(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アクレモニウム・セルロリティカス由来の、下記の特性を有するβ−グルコシダーゼ活性を示す酵素。
（ａ）基質特異性、作用特性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合を有する配糖体に作用し、グルコースを生成する。
（ｂ）分子量：１０８，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｃ）等電点：ｐＩ４．７（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動による）
（ｄ）至適ｐＨ：ｐＨ３．５〜４．０である。
（ｅ）作用最適温度：７０℃である。
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の特性を有するβ−グルコシダーゼ。
（ａ）配列表の配列番号２で示されたアミノ酸配列の１〜８３８番の配列を含んで成るタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号２で示された−２０〜−１番のアミノ酸配列の全部をＮ末端側にさらに有して成る上記（ａ）記載のタンパク質。
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の付加、挿入、削除、欠失、又は置換が生じた改変タンパク質であり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
アクレモニウム・セルロリティカス由来である請求の範囲第２項記載のβ−グルコシダーゼ。
【請求項４】
以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡから成る遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１で示された塩基配列から成るＤＮＡ。
（ｂ）配列表の配列番号２で示されたアミノ酸配列から成るタンパク質又は配列表の配列番号２で示されたアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸の付加、挿入、削除、欠失、又は置換が生じた改変タンパク質であり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質、をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
アクレモニウム・セルロリティカス由来である請求の範囲第４項記載の遺伝子。
【請求項６】
請求の範囲第４項記載のＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ構成物。
【請求項７】
請求の範囲第４項記載のＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクター。
【請求項８】
請求の範囲第６項記載のＤＮＡ構成物又は請求の範囲第７項記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
宿主が、大腸菌、酵母、放線菌又は糸状菌である請求の範囲第８項記載の宿主細胞。
【請求項１０】
酵母が、サッカロミセス属、ハンゼヌラ属又はピキア属に属する微生物である請求の範囲第９項記載の宿主細胞。
【請求項１１】
酵母が、サッカロミセス・セレビシエである請求の範囲第９項記載の宿主細胞。
【請求項１２】
糸状菌が、アクレモニウム属、フミコーラ属、アスペルギルス属、トリコデルマ属又はフザリウム属に属する微生物である請求の範囲第９項記載の宿主細胞。
【請求項１３】
糸状菌が、アクレモニウム・セルロリティカス、フミコーラ・インソレンス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・ビリデ又はフザリウム・オキシスポーラスである請求の範囲第９項記載の宿主細胞。
【請求項１４】
請求の範囲第１２項又は１３項に記載の宿主細胞を培養し、その宿主及び／又はその培養液から請求の範囲第２項に記載のβ−グルコシダーゼを採取する工程を含んでなる請求の範囲第２項に記載のβ−グルコシダーゼの製造法。
【請求項１５】
請求の範囲第１４項記載の方法で生産されたβ−グルコシダーゼ。
【請求項１６】
請求の範囲第１〜３項及び１５項のいずれか一項に記載のβ−グルコシダーゼを含んで成る酵素組成物。
【請求項１７】
請求の範囲第１〜３項及び１５項のいずれか一項に記載のβ−グルコシダーゼを含んで成る植物又は植物由来物を加工及び／又は利用効率を向上させるための酵素組成物。
【請求項１８】
請求の範囲第１〜３項及び１５項のいずれか一項に記載のβ−グルコシダーゼを含んで成る、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用することにより、植物又は植物由来物を加工及び／又は利用効率を向上させるための酵素組成物。
【請求項１９】
請求の範囲第１６〜１８項のいずれか一項に記載の酵素組成物が、さらにセルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ及びポリガラクツロン酸リアーゼのうちのいずれか一もしくは二以上の成分を含有することを特徴とする酵素組成物。
【請求項２０】
請求の範囲第１〜３項及び１５項のいずれか一項に記載のβ−グルコシダーゼ又は請求の範囲第１６〜１８項のいずれか一項に記載の酵素組成物を含有する飼料添加物。
【請求項２１】
請求の範囲第２０項記載の飼料添加物を含んで成る飼料。
【請求項２２】
請求の範囲第１〜３項及び１５項のいずれか一項に記載のβ−グルコシダーゼ又は請求の範囲第１６〜１８項のいずれか一項に記載の酵素組成物を含有するサイレージ用酵素剤。
【請求項２３】
請求の範囲第２２項記載のサイレージ用酵素剤を含んで成るサイレージ。
【請求項２４】
請求の範囲第１〜３項及び１５項のいずれか一項に記載のβ−グルコシダーゼ又は請求の範囲第１６〜１８項のいずれか一項に記載の酵素組成物を含有する食品加工用酵素剤。
【請求項２５】
請求の範囲第２４項記載の食品加工用酵素剤を含んで成る加工食品。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、β−グルコシダーゼ活性を有する新規酵素及びその用途に関し、詳しくはアクレモニウム属微生物に由来するβ−グルコシダーゼ活性を有する新規酵素及びその酵素組成物並びにこれらの用途に関する。
背景技術
セルロースは、高等植物細胞の主要な構成成分であり、広く天然に存在する。セルロースは、グルコースがβ−１，４−グルコシド結合により重合した高分子多糖であり、天然にはセルロースが結晶状あるいは非結晶状態で存在しており、さらには他の成分、リグニン、ヘミセルロース類、ペクチン類などとも複雑に結合して植物組織を構築している。
セルラーゼは、セルロースをセロオリゴ糖、セロビオース、最終的にはグルコースにまで分解する反応を触媒する酵素群の総称であり、その作用様式によって、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、β−グルコシダーゼなどに大別される。それらの作用様式を詳細に比較すると、種々の作用様式を示す複数の酵素が互いに補い合い、相乗効果を発現することにより、植物細胞壁の主成分であるセルロースを分解するものと考えられている。
β−グルコシダーゼは、セロオリゴ糖、セロビオース又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体からグルコースを遊離させる反応を触媒すると考えられ、セルロースの糖化系の最終段階及び配糖体からのグルコースの遊離において重要な酵素である。
β−グルコシダーゼの各分野への応用例として、飼料分野としては、飼料に添加することにより家畜の増体及び／又は飼料効率を改善できる。また、サイレージ用酵素剤として、牧草のサイロへの詰め込みの際に添加し、その発酵品質を改善せしめて良質なサイレージを調製する目的で、各種のセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、アミラーゼをそれぞれ単剤もしくは合剤で含む製剤、さらに、それら酵素の効果を高めることを目的としてこれら酵素と乳酸菌との合剤が既に市販されている。しかし、さらにβ−グルコシダーゼを強化することにより、セルロースの糖化効率が向上し、より良質なサイレージを調製することができる。
食品分野としては、ジュース、ワイン等の芳香成分の増加、果汁の清澄化、粘度低下、色味の改善、苦味除去や醸造、製パンにおける発酵歩合の向上などに利用できる。医薬分野としては、臨床検査用試薬に利用される。また、その他の分野としては、セルロースバイオマスのグルコースへの糖化促進や、セルロース製品の廃棄物の処理効率の向上に利用できる。
糸状菌アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）の生産する酵素に関して言えば、セルラーゼは糖化力の強いことが特徴であり、飼料用途やサイレージ用途での有効性が報告されている（特開平４−１１７２４４号公報、特開平７−２３６４３１号公報）。また、含有されているセルラーゼ成分についても報告されている（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５２，２４９３〜２５０１（１９８８）、同誌５３，３３５９〜３３６０（１９８９）、同誌５４，３０９〜３１７（１９９０））。
さらに、セルラーゼ中のβ−グルコシダーゼ活性に関しては、従来よく知られている、例えばトリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）等のセルラーゼに比べて著しく活性が高いことなどが報告されている（特公昭６０−４３９５４号公報）。
さらに、アクレモニウム・セルロリティカスの生産するβ−グルコシダーゼに関しては、３種のβ−グルコシダーゼが精製、純化されている（静岡大学大学院電子科学研究科  研究報告  ２１．９−１５．（２０００））。これらの酵素は、高度に精製され、酵素的、タンハク質的諸性質について詳細に分析されたが、アミノ酸配列の決定、遺伝子の単離には至っていない。
β−グルコシダーゼを産業上有効利用するためには、該酵素を単離、精製し、酵素的、物理的性質を明らかにすることが不可欠である。また、該酵素の発現増強及び大量生産を可能にするには、該酵素をコードする遺伝子を単離、解析することが必要となる。
本発明は、新規なβ−グルコシダーゼタンパク質、該β−グルコシダーゼをコードする遺伝子、この遺伝子を用いたβ−グルコシダーゼの発現方法、β−グルコシダーゼを含んで成る酵素組成物並びに該β−グルコシダーゼ又は該酵素組成物による植物及び／又は植物由来物の処理方法の提供を目的とするものである。
本発明者らは、上記課題を解決するため、アクレモニウム・セルロリティカスのセルラーゼ系を構築する種々の酵素を分画、精製して鋭意検討した。その結果、これら酵素群の中から、これまで知られていたβ−グルコシダーゼとは異なる新規なβ−グルコシダーゼを見出し、該酵素をコードする遺伝子を単離した。
該酵素は、前述のアクレモニウム・セルロリティカス由来の３種のβ−グルコシダーゼよりも著しく高い比活性を示した。
さらに、種々の植物又は植物由来物に対するβ−グルコシダーゼの作用効果を検討し、本発明を完成するに至った。
発明の開示
すなわち、本発明により、下記の発明が提供される。
請求の範囲第１項：  アクレモニウム属微生物由来の、下記の特性を有するβ−グルコシダーゼ活性を示す酵素。
（ａ）基質特異性、作用特性：本酵素はセロオリゴ糖、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合を有する配糖体に作用し、グルコースを生成する。
（ｂ）分子量：１０８，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｃ）等電点：ｐＩ４．７（ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動による）
（ｄ）至適ｐＨ：ｐＨ３．５〜４．０である。
（ｅ）作用最適温度：７０℃である。
請求の範囲第２項：  アクレモニウム属微生物が、アクレモニウム・セルロリティカスである請求の範囲第１項記載の酵素。
請求の範囲第３項：  以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）の特性を有するβ−グルコシダーゼ。
（ａ）配列表の配列番号２で示されたアミノ酸配列の一部もしくは１〜８３８番の配列を含んで成るタンパク質。
（ｂ）配列表の配列番号２で示された−２０〜−１番のアミノ酸配列の一部又は全部をＮ末端側にさらに有して成る上記（ａ）記載のタンパク質。
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列の改変タンパク質であり、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質。
請求の範囲第４項：  糸状菌由来である請求の範囲第３項記載のβ−グルコシダーゼ。
請求の範囲第５項：  糸状菌が、アクレモニウム属微生物である請求の範囲第４項記載のβ−グルコシダーゼ。
請求の範囲第６項：  アクレモニウム属微生物が、アクレモニウム・セルロリティカスに属する微生物である請求の範囲第５項記載のβ−グルコシダーゼ。
請求の範囲第７項：  以下の（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡから成る遺伝子。
（ａ）配列表の配列番号１で示された塩基配列から成るＤＮＡ。
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列の改変配列を含み、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列表の配列番号２で示されたアミノ酸配列から成るタンパク質又はその改変タンパク質をコードするＤＮＡ。
請求の範囲第８項：  糸状菌由来である請求の範囲第７項記載の遺伝子。
請求の範囲第９項：  糸状菌が、アクレモニウム属微生物である請求の範囲第８項記載の遺伝子。
請求の範囲第１０項：  アクレモニウム属微生物が、アクレモニウム・セルロリティカスに属する微生物である請求の範囲第９項記載の遺伝子。
請求の範囲第１１項：  請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列又はその改変配列を含んで成るＤＮＡ構成物。
請求の範囲第１２項：  請求の範囲第１１項記載のＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクター。
請求の範囲第１３項：  請求の範囲第１１項記載のＤＮＡ構成物又は請求の範囲第１２項記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
請求の範囲第１４項：  宿主が、大腸菌、酵母、放線菌又は糸状菌である請求の範囲第１３項記載の宿主細胞。
請求の範囲第１５項：  酵母が、サッカロミセス属、ハンゼヌラ属又はピキア属に属する微生物である請求の範囲第１４項記載の宿主細胞。
請求の範囲第１６項：  酵母が、サッカロミセス・セレビシエである請求の範囲第１５項記載の宿主細胞。
請求の範囲第１７項：  糸状菌が、アクレモニウム属、フミコーラ属、アスペルギルス属、トリコデルマ属又はフザリウム属に属する微生物である請求の範囲第１４項記載の宿主細胞。
請求の範囲第１８項：  糸状菌が、アクレモニウム・セルロリティカス、フミコーラ・インソレンス、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリゼ、トリコデルマ・ビリデ又ほフザリウム・オキシスポーラスである請求の範囲第１７項記載の宿主細胞。
請求の範囲第１９項：  請求の範囲第１３〜１８項のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養し、その宿主及び／又はその培養液から請求の範囲第１〜６項のいずれか一項に記載のβ−グルコシダーゼ又はその改変タンパク質を採取する工程を含んでなる請求の範囲第１〜６項のいずれか一項に記載のβ−グルコシダーゼ又はその改変タンパク質の製造法。
請求の範囲第２０項：  請求の範囲第１９項記載の方法で生産されたβ−グルコシダーゼ。
請求の範囲第２１項：  請求の範囲第１〜６項及び２０項のいずれか一項に記載のβ−グルコシダーゼを含んで成る酵素組成物。
請求の範囲第２２項：  請求の範囲第１〜６項及び２０項のいずれか一項に記載のβ−グルコシダーゼを含んで成る植物又は植物由来物を加工及び／又は利用効率を向上させるための酵素組成物。
請求の範囲第２３項：  請求の範囲第１〜６項及び２０項のいずれか一項に記載のβ−グルコシダーゼを含んで成る、アグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に作用することにより、植物又は植物由来物を加工及び／又は利用効率を向上させるための酵素組成物。
請求の範囲第２４項：  請求の範囲第２１〜２３項のいずれか一項に記載の酵素組成物が、さらにセルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ及びポリガラクツロン酸リアーゼのうちのいずれか一もしくは二以上の成分を含有することを特徴とする酵素組成物。
請求の範囲第２５項：  請求の範囲第１〜６項及び２０項のいずれか一項に記載のβ−グルコシダーゼ又は請求の範囲第２１〜２４項のいずれか一項に記載の酵素組成物を含有する飼料添加物。
請求の範囲第２６項：  請求の範囲第２５項記載の飼料添加物を含んで成る飼料。
請求の範囲第２７項：  請求の範囲第１〜６項及び２０項のいずれか一項に記載のβ−グルコシダーゼ又は請求の範囲第２１〜２４項のいずれか一項に記載の酵素組成物を含有するサイレージ用酵素剤。
請求の範囲第２８項：  請求の範囲第２７項記載のサイレージ用酵素剤を含んで成るサイレージ。
請求の範囲第２９項：  請求の範囲第１〜６項及び２０項のいずれか一項に記載のβ−グルコシダーゼ又は請求の範囲第２１〜２４項のいずれか一項に記載の酵素組成物を含有する食品加工用酵素剤。
請求の範囲第３０項：  請求の範囲第２９項記載の食品加工用酵素剤を含んで成る加工食品。
発明を実施するための最良の形態
本発明のβ−グルコシダーゼを含むセルラーゼ系を生産する微生物としては、アクレモニウム属の糸状菌があり、具体的には独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１中央第６）にブダペスト条約に基づき国際寄託されいるアクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２６）（１９８３年１月１２日付けで寄託された受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−６８６７より移管）、アクレモニウム・セルロリティカスＴＮ株（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６８５）（１９８４年１０月１３日付けで寄託された受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−７８９４より移管）などがある。これらの微生物によるβ−グルコシダーゼの製造については、既知の方法、例えば特公昭６０−４３９５４号公報、特公昭６３−６３１９７号公報に記載された方法に従って行えば良く、上記微生物の培養物からβ−グルコシダーゼを採取する。
上記微生物の培養終了後、培養物を遠心分離等により除去して得た上清液を粗酵素として用いることもできるが、通常は、この上清液を限外濾過法などにより濃縮し、防腐剤などを加えて濃縮酵素とするか、或いは濃縮後スプレードライ法によって粉末酵素とする。
本発明に係るβ−グルコシダーゼは、これら濃縮酵素又は粉末酵素を必要に応じて、部分精製又は高度に精製して得ることができる。
精製方法としては、常法、即ち硫酸アンモニウムなどによる塩析法；アルコールなどによる有機溶媒沈殿法；膜分離法；イオン交換体、疎水クロマトグラフ用担体、ゲル濾過用担体などを用いるクロマト分離法などを、単独又は適宜組み合わせて用いることができる。
本発明に係る酵素は、β−グルコシダーゼ活性を示す酵素、すなわちβ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｇｌｕｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ＥＣ３．２．１．２１であり、具体的にはセロオリゴ糖、セロビオース又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で加水分解し、グルコースを生成する酵素を意味する。
本発明の第一の態様によれば、アクレモニウム属微生物由来の、前記請求の範囲第１項に記載の特性を有するβ−グルコシダーゼ活性を示す新規酵素が提供される。
本発明の好ましい態様によれば、上記酵素はアクレモニウム・セルロリティカスから得られる。より詳細な本酵素の性質は次の通りである。
（ａ）作用及び基質特異性
本酵素は、セロオリゴ糖、セロビオース又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体をエキソ機作で加水分解し、グルコースを生成する。
本酵素の基質特異性については、セロオリゴ糖、セロビオースに対して高い活性を示す。また、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、ｐＮＰＧと略す）、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド（以下、ｏＮＰＧと略す）、サリシン等のアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体に対しても高い活性を示す。さらに結合様式の異なるβ−ｌｉｎｋｅｄ−グルコビオース（β−１，２、β−１，３、β−１，４及びβ−１，６結合）のいずれに対しても活性を示す。
（ｂ）分子量
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は、約１０８，０００である。
（ｃ）等電点
等電点ポリアクリルアミドゲル電気泳動による等電点（ｐＩ）は、約４．７である。
（ｄ）至適ｐＨ
ｐＮＰＧ分解活性における至適ｐＨは、約３．５〜４．０であるが、約ｐＨ３．０〜５．５において高い活性を有している。
（ｅ）至適温度（作用最適温度）
ｐＮＰＧ分解活性における至適温度は、約７０℃であるが、約４０〜７７℃において高い活性を有している。
（ｆ）分解活性
ｐＮＰＧ分解活性は、約２４０単位／ｍｇタンパク質であり、セロビオース分解活性は、約３７０単位／ｍｇタンパク質である。
ここで、当該酵素の活性測定法と１単位の定義については以下の通りである。
・ｐＮＰＧ分解活性
ｐＨ４．０、３７℃で、４．５ｍＭ  ｐＮＰＧ溶液に酵素を作用させ、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを生成する酵素量を１単位と定義した。
・セロビオース分解活性
ｐＨ４．０、３７℃で、１３．３ｍＭ  セロビオース溶液に酵素を作用させ、１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素量を１単位と定義した。
本発明の別の態様によれば、前記請求の範囲第３項に記載の特性を有するβ−グルコシダーゼ活性を示す酵素が提供される。すなわち、配列表の配列番号２で示されたアミノ酸配列の一部もしくは１〜８３８番目のアミノ酸配列を含んで成るタンパク質、あるいは該アミノ酸配列の改変タンパク質を含んでなるβ−グルコシダーゼ酵素である。配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列を含んで成るβ−グルコシダーゼ酵素を以下、β−グルコシダーゼＡと称する。
本発明において、配列番号２に記載されるアミノ酸配列の一部とは、例えばプローブとして利用可能な程度の長さ、さらには、その一部の配列であっても、依然としてβ−グルコシダーゼ活性を維持している、その部分配列を意味するものとする。
また、本発明には、上記タンパク質のＮ末端に、さらに配列番号２に記載の−２０〜−１番までのアミノ酸配列の一部又は全部を有するタンパク質も包含される。ここで、配列番号２に記載の−２０〜−１番までのアミノ酸配列は、シグナルペプチドと考えられることから、その一部の配列とは、シグナルペプチド活性を保持する、その部分配列に加え、発現宿主の種類によってプロセッシングされる位置に相違が生じた結果としてＮ末端に残る配列をも意味するものとする。
さらに、本発明には、前記タンパク質の改変タンパク質が含まれる。本発明において改変タンパク質とは、上記のタンパク質のアミノ酸配列において、複数（例えば、１〜数個）のアミノ酸の付加、挿入、削除、欠失又は置換などの改変が生じたタンパク質であって、依然としてβ−グルコシダーゼ活性を保持するものを意味する。
本発明に係る酵素は、糸状菌類、具体的には、アクレモニウム属（例えば、アクレモニウム・セルロリティカス）の微生物から得ることができる。
本発明によれば、前記請求の範囲第７項に記載の特性を有するＤＮＡから成る遺伝子が提供される。
このＤＮＡは、配列表の配列番号１で示された塩基配列からなるもの、当該塩基配列の改変配列を含み、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ及び前記配列表の配列番号２で示されたアミノ酸配列から成るタンパク質もしくはその改変タンパク質をコードするＤＮＡである。
タンパク質のアミノ酸配列が与えられれば、それをコードするＤＮＡ配列は容易に定まり、配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んで成るタンパク質及びその改変タンパク質をコードする種々の塩基配列を選択することができる。
本発明による塩基配列は、天然由来のものであっても、全合成したものであっても良く、また、天然由来のものの一部を利用して合成を行ったものでも良い。
本発明に係る塩基配列の典型的な取得方法としては、アクレモニウム・セルロリティカス由来の染色体ライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーから、遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば、部分アミノ酸配列の情報を基にして作成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行う方法などが挙げられる。
本発明に係るβ−グルコシダーゼのアミノ酸配列をコードする、典型的な配列は、配列表の配列番号１に記載の塩基配列の一部又は全部を有するものである。配列番号１に記載の塩基配列は、１〜３番のＡＴＧで始まり、２５７５〜２５７７番のＴＡＡで終了するオープンリーディングフレーム（以下、ＯＲＦと略記することがある。）を有する。また、６１〜６３番から始まる塩基配列は、８３８残基からなる前記成熟タンパク質のＮ末端アミノ酸に対応する。
本発明において、配列表の配列番号１に示したＤＮＡ配列を含むプラスミドを有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の形質転換体は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１中央第６）にブダペスト条約に基づき国際寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−７７０３（２０００年８月４日付けで寄託された受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７９８７より移管）である。
さらに、請求の範囲第７項記載の本発明には、前記塩基配列の改変配列が含まれる。本発明において改変配列とは、上記塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつβ−グルコシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を意味する。ストリンジェントな条件とは、プローブとして標識化した配列番号１に記載のＤＮＡ配列の全長を有するものを用い、ＥＣＬダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング検出システム（アマシャム社製）の方法に従って、１時間のプレハイブリダイゼーション（４２℃）の後、前記プローブを添加し、１５時間（４２℃）ハイブリダイゼーションを行った後、０．４％  ＳＤＳ、６Ｍ  尿素添加１倍濃度ＳＳＣ（ＳＳＣ；１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム）で４２℃、２０分間の洗浄を２回繰り返し、次に５倍濃度ＳＳＣで室温、１０分間の洗浄を２回行うような条件である。
本発明により、前記請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列、例えば配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質又はその改変タンパク質をコードする塩基配列（以下、単に「本発明に係るＤＮＡ配列」という）を、宿主微生物内で複製可能で、かつそのＤＮＡ配列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含んでなる発現ベクターが提供される（請求の範囲第１２項）。
この発現ベクターは、自己複製ベクター、即ち、染色体外の独立体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しない、例えばプラスミドを基本に構築することができる。また、この発現ベクターは、宿主微生物に導入されたとき、その宿主微生物のゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。
本発明によるベクター構築の手順及び方法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることができる。
本発明に係る発現ベクターは、これを実際に宿主微生物に導入して所望の活性を有するタンパク質を発現させるために、前記の本発明に係るＤＮＡ配列の他に、その発現を制御するＤＮＡ配列や微生物を選択するための遺伝子マーカー等を含んでいることが望ましい。発現を制御するＤＮＡ配列としては、プロモーター及びターミネーター並びにシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列等がこれに含まれる。
プロモーターは、宿主微生物において転写活性を示すものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種もしくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子の発現を制御するＤＮＡ配列として得ることができる。また、シグナルペプチドは、宿主微生物において、タンパク質の分泌に寄与するものであれば特に限定されず、宿主微生物と同種もしくは異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導されるＤＮＡ配列より得ることができる。
さらに、本発明における遺伝子マーカーは、形質転換体の選択の方法に応じて適宜選択することができるが、例えば薬剤耐性をコードする遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝子を利用することができる。
さらに、本発明によれば、請求の範囲第１３項に記載したように、上記発現ベクターによって形質転換された微生物（宿主細胞）が提供される。この宿主−ベクター系は特に限定されず、例えば、大腸菌、放線菌、酵母、糸状菌などを用いた系及びそれらを用いた他のタンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることができる。
この発現ベクターによる微生物の形質転換も、この分野で慣用されている方法に従い実施することができる。
また、本発明における好ましい態様によれば、本発明に係るＤＮＡ配列によってコードされるβ−グルコシダーゼ酵素を発現させ得る酵母細胞が提供される。
本発明における酵母細胞としては、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属又はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する微生物、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等が挙げられる。
さらに、本発明に係るＤＮＡ配列によってコードされるβ−グルコシダーゼ酵素を発現させ得る微生物として、不完全菌類に属する糸状菌が提供される。
本発明における糸状菌としては、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属又はフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属に属する微生物が挙げられる。さらに、それらの好ましい例としては、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、フザリウム・オキシスポーラス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｓ）等が挙げられる。
さらに、この形質転換体を適当な培地で培養し、その培養物から上記の本発明に係るタンパク質（β−グルコシダーゼ又はその改変タンパク質）を単離して得ることができる（請求の範囲第１９項）。すなわち、本発明の別の態様によれば、前記の本発明に係る新規タンパク質の製造方法が提供される。
形質転換体の培養及びその条件は、使用する微生物についてのそれと本質的に同等であってよい。また、形質転換体を培養した後、目的のタンパク質を回収する方法は、この分野で慣用されているものを用いることができる。
糸状菌アクレモニウム・セルロリティカスを用いて本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素を製造する方法としては、例えば特開２００１−１７１８０号公報に記載の方法を用いることができる。
すなわち、アクレモニウム・セルロリティカスにおいて最も高発現しているｃｂｈ１遺伝子のプロモーターの下流にβ−グルコシダーゼ遺伝子を連結した遺伝子発現用の組換えベクターを作製し、このベクターをアクレモニウム・セルロリティカスに導入することにより、β−グルコシダーゼタンパク質を大量に発現させることができる。
本発明の別の態様によれば、請求の範囲第２１項に記載したように、上記の本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素又はその改変タンパク質を含んでなる酵素組成物が提供される。
本発明に係る酵素組成物は、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素又はその改変タンパク質を、酵素組成物に一般的に含まれる成分、例えば賦形剤（例えば、乳糖、塩化ナトリウム、ソルビトール等）、界面活性剤、防腐剤等と混合して製造することができる。
また、本発明における酵素組成物の形状は任意であり、適当な形状、例えば粉末又は液体状に調製することができる。
本発明によって得られるβ−グルコシダーゼは、グルコース遊離能に優れており、セルロース、セロオリゴ糖、セロビオース及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を含有する植物又は植物由来物の加工や利用性向上に適している。すなわち、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素又は酵素組成物でセルロース、セロオリゴ糖、セロビオース及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を加水分解することにより、植物又は植物由来物を加工し及び／又は利用効率を向上させることができる。
すなわち、本発明によれば、β−グルコシダーゼ酵素又は酵素組成物でセルロース、セロオリゴ糖、セロビオース及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を加水分解することを特徴とする、該セルロース、セロオリゴ糖、セロビオース及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を含む植物又は植物由来物を加工及び／又は利用効率を向上させるための酵素組成物が得られる。
さらに、この酵素組成物を用いて、該セルロース、セロオリゴ糖、セロビオース及び／又はアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体を含む植物又は植物由来物を加工した酵素処理物を得ることができる。
上記の植物としては、全ての植物又はその切断物等に適用でき、植物由来物としては、細胞壁、表皮組織等の植物組織、植物組織由来物、細胞内容物、種々の糖タンパクや糖脂質、芳香性分や色素等といった抽出成分など全ての植物由来物に適用できる。
具体的には、飼料分野、食品分野では牧草、野菜、果実などが対象となり、これらを加工した果汁、ピューレ、ペースト、絞り粕、抽出粕にも適用することができる。また、セルロースバイオマスのグルコースへの糖化促進や、紙等のセルロースを含有する製品の廃棄物の処理効率の向上に利用できる。
上記のアグリコンとβ−Ｄ−グルコピラノシル結合をする配糖体としては、広く植物界に分布する種々のフェノール配糖体、ニトリル配糖体、クマリン配糖体、アントラセン配糖体、ステロイド配糖体（サポニン物質）、テルペン配糖体、苦味配糖体、フラボン配糖体、イソフラボン配糖体、フラボノール配糖体、フラバノン配糖体、ペラルゴニジン配糖体、シアニジン配糖体、デルフィニジン配糖体、トリテルペノイド配糖体、強心配糖体等が挙げられる。
さらに本発明によれば、β−グルコシダーゼ酵素又は酵素組成物に、さらにセルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ガラクタナーゼ、アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ポリガラクツロン酸リアーゼのいずれか一もしくは二以上の成分を含有させてなる酵素組成物が提供される。
この酵素組成物は、β−グルコシダーゼ酵素を単独で含んでなる酵素組成物に比べて、植物又は植物由来物の加工、利用効率をより一層向上させることが期待できる。
また、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素又は酵素組成物を動物飼料中に配合することにより、飼料中のβ−グルカンの消化能を改善することができる。あるいは、β−グルカンを分解することにより、飼料中に蓄積されているタンパク質の利用を促進させることができる。従って、本発明によれば、β−グルコシダーゼ酵素又は酵素組成物を含んでなる飼料添加物、さらには、この飼料添加物を飼料に添加する方法が提供される。この方法は、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素又は酵素組成物により飼料原料を処理する工程を含んでなる。
また、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素又は酵素組成物をサイレージに添加することにより、有意にサイレージの発酵品質を改善できることが見出された。従って、本発明によれば、β−グルコシダーゼ酵素又は酵素組成物を含むサイレージ用酵素剤が提供される。なお、このサイレージ用酵素剤には、必要に応じて、ラクトバチルス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス又はペディオコッカス属の乳酸菌等から成る製剤及び／又はプロピオニバクテリウム属等の酸生成菌から成る製剤と併用することができる。この場合には、相乗作用による一層の品質改善効果が期待できる。
さらに本発明によれば、上記のサイレージ用酵素剤を用いてサイレージを製造する方法及びこの方法により製造することを特徴とするサイレージが提供される。ここで、サイレージ原料としては、通常のサイレージに用いられる牧草、飼料作物、食品等の製造副産物、農業副産物、飼料等の全てが対象となる。
牧草としては、例えばイネ科牧草としては、チモシー、オーチャードグラス、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、メドウフェスク、ギニアグラス等を用いることができ、マメ科牧草としては、アルファルファ、クローバ等を用いることができる。
次に、飼料作物としては、トウモロコシ、ソルガム、大麦、ライムギ、ライコムギ等を用いることができる。
また、食品等の製造副産物としては、廃糖蜜、酢粕、ビール粕、トウフ粕、ミカン粕、焼酎粕等を用いることができる。さらに、農業副産物としては、麦藁、ビートトップ、ビートパルプ等を用いることができる。
また、サイレージ原料としての飼料は、通常、発酵飼料に使用される単味飼料及び配合飼料や濃厚飼料、これら飼料と粗飼料とを混合した混合飼料等を用いることができる。
また、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素又は酵素組成物を食品の加工に用いることにより、ジュース、ワイン等の芳香成分の増加、果汁の清澄化、粘度低下、色味の改善、苦味除去等の他、醸造、製パン等における発酵歩合の向上などの効果が得られる。さらに、食品の香り、色味、味等の品質を改善することができる。
従って、本発明によれば、β−グルコシダーゼ酵素又は酵素組成物を含んで成る食品加工用酵素剤が提供される。さらには、この食品加工用酵素剤を用いて食品を加工する方法及びこの方法によって製造されることを特徴とする食品が提供される。
また、本発明に係るβ−グルコシダーゼ酵素又は酵素組成物は、β−Ｄ−グルコシドを加水分解する活性が高いため、アミラーゼ活性測定用の臨床検査用試薬に利用することができる。
本発明に係る酵素並びに酵素組成物の使用方法としては、上記各種利用分野で通常採用されるｐＨ、温度などの条件下で行うことができるが、酵素の性質上、ｐＨ３．０〜６．０、温度１０〜８０℃の範囲が適当であり、より好ましくは、温度３０〜８０℃の範囲が適当である。酵素使用量については、時間と共にそれぞれの目的が達成されるような条件で使用すれば、十分な効果を得ることができる。
次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
実施例１  β−グルコシダーゼＡの精製
（１）酵素原末の調製
アクレモニウム属微生物由来のβ−グルコシダーゼ原末を得るため、下記の手法により微生物の培養を行った。培地は、すべて以下の組成からなる培地を常法により加熱滅菌したものを用いた。
〔培地組成〕
綿実油粕２％、セルロース２％、リン酸水素二カリウム１．２％、バクトペプトン１％、硝酸カリウム０．６％、尿素０．２％、塩化カリウム０．１６％、硫酸マグネシウム・七水塩０．００１％、硫酸銅・五水塩０．００１％（ｐＨ４．０）。
上記培地５００ｍＬに、アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２６）を接種し、３０℃で４８時間攪拌しながら培養した。次に、この培養液をシードとして、培地を１５Ｌにスケールアップし、さらにスケールアップを続けて最終的に６００Ｌ容タンク中の培養液量を３００Ｌとし、通気攪拌培養を７日間行った。
得られた培養液をフィルタープレスで濾過した後、限外濾過により１５Ｌまで濃縮し、乳糖２ｋｇを添加してスプレードライにより粉末化した。この方法で得られたβ−グルコシダーゼ原末は５．０ｋｇであった。
（２）β−グルコシダーゼＡの精製
上記（１）で得られた原末を酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、不純物を高速冷却遠心分離により除去した。得られた上清を酵素精製の出発材料として以下に示した方法で精製した。
（ａ）弱塩基性陰イオン交換クロマトグラフィー：ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）に上清をＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ７．５）で吸着せしめ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（０．０１Ｍ、ｐＨ７．５）中にＮａＣｌを０Ｍから０．１Ｍ含むリニアグラジェント溶出を行い、β−グルコシダーゼを示した画分を分取した。
（ｂ）アフィニティクロマトグラフィー：リガンドとしてＣｕ２＋を結合させたＣｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ファルマシア社製）に上記（ａ）で得たβ−グルコシダーゼ活性画分を０．１Ｍ  ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（０．０２５Ｍ、ｐＨ７．０）で吸着させ、０．１Ｍ  ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（０．０２５Ｍ）のｐＨ７．０からｐＨ２．５のリニアグラジェント溶出を行った。β−グルコシダーゼ活性を示した画分をそれぞれ再度Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦに供し、β−グルコシダーゼ活性を示した画分を得た。
（ｃ）疎水性クロマトグラフィー：ブチルトヨパール６５０Ｍ（東ソー（株）製）に上記（ｂ）で得たβ−グルコシダーゼ画分を１Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ７．０）で吸着させ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ７．０）中に（ＮＨ４）２ＳＯ４を１Ｍから０Ｍ含むリニアグラジェント溶出を行い、β−グルコシダーゼ活性を示した画分を分取した。
（ｄ）ゲルろ過クロマトグラフィー：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５（ファルマシア社製）に上記（ｃ）で得たβ−グルコシダーゼ活性画分を０．１Ｍ  ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（０．０２５Ｍ、ｐＨ７．０）で通過させ、β−グルコシダーゼ活性を示した画分を分取した。
（ｅ）等電点クロマトグラフィー：ＭｏｎｏＰ（ファルマシア社製）に上記（ｄ）で得たβ−グルコシダーゼ活性画分をイミダゾール−酢酸緩衝液（０．０２５Ｍ、ｐＨ６．２）で吸着させ、１０倍に希釈したＰｏｌｙｂｕｆｆｅｒ  ７４（ファルマシア社製）（ｐＨ３．８）で溶出を行い、β−グルコシダーゼ活性を示した画分（β−グルコシダーゼＡ）を分取した。
実施例２  β−グルコシダーゼＡの酵素的、タンパク質的諸性質
（１）基質特異性、作用特性
実施例１で得た精製β−グルコシダーゼＡの各種基質に対する活性を調べた。すなわち、２量体から５量体のセロオリゴ糖に酵素を作用させたところ、いずれの場合もグルコースを生成した。また、ｐＮＰＧ、ｏＮＰＧ及びサリシンに酵素を作用させたところ、全ての基質からグルコースを生成した。結合様式の異なるβ−ｌｉｎｋｅｄ−グルコビオース（β−１，２、１，３、１，４及び１，６結合）に酵素を作用させたところ、いずれの場合もグルコースを生成した。
（２）至適ｐＨ
実施例１で得たβ−グルコシダーゼＡの３７℃における至適ｐＨを第１図に示す。本酵素は、リン酸緩衝液で、ｐＨ３．５〜４．０のときに最大の活性を示した。
（３）至適温度（作用最適温度）
実施例１で得たβ−グルコシダーゼＡの作用最適温度を調べるため、酢酸緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ４．０）にてｐＮＰＧ分解活性を測定したところ、第２図に示すように至適温度は７０℃であった。
（４）分子量
実施例１で得たβ−グルコシダーゼＡの分子量を決定するため、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（８％ゲル、テフコ社製）を行った。
その結果、β−グルコシダーゼＡの分子量は約１０８，０００と算出された。
なお、この試験に用いた標準サンプルの分子量は、第１表の通りである。
0004801872.tif 000002
（５）等電点
実施例１で得られたβ−グルコシダーゼＡの等電点（ｐＩ）を決定するために、ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動（ｐＨ３．０〜１０．０、テフコ社製）を行った。
その結果、β−グルコシダーゼＡの等電点は４．７と算出された。
なお、この試験に用いた標準サンプルの等電点は、第２表の通りである。
0004801872.tif 000003
実施例３  β−グルコシダーゼＡのアミノ酸配列
（１）Ｎ末端アミノ酸配列
実施例１で得た精製β−グルコシダーゼＡのＮ末端アミノ酸配列を決定した。まず、８％Ｇｅｌ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｍｉｎｉ（テフコ社製）を用いて、それぞれの標品の電気泳動分離を行った後、ホライズブロット（アトー社製）にて、ミニプロブロット膜（パーキンエルマー社製）に転写し、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０（ナカライテスク社製）で染色した後、５０％メタノールで洗浄し風乾した。ここから、分子量１０８，０００のタンパク質がブロットされているバンドを切り出し、プロテインシーケンサー：プロサイス４９１（パーキンエルマー社製）に供し、Ｎ末端アミノ酸配列の決定を試みた。
β−グルコシダーゼＡのＮ末端アミノ酸配列を１５残基決定した。得られた配列は、配列表の配列番号３に示した通りであった。
（２）β−グルコシダーゼＡの部分アミノ酸配列
実施例１で得た精製β−グルコシダーゼＡ標品を還元カルボキシメチル化し、次いでリシルエンドペプチダーゼで処理した。この分解産物を、μ−ブロッター：ＡＢＩ  １７３Ａ（パーキンエルマー社製）に供して分離し、ＰＶＤＦ膜（パーキンエルマー社製）上にブロットした。得られたペプチド断片のアミノ酸配列を、前述のプロテインシーケンサーにより決定した。決定したβ−グルコシダーゼＡの部分アミノ酸配列Ｌ−４は、配列表の配列番号４に、Ｌ−５は、配列表の配列番号５に示された通りであった。
実施例４  β−グルコシダーゼＡのｃＤＮＡクローニング
（１）アクレモニウム・セルロリティカスのｍＲＮＡの単離とｃＤＮＡライブラリーの作製
アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８２６）をセルラーゼ誘導培地（４％セルロース、１％ペプトン、０．６％硝酸カリウム、０．２％尿素、０．１６％塩化カリウム、０．１２％硫酸マグネシウム、１．２％リン酸一カリウム、０．００１％硫酸亜鉛、０．００１％硫酸マンガン及び０．００１％硫酸銅（ｐＨ４．０））で３２℃にて４日間培養した後、遠心分離により菌体を回収した。
得られた菌体を液体窒素で凍結し、凍結乾燥後、乳鉢と乳棒を用いて磨砕した。磨砕した菌体からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社製）により、添付のプロトコールに従い、全ＲＮＡを単離した。さらに、全ＲＮＡから、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ファルマシア社製）により、添付のプロトコールに従い、ｍＲＮＡを精製した。
こうして得られたｍＲＮＡから、ＴｉｍｅＳＡＶＥＲ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ファルマシア社製）により、添付のプロトコールに従い、ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをファージベクターＬａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩ（ストラタジーン社製）に挿入した。
このようにして作製した組換えファージベクターについて、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔ（ストラタジーン社製）により、添付のマニュアルに従ってｉｎ  ｖｉｔｒｏパッケージングを行った。その後、この組換えファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株に感染させ、プレートにて培養し、プラークを形成させた。
このようにして作製したｃＤＮＡライブラリーは、５．５×１０５ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔｓであった。さらに、このｃＤＮＡライブラリーを、Ｌａｍｂｄａ  ＺＡＰ  ＩＩに添付のプロトコールに従い増幅した。この増幅したｃＤＮＡライブラリー中の組換えファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’株に感染させ、プレートにて培養し、プラークを形成させた。
（２）ＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅
上記（１）で作製したｃＤＮＡを鋳型にし、実施例３のβ−グルコシダーゼＡの部分アミノ酸配列の情報を基に、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法により、ＤＮＡ断片を増幅した。
各プライマーとして、ペプチドＬ−４（配列番号４）及びＬ−５（配列番号５）における部分アミノ酸配列（配列番号４の１〜６番目及び配列番号５の３〜８番目）に対応する、合成オリゴヌクレオチド（配列表の配列番号６及び７）を作製した。
ＰＣＲは、反応液５０μＬの反応液中、ｃＤＮＡ  ５０ｎｇを鋳型とし、１．２５ｕｎｉｔのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）、添付のバッファー、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｐｅ及び１μＭの上記プライマーを用い、以下の条件で反応を行った。
９４℃  １０分間の前処理後、９４℃  １分間（変性ステップ）、４８℃  １分間（アニーリングステップ）、７２℃  １分間（伸長ステップ）の反応条件を３０サイクル繰り返した後、７２℃  ２分間のインキュベーションを行い、反応を終了した。この反応により、約６００ｂｐのＤＮＡ断片が増幅した。
（３）ＰＣＲ産物のサブクローニング
前述のＰＣＲにて増幅された約６００ｂｐのＤＮＡ断片をＧＥＮＥＬＵＴＥ  ＭＩＮＵＳ  ＥｔＢｒ  ＳＰＩＮ  ＣＯＬＵＭＮＳ（シグマ社製）を用いて回収し、これをｐＵＣ１１８ベクター（宝酒造社製）に、ＤＮＡライゲーションキットＶｅｒ．１（宝酒造社製）を用いて連結した。得られた連結混合物で大腸菌ＪＭ１０９株コンピテントセル（Ｅ． ｃｏｌｉ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ＪＭ１０９、宝酒造社製）を形質転換した。次いで、得られた形質転換体を培養した後、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、添付のプロトコールに従ってプラスミドＤＮＡを回収した。
得られたプラスミドＤＮＡを複数の制限酵素によって切断した後、０．７％アガロースゲル電気泳動に供し、約６００ｂｐの断片が挿入されたプラスミドＤＮＡを選択した。目的のＰＣＲ産物がサブクローニングされたプラスミドをｐＡＢＧ０１とした。
（４）プラスミドｐＡＢＧ０１の塩基配列の解析
このようにしてクローニングしたＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、オートリードシーケンシングキット（ファルマシアバイオテク社製）とＡ．Ｌ．Ｆ．ＤＮＡシーケンサーＩＩ（ファルマシアバイオテク社製）を用いて、添付のプロトコールに従って行った。
解読された塩基配列をアミノ酸配列に翻訳したところ、一つの読み枠が、実施例３において示されたβ−グルコシダーゼＡの部分アミノ酸配列Ｌ−４及びＬ−５のプライマーに用いた部分以外の配列においても一致したので、目的とするβ−グルコシダーゼＡタンパク質をコードする遺伝子の一部であることが明らかとなった。
よって、このプラスミドｐＡＢＧ０１に含まれる挿入ＤＮＡを以降のスクリーニングのプローブとして用いることとした。
（５）プラークハイブリダイゼーションによるスクリーニング
まず、前記（３）で得られたプラスミドｐＡＢＧ０１から挿入ＤＮＡ断片を切り出し、これをＥＣＬ  ダイレクトＤＮＡ／ＲＮＡラベリング検出システム（アマシャム社製）を用いて、添付のプロトコールに従って標識化した。
次いで、前記（１）で作製したファージプラークは、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロントランスファーメンブラン（アマシャム社製）に写し取り、０．４Ｎ  水酸化ナトリウムでアルカリ処理し、メンブラン上の組換えファージＤＮＡを１本鎖に変性した後、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ：１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム）で洗浄し、風乾させ、ＤＮＡを固定した。
その後、Ｋｉｔに添付のプロトコールに従って、ハイブリダイゼーションを行い、検出反応を行った後、フジメディカルＸ線フィルム（富士写真フィルム社製）に感光させ、１３個の陽性ファージクローンを得た。
（６）ファージＤＮＡの調製
陽性ファージクローンからのＤＮＡの調製は、ファージベクターλＺＡＰ  ＩＩに添付のプロトコールに従い、プラスミドＤＮＡとして調製した。
アンピシリンに耐性を示す大腸菌ＳＯＬＲ  Ｓｔｒａｉｎから、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）にＤＮＡ断片がクローン化されたプラスミドを調製し、これを鋳型として前記（２）で使用したＬ−４及びＬ−５のプライマーを用い、前述と同様の条件下でＰＣＲを行った。
その結果、８個のプラスミドにおいて約６００ｂｐの増幅ＤＮＡ断片が得られた。よって、これらのプラスミドに目的とするＤＮＡがクローン化されていることが予測されたので、これらのプラスミドの挿入断片の大きさを調べたところ、１個のクローンが全領域を含むと思われる約２．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を含んでいた。
（７）ｃＤＮＡ塩基配列の決定
上記（６）において得られた陽性組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）プラスミドに挿入された約２．９ｋｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列は、Ｔ３、Ｔ７シーケンス用プライマーを使用し、前述と同様の方法で決定した。
その結果、この塩基配列は２５７７ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含んでおり、その塩基配列を配列表の配列番号１に示した。
このＯＲＦから予測される２１アミノ酸以降を含んで成るタンパク質のＮ末端のアミノ酸配列を常法により解析したところ、実施例３（１）において決定したβ−グルコシダーゼＡのＮ末端アミノ酸配列及び実施例３（２）において決定したβ−グルコシダーゼＡの内部アミノ酸配列と一致した。それ故に、本遺伝子は、β−グルコシダーゼＡをコードしていることが明らかとなった。
また、本知見からこのＯＲＦの最初の１〜２０アミノ酸、すなわち−２０〜−１のアミノ酸配列は、β−グルコシダーゼＡタンパク質を細胞外に分泌させるためのシグナル配列であると考えられた。さらに、配列表の配列番号１において、１〜８３８番のアミノ酸は前記成熟タンパク質をコードするものであった。
（８）菌株の寄託
β−グルコシダーゼＡをコードする約２．９ｋｂｐのｃＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）を有する大腸菌をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＡＣＣｂｇｌ０１と命名した。本菌は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番１中央第６）にブダペスト条約に基づき国際寄託されており、その受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−７７０３（２０００年８月４日付けで寄託された受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１７９８７より移管）である。
実施例５  アクレモニウム・セルロリティカス由来のβ−グルコシダーゼＡ遺伝子の過剰発現
（１）β−グルコシダーゼＡ遺伝子発現用の組換えベクターの作製
本実施例の工程の概略を、第３図に示す。
実施例４（３）で得られたβ−グルコシダーゼＡ  ｃＤＮＡの挿入されたプラスミドｐＡＢＧ０１を鋳型とし、配列表の配列番号８及び配列番号９記載のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、５０μＬの反応液中、２．５ｕｎｉｔのＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、添付のバッファー＃１、０．２ｍＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｎｇプラスミドＤＮＡ及び０．６μＭの上記プライマーを用い、以下の条件で反応を行った。
９８℃  １０分間の前処理後、９８℃  １５秒間（変性ステップ）、５５℃  ２秒間（アニーリングステップ）、７４℃  ３０秒間（伸長ステップ）の反応条件を１０サイクル繰り返した。
こうして得られたＰＣＲ反応液をエタノール沈殿し、ＰＣＲ産物を回収した後、制限酵素ＨｐａＩとＳｐｅＩで切断し、これを特開２００１−１７１８０号公報に記載されているデストマイシン耐性カセットを含むｐＣＢＨＥＸ／ＤｔＲ２のＨｐａＩとＮｈｅＩの間に挿入し、プラスミドｐＢＧＬＡ−Ｄｔを作製した。
プラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造社製）のＢａｍＨＩ部位を切断し、この切断部位を末端平滑化した後に、再度連結（セルフライゲーション）してＢａｍＨＩ部位を欠失したｐＵＣ１１８を作製した。このプラスミドのＸｂａＩ部位に、プラスミドｐＤＨＢＡＲ（Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｐｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：１０３６−１０４４）から制限酵素ＸｂａＩにより切り出したビアラホス耐性カセットを挿入した。このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、切断部位を平滑化した後に再度連結（セルフライゲーション）し、ＢａｍＨＩ部位を欠失したビアラホス耐性カセットを含むプラスミドを作製した。
このプラスミドから制限酵素ＸｂａＩによりビアラホス耐性カセットを切り出し、これを先に作製したプラスミドｐＢＧＬＡ−ＤｔのＸｂａＩ部位のデストマイシン耐性カセットと置き換え、タンパク質発現用プラスミドｐＢＧＬＡ−ｂａｒを作製した。
（２）β−グルコシダーゼＡ遺伝子の宿主への導入
アクレモニウム・セルロリティカスＹ−９４株を（Ｓ）培地（２％  ブイヨン、０．５％  イーストエキス及び２％  グルコース）において３０度で１６時間培養し、３５００ｒｐｍ、１０分間遠心することにより集菌した。
得られた菌体を０．５Ｍ  シュークロースで洗浄し、０．４５μｍのフィルターで濾過したプロトプラスト化酵素溶液（１０ｍｇ／ｍＬ  キチナーゼ、１０ｍｇ／ｍＬ  ザイモリアーゼ、３０ｍｇ／ｍＬ  β−グルクロニダーゼ及び０．５Ｍ  シュークロース）に懸濁した。３０℃で６０〜９０分間振盪し、菌糸をプロトプラスト化させた。脱脂綿によりこの懸濁液を濾過した後、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心してプロトプラストを回収し、ＳＵＴＣバッファー（０．５Ｍ  シュークロース、１０ｍＭ  塩化カルシウム及び１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））で洗浄した。
以上のようにして調製したプロトプラストを、１００μＬのＳＵＴＣバッファーに懸濁し、これに１０μｇのプラスミドｐＢＧＬＡ−ｂａｒ溶液（１０μＬ）を加え、氷上に５分間静置した。次に、４００μＬのＰＥＧ溶液（６０％  ＰＥＧ４０００、１０ｍＭ  塩化カルシウム及び１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を加え、氷中に２０分間静置した後、１０ｍＬのＳＵＴＣバッファーを加え、２５００ｒｐｍ、１０分間遠心した。遠心分離したプロトプラストを１ｍＬのＳＵＴＣバッファーに懸濁した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心して、最終的に１００μＬのＳＵＴＣバッファーに懸濁した。
以上の処理をしたプロトプラストを、ビアラホス（１０００μｇ／ｍＬ）添加（Ａ）寒天培地（３．９％  ポテトデキストロース寒天培地（日水製薬社製）、１７．１％  シュークロース）上に、（Ａ）軟寒天培地（１．３％  ポテトデキストロース寒天培地（日水製薬社製）、１７．１％  シュークロース）と共に重層し、３０℃、５〜９日間培養後、形成したコロニーを形質転換体とした。
（３）アクレモニウム・セルロリティカス形質転換体におけるβ−グルコシダーゼＡの発現と酵素活性の測定
（２）において得た形質転換体のうち、ビアラホスに対する耐性度の高い上位４株を、前記（実施例４（１）に記載）セルラーゼ誘導培地で培養した。培養上清をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により解析したところ、第４図に示すようにβ−グルコシダーゼＡ酵素は親株より分泌量が向上していた。
β−グルコシダーゼ活性は、セロビオース分解活性として測定し、培養上清１ｍＬ当たりの活性（Ｕ／ｍＬ）として表した。その結果は第３表の通りである。表から明らかなように、形質転換体は親株の約２５倍の活性を示した。
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実施例６
本発明におけるβ−グルコシダーゼのサイレージへの応用につき、以下の試験を実施した。
牧草として一般に用いられているチモシー（品種：ホクセン）を栽培・収穫し、２〜３ｃｍの長さに裁断した。裁断後のチモシーの水分は約７０％であった。次いで、実施例１にて調製した精製β−グルコシダーゼＡをスプレー装置（ジャクソン氏喉頭麻酔スプレー、五十嵐医科工業社製）を用いて当該裁断チモシーの表面に塗布した。精製β−グルコシダーゼＡの裁断チモシー単位重量に対する添加量は、０．０２３〜０．１１７単位とした。
精製β−グルコシダーゼＡを添加した裁断チモシー５０ｇをビニール袋に真空パックした後、２５℃で４週間静置保存してサイレージを調製した。当該サイレージに１５０ｍＬの脱イオン水を添加し、５℃にて一晩静置後、上清のｐＨを測定した。ｐＨ測定結果は、第４表の通りである。
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表から明らかなように、精製β−グルコシダーゼを添加した試験区は、いずれも該酵素無添加の対照区よりも、サイレージのｐＨが低く、かつβ−グルコシダーゼ添加量に対し、量依存的にｐＨが低下した。なお、サイレージにおいては、ｐＨが低いほど発酵品質が良好であるとされている。
以上のことから、β−グルコシダーゼはサイレージにおいて、その発酵品質を改善せしめることができ、有効であることが示された。
産業上の利用可能性
本発明により、アクレモニウム由来の新規β−グルコシダーゼ、該酵素をコードする遺伝子、該遺伝子を含む発現ベクター及び該発現ベクターで形質転換された宿主細胞が提供される。また、新規β−グルコシダーゼの効率的な製造方法も提供される。
さらに、このβ−グルコシダーゼ又は該酵素を包含する酵素組成物を植物又は植物由来物の加工などに利用する技術が提供され、飼料分野や食品分野等様々な用途での利用が期待される。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例１で得たβ−グルコシダーゼＡの３７℃における至適ｐＨを示す図である。
第２図は、実施例１で得たβ−グルコシダーゼＡの至適温度を示す図である。
第３図は、実施例５で示したプラスミドｐＢＧＬＡ−ｂａｒの作製方法を示す図である。
第４図は、アクレモニウム・セロリティカス形質転換体におけるβ−グルコシダーゼＡの発現を示す電気泳動の結果を示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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