(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍壊死因子-α(TNF-α)と特異的に結合し、
「Ser Tyr Asp Met His」のアミノ酸配列を有する重鎖の相補性決定領域1(CDR1)；
「Val Ile Trp Ser Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly」のアミノ酸配列を有する重鎖の相補性決定領域2(CDR2)；
「Glu Val Glu Ser Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met Asp Val」のアミノ酸配列を有する重鎖の相補性決定領域3(CDR3)
「Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Ile Asp Leu Gly」のアミノ酸配列を有する軽鎖の相補性決定領域1(CDR1)；
「Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser」のアミノ酸配列を有する軽鎖の相補性決定領域2(CDR2)；および
「Leu Gln His Lys Ser Tyr Pro Leu Thr」のアミノ酸配列を有する軽鎖の相補性決定領域3(CDR3)
を含み、
10-11Mより小さい解離定数（Kd）を有しており、
前記Kdを、TNF-αの3つのモノマーのTNF-α結合部位のモル濃度を使用して計算する、
ヒトモノクローナル抗体。
【請求項２】
配列番号70中に示すアミノ酸配列を含む重鎖のアミノ酸を含む、請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項３】
配列番号74中に示すアミノ酸配列を含む重鎖のアミノ酸を含む、請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項４】
配列番号72中に示すアミノ酸配列を含む軽鎖のアミノ酸を含む、請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項５】
腫瘍壊死因子-αと特異的に結合し、VH3-33/JH6b重鎖遺伝子、またはその保存型変異体を含む、請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項６】
A30/JK4軽鎖遺伝子によりコードされる、請求項5に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項７】
患者サンプル中の腫瘍壊死因子α(TNFα)のレベルをアッセイするための方法であって、請求項1に記載の抗TNFα抗体と患者由来の生物サンプルを接触させること、および前記サンプル中の前記抗体とTNFαの間の結合のレベルを検出することを含む方法。
【請求項８】
前記生物サンプルが血液である、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
請求項1に記載の抗体、またはFab、Fab'、F(ab')2、Fv、および単鎖抗体から選択されるその抗体断片、ならびに薬剤として許容可能な担体を含む組成物。
【請求項１０】
動物の腫瘍性疾患を治療するための薬剤の調製における、腫瘍壊死因子α(TNFα)と特異的に結合する請求項1に記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項１１】
前記腫瘍性疾患が、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経膠芽細胞腫、胃癌、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、および前立腺癌からなる群から選択される、請求項10に記載の使用。
【請求項１２】
動物の免疫介在炎症性疾患を有効に治療するための薬剤の調製における、腫瘍壊死因子α(TNFα)と特異的に結合する請求項1に記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項１３】
前記免疫介在炎症性疾患が、慢性関節リウマチ、糸球体腎炎、アテローム性動脈硬化症、乾癬、再狭窄、自己免疫疾患、クローン病、移植片対宿主反応、敗血症性ショック、悪液質、食欲不振および多発性硬化症からなる群から選択される、請求項12に記載の使用。
【請求項１４】
動物での腫瘍壊死因子誘導型アポトーシスを有効に治療するための薬剤の調製における、腫瘍壊死因子α(TNFα)と特異的に結合する請求項1に記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項１５】
ハイブリドーマ細胞系以外の細胞系中で発現させる、請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１６】
請求項1に記載のヒトモノクローナル抗体をコードするDNA。
【請求項１７】
請求項16に記載のDNAを含むベクター。
【請求項１８】
請求項17に記載のベクターが導入されている宿主細胞。
【請求項１９】
CHO細胞である、請求項18に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
請求項18に記載の宿主細胞中で請求項1から6および15のいずれか一項に記載のヒトモノクローナル抗体を発現する工程を含む、前記抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗原腫瘍壊死因子α(本明細書では以後TNFa)に対する抗体、およびこのような抗体の使用に関する。より詳細には、本発明は、抗原TNFaに対する完全ヒトモノクローナル抗体、およびこれらの抗体の使用に関する。本発明の態様は、このような抗体を発現するハイブリドーマまたは他の細胞系にも関する。本明細書の抗体は、TNFaの活性および/または過剰生成と関係がある疾患用の、診断物質および治療剤として有用である。
【背景技術】
【０００２】
TNFaは、感染性疾患、免疫障害、自己免疫病、移植片対宿主病(GVHD)、腫瘍形成/癌および癌関連悪液質と関連があることが実証されてきている。Feldman M.、2002 Nat.Rev.Immunol.、2:364を参照のこと。特にTNFaレベルは、グラム陰性敗血症、内毒性ショック(Michie他、1989 Br.J.Surg.76:670を参照)、クローン病、および慢性関節リウマチにおいて、劇的に誘導されている。このような広く様々な徴候にTNFaが関係することから、この炎症性サイトカインを標的とする特異的な生物療法剤を開発することの重要性が際立っている。
【０００３】
何人かの研究者達は、in vitroでTNFaの活性を中和する、TNFaに対するモノクローナル抗体の特性決定を報告している。Liang CM他、1986、Biochem.Biophys Res.Commun.、137:847、およびMeager A他、1987 Hybridoma 6:305を参照のこと。これらの抗体のいくつかは、ヒトTNFaのエピトープをマッピングするため、酵素イムノアッセイを開発するため、および組換えTNFaの精製を手助けするために使用されている。Fendly BM他、1987 Hybridoma、6:359;Hirai M他、1987 J.Immunol Methods、96:57;Moller A他、1990 Cytokine、2:162;Bringman TSおよびAggarwal BB、1987、Hybridoma、6:489を参照のこと。残念ながら、これらの研究用に作製された抗体は、ヒト患者を治療するための治療用中和TNFa抗体として有用であるとは思われない。なぜなら、これらの抗体は非ヒト種に由来し、TNFaに関する特異性を欠くからである。
【０００４】
TNFaに対する中和抗血清またはモノクローナル抗体は、実験的内毒素症において致死的攻撃後の病態生理学的有害事象を阻止し、死を防ぐことによって、非ヒト哺乳動物において有効性が示されている。これらの効果は、げっ歯類および非ヒト霊長類モデル系において実証されてきている。Beutler B他、1985 Science、229:869;Tracey KJ他、1987 Nature、330:662;Mathison JC他、1988 J.Clin.Invest.、81:1925;Shimamoto Y他、1988、Immunol.Lett.、17:311;Opal SM他、1990、J.Infect.Dis.、161:1148;Silva AT他、1990、J.Infect.Dis.、162:454;Hinshaw LB、他、1990、Circ.Shock、30:279を参照のこと。
【０００５】
様々な形の中和抗体が現在存在しており、Feldmanによって総説されている。Feldman M、2002、Nat.Rev.Immunol.、2:364を参照のこと。この総説中に記載されているように、治療上適切な抗体をもたらすと思われる、ヒトに対する慢性投与用の中和抗体を作製するために、多大な努力が費やされてきている。現在、抗体/TNFR融合体(fcIg/TNFR)タンパク質(Enbrel)は、ある程度の有用性を示しているが、薬剤の頻繁な投与(例えば1週間に2回)につながる血清中での短い半減期が問題である。長期治療用のTNFaに対する中和治療抗体は、抗体自体が免疫原性でない限りは、半減期の問題を乗り越えると思われる(3〜4週間に1回注射)。他の人達も、免疫原性が低い/免疫原性がないこと、およびその内因性ものに典型的な半減期という望ましい特徴を有するTNFaに対する中和抗体を作製することを試みたが、成功しなかった。このような抗体の例には、インフリキシマブ(cA2またはレミケード)などのマウス/ヒトキメラ、および人化抗体CDP571またはアダリムマブ(D2E7またはヒューミラ)がある。これらは、そのヒト抗体に非常に類似した中和治療抗体を作製するための試みを表す。
【０００６】
残念ながら、これらの薬剤の全可能性が、それらの固有の潜在的な免疫原性、短い半減期および/またはTNFaに対する低い親和力/親和性のために、実現しない可能性がある。これらのキメラ抗体によって誘導される宿主の免疫応答は、循環からの抗体の除去をもたらし、有効性が消失するために、反復投与を治療に不適切なものにする可能性がある。これらの問題は最終的に、患者に対する治療の有効性を低下させる。抗体またはその断片、例えば前述のものなどを使用すると、スケールアップおよび製造における他の問題にも遭遇する可能性がある。
【０００７】
したがって、前述の理由のために、TNFaが特定の疾患の病態生理の原因である臨床的に指示された集団の患者に対して代替法を提供する必要性が当分野で存在する。長期投与用の、完全なヒト、高親和性、中和モノクローナル抗体、またはその断片によって、低頻度の投与に適した半減期を有する非免疫原性治療選択の望ましい特徴が与えられる。
【非特許文献１】Feldman M.、2002 Nat.Rev.Immunol.、2:364
【非特許文献２】Michie他、1989 Br.J.Surg.76:670
【非特許文献３】Liang CM他、1986、Biochem.Biophys Res.Commun.、137:847
【非特許文献４】Meager A他、1987 Hybridoma 6:305
【非特許文献５】Fendly BM他、1987 Hybridoma、6:359
【非特許文献６】Hirai M他、1987 J.Immunol Methods、96:57
【非特許文献７】Moller A他、1990 Cytokine、2:162
【非特許文献８】Bringman TSおよびAggarwal BB、1987、Hybridoma、6:489
【非特許文献９】Beutler B他、1985 Science、229:869
【非特許文献１０】Tracey KJ他、1987 Nature、330:662
【非特許文献１１】Mathison JC他、1988 J.Clin.Invest.、81:1925
【非特許文献１２】Shimamoto Y他、1988、Immunol.Lett.、17:311
【非特許文献１３】Opal SM他、1990、J.Infect.Dis.、161:1148
【非特許文献１４】Silva AT他、1990、J.Infect.Dis.、162:454
【非特許文献１５】Hinshaw LB、他、1990、Circ.Shock、30:279
【非特許文献１６】Feldman M、2002、Nat.Rev.Immunol.、2:364
【非特許文献１７】Kabat他、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、NIH Publication 91〜3242、Bethesda MD[1991]、vols.1〜3
【特許文献１】米国特許第6,090,382号
【特許文献２】米国特許第5,436,154号
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【非特許文献２１】Stec他、J.Am.Chem.Soc.106:6077(1984)
【非特許文献２２】Stein他、NucL Acids Res.16:3209(1988)
【非特許文献２３】Zon他、Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991)
【非特許文献２４】Zon他、Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach、pp.87〜108(F.Eckstein編、Oxford University Press、Oxford England(1991))
【特許文献３】米国特許第5,151,510号
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【特許文献６】米国特許出願第07/610,515号
【特許文献７】米国特許出願第07/919,297号
【特許文献８】米国特許出願第07/922,649号
【特許文献９】米国特許出願第08/031,801号
【特許文献１０】米国特許出願第08/112,848号
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【特許文献１２】米国特許出願第08/376,279号
【特許文献１３】米国特許出願第08/430,938号
【特許文献１４】米国特許出願第08/464,584号
【特許文献１５】米国特許出願第08/464,582号
【特許文献１６】米国特許出願第08/463,191号
【特許文献１７】米国特許出願第08/462,837号
【特許文献１８】米国特許出願第08/486,853号
【特許文献１９】米国特許出願第08/486,857号
【特許文献２０】米国特許出願第08/486,859号
【特許文献２１】米国特許出願第08/462,513号
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【特許文献２４】米国特許第6,162,963号
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【非特許文献４９】GreenおよびJakobovits J.Exp.Med.188:483〜495(1998)
【特許文献３２】欧州特許EP0463151B1号
【特許文献３３】国際特許出願WO94/02602号
【特許文献３４】国際特許出願WO96/34096号
【特許文献３５】WO98/24893
【特許文献３６】WO00/76310
【特許文献３７】米国特許第5,545,807号
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【特許文献４２】米国特許第5,661,016号
【特許文献４３】米国特許第5,770,429号
【特許文献４４】米国特許第5,789,650号
【特許文献４５】米国特許第5,814,318号
【特許文献４６】米国特許第5,877,397号
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【特許文献４８】米国特許第6,255,458号
【特許文献４９】米国特許第5,591,669号
【特許文献５０】米国特許第6,023.010号
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【特許文献５２】米国特許第5,721,367号
【特許文献５３】米国特許第5,789,215号
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【特許文献５５】米国特許出願第07/574,748号
【特許文献５６】米国特許出願第07/575,962号
【特許文献５７】米国特許出願第07/810,279号
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【特許文献５９】米国特許出願第07/904,068号
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【特許文献６１】米国特許出願第08/053,131号
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【特許文献６５】米国特許出願第08/165,699号
【特許文献６６】米国特許出願第08/209,741号
【特許文献６７】欧州特許0546073B1号
【特許文献６８】国際特許出願WO92/03918
【特許文献６９】WO92/22645
【特許文献７０】WO92/22647
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【特許文献７９】欧州特許出願第773288号
【特許文献８０】欧州特許出願第843961号
【特許文献８１】米国特許第4,816,397号
【特許文献８２】米国特許第5,916,771号
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【特許文献８５】米国特許第4,681,581号
【特許文献８６】米国特許第4,735,210号
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【特許文献８８】米国特許第5,102,990号(RE35,500)
【特許文献８９】米国特許第5,648,471号
【特許文献９０】米国特許第5,697,902号
【特許文献９１】米国特許出願第08/759,620号
【特許文献９２】国際特許出願WO98/24893号
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【特許文献１０４】EP88,046
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【特許文献１０６】EP142,641
【特許文献１０７】日本国特許出願83-118008
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【非特許文献８０】Van Ostade他((1991)EMBO 10:827〜836
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の実施形態は、腫瘍壊死因子-aと特異的に結合し、「SerTyrAspMetHis」のアミノ酸配列を有する重鎖の相補性決定領域1(CDR1)を有するヒトモノクローナル抗体に関する。本明細書に記載する抗体は、「ValIleTrpSerAspGlySerIleLysTyrTyrAlaAspSerValLysGly」のアミノ酸配列を有する重鎖の相補性決定領域2(CDR2)、「GluValGluSerAlaMetGlyGlyPheTyrTyrAsnGlyMetAspVal」のアミノ酸配列を有する重鎖の相補性決定領域3(CDR3)、配列番号70中に示すアミノ酸配列を含む重鎖のアミノ酸、および配列番号74中に示すアミノ酸配列を含む重鎖のアミノ酸を含むこともできる。
【０００９】
他の実施形態は、「ArgAlaSerGlnGlyIleArgIleAspLeuGly」のアミノ酸配列を有する軽鎖の相補性決定領域1(CDR1)を有するヒトモノクローナル抗体を含む。本明細書の抗体は、「AlaAlaSerThrLeuGlnSer」のアミノ酸配列を有する軽鎖の相補性決定領域2(CDR2)、「LeuGlnHisLysSerTyrProLeuThr」のアミノ酸配列を有する軽鎖の相補性決定領域3(CDR3)、配列番号72中に示すアミノ酸配列を含む軽鎖のアミノ酸も含むことができる。
【００１０】
他の実施形態では、本発明は、腫瘍壊死因子-aと特異的に結合し、「ArgAlaSerGlnGlyIleArgIleAspLeuGly」のアミノ酸配列を有する軽鎖の相補性決定領域1(CDR1)、「AlaAlaSerThrLeuGlnSer」のアミノ酸配列を有する軽鎖の相補性決定領域2(CDR2)、および「LeuGlnHisLysSerTyrProLeuThr」のアミノ酸配列を有する軽鎖の相補性決定領域3(CDR3)を含むヒトモノクローナル抗体を提供する。
【００１１】
さらに他の実施形態は、「SerTyrAspMetHis」のアミノ酸配列を有する重鎖の相補性決定領域1(CDR1)、「ValIleTrpSerAspGlySerIleLysTyrTyrAlaAspSerValLysGly」のアミノ酸配列を有する重鎖の相補性決定領域2(CDR2)および「GluValGluSerAlaMetGlyGlyPheTyrTyrAsnGlyMetAspVal」のアミノ酸配列を有する重鎖の相補性決定領域3(CDR3)を有するヒトモノクローナル抗体を含む。
【００１２】
他の実施形態では、本発明は、腫瘍壊死因子-aと特異的に結合し、VH3-33重鎖遺伝子、またはその保存型変異体を含むヒトモノクローナル抗体を含む。本明細書に記載する抗体は、A30VK1軽鎖遺伝子を含むこともできる。
【００１３】
本発明の他の実施形態は、腫瘍壊死因子-aと特異的に結合するヒトモノクローナル抗体であって、カノニカルクラス1に対応する重鎖の相補性決定領域1(CDR1)を含むヒトモノクローナル抗体を含む。本発明で提供される抗体は、カノニカルクラス3に対応する重鎖の相補性決定領域2(CDR2)、カノニカルクラス2に対応する軽鎖の相補性決定領域1(CDR1)、カノニカルクラス1に対応する軽鎖の相補性決定領域2(CDR2)、およびカノニカルクラス1に対応する軽鎖の相補性決定領域3(CDR3)を含むこともできる。
【００１４】
他の実施形態では、本発明は、腫瘍壊死因子-aと特異的に結合し、「ArgAsnTyrMetSer」のアミノ酸配列を有する重鎖の相補性決定領域1(CDR1)を含む、ヒトモノクローナル抗体を提供する。抗体は、「ValIleTyrSerGlyAspArgThrTyrTyrAlaAspSerValLysGly」のアミノ酸配列を有する重鎖の相補性決定領域2(CDR2)、「GlyGluGlyGlyPheAspTyr」のアミノ酸配列を有する重鎖の相補性決定領域3(CDR3)、および配列番号50中に示すアミノ酸配列を有する重鎖のアミノ酸をさらに含むことができる。
【００１５】
本発明の他の実施形態では、ヒトモノクローナル抗体は、「ArgAlaSerGlnSerValSerSerAsnLeuAla」のアミノ酸配列を有する軽鎖の相補性決定領域1(CDR1)、「GlyAlaSerIleArgAlaThr」のアミノ酸配列を有する軽鎖の相補性決定領域2(CDR2)、「GlnGlnTyrAsnTyrTrpTrpThr」のアミノ酸配列を有する軽鎖の相補性決定領域3(CDR3)、および配列番号52中に示すアミノ酸配列を含む軽鎖のアミノ酸を含むことができる。
【００１６】
さらに実施形態では、本発明は、腫瘍壊死因子-aと特異的に結合し、「ArgAlaSerGlnSerValSerSerAsnLeuAla」のアミノ酸配列を有する軽鎖の相補性決定領域1(CDR1)、「GlyAlaSerIleArgAlaThr」のアミノ酸配列を有する軽鎖の相補性決定領域2(CDR2)、「GlnGlnTyrAsnTyrTrpTrpThr」のアミノ酸配列を有する軽鎖の相補性決定領域3(CDR3)、「ArgAsnTyrMetSer」のアミノ酸配列を有する重鎖の相補性決定領域1(CDR1)、「ValIleTyrSerGlyAspArgThrTyrTyrAlaAspSerValLysGly」のアミノ酸配列を有する重鎖の相補性決定領域2(CDR2)、および「GlyGluGlyGlyPheAspTyr」のアミノ酸配列を有する重鎖の相補性決定領域3(CDR3)を有するヒトモノクローナル抗体を含む。
【００１７】
他の実施形態では、本発明は、腫瘍壊死因子-aと特異的に結合し、VH3-53重鎖遺伝子、またはその保存型変異体を有するヒトモノクローナル抗体を提供する。本明細書の抗体は、L2VK3軽鎖遺伝子を含むこともできる。
【００１８】
他の実施形態では、本発明は、腫瘍壊死因子-aと特異的に結合するヒトモノクローナル抗体であって、カノニカルクラス1に対応する重鎖の相補性決定領域1(CDR1)を含む、ヒトモノクローナル抗体を含む。本明細書の抗体は、カノニカルクラス1に対応する重鎖の相補性決定領域2(CDR2)、カノニカルクラス2に対応する軽鎖の相補性決定領域1(CDR1)、カノニカルクラス1に対応する軽鎖の相補性決定領域2(CDR2)、およびカノニカルクラス3に対応する軽鎖の相補性決定領域3(CDR3)を含むこともできる。
【００１９】
本発明はさらに、患者サンプル中の腫瘍壊死因子α(TNFa)のレベルをアッセイするための方法であって、抗TNFa抗体と患者由来の生物サンプルを接触させること、および前記サンプル中の前記抗体とTNFaの間の結合のレベルを検出することを含む方法を提供する。さらに具体的な実施形態では、生物サンプルは血液である。
【００２０】
他の実施形態では、本発明は、抗体またはその機能性断片、および薬剤として許容可能な担体を含む組成物を提供する。
【００２１】
本発明のさらに他の実施形態は、腫瘍性疾患に罹患した動物を有効に治療する方法であって、腫瘍性疾患の治療を必要とする動物を選択すること、および腫瘍壊死因子α(TNFa)と特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体を治療上有効な用量、前記動物に投与することを含む方法を含む。
【００２２】
治療可能な腫瘍性疾患は、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経膠芽細胞腫、胃癌、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、および前立腺癌を含むことができる。
【００２３】
本発明の他の方法は、免疫介在炎症性疾患を有効に治療することに関する。これらの方法は、炎症状態の治療を必要とする動物を選択すること、および完全ヒトモノクローナル抗体であって、前記抗体が腫瘍壊死因子α(TNFa)と特異的に結合する抗体を、治療上有効な用量、前記動物に投与することを含む。治療可能な免疫介在炎症性疾患には、慢性関節リウマチ、糸球体腎炎、アテローム性動脈硬化症、乾癬、再狭窄、自己免疫疾患、クローン病、移植片対宿主反応、敗血症性ショック、悪液質、食欲不振、強直性脊椎炎および多発性硬化症がある。
【００２４】
本発明の他の実施形態は、動物での腫瘍壊死因子α(TNFa)誘導型アポトーシスを阻害する方法を含む。これらの方法は、TNFa誘導型アポトーシスの治療を必要とする動物を選択すること、および完全ヒトモノクローナル抗体であって、前記抗体がTNFaと特異的に結合する抗体を治療上有効な用量、前記動物に投与することを含む。
【００２５】
本発明の他の実施形態は、動物の腫瘍性疾患を治療するための薬剤の調製における抗体の使用を含み、前記モノクローナル抗体は腫瘍壊死因子α(TNFa)と特異的に結合する。治療可能な腫瘍性疾患は、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経膠芽細胞腫、胃癌、子宮内膜癌、腎臓癌、結腸癌、膵臓癌、および前立腺癌を含むことができる。
【００２６】
本明細書の抗体の他の使用は、動物の免疫介在炎症性疾患を有効に治療するための薬剤を調製するための使用であって、前記モノクローナル抗体が腫瘍壊死因子α(TNFa)と特異的に結合する使用であってよい。治療可能な免疫介在炎症性疾患は、慢性関節リウマチ、糸球体腎炎、アテローム性動脈硬化症、乾癬、再狭窄、自己免疫疾患、クローン病、移植片対宿主反応、敗血症性ショック、悪液質、食欲不振および多発性硬化症を含むことができる。
【００２７】
さらに他の実施形態では、本明細書に記載する抗体は、動物での腫瘍壊死因子誘導型アポトーシスを有効に治療するための薬剤を調製するために使用することができ、前記モノクローナル抗体は腫瘍壊死因子α(TNFa)と特異的に結合する。
【００２８】
本明細書に記載する本発明の実施形態は、TNFaと結合しTNFa機能に影響を与えるモノクローナル抗体に関する。他の実施形態は、TNFaに対する強い結合親和性、in vitroおよびin vivoでTNFaを中和する能力、およびTNFa誘導型アポトーシスを阻害する能力を含めて、治療的観点から望ましい性質を有する完全ヒト抗TNFa抗体および抗TNFa抗体調製物に関する。
【００２９】
好ましい実施形態では、本明細書に記載する抗体は、TNFaと非常に高い親和性(Kd)で結合する。例えば、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13または10-14M、あるいはこの中の任意の範囲または値だけには限られないが、これら未満のKdで、TNFaと結合することができる、ヒト、ウサギ、マウス、キメラまたは人化抗体。本明細書に記載するウサギ抗体R014は、10-13(fM)の範囲の測定親和性を有する。抗体299V.1および299V.2は、10-13または低い10-12(M)範囲の親和性を有することが示された。親和性および/または親和力の測定値は、本明細書に記載するように、KinExA(登録商標)および/またはBIACORE(登録商標)によって測定することができる。
【００３０】
したがって、本明細書に記載する一実施形態は、TNFaと結合する単離抗体、またはこれらの抗体の断片を含む。当分野で知られているように、抗体は例えば、モノクローナル、キメラおよび/または完全ヒト抗体であることが有利である可能性がある。本明細書に記載する本発明の実施形態は、これらの抗体を産生するための細胞も与える。
【００３１】
本発明の他の実施形態は、TNFaと結合し、表31〜34中に示す配列の1つを有する相補性決定領域(CDR)を有する重鎖のアミノ酸配列を含む完全ヒト抗体である。CDRの決定は、当業者によって容易に行うことができることを記す。例えば、Kabat他、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、NIH Publication 91〜3242、Bethesda MD[1991]、vols.1〜3を参照のこと。
【００３２】
さらに他の実施形態は、TNFaと結合し、表32および34中に示す配列の1つを含むCDRを有する軽鎖のアミノ酸配列を含む抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００３３】
他の実施形態は、TNFaと結合し、表31および33中に示すCDR配列の1つを有する重鎖のアミノ酸配列、ならびに表32および34中に示すCDR配列の1つを有する軽鎖のアミノ酸配列を含む抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００３４】
本発明の他の実施形態は、TNFβだけには限られないがこれを含めた、他のTNFaファミリーのメンバーと結合する完全ヒト抗体である。本明細書中の他の実施形態は、TNFaと本発明の完全ヒト抗体の結合に関して交差競合する、抗体である。
【００３５】
本発明の実施形態は、いずれか特定の形の抗体、あるいは作製法または産生法に限られないことは理解されよう。例えば、抗TNFa抗体は、(例えば、完全ヒトFc領域を有する)完全長抗体、または抗体断片(例えば、Fab、Fab'またはF(ab')2)であってよい。さらに抗体は、抗体を分泌するハイブリドーマから、あるいは遺伝子または抗体をコードする遺伝子で形質転換またはトランスフェクトされた、組換えによって生成した細胞から、製造することができる。
【００３６】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載する抗体のいずれかをコードする単離核酸分子、抗TNFa抗体をコードする単離核酸分子を有するベクター、またはこのような核酸分子のいずれかで形質転換した宿主細胞を含む。さらに、本発明の一実施形態は、核酸分子が発現されて抗体が産生する条件下で宿主細胞を培養して、次に抗体を回収することによって、抗TNFa抗体を産生する方法である。
【００３７】
本明細書の他の実施形態は、ヒトTNFa、またはその断片、および1つまたは複数のオルソログ配列、またはその断片を用いて、哺乳動物を免疫処置することによって、TNFaに対して高親和性の抗体を産生する方法を含む。
【００３８】
他の実施形態は、TNFaと特異的に結合する単離抗体の、作製および同定に基づく。TNFaは、腫瘍などの腫瘍性疾患および他の炎症性疾患において、高レベルで発現される。TNFaの生物活性を阻害することによって、炎症、およびTNFa誘導型アポトーシスを含めた、他の望ましい効果を妨げる可能性がある。
【００３９】
本発明の他の実施形態は、本明細書に記載するように調製した抗体を使用して、患者サンプル中のTNFaのレベルを検出する、疾患または状態を診断する方法を含む。一実施形態では、患者サンプルは血液または血清である。他の実施形態では、抗TNFa抗体を使用してTNFaの過剰発現を同定することを含む、危険因子を同定し、疾患を診断し、疾患を段階付けする方法を示す。
【００４０】
本発明の他の実施形態は、細胞と抗TNFa抗体を接触させ、その後TNFaの存在を検出することによって、細胞中のTNFaの発現と関係がある状態を診断するための方法を含む。好ましい状態には、乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌および膀胱癌などの腫瘍、癌を非制限的に含む腫瘍性疾患があるが、これらだけには限られない。他の実施形態では、抗TNFa抗体を使用して、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、自己免疫疾患、慢性関節リウマチ、乾癬、ブドウ膜炎(例えば、幼児期および血清陰性)、狼瘡、ならびに天疱瘡および糸球体腎炎などの免疫複合体によって仲介される他の疾患、新生児甲状腺機能亢進症(CH)、接触過敏症などの遅延型過敏症(DTH)、サルコイドーシス、ベーチェット病、慢性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、成人still病、原発性シェーグレン病、強皮症、巨大細胞性脈炎、SAPHO症候群、原発性胆汁性肝硬変(PBC)、サルコイドーシス、脊髄離開症候群、ウェグナー症候群および他の脈管炎、血液悪性腫瘍、蝸牛前庭障害、マクロファージ活性化症候群、喘息、間質性肺疾患、C型肝炎、肺線維症、排卵誘発、脊髄離開症候群、クローン病、移植片対宿主反応、敗血症性ショック、悪液質、食欲不振および多発性硬化症を非制限的に含む、免疫介在炎症性疾患(IMID)だけには限られないが、これらを含む炎症性疾患を診断することができる。抗体が診断することができる他の状態は、Salfeld他への米国特許第6,090,382号、およびBarbanti他への米国特許第5,436,154号中に開示されている。
【００４１】
他の実施形態では、本発明は、哺乳動物組織または細胞中のTNFaおよびTNFaファミリーのメンバーを検出して、腫瘍性疾患または炎症状態をスクリーニングするためのアッセイ用キットを含む。このキットは、TNFaと結合する抗体、および存在する場合、抗体とTNFaの反応を示すための手段を含む。抗体は、モノクローナル抗体であることが好ましい。一実施形態では、TNFaと結合する抗体を標識する。他の実施形態では、抗体は非標識状態の第1の抗体であり、キットはこの第1の抗体を検出するための手段をさらに含む。一実施形態では、手段は、抗免疫グロブリンである標識された第2の抗体を含む。蛍光色素、酵素、放射性核種、および放射線不透過性物質からなる群から選択されるマーカーで抗体を標識することが好ましい。
【００４２】
本発明の他の実施形態は、薬剤として許容可能な担体または希釈剤と混合された有効量の抗TNFa抗体を有する薬剤組成物を含む。さらに他の実施形態では、抗TNFa抗体、またはその断片を、治療剤と結合させる。治療剤は、例えば毒素または放射性同位体であってよい。例えば乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌および膀胱癌などの腫瘍、癌、ならびにアテローム性動脈硬化症、再狭窄、自己免疫疾患、慢性関節リウマチ、乾癬、ブドウ膜炎(例えば、幼児期および血清陰性)、狼瘡、および天疱瘡および糸球体腎炎などの免疫複合体によって仲介される他の疾患、新生児甲状腺機能亢進症(CH)、接触過敏症などの遅延型過敏症(DTH)、サルコイドーシス、ベーチェット病、慢性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、成人still病、原発性シェーグレン病、強皮症、巨大細胞性脈炎、SAPHO症候群、原発性胆汁性肝硬変(PBC)、サルコイドーシス、脊髄離開症候群、ウェグナー症候群および他の脈管炎、血液悪性腫瘍、蝸牛前庭障害、マクロファージ活性化症候群、喘息、間質性肺疾患、C型肝炎、肺線維症、排卵誘発、脊髄離開症候群、クローン病、移植片対宿主反応、敗血症性ショック、悪液質、食欲不振および多発性硬化症を非制限的に含む、免疫介在炎症性疾患(IMID)だけには限られないが、これらを含めた他の炎症状態を含めた疾患の治療用に、このような抗体を使用することができることが好ましい。抗体が治療することができる他の状態は、Salfeld他への米国特許第6,090,382号、およびBarbanti他への米国特許第5,436,154号中に開示されている。
【００４３】
さらに他の実施形態は、有効量の抗TNFa抗体を患者に投与することによって、患者中のTNFaの発現と関係がある疾患または状態を治療するための方法を含む。
【００４４】
この方法はin vivoで行うことができ、患者はヒト患者であることが好ましい。好ましい実施形態では、本発明の方法は、乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌および膀胱癌などの腫瘍、腫瘍、癌の治療に関する。他の実施形態では、炎症状態には、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、自己免疫疾患、慢性関節リウマチ、乾癬、ブドウ膜炎(例えば、幼児期および血清陰性)、狼瘡、および天疱瘡および糸球体腎炎などの免疫複合体によって仲介される他の疾患、新生児甲状腺機能亢進症(CH)、接触過敏症などの遅延型過敏症(DTH)、サルコイドーシス、ベーチェット病、慢性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、成人still病、原発性シェーグレン病、強皮症、巨大細胞性脈炎、SAPHO症候群、原発性胆汁性肝硬変(PBC)、サルコイドーシス、脊髄離開症候群、ウェグナー症候群および他の脈管炎、血液悪性腫瘍、蝸牛前庭障害、マクロファージ活性化症候群、喘息、間質性肺疾患、C型肝炎、肺線維症、排卵誘発、脊髄離開症候群、クローン病、移植片対宿主反応、敗血症性ショック、悪液質、食欲不振および多発性硬化症を非制限的に含む、免疫介在炎症性疾患(IMID)があるが、これらだけには限られない。抗体が治療することができる他の状態は、Salfeld他への米国特許第6,090,382号、およびBarbanti他への米国特許第5,436,154号中に開示されている。
【００４５】
他の実施形態では、本発明は、容器を含む製造物品を提供する。この容器は、抗TNFa抗体、および添付文書または標識を含む組成物を含み、この組成物を使用して、TNFaの過剰発現によって特徴付けられる腫瘍性または炎症疾患を治療することができることが示される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、抗TNFa抗体を患者に投与し、次に除去剤を投与して、血液から過剰な循環抗体を除去する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、抗TNFa抗体を改変して、補体を固定し、補体依存性細胞毒性(CDC)に関与する、抗体の能力を増大させることができる。一実施形態では、アミノ酸の置換などによって抗TNFa抗体を改変して、身体からの抗体の除去を変えることができる。あるいは、いくつか他のアミノ酸の置換は、身体からの抗体の除去を遅らせる可能性がある。
【００４８】
さらに他の実施形態は、腫瘍性疾患または炎症状態などの疾患を治療するための薬剤の調製における、抗TNFa抗体の使用である。一実施形態では、腫瘍性疾患は、乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌および膀胱癌などの、腫瘍および癌を含む。他の実施形態では、炎症状態は、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、自己免疫疾患、慢性関節リウマチ、乾癬、ブドウ膜炎(例えば、幼児期および血清陰性)、狼瘡、および天疱瘡および糸球体腎炎などの免疫複合体によって仲介される他の疾患、新生児甲状腺機能亢進症(CH)、接触過敏症などの遅延型過敏症(DTH)、サルコイドーシス、ベーチェット病、慢性関節炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、成人still病、原発性シェーグレン病、強皮症、巨大細胞性脈炎、SAPHO症候群、原発性胆汁性肝硬変(PBC)、サルコイドーシス、脊髄離開症候群、ウェグナー症候群および他の脈管炎、血液悪性腫瘍、蝸牛前庭障害、マクロファージ活性化症候群、喘息、間質性肺疾患、C型肝炎、肺線維症、排卵誘発、脊髄離開症候群、クローン病、移植片対宿主反応、敗血症性ショック、悪液質、食欲不振および多発性硬化症を非制限的に含む、免疫介在炎症性疾患(IMID)を含むが、これらだけには限られない。抗体が治療することができる他の状態は、Salfeld他への米国特許第6,090,382号、およびBarbanti他への米国特許第5,436,154号中に開示されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
本明細書に記載する本発明の実施形態は、TNFaと結合するモノクローナル抗体に関する。いくつかの実施形態では、抗体はTNFaと結合し、TNFa機能に影響を与える。他の実施形態は、TNFaに関する強い結合親和性、in vitroでTNFaを中和する能力、in vivoでのTNFa誘導型の肝臓損傷を阻害する能力、およびin vivoでのTNFa誘導型IL-6生成を阻害する能力を含めて、治療的観点から望ましい性質を有する、完全ヒト抗TNFa抗体および抗TNFa抗体調製物を与える。
【００５０】
したがって、本発明の実施形態は、TNFaと結合する単離抗体、またはこれらの抗体の断片を含む。当分野で知られているように、抗体は完全ヒトモノクローナル抗体であることが、有利である可能性がある。本発明の実施形態は、これらの抗体を産生するための細胞も与える。
【００５１】
さらに、本発明の実施形態は、診断ツールとしての、あるいは疾患を治療するための、これらの抗体の使用を与える。例えば、本発明の実施形態は、感染疾患、免疫障害、自己免疫病、移植片対宿主疾患(GVHD)、腫瘍形成、癌関連悪液質、グラム陰性敗血症、内毒性ショック、クローン病、および慢性関節リウマチと関係があるTNFaの発現を阻害するための、方法および抗体を与える。乳癌、卵巣癌、胃癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、肺癌、腎臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌および膀胱癌などの癌、ならびに慢性関節リウマチ、糸球体腎炎、アテローム性動脈硬化症、乾癬、臓器移植、再狭窄および自己免疫疾患だけには限られないが、これらを含めた他の炎症状態を治療するために、抗体を使用することが好ましい。このような治療に関して、本明細書に記載する抗体を含む製造物品を与える。さらに、本明細書に記載する抗体を有する、アッセイ用キットを与えて、腫瘍および炎症状態をスクリーニングする。
【００５２】
さらに、本明細書に記載する核酸、ならびにその断片および変異体は、例えば(a)対応するコードされているタンパク質、ポリペプチド、断片および変異体の、組換えまたは異種遺伝子産物としての生合成を指示するため、(b)本明細書に開示する核酸の検出および定量化用プローブとして、(c)アンチセンス分子を調製するための配列鋳型としてなどの、非制限的な例で使用することができる。このような使用は、以下の開示中でより完全に記載する。
【００５３】
さらに、本明細書に記載するタンパク質およびポリペプチド、ならびにその断片および変異体は、(a)抗TNFa抗体の産生を刺激するための免疫原として働かせること、(b)このような抗体の免疫原性アッセイにおける捕捉抗原、(c)本明細書に記載するTNFaポリペプチドと結合する物質のスクリーニングの標的として、および(d)抗体を用いた治療が、標的によって仲介される分子および/または細胞機能に影響を与えるような、TNFa特異的抗体の標的を含めた方法で使用することができる。
【００５４】
抗TNFa抗体に関する、他の実施形態、特徴などは、以下でさらに詳細に与える。
【００５５】
配列表
代表的なヒト抗TNFa抗体の、重鎖および軽鎖の可変領域の、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、配列表中に与え、その中身は以下の表1に要約する。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
定義
他に定義しない限り、本明細書で使用する科学用語および技術用語は、当業者により一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含むものとする。一般に、本明細書に記載する、細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチドの化学的性質およびハイブリダイゼーションに関して使用される命名、およびこれらの技法は、当分野でよく知られており一般的に使用されるものである。組換えDNA、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換(例えばエレクトロポレーション、リポフェクション)用に、標準的技法を使用する。酵素反応および精製技法は、製造者の仕様書に従い、あるいは当分野で一般的に実施されているように、あるいは本明細書に記載するように行う。前述の技法および手順は、当分野でよく知られている従来の方法に従い、本明細書中に引用し論じている、様々な一般的でより具体的な参照文献中に記載されているのと同様に一般的に行う。例えば、Sambrook他、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1989))を参照のこと。本明細書に記載する、分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品および薬剤化学に関して使用される命名、ならびにこれらの実験手順および技法は、当分野でよく知られており一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、薬剤調製物、配合物、および送達、および患者の治療用に、標準的技法を使用する。
【００５８】
本発明の開示に従い使用するように、以下の用語は、他に示さない限り、以下の意味を有すると理解されたい:
【００５９】
用語「TNFa」は、サイトカイン、腫瘍壊死因子-α(Pennica,D.他、1984、Nature 312:724〜729)を指す。TNFaは、カケクチンとしても当分野で知られている。
【００６０】
用語「中和」は、抗体を指すとき、抗体が結合する標的抗原のエフェクター機能を除去するかあるいは大幅に低下させる抗体の能力に関する。したがって、「中和」抗TNFa抗体は、TNFa活性などのエフェクター機能を、除去するかあるいは大幅に低下させることができる。
【００６１】
本明細書で使用する用語「単離ポリヌクレオチド」は、ゲノム、cDNA、あるいは合成起源またはそのいくつかの組合せのポリヌクレオチドを意味するものとし、その起源によって、「単離ポリヌクレオチド」は、(1)ポリヌクレオチドの全体または一部分と結合しておらず、この場合「単離ポリヌクレオチド」は天然に見られる、(2)天然では結合しないポリヌクレオチドと動作可能に連結している、あるいは(3)より大きな配列の一部分として天然には存在しない。
【００６２】
本明細書で述べる用語「単離タンパク質」は、cDNA、組換えRNA、あるいは合成起源またはそのいくつかの組合せのタンパク質を意味し、その起源、または誘導源によって、「単離タンパク質」は、(1)天然で見られるタンパク質と結合していない、(2)同じ源由来の他のタンパク質を含まない、例えばネズミタンパク質を含まない、(3)異なる種由来の細胞によって発現される、あるいは(4)天然には存在しない。
【００６３】
用語「ポリペプチド」は、本来のタンパク質、断片、またはポリペプチド配列の類似体を指すための一般用語として本明細書で使用する。それ故、本来のタンパク質、断片、および類似体は、ポリペプチド属の種である。本発明の好ましいポリペプチドは、ヒト重鎖免疫グロブリン分子およびヒトkappa軽鎖免疫グロブリン分子、ならびに重鎖免疫グロブリン分子と、kappa軽鎖免疫グロブリン分子などの軽鎖免疫グロブリン分子、およびこの逆を含む組合せによって形成される抗体分子、ならびにこれらの断片および類似体を含む。
【００６４】
本明細書で使用し、物体に適用する用語「天然に存在する」は、物体を天然中で見ることができるという事実を指す。例えば、天然源から単離することができる(ウイルスを含めた)生物中に存在し、研究室またはそれ以外で人間によって故意に改変されていない、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【００６５】
本明細書で使用する用語「動作可能に連結した」は、要素をその目的とする方法で働かせることができる関係にあると記載される、要素の位置を指す。例えば、コード配列と「動作可能に連結した」対照配列は、コード配列の発現が対照配列と適合性のある条件下で得られるような方法で結びついている。
【００６６】
本明細書で使用する用語「対照配列」は、それらが結びつくコード配列の発現およびプロセシングに影響を与えるのに必要な、ポリヌクレオチド配列を指す。このような対照配列の性質は、宿主生物に応じて異なり、原核生物では、このような対照配列は一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終了配列を含み、真核生物では、一般に、このような対照配列は、プロモーターおよび転写終了配列を含む。用語「対照配列」は、最小限、その存在が発現およびプロセシングに必要不可欠な、すべての要素を含むものとし、その存在が有利である他の要素、例えばリーダー配列および融合パートナー配列も含むことができる。
【００６７】
本明細書で述べる用語「ポリヌクレオチド」は、少なくとも10塩基長のポリマー形のヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチド、あるいは改変形のいずれかの型のヌクレオチドを意味する。この用語は、一本鎖および二本鎖形のDNAを含む。
【００６８】
本明細書で述べる用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在するオリゴヌクレオチドと、非天然オリゴヌクレオチドの結合によって1つに結合した、天然に存在する、改変型ヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、200塩基長さ以下を一般に含むポリヌクレオチドの部分集合である。好ましくは、オリゴヌクレオチドは10〜60塩基長であり、最も好ましくは12、13、14、15、16、17、18、19、または20〜40塩基長である。オリゴヌクレオチドは通常、例えばプローブ用に一本鎖であるが、オリゴヌクレオチドは、例えば遺伝子突然変異体の構築において使用するために、二本鎖であってよい。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。
【００６９】
本明細書で述べる用語「天然に存在するヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書で述べる用語「改変型ヌクレオチド」は、改変または置換された糖基などを有する、ヌクレオチドを含む。本明細書で述べる用語「オリゴヌクレオチド結合」は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデート、ホスホロアミデート、その他などの、オリゴヌクレオチド結合を含む。例えば、La Planche他、Nucl.Acids Res.14:9081(1986);Stec他、J.Am.Chem.Soc.106:6077(1984);Stein他、NucL Acids Res.16:3209(1988);Zon他、Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991);Zon他、Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach、pp.87〜108(F.Eckstein編、Oxford University Press、Oxford England(1991));Stec他、米国特許第5,151,510号;UhlmannおよびPeyman Chemical Reviews 90:543(1990)を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、望むならば、検出用の標識を含むことができる。
【００７０】
本明細書で述べる用語「選択的にハイブリダイズする」は、検出可能かつ特異的に結合することを意味する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびそれらの断片は、非特異的核酸との相当な量の検出可能な結合を最小限にする、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、核酸鎖と選択的にハイブリダイズする。高ストリンジェンシー条件を使用して、当分野で知られており本明細書で論じる、選択的ハイブリダイゼーション条件を得ることができる。一般に、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、または抗体断片と、当該の核酸配列の間の核酸配列相同性は、少なくとも80%、より典型的には、少なくとも85%、90%、95%、99%、および100%の高い相同性であることが好ましい。
【００７１】
2つのアミノ酸配列は、それらの配列の間に部分的または完全な同一性が存在する場合、「相同的」である。例えば、85%の相同性は、2つの配列が最大整合性のアラインメントをとるとき、85%のアミノ酸が同一であることを意味する。(2つの配列のいずれかが整合している)ギャップが、整合性を最大にする際に与えられ、5以下のギャップ長が好ましく、2以下がより好ましい。あるいは好ましくは、2つのタンパク質配列(または少なくとも約30アミノ酸長のタンパク質配列に由来するポリペプチド配列)は、突然変異のデータマトリクスおよび6以上のギャップペナルティーを用いるプログラムALIGNを使用して、これらの配列が(標準偏差単位で)5を超えるアラインメントスコアを有する場合、本明細書でこの用語を使用するように、相同的である。Dayhoff,M.OのAtlas of Protein Sequence and Structure、pp101〜110中(Volume 5、National Biomedical Research Foundation(1972))およびこの書物の増刊号pp1〜10を参照のこと。2つの配列またはその一部分は、ALIGNプログラムを使用して最適にアラインメントをとるとき、それらのアミノ酸が50%以上同一である場合、相同的であることがより好ましい。
【００７２】
用語「に対応する」は、ポリヌクレオチド配列が、参照ポリヌクレオチド配列の全体または一部分と相同的であること(すなわち、同一であるが、厳密には進化上関係がない)、あるいはポリペプチド配列が、参照ポリペプチド配列と同一であることを、意味するために本明細書で使用する。
【００７３】
対照的に、用語「と相補的」は、相補配列が参照ポリヌクレオチド配列の全体または一部分と相同的であることを意味するために、本明細書で使用する。例示のため、ヌクレオチド配列「TATAC」は参照配列「TATAC」に対応し、参照配列「GTATA」と相補的である。
【００７４】
以下の用語:「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、および「実質的同一性」は、2つ以上のポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の、配列の関係を記載するために使用する。「参照配列」は、配列比較の基盤として使用される明確な配列である。参照配列は、大きな配列の部分集合、例えば配列表中に与えられる完全長cDNAまたは遺伝子配列のセグメントなどであってよく、あるいは完全cDNAまたは遺伝子配列を含むことができる。一般に、参照配列は、少なくとも18ヌクレオチドまたは6アミノ酸長、しばしば少なくとも24ヌクレオチドまたは8アミノ酸長、しばしば少なくとも48ヌクレオチドまたは16アミノ酸長である。2つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、(1)2分子間の類似した配列(すなわち、完全なポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一部分)をそれぞれ含むことができ、(2)2つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間で異なる配列をさらに含むことができるので、2つ(あるいはそれより多くの)分子間の配列比較は典型的には、「比較ウインドウ」で2分子の配列を比較して、局所領域の配列類似性を同定し比較することによって行う。本明細書で使用する「比較ウインドウ」は、少なくとも約18の隣接ヌクレオチド位置または約6アミノ酸の概念上のセグメントを指し、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列は、少なくとも18個の隣接ヌクレオチドまたは6個のアミノ酸配列の参照配列と比較し、比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の一部分は、2つの配列の最適アラインメント用の参照配列(付加または欠失を含まない)と比較して、20パーセント以下の付加、欠失、置換など(すなわちギャップ)を含むことができる。比較ウインドウにアラインメントをとらせるための、配列の最適アラインメントは、SmithおよびWaterman Adv.Appl.Math.2:482(1981)の局所相同性アルゴリズムによって、NeedlemanおよびWunsch J.Mol.Biol.48:443(1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、PearsonおよびLipman Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A)85:2444(1988)の類似性探求法によって、これらのアルゴリズム(GAP、BESTFIT、FAST
A、およびTFASTA、Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中(Genetics Computer Group、575 Science Dr、Madison、Wis)、GENEWORKS(商標)、またはMACVECTOR(登録商標)ソフトウェアパッケージ)のコンピュータによる実施によって、あるいは調査によって行うことができ、様々な方法によって生じた、最良のアラインメント(すなわち、比較ウインドウで最高の割合の相同性をもたらす)を選択する。
【００７５】
用語「配列同一性」は、2つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、比較ウインドウで同一であること(すなわち、ヌクレオチド毎あるいは残基毎の単位で同一であること)を意味する。用語「配列同一性の割合」は、比較ウインドウで2つの最適にアラインメントをとる配列を比較し、同一の核酸塩基(例えばA、T、C、G、UまたはI)またはアミノ酸残基が両方の配列中に現れて、整合した位置の数を与える、位置の数を決定し、比較ウインドウ中の位置の合計数(すなわちウインドウの大きさ)で整合した位置の数を割り、その結果に100を掛けて配列同一性の割合を与えることによって計算される。本明細書で使用する用語「実質的同一性」は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特徴を示し、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸は、少なくとも18ヌクレオチド(6アミノ酸)の位置の比較ウインドウ、しばしば少なくとも24〜48ヌクレオチド(8〜16アミノ酸)位置のウインドウで参照配列と比較して、少なくとも85パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも90〜95パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも99の配列同一性を有する配列を含み、配列同一性の割合は、比較ウインドウで参照配列の合計20パーセント以下の欠失または付加を含むことができる配列と、参照配列を比較することによって計算される。参照配列は、大きな配列の部分集合であってよい。
【００７６】
本明細書で使用するように、20種の従来的アミノ酸およびそれらの略称は、従来の使用に従う。Immunology-A Synthesis(2nd Edition、E.S.Golub and D.R.Gren編、Sinauer Associates、Sunderland、Mass.(1991))を参照のこと。20種の通常のアミノ酸、α-、α-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸などの非天然アミノ酸、および他の通常ではないアミノ酸の立体異性体(例えばD-アミノ酸)も、本発明のポリペプチドに適した要素である可能性がある。通常ではないアミノ酸の例には、4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、ε-N,N,N-トリメチルリシン、ε-N-アセチルリシン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリシン、σ-N-メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびイミノ酸(例えば4-ヒドロキシプロリン)がある。本明細書で使用するポリペプチドの表記では、標準的使用および慣習に従い、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。
【００７７】
同様に、他に指定しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手端が5'端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向を5'方向と呼ぶ。新生RNA転写物の5'から3'の付加方向は、転写方向と呼び、RNAと同じ配列を有し、RNA転写物の5'から5'端への、DNA鎖上の配列領域は、「上流配列」と呼び、RNAと同じ配列を有し、RNA転写物の3'から3'端への、DNA鎖上の配列領域は、「下流配列」と呼ぶ。
【００７８】
ポリペプチドに適用すると、用語「実質的同一性」は、2つのペプチド配列が、デフォルトギャップ加重値を使用しプログラムGAPまたはBESTFITなどによって、最適にアラインメントをとらせると、少なくとも80パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも90パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも95パーセントの配列同一性、および最も好ましくは少なくとも99パーセントの配列同一性を共有することを意味する。同一ではない残基の位置は、保存型アミノ酸置換とは異なることが好ましい。保存型アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族-ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループは、リシン、アルギニン、およびヒスチジンであり、かつイオウ含有側鎖を有するアミノ酸のグループは、システインおよびメチオニンである。好ましい保存型アミノ酸置換基は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタミン酸-アスパラギン酸、およびアスパラギン-グルタミンである。
【００７９】
本明細書で論じるように、抗体または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列のわずかな変化は、本発明により含まれるものとして企図される。ただし、アミノ酸配列の変化が、本明細書に記載する抗体または免疫グロブリン分子と、少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、90%、95%、および最も好ましくは99%の配列同一性を保つものとする。特に、保存型アミノ酸置換が企図される。保存型の置換は、関連した側鎖を有するアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。遺伝的にコードされたアミノ酸は一般に、いくつかのファミリーに分けられる:(1)酸性=アスパラギン酸、グルタミン酸;(2)塩基性=リシン、アルギニン、ヒスチジン;(3)無極性=アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン;および(4)非帯電極性=グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。より好ましいファミリーは:セリンおよびスレオニンは、脂肪族-ヒドロキシファミリーであり、アスパラギンおよびグルタミンは、アミド含有ファミリーであり、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンは、脂肪族ファミリーであり、かつフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、芳香族ファミリーである。例えば、ロイシンとイソロイシンまたはバリン、アスパラギン酸とグルタミン酸、スレオニンとセリンの単離置換、またはアミノ酸と構造的に関係があるアミノ酸の同様の置換が、置換が骨格部位内のアミノ酸と関係ない場合は特に、生成する分子の結合機能または性質に対して重大な影響を有することはないと予想することは理にかなっている。アミノ酸の変化が機能的ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の特異的活性をアッセイすることによって、容易に決定することができる。アッセイは、本明細書に詳細に記載する。抗体または免疫グロブリン分子の断片または類似体は、当業者により容易に調製することができる。断片または類似体の好ましいアミノおよびカルボキシ末端は、機能性ドメインの境界近くに存在する。構造および機能性ドメインは、ヌクレオチドおよび/またはアミノ酸配列データと、公または占有の配列のデータベースを比較することによって同定することができる。好ましくは、コンピュータによる比較法を使用して、知られている構造および/または機能の他のタンパク質中に存在する、配列モチーフまたは予想されるタンパク質の立体配座ドメインを同定する。知られている三次元構造に折りたたまれているタンパク質の配列を、同定するための方法は知られている。Bowie他、Science 253:164(1991)。したがって、前述の例は、当業者は配列モチーフおよび構造の立体配座を理解することができ、これらを使用して、本明細書に記載する抗体に従い、構造および機能性ドメインを定義することができることを実証する。
【００８０】
好ましいアミノ酸置換は、(1)タンパク質分解されやすさを低下させる、(2)酸化されやすさを低下させる、(3)タンパク質複合体形成に関する結合親和性を変える、(4)結合親和性を変える、および(4)このような類似体の他の物理化学的または機能的性質を与えるかあるいは改変する置換である。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の、様々なムテインの配列を含むことができる。例えば、1つまたは複数のアミノ酸置換(好ましくは保存型アミノ酸置換)は、天然に存在する配列中(好ましくは、分子間の接触部位を形成するドメイン外のポリペプチドの部分中)で行うことができる。保存型アミノ酸置換が、親配列の構造特性を実質的に変えることはないはずである(例えば、置換アミノ酸が、親配列中に存在するらせんを破壊する、あるいは親配列を特徴付ける他の型の二次構造を破壊する傾向はないはずである)。当分野で認められているポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、Proteins、Structures and Molecular Principles(Creighton編、W.H.Freeman and Company、New York(1984));Introduction to Protein Structure(C.BrandenおよびJ.Tooze編、Garland Publishing、New York、N.Y.(1991));およびThornton他、Nature 354:105(1991)中に記載されている。
【００８１】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド断片」は、アミノ末端および/またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、天然に存在する配列、例えば完全長cDNA配列から推定される配列中の対応する位置と同一である、ポリペプチドを指す。断片は典型的には、少なくとも5、6、8または10アミノ酸長、好ましくは少なくとも14アミノ酸長、より好ましくは少なくとも20アミノ酸長、通常は少なくとも50アミノ酸長、およびさらにより好ましくは少なくとも70アミノ酸長である。本明細書で使用する用語「類似体」は、推定アミノ酸配列の一部分と実質的同一性を有し、以下の性質:(1)適切な結合条件下でのTNFaとの特異的結合、(2)適切なTNFa結合を阻害する能力、または(3)TNFa活性を阻害する能力の少なくとも1つを有する、少なくとも25アミノ酸のセグメントからなる、ポリペプチドを指す。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に関する、保存型アミノ酸置換(あるいは付加または欠失)を含む。類似体は、典型的には少なくとも20アミノ酸長、好ましくは少なくとも50アミノ酸長以上であり、しばしば可能な限り完全長の天然に存在するポリペプチドである可能性がある。
【００８２】
ペプチド類似体は、鋳型ペプチドの性質と類似した性質を有する非ペプチド薬剤として、薬剤産業において一般的に使用されている。これらの型の非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体」または「模倣ペプチド」と呼ばれる。Fauchere、J.Adv.Drug Res.15:29(1986);VeberおよびFreidinger TINSp.392(1985);およびEvans他、J.Med.Chem.30:1229(1987)。このような化合物は、コンピュータによる分子のモデル化によって開発されることが多い。治療上有用なペプチドと構造的に類似している、模倣ペプチドを使用して、同等の治療または予防効果を生み出すことができる。一般に模倣ペプチドは、ヒト抗体などの、範例ポリペプチド(すなわち、生化学的性質または薬理学的活性を有するポリペプチド)と構造的に類似しているが、当分野でよく知られている方法によって、--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH=CH--(シスおよびトランス)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--、および-CH2SO--からなる群から選択される結合によって場合によっては置換される、1つまたは複数のペプチド結合を有する。同じ型のD-アミノ酸(例えばL-リシンの代わりにD-リシン)と、同じ配列の1つまたは複数のアミノ酸の全体的置換を使用して、より安定したペプチドを生成することができる。さらに、コンセンサス配列またはほぼ同一のコンセンサス配列の変形を含む制約型ペプチドは、当分野で知られている方法によって(RizoおよびGierasch Ann.Rev.Biochetn.61:387(1992);例えばペプチドを環状にする分子間ジスルフィド架橋を形成することができる、内部システイン残基を加えることによって、生成することができる。
【００８３】
「抗体」または「抗体ペプチド」は、完全抗体、または特異的結合に関して完全抗体と競合する、その結合断片を指す。結合断片は、組換えDNA技法によって、あるいは完全抗体の酵素または化学的切断によって生成される。結合断片には、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、および単鎖抗体がある。「二重特異性」または「二重機能性」抗体以外の抗体は、それぞれのその結合部位が同一であると理解される。過剰の抗体が、カウンターレセプターと結合するレセプターの量を、(in vitroの競合結合アッセイで測定して)少なくとも約20%、40%、60%または80%、およびさらに通常は約85%を超えて低下させるとき、抗体はレセプターとカウンターレセプターの接着を実質的に阻害する。
【００８４】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンまたはT細胞レセプターと特異的に結合することができる任意のタンパク質抗原決定基を含む。エピトープ抗原決定基は通常、アミノ酸または糖鎖などの分子の化学的に活性がある表面基からなり、特異的な三次元構造特性、および特異的な電荷特性を通常有する。解離定数が1μM以下、好ましくは100nM以下、および最も好ましくは10nM以下であるとき、抗体は抗原と特異的に結合すると言える。
【００８５】
用語「物質」は、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的マクロ分子、または生物学的物質から作製した抽出物を示すために、本明細書で使用する。
【００８６】
TNFaポリペプチドに関する、「活性がある」または「活性」は、本来のTNFaポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を有する、TNFaポリペプチドの一部分を指す。「生物学的」は、本明細書で使用するとき、本来のTNFaポリペプチドの活性から生じる生物学的機能を指す。好ましいTNFaの生物学的活性は、例えばTNFa誘導型アポトーシスを含む。
【００８７】
「哺乳動物」は、本明細書で使用するとき、哺乳動物であると考えられる任意の動物を指す。哺乳動物は、ヒトであることが好ましい。
【００８８】
酵素、パパインによる抗体の消化によって、「Fab」断片および「Fc」断片としても知られ、抗原結合活性は有していないが、結晶化する能力を有する、2つの同一の抗原結合断片が生成する。酵素、ペプシンによる抗体の消化によって、抗体分子の2つのアームが結合した状態であり、2つの抗原結合部位を含む、F(ab')2断片が生成する。F(ab')2断片は、抗原を架橋させる能力を有する。
【００８９】
「Fv」は、本明細書で使用するとき、抗原認識部位と抗原結合部位の両方を保持している、抗体の最小断片を指す。
【００９０】
「Fab」は、本明細書で使用するとき、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖のCH1ドメインを含む、抗体の断片を指す。
【００９１】
用語「mAb」は、モノクローナル抗体を指す。
【００９２】
XENOMAX(登録商標)抗体配列の記載は、以下のように指定する:「AB」は抗体を指し、「TNFa」は抗体の結合特異性を指し、「X」はXENOMOUSE(登録商標)由来であることを指し、「G1」はIgG1イソ型を指し、あるいは「G2」はIgG2イソ型を指し、最後の三桁は、抗体が由来した単細胞の番号を指す、例えば:AB-TNFa-XG1-015。
【００９３】
用語「SC」は単細胞を指し、特定のXENOMAX(登録商標)由来の抗体は、SC次に三桁で、あるいは本明細書で抗体が由来した単細胞の番号を指す、三桁のみで呼ぶことができる。
【００９４】
ハイブリドーマ由来の抗体配列の記載は、以下のように指定する:「AB」は抗体を指し、「TNFa」は抗体の結合特異性を指し、「X」はXENOMOUSE(登録商標)由来であることを指し、「G1」はIgG1イソ型を指し、あるいは「G2」はIgG2イソ型を指し、「K」はkappaを指し、「L」はλを指し、最後の三桁は、抗体が由来した単細胞の番号を指す、例えば:AB-TNFa-XG2K-4.17。
【００９５】
「リポソーム」は、本明細書で使用するとき、本発明のTNFaポリペプチド、またはこのようなTNFaポリペプチドに対する抗体を含むことができる薬剤を、哺乳動物に送達するのに有用である可能性がある小胞を指す。
【００９６】
本明細書で使用する、「標識」または「標識された」は、ポリペプチドへの検出可能な成分、例えば放射標識、蛍光標識、酵素標識、化学発光標識またはビオチニル基の添加を指す。放射性同位体または放射性核種は、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131Iを含むことができ、蛍光標識はローダミン、リン光発光性ランタノイドまたはFITCを含むことができ、酵素標識は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼを含むことができる。
【００９７】
本明細書で使用する用語「薬剤物質または薬剤」は、患者に適切に投与したときに、所望の治療効果を誘導することができる化学化合物または組成物を指す。本明細書の他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(Parker,S.編、McGraw-Hill、San Francisco(1985))により例示されるのと同様に、当分野での従来の使用に従い使用する。
【００９８】
本明細書で使用する、「実質的に純粋」は、ある物体種が存在する主要な種であることをを意味し(すなわち、モル単位で、その種が組成物中の任意の他の個々の種より多量に存在する)、好ましくは、実質的に純粋な分画は、その物体種が存在するすべてのマクロ分子種の少なくとも約50パーセントを(モル単位で)構成する、組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべてのマクロ分子種の約80パーセントより多くを、より好ましくは、約85%、90%、95%、および99%より多くを構成する。物体種はほぼ均質に精製される(従来の検出法によって、組成物中の汚染物質種を検出することができない)ことが最も好ましく、この場合組成物は、1種のマクロ分子種から本質的になる。
【００９９】
用語「患者」は、ヒトおよび獣被験体を含む。
【０１００】
用語「SLAM」(登録商標)は、「Selected Lymphocyte Antibody Method」(Babcook他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、i93:7843〜7848(1996)、およびSchrader、米国特許第5,627,052号)を指す。
【０１０１】
用語「XENOMAX(登録商標)」は、XENOMOUSE(登録商標)動物と共に使用するとき、「Selected Lymphocyte Antibody Method」(Babcook他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、i93:7843-7848(1996))の使用の使用を指す。
【０１０２】
抗体の構造
基本的な抗体の構造単位は、テトラマーを含むことが知られている。それぞれのテトラマーは、ポリペプチド鎖の2つの同一の対から構成され、それぞれの対は、1本の「軽鎖」(約25kDa)および1本の「重鎖」(約50〜70kDa)を有する。それぞれの鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担う約100〜110以上のアミノ酸の可変領域を含む。それぞれの鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、kappaおよびλ軽鎖として分類される。重鎖はmu、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンとして分類され、それぞれIgM、IgD、IgA、およびIgEとして、抗体のイソ型を定義する。軽鎖および重鎖内では、可変領域と定常領域が、約12以上のアミノ酸の「J」領域によって結びつき、重鎖は約10以上のアミノ酸の「D」領域も含む。Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.編、第2編、Raven Press、N.Y.(1989))を一般的に参照のこと。それぞれの軽鎖/重鎖対の可変領域は、抗体結合部位を形成する。
【０１０３】
したがって、完全抗体は2つの結合部位を有する。二重機能性または二重特異性抗体中以外は、2つの結合部位は同一である。
【０１０４】
これらの鎖はいずれも、相補性決定領域すなわちCDRとも呼ばれる、3つの超可変領域によって結びついた、比較的保存された骨格領域(FR)の同じ一般的な構造を示す。それぞれの対の2本の鎖由来のCDRは、骨格領域の近くに並び、特異的エピトープとの結合を可能にする。N末端からC末端に、軽鎖および重鎖は、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含む。それぞれのドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1987および1991))、またはChothiaおよびLeak J.Mol.Biol.196:901〜917(1987);Chothia他、Nature 342:878〜883(1989)の定義に従う。
【０１０５】
二重特異性抗体または二重機能性抗体は、2本の異なる重鎖/軽鎖対、および2つの異なる結合部位を有する人工のハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab'断片の結合を含めた、様々な方法によって生成することができる。例えば、SongsivilaiおよびLachmann Clin.Exp.Immunol.79:315〜321(1990)、Kostelny他、J.Immunol.148:1547〜1553(1992)を参照のこと。二重特異性抗体の生成は、従来の抗体の生成と比較すると、比較的骨の折れるプロセスである可能性があり、収率および純度は二重特異性抗体に関しては一般に低い。二重特異性抗体は、1つの結合部位を有する断片(例えばFab、Fab'、およびFv)の形では存在しない。
【０１０６】
ヒト抗体および抗体の人化
ヒト抗体は、ネズミまたはラット可変領域および/または定常領域を有する抗体に関するいくつかの問題を回避する。このようなネズミまたはラット由来のタンパク質が存在することによって、抗体の迅速な除去がもたらされる可能性があり、あるいは患者による抗体に対する免疫応答の発生がもたらされる可能性がある。ネズミまたはラット由来の抗体の使用を回避するために、げっ歯類が完全ヒト抗体を生成するように、ヒト抗体の機能をげっ歯類に導入することによって、完全ヒト抗体を作製することができる。
【０１０７】
完全ヒト抗体を作製するための1つの方法は、工学処理されて、ヒト重鎖遺伝子座およびkappa軽鎖遺伝子座の245kbおよび190kbの大きさの生殖細胞系形状断片を含んでいる、XENOMOUSE(登録商標)系統のマウスを使用することによる。Green他、Nature Genetics 7:13〜21(1994)を参照のこと。XENOMOUSE(登録商標)系統は、Abgenix,Inc.(Fremont、CA)から入手可能である。
【０１０８】
XENOMOUSE(登録商標)の生成は、1990年1月12日に出願された米国特許出願第07/466,008号、1990年11月8日に出願された米国特許出願第07/610,515号、1992年7月24日に出願された米国特許出願第07/919,297号、1992年7月30日に出願された米国特許出願第07/922,649号、1993年3月15日に出願された米国特許出願第08/031,801号、1993年8月27日に出願された米国特許出願第08/112,848号、1994年4月28日に出願された米国特許出願第08/234,145号、1995年1月20日に出願された米国特許出願第08/376,279号、1995年8月27日に出願された米国特許出願第08/430,938号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/464,584号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/464,582号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/463,191号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/462,837号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/486,853号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/486,857号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/486,859号、1995年6月5日に出願された米国特許出願第08/462,513号、1996年10月2日に出願された米国特許出願第08/724,752号、および1996年12月3日に出願された米国特許出願第08/759,620号、ならびに米国特許第6,162,963号、米国特許第6,150,584号、米国特許第6,114,598号、米国特許第6,075,181号、および米国特許第5,939,598号、ならびに日本国特許3068180B2号、日本国特許3068506B2号、および日本国特許3068507B2号中に、さらに論じられ示されている。Mendez他、Nature Genetics 15:146〜156(1997)、ならびにGreenおよびJakobovits J.Exp.Med.188:483〜495(1998)も参照のこと。1996年6月12日に付与公開された欧州特許EP0463151B1号、1994年2月3日に公開された国際特許出願WO94/02602号、1996年10月31日に公開された国際特許出願WO96/34096号、1998年6月11日に公開されたWO98/24893、2000年12月21日に公開されたWO00/76310も参照のこと。前述の特許、出願のそれぞれの開示。
【０１０９】
他の手法では、GenPharm International,Inc.を含めた他者は、「小遺伝子座」手法を使用してきている。小遺伝子座手法では、Ig遺伝子座由来の数片(個々の遺伝子)を含ませることによって、外因性のIg遺伝子座を模倣する。したがって、1つまたは複数のVH遺伝子、1つまたは複数のDH遺伝子、1つまたは複数のJH遺伝子、mu定常領域、および第2の定常領域(好ましくはγ定常領域)を、動物中に挿入するための構築体に成形する。この手法は、Surani他への米国特許第5,545,807号、ならびにそれぞれLonbergおよびKayへの、米国特許第5,545,806号、米国特許第5,625,825号、米国特許第5,625,126号、米国特許第5,633,425号、米国特許第5,661,016号、米国特許第5,770,429号、米国特許第5,789,650号、米国特許第5,814,318号、米国特許第5,877,397号、米国特許第5,874,299号、および米国特許第6,255,458号、KrimpenfortおよびBernsへの米国特許第5,591,669号および米国特許第6,023.010号、Berns他への米国特許第5,612,205号、米国特許第5,721,367号、および米国特許第5,789,215号、ならびにChoiおよびDunnへの米国特許第5,643,763号、ならびに1990年8月29日に出願されたGenPharm Internationalの米国特許出願第07/574,748号、1990年8月31日に出願された米国特許出願第07/575,962号、1991年12月17日に出願された米国特許出願第07/810,279号、1992年3月18日に出願された米国特許出願第07/853,408号、1992年6月23日に出願された米国特許出願第07/904,068号、1992年12月16日に出願された米国特許出願第07/990,860号、1993年4月26日に出願された米国特許出願第08/053,131号、1993年7月22日に出願された米国特許出願第08/096,762号、1993年11月18日に出願された米国特許出願第08/155,301号、1993年12月3日に出願された米国特許出願第08/161,739号、1993年12月10日に出願された米国特許出願第08/165,699号、1994年3月9日に出願された米国特許出願第08/209,741号中に記載されている。欧州特許0546073B1号、国際特許出願WO92/03918、WO92/22645、WO92/22647、WO92/22670、WO93/12227、WO94/00569、WO94/25585、WO96/14436、WO97/13852、およびWO98/24884、ならびに米国特許第5,981,175号も参照のこと。Taylor他、1992、Chen他、1993、Tuaillon他、1993、Choi他、1993、Lonberg他、(1994)、Taylor他、(1994)、およびTuaillon他、(1995)、Fishwild他、(1996)をさらに参照のこと。
【０１１０】
Kirinは、マウスからのヒト抗体の作製も実証しており、その中では、ミクロ細胞の融合によって、大きな染色体の数片、または染色体全体を導入している。欧州特許出願第773288号および欧州特許出願第843961号を参照のこと。
【０１１１】
ヒト抗マウス抗体(HAMA)の応答によって、産業はキメラ抗体またはそれ以外の場合は人化抗体の調製に向かっている。キメラ抗体はヒト定常領域およびネズミ可変領域を有するが、いくつかのヒト抗キメラ抗体(HACA)の応答が、特に抗体の慢性的または多用量の使用において、観察されるであろうことが予想される。したがって、TNFaに対する完全ヒト抗体を与えて、HAMAまたはHACA応答の懸念および/または影響を無効にすることが望ましいと思われる。
【０１１２】
抗体療法
本明細書で論じるように、TNFa抗体の機能は、その操作形式の少なくとも一部分に対して重要であるようである。機能とは、例えばTNFaと共に働くTNFa抗体の活性を意味する。したがって、いくつかの観点で、TNFaに対する治療候補としての抗体の作製に関して、抗体が補体を固定し、CDCに関与することができることが望ましい可能性がある。以下のネズミIgM、ネズミIgG2a、ネズミIgG2b、ネズミIgG3、ヒトIgM、ヒトIgG1、およびヒトIgG3を非制限的に含めた、同じことができるいくつかのイソ型の抗体が存在する。作製される抗体は、このようなイソ型を最初に有している必要はなく、作製される抗体は、任意のイソ型を有することができ、当分野でよく知られている従来の技法を使用して、抗体のイソ型を後に変えることができることは理解されよう。このような技法には、特に、直接的な組換え技法の使用(例えば、米国特許第4,816,397号を参照)、細胞-細胞融合技法(例えば、米国特許第5,916,771号および米国特許第6,207,418号を参照)がある。
【０１１３】
細胞-細胞融合技法では、任意の望ましいイソ型を有する重鎖を有する、骨髄腫または他の細胞系を調製し、軽鎖を有する他の骨髄腫または他の細胞系を調製する。このような細胞は後に融合させることができ、完全抗体を発現する細胞系を単離することができる。
【０１１４】
例えば、本明細書で論じるTNFa抗体は、ヒト抗TNFaIgG2抗体である。このような抗体がTNFa分子との望ましい結合を有する場合、同じ可変領域(抗体の特異性および抗体の親和性のいくらかを定義する)を依然として有しながら、容易にイソ型が変わり、ヒトIgM、ヒトIgG1、またはヒトIgG3イソ型が生成する可能性がある。このような分子は、したがって、補体を固定しCDCに関与することができると思われる。
【０１１５】
したがって、前に論じた所望の「構造」属性に見合う、抗体候補が作製されると、それらの抗体は一般に、イソ型の変更によって、少なくともいくらかの所望の「機能」属性を与えられる可能性がある。
【０１１６】
他の療法の設計および作製
本発明に従い、TNFaに対する本明細書で生成し特徴付けした抗体の活性に基づいて、抗体要素を超える他の治療的物理療法の設計が容易になる。このような物理療法には、非制限的に、二重特異性抗体などの最新の抗体療法、免疫毒素、および放射標識療法、ペプチド療法剤、遺伝子療法剤、特に細胞内発現抗体、アンチセンス療法剤、および小分子の作製がある。
【０１１７】
最新の抗体療法剤の作製に関しては、補体固定が望ましい属性である場合、例えば二重特異性抗体、免疫毒素、または放射標識を使用することによって細胞を殺傷するために、補体への依存性を取り除くことができる可能性がある。
【０１１８】
例えば、二重特異性抗体に関しては、(i)2つの抗体であって、1つはTNFaに対する特異性を有し、他方は1つに結合する第2の分子に対する特異性を有する抗体、(ii)TNFaに特異的な1本の鎖、および第2の分子に特異的な第2の鎖を有する1つの抗体、または(iii)TNFaおよび他の分子に対する特異性を有する一本鎖抗体を含む、二重特異性抗体を作製することができる。このような二重特異性抗体は、よく知られている技法を使用して作製することができ;例えば、(i)および(ii)に関しては、例えば、Fanger他、Immunol Methods 4:72〜81(1994)、ならびにWrightおよびHarris、上記を参照し、(iii)に関しては、例えば、Trauneeker他、Int.J.Cancer(Suppl)7:51〜52(1992)を参照のこと。それぞれの場合、第2の特異性を、CD16またはCD64(例えば、Deo他、18:127(1997)を参照のこと)またはCD89(例えば、Valerius他、Blood.90:4485〜4492(1997)を参照のこと)を非制限的に含めた、重鎖活性化レセプターに施すことができる。前述の事項に従い調製した二重特異性抗体は、TNFaを発現する細胞を殺傷する可能性があると思われる。
【０１１９】
免疫毒素に関しては、当分野でよく知られている技法を使用して、抗体を改変して免疫毒素として働かせることができる。例えば、Vitetta Immunol Today 14:252(1993)を参照のこと。米国特許第5,194,594号も参照のこと。放射標識抗体の調製に関しては、当分野でよく知られている技法を使用して、このような改変型抗体を容易に調製することもできる。例えば、Junghans他、Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655〜686(第2版、ChafnerおよびLongo編、Lippincott Raven(1996))中を参照のこと。米国特許第4,681,581号、第4,735,210号、第5,101,827号、第5,102,990号(RE35,500)、第5,648,471号、および第5,697,902号も参照のこと。それぞれの免疫毒素および放射標識分子は、TNFaを発現する細胞を殺傷する可能性があると思われる。
【０１２０】
抗体の調製
本明細書に記載する抗体は、以下に記載するようにXENOMOUSE(登録商標)技術を使用することによって調製した。このようなマウスは、したがって、ヒト免疫グロブリン分子および抗体を産生することができ、ネズミ免疫グロブリン分子および抗体の産生において欠陥がある。同じことを達成するために使用する技法は、本明細書の背景技術の項中に開示する特許、出願、および参照文献中に開示する。しかしながら、特に、トランスジェニックマウスおよびそれに由来する抗体の産生の好ましい実施形態は、1996年12月3日に出願された米国特許出願第08/759,620号、および1998年6月11日に公開された国際特許出願WO98/24893号、および2000年12月21日に公開されたWO00/76310中に開示されている。Mendez他、Nature Genetics 15:146〜156(1997)も参照のこと。
【０１２１】
このような技術を使用することによって、様々な抗原に対する完全ヒトモノクローナル抗体が、産生されてきている。本質的には、XENOMOUSE(登録商標)系のマウスを当該の抗原(例えばTNFa)で免疫処置し、リンパ細胞(B細胞など)を、抗体を発現したマウスから回収し、回収した細胞系は骨髄型の細胞系と融合させて、不朽ハイブリドーマ細胞系を作製する。これらのハイブリドーマ細胞系をスクリーニングおよび選択して、当該の抗原に特異的な抗体を産生したハイブリドーマ細胞系を同定する。本明細書で与えるのは、TNFaに特異的な抗体を産生する、多数のハイブリドーマ細胞系を生成するための方法である。さらに、本明細書で与えるのは、このような抗体の重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列分析を含めた、このような細胞系によって生じる抗体の特徴付けである。
【０１２２】
あるいは、骨髄細胞と融合させてハイブリドーマを作製する代わりに、免疫処置したXENOMOUSE(登録商標)系のマウスから単離した回収細胞を、最初の抗原、好ましくはTNFaタンパク質に対する反応性に関してさらにスクリーニングする。このようなスクリーニングには、TNFaタンパク質を用いるELISA、当該の抗原と結合する知られている抗体を用いる競合アッセイ、TNFa誘導型アポトーシスのin vitroでの中和、および完全長TNFaを発現する一過的にトランスフェクトされたCHO細胞とのin vitroでの結合がある。当該の抗体を分泌する単一B細胞はしたがって、TNFa特異的溶血プラークアッセイ(Babcook他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、i93:7843〜7848(1996))を使用して単離される。溶解物の標的とされる細胞は、TNFa抗原でコーティングされた、ヒツジ赤血球細胞(SRBC)であることが好ましい。当該の免疫グロブリンおよび補体を分泌するB細胞培養物の存在下では、プラークの形成は、標的細胞の特異的なTNFa仲介の溶解を示す。プラークの中心の単一抗原特異的プラズマ細胞は単離することができ、抗体の特異性をコードする遺伝情報は、単一プラズマ細胞から単離する。逆転写酵素PCRを使用して、分泌される抗体の可変領域をコードするDNAを、クローニングすることができる。このようなクローニングされたDNAは、適切な発現ベクター、好ましくはpcDNAなどのベクターカセット、より好ましくは免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常ドメインを含むようなpcDNAベクター、中に、次いでさらに挿入することができる。次いで作製したベクターを、宿主細胞、好ましくはCHO細胞にトランスフェクトし、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、あるいは所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適したように改変した、従来の栄養培地中で培養することができる。本明細書には、TNFaに特異的な抗体を産生する、多数の単一プラズマ細胞の単離を記載する。さらに、抗TNFa抗体の特異性をコードする遺伝物質を単離し、適切な発現ベクター中に導入し、次いでこれを宿主細胞にトランスフェクトする。
【０１２３】
一般に、前述の細胞系によって産生した抗体は、完全ヒトIgG1またはIgG2重鎖、およびヒトkappa軽鎖を有していた。これらの抗体は高親和性を有しており、固相および溶液相のいずれかによって測定すると、典型的には約10-9〜約10-13MのKdを有していた。
【０１２４】
理解されているように、抗TNFa抗体は、ハイブリドーマ細胞系以外の細胞系中で発現させることができる。特定の抗体をコードする配列を、適切な哺乳動物宿主細胞の形質転換用に使用することができる。形質転換は、米国特許第4,399,216号、米国特許第4,912,040号、米国特許第4,740,461号、および米国特許第4,959,455号によって例示されるような、例えばウイルス中(またはウイルスベクター中)にポリヌクレオチドをパッケージ化すること、およびウイルス(またはベクター)を宿主細胞に導入すること、または当分野で知られているトランスフェクション手順による方法を含めた、ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入するための、任意の知られている方法によるものであってよい。使用する形質転換手順は、形質転換される宿主に依存する。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞中に導入するための方法は、当分野ではよく知られており、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中へのポリヌクレオチドの被包、およびDNAの核中への直接のマイクロインジェクションを含む。
【０１２５】
発現用の宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は、当分野ではよく知られており、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、幼若ハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えばHepG2)、およびいくつかの他の細胞系だけには限られないがこれらを含めた、American Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な多くの不朽細胞系を含む。特に好ましい細胞系は、どの細胞系が高い発現レベルを有し、構成的TNFa結合性を有する抗体を産生するかどうかを、決定することによって選択する。
【０１２６】
抗TNFa抗体は、患者サンプル中のTNFaを検出する際に有用であり、したがって本明細書に記載する病状の診断物質として有用である。さらに、(以下の実施例で実証するように)TNFa活性を有意に中和するそれらの能力に基づいて、抗TNFa抗体は、TNFaから生じる症状および状態を治療する際に、治療効果を有するであろう。特定の実施形態では、本明細書の抗体および方法は、熱、筋肉痛、昏睡状態、頭痛、悪心、および炎症を含めたTNFaから生じる症状を治療することに関する。他の実施形態は、本明細書に記載する抗体および方法を使用して、悪液質、食欲不振、慢性関節リウマチなどのリウマチ疾患、クローン病などの炎症性疾患、および乾癬、移植片対宿主反応、および敗血症性ショックなどの自己免疫疾患を治療することに関する。
【０１２７】
治療的投与および配合物
本明細書に記載する生物学的に活性がある抗TNFa抗体を、滅菌済み薬剤調製物または配合物中で使用して、血清TNFaのレベルを低下させ、これによって、例えば血清TNFaが異常に増大している病的状態を有効に治療することができる。抗TNFa抗体は、標的治療範囲内にTNFaを強く抑制する、適度な親和性を有することが好ましく、低頻度の投与を可能にする充分な作用時間を有することが好ましい。長い作用時間によって、皮下または筋肉内注射などの他の非経口経路より、低頻度でさらに好都合な投与スケジュールが可能になるであろう。
【０１２８】
in vivo投与用に使用するとき、抗体配合物は滅菌済みでなければならない。凍結乾燥および還元の前または後に、例えば滅菌済み濾過膜を介した濾過によって、これは容易に実施される。抗体は通常、凍結乾燥形または溶液中に保存されるであろう。治療用抗体組成物は一般に、滅菌済みアクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって貫通可能なストッパーなどの、配合物の回収を可能にするアダプターを有する、静脈内注射溶液用の袋またはバイアル中に置かれる。
【０１２９】
抗体投与の経路は、知られている方法、例えば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、クモ膜下、吸入または病巣内経路による、あるいは以下に示す徐放システムによる、注射または注入に従う。抗体は、注入によって連続的に、あるいは大量注射によって、投与することが好ましい。
【０１３０】
治療上使用される有効量の抗体は、例えば治療目的、投与の経路、および患者の状態に依存する。したがって、セラピストは必要に応じて用量を測定し投与の経路を変え、最適な治療効果を得ることが好ましい。典型的には、臨床医は、所望の効果を得る用量に達するまで、抗体を投与する。この治療の進行は、従来のアッセイによって、あるいは本明細書に記載するアッセイによって、容易に監視される。
【０１３１】
本明細書に記載する抗体は、薬剤として許容可能な担体との混合物中に、調製することができる。この治療用組成物は、静脈内あるいは鼻または肺を介して、好ましくは(凍結乾燥させた)液体または粉末状エアロゾルとして、投与することができる。組成物は、望むならば非経口的または皮下に投与することもできる。全身に投与するとき、治療用組成物は滅菌済みで、発熱物質を含まず、pH、等張性、および安定性に関して適切な事項を有する、非経口的に許容可能な溶液中に存在しなければならない。これらの条件は、当業者に知られている。簡潔には、本明細書に記載する化合物の剤形配合物は、望ましい程度の純度を有する化合物と、生理学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤を混合することによって、保存または投与用に調製する。このような物質は、使用する用量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、TRIS HCl、リン酸、クエン酸、酢酸、および他の有機酸塩などのバッファー;アスコルビン酸などの抗酸化剤;ポリアルギニンなどの低分子量(約10残基未満)ペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリジノンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンなどのアミノ酸;単糖、二糖、およびセルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含めた、他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール;ナトリウムなどの対イオン、および/またはTWEEN、PLURONICSまたはポリエチレングリコールなどの非イオン性界面活性剤を含む。
【０１３２】
注射用の滅菌済み組成物は、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(第20版、Lippincott Williams & Wilkens Publishers(2003))中に記載されたのと同様の、従来の薬剤習慣に従って配合することができる。例えば、水、またはゴマ、ピーナッツ、または綿花油などの天然に存在する植物油などの媒体、あるいはオレイン酸エチルなどの合成脂質媒体中に、活性化合物を溶解または懸濁させることが、望ましい可能性がある。バッファー、防腐剤、抗酸化剤などを、容認されている薬剤習慣に従って取り込ませることができる。
【０１３３】
徐放性調製物の適切な例には、ポリペプチドを含む固形疎水性ポリマーの半透過性物質があり、これらの物質は、成形品、フィルムまたはマイクロカプセルの形である。徐放性物質の例には、ポリエステル、Langer他、J.Biomed Mater.Res.、(1981)15:167〜277およびLanger、Chem.Tech.、(1982)12:98〜105によって記載されたヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号、EP58,481)、L-グルタミン酸とガンマエチル-L-グルタメート(Sidman他、Biopolymers、(1983)22:547〜556)、非分解性エチレン-酢酸ビニル(Langer他、上記)のコポリマー、LUPRON Depot(商標)(乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープリドから構成される注射可能なミクロスフェア)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシブチル酸(EP133,988)がある。
【０１３４】
エチレン-酢酸ビニルおよび乳酸-グリコール酸などのポリマーは、100日間の間分子を放出することができるが、いくつかのヒドロゲルは、さらに短期間タンパク質を放出する。被包されたタンパク質が身体中に長時間留まると、37℃における湿気に対する露出の結果として、タンパク質が変性または凝集する可能性があり、生物学的活性の消失および免疫原性の考えられる変化がもたらされる。関与する機構に応じて、タンパク質を安定させるための、合理的戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がジスルフィド交換による分子間S-S結合形成であることが発見される場合、スルフヒドリル残基の改変、酸性溶液からの凍結乾燥、湿気含有率の調節、適切な添加剤の使用、および特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって、安定化を行うことができる。
【０１３５】
徐放性組成物は、懸濁液中に結晶を保つことができる適切な配合物に懸濁した、抗体の結晶の調製物も含む。これらの調製物は、皮下または腹腔内に注射すると、徐放効果を生み出すことができる。他の組成物は、リポソームに捕捉された抗体も含む。このような抗体を含むリポソームは、それ自体が知られている方法によって調製される:米国特許第DE3,218,121号;Epstein他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、(1985)82:3688〜3692;Hwang他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、(1980)77:4030〜4034;EP52,322;EP36,676;EP88,046;EP143,949;142,641;日本国特許出願83-118008;米国特許第4,485,045号および米国特許第4,544,545号;およびEP102,324。
【０１３６】
所与の患者用の抗体配合物の用量は、疾患の重症度および型、体重、性別、食事、投与の時間および経路、他の投薬、および他の関連する臨床的要因を含めた、薬剤の作用を変えることが知られている様々な要因を考慮に入れて、主治医により決定される。治療上有効な用量は、in vitroまたはin vivoいずれかの方法によって、決定することができる。
【０１３７】
治療上使用される、本明細書に記載する抗体の有効量は、例えば治療目的、投与の経路、および患者の状態に依存する。したがって、セラピストは必要に応じて用量を決定し、投与の経路を変え、最適な治療効果を得ることが好ましい。典型的な一日当たりの用量は、前述の要因に応じて、約0.001mg/kg〜100mg/kg以上までの範囲であると思われる。典型的には、臨床医は、所望の効果を得る用量に達するまで、治療抗体を投与する。この治療の進行は、従来のアッセイによって、あるいは本明細書に記載するアッセイによって、容易に監視される。
【０１３８】
本明細書の組成物および方法に従った治療物質の投与を、適切な担体、賦形剤、および配合物中に取り込まれる他の物質と共に施して、改善された移動、送達、耐性などがもたらされることは理解されよう。これらの配合物には、例えば粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質(カチオン性またはアニオン性)含有媒体(Lipofectin(商標)など)、DNA結合体、無水吸収性ペースト、水中油型および油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス(様々な分子量のポリエチレングリコール)、半固体ゲル、およびカーボワックスを含む半固体混合物がある。任意の前述の混合物が、本発明に従った治療および療法において、適切である可能性がある。ただし、配合物中の活性成分が配合物によって不活性化されることはなく、配合物は投与の経路に対して生理学的に適合性および耐性があるものとする。Baldrick P.「Pharmaceutical excipient development:the need for preclinical guidance」。Regul.Toxicol.Pharmacol.32(2):210〜8(2000)、Wang W.「Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals」。Int.J.Pharm.203(1〜2):1〜60(2000)、Charman WN「Lipids,lipophilic drugs,and oral drug delivery-some emerging concepts」。J Pharm Sci.89(8):967〜78(2000)、Powell他、「Compendium of excipients for parenteral formulations」。PDA J Pharm Sci Technol.52:238〜311(1998)、および薬剤化学者によく知られている配合物、賦形剤および担体と関係がある他の情報に関する、これらの中の引用も参照のこと。
【０１３９】
本明細書に記載する抗体は、TNFaから生じる症状および状態を治療する際に、治療効果を有すると予想される。特定の実施形態では、本明細書の抗体および方法は、熱、筋肉痛、昏睡状態、頭痛、悪心、および炎症を含めた、TNFaから生じる症状を治療することに関する。他の実施形態は、本明細書に記載する抗体および方法を使用して、悪液質、食欲不振、慢性関節リウマチなどのリウマチ疾患、クローン病などの炎症性疾患、および乾癬、移植片対宿主反応、および敗血症性ショックなどの自己免疫疾患を治療することに関する。
【実施例】
【０１４０】
実施した実験および得られた結果を含めた、以下の実施例は、例示目的のみで与え、本明細書の教示を制限するものとして解釈すべきではない。
【０１４１】
(実施例1)
抗原の調製
XENOMOUSE(登録商標)動物の免疫処置用の、TNFa-KLH抗原の調製
組換えヒトTNFaを、R&D Systems(Minneapolis、MNカタログ番号210-TA/CF)から得た。XENOMOUSE(登録商標)動物の免疫処置用に使用した、TNFa-KLH抗原は、以下のように調製した:ヒトTNF-a(200μg)(R&D)を、50μgのキーホールリンペットヘモシアニン(KLH;Pierce、Rockford、IL)と混合させて、蒸留水を使用して165μlの最終体積にした。250μlの結合バッファー(0.1MのMES、0.9MのNaCl、pH4.7)を加え、TNFaとKLHを、1-エチル-3- [3-ジメチルアミノプロピル] カルボジイミド塩酸塩(EDC、Pierce、Rockford、IL)の10mg/mLのストック溶液25μlを加えることによって架橋させた。結合体を室温で2時間インキュベートし、未反応EDCを、1kDaのフィルタ(Centrifugalフィルタ;Millipore、Bedford、MA)を介して、PBS、pH7.4を使用して遠心分離によって除去した。
【０１４２】
XENOMOUSE(登録商標)動物の免疫処置用の、TNFa-TCE抗原の調製
ヒトTNFaを、XENOMOUSE(登録商標)動物の免疫処置用に、共通のT細胞エピトープ(TCE)(J.Immunol 1992 148(5):1499)とフレームが一致する融合タンパク質として、組換えによって作製した。
【０１４３】
ヒトTNFaを、ヒト末梢単球細胞(PBMC)からクローニングした。mRNAを精製hPBMCから単離し、cDNAを逆転写によって作製した。ヒトTNFaをPCRによって特異的に増幅させ、発現ベクターpGEX(Amersham Pharmacia)中において、破傷風毒素由来の共通のT細胞エピトープ(TCE)と共にクローニングした。融合タンパク質は大腸菌中で発現させ、Glutathione Sepharoseビーズ(カタログ番号17-0756-01、Amersham Pharmacia)上で精製し、トロンビン(Sigma)で切断し、製造者(Amersham Pharmacia)により記載されたのと同様に溶出させた。
【０１４４】
(実施例2)
抗体の作製
免疫処置
ヒトTNFaに対するヒトモノクローナル抗体を、XENOMOUSE(登録商標)マウス(XENOMOUSE(登録商標)XMG2L3または3B-3L3Abgenix,Inc.Fremont、CA)を連続的に免疫処置することによって開発した。
【０１４５】
ハイブリドーマを作製するために、XMG2L3および3B-L3XENOMOUSE(登録商標)マウスのコホートを、フットパッドを介してTNFa単独、あるいはTNFaとCPGで免疫処置した。最初の免疫処置は、マウス1匹当たり、TITERMAXGOLD(登録商標)(Sigma、Oakville、ON)と1:1(v/v)で混合した抗原10μgによるものであった。その後4回の追加抗原刺激を、マウス1匹当たり、ミョウバン(Sigma、Oakville、ON)と混合させた抗原10μgを用いて行い、一晩吸着させ、次にTITERMAXGOLD(登録商標)に溶かしたTNFaを1回注射し、ミョウバンを1回注射し、次いでマウス1匹当たり、PBSに溶かしたTNFa 10μgを最後に追加抗原刺激した。
【０１４６】
TNFaおよびCPGを与えたコホートを、前述のようにTNFaおよびTITERMAXGOLD(登録商標)で最初に免疫処置し、次の6回の追加抗原刺激は、前述と同様のミョウバンに吸着したTNFa、およびCPGによるものであった。最後の追加抗原刺激は、PBSに溶かしたTNFaおよびCPGによるものであった。詳細には、第0、3、9、16、21、25、30および35日に、動物を免疫処置した。動物は第28日および第39日に出血させて、以下に記載する採取選択用の血清を得た。
【０１４７】
XENOMAX(登録商標)によってモノクローナル抗体を作製するために、XMG2XENOMOUSE(登録商標)マウスのコホートを、フットパッド(FP)を介してTNFaで、皮下注射および腹腔内(BIP)注射により尾の底部を介して(実施例1で調製したのと同様の)TNFa-KLHで、あるいは皮下注射および腹腔内注射により尾の底部を介して(実施例1で調製したのと同様の)TNFa-TCEで免疫処置した。TNFaフットパッド免疫処置用に、最初の免疫処置は、マウス1匹当たり、TITERMAXGOLD(登録商標)と1:1(v/v)で混合した抗原2μgによるものであった。その後4回の追加抗原刺激を、マウス1匹当たり、ミョウバン(Sigma、Oakville、ON)と混合させた抗原2μgを用いて行い、一晩吸着させ、次にTITERMAXGOLD(登録商標)に溶かしたTNFaを1回注射し、ミョウバンを1回注射し、次いでマウス1匹当たり、PBSに溶かしたTNFa 2μgを最後に追加抗原刺激した。詳細には、第0、3、7、10、14、17、21および24日に、動物を免疫処置した。動物は第19日に出血させて、以下に記載する採取選択用の血清を得た。
【０１４８】
最初のBIP免疫処置物質、2μgまたは5μgのTNFa-KLHまたはTNFa-TCEをそれぞれ、マウス1匹当たりフロイントの完全アジュバント(CFA、Sigma、Oakville、ON)と1:1(v/v)で混合させた。その後の追加抗原刺激は、マウス1匹当たりフロイントの不完全アジュバント(IFA、Sigma、Oakville、ON)と1:1(v/v)で混合させた抗原それぞれ2μgまたは5μgを用いて最初に行い、次にマウス毎にPBSを最後に追加抗原刺激した。動物は、第0、14、28、42、56日および75日または93日(最終追加抗原刺激)に、免疫処置した。動物は第63日に出血させて、以下に記載する採取選択用の血清を得た。
【０１４９】
SLAMによってウサギ抗hTNFaモノクローナル抗体を作製するために、ニュージーランド白ウサギのコホートを、以下のように免疫処置した。フロイントの完全アジュバント(CFA)と1:1(v/v)で乳濁させたTNFa-TCE 250μgからなる、主要な追加抗原刺激物質を、ウサギの背脳体に沿った4箇所の部位に、皮下に与えた。これらに、後足を介した筋肉内への、フロイントの不完全アジュバント(IFA)と1:1(v/v)で乳濁させたTNFa-TCE 125μgを用いた、3回の免疫処置を続けた。それぞれの追加抗原刺激は21日離した。動物は4回目の免疫処置前に出血させた、血清学に関しては、以下の表9を参照のこと。
【０１５０】
採取用の動物の選択
抗hTNFa抗体の力価を、ELISAによって測定した。hTNFaを、4℃において一晩、Costar Labcoat Universal Binding Polystyrene96ウェルプレート(Corning、Acton、MA)上にコーティングした。非結合TNFaを含む溶液を除去し、プレートをUV光(365nm)で4分間(4000マイクロジュール)処理した。プレートはdH2Oで5回洗浄した。TNFaで免疫処置した動物、または非投薬のXENOMOUSE(登録商標)動物由来のXENOMOUSE(登録商標)の血清を、まったく同様に1:2に希釈した2%ミルク/PBS中において、1:100の最初の希釈液から滴定した。最後のウェルは空の状態にした。プレートはdH2Oで5回洗浄した。抗体と結合した、ヤギ抗ヒトIgGFc特異的ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP、Pierce、Rockford、IL)を、室温で1時間、1μg/mLの最終濃度で加えた。プレートはdH2Oで5回洗浄した。プレートは、30分間TMB色原体基質(Gaithersburg、MD)を加えることによって顕色させ、ELISAは、1Mのリン酸を加えることによって停止させた。個々のXENOMOUSE(登録商標)動物の特異的力価を、450nmでの光学濃度から測定し、表2〜8に示す。力価は相互的な血清の希釈を表し、したがって、その数が大きくなるほど、hTNFaに対する体液性免疫応答は高くなる。
【０１５１】
ウサギ抗TNFaの力価は前述のように測定したが、一次抗体の検出用に、ヤギ抗ウサギIgG重鎖および軽鎖特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP、Pierce、Rockford、IL)試薬を、抗ヒト試薬の代わりに使用した、表9を参照のこと。
【０１５２】
【表２】
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【０１５３】
表2中のXENOMOUSE(登録商標)動物はいずれも、ハイブリドーマの採取および作製用に選択した。
【０１５４】
【表３】
0004754219.tif 000008
【０１５５】
表3中のXENOMOUSE(登録商標)動物はいずれも、ハイブリドーマの採取および作製用に選択した。
【０１５６】
【表４】
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【０１５７】
表4中のXENOMOUSE(登録商標)動物はいずれも、ハイブリドーマの採取および作製用に選択した。
【０１５８】
【表５】
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【０１５９】
表5中のXENOMOUSE(登録商標)動物はいずれも、ハイブリドーマの採取および作製用に選択した。
【０１６０】
【表６】
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【０１６１】
XENOMOUSE(登録商標)動物(0651-2、0651-3、0651-5および0651-9)は、表6中の血清学的データに基づいて、XENOMAX(登録商標)の採取用に選択した。
【０１６２】
【表７】
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【０１６３】
XENOMOUSE(登録商標)動物(0797-4、0797-6、0797-7および0797-10)は、表7中の血清学的データに基づいて、XENOMAX(登録商標)の採取用に選択した。
【０１６４】
【表８】
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【０１６５】
XENOMOUSE(登録商標)動物(0796-2、0796-4、0796-7、0796-8および0796-10)は、表8中の血清学的データに基づいて、XENOMAX(登録商標)の採取用に選択した。
【０１６６】
【表９】
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【０１６７】
ウサギTPI-5由来の血液を、SLAMによりウサギモノクローナル抗体を作製するために採取した。
【０１６８】
(実施例3)
抗ヒトTNFα抗体の作製
ハイブリドーマによる抗hTNFα抗体の作製
リンパ細胞の回収、B細胞単離、ハイブリドーマの融合および作製
免疫処置したマウスを頸部脱臼によって殺傷し、リンパ節をそれぞれのコホートから採取し集めた。リンパ細胞をDMEM中で粉砕することによって解離させて、組織から細胞を切り離し、細胞をDMEM中に懸濁させた。細胞を計数し、リンパ球1億個当たり0.9mLのDMEMを細胞ペレットに加えて、完全ではないが軽く細胞を再懸濁させた。細胞1億個当たり100μLのCD90+磁気ビーズを使用して、15分間4℃で磁気ビーズと細胞をインキュベートすることによって、細胞を標識した。108個までの陽性細胞(または2×109個までの合計細胞)を含む、磁気標識した細胞の懸濁液をLS+カラムに充填し、DMEMでカラムを洗浄した。すべての溶出液を、CD90-陰性分画(これらの細胞の大部分はB細胞である)として回収した。
【０１６９】
P3骨髄腫細胞とB細胞が豊富なリンパ節細胞を、50mLの円錐チューブ中、DMEM中で、1:1(骨髄腫:リンパ節)の割合で組み合わせた。組み合わせた細胞は、5〜7分間800xg(2000rpm)で遠心分離にかけ、上清は生成したペレットからすぐに除去した。2〜4mLのプロナーゼ溶液(CalBiochem、カタログ番号53702;0.5mg/mL、PBS中)を細胞に加えて、細胞ペレットを軽く再懸濁させた。酵素処理は2分間を超えずに進行させて、3〜5mLのFBSを加えることによって反応を停止させた。充分なECF溶液を加えて合計体積を40mLにし、混合物は5〜7分間800xg(2000rpm)で遠心分離にかけた。上清を除去し、少体積のECF溶液を用いて細胞ペレットを軽く再懸濁させ、次に充分なECF溶液で合計体積を40mLにした。細胞を充分に混合させ計数し、次いで5〜7分間800xg(2000rpm)で遠心分離にかけた。上清を除去し、少体積のECF溶液に細胞を再懸濁させた。充分な追加のECF溶液を加えて、2×106細胞/mLに濃度を調節した。
【０１７０】
次いで細胞を電子細胞融合(ECF)装置(モデルECM2001、Genetronic,Inc.、San Diego、CA)中に置き、製造者の教示書に従って融合させた。ECFの後、細胞懸濁液を、滅菌条件下で融合チャンバーから注意深く除去し、DMEMに溶かした同体積のハイブリドーマ培地を含む滅菌チューブに移した。細胞は37℃で15〜30分間インキュベートし、次いで5分間400xg(1000rpm)で遠心分離にかけた。少体積の1/2HA培地(Sigma、カタログ番号A9666からのボトルの50×HA、および1リットルのハイブリドーマ培地)に、細胞を軽く再懸濁させ、さらに多量の1/2HA培地(96ウェルプレート当たり5×106個のB細胞、およびウェル当たり200μLに基づく)を用いて、適切に体積を調整した。細胞を充分に混合させ、96ウェルプレート中にピペット処理し、増殖させた。第7日または第10日に、培地の半分を除去し、1/2HA培地を細胞に再び与えた。
【０１７１】
ELISAによる候補抗体の選択
培養の14日後、ハイブリドーマ上清を、TNFa特異的モノクローナル抗体に関してスクリーニングした。ELISAプレート(Fisher、カタログ番号12-565-136)を、コーティングバッファー(0.1Mの炭酸バッファー、pH9.6、NaHCO3、8.4g/L)に溶かしたTNFa(2μg/mL)50μL/ウェルでコーティングし、次いで一晩4℃でインキュベートした。インキュベーションの後、プレートは洗浄バッファー(PBSに溶かした0.05%Tween20)で3回洗浄した。200μL/ウェルのブロッキングバッファー(1×PBSに溶かした0.5%BSA、0.1%Tween20、0.01%Thimerosal)を加え、室温で1時間プレートをインキュベートした。インキュベーションの後、プレートは洗浄バッファーで3回洗浄した。50μL/ウェルのハイブリドーマ上清、ならびに陽性および陰性対照を加え、室温で2時間プレートをインキュベートした。
【０１７２】
インキュベーションの後、プレートは洗浄バッファーで3回洗浄した。100μL/ウェルのヤギ抗huIgGfc-HRP検出抗体(カタログ番号H10507)、ヤギ抗hIgkappa-HRP(Southern Biotechnology、カタログ番号2060-05)、およびヤギ抗hIgラムダ(Southern Biotechnology、カタログ番号2070-05)を加え、室温で1時間プレートをインキュベートした。インキュベーションの後、プレートは洗浄バッファーで3回洗浄した。100ul/ウェルのTMB(BioFXLab、カタログ番号TMSK-0100-01)を加え、(陰性対照のウェルが色を示し始めることがほとんどなくなるまで)プレートを約10分間放置し、次いで50ul/ウェルの停止溶液(TMB停止溶液(BioFXLab、カタログ番号STPR-0100-01)を加え、波長450nmにおいてELISAプレートリーダー上で、プレートを読み取った。陽性ウェルの数を、表10中に表す。
【０１７３】
【表１０】
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【０１７４】
Lurninexを使用する、抗TNFaハイブリドーマ上清用のイソ型および軽鎖の使用を決定するための、二次スクリーニング
Lnminexプラットホームは、多数のアッセイを一度に行うのを可能にする、蛍光ビーズ系技術である。Lnminex読み取り装置は、異なるコード付けされたミクロスフェアの陽性のシグナル事象を確認することができる。これによって、それぞれのビーズを別々にコーティングすることが可能であり、したがって差別的にコーティングされたミクロスフェアを一緒に混合することが可能であり、したがって1ステップのアッセイで、それぞれの異なるミクロスフェアとの抗体の結合が可能である。抗体をイソ型で分類するために、それぞれのビーズが、特定の重鎖または軽鎖イソ型と特異的に結合することができるような方法で、ミクロスフェアをコーティングした。次いでミクロスフェアを一緒に混合し、それぞれの抗体のハイブリドーマ上清を加えた。20分のインキュベーションの後、ミクロスフェアを洗浄し、結合した抗体は、蛍光標識した二次抗体を使用して検出した。Lnminex読み取り装置を使用して、次いでミクロスフェアを読み取った。表10は、異なる融合体群に関して見られた、それぞれのイソ型の数を示す。
【０１７５】
ハイブリドーマ抗TNFa抗体によるTNFa誘導型アポトーシスの中和のアッセイ
47の抗TNFaハイブリドーマ抗体を、ヒトWM266.4細胞に対するTNFa誘導型アポトーシスの生物学的影響を中和する、それらの能力に関してアッセイした。Swell-Gel proteinA(Pierce)での精製によって、それぞれのハイブリドーマ上清からIgGを最初に増大させ、次いで溶出させ、中和し、正確に測定した。20,000個のWM266.6細胞を、96ウェルプレート中、完全培地(RPMI1640/10%FBS/Gln/P/S)中に平板培養し、37℃/10%CO2で一晩インキュベートした。培地を除去し、50μLの試験抗体およびTNFa(室温で30分プレインキュベートしたもの)を、無血清培地(RPMI1640/Gln/P/S)に加えた。50μLのシクロヘキサミドのプレートを、以下の最終的なアッセイ条件下で、前と同様に一晩インキュベートした。V=100μl、シクロヘキサミド=6μg/mL、トリマーとしてTNFa=600μg/mL=11.4pM、試験抗体濃度は、記載したように変わる。100μLのカスパーゼバッファーおよび0.3μLのカスパーゼ基質(APO-ONE、Promega)を、それぞれのウェルに加えた。
【０１７６】
励起波長@485nmおよび発光波長@530nmで、Victor Wallacプレートリーダーにおいて、カスパーゼ活性を測定した。ハイブリドーマ由来抗体による、アポトーシスの中和の一例は、図1に与える。図1は、ヒトWM266.4細胞において、様々なTNFa抗体がアポトーシスの中和に対して有していた影響を示す、棒グラフを示す。対照(pos)は、シクロヘキサミドのみの存在下における、TNFaによるアポトーシスの誘導を示す。他の対照は、6nMのマウス抗hTNFa抗体(R&D)による、アポトーシスの阻害を示す。Y軸は、TNFa誘導型アポトーシスの指標として、カスパーゼ3/7活性の相対量を表す。図1が示すように、3.2、3.7および4.17を含めた抗体は、3nMにおいてTNFa誘導型アポトーシスを中和する際に、非常に強力であった。
【０１７７】
ヨウ化プロピジウム取り込みのアッセイによるアポトーシスの中和
47の抗TNFaハイブリドーマ抗体の上清を、ヒトMCF-7細胞に対するTNFa誘導型アポトーシスの生物学的影響を中和する、それらの能力に関してさらにアッセイした。96ウェルプレートに、5000細胞/ウェル、200μl/ウェル、およびフェノールレッドを含まないDMEM+10%FCSで接種した。37℃+5%CO2で、細胞を一晩インキュベートした。それぞれのプレート上で、(実施例2に記載したのと同様に捕捉ELISAによって正確に測定し、標準曲線の対照抗体と比較した)ハイブリドーマ抗体の滴定値を、100pg/mL(トリマーとして1.9pM)TNFaの一定濃度において、三連で、アポトーシス培地(2.5%FCS、5μg/mLのCHXをフェノールレッドを含まないDMEMに溶かしたもの)中において、10μg/mL〜最終濃度0.005ng/mL(1:5に滴定)のウサギ014対照抗体と比べてアッセイした。TNFaのみを含む6つのウェルプレート、およびアポトーシス培地のみを含む6つのウェルも、インキュベートした。TNFa+/-中和抗体は、37℃+5%CO2で1時間プレインキュベートした。200μLの抗体を次いで細胞に移し、37℃+5%CO2で一晩インキュベートした。
【０１７８】
0.5μg/mLのPIおよび2.5μg/mLのヘキスト33342で1時間、細胞を染色した。アポトーシスの割合は、死んだ細胞の数(PI+ve)を計数し、細胞の合計数(ヘキスト+ve)で割ることによって測定した。ハイブリドーマ由来の、ヒト抗TNFa結合抗体が、MCF-7細胞のTNFa誘導型アポトーシスを中和する能力は、ヘキスト33342染色による合計細胞数の比率として、ヨウ化プロピジウム取り込みによって測定した。SLAM由来のウサギモノクローナル抗体、R014、ならびに3.2、4.17および3.7を含めた、様々な他のヒトモノクローナル抗体は、MCF-7細胞のTNFa誘導型アポトーシスを中和する際に、非常に強力であった。
【０１７９】
IgG2ハイブリドーマ4.17および3.2のイソ型変更および発現
ハイブリドーマ4.17および3.2から、mRNAを抽出した。逆転写酵素PCRを行って、cDNAを作製した。可変部位重鎖および軽鎖をコードするcDNAを、PCRを使用して特異的に増幅させた。可変部位重鎖領域は、IgG1発現ベクターにクローニングした。このベクターは、ヒトIgG1の定常ドメインを、pcDNA3.1+/Hygro(Invitrogen、Burlington、ON)の多重クローニング部位にクローニングすることによって作製した。可変部位軽鎖領域は、IgK発現ベクターまたはIgλにクローニングした。これらのベクターは、ヒトIgKまたはIgλの定常ドメインを、pcDNA3.1+/Neo(Invitrogen、Burlington、ON)の多重クローニング部位にクローニングすることによって作製した。次いで重鎖および軽鎖の発現ベクターを、70%の集合状態の60mm皿中に同時にリポフェクションし、ヒト胚腎臓293細胞およびトランスフェクトした細胞は、24〜72時間、元のプラズマ細胞と同一の特異性を有する組換え抗体を分泌させた。上清(3mL)をHEK293細胞から採取し、完全抗体の分泌をサンドウィッチELISAによって実証して、ヒトIgGを特異的に検出した。ELISAを使用して組換え抗体とTNFaの結合により、特異性を評価した。
【０１８０】
XENOMAX(登録商標)による抗hTNFa抗体の作製
B細胞の培養および選択
動物由来のB細胞を、採取し培養した。TNFa特異的抗体を分泌する細胞は、Babcook他、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93:7843〜7848(1996)中に記載されたのと同様に単離した。ELISAを使用して、主要なTNFa特異的ウェルを同定した。XENOMOUSE(登録商標)動物由来の約1800万個のB細胞を、500または150細胞/ウェルで48096ウェルプレート中において培養し、TNFaに関してスクリーニングして、抗原特異的なウェルを同定した。3,825ウェルが基底を大幅に超えるODを示し、その代表的なサンプルは表11に示す。ウサギB細胞も、抗hTNFa抗体を分泌するそれらの能力に関してスクリーニングして、陽性のものは以下に記載したようにさらにアッセイした。
【０１８１】
【表１１】
0004754219.tif 000018
【０１８２】
抗原特異的な抗体濃度の正規化
ELISA法を使用して、抗原特異的な抗体の濃度の上清を正規化した。平行して滴定した知られている濃度の抗標的(TNFa)抗体を使用して、標準曲線を作製することができ、上清中の抗原特異的な抗体の量は、標準およびその測定した濃度と比較することができる、以下の表12を参照のこと。
【０１８３】
【表１２】
0004754219.tif 000019
【０１８４】
限定的な抗原アッセイ
限定的な抗原分析は、すべての他の抗原特異的な抗体に対して、B細胞培養物上清中で調製された抗原特異的な抗体を、親和性によってランク付けする方法である。非常にわずかな抗原コーティングの存在下では、最高親和性の抗体のみが、平衡状態で任意の検出可能なレベルに、結合することができるはずである(例えば、2003年6月12日に公開された、「IDENTIFICATION OF HIGH AFFINITY MOLECULES BY LIMITED DILUTION SCREENING」という表題のPCT公開WO/03048730A2を参照のこと)。
【０１８５】
ビオチン化TNFaを、96ウェル培養プレート上において室温で1時間、3つの濃度;1ng/mL、0.1ng/mLおよび0.O1ng/mLで、ストレプトアビジンプレートと結合させた。PBSおよび0.05%アジ化ナトリウムに溶かした1%ミルク45μLをプレートに加え、次に5μLのB細胞上清をそれぞれのウェルに加える前に、それぞれのプレートはdH2Oで5回洗浄した。振とう装置上において室温で18時間後、再びプレートをdH2Oで5回洗浄した。それぞれのウェルに、1μg/mLで50μLのGt抗ヒト(Fc)-HRPを加えた。室温で1時間後、再びプレートをdH2Oで5回洗浄し、50μLのTMB基質をそれぞれのウェルに加えた。それぞれのウェルに50μLの1Mリン酸を加えることによって反応を停止させ、プレートは波長450nmで読み取り、表13に示す結果を得た。
【０１８６】
【表１３】
0004754219.tif 000020
【０１８７】
限定的な抗原分析
10ng/mL〜1000ng/mLの範囲の抗原特異的な抗体の濃度を有する、B細胞培養物上清を調製した。限定的な抗原分析から生じた結果は、4.17ハイブリドーマ由来抗体の滴定値と比較した。このアッセイでは、抗体の多くは検出可能な結合を与えることができなかったが、しかしながら、O.D.により測定して、すべての濃度で他の培養物上清および組換え抗体より明らかに優れていた、401A7および433F4を含めたいくつかのウェルが存在した(表13)。残りのクローンは、特異的な抗体の濃度を測定する充分な抗原データ(詳細に関しては前を参照)と、限定的な抗原の産生量を組み合わせることによって、さらに分析した。このようにして、B細胞培養物上清中の抗体と対照抗体のそれを、図2に示す濃度範囲で比較することができた。図2は、B細胞培養物上清中の抗体間の抗TNFa限定抗原結合と、対照抗体(4.17IgG2)の結合を、ある濃度範囲で比較する、点グラフである。三角形はB細胞培養物上清中のクローンを表し、ブロックは棒線の抗体(4.17IgG2)を表す。棒線の抗体曲線より上の位置の、B細胞培養物上清中のクローンは、潜在的に高い親和性を有するものとしてランク付けする。
【０１８８】
ヨウ化プロピジウム取り込みのアッセイによるアポトーシスの中和
フットパッド免疫処置したマウス由来のB細胞培養物の、ウェルの上清から同定した、全1455の抗TNFa抗体を、ヒトMCF-7細胞に対するTNFa誘導型アポトーシスの生物学的影響を中和する、それらの能力に関してさらにアッセイした。さらに、BIP免疫処置動物から同定した全2,370抗hTNFaの限定的な抗原分析の後、最高の動態ランキングを有する145の抗体を、TNFa活性の中和に関してさらに分析した。96ウェルプレートに、5000細胞MCF-7/ウェル、200μl/ウェル、およびフェノールレッドを含まないDMEM+10%FCSで接種した。37℃+5%CO2で、プレートを一晩インキュベートした。それぞれのプレート上で、B細胞培養物抗体上清を、100pg/mL(トリマーとして1.9pM)TNFaの一定濃度において、アポトーシス培地(2.5%FCS、5μg/mLのCHXをフェノールレッドを含まないDMEMに溶かしたもの)中において、最も強力な中和抗TNFaハイブリドーマ抗体、4.17および3.2および/またはウサギ014対照と比べてアッセイした。アポトーシス培地中にTNFaを含むまったく同様のウェル、およびアポトーシス培地のみを含むウェルを、対照としてインキュベートした。TNFa+/-試験サンプルは、37℃+/5%CO2で1時間プレインキュベートした。200μLのTNFa+/-を細胞に移し、37℃+/5%CO2で一晩インキュベートした。
【０１８９】
0.5μg/mLのPIおよび2.5μg/mLのヘキスト33342で1時間、細胞を染色した。アポトーシスの割合は、死んだ細胞の数(PI+ve)を計数し、細胞の合計数(ヘキスト+ve)で割ることによって測定した。一例は図3に示し、これはヒトMCF-7細胞におけるTNFa誘導型細胞アポトーシスを阻害する際の、様々なXENOMAX(登録商標)B細胞培養物上清の有効性を比較する、例示的な棒グラフを示す。いくつかのB細胞培養物ウェルの上清は、TNFa誘導型アポトーシスを中和する能力を示した。これらの上清には、164C7、179B1、401A7、410B1、439A3および460A12があった。
【０１９０】
ポリクローナル溶液中での抗hTNFa抗体による、TNFa誘導型アポトーシスの中和有効度の測定
ポリクローナルB細胞培養物上清中の抗原特異的な抗体の補外濃度を使用して、MCF-7細胞における、TNFa誘導型アポトーシスの中和の外見上の有効度を計算した。標準抗標的試薬と共にアッセイを行うことによって、この場合のハイブリドーマ由来の抗体3.2IgG2では、有効度線を設定して、標準より高い可能性がある有効度を有する、抗体を探すことが可能であった。
【０１９１】
MCF-7細胞におけるTNFa誘導型アポトーシスの中和に関する、計算した有効度の比較値の一例は、図4に示す。図4は、XENOMAX(登録商標)B細胞培養物上清により、ヒトMCF-7細胞におけるTNFa誘導型アポトーシスの中和に関する、計算した有効度の比較値を示す例示的な点グラフである。三角形はB細胞培養物上清の有効度を表し、一方で四角形は、棒線の対照、3.2IgG2の有効度を表す。いくつかのB細胞培養物上清は、低い抗TNFa抗体濃度で、3.2対照の標準曲線のそれを超えるTNFa誘導型アポトーシスの中和を示し、より高い有効度が示された。
【０１９２】
ウサギ抗体によるp55(TNFaレセプターI)とのTNFa結合の阻害
ウサギ抗TNFa中和抗体を、B細胞培養物上清由来の抗体が、そのp55レセプターとのTNFa結合を阻害することができたかどうか、調べることによって発見した。以下の手順に従った。96ウェルマイクロタイタープレートは、TNFaで一晩コーティングした。翌日、プレートを洗浄し、抗TNFa抗体+/-で1時間インキュベートした。次いでビオチン-p55をプレートに1時間加え、水で洗浄し、結合したp55は、ストレプトアビジン-HRPを使用して検出した。次いでプレートを洗浄し、前に記載した他のELISAで行ったのと同様に顕色させた。p55の結合を阻害した抗体は中和抗体と名付けた、表14を参照のこと。
【０１９３】
【表１４】
0004754219.tif 000021
【０１９４】
TNFa特異的溶血プラークアッセイ
いくつかの特殊な試薬を使用して、このアッセイを行った。これらの試薬は、以下のように調製した。
【０１９５】
ヒツジ赤血球細胞(SRBC)のビオチン化
SRBCを、25%ストックとしてRPMI培地中に保存した。250μLのSRBC含有細胞ペレットは、1.0mLのSRBCを新たなエッペンドルフチューブに等分試料分けすることによって得た。マイクロフュージ中において8000rpm(6800rcf)でパルススピンによって、SRBCをペレット状にし、上清を除去し、ペレットを1.0mLのPBS、pH8.6に再懸濁させ、遠心分離を繰り返した。洗浄サイクルは2回繰り返し、次いでSRBCペレットを15-mLのファルコンチューブに移し、PBS、pH8.6を用いて5mLにした。別の50mLのファルコンチューブ中において、2.5mgのSulfo-NHSビオチンを、45mLのPBS、pH8.6に加えた。ひとたびビオチンが完全に溶けた後、5mLのSRBCを加え、室温で1時間チューブを回転させた。SRBCは3000rpmで5分間遠心分離にかけ、上清は除去した。ビオチン化したSRBCはエッペンドルフチューブに移し、前と同様に、ただしPBS、pH7.4で3回洗浄し、次いで15mLのファルコンチューブ(5%B-SRBCストック)中において、免疫細胞培地(RPMI1640)を用いて5mLにした。必要となるまで、ストックは4℃で保存した。
【０１９６】
B-SRBCのストレプトアビジン(SA)コーティング
1mLの5%B-SRBCストックを、新たなエッペンドルフチューブに移した。B-SRBC細胞は前と同様に3回洗浄し、1.0mLのPBS、pH7.4に再懸濁させて、5%(v/v)の最終濃度を得た。10μLの10mg/mLストレプトアビジン(CalBiochem、San Diego、CA)ストック溶液を加え、チューブを混合し、室温で20分間回転させた。洗浄ステップを繰り返し、SA-SRBCを1mLのPBS、pH7.4(5%(v/v))に再懸濁させた。
【０１９７】
SA-SRBCのヒトTNFaコーティング
SA-SRBCを、10μg/mLでビオチン化TNFaを用いてコーティングし、混合し、室温で20分間回転させた。SRBCは前と同様に1.0mLのPBS、pH7.4で2回洗浄した。TNFaコーティングSRBCは、RPMI(+10%FCS)に再懸濁させて、5%(v/v)の最終濃度にした。
【０１９８】
免疫蛍光性(IF)によるTNFa-SRBCの質の決定
10μLの5%SA-SRBCおよび10μLの5%TNFaコーティングSRBCを、40μLのPBSを含む別々の新たな1.5mLのエッペンドルフチューブにそれぞれ加えた。対照ヒト抗TNFa抗体を、45μg/mLでSRBCのそれぞれのサンプルに加えた。チューブを室温で25分間回転させ、次いで細胞を100μLのPBSで3回洗浄した。細胞を50μLのPBSに再懸濁させ、Alexa488と結合したGt抗ヒトIgGFc抗体(Molecular Probes、Eugene、OR)40μg/mLと共にインキュベートした。チューブを室温で25分間回転させ、次いで100μLのPBSで洗浄し、細胞は10μLのPBSに再懸濁させた。10μLの染色細胞を、透明なガラス製の顕微鏡スライド上にスポットし、ガラス製カバーガラスで覆い、蛍光下で観察し、0〜4の任意単位で記録した。
【０１９９】
プラズマ細胞の調製
様々なアッセイによって、当該の免疫グロブリンを分泌するB細胞クローンを含むとして前に同定した、1つのミクロ培養ウェルの中身を採取した。100〜1000μLのピペットマンを使用して、37℃のRPMI(10%FCS)を加えることによって、ウェルの中身を回収した。ピペット処理することによって細胞を再懸濁させ、次いで新たな1.5mLのエッペンドルフチューブに移した(最終体積約500〜700μL)。室温で1分間、マイクロフュージ中において2500rpm(660rcf)で、細胞を遠心分離にかけ、次いでチューブを180℃で回転させ、2500rpmで1分間再度回転させた。凍結培地を除去し、免疫細胞を100μLのRPMI(10%FCS)に再懸濁させ、次いで遠心分離にかけた。RPMI(10%FCS)を用いたこの洗浄を繰り返し、細胞を60μLのRPMI(10%FCS)に再懸濁させ、使用する用意ができるまで氷上で保存した。
【０２００】
プラークアッセイ
シリコーン端部を有するガラススライド(2×3インチ)を事前に調製し、室温で一晩硬化させた。使用前に、スライドを約5μLのSigmaCoat(Sigma、Oakville、ON)で処理し、ガラス表面を均一に拭き取り、乾燥させ、次いで強く拭き取った。細胞の60μLサンプルに、60μLのそれぞれのTNFaコーティングSRBC(5%v/vストック)、4×モルモット補体(Sigma、Oakville、ON)ストック、RPMI(10%FCS)中で調製したもの、および4倍増大させた血清ストック(1:150、RPMI(10%FCS)中)を加えた。調製したスライド上に、混合物-)をスポットし(10〜15μL)、スポットは非希釈パラフィン油で覆った。37℃で少なくとも45分間、スライドをインキュベートした。
【０２０１】
プラークアッセイの結果
TNFaコーティングされたヒツジ赤血球細胞を使用して、ウェルから抗原特異的なプラズマ細胞を同定した(表15参照)。
【０２０２】
【表１５】
0004754219.tif 000022
【０２０３】
組換え抗TNFa抗体の発現
1種のプラズマ細胞を単離した後、mRNAを抽出し、逆転写酵素PCRを行って、可変部位重鎖および軽鎖をコードするcDNAを作製した。ヒト可変部位重鎖領域をクローニングして、IgG1発現ベクターにイソ型を変更した。このベクターは、ヒトIgG1の定常ドメインを、pcDNA3.1+/Hygro(Invitrogen、Burlington、ON)の多重クローニング部位にクローニングすることによって作製した。ヒト可変部位軽鎖領域は、IgK発現ベクターにクローニングした。これらのベクターは、ヒトIgKの定常ドメインを、pcDNA3.1+/Neo(Invitrogen、Burlington、ON)の多重クローニング部位にクローニングすることによって作製した。次いで重鎖および軽鎖の発現ベクターを、70%の集合状態の60mm皿中に同時にリポフェクションし、ヒト胚腎臓293細胞およびトランスフェクトした細胞は、24〜72時間、元のプラズマ細胞と同一の特異性を有する組換え抗体を分泌させた。上清(3mL)をHEK293細胞から採取し、完全抗体の分泌をサンドウィッチELISAによって実証して、ヒトIgGを特異的に検出した(表16)。ELISAを使用して組換え抗体とTNFaの結合により、特異性を評価した。
【０２０４】
【表１６】
0004754219.tif 000023
【０２０５】
分泌ELISA試験を、以下のように行った。対照プレートは、結合プレートと同様に、一晩2mg/mLのヤギ抗ヒトIgGH+Lでコーティングし、hTNFaは、Costar Labcoat Universal Binding Polystyrene96ウェルプレート上にコーティングし、4℃で一晩保った。プレートはdH2Oで5回洗浄した。非希釈ミニリポフェクション上清から、7ウェルに関して、組換え抗体を1:2で滴定した。プレートはdH2Oで5回洗浄した。ヤギ抗ヒトIgGFc特異的HRP結合抗体を、分泌および2つの結合アッセイ用に、室温で1時間1μg/mLの最終濃度で加えた。プレートはdH2Oで5回洗浄した。30分間TMBを加えることによってプレートを顕色させ、1Mのリン酸を加えることによってELISAを停止させた。それぞれのELISAプレートを分析して、450nmにおけるそれぞれのウェルの光学濃度を測定した。
【０２０６】
前述のように、ウサギ抗体遺伝子を回収し、クローニングし、発現させたが、ウサギIgG1重鎖定常またはkappa定常領域を含むベクターにクローニングした。完全ウサギ抗体、R014(ABTNFa-R014)と同様に、ウェル7A4由来の細胞(表14)を単離し、クローニングし、発現させた。
【０２０７】
組換え抗TNFa抗体の精製
大規模生成用に、重鎖および軽鎖発現ベクター(2.5μgのそれぞれの鎖/皿)を、HEK293細胞を含み70%の集密状態であった100mm皿10枚にリポフェクションした。トランスフェクトした細胞は、37℃で4日間インキュベートし、上清(6mL)を採取し、6mLの新たな培地と交換した。第7日に、上清を除去し、最初の採取物と共に集めた(10プレートから合計120mL)。Protein-A Sepharose(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ)親和性クロマトグラフィーを使用して、それぞれの抗体を上清から精製した(1mL)。500mcLの0.1Mグリシン、pH2.5を用いてプロテイン-Aカラムから抗体を溶出させた。溶出物はPBS、pH7.4中で透析し、濾過滅菌した。抗体は非還元SDS-PAGEにより分析して、純度および収率を評価した。OD250でのUV分析によって、濃度も測定した。
【０２０８】
(実施例4)
抗TNFa抗体と膜貫通TNFaの結合
可溶性および膜結合TNFaのいずれもTNFaレセプターと相互作用し、TNFaの炎症誘発性作用に寄与する可能性がある。したがって、299v2および263が、可溶型の分子以外に、膜結合TNFaとも有効に結合することができるかどうかを、確立することが重要であった。この目的のために、TNFaトランスフェクトCHO細胞および活性化T細胞を使用した。
【０２０９】
抗TNFa試薬とCHO細胞の表面で発現される膜貫通突然変異TNFaの結合を測定した。詳細には、精製、正確に測定したIgG2kappaおよびλハイブリドーマ抗体、およびイソ型変更したハイブリドーマ、およびXENOMAX(登録商標)由来IgG1組換え抗体を、チャイニーズハムスター卵巣細胞CHOの表面で発現される膜貫通TNFaと結合する、それらの能力に関してアッセイした。TNFaのcDNAを様々な位置で突然変異させて、細胞表面からのTNFaの切断を防いだ。次いでcDNAを、発現ベクターにクローニングした。CHO細胞をトランスフェクトし、安定した発現状態の細胞を薬剤選択下に置いて、DTNFa細胞系を作製した。抗TNFa抗体およびエタネルセプトを滴定し、1時間または18時間氷上でDTNFaCHO細胞に加えた。細胞を冷たいPBSで洗浄し、二次ビオチン化抗ウサギまたはヒトIgGを、氷上で10分間さらにインキュベートし、洗浄し、三次SA-PE標識抗体を氷上でさらに10分間加えた。蛍光活性化細胞選別法(FACS)を使用して、様々な濃度で抗体を用いて結合および染色概略を測定した。
【０２１０】
低濃度では、ヒト抗体、ならびにキメラインフリキシマブおよびウサギR014は、細胞上で膜貫通形のTNFaと結合し、一方エタネルセプトは弱い結合シグナルを明らかに示した。299v2、263、インフリキシマブ、アダリムマブおよびエタネルセプトは、0.1ug/mLでDTNF-CHO細胞上において、4℃で18時間インキュベートした。モノクローナル抗体に関しては、299v2およびアダリムマブは、263およびインフリキシマブほど明らかには染色しなかった。結果として生じたデータは、抗体依存性細胞障害活性(CDC)および抗体依存性細胞性細胞障害活性(ADCC)などのFc仲介の影響は、膜貫通TNFaを発現する細胞上で観察されるに違いないことを示唆する。作製した抗体のいくつかは、インフリキシマブおよびエタネルセプトより強力な、Fc仲介の影響を有する可能性がある。このことは、細胞表面のTNFaが、病的-生理学的役割を果たす可能性がある疾患、クローン病または乾癬などを、治療するのに非常に有益である可能性がある。
【０２１１】
可溶形のTNFaが病状の大部分を仲介している可能性がある、疾患徴候を治療するために、わずかなFc仲介のエフェクター機能を有する抗体が、望ましい可能性がある。IgG2またはIgG4イソ型として抗TNFa抗体を発現させることによって、これを得ることができると思われる。
【０２１２】
抗TNFa試薬と活性化PBMCの結合も測定した。PBMCは正常なドナーから単離し、抗CD3抗体と共にインキュベートして、T細胞を活性化させた。T細胞の活性化は、膜結合TNFaの表面のTNFaの発現を含む。膜結合TNFaと結合する抗TNFa試薬の能力を、FACS分析、光散乱面へのリンパ球の固定、およびPE結合抗ヒトIgG二次抗体の使用によって、様々な濃度で再度評価した。結果として生じた染色データによって、すべてのモノクローナル抗体299v2、263、インフリキシマブおよびアダリムマブは、T細胞活性化後にリンパ球を染色したが、一方エタネルセプトは染色しなかったことが示された。それらがT細胞活性を施されなかった場合、抗TNFa抗体はリンパ球を染色しなかった。
【０２１３】
(実施例5)
エピトープ領域分けアッセイ
抗TNFa抗体のエピトープマッピング
以下の事項は、抗TNFa抗体のエピトープをマッピングするために使用する方法を記載する。キメラTNFaタンパク質を、ヒトおよびマウスTNFaを使用して構築し、発現させた。ヒトおよびマウスTNFaの配列を表17に与える。
【０２１４】
【表１７】
0004754219.tif 000024
【０２１５】
ヒトTNFa-a遺伝子とネズミTNFa-a遺伝子に共通な制限切断部位を、インフレームの融合TNFaキメラタンパク質を構築するために使用した。7つの構築体:ヒトTNFa、マウスTNFa、H/MBglI、M/HBglI、H/MHincII、H/MPvulI、M/HPvuIIを作製した。すべてのタンパク質を発現させ、検出可能なレベルで分泌させ、ヒトおよびマウスTNFaに対するポリクローナル抗体を使用する、ELISAアッセイによって測定した。キメラTNFaタンパク質:アミノ酸結合部は以下の位置である:BglI-36/37、HinclI-90/92、PvuH-124/126。最後の2例における1個のアミノ酸の違いは、ネズミTNFa配列中の位置73に、ヒスチジン残基が存在しないことによるものである。ELISAによるこれらのタンパク質との抗TNFa抗体の結合の一例は、表18中に存在する。
【０２１６】
【表１８】
0004754219.tif 000025
【０２１７】
異なる抗体の結合部位を定義するために、hTNFaのいくつかの残基を、位置指定突然変異導入法を使用して突然変異させた。一群の抗体を、ELISAアッセイにより結合に関してスクリーニングした。ヒト残基を、位置27、31、および131でネズミ残基と置換した。位置73のヒスチジンは削除し、一例を表19中に示す。
【０２１８】
【表１９】
0004754219.tif 000026
【０２１９】
表19によって示されるように、ウサギ014、4.17、SC291、SC299およびSC313の結合部位は、ヒトTNFaの最初の36アミノ酸残基中に位置している。アミノ酸31〜35は、レセプター認識および生物学的応答の誘発と関係あることが示されてきており(Jones,E.Y.、Stuart,D.I.、およびWalker,NPC.、(1992)、Tumor Necrosis Factors:Structure、Function and Mechanism of Action(Aggarwal,B.B.、およびVilcek,J.編)pp93〜127、Marcel Dekker,Inc.、New York)、Arg31の非保存的変化が、さらなるエピトープマッピングのために導入された。位置31における1箇所のアミノ酸変化は、SC291、SC299およびSC313の結合を完全に阻害することが示され、一方モノクローナル抗体4.17はその結合活性の80%のみを失い、位置27における他の変化が、4.17の活性を阻害するのに必要であった。
【０２２０】
モノクローナル抗体3.2.の結合部位は、残基1と91の間に存在する。G1n27およびarg31の置換が、ヒトTNFaとのその結合に影響を与えることはなかったが、N末端はその結合活性に不可欠であるようである。モノクローナル抗体3.7エピトープは、残基36と157の間に存在する。
【０２２１】
モノクローナル抗体SC250、SC263、SC269、SC282、SC283およびインフリキシマブを使用して、キメラを中和することはできなかった。これらの抗体はすべて、ヒトTNFaに非常に特異的であり、それらのエピトープは、TNFaポリペプチドの異なる、非隣接位置に位置する残基の配列である。G1n27、Arg31、His73およびArg131は、中和結合部位とは関係がない。
【０２２２】
表20は、299v2、263、エタネルセプト、インフリキシマブおよびアダリムマブに行った、他のエピトープマッピングの結果を要約するものである。表20中に示されるように、299v2、エタネルセプト、およびアダリムマブは、アミノ酸1とアミノ酸36の間のヒトTNFの領域を含むキメラタンパク質と結合し、一方263およびインフリキシマブは、いかなるキメラタンパク質とも結合しない。すべての抗TNFa抗体はヒトTNFと結合するが、ネズミTNFとは結合しない。これらの結果は、299v2、エタネルセプト、およびアダリムマブの結合領域は、TNFの最初の36のアミノ酸内に含まれる可能性が最も高く、263およびインフリキシマブの結合領域は、分子全体に散在していることを示す。すべての抗TNFa抗体はタンパク質-変性感受領域と結合し、それらの結合領域が立体的であることが示される。
【０２２３】
【表２０】
0004754219.tif 000027
【０２２４】
表21に示すように、TNFaレセプターp75-hFcおよびp55-hFc(カタログ番号372-RI-050および372-RI/CF、R&Dからのもの)を、TNFaタンパク質との結合に関してさらに分析した。
【０２２５】
【表２１】
0004754219.tif 000028
【０２２６】
(実施例6)
抗マカークザルTNFa結合の交差反応性
ヒトおよびサル可溶性組換えTNFaとの結合
抗TNFa抗体を、可溶性組換えTNFaと結合する、それらの能力に関しても試験した。ヒトおよびサル(カニクイマカークザル)TNFaを、GSTとの融合タンパク質として大腸菌中で発現させた。結合はELISAによって評価した。299v2、263、エタネルセプト、インフリキシマブおよびアダリムマブ(「抗TNFa抗体」)を、0.5μg/mlのヒトGST-TNFa、2μg/mlのサルGST-TNFa、および10μg/mlのGSTを一晩コーティングした96ウェルプレート中でインキュベートした。HRP結合ヤギ抗ヒトIgG抗体を使用して、結合した抗体を検出した。抗TNFa抗体はいずれも、類似した用量応答でヒトTNFaと結合することが、結果によって示された(図5)。抗TNFa抗体は、サルTNFaとは異なる結合をする。299v2、エタネルセプト、およびアダリムマブは、類似した方式でカニクイマカークザルTNFaと結合するが、263およびインフリキシマブは、カニクイマカークザルTNFaとは結合しないようである(図6)。
【０２２７】
(実施例7)
動態分析
KinExA(登録商標)およびBIACORE(登録商標)技術を使用して、抗TNFa抗体の動態測定値を評価した。KinExA(登録商標)法は、平衡状態における正式な親和性の測定値の溶液系の測定を含む。それぞれのヒト抗TNFa抗体の結合動態を測定するために、3つのうちのまったく同様の2つの実験を行った。両方の実験において、知られている濃度の抗原を滴定し、異なる抗体濃度をそれぞれの抗原滴定物に加え、結合平衡状態に到達させた。ヒトTNFaにおけるKd測定値を決定するために、1つのトリマー(52.5kDa)、表22参照、3つのモノマー(17.5kDa)、表23参照の、TNFa結合部位のモル濃度を使用して、Kdを計算した。これらの結果は、二重曲線分析によって分析した。ウサギR014抗体の動態測定は前とほぼ同様に行ったが、しかしながら、知られている抗体濃度を使用して、未知の抗原濃度による方法を行い、Kdを計算した。さらに、親和性の影響の可能性を無効にするために、パパインによる切断によってFab断片を作製し、動態分析を繰り返した(表24参照)。
【０２２８】
他の動態定数も、BIACORE(登録商標)データから、それらの製品文献中に記載された方法を使用して計算した。会合速度定数(Ka)は、抗原-抗体反応の動態に基づいて計算した、標的抗原と抗体の結合の強度(程度)を表す値である。解離速度定数(Kd)は、抗原-抗体反応の動態に基づいて計算した、標的抗原からのこのモノクローナル抗体の解離の強度(程度)を表す値である。解離定数(Kd)は、会合速度定数(Ka)からの解離速度定数(Kd)値で割ることによって得られる値である、表25を参照のこと。
【０２２９】
【表２２】
0004754219.tif 000029
【０２３０】
【表２３】
0004754219.tif 000030
【０２３１】
【表２４】
0004754219.tif 000031
【０２３２】
【表２５】
0004754219.tif 000032
【０２３３】
カニクイマカークザルTNFaに関する299v2の結合親和性も測定した。なぜならこの抗体は、ELISAにおいてサルTNFaと結合することができることが、見出されているからである。KinExA法を使用して、この結合親和性を示すKdも測定した。299v2は626pMの親和性でサルTNFaと結合し、TNFaはモノマーとして、したがって、ヒトTNFaの親和性より約200倍低い親和性であるとみなされた。
【０２３４】
(実施例8)
IN VITROでの抗HTNFa抗体の特徴付け。
ヒトMCF-7細胞におけるTNFa誘導型アポトーシスの阻害
IgG2kappaおよびλハイブリドーマを、前に記載したのと同様に、大量に培養し、精製し正確に測定した。イソ型変更したハイブリドーマ、およびXENOMAX(登録商標)由来IgG1組換え抗体を、前に記載したのと同様に、発現させ、精製し正確に測定した。ヒトMCF-7細胞に対するTNFa誘導型アポトーシスの生物学的影響を中和する、それらの能力に関して、抗体をさらにアッセイした。96ウェルプレートに、5000細胞MCF-7/ウェル、200μl/ウェル、およびフェノールレッドを含まないDMEM+10%FCSで接種した。プレートは37℃+5%CO2で一晩インキュベートした。それぞれのプレート上で、0.005ng/ml〜10μg/mlの最終濃度で、それぞれの抗体の滴定値をアッセイした。抗TNFa試薬を、100pg/mL(トリマーとして1.9pM)TNFaの一定濃度において、三連または六連までで、アポトーシス培地(2.5%FCS、5μg/mLのCHXをフェノールレッドを含まないDMEMに溶かしたもの)に希釈した。アポトーシス培地中にTNFaのみを含む6つのウェル、およびアポトーシス培地のみを含む6つのウェルも、インキュベートした。TNFa+/-中和抗体は、37℃+5%CO2で1時間または18時間プレインキュベートした。200μLのTNFa+/-中和抗体を細胞に移し、37℃+5%CO2で一晩インキュベートした。
【０２３５】
0.5μg/mLのPIおよび2.5μg/mLのヘキスト33342で1時間、細胞を染色した。アポトーシスの割合は、死んだ細胞の数(PI+ve)を計数し、細胞の合計数(ヘキスト+ve)で割ることによって測定した。MCF-7細胞を使用して中和をアッセイし、ヨウ化プロピジウムとヘキスト33342染色の比率として検出した。4つのパラメータ曲線の適合により、IC50値を生成させるために使用した中和抗体滴定曲線の一例は、図7および8に線グラフとして与える。
【０２３６】
表26に示す結果は、1時間または18時間のTNFと抗体のプレインキュベーション時間地点における、MCF-7細胞におけるTNFa誘導型アポトーシスのin vitro阻害の、異なる実験から得たデータの平均値である。長い18時間のプレインキュベーションによって、親和性の違いをさらに容易に見ることができる。なぜなら、抗体-抗原結合が平衡状態に近づくからである。299v2は、任意の完全ヒトモノクローナル抗体およびインフリキシマブの中で、最も低いIC50を示した。親和性と中和有効度の間の、強い相関関係も観察される。
【０２３７】
【表２６】
0004754219.tif 000033
0004754219.tif 000034
【０２３８】
アポトーシスの抗TNFa中和に関する平均IC50値の一例は、棒グラフとして図9に表す。図9が示すように、すべての抗体が、TNFa誘導型アポトーシスの強力な中和物質である。特に抗体299v2は、インフリキシマブ、アダリムマブまたはエタネルセプトより良い平均有効度を有するようである。
【０２３９】
表27は、TNFとの1時間のプレインキュベーション後の、ウサギR014モノクローナル抗体による、MCF-7細胞におけるTNFa誘導型アポトーシスの阻害を示す。
【０２４０】
【表２７】
0004754219.tif 000035
【０２４１】
ヒトWM266.4細胞におけるTNFa誘導型アポトーシスの阻害
IgG2kappaおよびλハイブリドーマを、前に記載したのと同様に、大量に培養し、精製し正確に測定した。イソ型変更したハイブリドーマ、およびXENOMAX(登録商標)由来IgG1組換え抗体を、前に記載したのと同様に、発現させ、精製し正確に測定した。ヒトWM266.4細胞に対するTNFa誘導型アポトーシスの生物学的影響を中和する、それらの能力に関して、抗体をさらにアッセイした。20,000個のWM266.6細胞を、96ウェルプレート中、完全培地(RPMI1640/10%FBS/Gln/P/S)中に平板培養し、一晩37℃/10%CO2でインキュベートした。培地を除去し、50μLの試験抗体およびTNFa(室温で30分プレインキュベートしたもの)を、無血清培地(RPMI1640/Gln/P/S)に加えた。50μLのシクロヘキサミドのプレートを、以下の最終的なアッセイ条件下で、前と同様に一晩インキュベートした。V=100μL、シクロヘキサミド=6μg/mL、トリマーとしてTNFa=600μg/mL=11.4pM、試験抗体濃度は、記載したように変わる。100μLのカスパーゼバッファーおよび0.3μLのカスパーゼ基質(APO-ONE、Promega)を、ウェル毎に加えた。励起波長@485nmおよび発光波長@530nmで、Victor Wallacにおいて、カスパーゼ活性を測定した。アポトーシスを中和する抗体の能力の一例は、図10に示す。図10は、抗TNFaの中和に関する平均IC50値を示す、棒グラフである。中和はヒトWM266細胞に行い、カスパーゼ活性は、TNFa誘導型アポトーシスの指標として測定した。抗体のIC50の計算は、図7の簡単な説明中に記載したのと同様に行った。
【０２４２】
対照は、TNFaおよびシクロヘキサミド単独による、アポトーシスの誘導を示す。他の対照には、ウサギ014抗体、およびインフリキシマブ、およびエタネルセプト代用物としてp75-hFc(R&D)があった。グラフは、TNFa誘導型アポトーシスの指標としてカスパーゼ活性を示す。図10において見ることができるように、SC299V1抗体とSC299V2抗体は互いに常に類似しており、R014以外に、263およびおそらく234は、インフリキシマブおよびp75-hFcより強力である。4.17IgG2、SC282および3.2IgG2は、p75-hFcより強力であった。図10によっても示されるように、すべての抗体は、TNFa誘導型アポトーシスの強力な中和物質であった。
【０２４３】
ヒト全血中のTNFa誘導型IL-8産生の阻害
ヒト全血の培養によって、細胞培養物または実験動物中には存在する可能性がない、本来存在する臨床関連の状態が再生される。全血培養を使用して、TNFa誘導型IL-8産生を中和するための、抗TNFa抗体の有効性を評価した。静脈穿刺によって正常なドナーから全血を得て、EDTAチューブに回収し、96ウェルプレートに平板培養した。抗TNFa抗体をRPMI培地に希釈し、全血と混合させた。無関係なヒトIgG1抗体を、対照として使用した。これに、TNFaの添加を続けた(最終濃度100pg/ml、トリマーとしてTNFaを考えると1.9pMに対応)。次いでプレートを、37℃で6時間インキュベートした。インキュベーションの後、TritonX-100を0.5%v/vの最終濃度で培養物に加えて、細胞溶解を引き起こした。IL-8産生はELISAによって測定した。結果を表すために、IgG1対照の存在下でTNFaによって誘導されたIL-8を、100%として設定した。表28は、阻害曲線(図11)を使用して計算した、抗TNFa抗体のIC50を報告する。299v2およびエタネルセプト代用物は、最も低いIC50および最高の有効度を示す。
【０２４４】
【表２８】
0004754219.tif 000036
【０２４５】
抗体依存性細胞仲介型細胞障害活性
抗TNFa抗体をアッセイして、PBMC、主にNK細胞によって仲介される、TNFaトランスフェクトCHO細胞の殺傷を支持する、それらの能力を測定した。簡潔には、ヒトPBMCを正常なドナーから得て、エフェクター細胞に加えて、1:100エフェクター/標的細胞の比率を生み出すように測定した濃度で再懸濁した。同時に、膜結合TNFaを安定して発現する、TNFaトランスフェクトCHO細胞を、膜染色液PKH-26で標識した。次いでCHO細胞を、5μg/ml抗体有りまたは無しで、三連で96ウェル皿に接種した。30分のインキュベーションの後、エフェクター細胞を加えて、ADCC反応を37℃で一晩進行させた。この時点で、三連のサンプルを集め、製造者の教示書に従い染色液TOPO-3で染色し、FACSによって分析した。PKH-26およびTOPO-3二重陽性細胞(死んだ標的細胞)とPKH-26単独陽性細胞(生きた標的細胞)の数の比率を計算し、これを使用して結果をパーセンテージとして表した。これらの結果は、モノクローナル抗体が、エタネルセプト代用物として使用した、p75-hFcとは著しい違いで、ADCCを支持する能力を有することを示す(表29)。
【０２４６】
補体依存性細胞障害活性
抗TNFa抗体を、補体を固定し、それによってTNFaトランスフェクトCHO細胞の殺傷を仲介する能力に関してもアッセイした。簡潔には、CHO細胞を125000/ウェルで96ウェルプレートに接種し、5μg/mlで抗体をまったく同様に加えた。氷上での3時間のインキュベーションの後、ウサギ補体を10%の最終濃度まで加え、CDC反応を室温で30分進行させた。この時点で、細胞を0.5pg/mlのPIおよび2.5μg/mlのヘキスト33342で1時間染色し、オートスコープを使用して計数した。実験は三連で行った。TNFa誘導型アポトーシスアッセイに関して前に記載したのと同様に、結果を計算し表した。ADCCの場合と同様に、これらの結果は、モノクローナル抗体が、エタネルセプト代用物として使用した、p75-hFcとは違い、CDCを刺激する能力を有することを示す(表29)。
【０２４７】
【表２９】
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【０２４８】
(実施例9)
IN VIVOでの抗HTNFa抗体の特徴付け。
マウスにおけるTNFa誘導型の肝臓損傷の阻害
抗ヒトTNFa抗体が、ヒトTNFaをin vivoで中和するかどうかを試験するために、マウスにおけるヒトTNFaおよびD-ガラクトサミン(D-Ga1N)投与によって誘導される肝臓損傷に対して保護する、抗ヒトTNFa抗体の能力を試験した(Lehmann V他、J.Exp.Med.、1987 165(3):657〜63)。TNFaおよびD-Ga1Nを投与することによって、ショックおよび死を最終的にもたらす、肝細胞の広範囲のアポトーシス死によって特徴付けられる、LPSおよびD-Ga1Nによって誘導される肝臓損傷と似た、劇症の肝臓損傷が誘導される。D-Ga1N処理によって、マウスは、リポ多糖(LPS)およびネズミTNFaの致死的影響に対して、100〜1000倍を超えて敏感になる(Lehmann V他、J.Exp.Med.、1987 165(3):657〜63)。LPSおよびD-Ga1Nによって誘導されるアポトーシス性肝臓損傷は、内因的に生成されるTNFaに依存することが示されてきている(Leist M他、Am.J Pathol.、1995、146(5):1220〜34)。この肝臓損傷がp55レセプターを介して分泌されるTNFaシグナルのみに依存することも実証されてきており(Nowak M他、Am.J.Physiol.2000、278(5):R1202〜9)、D-Ga1Nは、マウス中ではp55TNFaレセプターにのみ結合する、ヒトTNFaの致死的影響にも敏感であることが示唆される。hTNFaおよびD-Ga1Nによって誘導される肝臓損傷は、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)の血清酵素活性を測定することによって評価した。
【０２４９】
実験は記載するように行った。約20gの重量の、8〜10週齢のBalb/cメスマウスを、Charles River Laboratoriesから得た。1グループ当たり8〜10匹のマウスを使用した。投与の用量および経路、ならびに血清中のALTレベルを測定する時間は、予備実験において定義した。マウスには、ヒトTNF(R&D System)(1μg/マウス、静脈内)の90分前に、D-Ga1N(Sigma)(900mg/kg、腹腔内)を注射した。1μg/マウスのTNFの静脈内投与によって、19nMのTNFの循環レベルがもたらされた(TNFはトリマーとして考える)。肝細胞の損傷は、市販の診断キット(Sigma)を使用してALTを測定することによって、TNF/Ga1N投与後6時間で評価した。in vivoでTNFaを阻害する、299v2、263、エタネルセプト、アダリムマブおよびインフリキシマブの能力を比較するために、用量応答性の実験を、TNF(1μg/マウス、静脈内)の90分前に、抗TNF試薬(1〜10静脈内μg/マウス)を注射することによって行った。対照マウスには、TNFの前に生理食塩水を与えた。データは対照の割合として表し、中和曲線を作製した(図12)。IC50は4つのパラメータ適合曲線を使用して計算した。表30は、異なる実験から平均した、異なる抗TNF試薬に関するIC50を示す。
【０２５０】
マウスにおけるTNFa誘導型IL-6産生の阻害
in vivoでTNFaを阻害する抗TNFa抗体の能力を試験するための他の手法として、抗TNFa抗体を使用して、ヒトによってマウス中で誘導されるIL-6の産生を阻害した。TNFaは、IL-6の誘導を含めた、多くの急性の生物学的作用を引き起こす(Benigni他、J.Immunol.157:5563、1996)。1グループ当たり8〜10匹のマウスを使用した。時間行程の実験で最初に確定したように、ヒトTNFaをマウスに注射することによって、注射後2時間でピークに達する、血清IL-6レベルの急速な上昇が引き起こされる。TNFaの投与の用量および経路を定義することを目的とした、他の予備実験の結果に基づいて、1μg/マウスのヒトTNFをマウスに静脈内注射した。IL-6レベルは、市販のELISAキット(R&D System)を使用してTNFa投与後2時間で測定した。用量応答性の実験を、TNF(1μg/マウス、静脈内)の90分前に、抗TNF抗体(1〜10静脈内μg/マウス)を注射することによって行った。対照マウスには、TNFの前に生理食塩水を与えた。データは対照の割合として表し、中和曲線を作製した(図13)。IC50は4つのパラメータ適合曲線を使用して計算した。表30は、異なる実験から平均した、異なる抗TNF抗体に関するIC50を示す。
【０２５１】
【表３０】
0004754219.tif 000038
【０２５２】
(実施例10)
抗TNFa抗体の構造分析
前の表1に示した抗体の、可変部位重鎖および可変部位軽鎖を塩基配列決定して、それらのDNA配列を決定した。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を含めて、すべての抗TNFa抗体に関する完全な配列情報を、ここに提示した配列表中に示す。
【０２５３】
表31は、様々なXENOMAX(登録商標)由来の抗体の重鎖領域と、個々の生殖細胞系の重鎖領域を比較する表である。表32は、様々なXENOMAX(登録商標)由来の抗体の軽鎖領域と、個々の生殖細胞系の軽鎖領域を比較する表である。表33は、様々なハイブリドーマ由来の抗体の重鎖領域と、個々の生殖細胞系の重鎖領域を比較する表である。表34は、様々なハイブリドーマ由来の抗体の軽鎖領域と、個々の生殖細胞系の軽鎖領域を比較する表である。
【０２５４】
【表３１】
0004754219.tif 000039
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【０２５５】
【表３２】
0004754219.tif 000041
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【０２５６】
【表３３】
0004754219.tif 000043
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【０２５７】
【表３４】
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0004754219.tif 000050
【０２５８】
(実施例11)
カノニカルクラスの抗体の決定
Chothia他は、それぞれの免疫グロブリン鎖の超可変領域に関する「カノニカルクラス」という観点で、抗体構造を記載している(J Mol Biol.1987 Aug 20;196(4):901〜17)。様々な免疫グロブリンのFabおよびVL断片の原子構造を分析して、それらのアミノ酸配列とそれらの抗原結合部位の三次元構造の間の関係を決定した。Chothia他は、そのパッキング、水素結合中には、比較的少数の残基が存在し、あるいは異常なphi、psiまたはomegaの立体配座をとる能力は、超可変領域の主鎖の立体配座に主に原因があったことを見出した。これらの残基は、超可変領域内の部位、および保存型βシート骨格中に存在することが見出された。未知の構造を有する免疫グロブリンの配列を調べることによって、Chothia他は、多くの免疫グロブリンが、知られている構造の1つの大きさと大きさが類似しており、観察された立体配座の原因である部位に同一の残基をさらに含んでいた、超可変領域を有することを示す。
【０２５９】
彼らの発見によって、これらの超可変領域は、知られている構造中の立体配座に近い立体配座を有することが暗示された。超可変領域の5つに関しては、立体配座のレパートリーは、比較的少数の別個の構造クラスに限られるようであった。超可変領域の、これらの一般的に存在する主鎖の立体配座は、「正統構造」と名付けられた。Chothia他による他の作品(Nature.1989 Dec21〜28;342(6252):877〜83)、および他の作品(Martin他、J Mol Biol.1996 Nov15;263(5):800〜15)によって、抗体の6つの超可変領域の少なくとも5つの、主鎖の立体配座の少数のレパートリーが存在することが確認された。
【０２６０】
前に記載したそれぞれの抗体を分析して、それぞれの抗体の相補性決定領域(CDR)のカノニカルクラスを決定した。知られているように、カノニカルクラスは、抗体重鎖のCDR1およびCDR2、ならびに抗体軽鎖のCDR1、CDR2およびCDR3のみが割り当てられてきている。以下の表(35および36)は、分析の結果を要約するものである。カノニカルクラスのデータは、*HCDR1-HCDR2-LCDR1-LCDR2-LCDR3の形であり、前式で「HCDR」は重鎖CDRを指し、「LCDR」は軽鎖CDRを指す。したがって、例えば、1-3-2-1-5のカノニカルクラスは、カノニカルクラス1の範疇のHCDR1、カノニカルクラス3の範疇のHCDR2、カノニカルクラス2の範疇のLCDR1、カノニカルクラス1の範疇のLCDR2、およびカノニカルクラス5の範疇のLCDR3を有する抗体を指す。
【０２６１】
割り当ては個々のカノニカルクラスに行い、抗体のアミノ酸とそれぞれのカノニカルクラスに関して定義したアミノ酸の、70%以上の同一性が存在した。70%未満の同一性が存在した場合、カノニカルクラスの割り当ては星印(「*」)で表して、適切なカノニカルクラスの最良の評価が、それぞれのCDRの長さおよびデータ全体に基づいて行われたことを示す。それぞれの抗体に関して定義したアミノ酸は、例えば前に参照したChothia他の論文中に見ることができる。
【０２６２】
【表３５】
0004754219.tif 000051
0004754219.tif 000052
【０２６３】
(実施例12)
TNF-aエピトープに対する発現および結合アッセイによる、抗TNF-a抗体のドメイン分析
配列/領域分けの結果
可変(V)領域の免疫グロブリン鎖は、多数の生殖細胞系DNAセグメントによってコードされており、これらはB細胞個体発生中、機能的可変領域(VHDJHまたはVKJK)に接合している。TNF-aに対する抗体応答の、分子的および遺伝的多様性は、詳細に研究された。これらのアッセイによって、抗TNF-aに特異的ないくつかの点が明らかになった。TNF-aに特異的な65の個別の抗体の分析によって、13の生殖細胞系VH遺伝子が与えられ、そのうちの54個がVH3ファミリー由来であり、そのうちの34個はVH3-33遺伝子セグメントを使用した。最も多かった遺伝子、VH3-33生殖細胞系遺伝子は、分析した65個の抗体のうち34個中で発現され、結合(KappaA30とL2またはλ)と関係がある軽鎖の型と明らかな関係がある、2つの異なる領域に限られた。機能的抗体の選択および領域分けによって、特定の領域中の抗体は同じIgVHを発現したことが示され、いくつかの場合、同じVHDJHの再編成が示された。さらに、H鎖とL鎖の対は領域内で保存されたことも発見された。これらの発見によって、任意の所与のエピトープに関しては、生殖細胞系レパートリーのわずか数個のメンバーを使用して、対応するパラトープが形成され、それぞれの抗原エピトープに関しては、限られた数のL鎖およびH鎖遺伝子が対になって、特異的なパラトープを形成することができることが示唆される。
【０２６４】
ヒトTNF-a上の生物学的に関連があるエピトープの位置は、ヒトTNF-aに特異的なモノクローナル抗体と一組のキメラヒト/マウスTNF-a分子の、発現および結合アッセイによって評価した。前に記載した抗体は4つの主な領域グループの範疇に入り、いずれもhTNF-aの生物学的活性に不可欠ないくつかの部位と関係がある。TNF-aのN末端ドメインは、レセプター結合と関係があることが見出された。
【０２６５】
TNF-aレセプター結合ドメインとの直接的な結合によってTNF-a活性を中和する、第1グループの抗体では、すべての抗体が、分泌されたTNF-a分子の最初の36残基の配列を認識した。これらの結果によって、両方のレセプターが同じN末端領域と結合することが示された。Van Ostade他((1993)nature、361:266〜269)は、P75レセプター結合ドメインは分子のベースの環中に局在し、位置29および32における1つのアミノ酸置換は、p75レセプターとの結合活性を低下させたことを報告した。グループIの抗体(kappa鎖A30/JK4と結合したVH3-33/JH6b)はいずれも、カノニカルクラス1-3-2-1-1を有する。試験したすべての抗体は、Lys11およびArg31が存在する、最初の36残基との結合を示す。軽鎖としてのλと結合したVH3-33/Jh6bを発現する抗体は、異なる特異性を示した。
【０２６６】
Van Ostade他((1991)EMBO 10:827〜836)は、ランダムおよび位置指定突然変異誘発によって、4領域のアミノ酸32〜34、84〜91、117〜119および143〜148の完全性は、生物学的活性を維持するために重要であることを実証した。L2kappa鎖と結合したVH3-33/JH4bを使用する抗体は、TNF-a分子の異なる不連続なドメインを認識することが示された。これらの抗体はヒトTNF-aに非常に特異的であり、それらのエピトープは、TNFポリペプチドの異なる、非隣接位置に位置する残基の配列である
【０２６７】
第3グループの抗体は、モノクローナル抗体3.2などλ軽鎖と結合したVH3-33を使用する抗体を含む。このグループの結合部位は、残基1と残基91の間に存在する。G1n27とarg31の置換によって、ヒトTNF-aとの結合に影響を与えることはなかったが、N末端は、それらの生物学的活性に重要であるようであった。これらの結果は表36中に以下に与える。
【０２６８】
【表３６】
0004754219.tif 000053
0004754219.tif 000054
0004754219.tif 000055
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【０２６９】
(実施例13)
関節炎を治療するための、抗TNF-a抗体および抗体結合体の使用
関節炎を有するヒト患者における抗TNF-a抗体治療の、in vivoでの効果を測定するために、このようなヒト患者に、有効量の抗TNF-a抗体を一定量の時間注射する。治療中の定期的な時間で、ヒト患者を観察して、患者の関節炎が治療されているかどうか測定する。
【０２７０】
抗TNF-a抗体で治療した関節炎患者は、対照抗体で治療した関節炎患者と比較して、炎症を含めた低レベルの関節炎症状を有する。使用することができる対照抗体には、試験する抗TNF-a抗体と同じイソ型の抗体があり、さらに対照抗体は、TNFa抗原と結合する能力を有することができない。
【０２７１】
(実施例14)
診断用物質としての抗TNF-a抗体の使用
サンプル中のTNFa抗原の検出
サンプル中のTNFa抗原を検出するための、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を開発することができる。このアッセイでは、マイクロタイタープレート、96ウェルマイクロタイタープレートまたは384ウェルマイクロタイタープレートなどのウェルに、この抗原を対照とする第1の完全ヒトモノクローナル抗体を数時間吸着させる。固定された抗体は、試験サンプル中に存在する可能性がある任意の抗原用の、捕捉抗体として働く。ウェルを洗浄し、乳タンパク質またはアルブミンなどのブロッキング剤で処理して、検体の非特異的吸着を防ぐ。
【０２７２】
その後、抗原を含む疑いがある試験サンプル、または標準量の抗原を含む溶液で、ウェルを処理する。このようなサンプルは、例えば、病状を示すと考えられるレベルの循環抗原を有する疑いがある被験体由来の、血清サンプルであってよい。
【０２７３】
試験サンプルまたは標準を洗浄除去した後、ビオチンとの結合によって標識した、第2の完全ヒトモノクローナル抗TNFa抗体で、ウェルを処理する。標識した抗TNFa抗体は、検出抗体として働く。過剰な第2の抗体を洗浄除去した後、アビジン結合ホースラディシュペルオキシダーゼ(HRP)および適切な色原体基質で、ウェルを処理する。試験サンプル中の抗原の濃度は、標準サンプルから開発した標準曲線との比較によって測定する。
【０２７４】
このELISAアッセイは、試験サンプル中のTNFa抗原を検出するための、非常に特異的で非常に感度の良いアッセイを与える。
【０２７５】
患者中のTNFa抗原濃度の測定
サンドウィッチELISAを開発して、ヒト血清中のTNFaレベルを正確に測定する。このサンドウィッチELISAからの、2つの完全ヒトモノクローナル抗TNFa抗体は、TNFa分子上の異なるエピトープを認識する。ELISAは以下のように行う:50μLの捕捉抗TNFa抗体を、コーティングバッファー(0.1MのNaHCO3、pH9.6)に2μg/mLの濃度で溶かしたものを、ELISAプレート(Fisher)にコーティングする。4℃で一晩のインキュベーションの後、200μLのブロッキングバッファー(0.5% BSA、0.1% Tween20、0.01% Thimerosal、PBS中)で、25℃において1時間プレートを処理する。0.05% Tween20をPBSに溶かしたもの(洗浄バッファー、WB)を使用して、プレートを3回洗浄する。正常または患者血清(Clinomics、Bioreclaimation)を、50%ヒト血清を含むブロッキングバッファーに希釈する。プレートは血清サンプルと共に4℃で一晩インキュベートし、WBで洗浄し、次いで100μL/ウェルのビオチン化検出抗TNFa抗体と共に25℃で1時間インキュベートする。洗浄後、プレートをHRP-ストレプトアビジンと共に15分間インキュベートし、前と同様に洗浄し、次いで色を生成させるために、100μL/ウェルのo-フェニレンジアミンをH2O2に溶かしたもの(Sigma現像液)で処理する。反応は50μL/ウェルのH2SO4(2M)を用いて停止させ、492nmにおいてELISAプレートリーダーを使用して分析した。血清サンプル中のTNFa抗原の濃度は、4パラメータ曲線適合プログラムを使用して、精製したTNFa抗原の希釈液との比較により計算する。
【０２７６】
均等物
前に記載した本明細書は、当業者が本発明を実施するのを可能にするのに充分なものであると考えられる。前の記載事項および実施例は、本発明のいくつかの好ましい実施形態を詳細に述べ、本発明者によって企図される最良の形態を記載する。しかしながら、詳細な前述の記載事項が書物中にどのように表れようとも、本発明は多くの方法で実施することができ、添付の特許請求の範囲およびその任意の均等物に従って、本発明が解釈されるべきであることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０２７７】
【図１】ヒトWM266細胞におけるTNFa誘導型細胞アポトーシスの中和に対する、様々なハイブリドーマ由来の、ヒト抗TNFa結合抗体が有する影響を示す、棒グラフの図である。このグラフは、TNFa誘導型アポトーシスの測定値として、カスパーゼ活性を示す。
【図２】B細胞培養物上清中の抗体間の抗TNFa限定抗原結合と、対照抗体(4.17IgG2)の結合を、ある濃度範囲で比較する、点グラフの図である。三角形はB細胞培養物上清中のクローンを表し、ブロックは棒線の抗体(4.17IgG2)を表す。棒線の抗体曲線より上の位置の、B細胞培養物上清中のクローンは、潜在的に高い親和性を有するものとしてランク付けする。
【図３】ヒトMCF-7細胞におけるTNFa誘導型細胞アポトーシスを阻害する際の、様々なXENOMAX(登録商標)B細胞培養物上清の有効性を比較する、例示的な棒グラフの図である。
【図４】XENOMAX(登録商標)B細胞培養物上清により、ヒトMCF-7細胞におけるTNFa誘導型アポトーシスの中和に関して計算した、有効度の比較値を示す例示的な点グラフの図である。三角形はB細胞培養物上清の有効度を表し、一方で四角形は、棒線の対照、3.2IgG2の有効度を表す。
【図５】ELISAによる、可溶性ヒトTNFを発現した大腸菌との抗TNF試薬の結合の、線グラフの図である。
【図６】ELISAによる、可溶性カニクイマカークザルTNFを発現した大腸菌との、抗TNF試薬の結合および交差反応の線グラフの図である。
【図７】IC50値を生成させるために使用した抗TNFa抗体の滴定曲線の中和の一例を示す、例示的な線グラフの図である。抗TNFa試薬は、37℃で1時間、100pg/mlのTNFaと共にプレインキュベートした。MCF-7細胞を使用して中和をアッセイし、ヨウ化プロピジウムとヘキスト33342染色の比率として検出した。
【図８】IC50値を生成させるために使用した抗TNFaの滴定曲線の中和の一例を示す、例示的な線グラフの図である。抗TNFa抗体は、37℃で18時間、100pg/mlのTNFaと共にプレインキュベートした。MCF-7細胞を使用して中和をアッセイし、ヨウ化プロピジウムとヘキスト33342染色の比率として検出した。
【図９】抗TNFaの中和に関する平均IC50値を示す、棒グラフの図である。中和およびIC50の計算は、図8の簡単な説明中に記載したのと同様に行った。
【図１０】抗TNFaの中和に関する平均IC50値を示す、棒グラフの図である。中和はヒトWM266細胞に行い、カスパーゼ活性は、TNFa誘導型アポトーシスの指標として測定した。抗体のIC50の計算は、図7の簡単な説明中に記載したのと同様に行った。
【図１１】ELISAによって測定した、TNFによるIL-8誘導の阻害に関する全血アッセイを表す、線グラフの図である。滴定曲線を使用して、IC50値を生成させた。
【図１２】抗TNF試薬を使用するTNFa誘導型肝不全のin-vivoでの阻害の、例示的な線グラフの図である。TNFaおよびD-GaINによって誘導された肝臓の損傷を、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)の血清酵素活性を測定することによって評価した。滴定曲線を使用して、IC50値を生成させた。
【図１３】抗TNF試薬を使用しELISAによって測定した、TNFa誘導型IL-6のin-vivoでの阻害の、例示的な線グラフの図である。滴定曲線を使用して、IC50値を生成させた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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