(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トレポネーマ・パリダム抗原を担持した不溶性担体と血清中の抗トレポネーマ・パリダム抗体との抗原抗体反応により生じる凝集の度合いを光学的に測定又は目視にて観察することにより血清中の抗トレポネーマ・パリダム抗体を測定する梅毒感染の診断に用いられる抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬であって、
トレポネーマ・パリダム抗原を担持した不溶性担体と、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来するセグメント及び親水性モノマーに由来するセグメントを有する共重合体とを含有する
ことを特徴とする抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬。
【請求項２】
トレポネーマ・パリダム抗原は、トレポネーマ・パリダム菌体由来抗原であることを特徴とする請求項１記載の抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬。
【請求項３】
トレポネーマ・パリダム抗原を担持した不溶性担体と血清中の抗トレポネーマ・パリダム抗体との抗原抗体反応により生じる凝集の度合いを光学的に測定又は目視にて観察することにより血清中の抗トレポネーマ・パリダム抗体を測定する抗トレポネーマ・パリダム抗体の測定方法であって、トレポネーマ・パリダム抗原を担持した不溶性担体と、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来するセグメント及び親水性モノマーに由来するセグメントを有する共重合体とを含有する抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬を用いることを特徴とする抗トレポネーマ・パリダム抗体の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血清干渉の発生を防止して、梅毒の感染の診断を精度良く行うことが可能な抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
梅毒の病原体であるトレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  Ｐａｌｌｉｄｕｍ）が生体に感染すると、該病原体に対する抗体が産生される。抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬は血中の抗トレポネーマ・パリダム抗体の有無を測定することにより、梅毒の感染を判定する試薬である。
【０００３】
従来、抗トレポネーマ・パリダム抗体測定は血球凝集を利用したＴＰＨＡ等の用手法で行われていたが、近年、生化学自動分析装置に適用可能な試薬（自動化試薬）が発売されている。この自動化試薬においては、患者の採血負担を軽減する目的で、用手法と比べて少量の血清で測定されることが多い。そのため、試薬と血中の抗体の反応により起こる抗原抗体反応量も少量となる。よって、自動化試薬においては、抗原抗体反応を促進する増感剤を添加する場合がある。一般に用いられる増感剤としては、ポリエチレングリコール、デキストラン等がある。また、抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬における増感剤としては、特許文献１にグルコシド誘導体をモノマー単位として含む水溶性重合体及び／又は溶性共重合体が効果を示すことが開示されている。
【０００４】
しかしながら、このような増感剤は、抗原抗体反応を促進する効果には優れているが、一部の検体で正確な測定結果が得られないという問題があった。具体的には、検体が血清である場合に、血清中に含まれている成分が変動することにより、測定に悪影響を与える血清干渉と呼ばれる現象が発生し、正確な測定結果が得られないという問題があった。
【特許文献１】特許第２９４７６００号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記現状に鑑み、血清干渉の発生を防止して、梅毒の感染の診断を精度良く行うことが可能な抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、トレポネーマ・パリダム抗原を担持した不溶性担体と血清中の抗トレポネーマ・パリダム抗体との抗原抗体反応により生じる凝集の度合いを光学的に測定又は目視にて観察することにより血清中の抗トレポネーマ・パリダム抗体を測定する梅毒感染の診断に用いられる抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬であって、トレポネーマ・パリダム抗原を担持した不溶性担体と、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来するセグメント及び親水性モノマーに由来するセグメントを有する共重合体とを含有する抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬である。
以下に、本発明を詳述する。
【０００７】
本発明者らは、鋭意検討の結果、抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬中に、増感剤として２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来するセグメント及び親水性モノマーに由来するセグメントを有する共重合体を含有させることにより、血清中の抗トレポネーマ・パリダム抗体を測定する場合に、血清干渉の発生を防止して、抗トレポネーマ・パリダム抗体の測定を精度良く行うことが可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００８】
本発明の抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬は、梅毒に対する抗原を担持した不溶性担体と、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来するセグメント及び親水性モノマーに由来するセグメントを有する共重合体（以下、単に共重合体ともいう）とを含有する。
上記親水性モノマーとして、メタクリル酸を用いた場合における上記共重合体の構造を下記一般式（１）に示す。
【０００９】
【化１】
0004629564.tif 000002
【００１０】
本発明の抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬は、上記共重合体を含有することで、検体として血清を使用する場合であっても、血清干渉を引き起こしてしまうことがなく、正確な測定結果を得ることができる。
なお、上記血清干渉を確認する方法としては、例えば、添加回収試験という方法を用いることができる。上記添加回収試験は、被測定物質である抗原又は抗体が高濃度で含まれる標準物質を、０．１〜５％程度になるように生理食塩水（変動成分がない血清のモデル）に添加して添加前後での測定値の差を求めた後、同様にして標準物質を被測定物質である抗原又は抗体を含む血清に添加して添加前後での測定値の差を求め、標準物質を生理食塩水に添加した場合での測定値の差を１００％としたときの割合を回収率として算出することにより、血清干渉の発生を確認する試験である。
【００１１】
上記２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンは、メタクリロイル基を有することから、他の重合性モノマーと共重合することが可能である。共重合可能な親水性モノマーとしては、例えば、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド等の（メタ）アクリル酸系単量体等が挙げられる。
【００１２】
上記親水性モノマーとしては特に限定されないが、例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。なかでも、血液成分中のタンパク質等と静電反発することが期待される理由から、カチオン性である（メタ）アクリル酸が好適である。
ここで、（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸又はメタクリル酸を意味する。
【００１３】
上記共重合体における上記２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来するセグメントと、親水性モノマーに由来するセグメントとの比としては特に限定されず、必要に応じて適宜選択されればよいが、モル比で５：５〜３：７であることが好ましい。上記２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンに由来するセグメントの比がこれ未満であると、抗トレポネーマ・パリダム抗体測定における血清干渉の発生を効果的に防ぐことができないことがある。
【００１４】
上記共重合体の重量平均分子量としては特に限定されないが、好ましい下限は５万、好ましい上限は５００万である。５万未満であると、凝集促進効果がなくなることがあり、５００万を超えると、試薬中に添加した場合に粘性が上がりすぎ、再現性等が悪化してしまうことがある。
【００１５】
本発明の抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬における上記共重合体の含有量の好ましい下限は０．１（ｗ／ｖ）％、好ましい上限は１．２（ｗ／ｖ）％である。０．１（ｗ／ｖ）％未満であると、血清干渉の発生を効果的に防止できないことがあり、１．２（ｗ／ｖ）％を超えると、試薬の粘性が上がりすぎ、再現性が低下することがある。
より好ましい下限は０．２（ｗ／ｖ）％、より好ましい上限は０．８（ｗ／ｖ）％である。
【００１６】
本発明の抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬は、上記共重合体に加えて、トレポネーマ・パリダム抗原を担持した不溶性担体を含有する。
【００１７】
上記トレポネーマ・パリダム抗原としては、例えば、トレポネーマ・パリダム菌体由来抗原を用いることが好ましい。
【００１８】
上記不溶性担体としては特に限定されないが、例えば、ポリスチレン、スチレン−スチレンスルホン酸塩重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレート等からなるものが挙げられる。
【００１９】
上記不溶性担体の粒子径としては、用いる測定方法や測定機器にもよるが、好ましい下限が０．０５μｍ、好ましい上限は１．０μｍである。０．０５μｍ未満であると、凝集による光学的変化量が小さく、測定に必要な高い感度が得られないことがあり、１．０μｍを超えると、ラテックス粒子の凝集による光学的変化量が測定可能域を超えてしまい、測定範囲が小さくなることがある。
【００２０】
上記不溶性担体にトレポネーマ・パリダム抗原を担持させる方法としては特に限定されず、公知の方法により、物理的、化学的結合により担持させる方法等が挙げられる。なお、このときに用いるトレポネーマ・パリダム抗原は、菌体破砕物であってもよく、精製物であってもよい。また、遺伝子組み換え技術により人工的に合成されたものを１種又はそれ以上組み合わせたものでもよい。
【００２１】
本発明の抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬は、上記トレポネーマ・パリダム抗原を担持した不溶性担体と、上記共重合体とを同一の媒体に分散及び溶解させることにより１液系のラテックス試薬として使用してもよく、また、上記トレポネーマ・パリダム抗原を担持した不溶性担体を含有する第１試薬と、上記共重合体を媒体に添加した緩衝液からなる第２試薬とで構成された２液系の試薬として使用してもよい。
【００２２】
上記媒体としては特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩緩衝液等が挙げられる。
【００２３】
上記１液系のラテックス試薬中には、更に、ウシ血清アルブミン、ショ糖、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、界面活性剤等を適宜溶解させもよい。
また、２液系の試薬として使用する場合にも、それぞれにウシ血清アルブミン、ショ糖、塩化ナトリウム、ＥＤＴＡ・２Ｎａ、界面活性剤等を適宜溶解させてもよい。
【００２４】
本発明の抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬を用い、検体中の抗トレポネーマ・パリダム抗体との抗原抗体反応により生じる凝集の度合いを光学的に測定又は目視にて観察することにより、検体中の抗トレポネーマ・パリダム抗体を測定することができる。
【００２５】
本発明の抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬を用い、抗原抗体反応を行う際のｐＨの好ましい上限は４．５、好ましい下限は１０．０であり、より好ましい下限は６．０、より好ましい上限は８．０である。
また、反応温度の好ましい下限は０℃、好ましい上限は５０℃であり、反応時間は適宜選択される。
【００２６】
上記凝集の度合いを光学的に測定する方法としては、公知の方法が用いられ、例えば、用いる不溶性担体の粒子の大きさ、濃度の選択、反応時間の設定により、散乱光強度、吸収光度、透過光強度の増減を測定する。また、これらの方法を併用することも可能である。また、上記測定を行う際の光の波長としては、３００〜９００ｎｍが好ましい。
【００２７】
上記の光学的測定方法に用いる装置としては、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出できる光学機器が挙げられ、一般的に使用されている生化学自動分析機であればいずれのものであっても使用することができる。
【００２８】
上記凝集の度合いを目視にて観察する方法としては、通常、検体と本発明の抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬とを含む溶液を判定板上で混合し、混合液を揺り動かした後、凝集の有無を判定する方法等を用いることができる。なお、凝集の度合いの観察には、目視による方法以外に、凝集状態をビデオカメラで撮影し、画像処理を施す方法を用いることも可能である。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、血清干渉の発生を防止して、梅毒の感染の診断を精度良く行うことが可能な抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【００３１】
（実施例１）
（１）抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬の調製
以下の手順に従いトレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液からなる第１試薬と、検体希釈液からなる第２試薬とから構成される２液系の抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬を調製した。
【００３２】
（１−１）トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液の調製
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１５０μｇ／ｍｌの蛋白濃度で溶解したトレポネーマ・パリダム抗原液４００μｌを平均粒径０．４００μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０（ｗ／ｖ）％、積水化学工業社製）１００μｌに添加し、４℃にて１時間攪拌した。次いで、ウシ血清アルブミン（セロロジカル製；ＢＳＡ）を１（ｗ／ｖ）％含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）２ｍｌを添加し、１．５時間攪拌した。
得られた液体を１０℃にて３０分間、１８，０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた沈殿物を、ＢＳＡを０．２５（ｗ／ｖ）％含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）４ｍｌに添加し、ラテックスを懸濁させることによりトレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
【００３３】
（１−２）検体希釈液の調製
ＢＳＡを１％含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にＬｉｐｉｄｕｒｅ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリル酸との共重合体：分子量１００万；日本油脂社製）を０．２（ｗ／ｖ）％添加した。
【００３４】
（実施例２）
実施例１の（１−１）トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液の調製において、得られた沈殿物にＢＳＡを０．２５（ｗ／ｖ）％含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５ｍｌを添加するとともに、（１−２）検体希釈液の調製において、Ｌｉｐｉｄｕｒｅを０．６（ｗ／ｖ）％添加した以外は、実施例１と同様にして、抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬を調製した。
【００３５】
（実施例３）
実施例１の（１−１）トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液の調製において、得られた沈殿物にＢＳＡを０．２５（ｗ／ｖ）％含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１２ｍｌを添加するとともに、（１−２）検体希釈液の調製において、Ｌｉｐｉｄｕｒｅを１．０（ｗ／ｖ）％添加した以外は、実施例１と同様にして、抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬を調製した。
【００３６】
（比較例１）
実施例１の（１−２）検体希釈液の調製において、ＢＳＡを１％含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に、Ｌｉｐｉｄｕｒｅの代わりにｐＧＥＭＡ（グリコシルエチルメタクリレートのホモポリマー、平均分子量１１４万、日本精化社製）を１（ｗ／ｖ）％添加した以外は実施例１と同様にして、抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬を調製した。
【００３７】
（評価）
（１）抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液の測定
抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液として、梅毒陽性標準血清（積水化学工業社製、５濃度）１６μＬを採取し、これに検体希釈液１７５μＬを混和し、３７℃で適時保持した後、トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液２５μＬを添加、撹拌した後、約８０秒から３００秒までの間の波長７００ｎｍでの吸光度の変化量を測定し、吸光度変化量（△ａｂｓ）とした。測定は自動分析装置日立７１７０型を使用した。結果を表１に示した。なお、Ｔ．Ｕ．は抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬であるメディエースＴＰＬＡ（積水化学工業社製）で血清を測定した場合の抗トレポネーマ・パリダム抗体の抗体価を表す単位であり、１０Ｔ．Ｕ．以上を陽性とする。
【００３８】
【表１】
0004629564.tif 000003
【００３９】
（２）添加回収試験
生理食塩水２４５μＬに、２，０００Ｔ．Ｕ．の抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液５μＬを添加し、評価（１）と同様の方法で添加前後の吸光度変化量を測定することにより、添加前後の抗体価の測定値の差を求めた。同様にして、５種類の梅毒陽性血清２４５μＬのそれぞれに２，０００Ｔ．Ｕ．の抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液５μＬを添加し、添加前後の抗体価の測定値の差を求めた後、生理食塩水に抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液を添加した場合における添加前後の抗体価の測定値の差を１００％として回収率を算出した。結果を表２に示した。
【００４０】
【表２】
0004629564.tif 000004
【００４１】
表２に示すように、Ｌｉｐｉｄｕｒｅを反応促進剤として使用した実施例１〜３では、各検体ともｐＧＥＭＡを反応促進剤として使用した比較例１よりも添加回収率が大幅に改善していることがわかる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明によれば、血清干渉の発生を防止して、梅毒の感染の診断を精度良く行うことが可能な抗トレポネーマ・パリダム抗体測定試薬を提供することができる。