(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸又はその塩を有効成分として含有する代謝性骨疾患予防治療剤。
【請求項２】
１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸又はその塩が、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を産生する微生物を培養し、培養物中に１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を産生させ、これを採取することにより得られたものである請求項１記載の代謝性骨疾患予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸（1,4-Dihydroxy-2-naphthoic acid或いは1,4-Dihydroxy-2-naphthalene carboxylic acid或いは略してＤＨＮＡと呼ぶこともある）の工業的製法、及びこの化合物を含有する腸内フローラの改善、乳糖不耐症の腹部不快症状の改善、代謝性骨疾患予防治療に有用な医薬及び飲食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
これまでの母乳栄養児と人工栄養児の腸内フローラの比較研究から、ビフィズス菌が人の健康に有用であることが示唆されてきた。現在では、各種消化管疾病等や老化に伴いビフィズス菌が有意に低下することと、腸内ビフィズス菌の増殖を促進することが発癌抑制、腸内腐敗の抑制、感染症の防止等に有効であることが確認されてきている。したがって、腸内のビフィズス菌を選択的に増殖させることは、健康維持や各種成人病等の予防・治療の観点から極めて重要であるといえる。
【０００３】
有用なビフィズス菌を増殖促進せしめる物質、いわゆるビフィズス因子については、従来よりいくつかの物質が研究され、報告されている。例えば、母乳中に含まれるＮ−アセチルグルコサミン(非特許文献１)、ペプチド関連物質(非特許文献２、３)、人参抽出物(非特許文献４、５)、糖関連物質(非特許文献６)等がある。
しかしながら、これらビフィズス菌の増殖促進物質の調製は、いずれも煩雑であり、ビフィズス菌のみを選択的に増殖させるという作用においても十分とは言えない点があった。
【０００４】
そこで、本発明者等はビフィズス菌の増殖を選択的に促進する化合物について研究を重ねた結果、ある種のナフトキノン誘導体及びナフタレン誘導体が各種ビフィズス菌(Bifidobacterium longum, B.breve, B.adolescentis, B.bifidum, B.infantis, B.animalis, B.pseudolongum等)に対して強い増殖促進活性を有することを見出した。また、これら既知の化合物のほかに新たなビフィズス菌増殖促進物質についても明らかにしており、その物質は、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)属菌により菌体内外に産生する高活性のビフィズス菌増殖促進物質で、従来未知の新規物質である２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンであることを確認した（特許文献１）。さらに、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン等が骨粗鬆症等の代謝性骨疾患の予防治療薬として有用であることも見出した（特許文献２）。
【０００５】
一方、ＤＨＮＡは、染料、顔料及び感光材料として工業材料として有用であることが知られており、これまでにも有機化学合成法により種々の合成法が開発されてきた（特許文献３、４、５等）。しかし、これまでの合成法は、有機溶媒中高温高圧下での反応あるいは、触媒などとして飲食用には適さない試薬等を用いる必要があった。これらの方法で製造されたＤＨＮＡから製造に用いた溶媒や試薬を完全に除去することは困難であり、従来の製造方法で得られたＤＨＮＡを飲食品や医薬に用いることは考えられていなかった。
【特許文献１】特開平8-98677号公報
【特許文献２】国際公開第01/28547号パンフレット
【特許文献３】特開昭57-128655号公報
【特許文献４】特開昭59-186942号公報
【特許文献５】特開昭60-104037号公報
【非特許文献１】Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,90,219(1955)
【非特許文献２】Am.J.Clin.Nutr.,32,1428(1974)
【非特許文献３】Agric.Biol.Chem.,48,2159(1984)
【非特許文献４】日農化誌,55,499(1981)
【非特許文献５】Chem.Pharm.Bull.,(Tokyo)14,1191(1966)
【非特許文献６】東北福祉大紀要,10,313(1986)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者は、ビフィズス菌に特異的な増殖促進作用を示す各種化合物についてさらに検討した結果、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸(DHNA)がプロピオニバクテリウム(Propionibacterium)属菌により菌体内外に大量に産生されることを見出すと共に、この培養物から採取した１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸含有組成物、又は１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸もしくはその塩が、牛乳不耐症の牛乳の摂取時にみられる腹部不快症状を低減する作用を有すること、さらには骨芽細胞の分化と機能発現を促進し、破骨細胞の形成を抑制することから代謝性骨疾患の予防治療に有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の塩としては、薬学的又は食品学的に許容できる塩が挙げられ、代表的な塩には、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、乳酸塩、クエン酸塩などが含まれるが、これらは例示であって、本発明はこれらの塩に限定されない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
すなわち、本発明は、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を産生する微生物を培養し、培養物中に１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を産生させ、これを採取することを特徴とする１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸の製造法を提供するものである。
また、本発明は、上記の製造法により得られた１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸含有組成物を提供するものである。
また、本発明は、上記の製造法により得られた１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸含有組成物、又は１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸もしくはその塩を有効成分として含有する腹部不快症状改善用飲食品、腹部不快症状改善剤、整腸剤、代謝性骨疾患予防治療用飲食品又は代謝性骨疾患予防治療剤を提供するものである。
また、本発明は、上記の製造法により得られた１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸含有組成物、又は１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸もしくはその塩の、腹部不快症状改善用飲食品、腹部不快症状改善剤、整腸剤、代謝性骨疾患予防治療用飲食品又は代謝性骨疾患予防治療剤の製造のための使用を提供するものである。
【０００８】
さらに本発明は、上記の製造法により得られた１，４−ジヒドロキシ−２−エナフトエ酸含有組成物、又は１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸もしくはその塩の有効量を投与することを特徴とする腹部不快症状の処置方法、整腸方法又は代謝性骨疾患の処置方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明に係るＤＨＮＡの工業的製法は、微生物に由来することから、安全性に優れており、ＤＨＮＡを高濃度に含む本組成物を経口摂取することで、腸内フローラの改善はもとより、牛乳の摂取時にみられる腹部不快症状の改善及び代謝性骨疾患の予防治療にも利用することができる。また、毒性がないことから、長期間摂取することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明における、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸(DHNA)を産生する菌の属の例としては、プロピオニバクテリウム（Propionibacterium）、エンテロバクター（Enterobacter）、スポロラクトバチルス（Sporolactobacillus）、バチルス（Bacillus）等があげられる。これらの微生物の多くは、従来より飲食品及び医薬品の製造に用いられてきたものであり、ＤＨＮＡを含有する飲食品及び医薬品を製造する上でこれらの菌を用いることは好ましい。プロピオン酸菌としては、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Propionibacterium freudenreichii）、プロピオニバクテリウム・トエニー（P. thoenii）、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（P. acidipropionici）、プロピオニバクテリウム・ジェンセニー（P. jensenii）などのチーズ用の菌、プロピオニバクテリウム・アビダム（P. avidum）、プロピオニバクテリウム・アクネス（P. acnes）、プロピオニバクテリウム・リンホフィラム（P. lymphophilum）、プロピオニバクテリウム・グラニュロサム（P. granulosam）などが挙げられる。また、バチルス属の菌としてはバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)、バチルス・コアギュランス(Bacillus coagulans)などが挙げられる。本発明に使用する微生物としては、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒが好適であり、例えばP. freudenreichii IFO 12424、あるいはP. freudenreichii ATCC 6207が挙げられる。
【００１１】
本発明により、ＤＨＮＡを製造するには、まずＤＨＮＡを産生する能力を有する菌株を、通常の微生物が増殖し得る栄養源を含む培地で好気的又は嫌気的に培養する。栄養源としては従来から微生物の培養に用いられている公知のものが使用できる。特に、脱脂粉乳培地、トリプチケース、フィトン、酵母エキス及びグルコースからなる培地の他、ホエイ粉、或いはそのプロテアーゼ処理物、或いはホエイ蛋白質濃縮物、その処理物及び乳清ミネラルのラクターゼ処理物を主成分とする培地が好適に用いられるが、本発明においては、培地の蛋白源として脱脂粉乳のプロテアーゼ処理物を用いることが最も望ましく、その際、培養時の添加物として、酵母エキス、乳糖の少なくともひとつを使用することで、培養液のＤＨＮＡ産生量を増大させることができる。また、培養時の添加物として、乳糖の他、グルコース又は乳糖のラクターゼ処理物も使用できるが、脱脂粉乳のプロテアーゼ処理物を培地の主原料に使用した場合には、糖質として乳糖が最も好ましい。以下に、培地原料に脱脂粉乳のプロテアーゼ処理物を用いた場合の培地調製法の一例を示す。
【００１２】
脱脂粉乳を１０％(w/v)の濃度になるように水で溶解し、プロテアーゼでタンパク質を分解する。使用量は、脱脂粉乳量に対し、０．２５％(w/w)とする。分解は、４７℃、ｐＨ６．８で６時間行い、分解中のｐＨ調整には炭酸カリウム水溶液を用いる。最終的な培地濃度として脱脂粉乳濃度を１０％(w/v)に調整し、最後に、酵母エキスを脱脂粉乳量に対し、１〜１０％(w/w)、好適には３〜７％(w/w)添加する。
【００１３】
培養方法としては、公知の各種好気的、嫌気的培養方法を用いることができるが、液体培地による好気又は嫌気培養法が大量生産の上から最も好ましい。培養温度は約２０〜４０℃、培地のｐＨは中性〜微酸性（好ましくはpH5.5-7.5）の条件下で培養する。液体培養では、培養開始後約１〜５日経過すると培地及び菌体中にＤＨＮＡが蓄積される。培養中に乳糖を添加することによりＤＨＮＡの産生量は増加する。培養を停止し、直ちにその培養物よりＤＨＮＡの採取に供することも可能であるが、好ましくは、培養液を冷却（3〜20℃、より好ましくは約10℃）し、保存(好ましくは２〜４週間程度)することによりＤＨＮＡをさらに蓄積させることができる。
【００１４】
次に、ＤＨＮＡの採取方法について説明する。得られた培養物を吸着クロマトグラフィーに付すのが好ましい。吸着剤としては、活性炭や合成吸着剤（例えばダイアイオンＨＰ−２０、三菱化学（株）製）などの逆相系の吸着剤を広く使用することができる。まず、吸着剤をカラムに充填し、０．５％(w/v)アスコルビン酸ナトリウム水溶液で洗浄する。次いで、得られた培養物をカラムに添加し（通過液をpassとした）、さらに０．５％(w/v)アスコルビン酸ナトリウム水溶液で水溶性画分を除去する。その後、０．５％(w/v)量アスコルビン酸ナトリウムを添加したエタノールで溶出し、このエタノール溶出画分を濃縮することで、ＤＨＮＡを高濃度に含む組成物を得ることができる。さらに、精製を行い、純粋なＤＨＡＮ又はその塩を得ることができる。尚、カラムからのＤＨＮＡの溶出液としてエタノールの代わりにメタノールを用いてもよい。
【００１５】
ＤＨＮＡの塩としては、薬学的又は食品学的に許容できる塩が挙げられ、代表的な塩には、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、乳酸塩、クエン酸塩などが含まれるが、これらは例示であって、本発明はこれらの塩に限定されない。
ＤＨＮＡは、ＤＨＮＡ産生菌の培養物中（菌体内及び／又は外）に含有されているので、吸着クロマトグラフィーを適用せずに培養物それ自体をロータリーエバポレーター等を使用し、濃縮することによってＤＨＮＡを高濃度に含有する組成物を得ることができる。また、通常の遠心分離法によって培養物から菌体を分離し得られた上清を濃縮することも好ましい。こうして得られた組成物は、利用する形態にあわせ、液状のまま用いてもよいし、粉末状に加工することもできる。
【００１６】
牛乳を飲んだ後に腹痛や腹鳴、下痢などの腹部不快症状をおこすものを牛乳不耐症と呼ぶが、この中の大部分は牛乳中等の乳糖を摂取したことによって起こる乳糖不耐症に相当する。そして、その原因の多くの場合、小腸ラクターゼ活性の欠乏又は減少によっている。本発明に係る組成物又はＤＨＮＡもしくはその塩は、牛乳の摂取時にみられる腹部不快症状を低減する作用を有し、さらには骨芽細胞の分化と機能発現を促進する作用、破骨細胞の形成抑制作用を有し、骨粗鬆症等の代謝性骨疾患の予防治療に有用である。飲食品又は医薬品いずれの形態でも利用することができ、例えば、医薬として直接投与することにより、或いは特定保健用食品等の特別用途食品、栄養機能食品として直接摂取することにより、あるいはまた、各種食品（牛乳、発酵乳、ヨーグルトその他）に添加しておきこれを摂取することによって、腸内フローラの改善や牛乳の摂取時等にみられる腹部不快症状を低減し、また代謝性骨疾患を予防治療することができる。
【００１７】
本発明に係る組成物、又はＤＨＮＡもしくはその塩を医薬品として使用する場合には、種々の形態で投与することができる。その形態として、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与をあげることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主剤に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味、矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。
この製剤をヒトに適用する場合、経口投与するのが好ましい。有効成分であるＤＨＮＡの治療有効量は治療される各患者の年齢及び条件によって変動するが、一般にＤＨＮＡとして、ヒト体重１ｋｇあたり１日量０．０３〜３μｇ、より好ましくは０．１〜１μｇ経口投与する。
【００１８】
本発明に係る組成物、又はＤＨＮＡもしくはその塩は、経口投与によって腸内フローラの改善や牛乳の摂取時にみられる腹部不快症状を低減する、代謝性骨疾患を予防又は治療するという所期の目的を達成しうるので、飲食品として使用することができる。そのためには、ＤＨＮＡを高濃度に含む本発明組成物又はＤＨＮＡもしくはその塩を各種補助剤や他の飲食品を用いて、ドリンク、錠剤、その他各種の飲食品にしたり、飲食品に直接添加する等、各種の方法を利用することができる。このように飲食品にすることで、長期間に亘って摂取することが可能であるため、通常の飲食品の他、特定保健用食品等の特別用途食品、栄養機能食品として市販に供することができる。
【実施例】
【００１９】
以下、試験例、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００２０】
試験例１  ＤＨＮＡ産生菌のスクリーニング
培養条件
脱脂粉乳培地（後記する実施例１に記載）にそれぞれ下記供試菌を摂取し、３７℃で１８〜７２時間、ガスパック法にて嫌気培養した。
（Ａ）Propionibacterium freudenreichii IFO 12424 （培養時間：７２時間）
（Ｂ）Propionibacterium acidipropionicii IFO 12425 （７２時間）
（Ｃ）Propionibacterium jensenii IFO 12427 （７２時間）
（Ｄ）Lactococcus lactis ATCC 10697 （２４時間）
（Ｅ）Leuconostoc mesenteroides JCM 9700 （２４時間）
（Ｆ）Lactobacillus acidophilus ATCC 4357 （１８時間）
（Ｇ）Lactobacillus plantarum IFO 12006 （１８時間）
（Ｈ）Lactobacillus rhamnosus JCM 1136 （１８時間）
（Ｉ）Lactobacillus casei ATCC 7469 （１８時間）
（Ｊ）Bifidobacterium longum ATCC 15707 （１８時間）
（Ｋ）Bifidobacterium bifidum ATCC 11146 （１８時間）
（Ｌ）Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 （１８時間）
（Ｍ）Bifidobacterium breve ATCC 15700 （１８時間）
【００２１】
ＤＨＮＡ分析条件（ＨＰＬＣ分析）
カラム：Ｃ１８、充填剤粒径３μｍ、内径４．６ｍｍ、長さ１５０ｍｍ
（Ｃ１８：インタクト（株）のＣａｄｅｎｚａ ＣＤ-Ｃ１８）
溶離液：アセトニトリル：メタノール：水：酢酸＝１０：２０：２００：０．１(5%アンモニア水でpH 7.0に調整)
流速：1.5mL／min
注入量：20μｌ
検出器：UV254nm
【００２２】
ＨＰＬＣサンプル調製法
各培養液１０ｍｌに０．１％(w/v)のアスコルビン酸ナトリウムを添加後、ｐＨ７．０に調整し、水で全量を２０ｍｌにした後、そのうち３ｍｌを等量のメタノールと混合して、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上清液を０．４５μｍのフィルターでろ過した。
【００２３】
ＤＨＮＡの定量
ＨＰＬＣサンプル中のDHNA量は、予め求めた市販のＤＨＮＡ（和光純薬（株）製）標品の保持時間（13分付近）、及びＨＰＬＣのピーク面積とＤＨＮＡ濃度との関係（検量線）をもとに算出した。
【００２４】
その結果、ＤＨＮＡはプロピオニバクテリウム（Ａ）〜（Ｃ）から３．０μｇ／ｍｌ以上検出された。ラクトコッカス（Ｄ）、ロイコノストック（Ｅ）からは微量に検出されたものの、ラクトバチルス（Ｆ）〜（Ｉ）、ビフィドバクテリウム（Ｊ）〜（Ｍ）からは検出することができなかった。すなわち、プロピオニバクテリウムは、本発明に使用しうるＤＨＮＡ産生菌として望ましいことが確認された（表１）。Bacillus subtilisについても同培地を用い、好気的に培養したところ、培養物にはＤＨＮＡが含有されていることが確かめられた。
【００２５】
【表１】
0004653785.tif 000002
【００２６】
実施例１  ＤＨＮＡ含有組成物の製造法
脱脂粉乳を１０％(w/v)の濃度になるように水で溶解した脱脂粉乳培地(脱脂粉乳の１０重量％還元液)にビール酵母エキス（アサヒビール（株）製）を０．１％(w/v)添加した液５０Ｌを容量５Ｌの三角フラスコ２０本に分注し、１２１℃、７分間オートクレーブで滅菌した。これらの培地にプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ(Propionibacterium freudenreichii)ＩＦＯ １２４２４株の賦活培養液６０ｍｌをそれぞれ接種し、３７℃で７２時間、窒素雰囲気下、嫌気培養したところ、１，４−ジヒドロキシ−２−ナフトエ酸を３μｇ／ｍｌ含有する組成物（50L）が得られた。なお、前記賦活培養液は、ＴＰＹＧ培地（トリプチケース（ＢＢＬ） ８ｇ、フィトンペプトン（ＢＢＬ） ３ｇ、ビール酵母エキス５ｇ、Ｌ−システイン塩酸塩 ０．５ｇ、グルコース ２０ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ２ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ３ｇ、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ、Ｈ2Ｏ １０００ｍｌ、ｐＨ６．５）に２％(w/v)のプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ(Propionibacterium freudenreichii)を接種し、３７℃で７２時間ガスパック法にて嫌気培養することで得る。
【００２７】
実施例２  ＤＨＮＡ高濃度含有組成物の製造法
脱脂粉乳を１０〜２０％(w/w)の濃度になるように水で溶解し、プロテアーゼ[アマノＡ](アマノ製薬(社)製)を脱脂粉乳量の０．２５％(w/w)添加し、４７℃で６時間酵素分解した。この間、炭酸カリウム水溶液でｐＨ６．８に保持した。８５℃、５分間加熱して酵素を失活させた後、脱脂粉乳量が１０％(w/w)となるよう水でメスアップした。ビール酵母エキス(アサヒビール(社)製)を脱脂粉乳の５％(w/w)量添加した後、２L容量のファーメンターに１．５Ｋｇ分注し、１２１℃、７分間オートクレーブで滅菌した。ファーメンター中に窒素ガスを上面通気で流し、撹拌は１５０ｒｐｍで行い、培地温度を３３℃に調整した。培地温度が３３℃に安定したら、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ(Propionibacterium freudenreichii)ＥＴ−３株(平成１３年８月９日付で、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭＢＰ−８１１５として寄託されている)の凍結濃縮スターターを培地に対し０．０５％(w/w)接種し、培養を開始した。途中、培養開始７２時間後と９６時間後に、培養液に対し、２％(w/w)量の乳糖と、１．３％(w/w)量の乳糖を添加した。３３℃で１２０時間、４０％(w/w)炭酸カリウム水溶液でｐＨ６．４５に保ちながら窒素雰囲気下で嫌気培養したところ、この時点で、培養液中に３０μｇ／ｍｌのＤＨＮＡが産生された。なお、培養開始１２０時間後のアルカリ消費量は培養液１．５ｋｇに対し、１３１ｇであった。さらに、この培養液にアスコルビン酸ナトリウムを培養液の０．５％(w/w)量添加し、炭酸カリウム水溶液でｐＨを８．０に調整後、１０℃まで冷却した。これを１０℃で２週間保存した結果、培養液中のＤＨＮＡの含量は、４０μｇ／ｍｌまで増加した。凍結濃縮スターターは、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ(Propionibacterium freudenreichii)ET-3株の賦活培養液（上記脱脂粉乳のプロテアーゼ処理物を主成分とする培養液で３３℃で４８時間窒素雰囲気下で嫌気培養する）を、培地（脱脂粉乳のプロテアーゼ処理物を主成分とする培養液）に対して２％(w/w)量接種し、３３℃で７２時間培養し、培養終了後、培地を回収して遠心分離し、菌体を20倍程度に濃縮した。その後、適量を滅菌した容器に分注し、−８０℃以下で凍結し、−８０℃で保存したものを使用した。
【００２８】
実施例３  実施例１で得られた組成物のカラムクロマトグラフィーによる濃縮
ダイアイオンＨＰ−２０（４Ｌ）をカラムに充填し、０．５％(w/v)アスコルビン酸ナトリウム水溶液で洗浄後、実施例１で得られた組成物４０Ｋｇをカラムに添加した。次に０．５％(w/v)アスコルビン酸ナトリウム水溶液８Ｌで水溶性画分を除去後、エタノール１２Ｌを流してＤＨＮＡを溶出させた。溶出液にはさらに０．５％(w/v)量アスコルビン酸ナトリウムを添加した。本エタノール画分をエバポレーターで濃縮し、ＤＨＮＡを１１５ｍｇを含む１０ｇの本発明組成物を得た。
【００２９】
実施例４  実施例１で得られた組成物のロータリーエバポレーターによる濃縮
実施例１で得られた組成物５Ｋｇに０．５％(w/w)量アスコルビン酸ナトリウムを添加し、ロータリーエバポレーターにて５倍に濃縮したところ、１Ｋｇ中にＤＨＮＡを１５ｍｇ含む本発明組成物が得られた。
【００３０】
実施例１〜３の組成物の製造には、チーズの製造に用いられているプロピオン酸菌を用いているため、実施例１〜３で得られた本発明品をそのまま飲食品として用いることができる。
【００３１】
実施例５  ＤＨＮＡの精製
実施例２で得られた濃縮物をｐＨ４．５に調整した０．５％(w/v)アスコルビン酸ナトリウム水溶液１Ｌに溶解し、酢酸エチル１Ｌで３回抽出した。酢酸エチル層をあわせて、無水硫酸ナトリウム２００ｇで脱水後減圧下濃縮した。濃縮物をメタノール８０ｍＬに溶解後、その４ｍＬをＣ１８カラムで精製した。保持時間２１分から３１分のＤＨＮＡ溶出画分に２５％(w/v)となるようにアスコルビン酸ナトリウムを加えた後、減圧下濃縮した。この濃縮物８００ｍＬを酢酸エチル３００ｍＬで２回抽出し、無水硫酸ナトリウム５０ｇで脱水後減圧下濃縮した。得られた最終精製物を500MHz 1H-NMRにて構造を解析したところＤＨＮＡであると同定した。最終的に培養液４０ＬからＤＨＮＡ  １１５ｍｇが得られた。
【００３２】
カラム：Capcell Pak C18 SG120, φ50×500mm, Lot.930210 (資生堂（株）製)
移動層：アセトニトリル：メタノール：水：酢酸=20:40:200:0.1(5%アンモニア水でpH 7.0に調整)
温度：室温
流速：100mL/min
注入量：4mL
検出器：UV254nm
＜最終精製物のNMRデータ＞
1H-NMR (500MHz, MeOH-d4):δ8.39 (1H, d, J=8.3Hz), 8.23 (1H, d, J=8.3Hz), 7.69 (1H, dd, J=8.3, 6.9Hz), 7.60 (1H, dd, J=8.3, 6.9Hz), 7.23 (1H, s)
【００３３】
実施例６  急性毒性試験
マウス５匹（５週齢：ICRを購入後、７日間訓化）を用いて実施例２記載のＤＨＮＡ含有組成物の急性毒性試験を実施した。１日当たり７８．３ｍｇ／ｋｇ（ＤＨＮＡは、０．９（≒１１５×（７８．３／（１０×１０００）））ｍｇ／ｋｇ）を最高投与量として５日間連続投与し、１４日間観察したが、死亡は認められず、体重、行動、臓器の解剖所見を調べたが何れも異常がないことを確認した。
【００３４】
実施例７  ＤＨＮＡを含有する本発明組成物を配合した食品の調製法（タブレットの調製）
実施例１で得られた組成物１０Ｋｇを品温５０℃で２４時間凍結乾燥し、凍結乾燥粉１Ｋｇを得た。次に同粉末をブドウ糖８０％(w/w)と乾燥コーンスターチ１０％(w/w)、粉末パラチニット７％(w/w)、クエン酸３％(w/w)から成るタブレット基剤に４０％(w/w)配合し、０．５ｇ毎に打錠した。
【００３５】
実施例８  ＤＨＮＡを含有する本発明組成物を配合した食品の調製法（乳飲料の調製１）
生乳１０Ｋｇにアスコルビン酸ナトリウム１５ｇ及びＤＨＮＡを含有する実施例２より得られた組成物１２５ｍｇを添加し、これを均質化した後に１３０℃で２秒間殺菌し、１００ｍｌ毎に容器に充填した。
【００３６】
実施例９  ＤＨＮＡを含有する本発明組成物を配合した食品の調製法（乳飲料の調製２）
プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ(Propionibacterium freudenreichii)ＥＴ−３株（FERM P-18454）をホエイ粉のプロテアーゼ処理物を主原料とする培地（１０重量％ホエイ粉還元液をプロテアーゼ（天野製薬（株）製：アマノＡ）で２時間タンパク分解（５０℃、ｐＨ７．０）した溶液にビール酵母エキス（アサヒビール製）を０．１％(w/v)添加した液５０Ｌをジャーファーメンターに供し、１２１℃、７分間滅菌した）に、賦活培養液６０ｍｌを接種し、３５℃、ｐＨ６．０で９０時間、嫌気培養後、０．５％(w/v)のアスコルビン酸ナトリウムを添加することで得られた本発明組成物１７７．５ｍｌを、生乳９８２２．５ｍｌに添加し、これを均質化した後に１３０℃で２秒間殺菌し、１００ｍｌ毎に容器に充填した（DHNA含量１１μｇ／１００ｍｌ）。
前記賦活培養液は、培養温度３５℃以外は、実施例１と同様の方法で得る。
【００３７】
実施例１０  乳飲料摂取時にみられる腹部不快症状の本発明品による影響１
試験飲料として実施例８で調製した乳飲料を用い、対照飲料として発酵前の培地を用いて同様に調製した乳飲料を用いた。被験者は、牛乳摂取による呼気中水素ガス濃度の測定を行い、小腸のβ-ガラクトシダーゼ活性が低く乳糖不耐症と考えられるヒトを選定した。具体的には、対照飲料４００ｍｌによるラクトース負荷試験を行い、呼気中の水素濃度が飲料摂取から６時間までに約２０ppm以上増加した１５名（男性７名、女性８名、平均年齢２８．０７±３．４１才）を被験者とした。
【００３８】
被験者は、試験前日２２時から試験当日１７時まで水以外の飲食をしないように制限した。試験当日１０時に対照飲料４００ｍｌを経口摂取し、経時的に１７時までアンケートによる腹部症状の記入（３０分毎）と呼気の採取（１時間毎）を行った。試験飲料の投与は、１週間後に対照飲料の投与と同じ要領にて実施した。なお、被験者には飲料の種類についての事前の告知は一切行わなかった。
【００３９】
呼気は１Ｌ容のコック付テドラ−バッグ（ジーエルサイエンス（株））にて採取し、水素ガスの分析はガスクロマトグラフィー（ＧＣ-８Ａ、島津製作所（株））にて行った。分析条件は、カラム：モレキュラーシーブ５Ａ（３ｍｍ×２ｍ）、オーブン温度：４０℃、キャリアガス：アルゴン、検出器：熱伝導度型検出器（ＴＣＤ:Thermal Conductivity Detector）とした。
アンケート用紙を各被験者に配布し、３０分毎に腹部症状について自己記入方式で調査した。腹部膨満感は、「接取直後に比較して非常におなかが張る」を４、「摂取直後に比較しておなかが張る」を３、「接取直後に比較して少しおなかが張る」を２、「摂取直後に比較して変わらない」を１として数値化し、摂取３０分後から６時間までの値を累積した。また、その他の腹部症状として下痢、腹痛、鼓腸（ゴロゴロなる）があった際にはアンケート用紙に併記させた。
【００４０】
乳飲料摂取から６時間後までの腹部症状を調べたところ、対照飲料摂取において腹部膨満感の累積値が１７．９３±４．８３であったのが、試験飲料では１５．９３±３．６５と有意（wilcoxon検定、ｐ＜０．０５）に減少した（図１）。また、摂取６時間後までに被験者が膨満感を訴えた回数を観察したところ、対照飲料摂取において３．４７±３．１１であったものが、試験飲料において２．４７±２．９０と減少傾向（ｐ＝０．１０８）であった（図２）。同様に、鼓腸（ゴロゴロ感）を訴えた回数も対照飲料摂取において２．８７±２．７５であったものが、試験飲料において１．４７±２．１０と有意（ｐ＜０．０５）に減少した（図３）。その他の腹部症状では、対照飲料摂取では下痢を呈する被験者が２名いたが、試験飲料摂取では下痢を訴える被験者がいなかったほか、対照飲料摂取で腹部不快症状がなかった被験者が２名であったのに対し、試験飲料摂取では６名に増加した（表２）。
【００４１】
また、呼気水素濃度の最大上昇量を求めたところ、対照飲料摂取での最大呼気水素濃度上昇量の平均値は４２．９±１３．７ppmであった。一方、試験飲料摂取後の最大呼気水素濃度上昇量の平均値は３４．７±１７．６ppmとなり、対照飲料摂取に比較して減少傾向（wilcoxon検定、ｐ＝０．０５１）であった（表２）。
【００４２】
【表２】
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【００４３】
実施例１１  乳飲料摂取時にみられる腹部不快症状の本発明による影響２
プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ(Propionibacterium freudenreichii)ＩＦＯ １２４２４株を実施例９と同様の方法で培養し得られた培養物５Ｋｇをさらにエバポレーターで５倍濃縮したところ、１Ｋｇ中ＤＨＮＡを４５ｍｇ含む組成物が得られた。得られた組成物３５．５ｇに生乳１０ｋｇ、アスコルビン酸ナトリウム１５ｇを用いて調製した乳飲料で実施例１０と同様の実験を行ったところ、本発明組成物を含有する乳飲料の摂取により、実施例１０とほぼ同様の結果が得られ、乳飲料摂取時にみられる腹部不快症状が改善されることが確認された。
【００４４】
実施例１２  ＤＨＮＡの骨芽細胞石灰化能促進効果
骨折手術時に得られた２０歳男性の長管骨骨膜より樹立した培養ヒト骨芽細胞（ＳａＭ−１）を使用した。このＳａＭ-１細胞は骨芽細胞の特徴をすべて保持していた（Koshihara, Y. et al.: In Vitro Cell. Dev. Biol., 25: 37-43, 1989）。ＳａＭ-１は、２ｍＭのα−グリセロリン酸存在下で、１α,２５(ＯＨ)2Ｄ3の濃度に依存して石灰化を促進することが知られている（Koshihara, Y. et al.: Biochem. Biophys. Res. commun., 145: 651-657,1987）。
１８ＰＤＬ(population doubling level)のＳａＭ-１を１２穴プレートに播き、コンフルエントになるまで培養した。つぎに石灰化促進剤である、α−グリセロリン酸を２ｍＭになるように添加した。この培養系に、１０-7Ｍ〜１０-5ＭのＤＨＮＡを添加し３２日間培養した。対照には溶媒のＤＭＳＯを培養液の０.１％になるように加えた。培地はそれぞれの試験物質を含む培地で１日おきに交換した。石灰化度はヒドロキシアパタイトの構成成分であるＣａ量で表した。
【００４５】
細胞外マトリックス中のＣａは、o-cresolphthalein complexone 法(OCPC法)（Gitleman, H. J.: Anal. Biochem., 18: 520-531,1967)に基づいたキット（カルシウムＣテストワコー）により定量した。
培養終了後Hank's液にて細胞を洗浄した。冷５％過塩素酸 ０.５mL／ウエル を加えて、4℃で１５分間振盪抽出した。抽出液２５μLと緩衝液２.５mLを混合後、発色液（ＯＣＰＣ０.４ｍｇ／mL、８−キノリノール含有）２５０μLを加えて攪拌し、５分後にその反応液を吸光度計（５７０ｎｍ）にて測定した（図４）。図４から、ＤＨＮＡは、濃度に依存して石灰化を促進することが確認された。
【００４６】
実施例１３  ＦＫ−５０６誘発骨粗鬆症モデル動物に対するＤＨＮＡの効果
免疫抑制剤として知られるＦＫ−５０６を動物に投与する事により骨粗鬆症様の病態を引き起こすことが知られている(J. Hard Tissue Biology, 103-107, 10(2), 2001)が、これは、骨芽細胞上に発現されるＲＡＮＫＬ(破骨細胞分化因子)の発現亢進により破骨細胞形成が進み、骨吸収優位となって骨粗鬆症病態を呈することが示唆されている。８週齢のＩＣＲ雄性マウスにＦＫ−５０６を１mg/kgで１０週間連続腹腔内投与した。この間、餌（CRF-1、オリエンタル酵母社製）は自由摂取とし、ＤＨＮＡを毎日７５μg/kgを１％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）水溶液に懸濁させて経口投与した。その結果、ＤＨＮＡ投与群は、コントロール群(ＦＫ５０６(+))に比べて有意に骨密度が高く、ＦＫ５０６投与による骨密度の低下が抑制されていることが明らかとなった（図５）。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ＤＨＮＡを高濃度に含有する本発明組成物を配合した乳飲料摂取から６時間後までに感じた腹部の膨満感の強さを示すグラフである。
【図２】ＤＨＮＡを高濃度に含有する本発明組成物を配合した乳飲料摂取から６時間後までに腹部の膨満感を訴えた回数を示すグラフである。
【図３】ＤＨＮＡを高濃度に含有する本発明組成物を配合した乳飲料摂取から６時間後までに感じた鼓腸（ゴロゴロ感）を訴えた回数を示すグラフである。
【図４】ＤＨＮＡの骨芽細胞石灰化能促進効果を示すグラフである。
【図５】ＤＨＮＡの骨密度低下抑制効果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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