(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造
【化１】
0004741138.tif 000008
を有する化合物。
【請求項２】
微生物DSM 12038又はその突然変異体もしくは変種を水性栄養培地で培養し、請求項１記載の化合物を単離して精製することからなる該化合物の製造方法。
【請求項３】
請求項１記載の化合物の有効量を、医薬上適切な生理学上許容しうるビヒクル、添加剤及び／又は他の活性化合物及び賦形剤と共に含む医薬。
【請求項４】
経過にマトリックス分解性メタロプロテイナーゼの高められた活性が関与する容態の予防及び治療のための医薬の製造における請求項１記載の化合物の使用。
【請求項５】
退行変性関節疾患、例えば変形性関節症、脊椎症、関節外傷後又は半月板もしくは膝蓋骨損傷もしくは靭帯断裂後の比較的長期の関節固定化後の軟骨融解、結合組織の状態、例えば膠原病、歯周状態、創傷治癒疾患及び運動組織の慢性状態、例えば炎症的に、免疫学的に又は代謝的に生じた急性及び慢性の関節炎、関節症、筋肉痛及び骨代謝疾患、潰瘍疾患、アテローム性動脈硬化症及び狭窄の治療のため、そしてまた、炎症、癌性疾患、腫瘍転移の形成、悪液質、食欲不振及び敗血症性ショックの治療のための請求項４記載の使用。
【請求項６】
医薬上適切な生理学上許容しうるビヒクル及び、適当ならばさらなる適切な活性化合物、添加剤又は賦形剤を用いて請求項１記載の化合物を適切な投与形態にすることからなる医薬の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はストロメマイシン、ストロメマイシン誘導体、それらの製造方法並びに医薬及びストロメリシン阻害剤としてのその使用に関する。
【０００２】
ストロメリシン（マトリックスメタロプロテイナーゼ３）は、実質的にプロテオグリカンの分解において酵素として含まれるマトリックスメタロプロテイナーゼであり、軟骨組織の重要な構成要素である(A. J. Fosang 等 J. Clin. Invest. 98 (1996) 2292−2299)。構造的にストロメマイシンと似た化合物は、Yasuzawa等により記載されている(The Journal of Antibiotics, 第XLIII巻, 第4号, (1990), 第336−343頁)。
【０００３】
そこで、結合組織疾患の治療に有効な化合物を見いだす試みにおいて、本発明のストロメマイシン及びストロメマイシン誘導体は、マトリックスメタロプロテイナーゼストロメリシンの阻害剤であることが見出された。
【０００４】
したがって、本発明は、式Ｉ
【化３】
0004741138.tif 000002
｛式中、Ｒ1は、
１.（Ｃ3−Ｃ10）−アルキル〔ここで、アルキルは、線状又は分枝状であり、そして非置換であるか又は
１.１  −ＯＲ3（ここで、Ｒ3は、水素原子又は（Ｃ1−Ｃ4）−アルキルである）、
１.２  −ＮＲ4Ｒ5（ここで、Ｒ4及びＲ5は、互いに独立して水素原子又は（Ｃ1−Ｃ4）−アルキルである）、
１.３  ハロゲン、例えば−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉ、
１.４  ＝Ｏもしくは
１.５  −ＣＯＯＨ
によって一、二もしくは三置換されている〕、又は
【０００５】
２.（Ｃ3−Ｃ10）−アルケニル〔ここで、アルケニルは、線状で又は分枝状であり、そして非置換であるか又は
２.１  −ＯＲ3（ここで、Ｒ3は、水素原子又は（Ｃ1−Ｃ4）−アルキルである）、
２.２  −ＮＲ4Ｒ5（ここで、Ｒ4及びＲ5は、互いに独立して水素原子又は（Ｃ1−Ｃ4）−アルキルである）、
２.３  ハロゲン、例えば−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉ、
２.４  ＝Ｏもしくは
２.５  −ＣＯＯＨ
によって一、二もしくは三置換されている〕であり、
【０００６】
Ｒ2は、
１.（Ｃ3−Ｃ10）−アルキル〔ここで、アルキルは、線状又は分枝状であり、そして非置換であるか、又は
１.１  −ＯＲ3（ここで、Ｒ3は、水素原子又は（Ｃ1−Ｃ4）−アルキルである）、
１.２  −ＮＲ4Ｒ5（ここで、Ｒ4及びＲ5は、互いに独立して水素原子又は（Ｃ1−Ｃ4）−アルキルである）、
１.３  ハロゲン、例えば−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉ、
１.４  ＝Ｏもしくは
１.５  −ＣＯＯＨ
によって一、二もしくは三置換されている〕、又は
【０００７】
２.（Ｃ3−Ｃ10）−アルケニル 〔ここで、アルケニルは、線状又は分枝状であり、そして非置換であるか又は
２.１  −ＯＲ3（ここで、Ｒ3は、水素原子又は（Ｃ1−Ｃ4）−アルキルである）、
２.２  −ＮＲ4Ｒ5（ここで、Ｒ4及びＲ5は、互いに独立して水素原子又は（Ｃ1−Ｃ4）−アルキルである）、
２.３  ハロゲン、例えば−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉ、
２.４  ＝Ｏもしくは
２.５  −ＣＯＯＨ、
によって一、二もしくは三置換されている〕であり、そして
【０００８】
Ｚは、ヘキソース（ここで、糖は、ピラノイド形態でＣ−グリコシド結合を通して結合される）である｝
の化合物及び／又は式Ｉの化合物の立体異性体の形態及び／又は式Ｉの化合物の生理学上許容しうる塩に関する。
【０００９】
式Ｉの好ましい化合物は、Ｒ1がノナジエニルであり、Ｒ2がノナジエニルであり、そしてＺがＤ(＋)−グルコース、Ｄ(＋)−マンノース、Ｄ(＋)−ガラクトース又はＤ(＋)−タロースである化合物である。
【００１０】
特に好ましい化合物は、
【化４】
0004741138.tif 000003
である。
この化合物は、以下でストロメマイシンと称する。
【００１１】
ヘキソースの用語は、天然に生じる全ての式Ｃ6Ｈ12Ｏ6のヘキソース、例えばＤ(＋)−グルコース、Ｄ(＋)−マンノース、Ｄ(＋)―ガラクトース又はＤ(＋)−タロースのことであると理解される。
【００１２】
さらに、本発明は、
ａ）微生物DSM 12038又はその突然変異体もしくは変種を水性栄養培地で培養し、化合物ストロメマイシンを単離して精製するか、又は
ｂ）ストロメマイシンを還元水素化によって式Ｉ（式中、Ｒ1及びＲ2は、Ｃ9−アルキルである）の化合物に転化するか、又は
ｃ）ストロメマイシンをオゾン分解によって式Ｉ（式中、Ｒ1及びＲ2は、
1.）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＯＨ、
2.）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨＯ又は
3.）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ
である）の化合物に転化するか、又は
【００１３】
ｄ）工程ｃ) ２により製造した式Ｉの化合物を、アルキリデンホスホランとの反応により１〜７個のメチレン基によって延長し、その際、導入された側鎖は、ヒドロキシル、エーテル、アミノ基又はＦ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ基といったような官能基を有することができ、
【００１４】
ｅ）化学構造のため鏡像異性体の形態で生じた、工程ａ)、ｂ)、ｃ)もしくはｄ)によって製造された式Ｉの化合物を、鏡像的に純粋な酸もしくは塩基と塩形成するか、キラル固定相上でクロマトグラフィ処理するか又はアミノ酸のような鏡像的に純粋なキラル化合物により誘導体化し、これによって得られたジアステレオマーを分離し、キラル補助基を除去して純粋な鏡像異性体に分離するか、又は
【００１５】
ｆ）工程ａ)、ｂ)、ｃ)、ｄ)もしくはｅ)によって製造された遊離形態の式Ｉの化合物を単離するか、又は酸性もしくは塩基性の基が存在する場合、生理学上許容しうる塩にそれを転化する
ことからなる式Ｉの化合物及び／又は式Ｉの化合物の立体異性体形態及び／又は式Ｉの化合物の生理学上許容しうる塩の製造方法に関する。
【００１６】
微生物DSM 12038は、真菌からなる群に属し、１９９８年３月４日にGerman Collection for Microorganisms and Cell Cultures、Mascheroder Weg 1b、D−38124 Brunswickのブダペスト条約の条件下で第DSM 12038号として寄託されている。
【００１７】
DSM 12038の変種は、それらがストロメマイシンを産生する限りにおいてDSM 12038の培養株から単離することによって得られたDSM 12038の菌株のことであると理解される。DSM 12038の突然変異体は、それらがストロメマイシンを産生する限りにおいて、突然変異後、DSM 12038の培養株から単離することによって得られたDSM 12038の菌株のことであると理解される。DSM 12038の突然変異体は、物理的手段、例えば紫外線もしくはＸ線照射といった照射によって、又は化学的突然変異原、例えばエチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）；２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（ＭＯＢ）もしくはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）によってそれ自体知られている方法で産生することができる。
【００１８】
突然変異体は、例えば培地から試料を取り出し、ストロメリシンにおける阻害作用を測定することによって発見される。ストロメマイシンは、DSM 12038を培養することによって産生される。栄養液には、炭素源、例えばショ糖、コーンスターチ、デキストロース、ラクトース、Ｄ―マンニトール、糖蜜又は麦芽エキス、及び窒素源、例えば大豆粉、落花生粉、タンパク質、ペプトン、ペプチド、トリプトン、肉エキス、酵母エキス又はアンモニウム塩もしくは硝酸塩が含まれる。
【００１９】
また、栄養液には、無機塩、例えばリン酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウム又はリン酸水素カリウムが含まれる。さらに、オレイン酸メチル又はダイズ油のような脂を栄養培地に加えることができる。さらにまた、微量元素、例えば鉄、マンガン、銅、亜鉛、コバルト又は他の金属の塩も加えられる。
【００２０】
好ましい栄養液には、カゼインペプトン約０.１％〜２％、好ましくは０.３％〜１％、ミートペプトン約０.１％〜２％、好ましくは０.３％〜２％、グルコース０.５％〜５％、好ましくは０.５％〜２％、及びマルトース０.５％〜５％、好ましくは０.３％〜２％が含まれる。パーセンテージは、総栄養液の重量に基づく。
【００２１】
DSM 12038は、２０℃〜３５℃の温度、好ましくは２３℃〜２８℃で、ｐＨ５〜９、好ましくは４〜６で培養する。培養は、まず最初に、振盪フラスコ中、その後発酵器中で攪拌しながら空気又は純酸素を通気して有気的に実施する。発酵器中の微生物は、４８〜２４０時間の間、好ましくは１５〜７２時間、特に１５〜３０時間培養する。ストロメマイシンの形成は、約１５〜３０時間後、最大に達する。
【００２２】
ストロメマイシンは、栄養液から直接、又は細胞を例えば遠心分離もしくは濾過によって分離した後に単離する。ストロメマイシンは、溶媒を用いた抽出又は樹脂、例えば XAD 16, HP 20, MCl Gel(R) CHP20Pもしくはイオン交換体上の吸着によって単離することができる。例えば、精製は吸着樹脂、例えばDiaion(R) HP−20 (Mitsubishi Casei Corp., Tokyo)、Amberlite(R) XAD 7 (Rohm and Haas, USA)、Amberchrom(R) CG (Toso Haas, Philadelphia, USA)上のクロマトグラフィによって実施される。分離は、広いｐＨ範囲で実施することができる。ｐＨ１〜ｐＨ９の範囲が好ましく、特に好ましくはｐＨ２〜ｐＨ８である。高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で使用される逆相担体は、さらに適切である。さらなる単離工程では、モレキュラーシーブ、例えばFractogel(R) TSK HW−40S 又は Sephadex(R) LH−20を使用する。
【００２３】
シス及び／又はトランス配置中にある１つ又は２つ、好ましくは２つの二重結合は、Ｃ9−アルケニル基（ノナジエニル側鎖）中に生じることができる。糖基の場合、適切にＣ−グリコシド結合した全てのＣ6−立体異性体が可能である。
【００２４】
微生物により調製されたストロメマイシンは、ストロメマイシン誘導体を製造するための出発物物質として役立つ。Ｒ1及び／又はＲ2がＣ9−アルキルである式Ｉの化合物は、例えばP. N. Rylander in “Hydrogenation Methods”Academic Press, New York (1985), 第２章に記載されたようなそれ自体で知られている方法でストロメマイシンを還元水素化することによって製造される。
【００２５】
ＯｓＯ4のような試薬との反応により、側鎖の二重結合をヒドロキシル化することが可能である（Chem. Rev. 80, 187 (1980)参照）。
【００２６】
知られているように、ノナジエニル側鎖（Ｒ1及びＲ2）における二重結合のオゾン分解により、Ｃ3側鎖を有する対応する誘導体が形成され、これは、酸化又は還元処理に応じて官能基としてアルデヒド基（例えば、Ｚｎ／酢酸又は硫化ジメチル／メタノールを用いて）、カルボキシル基（例えば、Ｈ2Ｏ2を用いて）又はＯＨ基（例えば、ＬｉＡｌＨ4又はＮａＢＨ4を用いて）を有す（W. Carruthers,“Some Modern Methods of Organic Synthesis”Cambridge University Press (1971), 第６章; White, King und O'Brien, Tetrahedron Lett. 3591 (1971); Bailey, P. S.,“Ozonisation in Organic Chemistry”第１巻及び第２巻, New York, Academic Press (1978, 1982))。
【００２７】
Ｃ3鎖は、穏やかな条件下でその後再び、アルデヒド誘導体を、知られているウィッティヒ反応によってアルキリデンホスホランと反応させることによって、例えば４〜１０個の炭素原子に延長することができ、その際、導入する側鎖は、官能基、例えばＯＲ3（Ｒ3＝Ｈ又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基）、ＮＲ4Ｒ5（Ｒ4、Ｒ5＝Ｈ又は１〜４個の炭素原子を有するアルキル基）、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉを含むことができ、これはH. J. Bestmann 等,“Selected Topics of the Wittig Reaction in the Synthesis of Natural Products”Topics in Current Chemistry 109, 85, (1983)に記載されている。
【００２８】
式Ｉの化合物中の糖は、知られている方法(H. Paulsen, Angew. Chem. Int. Ed. 21 (1982) 第155頁; R.R. Schmidt, Angew. Chem. Int. Ed. 25 (1986) 第212-235頁; T. Ogawa, Tetrahedron Lett. 31(1990)2439-2442)によって修飾される。
【００２９】
式Ｉの化合物の薬理学的に許容しうる塩は、Remington's Pharmaceutical Sciences(第17版, 第1418頁(1985))に記載されたような無機塩及び有機塩の両方のことであると理解される。生理学上許容しうる塩は、それらの立体異性体の形態を含む塩形成可能な式Ｉの化合物から、知られている方法で製造される。塩基性試薬については、例えば水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、アルコキシド、そしてまたアンモニア又は有機塩基、例えばトリメチル−もしくはトリエチルアミン、エタノールアミンもしくはトリエタノールアミン又は代わりに塩基性アミノ酸、例えばリジン、オルニチンもしくはアルギニン、カルボン酸形態の安定なアルカリ金属、アルカリ土類金属もしくは場合により置換されたアンモニウム塩である。また、式Ｉの化合物が塩基性基を有する場合、強酸を用いて安定な酸付加塩を製造することができる。これについて、適切な酸は、例えば無機酸及び有機酸の両方、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、ベンゼンスルホン酸、リン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、４−ブロモベンゼンスルホン酸、トリフルオロメチルスルホン酸、シクロヘキシルアミドスルホン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸及びトリフルオロ酢酸である。
【００３０】
また、本発明は、医薬上適切な生理学上許容しうるビヒクル、添加剤及び／又は他の活性化合物及び賦形剤と共に、有効量の少なくとも１つの式Ｉの化合物及び／又は式Ｉの化合物の生理学上許容しうる塩及び／又は場合により立体異性体の形態の式Ｉの化合物を含む医薬に関する。
【００３１】
本発明記載の化合物は、薬理学的性質のため、経過にマトリックス分解酵素、例えばマトリックスメタロプロテイナーゼストロメリシンの高められた活性を伴う全ての状態の予防及び治療について適切である。これには、退行性の関節状態、例えば変形性関節症、脊椎症、関節外傷又は半月板もしくは膝蓋骨の損傷もしくは靭帯断裂後の比較的長期の関節固定化後の軟骨融解が含まれる。さらにまた、それには、結合組織の状態、例えば膠原病、歯周状態、創傷治癒疾患、及び運動組織の慢性状態、例えば炎症的に、免疫学的に又は代謝的に生じた急性及び慢性の関節炎、関節症、筋肉痛及び骨代謝疾患が含まれる。さらに、式Ｉの化合物は、潰瘍、アテローム性動脈硬化症及び狭窄の治療に適している。さらに、式Ｉの化合物は、炎症、癌性疾患、腫瘍転移の形成、悪液質、食欲不振及び敗血症性ショックの治療に適している。
【００３２】
一般に、本発明記載の医薬は、経口的に又は非経口的に投与される。また、直腸、吸入、鼻内及び経皮的な投与も可能である。
また、本発明は、少なくとも１つの式Ｉの化合物を医薬上適切な及び生理学上許容しうるビヒクル並びに、適当ならばさらなる適切な活性化合物、添加剤又は賦形剤を用いて適切な投与形態にすることを特徴とする医薬の製造方法に関する。
【００３３】
適切な固形物、すなわち医薬製剤形態は、例えば顆粒、散剤、コーチング錠、錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ剤、ジュース、懸濁液、乳濁液、滴剤又は注射溶液、そしてまた活性化合物の遷延放出を伴う製剤であり、その製造には慣用の賦形剤、例えばビヒクル、崩壊剤、バインダー、コーティング剤、膨潤剤、滑剤又は潤滑剤、香料、甘味料及び可溶化剤が用いられる。記載できる頻繁に使用される賦形剤は、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、ラクトース、マンニトール及び他糖、タルク、乳蛋白、ゼラチン、デンプン、セルロース及びその誘導体、動物油及び植物油、例えばタラ肝油、ヒマワリ油、ラッカセイ油又はゴマ油、ポリエチレングリコール及び溶媒、例えば滅菌水及び一価又は多価アルコール、例えばグリセロールである。
【００３４】
医薬製剤は、用量単位で製造して投与するのが好ましく、各単位は活性成分として特定の用量の本発明の式Ｉの化合物を含んでいる。錠剤、カプセル剤、コーチング錠又は坐剤のような固形物用量単位の場合、この用量は、約1０００mgまででありうるが、好ましくは約５０〜３００mgであり、アンプル形態中の注射溶液の場合、約３００mgまででありうるが、好ましくは約１０〜１００mgである。
【００３５】
体重約７０kgの成人患者の治療では、式Ｉの化合物の有効性に応じて、活性化合物の日用量約２０mg〜１０００mg、好ましくは約１００mg〜５００mgが指示される。しかし、ある種の状況下では、より高い又はより低い日用量でも適当でありうる。日用量は、それぞれの用量単位又はいくつかのより小さな用量単位の形態で、そして特定の間隔で小分けされた用量の複数回投与によって投与することができる。
【００３６】
実施例１
DSM 12038の芽胞懸濁液の製造
５００mlの滅菌エルレンマイヤーフラスコ中の１００mlの栄養液（麦芽エキス２０ｇ、酵母エキス２ｇ、グルコース１０ｇ、水道水１ｌ中０.５ｇの（ＮＨ4)2ＨＰＯ4、滅菌前のｐＨ：６.０）に菌株DSM 12038を接種し、回転振盪機上、２５℃、１４０rpmで７２時間培養した。次に栄養培地オートミール注入液２.０ｇ／Ｌを含む５００mlの滅菌エルレンマイヤーフラスコに１２０mlの培養液を加え、固化するためこれに寒天１５ｇ／ｌを加え、均等に分配して振盪機の培養株を接種した。菌株を２５℃で１０〜１４日間培養した。菌株DSM 12038から形成された芽胞を、１滴のTriton(R)X 100(Serva)を含む５００mlの脱イオン水で洗浄し、直ちに再利用するか、又は５０％グリセロール中で−２２℃もしくは１０％ジメチルスルホキシド中で−１４０℃で保存した。
【００３７】
実施例２
振盪機の培養株の製造
０.５％カゼインペプトン、０.５％ミートペプトン、１％グルコース及び１０％マルトースを含む栄養液１００mlの入った５００mlの滅菌エルレンマイヤーフラスコに実施例１に従って製造した０.２mlの芽胞懸濁液を接種し、光が入らないようにして振盪機上で１４０ｒｐｍ及び２５℃で培養した。ストロメマイシンの最大量は、約２７時間後に到達した。
１０Ｌ又は１００Ｌ発酵器に接種するため、菌株DSM 12038並びに２％の麦芽エキス、０.２％の酵母エキス、１％のグルコース及び０.０５％のアンモニウムリン酸水素の栄養液を含む７２時間前の振盪機の培養株を用いた（約５％量を接種）。
【００３８】
実施例３
ストロメマイシンの製造
１０Ｌ発酵器は、以下の条件で運転した：
栄養培地：  カゼインペプトン      ５ｇ／Ｌ
ミートペプトン        ５ｇ／Ｌ
グルコース          １０ｇ／Ｌ
マルトース          １０ｇ／Ｌ
培養時間：  ２５〜３０時間
培養温度：  ２５℃
撹拌機の速度：  ３００ｒｐｍ
通気：      ０.５Ｌ／分
ｐＨ：      ５±０.５
１〜２mlのエタノール性ポリオール溶液を添加することで泡の形成を抑制した。最大産生は、２７時間後に達成された。
【００３９】
実施例４
ストロメマイシンの単離
実施例３で得られた培養液の７.５Ｌを遠心分離して培養濾液をバッチ式で１.５Ｌの吸着樹脂MCI Gel(R) CHP2OPに吸着させた。樹脂を吸引濾過器に入れ、最初に４ＬのＨ2Ｏで洗浄した。次に、各場合２０％、４０％、７０％又は１００％のイソプロパノールを含むイソプロパノール／水混合液を各場合２Ｌの画分を用いて溶出を実施した。ＨＰＬＣチェック及び活性試験の後、ストロメマイシンは、最初の２つの画分（２０％及び４０％のイソプロパノール）で溶出した。画分を集めて凍結乾燥した。次に生成物をＨＰＬＣによってさらに精製した：
【００４０】
１）カラム：RP18, Nucleosil 100 RP18−AB (Macherey & Nagel)、２５０×２１mm、５μ
溶離剤：ＣＨ3ＣＮ／０.１％ＴＦＡ
勾配：４０％ＣＨ3ＣＮで３７分間一定、次に１０分かけて１００％ＣＨ3ＣＮへ
流量：９ml／分；検出：２７５nm
ストロメマイシンは５２分後に溶出した。
【００４１】
２）カラム：Fractogel TSK HW40S, 200ml (Erimatechnik)、３００×２５mm
溶離剤：ＭｅＯＨ；流量２ml／分；検出：２３０nm
ストロメマイシンは、７５分後に溶出した。
収率：７.５Ｌの発酵器培地から２５mg。
【００４２】
得られたストロメマイシンは、以下の性質を有する：
外観：無色固形物；メタノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)に可溶；中性媒体中では安定であるが、強い酸性及びアルカリ性溶液中では不安定。
実験式：Ｃ38Ｈ48Ｏ12
ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィ）：
カラム：Purospher RP−18e（５μ、１２５×３mm）、溶離剤：勾配：ＣＨ3ＣＮ／０.１％Ｈ3ＰＯ4 ２０分かけて０％から１００％ＣＨ3ＣＮへ
流量：０.６ml／分
保持時間：１６.４分
検出：２３０nm
【００４３】
分子量：696.8 Da
HR−FAB−MS：697.32332 [M+H]+
1Ｈ−及び13Ｃ−ＮＭＲ：表１参照
ＵＶ／可視：ＭｅＯＨλnm（logε)：216 nm (4.87), 267 (4.33), 304 (434)
FT−IR：(KBr), ｖ=3419 cm-1(br), 2929 (m), 1608 (s), 1434 (w), 1252 (m), 1204 (w), 1151 (m), 1084 (w).
【００４４】
【表１】
0004741138.tif 000004
【００４５】
【表２】
0004741138.tif 000005
【００４６】
薬理学的実施例
ヒトストロメリシンの製造及び触媒ドメインの酵素活性の測定
酵素ストロメリシン（ＭＭＰ−３）は、Ye 等 (Biochemistry; 31(1992) 第11231−11235頁)に従って製造した。酵素活性又は酵素阻害剤の作用を測定するため、７０μｌの緩衝溶液及び１０μｌの酵素溶液を場合により酵素阻害剤を含む１０％濃度（ｖ／ｖ）の水性ジメチルスルホキシド溶液１０μｌと共に１５分間培養した。基質１mmol／Ｌを含む１０％濃度（ｖ／ｖ）の水性ジメチルスルホキシド溶液１０μｌを添加した後、酵素反応を、蛍光分光学法（３２８nm（ex）／３９３nm（em））によってモニターした。酵素活性は、吸光度増加／分として示される。ＩＣ50の値は、各場合に酵素の５０％阻害に至る阻害剤濃度として測定された。
【００４７】
緩衝溶液には、０.０５％のBrij (Sigma, Deisenhofen, Germany)及び０.１mol／Ｌのトリス／ＨＣｌ、０.１mol／ＬのＮａＣｌ、０.０１mol／ＬのＣａＣｌ2、及び０.１mol／Ｌのピペラジン−Ｎ,Ｎ′−ビス[２−エタンスルホン酸]（ｐＨ＝６.５）が含まれる。Ye等に従って製造した酵素ドメイン５μｇ／mlを含む酵素溶液。基質溶液には、１mmol／Ｌの蛍光原基質（７−メトキシクマリン−４−イル）アセチル−Pro−Leu−Gly−Leu −３−（２′,４′−ジニトロフェニル）−Ｌ−２,３−ジアミノプロピオニル−Ala −Arg−ＮＨ2(Bachem, Heidelberg, Germany)が含まれる。
ストロメマイシンについてＩＣ50値を測定したところ１１５μＭであった。
【００４８】
0004741138.tif 000006
【００４９】
0004741138.tif 000007