(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミド結合を形成する方法であって、該方法は、アミド結合を形成するために、ホスフィノチオエステルをアジドと反応させ、次いで結合された反応物を加水分解する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記ホスフィノチオエステルが活性カルボン酸誘導体とホスフィノチオールとの反応によって形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応が加水分解を容易にするのに十分な水の存在下で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記反応が水性有機媒質中で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記反応がＴＨＦおよび水の混合物中で実行される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ホスフィノチオールがｏ−（ジフェニルホスフィノ）−ベンゼンチオールである、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ホスフィノチオールが（ジフェニルホスフィノ）−メタンチオールである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
ペプチドが形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質が形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ホスフィノチオエステルがアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質のホスフィノチオエステルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アジドがアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質のアジドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ホスフィノチオエステルまたは前記アジドのうちの少なくとも１つがβ−アミノ酸のホスフィノチオエステルまたはアジドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ホスフィノチオエステルまたは前記アジドのうちの少なくとも１つが求電子側鎖基を有するアミノ酸のホスフィノチオエステルまたはアジドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記ホスフィノチオールが以下の式：
【化１】
0004694085.tif 000029
ここで、ｎおよびｍは０または１〜３に等しい整数であり、かつｎ＋ｍ=０〜４であり；点線は、二重結合が存在してもよいか、または該結合が芳香族基の一部であってもよいことを示し、ここで、示されるように、炭素間に二重結合が存在するか、または該結合が芳香環の一部である場合には、Ｒ４、Ｒ６およびＲ８は存在しない；
Ｒ１およびＲ２は、非置換であるかまたはハロゲン化基、ＯＨ基、ＯＲ基、ＣＯＨ基、ＣＯＲ基、ＣＯＯＨ基、ＣＯＯＲ基、またはＮ（Ｒ’）２基で置換される脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基から、独立して選択される基であり、ここでＲは、他のＲとは独立して、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そして各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、ＲおよびＲ’は非置換であるかまたはハロゲン化基、ＯＨ基、ＯＲ基、ＣＯＨ基、ＣＯＲ基、ＣＯＯＨ基、ＣＯＯＲ基、またはＮ（Ｒ’）２基で置換され、ここでＲは、他のＲとは独立して、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そして各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；そしてここでＲ１およびＲ２において、１つ以上の隣接しないＣＨ２基はＯ、Ｓ、ＣＯ、ＣＯＯ、またはＣＯＮＲ’で置き換えられ得；そして
Ｒ３〜Ｒ８は、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基から、独立して選択され、これらの基は、非置換であるかまたはハロゲン化基、ＯＨ基、ＯＲ基、ＣＯＨ基、ＣＯＲ基、ＣＯＯＨ基、ＣＯＯＲ基、またはＮ（Ｒ’）２基で置換され、ここでＲは、他のＲとは独立して、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そして各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、ここでＲ３〜Ｒ８において、１つ以上の隣接しないＣＨ２基はＯ基、Ｓ基、ＣＯ基、ＣＯＯ基、またはＣＯＮＲ’’基で置き換えられ得、ここで各Ｒ’’は、他のＲ’’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、または芳香族基であり、これらの基は非置換であるかまたはハロゲン化基、ＯＨ基、ＯＲ基、ＣＯＨ基、ＣＯＲ基、ＣＯＯＨ基、ＣＯＯＲ基、またはＮ（Ｒ’）２基で置換され、ここでＲは、他のＲとは独立して、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そして各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そしてここで、Ｒ１およびＲ２は共有結合的に連結されて、二環式基を含む環式基を形成し得るか、または、Ｒ３〜Ｒ８のうちの２つ以上は共有結合的に連結されて、二環式基を含む環式基を形成し得る、式、
を有する、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法であって、ここで、前記ホスフィノチオールが以下の式：
【化２】
0004694085.tif 000030
ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立して、非置換であるかまたはハロゲン化基、ＯＨ基、ＯＲ基、ＣＯＨ基、ＣＯＲ基、ＣＯＯＨ基、ＣＯＯＲ基、またはＮ（Ｒ’）２基で置換される脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基から選択される基であり、ここでＲは、他のＲとは独立して、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そして各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、ＲおよびＲ’は非置換であるかまたはハロゲン化基、ＯＨ基、ＯＲ基、ＣＯＨ基、ＣＯＲ基、ＣＯＯＨ基、ＣＯＯＲ基、またはＮ（Ｒ’）２基で置換され、ここでＲは、他のＲとは独立して、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そして各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；そしてここでＲ１およびＲ２において、１つ以上の隣接しないＣＨ２基はＯ、Ｓ、ＣＯ、ＣＯＯ、またはＣＯＮＲ’で置き換えられ得；そして
Ｒ３〜Ｒ４は、独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基から選択される基であり、これらの基は非置換であるかまたはハロゲン化基、ＯＨ基、ＯＲ基、ＣＯＨ基、ＣＯＲ基、ＣＯＯＨ基、ＣＯＯＲ基、またはＮ（Ｒ’）２基で置換され、ここでＲは、他のＲとは独立して、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そして各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、Ｒ３〜Ｒ４において、１つ以上の隣接しないＣＨ２基はＯ基、Ｓ基、ＣＯ基、ＣＯＯ基、またはＣＯＮＲ’’基で置き換えられ得；ここで各Ｒ’’は、他のＲ’’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、または芳香族基であり、これらの基は非置換であるかまたはハロゲン化基、ＯＨ基、ＯＲ基、ＣＯＨ基、ＣＯＲ基、ＣＯＯＨ基、ＣＯＯＲ基、またはＮ（Ｒ’）２基で置換され、ここでＲは、他のＲとは独立して、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そして各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そしてここで、Ｒ１およびＲ２は共有結合的に連結されて、二環式基を含む環式基を形成し得るか、または、Ｒ３〜Ｒ4のうちの２つ以上は共有結合的に連結されて、二環式基を含む環式基を形成し得る、式、
を有する、方法。
【請求項１６】
前記ホスフィノチオールにおいて、Ｒ３およびＲ４はどちらも水素であり、そしてＲ１およびＲ２がフェニル基または置換フェニル基から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ホスフィノチオールのＲ１およびＲ２基がｎ−ブチル基である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ホスフィノチオールのＲ１およびＲ２基がポリエーテルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ホスフィノチオールのＲ１およびＲ２基のうちの少なくとも１つが、以下の式：
【化３】
0004694085.tif 000031
ここで、ｐは０または１〜１０の範囲の整数であり、そしてＲは水素またはアルキル基である、式、
を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ホスフィノチオールが以下の式：
【化４】
0004694085.tif 000032
ここで、ｎおよびｍは０または１であり、そしてＸ１〜Ｘ４は芳香族基上の置換基であり、そのうちの２つは共有結合的に連結されて、脂環式または芳香族の環を形成し得、Ｘ１〜Ｘ４は、脂肪族、脂環式、芳香族基、ハロゲン化基、ＯＨ基、ＯＲ基、ＣＯＲ基、ＣＯＯＨ基、またはＣＯＯＲ基であり、ここで、Ｒは脂肪族、脂環式または芳香族、またはＮ（Ｒ’）２基であり、ここで、各Ｒ’は他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、または芳香族基であり、その全ては、非置換であるかまたは置換されている、式、
を有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
Ｒ１およびＲ２がフェニル基または置換フェニル基である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｒ１およびＲ２が電子供与基または電子吸引基で置換されたフェニル基である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ペプチドまたはタンパク質の合成方法であって、ここで該方法は、該ペプチドまたはタンパク質のアミド結合のうちの少なくとも１つが、請求項１に記載の方法によって形成される、方法。
【請求項２４】
固相ペプチド合成で形成された２つのペプチドが前記アミド結合の形成によってライゲーションされる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
組換えＤＮＡ発現法で形成された２つのペプチドまたはタンパク質が前記アミド結合の形成によってライゲーションされる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
固相ペプチド合成により形成されたペプチドまたはタンパク質が前記アミド結合の形成によって、組換えＤＮＡ発現法で形成されたペプチドまたはタンパク質へライゲーションされる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
ペプチドがアミノ酸の間にアミド結合を形成する連続的な一連のライゲーションによって形成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１に記載のライゲーション工程を包含する、ペプチドまたはタンパク質をレポータ分子で標識するための方法。
【請求項２９】
以下の式：
【化５】
0004694085.tif 000033
ここで、ｎおよびｍは０または１〜３に等しい整数であり、かつｎ＋ｍ=０〜４であり；点線は、二重結合が存在してもよいか、または該結合が芳香族基の一部であってもよいことを示し、ここで示されるように、炭素間に二重結合が存在するか、または該結合が芳香環の一部である場合には、Ｒ４、Ｒ６およびＲ８は存在しない；
Ｒ１およびＲ２は、非置換であるかまたはハロゲン化基、ＯＨ基、ＯＲ基、ＣＯＨ基、ＣＯＲ基、ＣＯＯＨ基、ＣＯＯＲ基、またはＮ（Ｒ’）２基で置換される脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基から、独立して選択される基であり、ここでＲは、他のＲとは独立して、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そして各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、ＲおよびＲ’は、非置換であるかまたはハロゲン化基、ＯＨ基、ＯＲ基、ＣＯＨ基、ＣＯＲ基、ＣＯＯＨ基、ＣＯＯＲ基、またはＮ（Ｒ’）２基で置換され、ここでＲは、他のＲとは独立して、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そして各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；Ｒ１およびＲ２において、１つ以上の隣接しないＣＨ２基はＯ、Ｓ、ＣＯ、ＣＯＯ、またはＣＯＮＲ’で置き換えられ得：そして、
Ｒ３〜Ｒ８は、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基から、独立して選択され、これらの基は、非置換であるかまたはハロゲン化基、ＯＨ基、ＯＲ基、ＣＯＨ基、ＣＯＲ基、ＣＯＯＨ基、ＣＯＯＲ基、またはＮ（Ｒ’）２基で置換され、ここでＲは、他のＲとは独立して、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そして各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、Ｒ３〜Ｒ８において、１つ以上の隣接しないＣＨ２基はＯ基、Ｓ基、ＣＯ基、ＣＯＯ基、またはＣＯＮＲ’’基で置き換えられ得、ここで各Ｒ’’は、他のＲ’’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、または芳香族基であり、これらの基は、非置換であるかまたはハロゲン化基、ＯＨ基、ＯＲ基、ＣＯＨ基、ＣＯＲ基、ＣＯＯＨ基、ＣＯＯＲ基、またはＮ（Ｒ’）２基で置換され、ここでＲは、他のＲとは独立して、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そして各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、Ｒ３〜Ｒ８のうちの２つ以上は共有結合的に連結されて、二環式基を含む環式基を形成し得；そしてここで該試薬がｏ−（ジフェニルホスフィノ）−ベンゼンチオールでない、ホスフィノチオール試薬。
【請求項３０】
前記ホスフィノチオールが、以下の式：
【化６】
0004694085.tif 000034
ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立して、非置換であるかまたはハロゲン化基、ＯＨ基、ＯＲ基、ＣＯＨ基、ＣＯＲ基、ＣＯＯＨ基、ＣＯＯＲ基、またはＮ（Ｒ’）２基で置換される脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基から選択される基であり、ここでＲは、他のＲとは独立して、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そして各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、ＲおよびＲ’は、非置換であるかまたはハロゲン化基、ＯＨ基、ＯＲ基、ＣＯＨ基、ＣＯＲ基、ＣＯＯＨ基、ＣＯＯＲ基、またはＮ（Ｒ’）２基で置換され、ここでＲは、他のＲとは独立して、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そして各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり；Ｒ１およびＲ２において、１つ以上の隣接しないＣＨ２基はＯ、Ｓ、ＣＯ、ＣＯＯ、またはＣＯＮＲ’で置き換えられ得；そして、
Ｒ３〜Ｒ４は、独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基から選択される基であり、これらの基は、非置換であるかまたはハロゲン化基、ＯＨ基、ＯＲ基、ＣＯＨ基、ＣＯＲ基、ＣＯＯＨ基、ＣＯＯＲ基、またはＮ（Ｒ’）２基で置換され、ここでＲは、他のＲとは独立して、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そして各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、Ｒ３〜Ｒ４において、１つ以上の隣接しないＣＨ２基はＯ基、Ｓ基、ＣＯ基、ＣＯＯ基、またはＣＯＮＲ’’基で置き換えられ得、ここで各Ｒ’’は、他のＲ’’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、または芳香族基であり、これらの基は、非置換であるかまたはハロゲン化基、ＯＨ基、ＯＲ基、ＣＯＨ基、ＣＯＲ基、ＣＯＯＨ基、ＣＯＯＲ基、またはＮ（Ｒ’）２基で置換され、ここでＲは、他のＲとは独立して、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そして各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、ヘテロ脂環式基、芳香族基またはヘテロ芳香族基であり、そしてここでＲ１およびＲ２、または、Ｒ３〜Ｒ４のうちの２つ以上は共有結合的に連結されて、二環式基を含む環式基を形成し得る、請求項２９に記載の試薬。
【請求項３１】
前記ホスフィノチオールのＲ１基およびＲ２基がｎ−ブチル基である、請求項３０に記載の試薬。
【請求項３２】
前記ホスフィノチオールのＲ１基およびＲ２基がポリエーテルである、請求項２９に記載の試薬。
【請求項３３】
前記ホスフィノチオールのＲ１基およびＲ２基のうちの少なくとも１つが、以下の式：
【化７】
0004694085.tif 000035
ここで、ｐは０または１〜１０の範囲の整数であり、かつＲは水素またはアルキル基である、式、
を有する部分を含む、請求項２９に記載の試薬。
【請求項３４】
前記ホスフィノチオールが、以下の式：
【化８】
0004694085.tif 000036
ここで、ｎおよびｍは０または１であり、そしてＸ１〜Ｘ４は芳香族基上の置換基であり、そのうちの２つは共有結合的に連結されて、脂環式または芳香族の環を形成し得、Ｘ１〜Ｘ４は、脂肪族基、脂環式基、芳香族基、ハロゲン化基、ＯＨ基、ＯＲ基、ＣＯＲ基、ＣＯＯＨ基、またはＣＯＯＲ基であり、ここで、Ｒは脂肪族、脂環式または芳香族であり、またはＮ（Ｒ’）２基であってもよく、ここで、各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族基、脂環式基、または芳香族基であり、その全ては、非置換であるかまたは置換される、
請求項２９に記載の試薬。
【請求項３５】
Ｒ１およびＲ２がフェニル基または置換フェニル基である、請求項３４に記載の試薬。
【請求項３６】
Ｒ１およびＲ２が電子供与基または電子吸引基で置換されたフェニル基である、請求項３４に記載の試薬。
【請求項３７】
ｎおよびｍが両方とも０である、請求項３４に記載の試薬。
【請求項３８】
Ｒ１およびＲ２が両方とも水素である、請求項３４に記載の試薬。
【請求項３９】
Ｒ１およびＲ２が両方ともフェニル基である、請求項３４に記載の試薬。
【請求項４０】
Ｒ１およびＲ２が両方ともｎ−ブチル基である、請求項３４に記載の試薬。
【請求項４１】
（ジフェニルホスフィノ）メタンチオールである、請求項２９に記載の試薬。
【請求項４２】
請求項２９に記載のホスフィノチオール試薬を１つ以上および次のもの：活性カルボン酸誘導体、アジド、アジドを生成するための試薬およびチオエステルを生成するための試薬：の一つ以上を含む、活性カルボン酸誘導体とアジドとの間にアミド結合を形成するためのキット。
【請求項４３】
請求項２９に記載のホスフィノチオール試薬を１つ以上およびアミノ酸側鎖のための１つ以上の保護剤を含む、ペプチドまたはタンパク質の合成用キット。
【請求項４４】
固相合成用の樹脂をさらに含む、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
前記樹脂がセーフティキャッチ樹脂である、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
アジドペプチドを生成するための試薬をさらに含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４７】
チオエステルを生成するための試薬をさらに含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４８】
前記ホスフィノチオエステルが脂質のホスフィノチオエステルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記アジドがアジドペプチドまたはアジドタンパク質である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記アジドがヌクレオシドアジドである、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記ホスフィノチオエステルがペプチドまたはアジドタンパク質のホスフィノチオエステルである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記アミド結合が糖類をペプチドへライゲーションさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
前記アミド結合が脂質をペプチドへライゲーションさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項５４】
前記アミド結合がヌクレオシドをペプチドへライゲーションさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
前記アミド結合が核酸をペプチドへライゲーションさせる、請求項１に記載の方法。
【請求項５６】
前記チオエステルまたは前記アジドが固体表面または支持材料に結合している、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ペプチド化学の分野に属し、特に、ペプチド及びタンパク質の合成に有用であると共に、誘導体化ペプチドまたはタンパク質の合成においても有用なアミド結合を形成するための方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
新しい方法はタンパク質の全化学合成を容易にしている。歴史的な参考文献として、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８４，２３２，３４１−３４７、Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８８，５７，９５７−９８９、Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９８９，２２，４７−５４が参照される。特に、Ｋｅｎｔ他は、「天然型（ｎａｔｉｖｅ）化学ライゲーション」と呼ばれる、２つの保護されていないペプチドを水溶液中でつなぎ合わせる簡潔な手段を開発した（Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．；Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ，Ｉ．；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４，２６６，７７６−７７９）。重要な先例としては、Ｗｉｅｌａｎｄ，Ｔ．；Ｂｏｋｅｌｍａｎｎ，Ｅ．；Ｂａｕｅｒ，Ｌ．；Ｌａｎｇ，Ｈ．Ｕ．；Ｌａｕ，Ｈ．Ｌｉｅｂｉｇｓ  Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．１９５３，５８３，１２９−１４９、Ｋｅｍｐ，Ｄ．Ｓ．；Ｇａｌａｋａｔｏｓ，Ｎ．Ｇ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８６，５１，１８２１−１８２９が参照される。概説としては、Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．；Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９７，２８９，２６６−２９８、Ｗｉｌｋｅｎ，Ｊ．；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８，９，４１２−４２６、Ｋｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒ，Ｇ．Ｇ．；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９９９，３，６６５−６７１、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．：Ｙｕ  Ｑ．；Ｍｉａｏ，Ｚ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  １９９９，５１，３１１−３３２；Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００，６９，９２３−９６０、Ｂｏｒｇｉａ，Ｊ．Ａ．；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００，１８，２４３−２５１が参照される。
【０００３】
天然型化学ライゲーションでは、１つのペプチドのＮ−末端システイン残基のチオレートが別のペプチドのＣ−末端チオエステルの炭素を攻撃し、最終的に２つのペプチド間にアミド結合が生成される（スキーム１）。このライゲーション法は、緩衝水溶液中のＶａｌＳＰｈとＣｙｓＯＨの反応がジペプチド：ＶａｌＣｙｓＯＨをもたらすと示された（Ｗｉｅｌａｎｄ他，１９５３）ときに発見された。
【０００４】
近年、Ｍｕｉｒ他は、組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）技法を用いてチオエステルフラグメント（断片）を容易に生成することができると証明することによって、天然型化学ライゲーションの有用性を発展させた。Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．；Ｓｏｎｄｈｉ，Ｄ．；Ｃｏｌｅ，Ｐ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８，９，６７０５−６７１０、Ｅｖａｎｓ，Ｊｒ．，Ｔ．Ｃ．；Ｂｅｎｎｅｒ，Ｊ．；Ｘｕ，Ｍ．−Ｑ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１９９８，７，２２５６−２２６４、Ａｙｅｒｓ，Ｂ．；Ｂｌａｓｃｈｋｅ，Ｕ．Ｋ．；Ｃａｍａｒｅｒｏ，Ｊ．Ａ．；Ｃｏｔｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．；Ｈｏｌｆｏｒｄ，Ｍ．；Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２０００，５１，３４３−３５４。概説としては、Ｈｏｌｆｏｒｄ，Ｍ．；Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １９９８，１５，９５１−９５６、Ｃｏｔｔｏｎ，Ｇ．Ｊ．；Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９９９，６，Ｒ２４７−Ｒ２５６、Ｅｖａｎｓ，Ｊｒ．，Ｔ．Ｃ．；Ｘｕ，Ｍ．−Ｑ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２０００，５１，３３３−３４２が参照される。「天然型化学ライゲーション」のこの発展は、「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ）タンパク質ライゲーション」と称されている。
【０００５】
【化９】
0004694085.tif 000002
天然型化学ライゲーションは強力ではあるが、重大な制限を有する。この方法は、システイン残基にペプチド結合を形成することに絶対的に依存する。球状タンパク質ではシステインは残基を１．７％だけしか含まない（ＭｃＣａｌｄｏｎ，Ｐ．；Ａｒｇｏｓ，Ｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １９８８，４，９９−１２２）ので、天然Ｘａａ−Ｃｙｓ結合における連結の形成は、必ずしも可能とは限らない。近代的なペプチド合成は、典型的には、５０より少ない残基のペプチドへ制限される（Ｄａｗｓｏｎ他，１９９４、Ｗｉｅｌａｎｄ他，１９５３、Ｋｅｍｐ他，１９８６、Ｍｕｉｒ他，１９９７、Ｗｉｌｋｅｎ他，１９８６、Ｋｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒ他，１９９９、Ｔａｍ他，１９９９、Ｄａｗｓｏｎ他，２０００、  Ｂｏｒｇｉａ他，２０００）。したがって、ペプチドがシステイン残基でのみカップリングされることを要求する方法では、大部分のタンパク質は調製できない。
【０００６】
さらに、余分なシステイン残基の導入は望ましくないことが多い。システインは、ジスルフィド結合、Ｏ２（ｇ）、および他の求電子試薬に対してとびぬけて反応性の最も高い残基である（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｃ．Ｈ．；ｄｅ  Ｗｅｃｋ，Ａ．Ｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９６５，１６８，２７−３５、Ｒａｉｎｅｓ，Ｒ．Ｔ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９７，４，４２４−４２７）。さらに、システインのスルフヒドリル基はβ脱離を受けてデヒドロアラニンを形成することができ、これは、さらなる反応を起こすことが可能である（Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｍ．Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．１９９９，４５９，１４５−１５９）。より一般的なライゲーションテクノロジを適用してシステイン制限を排除することは、全タンパク質合成の有用性を大きく発展させるであろう。
【０００７】
ＯｆｆｅｒおよびＤａｗｓｏｎは、最近、システインの存在を必要としないペプチドライゲーション法について記載している（Ｏｆｆｅｒ，Ｊ．；Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００，２，２３−２６）。彼らの方法では、ペプチド結合は、チオエステルおよびｏ−メルカプトベンジルアミンから形成される。この方法は有効であるが、必然的に、ライゲーション生成物中にｏ−メルカプトベンジルアミンを残す。
【０００８】
既知のＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応では、ホスフィンを用いて、アジドをアミンへ還元する。
【０００９】
ＰＲ３＋Ｎ３Ｒ’＋Ｈ２Ｏ  →  Ｏ＝ＰＲ３＋Ｈ２ＮＲ’＋Ｎ２（ｇ）
（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ，Ｈ．；Ｍｅｙｅｒ，Ｊ．Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９１９，２，６３５−６４６。概説としては、Ｇｏｌｏｌｏｂｏｖ，Ｙｕ．Ｇ．；Ｚｈｍｕｒｏｖａ，Ｉ．Ｎ．；Ｋａｓｕｋｈｉｎ，Ｌ．Ｆ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９８１，３７，４３７−４７２、Ｇｏｌｏｌｏｂｏｖ，Ｙｕ．Ｇ．；Ｋａｓｕｋｈｉｎ，Ｌ．Ｆ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９２，４８，１３５３−１４０６が参照される。）この反応の中間体はイミノホスホラン（Ｒ”３Ｐ＋−−ＮＲ）であり、これは求核体窒素を有する。
【００１０】
Ｖｉｌａｒａｓｓａ他は、分子間反応および分子内反応の両方において、イミノホスホランの窒素をアシル化できることを示した。これは、スキーム２の反応１および反応２に例示されるように「Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ライゲーション」と呼ばれている。例えば、Ｇａｒｃｉａ，Ｊ．；Ｕｒｐｉ，Ｆ．；Ｖｉｌａｒｒａｓａ，Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８４，２５，４８４１−４８４４、Ｇａｒｃｉａ，Ｊ．；Ｖｉｌａｒｒａｓａ，Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８６，２７，６３９−６４０、Ｕｒｐｉ，Ｆ．；Ｖｉｌａｒｒａｓａ，Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９８６，２７，４６２３−４６２４、Ｂｏｓｃｈ，Ｉ．；Ｒｏｍｅａ，Ｐ．；Ｕｒｐｉ，Ｆ．；Ｖｉｌａｒｒａｓａ，Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９３，３４，４６７１−４６７４、Ｉｎａｚｕ，Ｔ．；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．Ｓｙｎｌｅｔｔ．１９９３，８６９−８７０、Ｍｏｌｉｎａ，Ｐ．；Ｖｉｌａｐｌａｎａ，Ｍ．Ｊ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ  １９９４，１１９７−１２１８、Ｂｏｓｃｈ，Ｉ．；Ｕｒｐｉ，Ｆ．；Ｖｉｌａｒｒａｓａ，Ｊ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９５，９１−９２、Ｓｈａｌｅｖ，Ｄ．Ｅ．；Ｃｈｉａｃｃｈｉｅｒａ，Ｓ．Ｍ．；Ｒａｄｋｏｗｓｋｙ，Ａ．Ｅ．；Ｋｏｓｏｗｅｒ，Ｅ．Ｍ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９６，６１，１６８９−１７０１、Ｂｏｓｃｈ，Ｉ．；Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ａ．；Ｕｒｐｉ，Ｆ．；Ｖｉｌａｒｒａｓａ，Ｊ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９６，６１，５６３８−５６４３、Ｍａｕｎｉｅｒ，Ｖ．；Ｂｏｕｌｌａｎｇｅｒ，Ｐ．；Ｌａｆｏｎｔ，Ｄ．Ｊ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９９７，１６，２３１−２３５、Ａｆｏｎｓｏ，Ｃ．Ａ．Ｍ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８，２８，２６１−２７６、Ｔａｎｇ，Ｚ．；Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．Ｃ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９８，３９，４７７３−４７７６、Ａｒｉｚａ  Ｘ．；Ｕｒｐｉ，Ｆ．；Ｖｉｌａｄｏｍａｔ，Ｃ．；Ｖｉｌａｒｒａｓａ  Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９８，３９，９１０１−９１０２、Ｍｉｚｕｎｏ，Ｍ．；Ｍｕｒａｍｏｔｏ，Ｉ．；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．；Ｙａｇｉｎｕｍａ，Ｈ．；Ｉｎａｚｕ，Ｔ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ  １９９９，１６２−１６５、Ｍｉｚｕｎｏ，Ｍ．；Ｈａｎｅｄａ，Ｋ．；Ｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．；Ｍｕｒａｍｏｔｏ，Ｉ．；Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｔ．；Ａｉｍｏｔｏ，Ｓ．；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．；Ｉｎａｚｕ，Ｔ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，２８４−２９０、Ｂｏｕｌｌａｎｇｅｒ  Ｐ．；Ｍａｕｎｉｅｒ，Ｖ．；Ｌａｆｏｎｔ，Ｄ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２０００，３２４，９７−１０６、Ｖｅｌａｓｃｏ，Ｍ．Ｄ．；Ｍｏｌｉｎａ，Ｐ．；Ｆｒｅｓｎｅｄａ，Ｐ．Ｍ．；Ｓａｎｚ，Ｍ．Ａ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ２０００，５６，４０７９−４０８４、Ｍａｌｋｉｎｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．；Ｆａｌｃｏｎｅｒ，Ｒ．Ａ．；Ｔｏｔｈ，Ｉ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０００，６５，５２４９−５２５２が参照される。
【００１１】
ＳａｘｏｎおよびＢｅｒｔｏｚｚｉは、スキーム２の反応３に示されるように、ホスフィンがアシル供与体の役割も果たせることを報告した。Ｓａｘｏｎ，Ｅ．；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８７，２００７−２０１０。
【００１２】
スキーム２
Ｖｉｌａｒｒａｓａ他（１９８０年代および１９９０年代に多数の例）
【００１３】
【化１０】
0004694085.tif 000003
ＳａｘｏｎおよびＢｅｒｔｏｚｚｉ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００，２８７，２００７）
【００１４】
【化１１】
0004694085.tif 000004
最近、Ｓａｘｏｎ他は、ホスフィン試薬を用いてアジドからアミドを形成するためにＳｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションの変形を報告した。（Ｓａｘｏｎ，Ｅ．；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ｉ．；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００，２，２１４１−２１４３。）ホスフィン試薬、
【００１５】
【化１２】
0004694085.tif 000005
は、アジドヌクレオシドと反応されると、アシル基転移によるアミド形成をもたらすと報告される。ライゲーションは、ホスフィン試薬のアシル基以外の部分が生成物中にまったく残らないので、「痕跡がない（ｔｒａｃｅｌｅｓｓ）」と言われる。また著者らは、同じアジドヌクレオシドとホスフィノチオエステル、
【００１６】
【化１３】
0004694085.tif 000006
との反応は、始めに、アシル転移よりもアザ−イリド加水分解を生じることについても報告している。数日後のアミド生成物の観察は、アミン加水分解生成物とチオエステルの反応の予想される結果であると特徴付けられる。著者他は、使用されるホスフィノチオエステルは反応に「従順」でないと指摘している。
【００１７】
（発明の概要）
本発明は一般的に、スキーム３に示されるように、ホスフィノチオエステルとアジドの間にアミド結合を形成するための方法および試薬を提供する。反応は、広範な種類の化学種（スキーム３ではＲＰおよびＲＢで示される）の間でアミド結合の形成を可能にする。これらの反応が特に重要であるのは、ライゲーションされる部分がアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質フラグメントという点である。特定の実施形態では、本発明は、システイン残基に対する必要性を排除し、ライゲーションされたペプチド生成物中に残留原子をまったく残さない（すなわち、痕跡がない）ペプチドライゲーションのための方法および試薬を提供する。
【００１８】
【化１４】
0004694085.tif 000007
このライゲーションで有用なホスフィノチオエステルは、多数の方法で生成することができる。スキーム３に示されるように、例えばチオエステルまたはＮ−アシルスルホンアミドなどの活性カルボン酸誘導体は、ホスフィノチオエステルへ転換することができる。ホスフィノチオエステルを形成するために当該技術で既知の任意の方法を一般的に使用することができる。本発明は、ホスフィノチオール試薬を用いてホスフィノチオエステル、特に、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質フラグメントのホスフィノチオエステルを生成するための効率的な方法を提供する。この試薬を使用して、活性カルボン酸誘導体（例えば、チオエステルまたは活性スルファミル基）から、あるいはジシクロヘキシルカルボジイミドで媒介される従来のカップリング反応または同様のカップリングによってカルボン酸から、所望のホスフィノチオエステルを生成することができる。
【００１９】
また、本発明のライゲーション反応で有用なホスフィノチオエステルは、そのＣ−末端で樹脂へ付着されたペプチドまたはタンパク質フラグメントから生成することもできる。例えば、ペプチドまたはタンパク質フラグメントは、本発明のホスフィノチオール試薬との反応によって樹脂から遊離され、ホスフィノチオエステルを生成することができる。ペプチドまたはタンパク質フラグメントは、既知の固体ペプチド合成法、例えばＦｍｏｃに基づく方法を用いて、適切な樹脂上で合成することが可能である。樹脂上で合成されたペプチドまたはタンパク質フラグメントは、次に、ホスフィノチオールとの反応により遊離されてホスフィノチオエステルを生成することができ、これは次に、アジドとライゲーションされてアミド結合を形成することができる。本発明のこの態様では、ペプチド合成に適切であると当該技術で知られており、ホスフィノチオールエステルを生成するためのホスフィノチオールとの反応に適合することができる任意の樹脂は、本発明で使用することができる。当該技術で「セーフティキャッチ（ｓａｆｅｔｙ−ｃａｔｃｈ）」樹脂として既知の樹脂は特に重要である。Ｂａｃｋｅｓ，Ｂ．Ｊ．；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０００，６４，２３２２−２３３０が参照される。
【００２０】
ライゲーションが行われるＲＰおよびＲＢ部分は、反応条件と適合することができると共に、互いに、もしくはホスフィノチオエステルの他の官能基、例えばＲ１−２またはＸと、望ましくない反応を起こさない、広範な種類の化学的部分のいずれでもよい。スキーム３のＸ部分ならびにＲ１およびＲ２基はホスフィノチオール試薬から誘導され、以下に記載するように、アミド形成を容易にするように選択される。
【００２１】
ＲＰおよびＲＢは、１つまたは複数のハライド（特に、ＦまたはＣｌ）、ＯＨ、ＯＲ、ＣＯＨ、ＣＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＮＨ、ＣＯＮＲ、またはＮ（Ｒ’）２基で置換されることがどれも可能な脂肪族、ヘテロ脂肪族、脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族、およびへテロ芳香族より成る群から選択される部分を含む。ここで、Ｒは、他のＲとは独立して、脂肪族、ヘテロ脂肪族、脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族、またはヘテロ芳香族基であり、各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族、ヘテロ脂肪族、脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族またはヘテロ芳香族基の群から選択される。ＲおよびＲ’はまた、任意に、上に記載したように置換されてもよい。特に、脂肪族および／または脂環式部分を含むＲＰおよび／またはＲＢでは、１つまたは複数の隣接しないＣＨ２基は、Ｏ、Ｓ、ＣＯ、ＣＯＯ、Ｎ（Ｒ’）２、またはＣＯＮＲ’で置き換えることができ、ここでＲ’は上記に定義されたとおりである。ＲＰまたはＲＢ基の反応性官能基はどれも、保護基（Ｐｒ）の使用によって、望ましくない反応から保護することができる。
【００２２】
特定の実施形態では、ＲＰおよびＲＢはアミノ酸、ペプチド、またはタンパク質である。例えば、ペプチドまたはタンパク質のカルボキシ末端（Ｃ−末端）において、あるいはペプチドまたはタンパク質中の１つまたは複数のアミノ酸の酸側鎖基において、ホスフィノチオエステル基を形成することができる。例えば、ペプチドまたはタンパク質のアミノ末端（Ｎ−末端）において、あるいはペプチドまたはタンパク質中の１つまたは複数のアミノ酸の塩基側鎖基において、アジド基を形成することができる。ライゲーション法は、２つ以上のアミノ酸、２つ以上のペプチド、または２つ以上のタンパク質をライゲーションするために使用することができる。例えば、ペプチドを構成要素のアミノ酸から固体合成するためには、多サイクルのライゲーションを使用することができる。多サイクルのライゲーションを用いて、２つ以上の小さいペプチドを結合して、より大きいペプチドを形成することができる。結合されるペプチドは、固体合成法によって、自然源から、または組換え法によって得ることができる。
【００２３】
本発明の方法は、例えば、スキーム４に示されるペプチドおよびタンパク質の合成のために特に有用である。ここで、一緒にライゲーションされるアミノ酸部分において、ＲＡ１およびＲＡ２は、互いに独立して、脂肪族、ヘテロ脂肪族、脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族、またはヘテロ芳香族であり、これらはいずれも上記のように置換されてもよい。本発明の方法を使用して、１３Ｃおよび１５Ｎ同位体が濃縮されたように、特定の同位体が濃縮された天然アミノ酸と同様に非天然アミノ酸をライゲーションすることができる。
【００２４】
また、本発明の方法を使用して、ハロゲン化アルキルまたはエポキシドのような求電子側鎖基を有する１つまたは複数のアミノ酸を互いにライゲーションすることもできるし、あるいは、求電子側鎖基を有する１つまたは複数のアミノ酸をペプチドおよび／またはタンパク質に取り込むこともできる。また本発明の方法は、２つ以上のβ−アミノ酸を互いにライゲーションするため、１つまたは複数のβアミノ酸をα−アミノ酸へライゲーションするため、あるいは１つまたは複数のβ−アミノ酸をペプチドおよび／またはタンパク質に取り込むためにも使用することができる。
【００２５】
特に、ＲＡ１およびＲＡ２基は、酸性、塩基性、非極性または極性の任意のアミノ酸側鎖基を含む。ＲＡ１およびＲＡ２は、２０個の通常のα−アミノ酸側鎖または側鎖基、ならびにタンパク質中に見られる珍しいアミノ酸（例えば、ホモセリン）側鎖基および他の生物活性アミノ酸（例えば、オルニチンまたはシトルリン）側鎖基を含む。スキーム４に示される反応でアミド結合を含む生成物はジペプチドである。
【００２６】
【化１５】
0004694085.tif 000008
（１）ペプチドのＮ−末端にアジド基を付加し、アジド−ペプチドを別のアミノ酸（またはペプチド）のホスフィノチオエステルと反応させることによって、あるいは（２）ペプチドのＣ−末端にホスフィノチオエステルを形成し、次に形成されたホスフィノチオエステルをアジド酸（またはＮ−末端アジドペプチド）と反応させることによって、スキーム４に示されるペプチド生成物へさらなるアミノ酸を結合させることができる。本発明のホスフィノチオール試薬は、ホスフィノチオエステルを生成するために使用することができる。これらの工程はスキーム５に示される。工程１および／または工程２の繰り返しサイクルは、より長いペプチドを生成するために使用することができる。
【００２７】
【化１６】
0004694085.tif 000009
また、本発明の方法は、２つ以上の小さいペプチド（典型的には、５０個のアミノ酸の長さよりも短い）のライゲーションによってより大きいペプチドまたはタンパク質を合成するため、あるいは２つ以上のペプチドまたはタンパク質のライゲーションによるタンパク質の合成のために使用することもできる。この方法では、ライゲーションされるべき２つ以上のペプチドまたはタンパク質（同じでも異なっていてもよい）は、従来の固相法、例えば、自然源から得られる、または組換え法によって得られる、Ｆｍｏｃに基づく方法によって合成することができる。ライゲーションされるべき２つのペプチドまたはタンパク質の一方は、そのＣ−末端でホスフィノチオエステル基により誘導体化され、Ｎ−末端は適切な保護基で保護される。ライゲーションされるべき２つのペプチドまたはタンパク質の他方は、そのＮ−末端でアジド酸基により誘導体化され、適切な保護基で保護される。ペプチドホスフィノチオエステルは、例えば、本発明のホスフィノチオール試薬を用いて樹脂結合ペプチドまたはタンパク質フラグメントから生成でき、あるいはペプチドチオエステルとホスフィノチオール試薬の反応（エステル交換反応またはカップリング反応）によって生成することができる。ペプチドホスフィノチオエステルは次に、加水分解および窒素損失を伴って、アジドペプチドと反応されて、２つのペプチドをライゲーションするアミド結合を生成する。ライゲーション反応は、加水分解およびアミド生成を容易にするのに十分な水を含有する有機溶媒中、例えばＴＨＦと水の混合物中、で実行することができる。あるいは、ホスフィノチオエステルとアジドの反応は有機溶媒（両反応物が可溶である）中で開始され、加水分解およびアミド結合形成のために後で水が添加されてもよい。
【００２８】
ある実施形態では、ライゲーションは固相技法を用いて実行される。特に、樹脂に付着された第１のペプチドを本発明のホスフィノチオール試薬と反応させて、第１のペプチドを遊離させ、第１のペプチドのＣ−末端にホスフィノチオエステルを形成する。Ｃ−末端で樹脂に付着された第２のペプチドは、そのＮ−末端アミノ酸でアジド基により誘導体化される。樹脂から遊離した後、第１のペプチドは、樹脂に結合した第２のペプチドと加水分解および窒素損失を伴って反応し、２つのペプチドをライゲーションするアミド結合を生成する。ライゲーションされたペプチドは樹脂へ付着したままである。第１のペプチドは従来の固体法により形成することができる。第２のペプチドも従来の固相合成法で形成することができ、この場合、アジド酸はペプチド鎖へ付加された最後のモノマーである。すなわち、アジド基は最後のアミノ酸のアミノ基から元の位置で生成される。ライゲーションされたペプチド（または、タンパク質）は脱保護され、所望される場合には従来の方法によって樹脂から切断される。あるいは、Ｎ−末端脱保護、Ｎ−末端アジド酸形成、およびホスフィノチオエステルペプチドとの反応のサイクルを更に実行して、より長鎖のペプチドおよびタンパク質を生成することもできる。
【００２９】
本発明のライゲーション方法は、固相ペプチド合成の既知の変形と組み合わせることができる。例えば、本発明のライゲーション方法は、リシンベースの分枝コアを用いる多数の抗原ペプチド（ＭＡＰｓ）の合成において使用することができる。Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８８  ８５，５４０９−５４１３が参照される。
【００３０】
別の特定の実施形態では、ＲＰまたはＲＢ（スキーム３）の一方はペプチドまたはタンパク質基であり、他方は炭水化物基である。たとえば、ＲＢは、単糖類、二糖類、三糖類、または多糖類でよい。別の特定の実施形態では、ＲＰまたはＲＢの一方はペプチドまたはタンパク質基であり、他方はヌクレオシドまたは核酸である。別の実施形態では、ＲＰまたはＲＢの一方はペプチドまたはタンパク質基であり、他方は脂質である。更に別の特定の実施形態では、ＲＰまたはＲＢの一方はペプチドまたはタンパク質基であり、他方は、レポータ基、タグまたは標識（例えば、光学分光学、質量分析法または他の機器分析法によってその存在が検出可能な基）であり、蛍光または燐光基、同位体標識、もしくは放射能標識が含まれる。
【００３１】
本発明の方法は、一般的に、生合成経路においてチオエステル中間体を阻止する、すなわちチオエステル中間体と反応するために有用である。この点については、この方法は、単に、同定のためにこのような中間体を識別、タグ付けおよび／またはラベル付けするために使用することができる。あるいは、アミド結合の形成によって唯一の生成物を合成するために使用することができる。この方法は、例えば、ポリケチドの生合成においてチオエステル中間体を阻止するために使用することができる。その結果得られるカップリング生成物は、生物活性について試験することもできるし、生物活性生成物、例えば、天然に存在するポリケチドとは構造が変更され、おそらく機能も変更されたポリケチド、のさらなる合成において使用することもできる。
【００３２】
本発明の方法は、その実施形態のいずれにおいても、固相法を用いて実行することができる。ホスフィノチオエステル反応物またはアジド反応物はどちらも、反応性末端フリーな固体支持材料へ付着され得る。反応性ホスフィノチオエステル基を有して固体支持体へ結合された反応物は、フリーのアジド（すなわち、ここでは、アジド反応物は固体支持体へライゲーションされない）へライゲーションできる。反応性アジド基を有して固体支持体へ結合された反応物は、フリーのホスフィノチオエステルへライゲーションできる。一般的に、この方法を使用して、２つの生物学的分子の間、すなわち２つのペプチドの間、ペプチドと炭水化物（糖類、砂糖など）との間、ペプチドとヌクレオシドとの間、ペプチドと脂質との間など、にアミド結合を形成することができる。更に詳細には、この方法は、生物学的分子のうちの１つが固体支持体（すなわち、樹脂）へ付着されるライゲーションへ適用することができる。固体支持体へＮ−末端を介して付着されたホスフィノチオエステルペプチド反応物は、例えば、ＤＤＣ、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェイト（ＰｙＢＯＰ）のようなカップリング試薬を用いて、付着ペプチドのＣ−末端をホスフィノチオールへカップリングさせることによって生成することができる。アジド基をそのＮ−末端に有する樹脂結合されたペプチドは、トリフィルアジド（ｔｒｉｆｙｌ  ａｚｉｄｅ）または同様の試薬の反応によって生成することができる。
【００３３】
本発明のライゲーション法は、ペプチド、タンパク質、またはアミド結合を含む種々の化学種のコンビナトリアルライブラリの形成において使用することができる。また、本発明のライゲーション法は、当該のペプチドおよびタンパク質生成物の形成のための天然型化学ライゲーション方法と組み合わせて使用することもできる。
【００３４】
最も一般的には、本発明はホスフィノチオエステルとアジドの反応を提供する。特定の実施形態では、ホスフィノチオエステルは、ホスフィノチオール試薬を用いて調製することができる。本発明の反応の試薬として有用な新規のホスフィノチオールが提供される。
【００３５】
本発明はまた、本発明のホスフィノチオール試薬、および特に本明細書中に記載される種々の式のホスフィノチオール試薬の１つ以上を含む、ホスフィノチオエステルとアジドとの間にアミド結合を形成するための試薬キットも提供する。さらにキットは、アジドを形成するための試薬を含み得る。キットはまた、必要に応じて、固相法を用いて本発明の連結を実行するのに適切な樹脂または他の固相材料を含む。キットはまた、後でホスフィノチオエステルへ転換されるチオエステルを生成するための試薬を含み得る。キットはまた、必要に応じて、連結を実行するための溶媒または他の試薬、および反応を行うための使用説明書、ならびに／または所望の連結についてのホスフィノチオール試薬を選択するための説明書を含み得る。
【００３６】
特定の実施形態では、本発明は、１つ以上の本発明のホスフィノチオール試薬を含むペプチドまたはタンパク質の合成のためのキットを提供する。キットは、必要に応じて、１つ以上のアミノ酸側鎖保護基、アミノ酸またはペプチドのチオエステルを生成するための１つ以上の試薬、もしくはアミノ酸またはペプチドのアジド酸を生成するための１つ以上の試薬さらに含み得る。キットはまた、１つ以上のアミノ酸、アミノ酸チオエステルまたはアジド酸を含み得る。キットはまた、必要に応じて、固相法を用いて本発明の連結を行うのに適切な樹脂または他の固相材料を含み得る。キットはまた、必要に応じて、連結を実行するための溶媒または他の試薬、ならびに合成を行うための使用説明書、および／または所望の連結ついてホスフィノチオール試薬を選択するための説明書を含むことができる。本発明の試薬キットには、１つ以上の２−ホスフィノベンゼンチオールまたは１つ以上のホスフィノメタンチオールを含むキットが含まれる。
【００３７】
（発明の詳細な説明）
本発明の方法では、アミド結合は、ホスフィノチオエステルとアジドとの間に形成される。反応は、連結生成物中に試薬の原子が残されないという点で痕跡がない。反応は、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質の誘導体化のため、種々の生物学的分子の連結（例えば、ペプチドと糖類、ペプチドと脂質、ペプチドとペプチド、ペプチドとヌクレオシドまたは核酸など）のため、および特にペプチドおよびタンパク質の合成のための多数の用途において有用である。
【００３８】
いずれの特定の機構にも束縛されることを望まないが、この反応についての可能性のある機構が、スキーム６に示される。連結はホスフィノチオエステルとアジドとのカップリングによって始まり、反応性イミノホスホランおよび窒素ガスの形成に至る。イミノホスホラン窒素のチオエステルへの攻撃は、アミドホスホニウム塩をもたらす。アミドホスホニウム塩の加水分解は、アミドおよびホスフィンオキシドを生成する。重要なことは、ホスフィノチオールからの原子がアミド生成物中にまったく残らない、すなわち連結が痕跡を残さないことである。スキーム６は、チオエステルからのエステル交換反応によるホスフィノチオエステルの形成を示すが、有用なホスフィノチオエステルを製造する他の方法も利用可能である。最も一般的には、ホスフィノチオエステルは、ホスフィノチオール試薬と活性カルボン酸誘導体との反応によって形成され得る。「活性化」カルボン酸誘導体は、当該技術で理解されているように、求核攻撃に対して活性化されており、例としては、チオエステル、ハロゲン化アシル、アシルイミダゾール、活性化エステル、およびＮ−アシルスルホンアミド（ある種のセーフティキャッチリンカーにおいて使用される）が挙げられる。
【００３９】
本発明の連結反応は、ホスフィノチオール試薬として、ｏ−ホスフィノベンゼンチオール（Ｒ１Ｒ２ＰＣ６Ｈ４−ｏ−ＳＨ）（特にｏ−（ジフェニルホスフィノ）ベンゼンチオール（２））と、ホスフィノメタンチオール（Ｒ１Ｒ２Ｐ−ＣＨ２−ＳＨ）（特に（ジフェニルホスフィノ）メタンチオール２０）と、をそれぞれ用いるスキーム７およびスキーム８の特定の反応により例示される。
【００４０】
ｏ−ホスフィノベンゼンチオールは、アシル転移のための遷移状態において六員環の形成を可能にする（スキーム６参照）ので、試薬として最初に選択した。さらに、Ｒ１Ｒ２ＰＣ６Ｈ４−ｏ−ＳＨは、Ｒ１Ｒ２ＰＣＨ２ＣＨ２ＳＨなどのチオールのようにアミドホスホニウム塩のＣ−Ｐ結合の切断によってエピスルフィドおよび安定なアミドホスフィン（Ｒ１Ｒ２ＰＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｒ’’）の形成を可能にしない。さらに、チオフェノール自体は、ネイティブの化学連結中にチオエステルのチオエステル交換反応をもたらすことが知られている（Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．；Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ｍ．；Ｇｈａｄｉｒｉ，Ｍ．Ｒ．；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｇ．Ｈ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７，１１９，４３２５−４３２９）。リン上のＲ基（Ｒ１およびＲ２）は、リンの求核性を低くし、それにより、Ｏ２（ｇ）による有害な酸化に対するホスフィンの感受性を最小限にする電子吸引性（ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇ）フェニル基であるように選択した。
【００４１】
【化１７】
0004694085.tif 000010
スキーム７に示される変換では、ｏ−（ジフェニルホスフィノ）ベンゼンチオール（２）の作用によって、フェニルアラニルチオエステル（１、ここでＲはＢｎである）およびグリシルアジド（４）から、ペプチドＡｃＰｈｅＧｌｙＮＨＢｎ（５、ここでＲはベンジル（Ｂｎ）である）を合成した。ｏ−（ジフェニルホスフィノ）ベンゼンチオール（２）は、Ｂｌｏｃｋ，Ｅ．；Ｏｆｏｒｉ−Ｏｋａｉ，Ｇ．；Ｚｕｂｉｅｔａ，Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８９，１１１，２３２７−２３２９により記載されるように、クロロジフェニルホスフィンとオルトリチウム化チオフェノールの反応により調製した。チオエステル３（ここで、ＲはＢｎである）は、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を含有するＤＭＦ中、過剰のホスフィノベンゼンチオール２を用いて、チオエステル（１、ここでＲはＢｎ）のチオエステル交換反応により、定量的な収率で調製された。ホスフィンはアシル交換反応の注目すべき触媒である。Ｖｅｄｅｊｓ，Ｅ．；Ｄｉｖｅｒ，Ｓ．Ｔ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９３，１１５，３３５８−３３５９。したがって、チオエステル３（ここで、ＲはＢｎである）は、おそらく、アシルホスホニウム塩（Ｐｈ２Ｐ＋（Ｃ６Ｈ４−ｏ−ＳＨ）Ｃ（Ｏ）Ｒ）の形成が生じ、次に分子内のＰ−からＳ−へアシル移動が起こった結果である。
【００４２】
【化１８】
0004694085.tif 000011
【００４３】
【化１９】
0004694085.tif 000012
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂（クロロメチルポリスチレン−ジビニルベンゼン）へ共有結合で固定化することによって、過剰なチオールを除去した。チオエステル３（ここで、ＲはＢｎである）の非緩衝ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（３：１）溶液へアジド４（１当量）を添加し、得られた溶液を室温で１２時間攪拌した。次に、２ＮのＨＣｌを添加して反応を酸性にし、減圧下で溶媒を除去した。シリカゲルのクロマトグラフィーによって、精製アミド５（ここでＲはＢｎ、である）が収率３５％で得られた。他の主要な生成物は、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒら、１９１９年）から誘導され得るＧｌｙＮＨＢｎであった。ＲがＨである場合のスキーム７の反応の結果は、表１に示される。
【００４４】
チオエステル３とアジド４のカップリング効率に対する効果を決定するために、代替の溶媒条件もまた模索した。ｐＨ２、４、８および１３．５で緩衝したＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（３：１）中で反応を実行した。塩化メチレンまたはジメチルホルムアミド中でも反応を行い、次いで酸性水溶液を作用させた。これらの条件下の生成物の収率は、非緩衝ＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（３：１）での収率と同様であった。連結はまた、Ｎ−アセチルグリシン（スキーム７でＲ＝Ｈ）のｏ−ホスフィノベンゼンチオエステルとアジド４とをカップリングするためにも有効であった。
【００４５】
アミド５は、スキーム６に示される機構とは異なる機構で形成され得た。特に、連結のアミド生成物は、理論上は、アジドの還元、それに続く生じるアミンへのアシル転移から生じ得た。チオエステル３とグリシルアジド４との連結をもたらすために使用された条件と同一の条件（反応物濃度、溶媒、温度および時間）下で、チオエステル３および真正のＧｌｙＮＨＢｎを混合したコントロール実験によって、この機構は（少なくとも主要な経路として）除外された。アミド５の形成の証拠はまったく観察されなかった。
【００４６】
ホスフィノチオール２は、本発明の連結をもたらすのに十分な特性を有する。このホスフィノチオール試薬を用いる反応の収率は低かった。これは、ホスフィノチオール２の低い水溶性の結果であり得る。反応の溶媒を最適化することによって、または水溶液に対する高い溶解度を有する試薬を使用することによって、収率を改善し得る。ホスフィノチオール２との連結は、六員環の遷移状態を通じて発生する（スキーム６）。遷移状態のこの環のサイズを小さくすることは、求核性イミド窒素を求電子性チオエステル炭素の近位へ運び、そして、改善された連結生成物の収率を生じる。
【００４７】
より小さい環状遷移状態の効果は、五員環の遷移状態を形成するホスフィノチオール２０を用いるスキーム８の連結反応において評価した。ＡｃＯＨ、ＡｃＧｌｙＯＨ、およびＡｃＰｈｅＯＨから誘導される２０のチオエステルは、チオエステル交換反応またはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）とのカップリングのいずれかによって調製した。これらの反応をＴＬＣ分析により完了した後、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂を用いて、未反応ホスフィノチオールを固定した。ワークアップおよびクロマトグラフィーの後、９０％を越える収率で精製チオエステルを単離した。
【００４８】
連結をもたらすために、ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（３：１）中、室温で１２時間、それぞれのチオエステルをＮ３ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨＢｎ（１当量）と共に攪拌した。減圧下で溶媒を除去し、クロマトグラフィーにより生成物のアミドを精製した。ホスフィノチオール２０を用いて得られたアミド生成物の収率は、ホスフィノチオール２を用いて得られた収率よりもはるかに高い（表１を参照）。ＡｃＧｌｙＮＨＢｎは、２を用いては微量の収率であったのと比較して、２０を用いては９１％の単離収率で得られた。ＡｃＧｌｙＧｌｙＮＨＢｎは、２を用いると１５％であったのと比較して、２０を用いると８０％の収率で得られた。ＡｃＰｈｅＧｌｙＮＨＢｎは、２では３５％であったのと比較して、２０では９２％の収率で得られた。表１は、ホスフィノチオール２および２０を用いる連結の収率を要約する。
【００４９】
ホスフィノチオール２０の使用の別の利点は、クロロホルム中で過剰のトリクロロシランを用いる還元によって、試薬をそのホスフィンオキシドから再生し得ることである。
【００５０】
（表１：ホスフィノチオール２および２０を用いた連結の収率）
【００５１】
【表１】
0004694085.tif 000013
ａ条件：ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（３：１）；室温；１２時間
観察された収率の劇的な改善は、チオエステルおよびアジドの連結をもたらしアミドを形成するために、ホスフィノチオール２０が優れた試薬であることを示す。それに対して、Ｂｅｒｔｏｚｚｉおよび共同研究者ら（Ｓａｘｏｎ，Ｅ．；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｊ．Ｉ．；Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００，２，２１４１−２１４３）は、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ連結をもたらすためのホスフィノチオール２および２０のオキソ類似体の能力を評価した。驚いたことには、彼らは、Ｐｈ２ＰＣ６Ｈ４−ｏ−ＯＨがＰｈ２ＰＣＨ２ＯＨよりも高い収率を与えることを見出した。チオエステルとエステルの明白な正反対の反応性の根拠は不明確である。
【００５２】
ホスフィノチオール２０を用いて得られる高収率は、試薬中の求核体および求電子体の近接に起因し得る。連結の重要な中間体は、イミノホスホランであると考えられる（スキーム６）。２０のイミノホスホランからアミドホスホニウム塩へ至る遷移状態は、五員環を含む。この環のＣ−Ｓ結合およびＰ−Ｎ結合は両方とも、重要な二重結合特性を有する。従って、イミノホスホランは、比較的少数のコンホメーションを採用し得る。これに対して、ラクタムを形成するためのＮ３（ＣＨ２）１０Ｃ（Ｏ）ＳＰｙとＰＢｕ３の反応は、１２員環による遷移状態を介して進行する（Ｂｏｓｃｈ，Ｉ；Ｒｏｍｅａ，Ｐ；Ｕｒｐｉ，Ｆ；Ｖｉｌａｒａｓｓａ，Ｊ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９３  ３４：４６７１−４６７４）。この反応の収率はわずか２８％である。
【００５３】
ホスフィノチオール２０を用いて得られる高収率に寄与し得る別の因子は、アミド形成を容易にする安定なコンホメーションである。分子力学的計算は、イミノホスホラン中間体がβターン様コンホメーションを採用し得ることを示す。βターンは１０員環を定義するＯ…ＨＮ水素結合により安定化される。イミノホスホランのチオエステル、イミド、およびアミド基は、βターンの３つのアミド基に対応する位置に配置される。このコンホメーションでは、求核体イミド窒素は求電子体チオエステル炭素の３．０Å以内にある。さらに、Ｏ…ＨＮ水素結合はチオエステルを分極し、その炭素を更により求電子性にする。最後に、２つのフェニル基のバルクは、βターン様コンホメーションのイミノホスホランの画分を増大させることによって、アシル転移を加速するであろう（「反応性回転異性体効果」の例として：（ａ）Ｂｒｕｉｃｅ，Ｔ．Ｃ．；Ｐａｎｄｉｔ，Ｕ．Ｋ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６０，８２，５８５８−５８６５、（ｂ）Ｊｕｎｇ，Ｍ．Ｅ．；Ｇｅｒｖａｙ，Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１９９１，１１３，２２４−２３２を参照のこと）。この好ましいコンホメーションは、２との連結の間、および非ペプチジルアジドとチオエステルとの連結において近づきつらい。
【００５４】
ホスフィノチオール２０は、ホスフィノチオール２以上のさらなる本質的な利点を有する。一般的に、脂肪族チオール（例えば、２０）は、芳香族チオール（例えば、２）よりも高いｐＫａ値を有する。チオエステルの加水分解速度は、そのチオールのｐＫａ値と反対に相関する（Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｍ．Ｊ．Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｅｓｔｅｒｓ；Ｐａｔａｉ，Ｓ．編；Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６９；７３０−７３６頁）ので、脂肪族チオエステルは水溶液中でより長い半減期を有する。イミノホスホラン形成の前か後に起こるチオエステルの加水分解は連結と競合する副反応であるようなので、半減期が長いことは重要である。
【００５５】
したがって、ホスフィノチオール試薬の選択は、本発明のチオエステルおよびアジドの連結をもたらす際に、重要な側面である。本発明で有用なホスフィノチオールは、以下の一般構造を有する。
【００５６】
【化２０】
0004694085.tif 000014
ここで、ｎおよびｍは０または１〜３に等しい整数であり、ｎ＋ｍ＝０〜４である。点線は、二重結合が存在するか、または結合が芳香族基の一部であることを示す（示されるように、炭素間に二重結合が存在するか、あるいはこの結合が芳香環の一部である場合には、Ｒ４、Ｒ６およびＲ８は存在しない）。Ｒ１およびＲ２は、例えばハライド（特にＦまたはＣｌ）、ＯＨ、ＯＲ、ＣＯＨ、ＣＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、またはＮ（Ｒ’）２基で必要に応じて置換される脂肪族、脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族、またはヘテロ芳香族基から独立的に選択される基である。ここでＲは、他のＲとは独立して、脂肪族、脂環式、へテロ脂環式、芳香族またはヘテロ芳香族基であり、各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族、脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族またはヘテロ芳香族基である。ＲおよびＲ’は、Ｒ１およびＲ２について上に記載されたように必要に応じて置換され得る。Ｒ１およびＲ２において、１つ以上の隣接しないＣＨ２基はＯ、Ｓ、ＣＯ、ＣＯＯ、またはＣＯＮＲ’で置換され得、Ｒ１およびＲ２は一緒に、Ｐ原子を含む環を形成し得、そしてＲ３〜Ｒ８は、独立的して、Ｒ１およびＲ２について上に記載されたように任意に置換される、水素、脂肪族、脂環式、ヘテロ脂環式、芳香族またはヘテロ芳香族基から選択される。Ｒ３〜Ｒ８では、１つ以上の隣接しないＣＨ２基はＯ、Ｓ、ＣＯ、ＣＯＯ、またはＣＯＮＲ’基で置換され得、ここで各Ｒ’は他のＲ’とは独立して、Ｒ１およびＲ２について上に記載されたように必要に応じて置換される、水素、脂肪族、脂環式または芳香族基であり、Ｒ３〜Ｒ８のうちの２つ以上が共有結合されて、２環式基を含む環式基を形成し得る。
【００５７】
Ｒ１およびＲ２基として、とりわけ、アルキル基、アルケニル基、環式アルキル、環式アルケニル、二環式基、芳香族基、ヘテロ芳香族基、エーテル基、エステル基、アミド基、チオエーテル基およびケトン基が挙げられる。
【００５８】
Ｒ５〜Ｒ８はすべて水素ではないことが好ましい。ｎ＋ｍは０、１、または２であることもまた好ましい。特定の実施形態では、Ｒ３およびＲ４は両方とも水素であり、ｎおよびｍは両方ともゼロである。
【００５９】
特定の実施形態では、ホスフィノチオールは次式を有する。
【００６０】
【化２１】
0004694085.tif 000015
ここで、Ｒ１およびＲ２は、上記のように必要に応じて置換される芳香族またはヘテロ芳香族基であり、Ｒ３およびＲ４は上記で定義されたとおりである。Ｒ３およびＲ４は、好ましくは水素である。Ｒ１およびＲ２は、好ましくは、フェニル基および置換されたフェニル基を含む電子吸引基である。Ｒ３および／またはＲ４のうちの１つならびにＲ２は共有結合されて、上記のような基で置換され得るヘテロ芳香環を形成し得る。
【００６１】
他の実施形態では、ホスフィノチオールは次式を有し得る。
【００６２】
【化２２】
0004694085.tif 000016
ここで、Ｒ１〜Ｒ６は上記で定義されたとおりであり、Ｒ１およびＲ２ならびに／またはＲ４およびＲ５は必要に応じて共有結合されて、脂環式または芳香族の環を形成する。ここで、炭素間の点線は任意の二重結合または芳香環の一部を示し、示されるように炭素間に二重結合が存在する場合、Ｒ３およびＲ６は存在しない。
【００６３】
別の実施形態では、ホスフィノチオールは次の構造を有する。
【００６４】
【化２３】
0004694085.tif 000017
ここで、Ｒ１〜Ｒ８は上記に定義されたとおりであり、Ｒ１−Ｒ２、またはＲ４−Ｒ５、またはＲ５−Ｒ７、Ｒ４−Ｒ７、またはＲ４−Ｒ５−Ｒ７は必要に応じて共有結合されて、脂環式または芳香族の環を形成する。
【００６５】
さらなる実施形態では、ホスフィノチオールは次の構造を有する。
【００６６】
【化２４】
0004694085.tif 000018
ここで、ｎおよびｍは０または１であり、Ｒ１およびＲ２は上記に定義されたとおりであり、Ｘ１〜Ｘ４は芳香族基上の置換基であり、そのうちの２つは共有結合されて、脂環式または芳香族の環を形成し得る。Ｘ１〜Ｘ４は、脂肪族、脂環式、または芳香族基であり得るか、またはハライド、ＯＨ、ＯＲ、ＣＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ（ここで、Ｒは脂肪族、脂環式または芳香族である）またはＮ（Ｒ’）２基であり得る。ここで、各Ｒ’は他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族、脂環式または芳香族基であり、ＲおよびＲ’は、Ｒ１およびＲ２について上記に記載されたように、必要に応じて置換される。
【００６７】
別の実施形態では、ホスフィノチオールは次の構造を有する。
【００６８】
【化２５】
0004694085.tif 000019
ここでＲ１およびＲ２は上記に定義されたとおりであり、Ｍは、二環式を含む脂環式、またはヘテロ芳香族を含む芳香族の環を表す。Ｍはフェニル環、ナフタレン（または他の融合環）、ピリジン（または他のヘテロ芳香環）、もしくはシクロヘキセン（または他の脂環式環）を表し得る。Ｒ１およびＲ２は必要に応じて共有結合されて、リンを含有する環を形成する。
【００６９】
この構造の特定の例として、以下が挙げられる。
【００７０】
【化２６】
0004694085.tif 000020
ここで、Ｘ１〜Ｘ４は、存在する場合には、ヘテロ芳香環上の置換基であり、水素、ハライド、アルキル基、芳香族基、ＯＲ、ＣＯＲまたはＣＯＯＲ基から独立して選択され得る。ここでＲは、水素、脂肪族基、脂環式基、芳香族基、ＣＯＮＲ’またはＮ（Ｒ’）２基であり、各Ｒ’は他のＲ’と独立して、水素もしくは脂肪族または芳香族基であり得る。
【００７１】
さらなる特定の実施形態では、本発明のホスフィノチオール試薬として、以下が挙げられる：
【００７２】
【化２７】
0004694085.tif 000021
（ここでＲ１、Ｒ２、Ｘ１〜Ｘ４は上記に定義されたとおりである。）；および
【００７３】
【化２８】
0004694085.tif 000022
。ここでＲ１およびＲ２は上記に定義されたとおりであり、点線は任意の二重結合を示し、Ｘ１〜Ｘ１０は、存在する場合には、水素、脂肪族、脂環式または芳香族基であり得るか、またはハライド、ＯＨ、ＯＲ、ＣＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ（ここでＲは脂肪族、脂環式または芳香族である）、ＣＯＮＲ’、またはＮ（Ｒ’）２基であり得る。ここで、各Ｒ’は、他のＲ’とは独立して、水素、脂肪族、脂環式、または芳香族基であり、ＲおよびＲ’は、Ｒ１およびＲ２について上記に記されたように必要に応じて置換され、括弧内の置換基は二重結合が存在する場合には存在しない。
【００７４】
ホスフィノチオール試薬のＲ１およびＲ２基は、一般的に、好ましくない立体的または電子的相互作用を回避することによって反応の遷移状態の自由エネルギーの上昇を回避するように、また有機溶媒（その合成のため）および緩衝水溶液（応用のため）の両方に溶解性を提供するように選択される。ポリエチレングリコール基を使用して、例えば、有機溶媒および水溶液の両方に溶解性を与え得る。例示的なＲ１およびＲ２基は、次式のポリエーテル基を含む。
【００７５】
【化２９】
0004694085.tif 000023
ここで、ｐは０または１〜約１０の範囲の整数であり、好ましくはｐは１〜４であり、Ｒは水素またはアルキル基である。ポリエーテル基の炭素は、必要に応じて、ハライドまたは小さいアルキル基で置換される。特定の実施形態では、本発明のホスフィノチオール試薬はＲ１およびＲ２がフェニル基であり、これらのフェニル基は、水中での試薬の溶解度を増強するために１つ以上のポリエーテル基で置換され得る。
【００７６】
他の特定の実施形態では、本発明の試薬は次式を有する。
【００７７】
【化３０】
0004694085.tif 000024
ここで、ｐ１およびｐ２は０または１〜約１０の範囲の整数（１および１０を含む）であり、Ｒは水素またはアルキル基である。整数ｐ１およびｐ２は同じであるのが好ましく、１〜４の範囲（１および４を含む）が好ましい。
【００７８】
これらのホスフィネート試薬は、本発明のライゲーションで使用するための水溶性チオール試薬として特に興味深い。このタイプの試薬は、以前はアルコールをリン酸化するために使用されたホスホラミダイトＰＣｌ２（Ｎ（Ｃ２Ｈ５）２）によって合成することができる（Ｐｅｒｃｈ，Ｊ．Ｗ．；およびＪｏｈｎｓ，ＲＢ  １９８８  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ−Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ  ２，１４２−１４４）。ホスホラミダイトを市販の１ヶ所保護された（ｍｏｎｏｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）テトラ（エチレングリコール）と反応させた後、Ｎ（Ｃ２Ｈ５）２置換基をＣｌで置き換える。チオフェノールを用いるオルトリチウム化および脱保護によって、所望のホスフィネートが生じる。
【００７９】
【化３１】
0004694085.tif 000025
一般的に、ポリエーテル基を含むＲ１およびＲ２基は、容易に入手可能な出発物質から、当該分野で周知の方法によって合成することができる。
【００８０】
ホスフィノチオール試薬の反応性は、当該分野で公知のように、置換基Ｒ１およびＲ２の選択によって調整することができる。一般的に、これらの基は、アジドの電子的および立体的特性に少なくとも部分的に基づいて選択されたアジドとの所望の反応性を得るように、そして、酸素に対する試薬の感度を最小限にするように選択される。酸素に対してより敏感な試薬は、一般的に、取り扱いがより困難であり、試薬の有効性を消失または減少させ得る所望されないレベルの酸素を避けるために、使用の際により注意が必要である。しかし、グリコシドのアジドのように反応性の低いアジドを用いるライゲーションは、より反応性の高いホスフィノチオール試薬の使用によって有意に改良することができる。例えば、Ｒ１およびＲ２基としてｎ−ブチル基などのｎ−アルキル基を使用すると、試薬の反応性は有意に増大され得る。
【００８１】
さらなる例として、ホスフィノチオール試薬のフェニル置換基の電子供与基（当該分野で公知のように適切な環位置のアルコキシ基など）または電子吸引基（当該分野で公知のように適切な環位置のＮＯ２基など、特にｐ−ＮＯ２）の置換は、試薬の反応性を調整するために使用することができる。電子吸引基の付加は反応性を減少させる傾向にあり、そしてフェニル置換基の電子供与基の付加は試薬の反応性を増大させる傾向にある。
【００８２】
本発明において有用なホスフィノチオール試薬は、本明細書の教示の観点から、容易に入手可能な出発物質から、当該分野で周知の方法によって調製することができる。本発明の試薬はキットの形態で提供することができ、所望の反応用の溶媒を必要に応じて含み、反応を実行するための使用説明書を必要に応じて含み、そして、１以上のアジドまたはチオエステル反応物を任意に含む。キットはチオエステルおよび／またはアジドを生成するための試薬を含むことができる。また、試薬キットは、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質へカップリングするための標識基、タグ、またはレポータ分子を有する１以上の試薬ホスフィノチオールを含んでもよい。試薬キットは、例えば、選択された反応を実行するための成分の測定された相対量を含有するバイアルまたは他の容器を含むことができる。これらの試薬は、単一のライゲーション反応で使用するためにパッケージングされ、かつそのような大きさにされ得るか、または２つ以上のアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質フラグメントをライゲーションする段階的合成のためにパッケージングされ、かつそのような大きさにされ得る。
【００８３】
まだ知られていないホスフィノチオール２０の合成は、以下に実施例２で記載され、スキーム９に図示される。臭化フェニルマグネシウムをクロロメチル−ホスホン酸ジクロリド２３へ添加し、その結果生じるＧｒｉｇｎａｒｄ反応を１２時間還流させ、ホスフィンオキシド２４を得た。乾燥ＴＨＦ中、チオ酢酸およびトリエチルアミンと２４の混合物を１２時間還流しながら加熱した（Ｌａｍｏｕｒｅｕｘ，Ｇ．Ｖ．；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ，Ｇ．Ｍ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．  １９９３，５８，６３３−６４１、Ｗｏｙｃｅｃｈｏｗｓｋｙ，Ｋ．Ｊ．；Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．；Ｒａｉｎｅｓ，Ｒ．Ｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９９９，６，８７１−８７９）。フラッシュクロマトグラフィーにより精製し、脱色木炭で処理したあと、２つの工程の合計収率５４％でチオホスフィンオキシド２５を単離した。クロロホルム中で７２時間、過剰のトリクロロシランを用いて、２５をホスフィノチオエステル２６へ還元し、フラッシュクロマトグラフィーによってほぼ定量的な収率で２６を単離した。メタノール中で２時間、水酸化ナトリウムを用いてホスフィノチオエステル２６の加水分解を行い（Ｃｈａｒｒｉｅｒ，Ｃ．；Ｍａｔｈｅｙ，Ｆ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９７８，２７，２４０７−２４１０）、ホスフィノチオール２０を得た（酸性条件下での加水分解は失敗した）。この反応の間、得られたチオールの酸化を防止するために、反応混合物中にＡｒ（ｇ）を通気させた。アルミナによるクロマトグラフィーによりホスフィノチオール２０を精製し、７５％の収率で単離した。スキーム９のプロセス全体の収率は３９％であった。
【００８４】
【化３２】
0004694085.tif 000026
以下の用語は、本明細書および特許請求の範囲において示された意味を有する。
【００８５】
脂肪族という用語は、飽和または不飽和の炭化水素（アルカン、アルケン、アルキン）を示し、直鎖または分枝鎖であってもよい。脂肪族基は、とりわけハライド、ヒドロキシ基、チオール基、エステル基、ケトン基、カルボン酸基、アミンおよびアミドを含む種々の置換基または官能基によって必要に応じて置換することができる。ヘテロ脂肪族基は、炭化水素鎖中に１以上の非炭素原子を含有する脂肪族基である（例えば、１以上の隣接しないＣＨ２基がＯ、ＳまたはＮＨで置き換えられる）。
【００８６】
脂環式という用語は、１以上の飽和または不飽和環（例えば、３〜１０員環）を有する炭化水素を示し、二環式でもよい。脂環式基は、環状炭化水素と組み合わせて、分枝鎖および／または直鎖の脂肪族である部分を含むことができる。脂環式基は、脂肪族基について上記されたように置換することができる。ヘテロ脂環式基は、脂環式基の炭化水素鎖、環または直鎖もしくは分枝鎖の脂肪族部分に、１以上のヘテロ原子（非炭素原子）を含有する脂環式基である（例えば、１以上の隣接しないＣＨ２基がＯ、ＳまたはＮＨで置き換えられ得る）。
【００８７】
芳香族という用語は、１以上の芳香環を含む炭化水素を示し、これらは縮合環（例えば、ナフタレン基のような）でもよい。芳香族基は、芳香族と組み合わせて、分枝鎖および／または直鎖の脂肪族および／または脂環式である部分を含むことができる。
【００８８】
芳香族基は、脂肪族基について上記されたように置換することができる。ヘテロ芳香族基は、芳香環（例えば、ピリジン環）に１以上のヘテロ原子（非炭素原子）を含有する芳香族基である、芳香環のＣＨは、Ｏ、ＳまたはＮで置き換えることが可能である。芳香族基の任意の脂環式または脂肪族部分において、１以上の隣接しないＣＨ２基はヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、ＮＨ）で置き換え可能である。
【００８９】
また、脂肪族基、脂環式基、芳香族基、および対応するヘテロ原子含有基は、上記のような官能基で置換することもできる。芳香環は、例えば、所望され得るように、電子供与基または電子吸引基で置換することができる。電子供与基および電子吸引基は当該分野で周知である。
【００９０】
一般的なアミノ酸は、天然に存在するペプチドおよびタンパク質中に一般的に見出される２０個のアミノ酸であり、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸が含まれる。ＲＡ基は、とりわけ、一般的なアミノ酸の側鎖または側鎖基を含む。
【００９１】
タンパク質中に見出される一般的でないアミノ酸には、ヒドロキシル化、アルキル化、リン酸化、ホルミル化、およびアシル化された側鎖基を有するものが含まれ、とりわけ特に、４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、Ｏ−ホスホセリン、カルボキシグルタメート、アセチルリジン、およびＮ−メチルアルギニンが含まれる。生物学的活性を有するアミノ酸誘導体には、とりわけ、α−アミノ酪酸、チロキシン、シトルリン、オルニチン、ホモシステイン、Ｓ−アデノシルメチオニン、β−シアノアラニン、およびアザセリンが含まれる。ＲＡ基はまた、一般的なアミノ酸および一般的でないアミノ酸の側鎖基または側鎖、ならびにアミノ酸の生物学的に活性な誘導体の側鎖基を含むことができ、これらは、１以上のハライド、ヒドロキシル、アルキル基、チオール、保護されたチオール、アミノ基、保護されたアミノ基、アセチル、エステル、またはカルボン酸基で置換される。
【００９２】
また、本発明の方法は、ハロゲン化アルキル側鎖基またはエポキシド側鎖基などの求電子側鎖基を保有する２以上のアミノ酸を共にライゲーションするために、または１以上のこれらのアミノ酸をペプチドまたはタンパク質に取り込むためにも使用することができる。このようなアミノ酸の取込みは、塩基（典型的には、ピペリジン）でＦｍｏｃ保護基を除去する必要があるため、従来のペプチド合成では困難である。塩基は求核体としても作用することができ、求電子側鎖を攻撃する。たとえば、求電子側鎖を有するアミノ酸は、求電子側鎖を含むアジド酸を、最終モノマーとして合成ペプチドへ添加することによって製造され得る。そのペプチドの脱保護および樹脂からの切断は、求電子側鎖を保有するアジドペプチドを生じ、これは次に、本発明の方法を用いて、ホスフィノチオエステル基を保有する別のペプチドまたはタンパク質へライゲーションされ得る。
【００９３】
本発明の方法によってライゲーション可能なアミノ酸は、特定の同位体が富化されたもの、例えば１３Ｃまたは１５Ｎ−富化アミノ酸を含む。使用することができる同位体で富化されたアミノ酸には、一般的なアミノ酸または一般的でないアミノ酸、β−アミノ酸、および求電子側鎖基を有するアミノ酸が含まれる。
【００９４】
タンパク質およびペプチド中に一般的に見出されるアミノ酸はＬ−アミノ酸である。しかし、本発明は、Ｄ−アミノ酸、ならびにＤ−アミノ酸を含有するペプチドおよびタンパク質とともに機能する。ＲＡ基を含む反応物は、キラル非ラセミ、ラセミまたはアキラルであってもよい。所望のペプチドおよび／またはタンパク質の合成のために、適切なキラリティの反応物を容易に選択でき、かつ容易に入手可能である。ＲＡ基上の反応性官能基は、当該分野で公知のように、適切な保護基で保護することができる。保護基には、とりわけ、アセチル基、ベンジル基および他の保護基が含まれ、技術的に公知の方法またはペプチド合成において代表的に使用されるものが含まれる。当業者は、所定の官能基および所定の反応条件セットとともに使用するための技術的に公知の保護基を選択することができる。
【００９５】
本明細書中で例証されるライゲーションは、ペプチドまたはタンパク質を生成するために使用することができる。ペプチドは、アミノ酸の間にアミド結合を形成するためのライゲーションサイクルを繰り返すことによって、スキーム５に示されるように合成することができる。特定の実施形態では、ペプチド合成は、アミノ酸のうちの１つが固体支持体または樹脂へ共有結合される固相法を用いて実行することができる。本発明のライゲーション方法と組み合わせて使用するために、種々の樹脂が当該分野で利用可能である。例えば、有機溶媒および水性溶媒の両方での使用に適合性のあるＴｅｎｔａｇｅｌ、ＰＥＧＡ、または他の樹脂は、本発明のライゲーション方法との組み合わせにおいて有用である。
【００９６】
本発明のライゲーション方法は、固体支持体または樹脂上で成長中のペプチド鎖へアミノ酸を順次付加するために、従来の方法と組み合わせることができる。例えば、従来のＦｍｏｃ化学は、本発明のホスフィノチオエステルおよびアジド反応物を使用する１以上のライゲーション工程と組み合わせることができる。特定の例では、本発明のライゲーション方法を用いて、従来の方法（例えばＦｍｏｃベースの化学）で合成中のペプチド鎖へ、１以上のβ−アミノ酸、または求電子側鎖基を有する１以上のアミノ酸を導入することができる。
【００９７】
図１は、固体法と組み合わせて本発明のライゲーション方法を使用する、タンパク質構築物のための典型的なアプローチを示す。このアプローチでは、第１のペプチド１００は、そのＣ−末端を介して、チオエステル結合により樹脂１０１へ付着される。この第１のペプチドは、適切な保護基によりそのＮ−末端で保護される。この第１のペプチドは、例えば、従来の固相ペプチド合成法（例えばＦｍｏｃ法）によって合成することができる。結合された第１のペプチド（１００）は、２または２０のようなホスフィノチオール試薬１０２と反応され、Ｎ−末端保護されたペプチドをホスフィノチオエステル１０４として樹脂から遊離させる。
【００９８】
そのＣ−末端で樹脂１０１’へ付着され、そのＮ−末端に未保護のＮＨ２基を有する（脱保護の後）第２のペプチド１０５は、アジド酸１０６と反応し、そのＮ−末端にアジド基を有する樹脂結合ペプチド１０７を形成する。アジド−Ｎ−末端ペプチド１０７は、次に、加水分解および窒素消失を伴って、非結合Ｎ−末端保護ホスフィノチオエステル１０４と反応し、第１および第２のペプチド１０８をライゲーションするアミド結合を形成する。ライゲーションされたペプチドは樹脂へ連結されたままである。
【００９９】
ライゲーションされたペプチド１０８のＮ−末端を脱保護し；
脱保護されたペプチドをアジド酸と反応させて、そのＮ−末端にアジド酸を有する樹脂結合ペプチド１０７を生成し；そして
樹脂結合アジド酸ペプチドとホスフィノチオエステル１０４を、加水分解および窒素消失を伴って反応させて、ライゲーションされた樹脂結合ペプチド１０８を生成する、
というさらなるサイクルは、成長中のペプチド鎖へペプチドを付加する。このサイクルは所望のより大きなペプチドまたはタンパク質が合成されるまで継続される。
【０１００】
図１のアプローチでは、ライゲーションされるべきペプチドのアミノ酸の反応性（または潜在的な反応性）の側鎖または側鎖基は、適切な保護基を用いて反応から保護される。所望されるより大きなペプチドまたはタンパク質が合成された後、側鎖保護基は、従来の方法および試薬を用いて除去される（脱保護）。より大きなペプチドまたはタンパク質は、所望の折りたたみを容易にする条件へ必要に応じて供され、ペプチドまたはタンパク質生成物は、樹脂から必要に応じて切断される。タンパク質の折りたたみはまた、樹脂からタンパク質を切断した後に行われることができることに留意のこと。
【０１０１】
従来の固体法で形成されるペプチドは、代表的には、約３０〜５０個の範囲のアミノ酸長であるため、約３００個のアミノ酸長のタンパク質は、約８〜１０回のさらなるサイクルを必要とする。
【０１０２】
ペプチドチオエステルは、従来の固相ペプチド合成（例えば、Ｆｍｏｃベースの固相合成）（Ｉｎｇｅｎｉｔｏ，Ｒ．；Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｅ．；Ｆａｔｔｏｒｉ，Ｄ．；Ｐｅｓｓｉ，Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，１１３６９−１１３７４、Ｓｈｉｎ，Ｙ．；Ｗｉｎａｎｓ，Ｋ．Ａ．；Ｂａｃｋｅｓ，Ｂ．Ｊ．；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃ．Ｒ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，１１６８４−１１６８９；Ｓｗｉｎｎｅｎ，Ｄ．；Ｈｉｌｖｅｒｔ，Ｄ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００，２，２４３９−２４４２）、またはｒＤＮＡ技法（Ｍｕｉｒ他，１９９８、Ｅｖａｎｓ，Ｊｒ．他，１９９８、Ａｙｅｒｓ他，２０００、Ｈｏｌｆｏｒｄ他，１９９８、Ｃｏｔｔｏｎ他，１９９９、Ｅｖａｎｓ，Ｊｒ．，２０００）から生じることができる。あるいは、ペプチドは、例えばタンパク質のフラグメントとして天然から、または組換えシステムでの発現によって、生成することができる。これらのペプチドは、従来の試薬および方法を用いてチオエステルへ誘導体化することができる。いかなる供給源由来のペプチドでも、例えば保護ペプチドのα−アミノ基とＣＦ３ＳＯ２Ｎ３との反応によって、そのＮ−末端をアジドで誘導体化することができる（Ｚａｌｏｏｍ，Ｊ．；Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｄ．Ｃ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８１，４６，５１７３−５１７６）。アジド基はまた、従来の試薬および方法によってペプチドアミノ基へ付加することができる。
【０１０３】
本発明のライゲーションで用いられるような有機溶媒および水性溶媒での使用に適した固体支持材料、例えば樹脂は当該分野で公知であり、当業者は、実行される合成工程と適合可能な支持材料を容易に選択することができる。特に興味深いのは、本発明の方法を用いて後でライゲーションできるペプチドの合成のために、樹脂へのセーフティキャッチリンカー（ｓａｆｔｙ−ｃａｔｃｈ  ｌｉｎｋｅｒ）を使用することである。ネイティブな化学的ライゲーションはセーフティキャッチリンカーを用いて実行されている。Ｂｒｉｋ，Ａ．；Ｋｅｉｎａｎ  Ｅ．；Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０００（Ｊｕｎ）１６：６５（１２）：３８２９−３８３５を参照のこと。スキーム１０は、セーフティキャッチ樹脂上で従来の方法によりペプチドを合成し、本発明のホスフィノチオール試薬を用いてペプチドを遊離させることを示す。
【０１０４】
当業者は、本発明のライゲーション工程と適合可能な従来の方法によって、樹脂結合ペプチドを容易に合成することができる。特定の実施形態では、感光性結合基によって、ペプチドを固相合成用樹脂へ連結することができる。このような基は適切な波長の照射により切断される。
【０１０５】
本発明の方法で有用な種々の側鎖基の保護基は当該分野で公知であり、所定の反応条件に対して容易に選択することができる。生成物ペプチドまたはタンパク質に対する実質的な損害なく、側鎖を脱保護し、樹脂からペプチドおよびタンパク質を切断するための方法は当該分野で公知である。アジド置換アミノ酸は、市販の供給源からか、または当該分野で周知の慣用的方法の適用により、容易に入手可能である。
【０１０６】
【化３３】
0004694085.tif 000027
本発明の方法で使用される反応物および試薬は市販の供給源から容易に入手可能であるか、または、本明細書中での説明の観点から、当該分野で周知の方法を用いて調製することができる。例えば、アジドグリコシド（例えば、アジドマンノース）およびアジドヌクレオシド（例えば、ＡＺＴ）は当該分野で公知の方法により調製することができる。種々の生物学的に興味深い分子のチオエステルも、周知の方法により容易に入手することができる。ホスフィノチオエステルは、本明細書に説明された方法または当該分野で公知の方法により調製され、特に、転移チオエステル化（ｔｒａｎｓｔｈｉｏｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）反応またはカップリング反応による合成によって調製することができる。典型的な方法は実施例で提供される。アジド酸は容易に入手でき（Ｚａｌｏｏｍ，  Ｊ．；他、１９８１）、固相合成において使用することができる（Ｍｅｌｄａｌ，Ｍ．；Ｊｕｌｉａｎｏ，Ｍ．Ａ．；Ｊａｎｓｓｏｎ，Ａ．Ｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９７，３８，２５３１−２５３４）。また、シアル酸または特定の脂質のような種々の生物学的に興味深い分子のチオエステルも、公知の方法によって容易に入手可能である。
【０１０７】
ホスフィノチオール２０を用いる本発明のライゲーション方法は、容易なタンパク質合成を可能にするために特に有用である。
【０１０８】
さらに、本発明のライゲーション方法はネイティブな化学的ライゲーション（および、他の有効なカップリングストラテジー、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．；Ｌｕ，Ｙ．Ａ．；Ｃｈｕａｎ−Ｆａ，Ｌ．；Ｓｈａｏ，Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９５，９２，１２４８５−１２４８９；Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．；Ｙｕ，Ｑ．；Ｍｉａｏ，Ｚ．Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２０００，５１，３１１−３３２）に対して直交性であり、それゆえ、タンパク質合成の範囲を拡大する。さらには、両カップリング反応は、Ｈ２Ｏの存在下にて、未保護のペプチドで実行することができる。
【０１０９】
スキーム１１はネイティブな化学的ライゲーション単独、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーション単独、および２つの方法の連続的な組み合わせによって得ることができる最も単純なタンパク質を示す。チオール保護基またはアジド保護基の使用は、これらの方法の汎用性をさらにより拡大することができる。
【０１１０】
【化３４】
0004694085.tif 000028
本発明のライゲーション方法はまた、一般的に、生合成経路において天然のチオエステル中間体を阻止するために使用され得る。多数の生合成経路はチオエステル中間体の合成を介して進行する。（最近のレビューとしては、Ｋａｔｚ，Ｌ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９７，９７，２５５７−２５７５；Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９７，９７，２５７７−２５９０；Ｍａｒａｈｉｅｌ，Ｍ．Ａ．；Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓ，Ｔ．；Ｍｏｏｔｚ，Ｈ．Ｄ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９７，９７，２６５１−２６７３；ｖｏｎ  Ｄｏｈｒｅｎ，Ｈ；Ｋｅｌｌｅｒ，Ｕ．；Ｖａｔｅｒ，Ｊ．；Ｚｏｃｈｅｒ，Ｒ  Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１９９７，９７，２６７５−２７０５；Ｃａｎｅ，Ｄ．Ｅ．；Ｗａｌｓｃｈ，Ｃ．Ｔ．；Ｋｈｏｓｌａ，Ｃ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９８，２８２，６３−６８；Ｋｏｎｚ，Ｄ．；Ｍａｒａｈｉｅｌ，Ｍ．Ａ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９９９，６，Ｒ３９−Ｒ４８；Ｋｅａｔｉｎｇ，Ｔ．Ａ；Ｗａｌｓｃｈ，Ｃ．Ｔ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９９９，３，５９８−６０６を参照のこと。）
例えば、ポリケチドの生合成およびタンパク質の非リボソーム生合成はどちらも、チオエステル中間体によって進行する。ホスフィノチオールによるこれらの中間体の阻止によって、アジドへのライゲーションはアミド結合を形成することが可能である。意義深いことには、チオエステルの生合成ライブラリとアジドの化学ライブラリとのライゲーションは、分子の多様性を増大するための容易な手段である。本発明のライゲーション方法を用いて形成される化学ライブラリは、当該分野で公知の種々の方法により生物学的機能についてスクリーニングされ得る。
【０１１１】
図１に例示されるように、本発明のライゲーション方法は、固相合成で実行され得る。ライゲーションにおけるチオエステルまたはアジド反応物のどちらかを、固体表面または支持材料へ結合し得る。固相法の使用は、本発明のライゲーションの繰り返しサイクルによるペプチドの合成のために、特に有利である。固相法の使用はまた、より大きいペプチドまたはタンパク質を製造するための２つ以上のペプチドまたはタンパク質のライゲーションのためにも有利である。結合チオエステルとホスフィノチオール試薬および非結合アジド、または結合アジドと非結合チオエステルおよびホスフィノチオール試薬の反応は、結合ライゲーション生成物を生じる。様々な種を固体表面または支持材料へ付着させるための従来の方法を使用して、チオエステル反応物またはアジド反応物のいずれかをこのような材料へ付着し得る。
【０１１２】
本発明のホスフィノチオールおよびアジドのライゲーションは、好ましくは、ＴＨＦおよび水の混合物などの混合された有機／水性溶媒中で実行される。水はアミドホスホニウム塩の加水分解に関与し、所望のアミドを生成する。ＴＨＦまたは他の有機溶媒（例えば、塩化メチレン、ＤＭＦ）は、ホスフィノチオール試薬または反応物を可溶化するために含有される。従って、溶媒中に存在する水の量は、所望の加水分解をもたらすのに十分でなければならない。十分に水溶性のホスフィノチオール試薬では、ライゲーションを水性溶媒中で実行し得る。
【０１１３】
当業者は、本明細書の説明から見て、ライゲーションに使用される特定の反応条件（例えば、溶媒、反応温度および反応時間）が、所与の反応の特定の試薬（例えば、ホスフィノチオール）、反応物および生成物（例えば、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質）にまさに依存し得ることを理解する。反応条件は当該分野で理解される方法によって容易に最適化され得る。
【０１１４】
ホスフィノチオール２を用いる反応は、かつては、生成物の精製の前に（ＨＣｌで）酸性にして実行された。少なくともホスフィノチオール２０を使用する場合には、所望のアミド生成物を得るために反応混合物へ酸を添加する必要はないと考えられる。しかしながら、反応混合物の酸性化は、生成物の収率に影響を及ぼし得る。反応混合物へ塩基を添加することによって、適切な場合には、加水分解もまた容易になり得る。
【０１１５】
本発明のライゲーション方法の生成物は、当該分野で周知の従来の方法によって精製される。ペプチドおよびタンパク質を精製するための広範な種々の方法はいずれも、本発明の方法と組み合わせて使用され得る。
【０１１６】
チオエステルおよびアジドのライゲーションに基づくプロセスは、基礎研究および創薬のどちらにとっても、タンパク質の貴重な源である。本発明の方法は、強力な生物学的活性を有する、均質で、正確に折りたたまれたタンパク質への信頼できる経路として使用され得る。本発明の使用者は、タンパク質試薬およびタンパク質治療を製造および改良するために、合成および医化学の手段を応用し得る。
【０１１７】
以下の実施例は本発明をさらに説明することを意図したもので、決して、本発明を限定するつもりではない。
【０１１８】
（実施例）
（一般的な実験）
化学薬品および溶媒は、Ｎ−メチルメルカプトアセトアミド（Ｆｌｕｋａ（登録商標））、臭化ブロモアセチル（Ａｃｒｏｓ（登録商標））、およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（登録商標））を除いて、Ａｒｄｒｉｃｈ（登録商標）から購入した。使用したＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂（クロロメチルポリスチレン−ジビニルベンゼン）は、２００〜４００メッシュ（置換０．６３ｍｍｏｌ／ｇ）および７０〜９０メッシュ（１．２６ｍｍｏｌ／ｇ）であった。Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）ＴＬＣプレート（ＡＬ  ＳＩＬ  Ｇ／ＵＶ）を用いる薄層クロマトグラフィーによって反応を監視し、ＵＶまたはＩ２によって視覚化した。ＢｒｕｋｅｒのＡＣ−３００またはＶａｒｉａｎのＵＮＩＴＹ−５００スペクトロメータを用いてＮＭＲスペクトルを得た。リン−３１ＮＭＲスペクトルをプロトンデカップリングし、重水素化リン酸の外部標準に対して参照した。マススペクトルは、ウィスコンシン大学バイオテクノロジセンター（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ）においてエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）技術を用いて得られた。
【０１１９】
（実施例１）
（チオエステル１（ここで、Ｒは、ＨまたはＢｎである）（スキーム７を参照））
フレーム乾燥された反応容器へＮ−アセチルアミノ酸（Ｎ−アセチルグリシンまたはＮ−アセチルフェニルアラニン）および１当量のＮ−メチルメルカプトアセトアミド（ＮＭＡ）をアルゴン雰囲気下でチャージし、最終濃度が０．５〜０．７Ｍになるように乾燥ＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）中に溶解した。ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド、１．１当量）を添加して、室温で１０〜１２時間、混合物を攪拌した。ＤＣＵ（ジシクロヘキシル尿素）副産物をろ過して除去し、減圧下で溶媒を除去した。ＣＨ２Ｃｌ２およびヘキサンから生成物を再結晶した。チオエステル１Ｒ＝Ｈ）は収率９０％で得られ、チオエステル１Ｒ＝Ｂｎ）は収率９２％で得られた。チオエステル１Ｒ＝Ｈ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、１：１、３００ＭＨｚ）δ８．６２（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ、１Ｈ）、８．０５（ｂｓ、１Ｈ）、４．００（ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ、２Ｈ）、３．５６（ｓ、２Ｈ）、２．５９（ｄ、Ｊ＝４．５Ｈｚ、３Ｈ）、１．９３（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、７５ＭＨｚ）δ１９７．９５、１７０．０７、１６７．１３、４８．５４、３１．８１、２５．８４、２２．２６ｐｐｍ；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ２０４．２５（Ｍ＋＝２０４．９、フラグメント１０５．９、１００．０、７２．０）。チオエステル１Ｒ＝Ｂｎ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３：ＣＤ３ＯＤ、１：１、５００ＭＨｚ）δ７．３０−７．２７（ｍ、２Ｈ）、７．２４−７．１９（ｍ、３Ｈ）、４．７９（ｄｄ、Ｊ＝１０、５Ｈｚ、１Ｈ）、３．５７（見かけ上（ａｐｐａｒｅｎｔ）１、Ｊ＝１５Ｈｚ、２Ｈ）、３．２４（ＡＢＸ、Ｊ−１４、５Ｈｚ、１Ｈ）、２．９１（ＡＢＸ、Ｊ＝１４、１０Ｈｚ、１Ｈ）、２．７６（ｓ、３Ｈ）、１．９５（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３：ＣＤ３ＯＤ、１：１、１２５ＭＨｚ）δ２００．２６、１７２．８３、１６９．９２、１３６．９３、１２９．４７、１２８．９８、１２７．４０、６１．２４、３７．７３、３２．７２、２６．７２、２２．４０ｐｐｍ；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ２９４．３７（ＭＨ＋−２９５．０、フラグメント１９０．０、１６２．２、１２０．２）。
【０１２０】
（２−ホスフィノベンゼンチオール（２））
化合物２（ｏ−を、Ｂｌｏｃｋ，Ｅ．；Ｏｆｏｒｉ−Ｏｋａｉ，Ｇ．；Ｚｕｂｉｅｔａ，Ｊ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８９，１１１，２３２７−２３２９の方法によって調製し、ＮＭＲデータ（１Ｈおよび３１Ｐ）をその公表データと相関させた。さらなるスペクトルデータ。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）δ１３７．７１（ｄ、Ｊ＝３０Ｈｚ）、１３５．９３（ｄ、Ｊ＝８．７５Ｈｚ）、１３５．３５（ｄ、Ｊ＝９．７５Ｈｚ）、１３３．９８、１３３．８３、１３０．４５、１２９．２５、１２９．００、１２８．６７（ｄ、Ｊ−６．７５Ｈｚ）、１２５．９２ｐｐｍ；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ２９４．３５（ＭＨ＋−２９５．０）。
【０１２１】
（チオエステル３（Ｒ＝ＨまたはＢｎ））
方法Ａ（チオエステル交換反応）。フレーム乾燥された反応容器へ化合物１（１当量）および化合物２（１０当量）をアルゴン雰囲気下でチャージし、乾燥ＤＭＦ（０．２５Ｍ）中に溶解した。乾燥アルゴンを混合物中でバブリングさせ、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、５当量）を添加した。混合物を１２時間攪拌したあと、さらに５当量のＤＩＥＡを添加した。少なくとも化合物２のモル量に等しい負荷容量（ｌｏａｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ）を有するＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂（高負荷容量および低負荷容量の両方を別々の場合に使用した）を混合物へ添加し、過剰のホスフィノベンゼンチオールおよびＮ−メチルメルカプトアセトアミドを除去した。この混合物をアルゴン下でさらに１２時間攪拌し、樹脂をろ過して除去した。減圧下で溶媒を除去し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２中に溶解させ、不溶のＤＩＥＡ塩をろ過して除去した。再び溶媒を除去し、残渣は、さらに精製することなく次のカップリング反応で使用した。反応は、ＴＬＣで判断されるように、定量的収率で進行した。
【０１２２】
方法Ｂ（ＤＣＣカップリング）。フレーム乾燥された反応容器へ化合物１Ｒ＝ＨまたはＲ＝Ｂｎ）（１当量）および化合物２（１当量）をアルゴン雰囲気下で添加した。ＤＣＣ（１．１当量）を添加し、反応を１２時間攪拌した。ＤＣＵ副産物をろ過して除去し、減圧下で溶媒を除去した。クロマトグラフィー（シリカゲル、酢酸エチル：ヘキサン１：１、その後１００％酢酸エチル）により化合物３Ｒ＝ＨまたはＲ＝Ｂｎ）を精製した。化合物３Ｒ＝Ｈ）は６１％の収率で得られ、化合物３Ｒ＝Ｂｎ）は５２％の収率で得られた。チオエステル３（Ｒ＝Ｈ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ７．４８（ｄｄｄ、Ｊ−５．５、４、１．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４１（ｔｄ、Ｊ＝７．５、１．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．３７−７．３２（ｍ、７Ｈ）、７．２８−７．２４（ｍ、４Ｈ）、６．９２（ｄｄｄ、Ｊ＝７．５、３、１．５Ｈｚ、１Ｈ）、５．８６（ｂｓ、１Ｈ０、４．０７（ｄ、Ｊ＝６Ｈｚ）、２Ｈ）、２．０２（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）δ１９４．８３、１７０．６３、１４４．０４、１３８．００、１３６．６８（ｄ、Ｊ＝１０．７５Ｈｚ）、１３４．８４、１３４．６９、１３０．９５、１３０．３０、１２９．６８、１２９．３４（ｄ、Ｊ＝６．８８Ｈｚ）、４９．７８、２３．６９ｐｐｍ；３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２０２Ｈｚ）−９．９１ｐｐｍ；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３９３．４４（ＭＨ＋−３９４．２、フラグメント２９５．２、２２５．２）。チオエステル３（Ｒ＝Ｂｎ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ７．４４（ｄｄｄ、Ｊ＝７．５、４、１．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．４０（ｔｄ、Ｊ＝７．５、１．５Ｈｚ、１Ｈ）、７．３６−．３１（ｍ、７Ｈ）、７．２８−７．２１（ｍ、７Ｈ）、７．１２−７．１０（ｍ、２Ｈ）、６．８９（ｄｄｄ、Ｊ＝８、３、１Ｈｚ、１Ｈ）、５．６３（ｄ、Ｊ＝１３．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．９２（ｍ、１Ｈ）、２．９５（ＡＢＸ、Ｊ＝１４．５、５．５Ｈｚ、１Ｈ）、２．６４（ＡＢＸ、Ｊ−１４、８Ｈｚ、１Ｈ）、１．９１（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）δ１９７．４７、１７０．４３、１３７．９４、１３６．４０、１３４．８３、１３４．７５、１３４．６７、１３４．５８、１３０．７９、１３０．３０、１２９．９４、１２９．６４（ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ）、１２９．３３、１２７．７７、６０．２９、３８．２４、２３．７９ｐｐｍ；３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２０２Ｈｚ）−１０．３３ｐｐｍ；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ４８３．５６（ＭＨ＋−４８４．２、フラグメント２９５．２）。
【０１２３】
（アジド４）
フレーム乾燥された反応容器へベンジルアミン（２０．４ｍＬ、１８６ｍｍｏｌ）および塩化メチレン（１８６ｍＬ）をアルゴン雰囲気下で添加し、溶液を氷浴中で０℃まで冷却した。臭化ブロモアセチル（８．１ｍＬ、９３ｍｍｏｌ）を溶液へ滴下した。ほぼ即座に、溶液からベンジルアミンのＨＢｒ塩が沈殿した。反応を室温まで暖め、１時間攪拌した。ベンジルアミン塩をろ過して除去し、有機相を２ＮのＨＣｌ（７５ｍＬ）で２回洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、減圧下で溶媒を除去した。得られた白色固体をＴＨＦ（２００ｍＬ）および水（５０ｍＬ）中に溶解させた。アジ化ナトリウム（３０．３ｇ、４６６ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１７時間還流させながら激しく攪拌した。次に有機層を水層から分離させ、飽和食塩溶液（７５ｍＬ）で２回洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、ろ過し、減圧下で溶媒を除去した。アジド６を９８％の収率で単離し、更に精製することなく使用した。スペクトルデータ。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ７．３９−７．２７（ｍ、５Ｈ）、６．７１（ｂｓ、１Ｈ）、４．４７（ｄ、Ｊ＝５、７Ｈｚ）、４．００（ｓ、２Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）δ１６６．６６、１３７．３９、１２８．４３、１２７．４５、１２７．３５、５２．０６、４３．０８ｐｐｍ；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ１９０．２０（ＭＨ＋＝１９１．０、フラグメント９１．２）。
【０１２４】
（アミド５Ｒ＝ＨまたはＢｎ））
チオエステル３Ｒ＝ＨまたはＢｎ）（１当量）およびアジド６（１当量）をＴＨＦ：Ｈ２Ｏ（３：１）中０．２Ｍの濃度へ溶解させた。おそらく、遊離したチオレートから、黄色が急速に生じた。室温で１２〜１６時間、混合物を攪拌し、次に、黄色が透明になるまで２ＮのＨＣｌで酸性にした。減圧下で溶媒を除去し、クロマトグラフィー（シリカゲル、塩化メチレン中２．５〜１０％メタノール）によって、アミド生成物をホスフィンオキシド副産物（これもスペクトル的に特徴付けたが、データは示さない）から分離した。精製はしばしば複数のカラムを必要とした。アミド７および８の収率は１５％〜４０％の範囲であった。アミド５Ｒ＝Ｈ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ２：ＣＤ３ＯＤ、１：１、５００ＭＨｚ）δ７．３３−７．２２（Ｍ、５Ｈ）、４．４１（ｓ、２Ｈ）、３．９２（ｓ、２Ｈ）、３．８６（ｓ、２Ｈ）、２．０１（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３：ＣＤ３ＯＤ、１：１、１２５ＭＨｚ）δ１７３．５６、１７１．５２、１７０．６７、１３８．８３、１２９．０４、２１８．０２、１２７．７８、４３．７０、４３．６２、４３．１６、２２．４５ｐｐｍ；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ２６３．２９（ＭＨ＋−２６４．０）。アミド５Ｒ＝Ｂｎ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３：ＣＤ３ＯＤ、１：１、５００ＭＨｚ）δ７．３２−７．１９（ｍ、１０Ｈ）、４．４８（見かけ上、ｔ、Ｊ−７．５Ｈｚ、１Ｈ）、４．４４（ｄ、Ｊ＝１５Ｈｚ、１Ｈ）、４．３４（ｄ、Ｊ＝１４．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．９５（ｄ、Ｊ＝１６．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．７１（ｄ、Ｊ＝１６．５Ｈｚ、１Ｈ）、３．１１（ｄｄ、Ｊ＝１３．５、７Ｈｚ、１Ｈ）、２．９４（ｄｄ、Ｊ＝１４、８Ｈｚ、１Ｈ）、１．８８（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３：ＣＤ３ＯＤ、１：１、１２５ＭＨｚ）δ１７３．４２、１７２．８１、１７０．３４、１３８．６１、１３７．１８、１２９．５５、１２９．０１、１２８．９３、１２７．８６、１２７．６８、１２７．４０、５６．１２、４３．５３、４３．１８、３７．７６、２２．３６ｐｐｍ；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３５３．４２（ＭＮａ＋＝３７６．２、ＭＨ＋＝３５４．２、フラグメント１６５．２、１２０．２、９１．２）。
【０１２５】
（実施例２）
（ホスフィンオキシド２４（スキーム９参照））
新たに蒸留したＴＨＦ（２４０ｍＬ）中にクロロメチルホスホン酸ジクロリド２３（２０ｇ、１２０ｍｍｏｌ）を溶解した。臭化フェニルマグネシウム（１．０Ｍ）のＴＨＦ（２４０ｍＬ、２４０ｍｍｏｌ）溶液を１時間にわたって滴状で添加した。得られた混合物を２４時間還流させながら攪拌した。次に水（２０ｍＬ）の添加によって反応を失活させ、減圧下で溶媒を除去した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２中に溶解させ、水（５０ｍＬ）で１回、および食塩水（５０ｍＬ）で１回洗浄した。無水ＭｇＳＯ４（ｓ）により有機層を乾燥させ、ろ過し、減圧下で溶媒を除去した。フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、塩化メチレン中３％のメタノール）によって残渣を精製した。ホスフィンオキシド２４は、白色固体として収率６３％で単離された。スペクトルデータ。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ７．８４−７．７９（ｍ、４Ｈ）、７．６２−７．５８（ｍ、２Ｈ）、７．５４−７．５０（ｍ、４Ｈ）、４．０５（ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）δ１３２．６０、１３１．５１（ｄ、Ｊ＝９．６Ｈｚ）、１２９．６４（ｄ、Ｊ＝１０３．９Ｈｚ）、１２８．７２（ｄ、Ｊ＝１１．６Ｈｚ）、３７．６４（ｄ、Ｊ＝７１．９Ｈｚ）ｐｐｍ；３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２０２Ｈｚ）２８．４６ｐｐｍ；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ２５０．０３（ＭＨ＋＝２５１．０、Ｍ２Ｈ＋−５０１．２、フラグメント１７３．０、１４３．０、９１．０）。
【０１２６】
（化合物２５）
ホスフィンオキシド２４（１８．９４ｇ、７５．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．４５Ｌ）中に溶解した。チオ酢酸（３４．３ｍＬ、４８０ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を氷浴中で冷却した。Ａｒ（ｇ）を反応混合物中に１時間バブリングさせた。ジイソプロピルエチルアミン（８３．６ｍＬ、４８０ｍｍｏｌ）を滴状で添加し、得られた混合物を２４時間還流させて加熱した。別の一定量のチオ酢酸を、室温に放置すると凝固するオレンジオイルとして単離した。次に（３５．２ｍＬ、４９２ｍｍｏｌ）を添加した後、トリエチルアミン（６０．０ｍＬ、４９２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物をさらに２４時間還流させて加熱し、その後、よく換気したフード内で（悪臭！）、減圧下で溶媒を除去した。得られた黒色オイルを塩化メチレン（０．３５Ｌ）に溶解し、この溶液を２ＮのＨＣｌ（０．１５Ｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム溶液（０．１５Ｌ）、および食塩水（０．１５Ｌ）で洗浄した。有機層を無水ＭｇＳＯ４（ｓ）で乾燥させ、ろ過した。この溶液へ活性炭を添加し、次に３０分間還流させて加熱した。活性炭をろ過によって除去し、減圧下で溶媒を除去し、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン中７０＆酢酸エチル）で精製した。溜まった画分を塩化メチレン（０．３０Ｌ）に溶解し、活性炭による処理を繰り返した。溶媒を除去して、チオアセテート２５を、室温に放置すると凝固するオレンジオイルとして単離した。この反応の収率は８５％であった。スペクトルデータ。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ７．８０−７．７５（ｍ、４Ｈ）、７．５６−７．５２（ｍ、２Ｈ）、７．４９−７．４６（ｍ、４Ｈ）、３．７７（ｄ、Ｊ＝８Ｈｚ、２Ｈ）、２．２５（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）δ１９２．８２、１３２．１１、１３１．０５（ｄ、Ｊ＝１０２Ｈｚ）、１３０．８６（ｄ、Ｊ＝９．７５Ｈｚ）、１２８．４６（ｄ、Ｊ＝１２．６３Ｈｚ）、２９．８３、２７．１２（ｄ、Ｊ＝６９．８８Ｈｚ）ｐｐｍ；３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２０２ＭＨｚ）δ２９．１４ｐｐｍ；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ２９０．０５（ＭＨ＋＝２９１．０、Ｍ２Ｈ＋＝５８１．２、フラグメント２４９．２、１７１．０、１２５．０）。
【０１２７】
（ホスフィン２６）
チオアセテート２５（１８．６５ｇ、６４．２ｍｍｏｌ）を無水クロロホルム（１６０ｍＬ）中に溶解した。この溶液へ、トリクロロシラン（９７ｍＬ、９６３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をＡｒ（ｇ）下で７２時間攪拌した。減圧下で溶媒を除去し（注意：除去した溶媒中の過剰のトリクロロシランは、十分換気したフード内で飽和炭酸水素ナトリウム溶液をゆっくり添加することによって失活させた）、残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、塩化メチレン中３％のメタノール）により精製した。ホスフィン２６は、白色固体として９８％の収率で単離された。スペクトルデータ。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、５００ＭＨｚ）δ７．４３−７．４０（ｍ、４Ｈ）、７．３３−７．３０（ｍ、６Ｈ）、３．５０（ｄ、Ｊ＝４Ｈｚ、２Ｈ）、２．２３（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）δ１９４．０１、１３６．４２（ｄ、Ｊ＝１３．６Ｈｚ）、１３２．２８（ｄ、Ｊ＝１９．４Ｈｚ）、１２８．６９、１２８．１１（ｄ、Ｊ＝６．８Ｈｚ）、２９．８３、２５．４１（ｄ、Ｊ＝２３．４Ｈｚ）ｐｐｍ；３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２０２ＭＨｚ）−１５．１１ｐｐｍ；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ２７４．０６（ＭＨ＋＝２７５．０、フラグメント２３３．０、１９９．２、１２１．２）。
【０１２８】
（（ジフェニルホスフィノ）メタンチオール（２０））
ホスフィン２６（１７．２７ｇ、６３．０ｍｍｏｌ）を無水メタノール（０．４０Ｌ）中に溶解し、Ａｒ（ｇ）を１時間、溶液中にバブリングさせた。次に水酸化ナトリウム（５．０４ｇ、１２７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をアルゴン下で２時間攪拌した。減圧下で溶媒を除去し、残渣を塩化メチレン（０．３０Ｌ）に溶解させた。得られた溶液を２ＮのＨＣｌ（２×０．１０Ｌ）および塩水（０．１０Ｌ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４（ｓ）で乾燥させ、ろ過し、減圧下で溶媒を除去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（アルミナ、ヘキサン中２５％の酢酸エチル）で精製した。（ジフェニルホスフィノ）メタンチオール２は、透明オイルとして収率７４％で単離された。スペクトルデータ。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ７．４１−７．３８（ｍ、４Ｈ）、７．３３−７．２６（ｍ、６Ｈ）、３．０２（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ）、１．３８（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、１Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）δ１３２．５４（ｄ、Ｊ＝１７．１Ｈｚ）、１２８．８６、１２８．３６、１２８．１４、２０．６０（ｄ、Ｊ＝２１．７Ｈｚ）ｐｐｍ；３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２１ＭＨｚ）δ−７．９４ｐｐｍ；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ２３２．０５（ＭＨ＋−２３３．０、フラグメント１８３．０、１５５．０、１３９．０、９１．２）。
【０１２９】
（ＡｃＰｈｅＣＨ２ＰＰｈ２（表１））
方法Ａ（チオエステル転移反応）。ホスフィノチオール２０（５００ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）に溶解した。溶液を、０．５時間Ａｒ（ｇ）をバブリングさせることによって、酸素除去した。この溶液へＮａＨ（５１．６ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物はスラリーを形成し、これにＤＭＦ（２ｍＬ）を添加して、任意の沈殿物を溶解させた。Ｎ−アセチルフェニルアラニンのＮ−メチルメルカプトアセトアミド（ＮＭＡ）チオエステル（６３ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を８時間攪拌した。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂（１．５ｇ、１．２６ｍｍｏｌ／ｇ）を添加し、６時間攪拌し、ろ過で樹脂を除去することによって、未反応ホスフィノチオール２０を除去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン中５０％の酢酸エチル）で精製した。ＡｃＰｈｅＳＣＨ２ＰＰｈ２は、白色固体として収率９２％で単離された。
【０１３０】
方法Ｂ（ＤＣＣカップリング）。化合物２０（５００ｍｇ、２．１５ｍｍｏｌ）およびＮ−アセチルフェニルアラニン（４４６ｍｇ、２．１５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１５ｍＬ）にＡｒ（ｇ）下で溶解させた。次に、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、４８９ｍｇ、２．３７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で１２時間攪拌した。１，３−ジシクロヘキシル尿素（ＣＵ）副産物をろ過により除去し、減圧下で溶媒を除去し、方法Ａと同様に残渣をクロマトグラフィーで精製した。ＡｃＰｈｅＳＣＨ２ＰＰｈ２は、白色固体として８４％の収率で単離された。スペクトルデータ。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ７．４４−７．３９（ｍ、４Ｈ）、７．３５−７．３３（ｍ、６Ｈ）、７．２６−７．２１（ｍ、３Ｈ）、７．１１−７．０９（ｍ、２Ｈ）、６．２９（ｄ、Ｊ＝８．４Ｈｚ、１Ｈ）、４．９８−４．９１（ｍ、１Ｈ）、３．５７−３．４４（ｍ、２Ｈ）、３．０９（ｄｄ、Ｊ＝１４．１、５．４Ｈｚ、１Ｈ）、２．９３（ｄｄ、Ｊ＝１４．１、７．５Ｈｚ、１Ｈ）、１．８８（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２５ＭＨｚ）δ１９８．９０１、１６９．８６、１３５．５０、１３２．６２（ｄ、Ｊ＝１９．４Ｈｚ）、１２９．１１（ｄ、Ｊ−９．８Ｈｚ）、１２８．７９（ｄ、Ｊ＝３５．９Ｈｚ）、１２８．５０、１２８．４５、１２６．９９、５９．５６、３７．９９、２５．６１（ｄ、Ｊ＝２４．４Ｈｚ）、２２．８８ｐｐｍ；３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２１ＭＨｚ−４４．５５ｐｐｍ。
【０１３１】
（ＡｃＧｌｙＣＨ２ＰＰｈ２（表１））
方法Ａ。ホスフィノチオール２０（５００ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）を５ｍＬの乾燥ＴＨＦに溶解させた。溶液を、０．５時間Ａｒ（ｇ）をバブリングさせることによって、酸素除去した。この溶液へＮａＨ（５１．６ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物はスラリーを形成し、これにＤＭＦ（２ｍＬ）を添加して、任意の沈殿物を溶解させた。Ｎ−アセチルグリシンのＮＭＡチオエステル（４４ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を８時間攪拌した。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ樹脂（１．５ｇ、１．２６ｍｍｏｌ／ｇ）を添加し、６時間攪拌し、ろ過で樹脂を除去することによって、未反応ホスフィノチオール２０を除去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン中５０％の酢酸エチル）で精製した。ＡｃＧｌｙＣｈ２ＰＰｈ２は、白色固体として収率９１％で単離された。
【０１３２】
方法Ｂ。ホスフィノチオール２０（１００ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）およびＮ−アセチルグリシン（５５ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３ｍＬ）にＡｒ（ｇ）下で溶解させた。ＤＣＣ（９８ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１２時間攪拌した。ＤＣＵ副産物をろ過により除去し、減圧下で溶媒を除去し、方法Ａと同様に残渣をクロマトグラフィーで精製した。ＡｃＧｌｙＣＨ２ＰＰｈ２は、白色固体として６７％の収率で単離された。スペクトルデータ。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、３００ＭＨｚ）δ７．４６−７．３９（ｍ、４Ｈ）、７．３８−７．３６（ｍ、６Ｈ）、６．４４（ｂｓ、１Ｈ）、４．１５（ｄ、Ｊ＝５／７Ｈｚ、２Ｈ）、３．５３（ｄ、Ｊ＝３．６Ｈｚ、２Ｈ）、２．０２（ｓ、３Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、７５ＭＨｚ）δ１９６．１３、１７０．２９、１３６．４５（ｄ、Ｊ＝１３．６Ｈｚ）、１３２．６２（ｄ、Ｊ＝１９．１Ｈｚ）、１２９．１７、１２８．５４（ｄ、Ｊ＝６．７Ｈｚ）、４８．９８、２５．２９（ｄ、Ｊ−２４．２Ｈｚ）、２２．８４ｐｐｍ；３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、１２１ＭＨｚ）δ−１５．２０ｐｐｍ；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３３１．０８（ＭＨ＋−３３２．２、ＭＫ＋−３７０．０）。
【０１３３】
（ＡｃＧｌｙＮＨＢｎ（表１））
チオエステルＡｃＳＣＨ２ＰＰｈ２（２７１ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）およびアジドＮ２ＧｌｙＮＨＢｎ（１８７ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（３：１、９．４ｍＬ）に溶解させ、混合物を室温で１２時間攪拌した。減圧下で溶媒を除去し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、塩化メチレン中５％のメタノール）によって残渣を精製した。ＡｃＧｌｙＮＨＢｎは、白色固体として収率９１％で得られた。スペクトルデータ。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３：ＣＤ３ＯＤ、１：１、１２５ＭＨｚ）δ１７１．７６、１６９．３７、１３７．４９、１２７．８３、１２６．７７、１２６．５９、４２．５０、４２．０９、２１．３２ｐｐｍ；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ２０６．１１（ＭＨ＋−２０７．０）。
【０１３４】
他のアミド生成物について、およびＮＭＡチオエステルについての実験的およびスペクトル的情報は、Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｂ．Ｌ．；Ｋｉｅｓｓｌｉｎｇ，Ｌ．Ｌ．；Ｒａｉｎｅｓ，Ｒ．Ｔ．Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００，２，１９３９−１９４１のサポーティングインフォメーション（Ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に見出され得、これはその全体が本明細書中に参考として援用される。
【０１３５】
（実施例３：セーフティキャッチ樹脂を用いるペプチドホスフィノチオエステルの合成）
ペプチドの合成および活性化。ＢａｃｋｅｓおよびＥｌｌｍａｎの方法（Ｂａｃｋｅｓ，Ｂ．Ｊ．；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９９，６４，２３２２−２３３０）に従って、４−スルファミルブチリルＡＭ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ０１−６４−０１５２）をＦｍｏｃＧｌｙＯＨで充填した。Ｇｌｕ（ｔＢｕ）およびＣｙｓ（Ｔｒｔ）によるペプチド鎖伸長を、標準ＰｙＢＯＰ／ＨＯＢｔカップリング手順を用いて実行した。
【０１３６】
樹脂の活性化。約１ｇの樹脂（０．４７７ｍｍｏｌのペプチド）をＣＨ２Ｃｌ２中で１時間膨潤させ、次に排出した。ヨードアセトニトリル（１．８ｍＬ、２５ｍｍｏｌ）、ジイソプロピル−エチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１．７ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）、および１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ、４０ｍＬ）を混合し、塩基性アルミナのプラグによってろ過し、続いて樹脂へ添加した。室温で１８時間、Ａｒ（ｇ）をバブリングさせることによって樹脂を攪拌した。次に樹脂をＮＭＰ（５×１０ｍＬ）、ＤＭＦ（５×１０ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（５×１０ｍＬ）で洗浄した。次に樹脂を、直ちに次の工程で使用した。
【０１３７】
ペプチドホスフィノチオエステルの樹脂からの遊離。２０ｍＬのＤＭＦ中の（ジフェニルホスフィノ）メタンチオール（０．８８ｇ、３．８ｍｍｏｌ）を活性セーフティキャッチ樹脂へ添加した。Ａｒ（ｇ）をバブリングさせることによって混合物を１８時間攪拌した。次に樹脂をろ過し、ＤＭＦ（５×１０ｍＬ）およびＣＨ２Ｃｌ２（５×１０ｍＬ）で洗浄した。溶出液を捕集し、減圧下で溶媒を除去した。残渣をクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン中３０％ＥｔＯＡｃ）により精製し、２８５ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃＣｙｓ（Ｔｒｔ）Ｇｌｕ（ｔＢｕ）ＧｌｙＳＣＨ２ＰＰｈ２を白色固体として得た。活性ペプチドについてのＦｍｏｃ−充填アッセイ（Ｆｍｏｃ−ｌｏａｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）に基づいて、これは、所望のペプチドホスフィノチオエステルの収率５７％であることを示す。
【０１３８】
当業者は、本明細書中に特に開示された以外の方法、試薬、反応物、反応条件（例えば、溶媒、温度、反応時間）および精製方法が、必要以上の実験なしに本発明の実行において使用可能であることを理解する。本明細書中に特に開示または説明された方法、試薬、反応物、反応条件、および精製方法の当該分野で公知の全ての機能的等価物は、それぞれが参考として個々に援用されるように、その全体が本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、本発明の連結方法のタンパク質合成への適用を示す図である。
【図１】
0004694085.tif 000037