(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４に示すアミノ酸配列中の第９９番目のアミノ酸がセリンからフェニルアラニンに置換されてなることを特徴とする蛋白質、あるいは、配列番号４に示すアミノ酸配列中の第９９番目のアミノ酸がセリンからフェニルアラニンに置換されているアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加、あるいはそれらの組合せが生じており、かつ、植物中にて存在させることで発芽後の栄養成長期間が短縮することを特徴とする蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載の蛋白質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
配列番号２に示す塩基配列中の第２９６番目の塩基がシトシンからチミンに置換されてなる請求項２に記載のＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２または３に記載のＤＮＡを植物中にて発現させるステップを含む、植物の栄養成長期間を短縮する方法。
【請求項５】
請求項２または３に記載のＤＮＡをＦＴ遺伝子の過剰発現状態で植物中にて発現させるステップを含む、植物の栄養成長期間を消失させる方法。
【請求項６】
植物の栄養成長期間を短縮するための、請求項２または３に記載のＤＮＡの、使用。
【請求項７】
植物の栄養成長期間を消失させるための、請求項２または３に記載のＤＮＡとＦＴ遺伝子との組合せの、使用。
【請求項８】
シロイヌナズナの第４番染色体にコードされている、配列番号２に示す塩基配列をオープンリーディングフレームとして含む遺伝子を、配列番号５に示す塩基配列となるように改変したことを特徴とするシロイヌナズナ。
【請求項９】
さらに、過剰発現するようにＦＴ遺伝子を導入してなることを特徴とする請求項８に記載のシロイヌナズナ。
【請求項１０】
請求項２または３に記載のＤＮＡを導入したことを特徴とするトランスジェニック植物。
【請求項１１】
さらに、過剰発現するようにＦＴ遺伝子を導入してなることを特徴とする請求項１０に記載のトランスジェニック植物。
【請求項１２】
請求項２または３に記載のＤＮＡを植物に導入するステップを少なくとも含むことを特徴とするトランスジェニック植物の生産方法。
【請求項１３】
さらに、過剰発現するようにＦＴ遺伝子を導入するステップを含むことを特徴とする請求項１２に記載のトランスジェニック植物の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、花成に関する遺伝子およびその遺伝子産物としての蛋白質と、その変異遺伝子および変異蛋白質と、この変異遺伝子を導入することによって、栄養成長期間を短縮可能とするトランスジェニック植物、およびその生産方法とに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
一般に、植物においては、発芽後の栄養成長から生殖成長に移行すると、それまで葉を形成していた茎の先端や腋芽の成長点の構造が変化して、花が形成される。この栄養成長から生殖成長への移行現象を「花成」という。つまり花成は、植物の繁殖に直結する現象であるため、植物の生活環上で最も重要な現象であると見なすことができる。
【０００３】
また、植物は繁殖のために種子を形成することが一般的であるため、花成は、植物の生存においても非常に重要な現象となる。すなわち、植物は、生活環を通してほぼ一定の場所に固着して生活することがほとんどであるが、花成を経て種子という形態をとると、強い環境耐性を実現できる。したがって、植物は種子となることで、生育に不適な環境から時間的・空間的に逃れることが可能になり、生存の可能性を飛躍的に高めることができる。
【０００４】
換言すれば、花成を人為的に制御することが可能となれば、植物の繁殖と生育を効率的に制御できることになる。それゆえ、従来より、花成の制御機構の解明および理解は、学術的観点だけでなくアグリビジネスなどの産業的観点からも進められている。
【０００５】
特に近年では、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）を用いた研究によって、分子遺伝学的な検証に基づく花成の制御機構の解明と理解とが急速に進んでいる。
【０００６】
シロイヌナズナは、世代時間が短い、生育が容易、個体が比較的小さい、１個体から多数の種子が得られるなど、実験植物としての利点が多い。しかも、既知の植物中ではそのゲノムサイズが最も小さい（約１３５Ｍｂ）ため遺伝学の材料としても好んで用いられる。それゆえ、シロイヌナズナは、各種農作物などの産業植物を含む高等植物のモデルとして注目されており、早くからゲノム構造解析が進められ、近年、ゲノム構造がほぼ明らかにされた。
【０００７】
上記シロイヌナズナを用いた研究によって、花成の制御機構には、部分的に機能が重複する４つの制御経路が存在することが明らかとなっている。また、各制御経路上で機能する重要な遺伝子（花成制御遺伝子と称する）も同定され、個々の制御経路の解明および理解も進んでいる。それゆえ、現在、花成の制御機構において非常に大きな関心を集めているのが、上記４つの制御経路がどのように統合されて、最終的に花成を引き起こすのかという点である。
【０００８】
本発明者らは、以前に、花成制御遺伝子の一つであるFLOWERING LOCUS Ｔ遺伝子（ＦＴ遺伝子）をクローニングして解析した結果、このＦＴ遺伝子が上記４つの花成制御経路を統合する「花成のスイッチ遺伝子」の有力な候補であることを見出している（Y.Kobayashi, H.Kaya, K.Goto, M.Iwabuchi & T.Araki : Science, 286 1960-1962 (1999) 他）。上記ＦＴ遺伝子は、花芽分裂組織決定遺伝子の最も重要なものとして知られているLEAFY 遺伝子（ＬＦＹ遺伝子）と同時に強制発現させることで、植物の発芽後に、栄養成長を経ずに直ちに花成して花芽を形成させることができる。
【０００９】
それゆえ、花成の制御機構の解明および理解を進めることで、上記ＦＴ遺伝子を中心とした、花成の人為的な制御系を確立できる可能性が示唆されている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、上記ＦＴ遺伝子については、実質的に研究が開始されたばかりであるため、ＦＴ遺伝子の詳細な機能については分からないことも多い。このＦＴ遺伝子が、上記４つの制御経路を統合する作用に大きく関与していることはほぼ確実であるが、上記ＬＦＹ遺伝子のように、ＦＴ遺伝子と組み合わせて発現させることで、花成をより効果的に促進できるような他の花成制御遺伝子が存在する可能性も強く示唆される。
【００１１】
このような他の花成制御遺伝子が見出されれば、ＦＴ遺伝子の機能をより詳細に解明し、その理解を進めることが可能となり、ＦＴ遺伝子を中心とする花成の人為的制御系の確立の可能性をより一層高めることが期待される。
【００１２】
また、上記他の花成制御遺伝子が、花成を効果的に促進でき、かつ花や種子の形成にも影響がないのであれば、この遺伝子のみでも、種苗産業分野へ有効に利用できる可能性がある。
【００１３】
本発明は、上記問題点に鑑みてなされたものであって、その目的は、花成の制御機構の理解・解明と、花成の人為的制御系の確立とに応用できる可能性が高い、シロイヌナズナ由来の未知の花成制御遺伝子を見出し、その塩基配列およびそれがコードする蛋白質のアミノ酸配列を決定するとともに、特定された上記花成制御遺伝子を利用して、植物の花成を制御する方法を提案することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題に鑑み鋭意検討した結果、その一部改変することで、正常な花の形態と正常な種子形成能に影響を及ぼさずに、花成を促進させるという、花成を制御する方法を実現することが可能であり、さらに、ＦＴ遺伝子を中心とする花成の人為的制御系の確立にも利用できる可能性が高い新たな花成制御遺伝子を見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１５】
すなわち、本発明にかかる遺伝子は、上記の課題を解決するために見出された新規な花成制御遺伝子であって、植物のゲノムから単離され、その一部を改変した状態で植物中にて発現させることで、栄養成長期間を短縮することを特徴としている。
【００１６】
上記遺伝子としては、たとえば、シロイヌナズナの第４番染色体にコードされ、その一部を改変した状態で植物中にて発現させることで、栄養成長期間を短縮し、好ましくは、その一部を改変した状態で、かつＦＴ遺伝子の過剰発現状態で植物中にて発現させることで、発芽後に本葉形成を回避して花を形成する花成制御遺伝子CRYPTIC PRECOCIOUS遺伝子（ＣＲＰ遺伝子）を挙げることができる。
【００１７】
上記構成によれば、上記遺伝子の一部を改変させた状態で、少なくともシロイヌナズナで発現させることにより、通常よりも栄養成長の期間を短縮することが可能になる。しかも、ＦＴ遺伝子の過剰発現とともに発現させることで、発芽後すぐに花を形成することも可能となる。すなわち、上記遺伝子を改変させれば、それ単独でも花成の促進が可能となる上に、ＦＴ遺伝子を過剰発現させれば、実質的に栄養成長を経ないで生殖成長に移行できるため、花成を極めて促進させることができる。
【００１８】
上記ＦＴ遺伝子は「花成のスイッチ遺伝子」であることが公知であるが、本発明の完成により、上記遺伝子がＦＴ遺伝子を中心とする花成の制御機構に重要に関与することが明らかとなった。その結果、本発明にかかる遺伝子は、ＦＴ遺伝子を中心とする花成の人為的制御系の確立に応用できる可能性が高いことが示唆される。
【００１９】
上記遺伝子の具体的な一例であるＣＲＰ遺伝子は、具体的には、配列番号１に示す塩基配列からなるゲノムＤＮＡであり、配列番号２に示す塩基配列をオープンリーディングフレームとして含むＤＮＡであり、さらに、配列番号３に示す塩基配列を有するｃＤＮＡである。
【００２０】
上記構成によれば、ＣＲＰ遺伝子は約１１ｋｂｐ（塩基対、base pair ）のサイズを有するＤＮＡであり、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の塩基配列は、約６．７ｋｂｐのサイズを有しており、そのｃＤＮＡは約７．１ｋｂｐのサイズを有している。それゆえ、本発明では、ＣＲＰ遺伝子をコードするポリヌクレオチド、すなわちｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよびそのフラグメントを含む遺伝子を得ることができる。
【００２１】
なお、本発明における「遺伝子」または「ポリヌクレオチド」には、ＲＮＡおよびＤＮＡが含まれるものとする。ＲＮＡには、ｍＲＮＡが含まれ、ＤＮＡには、たとえば、クローニングや化学合成技術またはそれらの組み合わせで得られるようなｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを包含するＤＮＡが含まれる。また、ＤＮＡは二本鎖でも、一本鎖でもよい。一本鎖ＤＮＡは、センス鎖となるコード鎖でもよく、アンチセンス鎖となるアンチコード鎖でもよい。
【００２２】
さらに、上記構成によれば、ＣＲＰ遺伝子のＯＲＦは、２２３５のアミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることが分かる。それゆえ、本発明にかかるＣＲＰ蛋白質とは、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する蛋白質である。また、本発明にかかるＤＮＡとは、配列番号４に示すポリペプチドをコードする、上記ＤＮＡとは異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。したがって、本発明にかかるＤＮＡには、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡであれば、配列番号２や配列番号３に示す塩基配列を含むＤＮＡでなくてもよい。
【００２３】
なお、上述した、配列番号４に示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、上記ポリペプチドをコードする単一の連続領域、またはイントロンで中断されているような不連続領域を含むポリヌクレオチドが包含される。
【００２４】
上述したように、本発明にかかるＣＲＰ遺伝子は、その一部を改変した状態で植物中にて発現させることで、栄養成長期間を短縮するＤＮＡであり、さらに、ＦＴ遺伝子の過剰発現状態で植物中にて発現させることで、ほぼ栄養成長期間を消失させるＤＮＡである。それゆえ、本発明にかかるＤＮＡには、上記ＣＲＰ遺伝子の一部を改変した変異型ＣＲＰ遺伝子も含まれ、特に、ＣＲＰ遺伝子のＯＲＦである、配列番号２に示す塩基配列における塩基の一部を改変したＤＮＡであって、植物中で発現することにより栄養成長期間を短縮することを特徴とするＤＮＡ、すなわち変異型ＣＲＰ遺伝子も含まれる。
【００２５】
また、上記変異型ＣＲＰ遺伝子のより好ましい一例としては、配列番号２に示す塩基配列中の第２９６番目の塩基をシトシンからチミンに置換されてなるＤＮＡ、すなわち配列番号５に示す塩基配列を有するCRYPTIC PRECOCIOUS-1D 変異遺伝子（ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子）が挙げられる。
【００２６】
また、本発明にかかるＣＲＰ蛋白質の変異体、すなわち変異型ＣＲＰ蛋白質は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する蛋白質の変異体であって、植物中にて存在させることで発芽後の栄養成長期間を短縮させることを特徴とする蛋白質であればよい。
【００２７】
この変異型ＣＲＰ蛋白質のより好ましい一例としては、配列番号４に示すアミノ酸配列中の第９９番目のアミノ酸がセリンからフェニルアラニンに置換されてなる蛋白質、すなわち、配列番号６に示すアミノ酸配列を有するＣＲＰ−１Ｄ変異蛋白質を挙げることができる。
【００２８】
したがって、本発明にかかる変異型ＣＲＰ遺伝子としては、配列番号６に示すＣＲＰ−１Ｄ変異蛋白質をコードするポリヌクレオチドであってもよい。
【００２９】
また、本発明にかかる他のＣＲＰ遺伝子は、イネの第１０番染色体にコードされ、配列番号１ないし３の何れかに示す塩基配列を有するＤＮＡと相同性を有するＤＮＡである。具体的には、たとえば、配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができ、配列番号８に示す塩基配列をオープンリーディングフレームとして含むＤＮＡを挙げることができる。
【００３０】
上記イネ由来のＣＲＰ遺伝子（ＯｓＣＲＰ遺伝子と称する）は、イネゲノムのデータベースに対してホモロジー検索を行った結果得られたものであり、シロイヌナズナ由来の上記ＣＲＰ遺伝子と高い相同性を示すものである。それゆえ上記構成によれば、ＯｓＣＲＰ遺伝子も、ＦＴ遺伝子を中心とする花成の人為的制御系の確立に応用できる可能性が高いことが示唆される。
【００３１】
また、本発明にかかる他のＣＲＰ蛋白質としては、配列番号９に示すアミノ酸配列を有する蛋白質、すなわちイネのＣＲＰ蛋白質（ＯｓＣＲＰ蛋白質）が挙げられる。それゆえ、本発明にかかるＯｓＣＲＰ遺伝子となるＤＮＡには、配列番号９に示すポリペプチドをコードする、異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。
【００３２】
なお、本発明者らは、データベースに対する相同性の検索によって、タバコゲノム中にも、上記ＣＲＰ遺伝子と相同性を有すると考えられるＮｔＣＲＰ遺伝子を見出している。このＮｔＣＲＰ遺伝子は、配列番号１０に示す塩基配列を部分塩基配列として含むものであり、その遺伝子産物としてのＮｔＣＲＰ蛋白質は、配列番号１１に示す部分アミノ酸配列を含むものである。
【００３３】
また、本発明における「相同性」とは、たとえばポリヌクレオチドの場合、ロウ・ストリンジェント条件下で、ハイブリダイゼーションが起こり得る程度に類似性を有することを指す。また、本発明において「相同性」を具体的な数値限定として示せば、たとえば、汎用されている相同性検索アルゴリズムであるＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool ）［S.F.Altschul, W.Gish, W.Miller, E.W.Myers & D.J.Lipman:J Mol Biol., 215(3)403-410(1990) ］によるアミノ酸配列レベルの相同性検索で、P-value(ＢＬＡＳＴ２の場合はE-value 。ただし、E-value ＜0.01の場合には、E-value とP-value とはほぼ等しいと見なせる）が０．００１未満であるような一つまたは複数のhigh-scoring segment pair （ＨＳＰ）が存在することとする。なお、上記数値限定における下限（最高度の相同性を意味する）は０である。
【００３４】
本発明にかかる上記ＣＲＰ遺伝子は、ＦＴ遺伝子を過剰発現させてなるシロイヌナズナを突然変異させることで得られる早咲き表現型を極端に昂進するcryptic precocious- １Ｄ（ｃｒｐ−１Ｄ）突然変異体からクローニングされたものである。
【００３５】
それゆえ、本発明には、上記ｃｒｐ−１Ｄ突然変異体のシロイヌナズナ、すなわち、第４番染色体にコードされている、配列番号２に示す塩基配列をオープンリーディングフレームとして含むＣＲＰ遺伝子を、配列番号５に示す塩基配列からなるＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子となるように改変し、より好ましくは、過剰発現するようにＦＴ遺伝子を導入してなるシロイヌナズナも含まれる。
【００３６】
このような突然変異型のシロイヌナズナでは、花成を促進させることができるだけでなく、形成される花にも種子にも異常が見られないため、実験植物として広く利用されているシロイヌナズナを迅速に繁殖させるような用途に好ましく用いることが可能である。
【００３７】
なお、上記「過剰発現（高レベル発現）させているＦＴ遺伝子」とは、組織・発生段階を問わずに高い転写活性を有するようなプロモーターによって発現が制御されるＦＴ遺伝子のことを指す。具体的には、たとえば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５ＳＲＮＡプロモーターにより発現が制御されるＦＴ遺伝子を挙げることができる。
【００３８】
また、本発明における有望な応用技術としては、たとえば、上記ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子、または、ＣＲＰ遺伝子の一部を改変した状態で植物中にて発現させることで、栄養成長期間を短縮する変異型ＣＲＰ遺伝子を導入したことを特徴とするトランスジェニック植物を挙げることができる。このトランスジェニック植物においては、上記のように、プロモーターの選択によって、ＦＴ遺伝子を過剰発現するように導入してなることがより好ましい。
【００３９】
上記トランスジェニック植物は、上記ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子、または、ＣＲＰ遺伝子の一部を改変した状態で植物中にて発現させることで、栄養成長期間を短縮する変異型ＣＲＰ遺伝子を植物に導入するステップを少なくとも含み、好ましくは、過剰発現するようにＦＴ遺伝子を導入するステップを含む生産方法によって生産され得る。
【００４０】
上記構成または方法によれば、トランスジェニック植物の栄養成長期間を短縮化することが可能であり、特に、ＦＴ遺伝子の過剰発現状態では、ほぼ栄養成長を消失させることが可能である。それゆえ、本発明を好適に応用できる用途として、花成促進による繁殖、たとえば種子作物等を迅速に生産するような用途を挙げることができる。
【００４１】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の一形態について図１ないし図５３に基づいて説明すれば、以下の通りである。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【００４２】
本発明にかかる新規な花成制御遺伝子として、本実施の形態では、シロイヌナズナ由来の花成制御遺伝子CRYPTIC PRECOCIOUS遺伝子（ＣＲＰ遺伝子）を挙げて説明する。上記ＣＲＰ遺伝子は、突然変異によって、野生型背景で花成早化の表現型のみを示し、さらに、FLOWERING LOCUS Ｔ遺伝子（ＦＴ遺伝子）の過剰発現背景では、これによって引き起こされる早熟花成を劇的に昂進し、栄養成長相をほぼ完全に消失させる遺伝子である。それゆえ、上記ＣＲＰ遺伝子は、植物の花成制御に重要に関わる新規な遺伝子であり、ＦＴ遺伝子の発現に重大に関与すると考えられる。
【００４３】
上記ＣＲＰ遺伝子は、図１に示すように、１２個のエクソン（図中帯形状で表示）と１１個のイントロン（図中線で表示）とから構成されている。後述するｃｒｐ−１Ｄ突然変異は、図中矢印で示す位置に存在する。なお、図１では、エクソンのうち、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を網かけ部分として示し、１ｋｂのスケールも併記する。
【００４４】
上記ＣＲＰ遺伝子のＤＮＡとしては、図２ないし図１０および配列番号１の塩基配列に示すように、１１０００塩基対（１１ｋｂｐ）のサイズを有している。上記ＣＲＰ遺伝子は、シロイヌナズナ・ゲノムの第４番染色体に１コピーしか存在せず、シロイヌナズナ・ゲノム中には、ＣＲＰ遺伝子と相同性を有する遺伝子は他には存在しない。なお、図２ないし図１０および配列番号１の塩基配列に示すＣＲＰ遺伝子をゲノムＣＲＰ遺伝子と称する。
【００４５】
ゲノムＣＲＰ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、図１１ないし図１５および配列番号２の塩基配列に示すように、６７０８塩基対すなわち約６．７ｋｂｐのサイズを有している。また、ゲノムＣＲＰ遺伝子から得られるｃＤＮＡクローンは、図１６ないし図２１および配列番号３の塩基配列に示すように、７１４９塩基対すなわち約７．１ｋｂｐのサイズを有している。
【００４６】
それゆえ、本発明にかかるＣＲＰ遺伝子としてのＤＮＡは、植物のゲノム中に含まれる形態、すなわちイントロンなどの非コード配列を含む「ゲノム」形ＤＮＡであってもよいし、逆転写酵素やポリメラーゼを用いてｍＲＮＡを経て得られるｃＤＮＡ、すなわちイントロンなどの非コード配列を含まない「転写」形ＤＮＡであってもよい。
【００４７】
また、本発明にかかるＣＲＰ遺伝子としてのＤＮＡには、コードされているＣＲＰ蛋白質の形成に悪影響を与えないか妨げない限りにおいて、他のＤＮＡ配列を含んでいてもよい。たとえば、後述する遺伝子組み換え等に用いるために、リンカーを末端に含ませることもできる。
【００４８】
上記ゲノムＣＲＰ遺伝子は、図２２および図２３並びに配列番号４のアミノ酸配列に示すように、２２３５のアミノ酸残基からなるポリペプチドをコードしている。換言すれば、ＣＲＰ遺伝子産物としての蛋白質は、２２３５のアミノ酸残基からなる蛋白質である。本発明では、この蛋白質をＣＲＰ蛋白質と称する。
【００４９】
上記ＣＲＰ蛋白質は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster ）、ヒト、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）で転写メディエーター、または転写コアクチベーターとして知られる蛋白質と部分的な相同性を有している。すなわち、これら公知の転写メディエーターなどの蛋白質とＣＲＰ蛋白質とは類似した配列を含む領域を持つ。
【００５０】
たとえば、ＣＲＰ蛋白質と、キイロショウジョウバエの転写コアクチベーターkohtalo （ｋｔｏ) 蛋白質（２５３１アミノ酸）との間でアミノ酸配列を比較すると、図２４に示すように、ＣＲＰ蛋白質における６１番目のアミノ酸：セリンから２６１番目のアミノ酸：ロイシンまでの領域は、ｋｔｏ蛋白質と非常に類似する配列を有している。特に、アミノ酸配列における６２番目から６７番目までの領域と、２１０番目から２１６番目までの領域とについては、ＣＲＰ蛋白質とｋｔｏ蛋白質との間で完全に一致している。
【００５１】
一般に、転写調節因子による転写の調節、すなわち転写反応の促進または抑制には、転写メディエーターまたは転写コアクチベーターが介在するが、上記ｋｔｏ蛋白質とＣＲＰ遺伝子との相同性から鑑みて、本発明にかかるＣＲＰ遺伝子は、花成の制御機構に関わる転写メディエーターまたは転写コアクチベーターをコードする遺伝子であると推測される。
【００５２】
従来、このような花成の制御機構に関わる転写メディエーターまたは転写コアクチベーターをコードすると推測される遺伝子はクローニングされておらず、それゆえ、ＣＲＰ遺伝子は、この種の遺伝子としては初めてクローニングされたものとなる。
【００５３】
上記ＦＴ遺伝子は、花成の制御機構において「花成のスイッチ遺伝子」として機能することが知られている。そのため、本発明にかかるＣＲＰ遺伝子は、ＦＴ遺伝子の発現の調節に応用できる可能性が高い。それゆえ、本発明にかかるＣＲＰ遺伝子は、花成の人為的な操作や花成の人為的な制御、さらには、ＦＴ遺伝子を中心とする花成の人為的制御系の確立に、有効に利用できる可能性がある。
【００５４】
本発明にかかるＣＲＰ遺伝子のクローニング方法としては、従来公知の方法を利用することが可能であり、特に限定されるものではない。本発明においては、その目的が、従来知られていない全く新規の花成制御遺伝子をクローニングすることであったので、後述する実施例で説明するように、シロイヌナズナＦＴ遺伝子を過剰発現するトランスジェニック・シロイヌナズナ（形質転換シロイヌナズナ）を、突然変異誘起剤エチルメタンスルフォン酸で処理して得られる早咲き表現型の突然変異体を用いて、シロイヌナズナのゲノムデータベースからＣＲＰ遺伝子を同定し、クローニングしている。
【００５５】
本発明では、シロイヌナズナ由来の上記ＣＲＰ遺伝子を用いて、他の植物からＣＲＰ遺伝子と相同性を有するＤＮＡをクローニングすることが可能である。この場合のクローニング方法としても、従来公知の方法を利用することが可能であり、特に限定されるものではない。
【００５６】
具体的には、ゲノムの少なくとも一部がデータベース化されている植物の場合には、上記ＣＲＰ遺伝子の塩基配列に基づいて相同性のある塩基配列をデータベース中から検索すればよい。本発明では、後述するように、少なくともイネおよびタバコからＣＲＰ遺伝子との相同性を有する塩基配列を見出している。
【００５７】
また、ゲノムがデータベース化されていない植物の場合には、たとえば、従来公知のＤＮＡライブラリーを用いたハイブリダイゼーション法を用いることもできる。具体的には、適切なクローニング・ベクターを使用して対象となる植物からゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを調製するステップと、上記ＣＲＰ遺伝子の少なくとも一部をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行い、ライブラリーから上記プローブにポジティブの断片を検出するステップとを含む方法を用いることができる。
【００５８】
なお、本発明では、汎用されている相同性検索アルゴリズムである上記ＢＬＡＳＴによる塩基配列およびアミノ酸配列レベルの相同性検索によって、後述するように、イネおよびタバコのゲノムのデータベースからＣＲＰ遺伝子との相同性を有する塩基配列を見出している。
【００５９】
本発明にかかるＣＲＰ遺伝子の一部を改変することによって、変異型ＣＲＰ遺伝子が得られるが、この変異型ＣＲＰ遺伝子は、植物中にて発現させることで、栄養成長期間を短縮することが可能なものが含まれる。中でも、より好ましい一例としては、本発明では、配列番号２に示す塩基配列中の第２９６番目の塩基をシトシン（ｃ／Ｃ）からチミン（ｔ／Ｔ）に置換してなるＤＮＡ、すなわち図２５ないし図２９および配列番号５に示す塩基配列をＯＲＦとして有するCRYPTIC PRECOCIOUS-1D 変異遺伝子（ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子）が挙げられる。
【００６０】
このＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子のＯＲＦは、上記第２９６番目の塩基の改変を除いては、上記ＣＲＰ遺伝子のＯＲＦと全く同じであり、サイズも６７０８塩基対である。しかしながら、上記ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子は、それ単体のみで植物中にて発現させても栄養成長期間を短縮化して花成を促進する機能を有しており、さらには、ＦＴ遺伝子が過剰発現されている状態で、植物中にて発現させれば、ほぼ栄養成長期間を無くすまでに花成を促進するという機能を有している。
【００６１】
また、上記ＣＲＰ遺伝子が上記ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子に改変されることによって発現する突然変異を、本発明では、後述する実施例に示すように、cryptic precocious-1D （ｃｒｐ−１Ｄ）と命名しており、本発明にかかるＣＲＰ遺伝子の名称もこれに由来している。なお、このｃｒｐ−１Ｄ突然変異は優性である。
【００６２】
上記ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子産物は、図２２および図２３並びに配列番号４に示すアミノ酸配列を有する蛋白質の変異体であって、図２２および図２３並びに配列番号４に示すアミノ酸配列中の第９９番目のアミノ酸がセリン（Ser ）からフェニルアラニン（Phe ）に置換されてなる蛋白質、すなわち、図３０および図３１並びに配列番号６に示すアミノ酸配列を有するＣＲＰ−１Ｄ変異蛋白質である。
【００６３】
このＣＲＰ−１Ｄ変異蛋白質は、上記第９９番目のアミノ酸の置換を除いては、上記ＣＲＰ蛋白質のアミノ酸配列と全く同じであり、サイズも２２３５のアミノ酸残基である。しかしながら、このＣＲＰ−１Ｄ変異蛋白質を植物中にて存在させると、少なくとも、その植物は、発芽後の栄養成長期間を短縮することができる。特に、ＦＴ遺伝子産物としてのＦＴ蛋白質が過剰に存在する状況では、上記植物の栄養成長期間をほぼ無くすまでに短縮することが可能である。
【００６４】
上記ｃｒｐ−１Ｄ突然変異が優性であることから、上記第９９番目のアミノ酸の置換により、ＣＲＰ−１Ｄ変異蛋白質は、ＣＲＰ蛋白質と比較して、新しい機能が賦与されたか、共存する正常なＣＲＰ蛋白質の機能を阻害するような性質が賦与されたかの少なくとも何れかであると推測される。
【００６５】
また、上記新しい機能または阻害性質の付与から鑑みれば、本発明にかかる変異型ＣＲＰ蛋白質としては、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する蛋白質の変異体であって、植物中にて存在させると発芽後の栄養成長が短縮するものであれば、上記ＣＲＰ−１Ｄ変異蛋白質のみに限定されるものではない。
【００６６】
具体的には、第９９番目のセリンを、フェニルアラニンと共通する性質（芳香環を含む側鎖を持つ、あるいは、大きな側鎖を持つ）のアミノ酸へ置換することによっても、同様の機能が生じる可能性は高い。また、複数のアミノ酸が置換されることによっても同様の機能が生じる可能性もある。
【００６７】
したがって、本発明にかかる変異型ＣＲＰ蛋白質には、配列番号４に示すＣＲＰ蛋白質のアミノ酸配列において、数個、具体的には、５〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１個のアミノ酸残基が置換、欠失または付加、あるいはそれらの組み合わせが生じているポリペプチドが含まれてもよい。勿論、特に好ましいのは、第９９番目のアミノ酸残基がセリンからフェニルアラニン、またはそれに類似するアミノ酸に置換されたポリペプチドである。
【００６８】
本発明者らは、上述したように、シロイヌナズナ由来のＣＲＰ遺伝子を用いて、イネ（Oryzae sativa ）から相同遺伝子と考えられる遺伝子をクローニングしている。具体的には、データベースに登録されているイネの第１０番染色体の塩基配列の中から、ＣＲＰ遺伝子の相同遺伝子と考えられる塩基配列を見出し、この塩基配列を有する遺伝子を、ＯｓＣＲＰ遺伝子と命名した。なお、ＯｓＣＲＰ遺伝子の検索に関しては、ＢＬＡＳＴ２による相同性検索で、E-value ＝０である。
【００６９】
上記ＯｓＣＲＰ遺伝子としてのＤＮＡ（ゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子）は、図３２ないし図４１および配列番号７の塩基配列に示すように、１３０００塩基対（１３ｋｂｐ）のサイズを有している。ゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子が存在する領域は、現状では，イネ・ゲノムの第１０番染色体に１コピー存在している。したがって、イネ・ゲノム中では、ＣＲＰ遺伝子と相同性を有する遺伝子が、少なくとも１コピー存在することになる。このゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子のＯＲＦは、図４２ないし図４６および配列番号８の塩基配列に示すように、６５６１塩基対すなわち約６．６ｋｂｐのサイズを有している。
【００７０】
上記ゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子は、図４７および図４８並びに配列番号９のアミノ酸配列に示すように、２１８６のアミノ酸残基からなるポリペプチドをコードしている。換言すれば、ＯｓＣＲＰ遺伝子産物としてのＯｓＣＲＰ蛋白質は、２１８６のアミノ酸残基からなる蛋白質である。
【００７１】
上記ＯｓＣＲＰ蛋白質とＣＲＰ蛋白質との間で、アミノ酸配列の相同性を見た場合、図４９ないし図５１に示すように、上記ｋｔｏ蛋白質において相同性の高かった領域を含む第４８番目から第２６８番目の領域、第５３４から第５７７番目までの領域、第６３４番目から第６５４番目までの領域、第６６９から第６８９番目までの領域、第９２４から第９６０番目までの領域、第１６６９から第１６９３番目までの領域、第２２０６から第２２３５番目までの領域等については、よく保存されている。
【００７２】
上記の比較結果から、ＣＲＰ遺伝子産物としてのＣＲＰ蛋白質においては、アミノ酸配列における第９９番目のセリンと、第６１番目のセリンから第２６１番目のロイシンまでの領域とが非常に重要であることが分かる。
【００７３】
また、イネと同様に、データベースに登録されているタバコ（Nicotiana tabacum ）のゲノムの塩基配列の中から、シロイヌナズナ由来のＣＲＰ遺伝子の相同遺伝子の一部と推測される塩基配列を見出し、この塩基配列を含む遺伝子を、ＮｔＣＲＰ遺伝子と命名した。なお、ＮｔＣＲＰ遺伝子の検索に関しては、予想される全アミノ酸配列の一割程度の長さであることもあり、ＢＬＡＳＴ２による相同性検索で、E-value ＝４ｅ-10 程度である。
【００７４】
図５２および配列番号１０に示す塩基配列は、ＮｔＣＲＰ遺伝子のＯＲＦの部分塩基配列（２８５塩基対分）であり、ＣＲＰ遺伝子における第１ないし第３エクソンを含む領域に対して相同性を有している。また、この部分塩基配列の遺伝子産物としての部分アミノ酸配列は、図５３および配列番号１１に示すように、Ｎ末端の９６のアミノ酸残基分に相当する。
【００７５】
このように、本発明にかかるシロイヌナズナ由来のＣＲＰ遺伝子と類似する遺伝子は、イネやタバコでも見出されており、さらにはキイロショウジョウバエ、ヒト、出芽酵母でも見出されている。したがって、ＣＲＰ遺伝子に類似する塩基配列のＤＮＡは、幅広い種のゲノム中で保存されていることが示唆される。
【００７６】
それゆえ、本発明にかかる変異型ＣＲＰ遺伝子を導入することで花成を促進させ得る植物としては、シロイヌナズナに特に限定されず、幅広い種類の植物を用いることができる可能性は非常に高い。特に、ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子を植物に導入して高いレベルで発現させれば、栄養成長期間を短縮し、花の形成を早めることができる可能性は非常に高いと推測される。この場合でも、シロイヌナズナの場合と同様、花の形態・種子形成能は正常であると推測される。特に、ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子とＦＴ遺伝子を同時に導入し、植物内で高いレベルで発現させれば、実質的に、栄養成長期間を経ずに花を形成させ得る可能性は非常に高い。しかも、この場合にも、花の形態・種子形成能は正常であると推測される。
【００７７】
したがって、本発明には、少なくともＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子を導入してなるトランスジェニック植物も含まれ、ＦＴ遺伝子を過剰発現するとともに、ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子を発現するトランスジェニック植物も含まれる。
【００７８】
上記トランスジェニック植物では、ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子が発現するため、花成を促進することが可能である。しかも、特にＦＴ遺伝子が過剰発現する条件下では、後述するシロイヌナズナを用いた実施例の結果を考慮すれば、ほぼ栄養成長を回避し得るまで花成を促進できる可能性が非常に高い。そのため、発芽から迅速に種子を得ることが可能である。しかも花や種子の形成能はほぼ正常であると推測されるため、本発明を好適に応用できる分野の一つとして、植物の種子を迅速に生産する用途を挙げることができる。
【００７９】
本発明における上記植物としては、花を形成する植物を全て含めてよい。また、上記植物には、完全な植物だけでなく、その一部、例えば、葉、種子、塊茎、挿木等を含めてもよい。さらには、上記植物には、予め形質転換された遺伝子組み換え植物やその子孫を起源とする植物組織、プロトプラスト、細胞、カルス、器官、植物種子、胚芽、花粉、卵細胞、接合子などの増殖可能な植物材料；花、茎、実、葉、根などを含む植物の一部；等も含めてよい。なお、上記植物材料は、有性的または無性的にin vitroまたはin vivo で繁殖可能なものを指す。
【００８０】
本発明において、植物にＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子やＦＴ遺伝子を導入する方法としては、ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子やＦＴ遺伝子を含むベクターを用いて、宿主細胞すなわち上記植物を形質転換することによって導入する方法を用いることが可能である。
【００８１】
上記ベクターは、公知の形質転換方法によって植物（宿主細胞）に導入される。植物を形質転換する方法としては、具体的には、たとえば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウムによる形質転換法、直接遺伝子転移法、弾道粒子加速法、プロトプラスト形質転換／再生法などを挙げることができるが、特に限定されるものではない。また、上記形質転換方法としては、標的となる植物の種類、たとえば単子葉植物・双子葉植物などに応じて適宜選択されるものであり、特に限定されるものではない。
【００８２】
本発明では、植物中でＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子を安定して発現させる等の目的で、ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子を組み換えてなる組み換えベクターを用いても構わない。なお、上記組み換え方法については、従来公知の方法を用いることが可能であり、特に限定されるものではない。なお、以下の説明で、ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子の導入に関する技術は、組み換え技術等も含めて、ＦＴ遺伝子の導入および発現にも応用できることは言うまでもない。
【００８３】
上記ベクターとしては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを挙げることができるが特に限定されるものではない。上記ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子やＦＴ遺伝子は、シロイヌナズナ等由来となる植物から単離された形態で、好ましくは組み換えられて、ベクター中に組み込まれればよい。
【００８４】
たとえば、上記組み換えの一例としては、プロモーター・シグナル配列・転写ターミネーター等の適切な調節配列とＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子（またはＦＴ遺伝子）とを連結するような例が挙げられる。上記植物または植物細胞中で有効に機能し得るプロモーターとしては、たとえばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）１９ＳＲＮＡプロモーターまたは３５ＳＲＮＡプロモーターおよびＣａＭＶ二重プロモーター；ノパリンシンターゼプロモーター；病因関連（ＰＲ）蛋白プロモーター：等が挙げられるが特に限定されるものではない。
【００８５】
導入されたＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子は、植物細胞中でベクターとして存在してもよいし、植物ＤＮＡ中に「外部」ＤＮＡ、又は「付加」ＤＮＡとして含まれてもよい。ここで言う「外部」ＤＮＡとは、植物ゲノム中には天然に存在しないが人為的操作の結果、植物ゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。また上記「付加」ＤＮＡとは、特定の植物ゲノム中に天然に存在するが、人為的操作の結果、さらに追加して植物ゲノム中に挿入されたＤＮＡを意味する。
【００８６】
上記ベクターとして、一般的に用いられるものとしては、たとえば、アグロバクテリウム  ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens ）のＴｉプラスミドを挙げることができる。このＴｉプラスミドは、双子葉植物の形質転換にも単子葉植物の形質転換にも用いることが可能である。この場合、上記ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子は、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡに組み込まれた上で、植物細胞に導入される。
【００８７】
上記Ｔｉプラスミドを植物細胞に導入する方法としては、特に限定されるものではなく、Ｔｉプラスミドを「完全な」植物に感染させる、上記植物材料に感染させる、あるいは、植物細胞をプロトプラスト化またはスフェロプラスト化して、これをアグロバクテリウム・ツメファシエンスと共に同時培養する等の方法を用いることが可能である。
【００８８】
また、本発明では、シロイヌナズナ由来のＣＲＰ−１Ｄ遺伝子を、植物細胞のゲノムに導入し、その植物細胞から形質転換された「完全な」植物（形質転換植物）を再生して、必要なら増殖させ、さらに、親世代または継代される子孫世代として得られる形質転換植物から、植物の所望の一部、たとえば種子を得るような手法を用いることも可能である。なお、上記完全な植物の増殖には、水耕栽培や温室栽培等を含む、一般的な従来公知の農業の方法を利用すればよい。
【００８９】
また、本発明では、親世代の植物には、ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子が安定して発現することが好ましいが、子孫世代の植物では、必ずしも安定して発現する必要はない。換言すれば、子孫世代の植物では、親世代の植物に導入されたＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子を意図的に消失させるような比較的「不安定」な形質転換法を選択することも可能である。
【００９０】
たとえば、本発明の用途としては、植物の種子を迅速に生産する用途を想定することができる。たとえば、交配による育種の途中の段階で、少量でもよいから少しでも早く種子を得たいような場合には、本発明を好適に利用することができる。
【００９１】
この場合、ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子とＦＴ遺伝子とを発現させれば、対象となる植物の栄養成長期間をほぼ消失させて、迅速に植物の種子を得ることが可能である。しかしながら、上記対象となる植物が、たとえば園芸用の花卉であり、産業上利用するには、栄養成長でなければ生じない本葉が重要となる場合には、栄養成長期間の消失は好ましくないことになる。そこで、このような場合では、親世代のみで栄養成長期間を消失させ、子孫世代では、少なくともＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子が発現しないようにしておけば、上記問題点を解消することが可能である。
【００９２】
本発明を利用することができる上記植物としては、花を形成する植物であればよい。具体的には、アサガオなど花そのものを利用する鑑賞用や園芸用の花卉、シロイヌナズナなどの実験植物、あるいは、花成後に生じる種子（ここでは果実も含む）を利用する種子作物を挙げることができる。特に種子作物の場合には、産業上の利用では、たとえば上述したような、親世代で消失した栄養成長を子孫世代で復活させるような必然性がない場合が多く、種子を迅速に生産できればよいため、好ましい利用対象植物として挙げることが可能である。
【００９３】
上記種子作物としては、たとえば、イネ、キビ、アワ、トウモロコシ、大麦、コムギ、モロコシ、ライムギ、エンバク等の穀物類；大豆、小豆等のマメ科植物；ワタ、ナタネ等のその他の種子を利用する植物；トマト、キュウリ、ナスなどの実生の野菜；リンゴ、ナシ、サクランボ、ブドウ、柑橘類、バナナ等の果物；ココア、コーヒー等の嗜好品作物；等を挙げることができる。
【００９４】
このように、本発明にかかるトランスジェニック植物は、上記ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子を植物に導入したものであるので、栄養成長期間を短縮化することが可能である。特に、ＦＴ遺伝子の過剰発現状態では、子葉が生じた後に、ほぼ栄養成長を経ずに花を形成する可能性が高い。そのため、花成促進による植物の繁殖、たとえば上記種子作物等を迅速に生産するような用途に応用することが可能となっている。
【００９５】
さらには、本発明には、上述してきたトランスジェニック植物を生産する方法が含まれてもよい。すなわち、ある特定の植物を迅速に生産したい場合には、上述した各種の形質転換法を用いて、ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子、または、ＦＴ遺伝子およびＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子を植物に導入すればよい。
【００９６】
また、本発明にかかる上記ＣＲＰ遺伝子は、後述する実施例で詳細に述べるように、ＦＴ遺伝子を過剰発現させてなるシロイヌナズナを突然変異させることで得られる早咲き表現型を極端に昂進するcryptic precocious-1D （ｃｒｐ−１Ｄ）突然変異体からクローニングされたものである。したがって、上記ｃｒｐ−１Ｄ突然変異体のシロイヌナズナも十分利用価値を有する。
【００９７】
シロイヌナズナは、（１）世代時間が約５〜６週間と非常に短いこと、（２）通常の実験室内で水耕栽培によって生育できること、（３）植物体そのものが２０〜３０ｃｍ程度と小さいこと、（４）自家和合性（同じ花の花粉で受精する）であるため、多数の種子（１個体当たり数百から数千個）が得られること、（５）染色体数が少ないため、遺伝子のマッピングが容易であること、（６）ゲノムサイズが既知の植物中最小であること等の利点があるため、小型の実験植物としては、非常によく用いられている。
【００９８】
ここで、上記ｃｒｐ−１Ｄ突然変異型のシロイヌナズナでは、後記の実施例で述べるように、花成を促進させることができるだけでなく、形成される花にも種子にも異常が見られない。それゆえ、実験用等にシロイヌナズナを迅速に繁殖させるような用途には、上記ｃｒｐ−１Ｄ突然変異型のシロイヌナズナを特に好ましく用いることができる。
【００９９】
上記ｃｒｐ−１Ｄ突然変異型のシロイヌナズナの生産方法は特に限定されるものではない。たとえば、後記の実施例に示すように、ＦＴ遺伝子を過剰発現するように形質転換したトランスジェニック・シロイヌナズナ（形質転換シロイヌナズナ）を、従来公知の突然変異誘起剤で処理することによって容易に得ることができる。あるいは、上述した従来公知の形質転換法を用いて、ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子を野生型のシロイヌナズナに導入してもよい。
【０１００】
なお、ＦＴ遺伝子を過剰発現させる方法としては、特に限定されるものではなく、前述したＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子の導入に関する技術を応用すればよい。一般的には、組織・発生段階を問わずに高い転写活性を有するプロモーターを選択することによって、ＦＴ遺伝子を野生型よりも過剰に発現させればよい。たとえば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣＡＭＶ）の３５ＳＲＮＡプロモーターにより発現が制御されるＦＴ遺伝子を好ましく用いることができる。
【０１０１】
【実施例】
次に、本発明にかかるＣＲＰ遺伝子およびＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子、並びにＣＲＰ蛋白質およびＣＲＰ−１Ｄ変異蛋白質の具体的な取得方法について、図５４および図５５に基づいて、より詳細に説明する。なお、本発明は、これに限定されるものではない。
【０１０２】
〔突然変異体の取得〕
文献１：Y.Kobayashi, H.Kaya, K.Goto, M.Iwabuchi & T.Araki : Science, 286 1960-1962 (1999) に開示している、シロイヌナズナ由来のＦＴ遺伝子がＣＡＭＶの３５ＳＲＮＡプロモーターにより過剰発現（高レベル発現）するトランスジェニック・シロイヌナズナ（形質転換シロイヌナズナ）を、突然変異誘起剤エチルメタンスルフォン酸で処理した。このときの処理方法については、文献２：『新版・モデル植物の実験プロトコール』（島本功・岡田清孝監修  秀潤社  2001）の第６３〜６８頁に記載している処理方法を用いた。
【０１０３】
得られた形質転換シロイヌナズナの子孫から、ＦＴ遺伝子の過剰発現による早咲き表現型を極端に昂進する突然変異体の系統を見出し、その性質の遺伝性を確認した。原因となる突然変異は優性であり、cryptic precocious-1D （ｃｒｐ−１Ｄと略す）と命名した。ｃｒｐ−１Ｄ突然変異体において突然変異をおこしている遺伝子を突然変異の名称にもとづいて CRYPTIC PRECOCIOUS （ＣＲＰ）遺伝子と命名した。
【０１０４】
〔ｃｒｐ−１Ｄ突然変異体の性質の評価〕
上記ＣＲＰ遺伝子の遺伝子型としてｃｒｐ−１Ｄ突然変異をホモ接合で有するシロイヌナズナと、対照標準（コントロール）として、野生型ホモ接合のシロイヌナズナ（正常なＣＲＰ遺伝子を有するシロイヌナズナ）とをそれぞれ１５個体準備し、長日（１６時間明・８時間暗）の条件で生育させた。この生育時における栄養成長期間の長さに基づいて、ｃｒｐ−１Ｄ突然変異体の性質を評価した。なお、栄養成長期間の長さについては、栄養成長の過程で形成されるロゼット葉の数を指標とした。
【０１０５】
図５４に示すように、発芽後４週間目における花成の状態を比較すると、ｃｒｐ−１Ｄ突然変異をホモ接合で有するシロイヌナズナ（図中、形質転換植物と表現）ではすでに開花・結実が始まっているのに対して、野生型ホモ接合のシロイヌナズナではようやく蕾が形成された程度であった。
【０１０６】
また、最終的には、表１に示すように、野生型のシロイヌナズナ（図中、非形質転換植物と表現）では、ｃｒｐ−１Ｄ突然変異をホモ接合に持たせた場合には、本葉を形成する栄養成長期間（３〜４週間）が数日程度短縮された。なお、形成された花の形態や種子形成能には異常はなかった。
【０１０７】
【表１】
0004685278.tif 000002
【０１０８】
さらに、上記ｃｒｐ−１Ｄ突然変異をホモ接合で有するシロイヌナズナと、上記野生型ホモ接合のシロイヌナズナを、シロイヌナズナ由来のＦＴ遺伝子で形質転換し、ＦＴ遺伝子を高いレベルで発現させた形質転換シロイヌナズナとした上で、上記と同様の条件にて、ｃｒｐ−１Ｄ突然変異体の性質を評価した。
【０１０９】
図５５（ａ）および表２に示すように、ＦＴ遺伝子を過剰発現させると、正常なＣＲＰ遺伝子を有する野生型ホモ接合の形質転換シロイヌナズナ（図中、形質転換植物と表現）でも、子葉形成後、２〜４枚の本葉を形成する短い栄養成長期間を経たのみで、花が形成された（上記文献１参照）。
【０１１０】
さらには、図５５（ｂ）および表２に示すように、同じ形質転換シロイヌナズナがｃｒｐ−１Ｄ突然変異をヘテロ接合で有する場合では、発芽後、本葉を形成することなく花が形成された。なお、何れの場合でも、形成された花の形態や種子形成能には異常はなかった。また、図５５（ａ）・（ｂ）では、発芽後１週間目の結果を示している。
【０１１１】
【表２】
0004685278.tif 000003
【０１１２】
〔ＣＲＰ遺伝子の同定〕
まず、上記文献２、および文献３：『モデル植物ラボマニュアル』（岩淵雅樹・岡田清孝・島本功監修  シュプリンガー・フェアラーク東京  2000）の第５１〜６６頁に記載している方法を用いて、ｃｒｐ−１Ｄ突然変異体を用いてＣＲＰ遺伝子の染色体上における位置を決定した。その結果と、データベースにあるシロイヌナズナのゲノムの塩基配列情報にもとづいて、ＣＲＰ遺伝子が存在する領域を第４番染色体の約３００００塩基対の範囲に限定した。その領域内に予測された遺伝子について、野生型株とｃｒｐ−１Ｄ突然変異株とで塩基配列の比較を行った。その結果、１つの遺伝子が両者の間で異なる塩基配列を持つことを確認し、その遺伝子がＣＲＰ遺伝子であると判断した。
【０１１３】
〔ＣＲＰ遺伝子のｃＤＮＡクローンの取得〕
ＣＲＰ遺伝子の塩基配列から、約７１００塩基対のｃＤＮＡが予想され、完全長ｃＤＮＡクローンを単一のクローンとして取得することは容易でないと判断した。そこで、ｃＤＮＡを前半分と後半分の２つに分けて、それぞれを別々に取得したのち、それらを連結して完全長ｃＤＮＡクローンを作成した。
【０１１４】
ｃＤＮＡの中ほどに制限酵素SphIの認識・切断部位が１箇所ある。そこで、前半分と後半分がいずれも制限酵素SphIの認識・切断部位を含むように一部重複するかたちでｃＤＮＡを二分し、文献４：『新版・植物のＰＣＲ実験プロトコール』（島本功・佐々木卓治監修  秀潤社  1997）の第１０６〜１０９頁に記載している方法を用いて、それぞれをＲＴ−ＰＣＲ法により増幅・取得した。その結果得られた前半分と後半分を制限酵素SphIで切断し、ＤＮＡリガーゼにより連結し、完全長ｃＤＮＡクローンとした。
【０１１５】
なお、本実施例でクローニングされたＣＲＰ遺伝子およびＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子、これら遺伝子にコードされているＣＲＰ蛋白質およびＣＲＰ−１Ｄ蛋白質、並びに、前記実施の形態で述べたＯｓＣＲＰ遺伝子とそれにコードされているＯｓＣＲＰ蛋白質、ＮｔＣＲＰ遺伝子とそれにコードされているＮｔＣＲＰ蛋白質の配列について、改めて表３として以下にまとめておく。
【０１１６】
【表３】
0004685278.tif 000004
【０１１７】
【発明の効果】
以上のように、本発明にかかる遺伝子は、植物のゲノムから単離され、その一部を改変した状態で植物中にて発現させることで、栄養成長期間を短縮する遺伝子であり、具体的には、シロイヌナズナの第４番染色体にコードされるＣＲＰ遺伝子を挙げることができる。上記遺伝子は、その一部を改変した状態で、かつＦＴ遺伝子の過剰発現状態で植物中にて発現させることで、発芽後に本葉形成を回避して花を形成するものである。
【０１１８】
それゆえ、上記構成では、花成を促進させるという、花成制御の一つの方法を実現できる上に、ＦＴ遺伝子を中心とする花成の制御機構に重要に関与することが明らかであるため、ＦＴ遺伝子を中心とする花成の人為的制御系の確立に応用することができるという効果を奏する。
【０１１９】
上記ＣＲＰ遺伝子は、具体的には、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡであり、配列番号２に示す塩基配列をオープンリーディングフレームとして含むＤＮＡであり、さらに、配列番号３に示す塩基配列を有するｃＤＮＡである。
【０１２０】
また、本発明にかかるＣＲＰ蛋白質とは、上記塩基配列を有するＣＲＰ遺伝子の遺伝子産物であり、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する蛋白質である。また、本発明にかかるＤＮＡとは、配列番号４に示すポリペプチドをコードする、上記ＤＮＡとは異なる塩基配列を有するポリヌクレオチド（遺伝子）であってもよい。
【０１２１】
さらに、本発明にかかる変異型ＣＲＰ遺伝子は、ＣＲＰ遺伝子のＯＲＦであり、配列番号２に示す塩基配列における塩基の一部を改変したＤＮＡであって、植物中で発現することにより栄養成長期間を短縮するＤＮＡである。この変異型ＣＲＰ遺伝子のより好ましい一例としては、配列番号２に示す塩基配列中の第２９６番目の塩基をシトシンからチミンに置換されてなるＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子が挙げられる。
【０１２２】
また、本発明にかかるＣＲＰ蛋白質の変異体、すなわち変異型ＣＲＰ蛋白質は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する蛋白質の変異体であって、植物中にて存在させることで発芽後の栄養成長が短縮する蛋白質である。この変異型ＣＲＰ蛋白質のより好ましい一例としては、配列番号４に示すアミノ酸配列中の第９９番目のアミノ酸がセリンからフェニルアラニンに置換されてなる蛋白質、すなわち、配列番号６に示すアミノ酸配列を有するＣＲＰ−１Ｄ変異蛋白質が挙げられる。
【０１２３】
したがって、本発明にかかる変異型ＣＲＰ遺伝子としては、配列番号６に示すＣＲＰ−１Ｄ変異蛋白質をコードするＤＮＡであってもよい。
【０１２４】
また、本発明にかかる他のＣＲＰ遺伝子は、イネの第１０番染色体にコードされ、配列番号１ないし３の何れかに示すＤＮＡと相同性を有するＤＮＡ、たとえば、配列番号７に示す塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができ、配列番号８に示す塩基配列をオープンリーディングフレームとして含むＤＮＡを挙げることができる。
【０１２５】
また、本発明にかかる他のＣＲＰ蛋白質としては、配列番号９に示すアミノ酸配列を有する蛋白質、すなわちイネのＣＲＰ蛋白質（ＯｓＣＲＰ蛋白質）が挙げられる。
【０１２６】
さらに、本発明には、上記ｃｒｐ−１Ｄ突然変異体のシロイヌナズナも含まれる。このｃｒｐ−１Ｄ突然変異体のシロイヌナズナでは、花成を促進させることができるだけでなく、形成される花にも種子にも異常が見られないため、実験植物として広く利用されているシロイヌナズナを迅速に繁殖させるような用途に、特に好ましく用いることができるという効果を奏する。
【０１２７】
本発明における有望な応用技術としては、たとえば、上記ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子、または、ＣＲＰ遺伝子の一部を改変した状態で植物中にて発現させることで、栄養成長期間を短縮する変異型ＣＲＰ遺伝子を導入したことを特徴とするトランスジェニック植物が挙げられる。また、上記ＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子または変異型ＣＲＰ遺伝子を植物に導入するステップを少なくとも含むことを特徴とするトランスジェニック植物の生産方法が挙げられる。
【０１２８】
上記構成または方法によれば、トランスジェニック植物の栄養成長期間を短縮化することが可能であり、特に、ＦＴ遺伝子の過剰発現状態では、ほぼ栄養成長を消失させることも可能である。その結果、花成する植物の繁殖、たとえば種子作物等を迅速に生産するような用途に応用することが可能となるという効果を奏する。
【０１２９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明にかかるＣＲＰ遺伝子のエクソンおよびイントロンの概略構造を示す遺伝子構造図である。
【図２】配列番号１に対応するゲノムＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す配列図である。
【図３】配列番号１に対応するゲノムＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す、図２の続きとなる配列図である。
【図４】配列番号１に対応するゲノムＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す、図３の続きとなる配列図である。
【図５】配列番号１に対応するゲノムＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す、図４の続きとなる配列図である。
【図６】配列番号１に対応するゲノムＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す、図５の続きとなる配列図である。
【図７】配列番号１に対応するゲノムＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す、図６の続きとなる配列図である。
【図８】配列番号１に対応するゲノムＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す、図７の続きとなる配列図である。
【図９】配列番号１に対応するゲノムＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す、図８の続きとなる配列図である。
【図１０】配列番号１に対応するゲノムＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す、図９の続きとなる配列図である。
【図１１】配列番号２に対応するゲノムＣＲＰ遺伝子のＯＲＦの塩基配列を示す配列図である。
【図１２】配列番号２に対応するゲノムＣＲＰ遺伝子のＯＲＦの塩基配列を示す、図１１の続きとなる配列図である。
【図１３】配列番号２に対応するゲノムＣＲＰ遺伝子のＯＲＦの塩基配列を示す、図１２の続きとなる配列図である。
【図１４】配列番号２に対応するゲノムＣＲＰ遺伝子のＯＲＦの塩基配列を示す、図１３の続きとなる配列図である。
【図１５】配列番号２に対応するゲノムＣＲＰ遺伝子のＯＲＦの塩基配列を示す、図１４の続きとなる配列図である。
【図１６】配列番号３に対応するＣＲＰ遺伝子のｃＤＮＡクローンの塩基配列を示す配列図である。
【図１７】配列番号３に対応するＣＲＰ遺伝子のｃＤＮＡクローンの塩基配列を示す、図１６の続きとなる配列図である。
【図１８】配列番号３に対応するＣＲＰ遺伝子のｃＤＮＡクローンの塩基配列を示す、図１７の続きとなる配列図である。
【図１９】配列番号３に対応するＣＲＰ遺伝子のｃＤＮＡクローンの塩基配列を示す、図１８の続きとなる配列図である。
【図２０】配列番号３に対応するＣＲＰ遺伝子のｃＤＮＡクローンの塩基配列を示す、図１９の続きとなる配列図である。
【図２１】配列番号３に対応するＣＲＰ遺伝子のｃＤＮＡクローンの塩基配列を示す、図２０の続きとなる配列図である。
【図２２】配列番号４に対応するＣＲＰ蛋白質のアミノ酸配列を示す配列図である。
【図２３】配列番号４に対応するＣＲＰ蛋白質のアミノ酸配列を示す、図２２の続きとなる配列図である。
【図２４】ＣＲＰ蛋白質と、キイロショウジョウバエの転写コアクチベーターｋｔｏ蛋白質とにおけるアミノ酸配列の相同性を示す比較配列図である。
【図２５】配列番号５に対応するＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子のＯＲＦの塩基配列を示す配列図である。
【図２６】配列番号５に対応するＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子のＯＲＦの塩基配列を示す、図２５の続きとなる配列図である。
【図２７】配列番号５に対応するＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子のＯＲＦの塩基配列を示す、図２６の続きとなる配列図である。
【図２８】配列番号５に対応するＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子のＯＲＦの塩基配列を示す、図２７の続きとなる配列図である。
【図２９】配列番号５に対応するＣＲＰ−１Ｄ変異遺伝子のＯＲＦの塩基配列を示す、図２８の続きとなる配列図である。
【図３０】配列番号６に対応するＣＲＰ−１Ｄ変異蛋白質のアミノ酸配列を示す配列図である。
【図３１】配列番号６に対応するＣＲＰ−１Ｄ変異蛋白質のアミノ酸配列を示す、図３０の続きとなる配列図である。
【図３２】配列番号７に対応するイネ由来のゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す配列図である。
【図３３】配列番号７に対応するイネ由来のゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す、図３２の続きとなる配列図である。
【図３４】配列番号７に対応するイネ由来のゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す、図３３の続きとなる配列図である。
【図３５】配列番号７に対応するイネ由来のゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す、図３４の続きとなる配列図である。
【図３６】配列番号７に対応するイネ由来のゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す、図３５の続きとなる配列図である。
【図３７】配列番号７に対応するイネ由来のゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す、図３６の続きとなる配列図である。
【図３８】配列番号７に対応するイネ由来のゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す、図３７の続きとなる配列図である。
【図３９】配列番号７に対応するイネ由来のゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す、図３８の続きとなる配列図である。
【図４０】配列番号７に対応するイネ由来のゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す、図３９の続きとなる配列図である。
【図４１】配列番号７に対応するイネ由来のゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子の塩基配列を示す、図４０の続きとなる配列図である。
【図４２】配列番号８に対応するイネ由来のゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子のＯＲＦの塩基配列を示す配列図である。
【図４３】配列番号８に対応するイネ由来のゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子のＯＲＦの塩基配列を示す、図４２の続きとなる配列図である。
【図４４】配列番号８に対応するイネ由来のゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子のＯＲＦの塩基配列を示す、図４３の続きとなる配列図である。
【図４５】配列番号８に対応するイネ由来のゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子のＯＲＦの塩基配列を示す、図４４の続きとなる配列図である。
【図４６】配列番号８に対応するイネ由来のゲノムＯｓＣＲＰ遺伝子のＯＲＦの塩基配列を示す、図４５の続きとなる配列図である。
【図４７】配列番号９に対応するイネ由来のＯｓＣＲＰ蛋白質のアミノ酸配列を示す配列図である。
【図４８】配列番号９に対応するイネ由来のＯｓＣＲＰ蛋白質のアミノ酸配列を示す、図４７の続きとなる配列図である。
【図４９】ＯｓＣＲＰ蛋白質とＣＲＰ蛋白質とにおけるアミノ酸配列の相同性を示す比較配列図である。
【図５０】ＯｓＣＲＰ蛋白質とＣＲＰ蛋白質とにおけるアミノ酸配列の相同性を示す、図４９の続きとなる比較配列図である。
【図５１】ＯｓＣＲＰ蛋白質とＣＲＰ蛋白質とにおけるアミノ酸配列の相同性を示す、図５０の続きとなる比較配列図である。
【図５２】配列番号１０に対応するタバコ由来のＮｔＣＲＰ遺伝子のＯＲＦの部分塩基配列を示す配列図である。
【図５３】配列番号１１に対応するタバコ由来のＮｔＣＲＰ蛋白質の部分アミノ酸配列を示す配列図である。
【図５４】ｃｒｐ−１Ｄ突然変異をホモ接合で有するシロイヌナズナと、野生型ホモ接合のシロイヌナズナとにおいて、発芽後４週間目での生育状態を示す図である。
【図５５】（ａ）は、野生型ホモ接合のシロイヌナズナをＦＴ遺伝子で形質転換して、ＦＴ遺伝子を高レベルで発現させた場合の、発芽後１週間目の生育状態を示す図であり、（ｂ）は、シロイヌナズナをＦＴ遺伝子で形質転換して、ＦＴ遺伝子を高レベルで発現させた植物にｃｒｐ−１Ｄ突然変異をヘテロ接合で持たせた場合の、発芽後１週間目の生育状態を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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