(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えＤＮＡ分子であって、ＩＦＮ−αまたはＩＦＮ−βにより誘導されうりかつ配列番号２または配列番号８のアミノ酸配列を含むＩＦＮＡＲ１受容体結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
さらにセンス配向でＩＦＮＡＲ１受容体結合タンパク質をコードする前記配列に作動可能に連結されているプロモーターを含み、組換えＤＮＡ分子が適当な発現宿主内にあるとき前記プロモーターが前記タンパク質を発現することができる請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記プロモーターがヒト細胞における強力な構成的プロモーターである請求の範囲第２項記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記プロモーターがインターフェロン誘導性プロモーターである請求の範囲第２項記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列が配列番号１または配列番号７である請求の範囲第１項記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６】
組換えＤＮＡ分子であって、センスまたはアンチセンス配向のいずれかで配列番号１または配列番号７のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子、またはアンチセンス配向で配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、インターフェロン誘導性ＩＦＮＡＲ１受容体結合タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を抑制することができる配列番号７の断片である組換えＤＮＡ分子。
【請求項７】
前記配列がセンス配向である請求の範囲第６項記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項８】
前記配列がアンチセンス配向である請求の範囲第６項記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項９】
組換えＲＮＡ分子であって、請求の範囲第６項記載の前記ＤＮＡ分子の配列に相当する配列である組換えＲＮＡ分子。
【請求項１０】
前記配列がセンス配向である請求の範囲第９項記載の組換えＲＮＡ分子。
【請求項１１】
前記配列がアンチセンス配向である請求の範囲第９項記載の組換えＲＮＡ分子。
【請求項１２】
さらにアンチセンス配向で前記配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む組換えＤＮＡ分子からなる請求の範囲第８項記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１３】
前記配列が配列番号７の５’末端由来の配列番号１２のヌクレオチド配列を含む部分である請求の範囲第１２項記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１４】
前記プロモーターがインターフェロン誘導性プロモーターである請求の範囲第１２項記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項１５】
請求の範囲第１項〜第５項のいずれかひとつに記載の組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項１６】
請求の範囲第６項〜第８項および第１２項〜第１４項のいずれかひとつに記載の組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求の範囲第１５項記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１８】
請求の範囲第１６項記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
配列番号１２のヌクレオチド配列からなる組換えＤＮＡ分子を含む発現ベクターを含む組織移植体の生存を延長するための薬剤。
【請求項２０】
配列番号２または配列番号８の配列を含むＩＦＮＡＲ１結合タンパク質。
【請求項２１】
請求の範囲第２０項記載のＩＦＮＡＲ１結合タンパク質に特異的な抗体の可変部を含む分子。
【請求項２２】
モノクローナル抗体からなる請求の範囲第２１項記載の分子。
【請求項２３】
ＩＦＮＡＲ１受容体結合タンパク質を提供する方法であって、請求の範囲第１項記載のＤＮＡを適当な発現宿主に前記タンパク質の発現が前記宿主の培養の際えられうる方法で導入し、前記タンパク質の発現をえるために前記宿主を培養することからなるＩＦＮＡＲ１受容体結合タンパク質を提供する方法。
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
この発明は、一般に、インターフェロン作用の分子機構に関し、さらに詳しくは、新規なインターフェロン受容体１結合タンパク質、それらをコードする組換えＤＮＡ分子、およびインターフェロンに対する細胞応答の調節方法に関する。
発明の背景
Ｉ型インターフェロン類（ＩＦＮ−αサブタイプとＩＦＮ−βサブタイプ）は、細胞に対して、ウイルス複製の阻害（抗ウイルス作用）、細胞増殖の阻害（抗腫瘍作用）、および免疫細胞の活性の調節（免疫調節作用）などの多面的作用を示す。インターフェロン（ＩＦＮ）のこれら多くの作用は、細胞の形態学的および生化学的な変化に関連している（レベル（Ｒｅｖｅｌ）の１９８４年の報告、総説）。
インターフェロンは、種特異的受容体を通じてその活性を発揮する。Ｉ型インターフェロン類の場合、２つの膜貫通受容体鎖（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｈａｉｎｓ）、すなわちＩＦＮＡＲ１（ウゼ（Ｕｚｅ）らの１９９０年の報告）およびＩＦＮＡＲ２−２（またはＩＦＮＡＲ２−ｃ、ドマンスキー（Ｄｏｍａｎｓｋｉ）らの１９９５年の報告）が確認されている。ＩＦＮ−α，β，ωにより生ずるシグナル伝達には、ヤーヌス（Ｊａｎｕｓ）キナーゼ（Ｊａｋ）ファミリーのタンパク質チロシンキナーゼおよびスタット（Ｓｔａｔ）ファミリーの転写因子が関与する（ダーネル（Ｄａｒｎｅｌｌ）らの１９９４年の報告）。Ｊａｋ−Ｓｔａｔ経路のタンパク質は、ＩＦＮＡＲ１とＩＦＮＡＲ２の受容体鎖の細胞質内（ＩＣ）ドメインに結合することによって活性化される。ＩＦＮＡＲ１のＩＣドメインに結合するタンパク質としてはｔｙｋ２とＳｔａｔ２がある（アブラモヴィック（Ａｂｒａｍｏｖｉｃｈ）らの１９９４年の報告）。Ｓｔａｔ２はＳｔａｔ１をともなって、ＩＦＮ誘導ＩＳＧＦ３転写複合体を生成し、この複合体はＩＦＮ誘導型遺伝子を活性化する（レヌン（Ｌｅｎｕｎｇ）らの１９９５年の報告）。Ｓｔａｔ３を含有する転写複合体もＩＦＮ−βによって誘導され（ハーロック（Ｈａｒｒｏｃｈ）らの１９９４年の報告）、そしてＳｔａｔ３のＩＦＮ依存性のＩＦＮＡＲ１−ＩＣに対する結合が観察された（ヤン（Ｙａｎｇ）らの１９９６年の報告）。タンパク質チロシンホスファターゼのＰＴＰ１ＣとＰＴＰ１Ｄは、ＩＦＮが付加する際、ＩＦＮＡＲ１と可逆的に結合する（デビッド（Ｄａｖｉｄ）らの１９９５年ａの報告）。加えて、２つのセリン／トレオニンタンパク質キナーゼである４８ＫＤａのＥＲＫ２ＭＡＰキナーゼ（デビッド（Ｄａｖｉｄ）らの１９９５年ｂの報告）およびｃＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼＡ（デビッド（Ｄａｖｉｄ）らの１９９６年の報告）は、ＩＦＮＡＲ１−ＩＣの単離された膜近位の５０残基に結合する。したがって、Ｉ型ＩＦＮ受容体のＩＣドメインは、細胞に対するＩＦＮの生物学的作用を生成させそして調節する働きをする多くのタンパク質の結合部位として働く。
酵母におけるツーハイブリッドスクリーニング（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）は、特定のポリペプチド配列に結合する新しいタンパク質を同定する有力な方法である（フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）とソング（Ｓｏｎｇ）の１９８９年の報告）。要約すると、ツーハイブリッドスクリーニングは、（ａ）特定のポリペプチド（ベイト（ｂａｉｔ））がＧａｌ４転写因子のＤＮＡ結合ドメインに融合されているプラスミドＤＮＡおよび（ｂ）ｐＡＣＴプラスミド中のＧａｌ４の活性化ドメインに融合されているｃＤＮＡライブラリーを、酵母細胞にトランスフェクトすることによって実施する。そのとき、前記ポリペプチドのベイトに結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡをトランスフェクトされた酵母細胞はＧａｌ４活性を再構成するであろう。前記ポリペプチドのベイトに結合するそのようなタンパク質の存在は、好ましくは酵母ゲノムに導入されているＧＡＬ１−ｌａｃＺ構造体から、β−ガラクトシダーゼなどの酵素の活性が発現されることによって明らかになる。この試験で陽性の酵母のクローンから、ｐＡＣＴプラスミドを単離して、そのインサートのヌクレオチド配列を決定しかつそれがコードするタンパク質を同定することができる。この方法によって、サイトカイン受容体のＩＣドメインと相互に作用する新規なタンパク質を同定することが可能である（ボルディン（Ｂｏｌｄｉｎ）らの１９９５年の報告）。
この明細書でのいずれの文書の引用も、そのような文書が直接関連する従来技術であると容認するものではなく、または、本願の請求の範囲の特許性にとっての材料であるとみなすものではない。いずれの文書の内容または日付に関する陳述も、出願人が出願時に入手可能な情報に基づいており、そしてこのような陳述の正確さについては容認するものではない。
発明の要約
本発明は、ＩＦＮ受容体１（ＩＦＮＡＲ１）結合タンパク質であることが確認された、本明細書でＩＲ１Ｂ１およびＩＲ１Ｂ４と呼称される２つの新規なヒトタンパク質、ならびにこれら２つのタンパク質をコードするＤＮＡに関する。ＩＲ１Ｂ１タンパク質とＩＲ１Ｂ４タンパク質は各々、ＩＦＮＡＲ１の細胞質内（ＩＣ）ドメインと相互作用し、インターフェロンに対する細胞応答を仲介する。
本発明は、ＩＲ１Ｂ１タンパク質またはＩＲ１Ｂ４タンパク質のいずれか、あるいはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含有する組換えＤＮＡ分子、およびその組換えＤＮＡ分子がコードするタンパク質に関する。前記組換えＤＮＡ分子において、ＩＲ１Ｂ１タンパク質またはＩＲ１Ｂ４タンパク質、あるいはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列が、センス配向またはアンチセンス配向のいずれかで、プロモーターに作動可能に連結されている。
センス配向で新規なＩＦＮＡＲ１結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する組換えＤＮＡ分子を、腫瘍中に直接投与することによって、癌の治療における外因性インターフェロン療法に対する応答が促進される。
さらに、本発明は、アンチセンス配向で、新規なＩＦＮＡＲ１結合タンパク質またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含有する組換え分子を、患者に移植する前に、移植組織中に導入することによって、組織移植体の生存を延長する方法に関する。
したがって、本発明はまた、このようなＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質を含有する医薬組成物および、その組成物を使用する治療法に関する。
また、本発明は、本発明の新規なタンパク質に対し特異的な抗体に関する。
【図面の簡単な説明】
図１は、酵母におけるツーハイブリッド遺伝子相互作用分析によって測定した、ＩＲ１Ｂ１とＩＦＮＡＲ１−ＩＣドメインの相互作用を示す。図１の下方の四角枠内に、各種の「ベイト」と組合わせたｐＡＣＴ中のｃＤＮＡインサートを示す。
図２は、酵母におけるツーハイブリッド遺伝子相互作用分析によって測定した、ＩＲ１Ｂ４とＩＦＮＡＲ１−ＩＣドメインの相互作用を示す。図２の下方の四角枠内に、各種の「ベイト」と組み合わせたｐＡＣＴ中のｃＤＮＡインサートを示す。
図３は、ＩＲ１Ｂ１の、ヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
図４は、ＩＲ１Ｂ１のアミノ酸配列（配列番号２）と、２つのカルシウム結合タンパク質、カルシニューリンＢ（略号ＣＡＬＢ；配列番号３）およびカルトラクチン（略号ＣＡＴＲ；配列番号４）のアミノ酸配列との相同性と配列を示す。ＩＲ１Ｂ１とＣＡＬＢ内またはＣＡＬＢとＣＡＴＲ間の同一のアミノ酸は、その間の記号「｜」で示してある。ＩＲ１Ｂ１とＣＡＴＲ間で同一であって、ＣＡＬＢとは同一でないものは、その間の記号「：」で示してある。太い活字で示す領域は、カルシウム結合ヘリックス−ループ−ヘリックスＥＦハンドのドメインである。
図５は、ＩＲ１Ｂ１のｃＤＮＡとハイブリッドを形成させたヒト骨髄腫Ｕ２６６Ｓ細胞中のＩＲ１Ｂ１  ｍＲＮＡと１８ＳｒＲＮＡ（下方ライン）、および前記細胞をＩＦＮ−α８またはＩＦＮ−βのいずれかで２ｈｒまたは１８ｈｒ処理した際のＩＲ１Ｂ１の迅速かつ一時的な誘導のノーザンブロットを示す。第一ラインは、ＩＦＮによる処理なしで２ｈｒ後のコントロールである。
図６Ａと６Ｂは、ＩＲ１Ｂ４と単離されたＩＦＮＡＲ１−ＩＣドメインとのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの相互作用（図６Ａ）およびＩＲ１Ｂ４とヒトＵ２６６ＳおよびヒトＵ２６６Ｒの細胞膜からの細胞抽出物とのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの相互作用（図６Ｂ）を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥレーンである。図６Ａにおいて、［35Ｓ］メチオニンの標識をつけた翻訳産物であって、フラッグ（ｆｌａｇ）−ＩＲ１Ｂ４のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写産物ありまたはなしのものを、抗フラッグＭ２ビーズで免疫沈降させたか（１０μｌ）（レーン１と４）、または１００個のアミノ酸長のＩＦＮＡＲ１−ＩＣドメインと融合したＧＳＴと結合した（レーン２と５）、もしくはＧＳＴのみと結合した（レーン３と６）グルタチオンビーズと反応させた（５０μｌ）。４℃で一夜インキュベートした後（最終容量１００μｌ）、該ビーズを洗浄し、次にＳＤＳで溶出させたタンパク質を還元条件下で沸騰させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。図６Ｂの場合は、Ｕ２６６Ｓ細胞（レーン１）またはＵ２６６Ｒ細胞（レーン２）をＢｒｉｊ緩衝液およびアンチプロテアーゼで抽出し（アブラモヴィック（Ａｂｒａｍｏｖｉｃｈ）らの１９９４年の報告）、次いで０．３５ｍｌ（１０7細胞）をフラッグＩＲ１Ｂ４転写産物の［35Ｓ］メチオニンの標識を付けた翻訳産物７５μｌとともに４℃にて一夜インキュベートした。プロテインＧビーズに固定化した抗ＩＦＮＡＲ１  ｍＡｂＲ３（２５μｌ）を２．５ｈｒかけて添加し、Ｂｒｉｊ緩衝液中で洗浄し、次にＳＤＳで溶出させ、沸騰させ、そして還元されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。前記のような抗フラッグＭ２ビーズによるコントロールを泳動した（レーン３）。乾燥したゲルを、ホスファーイメージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏｒ−Ｉｍａｇｅｒ）で視覚化した。図６Ａの最初の３つのレーンでは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳反応にＩＲ１Ｂ４  ｍＲＮＡを添加しなかった。図６Ａの続く３つのレーンでは、フラッグタンパク質に融合させたＩＲ１Ｂ４タンパク質をコードするｍＲＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの系で翻訳した。
図７は、ＩＲ１Ｂ４のヌクレオチド配列（配列番号７）とそれから導き出されるアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
図８は、ＩＲ１Ｂ４のアミノ酸配列（配列番号８）とＰＲＭＴ１のアミノ酸配列（配列番号９）およびそれらの差を示す。
図９は、ＩＲ１Ｂ４のアミノ酸配列とＨＣＰ−１のアミノ酸配列（配列番号１０）およびそれらの差を示す。
図１０はメチルトランスフェラーゼアッセイを示す。Ｕ２６６Ｓ細胞の抽出物を、プロテインＡと抗ＩＦＮＡＲ１抗体でコートしたビーズと反応させるか（レーン１）またはプロテインＡだけでコートしたビーズと反応させた（レーン２）。メチルトランスフェラーゼ活性を、ヒストンに14Ｃ（メチル）−Ｓ−アデノシルメチオニンで標識を付け次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動法でヒストンバンド中の放射能を分析することによって測定した。
図１１は、Ｕ２６６Ｓ細胞内のタンパク質−アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性のアッセイを示す。レーン１では、ヒトＵ２６６Ｓ細胞のタンパク質−アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を、配列番号１１の配列を有するペプチドＲ１をメチル化することによって測定した。レーン２では、ＩＲ１Ｂ４  ｃＤＮＡの開始コドンのまわりのヌクレオチド１２−３３の配列に相補的な配列番号１２のアンチセンスオリゴヌクレオチドを添加した。レーン３では、対応するセンスオリゴヌクレオチドを添加した。アンチセンスオリゴヌクレオチドはタンパク質−アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を実質的に阻害するが、コントロールのセンスオリゴヌクレオチドはほとんど作用しないことが分かる。
図１２は、図１１で使用したアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ−１）、対応するセンスオリゴヌクレオチド（Ｓ−３）、およびＩＲ１Ｂ４  ｃＤＮＡの中央部にかかわる他のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ−２）の存在下または非存在下でのＩＦＮ−βによる処理に応答するヒトＵ２６６Ｓ細胞の増殖阻害を示すグラフである。細胞密度を、アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）を用いる発色試験で定量し（実施例７参照）、細胞密度の減少を、未処理のコントロールウェルに対する％で計算して増殖阻害としてプロットした。
発明の詳細な説明
本発明は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α、βまたはω）受容体のＩＦＮＡＲ１鎖の細胞質内ドメイン（ＩＣ）と相互作用し、本明細書ではＩＦＮ受容体結合タンパク質１（ＩＲ１Ｂ１）およびＩＦＮ受容体結合タンパク質４（ＩＲ１Ｂ４）と呼ばれる２つの新規なヒトタンパク質の発見に関する。これら２つの新規なタンパク質とＩＦＮＡＲ１との相互作用は、酵母におけるツーハイブリッド遺伝子試験によって示した。この試験では、酵母のレポーターストレインＳＦＹ５２６（バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）らの１９９３年の報告）に、Ｇａｌ４活性化ドメインに融合させたＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のｃＤＮＡをトランスフェクトすると、ＩＦＮＡＲ１−ＩＣドメイン（Ｇａｌ４ＤＮＡ結合ドメインに融合されている）がベイトとして使用されたときのみβ−ガラクトシダーゼ活性がもたらされた。
ＩＲ１Ｂ１  ｃＤＮＡの配列は１９１個のアミノ酸ポリペプチドをコードしている。配列データベースのコンピュータサーチでは、ＩＲ１Ｂ１が、カルシウム結合タンパク質であるカルシニューリンβおよびカルトラクチンに対して、たとえばカルシウム結合部位（Ｅ−Ｆハンドル）と著しい相同性を示す新規なタンパク質であることが明らかになった。カルシニューリンβ（ゲリーニ（Ｇｕｅｒｉｎｉ）らの１９８９年の報告）は、セリン／トレオニンホスファターゼの１９ｋＤａのサブユニットであり、転写因子ＮＦＡＴの、Ｔ−リンパ球の核へのトランスロケーションを活性化する際に重要な役割を演じ、かつシクロスポリンなどの免疫抑制剤によって阻害される。カルトラクチン（リー（Ｌｅｅ）とファン（Ｈｕａｎｇ）の１９９３年の報告）は、２１ｋＤａのタンパク質であって、中心体内に見られる細胞骨格関連タンパク質であり、そして、有糸分裂中の染色体の運動に関与しており、より一般的には、微小管形成中心に関与している。したがって、新規なＩＲ１Ｂ１タンパク質は、カルシウム調節タンパク質のカルシニューリンおよびカルトラクチンのファミリーの新しいメンバーである。
驚くべきことに、ＩＲ１Ｂ１の遺伝子は、ヒト細胞内で、ＩＦＮによる処理によって迅速に活性化されることが発見された。したがって、これは、ＩＦＮによって誘導されるカルシウム結合タンパク質の最初の例である。カルシウムイオンは細胞の形態、接着および分裂を調節するので、細胞内のＩＲ１Ｂ１活性の調節は、正常細胞と悪性細胞のＩＦＮに対する応答に影響しうる。細胞におけるＩＦＮの作用を仲介するＩＲ１Ｂ１の役割は、ＩＲ１Ｂ１と、ＩＦＮ受容体鎖のＩＣドメインとの相互作用によって維持される。
ＩＲ１Ｂ４は、ＩＲ１Ｂ１と同様に、配列データベースのコンピュータサーチによって確認したところ、新規なタンパク質であることが発見されたが、ＩＲ１Ｂ４は、Ｓ−アデノシルメチオニンを利用して、タンパク質中のアルギニン残基をメチル化し、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＰＲＭＴ１；カガン（Ｋａｇａｎ）とクラーク（Ｃｌａｒｋｅ）の１９９４年の報告；リン（Ｌｉｎ）らの１９９６年の報告）と呼ばれている酵素に対して配列の相同性を有することも発見された。ＩＲ１Ｂ４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＩＦＮＡＲ１のＩＣドメインに直接、結合することが発見され、そして、ＰＲＭＴの活性とヒト細胞から単離されたＩＦＮ−α、β受容体のＩＦＮＡＲ鎖との構成的関連がヒストンのメチル化によって示された。ＩＲ１Ｂ４  ｃＤＮＡ由来のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドをヒト細胞培養物に添加したとき、細胞培養物内のＰＲＭＴ活性が消失することが観察された。この方式で処理したヒト骨髄腫細胞は、増殖阻害で測定したところ、ＩＦＮに対する応答が著しく低下することを示した。したがって、ＩＲ１Ｂ４／ＰＲＭＴは、ＩＦＮ受容体が腫瘍細胞の増殖阻害を起こす経路に関与し、またＩＦＮ受容体の他の機能にも関与している。ＰＲＭＴの公知の基質には、多くのＲＮＡとＤＮＡの結合タンパク質およびとくに異種核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）がある。ｈｎＲＮＰは、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送、プレｍＲＮＡの選択的スプライシング、および転写後の調節に関与している（リウ（Ｌｉｕ）とドレイファス（Ｄｒｅｙｆｕｓｓ）の１９９５年の報告）。したがって、新規なヒトＩＲ１Ｂ４／ＰＲＭＴのｃＤＮＡとタンパク質は、そのＩＦＮ受容体との関連によって発見されたが、ヒトまたは動物の細胞のＩＦＮに対する応答を変化させるために使用できる。
本発明による組換えＤＮＡ分子は、ＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のタンパク質あるいはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含んでおり、そしてＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のｃＤＮＡの発現を増大することによってＩＦＮに対する細胞応答を増大し、またはアンチセンスＲＮＡ分子によってＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のタンパク質の発現を減らすことによってＩＦＮに対する細胞応答を減らすために使用することができる。
ＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のｃＤＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏでの発現が増大することは、癌の治療法に有用であろう。この場合、ＩＦＮに対する細胞応答の増大は悪性細胞の増殖の減少をもたらし、かつ外因性ＩＦＮ療法に対する応答が高まる。ＩＦＮに対する細胞応答を増大させるため、標的部位に、ＩＲ１Ｂ１とＩＲ１Ｂ４のｉｎ  ｖｉｖｏでの発現を増大させるため、強力な構成的プロモーターにセンス配向で作動可能に連結されたＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のｃＤＮＡを含有する発現ベクターを、標的部位に、たとえば脳腫瘍または転移性腫瘍の小結節（たとえば骨髄腫または乳癌）中に、直接注入しても良い。
逆に、ＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏでの発現の減少は、組織移植体の生存を延長するのに有用であろう。というのは、これら移植体の宿主内での拒絶反応は、その合成がＩＦＮの刺激に依存している組織適合性抗原（ＭＨＣクラス１）によって仲介されるからである。適切なベクターに保持されかつプロモーターにアンチセンス配向で作動可能に連結されている、ＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４、あるいはそのフラグメントのｃＤＮＡが、移植される組織の細胞中に導入されると、アンチセンスＲＮＡの発現は、ＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のｍＲＮＡ（またはＩＲ１Ｂ１／ＩＲ１Ｂ４のセンスＲＮＡ）の分解をもたらし、そのためＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のタンパク質の細胞レベルが低下する。
アンチセンスＲＮＡは、アンチセンス方向、すなわち、ＤＮＡおよびその転写されたセンスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の正常またはセンス方向と逆方向に配向されたコード配列に作動可能に連結された上流のプロモーターから転写される。前記センスＲＮＡに相補的なアンチセンスＲＮＡを発現させることは、ＲＮＡ分子の生物学的機能を調節する強力な方法である。センスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの安定な二重らせんの生成を通じて、正常またはセンスＲＮＡの転写産物は不活性になり、翻訳できなくなる。
本発明の実施態様としての組換えＤＮＡ分子は、センス配向またはアンチセンス配向で、プロモーターに作動可能に連結されたＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４、あるいはそのフラグメントのｃＤＮＡを含有している。用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼに結合して、「作動可能に連結した」核酸配列の転写を促進できる二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの配列を含むものとする。したがって、プロモーターが、ＤＮＡ配列の配向のいかんにかかわらずそのＤＮＡ配列を転写できる場合、そのＤＮＡ配列はプロモーターの配列に作動可能に連結されているであろう。
転写を調節するために使用されるタイプのプロモーターは、宿主／標的の細胞内で機能するタイプのプロモーターである。哺乳類の細胞内で機能するプロモーターの例としては、ＳＶ４０初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼプロモーター、ラウス肉腫（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）極初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ＬＴＲプロモーター、インターフェロンβプロモーター、熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）プロモーターおよび当該技術分野で公知の他の多くのプロモーターがある。
ＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のタンパク質の発現のため、センス配向でＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のｃＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターは、強力な構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プロモーターが好ましい。このプロモーターによって、ＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４の発現を調節する内因性細胞機構の存在にかかわらず、高レベルのＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４を得ることができる。
同様に、アンチセンス配向でＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のｃＤＮＡに作動可能に連結されているプロモーターは強力なプロモーターが好ましく、たとえば、エプスタイン・バー・ウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ）（ＥＢＶ）中に存在し、高レベルでアンチセンスＲＮＡを発現できる領域を調節するプロモーターがある（ダイス（Ｄｅｉｓｓ）とキムチ（Ｋｉｍｃｈｉ）の１９９１年の報告）。
前記アンチセンス配列は、宿主／標的の細胞、好ましくはヒトの細胞内でのみ発現可能であることが好ましく、かつ発現されたアンチセンスＲＮＡは安定でなければならない（すなわち迅速には分解されない）。そのアンチセンスＲＮＡは、宿主／標的細胞内で発現されたセンスｍＲＮＡとのみ特異的にハイブリッドを形成して、本質的に、翻訳できない安定な二本鎖ＲＮＡ分子を生成しなければならない。換言すれば、宿主／標的細胞内で発現されたアンチセンスＲＮＡは、発現されたセンスｍＲＮＡがＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のタンパク質に翻訳されるのを阻害する。ベクターが保持するアンチセンス配列は、そのアンチセンス部分がセンスｍＲＮＡとハイブリッドを形成して、ＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のタンパク質に翻訳されるのを阻害できる限り、ＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４の全ｃＤＮＡ配列あるいはその一部分だけを保有していればよい。したがって、この明細書と請求の範囲を通じて使用される「アンチセンス」配列は、形質転換／トランスフェクションがなされた細胞内で発現することができ、かつＩＲ１Ｂ１もしくはＩＲ１Ｂ４の「センス」ｍＲＮＡと特異的にハイブリッドを形成して翻訳できない二本鎖ＲＮＡ分子を生成できる全アンチセンス配列またはその一部分と定義する。
アンチセンス配列は、ＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のｍＲＮＡの全長とハイブリッドを形成する必要はない。代わりに、アンチセンス配列は、「センス」ｍＲＮＡの５’−非翻訳非コード配列、コード配列または３’−非翻訳配列などの選択された領域とハイブリッドを形成すればよい。アンチセンス配列は、たとえばキャップおよび開始コドン部位における、５’−コード配列および／または５’−非コード領域とハイブリッドを形成することが好ましい。というのは、開始コドンを標的にすることがより効率的であり、一方、コード領域内の内部配列を標的とすることは効率的でないことがアンチセンスオリゴヌクレオチドの多数の例で観察されているからである（ウィックストロム（Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ）の１９９１年の報告）。ＩＲ１Ｂ４のセンスｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンス配列の有効性は、実施例７に記載されている、Ｕ２６６Ｓ細胞におけるタンパク質−アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性のアッセイで容易に試験できる。哺乳類のゲノムの大きさからみて、アンチセンスのＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４の配列は、長さが、好ましくは少なくとも１７塩基対であり、より好ましくは少なくとも３０塩基対である。しかし、さらに短い配列が有用なこともあるかもしれず、すなわち、このような配列は、他の哺乳類の配列とハイブリッドを偶発的に形成することはなく、またはこのような「交差ハイブリッド形成」は、この発明の目的の達成を阻害する方式および程度において細胞の代謝を阻害しない。
好ましいハイブリッド形成標的と好ましいアンチセンス配列の長さは、組織的な実験によって容易に決定できる。オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、米国ニューヨーク州ニューヨーク、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．１９８７〜１９９６年、およびサンブルック（Ｓａｎｂｒｏｏｋ）ら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）などに記載の標準の方法を利用して、ベクターから、アンチセンス配列の徐々に長い部分を組織的に取り出すことができる。全長のアンチセンス配列のみならず、好ましくは、アンチセンス配列の５’末端において、少しずつ欠失させた一連のものを生成させてもよい。このようにして、好ましくはセンスｍＲＮＡの５’末端に相補的なままの一組の末端切断型のアンチセンス配列を形成し、その結果、センスｍＲＮＡの５’末端が二本鎖であり（アンチセンスＲＮＡの３’末端を相補する）かつ翻訳できないままであるＲＮＡ分子が生成する。さらに、たとえばオリゴヌクレオチドＡＳ−１（配列番号１２）のようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、化学的に容易に合成することができ、そしてプロモーターと作動可能に連結してベクター中に導入し、ＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞発現を減らすのに使用される。
本発明のベクターは、当該技術分野で公知のエピソームの、複製可能なまたは染色体に組み込むことができるベクターなどの、哺乳類細胞にトランスフェクトするのに通常用いられる適切な真核ベクターまたは原核ベクターであってよい。ＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のアンチセンスＲＮＡを発現させるのに特に好ましいベクターは、プロモーターとして働くエプスタイン・バー・ウイルス調節領域（ダイス（Ｄｅｉｓｓ）とキムチ（Ｋｉｍｃｈｉ）の１９９１年の報告）を含有するエピソームのプラスミドであり、このプロモーターは、前記調節領域に対しアンチセンス配向で配置されたＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のｃＤＮＡに作動可能に連結されている。アンチセンスベクターおよびオリゴヌクレオチドのホスホロチオエートの使用は、ビイ  イー  フーバー（Ｂ．Ｅ．Ｈｕｂｅｒ）およびジェイ  エス  ラゾ（Ｊ．Ｓ．Ｌａｚｏ）編、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、７１６巻、１９９４年（たとえばミリガン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ）らの報告、２２８〜２４１頁）に記載されている。
本発明によれば、ＩＦＮに対する細胞の応答を減らすことによって、移植を必要とする患者に移植される組織または器官の生存を延長することができる。移植組織の拒絶反応は組織適合性抗原によって仲介され、これらＭＨＣクラスＩ抗原の合成はＩＦＮの刺激に依存している。したがって、ＩＦＮの刺激に対する細胞応答が低下すると、移植組織の生存が延長されるであろう。本発明による組織移植体の生存を延長する方法には、患者に移植すべき組織または器官の細胞に、アンチセンス配向でプロモーターに作動可能に連結されたＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のｃＤＮＡ配列あるいはそのフラグメントを含有する組換えＤＮＡ分子を導入することが関与しており、その結果、アンチセンスのＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のＲＮＡが、そのようなトランスフェクトされた細胞／形質転換細胞の中で発現される。その組換えＤＮＡ分子は、前記目的に適した当該技術分野で公知の方法で組織または器官の細胞内に導入されうる。組換えＤＮＡ分子の組織または器官の細胞中への導入につづき、その組織または器官を、そのような移植を必要とする患者に移植できる。
発現ベクターであり、かつセンス配向でプロモーターに作動可能に連結されたＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のｃＤＮＡを保有する組換えＤＮＡ分子を含有する医薬組成物は、腫瘍、たとえば脳腫瘍および転移性腫瘍の小結節中に直接、注射して、これら腫瘍内の細胞を、癌の治療法としての外因性ＩＦＮ療法に対してより応答性を高くすることができる。外因性ＩＦＮ療法に対する細胞の応答性が高められると、悪性の細胞の増殖が阻止されるであろう。
ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの遺伝子導入（ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ）はよく報告されている。すなわちＡｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ：Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、７１６巻、１９９４年における、たとえばジイ  イー  プラウツ（Ｇ．Ｅ．Ｐｌａｕｔｚ）の“Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ”（１４４〜１５３頁）およびレーマー（Ｒｏｅｍｅｒ）らの“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ５３  Ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｂｙ  Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”（２６５〜２８２頁）がある。移植すべき組織または器官あるいは腫瘍の細胞中に組換えＤＮＡ分子を挿入する方法としては、アデノウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス関連ウィルス（ＡＡＶ）のベクターならびに直接ＤＮＡ注射またはオリゴヌクレオチド−リポソーム注射がある。レトロウィルスベクターを脳腫瘍に注射するとか、またはアデノウィルスを用いてのう胞性線維症の患者の上気道細胞に感染させる臨床試験がよく知られている。
作動可能に連結されているプロモーターに対しセンス配向またはアンチセンス配向でＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のｃＤＮＡあるいはそのフラグメントをコードする組換えＤＮＡ分子を含有する医薬組成物には、前記組換えＤＮＡ分子をその目的を達成するのに有効な量で含有しているすべての組成物が含まれる。さらに、該医薬組成物は、前記組換えＤＮＡ分子を安定化するかまたはそれを投与しやすくするのに適切な薬学的に許容されうる担体または賦形剤を含有していてよい。
本発明の他の実施態様は、生検試料から得られる腫瘍組織中のＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４のタンパク質のレベルをアッセイする免疫検出法などの診断法、またはタンパク質のアフィニティークロマトグラフィーによる精製に用いられる、ＩＦＮＡＲ１結合タンパク質のＩＲ１Ｂ１またはＩＲ１Ｂ４あるいはそのフラグメントに対して特異的な抗体の抗原結合部分を含有する分子に関する。
用語「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、抗イディオタイプ（抗ｉｄ）抗体、一本鎖抗体、および組換えで製造されたヒト化抗体、ならびに公知の方法であるが限定されないたとえば酵素的開裂法、ペプチド合成法または組換え法で提供される、前記抗体の活性画分が含まれるものとする。
ポリクローナル抗体は、抗原で免疫性を与えられた動物の血清由来の、抗体分子の不均質集団である。モノクローナル抗体は、抗原に対し特異的な抗体の実質的に均質の集団を含有し、その集団は実質的に同じエピトープ結合部位を含有している。ｍＡｂは当業者にとって公知の方法で得てよい。たとえば、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ），Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻４９５〜４９７頁、１９７５年；米国特許第４，３７６，１１０号；オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、前掲文献、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８年）；およびコリガン（Ｃｏｌｌｉｇａｎ）ら編、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、米国ニューヨーク、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２年、１９９３年）参照。なおこれら引用文献の内容はすべて本明細書に援用するものである。これら抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＧＩＬＤおよびそれらのサブクラスを含む免疫グロブリンクラスの抗体である。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養してよい。ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｓｉｔｕで高い力価のｍＡｂを産生すれば、現時点で好ましい製造法になる。
キメラ抗体は、その異なる部分が異なる動物種由来である分子であり、たとえばマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ｍＡｂ由来の可変部およびヒト免疫グロブリンの定常部を有する抗体がある。キメラ抗体は、主として、使用時に免疫原性を減らしかつ産生中、収率を高くするために使用され、たとえば、マウスｍＡｂはハイブリドーマから高い収率で得られるがヒト内では免疫原性が高いのでヒト／マウスキメラｍＡｂが使用される。キメラ抗体およびその製造法は当該技術分野で公知である（カビリ（Ｃａｂｉｌｌｙ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻３２７３〜３２７７頁、１９８４年；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１巻６８５１〜６８５５頁、１９８４年；ブリアン（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻６４３〜６４６頁、１９８４年；カビリ（Ｃａｂｉｌｌｙ）ら、欧州特許願第１２５０２３号（１９８４年１１月１４日付けで公開）；ニューバーガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻２６８〜２７０頁、１９８５年；タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ）ら、欧州特許願第１７１４９６号（１９８５年２月１９日付け公開）；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、欧州特許願第１７３４９４号（１９８６年３月５日付け公開）；ニューバーガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）ら、ＰＣＴ特許願ＷＯ８６０１５３３号（１９８６年３月１３日付け公開）；クドー（Ｋｕｄｏ）ら、欧州特許願第１８４１８７号（１９８６年６月１１日付け公開）；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、欧州特許願第１７３４９４号（１９８６年３月５日付け公開）；サハガン（Ｓａｈａｇａｎ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３７巻１０６６〜１０７４頁、１９８６年；ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）ら、国際公開公報ＷＯ９７０２６７１号（１９８７年５月７日付け公開）；リウ（Ｌｉｕ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻３４３９〜３４４３頁、１９８７年；サン（Ｓｕｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４巻２１４〜２１８頁、１９８７年；ベター（Ｂｅｔｔｅｒ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０巻１０４１〜１０４３頁、１９８８年；ならびにハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、前掲文献）。
抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位と一般に結合する特有の決定基を認識する抗体である。Ｉｄ抗体は、ｍＡｂの供給源として同じ種でかつ同じ遺伝子型の動物（たとえばマウス系統）に、抗Ｉｄが調製されているｍＡｂで免疫性を与えることによって製造することができる。その免疫性を与えられた動物は、免疫性を与える抗体のイディオタイプ決定基を認識し応答して、これらイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生する。たとえば、米国特許第４，６９９，８８０号参照。
また、抗Ｉｄ抗体は、さらに他の動物に免疫応答を誘導して、いわゆる抗抗Ｉｄ抗体を産生させる「免疫原」としても使用してよい。抗抗Ｉｄは、抗Ｉｄを誘導する原ｍＡｂとエピトープが同じであってよい。したがって、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を用いることによって、同一の特異性を有する抗体を発現する他のクローンを同定することができる。
本発明の抗体は、モノクローナル抗体などの無傷の（ｉｎｔａｃｔ）抗体であってよいが、目的とする機能を提供する抗体のエピトープ結合部位であると解するべきである。したがって、前記無傷の抗体のみならず、そのタンパク質分解フラグメントたとえばＦａｂフラグメントまたはＦ（ａｂ’）2フラグメントも使用できる。ＦａｂフラグメントとＦ（ａｂ’）2フラグメントは、無傷の抗体のＦｃフラグメントを欠いており、循環系からはより速く消失し、そして無傷の抗体より、非特異的組織結合性が低い（ワール（Ｗａｈｌ）ら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．、２４巻３１６〜３２５頁、１９８３年）。そのようなフラグメントは、一般的にタンパク質分解開裂法で製造され、たとえばパパイン（Ｆａｂフラグメントを製造する場合）またはペプシン（（Ｆ（ａｂ’）2フラグメントを製造する場合）などの酵素を使用する。
さらに、抗体の可変部をコードするＤＮＡは、他の抗体に挿入してキメラ抗体を生成させることができ（たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）またはＴ細胞受容体に挿入して同じ広い特異性を有するＴ細胞を生成させることができる（エッシャー  ゼット（Ｅｓｈｈａｒ、Ｚ．）ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．、１０巻２７〜２９頁、１９９０年；グロス  ジイ（Ｇｒｏｓｓ，Ｇ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻１００２４〜１００２８頁、１９８９年参照）。一本鎖抗体も製造して使用できる。一本鎖抗体は、抗原結合性を有しかつ免疫グロブリンの軽鎖と重鎖の可変部（結合したＶH−ＶLまたは一本鎖のＦv）に相同もしくは類似の一対のアミノ酸配列を含有する一本鎖複合体のポリペプチドでありえる。ＶHとＶLの両者は天然のモノクローナル抗体の配列をコピーしてよく、または、これら鎖の一方または両者は米国特許第５，０９１，５１３号に記載されているタイプのＣＤＲ−ＦＲ構造体を含有していてもよい。前記軽鎖と重鎖の可変部に類似の別のポリペプチドは、ともにポリペプチドリンカーによって保持されている。とくに、ＶH鎖とＶL鎖のポリペプチド構造をコードするＤＮＡが知られている場合の前記一本鎖抗体の製造法は、たとえば、米国特許第４，９４６，７７８号、同第５，０９１，５１３号および同第５，０９６，８１５号に記載の方法によって実施してよい。
したがって、「抗体の抗原結合部分を含有する分子」という用語には、任意の動物細胞系または微生物により生成され、また任意のイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）の無傷の免疫グロブリン分子のみならずそれらの反応性画分、それらは限定されないが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、その重鎖および／または軽鎖の可変部およびそのような反応性画分を含有するキメラまたは一本鎖抗体があり、ならびにそのような抗体反応性画分が物理的に挿入されている他のタイプの分子または細胞、たとえばキメラＴ細胞受容体またはそのような受容体を有するＴ細胞、あるいはそのような反応性画分を含有する分子の一部分によって、治療用分子を送達するために開発された分子が含まれるものとする。
本発明は、充分に説明したので、本発明を例示するために提供されかつ本発明を限定するものではない下記実施例を参照することによって一層容易に理解されるであろう。
実施例１
２つのヒトタンパク質であるＩＲ１Ｂ１およびＩＲ１Ｂ４は、ＩＦＮ受容体に結合する。
ＢａｍＨ１−センスプライマー（５’ｃｔｇａｇｇａｔｃｃＡＡＡＧＴＣＴＴＣＴＴＧＡＧＡＴＧＣＡＴＣ（配列番号５））およびＥｃｏＲＩアンチセンスプライマー（５’ｔｇａｃｇａａｔｔｃｃｔａＴＣＡＴＡＣＡＡＡＧＴＣ（配列番号６））を使ってＰＣＲで増幅した全ＩＦＮＡＲ１−ＩＣドメインをコードするｃＤＮＡフラグメントをブルースクリプトベクター（ＢＳ−ＳＫ＋、ストラテジーン）中にクローン化した。このＢＳ−ＩＦＮＡＲ１−ＩＣ由来のＢａｍＨ１−ＳａｌＩフラグメントをｐＧＢＴ10ベクター（クローンテック）に導入し、ツーハイブリッドスクリーニングのためＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ｐＧＢＴ10−ＩＦＮＡＲ１−ＩＣ）のあとに同相に融合した。ツーハイブリッドスクリーニング法（フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）とソング（Ｓｏｎｇ）、１９８９年）を、酵母のレポーターストレインであるＹ１５３をｐＧＢＴ10−ＩＦＮＡＲ１−ＩＣで同時に形質転換するため、ヒトエプスタイン・バー・ウィルス（ＥＢＶ）で形質転換したＢリンパ球由来のｐＡＣＴプラスミドｃＤＮＡライブラリーを使ってダーフィー（Ｄｕｒｆｅｅ）ら（１９９３年）の修正法により実施した。酵母Ｙ１５３ストレインは、Ｇａｌ４転写因子の活性が再構成された場合にのみ転写されるＧＡＬ１アップストリームアクチベーティング配列（ＵＡＳ）の支配下にある２つのレポーター遺伝子を有する。これには、この特定の酵母クローンに導入されたｐＡＣＴプラスミドによりコードされる融合タンパク質がｐＧＢＴ10プラスミド由来のＩＦＮＡＲ１−ＩＣドメインに親和性を有するということが必要である。レポーター遺伝子の１つはＧＡＬ１  Ｈｉｓ３であり、それは、ヒスチジン欠損培地中での増殖を可能にする。その他のレポーター遺伝子はＧＡＬ−ＬａｃＺであり、それは、β−ガラクトシダーゼ活性を付与する。加えて、ｐＡＣＴプラスミドはＬｅｕ２遺伝子を有し、また、ｐＧＢＴ10プラスミドはＴＲＰ１遺伝子を有しており、それぞれ、ロイシンおよびトリプトファン欠損培地中での増殖を可能にする。２５ｍＭ  ３−アミノトリアゾール存在下トリプトファン、ロイシン、ヒスチジン欠損人造ＳＣ培地にてコロニーを選抜した（それにより、さらにヒスチジン原栄養株（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｈｙ）を選抜する）。ついで、増殖コロニーを、Ｘ−ｇａｌフィルターアッセイ（ブリーデン（Ｂｒｅｅｄｅｎ）とネイスミス（Ｎａｙｓｍｉｔｈ）、１９８５年）を使ってβ−ガラクトシダーゼ活性について試験した。
９つの陽性な酵母クローンを得て、それらのｐＡＣＴプラスミドを、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１にトランスフェクトし、ｌｅｕ+  形質転換細胞を選抜することにより、回収した。各酵母ＤＮＡについて、２つのそのようなＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１クローンを単離した。これらＥ．ｃｏｌｉクローン由来のｐＡＣＴプラスミドの部分ＤＮＡシークエンシングは、ＩＲ１Ｂ１およびＩＲ１Ｂ４と呼称される２つのｃＤＮＡ配列に分かれることを示した。ＩＲ１Ｂ１およびＩＲ１Ｂ４グループのｐＡＣＴプラスミドを、ラミン（ｌａｍｉｎ）、ｃｄｋ２およびｐ５３または他のコントロールインサートを保持するｐＡＳプラスミド（クローンテック）とでＳＦＹ５２６酵母レポーターストレイン（バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）ら、１９９３年）を同時に形質転換することにより、特異性試験に供した。ＳＣ培地（−ｔｒｐ、−ｌｅｕ）中で増殖するコロニーをβ−ガラクトシダーゼ発現について試験した。明らかに陽性なｐＡＣＴプラスミドから、インサートをＸｈｏＩで切りだし、ＢＳ−ＫＳ（ストラテジーン）にクローン化し、そして３７３Ａ  ＤＮＡシーケンサー（アプライド  バイオシステムズ）にてダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングキットを使い、Ｔ７およびＴ３プロモーターからシークエンシングを行った。
図１は、異なるｐＡＳまたはｐＧＢＴ10プラスミドと共に酵母ＳＦＹ５２６に同時にトランスフェクトされたｐＡＣＴクローンＩＲ１Ｂ１についての結果を示す。フィルターの画線接種（ｓｔｒｅａｋ）１〜９にて選抜的なＳＣ培地（−ｔｒｐ、−ｌｅｕ）において酵母細胞が増殖した。Ｘ−ｇａｌ試薬（５−ブロモ−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）による染色では、画線接種２および４のみが陽性であった。図１に示すように、画線接種４は活性なｌａｃＺ遺伝子を有するコントロール酵母である。画線接種２はＩＲ１Ｂ１およびＩＦＮＡＲ１−ＩＣ融合タンパク質の組み合わせである。ＩＲ１Ｂ１のみ（画線接種９）またはＩＲ１Ｂ１およびＩＦＮＡＲ１−ＩＣ以外のどのほかの組み合わせでもβ−ガラクトシダーゼ活性を示さなかった。それゆえＩＲ１Ｂ１はＩＦＮＡＲ１  ＩＦＮ受容体鎖のＩＣドメインと特異的に結合することができる。
同様に、図２は、異なるｐＡＳまたはｐＧＢＴ10プラスミドと共に酵母ＳＦＹ５２６に同時にトランスフェクトされたｐＡＣＴクローンＩＲ１Ｂ４についての結果を示す。フィルターの画線接種１〜８にて選抜的なＳＣ培地（−ｔｒｐ、ｌｅｕ）において酵母細胞が増殖し、Ｘ−ｇａｌ試薬による染色では、画線接種３および７のみが陽性であった。図２の下部の囲み部分に示すように画線接種７は活性なｌａｃＺ遺伝子を有するコントロール酵母である。画線接種３はＩＲ１Ｂ４およびＩＦＮＡＲ１−ＩＣ融合タンパク質の組み合わせである。ＩＲ１Ｂ１を用いて得られた結果のように、ＩＲ１Ｂ４のみ（画線接種１）またはＩＲ１Ｂ４およびＩＦＮＡＲ１−ＩＣ以外のどのほかの組み合わせでもβ−ガラクトシダーゼ活性を示さなかった。それゆえＩＲ１Ｂ４もまたＩＦＮＡＲ１  ＩＦＮ受容体鎖のＩＣドメインと特異的に結合することができる。
実施例２
ＩＲ１Ｂ１タンパク質配列はカルシウム結合ＥＦハンドサイトを示す。
ｐＡＣＴ−ＩＲ１Ｂ１プラスミドのｃＤＮＡインサートを制限酵素ＸｈｏＩで切りだし、ブルースクリプトＢＳ−ＫＳベクターにクローン化し、そして３７３Ａ  ＤＮＡシーケンサー（アプライド  バイオシステムズ）にてダイデオキシターミネーターサイクルシークエンシングキットを使い、Ｔ７およびＴ３プロモーターからシークエンシングを行った。最も長いプラスミドはＧａｌ４アクチベーションドメインおよびｐＡＣＴプラスミドのリンカー配列に続く８３０のヌクレオチド（図３）の配列を有し、そして１９１のアミノ酸のオープンリーディングフレームがその中に見られた（図３）。タンパク質データベースのオンラインサーチを、バイオアクセルレーター  アラインメント（Ｂｉｏａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）とヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）、１９９２年）およびブラストピイ  アルゴリズム（ＢｌａｓｔＰ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）（アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、１９９０年）を使って実施した。カルトラクチン（ｃａｌｔｒａｃｔｉｎ）（ＣＡＴＲ＿ＨＵＭＡＮ，ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳＷ  Ｎｅｗ  Ｐ４１２０８）については６２．１％の類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）および５２〜１７３のアミノ酸では３２．４％の相同性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、そしてカルシニューリンＢ（ＣＡＬＢ  ＮＡＥＧＲ，ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐ４２３２２；ＣＡＬＢ＿ＨＵＭＡＮ，ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｐ０６７０５）については５９．８％の類似性および５０〜１７１のアミノ酸では３２．５％の相同性という最も高いスコアが得られた。
図４はヒトカルシニューリンＢ（ＣＡＬＢ）およびカルトラクチン（ＣＡＴＲ）とともにＩＲ１Ｂ１の配列を示す。カルシウムを結合するヘリックス−ループ−ヘリックスＥＦ−ハンドドメインを、太くそして下線を引いた文字で示す。ＩＲ１Ｂ１は２つのＥＦ−ハンドサイトを有するが、最初の２つのＥＦ−ハンドドメインは保存されていない。ＩＲ１Ｂ１はカルシニューリンＢ（図４に縦線で示す）およびカルトラクチン（図４にコロンで示す）の両者に相同性を示す。しかしながら、ＩＲ１Ｂ１は明らかに新規なものであり、以前には同定されていない異なったヒトタンパク質である。
実施例３
ＩＲ１Ｂ１はＩＦＮで誘導される遺伝子産物である。
ヒト骨髄腫Ｕ２６６Ｓ細胞（５ｍｌサスペンジョン培養物中、約３ｘ１０6個の細胞）を、組換えＩＦＮ−α８（２ｘ１０8ＩＵ／ｍｇ  細菌由来）または組換えＩＦＮ−β（３ｘ１０8ＩＵ／ｍｇ  ＣＨＯ細胞由来）で、７５０ＩＵ／ｍｌにて２時間または１８時間処理した。ＩＦＮで処理後、細胞を回収し、グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）チオシアネートおよびフェノールを含有するＴｒｉ試薬（モレキュラーリサーチセンター、シンシナティ、オハイオ）で抽出した。抽出したＲＮＡをエタノール沈殿し、ホルムアルデヒドで変性して、ホルムアルデヒド−アガロースゲル（１０ｕｇＲＮＡ／スロット）にて電気泳動により分析し、ジーンスクリーンプラス（デュポン、ニューイングランドニュークリアー、ビレリカ、エムエイ）上にブロットした。ノーザンブロットを、32Ｐ−ｄＣＴＰおよびランダムプライミングを使ってレディプライムキット（Ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  ｋｉｔ）（アマシャム、ユウケイ）によりラベルした１０6ｃｐｍのＩＲ１Ｂ１  ｃＤＮＡと反応させた。
図５は、ＩＲ１Ｂ１  ｃＤＮＡが１．１ｋｂ  ＲＮＡにハイブリダイズしたことを示す。ＩＲ１Ｂ１  ｍＲＮＡの量は、Ｕ２６６Ｓ細胞のＩＦＮ−β処理後、２時間で著しく増加した。しかしながら、ＩＦＮ−β処理後１８時間において、ＩＲ１Ｂ１  ｍＲＮＡは細胞から消失し、このことは、誘導が急速にしかも一時的に起こることを示している。多くのＩＦＮで誘導されたｍＲＮＡが、ＩＦＮ処理後２４時間以上にわたって細胞中に蓄積しつづける（レベル（Ｒｅｖｅｌ）とチェバス（Ｃｈｅｂａｔｈ）、１９８６年）。
同量のＲＮＡが各レーンに存在することを確認した。図５の下部に示すように、同じＵ２６６Ｓ（ＩＦＮ受容体が豊富）ＲＮＡの１８ＳリボソームｃＤＮＡプローブへのハイブリダイゼーションは、各レーンの同量の１８Ｓ  ｒＲＮＡを示す（１８Ｓ  ｒＲＮＡを泳動したブロットの部分のみを示す）。誘導のため１，２００Ｕ／ｍｌのＩＦＮを使用した別の実験では、ＩＲ１Ｂ１  ｍＲＮＡがまたＩＦＮ−α８と共に２時間において観察されたが、３０分においては観察されなかった（示していない）。
ＩＲ１Ｂ１  ｍＲＮＡは、異なったヒト細胞（Ｕ２６６、ダウジ（Ｄａｕｄｉ）とＴＨＰ−１細胞）で同じ１．１ｋｂのサイズを有することが明らかとなった。このサイズは、カルトラクチンｍＲＮＡのそれに近似しているが、カルシニューリンＢ  ｍＲＮＡ（２．５ｋｂ）のそれには近似していないことは注目すべきことである。小さなサイズのｍＲＮＡは、約２０ｋＤａの小さなタンパク質であるＩＲ１Ｂ１に一致する。
実施例４
ＩＲ１Ｂ４タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＦＮＡＲ１に結合する。
ＩＲ１Ｂ４のＩＦＮＡＲ１のＩＣドメインへの結合を、網状赤血球溶解物におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳を使うタンパク質タグ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔａｇ）（フラッグ配列）によるＩＲ１Ｂ４タンパク質の合成、およびこのタンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて組換えＩＦＮＡＲ１−ＩＣ融合タンパク質と反応させることにより、試験した。ＸｈｏＩで切断し、クレノー酵素で補充した実施例１由来のｐＡＣＴ−ＩＲ１Ｂ４  ＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで切断し、補充したＰＥＣＥ−フラッグ発現ベクター（エリス（Ｅｌｌｉｓ）ら、１９８６年）中にクローン化した。Ｉｎ−ｆｒａｍｅのフラッグ−ＩＲ１Ｂ４融合物を含むＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩで切断したＢＳ−ＳＫ中Ｔ３プロモーターの下流に再クローン化した。フラッグ融合物の配列をＴ３プロモーターからシークエンシングすることにより明らかにした。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写（プロメガキット）を、Ｔ３ポリメラーゼおよび１ｕｇのＢａｍＨＩで１本鎖化したＢＳ−フラッグ−ＩＲ１Ｂ４  ＤＮＡを使って行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの翻訳を、ウサギ網状赤血球溶解物（プロメガキット）において、［35Ｓ］メチオニン（アマシャム）および５ｕｇのＲＮＡ転写物を使って３０℃で１時間行った。該産物を使用前にＲＮａｓｅ処理した。ＧＳＴ−ＩＦＮＡＲ１−ＩＣ融合タンパク質を、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩをクローニングすることにより、つまりｐＧＥＸ２（ファルマシア  バイオテク）の同サイトにＢＳ−ＩＦＮＡＲ１−ＩＣ（前記参照）を挿入することにより調製した。ＧＳＴおよびＧＳＴ−ＩＦＮＡＲ１−ＩＣをＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、グルタチオニン−アガロースビーズ（シグマ）へ結合させ回収した。
抗フラッグＭ２アガロースビーズは、コダックサイエンティフィックイメージングシステムからのものである。ＩＦＮ受容体（ＩＦＮＡＲ１）のα成分に対するモノクローナル抗体ＩＦＮａＲ３は、オウ  コーラモニチ博士（Ｄｒ．Ｏ．Ｃｏｌａｍｏｎｉｃｉ）（コーラモニチ（Ｃｏｌａｍｏｎｉｃｉ）ら、１９９０年）から提供していただいたものであり、１：１００に希釈して使用した。ＩＦＮＡＲ１−ＩＣ（Ａｂ  ６３１）のＣ末端ペプチドに対するウサギ抗体を調製し、プロテインＧビーズ（ファルマシア）をｍＡｂ  ＩＦＮａＲ３と共に使用することを除き、以前詳細に述べたアンチプロテアーゼによる２ｘ１０7個のヒト骨髄腫Ｕ２６６ＳおよびＵ２６６Ｒ細胞のＢｒｉｊ抽出物（０．７５ｍｌ）からＩＦＮＡＲ１を免疫沈降するのに使用した（アンブロビック（Ａｍｂｒｏｖｉｃｈ）ら、１９９４年）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびフジックスＢＡＳ１０００ホスファーイメージャーにおける分析を以前のように行った（ハーロック（Ｈａｒｒｏｃｈ）ら、１９９４年）。
翻訳産物を抗フラッグ抗体により免疫沈降させると、約３２ｋＤａのタンパク質産物が得られることが初めて明らかとなった（図６Ａおよび６Ｂ）。図６Ａおよび６Ｂにおいて、抗フラッグ抗体の使用が表示される時（＋ｓｉｇｎによる）はいつも、ＩＲ１Ｂ４フラッグ融合ｍＲＮＡ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで相当するＤＮＡ構造体から転写されたもの）の放射活性翻訳産物がアガロースビーズ（コダックサイエンティフィックイメージングシステムの商品）に結合した抗フラッグＭ２抗体と反応したということを意味する。フラッグアミノ酸配列に融合したＩＲ１Ｂ４を含む翻訳されたタンパク質はこれらの抗フラッグ抗体ビーズに結合し、遠心分離してビーズを沈降させたあと、該タンパク質をＳＤＳ緩衝液で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。これらの反応は、期待される融合タンパク質が存在することを示すためのコントロールとして機能する。
ＩＦＮＡＲ１−ＩＣに融合したグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）が結合するグルタチオン−セファロース（シグマ）のビーズを網状赤血球溶解物翻訳反応に加えた。ビーズを遠心分離し、洗浄し、ＧＳＴビーズに結合したタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ  １％）で溶出し、そしてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析した。35Ｓメチオニンでラベルされた３２ｋＤａのタンパク質がＧＳＴ−ＩＦＮＡＲ１−ＩＣに結合していることが観察されたが、ＧＳＴのみには結合は観察されなかった（図６Ａ）。このことは、ＩＲ１Ｂ４が単離されたＩＦＮＡＲ１−ＩＣペプチド領域に直接結合することを示している。
ＩＲ１Ｂ４がヒト細胞膜に存在するようなＩＦＮＡＲ１タンパク質と相互作用するかを明らかにするため、ヒト骨髄腫Ｕ２６６細胞の界面活性剤抽出物を網状赤血球溶解物由来のＩＲ１Ｂ４  ｍＲＮＡの35Ｓメチオニンでラベルした翻訳産物と混合した。ＩＦＮＡＲ１タンパク質をＩＦＮＡＲ１のエクトドメインに特異的なモノクローナル抗体ＩＦＮａＲ３（コーラモニチら由来、１９９０年）により免疫沈降した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、界面活性剤抽出物がＵ２６６Ｓ（ＩＦＮ受容体が豊富）に由来する時は３２ｋＤａのＩＲ１Ｂ４フラッグバンド（図６Ｂ）の存在を示し、ＩＦＮ受容体欠損Ｕ２６６由来の突然変異体ＩＦＮ−α、β抵抗性の誘導細胞系（アブラモヴィック（Ａｂｒａｍｏｖｉｃｈ）ら、１９９４年）であるＵ２６６Ｒ細胞に由来する時は存在しないことを示した。Ｕ２６６Ｓ抽出物をＩＦＮＡＲ１のＣ末端ペプチドに対するＡｂ  ６３１と反応させると、３２ｋＤａバンドが同様に見られ、また、Ｃｏｓ−７細胞をｆｌｇ−ＩＲ１Ｂ４およびヒトＩＦＮＡＲ１  ｃＤＮＡにより変質させると、ＩＦＮＡＲ１が抗フラッグにより沈降した。これらの結果は、特異的な方法でヒト細胞に由来する無傷のＩＦＮＡＲ１にＩＲ１Ｂ４が結合することを示している。
実施例５
ＩＲ１Ｂ４のｃＤＮＡおよびタンパク質の配列
ＩＲ１Ｂ４  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、３６１のアミノ酸からなる長いタンパク質をコードするオープンリディングフレームを有する（図７）。このヒトｃＤＮＡは、Ｕ２６６骨髄腫細胞を含む種々のヒト細胞において１．５ｋｂの構成要素的に発現されるｐｏｌｙ−Ａ+  ｍＲＮＡを認識した。タンパク質データベースのオンラインサーチを、バイオアクセルレーター  アラインメント（Ｂｉｏａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）とヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）、１９９２年）およびブラストピイ  アルゴリズム（ＢｌａｓｔＰ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）（アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、１９９０年）を使って実施し、そして、ＩＲ１Ｂ４は、タンパク質−アルギニンメチルトランスフェラーゼファミリーの特有の構成要素であることがわかった。リン（Ｌｉｎ）らによって記載されているラットＰＲＭＴ１  ｃＤＮＡ（１９９６年、Ｇｅｎｂａｎｋ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｉ．Ｄ．１３９００２４；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｕ６０８８２）は、アラインメントコンピュータープログラムで分析するとほんの８１．４％の相同性を示す。アミノ酸レベルでは（図８）、ヒトＩＲ１Ｂ４／ＰＲＭＴはＰＲＭＴ１のアミノ末端で明らかに異なり、最初の１９のアミノ酸は全く異なっている。ＩＲ１Ｂ４のＮ末端シークエンシングのみでは、ＩＲ１Ｂ４がＰＲＭＴ１に相同性を示すことについての示唆を全く示さなかった。以前記載されている他のヒトタンパク質であるＨＣＰ−１（ニカワ（Ｎｉｋａｗａ）ら、１９９６年；Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｄ６６９０４）もまたＩＲ１Ｂ４に相同性を有することが明らかとなった。しかしながら、ＨＣＰ−１はアミノ酸配列が残基１４７−１７５で異なっている（図９）。ＨＣＰ−１は酵母においてｉｒｅ１５変異を補足するその能力に基づいて独自に同定され、その酵素的機能については以前に同定はされていない（ニカワ（Ｎｉｋａｗａ）ら、１９９６年）。それゆえ、ＩＲ１Ｂ４は新規なヒトタンパク質である。
実施例６
ＩＦＮＡＲ１−ＩＣに結合したＩＲ１Ｂ４は、メチルトランスフェラーゼ活性を有する
メチルトランスフェラーゼ活性をＩＦＮＡＲ１受容体と共にヒト細胞抽出物から同時に免疫沈降できた。Ｕ２６６Ｓ細胞のＢｒｉｊ界面活性剤抽出物を、抗ＩＦＮＡＲ１抗体Ａｂ  ６３１（アブラモヴィック（Ａｂｒａｍｏｖｉｃｈ）ら、１９９４年）ありまたはなしで４℃にて一夜反応させた。タンパク質Ａビーズ（５０％のＩＰＡ−４００ファーストフロー４０ｕｌ、レプリゲン）を１時間加えた。該ビーズを洗浄し、そして０．１ｍｌの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭ  ＥＧＴＡ，５０ｕＭ（０．２５ｕＣｉ）１４Ｃ−（メチル）−Ｓ−アデノシルメチオニン（アマシャム）、および１００ｕｇ  ヒストン（子牛胸腺由来のタイプＩＩＡ、シグマ）中で３０℃にて３０分間インキュベートした。ヒストンのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのメチル化を、リン（Ｌｉｎ）ら（１９９６年）により記載される条件の下で実施した。ヒストンバンドにおける放射活性をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミド）およびホスファーイメージャーにおける露光の後に分析した。14Ｃメチルラベルしたヒストンは、抗ＩＦＮＡＲ１でコートしたビーズにより観察されたが、コントロール反応ではそれらにより観察されなかった（図１０）。それゆえ、タンパク質メチルトランスフェラーゼ活性は、これらヒト細胞のＩＦＮ受容体鎖と構成要素的に関係している。Ｕ２６６Ｓ細胞へのＩＦＮ−βの添加後５分にＩＦＮＡＲ１を免疫沈降させた際、同様な酵素活性が回収された。
実施例７
ＩＦＮ作用におけるＩＲ１Ｂ４／ＰＲＭＴ１の関わり
ＩＲ１Ｂ４  ｃＤＮＡ（ＡＳ−１、アンチセンス配列５’−ＧＧＣＴＡＣＡＡＡＡＴＴＣＴＣＣＡＴＧＡＴＧ−３’；配列番号１２）の開始コドン周辺のヌクレオチド１２−３３の配列に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）（シュタイン（Ｓｔｅｉｎ）ら、１９８９年）を化学的に合成した。オリゴヌクレオチドを、９６穴マイクロプレートに播種したＵ２６６Ｓ細胞（８０００細胞／ウェル（穴）／０．２ｍｌ  ＲＰＭＩ、１０％  ＦＣＳ）に、初日においては１０ｕＭの最終濃度で添加し、また２日後においては５ｕＭで再添加した。ＩＦＮ−βを初日において６４または１２５ＩＵ／ｍｌで添加した。３日培養後、酸化還元に基づく比色細胞密度指示薬（バイオソース、カマリロ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ）、シイエイ）アラマーブルー（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）２０ｕｌを各ウェルに添加し、６−７時間にわたってインキュベーションした。複数のウェルの多数の読み取りができるマイクロプレートＥＬＩＳＡリーダー（試験フィルター（ｆｉｌｔｅｒ）５３０ｎｍ、対象フィルター  ６３０ｎｍ）にて、色を測定した。生存細胞数によるグロースカーブとＯＤによるものとの相関関係が明らかになった。メチルトランスフェラーゼを測定するため、プールしたウェルからの細胞を、２５ｕｌ／ウェルの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、４０ｕｇ／ｍｌロイペプチンおよびアプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）、２０ｕｇ／ｍｌペプスタチン（ｐｅｐｓｔａｔｉｎ）、１ｕＭフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）中で凍結−解凍により溶解した。２５ｕｌの細胞抽出物、１００ｕＭペプチドＲ１（ナジュボイヤ（Ｎａｊｂａｕｅｒ）ら、１９９３年；ゲノシス（Ｇｅｎｏｓｙｓ）、ケンブリッジ、ユウケイから得られた）、３ｕＣｉの［3Ｈ］（メチル）Ｓ−アデノシルメチオニン（アマシャム、７３Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含む５０ｕｌ中で反応を３０℃にて３０分間行った。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（１６％）にて電気泳動後、５０％メタノール、１０％酢酸中で固定し、アンプリファイ（登録商標）（アマシャム）で処理し、オートラジオグラフィーを８日間実施した。Ｒ１ペプチド基質へのトリチウム化メチル基の取り込みにより測定すると、このＡＳ−１アンチセンスＤＮＡはＵ２６６Ｓ細胞においてタンパク質−アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性を著しく減少することができ（図１１）、そして、この酵素のＩＦＮ作用における働きについての役割を調査するのに使用した。細胞に関し最も直接的に定量でき、またラットＰＲＭＴ１と増殖関連遺伝子産物との相互作用が観察されているため（リン（Ｌｉｎ）ら、１９９６年）、ＩＦＮの増殖阻害活性を選択した。ＩＲ１Ｂ４／ＰＲＭＴ  ｃＤＮＡの開始コドン周辺の配列と相補的なアンチセンス−１オリゴヌクレオチドＡＳ−１の添加により、ヒト骨髄腫Ｕ２６６Ｓ細胞においてＩＦＮ−βの増殖阻害効果が減少した（図１２）。このことは、アンチセンスＡＳ−１の存在下、ＩＦＮ処理細胞がより高い増殖を示したことを意味する（ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ）のいずれの毒性効果も除く）。���ＦＮ非存在下における増殖には有意な影響は与えなかった。同じｃＤＮＡ領域に相当するセンスオリゴヌクレオチドＳ−３は、アンチセンス−１と比較して、ほんの小さな効果（Ｓ−３、図１２）しか持たなかった。センスＳ−３はまた酵素活性のレベルに対しほんのわずかな阻害効果しか持たなかった（図１１）。ｃＤＮＡの中位に対するものであり、配列番号７のヌクレオチド５７２−５９２に相補的な他のアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドＡＳ−２（配列番号１３）は、ほとんど影響を持たなかった（図１２）。アンチセンス−１オリゴヌクレオチドにより部分的にＰＲＭＴ活性が欠損した骨髄腫細胞におけるＩＦＮ−βの増殖阻害効果の５倍までの減少は、ＩＲ１Ｂ４／ＰＲＭＴ酵素とＩＦＮＡＲ１受容体のＩＣドメインとの関係が細胞におけるＩＦＮ作用にとって機能的に重要であることを示している。
これらの実験はまた、ＩＲ１Ｂ４タンパク質が、図１１に説明される実験において使用されたＲ１ペプチド  Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ（配列番号１１；ナジュボイヤ（Ｎａｊｂａｕｅｒ）ら、１９９３年）のようなＰＲＭＴクラスの酵素のペプチド基質をメチル化することを示している。グリシニン残基に隣接するアルギニン残基におけるタンパク質のメチル化は（たとえば、前記ペプチドにおけるように）、細胞にシグナルを伝達するのに働くリン酸化のような一種のタンパク質修飾でありうる。ｈｎＲＮＰグループのタンパク質は、ＰＲＭＴ酵素の標的であり、そしてこれらのタンパク質はｍＲＮＡプロセッシング、スプライシング、輸送および安定性に影響を与えるので（リウ（Ｌｉｕ）とドレイファス（Ｄｒｅｙｆｕｓｓ）、１９９５年）、それらのメチル化は遺伝子発現の転写後調節においてある役割を演じるかもしれない。ＩＦＮ受容体の鎖に結合するとしてここで発見されたＩＲ１Ｂ４／ＰＲＭＴタンパク質は、ＩＦＮへの応答における遺伝子発現についての変化を仲介することができるかもしれない。他のタンパク質基質は、ＩＦＮ受容体複合体および転写因子の他の成分を含むＩＦＮ受容体を通じてメチル化されるかもしれない。リン（Ｌｉｎ）ら（１９９６年）は、ラットＰＲＭＴ１の増殖因子で誘導されるタンパク質への結合はＰＲＭＴ１を活性化し、そして、おそらく細胞の細胞質においてＰＲＭＴ１に結合する何らかの阻害性タンパク質を除去することによりその基質特異性を修飾することを観察した。ＩＦＮ受容体のＩＦＮＡＲ１鎖へ結合したＩＲ１Ｂ４の同様な活性化が期待できうる。
結論
新規タンパク質ＩＲ１Ｂ１は、Ｉ型インターフェロン受容体のＩＦＮＡＲ１鎖の細胞内ドメインと相互作用することを述べた。このタンパク質は、ヒト細胞のＩＦＮ処理に続いて非常に急速にしかも一時的に誘導される。ＩＲ１Ｂ１は、カルシウム結合タンパク質の特徴（ｈａｌｌｍａｒｋ）であるヘリックス−ループ−ヘリックスＥＦハンドルサイトの存在により特徴づけられる。カルシウムイオンの流動はＩＦＮの作用機構に関係し、とくに、細胞形態および細胞骨格の組織化における初期の細胞の応答および変化について関係する（タム（Ｔａｍｍ）ら、１９８７年）。カルシウムイオンで活性化される酵素は、ＩＦＮへの応答において、ジアシルグリセロールのようなセカンドメッセンジャーを産生することができうる。さらに、カルモジュリン様タンパク質は多くのタンパク質キナーゼを調節し、これらの経路は、ＩＦＮ処理細胞において機能することが観察されている（タムら、１９８７年）。ＩＦＮ受容体結合タンパク質ＩＲ１Ｂ１は細胞においてＩＦＮのそのようなＣａ++依存効果に関与しているようである。
ＩＦＮＡＲ１−ＩＣドメインと相互作用するタンパク質のためのツーハイブリッドスクリーニング（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）ではまた他のタンパク質ＩＲ１Ｂ４を同定し、それは、タンパク質−アルギニンメチルトランスフェラーゼファミリーの酵素の構成要素であることが明らかとなった（ＰＲＭＴ１；リンら、１９９６年）。この酵素は多くのＲＮＡおよびＤＮＡ結合タンパク質、とくに異種核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）をメチル化することが知られている。ｈｎＲＮＰは、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送、プレｍＲＮＡの副スプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ）、および転写後調節に関与している（リウ（Ｌｉｕ）とドレイファス（Ｄｒｅｙｆｕｓｓ）、１９９５年）。ＩＦＮＡＲ１−ＩＣドメイン上に連結するＩＲ１Ｂ１およびＩＲ１Ｂ４／ＰＲＭＴ１タンパク質は、ダーネル（Ｄａｒｎｅｌｌ）ら（１９９４年）により記載される既知のジャック−スタット（Ｊａｋ−Ｓｔａｔ）経路以外に存在するＩＦＮの新規なシグナル機構を明らかにする。
本発明を完全に記載したので、本発明の思想および範囲から離れることなくまた不適切な実験なく、同じことが、等しいパラメーター、濃度、条件の広い範囲内において実施されうることが当業者により理解されるであろう。
本発明は特定の具体例との関連で記載されているが、さらなる修飾が可能であると理解されるであろう。本願は、一般に本発明の原理に従う、また本発明の技術分野における既知のまたは慣習的方法内で生ずる、および以下に添付する請求の範囲における前記説明にある必須事項に適用されるかもしれないような本開示からの発展を含むいずれのバリエーション、使用、または適用をカバーすることを意図している。
雑誌記事または要約、公開されたまたはそれに相当する米国または外国特許出願、認定された米国または外国特許、またはその他のあらゆる引用例は、この引用文献に全て包含しており、それは引用した引用例に存在する全てのデータ、表、図、および文書を含んでいる。さらに、ここに引用した引用例の中に引用される引用文献の全ての内容もまた引用文献に全て包含されている。
既知の方法の段階、従来の方法の段階、既知の方法または従来の方法に対する引用例は、本発明のいずれの側面、記載または具体例も本技術分野において開示、教示または示唆されているとすることについて、いずれの場合においても認めるものではない。
前記した特定の具体例において本発明の一般的な性質を充分に明らかにしているので、他者は、本分野の技術内の知識を適用することにより（ここに引用される引用例の内容を含む）、不適切な実験なく、本発明の一般的概念からはなれることなく、特定の具体例のような種々の用途のために容易に修飾および／または適用することができるであろう。それゆえ、そのような適用および修飾は、ここに示される教示または指導に基づくものであり、開示された具体例と等しい意味および範囲にあると意図されている。
ここにある表現または術語は、記載を目的とするものであり限定するものではないと理解されるべきであって、それゆえ、本明細書の表現または術語は、当該技術分野における通常の技術の１つについての知識と組み合わせ、ここで示されている教示や示唆に照らし、当業者により理解されるべきである。
引用文献
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0004614473.tif 000003
0004614473.tif 000004
配列表
（1）一般情報：
（i）出願人：レベル、マイクル
チェバス、ジュディス  イー
アブラモビッチ、カロライナ
（ii）発明の名称：新規なＩＦＮ受容体１結合タンパク質、それらをコードするＤＮＡ、およびインターフェロンに対する細胞応答の調節方法
（iii）配列の数：13
（iv）連絡先：
（A）受信人：ブラウディ  アンド  ネイマーク
（B）街路：セブンスストリート  ４１９、エヌ  ダブリュー、スウィート  ３００（番地なし）
（C）都市：ワシントン
（D）州：ディストリクト  オブ  コロンビア
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号（ZIP）：20004
（v）機械読み取り可能形式：
（A）媒体の形式：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：IBM製パーソナルコンピュータ互換機
（C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウェア：PatentIn  Release  #1.0、バージョン  #1.30
（vi）現行の出願データ：
（A）出願番号：US
（B）出願日：
（vi）先願のデータ
（A）出願番号：US  60／035,636
（B）出願日：1997年1月15日
（viii）代理人についての情報：
（A）氏名：ブラウディ、ロジャー  エル
（B）登録番号：25,618
（C）ファイル番号：REVEL=14  PCT
（ix）通信についての情報
（A）電話：202-628-5197
（B）ファックス：202-737-3528
（2）配列番号1に関する情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：830塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：1本鎖
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）特徴：
（A）名称／キー：CDS
（B）ロケーション：43..615
（xi）配列：配列番号1：
0004614473.tif 000005
（2）配列番号２に関する情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：191アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号2：
0004614473.tif 000006
（2）配列番号3に関する情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：170アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：1本鎖
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号3：
0004614473.tif 000007
（2）配列番号4に関する情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：172アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：1本鎖
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号4：
0004614473.tif 000008
（2）配列番号5に関する情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：31塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：1本鎖
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号5：
0004614473.tif 000009
（2）配列番号6に関する情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：25塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：1本鎖
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号6：
0004614473.tif 000010
（2）配列番号7に関する情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：1308塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：1本鎖
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：cDNA
（ix）特徴：
（A）名称／キー：CDS
（B）ロケーション：16..1098
（xi）配列：配列番号7：
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0004614473.tif 000012
（2）配列番号8に関する情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：361アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号8：
0004614473.tif 000013
（2）配列番号9に関する情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：353アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：1本鎖
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号9：
0004614473.tif 000014
（2）配列番号10に関する情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：360アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：1本鎖
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：タンパク質
（xi）配列：配列番号10：
0004614473.tif 000015
（2）配列番号11に関する情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：10アミノ酸
（B）配列の型：アミノ酸
（C）鎖の数：1本鎖
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列：配列番号11：
0004614473.tif 000016
（2）配列番号12に関する情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：22塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：1本鎖
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号12：
0004614473.tif 000017
（2）配列番号13に関する情報：
（i）配列の特性：
（A）配列の長さ：21塩基対
（B）配列の型：核酸
（C）鎖の数：1本鎖
（D）トポロジー：直線状
（ii）配列の種類：cDNA
（xi）配列：配列番号13：
0004614473.tif 000018
【図１】
0004614473.tif 000019
【図２】
0004614473.tif 000020
【図３】
0004614473.tif 000021
【図４】
0004614473.tif 000022
【図５】
0004614473.tif 000023
【図６Ａ】
0004614473.tif 000024
【図６Ｂ】
0004614473.tif 000025
【図７】
0004614473.tif 000026
【図８】
0004614473.tif 000027
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
0004614473.tif 000030
【図１２】
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