(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
粘膜投与のためのワクチンであって、
Ａ）１０２〜１０８ｂｐのサイズの二本鎖ＲＮＡ；および
Ｂ）インフルエンザウイルスのＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＳ２からなる群より選択される少なくとも１つのサブユニットを含むインフルエンザウイルスのサブユニット抗原、または
百日咳菌の不活化抗原、
を含む、ワクチン。
【請求項２】
前記粘膜は、鼻の粘膜を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記Ａ）対前記Ｂ）の重量比が１：１〜１０：１である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記二本鎖ＲＮＡは、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
前記サブユニットは、少なくともＮＡまたはＨＡを含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
前記二本鎖ＲＮＡは、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
ヒトを除く動物の感染疾患を予防するための方法であって、
Ａ）粘膜投与のためのワクチンであって、
ａ）１０２〜１０８ｂｐのサイズの二本鎖ＲＮＡ；および
ｂ）インフルエンザウイルスのＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＳ２からなる群より選択される少なくとも１つのサブユニットを含むインフルエンザウイルスのサブユニット抗原、または
百日咳菌の不活化抗原、
を含む、ワクチンを、少なくとも１回粘膜投与する工程を包含する、方法。
【請求項８】
前記ワクチンの投与は、少なくとも２回行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ワクチンの投与は、間隔が少なくとも１週間以上である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記二本鎖ＲＮＡは、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
感染疾患を予防するためのワクチンキットであって、
Ａ）粘膜投与のためのワクチンであって
ａ）１０２〜１０８ｂｐのサイズの二本鎖ＲＮＡ；および
ｂ）インフルエンザウイルスのＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＳ２からなる群より選択される少なくとも１つのサブユニットを含むインフルエンザウイルスのサブユニット抗原、または
百日咳菌の不活化抗原、
を含む、ワクチン；ならびに
Ｂ）該ワクチンを、少なくとも１回粘膜投与することを指示する指示書、
を備える、キット。
【請求項１２】
前記ワクチンの投与は、少なくとも２回行われる、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記ワクチンの投与は、間隔が少なくとも１週間以上である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
前記二本鎖ＲＮＡは、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含む、請求項１１に記載のキット。
【請求項１５】
ａ）１０２〜１０８ｂｐのサイズの二本鎖ＲＮＡ；および
ｂ）インフルエンザウイルスのＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＳ２からなる群より選択される少なくとも１つのサブユニットを含むインフルエンザウイルスのサブユニット抗原、
または百日咳菌の不活化抗原の、インフルエンザウイルスおよび百日咳菌からなる群より選択される病原体による感染を予防するための粘膜投与ワクチンの製造のための使用。
【請求項１６】
前記二本鎖ＲＮＡは、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含む、請求項１５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ワクチン構成に関する。より詳細には、二本鎖ＲＮＡをアジュバントとして用いた新規ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
現行の認可ワクチンには、以下のような限界がある。例えば、インフルエンザウイルス（特にＡ型インフルエンザウイルス）では抗原変異が顕著に生じ、それまでのワクチン（すなわち、それまでに獲得された感染）により生じている抗体では中和されないウイルスが発生することが頻繁であり、ワクチンの効力が一シーズンのみに終わることが多い。また、表面糖タンパク質（ヘマグルチニン［赤血球凝集素；ＨＡ］およびノイラミニダーゼ［ＮＡ］）をコードする遺伝子の点突然変異（抗原連続変異）、抗原の不連続変異により免疫学的に異なる新規の株が生じることが頻繁にある。なお、この場合、内部タンパク質は連続変異株および不連続変異株内でも比較的高度に保存される。現行のワクチンによる免疫は、細胞性免疫を基礎にした異種株間共通免疫ではなく、同種株液性免疫を引き出すに過ぎないことから、流行する株とワクチンの株とが異なると効果は減弱することになる。
【０００３】
あるいは、インフルエンザウイルスの優勢流行株が、ある年からその翌年にかけて有意に不連続変異または連続変異しない場合でも、抗体力価が低減するため、免疫は毎年実施しなければならないという欠点もある。血球凝集阻止（ＨＩ）および中和の抗体は数か月から数年存続し、その後次第に低減することが報告されている。しかし、そのような低減が見られない場合でも、年に１度の接種が推奨されている。なぜなら、ワクチン接種後その年内に抗体力価が低減する可能性があるからである。
【０００４】
ワクチンの有効性には改良の余地が有る。なぜなら、次シーズンのワクチンの開発は、次の流行株を予測することに依存する。従って、このような予測には不正確性が伴い、ワクチン用に用いる株と実際に野外で流行するものとが適合しないということが起こり得る。また、新型株が生じる場合は、例えば、１９９２〜１９９３年のインフルエンザシーズン中に起きたように、新規のＨ３Ｎ２株（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／９２）の出現に対して、予測されたワクチンは無効であることが多い。新型ウイルスは、インフルエンザシーズンの後期になってから臨床的に明らかになることが多く、現状では、認可ワクチンの製造および調剤に時間を要するために、既存のワクチンによる防御が不十分である場合が多い。仮にワクチンの株と流行株とがよく適合した場合でも、認可ワクチンは小児および青年の約７０％、高齢者の３０〜４０％の疾患を予防するに過ぎないといわれている。
【０００５】
従来のワクチンでは特に、粘膜（例えば鼻腔）免疫を行うことはほとんど不可能であり、特に、インフルエンザウイルスなどで主流である皮下接種型の現行の不活化ワクチン、成分ワクチンなどでは、粘膜免疫を惹起できないことがわかっており、そのような粘膜免疫を惹起し得るワクチン組成物が渇望されている。
【０００６】
また、従来のワクチンでは株間でさえ交叉免疫を惹起し得ないことから、少なくとも株間あるいはサブタイプ間でも交叉免疫を惹起し得るワクチンの開発もまた渇望されている。Ａ株２種およびＢ株１種の混合物が主流であるインフルエンザワクチンでは、特に、予測が不要になるか少なくとも低減されるようなワクチンの開発も渇望されている。
【０００７】
さらに、ワクチンとして簡便な接種法である粘膜接種で有効なワクチンもまた渇望されている。これは、特にインフルエンザウイルスなどでは、現在行われていないことから、集団免疫を容易にする意味からもその解決策の登場が待ち望まれている。あるいは、抗体持続期間が増大するようなものもまた渇望されている。  
【０００８】
非特許文献１（Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１１０（８），１１７５−１１８４，（２００２））は、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をアジュバンとするＵＶ不活化ｗｈｏｌｅ（全体）インフルエンザウイルスを気道経路で投与したことが開示されている。しかし、ＩｇＧ抗体の上昇はＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を加えない場合と差が無いことが非特許文献１の図２に示されている。したがって、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）はアジュバントとしてはそれほど有効ではないことが示唆されている。また、抗体を上昇させるためには短鎖のリン脂質を併用することが記載されている。
【０００９】
非特許文献２（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，１０（１０），７５０−７５９（１９７１））および非特許文献３（Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏ１．，１０（１０），７６０−７６９，（１９７１））は、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をアジュバントとする不活化ワクチニアウイルスを経鼻接種することが記載されている。しかし、非特許文献２は、涙液中のＩｇＡ抗体産生が増加することを記載するが、感染予防効果には言及していない。
【００１０】
特許文献１（特公昭５０−２００９号（ＵＳ３９０６０９２）Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ）は、吸着型アジュバントにポリヌクレオチド（Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含む）を加えることにより、インフルエンザワクチンの抗体反応を増進させることを開示している。しかし、特許文献１は、感染予防効果には言及していない。
【００１１】
非特許文献４（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，８８（４），３２５−３３８，（２００２））は、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をアジュバントとする不活化ワクチンを腹腔内接種後、ＩｇＧ，ＩｇＭの有為な上昇を報告するが、鼻腔などへの粘膜投与での効果は示されておらず、しかも、感染予防効果には言及していない。
【００１２】
非特許文献５（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．＆  Ｍｅｄ．，１３３，３３４−３３８（１９７０））は、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をアジュバントとして羊赤血球を静注して免疫する時、血中抗体が上昇することを報告しているが、感染予防効果には言及していない。
【００１３】
非特許文献６（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４９，９８１−９８８（１９９２））は、コレラ毒素のアジュバントとしての可能性を記載するが、二本鎖ＲＮＡについてはなんら記載していない。
【特許文献１】特公昭５０−２００９号
【非特許文献１】Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１１０（８），１１７５−１１８４，（２００２）
【非特許文献２】Ｉｎｖｅｓｔ，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．，１０（１０），７５０−７５９（１９７１））
【非特許文献３】Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏ１．，１０（１０），７６０−７６９，（１９７１）
【非特許文献４】Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，８８（４），３２５’３３８，（２００２）
【非特許文献５】Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．＆  Ｍｅｄ．，１３３，３３４−３３８（１９７０）
【非特許文献６】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４９，９８１−９８８（１９９２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述のような状況の中、本発明は、粘膜投与するとき、従来のアジュバント以上にアジュバント能を有し、株を越えた防御反応を提供し得るアジュバントを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記課題は、サブユニット抗原とともに用いた場合、二本鎖ＲＮＡ（例えば、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））が予想外に上記能力を有していることを見いだしたことによって解決された。
【００１６】
上述のように、現行の不活化インフルエンザＨＡワクチンは、有効なワクチンであるが、インフルエンザウイルスの進入門戸である呼吸器粘膜上皮でのＩｇＡ抗体の誘導は低いことから、これを改善することにより、さらに効果が増強できると考えられる。
【００１７】
そこで、マウスのインフルエンザモデルにおいてアジュバント併用経鼻ワクチンを用いて気道粘膜に交叉反応性の高い分泌型ＩｇＡ抗体を産生させることを試みた。アジュバントとしてコレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ＊）を用い良好な結果が得られた。しかし、ヒトでの経鼻投与を考えた場合、コレラ毒素は顔面神経麻痺などの副作用が報告されていることから、コレラ毒素を用いたアジュバントを使用せずに、ＩｇＧ抗体を誘導できたならば、より安全なワクチンになると考えられる。ＩｇＡは、補体系の第２経路を活性化し、粘膜感染における局所免疫反応に重要な働きを持つが、そのＩｇＡの血漿中半減期は５〜6日であり、新たに置き換えられていることから、例えば涙液中のＩｇＡが増加したとしても感染予防効果まで予測できないと考えられる。
【００１８】
そこで、生態の微生物成分を認識し、自然免疫系を刺激するＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）のあるリガンドが安全性に優れていて、粘膜ワクチンの強力なアジュバントになり得る可能性があるかを検討したところ、予想外の感染防御効果を示す粘膜投与ワクチンを得ることができた。
【００１９】
従って、本発明は、以下を提供する。
（１）  粘膜投与のためのワクチンであって、
Ａ）二本鎖ＲＮＡ；および
Ｂ）病原体のサブユニット抗原または不活化抗原、
を含む、ワクチン。
（２）  上記粘膜は、鼻の粘膜を含む、項目１に記載のワクチン。
（３）  上記病原体は、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、風疹ウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳウイルス）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌およびコレラ菌からなる群より選択される、項目１に記載のワクチン。
（４）  上記病原体は、インフルエンザウイルスである、項目１に記載のワクチン。
（５）  上記サブユニットは、インフルエンザウイルスのＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＳ２からなる群より選択される少なくとも１つのサブユニットを含む、項目１に記載のワクチン。
（６）  上記二本鎖ＲＮＡは、分泌型ＩｇＡを産生するに十分な濃度で存在する、項目１に記載のワクチン。
（７）  上記二本鎖ＲＮＡは、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、項目１に記載のワクチン。
（８）  上記二本鎖ＲＮＡのサイズは、１０２〜１０８ｂｐである、項目１に記載のワクチン。
（９）  上記サブユニットは、少なくともＮＡまたはＨＡを含む、項目１に記載のワクチン。
（１０）  上記二本鎖ＲＮＡは、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含む、項目１に記載のワクチン。
（１１）  感染疾患を予防するための方法であって、
Ａ）粘膜投与のためのワクチンであって、
ａ）二本鎖ＲＮＡ；および
ｂ）病原体のサブユニット抗原または不活化抗原、
を含む、ワクチンを、少なくとも１回粘膜投与する工程を包含する、方法。
（１２）  上記ワクチンの投与は、少なくとも２回行われる、項目１１に記載の方法。
（１３）  上記ワクチンの投与は、間隔が少なくとも１週間以上である、より好ましくは３週間以上である、項目１１に記載の方法。
（１４）  上記二本鎖ＲＮＡは、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含む、項目１１に記載の方法。
（１５）  感染疾患を予防するためのワクチンキットであって、
Ａ）粘膜投与のためのワクチンであって
ａ）二本鎖ＲＮＡ；および
ｂ）病原体のサブユニット抗原または不活化抗原、
を含む、ワクチン；ならびに
Ｂ）上記ワクチンを、少なくとも１回粘膜投与することを指示する指示書、
を備える、キット。
（１６）  上記ワクチンの投与は、少なくとも２回行われる、項目１５に記載のキット。
（１７）  上記ワクチンの投与は、間隔が少なくとも１週間以上である、より好ましくは３週間以上である、項目１５に記載のキット。
（１８）  上記二本鎖ＲＮＡは、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含む、項目１５に記載のキット。
（１９）  二本鎖ＲＮＡの、ワクチンの粘膜投与のための使用。
（２０）  上記二本鎖ＲＮＡは、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含む、項目１９に記載の使用。
（２１）  二本鎖ＲＮＡの、粘膜投与のためのワクチンの製造のための使用。
（２２）  上記二本鎖ＲＮＡは、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含む、項目２１に記載の使用。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により、粘膜投与により簡単にワクチン接種し、かつ、交叉免疫性を得ることができるワクチン形態が提供される。これにより、例えば、インフルエンザウイルスでは、流行株を予測しなくても、有効なワクチンを製造することができ、効率よい予防対策を講じることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下に本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００２２】
（定義）
本明細書において「ワクチン」とは、身体中に投与されて、活性な免疫を生成する、通常感染性因子または感染因子のある部分を含む抗原性懸濁液または溶液をいう。ワクチンを構成する抗原性部分は、微生物（例えば、ウイルスまたは細菌など）または微生物から精製された天然の産生物、合成生成物または遺伝子操作したタンパク質、ペプチド、多糖または同様な産生物であり得る。生ワクチンとしては、例えば、ＢＣＧ、種痘、ポリオ、水痘、はしか、風疹、おたふくかぜ、牛疫、ＮＤＶ、マレック病などが挙げられるがそれらに限定されない。不活化ワクチンとしては、百日咳、ジフテリア（トキソイド）、破傷風（トキソイド）、インフルエンザ、日本脳炎などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００２３】
本明細書において「不活化抗原」とは、ワクチン用抗原として使用される、感染能を失わせた抗原をいい、完全ウイルス粒子であるビリオン、不完全ウイルス粒子、ビリオン構成粒子、ウイルス非構造タンパク質、感染防御抗原、中和反応のエピトープなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において「不活化抗原」とは、感染力を失わせるが免疫原性を保持させた抗原をいい、そのような抗原がワクチンとして使用されるときは、「不活化ワクチン」という。そのような不活化抗原としては、例えば、物理的（例えば、Ｘ線照射、熱、超音波）、化学的（ホルマリン、水銀、アルコール、塩素）などの操作により不活化されたものが挙げられるがそれらに限定されない。サブユニット抗原自体も、通常感染力が喪失されていることから、不活化抗原の定義内に入る。あるいは、死滅したウイルスを使用してもよい。
【００２４】
本明細書においてウイルスの「サブユニット抗原」とは、「成分」ともいい、そのようなサブユニット抗原は、天然のウイルスなどの病原体から精製してもよく、合成または組換え技術により作製してもよい。そのような方法は当該分野において周知であり、慣用されるものであり、市販される機器、試薬、ベクターなどを用いて実施することができる。例えば、インフルエンザウイルスでは、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、マトリクス（Ｍ１、Ｍ２）、非構造（ＮＳ）、ポリメラーゼ（ＰＢ１、ＰＢ２：塩基性ポリメラーゼ１および２、酸性ポリメラーゼ（ＰＡ））、核タンパク質（ＮＰ）などの、粒子の表面にでている分子であることが好ましい。現在ＨＡは１５種類、ＮＡは９種類が知られており、これが変わると新しい株が生まれ得る。
【００２５】
本明細書において「アジュバント」とは、投与された免疫原と混合するとき、免疫応答を増加するか、あるいはそうでなければ変更する物質である。
【００２６】
本明細書において「ＣＴ」または「コレラ毒素」とは、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）の産生する外毒素で、コレラ菌感染による下痢症状の原因物質をいう。コレラ毒素は、有効なアジュバントとして使用されているが、その毒性のために臨床応用はされていない。従って、通常ＣＴは、ワクチンの有効なアジュバントを探索する際のポジティブコントロールとして使用される。
【００２７】
本明細書において「二本鎖ＲＮＡ」とは、任意の二本鎖のＲＮＡをいう。そのサイズは、たとえば、ゲル電気泳動などで測定され得る。従来二本鎖ＲＮＡをワクチンのアジュバントとして用いる試みはなされているが、ワクチンが感染防御に有効であったという報告はほとんどなされていない。そのような二本鎖ＲＮＡとしては、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、Ｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ）、Ｐｏｌｙ（Ｇ：Ｃ）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００２８】
本明細書において「Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）」とは、ポリイノシン酸（ｐＩ）とポリシチジン酸（ｐＣ）とを含む二本鎖ＲＮＡであり、上述の二本鎖ＲＮＡの範囲内に入る。
【００２９】
本明細書では、不活化抗原またはサブユニット抗原のいずれもがその抗原として用いられ得る。
【００３０】
本明細書において「粘膜投与」とは、粘膜を経由する投与形態をいう。本明細書において「粘膜」とは、脊椎動物において、消化器、呼吸器、泌尿生殖器など特に外通性の中腔器官の内壁をいう。従って、そのような粘膜投与としては、例えば、鼻腔投与（経鼻投与）、口腔投与、膣内投与、上気道投与、肺胞投与などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、鼻腔投与が有利である。鼻腔は特に、インフルエンザウイルスなどの呼吸器系感染疾患の感染経路でもあることから、粘膜投与によりＩｇＡ反応を引き起こすことも可能であるからである。
【００３１】
本明細書において「経鼻投与」とは、鼻粘膜を経由した投与方法をいう。  
【００３２】
本明細書において「病原体」とは、宿主に対して疾患または障害を発生し得る生物をいう。ヒトに対する病原体としては、例えば、ウイルス、細菌、原虫、リケッチア、クラミジア、真菌などが挙げられるがそれらに限定されない。ワクチンが有効とされるのは、通常、ウイルス、細菌などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００３３】
本明細書において対象とされるウイルスは、どのような種類のものでもよく、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルスなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００３４】
ヒトにとって病原体であるウイルスとしては、例えば、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、風疹ウイルス、ＳＡＲＳウイルス（コロナウイルスの一種）、ＨＩＶが挙げられるがそれらに限定されない。このようなウイルスは、好ましくはインフルエンザウイルスである。
【００３５】
本発明が対象とする細菌は、どのような細菌であってもよく、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌が挙げられるがそれらに限定されない。
【００３６】
ヒトにとって病原体である細菌としては、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ型菌、肺炎菌およびコレラ菌などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００３７】
本明細書において「インフルエンザウイルス」とは、オルソミクソウイルス科に属する−鎖ＲＮＡウイルスである。脂質二重膜のエンベロープを持ち、Ｍ１（膜タンパク質）に裏打ちされ、その膜にＭ２、ＨＡ（血球凝集素）、ＮＡ（ノイラミニダーゼ）およびＭ２の糖タンパク質といった特徴的な膜タンパク質がはまり込んでいる。ＲＮＡは８つに分節しており、これらは核タンパク質とともに複合体ＲＮＰ（リボヌクレオシドカプシド）を形成し、エンベロープ裏打ちタンパク質Ｍ１に弱く結合している。
【００３８】
インフルエンザウイルスのタンパク質のうちＨＡおよびＮＡは、小胞体膜にはまり込んだ形で作られ、ゴルジ装置を経て細胞表面に出る。従って、ＨＡまたはＮＡあるいはその両方は、良好な免疫原であり、ワクチンの主原料として使用されている。
【００３９】
本明細書において「分泌型ＩｇＡを産生するに十分な濃度」とは、アジュバントまたはワクチン自体の能力をいい、投与された後、免疫反応が起こるときに、分泌型ＩｇＡを産生することができる、アジュバントまたはワクチン自体の濃度をいう。そのような濃度は、インビトロまたはインビボで当該分野において公知の方法を用いて実施することができる。
【００４０】
本明細書において「分泌型ＩｇＡ」とは、分泌性であるＩｇＡをいう。ＩｇＡは、外分泌液中の主要な免疫グロブリンで、粘膜表面の感染防御に役立っている。唾液、鼻汁、腸、気管などの分泌液中、あるいは初乳中に多く見られるが血清中にも存在する。このような分泌型ＩｇＡの測定方法としては、例えば、免疫拡散法が挙げられるがそれらに限定されず、例示的な好ましい方法としては、実施例に記載されるようなものを用いることができる。  
【００４１】
（本発明において使用され得る一般生化学手法の説明）
（ワクチンの作製法）
本明細書においてワクチン中に含まれるサブユニット抗原または不活化抗原は、上述のように、ワクチンから不活化、精製などにより天然の材料から作製することができるし、あるいは遺伝子工学的にポリペプチドを調製することまたは合成により人工的に作製することができる。通常、本発明のワクチンは、ウイルスなどを発育鶏卵などを用いて増殖し、増殖したウイルスなどを不活化またはその中から成分を分離精製することによって製造することができる。
【００４２】
本明細書において本発明のワクチンは、液状または乾燥した形態で、密栓したバイアル瓶、シリンジ、アトマイザーまたはそれに類するもの、あるいは熔封したアンプルに入れて提供され得る。
【００４３】
インフルエンザウイルスワクチンを製造する場合は、以下のような手順を用いることができるがそれに限定されない。
【００４４】
目的のインフルエンザウイルス株としては、例えば、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／３５２／８９（Ｈ３Ｎ２）；Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１（Ｈ１Ｎ１）；Ｂ／Ｐａｎａｍａ／４５／９０；Ａ／Ｇｅｏｒｇｉａ／０３／９３；Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９（Ｈ３Ｎ２）；Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇ／７／９７；Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００４５】
これらのウイルスは、例えば、９〜１１日齢発育鶏卵胚中で継代により増殖させ、必要に応じて、培養細胞（例えば、ＭＤＣＫ細胞）中で増殖させる。ウイルスは、Ｍａｓｓｉｃｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １０１，２４２−２４９（１９８０））が記載した方法またはその変法により精製することができる。手短に言えば、ウイルス懸濁液を８０００ｒｐｍで遠心分離（例えば、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ遠心分離器。ＧＳ−３ローター）して明澄化し、次いでＢｅｃｋｍａｎ  １９型ローターで１８，０００ｒｐｍで２時間遠心分離してペレットとする。
【００４６】
ペレット化ウイルスをＳＴＥ（０．１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、４，０００ｒｐｍで１０分遠心分離（Ｈｅｒｍｌｅ  Ｚ３６０Ｋ遠心分離器）して、凝集物を除去する。上清２ｍｌを、６０％ショ糖  ２ｍｌとＳＴＥで緩衝した上層の３０％ショ糖  ７ｍｌから成る不連続ショ糖勾配上に層とし、３６，０００ｒｐｍ（ＳＷ−４０ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ）で９０分遠心分離する。
【００４７】
バンド化ウイルスを界面で収集し、ＳＴＥで１０倍に希釈して、３０，０００ｒｐｍで２時間（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｔｉ４５ローター）ペレット化する。次にペレット化ウイルスを−７０℃で凍結する。
【００４８】
ウイルスのサブユニット抗原は、組換えＤＮＡ技術を用いて培養（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１細胞）により生産することができる。発現ベクターとしては、ｐＣＸＮ（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ  Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，(Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２６（１），１６５−１７２（２００１））等を利用することができるがそれらに限定されない。形質転換した細胞は、可溶化緩衝液（８％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ７．０））等に溶解し、等量のＰＢＳを加えて懸濁し、例えば、３６０，０００ｒｐｍで遠心分離（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＸＬ−７０遠心分離機Ｔｙｐｅ  ５５．１Ｔｉローター）することにより可溶性画分を回収する。回収された可溶性画分は、目的とする抗原またはそれに付加されたペプチド配列に特異的に親和性を持つモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体をはじめとするタンパク質またはペプチドなどを担体に結合させたアフィニティーカラムに吸着させ、０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ８０（ｐＨ２．７）等、ｐＨその他の変化により結合力を減弱せしめる溶液を用いて溶出し、精製することができる。また、溶媒抽出法、硫安沈澱等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロースなどの樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲル濾過法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動法等の手法を用いることもできる。精製された抗原は、ＰＢＳなどの緩衝液で透析し、例えば、−７０℃で凍結することができる。
【００４９】
このような形でワクチンを生成することができる。
【００５０】
（アジュバント）
アジュバントは、抗原と組み合わせることで抗体産生の増大、免疫応答の増強を起こす物質の総称であり、より好ましい実施形態では、変調させるか、または効力のある無毒のアジュバントが使用される。アジュバントは通常のワクチン抗原とともに使用して、より早い、より効力のある、あるいはより延長した応答を誘発するために要求される。このようなアジュバントは、また、抗原の供給が限定されるか、あるいは産生にコストがかかる場合において有用である。
【００５１】
アジュバントは、例えば、鉱物、バクテリア、植物、合成または宿主の産生物に場合に応じて分類される。
【００５２】
第一のクラスは、鉱物のアジュバント、例えば、アルミニウム化合物である。アジュバントとしてのアルミニウム化合物の最初の使用は１９２６年に記載された。その時以来、アルミニウム化合物とともに沈澱させた抗原あるいは予め形成されたアルミニウム化合物と混合されまたはそれに吸着された抗原が、動物およびヒトにおける免疫応答の増強するために使用されている。アルミニウム化合物および同様なアジュバントは次のメカニズムを通して働くようである。アルミニウムは、抗原に物理的に結合して粒子を形成し、注射後組織の抗原の吸収速度を遅くさせ、こうして抗原と抗原を提示する細胞、例えば、マクロファージまたは濾胞−樹状細胞との間の相互作用の時間を延長する。あるいは、アジュバントは、さらに、そのような相互作用を活性化する。アルミニウム粒子はウサギの局所リンパ節において免疫後７日に実証され、そして他の有意の機能が節それら自体におけるＴ細胞含有領域に抗原を向けることがあり得る。アジュバントの効力は、所属リンパ節の活性化と相関関係を有することが示されている。多数の研究はアルミニウムとともに投与された抗原が液性免疫を活性化することを証明したが、細胞性免疫性は、わずかに増加するだけあるように思われる。アルミニウムは、また、補体の経路を活性化するとして記載された。このメカニズムは局所炎症反応ならびに免疫グロブリンのメモリーにおいてある役割を演じ得る。
【００５３】
アルミニウム化合物は現在ヒトにおいて使用されているほぼ唯一の安全なアジュバントである。しかし、アルミニウムを含有するワクチンは時々局所的反応を引き起こす。アレルギーの発現は通常臨床的に大きな問題でないが、アルミニウム化合物は、また、好酸球をＴ細胞依存性メカニズムを経て注射領域に誘導し、抗原のプライミング後ＩｇＥの応答を誘発し、そしてＩｇＥの応答についてヘルパー機能をもつ特異的細胞の集団を活性化するといわれている。
【００５４】
バクテリア由来のアジュバントは最近精製されそして合成されている（例えば、ムラニルジペプチド、リピドＡ）。また、宿主由来免疫活性タンパク質は、クローニングされている（インターロイキン１およびインターロイキン２）。最近、ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、リポ多糖およびフロインド完全アジュバント（ＦＣＡ）が実験室レベルで使用されつつある。
【００５５】
他の物質もまた、アジュバントとして種々使用されてきている。それらは植物産生物、例えば、サポニン、動物産生物、例えば、キチンおよび多数の合成化学物質を包含する。
【００５６】
本明細書では、二本鎖ＲＮＡがアジュバントとして使用される。この二本鎖ＲＮＡの調製方法は、上述の核酸分子の調製方法に準ずることができ、当該分野において周知の方法を用いることができる。そのようなものの例示としては、シグマ・アルドリッチジャパン（株）、ヤマサ醤油、Ｆｌｕｋａなどからが入手可能であるキットを用いることができる。
【００５７】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）もまた、当該分野において周知の方法を用いて製造することができる。そのような方法は、非特許文献１〜３などに記載されており、例えば、好ましくは、２つの選択したホモポリマーをｐＨ７．０（０．００６モルリン酸ナトリウム、０．１５モル塩化ナトリウム）のリン酸緩衝液に等モルの濃度で混ぜることなどが挙げられるがそれらに限定されない。複合体は、混合後直ちに形成され得る。
【００５８】
（コンピュータスクリーニング）
タンパク質立体構造データスクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗原または不活化抗原、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよく、インシリコ・スクリーニング（コンピュータを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。従って、このようなスクリーニングによって得られた薬物もまた、本発明のワクチンの成分として用いることができる。
【００５９】
（疾患）
本明細書において本発明が対象とし得る疾患は、ワクチン投与によって予防し得る任意の疾患を包含する。そのような疾患としては、細菌性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー疾患などが挙げられるがそれらに限定されず、例えば、水痘、麻疹、ムンプス、ポリオ、ロタ、インフルエンザ、風疹、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、百日咳、髄膜炎およびコレラ、ＲＳ（呼吸器性シンシチウム）ウイルス感染症、インフルエンザｂ型菌、肺炎球菌感染症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００６０】
（治療活性または予防活性の証明）
本発明の化合物または薬学的組成物は、好ましくは、ヒトでの使用の前にインビトロで、そして次いでインビボで、および動物レベルで、所望の治療活性または予防活性について試験される。細胞株および／または組織サンプルに対する化合物または組成物の効果は、当業者に公知である技術を利用して決定され得る。本発明に従って、特定の化合物の投与が示されるか否かを決定するために用いられ得るインビトロアッセイとしては、抗原と抗体との結合を観察することなどが挙げられる。動物レベルの試験では、ヒトと同様にワクチンを投与し、抗体力価の上昇（例えば、ＥＬＩＳＡによる）、あるいは細胞障害性Ｔ細胞の活性化などを確認することによって判定することができる。
【００６１】
（予防のための投与および組成物）
本発明の組成物、ワクチンなどで用いられ得る薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、ワクチン、またはその改変体もしくは誘導体を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。
【００６２】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００６３】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。
【００６４】
以下に本発明の医薬組成物の一般的な調製法を示す。なお、動物薬組成物、医薬部外品、水産薬組成物、食品組成物および化粧品組成物等についても公知の調製法により製造することができる。
【００６５】
本発明のワクチンなどは、薬学的に受容可能なキャリアと配合して非経口的に投与することができる。
【００６６】
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。
【００６７】
様々な送達系が公知であり、本発明では粘膜投与が企図される。本発明の化合物を投与するために用いられ得る技術としては、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルなどが挙げられる。導入方法としては、鼻腔内、膣内、気道下、口腔内、直腸粘膜および腸粘膜などの粘膜経路が挙げられるがそれらに限定されない。この場合、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。粘膜投与する場合には、例えば、吸入器または噴霧器の使用、およびエアロゾル化剤を用いた処方により、肺投与もまた使用され得る。
【００６８】
特定の実施形態において、本発明の化合物または組成物を、投与部位の粘膜面のみならず、その他の組織の粘膜面においてもＩｇＡ分泌亢進可能であるような粘膜面に局所的に投与することが望まれ得る。
【００６９】
本発明の予防方法において使用される組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類など）、患者の年齢、体重、既往歴などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、既往歴、および経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与、あるいは毎年流行前に１回の頻度などが挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましく、少なくとも約１週間の間隔をあけて追加免疫をすることが有利である。より好ましくは、追加免疫の間隔は少なくとも約３週間であり得る。
【００７０】
本発明のワクチンなどの投与量は、被験体の年齢、体重、症状または投与方法などにより異なり、特に限定されないが、通常成人１日あたり、経口投与の場合、１０ｍｇ〜１ｇであり得る。粘膜（例えば経鼻）投与の場合、０．００１ｍｇ〜１０ｍｇであり、好ましくは、０．１ｍｇ〜１ｍｇであり得る。
【００７１】
本明細書中、「投与する」とは、本発明のワクチンなどまたはそれを含む医薬組成物を、単独で、または他の治療剤と組み合わせて処置が意図される宿主に与えることを意味する。組み合わせは、例えば、混合物として同時に、別々であるが同時にもしくは並行して；または逐次的にかのいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療混合物としてともに投与される提示を含み、そして組み合わせた薬剤が、別々であるが同時に（例えば、同じ個体へ別々の粘膜を通じての場合）投与される手順もまた含む。「組み合わせ」投与は、第１に与えられ、続いて第２に与えられる化合物または薬剤のうちの１つを別々に投与することをさらに含む。
【００７２】
本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法または診断する方法などを医師、患者など投与を行う人、診断する人（患者本人であり得る）に対して記載したものである。この指示書は、本発明の診断薬、予防薬、医薬などを投与する手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、瓶に貼り付けられたフィルム、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【００７３】
本発明の方法による予防処置の終了の判断は、市販のアッセイもしくは機器使用によって惹起される抗体を確認することによって行うことができる。
【００７４】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つ以上の成分を満たした１つ以上の容器を備える薬学的パッケージまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に任意に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。
【００７５】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
【００７６】
１つの局面において、本発明は、粘膜投与のためのワクチンを提供する。このワクチンは、Ａ）二本鎖ＲＮＡ；およびＢ）ウイルスのサブユニット抗原または不活化抗原、を含む。ここで、二本鎖ＲＮＡ、ウイルスサブユニット抗原および不活化抗原は当該分野において周知の方法により調製することができる。粘膜投与のために適切な形態は、当該分野において周知であり、例えば、液状にすること、あるいは、噴霧形態にすることなどが挙げられるがそれらに限定されない。本発明は、二本鎖ＲＮＡとウイルスサブユニット抗原または不活化抗原との組み合わせにより、気道粘膜の分泌型ＩｇＡの力価が上昇し、実際に感染防御効果が実証された。このような効果は、従来、二本鎖ＲＮＡはアジュバントとして抗体まで産生するが、実際の感染防御効果を発揮しないことが多数報告されている現状にかんがみると、予想外の顕著な効果であるといえる。
【００７７】
本発明のワクチンは、粘膜投与によりその顕著な効果を達成することから、粘膜を経由する投与（例えば、経鼻投与、口腔内投与など）であればどのような経路を経由してもよいが、好ましい実施形態では、経鼻経路をとることができる。
【００７８】
好ましい実施形態では、本発明のワクチンの対象となる病原体は、例えば、水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、風疹ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＨＩＶ、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ菌、肺炎菌およびコレラ菌からなる群より選択されるものであり得る。好ましくは、病原体は、インフルエンザウイルスである。本発明は、インフルエンザウイルスの型（Ａ型、Ｂ型）内の株（例えば、Ｈ１Ｎ１など）内の亜型同士の交叉反応性を実質的に史上初めて示すワクチンを提示したという優れた効果を示す。場合によっては、型の壁を超えた交叉反応性を示すことから、本発明は、従来技術では達成されなかった効果を示す。インフルエンザウイルスは、毎年流行が変わり、ウイルス自体が変化することから、従来毎年予測してインフルエンザウイルスのワクチンを調製していた。しかし、本発明により、株、亜種を超えた交叉反応性が達成されることから、流行を予測しなくても予め有効なインフルエンザワクチンを提供することができるようになったという効果が示される。また、予測する必要がなくなったことから、長期保存したワクチンを利用可能とすることができる。
【００７９】
好ましい実施形態では、本発明で使用される病原体のサブユニットは、インフルエンザウイルスのＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＰ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよびＮＳ２からなる群より選択されるサブユニットを含む。より好ましくは、表面に提示されているサブユニット（例えば、ＨＡ、ＮＡ）を用いる。より好ましくは、この表面提示サブユニットを複数（例えば、ＨＡおよびＮＡ）使用することが有利である。表面に提示されているサブユニットを使用することによって、より有効な抗原抗体反応を惹起し得、中和抗体を惹起することが可能となるからである。
【００８０】
好ましくは、二本鎖ＲＮＡは、分泌型ＩｇＡを産生するに十分な濃度で存在する。そのような二本鎖ＲＮＡの濃度は、例えば、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌであり、より好ましくは、０．５〜２ｍｇ／ｍｌであり、さらに好ましくは、約１ｍｇ／ｍｌ（例えば、０．８〜１．２ｍｇ／ｍｌ）である。
【００８１】
好ましくは、二本鎖ＲＮＡは、分泌型ＩｇＡを産生するに十分なサイズで提供される。そのようなサイズとしては、例えば、１０２ｂｐ以上であり、０〜３×１０６ｂｐ、より好ましくは３００ｂｐ以上の大きさが好ましいがそれらに限定されない。本発明の二本鎖ＲＮＡのサイズの上限は限定されないが、例えば、サイズの上限としては、１０８ｂｐが挙げられるがそれらに限定されない。
【００８２】
好ましい実施形態において、本発明のワクチンにおいて使用されるサブユニットは、少なくともＮＡまたはＨＡを含むことが有利である。これらの一方、より好ましくは両方を含むことによって、有効に中和抗体を惹起し得、抗ウイルス効果が達成されるからである。
【００８３】
二本鎖ＲＮＡは、好ましくは、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含むが、他の二本鎖ＲＮＡ（例えば、Ｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ）、Ｐｏｌｙ（Ｇ：Ｃ）、それらの混合物などを用いることができる。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、どのようなものを用いてもよく、ヌクレオチドが改変されていても改変されていなくてもよい。
【００８４】
別の局面において、本発明は、感染性疾患を予防するための方法を提供する。この方法は、Ａ）粘膜投与のためのワクチンであって、ａ）二本鎖ＲＮＡ（好ましくは、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））；およびｂ）ウイルスのサブユニット抗原、を含む、ワクチンを、少なくとも１回粘膜投与する工程を包含する。ワクチンの粘膜投与は、投与される部位に応じて適切な形態で行うことができる。経鼻投与の場合、噴霧、塗布、あるいは直接ワクチン液をたらすなどの種々の方法を用いることができる。
【００８５】
ワクチン投与は、好ましくは、少なくとも２回行うことが有効である。このような免疫を、場合によって追加免疫という。追加免疫を行うことによって、より効果の高い感染防御効果を奏することができる。
【００８６】
複数回ワクチン投与を行う場合、間隔は少なくとも１週間以上、より好ましくは３週間以上あけることがこのましい。二本鎖ＲＮＡ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、抗原などの態様は本明細書中上述のとおり行うことができる。
【００８７】
別の局面において、本発明は、感染疾患を予防するためのワクチンキットを提供する。このキットは、Ａ）粘膜投与のためのワクチンであってａ）二本鎖ＲＮＡ；およびｂ）ウイルスのサブユニット抗原、を含む、ワクチン；ならびにＢ）該ワクチンを、少なくとも１回投与することを指示する指示書、を備える。このキットは、医薬品としてパッケージで販売され得る。指示書は、厚生労働省などの当局の認可を示す文言と、使用方法を示す文言が記載されている。ワクチンの調製、投与方法は、本明細書中上述のとおりである。
【００８８】
（インフルエンザワクチンサブユニット抗原のポリペプチド形態）
１つの局面において、本発明は、感染症の疾患、障害または状態の予防、処置または予後のための組成物であって、予防、処置または予後上有効な量のインフルエンザワクチンサブユニット抗原、またはそのフラグメントもしくは改変体と、二本鎖ＲＮＡを含む、組成物を提供する。ここで、予防、処置または予後上有効な量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができ、そのような量を決定するためには、例えば、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、既往歴などを考慮して、当業者が容易に決定することができる（例えば、「ワクチンハンドブック」、国立予防衛生研究所学友会編（１９９４）；「予防接種の手引き  第８版」、木村三生夫、平山宗宏、堺春美編、近代出版（２０００）；「生物学的製剤基準」、細菌製剤協会編（１９９３）など）を参照のこと）。
【００８９】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、実施例のみに限定されるものではなく、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００９０】
以下の実施例では、対象となる患者からはすべて事前に告知しコンセントもらった上で実験を行った。動物の取り扱いは、国立感染症研究所および大阪大学において規定される基準を遵守した。以下の実施例で使用した試薬は、シグマアルドリッチジャパン、ヤマサ醤油、Ｆｌｕｋａのいずれかから入手した。
【００９１】
（実施例１．合成二本鎖ＲＮＡであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のアジュバント作用）
本実施例では、合成二本鎖ＲＮＡとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をアジュバントとして用いて不活化ウイルスまたはサブユニット抗原の中和抗体惹起能、ひいては感染防御効果を確認した。
【００９２】
（材料）
マウス：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）
ウイルス：インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ８）株（国立感染症研究所（東京都新宿区戸山１−２３−１）から入手した）
ワクチン：インフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ８）株Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ）株（国立感染症研究所）；Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ）株（国立感染症研究所）；Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｇｕｉｚｈｏｕ）株（国立感染症研究所）；エーテル処理不活化ＨＡワクチン（財団法人  阪大微生物病研究会、香川県観音寺市八幡町２−９−４１）
アジュバント：ポジティブコントロールとしてＣＴＢ＊（ＣＴＢ（コレラ毒素Ｂサブユニット）、０．１％ＣＴ（コレラ毒素）を含む）、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）。
【００９３】
（方法）
６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ（株）、東京）各群５匹ずつを用いた。ＰＲ８ＨＡワクチン（国立感染症研究所、財団法人  阪大微生物病研究会）１μｇをそれぞれのアジュバントとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、０．１μｇ、１μｇ、３μｇ、１０μｇと共にそれぞれの鼻腔内に５μ１を接種し３週後同量のワクチンをアジュバントなしもしくはアジュバント有りを経鼻接種し、さらに２週後に、１００ｐｆｕのＰＲ８インフルエンザウイルスを片鼻１．２μ１ずつ接種し感染を行った。コントロールとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）１０μｇおよび１μｇのみ、ＰＲ８ＨＡワクチンのみ、処置なしの群をおいた。感染３日後に鼻腔洗浄液、血清を回収し、鼻腔洗浄液中のＩｇＡ、血清中のＩｇＧをＥＬＩＳＡ法を用い、鼻腔洗浄液中のウイルス価をＭＤＣＫ細胞を用いたプラークアッセイで測定した。
【００９４】
同様に経鼻免疫したマウスに４０ＬＤ５０の致死量（１０４．７ＥＩＤ５０（５０％の発育鶏卵において感染性を示すウイルス量の約５００００倍量）のウイルスを２０μ１感染しその生存を観察した。
【００９５】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をアジュバントに用いた経鼻インフルエンザワクチンの交叉防御をみる為に亜型の違うインフルエンザウイルスＨ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ８）株Ｈ１Ｎ１（Ｂｅｉｊｉｎｇ）株、Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ）株、Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｇｕｉｚｈｏｕ）株のワクチンを３μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）とともに経鼻接種し３週後ワクチンのみを接種、さらに２週後に１００ｐｆｕのＰＲ８インフルエンザウイルスを片鼻１．２μ１ずつ接種し感染を行った。感染３日後に鼻腔洗浄液、血清を回収し、鼻腔洗浄液中のＩｇＡ、血清中のＩｇＧをＥＬＩＳＡ法を用い、鼻腔洗浄液中のウイルス価をＭＤＣＫ細胞を用いたプラークアッセイで測定した。
【００９６】
（結果）
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をアジュバントに用いた経鼻インフルエンザワクチンによる抗体誘導と感染防御
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の粘膜アジュバント能を評価した。６週間前に１μｇのＰＲ８ワクチンを０．１μｇ−１０μｇに変量したＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と共に経鼻接種し更に２週間前に同量のワクチンをワクチンのみまたはアジュバントと共に経鼻接種した。鼻腔粘膜でのＩｇＡ抗体応答と血中ＩｇＧ応答を図１にし示した。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の用量依存性のアジュバント効果を見るためにＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の量は０．１μｇから１０μｇまで段階的に増やしそのアジュバント作用をみた。その結果鼻腔粘膜にＩｇＡの応答のためには最低で０．１μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を初回免疫時に使うと応答が見られる。鼻腔粘膜に誘導されるＩｇＡの量はＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の量依存的であり量を増やせば増やすほどそのアジュバント効果がみられた。２回の免疫ともにＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を用いると１μｇの量で鼻腔洗浄液中に１００ｎｇ／ｍｌ以上のＩｇＡ分泌がみられ、初回のみの利用の場合３μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）添加で１００ｎｇ／ｍｌ以上の特異的ＩｇＡ誘導がみられている。血清中のＩｇＧも同時にしらべたがそれらはＩｇＡの分泌に相関するものであり１μｇのＰＲ８ワクチンをＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と共に４週間隔で２回免疫すると１．５μｇ／ｍ１の血中ＩｇＧが得られた。
【００９７】
また、同様の免疫条件で２回目の免疫の２週間後に１００ｐｆｕのＰＲ８ウイルスを片鼻１．２μ１ずつ感染を行った。ワクチン接種をしないコントロール群では鼻腔洗浄液中に１０３ｐｆｕ／ｍｌ以上のウイルス価にウイルス増殖が見られた（図２）。しかし、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用で経鼻ワクチン接種を２回行った群、では完全にウイルス増殖が抑制され、また、ワクチン単独で１μｇ以上ずつ２回免疫した群、３μｇ以上のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を初回免疫時のみに使用した群ではまったくウイルス抑制効果は見られなかった（図２）。
【００９８】
また、１μｇ、０．１μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を初回のみ併用した群でも１００．８ｐｆｕ／ｍｌ、１０１．６ｐｆｕ／ｍｌと著明なウイルスの増殖抑制が見られた。ワクチンのみの２回投与群ではウイルスの増殖抑制はまったく見られなかった。
【００９９】
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のアジュバント作用に二本鎖ＲＮＡである構造が重要であることを示すため、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を１００℃で５分間加熱し、ただちに氷上で冷却し１μｇをワクチンと共に経鼻接種した。その結果、変性無しのとき１２１μｇ／ｍｌ見られていたＩｇＡ応答は２１μｇ／ｍｌに激減し血中のＩｇＧ応答も１．５μｇ／ｍ１から０．７μｇ／ｍｌに減少した。
【０１００】
また、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のｄｅｎａｔｕｒｅによってウイルスの増殖抑制効果も見られなくなった。
【０１０１】
次にＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻ワクチン接種による致死量のインフルエンザウイルス感染による肺炎の防御効果について検討した。６週間前に１μｇのＰＲ８ワクチンとＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を１０μｇ、３μｇ、１μｇ併用し経鼻接種、２週間前にワクチンのみで追加免疫し、４０ＬＤ５０のＰＲ８ウイルス２０μ１感染後、肺炎の防御能を調べた。ワクチンを施さない群ではマウスは１週間以内に５／５が死亡し３日後の肺のウイルス価も１０６ｐｆｕ以上にのぼった。しかしワクチン群では１μｇ以上のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用で全マウスが生存した。この結果を以下に示す。
【０１０２】
【表１】
0004817625.tif 000002
このように、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）はアジュバントとして感染防御に十分な粘膜ＩｇＡ抗体応答を引き出すことができることがわかった。
【０１０３】
（実施例２：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻ワクチンによる交叉防御）
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻インフルエンザワクチンにより誘導されるインフルエンザ感染防御についてその交叉防御能について検討を行った。ＰＲ８と亜型の違うインフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ）株Ｈ１Ｎ１（Ｙａｍａｇａｔａ）株Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｇｕｉｚｈｏｕ）株のワクチンを３μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と初回免疫し４週後に同じ株のワクチンのみを接種、さらに２週間後に１００ｐｆｕのＨ１Ｎ１（Ａ／ＰＲ８）株を１００ｐｆｕ感染させその３日後に鼻腔洗浄液中のＰＲ８と交叉反応するＩｇＡ、血清中のＩｇＧを測定、またＰＲ８ウイルスの交叉防御による感染防御について調べた。
【０１０４】
図３、４に示すごとく同じ亜型のＨ１Ｎ１（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ）株Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｙａｍａｇａｔａ）株に対してはＩｇＡ、ＩｇＧ応答ともに見られウイルスの感染も完全に抑えた。亜型の違うＨ３Ｎ２（Ａ／Ｇｕｉｚｈｏｕ）株に対しては交叉反応するＩｇＡ、ＩｇＧが少量みられウイルス感染の部分防御がみられた。
【０１０５】
このようにＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻インフルエンザワクチンによる交叉防御が確認された。
【０１０６】
（実施例３：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の中枢神経への安全性について）
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をヒトの経鼻ワクチンとして用いる場合、鼻腔が脳と近接している為、中枢神経への安全性が重要である。そこでＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の安全性を確認する目的でＢＡＬＢ／ｃマウスヘの脳内接種を試みた。０．２５μｇ、２．５μｇ、２５μｇのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を２５μ１のＰＢＳに溶解し二段針を用いて脳内接種を行った。接種後の体重変化を測定しまた生存を観察した。対照として２５μｇ、１０μｇ、２５μｇのＣＴＢ＊（ＣＴＢ、０．１％ＣＴを含む）を同様に２５μ１のＰＢＳに溶解し脳内接種を行った。
【０１０７】
図５に示すごとくＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）脳内接種群のマウスは全群とも２週間以上生存し体重変化も２５μｇ接種群で５％の体重減少がみられるのみであった。一方対照に用いたＣＴＢ＊（ＣＴＢ  ｗｉｔｈ  ０．１％ＣＴ）を脳内接種した群においては１０μｇ投与で１／５匹２５μｇ投与で２／５匹それぞれ４日目で死亡し体重減少も１５％に及んだ。
【０１０８】
（考察）
インフルエンザウイルスの感染防御に粘膜での分泌型ＩｇＡ抗体が現行ワクチンで誘導されるＩｇＧ抗体よりも有効である事は数多くの研究結果よりあきらかである。粘膜でのＩｇＡ誘導には経鼻ワクチンが有効であるが多くの試みにもかかわらず現在のところヒトで使用できるアジュバントが確立されていない。合成二本鎖ＲＮＡであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）はヒトへ静注された実績もありＩｇＡ誘導に有効であり経鼻ワクチンのアジュバントとしてヒトヘの応用に有用であると考えられる。
【０１０９】
本実施例の実験結果を踏まえると、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は粘膜でのインフルエンザウイルス感染防御に有効な経鼻ワクチンのアジュバントとして有用性が高い。さらに他の病原体の粘膜ワクチンヘの応用も考えられる。
【０１１０】
インフルエンザ等の呼吸器感染の防御には粘膜より分泌される特異的ＩｇＡ抗体が非常に有効である。型の違うウイルスの交叉防御は粘膜に分泌されるＩｇＡ抗体が主に担っておりインフルエンザに自然罹患後回復したヒトにはこのＩｇＡ抗体が誘導され同亜型の変異ウイルスの流行に対しても感染防御ができる。未感染の個体の感染防御の方法にはワクチン接種があるが現在用いられている皮下接種によるワクチンでは粘膜免疫応答が得られず交叉防御能を持つ、より効果的なワクチン開発が求められている。粘膜での分泌型ＩｇＡの誘導には経鼻で抗原接種する方法が有るが抗原の接種のみでは十分な抗体応答はみられずより効果的な免疫応答の為ワクチンと同時に投与するアジュバントが必要となる。
【０１１１】
本実施例では、本発明者らは粘膜免疫誘導に有効なアジュバントとして合成二本鎖ＲＮＡであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を用い鼻腔粘膜でのＩｇＡ分泌と血清中のＩｇＧ応答と致死量のインフルエンザウイルスに対する感染防御を実証した。
【０１１２】
その免疫応答はワクチン株と亜型の違うウイルスに対する抗体誘導もみられまたワクチン株と亜型の異なるウイルスに対する感染防御もみられ、交叉防御能が確認された。また、経鼻ワクチンの人への応用を考える場合アジュバントの安全性が問題になる。今回用いた経鼻接種では投与部位が中枢神経に非常に近接した部位であるためその神経系へ与える影響と安全性を確認する為に０．２５μｇ〜２５μｇ／ｍｏｕｓｅの量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を脳内接種を行った。その結果対照としたコレラ毒素Ｂサブユニットに０．１％の全毒素を添加したコレラ毒素（ＣＴＢ）では４日目で死亡するマウスが見られ（１０μｇ投与群で１、５、２５μｇ投与群で２／５）体重も１５％以上の減少が見られたのに対し、ｐｏｌｏｙ（Ｉ：Ｃ）投与群では全てのマウスが８日間生存し体重減少も２５μｇ接種群で一過性に５％ほどみられたに留まり、過剰量の脳内接種でも死亡がみられず安全性も確認された。
【０１１３】
現行の不活化インフルエンザＨＡワクチンは、有効なワクチンであるが、インフルエンザウイルスの侵入門戸である呼吸器粘膜上皮でのＩｇＡ抗体の誘導能は低いため、これを改善することにより、さらにその効果が増強可能であると考えられる。本実施例における実験では、現行不活化インフルエンザＨＡワクチンにＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）をアジュバントとして加え、これを経鼻投与することにより、ウイルス特異的ＩｇＡが粘膜表面に効率よく誘導されることが示された。また、マウスにおける実験で、ウイルスのチャレンジによる致死的感染を防御し、かつ、異なる株のウイルスのチャレンジにおいても有効であることが示唆された。
【０１１４】
また、利用の可能性としてインフルエンザウイルス以外に、呼吸器その他の粘膜経路で感染する病原体（水痘ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ポリオウイルス、ロタウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、風疹ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＨＩＶ、百日咳菌、髄膜炎菌、インフルエンザｂ菌、肺炎菌およびコレラ菌等の不活化抗原ワクチンのアジュバントとしても利用が考えられる。
【０１１５】
（実施例４：不活化ウイルス粒子をＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と併用する経鼻インフルエンザワクチンとして用いたときの予防効果）
現行のエーテル処理ＨＡ（Ｓｐｌｉｔ−ｐｒｏｄｕｃｔ  ｖａｃｃｉｎｅ）のみではなく、他の形態のワクチンを使用した場合のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻ワクチンの有用性を確認した。
【０１１６】
（材料）
ワクチン：エーテル処理ＨＡワクチン（財団法人阪大微生物研究会製）、ホルマリン不活化全ウイルス粒子ワクチン（Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｗｈｏｌｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｖａｃｃｉｎｅ）、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルス）（財団法人阪大微生物研究会製）
マウス：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）。
【０１１７】
（方法）
Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのホルマリン不活化全ウイルス粒子ワクチン（Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｗｈｏｌｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃａｃｃｉｎｅ）（０．１μｇ）をＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（１００−１０００ｂｐ、Ｓｉｇｍａ）（０．１μｇ）併用経鼻インフルエンザワクチンのワクチン成分としてＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）に投与し、３週間後に同じワクチンを２回目投与した。
【０１１８】
その１週間後にマウスの鼻洗浄液と血清中のＨＡとＮＡとに対する抗体応答をそれぞれ粘膜および全身の防御免疫の指標として測定した。
【０１１９】
（結果）
不活化全ウイルス粒子をＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻インフルエンザワクチンのワクチン成分として用いたときにも、粘膜の防御免疫および全身の防御免疫が高められた。
【０１２０】
しかも、ワクチンとＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）とをそれぞれ０．１μｇで用いたときでも、ｓｐｌｉｔ−ｐｒｏｄｕｃｔ  ｖａｃｃｉｎｅをＣＴＢ＊と併用して完全なウイルス感染阻止が予測されるアジュバント活性の陽性対照群と同等の応答を示した。さらに、これらの応答は、ｓｐｌｉｔ−ｐｒｏｄｕｃｔ  ｖａｃｃｉｎｅをＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）とともに用いた場合よりも高かった。したがって、ｓｐｌｉｔ−ｐｒｏｄｕｃｔ  ｖａｃｃｉｎｅのみではなく、他の形態のワクチンを使用した場合にもＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻ワクチンの有用性が明らかであった（図６）。
【０１２１】
（実施例５：経鼻インフルエンザワクチンのアジュバントとしてのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の分子の大きさ）
経鼻インフルエンザワクチンのアジュバントとして有用なＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の分子の大きさを検討した。
【０１２２】
（材料）
ウイルス：Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルス
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）サイズ：（Ｌ）１０−３００ｂｐ（Ｆｌｕｋａ）、（Ｍ）１００−１０００ｂｐ（Ｓｉｇｍａ）、（Ｈ）＞３．３×１０６ｂｐ（Ｆｌｕｋａ）
マウス：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）。
【０１２３】
（方法）
Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＳｐｌｉｔ−ｐｒｏｄｕｃｔ  ｖａｃｃｉｎｅ（０．４μｇ）を様々な大きさのＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（１０−３００ｂｐ（Ｆｌｕｋａ）、（Ｍ）１００−１０００ｂｐ（Ｓｉｇｍａ）、（Ｈ）＞３．３×１０６ｂｐ（Ｆｌｕｋａ））の０．１μｇといっしょにＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）に経鼻投与し、３週間後に同じワクチンを２回目投与した。  その１週間後にマウスの鼻洗浄液および血清中のＨＡおよびＮＡに対する抗体応答をそれぞれ粘膜および全身の防御免疫の指標として測定した。
【０１２４】
（結果）
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の分子の大きさが１０−３００ｂｐを用いた実験群において他の２群よりも低い粘膜免疫応答が認められた。従って、経鼻インフルエンザワクチンのアジュバントとして有用なＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の分子の大きさは約３００ｂｐ以上と考えられる（図７）。
【０１２５】
（実施例６：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）以外の２本鎖ＲＮＡのアジュバント作用）
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の経鼻インフルエンザワクチンのアジュバントとしての作用を、他の２本鎖ＲＮＡであるＰｏｌｙ（Ａ：Ｕ）および単鎖のＰｏｌｙ（Ａ，Ｕ）と比較した。
【０１２６】
（材料）
サブユニット：精製ＨＡ
アジュバント：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、Ｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ）、Ｐｏｌｙ（Ａ，Ｕ）。
【０１２７】
（方法）
Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスから特異的抗ＨＡモノクローナル抗体結合カラムを用いてＨＡ分子を精製し、その１μｇをＰｏｌｙ（Ａ：Ｕ）（Ｓｉｇｍａ）および単鎖のＰｏｌｙ（Ａ，Ｕ）（Ｓｉｇｍａ）の１μｇといっしょにＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）に経鼻投与し、３週後にＨＡのみを２回目投与した。その１週間後にマウスの鼻洗浄液および血清中のＨＡに対する抗体応答をそれぞれ粘膜および全身の防御免疫の指標として測定した。
【０１２８】
（結果）
Ｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ）および単鎖Ｐｏｌｙ（Ａ，Ｕ）にもアジュバント活性が認められた。Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のアジュバント活性と比べると、Ｐｏｌｙ（Ａ：Ｕ）、単鎖（Ａ，Ｕ）の順に小さかった（図８）
従って、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）以外の二本鎖ＲＮＡにも経鼻インフルエンザワクチンと併用するとアジュバント活性が見られることが確認された。
【０１２９】
（実施例７：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻投与条件でいくつかのインフルエンザウイルスのサブユニットによる防御免疫誘導）
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻投与条件でいくつかのインフルエンザウイルスのサブユニットは防御免疫を誘導することを確認した。
【０１３０】
（材料）
サブユニット：ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１およびＮＰ
アジュバント：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（１００−１０００ｂｐ、Ｓｉｇｍａ）
マウス：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）。
【０１３１】
（方法）
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と一緒に経鼻投与されたインフルエンザウイルスのサブユニット、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１およびＮＰの防御効果誘導能を比較した。即ち、Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスから特異的抗モノクローナル抗体結合カラムを用いてＨＡ、ＮＡ、Ｍ１およびＮＰ分子を精製し、その１μｇをＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（１００−１０００ｂｐ、Ｓｉｇｍａ）の１μｇと一緒にＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）に経鼻投与し、３週間後にそれぞれの分子を２回目投与した．その一週間後にマウスの鼻洗浄液および血清中のそれぞれの分子に対する抗体応答を粘膜および全身の防御免疫の指標として測定した。
【０１３２】
（結果）
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）はどのサブユニットに対する粘膜および全身の免疫応答をも増強することが示された。しかしながら、ＨＡおよびＮＡに対する液性免疫増強によっては予防効果が高められたが、ＮＰに対する液性免疫増強によっては予防効果を高められなかった。従って、ＨＡおよびＮＡが強い防御抗原であり、サブユニットによって予防効果誘導能に違いもあることが分かった。
【０１３３】
（実施例８：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻インフルエンザワクチンの有効性を高める投与回数と投与間隔）
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻インフルエンザワクチンの有効性を高める投与回数と投与間隔を検討する。
【０１３４】
（材料）
ワクチン：Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＳｐｌｉｔ−ｐｒｏｄｕｃｔ  ｖａｃｃｉｎｅ（１μｇ）
アジュバント：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）［１００−１０００ｂｐ、Ｓｉｇｍａ］
マウス：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）。
【０１３５】
（方法）
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻インフルエンザワクチンの有効性を高める投与回数と投与間隔を検討するために、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのＳｐｌｉｔ−ｐｒｏｄｕｃｔ  ｖａｃｃｉｎｅ（１μｇ）をＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（１００−１０００ｂｐ、Ｓｉｇｍａ）の１μｇと一緒にＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）に経鼻投与し、１、３、４、６週間後に同じワクチンを２回目投与した。その１あるいは２週間後にマウスの鼻洗浄液および血清中のＨＡおよびＮＡに対する抗体応答をそれぞれ粘膜および全身の防御免疫の指標にして測定した。また、この時一回投与のみで１および８週後の実験群もおかれた。
【０１３６】
（結果）
一週間以上の間隔で２回以上の投与がＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻インフルエンザワクチンの有効性を高めるのに有効であった（図９）。
【０１３７】
（実施例９：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻インフルエンザワクチンのヒトでの予防効果）
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻インフルエンザワクチンのヒトでの有効性について抗インフルエンザ抗体応答から確認する。
【０１３８】
（材料）
ワクチン：現行のインフルエンザの三価ワクチン［Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｐａｎａｍａ（Ｈ３Ｎ２）、Ｂ／Ｓｈａｎｇｄｏｎｇの３ウイルス株由来のｓｐｌｉｔ−ｐｒｏｄｕｃｔ  ｖａｃｃｉｎｅ］（財団法人阪大微生物病研究会）
アジュバント：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（１００−１０００ｂｐ、Ｓｉｇｍａ）。
【０１３９】
（被験者）
健常人  ２〜数名。
【０１４０】
（方法）
健康成人に、４００μｇ／ｍｌの三価ワクチンと７００μｇ／ｍｌのＰｏｌｙＩ：Ｃを含む液を、３００μＬ（１５０μＬずつ左右鼻腔に）噴霧投与し、さらに４週間後再投与する。再投与後二週間目に唾液及び血清材料を採取し、ＨＡおよびＮＡに対する抗体応答を測定する。投与前、２回投与後の抗体価の比によって、この経鼻ワクチンの抗体応答誘導能を評価する。
（結果）
被験者にワクチン中の３株に対する唾液中のＩｇＡ抗体の増加が認められる。
【０１４１】
また、一部の被験者において、血清中の抗ＮＡ−ＩｇＧ抗体やＨＩ抗体の上昇が認められる。
【０１４２】
（実施例１０：百日咳のワクチンをＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と共に経鼻投与した場合の免疫能の増強）
インフルエンザ以外感染症である百日咳のワクチンをＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と共に経鼻投与した場合の免疫能の増強を確認した。
【０１４３】
（材料）
ワクチン：百日咳ワクチン（財団法人阪大微生物研究会製）
アジュバント：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（１００−１０００ｂｐ、Ｓｉｇｍａ）
マウス：ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）。
【０１４４】
（方法１）
百日咳ワクチン（財団法人阪大微生物病研究会製）（１〜３μｇ）をＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（１００〜１０００ｂｐ、Ｓｉｇｍａ）、の０．１μｇ〜１０μｇと一緒にＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）に経鼻投与し、３週間後に同じワクチンを２回目投与した。2回目投与後1週間目のマウスの鼻洗浄液と血清中の百日咳ワクチンに対する抗体応答をＥＬＩＳＡ法により測定し、粘膜および全身の防御免疫の指標とした。
【０１４５】
（結果）
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は百日咳ワクチンに対する防御免疫をも高め、インフルエンザ以外の感染症に対するワクチンに対する防御免疫増強にも有効であることが示唆された（図１０）。
【０１４６】
（方法２）
百日咳ワクチン（財団法人阪大微生物研究会製）（１〜３μｇ）をＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（１００−１０００ｂｐ、Ｓｉｇｍａ）、の０．１−１０μｇと一緒にＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）に経鼻投与し、３週後に同じワクチンを２回目投与した。２回目投与後一週間目にマウスの鼻洗浄液と血清中の百日咳ワクチンに対する抗体応答をＥＬＩＳＡ法により測定し、粘膜と全身の防御免疫の指標とした。また、２回目投与後２〜３週間後に、百日咳菌強毒株を免疫マウスの脳内あるいは鼻腔内（噴霧）に接種１４日間観察し、免疫マウスの生存率から効果を推定した。
【０１４７】
（結果）
マウス生存率から、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は百日咳ワクチンに対する防御免疫をも高め、インフルエンザ以外の感染症に対するワクチンに対する防御免疫増強に有効であることが確認された。
【０１４８】
（実施例１１：水痘ワクチンをＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）とともに経鼻投与した場合のヒトでの予防効果）
追加接種としてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻水痘生ワクチンの成人での安全性および有効性について、経鼻粘膜接種法により行い、液性免疫および細胞性免疫を水痘ワクチン単独経鼻接種を行った群と比較する。
【０１４９】
（材料）
ワクチン：水痘生ワクチン（財団法人阪大微生物研究会製）
アジュバント：Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（１００−１０００ｂｐ、Ｓｉｇｍａ）
健常人：各群２〜数名。
【０１５０】
（方法）
水痘生ワクチン２バイアル／人に注射用生理食塩水中を加え、これを健康成人にネブライザーで経鼻接種する。また、現行のワクチンとＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（１００−１０００ｂｐ、Ｓｉｇｍａ）を含むワクチン液を、３００μｌ（１５０μｌずつ左右鼻腔に）噴霧投与する。液性免疫および細胞性免疫を測定することにより、予防効果を確認する。
【０１５１】
（結果）
Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は水痘生ワクチンに対する防御免疫をも高め、インフルエンザ以外の感染症に対するワクチンに対する防御免疫増強に有効であることが示唆される。
【０１５２】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１５３】
本発明により、粘膜投与により簡単にワクチン接種し、かつ、交叉免疫性を得ることができるワクチン形態が提供される。これにより、例えば、インフルエンザウイルス対策において、有効なワクチンを製造することができ、効率よい予防対策を講じるための医薬などの産業において大いに利用される可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】図１は、実施例において例示される、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のアジュバント効果を示すデータである。左の欄は、投与形態を示し、中の欄は、鼻洗浄液中のＩｇＡ量を示し、右の欄は、血清中のＩｇＡ量を示す。
【図２】図２は、実施例において例示される、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）のアジュバント効果を示すデータである。左の欄は、投与形態を示し、右の欄は、ウイルスの生存状況を示す。
【図３】図３は、種々のウイルス株に対する本発明のワクチン接種のＩｇＡ惹起効果を示す図である。
【図４】図４は、種々のウイルス株に対する本発明のワクチン接種のウイルス増殖抑制効果を示す図である。
【図５】図５は、本発明のワクチン接種の脳内投与における毒性を示す図である。上は本発明のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を示し、下はポジティブコントロールのＣＴＢ＊を示す。
【図６】図６は、不活化ウイルス粒子をＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と併用する経鼻インフルエンザワクチンとして用いたときの免疫効果：鼻洗浄液と血清中抗ＨＡおよび抗ＮＡ抗体価を示す。
【図７】図７は、不活化ウイルス粒子を種々サイズ（Ｌ、Ｍ、Ｈ）のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）と併用する経鼻インフルエンザワクチンとして用いたときの免疫効果：鼻洗浄液および血清中流ＨＡと抗ＮＡ抗体価を示す。
【図８】図８は、２本鎖ＲＮＡあるいは単鎖ＲＮＡとサブユニットＨＡを併用する経鼻インフルエンザワクチンとして用いたときの免疫効果：鼻洗浄液および血清中抗ＨＡ抗体価を示す。
【図９】図９は、一週間以上の間隔で２回以上の投与がＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）併用経鼻インフルエンザワクチンの有効性を示す結果である。
【図１０】図１０は、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は百日咳ワクチンに対する防御免疫をも高め、インフルエンザ以外の感染症に対するワクチンに対する防御免疫増強にも有効であることを示す結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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