(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
食品中の微生物数の迅速測定に供する食品試料の前処理方法であって、液状の食品試料を3900×ｇ〜6500×ｇで１分間以上または1300×ｇ〜5200×ｇで３分間以上または300 ×ｇ〜2900×ｇで５分間以上遠心分離し、その沈殿の懸濁液を孔径１μｍ〜５μｍの多孔性フィルムからなるフィルタであるトラックエッチドメンブレンフィルタに通した後に、その濾過液を食品試料として迅速測定に供することを特徴とする、微生物数迅速測定用食品試料の前処理方法。
【請求項２】
微生物数の迅速測定方法が、ＡＴＰ法である、請求項１に記載の前処理方法。
【請求項３】
微生物数の迅速測定方法が、微生物を蛍光標識する原理による方法である、請求項１に記載の前処理方法。
【請求項４】
多孔性フィルムの孔径が２μｍ〜３μｍである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の前処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品中の微生物数を迅速に測定する際に、 精度の高い測定値を得るための食品試料の前処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
食品衛生法に基づく成分規格は、「食品、添加物等の規格基準」として食品別に定められ、それぞれに菌数 (生菌総数、大腸菌群、大腸菌、乳酸菌、芽胞菌、腸球菌、緑膿菌、食中毒菌など) の上限が定められている。また、成分規格以外の製造基準、調理基準、保存基準、加工基準などにも同様に微生物数の規格が定められている。これら微生物数の規格のうち、生菌総数は一般生菌数とも呼ばれ、国際的に広く支持されている。
生菌総数の測定法は、一般的には、平板法と呼ばれる、標準寒天培地を用いて３５℃、４８〜７２時間、有酸素 (好気性) の条件で培養して得られる微生物の総集落数をもって把握する方法が用いられている。
しかし、この方法は、微生物の増殖をモニターする試験であるため、検査に要する時間が長く、惣菜などの腐敗し易く、製造直後に出荷する食品については、汚染が発生した場合に迅速な対応が取れないと言う欠点があった。
【０００３】
そのような背景から、平板法に替わる、 一般生菌数の迅速測定法が多方面より提案されている。例えば、微生物中のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の発光量（相対発光量：Relative Light Unit, RLU）をルミノメータにて測定し、これから微生物数を算出するＡＴＰ法が知られている。しかしながら、ＡＴＰは微生物中のみならず、食材中にも大量に含有されているので、通常のＡＴＰ法では、食材中のＡＴＰを除去する前処理を行わない限り、バックグラウンド値が高すぎて実用的ではないという欠点があった。
【０００４】
そこで、ＡＴＰ法において食材中のＡＴＰをＡＴＰ分解酵素によって除去してから、細菌細胞膜を溶解して菌体内ＡＴＰを溶出させ、ホタルルシフェラーゼによってＡＴＰの発光反応を行うという方法も提案されている（非特許文献１参照）。しかしながら、この方法でＡＴＰの消去操作を行ってもなお、ＡＴＰ測定値のバックグラウンド値が１０3 ＲＬＵ以上の高い値を示すことが多く、実用的には問題点が多かった。
【非特許文献１】ルシフェールＨＳセット（キッコーマン株式会社製）パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明はこのような従来の実状に鑑みてなされたものであり、本発明の課題は、食品中の微生物数を迅速かつ高精度で測定するために、迅速かつ簡便に食材由来の定量阻害成分を食品試料から有効に除去する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者等は、迅速かつ簡便に食材由来の定量阻害成分を食品試料から有効に除去する方法について研究を重ねた結果、 食材由来の可溶性成分、あるいは細菌よりも小さな夾雑物を遠心分離で除去し、細菌よりも大きな夾雑物を特定のフィルタで除去することにより、 上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
即ち、本発明は、「食品中の微生物数の迅速測定に供する食品試料の前処理方法であって、液状の食品試料を3900×ｇ〜6500×ｇで１分間以上または1300×ｇ〜5200×ｇで３分間以上または300 ×ｇ〜2900×ｇで５分間以上遠心分離し、その沈殿の懸濁液を孔径１μｍ〜５μｍの多孔性フィルムからなるフィルタであるトラックエッチドメンブレンフィルタに通した後に、その濾過液を食品試料として迅速測定に供することを特徴とする、微生物数迅速測定用食品試料の前処理方法」を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明を適用することで、迅速かつ高精度に食品中の一般生菌数を把握することが可能となる。この事により、食品の衛生状態の検査時間が飛躍的に短縮され、これまで生鮮食品をいち早く出荷したいとする当該業界の要望に応えることができ、高い衛生状態の食品を消費者に確実に提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明の微生物数迅速測定用食品試料の前処理方法を、その好ましい実施形態に基づいて説明する。
本発明において微生物数の測定対象の食品としては、その種類が制限されるものではないが、本発明で前処理される食品試料は、液状である必要がある。固形食品においては、該食品試料として、例えば、固形食品に滅菌蒸留水などを添加した後、ストマッカー（登録商標、宝産業株式会社製の均質化機）やホモジナイザーなどでホモジナイズした懸濁液を調製する。該懸濁液中の固形物濃度は、１〜５０質量％程度とするとよく、より好ましくは５〜２０質量％である。
液状食品においては、そのまま上記食品試料として用いてもよく、必要に応じて適宜希釈して用いてもよい。
【００１０】
上記食品試料の遠心分離は、2900×g 以上で１分間以上、好ましくは3900×g 〜6500×g で１分間以上、または、1300×g 〜5200×g で３分間以上、好ましくは2000×g 〜3900×g で３分間以上、または、300 ×g 〜2900×g で５分間以上、好ましくは700 ×g 〜2000×g で５分間以上、行うことが好ましい。ローターの回転数は半径によって異なる。例えば、半径7.2cm のローターを使用した場合は、6000ｒｐｍ以上で１分間以上、好ましくは7000ｒｐｍ〜9000ｒｐｍで１分間以上、または、4000ｒｐｍ〜8000ｒｐｍで３分間以上、好ましくは5000ｒｐｍ〜7000ｒｐｍで３分間以上、または、2000ｒｐｍ〜6000ｒｐｍで５分間以上、好ましくは3000ｒｐｍ〜5000ｒｐｍで５分間以上となる。
【００１１】
遠心分離した後、上清を除去し、得られた沈殿の懸濁液を調製する。該沈殿の懸濁液は、再び、上記の「遠心分離、上清の除去、得られた沈殿の懸濁液の調製」を繰り返す、洗浄工程を加えるのが好ましく、該洗浄工程は複数回加えるのがさらに好ましい。
上記沈殿の懸濁液については、特に制限はないが、遠心分離操作の前後でその沈殿濃度が変わらないように調製するのが好ましい。
【００１２】
こうして得られた沈殿の懸濁液を、孔径１μｍ〜５μｍ、好ましくは２μｍ〜３μｍの多孔性フィルムからなるフィルタにより濾過する。該多孔性フィルムの材質は特に制限されないが、厚みは、好ましくは６μｍ〜１１μｍである。
斯かる多孔性フィルムからなるフィルタとしては、市販のトラックエッチドメンブレンフィルタ（以下、ＴＥフィルタと称する）を用いることができ、例えば、日本ミリポア社製のアイソポア（登録商標）ＴＥフィルタを好適に用いることができる。
濾過方法としては、加圧法、吸引法、遠心濾過法などが用いられるが、特に制限はない。
【００１３】
上記濾過により得られた濾過液を食品試料として迅速測定に供する。該濾過液は、微生物由来の成分のみが含まれているので、各種迅速測定法の測定試料として供することによって、平板培養法で測定したときとほぼ同じ、精度の高い測定値を得ることができる。
本発明の方法により前処理された食品試料を適用できる迅速測定法に特に制限はなく、ＡＴＰ法や微生物を蛍光標識する原理による方法を好適に適用することができ、例えばＡＴＰ法の場合、常法どおり、ルシフェラーゼとルシフェリンなどの発光試薬を添加し、ルミノメータでＡＴＰ発光量を測定すればよい。
【実施例】
【００１４】
以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されず、様々な実施形態が可能であり、本発明は本明細書および図面に開示の思想に従ったものであるかぎり、すべての実施形態を包含することは理解されるべきである。
【００１５】
試験用菌株の準備
市販のほうれん草白和えから分離し、簡易同定キットにより同定したLeuconostoc 属株（以下、 菌株と称する）を用意し、トリプソーヤブイヨン培地(TSB）で３５℃、一昼夜培養した培養液を適宜希釈して用いた。
【００１６】
実施例１〜４および比較例１〜４
遠心分離およびＴＥフィルタ濾過を組合せた前処理法による生菌数判別評価
ほうれん草白和え１０ｇに９０ｍｌの０．１％ペプトン水を加え、ストマッカー（登録商標、宝産業株式会社製の均質化機）により処理し、１０％懸濁液を調製した。該懸濁液に、菌株を表１に示す量添加したものを試料液として用いた。各試料液１ｍｌを遠心分離チューブに採り、680 ×g （3000ｒｐｍ）で５分間（室温）遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿を洗浄するために、沈殿を０．１％ペプトン水１ｍｌで懸濁して再び同条件で遠心分離した後、上清を除去し、得られた沈殿を再懸濁した。この洗浄操作をもう一度繰り返した後、洗浄後の懸濁液を孔径３μｍの市販のＴＥフィルタ（日本ミリポア社製 ISOPORE(R) TSTPフィルタ）で濾過した（濾過方法：加圧法）。得られた濾過液を食品試料としてＡＴＰ法に供し、該濾過液のＡＴＰ発光量をルミテスターC-100 （キッコーマン株式会社製）にて測定した。
また、比較例として、ほうれん草白和え１０ｇに９０ｍｌの滅菌蒸留水を加え、ストマッカーにより処理して調製した１０％懸濁液に、菌株を表１に示す量添加したものを、遠心分離およびＴＥフィルタ濾過による前処理を行うことなく、そのまま試料液としてＡＴＰ法に供し、該試料液のＡＴＰ発光量をルミテスターC-100 にて測定した。また、実施例１〜４で用いた遠心分離処理前の試料液の生菌数および比較例１〜４で用いた試料液の生菌数を平板培養法で測定した。
これらの測定結果を表１に示す。また、それぞれの生菌数と発光量の相関を評価した結果を図１および図２に示す。図１が実施例１〜４の結果であり、図２が比較例１〜４の結果である。
【００１７】
【表１】
0004685528.tif 000002
【００１８】
この結果、遠心分離およびＴＥフィルタ濾過を組合せた前処理法を用いたＡＴＰ法の測定結果（実施例１〜４の結果）は、前処理を行わないＡＴＰ法の測定結果（比較例１〜４の結果）に比べ、平板培養法で測定した生菌数との相関が高いことが確認された。
【００１９】
実施例５〜８
試料前処理方法の他の食品への適用性の検討
ポテトサラダについて実施例１〜４と同様の手順で、ＡＴＰ発光量および平板培養法による生菌数を測定した。その測定結果を表２および図３に示す。
【００２０】
【表２】
0004685528.tif 000003
【００２１】
この結果、ポテトサラダにおいても、遠心分離およびＴＥフィルタ濾過を組合せた前処理法を用いたＡＴＰ法によるＡＴＰ発光量の値は、生菌数と高い相関があることが確認された。
【００２２】
実施例９〜１２および比較例５〜８
蛍光による測定における前処理の評価
菌株を表３に示す量添加した以外は、実施例１〜４と同様にして、前処理した濾過液を得た。得られた濾過液について、Molecular Probes社製 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability キットを用いて、蛍光による菌数測定を行った。
また、比較例として、ほうれん草白和え１０ｇに９０ｍｌの滅菌蒸留水を加え、ストマッカーにより処理して調製した１０％懸濁液に、菌株を表３に示す量添加したものを、遠心分離およびＴＥフィルタ濾過による前処理を行うことなく、そのまま試料液として、前記キットを用いた蛍光による菌数測定に供した。また、実施例９〜１２で用いた遠心分離処理前の試料液の生菌数および比較例５〜８で用いた試料液の生菌数を平板培養法で測定した。
これらの測定結果を表３に示す。
【００２３】
【表３】
0004685528.tif 000004
【００２４】
この結果、 特に比較例６〜８の場合は蛍光量が測定限界を越えており測定不能であったことからも、本発明の方法を用いて前処理をした食品試料（実施例９〜１２の濾過液）は、前処理を施さずに測定した場合（比較例５〜８の場合）に比べ蛍光量が低減し、平板培養法で測定した生菌数との相関が高いことが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例１〜４における生菌数とＡＴＰ発光量の相関を評価した結果を示すグラフである。
【図２】比較例１〜４における生菌数とＡＴＰ発光量の相関を評価した結果を示すグラフである。
【図３】実施例５〜８における生菌数とＡＴＰ発光量の相関を評価した結果を示すグラフである。
【図１】
0004685528.tif 000005
【図２】
0004685528.tif 000006
【図３】
0004685528.tif 000007