(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）レセプター由来の細胞外リガンド結合ドメインおよびレセプター由来の細胞質ドメインを含む組換えレセプターポリペプチドであって、
細胞質ドメインの少なくとも１個の活性化部位が不活性化されており、細胞質ドメインが少なくとも２個の部分、すなわちレセプターの細胞質ドメインに由来する第一の部分、および第一の部分が由来するレセプターの細胞質ドメインに異種である、異種のベイトポリペプチドを含む第二の部分を含み、ここで細胞質ドメインは少なくともＪＡＫ結合部位を含む、組換えレセプターポリペプチド；および
（２）異種のベイトポリペプチドと相互作用する第一のポリペプチド、および少なくとも１個の活性化部位を含む第二のポリペプチドを含む組換えプレイポリペプチド
を含むレセプター複合体であって、
ここでレセプター複合体は、該リガンド結合ドメインへのリガンドの結合により、そして該異種ベイトペプチドへの該組換えプレイポリペプチドの結合により活性化される、レセプター複合体。
【請求項２】
組換えレセプターポリペプチドが、ホモ多量体化レセプターポリペプチドである、請求項１記載のレセプター複合体。
【請求項３】
組換えレセプターポリペプチドが、ヘテロ多量体化レセプターポリペプチドである、請求項１記載のレセプター複合体。
【請求項４】
組換えプレイポリペプチドの結合が、異種ベイトペプチドの修飾状態に依存する、請求項１〜３のいずれか１項記載のレセプター複合体。
【請求項５】
修飾状態が、リン酸化、アセチル化、アシル化、メチル化、ユビキチン化、またはグリコシル化の有無である、請求項４記載のレセプター複合体。
【請求項６】
修飾状態の変化が、リガンド結合ドメインへのリガンドの結合に依存する、請求項４または５記載のレセプター複合体。
【請求項７】
細胞質ドメインが、少なくとも１個のチロシンリン酸化部位が不活性化されているレプチンレセプター細胞質ドメインまたは該不活性化レプチンレセプター細胞質ドメインの機能的断片を含む、請求項１〜６のいずれか１項記載のレセプター複合体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項記載のレセプター複合体を用いて、化合物と化合物の結合を検出する方法。
【請求項９】
結合が、修飾状態に依存するものである、請求項８記載の化合物と化合物の結合を検出する方法。
【請求項１０】
修飾が、リン酸化、アセチル化、アシル化、メチル化、ユビキチン化、またはグリコシル化である、請求項９記載の、化合物と化合物の結合を検出する方法。
【請求項１１】
結合が、３種類以上のパートナーを介する、請求項８〜１０のいずれか１項記載の、化合物と化合物の結合を検出する方法。
【請求項１２】
１種類以上のパートナーが、タンパク質性でないか、完全にはタンパク質性でない、請求項１１記載の、化合物と化合物の結合を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、細胞外リガンド結合ドメイン、および、異種のベイト（おとり、bait）ポリペプチドを含む細胞質ドメインを含む組換えレセプターであって、該リガンド結合ドメインへのリガンドの結合、および該異種ベイトペプチドへのプレイポリペプチドの結合によって活性化される組換えレセプターに関する。また、本発明は、該組換えレセプターを用いて、化合物−化合物結合を検出する方法にも関する。
【０００２】
タンパク質−タンパク質相互作用は、複製および遺伝子発現から生物の形態形成に至るまでのあらゆる生物学的過程において重要な鍵となっている。とりわけ、タンパク質−タンパク質相互作用は、リガンド−レセプター相互作用およびそれに引き続いて起きるシグナル経路を支配している。すなわち、酵素サブユニットの集合、リボソーム、フィラメント、およびウイルス粒子などの生物学的超分子構造体の形成、ならびに抗原−抗体相互作用において重要である。
【０００３】
研究者は、タンパク質−タンパク質相互作用を同定するためにいくつかの方法を開発してきた。中でも、タンパク質の同時精製、および免疫共沈殿が最初に用いられた技術である。しかし、これらの方法は冗漫であり、高速大量スクリーニングを行なうことができない。さらに、これらの方法では、正常な細胞のコンテキストを破壊する細胞溶解が必要である。遺伝学的な手法を導入することによって、大きな進展が得られた。中でも、酵母のツーハイブリッド法（FieldとSong, 1989）が最も重要な方法である。この技術は広範に用いられるようになったが、いくつか短所がある。融合タンパク質を核に転移させなければならないが、これは必ずしも確実ではない。本質的に転写活性化特性をもつタンパク質は、偽陽性の結果をもたらす可能性がある。さらに、リン酸化など、タンパク質の二次修飾に依存する相互作用は簡単に検出できるものではない。
【０００４】
このような問題の１つ以上を解決するために、これに代わるシステムがいくつか開発されている。
【０００５】
ファージディスプレイによる方法では、核移行を行わずにすむ。国際公開公報第９００２８０９号には、どのようにして、繊維状ファージなどの遺伝子パッケージの表面上に結合タンパク質を表示し、それによって結合タンパク質をコードする遺伝子をファージの中にパッケージすることができるのかが記載されている。標的分子を認識する結合タンパク質をもつファージを単離して増幅する。例えば、国際公開公報第９２２０７９１号、国際公開公報第９７１０３３０号、および国際公開公報第９７３２０１７号で記載されているように、ファージディスプレイ法にいくつかの改良を加えることが提案されている。
【０００６】
しかしながら、これらの方法にはすべて、ファージディスプレイ法に固有の難点がある。すなわち、タンパク質をファージ表面に曝露する必要があり、インビボでの相互作用とは生理学的に似ていない環境に曝すことになるという難点である。さらに、ファージライブラリーをスクリーニングする場合、ファージ間で競争が起こり、親和性の高い結合体を選択する結果になる。最後に、修飾依存型ファージディスプレイ系は未だ記載されていない。
【０００７】
米国特許第５６３７４６３号は、修飾依存型のタンパク質−タンパク質相互作用をスクリーニングできるように、酵母ツーハイブリッド系を改良したことを記載している。しかし、この方法は、細胞質の中でその活性を発揮し、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する酵素以外の酵素を修飾する可能性をもつ修飾酵素の共発現に依存するものであるため、そうなると宿主生物の生存力に影響を与える可能性がある。
【０００８】
米国特許第５７７６６８９号には、いわゆるタンパク質動員系によって興味深い進展があったことが記載されている。グアニンヌクレオチド交換因子（Ｓｏｓ）を原形質膜に動員し、そこでＳｏｓがＲａｓレポーター分子を活性化することによって、タンパク質−タンパク質相互作用を検出する。この結果、用いられる培養条件下では通常生存できない細胞を生き残らせることができる。この方法は、確かに、タンパク質−タンパク質相互作用が生理学的条件下において膜下の領域で生じるという利点があるが、いくつかの欠点もある。修飾依存的な相互作用を検出することができない。さらには、この方法が多面的なＲａｓ経路を用いているため、技術的に複雑な事態をもたらす可能性がある。
【０００９】
低く制御可能なバックグラウンドで相互作用を生理学的な条件下で調べることができる、タンパク質−タンパク質相互作用を選択するシステムであって、かつ、修飾依存的なタンパク質−タンパク質相互作用を単離することができるシステムに対する需要が依然として存在する。
【００１０】
本発明は、このような需要を満たし、かつ、更なる利点も提供する。本発明の概要図を図１に示す。
【００１１】
本発明の一側面は、細胞外リガンド結合ドメイン、および異種ベイトポリペプチドを含む細胞質ドメインを含む組換え膜内外型レセプターであって、該リガンド結合ドメインへのリガンドの結合、および該異種ベイトポリペプチドへのプレイペプチドの結合によって活性化されるレセプターを提供する。組換えレセプターは、リガンド結合ドメインと細胞質ドメインとが２種の異なったレセプターに由来するキメラレセプターでもよい。好適には、レセプターは多量体化レセプターであり、ホモ多量体化レセプターであっても、ヘテロ多量体化レセプターであってもよい。組換えレセプターの細胞質ドメインは、異種のベイトポリペプチドを含むが、これは、内在する内部断片への挿入または置換として、カルボキシ末端に融合されていてもよいし、このカルボキシ末端の一部を置換するか、細胞質ドメインそのものの中に置くこともできる。ホモ多量体化レセプターの場合には、すべての鎖がベイトを含んでいる必要はなく、構成鎖の一つが、その細胞質ドメインの中にベイトを含んでいれば十分である。レセプターの細胞質ドメインにおいて少なくとも１個の活性化部位が不活性化されている結果、レセプターが活性化されず、該組換えレセプターのリガンド結合ドメインにリガンドが結合しただけではシグナル伝達経路も活性化されないようになっている。このような不活性化は、活性化されるアミノ酸を別のアミノ酸で置換したり、活性化部位のアミノ酸配列を変化させたり、活性化部位を欠失させたりするなど、いくつかの方法によって行なうことができる。異種ベイトポリペプチドの挿入、および活性化部位の不活性化によって、本来の細胞質ドメインに一つ以上の欠失が生じる可能性がある。細胞質ドメインを変化させるときに唯一の制約要素となるのは、該細胞質ドメインが、直接的にせよ間接的にせよ、Ｊａｋ結合部位などの修飾酵素活性結合部位を保持することによって、または細胞質ドメイン自体における活性型修飾酵素活性を取り込むことによって、本来の修飾酵素活性を保持しなければならないということである。レセプターおよびシグナル伝達経路の活性化は、リガンド結合ドメインへのリガンドの結合、およびレセプターの細胞質ドメインに含まれる異種ベイトポリペプチドへのプレイポリペプチドの結合によって生じる。ベイトポリペプチドを含む組換えレセプターをコードする遺伝子は、構成プロモーターまたは誘導プロモーターの下流に置くことができる。プレイポリペプチドと内在性ポリペプチドとの間で結合部位に対する競合が起きる場合には、後者の構造の方が有利である。プレイポリペプチド存在下で、ベイトポリペプチドを含む組換えレセプターを誘導すると、結合を促進するとともに、内在性ポリペプチドによって結合部位が飽和するのを避けることができる。
【００１２】
一つの好適な態様は、活性化部位がリン酸化部位であり、修飾酵素活性がキナーゼである、本発明に係る組換えレセプターである。
【００１３】
本発明の別の好適な態様は、細胞質ドメインのカルボキシ末端の中に、または、好適にはそのカルボキシ末端に、異種のベイトポリペプチドを融合したホモ多量体化組換えレプチンレセプターである。該異種ベイトポリペプチドは、該細胞質ドメインの一部を置き換えたものでありえる。好適には、細胞質ドメインの３つの保存されたチロシンリン酸化部位を不活性化するが、さらに好適には、チロシンをフェニルアラニンで置換して不活性化する。別の好ましい態様は、上記したように、異種ベイトポリペプチドを含む、レプチンレセプターの不活性細胞質ドメインが、エリスロポエチン（ＥＰＯ）レセプターのリガンド結合ドメインに融合しているホモ多量体化組換えレセプターである。さらに別の態様は、異種ベイトポリペプチドを含む、レプチンレセプターの不活性細胞質ドメインが、一つのサブユニットでは、インターロイキン−５レセプターα鎖リガンド結合ドメインに融合しており、もう一つのサブユニットでは、インターロイキン−５レセプターβ鎖に融合している、ヘテロ多量体化組換えレセプターである。さらに別の態様は、異種ベイトポリペプチドを含む、レプチンレセプターの不活性細胞質ドメインが、一つのサブユニットでは、ＧＭ−ＣＳＦ−α鎖リガンド結合ドメインに融合しており、もう一つのサブユニットでは、インターロイキン−５レセプターβ鎖に融合している、ヘテロ多量体化組換えレセプターである。
【００１４】
本発明の別の側面は、リガンド結合ドメイン、ならびに、これに限定されないが、リン酸化、アセチル化、アシル化、メチル化、ユビキチン化、またはグリコシル化またはタンパク質分解処理などの修飾によって改変することのできる異種ベイトポリペプチドを含む細胞質ドメインを含む組換えレセプターにおいて、該組換えレセプターが、該リガンド結合ドメインへのリガンドの結合、および、該異種ベイトポリペプチドへのプレイポリペプチドの結合によって活性化され、また、該異種ベイトポリペプチドへのプレイポリペプチドの該結合が、異種ベイトポリペプチドの修飾状態、すなわち、修飾を伴う結合だけか、あるいは、修飾を伴わない結合だけかという状態に依存している組換えレセプターを提供することである。該修飾状態は、リン酸化、アセチル化、アシル化、メチル化、ユビキチン化、またはグリコシル化またはタンパク質分解による切断があるか否かでありうるが、これらに限定されない。ベイトは、活性化部位を修飾している修飾酵素活性と必ずしも同じである必要はないが、それらでもありうるベイト修飾酵素活性によって修飾される。組換えレセプターは、リガンド結合ドメインと細胞質ドメインとが２種の異なったレセプターに由来するキメラレセプターでもよい。好適には、レセプターは、多量体化レセプターである。上記したように、組換えレセプターの細胞質ドメインは、異種のベイトポリペプチドを含むが、これは、内在する内部断片への挿入または置換として、カルボキシ末端に融合されていてもよいし、このカルボキシ末端の一部を置換するか、細胞質ドメインそのものの中に置くこともできる。ホモ多量体化レセプターの場合には、すべての鎖がベイトを含んでいる必要はなく、構成鎖の一つが、その細胞質ドメインの中にベイトを含んでいれば十分である。レセプターの細胞質ドメインにおいて少なくとも１個の活性化部位が不活性化されている結果、レセプターが活性化されず、該組換えレセプターのリガンド結合ドメインにリガンドが結合しただけではシグナル伝達経路も活性化されないようになっている。このような不活性化は、活性されるアミノ酸を別のアミノ酸で置換したり、活性化部位のアミノ酸配列を変化させたり、活性化部位を欠失させたりするなど、いくつかの方法によって行なうことができる。異種ベイトポリペプチドの挿入、および活性化部位の不活性化によって、本来の細胞質ドメインに一つ以上の欠失が生じる可能性がある。細胞質ドメインを変化させるときに唯一の制約要素となるのは、該細胞質ドメインが、直接的にせよ間接的にせよ、修飾酵素結合部位を保持することによって、または細胞質ドメイン自体の中にある活性型修飾酵素活性を取り込むことによって、本来の修飾酵素活性を保持しなければならないということである。好適には、活性化部位はリン酸化部位であり、修飾酵素活性はキナーゼ活性である。
【００１５】
ベイトの修飾はシスまたはトランスに作用するものである。すなわち、酵素活性が、同一の細胞質ドメインに存在するものでも、または、どこか別のところから来るものでもよい。好適には、ベイトの修飾は、リガンドのリガンド結合ドメインへの結合によって誘導される。好ましい態様は、ベイトは、細胞質ドメインの固有のキナーゼ活性、好適には、該細胞質ドメインに結合するＪａｋキナーゼによってリン酸化されるホモ二量体化レセプターである。別の好ましい態様は、一つの鎖の細胞質ドメインが、修飾されるベイトを含み、別の鎖の細胞質ドメインがベイト修飾酵素活性を含むヘテロ多量体化レセプターである。
【００１６】
レセプターおよびシグナル伝達経路の活性化は、リガンドのリガンド結合ドメインへの結合、および、レセプターの細胞質ドメインの中に位置する異種のベイトポリペプチドへのプレイポリペプチドの結合によって行なわれる。該プレイポリペプチドの結合は、該異種ベイトポリペプチドの修飾状態に依存するが、これは、ベイトが修飾されているときにのみ、あるいは、ベイトが修飾されていないときにのみ結合が起こることを意味する。
【００１７】
本発明の別の側面は、直接的または間接的にベイトポリペプチドと相互作用することができるポリペプチド、および、少なくとも１個の活性化部位を含む別のポリペプチドを含む融合タンパク質であるプレイポリペプチドを提供することである。該活性化部位は、好適には、リン酸化部位であり、より好適には、チロシンリン酸化部位である。さらに好適には、該チロシンリン酸化部位はシグナル伝達および転写活性化因子（ＳＴＡＴ）結合部位の一部であり、もっとも好適なのは、ＳＴＡＴ１および／またはＳＴＡＴ３結合部位の一部である。直接的な相互作用とは、異種ベイトポリペプチドとプレイポリペプチドとの間に直接のタンパク質−タンパク質接触があることを意味し、間接的な相互作用とは、異種ベイトポリペプチドが１個以上のポリペプチドと相互作用して、該プレイポリペプチドと相互作用する複合体を形成すること、あるいはその逆を意味する。後者の場合、プレイポリペプチドは、複合体由来の１種類のポリペプチドとのみ相互作用するか、いくつかのポリペプチドと相互作用するかであろう。プレイポリペプチドのベイトポリペプチドへの結合は、該ベイトポリペプチドおよび／または結合複合体に含まれるタンパク質の修飾状態に依存することがある。
【００１８】
核タンパク質の相互作用を調べる場合には、プレイポリペプチドが核外移行配列（ＮＥＳ）を含むようにして、細胞質ゾルの中で確実に利用できるようにすることができる。ｃＡＭＰ−依存型タンパク質キナーゼの熱安定性インヒビターのＮＥＳシグナル（アミノ酸３７〜４６位）は、強い核局在シグナルより優位に立つことが明らかになっている（Wileyら、1999）。このＮＥＳは、強い核局在シグナルがあっても、プレイポリペプチドを細胞質の中に留めておくことができ、ベイトとの相互作用を促進する。
【００１９】
好ましい態様の一つは、本発明に係る組換えレセプターの異種ベイトポリペプチドと相互作用する、本発明に係るプレイポリペプチドである。組換えレセプターのリガンド結合ドメインにリガンドが結合するに際し、また、該異種ベイトポリペプチドを該プレイポリペプチドと直接的または間接的に相互作用させるに際して、レセプターの細胞質ドメインに固有の修飾酵素活性によってプレイポリペプチドの活性化部位を修飾することができる。活性化部位の修飾はシグナル伝達経路を活性化する。好適には、該活性化部位はリン酸化部位であり、修飾酵素活性はキナーゼ活性である。より好適には、この活性化は、ＳＴＡＴポリペプチドをリン酸化されたリン酸化部位に結合させ、該ＳＴＡＴポリペプチドをリン酸化した後、リン酸化されたＳＴＡＴ分子２個を二量体化することを含む。
【００２０】
本発明の別の側面は、本発明に係る組換えレセプターをコードするベクター、および／または本発明に係るプレイポリペプチドをコードするベクターである。該組換えレセプターおよび該プレイポリペプチドは、一つ、または別々のベクター上に位置することができる。ベクターは、当業者に既知のいずれのベクターでもよい。染色体外ベクター、組込み型ベクター、およびウイルスベクターなどがあるが、これらに限定されない。好ましい態様は、ｃｒｅ−ｌｏｘまたはｆｌｐ−ｆｒｔなどのリコンビナーゼを利用した組み込みによって、ベイトを染色体の中に組み込むことができるベイトベクター、および／または、レトロウイルスによるゲノムへの組み込みを可能にするレトロウイルス型プレイベクターである。
【００２１】
本発明の別の側面は、本発明に係る組換えレセプターを含む真核細胞である。好適には、真核細胞は、本発明に係る１種類以上のベクターによってトランスフェクトすることによって得られる。該真核細胞には、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞があるが、これらに限定されない。好適な真核細胞は哺乳動物細胞である。好適な態様は、レトロウイルスｃＤＮＡライブラリーを用いても安全にレトロウイルスが作用できるようになっている、マウスレトロウイルスレセプターを発現する真核細胞株である。
【００２２】
本発明のさらに別の側面は、本発明に係る１種類以上のベクターを構築することができる、１種類以上のクロニーングベクターを含むキットである。細胞質ドメインをコードする部分が、ポリペプチドをコードする核酸断片を「インフレーム」で融合させうる１個以上の制限酵素部位を含む、組換えレセプターをコードするクロニーングベクターは、本発明に係る組換えレセプターをコードするベクターを構築するために容易に使用できることは、当業者には明らかである。同様に、少なくとも１個の活性化部位を含む第一のポリペプチドをコードするクロニーングベクターであって、第二のポリペプチドをコードする核酸が、該第一のポリペプチドと「インフレーム」で融合できるように１個以上の制限部位を含むクロニーングベクターは、本発明に係るプレイポリペプチドをコードするベクターを構築するために容易に用いることができる。または、組換えレセプターをコードするベクター、およびプレイポリペプチドをコードするベクターの両方を構築するために、当業者に既知のクロニーング法を用いることもできる。
【００２３】
本発明のさらに別の側面は、本発明に係る組換えレセプターおよび／またはプレイポリペプチドを用いて、化合物−化合物結合を検出する方法である。好ましい態様では、本発明に係る組換えレセプターを保有する真核細胞は、本発明に係るプレイポリペプチドをコードするベクターライブラリーによって形質転換またはトランスフェクトされている。ベイト−プレイ結合によってシグナル伝達経路が活性化されるため、この結合は、レポーター系を用いて検出することができる。これは本質的な特徴ではないが、キメラレセプターを使用することによって、この方法のさらなる利点が示される。本方法においてキメラレセプターを使用することの第一の利点は、非ベイト特異的なバックグランドを除去することが可能になることである。実際、ベイトを含まないレセプターおよびベイトを含むレセプターという、２つの異なるレセプターを使用することによって、ベイト特異的結合と非ベイト特異的結合の間にちがいを生ずる。これは、第一のリガンド結合ドメインと、活性化部位も異種ベイトポリペプチドも含まない細胞質ドメインとを含む第一のレセプター、および、今度は異種ベイトポリペプチドをもつ、同一の不活性化された細胞ドメインと、第二のリガンド結合ドメインを含む第二のレセプターという、少なくとも２種類のレセプターを保持する宿主細胞を使用することによって実現することができる。第一のリガンドを外部から培地に添加して第一のリガンドをレセプターに結合させると、陽性のシグナルは、活性化部位を含むポリペプチドに融合されたプレイポリペプチドが、レセプターの細胞質ドメインと非ベイト特異的に相互作用したときにのみ検出できる。すなわち、これらの細胞を選択するか、および／または除去させることができる。ベイト特異的でない相互作用をするプレイの選択および／または除去の後、第二のリガンドを培地に添加することができる。第二のリガンドがそのリガンド結合ドメインに結合すると、細胞質ドメインに結合しているプレイが除去されるため、特異的なベイト−プレイ相互作用が起きたところで陽性シグナルを検出することができる。キメラレセプターを使用することのもう一つの利点は、同じような方法で、密接に関連しているが異なるベイトに結合しているプレイのためにサブトラクティブ選択を行なうことができることである。
【００２４】
化合物−化合物結合を検出する本方法の具体的な態様の一つは、該結合がタンパク質−タンパク質相互作用である方法である。別の具体的な態様は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出する方法であって、該相互作用が修飾状態依存的である方法である。さらに別の具体的態様は、結合が３種類以上のパートナーによってもたらされる化合物−化合物結合を検出する方法である。この場合、１種類以上のパートナーはタンパク質性ではないか、完全にはタンパク質性ではない。本発明に係る組換えレセプターが、非限定的な一例として、低分子に結合しうるものであることは、当業者にとって明らかなことである。一方、本発明に係るプレイポリペプチドも低分子に結合することができ、その結果、該低分子によってベイトとプレイが一つに連結する。該低分子は、宿主細胞の中に、細胞そのものによって産生される化合物として、または、培地から取り込まれた化合物として存在することがある。
【００２５】
好ましくは、該化合物−化合物結合を検出する方法は、本発明に係る組換えレセプターを含む真核細胞を構築する工程、その後、本発明に係るプレイポリペプチドベクターのライブラリーによって該細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程を含む。化合物−化合物結合は、レセプターを活性化することによって、シグナル伝達経路を活性化し、レポーター系を誘導することによって検出する。レポーター系は、本発明に係る組換えレセプターをもつ細胞を検出および／または選択できるものであればどのような系でもよい。当業者にとって、いくつかのレポーター系が使用可能であることは明らかである。非限定的な例として、ルシフェラーゼ遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、または細胞表面マーカー遺伝子を、シグナル伝達経路によって誘導されるプロモーターの後ろに配置することができる。または、シグナル伝達経路の活性化、すなわち、シグナル伝達経路化合物のリン酸化および／または二量体化などが起こると該経路の化合物の性質が変化することに基づいたレポーター系を用いることもできる。
【００２６】
定義
以下の定義を、本明細書において、本発明を説明するために使用するさまざまな用語の意味と範囲を説明および定義するために示す。
【００２７】
ここで「レセプター」とは、必ずしも１個のポリペプチドを指すものではなく、２個以上のポリペプチドからなり、リガンド結合ドメインと細胞質ドメインを含むレセプター複合体を指すこともある。組換えレセプターとは、該ポリペプチドの少なくとも一つが組換え体であることを意味する。好ましくは、細胞質ドメインを含むポリペプチドが組換え体のものである。
【００２８】
レセプターの「活性化部位」とは、野生型のレセプターにおいて、リガンドがリガンド結合ドメインに結合した後に修飾され、その結果、レセプターの再構築と、その後の修飾酵素活性の活性化をもたらす部位であり、そこには、シグナル伝達経路の化合物が修飾後結合することができるという部位である。あるいは、同様の機能を発揮することができる部位である。
【００２９】
後者の場合、野生型レセプターと同様に活性化部位が同一のポリペプチド上に存在する必要はなく、レセプター複合体の別のポリペプチド上に存在することも可能である。
【００３０】
ここで「修飾酵素活性」とは、レセプターの細胞質ドメインに結合しているか、組み込まれていて、リガンドがリガンド結合ドメインに結合することによって（例えば、立体構造上の変化によって）続いてレセプターの再構築が起きると正常に誘導される酵素活性を意味する。また、活性化部位を修飾することができる。好ましくは、活性化部位はリン酸化部位であり、修飾酵素はキナーゼ活性である。ベイト修飾酵素活性とは、ベイトを修飾する活性を意味する。これは、修飾酵素活性と同一であってもよいが、必ずしもそうである必要はない。
【００３１】
ここで「レセプターの活性化」とは、シグナル伝達経路の化合物が、その活性化が通常１個以上の遺伝子の誘導または抑制をもたらす修飾された活性化部位に結合することによって、レセプターがシグナル伝達経路を誘導することを意味する。該遺伝子は、好適には、レセプターの活性化を観察することを可能にするレポーター遺伝子である。「活性化されたレセプター」とは、該部位を修飾することによって、活性化部位への化合物の結合が可能になっているレセプターである。活性化部位を修飾しなくても修飾酵素活性が誘導されているレセプターは、活性化されているとは見なされない。
【００３２】
ここで「多量体化レセプター」とは、活性化されたレセプターが数個のポリペプチドを含むことを意味する。必ずしも多量体化がリガンド結合によって起こることを意味しない。すなわち、レセプターは、リガンドが結合すると立体構造が変化する、予め形成された複合体として存在していてもよい。
【００３３】
ここで「ポリペプチド」とは、どのような長さであっても、タンパク質性の構造物を意味し、ペプチド、リン酸化されたタンパク質、およびグリコシル化されたタンパク質などの分子を含む。本明細書において、ポリペプチドは、必ずしも、独立した化合物を意味するものではなく、タンパク質のドメインなど、大き目の化合物の一部を指すために用いることもできる。
【００３４】
「レセプターの細胞質ドメインに含まれる異種ベイトポリペプチド」とは、細胞質ドメインの中に、または細胞質ドメインと融合して、非組換えレセプターの細胞質ドメインには存在しないポリペプチドがあることを意味する。該異種ベイトポリペプチドは、該細胞質ドメインの一部を置換することもできる。本発明書において「ベイト」とは、このポリペプチドが、正常なレセプター複合体には属していない別のポリペプチドと相互作用できることを意味する。
【００３５】
ここで「プレイポリペプチド」とは、異種ベイトポリペプチドと結合することができるポリペプチド、および少なくとも１個の活性化部位を含むポリペプチドを含む融合タンパク質を意味する。
【００３６】
「リガンド」とは、レセプターの細胞外ドメインに結合することができ、該細胞外ドメインに結合することによってシグナル伝達経路を開始させることのできるすべての化合物を意味する。ここで、「開始させる」とは、例えば、多量体化レセプターの多量体化などのように、リガンドがレセプターの細胞外ドメインに結合した後に引き続いて通常、直接的に起こる現象が始まることを意味するが、レセプターの活性化、および／またはシグナル伝達経路の達成を意味するものではない。
【００３７】
「化合物」とは、単一または複合した有機分子または無機分子、ペプチド、ペプチド模倣物、タンパク質、抗体、炭水化物、核酸、またはそれらの誘導体など、何らかの化学物質または生物化合物を意味する。
【００３８】
「結合（する）」とは、直接的にせよ、間接的にせよ、何らかの相互作用を意味する。直接的相互作用とは、結合パートナー間での接触を意味する。間接的な相互作用とは、２個より多い化合物の複合体の中で相互作用するパートナー同士が相互作用することを意味する。この相互作用は、１個以上の架橋化合物による補助を用いるという、完全に間接的であってもよいし、または、直接的な接触はあるものの、１個以上の化合物の相互作用によって安定化されるという一部間接的なものであってもよい。
【００３９】
「不活性化されたレプチンレセプターの細胞質ドメインの機能的断片」とは、Ｊａｋキナーゼの結合が依然として可能なレプチンレセプター細胞質ドメインの断片を意味する。
【００４０】
「活性化部位の不活性化」とは、ポリペプチド中の修飾されうる残基の位置における修飾を阻害する何らかの変化、突然変異または欠失を意味する。特に、チロシンリン酸化部位の不活性化は、ポリペプチド中のリン酸化されうるチロシン残基の位置におけるリン酸化を阻害する何らかの変化、突然変異または欠失を意味する。好適には、この位置における突然変異、より好適には、チロシンをフェニルアラニンに代える変化である。
【００４１】
「クロニーングベクター」とは、一般的には、別のベクターを構築するための中間的な段階と考えられているベクターである。これは、目的とする宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用される１個以上の新しいベクターを得るため、またはクロニーングベクターそのものとして使用するために１個以上の核酸断片を挿入することを目的としたものである。
【００４２】
実施例
実施例のための材料および方法
細胞株、トランスフェクションおよび感染の手順
トランスフェクションは、リン酸カルシウム法（Grahamとvan der Eb, 1973）により行なった。
【００４３】
組換えマウスレプチン、組換えヒト白血病抑制因子（ＬＩＦ）、および組換えヒトエリスロポエチン（Ｅｐｏ）はすべて、Ｒ＆Ｄシステムズ社（R&D Systems）から購入した。一般的な刺激条件は、１００ng／mlレプチンと１ng／ml  ＬＩＦおよび５０ng／ml  Ｅｐｏであった。
【００４４】
ｇｐ１３０−ＣＩＳまたはＬａｃＺをコードする配列をもつエコトロピック・レトロウイルスを作出するために、トランスフェクションを行なう前の日にペトリ皿当たり６×１０6細胞という密度でφＮＸ−Ｅｃｏ細胞を播種した。リン酸カルシウム法にしたがって、５０μgのレトロウイルスベクターｐＢＧ１−ＣＩＳで細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの前に２５μＭのクロロキンを５分間加えた。トランスフェクション後２４時間目と４８時間目に培地を回収し、０．２２μmのＧＶフィルター（ミリポア社（Millipore）による濾過を行ない、−８０℃で保存した。ＨＥＫ  ｃＤＮＡライブラリーのパッケージングは上記した通りに行なったが、但し、１７５cm2ファルコンに入った１．６×１０7個の細胞を８７μgのｐＢＧ１−ＨＥＫ２９３ｃＤＮＡでトランスフェクトした。力価を測定するために、並行実験において、１０％ｐＭＦＧ−ＥＧＦＰ（マサチューセッツ州ケンブリッジのMulligan博士からの贈与）をＤＮＡに組み込んだ。ＥＧＦＰ発現細胞をＦＡＣＳ分析によって測定したところ、ウイルス力価は約５×１０6感染単位／mlであった。
【００４５】
ＣＩＳ「プレイ」に感染させるため、標的細胞を２×１０4細胞／ウェルという密度で２４ウェル培養皿に、また１０6を７５cm2培養フラスコに播種した。翌日、指示通りに培地で希釈したウイルスを含む上清とともに細胞を２４〜４８時間インキュベートした。ポリブレン（シグマ社（Sigma））を最終濃度２．５μg／mlで加えた。感染後、Ｅｐｏ（５０ng／ml）で２４〜４８時間刺激した後、１０日間ピューロマイシン（指示どうりに１〜２μg／ml；シグマ社）選択を行なった。
【００４６】
ベイト、プレイ、およびレポーター／セレクターコンストラクトの構築
ＥｐｏＲ／ＬｅｐＲキメラの作成
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はすべてＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン社（Stratagene）、一般的には、１回の反応につき２．５〜５ＵのＰｆｕを用いた）を用いて行なった。マウスレプチンレセプター（ＬｅｐＲ）の膜内外部位と細胞内部位（８３９〜１１６２位のアミノ酸）を、ＰａｃＩ制限酵素認識部位をもつフォワードプライマーＭＢＵ−Ｏ−４４７、ならびにリンカー配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）、およびＳａｌＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｅＩ、ＮｏｔＩ、およびＸｂａＩ認識部位をもつマルチクロニーング部位（ＭＣＳ）の両方を含むリバースプライマーＭＢＵ−Ｏ−４４８を用いてＰＣＲによって増幅した。この断片には、ＬｅｐＲの細胞外部分のアミノ酸が１個だけ（Ｇｌｙ）含まれていた。プライマー設計によって、ＰａｃＩを作出するＬｅｕ−Ｉｌｅ配列と細胞外部位のＧｌｙとの間にＡｓｎが挿入される結果となった。増幅産物をゲル精製し、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ベクター（インビトロジェン社（Invitrogen））に連結させた。このｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）上のＰａｃＩ−ＳａｃＩコンストラクトをゲル精製後にＰａｃＩ−ＳａｃＩ消化して、所望のＬｅｐＲ断片を得た。
【００４７】
ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥｐｏＲ／ＩＦＮａＲ２−２（Pattynら、1999）ベクターはＥｐｏＲ／ＩＦＮａＲ２−２レセプターキメラを発現するが、以下の通りに構築した：すなわち、ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社（Quiagen）を用いて、５×１０6個のＴＦ−１細胞からＲＮＡを単離した。以下の通りにＲＴ−ＰＣＲを行なった：２μl（２μg）のオリゴＴ（１２〜１８重合体；ファルマシア社（Pharmacia））を加えて７０℃で１０分間インキュベートし、この反応混合液を氷上で１分間冷却し、４μlの１０×ＲＴ緩衝液（ライフサイエンス社（Life Sciences））、１μlの２０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（ファルマシア社）、２μlの０．１Ｍ  ＤＴＴ、および１μlのＭＭＬＶ逆転写酵素（２００  Ｕ；スーパースクリプトＲＴライフテクノロジーズ社（Life Technologies））を最終容量が２０μlになるよう加えてｃＤＮＡを調製した。インキュベーションは次の通りに行なった：室温で１０分間、４２℃で５０分間、９０℃で５分間、そして０℃で１０分間。この後、０．５μlのＲｎａｓｅＨ（２Ｕ；ライフテクノロジーズ社）を加え、その混合液を３７℃で２０分間インキュベートしてから氷上で冷却した。このｃＤＮＡに対するＰＣＲは、Ｐｆｕ酵素（５Ｕ；ストラタジーン社）を用いて行なった。フォワードプライマー（ＭＢＵ−Ｏ−１６７）およびリバースプライマー（ＭＢＵ−Ｏ−３０８）は、ＫｐｎＩ部位とＰａｃＩ部位の間にあるＥｐｏＲの細胞外部分（１〜２４９位のアミノ酸）を増幅するよう設計されていた。正しいサイズのバンドを精製し、ＤＮＡをＫｐｎＩとＰａｃＩで消化して、ＫｐｎＩ−ＰａｃＩで切り開いたｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２ベクターに挿入した。このベクターは、ＩＬ−５Ｒαレセプターの細胞外ドメインが、ＩＦＮａＲ２−２の膜内外ドメインおよび細胞内ドメインに融合しているキメラレセプターを含んでいる。部位特異的突然変異誘発法によって、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ（商標）部位特異的変異誘発キット（ラホヤ（La Jolla）にあるストラタジーン社）を用いて、この融合点にＰａｃＩ部位を加えたところ、ＩＦＮａＲ２−２の膜部位の最近位にある細胞外アミノ酸（Ｌｙｓ）の前に２個のアミノ酸（Ｌｅｕ−Ｉｌｅ）が挿入された。このように、コード配列の前にあるＫｐｎＩ部位、および細胞外／膜内外ドメイン融合部位に作られたＰａｃＩ部位を用いて、上記したように、ＩＬ−５Ｒαの細胞外ドメインをＥｐｏＲの一つと交換することができた。
【００４８】
ＰａｃＩ−ＳａｃＩ消化で作出したＬｅｐＲ断片をＰａｃＩ−ＳａｃＩ消化してゲル精製したｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥｐｏＲ／ＩＦＮａＲ２−２ベクターに連結して、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥｐｏＲ／ＬｅｐＲを得た。
【００４９】
ＩＬ−３Ｒα／ＬｅｐＲキメラ、ＩＬ−５Ｒα／ＬｅｐＲキメラ、ＧＭ−ＣＳＦＲα／ＬｅｐＲキメラ、およびβc／ＬｅｐＲキメラの作成
ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２ベクターとｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βc／ＩＦＮａＲ１ベクターは、それぞれ、ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２キメラとβc／ＩＦＮａＲ１キメラを発現し、ＩＬ−５Ｒα鎖またはβc鎖の細胞外部位、ならびにＩＦＮａＲ２−２またはＩＦＮａＲ１の膜内外部分および細胞内部分からなる。ＰａｃＩ部位を用いて、膜内外部セグメントの直前に融合部位を作出した。これらベクターのＩＦＮａＲ２−２またはＩＦＮａＲ１の部分を、ＰａｃＩ部位と、ＩＦＮａＲ２−２またはＩＦＮａＲ１の終止コドンの直後にあるＸｂａＩ部位を用いて、同じＬｅｐＲセグメントで置換した。このようにして、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥｐｏＲ／ＬｅｐＲベクター（実施例１参照）をＰａｃＩ−ＸｂａＩで消化してＬｅｐＲ断片を作成し、これを、ＰａｃＩ−ＸｂａＩで切り開いてゲル精製したｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＩＬ−５Ｒα／ＩＦＮａＲ２−２ベクターとｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βc／ＩＦＮａＲ１ベクターの中に挿入して、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＩＬ−５Ｒα／ＬｅｐＲベクターとｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βc／ＬｅｐＲベクターを得た。
【００５０】
ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＩＬ−３Ｒα／ＬｅｐＲベクターとｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＧＭ−ＣＳＦＲα／ＬｅｐＲベクターは以下のように構築した：Ｐｆｕポリメラーゼによる標準的なＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、ＩＬ−３Ｒα鎖とＧＭ−ＣＳＦＲα鎖の細胞外部位を増幅した。２μlのＴＦ−１  ｃＤＮＡをインプットとして用いた。フォワードプライマーは、ＭＢＵ−Ｏ−７５２（ＩＬ−３Ｒα）およびＭＢＵ−Ｏ−７５４（ＧＭ−ＣＳＦＲα）であり、ＫｐｎＩ部位を作出した。リバースプライマー、ＭＢＵ−Ｏ−７５３（ＩＬ−３Ｒα）およびＭＢＵ−Ｏ−７５５（ＧＭ−ＣＳＦＲα）は、インフレームでのＬｅｐＲ融合を可能にするＰａｃＩ部位をもつ。ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ベクターにサブクロニーングした後、ＫｐｎＩ−ＰａｃＩで切り出した細胞外断片を、ＫｐｎＩ−ＰａｃＩで切り開いたｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＩＬ−５Ｒα／ＬｅｐＲに連結させた。ＧＭ−ＣＳＦＲαの構築については、この細胞外部位が内部にＫｐｎＩ部位を含んでいたため、ＫｐｎＩで部分消化したものを利用した。こうして得られたベクターｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＩＬ−３Ｒα／ＬｅｐＲおよびｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＧＭ−ＣＳＦＲα／ＬｅｐＲは、ＬｅｐＲの膜内外および細胞質末端部に融合した、ＩＬ−３Ｒα鎖またはＧＭ−ＣＳＦＲα鎖の細胞外部位からなるキメラレセプターを含んでいる。
【００５１】
ＥｐｏＲ／ＬｅｐＲ−Ｆ３キメラの作成
鋳型ｐＭＥＴ７−ＬｅｐＲに対しＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン社）を用いたＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ（商標）部位特異的変異誘発法によって、変異型レプチンレセプター（Eyckermanら、1999）であるＹ９８５−１０７７ＦおよびＹ９８５−１０７７−１１３８Ｆ（ＬｅｐＲ−Ｆ３；以前はＦ−ａｌｌと呼ばれていた）を作成した。変異原となるオリゴヌクレオチドはＭＢＵ−Ｏ−１５７、ＭＢＵ−Ｏ−１５８、ＭＢＵ−Ｏ−１５９、ＭＢＵ−Ｏ−１６０、ＭＢＵ−Ｏ−１６１、およびＭＢＵ−Ｏ−１６２であった。各単一変異と制限酵素切断の変更とを組み合わせて、制限酵素切断とＤＮＡ配列解析によって確認した。連続法を用いて二重および三重の変異体を作出した。作成した変異体のシグナル伝達特性を、ｒＰＡＰ１−ｌｕｃｉレポーターコンストラクト（下記参照）、およびメタロチオネインＩＩ遺伝子転写物の誘導のノーザンブロット解析を用いて、遺伝子誘導レベルで調べた。Ｙ９８５−１０７７Ｆ二重変異体は、野生型ＬｅｐＲに較べて、関連遺伝子を強く刺激することが示されたが、これは、おそらく、ＳＨＰ−１やＳＨＰ−２などのチロシンリン酸化酵素を含むＳＨ２モジュールの補充が行なえなくなったためであろう。Ｙ９８５−１０７７−１１３８Ｆ三重変異体（ＬｅｐＲ−Ｆ３）では、Ｂｏｘ３またはＳＴＡＴ−３への会合モチーフが失われたために、ほぼ完全に誘導が行なえなくなったことが示された。この結果、会合したＪＡＫ２キナーゼのリン酸化および活性化を依然として行なうことができるが、対象となる遺伝子への刺激シグナルを伝達することができないレセプターが得られる。
【００５２】
ＭＢＵ−Ｏ−４４７およびＭＢＵ−Ｏ−４４８を、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用いて、この鋳型ｐＭＥＴ７−ＬｅｐＲ−Ｆ３ベクターをＰＣＲ増幅した結果、ＬｅｐＲ−Ｆ３の膜内外ドメインから細胞内ドメインまでのＬｅｐＲ−Ｆ３増幅産物（細胞外部分のＧｌｙが１個余分にある。上記参照）が得られたので、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ベクターにサブクロニーングした。こうして得られたプラスミドをＰａｃＩ−ＳａｃＩ消化して、ＬｅｐＲ−Ｆ３配列を含むＤＮＡ断片を得て、ＰａｃＩ−ＳａｃＩ消化しゲル精製したｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥｐｏＲ／ＩＦＮａＲ２−２ベクターに連結させた（上記参照）。この結果、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥｐｏＲ／ＬｅｐＲ−Ｆ３が得られ、ｐＳＥＬ１と改名した。
【００５３】
プレイベクターの作成
強力な定常型ハイブリッドＳＲαプロモーターを含むｐＭＥＴ７ベクター（Takebeら、1988）の中にプレイコンストラクトを作成した。
【００５４】
部位特異的変異誘発法（Quikchange（商標）、ストラタジーン社）によって、ｐＭＥＴ７ｍｃｓベクター中のｐＭＥＴ７プロモーターの後ろで、かつ唯一のＥｃｏＲＩ部位の前にユニークなＡｐａＩ部位を導入した（プライマー、ＭＢＵ−Ｏ−５６７およびＭＢＵ−Ｏ−５６８）。
【００５５】
ｐＭＥＴ７ｍｃｓは、ユニークなＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢｓｔＥＩＩ、ＡｇｅＩ、およびＸｈｏＩ制限酵素部位を付加的に挿入して拡大したＭＣＳを含む、ｐＭＥＴ７の改変ベクターである。フォワードプライマーＭＢＵ−Ｏ−５８６およびリバースプライマーＭＢＵ−Ｏ−４４３を用いた、鋳型ｐＳＶＬ−ｇｐ１３０のＰＣＲ増幅によって、ヒトｇｐ１３０鎖の１５８アミノ酸長の細胞内部断片をコードするＤＮＡ断片を作成したが、これは、４つのＳＴＡＴ−３会合モチーフ（７６１〜９１８位のアミノ酸、終止コドンは共増幅しなかった）を含む。フォワードプライマーは、ＡｐａＩ制限酵素部位の５′〜３′まで、Ｋｏｚａｋ保存配列、フラグ−タグのコード配列（Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ）、およびＢｇｌＩＩ制限酵素部位を含む。リバースプライマーは、付加的なヒンジ配列（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）コードし、ＥｃｏＲＩ認識部位をもつ。ＰＣＲ産物（ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）にサブクロニーングした後）およびｐＭＥＴ７−ｍｃｓＡをＡｐａＩおよびＥｃｏＲＩで消化すると、ｇｐ１３０断片をｐＭＥＴ７ベクターに連結できるようになり、ｐＭＥＴ７−フラグ−ｇｐ１３０コンストラクトができた。
【００５６】
ＨｙｂｒｉＺＡＰ−２．１ツーハイブリッドｃＤＮＡ合成キット由来のベクター（ストラタジーン社、ｐＳＶ４０）を鋳型に用いてＳＶ４０ラージＴ（ＳＶＴ）を増幅した。プライマーＭＢＵ−Ｏ−４４５およびＭＢＵ−Ｏ−４４６を用いて、２６１位と７０８位の間の４４８アミノ酸をコードするＤＮＡ断片を作成した。Ｎ−末側の欠失によって、ＳＶＴにある核標的シグナルが消失する。フォワードプライマーは、ｇｐ１３０−ヒンジ配列にインフレームで連結することを可能にするＥｃｏＲＩ認識部位をもつ。リバースプライマーは、さらにＮｒｕＩ、ＸｈｏＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮｏｔＩ、およびＸｂａＩの各制限部位をもち、ＳＶＴコード配列の後ろに終止コドンもコードしている。ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）へのサブクロニーングした後、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩをもつ切断増幅産物を回収すると、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩで切り開いたｐＭＥＴ７−フラグ−ｇｐ１３０ベクターへの連結が可能となってｐＭＥＴ７−フラグ−ｇｐ１３０−ＳＶＴが得られた。そして、これをｐＭＧ１−ＳＶＴと改名した。ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩまたはＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩで消化すると、モデルプレイ、またはｃＤＮＡライブラリーをこのベクターの中に挿入することが可能になる。これらの場合、ＳＶＴ断片は、「スタッファー（詰め物）」として機能する。
【００５７】
ｐ５３−ＳＶＴ相互作用トラップベクターの構築
ＨｙｂｒｉＺＡＰ−２．１ツーハイブリッドｃＤＮＡ合成キット（ストラタジー社）由来のｐ５３対照プラスミドを鋳型に用いて、ＭＢＵ−Ｏ−４５０およびＭＢＵ−Ｏ−４５１によってマウスｐ５３を包含するＤＮＡ断片を増幅した。フォワードプライマーは、ＥｐｏＲ／ＬｅｐＲ−Ｆ３ヒンジコンストラクトへのインフレームでの連結を可能にするＳａｌＩ制限酵素部位をもつ。リバースプライマーは、終止コドンおよびＸｂａＩ制限酵素部位をもつ。２４３アミノ酸長のｐ５３断片（７３〜３１５位のアミノ酸）は、ＳＶＴとの相互作用部位をもつが、核標的シグナルとオリゴマー化ドメインを持たない。ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）でサブクロニーングし、ＳａｌＩ−ＸｂａＩで消化し、ゲル精製して、ＳａｌＩ−ＸｂａＩで切断し、ゲル精製したｐＳＥＬ１ベクターに連結した断片を回収し、ｐＳＥＬ１−ｐ５３が得られた。
【００５８】
ｐＭＧ１−ＳＶＴベクターは上記の通り作成した。
【００５９】
ＭＢＵ−Ｏ−６９５およびＭＢＵ−Ｏ−６９６を、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用い、ｐＭＧ１−ＳＶＴを鋳型に用いた増幅によって、ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩ認識部位の間（２６１〜７０８位のアミノ酸＋終止コドン）のＳＶＴ断片が得られた。ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ消化し、精製したＰＣＲ断片をＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩで切断し、ゲル精製したｐＭＧ１−ＳＶＴベクターに連結して、ｐＭＥＴ７−ＳＶＴが得られた。
【００６０】
ＥｐｏＲ−ＣＩＳ相互作用トラップベクターの構築
ＲＮｅａｓｙキット（キアゲン社）を用いて５×１０6個のＴＦ−１細胞からＲＮＡを調製し、５０μlの水で溶出を行い、このうち１０μlをＲＴ−ＰＣＲのインプットとして使用した。Ｉ．１．１の項に記載されているように標準的な反応条件を用いてＲＴ−ＰＣＲを行なった。４μlのＴＦ１  ｃＤＮＡから、ＭＢＵ−Ｏ−６７５およびＭＢＵ−Ｏ−６７６をそれぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用い、２回連続したＰＣＲ反応と、その間にゲル精製を行なってヒトＥｐｏＲの細胞内部断片（３７０〜４５３位のアミノ酸）を増幅した。ＳａｃＩ認識部位とＸｂａＩ認識部位が、それぞれフォワードプライマーとリバースプライマーの中に存在している。リバースプライマーは終止コドンもコードしている。正しいサイズをもつＰＣＲ増幅バンドをゲル精製してから、断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）にサブクロニーングし、ＳｓｔＩ（ＳａｃＩと同じ認識部位をもつ）とＸｂａＩで消化して、ＳｓｔＩ−ＸｂａＩで消化してゲル精製したｐＳＥＬ１ベクターに連結した。その結果、ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲコンストラクトができた。
【００６１】
部位特異的変異誘発法（Quikchange（商標）、ストラタジーン社）によって、ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲコンストラクトに、ヒトＥｐｏＲの４２６位にあるＴｙｒをＰｈｅに変える変異を導入し、不活性なＥｐｏＲ断片を得た。ＰＣＲを利用した変異誘発のためにフォワードプライマーＭＢＵ−Ｏ−７１７およびリバースプライマーＭＢＵ−Ｏ−７１８を用いたが、ＥｃｏＲＩ酵素認識部位も挿入される結果となった。制限酵素解析およびＤＮＡ配列解析によって、変異が導入されたことを確認した。このコンストラクトをｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲＹ−Ｆと名付けた。
【００６２】
ＭＢＵ−Ｏ−６７７およびＭＢＵ−Ｏ−６７８を、それぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用いて、マウスサイトカイン誘導型ＳＨ２含有タンパク質ＣＩＳのコード領域全域（２〜２５７位のアミノ酸）を増幅した。フォワードプライマーは、ＥｃｏＲＩ認識部位をもち、リバーズプライマーは、ＸｂａＩ認識部位と終止コドンをもつ。増幅・ゲル精製された断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ベクターにサブクロニーングした。挿入配列をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化し、ゲル精製により回収し、それを、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩで消化し、ゲル精製したｐＭＧ１−ＳＶＴベクターにクロニーングして、ｐＭＧ１−ＣＩＳベクターができた。
【００６３】
ＩＲＳ１−Ｖａｖ相互作用トラップベクターの構築
変異誘発法（Quikchange（商標）、ストラタジーン社）によって、変異型レプチンレセプターＹ９８５−１０７７Ｆ（ｐＭＥＴ７  ＬｅｐＲ  Ｙ９８５−１０７７Ｆ）内の４個のアミノ酸（Ｐ1137−Ｙ−Ｍ−Ｐ1140）を、ヒトＩＲＳ１（インシュリンレセプター基質１；Ｓ892−Ｐ−Ｇ−Ｅ−Ｙ−Ｖ−Ｎ−Ｉ−Ｅ−Ｆ901）のホスホチロシンコード領域と交換した。これによって、レプチンレセプター内の機能的ＳＴＡＴ３会合モチーフが除去される。ＰＣＲを利用した変異誘発には、プライマーＭＢＵ−Ｏ−５１５およびＭＢＵ−Ｏ−５１６を使用した。このコンストラクトをｐＭＥＴ７  ＬｅｐＲ−ＩＲＳ１と名付けた。
【００６４】
Ｐｆｕポリメラーゼによる標準的なＲＴ−ＰＣＲ法を用い、２μlのＨｅｐＧ２  ｃＤＮＡをインプットとして、また、ＭＢＵ−Ｏ−４６７およびＭＢＵ−Ｏ−４６８をそれぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用いて、全長のヒトＧＲＢ２（成長レセプター結合２；１〜２１７位アミノ酸）を増幅した。フォワードプライマーは、ｐＭＧ１ベクター中のｇｐ１３０鎖へのインフレームでの融合を可能にする付加的ＥｃｏＲＩ部位をもち、リバースプライマーは、終止コドンの後ろに付加的ＸｂａＩ部位をもつ。ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ベクターにサブクロニーングした後、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩで切り出した断片を、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩで切断したｐＭＧ１ベクターに連結させ、ｐＭＧ１−ＧＲＢ２を得た。同様に、ＭＢＵ−Ｏ−４６９およびＭＢＵ−Ｏ−４７０を、それぞれフォワードおよびリバースとして用いて、ＧＲＢ２のＳＨ２ドメイン（６０〜１５８位のアミノ酸）を増幅した。フォワードプライマーは、ｇｐ１３０鎖へのインフレームでの融合を可能にする付加的ＥｃｏＲＩ認識部位をもち、リバースプライマーは、付加的な終止コドンとＸｂａＩ酵素認識部位をもつ。ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ベクターにＰＣＲ断片をサブクロニーングした後、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩを作出した断片を、ＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩで切断したｐＭＧ１ベクターに連結させ、ｐＭＧ１−ＧＲＢ２Ｓベクターを得た。
【００６５】
ｐＭＧ１−ＧＲＢ２コンストラクトを鋳型とし、また、ＭＢＵ−Ｏ−７７０およびＭＢＵ−Ｏ−４６８をそれぞれフォワードプライマーおよびリバースプライマーとして用いて、Ｃ末側ＳＨ３ドメイン（１５９〜２１７位のアミノ酸）を含むヒトＧＲＢ２の断片を増幅した。ＭＢＵ−Ｏ−７７０は、ＢｇｌＩＩ部位によるフラグ−タグへのインフレームでの融合を可能にするものであり、ＭＢＵ−Ｏ−４６８については上に記載されている。このＰＣＲ断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ベクターにサブクロニーングした後、ＧＲＢ２断片を、ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩを利用した交換によってｐＭＧ１ベクターの中に挿入し、その結果、ｐＭＥＴ７−ＧＲＢ２ＳＨ３ベクターが得られた。
【００６６】
ヒトＴＦ１細胞株のｍＲＮＡから、Ｐｆｕポリメラーゼを用いて標準的なＲＴ−ＰＣＲ法によって、ヒトＶａｖの断片（ＶａｖＳ：２５９〜７８９位のアミノ酸）を増幅した。プライマーは、フォワードおよびリバースとして、それぞれＭＢＵ−Ｏ−７３７およびＭＢＵ−Ｏ−７３８であった。ＭＢＵ−Ｏ−７３７は、ｇｐ１３０へのインフレームでの融合を可能にする付加的ＥｃｏＲＩをもち、ＭＢＵ−Ｏ−７３８は、終止コドンとＸｈｏＩ酵素認識部位をもつ。増幅断片をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ベクターにサブクロニーングし、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩを利用した交換によってｐＭＧ１ベクターに連結した。また、フォワードプライマーＭＢＵ−Ｏ−７７１、リバースプライマーＭＢＵ−Ｏ−７４１、および鋳型としてｐＭＧ１−ＶａｖＳを用いてＶａｖＳ断片も増幅した。このフォワードプライマーは、フラグタグへのインフレームでの融合を可能にするＢａｍＨＩ部位をもち、リバースプライマーは、終止コドンとＸｂａＩ制限酵素部位をもつ。増幅産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ベクターにサブクロニーングし、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで切り出した。精製した断片を、ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩで切断したｐＭＧ１ベクターにクロニーングして、ｐＭＥＴ７−ＶａｖＳコンストラクトを得た。
【００６７】
ｐＧＬ３−ｒＰＡＰ１−ｌｕｃｉおよびｐＳＥＡＰ−ｒＰＡＰレポーターコンストラクトの構築
ＤＮＡｚｏｌ処理法（ギブコＢＲＬ社（GIBCO BRL））を用いて、ラット褐色細胞腫ＰＣ１２細胞株からゲノムＤＮＡを単離した。「オリゴプライマー３」プログラム（http://www-genome.wi.mit.cdu/cgi-bin/primer3.cgi）を用いて、ラットＰＡＰ１プロモーターをＰＣＲ増幅するために最適なプライマーを選択した。フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれＭＢＵ−Ｏ−２２２およびＭＢＵ−Ｏ−２２３であった。増幅は、Ｔａｑポリメラーゼを用いて、９４℃で２分間、５７℃で２分間、７２℃で２分間を３０サイクル行なった後、７２℃で１０分間充填（filling-in）反応を行なった。最適なＭｇＣｌ2濃度は６ｍＭであることが測定された。プロモーター断片をクレノウポリメラーゼで平滑化した後、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ベクターにクロニーングした。連続して、ＰｓｔＩ消化、末端を平滑化するためのクレノウ処理、およびＢａｍＨＩ消化を行なうことによって、プラスミドコンストラクトから、このプロモーター断片を切り出して、平滑−突出末端断片を得た。ゲル精製した断片を、ＳｍａＩ−ＢｇｌＩＩで切り開いた、ゲル精製ｐＧＬ３対照用ベクター（プロメガ社）にクロニーングした。ＳｓｔＩ−ＳｐｅＩ制限酵素によって消化し、ゲル精製したところ、ＳｓｔＩ−ＮｈｅＩの位置にクロニーングされた断片と、精製されたｐＧＬ３基本ベクターが得られ、ｐＧＬ３−ｒＰＡＰ１−ｌｕｃｉコンストラクトとなった。ＤＮＡ配列決定によって、１０ヌクレオチドが公開されている配列と異なっていることが明らかになったが、このプロモーター部位のレプチン依存型誘導に影響を与えることはなかった。
【００６８】
ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩによる部分消化を用いてｐＧＬ３  ｒＰＡＰ１−ｌｕｃｉから全長ｒＰＡＰ１プロモーター断片を切り出して、ＫｐｎＩ−ＸｈｏＩで切り開いたｐＸＰ２ｄ２ベクター（S. Nordeen教授からの贈与）に連結して、ｐＸＰ２ｄ２−ｒＰＡＰ１−ｌｕｃｉを得た。プライマーＭＢＵ−Ｏ−７１９およびＭＢＵ−Ｏ−７２０を用い、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ２（クロンテック社（Clontech））を鋳型としてピューロマイシンのコード配列を増幅した。ＸｈｏＩ−ＸｂａＩを併用して消化することで、ｐＸＰ２ｄ２−ｒＰＡＰ１−ｌｕｃｉコンストラクトへの挿入が可能になり、ｐＸＰ２ｄ２−ｒＰＡＰ１−ｐｕｒｏＲが得られた。
【００６９】
ＭｌｕＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いてｐＧＬ３−ｒＰＡＰ１−ｌｕｃｉコンストラクトを消化し、ｒＰＡＰ１プロモーターの全域にわたる断片が得られた。この断片をゲル精製し、ＭｌｕＩ−ＸｈｏＩで切断してからゲル精製したｐＳＥＡＰベクター（ＴＲＯＰＩＸ、パーキンエルマー社（Perkin Elmer））に連結して、ｐＳＥＡＰ−ｒＰＡＰ１コンストラクトを得た。ＴＲＯＰＩＸ（パーキンエルマー社）のPhospha-Light（商標）レポーター測定キットを用いて、ＰＣ１２細胞をｐＭＥＴ７  ＬｅｐＲおよびｐＳＥＡＰ−ｒＰＡＰ１で一過的に同時トランスフェクトることによって、このコンストラクトの機能性を測定した。
【００７０】
ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ−ＥｐｏＲおよびｐＢＧ１−ＳＶＴ、ｐＢＧ１−ＣＩＳ、およびｐＢＧ１−ｃｃｄＢベクターの構築
ＭＢＵ−Ｏ−１６７およびＭＢＵ−Ｏ−７６９を用い、鋳型ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲ上で完全長キメラコンストラクトを再増幅して、ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクターの中にＥｐｏＲ−ＬＲ−Ｆ３−ＥｐｏＲが挿入されたものを得、引き続き、ＫｐｎＩおよびＮｏｔＩ部位を用いてサブクロニーングを行なった。このコンストラクトをｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ−ＥｐｏＲと名付けた。
【００７１】
フォワードプライマーＭＢＵ−Ｏ−７６６とＭＢＵ−Ｏ−４４６を用いて、ｐＭＧ１−ＳＶＴからＳＶＴ断片を再増幅した。ＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ消化によって、ｐＢＭＮ−Ｚレトロウイルスベクター（G. Nolanからの贈与）への挿入が可能になり、ベクターｐＧＢ１−ＳＶＴが得られた。ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩを利用してＳＶＴ断片をＣＩＳ（ｐＭＧ１−ＣＩＳ）と交換した結果、ｐＧＢ１−ＣＩＳベクターが得られた。
【００７２】
ｐＢＧ１ベクターにｃＤＮＡライブラリーを挿入する場合に、ベクターの自己連結を対抗選択できるようにするため、プライマーＭＢＵ−Ｏ−８３５およびＭＢＵ−Ｏ−８３６、ならびに鋳型ｐＥＮＴＲＹ１１（ライフテクノロジー社）を用いて、対照大腸菌の細胞死遺伝子（ｃｃｄＢ）を増幅し、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ制限部位を利用した挿入によってｐＢＧ１−ＣＩＳベクターにクロニーングし、ｐＢＧ１−ｃｃｄＢベクターを得た。
【００７３】
ベイト−修飾酵素キメラ、基質−ベイトキメラおよび基質−プレイキメラの構築
ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＧＭ−ＣＳＦＲα／ＬｅｐＲ−Ｆ３キメラおよびｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βc／ＬｅｐＲ−Ｆ３キメラの作成
ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＧＭ−ＣＳＦＲα／ＬｅｐＲおよびｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βc／ＬｅｐＲ中のＬｅｐＲ断片を、ＰａｃＩおよびＮｏｔＩ部位を用いて、ｐＳＥＬ１のＬｅｐＲ−Ｆ３断片（ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＥｐｏＲ／ＬｅｐＲ−Ｆ３）で置き換えた。したがって、ｐＳＥＬ１コンストラクトをＰａｃＩ−ＮｏｔＩで消化してＬｅｐＲ−Ｆ３断片を作成し、ゲル精製して、ＰａｃＩ−ＮｏｔＩで切り開きゲル精製したｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＧＭ−ＣＳＦＲαベクターまたはｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βcベクターに挿入して、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＧＭ−ＣＳＦＲα／ＬｅｐＲ−Ｆ３ベクターまたはｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βc／ＬｅｐＲ−Ｆ３ベクターを得た。
【００７４】
ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＧＭ−ＣＳＦＲα／ＬｅｐＲ−Ｆ３−修飾酵素キメラおよびｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βc／ＬｅｐＲ−Ｆ３−修飾酵素キメラの作成と、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＧＭ−ＣＳＦＲα／ＬｅｐＲ−Ｆ３−ベイトキメラおよびｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βc／ＬｅｐＲ−Ｆ３−ベイトキメラの作成
ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＧＭ−ＣＳＦＲα／ＬｅｐＲ−Ｆ３ベクターおよびｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βc／ＬｅｐＲ−Ｆ３ベクターをＳａｌＩで消化して、ゲル精製し、末端をクレノウ断片で平滑化した（ベーリンガーマンハイム社（Boehringer Mannheim）。これらの平滑末端化ベクターをアルカリホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社）とインキュベートして、平滑化末端を脱リン酸化した。修飾酵素に関しては、マウスＡＬＫ４の細胞質側末端部にＴ２０６Ｄ変異をもち、定常的に活性化されたキナーゼを含む、ｐＧＢＴ９ベクター中のコンストラクトをＤ．Ｈｕｙｌｅｂｒｏｅｃｋ教授から取得した。ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化によって、このコンストラクトからＡＬＫ４の変異細胞質側尾部を取り除き、ゲル精製し、さらにクレノウ断片とインキュベートして末端を平滑化した。この挿入配列を、切り開いたｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＧＭ−ＣＳＦＲα／ＬｅｐＲ−Ｆ３ベクターおよびｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βc／ＬｅｐＲ−Ｆ３ベクターに連結して、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＧＭ−ＣＳＦＲα／ＬｅｐＲ−Ｆ３−ＡＬＫ４ＣＡベクターおよびｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βc／ＬｅｐＲ−Ｆ３−ＡＬＫ４ＣＡベクターを得た。
【００７５】
ベイトに関しては、ｐｃｄｅｆベクター中に完全長Ｓｍａｄ３タンパク質をコードするヒトｃＤＮＡを含むコンストラクトをＤ．Ｈｕｙｌｅｂｒｏｅｃｋ教授からいただいた。Ｓｍａｄ３挿入配列をＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ消化によって取り除き、ゲル精製し、さらにクレノウ断片（ベーリンガーマンハイム社）とで末端を平滑化した。このＳｍａｄ３挿入配列を、切り開いたｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＧＭ−ＣＳＦＲα／ＬｅｐＲ−Ｆ３ベクターおよびｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βc／ＬｅｐＲ−Ｆ３ベクター（上記）に連結して、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−ＧＭ−ＣＳＦＲα／ＬｅｐＲ−Ｆ３−Ｓｍａｄ３およびｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βc／ＬｅｐＲ−Ｆ３−Ｓｍａｄ３を得た。
【００７６】
ｐＭＧ２−プレイキメラの作成
ｐＭＧ２ベクターを構築するために、ｐＭＧ１−ＳＶＴベクターをＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化してから、クレノウ断片（ベーリンガーマンハイム社）とインキュベートして末端を平滑化した。この平滑化末端ベクターをアルカリホスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社）とインキュベートして、平滑化末端を脱リン酸化した。そして、ゲートウェイベクター変換システム（Gateway Vector Conversion System）のｒｆＢカセット（ライフテクノロジーズ社）を切り開いたベクターに連結させて、ＰＭＧ１−ｇａｔｅｗａｙベクターとした。プライマーＭＢＵ−Ｏ−１０９４およびＭＢＵ−Ｏ−１０７６を用いて、鋳型ｐＭＧ１−ＳＶＴ上でＰＣＲ反応を行ない、ｇａｔｅｗａｙ組換え部位を含む断片を得た。この断片もｇｐ１３０鎖の一部（９０５〜９１８位のアミノ酸）を含んでいる。そして、２段階式ゲートウェイ反応（ライフテクノロジーズ社）を用いて、この断片をＰＭＧ１−ｇａｔｅｗａｙベクターにクロニーングして、全部で６個のＳＴＡＴ動員部位をもつプレイコンストラクトであるｐＭＧ２−ＳＶＴを得た。このｐＭＧ２−ＳＶＴコンストラクトをＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩで消化し、ベクターをゲル精製した。プレイに関しては、最初の３アミノ酸を欠失しただけでほぼ完全長のヒトＳｍａｄ４タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むコンストラクトをD. Huylebroeck教授からいただいた。ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩで消化して、このＳｍａｄ４挿入配列を取り出し、ゲル精製してから切り開いたｐＭＧ２ベクターに連結させた。
【００７７】
レポーター細胞株の構築
Ｈｅｋ２９３Ｔ  ＰＡＰ２１レポーター細胞株の選択
ブラスチシジンシステム（インビトロジェン社）を用いて、内在ｐＳＥＡＰ−ｒＰＡＰ１レポーターコンストラクトをもつ安定した細胞株を作出した。毒物であるブラスチシジン（インビトロジェン社）に対するＨｅｋ２９３Ｔ細胞の感受性を評価したところ３μg／mlであった。１０6個の細胞をペトリ皿に播種し、播種の翌日、製造業者の指示に従い、リン酸カルシウムトランスフェクション系（ライフテクノロジーズ社）を用いてトランスフェクトした。全部で２０μgのＤＮＡをトランスフェクトした（ｐＳＥＡＰ−ｒＰＡＰ１、１８μgと、ブラスチシジン耐性遺伝子を含むｐｃＤＮＡ６／Ｖ５−ＨｉｓＡ、２μg）。４８時間後、トランスフェクトされた細胞を９６ウェル培養皿に、各ウェル当たり１０細胞を播種した。２４時間後、ブラスチシジンを濃度３μg／mlで加えて、細胞を選択条件下で３〜４週間維持した。得られた単細胞クローンを、２０ng／mlのハイパー−ＩＬ６（ＩＬ−６とその特異的レセプターＩＬ６−Ｒαとの融合タンパク質；Fisherら、1997）によって２４時間刺激してスクリーニングした。最も反応性の高い細胞株としてＨｅｋ２９３Ｔ  ＰＡＰ２１を選択した。
【００７８】
Ｈｅｋ２９３−１６細胞株の作成
Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３細胞（インビトロジェン社）を、マウスのエコトロピックレトロウイルスレセプター（ｍＥｃｏＲ）用およびネオマイシン耐性用の発現カセットを含むプラスミドによって安定的にトランスフェクトした。ネオマイシン耐性細胞（４００μg／mlジェネテシンに対する抵抗性；ライフテクノロジーズ社）のプールを、それぞれ５：１の割合で以下の２種類のプラスミドによって重複トランスフェクトした。ｉ）ｒＰＡＰ１のプロモーター配列（ｐＸＰ２ｄ２−ｒＰＡＰ１−ｐｕｒｏR）制御下でピューロマイシン耐性マーカー（ピューロマイシン−Ｎ−アセチル−トランスフェラーゼ）をコードするｃＤＮＡを含むプラスミド、ｉｉ）ＥＭ７プロモーター（ｐｃＤＮＡ６／Ｖ５−Ｈｉｓ、インビトロジェン社）制御下でブラスチシジン耐性マーカー（ブラスチシジンＳデアミナーゼ）に対するｃＤＮＡを含むプラスミド。ブラスチシジンＳ（５μg／ml、インビトロジェン社）で選択した後、シングルコロニーを採って、２４ウェル培養皿に播種した。ＬＩＦ（１ng／ml）の存在下または不在下でピューロマイシン耐性（１μg／ml、シグマ社；播種４８時間後に加えた）を観察した。さらに５日後、生き残った細胞を、標準的な方法を用いてクリスタルバイオレットで染色した。
【００７９】
ＲＴ−ＰＣＲ解析
別段の記載がない限り、細胞を１００μlのＲＬＴ緩衝液（RNeasy（登録商標）法、キアゲン社）中で溶解し、キアシュレッダー（Qiashredder）カラム（キアゲン社）を用いて染色体ＤＮＡを剪断した。ビーズは、製造業者の指示に従って、前もって処理しておいた（ダイナビーズＭ−２８０ストレプトアビジン、ダイナル（Dynal）社）。簡単に説明すると、ダイナビーズを高塩濃度緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌ，  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＬ，  ｐＨ  ７．５，および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で２回洗浄してから、ｇｐ１３０鎖に向けられた２００ｐｍｏｌのビオチン化オリゴヌクレオチド（５′ＧＧＧＣＴＧＧＧＴＡＧＡＣＴＣＧＧＡＴＣＴＴＧＡＧＡＡＧＡＣ）とインキュベートした。次に、上記高塩濃度緩衝液中でビーズを３回洗浄してから、濃度が１０μg／μlになるよう低塩濃度緩衝液（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣＬ，ｐＨ  ７．５，  および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。この懸濁液５μlを、高塩濃度緩衝液で１／５に希釈した１００μlの全細胞溶解液に加えた。室温で１５分間ゆっくりと回転させた後、ビーズを低塩濃度緩衝液で３回洗浄してから、６５℃で２分間、３０μlの水に溶出した。この試料１５μlを、キアゲンワンステップＲＴ−ＰＣＲキット（Qiagen OneStep RT-PCR Kit）による標準的なＲＴ−ＰＣＲ反応のためのインプットとして用いた。「プレイ」断片を増幅するためにプライマー５′ＧＧＣＡＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＧＡＣＴＧおよび５′ＴＣＧＴＣＧＡＣＣＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧＣを用いた。ＣＩＳを「プレイ」用鋳型として用いたパイロット実験において、１０3個未満の細胞の溶解液を用いて効率的な増幅を行なうことができた。
【００８０】
レポーターアッセイ法、結合アッセイ法、細胞生存アッセイ法、およびＦＡＣＳ解析
細胞を溶解し、ルシフェラーゼの基質（ルシフェリン、Duchefa社）を加えた後、ルシフェラーゼを測定した。トップカウント（TopCount）化学発光計測装置（キャンベラ・パッカード社（Canberra Packard））を用いて発光を測定した。すべてのトランスフェクションについて３回反復し、ガラクトスター（GalactoStar）キット（ＴＲＯＰＩＸ社）を用いて測定された定常的にβ−ガラクトシダーゼを発現する発現コンストラクト（ｐＵＴ６５１）を用いて、すべてのルシフェラーゼ計測値を標準化した。
【００８１】
ピューロマイシン耐性細胞コロニーを、常法を用いてクリスタルバイオレットで染色した。
【００８２】
ヤギ抗ヒトＥｐｏＲポリクローナルＩｇＧ（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を２μg／mlで、また、Ａｌｅｘａ４８８−結合ロバ抗ヤギＩｇＧ（モレキュラープローブ社（Molecular Probe））を４μg／mlを用いて、ヒトエリスロポエチンレセプターの発現を観察した。ＦＬＡＧでタグした「プレイ」コンストラクトの発現を明らかにするために、製造業者のプロトコール（イミュノクオリティープロダクツ社（Immuno Quality Products））に従って細胞を固定してStarfiqs（商標）で透過性化し、８μg／mlの抗ＦＬＡＧマウスｍＡｂ（シグマ社）、および、フルオレセイン結合ヒツジ抗マウスＩｇＧ（アマーシャム社（Amersham））で染色し、１／５０に希釈した。ＦＡＣＳ解析はすべて、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディキンソン社（Becton Dickinson）上で行なった。
【００８３】
レトロウイルスｃＤＮＡライブラリーの作成とスクリーニング条件
常法を用いて、ＨＥＫ２９３ライブラリーの構築を行なった。簡単に説明すると、５μgのＨＥＫ２９３のポリＡ＋ｍＲＮＡを、スーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（ライフテクノロジーズ社）を用いたオリゴ−ｄＴプライマーおよびランダムプライマーによる第１鎖合成のためのインプットとして用いた。オリゴ−ｄＴプライマーおよびランダムプライマーはともにＮｏｔＩ部位をもつ。第２鎖合成後、ＥｃｏＲＩ部位をもつアダプターを連結させた。ｃＤＮＡをアガロースゲル電気泳動を用いて解析し、０．５から２．５Ｋｂｐの断片を、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩで切り開いたｐＢＧ１−ｃｃｄＢベクターに無指向にクロニーングした。
【００８４】
スクリーニングするためには、全部で６．１０7個の「ベイト」発現細胞を、１７５cm2の組織培養用フラスコ当たり２．１０6個の密度で播種し、播種後２４時間目に細胞をレトロウイルスＨＥＫ２９３「プレイ」ｃＤＮＡライブラリー（２．１０6の複雑性）にさらに２４時間感染させた。感染後、５０ng／mlのＥｐｏで細胞を６．５時間刺激し、ピューロマイシンを最終濃度２μg／mlで２０日間添加した。単一細胞のコロニーを採取して、機能測定法とＲＴ−ＰＣＲシーケンシングを用いて解析を行なった。
【００８５】
免疫沈殿法とウエスタンブロット解析
ＥｐｏＲ「ベイト」リン酸化を証明するために、ＥｐｏＲ「ベイト」またはＥｐｏＲ「ベイト」Ｙ４０２Ｆ変異体をコードするプラスミドおよびＣＩＳ／ＳＯＣＳ−２「プレイ」をコードするプラスミドで約３．１０6個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過的にトランスフェクトした。刺激された細胞および無刺激の細胞の清澄化した細胞溶解液（修正ＲＩＰＡ緩衝液中：５０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ  ８．０；２００ｍＭ  ＮａＣｌ；１％  ＮＰ４０；０．５％  ＤＯＣ；０．０５％  ＳＤＳ；２ｍＭ  ＥＤＴＡ；１ｍＭ  Ｎａ3ＶＯ4；１ｍＭ  ＮａＦ；２０ｍＭ  β−グリセロリン酸；コンプリート（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標））プロテアーゼインヒビター混合液（ロシュ社（Roche））を、２μgのヤギ抗ヒトＥｐｏＲポリクローナルＩｇＧおよびプロテインＧセファロース（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック（Amersham Pharmacia Biotech））とともにインキュベートした。沈殿、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびブロッティングの後、ＰＹ２０抗体（トランスダクションラボラトリーズ社（Transduction Laboratories））を用いてリン酸化を示した。
【００８６】
ＨＥＫ２９３細胞内でＥｐｏＲ／ＥｐｏＲＦ「ベイト」とＳＯＣＳ−２「プレイ」のトランスフェクションを行なった後、「プレイ」の免疫沈降を行なった。清澄化した細胞溶解液（修正ＲＩＰＡ）を抗ＦＬＡＧ  Ｍ２親和性ゲルとインキュベートして、ＳＯＣＳ−２「プレイ」を沈殿させた。ＰＹ２０抗体を用いて、「プレイ」のリン酸化を示した。ブロットからプローブ除去し、抗ＦＬＡＧ抗体で再プローブして、「プレイ」の発現レベルを明らかにした。
【００８７】
Ｐｈｏｓｐｈｏ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）抗体（セルシグナリング社（Cell Signaling））を製造業者の指示に従って用いて、ＳＴＡＴ３リン酸化を証明した。抗ＳＴＡＴ３抗体（トランスダクションラボラトリーズ社）を用いて、同一のブロット上でＳＴＡＴ３の発現を確めた。
【００８８】
実施例１：Ｈｅｋ２９３Ｔ  ＰＡＰ２１細胞株におけるＥｐｏＲ−ＬｅｐＲキメラの機能性
ＥｐｏＲ／ＢＬｅｐＲキメラの機能性を測定するために、３組のプラスミドでＨｅｋ２９３Ｔ  ＰＡＰ２１細胞をトランスフェクトした：
【００８９】
【表１】
0004756813.tif 000002
【００９０】
トランスフェクションは、リン酸カルシウム法（Grahamとvan der Eb, 1973）により行なった。３．４μgを全ＤＮＡインプット（ｐＵＴ６５１を０．４μg、その他を各１μgずつ）として用いると沈殿が形成されて、全量で３００μlの混合液になった。この混合液２００μlを、トランスフェクションの前日６ウェル培養皿（ファルコン社）に播種した４×１０5個のＨｅｋ２９３Ｔ  ＰＡＰ２１細胞に加えた。混合液を加えた６時間後にダルベッコのＰＢＳ（ライフテクノロジー社）で細胞を１回洗浄し、新しいＤＭＥＭ培地（ライフテクノロジー社）を加えた。トランスフェクトした２日後に培地を除去し、２００μlの細胞分離剤（ライフテクノロジー社）を用いて細胞を再懸濁した。１２００μlのＤＭＥＭ培地で中和した後、各条件毎に３回反復で９６ウェル培養皿（コースター社（Costar））に５０μlの細胞懸濁液を播種し、組換えヒトレプチン（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を最終濃度１００ng／mlで、もしくは組換えヒトエリスロポエチン（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を最終濃度０．５ユニット／mlで加えるか、または、レプチン（上記と同じ濃度）とフォルスコリン（シグマ社、最終濃度１０μＭ）を一緒に加えるか、または、エリスロポエチン（上記と同じ濃度）とフォルスコリン（シグマ社、上記と同じ濃度）を一緒に加えるかして細胞を刺激した。無刺激の陰性対照も実験に組み込んだ。フォルスコリンは、細胞内に存在するアデニル酸シクラーゼを活性化して、二次メッセンジャーｃＡＭＰのレベルを高める化学薬品である。トランスフェクトした細胞をフォルスコリンだけで処理してもルシフェラーゼ活性を有意に誘導することはなかった。未決定のメカニズムによって、ｃＡＭＰが上昇するとＰＡＰ１誘導に対するレプチンシグナルによる強い共刺激が生じる（Eyckermanら、1999）。刺激してから２４時間後に、ウェルの中で細胞を溶解して、ルシフェラーゼの基質（ルシフェリン、Duchefa社）を加えた。トップカウント化学発光計測装置（キャンベラ・パッカード社（Canberra Packard））を用いて発光を測定した。模擬対照用トランスフェクション（トランスフェクションａ）では、すべての場合にシグナルは現れなかった。結果を図２に示す。ＥｐｏＲ／ＬｅｐＲキメラによるトランスフェクションの結果、エリスロポエチンで３．７倍の誘導、エリスロポエチンとフォルスコリンで６．５倍の誘導が起きた。レプチンで刺激したときも、レプチン＋フォルスコリンで刺激したときにも有意なシグナルは検出されなかった。ＬｅｐＲ  Ｙ９８５／１０７７Ｆ変異体でトランスフェクトされた細胞では、レプチンで刺激したとき３３．２倍の誘導が検出され、フォルスコリンと共刺激したときには３７．６倍の誘導が検出された。エリスロポエチンで刺激された細胞およびエリスロポエチン＋フォルスコリンで刺激された細胞ではシグナルが検出されなかった。すべての結果を、内部対照トランスフェクションベクターｐＵＴ６５１とガラクトスター（GalactoStar）キットを用いて標準化した（上記参照）。
【００９１】
ＥｐｏＲ／ＬｅｐＲとＬｅｐＲ  Ｙ９８５／１０７７Ｆの間における誘導の差異は、後者のレセプターコンストラクトでは、複合体へのチロシンリン酸化酵素およびＳＯＣＳタンパク質の動員に関与するチロシンが消失しているためにシグナルの強化がもたらされる可能性が高い（Eyckermanら、1999）。
【００９２】
実施例２：ｐ５３−ＳＶ４０ラージＴ相互作用トラップの機能性
この修飾依存的相互作用の機能性を調べるために、以下のとおりにプラスミドを組み合わせたものを、トランスフェクションの前日に６ウェル培養皿の中で播種された４×１０5個のＨｅｋ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした：
【００９３】
【表２】
0004756813.tif 000003
【００９４】
３．１μgのＤＮＡ（ｐＵＴ６５１を０．１μg、その他を各１μgずつ）を含んだ３００μlの沈殿混合液を調製した。２００μlを６時間細胞に加え、その後、ダルベッコのＰＢＳで１回洗浄した。洗浄後、ＤＭＥＭ培地を細胞に加えた。２４時間後、２２００μlのＤＭＥＭ培地で中和した２００μlの細胞分離剤を用いて細胞を再懸濁した。各トランスフェクションおよび刺激を３回反復して行なうたびに９６ウェル培養皿の中にこの細胞懸濁液を４０μl入れた。６０μlのＤＭＥＭを最終容量が１００μlになるように加え、２４時間後にエリスロポエチンまたはエリスロポエチン＋フォルスコリン（上記と同じ濃度）で細胞を２４時間刺激した。無刺激の陰性対照も実験に組み込んだ。ルシフェラーゼ測定結果を図３に示す。
【００９５】
トランスフェクションａ、ｂおよびＣのトランスフェクトした細胞は、調べたすべての条件下においてレポーターコンストラクトの有意な誘導を示さなかった。トランスフェクションｄのトランスフェクトした細胞では、エリスロポエチン、およびエリスロポエチンとフォルスコリンで刺激した後は、順に、９．４倍および１４．６倍の誘導が検出され、相互作用依存的なシグナルとなることを示唆した。トランスフェクションｅおよびｆではシグナルが検出されなかった。このことは、特異的な相互作用があって、ｇｐ１３０依存型ＳＴＡＴ３活性化をもたらすことを示唆している。すべての結果を、内部対照トランスフェクションベクターｐＵＴ６５１とガラクトスターキットを用いて標準化した（上記参照）。
【００９６】
実施例３：ＥｐｏＲ−ＣＩＳリン酸化依存型相互作用トラップの機能性
ＥｐｏＲ−ＣＩＳリン酸化依存型相互作用トラップの機能性を測定するために、以下のとおりにプラスミドを組み合わせ、トランスフェクションの前日に播種された４×１０5個のＨｅｋ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした：
【００９７】
【表３】
0004756813.tif 000004
【００９８】
３．１μgのＤＮＡ（ｐＵＴ６５１を０．１μg、その他を各１μgずつ）を含んだ３００μlの沈殿混合液を調製した。この混合液の２００μlを細胞に使用した。６時間後、細胞をダルベッコのＰＢＳで１回洗浄し、ＤＭＥＭ培地を加えた。４８時間後、２５０μlの細胞分離剤を用いて細胞を再懸濁した。２２００μlのＤＭＥＭ培地で中和した後、この細胞懸濁液１００μlを９６ウェル培養皿（コースター社）に入れた。エリスロポエチン、またはエリスロポエチンにフォルスコリンを加えたもので細胞を刺激した（最終濃度については上記参照）。無刺激の陰性対照も実験に組み込んだ。刺激してから２４時間後に、ルシフェラーゼ発現をトップカウント化学発光計測装置（キャンベラ・パッカード社）を用いて測定した。トランスフェクションａ、ｂ、ｃ、ｅ、ｆおよびｇのトランスフェクトした細胞は、ルシフェラーゼ活性の有意な誘導を示さなかった。トランスフェクションｄのトランスフェクトした細胞は、エリスロポエチン、またはエリスロポエチンとフォルスコリンで刺激した後は、順に、６．２倍および１０．５倍の誘導を示した。このことは、ＥｐｏＲベイトのエリスロポエチン依存的なリン酸化が起きて、ＣＩＳタンパク質とＥｐｏＲの間に相互作用が起きることを示している。相互作用によって、ｇｐ１３０のリン酸化、ＳＴＡＴ活性化、またｒＰＡＰ１プロモーターへのシグナル伝達をもたらし、ルシフェラーゼ活性をもたらす（図４）。
【００９９】
実施例４：ＩＲＳ１−ＧＲＢ２−Ｖａｖ間接的相互作用トラップの機能性
ＩＲＳ１−ＧＲＢ２−Ｖａｖ間接的相互作用トラップの機能性を調べるために、以下のとおりにプラスミドを組み合わせ、トランスフェクションの前日に播種された４×１０5個のＨｅｋ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした：
【０１００】
【表４】
0004756813.tif 000005
【０１０１】
３．０５μgのＤＮＡ（ｐＵＴ６５１を０．０５μg、その他を各１μgずつ）を含む３００μlの沈殿混合液を調製した。この混合液２００μlを１６時間細胞に加えた。トランスフェクション後、細胞をダルベッコのＰＢＳで１回洗浄し、ＤＭＥＭを添加した（どちらもＧｉｂｃｏ  ＢＲＬ社から）。４８時間後、１．８  mlのＤＭＥＭ培地で中和された２００μlの細胞分離剤（Gibco BRL社）を用いて細胞を再懸濁した。１００μlの細胞懸濁液をコースター社の９６ウェル培養皿に播種し、最終容量にして２００μl、最終濃度にして１００ng／mlのレプチン、１００ng／mlのレプチンに１０μＭのフォルスコリンを加えたもの、１０μＭのフォルスコリン中で刺激するか、無刺激のままにした。刺激を加えて２４時間後に、上記したように、ルシフェラーゼおよびガラクトシダーゼの活性測定を行なった。これらの結果（図５）から、トランスフェクションａ、ｂ、ｃおよびｄの細胞は、ｒＰＡＰ１プロモーターの有意な誘導を示さないと結論づけることができる。トランスフェクションｅの細胞は、レプチンによる僅かな誘導を示し、フォルスコリンで共刺激すると中度の誘導（２．５倍）を示す。これらは、ＩＲＳ−１とＧＲＢ２Ｓの間に直接的な相互作用があることを示唆している。トランスフェクション実験ｆは、レプチンによって明らかにルシフェラーゼ活性が誘導されること（５．２倍）を示しており、それは、フォルスコリンで共刺激するとより顕著になる（１２．０倍）。このことは、ＩＲＳ１とＶａｖの間に相互作用があり、おそらく、内在するＧＲＢ２によって仲介されることを示している。
【０１０２】
この相互作用におけるＧＲＢ２の特異性と関与を調べるため、また、ｇｐ１３０鎖の動員によってシグナルが発生するか否かを試験するために、いくつかの対照実験を行なった。
【０１０３】
プラスミドを以下の通りに組み合わせて、上記したものと同じ方法で調べた：
【０１０４】
【表５】
0004756813.tif 000006
【０１０５】
０．０５μgのｐＵＴ６５１  ＤＮＡと１μgのｐＭＥＴ７  ＬｅｐＲ−ＩＲＳ１およびｐＧＬ３−ｒＰＡＰ１−ｌｕｃｉを３００μlの沈殿混合液に加えた。結果（図６）を誘導倍率で示す。これらの結果は、ＧＲＢ２ＳＨ３を過剰発現させると、用量依存的にｒＰＡＰ１誘導が阻害されることを明確に示している。Ｖａｖ結合に関して内在ＧＲＢ２と競合するため、複合体へのｇｐ１３０−ＶａｖＳ融合タンパク質の動員が阻害され、ｒＰＡＰ１プロモーターの活性化が用量依存的に低下する結果となる。このことから、ルシフェラーゼ活性の誘導には、特異的なＧＲＢ２−ＶａｖＳ相互作用が必要となると結論することができる。
【０１０６】
ｒＰＡＰ１プロモーターの誘導におけるｇｐ１３０動員の重要な役割を調べるために、以下の通りにプラスミドを組み合わせ、上記したようにトランスフェクトした。
【０１０７】
【表６】
0004756813.tif 000007
【０１０８】
３００μlの沈殿混合液は、０．０５μgのｐＵＴ６５１  ＤＮＡと１μgのｐＭＥＴ７  ＬｅｐＲ−ＩＲＳ１およびｐＧＬ３−ｒＰＡＰ１−ｌｕｃｉのＤＮＡも含んでいた。標準化した結果（図７）から、未結合のＶａｖＳとの用量依存的な競合によってルシフェラーゼ活性の有意な低下がもたらされるため、ＰＡＰ１プロモーターの誘導にとってｇｐ１３０−ＶａｖＳ融合コンストラクト中のｇｐ１３０が重要であると結論することができる。
【０１０９】
実施例５：ライブラリースクリーニング法の最適化
簡単な相互作用依存的ｃＤＮＡライブラリースクリーニングを可能にするため、図８にまとめたような選択系を開発した。ＨＥＫ２９３細胞クローンは、（ｉ）転写活性をもつ遺伝子座中にＦＲＴ組み込みカセットを含み（Ｆｌｐ−Ｉｎ−２９３細胞株、インビトロジェン社）、（ii）マウスのエコトロピックレトロウイルスレセプターＥｃｏＲを安定して発現し、かつ、（iii）ピューロマイシン耐性遺伝子のＳＴＡＴ−調節による発現を指令する、安定して組み込まれたｐＸＰ２ｄ２−ｒＰＡＰ１−ｐｕｒｏR 選択用カセットをもつものが用いられた。ＨＥＫ２９３−１６クローンは、ピューロマイシン（１μg／ml）に対して高い感受性を示したが、内在ｇｐ１３０をＬＩＦ（白血病抑制因子）誘導によって活性化するとピューロマイシン耐性を獲得した（図９Ａ）。典型的なスクリーニング実験は以下の一連の工程を含む：（ｉ）ｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ−ＥｐｏＲ「ベイト」ベクターをＦｌｐリコンビナーゼによって組み込むと、ＥｐｏＲ「ベイト」の発現が得られた。ハイグロマイシンを含む培地の中での増殖（１００μg／ml、１０日間）によって同質遺伝子系細胞を選択し、抗ＥｐｏＲ抗体を用いたＦＡＣＳ解析を行なったところ、細胞集団のほぼ全体がキメラ「ベイト」レセプターを均一に発現することを示した（図９Ｂ）。（ii）続いて、ハイグロマイシン耐性細胞を、２４〜４８時間、ＣＩＳ「プレイ」を発現するレトロウイルスに感染させた。レトロウイルスの遺伝子導入法は、単一の組み込み体からの発現を達成できるように選択した（Kitamuraら、1995; KojimaとKitamura、1999）。（iii）細胞は、ピューロマイシン選択を行なう前に、Ｅｐｏ（５０ng／ml）でさらに２４〜４８時間処理した。図９Ｃに示すように、コロニー形成は、ＥｐｏＲ「ベイト」タンパク質とｇｐ１３０−ＣＩＳ「プレイ」タンパク質を共発現する、Ｅｐｏにより刺激したＨＥＫ２９３−１６細胞でのみ見られた。透過性化されたピューロマイシン耐性細胞を、抗ＦＬＡＧ抗体によってＦＡＣＳ解析したところ、「プレイ」ポリペプチドの発現を確認した（図９Ｄ）。ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、発現された「プレイ」転写物を迅速に同定した。すべての「プレイ」ポリペプチドがヒトｇｐ１３０に融合しているという事実を利用して、ビオチン化したｇｐ１３０特異的なプライマーを用いて、ストレプトアビジン−マグネットビーズによって細胞溶解液から直接に「プレイ」転写物を選択した。逆転写後、ｇｐ１３０／３′ＬＴＲプライマー対を使用して選択的にＰＣＲ増幅した「プレイ」挿入配列を得た。Ｅｐｏ刺激したピューロマイシン耐性細胞から回収した、このような増幅産物のＤＮＡ配列を解析したところ、ｇｐ１３０−ＣＩＳ「プレイ」をコードする転写産物が予想通りに発現していることが分かった（図９Ｄ、挿入図）。図９Ｅは、複合レトロウイルスＨＥＫ２９３  ｃＤＮＡライブラリーをｇｐ１３０−ＣＩＳ「プレイ」を発現するレトロウイルスの一連の希釈液と混合した「スパイキング」実験の結果を示している。リガンドが存在するときにのみ、細胞クローンの用量依存的な回収が見られた。並行実験においてＲＴ−ＰＣＲサイクルシーケンシングを行なったところ、解析した２１クローンのうち１９クローンにおいてｇｐ１３０−ＣＩＳ「プレイ」の発現を確認することができた。
【０１１０】
実施例６：ＭＡＰＰＩＴ法によるライブラリースクリーニング
レトロウイルスＨＥＫ２９３  ｃＤＮＡライブラリー（２．１０6個のインディペンデントクローン）を用いてＥｐｏＲ「ベイト」によるスクリーニング実験を行なった。単一の組み込み体に有利になるよう、ＥｐｏＲ「ベイト」を発現する６．１０7個のＨＥＫ２９３−１６細胞を推定感染効率４％で感染させた。Ｅｐｏ刺激と２μg／mlのピューロマイシンを含む培地中で選択を行なってから３週間後、３３個のコロニーを採取して、機能アッセイ法で解析した（図９Ｆ）。全てのクローンが安定して「ベイト」と「プレイ」を共発現するため、「ベイト」をもたないＬＲ−Ｆ３と、ｒＰＡＰ１−ルシフェラーゼコンストラクトとの同時トランスフェクションによって、ＥｐｏＲ「ベイト」との特異的相互作用を迅速に明らかにすることができた。３個のクローンは、レプチンではなくＥｐｏによって誘導されることが分かったが、このことは、Ｙ４０２ＥｐｏＲモチーフとの相互作用が特異的に起こったことを示している。これらのクローンの一つにおいて、ＲＴ−ＰＣＲ解析を行なったところ、１７００塩基の特異的な増幅産物が存在することが分かり、サイクルシーケンシングによって、この断片が、ＳＯＣＳファミリーの別のメンバーであるＳＯＣＳ−２をコードすることが明らかになった。後者を、そのプレ−ＳＨ２ドメイン内側でインフレームになるようｇｐ１３０に融合させた（図９Ｆ）。これも、このツーハイブリッド法に見られるバックグランドの低さをさらに際立たせている。プラスミドベクターにサブクロニーングした後、ＳＯＣＳ−２「プレイ」とＳＴＡＴ３のリガンド依存型リン酸化はＹ４０２ＥｐｏＲモチーフのリン酸化に依存していることが明らかになった（図９Ｇ）。このことは、レポーター遺伝子を活性化する前にリン酸化（および相互作用）の段階がそれぞれあること実証している。
【０１１１】
実施例７：ヘテロ二量体レセプターを用いたＭＡＰＰＩＴの使用：Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞株におけるＩＬ３Ｒ−、ＩＬ５Ｒ−、およびＧＭ−ＣＳＦＲ−ＬｅｐＲキメラの機能性
Ｅｐｏ、ＩＬ３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、およびＧＭ−ＣＳＦＲ−ＬｅｐＲキメラの機能性を比較するために、プラスミドを以下の通りに組み合わせて、４×１０5個のＨｅｋ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、トランスフェクションの前日に播種した。
【０１１２】
【表７】
0004756813.tif 000008
【０１１３】
０．０５μgのｐＵＴ６５１、その他のベクターを各１μgずつ含んだ３００μlの沈殿混合液を先に記したように調製した。この混合液２００μlを細胞に使用した。６時間後、細胞をダルベッコのＰＢＳで１回洗浄した。２日後、細胞分離剤を用いて細胞を再懸濁し、９６ウェル培養皿（コースター社）に移した。トランスフェクションａ〜ｇを、それぞれ、１００００、１０００、１００、１０ｐｇ／mlのサイトカインで刺激した。トランスフェクションｈの細胞は、ｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ−βc／ＬｅｐＲのみを発現するが、１０ng／mlのＥｐｏ、ＩＬ３Ｒ、ＩＬ５Ｒ、またはＧＭ−ＣＳＦで処理した。無刺激の陰性対照も実験に含まれていた。刺激してから２４時間後にルシフェラーゼ発現を測定した。結果を図１０に示す。ＥｐｏＲ／ＬｅｐＲキメラ、およびＩＬ−３Ｒα／ＬｅｐＲとβc／ＬｅｐＲとを組み合わせたものは、同じような倍率の誘導を示す。バックグランドを超えたことのシグナルは、１ng／mlのサイトカイン濃度で見られる。ＩＬ−５Ｒα／ＬｅｐＲとβc／ＬｅｐＲのキメラでトランスフェクトした細胞に対するＩＬ−５の生物活性は、ＩＬ−３またはＥｐｏの活性よりも低い。ＧＭ−ＣＳＦＲとＬｅｐＲのキメラでトランスフェクトした細胞は、刺激に対する感受性がずっと高く、１０ｐｇ／mlという低い濃度で、明らかに７．７倍の誘導が起きる。陰性対照であるトランスフェクションｅ、ｆ、ｇ、およびｈの細胞では、ルシフェラーゼ活性の有意な誘導がないことが示された。
【０１１４】
実施例８：Ｓｍａｄ３−Ｓｍａｄ４リン酸化依存型相互作用トラップの機能性
Ｓｍａｄ３−Ｓｍａｄ４リン酸化依存型相互作用トラップの機能性を測定するために、以下のとおりにプラスミドを組み合わせ、トランスフェクションの前日に播種された４×１０5個のＨｅｋ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした：
【０１１５】
【表８】
0004756813.tif 000009
【０１１６】
２．９２μg（０．０２μgのｐＵＴ６５１、０．２μgのｐＸＰ２ｄ２−ｒＰＡＰ１−ｌｕｃｉ＋その他各０．９μgずつ）を含む３００μlの沈殿混合液を調製した。この混合液２００μlを細胞に使用した。６時間後、細胞をダルベッコのＰＢＳで１回洗浄し、ＤＭＥＭ培地を加えた。４８時間後、２００μlの細胞分離剤を用いて細胞を再懸濁した。２２００μlのＤＭＥＭ培地で中和した後、この細胞懸濁液４０μlを９６ウェル培養皿（コースター社）に入れた。最終濃度１ng／mlのＧＭ−ＣＳＦ、１ng／mlのＧＭ−ＣＳＦに１０μＭのフォルスコリンを加えたもの、１０μＭのフォルスコリンによって、最終容量１００μlにして細胞を刺激するか、無刺激のまま放置した。刺激してから２４時間後に、ルシフェラーゼおよびガラクトシダーゼの活性測定を上記したとおり行なった。これらの結果（図１１）から、トランスフェクションｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、およびｊの細胞は、ルシフェラーゼ活性の有意な誘導を示さなかったと結論することができる。トランスフェクションａの細胞は、ＧＭ−ＣＳＦによる僅かな誘導（３倍）を示し、フォルスコリンで共刺激すると３７倍にまで上昇する。トランスフェクション実験ｂは、ＧＭ−ＣＳＦによってｒＰＡＰ１プロモーターを明らかに誘導することが示されている（９倍）が、これは、フォルスコリンで共刺激するとより顕著になる（７１倍）。このことは、ベイト−修飾酵素活性である、Ｓｍａｄ３ベイトのＡＬＫ４ＣＡ依存型リン酸化を示唆するものであり、Ｓｍａｄ４とリン酸化Ｓｍａｄ３の間に相互作用が起きる。相互作用をｇｐ１３０のリン酸化、ＳＴＡＴの活性化、およびｒＰＡＰ１プロモーターに対するシグナル伝達をもたらし、ルシフェラーゼ活性をもたらす。
【０１１７】
実施例９：非ポリペプチド性化合物を含む、化合物−化合物相互作用をスクリーニングするためのＭＡＰＰＩＴの使用
フジスポリン（Fujisporin）で実験を行ない、ＦＫ５０６をサイクロスポリンＡに化学的に結合させる（例えば国際公開公報第９４／１８３１７号）。または、ＦＫ５０６をテトラサイクリン、またはステロイドリガンドに融合させることによって２価の化合物を得る。このようなハイブリッド化合物は、ＦＫＢＰ１２およびサイクロフィリン（または、テトラサイクリン／ステロイドレセプター）という両方のタンパク質パートナーと相互作用することができる。
【０１１８】
レセプター／ＦＫＢＰ１２のキメラを安定して発現する細胞を膜透過性２価化合物で処理し、余分な化合物を洗い流した後、「プレイ」の発現を強化するために感染またはトランスフェクトする。または、レセプター／ＦＫＢＰ１２および「プレイ」キメラはどちらも、化合物を加える前に同時に発現されている。化合物の用量応答を慎重に行なう。ハイブリッド化合物に二量体化作用があるとすると、釣り鐘型の用量応答曲線が得られる。特異性制御手段として過剰量の１価化合物を添加し、シグナル出力を有意に低下させる。
【０１１９】
【表９】
0004756813.tif 000010
0004756813.tif 000011
0004756813.tif 000012
0004756813.tif 000013
【０１２０】
【表１０】
0004756813.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【図１】  レセプターを用いた相互作用捕捉法の原理
リガンド結合によって、修飾酵素活性（ＭＡ）の活性化が起きる。正常なレセプター活性化部位の不活性化（不活性化された活性化部位、ｉＡＳ）によって、修飾酵素活性を活性化しても、組換えレセプターの細胞質ドメインにある異種ベイト（「ベイト」と表示する）が、活性化部位（ＡＳ）を含むポリペプチドに融合しているプレイポリペプチド（「プレイ」と表示する）に結合しない限り、シグナル伝達経路の活性化は起きなくなる。ここで、修飾酵素活性はこの活性化部位を修飾することができるが、この活性化部位の修飾（ｘ）によって、シグナル伝達経路の活性化とレポーター系の誘導が起きる（「検出可能な活性」と表示する）。
【図２】  化学発光計測器で、ルシフェラーゼ発光を測定したときのＨｅｋ２９３Ｔ  ＰＡＰ２１細胞株におけるＥｐｏＲ−ＬｒｐＲキメラの機能性（１秒当たりのカウント数、ｃｐｓ）
以下のベクターで細胞をトランスフェクトした：
a. pSV-SPORT + pMET7mcs + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
b. pSV-SPORT EpoR/LepR + pMET7mcs + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
c. pMET7 LepRY985/1077F + pMET7mcs + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
ＮＣ：無刺激の陰性対照。刺激は、実施例に記載されているとおりに行なった。
【図３】  化学発光計測器で、ルシフェラーゼ発光を測定したときのｐ５３−ＳＶ４０ラージＴ相互作用トラップの機能性（ｃｐｓ）
以下で細胞をトランスフェクトした：
a. pSV-SPORT + pMG1-SVT + pGL3-rPAP1-luci +pUT651
b. pSV-SPORT + pMG1-CIS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
c. pSV-SPORT + pMET7-SVT + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
d. pSEL1-p53 + pMG1-SVT + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
e. pSEL1-p53 + pMG1-CIS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
f. pSEL1-p53 + pMET7-SVT + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
ＮＣ：無刺激の陰性対照。刺激は、実施例に記載されているとおりに行なった。
【図４】  化学発光計測器で、ルシフェラーゼ発光を測定したときのＥｐｏＲ−ＣＩＳリン酸化依存的相互作用トラップの機能性（ｃｐｓ）
以下で細胞をトランスフェクトした：
a. pSV-SPORT + pMG1-CIS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
b. pSV-SPORT + pMG1-SVT + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
c. pSV-SPORT + pEF-FLAG-I/mCIS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
d. pSEL1-EpoR + pMG1-CIS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
e. pSEL1-EpoR + pEF-FLAG-I/mCIS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
f. pSEL1-EpoRY-F + pMG1-CIS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
g. pSEL1-EpoR + pMG1-SVT + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
ＮＣ：無刺激の陰性対照。刺激は、実施例に記載されているとおりに行なった。
【図５】  化学発光計測器で、ルシフェラーゼ発光を測定したときのＩＲＳ１−ＧＲＢ２−Ｖａｖ間接相互作用トラップの機能性（ｃｐｓ）
以下で細胞をトランスフェクトした：
a. pMET7mcs + pMG1-CIS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
b. pMET7mcs + pMG1-GRB2S + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
c. pMET7mcs + pMG1-VavS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
d. pMET7 LepR-IRS1 + pMG1-CIS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
e. pMET7 LepR-IRS1 + pMG1-GRB2S + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
f. pMET7 LepR-IRS1 + pMG1-VavS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
ＮＣ：無刺激の陰性対照。刺激は、実施例に記載されているとおりに行なった。
【図６】  化学発光計測器で、ルシフェラーゼ発光を測定したときのＩＲＳ１−ＧＲＢ２−Ｖａｖ間接相互作用トラップの機能性：ＧＲＢ２用量依存的シグナル阻害（ｃｐｓ）
以下で細胞をトランスフェクトした：
a. pMET7 LepR-IRS1 + 200 ng pMG1-VavS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
b. pMET7 LepR-IRS1 + 200 ng pMG1-VavS + 200 ng pMET7 GRB2SH3 + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
c. pMET7 LepR-IRS1 + 200 ng pMG1-VavS + 1000 ng pMET7 GRB2SH3 + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
ＮＣ：無刺激の陰性対照。刺激は、実施例に記載されているとおりに行なった。
【図７】  化学発光計測器で、ルシフェラーゼ発光を測定したときのＩＲＳ１−ＧＲＢ２−Ｖａｖ間接相互作用トラップの機能性：ＶａｖＳ用量依存的シグナル阻害（ｃｐｓ）
以下で細胞をトランスフェクトした：
a. pMET7 LepR-IRS1 + 200 ng pMG1-VavS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
b. pMET7 LepR-IRS1 + 200 ng pMG1-VavS + 200 ng pMET7 VavS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
c. pMET7 LepR-IRS1 + 200 ng pMG1-VavS + 1000 ng pMET7 VavS + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
ＮＣ：無刺激の陰性対照。刺激は、実施例に記載されているとおりに行なった。
【図８】  最適化ＭＡＰＰＩＴ法によるツーハイブリッド・スクリーニング法の概略
本方法は、囲みの数字で示した３つの連続した工程を含む。まず、Ｃ−末側に「ベイト」（ＣＲ−Ｂａｉｔ）をもつキメラレセプターを発現する細胞を、リコンビナーゼを利用したゲノム組み込み法によって生成した後、ハイグロマイシン選択を行なう。次に、レトロウイルス遺伝子を転移させて、ｇｐ１３０−「プレイ」キメラを発現させる。最後に、同種の「ベイト」−「プレイ」相互作用が起きると、リガンド結合によって、ピューロマイシン耐性マーカーの誘導をもたらすシグナル伝達カスケードが誘導されるとともに、選択培地の中で細胞コロニーが同時に形成される。溶解した細胞コロニーから転写物をコードする「プレイ」を直接ＲＴ−ＰＣＲで増幅して、迅速に「プレイ」を同定することができる。
【図９Ａ】  ツーハイブリッド・スクリーニングを行なうためのＭＡＰＰＩＴ法の手順
（Ａ）ＨＥＫ２９３−１６細胞株はピューロマイシン耐性を示す。ＨＥＫ２９３−１６細胞を２４ウェル培養皿に播種し、そのまま処理しないで置く（上段のウェル）か、ＬＩＦを用いて予めｇｐ１３０の活性化を４８時間行なってから（中段のウェル）、またはそれを行わず（下段のウェル）にピューロマイシン（１μg／ml）選択を行なった。１週間後、生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。
（Ｂ）ＥｐｏＲ「ベイト」を発現する同質遺伝子系ＨＥＫ２９３−１６細胞の選択。ＨＥＫ２９３−１６細胞をｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ−ＥｐｏＲ「ベイト」およびＦｌｐリコンビナーゼ発現ベクターによって同じトランスフェクトしてから、１０日間ハイグロマイシン（１００μg／ml）耐性による選択を行なった。細胞を、ＥｐｏＲおよびＡｌｅｘａ４８８で標識した二次抗体の細胞外ドメインを認識するポリクローナル抗血清を用いて染色した。実線と点線は、それぞれ、親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、およびハイグロマイシン選択されたＨＥＫ２９３−１６細胞を示す。
（Ｃ）同起源の「プレイ」−「ベイト」相互作用を利用した細胞選択。（Ｂ）のハイグロマイシン耐性細胞を２４ウェル培養皿に播種し、ＣＩＳ「プレイ」を発現するレトロウイルス（レトロウイルス保存液を３０分の１に希釈したもの）に４８時間感染させ、そのまま無処理のまま置く（上段のウェル）か、ピューロマイシン（１μg／ml）で処理する前に、さらに４８時間Ｅｐｏで刺激した（中段のウェル）。下段のウェルは、上記のようにして選択されたが、無関係なｌａｃＺタンパク質を発現する（レトロウイルス保存液を３分の１に希釈したもの）、Ｅｐｏで刺激された細胞を示している。７日後、生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。
（Ｄ）ピューロマイシン耐性細胞は、「プレイ」キメラを発現する。親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、または（ｃ）で得られたピューロマイシン耐性細胞を透過性にし、続いて抗ＦＬＡＧ抗体、およびＦＩＴＣ標識した二次抗体で処理してから、ＦＡＣＳ分析を行なった。実線と点線は、それぞれ、親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、およびピューロマイシン選択されたＨＥＫ２９３−１６細胞を示す。「プレイ」キメラをコードする転写物の（ＩＮＳＥＴ）ＲＴ−ＰＣＲ検出法。（Ｃ）で得られた細胞を溶解し、「プレイ」をコードする転写物をＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。矢印はＣＩＳ特異的増幅産物を示しているが、これはＤＮＡシーケンシングによって確認された。親株細胞に対する陰性対照処理も行なった（真ん中のレーン）。Ｍ：マーカーレーン
（Ｅ）ｇｐ１３０−ＣＩＳ「プレイ」発現細胞クローンの用量依存的回収。ＥｐｏＲ「ベイト」発現細胞を７５cm2の培養フラスコに播種し、複合的レトロウイルスＨＥＫ２９３  ｃＤＮＡライブラリーで１０分の１ずつ連続希釈したＣＩＳ「プレイ」発現レトロウイルスを感染させた。選択後、ピューロマイシン耐性コロニーをクリスタルバイオレットで染色した。パネル１は、Ｅｐｏ刺激することなしに、ＣＩＳ「プレイ」の１／１０希釈したものを感染させた細胞を示す。パネル２〜５は、１／１０から１／１０，０００連続希釈した場合を示し、一方、パネル６は、ＣＩＳ「プレイ」不在下でレトロウイルスｃＤＮＡライブラリーに感染させた細胞の結果を示している。並行して行なった「スパイキング（spiking）」実験において、２１個の解析されたクローン中１９個がｇｐ１３０−ＣＩＳ「プレイ」転写物を含んでいた。
（Ｆ）ＥｐｏＲ「ベイト」−ＳＯＣＳ−２「プレイ」相互作用の機能的解析。ＥｐｏＲ「ベイト」を用いてＨＥＫ２９３  ｃＤＮＡライブラリーをＭＡＰＰＩＴスクリーニングしたところ、ＳＯＣＳ−２「プレイ」コンストラクトを発現する細胞クローンが単離された。この選択クローンを、ｐＸＰ２ｄ２−ｒＰＡＰ１−ｌｕｃｉレポーターだけで一過的にトランスフェクトするか、またはＬＲ−Ｆ３変異型をコードするベクターと一緒に一過的にトランスフェクトして、それぞれ、Ｅｐｏまたはレプチンで２４時間刺激するか、そのまま刺激しないままにした。上段のパネルは、上部に活性化されたレセプターの概略図を示すとともに、対応するルシフェラーゼの誘導を示している。下段のパネルには、ＳＯＣＳ−２「プレイ」キメラと、本来のＳＯＣＳ−２およびＣＩＳを図示した。
（Ｇ）ＥｐｏＲ「ベイト」−ＳＯＣＳ−２「プレイ」相互作用はリン酸化依存的である。（上段パネル）ＥｐｏＲ「ベイト」をもつキメラレセプター（２９３−１６  ＥｐｏＲ）またはこれを持たないキメラレセプター（２９３−１６  ＬＦ−Ｆ３）を発現するＨＥＫ２９３−１６細胞をＥｐｏで刺激するか、無処理のまま置いた。ＥｐｏＲ「ベイト」のリガンド依存的リン酸化が見られるが、一方で、ＬＲ−Ｆ３キメラのリン酸化は起こらなかった。
（中段および下段のパネル）ＥｐｏＲ「ベイト」発現用コンストラクト（ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲ）およびＳＯＣＳ−２「プレイ」発現用コンストラクトによって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過的にトランスフェクトした。中段パネルおよび下段パネルは、それぞれ、リガンド依存的「プレイ」、および、ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲでトランスフェクトしたときにのみ観察され、ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲＦでトランスフェクトしたときには観察されなかったＳＴＡＴ３リン酸化を示している。また、ＳＯＣＳ−２「プレイ」およびＳＴＡＴ３についての発現対照も示す。
【図９Ｂ】  ツーハイブリッド・スクリーニングを行なうためのＭＡＰＰＩＴ法の手順
（Ａ）ＨＥＫ２９３−１６細胞株はピューロマイシン耐性を示す。ＨＥＫ２９３−１６細胞を２４ウェル培養皿に播種し、そのまま処理しないで置く（上段のウェル）か、ＬＩＦを用いて予めｇｐ１３０の活性化を４８時間行なってから（中段のウェル）、またはそれを行わず（下段のウェル）にピューロマイシン（１μg／ml）選択を行なった。１週間後、生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。
（Ｂ）ＥｐｏＲ「ベイト」を発現する同質遺伝子系ＨＥＫ２９３−１６細胞の選択。ＨＥＫ２９３−１６細胞をｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ−ＥｐｏＲ「ベイト」およびＦｌｐリコンビナーゼ発現ベクターによって同じトランスフェクトしてから、１０日間ハイグロマイシン（１００μg／ml）耐性による選択を行なった。細胞を、ＥｐｏＲおよびＡｌｅｘａ４８８で標識した二次抗体の細胞外ドメインを認識するポリクローナル抗血清を用いて染色した。実線と点線は、それぞれ、親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、およびハイグロマイシン選択されたＨＥＫ２９３−１６細胞を示す。
（Ｃ）同種の「プレイ」−「ベイト」相互作用を利用した細胞選択。（Ｂ）のハイグロマイシン耐性細胞を２４ウェル培養皿に播種し、ＣＩＳ「プレイ」を発現するレトロウイルス（レトロウイルス保存液を３０分の１に希釈したもの）に４８時間感染させ、そのまま無処理のまま置く（上段のウェル）か、ピューロマイシン（１μg／ml）で処理する前に、さらに４８時間Ｅｐｏで刺激した（中段のウェル）。下段のウェルは、上記のようにして選択されたが、無関係なｌａｃＺタンパク質を発現する（レトロウイルス保存液を３分の１に希釈したもの）、Ｅｐｏで刺激された細胞を示している。７日後、生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。
（Ｄ）ピューロマイシン耐性細胞は、「プレイ」キメラを発現する。親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、または（ｃ）で得られたピューロマイシン耐性細胞を透過性にし、続いて抗ＦＬＡＧ抗体、およびＦＩＴＣ標識した二次抗体で処理してから、ＦＡＣＳ分析を行なった。実線と点線は、それぞれ、親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、およびピューロマイシン選択されたＨＥＫ２９３−１６細胞を示す。「プレイ」キメラをコードする転写物の（ＩＮＳＥＴ）ＲＴ−ＰＣＲ検出法。（Ｃ）で得られた細胞を溶解し、「プレイ」をコードする転写物をＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。矢印はＣＩＳ特異的増幅産物を示しているが、これはＤＮＡシーケンシングによって確認された。親株細胞に対する陰性対照処理も行なった（真ん中のレーン）。Ｍ：マーカーレーン
（Ｅ）ｇｐ１３０−ＣＩＳ「プレイ」発現細胞クローンの用量依存的回収。ＥｐｏＲ「ベイト」発現細胞を７５cm2の培養フラスコに播種し、複合的レトロウイルスＨＥＫ２９３  ｃＤＮＡライブラリーで１０分の１ずつ連続希釈したＣＩＳ「プレイ」発現レトロウイルスを感染させた。選択後、ピューロマイシン耐性コロニーをクリスタルバイオレットで染色した。パネル１は、Ｅｐｏ刺激することなしに、ＣＩＳ「プレイ」の１／１０希釈したものを感染させた細胞を示す。パネル２〜５は、１／１０から１／１０，０００連続希釈した場合を示し、一方、パネル６は、ＣＩＳ「プレイ」不在下でレトロウイルスｃＤＮＡライブラリーに感染させた細胞の結果を示している。並行して行なった「スパイキング（spiking）」実験において、２１個の解析されたクローン中１９個がｇｐ１３０−ＣＩＳ「プレイ」転写物を含んでいた。
（Ｆ）ＥｐｏＲ「ベイト」−ＳＯＣＳ−２「プレイ」相互作用の機能的解析。ＥｐｏＲ「ベイト」を用いてＨＥＫ２９３  ｃＤＮＡライブラリーをＭＡＰＰＩＴスクリーニングしたところ、ＳＯＣＳ−２「プレイ」コンストラクトを発現する細胞クローンが単離された。この選択クローンを、ｐＸＰ２ｄ２−ｒＰＡＰ１−ｌｕｃｉレポーターだけで一過的にトランスフェクトするか、またはＬＲ−Ｆ３変異型をコードするベクターと一緒に一過的にトランスフェクトして、それぞれ、Ｅｐｏまたはレプチンで２４時間刺激するか、そのまま刺激しないままにした。上段のパネルは、上部に活性化されたレセプターの概略図を示すとともに、対応するルシフェラーゼの誘導を示している。下段のパネルには、ＳＯＣＳ−２「プレイ」キメラと、本来のＳＯＣＳ−２およびＣＩＳを図示した。
（Ｇ）ＥｐｏＲ「ベイト」−ＳＯＣＳ−２「プレイ」相互作用はリン酸化依存的である。（上段パネル）ＥｐｏＲ「ベイト」をもつキメラレセプター（２９３−１６  ＥｐｏＲ）またはこれを持たないキメラレセプター（２９３−１６  ＬＦ−Ｆ３）を発現するＨＥＫ２９３−１６細胞をＥｐｏで刺激するか、無処理のまま置いた。ＥｐｏＲ「ベイト」のリガンド依存的リン酸化が見られるが、一方で、ＬＲ−Ｆ３キメラのリン酸化は起こらなかった。
（中段および下段のパネル）ＥｐｏＲ「ベイト」発現用コンストラクト（ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲ）およびＳＯＣＳ−２「プレイ」発現用コンストラクトによって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過的にトランスフェクトした。中段パネルおよび下段パネルは、それぞれ、リガンド依存的「プレイ」、および、ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲでトランスフェクトしたときにのみ観察され、ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲＦでトランスフェクトしたときには観察されなかったＳＴＡＴ３リン酸化を示している。また、ＳＯＣＳ−２「プレイ」およびＳＴＡＴ３についての発現対照も示す。
【図９Ｃ】  ツーハイブリッド・スクリーニングを行なうためのＭＡＰＰＩＴ法の手順
（Ａ）ＨＥＫ２９３−１６細胞株はピューロマイシン耐性を示す。ＨＥＫ２９３−１６細胞を２４ウェル培養皿に播種し、そのまま処理しないで置く（上段のウェル）か、ＬＩＦを用いて予めｇｐ１３０の活性化を４８時間行なってから（中段のウェル）、またはそれを行わず（下段のウェル）にピューロマイシン（１μg／ml）選択を行なった。１週間後、生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。
（Ｂ）ＥｐｏＲ「ベイト」を発現する同質遺伝子系ＨＥＫ２９３−１６細胞の選択。ＨＥＫ２９３−１６細胞をｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ−ＥｐｏＲ「ベイト」およびＦｌｐリコンビナーゼ発現ベクターによって同じトランスフェクトしてから、１０日間ハイグロマイシン（１００μg／ml）耐性による選択を行なった。細胞を、ＥｐｏＲおよびＡｌｅｘａ４８８で標識した二次抗体の細胞外ドメインを認識するポリクローナル抗血清を用いて染色した。実線と点線は、それぞれ、親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、およびハイグロマイシン選択されたＨＥＫ２９３−１６細胞を示す。
（Ｃ）同種の「プレイ」−「ベイト」相互作用を利用した細胞選択。（Ｂ）のハイグロマイシン耐性細胞を２４ウェル培養皿に播種し、ＣＩＳ「プレイ」を発現するレトロウイルス（レトロウイルス保存液を３０分の１に希釈したもの）に４８時間感染させ、そのまま無処理のまま置く（上段のウェル）か、ピューロマイシン（１μg／ml）で処理する前に、さらに４８時間Ｅｐｏで刺激した（中段のウェル）。下段のウェルは、上記のようにして選択されたが、無関係なｌａｃＺタンパク質を発現する（レトロウイルス保存液を３分の１に希釈したもの）、Ｅｐｏで刺激された細胞を示している。７日後、生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。
（Ｄ）ピューロマイシン耐性細胞は、「プレイ」キメラを発現する。親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、または（ｃ）で得られたピューロマイシン耐性細胞を透過性にし、続いて抗ＦＬＡＧ抗体、およびＦＩＴＣ標識した二次抗体で処理してから、ＦＡＣＳ分析を行なった。実線と点線は、それぞれ、親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、およびピューロマイシン選択されたＨＥＫ２９３−１６細胞を示す。「プレイ」キメラをコードする転写物の（ＩＮＳＥＴ）ＲＴ−ＰＣＲ検出法。（Ｃ）で得られた細胞を溶解し、「プレイ」をコードする転写物をＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。矢印はＣＩＳ特異的増幅産物を示しているが、これはＤＮＡシーケンシングによって確認された。親株細胞に対する陰性対照処理も行なった（真ん中のレーン）。Ｍ：マーカーレーン
（Ｅ）ｇｐ１３０−ＣＩＳ「プレイ」発現細胞クローンの用量依存的回収。ＥｐｏＲ「ベイト」発現細胞を７５cm2の培養フラスコに播種し、複合的レトロウイルスＨＥＫ２９３  ｃＤＮＡライブラリーで１０分の１ずつ連続希釈したＣＩＳ「プレイ」発現レトロウイルスを感染させた。選択後、ピューロマイシン耐性コロニーをクリスタルバイオレットで染色した。パネル１は、Ｅｐｏ刺激することなしに、ＣＩＳ「プレイ」の１／１０希釈したものを感染させた細胞を示す。パネル２〜５は、１／１０から１／１０，０００連続希釈した場合を示し、一方、パネル６は、ＣＩＳ「プレイ」不在下でレトロウイルスｃＤＮＡライブラリーに感染させた細胞の結果を示している。並行して行なった「スパイキング（spiking）」実験において、２１個の解析されたクローン中１９個がｇｐ１３０−ＣＩＳ「プレイ」転写物を含んでいた。
（Ｆ）ＥｐｏＲ「ベイト」−ＳＯＣＳ−２「プレイ」相互作用の機能的解析。ＥｐｏＲ「ベイト」を用いてＨＥＫ２９３  ｃＤＮＡライブラリーをＭＡＰＰＩＴスクリーニングしたところ、ＳＯＣＳ−２「プレイ」コンストラクトを発現する細胞クローンが単離された。この選択クローンを、ｐＸＰ２ｄ２−ｒＰＡＰ１−ｌｕｃｉレポーターだけで一過的にトランスフェクトするか、またはＬＲ−Ｆ３変異型をコードするベクターと一緒に一過的にトランスフェクトして、それぞれ、Ｅｐｏまたはレプチンで２４時間刺激するか、そのまま刺激しないままにした。上段のパネルは、上部に活性化されたレセプターの概略図を示すとともに、対応するルシフェラーゼの誘導を示している。下段のパネルには、ＳＯＣＳ−２「プレイ」キメラと、本来のＳＯＣＳ−２およびＣＩＳを図示した。
（Ｇ）ＥｐｏＲ「ベイト」−ＳＯＣＳ−２「プレイ」相互作用はリン酸化依存的である。（上段パネル）ＥｐｏＲ「ベイト」をもつキメラレセプター（２９３−１６  ＥｐｏＲ）またはこれを持たないキメラレセプター（２９３−１６  ＬＦ−Ｆ３）を発現するＨＥＫ２９３−１６細胞をＥｐｏで刺激するか、無処理のまま置いた。ＥｐｏＲ「ベイト」のリガンド依存的リン酸化が見られるが、一方で、ＬＲ−Ｆ３キメラのリン酸化は起こらなかった。
（中段および下段のパネル）ＥｐｏＲ「ベイト」発現用コンストラクト（ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲ）およびＳＯＣＳ−２「プレイ」発現用コンストラクトによって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過的にトランスフェクトした。中段パネルおよび下段パネルは、それぞれ、リガンド依存的「プレイ」、および、ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲでトランスフェクトしたときにのみ観察され、ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲＦでトランスフェクトしたときには観察されなかったＳＴＡＴ３リン酸化を示している。また、ＳＯＣＳ−２「プレイ」およびＳＴＡＴ３についての発現対照も示す。
【図９Ｄ】  ツーハイブリッド・スクリーニングを行なうためのＭＡＰＰＩＴ法の手順
（Ａ）ＨＥＫ２９３−１６細胞株はピューロマイシン耐性を示す。ＨＥＫ２９３−１６細胞を２４ウェル培養皿に播種し、そのまま処理しないで置く（上段のウェル）か、ＬＩＦを用いて予めｇｐ１３０の活性化を４８時間行なってから（中段のウェル）、またはそれを行わず（下段のウェル）にピューロマイシン（１μg／ml）選択を行なった。１週間後、生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。
（Ｂ）ＥｐｏＲ「ベイト」を発現する同質遺伝子系ＨＥＫ２９３−１６細胞の選択。ＨＥＫ２９３−１６細胞をｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ−ＥｐｏＲ「ベイト」およびＦｌｐリコンビナーゼ発現ベクターによって同じトランスフェクトしてから、１０日間ハイグロマイシン（１００μg／ml）耐性による選択を行なった。細胞を、ＥｐｏＲおよびＡｌｅｘａ４８８で標識した二次抗体の細胞外ドメインを認識するポリクローナル抗血清を用いて染色した。実線と点線は、それぞれ、親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、およびハイグロマイシン選択されたＨＥＫ２９３−１６細胞を示す。
（Ｃ）同種の「プレイ」−「ベイト」相互作用を利用した細胞選択。（Ｂ）のハイグロマイシン耐性細胞を２４ウェル培養皿に播種し、ＣＩＳ「プレイ」を発現するレトロウイルス（レトロウイルス保存液を３０分の１に希釈したもの）に４８時間感染させ、そのまま無処理のまま置く（上段のウェル）か、ピューロマイシン（１μg／ml）で処理する前に、さらに４８時間Ｅｐｏで刺激した（中段のウェル）。下段のウェルは、上記のようにして選択されたが、無関係なｌａｃＺタンパク質を発現する（レトロウイルス保存液を３分の１に希釈したもの）、Ｅｐｏで刺激された細胞を示している。７日後、生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。
（Ｄ）ピューロマイシン耐性細胞は、「プレイ」キメラを発現する。親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、または（ｃ）で得られたピューロマイシン耐性細胞を透過性にし、続いて抗ＦＬＡＧ抗体、およびＦＩＴＣ標識した二次抗体で処理してから、ＦＡＣＳ分析を行なった。実線と点線は、それぞれ、親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、およびピューロマイシン選択されたＨＥＫ２９３−１６細胞を示す。「プレイ」キメラをコードする転写物の（ＩＮＳＥＴ）ＲＴ−ＰＣＲ検出法。（Ｃ）で得られた細胞を溶解し、「プレイ」をコードする転写物をＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。矢印はＣＩＳ特異的増幅産物を示しているが、これはＤＮＡシーケンシングによって確認された。親株細胞に対する陰性対照処理も行なった（真ん中のレーン）。Ｍ：マーカーレーン
（Ｅ）ｇｐ１３０−ＣＩＳ「プレイ」発現細胞クローンの用量依存的回収。ＥｐｏＲ「ベイト」発現細胞を７５cm2の培養フラスコに播種し、複合的レトロウイルスＨＥＫ２９３  ｃＤＮＡライブラリーで１０分の１ずつ連続希釈したＣＩＳ「プレイ」発現レトロウイルスを感染させた。選択後、ピューロマイシン耐性コロニーをクリスタルバイオレットで染色した。パネル１は、Ｅｐｏ刺激することなしに、ＣＩＳ「プレイ」の１／１０希釈したものを感染させた細胞を示す。パネル２〜５は、１／１０から１／１０，０００連続希釈した場合を示し、一方、パネル６は、ＣＩＳ「プレイ」不在下でレトロウイルスｃＤＮＡライブラリーに感染させた細胞の結果を示している。並行して行なった「スパイキング（spiking）」実験において、２１個の解析されたクローン中１９個がｇｐ１３０−ＣＩＳ「プレイ」転写物を含んでいた。
（Ｆ）ＥｐｏＲ「ベイト」−ＳＯＣＳ−２「プレイ」相互作用の機能的解析。ＥｐｏＲ「ベイト」を用いてＨＥＫ２９３  ｃＤＮＡライブラリーをＭＡＰＰＩＴスクリーニングしたところ、ＳＯＣＳ−２「プレイ」コンストラクトを発現する細胞クローンが単離された。この選択クローンを、ｐＸＰ２ｄ２−ｒＰＡＰ１−ｌｕｃｉレポーターだけで一過的にトランスフェクトするか、またはＬＲ−Ｆ３変異型をコードするベクターと一緒に一過的にトランスフェクトして、それぞれ、Ｅｐｏまたはレプチンで２４時間刺激するか、そのまま刺激しないままにした。上段のパネルは、上部に活性化されたレセプターの概略図を示すとともに、対応するルシフェラーゼの誘導を示している。下段のパネルには、ＳＯＣＳ−２「プレイ」キメラと、本来のＳＯＣＳ−２およびＣＩＳを図示した。
（Ｇ）ＥｐｏＲ「ベイト」−ＳＯＣＳ−２「プレイ」相互作用はリン酸化依存的である。（上段パネル）ＥｐｏＲ「ベイト」をもつキメラレセプター（２９３−１６  ＥｐｏＲ）またはこれを持たないキメラレセプター（２９３−１６  ＬＦ−Ｆ３）を発現するＨＥＫ２９３−１６細胞をＥｐｏで刺激するか、無処理のまま置いた。ＥｐｏＲ「ベイト」のリガンド依存的リン酸化が見られるが、一方で、ＬＲ−Ｆ３キメラのリン酸化は起こらなかった。
（中段および下段のパネル）ＥｐｏＲ「ベイト」発現用コンストラクト（ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲ）およびＳＯＣＳ−２「プレイ」発現用コンストラクトによって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過的にトランスフェクトした。中段パネルおよび下段パネルは、それぞれ、リガンド依存的「プレイ」、および、ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲでトランスフェクトしたときにのみ観察され、ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲＦでトランスフェクトしたときには観察されなかったＳＴＡＴ３リン酸化を示している。また、ＳＯＣＳ−２「プレイ」およびＳＴＡＴ３についての発現対照も示す。
【図９Ｅ】  ツーハイブリッド・スクリーニングを行なうためのＭＡＰＰＩＴ法の手順
（Ａ）ＨＥＫ２９３−１６細胞株はピューロマイシン耐性を示す。ＨＥＫ２９３−１６細胞を２４ウェル培養皿に播種し、そのまま処理しないで置く（上段のウェル）か、ＬＩＦを用いて予めｇｐ１３０の活性化を４８時間行なってから（中段のウェル）、またはそれを行わず（下段のウェル）にピューロマイシン（１μg／ml）選択を行なった。１週間後、生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。
（Ｂ）ＥｐｏＲ「ベイト」を発現する同質遺伝子系ＨＥＫ２９３−１６細胞の選択。ＨＥＫ２９３−１６細胞をｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ−ＥｐｏＲ「ベイト」およびＦｌｐリコンビナーゼ発現ベクターによって同じトランスフェクトしてから、１０日間ハイグロマイシン（１００μg／ml）耐性による選択を行なった。細胞を、ＥｐｏＲおよびＡｌｅｘａ４８８で標識した二次抗体の細胞外ドメインを認識するポリクローナル抗血清を用いて染色した。実線と点線は、それぞれ、親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、およびハイグロマイシン選択されたＨＥＫ２９３−１６細胞を示す。
（Ｃ）同種の「プレイ」−「ベイト」相互作用を利用した細胞選択。（Ｂ）のハイグロマイシン耐性細胞を２４ウェル培養皿に播種し、ＣＩＳ「プレイ」を発現するレトロウイルス（レトロウイルス保存液を３０分の１に希釈したもの）に４８時間感染させ、そのまま無処理のまま置く（上段のウェル）か、ピューロマイシン（１μg／ml）で処理する前に、さらに４８時間Ｅｐｏで刺激した（中段のウェル）。下段のウェルは、上記のようにして選択されたが、無関係なｌａｃＺタンパク質を発現する（レトロウイルス保存液を３分の１に希釈したもの）、Ｅｐｏで刺激された細胞を示している。７日後、生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。
（Ｄ）ピューロマイシン耐性細胞は、「プレイ」キメラを発現する。親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、または（ｃ）で得られたピューロマイシン耐性細胞を透過性にし、続いて抗ＦＬＡＧ抗体、およびＦＩＴＣ標識した二次抗体で処理してから、ＦＡＣＳ分析を行なった。実線と点線は、それぞれ、親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、およびピューロマイシン選択されたＨＥＫ２９３−１６細胞を示す。「プレイ」キメラをコードする転写物の（ＩＮＳＥＴ）ＲＴ−ＰＣＲ検出法。（Ｃ）で得られた細胞を溶解し、「プレイ」をコードする転写物をＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。矢印はＣＩＳ特異的増幅産物を示しているが、これはＤＮＡシーケンシングによって確認された。親株細胞に対する陰性対照処理も行なった（真ん中のレーン）。Ｍ：マーカーレーン
（Ｅ）ｇｐ１３０−ＣＩＳ「プレイ」発現細胞クローンの用量依存的回収。ＥｐｏＲ「ベイト」発現細胞を７５cm2の培養フラスコに播種し、複合的レトロウイルスＨＥＫ２９３  ｃＤＮＡライブラリーで１０分の１ずつ連続希釈したＣＩＳ「プレイ」発現レトロウイルスを感染させた。選択後、ピューロマイシン耐性コロニーをクリスタルバイオレットで染色した。パネル１は、Ｅｐｏ刺激することなしに、ＣＩＳ「プレイ」の１／１０希釈したものを感染させた細胞を示す。パネル２〜５は、１／１０から１／１０，０００連続希釈した場合を示し、一方、パネル６は、ＣＩＳ「プレイ」不在下でレトロウイルスｃＤＮＡライブラリーに感染させた細胞の結果を示している。並行して行なった「スパイキング（spiking）」実験において、２１個の解析されたクローン中１９個がｇｐ１３０−ＣＩＳ「プレイ」転写物を含んでいた。
（Ｆ）ＥｐｏＲ「ベイト」−ＳＯＣＳ−２「プレイ」相互作用の機能的解析。ＥｐｏＲ「ベイト」を用いてＨＥＫ２９３  ｃＤＮＡライブラリーをＭＡＰＰＩＴスクリーニングしたところ、ＳＯＣＳ−２「プレイ」コンストラクトを発現する細胞クローンが単離された。この選択クローンを、ｐＸＰ２ｄ２−ｒＰＡＰ１−ｌｕｃｉレポーターだけで一過的にトランスフェクトするか、またはＬＲ−Ｆ３変異型をコードするベクターと一緒に一過的にトランスフェクトして、それぞれ、Ｅｐｏまたはレプチンで２４時間刺激するか、そのまま刺激しないままにした。上段のパネルは、上部に活性化されたレセプターの概略図を示すとともに、対応するルシフェラーゼの誘導を示している。下段のパネルには、ＳＯＣＳ−２「プレイ」キメラと、本来のＳＯＣＳ−２およびＣＩＳを図示した。
（Ｇ）ＥｐｏＲ「ベイト」−ＳＯＣＳ−２「プレイ」相互作用はリン酸化依存的である。（上段パネル）ＥｐｏＲ「ベイト」をもつキメラレセプター（２９３−１６  ＥｐｏＲ）またはこれを持たないキメラレセプター（２９３−１６  ＬＦ−Ｆ３）を発現するＨＥＫ２９３−１６細胞をＥｐｏで刺激するか、無処理のまま置いた。ＥｐｏＲ「ベイト」のリガンド依存的リン酸化が見られるが、一方で、ＬＲ−Ｆ３キメラのリン酸化は起こらなかった。
（中段および下段のパネル）ＥｐｏＲ「ベイト」発現用コンストラクト（ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲ）およびＳＯＣＳ−２「プレイ」発現用コンストラクトによって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過的にトランスフェクトした。中段パネルおよび下段パネルは、それぞれ、リガンド依存的「プレイ」、および、ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲでトランスフェクトしたときにのみ観察され、ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲＦでトランスフェクトしたときには観察されなかったＳＴＡＴ３リン酸化を示している。また、ＳＯＣＳ−２「プレイ」およびＳＴＡＴ３についての発現対照も示す。
【図９Ｆ】  ツーハイブリッド・スクリーニングを行なうためのＭＡＰＰＩＴ法の手順
（Ａ）ＨＥＫ２９３−１６細胞株はピューロマイシン耐性を示す。ＨＥＫ２９３−１６細胞を２４ウェル培養皿に播種し、そのまま処理しないで置く（上段のウェル）か、ＬＩＦを用いて予めｇｐ１３０の活性化を４８時間行なってから（中段のウェル）、またはそれを行わず（下段のウェル）にピューロマイシン（１μg／ml）選択を行なった。１週間後、生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。
（Ｂ）ＥｐｏＲ「ベイト」を発現する同質遺伝子系ＨＥＫ２９３−１６細胞の選択。ＨＥＫ２９３−１６細胞をｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ−ＥｐｏＲ「ベイト」およびＦｌｐリコンビナーゼ発現ベクターによって同じトランスフェクトしてから、１０日間ハイグロマイシン（１００μg／ml）耐性による選択を行なった。細胞を、ＥｐｏＲおよびＡｌｅｘａ４８８で標識した二次抗体の細胞外ドメインを認識するポリクローナル抗血清を用いて染色した。実線と点線は、それぞれ、親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、およびハイグロマイシン選択されたＨＥＫ２９３−１６細胞を示す。
（Ｃ）同種の「プレイ」−「ベイト」相互作用を利用した細胞選択。（Ｂ）のハイグロマイシン耐性細胞を２４ウェル培養皿に播種し、ＣＩＳ「プレイ」を発現するレトロウイルス（レトロウイルス保存液を３０分の１に希釈したもの）に４８時間感染させ、そのまま無処理のまま置く（上段のウェル）か、ピューロマイシン（１μg／ml）で処理する前に、さらに４８時間Ｅｐｏで刺激した（中段のウェル）。下段のウェルは、上記のようにして選択されたが、無関係なｌａｃＺタンパク質を発現する（レトロウイルス保存液を３分の１に希釈したもの）、Ｅｐｏで刺激された細胞を示している。７日後、生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。
（Ｄ）ピューロマイシン耐性細胞は、「プレイ」キメラを発現する。親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、または（ｃ）で得られたピューロマイシン耐性細胞を透過性にし、続いて抗ＦＬＡＧ抗体、およびＦＩＴＣ標識した二次抗体で処理してから、ＦＡＣＳ分析を行なった。実線と点線は、それぞれ、親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、およびピューロマイシン選択されたＨＥＫ２９３−１６細胞を示す。「プレイ」キメラをコードする転写物の（ＩＮＳＥＴ）ＲＴ−ＰＣＲ検出法。（Ｃ）で得られた細胞を溶解し、「プレイ」をコードする転写物をＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。矢印はＣＩＳ特異的増幅産物を示しているが、これはＤＮＡシーケンシングによって確認された。親株細胞に対する陰性対照処理も行なった（真ん中のレーン）。Ｍ：マーカーレーン
（Ｅ）ｇｐ１３０−ＣＩＳ「プレイ」発現細胞クローンの用量依存的回収。ＥｐｏＲ「ベイト」発現細胞を７５cm2の培養フラスコに播種し、複合的レトロウイルスＨＥＫ２９３  ｃＤＮＡライブラリーで１０分の１ずつ連続希釈したＣＩＳ「プレイ」発現レトロウイルスを感染させた。選択後、ピューロマイシン耐性コロニーをクリスタルバイオレットで染色した。パネル１は、Ｅｐｏ刺激することなしに、ＣＩＳ「プレイ」の１／１０希釈したものを感染させた細胞を示す。パネル２〜５は、１／１０から１／１０，０００連続希釈した場合を示し、一方、パネル６は、ＣＩＳ「プレイ」不在下でレトロウイルスｃＤＮＡライブラリーに感染させた細胞の結果を示している。並行して行なった「スパイキング（spiking）」実験において、２１個の解析されたクローン中１９個がｇｐ１３０−ＣＩＳ「プレイ」転写物を含んでいた。
（Ｆ）ＥｐｏＲ「ベイト」−ＳＯＣＳ−２「プレイ」相互作用の機能的解析。ＥｐｏＲ「ベイト」を用いてＨＥＫ２９３  ｃＤＮＡライブラリーをＭＡＰＰＩＴスクリーニングしたところ、ＳＯＣＳ−２「プレイ」コンストラクトを発現する細胞クローンが単離された。この選択クローンを、ｐＸＰ２ｄ２−ｒＰＡＰ１−ｌｕｃｉレポーターだけで一過的にトランスフェクトするか、またはＬＲ−Ｆ３変異型をコードするベクターと一緒に一過的にトランスフェクトして、それぞれ、Ｅｐｏまたはレプチンで２４時間刺激するか、そのまま刺激しないままにした。上段のパネルは、上部に活性化されたレセプターの概略図を示すとともに、対応するルシフェラーゼの誘導を示している。下段のパネルには、ＳＯＣＳ−２「プレイ」キメラと、本来のＳＯＣＳ−２およびＣＩＳを図示した。
（Ｇ）ＥｐｏＲ「ベイト」−ＳＯＣＳ−２「プレイ」相互作用はリン酸化依存的である。（上段パネル）ＥｐｏＲ「ベイト」をもつキメラレセプター（２９３−１６  ＥｐｏＲ）またはこれを持たないキメラレセプター（２９３−１６  ＬＦ−Ｆ３）を発現するＨＥＫ２９３−１６細胞をＥｐｏで刺激するか、無処理のまま置いた。ＥｐｏＲ「ベイト」のリガンド依存的リン酸化が見られるが、一方で、ＬＲ−Ｆ３キメラのリン酸化は起こらなかった。
（中段および下段のパネル）ＥｐｏＲ「ベイト」発現用コンストラクト（ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲ）およびＳＯＣＳ−２「プレイ」発現用コンストラクトによって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過的にトランスフェクトした。中段パネルおよび下段パネルは、それぞれ、リガンド依存的「プレイ」、および、ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲでトランスフェクトしたときにのみ観察され、ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲＦでトランスフェクトしたときには観察されなかったＳＴＡＴ３リン酸化を示している。また、ＳＯＣＳ−２「プレイ」およびＳＴＡＴ３についての発現対照も示す。
【図９Ｇ】  ツーハイブリッド・スクリーニングを行なうためのＭＡＰＰＩＴ法の手順
（Ａ）ＨＥＫ２９３−１６細胞株はピューロマイシン耐性を示す。ＨＥＫ２９３−１６細胞を２４ウェル培養皿に播種し、そのまま処理しないで置く（上段のウェル）か、ＬＩＦを用いて予めｇｐ１３０の活性化を４８時間行なってから（中段のウェル）、またはそれを行わず（下段のウェル）にピューロマイシン（１μg／ml）選択を行なった。１週間後、生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。
（Ｂ）ＥｐｏＲ「ベイト」を発現する同質遺伝子系ＨＥＫ２９３−１６細胞の選択。ＨＥＫ２９３−１６細胞をｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴ−ＥｐｏＲ「ベイト」およびＦｌｐリコンビナーゼ発現ベクターによって同じトランスフェクトしてから、１０日間ハイグロマイシン（１００μg／ml）耐性による選択を行なった。細胞を、ＥｐｏＲおよびＡｌｅｘａ４８８で標識した二次抗体の細胞外ドメインを認識するポリクローナル抗血清を用いて染色した。実線と点線は、それぞれ、親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、およびハイグロマイシン選択されたＨＥＫ２９３−１６細胞を示す。
（Ｃ）同種の「プレイ」−「ベイト」相互作用を利用した細胞選択。（Ｂ）のハイグロマイシン耐性細胞を２４ウェル培養皿に播種し、ＣＩＳ「プレイ」を発現するレトロウイルス（レトロウイルス保存液を３０分の１に希釈したもの）に４８時間感染させ、そのまま無処理のまま置く（上段のウェル）か、ピューロマイシン（１μg／ml）で処理する前に、さらに４８時間Ｅｐｏで刺激した（中段のウェル）。下段のウェルは、上記のようにして選択されたが、無関係なｌａｃＺタンパク質を発現する（レトロウイルス保存液を３分の１に希釈したもの）、Ｅｐｏで刺激された細胞を示している。７日後、生存細胞をクリスタルバイオレットで染色した。
（Ｄ）ピューロマイシン耐性細胞は、「プレイ」キメラを発現する。親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、または（ｃ）で得られたピューロマイシン耐性細胞を透過性にし、続いて抗ＦＬＡＧ抗体、およびＦＩＴＣ標識した二次抗体で処理してから、ＦＡＣＳ分析を行なった。実線と点線は、それぞれ、親株であるＨＥＫ２９３−１６細胞、およびピューロマイシン選択されたＨＥＫ２９３−１６細胞を示す。「プレイ」キメラをコードする転写物の（ＩＮＳＥＴ）ＲＴ−ＰＣＲ検出法。（Ｃ）で得られた細胞を溶解し、「プレイ」をコードする転写物をＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。矢印はＣＩＳ特異的増幅産物を示しているが、これはＤＮＡシーケンシングによって確認された。親株細胞に対する陰性対照処理も行なった（真ん中のレーン）。Ｍ：マーカーレーン
（Ｅ）ｇｐ１３０−ＣＩＳ「プレイ」発現細胞クローンの用量依存的回収。ＥｐｏＲ「ベイト」発現細胞を７５cm2の培養フラスコに播種し、複合的レトロウイルスＨＥＫ２９３  ｃＤＮＡライブラリーで１０分の１ずつ連続希釈したＣＩＳ「プレイ」発現レトロウイルスを感染させた。選択後、ピューロマイシン耐性コロニーをクリスタルバイオレットで染色した。パネル１は、Ｅｐｏ刺激することなしに、ＣＩＳ「プレイ」の１／１０希釈したものを感染させた細胞を示す。パネル２〜５は、１／１０から１／１０，０００連続希釈した場合を示し、一方、パネル６は、ＣＩＳ「プレイ」不在下でレトロウイルスｃＤＮＡライブラリーに感染させた細胞の結果を示している。並行して行なった「スパイキング（spiking）」実験において、２１個の解析されたクローン中１９個がｇｐ１３０−ＣＩＳ「プレイ」転写物を含んでいた。
（Ｆ）ＥｐｏＲ「ベイト」−ＳＯＣＳ−２「プレイ」相互作用の機能的解析。ＥｐｏＲ「ベイト」を用いてＨＥＫ２９３  ｃＤＮＡライブラリーをＭＡＰＰＩＴスクリーニングしたところ、ＳＯＣＳ−２「プレイ」コンストラクトを発現する細胞クローンが単離された。この選択クローンを、ｐＸＰ２ｄ２−ｒＰＡＰ１−ｌｕｃｉレポーターだけで一過的にトランスフェクトするか、またはＬＲ−Ｆ３変異型をコードするベクターと一緒に一過的にトランスフェクトして、それぞれ、Ｅｐｏまたはレプチンで２４時間刺激するか、そのまま刺激しないままにした。上段のパネルは、上部に活性化されたレセプターの概略図を示すとともに、対応するルシフェラーゼの誘導を示している。下段のパネルには、ＳＯＣＳ−２「プレイ」キメラと、本来のＳＯＣＳ−２およびＣＩＳを図示した。
（Ｇ）ＥｐｏＲ「ベイト」−ＳＯＣＳ−２「プレイ」相互作用はリン酸化依存的である。（上段パネル）ＥｐｏＲ「ベイト」をもつキメラレセプター（２９３−１６  ＥｐｏＲ）またはこれを持たないキメラレセプター（２９３−１６  ＬＦ−Ｆ３）を発現するＨＥＫ２９３−１６細胞をＥｐｏで刺激するか、無処理のまま置いた。ＥｐｏＲ「ベイト」のリガンド依存的リン酸化が見られるが、一方で、ＬＲ−Ｆ３キメラのリン酸化は起こらなかった。
（中段および下段のパネル）ＥｐｏＲ「ベイト」発現用コンストラクト（ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲ）およびＳＯＣＳ−２「プレイ」発現用コンストラクトによって、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過的にトランスフェクトした。中段パネルおよび下段パネルは、それぞれ、リガンド依存的「プレイ」、および、ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲでトランスフェクトしたときにのみ観察され、ｐＳＥＬ１−ＥｐｏＲＦでトランスフェクトしたときには観察されなかったＳＴＡＴ３リン酸化を示している。また、ＳＯＣＳ−２「プレイ」およびＳＴＡＴ３についての発現対照も示す。
【図１０】  化学発光計測器で、ルシフェラーゼ発光を測定したときのＨｅｋ２９３Ｔ細胞株におけるＩＬ３Ｒ−、ＩＬ５Ｒ−、およびＧＭ−ＣＳＦＲ−ＬｅｐＲキメラの機能性（ｃｐｓ）
以下で細胞をトランスフェクトした：
a. pSV-SPORT-EpoR/LepR + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
b. pSV-SPORT-IL-3Rα/LepR + pSV-SPORT-βc/LepR + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
c. pSV-SPORT-IL-5Rα/LepR + pSV-SPORT-βc/LepR + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
d. pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR + pSV-SPORT-βc/LepR + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
e. pSV-SPORT-IL-3Rα/LepR + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
f. pSV-SPORT-IL-5Rα/LepR + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
g. pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
h. pSV-SPORT-βc/LepR + pGL3-rPAP1-luci + pUT651
ＮＣ：無刺激の陰性対照。刺激は、実施例に記載されているとおりに行なった。
【図１１】  化学発光計測器で、ルシフェラーゼ発光を測定したときのＳｍａｄ３−Ｓｍａｄ４リン酸化依存的相互作用トラップの機能性（ｃｐｓ）
以下で細胞をトランスフェクトした：
a. pSV-SPORT-βc/LepR-F3-ALK4CA + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-Smad3 + pMG2-Smad4 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
b. pSV-SPORT-βc/LepR-F3-Smad3 + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-ALK4CA + pMG2-Smad4 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
c. pSV-SPORT-βc/LepR-F3 + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-Smad3 + pMG2-Smad4 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
d. pSV-SPORT-βc/LepR-F3-Smad3 + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3 + pMG2-Smad4 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
e. pSV-SPORT-βc/LepR-F3-ALK4CA + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3 + pMG2-Smad4 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
f. pSV-SPORT-βc/LepR-F3 + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-ALK4CA + pMG2-Smad4 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
g. pSV-SPORT-βc/LepR-F3-ALK4CA + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-Smad3 + pMG2 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
h. pSV-SPORT-βc/LepR-F3-Smad3 + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-ALK4CA + pMG2 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
i. pSV-SPORT-βc/LepR-F3-ALK4CA + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-Smad3 + pMET7-Smad4 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
j. pSV-SPORT-βc/LepR-F3-Smad3 + pSV-SPORT-GM-CSFRα/LepR-F3-ALK4CA + pMET7-Smad4 + pXP2d2-rPAP1luci + pUT651.
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
0004756813.tif 000037
【図９Ｂ】
0004756813.tif 000038
【図９Ｃ】
0004756813.tif 000039
【図９Ｄ】
0004756813.tif 000040
【図９Ｅ】
0004756813.tif 000041
【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
0004756813.tif 000043
【図１０】
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【図１１】
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