(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホモポリメリック核酸と、逆転写酵素と、DNAポリメラーゼとを含有し、前記ホモポリメリック核酸はホモポリメリックリボ核酸又はホモポリメリックデオキシリボ核酸であって１００〜５０００塩基長さのオリゴヌクレオチドである、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応に用いるための組成物。
【請求項２】
１種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、いずれかの１種以上のヌクレオチド、緩衝剤、塩、及びＲＴ−ＰＣＲにおいて有用な添加剤から成る群の少なくとも１つをさらに含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ホモポリメリックリボ核酸が、ホモポリメリックポリ(A)、ホモポリメリックポリ(U)、ホモポリメリックポリ（C）、及びホモポリメリックポリ（G）から成る群から選択される請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ホモポリメリックデオキシリボ核酸が、ホモポリメリックポリ(dA)、ホモポリメリックポリ(dI)、ホモポリメリックポリ(dC)、ホモポリメリックポリ(dG)、及びホモポリメリックポリ(dT)から成る群から選択される請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、少なくとも10ngのホモポリメリック核酸を含有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、10〜2000ngのホモポリメリック核酸を含有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、100〜1000ngのホモポリメリック核酸を含有する請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、200〜600ngのホモポリメリック核酸を含有する請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記逆転写酵素が、AMV-RT、M-MLV-RT、HIV-RT、EIAV-RT、RAV2-RT、C.ヒドロゲノホルマンス（C.hydrogenoformans）DNAポリメラーゼ、スーパースクリプト（SuperScript）I、スーパースクリプト(SuperScript)II、逆転写活性を有するそれらの突然変異体、及び逆転写活性を有するそれらの変異体から成る群から選択される請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記DNAポリメラーゼが、Taq、Tbr、Tfl、Tru、Tth、Tli、Tac、Tne、Tma、Tih、Tfi、Pfu、Pwo、Kod、Bst、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4、VENTTM、DEEPVENTTM、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するそれらの突然変異体、及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有する変異体から成る群から選択される請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
１種以上のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含有する請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、ランダムプライマー、ホモポリマー、又はターゲットRNA鋳型に特異的なプライマーから成る群から選択される請求項１１の組成物。
【請求項１３】
緩衝剤をさらに含有する請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記緩衝剤が、トリス(TRIS)、トリシン(TRICINE)、ビス-トリシン(BIS-TRICINE)、ヘペス(HEPES)、モプス(MOPS)、テス(TES)、タプス(TAPS)、ピペス(PIPES)、及びキャプス(CAPS)から成る群から選択される請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
塩溶液をさらに含有する請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記塩溶液が、塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、及び酢酸リチウムから成る群から選択される請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ＲＴ−ＰＣＲにおいて有用な添加剤をさらに含有する請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
ＲＴ−ＰＣＲにおいて有用な前記添加剤が、ＤＭＳＯ、グリセロール、ホルムアミド、ベタイン、塩化テトラメチルアンモニウム、ＰＥＧ、ツイーン(Tween)２０、ＮＰ４０、エクトイン、ポリオール類、大腸菌ＳＳＢタンパク質、ファージＴ４遺伝子３２タンパク質、ＢＳＡから成る群から選択される請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
１種以上のヌクレオチドをさらに含有する請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ヌクレオチドが、デオキシヌクレオチドトリホスフェートである請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記デオキシヌクレオチドトリホスフェートが、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、dUTP、α-チオ-dNTP類、ビオチン−dUTP、フルオレセイン-dUTP、及びジゴキシゲニン-dUTPから成る群から選択される請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
a) 少なくとも１種の逆転写酵素、少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼ、及びホモポリメリック核酸を含有する反応混合物へＲＮＡ鋳型を添加する工程；及び
b) 前記ＲＮＡ鋳型の一部と相補的なＤＮＡ分子の重合を許容するのに十分な条件下で前記反応混合物をインキュベートする工程
を有し、
前記ホモポリメリック核酸はホモポリメリックリボ核酸又はホモポリメリックデオキシリボ核酸であって１００〜５０００塩基長さのオリゴヌクレオチドである、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡを生成させるための方法。
【請求項２３】
前記反応混合物が、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、いずれかの１種以上のヌクレオチド、緩衝剤、塩、及びＲＴ−ＰＣＲにおいて有用な添加剤から成る群の少なくとも１つをさらに含有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記反応混合物が、１種以上のヌクレオチドをさらに含有する、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヌクレオチドが、デオキシヌクレオチドトリホスフェートである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記デオキシヌクレオチドトリホスフェートが、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、dUTP、α-チオ-dNTP類、ビオチン−dUTP、フルオレセイン-dUTP、及びジゴキシゲニン-dUTPから成る群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ホモポリメリックリボ核酸が、ホモポリメリックポリ(A)、ホモポリメリックポリ(U)、ホモポリメリックポリ(C)、及びホモポリメリックポリ(G)から成る群から選択される請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ホモポリメリックデオキシリボ核酸が、ホモポリメリックポリ(dA)、ホモポリメリックポリ(dI)、ホモポリメリックポリ(dC)、ホモポリメリックポリ(dG)、及びホモポリメリックポリ(dT)から成る群から選択される請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、熱安定性ポリメラーゼである請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Taq、Tbr、Tfl、Tru、Tth、Tli、Tac、Tne、Tma、Tih、Tfi、Pfu、Pwo、Kod、Bst、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4、VENTTM、DEEPVENTTM、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するそれらの突然変異体、及びＤＮＡポリメラーゼ活性を有するそれらの変異体から成る群から選択される請求項２２〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記逆転写酵素が、AMV-RT、M-MLV-RT、HIV-RT、EIAV-RT、RAV2-RT、C.ヒドロゲノホルマンス（C.hydrogenoformans）DNAポリメラーゼ、スーパースクリプト(SuperScript)I、スーパースクリプト(SuperScript)II、逆転写活性を有するそれらの突然変異体、及び逆転写活性を有するそれらの変異体から成る群から選択される請求項２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記反応混合物が、オリゴヌクレオチドプライマーをさらに含有する請求項２２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記RNA鋳型の一部と相補的である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＲＮＡ鋳型の一部と相補的な前記ＤＮＡ分子が、ＤＮＡ複製法により増幅される請求項２２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＤＮＡ複製法が、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を含む請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＤＮＡ生成及び増幅を組み合わせた反応が、共役反応混合物において起こる請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記反応が、23℃〜100℃の間で進行する請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
逆転写反応が37℃〜70℃の間で起こり、かつ前記ＰＣＲ増幅が、60℃〜95℃の間で起こる請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＰＣＲ増幅が、少なくとも25サイクルの変性、アニーリング、及び重合から成る請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記逆転写が、37℃〜60℃の間で起こり、変性が94℃で起こり、アニーリングが60℃で起こり、かつ重合が72℃で起こる請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分子生物学の分野に属する。本発明は、リボ核酸鋳型からの核酸類の生成及び更なる核酸複製のために有用な新規組成物及び方法に関する。本発明は、具体的には逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）による核酸類の生成及び増幅に関する。
【０００２】
【発明の背景】
核酸類の検出、分析、転写及び増幅は、現代の分子生物学において最も重要な操作法である。RNA分析のためのそのような操作法の適用は、遺伝子発現の研究、伝染性病原体（infectious agents）又は遺伝病の診断、cDNAの生成及びレトロウイルス類の分析等においてとりわけ重要である。ポリメラーゼ連鎖反応がその後適用されるRNAの逆転写は、一般にRT-PCR又はRNA-PCRと呼ばれ、RNAの検出及び定量のために幅広く利用されるようなった。
【０００３】
RT-PCR操作法は、(i)RNA鋳型からのｃDNAの合成；及び(ii)PCR増幅を介する新規に合成されたｃDNAの複製という、２つの別々の分子合成から成る。RT-PCRは、３つの一般的なプロトコル、即ち、（１）２段階RT-PCRとも呼ばれる非共役（uncoupled）RT-PCR；（２）単一ポリメラーゼがRNAからのｃDNA生成及び後続のDNA増幅の両方のために使用される、単一酵素共役(coupled)RT-PCR（共役RT-PCRは、１段階RT-PCR又は連続RT-PCRとも呼ばれる）；並びに（３）少なくとも２種の別々のポリメラーゼが初期ｃDNA合成及びその後の複製のために使用される、二（又は二以上）酵素共役RT-PCRの下で行われ得る。
【０００４】
非共役RT-PCRにおいて、逆転写は、逆転写酵素活性のために最適なバッファー及び反応条件を用いた独立した段階として行われる。ｃDNA合成が続いて行われ、RT反応生成物のアリコート（aliquot）が、PCR増幅のために最適な条件の下で、TaqDNAポリメラーゼのような熱安定性DNAポリメラーゼとともにPCR増幅のための鋳型として使用される。
【０００５】
共役RT-PCRにおいて、単一反応混合物中で逆転写及びPCR増幅が組み合わされる。二酵素RT-PCRは、レトロウイルス又は細菌性逆転写酵素（例えば、AMV-RT、MMLV-RT、HIV-RT、EIAV-RT、RAV2-RT、カルボキシドサーマス・ヒドロゲノホルマンスDNA（Carboxydothermus hydrogenoformans DNA）又はそれらの突然変異体、変異体若しくは誘導体）、及び熱安定性DNAポリメラーゼ（例えば、Taq、Tbr、Tth、Tih、Tfi、Tfl、Pfu、Pwo、Kod、VENT、DEEPVENT、Tma、Tne、Bst、Pho、Sac、Sso 、ES4等又はそれらの突然変異体、変異体若しくは誘導体）を使用するのに対して、単一酵素RT-PCRは、TaqDNAポリメラーゼ及びTthDNAポリメラーゼのような数種のDNAポリメラーゼの逆転写酵素活性を利用する。
【０００６】
共役RT-PCRは、非共役RT-PCRよりも、多くの利点を提供する。共役RT-PCRは、非共役RT-PCRよりも、反応混合試薬及び核酸生成物の必要な処理工程（handling）はより少なくて済み（例えば、２つの反応段階の間への成分又は酵素添加のために反応管を開けること）、それ故、労働力をより少なくすることができ、必要な人員時間は低減される。共役RT-PCRはまた、必要とする試料もより少なく、かつ汚染の危険性が低減される（セルナー（Sellner）及びタルベット（Turbett）、1998)。
【０００７】
単一酵素共役RT-PCRは、今までのところ、最も簡単なRT-PCR操作法である。しかし、多量のDNAポリメラーゼを必要とするため、この系を実施するためには高い費用がかかる。さらに、この単一酵素共役RT-PCR法は、非共役RT-PCRよりも感度が低く（クージ（Cusi）ら、1994）、かつ重合する核酸類の長さは1キロベース・ペアよりも短く（＞1kbp）制限されることが見出された。単一反応混合物中で共役されるときでさえ、二酵素RT-PCR系は、一般に単一酵素系を超える高い感度を示す。この効果は、DNAポリメラーゼの逆転写酵素活性と比べ、逆転写酵素の効率が高いことに起因すると考えられている（セルナー及びタルベット、1998）。
【０００８】
二酵素共役RT-PCR系は、非共役プロトコルよりも感度がより高いにもかかわらず、ｃDNAの複製の際に、逆転写酵素がDNAポリメラーゼを直接阻害し、それによりこの技術の感度及び効率が低下することが見出された（セルナーら、1992；アツシンキ（Aatsinki）ら、1994；マレット（Mallet）ら、1995）。鋳型RNA量を増加すること、逆転写酵素に対するDNAポリメラーゼの比率を増加すること、DNAポリメラーゼにおける逆転写酵素の阻害効果を減少させ得る修飾試薬を添加すること（例えば、非相同tRNA、T4遺伝子32タンパク質、硫黄又は酢酸塩含有分子）、及びDNAポリメラーゼ添加前の逆転写酵素の熱不活性化を含むDNAポリメラーゼにおける逆転写酵素の阻害活性を抑えるための様々な溶液が試されている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらの修正されたRT-PCR法のすべては、重大な欠点を有する。利用できる試料の量が制限されている場合には、鋳型DNA量を増やすことができない。DNAポリメラーゼに対する逆転写酵素の比率を個々に最適化することは、１段階RT-PCRのための既製の（ready-to-use）試薬キットにおいて実用的ではない。DNA重合の逆転写酵素阻害を緩和するために現在提案されている修飾試薬の正味の（net）効果は、議論を呼んでおり、未だ決着していない。即ち、これらの試薬によるプラスの（positive）効果はRNA鋳型量、RNA組成物に大きく依存し、又、特異的な逆転写酵素とDNAポリメラーゼの組み合わせを必要とすることもある（例えば、チャンドラー（Chandler）ら、1998を参照）。最終的に、DNAポリメラーゼ添加前の逆転写酵素の熱不活性化は共役RT-PCRの利点を否定し、そして初期に議論された非共役RT-PCR系の全ての欠点を伴っている。
【００１０】
RT-PCR応用の重要性により、高い感度を示し、一般化された既製の構成の形態を有する共役RT-PCR系は、必要な初期試料（initial sample）は少量ですみ、実施者の操作量を減少させ、汚染の危険性を最少化し、試薬の消費を最少化し、特異的反応バッファーを使用しなければならないという制限を受けず、かつこの技術において必要とされる核酸最終製品の量を最大化する。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明は、リボ核酸鋳型からの核酸類の生成、更に核酸複製のために有用な新規組成物及び方法に関する。具体的には、本発明は、ホモポリメリック核酸の存在下で2種以上の異なるポリメラーゼを利用した、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）による核酸類の生成及び増幅に関する。ホモポリメリック核酸の存在は、少なくとも１つが逆転写活性を有するポリメラーゼを２種以上含有する組成物が使用されるときに生ずるDNAポリメラーゼの阻害を打ち消すために役立つ。本発明の組成物及び方法は、RNA鋳型の一部と相補的なDNA分子を生成し、かつ複製するために使用される。
【００１２】
本発明は、一般的に、RNA鋳型からの核酸の生成及び複製において使用され得るすべての反応混合物に関する。本発明の１つの態様は、ホモポリメリック核酸及び以下の反応成分、即ち、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、いずれかの１種以上のヌクレオチド塩基、適当な緩衝剤、塩溶液、又はRT-PCRにおいて有用なその他の添加剤を１種以上含有する組成物に関する。
【００１３】
本発明は、以下のような、RNAターゲットからのｃDNAの生成のための既知の方法と比較して種々な利点を提供するが、これらに限定されない。
・１種の反応溶液を用い、かつ試薬及び製品の処理工程が減った、共役RT-PCRを許容すること（permitting）；
・RNA鋳型の少量の初期試料の使用を許容すること；
・様々な種類の逆転写酵素の使用を許容すること；
・様々な種類のDNAポリメラーゼの使用を許容すること；
・特異化（specialized）反応添加剤（例えば、硫酸塩及び酢酸塩含有混合物）
をさらに含むバッファーを包含する、様々な種類の反応混合バッファー及び塩溶液の使用を許容すること。
・（ｔRNA添加剤を用いて観察される）特異性及び生成物収量に対する不利な効果を減少すること；
・市販の容易に合成され、かつ安価である試薬を用いて実施すること。
【００１４】
そのため、本発明は、リボ核酸（RNA）を含有する試料からの核酸分子の迅速かつ能率的な生成、並びにRNA分子の検出及び定量を促進する。本発明はまた、種々な工業的、医学的及び法廷で用いる（forensic）目的のために使用され得るｃDNA類の迅速生産及び増幅においても有用である。
【００１５】
ホモポリメリック核酸は、ポリ(A)、ポリ(C)、ポリ(G)、若しくはポリ(U)のようなリボ核酸ホモポリマー、又はポリ(dA)、ポリ(dC)、ポリ(dG)、ポリ(dT)、若しくはポリ(dI)のようなデオキシリボ核酸ホモポリマーであり得る。RT-PCRのために使用されるホモポリマーは、２塩基以上の長さ、好ましくは100〜5000塩基長さ、より好ましくは200〜2000塩基長さのオリゴヌクレオチドである。RT-PCTのために使用される核酸ホモポリマーの量は、10ngよりも多く、好ましくは10ng〜2000ng、より好ましくは100ng〜1000ng、そして最も好ましくは200ng〜600ngであることもある。
【００１６】
逆転写酵素は、逆転写酵素活性を示すいずれの酵素でもあり得る。好ましくは、逆転写酵素は、AMV-RT、MMLV-RT、HIV-RT、EIAV-RT、RAV2-RT、C.ヒドロゲノホルマンス（C.hydrogenoformans）DNAポリメラーゼ、スーパースクリプト（SuperScript）I、スーパースクリプト（SuperScript）II、又は逆転写酵素活性を有するそれらの突然変異体、変異体及び誘導体である。
【００１７】
ここで使用されるように、突然変異体、変異体及び誘導体は、それらの化学種の限定的な（definitive）化学的活性を依然として保持し、存在し又は生成され得る化学種の並べ替え（permutations）を示す。それらの例には、検出できるようにラベルされ、又は別の方法で修正され、それによりその化合物の化学的又は物理的特徴が変化し得る化合物が含まれるが、それらに限定されない。
【００１８】
DNAポリメラーゼは、DNA分子を複製することができるいずれのポリメラーゼでもあり得る。好ましくは、DNAポリメラーゼは、PCRにおいて有用な、熱安定性ポリメラーゼである。DNAポリメラーゼは、より好ましくは、Taq、Tbr、Tth、Tih、Tfi、Tfl、Pfu、Pwo、Kod、VENT、DEEPVENT、Tma、Tne 、Bst、Pho、Sac、Sso、Poc、Pab、ES4、又はDNAポリメラーゼ活性を有するそれらの突然変異体、変異体及び誘導体である。
【００１９】
オリゴヌクレオチドプライマーは、２つ以上のヌクレオチド長さのいずれのオリゴヌクレオチドでもあり得る。プライマーは、ランダムプライマー、ホモポリマー、又はターゲットRNA鋳型に特異的なプライマー（例えば、配列特異的プライマー）であることができる。
【００２０】
更なる組成的態様は、ホモポリメリック核酸及び１種以上のヌクレオチド又はそれらの誘導体のようなその他の反応混合物成分を含む。その核酸は、好ましくはデオキシヌクレオチドトリホスフェート、即ち、dNTP（例えば、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、dUTP、α-チオ-dNTP類、ビオチン−dUTP、フルオレセイン-dUTP、ジゴキシゲニン（digoxigenin）-dUTP）である。
【００２１】
本発明の緩衝剤、塩溶液及びその他の添加剤には、RT-PCRにおいて有用なそれらの溶液が含まれる。好ましい緩衝剤には、例えば、トリス(TRIS)、トリシン(TRICINE)、ビス−トリシン(BIS-TRICINE)、ヘペス(HEPES)、モプス(MOPS)、テス(TES)、タプス(TAPS)、ピペス(PIPES)、キャプス(CAPS)が含まれる。好ましい塩溶液には、例えば塩化カリウム、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、及び酢酸リチウムが含まれる。好ましい添加剤には、例えばDMSO、グリセロール、ホルムアミド、ベタイン、塩化テトラメチルアンモニウム、PEG、ツイーン（Tween）20、NP40、エクトイン（ectoine）、ポリオール類、大腸菌（E.coli）SSBタンパク質、ファージT4遺伝子32タンパク質、BSAが含まれる。
【００２２】
本発明の更なる態様は、リボ核酸鋳型からの核酸類の生成及び更なる核酸複製のための方法に関する。この方法は、(a)逆転写酵素、核酸ポリメラーゼ、又はそれらの誘導体及びホモポリメリック核酸を含む反応混合物へRNA鋳型を添加すること、及び(b)少なくともRNA鋳型の一部と相補的な核酸分子の重合を許容するのに十分な条件の下で、この反応混合物をインキュベートすることを含む。好ましい態様において、この方法は、少なくともRNA鋳型の一部と相補的なDNA分子の複製を含む。より好ましくは、このDNA複製方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）である。最も好ましくは、この方法は、共役逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）から成る。
【００２３】
より詳細な態様において、RT-PCRは、約23℃〜約100℃の間で起こる。好ましくは、逆転写が約35℃〜約75℃の間で起こり、次いでPCRが約60℃〜約95℃の間で行われる。最も好ましい条件の下では、逆転写は約37℃〜約60℃の間で起こり、変性が約94℃で起こり、アニーリング（annealization）が約60℃で起こり、そして重合が約72℃で起こる。
【００２４】
図１は、ホモポリメリックポリ（A）によるPCRの逆転写酵素阻害の減少を表す臭化エチジウム(EtdBr)染色1%アガロースゲルの写真である。レーン１は、ゲル参照マーカーとして使用された核酸ラダーである。レーン２及び３は、ホモポリメリックポリ（A）を含まないコントロールである。レーン４及び５は、100ngのポリ（A）の存在下でのRT-PCR反応の核酸生成物を示す。レーン６及び７は、200ngのポリ（A）の存在下でのRT-PCR反応の核酸生成物を示す。レーン８及び９は、400ngのポリ（A）の存在下でのRT-PCR反応の核酸生成物を示す。
図２は、2a ホモポリメリックポリ（U）、及び2b ホモポリメリックポリ（C）によるPCRの逆転写酵素阻害の減少を表す臭化エチジウム(EtdBr)染色1%アガロースゲルの写真である。レーン１は、ゲル参照マーカーとして使用された核酸ラダーである。レーン２及び３は、ホモポリメリック核酸を含まないコントロールである。レーン４及び５は、100ngの(2a)ポリ（U）、又は(2b)ポリ(C)の存在下でのRT-PCR反応の核酸生成物を示す。レーン６及び７は、200ngの(2a)ポリ（U）、又は(2b)ポリ(C)の存在下でのRT-PCR反応の核酸生成物を示す。レーン８及び９は、400ngの(2a)ポリ（U）、又は(2b)ポリ(C)の存在下でのRT-PCR反応の核酸生成物を示す。
図３は、ホモポリメリックポリ（dA）によるPCRの逆転写酵素阻害の減少を表す臭化エチジウム(EtdBr)染色1%アガロースゲルの写真である。レーン１は、ゲル参照マーカーとして使用された核酸ラダーである。レーン２〜４は、ホモポリメリックポリ(dA)を含まないコントロールである。レーン５〜７は、200ngのポリ（dA）の存在下でのRT-PCR反応の核酸生成物を示す。レーン８〜１０は、400ngのポリ（A）の存在下でのRT-PCR反応の核酸生成物を示す。
図４は、異なる逆転写酵素を用いたPCR阻害におけるホモポリメリックポリ（A）の減少効果を表す臭化エチジウム(EtdBr)染色1%アガロースゲルの写真である。レーン１は、ゲル参照マーカーとして使用された核酸ラダーである。レーン２〜４、９〜１１、及び１６〜１８は、ホモポリメリックポリ（A）を含まないコントロールである。レーン５〜７は、AMV-RTを用いたRT-PCR反応の核酸生成物を示す。レーン１２〜１４は、MMLV-RTを用いたRT-PCR反応の核酸生成物を示す。レーン１９〜２１は、MMLV-RT RNase Hを用いたRT-PCR反応の核酸生成物を示す（レーン８及び１５は、スペーサーとして使用されていない）。
図５は、異なるバッファー及び塩条件下での異なるDNAポリメラーゼにおけるホモポリメリックポリ（A）の減少効果を表す臭化エチジウム(EtdBr)染色1%アガロースゲルの写真である。図５ａは、ホモポリメリックポリ（Ａ）が存在しない（レーン２〜４）、及びホモポリメリックポリ（Ａ）が存在する（レーン５〜７）場合のアンプリタック（AmpliTaq）ＤＮＡポリメラーゼを用いたRT-PCR核酸生成物を表す。レーン１は、ゲル参照マーカーとして用いられる核酸ラダーである。図５ｂは、ホモポリメリックポリ（Ａ）が存在しない（レーン２〜４）、及びホモポリメリックポリ（Ａ）が存在する（レーン５〜７）場合のPFU DNAポリメラーゼを用いたRT-PCR核酸生成物を表す。レーン１及び８は、ゲル参照マーカーとして用いられる核酸ラダーである。
図６は、tRNA及びrRNAのものと比較したホモポリメリック核酸によるPCRの逆転写酵素阻害の減少を表す臭化エチジウム(EtdBr)染色1%アガロースゲルの写真である。レーン１は、ゲル参照マーカーとして用いられる核酸ラダーである。レーン３〜５は、標準RT-PCR反応混合物へいずれかの核酸が添加されていないコントロールである。レーン７〜９は、ホモポリメリックポリ(A)の存在下でのRT-PCR反応の核酸生成物を示す。レーン１１〜１３は、ｔRNA存在下でのRT-PCR反応の核酸生成物を示す。レーン１５〜１７は、rRNA存在下でのRT-PCR反応の核酸生成物を示す。（レーン２、６、１０及び１４は、スペーサーとして使用されていない。）
【００２５】
【発明の実施の形態】
本発明は、RNA鋳型からの核酸類の生成における使用のため、及び特に逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）生成物及び核酸類の分析のための組成物及び方法に関する。本発明は、RNA鋳型からの核酸類の生成において有用な１種以上の成分と組み合わせたホモポリメリック核酸を含む組成物を提供する。そのような成分は、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、１種以上のオリゴヌクレオチドプライマー、いずれか１種以上のヌクレオチド塩基、適当な緩衝剤、塩、又はRT若しくはRT-PCRにおいて有用なその他の添加剤を含むことができる。本発明の方法は、RNA鋳型から核酸を生成させるため、そして好ましくは新しく合成された核酸を複製するためにも、ホモポリメリック核酸を他の試薬と組み合わせて利用する。核酸分子の生成、複製、分析、定量及び別の方法の操作のために有用な、本発明の組成物及び方法は、共役又は非共役RT-PCR操作法において最も有用である。
【００２６】
RT-PCRは、RNA鋳型由来の核酸の生成及び複製のために使用される一種の分子操作である。RT-PCRは、ここでは、制限なしに本発明の組成物及び方法を利用することができる典型的なプロトコルとして説明されている。本発明が、逆転写酵素及びDNAポリメラーゼ活性の組み合わせを用いる他の方法における有用性を有することは、当業者に理解される。RT-PCRは、２つの別々の分子合成、即ち(i)RNA鋳型からのｃDNAの合成；及び（ｉｉ）PCR増幅による新しく合成されたｃDNAの複製、を用いる。
【００２７】
逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）
RT-PCRにおいて、反応混合物は少なくともRNA鋳型の一部と相補的なDNA分子の合成を許容するのに十分な温度において、（適当な緩衝剤中で）まずインキュベートされる。逆転写反応混合物の成分は、それから相補的DNA（ｃDNA）が転写されるRNA鋳型、逆転写酵素活性を示す核酸ポリメラーゼ、及び核酸合成のために必要とされる適当なヌクレオチド構築ブロックス（blocks）を通常含有する。本発明の目的のために、ｃDNAは、その核酸配列がRNA分子と相補的であるいずれかのDNA分子として定義される。RNA鋳型は、それからｃDNA分子が合成され得る核酸配列を提供するために使用されるいずれかのRNA分子として定義される。RNA鋳型からのｃDNAの合成は、逆転写酵素活性を示す核酸ポリメラーゼを使用することによって通常達成される。本発明の目的のために、逆転写酵素活性はRNA鋳型からのｃDNA分子の重合のための酵素の能力を指し示し、かつ、逆転写酵素は、逆転写酵素活性を有するいずれかの酵素を幅広く指し示す。逆転写は、約20℃〜約75℃、好ましくは約35℃〜70℃の温度範囲において通常起こる。
【００２８】
ｃDNA分子を生成するためのRNA鋳型の逆転写の後に、このｃDNAは、ｃDNA分子の複製のために十分な条件の下で（適当な緩衝剤中で）インキュベートされる。この反応混合物は、共役（連続又は一段階とも呼ばれる）RT-PCRにおいて使用されるような前（previous）逆転写反応混合物のものと同様であることもあり、又はこの反応物は前逆転写反応混合物のアリコートを含むこともあり、かつ非共役（二段階）RT-PCRの場合には、核酸複製のために更に修飾されることもある。複製反応混合物の成分は、核酸鋳型（この例においてはｃDNA）；核酸ポリメラーゼ；及び核酸合成のために必要とされる適当なヌクレオチド構築ブロックスを通常含有する。核酸複製は、その配列が他方の核酸によって決定され、かつその（他方の）核酸と相補的である核酸の重合を指し示す。ここで用いられるDNA複製は、DNA増幅と類義語である。DNA増幅は、好ましくは繰り返し起こり、それにより核酸配列の両鎖、即ち、RNA鋳型と相補的なDNA、及びその核酸配列がRNA鋳型と実質的に同一であるDNAを複製する。繰り返し、又は周期的なDNA複製は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）において熱安定性ポリメラーゼを用いて有利に達成され得る。
【００２９】
PCRは、当分野において周知の技術である。PCRは、反応混合物を、(i)核酸変性、(ii)オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング、及び(iii)核酸重合のサイクルに付すことにより核酸類を増幅するために使用される。増幅のために好ましい反応条件は、熱循環（thermocycling）、即ちPCRサイクルの各々の段階を促進するために、反応混合物の温度を変化させることを含む。PCRは、初期の延長された変性段階及び最後の延長された伸長（重合）段階が（任意に、及び好ましくは）付け足された、変性、アニーリング及び複製からなる多数のサイクルを介して通常行われる。熱循環は、約23℃〜約100℃の間、好ましくは約37℃〜約95℃の間の温度範囲内で通常起こる。核酸変性は、約90℃〜約100℃の間、好ましくは約94℃において通常起こる。アニーリングは、約37℃〜約75℃の間、好ましくは約60℃において通常起こる。重合は、約55℃〜約80℃の間、好ましくは約72℃において通常起こる。熱循環の数は、実施者（practitioner）の好みや、所望のDNA生成物の量により大きく異なる。PCRサイクルの数は、好ましくは約5〜約99の範囲であり、より好ましくは約20サイクルより多く、最も好ましくは約40サイクルである。
【００３０】
RNA鋳型
鋳型RNAは、実施者に既知、又は未知の、いずれかの興味のあるリボ核酸であり得る。鋳型RNAは、人工的に合成され、又は天然供給源から単離され得る。このRNA鋳型は好ましくはｍRNAである。このRNA鋳型は、より好ましくは生物活性であり、又は生物活性ポリペプチドをコードする。
【００３１】
ホモポリメリック核酸類
本発明は、ホモポリメリック核酸類が、RT-PCRにおいて観察されるような、逆転写酵素による核酸複製の阻害を抑制し、又はそうでなければ減少させることができる阻害緩和剤として働くことの発見に関する。ホモポリメリック核酸は、単一ヌクレオチド種から成る２つ以上の塩基長さのいずれのオリゴヌクレオチドであることもできる。ホモポリメリック核酸類は、リボ核酸類又はデオキシリボ核酸類であることができる。好ましいホモポリメリックリボ核酸類には、ポリ（A）、ポリ（C）、ポリ（G）,又はポリ（U）が含まれる。好ましいホモポリメリックデオキシリボ核酸類には、ポリ(dA)、ポリ(dC)、ポリ(dG)、ポリ（ｄT）、又はポリ(dI)が含まれる。RT-PCRのために使用されるホモポリマーは、２つ以上の塩基長さ、好ましくは100〜5000の塩基長さ、より好ましくは200〜2000の塩基長さのオリゴヌクレオチドである。RT-PCRのために使用される核酸ホモポリマーの量は、10ngより多く、好ましくは10ng〜2000ngの間、より好ましくは100ng〜1000ngの間、最も好ましくは200ng〜600ngの間であることができる。
【００３２】
逆転写酵素
本発明において有用な逆転写酵素は、逆転写酵素活性を示すいずれのポリメラーゼであることもできる。好ましい酵素には、減少したRNase H活性を示すものが含まれる。種々の逆転写酵素は、当分野において知られており、かつ市販されている（例えば、ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス（Indianapolis）、IN；ライフテクノロジーズ社、ロックビル（Rockville）、MD；ニューイングランド・バイオラボ社、ビバリー（Beverley）、MA；パーキンエルマー社、ノルウォーク（Norwalk）、CT；ファーマシア LKB バイオテクノロジー社、ピスケイトウェイ（Piscataway）、NJ；キアゲン社、バレンシア、CA；ストラタジーン、ラ・ジョラ（La Jolla）、CA 製）。好ましい逆転写酵素には、トリ骨髄芽球ウイルス（Avian Myeloblastosis Virus）逆転写酵素(AMV-RT)、モロニーネズミ白血病ウイルス（Moloney Murine Leukemia Virus）逆転写酵素（MMLV-RT）、ヒト免疫ウイルス（Human Immunovirus）逆転写酵素（HIV-RT）、EIRV-RT、RAV2-RT、C.ヒドロゲノホルマンス（C.hydrogenogormans）DNAポリメラーゼ、rTthDNAポリメラーゼ、スーパースクリプト（SuperScript）I、スーパースクリプト(SuperScript)II、並びにそれらの突然変異体、変異体、及び誘導体が含まれる。本発明の範囲又は好ましい態様から逸脱することなしに、上記に具体的には開示されていない逆転写酵素を含む様々な逆転写酵素が本発明において使用され得ることが理解されるべきである。
【００３３】
ＤＮＡポリメラーゼ
本発明において有用なＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ分子を複製することができるいずれのポリメラーゼであることもできる。好ましいＤＮＡポリメラーゼは、PCRにおいてとりわけ有用な熱安定性ポリメラーゼである。熱安定性ポリメラーゼは、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）(Taq )、サーマス・ブロキアナス（Thermus brockianus）(Tbr)、サーマス・フラブス（Thermus flavus）(Tfl)、サーマス・ルバー（Thermus ruber）(Tru)、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）(Tth)、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）(Tli)、及びサーモコッカス属のその他の種、サーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）(Tac)、サーモトガ・ネアポリタナ（Thermotoga neapolitana）(Tne)、サーモトガ・マリチマ（Thermotoga maritima）(Tma)、及びサーモトガ属のその他の種、フィロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)(Pfu)、フィロコッカス・ウォエセイ（Pyrococcus woesei）(Pwo)、及びフィロコッカス属のその他の種、バシラス・ステロサーモフィルス（Bacillus sterothermophilus）(Bst)、スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius）(Sac)、スルホロブス・ソルファタリクス（Sulfolobus solfataricus）(Sso)、フィロディクチウム・オックルタム(Pyrodictium occultum)(Poc)、フィロディクチウム・アビッシ(Pyrodictium abyssi)(Pab)、及びメタノバクテリウム・サーモアウトトロフィクム(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mth) のような幅広い種類の好熱菌、並びにそれらの突然変異体、変異体及び誘導体から単離される。
【００３４】
種々のDNAポリメラーゼが、当分野において知られており、かつ市販されている（例えば、ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス、IN；ライフテクノロジー社、ロックビル、MD；ニューイングランド・バイオラボ社、ビバリー、MA；パーキンエルマー社、ノルウォーク、CT；ファルマシア LKB バイオテクノロジー社、ピスケイトウェイ、NJ；キアゲン社、バレンシア、CA;ストラタジーン、ラ・ジョラ、CA 製）。熱安定性DNAポリメラーゼは、Taq、Tbr、Tfl、Tru、Tth、Tli、Tac、Tne、Tma、Tih、Tfi、Pfu 、Pwo、Kod、Bst、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4、VENTTM、DEEPVENTTM、並びにそれらの活性突然変異体、変異体及び誘導体から成る群から好ましくは選択される。本発明の範囲又は好ましい態様から逸脱することなしに、上記に具体的には開示されていないDNAポリメラーゼを含む様々なDNAポリメラーゼが本発明において使用され得ることが理解されるべきである。
【００３５】
オリゴヌクレオチドプライマー
本発明において有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、２つ以上の塩基長さのいずれのオリゴヌクレオチドでもあり得る。PCRプライマーは、好ましくは約15〜約30の塩基長さであり、かつ回文式（palindromic）（自己相補的）ではなく、又は反応混合物中で使用されることがある他のプライマーと相補的でない。プライマーは、ランダムプライマー、ホモポリマー、又はターゲットDNA鋳型に対し特異的なプライマー（例えば、配列特異的プライマー）であることができるが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチドプライマーは、相補的核酸の重合を促進するためにターゲット核酸の領域へハイブリダイズさせるために使用されるオリゴヌクレオチドである。好ましいRT-PCR技術において、RNA鋳型の一部と相補的な第一核酸分子（例えばｃDNA分子）の逆転写を促進するため、かつその核酸の複製（例えば、DNAのPCR増幅）を促進するためにも役立つ。いずれのプライマーも、当業者により合成されることができ、かつ多数の販売者のいずれかから購入することができる（例えば、ベールンガーマンハイム社、インデイアナポリス、IN；ニューイングランド、バイオラボ社、ビバリー、MA；ファルマシア LKB バイオテクノロジー社、ピスケイトウェイ、NJ製）。本発明の範囲又は好ましい態様から逸脱することなしに、ここで具体的に開示されないものを包含する非常に多数のプライマーが本発明において有用であると理解すべきである。
【００３６】
ヌクレオチド塩基
本発明において有用なヌクレオチド塩基は、核酸の重合において有用ないずれのヌクレオチドでもあり得る。ヌクレオチドは、自然発生的な、独特な、修飾された、誘導された、又は人工のものであることができる。ヌクレオチドは、非ラベルの、又は（例えば、放射性同位体元素、ビタミン、蛍光性又は化学発光性部位（moieties）、ジオキシゲニン（dioxigenin）を用いる）当分野において既知の方法により、検出できるようにラベルされることもある。これらの核酸類は、好ましくはデオキシヌクレオシドトリホスフェート類、dNTP類（例えば、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dITP、dUTP、α-チオ-dNTP類、ビオチン−dUTP、フルオレセイン-dUTP、ジゴキシゲニン（digoxigenin）-dUTP、7-デアザ-dGTP）である。dNTP類もまた、当分野において周知であり、市販されている（例えば、ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス、IN；ニューイングランド・バイオラボ社、ビバリー、MA；ファルマシア LKB バイオテクノロジー社、ピスケイトウェイ、NJ製）。
【００３７】
緩衝剤及び塩溶液
本発明において有用な緩衝剤及び塩は、例えば、逆転写酵素及びDNAポリメラーゼ活性のために、核酸合成のために適当な安定ｐH及びイオン条件をもたらす。様々な緩衝剤及び塩溶液及び修正された緩衝剤が、ここで具体的に開示されていない物質を含め、本発明において有用であり得ることが当分野において知られている。好ましい緩衝剤には、トリス(TRIS)、トリシン(TRICINE)、ビス-トリシン(BIS-TRCINE)、ヘペス(HEPES)、モプス(MOPS)、テス(TES)、タプス(TAPS)、ピペス(PIPES)、キャプス(CAPS)が含まれるが、これらに限定されない。好ましい塩溶液には、酢酸カリウム、硫酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化マンガン、酢酸マンガン、硫酸マンガン、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化リチウム、及び酢酸リチウムが含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
RT-PCRにおいて有用なその他の添加剤
本発明によりまず第一に開示されたものとは別に、逆転写、複製、及び／又は両反応の組み合わせを促進することができるその他の添加剤（例えば、RT-PCRを促進するための物質）が、当分野において知られている。本発明の組成物及び方法に従って、リボ核酸鋳型からの核酸類の生成及び複製を最適化するために、１種以上のこれらの添加剤が本発明の組成物に組み入れられることができる。添加剤は、有機又は無機化合物であり得る。本発明において有用な阻害緩和剤には、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン(BSA)、卵白アルブミン、アルブマックス(albumax)、カゼイン、ゼラチン、コラーゲン、グロブリン、リゾチーム、トランスフェリン、ミオグロビン、ヘモグロビン、α-ラクトアルブミン、フマラーゼ、グリセルアルデヒド-3-ホスフェート デヒドロゲナーゼ（GAPDH）、アミログルコシダーゼ、カルボニック・アンヒドラーゼ（carbonic anhydrase）、β-ラクトグロブリン、アプロチニン（aprotinin）、大豆トリプシン阻害剤、トリプシノゲン、ホスホリラーゼb、ミオシン、アクチン、β-ガラクトシダーゼ、カタラーゼ、トリプシン大豆消化物類（triptic soy digests）、トリプトーセ（tryptose）、レクチン類、大腸菌単一鎖結合(SSB)タンパク質(E.coli single stranded binding protein)、ファージT4遺伝子32タンパク質等のようなポリペプチド類、又はそれらのフラグメント類若しくは誘導体類が含まれるが、これらに限定されない。非ポリペプチド(nonpolypeptide)添加剤の例は、tRNA、rRNA、硫黄含有化合物類、酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（DMSO）、グリセロール、ホルムアミド、ベタイン、塩化テトラメチルアンモニウム(TMAC)、ポリエチレングリコール(PEG)、ツイーン（Tween)20、NP40、エクトイン、及びポリオール類を含むが、これらに限定されない。好ましい添加剤は、DMSO、グリセロール、ホルムアミド、ベタイン、TMAC、PEG、ツイーン（Tween)20、NP40、エクトイン、ポリオール類、大腸菌(SSB)タンパク質、ファージT4遺伝子32タンパク質、BSAを含む。
【００３９】
ここで説明された本発明の組成物及び方法の、その他の適当な修正及び適用は明らかであり、かつ本発明の範囲又はそれらの開示された態様の範囲を逸脱することなしに行い得ることは、当業者であればすぐに明らかになるであろう。ここで本発明が詳細に開示されたので、同様のことは、これとともに説明目的のみを有する以下の実施例を参照にして、より明らかに理解されるであろうが、これらは本発明を限定するものではない。
【００４０】
【実施例】
実施例１
逆転写酵素による核酸増幅の阻害
核酸複製における逆転写酵素の阻害効果を研究するため、RanBP2遺伝子の500bpフラグメントを含有するプラスミドの103及び102のコピーが、PCR増幅のための鋳型として使用された。これらの反応は50μlの最終容量で行われた。この反応混合物は、50mMのKCl、10mMのトリス-HCl、pH8.3、0.001%のゼラチン、1.5mMのMgCl2、2mMのDTT、200μMの各dNTP、0.16μMのセンス及びアンチセンスプライマー（それぞれ、配列番号（SEQ ID NO）1及び2）、2.5ユニットのホットスター(HotStar)TaqTM DNAポリメラーゼ（キアゲン）、10ユニットの組換えRNasIn（プロメガ(Promega)TM）及び0〜5ユニットへ量が増加するオムニスクリプト（Omniscript）RT（キアゲン）を含有していた。共役RT-PCRをシュミレーションするために、PCRは、予め37℃において30分間インキュベーション段階が行われた（“偽（pseudo）RT”）。このPCRプログラムは、初期RT変性/ホットスター・Taq活性化段階（initial denaturation/HotStarTaq activation step）（15分、95℃）、45サイクル（30秒、94℃；1分、60℃、1分、72℃）及び最終伸長段階(final extension step)（10分、72℃）から構成された。PCRは、バイオメトラ・ウノII熱循環機（Biometra Uno II thermocycler）において行われた。
これらの試料は、1%アガロースゲルにおいて（３回）分析され、生成収率が、比重計によって（densitometrically）決定された。逆転写酵素なしのこれらの試料の生成収率を、100%に設定した。
【００４１】
PCRにおけるオムニスクリプト(Omniscript)RTの阻害効果
【表１】
0004777497.tif 000002
【００４２】
これらの結果は、限られた量の鋳型DNAが存在する場合、たとえわずかな量でも逆転写酵素が存在すれば、DNA複製効率が劇的に減少したことを明らかに示す。鋳型としてゲノミックDNAを用いた比較実験は、とりわけごく少量の鋳型DNAが使用された際の、PCRにおけるオムニスクリプト(Omniscript)RTの阻害効果を示した。
【００４３】
実施例２
ホモポリメリックポリ(A)による核酸増幅の逆転写酵素阻害の減少
DNA複製における逆転写酵素の阻害効果が、ホモポリメリックポリ(A)の使用により緩和されるという発見を示すために、（ファルマシア製の市販の）ポリ(A)が、様々な量のHeLa細胞からの全RNAを含有する試料へ、量を増加させながら添加された。HeLa全RNAからのβ-アクチンmRNAの626bpフラグメントが、RT-PCRのためのRNA鋳型として選択された。
【００４４】
50μlの最終容量で反応が行われた。２つの反応混合物は、50mMのKCl、10mMのトリス-HCl、pH8.3、0.001%のゼラチン、2.5mMのMgCl2、2mMのDTT、400μMの各dNTP、0.4μMのセンスおよびアンチセンスプライマー類（それぞれ、配列番号3及び4）、5ユニットのホットスター(HotStar)TaqDNAポリメラーゼ（キアゲン）、0.5ユニットのオムニスクリプト(Omniscript)RT及び1及び10ngのHeLa全RNAをそれぞれ含有した。反応は、0ng、100ng、200ng及び400ngのポリ（A）ホモポリマーの存在下で行われた。逆転写は、42℃で30分間行われた。このPCRプログラムは、初期RT変性/ホットスター・Taq活性化段階（15分、95℃）、40サイクル（1分、94℃；1分、60℃、1分、72℃）、及び最終伸長段階（10分、72℃）から構成された。RT-PCRは、エッペンドルフ勾配循環機（Eppendorf gradient cycler）において行われた。
【００４５】
これらの試料は、1%アガロースゲルにおいて（２回）分析された。ポリ（A）の添加による有効性及び特異性の明らかな改善は、全HeLaRNA試料が1及び10ng存在する両方の場合に観察された。RT-PCRの収率は、ポリ(A)量の増加に伴い、著しく増加した。図１は、鋳型として1ngのHeLa全RNAを使用した際の、ポリ(A)の効果を示す。同様の効果は、10ngの全HeLaRNAが、鋳型として使用された際にも観察された（データは示されていない）。これらの結果は、ポリ(A)ホモポリマーの添加が、ホットスター（HotStar）TaqDNAポリメラーゼ（キアゲン）におけるオムニスクリプト(Omniscript)RT（キアゲン）の阻害効果を減少させ、それ故、一段階RT-PCRにおけるより高い感度及び特異性に寄与することを示す。
【００４６】
実施例３
他のホモポリメリックリボ核酸類による核酸増幅の逆転写酵素阻害の減少
ホモポリメリックリボ核酸の存在によるDNA複製における逆転写酵素の阻害効果の減少が、ホモポリメリックリボ核酸類に、一般的に共通した特性であることを示すために、実施例２に記載された実験が、ポリ（A）の代わりにポリ(U)及びポリ(C)を用いて繰り返された。
【００４７】
同様のβ-アクチンmRNAの626bpフラグメントが、鋳型RNAとして選択された。反応が行われ、50μlの最終容量で反応が行われた。この反応混合物は、50mMのKCl、10mMのトリス-HCl、pH8.3、0.001%のゼラチン、2.5mMのMgCl2、2mMのDTT、400μMの各dNTP、0.4μMのセンスおよびアンチセンスプライマー類（それぞれ、配列番号3及び4）、5ユニットのホットスター（HotStar）TaqDNAポリメラーゼ（キアゲン）、0.5ユニットのオムニスクリプト(Omniscript)RT（キアゲン）及び1ngのHeLa全RNAを含有した。反応は、ポリ(U)（ファルマシア）及びポリ(C)（ファルマシア）がそれぞれ0ng、100ng、200ng及び400ng存在する下で行われた。逆転写は、42℃で30分間行われた。このPCRプログラムは、初期RT変性/ホットスター・Taq活性化段階（15分、95℃）、40サイクル（1分、94℃；1分、60℃、1分、72℃）及び最終伸長段階（10分、72℃）から構成された。RT-PCRは、エッペンドルフ勾配循環機において行われた。
【００４８】
これらの試料は、1%アガロースゲルにおいて（３回）分析された。図2a及び2bは、鋳型として1ngのHeLa全RNAを、かつ各ホモポリメリックリボ核酸0ng、100ng及び400ngを使用した場合の、ポリ（U）及びポリ（C）の効果をそれぞれ示す。この一連の実験の結果は、ホモポリメリックリボ核酸類の添加が、DNA複製における逆転写酵素の阻害効果を抑制し、又は減少させることを示す。
【００４９】
実施例４
ホモポリメリックデオキシリボ核酸類による核酸増幅の逆転写酵素阻害の減少
DNA複製における逆転写酵素の阻害効果の減少が、一般的にホモポリメリック核酸類に共通した特色であることを示すために、実施例２及び３に記載されたような実験がホモポリメリックデオキシリボ核酸（ポリ(dA)）を用いて繰り返された。
【００５０】
同様のβ-アクチンmRNAの626bpフラグメントが、鋳型RNAとして選択された。50μlの最終容量で反応が行われた。この反応混合物は、50mMのKCl、10mMのトリス-HCl、pH8.3、0.001%のゼラチン、2.5mMのMgCl2、2mMのDTT、400μMの各dNTP、0.4μMのセンスおよびアンチセンスプライマー類（それぞれ、配列番号3及び4）、5ユニットのホットスター（HotStar）TaqDNAポリメラーゼ（キアゲン）、0.5ユニットのオムニスクリプト(Omniscript)RT（キアゲン）及び1ngのHeLa全RNAを含有した。反応は、0ng、100ng、200ng及び400ngのポリ(dA)ホモポリマー（ファルマシア）の存在下で行われた。逆転写は、42℃で30分間行われた。このPCRプログラムは、初期RT変性/ホットスター・Taq活性化段階（15分、95℃）、40サイクル（1分、94℃；1分、60℃、1分、72℃）及び最終伸長段階（10分、72℃）から構成された。RT-PCRは、エッペンドルフ勾配循環機において行われた。
【００５１】
これらの試料は、1%アガロースゲルにおいて（３回）分析された。図3は、ポリ(dA)の添加が、RT-PCRを実質的に改善することを示す。これらの結果は、DNA複製における逆転写酵素の阻害効果が、ホモポリメリック核酸類（デオキシリボ核酸類並びにリボ核酸類）の添加により、一般的に減少することを示す。
【００５２】
実施例５
様々な逆転写酵素条件下でのホモポリメリック核酸類による核酸増幅の逆転写酵素阻害の減少
DNA複製における逆転写酵素の阻害効果を減少させるための本発明の有効性が、使用される逆転写酵素には依存しないことを示すために、前記実施例の実験が、逆転写酵素活性を示す様々な酵素を用いて繰り返された。
【００５３】
同様のβ-アクチンmRNAの626bpフラグメントが、鋳型RNAとして選択された50μlの最終容量で反応が行われた。この反応混合物は、50mMのKCl、10mMのトリス-HCl、pH8.3、0.001%のゼラチン、2.5mMのMgCl2、2mMのDTT、400μMの各dNTP、0.4μMのセンスおよびアンチセンスプライマー類（それぞれ、配列番号3及び4）、5ユニットのホットスター(HotStar)TaqDNAポリメラーゼ（キアゲン）、及び1及び10ngのHeLa全RNAをそれぞれ含有した。３種の逆転写酵素が試験された。この反応混合物は、10ユニットのAMV-RT（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Roche Molecular Biochemicals）、50ユニットのM-MLV-RT（プロメガ(Promega)、組換え型）、又は50ユニットのM-MLV、RNaseH-RT（スーパースクリプト(SuperScript)II RT、LTI、組換え型）のいずれかを含有した。反応は、0ng、100ng、200ng及び400ngのポリ(A)ホモポリマーの存在下で行われた。逆転写は、42℃で30分間行われた。このPCRプログラムは、初期RT変性/ホットスター・Taq活性化段階（15分、95℃）、40サイクル（1分、94℃；1分、60℃。1分、72℃）及び最終伸長段階（10分、72℃）から構成された。RT-PCRは、バイオメトラ・ウノII熱循環機において行われた。
【００５４】
感度の明らかな増加（即ち、一段階RT-PCRにおけるPCRの減少された阻害）が、試験された３種の逆転写酵素全てにおいて観察された。図４は、ポリ(A)ホモポリマーの欠乏下（-）又は400ng存在下(+)において、鋳型としてβ-アクチンを用いた結果（３回）を要約する。AMV-RT及びMMLV-RTに対して、鋳型としての全RNAを1ng用いた結果が示されている。M-MLV、RNaseH-RTに対して、10ngの鋳型RNAを用いて得られた結果が示されている。
【００５５】
これらの結果は、この反応混合物中で使用される逆転写酵素に依存せずに、DNA複製における逆転写酵素の阻害効果を減少させるための本発明の有効性を示す。本発明は、使用される逆転写酵素にかかわらず、一般的にRT-PCRを最適化する要素として使用され得る。
【００５６】
実施例６
様々なDNAポリメラーゼ、バッファー及び塩条件の下でのホモポリメリック核酸類による核酸増幅の逆転写酵素阻害の減少
様々な反応混合物中で、DNA複製における逆転写酵素の阻害効果を減少させる本発明の有用性を更に示すために、異なるDNAポリメラーゼ、緩衝剤及び塩溶液を用いた試験が行われた。
【００５７】
２種のDNAポリメラーゼ、即ち未修正組換えTaqDNAポリメラーゼ（アンプリタック（AmpliTaq）、パーキンエルマー）、及び組換えPfuDNAポリメラーゼ（ストラタジーン）が試験された。１つの試験群では、50mMのKCl、10mMのトリス-HCl、pH8.3、0.001%のゼラチン、2.5mMのMgCl2、400μMの各dNTP、及び1ngのHeLa全RNAを含有する反応混合物において、5ユニットのアンプリタック(AmpliTaq)DNAポリメラーゼを使用した。２番目の試験群では、20mMのトリス-HCl、pH8.8、10mMのKCl、10mMの(NH4)2SO4、2mMのMgSO4、0.1%トリトン(Triton)X-100、0.1mg/mlのBSA、200μMの各dNTP、及び1ng又は100ngのHeLa全RNAを含有する混合物中で、5ユニットのPfuDNAポリメラーゼを使用した。全ての反応混合物は、2mM DTT、0.4μMのセンス及びアンチセンスプライマー（それぞれ、配列番号3及び4）、及び0.5ユニットのオムニスクリプト(Omniscript)RTを含有した。50μlの最終容量で反応が行われた。
【００５８】
反応は、0ng、100ng、200ng及び400ngのポリ(A)ホモポリマーの存在下で行われた。逆転写は、42℃で30分間行われた。このPCRプログラムは、初期RT変性段階（5分、94℃）、40サイクル（1分、94℃；1分、60℃、1分、72℃）及び最終伸長段階（10分、72℃）から構成された。RT-PCRは、バイオメトラ・ウノII熱循環機において行われた。
【００５９】
結果から、最終反応混合物中で使用されたDNAポリメラーゼ、緩衝剤又は塩溶液にかかわりなく、核酸類の増幅の改善がホモポリメリック核酸の存在下で生じたことが立証される。図5a及び5bには、ポリ(A)の欠乏下（-）又は400ng存在下において、1ngの全HeLaRNAを使用した結果が記載されている。共役RT-PCRにおけるホモポリメリック核酸類の阻害緩和効果は、特別な熱安定性DNAポリメラーゼ、特別な緩衝剤又は塩溶液によって制限されない。それ故、本発明は様々なイオン条件、異なるpH値の下において有用であり、かつ様々なDNAポリメラーゼ類へ応用され得ることが示された。
【００６０】
実施例７
異なるターゲットリボ核酸類におけるホモポリメリック核酸類による核酸増幅の逆転写酵素阻害の減少
DNA複製における逆転写酵素の阻害効果を減少させるための本発明の有効性が、目的のターゲットRNA鋳型及び使用されるオリゴヌクレオチドプライマー類には依存しないことを示すために、異なる遺伝子フラグメントを逆転写し、そして複製することを目的として試験が行われた。これらの試験のために、全HeLaRNAからのα-カテニン（catenin）mRNAの690bpフラグメントが、RT-PCRのためのRNA鋳型として選択された。
【００６１】
50μlの最終容量で反応が行われた。この反応混合物は、50mM KCl、10mMトリス-HCl、pH8.3、0.001%ゼラチン、2.5mM MgCl2、2mM DTT、400μMの各dNTP、0.4μMのセンス及びアンチセンスプライマー類（それぞれ、配列番号5及び6）、5ユニットのホットスター（HotStar）TaqDNAポリメラーゼ（キアゲン）、0.5ユニットのオムニスクリプト(Omniscript)RT及び5ngの全HeLaRNAを含有した。反応は、0ng、又は500ngのポリ(A)ホモポリマーの存在下で行われた。逆転写は、42℃で30分間行われた。このPCRプログラムは、初期RT変性/ホットスター・Taq活性化段階（15分、95℃）、40サイクル（1分、94℃；1分、50℃、1分、72℃）及び最終伸長段階（10分、72℃）から構成された。RT-PCRは、MJR PTC 200熱循環機において行われた。
【００６２】
これらの試料は、1%アガロースゲルにおいて（３回）分析された。ポリ(A)の添加による有効性及び特異性の明らかな改善は、5ngのHeLa全RNAからのα-カテニン鋳型の逆転写及び増幅において観察された（図６）。これらの結果は、共役RT-PCRにおけるホモポリメリック核酸類の阻害緩和効果が、特定の鋳型RNA又は特定のオリゴヌクレオチドプライマーの使用に対して特異的でないことを示す。
【００６３】
これらの結果は、ポリ(A)ホモポリマーの添加が、ホットスター（HotStar）TaqDNAポリメラーゼ（キアゲン）におけるオムニスクリプト(Omniscript)RT（キアゲン）の阻害効果を減少させ、それ故一段階RT-PCRにおいてより高い感度及び特異性に寄与することを示す。
【００６４】
実施例８
他の核酸類と比較したホモポリメリック核酸類による核酸増幅の逆転写酵素阻害の減少
前述の実施例では、反応混合物において使用された逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマー、RNA鋳型、緩衝剤、又は塩溶液に依存せずにDNA複製における逆転写酵素の阻害効果を減少させる際の、ホモポリメリック核酸類のプラスの（positive）効果を示した。
【００６５】
DNA複製における逆転写酵素の阻害効果を減少させる、本発明の特徴的な利点を示すために、同時試験が、ホモポリメリック核酸類と他の核酸類、具体的には非相同RNA分子類とを比較して行われた。
【００６６】
α-カテニンmRNAの690bpフラグメントが、RNA鋳型として選択された。50μlの最終容量で反応が行われた。この反応混合物は、50mMのKCl、10mMのトリス-HCl、pH8.3、0.001%のゼラチン、2.5mMのMgCl2、2mMのDTT、400μMの各dNTP、0.4μMのセンス及びアンチセンスプライマー類（それぞれ、配列番号5及び6）、5ユニットのホットスター（HotStar）TaqDNAポリメラーゼ（キアゲン）、0.5ユニットのオムニスクリプト(Omniscript)RT（キアゲン）、及び5ngのHeLa全RNAを含有した。
【００６７】
一連の試験は、更に核酸を添加せず、又は500ngのポリ(A)（ファルマシア）、500ngのtRNA（シグマ）、若しくは500ngの大腸菌16S、23S rRNA（ロッシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）のいずれかを含有した反応混合物から構成された。逆転写は、42℃で30分間行われた。このPCRプログラムは、初期RT変性/ホットスター・Taq活性化段階（15分、95℃）、40サイクル（1分、94℃；1分、50℃、1分、72℃）及び最終伸長段階（10分、72℃）から構成された。RT-PCRは、MJR
PTC 200熱循環機において行われた。
【００６８】
図６は、核酸類を追加しない場合(-)、又は追加した場合(+)の、RT-PCRの比較結果を示す。反応混合物中で鋳型RNA以外には更にRNAが存在しない場合は、いずれのDNA生成物も殆ど検出されなかった。同様のマイナスの(negative)結果は、反応混合物に500ngのtRNAが添加された場合に得られた。このことから、セルナー（Sellner）ら（1992）によって仮定された一段階RT-PCRにおけるtRNAのプラスの効果を示すことができなかったチャンドラー(Chandler)ら（1998）の研究が裏付けられた。反応物への500ngのrRNAの添加により、所望の核酸生成物の増幅が引き起こされた。しかし、400bpの範囲の大きさの第２非特異的バンドもまた現われた。この結果は、そのような分子が、潜在的に、間違って開始される（mispriming）際のターゲットとして作用するという、理論的考察に基づく阻害緩和剤としてのrRNAの明らかな欠点を明白に示す。ホモポリメリック核酸の利用のみが、RT-PCRの明らかな改善を結果的にもたらしたので、DNA複製における逆転写酵素の阻害効果を減少させる、本発明の組成物及び方法の優れた点が示された。
【００６９】
本発明は、分子生物学の分野において周知の全技術を参照として組み入れる。これらの技術には、以下の刊行物に記載された技術が含まれるが、これらには限定されない。
オールド、R.W.（Old,R.W.）及びS.B.プリムローズ(S.B.Primrose)、遺伝子操作の原理；ゲノム工学概論(Principles of Gene Manipulation;An Introduction To Genomic Engineering)（第３版、１９８５）ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ（Blackwell Scientific Publications）、ボストン。微生物学の研究；V.2:409pp.（ISBN 0-632-01318-4）。
サムブロック、J.（Sambrook,J.）ら、分子クローニング：実験マニュアル（第２版、１９８９）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ＮＹ、Vols.1-3。（ISBN 0-87969-309-6）
ウィナッカー、E.L.（Winnacker,E.L.）、遺伝子からクローンへ：遺伝子技術概論（Introduction To Gene Technology）（１９８７）、VCHパブリッシャーズ、NY（ホルスト・イベルガウフツ（Horst Ibelgaufts）により翻訳）。634pp.（ISBN 0-89573-614-4）。
【００７０】
参考文献
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コンプトン（Compton）、J.Nucleic acid sequence-based amplification.Nature 350:91-92(1991)。
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セルナー及びタルベット。３種のRT-PCR法の比較。BioTechniques 25(2):230-234(８月号、1998)。
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ここに記載された各刊行物が参照された。
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  ホモポリメリックポリ（A）によるPCRの逆転写酵素阻害の減少を表す臭化エチジウム(EtdBr)染色1%アガロースゲルの写真。
【図２】  2a ホモポリメリックポリ（U）、及び2b ホモポリメリックポリ（C）によるPCRの逆転写酵素阻害の減少を表す臭化エチジウム(EtdBr)染色1%アガロースゲルの写真。
【図３】  ホモポリメリックポリ（dA）によるPCRの逆転写酵素阻害の減少を表す臭化エチジウム(EtdBr)染色1%アガロースゲルの写真。
【図４】  異なる逆転写酵素を用いたPCR阻害におけるホモポリメリックポリ（A）の減少効果を表す臭化エチジウム(EtdBr)染色1%アガロースゲルの写真。
【図５】  異なるバッファー及び塩条件下での異なるDNAポリメラーゼにおけるホモポリメリックポリ（A）の減少効果を表す臭化エチジウム(EtdBr)染色1%アガロースゲルの写真。
【図６】  tRNA及びrRNAのものと比較したホモポリメリック核酸によるPCRの逆転写酵素阻害の減少を表す臭化エチジウム(EtdBr)染色1%アガロースゲルの写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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