(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸テンプレートについてサーモサイクリング反応を行うことによって核酸テンプレートを処理する方法であって、
ａ)核酸テンプレートを精製カラムに通過させることによる核酸テンプレート精製；
ｂ)段階ａ)で精製した核酸についてのサーモサイクリング反応；および
ｃ)生成物をゲル濾過カラムに通過させることによる段階ｂ)の生成物の精製；
の段階を含み、段階ａ)からｃ)が、カラムを含む流体用の微小構造を含む微小流体ディスク中で連続して行なわれることを特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、
Ａ)各微小構造が、
i)少なくとも一つの入口；接続先
ii)核酸テンプレートを精製するための精製カラムを含む第１チャンバー；接続先
iii)サーモサイクリング反応のための第２チャンバー；接続先
iv)サーモサイクリング反応の生成物を精製するためのゲル濾過カラムを含む第３チャンバー
を含み；そして
Ｂ)第１チャンバー中で段階ａ)を行い、第２チャンバー中で段階ｂ)を行い、第３チャンバー中で段階ｃ)を行う；
ことを特徴とする、方法。
【請求項３】
核酸テンプレートを含む細胞培養物を融解試薬で処理し、細胞質膜を融解させ、その後、融解物を微小流体ディスクの微小構造に入れ、段階ａ)からｃ)を行い、続いて精製した生成物を分析することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サーモサイクリング反応が核酸シークエンシング反応であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
段階ａ)からｃ)に続いて、段階ｃ)で得られた精製した生成物の分離である段階ｄ)を行うことを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
段階ｄ)が電気泳動的分離である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、
Ａ)微小構造が、第３チャンバーに接続しており、第４チャンバーに含まれる分離マトリックスを通した電位を適用するための手段を含む第４チャンバーを含むこと；および
Ｂ)第４チャンバー中で段階ｄ)を行うこと；
を特徴とする、方法。
【請求項８】
核酸テンプレートがプラスミドである、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
微小流体ディスクを通した流体の流動をディスクの回転により行なう、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
微小構造が放射状に広がる、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、回転可能なディスク、とりわけ、流体のための微小構造体を含む微小流体ディスクを有する微細加工された装置に関し、このとき、核酸シークエンシングに必要な段階を統合的で連続的な手法で行われる。
【０００２】
シークエンシングプロセスは、とりわけロボットの形態による自動化を応用し、複合状態にある微小容量の液体を利用することで産業的規模に達している。このプロセスは、ゲノムを破砕する段階と、対象とするフラグメントをクローンベクター内に挿入し、個々のクローンを分離する段階と、挿入されたフラグメントを含むベクターを精製する段階と、挿入されたフラグメントをシークエンシング反応におけるテンプレートとして使用する段階とを有する。得られたシークエンシングデータは、ソフトウェアを用いて配列され、数多くのフラグメントから連続した配列を得る。このプロセスについて、以下より詳細に説明する。
【０００３】
フラグメントのサイズにより、異なるクローンベクターを用いて、フラグメントをクローン化することができる。クローン化する目的は、生物学的システム(細菌またはウィルス)を通じて、莫大な数の複製物を与えるために、挿入配列を複製することにある。巨大なフラグメントは、しばしば、ＢＡＣ(Bacterial Artificial Chromosomes：細菌人工染色体)またはコスミド内にクローン化される。より小さいフラグメントは、一般に、ｐＵＣ１８などの細菌プラスミドか、ファージＭ１３のいずれかの中でクローン化される。
【０００４】
プラスミド内でクローン化されるフラグメントを用いて、新たにゲノムをシークエンシングするための通常のプロセスは、連続的に行われる可能性のある数多くの段階を有する。これらの段階の具体例について、以下に広範に説明する。
【０００５】
１)細菌培養物の調製
関心のあるゲノムのフラグメントが形成されて、大腸菌細菌の菌株内に保持されたプラスミド(例えば、ｐＵＣ１８)内に挿入される。このプロセスは、形質転換と呼ばれる。
【０００６】
形質変換された細菌は、(宿主細菌に抗生物質の耐性を与える遺伝子を有する)プラスミドを含むこれらの細菌を選択するために、成長培地および抗生物質を含む寒天プレート上に広げられる。この寒天プレートは、「空の」または挿入配列の存在しないプラスミドを含むクローンだけでなく、挿入配列を含むプラスミドを有する細菌の存在を明確に示すインジケータを含み得る。細菌培養物は、個々の細菌細胞、および娘コロニーがプレート上で互いに十分に離れる程度に広げられる前に、希釈される。これにより、ただ１つの配列からなるクローンを含む個々のコロニーが取り出される。
【０００７】
このプレートを、３７℃で一晩培養する。個々の細菌細胞は、プレート上で重ならない細胞コロニーを形成する。
【０００８】
手動でまたはロボットを用いてコロニーを取り出し、これを用いて直接的にプラスミドを調製するか、より一般的には、一晩液体培養(通常、１ないし２ｍｌ)に接種して、より多量の細菌およびより多数の挿入配列の複製物を得る。
【０００９】
２．挿入配列を含むプラスミドの抽出
核酸テンプレートの品質は、シークエンシング反応を成功させる鍵となる要因である。このテンプレートは、プラスミドまたはプラスミドから得られるポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)生成物であってもよい。細菌抽出物の直接的なシークエンシングに関する報告があり、(例えば、Frothingham, R.およびR. L. Allen (1991)、Chen Q.,およびC. Neville (1996)らの“Rapid 16S ribosomal DNA sequencing from a single colony without DNA extraction or purification”, Biotechnique 11(1)らを参照されたい。)ほとんどの主だったシークエンシング装置は、うまくシークエンシングできるように、純粋なプラスミドを抽出することに多大な注意を払っている。
【００１０】
プラスミドを抽出し、精製するための数多くの方法が開発されてきた。１つの一般的な方法は、(ｉ)ＮａＯＨを使用して細菌細胞を融解し、(ii)タンパク質および染色体ＤＮＡを沈殿させ、(iii)イソチオシアン酸グアニジンまたはヨウ化ナトリウムなどのカオトロープの存在下でガラス基質(または吸着および吸収により抽出すべき核酸を選択的に保持する他の精製カラム)で溶液中のプラスミドを抽出し、(iv)エタノール溶液で洗浄し、塩および残渣汚染物を除去し、(ｖ)最後に、低イオン強度緩衝液または水を用いて基質からのプラスミドの抽出する。また、このプロセスには、ＲＮaseに曝して、ＲＮＡを分解する段階も含まれる。
【００１１】
この方法は、ＧＦＸ微小プラスミド調製キット(Amersham Pharmacia Biotech)などの多くの市販キットの基礎となっている。これらのキットは、通常、溶液Ｉ、溶液II、溶液IIIの一連の溶液を有し、溶液Ｉは、約100mM Tris-HCl pH7.5, 10mM EDTA, 400μg/mL ＲＮase Ｉで、溶液IIは、約100mM NaOH, 1% w/v SDSを有し、溶液IIIは、アセテートおよびカオトロープを含む緩衝溶液を有する。
【００１２】
ガラス基質内のガラス表面を変更することが、例えば、米国特許第５,６０６,０４６号に開示されている。ＰＥＧおよび塩が存在する中、磁気ビーズ(Magenetic beads)に可逆的で、かつ不特定に結合させることによる抽出について、例えば、Hawkins, T.L.およびT. O'Conneor-Morin (1994)らの“DNA purification and isolation using a solid-phase”, Nucleic Acids Res 22(21): 4543-4、または三重媒介の類似物捕獲技術(triplex-mediated affinity capture)(米国特許第５,５９１,８４１号)に開示されている。適当な精製材料は、ゲル、樹脂、膜、ガラス、または核酸を選択的に保持する他の表面を含む。
【００１３】
次いで、プラスミド質をアガロースゲル電気泳動を用いて評価し、その量を分光光度法により決定でき、両方の技術とも当業者によく知られている。水中にまたは次段階(すなわち、ＰＣＲまたはサイクルシークエンシングのような直接シークエンシング反応)に適合できる希釈緩衝液中にプラスミドを得ることが有利である。
【００１４】
プラスミドの収量(または恐らく質)が直接シークエンシングに不十分である場合、挿入配列およびフランキング配列をカバーするプラスミドの具体的な領域を慣用のポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)をにより増幅でき、シークエンシングテンプレートを得る。このＰＣＲ生成物は、シークエンシングのテンプレートとして使用する前に“クリーンアップ”されなければならない。クリーンアップは、もしそうしなければサイクルシークエンシング反応を妨害する、非挿入ヌクレオチドおよびプライマーの除去を含む。一つの方法は、エキソヌクレアーゼIIIおよびシュリンプ・アルカリホスファターゼへの暴露、これらの酵素の熱変性による不活性化および反応物のサイクルシークエンシングにおける直接の使用を含む。
【００１５】
３)サイクルシークエンシング
サイクルシークエンシング反応は、テンプレート核酸とシークエンシングプライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素および、少量のジデオキシ(連鎖停止)形の一つの塩基を含む４つのデオキシヌクレオチド(ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴ)の混合、続く加熱と冷却のサイクル(すなわち、熱循環)を含む。反応は−各々少量の各ジデオキシヌクレオチドを、蛍光標識プライマーと共に含む−４つの異なる試験管で、または異なる蛍光標識と非標識プライマーのジデオキシヌクレオチドを伴うジデオキシヌクレオチドの使用を介して一つの試験管内で行なう。結果は、テンプレート鎖の配列と相補的な核酸鎖の蛍光標識ラダーである。サイクルシークエンシング反応は、一般に、サーモサイクラー中のマイクロタイタープレート(９６ウェルまたは３８４ウェル)中で１０−２０μlの規模で行なう。
【００１６】
４)クリーン・アップ
標識ヌクレオチドターミネーターを使用する場合、非挿入蛍光ヌクレオチドを除去するために、反応混合物はその後“クリーン・アップ”しなければならない。これらは、そうしなければシークエンシングラダーの電気泳動的分離で見え、結果の質を落とす。
【００１７】
キャピラリー電気泳動装置を使用する場合、動電学的注入を容易にするためにシークエンシングラダーから塩を除去する必要もある。このクリーン・アップは、一般に、エタノールおよび塩の添加による沈殿により、またはゲル濾過により行なう。プライマー-標識反応の場合、脱塩は、キャピラリー電気泳動を使用する場合のみ必要である。
【００１８】
５)シークエンシング反応の分析
停止したシークエンシング反応を、次いで、続く分析のために、スラブゲル(例えば、ABI PRISM 377またはALFexpressで使用されているような)、またはキャピラリーカラム(例えば、MegaBACE(Amersham Pharmacia Biotech)またはPE ABI 3700(PE Biosystems))であり得る、変性ゲルで分離する。
【００１９】
最近、これらの段階の自動化が、マイクロファブリケーション、すなわち、これらの段階をできるだけ少量で行なうことを強調して記載されている。
【００２０】
大部分の自動化は、ピペットおよびマイクロタイタープレート(９６ウェルおよび３８４ウェル)を使用して手動で通常行なわれている段階を行なうためのロボットの使用を目的とする。個々の段階を別々のプレートで行ない、プレートとフォーマットの間の液体の移動を、ピペッティングロボットを使用して行なう。最近、多くのロボットからなるにもかかわらず、一つの装置に種々の段階を統合させる試みがなされている。一つの例が、Trevor Hawkins(Whitehead Institute)により開発されたSequatronである。これは、Ｍ１３を精製し、シークエンシング反応を超薄層スラブゲルまたはキャピラリーのための調製物で行なうためのロボットを含む。方法は、ＤＮＡの固相単離に基づき(例えば、Hawkins, T. L., T. O'Connor-Morin, et al. (1994). “DNA purification and isolation using a solid-phase”. Nucleic Acids Res 22(21):4543-4参照)、２４時間あたり２５,０００を超えるサンプルのスループットを可能にする。加えて、Washington Universityのグループは、また大きなロボットおよびマルチタイタープレートに基づくＭ１３プラークおよびテンプレート調製物の採取のためのロボットを開発している。
【００２１】
マイクロマシンを用いるシリコン構造上でのカオトロープ存在下でのＤＮＡの単離法が公開されている(Christel, L. A., K. Petersen, et al. (1999). “Rapid, automated nucleic acid probe assays using silicon microstructures for nucleic acid concentration.” J Biomech Eng 121(1):22-7)。米国特許第５,８８２,４９６号は、加熱反応チャンバー、電気泳動装置およびサーモニューマティック(thermopneumatic)センサー−アクチュエーター、化学前濃縮物、および濾過または制御流動装置の表面領域を増加させるための多孔性シリコン構造の製作および使用を記載している。特に、このような高表面領域または特異的孔サイズ多孔性シリコン構造は、小規模スケールでこのようなプロセスを使用する適用において、吸着、蒸発、脱着、縮合ならびに液体およびガスの流れを明白に増加させるために有用である。
【００２２】
融合シリカキャピラリーにおける一つの細菌コロニーからのプラスミドの直接シークエンシング法が開発されている(Zhang, Y., H. Tan, et al. (1999). “Multiplexed automated DNA sequencing directly from single bacterial colonies.” Analytical Chemistry 71(22):5018-25)。別の方法は、レーザー−励起共焦点顕微鏡に基づく検出法を含む、ガラスチップにおける分離を含む(例えば、Kheterpal, I. and R. A. Mathies (1999).“Capillary array electrophoresis DNA sequencing.”Analytical Chemistry 71(1):31A-37A参照)。
【００２３】
米国特許第５,６１０,０７４号は、同じ液体中に溶解、懸濁または分散している物質の混合物からの、連続段階での物質の単離のための遠心ローターを記載している。複数のサンプルを、各々は分割および単離工程の個々の段階が行なわれる一連の相互連結した、チャンバーのあるそして通気されたコンパートメントを含む複数の分画セルの手段により同時に処理する。この遠心ローターにおいて、サンプル液またはプロセスの任意の段階でのそのフラクションの一つで満たされている特異的コンパートメントは、ローターの回転の速度と方向および重力の両方の組合せにより制御される。相互連結、チャンバーおよび各コンパートメントの通路は、サンプルおよび試薬液体の予め決定した量が、コンパートメントからあふれ出ないようなサイズと角度にする。しかし、このようなローターは相対的に嵩高く、相対的に大容量の溶液を必要とし、製造が複雑である。
【００２４】
回転可能な、通常、プラスティックでできたディスクから形成されるマイクロチャネルに基づく微量分析システムは、しばしば、“遠心ローター”、“チップ上の試験(lab on a chip)”または“ＣＤデバイス”としばしば呼ばれる。このようなディスクは、少量の流体の分析および分離の実行に使用できる。酵素アッセイを行なう目的でプラスティックディスクのチャネルを通して液体を移動させる原理は、例えば、Duffy, D. C., H. L. Gillis, et al. (1999). “Microfabricated centrifugal microfluidic systems: characterizatoin and multiple enzymatic assays.” Analytical Chemistry 71(20):4669-4678に記載されている。適当なプラスティックディスクの一つのタイプは、コンパクトディスクまたはＣＤと呼ばれるものである。
【００２５】
このようなディスクを回転させた場合、遠心力がディスクの中心に向かう。ディスクに流体がある場合、この遠心力は、表面張力、張力および毛管力の結果であり得る。流体のディスクの外側へ向かう移動は、通常、ディスクの回転速度を上げることにより遠心力を負かすことにより達成される。
【００２６】
経費を削減するために、ディスクは試薬または流体の一つのタイプでの使用に限定すべきでなく、種々の流体で働くことができるようにすべきである。更に、サンプルの調製中、ディスクを修飾することなく流体またはサンプルの任意の組合せの正確な容量を排気することを可能にすることが望ましい場合がしばしばある。マイクロチャンネルの細い幅のために、マイクロチャンネルの二つの流体のサンプルの間に存在する気泡は分離バリアーとして作用し得、またはマイクロチャンネルを遮断し、それにより流体が入ることを想定されたマイクロチャンネルに入ることを妨げる。この問題を解決するために、米国特許第５,５９１,６４３号は、望ましくない空気を、流体がマイクロチャンネルに入るのと同時に排気できるのに十分に大きい断面領域を有するマイクロチャンネルを含む遠心ローターの使用を教示する。
【００２７】
本発明は、テンプレート単離、サイクルシークエンシングおよびＣＤデバイスへのクリーンアップの段階の統合のための装置、およびこの装置の使用法に関する。特に、本発明は多数のサンプルの取り扱いを可能にし、したがって、自動化を非常に単純化し、試薬の消費およびしたがって全費用を削減し、必要な装置のサイズを減少させる、一つの密閉デバイスに関する。今日まで、一つの封入された構造内で、クリーン・アップされたシークエンシング反応の獲得を介した、ＤＮＡテンプレート細菌コロニーの単離を可能にする類似の統合レベルの装置の報告はない。
【００２８】
したがって、本発明の第１の態様により：
ａ)核酸テンプレート精製の段階：
ｂ)サーモサイクリング反応の段階：および
ｃ)段階ｂ)の生成物の精製の段階
を含み、段階が微小流体ディスクで連続して行なわれることを特徴とする、一連の段階を行なう方法を提供する。
【００２９】
適当には、核酸テンプレートはプラスミドＤＮＡであるが、ゲノム真核または原核由来テンプレートも使用できる。他の核酸テンプレートは、当業者に既知の適当な抽出および精製プロトコールを使用して、Bacterial Artificial Chromosomes (BAC)またはＭ１３から精製できる。
【００３０】
他の実施態様において、サーモサイクリング反応は、直接単純細菌抽出物で、プラスミドの予めの単離なしに行なうことができる。
【００３１】
第１の態様の好ましい実施態様において、微小流体ディスクを通した流体の流れを、ディスクの回転により行なうことができる。ディスクを約２５０rpm(低速)から１５,０００rpm(高速)の範囲の種々の速度で回転(または回転)できる。方法の任意の特定の段階でのディスクを通した流体の正確な流れを達成するために必要な実際の速度は：
−微小流体ディスク上における構造の位置(すなわち、構造がディスクの中心から遠いほど、構造がディスクの中心にああるのと同じ遠心力を達成するために必要なrpmが低い)；
−液体が通過すべき構造の物理的寸法；
−液体の粘性；および
−構造における表面の化学的および物理的特性
を含む多くの因子に依存する。
【００３２】
第１の態様の特に好ましい実施態様において、サーモサイクリング反応、段階ｂ)は、核酸シークエンシング反応またはサイクルシークエンシング反応である。他の好ましいサーモサイクリング反応は、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を含む。
【００３３】
第１の態様の他の実施態様において、方法は更に：
ｄ)段階ｃ)で得られた精製産物の分離の段階；
を含み、好ましくは段階ｄ)はシークエンシング反応の生成物の電気泳動的分離である。好ましくは、分離段階ｄ)はまた段階ａ)−ｃ)と同じ微小流体ディスクで行なう。
【００３４】
特に好ましい実施態様において、段階ａ)は、核酸テンプレートを微小流体ディスクに含まれる微小構造における精製カラムを通すことにより行ない、段階ｃ)は、段階ｂ)の生成物を微小流体ディスクに含まれる微小構造におけるゲル濾過カラムを通すことにより行なう。
【００３５】
第１の態様の一つの実施態様において：
ａ)テンプレート核酸を含む細胞の培養を融解試薬で処理し、細胞質膜を融解させる；
ｂ)段階ａ)の融解物を微小流体ディスクの微小構造に入れ、ここで各微小構造はテンプレート核酸を精製するための手段を含む第１チャンバー、サーモサイクリング反応のための手段を含む第２チャンバー、およびサーモサイクリング反応の生成物を精製するための手段を含む第３チャンバーを含む：
ｃ)分析のために精製産物を回収する
ことを含む、テンプレート核酸における核酸シークエンシング反応を行なう方法を提供する。
【００３６】
一つの実施態様において、第３チャンバーで精製した後に得られる精製産物を、テンプレート配列データを得るためにキャピラリー電気泳動ＤＮＡシークエンサー(MegaBACE(登録商標)(Amersham Pharmacia Biotech)のような)に移すことができる。他の実施態様において、精製産物を、“サンプル調製”微小流体ディスクに直接結合した円形デバイスで分析する。
【００３７】
他の実施態様において、第１チャンバーからの溶出液を最初に容量決定構造に向け、サーモサイクリング反応の手段を含む第２チャンバーに正確な量の液体の正確な移動を確実にする。
【００３８】
本発明の第２の態様において：
ａ)少なくとも一つの入口；接続先
ｂ)テンプレート核酸を精製するための手段を含む第１チャンバー；接続先
ｃ)サーモサイクリング反応のための手段を含む第２チャンバー；接続先
ｄ)サーモサイクリング反応の産物を精製するための手段を含む第３チャンバーを含むことを特徴とする、流体用の微小構造を提供する。
【００３９】
第２の態様の好ましい実施態様において、流体用の微小構造は更に：
ｅ)第３チャンバーに接続した分離マトリックスを通した電位を適用するための手段を含む第４チャンバー
を含む。
【００４０】
本発明のこの態様において、シークエンシングラダーの電気泳動的分離は、同じ微小流体ディスクまたはＣＤで行なう。分離は、円形デバイスの外側末端から、一つの検出器が通過したバンドを検出できる場所である内側中心に向かう(例えば、Shi, Y., P. C. Simpson, et al. (1999).“Radial capillary array electrophoresis microplate and scanner for high-performance nucleic acid analysis.”Analytical Chemistry 71 (23):5354-61に記載)。これは、サンプル調製のスケールの更なる減少および全工程の緊密さおよび自動化の明白な増加を可能にする。
【００４１】
適当には、微小構造を含むチャンバーおよびチャネルは、約１０−５００ミクロンの範囲の深さである。
【００４２】
第２の態様の他の実施態様において、流体の微小構造は更に、サンプルおよび試薬の挿入および不用物の退出を可能にするように配置された複数の入口および廃棄出口を含む。
【００４３】
特に好ましい実施態様において、不用物の出口は不用物の有効な退出のための真空ポンプに接続することができる。
【００４４】
本発明の第３の態様において、テンプレート核酸のサーモサイクリング反応をを行なうための装置を提供し、該装置は微小流体ディスクを含み、該ディスクは第２の態様にしたがった流体用の複数の放射状に広がる微小構造を含む。
【００４５】
第３の態様の一つの実施態様において、多くの微小構造が一つの微小流体ディスクに含まれる。好ましい実施態様において、微小構造の数は１−１０００、好ましくは８０から１００であり、一つのディスクに放射状に配置される。特に好ましい実施態様において、９６微小構造を一つのディスク上に配置させ、９６ウェルアッセイフォーマットと適合するディスク装置を作る。
適当には、装置は１２cmのコンパクトディスクの形である。
【００４６】
第３の態様の他の実施態様において、装置は更に同じディスク上での細菌培養または最初の核酸テンプレート調製に適した複数のウェルを含むことができる。おｋれは、マイクロタイタープレートと微小流体ディスクの間の形式変化の必要性を避ける利点を有する。
【００４７】
好ましい実施態様において、微小流体ディスク上での微小構造の入り口は、共通の環状チャネルのような中心に集まる分布のチャネルに接続し、同時にディスク上の全ての微小構造への試薬の中心に集まる分布を可能にする。好ましくは、廃棄チャネルを共通の環状廃棄チャネルに接続し、一つの態様においては、それはディスクの外側の末端に向かう。また好ましいのは、統合された構造を通した液体の流れを可能にする微小構造における複数の通風孔である。
【００４８】
図面の簡単な説明
本発明を、添付の図面の手段により実施態様の非限定的例により説明し、ここで：
図１ａは微小流体ディスクにおけるその配向を示す本発明の流体の微小構造のプランにおける模式図を示す(一部示す)；
図１ｂは、本発明の流体のための一つの微小構造のプランの模式図を示す；
図１ｃは、図１ｂのマイクロチャネルの廃棄制御構造(３４)の拡大図を示し、ここで、ａは微小流体ディスクが低速で回転した場合の液体の経路を示し、ｂは微小流体ディスクが高速で回転した場合の液体の経路を示す；
図１ｄは、図１ｂに示す微小構造のサンプル調製マイクロチャンネル構造(すなわち、(１３)−(２２)の部分)と電気泳動構造((２３)−(２８)の部分)の間の領域(３６)の拡大図を示す；
図１ｅは、微小流体ディスク上に配置された本発明の流体のための微小構造の別の態様を示す；
図２は本発明の微小流体ディスク上のウェルの二つの可能性能ある構造を示す。
【００４９】
本発明を説明する実施態様の詳細な記載
本発明の流体用の微小構造の一つの例(１)を、微小流体ディスク(２)上に配置された、一部を示す図１ａに示す。流体用の微小構造(１)は、微小流体ディスク(３)の中心穴に最も近い入口(５)を有するディスク上に放射状に配置される。微小流体ディスクの外側の端を示す(４)。流体用の微小構造は、一連の専属されたマイクロチャンネルを含む。微小流体ディスク(２)は、その直径よりもかなり小さい厚さを有し、中心穴(３)の回りを回転することが考慮され、それにより遠心力がディスクナかのマイクロチャンネルに配置された流体をディスクの外側の端または末端(４)に向けて流す。流れは毛管作用、圧力および遠心力の両方、すなわち、ディスクの回転により駆動される。下記のように、疎水性ブレーキを流れの制御に使用できる。
【００５０】
適当には、微小流体ディスクは１または２片鋳造構築物であり、所望により透明のまたは重合物質から、別々のモールディングの手段により形成され、それを一緒に集合させ(例えば、加熱により)、決められた位置に入口を有する密閉構造を提供し、デバイスの液体での充填および液体サンプルの除去を可能にする。好ましいプラスチックまたは重合物質は、好ましくは低自己蛍光を有し、ポリスチレンおよびポリカーボネートから選択される。別法として、マイクロチャネルの表面は、更に、化学的または物理的手段により選択的に修飾し得、表面特性を変え、マイクロチャネル内に疎水性または親水性の局所領域を作り、所望の特性を付与する。好ましいプラスチックは、電荷表面を有するポリマー、好ましくは化学的またはイオン−プラズマ処理ポリスチレン、ポリカーボネートまたは他の硬い透明のポリマーから選択される。
【００５１】
マイクロチャネルは、マイクロチャネルをディスクの表面に微小機械加工し、カバープレート、例えば、プラスチックフィルムを表面に接着させ、チャネルを閉じる、微小機械加工法により形成し得る。
【００５２】
疎水性ブレーキを、例えば、オーバーヘッドペン(パーマネント・インク)(Snowman pen, Japan)でマーキングすることにより、マイクロチャネル構造に導入できる。疎水性ブレーキの目的は、流体を望ましくない方向に誘導する毛管作用の防止である。疎水性ブレーキは、遠心力により、すなわち、ディスクを高速で回転させることにより打開できる。
【００５３】
図１ａにおいて、矢印は流体および／または空気の微小構造における入口および出口からの流れを示す。これらの開口部は下記により詳述する。
【００５４】
図１ａはまた微小流体ディスクの外側端(４)に向かって位置決めされたウェル(１２)を示す。このウェルは、サンプルの入口(５)への添加の前にサンプル調製に使用できる。例えば、使用する核酸テンプレートが細菌コロニー由来である場合、細菌コロニーを最初に、例えば、ピペッティングロボットにより取りだし、固体液体培地の表面から、それを約１０μlの等張液に懸濁させる。懸濁液をついで微小流体ディスクのウェル(１２)に入れる。細菌細胞をついで微小流体ディスクを回転させることによりペレット化でき、上清を傾捨し得る。ペレットをついで溶液Ｉに再懸濁し、続いて回転し、溶液IIおよびIIIに連続して再懸濁する。沈殿ゲノムＤＮＡおよびタンパク質を回転によりペレット化し、プラスミド含有上清をさらに処理する(下記参照)。
【００５５】
図１ｂは、流体用微小構造(１)のより詳細な図である。微小構造は、各々試薬およびサンプルの適用領域として使用し得入口(５)、(８)および(９)、出口(６)および(１１)、通風孔(１０)および、入口および通風孔(７)の両方として働くことができる開口部を含む。通風孔は、ディスクの頂上表面を介して外気に開き、マイクロチャネル中の流体が構造中に吸い込まれ戻るのを防ぐ。
【００５６】
適当には、入口および出口は環状分布チャネルと結合できる。
適当には、廃棄出口を真空に接続し、不用物の除去を促進できる。
【００５７】
微小構造は、更に、一連のチャンバーを含む。液体のマイクロチャネルおよびチャンバーを通した移動は、微小流体ディスクを使用する再、下に記載する。
【００５８】
サンプル添加前に、二つの精製カラムを下記のように微小構造に挿入する：
１)懸濁液中のNaked Sephasilを入口(５)を通して第１チャンバー(１３)に入れ、微小流体ディスクを回転する。Sephasilの移動を、深さを＞２０μから＜１０μ(影を付けた領域(１４)として)からSephasilカラム(１５)までは変えることにより停止させる。他の適当なマトリックスは、好ましくは、容易に充填でき、１５−５０μmの範囲の直径を有する単分散球体でなければならない。
【００５９】
図１ｃは、液体のSephasil懸濁液からの除去を可能にする、図１ｂのマイクロチャネル構造に示す廃棄制御構造(３４)の拡大図を示す。ディスクを低速で回転させることにより、Sephasil懸濁液からの廃液は最も近い出口の壁を伝い(すなわち、矢印ａにより示される方向)、廃棄出口(６)を通して構造から出る。
【００６０】
２)懸濁液中のSephadex G-50(ＤＮＡグレート)をチャンバー(１６)に、入口(９)を通して入れる。微小流体ディスクの回転により、Sephadex G-50のチャンバー(１６)の外への移動を、深さを＞２０μから＜１０μ(影を付けた領域(１７)により示す)からSephadex G50ベッド(３５)までは変えることにより停止させる。
【００６１】
懸濁液からの液体を、微小構造から、廃棄出口(１１)を通して、制御領域(１９)を通過させて、出るように、十分な遠心力(微小流体ディスクを回転させることにより)を付加することにより除去する。領域(１９)は、液体流を、チャネルの物理的収縮および／または表面疎水性の増加により、液体が得られる流体バリアーを、微小流体ディスクの回転により一定の遠心力に到達したときのみ通るように制御する。
【００６２】
微小流体ディスクは、ここで、サンプル添加の準備ができた。
【００６３】
サンプルが細菌プラスミド核酸である場合、細菌融解物からの上清を第１チャンバー(１３)に、入口(５)を通して添加する。遠心力を適用することにより、サンプルはSephsilカラム(１５)を通す。プラスミドはSephasil上に捕獲され、また入口(５)を通してチャンバー(１３)にに挿入された洗浄溶液で洗浄し、微小流体ディスクを低速で回転させることにより、洗浄溶液をSephasilから廃棄制御構造(３４)に移動させ、そこから、廃棄出口(６)を通して微小構造から出る。
【００６４】
プラスミドをSephasilから無から、水をチャンバー(１３)に入口(５)を通して添加することにより溶出し、溶出液が高速遠心力の適用により廃棄制御構造(３４)の外側チャネル(すなわち、矢印ｂで示す方向)、および第２チャンバー(１８)およびＵ屈曲構造に行く。液体流を、必要な場合、制御領域(２０)の次元の変化および／または表面疎水性の増加により変化し得、液体が、得られる流体バリアーを、微小流体ディスクの回転により一定の遠心力に到達したときのみ通るように制御する。
【００６５】
チャンバー(１８)内の液体を第３チャンバー、ダブルＵ構造に、遠心力により移動させる。同時に、サイクルシークエンシング用の試薬を、入口(８)を通して挿入する。したがって、プラスミド溶出液およびシークエンシング試薬をチャンバー(２１)で混合する。
【００６６】
サイクルシークエンシング反応を、チャンバー(２１)の温度を約６０℃から９５℃の間にし、その間微小流体ディスクをチャンバー内の蒸発を減少させ、また泡形成による液体カラムの破壊の危険性を減少させるために、回転させることにより行なう。適当には、サイクルシークエンシング反応の反応容量は２５０−５００nlの間であり得る。
【００６７】
サイクリングが完了したとき、液体プラグをチャンバー(１８)に入口を(７)を通して入れ、液体プラグをチャンバー(２１)中の液体を置き換え、第４チャンバー(１６)内のSephaexベッド、更に、第２Ｕ屈曲構造、チャンバー(２２)を通過させる。この方法で、塩および非包含色素ターミネーターはSephadexに残り、したがって、ゲル濾過の工程を通してシークエンシング反応から除去する。精製反応産物(すなわち、シークエンシング産物のラダー)をチャンバー(２２)に残す。適当には、反応サンプル５００ナノリットル未満の容量である。
【００６８】
高粘性ゲルマトリックスのような電気泳動用培地を、チャンバー(２３)、(２４)、(２５)および(２７)から導かれるチャネルに適当な緩衝液と共にチャネル(２６)に入れる。
【００６９】
図１ｄに関して、電位をチャンバー(２３)と(２４)の間に適用させ、精製反応産物のプラグを矢印１'で示すチャンバー(２２)からチャネル(２６)のゲルマトリックスに通過させる。深さの減少を示し(３７)、これは高粘性ゲルマトリックスの移動を制限し、チャネル(２６)に残す。
【００７０】
電位をチャンバー(２５)と(２７)の間に適用させ、反応産物(配列ラダー)を矢印２'で示すチャネル(２６)のゲルマトリックスに移動させる。生成物は、点(２８)を通過したときに検出でき、したがって、プラスミド中のＤＮＡの塩基配列を導く情報を得る。
【００７１】
図１ｅの本発明の微小構造の他の実施態様において、チャンバー(２３)−(２５)、(２７)および(２８)として図１ｂに記載された電気泳動構造およびチャネル(２６)が無い。この態様において、サーモサイクリング反応の精製産物(すなわち、チャンバー(１６)からの溶出液)をウェル(２９)に別の電気泳動デバイスへの移動のために保持する。この態様において、生成物は約サブマイクロリットル容量で得られ、これは更なる分析のための別の構造に移動するための液体(例えば、ホルムアミドまたは水)の添加により希釈できる。
【００７２】
図２は、ウェル(１２)および(２９)のような、ウェルの二つの可能性のある構造の側面図を示す。一つの適当なウェルは円筒状(３１)の形である。他は、フルストロコニカル(frustroconical)(３２)の形である；両方の形とも、ウェルの頂上および底の形が実質的に円形であり、底円は頂上円の直径よりも大きい直径を有する。遠心力の方向は矢印(３３)で示す。
【００７３】
本発明を、更に、以下の非限定的実施例を参照して記載する。
【００７４】
実施例１
１．形質転換細菌をＬＢ培地＋グルコースと１００μg／mlアンピシリンおよびインディケーターさえ含む寒天プレートに広げる。プレートを一晩、３７℃でインキュベートする。
２．一つの細菌細胞(クローン)由来のコロニーを目で(またはロボットを使用して)同定する。コロニーを、約１０μlの等張液に再懸濁することにより微小流体ディスクのウェルに移す。
【００７５】
３．細菌細胞を遠心により遠沈させ、上清を除去する。
４．３マイクロリットルの溶液Ｉ(１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、４００μg／ml  ＲＮａｓｅ Ｉ)を添加し、細菌細胞をピペッティングロボットにより再懸濁させ、３分間インキュベートする(注：プラスミド調製用の全試薬はGFX Micro Plasmid Prep Kit, Amersham Pharmacia Bioteckからである)。
【００７６】
５．３マイクロリットルの溶液II(１９０ｍＭ  ＮａＯＨ、１％ｗ／ｖ  ＳＤＳ)を、ピペッティングロボットで混合しながら添加し、３分間インキュベーションする。
６．６マイクロリットルの溶液III(アセテートおよびカオトロープ含有緩衝液)を、ピペッティングロボットで混合しながら添加する。
７．混合物を遠心し、上清をプラスミド単離のための構造に移す。
【００７７】
８．上清を、構造の深いおよび浅いセクションの間え捕捉された裸のSephasilビーズ(Sephasilを微小構造に添加し、微小流体ディスクを約１０００rpmで回転させ、液体を除去することにより調製)を通す。プラスミドはSephasilカラムに捕捉され、微量流体ディスクの回転により、非結合物質が廃棄チャネルを通して出る。
【００７８】
９．カラムを洗浄溶液(８０％エタノール含有Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液)で洗浄し、汚染タンパク質を除去する。再び、洗浄液を微小流体ディスクを約１０００rpmで回転させることにより廃棄へ向ける。
１０．プラスミドを１−２μlの水の添加およびついで高速での回転により溶出させる。この溶出液をサーモサイクリングチャンバーに向け、そこで、サイクルシークエンシングを２５０−５００nlの全量で行なう。
【００７９】
１１．段階１０と平行して、サイクルシークエンシング試薬(酵素、プライマー、緩衝液、ヌクレオチドおよび蛍光ターミネーター)(DYEnamic ET dye terminator kit (MegaBACE(登録商標)から得る)を同じサーモサイクリングチャンバーに入れる。
１２．サーモサイクリングを、チャンバーへの熱および冷却の適用を変えることにより行ない、９５℃および約６０℃の間で２５−３５サイクルをサイクリングさせる。
【００８０】
１３．反応混合物をサーモサイクリングチャンバーから、遠心力によりおよびゲル濾過チャンバーを通して排出する。ゲル濾過チャンバーは、微小構造中の深いおよび浅いセクションの間に捕捉された単分散(ふるった)Sephadex G-50 ＤＮＡグレードビーズを含む。非包含ターミネーターおよびまた塩が保持される。残りの配列ラダーは、最終“ピックアップ”ウェルに続き、必要な場合、より多くの水を添加し、液体取り扱いを助け、蒸発を減少させる。
１４．クリーン・アップ反応物を、ピペッティングロボットによりピックアップウェルから取りだし、マイクロタイタープレートに入れ、MegaBACEによる更なる処理のために５−１０μlに希釈する。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】  微小流体ディスクにおけるその配向を示す本発明の流体の微小構造のプランにおける模式図を示す(一部示す)；
【図１ｂ】  本発明の流体のための一つの微小構造のプランの模式図を示す；
【図１ｃ】  図１ｂのマイクロチャネルの廃棄制御構造(３４)の拡大図を示し、ここで、ａは微小流体ディスクが低速で回転した場合の液体の経路を示し、ｂは微小流体ディスクが高速で回転した場合の液体の経路を示す；
【図１ｄ】  図１ｂに示す微小構造のサンプル調製マイクロチャンネル構造(すなわち、(１３)−(２２)の部分)と電気泳動構造((２３)−(２８)の部分)の間の領域(３６)の拡大図を示す；
【図１ｅ】  微小流体ディスク上に配置された本発明の流体のための微小構造の別の態様を示す；
【図２】  本発明の微小流体ディスク上のウェルの二つの可能性能ある構造を示す。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図２】
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