(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液状ロタウイルスワクチン製剤であって、
ａ）少なくとも一株のロタウイルス１×１０5〜１０００×１０5ｐｆｕ／ｍＬ、
ｂ）糖１〜７０％（ｗ／ｖ）、
ｃ）リン酸ナトリウム０．０１〜２Ｍ、および
ｄ）コハク酸塩、クエン酸塩および乳酸塩からなる群から選択される少なくとも一種のカルボン酸塩０．０５〜２Ｍを含む製剤。
【請求項２】
前記糖が、スクロース、マンニトール、ラクトース、ソルビトール、ブドウ糖、フコース、トレハロース、ポリアスパラギン酸、イノシトールヘキサリン酸（フィチン酸）、シアル酸またはＮ−アセチルノイラミン酸−ラクトースからなる群から選択される、請求の範囲第１項に記載の製剤。
【請求項３】
さらに、
ｅ）組織培養培地、生理的食塩水および水からなる群から選択される少なくとも一種の希釈剤を含む、請求の範囲第１項に記載の液状ワクチン製剤。
【請求項４】
糖の濃度が５〜７０％、リン酸ナトリウムの濃度が０．０５〜０．３Ｍ、および前記少なくとも一種のカルボン酸がクエン酸塩またはコハク酸塩であり、その濃度が０．０５〜０．７Ｍである、請求の範囲第１項に記載の製剤。
【請求項５】
ｐＨがｐＨ５．０〜ｐＨ８．０である、請求の範囲第１項に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、ワクチン類として有用であるロタウイルス類の新規な液状および凍結乾燥製剤、およびその調製方法に関する。
発明の背景
ロタウイルス類（ＲＶ）は、先進国では幼児および若齢の小児の入院を必要とする疾患であり、世界の発展途上地域では５歳未満の小児でしばしば死因ともなる急性の胃腸炎の原因となる。米国、オーストラリア、および日本における研究により、急性下痢性疾患で入院する小児の３４から６３％がロタウイルス感染によることが明らかとなった。米国の健康維持組織によれば、ロタウイルス性胃腸炎による入院の発生率は、１３から２４ヶ月の小児で１００，０００人あたり２２２人、また１歳未満の小児では１００，０００人あたり３６２人であると推定された。この小児科母集団では、急性下痢症によるすべての入院の６３％にロタウイルスの感染が関わっていた。１９７３年から１９８３年までの米国における死亡者数データの調査から、下痢性疾患により４歳未満の小児が毎年５００人死亡し、米国においては下痢による冬季の死亡増加の２０から８０％にロタウイルス感染症が関わっていることが明らかとなった。ロタウイルスは、第三世界の国々において、かなりの比率で下痢性疾患による死亡の原因ともなっている。したがって、有効なロタウイルスワクチンは、世界の先進国および発展途上国いずれにおいても小児の健康に大きな影響力を持つと思われる。
ロタウイルス類は、１１の遺伝子セグメントから形成される二重鎖ＲＮＡゲノムとともに内部および外部のカプシドを有している。プラーク減少中和試験（plaque reduction newtralization test）により多種多様の血清型が決定され、再集合体（reassortant）ウイルスの研究により、２つの外部カプシドタンパク、ＶＰ７およびＶＰ４がウイルス血清型の抗原決定基であることが明らかとなった。ＶＰ７タンパクは、あるヒトロタウイルスの遺伝子セグメント７，遺伝子セグメント８あるいは遺伝子セグメント９によってコードされている。ＶＰ７をコードする遺伝子の位置は、従来の実験法によりそれぞれ特定のロタウイルスごとに決定することができる。ＶＰ４タンパクは、ロタウイルスの４番遺伝子による８８，０００ダルトンの主要表面構造タンパク産物である。ＶＰ７と同様に、ＶＰ４は主要な血清型特異的抗原として機能し、血清中和（ＳＮ）試験に反応し、血清型特異的中和抗体を誘起し、また、マウス実験系においてロタウイルス性疾患に対する血清型特異的免疫防御を誘起することができる。初期のいくつかの文献では、ＶＰ４はＶＰ３と呼ばれていた。１９８８年以降、命名法の変更により、より正しく、このタンパクをＶＰ４と呼ぶようになった。
ＶＰ７およびＶＰ４タンパクをコードする遺伝子セグメントが独立して分離するため、血清型を決める命名法に、ＶＰ７で決定されるＧタイプ、およびＶＰ４で決定されるＰタイプをともに含むことが提案された。米国における大部分のヒトロタウイルス感染症は、Ｇタイプ１、２、３、または４、およびＰタイプ１、２、または３によるものである。しかし、たとえばタイプＧ９を含むその他のヒトロタウイルスタイプがアジア、欧州およびある第三世界の国々ではより一般的である。
多くの動物ロタウイルス類はヒトで弱毒化することから、ウシ血清型Ｇ６ＷＣ３ロタウイルスを含め、ロタウイルス生ワクチンとしての可能性が評価されてきた。ＷＣ３ワクチンウイルスは、幼児では免疫原性および非反応原性（non-reactogenic）であることが判明したが、ヒトロタウイルス感染に対して防御免疫を与えることには結びつかなかった。ロタウイルス性下痢に対する永続的防御を包含するには、血清型特異的免疫が必要であることが示唆された。
当技術分野にとって、ロタウイルス感染およびそれによる重症の臨床症状に対して防御免疫を与える有効なワクチンの必要性がある。
ロタウイルスワクチン類を全世界中に流通させるには、種々の環境条件で安定であるようにワクチンを製剤化する必要がある。ワクチンを安定化するのに用いられる成分は知られている。しかし、ロタウイルスワクチン類を安定化するのに有用な成分の特定の製剤化は、実験的に決めなければならない。本発明の一目的は、ロタウイルスワクチン類を安定化する製剤化である。
【図面の簡単な説明】
第１図は３７℃、１週間のロタウイルス安定性に対する緩衝液の組合せの効果。Ｇ１再集合体のデータをパネルＡに、Ｐ１再集合体のデータをパネルＢに示す。すべての値は、対照、すなわち０日目の試料に対して標準化（normalized）されたｐｆｕ／ｍＬで表す。緩衝液の組合せを以下に示す。０．０５Ｍクエン酸ナトリウム＋０．１５Ｍ炭酸水素ナトリウム（□）、０．０５Ｍクエン酸ナトリウム＋０．１５Ｍリン酸ナトリウム（○）、０．０５Ｍ乳酸＋０．１５Ｍ炭酸水素ナトリウム（△）、０．０５Ｍ乳酸＋０．１５Ｍリン酸ナトリウム（▽）および０．２０Ｍコハク酸ナトリウム＋０．０５Ｍリン酸ナトリウム（◇）。すべての調製物のｐＨは７である。
第２図は重炭酸塩と比較した製剤緩衝液の酸中和能。それぞれの緩衝液１ｍＬを０．０１Ｎ  ＨＣｌで滴定した。記号：０．４Ｍ炭酸水素ナトリウム（●）、０．１Ｍクエン酸ナトリウム＋０．３Ｍリン酸ナトリウム（○）、０．１Ｍクエン酸ナトリウム＋０．３Ｍ炭酸水素ナトリウム（＋）、および０．２Ｍコハク酸ナトリウム＋０．１Ｍリン酸ナトリウム（▽）。
第３図は５％スクロース／０．１Ｍコハク酸ナトリウム／０．０５Ｍリン酸ナトリウムの液状製剤中、種々の温度で保存後の再集合体ロタウイルスの安定性データ。Ｇ１ロタウイルスのデータをパネルＡに、Ｐ１ロタウイルスのデータをパネルＢに示す。
第４図は５０％スクロース／０．１Ｍコハク酸ナトリウム／０．０５Ｍリン酸ナトリウムの液状製剤中、種々の温度で保存後の再集合体ロタウイルスの安定性データ。Ｇ１ロタウイルスのデータをパネルＡに、Ｐ１ロタウイルスのデータをパネルＢに示す。
第５図はより高濃度の緩衝液、スクロースおよび加水分解ゼラチンを含むＧ１ロタウイルス液状製剤の種々の温度での安定性データ。Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地（「ＷＥ」）、５０％スクロース、０．２Ｍコハク酸ナトリウム、および０．１Ｍリン酸ナトリウム中のＧ１ロタウイルスのデータをパネルＡに示す。Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地、７０％スクロース、０．２Ｍコハク酸ナトリウム、および０．１Ｍリン酸ナトリウム中のワクチンの安定性データをパネルＢに示す。５０％スクロース、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、および０．３Ｍリン酸ナトリウム中Ｇ１ロタウイルスのデータをパネルＣに示す。Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地、５０％スクロース、０．２Ｍコハク酸ナトリウム、０．１Ｍリン酸ナトリウムおよび５％加水分解ゼラチン中のＧ１ロタウイルスのデータをパネルＤに示す。
第６図はより高濃度の緩衝液、スクロースおよび加水分解ゼラチンを含むＰ１ロタウイルス液状製剤の種々の温度での安定性データ。Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地、５０％スクロース、０．２Ｍコハク酸ナトリウム、および０．１Ｍリン酸ナトリウム中のＰ１ロタウイルスのデータをパネルＡに示す。Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地、７０％スクロース、０．２Ｍコハク酸ナトリウム、および０．１Ｍリン酸ナトリウム中のワクチンの安定性データをパネルＢに示す。５０％スクロース、０．１Ｍクエン酸ナトリウム、および０．３Ｍリン酸ナトリウム中のＰ１ロタウイルスのデータをパネルＣに示す。Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地、５０％スクロース、０．２Ｍコハク酸ナトリウム、０．１Ｍリン酸ナトリウムおよび５％加水分解ゼラチン中のＰ１ロタウイルスのデータをパネルＤに示す。
第７図はロタウイルス液状製剤を５０％スクロース、０．１Ｍコハク酸ナトリウム、および０．０５Ｍリン酸ナトリウム中、種々の温度で保存後の安定性データ。Ｇ２ロタウイルスのデータをパネルＡに、Ｇ３ロタウイルスの安定性データをパネルＢに示す。
第８図はＧ１ロタウイルス凍結乾燥製剤の種々の温度で保存後の安定性データ。凍結乾燥の前に１％スクロース、４％マンニトールおよび１０ｍＭリン酸ナトリウムに透析したＧ１ロタウイルスのデータをパネルＡに示す。凍結乾燥の前に１％ラクトース、４％マンニトールおよび１０ｍＭリン酸ナトリウムに透析したワクチンの安定性データをパネルＢに示す。凍結乾燥の前に１％スクロース、４％マンニトールおよび７５ｍＭリン酸ナトリウムに透析したＧ１ロタウイルスのデータをパネルＣに示す。
第９図はＰ１ロタウイルス凍結乾燥製剤の種々の温度で保存後の安定性データ。凍結乾燥の前に１％スクロース、４％マンニトールおよび１０ｍＭリン酸ナトリウムに透析したＰ１ロタウイルスのデータをパネルＡに示す。凍結乾燥の前に１％ラクトース、４％マンニトールおよび１０ｍＭリン酸ナトリウムに透析したワクチンの安定性データをパネルＢに示す。凍結乾燥の前に１％スクロース、４％マンニトールおよび７５ｍＭリン酸ナトリウムに透析したＰ１ロタウイルスのデータをパネルＣに示す。
発明の詳細な説明
本発明は、ワクチン類として有用であるロタウイルス類の新規な製剤類、およびその調製法を提供する。より特定すると、本発明は液状および凍結乾燥ロタウイルスワクチンの安定化した製剤類に関する。さらに、いくつかの前記製剤は、高濃度の緩衝性成分を含むことから、胃酸の前中和の有無にかかわらず経口投与することができる。
ワクチンの全世界への流通、および常温の多様性のため、種々の環境条件で安定であるようにワクチンを製剤化する必要がある。種々の安定化法が用いられてきた。それらの方法には下記のものがある。
ａ）低温（−１０℃〜−７０℃）。大部分のワクチンは、極度の低温における保存に安定である。しかし、低温保存装置は高価であり、常に利用できるわけではないので、この解決法の有用性と実用性には限りがある。
ｂ）凍結乾燥。凍結乾燥ワクチン類はかなり安定であり、あらかじめ定められた長さの時間は２〜８℃で保存できる。しかし、凍結乾燥は、乾燥中にウイルス力価の損失をもたらし、それによって製造工程の収率を減少させる。さらに、長期保存中に、凍結乾燥ワクチンが劣化し、ワクチンが免疫を与えるのに十分な力価を持たなくなりそう、または持たなくなるところまで劣化することもある。さらに、凍結乾燥ワクチンは使用前に再構成する必要があるため、使用前に室温で放置する間に、液状の再構成した調製物が効力を失うこともある。再構成による力価の損失により、免疫を与えるには不十分な力価になる可能性もある。
ｃ）安定化剤。これらは特定の化学的化合物であって、生物学的分子および／またはワクチンに添加され、低温保存あるいは凍結乾燥法と組み合わせて用いられる一般的な薬剤賦形剤に作用し、安定化する化合物である。
これらの製剤は、（１）ワクチン原液（bulk）を安定化剤で希釈する、（２）安定化剤への透析／ダイアフィルトレーション、または（３）ワクチン原液の濃縮および安定化剤へのダイアフィルトレーションと、必要ならば、それに続く凍結乾燥、のいずれかによって調製することができる。
本発明の安定剤組成物は、下記の成分を大体下記の量だけ含有する。便宜上、量は概数で示してある。しかし、記述された値の１０または２０パーセント以内の量も、適切であると予想できることが当業者には理解されよう。すなわち、２０％と記述した場合、１６〜１８％から２２〜２４％の範囲が暗示されてあり、適切である。液状製剤の場合：
スクロース                      １〜７０％（ｗ／ｖ）
リン酸ナトリウムまたはリン酸    ０．０１〜２Ｍ
カリウム
コハク酸ナトリウムまたはクエン  ０．０５〜２Ｍ
酸ナトリウム
組織培養培地、食塩水、または水  ０〜残りの体積の調整分
凍結乾燥製剤の場合：
リン酸ナトリウム                ０．０５〜２Ｍ
スクロース                      １〜２０％（ｗ／ｖ）
マンニトール                    １〜２０％（ｗ／ｖ）
ラクトース                      １〜２０％（ｗ／ｖ）
さらに、下記のものが含まれていてもよい。：
加水分解ゼラチン                ２．５％（ｗ／ｖ）
塩化ナトリウム                  １５０ｍＭ
グルタミン酸ナトリウム          ７ｍＭ
スクロースの代わりに、同じような浸透性（osmolality）の下記化合物を使用することもできる、。フコース、トレハロース、ポリアスパラギン酸、イノシトールヘキサリン酸（フィチン酸）、シアル酸またはＮ−アセチルノイラミン酸−ラクトース。また、スクロースのかわりに、ブドウ糖、マンニトール、ラクトース、またはソルビトールなどの適当な糖または糖アルコールのいずれも、所望の安定化を達成するために有効な濃度で使うことができる。
糖の濃度は製剤の粘度に関係する。低い粘度が望ましい場合には、当技術分野で知られているように、低濃度のスクロースなどの糖を用いるのが好ましい。当業者も認めているように、糖濃度の上限は、ある製剤が必要なろ過または製造ステップに耐えられるかどうかによって決めてもよい。
組織培養培地、食塩水または水は希釈剤として用いることができる。しばしばＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地（「ＷＥ」）が用いられるが、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地または改変Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地のいずれかを意味している。
胃酸を中和する緩衝剤はクエン酸塩、リン酸塩およびコハク酸塩に限定されず、重炭酸塩またはフマル酸塩、酒石酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩などの通常のカルボン酸（カルボン酸塩）を含むことができるが、これらに限定されるものではない。それらを用いる適切さについては、リン酸塩、クエン酸塩またはコハク酸塩の代わりに、またはそれらと組み合わせて使用して製剤化を試みることによって簡単に評価できる。本発明の液状および凍結乾燥製剤には約２．０Ｍまでのカルボン酸塩を用いることができるが、約１．０Ｍ未満、例えば約０．０５〜０．９Ｍの使用が好ましく、０．７Ｍ未満、例えば０．０５〜約０．７Ｍでもよい。また、０．５Ｍ未満、例えば約０．０５〜０．４５Ｍでの使用も好ましい。これらの範囲にある特定の濃度が適当と思われる。また、より高濃度の緩衝成分（例えば、リン酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩）を、例えば、さらに胃酸中和が必要な場合には用いることができる。リン酸塩／クエン酸塩またはリン酸塩／コハク酸塩緩衝液においてさらに大きな緩衝能力が有用な場合は、リン酸塩よりむしろ緩衝剤としてコハク酸塩またはクエン酸塩の濃度をさらに増加することの方が好ましい。
本発明の液状および凍結乾燥製剤には約２．０Ｍまでのリン酸塩を用いることができるが、約１．０Ｍ未満、例えば約０．０１０〜０．８Ｍの使用が好ましく、０．５Ｍ未満、例えば約０．０１０〜０．４５Ｍであることが多い。約０．３５Ｍ未満、例えば０．０１０〜０．３０Ｍの使用が最も好ましい。これらの範囲にある特定の濃度が適当と思われる。液状製剤においては、約または０．３０Ｍ以下、例えば０．０１０〜０．３５Ｍのリン酸塩濃度を維持し、例えば長期の保存または凍結／融解サイクルの間にリン酸塩が沈殿するのを防止するのが好ましい。したがって、いずれの製剤においても、リン酸塩濃度の上限は、リン酸塩の形成または沈殿、および塩が安定性および投与などの点で製剤のできばえに悪影響を及ぼすかどうかによって決めることができる。いずれの製剤についても、ｐＨ６〜８の範囲にｐＨ調整することを含む標準的な経験的試験によって、特定の濃度を容易に決めることができる。
一般的な指針として、いくつかの液状製剤の酸中和能の例を下記表１に示す。いくつかの好ましい製剤も示す。
0004653262.tif 000002
凍結乾燥製剤の場合：
リン酸ナトリウム              ２０ｍＭ
加水分解ゼラチン              ２．５％（ｗ／ｖ）
スクロース                    ５％（ｗ／ｖ）
塩化ナトリウム                １５０ｍＭ
グルタミン酸ナトリウム        ７ｍＭ
または
スクロースまたはラクトース    １％（ｗ／ｖ）
マンニトール                  ４％（ｗ／ｖ）
リン酸ナトリウムまたはリン酸  ０．０１〜０．１Ｍ
カリウム
本発明の液状ウイルスワクチン安定剤の好ましい製剤は以下の通りである。
スクロース                    ５０％（ｗ／ｖ）
リン酸ナトリウムまたはリン酸  ０．１Ｍ
カリウム
コハク酸ナトリウム            ０．２Ｍ
組織培養培地                  すべての希釈に使用
または
スクロース                    ５０％（ｗ／ｖ）
リン酸ナトリウムまたはリン酸  ０．３Ｍ
カリウム
クエン酸ナトリウム            ０．１Ｍ
組織培養培地                  すべての希釈に使用
または
スクロース                    ３０％（ｗ／ｖ）
リン酸ナトリウムまたはリン酸  ０．３Ｍ
カリウム
クエン酸ナトリウム            ０．７Ｍ
組織培養培地                  すべての希釈に使用
これらの好ましい製剤において、組織培養培地の代わりに、またはそれと組み合わせて生理的食塩水または水を使用することも適切である。
本発明は、ワクチン類として用いるのに適当な再集合体ロタウイルス（ＲＲＶ）の製剤を含むが、ＲＲＶはヒトに対する安全性、およびヒトロタウイルス感染に対し免疫防御を与える能力を特徴としている。ＲＲＶは弱毒化ウシロタウイルス（好ましくはＷＣ３またはその子孫）と、疫学的に重要なヒト血清型を示す少なくとも１つのロタウイルスとの間の遺伝子再集合によって生成する。あるタイプのＲＲＶでは、ヒトロタウイルスは、少なくともＶＰ７タンパクをエンコードする遺伝子セグメントを再集合体に与える。別のタイプのＲＲＶでは、ヒトロタウイルス親株は少なくともＶＰ４タンパクをエンコードする遺伝子セグメントを再集合体に与える。さらに別のタイプのＲＲＶでは、ヒトロタウイルス親株は少なくともＶＰ７およびＶＰ４遺伝子セグメントの両方を与える。別のタイプのＲＲＶでは、ヒトロタウイルス親株は、遺伝子セグメントとさらにＶＰ７および／またはＶＰ４抗原をエンコードする遺伝子セグメントを与える。
ＲＲＶにおいて中和抗原ＶＰ７および／またはＶＰ４をコードするヒトロタウイルス遺伝子は、免疫化したいいずれのヒトロタウイルス血清型から選択してもよい。本発明の再集合体では、ＶＰ７遺伝子はＧ１、Ｇ２、Ｇ３、またはＧ４ヒトロタウイルス血清型由来であり、ＶＰ４タンパクはヒトＰ１またはＰ２血清型由来であることが望ましい。本発明に有用な株を含むヒトロタウイルス感染症に臨床的に有意義であることが知られているロタウイルス株（以下「ヒトロタウイルス株」と呼ぶ）には、以下に示す株がある。
血清型Ｇ１：ＷＩ７９、Ｗａ、Ｄ、
血清型Ｇ２：ＷＩＳＣ２およびＤＳ１株、
血清型Ｇ３：ＷＩ７８、Ｐ、ＨＣＲ３Ａ株、
血清型Ｇ４：Ｂｒｉｃｏｕｔ（Ｂｒ）Ｂ、ＳＴ３、
血清型Ｇ８：６９Ｍ、
血清型Ｇ９：ＷＩ６１、
血清型Ｐ１：ＷＩ７９、ＷＩ７８、ＷＩ６１、Ｗａ、
血清型Ｐ２：ＤＳ１、および
血清型Ｐ３：ＷＩＳＣ２、ＢｒＢ、ＢｒＡ、Ｍ３７。
ヒトロタウイルス株のこのリストは排他的なものではない。例えば、過去に動物感染症で同定されたいくつかのロタウイルス株もヒト感染症で見出されている。これらの株は、例えば「ブタ」ロタウイルスＯＳＵ、血清型Ｇ５、および「ウシ」ロタウイルスＢ２２３、血清型Ｇ１０のように、本発明の目的のための「ヒト」ロタウイルス株として有用であると思われる。当業者であれば、適当な寄託先または学術的あるいは商業的生産者から、他の適切なヒト株を容易に入手できる。
本発明の再集合体類に含まれる非ヒト遺伝子は、米国特許４，６３６，３８５に詳しく記載されている弱毒化した血清型Ｇ６のウシロタウイルスＷＣ３株またはその子孫から得るのが好ましい。しかし、その他のロタウイルス再集合体、特に他のウシ再集合体も好ましい。
0004653262.tif 000003
ＷＩ７９−３，９およびＷＩ７８−１，６−１１の寄託は、ブダペスト条約の要件に合うように変更されている。他の寄託はすべて、寄託時からブダペスト条約のもとで行われた。表２に示した寄託物を公共に利用する上のあらゆる制限条件は、本出願に特許が付与された段階では不可逆的に取り除かれ、培地は寄託日から３０年間、または直近の試料の依頼から少なくとも５年のいずれか長い期間、維持される。さらに、生きた試料が寄託先で調合できない場合は、寄託物は置き換えられる。本特許出願の係属中は、資格のあるＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒが定めた者にこれらの寄託物の利用を提供しなければならない。
ワクチン組成物
ヒトロタウイルス感染症による急性下痢に対して免疫的防御を与えるワクチン類は、本発明の製剤において、１つまたは複数のロタウイルス再集合体を含むことができる。典型的なロタウイルス再集合体、およびその組合せ、およびワクチンとしての用途が、米国特許５，６２６，８５１および米国出願第０８／４５６，９０６号に見出され、そのいずれも、そのすべてを参照として本明細書中に編入する。いくつかの典型的なワクチン組成物を表３に要約して示す。
0004653262.tif 000004
本発明のロタウイルスワクチン類は従来の成分を含有することができる。適切な成分は当業者には知られている。これらのワクチン組成物は液状または凍結乾燥の形で調製できる。その他の任意選択の成分、例えば、安定剤、緩衝液、保存剤、香味料、賦形剤なども加えることができる。ワクチン組成物を安定化するのに有用な特定の製剤の決定には広範な実験が必要であった。
経口投与に適応させる場合、ある製剤は坦体としてＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地（「ＷＥ」）／５０％スクロース／０．１Ｍコハク酸塩／５０ｍＭリン酸塩液体を含む。別の製剤は、０．２Ｍコハク酸塩および０．１Ｍリン酸塩、または０．１Ｍクエン酸塩および０．３Ｍリン酸塩を含む。別の製剤は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地／３０％スクロースと０．７Ｍクエン酸塩および０．３Ｍリン酸塩を含む。さらに、追加免疫のための、または経口投与の場合に現れる免疫応答を増強するための新規なアジュバント類も、これらの製剤と共存できると思われる。非経口投与に適応させる場合、従来のアジュバント類（例えば、アルミニウム塩類）または新規なアジュバントをワクチン組成物に用いることもできる。
任意選択で、その他の活性成分および／または免疫化抗原を含有させてワクチンを製剤化してもよい。例えば、経口投与に適応させる場合、Ｓａｂｉｎポリオワクチンを用いた製剤化が望ましいこともある。
追加免疫ワクチンの接種時期、回数および量を含む、ワクチン接種方法に関する用法は種々の宿主および環境要素、例えば患者の年齢、投与時期、地理的位置および地理的環境などを考慮して決めなければならない。
ワクチン接種の方法
したがって、ヒトロタウイルス感染症に対し、新規ＲＲＶワクチン組成物類をヒトに接種する方法も本発明に含まれる。本明細書中に記載する１つまたは複数の再集合体を含むワクチン組成物は適切な投与量で、好ましくは液状で、また、好ましくは経口により投与される。
すべての投与経路での用量は、一般的には再集合体１０5〜１０9プラーク形成単位（ｐｆｕ）であり、好ましい用量は１０7ｐｆｕである。ワクチンをさらに追加して投与することもできる。「ロタウイルスシーズン」に先立って、感受性幼児および小児に一年毎に予防接種するのが好ましと思われる。ヒトにおけるロタウイルス感染症は、同じ季節の間に、例えば米国では冬に、様々な地域で発生することが観察されてきた。感受性幼児および小児に、そのシーズンに先立って繰り返し予防接種することも必要かもしれない。例えば、米国の場合に、最近好ましいとされている一用法は、ロタウイルスシーズンの開始に先立って、約２ヶ月の間隔で３回投与するものである。
下記の実施例は、本発明のＲＲＶワクチン組成物類の調製法を例示したものである。これらの実施例は例として示したに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
経口により投与されたワクチンは、胃の低いｐＨの環境にさらされる。大部分のワクチンは、このような極端な条件により不活性化する傾向がある。活性なワクチンの送達を確かめるため、酸中和能ならびにロタウイルスを安定化する能力について、可能性のある緩衝液の試験を行った。
酸中和緩衝液存在下でのロタウイルスの安定性
クエン酸塩、乳酸塩、およびコハク酸塩緩衝液の組合せ（全部で５種類）について、３７℃で１週間にわたりロタウイルス安定性に対する効果を評価した。第１図の説明文に示した濃度の緩衝液を、同体積のＷＥ培地中のロタウイルスに加え、０，３、または７日間インキュベートした。
Ｇ１血清型の場合、重炭酸塩の組合せは、値が５％スクロースの値（０．５日）と同じであり、感染性力価の半減時間（ｔ1/2）に影響しなかった。対照的に、クエン酸塩、乳酸塩、コハク酸塩を含有するリン酸塩緩衝液は、ウイルスを安定化させ、それぞれ１．２、１．４、および１．５日のｔ1/2の値を示した（第１図）。
第１図に示すように、Ｐ１の安定化に対しリン酸塩は同様の効果を示した。５％スクロース溶液の約１．２日という値と比較して、乳酸塩／リン酸塩緩衝液は２．４日のｔ1/2、コハク酸塩／リン酸塩の組合せは６．８日のｔ1/2であった。Ｇ１ロタウイルス類に対する効果と同様、重炭酸塩を含む緩衝液の組合せは、リン酸塩を含有する同様の緩衝液ほどにはＰ１血清型へ安定性を与えなかった。
ロタウイルスと酸中和緩衝液の組合せ−単回投与の可能性
コハク酸塩／リン酸塩ならびにその他の緩衝液の安定化効果は、製剤が酸中和剤を含有できることを示唆する。試験した緩衝液１ｍＬは、十分な酸を中和し、ｐＨを３．５以上に保つようであるが（第２図）、このｐＨは、本発明者の直接実験および科学文献から、ロタウイルス感染性の保存のために必要であることが知られている条件である。幼児の胃酸体積および酸分泌速度からすれば、本発明に記載の液状製剤で約０．５時間、ｉｎ  ｖｉｖｏのｐＨを維持することができるが、ヒトの臨床試験を行って、これらの推測を確認しなければならないであろう。緩衝能の別の試験として、酸中和能に関するＵＳＰ試験を行った。表４に示すように、ＲＶ製剤緩衝成分は同体積の人工栄養乳と比べ、より効果的であった。
表４．新規液状ロタウイルス製剤（１）、過去の臨床試験で使用した製剤（２）、組織培養培地（３）、人工栄養乳（４）、および制酸剤（５）について、ＵＳＰ試験で測定した酸中和能
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凍結乾燥製剤に関しては、本発明に記載する酸中和緩衝液または重炭酸塩溶液などの通常入手できる酸中和成分で再構成することにより、付加的な緩衝能を得ることができる。したがって、液状あるいは凍結乾燥製剤のいずれでも、前処理することなく十分な緩衝能が可能である。その結果、一度胃酸中和ステップを行い、続いてワクチンを投与するよりむしろ、ロタウイルスワクチンを単回投与で投与するできることが好ましいと思われる。しかし、緩衝液とワクチンの同時投与は、この手段によるワクチンの有効性を信頼する患者でさらに評価しなければならない。ロタウイルスによる通常の経口ワクチン接種の際、十分な胃酸中和を確保するために、患者の前処理（処方給食または重炭酸塩投与あるいはＭｙｌａｎｔａなどの制酸剤）がまだ必要な場合、これらの製剤は、次項に記載するように、保存安定性の大きな増強を提供しなければならない。さらにロタウイルス再集合体は、人工栄養乳（例えば、Ｉｓｏｍｉｌ(R)およびＳｉｍｉｌａｃ(R)）ならびに重炭酸塩緩衝液と共存し、これらの中和剤が存在してもしなくても同等の熱安定性を示す。
実施例２
ロタウイルス上に推定されている結合部位が、安定化の標的と考えることができる。カルシウムおよび亜鉛の結合部位がロタウイルスタンパクに存在すると示唆されてきたし、これらの陽イオンがワクチンを安定化すると考えられる。その他の２価陽イオンもこれらまたは他の部位に結合し、ロタウイルスおよびその再集合体を安定化すると思われる。ワクチンを安定化できるが、その免疫原生を与える能力を妨害しない化合物を同定するために、その他の化合物による結合も検討した。
ａ．２価金属イオンの効果
ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどの金属キレート剤の添加は、ＲＶ感染性の損失を起こすことが知られており、これはＲＶ外殻の崩壊によると考えられている。このことは金属類が構造維持のために必要であることを示唆している。したがって、２価金属イオンを検討し、それらのロタウイルス（ＲＶ）安定化能力を評価した。
ＷＥ培地中のロタウイルスを４℃で約１６時間、２０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液および１００ｍＭＮａＣｌに透析した。最終溶液にそれぞれ１０ｍＭのＣａＣｌ2、ＭｎＣｌ2、ＭｇＣｌ2、ＺｎＣｌ2、またはＣａＣｌ2＋ＺｎＣｌ2を補給し、金属イオン１０ｍＭの最終濃度とした。製剤化に先立って試料をろ過してもよい。試料を３７℃で０、２／３、および７日間インキュベートし、次いで分析まで−７０℃で保存した。それぞれのデータ点は２つの同一試料の平均を示す。
表５に示すように、組織培養培地なしにロタウイルス原液を製剤に透析することによって調製した場合、カルシウムおよびマンガンは、３７℃でＧ１およびＰ１ロタウイルス再集合体のいずれの安定性も増加させる。亜鉛はＧ１の不活性化半減期（ｔ1/2）を劇的に減少させ、カルシウムが存在してもしなくてもＰ１のｔ1/2を有意に減少させる。Ｚｎ2+をＣａ2+に置き換えることも可能であり、ＥＤＴＡによるＣａ2+の除去に類似した方法で外部カプシドの不安定化を起こす。別の説明は、Ｚｎ2+が外因性メタロプロテイナーゼを活性化するか、または細胞培養に由来するヌクレアーゼを活性化することも考えられている。２価金属の添加は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅまたは改変Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅなどの組織培養培地を含有する安定化剤中で製剤化された場合には、ＲＶの熱的安定性を増加させない。Ｇ２およびＧ３再集合体は、陽イオン補給組織培養培地中で比較した場合はＧ１およびＰ１再集合体と同様の挙動をするようであった。
したがって、本明細書中に記載のロタウイルス安定製剤の調製においては、十分な濃度の２価金属イオンが存在することが好ましい。おそらく、これらの金属イオンは、組織培養培地およびウイルス原液を調製するための細胞培養に用いられる細胞から供給されている。必要ならば、金属イオンを個々に直接添加するか組織培養培地の使用によって最終的な製剤に補給することもできる。
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ｂ．生物学的に関連する糖類およびポリアニオンの効果
前述の予備的実験では、ロタウイルス再集合体がリン酸塩緩衝液で安定化することが明らかとなった。リン酸塩によって安定化され、また、硫酸、イノシトールヘキサリン酸（フィチン酸）および種々の硫酸化化合物（ヘパリンおよび硫酸化β−シクロデキストリン）などの関連するポリアニオンによっても安定化される単量体タンパクの例があることから、これらの化合物のロタウイルス安定化能について試験した。低濃度のリガンドで高い電荷密度が維持できることから、重合型のポリアニオンは一般的により効果的な安定化剤とされている。したがって、高い負電荷密度によりポリアスパラギン酸も検討した。ＶＰ４と結合することにより、熱誘起分解または変性に対する保護を行うのではないかという理由で、シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸）を検討した。同様に、Ｎ−アセチルノイラミン酸−ラクトースおよびムチンなどのシアル酸誘導体も試験した。宿主の成熟によるＲＶ感染性の喪失は、シアル酸の存在下でのフコースへの切換えによるものと示唆されていたので、フコースを検討した。最後に、好ましい乾燥賦形剤として特性が広く知られていることから、トレハロースを検討した。
表６に見られるように、種々の化合物がロタウイルス製剤に添加され、加速安定試験においてウイルスを安定化する。イノシトールヘキサリン酸は、この試験の他のリガンドと比較して、最大のＲＶ安定化能力を示した。Ｇ１に関しては、３７℃での熱安定性が４倍まで増加するのが観察された。ムチンは感染力を妨げるが、これはおそらくビリオン構造を不安定化することによるのではなく、むしろＲＶを隔絶することによる（凝集塊が分析に先立って観察された）ためと考えられる。硫酸化重合体類には無視できる程度の効果しかなかったが、その他の試験化合物はすべて、様々な程度でＲＶを安定化した。例えば、トレハロースは、Ｇ１の場合に不活性化半減期を２倍以上に延長し、Ｐ１の場合では５０％未満であった。
シアル酸はＧ１およびＰ１ＲＶのいずれも安定化した。結合部位がＶＰ４上に位置するならば、シアル酸はＧタイプを安定化し、Ｐタイプはしない筈である。これらの実験では、ポリアニオンの存在下で一般的に、Ｐ１はより短い半減期を持つようであった。ヘパリンおよびポリアスパラギン酸存在下の低いｔ1/2は、ＲＶが不安定化されたというよりむしろ、それらのリガンドと強固に結合することを示唆しているのかもしれない。安定性抑制の機構は、完全に明らかになってはいない。プラーク分析で測定される低レベルの感染性は、ビリオン自体の不安定化またはリガンドによるＲＶの隔絶化による可能性もある。ＲＶと賦形剤との間の会合が中程度であれば、リガンドは分析の希釈条件（ならびにｉｎ  ｖｉｖｏ）で解離することが予想される。強固に結合した複合体は安定なウイルス粒子を含むかも知れないが、解離できないためにもはや感染性ではない。後者の場合は、ムチン、ヘパリン、およびおそらくポリアスパラギン酸に当てはまるようである。また、プラーク分析で用いた細胞に対する賦形剤の有害効果は無視することはできない。機構に関係なく、ある種のポリアニオンは何らの利点も与えない。イノシトールヘキサリン酸は検討したすべてのリガンドのうちで最も好ましいように見え、リン酸塩含有緩衝液による安定性を上回った。これらの結果は、リン酸塩が劇的にＲＶを安定化することを明らかにする本発明に記載の前述の試験を支持している。したがって、種々のリン酸塩類（例えばモノリン酸塩類およびポリリン酸塩類）およびリン酸化化合物類（例えば、リン酸化糖類）がロタウイルスを安定化できる。
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実施例３
いくつかのＧ１およびＰ１ロタウイルスの最適化凍結乾燥および液状製剤について、種々の温度で１年間の詳しい安定性データをとり、非最適化製剤、ＷＥ培地／５％スクロースの安定性データと比較した。スクロース、リン酸ナトリウム、およびコハク酸ナトリウムまたはクエン酸ナトリウムを含有するＷＥ培地中にロタウイルス再集合体を含有する最適化液状製剤は、本質的な安定性の改善を示した。凍結乾燥製剤の場合には、保存安定性がさらに改善するのが観察された。適切な製剤化により、ロタウイルスの熱安定性は、既存の生−ウイルス液剤（すなわちＯＰＶ）および凍結乾燥（例えば、麻疹）ワクチンの熱安定性を上回る。
コハク酸塩／リン酸塩あるいはクエン酸塩／リン酸塩緩衝液のいずれの安定化効果も、胃酸中和との組合せによる安定性増強力をもたらす。液状製剤ならびに、緩衝液を用いて再構成可能な凍結乾燥製剤は、単回投与で製剤を送出することができる。
ａ．液状製剤安定性データ
Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地／５％スクロース／０．１Ｍコハク酸塩／５０ｍＭリン酸塩中ｐＨ７で製剤化した場合、Ｇ１ロタウイルス再集合体ワクチンは、４℃で１年後に、−７０℃で保存した試料と比較すると０．７ｌｏｇ力価を失う（第３図）。Ｐ１再集合体ワクチンは同じ条件で０．２ｌｏｇを失う。２２℃で６ヶ月後、Ｇ１再集合体は２．６ｌｏｇの感染性力価を失い、Ｐ１再集合体ロタウイルスは５．２ｌｏｇを失う。最近臨床試験に使用されたＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地／５％スクロース中のＧ１再集合体の非最適化液状製剤と比較すると、この製剤では２２℃で６ヶ月間のインキュベーション後で５ｌｏｇ以上の感染性を、また４℃で１年後１〜２ｌｏｇを失っている。これらのデータは本発明に記載の特定の緩衝液の組合せの付加的安定化効果を示している。
Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地／５０％スクロース／０．１Ｍコハク酸塩／５０ｍＭリン酸塩中ｐＨ７で、Ｇ１ロタウイルス再集合体ワクチンは、４℃で１年後に、−７０℃で保存した試料と比較すると０．８ｌｏｇ力価を失う（第４図）。Ｐ１再集合体ワクチンは同じ条件で０．３ｌｏｇより少ない値しか失わない。２２℃では、Ｇ１およびＰ１ワクチンのいずれも、１年後に約２ｌｏｇの感染性を失う。これらのデータは、高濃度の糖に付加的安定化効果のあることを示している。
より高濃度の緩衝液による付加的製剤（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地／５０％スクロース／０．２Ｍコハク酸塩／０．１Ｍリン酸塩、ｐＨ７）では、４℃でＧ１ロタウイルスワクチンをより一層安定化し、−７０℃で保存した同じ試料と比較しても有意な力価損失はもたらさなかった（第５図）。さらに、４℃で１年間保存したいずれの最適化液状製剤にもＧ１力価の損失は観察されない。Ｐ１再集合体の感染性はすべての製剤で、−７０℃で保存した試料と比較しても０．２ｌｏｇの低下である（第６図）。Ｇ１およびＰ１ロタウイルス再集合体の４℃での安定性は、より高濃度の緩衝液を用いた製剤の場合と同じであったが、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地／５０％スクロース／０．１Ｍクエン酸酸塩／０．３Ｍリン酸塩を含有するｐＨ７の製剤は、他の製剤と比較して２２℃での損失は少ない。例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地／５０％スクロース／０．２Ｍコハク酸塩／０．１Ｍリン酸塩中のＧ１ロタウイルスは、２２℃で１年後１．５ｌｏｇの力価の損失を示し、一方、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地／５０％スクロース／０．１Ｍクエン酸塩／０．３Ｍリン酸塩製剤のこの間の損失は０．６ｌｏｇに過ぎない。前述のスクリーニング試験に示されるように、リン酸塩およびリン酸化化合物類の存在がロタウイルス再集合体の熱安定性を増すことから、後者の製剤の高濃度のリン酸塩が安定性増加の原因と考えられる。クエン酸塩／リン酸塩緩衝製剤中のロタウイルスは、２２℃でより安定のようであり、４５℃ではいずれの再集合体の場合にも、また３７℃ではＰ１ロタウイルスの場合に、安定でなくなる。
Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地／５０％スクロース／０．１Ｍコハク酸酸塩／５０ｍＭリン酸塩中ｐＨ７、４℃で１２ヶ月後、Ｇ２ロタウイルス再集合体は０．２ｌｏｇの感染性を失い、Ｇ３再集合体では、−７０℃で同じ試料を保存した場合と比較して力価が０．３ｌｏｇ減少した（第７図）。同じ製剤中のＧ１およびＰ１再集合体を比較すると（第３図）、Ｇ２およびＧ３はＰ１ロタウイルス再集合体と同等の安定性を有しており、Ｇ１再集合体の４℃で見られた安定性より勝っている。しかし、Ｇ２およびＧ３ワクチンは、２２℃におけるＧ１ワクチンと比べると安定でないようである。
Ｇ１再集合体の安定性をスクロース、リン酸塩およびクエン酸塩を含む製剤中、組織培養培地を存在させ、およびさせずに検討した（表７）。この試験では、ＷＥに５％スクロースのみを含有する製剤Aを標準とした。試験製剤Ｂは、ＷＥ中に５０％スクロースと０．３Ｍリン酸ナトリウムおよび０．１Ｍクエン酸ナトリウムを含有する。試験製剤Ｃは、WEは加えず、５０％スクロース、０．３Ｍリン酸ナトリウムおよび０．１Ｍクエン酸ナトリウムを含有する。ウイルス原液を、製剤ＢまたはＣで１０倍に希釈する。したがって、Ｂでは液体媒質の１００％が組織培養培地であり、一方Ｃでは１０％が組織培養培地である。Ｃでは、ウイルス原液が組織培養培地の唯一の供給源である。表７に示すように、製剤ＢおよびＣは製剤Ａに比べ大きな安定性を示した。製剤中の組織培養培地の有無は、３０℃におけるロタウイルスの安定性に対し小さいが測定可能な効果をもたらした（ＢおよびＣを比較せよ、表７）。この効果は３７℃ではより大きくなるが、それでも標準（製剤Ａ）と比較すると小さいものであった。これらのデータは、安定性の改善を得るためには広い濃度範囲（１０〜１００％）の組織培養培地が受け入れられることを示している。
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１０％未満の体積比での組織培養培地の効果を検討するため、透析を行い、ウイルス原液から組織培養培地を完全に除去した。ロタウイルス液状製剤が透析したウイルス原液から調製され、したがって最終製剤が０％の組織培養培地を含有する場合、ロタウイルス原液を組織培養培地を用いずに安定剤で単純に希釈して得た製剤（最終ワクチン製剤には１０％の組織培養培地が存在することになる）に比べると、より早く不活性化される。このことは、ＷＥ組織培養培地に存在する必須の安定化成分が透析によって除去されてしまったことを示唆している。有効量の組織培養培地が存在しない場合には、カルシウムなどの２価陽イオンを、透析したワクチン製剤に加え、安定性を改善することができる（表５を参照）。種々の製造規模での透析は、ダイアフィルトレーションまたは限外ろ過を用いて行うこともできる。
Ｇ１再集合体の安定性を一定範囲のｐＨで検討した。ロタウイルスＧ１再集合体を０．３Ｍリン酸ナトリウム／０．１Ｍクエン酸ナトリウム／５０％スクロース安定化剤中、種々のｐＨ値で製剤化した。ウイルス力価から、加速安定条件下で、約ｐＨ４．０から約ｐＨ８．０の範囲、特に約ｐＨ５．０から約ｐＨ７．０の間でＧ１再集合体の安定性がより大きいことがわかる。「約ｐＨ」というのは、記述されたｐＨ値の前後０．３単位であることを意味する。
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ｂ．凍結乾燥製剤の安定性データ
１％スクロース／４％マンニトール／１０ｍＭリン酸ナトリウムのｐＨ７の凍結乾燥製剤において、Ｇ１ワクチンは２２℃、１年後に０．３ｌｏｇの損失を示した（第８図）。１％スクロース／４％マンニトール／７５ｍＭリン酸ナトリウムを含有するｐＨ７の製剤は、２２℃またはそれ以下の温度では１年後においても有意な損失を示さなかった。Ｐ１ワクチンは、対応するＧ１製剤に比べ、低い安定性を示した。１％スクロース／４％マンニトール／１０ｍＭリン酸ナトリウム中、４℃で１年では、Ｐ１再集合体は、７０℃で保存したワクチンと比較すると０．４ｌｏｇの力価の損失を示す（第９図）。さらにリン酸塩濃度の高い同様の製剤は０．２ｌｏｇ未満の感染性の損失を示す。リン酸塩、スクロースおよび加水分解ゼラチン安定剤中のＰ１ワクチンは４℃で１年後も有意な損失を示さなかった。これらの凍結乾燥製剤は、ロタウイルス原液を安定化剤で１０倍に希釈する（組織培養培地の最終濃度は１０％）か、ロタウイルス原液を安定化剤に透析（組織培養培地を完全に除去）することによって調製した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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