(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とする血管障害の程度の検出方法。
【請求項２】
血管障害の程度が、心疾患の程度または脳血管疾患の程度である請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
被検試料が、血液、血清または血漿である請求項１または２記載の検出方法。
【請求項４】
抗ＰＴＸ３抗体を用いて被検試料中のＰＴＸ３タンパク質濃度を測定するものである請求項１〜３のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項５】
支持体に固定した抗ＰＴＸ３抗体と標識物質で標識された抗ＰＴＸ３抗体を用いる請求項４記載の検出方法。
【請求項６】
標識物質がビオチンである請求項５記載の検出方法。
【請求項７】
抗ＰＴＸ３抗体が全長ＰＴＸ３およびそのペプチド断片を認識する抗体である請求項４〜６のいずれかの１項記載の検出方法。
【請求項８】
抗ＰＴＸ３抗体を含有する血管障害の程度の診断薬。
【請求項９】
支持体に固定した抗ＰＴＸ３抗体と、標識物質で標識された抗ＰＴＸ３抗体を含むものである請求項８記載の診断薬。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、血管障害の程度の判定方法および血管障害治療薬のスクリーニング方法に関する。
【技術分野】
【０００２】
ＰＴＸ３は、Ｐｅｎｔｒａｘｉｎ、Ｐｅｎｔａｘｉｎ、ＴＳＧ−１４、ＭＰＴＸ３とも呼ばれ、インターロイキン１（ＩＬ−１）刺激を受けたヒト臍帯内皮細胞に発現しているものとして発見されたペントラキシンファミリーに属する分泌タンパク質である（非特許文献１）。【０００３】
ペントラキシンファミリーには炎症性タンパクとして知られているＣ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＰ）やｓｅｒｕｍ  ａｍｙｌｏｉｄ  Ｐ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ（ＳＡＰ）などが存在する。Ｐｅｎｔｒａｘｉｎは、別名Ｌｏｎｇ  Ｐｅｎｔｒａｘｉｎとも呼ばれ、ＣＲＰはＳｈｏｒｔ  Ｐｅｎｔｒａｘｉｎともよばれる。Ｐｅｎｔｒａｘｉｎは構造中にＣＲＰ配列部分を有することからの呼称であり、炎症性タンパクとして機能していることが推定される。しかし、ＰＴＸ３はＣＲＰやＳＡＰと異なりＩＬ−６による誘導を受けない。またＰＴＸ３タンパク質を発現する細胞種もＣＲＰやＳＡＰとは異なることから、ＰＴＸ３はＣＲＰやＳＡＰとは異なる機能も有することが示唆されている（非特許文献２）。【０００４】
一方で、炎症反応の一種と考えられる急性心筋梗塞の患者でＰＴＸ３の血中濃度が高く上がること、小血管炎のインディケータとなりうる、進行性動脈硬化巣プラークにおける免疫染色による検出等が発見され、炎症への関与が推定された（非特許文献３）。【０００５】
炎症と言う呼称は広範囲に渡り、皮膚炎、各種臓器の炎症等がある。それらの中で血管の炎症は心疾患、脳疾患等の重篤な疾患に繋がる。心疾患においては、急性心筋梗塞の危険因子として血中高総コレステロール値、高血圧、糖尿病、肥満、喫煙が挙げられる。血中高総コレステロール値については、この危険因子除去のため食事療法のみならず高脂血症低下剤として各種スタチン類による治療がなされている。脳疾患においては、血管障害による痴呆症等があげられ、アスピリンによる治療が行われている。【０００６】
従来のＰＴＸ３の測定法として、非特許文献３に記載のＥＬＩＳＡ法による方法が知られている。この測定法においては、ＰＴＸ３濃度は、心筋梗塞発作の７．５時間に最大値が２２ｎｇ／ｍＬとなり、その後急激に減少し、心疾患を有していないと思われる正常者の０．５から２．５ｎｇ／ｍＬになるとの記載がある。このように、従来のＰＴＸ３測定結果によれば、心筋梗塞発作時のみに血中ＰＴＸ３濃度が高くなることは知られているが、心筋梗塞や脳血管障害性痴呆症になる以前の段階でＰＴＸ３濃度がどのように変化しているのかは全くわかっていない。【０００７】
血管障害の治療薬として、高脂血症治療薬スタチンおよび解熱・鎮痛薬アスピリンが知られているが、それらは疫学的調査により血管障害を改善することが明らかにされたものであり、血管障害治療を目的に開発された薬物は無い。
【非特許文献１】Ｂｒｅｖｉｏｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，  ２６７（３１），２２１９０−７（１９９２）
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７（３１），２２１９０−７（１９９２）；Ｄｏｍｙａｋｕ  Ｋｏｋａ（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ），２４（７−８），３７５−８０（１９９６）
【非特許文献３】Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，４４／１２  （２８４１−５０），２００１、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０２，６３６−４１（２０００）、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２００２；２２：ｅ１０−ｅ１４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
心筋梗塞や脳血管障害性痴呆症になる以前の血管障害の程度が判定できれば、心疾患や脳血管疾患の程度が診断でき、かつ心疾患治療薬や脳血管疾患治療薬の治療効果が判定できる。また、血管障害の程度が判定できる系が開発できれば、血管障害治療薬のスクリーニングも可能となる。
従って本発明の目的は、心筋梗塞や脳血管障害性痴呆症の危険因子としての血管障害の程度を判定する方法および血管障害治療薬のスクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで本発明者は、心筋梗塞の発作時急性期にしか血中濃度が上昇しないと考えられていたＰＴＸ３濃度に着目し、血管障害を治療することが知られているスタチン類およびアスピリンを用い、それらの投与前後で血中のＰＴＸ３タンパク濃度を測定したところ、これらの薬物投与後に明確にＰＴＸ３濃度が低下した。さらに、心筋梗塞ならびにその前兆疾患と考えられる安定狭心症および不安定狭心症患者について血漿中ＰＴＸ３濃度を測定した結果、血管障害の重篤化に比例しＰＴＸ３の濃度が明らかに高値を示した。
一方、ＰＴＸ３と同じくペントラキシンファミリーに属する炎症性タンパクであるＣＲＰが感冒の診断として使用されていることから、感冒患者における血液中ＰＴＸ３濃度を検討した。その結果、ＣＲＰとは異なり血中濃度の上昇は認められなかった。これらのことから、ＰＴＸ３が全身性の炎症反応の診断マーカーではなく、血管に特異性の高い、障害の程度を知るに有用な診断マーカーであることを見出した。またこの方法が血管障害治療薬のスクリーニング方法として使用できることを見出し、本発明を完成した。【００１０】
本発明において、新たに抗ＰＴＸ３抗体を作製し高感度測定系を確立し、スタチン投与前後およびアスピリン投与前後の血清中ＰＴＸ３を測定し、投与後のＰＴＸ３低下が確認されたことから、本発明を完成させるに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、被検試料中のＰＴＸ３濃度を測定することを特徴とする血管障害の程度の判定方法を提供するものである。
また、本発明は、抗ＰＴＸ３抗体を含有する血管障害の程度の診断薬を提供するものである。
さらに本発明は、動物または細胞に被験物質を投与または接触させ、ＰＴＸ３タンパク質又はＰＴＸ３遺伝子量の変化を測定することを特徴とする血管障害治療薬のスクリーニング方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、急性心筋梗塞や血管障害性痴呆症等が発症する以前における血管障害の程度が診断できることで、心疾患や脳血管疾患の程度が診断でき、より重篤な心および脳疾患への移行を予防することができる。また、薬物治療による血管障害の治療指針を得ることができる。さらに、心および脳血管障害の新規な治療薬をスクリーニングすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ウエスタンブロティングによるリコンビナントＰＴＸ３と天然ＰＴＸ３の比較結果を示す図である。
【図２】新規構築した複数のＥＬＩＳＡ標準曲線を示す図である。
【図３】臨床試料測定に供した新規構築のＰＴＸ３測定系と従来法のＰＴＸ３測定系との比較を示す図である。
【図４】心疾患患者血液中ＰＴＸ３の測定結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
測定とは、定量的または非定量的な測定を含み、例えば、非定量的な測定としては、単にＰＴＸ３タンパク質が存在するか否かの測定、ＰＴＸ３タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定、ＰＴＸ３タンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定などを挙げることができ、定量的な測定としては、ＰＴＸ３タンパク質の濃度の測定、ＰＴＸ３タンパク質の量の測定などを挙げることが出来る。なおＰＴＸ３遺伝子の塩基配列を配列番号１に、ＰＴＸ３タンパク質のアミノ酸配列を配列番号２に示す。【００１５】
被検試料とは、ＰＴＸ３のタンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されないが、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿などを挙げることができるが、好ましいのは血液、血清、血漿である。又、生物の体から採取された細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。【００１６】
血管の障害は血管内皮細胞の障害、血管中膜平滑筋細胞の遊走、マクロファージの集積・泡沫化、血栓の付着、プラークの形成、血管の線維化、プラークの破裂といった経過を辿り、重篤な疾患を呈す。
すなわち、本発明における血管障害には、高脂血症および脳疾患の他に高血圧症、糖尿病、肥満および喫煙が原因として生ずる血管障害が含まれる。
また、本発明における血管障害の程度とは上記血管障害の進行過程に伴う障害の程度を言う。すなわち、上記進行過程をたどる血管障害は最終的なプラークの破裂に至る程度の尺度として病理組織的に次のように示される。（ａ）ｌｉｐｉｄ  ｃｏｒｅの大きさ、（ｂ）ｆｉｂｒｏｕｓ  ｃａｐ  の厚さ、（ｃ）ｓｈｅａｒ  ｓｔｒｅｓｓの強さ、（ｄ）炎症細胞の浸潤の程度の具合であり、（ａ）は大きければ大きいほど、（ｂ）は薄ければ薄いほど、（ｃ）は強ければ強いほど、（ｄ）は強ければ強いほどプラーク破裂のしやすさは増す。したがって本発明における血管障害の程度は上記の（ａ）〜（ｄ）の程度を言う。【００１７】
本発明方法においては、ＰＴＸ３の測定は、抗ＰＴＸ３抗体を用いる免疫学的測定法が好ましい。以下、抗ＰＴＸ３抗体を用いた測定法について詳細に説明する。
１．抗ＰＴＸ３抗体の作製
本発明で用いられる抗ＰＴＸ３抗体はＰＴＸ３タンパク質に特異的に結合すればよく、その由来、種類（モノクローナル、ポリクローナル）および形状を問わない。具体的には、マウス抗体、ラット抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト型化抗体などの公知の抗体を用いることができる。抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
又、支持体に固定される抗ＰＴＸ３抗体と標識物質で標識される抗ＰＴＸ３抗体はＰＴＸ３分子の同じエピトープを認識してもよいが、異なるエピトープを認識することが好ましい。【００１８】
本発明で使用される抗ＰＴＸ３抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗ＰＴＸ３抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものを含む。【００１９】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、ＰＴＸ３を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。【００２０】
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。
まず、抗体取得の感作抗原として使用されるＰＴＸ３を、入手可能な細胞の培養上清から精製して得る。あるいは、特表２００２−５０３６４２に開示された方法に従い得ることも出来る。
次に、この精製ＰＴＸ３タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、ＰＴＸ３の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトＰＴＸ３のアミノ酸配列より化学合成により得ることもできるし、ＰＴＸ３遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで得ることもでき、さらに天然のＰＴＸ３をタンパク質分解酵素により分解することによっても得ることができる。部分ペプチドとして用いるＰＴＸ３の部分および大きさは限られない。【００２１】
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。【００２２】
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法に従って行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に４〜２１日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。特に分子量の小さい部分ペプチドを感作抗原として用いる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。【００２３】
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。【００２４】
前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．（１９７９）１２３，１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１，１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６，５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ．Ｄ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９７６）８，４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６，２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ  Ｓｔ．  Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５，１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８，３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１３１−１３３）等が好適に使用される。【００２５】
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。【００２６】
より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等が使用され、さらに所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。【００２７】
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を１〜１０倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なＲＰＭＩ１６４０培養液、ＭＥＭ培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。【００２８】
細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め３７℃程度に加温したポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば平均分子量１０００〜６０００程度）溶液を通常３０〜６０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。【００２９】
このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。上記ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。【００３０】
目的とする抗体のスクリーニングおよび単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法で行えばよい。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の９６ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させ、担体を洗浄した後に酵素標識第２次抗体等を反応させることにより、培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれるかどうか決定できる。目的とする抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることができる。この際、抗原としては免疫に用いたものを用いればよい。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＴＸ３に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、ＰＴＸ３への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平１−５９８７８号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるＰＴＸ３を投与して抗ＰＴＸ３抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からＰＴＸ３に対するヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ９４／２５５８５号公報、ＷＯ９３／１２２２７号公報、ＷＯ９２／０３９１８号公報、ＷＯ９４／０２６０２号公報参照）。【００３１】
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。【００３２】
当該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。【００３３】
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる（例えば、Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９０）１９２，７６７−７７５，１９９０参照）。
具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を産生するハイブリドーマから、抗ＰＴＸ３抗体の可変（Ｖ）領域をコードするｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により行って全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等を使用して目的のｍＲＮＡを調製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。【００３４】
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いて抗体Ｖ領域のｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（生化学工業社製）等を用いて行う。また、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うには、５’−Ａｍｐｌｉ  ＦＩＮＤＥＲ  ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびＰＣＲを用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５，８９９８−９００２、Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）等を使用することができる。【００３５】
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を精製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするＤＮＡの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。【００３６】
目的とする抗ＰＴＸ３抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（Ｃ領域）をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターへ組み込む。【００３７】
本発明で使用される抗ＰＴＸ３抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。【００３８】
抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（Ｈ鎖）または軽鎖（Ｌ鎖）をコードするＤＮＡを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはＨ鎖およびＬ鎖をコードするＤＮＡを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（ＷＯ９４／１１５２３号公報参照）。【００３９】
また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生されるタンパク質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。【００４０】
本発明では、上記抗体のほかに、人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。【００４１】
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体Ｖ領域をコードするＤＮＡをヒト抗体Ｃ領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。【００４２】
ヒト型化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ；  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出願公開番号ＥＰ  １２５０２３号公報、ＷＯ９６／０２５７６号公報参照）。【００４３】
具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）とを連結するように設計したＤＮＡ配列を、ＣＤＲおよびＦＲ両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲ法により合成する（ＷＯ９８／１３３８８号公報に記載の方法を参照）。【００４４】
ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９３）５３，８５１−８５６）。【００４５】
キメラ抗体およびヒト型化抗体のＣ領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよい。【００４６】
キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域およびＣ領域とからなる。ヒト型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。【００４７】
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られず、ＰＴＸ３に結合する限り、抗体の断片またはその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、１個のＦａｂと完全なＦｃを有するＦａｂ／ｃ、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６、Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．＆  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６５２−６６３、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１２１，６６３−６６９、Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７参照）。【００４８】
ｓｃＦｖは、抗体のＨ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域とを連結することにより得られる。このｓｃＦｖにおいて、Ｈ鎖Ｖ領域とＬ鎖Ｖ領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。Ｖ領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。【００４９】
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体のＨ鎖またはＨ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡ、およびＬ鎖またはＬ鎖Ｖ領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部または所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、およびその両端が各々Ｈ鎖、Ｌ鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。【００５０】
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。【００５１】
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。【００５２】
抗体の修飾物として、標識物質等の各種分子と結合した抗ＰＴＸ３抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。【００５３】
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）であってもよい。二重特異性抗体はＰＴＸ３分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がＰＴＸ３を認識し、他方の抗原結合部位が標識物質等を認識してもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体のＨＬ対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。【００５４】
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その３’側下流にポリＡシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｅｎｈａｎｃｅｒ）を挙げることができる。【００５５】
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター１ａ（ＨＥＦ１ａ）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等が挙げられる。【００５６】
ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｕｌｌｉｇａｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）により、また、ＨＥＦ１ａプロモーター／エンハンサーを使用する場合はＭｉｚｕｓｈｉｍａらの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）により、容易に遺伝子発現を行うことができる。【００５７】
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列および発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させることができる。プロモーターとしては、例えばｌａｃｚプロモーター、ａｒａＢプロモーターを挙げることができる。ｌａｃｚプロモーターを使用する場合はＷａｒｄらの方法（Ｎａｔｕｒｅ（１０９８）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）により、あるいはａｒａＢプロモーターを使用する場合はＢｅｔｔｅｒらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，  １０４１−１０４３）により発現することができる。【００５８】
抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直して（ｒｅｆｏｌｄ）使用する。【００５９】
複製起源としては、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）遺伝子、チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｅｃｏｇｐｔ）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子等を含むことができる。【００６０】
本発明で使用される抗体の製造のために、任意の発現系、例えば真核細胞または原核細胞系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。【００６１】
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ミエローマ、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ細胞中で発現される。
次に、形質転換された宿主細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができ、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできる。【００６２】
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）。【００６３】
２．ＰＴＸ３の測定
本発明において測定するＰＴＸ３は、特に限定されず、全長ＰＴＸ３でも、その断片でもよい。
被検試料に含まれるＰＴＸ３タンパク質の検出方法は特に限定されないが、抗ＰＴＸ３抗体を用いた免疫学的方法により検出することが好ましい。免疫学的方法としては、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのは酵素結合免疫吸着定量法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡなどの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法により行うことが可能である。【００６４】
抗ＰＴＸ３抗体を用いた一般的な検出方法としては、例えば、抗ＰＴＸ３抗体を支持体に固定し、ここに被検試料を加え、インキュベートを行い抗ＰＴＸ３抗体とＰＴＸ３タンパク質を結合させた後に洗浄して、抗ＰＴＸ３抗体を介して支持体に結合したＰＴＸ３タンパク質を検出することにより、被検試料中のＰＴＸ３タンパク質の検出を行う方法を挙げることができる。【００６５】
本発明において用いられる支持体としては、例えば、アガロース、セルロースなどの不溶性の多糖類、シリコン樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、ナイロン樹脂、ポリカーボネイト樹脂などの合成樹脂や、ガラスなどの不溶性の支持体を挙げることができる。これらの支持体は、ビーズやプレートなどの形状で用いることが可能である。ビーズの場合、これらが充填されたカラムなどを用いることができる。プレートの場合、マルチウェルプレート（９６穴マルチウェルプレート等）、やバイオセンサーチップなどを用いることができる。抗ＰＴＸ３抗体と支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により結合することができる。これらの支持体はすべて市販のものを用いることができる。【００６６】
抗ＰＴＸ３抗体とＰＴＸ３タンパク質との結合は、通常、緩衝液中で行われる。緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液、などが使用される。また、インキュベーションの条件としては、すでによく用いられている条件、例えば、４℃〜室温にて１時間〜２４時間のインキュベーションが行われる。インキュベート後の洗浄は、ＰＴＸ３タンパク質と抗ＰＴＸ３抗体の結合を妨げないものであれば何でもよく、例えば、Ｔｗｅｅｎ２０等の界面活性剤を含む緩衝液などが使用される。【００６７】
本発明のＰＴＸ３タンパク質測定方法においては、ＰＴＸ３タンパク質を検出したい被検試料の他に、コントロール試料を設置してもよい。コントロール試料としては、ＰＴＸ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料やＰＴＸ３タンパク質を含む陽性コントロール試料などがある。この場合、ＰＴＸ３タンパク質を含まない陰性コントロール試料で得られた結果、ＰＴＸ３タンパク質を含む陽性コントロール試料で得られた結果と比較することにより、被検試料中のＰＴＸ３タンパク質を検出することが可能である。また、濃度を段階的に変化させた一連のコントロール試料を調製し、各コントロール試料に対する検出結果を数値として得て、標準曲線を作成し、被検試料の数値から標準曲線に基づいて、被検試料に含まれるＰＴＸ３タンパク質を定量的に検出することも可能である。【００６８】
抗ＰＴＸ３抗体を介して支持体に結合したＰＴＸ３タンパク質の測定の好ましい態様として、標識物質で標識された抗ＰＴＸ３抗体を用いる方法を挙げることができる。【００６９】
例えば、支持体に固定された抗ＰＴＸ３抗体に被検試料を接触させ、洗浄後に、ＰＴＸ３タンパク質を特異的に認識する標識抗体を用いて検出する。【００７０】
抗ＰＴＸ３抗体の標識は通常知られている方法により行うことが可能である。標識物質としては、蛍光色素、酵素、補酵素、化学発光物質、放射性物質などの当業者に公知の標識物質を用いることが可能であり、具体的な例としては、ラジオアイソトープ（３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉなど）、フルオレセイン、ローダミン、ダンシルクロリド、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカリドオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ビオチンなどを挙げることができる。標識物質としてビオチンを用いる場合には、ビオチン標識抗体を添加後に、アルカリホスファターゼなどの酵素を結合させたアビジンをさらに添加することが好ましい。標識物質と抗ＰＴＸ３抗体との結合には、グルタルアルデヒド法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、過ヨウ素酸法、などの公知の方法を用いることができる。【００７１】
具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＰＴＸ３抗体を支持体に固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡ、ゼラチン、アルブミンなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、標識抗ＰＴＸ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、プレートに残った標識抗ＰＰＴＸ３抗体を検出する。検出は当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、放射性物質による標識の場合には液体シンチレーションやＲＩＡ法により検出することができる。酵素による標識の場合には基質を加え、基質の酵素的変化、例えば発色を吸光度計により検出することができる。基質の具体的な例としては、２，２−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、１，２−フェニレンジアミン（オルソ−フェニレンジアミン）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＥ）などを挙げることができる。蛍光物質の場合には蛍光光度計により検出することができる。【００７２】
本発明のＰＴＸ３タンパク質測定方法の特に好ましい態様として、ビオチンで標識された抗ＰＴＸ３抗体およびアビジンを用いる方法を挙げることができる。【００７３】
具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を含む溶液をプレートなどの支持体に加え、抗ＰＴＸ３抗体を固定する。プレートを洗浄後、タンパク質の非特異的な結合を防ぐため、例えばＢＳＡなどでブロッキングする。再び洗浄し、被検試料をプレートに加える。インキュベートの後、洗浄し、ビオチン標識抗ＰＴＸ３抗体を加える。適度なインキュベーションの後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素と結合したアビジンを加える。インキュベーション後、プレートを洗浄し、アビジンに結合している酵素に対応した基質を加え、基質の酵素的変化などを指標にＰＴＸ３タンパク質を検出する。【００７４】
本発明のＰＴＸ３タンパク質測定方法の他の態様として、ＰＴＸ３タンパク質を特異的に認識する一次抗体を一種類以上、および該一次抗体を特異的に認識する二次抗体を一種類以上用いる方法を挙げることができる。【００７５】
例えば、支持体に固定された一種類以上の抗ＰＴＸ３抗体に被検試料を接触させ、インキュベーションした後、洗浄し、洗浄後に結合しているＰＴＸ３タンパク質を、一次抗ＰＴＸ３抗体および該一次抗体を特異的に認識する一種類以上の二次抗体により検出する。この場合、二次抗体は好ましくは標識物質により標識されている。【００７６】
本発明のＰＴＸ３タンパク質の測定方法の他の態様としては、凝集反応を利用した検出方法を挙げることができる。該方法においては、抗ＰＴＸ３抗体を感作した担体を用いてＰＴＸ３を検出することができる。抗体を感作する担体としては、不溶性で、非特異的な反応を起こさず、かつ安定である限り、いかなる担体を使用してもよい。例えば、ラテックス粒子、ベントナイト、コロジオン、カオリン、固定羊赤血球等を使用することができるが、ラテックス粒子を使用するのが好ましい。ラテックス粒子としては、例えば、ポリスチレンラテックス粒子、スチレン−ブタジエン共重合体ラテックス粒子、ポリビニルトルエンラテックス粒子等を使用することができるが、ポリスチレンラテックス粒子を使用するのが好ましい。感作した粒子を試料と混合し、一定時間攪拌する。試料中に抗ＰＴＸ３抗体が高濃度で含まれるほど粒子の凝集度が大きくなるので、凝集を肉眼でみることによりＰＴＸ３を検出することができる。また、凝集による濁度を分光光度計等により測定することによっても検出することが可能である。【００７７】
本発明のＰＴＸ３タンパク質の測定方法の他の態様としては、例えば、表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを用いた方法を挙げることができる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーはタンパク質−タンパク質間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）等のバイオセンサーを用いることによりＰＴＸ３タンパク質と抗ＰＴＸ３抗体の結合を検出することが可能である。具体的には、抗ＰＴＸ３抗体を固定化したセンサーチップに、被検試料を接触させ、抗ＰＴＸ３抗体に結合するＰＴＸ３タンパク質を共鳴シグナルの変化として検出することができる。【００７８】
本発明の測定方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもでき、一度に大量の試料について検査を行うことも可能である。【００７９】
本発明は、血管障害の程度の診断薬の提供をも目的とするが、該診断薬は少なくとも抗ＰＴＸ３抗体を含む。ここで診断薬には、キットも含まれる。該診断薬がＥＬＩＳＡ法に基づく場合は、抗体を固相化する担体を含んでいてもよく、抗体があらかじめ担体に結合していてもよい。該診断薬がラテックス等の担体を用いた凝集法に基づく場合は抗体が吸着した担体を含んでいてもよい。また、該診断薬は、適宜、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等を含んでいてもよい。【００８０】
血管障害治療薬のスクリーニング方法は、被験物質を動物または細胞に投与または接触させ、ＰＴＸ３タンパク質量又はＰＴＸ３遺伝子量を測定することにより行なわれる。動物を使用する場合には、被験物質を経口、静注等の手段で投与し、その投与前後の血中ＰＴＸ３蛋白又は血中ＰＴＸ３遺伝子濃度を測定し、被験物質非投与群と比較することによりスクリーニングできる。このとき、動物としては、高脂血症、脳疾患、糖尿病、肥満症、高血圧症のモデル動物が使用できる。特に、動脈硬化モデルとしての高脂肪食負荷動物、ＷＨＨＬウサギ、アポＥ欠損マウス、ＬＤＬ受容体欠損マウス、ヒト型アポＢ導入マウス、ドミナント変異アポＥ導入マウス、高ＬＤＬ血症ブタおよびミニブタ等ならびに脳疾患モデルとしてはＳＨＲＳＰラット、肥満・糖尿病モデルとしては、レプチン欠損マウス、ＮＯＤマウス、ＫＫ／Ｔａ  Ｊｃｌマウス、ＫＫ−Ａｙ／Ｔａ  Ｊｃｌマウス、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂ  Ｊｃｌマウス、Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／＋ｍ  Ｊｃｌマウス、ＧＫ／Ｊｃｌラット、さらに、高血圧発症モデルとしてはＳＨＲラット、心臓疾患として冠動脈バルーン傷害モデル（ラット、ウサギ）等の血管障害を有するモデル動物を用いるのが好ましい。【００８１】
また、細胞を用いる場合には、ＰＴＸ３産生細胞株およびＰＴＸ３強制発現細胞を用い、被験物質を加えて培養し、産生されたＰＴＸ３タンパク質又はＰＴＸ３遺伝子量を公知の方法にて測定した後、無添加時の量と比較することによりスクリーニングすることができる。【００８２】
ＰＴＸ３タンパク質を測定する方法としてはＥＬＩＳＡ等の知られた方法が利用できる。また、遺伝子量測定方法として、定量的ＲＴ−ＰＣＲによる方法等が挙げられる。また、ＰＴＸ３遺伝子の発現を抑制する物質のスクリーニングのためには、一般的に用いられているレポータージーンアッセイを用いることもできる。一般的な方法とは、ＰＴＸ３遺伝子のプロモーター領域をルシフェラーゼやガラクトシダーゼ、ＧＦＰ等のマーカータンパク質のｃＤＮＡの上流に接続したベクターを作製し、このベクターを一般的な方法により、動物細胞にトランスフェクションする。トランスフェクションされた細胞に、被験物質を加えて培養し、マーカータンパク質をそれぞれに適した方法によって検出することによって目的の化合物をスクリーニングすることができる。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。【００８４】
実施例１  ＰＴＸ３のクローニング
ＰＴＸ３の全長ＯＲＦ領域を含む配列のクローニングを実施した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の１本鎖ｃＤＮＡを上記（００３４）記載の方法により調製し、それを鋳型としてＧｅｎＢａｎｋ番号（ＮＭ＿００２８５２）よりデザインしたプライマーＰＴＸ３−Ｆ（ＫｐｎＩ）（配列番号：３）とＰＴＸ３−Ｒ（ＢａｍＨＩ）（配列番号：４）を用いて、ＰＣＲ法にて、全長ＯＲＦ遺伝子の単離を行った。ＰＣＲ法により得られたフラグメントをＺｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いベクター挿入し、塩基配列解析を定法にて実施した後、ＫｐｎＩサイトおよびＢａｍＨＩサイトにて切断したフラグメントをｐｈＣＭＶベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）へ挿入し、トランスファーベクターｐｈＣＭＶ−ＰＴＸ３を作製した。【００８５】
実施例２  リコンビナントＰＴＸ３発現細胞の構築
ＦｕＧＥＮＥ  ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）のプロトコールに準じて、トランスフェクション前日に６ウェルデイッシュに１ｘ１０５ｃｅｌｌのＣＨＯ細胞を播種し一晩培養を行い、翌日に８μｇの発現ベクターｐｈＣＭＶ−ＰＴＸ３と１６μＬのＦｕＧＥＮＥ  ６  ｒｅａｇｅｎｔを無血清ＤＭＥＭ培地１００μＬに混合し、２０分間の室温におけるインキュベーション後、細胞に添加した。トランスフェクション翌日に限外希釈法および選択試薬であるＧ４１８を用いてクローニングを実施した。各クローンの培養上清を回収し、ＰＴＸ３タンパク質発現細胞のスクリーニングを行った。その結果、約２〜３μｇ／ｍＬのＰＴＸ３タンパク質を恒常的に発現するクローン（以後、ＣＨＯ−ＰＴＸ３）を選択することが出来た。【００８６】
実施例３  リコンビナントＰＴＸ３タンパク質の取得
蛋白質の精製はＢｏｔｔａｚｚｉらの方法（Ｂｏｔｔａｚｚｉ  Ｂ，Ｖｏｕｒｅｔ−Ｃｒａｖｉａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９７；２７２（５２）：３２８１７−２３．）に準じて実施した。具体的にはＣＨＯ−ＰＴＸ３を１５０ｃｍ２のフラスコにて培養の後、ローラーボトル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用い１ボトル当たり３００ｍＬの無血清培地（Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ，ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）用い、１分間当たり１回転になるようにローリングのスピードの調節を行い４日間培養し、培養上清を回収した。１Ｌの培養上清を、限外濾過膜濃縮装置、ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬデバイス  バイオマックス１００（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いて５０ｍＬまで濃縮を行った。濃縮液を５０ｍＭ  Ｉｍｉｄａｏｌｅ，ｐＨ６．６の緩衝液５Ｌに対し透析した。透析操作は同緩衝液に対し、２度実施した。次いで、ＨｉＰｒｅｐ  １６／１０  Ｑ  ＸＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いたイオン交換クロマトグラフィーにアプライした。バックグランドレベルが低くなるまで洗浄した後、ＮａＣｌの濃度を０から０．５８Ｍに３５分間かけて増加させ、その後１ＭのＮａＣｌにてＰＴＸ３の溶出を行った。尚、溶出のモニターは２８０ｎｍの吸光度にて行った。ＰＴＸ３蛋白質を含むフラクションを集め、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−３００によるゲル濾過クロマトグラフィーをＰＢＳにて展開した。さらにＰＴＸ３のうち多量体ＰＴＸ３のみを得るためにＳｕｐｅｒｏｓｅ  ６ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して精製した。すなわち、分子量スタンダードを用いキャリブレーションを行った後にＰＴＸ３をカラムへアプライし、流速０．４ｍＬ／ｍｉｎにてＰＢＳにより溶出を行った。各溶出フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析を行い、精製リコンビナント多量体ＰＴＸ３タンパク質を得た。【００８７】
実施例４  天然ＰＴＸ３タンパク質の取得
ＨＵＶＥＣの培養上清からＰＴＸ３タンパク質の取得を試みた。すなわち、１７５ｃｍ２フラスコを用い、５％  ＦＢＳを含むＥＧＭ−２培地にて３７℃、３日培養後、培養液を回収した。蛋白質の精製はＢｏｔｔａｚｚｉらの方法（Ｂｏｔｔａｚｚｉ  Ｂ，Ｖｏｕｒｅｔ−Ｃｒａｖｉａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９７；２７２（５２）：３２８１７−２３．）に準じて、具体的には上記実施例３と同様な操作にて天然ＰＴＸ３を取得した。【００８８】
実施例５  ウエスタンブロティングによるリコンビナントＰＴＸ３と天然ＰＴＸ３の比較
天然より得たＰＴＸ３とリコンビナントＰＴＸ３の比較をウエスタンブロティングにより行った。すなわち、天然ＰＴＸ３とリコンビナントＰＴＸ３の０．５μｇ／ｍＬ溶液１０μＬを還元状態でＳＤＳ−ＰＡＧＥし、泳動後のゲルをＰＶＤＦ膜に転写した。転写した膜上のＰＴＸ３を抗ＰＴＸ３ポリクローナル抗体（ＡＬＥＸＩＳ社）と反応させた。その後、抗ＰＴＸ３ポリクローナル抗体はＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体と反応させ、ＰＴＸ３のバンドを検出した。その結果を図１に示した。図１に示すように両者は分子量の上でほぼ一致した。若干の差は糖鎖の違いに基づくものと推察した。【００８９】
実施例６  抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体の作製
モノクローナル抗体は下記の操作により作製した。すなわち、Ｂａｌｂ／Ｃマウス  （ＣＲＬ）あるいはＰＴＸ３ノックアウトマウスにＰＴＸ３を免疫した。初回免疫には免疫タンパク質を１０あるいは１００μｇ／匹となるように調製し、ＦＣＡ（フロイント完全アジュバント（Ｈ３７  Ｒａ）、Ｄｉｆｃｏ（３１１３−６０）、ベクトンディッキンソン（ｃａｔ＃２３１１３１））を用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。２週間後に５あるいは５０μｇ／匹となるように調製したものをＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント、Ｄｉｆｃｏ（０６３９−６０）、ベクトンディッキンソン（ｃａｔ＃２６３９１０））でエマルジョン化したものを皮下に投与した。以降１週間間隔で追加免疫を合計２回行った。最終免疫については５あるいは５０μｇ／匹となるようにＰＢＳに希釈し尾静脈内に投与した。ＰＴＸ３タンパク質をコートしたイムノプレートを用いたＥＬＩＳＡによりＰＴＸ３に対する血清中の抗体価が飽和しているのを確認後、マウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１とマウス脾臓細胞を混合し、ＰＥＧ１５００（ロシュ・ダイアグノスティック、ｃａｔ＃７８３  ６４１）により細胞融合を行った。９６穴培養プレートに播種し、翌日よりＨＡＴ培地で選択後培養上清をＥＬＩＳＡでスクリーニングした。陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した後、拡大培養を行い培養上清を回収した。ＥＬＩＳＡによるスクリーニングは、ＰＴＸ３タンパク質との結合活性を指標に行い、強い結合能を有する抗ＰＴＸ３抗体を多数得た。【００９０】
モノクローナル抗体の精製はＨｉ  Ｔｒａｐ  ＰｒｏｔｅｉｎＧ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＣＡＴ＃１７−０４０４−０１）を用いて行った。ハイブリドーマ培養上清を直接カラムにチャージし、結合バッファー（２０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．０））にて洗浄後、溶出バッファー（０．１Ｍ  グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．７））で溶出した。溶出液は中和バッファー（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０））を加えたチューブに採取し、直ちに中和した。抗体溶出画分をプールした後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで一昼夜透析を行いバッファー置換した。精製された抗体は０．０２％となるようにＮａＮ３を添加した後、４℃で保管した。【００９１】
抗ＰＴＸ３モノクローナル抗体のアイソタイピングは次のように行った。
抗体濃度はヤギ抗マウスＩｇＧ（ｇａｍｍａ）（ＺＹＭＥＤ  ＣＡＴ＃  ６２−６６００）とアルカリホスファターゼ−ヤギ抗マウスＩｇＧ（ｇａｍｍａ）（ＺＹＭＥＤ  ＣＡＴ＃６２−６６２２）を用いたマウスＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡを行い、市販の精製マウスＩｇＧ１抗体（ＺＹＭＥＤ  ＣＡＴ＃  ０２−６１００）をスタンダードとして定量した。抗ＰＴＸ３抗体のアイソタイピングは、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＰＩＥＲＣＥ  ＣＡＴ＃  ３７５０２）を用い、方法は添付のマニュアルに従った。アイソタイピングの結果、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＭクラスの抗体が得られた。【００９２】
実施例７  抗ＰＴＸ３ポリクローナル抗体の作製
１０週令、体重２ｋｇのニュージーランドホワイトウサギに免疫を行った。初回免疫にはＰＴＸ３蛋白質を１００μｇ／匹となるように調製し、ＦＣＡ（フロイント完全アジュバント（Ｈ３７  Ｒａ）、Ｄｉｆｃｏ（３１１３−６０）、ベクトンディッキンソン（ｃａｔ＃２３１１３１））を用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。２週間後に１００μｇ／匹となるように調製したものをＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント、Ｄｉｆｃｏ（０６３９−６０）、ベクトンディッキンソン（ｃａｔ＃２６３９１０））でエマルジョン化したものを皮下に投与した。その後も２週間間隔で１００μｇ／匹のＦＩＡエマルジョンを皮下投与し、合計５回免疫を行った。５回免疫後に部分採血を行い、ウサギ血清中の抗体価を、９６ウェルプレートに抗原をコートしたＥＬＩＳＡ法にて評価した。その後全採血を行い、血清分離した後、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラム精製により抗体を分画した。０．０２％となるようにＮａＮ３を添加し４℃で保管した。【００９３】
実施例８  ＥＬＩＳＡ系の構築と測定
血中のＰＴＸ３を検出するため、ＰＴＸ３のサンドイッチＥＬＩＳＡ系を以下のように構築した。すなわち、９６ウェルプレートにコートする抗体にはＰＰＭＸ０１０１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９６９７）、ＰＰＭＸ０１０２、ＰＰＭＸ０１１２、ＰＰＭＸ０１４８等のモノクローナル抗体を、これらに結合したＰＴＸ３を検出する抗体としてビオチンで標識したポリクローナル抗体（ＡＬＥＸＩＳ社または実施例７で作製した抗体）を用いた。尚、抗体のビオチン化にはＰｉｅｒｃｅ社のＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ  （ＣＡＴ＃  ２１３３５）を用いておこなった。【００９４】
９６ウェルイムノプレートに１０μｇ／ｍＬとなるように抗ＰＴＸ３抗体をＰＢＳ（−）で希釈したものをコートし、４℃で一晩インキュベートした。翌日３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄バッファー（０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ＰＢＳ）で３回洗浄後、ＡＢＩ社のイムノアッセイスタビライザー（ＡＢＩ  ＃１０−６０１−００１）を１５０μＬ加え、ブロッキングを行った。室温で数時間後、あるいは４℃で一晩保管後、精製蛋白質、ヒト血清などを、動物血清などを含む希釈バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０，０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）で適当に希釈したものを加え２時間室温でインキュベートした。次いで、動物血清などを含むＰＢＳ（−）で２０μｇ／ｍＬとなるように希釈したビオチン標識した抗ＰＴＸ３抗体を加え２時間室温でインキュベートした。反応液を捨てた後、動物血清を適当量含んだＣｙｇｎｕｓ社のＳｔａｂ−ＥＬＩＳＡ−ｒ（Ｃｙｇｎｕｓ  ＃Ｉ−０３０）を用いて、Ｖｅｃｔｏｒ社のストレプトアビジン−ＨＲＰＯ（Ｖｅｃｔｏｒ  ＃ＳＡ−５００４）を３μｇ／ｍＬに希釈したものを加え、０．５時間室温でインキュベートした。３００μＬ／ｗｅｌｌの洗浄バッファーで５回洗浄した後、添付のプロトコールに従いＳｃｙｔｅｋ社のＴＭＢ（Ｃａｔ＃ＴＭ４９９９）を用いて発色させ、マイクロプレートリーダーで吸光度を測定した。【００９５】
サンプル中のＰＴＸ３タンパク質濃度の換算には、表計算ソフトＧｌａｐｈＰａｄ  ＰＲＩＳＭ（ＧｌａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．ｖｅｒ．３．０）を用いて解析した。精製ＰＴＸ３を用いてスタンダードカーブを作製した結果、より低い濃度のＰＴＸ３タンパク質の測定を可能にした複数の測定系を構築することができた（図２）。【００９６】
実施例９  従来の測定系との標準曲線の比較
ＥＬＩＳＡの標準曲線は濃度検定されたＰＴＸ３タンパク質標準品（ＡＬＥＸＩＳ社）を用いて、３０、１０、３、１、０．３、０．１、０．０３、０．０１ｎｇ／ｍＬの標準品希釈液をもちいて作製した。さらに、ＥＬＩＳＡの感度比較のために非特許文献３の抗体すなわちＡＬＥＸＩＳ社より購入のＭＮＢ４抗体を用いて上記と同様に標準曲線を求めた。今回作製した測定系と非特許文献３の抗体による測定（図３）との比較において、明らかに新規測定系の感度がすぐれていることが確認できた。【００９７】
実施例１０  スタチン投与試験
スタチン投与開始前に採血を行い、次にアトロバスタチンを１日１回夕食後に１週間投与した後に採血を行った。採血した血液サンプルは、３７℃、２時間のインキュベーションの後、１０００ｒｐｍ、１０分間の血清分離を行った。血清上清成分を回収し−８０℃にて保存した。これらの血清を用いて新規に構築したＥＬＩＳＡ系にて血清中ＰＴＸ３タンパク質濃度の測定を行った。その結果６例中６例にて血清中ＰＴＸ３蛋白濃度の減少が認められた（表１）。さらにｔ検定の結果、アトロバスタチン１週間投与後のＰＴＸ３濃度が有意に（ｐ＜０．０１）下がる結果となった。【００９８】
【表１】
0004667372.tif 000002
【００９９】
実施例１１  血液サンプルの選択
従来、血液成分の測定における血液サンプルとして、血清および血漿（クエン酸、ＥＤＴＡ、ヘパリン）が使用されている。本特許においては、最も一般的な採血方法である血清を用いて検討した。今回、採血方法による血中ＰＴＸ３濃度の差異をＰＰＭＸ０１１２モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ系にて標準品のＰＴＸ３の添加試験にて検討したところ、表２に示すようにＥＤＴＡによる採血方法が最適であることが明らかとなった。【０１００】
【表２】
0004667372.tif 000003
【０１０１】
実施例１２  血液サンプルの安定性試験
多くの血液成分は凍結保存において安定である。しかしながら、物質によっては安定性が確保できない場合もあることから、−８０℃における血漿中ＰＴＸ３の安定性をＰＰＭＸ０１１２モノクローナル抗体使用ＥＬＩＳＡ系にて標準品のＰＴＸ３の添加試験にて検討した。その結果、表３に示すように保存により測定値の低下が確認された。【０１０２】
【表３】
0004667372.tif 000004
【０１０３】
実施例１３  測定条件の改良
実施例１２にて、−８０℃におけるＰＴＸ３の保存性が確保できないことが判明したが、その原因としてＰＴＸ３の劣化のみならず他の血漿成分の変化に基づくことが推察された。後者の解決のため、ＰＰＭＸ０１１２モノクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ系にて測定時使用緩衝液へのＥＤＴＡあるいはプロテアーゼ阻害剤の添加を検討した。その結果、ＥＤＴＡの添加により測定値の改善が認められた（表４）。さらに、ＥＤＴＡ存在下Ｔｗｅｅｎ２０およびＢｒｉｄｊｅ等の各種界面活性剤を血漿サンプルに添加した。表５に示すように、ＥＤＴＡのみでは不十分であった改善効果がＴｗｅｅｎ２０により充分な改善効果を得ることができた。
この結果から、保存期間中のＰＴＸ３含量の低下は、ＰＴＸ３以外の血漿成分の変化によるものと推察された。【０１０４】
【表４】
0004667372.tif 000005
【０１０５】
【表５】
0004667372.tif 000006
【０１０６】
実施例１４  ＥＬＩＳＡ測定用モノクローナル抗体の選択
実施例６で作製したモノクローナル抗体およびビオチン標識ポリクローナル抗体を用いて、実施例１３の改良測定条件下における最適の抗体の選択を行った。すなわち、ＥＤＴＡおよび界面活性剤を添加した緩衝液でＥＤＴＡ採血血漿を希釈する。次いで、各種モノクローナル抗体をプレコートしたプレートに希釈検体を添加する。洗浄後、ビオチン標識ポリクローナル抗体を添加する方法によりモノクローナル抗体を選択した。その結果、最適な抗体としてＰＰＭＸ０１０２が選択されたことから、そのモノクローナル抗体をＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３９５として独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６  茨城県つくば市東１−１−１  中央第６）へ寄託した。【０１０７】
実施例１５  従来測定系および新規構築測定系による健常者血漿へのＰＴＸ３の添加回収試験ならびに凍結保存後の安定性試験
従来測定系であるＡＬＥＸＩＳ社より購入のＭＮＢ４を用いた測定系、ＰＰＭＸ０１１２を用いた測定系および新規作製ＰＰＭＸ０１０２（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３９５）を用いた測定系を用いて、健常者血漿によるＰＴＸ３の添加回収試験を実施した。すなわち、５ｎｇ／ｍＬのＰＴＸ３を健常者ボランテアＥＤＴＡ採血血漿に添加、混和後の濃度を測定した。その結果は表６に示すように、ＰＰＭＸ０１１２において８６％の回収率であるのに対し、他の測定系においてはほぼ添加量にあった測定結果であった。一方、ＰＴＸ３添加血漿を−８０℃、１日保存後解凍後の測定値は、新規作製ＰＰＭＸ０１０２（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３９５）を用いた測定系では、ほぼ１００％の回収が得られたのに対し、ＭＮＢ４を用いた測定系では添加したＰＴＸ３の回収が８７％に過ぎなかった（表７）。【０１０８】
【表６】
0004667372.tif 000007
【０１０９】
【表７】
0004667372.tif 000008
【０１１０】
実施例１６  心疾患患者血液中ＰＴＸ３の測定
各種心疾患患者から採血をし、ＰＰＭＸ０１０２（ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０３９５）  を用いたＥＬＩＳＡにてＰＴＸ３濃度を測定することにより、病態によるＰＴＸ３の変動を検討した。すなわち、冠動脈（ＣＡ）での正常冠動脈群（ＡＮＣＡ）２５名、安定狭心症群（ＡＰ）９名、不安定狭心症群（ＵＡＰ）３名、心筋梗塞群（ＡＭＩ）３名の４群に分け、血漿中ＰＴＸ３濃度を測定し、群間比較を行った。その結果、ＵＡＰ  ＣＡ群ではＡＮＣＡ  ＣＡ群に比べ、ＰＴＸ３値は有意に増加し、またＡＭＩ  ＣＡ群ではＡＮＣＡ  ＣＡ群、ＡＰ  ＣＡ群に比べ、ＰＴＸ３値は有意に増加した。図４に示すように、安定狭心症、不安定狭心症、心筋梗塞と病態の悪化につれＰＴＸ３の濃度が増加することが明らかとなった。このことから、心疾患の悪化の程度は血管障害の悪化の程度に比例しているものと思われる。従って、血漿中ＰＴＸ３濃度を測定することにより血管障害の結果として生ずると考えられる心疾患のモニター、病態の管理、治療方針策定に役立つことが期待出来る。【０１１１】
実施例１７  感冒患者における血液中濃度
ＰＴＸ３と同じくペントラキシンファミリーに属する炎症性タンパクであるＣＲＰが感冒の診断として使用されている。ＰＴＸ３の産生細胞がＣＲＰの肝細胞と異なり、内皮および平滑筋細胞等の血管構成細胞に限局されており、ＰＴＸ３の血管特異性を証明するため、感冒患者３名における血液中濃度を測定した。その結果、表８に示すように発症前値０．６７〜１．１５、平均で０．９２ｎｇ／ｍＬであるのに対し、発症後は０．７９〜１．０６、平均で０．９０ｎｇ／ｍＬであり、ほぼ同様の測定値であった。この結果より、ＰＴＸ３が全身性の炎症反応の診断マーカーではなく、血管に特異性の高いマーカーであり、血管の障害の程度を知るに有用であることを確認した。【０１１２】
【表８】
0004667372.tif 000009
【図１】
0004667372.tif 000010
【図２】
0004667372.tif 000011
【図３】
0004667372.tif 000012
【図４】
0004667372.tif 000013
【配列表】
0004667372000001.app