したトロンビン（以下205Dトロンビン）の発現
205DトロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。205Dトロンビン塩基配列を配列番号１７に示す。
205Dトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認した。結果を図４５（SS結合還元下におけるウェスタンブロットの図）に示す。素通り分画にすべてのトロンビンのバンドが現われ、溶出ピークにはトロンビンのバンドが確認されなかった。これにより、205Dトロンビンは活性中心のアミノ酸の置換により基質結合能が低下していることがわかった。アプライ前サンプルで標準トロンビンの分子量より上に現れているバンドはエカリンによってA,B鎖に活性化（切断）されなかったトロンビンであり、エカリンに対する感受性も著しく低下していることも確認された。【０１３３】
[実験例８]
（１）B鎖205セリンをアスパラギンに置換したトロンビン（以下205Nトロンビン）の発現
205NトロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。205Nトロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１９に示す。
205Nトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にほぼすべてのトロンビンのバンドが現われ、溶出ピークにはトロンビンのバンドが確認されなかった。これにより、205Nトロンビンは活性中心のアミノ酸の置換により基質結合能が低下していることがわかった。【０１３４】
[実験例９]
AHTのトロンビンレセプター結合能の測定を、方法Ｄにより測定したところ、該AHTとトロンビンレセプターの解離定数は1.2μMであった。【０１３５】
[実験例１０]
（１）B鎖205セリンをアラニンにB鎖99アスパラギン酸をアスパラギンに置換したトロンビン（205A99Nトロンビン）の発現
205A99NトロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。
205A99Nトロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２１に示す。
205A99Nトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にバンドは確認されず、溶出ピークにトロンビン同様のバンドが確認された。引き続き実験例１の（３）の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された205A99Nトロンビンが約5.5ｍｇ得られた。【０１３６】
（２）205A99Nトロンビンの基質分解活性測定
（１）で得られた205A99Nトロンビンのトロンビン基質分解活性を、前述の方法Ａに従って測定した結果、インキュベーション後の吸光度の増加はみられなかった。
さらに、205A99Nトロンビンのトロンビン基質分解活性を、前述の方法Ｂに従って測定した結果、FXIIIのA鎖活性化産物のバンドは確認されなかった。【０１３７】
（３）205A99NトロンビンのＡＰＴＴの測定  205A99Nトロンビン50μgを、PBS 1mlに溶解し、その100μｌを、標準血漿（国際試薬社）に100μｌと混和し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１で添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは55秒であったのに対し、205A99NトロンビンのAPTTは58秒であった。【０１３８】
[実験例１１]
（１）B鎖203グリシンをアラニンにB鎖205セリンをアラニンに置換したトロンビン（203A205Aトロンビン）の発現
203A205AトロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。203A205Aトロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２３に示す。
203A205Aトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にはバンドは確認されず、溶出ピークにトロンビン同様のバンドが確認された。引き続き実験例１の（３）の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された203A205Aトロンビンが約4ｍｇ得られた。
次いで方法Fに従いヘパリンゲルへの結合能を測定したところA４０%にて溶出されヒト野生型トロンビンに比較し４０％への親和性の低下が確認された。【０１３９】
（２）203A205Aトロンビンの基質分解活性測定
（１）で得られた203A205Aトロンビンのトロンビン基質分解活性を、前述の方法Ａに従って測定した結果、インキュベーション後の吸光度の増加はみられなかった。
さらに、203A205Aトロンビンのトロンビン基質分解活性を、前述の方法Ｂに従って測定した。結果を図４３に示す。レーン６のインキュベーション3時間後においてもＦXIIIのA鎖活性化産物のバンドは確認されなかった。203A205AトロンビンはヒルジンC末端ペプチド結合能を有し且つ十分に活性を失っていることが分かった。203A205Aトロンビン100μgを、5mM PIPES緩衝液  0.15M NaCl（pH7.4）1mlに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。5mM PIPES緩衝液  0.15M NaCl（pH7.4）を、標準血漿（国際試薬社）に１：１の割合となるように添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは55秒であったのに対し、203A205AトロンビンのAPTTは59秒であった。【０１４０】
（３）カルボキシル基修飾体のAPTT試験
さらに、1mg/5mlの203A205Aトロンビン  0.5M NaCl（pH6.5）を0.25M  グリシンエチルエステル  0.5M NaCl（pH6.5）に4℃で3時間透析した後  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(和光純薬)）を、その濃度が20mg/mlになるように添加し、２５℃にて１時間インキュベーションし、203A205Aトロンビンのカルボキシル基を修飾した。可溶化状態で約80％のカルボキシル基修飾体が回収された。
カルボキシル基修飾203A205Aトロンビン50μgを、PBS  １ｍｌに溶解した溶液100μｌを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１で添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは45秒であったのに対し、カルボキシル基修飾203A205Aトロンビンはそれぞれ46秒であった。【０１４１】
（４）プロトロンビン時間（PT）の測定
203A205Aトロンビン及びカルボキシル基修飾203A205Aトロンビン50μgを、PBS１ｍｌに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）にそれぞれ容量比で１：１の割合となるように添加し、PTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１（容量比）となるように添加したものをコントロールとし、PTを測定した。なお、PT試薬にはSIGMA社のTHROMBOPLASTIN WITH CALSIUMを使用した。その結果、コントロールのPTは20秒であったのに対し203A205Aトロンビンは21秒、カルボキシル基修飾203A205AトロンビンのPTは20秒でありいずれもPTの延長効果は示さなかった。【０１４２】
（５）PRPを用いた203A205Aトロンビンの抗血小板効果の評価
評価１：採血直後のクエン酸添加全血10mlを、800rpmで15分遠心し、上澄みよりPRP2mlを得た。さらに2800rpmで10分遠心分離することによりPPPを得た。１００μｌ添加した場合に203A205Aトロンビンの終濃度が、100μｇ／ｍｌになるように濃度が調製された、203A205AトロンビンのPBS溶液を、１００μｌずつPRP130μｌに添加し、惹起物質として（i）1μｇ/mlＭ−トロンビンPBS溶液、（ii）５ｍｇ/mlリストセチン  PBS溶液35μｌを添加した。コントロールとして、PRP130μｌに、５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl、pH7.4  100μｌを添加し血小板凝集抑制実験を行ったが(i)(ii)いずれの惹起物質に対してもコントロールと203A205Aトロンビンに違いは無かった。【０１４３】
（６）203A205AトロンビンのＦｂｇｎ及びFVIIIへの結合特異性の比較
203A205Aトロンビン約0.1mg/mlの濃度の10mM リン酸緩衝液（pH7.7）溶液を、それぞれNHS活性化CMデキストランキュベット（日製産業社）に添加し、10分間、25℃で撹拌することにより、被験サンプル（トロンビン誘導体）をNHS活性化CMデキストランキュベットに固定し、203A205Aトロンビン固定化キュベットを得た。（約６００arc固相化）引き続き１M エタノールアミン（pH8）を0.2ml加えブロッキング処理を行った。203A205Aトロンビンキュベットに100nMのＦｂｇｎ及びFVIIIを添加しそれぞれの結合曲線をモニターした。結果を図２４に示す。図２４より203A205AトロンビンはFVIIIに、AHTと比較すると固定化蛋白量との対比による値で約５％のシグナルしか示さなかった。本配列の誘導体の基質結合能そのものが低下しそれによって抗凝固能を有さなかった推測される。【０１４４】
[実験例１２]
（１）Ｂ鎖２０５セリンをアラニンに、Ｂ鎖４３ヒスチジンをアラニンに置換したトロンビン（205A43Aトロンビン）の発現
205A43AトロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。205A43Aトロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２５に示す。
205A43Aトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にはバンドは確認されなかった。溶出ピークにトロンビン同様のバンドが確認されたことより９５％以上の205A43Aトロンビンの結合が認められた。
引き続き実験例１の（３）の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された205A43Aトロンビンが約3ｍｇ得られた。
ヒルジンC末端ペプチドカラムによる精製を図３８に示す。ヒルジンC末端ペプチド精製工程においても素通り（レーン４）にはトロンビンの溶出は認められず、溶出フラクションに純化された205A43Aトロンビンの回収が確認される。
次いで方法Fに従いヘパリンゲルへの結合能を測定したところA５０%にて溶出された。【０１４５】
（２）205A43Aトロンビンの基質分解活性測定
（１）で得られた205A43Aトロンビンのトロンビン基質分解活性を、前述の方法Ａに従って測定した結果、インキュベーション後の吸光度の増加はみられなかった。
205A43Aトロンビン50μgを、PBS1mlに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１の割合となるように添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは46秒であったのに対し、205A43AトロンビンのAPTTは78秒であり、1.7倍にAPTTを延長した。この延長効果は同条件下のアンヒドロトロンビンに比較し1.25倍のAPTT延長効果であった。【０１４６】
（３）PTの測定：205A43Aトロンビン50μgを、PBS  1mlに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、PTを測定した。またPBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１の割合となるように添加したものをコントロールとし、ＰＴを測定した。なお、ＰＴ試薬にはＳＩＧＭＡ社のTHROMBOPLASTIN WITH CALSIUMを使用した。その結果、コントロールのPTは24秒であったのに対し、205A43AトロンビンのＰＴは25秒であった。【０１４７】
（４）カルボキシル基修飾205A43AトロンビンのＡＰＴＴの測定
1mg/5mlの205A43Aトロンビン／５０ｍＭリン酸緩衝液／０．５Ｍ  NaCl（pH6.5）を0.25M グリシンエチルエステル／0.5M NaCl（pH6.5）に4℃で3時間透析した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(和光純薬)）を、その濃度が20mg/mlになるように添加し、２５℃にて１時間インキュベーションし、205A43Aトロンビンのカルボキシル基を修飾した。修飾体の質量分析の結果、約16個のカルボキシル基が修飾された。
【０１４８】
修飾された205A43Aトロンビン50μｇをPBS 1mlに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１で添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは46秒であったのに対し、カルボキシル基修飾205A43AトロンビンのAPTTは１90秒であった。【０１４９】
（５）プロトロンビン時間（PT）の測定
カルボキシル基修飾205A43Aトロンビン50μgを、PBS１ｍｌに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、PTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１（容量比）となるように添加したものをコントロールとし、PTを測定した。なお、PT試薬にはSIGMA社のTHROMBOPLASTIN WITH CALSIUMを使用した。その結果、コントロールのPTは22秒であったのに対しカルボキシル基修飾205A43AトロンビンのPTは23秒であり修飾体においても205A43AトロンビンはPTの延長効果は示さなかった。【０１５０】
（６）PRPを用いた205A43Aトロンビンの抗血小板効果の評価
評価１：採血直後のクエン酸添加全血10mlを、800rpmで15分遠心し、上澄みよりPRP2mlを得た。さらに2800rpmで10分遠心分離することによりPPPを得た。１００μｌ添加した場合に205A43Aトロンビンの終濃度が、３０μｇ／ｍｌになるように濃度が調製された、205A43AトロンビンのPBS溶液を、１００μｌずつPRP130μｌに添加し、惹起物質として５ｍｇ/mlリストセチン  PBS溶液35μｌを添加した。コントロールとして、PRP130μｌに、５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl、pH7.4  100μｌを添加し透過率の経時変化を記録した。
結果を図３に示す。
評価２：惹起物質として1μｇ/mlＭ−トロンビンPBS溶液を用いた以外は、評価１の方法に準じて実験を行った。コントロールとして、PRP130μｌに、PBS  100μｌを添加し透過率の経時変化を記録した。結果を図４に示す。
評価３：惹起物質として1μｇ/mlＭ−トロンビンPBS溶液を用い１００μｌ添加した場合に205A43Aトロンビンの終濃度が、それぞれ120μｇ／ｍｌ,30μｇ/mlになるように濃度が調製された、205A43AトロンビンのPBS溶液を加え、評価1の方法に準じて実験を行った。結果を図１５に示す。
評価４：205A43Aトロンビンの終濃度が、150μｇ／ｍｌになるように濃度が調製された、205A43AトロンビンのPBS溶液を、１００μｌずつPRP130μｌに添加し、惹起物質として５ｍｇ/mlリストセチン  PBS  溶液35μｌを添加した。コントロールとして、PRP130μｌに、PBS  100μｌを添加し透過率の経時変化を記録した。205A43Aトロンビンは高濃度においてもリストセチン惹起血小板凝集抑制効果は確認されなかった。【０１５１】
（７）PRPを用いたカルボキシル基修飾205A43Aトロンビンの抗血小板効果の評価
評価１：採血直後のクエン酸添加全血10mlを、800rpmで15分遠心し、上澄みよりPRP2mlを得た。さらに2500rpmで10分遠心分離することによりPPPを得た。１００μｌ添加した場合、カルボキシル基修飾205A43Aトロンビンの終濃度が、それぞれ３０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、７．５μｇ／ｍｌになるように濃度が調整された、カルボキシル基修飾205A43Aトロンビンの５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl（pH7.4）溶液３種類を、それぞれ１００μｌずつPRP130μｌに添加し、惹起物質として５ｍｇ/mlリストセチン５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl（pH7.4）溶液35μｌを添加した。コントロールとして、PRP130μｌに、５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl（pH7.4）100μｌを添加し透過率の経時変化を記録した。なお、透過率の測定はEASY TRACER ET-800 （東京光電株式会社）を用いて行った。結果を図５〜７に示す。
評価２：惹起物質として1μｇ/mlＭ−トロンビン５ｍM  リン酸緩衝液
0.15M  NaCl（pH7.4）溶液を用いた以外は、評価（１）の方法に準じて実験を行った。コントロールとして、PRP130μｌに、５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl（pH7.4）100μｌを添加し透過率の経時変化を記録した。なお、透過率の測定はEASY TRACER ET-800 （東京光電株式会社）を用いて行った。結果を図８〜１０に示す。【０１５２】
（８）ＩＡｓｙｓを用いたトロンビン基質結合能比較実験
205A43Aトロンビン誘導体及びAHTの0.1mg/mlの濃度の10mM リン酸緩衝液（pH7.7）溶液を、それぞれNHS活性化CMデキストランキュベット（日製産業社）に添加し、10分間、25℃で撹拌することにより、被験サンプル（トロンビン誘導体）をNHS活性化CMデキストランキュベットに固定し、205A43Aトロンビン及びAHT固定化キュベットを得た。1307arcの205A43Aトロンビンがキュベットに固定化された。引き続き１M エタノールアミン（pH8）を0.2ml加えブロッキング処理を行った。205A43Aキュベット及びAHTキュベットに100nMのＦｂｇｎ及びFVIIIを添加しそれぞれの結合曲線をモニターした。結果を図１６および図１４に示す。図１４よりAHTキュベットにはＦｂｇｎとFVIIIがほぼ同程度結合しているのに対し、図１６から205A43AキュベットにはFVIIIの方がＦｂｇｎより多い結合が確認された。
205A43Aトロンビン誘導体のFVIIIとFbgn結合能の比はAHTに比較し約1.4倍向上している事が確認された。
また、AHTに対し固定化蛋白との対比で同等のFVIII結合能を有していると考えられた。【０１５３】
（９）205A43Aトロンビンの修飾個数とAPTT延長効果の実験
1mg/5mlの205A43Aトロンビン／５０ｍＭリン酸緩衝液  0.5M NaCl（pH6.5）を0.25M  グリシンエチルエステル  0.5M NaCl（pH6.5）に4℃で3時間透析した後、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(和光純薬)）を、その濃度が20mg/mlになるように添加し、２５℃にて10分、60分、120分反応させカルボキシル基を修飾した。各反応時間に残存カルボジイミドを終濃度0.5Mになるようにグリシンを添加し反応を終了させた。
未反応205A43Aトロンビンに比較し、10分反応サンプルでは分子量が約480Da増加（5.6個修飾に相当）、60分反応サンプルでは分子量が1240Da増加（14.6個修飾に相当）、120分反応サンプルでは分子量が1900Da増加（22.4個修飾に相当）するカルボキシル基修飾反応が確認された。【０１５４】
各トロンビン誘導体のAPTT延長効果
各修飾体をそれぞれ50、25、12.5μｇ/ｍｌに調整しPBSに透析した。各サンプルと標準血漿を１：１に混合しAPTTを測定した。測定結果を下記表２に示す。なお、ＡＰＴＴは各サンプルとも２回測定し、その平均値を求めた。【０１５５】
【表２】
0004848270.tif 000003
【０１５６】
以上の結果より  205A43Aトロンビンにおいては5.6個の修飾においても未修飾よりもAPTTの延長効果の増強が確認された。14.6、22.4個と修飾数が増えるにつれAPTT延長効果は増加したが  22.4個修飾においては回収率は約５０％にまで低下した。回収率とAPTT延長効果の観点から5個以上の修飾が修飾によるAPTT延長効果には効率的であるが２２個以上の修飾は回収率の低下があることが確認された。
構造変化を最小にするため単純に活性中心セリンをデヒドロアラニンに変換することで得られたAHTに比較し、205A43Aトロンビンは高いFVIII特異性を有している事が分かった。【０１５７】
以上の結果から、205A43Aトロンビン誘導体はカルボキシル基修飾の有無に関わらず強いAPTT延長効果を有した。またカルボキシル基の修飾によってさらにAPTT延長効果は増加した。M-トロンビン惹起血小板凝集抑制（PAR1活性化阻害）に依存した血小板凝集抑制効果はカルボキシル基の修飾の有無にかかわらず有したが、カルボキシル基の修飾後の方が非常に強いものであった。したがって、205A43AトロンビンはAPTTを中心とした血液凝固に主に強く作用し且つおだやかな血小板凝集抑制効果を有するのに対し、カルボキシル基修飾205A43AトロンビンはAPTTと共に強い抗血小板能を有する事が分かった。修飾された205A43AトロンビンはM-トロンビン惹起血小板凝集抑制（PAR1活性化阻害）に加えリストセチン惹起血小板凝集抑制効果も有していたが、修飾をしていない205A43Aトロンビンは高濃度においてもリストセチン惹起血小板凝集を有してはいなかった。よって下記に示される特徴を有した抗血栓効果を有するトロンビン誘導体が得られた。
カルボキシル基修飾205A43Aトロンビン：
APTT延長効果（大）、PAR１阻害（大）、リストセチン惹起血小板凝集（大）      205A43Aトロンビン：
APTT延長効果（大）、PAR１阻害（小）、リストセチン惹起血小板凝集（無し）
また、ＩＡｓｙｓを用いたトロンビン基質結合能比較実験において205A43Aトロンビンが非常に高いAPTT延長効果を有していた理由として、２０５番目のセリンおよび４３番目のヒスチジンを同時に変異させた本トロンビン誘導体がその変異によって、完全に基質分解活性を失うとともに、AHTに比較し高いFVIII結合能（Ｆｂｇｎとの結合能が相対的に低下）を有していたためと推測された。後述の実験例１６および１７記載のように他のアミノ酸の置換の組み合わせにおいても２０５番目のセリンおよび４３番目のヒスチジンを同時に変異させたトロンビン誘導体はAPTT延長を主効果とした高い抗血栓効果を有することがわかった。【０１５８】
[実験例１３] 
（１）B鎖203グリシンをアラニンにB鎖205セリンをグリシンにB鎖７７リシンをグルタミン酸に置換したトロンビン（77E203A205Gトロンビン）の発現
77E203A205GトロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。77E203A205Gトロンビン塩基配列を配列番号２７に示す。
77E203A205Gトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にはバンドは確認されず、溶出ピークにトロンビン同様のバンドが確認された。引き続き実験例１の(3)の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された77E203A205Gトロンビンが約3ｍｇ得られた。【０１５９】
（２）77E203A205Gトロンビン添加血液のAPTTの測定
77E203A205Gトロンビン50μgをPBSに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。同様にPBSを、標準血漿（国際試薬社）に容量比１：１の割合となるように添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは４４秒であったのに対し、77E203A205GトロンビンのAPTTは７４秒であり1.68倍にAPTTを延長した。
実験例２において203A205Gトロンビンは同条件下APTTの延長が1.09倍であったので77番目リシンをグルタミン酸に置換することで1.5倍にAPTT延長効果が増加している。【０１６０】
（３）PRPを用いた77E203A205G トロンビンの抗血小板効果の評価
評価１：採血直後のクエン酸添加全血10mlを、800rpmで15分遠心し、上澄みよりPRP2mlを得た。さらに2800rpmで10分遠心分離することによりPPPを得た。１００μｌ添加した場合に77E203A205G トロンビンの終濃度が、７０μｇ／ｍｌになるように濃度が調製された、77E203A205GトロンビンのPBS溶液を、１００μｌずつPRP130μｌに添加し、惹起物質として５ｍｇ/mlリストセチン  PBS溶液35μｌを添加した。コントロールとして、PRP130μｌに、５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl、pH7.4  100μｌを添加し透過率の経時変化を記録したが  リストセチン惹起血小板凝集抑制作用は確認されなかった。
評価２：惹起物質として1μｇ/mlＭ−トロンビンPBS溶液を用いた以外は、評価１の方法に準じて実験を行った。コントロールとして、PRP130μｌに、PBS  100μｌを添加し透過率の経時変化を記録したが、Ｍ−トロンビン惹起血小板凝集抑制作用を示さなかった。
以上より、203A205Gトロンビンは十分な抗血栓能を有していなかったが77E203A205Gトロンビンは７７リシンの置換によりＦｂｇｎ結合能を低下させることにより大幅なAPTT延長効果の増加が起こった。また、77E203A205G トロンビンはＭ−トロンビン及びリストセチン惹起血小板凝集に対し抑制効果を示さなかった。【０１６１】
（４）カルボキシル基修飾体のAPTT試験
さらに、1mg/5mlの77E203A205Gトロンビン  0.5M NaCl（pH6.5）を0.25M  グリシンエチルエステル  0.5M NaCl（pH6.5）に4℃で3時間透析した後  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(和光純薬)）を、その濃度が20mg/mlになるように添加し、２５℃にて１時間インキュベーションし、77E203A205Gトロンビンのカルボキシル基を修飾した。可溶化状態で約35％の修飾体が回収された。
カルボキシル基修飾77E203A205G トロンビン50μgを、PBS  １ｍｌに溶解した溶液100μｌを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１で添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは45秒であったのに対し、カルボキシル基修飾77E203A205GトロンビンのAPTTはそれぞれ77.5秒であった。【０１６２】
（５）プロトロンビン時間（PT）の測定
77E203A205Gトロンビン及びカルボキシル基修飾77E203A205Gトロンビン50μgを、PBS１ｍｌに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）にそれぞれ容量比で１：１の割合となるように添加し、PTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１（容量比）となるように添加したものをコントロールとし、PTを測定した。なお、PT試薬にはSIGMA社のTHROMBOPLASTIN WITH CALSIUMを使用した。その結果、コントロールのPTは20秒であったのに対し77E203A205Gトロンビンは22秒、カルボキシル基修飾77E203A205GトロンビンのPTは23秒でありいずれもPTの延長効果は示さなかった。【０１６３】
（６）PRPを用いたカルボキシル基修飾77E203A205G トロンビンの抗血小板効果の評価
評価１：採血直後のクエン酸添加全血10mlを、800rpmで15分遠心し、上澄みよりPRP2mlを得た。さらに2800rpmで10分遠心分離することによりPPPを得た。１００μｌ添加した場合に修飾77E203A205G トロンビンの終濃度が、５０μｇ／ｍｌになるように濃度が調製された、修飾77E203A205GトロンビンのPBS溶液を、１００μｌずつPRP130μｌに添加し、惹起物質として５ｍｇ/mlリストセチン  PBS溶液35μｌを添加した。コントロールとして、PRP130μｌに、５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl、pH7.4  100μｌを添加し透過率の経時変化を記録した。結果を図２５に示す。【０１６４】
評価２：惹起物質として1μｇ/mlＭ−トロンビンPBS溶液を用いた以外は、評価１の方法に準じて実験を行った。コントロールとして、PRP130μｌに、PBS  100μｌを添加し透過率の経時変化を記録した。結果を図２６に示す。
以上の結果よりカルボキシル基修飾77E203A205Gトロンビンはカルボキシル基の修飾前に比較しAPTT延長効果の増強は確認されなかったが、Ｍ−トロンビン惹起血小板凝集、リストセチン惹起血小板凝集抑制効果を示した。また、７７のグルタミン酸への置換により置換前に比較し回収率の顕著な低下が確認された。【０１６５】
（７）77E203A205GトロンビンのＦｂｇｎ及びＴＭへの結合特異性の確認
203A205Gトロンビンの0.1mg/ml  10mM リン酸バッファー（pH7.7）溶液、および77E203A205Gトロンビンの0.1mg/ml  10mM リン酸バッファー（pH7.7）溶液を、それぞれNHS活性化CMデキストランキュベット（日製産業社）に添加し、10分間、25℃で撹拌することにより、被験サンプル（トロンビン誘導体）をNHS活性化CMデキストランキュベットに固定し、203A205Gトロンビン固定化キュベットおよび77E203A205Gトロンビン固定化キュベットを得た。203A205Gキュベットには約4100arcの蛋白質が77E203A205Gキュベットには約2000arcの蛋白質が固相化された。引き続き１M エタノールアミン（pH８）を0.2ml加えブロッキング処理を行った。
さらに両キュベットを50mM  リン酸緩衝液、２M  NaCl、30mM  ベンズアミジン（pH7.4）で洗浄、再生後、両キュベットに５００ｎMのＦｂｇｎ溶液（50mM  リン酸緩衝液、0.15M  NaCl（pH7.4）に溶解）を100μｌ加えたところ、3分後203A205Gトロンビン固相化キュベットには約３００arc secのＦｂｇｎが吸着され、77E203A205Gトロンビン固相化キュベットには約８０arc secのＦｂｇｎが吸着された。
さらに両キュベットを同様に洗浄、再生後、両キュベットに５００ｎMのＦＶＩＩＩ溶液（５０ｍM  Tris塩酸  ０．１５M  NaCl  １０ｍM  CaCl2（pH7.4）に溶解）を100μｌ加えたところ3分後203A205Gトロンビン固相化キュベットには約３００arc secのＦＶＩＩＩが吸着され、77E203A205Gトロンビン固相化キュベットには約３００arc secのＦＶＩＩＩが吸着された。
さらに両キュベットを50mM  リン酸緩衝液、２M  NaCl、30mM  ベンズアミジン（pH7.4）で洗浄、再生後、203A205Gトロンビン固定化キュベットおよび77E203A205Gトロンビン固定化キュベットそれぞれに、50nMの可溶性ＴＭ溶液（コスモバイオ）（50mM  リン酸緩衝液、0.15M  NaCl（pH7.4）に溶解）を100μｌ加えたところ、3分後  203A205Gトロンビン固相化キュベットには約100arc secのＴＭが吸着され、77E203A205Gトロンビン固相化キュベットには約20arc secのＴＭが吸着された。
以上の結果より203A205Gトロンビン誘導体に新たにB鎖７７リシンのグルタミン酸への置換を加えることでキュベット上で血液凝固第８因子吸着に対してＦｂｇｎ吸着量は約3分の1に  ＴＭ吸着は約2分の1に低下している事がわかった。
またIAｓｙｓ  FAST  FIT  PROGRAM（日製産業）による解析の結果203A205G  に対するＦｂｇｎ結合定数は１０．８ｎM、ＦＶＩＩＩ結合能は５．０７ｎM、77E203A205Gに対するＦｂｇｎ結合能は１９０ｎM、ＦＶＩＩＩ結合能は２２．５ｎMであった。
このB鎖７７リシンの置換によりＦｂｇｎに対するFVIII特異性の向上に起因し実験例１３に記載の77E203A205Gトロンビンは203A205Gトロンビンに比較し高いAPTT延長能を有していることが予測された。【０１６６】
［実験例１４］
（１）B鎖203グリシンをアラニンにB鎖205セリンをアラニンにB鎖99アスパラギン酸をアスパラギンにB鎖７７リシンをグルタミン酸に置換したトロンビン（77E203A205A99Nトロンビン）の発現
77E203A205A99NトロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。77E203A205A99Nトロンビン塩基配列を配列番号２９に示す。
77E203A205A99Nトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にはバンドは確認されず、溶出ピークにトロンビン同様のバンドが確認された。引き続き実験例１の（３）の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された77E203A205A99Nトロンビンが約3ｍｇ得られた。【０１６７】
（２）77E203A205A99Nトロンビン添加血液のAPTTの測定
77E203A205A99Nトロンビン50μgをPBSに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。同様にPBSを、標準血漿（国際試薬社）に容量比１：１の割合となるように添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは４１秒であったのに対し、77E203A205A99NトロンビンのAPTTは３９秒であった。以上より、77E203A205A99Nトロンビンはヒルジンゲルへの結合能を有し且つ、活性が十分に低下し且つＦｂｇｎ結合能を低下させる変異を加えてはているものも十分な抗APTT効果を有していないことがわかった。【０１６８】
実験例１５
B鎖203グリシンをアラニンに置換したトロンビン（203Aトロンビン）の発現
203AトロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。203Aトロンビン塩基配列を配列番号３１に示す。
203Aトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にはバンドは確認されず、溶出ピークにトロンビン同様のバンドが確認された。引き続き実験例１の(3)の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された203Aトロンビンが約２mg得られた。
203Aトロンビンのトロンビン基質分解活性を、前述の方法Ｂに従って測定した。結果を図２０に示す。FXIIIのA鎖は30分後においてすでに分解物が確認され3時間後には半量以上が分解を受けた。
さらに、203Aトロンビンのトロンビン基質分解活性を、前述の方法Cに従って測定した結果、３時間後クロットが形成された。
以上の結果より  203Aトロンビンは 非特許文献５において完全に活性を失った誘導体と報告されているものも、本発明におけるトロンビン基質を用いた活性測定法においては、抗血栓剤として使用する目的においては明らかなトロンビン基質分解活性が確認され抗血栓剤として使用することが困難であることが分かった。【０１６９】
実験例１６
（１）205セリンをグリシンに43ヒスチジンをアラニンに置換したトロンビン（205G43Aトロンビン）の発現
205G43AトロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。205G43Aトロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３３に示す。
205G43A トロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にはバンドは確認されず、溶出ピークにトロンビン同様のバンドが確認された。引き続き実験例１の（３）の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された205G43A トロンビンが約0.5mg得られた。【０１７０】
（２）205G43A トロンビンの基質分解活性測定
（１）で得られた205G43A トロンビンのトロンビン基質分解活性を、前述の方法Ａに従って測定した結果、インキュベーション後の吸光度の増加はみられなかった。
さらに、205G43A トロンビンのトロンビン基質分解活性を、前述の方法Ｂに従って測定した結果、FXIIIのA鎖活性化産物のバンドは確認されなかった。205G43A トロンビンはヒルジンC末端ペプチド結合能を有し且つ十分に活性を失っていることが分かった。205G43Aトロンビン24μg及び12μｇを、PBS  1mlに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１の割合となるように添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは43秒であったのに対し、205G43AトロンビンのAPTTはそれぞれ62秒、55秒でありそれぞれ1.44倍、1.28倍にAPTTを延長した。
25μｇ/ｍｌのAhT添加のAPTT延長効果が1.25倍であり  24μｇ/ｍｌの205G43A トロンビンが1.44倍にAPTTを延長していることより、205G43A トロンビンはAhTに比べ1.15倍以上高いAPTT延長効果を示した。
以上の結果より、活性中心のセリン、ヒスチジンを同時に置換した205G43A トロンビンは低濃度においてもカルボキシル基の修飾を行わずに高いAPTT延長効果を示すことがわかった。【０１７１】
実験例１７
（１）205セリンをアラニンに43ヒスチジンをセリンに置換したトロンビン（205A43Sトロンビン）の発現
205A43SトロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。205A43Sトロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３５に示す。
205A43S トロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にはバンドは確認されず、溶出ピークにトロンビン同様のバンドが確認された。引き続き実験例１の（３）の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された205A43S トロンビンが約3mg得られた。【０１７２】
（２）205A43S トロンビンの基質分解活性測定
（１）で得られた205A43S トロンビンの基質分解活性を、前述の方法Ｂに従って測定した結果、FXIIIのA鎖活性化産物のバンドは確認されなかった。205A43S トロンビンはヒルジンC末端ペプチド結合能を有し且つ十分に活性を失っていることが分かった。次に205A43S トロンビン40μgを、PBS 1mlに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１の割合となるように添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは42秒であったのに対し、205A43SトロンビンのAPTTは72秒であり1.71倍にAPTTを延長した。50μｇ/ｍｌのAhTが1.36倍にAPTTを延長効果であったことより205A43S トロンビンはAhTに比べ少なくとも1.26倍以上の延長効果を持つ事が示された。以上の結果より、活性中心のセリン、ヒスチジンを同時に置換した205A43S トロンビンはカルボキシル基の修飾を行わずに高いAPTT延長効果を示すことがわかった。
【０１７３】
（３）205A43SトロンビンのＦｂｇｎ及びFVIIIへの結合特異性の比較
205A43Sトロンビン誘導体またはAHTの 約0.1mg/mlの10mM リン酸緩衝液（pH7.4）溶液を、NHS活性化CMデキストランキュベット（日製産業社）に添加し、10分間、25℃で撹拌することにより、被験サンプル（トロンビン誘導体）をNHS活性化CMデキストランキュベットに固定し、205A43SトロンビンまたはAHT固定化キュベットを得た。約1200arcの205A43Sトロンビンがキュベットに固定化された。引き続き１M エタノールアミン（pH８）を0.2ml加えブロッキング処理を行った。205A43SキュベットまたはAHTキュベットに100ｎMのＦｂｇｎまたはFVIIIを添加しそれぞれの結合曲線をモニターした。結果を図１７に示す。図１４よりAHTキュベットにはＦｂｇｎとFVIIIがほぼ同程度結合しているのに対し、図１７より205A43SトロンビンキュベットにはFVIIIの方がＦｂｇｎより多い結合が確認された。
さらに結合シグナルの比よりFVIIIとFbgnの結合比はAhTに比較し約1.2倍に向上している事が確認された。
また固定化蛋白との対比を考えると少なくとも205A43SトロンビンはAHT同等のFVIII結合能を有することが示された。構造変化を最小にするため単純に活性中心セリンをデヒドロアラニンに変換する事で得られたAHTに比較し、205A43Sトロンビンは高いFVIII特異性を有している事が分かった。【０１７４】
実験例１８
（１）B鎖77リシンをグルタミン酸に205セリンをアラニンに43ヒスチジンをアラニンに置換したトロンビン（77E205A43Aトロンビン）の発現
77E205A43A トロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。77E205A43A トロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３７に示す。
77E205A43A トロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にはバンドは確認されず、溶出ピークにトロンビン同様のバンドが確認された。引き続き実験例１の（３）の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された77E205A43A トロンビンが約3mg得られた。【０１７５】
（２）77E205A43A トロンビン50μg及び25μｇを、PBS  1mlに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１の割合となるように添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは45秒であったのに対し、77E205A43AトロンビンのAPTTはそれぞれ92秒（50μg）、85秒（25μg）であり、それぞれ2.04倍、1.89倍の延長であった。実施例12にて50μｇ/ｍｌの205A43Aトロンビンが1.7倍のAPTT延長効果であったのB鎖７７リシンのグルタミン酸への置換で置換前に比較しAPTT延長効果が1.2倍に向上した。【０１７６】
（３）PRPを用いた77E205A43A トロンビンの抗血小板効果の評価
評価１：採血直後のクエン酸添加全血10mlを、800rpmで15分遠心し、上澄みよりPRP2mlを得た。さらに2800rpmで10分遠心分離することによりPPPを得た。１００μｌ添加した場合に77E205A43A トロンビンの終濃度が、100μｇ／ｍｌになるように濃度が調製された、77E205A43AトロンビンのPBS溶液を、１００μｌずつPRP130μｌに添加し、惹起物質として５ｍｇ/mlリストセチン  PBS溶液35μｌを添加した。コントロールとして、PRP130μｌに、５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl、pH7.4  100μｌを添加し透過率の経時変化を記録したが、コントロールと同様の活性化曲線を示し、抑制作用は示さなかった。【０１７７】
評価２：惹起物質として1μｇ/mlＭ−トロンビンPBS溶液を用いた以外は、評価１の方法に準じて実験を行った。コントロールとして、PRP130μｌに、PBS  100μｌを添加し透過率の経時変化を記録した。結果を図２７に示す。
以上の結果より77E205A43A トロンビンは、77リシンをグルタミン酸に変化させることでＦｂｇｎ結合能が特異的に低下し、もともと２０５番目のセリン及び４３番目のヒスチジンの同時変異によりFVIII結合能が高まり強いAPTT抑制効果を持っていた205A43Aトロンビンよりも、さらに強いAPTT抑制効果を示すことがわかった。また、77E205A43A トロンビンはリストセチン惹起血小板凝集抑制能は示さなかったが、Ｍ−トロンビン惹起血小板凝集抑制効果は示した。【０１７８】
（４）カルボキシル基修飾体のAPTT試験
さらに、1mg/5mlの77E205A43Aトロンビン  0.5M NaCl（pH6.5）を0.25M  グリシンエチルエステル  0.5M NaCl（pH6.5）に4℃で3時間透析した後  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(和光純薬)）を、その濃度が20mg/mlになるように添加し、２５℃にて１時間インキュベーションし、77E205A43A トロンビンのカルボキシル基を修飾した。可溶化状態で約40％の修飾体が回収された。
カルボキシル基修飾77E205A43A トロンビン50μg及び25μｇを、PBS  １ｍｌに溶解した溶液100μｌを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１で添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは45秒であったのに対し、カルボキシル基修飾77E205A43AトロンビンのAPTTはそれぞれ119秒（50μg）、89秒（25μg）であった。【０１７９】
（５）PRPを用いたカルボキシル基修飾77E205A43A トロンビンの抗血小板効果の評価
評価１：採血直後のクエン酸添加全血10mlを、800rpmで15分遠心し、上澄みよりPRP2mlを得た。さらに2800rpmで10分遠心分離することによりPPPを得た。１００μｌ添加した場合に修飾77E205A43A トロンビンの終濃度が、30μｇ／ｍｌになるように濃度が調製された、カルボキシル基修飾77E205A43AトロンビンのPBS溶液を、１００μｌずつPRP130μｌに添加し、惹起物質として５ｍｇ/mlリストセチン  PBS溶液35μｌを添加した。コントロールとして、PRP130μｌに、５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl、pH7.4  100μｌを添加し透過率の経時変化を記録した。結果を図２８に示す。【０１８０】
評価２：惹起物質として1μｇ/mlＭ−トロンビンPBS溶液を用いた以外は、評価１の方法に準じて実験を行った。コントロールとして、PRP130μｌに、PBS 100μｌを添加し透過率の経時変化を記録した。カルボキシル基修飾77E205A43Aトロンビンは結果を終濃度30μg/ｍｌにてＭ−トロンビン惹起血小板凝集を完全に抑制した。
以上の結果より77E205A43Aトロンビンは修飾によりAPTT延長能が増加した。又、Ｍ−トロンビン惹起血小板凝集及びリストセチン惹起血小板凝集抑制効果も示した。しかしながら77E203A205Gトロンビンのカルボキシル基修飾体同様に77E205A43Aトロンビンは修飾語の回収率はB鎖77のグルタミン酸への置換によって205A43Aトロンビンの修飾体に比較し大きく低下した。
【０１８１】
実験例１９
（１）B鎖24グルタミンをグルタミン酸に205セリンをアラニンに43ヒスチジンをアラニンに置換したトロンビン（24E205A43Aトロンビン）の発現
24E205A43A トロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。24E205A43A トロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３９に示す。
24E205A43A トロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画に若干のバンドが確認された。また、溶出ピークに大部分のトロンビンのバンドが確認された。引き続き実験例１の（３）の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った後、組み換えトロンビンを含有した溶出溶液を50mM NaHCO3 pH8に対して透析し、50mM NaHCO3 pH8  で平衡化したHI TRAP  ベンズアミジンカラム５ml(ファルマシア社)  にアプライした。50mM NaHCO3 0.3M NaCl pH8にて充分洗浄した後  50mM NaHCO3 0.3M NaCl 0.1M  ベンズアミジン  pH8にて溶出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された24E205A43A トロンビンが約１mg得られた。
24E205A43A トロンビン50μgを、PBS  1mlに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１の割合となるように添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは42秒であったのに対し、24E205A43AトロンビンのAPTTは62秒であった。【０１８２】
（２）24E205A43Aトロンビン及びAHTのＦｂｇｎ及びFVIIIへの結合特異性の比較
24E205A43Aトロンビン及びAHTを0.1mg/ml  10mM リン酸緩衝液（pH7.4）溶液を、それぞれNHS活性化CMデキストランキュベット（日製産業社）に添加し、10分間、25℃で撹拌することにより、被験サンプル（トロンビン誘導体）をNHS活性化CMデキストランキュベットに固定し、24E205A43Aトロンビン及びAHT固定化キュベットを得た。（それぞれ1380arc, 2400arc固相化）引き続き１M エタノールアミン（pH８）を0.2ml加えブロッキング処理を行った。
24E205A43Aトロンビンキュベット及びAHTキュベットにそれぞれ100ｎMのＦｂｇｎ及びFVIIIを添加しそれぞれの結合曲線をモニターした。結果を図１８および図１４に示す。
図１８より24E205A43AトロンビンキュベットにはFVIIIの方がＦｂｇｎより多くの結合が確認された。24E205A43Aは高いFVIII特異性を有している事が確認された。【０１８３】
（３）205A43Aトロンビン及び24E205A43AトロンビンのＴＭ結合能の比較
205A43Aトロンビン及び24E205A43Aトロンビン固定化キュベットに対し16.7nM  ついで50nMのＴＭを加えた。
結合曲線を図１９に示す。尚  205A43Aトロンビンは約980arc, 24E205A43Aトロンビンは約1380arcのトロンビン誘導体が固定化されている。
以上の結果より24E205A43AトロンビンはＦｂｇｎに対しFVIII特異性が高い誘導体でありAPTT延長効果も有していた。さらにはＴＭ結合能も大きく低下していることより生態に投与した際、本トロンビン変異体が生体内でのトロンビンによるプロテインCの活性化を抑制（阻害）することは無いと考えられる。【０１８４】
実験例２０
205セリンをアラニンに99アスパラギン酸をアラニンに置換したトロンビン（205A99Aトロンビン）の発現
205A99AトロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。205A99Aトロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号４１に示す。
205A99A トロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法にエカリンによる活性化を行ったところ、エカリンによるA,B鎖への切断が起こらなかった。
この結果より205A99Aトロンビンをプレトロンビンの形でCHO細胞にて発現した本実験においては2本鎖に活性化された205A99Aトロンビンを得ることはできなかった。【０１８５】
[実験例２１]
カルボキシル基修飾AHT及びカルボキシル基修飾203A205Gトロンビン、および205A43AトロンビンのAPTTの比較
PBSに溶解した50μｇ/mlのカルボキシル基修飾AHT、カルボキシル基修飾203A205Gトロンビン、205A43Aトロンビンを以下の２方法でAPTTを測定した。コントロールとしてPBSのみを添加して下記方法a,ｂにてAPTTを測定した。尚  カルボキシル基修飾AHTは残存活性の影響を極力防ぐために合成後、再度APMSF試薬（シグマ社）を２mg/ml添加し不活性化を行い、さらにその後PBSにて十分透析を行い残存APMSF試薬の除去を行った。【０１８６】
方法a：標準血漿１００μlにAPTT試薬５０μｌを加え３７℃で５分インキュベーションを行ったものにPBSに溶解した各サンプル１００μｌを加えさらにすばやく０．１M  CaCl2 を１２μｌ加えカルシウム添加から凝固までの時間を測定した。
方法ｂ：標準血漿１００μｌに、PBSに溶解した各サンプル１００μｌ及びAPTT試薬５０μｌを加え３７℃で５分インキュベーションを行った後０．１M  CaCl2 を２２μｌ加えカルシウム添加から凝固までの時間を測定した。【０１８７】
結果を以下に示す。
コントロール                            方法ａ  ４３秒；  方法ｂ  ４５秒
カルボキシル基修飾AHT                  方法a  １０５秒；方法ｂ  ６６秒
カルボキシル基修飾203A205Gトロンビン   方法a  ７５秒；  方法ｂ  ８０秒
205A43Aトロンビン                      方法a  ６７秒；  方法ｂ  ７７秒
カルボキシル基修飾205A43Aトロンビン    方法a   145秒；  方法ｂ  170秒【０１８８】
以上より、カルボキシル基修飾AHTにおいては方法aにて良くAPTTを延長したのに対しカルボキシル基修飾203A205Gトロンビン、205A43Aトロンビンにおいては方法ｂにて良くAPTTが延長された。またカルボキシル基修飾203A205Gトロンビンは205A43Aトロンビンよりも同一条件においてAPTT延長効果は高かった。
方法ａは標準血漿と各トロンビン誘導体混合物のインキュベーション時間が無いのに対し方法ｂは標準血漿と各トロンビン誘導体混合物が３７℃で５分インキュベーションされる。カルボキシル基修飾AHTにおいて方法ｂでAPTT延長効果が少なくなった理由としてトロンビンから化学的に合成されるAHTにおいて極微量に残存するトロンビンの存在を完全に否定できず極わずかなトロンビンが標準血漿と３７℃インキュベーションすることで微量の血液凝固因子（特にFVIII）活性化が起き、APTT延長効果を抑制したものと考えられた。一方、カルボキシル基修飾203A205Gトロンビン、205A43Aトロンビンにおいては遺伝子組み換え技術によって完全に活性を失っているトロンビン誘導体であり、標準血漿とインキュベーションした場合においても血液凝固因子の活性化は起きず、むしろインキュベーションを行った場合の方が平衡化され基質特異性が良く反映され顕著にAPTTを延長した。
以上の考察より、極微量のトロンビンの混入が考えられるAHTを用いるよりも、抗血栓剤としてトロンビン誘導体及びそのカルボキシル基修飾トロンビン誘導体は、遺伝子工学的に完全に不活性化されかつ均一な機能を有する。したがって、本発明のトロンビン誘導体及びそのカルボキシル基修飾トロンビン誘導体は、安定かつ高い薬効を示すことが予想される。【０１８９】
実験例２２
（１）B鎖77リシンをアラニンに205セリンをアラニンに43ヒスチジンをアラニンに置換したトロンビン（77A205A43Aトロンビン）の発現
77A205A43A トロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。77A205A43A トロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号43に示す。
77A205A43A トロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にはバンドは確認されず、溶出ピークにトロンビン同様のバンドが確認された。引き続き実験例１の（３）の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された77A205A43A トロンビンが約3mg得られた。
次いで方法Fに従いヘパリンゲルへの結合能を測定したところ野生型ヒトトロンビンと同等の溶出位置（A50%）にて溶出された。活性中心及びエクソサイトI上のアミノ酸の置換を行ったがヘパリン結合能は保持されていた事が確認された。【０１９０】
（２）77A205A43A トロンビン50μg及び25μｇを、PBS  1mlに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１の割合となるように添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは45秒であったのに対し、77A205A43AトロンビンのAPTTはそれぞれ90.5秒、85秒でありそれぞれ2.01倍、1．89倍の延長効果を示した。実施例12にて50μｇ/ｍｌの205A43Aトロンビンが1.7倍のAPTT延長効果であったので、B鎖７７リシンのアラニンへの置換でAPTT延長効果が1.2倍に増強された。【０１９１】
（３）カルボキシル基修飾体のAPTT試験
さらに、1mg/5mlの77A205A43Aトロンビン  0.5M NaCl（pH6.5）を0.25M  グリシンエチルエステル  0.5M NaCl（pH6.5）に4℃で3時間透析した後  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(和光純薬)）を、その濃度が20mg/mlになるように添加し、２５℃にて１時間インキュベーションし、77A205A43A トロンビンのカルボキシル基を修飾した。可溶化状態で約85％の修飾体が回収された。
カルボキシル基修飾77A205A43A トロンビン50μg及び25μｇを、PBS  １ｍｌに溶解した溶液100μｌを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１で添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは45秒であったのに対し、カルボキシル基修飾77A205A43AトロンビンのAPTTはそれぞれ144、109秒であった。【０１９２】
（４）プロトロンビン時間（PT）の測定
77A205A43Aトロンビン及びカルボキシル基修飾77A205A43Aトロンビン50μgを、PBS１ｍｌに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）にそれぞれ容量比で１：１の割合となるように添加し、PTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１（容量比）となるように添加したものをコントロールとし、PTを測定した。なお、PT試薬にはSIGMA社のTHROMBOPLASTIN WITH CALSIUMを使用した。その結果、コントロールのPTは23秒であったのに対し77A205A43Aトロンビンは24秒、カルボキシル基修飾77A205A43AトロンビンのPTは25秒でありいずれもPTの延長効果は示さなかった。以上の結果よりB鎖７７リシンをアラニンに置換することで置換前に比較しAPTT延長効果が高まった。又、修飾体においても７７リジンをアラニンに置換することでAPTT延長効果が増強された。又、B鎖77をグルタミン酸に置換した場合に比べ修飾した場合の回収率の大きな低下は認められなかったことよりB鎖７７における修飾の適性はアラニンの方が高い事が示された。【０１９３】
実験例２３
（１）B鎖６５リシンをアラニンに205セリンをアラニンに43ヒスチジンをアラニンに置換したトロンビン（65A205A43Aトロンビン）の発現
65A205A43A トロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。65A205A43A トロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号４５に示す。
65A205A43A トロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。引き続き実験例１の（３）の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された65A205A43A トロンビンが約3mg得られた。【０１９４】
（２）65A205A43A トロンビン50μg及び25μｇを、PBS  1mlに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１の割合となるように添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは42秒であったのに対し、65A205A43AトロンビンのAPTTはそれぞれ93秒、86秒でそれぞれ2.21倍、2.05倍の延長効果であった。実施例12にて50μｇ/ｍｌの205A43Aトロンビンが1.7倍のAPTT延長効果であったの６５リシンのアラニンへの置換でAPTT延長効果が１．３倍に増強された。【０１９５】
（３）カルボキシル基修飾体のAPTT試験
さらに、1mg/5mlの65A205A43Aトロンビン  0.5M NaCl（pH6.5）を0.25M  グリシンエチルエステル  0.5M NaCl（pH6.5）に4℃で3時間透析した後  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(和光純薬)）を、その濃度が20mg/mlになるように添加し、２５℃にて１時間インキュベーションし、65A205A43A トロンビンのカルボキシル基を修飾した。
カルボキシル基修飾65A205A43A トロンビン50μg、25μｇを、PBS  １ｍｌに溶解した溶液100μｌを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１で添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは41秒であったのに対し、カルボキシル基修飾65A205A43A トロンビンのAPTTはそれぞれ118秒、88秒であった。【０１９６】
（４）プロトロンビン時間（PT）の測定
65A205A43Aトロンビン及びカルボキシル基修飾65A205A43Aトロンビン50μgを、PBS１ｍｌに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）にそれぞれ容量比で１：１の割合となるように添加し、PTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１（容量比）となるように添加したものをコントロールとし、PTを測定した。なお、PT試薬にはSIGMA社のTHROMBOPLASTIN WITH CALSIUMを使用した。その結果、コントロールのPTは23秒であったのに対し65A205A43Aトロンビンは22秒、カルボキシル基修飾65A205A43AトロンビンのPTは25秒でありいずれもPTの延長効果は殆ど示さなかった。【０１９７】
（５）PRPを用いた65A205A43Aトロンビンの抗血小板効果の評価
評価１：採血直後のクエン酸添加全血10mlを、800rpmで15分遠心し、上澄みよりPRP2mlを得た。さらに2800rpmで10分遠心分離することによりPPPを得た。１００μｌ添加した場合に65A205A43Aトロンビンの終濃度が、100μｇ／ｍｌになるように濃度が調製された、65A205A43AトロンビンのPBS溶液を、１００μｌずつPRP130μｌに添加し、惹起物質として５ｍｇ/mlリストセチン  PBS溶液35μｌを添加した。コントロールとして、PRP130μｌに、５ｍM  リン酸緩衝液  0.15M  NaCl、pH7.4  100μｌを添加し血小板凝集抑制実験を行ったがコントロールと65A205A43Aトロンビンに違いは無かった。【０１９８】
評価２：惹起物質として1μｇ/mlＭ−トロンビンPBS溶液を用い65A205A43Aトロンビンの終濃度が、100,50,25,10μｇ／ｍｌになるように添加した以外は、評価１の方法に準じて実験を行った。コントロールとして、PRP130μｌに、PBS  100μｌを添加し透過率の経時変化を記録した。結果を図２９、３０、３１に示す。
評価３：惹起物質として1μｇ/mlＭ−トロンビンPBS溶液を用い１００μｌ添加した場合に修飾65A205A43Aトロンビンの終濃度が、それぞれ36,18,9,4.5μｇ／ｍｌになるように濃度が調製された、修飾65A205A43AトロンビンのPBS溶液を加え、評価1の方法に準じて実験を行った。結果を図３２、３３、３４に示す。
評価４：修飾65A205A43Aトロンビンの終濃度が、36μｇ／ｍｌになるように濃度が調製された、修飾65A205A43AトロンビンのPBS溶液を、１００μｌずつPRP130μｌに添加し、惹起物質として５ｍｇ/mlリストセチン  PBS  溶液35μｌを添加した。コントロールとして、PRP130μｌに、PBS  100μｌを添加し透過率の経時変化を記録した。結果を図３５に示す.【０１９９】
以上の結果より65A205A43Aは205A43Aに比較して高いAPTT延長効果を有し且つより低濃度で強いＭ−トロンビン惹起血小板凝集抑制効果を示した。また修飾65A205A43Aトロンビンはリストセチン惹起血小板凝集抑制効果を示すと共に、他の誘導体に比較しさらに高いレベルのトロンビンレセプター活性化抑制効果を示した。【０２００】
（６）65A205A43Aトロンビン及び205A43AトロンビンのＦｂｇｎ及びFVIIIへの結合特異性の比較
65A205A43Aトロンビン誘導体及び205A43Aトロンビンの約0.1mg/mlの濃度の10mM リン酸緩衝液（pH7.7）溶液を、それぞれNHS活性化CMデキストランキュベット（日製産業社）に添加し、10分間、25℃で撹拌することにより、被験サンプル（トロンビン誘導体）をNHS活性化CMデキストランキュベットに固定し、65A205A43Aトロンビン固定化キュベットを得た。（約1800arc結合）引き続き１M エタノールアミン（pH8）を0.2ml加えブロッキング処理を行った。65A205A43Aキュベットに100nMのＦｂｇｎ及びFVIIIを添加しそれぞれの結合曲線をモニターした。結果を図３６に示す。図３６より205A43Aトロンビンに比較し65A205A43AキュベットではFbgn結合能が低下しそれによりFVIIIの特異性が高くなっている事が確認された。
FVIII、Fbgn結合能の比はB鎖６５リシンの置換前に比較し2.8倍に向上していることが確認された。【０２０１】
（７）205A43Aトロンビン及び65A205A43AトロンビンのＴＭ結合能の比較
65A205A43Aトロンビン固定化キュベットに対し16.7nM、ついで50nMのＴＭを加えた。
結合曲線を図３７に示す。尚、65A205A43Aトロンビンは約1800arc固定化されている。
以上の結果より図１９記載の205A43AトロンビンのＴＭ結合能と比較した場合、固定化蛋白量の相対的な比率で換算すると65A205A43AはB鎖６５リシンの置換前に比較し約30％にＴＭ結合能が低下していた。ＴＭ結合能が低下していることより生態に投与した際、65A205A43Aトロンビン変異体が生体内でのトロンビンによるプロテインC 活性化の抑制（阻害）が低下していると考えられる。【０２０２】
実験例２４
（１）B鎖205セリンをグリシンに置換したトロンビン（以下205Gトロンビン）の発現
205GトロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。
205Gトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現させた。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にはバンドは確認されず、溶出ピークにトロンビン同様のバンドが確認された。引き続き実験例１の（３）の方法に準じて硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上  ほぼ純化された205Gトロンビンが約５ｍｇ得られた。
【０２０３】
（２）205Gトロンビンの基質分解活性測定
トロンビンのトロンビン基質分解活性を、前述の方法Ｂに従って測定した結果を図４２に示す。レーン７に3時間インキュベーション後のサンプルが示されている。約５０％の分解されたＦXIIIのバンドが確認された。以上より、205Gトロンビンは抗血栓剤として使用する上で問題となる活性が残存していることがわかった。【０２０４】
実験例２５
（１）B鎖197アルギニンをアラニンに205セリンをアラニンに43ヒスチジンをアラニンに置換したトロンビン（197A205A43Aトロンビン）の発現
197A205A43A トロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。197A205A43Aトロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号47に示す。
197A205A43A トロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にはバンドは確認されず、溶出ピークにトロンビン同様のバンドが確認された。引き続き実験例１の（３）の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された197A205A43Aトロンビンが3mg得られた。
【０２０５】
（２）197A205A43A トロンビン50μg及び25μｇを、PBS  1mlに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１の割合となるように添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは43.5秒であったのに対し、197A205A43AトロンビンのAPTTはそれぞれ77.5秒、65秒であった。
以上の結果より197A205A43Aは197アルギニンの置換前に比較し若干強いAPTT延長効果を示した。また、１９７アルギニンの置換によりRGDA配列に起因した細胞増殖活性は喪失していると考えられる。【０２０６】
実験例２６
（１）B鎖77リシンをセリンに205セリンをアラニンに43ヒスチジンをアラニンに置換したトロンビン（77S205A43Aトロンビン）の発現
77S205A43A トロンビンのＤＮＡに相当する変異導入プライマーを用いたPCR法にて合成した。77S205A43Aトロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号49に示す。
77S205A43A トロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にはバンドは確認されず、溶出ピークにトロンビン同様のバンドが確認された。引き続き実験例１の（３）の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された77S205A43A トロンビンが2.5mg得られた。【０２０７】
（２）77S205A43A トロンビン50μgを、PBS  1mlに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１の割合となるように添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは4８秒であったのに対し、77S205A43AトロンビンのAPTTはそれぞれ８６秒であった。【０２０８】
実験例２７
（１）B鎖６５リシンをアラニンにB鎖７７リシンをアラニンに205セリンをアラニンに43ヒスチジンをアラニンに置換したトロンビン（65A77A205A43Aトロンビン）の発現
65A77A205A43Aトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。65A77A205A43Aトロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号51に示す。引き続き実験例１の（３）の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された65A77A205A43Aトロンビンが3mg得られた。【０２０９】
（２）65A77A205A43Aトロンビン50μg及び25μｇ及び12.5μｇを、PBS  1mlに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１の割合となるように添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは4９秒であったのに対し、65A77A205A43AトロンビンのAPTTはそれぞれ１４５．５秒、１１２．５秒、８６．５秒で2.3倍、1.77倍であった。。実施例12にて50μｇ/ｍｌの205A43Aトロンビンが1.7倍のAPTT延長効果であったの６５リシンのアラニン、B鎖７７リシンのアラニンへの置換でAPTT延長効果が1.３５倍に増強された。
B鎖65及び７７番目のアミノ酸の置換の相乗効果によって65A77A205A43Aトロンビンが非常に高いAPTT延長効果を有する事が確認された。【０２１０】
実験例２８
（１）B鎖６５リシンをアラニンにB鎖２４５アルギニンをアラニンに205セリンをアラニンに43ヒスチジンをアラニンに置換したトロンビン（65A245A205A43Aトロンビン）の発現
65A245A205A43Aトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。65A245A205A43Aトロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号53に示す。引き続き実験例１の（３）の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された65A245A205A43Aトロンビンが２mg得られた。
引き続き方法Fに従ってヘパリン結合能の確認を行ったところA35%にて溶出された。
ヒト野生型トロンビンの３５％にヘパリン親和性が低下した。このヘパリン親和性の低下はヘパリン結合領域であるエクソサイトII上のアミノ酸  ２４５アルギニンの置換に起因すると考えられる。【０２１１】
（２）65A245A205A43Aトロンビン50μg及び25μｇを、PBS  1mlに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１の割合となるように添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは41秒であったのに対し、65A245A205A43AトロンビンのAPTTはそれぞれ６５秒、６０秒であった。
以上の結果より65A245A205A43AトロンビンはAPTT延長効果を有し且つエクソサイトII上のアミノ酸の置換によってヘパリン親和性がヒト野生型トロンビンに比較し低下していることが示された。【０２１２】
実験例２９
（１）B鎖６５リシンをアラニンにB鎖２４８リシンをアラニンに205セリンをアラニンに43ヒスチジンをアラニンに置換したトロンビン（65A248A205A43Aトロンビン）の発現
65A248A205A43Aトロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。65A248A205A43Aトロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号55に示す。引き続き実験例１の（３）の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された65A248A205A43Aトロンビンが２mg得られた。
引き続き方法Fに従ってヘパリン結合能の確認を行ったところ  A35%にて溶出された。
ヒト野生型トロンビンの３５％にヘパリン親和性が低下した。このヘパリン親和性の低下はヘパリン結合領域であるエクソサイトII上のアミノ酸  ２４８リシンの置換に起因すると考えられる。【０２１３】
（２）65A248A205A43Aトロンビン50μg及び25μｇを、PBS  1mlに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１の割合となるように添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは4５秒であったのに対し、65A248A205A43AトロンビンのAPTTはそれぞれ８３秒、７１秒であった。
以上の結果より65A248A205A43Aトロンビンにおいても65A245A205A43Aトロンビン同様にAPTT延長効果を有し且つエクソサイトII上のアミノ酸の置換によってヘパリン親和性がヒト野生型トロンビンに比較し低下していることが示された。【０２１４】
実験例３０
採血直後のクエン酸添加全血200μｌをガラスチューブに入れ、PBSに溶解した205A43Aトロンビン，M-205A43AトロンビンM-65A205A43Aトロンビン溶液（100μｇ/ｍｌ）  及び  PBSをそれぞれ20μｌを添加した。各トロンビン誘導体添加血液に0.1M  CaCl2 を30μｌを添加した。
カルシウム添加後、30秒毎に流動性を確認し  流動性を失った時間（凝固時間を）測定した結果
PBS                          4分30秒
205A43Aトロンビン            7分
M-205A43Aトロンビン          8分30秒
M-65A205A43Aトロンビン溶液  8分30秒
となった。全血においても205A43Aトロンビン，M-205A43AトロンビンM-65A205A43Aトロンビンは高い抗凝固能を示した。【０２１５】
実験例３１
（１）B鎖１９フェニルアラニンをアラニンに205セリンをアラニンに43ヒスチジンをアラニンに置換したトロンビン（19A205A43Aトロンビン）の発現
19A205A43A トロンビンを実験例１の（１）の方法で発現した。19A205A43Aトロンビンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号57に示す。実験例１の（２）の方法に準じてヒルジンＣ末端ペプチド結合能を確認したところ、素通り分画にはバンドは確認されず、溶出ピークにトロンビン同様のバンドが確認された。引き続き実験例１の（３）の方法に準じ、硫酸化セルロファイン、ヒルジンＣ末端ペプチドカラムによる精製を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ほぼ純化された19A205A43A トロンビンが約3mg得られた。【０２１６】
（２）19A205A43A トロンビン50μg及び25μｇを、PBS  1mlに溶解したものを、標準血漿（国際試薬社）に容量比で１：１の割合となるように添加し、APTTを測定した。PBSを、標準血漿（国際試薬社）に１：１の割合となるように添加したものをコントロールとし、APTTを測定した。なお、APTT試薬には国際試薬社のものを使用した。その結果、コントロールのAPTTは46．5秒であったのに対し、19A205A43AトロンビンのAPTTはそれぞれ83.5秒、79秒であった。
19フェニルアラニンのアラニンへの置換により置換前に比較しAPTT延長効果が若干向上していることが示された。【０２１７】
（3）19A205A43AトロンビンのＦｂｇｎ及びFVIIIへの結合特異性の比較
19A205A43Aトロンビン誘導体の約0.1mg/mlの濃度の10mM リン酸緩衝液（pH7.7）溶液を、NHS活性化CMデキストランキュベット（日製産業社）に添加し、10分間、25℃で撹拌することにより、被験サンプル（トロンビン誘導体）をNHS活性化CMデキストランキュベットに固定し、19A205A43Aトロンビン固定化キュベットを得た。（約1000arc結合）引き続き１M エタノールアミン（pH8）を0.2ml加えブロッキング処理を行った。19A205A43Aキュベットに100nMのＦｂｇｎ及びFVIIIを添加しそれぞれの結合曲線をモニターした。結果を図４７に示す。205A43Aトロンビンに比較し19A205A43AキュベットではFbgn結合能が低下し且つ、FVIIIの特異性が高くなっている事がが確認された。
【産業上の利用の可能性】
【０２１８】
本発明のトロンビン誘導体は、従来のトロンビン誘導体に比べて、より少ない使用量で安定な抗血栓効果を得ることができる。この効果は、例えば、実施例に示すような血漿のAPTT測定や全血凝固時間測定、血小板凝集能抑制効果によって確認することができる。本発明において、抗血栓効果とは、抗血小板、抗血液凝固の１次止血、２次止血を合わせた全体での抗血栓作用を意味する。本発明の抗血小板効果、および抗血液凝固効果を有するトロンビン誘導体は、例えば、１次止血においては主にGPIｂα（血小板受容体糖タンパク質Iｂα）およびＰＡＲ１をはじめとするトロンビンレセプターに作用することで血小板へのカルボキシル基修飾トロンビン（以下「Ｍ−トロンビン」と言うことがある）、リストセチンおよびずり応力等の刺激を抑制して血小板凝集および粘着を抑制し、２次止血においては主にＦＶＩＩＩの活性化を抑制してAPTTを特異的に延長する。
【０２１９】
また、活性中心アミノ酸及びその他のアミノ酸の置換を行うことにより、高いAPTT延長効果を持つが抗血小板効果は低いタイプのトロンビン誘導体や、高いAPTT延長効果と高い抗血小効果（但しPAR1阻害効果のみ）を有するタイプのトロンビン誘導体など、効果の発現態様が異なるトロンビン誘導体が得られる。この活性中心アミノ酸およびそれ以外のアミノ酸が置換された本発明のトロンビン誘導体は、生体内で起こるＴＭ上におけるトロンビンによるプロテインCの活性化を抑制する。
さらに、本発明のトロンビン誘導体のカルボキシル基を修飾すれば、単にＡＰＴＴを延長するのみならず、アミノ酸の置換に依存して抗血小板効果、特にPAR1活性化及びリストセチン惹起血小板凝集抑制効果をも付加、制御することができ、種々の血栓症に適応しうる抗血液凝固効果、抗血小板効果を持ったトロンビン誘導体を得ることが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図２３】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【配列表】
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