(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルピンの配列を含み、
前記セルピンの反応性セルピンループ（Ｐ６−Ｐ’６）は、カリクレインに特異的な基質活性部位配列のうち少なくとも１つを含み、
前記カリクレインに特異的な基質活性部位配列は、ＳＳＲＴＥ、ＫＴＲＳＮ、ＩＳＰＲＳ、ＧＶＦＲＳ、ＧＴＶＲＳ、ＥＴＫＲＳ、ＬＧＲＳＬ、ＲＧＲＳＥ、ＲＲＳＩＤ、ＶＬＲＳＰ、ＰＦＲＳＳ、ＲＳＧＳＶ、ＡＲＡＲＳ、ＳＤＲＴＡ、ＫＬＲＴＴ、ＲＡＡＭＭ、ＴＲＡＰＭ、ＤＶＲＡＡ、ＰＧＲＡＰ、ＶＥＳＲＡ、ＡＲＡＳＥ、ＴＬＱＲＶ、ＲＬＥＲＶ、ＥＲＶＳＰ、ＳＳＰＲＶ、ＲＶＧＰＶ、ＰＳＡＲＭ、ＲＧＲＭＡ、ＴＶＲＭＰ、ＬＲＭＰＴ、ＨＲＭＳＳ、ＲＰＱＥＬ、ＶＲＰＬＥ、ＳＧＲＬＡ、ＧＴＬＲＦ、ＱＷＲＮＳ、ＲＮＤＫＬ、ＭＲＮＲＡ、ＴＲＤＳＲ、ＴＧＳＲＤ、ＩＭＳＲＱ、ＬＴＴＳＫおよびＰＦＲＫＩから選ばれるペンタペプチドである、カリクレインに対する組み換えインヒビタータンパク質。
【請求項２】
請求項１において、
前記カリクレインはｈＫ２カリクレインである、カリクレインに対する組み換えインヒビタータンパク質。
【請求項３】
請求項１または２において、
前記反応性セルピンループは、配列番号１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２の配列からなる群から選ばれる、カリクレインに対する組み換えインヒビタータンパク質。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれかにおいて、
前記セルピンの配列は、α−１アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）、プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）、α−１アンチプロテイナーゼ（ＡＡＴ）、ヒトα−１アンチトリプシン関連タンパク質前駆体（ＡＴＲ）、α−２−プラスミンインヒビター（ＡＡＰ）、ヒト抗トロンビン−III前駆体（ＡＴIII）、プロテアーゼインヒビター１０（ＰＩ１０）、ヒトコラーゲン結合タンパク質２前駆体（ＣＢＰ２）、プロテアーゼインヒビター７（ＰＩ７）、プロテアーゼインヒビタールーセプリン２（ＨＬＳ２）、ヒトプラスマプロテアーゼＣ１インヒビター（Ｃ１  ＩＮＨ）、単球／好中球エラスターゼインヒビター（Ｍ／ＮＥＩ）、プラスミノーゲン活性化インヒビター−３（ＰＡＩ３）、プロテアーゼインヒビター４（ＰＩ４）、プロテアーゼインヒビター５（ＰＩ５）、プロテアーゼインヒビター１２（ＰＩ１２）、ヒトプラスミノーゲン活性化インヒビター−１前駆体内皮（ＰＡＩ−１）、ヒトプラスミノーゲン活性化インヒビター−２胎盤（ＰＡＩ−２）、色素上皮由来因子前駆体（ＰＥＤＦ）、プロテアーゼインヒビター６（ＰＩ６）、プロテアーゼインヒビター８（ＰＩ８）、プロテアーゼインヒビター９（ＰＩ９）、ヒト扁平上皮細胞癌抗原（ＳＣＣＡ−１）、ヒト扁平上皮細胞癌抗原（ＳＣＣＡ−２）、Ｔ４−結合グロブリン（ＴＢＧ）、メグシン、およびプロテアーゼインヒビター１４（ＰＩ１４）からなる群から選ばれる、カリクレインに対する組み換えインヒビタータンパク質。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれかにおいて、
配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、および配列番号１４からなる群から選ばれる配列からなる、カリクレインに対する組み換えインヒビタータンパク質。
【請求項６】
請求項５において、
配列番号４または配列番号８で表される配列からなる、カリクレインに対する組み換えインヒビタータンパク質。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれかに記載のカリクレインに対する組み換えインヒビタータンパク質であって、
前記カリクレインに特異的な基質活性部位配列の少なくとも１つが、ファージディスプレイランダムペンタペプチドライブラリーを用いて、カリクレインによって選択された基質ペプチドである、カリクレインに対する組み換えインヒビタータンパク質。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれかに記載のカリクレインに対する組み換えインヒビタータンパク質をコードする、精製および単離されたＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８において、
前記配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１３を含む群から選ばれる、精製および単離されたＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の精製および単離されたＤＮＡを含む、発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１０において、
前記精製および単離されたＤＮＡが機能するように、該精製および単離されたＤＮＡと結合するプロモーターをさらに含む、発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターを用いて形質転換された、真核または原核宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１ないし７のいずれかに記載のカリクレインに対する組み換えインヒビタータンパク質を活性物質として含み、かつ、１またはそれ以上の薬学的に許容しうる担体を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
ほ乳類での、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、または感染症を治療または防止するための薬剤の調整に使用される、請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１４において、
前記がんは前立腺がん、乳がん、または転移性がんである、医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１４において、
前記炎症性疾患は良性前立腺肥大である、医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１ないし７のいずれかに記載のカリクレインに対する組み換えインヒビタータンパク質の製造方法であって、
（ａ）カリクレインに特異的な基質活性部位をコードするポリヌクレオチド配列を選択すること、
（ｂ）前記ポリペプチド配列を、セルピンの配列をコードする配列中に導入し、カリクレインに対する組み換えインヒビタータンパク質を得ること、
（ｃ）適切な条件下で細胞発現系にて前記カリクレインに対する組み換えインヒビタータンパク質を発現させること、および
（ｄ）前記カリクレインに対する組み換えインヒビタータンパク質を回収すること
を含む、方法。
【請求項１８】
請求項１７において、
前記工程（ａ）は、ファージディスプレイライブラリスクリーニングにより行なわれる、方法。
【請求項１９】
請求項１７または１８において、
前記適切な条件は、前記細胞発現系にて１０−４０℃で１０−３０時間培養することである、方法。
【請求項２０】
請求項１９において、
前記適切な条件は、１６℃で１６時間培養することである、方法。
【請求項２１】
請求項１７ないし２０のいずれかにおいて、
前記工程（ｄ）は、前記細胞発現系から前記カリクレインに対する組み換えインヒビタータンパク質を抽出した後に分離することにより行なわれる、方法。
【請求項２２】
請求項２１において、
前記カリクレインに対する組み換えインヒビタータンパク質の分離は、アフィニティークロマトグラフィーにより行なわれる、方法。
【請求項２３】
請求項１７ないし２１のいずれかにおいて、
前記カリクレインに対する組み換えインヒビタータンパク質はさらに、前記カリクレインの活性に対する阻害活性を評価される、方法。
【請求項２４】
請求項１７ないし２１のいずれかにおいて、
前記細胞発現系は、細菌細胞である、方法。
【請求項２５】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１３からなる群から選ばれるいずれかの精製および単離されたＤＮＡ、該ＤＮＡの配列に相補的な配列であるＤＮＡ、および／または該ＤＮＡの断片を含む、試料中のカリクレインを検出するためのキット。
【請求項２６】
請求項１ないし７のいずれかに記載のカリクレインに対する組み換えインヒビタータンパク質を含む、試料中のカリクレインを検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、インヒビターのポリペプチド配列と、プロテアーゼに特異的な基質-酵素相互作用部位からなる少なくとも１つのポリペプチド配列とを含む、プロテアーゼに対するキメラインヒビタータンパク質に関する。
【０００２】
今回の発明の別の目的は、プロテアーゼに対するキメラインヒビタータンパク質をコードする精製・単離されたＤＮＡ配列、前述の精製・単離されたＤＮＡ配列を含むことで特徴付けられた発現ベクター、この発現ベクターを用いて形質転換された真核または原核宿主細胞およびキメラインヒビタータンパク質の産生方法を規定することである。
【背景技術】
【０００３】
［発明の背景］
生物が発現するタンパク質のうち、プロテアーゼは、細胞の生死に関わる経路を媒介する最も重要なタンパク質に含まれる。実際に、プロテアーゼと基質との初期相互作用とそれに続く基質の分解は、血栓症、血液凝固、およびアポトーシスを含む必須の生体事象の膨大な多様性を構成している。
【０００４】
がん、自己免疫疾患、炎症、および感染症など、プロテアーゼが関連している多くの病状においては、制御不能なタンパク質分解またはプロテアーゼと抗プロテアーゼとのアンバランスが主要な要因であろうという仮説に基づいて、前記タンパク質分解または前記アンバランスについて精力的な研究が続けられている。
【０００５】
がんや炎症性疾患（慢性関節リウマチや肺気症など）のモデルにおいて、抗プロテアーゼ治療薬を用いて行われたさまざまな研究は、症状の改善を示す興味深い結果を示し、抗プロテアーゼ治療の効果およびプロテアーゼとインヒビターのバランスの役割を裏付けている。
【０００６】
たとえば、前立腺がんはアメリカ人男性で最も頻繁に診断されるがんのひとつであるが、プロテアーゼは急速ながんの成長、浸潤、および転移を含むがん細胞の悪性挙動において中心的な役割を果たしていると考えられている。
【０００７】
ヒト腺性カリクレインタンパク質(human kallikrein 2: hK2)は、前立腺上皮で優位に発現するトリプシン様セリンプロテアーゼである。ｈＫ２はヒト精漿から初めて単離され、前立腺がんの診断マーカーであることが近年明らかになった(デペルセス他，「ｈＧＫ−１としても知られている、前立腺カリクレインｈＫ２のヒト精漿からの単離」，バイオケミカ エ バイオフィジカ アクタ，第１２４５巻，３１１−３６１頁，１９９５年（Deperthes et al. 1995 “Isolation of prostatic kallikrein hK2, also known as hGK-1,
in human seminal plasma” Biochim Biophys Acta, 1245, 311-6）)。
【０００８】
ｈＫ２はマーカーとして機能するほか、ｈＫ２のタンパク質分解活性は、ｈＫ２ががんの進行に寄与していることを示唆している。この酵素についてはいくつかの潜在的な機能が提案されており、前記機能には、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の活性化、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子−１の不活性化、ｐｒｏ−ＰＳＡの活性化、フィブロネクチンの分解、およびインシュリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦ−ＢＰ）の分解が含まれる(クロウチェ他，「フェーズディスプレイにより選択された基質を用いた、ヒトカリクレイン２に特異的な組み換えインヒビターの開発」，ヨーロピアン ジャー
ナル オブ バイオケミストリー，第３巻，６０７−６１３頁，２００４年（Cloutier et al., 2004 “Development of recombinant inhibitors specific to human kallikrein 2
using phase-display selected substrates” Eur J Biochem, 3, 607-13）を参照)。
【０００９】
がん（特に前立腺がん）中で、ｈＫ２は、ＰＩ−６として知られているプロテアーゼインヒビターと特異的な複合体を形成することが最近明らかになった。
【００１０】
この特異的な複合体の発見に基づいて、米国特許第６，２８４，８７３号および米国特許第６，４７２，１４３号は、がんの有無または組織の壊死の有無を決定する診断方法を提供している。
【００１１】
前立腺組織に特異的な発現、ならびに、がん発生に関与するすべての潜在的な基質との関連により、ｈＫ２は潜在的な治療ターゲットであると考えられている(ダルソン他，「前立腺上皮内新生物および腺癌におけるヒト腺性カリクレイン２（ｈＫ２）の発現：新規な前立腺がんマーカー」，ウロロジー，第４９巻，８５７−８６２頁，１９９７年（Darson et al. 1997 “Human glandular kallikrein 2 (hK2) expression in prostatic intraepithelial neoplasia and adenocarcinoma: a novel prostate cancer marker” Urology, 49, 857-62）。このため、特異的でかつ長期間にわたって機能するプロテアーゼインヒビター、特にカリクレインインヒビターの開発は有益である。
【００１２】
これらのプロテアーゼインヒビターの候補は、セルピン(serpin: serine protease inhibitors)ファミリーから選択可能である。このファミリーは複雑な生理的過程の制御に関与する大きなタンパク質ファミリーである。約４５ｋＤａの分子量を有するこれらのタンパク質は２つのサブグループに分けることができる。一方はインヒビターであり、他方は非インヒビターである。
【００１３】
セルピンは、露出した柔軟な反応性ループ部位または反応性セルピンループ（reactive-serpin loop: RSL）を有し、前記反応性ループ部位または前記反応性セルピンループは、推定される標的プロテアーゼとの相互作用に関連している。酵素へ結合し、ＲＳＬのＰ１−Ｐ１’の切断部位が開裂すると、共有結合した複合体が形成される（ハンチントン他，「セルピン−プロテアーゼ複合体の構造は変形により阻害を示す」，２０００年，ネイチャー，第４０７巻，９２３−９２６頁(Huntington et al. 2000 “Structure of a serpin-protease complex shows inhibition by deformation” Nature, 407, 923-6)）。この複合体の形成は大きな配座再配置を引き起こし、これにより、標的プロテアーゼを不可逆的にトラップする。セルピンの阻害特異性は主に、Ｐ１−Ｐ１’に位置するアミノ酸残基の特性およびＲＳＬの長さに基因する。セルピンのＲＳＬドメインまたはセルピンの反応部位の改変は、セルピン−酵素間の阻害プロセスを理解し、特異的なインヒビターを開発するためのアプローチのひとつである（デュホー他，「フリンとの反応に関する、α １−アンチトリプシンのＰ６−Ｐ１領域内におけるアルギニン残基の寄与」，ジャーナル
オブ バイオロジカル ケミストリー，第２７６巻，３８９７１−３８９７９頁，２００１年、ならびに、プロントニック他，「セリン α（１）−アンチキモトリプシンの阻害特性における反応部位位置の効果」，ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー，第２７７巻，２９９２７−２９９３５頁，２００１年（(Dufour et al. 2001 “The contribution of arginine residues within the P6-P1 region of alpha 1-antitrypsin to its reaction with furin” J Biol Chem 276, 38971-9  and  Plotnick et al. 2002 “The effects of reactive site location on the inhibitory properties of the serpin
alpha(1)-antichymotrypsin” J Biol Chem, 277, 29927-35)）。
【００１４】
プロテインＣ、α２アンチプラスミン、アンチトロンビン−III、α１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）、またはプロテアーゼインヒビター６などのいくつかのセルピンはｈ
Ｋ２のインヒビターとして確認されている（サエディ他，「ヒトカリクレイン２（ｈＫ２）は前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）ではなく、前立腺癌細胞から遊離されるプロテアーゼインヒビター６（ＰＩ−６）と速やかに複合体を形成する」，インターナショナル ジャーナル オブ キャンサー，第９４巻，５５８−５６３頁（(Saedi et al. 2001 “Human kallikrein 2 (hK2), but not prostate-specific antigen (PSA), rapidly complexes with
protease inhibitor 6 (PI-6) released from prostate carcinoma cells” Int J Cancer, 94, 558-63)）。ｈＫ２−ＡＣＴ間の比較的遅い複合体形成は主に、ＲＳＬ中のＰ１−Ｐ１’部位のＬｅｕ３５８残基−Ｓｅｒ３５９残基に起因し、これらの残基はこのトリプシン様酵素にとって好ましくないペプチド結合である。
【００１５】
現在までに、新しいカリクレインインヒビター（プラスマカリクレインを特異的に阻害するカリクレインインヒビター）の選択ならびにその治療方法および診断方法への利用が発表されている(米国特許第６，０５７，２８７号，米国特許第６，３３３，４０２号，米国特許第５，９９４，１２５号，および米国特許第５，７９５，８６５号)。しかしながら、これらの特許は、ウシ膵トリプシンインヒビターのＫｕｎｉｔｚドメインに相同なインヒビターの産生（特に、プラスマカリクレインを特異的に阻害する、リプロプロテイン（liproprotein）に関連する凝固インヒビター（ＬＡＣＩ）のＫｕｎｉｔｚドメインに相同なタンパク質の産生）について記述している。
【００１６】
これらのインヒビターはプラスマカリクレインに特異的であるのに加えて、これらのインヒビターはかなり小さな分子であり、プラスマカリクレインに可逆的な様式で結合する。このアプローチの主な欠点の一つは、標的プロテアーゼを可逆的な様式で阻害するタンパク質の利用により、プロテアーゼ複合体が解離して、そのプロテアーゼの酵素活性が回復する危険性があることである。
【発明の開示】
【００１７】
したがって、ここで記載されているように、より大きなインヒビターを使用する利点の一つは、不可逆的な方法で標的プロテアーゼを阻害する共有結合複合体の形成を導くことである。本発明のさらなる利点は、大きな共有結合複合体が血液循環から速やかに除かれることが知られていることである。
【００１８】
［発明の要旨］
したがって、本発明の目的は、プロテアーゼに対して高い特異性を有するプロテアーゼインヒビタータンパク質、ならびに医薬品組成物における前記インヒビタータンパク質の利用を提供することである。このインヒビタータンパク質は、阻害ポリペプチド配列と、プロテアーゼに特異的な基質−酵素相互作用部位からなる少なくとも１つのポリペプチド配列とを含む範囲においてキメラである。
【００１９】
本発明の他の目的は、プロテアーゼに対するキメラインヒビタータンパク質をコードする、精製および単離されたＤＮＡ配列、前記精製および単離されたＤＮＡ配列を含むことを特徴とする発現ベクター、ならびにこの発現ベクターを用いて形質転換された真核宿主細胞および原核宿主細胞を提供することである。
【００２０】
本発明のさらに他の目的は、プロテアーゼに対するキメラインヒビタータンパク質の製造方法を提供することである。この方法は以下の工程を含む。
【００２１】
（ａ）プロテアーゼに特異的な基質−酵素相互作用部位をコードするポリヌクレオチド配列を選択すること、
（ｂ）前記ポリペプチド配列を、セリンプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼに対するインヒビタータンパク質をコードする配列中に導入し、キメラ配列を得ること、
（ｃ）適切な条件下で細胞発現系にて前記キメラ配列を発現させること、および
（ｄ）プロテアーゼに対するキメラインヒビタータンパク質を回収すること。
【００２２】
［発明の詳細な説明］
本発明は、阻害ポリペプチド配列と、プロテアーゼに特異的な基質−酵素相互作用部位からなる少なくとも１つのポリペプチド配列とを含む、プロテアーゼに対するキメラインヒビタータンパク質に関する。
【００２３】
「キメラインヒビタータンパク質」という用語は、２以上のポリペプチドを含むタンパク質のことを指し、ここで、前記タンパク質は異なる由来からなり、換言すれば、自然界において共に発生しないものである。
【００２４】
ここで用いられているように、「タンパク質」、「ポリペプチド（の）」、および「ペプチド（の）」という用語は、本発明においては、置換可能であるとして使用されており、これらは、隣り合う残基におけるα−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合により互いに結合された一連のアミノ酸残基を示す。
【００２５】
本発明のキメラタンパク質はプロテアーゼに対するインヒビターであり、阻害ポリペプチド配列と、プロテアーゼに特異的な基質−酵素相互作用部位からなる少なくとも１つのポリペプチド配列とから構成されている。基質−酵素相互作用部位のポリペプチド配列は、特定のプロテアーゼに対してそのインヒビターに非常に高い選択性を与え、この基質−酵素相互作用部位のポリペプチド配列は、阻害されるプロテアーゼに基づき選ばれる。
【００２６】
一般的に、基質−酵素相互作用部位のポリペプチド配列は基質作用部位配列であることができる。「基質作用部位配列」という用語は、基質上に見られ、プロテアーゼにとって選択的な認識部位である配列を指す。プロテアーゼによる基質作用部位配列の認識は、基質の活性化、不活性化、または分解を導き、ほとんどの場合、この高アフィニティー相互作用は、特異的な配列の認識のみならず、その３次元配座の認識と関連している。
【００２７】
基質作用部位配列を有するキメラ分子も本発明に含まれる。「キメラ分子」という用語は、基質作用部位配列の機能部位を含むことができ、例えば、当業者に知られているタンパク質化学技術によって得ることができるポリヌクレオチド配列を指す。
【００２８】
基質作用部位配列またはその断片あるいはそれに類似する部分の特定の組み合わせもまた本発明に含まれると考えられる。
【００２９】
「断片」という用語は、基質作用部位のそれぞれの配列の長さの少なくとも４０％のアミノ酸を共有している配列を指す。これらの配列は、これらの配列が基因する本来の配列と同じ特性を示す限りにおいて用いることができる。これらの配列は、基質作用部位のそれぞれの配列の長さのうち７０％以上のアミノ酸配列を共有しているのが好ましく、８０％以上のアミノ酸配列を共有しているのがより好ましく、９０％以上のアミノ酸配列を共有しているのが特に好ましい。
【００３０】
これらの断片は、例えば化学合成のような当該技術分野で知られているさまざまな方法および技術によって調製可能である。
【００３１】
本発明はまた、基質作用部位配列の変異体を含む。「変異体（バリアント）」という用語は、本来のポリペプチド配列とある程度異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドのことを指し、すなわち、「変異体」とは、保存性アミノ酸の置換により本来の配列とは異なるアミノ酸配列であり、これにより、１つ以上のアミノ酸が同じ特性および構造的な役割
を有する別のアミノ酸によって置換されている。アミノ酸配列の変異体は、本来のアミノ酸配列中のある部位で置換、欠失、および／または挿入を含む。ここで、保存性アミノ酸の置換は、以下の５つの群のうちの１つにおける交換として定義される。
【００３２】
I. 小さく、非極性または僅かな極性を有する脂肪族残基：Ala, Ser, Thr, Pro, Gly
II. 極性を有し、正に帯電している残基：His, Arg, Lys
III. 極性を有し、負に帯電している残基およびそのアミド：Asp, Asn, Glu, Gln
IV. 大きく、芳香性の残基：Phe, Tyr, Trp
V. 大きく、非極性の脂肪族残基：Met, Leu, Ile, Val, Cys
【００３３】
本発明の基質は好ましくはセルピンであり、この場合、基質作用部位配列は反応性セルピンループ（RSL: Reactive Serpin Loop）配列、その断片、そのキメラ分子、その組み合わせ、および／またはそのバリアントであってもよい。
【００３４】
「反応性セルピンループ」、「反応性部位ループ」、または「ＲＳＬ」という用語は、セルピン中に見られる露出した柔軟な反応部位のループを指し、このループは、推定される標的プロテアーゼとの相互作用に関連していることが示唆される。切断部位のアミノ酸側の残基から、その結合部位から離れる方向に向かって、残基は慣習的にＰ１，Ｐ２，Ｐ３，…などと呼ばれる。切断部位に続いている残基は、Ｐ１’，Ｐ２’，Ｐ３’，…などと呼ばれる。ＲＳＬは通常、６−１２アミノ酸残基で構成されている。
【００３５】
このＲＳＬ配列は配列番号１６，１７，１８，１９，２０，２１および２２、その断片、そのキメラ分子、その組み合わせ、および／またはその変異体を含む群から選択可能である。
【００３６】
ＲＳＬ配列は、表１に示された以下の可能性から選択可能である。
【００３７】
【表１】
0004754478.tif 000002
【００３８】
通常、前記プロテアーゼはカリクレイン、キモトリプシン（Ｃｈｔｒ）、ウロキナーゼ（ｕＰＡ）、およびヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）を含む群から選ばれる。前記プロテアーゼはヒトカリクレインであることが好ましく、ｈＫ２（ｈＧＫ−１としても知られている)であることが特に好ましい。
【００３９】
ｈＫ２は１５のメンバーからなり、カリクレイン遺伝子ファミリーに属し、前立腺特異抗原（ＰＳＡまたはｈＫ３）およびｈＫ２のみが前立腺で高いレベルで発現する。ｈＫ２の潜在的な生理的役割の１つは、射精直後に形成される、精子を取り囲むゲル成分のタンパク質分解で、特に、セメノゲリン（se menogelins）およびフィブロネクチン（fibronectin）の分解である。加えて、ｈＫ２がインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）結合タンパク質の加水分解によって、ＩＧＦによる細胞分裂作用を高めることが可能であることがin vitroの実験で示されている。in vitroの実験ではまた、ｈＫ２がプロウロキナーゼを活性化し、キニノゲン（kininogens）からブラジキニン様物質を生成し（Ｂ２ブラジキニンリセプターを介した、ＥＧＦリセプターの潜在的活性化）、プロＰＳＡを活性型に変換することが示されている。これらのｈＫ２の活性は、細胞外マトリクスタンパク質の分解におけるｈＫ２の潜在的な役割を証明する。加えて、ｈＫ２は、細胞分裂因子の放出および成長に関わる受容体の活性化により、前立腺がんの発達を高めることができる。
【００４０】
阻害されるプロテアーゼがシステインプロテアーゼである場合、このプロテアーゼはカテプシン(Ｋ，Ｌ，およびＳのサブタイプ)、プロホルモンチオールプロテイナーゼ（prohormone thiol proteinase）、およびカスパーゼファミリー（カスパーゼ１，３，４，および８）を含む群選ばれる。
【００４１】
システインプロテアーゼは、触媒活性を得るためにシステイン残基を用いるプロテアーゼ酵素であり、少なくとも３０のタンパク質ファミリーに分類可能である。それぞれのファミリーは、相同なアミノ酸配列を持ち、そのファミリーメンバーの類似する三次元構造を反映する進化的に保存された配列モチーフを含む。
【００４２】
キメラインヒビタータンパク質の阻害ポリペプチド配列は通常、セリンプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼである。
【００４３】
阻害ポリペプチド配列がセリンプロテアーゼに由来する場合、この阻害ポリペプチド配列はセルピンの配列、その断片、そのキメラ分子、その組み合わせ、および／またはその変異体であることが好ましい。
【００４４】
このセルピンの配列は、α−１アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）、プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）、α−１アンチプロテイナーゼ（ＡＡＴ）、ヒトα−１アンチトリプシン関連タンパク質前駆体（ＡＴＲ）、α−２−プラスミンインヒビター（ＡＡＰ）、ヒト抗トロンビン−III前駆体（ＡＴIII）、プロテアーゼインヒビター１０（ＰＩ１０）、ヒトコラーゲン結合タンパク質２前駆体（ＣＢＰ２）、プロテアーゼインヒビター７（ＰＩ７）、プロテアーゼインヒビタールーセプリン２（ＨＬＳ２）、ヒトプラスマプロテアーゼＣ１インヒビター（Ｃ１  ＩＮＨ）、単球／好中球エラスターゼインヒビター（Ｍ／ＮＥＩ）、プラスミノーゲン活性化インヒビター−３（ＰＡＩ３）、プロテアーゼインヒビター４（ＰＩ４）、プロテアーゼインヒビター５（ＰＩ５）、プロテアーゼインヒビター１２（ＰＩ１２）、ヒトプラスミノーゲン活性化インヒビター−１前駆体内皮（ＰＡＩ−１）、ヒトプラスミノーゲン活性化インヒビター−２胎盤（ＰＡＩ−２）、色素上皮由来因子前駆体（ＰＥＤＦ）、プロテアーゼインヒビター６（ＰＩ６）、プロテアーゼインヒビター８（ＰＩ８）、プロテアーゼインヒビター９（ＰＩ９）、ヒト扁平上皮細胞癌抗原（ＳＣＣＡ−１）、ヒト扁平上皮細胞癌抗原（ＳＣＣＡ−２）、Ｔ４−結合グロブリン（
ＴＢＧ）、メグシン、およびプロテアーゼインヒビター１４（ＰＩ１４）、これらの断片、これらの分子キメラ、これらの組み合わせ、および／またはこれらの変異体を含む群から選択可能である。
【００４５】
これらのセルピンのほとんどは異なる名前を有するため、その内訳を要約する以下に表（表２）を含める。
【００４６】
【表２】
0004754478.tif 000003
0004754478.tif 000004
【００４７】
本発明にかかるキメラインヒビタータンパク質の例として、驚くべきことに、本出願人は下記の表３中に要約されたｈＫ２プロテアーゼに特異的な６つの新しいインヒビタータンパク質を見出した。これらのインヒビターは以下のとおりである。
【００４８】
【表３】
0004754478.tif 000005
【００４９】
これらのキメラインヒビタータンパク質は、セルピンの特異性を変えるために、α１−アンチキモトリプシン（ｒＡＣＴ）のＲＳＬを変更することにより得られたものであり、ｒＡＣＴは、キモトリプシン、肥満細胞キマーゼ、カテプシンＧ、ｈＫ２、およびＰＳＡ（ｈＫ３）などの多くのヒト酵素を阻害することが知られている。実施例１で詳細に説明されているようなファージディスプレイ技術により酵素ｈＫ２の基質として選ばれたペプチド配列は、ＲＳＬの切断部位および周辺のアミノ酸残基を置換するために使用されている。組み換えインヒビターはバクテリア中で産生され、アフィニティークロマトグラフィーによって精製された。
【００５０】
野生型ｒＡＣＴはｈＫ２を非常にゆっくりと（１２−１６時間で）阻害するのに比べて、改変されたｒＡＣＴは共有結合した複合体を数分間以内で非常に敏速に形成することが明らかになっている。６つのｒＡＣＴ変異体のうち３つはｈＫ２に特異的であり、大きな会合定数(association constant)を示した（表５および表６参照）。過剰のインヒビター（［Ｉ（インヒビター）］０：［Ｅ（酵素）］０＝１００：１（濃度比））との３０分間の反応により、ｈＫ２の酵素活性はｒＡＣＴ６．２、ｒＡＣＴ８．３、ｒＡＣＴ６．７およびｒＡＣＴ６．１によって完全に阻害され、その一方で、ｒＡＣＴ８．２０およびｒＡＣＴ５．１８はｈＫ２の酵素活性をそれぞれ９５％および７３％阻害した。この条件下で、野生型ｒＡＣＴは、ｈＫ２に対する阻害活性を全く示さなかった。これらの変異体のうち、ｒＡＣＴ８．３およびｒＡＣＴ５．１８の２つはｈＫ２に対して特異的に作用し、他のテストされた酵素を全く阻害しなかった。別の２つの変異体ｒＡＣＴ６．７およびｒＡＣＴ６．２はそれぞれ、ＰＫを３６％および１００％阻害した。野生型ＡＣＴと同様に、変異体ｒＡＣＴ８．２０は２つのキモトリプシン様プロテアーゼＣｈｔｒおよびＰＳＡの活性を阻害したが、付加的にＰＫおよびＨＮＥも同様に阻害した。どの組み換えセルピンも、ｈＫ１およびｕＰＡに対する阻害活性を示さなかった。
【００５１】
加えて、本出願人はまた、ｒＡＣＴＷＴのＲＳＬ中のＰ３−Ｐ３’残基を、プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）のＲＳＬをコードする基質５残基ペプチドで置換することにより、ｈＫ２およびｈＫ３を阻害することができるキメラインヒビター（ＭＤＣＩ）の産生を導き出せることを見出した。
【００５２】
したがって、プロテアーゼのキメラインヒビターは、ＭＤ８２０、ＭＤ６２、ＭＤ６１、ＭＤ６７、およびＭＤＣＩを含む群から選択可能である。このキメラインヒビタータンパク質は、ＭＤ６２またはＭＤ６１が好ましい。
【００５３】
阻害の化学量論（ＳＩ）値が１よりも大きい場合、通常、セルピンが基質として挙動すると解釈されることが知られている。この図式では、ＲＳＬにおける初期のミカエルス複合体の形成および開裂の後、ほとんどの複合体は、活性型酵素と、完全に不活性化された切断されたインヒビターとに分離される。本出願人はインヒビターの非複合体形成に関して、ＡＣＴ変異体とｈＫ２との間の反応を分析し、プロテアーゼに対して１０倍過剰のインヒビターを含む試料をインキュベートしている。これらの条件は、テストされたＡＣＴ変異体のために計算されたＳＩ値に近いかもしくはそれよりも下であり（表４参照）、通常、セルピンまたはセルピン−プロテアーゼ複合体のタンパク質分離が起こりやすい。驚くべきことに、本出願人は、大きなＳＩ値にもかかわらず、ｈＫ２によるＡＣＴ変異体の分解が観察されないというその仮説の矛盾を見出した。その仮説に拘泥するつもりはなく、ＡＣＴの分解の欠如に関して可能性のある説明は、ＳＩ値の決定が行われた条件に存在する。共有結合しているＡＣＴ−ｈＫ２複合体は、in vitroで非常にゆっくりと形成される。このことは、野生型ＡＣＴは２５℃で３０分間のインキュベートした後、ｈＫ２に対して阻害活性を全く示さず（表５）、３７℃でのより長いインキュベーションを行なった後でさえ、ｈＫ２が野生型ＡＣＴと部分的にのみ複合体を形成したという我々の観察結果と一致する（図３）。
【００５４】
本出願人はまた、これらの新しいインヒビターに関して、他のプロテアーゼに対する特異性を評価した。その評価は、今後のin vivoでの応用へのより有意な置換を確実にするために、全てのプロテアーゼに対して同じ条件下(擬似生理的条件下)で行われた。ｈＫ２に対するファージディスプレイによって選ばれた基質でＲＳＬ開裂部位を置換することにより、野生型ＡＣＴは、ｈＫ２に対してより高い感受性を有するインヒビターへと改変される。加えて、これらのインヒビターのうちの２つは、ｈＫ２に対してのみ阻害活性を有し、類似する生物学的基質を標的としていることが知られている他の酵素（プラスマカリクレイン、ｈＫ１、ＰＳＡ、ウロキナーゼ （ｕＰＡ）、好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）など）に対しては阻害活性を示さなかった。本出願人の知る限り、本出願はｈＫ２に特異的なインヒビターの開発について述べる初めての報告である。
【００５５】
興味深いことに、ｒＡＣＴ８．２０（ＭＤ８２０）はｈＫ２のほか、キモトリプシンを阻害し、かつ、プラスマカリクレインおよびヒトエラスターゼをより弱く阻害し、広範囲な阻害特異性を示す。
【００５６】
これまでに、セルピンによるシステインプロテアーゼの阻害を詳しく報告した事例が多数存在しており（ゲッティン Ｐ．Ｇ．Ｗ．，「セルピンの構造、機構、および機能」，ケミストリーレビュー，第１０２巻，４７５１−４８０３頁，２００２年（Gettins P.G.W., 2002 “Serpin structure, mechanism, and function” in Chem. Rev, 102, 4751-4803））、キメラインヒビタータンパク質の阻害ポリペプチド配列はまた、システインプロテアーゼによっても選ばれてもよい。これらの例は、セルピンの扁平上皮細胞癌抗原１によるカテプシンＫ，Ｌ，およびＳの活性阻害、α−１アンチキモトリプシンによるプロホルモンチオールプロテイナーゼの活性阻害、ウイルス由来セルピンｃｒｍＡによるカスパーゼ１（インターロイキン１β転換酵素）、カスパーゼ３、およびカスパーゼ８を含むカスパーゼファミリーメンバーの活性阻害、およびヒトセルピンＰＩ９によるカスパーゼ１，４，および８の活性阻害である。
【００５７】
組み換え技術を用いて、本発明にかかるプロテアーゼに対するキメラインヒビタータンパク質を調製する場合、ポリペプチドをコードする核酸分子またはその断片が使われるのが好ましい。
【００５８】
したがって、本発明は、上述のプロテアーゼに対するキメラインヒビタータンパク質をコードする、精製および単離されたＤＮＡ配列に関する。
【００５９】
「精製および単離されたＤＮＡ配列」という用語は、本発明のプロテアーゼに対するキメラインヒビタータンパク質をコードする核酸分子、あるいは、本発明にしたがって、プロテアーゼに対するキメラインヒビタータンパク質のようなタンパク質をコードする核酸を指す。核酸は、制限がない（または実質上制限がない）物質であり、前記物質は、自然界または調製された環境（例えば培養細胞中）で、他のポリペプチドまたは核酸などの物質と自然に結合する。ここで、調製された環境では、その調製がin vitroまたはin vivoで行われている組み換えＤＮＡ技術による。
【００６０】
ここで使用されるＤＮＡはあらゆるポリデオキシヌクレオチド配列であり、例えば、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、一方または両方の鎖が２つ以上の断片から構成されている二本鎖ＤＮＡ、一方または両方の鎖が解釈できない燐酸エステル骨格を有する二本鎖ＤＮＡ、１つ以上の一本鎖部位と１つ以上の二本鎖部位を含むＤＮＡ、ＤＮＡ鎖が完全に相補的な二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ鎖の一部のみが相補的な二本鎖ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、共有結合によって閉じられたＤＮＡ、直鎖ＤＮＡ、共有結合によって架橋されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成されたＤＮＡ、半合成されたＤＮＡ、生合成されたＤＮＡ、自然界から単離され
たＤＮＡ、酵素によって消化されたＤＮＡ、摘み取られたＤＮＡ、放射線標識されたＤＮＡおよび蛍光標識されたＤＮＡなどの標識化されたＤＮＡ、１つ以上の自然界には存在しない種類の核酸を含むＤＮＡである。
【００６１】
プロテアーゼに対するキメラインヒビタータンパク質をコードするＤＮＡ配列またはその断片は、標準的な化学技術（例えば、ホスホトリエステル法、あるいは自動化された合成方法およびＰＣＲ法を介した方法など）によって合成可能である。
【００６２】
本発明にかかるキメラインヒビタータンパク質をコードする、精製および単離されたＤＮＡ配列は、酵素学的な技術によって産生させてもよい。この場合、制限酵素は予め決定された認識配列を開裂し、かつ、キメラインヒビタータンパク質またはその断片をコードするＤＮＡ(またはＲＮＡ)などの核酸配列を含むより大きな核酸分子から核酸配列を単離するために使用可能である。
【００６３】
ポリリボヌクレオチド（ＲＮＡ）の形態の核酸はまた、本発明に含まれ、例えば、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、一方または両方の鎖が２つ以上の断片から構成されている二本鎖ＲＮＡ、一方または両方の鎖が解釈できない燐酸エステル骨格を有する二本鎖ＲＮＡ、１つ以上の一本鎖部位と１つ以上の二本鎖部位を含むＲＮＡ、ＲＮＡ鎖が完全に相補的な二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ鎖の一部のみが相補的な二本鎖ＲＮＡ、共有結合によって架橋されたＲＮＡ、酵素によって消化されたＲＮＡ、摘み取られたｍＲＮＡ、化学合成されたＲＮＡ、半合成されたＲＮＡ、生合成されたＲＮＡ、自然界から単離されたＲＮＡ、放射線標識されたＲＮＡおよび蛍光標識されたＲＮＡなどの標識化されたＲＮＡ、１つ以上の自然界には存在しない種類の核酸を含むＲＮＡである。
【００６４】
プロテアーゼに対するキメラインヒビタータンパク質をコードする、精製および単離されたＤＮＡは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、および配列番号１３を含む群から選ばれるのが好ましい。
【００６５】
本発明はまた、前述の変異体の配列を含み、該変異体の配列は保存性ヌクレオチドの置換により、リファレンス配列と異なるヌクレオチド配列であり、これにより、１つ以上のヌクレオチドが同じ性質を有する別のヌクレオチドによって置換されている。
【００６６】
また、本発明の別の目的は、前述したようなプロテアーゼに対するキメラインヒビタータンパク質をコードする、精製および単離された配列を含む発現ベクターを提供することである。発現ベクターの選定は、当該技術分野でよく知られているように、所望の機能的性質（例えば、キメラインヒビタータンパク質の発現、形質転換またはトランスフェクトされる宿主細胞）に直接依存する。
【００６７】
加えて、発現ベクターはさらに、精製および単離されたＤＮＡ配列と操作上結合されるプロモーターをも含んでいてもよい。これは、本発明のプロテアーゼに対するキメラインヒビタータンパク質をコードする精製および単離された結合ＤＮＡ配列が、発現を許容される適切な制御配列の制御下にあることを意味し、ここで、発現とは、換言すれば、挿入された単離および精製されたＤＮＡ配列の転写および翻訳のことである。
【００６８】
ここで用いられているように、「プロモーター」という用語は、当該技術分野で知られているような付加的な制御配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー、ポリペプチドの発現のために通常機能しているポリアデニル化部位およびスプライス部位）を指し、あるいは、１つ以上離れた標的配列を付加的に含んでいてもよく、選択可能なマーカーを任意にコードしていてもよい。
【００６９】
宿主細胞に適応可能な状態で使用可能なプロモーターとしては、例えば、ポリオマウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、パピローマウイルス（例えばウシパピローマウイルス）、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（例えば、マウスまたはヒトのサイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、そしてシミアンウイルス４０（例えば、ＳＶ４０初期および後期プロモーター）などのウイルスのゲノムから得られたプロモーター、あるいは、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、またはヒートショックプロモーターなどの外来の哺乳類プロモーターから得られたプロモーターが挙げられる。
【００７０】
使用可能なエンハンサーとしては、例えば、哺乳類の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインシュリン）から既知のエンハンサー配列、あるいは、真核細胞ウイルスのエンハンサー（例えば、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターのエンハンサー、ポリオーマのエンハーサー、アデノウイルスのエンハンサー）から既知のエンハンサー配列が挙げられる。
【００７１】
本発明のＤＮＡ配列の発現において、膨大な種類の宿主／発現ベクターの組み合わせを用いることができる。有用な発現ベクターは例えば、染色体由来のＤＮＡ配列、非染色体由来のＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列の断片からなることができる。適切なベクターは、ＳＶ４０の誘導体、既知の細菌プラスミドおよびその誘導体（例えば、Ｅ.ｃｏｌｉのプラスミド，ｃｏｌ Ｅｌ，ｐＣＲｌ，ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９）、ＲＰ４などのプラスミド、ファージＤＮＡ（例えば、多数のファージＸ誘導体（例えばＮＭ９８９））、他のファージＤＮＡ（例えば、Ｍ１３、糸状一本鎖ファージＤＮＡ）、酵母プラスミドまたはその誘導体（例えば、２μプラスミド）、真核生物細胞で有用なベクター（例えば、昆虫または哺乳類の細胞で有用なベクター）、プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせから得られたベクター（ファージＤＮＡまた他の発現を制御する配列が機能するように改変されたプラスミドなど）、ならびにこれらの類似物を含む。
【００７２】
最も好ましい発現ベクターはｐＱＥ−９である。
【００７３】
本発明の別の目的は、ここで述べられている発現ベクターによって形質転換またはトランスフォームされた真核または原核宿主細胞を提供することである。
【００７４】
「形質転換された細胞」または「トランスフォームされた細胞」あるいは「形質転換／トランスフォームされた細胞」という用語は、細胞外ＤＮＡが導入され、かつ、その細胞外ＤＮＡを保持する細胞を意味する。そのＤＮＡは、核酸が染色体の構成成分としてまたは染色体外成分として複製できるように細胞に導入されてもよい。
【００７５】
本発明にしたがって精製および単離されたＤＮＡを含む発現ベクターを、適切な真核または原核宿主細胞に形質転換またはトランスフォームすることは、典型的には、使用されるベクターに依存する良く知られた方法によって達成される。これらの方法に関しては、例えば、マニアチス他，「分子クローニング，研究室マニュアル」，コールド・スプリング・ハーバー研究室，１９８２年（Maniatis et al. 1982, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory）および商業的に利用可能な方法を参照されたい。
【００７６】
ここで開示されているキメラインヒビタータンパク質は、細胞発現系で組み換えにより産生されるのが好ましい。
【００７７】
本発明のＤＮＡ配列の発現において、多くの種類の単細胞系宿主細胞が有用である。こ
れらの宿主は、良く知られた真核宿主および原核宿主（Ｅ．ｃｏｌｉ，シュードモナス（Pseudomonas），バチルス（Bacillus），ストレプトマイセス（S treptomyces）などの菌株）、真菌（酵母など）、動物細胞（ＣＨＯ，ＹＢ／２０，ＮＳＯ，ＳＰ２／０，Ｒ１．１，Ｂ−Ｗ細胞，およびＬ−Ｍ細胞，アフリカミドリザル腎細胞（例えば、ＣＯＳ１，ＣＯＳ７，ＢＳＣ１，ＢＳＣ４０，ＢＭＴ１０），昆虫細胞（例えばＳｆ９））、および組織培養したヒト由来細胞および植物由来細胞を含んでいてもよい。宿主細胞は好ましくは細菌細胞であり、より好ましくはＥ．ｃｏｌｉ細胞である。
【００７８】
本発明はまた、ここで述べられているキメラインヒビタータンパク質を活性物質として含む医薬組成物に関し、１つ以上の薬学的に許容しうる担体，賦形剤，補助剤と任意に組み合わせられる。
【００７９】
ここで述べられているように、少なくとも１つのキメラインヒビタータンパク質に加えて、その医薬組成物は、活性化合物を薬学的に許容しうる調剤へと調合するプロセスを容易にする１以上の薬学的に許容しうる担体，賦形剤，補助剤などを含んでいてもよい。
【００８０】
許容しうる担体、賦形剤、および補助剤は、適用される投与量および濃度において、服用者に対して非毒性であり、かつ、バッファー（燐酸，クエン酸，およびその他の有機酸など）、抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）、保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム，塩化ヘキサメソニウム，塩化ベンゾアルコニウム，塩化ベンゼソニウム，フェノール，ブチルオーベンジルアルコール）、アルキルパラベン（メチルパラベン，プロピルパラベンなど），カテコール，レソシノール，シクロヘキサノール，３−ペンタノール，ｍ−クレゾールなど）、低分子量のポリペプチド（１０残基未満）、タンパク質（血清アルブミン，ゼラチン，免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、アミノ酸（グリシン，グルタミン，アスパラギン，ヒスチジン，アルギニン，リジンなど）、単糖類，二糖類，およびその他の炭水化物（グルコース，マンノース，またはデキストリンを含む）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、糖（ショ糖，マンニトール，トレハロース，ソルビトールなど）、塩形成カウンターイオン（ナトリウムなど）、金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）、および／または非イオン性界面活性剤（ツイーン（登録商標）、プロロニック（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含む。
【００８１】
医薬組成物の投与形態は全身的または局所的であってもよい。例えば、そのような組成物の投与は、さまざまな非経口経路（皮下経路，静脈経路，皮内経路，筋肉内経路，腹膜内経路，鼻腔内経路，真皮内経路，口腔内経路など）であってもよく、または、移植された装置を介するものであってもよく、あるいは、蠕動手段によって送達されてもよい。
【００８２】
ここで述べられているように、キメラインヒビタータンパク質を含む医薬組成物はまた、生体吸収性マトリクス中に活性物質として含有または含浸されていてもよく、ここで、前記マトリクスは懸濁液、ゲル、または固形支持体の形態で投与される。加えて、前記マトリクスはバイオポリマー（bi opolymer）からなるものであってもよい。
【００８３】
徐放性調剤を調製してもよい。徐放性調剤の適切な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスであり、そのマトリクスは、例えばフィルムまたはマイクロカプセルなどの成形物の形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートの共重合体、非分解性のエチレン−酢酸ビニル共重合体、分解性の乳酸−グリコール酸共重合体（ルプロン デュポン（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注入可能なマイクロスフェア），およびポリ−Ｄ−（−
）−３−ヒドロキシ酪酸）が含まれる。
【００８４】
in vivo投与に用いられる調剤は無菌でなければならない。これは、例えば無菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。
【００８５】
いずれかの効果およびある種の効果を期待する場合、本発明のキメラインヒビタータンパク質の適切な投与量は、服用者の年齢、性別、健康状態、体重、ならびに同時に行なう治療の種類に依存すると思われる。
【００８６】
適切な投与形態は、疾患、キメラインヒビタータンパク質、および投与様式に依存するだろう。可能性がある投与形態には、錠剤、カプセル、トローチ剤、練り歯磨き、座薬、吸入剤、液体、軟膏、および非経口注射が含まれる。
【００８７】
キメラインヒビタータンパク質のアミノ酸のアミノ酸修飾も本発明に含まれ、この修飾は、非水溶性マトリクスまたは他の微細分子担体にキメラインヒビタータンパク質を架橋したり、あるいは、血液−脳関門を通過する際の可溶性、吸収性、および透過性を改善したりするのに有用であるかもしれない。
【００８８】
そのような修飾は当該技術分野でよく知られており、その代わりに、タンパク質およびその均等物の潜在的に望ましくない副作用を除去または緩和してもよい。
【００８９】
本発明の好ましい医薬組成物がキメラインヒビタータンパク質を活性物質として含む一方で、ここで述べられているように、代わりの医薬組成物は、プロテアーゼに対するキメラインヒビタータンパク質をコードする精製および単離されたＤＮＡ配列を活性物質として含んでいてもよい。この医薬組成物は、精製および単離されたＤＮＡ単独で含んでいてもよいし、あるいは、前記精製および単離されたＤＮＡ配列を含む発現ベクターまたはそのベクターを用いて前もってトランスフェクトされた宿主細胞を含んでいてもよい。後者の例においては、抗原性の問題を避けるために、治療対象の患者から宿主細胞を単離するのが好ましいだろう。これらの遺伝子治療および細胞治療のアプローチは、医薬組成物を繰り返し投与する必要のある患者にとって特に好都合であろう。なぜなら、精製および単離されたＤＮＡ配列、発現ベクター、ならびに発現ベクターを用いて前もってトランスフェクトさせた宿主細胞を、そのタンパク質を内因的に産生するであろう患者の細胞中へ組み込むことが可能だからである。
【００９０】
本願による開示は、哺乳類のタンパク質分解に関連する疾患を治療または予防する方法を提供し、ここで述べられているように、該方法は、医薬組成物を前記哺乳類に投与することを含む。
【００９１】
本発明にかかる、タンパク質分解に関連する疾患を治療または予防する方法は、その疾患がｈＫ２の活性が有害な疾患である場合に有益であり、そのような疾患は、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患（前立腺肥大症など）、または感染症などである。
【００９２】
「がん」という用語は、無秩序な細胞成長によって一般的に特徴付けられる哺乳類の生理学的な状況を指したり、または記述したりする。
【００９３】
好ましい方法としては、哺乳類はヒトの患者であり、投与されるキメラインヒビタータンパク質は表３の組み換えセルピンの例から選ばれ、これらのセルピンはｈＫ２プロテアーゼを特異的に阻害する。
哺乳類のタンパク質分解に関連する疾患の治療または予防のために必要な薬物を調製するために、ここで述べられている本発明の医薬組成物を使用することはまた、本発明の範囲に含まれる。この場合、その疾患は、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患（前立腺肥大症など）、または感染症など、ｈＫ２の活性が有害な疾患である。
【００９４】
がんの例は前立腺がんに限定されず、がんの例には乳がんまたは転移性がんが含まれる。
【００９５】
本発明のキメラインヒビタータンパク質は、予定された目的を達成する量にて一般的に使用可能である。疾患を治療または予防するために使用するに際して、キメラインヒビタータンパク質またはその医薬組成物は、治療にとって効果的な量で投与される。
【００９６】
「治療にとって効果的な量」とは、治療を受ける被験者の症状を改善または予防したり、あるいは、治療を受ける被験者を延命したりするのに効果をもたらす量である。治療にとって効果的な量の決定は、特にここで提供されている詳細な開示にしたがって、当業者に理解可能な範囲内で行われる。
【００９７】
全身投与用の治療にとって効果的な量または投与量ははじめに、in vitro評価から予測可能である。例えば、投与量は、培養細胞にて決定されたＩＣ５０を含む血中濃度の範囲に収まるようにモデル動物に処方される。そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために用いることができる。
【００９８】
初期投与量はまた、当該技術分野で良く知られている技術（例えばモデル動物）によるin vivoデータから予測可能である。当業者は、動物実験のデータに基づいてヒトへの投与量を容易に最適化でき、言うまでもなく、その投与量は、治療を受ける被験者自身、被験者の体重、疾患の重篤さ、投与方法、ならびに処方する医師の判断に依存する。
【００９９】
本発明はまた、プロテアーゼに対するキメラインヒビタータンパク質の製造方法を含み、該方法は以下の工程を含む。
【０１００】
（ａ）プロテアーゼに特異的な基質−酵素相互作用部位をコードするポリヌクレオチド配列を選択すること、
（ｂ）前記ポリペプチド配列を、セリンプロテアーゼまたはシステインプロテアーゼに対するインヒビタータンパク質をコードする配列中に導入し、キメラ配列を得ること、
（ｃ）適切な条件下で細胞発現系にて前記キメラ配列を発現させること、および
（ｄ）プロテアーゼに対するキメラインヒビタータンパク質を回収すること。
【０１０１】
プロテアーゼに特異的な基質作用部位をコードするポリヌクレオチド配列の選定は、以以下に示す様々な技術を用いて行なうことができる。該技術は例えば、プロテアーゼ選定のための基質（無菌状態の細胞からペプチドを直接提示するマウス白血病レトロウイルスなど）の提示(ブッコルズ（Buchholz）他，１９９８年)、あるいは、所望の酵素でトランスフェクトされた哺乳類の細胞を用いて、プロテアーゼの開裂部位をin vivo で選定するために使用されるキメラセンダイウウイルスライブラリーを用いた同様の方法（パシニ他，「キメラセンダイウイルスライブラリを用いた、プロテアーゼ開裂部位のin vivoでの選定」，ジャーナル オブ ビロロジー，第７４巻，第２２号，１０５６３−１０５７０（Pacini et al, 2000 “ In vivo selection of protease cleavage sites by using chimeric Sindbis virus libraries” J. Virol. 74, 22: 10563-70））である。
【０１０２】
酵母システムの１つであるＧＡＳＰ（部位特異的タンパク質分解のための遺伝子定量法）も本発明に含まれる。このシステムでは、全長の膜タンパク質に対してランダムな基質を融合することにより、基質を酵母の膜に結合させる。その膜上では、細胞内転写因子がレポーター遺伝子のプロモーターに結合する（カン他，「部位特異的なタンパク質分解の
ための改良された戦略」，モレキュラー セル，第３０巻，第１１（２）号，２６３−２６６号（Kang et al., 2001 “An improved strategy for a genetic assay for site-specific proteolysis” Mol. Cell. 30; 11(2): 263-6））。
【０１０３】
近年、プロテアーゼの基質特異性を決定するための多数のコンビトリニアルな化学ライブラリーが発表されている。この化学ライブラリーには、蛍光基質ライブラリーおよび位置走査−合成コンビトリニアルライブラリが含まれる。
【０１０４】
別の方法は、固定化ペプチドライブラリーと名づけられた方法であり、液相中の蛍光強度を測定することにより、ライブラリー中の各メンバーに対する相対的な基質特異性（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を決定し、エドマンシークエンスによって切断部位を同定する（ヒュ他，「固定化ペプチドライブラリーを用いた、クロストリジウム属ヒストリチクム菌β−コラゲナーゼの基質特異性の迅速な同定」，ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー，第８巻，第２７７（１０）号，８３６６−８３７１頁，２００２年（Hu et al. 2002 “Rapid determination of substrate specificity of clostridium histolyticum beta-collagenase using an immobilized peptide library” J. Biol. Chem. 8, 277 (10): 8366-71）。
【０１０５】
プロテアーゼの基質特異性がファージディスプレイ技術によって同定される場合、包括的な多様性を含むファージディスプレイランダムペプチドライブラリーが生成され、精製されたプロテアーゼによってスクリーニングされる。この既知の技術は、決められた長さのアミノ酸からなる、考えられる全てのアミノ酸の組み合わせを含むファージディスプレイランダムペプチドライブラリーを構築するために、前述の特異的なケースに適応される。これにより、巨大なライブラリーが、糸状ファージの先端でランダムな配列を提示するように構築され、次いで増幅されて、その特異性を迅速に評価するためにプロテアーゼによってスクリーニングされる。
【０１０６】
実施例１，２によれば、本出願人は、完全だと考えられる１．８×１０８個の独立した形質転換体を含むペンタマー（５アミノ酸）ライブラリーを構築した。なぜなら、理論上、３．２×１０６個の可能性があるランダムペンタマー配列のうち全てが表されていたからである。
【０１０７】
ファージの配列はさらに、ペンタマーがランダムに挿入されたことを立証した。次いで、ランダムなペンタペプチドを提示するファージはリガンド（６×Ｈｉｓ）と融合され、アフィニティー支持体（この場合、Ｎｉ−ＮＴＡマトリクス）に固定化される。プロテアーゼとインキュベートさせた後（実施例１，２の場合、プロテアーゼはｈＫ２であった）、感度が高い基質を発現するファージは固相から遊離される。遊離されたファージは、Ｆ因子が陽性である細菌を感染させて、滴定および増幅させるために使用される。次いで、これらのファージは沈殿法によって精製された後、増幅され、次いで、アフィニティー支持体に固定されて、次回のスクリーニングに使用される。このペンタペプチドの選定は、極めて高い特異性を有するポリヌクレオチド配列を得るために、計８回繰り返される。最後の回で選定されたファージは、ペトリ皿にプレートすることによってクローニングされて、個々のファージのＤＮＡは、基質作用部位をコードする部位が増幅されて、酵素によって切断された配列が決定される。
【０１０８】
次に、キメラ配列を得るために、基質作用部位をコードするポリヌクレオチド配列は、セリンプロテアーゼのインヒビターをコードする配列（例えばｒＡＣＴをコードする配列）に導入される。２つのサイレントな制限部位Ｓａｃ ＩＩおよびＭｌｕ Ｉが、ｒＡＣＴのＲＳＬドメインのＰ１コドンの１８ｂｐ上流および１８ｂｐ下流にあらかじめ組み込まれることにより、基質作用部位をコードする選択されたポリヌクレオチド配列がサブクロ
ーニングされる。
【０１０９】
組み換えキメラインヒビターは、例えば、適切な培養条件下において、大腸菌ＴＧ１株中で産生される。適切な培養条件は、発現される組み換えキメラインヒビターに依存し、１０−４０℃の間の温度内ならびに１０−３０時間内に含まれる。驚くべきことに、本出願人は、実施例１，２の場合、１６℃での１６時間の培養により、完全に正常なｒＡＣＴ変異体を発現および産生できることを見出した。
【０１１０】
最後に、組み換えキメラインヒビターは、組み換えキメラインヒビターが分泌される場合、培地から抽出され、一方、組み換えキメラインヒビターが分泌されない場合、細胞発現系から抽出されて、当該技術分野で知られている技術（高速液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、減外濾過、イオン交換など）によって精製される。特定の組み換えキメラインヒビターを精製するために使用される実際の条件は、全体の電荷、疎水性、および親水性などの因子に一部依存する可能性があり、当業者はこのことを容易に理解できるだろう。
【０１１１】
アフィニティークロマトグラフィー精製のため、組み換えキメラインヒビターまたはＨｉｓタグに特異的に結合する抗体を用いてもよい。別のアフィニティー分子（Ｈｉｓタグに特異的に結合する、アガロースビーズに結合されたＮｉ２＋−ニトリロトリ酢酸など）はまた、本発明の想定の範囲内である。
【０１１２】
次いで、キメラインヒビタータンパク質について、プロテアーゼ活性の阻害能がさらに評価された。この評価は、スキャッチャード（Scatchard）法のような一般的な方法によって行なうことができる（スキャッチャード（Scatchard）, 1949 Ann NY Acad Sci, 51:
660-669）。この方法は、タンパク質の結合に用いられた結合能を測定および分析する伝統的な方法であり、純度が比較的高いタンパク質を必要とし、かつ、結合タンパク質と非結合タンパク質とを分離する能力を必要とする。
【０１１３】
キメラインヒビタータンパク質の酵素に対するアフィニティーを測定する第２の適切な方法は、酵素の働きを悪くするキメラインヒビタータンパク質の能力を測定することである。この方法は、酵素が基質から遊離する速度、ならびに発色性または蛍光性の基質の利用可能性に依存して、純度が比較的高いキメラインヒビタータンパク質を必要とする。
【０１１４】
本発明のキメラインヒビタータンパク質は、野生型のインヒビタータンパク質よりも強いアフィニティーによって、プロテアーゼ活性を阻害するのが好ましい。
【０１１５】
ここで開示されているキメラインヒビタータンパク質は、細胞発現系において、組み換えにより製造されるのが好ましい。この発現システムは、真核または原核宿主細胞であることができる。
【０１１６】
本発明のキメラインヒビタータンパク質の発現において、多くの種類の単細胞系宿主細胞が利用できる。これらの宿主は、良く知られた真核宿主および原核宿主（Ｅ．ｃｏｌｉ，シュードモナス，バチルス，ストレプトマイセスなどの菌株）、真菌（酵母など）、動物細胞（ＣＨＯ，ＹＢ／２０，ＮＳＯ，ＳＰ２／０，Ｒ１．１，Ｂ−Ｗ細胞，およびＬ−Ｍ細胞，アフリカミドリザル腎細胞（例えば、ＣＯＳ１，ＣＯＳ７，ＢＳＣ１，ＢＳＣ４０，ＢＭＴ１０），昆虫細胞（例えばＳｆ９））、および組織培養したヒト由来細胞および植物由来細胞を含んでいてもよい。宿主細胞は好ましくは、バチルス属，エシェリヒア属，サルモネラ属，およびエルビニア属を含む群から選ばれる細菌細胞である。より好ましくは、細菌宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ（エシェリヒア．コリ）細胞である。
【０１１７】
本発明にしたがって精製および単離されたＤＮＡを含む発現ベクターを、適切な真核または原核宿主細胞に形質転換またはトランスフォームすることは、典型的には、使用されるベクターに依存する良く知られた方法によって達成される。これらの方法に関しては、例えば、マニアチス他，「分子クローニング，研究室マニュアル」，コールド・スプリング・ハーバー研究室，１９８２年（Maniatis et al. 1982, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory）および商業的に利用可能な方法を参照されたい。
【０１１８】
本発明の別の目的は、精製および単離されたＤＮＡ配列を含む試料中のプロテアーゼをin vivo または in vitroにて検出する診断キットを提供することであり、この精製および単離されたＤＮＡ配列は、配列番号１，３，５，７，９，１１，１３の配列、該配列と相補的な配列、該配列の断片、および／または該配列の変異体を含む群から選ばれる。
【０１１９】
あるいは、本発明にかかるプロテアーゼに対するキメラインヒビタータンパク質を含む試料中のプロテアーゼを検出する診断キットはまた、本発明の範囲内である。プロテアーゼに対する前述のキメラインヒビタータンパク質は例えば、ＭＤ８２０、ＭＤ６２、ＭＤ６１、ＭＤ６７、およびＭＤＣＩを含む群から選ばれてもよい。
【０１２０】
ここで用いられているように、「試料」という用語は、プロテアーゼ、またはプロテアーゼをコードする配列を含むことができるあらゆる適切なサンプルを指し、ここで、プロテアーゼをコードする配列は、キメラインヒビタータンパク質に結合するプロテアーゼをコードする配列と結合可能であるか、あるいは、前述のキメラインヒビタータンパク質をコードする精製および単離されたＤＮＡ配列と結合可能である。
【０１２１】
診断キットは、プロテアーゼの検出を可能にするシステムを含み、シグナルの検出は、存在するプロテアーゼの量に依存する。そのシグナルは、視覚的にまたは機器を用いて検出することができる。潜在的なシグナルは、着色された生成物、蛍光生成物、または発光生成物の生成、検査成分または検査生成物による吸収特性の変化または放射線の放出、ならびに成分生成物の沈殿や凝集である。前述の成分はラベル（例えば、放射性同位体、蛍光色素、酵素、補酵素、酵素基質、高電子密度化合物、または凝集性の粒子など）であってもよく、そのラベルは、この診断キット中に存在するキメラインヒビタータンパク質、または精製および単離されたＤＮＡ配列に結合される。
【０１２２】
最後に、本願による開示は、哺乳類のタンパク質分解に関連する疾患の治療または予防方法を提供し、該方法は、組み換え野生型セルピンを活性物質として含む医薬組成物を哺乳類に投与することを含む。
【０１２３】
上述した、タンパク質分解に関連する疾患を治療または予防する方法は、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患（前立腺肥大症など）、または感染症などのように、その疾患がｈＫ２の活性が有害である疾患の場合に有用である。
【０１２４】
上述の記載は、以下の実施例を参照することによってより完全に理解されるだろう。しかしながら、このような実施例は、本発明を実施する方法の例示であり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１２５】
［実施例１］
ファージディスプレイにより選ばれた基質を用いた、ヒトｈＫ２に特異的な組み換えＡＣＴインヒビターの開発
【０１２６】
方法
ｈＫ２およびｈＫ３ （ＰＳＡ）は前述のようにヒトの精液から精製され（フレネット Ｇ，ゲルバス Ｙ，トレンブライ ＲＲ，デューブ ＪＹ．，「カリクレインｈＫ２によって精製された前立腺特異抗原の調製のコンタミネーション」，ジャーナル オブ ウロロジー，第１５９巻，１３７５−１３７８頁，１９９８年（Frenette G, Gervais Y, Tremblay RR, Dube JY. 1998 “Contamination of purified prostate-specific antigen preparations by kallikrein hK2” J Urol. 159, 1375-8））、抗ｈＫ２モノクローナル抗体および抗ＰＳＡモノクローナル抗体は、ＲＲ トレンブライ（RR Tremblay）教授（ラバル大学，カナダ）より進呈された。ヒトキモトリプシン（Ｃｈｔｒ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、ｈＫ１、プラスマカリクレイン（ＰＫ）、好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）、および市販のＡＣＴ（ヒトプラスマα−１−アンチキモトリプシン）は、カルビオケム（Calbiochem）社より購入した。Z-Phe-Arg-AMC、Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC、Z-Gly-Gly-Arg-AMC、およびMeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMCはカルビオケム社より購入した。CFP-TFRSA-YFP蛍光基質は、これまでの発表に従って開発された（マハジャン ＮＰ他，「新規な突然変異体緑色発光タンパク質のプロテアーゼの基質は、アポトーシスの間、特異的なカスパーゼを活性化することを明らかにした」，ケミストリー アンド バイオロジー，第６巻，４０１−４０９頁，１９９９年（Mahajan NP et al. 1999 “Novel mutant green fluorescent protein protease substrates reveal the activation of specific caspases during apoptosis” Chem Biol. 6, 401-9））。ヒトα−１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）のｃＤＮＡは、ペンシルベニア大学のハーヴェイ ルビン博士（Dr. Harvey Rubin）より寄贈された。
【０１２７】
部位特異的な突然変異の誘発
ＡＣＴのｃＤＮＡをＰＱＥ−９発現ベクター（キアゲン，ドイツ，図９参照）にサブクローニングし、ｒＡＣＴＷＴのＮ末端にＨｉｓ６タグを導入した後、２つの制限部位Ｓａｃ IIおよびＭｌｕ Ｉは、ＲＳＬのＰ１コドンの１８ｂｐ上流と１８ｂｐ下流にそれぞれ組み込まれた。これらの部位は、Ｓａｃ II部位のためのオリゴヌクレオチドである5 ’-GTGATTTTGACCGCGGTGGCAGCAG-3’と、Ｍｌｕ Ｉ部位のためのオリゴヌクレオチドである5 ’-GCACAATGGTACGCGTCTCCACTAATG-3’とを用いてサイレント変異によって作成され、ストラタジーン（Stratagene）によって市販されているクイックチェンジ（quickchange）変異誘発プロトコルが行なわれた。
【０１２８】
基質ファージディスプレイライブラリーの構築
基質ファージライブラリーは、改変されたｐＨ０５０８ｂプラスミドを用いて調製された（ローマン他，「１価のファージディスプレイによる高アフィニティー結合タンパク質の選択」，バイオケミストリー，第１２巻，１０８３２−１０８３８頁，１９９１年（Lowman et al. 1991 “Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display” Biochemistry, 12, 10832-8））。そのコンストラクションは、Ｍ１３ジーンIIIのカルボキシル基末端領域（コドン２４９−４０６）の直前にあるGly-Gly-Gly-Ser-repeat-rich部位の一端にＨｉｓ６タグを有する。ランダムなペンタマー（５アミノ酸）は、フランキング部位に相当する、５’がビオチン化されたプライマー（5'-TGAGCTAGTCTAGATAGGTG-3'および5'-TGCAGCGACTGCTATGA-3'）を用いて、変性したコドンの両端に適切な制限部位を有する鋳型オリゴヌクレオチド5'TGAGCTAGTCTAGATAGGTGGCGGTNNSNNSNNSNNSNNSGGGTCGACGTCGGTCATAGCAGTCGCTGCA-3'（ここで、「Ｎ」はいずれかのヌクレオチドであり、「Ｓ」はＧまたはＣを示す。）のＰＣＲ伸長法によって調製された。
【０１２９】
ＰＣＲの鋳型は、既に発表されているように分解・精製され（スミス Ｇ．Ｐ，スコット Ｊ．Ｋ．，「糸状ファージ上に提示された、ペプチドおよびタンパク質のライブラリー」，メソッズ エンズーモロジー，第２１７巻，２２８−２５７頁，１９９３年（Smith
G.P, Scott J.K. 1993 “Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage” Methods Enzymol. 217, 228-57））、ＸｂａＩ／ＳａｌＩで消化されたｐＨ０５０８ｂベクターに挿入されて、エレクトロポレーション法によってＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｆ因子なし）に導入された。ライブラリーの範囲は形質転換効率から判断され、この形質転換効率は、アンピシリンおよびテトラサイクリン（１００および１５μｇ／ｍＬ）を含むLuria-Bertaniプレート上で形質転換された細胞の一部をプレーティングすることにより決定された。残りの形質転換された細胞は、ファージライブラリーを調製するため、１００プラーク形成ユニット（plaque forming unit: p.f.u．）／ｍＬの濃度になるようにＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージを加えて一晩培養された。ファージは上清から回収され、ポリ（エチレングリコール）沈殿法によって精製された。このうち２００クローンがシークエンシングのために任意に選ばれ、ライブラリーのランダム化が確認された。
【０１３０】
ファージディスプレイされたペンタペプチドライブラリーのスクリーニング
この新しいペンタペプチドライブラリーは、ｈＫ２による８回のスクリーニングを受けた。セファロースビーズに結合される１００μｌのＮｉ２＋−ニトリロトリ酢酸（Ｎｉ２＋ニトリロトリ酢酸樹脂）は、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含む１０ｍＬのＮａＣｌ／Ｐｉで洗浄された。ファージ粒子（１０１１個）は、平衡化されたＮｉ２＋−ニトリロトリ酢酸ビーズに添加され、４℃で３時間緩やかに振とうすることによりビーズに結合された。そのビーズを１ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ／Ｐｉ／ＢＳＡ、５ｍＭのイミダゾール、０．１％のツイーン２０で洗浄して、結合しなかったファージを取り除いた後、ＮａＣｌ／Ｐｉ溶液で平衡化された。
【０１３１】
基質ファージは、２７ｎＭ（最終濃度）のｈＫ２に３７℃で４５分間曝された。また、プロテアーゼの無いコントロール実験も同時に行われた。上清中に遊離された分解されたファージはＸＬ１−Ｂｌｕｅエシェリヒア．コリで増幅され、次のスクリーニングに使われた。８回のパンニングで約１５の異なるクローンが５回目、６回目、８回目のスクリーニングから選ばれ、プラスミドＤＮＡが単離され、基質をコードする領域の配列が確認された。
【０１３２】
組み換え野生型ＡＣＴおよびその変異体の構築ならびに発現
６つの変異体は、ＲＳＬのＰ３−Ｐ３’間に位置する反応性部位ループを変更したものであるが（以下の表４参照）、これら６つの変異体は、フランキング領域に相当するプライマー（5 ’-TACCGCGGTCAAAATC-3’および5 ’-TCACGCGTGTCCAC-3’）を用いて、以下の鋳型オリゴヌクレオチド（ここで下線を付けた配列は、ＲＳＬ中の新しい切断部位をコードする）のＰＣＲ伸長法によって生成された。
ｒＡＣＴ８．２０，  5 ’-TACCGCGGTCAAAATCACCCTCCGTTCTCGAGCAGTGGAGACGCGTGA-3’；
ｒＡＣＴ６．３，  5 ’-TACCGCGGTCAAAATCACCAGGAGGTCTATCGATGTGGAGACGCGTGA-3’；
ｒＡＣＴ８．３，  5 ’-TACCGCGGTCAAAATCAGGGGGAGATCTGAGTTAGTGGAGACGCGTGA-3’；
ｒＡＣＴ６．７，  5 ’-TACCGCGGTCAAAATCAAGCTTAGAACAACATTAGTGGAGACCGCTGA-3’；
ｒＡＣＴ６．１，  5 ’-TACCGCGGTCAAAATCATGACAAGATCTAACTTAGTGGAGACGCGTGA-3’；
ｒＡＣＴ５．１８，  5 ’-TACCGCGGTCAAAATCACCGAGCGTGTCTCGCCCGTGGAGACGCGTGA-3’
【０１３３】
ＰＣＲ産物は、ＳａｃＩＩおよびＭｌｕＩの２つの制限酵素によって消化され、制限酵素によって消化されたｒＡＣＴＷＴにサブクローニングされた。組み換えセルピンは、ＴＧ１Ｅ．ｃｏｌｉ株により産生された。細胞は、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む２ｘＴＹ倍地（１Ｌ当たり１６ｇのトリプトン、１０ｇの酵母抽出物、５ｇ／ＬのＮａＣｌを含む）中で３７℃にてＡ６００＝０．５まで培養された。次いで、最終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピルチオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）が添加され、１６℃で１６時間組み換えセルピンを発現させた。１００ｍＬの培地から得られた細胞は、遠心によって回収され、冷却したＰＢＳで懸濁した後、フレンチプレスにて破砕されて、すべ
ての可溶性細胞内タンパク質が回収された。細胞破砕物の残骸は遠心によって除去され、Ｎｉ２＋−ニトリロトリ酢酸アフィニティアガロースビーズが上清に添加されて、４℃で９０分間かけて、組み換えセルピンに結合させた。次いで、その樹脂を５０ｍＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０，５００ｍＭのＮａＣｌ，２５ｍＭのイミダゾールを含む）で洗浄した後、結合タンパク質を５０ｍＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０，５００ｍＭのＮａＣｌ，１５０ｍＭのイミダゾールを含む）で１０分間溶出した。精製が完了した後、ｒＡＣＴは、５０ｍＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０，５００ｍＭのＮａＣｌ，０．０５％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘを含む）に対して４℃で１６時間透析された。タンパク質濃度は、精製されたサンプル毎にブラットフォード法を用いて決定され、クマシンブルーで染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の密度により正規化された（ラエミリ ＵＫ．，「バクテリオファージＴ４の頭部のアセンブリにおける構造タンパク質の開裂」，ネイチャー，第２２７巻，６８０−６８５頁，１９７０年（Laemmli UK. 1970 “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4” Nature, 227, 680-5））。
【０１３４】
【表４】
0004754478.tif 000006
【０１３５】
阻害評価および化学量論阻害（ＳＩ）
化学量論阻害（ＳＩ）値は、ｈＫ２および他の異なる酵素に対するｒＡＣＴＷＴおよびその変異体の阻害活性のために決定された。初期テストはｈＫ２，ＰＳＡ，ｈＫ１，キモトリプシン（Ｃｈｔｒ），プラスマカリクレイン（ＰＫ），ウロキナーゼ（ｕＰＡ），およびヒト好中球エラスターゼ（ＨＮＥ）に対してモル濃度で１００倍過剰のｒＡＣＴを用いて行われた。その反応は、２５℃で３０分間（ＰＳＡは３７℃で９０分間）５０ｍＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ７．５，１５０ｍＭのＮａＣｌ，０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ
−１００，０．０１％ＢＳＡを含む）中で行われ、残存する酵素活性は蛍光基質を加えることによって測定された（hK1,hK2,PK:Z-Phe-Arg-AMC、Chtr:Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC、uPA:Z-Gly-Gly-Arg-AMC、HNE:MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC、PSA: CFP-TFRSA-YFP）。インヒビター存在下での酵素活性は、インヒビターの不存在下での反応と比較された。阻害活性が確認された反応では、異なる濃度の組み換えセルピンをインキュベートすることによってＳＩが決定された。インヒビター対酵素の比（［Ｉ］０／［Ｅ］０）に対する、残された酵素活性（阻害される酵素の反応速度／阻害されなかった酵素の反応速度）を線形回帰分析することにより、その化学量論阻害（グラフと横軸との交点）が得られた。
【０１３６】
酵素反応
異なるｒＡＣＴと、ｈＫ２、キモトリプシン、ＰＫ、およびＨＮＥとの相互作用を表す結合定数は、プログレスカーブ法を用いて擬一次条件下で決定された（Morrison JF, Walsh CT. 1988 “ The behavior and significance of slow-binding enzyme inhibitors”
Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 61, 201-301）。この条件下では、一定量の酵素（２ｎＭ）が異なる濃度のインヒビター（０−８００ｎＭ）および過剰量の基質（１０μＭ）と混合された。それぞれの反応は、５０ｍＭのＴｒｉｓバッファー（ｐＨ７．５，１５０ｍＭのＮａＣｌ，０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００，および０．０１％のＢＳＡを含む）を用いて２５℃で４５分間行われ、生成物の形成速度は、ＦＬＸ８００蛍光９６ウエルマイクロプレートリーダー（バイオテック，ＵＳＡ）を用いて測定された。このモデルでは、阻害活性は反応過程全体として不可逆であると考えられ、酵素活性の進行は生成物（Ｐ），初期反応速度（νｚ）によって表され、かつ、一次結合定数（ｋｏｂｓ）（インヒビター濃度のみに依存する定数）における反応時間（ｔ）に従って阻害され、速度定数は阻害濃度にのみ依存する。
【０１３７】
［式１］
0004754478.tif 000007
【０１３８】
それぞれのインヒビターについて、異なる４つのインヒビター濃度を用い、式１にしたがってデータを非線形回帰してｋｏｂｓが計算された。ｋｏｂｓをインヒビターの濃度［Ｉ］に対してプロットすることにより、二次結合定数（ｋ’）（グラフの傾き（ｋ’＝Δｋｏｂｓ／Δ［Ｉ］）に一致する）が決定された。基質とインヒビターの間で起こる競合反応のため、下記の式２は、基質濃度［Ｓ］およびその基質に対する酵素のＫｍによりｋ’を補正し、ｋａを与える。
【０１３９】
［式２］
0004754478.tif 000008
【０１４０】
各Ｋｍは次のとおりである。ｈＫ２に対するZ-FR-AMC：６７μＭ、キモトリプシンに対するSuc-AAPF-AMC：１４５μＭ、ＰＫに対するZ-FR-AMC：１７０μＭ、ＨＮＥに対するMeOSuc-AAPV-AMC：１３０μＭ。
【０１４１】
複合体形成およびインヒビターの分解に関するウエスタンブロット法による分析
ｈＫ２は、５０ｍＭＴｒｉｓバッファー（２００ｍＭのＮａＣｌ，０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）中で、［Ｉ］０／［Ｅ］０＝１００：１の条件で異なる組み換えＡＣＴと３７℃で３時間インキュベートされた。
【０１４２】
タンパク質サンプルは、９５℃で５分間加熱された後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％のアクリルアミドを用い、Ｔ：Ｃ比が１９：１である。）によって分離されて、次いで、Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬニトロセルロース（アマシャム ファルマシア）へと電気的に写し取られた。反応していないｈＫ２およびｈＫ２−ＡＣＴ複合体は、マウス抗ｈＫ２モノクローナル抗体およびアルカリフォスフェートコンジュゲーテッドヤギ抗マウス二次抗体により検出された。ウエスタンブロット結果は、ＥＣＬ検出キット（アマシャム ファルマシア バイオテック）により視覚化された。また、ｈＫ２は、５０ｍＭのＴｒｉｓバッファー（２００ｍＭのＮａＣｌおよび０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）中で、［Ｉ］０／［Ｅ］０＝１０：１にて、ＡＣＴ８．３またはＡＣＴ６．７と２５℃で３０分間（速度論的条件）インキュベートした。タンパク質は、抗Ｈｉｓ６モノクローナル抗体と同様の二次抗体を用いて、前述のプロトコルにしたがって、ウエスタンブロット法により検出された。
【０１４３】
可溶性組み換え野生型ＡＣＴとその変異体の産生
野生型セルピンα−１−アンチキモトリプシンは、ｈＫ２に特異的なインヒビターを開発するために使用された。ｒＡＣＴＷＴのＲＳＬ構造中に位置するＰ３−Ｐ３’残基は、上述したようなファージディスプレイ技術によってあらかじめ選ばれた基質ペンタペプチドにより置換された。表１に示された６つのｒＡＣＴ変異体が設計され、かつ構築された。基質ペプチド中の切断部位は、ｒＡＣＴＷＴのＲＳＬのＬｅｕ３５８−Ｓｅｒ３５９にしたがって配列された。ｒＡＣＴＷＴおよびその変異体は、Ｎ末端にＨｉｓタグを含む融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１中で発現された。それぞれの変異体は主に、活性を有する可溶性のタンパク質として蓄積されるように低い温度で産生された。そのタンパク質は非変性条件下で精製され、精製されたタンパク質の量は１．０−２．５ｍｇ／Ｌであった。精製されたセルピンの純度は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によってバリアント６．１（レーン１）および野生型ＡＣＴ（レーン２）が評価されているように、９８％以上であった（図１）。
【０１４４】
ｒＡＣＴ変異体はカリクレインｈＫ２に非常に特異的である
ヒト好中球エラスターゼ，キモトリプシン様プロテアーゼ（Ｃｈｔｒ，ＰＳＡ，またはｈＫ３）、およびトリプシン様プロテアーゼ（ｈＫ２，ｈＫ１，ＰＫ，ｕＰＡ）を含む酵素群は、ｒＡＣＴ変異体の特異阻害性を決定するためにスクリーニングされた（表５）。
【０１４５】
【表５】
0004754478.tif 000009
【０１４６】
過剰のインヒビター（［Ｉ］０／［Ｅ］０＝１００：１）と３０分間反応させることにより、ｈＫ２の活性は、ｒＡＣＴ６．２、ｒＡＣＴ８．３、ｒＡＣＴ６．７、およびｒＡＣＴ６．１によって完全に阻害されたのに対して、ｒＡＣＴ８．２０およびｒＡＣＴ５．１８の酵素活性はそれぞれ９５％、７３％であった。この条件下で、野生型ｒＡＣＴはｈＫ２に対して阻害活性を全く示さなかった。これらのバリアントのうちｒＡＣＴ８．３およびｒＡＣＴ５．１８はｈＫ２に特異的であり、試験が行なわれた他の酵素に対して阻害活性を示さなかった。他の２つのバリアント（ｒＡＣＴ６．７およびｒＡＣＴ６．２）はそれぞれ３６％、１００％のＰＫの阻害活性を示した。野生型ＡＣＴのように、変異体ｒ
ＡＣＴ８．２０は２つのキモトリプシン様プロテアーゼＣｈｔｒおよびＰＳＡの活性を阻害したが、加えてＰＫおよびＨＮＥに対しても阻害活性を示した。ｈＫ１およびｕＰＡに対しては，どの組み換えセルピンも阻害活性を示さなかった。
【０１４７】
ｈＫ２に対する変異体ＡＣＴの化学量論阻害は、野生型ＡＣＴと比較して劇的に改善されている。
【０１４８】
化学量論阻害の決定は、最も価値がある比較を行なうために、全ての酵素に対して生理的な条件下のｐＨおよびイオン強度で行われた。組み換え野生型ＡＣＴは、キモトリプシンに対してＳＩ値２を与え（表６）、この値は、類似する条件下で市販のＡＣＴによって得られた値と一致した（データは示さず）。
【０１４９】
【表６】
0004754478.tif 000010
【０１５０】
全ての組み換えバリアントのＳＩ値を決定するために、本出願人は、濃度の異なるｒＡＣＴ８．２０（ｘ）、ｒＡＣＴ６．２（□）、ｒＡＣＴ８．３（△）、ｒＡＣＴ６．７（◇）、ｒＡＣＴ６．１（＊）、ｒＡＣＴ５．１８（○）、およびｒＡＣＴＷＴ（＋）（６．２５−５００ｎＭ）と、ｈＫ２（５ｎＭ）とを反応バッファー中で２５℃にて３０分間反応させた。インヒビターとの反応後に残されたｈＫ２の酵素活性（反応速度）は、蛍光基質Z-FR-AMC（１０μＭ）を用いて評価された。評価された反応速度は、阻害されていない酵素（コントロール）の反応速度（ｖ０）に対する阻害された酵素の反応速度（ｖｉ）
の比に相当する。ＳＩは、インヒビターと酵素との比を推定することによって、線形回帰分析を用いて決定された（すなわち、ｘ軸のとの交点）。
【０１５１】
図２に示されているように、新たに構築されたＡＣＴの新しい変異体は、野生型ＡＣＴと比較して、ｈＫ２に対して低いＳＩ値を示した。これらの変異体のうちｒＡＣＴ６．７、ｒＡＣＴ６．１およびｒＡＣＴ６．２は、ｈＫ２に対して最も低い化学量論阻害値を示した（それぞれ９，１９および２５）。ｒＡＣＴ６．２およびｒＡＣＴ６．１がＰＫに対して最も低いＳＩ値（１８および１６）を示した一方で、ｒＡＣＴ６．７のＳＩ値はずっと大きかった（２２７）。ｈＫ２に特異的な２つの組み換えＡＣＴ、ｒＡＣＴ８．３およびｒＡＣＴ５．１８はそれぞれ、より大きなＳＩ値（３４および１３９）を示した。ｒＡＣＴ８．２０インヒビターのＳＩ値は、ｈＫ２を含む、試験が行なわれた全てのプロテアーゼに対して、１００より大きかった。
【０１５２】
変異体ＡＣＴは、インヒビターを分解することなくｈＫ２と安定な複合体を形成する
ｈＫ２は、インヒビター：酵素の濃度比が１００：１の条件にて、ｒＡＣＴ８．２０、ｒＡＣＴ６．２、ｒＡＣＴ８．３、ｒＡＣＴ６．７、ｒＡＣＴ６．１、ｒＡＣＴ５．１８および野生型ｒＡＣＴと３７℃で３時間インキュベートさせた。ｒＡＣＴとｈＫ２との反応生成物のウエスタンブロット分析は、酵素と相互作用した後のインヒビターの運命を決定するために、マウス抗ｈＫ２抗体を用いて還元条件で行われる（ｒＡＣＴ８．２０（レーン１）、ｒＡＣＴ６．２（レーン２）、ｒＡＣＴ８．３（レーン３）、ｒＡＣＴ６．７（レーン４）、ｒＡＣＴ６．１（レーン５）、ｒＡＣＴ５．１８（レーン６）および野生型ｒＡＣＴ（レーン７））。図３Ａは、ｈＫ２をＡＣＴ変異体とインキュベートさせた場合、遊離ｈＫ２（Ｅ）が共有結合複合体（ＩＥ）を形成することによって完全に消失したことを示している。この共有結合複合体は、インキュベーションを１６時間行なっても分解せず、非常に高い安定であることが示された（データは図示せず）。野生型ＡＣＴはｈＫ２の活性をさらにゆっくり阻害したが、その複合体はインキュベーションを３時間行なうと、ほとんど解離した。ｈＫ２を用いて測定されたＳＩ値の上昇は、ＡＣＴバリアントインヒビターが複合体を形成せずに分解したのに起因するものではない。
【０１５３】
さらに、ＡＣＴ８．３（レーン１）およびＡＣＴ６．７（レーン３）は、平衡条件下（２５℃、３０分間）で、インヒビター／酵素の比が１０：１にて、ｈＫ２とインキュベートさせた（レーン２およびレーン４はそれぞれウエスタンブロットによる）。複合体の形成は、マウスの抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体を用いて還元条件下でウエスタンブロット法により分析された（図３Ｂ）。全てのインヒビタータンパク質は、ｈＫ２と複合体を形成するか、または遊離しない形態で存在しており、このことは、セルピン−酵素相互作用の潜在的な基質経路が限界に近いことを示している。
【０１５４】
変異体ＡＣＴはｈＫ２と最も高い結合定数を示した。
変異体ＡＣＴとの阻害反応の速度は、これらのインヒビターとの反応性を有する各プロテアーゼに対して決定された。最終的に、ｈＫ２と組み換えセルピンとの相互作用は、プログレスカーブ法を用いて擬一次条件下で測定された。ｈＫ２（２ｎＭ）と基質であるZ-FR-AMC（１０μＭ）は、種々の濃度（２０−８００ｎＭ）のインヒビターｒＡＣＴ８．２０（◇）およびｒＡＣＴ５．１８（＋）（図４Ａ）と、ｒＡＣＴ６．２（○）、ｒＡＣＴ８．３（□）、ｒＡＣＴ６．７（△）、およびｒＡＣＴ６．１（×）（図４Ｂ）とに添加された。典型的なプログレスカーブについて、式１を用いて非線形回帰分析を行ない、その割合（ｋｏｂｓ）がセルピン濃度に対してプロットされた。ｋｏｂｓを決定した後、結合定数（ｋａ）がプロテアーゼに対するそれぞれの基質のＫｍを用いて決定された（表６）。キモトロプシンに対する野生型ＡＣＴのｋａ値は、発表済みのデータに一致した（クーレイ他，「セルピンＭＮＥＩは、２つの作用部位での効率的な反応を介して、エラスターゼ様セリンプロテアーゼおよびキモトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害する。」，
バイオケミストリー，第４０巻，１５７６２−１５７７０頁，２００１年（Cooley et al. 2001 “The serpin MNEI inhibits elastase-like and chymotrypsin-like serine proteases through efficient reＡＣＴions at two ＡＣＴive sites” Biochemistry, 40,
15762-70））。組み換えｒＡＣＴ６．７は、ｈＫ２に対して最も高いｋａ値（８９９１Ｍ−１ｓ−１）を示し、その一方で、ＰＫに対するｋａ値は４５倍小さかった。これに対して、組み換えｒＡＣＴ６．２は、ｈＫ２およびＰＫに対してほぼ同じｋａ値を示し、このことは、これら２つのプロテアーゼに対しては相互作用に差が無いことを示している。ｈＫ２に特異的な組み換えインヒビターであるｒＡＣＴ８．３およびｒＡＣＴ５．１８のｋｏｂｓは、より小さな値２４３９および５９５Ｍ−１ｓ−１を示し、その一方で、非特異的なＡＣＴ８．２０のｋａ値は１７７９Ｍ−１ｓ−１を示し、この値は、Ｃｈｔｒ、ＰＫ、およびＨＮＥに比較して優位であった。組み換えセルピンの一つであるｒＡＣＴ６．１は、ｈＫ２よりもＰＫに対してより高い反応性を示した。
【０１５５】
［実施例２］
ヒトｈＫ２プロテアーゼおよびヒトｈＫ３プロテアーゼに対して特異的な組み換えＡＣＴの開発
ｒＡＣＴＷＴのＲＳＬ構造中に位置するＰ３−Ｐ３’残基は、実施例１で述べられたように、プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）のＲＳＬをコードする基質ペンタペプチドによって置換された（表７）。
【０１５６】
【表７】
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【０１５７】
まず、組み換えタンパク質ＡＣＴＰＣＩ（ＭＤＣＩ）を産生するために、ＴＧ１細胞は、相当するコンストラクションを用いて形質転換された後、適切な培養液中で培養された。次に、その細胞は最適な光学密度（濁度）に誘導され、１６℃で１６時間組み換えインヒビターを発現させた。組み換えインヒビターＡＣＴＰＣＩは細菌の細胞質内から抽出され、前述の実施例で示されたように、Ｎｉ−ＮＴＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって分離された。
【０１５８】
組み換えＡＣＴの発現に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析
実施例１および実施例２で開発された、異なるインヒビターの純度は、図５で示されるように、還元状況下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって評価された。
【０１５９】
インヒビターの評価
これらのインヒビターはさらに、ヒトカリクレインｈＫ２，ｈＫ３（図６）およびプラスマカリクレイン、トリプシン、ウロキナーゼ、エラスターゼ、トロンビン、ｈＫ１４、およびｈＫ８（表８）の活性を阻害する特異性および親和力を評価するために分析された。これらの２つの酵素（ｈＫ２およびｈＫ３）は、異なる酵素特異性を有しているが（ｈＫ２はトリプシン様であり、ｈＫ３はキモトリプシン様である。）、本来どちらもＡＣＴによって活性が阻害される。ＡＣＴは、血液循環中で天然のｈＫ３インヒビターとして機能すると考えられており、その一方で、ＡＣＴのｈＫ２に対する阻害活性は弱い。
【０１６０】
ｒＡＣＴとヒトカリクレインとの間の阻害活性は、図６で示されるように、ウエスタンブロット法によって分析された。変異体ＡＣＴ毎に、１μｇのインヒビターを、１００ｎｇのｈＫ２またはｈＫ３と生理的な条件下で３７℃にて１時間インキュベートさせた。
【０１６１】
抗ｈＫ２モノクローナル抗体９Ｄ５を用いた検出結果が図６Ａに示されている。
レーン１：ｈＫ２のみ、
レーン２：市販のＡＣＴ＋ｈＫ２
レーン３：野生型ＡＣＴ＋ｈＫ２、
レーン４：ＭＤ８２０＋ｈＫ２、
レーン５：ＭＤＣＩ＋ｈＫ２、
レーン６：ＭＤ６２＋ｈＫ２、
レーン７：ＭＤ６１+ｈＫ２
【０１６２】
図６Ｂは、抗Ｈｉｓ抗体によるｈＫ３−ＡＣＴ複合体の検出を示している（組み換えＡＣＴタンパク質中のＨｉｓタグを検出）。
【０１６３】
レーン１：ＰＳＡのみ、
レーン２：市販のＡＣＴ＋ＰＳＡ、
レーン３：野生型ＡＣＴ＋ＰＳＡ、
レーン４：ＭＤ８２０＋ＰＳＡ、
レーン５：ＭＤＣＩ＋ＰＳＡ、
レーン６：ＭＤ６２＋ＰＳＡ、
レーン７：ＭＤ６１＋ＰＳＡ
【０１６４】
ｈＫ２の特性によって選抜された基質配列による反応ループ内のアミノ酸の置換は、ＡＣＴを、ｈＫ３活性を阻害することなく、ｈＫ２に非常に特異的なインヒビターへと変換した（ＭＤ８２０，ＭＤ６１，ＭＤ６２）。これらの結果は、表４で上記に示された結果を裏付ける。プロテインＣインヒビター（ＰＣＩ）の反応ループに基づくＭＤＣＩのみが、評価された両方のカリクレイン（ｈＫ２およびｈＫ３）の活性を阻害した。
【０１６５】
ＭＤ６１およびＭＤ６２は、全てのｈＫ２タンパク質の活性を３分未満で阻害する（同じ条件下で）。ＭＤ６１およびＭＤ６２は、同量のｈＫ２の活性を阻害するために１２時間より長いインキュベーションを必要とする野生型または市販のα−１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）（データを図示せず）と比較して、ｈＫ２と非常に高い親和性を有するインヒビターである。
【０１６６】
【表８】
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［実施例３］
【０１６７】
ＭＤインヒビターによるがん成長の抑制
３．１．ＭＤ６２インヒビターおよびＭＤ６７インヒビターによるがん成長の抑制
アンドロジェン非依存性のヒト前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５は、米国型培養コレクション（American Type Culture Collection）から得られた。ｈＫ２遺伝子で形質転換されたＤＵ１４５細胞株（ＤＵ１４５／ｈＫ２）を得るために、レトロウイルス技術が用いられた。
【０１６８】
対数増殖期のＤＵ１４５／ｈＫ２細胞株が集められ、１μｇまたは１０μｇのインヒビターを含むＤＭＥＭ（インビトロジェン）中で７．５×１０７細胞個／ｍＬの濃度になるように懸濁された。この細胞縣濁液は、マトリゲル（matrigel；ＢＤバイオサイエンス）と１：２の割合で混合された後、８週齢のオス無胸腺スイスヌードマウス（グループ当り２匹）の右左のわき腹に皮下注入された（３×１０６細胞個／４０μｌ）。各マウスは２箇所に細胞縣濁液を注入された。
【０１６９】
腫瘍植え付けの６、１２および１８日後に、５０μｇまたは１０μｇのＭＤ６２，ＭＤ６７、ならびに１００μｇまたは１０μｇのＡＣＴ−ＷＴが皮下注入された。腫瘍植え付けの２４、３０、３３、３６、３９、および４１日後に、２５μｇまたは５μｇのＭＤ６２，ＭＤ６７、ならびに５０μｇまたは５μｇのＡＣＴ−ＷＴが皮下注入された。
【０１７０】
図１０Ａは、ＭＤ６２によるがん成長の抑制を示している。ｈＫ２で形質転換された前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５（３×１０６細胞個）はヌードマウスに移植され、次いで、ＭＤ６２（注入当り５μｇまたは２５μｇ）によって処置を施された。
【０１７１】
図１０Ｂは、ＭＤ６７によるがん成長の抑制を示している。ｈＫ２で形質転換された前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５（３×１０６細胞個）はヌードマウスに移植され、次いで、ＭＤ６２（注入当り５μｇまたは２５μｇ）によって処置を施された。
【０１７２】
３．２．ＭＤＣＩインヒビターによる腫瘍の成長の抑制
アンドロジェン非依存性のヒト前立腺癌細胞株ＤＵ−１４５は、米国型培養コレクションから得られた。ｈＫ２遺伝子を感染させたＤＵ１４５細胞株（ＤＵ１４５／ｈＫ２）を得るために、レトロウイルス技術が用いられた。
【０１７３】
対数増殖期のＤＵ１４５／ｈＫ２細胞株が集められ、１μｇまたは１０μｇのインヒビターを含むＤＭＥＭ（インビトロジェン）中で７．５×１０７細胞個／ｍＬの濃度になる
ように懸濁された。この細胞縣濁液は、マトリゲル（matrigel；ＢＤバイオサイエンス）と１：２の割合で混合された後、８週齢のオス無胸腺スイスヌードマウス（グループ当り２匹）の右左のわき腹に皮下注入された（３×１０６細胞個／４０μｌ）。各マウスは２箇所に細胞縣濁液を注入された。
【０１７４】
腫瘍植え付けの６、１２および１８日後に、１００μｇまたは１０μｇのＭＤＣＩまたはＡＣＴ−ＷＴが皮下注入された。がん植え付けの２４、３０、３３、３６、３９、および４１日後に、５０μｇまたは５μｇのＭＤＣＩまたはＡＣＴ−ＷＴが皮下注入された。
【０１７５】
図１１は、ＭＤＣＩによる腫瘍成長の抑制を示している。ｈＫ２で形質転換された前立腺腫瘍細胞株ＤＵ−１４５（３×１０６細胞個）はヌードマウスに移植され、次いで、ＭＤ６２（注入当り５μｇまたは２５μｇ）によって処置を施された。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】図１は、精製された組み換えＡＣＴ．変異体（Variant） ６．１（レーン１）および組み換え野生型ＡＣＴ（ｒＡＣＴＷＴ）（レーン２）の還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２】図２は、ｒＡＣＴＷＴおよびその変異体のｈｋ２に対する化学量論阻害（SI: Stoichiometry of Inhibition）を示す。ＳＩは、線形回帰分析を用いて、インヒビターと酵素との濃度比率(Ｉ／Ｅ比)を推定することにより決定された(すなわち、ｘ切片)。
【図３】図３のＡおよびＢは、ｈＫ２と組み換えインヒビターとの複合体形成を示す。矢印はｈＫ２（Ｅ）、インヒビター（Ｉ）、およびｈＫ２−ＡＣＴ複合体（Ｅ−Ｉ）をそれぞれ示す。
【図４】図４のＡおよびＢは、擬一次条件下(pseudo-first order condition)におけるｒＡＣＴＷＴおよびその変異体によるｈＫ２の活性阻害を示す。ｈＫ２と組み換えセルピンとの相互作用は、プログレスカーブ（progress curve）法により擬一次条件下で測定された。
【図５】図５は、実施例１および実施例２で開発されたインヒビターの還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によるインヒビターの純度の決定に相当する。
【図６】図６のＡおよびＢは、組み換えＡＣＴとｈＫ２の阻害反応(図６Ａ)、ならびに組み換えＡＣＴとＰＳＡとの阻害反応(図６Ｂ)のウエスタンブロット法による分析を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、ＭＤ８２０のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＭＤ６２のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＭＤ８３のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ＭＤ６７のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。
【図７Ｅ】図７Ｅは、ＭＤ６１のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。
【図７Ｆ】図７Ｆは、ＭＤ５１８のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。
【図７Ｇ】図７Ｇは、ＭＤＣＩのＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。
【図８】図８は、ＡＣＴインヒビターおよびＭＤインヒビターのＲＳＬ配列の比較を示す。文字飾りのない残基はＡＣＴＷＴと共通であり、太字や下線で示された残基はＡＣＴ変異体のＲＳＬ中の変異に相当する。セルピン中の推定の切断部位は、Ｐ１−Ｐ１’残基間のアスタリスクによって印が付けられている。
【図９】図９は、ｐＱＥ９発現ベクターのマップを示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＭＤ６２による腫瘍成長の阻害を示す。ｈＫ２を発現するように形質転換された前立腺がん細胞株ＤＵ−１４５(３×１０６個の細胞)はヌードマウスに移植され、ＭＤ６２(５μｇまたは２５μｇの注入)による処置を施された。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＭＤ６７による腫瘍成長の阻害を示す。ｈＫ２を発現するように形質転換された前立腺がん細胞株ＤＵ−１４５(３×１０６個の細胞)はヌードマウスに移植され、ＭＤ６７(５μｇまたは２５μｇの注入)による処置を施された。
【図１１】図１１は、ＭＤＣＩによる腫瘍成長の阻害を示す。前立腺がん細胞ＤＵ−１４５(３×１０６個の細胞)はｈＫ２を発現するように形質転換されたものであり、前記細胞はヌードマウスに移植され、ＭＤＣＩ(５μｇまたは５０μｇの注入)による処置を施された。
【図２】
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【図４】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【配列表】
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