(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料内で励起および／または後方散乱を経た光ビームの光学的検出のための装置であって、
試料照明を、試料平面と検出平面との間の光路の瞳面および／または瞳面の近傍に集束するための手段であって、集束するための手段の試料平面から見た後方焦点面が瞳面であることと、この瞳面内に配備され、照明光を検出光から空間的に分離するための手段とを備え、
空間的に分離するための手段が、反射または透過に形成された中央の第１の区分と、該第１の区分を取り囲む透過または反射に形成された第２の区分とを有するビームスプリッタであり、
透過に形成された前記第１の区分が検出器方向への検出光の通過のために、反射に形成された前記第２の区分が照明光の結合のために用いられるか、または
反射に形成された前記第１の区分が検出光の結合のために、透過に形成された前記第２の区分が照明光の通過のために用いられる、励起光ビームの光学的検出のための装置。
【請求項２】
試料から発せられる蛍光および／またはルミネセンス光および／または燐光および／または拡散した照明光が、検出される請求項１に記載の励起光ビームの光学的検出のための装置。
【請求項３】
ビームスプリッタが偏光分割器として形成されている請求項１に記載の励起光ビームの光学的検出のための装置。
【請求項４】
ラインフォーカスによって走査される請求項１あるいは３に記載の励起光ビームの光学的検出のための装置。
【請求項５】
広視野顕微鏡用傾斜照明を有する請求項１〜４の１項に記載の励起光ビームの光学的検出のための装置。
【請求項６】
傾斜照明の角度を変化させるために、顕微鏡の光軸に垂直に移動させることのできるレンズが配備されている請求項５に記載の励起光ビームの光学的検出のための装置。
【請求項７】
広視野顕微鏡に構造照明が配備されている請求項１〜６の１項に記載の励起光ビームの光学的検出のための装置。
【請求項８】
試料を深度解像方法を用いて検出する請求項７に記載の励起光ビームの光学的検出のための装置。
【請求項９】
レーザ走査型顕微鏡における、請求項１〜８の１項に記載の励起光ビームの光学的検出のための装置。
【請求項１０】
ラインスキャナが配備されている請求項１〜９の１項に記載の励起光ビームの光学的検出のための装置。
【請求項１１】
走査ラインに構造照明が重なっている請求項１０に記載の励起光ビームの光学的検出のための装置。
【請求項１２】
ラインの長さが、顕微鏡装置の焦点距離および／または像倍率の変動により変化する請求項１０あるいは１１に記載の励起光ビームの光学的検出のための装置。
【請求項１３】
ラインの長さが、中間像内の調節可能な絞りによって変化する請求項１１あるいは１２に記載の励起光ビームの光学的検出のための装置。
【請求項１４】
デスキャン検出が行われる請求項１０〜１３の１項に記載の励起光ビームの光学的検出のための装置。
【請求項１５】
１方向の検出光について部分的なデスキャン検出が行われる請求項１０〜１３の１項に記載の励起光ビームの光学的検出のための装置。
【請求項１６】
ノンデスキャン検出が行われる請求項１０〜１３の１項に記載の励起光ビームの光学的検出のための装置。
【請求項１７】
ＣＣＤカメラによる検出が行われる請求項１０〜１６の１項に記載の励起光ビームの光学的検出のための装置。
【請求項１８】
選択された試料の検出が行われる請求項１０〜１７の１項に記載の励起光ビームの光学的検出のための装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、顕微鏡法、特に蛍光顕微鏡法、レーザ走査型顕微鏡法、蛍光相関分光法および走査型近視野顕微鏡法における、主として生物学上の試料、プレパラートおよび付属する構成成分を検査するための方法に関するものである。
それと共に、作用物質を検査するための蛍光検出に基づく方法（ハイ・スループット・スクリーニング）も含まれる。それにより、オーバーラップ部分を持つ蛍光スペクトルの場合では、多重蛍光団を含む試料に対し、試料内複数点への同時照明によるリアルタイムでの検査が、厚い試料の空間構造においても可能となる。
【０００２】
【従来の技術】
生物プレパラートを検査するための光学顕微鏡の古典的利用分野の１つに蛍光顕微鏡法（文献：Pawley著"Handbook of Biological Confocal Microscopy”「生物共焦点顕微鏡法ハンドブック」、Plenum Press刊、１９９５年）がある。この場合では特定の色素が細胞部分への特殊標識付けのために使用される。
【０００３】
色素分子は、入射した一定エネルギーを持つ光子１個の吸収により光子基底状態から励起状態へ励起される。この励起は一般に１光子吸収と称される（図１ａ）。色素分子は、このように励起された状態からさまざまな方法で基底状態に戻ることができる。蛍光顕微鏡法では蛍光光子の放出下での移行が最も重要である。放出される光子の波長はストークス変位のため励起放出に比較して原則的に赤側にずれる。すなわち長波長側である。ストークス変位が蛍光ビームの励起光ビームからの分離を可能にする。
【０００４】
蛍光は、ブロックフィルタと組み合わせた適当なダイクロイック・ビームスプリッタによって励起放出から分離し別途観察する。そうすることによって、さまざまな色素で着色された個々の細胞部分の描写が可能である。しかし原則的には、プレパラートのいくつかの部分を、独特な堆積の仕方をするさまざまな色素で同時に着色することもできる（多重蛍光）。個々の色素から送出される蛍光信号を区別するために、ここでも特殊なダイクロイック・ビームスプリッタを使用する。
【０００５】
高いエネルギーを持つ１光子による色素分子の励起（１光子吸収）のほかに、より小さいエネルギーを持つ複数の光子による励起も可能である（図１ｂ）。この場合、個々の光子のエネルギ総和は高エネルギ光子の何倍にも相当する。この種の色素励起は多光子吸収と称される（文献：Corle、 Kino著、”Confocal Scanning Optical Microscopy and Related Imaging Systems”「共焦点走査型光学顕微鏡法と関連画像システム」；Academic Press刊１９９６年）。しかし、色素放出はこの種の励起によっては影響されない。すなわち、多光子吸収の場合、放出スペクトルは負のストークス・シフトを起すため、励起放出に比較するとその波長は短い。励起光ビームを放出光ビームから分離するのは１光子吸収の場合と同じ方法で行う。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
以下に現状技術を共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＬＳＭ）の例で説明する（図２）。
ＬＳＭは大きく分けて次の４モジュールから成っている：
光源、走査モジュール、検出ユニット、顕微鏡
これらのモジュールを以下により詳しく説明する。それに加え、ＤＥ１９７０２７５３Ａ１も参考になる。
【０００７】
プレパラート中にあるさまざまな色素の個別励起は、さまざまな波長のレーザをＬＳＭ内で使用する。励起波長の選択は検査対象色素の吸収特性に従って行う。励起光ビームは光源モジュール内で生成される。この場合さまざまなレーザ（アルゴン、アルゴン・クリプトン、ＴｉＳａレーザ）が使用の対象になる。そのほか、光源モジュールでは波長の選択および必要な励起波長の強度調整を、たとえば音響光学結晶の使用により行う。それに続き、レーザビームはファイバまたは適当なミラー装置を通じて走査モジュール内に導かれる。
【０００８】
光源で生成されたレーザビームは対物レンズを通り、回折の抑制下でスキャナ、走査レンズ系、円筒レンズを経由してプレパラート内へ集束される。スキャナにより試料をｘ−ｙ方向にドット走査する。試料走査における画素上滞留時間は多くの場合マイクロ秒未満ないし数秒の範囲とする。
【０００９】
蛍光の共焦点検出（デスキャン検出）の場合、焦点面（試料）からおよびその上・下にある平面から放出された光は、スキャナを通じてダイクロイック・ビームスプリッタ（ＭＤＢ）に達する。ＭＤＢは蛍光を励起光から分離する。続いて蛍光は、正確に焦点面と共役な平面内にある絞り（共焦点絞り／ピンホール）で集束する。これによって焦点外の蛍光成分が遮断される。絞りの寸法をさまざまに変化させることによって、顕微鏡の光学分解能を調節することが可能である。絞りの後ろに別のダイクロイック・ブロックフィルタ（ＥＦ）があり、これが再度励起ビームを差し止める。蛍光は、ブロックフィルタを通過した後、点像検出器（ＰＭＴ）によって測定される。
【００１０】
多光子吸収を利用した場合、色素蛍光の励起は励起強度が特に強い小ボリューム部分に起こる。この領域は、共焦点装置を使用した場合の検出領域より極僅かに大きいだけである。したがって共焦点絞りの使用は省くことができ、検出は対物レンズの直後で行うことができる（ノンデスキャン検出）。
【００１１】
多光子吸収によって励起される色素蛍光を検出するための別の装置では、さらにデスキャン検出が行われるが、しかしこの場合では対物レンズの瞳は検出ユニット内へ結像する（非共焦点デスキャン検出）。
【００１２】
３次元照明による像のうち、対応の１光子吸収もしくは多光子吸収と接続している二検出器の装置によって、対物レンズの焦点面内に存在する平面（光学的断面）のみが再現される。それに続いて、試料のさまざまな深さｚにおけるｘ−ｙ平面内のいくつかの光学的断面の描画により、コンピュータでサポートされた試料の３次元像が生み出される。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
したがって、ＬＳＭは厚いプレパラートを検査するのに適している。励起波長は使用色素の固有吸収特性で決定される。色素の放出特性に合わせたダイクロイックフィルタにより、それぞれの色素から送出される蛍光のみが確実に点像検出器で測定されることになる。
【００１４】
バイオメディカル分野においては、目下のところいくつかのさまざまな細胞領域がさまざまな色素で同時に標識付けされている（多重蛍光）。現状技術では、個々の色素はさまざまな吸収特性に基づき、または放出特性（スペクトル）に基づき別々に検出されている。それぞれ別個の検出には、複数色素の蛍光に対する追加分割を副ビームスプリッタ（ＤＢＳ）で行ない、個々の色素放出検出を別々の点像検出器（ＰＭＴｘ）内で行なう。
【００１５】
細胞およびその他粒子の検査および分類には流動細胞計量計が用いられる。その場合、細胞を液体に溶かし、毛管を通じてポンピングする。細胞検査には側面からレーザ光ビームを照射してそれを毛管に集束させる。細胞は各種の色素またはバイオ分子で着色しておく。励起された蛍光および後方散乱励起光を測定する。試料の蛍光信号を励起光から分離するのはダイクロイック・ビームスプリッタで行う（ＭＤＢについては図２参照）。現技術状況については、M.R. Melamed,T. Lindmo, M.L. Mendelsohn著“Flow Cytometry and Sorting”（「流動細胞の計量および分類」第２版、Wiley & Sons, Inc.社（ニューヨーク）出版、１９９０年刊、８１〜１０７ページ）に記述されている。
【００１６】
後方散乱信号から細胞の大きさが測定できる。個々の細胞の蛍光スペクトル特性から様々な細胞を分離／分類することで、個別に計量することができる。細胞の分類は、静電界において様々な毛管の使用下で行う。その結果は、例えば色素Ａ着色の細胞数と色素Ｂ着色の細胞数がしばしば棒グラフで描かれ比較される。流動速度は、典型例では数１０〜１００ｃｍ／秒である。従って、高感度の検出が必要になる。検出量の制限のため、現状技術では共焦点検出が行われている。
【００１７】
現状技術では点像スキャナの代わりにいわゆるラインスキャナも使用されている（文献：Corle、 Kino「共焦点走査型光学顕微鏡法と関連画像システム」アカデミック・プレス、１９９６年刊）。その原理構造は本質的には図２のＬＳＭに一致する。但し、点フォーカスでなくラインが試料（３）に結像するのであり、検査試料は一方向（ｘまたはｙ方向）にのみ走査される。点走査の代わりにライン走査にすることによって、画像記録率を相当拡大させることができる。それにより、この走査法はリアルタイムでの迅速経過過程の観察（リアルタイム顕微鏡検査）に使用できる。しかし、軸方向の光学分解能は点像スキャナよりも約１４ファクタ劣っている。
【００１８】
現状技術に基づくリアルタイム顕微鏡検査の別な装置では、拡大光源によって検査対象フィールドが完全に照明されるものがある。しかし、走査フィールド全体の中で特殊な点模様だけは迅速回転ディスクでは捕らえられずに漏れている。この方法は文献では殆どがニポーディスク法と称されている（文献：Corle、 Kino「共焦点走査型光学顕微鏡法と関連画像システム」アカデミック・プレス、１９９６年刊）。
【００１９】
いわゆる構造照明（構造光）（図３参照）として知られている、現状技術に基づくまた別な方法では、振幅構造（例えば格子）の光学結像における変調深度が視野深度の判定基準として利用されている。この周期性構造の画像は、その変調の周波数および変調の位相位置（画像位相）で弁別される。
光軸に対し垂直に構造の位相シフトをすることにより様々な投影画面を得ることができる。
【００２０】
縞のない、深度差のある光学切断面を算定するためには、一般には少なくとも０°、１２０°および２４０°の３つの位相画像ＰＢが必要である。これらの位相画像（ＰＢ）から、続いて画像プロセッサにおける次式を用いた算定より（共焦点）光学切断画像が得られる：
ＩＳＥＣＴＩＯＮ（Ｘ）＝Ｃｏｎｓｔ・√（（Ｉ（ｘ，０°）−Ｉ（ｘ，１２０°））２＋（Ｉ（ｘ，１２０°）−Ｉ（ｘ，２４０°））２＋（Ｉ（ｘ，０°）−Ｉ（ｘ，２４０°））２）
但し、式中Ｉ（ｘ，角度）は、当該位相画像の各画素における強度を表わしている。
最も簡単な例では、３またはそれ以上の位相画像記録が逐次的に行われる。その場合、画像測定中には試料は動かさないものとする。そのように位相画像から算定された切断画像または断面成層は、続いて３次元評価ソフトウェアにより標準ＰＣおよびモニタに表示することができる。
【００２１】
光軸に沿った方向での位置分解度は、光の波長、対物レンズの開口数および変調振動数に依存している。
算定アルゴリズムに関する詳細については、T．Wilsonおよび協働者による“Method of obtaining Optical sectioning by using structured light in A conventional Microscope”「従来型顕微鏡での構造化光ビームの使用による光学切断面の形成法」（Optics Letters「光学レポート」２２（Ｎｏ．２４）１９９７年刊）が参考になる。
【００２２】
たとえばいわゆるチップリーダにおける色素のスクリーニングのための装置は、光学的構成面でレーザ走査型顕微鏡に類似する。しかしその装置による場合、たとえば生体チップ上における作用物質のスクリーニングなど巨視的試料の検査なので、明らかに大きな画像フィールドが走査される。この場合走査フィールドの辺の長さは数十ミリメートルに及ぶ。これらの走査フィールドは、たとえばガルヴォスキャナ走査角の拡大によって、試料を例えば図６Ａのように顕微鏡装置の中間像内に配置することによって、または中間像を試料上に拡大して結像させる特別な対物レンズ装置（マクロ対物レンズ）によって、達成することができる。
【００２３】
励起光の試料放出光からの分離は、現状技術に基づき、ストークス・シフトを利用した分光分離によって、試料の照明／検出に使用する光学系の開口数制限によって、またはさまざまな偏光方向への分配によって行われる。励起光を試料放出光から分光分離するには、特別なダイクロイック・ビームスプリッタが使用される。これらは殆どの場合図３ａに示したように、励起光をできる限り効率的に反射させ、試料からの放出光をできる限り効率的に透過させるように設計されている。反射度（反射率）は波長別に表示している。偏光された励起光を使用する場合、反射する波長領域の最小スペクトル帯域幅（ｓ）は約１０ｎｍで、エッジ峻度（ｆ）は多くが＞５ｎｍである。それゆえ、励起波長を使用する場合、現状技術に基づき、ダイクロイック・ビームスプリッタによって試料からの放出光を効率的に分離することができる。
【００２４】
しかし、複数波長をもつ複数色素の同時励起では（多蛍光顕微鏡法）、殆どの場合励起光と放出光のスペクトルが重なり合うため、効率が悪くなる。さらに、さまざまな吸収特性をもつさまざまな色素を使用する場合には、その都度特別なビームスプリッタを創出しなければならない。広視野顕微鏡では、試料は殆どが白色光源の光で広帯域に亘って励起される。その場合励起光と放出光のスペクトルが一部重なり合う。それゆえ、現状技術に基づきダイクロイック・ビームスプリッタを使用する場合には、励起光と放出光との分離効率が悪くなる。
【００２５】
試料照明光学系（４）（図３ｂ）の開口数を制限することによる励起光の放出光からの分離は、たとえば、軸に近いビーム（１）のみが試料（２）の方向に達するよう、開口の制限下で試料を照明することにより行うことができる。放出は全空間方向に対して行われるから、残った開口領域内でこの試料（２）の光を収集することができる。それに続く、励起光の放出光からの分離は、部分的に完全反射する（黒い領域）平面板（３）によって行われる。試料から放出された光の検出は、ビーム方向（５）で行われる。現状技術から公知である開口数分割方法の場合、開口の制限によって、１つには検出効率が、またもう１つには装置の光学的分解能が低下するのが欠点である。その際、両パラメータは互いに関連している。たとえば分離効率を高く設定すれば、光学的分解能は低下する。
【００２６】
試料（２）を偏光（１）（図３ｃ）によって励起する場合、偏光でない放出光（５）の分離は偏光分割器（３）によって行われる。しかしこの場合、試料からの放出光は最大で全体の５０％しか検出されない。
【００２７】
現状技術に基づく方法すべてに共通する短所は、励起光の試料放出光からの分離が波長に依存していること、または−要求されるスペクトル特性および照明線の数に依存して−典型例ではそれが７０％〜９０％という低効率のもとで行われる点である。
加えて、現状技術に基づく方法は、ビームが分離用光学素子に大きく傾斜して当たる光学系での使用には適していない。たとえば、ダイクロイック・ビームスプリッタの場合ではスペクトル特性が変わり、また偏光分割器の場合では偏光分割の効率が悪化するからである。
【００２８】
試料内で励起および／または後方散乱を経た光ビーム（たとえば蛍光／ルミネセンス）から、高い効率で励起光を非常に有利に分離することのできる、本発明に基づく方法および装置を説明する。この方法での分離は現状技術とは異なり波長に依存せず、したがって特に多重蛍光顕微鏡法における使用に、すなわちさまざまな色素の同時励起に非常に適している。それにより、複数の励起波長や分光検出波長領域間での迅速切り換えが−ＥＰ９７７０６９ Ａ２に記載されているようないわゆるマルチトラッキングが−極めて容易に実現できる。
【００２９】
さらに、試料から検出器方向へ散乱する光を、直接的反射光から分離することも可能である。試料内で励起および／または後方散乱を経た光ビームから励起光ビームを分離させるための素子は、特に、大きいビーム傾斜角になる場所への設置に適している。
光学的分解能については、本発明に基づく装置の場合、現状技術で検出光路からの励起光路分離のための装置に比較して見劣りしない。さらに、試料が相互作用する場所では照明配分の操作が可能である。それによって、いわゆる対象領域（ＲＯＩ）をリアルタイムで走査することが可能である。加えて、広視野顕微鏡法から知られている照明法、たとえば傾斜照明が実現できる。
【００３０】
本発明に基づく解決策は、顕微鏡の画像形成システムにも分析システムにも使用できる。顕微鏡システムとしては、生物学プレパラートを２００ｎｍまでの光学的分解能で３次元検査をするためのレーザ走査型顕微鏡、表面を１０ｎｍまでの分解能で高分解検査するための走査型近傍界顕微鏡、分子濃度の定量測定、および分子拡散の測定のための蛍光相関顕微鏡などの画像形成システムがある。以上のほか、蛍光検出に基づく色素検査法および流動細胞計量法も本発明に含まれる。
上記システムのいずれにおいても、プレパラートの特殊マーキングには蛍光色素が使用される。上記課題は、独立特許請求項に基づく方法および装置により解決される。その他の好ましい態様は、従属請求項の対象である。
【００３１】
本発明に基づく方法により、同時に使用できる色素符合数、すなわち同時に検査し得る、たとえば細胞特性の数を増やすことができる。個々の色素のスペクトル標識が極度に重なり合ったり、もしくは互いに近接している場合、個々の色素の蛍光信号を分離して検出するためには、現状技術では検出波長領域、または開口数を減らさねばならない。これにより検出感度は低下する。すなわち高い増幅が必要になることから、検出器の雑音が高くなる。これは、本発明に基づく方法および装置により防止される。
【００３２】
【発明の実施の形態】
以下では、試料内で励起および／または後方散乱を経た光ビーム（以下検出光）を、特に効率的に、かつ波長の如何に関わらず励起光から分離させるさまざまな装置について、より詳細に説明する。本装置は、このように、特に迅速なマルチトラッキングに適している。試料内の被励起光ビームは、以下の説明では、無指向性で、主として大きい立体角で試料から放出される光のことである。それは特に、試料内で励起された蛍光およびルミネセンス光である。
【００３３】
１．広視野顕微鏡
図４Ａは、本発明に基づく広視野顕微鏡における装置を模式的に示している。広視野顕微鏡では殆どの場合、スペクトル広帯域の光源により、試料内検査対象フィールドの複数点へ均一に同時照明することが要求される。その場合、光源ＬＱは顕微鏡装置の瞳内へ、すなわち対物レンズの後方焦点面の中または近傍へ、または対物レンズの後方焦点面（後方焦点面Ｐと称す）に共役な平面内へ光学系Ｌ１を通って集束させる。平行ビームを有する光源の光は、後方焦点の位置に正確にＰが存在する別の光学系Ｏ、たとえば顕微鏡対物レンズによって、検査対象試料ＰＲ内へ誘導され結像する。実線は照明光路を表す。観測光路、たとえば蛍光励起の場合は点線で記入されている。
【００３４】
試料相互作用の特性により、たとえば蛍光励起またはルミネセンス励起の場合、試料から放出された光はわずかな空間コヒーレンスを有する。すなわち、試料内で励起された各点は、本質的には隣接点に左右されず、点放射器として全空間方向に放出する。光学系Ｏ（たとえば顕微鏡対物レンズ）は、円筒レンズＴＬと共に個々の点放射器を顕微鏡装置の中間像平面ＺＢ内へ結像させ、また瞳Ｐはさまざまな伝播方向の互いにインコヒーレントな波面によって一様に照明される（点線の光路）。
【００３５】
中間画像平面内では、現状技術から公知であるように、ＣＣＤカメラまたは接眼レンズが試料の検出および／または観測に用いられる。蛍光またはルミネセンスを撮像する際には、試料から後方散乱する励起光を抑制するため放出フィルタ（ダイクロイック・フィルタ）Ｆの向きを変える。
【００３６】
瞳Ｐには、図４Ｂに示した、本発明に基づく、励起光と検出光との分離を行う素子ＭＤＢが存在する。ＭＤＢは、ハッチングをした領域ＨＲでは完全反射する。ＸＹ座標原点のまわりに白で描かれた領域ＨＴは特に、試料励起の行われる波長領域について高い透過性を持つ。最も単純な例では、ＨＴ領域は他の領域である反射素子内で孔として構成することができる。
【００３７】
本発明に従えば、励起光はＨＴ領域を通過して集束する。試料からの直接的反射光は、主としてＨＴ領域を通過して再び光源に達する。試料から広く散乱した励起光および／または試料内で励起された光はＭＤＢの全表面上に、顕微鏡光学系の瞳寸法に対応した形で当たり、その場合ＨＲ領域上に当たる成分はＴＬの方向に転向し、中間像での観測用に提供される。このＭＤＢ装置の場合、ＨＴ領域へ入る検出光成分のみが失われることになる。
【００３８】
ＨＴ対ＨＲの面積比率は：
Ｒ＝（Ａpupille-ＡＨＴ）／Ａpupille＝（ｒpupille２‐ｒＨＴ２）／ｒ２pupille  ここで視野顕微鏡におけるＨＲ領域の半径は典型例で約５ｍｍであり、ＨＴ領域は約＜０５ｍｍである。従って、上記比率、つまりＭＤＢのビーム分配効率Ｒ＝９９％となる。この効率は使用される波長に依存しない。
【００３９】
レンズＬ１を光軸に垂直に少し移動させることによって、試料上に当たる照明の角度を変化させることができる。それゆえ、調節次第でさまざまな照明シナリオ、たとえば傾斜照明または暗視野照明が実現できる。
【００４０】
２．構造照明を持つ広視野顕微鏡
図５Ａは、本発明に基づく構造照明（構造光）を持つ広視野顕微鏡についての装置を示している。実線は顕微鏡装置の照明光路を表わしている。観測光路は点線で描かれている。光源ＬＱの光は、光源モジュール内で、たとえばフレネル複プリズムＦＢＰにより２つの等強度の部分ビームに分配されるが、これらは中間像ＺＢにおいて小さい角度（典型例では＜５°）で交差する。
【００４１】
また別なビーム分割方法が、現状技術から、たとえばＤＥ１９９０４５９２Ａ１から公知である。光学系Ｌ１によって、両部分ビームはそれぞれ別々の場所で顕微鏡装置の第１瞳（スキャナＸ）に集束する。続く光路内で、顕微鏡装置の瞳（スキャナＸ）（対物レンズの後方焦点面に共役な平面に対応する）は、走査光学系ＳＯ、円筒レンズＴＬを通って対物レンズ瞳Ｐ１に結像する。
【００４２】
試料ＰＲに対する広視野内での照明は、対物レンズＯを用いて２つの部分ビームにより小さい角度で行われるので、試料内では強度の変調、すなわち正弦型の干渉構造が発生する。正弦型構造の位相の位置は、スキャナＸにより試料平面の方向で移動させることができる。構造の位相を光軸に垂直な構造の位相の移動により、異なった投影シナリオを得ることができる。これらのさまざまな投影シナリオを得るために、中間像ＺＢ／ＤＥにおいてカメラにより位相像の検出を行う。
【００４３】
励起光と検出光の分離は、図５Ｂに示した光学素子ＭＤＢによって行われる。ＭＤＢはハッチングされた領域ＨＲ内では完全反射する。白で描かれた領域ＨＴは、特に試料励起の行われる波長領域について高い透過性を持つ。最も単純な例では、ＨＴ領域は他の領域である反射素子内で孔として構成することができる。
本発明に従えば２つの励起光部分ビームがＨＴ領域を透過して集束する。試料からの直接的反射光は、主としてＨＴ領域を通過して再び光源に達する。試料内で広く散乱した励起光および／または励起された光はＭＤＢの全表面上に、顕微鏡光学系の瞳寸法に対応した形で当たり、その場合ＨＲ領域上に当たる成分は方向ＴＬに転向し、中間像での観測用に提供される。
【００４４】
このＭＤＢ装置の場合、試料からＨＴ領域へ入る検出光成分のみが失われることになる。その場合のＨＴ対ＨＲ表面比率は：
Ｒ＝（Ａpupille‐ＡＨＴ）／Ａpupille＝（ｒpupille２‐２ｒＨＴ２）／ｒ２pup illeここで、広視野顕微鏡におけるＨＲ領域の半径は典型例で約５ｍｍであり、ＨＴ領域は約＜０５ｍｍである。従って、上記比率、つまりＭＤＢのビーム分配効率は波長に関係なく、約Ｒ＝９８％となる。
【００４５】
帯構造のない、深度弁別された光学的断面の計算を可能にするには、一般には、０°と１８０°での、少なくとも２つの位相像ＰＢが必要である。これらの位相像（ＰＢ）は、続いてイメージ・プロセッサによる計算で（共焦点）光学的断面像に変換され、モニタ上に表示される。
【００４６】
３．ラインスキャナ
図６Ａは本発明に基づくラインスキャナについての装置を模式的に示している。実線は照明光路を表す。ラインスキャナの場合、試料はラインフォーカスによって、たとえばＸ座標に沿って照明され、照明は座標系の中で線に垂直に移動させる。その場合、光源ＬＱは顕微鏡装置の中間像平面ＺＢ１内へ光学系Ｌ１を通じてライン状に集束する。Ｌ１によりＺＢ１内のＹ方向で、たとえば円筒レンズにより試料平面内へ集束することによって、回折の制限されたライン状強度配分が試料上のＸに沿って得られる。
【００４７】
試料上でのＸに沿うライン状強度配分は、そのほか現状技術に基づく回折素子またはホログラフィ素子によって（文献：“Diffractive Optics improve product design”「回折光学による製品設計の改良」、Photonics Spectra, Laurin Publishing Co.,Inc.、１９９５年９月）行うこともできる。
【００４８】
さらに、ＵＳ 4,826,299に記載されているような、いわゆるパウエルレンズを使用することもできる。後者の素子は、例えば単一モードレーザにおける典型例であるガウス型照明強度配分の場合では、円筒レンズに比較して、より均一なライン沿い強度配分を生み出す。パウエル・レンズおよび回折素子、ホログラフィ素子は、この場合，たとえば顕微鏡装置の瞳面内で、光源とスキャナとの間に配置するのが特に有利である。もう１つの光学系Ｌ３によって、光は顕微鏡装置の瞳Ｐ１に結像する。顕微鏡装置の瞳面内では、ｙ軸に沿ってそれぞれ１つのラインフォーカスが生じる。瞳面Ｐ１およびスキャナ（ｙ−Ｐ２）は互いに、また対物レンズの後方焦点面（Ｐ３）にも共役な顕微鏡装置の瞳面なので、スキャナは回折制限され集束したライン状強度配分をこれに垂直に移動させることができる（試料内のｙ座標）。
【００４９】
ＺＢ１の試料への結像は、走査光学系（ＳＯ）、円筒レンズ（ＴＬ）および対物レンズ（Ｏ）を通じて行われる。リレー光学系（ＲＬ１）は、顕微鏡装置の共役な瞳面Ｐ１およびＰ２を作り出す。リレー光学系は、現状技術に基づく特別な装置内では省くこともできる。たとえば、Ｐ１とＰ２間の距離短縮の場合は省くことができる。さらに、Ｐ１の素子ＭＤＢは、スキャナに直接的に取り付け、ラインフォーカスをＹ方向に走査するために利用することもできる。この装置の場合には、リレー光学系延いては瞳面Ｐ２も完全に省くことができる。
【００５０】
ラインを形作るための伝送光学系Ｌ１は、原則的に反射素子によって、たとえばその焦点がＰ１上にある円筒鏡によって代替することもできる。円筒鏡は、図６Ａに描かれたｘｚ平面内で４５ーの角度で配置される。この平面内で、鏡は集束させる作用も有している。さらに、鏡によって光路は光源の方へ９０ー回転する。観測光路は、たとえば蛍光励起については、点線で記入されている。
【００５１】
試料相互作用の特性により、たとえば蛍光励起またはルミネセンス励起の場合、試料から放出された光はわずかな空間コヒーレンスを有する。すなわち、試料内で励起された各点は、本質的には隣接点に左右されず、点放射器として全空間方向に放出する。光学系Ｏ（たとえば顕微鏡対物レンズ）は、円筒レンズＴＬと共に個々の点放射器を顕微鏡装置の中間像平面ＺＢ内へ結像させ、また瞳Ｐはさまざまな伝播方向の互いにインコヒーレントな波面によって一様に照明される（点線の光路）。
【００５２】
続いて、試料の光は共焦点検出の場合結像光学系（ＰＯ）によりスリット絞り（ＳＢ）（スリット位置は図でＸ方向の長さ）を通って集束し、それによって、焦点外部に生じた検出光は遮断される。非デスキャン検出の場合、絞りは省くことができる。スリット絞りの後ろに、（ラインフォーカスに沿って）位置分解するライン検出器または面検出器（ＤＥ）（ラインの位置はＸ方向）があって、これが試料内で励起および／または後方散乱を経た光ビームを検出する。ラインフォーカスは、ガルヴォスキャナ（ｙ）により空間１方向で走査する。
【００５３】
蛍光またはルミネセンスを撮像する場合には、試料から後方散乱した励起光を抑制するため、放出フィルタ（ダイクロイック・フィルタ、Ｆ）の向きを変える。瞳Ｐ１内には、図６Ｂに示した素子ＭＤＢが存在し、これが励起光を検出光から分離する。
【００５４】
説明上の理由から、素子ＭＤＢは拡大して示す。
ＭＤＢはハッチングされた領域ＨＲでは完全反射する。白で描かれた領域ＨＴは特に、試料励起の行われる波長領域について高い透過性を持つ。ＭＤＢの外側の縁取りが、顕微鏡ユニット瞳直径の位置になる。最も単純な例では、ＨＲ領域を狭い鏡で構成することができる。本発明に基づけば励起光はＨＲ領域に集束する。
【００５５】
試料からの直接的反射光は、主としてＨＲ領域に達して再び光源へと向かう。試料内で広く散乱した励起光および／または励起された光はＭＤＢの全表面上に、顕微鏡光学系の瞳寸法に対応した形で当たり、その場合ＨＴ領域に当たる成分は、中間像ＳＢ／ＤＥにおける観測に用いられる。このＭＤＢ装置の場合、ＨＲ領域上に当たった検出光のみが失われる。
ＨＴ対ＨＲの面積比率は：
Ｒ＝（Ａpupille−ＡＨＴ）／Ａpupille＝（πｒpupille−２ｂＨＴ）／πｒpupille  ここで、顕微鏡におけるＨＴ領域の瞳半径は典型例で約５ｍｍであり、ＨＲ領域の広さは、約ｂＨＴ＜０２５ｍｍである。従って、上記比率、つまりＭＤＢのビーム分配効率は、波長に依存せずＲ＝９７％である。
【００５６】
４．構造化されたライン走査――デスキャン
図７Ａは、構造照明を持つラインスキャナについての本発明に基づく装置を模式的に示している。実線は照明光路を示す。構造照明を持つラインスキャナの場合、試料はラインフォーカスによって照明し、座標内を線に垂直に移動させる。強度は線に沿って周期的に変化する。このため光源ＬＱは、たとえばフレネル複プリズムなどの光学素子によって２つの部分ビーム（Ｔ１／Ｔ２）に分割され、これらは顕微鏡装置の中間像平面ＺＢ１内においてＸＺ平面内で交差し、ＭＤＢの平面内に集束する。
【００５７】
ビーム分割のための別な方法が、現状技術から公知になっている。加えて、別の光学系Ｌ１によって光はＺＢ１にライン状に集束する。Ｌ１は、この場合、図６Ａに基づき記載された素子Ｌ１と同一である。ＺＢ１内のＹ方向に集束させることによって、回折の抑えられた、構造化されたライン状強度配分が試料上のＸに沿って生じる。
【００５８】
もう１つの光学系Ｌ３によって、光は顕微鏡装置の瞳Ｐ１内に結像する。顕微鏡装置の瞳面内に、それぞれ２つのラインフォーカスがＹ軸に沿って生じる。瞳面Ｐ１および２つのスキャナ（ｙ−Ｐ３）および（ｘ−Ｐ２）は、互いに、また対物レンズ（Ｐ４）の後方焦点面にも共役な顕微鏡装置の瞳面なので、スキャナは構造化されたライン状の、かつ回折制限されて集束した強度配分を、Ｘに垂直にもしくはそれに沿って移動させる（試料内のｙ座標もしくはｘ座標）。
【００５９】
ＺＢ１の試料内への結像は、走査光学系（ＳＯ）、円筒レンズ（ＴＬ）および対物レンズ（Ｏ）を通じて行われる。リレー光学系（ＲＬ１およびＲＬ２）は、顕微鏡装置の共役な瞳面Ｐ１からＰ３を作り出す。リレー光学系は、現状技術に基づく特別な装置においては省くこともできる。たとえば、Ｐ２とＰ３との間の距離を短縮する場合には省略できる。さらに、Ｐ１内の素子をラインフォーカスに沿ってＸまたはＹ方向での走査に直接使用することもできる。その場合この装置では、瞳面Ｐ２またはＰ３は完全に省略できる。
【００６０】
観測光路は、たとえば蛍光励起の場合点線で描かれており、前出図６Ａと同様に記入されている。
ＤＥにはやはり、検出光を位置分解により（ラインフォーカスに沿って）検出するライン検出器または面検出器（ＤＥ）（ライン位置はＸ方向）が存在する。蛍光またはルミネセンスを撮像する場合、試料からの後方散乱した励起光を抑制するため、放出フィルタ（ダイクロイック・フィルタ）Ｆの向きを変える。
【００６１】
瞳Ｐ１には、図７Ｂに示したような、励起光を検出光から分離する素子ＭＤＢが存在する。ＭＤＢは、ハッチングされた領域ＨＲ内で完全反射する。白で描かれた領域ＨＴは、特に試料励起が行われる波長領域について高い透過性を持つ。ＭＤＢの外側の縁取りが、顕微鏡ユニット瞳直径の位置になる。距離ａは、ＦＢＰにおける両部分ビームの角度分割から生じるもので、光学装置の構成次第によるが約１ｍｍである。本発明によれば、ＨＲ領域上に両励起光の部分ビームが集束する。
【００６２】
試料からの直接的反射光は、主としてＨＲ領域に達し、再び光源へと向かう。試料内で散乱した励起光および／または被励起光はＭＤＢの全表面上に、顕微鏡光学系の瞳寸法に対応した形で当たり、またＨＴ領域上に当たった成分は、検出用として中間像ＳＢ／ＤＥに達する。このＭＤＢ装置の場合、ＨＲ領域に当たった検出ビームの成分だけが失われることになる。
ＨＴ対ＨＲの面積比率は：
Ｒ＝（Ａpupille−ＡＨＴ）／Ａpupille＝（πｒpupille−４ｂＨＴ）／πｒpupille
ここで、顕微鏡におけるＨＴ領域の瞳半径は典型例では約５ｍｍであり、ＨＲ領域の幅は、約ｂＨＴ＜０２５ｍｍである。従って、上記比率、つまりＭＤＢのビーム分配効率はＲ＝９４％となる。
【００６３】
帯構造のない、深度弁別された光学的断面の計算を可能にするためには、一般に０°と１８０°での少なくとも２つの位相像ＰＢが必要である。位相像はＸスキャナのさまざまな設定下でＹスキャナにより作り出される。この位相像（ＰＢ）は、続いて（共焦点）イメージ・プロセッサによる計算で光学的断面像に変換され、モニタ上に表示される。この場合、構造化されたラインフォーカスの光学的結像の変調深度が深度鮮明度に対する基準として利用されるので、スリット絞りは原則的に省略することもできる。
【００６４】
図７では、２つの干渉する部分ビームによる代わりに光源およびＬ１に対して後置された、たとえば中間像ＺＢ１内にあって正弦型強度経過を示す線形格子Ｇ（図７Ａ２に基づく装置）によって、構造化された走査ラインが作り出される。Ｇで作り出された空間周波数がＬ３を通じてＭＤＢ平面（瞳面）へ結像する。
【００６５】
５．構造化されたライン走査――部分デスキャン
図８Ａは本発明に基づく、検出光が１座標でのみデスキャンされる、すなわちＹスキャナを通じてのみ誘導される装置を示す。これは、観測光路内の光学素子の数を少なくすることができるという長所を持つ。照明光路は図７Ａの場合に類似している。７Ｂの図との比較では、ただ素子ＭＤＢ（図８Ｂ参照）において、ＨＴとＨＲの領域が入れ替わっただけである。励起光は２つのスリットを通って集束する。観測対象の試料光ビームは、ＭＤＢ Ｐ１においてわきの方へ反射し、ＺＢ内に配置されている検出器ＤＥで検出される。
【００６６】
６．構造化されたライン走査――ノンデスキャン
図９は、検出光がデスキャンされずに、すなわちスキャナを通じて誘導されるのではなくて、ＣＣＤカメラを通して中間像（たとえば顕微鏡のＴＶポート）により測定される、本発明に基づく別な装置を示している。これは、観測光路内の光学素子の数をかなり減らすことができるという長所を持つ。さらに、たとえば蛍光寿命の３Ｄ分解測定には、タイムゲート・カメラなどの特別なＣＣＤカメラを使用することもできる。照明光路は図８Ａの場合に類似する。観測対象の試料光ビームは、ＭＤＢ Ｐ１においてわきの方へ反射し、ＺＢに配置された検出器ＤＥで検出される。
【００６７】
本発明に基づくすべての装置において、領域ＨＴおよびＨＲの反射特性は入れ替えることも可能であり、その場合ではＨＲ領域が高い透過性を持つ。それには、光源ＬＱからＭＤＢまでの光路を、ＭＤＢから検出器ＤＥまでのものと入れ替えなければならない。さらに素子は、偏光励起光を使用する場合、１つの偏光素子から構成することもできる。
【００６８】
作用についてはモデル例としての図７に基づき説明する。ここでは励起光はＭＤＢのＨＲ領域で反射する。偏光励起光を使用する場合、鏡の代わりにＨＲ領域へ偏光分割器を配置することもできる。偏光素子を使用することによる、ＨＲ領域での検出光の損分はわずか５０％である。
【００６９】
図６から９の装置は、特別な対象領域ＲＯＩの走査にも適している（ＥＰ 977069 A2参照）。この場合レーザ光は、利用者によって予備選択された一定領域に対してのみ開放される。
照明ライン（Ｘ座標に沿った）の長さ設定は、たとえばＬ３の実効焦点距離の変更（たとえば図７参照）によって実現できる。これは顕微鏡装置の像倍率を変更させる結果となる。焦点距離の変更は、特に適合光学系によって迅速に行える。
【００７０】
ラインに影響を与える別な可能性として、ＺＢ１において調節可能な機械的絞りによってラインを遮断したり、または幅が調節可能な２つの個別遮断を行うという方法がある。加えて、Ｌ１を絞りＺＢ１における光軸に垂直に移動させることによって、またはＸスキャナによって、試料内のラインカットの位置に影響を与えることができる。それゆえ、利
用者によって予定された試料内の任意の領域に、異なる励起光出力を当てることができる。
【００７１】
現状技術に基づく方法に比べこの方法の長所は、ＲＯＩをリアルタイムで走査することができることである。図１０はモデル例として走査フィールド内のＲＯＩを示している。黒で描かれているのは照明された領域である。スキャナＸおよびＹ、および絞りもしくはＭＤＢの制御は、検査対象ＲＯＩに対応して、光出力調整素子との組み合わせで行われる。走査フィールドは、本装置によって潜在的に検査可能な試料の全カット部分を表わしている。
【００７２】
原則として、説明したスキャナの機能は、少なくとも１平面内では然るべき走査テーブル（物体スキャナ）によって代替することもできる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ａ）１光子吸収、ｂ）多光子吸収
【図２】現状技術の共焦点レーザ走査型顕微鏡
【図３】現状技術の共焦点走査型光学顕微鏡法
【図４】Ａ）本発明に基づく広視野顕微鏡における装置の模式図、Ｂ）光学素子ＭＤＢ
【図５】Ａ）本発明に基づく構造化照明を持つ広視野顕微鏡の装置、Ｂ）光学素子ＭＤＢ
【図６】Ａ）ラインスキャナについての装置の模式図、Ｂ）光学素子ＭＤＢ
【図７】Ａ）照明を持つラインスキャナの装置の模式図、Ｂ）光学素子ＭＤＢ
【図８】検出光が１座標でのみデスキャンされる、Ｙスキャナを通じてのみ誘導される装置
【図９】検出光が、ＣＣＤカメラを通して中間像により測定される別な装置
【図１０】走査フィールド内のＲＯＩを示すモデル例
【符号の説明】
１ 偏光
２ 試料
３ 平面板
４ 照明光学系
５ 放出光
Ｌ１ 素子
Ｐ 瞳面
ＳＯ 走査光学系
ＴＬ 円筒レンズ
Ｏ 対物レンズ
ＲＬ リレー光学系
ＤＥ 面検出器
ＭＤＢ 光学素子
ＰＢ 位相像
ＺＢ 中間像
ＬＱ 光源
Ｆ 放出フィルタ（ダイクロイック・フィルタ）
Ｘ スキャナ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0004670031.tif 000009
【図９】
0004670031.tif 000010
【図１０】
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