(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１記載の少なくとも3´末端の20塩基配列を含むＤＮＡを含む、Ｈ−ｒａｓにより癌化した腫瘍に対する悪性腫瘍形成抑制剤。
【請求項２】
配列番号１記載の少なくとも3´末端の20塩基配列を含むＤＮＡを含む、Ｈ−ｒａｓにより癌化した腫瘍に対する悪性腫瘍良性化剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、悪性腫瘍の形成を抑制しうるDNAを含むベクター及びそれを含む悪性腫瘍形成抑制剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ほ乳類のヒアルロン酸を合成する酵素としては、ヒアルロン酸合成酵素１（Biol. Biochem. Res. Commun., 222 (1996), p.816）、ヒアルロン酸合成酵素２（以下「HAS2」とも記載する）及びヒアルロン酸合成酵素３（WO98/00551）が知られている。
【０００３】
特に転移能の高い腫瘍細胞において上記酵素の発現量が、高まっていることが知られている（J. Aichi Med. Univ. Assoc., 17(1989), pp.575-583）。また、癌遺伝子により形質転換した培養細胞において、上記ヒアルロン酸合成酵素の発現量に変化が生ずることが知られており、例えばH-ras遺伝子により形質転換したラットの細胞ではHAS2の遺伝子の発現が亢進していることが知られている（Connective Tissue vol.31(1999), p.104）。
【０００４】
しかし、HAS2の遺伝子発現が亢進している癌細胞において、HAS2のアンチセンスDNAが腫瘍形成を抑制することはこれまでは確認されておらず、当該アンチセンスDNAをヒアルロン酸合成酵素２の発現が亢進した悪性腫瘍細胞に導入し、該酵素のmRNAの翻訳のみを阻害することで、悪性腫瘍の形成を抑制することができることは知られていなかった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
従来、癌細胞の悪性腫瘍形成能を抑制するためには、種々の化学療法剤（アルキル化剤（イホスフィミド、塩酸ナイトロジェンマスタード-N-オキシド等）、代謝拮抗剤（6-メルカプトプリンリボシド、エノシタビン、テガフール、フルオロウラシル等）、抗生物質製剤（アクチノマイシンD、アクラルビシン、ダウノルビシン、ピラルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンC等）、植物成分製剤（エトポシド、イリノカテン、ビノレルビン等）、その他の薬剤（ウベニメクス、L-アスパラギナーゼ、塩酸ファドロゾール水和物、レンチナン等））及び放射線医薬品が用いられてきた。しかし、これらの化学療法剤は重篤な副作用を呈する危険性を有し、また、放射線医薬品などでは患者のみならず術者の被爆の危険性も伴う。従って、より副作用の少なく、安全性の高い薬剤の開発が望まれてきた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題に鑑み、悪性腫瘍形成能を効率よく抑制し、且つ副作用の少ない物質を鋭意探索した結果、驚くべきことにヒアルロン酸合成酵素２のアンチセンスDNAを用いて該酵素の翻訳を抑制することにより、悪性腫瘍の腫瘍形成能の抑制することができることを見い出して本発明を完成した。
【０００７】
すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）配列番号１記載の塩基配列の少なくとも3'末端の20塩基配列を含むDNA、又はそれに相補的なポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるDNAを含み、前記DNAの5'上流域に転写開始点が組み込まれたヒアルロン酸合成酵素2遺伝子の翻訳を抑制しうるベクター。
（２）配列番号１記載の塩基配列の少なくとも3'末端の20塩基配列を含むDNA、又はそれに相補的なポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるDNAを含むヒアルロン酸合成酵素２発現抑制剤。
（３）配列番号１記載の塩基配列の少なくとも3'末端の20塩基配列を含むDNA、又はそれに相補的なポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるDNAを含む悪性腫瘍形成抑制剤。
（４）配列番号１記載の塩基配列の少なくとも3'末端の20塩基配列を含むDNA、又はそれに相補的なポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるDNAを含む悪性腫瘍良性化剤。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、発明の実施の形態により本発明を詳説する。
<1>本発明ベクター
本発明ベクターは、配列番号１記載の塩基配列の少なくとも3'末端の20塩基配列を含むDNA、又はそれに相補的なポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるDNAを含み、前記DNAの5'上流域に転写開始点が組み込まれたヒアルロン酸合成酵素2遺伝子の翻訳を抑制しうるベクターである。
【０００９】
配列番号２記載の塩基配列を有するDNAは、HAS2をコードするDNAのアンチセンスDNAの3'末端の20塩基である。本発明におけるストリンジェントな条件下とは、一般にハイブリダイゼーションを使用する核酸の検出法に用いられる条件を指称するが、例えば37.5％ホルムアミド、5×SSPE（塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム／EDTA（エチレンジアミン四酢酸）緩衝液）、５×デンハルト溶液(Denhardt's solution)、0.5％  SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）存在下での42℃で条件が例示される。
【００１０】
上述のHAS2のアンチセンスDNAは、HAS2のmRNAに相補的なアンチセンスRNAを逆転写によって生ずるDNA（すなわちHAS2のcDNAのアンチセンス鎖）である。前記アンチセンスRNAは、必ずしもmRNAの全体に相補的な配列である必要はなく、少なくともmRNAの5'末端の20塩基対に相補的な塩基配列、好ましくは30塩基対以上600塩基対未満の塩基配列に相補的な塩基配列からなるRNAが挙げられ、そのようなRNAを逆転写することによって生ずるDNAを本発明ベクターとして使用することが可能である。従って、本発明ベクターに使用するDNAは、配列番号１記載の塩基配列の少なくとも3'末端の20塩基配列を含むDNA（配列番号２記載の塩基配列を有するDNA）、又はそれに相補的なポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるDNAが、HAS2遺伝子の発現の抑制をすべき細胞内で機能しうるベクターに組み込まれたベクターであれば本発明ベクターに使用することができる。
【００１１】
本発明ベクターは、上記DNA断片の5'上流域に転写開始点を有するベクターである。すなわち、本発明ベクターを導入した宿主細胞においては、少なくとも配列番号３の塩基配列を有するRNAが生成される。
【００１２】
本発明ベクターの宿主細胞としては、ほ乳類の細胞であることが好ましく、特にヒト、イヌ、ネコ、サル、ネズミ、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジなどの悪性腫瘍を形成し得る細胞が挙げられ、前記悪性腫瘍を形成し得る細胞は生体内に存在する細胞でも良く、また培養細胞でも良い。
【００１３】
特に、本発明ベクターを悪性腫瘍の形成を抑制するための医薬として使用する際には、目的の宿主細胞に効率よく本発明ベクターを導入する必要があるため、本発明ベクターはウイルスベクターであることが好ましい。そのような本発明ベクターとしては、例えばアデノウイルスベクターなどのほ乳類感染性のウイルスベクターに上記DNA断片を組み込んだベクターが例示される。
【００１４】
本発明ベクターは以下の調製法により調製することができる。
本発明ベクターは配列番号１記載の塩基配列のうち、3'末端から20個程度の塩基配列のDNA断片を人工的に調製し、この断片を適当なベクターに組み込むことで調製することもできるが、以下の方法に従って既知のHAS2のcDNAを利用して調製することも好ましい。
【００１５】
HAS2のcDNAは、例えばJ. Biol. Chem., vol.271 (1996),  no.38, pp.22945-22948（ヒト由来HAS2）又はJ. Biol. Chem., vol.271 (1996), no.38, pp.23400-23406（マウス由来HAS2）に記載の方法により調製することができる。得られたHAS2のcDNAは、本発明ベクターへの調製操作を容易とするために、プラスミドベクター等の公知のベクターに挿入した状態としておくことが好ましい。このようなプラスミドベクターとしては、例えばpCXN2(Niwa, H., Yamanura, K. and Miyazaki, J. (1991) Gene 108, 193-200)又はpFLAG-CMV-2（イーストマン  コダック(Eastman Kodak)製）等の哺乳類細胞用発現ベクターが挙げられるがこれに限定はされない。
【００１６】
HAS2のcDNAの全長を組み込んだ本発明ベクターを調製する場合は、上記プラスミドベクターに挿入して得られたHAS2のcDNAを適当な制限酵素で切り出して使用する。前記制限酵素としてはHAS2のcDNAを挿入したプラスミドベクターからHAS2のcDNAの全長が切り出せるような制限酵素であれば、いずれも使用することができるが、HAS2のcDNAを上記プラスミドベクターに挿入する際に使用した制限酵素サイトを切断しうる制限酵素を使用することできる。例えば得られたHAS2のcDNAをpFLAG−CMV-2ベクターにBgl II及びSma Iの相補末端を使用して挿入した場合は、Bgl II、Not I、又はHind III、及びSma I等の制限酵素を使用することでHAS2のcDNAの全長を含む断片を上記プラスミドベクターから切り出すことができる。
【００１７】
上記の通り切り出したHAS2のcDNAを使用して本発明ベクターを調製する。HAS2のcDNAを組み込むべき本発明ベクター調製用のベクターとしては、 pCXN2、pFLAG-CMV-2、pEXneoなどの他、pAxCAwt（寶酒造株式会社製）及びpAdeno-X（クロンテック社製）等のアデノウイルスベクターを使用することができ、これらは本発明ベクターを悪性腫瘍形成抑制剤として使用する際に特に有用である。プラスミドベクターからHAS2のcDNAを切り出す際に使用した制限酵素に対応する制限酵素サイトを、上記本発明ベクター調製用のベクターが有していればその制限酵素サイトを使用してHAS2のcDNAを挿入することができ、有していない場合は上記で切り出したHAS2のcDNAをT4 DNAポリメラーゼなどで処理し、上記HAS2のcDNAの相補末端を平滑末端とした後に、公知の手法を用いて制限酵素のリンカー配列を平滑末端に結合して上記本発明ベクター調製用のベクターに挿入することができる。
【００１８】
挿入して得られたベクターを公知の手法（例えば塩基配列の解析、制限酵素消化断片の構成の解析等）を用いて解析し、HAS2のcDNAが逆方向に挿入されたベクターを選択する。すなわち、HAS2のcDNAのアンチセンス鎖の5'上流域にベクターの転写開始点が配置されているベクターを本発明ベクターとして選択する。このようにして得られた本発明ベクターは、悪性腫瘍の形成を抑制する働きを有する。
マウスのHAS2のcDNAを使用して調製した本発明ベクターに挿入されたHAS2のアンチセンス配列を配列番号１に記載する。
【００１９】
<2>本発明薬剤
本発明薬剤は、配列番号１記載の塩基配列の少なくとも3'末端の20塩基配列を含むDNA、又はそれに相補的なポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるDNAを含む薬剤である。
【００２０】
本発明における、「配列番号１記載の塩基配列の少なくとも3'末端の20塩基配列を含むDNA、又はそれに相補的なポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるDNA」は、上記<1>本発明ベクターに記載したものと同義である。上記DNAはHAS2の発現を抑制する働きを有するため、本発明薬剤はHAS2発現抑制剤として使用することが可能であり、新たな悪性腫瘍の形成を抑制し、悪性腫瘍を構成する細胞を正常化する性質を利用した悪性腫瘍形成抑制剤や悪性腫瘍良性化剤として使用することもできる。
【００２１】
上記DNAは、溶解状態でそのままの形態で本発明薬剤として使用される他、本発明ベクターに挿入された形態で使用してもよく、また、特に医薬として使用する際には、薬学的に使用することができる製剤に処理することを容易にする賦形剤と、補助剤などからなる適宜の薬学的に許容することができるキャリアを含む薬剤の一部として使用することもできる。
【００２２】
非経口投与に適した配合物として、水溶液の形態をなす上記DNA、例えば水溶性塩の水溶液がある。適宜の親油性溶媒又は担体としては脂肪油、例えばごま油又は合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル若しくはトリグリセリドがある。水溶性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を高める物質を含めることができ、これには例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及びデキストランなどを例示することができる。懸濁液はまた、必要に応じて安定化剤を含むことができる。
【００２３】
このような医薬は、悪性腫瘍組織、特に固形の悪性腫瘍組織に直接本発明ベクターを注入することで、当該ベクターが生体内の悪性腫瘍細胞に容易に感染し、上記DNA断片が該細胞に導入されることで、新たな悪性腫瘍の形成を抑制し、悪性腫瘍を構成する細胞を正常化することができる。
【００２４】
尚、本明細書における悪性腫瘍の形成の抑制作用とは、悪性腫瘍の数の増加を抑制する作用、及びたとえ腫瘍が形成されるとしてもそれを形成する細胞には一般的な悪性腫瘍に観察される巨細胞が観察されず、腫瘍の境界が明確で浸潤が実質的に観察されないことを指称し、後述の実施例に記載の方法により確認することが可能である。
【００２５】
【実施例】
<1>  HAS2のcDNAベクターの構築
マウス由来のHAS2を使用した。マウスHAS2のcDNAは、マウス17日齢の胚cDNA（Marathon-Ready  TM  cDNA、クロンテック社製）からSpicer, A.P. et al. (1996)J. Biol. Chem., 271, 23400-23406に記載の方法に従ってクローン化した。
【００２６】
マウスHAS2 cDNA断片を、配列番号４及び５に示す塩基配列を有するプライマーを用いて、PCR法により増幅した。配列番号４に示す塩基配列は、Bgl II部位及びHAS2の配列番号６に示すアミノ酸配列（マウスのHAS2の構成アミノ酸の２〜９位）に相当する配列を含んでいる。また、配列番号５に示す塩基配列は、Sma I部位及びHAS2の配列番号７に示すアミノ酸配列（マウスのHAS2の構成アミノ酸の545〜552位）に相当する配列を含んでいる。
得られたPCR断片を電気泳動により精製し、pFLAG-CMV-2ベクター（イーストマン・コダック）のBgl II及びSma I部位にサブクローン化し、pFLAG-HAS2を構築した。
【００２７】
<2>  本発明ベクター（プラスミドベクター）の構築
pFLAG-mHAS2 ベクターを制限酵素 SacI及びSmaI で切断し、得られたHAS2のcDNAの全長に相当するDNAフラグメントの相補末端（cohesive end）をT4 DNA ポリメラーゼで平滑末端（blunt end）にした。アガロースゲル電気泳動からの切り出しにより精製したHAS2 cDNA フラグメントを、pEXneo 発現ベクター（篠村多摩之博士より供与。ref. J. Biol.Chem. (1999) vol.274, No.35, pp.25085-25-92）のEcoRV サイトにサブクローニングした。常法に従って塩基配列の解析を行って、挿入したDNA断片の5'上流域に転写開始点が存在するうベクターを選択することで、配列番号１記載のDNA（図１中「HAS2 AS」と記載）が挿入された発現ベクターpEXneo-HAS2 ASを作製した（図１）。
【００２８】
<3>  本発明ベクター（アデノウイルスベクター）の構築
ウイルスベクター作製には TAKARA Adenovirus Expression Vector kit およびCLONTECH Adeno-X Expression Systgem を用いた。
pFLAG-mHAS2ベクターを用いて<2>と同様の方法でHAS2のcDNAの全長に相当するDNAフラグメントを調製した。また、pFLAG-mHAS2を制限酵素Cla Iで切断することで5'側DNAフラグメント(0.36kb)を切り出し、T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端にした後に、アデノウイルス発現ベクター pAxCAwt （TAKARA）の Swa I サイトにサブクローニングを行い、塩基配列を解析することで挿入したDNA断片の5'上流域に転写開始点が存在するベクターを選択した。得られたアデノウイルスベクターをそれぞれpAxCAwt-mHAS2 AS F（図２：挿入したDNAを「HAS2 AS」と記載）及びpAxCAwt-mHAS2 AS 5'とした。
【００２９】
<4>  部位特異的変異HAS2発現ベクターの作製
Quick-Change 部位特異的変異キット（Stratagene社）を用いて、pFLAG-mHAS2に HAS2の 354位 Trp残基を Tyr残基に置換する変異（W354Y）を導入して、部位特異的変異HAS2発現ベクターpFLAG-mHAS2 W354Yを作製した。
【００３０】
<5>  部位特異的変異HAS2のアデノウイルスベクターの作製
<4>で得られた pFLAG-mHAS2 W354Y より、FLAG tag を含んだ mHAS2 W354Y の全長に相当するcDNA をSacIおよびSmaIで切り出して、T4 DNA ポリメラーゼにより平滑末端にした後、pAxCAwt のSwaIサイトのサブクローニングを行い、部位特異的変異HAS2ウイルス発現ベクター pAxCAwt-FLAG mHAS2 W354Y を作製した。
【００３１】
また同様に、pFLAG-mHAS2 W354Y を制限酵素SacI,SmaIで切断して、FLAG tag を含んだ mHAS2 W354Y のcDNA を切り出し、NheI, KpnI で切断した pShuttle（CLONTECH社）とともに平滑末端にしてサブクローニングを行い、部位特異的変異HAS2シャトルベクターpShuttle FLAG mHAS2 W354Y を作製した（図３：挿入されたDNA断片を「mHAS2 W354Y」と記載）。
上記 pShuttle FLAG mHAS2 W354Y および pAdeno-X （CLONTECH）を制限酵素PI-SceI, I-CeuI で切断してサブクローニングを行い、 pAdeno-X FLAG mHAS2 W354Y（図４）を作製した。
【００３２】
<6>  本発明ベクターの腫瘍良性化効果
<2>のpEXneo-HAS2 AS 発現ベクターを、がん遺伝子 H-ras でトランスフォームしたラット線維芽細胞（H-ras 3Y１）（名古屋大学  濱口道成博士より供与）にトランスフェクトし、stable transfectant（安定トランスフェクション細胞株）を得た。同様にHAS2遺伝子を正方向に導入した pEXneo-HAS2とHAS2を導入していないpEXneo も H-Ras 3Y1 細胞にトランスフェクトして、それぞれのstable transfectansts (安定トランスフェクション細胞株)を得た。
【００３３】
H-ras 3Y1細胞は、もとの細胞株（3Y1）に比べ、HAS2産生が高いのであるが、pEXneo-HAS2 をトランスフェクトした細胞は更にHAS2産生が上昇し、ヒアルロン酸合成能も高くなった。一方、pEXneo-HAS2 AS をトランスフェクトしたH-Ras 3Y1細胞株はHAS2 産生が低下し、ヒアルロン酸合成も多くの株で減少した。なお、コントロールのpEXneo をトランスフェクトしたH-Ras 3Y1 細胞は、ほとんど変化しなかった。
【００３４】
これらの安定トランスフェクション細胞株の内、pEXneo-HAS2 AS のH-Ras 3Y1 transfctant クローン株を２種（AS-6, AS-10）、pEXneo-HAS2 のtransfectantクローン株を３種（Ras 2-2, Ras 2-3, Ras 2-11）、pEXneoのtransfctant クローン株を２種(M-2, M-4)選択して、次の実験に用いた。
【００３５】
８週齡の雌マウス（F344）の腹腔内に、個体あたり 2x106個の上記transfectant細胞を投与し（１群５匹）、6週間後に屠殺し、腹腔内を観察した（図５：AS-10、図６：Ras 2-3、図７：Ras M-4（陽性対照））。Ras 2-2, Ras 2-3, Ras 2-11, M-2, M-4 細胞株を投与したマウスでは、大小の腫瘍塊が腹腔全体に広がっていた。しかし、AS-6, AS-10 では、小さな腫瘍数個のみ、あるいは腹腔後壁に大きな血腫様の腫瘍一つと小さな腫瘍数個を認めるのみであった。
【００３６】
また腹腔内の組織を採取し、組織標本を作製した（図８：AS-6、図９：Ras 2-2、図１０：Ras M-2（陽性対照））。これらの腫瘍の組織像では、AS-6, AS-10投与マウス由来の腫瘍組織は、Ras 2-2, Ras 2-3, Ras 2-11, Ras M-2, Ras M-4投与マウス由来の腫瘍組織と比較して、細胞同士が小さく凝集し、巨細胞は観察されなかった。また腫瘍の境界がきわめてはっきりとしていた。それと比して、Ras 2-2, Ras 2-3, Ras 2-11においては細胞同士の結合が粗であり、多数の円形細胞や星芒型の細胞も含まれ、一見して多型性に富み、特に円形細胞が不規則に繋がっている様子は低分化のカルシノーマ（Carcinoma）に類似していた。Ras M-2, Ras M-4においては、若干の巨細胞が観察され、細胞境界の不明瞭な紡錘型細胞からなり、肉腫様の形態が観察された。
【００３７】
<7>  部位特異的変異HAS2のヒアルロン酸合成活性阻害効果
［表１］に示すように、HAS2 発現ベクター；pFLAG-mHAS2 （表中HAS2と記載）を10 μg、部位特的変異HAS2発現ベクター；pFLAG-mHAS2 W354Y (同Mutant)を０から100μg、および導入遺伝子量を調整するためにHAS遺伝子が挿入されていないベクターであすpFLAG CMV2（同Mock）を、100μgからpFLAG-mHAS2 W354Y（Mutant）遺伝子量（0〜100μg）を差し引いた量をそれぞれ同時に、9×105個のCOS1細胞にエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。エレクトロポレーション装置は Gene Pulser （バイオラッド社）を用い、操作方法は装置のマニュアルに従った。トランスフェクトされたCOS1細胞は、10%ウシ胎仔血清および 2mM L-グルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地で37℃で３日間培養した。
【００３８】
HAS2活性はJ. Biol. Chem., vol.271, no.17 (1996), pp.9875-9878に記載された方法と同様に行った。
【００３９】
【表１】
表１
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【００４０】
表１に示すように、ミュータント遺伝子によりHAS2の活性が低下した。その低下の程度はミュータント遺伝子の量に依存的だった。このことはミュータント遺伝子を上述のHAS2のアンチセンスDNAと同様の腫瘍良性化剤として使用することができる可能性を示唆している。
【００４１】
【発明の効果】
本発明により、悪性腫瘍の形成を抑制するベクター及びそれを含む悪性腫瘍形成抑制剤、及び悪性腫瘍良性化剤が提供される。
【００４２】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】  本発明ベクターpEXneo-HAS2 ASの構造を示す図。
【図２】  本発明ベクターpAxCAwt-mHAS2 AS Fの構造を示す図。
【図３】  本発明ベクターpShuttle FLAG mHAS2 W354Yの構造を示す図。
【図４】  ベクターpAdeno-X FLAG mHAS2 W354Yの構造を示す図。
【図５】  本発明ベクターを導入した腫瘍細胞を投与したマウスの腹腔内の写真。
【図６】  pEXneo-HAS2を導入した腫瘍細胞を投与したマウスの腹腔内の写真。
【図７】  陽性対照の腫瘍細胞を投与したマウスの腹腔内の写真。
【図８】  本発明ベクターを導入した腫瘍細胞を投与したマウスの腫瘍組織の顕微鏡写真。
【図９】   pEXneo-HAS2を導入した腫瘍細胞を投与したマウスの腫瘍組織の顕微鏡写真。
【図１０】  陽性対照の腫瘍細胞を投与したマウスの腫瘍組織の顕微鏡写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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