(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の二本鎖ＤＮＡおよび第２の二本鎖ＤＮＡを含む溶液から第１の二本鎖ＤＮＡを精製する方法であって、（ｉ）前記溶液を特異的配列と非標準的三要素を形成せずにハイブリッドを形成することによって前記第２の二本鎖ＤＮＡと三重らせんを形成することができる共有結合オリゴヌクレオチドを含む第１の支持体に通過させる工程と、（ｉｉ）前記第１の支持体を通過させた溶液を回収する工程と、（ｉｉｉ）前記回収溶液を特異的配列と非標準的三要素を形成せずにハイブリッドを形成することによって前記第１の二本鎖ＤＮＡと三重らせんを形成することができる共有結合オリゴヌクレオチドを含む第２の支持体に通過させる工程とを含み、前記第１の二本鎖ＤＮＡ中に存在する特異的配列が配列ＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡ（配列番号２９）を含み、前記第２の二本鎖ＤＮＡ中に存在する特異的配列が配列ＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡ（配列番号２７）を含む、方法。
【請求項２】
第１の二本鎖ＤＮＡおよび第２の二本鎖ＤＮＡを含む溶液から第１の二本鎖ＤＮＡを精製する方法であって、（ｉ）前記溶液を特異的配列とのハイブリッド形成によって前記第２の二本鎖ＤＮＡと三重らせんを形成することができる共有結合オリゴヌクレオチドを含む第１の支持体に通過させる工程と、（ｉｉ）前記第１の支持体を通過させた溶液を回収する工程と、（ｉｉｉ）前記回収溶液を特異的配列とのハイブリッド形成によって前記第１の二本鎖ＤＮＡと三重らせんを形成することができる共有結合オリゴヌクレオチドを含む第２の支持体に通過させる工程とを含み、前記第１の二本鎖ＤＮＡと三重らせんを形成することができるオリゴヌクレオチドが配列ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴ（配列番号３０）を含み、前記第２の二本鎖ＤＮＡと三重らせんを形成することができるオリゴヌクレオチドが配列ＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴ（配列番号２８）を含む、方法。
【請求項３】
前記溶液が細胞溶解物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞溶解物が透明溶解物である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記二本鎖ＤＮＡが予備精製されている、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記特異的配列が、二本鎖ＤＮＡに人為的に移入されているか又は二本鎖ＤＮＡ中に天然に存在する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、エステル結合、アミド結合、またはアミン結合によって前記支持体に結合している、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが、炭素鎖（ＣＨ２）ｎ（式中、ｎは１と１８との間の整数である）を含むアームを介してカラムに結合しており、前記アームがリン酸塩を介して前記オリゴヌクレオチドに結合しており、アミド結合によって前記カラムに結合している、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼに耐性を示すか前記ヌクレアーゼから保護されるか前記特異的配列に対する親和性が増加する、少なくとも１つの化学修飾を有する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのシトシンがメチル化されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記二本鎖ＤＮＡが環状ＤＮＡである、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記環状ＤＮＡがプラスミドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記二本鎖ＤＮＡ中に存在する特異的配列が前記オリゴヌクレオチドとのいくつかのハイブリッド結合部位を有する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記支持体が官能化クロマトグラフィー支持体、官能化プラスチック表面、または官能化ラテックスビーズである、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記支持体が官能化クロマトグラフィー支持体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記精製二本鎖ＤＮＡが０．５％以下の含量の染色体ＤＮＡを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記精製二本鎖ＤＮＡが０．０１％以下の含量の染色体ＤＮＡを有する、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願についてのクロスリファレンス）
本出願は、１９９５年１１月８日提出のＰＣＴ仏国出願９５／０１４６８の米国国内段階である、１９９７年６月９日提出の米国出願番号０８／８６０，０３８の一部継続出願である、２０００年３月２６日提出の出願番号０９／５８０，９２３の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、新規のＤＮＡ精製法に関する。本発明の方法は、薬理学的に有効な二本鎖ＤＮＡを迅速に精製することができる。より詳細には、本発明の精製法は、ＤＮＡ配列とオリゴヌクレオチド配列との間の特異的ハイブリッド形成を含む。
【０００３】
遺伝子および細胞治療技術は、現在、著しい発展を遂げている。しかし、これらの技術は、大量の薬学的純度のＤＮＡを産生できなければならない。実際、これらの新規の治療では、薬物はしばしばＤＮＡ自体からなり、適切な量を製造し、単離し、ヒトへの治療に適切な様式で精製することができることが不可欠である。
【０００４】
近年、遺伝子治療またはワクチン接種のためにプラスミドＤＮＡを注射できることは、種々の細胞型からＤＮＡ発現ベクターを取り出し、その後これらのプラスミドによってコードされる遺伝子を発現させることができることを示した多数の報告によって証明されている（Ｌｅｄｌｅｙ、１９９５、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、６、１１２９）。
【０００５】
遺伝子治療またはワクチン接種用の目的の遺伝子には、例えば、腫瘍抑制遺伝子、自殺遺伝子、または抗センス配列を含み得る。これらはまた、αフェトプロテインＡＦＰ（Ｍｏｒｉｎａｇａ、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０、４６０４）、酵素、ホルモン、サイトカイン、ＦＧＦ（Ｊｏｕａｎｎｅａｕら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、２８９３）またはＶＥＧＦＢ（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ  Ｂら、１９９６、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、９３、５７６）などの成長因子、Ｂ欠失第ＶＩＩＩ因子（Ｔｒｕｅｔｔら、１９８５、ＤＮＡ、４、３３３）、アポリポプロテイン、神経伝達物質、神経栄養因子、天然もしくはキメラ免疫グロブリンなどのタンパク質をコードすることができる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのβガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺなどのレポーター遺伝子も使用することができる。
【０００６】
ヒトで遺伝子送達ベクターとしてプラスミドＤＮＡを使用するための主要な問題は、この製剤のｉ）製造およびｉｉ）純度である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ宿主における高コピー数のプラスミドベクターの産生技術は、最近開発された。現在使用されているプラスミドは、ＣｏｌＥ１由来のプラスミド（ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、またはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｌａｈｉｊａｎｉら、１９９６、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、７、１９７１）など）またはｐＣＯＲプラスミド（Ｓｏｕｂｒｉｅｒら、１９９９、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、６、１４８２）のいずれかである。
【０００７】
遺伝子治療用ベクターとしてのプラスミドＤＮＡの使用によって生じる第２の懸念は、プラスミドベクター自体の純度である。ＣｓＣｌ勾配による超遠心分離法またはクロマトグラフィーなどの現在の精製法は、宿主のゲノムＤＮＡおよびＲＮＡまたはタンパク質などの汚染物質の除去には非効率的であり得る。特に、化学構造がプラスミドのそれと非常に近い宿主ゲノムＤＮＡは、古典的なクロマトグラフィーを使用しての除去は非常に困難である。０．５％から１％までの典型的な宿主ゲノムＤＮＡ濃度が、典型的なクロマトグラフィーによって得られたプラスミド調製物で見出される。したがって、ヒト遺伝子治療用の安全なベクターとしてのプラスミドＤＮＡを開発するために、宿主ゲノムＤＮＡ含有量をさらに低レベル、典型的には０．１％または０．０１％以下に低下させる精製技術が必要である。
【０００８】
本発明は、簡単で特に有効な新規のＤＮＡ精製法を記載する。特に高純度且つ高収率で得ることができる。本発明の方法は、特に、精製すべきＤＮＡに挿入された配列と天然または改変塩基から構成されるオリゴヌクレオチドとの間の特異的相互作用に基づく。
【０００９】
いくつかのオリゴヌクレオチドがＤＮＡ二重らせんの大きな溝で特異的に相互作用して三重らせんを局所的に形成し、標的遺伝子の転写を阻害することができることが最近示されている（Ｈｅｌｅｎｅ  ｅｔ  Ｔｏｕｌｍｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０４９、１９９０、９９）。これらのオリゴヌクレオチドは、オリゴプリン−オリゴピリミジン配列（すなわち、一方の鎖にオリゴプリン配列を有し、相補鎖にオリゴピリミジン配列を有する領域）でＤＮＡ二重らせんを選択的に認識して、その部位で局所的に三重らせんを形成する。第３の鎖の塩基（オリゴヌクレオチド）は、ワトソン−クリック塩基対のプリンと水素結合（フーグスティーン型または逆フーグスティーン型）を形成する。
【００１０】
プラスミドを単離するためのこの型の相互作用の使用は、先行技術に記載されている。すなわち、Ｉｔｏら（ＰＮＡＳ、８９、１９９２、４９５）は、プラスミドの特定の配列を認識してそれと三重らせんを形成することができるビオチン化オリゴヌクレオチドの使用が記載している。次いで、このようにして形成された複合体を、ストレプトアビジンコート磁性ビーズと接触させる。ビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用により、ビーズの磁性分離および溶出によるプラスミドの分離が可能である。しかし、この方法はいくつかの欠点がある。特に、２つの一連の特異的相互作用（第１にオリゴヌクレオチドとプラスミドとの間、第２にビオチン化複合体とストレプトアビジンビーズとの間）が必要である。さらに、最終溶液は、薬学的組成物で使用することができないビオチン化オリゴヌクレオチドで汚染され得る。
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、この型の相互作用を使用する新規で改善されたＤＮＡ精製法を記載する。より詳細には、本発明の方法は、支持体に共有結合したオリゴヌクレオチドを使用する。この方法は特に迅速であり、特に収率および純度が高い。さらに、本方法は、特に他の核酸、タンパク質、内毒素（リポ多糖類など）、ヌクレアーゼなどを含む複合体混合物からＤＮＡを精製することができる。さらに、使用支持体は容易に再利用することができ、得られたＤＮＡは改良された薬学的安全性を示す。最後に、本方法は、先行技術とは対照的に、１工程のみを必要とする。
【００１２】
したがって、本発明の第１の主題は、他の成分と混合したＤＮＡを、前記ＤＮＡ中に存在する特異的配列とのハイブリッド形成によって三重らせんを形成することができるオリゴヌクレオチドに共有結合した支持体を通過させる、二本鎖ＤＮＡの精製法にある。特異的配列は、二本鎖ＤＮＡ中に天然に存在する配列であるか、その後人為的に移入した合成配列であり得る。
【００１３】
本発明で使用されるオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡと直接ハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは、以下の塩基を含むことができる：
−チミジン（Ｔ）（二本鎖ＤＮＡのＡ．Ｔダブレットとトリプレットを形成することができる）（Ｒａｊａｇｏｐａｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、２８、１９８９、７８５９）；
−アデニン（Ａ）（二本鎖ＤＮＡのＡ．Ｔダブレットとトリプレットを形成することができる）；
−グアニン（Ｇ）（二本鎖ＤＮＡのＧ．Ｃダブレットとトリプレットを形成することができる）；
−プロトン化シトシン（Ｃ＋）（二本鎖ＤＮＡのＧ．Ｃダブレットとトリプレットを形成することができる）（Ｒａｊａｇｏｐａｌら、前出）；
−ウラシル（Ｕ）（Ａ．ＵまたはＡ．Ｔ塩基対とトリプレットを形成することができる）。
【００１４】
好ましくは、使用されるオリゴヌクレオチドはシトシンリッチのホモピリミジン配列を含み、ＤＮＡ中の特異的配列はホモプリン−ホモピリミジン配列である。シトシンの存在により、シトシンがプロトン化される酸性ｐＨで安定であり、シトシンが中和される塩基性ｐＨで不安定化する三重らせんを有することができる。
【００１５】
ハイブリッド形成によって三重らせんを形成させるために、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡ中の特異的配列が相補的であることが重要である。これに関して、最高の収量および最良の選択性を得るために、完全に相補的なオリゴヌクレオチドおよび特異的配列を本発明の方法で使用する。これらは、特に、オリゴヌクレオチドはポリ（ＣＴＴ）であり、特異的配列はポリ（ＧＡＡ）であり得る。例として、配列５’−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３’（ＧＡＧＧ（ＣＴＴ）７；配列番号１）（式中、塩基ＧＡＧＧは三重らせんを形成しないが、オリゴヌクレオチドを結合アームから離す空間を得ることが得きる）のオリゴヌクレオチドを挙げることができる；配列（ＣＴＴ）７（配列番号２６）もまた挙げることができる。これらのオリゴヌクレオチドは、相補的単位（ＧＡＡ）を含む特異的配列と三重らせんを形成することができる。問題の配列は、特に、実施例に記載の７、１４、または１７個のＧＡＡ単位を含む領域であり得る。
【００１６】
特に目的とする別の配列は、配列５’−ＡＡＧＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＡＡ−３’（配列番号５）である。この配列は、オリゴヌクレオチド５’−ＡＡＧＧＡＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧＧＡＡ−３’（配列番号６）または５’−ＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＴ−３’（配列番号７）と三重らせんを形成する。
【００１７】
この場合、オリゴヌクレオチドは逆平行でポリプリン鎖と結合する。これらの三重らせんは、Ｍｇ２＋の存在下でのみ安定である（Ｖａｓｑｕｅｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５、３４、７２４３〜７２５１；Ｂｅａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｖａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５１、１３６０〜１３６３）。
【００１８】
上記のように、特異的配列は、二本鎖ＤＮＡ中に天然に存在する配列または二本鎖ＤＮＡ中に人為的に移入された合成配列であり得る。二本鎖ＤＮＡ（例えば、プラスミドの複製起点またはマーカー遺伝子）中に天然に存在する配列と三重らせんを形成することができるオリゴヌクレオチドを使用することが特に有利である。これに関して、出願人は、プラスミド配列分析を行い、これらのＤＮＡのいくつかの領域（特に複製起点）がホモプリン−ホモピリミジン領域を有し得ることを示すことができた。これらの天然のホモプリン−ホモピリミジン領域と三重らせんを形成することができるオリゴヌクレオチドの合成により、修飾していないプラスミド、特にｐＵＣ、ｐＢＲ３２２などの市販の型のプラスミドを本発明の方法に適用することができる。二本鎖ＤＮＡ中に天然に存在するホモプリン−ホモピリミジン配列のうち、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドＣｏｌＥ１の複製起点に存在する配列５’−ＣＴＴＣＣＣＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＡＧＧ−３’（配列番号２）の全部または一部を含む配列を挙げることができる。この場合、三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドは、配列５’−ＧＡＡＧＧＧＣＴＴＣＣＣＴＣＴＴＴＣＣ−３’（配列番号３）を有し、Ｂｅａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｖａｎ（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９２、１１４、４９７６〜４９８２）およびＪａｙａｓｅｎａ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９２、２０、５２７９〜５２８８）に記載の二重らせんの２つの鎖に交互に結合する。プラスミドｐＢＲ３２２のβラクタマーゼ遺伝子の配列５’−ＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧ−３’（配列番号４）（Ｄｕｖａｌ−Ｖａｌｅｎｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９２、８９、５０４〜５０８）も挙げることができる。
【００１９】
ＣｏｌＥ１およびｐＣＯＲの複製起点中に特定のオリゴヌクレオチドと三重らせん構造を形成することができる２つのさらなる標的配列が同定されている。ＣｏｌＥ１由来のプラスミドは、プラスミド複製に関連するＲＮＡ−ＩＩ転写の上流にマッピングされた１２量体のホモプリン配列（ＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡ）（配列番号２７）を含む。この配列は、１２量体の相補的ＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴ（配列番号２８）オリゴヌクレオチドと安定なトリプレックス構造を形成する。ｐＣＯＲ骨格は、ｐＣＯＲのγ複製起点のＡ＋Ｔリッチなセグメント中に存在する１４個の非反復塩基（ＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡ）（配列番号２９）のホモプリンストレッチを含む（Ｌｅｖｃｈｅｎｋｏら、１９９６、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２４、１９３６）。この配列は、１４量体の相補的オリゴヌクレオチド（ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴ）（配列番号３０）と安定なトリプレックス構造を形成する。対応するオリゴヌクレオチドＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴ（配列番号２８）およびＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴ（配列番号３０）は、有効且つ特異的にいずれかのＣｏｌＥ１ｏｒｉまたはｐＣＯＲ（ｏｒｉγ）の複製起点内に存在する各相補的配列を標的する。実際、１つの非標準的三要素（Ｔ＊ＧＣまたはＣ＊ＡＴ）により、トリプレックス構造を完全に不安定にすることができる。
【００２０】
複製起点またはマーカー遺伝子中に存在する配列と三重らせんを形成することができるオリゴヌクレオチドの使用は、同一のオリゴヌクレオチドを使用して複製起点またはマーカー遺伝子を含む任意のＤＮＡを精製可能であるので有利である。したがって、プラスミドまたは二本鎖ＤＮＡ中に人為的な特異的配列を組み込むためにこれらを改変する必要がない。
【００２１】
完全に相補的な配列が好ましいにもかかわらず、親和性を過剰に損なわない場合、オリゴヌクレオチド配列とＤＮＡ中に存在する配列との間にいくつかのミスマッチを許容することができることが理解される。Ｅ．ｃｏｌｉのβラクタマーゼ遺伝子中に存在する配列５’−ＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧ−３’（配列番号８）を挙げることができる。この場合、ポリプリン配列を中断するチミンを、第３の鎖のグアニンによって認識し、それによって２つのＴ＊ＡＴトリプレットに隣接する場合に安定なＧ＊ＴＡトリプレットを形成することができる（Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９２、３１、２８２９〜２８３４）。
【００２２】
特定の実施形態によれば、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列（ＣＣＴ）ｎ、配列（ＣＴ）ｎ、または配列（ＣＴＴ）ｎ（式中、ｎは１と１５との間の整数）を含む。（ＣＴ）ｎまたは（ＣＴＴ）ｎの配列型を使用することが特に有利である。実際、出願人は、精製収率はオリゴヌクレオチド中のＣの量に影響を受けることを示した。特に、実施例７に示すように、オリゴヌクレオチドがより少数のシトシンを含む場合に精製収率が増大する。本発明のオリゴヌクレオチドもまた、（ＣＣＴ）、（ＣＴ）、または（ＣＴＴ）単位と組み合わせることができることが理解される。
【００２３】
使用されるオリゴヌクレオチドは、天然（非改変天然塩基から構成される）でも化学修飾されていてもよい。特に、オリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼに対して耐性を示すかヌクレアーゼから保護することができるか、特異的配列に対する親和性が増加するように一定の化学修飾を有することが有利であり得る。
【００２４】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドはまた、ヌクレアーゼ耐性をより強化する目的で骨格の改変を受けたヌクレオシドの任意の結合した連続物を意味すると理解される。可能な改変のうち、ＤＮＡと三重らせんを形成することができるオリゴヌクレオチドホスホロチオエート（Ｘｏｄｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９４、２２、３３３０）ならびにホルムアセタールまたはメチルホスホネート骨格を有するオリゴヌクレオチド（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９１、１１３、７７６７〜７７６８）を挙げることができる。ＤＮＡと三重らせんを形成するヌクレオチドのαアノマーで合成したオリゴヌクレオチドを使用することも可能である（Ｌｅ  Ｄｏａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９８７、１５、７７４９〜７７６０）。骨格の別の改変は、ホスホロアミデート結合である。例えば、ＤＮＡと特に安定な三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドが得られるＧｒｙａｚｎｏｖ  ａｎｄ  Ｃｈｅｎによって記載されたＮ３’−Ｐ５’ヌクレオチド間ホスホロアミデート結合（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９４、１１６、３１４３〜３１４４）を挙げることができる。骨格の他の改変のうち、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボース、ホスホジエステル（Ｓｕｎ  ａｎｄ  Ｈｅｌｅｎｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、１１６、３１４３〜３１４４）などの使用も挙げることができる。最後に、燐ベースの骨格を、ＰＮＡ（ペプチド核酸）などのポリアミド骨格（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７〜１５００；Ｋｉｍら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９３、１１５、６４７７〜６４８１）またはＤＮＧ（デオキシリボ核グアニジン（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９５、９２、６０９７〜６１０１）などのグアニジンベースの骨格、または三重らせんも形成するＤＮＡのポリカチオンアナログと置換して三重らせんを形成することもできる。
【００２５】
第３の鎖のチミンもまた、ＤＮＡのオリゴヌクレオチド親和性を増大させる５−ブロモウラシルと置換することができる（Ｐｏｖｓｉｃ  ａｎｄ  Ｄｅｒｖａｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９８９、１１１、３０５９〜３０６１）。第３の鎖はまた、非天然塩基を含むことができ、その塩基のうち、７−デアザ−２’−デオキシキサントシン（Ｍｉｌｌｉｇａｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９３、２１、３２７〜３３３）、８−オキソアデニン、２−アミノプリン、２’−Ｏ−メチルシュードイソシチジン、または当業者に公知の任意の改変（概要については、Ｓｕｎ  ａｎｄ  Ｈｅｌｅｎｅ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、１９９３、３、３４５〜３５６を参照のこと）を挙げることができる。
【００２６】
オリゴヌクレオチドの別の改変型は、より詳細には、オリゴヌクレオチドと特異的配列との間の相互作用および／または親和性の改良を目的とする。特に、本発明のほとんどの有利な改変は、オリゴヌクレオチドのシトシンのメチル化からなる（実施例５を参照のこと）。したがって、このようにしてメチル化されたオリゴヌクレオチドは、中性に近いｐＨ範囲（＞５）で特異的配列と三重らせんを形成する注目すべき性質を示す。したがって、先行技術よりも高いｐＨ値（すなわち、プラスミドＤＮＡの分解リスクがより低くなるｐＨ値）で作用可能である。
【００２７】
本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチドの長さは、少なくとも３塩基、好ましくは５と３０との間である。１０塩基より長いオリゴヌクレオチドを使用することが有利である。当業者はそれぞれの場合によって相互作用の所望の選択性および安定性を適切にするような長さを適用することができる。
【００２８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、任意の公知の技術によって合成することができる。特に、これらを、核酸合成手段によって調製することができる。当業者に公知の任意の他の方法を、使用することができることが極めて明白である。
【００２９】
オリゴヌクレオチドを支持体に共有結合させるために、一般に、オリゴヌクレオチドを官能化する。したがって、これの５’または３’の位置をチオール、アミン、またはカルボキシル末端基で改変することができる。特に、チオール、アミン、またはカルボキシル基の付加により、例えば、オリゴヌクレオチドをジスルフィド、マレイミド、アミン、カルボキシル、エステル、エポキシド、臭化シアン、またはアルデヒド官能基を有する支持体に結合可能である。オリゴヌクレオチドと支持体との間のジスルフィド、チオエーテル、エステル、アミド、またはアミン結合の確立により、これらの結合が形成される。当業者に公知の任意の他の方法（例えば、二官能化結合試薬など）を使用することができる。
【００３０】
さらに、結合オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を改良するために、オリゴヌクレオチドは、塩基に「アーム」および「スペーサー」配列を含むことが有利であり得る。アームの使用により、実際に、支持体からの選択距離でオリゴヌクレオチドと結合することが可能であり、ＤＮＡとの相互作用条件を改良することができる。アームは、１から１８個、好ましくは６から１２個の（ＣＨ２）基を含む直鎖炭素鎖およびカラムに結合するアミンからなることが有利である。アームは、オリゴヌクレオチドまたはハイブリッド形成を干渉しない塩基から構成される「スペーサー」のリン酸塩に結合している。したがって、「スペーサー」は、プリン塩基を含むことができる。例として、「スペーサー」は、配列ＧＡＧＧを含むことができる。アームは、６から１２個の炭素原子を含む直鎖炭素鎖から構成されることが有利である。
【００３１】
本発明の実施のために、異なる型の支持体を使用することができる。これらは、バルクまたはカラムにプレパックされた官能化クロマトグラフィー支持体、官能化プラスチック表面、または官能化ラテックスビーズ、磁性ビーズなどであり得る。クロマトグラフィー支持体を使用することが好ましい。例として、使用することができるクロマトグラフィー支持体は、アガロース、アクリルアミド、またはデキストランおよびその誘導体（セファデックス、セファロース、スーパーロースなど）、ポリマー（ポリ（スチレン／ジビニルベンゼン）など）またはグラフト化シリカもしくは非グラフト化シリカである。クロマトグラフィーカラムは、拡散または灌流モードで操作することができる。
【００３２】
より良好な精製収率を得るために、プラスミドにオリゴヌクレオチドとのいくつかのハイブリッド形成位置を含む配列を使用することが特に有利である。いくつかのハイブリッド形成部位の存在により、実際に、前記配列とオリゴヌクレオチドとの間の相互作用が促進され、精製収率が改良される。したがって、（ＣＣＴ）、（ＣＴ）、または（ＣＴＴ）モチーフのｎ回反復を含むオリゴヌクレオチドについて、少なくともｎ個の相補的モチーフ、好ましくはｎ＋１個の相補的モチーフを含むＤＮＡ配列を使用することが好ましい。したがって、ｎ＋１個の相補モチーフを有する配列により、オリゴヌクレオチドとの２つのハイブリッド形成部位が得られる。有利には、ＤＮＡ配列は、１１個のハイブリッド形成部位（すなわち、ｎ＋１０個の相補モチーフ）を含む。
【００３３】
本発明の方法を使用して、任意の型の二本鎖ＤＮＡを精製することができる二本鎖ＤＮＡの例は、一般に治療に重要な１つまたは複数の遺伝子を含むプラスミドなどの環状ＤＮＡである。このプラスミドはまた、複製起点、マーカー遺伝子などを有し得る。本発明の方法を、細胞溶解物に直接適用することができる。この実施形態では、形質転換での増幅後に細胞培養したプラスミドを、細胞溶解後に直接精製する。本発明の方法を、透明溶解物（すなわち、細胞溶解物の中和および遠心分離後に得られた上清）に適用することもできる。公知の方法で精製された溶液にも適用可能であることが極めて明白である。本方法はまた、重要な配列を有する線状または環状ＤＮＡを異なる配列のＤＮＡを含む混合物から精製可能である。本発明の方法を、二本鎖ＤＮＡの精製に使用することもできる。
【００３４】
細胞溶解物は、原核細胞または真核細胞の溶解物であり得る。
【００３５】
原核細胞に関しては、例として細菌Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、またはＳｔｒｅｐｏｍｙｃｅｓを挙げることができる。真核細胞に関しては、動物細胞、酵母、真菌などを挙げることができ、より詳細には、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母またはＣＯＳ、ＣＨＯ、Ｃ１２７、ＮＩＨ３Ｔ３などである。
【００３６】
本発明の方法は、非常に高い純度のプラスミドＤＮＡを迅速且つ簡単に得ることができるので特に有利である。特に、実施例に例示のように、本方法は、目的のプラスミドＤＮＡを、断片化ＤＮＡ、内毒素、タンパク質、ヌクレアーゼなどの汚染成分から有効に分離することができる。より詳細には、本発明の方法は、染色体ＤＮＡ含量が０．５％以下の二本鎖ＤＮＡ（特に、プラスミド起源の二本鎖ＤＮＡ）を調製することができる。さらにより好ましくは、得られたＤＮＡ調製物の染色体ＤＮＡ含有率は、０．２％以下である。したがって、本発明は、薬学的に（特に、遺伝子治療または細胞治療）使用することができるプラスミドＤＮＡを含む組成物を記載する。これに関して、本発明の主題はまた、上記の方法によって調製した二本鎖ＤＮＡ（直鎖またはプラスミド起源）を含む薬学的組成物である。
【００３７】
本発明はまた、０．５％以下、好ましくは０．２％以下、さらにより好ましくは０．１％以下、さらにより好ましくは０．０１％以下の染色体ＤＮＡ含有率のプラスミドＤＮＡに関する。以下に例示のように、トリプレックス親和性相互作用工程を、古典的なクロマトグラフィー工程後の精製プロセスに組み込んだ。この親和性工程は、どのような出発純度でもプラスミド調製物の純度を有意に改良する。オリゴヌクレオチド（クロマトグラフィー支持体に共有結合している）と精製すべき目的のプラスミドとの間のトリプレックス構造の形成は、オリゴヌクレオチドとトリプレックス構造を形成することができる配列のプラスミド上の存在に依存する。このトリプレックス構造は、オリゴヌクレオチドがプロトン化される酸性ｐＨでのみ安定である。次いで、プラスミドＤＮＡは、ｐＨを中性に上昇させることによってカラムから簡単に溶出される。
【００３８】
組成物は、「裸の」、またはリポソーム、ナノ粒子、カチオニックリピド、ポリマー、組換えウイルス、もしくはタンパク質などの輸送担体と組み合わせたプラスミドＤＮＡを含むことができる。
【００３９】
１つの実施形態では、本発明の方法を使用して、異なる型および配列の２つまたはそれ以上の二本鎖ＤＮＡを含む混合物から１つの型の二本鎖ＤＮＡを精製することができる。この方法を細胞溶解物に直接適用して、細胞培養によって増幅させた二本鎖ＤＮＡを培養細胞溶解後に精製することができる。この方法を、透明溶解物（すなわち、細胞溶解物の中和および遠心分離後に得られる上清）に適用することもできる。本方法を、予備精製溶液にさらに適用することができる。
【００４０】
より詳細には、第１および第２の二本鎖ＤＮＡを含む溶液から第１の二本鎖ＤＮＡを精製する方法であって、（ｉ）前記溶液を特異的配列とのハイブリッド形成によって前記第２の二本鎖ＤＮＡと三重らせんを形成することができる共有結合オリゴヌクレオチドを含む第１の支持体に通過させる工程と、（ｉｉ）前記第１の支持体を通過させた、非結合の第１の二本鎖ＤＮＡが豊富な溶液を回収する工程と、（ｉｉｉ）前記回収溶液を前記第１の二本鎖ＤＮＡの特異的配列とのハイブリッド形成によって三重らせんを形成することができる共有結合オリゴヌクレオチドを含む第２の支持体に通過させる工程とを含む方法である。場合によって洗浄後、第１の二本鎖ＤＮＡを、第２の支持体から溶出することができる。この二重精製法を使用して、第１の二本鎖ＤＮＡを、いかなる検出レベルの第２の二本鎖ＤＮＡを含むことなく第２の支持体から回収することができる。
【００４１】
本発明の特定の実施形態では、第１の二本鎖ＤＮＡ分子は、配列５’−ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴ−３’（配列番号３０）を有するオリゴヌクレオチドと安定なトリプレックス構造を形成する特異的配列５’−ＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡ−３’（配列番号２９）を有するｐＣＯＲプラスミドである。第２の二本鎖ＤＮＡ分子は、配列５’−ＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴ−３’（配列番号２８）を有するオリゴヌクレオチドと安定なトリプレックス構造を形成する特異的配列５’−ＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡ−３’（配列番号２７）を有するＣｏｌＥ１由来のプラスミドである。したがって、ｐＣＯＲプラスミドを、本発明の二重精製法の使用によってＣｏｌＥ１由来のプラスミドなどの他のプラスミドを含む溶液から精製することが有利である。
【００４２】
本出願は、以下の実施例によってより詳細に記載されているが、これらは本発明の例示を目的とし、限定を目的としない。
【００４３】
（詳細な説明）
一般的なクローニング技術および分子生物学
制限酵素を使用した消化、ゲル電気泳動、Ｅ．ｃｏｌｉでの形質転換、拡散沈殿などの伝統的分子生物学法は、文献（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｔ.，Ｅ.ＦＦｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９、「分子クローニング：実験マニュアル」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．，  Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，  Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｓｔｏｎ，  Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，  Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，ａｎｄ  Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ、１９８７、「現代の分子生物学プロトコール」、１９８７〜１９８８、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されている。核酸配列を、既に公開されたプロトコール（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７）による鎖終端法によって同定した。
【００４４】
制限酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ（Ｂｉｏｌａｂｓ）から得た。
【００４５】
ライゲーションを行うために、ＤＮＡフラグメントを、ファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＡＴＰを含む緩衝液中でインキュベートする。
【００４６】
製造者の説明書にしたがってＢｉｏｓｅａｒｃｈ８６００自動ＤＮＡ合成機を使用したシアノエチル基によるβ部位で保護したホスホアミダイトを使用したホスホアミダイト化学（Ｓｉｎｈａ，Ｎ．Ｄ．，  Ｊ．Ｂｉｅｒｎａｔ，  Ｊ．ＭｃＭａｎｕｓ  ａｎｄ  Ｈ．Ｋｏｓｔｅｒ、１９８４、「ポリマー支持体オリゴヌクレオチド合成ＸＶＩＩＩ：最終生成物の脱保護および単離を簡単にするＤＮＡフラグメント合成のためのデオキシヌクレオシドのβ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジアルキルアミノ−／Ｎ−モルフォリノホスホアミダイトの使用」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１２、４５９３〜４５５７：Ｇｉｌｅｓ，Ｊ．Ｗ．、１９８５、「自動化ＤＮＡ合成の進歩」、Ａｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、Ｎｏｖ．／Ｄｅｃ．）を使用して、オリゴヌクレオチドを合成する。
【００４７】
形質転換効率について試験すべきライゲーションＤＮＡまたはＤＮＡを使用して、以下の株を適切に形質転換する：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５α（Ｆ／ｅｎｄＡ１，ｈｓｄＲ１７、ｓｕｐＥ４４、ｔｈｉ−１、ｒｅｃＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１、Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｑＦ）Ｕ１６９，ｄｅｏＲ、Φ８０ｄｌａｃ（ｌａｃＺΔＭ１５））（任意のＣｏｌＥ１プラスミド用）；またはＥ．ｃｏｌｉＸＡＣ−ｐｉｒ（任意のｐＣｏｒ由来のプラスミド用）。
【００４８】
プラスミドＤＮＡのミニ調製物を、Ｋｌｅｉｎら、１９８０のプロトコールにしたがって作製する。
【００４９】
Ｅ．ｃｏｌｉ株の増殖にＬＢ培養培地を使用する（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２）。株を、３７℃でインキュベートする。細菌を、適切な抗生物質を補足したＬＢ培地のディッシュ上にプレートする。
【００５０】
実施例１
１．１．カラムの調製
装置
使用カラムは、ペリスタリックポンプ（出力＜１ｍｌ／分）に接続したＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で活性化した１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐカラムである。使用する特異的オリゴヌクレオチドは５’末端にＮＨ２基を有し、その配列は以下である：
５’−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３’（配列番号１）。本実施例で使用する緩衝液は、以下である：
結合緩衝液：０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）
緩衝液Ａ：０．５Ｍエタノールアミン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．３）
緩衝液Ｂ：０．１Ｍ酢酸、０．５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ４）。
【００５１】
方法：
カラムを６ｍｌの１ｍＭ  ＨＣｌで洗浄し、結合緩衝液中で希釈したオリゴヌクレオチド（１ｍｌ中５０ｎｍｏｌ）をカラムに供し、室温で３０分間放置する。カラムを６ｍｌの緩衝液Ａ、その後６ｍｌの緩衝液Ｂで連続して３回洗浄する。したがって、オリゴヌクレオチドはＣＯＮＨ結合によりカラムに共有結合する。カラムを０．１％ＮａＮ３のＰＢＳ溶液にて４℃で保存し、少なくとも４回使用することができる。
【００５２】
１．２．プラスミドの構築
以下の２つのオリゴヌクレオチドを合成した。
【００５３】
オリゴヌクレオチド４８１７：
５’−ＧＡＴＣＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧ−３’（配列番号９）オリゴヌクレオチド４８１８：
５’−ＡＡＴＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＧ−３’（配列番号１０）
ハイブリッド形成してプラスミドにクローン化する場合、これらのオリゴヌクレオチドを上記の対応するプラスミドにホモプリン−ホモピリミジン配列（ＧＡＡ）１７（配列番号３３）を移入する。
【００５４】
これら２つのハイブリッド形成オリゴヌクレオチドに対応する配列を、アンピシリン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＢＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）のマルチクローニング部位にクローン化した。このために、オリゴヌクレオチドを以下の様式でハイブリッド形成した：１μｇのこれら２つのオリゴヌクレオチドを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む４０ｍｌの最終緩衝液に共に入れた。この混合物を９５℃に加熱し、ゆっくりと温度が低下するように室温に置いた。１０ｎｇのハイブリッド形成オリゴヌクレオチド混合物を、最終的に３０μｌのＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した２００ｎｇのプラスミドｐＢＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）でライゲートした。ライゲーション後、アリコートをＤＨ５ａに形質転換した。形質転換混合物を、アンピシリン（５０ｍｇ／ｌ）およびＸ−ｇａｌ（２０ｍｇ／ｌ）を補足したＬ培地にプレートした。組換えクローンは、Ｅ．ｃｏｌｉのβガラクトシダーゼのフラグメントωがα相補性を示す親プラスミド（ｐＢＫＳ＋）と対照的にこの培地上の青色を脱色する。６クローンからのプラスミドＤＮＡの微量調製後、これらは全てｐＢＫＳ＋のＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ部位との間に存在するＰｓｔＩ部位が消滅し、マルチクローニング部位を含む４４８ｄｂｐのＰｖｕＩＩバンドの分子量が増加した。１つのクローンを選択し、対応するプラスミドをｐＸＬ２５６３と名づけた。クローン化配列を、プラスミドｐＢＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）についてプライマー−２０（５’−ＴＧＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＴＧ−３’（配列番号１１））（Ｖｉｅｒａ  Ｊ．ａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄｓｓｉｎｇ、１９８２、「ｐＵＣプラスミド：挿入変異誘発および合成普遍プライマーを使用した配列決定用のＭ１３ｍｐ７由来の系」、Ｇｅｎｅ、１９、２５９〜２６８）を使用した配列決定によって確認した。プラスミドｐＸＬ２５６３を、供給者の説明にしたがってＷｉｚａｒｄ  Ｍｅｇａｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により精製した。このプラスミドＤＮＡ調製物を、その後下記の実施例で使用した。
【００５５】
１．３．プラスミド精製
装置：
プラスミドｐＸＬ２５６３（１．２に記載）を、プラスミドｐＢＫＳ＋も含む溶液から１．１．に記載のオリゴヌクレオチドに結合したＨｉＴｒａｐカラムで精製した。この精製で使用した緩衝液は以下である：
緩衝液Ｆ：２Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍ酢酸（ｐＨ４．５）
緩衝液Ｅ：１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ。
【００５６】
方法：
カラムを６ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄し、プラスミド（２０μｇのｐＸＬ２５６３および２０μｇのｐＢＫＳ＋の４００μｌ緩衝液Ｆ溶液）をカラムに供し、室温で２時間インキュベートした。カラムを１０ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄し、その後乾燥液Ｆで溶出する。１時間の１％アガロースゲルでの電気泳動および臭化エチジウム染色後にプラスミドが検出される。溶液中のプラスミドの割合を、Ｅ．ｃｏｌｉに対するその形質転換活性の測定によって評価する。
【００５７】
結果：
３０％のｐＸＬ２５６３および７０％のｐＢＫＳ＋を含む混合物から開始して、１００％のｐＸＬ２５６３を含む溶液をカラム溶出口で回収する。２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでのＯＤ比によって評価した純度は１．９から２．５に上昇し、この方法により汚染タンパク質が除去されたことを示す。
【００５８】
実施例２
２．１．−本実施例は、プラスミドＤＮＡ精製実験を示す。カラムへのオリゴヌクレオチド（５’−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３’（配列番号１））の結合を、実施例１に記載のように行う。結合のために、オリゴヌクレオチドを５’末端で６個の炭素原子を含むアームによってスペーサーのリン酸に結合したアミン基で改変する（改変オリゴヌクレオチド、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  ＳＡ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）。プラスミドｐＸＬ２５６３を、供給者の説明にしたがってＷｉｚａｒｄ  Ｍｅｇａｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）により精製した。本実施例で使用した緩衝液は以下である：
緩衝液Ｆ：０から２Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍ酢酸（ｐＨ４．５から５）
緩衝液Ｅ：１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ。
【００５９】
カラムを６ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄し、その後４００μｌの緩衝液Ｆで希釈した１００μｇのプラスミドｐＸＬ２５６３をカラムに供し、室温で２時間インキュベートする。カラムを１００ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄し、緩衝液Ｅを使用して溶出する。プラスミドを、２６０ｎｍでの光学密度の測定によって定量する。
【００６０】
本実施例では、ＮａＣｌのモル濃度が０から２Ｍに変化する緩衝液（緩衝液Ｆ）中で結合させる。ＮａＣｌのモル濃度が減少した場合、精製収率は減少する。結合緩衝液のｐＨは、４．５から５に変化し得るが、精製収率は４．５でより高くなる。塩基性ｐＨの別の溶出緩衝液を使用することができる：したがって、５０ｍＭホウ酸（ｐＨ９）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液を使用して溶出液を使用した。
【００６１】
２．２．−オリゴヌクレオチドの結合
カラムへの（５’−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３’（配列番号１））の結合を実施例１に記載のように行う。プラスミドｐＸＬ２５６３を、供給者の説明にしたがってＷｉｚａｒｄ  Ｍｅｇａｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して精製した。本実施例で使用した緩衝液は以下である：
緩衝液Ｆ：０．１Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍ酢酸（ｐＨ５）
緩衝液Ｅ：１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ。
【００６２】
カラムを６ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄し、その後４００μｌの緩衝液Ｆで希釈した１００μｇのプラスミドｐＸＬ２５６３をカラムに供し、室温で１時間インキュベートする。カラムを１０ｍｌの緩衝液Ｆで洗浄し、緩衝液Ｅを使用して溶出する。オリゴヌクレオチドカラムの通過前後のプラスミドサンプル中に存在するゲノムまたは染色体Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡの含有量を測定する。このゲノムＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｇａｌＫ遺伝子中のプライマーを使用したＰＣＲによって定量する。以下のプロトコールに従い、これらのプライマーの配列は、Ｄｅｂｏｕｃｋら（Ｎｕｃｌｅｉｄ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、１９８５、１３、１８４１から１８５３）に記載されている（５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＴＧＧＧＧＡＣＣＡＡＡＧＣＡＧＴＴＴＣ−３’（配列番号２４）および５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＴＧＴＴＣＡＣＧＡＣＧＧＧＴＧＴ−３’（配列番号２５））。反応溶液は、２５μｌのＰＣＲ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｆｒａｎｃｅ、Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ）中に２５μｌのＰＣＲ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｆｒａｎｃｅ、Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒｅｓ）：１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；０．２ｍＭ  ｄＸＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｏｒｓａｙ）；０．５μＭプライマー；２０Ｕ／ｍｌ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む。以下の順序で反応を行う：
−９５℃で５分間
−９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、７８℃で１分間を３０サイクル、
−７８℃で１０分間。
【００６３】
１２４塩基対長の増幅ＤＮＡフラグメントを、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＵＳＡ）の存在下での３％アガロースゲルでの電気泳動によって分離し、Ｅ．ｃｏｌｉＢ株（Ｓｉｇｍａ、ｒｅｆＤ４８８９）由来のＵｌｔｒａｐｕｒＤＮＡシリーズとの基準化によって定量する。
【００６４】
カラムに供したサンプル中に１％の染色体ＤＮＡが存在し、オリゴヌクレオチドカラムで精製されたサンプル中に０．２％存在する。
【００６５】
実施例３．透明溶解物での実験
本実施例は、いわゆる「ミニプレップ」スケールでの細菌培養物の透明溶解物からのプラスミドＤＮＡ精製を記載する：プラスミドｐＸＬ２５６３を含むＤＨ５α株の１．５ｍｌの一晩培養物を遠心分離し、ペレットを１００μｌの５０ｍＭグルコース、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中に再懸濁する。２００μｌの０．２Ｍ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳを添加し、チューブを反転して混合し、１５０μｌの３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５）を添加し、チューブを反転して混合する。遠心分離後、上清を回収し、実施例１のようにして得たオリゴヌクレオチドカラムにロードする。結合、洗浄、および溶出は、実施例１と同一である。１．５ｍｌの培養物から約１μｇのプラスミドが回収される。獲得したプラスミドにアガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色を行うと、「スーパーコイル」環状ＤＮＡの１本のバンドの形態をとっている。本方法で精製したプラスミドからは微量の高分子量（染色体）ＤＮＡまたはＲＮＡも検出不可能である。２６０ｎｍと２８０ｎｍとの光学密度の比は、２を超える。
【００６６】
実施例４
４．１：本実施例は、プラスミドｐＸＬ２５６３を含むＤＨ５α株の２０ｍｌの細菌培養から出発する、実施例３と同一の条件下で行ったプラスミドＤＮＡ精製実験を記載する。細胞ペレットを、１．５ｍｌの５０ｍＭグルコース、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中にとる。２ｍｌの０．２Ｍ  ＮａＯＨ、１％ＳＤＳで溶解し、１．５ｍｌの３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５）で中和する。次いで、ＤＮＡを２ｍｌの２−プロパノールで沈殿させ、ペレットを０．５ｍｌの０．２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）、０．１Ｍ  ＮａＣｌにとり、実施例１の方法で得たオリゴヌクレオチドカラムにロードする。洗浄緩衝液のＮａＣｌのモル濃度が０．１Ｍであること以外は実施例１に記載のように、結合、カラムの洗浄、および溶出を行う。約１６μｇのプラスミドが得られる。獲得したプラスミドにアガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色を行うと、「スーパーコイル」環状ＤＮＡの１本のバンドの形態をとっている。精製したプラスミドからは微量の高分子量（染色体）ＤＮＡまたはＲＮＡも検出不可能である。制限酵素でのプラスミド消化により、推定分子量が３キロベースの１本のバンドが得られる。サンプル中のタンパク質濃度は、透明溶解物中の１２５μｇ／ｍｌから精製プラスミド中の１μｇ／ｍｌに減少する（Ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡアッセイ、Ｐｉｅｒｃｅ）。ＬＡＬアッセイ（Ｂｉｏｓｅｐｒａ）によって評価した内毒素濃度を、精製プラスミド中の出発透明溶解物に関する１０を超える因子で割る。
【００６７】
４．２：使用プラスミドは、サイトメガロウイルスプロモーター、ルシフェラーゼをコードする遺伝子、およびプラスミドｐＸＬ２５６３起源のホモプリン−ホモピリミジン配列（ＧＡＡ）１７（配列番号３３）を含むカセットを含む。このプラスミドを含む株ＤＨ１（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９）を、７リットルの発酵槽中で培養する。透明溶解物を、２００グラムの細胞から調製する：細胞ペレットを２リットルの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）、５０ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ中にとり、これに２リットルの０．２ＭＮａＯＨ、１％ＳＤＳを添加する。溶解物を１リットルの３Ｍ酢酸カリウムの添加によって中和する。濾過透析後、４ｍｌのこの溶解物を、実施例１．１に記載の方法に従って配列５’−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３’（配列番号１）のオリゴヌクレオチドに結合した５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ−ＮＨＳカラムに供する。洗浄および溶出を実施例１に記載のように行う。約４００μｇのプラスミドが回収される。実施例２．２に記載の技術によって測定したこのサンプル中のゲノムＤＮＡレベルは、０．１％である。
【００６８】
実施例５：改変オリゴヌクレオチドの使用
本実施例は、メチル化シトシンを有するオリゴヌクレオチドの使用を記載する。使用したオリゴヌクレオチド配列は以下である：
５’−ＧＡＧＧＭｅＣＴＴＭｅＣＴＴＭｅＣＴＴＭｅＣＴＴＭｅＣＴＴＭｅＣＴＴＭｅＣＴＴ−３’（配列番号１２）。
【００６９】
本オリゴヌクレオチドは、５’末端にＮＨ２基を有する。ＭｅＣ＝５−メチルシトシン。本オリゴヌクレオチドより、実施例１の条件下にてｐＨ５の結合緩衝液を用いて（これによりプラスミドの分解リスクが軽減される）プラスミドｐＸＬ２５６３を精製することができる。
【００７０】
実施例６
上記の実施例では、使用オリゴヌクレオチドの５’末端を６個の炭素原子を含むアームを介したリン酸塩に結合したアミン基（ＮＨ２−（ＣＨ２）６）で改変する。本実施例では、アミン基を１２個の炭素原子を含むアームを介した５’末端のリン酸塩に結合させる（ＮＨ２−（ＣＨ２）１２）。実施例２に記載のように、緩衝液Ｆ（２Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍ酢酸（ｐＨ４．５））を使用して、オリゴヌクレオチドの結合およびカラムへの通過を行う。本ヌクレオチドによりより高い精製収率を得ることが可能であり（収率５３％）、６個の炭素原子を含むオリゴヌクレオチドを使用するとこの収率は上何時の条件下で４５％台である。
【００７１】
実施例７
実施例１．２に記載のクローニングストラテジーの後、ホモプリン−ホモピリミジン配列を有する以下の別の２つのプラスミドを構築した：配列（ＧＧＡ）１６（配列番号３４）を含むプラスミドｐＸＬ２７２５および配列（ＧＡ）２５（配列番号３５）を含むプラスミドｐＸＬ２７２６。
【００７２】
実施例７．１：プラスミドの構築
プラスミドｐＸＬ２７２５およびｐＸＬ２７２６（プラスミドｐＸＬ２５６３のアナログ）を、以下のオリゴヌクレオチド対を使用し、実施例１．２に記載のクローニングストラテジーにしたがって構築した。
【００７３】
５９８６：５’−ＧＡＴＣＣ（ＧＡ）２５ＧＧＧ−３’（配列番号１３）
５９８７：５’−ＡＡＴＴＣＣＣ（ＴＣ）２５Ｇ−３’（配列番号１４）
５９８１：５’−ＧＡＴＣＣ（ＧＧＡ）１７ＧＧ−３’（配列番号１５）
５９８２：５’−ＡＡＴＴ（ＣＣＴ）１７ＣＣＧ−３’（配列番号１６）
オリゴヌクレオチド対５９８６および５９８７を使用して、ｐＢＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位でのオリゴヌクレオチドクローニングによりプラスミドｐＸＬ２７２６を構築し、オリゴヌクレオチド５９８１および５９８２をプラスミドｐＸＬ２７２５の構築に使用した。プラスミドｐＸＬ２５６３構築と同一の実験条件を使用したが、オリゴヌクレオチド対のみ変更した。同様に、クローン化配列を、プラスミドの配列決定によって評価した。これにより、プラスミドｐＸＬ２７２５は予想される配列に関して改変されていると認めることができる：配列ＧＧＡの繰り返しが１７回である代わりに、ＧＧＡ（ＧＧＡ）１５（配列番号１７）が存在する。
【００７４】
実施例７．２：カラムの調製および精製
これらのホモプリン配列と三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを、実施例１．１に記載の技術にしたがってＨｉＴｒａｐカラムに結合させた。配列５’−ＡＴＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴ−３’（配列番号１８）のオリゴヌクレオチドをプラスミドｐＸＬ２７２５の精製に使用し、配列５’−ＡＧＴＧＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴ−３’（配列番号１９）のオリゴヌクレオチドをプラスミドｐＸＬ２７２６の精製に使用した。
【００７５】
これにより得られた２つのカラムにより、以下の緩衝液を使用し、実施例２に記載の技術にしたがって対応するプラスミドを精製することができた。
【００７６】
緩衝液Ｆ：２Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍ酢酸（ｐＨ４．５）
緩衝液Ｅ：１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ
得られた収率は、ｐＸＬ２７２５およびｐＸＬ２７２６でそれぞれ２３％および３１％である。
【００７７】
実施例８
本実施例は、精製収率に対するプラスミド中に存在する特異的配列の長さの影響を例示する。
【００７８】
実施例８．１：プラスミドの構築
本発明の組成物の活性を同定するためにこれらの実施例で使用するレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子（Ｌｕｃ）である。
【００７９】
プラスミドｐＸＬ２６２１は、制限酵素ＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの切断によってｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から抽出した６６１ｂｐのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位でベクターｐＧＬ基本ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にルシフェラーゼをコードする遺伝子のクローン化した上流を含むカセットを含む。本プラスミドを、分子生物学の標準的技術を使用して構築した。
【００８０】
プラスミドｐＸＬ２７２７−１およびｐＸＬ２７２７−２を、以下の様式で構築した。
【００８１】
２μｇのプラスミドｐＸＬ２６２１を、ＢａｍＨＩで線状化した；酵素を６５℃で１０分間の処理で不活化した；同時にオリゴヌクレオチド６００６および６００８をプラスミドｐＸＬ２５６３の構築で記載のようにハイブリッド形成させた。
【００８２】
６００６：５’−ＧＡＴＣＴ（ＧＡＡ）１７ＣＴＧＣＡＧＡＴＣＴ−３’（配列番号２０）
６００８：５’−ＧＡＴＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＧ（ＴＴＣ）１７Ａ−３’（配列番号２１）
【００８３】
このハイブリッド形成混合物を、プラスミドのｐＸＬ２６２１のＢａｍＨＩ末端でクローン化し、ＤＨ５αへの形質転換後、オリゴヌクレオチドにＰｓｔＩ部位が移入されているので組換えクローンをＰｓｔＩ酵素制限分析によって同定した。２つのクローンを選択し、クローン化フラグメントのヌクレオチド配列を、配列決定反応プライマーとしてプライマー（６２８２、５’−ＡＣＡＧＴＣＡＴＡＡＧＴＧＣＧＧＣＧＡＣＧ−３’（配列番号２２））を使用して確認した（Ｖｉｅｒａ  Ｊ．ａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄｓｓｉｎｇ、１９８２、「ｐＵＣプラスミド：挿入変異誘発および合成普遍プライマーを使用した配列決定用のＭ１３ｍｐ７由来の系」、Ｇｅｎｅ、１９、２５９〜２６８）。
【００８４】
第１のクローン（ｐＸＬ２７２７−１）は、ＧＡＡ１０回繰り返し配列を含む。第２のクローン（ｐＸＬ２７２７−２）は、配列５’−ＧＡＡＧＡＡＧＡＧ（ＧＡＡ）７ＧＧＡＡＧＡＧＡＡ−３’（配列番号２３）を含む。
【００８５】
実施例８．２：カラムの調製および精製
カラム（実施例１に記載のカラムおよびオリゴヌクレオチド５’−ＧＡＧＧＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴ−３’（配列番号１）に結合したカラムなど）を使用する。
【００８６】
プラスミドｐＸＬ２７２７−１は、配列ＧＡＡの１４回反復を含む。したがって、対応するヒアブリッド形成配列ＣＴＴを７回だけ反復する上記のオリゴヌクレオチドは、８つの異なる部位でプラスミドとハイブリッド結合することができる。それに対して、プラスミドｐＸＬ２７２７−２は、カラムに結合したオリゴヌクレオチドと同一の長さのハイブリッド形成配列（ＧＡＡ）７（配列番号７）を有する。したがって、このオリゴヌクレオチドは、ｐＸＬ２７２７−２上のたった１つの部位でハイブリッド形成することができる。
【００８７】
実験は、以下の緩衝液を使用し、実施例２と同一である。
【００８８】
緩衝液Ｆ：２Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍ酢酸（ｐＨ４．５）
緩衝液Ｅ：１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ
精製収率は、プラスミドｐＸＬ２７２７−１で２９％、ｐＸＬ２７２７−２で１９％である。
【００８９】
実施例８．３：哺乳動物細胞のインビトロトランスフェクション
使用細胞は、実験の前日に５０，０００細胞／ウェルを基本として２４ウェル培養プレートに接種したＮＩＨ３Ｔ３細胞である。プラスミドを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に希釈し、リポフェクタントＲＰＲ１１５３３５と混合する。リポフェクタント正電荷／ＤＮＡ負電荷比６を使用する。混合物をボルテックスし、室温で１０分間静置し、ウシ胎児血清を含まない培地中で希釈し、１μｇＤＮＡ／培養ウェルの比率で細胞に添加する。３７℃で２時間後、１０％体積／体積のウシ胎児血清を添加し、細胞を５％ＣＯ２の存在下、３７℃で４８時間インキュベートする。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、記載のプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａキット、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にしたがって、ＬｕｍａｔＬＢ９５０１照度計（ＥＧ  ａｎｄ  Ｇ  Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｅｖｒｙ）にて測定する。実施例８．２に記載のように精製したプラスミドｐＸＬ２７２７−１のトランスフェクション収率は、Ｗｉｚａｒｄ  Ｍｅｇａｐｒｅｐキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して精製した同一のプラスミドを使用して得た収率の２倍である。
【００９０】
実施例９：ｐＣＯＲ由来プラスミドの精製
以下の実施例は、三重らせん親和性クロマトグラフィーを使用したｐＣＯＲ由来プラスミドの精製を示す。この技術は、従来のクロマトグラフィー法で達成されなかったレベルまで核酸汚染物質（特に、宿主のゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ）を取り除くことが認められた。
【００９１】
トリプレックス親和性ゲルを、クロマトグラフィーマトリクスとしてＳｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１０００ＳＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して合成した。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１０００を、最初にｍ−過ヨウ素酸ナトリウムの０．２Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．７）（３ｍＭ、室温、１時間）で活性化した。次いで、オリゴヌクレオチドを、タンパク質の結合について以前に記載のように（Ｈｏｒｎｓｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８６、９３、８３〜８８）、その５’−ＮＨ２末端部分を介して活性化マトリクスのアルデヒド基に結合させた。これらの実験に使用したホモピリミジンオリゴヌクレオチド（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、ＨＰＬＣ精製）は、ｐＣＯＲプラスミドの複製起点（ｏｒｉγ）中に存在する短い１４量体のホモプリン配列（５’−ＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡ−３’（配列番号２９））に相補的な配列を有していた（Ｓｏｕｂｒｉｅｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９９、６、１４８２〜１４８８）。上記で考察するように、ホモピリミジンオリゴヌクレオチド配列は、５’−ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴ−３’（配列番号３０）である。
【００９２】
以下のプラスミドをクロマトグラフ分析を行った：ｐＸＬ３２９６（導入遺伝子を含まないｐＣＯＲ、２．０ｋｐｂ）、ｐＸＬ３１７９（ｐＣＯＲ−ＦＧＦ、２．４ｋｐｂ）、ｐＸＬ３５７９（ｐＣＯＲ−ＶＥＧＦＢ、２．５ｋｂｐ）、ｐＸＬ３６７８（ｐＣＯＲ−ＡＦＰ、３．７ｋｂｐ）、ｐＸＬ３２２７（ｐＣＯＲ−ｌａｃＺ５．４ｋｂｐ）およびｐＸＬ３３９７（ｐＣＯＲ−Ｂ欠失ＦＶＩＩＩ、６．６ｋｂｐ）。これら全てのプラスミドを、２つの陰イオン交換クロマトグラフィー工程によって実施例４に記載のようにして得た透明溶解物から精製した。ＣｓＣｌでの超遠心分離法によって精製したプラスミドｐＢＫＳ＋（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋）（ＣｏｌＥ１由来のプラスミド）も研究した。使用した全てのプラスミドのトポロジー状態はスーパーコイル（＞９５％）であった。
【００９３】
各プラスミドＤＮＡ精製実験では、３００μｇのプラスミドＤＮＡの６ｍｌの２Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．０）溶液を、上記のオリゴヌクレオチド５’−ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴ−３’（配列番号３０）を含む親和性カラムに流速３０ｃｍ／時でロードした。５体積の同一の緩衝液でのカラム洗浄後、結合したプラスミドを、１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ９．０）で溶出し、ＵＶ（２６０ｎｍ）で定量し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｇｅｎ−Ｐａｋカラムでのイオン交換クロマトグラフィーを行った（Ｍａｒｑｕｅｔら、ＢｉｏＰｈａｒｍ、１９９５、８、２６〜３７）。回収した画分中のプラスミド回収率は、ｐＸＬ３２９６で２０７μｇ、ｐＸＬ３１７９で１９６μｇ、ｐＸＬ３５７９で１９２μｇ、ｐＸＬ３６７８で１３９μｇ、ｐＸＬ３２２７で９７μｇ、およびｐＸＬ３３９７で７９μｇであった。
【００９４】
ｐＢＫＳをこのカラムでクロマトグラフ分析した場合、プラスミド結合は検出不可能であった。これは、オリゴヌクレオチド５’−ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴ−３’（配列番号３０）によりｐＣＯＲ（ｏｒｉγ）中に存在する相補的１４量体配列５’−ＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡ−３’（配列番号２９）と安定なトリプレックス構造が得られるが、ｐＢＫＳ中に存在するより密接に関連する配列では得られないことを示す。これは、１つの非標準的三要素（この場合Ｔ＊ＧＣ）の移入により、トリプレックス構造が完全に不安定化することを示す。
【００９５】
コントロールとして、ｐＸＬ３１７９を非常に類似するがオリゴヌクレオチドを使用しない条件下で合成したブランクカラムでクロマトグラフ分析を行った場合、プラスミド結合は認められなかった（＜１μｇ）。
【００９６】
本明細書中に報告した条件下でのこの親和性精製カラムの操作により、Ｄ宿主ゲノムＤＮＡによる汚染レベルは、ｐＸＬ３２９６の調製物では２．６％から０．０７％に減少した。同様に、サンプルを同一の親和性カラムでクロマトグラフ分析を行った場合、宿主ＤＮＡによる汚染レベルは、ｐＸＬ３１７９の調製物では０．５％から０．００８％に減少した。さらに、ＲＮＡによる汚染レベルは、この親和性精製カラムの使用によって、ｐＸＬ３１７９の調製物ではＲＮＡは４３％から０．２％に非常に減少した。
【００９７】
さらに、親和性カラムのオリゴヌクレオチド５’−ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴ−３’（配列番号３０）をオリゴヌクレオチド５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴ−３’（配列番号３１）に置換した場合、プラスミドＸＬ３５７９回収率は、８％未満であった。配列番号３１に記載のオリゴヌクレオチドはｐＸＬ３５７９内のＶＥＧＦＢ配列の一部（すなわち、ＡＴＧに関するヌクレオチド３７９〜３８９）と相補的であるが、有意なトリプレックス親和性は得られない。これは、この親和性精製には、非無作為ホモプリン−ホモピリミジンＤＮＡ配列が必要であることを示す。
【００９８】
実施例１０：ＣｏｌＥ１由来プラスミドの精製
以下の実施例は、三重らせん親和性クロマトグラフィーを使用したＣｏｌＥ１由来のプラスミドの精製を示す。この技術は、従来のクロマトグラフィー法で達成されなかったレベルまで核酸汚染物質（特に、宿主のゲノムＤＮＡおよびＲＮＡ）を取り除くことが認められた。
【００９９】
トリプレックス親和性ゲルを、実施例９に記載のように過ヨウ素酸塩酸化Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１０００ＳＦへの配列５’−ＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴ−３’（配列番号２８）を有するオリゴヌクレオチドの結合によって合成した。
【０１００】
プラスミドｐＸＬ３２９６（導入遺伝子を含まないｐＣＯＲ）およびｐＢＫＳ（ＣｏｌＥ１由来プラスミド）を、実施例９に記載の条件下でオリゴヌクレオチド５’−ＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴ−３’（配列番号２８）を含む１ｍｌカラムでクロマトグラフ分析を行った。回収した画分中のプラスミド回収率は、ｐＢＫＳでは１７５μｇであり、ｐＸＬ３２９６では１μｇ未満であった。これは、オリゴヌクレオチド５’−ＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴ−３’（配列番号２８）はｐＢＫＳ中に存在する相補的１２量体配列（５’−ＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡ−３’（配列番号２７））と安定なトリプレックス構造が得られるが、非常に密接に関連する１２量体配列（５’−ＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡ−３’（配列番号３２））では得られないことを示す。これは、１つの非標準的三要素（この場合Ｃ＊ＡＴ）の移入により、トリプレックス構造が完全に不安定化することを示す。
【０１０１】
実施例１１：二重精製法
以下の実施例は、三重らせん親和性クロマトグラフィーを使用したｐＢＳＫなどの別のスーパーコイル二本鎖分子を含む混合物中のｐＸＬ３２９６などのスーパーコイル二本鎖ＤＮＡ分子の精製を示す。両方の二本鎖ＤＮＡ分子は類似のサイズを有し得るが、各ＤＮＡ分子は異なる標的配列と三重らせんを形成することができる固有の配列を含む。先に考察したように、ｐＸＬ３２９６などの分子は配列５’−ＡＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡ−３’（配列番号２９）を含むが、配列５’−ＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡ−３’（配列番号２７）を含まない。これに対して、ｐＢＳＫなどの分子は配列番号２７を含むが、配列番号２９を含まない。
【０１０２】
第１の工程では、ｐＸＬ３２９６およびｐＢＳＫを含む混合物を、実施例１０に記載のカラムなどのオリゴヌクレオチド５’−ＴＣＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴ−３’（配列番号２８）を含む第１の親和性カラムにロードした。溶液を、非結合ＤＮＡ分子を含む第１のカラムを通過させた。第２の工程では、第１の工程由来の非結合ＤＮＡ分子を、実施例９に記載のカラムなどのオリゴヌクレオチド５’−ＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴ−３’（配列番号３０）を含む第２の親和性カラムにロードした。次いで、実施例９に記載のように、第２のカラムを洗浄して結合分子を溶出した。第２のカラムからｐＸＬ３２９６分子のみが溶出された。ｐＢＳＫ分子は、第２のカラム由来の溶出物（すなわち、カラムから溶出された溶液）中に検出されなかった。
【配列表】
0004803945.tif 000002
0004803945.tif 000003
0004803945.tif 000004
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