(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列における５２番目のバリン残基から２１８番目のアスパラギン酸残基までのアミノ酸配列からなるポリペプチドを有効成分とするＮＫ活性抑制剤としての医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なポリペプチド、それをコードするＤＮＡ、及び、それらの製造方法並びに用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
インターロイキン１（以下、「ＩＬ−１」と言う。）は、有核細胞が産生するサイトカインであって、ほとんど全ての器官系或いは恒常性維持機構に関与する生体にとって重要なポリペプチドである。ＩＬ−１の生物学的活性を例示すると、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化、好中球の活性化、血管内皮細胞表面の性状の変化、骨及び軟骨の崩壊促進、造血促進、前駆Ｂ細胞の成熟誘導、成熟Ｂ細胞の増殖誘導、Ｔ細胞の活性化及びＩＬ−２産生誘導、サイトカイン産生誘導、ある種の腫瘍細胞に対する細胞障害性／細胞制止性作用、繊維芽細胞の分裂促進、及び軟寒天中での腫瘍細胞の増殖促進作用等の活性を挙げることができる。これまで、ＩＬ−１には、ＩＬ−１αとＩＬ−１βの二種類のＩＬ−１が報告されている。これらＩＬ−１α及びＩＬ−１βは、何れも同じ細胞表面受容体に結合し、同等の生物学的性質を持っているが、これらＩＬ−１αとＩＬ−１βの塩基配列の相同性は約４５％で、アミノ酸配列の相同性は約２６％程度に過ぎないことが明らかにされている。又、ＩＬ−１関連物質としては、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１Ｒａ）及びＩＬ−１受容体β（ＩＬ−１Ｒａβ）の存在が明らかにされている。斯かる状況下、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒａ及びＩＬ−１Ｒａβなどの所謂、ＩＬ−１ファミリー以外に、他のＩＬ−１類縁体が存在するのではないかとの指摘が為されているが、未だそのような報告はない。そのようなＩＬ−１類縁体は、生体の免疫機構をより詳細に解明し、また、新たな医薬品を開発する上で有用であり、斯界に於いては、斯かる類縁体のスクリーニングとその確立が希求されていた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第一の課題は、従来公知のＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒａ及びＩＬ−１Ｒａβとは異なる、ＩＬ−１類縁体としての新規なポリペプチド（以下、「本発明のポリペプチド」と言う。）を提供することにある。
【０００４】
本発明の第二の課題は、本発明のポリペプチドと結合する受容体蛋白質を提供することにある。
【０００５】
本発明の第三の課題は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを提供することにある。
【０００６】
本発明の第四の課題は、前記ＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡを提供することにある。
【０００７】
本発明の第五の課題は、前記組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体を提供することにある。
【０００８】
本発明の第六の課題は、本発明のポリペプチドの製造方法を提供することにある。
【０００９】
本発明の第七の課題は、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を提供することにある。
【００１０】
本発明の第八の課題は、本発明のポリペプチドを有効成分とする医薬組成物を提供することにある。
【００１１】
本発明の第九の課題は、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を含んでなる医薬組成物を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者等は、上記課題を解決するために、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＩＬ−１ＲａのｃＤＮＡを用いて、培養株化された動物細胞由来のｍＲＮＡを広く検索した。その結果、培養株化されたヒトＴ細胞であるＨＰＢ−ＭＬＴ細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２４３０）から、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドを単離することに成功した。本発明のポリペプチドは、前述したように、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＩＬ−１ＲａのｃＤＮＡに基づいて得られたものであるが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＩＬ−１Ｒａとのアミノ酸配列の相同性は２０％未満に過ぎず、ＩＬ−１ファミリーに属するも、従来公知のＩＬ−１ファミリーとは異なる新規ポリペプチドであることが判明した。本発明はこの知見に基づいて為された発明である。
【００１３】
すなわち、本発明の前記第一の課題は、培養株化されたヒトＴ細胞であるＨＰＢ−ＭＬＴ細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２４３０）由来の新規ポリペプチドにより解決するものである。
【００１４】
本発明の第二の課題は、本発明のポリペプチドと結合する受容体蛋白質により解決するものである。
【００１５】
本発明の第三の課題は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡにより解決するものである。
【００１６】
本発明の第四の課題は、当該ＤＮＡと自律複製可能なベクターを含んでなる複製可能な組換えＤＮＡにより解決するものである。
【００１７】
本発明の第五の課題は、当該組換えＤＮＡを適宜宿主に導入してなる形質転換体により解決するものである。
【００１８】
本発明の第六の課題は、本発明のポリペプチドの製造方法により解決するものである。
【００１９】
本発明の第七の課題は、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体により解決するものである。
【００２０】
本発明の第八の課題は、本発明のポリペプチドを有効成分とする医薬組成物により解決するものである。
【００２１】
本発明の第九の課題は、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を含んでなる医薬組成物により解決するものである。
【００２２】
【発明の実施の形態】
本発明のポリペプチドは、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、更には、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、中間部分アミノ酸配列として配列表における配列番号７に示すアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなるポリペプチドを意味する。より詳細には、本発明のポリペプチドは、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド、更には、配列表における配列番号５に於けるアミノ酸配列中の１箇所又は２箇所以上に於いて、１個以上のアミノ酸が欠失、付加及び／又は置換したアミノ酸配列、即ち、配列表における配列番号５に於けるアミノ酸配列中、１乃至５５個のアミノ酸が欠失、付加及び／又は置換したアミノ酸配列からなるポリペプチドが、本発明のポリペプチドとして好適に使用できる。斯かる本発明のポリペプチドは、特徴的な生物学的活性として、ナチュラルキラー（ＮＫ）活性を抑制する作用を有する。
【００２３】
本発明のポリペプチドは、当該ポリペプチド産生能を有するヒト及びヒト以外の温血動物由来の細胞から得ることができると共に、遺伝子工学的手法を用いて得ることができる。好適には、本発明のポリペプチド産生能を有する培養株化されたヒトＴ細胞、殊に、ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２４３０）を栄養培地中で培養することにより得ることができる。又、本発明のポリペプチド産生能を有する培養株化されたヒト細胞を、ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖法として、ヒト以外の温血動物の栄養分を含んだ体液（以下、「体液」と言う。）の供給を受けながら増殖させ、その培養液及び／又は増殖細胞から容易に得ることができる。前記ヒト以外の温血動物を用いる増殖方法は、マウス、ヌードマウス、ラット、ヌードラット、モルモット、ハムスターなどのげっ歯類の新生児を使用し、これら温血動物に、例えば、ウサギ由来の抗胸腺抗体などを注射して免疫反応を減弱させた後、本発明のポリペプチド産生能を有する培養株化されたヒト細胞を、動物１匹当たり約１×１０５乃至１×１０８個皮下又は腹腔内に注射して移植するか、あるいは、これら温血動物の成長個体の体外又は体内に設けられ、温血動物の体液が環流可能な拡散チャンバーなどの容器内に本発明のポリペプチド産生能を有する培養株化されたヒト細胞を収容し、その後、通常一般の方法により動物を約２乃至１０週間飼育する。この飼育期間、移植したヒト細胞は温血動物の体液を利用しながら増殖させる。本発明のポリペプチドが増殖細胞中に含まれている場合、増殖細胞を細胞塊、腹水又は細胞浮遊液として採取し、必要に応じて、これを適宜分散溶媒を用いて分散・洗浄した後、増殖細胞を以下に述べる機械的破壊又は化学的破壊処理して、得られる破壊物から目的とする本発明のポリペプチドを採取する。ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖法は、栄養培地を用いる生体外の増殖方法と比較して、より低コストと低労力でより短時間に所望量の増殖細胞が得られるとの利点がある。なお、ｉｎ  ｖｉｖｏ増殖方法は、例えば、特公昭５６−５４１５８号公報などに詳述されている。
【００２４】
本発明のポリペプチドを前記細胞培養液から採取するには、増殖細胞を除去した培養上清から採取するか、又は、増殖細胞を分離又は分離せずに培養上清と共に超音波を印加して破砕したり、ホモゲナイズ、凍結融解、あるいは、低張媒体中に浸漬するなどして増殖細胞を破砕した後、得られる破砕物又は破砕物と培養上清との混合物から当該ポリペプチドを採取する。斯かる破砕物又は混合物から本発明のポリペプチドを採取するには、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動など、通常、蛋白質を分離、精製するために斯界に於いて使用される１種以上の方法を採用することができる。使用目的に応じて、採取した本発明のポリペプチド含有液を濃縮し、凍結乾燥して、本発明のポリペプチドを含有する液状又は固状物を得る。得られる本発明のポリペプチドの純度は、前記手法を組み合わせることにより、そのアミノ酸配列を正確に分析できる程度に、実質的に純粋なレベルまで精製することができる。
【００２５】
又、本発明のポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡに通常の遺伝子工学的手法を適用して得ることもできる。このようにして得られる組換え型ポリペプチであっても、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列、及び、当該アミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、Ｎ−末端側に、中間部分アミノ酸配列として配列表における配列番号７に示すアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなるポリペプチドである限り、本発明のポリペプチドに包含される。また、本発明のポリペプチド断片とは、前記した本発明のポリペプチドを酵素、薬剤等により切断して得ることのできるポリペプチド断片を意味し、斯かるポリペプチド断片はポリペプチド合成することも可能である。
【００２６】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、例えば、配列表における配列番号４に示す塩基配列、当該塩基配列と少なくとも７５％の相同性を有し、その５´末端側に配列表における配列番号８に示す塩基配列からなる塩基配列を含んでなる塩基配列、又は、それら塩基配列に相補的な塩基配列を含んでなるＤＮＡに基づいて、通常の化学合成を適用することによっても得ることができる。いずれにしても、本発明によるＤＮＡは、一旦入手しさえすれば、ＰＣＲ法や、自律複製可能なベクターを用いる方法などを適用することにより、所望のレベルにまで容易に増幅させて得ることができる。又、当該ＤＮＡを公知の方法により断片化して得られるＤＮＡ断片は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡをスクリーニングする場合に有用であると共に、本発明のポリペプチドに対する抗体を遺伝子組換え技術により調製する場合に有用である。遺伝子工学的手法による抗体を製造する手法自体は公知であり、この手法は大量にヒト由来の抗体（ヒト化抗体）を得るのに有用な手法である。
【００２７】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、当該ＤＮＡが自律複製可能なベクターに挿入された、組換えＤＮＡとしての形態のものも包含する。斯かる組換えＤＮＡは、上述のように一旦目的とするＤＮＡが入手できれば、通常一般の遺伝子工学的手法により比較的容易に調製することができる。本発明で用いるベクターは、適宜の宿主内で自律複製できるものであればよく、具体例には、例えば、大腸菌を宿主として用いるｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３及びλｇｔ・λＣ等、枯草菌を宿主として用いる、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１及びφ１０５等、２種以上の微生物を宿主として用いるｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７等を挙げることができる。斯かるベクターに本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを挿入するには、斯界において慣用の方法が用いられる。具体的には、上述のようにして得られる本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡと自律複製可能なベクターとを制限酵素及び／又は超音波により切断した後、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片とベクター断片を連結する。ＤＮＡの切断に塩基配列に特異的に作用する制限酵素、とりわけ、ＫｐｎＩ、ＡｃｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＸｈｏＩなどを用いれば、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片とベクター断片を連結するのが容易となる。連結するには、必要に応じて、両者をアニーリングした後、生体内又は生体外でＤＮＡリガーゼを作用させればよい。斯くして得られる組換えＤＮＡは、適宜の宿主において無限に複製可能である。
【００２８】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、更に、当該ＤＮＡが適宜の宿主に導入された、形質転換体としての形態のものも包含する。斯かる形質転換体は、通常、上述のようにして得られるＤＮＡ乃至は組換えＤＮＡを適宜の宿主に導入して形質転換することにより容易に得ることができる。宿主としては、当該組換えＤＮＡにおけるベクターに応じて選択される、斯界において慣用される微生物、植物、動物由来の種々の細胞を用いることができる。宿主微生物としては、例えば、大腸菌、枯草菌、アルスロバクター属の微生物をはじめとする細菌の他、放線菌、酵母、真菌などの何れも有利に用いることができる。宿主微生物に本発明によるＤＮＡを導入するには、例えば、公知のコンピテントセル法やプロトプラスト法を適用すればよい。なお、本発明による形質転換体において、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡは、宿主の染色体から独立した状態にあっても、斯かる染色体に組み込まれた状態にあってもよい。宿主の染色体に組み込まれた当該ＤＮＡは、宿主内で安定して保持されるという特徴があり、組換え型の本発明のポリペプチドの製造に有利な場合がある。又、培養物自体を直接これらの菌体の破砕方法のいずれかを用いて処理し、上述の分離手段のいずれかを適用し、本発明のポリペプチドを含む菌体抽出液として得ることも有利に実施できる。このようにして得られる菌体抽出液から高純度の本発明のポリペプチドを採取する手法としては、公知の蛋白質の精製手段を適宜採用することにより達成できる。殊に、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する、本発明の抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによれば、高純度の本発明ポリペプチドを工業的に容易に製造することができる。
【００２９】
また、本発明のＤＮＡ断片とは、前記した本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを酵素、薬剤等により切断して得ることのできるＤＮＡ断片を意味し、斯かるＤＮＡ断片は、化学合成することも可能である。
【００３０】
本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体、殊に、モノクローナル抗体は、本発明のポリペプチド又はその抗原性フラグメントを抗原として用いることにより得ることができる。具体的には、例えば、斯かる抗原で免疫感作しておいた哺乳動物より採取した抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来の細胞とのハイブリドーマを作製し、これより本発明のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマのクローンを選択し、これを生体内外で培養することにより得ることができる。斯かる抗原としては、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列又はそれと相同的なアミノ酸配列をコードするＤＮＡを導入した形質転換体を培養することによって得ることができ、それらは、通常、完全精製又は部分精製した状態で使用される。抗原性フラグメントを得るには、これら完全精製品又は部分精製品を化学的又は酵素的に分解するか、配列表における配列番号５に示すアミノ酸配列に基づいてペプチド合成すればよい。また、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体には、生体に本来的に存在し、生体から単離し、精製された、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する当該ポリペプチドの受容体蛋白質も包含される。
【００３１】
免疫感作は慣用の方法によればよく、例えば、上記のごとき抗原を単独又は適宜アジュバントとともに、哺乳動物の静脈、皮内、皮下又は腹腔内に注射接種し、一定期間飼育する。哺乳動物は特に限定されることなく、所期の抗体産生細胞が得られる限り、その種類、大きさ、雌雄は問わない。通常はラット、マウス、ハムスターなどのげっ歯類が用いられ、後記無限増殖可能な哺乳類由来の細胞との適合性も勘案しながら、最適のものが選択される。用いる哺乳動物の種類や大きさにも依るが、抗原の接種量は、通常、総接種量を約５乃至５００μｇ／匹とし、これを約１乃至２週間の間隔を置いて２乃至５回に分けて接種する。そして、最終接種から３乃至５日後に脾臓を摘出し、分散して抗体産生細胞としての脾細胞を得る。尚、この際、哺乳動物の血液から、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を含む血清（抗血清）を採取することも可能である。
【００３２】
斯くして得られた抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来の細胞とを融合させて、目的のハイブリドーマを含む細胞融合産物を得る。無限増殖可能な哺乳類由来の細胞には、通常、Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ１８）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ９）及びＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）などのマウス骨髄腫由来の細胞株又はその変異株が用いられる。細胞融合は、例えば、ポリエチレングリコールやセンダイウイルスを始めとする融合促進剤や電気パルスによる慣用の方法が用いられる。一例を挙げると、融合促進剤を含む融合培地に、抗体産生細胞と無限増殖可能な哺乳類由来の細胞を、約１：１乃至１：１０の割合で浮遊させ、この状態のまま、約３０乃至４０℃で約１乃至５分間インキュベートする。融合培地には、例えば、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地及びイスコフ改変ダルベッコ培地を始めとする通常一般のものを用いることができるが、血清は除いておくのが望ましい。
【００３３】
目的のハイブリドーマを選択するには、まず、上記のようにして得た細胞融合産物をＨＡＴ培地などの選択用培地に移し、約３０乃至４０℃で約３日乃至３週間培養して、ハイブリドーマ以外の細胞を死滅させる。つぎに、ハイブリドーマを常法により培養し、培養物中に分泌された抗体を本発明のポリペプチドとの反応性を試験して検出する。試験には、エンザイムイムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ及びバイオアッセイなどの抗体を検出するための慣用の方法が用いられる。例えば、富山朔二・安東民衛編『単クローン抗体実験マニュアル』、１９９２年、講談社サイエンティフィック社発行、１０５乃至１５２頁には、そのための方法が種々詳述されている。本発明のポリペプチドに特異的な抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈法などによりクローニングして、単一クローンを得ることができる。
【００３４】
本発明のモノクローナル抗体は、斯かるハイブリドーマを生体内外で培養することにより得ることができる。培養には、哺乳類由来の細胞を培養するための慣用の方法が用いられ、例えば、生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）の培養培地で培養するときには、その培養物から、又、ヒト以外の温血動物に移植して生体内（ｉｎｖｉｖｏ）で増殖させるときには、その腹水及び／又は血液からモノクローナル抗体を採取する。培養物又は腹水若しくは血液からモノクローナル抗体を採取するには、抗体一般を精製するための斯界における慣用の方法が用いられる。個々の方法としては、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、遠心分離、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動及び等電点電気泳動が挙げられ、これらは必要に応じて組合せて適用される。精製したモノクローナル抗体は、その後、濃縮・乾燥し、用途に応じて液状又は固状とする。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによる本発明のポリペプチドの精製に極めて有用である。即ち、本発明のモノクローナル抗体を、本発明のポリペプチドとそれ以外の夾雑蛋白質を始めとする夾雑物質との混合物に接触させて、当該モノクローナル抗体に本発明のポリペプチドのみを吸着させる工程と、吸着した本発明のポリペプチドを当該モノクローナル抗体から脱着させる工程を含んでなる。これら両工程は、通常、水性媒体中で行なう。当該モノクローナル抗体は、通常、ゲル状の水不溶性担体に固定化した状態で用いられ、その水不溶性担体を円筒状のカラムに充填し、これに、例えば、形質転換体の培養液又はそれらの粗精製品を通液すると、実質的に本発明のポリペプチドのみが水不溶性担体に固定化した当該モノクローナル抗体に吸着する。吸着した本発明のポリペプチドは、当該モノクローナル抗体周囲の水素イオン濃度を変えることにより脱着させることができる。例えば、当該モノクローナル抗体がＩｇＧのクラスに属する場合は、酸性側のｐＨ、通常、ｐＨ２乃至３で、又、ＩｇＭのクラスに属する場合は、アルカリ側のｐＨ、通常、ｐＨ１０乃至１１で脱着・溶出させる。本発明のモノクローナル抗体を用いる精製方法によるときには、本発明のポリペプチドを最少限の労力と時間で高度に精製できる。
【００３６】
本発明のモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの検出を必要とする諸分野にも広範な用途を有する。すなわち、本発明のモノクローナル抗体にラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイなどの標識イムノアッセイを適用するときには、被検試料中の本発明のポリペプチドの検出及び定量を迅速且つ正確に分析することができる。斯かる検出及び分析において、本発明のモノクローナル抗体は、例えば、放射性物質、酵素及び／又は蛍光物質により標識して用いられる。本発明のモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドに特異的に反応し、免疫学的に反応するので、斯かる免疫反応を前記標識物質を指標に検出すれば、被検試料中の極微量の本発明のポリペプチドを高精度で検出することができる。殊に、標識イムノアッセイは、バイオアッセイと比較して、一度に数多くの被検試料を分析できる上、分析に要する時間と労力が低減でき、しかも、分析が高精度であるという特徴がある。したがって、本発明による検出方法は、本発明のポリペプチドを製造する際の工程管理や、得られる製品の品質管理に極めて有用である。なお、本発明はモノクローナル抗体の標識や標識アッセイそのものに係わるものではないので詳細な説明は省くが、例えば、ピー・ティッセン著、石川栄治訳『エンザイムイムノアッセイ』、１９８９年、東京化学同人発行、１９６乃至３４８頁などには、モノクローナル抗体の標識や標識アッセイ方法について詳述されている。
【００３７】
次に、本発明の医薬組成物について説明する。本発明のポリペプチドは、哺乳動物の免疫系に深く関与しているＮＫ活性を抑制する作用を有していることから、それ単独、又は、公知のＮＫ活性抑制剤、免疫調節剤、生理活性物質等と併用して、更には、必要に応じて、医薬的に許容される担体と併用して、ＮＫ活性抑制剤としての医薬組成物とすることができる。当該医薬組成物に配合する本発明のポリペプチドの投与量は、通常、ヒト成人１日当たり０．００１〜１００μｇ、好ましくは、０．０１〜１０μｇ、より好ましくは、０．１〜１μｇの範囲から選択される。当該医薬組成物の剤形としては、液剤、粉剤、錠剤、顆粒剤、ペースト剤等の形態を例示でき、それらは、単位投与形態とするのが望ましい。又、本発明の抗体を含んでなる医薬組成物とは、当該抗体が本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する形態にある組成物全般を意味する。
【００３８】
ところで、本発明ポリペプチドをコードするＤＮＡは、いわゆる、「遺伝子療法」にも適用することができる。すなわち、通常の遺伝子療法に於いて、本発明のＤＮＡを、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどのウイルス由来のベクターに挿入するか、カチオニックポリマーや膜融合型リポソームなどのリポソームに包埋した状態で、ＮＫ活性を抑制する必要性のある疾患に罹患した患者に直接注入するか、あるいは、前記患者からリンパ球を採取し、採取したリンパ球に生体外で導入した後、その患者に自家移植することができる。又、養子免疫遺伝子療法に於いては、効果細胞に本発明のＤＮＡを通常の遺伝子療法の場合と同様にして導入し、前記患者や免疫疾患等に罹患した患者を治療することも可能である。
【００３９】
以下、本発明を実験に基づいてより詳細に説明する。
【００４０】
【実験１】
＜ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞由来ｍＲＮＡの取得＞
ヒトＴ細胞であるＨＰＢ−ＭＬＴ細胞（ＦＥＲＭ  ＢＰ−２４３０）を、ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて培養して湿重量で１．１ｇの細胞を採取した。これを５Ｍグアニジンイソチオシアネート、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）、及び８％（ｗ／ｖ）β−メルカプトエタノールからなる混液（ｐＨ７．０）７．７ｍｌに浸し、ホモゲナイザーで細胞を破砕し、４℃で１５時間静置した。次に、常法に従って、３５ｍｌ容遠心チューブに、５．７Ｍ塩化セシウムを含む１００ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を１ｍｌ注入し、その液面に前記細胞破砕物を１０ｍｌ重層し、この状態で２０℃、２５，０００ｒｐｍの条件で２０時間超遠心分離してＲＮＡ画分を採取した。このＲＮＡ画分を１５ｍｌ容遠心チューブにとり、等量のクロロホルム／イソブタノール混液（体積比で４：１）を加え、５分間振盪し、４℃、１５，０００ｒｐｍの条件で１０分間遠心分離した後、水層部を採取し、これに２．５倍容のエタノールを加え、−２０℃で２時間静置して全ＲＮＡを沈殿させた。この沈殿物を採取し、７５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液で洗浄後、滅菌蒸留水０．５ｍｌに溶解して全ＲＮＡを取得した。これをオリゴ結合ビーズ『Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜ｓｕｐｅｒ＞』（日本合成ゴム株式会社製）を用いて精製して得られたＨＰＢ−ＭＬＴ細胞由来ｍＲＮＡを下記の実験に供した。
【００４１】
【実験２】
＜ポリペプチドのｃＤＮＡの取得＞
【実験２−１】
＜ポリペプチドの部分ｃＤＮＡの取得＞
上記で得たｍＲＮＡ１μｇを０．５ｍｌ容チューブに入れ、サーマルサイクラー（商品名『ＤＮＡサーマルサイクラー４８０』、パーキンエルマー社製）を用いて、７０℃で５分間加熱した後、４℃に急冷した。次に１０×ＰＣＲ反応液を２μｌ、２５ｍＭ塩化マグネシウムを２μｌ、１００ｍＭジチオトレイトールを２μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓを１μｌ、０．２μｇ／μｌのランダムヘキサマーを１μｌ、３５Ｕ／μｌのリボヌクレアーゼインヒビター（商品名『ＲＮａｓｉｎ』、プロメガ社製）を０．５μｌ、２００Ｕ／μｌの逆転写酵素（商品名『Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ（ＡＭＶ）由来逆転写酵素』、日本合成ゴム社製）を１μｌ加え、滅菌蒸留水で全量を２０μｌとした。この混合物を２５℃で１０分間、４２℃で３０分間、９９℃で５分間インキュベートして逆転写酵素を反応させ、第１ストランドｃＤＮＡを含む水溶液を得た。次いで、ジェンバンク・データベースより、ヒトＩＬ−１α（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｅ０１１４６）、ヒトＩＬ−１β（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｅ００６１９）およびヒトＩＬ−１Ｒａ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｍ５５６４６）のｃＤＮＡ塩基配列を入手し、ホモロジー検索をコンピュータソフト（ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ  Ｖｅｒ．９．０）を用いて行ない、三者に比較的保存された塩基配列領域について、センスプライマー１（ｓ１；５′−（Ｃ／Ｇ）（Ｔ／Ａ）ＣＴＡＣＡＧ（Ｃ／Ｔ）ＴＧ（Ｇ／Ｃ／Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｃ）（Ｇ／Ｃ）Ａ−３′）とアンチセンスプライマー１（ａ１；５′−（Ｇ／Ｔ）（Ｃ／Ｇ）ＧＧＣ（Ａ／Ｃ）ＧＡＣ（Ｔ／Ｇ）Ｃ（Ａ／Ｃ）（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｇ）−３′）を設計し、ＰＣＲ増幅させた。ストラタジーン社製の１０×Ｐｆｕ反応液５μｌ、２．５Ｕ／ｍｌのＰｆｕポリメラーゼ１μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰｓ（１００ｎｇ／μｌ）を４μｌ、ｓ１プライマーを１μｌ、及び１００ｎｇ／μｌのａ１プライマー１μｌ加え、滅菌蒸留水で全量を５０μｌとした。反応は、９４℃で４５秒間、４２℃で４５秒間、７２℃で２１０秒間の一連の処理を３０サイクル行った。得られたＰＣＲ産物を２．０％アガロースゲルにて電気泳動したところ、約１００ｂｐ付近にバンドが検出された。この付近の増幅断片をゲルから切り出し、抽出用キット（『ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ』、キアゲン社製）を用いて精製を行った。即ち、１．５ｍｌ容チューブに目的のゲル断片を入れた後、前記抽出用キットに付属されている『ＱＸ１』溶液を３００μｌ加え、次いで前記抽出用キットに付属されているＤＮＡ吸着用ゲル『ＱＩＡＥＸ  ＩＩ』を１０μｌ加え、５０℃にて１０分間インキュベートした。１３，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した後、上清を除去し、沈殿物にＱＸ１溶液を５００μｌ加えて懸濁した後、１３，０００ｒｐｍの条件で３０秒間遠心処理して沈殿を洗浄した。その後、得られた沈澱物にＰＥ溶液を５００μｌ加え、同様の遠心処理条件で２回洗浄した後、上清除去し、１５分間室温にて乾燥した。最後に１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝溶液（ＴＥ緩衝液、ｐＨ８．０）を２０μｌ加え、室温で５分間静置してＤＮＡを抽出した後、１３，０００ｒｐｍの条件で３０���間遠心処理して、目的のＤＮＡ断片を得た。
【００４２】
次に、クローニングキット（商品名『ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ』、ストラタジーン社製）を用いて、ＤＮＡ断片−１のクローニングを行った。０．５ｍｌ容チューブに１０ｎｇ／μｌのｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）クローニングベクターを１μｌ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  １０×反応溶液を１μｌ、１０ｍＭ  ｒＡＴＰを０．５μｌ、５Ｕ／μｌのＤＮＡ断片−１を４μｌ、５Ｕ／μｌのＳｒｆＩ制限酵素を１μｌ、４Ｕ／μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼを１μｌ加え、更に滅菌蒸留水を加えて全量を１０μｌとした。これを室温にて１時間反応させてライゲーションを行った。次いで６５℃にて１０分間インキュベートして反応を停止させた後、４℃に冷却した。その後、常法に従い下記の方法で形質転換を行った。大腸菌株（商品名『ＥｐｉｃｕｒｉａｎＣｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ′  Ｋａｎ  ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ』、ストラタジーン社製）を予め氷冷しておいたファルコン２０５９ポリプロピレンチューブ（ファルコン社製）に４０μｌ入れ、１．４４Ｍβ−メルカプトエタノールを０．７μｌ加え、１０分間氷中にて冷却した。これに前記ライゲーション産物を２μｌ加えて穏やかに撹拌した後、３０分間氷中に静置した。次いで、４２℃にて４５秒間加熱後、ＳＯＣ培地を４５０μｌ加え、３７℃で１時間振盪培養した。その後、発色指示薬としてのＸ−ｇａｌ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）０．４ｍｇ、１００ｍＭイソプロピルチオガラクトシドを４０μｌ含むＬＢ培地（１％塩化ナトリウム、１％トリプトン、０．５％酵母エキス、２％アガーを含む）にこの培養産物を植菌し、３７℃にて１６時間培養した。ｓ１、ａ１プライマーを用いたコロニーＰＣＲによって、目的とする１００ｂｐのバンドが出されたコロニーを、ＬＢ培地に接種し、３７℃で１６時間で振盪培養した。得られた菌体培養液２ｍｌを用いて、常法に従って下記の方法でプラスミドを調製した。即ち、菌体を３，０００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離して回収した後、１０ｎｇ／μｌのリゾチウムを１００μｌ入れ、室温にて５分間インキュベートし、０．２Ｍドデシル硫酸ナトリウム２００μｌを加えて混合し、５分間氷中で冷却した後、５Ｍ酢酸カリウムを１５０μｌ加え、５分間氷中にて冷却した。１５，０００ｒｐｍの条件で５分間遠心処理した後、上清４００μｌを１．５ｍｌ容チューブに取り、これに当量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（体積比で２５：２４：１）を加え、５分間激しく振盪した後、１５，０００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離し、タンパク質を除去した。次いで、水層２８０μｌを回収し、常法に従ってエタノール沈殿を行った。その後、ＲＮａｓｅ（４０ｍｇ／ｍｌ）／ＴＥを６０μｌ加え、３７℃にて１時間３０分インキュベートした後、２０％ポリエチレングリコールを３０μｌ入れ、１．５時間氷中にて静置した。次いで、１５，０００ｒｐｍの条件で３０分間遠心分離し、上清を除去した後、沈殿を７５％（ｖ／ｖ）冷エタノール水溶液２００μｌで洗浄し、減圧下で１０分間乾燥し、滅菌水に溶解させた。得られたプラスミドにつき、ジデオキシ法により、ＤＮＡシーケンサー（商品名『ＤＮＡシーケンサー３７３Ａ』、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて塩基配列を解析した結果、配列表における配列番号１に示す本発明のポリペプチドのｃＤＮＡの部分塩基配列を暫定的に決定した。その後、完全長の本発明のポリペプチドのｃＤＮＡのクローニングを目的として、５′及び３′末端のｃＤＮＡ塩基配列の取得をＲＡＣＥキット（商品名『５′／３′ＲＡＣＥ  Ｋｉｔ』、ロシュダイアグノスティックス社製）を用いて行った。
【００４３】
【実験２−２】
＜５′ＲＡＣＥ法＞
アンチセンスプライマー２（ａ２）として、配列表における配列番号１の塩基配列に於ける第１０３〜８６番目に相当する５′−ＡＴＧＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＣＣＡＣＣ−３′、アンチセンスプライマー３（ａ３）として、配列表における配列番号１の塩基配列の８３〜６５番目に相当する５′−ＡＧＣＣＣＴＡＴＡＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧ−３′、アンチセンスプライマー４（ａ４）として、配列表における配列番号１の塩基配列の６１〜４２番目に相当する５′−ＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＡＴＴＣＣＴＴＴＴＧ−３′を作出した。先ず、５×ｃＤＮＡ合成溶液（２５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．５）、４０ｍＭ塩化マグネシウム、１５０ｍＭ塩化カリウム、５ｍＭジチオトレイトール）を４μｌ、２．５ｍＭｄＮＴＰｓを２μｌ、ａ２プライマー（１００ｎｇ／μｌ）を１μｌ、ヒトＨＰＢ−ＭＬＴ細胞ｍＲＮＡを２４０ｎｇ、ＡＭＶ（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ）由来逆転写酵素（２０Ｕ／μｌ）を１μｌ加え、ＤＥＰＣ処理水を入れ全量を２０μｌとした。これを５５℃で１時間、６５℃で１０分間反応させてｃＤＮＡを得た。これをスピンカラムを用いて精製した。即ち、合成産物に１００μｌの反応溶液（３Ｍグアニジンチオシアネート、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ６．６）、５％エタノール）を加え、スピンカラムに前記産物を入れ、１５，０００ｒｐｍで３０秒間遠心処理した。次に洗浄溶液（２０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）／エタノール）を５００μｌ加え、１５，０００ｒｐｍで３０秒間遠心処理して洗浄し、再度同洗浄溶液２００μｌを加えて同様の操作を繰り返した。次いで、洗浄処理して得られた沈殿物に、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．５）及び１ｍＭＥＤＴＡを含む抽出溶液を５０μｌ加え、１５，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離してｃＤＮＡ精製物を得た。精製物１９μｌに、１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ塩化マグネシウム、及び５００ｍＭ塩化カリウムを含む１０×反応液を２．５μｌ、２ｍＭｄＡＴＰを２．５μｌ加えて、全量を２４μｌとした。これを９４℃で３分間加熱後、直ちに急冷し、ターミナルトランスフェラーゼ（１０Ｕ／μｌ）を１μｌ加え、３７℃で３０分間、７２℃で１０分間保温した。次に合成産物５μｌ、３７．５μＭ  オリゴｄＴ−アンカープライマー（５′−ＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶ−３′、ＶはＡ、Ｃ又はＧを示す）を１μｌ、ａ３プライマー（１００ｎｇ／μｌ）を１μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓを１μｌ、Ｐｆｕポリメラーゼ（２．５Ｕ／ｍｌ）を１μｌ、１０×Ｐｆｕ反応液を５μｌ加えて滅菌蒸留水で５０μｌとし、９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で２分間処理する一連の処理を３５サイクル行って合成産物を増幅させた。更に増幅産物を１μｌ採取し、同様の条件で増幅を行った（但し、再増幅時には、１２．５μＭ  ＰＣＲアンカープライマー（５′−ＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣ−３′）と９０ｎｇ／μｌのａ４プライマーを使用）。ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲルを用いて電気泳動を行ったところ、約５５０ｂｐのバンドが検出された。その後、検出された断片を、前述と同様に抽出用キッ���（商品名『ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ』、キアゲン社製）を用いて精製を行い、クローニングキット（『ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ』、ストラタジーン社製）を用いてクローニングを行った。次いで、常法に従い大腸菌株（商品名『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ′  Ｋａｎｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ』、ストラタジーン社製）を用いて形質転換を行った。得られた形質転換体を栄養培地中で培養してコロニーを形成させ、コロニーＰＣＲにより目的のバンドが検出されたコロニーを選択してＬＢ−液体培地に植菌し、３７℃で１６時間で振盪培養した。菌体培養液２ｍｌから、常法に従ってプラスミドを調製し、得られたプラスミド『ｐＣＲＩＬＬ−５』をジデオキシ法により、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列解析を行った結果、配列表における配列番号２に示す５′末端側ｃＤＮＡ部分に約５７５ｂｐ相当の塩基配列が得られた。
【００４４】
【実験２−３】
＜３′ＲＡＣＥ法＞
センスプライマー２（ｓ２）として、配列表における配列番号１の塩基配列の２４〜４２番目に相当する５′−ＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣＴＧＣＣ−３′を作出した。次いで、５×ｃＤＮＡ合成溶液を４μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓを２μｌ、３７．５μＭオリゴｄＴ−アンカープライマーを１μｌ、ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞ｍＲＮＡを５４０ｎｇ、２０Ｕ／μｌのＡＭＶ由来逆転写酵素を１μｌ加え、ＤＥＰＣ処理水で全量を２０μｌとし、サーマルサイクラーを用いて５５℃で６０分間、６５℃で１０分間反応させてＤＮＡ産物を得、このＤＮＡ産物を１μｌ、１２．５μＭ  ＰＣＲアンカープライマー（５′−ＧＡＣＣＡＣＧＣＧＴＡＴＣＧＡＴＧＴＣＧＡＣ−３′）を１μｌ、ｓ２プライマー（１００ｎｇ／μｌ）を１μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓを１μｌ、２．５Ｕ／μｌのＰｆｕポリメラーゼを１μｌ、１０×Ｐｆｕ反応液５μｌに、滅菌蒸留水を加えて全量を５０μｌとした。これを９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で１２０秒間処理する一連の処理を３５サイクル行って前記ＤＮＡ産物を増幅させた。増幅産物を１．２％アガロースゲルを用いて電気泳動したところ、約３２０ｂｐのバンドが検出された。その後、検出されたバンドを切除し、前述と同様に、抽出用キット（『ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ』、キアゲン社製）を用いて精製し、続いて常法に従って、大腸菌株（『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ′  Ｋａｎ  ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ』、ストラタジーン社製）を用いて形質転換した。得られた形質転換体を栄養培地中で培養してコロニーを形成させ、コロニーＰＣＲによって、目的のバンドが検出されたコロニーを選択してＬＢ−液体培地に植菌し、３７℃で１６時間で振盪培養した。常法に従って得られたプラスミド『ｐＣＲＩＬＬ−３』を、ジデオキシ法により塩基配列を解析した。その結果、本発明のポリペプチドの３′末端側ｃＤＮＡ部分の塩基配列として、配列表における配列番号３に示す２４８ｂｐの塩基配列が得られた。
【００４５】
【実験２−４】
＜ポリペプチドのｃＤＮＡの取得＞
実験２−２及び実験２−３で得られた塩基配列を基に、本発明のポリペプチドｃＤＮＡの５′末端側のセンスプライマーｓ４（５′−ＧＡＧＡＡＣＴＧＡＡＧＧＣＡＡＡＣＡＧ−３′）及び３′末端側のアンチセンスプライマーａ５（５′−ＡＧＴＧＡＧＣＡＧＧＴＴＴＧＧＧＧＴＴ−３′）を作出し、本発明のポリペプチドの完全長塩基配列についてＲＴ−ＰＣＲ法にて増幅した。即ち、５×ｃＤＮＡ合成溶液を４μｌ、２．５ｍＭ  ｄＮＴＰｓを２μｌ、３７．５μＭオリゴｄＴ−アンカープライマーを１μｌ、ＨＰＢ−ＭＬＴ細胞ｍＲＮＡを５４０ｎｇ、２０Ｕ／μｌのＡＭＶ由来逆転写酵素を１μｌ加えＤＥＰＣ処理水で２０μｌとし、サーマルサイクラーを用いて５５℃で６０分間、６５℃で１０分間反応させた。得られたｃＤＮＡ１μｌに、１００ｎｇ／μｌの作出したセンスプライマーｓ４及びアンチセンスプライマーａ５をそれぞれ１μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓを１μｌ、２．５Ｕ／μｌのＰｆｕポリメラーゼを１μｌ、１０×Ｐｆｕ反応液を５μｌ加え、更に、滅菌水を加えて５０μｌとした。これを９４℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃で１２０秒間処理する一連の処理を３５サイクル行って前記ｃＤＮＡを増幅させた。増幅産物を１．２％アガロースゲルを用いて電気泳動したところ、約８５０ｂｐのバンドが検出された。次に、検出された断片を、前述と同様に抽出用キット（商品名『ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ』、キアゲン社製）を用いて精製し、クローニングキット（商品名『ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（＋）  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ』、ストラタジーン社製）を用いてクローニングし、続いて常法に従って大腸菌株（商品名『Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ  Ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ′  Ｋａｎｓｕｐｅｒｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ』、ストラタジーン社製）を形質転換した。得られた形質転換体を栄養培地中で培養してコロニーを形成させ、コロニーＰＣＲによって、目的のバンドが検出されたコロニーを選択してＬＢ−液体培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。菌体培養液２ｍｌから、常法に従ってプラスミドを調製し、得られたプラスミドをプラスミド『ｐＣＲＩＬＬ−ｆｕｌｌ』と命名した。このプラスミド『ｐＣＲＩＬＬ−ｆｕｌｌ』の塩基配列をジデオキシ法により、ＤＮＡシーケンサーを用いて解析し、配列表における配列番号４に示す本発明のポリペプチドｃＤＮＡを決定した。又、配列表における配列番号４に対応する本発明のポリペプチドのアミノ酸配列を配列表における配列番号５に示す。
【００４６】
【実験３】
＜生物活性＞
常法に従って、健常人から末梢血を採取し、水溶性非イオン性ポリマー（商品名『ファイコール』、ファルマシア社製）を用いてＮＫ細胞を含む末梢血リンパ球を採取した。採取したＮＫ細胞を含む末梢血リンパ球を、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール及び１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて２回洗浄し、５×１０６個／ｍｌの細胞濃度となるように懸濁した。この細胞懸濁液を９６ウェルマイクロプレートに各ウェル当たり１００μｌずつ分注し、各ウェルに、後述する実施例２で得た本発明のポリペプチド標品を所定濃度含有する溶液を５０μｌ及び上記培地を５０μｌそれぞれ添加し、３７℃で１８時間インキュベートした。培養後のＮＫ細胞を含む末梢血リンパ球を回収し、５１Ｃｒ標識したＫ−５６２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２４３）と濃度比（ＮＫ細胞を含む末梢血リンパ球（エフェクター細胞（Ｅ））／Ｋ−５６２細胞（ターゲット細胞（Ｔ））（＝Ｅ／Ｔ比）＝６．２５及び２５の割合で混合した後、３７℃で４時間培養した。培養後、９６ウェルマイクロプレートを２，０００ｒｐｍの条件で５分間遠心分離し、上清中の５１Ｃｒのカウント数を測定することにより、本発明のポリペプチドがＮＫ活性に及ぼす影響を調べた。その結果を図１に示す。
【００４７】
図１の結果から明らかなように、本発明のポリペプチドが添加されたＮＫ細胞を含む末梢血リンパ球は、本発明のポリペプチド無添加のＮＫ細胞を含む末梢血リンパ球と比べ、上清中の５１Ｃｒのカウント数が著しく低下し、このことは、本発明のポリペプチドが、ＮＫ細胞活性を抑制することを示すものである。
【００４８】
【実施例１】
＜組換えＤＮＡ及び形質転換体の調製＞
本発明のポリペプチドとして、配列表における配列番号５に示す本発明のポリペプチドのｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列の５２番目のバリン残基からＣ−末端アミノ酸残基であるアスパラギン酸残基までの１６７個のアミノ酸配列からなるポリペプチドを大腸菌を用いる系で発現させる目的で、下記の組換えＤＮＡを調製した。即ち、０．５ｍｌ容反応チューブに１０×Ｐｆｕ反応液（ストラタジーン社製）を１０μｌ、Ｐｆｕポリメラーゼ（２．５Ｕ／ｍｌ）を１μｌ、２５ｍＭ  ｄＮＴＰｓを１μｌ、上記で得られたプラスミドｐＣＲＩＬＬ−ｆｕｌｌを１ｎｇ、５′−ＡＣＴＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＡＡＧＡＡＣＴＴＡＡＡＣＣＣＧ−３′（無作為な４塩基に引き続き、ＮｄｅＩサイト及び配列表における配列番号４に於ける２７４番目から２９１番目の塩基配列に相当）及び５′−ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＡＡＴＣＧＣＴＧＡＣＣＴＣ−３′（無作為な４塩基に引き続き、ＢａｍＨＩサイトと終始コドン及び配列表における配列番号４に於ける７７７番目から７６３番目の塩基配列に相当）で表わされる塩基配列のセンスプライマー及びアンチセンスプライマーをそれぞれ適量加え、滅菌蒸留水で５０μｌとした。その後、常法により、得られた混合物を９４℃で０．５分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間、この順序でインキュベートする一連の処理を３０サイクル繰り返してＰＣＲ反応させた。得られたＰＣＲ産物を、常法に従って、制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにて３７℃で２時間消化後、７０℃で１５分間熱処理し、両制限酵素を失活させた。一方、プラスミド（商品名『ｐＥＴ−３ａ』、ノバジェン社製）も同様に制限酵素ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩにて３７℃で２時間消化後、７０℃で１５分間熱処理を行なった。制限酵素消化後のベクター『ｐＥＴ−３ａ』１００ｎｇと同様の制限酵素処理後のＰＣＲ産物２００ｎｇとをライゲーションキット（商品名『ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２』、宝酒造株式会社製）を用いてライゲーション反応を行ない、発現用プラスミドｐＥＴＩＬＬ−ＥＸを構築した。ｐＥＴＩＬＬ−ＥＸを常法に従って、ノバジェン製大腸菌『ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ』を形質転換して形質転換体を得た。この形質転換体を形質転換体『ＩＬＬ−ＥＸ−１』と命名した。尚、本実験で用いた、配列表における配列番号５に示す本発明のポリペプチドのｃＤＮＡがコードするアミノ酸配列の５２番目のバリン残基からＣ−末端アミノ酸残基であるアスパラギン酸残基までの１６７個のアミノ酸配列は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒａ、及びＩＬ−１Ｒａβとの相同性は図２に示すように２０％程度に過ぎなかった。図２中、アルファベットはアミノ酸の１文字略記号を示す。
【００４９】
【実施例２】
＜ポリペプチドの調製＞
実施例１で得た形質転換体『ＩＬＬ−ＥＸ−１』を、アンピシリン５０μｇ／ｍｌとクロラムフェニコール２０μｇ／ｍｌを含むＬＢ培地（ｐＨ７．２）５ｍｌに接種し、３７℃で１８時間培養した後、培養物から菌体液１ｍｌを採取し、上記２種類の抗生物質を含むＬＢ培地１００ｍｌに接種した。その後、３７℃で４時間培養後、１００ｍＭ  ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）１ｍｌを添加し、２時間培養した。培養後、１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して大腸菌を回収した。このペースト状の大腸菌に、０．５Ｍ尿素、０．１％β−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）１０ｍｌを添加し、室温で３時間攪拌した。攪拌後、１０，０００ｒｐｍの条件で２０分間遠心し、菌体を回収した。この菌体に、８Ｍ尿素、０．１％β−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）１０ｍｌを添加し、室温で１８時間攪拌した。攪拌後、１０，０００ｒｐｍの条件で２０分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を０．５Ｍ尿素、０．１％β−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）１Ｌに対して４℃にて１８時間透析を行い、１０，０００ｒｐｍの条件で２０分間遠心分離し、上清を回収した。この上清をクロマトグラフィー用ゲル（商品名『Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５』、ファルマシア社製）を用いるゲル濾過した。この際、０．１％β−メルカプトエタノールを含むＰＢＳを溶出液として用い、分子量約２０ｋＤａの画分を回収することにより、精製した本発明のポリペプチド標品を得た。
【００５０】
【実施例３】
〈ハイブリドーマ及びモノクローナル抗体の調製〉
【実施例３−１】
〈ハイブリドーマの調製〉
１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に実施例２の方法により得た精製した本発明のポリペプチドを完全フロイントアジュバントともに２０μｇ／匹の割合で注射により接種した。この接種を２週間おきに２回、４週間に亘ってマウスに接種し、最後の接種から１週間後に更に接種し、その３日後に脾臓を摘出し、摘出した脾臓を生理食塩水中に分散して懸濁状の脾細胞を得た。
【００５１】
この脾細胞とマウス骨髄腫由来のＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）を、３７℃に予温しておいた血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）にそれぞれ細胞密度３×１０４個／ｍｌ及び１×１０４個／ｍｌになるように浮遊させ、遠心分離後、沈澱部を採取した。この沈澱に平均分子量１，５００ダルトンの５０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールを含む血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）１ｍｌを１分間かけて滴々加え、３７℃で１分間インキュベートした後、全量が５０ｍｌになるまで血清無含有のＲＰＭＩ１６４０培地（ｐＨ７．２）を滴々加え、遠心分離後、沈澱部を採取した。この沈澱をＨＡＴ培地に浮遊させ、９６ウェルマイクロプレートに２００μｌ／ウェルずつ分注し、３７℃で１週間インキュベートしてハイブリドーマを選択した。
【００５２】
各ウェルにおける培養上清中に分泌された抗体につき、実施例２の方法により得た精製ポリペプチドとの反応性をエンザイムイムノアッセイにより調べ、前記精製ポリペプチドに反応性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選別した。引続き、このハイブリドーマに常法にしたがって限界希釈を繰返し適用し、本発明のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマクローンを得た。
【００５３】
【実施例３−２】
〈モノクローナル抗体の調製〉
実施例３−１で得た本発明のモノクローナル抗体を産生し得るハイブリドーマクローンを栄養培地中で培養し、培養物を精製したところ、ＢＡＬＢ／ｃマウス１匹当たり、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応するモノクローナル抗体約５ｍｇを得た。
【００５４】
【実施例４】
＜エンザイムイムノアッセイによるポリペプチドの検出〉
常法にしたがって、実施例２の方法により得た本発明のポリペプチドでウサギを免疫感作した後、血液を採取し、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を精製し、単離した。当該抗体をＰＢＳに２０μｇ／ｍｌになるように溶解し、９６ウェルマイクロプレートに１００μｌ／ウェルずつ分注した。マイクロプレートを室温下で３時間インキュベートした後、当該抗体溶液を除き、１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳを２００μｌ／ウェルずつ加え、４℃で一晩静置した。
【００５５】
マイクロプレートからＰＢＳを除き、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄後、実施例２の方法により得た本発明のポリペプチドを０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにより適宜濃度に希釈して１００μｌ／ウェルずつ加え、振盪下、室温下で２時間反応させた。０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄し、予めビオチン標識した本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体を１００μｌ／ウェルずつ加え、振盪しながら室温下で２時間反応させ、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄した後、西洋ワサビパーオキシダーゼとストレプトアビジンとの複合体を１００μｌ／ウェルずつ加え、振盪しながら室温下でさらに２時間反応させた。０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むＰＢＳで洗浄後、精製ポリペプチドに結合した西洋ワサビパーオキシダーゼの活性をｏ−フェニレンジアミンを基質に波長４９２ｎｍにおける吸光度として測定した。本検出方法によれば、好感度で本発明のポリペプチドを精度良く検出し得る。
【００５６】
【発明の効果】
上記したように、本発明は、配列表における配列番号５、又は、当該アミノ酸配列と少なくとも７５％の相同性を有し、その中間部分アミノ酸配列として配列表における配列番号７に示すアミノ酸配列を含んでなるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び、配列表における配列番号４に示す塩基配列、配列表における配列番号４に示す塩基配列と少なくとも７５％の相同性を有する塩基配列を有し、その５´末端側に配列表における配列番号８に示す塩基配列を含んでなる塩基配列、又は、それら塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡ、更には、本発明のポリペプチドと免疫学的に反応する抗体、及び本発明のポリペプチドを検出する方法を提供する発明である。本発明によれば、哺乳動物の免疫系に関する研究、更には、ＮＫ活性抑制剤／調節剤としての医薬品開発にも貢献し得る発明である。
【００５７】
本発明は、斯くも顕著な作用効果を発揮するものであり、斯界に貢献すること誠に多大な意義のある発明であると云える。
【００５８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のポリペプチドがＮＫ活性に及ぼす影響を示す図である。
【図２】本発明の実施例２のポリペプチド、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１Ｒａ及びＩＬ−１Ｒａβとの相同性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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