(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィルム状に加工した７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ−３８）に、空リポソーム分散液を添加して、当該７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ−３８）を空リポソームに内封させることを特徴とする７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ−３８）内封リポソーム製剤の製造法。
【請求項２】
リポソームの平均粒子径が２００ｎｍ以下である請求項１記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗腫瘍活性を有するカンプトテシン類の製剤に関し、特にナノスケールの微小粒子内に効率よくカンプトテシン類を包含する微小粒子組成物製剤の製造法及びその微小粒子組成物製剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ、以下ＣＰＴと略記する）は、中国原産のヌマミズキ（中国名：喜樹、学名：Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ ａｃｕｍｉｎａｔａ）の根、幹、枝、葉、実に含有されるアルカロイドである。ＣＰＴの半合成誘導体である７−エチル−１０−ピペリジノピペリジノカルボニルオキシカンプトテシン（以下、ＣＰＴ−１１と略記する。非特許文献１参照。）は、ＣＰＴの高い抗腫瘍活性を維持し、かつ毒性が軽減した化合物として特に重要な物質である。このＣＰＴ−１１は、肝臓及び腫瘍組織においてカルボキシエステラーゼにより活性代謝物の７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（以下、ＳＮ−３８と略記する）に代謝され、このＳＮ−３８が強い抗腫瘍活性を示す（非特許文献２〜４参照）。
【０００３】
即ち、ＣＰＴ−１１はＳＮ−３８のプロドラッグと位置付けられる。このＣＰＴ−１１が、ＳＮ−３８に代謝され、抗腫瘍性を表す作用機能は、いくつかの文献に詳細に報告されている（非特許文献５〜１１参照）。
【０００４】
一方、疾病の治療を目的として数多くの薬物が開発されているが、それらの多くは副作用などの問題点を抱えている。特に癌治療における化学療法剤は重要な役割を担っているが、充分な治療効果を期待すると必然的に副作用を伴う結果となるのが現状である。副作用として正常組織にも大きな損傷を与えることが知られている抗腫瘍剤の治療効果を高め、同時に副作用の軽減を図るためには、より選択的に薬物を腫瘍局所に到達させる必要がある。
【０００５】
そこで、効果的な薬物送達システム(Drug Delivery System: DDS)が注目されており、そのひとつの有効な手段としてリポソームの有用性が示されている（非特許文献１２、１３参照）。リポソームは、リン脂質二分子膜からなる閉鎖系の脂質小胞体であり（非特許文献１４参照）、その構成成分が生体成分のリン脂質から構成されているため抗原性と有毒性が低く、大きさや脂質組成を自由に変化させることにより体内動態を制御することができるなど、多くの利点を有している。
【０００６】
また、水溶性、脂溶性、高分子化合物のようなさまざまな薬物の内封と持続的放出が可能であり（非特許文献１５参照）、ドラッグキャリアとして有用性が報告されている（非特許文献１６、１７参照）。
【０００７】
一般的に固形腫瘍組織には分岐の多い新生血管が異常に発達している。この腫瘍新生血管は正常な血管に比べ血管壁が薄く、内皮細胞間の結合が比較的ルーズであり、リンパ管が発達していないという特徴を有している。高分子物質やリポソームのような微粒子は、このルーズなジャンクションを通り、血中から腫瘍組織間質へ漏出し腫瘍組織に分布する（非特許文献１８参照）ことが可能で、いったん漏出したものは管腔側に戻りにくく、組織に蓄積する。このような固形腫瘍へのリポソームの特性はEPR (Enhanced Permeability and Retention) 効果と呼ばれ（非特許文献１９参照）、腫瘍組織へのターゲティングを行う場合、重要な要素となる。
【０００８】
一方、リポソームの血中滞留性、腫瘍蓄積性は、肝臓のクッパー細胞、脾臓のマクロファージに代表される網膜内皮系 (Reticuloendothelial system, RES) の捕捉により著しくそこなわれる（非特許文献２０参照）。そこでＲＥＳ捕捉を回避し、血中滞留性の増加に伴う受動的ターゲティングを目的としてリポソームのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾化が行われている（非特許文献２１参照）。
【０００９】
かかる観点に基づき、ＣＰＴ−１１のリポソーム化は、既に研究がなされており、抗腫瘍効果増強、副作用軽減効果のあることが報告されている（非特許文献２２参照）。しかし、当該リポソーム製剤は、血中滞留時間が短く腫瘍蓄積性が低いなどの欠点を有し、臨床に適用する上で十分満足できるものではない。
【００１０】
しかしながら、カンプトテシン類に関するリポソーム製剤の報告例は数少ない（特許文献１、２参照）。町田ら（特許文献３参照）は、乳酸とグリコール酸との共重合体からなる担体にＣＰＴ−１１を内封させたマイクロスフェア製剤を報告しているが、その粒子径は２−７０μである。この大きさの粒子は毛細血管を塞栓して危険なうえＲＥＳ系によって異物として補足されるため、静脈注射などの循環血液に直接のせることはできない。さらに、注射剤の滅菌法として最も信頼性が高く、繁用される濾過滅菌法（０．２２〜０．４５μmのフィルターで濾過）を用いることができない。
【００１１】
また、活性代謝物であるＳＮ−３８のリポソーム化研究はさらに少ない。我々は、既に構成脂質の種類や比率、緩衝液のpH等の観点から検討を行ってきた。しかしながら、これまでで最も良い内封率を示した製造条件は、製造時の薬物添加濃度（ＳＮ−３８濃度）を２０μg/ml、リポソーム構成脂質としてＬ−α−ジステアロイルホスファチジルコリン (ＤＳＰＣ)、緩衝液として９．０％ショ糖液/１０mM乳酸緩衝液（pH５．６）混液を用い、ＤＳＰＣに対するコレステロールの比を２：１とするものである。しかしながら、このようにして得られたリポソーム製剤は、実用性が可能となるリポソーム中の薬物内封率に比べるとＳＮ−３８の内封率は非常に低い（０．６８％）ものであった（非特許文献２３参照）。
【００１２】
【非特許文献１】
Chem. Pharm. Bull., 1991 39(6) 1446-1454
【非特許文献２】
Xenobio. Metabol. Dispos. 6: 899-907, 1991.
【非特許文献３】
J. Pharmacobiodyn., 14: 341-349, :1991.
【非特許文献４】
Jpn. J. Cancer Chemother., 18: 2175-2178, 1991.
【非特許文献５】
Cancer Res., 1990 50, 1715.
【非特許文献６】
J. Aichi Med. Univ. Assoc., 1987 15, 683.
【非特許文献７】
Exp. Cell. Res., 1985 158, 1
【非特許文献８】
Cancer Treatment Report, 1987 71, 341.
【非特許文献９】
Xenobio. Metabol. Dispos. 6: 899-907, 1991.
【非特許文献１０】
J. Pharmacobiodyn., 14: 341-349, :1991.
【非特許文献１１】
Jpn. J. Cancer Chemother., 18: 2175-2178, 1991.
【非特許文献１２】
Drug Delivery System, 6: 415-426, 1991.
【非特許文献１３】
油化学, 34: 784-798, 1985.
【非特許文献１４】
Drug Delivery System, 17-4: 314-320, 2002.
【非特許文献１５】
Int. J. Cancer, 99: 130-137, 2002.
【非特許文献１６】
Cancer Res., 39: 1390-1395, 1979.
【非特許文献１７】
J. Pharm. Sci., 73: 203-206, 1984.
【非特許文献１８】
Drug Delivery System, 9:185-/92,1994.
【非特許文献１９】
Drug Delivery System, 15-1: 39-48, 2000.
【非特許文献２０】
Cancer Res., 44: 375-378, 1984.
【非特許文献２１】
J. Drug Targeting, 3: 283-289, 1995.
【非特許文献２２】
Cancer Letter, 127: 99-106,1998.
【非特許文献２３】
Cancer Letter, 127: 99-1.06.1998.
【非特許文献２４】
Cancer Letter, 127: 99-1.06.1998.
【非特許文献２５】
J. Mol. Biol., 13: 238-252, 1965.
【非特許文献２６】
Biochem. Biophys. Acta, 1108: 40-48, 1992.
【非特許文献２７】
J. Drug Targeting, 3: 283-289, 1995.
【非特許文献２８】
Biochem. Biophys. Acta, 1108: 40-48, 1992.
【非特許文献２９】
Biochim. Biophys. Acta, 691: 332-340, 1982.
【非特許文献３０】
Arch Biochem. Biophys., 212: 186-194, 1981.
【非特許文献３１】
Biochim. Biophys. Acta, 817:193-196, 1985.
【非特許文献３２】
Biochem. Biophys. Acta, 816: 1-8, 1985.
【特許文献１】
特開平７−２７７９８１号公報
【特許文献２】
特開２００２−１５４９６３号公報
【特許文献３】
特開２００２−１５４９６３号公報
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、癌細胞への移行性及び製造時の滅菌を考慮したナノスケールのカンプトテシン含有リポソーム製剤又は微小粒子組成物製剤を提供すると共に、臨床に適用可能な高い含有率で当該製剤を製造する技術を提供するものである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決すべく種々検討したところ、ポリエチレングリコール修飾脂質を微小粒子組成物構成脂質とする手段、微小粒子組成物分散液を調製後に１〜３回凍結融解する手段、及びフィルム状に加工したカンプトテシン類に空微小粒子組成物分散液を添加してカンプトテシン類を微小粒子組成物中内封させる手段を単独で又は組み合せて用いることにより、カンプトテシン類、特にＳＮ−３８の内封率が著しく向上するとともにナノスケールのカンプトテシン類含有リポソーム製剤又は微小粒子組成物製剤が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１５】
すなわち、本発明はポリエチレングリコール修飾脂質を構成成分とする微小粒子組成物にカンプトテシン類を含有する微小粒子組成物製剤を提供するものである。
また本発明は、微小粒子組成物にカンプトテシン類を内封したリポソーム分散液を調製後、１〜３回凍結と融解を繰り返す（凍結融解処理）ことを特徴とするカンプトテシン類内封微小粒子組成物製剤の製造法を提供するものである。
さらに本発明は、フィルム状に加工したカンプトテシン類に、空微小粒子組成物分散液を添加して、当該カンプトテシン類を空微小粒子組成物に内封させることを特徴とするカンプトテシン類内封微小粒子組成物製剤の製造法を提供するものである。
【００１６】
【発明の実施の形態】
まず、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧという）修飾脂質を用いた微小粒子組成物製剤について説明する。なお、微小粒子組成物製剤とは、内部に水相が形成されたリポソーム製剤のみならず、水相の形成されていないマイクロスフェアエマルジョン等を含むものであり、リポソーム製剤であることが好ましい。
本発明微小粒子組成物製剤に用いるＰＥＧ修飾脂質としては、ＰＥＧ修飾リン脂質、ＰＥＧ修飾モノグリセリド、ＰＥＧ修飾ジグリセリド、ＰＥＧ修飾ソルビタン脂肪酸エステル、ＰＥＧ修飾モノアルキルエーテル等が挙げられる。ここで脂質の修飾に用いられるＰＥＧの平均分子量は４００〜１００００の範囲にあればいずれでもよいが、さらに１０００〜５０００、特に１０００〜２０００が好ましい。より具体的なＰＥＧ修飾脂質としては、ジ−Ｃ12-24アシル−グリセロ−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−ＰＥＧ、ジ−Ｃ12-24アシル−グリセロール−モノＰＥＧエーテル、モノＣ12-24アシルグリセロール、ジＰＥＧエーテル等が挙げられる。さらに具体的には１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−（ポリエチレングリコール）、１−モノメトキシ−ポリエチレングリコール−２，３−ジステアロイルグリセロール等が挙げられる。
【００１７】
これらのＰＥＧ修飾脂質以外に用いることのできる脂質としては、リン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質等が挙げられ、このうちリン脂質が特に好ましい。
【００１８】
リン脂質としては、例えばホスファチジルコリン（大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルエタノールアミン（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、水素添加リン脂質等の天然又は合成のリン脂質等が挙げられる。
【００１９】
グリセロ糖脂質としては、例えばスルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等が挙げられる。スフィンゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等が挙げられる。
【００２０】
具体的なＰＥＧ修飾脂質と他の脂質の組み合せてとしては、ＰＥＧ修飾リン脂質とリン脂質の組み合せ、ＰＥＧ修飾ジグリセリドとリン脂質の組み合せが好ましい。これらのＰＥＧ修飾脂質及び他の脂質はそれぞれ一種を組み合せてもよいし、二種以上を組み合せてもよい。
【００２１】
ＰＥＧ修飾脂質と他の脂質の配合比は、ナノスケールの安定な微小粒子組成物を形成する点から、重量比で１：５０〜１：２、さらに１：２０〜１：３、特に１：９〜１：４が好ましい。
【００２２】
また、必要に応じて、上記脂質と共に、膜安定化剤としてステロール類等、抗酸化剤としてトコフェロール等、荷電物質としてステアリルアミン、ジセチルホスフェート、ガングリオシド等を用いてもよい。
【００２３】
本発明の微小粒子組成物製剤の製造には、公知のリポソーム製剤の調製方法を適用することができ、例えばバンガム（Bangham）らのリポソーム精製法［ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.), 13, 238(1965)］、エタノール注入法［ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー(J. Cell. Biol.), 66, 621(1975)］、フレンチプレス法［フェブス・レター(FEBS Lett.), 99, 210(1979)］、凍結融解法［アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス(Arch. Biochem. Biophys.), 212, 186(1981)]、逆相蒸発法［プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ユー・エス・エー(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 75, 4194(1978)］等が挙げられる。例えば、ＰＥＧ修飾脂質、他の脂質及びカンプトテシン類を有機溶媒に溶解し、次いで有機溶媒を減圧留去して容器内壁にリピッドフィルムを形成する。これに水性溶液を加えて７０〜８０℃で水和膨張させ、超音波処理して微小粒子組成物分散液を得る。次いでこれをエクストルーダー及びメンブランフィルターを用いて、整粒（２００nm以下）することにより本発明の微小粒子組成物製剤が得られる。この微小粒子組成物はリポソームの形態を有しているのが好ましい。
【００２４】
次に凍結融解処理を用いたカンプトテシン類内封微小粒子組成物製剤の製造法について説明する。本発明凍結融解処理に用いる微小粒子構成成分としては、前記のＰＥＧ非修飾脂質のみでもよいし、ＰＥＧ修飾脂質と他の脂質の組み合せでもよい。また、脂質以外の成分も前記同様に用いることができる。
【００２５】
本発明者は、前記の公知の調製方法によりカンプトテシン類内封微小粒子分散液を調製した後、１〜３回の凍結融解処理をすることにより、カンプトテシン内封率が顕著に向上することを見出した。凍結融解処理は１回が特に好ましい。
また、凍結融解処理は、整粒する前後のいずれでもよいが、整粒する前に凍結融解処理し、次いで整粒（２００nm以下）するのが内封率向上の点で好ましい。ここで、整粒は、例えば孔径２００nmのメンブレンフィルターで濾過すればよい。
【００２６】
凍結融解処理手段としては、微小粒子分散液を−７５〜−８４℃で急速凍結し、室温で融解するのが好ましい。なお、融解後超音波処理するのがより好ましい。
【００２７】
次にフィルム状に加工したカンプトテシン類に、空微小粒子組成物分散液を添加して、当該カンプトテシン類を空微小粒子組成物に内封させる方法について説明する。
【００２８】
空微小粒子組成物としては、空リポソームが好ましい。以下、空リポソームを用いた場合を例にして説明する。空リポソームの調製法は、カンプトテシン類を用いない以外は、前記凍結融解処理の場合と同様にして行なわれる。すなわち、リポソーム構成成分としての脂質は、ＰＥＧ非修飾脂質のみでもよいし、ＰＥＧ修飾脂質と他の脂質の組み合せでもよい。また脂質以外の成分も前記同様に用いることができる。さらに、空リポソームの調製手段もカンプトテシン類すなわち内封成分を用いない以外は、前記公知の手段により行なわれる。
【００２９】
調製した空リポソームは、カンプトテシン類を内封させる前に整粒（２００nm以下）することが好ましい。この段階で整粒することにより、ナノスケールのリポソーム製剤が効率良く得られる。また、カンプトテシン類の場合、整粒された空リポソームへの内封効率が高い。
【００３０】
空リポソームへのカンプトテシン類の内封手段としては、分子フィルムローディング法、すなわちフィルム状に加工したカンプトテシン類に空リポソーム分散液を添加して内封させる方法が、内封率の点で特に好ましい。
【００３１】
より詳細には、有機溶媒に溶解させたカンプトテシン類から溶媒を留去して、カンプトテシン類をフィルム状に加工する。次いでこれに整粒された空リポソーム分散液を加えて、内封させればよい。
【００３２】
本発明の前記手段による微小粒子組成物製剤中のカンプトテシン類の内封率は２０〜５０％もの高率である。カンプトテシン類としては、ＣＰＴ−１１、ＳＮ−３８が挙げられる。ＳＮ−３８が特に好ましい。特に本発明により得られるＳＮ−３８内封微小粒子組成物製剤は、ＳＮ−３８が活性本体であるにもかかわらず、難溶性であることからプロドラッグ化が図られた経緯を考慮すれば、新たな製剤を提供するものであり、臨床適用上極めて重要である。
【００３３】
上記の方法により得られる本発明の微小粒子組成物製剤は、そのままでも使用できるが、使用目的、保存条件等により、マンニトール、ラクトース、グリシン等の賦形剤を加えて凍結乾燥することもできる。また、グリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存してもよい。本発明で得られる微小粒子組成物製剤は、注射剤として用いるのが一般的であるが、経口剤、点鼻剤、点眼剤、経皮剤、坐剤、吸入剤等として加工して使用することもできる。なお注射剤として用いる場合の本発明微小粒子組成物製剤は１００〜２００nmに整粒するのが好ましい。
【００３４】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに何ら限定されるものではない。
【００３５】
Ａ．実験材料及び実験方法
１）ＳＮ−３８
リポソームを調製するために用いたＳＮ−３８は、（株）ヤクルト本社で製造したものを用いた。
【００３６】
２）リポソーム原料
Ｌ−α−ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、Ｌ−α−ジステアロイルホスファチジル−ＤＬ−グリセロール（ＤＳＰＧ）はそれぞれ日本油脂(株)COASTOMEシリーズのＭＣ８０８０（ＰＣ純度９９．８％）、ＭＧＬ８０８０（Ｎａ塩型、ＰＧ純度９９％以上）を用いた。コレステロール（ＣＨＯＬ）は和光純薬(株)より購入した。分子量２０００の１−モノメトキシ−ポリエチレングリコール−２，３−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＧ：２０００（ＰＥＧ  ２０００））は日本油脂(株)より供与されたものを用いた。
【００３７】
３）９．０％スクロース／１０mM乳酸緩衝液（pH５．６）の調製法
スクロース（和光純薬）９０ｇを蒸留水に溶解し、pH５．５に調整した０．１Ｍ乳酸緩衡液(Michaelisの緩衝液;０．１Ｎ乳酸／０．１Ｎ乳酸ナトリウム（２：９，v/v)）１００mlを加え、さらに蒸留水を加えて全量１０００mlとし、ニトロセルロースメンブランフィルター（孔径０．２μm、ADVANTEC社製)で濾過して用いた。
【００３８】
４）ＰＢＳ（pH９．０）
塩化ナトリウム（和光純薬）２．９ｇ、リン酸水素ニナトリウム（和光純薬）２．９ｇ、塩化カリウム（和光純薬）、０．２ｇとリン酸二水索カリウム（和光純薬）０．２ｇを秤量、溶解し、蒸留水で全量１，０００mlとしたあと、pH調整用炭酸水素ナトリウムを加えpH９．０とした。
【００３９】
５）クロロホルム：メタノール(４：１、v/v)混液(リポソーム調製用溶媒)
蒸留クロロホルム(和光純薬)と蒸留メタノール(和光純薬)を４：１(v/v)に混和して用いた。
【００４０】
６）１．０mg／ml ＳＮ−３８標準液
ＳＮ−３８ １．０mgを１−ブタノールに溶解し、全量１．０mlとしたものを１．０mg/ml ＳＮ−３８標準液とした。
【００４１】
その地の試薬は全て特級試薬をそのまま用い、常法に従って調製した。
【００４２】
Ｂ．リポソーム製剤の調製
１）  対照リポソーム製剤及びＳＮ−３８含有ＰＥＧ修飾リポソームの調製
対照リポソーム製剤の調製は、以下の構成脂質ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＳＰＧ（１３４：６７：６０μmol）にＳＮ−３８を水和時の濃度が０．０４８μM（２０μg／ml）となるように添加し、Banghamらの方法を改良して行った。この条件で調製したＳＮ−３８含有リポソームを対照製剤とし、以下に示す各種リポソーム調製法により調製したリポソームとの比較対照とした。
【００４３】
ＳＮ−３８含有ＰＥＧ修飾リポソームでは、同様にＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＳＰＧ（１３４：６７：６０μmol)、ＳＮ−３８ ０．２４μmol（０．１mg）とＰＥＧ−２０００−ＤＳＧ ｌ５μmolをクロロホルム：メタノール混液に溶解し、完全に分散させた。その後、窒素ガス気流下ロータリーエバポレーターで有機溶媒を減圧留去してフラスコ内壁にリピッドフィルムを作り、さらにデシケーター中に入れ、真空ポンプを用いて溶媒を完全に留去した。これに９．０％スクロース／１０mM乳酸緩衝液（pH５．６）５．０mlを加え、７５℃で１０分問水和膨張させ、窒素ガスバブリングにより窒素置換した後、２０分間超音波処理してリポソーム分散液とした。
【００４４】
さらに、エクストルーダー及びポリカーボネート製メンブランフィルターを用いたエクストルージョン法で整粒した。これをＳＮ−３８含有ＰＥＧ修飾リポソーム（ＳＮ−３８ PEG-Lip)とした。調製したＳＮ−３８含有ＰＥＧ修飾リポソームをあらかじめ９．０％スクロース／１０mM乳酸緩衝液（pH５．６）で洗浄、等張化した透析用チューブ（三光純薬）中にいれ、充分な量の９．０％スクロース／１０mM乳酸緩衝液（pH５．６）中で１６時間透析を行い、リポソームに内封されていないＳＮ−３８を取り除いた。
【００４５】
２）凍結融解法によるＳＮ−３８含有リポソーム製剤の調製
リポソームはＳＮ−３８を水和時の濃度が０．０４８μM（２０μg／ml）となるように添加し、次に示す方法に従って調製した。まず、ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＳＰＧ（１３４：６７：６０μmol）とＳＮ−３８ ０．４８μmol（０．２mg）をクロロホルム：メタノール混液に溶解し、完全に分散させた。その後、窒素ガス気流下ロータリーエバポレーターで有機溶媒を減圧留去してフラスコ内壁にリピッドフィルムを作り、さらにデシケーター中に入れ、真空ポンプを用いて溶媒を完全に留去した。これに９．０％スクロース／１０mM乳酸緩衝液（pH５．６）１０mlを加え、７５℃で１０分間水和膨張させ、窒素ガスバブリングにより窒素置換した後、２０分間超音波処理してリポソーム分散液とした。その後、−８４℃で凍結後、室温で融解し、７５℃で超音波処理する操作を１〜３回繰り返した。
【００４６】
さらに、エクストルーダー及びポリカーボネート製メンブランフィルターを用いたエクストルージョン法で整粒した。あらかじめ９．０％スクロース／ｌ０mM乳酸緩衝液（pH５．６）で洗浄、等張化した透析用チューブ（三光純薬）中にいれ、充分な量の９．０％スクロース／１０mM乳酸緩衝液（pH５．６）中で１２時間透析を行い、リポソームに内封されていないＳＮ−３８を取り除いた。
【００４７】
ＳＮ−３８内封率における凍結融解のサイクル数における影響を検討するため、凍結融解０、１、２、３回のそれぞれのリポソームをサンプリングした。さらに各リポソームにおいて、エクストルージョン法で整粒する前のリポソームも透析にかけ、ＳＮ−３８内封量を定量し、ＳＮ−３８内封率におけるエクストルージョン法の影響を比較検討した。
【００４８】
３）分子フィルムローディング法によるＳＮ−３８含有リポソームの調製
ＤＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ＤＳＰＧ（１３４：６７：６０μmol）をクロロホルム：メタノール混液に溶解し、完全に分散させた。その後、窒素ガス気流下ロータリーエバポレーターで有機溶媒を減圧留去してフラスコ内壁にリピッドフィルムを作り、さらにデシケーター中に入れ、真空ポンプを用いて溶媒を完全に留去した。これにpH９．０のＰＢＳ ３．０mlを加え、７５℃で１０分間水和膨張させ、窒素ガスバブリングにより窒素置換した後、２０分間超音波処理してリポソーム分散液とした。
【００４９】
その後、エクストルーダー及びポリカーボネート製メンブランフィルターを用いたエクストルージョン法で整粒した。さらに、０．１Ｎ ＨＣｌを加えpH５．６とするか、又は９．０％スクロース／１０mM乳酸緩衝液（pH５．６）を加えて透析を行い空リポソームを調製した。
【００５０】
一方、クロロホルム：メタノール混液に溶解させておいたＳＮ−３８（５mg／ml）を２０μｌとり、その後、窒素ガス気流下ロータリーエバポレーターで有機溶媒を減圧留去して、フラスコ内壁にＳＮ−３８よりなる薄膜（フィルム）を作り、これに、空リポソームを添加し６０℃で１時間インキュベートした。あらかじめ９．０％スクロース／１０mM乳酸緩衝液（pH５．６）で洗浄、等張化した透析用チューブ（三光純薬）中にいれ、充分な量の９．０％スクロース／１０mM乳酸緩衝液（pH５．５）中で１６時間透析を行い、リポソームに内封されていないＳＮ−３８を取り除いた。
【００５１】
＜ＳＮ−３８定量法＞
ＳＮ−３８含有リポソーム１０μｌに１−ブタノール４．０mlを加え、ボルテックスを用いて混和し、分光蛍光光度計(Fluorescence Spectrophotometer F-2000、日立製作所)を用いて励起波長３８０nm、蛍光波長４６０nmにおける蛍光強度を測定し、検量線を用いることによりＳＮ−３８量を算出した。
【００５２】
＜粒度分布測定＞
ＥＬＳ−８０００（大塚電子）を用いて、粒径測定専用角セルユニット（粒径測定用角セル１０nm）及び設定（ＣＥＬＬ ＴＹＰＥ：ＥＬＳ−ＲＥＣＴＡＮＧ）で測定した。試料は測定可能な濃度になるよう適当に９．０％スクロース／１０mM乳酸緩衝液（pH５．６）で希釈して用いた。測定及びデータ処理は２５℃において、装置付属の粒径測定ルーチンである“SIZEAUTO”で行った。
【００５３】
＜ゼータ電位測定＞
ＥＬＳ−８０００（大塚電子）を用いて、ゼータ電位測定用セルユニット（水系標準ＥＬＳセル）及び設定（ＣＥＬＬ ＴＹＰＥ：ＥＬＳ−ＳＴＡＮＤＡＲＤ）で測定した。試料は測定可能な濃度になるよう適当に９．０％スクロース／１０mM乳酸緩衝液（pH５．６）で希釈した。測宏及びデータ処理は、２５℃において引加電圧１００mV、装置付属のゼータ電位測定ルーチンである“AUTOAQ2”で行った。
【００５４】
Ｂ．結果
従来技術の中で最も高い内封率を示した条件（非特許文献２４参照）でＳＮ−３８のリポソーム製剤を調製し、対照製剤とした。
【００５５】
１）ＳＮ−３８リポソーム製剤のＰＥＧ修飾の効果
対照製剤と同じ条件でＰＥＧ修飾リポソームを用い、ＳＮ−３８のＰＥＧ修飾リポソームを調製した。
調製されたＳＮ−３８のＰＥＧ修飾リポソームの内封率を測定し、対照製剤と比較した（図１）。図１に示したように、対照製剤の内封率は０．６８％であった。これに対し、ＰＥＧ修飾リポソームでは２．４３％となり、ＰＥＧ修飾化により内封率が大きく向上した。それぞれの製剤の粒子径は、１２５．６nm、１２７．１nmであり、内封量の向上は粒子径に影響はなかった。それぞれのゼータ電位は、−３５．６mV、−１９．２mVであった。ゼータ電位は固定層と拡散層の境界面に近いスベリ面での電位を示す。対照製剤のスベリ面は、マイナスの荷電を持つＤＳＰＧが存在するが、ＰＥＧ修飾リポソームのスベリ面は、ＰＥＧの影響で絶対値が小さくなると考えられる。この現象はＰＥＧ修飾脂質が有効に膜に導入されていることを示すものと考えられる。
【００５６】
２）ＳＮ−３８リポソーム製剤の凍結融解の効果
水溶性薬物は時にリポソーム化しにくい場合があり、凍結融解の手段により、薬物のリポソームは内封率が上昇するという報告がされている（非特許文献２９参照）。一方、脂溶性薬物は一般にリポソーム化しやすいといわれ、脂溶性薬物では、このような手段はあまり試みられない。しかし、ＳＮ−３８では、ＳＮ−３８自身がリポソーム膜形成を妨害するためか、その内封率は非常に低い。そこで、リポソーム調製法の過程に凍結融解工程を組み入れた。製造工程に組み入れる凍結融解を１〜３回行い、その内封率への影響を検討した。
【００５７】
凍結融解のサイクル数は、繰り返すごとに内封率が上昇し、その後プラトーに達するといわれているが、エクストルージョン後のＳＮ−３８の凍結融解リポソーム製剤では、１回の凍結融解で９．２９％の内封率を達成できた。しかし、それ以上の繰返しでは、返って内封率を減少させる結果となった。凍結融解によるリポソーム製剤の粒子径は、１回のとき１２０．９nm、２回１０８．１nm、３回９６．２nmであった。
【００５８】
３）分子フィルムローディング法によるリポソーム製剤
ＳＮ−３８リポソーム製剤は整粒の際、フィルタを通過せず、内封率が減少する。そこで、整粒後にＳＮ−３８を内封する方法でのリポソーム調製を試みた。リモートローディング法はエクストルージョンを行った空リポソームに両親媒性薬物を内封する方法である（非特許文献３２参照）。本発明者はリモートローディング法を改良し、空リポソームを調製した後に、フィルム状に加工した脂溶性薬物であるＳＮ−３８を分子フィルムローディング法で内封させ、目的のリポソーム製剤を製造することができた。すなわち、ＳＮ−３８を有機溶媒に溶解し、フィルム状に加工して行った。これは、一度溶解したＳＮ−３８が非常に小さな集合体となってフィルム状に付着し、これに空リポソームが接触することにより、空リポソームに取り込まれるものと考えられた。
【００５９】
一般に脂溶性薬物は、一般的な方法でリポソーム化が可能とされているが、ＳＮ−３８の場合には、ＳＮ−３８の存在が脂質膜の形成を妨害し、凝集により大粒子となってしまうため、これまでの方法では整粒により大部分のＳＮ−３８は脂質と一緒にフィルター上に残存し、効率を下げる。これに対し、分子フィルムローディング法は予め空リポソームを形成させた後にＳＮ−３８を取り込ませる方法であり、フィルム化したＳＮ−３８がリポソーム膜への高度の取り込みを可能にした。
【００６０】
さらに、ＳＮ−３８の等電点は約７．８９であり、それより酸性領域で脂溶性、アルカリ性領域で水溶性となる。pH５．６の外水相に添加されたＳＮ−３８は脂溶性を示し、リポソーム膜に溶け込む。その後、pH９．０の内水相に触れると水溶性となりリポソーム内に引き込まれると考えられるので、内水相pH９．０で空リポソームを調製したところ内封率は著しく上昇した。リポソーム製剤の粒子径は、弱酸性のとき１４０．６nmであり、アルカリ性で１７４．５nmであった。
【００６１】
【発明の効果】
本発明によれば、カンプトテシン類、特に抗腫瘍剤ＣＰＴ−１１の活性本体であるＳＮ−３８をリポソームに直接高内封率で内封し、可溶化及び徐放化をはかったナノスフェアリポソーム製剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＥＧ修飾脂質を用いたリポソームのＳＮ−３８内封率を示す。
【図２】製造工程における凍結融解処理の効果を示す。
【図３】分子フィルムローディング法によるリポソームのＳＮ−３８内封率を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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