(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号４のペプチド配列からなるヒト癌関連ポリペプチドLAPTM4B-35。
【請求項２】
癌促進機能を備える請求項1記載のヒト癌関連ポリペプチドLAPTM4B-35。
【請求項３】
配列表の配列番号７のペプチド配列からなるヒト癌関連ポリペプチド。
【請求項４】
癌感受性機能を備える請求項３記載のヒト癌関連ポリペプチド。
【請求項５】
癌が肝臓がんおよび上皮起源のである請求項１、２又は５のいずれかに記載のヒト癌関連ポリペプチド。
【請求項６】
１）配列表の配列番号１、２、３または６により規定されるポリヌクレオチド
２）請求項２及び４に記載の配列表の配列番号４または７のいずれかをコードするポリヌクレオチドからなり、
上記配列の一つからなるヒト癌関連ポリヌクレオチド。
【請求項７】
癌が肝臓がんおよび上皮起源のである請求項６記載のヒト癌関連ポリヌクレオチド。
【請求項８】
プロモータとしてLAPTM4B遺伝子の発現をレギュレイトする配列表の配列番号８からなるヒト癌関連ポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１に記載のヒト癌関連ポリペプチドLAPTM4B-35の抗体。
【請求項１０】
請求項６に記載のヒト癌関連ポリヌクレオチドの発現ベクター。
【請求項１１】
請求項６記載のヒト癌関連ポリヌクレオチドをトランスフェクトし突然変異した細胞株。
【請求項１２】
配列表の配列番号１、２又は３に記載のヒト癌関連ポリヌクレオチドを用いるがん診断の試薬の製造に使用するヒト癌関連ポリヌクレオチドの使用方法。
【請求項１３】
請求項３または請求項６に記載のヒト癌関連ポリペプチド又はヒト癌関連ポリヌクレオチドの使用方法において、前記ヒト癌関連ポリヌクレオチドが配列表の配列番号６のヒト癌関連ポリヌクレオチドであり、及び前記ポリペプチドが配列番号７のポリペプチドからなり、いずれか一つを肝臓がんに感受性のある個人を同定するために使用する方法。
【請求項１４】
請求項１又は３のヒト癌関連ポリペプチドの使用方法であって、該ポリペプチドが配列番号４及び７であって、癌診断のための試薬の製造に使用される方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ヒト癌関連遺伝子、それがコードする産物、並びに遺伝子工学およびタンパク質工学の領域、並びに医学的診断および治療におけるそれらの適用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
癌は、ヒトの生命を脅かす主要な健康問題である。肝細胞癌（HCC）は、癌疾患のなかで最も深刻なものの一つである。原発性肝細胞癌の新たな症例は、毎年世界中で100万を超えることが報告されている。新たな症例の70％がアジアで起こり、世界中の新たな症例の約40〜45％が中国で起こる。中国における１年あたりの新たな肝細胞癌の症例総数は、約450,000であり、その数は、とりわけ20〜60才の人に増えている。高い発症率、早期診断の困難性、迅速な増殖速度、高い再発率、および高い死亡率により、HCCは最も悪性の癌とされている。多くのHCC患者は、診断されたときには既に中期または末期まで進行しており、適切な治療をしなければ3〜6ヶ月しか生存できない。
【０００３】
発癌（cancerogenesis）の根底にあるメカニズムを解明することは、癌の予防、診断および治療に役立つであろう。早期診断は、治癒率を高め、死亡率を減少させるのに重要である。現在使用されるHCC診断マーカー、血清AFPは、HCC患者において30％の陰性を示すが、ある種の良性肝疾患が血清AFPレベルの有意な増大を引き起こすため、鑑別診断は困難である。肝癌発生（hepatocarcinogenesis）は、個人の遺伝的感受性と関連することが見出されている。様々な遺伝的背景を備えた個人は、環境の発癌物質に対して様々な処理能力を有する。これは、個人が癌に罹患する様々なリスクに通じる。発癌に対する様々な遺伝的感受性を引き起こす様々な遺伝子型と遺伝的多様性がある。
【０００４】
癌は、本質的に細胞の遺伝性疾患である。多数の癌関連遺伝子が発見されているが、発癌および進行のメカニズムは、まだ解明されていない。公知の癌遺伝子は、細胞の局在およびそれらがコードするタンパク質の機能によって5つのカテゴリーに分けることができる：Ｉ．増殖因子をコードする遺伝子、sis、int-2、hst、fgf-5など；II．増殖因子レセプターをコードする遺伝子、erbB、erbB-2、fms、met、rosなど；III．細胞質中のシグナル伝達分子をコードする遺伝子、Abl、src、ras、raf、yes、fgr、fes、lck、mosなど；IV．細胞増殖およびアポトーシスの調節分子をコードする遺伝子、bcl-1、bcl-2など；およびＶ．核ＤＮＡ−結合タンパク質 (転写因子) をコードする遺伝子、myc、myb、fos、jun、B-lym、ski、ets、relなど。ras、src、myc、metおよびp53などは、HCCと密接に関連のある遺伝子であることが実証されている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、新規なヒト癌関連遺伝子およびそれがコードする産物を提供する。
【０００６】
本発明により提供される新規なヒト癌関連遺伝子はＬＡＰＴＭ４Ｂ遺伝子と称される。  以下に後述するポリペプチド（タンパク質）ＬＡＰＴＭ４Ｂ−３５（配列表の配列番号４）、ＬＡＰＴＭ４Ｂ−２４（配列表の配列番号５）及び配列表の配列番号４のペプチド配列（タンパク配列）はＬＡＰＴＭ４Ｂ遺伝子によりコードされる。配列表の配列番号４、５または７のペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては配列表の配列番号１、２，３または６のポリヌクレオチドを挙げることができる。したがって、本発明は、以下の配列の一つを含む：まず、配列表の配列番号４のペプチド配列のポリペプチド（ＬＡＰＴＭ４Ｂ−３４）、配列番号５のペプチド配列のポリペプチド（ＬＡＰＴＭ４Ｂ−２４）、または配列番号７のペプチド配列のポリペプチド
そして
１）配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号６のヌクレオチド配列のポリヌクレオチド：
２）配列表の配列番号４、配列番号５、または配列番号７のペプチド配列（タンパク配列）をコードするポリヌクレオチド
３）配列表の配列番号１、配列番号２、配列番号３、または配列番号６により規定されるＤＮＡ配列に対して９０％より高い相同性を有するＤＮＡ配列。これらＤＮＡ配列は同一または類似の機能を備えたタンパク質（ポリペプチド）をコードすることができる。
【０００７】
上述の配列表の配列番号１は、954塩基を含有する。これは、完全なオープンリーディングフレームである。配列番号１は、二つの開始部位を有し、一つは５’末端が1-3部位の塩基であり、もう一つは５’末端が274-276部位の塩基である。配列番号１の二つの完全なｃＤＮＡは、２つの択一的なテーリングシグナルを有する。配列番号１の５’末端が85塩基だけ外側に伸び、３’末端が401塩基だけ外側に伸びると、配列表の配列番号２が得られる。この遺伝子は1440塩基を含有する。配列番号１の５’末端が85塩基だけ外側に伸び、３’末端が1130塩基だけ外側に伸びると、配列表の配列番号３が得られる。この遺伝子は、2169塩基から成る。LAPTM4B遺伝子は、染色体8q22.1に局在する。
【０００８】
配列表において配列番号６は、2264塩基から成る、配列番号１の対立遺伝子である。そのオープンリーディングフレームは、7塩基から開始して1129塩基までである。この配列は、タンデムに配置された2つの19 bp ＤＮＡセグメントを含有し、その配列はgcttgg agctccagca gctである。これら19 bp ＤＮＡセグメントは、配列番号６のnt 124−nt 161に局在する。
【０００９】
ヒト癌関連LAPTM4Bタンパク質は、配列４、および/または配列５、および/または配列７のアミノ酸配列を有する。あるいは、一または数個のアミノ酸残基が置換、欠失、または付加された後の配列４、および/または配列５、および/または配列７から成る。しかし、上述の改変された配列４、および/または配列５、および/または配列７は、未変化の配列４、および/または配列５、および/または配列７と同一または類似の活性をなお保持する。
【００１０】
配列表の配列４は、配列番号１の全配列によりコードされる317アミノ酸残基から成る。その分子量は35kDaであり、推定される等電点は9.05である。配列表の配列５は、配列番号１の274thから954thまでの塩基のセグメントによりコードされる226アミノ酸残基を含有する。その分子量は24kDaであり、推定される等電点は4.65である。配列表の配列７は、370アミノ酸残基を含有するタンパク質である。
【００１１】
LAPTM4Bは、16の正常組織において様々なレベルで広範囲に発現している。その転写発現は、精巣、心筋、および骨格筋において非常に高く、卵巣、腎臓、および膵臓において中程度で、肝臓、脾臓、小腸、大腸、および胸腺において低く、肺および末梢血液細胞において非常に低い。8の胎児組織において、その発現は心臓、骨格筋、および腎臓で高い。胎児肝臓におけるその発現は、成人肝臓の発現より僅かに高い。しかし、幾つかの癌組織においてその発現は、有意にアップレギュレートされる。たとえば、ノザンブロット分析により、87.3％（48/55）ヒト肝細胞癌組織の転写レベルは、胎児肝臓および正常な肝臓の転写レベルより有意に高いことが示される（図１−Ａ）。また、インサイチューハイブリダイゼーション（図２−Ａ）、免疫組織化学（図２−Ｂ）、および免疫細胞化学（図２−Ｃ）により、LAPTM4B遺伝子発現は、肝細胞癌組織で特に高いが、その発現は、対照の（paired）非癌性肝臓組織では相対的に低いことが示される（図２−Ａおよび２−Ｂ）。試験されたヘパトーム組織由来の5の細胞株のうち、HLEを除くすべて、SMMC-7721、QGY-7701、BEL7402およびHG116において発現は高い（図１−Ｂおよび図２−Ｃ）。肝細胞癌組織および肝細胞癌細胞株において高度に過剰発現するタンパク質産物は、主に配列番号４のLAPTM4B-35であり、一方配列番号５のLAPTM4B-24は、発現レベルの僅かなアップレギュレーションを示すだけであることは重要である。これにより、肝細胞癌組織においてLAPTM4B-24タンパク質に対するLAPTM4B-35タンパク質の比が著しく増大する結果に至る（図２−Ｂ）。対照の非癌性組織においてLAPTM4B-35およびLAPTM4B-24の発現は僅かに増大するが、その比は正常な肝臓の比と同じである（表１参照）。これは、おそらく肝細胞癌の前癌性徴候である。加えて、LAPTM4B遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルは、肝細胞癌組織の分化とネガティブな関係がある。低分化の肝細胞癌組織は発現が高いが、高分化の肝細胞癌組織は相対的に発現が低い（図１−Ｃ）。ウェスタンブロットおよび免疫組織化学法を使用して、LAPTM4B遺伝子と他の癌との関係を決定する。その結果は、LAPTM4B-35タンパク質の発現が、幾つかの上皮起源の癌の組織および細胞株、たとえば胃癌、乳癌、高転移性ヒト肺癌、および前立腺癌でアップレギュレートされることを示す（図１１）。更に、同系のヒト肺癌および前立腺癌細胞株におけるLAPTM4B-35の発現は、転移の可能性が低い細胞と比べて転移の可能性が高い細胞において大きくアップレギュレートされる。しかし、インサイチューまたは転移性癌に由来するヒト黒色腫の細胞株において、それは明らかに発現しない。LAPTM4B-35は、成体のラットおよびマウスの肝臓組織において低レベルで発現するが、その発現は、禁欲的に増殖した（ascetically qrown）マウス肝細胞癌および正常な増殖状況下で再生したラット肝臓の何れにおいても、明らかにアップレギュレートされない。
【表１】
0004617257.tif 000002
【００１２】
配列番号４、配列番号５、および配列番号７のLAPTM4Bタンパク質は、４つのフラグメントの膜−横断配列、１つのN-グリコシル化部位、その細胞質領域に典型的なリソソームおよびエンドソームターゲッティングシグナルを有する。これらはすべて、膜貫通タンパク質のタンパク質スーパーファミリーに属する。しかし、これらは種々の数のリン酸化部位を有する。配列番号４のLAPTM4B-35は、インテグリンα6β1（細胞外マトリクスにおけるラミニンの唯一の固有のレセプター）および上皮増殖因子レセプター（EGFR）とともに原形質膜において複合体を形成可能であることが実験により示される（図１４−Ａ、Ｂ、およびＣ）。この複合体は、細胞の原形質膜に共に局在する（colocalize）。LAPTM4B-35は、細胞外マトリクスおよび増殖因子の両方からの増殖シグナルを原形質膜において統合することが可能である。これにより、正常な真核細胞の足場依存性細胞増殖の分子メカニズムを更に解明することができ、すなわち、真核細胞の増殖には、増殖因子からの刺激シグナルが必要であるだけでなく、細胞外マトリクスからの一定の刺激シグナルも必要である。これは、細胞増殖の調節メカニズムを理解する際の突破口に相当する。LAPTM4Bタンパク質Ｃ末端の細胞質領域においてチロシン基（Tyr285）がリン酸化され得ることが、実験により示される（図１５−Ａ）。細胞がラミニン基板に付着しているとき、そのリン酸化は急激に増大し（図１５−Ａ）、LAPTM4B-EC2-pAb抗体により完全に阻害することができるが（図１５−Ｂ）、無関係の抗体は阻害効果を何ら示さない（図１５−Ｃ）。リン酸化の後、Tyr285は、細胞内シグナル分子のSH2ドメインと結合する部位を形成する。一方、LAPTM4BのＮ末端およびＣ末端配列は、Pro−リッチドメインおよび典型的なSH3 Iドメインの結合部位を含有する。上記結果より、配列番号４のLAPTM4B-35タンパク質が、シグナル伝達のための重要なドッキングタンパク質であるか、または原形質膜における特別なミクロドメインのオーガナイザーであるかもしれないことが示唆される。それは、細胞内および細胞外の両方から関連シグナル分子を集め、細胞増殖、分化、およびアポトーシスのためのシグナル伝達を完了させることができる。マウスNIH3T3細胞およびHLEヒト肝細胞癌細胞を配列番号４のｃＤＮＡによりトランスフェクションすると、安定にトランスフェクトされ、LAPTM4B-35を過剰発現するNIH3T3-AEおよびHLE-AE細胞株がつくられることを実験結果は示す。増殖曲線（図４）、3H-TdRの取込み（図５）、および細胞周期のＳ期にある細胞数（図６）はすべて、細胞の増殖速度が大きく増大したことを示す。更に、トランスフェクト細胞の増殖は、血清中の増殖因子にほとんど依存しないことが示され、トランスフェクト細胞は、軟寒天に大きなコロニーを形成することができる。NIHマウスにNIH3T3-AE細胞を接種すると、中度の悪性線維肉腫を形成することができ（図７）、このことは、LAPTM4B-35の過剰発現が細胞増殖のコントロールを不能にすることを示す。また、HLE-AE細胞の移動能力は強化され、Matrigelへの侵入能力は著しく高まり、このことは、LAPTM4B-35の過剰発現が細胞の悪性表現型の進行を促進することを示す。一方、配列番号５のｃＤＮＡ（LAPTM4B-35のＮ末端の91アミノ酸を切除したコード配列）をトランスフェクトした���ウスBHK、NIH3T3、およびHLE肝細胞癌細胞株は、長時間生存できない。この結果は、配列番号４のLAPTM4B-35タンパク質のＮ末端上の91アミノ酸配列が、細胞増殖を調節する際に重大な役割を果たすことを示す。LAPTM4B-35タンパク質およびLAPTM4B-24タンパク質は、細胞の増殖および生存において拮抗する逆の機能を有する。LAPTM4B-35の過剰発現は細胞の悪性転換を加速し、一方LAPTM4B-24の過剰発現は細胞死を促進する。これらの発現の平衡および調節は、発癌および悪性癌の進行に極めて重要である。LAPTM4B遺伝子は、原癌遺伝子ファミリーに属し得る。癌治療において、配列番号４のLAPTM4B-35の発現を阻害し、配列番号５のLAPTM4B-24の発現を強化すると、肝細胞癌の増殖を抑制することができ、その悪性表現型を逆行させるか、またはその進行を徐々に遅らせることができる。更に、LAPTM4B-35の過剰発現は、細胞周期の調節因子、たとえばサイクリンD1 (図１３−Ａ) およびサイクリンE (図１３−Ｂ)のアップレギュレーションを促進し、また、幾つかの原癌遺伝子、たとえばc-Myc (図１３−Ｃ)、c-Jun (図１３−Ｄ)、およびc-Fos (図１３−Ｅ) などの過剰発現を促進する。
【００１３】
配列番号４のLAPTM4B-35タンパク質のエピトープに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体、たとえば配列番号４のLAPTM4B-35の第二細胞外領域に対するポリクローナルLAPTM4B-EC2232-241-pAb、配列番号４のLAPTM4B-35のＮ末端配列に対するポリクローナル抗体 (LAPTM4B-N1-99-pAbおよびLAPTM4B-N28-37-pAb)、およびLAPTM4Bに対するモノクローナル抗体は、癌の診断および治療におけるLAPTM4B-35およびLAPTM4B-24の効果を研究する際に重要である（図２、３、８、１１、１２、１４、１５）。たとえば、LAPTM4B-EC2232-241-pAb、LAPTM4B-N1-99-pAbポリクローナル抗体およびLAPTM4B-N1-99-mAbモノクローナル抗体は、LAPTM4Bタンパク質の発現、細胞内局在、分離および精製、およびタンパク質−タンパク質相互作用を分析するために使用することができる。また、これらは、血中のLPTM4Bの抗体および抗原を検出するために使用することもできる（図８）。更に、LAPTM4B-EC2232-241-pAbは、癌細胞の増殖（図１２）、LAPTM4Bタンパク質のTyr285リン酸化（図１５−Ｂ）、並びにシグナル分子FAK（図１６−Ａ）およびMAPK（図１６−Ｂ）のリン酸化および活性化を阻害することができる。従って、配列番号４のLAPTM4B-35タンパク質のエピトープに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体すべてが、本発明に包含される。
【００１４】
配列番号８は、LAPTM4B遺伝子のプロモーター配列である。LAPTM4B遺伝子発現の調節を研究するために、LAPTM4B遺伝子のプロモーターおよび上流配列の配列番号８をクローニングする。LAPTM4B遺伝子のプロモーター領域に、典型的なCCAAT (TTGCGCAAT)、TATAカセットは存在しない。しかし、転写因子の種々の結合部位が、LAPTM4Bプロモーターの上流領域に存在し、たとえばCREBP1/c-Jun、CEBP、PAX2/5/8、GATA、STAT、c-Ets-1、E2F、LYF-1、およびc/v-Mybが存在する（図１７Ａ）。これら転写因子は、種々の組織の細胞においてLAPTM4Bの発現を特異的に調節することができる。癌細胞におけるこれら転写因子の異常な発現および活性化は、おそらくLAPTM4Bタンパク質の発現バランスを失わせる。更に、LAPTM4Bプロモーターの上流ドメインに、高度に相同な2つの繰り返し配列が存在する。これらがLAPTM4B発現の調節に貢献しているかどうか研究することは価値がある。様々な長さのLAPTM4Bプロモーターの上流領域配列−プロモーター−５’ＵＴＲ-35bpコード領域−ルシフェラーゼレポーター遺伝子から成る一連のベクターを構築し、これらベクターを使用して、ヒト肝細胞癌HCC由来のBEL7402細胞およびHLE細胞にトランスフェクトする。図１７に示されるとおり、種々のベクターでトランスフェクトされた細胞はすべて、種々の強度でルシフェラーゼ活性を示し、これは、これらセグメントにおける転写活性を示唆する。最小のフラグメントは、転写開始部位の上流領域の約38 bpにあるＤＮＡセグメント（pGL-PF4）である。これは、LAPTM4Bコアプロモーターとしての基本的なプロモーター活性および機能を保持する。BEL7402のpGL-PF4トランスフェクタントの活性は、レファレンスプロモーターSV40の20％であるが、HLEでその活性は低く、SV40活性の6％しかなく、BEL7402の活性の約1/3である。これらデータは、これら2つの細胞株におけるLAPTM4Bプロモーターの天然の活性を一部反映している。これは、ｍＲＮＡの発現がBEL7402細胞株で高くHLE細胞株で低いノザンブロットの結果と一致している。加えて、pGL-PF4トランスフェクタントは、これら2つの細胞において劇的に異なる活性を示す。BEL7402細胞においてその活性は、HLE細胞の活性より7倍高い。明らかに、BEL7402およびHLE細胞株には、LAPTM4B遺伝子転写の異なる調節メカニズムが存在する。
【００１５】
本発明の態様において、異なるLAPTM4B遺伝子型と肝細胞癌の感受性との関係を決定するために、ゲノムＤＮＡの遺伝子型を特定する。LAPTM4Bは、2つの対立遺伝子、LATPM4B*1およびLATPM4B*2、すなわち配列番号６を有し、ＰＣＲクローニングにより得られる。図９に示されるとおり、対立遺伝子*1と*2の違いは、第一エキソン５’ＵＴＲにおける19 bp配列である。対立遺伝子*1は、かかる配列を一つしか有していないが（nt 124〜142dup）、*2は、緊密にタンデムに配置された状態でかかる配列を2つ含有する（124-142dup、+1のナンバリング基準としての転写開始部位TSSにGをとる）。19-bp配列の挿入は、トリプレットシフトにより、対応の*1対立遺伝子の５’ＵＴＲにおいて停止コドンを除去する。この結果、オープンリーディングフレームは、タンパク質のＮ末端において53個のアミノ酸だけ上流に伸張され得る。このとき配列番号６によりコードされるタンパク質は、370アミノ酸残基を含有することになる（配列番号７）。ヒトの集団で検出されるLAPTM4B遺伝子型は、それぞれ*1/*1、*1/*2および*2/*2である（図１０）。LAPTM4B遺伝子型*2/*2の個人が肝細胞癌HCCを発症するリスクは、*2/*2型でない個人より2.89倍高いことが研究により示される（表２）。しかし、食道癌の患者においてLAPTM4B遺伝子型は、正常集団との差異がみられない（表３）。このことは、LAPTM4B *2/*2遺伝子型が、肝細胞癌の感受性と特に関係があることを示唆する。この結果、本発明により提供されるLAPTM4B対立遺伝子LAPTM4B*2は、肝細胞癌に罹患しやすいヒトまたは肝細胞癌を発症するリスクの高いヒトをスクリーニングし診断するためのターゲットとして使用することができる。特に、罹患しやすいヒトまたはリスクの高いヒトをスクリーニングするためのターゲットとしてLAPTM4B *2/*2遺伝子型を使用することにより、より正確にすることができる。LAPTM4B遺伝子型の*1/*1、*1/*2および*2/*2、LAPTM4B*2コードタンパク質またはその抗体、および/またはヒトゲノム由来のLAPTM4Bエクステンダーおよびスカベンジャーのすべてが、肝細胞癌に罹患しやすいヒトまたは肝細胞癌を発症するリスクの高いヒトをスクリーニングするために使用することができる。
【００１６】
配列番号１、２、３、６、８記載の配列を含有する発現ベクター、配列番号１、２、３、６、８の配列を含有するトランスフェクション細胞株、および配列番号１、２、３、６、８を増幅するプライマーのすべてが、本発明に包含される。
【発明の詳細な説明】
【００１７】
患者および正常なコントロールグループの由来：
57症例の肝細胞癌患者、50人の男性および7人の女性は、年齢35〜70才であった。平均年齢は54±6.0であった。試験組織は、外科的に切除した試料から得た。コントロールグループの血液サンプルは、臨床試験により症状も癌もみられない同年齢の206人から、および209人の新生児の臍静脈から集めた。
【００１８】
109人の食道癌患者、76人の男性および33人の女性は、年齢30〜70才であった。平均年齢は55±5.4であった。試験組織は、外科的に切除した試料から得た。臨床試験により症状も癌もみられないと決定された116人の患者を、コントロールグループＳとして選択した。その血液サンプルを試験のために採取した。サンプルのすべてを抽出し、ゲノムＤＮＡを得た。
【００１９】
統計的方法
カイ二乗（Χ2）測定および単一因子ANOVA分散を、データの処理および分析のために使用した。
【００２０】
例１：種々の増殖および分化状態にある４タイプの肝臓組織におけるLAPTM4B発現のノザンブロット分析
種々の増殖および分化状態にある４タイプの肝臓組織を選択した。これらは、正常な成人の肝臓（ＮＬ、ほとんど増殖せず高度に分化している）、胎児肝臓（ＦＬ、活発に増殖し低度に分化している）、肝細胞癌（ＨＣＣ、増殖がコントロールされておらず異常に分化している）、および対照の非癌性肝臓（ＰＮＬ、一般に活発な増殖状態の前癌期である）から得た。これら組織における遺伝子の転写を検出するためにノザンブロット分析を使用した。ＲＮＡサンプルは、外科的切除により新たに得た5つの正常な成人肝臓組織、流産胎児由来の5つの肝臓組織、55個のＨＣＣ組織、および55個の対照の非癌性肝臓組織から抽出した。ＲＮＡサンプルを電気泳動により分離した後、ナイロンフィルムに移し、Digラベルのプローブとハイブリダイズさせた。フィルムを68℃で洗浄し、ハイブリダイゼーションシグナルをマニュアルに従って現像した。その結果を図１に示す。バンド１は、胎児肝臓由来のサンプルであった。バンド２は、正常な成人の肝臓サンプル由来であった。バンド３、５、７、および９は、ＨＣＣ由来のサンプルであった。バンド４、６、８、１０は、ＰＮＬ組織由来であった。その結果より、種々の肝臓組織におけるLAPTM4Bの発現は、以下の順であることが示される：ＨＣＣ組織＞ＰＮＬ組織および胎児肝臓組織＞正常な成人の肝臓組織。
【００２１】
例２：LAPTM4B遺伝子、対立遺伝子、およびプロモーターのクローニング
２−１  LAPTM4B遺伝子のクローニング
蛍光ディファレンシャルディスプレイ技術を使用することにより、未知の遺伝子ｃＤＮＡセグメント（ＬＣ２７）を、正常な成人の肝臓（ＮＬ）、胎児の肝臓（ＦＬ）、癌性肝臓（ＨＣＣ）、および対照の非癌性肝臓（ＰＮＬ）など様々な増殖および分化状態にある４タイプのヒト肝臓組織におけるディファレンシャルディスプレイスペクトルから得た。ＬＣ２７セグメント（426 bp）は、５’方向へのＥＳＴによる相同配列のスプライシング、その後のＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ端の迅速増幅）および高温のＲＴ−ＰＣＲ技術により伸張した。2つの全長ｃＤＮＡ配列、すなわち配列番号２および３が産生され、その後、配列決定およびＢＬＡＳＴプログラム分析により確認した。
【００２２】
２−２  LAPTM4Bプロモーターのクローニング
５’末端にあるLAPTM4B遺伝子の第一エキソンの上流領域の配列を、バイオインフォマティクスにより得、プライマーＦ１およびＲ１を設計した。鋳型としてＨＣＣ由来のヒトゲノムＤＮＡを用いて、LAPTM4Bプロモーターおよびその上流配列を、Platinum Pfx DNAポリメラーゼを用いたＰＣＲにより得た。Xho IおよびHind III酵素で切断した後、pGL3-Basicvectorに挿入してpGL3-PF1を形成し、その配列を決定した（すなわち、試験結果は図１６の分図ａに示す）。
【００２３】
図１７−Ａに示されるとおり、LAPTM4Bプロモーター配列に典型的なCCAAT (TTGCGCAAT) およびTATAボックスは見られなかった。LAPTM4Bプロモーターの上流領域には、種々の転写因子、たとえばCREBP1/c-Jun、CEBP、PAX2/5/8、GATA、STAT、c-Ets-1、E2F、LYF-1、およびc/v-Mybに対する多くの結合部位が存在する。これらは、LAPTM4B発現の調節に機能し得る。肝細胞癌においてこれら転写因子の異常な発現および活性は、おそらくLAPTM4Bタンパク質の発現バランスを失わせる。更に、LAPTM4B上流領域は、高度に相同な2つの繰り返し配列を含有する。これらがLAPTM4B発現の調節に何らかの影響を及ぼすかどうかに関して更に研究することは価値がある。
【００２４】
２−３．  LAPTM4B対立遺伝子のクローニングおよび配列分析
２−３−１．  ＤＮＡの分離
ゲノムＤＮＡは、標準的なフェノール−クロロホルム法に従って、肝細胞癌および食道癌の外科的切除に由来する血液リンパ球または癌組織のサンプルから抽出した。
【００２５】
２−３−２．  対立遺伝子のクローニングおよび配列分析
プロモーター配列のクローニングと同じ手法を用いることにより、2つのプライマー、Ｆ１：5’GCGCTCGAGGCTCCAGGTG GAAGAGTGTGC 3’(下線で示されるとおり５’末端配列にXhoI酵素切断部位を含む)、およびＲ１：5’GCGAAGCTT GGACTTGGCCATGTGACCCG 3’(下線で示されるとおり５’末端配列にXhoI酵素切断部位を含む) を、LAPTM4B遺伝子配列の配列番号３に基づいて設計し、合成した。その後、プロモーター配列およびLAPTM4Bの第一エキソンにあるその前方配列を、ＰＣＲによりヒトゲノムＤＮＡからクローニングした。種々のヒトゲノムＤＮＡから構築したpGL3-PF1ベクターを、LAPTM4B対立遺伝子をスクリーニングするために配列決定した。元のLAPTM4B配列をLAPTM4B*1と名付けた。他方をLAPTM4B*2と名付け、これはすなわち配列表の配列番号６である。図９(Ａ)は、LAPTM4Bプロモーターおよびその第一エキソンの概略図を示す。長方形のフレームは、第一エキソンを示し、黒色領域はコード領域を表し、白色は非コード領域であり、グレー領域は19 bp ＤＮＡ配列を示す。水平な線は、プロモーター部分を表し、Ｆ１、Ｆ２、Ｒ１、およびＲ２は、４つのプライマーが位置するところである。開始コドンＡＴＧの“Ａ”は、配列の＋１と定義される。図９(Ｂ)は、LAPTM4B対立遺伝子の部分配列およびその配列決定グラフィックスペクトルを示す。下線部は、19 bp ＤＮＡ配列である。この結果より、LAPTM4B*1は、１コピーの19 bp ＤＮＡ配列を含有し、LAPTM4B*2は、LAPTM4B*1の第一エキソンの非コード領域（nt-33−-15）で連結された２コピーの19 bp ＤＮＡ配列を含有することが明らかである。
【００２６】
配列分析により、LAPTM4B*2およびLAPTM4B*1は、同じプロモーターを保持することが示される。LAPTM4B対立遺伝子*1プロモーターと*2プロモーターの配列の違いはない。
【００２７】
２−３−３．  LAPTM4B遺伝子型の分類
Ｅ２(5’GCCGACTAGGGGACTGGCGGA 3’) およびＲ２ (5’CGAGAGCTCCGAGCTTCTGCC 3’) プライマーを設計し、合成した。LAPTM4Bの第一エキソンの部分配列を、正常なヒト、肝細胞癌、および食道癌組織に由来するゲノムＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ条件は以下のとおりとした：96℃で前変性5分間；94℃で30秒間、68℃で30秒間、72℃で1分間を35サイクル；72℃で5分間。その後ＰＣＲ産物に、2％アガロースゲル電気泳動分析を行った。図１０は、ヒト集団におけるLAPTM4B遺伝子の*1/*1、*1/*2、および*2/*2の3つのタイプを示す。
【００２８】
例３：レポータープラスミドの構築およびプロモーター活性の分析
LAPTM4Bプロモーター−５’ＵＴＲ、エキソンの35bpコード配列およびルシフェラーゼレポーター遺伝子を種々の長さで備えた上流配列を含有する一連のベクターを構築した。すなわち、LAPTM4B遺伝子プロモーターおよび上流配列を、Xho IおよびHind III酵素により切断し、pGL3-Basicベクターに連結してpGL3-PF1を形成し、配列決定により同定した。その後、pGL3-PF1を鋳型として使用し、プライマーＦ２、Ｆ３、およびＦ４ vs.Ｒ１を使用してＰＣＲによりそれぞれ増幅し、種々の長さのプロモーターセグメントおよびルシフェラーゼ遺伝子を含有するベクターpGL3-PF2、pGL3-PF3、およびpGL3-PF4を構築した。これら構築物は配列決定により同定した。
【００２９】
これらプライマーの配列は以下のとおりである：
Ｆ１： 5’’’GCGCTCGAG GCTCCAGGTGGA AGAGTGTGC 3 (nt -1341- -1321)
Ｆ２： 5’’’GCGCTCGAG TAA AAACGCTGTGCCAGGCGT 3’’’(nt -881- -861)
Ｆ３： 5’’’CCGCTCGAG TACCGGAAGCACAGCGAGGAT 3’’’(nt -558- -538)
Ｆ４： 5’’’GCGCTCGAG AGTAGAAGGGAAGAAAATCGC 3’’’(nt -38- -18)
Ｒ１： 5’’’GCGAAGCTT GGACTTGGCCATGTGACCCG 3’’’(nt 172-191)
これらベクターを使用して、BEL-7402細胞およびHLE細胞を別々にトランスフェクトし、プロモーター活性を測定した。図１７ｂに示されるとおり、ベクターでトランスフェクトした細胞はすべて、様々な強度でルシフェラーゼ活性を有する。pGL3-PF3は、BEL-7402細胞およびHLE細胞の両細胞において同様の活性を示し、これはSV40プロモーター（pGL3-Promoter）活性の約27％であった。しかし、これをpGL3-PF4活性と比較すると、BEL-7402細胞ではほとんど差がなかった。HLE細胞においてpGL3-PF3活性は、pGL3-PF4より７倍高かった。図１７ａに示されるとおり、pGL3-PF3（−41〜−558）は、転写因子に対する多くの潜在的な結合部位を有する。それらの一つまたは複数、とりわけc-Ets-1が、ＨＬＥ細胞において調節的な役割を果たし、HLE細胞においてpGL3-PF3およびpGL3-PF4トランスフェクタントのルシフェラーゼ活性を著しく異なったものにすることができる。pGL3-PF3活性は、BEL-7402細胞およびHLE細胞の両細胞においてpGL3-PF1およびpGL3-PF2活性より高く、このことは幾つかの負の調節因子が存在することを暗示する。これらの負の調節因子の一つまたは複数は、プロモーター上流ターゲット配列（-558上流）に結合し、ダウンレギュレートされたLAPTM4B遺伝子発現を引き起こす。この抑制効果は、7402細胞よりもHLE細胞において強かった。このことは、HLE細胞がLAPTM4Bの発現を強力に抑制する幾つかの因子を含有し得ることを意味する。また、図１−Ｂに示されるノザンブロット分析は、HLE細胞におけるLAPTM4Bの低い発現を示し、これは上記仮説を裏付けるものである。pGL3-PF2ベクターは、2つのＤＮＡ繰り返しフラグメント（−41〜 −328, −574〜 −859）を含有し、pGL3-PF3よりＤＮＡフラグメント（−574〜 −859）が一つ多い。pGL3-PF3は、何れの細胞においてもpGL3-PF2より高い活性を示す。この結果は、2つの繰り返し配列が遺伝子発現を負に調節することを示す。これらは、転写因子に対する多くの潜在的な結合配列を有し、負の調節因子それぞれに対して2つの結合部位を提供する。多くの転写因子はしばしばダイマーを形成するため、これらは、機能を果たすためには2つのターゲット配列と結合しなければならない。pGL3-PF3の場合、一つの結合部位しか提供できないため、機能は現れない。pGL3-PF3トランスフェクタントは、脱抑制効果を有しているため、その活性は他のベクタートランスフェクタントより高い。
【００３０】
例４：LAPTM4Bタンパク質発現のウェスタンブロット分析
組織サンプルを氷上に置き、はさみで小片に切断した。0.1グラムのウェット組織を選択し、手動ホモジナイザーに置いた。各チューブに1 mL溶解バッファーを添加し、その混合物を完全にホモジナイズした。溶解物を新たなチューブに移し、4℃、12000 gで10分間遠心分離し、残渣を除去した。細胞を使用した場合、培養皿の細胞を0.25％トリプシンバッファーで処理し、その後PBSで2回洗い、500 gで3分間遠心分離した。透明の上清を集め、上清中のタンパク質をSDS-PAGE電気泳動により分離し、次いでNCメンブレンに移した。そのメンブレンを、0.05% Tween 20を含有するTBSバッファー中の5％脱脂粉乳を用いて、4℃で一晩ブロックした。その後、それを、ウサギポリクローナル抗体、LAPTM4B-EC2 232-241-pAb (1:500希釈) またはマウス抗-FLAG M2モノクローン抗体 (Sigma, 1:750希釈) と室温で2時間インキュベートし、その後TBSで3回洗った。ペルオキシダーゼ結合二次抗体（IgG）、たとえばヤギ抗ウサギまたはヤギ抗マウス (1:3000希釈) と2時間更にインキュベートし、その後TBSバッファー (pH 8.0、0.05% Tween 20含有) で3回洗った。最後の洗浄は、Tween 20を含有しないバッファーを用いた。陽性のバンドを露呈するためにECL (Santa Cruz) を使用した（製造元の指示どおり実施した）。1つのメンブレンに2つの抗体を連続してハイブリダイズさせる場合、ECLで露呈したメンブレンは、まずTBSで洗い、その後30 mL TBS (2% SDSおよび210μL β-メルカプトエタノール) を用いて室温で30分間洗浄した。この30分のTBS洗浄により、第二のハイブリダイゼーションに使用可能なメンブレンにおいて、先の抗体およびそのシグナルが除去される。図３は、LAPTM4B-35がHCC組織およびHCC細胞株で過剰発現したことを示す。
【００３１】
例５：全長ｃＤＮＡトランスフェクションにより実証される、癌細胞の細胞増殖および悪性表現型に対する本発明の遺伝子の調節効果
鋳型としてpGEMT-E2E7プラスミドを使用し、プライマーＡまたはＢおよびＥ、およびPfx ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲにより、LAPTM4B遺伝子の全長もしくは部分ｃＤＮＡ、またはリーディングフレームを増幅した。BamHI酵素切断部位（GGATCC）およびリボソーム結合部位配列（GCCACC）は、５’末端においてプライマーＡおよびＢで導入し、EcoRI酵素切断部位（GAATTC）は、プライマーＥで組み込んだ。増幅産物ＡＥおよびＢＥを制限酵素BamHIおよびEcoRIにより制限処理し、精製し、pcDNA 3.0ベクターにライゲートした。これらをDH5 E.coliに慣用的な手法で形質転換し、ポジティブクローンを選択し、構築されたプラスミドの配列を同定のために決定した。構築されたプラスミドは、それぞれpcDNA3/AEおよび-BEと名付けた。pcDNA3/AEは、全長ＯＲＦを含有するが、pcDNA3/BEは、第二のＡＴＧから始まりＴＡＡまでのＯＲＦを含有する。pcDNA3/BEによりコードされるタンパク質は、pcDNA3/AEと比較すると、Ｎ末端において91のアミノ酸を欠損している。
【００３２】
マウスBHK、NIH3T3細胞株およびヒト肝細胞癌HLE細胞株（LAPTM4Bの発現レベルはすべて非常に低い）を、pcDNA3/AEまたは-BEによりトランスフェクトし、LAPTM4B発現が安定して高いクローンを選抜した。生存細胞の総数を酸性ホスファターゼ法により測定し、細胞増殖曲線をプロットした。フローサイトメトリーにより細胞周期を分析した。細胞周期調節タンパク質、たとえばサイクリンD1およびサイクリンE、および原癌遺伝子産物、たとえばc-Myc、c-Fos、およびc-Jun（細胞増殖を調節するための転写因子）の発現レベルを、ウェスタンブロット分析により測定した。その結果は、LAPTM4B-AE発現プラスミドによりトランスフェクトされた後、細胞の増殖速度が増大することを示す（図４、５、６）。また、サイクリンD1、サイクリンE、c-Myc、c-Fos、およびc-Junの発現も大きく増大した（図１３−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅのそれぞれ）。しかし、LAPTM4B-35過剰発現細胞では、血清に対する増殖依存性が大幅に低下した（HLE-AE細胞の増殖は通常1％ FCSで進行するが、HLEおよびHLE-MOCK細胞は、同じ条件で増殖を停止する）。一方、HLE-AE細胞の足場依存性細胞増殖は、明らかに減退した。HLE-AE細胞の大きなコロニーが軟寒天ゲルに形成され、このことは、この遺伝子が細胞増殖の調節に関与すること、並びにその過剰発現（活性化）が細胞増殖の異常調節に関連することを示す。更に、HLE-AE細胞の移動能力は増大した（メンブレン孔を通って移動したHLE-AE細胞は、コントロールの1216±403.8から4082.5±748.8まで増大した）。また、Matrigelに侵入する能力は、（コントロールの25±12.73細胞から1325±424.26細胞まで）大幅に増大した。これら結果は、LAPTM4Bの過剰発現が、細胞の悪性表現型の進行を促進することを示す。これに対し、LAPTM4B-BE発現ベクターによりトランスフェクトされたBHK-BE、NIH3T3-BE、およびHLE-BE細胞は、クローンを形成することができなかった。これらはすべて3週間以内に死滅した。これらの結果は、LAPTM4B-24が、LAPTM4B-35に対するアンタゴニストの役割を果たすことを実証する。
【００３３】
例６：マウスに対するLAPTM4B cDNAトランスフェクト細胞の腫瘍形成効果
6週齢のオスマウスを無作為に選抜し3グループに分けた。第一のコントロールグループでは、マウスに生理食塩水を注射した。第二のコントロールグループでは、マウスにpcDNA3 MOCK（プラスミドを保持しない）トランスフェクト細胞を接種した。試験グループでは、すべてのマウスにpcDNA/AE（全長ｃＤＮＡ含有プラスミド）トランスフェクトNIH3T3細胞を接種した。各マウスに2×106細胞を皮下接種した。各グループのマウスは4〜6匹であった。接種から21日後にマウスを屠殺し解剖した。図７に示すとおり、試験グループの2匹のマウス（接種されたマウスの半数）は、明らかに中程度の悪性線維肉腫を発症し（Ａ、Ｂ）；他の2匹のマウスは、接種部位にリンパ組織が確認された（Ｃ、Ｄ）。対照的に、2つのコントロールグループの12匹のマウスは、接種後86日間、腫瘍形成の徴候を示さなかった。
【００３４】
例４、５、および６の結果は、LAPTM4Bが新規の原癌遺伝子であり得ることを示す。
【００３５】
例７：ELISA法による肝細胞癌患者の血清におけるLAPTM4B抗原の基本分析
96ウェル培養プレートを、ＨＣＣ患者および既知の合意による正常なヒトに由来する種々の希釈率の血清を用いて4℃で一晩コートした。各ウェルを0.5% Tween-20洗浄溶液で洗浄し、次いで室温で1時間ブロッキングのために2% BSAを添加した。その後、LAPTM4B-EC2-pAb抗体を種々の希釈率で添加し、室温で2時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ホースラディシュペルオキシダーゼによりラベルされたヤギ抗ウサギ抗体（1:1000倍希釈）を添加した。室温に2時間置き、ＰＢＳで1回洗浄した後、1 g/mL o-フェニルジアミンを10-15分間添加して発色させ、反応を停止させるためにH2SO4を使用した。酵素分析用のマイクロタイターを使用し、490 nmでＯＤを測定し、抗原レベルを評価した。その結果を図８に示す。明らかに、肝細胞癌患者の血清は、正常なヒトの血清より高いレベルのLAPTM4B抗原を含有しており、これは、LAPTM4Bが肝細胞癌を診断するための新規マーカーとなる可能性があることを示唆する。
【００３６】
例８：同時免疫沈降（co-immunoprecipitation）および抗体阻害分析による、シグナル伝達におけるLAPTM4Bタンパク質の機能決定
細胞溶解物を例４の方法に従って調製した。一次抗体を上清に添加した。4℃で1時間振盪した後、50μLタンパク質G-アガロース懸濁液を添加し、その混合物を4℃で少なくとも3時間または一晩振盪した。免疫複合体の沈殿を、12000 gで20秒間遠心分離した後に収集した。その複合体を、1 mL洗浄バッファーIを添加することにより再懸濁し、4℃で20分間振盪した。その混合物を12000 gで20秒間遠心分離し、上清を注意して取り除いた。この工程を1回繰り返した。その後、その複合体を、洗浄バッファーIIを添加することにより再懸濁し、4℃で20分間振盪し、12000 gで20秒間遠心分離した。上清を注意して取り除いた。最後の2つの工程を１回繰り返した。その複合体を、洗浄バッファーIIIを添加することにより再懸濁し、4℃で20分間振盪し、12000 gで20秒間遠心分離した。上清を完全に取り除いた。沈殿に50μL 1×SDSローディングバッファーを添加し、その混合物を100℃の温浴で5分間ボイルして、サンプル中の免疫複合体を変性し解離させた。12000 gで20秒間遠心分離した後、上清を取り除き、SDS-PAGE装置で分析した。
【００３７】
BEL-7402細胞を、血清フリー培地においてLN-1物質の上で、0、10、20、および40分間それぞれプレインキュベートした。同時免疫沈降（co-immunoprecipitation）は、細胞溶解物由来のLAPTM4B-EC2-pAbを用いて実施した。同時免疫沈降物（co-immunoprecipitates）をタンパク質G−セファロースにそれぞれ吸着させ、10％非還元的SDS-PAGEにより分析した。その後、LAPTM4B、FAKおよびMAPKのリン酸化を、p-Tyr mAbを用いたウェスタンブロットによりそれぞれ分析した。
【００３８】
BEL-7402細胞に、LAPTM4B-EC2-pAb (15μg/mL) および抗-Glut2 (15μL/mL) 抗体をそれぞれ、37℃において5％ CO2の下で2時間プレ接種し、その後LN-1物質の上に播き、表示の時間インキュベートした。同じ条件の下で、抗-Glut2抗体で処理した細胞および抗体で処理しない細胞をコントロールとして用いた。各グループにおける細胞溶解物を、p-Tyr mAbを用いたウェスタンブロット分析により分析した。LAPTM4Bのリン酸化に対する種々の抗体の阻害効果を分析した。その結果は、ヒト肝細胞癌BEL-7402細胞をラミニン基板上に接着させると、LAPTM4B-35が最もリン酸化されることを示す。LAPTM4B-35のリン酸化は、細胞接着から10分後に最大レベルに達した（図１５−Ａ）。一方、LAPTM4B-EC2-pAbは、そのリン酸化をほぼ完全に阻害することができるが（図１５−Ｂ）、抗-Glut2（無関係の原形質膜タンパク質Glut2に対する抗体）は、かかる阻害効果を示さなかった（図１５−Ｃ）。これに対し、LAPTM4B-24はリン酸化されない。LAPTM4B-35 Tyr285のリン酸化は、SH2ドメインを含有するシグナル分子のための結合部位を形成する。一方、LAPTM4B-35自体は、SH3ドメインを含有するシグナル分子のための典型的な結合部位を提示する。従って、LAPTM4B-35は、シグナル伝達のための分子の非常に重要なドッキングタンパク質として、またはメンブレンミクロドメインの特別なオーガナイザーとしておそらく機能する。これは、細胞内または細胞外で関連のシグナル分子を集めることができ、その結果、細胞の増殖、分化およびアポトーシスと関連したシグナル伝達に極めて重要な役割を果たす。更に、ヒト肝細胞癌細胞のラミニン基板上の接着は、細胞質シグナル分子FAKのTyrリン酸化を引き起こすことができ（図１６−Ａ）、LAPTM4B-EC2-pAbおよび細胞外領域α6のエピトープに対する抗インテグリンα6 mAbは何れも、BEL 7402細胞とプレインキュベートすることにより、FAKタンパク質の発現レベルに影響を及ぼすことなくFAKのリン酸化を妨害することができる。同様に、BEL 7402細胞のラミニン基板上の接着は、シグナル分子MAPKのTyrリン酸化を誘導することができ（図１６−Ｂ）、そのリン酸化は、LAPTM4B-EC2-pAbと細胞をプレインキュベートすることにより、MAPKタンパク質の発現レベルを変化させることなく阻害することができる。これらの結果は、LAPTM4B-EC2ドメイン（第二の細胞外領域）とインテグリンα6サブユニットとの相互作用が、FAK-MAPKシグナリング経路の引き金を引く際に重要な役割を果たすことを示唆する。
【００３９】
例４〜８の結果は、LAPTM4B-35が細胞の増殖、分化、およびアポトーシスを調節するための薬剤のターゲットとなる可能性があることを示唆する。
【００４０】
例９：LAPTM4B遺伝子型の分類
正常な個人および肝細胞癌患者の血液に由来するゲノムＤＮＡのLAPTM4B遺伝子型を、ＰＣＲにより検出した。2つのプライマーを、LAPTM4B遺伝子配列３の19 bp DNA配列のフランキング配列に従って設計し、合成した：
F2： 5’GCCGACTAGGGGACTGGCGGA 3’
R2： 5’CGAGAGCTCCGAGCTTCTGCC  3’
第一エキソンの部分配列を、ゲノムＤＮＡを鋳型として用いて増幅した。ＰＣＲ条件は以下のとおりとした：96℃のプレ変性5分、94℃で30秒、68℃で30秒、72℃で1分を35サイクル、72℃の伸長5分。ＰＣＲ産物を2%アガロースゲル電気泳動により分析し、その結果を図１０に示す。レーン１、６、１２、および１３は、LAPTM4B*1/*1の204 bpヌクレオチドセグメントを表す。レーン５、８、９、１４、および１５は、LAPTM4B*2/*2の223 bpヌクレオチドセグメントを表す。レーン２、３、４、７、１０、および１１は、LAPTM4B*1/*2の204 bpおよび223 bpヌクレオチドセグメントを表す。ラインＭはマーカーである。この結果は、ホモ接合の遺伝子ペア*1/*1または*2/*2では、204 bpまたは223 bp ＤＮＡセグメントの何れかが増幅されたが、*1/*2のハイブリッド遺伝子ペアでは、204 bpおよび223 bp ＤＮＡセグメントの両方が同時に増幅されたことを示す。従って、中国人のLAPTM4Bの遺伝子型は、LAPTM4B*1/*1、*1/*2、および*2/*2に分類することができる（図１０）。
【００４１】
例１０：正常なヒトおよび肝細胞癌患者におけるLAPTM4B遺伝子型および対立遺伝子の度数分布
本発明の態様の一つにおいて、209人の正常な中国人および57人の肝細胞癌患者におけるLAPTM4B遺伝子型の存在頻度を、表２で分析し、比較した。ハーディ-ワインベルグの等式を用いて予測分析値を得た。肝細胞癌患者のLAPTM4B対立遺伝子*1および*2の頻度は、正常なヒトとは有意に異なる。その比は、それぞれ0.5175：0.6746および0.4825：0.3254である。正常なヒト集団におけるLAPTM4B対立遺伝子*1および*2の存在頻度は、0.6746および0.3253であるが、肝細胞癌患者におけるLAPTM4B対立遺伝子*1および*2の存在頻度は、0.5175および0.4825である。肝細胞癌患者のグループにおける遺伝子型*1/*1 (p=0.029) および*2/*2 (p=0.003) の存在頻度は、コントロールグループとは統計的に有意な差がある。肝細胞癌患者グループでは、*1/*1は29.8％のみであるが、正常なコントロールグループでは、*1/*1は45.93％である。肝細胞癌患者グループにおける*2/*2遺伝子型の存在頻度は、コントロールグループの11.01％と比較して26.32％であり、その存在頻度は有意に高い（p＜0.01）。この分析は、*2/*2遺伝子型の個人がHCCに罹患するリスクは、他の遺伝子型が肝細胞癌を発症するリスクの2.89倍高いことを示す。このように、LAPTM4B*2/*2遺伝子型は、肝細胞癌を発症する感受性と互いに関係がある。
【００４２】
表３に示すとおり、LAPTM4B遺伝子型が異なる患者は、肝細胞癌のグレード、病期、またはHBV感染において違いを示さなかった。ＨＣＣ患者の83.3％がポジティブなHBVを有する。
【表２】
0004617257.tif 000003
【表３】
0004617257.tif 000004
【００４３】
例１１：食道癌患者における遺伝子型および対立遺伝子の頻度
LAPTM4B遺伝子型が他の癌を発症する感受性と関連があるかどうか研究するため、同じ位置から採取した116人の正常なヒトおよび109人の食道癌患者の血液に由来するゲノムＤＮＡを分析した。表４に示すとおり、食道癌患者のLAPTM4B遺伝子型は、正常なヒト集団のコントロールグループと有意な差がない。LAPTM4B対立遺伝子は、食道癌を発症する感受性とは関連がない。
【表４】
0004617257.tif 000005
【００４４】
例１２：幾つかの上皮起源の癌におけるLAPTM4B-35の発現
LAPTM4B-35タンパク質の発現と他の癌との関係を、免疫組織化学的手法により調べた。食道癌、乳癌、肺癌、胃癌、結腸癌、および直腸癌のポジティブ組織およびネガティブコントロールの非癌性組織に由来する固定標本を、外科的な切除により得、以下の工程に従って処理した：
１．キシレンによる標本の脱ワックス
２．様々な濃度のエタノール、100%−95%−90%−80%−70%を用いたカトクロミー（katocromy）。内在性ペルオキシダーゼを除去するためにPBSを使用した
３．クエン酸ナトリウムにより抗原の修復
４．2回のPBS洗浄
５．通常のヤギ血清ブロッキング
６．LAPTM4B-N1-99pAbを37℃で1時間保つ
７．3回のPBS洗浄
８．HRP標識のヤギ抗ウサギ抗体を37℃で1時間保つ
９．3回のPBS洗浄
１０．DABによる発色
１１．ヘマトキシリンを用いた核の保持
１２．様々な濃度（70%−80%−90%−95%−100%）のエタノールによる脱水の上昇
１３．マウンティング
図１１に示されるとおり、１１−Ａは正常な食道組織（ネガティブ）を示し、Ｂは食道癌組織（ポジティブ）であり、Ｃは正常な乳房組織（ネガティブ）であり、Ｄは乳癌組織（ポジティブ）であり、Ｅは正常な肺組織（ネガティブ）であり、Ｆは肺癌組織（ポジティブ）であり、Ｇは正常な胃組織（ネガティブ）であり、Ｈは胃癌組織（ポジティブ）である。図から分かるとおり、LAPTM4Bは肺癌、胃癌、および乳癌の組織で明らかに発現していたが、食道癌および大腸癌で明らかに発現していなかった。
【産業上の適用】
【００４５】
本発明においてLAPTM4B遺伝子によりコードされるタンパク質は、幾つかの癌を早期診断する際の新規マーカーとして使用できる可能性がある。臨床試験で広く適用されるELISA法、および調製済みの関連の試験試薬キットを用いることにより、癌、とりわけ原発性肝細胞癌の早期診断の効率および正確性を改良することができる。
【００４６】
LAPTM4B遺伝子は、癌治療におけるターゲット遺伝子として使用することができる。LAPTM4B-35の発現を抑制し、LAPTM4B-24の発現を促進することにより、肝細胞癌細胞の増殖を阻害したり、悪性表現型を逆行させたり、あるいはその進行を遅らせたりすることができる。たとえば、LAPTM4B遺伝子の発現産物、LAPTM4B-35は、新たに開発されたsiRNAインターフェアレンス技術により阻害することができる。更に、LAPTM4B-BE-cDNAは、人工的につくられたウイルス発現ベクターに組み換えることができ、LAPTM4B-24発現のアップレギュレーションによる抗腫瘍遺伝子治療において使用することができる。また、LAPTM4B-35タンパク質は、薬学的治療のための新規ターゲットとして使用することもできる。LAPTM4B-35タンパク質は、細胞シグナル伝達分子の複合体を組み立てる足場として機能することができ、シグナル分子のための複数の結合部位を含有するため、ターゲットとしてLAPTM4Bタンパク質を備えた種々の新規医薬が開発される可能性は高い。更に本発明は、LAPTM4B-EC2-pAb抗体が腫瘍細胞の増殖を阻害し、そのシグナル伝達を遮断することができることを初めて実証した。本発明のこの発見に基づいて、肝細胞癌および幾つかの他の癌の進行を阻害するために抗体を使用する可能性について更なる研究を続けることができる。その効果について更に理解した後には、ＨＣＣ患者に対する臨床治療のために、ヒト化可溶性シングル鎖抗体を開発することができる。またペプチドワクチンも開発することができる。ワクチンがうまく調製できた場合、これは、肝細胞癌や幾つかの他の癌の治療を助けるだけでなく、リスクの高い集団の癌発生を予防するでしょう。要するに、本発明の態様に基づいて、多くの新規抗癌アプローチを開発することができる。肝細胞癌および他の癌の重要な補充療法として、本発明は、肝細胞癌および他の癌の治癒率を高める手助けとなるでしょう。このプロジェクトは、人間社会に多大なインパクトを与えるでしょう。
【００４７】
特定の態様において、ゲノムＤＮＡのLAPTM4B遺伝子型が特定された。種々の遺伝子型と肝細胞癌に対する感受性との関係、並びに他の癌との関係が調査された。遺伝子型の一つ、LAPTM4B*2/*2が、肝細胞癌の感受性と密接に関連していることが見出された。その結果、これは、原発性肝細胞癌に高いリスクで罹患しやすい人をスクリーニングするための新たな正確な基準を提供する。肝細胞癌を発症するリスクの高い人を評価し予防することは重要な意味を有することである。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１−Ａは、正常なヒト肝臓、正常な胎児肝臓および肝細胞癌組織における本発明の遺伝子の転写発現を示すノザンブロット分析プロフィールである。    図１−Ｂは、ヒト肝細胞癌細胞株における本発明の遺伝子の転写発現を示すノザンブロット分析スペクトルである。    図１−Ｃは、ヒト肝細胞癌組織における本発明の遺伝子の転写レベルと癌分化状態の関係を示す図である。
【図２】図２−Ａは、肝細胞癌組織のインサイチューハイブリダイゼーションの図である。肝細胞癌結節においてLAPTM4B  ｍＲＮＡは、強いポジティブ染色を示す。    図２−Ｂは、肝細胞癌結節においてLAPTM4Bタンパク質が強いポジティブ染色を示す、免疫組織化学的な図である。    図２−Ｃは、LAPTM4Bタンパク質がトランスフェクト細胞に存在することを示す、免疫細胞化学的な図である。
【図３】正常な肝臓（NL）、肝細胞癌（HCC）、および対照の非癌性肝臓（PNL）の組織における、本発明の遺伝子によりコードされるLAPTM4B-35およびLAPTM4B-24タンパク質の発現スペクトルを示す、ウェスタンブロット分析図を示す。
【図４】図４は、本発明のｃＤＮＡ−トランスフェクト細胞の増殖が加速した増殖曲線を示す。
【図５】図５は、本発明のLAPTM4B  ｃＤＮＡ−トランスフェクト細胞のＤＮＡ合成が増大した棒グラフを示す。
【図６】図６は、本発明のｃＤＮＡ−トランスフェクト細胞のＳ期の細胞数の増大を示す円グラフである（フローサイトメトリー分析）。
【図７】図７は、マウスに対する本発明のｃＤＮＡ−トランスフェクト細胞の発癌性効果を示す。
【図８】図８は、肝細胞癌患者の血清における本発明の抗原のレベルを示す棒グラフである。
【図９】図９は、本発明のLAPTM4B対立遺伝子の部分配列を示す。
【図１０】図１０は、ヒト集団における本発明のLAPTM4B対立遺伝子の遺伝子型分布を示す。
【図１１】図１１は、上皮由来の種々の癌組織の免疫組織学的な図である。
【図１２】図１２は、肝細胞癌細胞の増殖に対するLAPTM4B-EC2-pAb抗体の阻害効果を示す棒グラフである。
【図１３】図１３−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥは、本発明のｃＤＮＡ−トランスフェクト細胞のサイクリンD1、サイクリンE、c-Myc、c-Fos、およびc-Junの発現がアップレギュレートされたことをそれぞれ示すウェスタンブロット分析図である。
【図１４】図１４−Ａ、Ｂ、およびＣは、本発明の遺伝子産物（LAPTM4Bタンパク質）と、α6β1インテグリンおよび上皮増殖因子レセプター（EGFR）との相互作用をそれぞれ表す、同時免疫沈降（co-immunoprecipitation）の分析図である。
【図１５】図１５Ａ、Ｂ、およびＣは、LAPTM4Bタンパク質のTyrリン酸化およびTyrリン酸化に対するLAPTM4B-EC2-pAbの阻害効果を示す、免疫沈降の分析図である。
【図１６】図１６−ＡおよびＢは、LAPTM4BがFAK-MAPKシグナル伝達経路に関与することをそれぞれ示す、同時免疫沈降（co-immunoprecipitation）の分析図である。
【図１７】図１７は、本発明のLAPTM4Bプロモーターの種々のフラグメントの転写活性を示す図である。
【図１】
0004617257.tif 000006
【図２】
0004617257.tif 000007
【図３】
0004617257.tif 000008
【図４】
0004617257.tif 000009
【図５】
0004617257.tif 000010
【図６】
0004617257.tif 000011
【図７】
0004617257.tif 000012
【図８】
0004617257.tif 000013
【図９】
0004617257.tif 000014
【図１０】
0004617257.tif 000015
【図１１】
0004617257.tif 000016
【図１２】
0004617257.tif 000017
【図１３】
0004617257.tif 000018
【図１４】
0004617257.tif 000019
【図１５】
0004617257.tif 000020
【図１６】
0004617257.tif 000021
【図１７】
0004617257.tif 000022
【配列表】
0004617257000001.app