(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム組成物を製造する方法であって、
リポソーム形成用組成物であって、水性媒体と、界面活性剤と、該界面活性剤の存在下において前記水性媒体中に溶解させた脂質とを少なくとも含んでなり、かつ有機溶媒の含有量が前記リポソーム形成用組成物の０．１重量％以下である、リポソーム形成用組成物を用意する工程と、
前記リポソーム形成用組成物を、２０〜６０ｍＬ／ｍｉｎの流速で、血液の人工透析に用いることができる中空糸透析カラム中を循環させることにより透析する工程と
を含んでなる、方法であって、
前記界面活性剤が、ｎ−オクチルグルコシド、コール酸、デオキシコール酸、ポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチルフェニルエーテルおよびｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミドからなる群から選択され、
前記脂質が、レシチンまたはホスファチジルコリンであり、
前記リポソーム組成物が、リポソーム粒子を有効成分として含んでなり、該リポソーム粒子の平均粒径が５０〜１８０ｎｍであり、かつ粒度分布の標準偏差が１５〜６５ｎｍである、方法。
【請求項２】
前記界面活性剤がｎ−オクチルグルコシドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リポソーム形成用組成物において、前記脂質と前記界面活性剤とのモル比が１：５〜１：８．３である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記リポソーム形成用組成物のｐＨが６〜８である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中空糸透析カラムを利用したリポソームを製造する方法およびこれにより得られるリポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは脂質２分子膜からなる閉鎖小胞体である。天然の生体膜は、脂質の２分子膜構造をとっているといわれており、リポソームは、生体膜に類似の構造をとっていることから、細胞膜との高い親和性を有し、ドラッグキャリヤーとしての高い能力が期待されている。近年、ＤＤＳを目指したリポソーム製剤の開発が、医薬品分野だけでなく、化粧品分野においても進められている。
【０００３】
リポソームの製法としては、種々の方法が知られている。例えば、一般的なリポソームの製造方法として（１）脂質を適当な有機溶媒（たとえば、クロロホルム、エーテル等）に溶解させ、減圧下にこれらの溶媒を留去し、一旦脂質薄膜を形成させた後、この脂質薄膜を機械的撹拌手段により水に水和（または膨潤）させる方法、（２）脂質をエーテルあるいはエタノール等の有機溶媒に溶解させ、この溶液を高温に暖めた水中にシリンジあるいはノズル等より、加圧下、一定速度で注入し、注入とともに有機溶媒が留去あるいは希釈されることにより脂質が二重層を形成し、リポソームが調製される方法、（３）脂質をコール酸あるいはデオキシコール酸などの界面活性剤とともに水溶液中で混合ミセルを形成させ、該ミセル溶液を透析あるいはゲル濾過等の操作によりコール酸あるいはデオキシコール酸などの界面活性剤を除去し、リポソームを調製する方法、（４）脂質を溶解した有機溶媒を水相に加え、超音波処理し、一旦Ｗ／Ｏ型エマルションを形成し、ついで有機溶媒を除去することによりゲル化させ、このゲルを機械的撹拌により転相させリポソームを調製する方法等が挙げられる。
【０００４】
また、特開平６−２３９７３４号公報（特許文献１）には、脂質をエタノールもしくはエタノール水溶液に溶解し、この溶液と水溶液とを混合することを特徴とする、リポソームの調整方法が開示されている。
【０００５】
また、Victoria Rhoden and Stanly M. Goldin, "Formation of Unilamellar Lipid Vescles of Controllable Dimensions by Detergent Dialysis", American Chemical Society, USA, 1979, Vol. 18, No.19, p.4173-4176（非特許文献１）には、ホスファチジルコリンとコール酸とを用いて混合液とし、中空糸型透析によりこの混合液からコール酸を実質的に除去し、リポソームを調製する方法が開示されている。
【０００６】
【特許文献１】特開平６−２３９７３４号公報
【非特許文献１】Victoria Rhoden and Stanly M. Goldin, American Chemical Society, USA, 1979, Vol. 18, No.19, p.4173-4176
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、今般、有機溶媒を使わずに、脂質を界面活性剤の作用によって水性媒体中に溶解させたリポソーム形成用組成物を調製し、これを中空糸透析カラムを用いて透析することにより、粒子径が小さく、均質なリポソームを極めて効率的かつ簡便に調製できる、との知見を得た。本発明はかかる知見に基づくものである。
【０００８】
従って、本発明は、粒径が小さくかつ均質なリポソームの効率的な生産を可能とするリポソームの製造方法およびこの方法により得られるリポソームの提供を目的とする。
【０００９】
そして、本発明によるリポソームの製造方法は、水性媒体と、界面活性剤と、この界面活性剤の存在下において水性媒体中に溶解させた脂質とを少なくとも含んでなり、かつ有機溶媒を実質的に含まないリポソーム形成用組成物を用意する工程と、このリポソーム形成用組成物を血液の人工透析に用いることができる中空糸透析カラムを用いて透析する工程とを含んでなるものである。
【００１０】
さらに、本発明によるリポソームは、前記の方法により得られるものである。
【００１１】
本発明のリポソームによれば、ＤＤＳ医薬に応用することにより、適用部位における一定の到達時間および薬効を達成することができる。さらに、本発明によるリポソームは、化粧品にも応用することができ、ざらつきがなく、使用感の良い化粧品の調製が可能となる。
【発明の具体的説明】
【００１２】
リポソーム形成用組成物の調製
本発明によれば、まず、水性媒体と、界面活性剤と、脂質とを少なくとも含んでなり、かつ有機溶媒を実質的に含まないリポソーム形成用組成物を用意する。ここで、「有機溶媒を実質的に含まない」とは、リポソーム形成用組成物が有機溶媒を全く含まないか、または脂質の溶解に寄与しない程度の微量の有機溶媒を含んでいてもよいことを意味し、このような有機溶媒の量は、好ましくはリポソーム形成用組成物全重量に対して０．１重量％以下、より好ましくは０．０１重量％以下とされる。
【００１３】
リポソーム形成用組成物は、脂質および界面活性剤を水性媒体中に添加し、得られる混合物を攪拌して脂質を溶解させることにより調製することができる。また、リポソーム形成用組成物には、他の成分を添加してもよい。リポソーム形成用組成物を調製する際の温度は使用する脂質の相転移温度によって適宜決定されるが、好ましくは１５〜３０℃、より好ましくは２０〜２５℃とされる。
【００１４】
水性媒体
本発明に用いられる水性媒体としては、例えば、水、生理食塩水、緩衝溶液、糖液、各種塩溶液等が挙げられる。
【００１５】
脂質
本発明に用いられる脂質は、リポソームの製造に利用可能なものであればよく、例えば、リン脂質、糖脂質などが挙げられる。さらに、リン脂質としては、卵黄レシチン、水添卵黄レシチン、大豆レシチン、水添大豆レシチンなどのレシチン、卵黄ホスファチジルコリンなどのホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン等が挙げられる。糖脂質としては、スフィンゴシン、ガングリオシド等が挙げられる。さらに、本発明に用いられる他の脂質としては、例えば、コレステロール等が挙げられる。本発明の好ましい実施態様によれば、前記脂質はリン脂質とされ、より好ましくはレシチンまたはホスファチジルコリン、さらに好ましくは卵黄レシチンまたは卵黄ホスファチジルコリンとされる。
【００１６】
水性媒体に添加される脂質の量は特に制限されないが、リポソーム形成用組成物の全量に対し、好ましくは３〜１０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜１０ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは約５ｍｇ／ｍＬとされる。
【００１７】
界面活性剤
本発明に用いられる界面活性剤は、脂質を水性媒体に溶解させうるものであればよく、例えば、ｎ−オクチルグルコシド（n-Octyl-β-D-glucopyranoside)、コール酸、デオキシコール酸、TritonX-100、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（n-Nonanoyl-N-methylglucamide：ＭＥＧＡ−９）等が挙げられ、好ましくはｎ−オクチルグルコシドとされる。また、本発明の好ましい態様によれば、界面活性剤はデオキシコール酸とされる。
【００１８】
水性媒体に添加される界面活性剤の量は、脂質の水性媒体への溶解を可能とする量であればよいが、リポソーム形成用組成物の全量に対し、好ましくは３０〜１００ｍＭ、より好ましくは３０〜５０ｍＭ、さらに好ましくは約５０ｍＭとされる。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様によれば、リポソーム形成用組成物中における前記脂質と前記界面活性剤とのモル比は、１：５〜１：８．３、より好ましくは１：８とされる。
【００２０】
その他の成分
リポソーム形成用組成物には、所望により、種々の物質を、リポソームの形成を妨げない範囲内で添加することができる。このような添加物としては、例えば、各種金属イオン、塩類（ＫＣｌ等）、糖類、アミノ酸類、コレステロール、コレスタノール等のステロール類等の膜安定化剤、ジセチルホスフェート、ホスファチジン酸、ガングリオシド、ステアリルアミン等の荷電物質、α−トコフェロール等の酸化防止剤等を挙げることができる。これらの添加物の含有量は、その使用目的に応じて決定される。
【００２１】
さらに、前記添加物には、リポソームの脂質膜中に、またはその内腔中に含有させてその機能を利用する物質があり、例えば、医薬品、医薬部外品、化粧品等における有効成分が挙げられる。このような有効成分としては、抗細菌性化合物類、抗ウイルス性化合物類、抗真菌性化合物類、抗寄生体化合物類、抗腫瘍性化合物類、ビタミン類、膜蛋白質、酵素等の各種蛋白質、ホルモン類、放射線標識物質、蛍光化合物類、多糖類、核酸類等を挙げることができる。これらの添加物の含有量は、その使用目的に応じて決定される。
【００２２】
リポソーム形成用組成物のｐＨ
リポソーム形成用組成物のｐＨは、リポソームの形成を妨げない範囲内において、リポソームの組成及びその用途などに応じて選択され、例えば、機能性物質を添加する場合には、該機能性物質の変性や破壊を生じないｐＨが選択される。すなわち、本発明の好ましい実施態様によれば、リポソーム形成用組成物のｐＨは６〜８、より好ましくは７．４〜７．８とされる。
【００２３】
透析工程
本発明によれば、リポソーム形成用組成物は、中空糸透析カラムを用いて透析する。本発明に用いる中空糸透析カラムは、所望するリポソームの粒径や必要とされる透析性能等を勘案して適宜選択されるが、好ましくは、数千〜１万数千本の中空糸状の透析膜（中空糸膜）を束ね、円筒形のプラスチック容器に充填されてなるものとされる。好適な中空糸透析カラムとしては、血液の人工透析に用いられるもの、特に、腎不全患者の血液の人工透析に用いられるものが挙げられ、これに含まれる中空糸膜は、典型的には、内径１７５〜２８０μｍ、および膜厚７〜５０μｍを有する。また、好適な中空糸透析カラムは、その分画が分子量約２７,０００〜３３，０００であるもの、より好ましくは分子量約３０，０００であるものとされる。
【００２４】
中空糸膜は、例えば、セルロース系膜（酢酸セルロース、再生セルロースなど）、合成高分子膜（ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、エチレン・ビニルアルコール共重合体、ポリスルフォン、ポリアミド等）などから製造された中空繊維であってよい。また、本発明に用いる中空糸透析カラムの円筒形のプラスチック容器のサイズは、透析スケールに応じて適宜選択される。
【００２５】
本発明による透析工程では、リポソーム形成用組成物を中空糸透析カラムに注入し、同時に透析外液を流すことにより、界面活性剤やリポソーム未封入成分などを極めて効率よく除去することができる。具体的な方法としては、中空糸透析カラムに、リポソーム形成用組成物を２０〜６０ｍＬ／ｍｉｎ、好ましくは２０〜４０ｍＬ／ｍｉｎの速度で注入し、１０〜１５分間循環させ、透析外液を１００〜３３０ｍＬ／ｍｉｎの速度で流すことにより好ましく実施できる。ここで、中空糸透析カラム内部の温度は２０〜２５℃であることが好ましい。
【００２６】
透析外液は、界面活性剤、リポソーム封入成分の種類等に応じて適宜選択してよいが、好ましくはリポソーム形成用組成物に用いられる水性溶剤とされる。
【００２７】
本発明による透析工程によれば、例えば、１５分間あたり、２．０〜３．０８ｍｇ／ｍＬの脂質濃度を有するリポソーム形成用組成物を処理することが可能となる。また、本発明によれば、添加した界面活性剤の９０％以上が除去される。
【００２８】
リポソーム
本発明による製造方法によって得られるリポソームは、リポソーム粒子の９０％以上の粒径が２００ｎｍ以下のものとして調製される。そして、本発明の好ましい実施態様によれば、本発明によるリポソームは、平均粒径が５０〜１８０ｎｍ、より好ましくは約５０〜６５ｎｍであり、粒度分布の標準偏差が１５〜６５ｎｍ、より好ましくは約１５〜２０ｎｍである。
【００２９】
本発明によるリポソームは、封入される薬物の種類に応じて、種々の治療目的の医薬品、医薬部外品、化粧品等に適用することができる。従って、本発明のリポソームには、例えば一般的に汎用される製剤構成成分として水溶性高分子、多価アルコール、防腐剤、キレート剤等を添加して用いても良い。
［実施例］
【００３０】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
１００ｍＭ ＫＣｌ水溶液(約ｐＨ７）に、５０ｍＭのｎ−オクチルグルコシドおよび５ｍｇ／ｍＬの卵黄レシチンを溶解させ、室温（２５℃）にて攪拌し、リポソーム形成用組成物とした。このリポソーム形成用組成物５０ｍＬをフラスコに満たし、図１に示すように、ローラーポンプを用いて人工透析用中空糸カラム（FH66D、Gambro社製）の血液流入側に２０〜４５ｍＬ／ｍｉｎで流し、１５分以上循環させた。これと同時に、１００ｍＭ ＫＣｌ水溶液（以下「透析外液」という）を、ローラーポンプを用いて、図１に示すように中空糸の透析液側に１２０ｍＬ／ｍｉｎで流した。透析外液は、リポソーム形成用組成物５０ｍＬに対して２Ｌを使用し、これを循環させた。人工透析用中空糸カラムより流出したリポソーム液を採取した。そして、採取したリポソームについて、６００ｎｍにおける吸光度を紫外可視分光光度計（DU series 640）を用いて測定したところ、吸光度が約０．５〜０．６までの懸濁したリポソームを得た。上記懸濁したリポソームの粒径は、動的散乱法に基づき、サブミクロン粒子アナライザー(Ｎ５、ベックマン・コールター社製)で測定した（温度；２５℃、アングル；９０．０°、測定時間；２００秒，解析方法；ＳＤＰ法）。ここで、リポソーム形成用組成物を３５ｍＬ／ｍｉｎで流したときのリポソームの粒度分布は表１に示す通りである。表１によれば、リポソームの平均粒径は約１５６．６ｎｍであり、粒度分布の標準偏差は約３３．９ｎｍであった。得られたリポソーム懸濁液中のｎ−オクチルグルコシドが３．７ｍＭであった。
【表１】
0004617458.tif 000002
【実施例２】
【００３２】
卵黄レシチンの代わりに卵黄ホスファチジルコリンを用いる以外、実施例１と同様の処理を行ったところ、実施例１と同様のリポソームが得られ、その粒度分布も同様であった。
【実施例３】
【００３３】
各種界面活性剤を用いて、実施例１に準じた方法によって処理して得られたリポソームのデータは表２の通りであった。
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、中空糸透析カラムを用いたリポソームの製造方法の模式図である。
【図１】
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