(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含む、試料中のサイクリン／ＣＤＫ複合体の、ＲＢタンパク質またはその部分ペプチドに対するリン酸化酵素活性の測定方法：
（ａ）固相に固定化したＲＢタンパク質基質と、試料とを、リン酸化酵素によるリン酸化反応に必要な条件下で反応させる工程；
（ｂ）工程（ａ）の反応生成物に、ＲＢタンパク質基質のリン酸化状態を識別しうる抗体を反応させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）の反応生成物に、該リン酸化状態を識別しうる抗体に結合する標識された抗体を反応させる工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）の反応生成物中の標識抗体の標識に基づいて、該ＲＢタンパク質基質のリン酸化レベルを、測定する工程；
ここで、該サイクリン／ＣＤＫ複合体、及び該リン酸化状態を識別しうる抗体が、以下の組合せからなる群から選択される、方法；
該複合体がサイクリンＡ／ＣＤＫ２であり、該抗体がＲＢタンパク質の７８０位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＢ／ＣＤＫ１であり、該抗体がＲＢタンパク質の３５６位のスレオニンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＢ／ＣＤＫ１であり、該抗体がＲＢタンパク質の６１２位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＢ／ＣＤＫ１であり、該抗体がＲＢタンパク質の７８０位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＤ１／ＣＤＫ４であり、該抗体がＲＢタンパク質の３５６位のスレオニンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＤ１／ＣＤＫ４であり、該抗体がＲＢタンパク質の６１２位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、及び
該複合体がサイクリンＥ／ＣＤＫ２であり、該抗体がＲＢタンパク質の７８０位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である。
【請求項２】
以下の工程を含む、サイクリン／ＣＤＫ複合体の、ＲＢタンパク質に対するリン酸化酵素活性を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法：
（ａ）サイクリン／ＣＤＫ複合体、およびＲＢタンパク質基質とを、被検化合物の存在下または非存在下で、リン酸化反応に必要な条件下で反応させる工程；
（ｂ）工程（ａ）の反応生成物を、固相に固定化した、ＲＢタンパク質基質のリン酸化状態を識別しうる抗体と、反応させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）の反応生成物に、該ＲＢタンパク質基質に結合する抗体を反応させる工程；
（ｄ）工程（ｃ）の反応生成物に、該ＲＢタンパク質基質に結合する抗体に結合する標識された抗体を反応させる工程；
（ｅ）工程（ｄ）の反応生成物中の標識抗体の標識に基づいて、該ＲＢタンパク質基質のリン酸化レベルを、測定する工程；及び
（ｆ）工程（ｅ）で測定した被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの場合におけるＲＢタンパク質基質のリン酸化のレベルを比較して、該基質のリン酸化のレベルを低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程；
ここで、該サイクリン／ＣＤＫ複合体、及び該リン酸化状態を識別しうる抗体が、以下の組合せからなる群から選択される、方法；
該複合体がサイクリンＡ／ＣＤＫ２であり、該抗体がＲＢタンパク質の７８０位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＢ／ＣＤＫ１であり、該抗体がＲＢタンパク質の３５６位のスレオニンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＢ／ＣＤＫ１であり、該抗体がＲＢタンパク質の６１２位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＢ／ＣＤＫ１であり、該抗体がＲＢタンパク質の７８０位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＤ１／ＣＤＫ４であり、該抗体がＲＢタンパク質の３５６位のスレオニンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＤ１／ＣＤＫ４であり、該抗体がＲＢタンパク質の６１２位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、及び
該複合体がサイクリンＥ／ＣＤＫ２であり、該抗体がＲＢタンパク質の７８０位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である。
【請求項３】
以下の工程を含む、試料中の、リン酸化されたＲＢタンパク質に対する脱リン酸化酵素活性の測定方法：
（ａ）固相に固定化したリン酸化されたＲＢタンパク質基質と、試料とを、脱リン酸化反応に必要な条件下で反応させる工程；
（ｂ）工程（ａ）の反応生成物に、ＲＢタンパク質基質のリン酸化状態を識別しうる抗体を反応させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）の反応生成物に、該ＲＢタンパク質基質のリン酸化状態を識別しうる抗体に結合する標識された抗体を反応させる工程；及び
（ｄ）工程（ｃ）の反応生成物中の標識抗体の標識に基づいて、該ＲＢタンパク質基質のリン酸化レベルを、測定する工程；
ここで、該ＲＢタンパク質をリン酸化したサイクリン／ＣＤＫ複合体、及び該リン酸化状態を識別しうる抗体が、以下の組合せからなる群から選択される、方法；
該複合体がサイクリンＡ／ＣＤＫ２であり、該抗体がＲＢタンパク質の７８０位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＢ／ＣＤＫ１であり、該抗体がＲＢタンパク質の３５６位のスレオニンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＢ／ＣＤＫ１であり、該抗体がＲＢタンパク質の６１２位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＢ／ＣＤＫ１であり、該抗体がＲＢタンパク質の７８０位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＤ１／ＣＤＫ４であり、該抗体がＲＢタンパク質の３５６位のスレオニンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＤ１／ＣＤＫ４であり、該抗体がＲＢタンパク質の６１２位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、及び
該複合体がサイクリンＥ／ＣＤＫ２であり、該抗体がＲＢタンパク質の７８０位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である。
【請求項４】
以下の工程を含む、リン酸化されたＲＢタンパク質に対する脱リン酸化酵素の脱リン酸化酵素活性を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法：
（ａ）リン酸化されたＲＢタンパク質に対する脱リン酸化酵素、およびリン酸化されたＲＢタンパク質基質を、被検化合物の存在下または非存在下で、脱リン酸化反応に必要な条件下で反応させる工程；
（ｂ）工程（ａ）の反応生成物を、固相に固定化した、ＲＢタンパク質基質のリン酸化状態を識別しうる抗体と反応させる工程；
（ｃ）工程（ｂ）の反応生成物に、該ＲＢタンパク質基質と結合する抗体を反応させる工程；
（ｄ）工程（ｃ）の反応生成物に、該ＲＢタンパク質基質に結合する抗体に結合する標識された抗体を反応させる工程；
（ｅ）工程（ｄ）の反応生成物中の標識抗体の標識に基づいて、該ＲＢタンパク質基質の脱リン酸化レベルを測定する工程；及び
（ｆ）工程（ｅ）で測定した被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの場合におけるＲＢタンパク質基質の脱リン酸化のレベルを比較して、該基質の脱リン酸化レベルを低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程；
ここで、該ＲＢタンパク質をリン酸化したサイクリン／ＣＤＫ複合体、及び該リン酸化状態を識別しうる抗体が、以下の組合せからなる群から選択される、方法；
該複合体がサイクリンＡ／ＣＤＫ２であり、該抗体がＲＢタンパク質の７８０位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＢ／ＣＤＫ１であり、該抗体がＲＢタンパク質の３５６位のスレオニンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＢ／ＣＤＫ１であり、該抗体がＲＢタンパク質の６１２位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＢ／ＣＤＫ１であり、該抗体がＲＢタンパク質の７８０位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＤ１／ＣＤＫ４であり、該抗体がＲＢタンパク質の３５６位のスレオニンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＤ１／ＣＤＫ４であり、該抗体がＲＢタンパク質の６１２位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、及び
該複合体がサイクリンＥ／ＣＤＫ２であり、該抗体がＲＢタンパク質の７８０位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である。
【請求項５】
ＲＢタンパク質基質が、ＲＢタンパク質、ＲＢタンパク質の部分ペプチド、およびＲＢタンパク質もしくはＲＢタンパク質の部分ペプチドとグルタチオン‐S‐トランスフェラーゼ（GST）との融合タンパク質からなる群の中から選択される、請求項１−４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
固相が、粒子状担体、ビーズ状担体、およびマイクロタイタープレートからなる群の中から選択される請求項１−５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
標識が、酵素標識、蛍光標識、および放射標識からなる群の中から選択される標識である、請求項１−６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
標識が、ペルオキシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコース-6-リン酸脱水素酵素、およびアセチルコリンエステラーゼデルフィニウムからなる群の中から選択される標識である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＲＢタンパク質基質と、以下の組合せからなる群から選択される、サイクリン／ＣＤＫ複合体、及び該リン酸化状態を識別しうる抗体を含む、請求項１−８のいずれか一項に記載の方法のためのキット；
該複合体がサイクリンＡ／ＣＤＫ２であり、該抗体がＲＢタンパク質の７８０位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＢ／ＣＤＫ１であり、該抗体がＲＢタンパク質の３５６位のスレオニンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＢ／ＣＤＫ１であり、該抗体がＲＢタンパク質の６１２位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＢ／ＣＤＫ１であり、該抗体がＲＢタンパク質の７８０位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＤ１／ＣＤＫ４であり、該抗体がＲＢタンパク質の３５６位のスレオニンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、
該複合体がサイクリンＤ１／ＣＤＫ４であり、該抗体がＲＢタンパク質の６１２位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である、及び
該複合体がサイクリンＥ／ＣＤＫ２であり、該抗体がＲＢタンパク質の７８０位のセリンのリン酸化状態を識別しうる抗体である。
【請求項１０】
該ＲＢタンパク質基質のリン酸化状態を識別する抗体に結合する抗体をさらに含む、請求項９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、サイクリン／ＣＤＫ複合体のリン酸化酵素活性、あるいは脱リン酸化酵素活性の測定方法、サイクリン／ＣＤＫ複合体の阻害剤もしくは促進剤のスクリーニング方法、並びにそのためのキットに関する。
背景技術
細胞は増殖する際に、そのゲノムＤＮＡを複製し、娘細胞へ均等に分配した後分裂するという過程を周期的に繰り返す。このような周期は細胞周期と呼ばれている。細胞周期はＧ１期（ＤＮＡ合成準備期）、Ｓ期（ＤＮＡ合成期）、Ｇ２期（分裂準備期）、Ｍ期（分裂期）に分けることができ、各段階を順番に経て細胞は分裂する。細胞周期の進行は数多くの分子により精緻な調節を受け、不必要な細胞の増殖を制御している。これまでに細胞周期の進行に関与する分子のクローニングや機能解析が数多く行われ、多くの癌においてこれらの細胞周期の進行に関する分子の異常が報告され、それが発癌の原因となっていると考えられている。
たとえば、Ｇ１期からＳ期への進行に際しては、ＲＢタンパク質（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のリン酸化が重要であることが明らかにされている。ＲＢタンパク質は非リン酸化型において、Ｅ２Ｆ／ＤＰと結合し、不活性状態におくことでＳ期への進行を抑制している。Ｅ２Ｆ／ＤＰは、Ｓ期の進行に必要なジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）やＤＮＡポリメラーゼなどの遺伝子の発現を誘導する転写因子である。サイクリンＤ／ＣＤＫ４、サイクリンＤ／ＣＤＫ６、あるいはサイクリンＥ／ＣＤＫ２の作用によってリン酸化されたＲＢタンパク質は、Ｅ２Ｆ／ＤＰを遊離する。ここでＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ；Ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅ）は、サイクリンと複合体を形成することによってリン酸化活性を発現する酵素タンパク質である。すなわち、Ｇ１期からＳ期への進行はＲＢのリン酸化によって調節されている（実験医学別冊・ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ用語ライブラリー「細胞周期」，ｐ６２−９３，１９９５，羊土社発行）。
多くの癌症例において、ＲＢタンパク質リン酸化の調節がうまく機能していないことが示され、このことが、不必要なＳ期への進行、すなわち細胞増殖を促進し、結果的に発癌に関与するものと考えられている。たとえば、サイクリン／ＣＤＫ複合体の阻害因子であるｐ２１の転写誘導に働くｐ５３機能異常（欠失、点突然変異）は様々な腫瘍において高頻度に認められる。このような症例においてはｐ２１が正常に産生されないために、サイクリン／ＣＤＫ複合体によるＲＢタンパク質のリン酸化が異常に亢進され、結果的に発癌につながるのではないかと考えられる。また、ｐ１５、ｐ１６といったサイクリン／ＣＤＫ複合体の阻害因子の欠損が、多くの腫瘍で報告されている。この場合も、ＲＢタンパク質のサイクリン／ＣＤＫ複合体による異常なリン酸化が癌化の要因となっているものと考えられる。さらに、サイクリンＤ１の発現亢進も、同様な理由で、発癌に関わっているものと考えられている。
このような背景からサイクリン／ＣＤＫ複合体は抗癌剤開発の標的分子となっており、サイクリン／ＣＤＫ複合体活性を調整する化合物のスクリーニングシステムを開発することは有用である。このようなスクリーニングには現状ではラジオアイソトープ（以下ＲＩと省略する）標識化合物を用いた方法が一般的である。しかしＲＩの使用には、常に危険性や廃棄の問題が伴うことから、非ＲＩ標識によって実施することができるシステムが望まれていた。
他方、リン酸化酵素活性の簡便な測定方法として、ＰＫＡやＰＫＣの活性測定方法が実用化されている。この方法は、ＰＳペプチドと呼ばれる合成ペプチドを基質として用い、その酵素的なリン酸化を、リン酸化されたＰＳペプチドを認識する抗体によって検出することによって、リン酸化酵素活性を測定している（Ｔ．Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａ．Ｓｕｚｕｋｉ（Ｅｄ）：２９３−２９８，１９９１）。しかしこの方法において基質ペプチドとなるＰＳペプチドは、ＲＢタンパク質のリン酸化酵素であるサイクリン／ＣＤＫ複合体の基質とならない。更に、この方法で用いられているリン酸化の程度を検出するための抗体は、リン酸化されたＲＢタンパク質を認識するものではないためＲＢタンパク質のリン酸化酵素活性の測定には利用することができない。リン酸化ＲＢタンパク質を認識する抗体は公知であるが、これらの抗体を用いてＲＢタンパク質のリン酸化酵素活性が測定可能なことは知られていない。
発明の開示
本発明は、ＲＢタンパク質をリン酸化する酵素であるサイクリン／ＣＤＫ複合体の活性測定方法、あるいはこれらのリン酸化酵素の作用によってリン酸化されたＲＢタンパク質に対する脱リン酸化活性の測定方法の提供を課題とする。また、本発明は、サイクリン／ＣＤＫのリン酸化活性を制御することができる化合物のスクリーニング方法の提供を課題とする。また本発明は、ＲＢタンパク質を基質としたサイクリン／ＣＤＫ複合体のリン酸化酵素活性を制御することができる化合物のスクリーニング方法の提供を課題とする。更に本発明は、単にこれらのリン酸化酵素活性を測定することのみならず、複数のサイクリン／ＣＤＫ複合体が共存する試料におけるサイクリン／ＣＤＫ複合体のリン酸化活性を個別に把握することができる測定方法の提供を課題とする。本発明は、これらの活性測定方法、あるいはスクリーニング方法として、ＲＩ標識化合物の使用を避けることができる新たなシステムの提供を課題とする。加えて本発明は、これら測定方法やスクリーニング方法のためのキットの提供を課題とする。
本発明は、上記課題を解決するために、サイクリン／ＣＤＫ複合体によってリン酸化される基質としてＲＢタンパク質を用い、ＲＢタンパク質のリン酸化のレベルの変化を、免疫学的に測定することによって、サイクリン／ＣＤＫ複合体のリン酸化活性の把握が可能なのではないかと考えた。ＲＢタンパク質は先に述べたとおり発癌との関連性が多く報告されていることから、基質タンパク質として好適である。本発明者らは、ＲＢタンパク質の被リン酸化部位の中でも、特に３５６位のスレオニン残基、６１２位のセリン残基、７８０位のセリン残基、あるいは８０７位のスレオニン残基等におけるリン酸化状態が、サイクリン／ＣＤＫ複合体のリン酸化活性の評価に特に有用であると考えた。そして、これらの被リン酸化部位のリン酸化状態を識別しうる抗体を利用することにより、簡便に基質のリン酸化レベルの評価が可能であることを見出した。さらに、本発明者らはこれらの抗体を利用することにより、酵素活性によるＲＢタンパク質のリン酸化や脱リン酸化を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニングが可能であることを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下のサイクリン／ＣＤＫ複合体のリン酸化酵素活性測定方法、脱リン酸化酵素活性測定方法、ならびにこれらの測定方法に基づくサイクリン／ＣＤＫ複合体の、リン酸化酵素や脱リン酸化酵素の活性を調整する化合物のスクリーニング方法に関する。
〔１〕次の工程を含む、試料中のサイクリン／ＣＤＫ複合体の、ＲＢタンパク質またはその部分ペプチドに対するリン酸化酵素活性の測定方法。
（ａ）ＲＢタンパク質基質と試料とを、リン酸化酵素によるリン酸化反応に必要な条件下で接触させる工程
（ｂ）ＲＢタンパク質基質のリン酸化レベルの変化を、前記基質のリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程
〔２〕以下の工程を含む、サイクリン／ＣＤＫ複合体の、ＲＢタンパク質に対するリン酸化酵素活性を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）サイクリン／ＣＤＫ複合体、およびＲＢタンパク質基質とを、被検化合物の存在下、リン酸化反応に必要な条件下で接触させインキュベートする工程
（ｂ）ＲＢタンパク質基質のリン酸化レベルの変化を、前記基質のリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下における基質のリン酸化のレベルと比較して、基質のリン酸化のレベルの変化を低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程
〔３〕以下の工程を含む、試料中のリン酸化されたＲＢタンパク質に対する脱リン酸化酵素活性の測定方法であって、前記リン酸化されたＲＢタンパク質が、サイクリン／ＣＤＫ複合体によってリン酸化されたものである方法。
（ａ）リン酸化されたＲＢタンパク質基質と試料とを、脱リン酸化反応に必要な条件下で接触させインキュベートする工程
（ｂ）ＲＢタンパク質基質のリン酸化レベルの変化を、前記基質のリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程
〔４〕以下の工程を含む、リン酸化されたＲＢタンパク質に対する脱リン酸化酵素活性を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法。
（ａ）前記リン酸化されたＲＢタンパク質に対する脱リン酸化酵素、およびリン酸化されたＲＢタンパク質基質を、被検化合物の存在下、脱リン酸化反応に必要な条件下で接触させインキュベートする工程
（ｂ）ＲＢタンパク質基質の脱リン酸化レベルの変化を、前記基質のリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程
（ｃ）被検化合物の被存在下における基質の脱リン酸化のレベルと比較して、基質の脱リン酸化レベルの変化を低下もしくは増加させる化合物を選択する工程
〔５〕サイクリンが、サイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、サイクリンＤ３、およびサイクリンＥで構成される群から選択されるいずれかのサイクリンである、〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の測定方法。
〔６〕ＣＤＫが、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、およびＣＤＫ６で構成される群から選択されるいずれかのＣＤＫである、〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の測定方法。
〔７〕サイクリン／ＣＤＫ複合体が、以下の群から選択されるいずれかの組み合わせからなる〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の測定方法。
サイクリンＡ／ＣＤＫ１、
サイクリンＡ／ＣＤＫ２、
サイクリンＢ／ＣＤＫ１、
サイクリンＤ１／ＣＤＫ４、
サイクリンＤ１／ＣＤＫ６、
サイクリンＤ２／ＣＤＫ４、
サイクリンＤ２／ＣＤＫ６、
サイクリンＤ３／ＣＤＫ４、
サイクリンＤ３／ＣＤＫ６、および
サイクリンＥ／ＣＤＫ２
〔８〕リン酸化酵素がサイクリンＤ１／ＣＤＫ４であり、抗体がＲＢタンパク質の７８０位セリンのリン酸化状態を識別しうるものである〔７〕に記載の方法。
〔９〕リン酸化状態を識別することができる抗体が、そのリン酸化部位を識別しうるものであり、異なる部位をリン酸化する複数のサイクリン／ＣＤＫ複合体が共存する試料に含まれるサイクリン／ＣＤＫ複合体の活性を個別に測定する〔１〕に記載の方法。
〔１０〕抗体が、リン酸化されていないＲＢタンパク質基質よりも、リン酸化されたＲＢタンパク質基質との反応性が高いものである〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕抗体が、リン酸化されたＲＢタンパク質基質よりも、リン酸化されていないＲＢタンパク質基質との反応性が高いものである〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕ＲＢタンパク質基質が標識されている、〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕ＲＢタンパク質基質が固相化されている、〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕抗体が標識されている、〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕ＲＢタンパク質基質のリン酸化レベルの評価をＥＬＩＳＡ法により行う、〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕〔２〕に記載のスクリーニング方法により単離することができる化合物を主成分として含む、サイクリン／ＣＤＫ複合体のタンパク質リン酸化酵素の活性調整剤。
〔１７〕〔４〕に記載のスクリーニング方法により単離することができる化合物を主成分として含む、サイクリン／ＣＤＫ複合体のタンパク質リン酸化酵素によってリン酸化されたタンパク質に対する脱リン酸化酵素の活性調整剤。
〔１８〕天然由来である、〔１６〕または〔１７〕のいずれかに記載の活性調整剤。
〔１９〕ＲＢタンパク質、またはヒト以外の種におけるそのホモログの被リン酸化部位を含むアミノ酸配列からなるペプチドを含む、〔１〕−〔４〕のいずれかに記載の方法に用いるための抗体作成用免疫原。
〔２０〕被リン酸化部位がリン酸化されている〔１９〕に記載の免疫原。
〔２１〕被リン酸化部位が、ヒトＲＢタンパク質における３５６位のスレオニン、６１２位のセリン、７８０位のセリン、および８０７位のスレオニンからなる群から選択される少なくとも１つである〔１９〕または〔２０〕のいずれかに記載の免疫原。
〔２２〕被リン酸化部位が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、および配列番号：８のいずれかからなるアミノ酸配列から選択される〔２１〕に記載の免疫原。
〔２３〕ＲＢタンパク質基質のリン酸化状態を識別する抗体を含む、〔１〕−〔４〕に記載のいずれかの方法のためのキット。
なお、本発明において「ペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合した化合物を指し、その鎖長は問わない。従って、タンパク質もまた本発明における「ペプチド」に含まれる。
本発明で測定の対象としているサイクリン／ＣＤＫ複合体を構成するサイクリンとしては、たとえばサイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＤ１、サイクリンＤ２、サイクリンＤ３、およびサイクリンＥが知られている。一方ＣＤＫには、たとえばＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、およびＣＤＫ６が公知である。これらのタンパク質を構成するアミノ酸配列や、それをコードするＤＮＡの塩基配列も明らかにされている。サイクリンとＣＤＫの組み合わせとしては、たとえば次の組み合わせが報告されている。しかし、本発明のサイクリン／ＣＤＫ複合体は、これらの公知の組み合わせに限定されない。
サイクリンＡ／ＣＤＫ１、
サイクリンＡ／ＣＤＫ２、
サイクリンＢ／ＣＤＫ１、
サイクリンＤ１／ＣＤＫ４、
サイクリンＤ１／ＣＤＫ６、
サイクリンＤ２／ＣＤＫ４、
サイクリンＤ２／ＣＤＫ６、
サイクリンＤ３／ＣＤＫ４、
サイクリンＤ３／ＣＤＫ６、および
サイクリンＥ／ＣＤＫ２
複合体を構成するサイクリンとＣＤＫは、ヒト組織に由来する天然の酵素の他、それをコードする遺伝子を適当な発現系で発現させることによって得ることができる組み換え体であっても良い。また、酵素の由来は、ヒトに限定されずに、他の脊椎動物や、微生物におけるホモログであることができる。更に、天然の酵素タンパク質と同一のアミノ酸配列を持つ酵素のみならず、その酵素活性の発現を支える領域（キナーゼ領域）のみで構成される変異体、あるいはこの領域を他のタンパク質と融合させた融合タンパク質等、本質的に同じ酵素活性を持つ酵素タンパク質は、いずれも本発明によるリン酸化酵素活性の測定方法の対象とすることができる。
本発明は、第一にサイクリン／ＣＤＫ複合体によってリン酸化されるＲＢタンパク質基質に特異的に結合する抗体を利用した、サイクリン／ＣＤＫ複合体のリン酸化活性の測定方法に関する。より具体的には、次の工程（ａ）および（ｂ）を含む測定方法である。
（ａ）ＲＢタンパク質基質と試料とを、リン酸化酵素によるリン酸化反応に必要な条件下で接触させる工程
（ｂ）ＲＢタンパク質基質のリン酸化レベルの変化を、前記基質のリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程
本発明において、ＲＢタンパク質基質とは、ヒトＲＢタンパク質、他の種におけるＲＢタンパク質のホモログ、並びにこれらのタンパク質の少なくとも被リン酸化部位を含む部分ペプチドを意味する。更に被リン酸化部位とは、少なくともリン酸化されるアミノ酸の前後１アミノ酸を含む３アミノ酸残基からなるアミノ酸配列を言う。基質となるＲＢタンパク質やそのホモログは、天然のもの、遺伝子組換え技術を利用して調製されたもの、合成ペプチドのいずれであることもできる。ＲＢタンパク質（Ｎａｔｕｒｅ  ３２９，６１４０，６４２−６４５，１９８７；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ２８４１９）やそのホモログであるｐ１０７（Ｃｅｌｌ  ６６，１１５５−１１６４，１９９１；Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７／７Ａ，１１１１−１１２５，１９９３；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｌ１４８１２）やｐ１３０（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７／１２Ａ，２３６６−２３７７，１９９３；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ７６０６１）の構造は公知であり、それをコードするＤＮＡの塩基配列も明らかにされている。ペプチドの精製を容易にする目的で他のペプチド（例えば、グルタチオン‐Ｓ‐トランスフェラーゼ）と融合されていてもよい。ＲＢタンパク質基質は、予想される酵素活性に対して十分な量で使用する。例えばある基質濃度でリン酸化反応を行ったときに、基質の大部分がリン酸化されるような場合は、基質が不足する心配がある。このようなケースでは、基質濃度を高める、あるいは試料の希釈等によって、基質のリン酸化酵素活性に対する相対濃度を上げることが望まれる。
ＲＢタンパク質基質として、ＲＢタンパク質やそのホモログの被リン酸化領域を含む部分アミノ酸配列で構成されるペプチド断片を利用することもできる。たとえばヒトＲＢタンパク質のアミノ酸配列から選択した、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、あるいは配列番号：８として示したアミノ酸配列のいずれかを含むペプチドは、ＲＢタンパク質基質として利用することができる。また、これらのペプチドの被リン酸化部位がリン酸化されたペプチドは、本発明におけるリン酸化ペプチドとして利用することができる。
本発明においてＲＢタンパク質基質は、サイクリン／ＣＤＫ複合体によるリン酸化が可能な条件下で試料と接触させられる。リン酸化が可能な条件とは、目的とするサイクリン／ＣＤＫ複合体の活性の維持に必要なｐＨを与える反応媒体中で、ＲＢタンパク質基質とともに反応に必要な成分の存在下、適切な反応温度でインキュベートすることを意味する。反応に必要な成分としては、リン酸化反応に必要なリン酸基を供給する基質、リン酸化反応物を保護する目的で添加するフォスファターゼ阻害剤等が挙げられる。リン酸基を供給する基質には、一般にアデノシン３リン酸（以下ＡＴＰと省略する）等が用いられ、フォスファターゼ阻害剤としてはβ‐グリセロリン酸等が用いられる。本発明において用いられるリン酸化反応のための緩衝液として、次の組成からなるサイクリン／ＣＤＫ用反応バッファーを示すことができる。
サイクリン／ＣＤＫ用反応バッファー：
５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ
１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１ｍＭ  ＤＴＴ
０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ
１ｍＭ  ＥＧＴＡ
５ｍＭ  ＡＴＰ
本発明では、リン酸化されたＲＢタンパク質基質は、そのリン酸化状態を識別することができる抗体との免疫学的な反応によって、リン酸化のレベルが評価される。本発明において、リン酸化のレベルとは、ＲＢタンパク質基質に占めるリン酸化ＲＢタンパク質基質の割合のみならず、ＲＢタンパク質基質上のリン酸化の程度を意味する用語として用いる。したがって、たとえばＲＢタンパク質基質のリン酸化レベルの上昇とは、リン酸化された基質の割合が増大する状態、あるいは基質上のリン酸化部位が増大する状態のいずれをも意味する。
本発明に用いるリン酸化状態を識別しうる抗体とは、リン酸化の有無によりＲＢタンパク質基質との反応性が変化する抗体を意味する。具体的には、リン酸化されたＲＢタンパク質基質に対する反応性が、リン酸化されていない状態に対する反応性よりも大きい（または小さい）抗体を示すことができる。ＲＢタンパク質基質のリン酸化状態を識別しうる抗体は公知である。同様の抗体は、当業者に公知の方法（例えば、細胞工学  別冊  抗ペプチド抗体実験プロトコール  １９９４年  秀潤社、Ｂ．Ｍ．Ｔｕｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｇ．Ｆｅｌｌｏｗｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７９，１３１−１３９，１９８９、Ｓ．Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ２４，７７９−７８９，１９８７、Ｐｆｅｆｆｅｒ，Ｕ．，Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｎ．ａｎｄ  Ｖｉｄａｌｉ，Ｇ．Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２６１，２４９６−２４９８，１９８６）により調製することができる。抗体としては、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。
たとえばリン酸化ＲＢタンパク質基質特異的なポリクローナル抗体は、リン酸化ペプチドで免疫することによって得た抗血清から、非リン酸化ペプチドカラム（非特異反応抗体吸収用カラム）やリン酸化ペプチドカラム（特異抗体精製用カラム）を用いて精製することが可能である。あるいはリン酸化ペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞から樹立したハイブリドーマから、特異抗体を産生するものをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをクローニングすることができる。スクリーニングは、培養上清の非リン酸化ペプチドやリン酸化ペプチドに対する反応性をＥＬＩＳＡ法により調べ、リン酸化ペプチドに対して反応性の高いクローンを選択することにより行う。クローニングされたハイブリドーマを培養すれば、必要なモノクローナル抗体を培養上清や腹水から精製することができる。
本発明で用いる抗体を作製するための免疫原は、ヒトＲＢタンパク質の被リン酸化部位を構成するアミノ酸配列を含むペプチドを用いて作成することができる。したがって、たとえば配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、あるいは配列番号：８として示したようなヒトＲＢタンパク質の被リン酸化部位を持つ部分アミノ酸配列を含む領域を選択することにより、本発明の免疫原とすることができる。被リン酸化部位とは、少なくともリン酸化されるアミノ酸の前後１アミノ酸を含む３アミノ酸残基からなる。なお本発明の免疫原を構成するペプチドのアミノ酸配列は、ヒトＲＢタンパク質に限定されない。すなわち、他の種におけるＲＢタンパク質のホモログを構成するアミノ酸配列から、前記被リン酸化部位を構成するアミノ酸配列を含む領域を選択し本発明の免疫原とすることができる。ＲＢタンパク質のホモログとしては、ｐ１０７やｐ１３０が公知である。これらのホモログのアミノ酸配列に基づいて調製された免疫原によって、ヒトのＲＢタンパク質のリン酸化を識別することができる抗体を得ることができる。
免疫原に用いるペプチドの被リン酸化部位におけるリン酸化の有無により、抗体の反応性が左右される。すなわち、リン酸化したペプチドを用いれば、リン酸化ＲＢに対する反応性が高い抗体が、逆にリン酸化されていなければ非リン酸化ＲＢタンパク質に対する反応性が高い抗体を得ることができる。免疫原を構成するペプチドは、たとえば化学的に合成されたものや、遺伝子組み換え体、あるいは天然のＲＢタンパク質やそのホモログ、並びにそれらの断片として得ることができる。これらのペプチドを目的とする部位において特異的にリン酸化する方法も公知である。ペプチドは、キャリアータンパク質と共有結合させることで免疫原性を高めることができる。キャリアータンパク質には、一般にキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）等が利用される。キャリアータンパク質との共有結合のための架橋物質としてはｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルが利用できる。このようにして得られた免疫原には、さらに公知のアジュバントを配合することができる。
本発明の望ましい実施態様においては、単にリン酸化状態を識別しうるのみならず、ＲＢタンパク質基質の被リン酸化部位の周囲を含めた構造の相違を認識することができる抗体に基づいた測定方法が提供される。サイクリン／ＣＤＫ複合体は必ずしもＲＢタンパク質基質の同じ部分をリン酸化するわけではない。たとえば、サイクリンＤ１／ＣＤＫ４は、ＲＢタンパク質の７８０位のセリン残基、７９５位のセリン残基、８１１位のスレオニン残基を中心にとしてリン酸化が進行する。一方、サイクリンＢ／ＣＤＫ２は、主たるリン酸化部位は３５６位のスレオニン残基、８２１位のスレオニン残基である。両者の特異性を表１にまとめた。なお本発明においては、アミノ酸を示すコード（１文字または３文字）の後に、ＲＢタンパク質におけるＮ末端から数えたそのアミノ酸残基の位置を表示することによりアミノ酸を特定する。たとえば、Ｓ７８０は、７８０位のセリンを意味する。
0004828752.tif 000002
したがって、たとえば７８０位セリンのリン酸化状態を識別しうる抗体を利用すれば、サイクリンＤ１／ＣＤＫ４複合体のリン酸化酵素活性を特異的に測定することができる。このように、被リン酸化部位を特異的に認識する抗体を利用することによって、サイクリンＤ１／ＣＤＫ４によるリン酸化と、サイクリンＢ／ＣＤＫ２によるリン酸化とを区別して評価することができる。すなわち本発明は、複数のサイクリン／ＣＤＫ複合体が共存する可能性のある試料を用い、個々のリン酸化活性を独立して把握することができる測定方法を提供する。
ＲＢタンパク質基質と抗体との反応は、公知のイムノアッセイの原理を利用して検出することができる。一般的には、ＲＢタンパク質基質と抗体のいずれかを固相化した状態で用いることにより、未反応成分との分離を容易に行うことができる。タンパク質やペプチド、あるいは抗体を固相化する方法は公知である。たとえばＲＢタンパク質基質や抗体は、化学結合や物理吸着によって固相に直接固定できる。またＲＢタンパク質基質をビオチン化しておけば、ストレプトアビジンを感作した固相に捕捉し間接的に固相化することができる。一般的に、ＲＢタンパク質基質を固定化する場合には、タンパク質の担体への吸着が飽和する条件で行われる。この場合、ビオチン化したＲＢタンパク質基質の固相化は、試料との接触前、接触後、あるいは接触と同時等、任意のタイミングで行うことができる。更に、互いに親和性を有する組み合わせであれば、アビジン−ビオチン系以外でも本発明に適用することができる。たとえば、ＲＢタンパク質基質を適当な抗原性物質との接合体としておき、この抗原性物質に対する抗体を感作した固相を利用してＲＢタンパク質基質の捕捉が可能である。
本発明において、ＲＢタンパク質基質や抗体を固定化するための固相としては、反応容器の内壁、粒子状担体、あるいはビーズ状担体など、一般的に固相として利用されているものを利用することができる。その素材についても、一般にタンパク質の物理吸着や化学結合に利用されているものを利用することができる。具体的には、ポリスチレン製のマイクロタイタープレート等が利用される。
本発明において、リン酸化のレベルの変化をイムノアッセイの原理に基づいて評価するとき、ＲＢタンパク質基質と抗体とは、そのいずれかを標識しておくことにより、簡便な操作を実現できる。標識としては、検出可能な感度を有すれば特に制限はなく、例えば、ペルオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、アセチルコリンエステラーゼなどの酵素標識、デルフィニウムなどの蛍光標識、放射標識などを用いることが可能である。また直接標識のみならず、該抗体と特異的に結合する物質、例えば、二次抗体、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ（ＡとＧの融合タンパク質）などを標識する、いわゆる間接標識系を利用することもできる。
ＲＢタンパク質基質のリン酸化レベルの評価は、抗体の特異性と上記標識に応じて当業者に公知の方法で行うことができる（例えば、超高感度酵素免疫測定法  石川榮治著  学会出版センター（１９９３）参照）。すなわち、リン酸化されたＲＢタンパク質基質との反応性を持つ抗体を標識したＲＢタンパク質と組み合わせて利用する場合には、抗体と反応した標識ＲＢタンパク質基質に由来するシグナルの大きさがリン酸化活性に比例する。逆に、リン酸化されないＲＢタンパク質との反応性を持つ抗体を用いれば、シグナルの大きさはリン酸化活性と逆比例することになる。リン酸化レベルは、リン酸化レベルが判明しているＲＢタンパク質基質を標準試料として予め作成した検量線に基づいて定量化することができる。あるいは、リン酸化酵素活性フリーの試料を対照として、定性的な比較を行うこともできる。
本発明によるリン酸化酵素活性の測定方法は、サイクリン／ＣＤＫ複合体の存在が疑われるあらゆる試料を対象とすることができる。代表的な試料としては、ヒトや非ヒト動物に由来する組織、各種培養細胞の抽出液およびその抽出物、細胞の培養上清、血液、尿、体液、汗、唾液、母乳などの分泌物等を示すことができる。
本発明は、リン酸化酵素活性のみならず、サイクリン／ＣＤＫ複合体によってリン酸化されたＲＢタンパク質基質に対する脱リン酸化酵素活性の測定方法をも提供する。本発明に基づく脱リン酸化酵素活性の測定方法は、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む。
（ａ）リン酸化されたＲＢタンパク質基質と試料とを、脱リン酸化反応に必要な条件下で接触させインキュベートする工程
（ｂ）基質のリン酸化レベルの変化を、前記基質のリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程
ＲＢタンパク質基質のリン酸化は、前記リン酸化が可能な条件下で、サイクリン／ＣＤＫ複合体によってＲＢタンパク質を処理することによって得ることができる。
脱リン酸化酵素活性の測定に用いる、ＲＢタンパク質基質のリン酸化状態を識別しうる抗体とは、先に述べたものと同じ抗体を利用することができる。また、イムノアッセイに基づくＲＢタンパク質基質のリン酸化レベルの評価方法も、先に述べたのと同様の原理に基づいて実施することができる。ただし、脱リン酸化酵素活性における標識ＲＢタンパク質基質（あるいは標識抗体）に由来するシグナルの大きさと、測定すべき酵素活性の大きさの関係が逆になる点のみが相違する。
現在のところ、ヒトの生体内でサイクリン／ＣＤＫ複合体によってリン酸化されたタンパク質の脱リン酸化酵素として機能しているタンパク質は同定されていない。しかし組織抽出液、細胞抽出液中等に含まれるトータルプロテインフォスファターゼ活性を測定するという測定系となりうる。
本発明の脱リン酸化酵素活性の測定方法は、リン酸化酵素活性の測定方法と同様に、その存在が疑われるあらゆる試料を測定対象とすることができる。たとえば、抽出液中に含まれる脱リン酸化酵素の精製を試みようとする場合、各画分に見出される脱リン酸化酵素活性は、酵素の精製の指標として有用である。
本発明に基づくリン酸化酵素、あるいは脱リン酸化酵素活性の測定方法は、それぞれリン酸化酵素、あるいは脱リン酸化酵素の阻害剤もしくは促進剤のスクリーニングに利用することができる。すなわち本発明は、リン酸化酵素、あるいは脱リン酸化酵素の活性を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法に関する。本発明において、これらの酵素活性を阻害、あるいは促進する化合物を総称して酵素活性を調整する化合物と呼ぶ。
本発明に基づくリン酸化酵素活性を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニング方法は、以下の工程（ａ）−（ｃ）を含む。
（ａ）サイクリン／ＣＤＫ複合体、およびＲＢタンパク質基質とを、被検化合物の存在下、リン酸化反応に必要な条件下で接触させインキュベートする工程
（ｂ）ＲＢタンパク質基質のリン酸化レベルの変化を、前記基質のリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下における基質のリン酸化のレベルと比較して、基質のリン酸化のレベルの変化を低下もしくは上昇させる化合物を選択する工程
サイクリン／ＣＤＫ複合体とＲＢタンパク質基質との接触、およびＲＢタンパク質基質のリン酸化レベルの評価は、上記のリン酸化酵素活性の測定方法と同様に行うことができる。その結果、被検化合物の非存在下でＲＢタンパク質基質のセリン残基またはスレオニン残基に結合しているリン酸基の検出量が低下すれば、スクリーニングに用いた被検化合物は、リン酸化酵素の活性を促進すると判定される。
本発明によるスクリーニングに用いるリン酸化酵素には、天然のサイクリン／ＣＤＫのみならず、組み換え体として得られる酵素タンパク質を利用することができる。また天然の酵素と同じアミノ酸配列を持つもののみならず、そのキナーゼ領域のみからなる酵素断片を用いることもできる。キナーゼ領域のみを用いることにより、発現生成物を小さくすることができ、その結果として組み換え体としてより多量の酵素タンパク質を容易に得ることができる。
一方、本発明に基づく脱リン酸化酵素活性を阻害する、もしくは促進する化合物のスクリーニング方法は、以下の工程の（ａ）−（ｃ）を含む。
（ａ）前記リン酸化されたＲＢタンパク質に対する脱リン酸化酵素、およびリン酸化されたＲＢタンパク質基質を、被検化合物の存在下、脱リン酸化反応に必要な条件下で接触させインキュベートする工程
（ｂ）ＲＢタンパク質基質の脱リン酸化レベルの変化を、前記基質のリン酸化状態を識別しうる抗体との反応性の変化に基づいて検出する工程
（ｃ）被検化合物の被存在下における基質の脱リン酸化のレベルと比較して、基質の脱リン酸化レベルの変化を低下もしくは増加させる化合物を選択する工程
これらのスクリーニング方法において用いられる被検化合物としては、例えば、ペプチド（タンパク質を含む）、合成低分子化合物、動植物や細菌の細胞抽出物、細胞培養上清などが用いられるが、これらに制限されない。また、脱リン酸化酵素としては、例えば、大腸菌アルカリフォスファターゼ、牛小腸アルカリフォスファターゼ、ならびにヒトＣｄｃ２５、Ｃｄｃ１４等のプロテインフォスファターゼ等を用いることができる。
脱リン酸化酵素とリン酸化されたＲＢタンパク質基質との接触、およびＲＢタンパク質基質のリン酸化レベルの評価は、上記の脱リン酸化酵素活性の検出方法と同様に行うことができる。その結果、被検化合物の非存在下でＲＢタンパク質基質のセリン残基および／またはスレオニン残基に結合しているリン酸基を検出した場合（対照）と比較して、ＲＢタンパク質のセリン残基および／またはスレオニン残基に結合しているリン酸基の検出量が増加していれば、スクリーニングに用いた被検化合物は、脱リン酸化酵素の活性を阻害すると判定される。逆に、ＲＢタンパク質のセリン残基および／またはスレオニン残基に結合しているリン酸基の検出量が低下していれば、スクリーニングに用いた被検化合物は、脱リン酸化酵素の活性を促進すると判定される。
これら本発明のスクリーニング方法において、被検化合物として、動植物や細菌の細胞抽出物、細胞培養上清などを用いた場合には、当業者に公知の方法（例えば、各種クロマトグラフィー）によりこれらを分画して、それぞれ検出を行うことにより、リン酸化（または脱リン酸化）酵素の活性を阻害する単一の化合物を最終的に特定することが可能である。これらスクリーニングにより単離されたリン酸化酵素および脱リン酸化酵素の活性を阻害もしくは促進する化合物は、これらの酵素活性の活性調整剤として利用することができる。これらの化合物は、特に癌治療薬やリウマチ治療薬の候補化合物として有用である。本発明のスクリーニング法により単離される化合物を、リン酸化酵素活性、あるいは脱リン酸化酵素活性の活性調整剤として用いる場合には、公知の製剤学的製造法により製剤化して用いることも可能である。例えば、薬理学上許容される担体または媒体（生理食塩水、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤など）とともに患者に投与される。投与は、化合物の性質に応じて、経皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、静脈内、または経口的に行われる。投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適宜適当な投与量を選択することが可能である。
加えて本発明は、上記測定方法、またはスクリーニングに用いる、ＲＢタンパク質基質のリン酸化状態を識別することができる抗体を含むキットに関する。本発明のキットは、リン酸化酵素活性の検出に用いる場合には、前記抗体以外に、例えばＲＢタンパク質基質および緩衝液等で構成される。また、脱リン酸化酵素活性の検出に用いる場合には、前記抗体以外に、リン酸化されたＲＢタンパク質基質および緩衝液で構成される。これら酵素の活性を阻害もしくは促進する化合物のスクリーニングに用いる場合には、さらにリン酸化酵素（あるいは脱リン酸化酵素）を組み合わせる。ＲＢタンパク質基質、あるいは前記抗体のいずれかは、上記のような標識を付与することができ、他方を固相化しておくことができる。
キットには、リン酸化酵素（あるいは脱リン酸化酵素）の活性や、測定系そのものの検定のために、酵素標品やＲＢタンパク質基質標品を組み合わせることができる。これらの標品や、前記抗体には、安定化などのための他の成分を加えることができる。例えば、１％程度のＢＳＡ、および終濃度０．２〜１０％（好ましくは１％）のシュークローズ、フルクトースなどのポリオール類を、標品中に凍結乾燥後のタンパク質変性防止剤として添加することができる。以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。
発明を実施するための最良の形態
〔実施例１〕  抗リン酸化ペプチド抗体の作製
（１）  免疫原の作製
（ａ）  ペプチドの作製
リン酸化サイトとして報告されたヒトＲＢタンパク質の３５６位のスレオニン、６１２位のセリン、７８０位のセリン、８０７位のセリンをそれぞれ含む以下の８本のペプチドを、ペプチド合成機を用いて作製した。
0004828752.tif 000003
上記アミノ酸配列は１文字表記で、アミノ末端からカルボキシル末端方向に記した。Ｓ（ｐ）、Ｔ（ｐ）はそれぞれリン酸化セリン残基、リン酸化スレオニン残基を示す。９０％以上の純度であることをＨＰＬＣにより確認した。ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐＲＢ−Ｔ３５６はヒトＲＢタンパク質の３５０番目から３６２番目までの、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐＢＲ−Ｓ６１２は６０６番目から６１８番目までの、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐＲＢ−Ｓ７８０は７７４番目から７８６番目までの、そしてｐｈｏｓｐｈｏ−ｐＲＢ−Ｓ８０７は８０１番目から８１５番目までのアミノ酸配列に相当する。全てのペプチドのカルボキシル末端のシステイン残基は、ペプチドをキャリアータンパク質に共有結合させるために導入した。
（ｂ）  ペプチドのキャリアータンパク質への結合
免疫原とするために、リン酸化ペプチド（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐＲＢ−Ｔ３５６、−Ｓ６１２、−Ｓ７８０、および−Ｓ８０７）をそれぞれキャリアータンパク質であるキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ））と共有結合させた。これらのペプチドとＫＬＨの結合にはｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステル（ｍ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｚｏｙｌ−Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ  ｅｓｔｅｒ（ＭＢＳ））を架橋物質として用いた。等量のＫＬＨとペプチドを架橋した。このペプチド−ＫＬＨを免疫原として使用した。
（ｃ）  免疫原の調製と免疫方法
キャリアータンパク質ＫＬＨとそれに結合したペプチド（ペプチド−ＫＬＨ）１０μｇ（１００μｌ）をマウスの１回あたりの免疫原として用いた。１．５ｍｌチューブで、１００μｌのフロイント完全アジュバントとペプチド−ＫＬＨ（各１００μｌ）を１ｍｌシリンジと２１ゲージ注射針を用いて、完全にエマルジョン化するまで混合した。
マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に対し、腹腔に各リン酸化ペプチドとアジュバントのエマルジョンを２６ゲージ注射針を使用して注射した。免疫は１週間ごとに１回、合計４回行った。４回目の免疫の際、抗体力価をチェックするため、マウスの眼下静脈蒼より５０〜１００μｌ採血し、ＥＬＩＳＡ法により抗体力価を確認した。
（２）  ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐＲＢ−Ｔ３５６、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐＲＢ−Ｓ６１２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐＲＢ−Ｓ７８０、およびｐｈｏｓｐｈｏ−ｐＲＢ−Ｓ８０７に対するモノクローナル抗体の作成
（ａ）  ハイブリドーマの作製
十分な抗体力価の確認後、マウスより脾臓を摘出し、ポリエチレングリコールを用いてミエローマ細胞と細胞融合させた。ハイブリドーマの選別はＨＡＴ（ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ，ａｍｉｎｏｐｒｅｒｉｎ，ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）セレクションで行った。ハイブリドーマの培養上清を用いたＥＬＩＳＡ法により、非リン酸化ペプチド（ｐＲＢ−Ｔ３５６、ｐＲＢ−Ｓ６１２、ｐＲＢ−Ｓ７８０、ｐＲＢ−Ｓ８０７）よりもリン酸化ペプチド（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐＢＲ−Ｔ３５６、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐＲＢ−Ｓ６１２、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐＲＢ−Ｓ７８０、ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐＲＢ−Ｓ８０７）に対して反応性の高いクローンのスクリーニングを行った。
（ｂ）  腹水の取得と抗体の精製
限界希釈法により得られたハイブリドーマクローンを７５ｃｍ２フラスコで培養した後、マウスの腹腔に注射した。ハイブリドーマを注射する１０日前に１ｍｌの、３日前に０．５ｍｌのプリスタン（Ｓｉｇｍａ）をマウスに注射しておいた。１〜２週間後にマウスの状態を見ながら腹水を採取した。腹水に終濃度５０％になるように硫安を添加し、４℃で１時間以上攪拌した。高速遠心によりその沈澱を回収した。最小限の純水で沈澱を完全に溶解後、透析膜を用いてＰＢＳに対して透析した。完全にＰＢＳに平衡化させた後、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａセファロース（ファルマシア社製）と複合体を形成させた。最後にｐｒｏｔｅｉｎ  Ａセファロースから抗体を溶出させた。
（３）  抗体力価および特異性の検定
ペプチドを１０μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳに溶かし、ＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレートに１ウェルあたり５０μｌづつ分注して、４℃で一晩感作した。感作後、ペプチド溶液を除き、１％ＢＳＡ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳを１ウェルあたり２００μｌづつ分注して、室温で１時間以上ブロッキングした。
精製した抗体を０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳで必要に応じて希釈した。希釈したそれらのサンプルを感作プレート１ウェルあたり１００μｌ添加し、室温に１時間静置した（一次反応）。一次反応後、洗浄瓶を用いて、各ウェルをＰＢＳで４回以上、十分に洗浄した。０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＰＢＳで３０００倍希釈した西洋ワサビ  ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ＭＢＬ社製３３０）を各ウェルに１００μｌづつ分注し、室温に１時間静置した（二次反応）。二次反応後同様に、ＰＢＳで洗浄した後、７５０μＭ  ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）溶液を１ウェルあたり１００μｌ添加し、３０℃で５〜２０分間発色させた（発色反応）。１．５Ｎ  Ｈ３ＰＯ４を１００μｌづつ加え発色反応を停止させ、マイクロタイタープレートリーダーを用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
〔実施例２〕  組み換えサイクリンＤ１／ＣＤＫ４、サイクリンＥ／ＣＤＫ２、サイクリンＢ／ＣＤＫ１の作製
（１）  ＰＣＲ法によるサイクリン、ＣＤＫのｃＤＮＡ単離
（ａ）  各サイクリン、ＣＤＫ増幅用プライマーの設定
各サイクリン、ＣＤＫの全長ｃＤＮＡを増幅するため、以下に示すプライマーを作製した。各サイクリンおよびＣＤＫのｃＤＮＡの塩基配列は次のアクセッションナンバーでＧｅｎＢａｎｋに登録されている。
サイクリンＤ１：Ｘ５９７９８
サイクリンＥ：Ｍ７３８１２，Ｍ７４０９３
サイクリンＢ：Ｍ２５７５３
ＣＤＫ１：Ｘ０５３６０
ＣＤＫ２：Ｘ６１６２２，Ｘ６２０７１
ＣＤＫ４：ＮＭ＿００００７５
＜サイクリンＤ１増幅用プライマー＞
フォワードプライマー（ｈｃｙ−Ｄ１  Ｆ１）：  ５’−ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＣＴＧ  ＴＧＣ−３’（配列番号：９）（５’側３つの塩基（ＡＴＡ）は制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。５’側４番目から９番目（ＧＧＡ  ＴＣＣ）は制限酵素Ｂａｍ  ＨＩサイト。）
リバースプライマー（ｈｃｙ−Ｄ１  Ｒ１）：  ５’−ＡＴＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＧＣＴ  ＣＣＧ  ＣＡＣ  ＧＴＣ−３’（配列番号：１０）（５’側３つの塩基（ＡＴＡ）は制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。５’側４番目から９番目（ＣＴＣ  ＧＡＧ）は制限酵素ＸｈｏＩサイト。）
＜サイクリンＥ増幅用プライマー＞
フォワードプライマー（ｈｃｙ−Ｅ  Ｆ１）：  ５’−ＡＴＡ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＡＴＧ  ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＧＣＧ−３’（配列番号：１１）（５’側３つの塩基（ＡＴＡ）は制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。５’側４番目から９番目（ＡＧＡ  ＴＣＴ）は制限酵素Ｂｇｌ  ＩＩサイト。）
リバースプライマー（ｈｃｙ−Ｅ  Ｒ１）：  ５’−ＡＴＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＧＣ  ＣＡＴ  ＴＴＣ  ＣＧＧ  ＣＣＣ  ＧＣＴ  ＧＣＴ−３’（配列番号：１２）（５’側３つの塩基（ＡＴＡ）は制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。５’側４番目から９番目（ＣＴＣ  ＧＡＧ）は制限酵素ＸｈｏＩサイト。）＜サイクリンＢ増幅用プライマー＞
フォワードプライマー（ｈｃｙ−Ｂ  Ｆ１）：  ５’−ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＧ  ＣＴＣ  ＣＧＡ  ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＡＧＧ−３’（配列番号：１３）（５’側３つの塩基（ＡＴＡ）は制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。５’側４番目から９番目（ＣＴＣ  ＧＡＧ）は制限酵素ＸｈｏＩサイト。）
リバースプライマー（ｈｃｙ−Ｂ  Ｒ１）：  ５’−ＡＴＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＡＣ  ＣＴＴ  ＴＧＣ  ＣＡＣ  ＡＧＣ  ＣＴＴ  ＧＧＣ−３’（配列番号：１４）（５’側３つの塩基（ＡＴＡ）は制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。５’側４番目から９番目（ＣＴＣ  ＧＡＧ）は制限酵素ＸｈｏＩサイト。）＜ＣＤＫ１増幅用プライマー＞
フォワードプライマー（ｈＣＤＫ１  Ｆ１）：  ５’−ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＴＡＴ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＡＴＡ−３’（配列番号：１５）（５’側３つの塩基（ＡＴＡ）は制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。５’側４番目から９番目（ＧＧＡ  ＴＣＣ）は制限酵素ＢａｍＨＩサイト。）
リバースプライマー（ｈＣＤＫ１  Ｒ１）：  ５’−ＡＴＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＡＣＴ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＡＡＴ  ＣＴＧ  ＡＴＴ  ＧＴＣ−３’（配列番号：１６）（５’側３つの塩基（ＡＴＡ）は制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。５’側４番目から９番目（ＣＴＣ  ＧＡＧ）は制限酵素ＸｈｏＩサイト。）＜ＣＤＫ２増幅用プライマー＞
フォワードプライマー（ｈＣＤＫ２  Ｆ１）：  ５’−ＡＴＡ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＧ  ＡＡＣ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  ＡＡＧ  ＧＴＧ−３’（配列番号：１７）（５’側３つの塩基（ＡＴＡ）は制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。５’側４番目から９番目（ＧＧＡ  ＴＣＣ）は制限酵素Ｂａｍ  ＨＩサイト。）
リバースプライマー（ｈＣＤＫ２  Ｒ１）：  ５’−ＡＴＡ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＴＣＡ  ＧＡＧ  ＴＣＧ  ＡＡＧ  ＡＴＧ  ＧＧＧ  ＴＡＣ−３’（配列番号：１８）（５’側３つの塩基（ＡＴＡ）は制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。５’側４番目から９番目（ＣＴＣ  ＧＡＧ）は制限酵素ＸｈｏＩサイト。）＜ＣＤＫ４増幅用プライマー＞
フォワードプライマー（ｈＣＤＫ４  Ｆ１）：  ５’−ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＡＣＣ  ＴＣＴ  ＣＧＡ  ＴＡＴ  ＧＡＧ−３’（配列番号：１９）（５’側３つの塩基（ＣＡＴ）は制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。５’側４番目から９番目（ＧＧＡ  ＴＣＣ）は制限酵素ＢａｎＨＩサイト。）
リバースプライマー（ｈＣＤＫ４  Ｒ１）：  ５’−ＣＡＴ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＣＧＧ  ＡＴＴ  ＡＣＣ  ＴＴＣ  ＡＴＣ  ＣＴＴ−３’（配列番号：２０）（５’側３つの塩基（ＣＡＴ）は制限酵素処理を円滑に行わせるためのもの。５’側４番目から９番目（ＧＴＣ  ＧＡＣ）は制限酵素ＳａｌＩサイト。）（ｂ）  鋳型ＤＮＡの調製
サイクリン、  ＣＤＫの全長ｃＤＮＡをＰＣＲ法で増幅するための鋳型として、ヒト乳癌由来のＺＲ７５−１細胞のｃＤＮＡを用いた。まず、ｃＤＮＡを作製するため、ＺＲ７５−１細胞よりフェノール−チオシアン酸グアニジン法（ニッポンジーン、ＩＳＯＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを抽出、精製した。抽出した全ＲＮＡを基にオリゴｄＴまたはオリゴランダムプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した（逆転写反応）。
（ｃ）  ＰＣＲ反応の条件
ＰＣＲ反応は以下の３段階の条件で行った。
１；  ９５℃５分間（変性）、５２℃１分間（アニール）、７２℃２分間（伸長）を１サイクル
２；  ９４℃３０秒間（変性）、６２℃３０秒間（アニール）、７２℃２分間（伸長）を３５サイクル
３；  ７２℃１０分間を１サイクル
（ｄ）  ベクターへのクローニングと組み換えバキュロウイルス液の調製
増幅された各ＰＣＲ産物をそれぞれ対応する制限酵素で消化した。制限酵素消化ＤＮＡをアガロースゲルで電気泳動した後、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ（ＢＩＯ１０１社製）で精製した。精製ＤＮＡを予めＰＣＲ産物の両末端と同じ制限酵素により消化したｐＦＡＳＴＢＡＣＨＴベクター（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）へライゲーションした後、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，第二版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）」の方法に従って大腸菌（ＤＨ５α）株を形質転換し、複数のシングルコロニーを取得した。シングルコロニーから採取した、精製したｐＦＡＳＴＢＡＣＨＴベクター（ｐＦＡＳＴＢＡＣ−ｎ６ｈｉｓ−ｈｃｙＤ、ｐＦＡＳＴＢＡＣ−ｎ６ｈｉｓｈｃｙＥ、ｐＦＡＳＴＢＡＣ−ｎ６ｈｉｓ−ｈｃｙＢ、ｐＦＡＳＴＢＡＣ−ｎ６ｈｉｓ−ｈＣＤＫ１、ｐＦＡＳＴＢＡＣ−ｎ６ｈｉｓ−ｈＣＤＫ２、ｐＦＡＳＴＢＡＣ−ｎ６ｈｉｓ−ｈＣＤＫ４）を大腸菌（ＤＨ１０ＢＡＣ株）へトランスフォーメーションし、Ｌｕｒｉａ寒天プレート（１０ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１２ｇ／Ｌ寒天、２００μｇ／ｍｌ  Ｘ−Ｇａｌ、４０μｇ／ｍｌ  ＩＰＴＧ、１０μｇ／ｍｌテトラサイクリン、７μｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０μｇ／ｍｌカナマイシン）上で生育させた。ＤＨ１０ＢＡＣ内では、部位特異的トランスポジションによって、ｐＦＡＳＴＢＡＣＨＴ内の発現カセットがバクミドＤＮＡへ転移する。転移の起きたシングルの白いコロニーから組み換えバクミドＤＮＡを精製した。組み換えバクミドＤＮＡをＣＥＬＬ  ＦＥＣＴＩＮ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を用いてＳｆ９細胞のトランスフェクションを行った。組み換えバキュロウイルスは培養液中に産出されるので、約１週間後に培養液を遠心分離し、その上清をウイルス液とした。以上の操作は基本的にＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）により行った。
（ｅ）  塩基配列の確認
「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（前記）」の方法に従い、ｐＦＡＳＴＢＡＣ−ｎ６ｈｉｓ−ｈｃｙＤ、ｐＦＡＳＴＢＡＣ−ｎ６ｈｉｓ−ｈｃｙＥ、ｐＦＡＳＴＢＡＣ−ｎ６ｈｉｓ−ｈｃｙＢ、ｐＦＡＳＴＢＡＣ−ｎ６ｈｉｓ−ｈＣＤＫ１、ｐＦＡＳＴＢＡＣ−ｎ６ｈｉｓ−ｈＣＤＫ２、ｐＦＡＳＴＢＡＣ−ｎ６ｈｉｓ−ｈＣＤＫ４）を精製した。それらのインサートＤＮＡの塩基配列の決定をサンガー法に基づき、オートシークエンサーで行った。インサートＤＮＡの配列とデータベース上に公開されている配列を比較し、クローニングされたｃＤＮＡがそれぞれ、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＥ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４であることを確認した。
（ｆ）  組み換えタンパク質の精製
Ｓｆ９細胞を７５ｃｍ２のフラスコにほぼコンフルエントな状態にまで培養し、その培養液に組み換えバキュロウイルス液を加えた。感染後３〜４日目に細胞を氷冷ＰＢＳに懸濁し、遠心洗浄を行った。細胞をＨＧＮバッファー（−ＤＴＴ）に懸濁し、氷冷しながら超音波処理を行った。続いて遠心分離を行い、得られた上清を可溶性画分とし精製に用いた。ｐＦＡＳＴＢＡＣＨＴベクターの発現カセットではＮ末端側に６つのＨｉｓ残基（６ｘＨｉｓ）が付加される。抽出液の一部を用いてウエスタンブロットを行った後、抗５ｘＨｉｓ抗体（ＧＩＡＧＥＮ社製）によりタンパク質の発現を確認した。可溶性分画をＮｉ−キレーティングセファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に通し、６ｘＨｉｓ−Ｔａｇを介して組換えタンパク質をカラムに吸着させた。６ｘＨｉｓ−ＴａｇはＮｉ２＋と錯体を形成するため、カラムのＮｉ２＋に組み換えタンパク質が吸着する。カラムをＨＧＮバッファー（−ＤＴＴ）で洗浄した後、組み換えタンパク質をエリューションバッファー（５０ｍＭ〜１Ｍイミダゾール、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９）で溶出した。その際のイミダゾールの濃度は、１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、１Ｍと段階的に変化させて溶出を行った。
各イミダゾール画分について、ウエスタンブロットで抗５ｘＨｉｓ抗体により検出される組み換えタンパク質が存在する画分を透析液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５０％グリセロール）に対して一晩透析した。
透析後のサンプルをＭｏｎｏＱカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に通した。ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて吸着されたタンパク質を、０〜１Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０％グリセロールで濃度勾配をかけながら溶出させた。ウェスタンブロットで抗５ｘＨｉｓ抗体により検出された組み換えタンパク質が存在する画分について透析液に対して透析を行った。
〔実施例３〕  ＥＬＩＳＡによるサイクリンＤ１／ＣＤＫ４、サイクリンＥ／ＣＤＫ２、サイクリンＢ／ＣＤＫ１活性測定系
（１）  活性測定用基質の作製
サイクリン／ＣＤＫ複合体の基質として様々な分子が知られているが発癌との関係で最も興味深いＲＢタンパク質を基質として選択した。ヒトＲＢタンパク質のアミノ酸配列３０７ａａ−４０５ａａ、５４０ａａ−６４５ａａ、および７２３ａａ−８３３ａａをコードするｃＤＮＡ配列を、発現ベクターｐＧＥＸに組み込み、大腸菌内でグルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させた。発現させたそれぞれの産物を、アミノ酸配列順にＧＳＴ−ｐＲＢ１、ＧＳＴ−ｐＲＢ２、ＧＳＴ−ｐＲＢ３と名付けた。
ｐＧＥＸベクターでは、組み換えタンパク質は、ＧＳＴとの融合タンパク質として作られる。このＧＳＴ酵素がグルタチオン（ＧＳＨ）に対してアフィニティーを持っていることを利用して、組み換えタンパク質の精製を行った。組み換えタンパク質の発現を確認した後、その菌体を１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳに懸濁後、超音波処理により菌体を破砕した。高速遠心後、上清を組み換えタンパク質を含む可溶性分画とした。この可溶性分画をＧＳＨ−セファロース４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に通し、ＧＳＴ−ｐ５３（１−９９）タンパク質をカラムに吸着させた。カラムをＷＥバッファー（１０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５）で洗浄後、組み換えタンパク質をＧバッファー（１０ｍＭ  ＧＳＨ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ９．６）を用いて溶出した。溶出された各発現蛋白は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、５０％グリセリンに対して透析した。
（２）  基質感作プレートの作製
ＧＳＴ−ｐＲＢ１、ＧＳＴ−ｐＲＢ２、ＧＳＴ−ｐＲＢ３を２０μｇ／ｍｌになるようにＰＢＳで希釈し、ＥＬＩＳＡ用マイクロタイタープレートに１ウェルあたり５０μｌづつ分注して、４℃で一晩感作した。感作後、１％ＢＳＡ−０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳを１ウェルあたり２００μｌずつ分注し、室温で１時間以上ブロッキングを行った。
（３）  リン酸化反応
サイクリン／ＣＤＫ用反応バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．０２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、５ｍＭ  ＡＴＰ）中に各酵素（組み換えサイクリンＤ１／ＣＤＫ４、サイクリンＥ／ＣＤＫ２、サイクリンＢ／ＣＤＫ１）を１アッセイあたり約１００ｎｇとなるように加え固相プレートに分注（５０μｌ／ウェル）。３０℃で１時間、インキュベーションした。
（４）  抗原抗体反応
一次反応：  ＰＢＳで５回洗浄後、各５０倍希釈した抗リン酸化モノクローナル抗体Ｔ３５６（１Ｃ２）、Ｓ６１２（３Ｃ１２）、Ｓ７８０（２Ｃ４）、Ｓ８１２（５Ｈ１２）をウェルあたり１００μｌずづ分注し、室温で１時間インキュベーションした。
二次反応：  ＰＢＳで１０回洗浄後、４００００倍希釈したＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社製）をウェルあたり１００μｌずつ分注し、室温で１時間インキュベーションした。
発色：  ＰＢＳで５回洗浄後、ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｔｉｄｉｎｅ）をウェルあたり１００μｌずつ分注し、室温で３０分間発色させた後、１．５Ｎ  Ｈ３ＰＯ４をウェルあたり１００μｌずつ分注し反応を停止させた。
（５）  測定結果
表２で示すように、発現させた各サイクリン／ＣＤＫ複合体の活性を感度よく検出することが可能であった。
0004828752.tif 000004
〔実施例４〕Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１／ＣＤＫ阻害剤スクリーニングシステムの構築＜ＥＬＩＳＡ法＞
１）抗体感作条件
抗リン酸化ＲＢモノクロナル抗体には、クローン１Ｃ１２（Ｔｈｒ３５６特異的）、クローン４Ｅ４（Ｓｅｒ６１２特異的）、クローン２Ｃ４（Ｓｅｒ７８０特異的）を用いた。各抗リン酸化ＲＢ抗体をＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希釈し、マイクロプレート各ウェルに１００μｌづつ添加し、４℃で１５時間インキュベーションした。抗体溶液を振り払った後、２．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ（５％  ｓｕｃｒｏｓｅ，０．１％ＮａＮ３）中で、４℃、２４時間ブロッキングした。風乾の後測定に供した。
２）リン酸化反応
基質には、ＲＢアミノ酸配列３０１ａａ−９２８ａａを大腸菌内でＧＳＴ  ｆｕｓｉｏｎ蛋白として発現させ、グルタチオンセファロース、フォスフォセルロース（Ｐ１１）を用いて精製したものを用いた（ＲＢ３０１）。Ｃｙｃｌｉｎ／ＣＤＫには、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１／ＣＤＫ４、Ｃｙｃｌｉｎ  Ａ／ＣＤＫ２、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ／ＣＤＫ２、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ／ＣＤＫ１各々バキュロバイラスを用いて、ｓｆ９内で発現させ、コバルトカラム、フォスフォセルロース（Ｐ１１）を用いて精製したものを用いた。
リン酸化バッファー（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，０．０５％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ，１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，２ｍＭ  ＥＧＴＡ，２００μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）にＲＢ３０１（１０μｇ／ｍｌ）、１００μＭ  ＡＴＰ、Ｃｙｃｌｉｎ／ＣＤＫを添加し（最終容量１８０μｌ）、３０℃で３０分反応させた後、ＰＢＳ（１０％スキムミルク、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ，５０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を各アッセイあたり１８０μｌ加えて反応を停止させた。
３）反応
リン酸化反応終了後、反応液を１００μｌづつ抗体感作プレートに添加し、室温で１時間インキュベーションした（一次反応）。洗浄ビンで５回洗浄（洗浄液／ＰＢＳ（５００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）の後、０．５μｇ／ｍｌ抗ＧＳＴポリクロナル抗体をマイクロプレートの各ウェルに１００μｌづつ添加し、室温で１時間インキュベーションした（二次反応）。洗浄ピンで５回洗浄（洗浄液／ＰＢＳ（５００ｍＭ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）の後、２００００倍希釈ＨＲＰ標識抗ラビットＩｇＧ抗体をマイクロプレートの各ウェルに１００μｌづつ添加し、室温で３０分インキュベーションした（三次反応）。その後、ＴＭＢ（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｔｉｄｉｎｅ）を用いて、室温で３０分発色させた（発色反応）。
＜ＲＩ法＞
上記ＥＬＩＳＡ法と同様に０．３μｃｉγ−３２Ｐ−ＡＴＰによるリン酸化反応を行った後、１０％ＴＣＡ、０．２％ピロリン酸ナトリウムで反応を停止させた。不溶化した基質をグラスフィルターに吸着させ、２％ＴＣＡ，０．０２％ピロリン酸ナトリウムで洗浄の後、放射線量をカウントした。
図１にＥＬＩＳＡ法によるリン酸化反応測定結果について示す。いずれの酵素、リン酸化サイトの組み合わせにおいても、酵素の量に依存したＯＤ値を上昇を認め、その反応曲線はなめらかなシグモイドカーブを描いた。このことから、本発明で構築したＥＬＩＳＡ系は、Ｃｙｃｌｉｎ／ＣＤＫのリン酸化活性を良好に測定できるものと考えられた。精製した４種類の酵素の間で、各サイトに対するリン酸化活性を比較すると、酵素によってリン酸化サイトに対する選択性のあることが示された。Ｃｙｃｌｉｎ  Ａ／ＣＤＫ２，Ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ／ＣＤＫ２はＴｈｒ３５６，Ｓｅｒ６１２に、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１／ＣＤＫ４はＳｅｒ７８０に選択性がみられた。また、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ／ＣＤＫ１はＳｅｒ６１２に選択性がみられた。ＲＩ法との間で、感度の比較を行ったところ、ＲＩ法と同等以上であることが示された（図１０）。特に、Ｃｙｃｌｉｎ  Ａ／ＣＤＫ２，Ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ／ＣＤＫ２においてはＥＬＩＳＡ法はＲＩ法に比較して、１０倍程度感度が高いものと考えられた。
次に本ＥＬＩＳＡ系を用いて、阻害剤の阻害効果の判定が可能であるかどうか市販の薬剤を使って検討した。
薬剤としては、ｃｄｃ２，ｃｄｋ２選択的阻害剤であるＯｌｏｍｏｕｃｉｎｅ（ＩＣ５０＝７μＭ）、Ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ（ＩＣ５０＝７００ｎＭ）、リン酸化酵素全般的な阻害剤であるＫ２５２ａ（ＰＫＣに対するＫｉ＝２５ｎＭ）、ＭＥＫに対する阻害剤ＵＯ１２６（ＩＣ５０＝５５ｎＭ／ｃｄｋ２，４に対しては＞１０μＭ）、Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ−ｉｓｏｍｅｒ（Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅに対する陰性コントロール）の５種類を使用した。
図２〜図５にＫ２５２ａ、Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ、Ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅの阻害効果についてＥＬＩＳＡ法で検討した結果を示した。いずれの阻害剤を用いた場合においても阻害剤添加濃度依存的にＯＤ値の低下をみた。Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ、ＲｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅのＩＣ５０は公示の値ではそれぞれ７μＭ、７００ｎＭであるが、本発明における検討では、この値より１０倍近く高くなった。
これは、これら阻害剤がＡＴＰ拮抗剤であるため、アッセイ系に用いるＡＴＰ濃度によって値が異なるためと考えられる。論文上の報告（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｂｙ  ｐｒｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｖｅｓｅｌｙ  Ｊ．，Ｈａｖｌｉｅｋ  Ｌ．，Ｓｔｎａｄ  Ｍ．，Ｂｌｏｗ  ＪＪ．，Ｄｏｎｅｌｌａ−Ｄｅａｎａ  Ａ．，Ｐｉｎｎａ  Ｌ．，Ｌｅｔｈａｍ  ＤＳ．，Ｋａｔｏ  Ｊ．，Ｄｅｔｉｖａｕｄ  Ｌ．，Ｌｅｃｌｅｒｃ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４  Ｓｅｐ．１  ２２４：２  ７７１−８６）では、ＡＴＰの濃度が１５μＭ、使用している基質がｈｉｓｔｏｎｅＨ１であるのに対し、本発明において検討したＥＬＩＳＡ系ではＡＴＰ濃度が１００μＭ、基質がＲＢであることも原因ではないかと考えられる。
またＯｌｏｍｏｕｃｉｎｅ、Ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅはｃｄｃ２、ｃｄｋ２選択的阻害剤で、ｃｄｋ４に対しては阻害効果が著しく弱いことが報告されている（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ，，ａｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｃｄｃ２，ｃｄｋ２  ａｎｄ  ｃｄｋ５．Ｍｅｉｊｅｒ  Ｌ．，Ｂｏｒｇｎｅ  Ａ．，Ｍｕｌｎｅｒ  Ｏ．，Ｃｈｏｎｇ  ＪＰ．，Ｂｌｏｗ  ＪＪ．，Ｉｎａｇａｋｉ  Ｍ．，Ｄｅｌｃｒｏｓ  ＪＧ．，Ｍｏｕｌｉｐｏｕｘ  ＪＰ．，Ｅｕｒ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７  Ｊａｎ  １５  ２４３：１  −２  ５２７−３９）。本発明における検討結果はこの報告を反映したものとなった（Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１／ＣＤＫ４に対する阻害効果は他の３種類に比べて低い）。また、阻害効果の期待できないＯｌｏｍｏｕｃｉｎｅ−ｉｓｏｍｅｒ．ＵＯ１２６においては、検討した濃度の範囲内では、ほとんど、ＯＤ値の低下はみられなかった（図６〜図９）。
さらに、ＲＩ法と同様な阻害効果の判定が可能かどうか、Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ、Ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ、Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ−ｉｓｏｍｅｒを用いて、ＥＬＩＳＡ法と、ＲＩ法の間で阻害効果の判定について比較したところ、図１１〜１３に示すように、ほぼ同様の阻害曲線を得ることができた。
以上のことから、本発明で構築したＥＬＩＳＡのシステムは、阻害剤のスクリーニング方法として有用であることが裏付けられた。
産業上の利用の可能性
実施例に示したように、抗リン酸化ペプチド特異抗体を用いたＥＬＩＳＡ法によって、サイクリンＤ１／ＣＤＫ４、サイクリンＥ／ＣＤＫ２、サイクリンＢ／ＣＤＫ１の酵素活性を測定することができた。これまでこれら酵素の活性測定では、ＲＩである３２Ｐで標識されたγ−３２Ｐ−ＡＴＰを用いるために、廃液の処理といった手続きや特別な施設等を必要とした。これに対して本発明による測定方法ではＲＩを使用せず、しかも十分な感度を持った測定方法を実現することができる。加えて本発明は、リン酸化部位を特異的に認識する抗体の利用により、複数種のサイクリン／ＣＤＫ複合体が共存する試料に含まれる、特定の複合体の活性のみを特異的に測定することを可能とした。
またこの測定方法をサイクリン／ＣＤＫ複合体の活性調整剤のスクリーニング方法に応用すれば、簡便で迅速なスクリーニングを通常の実験室で行うことが可能である。更に、本発明に基づくスクリーニング方法は、各種の化学合成物質、細胞や細菌の抽出液、あるいは培養上清のような、幅広い候補化合物に対して適用することができる。したがって、本発明のスクリーニング方法は、サイクリン／ＣＤＫ複合体の酵素活性を調整する化合物のスクリーニングにおいて、きわめて有用である。
【配列表】
0004828752.tif 000005
0004828752.tif 000006
0004828752.tif 000007
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【図面の簡単な説明】
図１は、ＥＬＩＳＡ法によるＲＢ各部位のリン酸化反応測定結果について示した図である。各グラフには、測定に用いたモノクローナル抗体の名称とそれが認識するリン酸化部位を示した。また図中、Ｄ１／４はＣｙｃｌｉｎ  Ｄ１／ＣＤＫ４、Ｅ／２はＣｙｃｌｉｎ  Ｅ／ＣＤＫ２、Ａ／２はＣｙｃｌｉｎ  Ａ／ＣＤＫ２、Ｂ／１はＣｙｃｌｉｎ  Ｂ／ＣＤＫ１の組み合わせをそれぞれ示す。
図２は、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ／ＣＤＫ１を用いたときの、阻害剤Ｋ２５２ａ（Ｋ）、Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ（Ｏ）、Ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ（Ｒ）各々の阻害効果についてＥＬＩＳＡ法で検討した結果を示した図である。
図３は、Ｃｙｃｌｉｎ  Ａ／ＣＤＫ２を用いたときの、阻害剤Ｋ２５２ａ（Ｋ）、Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ（Ｏ）、Ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ（Ｒ）各々の阻害効果についてＥＬＩＳＡ法で検討した結果を示した図である。
図４は、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ／ＣＤＫ２を用いたときの、阻害剤Ｋ２５２ａ（Ｋ）、Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ（Ｏ）、Ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ（Ｒ）各々の阻害効果についてＥＬＩＳＡ法で検討した結果を示した図である。
図５は、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１／ＣＤＫ４を用いたときの、阻害剤Ｋ２５２ａ（Ｋ）、Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ（Ｏ）、Ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ（Ｏ）各々の阻害効果についてＥＬＩＳＡ法で検討した結果を示した図である。
図６は、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｂ／ＣＤＫ１を用いたときの、阻害剤Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ−ｉｓｏｍｅｒ（Ｏｉ）及びＵ０１２６（Ｕ）の阻害効果についてＥＬＩＳＡ法で検討した結果を示した図である。
図７は、Ｃｙｃｌｉｎ  Ａ／ＣＤＫ２を用いたときの、阻害剤Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ−ｉｓｏｍｅｒ（Ｏｉ）及びＵ０１２６（Ｕ）の阻害効果についてＥＬＩＳＡ法で検討した結果を示した図である。
図８は、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｅ／ＣＤＫ２を用いたときの、阻害剤Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ−ｉｓｏｍｅｒ（Ｏｉ）及びＵ０１２６（Ｕ）の阻害効果についてＥＬＩＳＡ法で検討した結果を示した図である。
図９は、Ｃｙｃｌｉｎ  Ｄ１／ＣＤＫ４を用いたときの、阻害剤Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ−ｉｓｏｍｅｒ（Ｏｉ）及びＵ０１２６（Ｕ）の阻害効果についてＥＬＩＳＡ法で検討した結果を示した図である。
図１０は、ＥＬＩＳＡ法とＲＩ法との感度比較の結果を示した図である。実線はＥＬＩＳＡ法、破線はＲＩ法を示す。
図１１は、Ｃｙｃｌｉｎ／ＣＤＫ活性に対する阻害剤Ｏｌｍｏｕｃｉｎｅの阻害効果をＥＬＩＳＡ法とＲＩ法で比較した結果を示す図である。
図１２は、Ｃｙｃｌｉｎ／ＣＤＫ活性に対する阻害剤Ｒｏｓｏｃｏｖｉｔｉｎｅの阻害効果をＥＬＩＳＡ法とＲＩ法で比較した結果を示す図である。
図１３は、Ｃｙｃｌｉｎ／ＣＤＫ活性に対する阻害剤Ｏｌｍｏｕｃｉｎｅ−ｉｓｏｍｅｒの阻害効果をＥＬＩＳＡ法とＲＩ法で比較した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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