(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シンチレータ物質を含み、相互作用物質が保持された支持体を含む分析部材であって、
相互作用物質が、抗体、抗原、酵素、酵素の基質、還元剤、酸化剤、タンパク質、核酸、脂質構造体、受容体、膜及び炭水化物からなる群から選ばれ、
相互作用物質が、ジビニルスルホン、1,6-ヘキサン-ビス-ビニルスルホン及びその組合わせからなる群より選ばれるリンカー物質によって該支持体に共有結合していることを特徴とする前記分析部材。
【請求項２】
支持体が、相互作用物質が共有結合される前に表面変性に供されていない請求項１記載の分析部材。
【請求項３】
シンチレータ物質がポリスチレン系シンチレータ物質である、請求項１又は２記載の分析部材。
【請求項４】
リンカー物質が該支持体に共有結合を形成する、請求項１記載の分析部材。
【請求項５】
相互作用物質が結合対部分を含んでいる、請求項１記載の分析部材。
【請求項６】
結合対部分が、タンパク質、核酸、脂質構造、受容体、及び炭水化物からなる群より選ばれる、請求項５記載の分析部材。
【請求項７】
相互作用物質が、ホスファチジルエタノールアミン、ストレプトアビジン、コムギ胚芽凝集素、DNA、RNA、及びその組合わせからなる群より選ばれる、請求項１記載の分析部材。
【請求項８】
リンカー物質が相互作用物質に共有結合する、請求項１記載の分析部材。
【請求項９】
リンカー物質が、相互作用物質の該支持体への共有結合を活性化する、請求項１記載の分析部材。
【請求項１０】
リンカー物質が、-COOH、SH、OH、第一アミン、第二アミン、脂肪族炭化水素、芳香族炭化水素、及びその組合わせからなる群より選ばれた部分と反応できる化合物を含んでいる、請求項１記載の分析部材。
【請求項１１】
分析部材の製造方法であって、
シンチレータ物質を含む支持体を供給する工程;
抗体、抗原、酵素、酵素の基質、還元剤、酸化剤、タンパク質、核酸、脂質構造体、受容体、膜及び炭水化物からなる群から選ばれる相互作用物質を供給する工程;
相互作用物質を支持体に共有結合できるリンカー物質であって、1,6-ヘキサン-ビス-ビニルスルホン及びその組合わせからなる群より選ばれるリンカー物質を供給する工程
; 及び
相互作用物質を支持体に結合し、よって相互作用物質が共有結合によって支持体上に保持される工程
を含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項１２】
相互作用物質が、タンパク質、核酸、脂質構造体、受容体、炭水化物、及びその組合わせからなる群より選ばれる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
相互作用物質が、ホスファチジルエタノールアミン、ストレプトアビジン、コムギ胚芽凝集素、DNA、RNA、及びその組合わせからなる群より選ばれる、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記相互作用物質がリンカー物質によって前記支持体に共有結合され、及び前記支持体が、更に、該相互作用物質が共有結合される前に表面変性に供されない、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的には、相互作用物質を支持体に結合するための方法及び材料に関する。更に詳細には、本発明は、相互作用物質が保持された支持体から構成される分析部材に関する。最も詳細には、本発明は、相互作用物質が結合物質によって共有結合した分析部材に関する。
【０００２】
発明の背景
多くの化学分析や生化学分析は、支持部材上に保持される相互作用物質を用いる。本開示に関して、相互作用物質は、分析の少なくとも1工程において分析の他の化学成分と相互作用する物質を含むことを意味する。相互作用は、結合反応、又は新しい化学物質を生成する反応又は化学物質の構造を変える反応を含み得るものである。相互作用物質は、分子物質、高分子物質、又は膜、層状構造物や分析の化学成分と相互作用する他の分子のような物質の集合物を含み得る。例えば、相互作用物質には、抗体、抗原、酵素又は他の触媒物質、酵素の基質、還元剤、酸化剤、タンパク質、核酸、脂質構造(lipid structure)、受容体、膜、炭水化物や種々の重合した物質が含まれ得る。
しばしば、化学反応における少なくとも1種の相互作用物質は、プレート、ビーズ本体又は他の粒状材料、チューブ、リング、多孔性マトリックス又は様々な設計の他の材料を含むことができる支持体部分上に保持されている。本開示の範囲内で、そのような支持構造を支持体と呼ぶ。支持体の特に重要な種類は、シンチレータ物質が組込まれた支持体を含んでいる。当該技術において既知であるように、シンチレータ物質は、エネルギー入力に応答して、最も典型的には、放射化学の崩壊プロセスで生成する粒子又は高エネルギー光子から光を発するものである。シンチレータが被覆された支持体は、シンチレータ支持体によって生じる光が特定物質の存在又は量を表わす様々な分析操作の放射性化学物質と組合わせてしばしば用いられる。
【０００３】
一般に、従来技術は、相互作用する物質を支持体上に保持するためのさまざまな方法を実施してきた。そのような方法は、支持体に相互作用物質を十分に固定しなければならないので、必要なように被覆支持体の貯蔵と使用の間中ずっと保持される。従来技術においては、相互作用物質は、親水性/疎水性相互作用、又は吸着等の物理的プロセスによって支持体上に保持されている。ある場合には、支持体は、相互作用物質の接着を容易にする物質で被覆される。ある場合には、共有結合によって物質が支持体に結合される。しかしながら、そのような従来技術は、共有結合が達成される化学的に変性された部位を与えるためにかなり極端な条件下で支持体、又は相互作用物質を前処理することを必要とした。例えば、重合した分析プレート上にカルボキシル基をグラフトするために60Co照射が用いられ、タンパク質がEDAC活性化共有結合によって続いて付加し得るように該プレートを変性する(Larssenら1987)。そのような表面変性工程は、コストがかかり、実施が難しい。従って、照射、グラフト化、化学的変性、又は支持体又は相互作用物質の前処理を必要とせずに相互作用物質を支持体上に共有結合で保持させる本発明の方法が求められている。相互作用物質を支持体に付加するために用いられる材料又は方法は、相互作用物質又は得られた組合わせの企図された使用を妨害してはならない。これには、シンチレータ支持体を用いる場合に多くの物質がシンチレーションを消光し得るか又は基質の使用を妨害し得るので、かなり問題がある。
【０００４】
下で詳細に説明されるように、本発明は、相互作用物質がリンカー物質と共有結合相互作用によって、又はリンカー物質によって開始された共有結合相互作用によって支持体上に保持される方法及び材料に関する。リンカー物質は、相互作用物質に共有結合するように、又は共有結合又は他の方法によって支持体に結合できるように選ばれる。また、リンカー物質は、相互作用物質を支持体に共有結合させるが、それ自体は最終結合に組込まれない。そのような場合には、リンカー物質は触媒に似ている。本開示の範囲内で、相互作用物質は、リンカーが結合を生じ又は結合に関与するので、リンカーによって支持体に共有結合されるとみなされる。共有結合は化学結合であり、原子間の電子の共有によって結合が生じ、それだけで吸着のような物理的プロセス、又は純粋なイオン結合のような他の種類の化学結合と区別される。化学結合理論に従って、共有結合が、ある程度のイオン性をもち、なお共有結合とみなし得ることは理解されるべきである。従って、本開示の範囲内で、共有結合は、その結合にある程度のイオン性があるにしてもある程度の電子の共有がある結合であると理解すべきである。
本発明の方法及び材料は、種々の相互作用物質を種々の基質に効率よく結合するものである。本発明の結合材料及び方法は、シンチレーター支持体が使われる場合に用いることができ、そのような支持体に悪影響を及ぼさないことは重要なことである。本発明の材料及び方法は、相互作用物質が支持体上に保持されている様々な適用に関して用いることができ、1つの適用が分析を含んでいる。本発明が特に利用される分析のタイプは、酵素の基質が支持体上に固定化されている酵素分析である。そのような分析の個々のタイプには、基質として合成膜が使われ、シンチレータ支持体を含む種々の支持体にそのような合成膜物質を結合するために本発明が容易に用いられる。
【０００５】
多くの細胞内又は細胞間プロセスが膜仲介であることから、これらのプロセスを研究する方法として生体膜の再構成に関する研究が多かった。リン脂質人工平面二重層膜を形成する操作の最初の開発(Muellerら, 1962)及び平面膜へのイオンチャネルを含む小胞の融合の証明以来(Miller & Racker, 1976)、研究には様々な人工膜システム又は生体膜に取込まれる又は結合する機能分子を研究する様々な方法が用いられた(Hoekstra & Duzgunes, 1993)。一部の研究者は、ビオチニル化脂質(例えば、Wright & Huang, 1992を参照されたい)又は機能酵素(例えば、Hianikら, 1996を参照されたい)を人工膜に取込んだが、膜又は取込まれた分子の性質を研究することが目的であり、本発明のように外因性分子の性質を研究する手段として合成膜を用いることが目的ではなかった。この領域の現在の手法や研究の総説については、Ottova & Tien, 1997を参照されたい。
ホスホリパーゼC(PLC)は、ホスホグリセリドのジアシルグルセロールとリン酸化アルコール、例えば、セリン、コリン、イノシトール、グリセロール、又はエタノールアミンへの加水分解を触媒する酵素の一般名である。例えば、個々のホスホリパーゼCは、ホスファチジルイノシトール-4-ホスフェート(PIP)又はホスファチジルイノシトール-4,5-ビスホスフェート(PIP2)を加水分解し、その結果、それぞれの場合に2つの第二メッセンジャー: 疎水性ジアシルグリセロールと親水性イノシトールホスフェート(それぞれIP2又はIP3)が形成される。この加水分解は、内在性又は外因性標識基質を用いた様々な方法によってモニターし得る。
【０００６】
De Vivo(1994)は、PIP2の加水分解を測定するために用いられる現在の方法を記載している。内在性基質方法においては、問題の細胞をmyo-[3H]-イノシトールの存在下に培養する。細胞は、ホスファチジルイノシトールシンターゼを用いてイノシトールをホスファチジルイノシトール(PI)に変換し、順次PIがホスファチジルイノシトールキナーゼによってPIP-[3H]とPIP2-[3H]に変換される。ポリホスホイノシチドプールが定常状態に標識される場合、適切な刺激因子を細胞培養液に添加することにより(例えば、無傷細胞にレセプターアゴニスト又は透過性を上げた細胞にグアニリルヌクレオチド)、PIPとPIP2の分解が開始する。
外因性基質方法においては、基質として精製した標識リン脂質が用いられる。リン脂質を、界面活性剤の存在下又は不在下に混合し、氷上で簡単に音波処理して小胞を調製する。基質のアリコートをPLC(膜又は精製した酵素)、しばしばGタンパク質サブユニットの供給源と混合する。
内在性及び外因性基質方法のいずれにおいても、親水性反応生成物を疎水性基質から分離するために溶媒抽出が用いられる。スフィンゴミエリナーゼ分析の現在の方法にも、溶媒抽出工程が必要である。環境上及び健康上の理由から抽出工程を取り除くことが望ましい。更に、例えば、薬剤候補の高スループットスクリーニングに必要であるように、多数の試料の抽出を自動化することは困難である。
【０００７】
発明の概要
相互作用物質がリンカー物質によって共有結合された支持体を含むタイプの分析部材が開示される。リンカー物質は、相互作用物質、及び/又は支持体に共有結合することができ、相互作用物質を支持体に共有結合させることもできる。
具体的な例では、相互作用物質は、結合対の一部分であり得る。そのような相互作用物質には、タンパク質、核酸、脂質又は受容体が含まれ得る。他の具体的な例では、支持体は、シンチレータ支持体であり得る。リンカーは、更に、支持体部分に共有結合できるものであり得る。他の結合プロセスによって保持もされ得る。ある具体的な例では、リンカーは、ビニルホスホン、カルボジイミド、又は活性化した場合、相互作用物質に共有結合できる、又は相互作用物質を共有結合させることができる光化学活性化可能化合物であり得る。
ある具体的な例では、相互作用物質は、ホスファチジルエタノールアミン、ストレプトアビジン又はコムギ胚芽凝集素を含み得る。
本発明は、また、相互作用物質を支持体に共有結合する方法を含んでいる。
【０００８】
本発明の他の利点は、添付の図面と共に考えられる場合に下記の詳細な説明によって更に良く理解されるように容易に理解される。
図１は、[3H]PIP2が被覆された96ウェルリン脂質FlashPlate(登録商標)上の種々の量の精製した組換えPLCγ1の動力学的活性を示すグラフである。0.1mlの50mM NaP1、pＨ6.7、0.1M NaCl、0.1mM CaCl2、0.1mM EGTA中の異なる濃度の精製した組換えPLCを個々のウェルに添加し、Packard TopCount(登録商標)により時間の関数として放射能の放出をモニターした。(コネチカット州メリデンのパッカードインスツルメント社製のマイクロプレートスキャンシステム)。
図２Ａは、[3H]PIP2が被覆された96ウェルリン脂質FlashPlate(登録商標)に対するPLCδ1への添加剤の影響を示すグラフである。放射能の放出に対する異なる濃度のデオキシコール酸塩の影響を0.2ml HEPES-NaOH、pＨ7.0、0.14M KCl、0.1mM CaCl2、0.1mM EGTA、％(wt/vol)に基づく[デオキシコール酸塩]中の13mU PLCにより時間の関数としてモニターした。
図２Ｂは、0.2mlの50mM HEPES-NaOH、pＨ6.7、0.15M KCl、0.1mM CaCl2、0.1mM EGTA、0.04％デオキシコール酸塩(wt/vol)中の100mU PLC活性に対する0.2mMスペルミン添加の影響を示すグラフである。放射能の放出をPackard TopCount(登録商標)によりモニターした。
【０００９】
図３は、[3H]PIP2が被覆された96ウェルリン脂質FlashPlate(登録商標)上で測定した場合のGTPγSによる粗HL60サイトゾル標品にGTPγSを添加することによるPLC活性の刺激を示すグラフである。種々の量のHL60サイトゾルタンパク質を0.2mlの50mM HEPES-NaOH、pＨ6.7、0.15M KCl、0.1mM CaCl2、0.1mM EGTA、0.04％デオキシコール酸塩(wt/vol)を0.2mM GTPγSの存在下か又は不在下に含む個々のウェルに添加した。放射能の放出をPackard TopCount(登録商標)によりモニターした。
図４は、[3H]PIP2が被覆された96ウェルリン脂質FlashPlate(登録商標)上で測定した場合のストレプトリシンSの透過性を上げたA431ヒトがん細胞からの細胞内PLC活性の放出を示すグラフである。A431浮遊細胞のアリコートを50mM HEPES-NaOH、pＨ6.7、0.15M KCl、0.1mM CaCl2、0.1mM EGTA、0.04％デオキシコール酸塩(wt/vol)、10単位/mlのストレプトリシンSを含有し、容量反応緩衝液で0.2mlに調整したウェルに配分した。放射能の放出をPackard TopCount(登録商標)によりモニターした。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、相互作用物質を支持体上に付加する共有結合技術の使用に関する。共有結合の使用により、相互作用物質がしっかりと確実に保持される。本発明は、様々な目的に対して様々な異なる基質に様々な物質を付加するために用いることができるとともに、分析材料の製造にかなり重要な有用性があり、本発明の共有結合技術がシンチレータを妨害しないので、分析材料が支持体中にシンチレータを含む場合に特に有用性がある。本明細書でリンカー物質と呼ばれる共有結合物質は、相互作用物質と共有結合をつくり得る、又は相互作用物質の支持体への共有結合を活性化し得る少なくとも1つの反応性部位をもつものである。それだけで、共有結合物質は、カルボン酸基、第一アミン又は第二アミン、スルフヒドリル基、ヒドロキシル基又はアルデヒド基のような基と反応できるものである。相互作用物質を支持体に共有結合させる過程で、リンカー物質自体の分子構造が変化し得ることは理解すべきである。従って、本開示が具体的なリンカー物質によって支持体に共有結合される相互作用物質を言う場合、そのリンカー物質が相互作用物質自体に共有結合するか又は支持体に直接共有結合することを活性化することにより化学的に変化することができることは理解すべきである。
【００１１】
本発明の方法が反応性部位を得るために支持体又は相互作用物質の前処理を必要としないことは注目すべきことである。それだけで、本発明は、結合に反応しやすくするためにイオン化照射処理又は極端な化学処理に供すべき支持体又は相互作用物質を必要とする従来技術のプロセスと区別される。それだけで、本発明は、従来技術のプロセスより著しく改良されたものである。
相互作用物質に共有結合する結合物質の特に好ましい群は、ビニルスルホンを含み、個々の例としてはジビニルスルホンや1,6-ヘキサンビスビニルスルホンが含まれる。結合に直接組込まれないが相互作用物質の共有結合を活性化するリンカー物質の他の好ましい群は、カルボジイミドを含み、特に好ましい物質は、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドである。ある場合には、共有結合リンカー物質が光化学的に活性化可能であり得るので、共有結合の開始は試薬を適切に照射することにより達成することができる。
リンカーが相互作用物質に共有結合する場合には、結合物質は、結合した相互作用物質を支持体上に保持するように機能しなければならない。従って、リンカー物質は、支持体に化学的に又は物理的に結合する。ある場合には、そのようなリンカー物質は、支持体に共有結合できる。リンカー物質が相互作用物質の共有結合を活性化するが結合に関与しない場合には、リンカーは支持体に結合できることを必要としないが、ある場合にはそのようにする。
【００１２】
下で詳細に説明されるが、本発明の具体的な実施態様においては、相互作用物質は人工膜のような脂質物質を含んでもよい。相互作用物質は、タンパク質、核酸、他の脂質又は受容体分子を含んでもよい。下記の非常に具体的な実施例においては、相互作用物質には、ホスファチジルエタノールアミン、ストレプトアビジン、又はコムギ胚芽凝集素が含まれる。
本発明の他の態様によれば、支持体を、相互作用物質を後に共有結合するためにリンカー物質で被覆することができる。そのように被覆した支持体は、それ自体で又はそれ自体からのもので貯蔵製品を構成し、後で使用するために販売し得る。
本発明のユニークな特徴は、酵素の基質を与えるために支持体に結合した相互作用物質を用いる分析の具体的な種類に関して述べられている。この分析は、反応生成物を抽出することを必要とせずに試料中の酵素活性の実験を可能にする。本発明を用いる分析は、均質分析様式か又は不均質分析様式で使用し得るし、放射検出法か又は非放射検出法を用い得る。適切な基質設計においては、本発明は、ホスホリパーゼのような様々な酵素を実験するために使用することができ、分析法は抽出工程を必要としない。本発明での使用に適切な酵素基質としては、リン脂質、スフィンゴ脂質、又は他の両親媒性分子、例えば、グリコシルジアシルグリセロール、セラミド、ガングリオシド、又はカルジオリピンのような複合リン脂質が含まれるがこれらに限定されない。酵素は、精製、半精製又は粗抽出物が使用し得る。本発明はこの個々の種類の分析に関して記載されているが、分析又は他の方法で使用に他の種類の物質を他の支持体に結合するために使用し得ることは理解すべきである。
【００１３】
極性部分上に標識された両親媒性酵素基質は、固体支持体上に形成されかつ疎水性相互作用及び/又は共有結合によって保持される脂質層のような適切な疎水性層へ疎水性相互作用によって取込まれる。適切な疎水性層は、疎水性相互作用によって両親媒性基質を結合する成分を取込むものである。使用する具体的な基質は、問題の酵素の作用及び標識に適切な場所に対する感受性について設計又は選択される。基質を標識するために用いられる適切なリポーター群としては、放射性同位元素、酵素、蛍光原材料、熱量材料、磁性材料、化学発光材料又は電気化学材料又は特定の結合対の部分が含まれるがこれらに限定されない。
適切な固相支持体としては、合成ポリマー支持体、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、積層ポリスチレン又はカルボキシル化ポリスチレンのような置換ポリスチレン; ポリアクリルアミド; ポリアミド; ポリ塩化ビニル等; ガラスビーズ; ニトロセルロース; ナイロン; 二フッ化ビニリデン樹脂; 表面変性ナイロン等が含まれるがこれらに限定されない。固体支持体として96ウェルFlashPlateを用いるホスホリパーゼ用の均質分析法は、十分に適用することがわかった。(FlashPlateは、各ウェルの内部がポリスチレン系シンチラントの薄層で被覆されている96ウェル白色ポリスチレンマイクロプレートである。)
【００１４】
このようにして、本発明は、酵素に基づく急速な分析を行う方法及び材料に関することがわかる。分析は定量的又は定性的であってもよく、多くの試料調製工程又は抽出工程を必要としない。分析は、酵素と反応性である両親媒性基質の使用に依存する。両親媒性基質には、リポーター部分(標識とも言われる)をもつ親水性部分と疎水性部分が含まれる。
典型的な分析においては、疑わしい標的酵素を含む物質の試料を、前述のように支持体上に配置されることが好ましい疎水性層と接触させて配置する。試料を、典型的には水を含む極性溶媒中に配置し、試料中にある酵素の少なくとも一部が基質材料と相互作用する。この相互作用の結果、基質が切断し、リポーター物質を含む親水性断片が遊離する。親水性断片は、疎水性層に低親和性であり、外部の極性溶媒へ移動する。反応の検出は、疎水性層の残留リポーター活性を測定することにより達成されることが最も好ましく、この残留リポーター活性は、試料中の酵素の活性に逆比例する。また、酵素活性は、水性材料中のリポーター標識断片を検出することにより測定することができる。
上記のように、リポーター部分は、トリチウムのような放射性物質を含むことができ、ある場合には、疎水性層はシンチレータ物質を含む支持体上に配置されてもよい。他の場合には、リポーター物質は、標識磁性材料、標識蛍光材料、抗体/抗原対の部分、蛍光物質、発色剤、化学発光材料、分析の標的酵素と異なる酵素、電気化学活性材料等を含むことができ、他のそのようなリポーター物質は、当業者に明らかである。
下記の実施例は、本発明を具体的に説明するものである。
【００１５】
比較例I
スフィンゴミエリナーゼ分析
本実施例においては、支持プレート上に脂質層を保持するために非共有結合が用いられる。
酵素基質の調製: ストレプトアビジンで被覆したFlashPlateをNEN(登録商標)ライフサイエンスプロダクツ(Life Science Products)から入手した。ビオチニル化ホスファチジルエタノールアミン(PE)(Avanti)をPBS(0.01Mリン酸ナトリウム緩衝液、pＨ7.4中0.1M NaCl)中の10マイクログラム/mlまで希釈し、0.1mlを各ウェルに添加した。ストレプトアビジンに結合させるために室温で一晩インキュベートした後、残存している溶液を吸引によりウェルから除去した。スフィンゴミエリン(卵)[コリンメチル-3H](NEN(登録商標)Life Science Products, Inc.)を0.1％ウシ血清アルブミン[BSA]を含むトリス-HCl、pＨ7.0で1.0マイクロキュリー/mlまで希釈し、0.1mlを各ウェルに添加した。室温で一晩インキュベートした間に、スフィンゴミエリンがPEと疎水的に相互作用して3H標識固相脂質層を形成した。次に、プレートを吸引し、風乾した。
酵素分析: スフィンゴミエリナーゼ(Sigma)を1mg/ml CaCl2及び1mg/ml MgCl2を含むPBS中で連続して希釈し、0.1mlを各ウェルに添加し、室温で一晩インキュベートした。スフィンゴミエリナーゼの活性によってスフィンゴミエリンから切断した親水性3H標識断片が疎水性固相脂質層から水溶液へ移動し、計数すべきシンチラントから十分近い3H量が減少した。表1の結果から、スフィンゴミエリナーゼ量が増加するとウェル内に検出された放射能量の減少が生じることがわかる。スフィンゴミエリナーゼを含まないウェルを負の対照として用いた。
【００１６】
【表１】
0004680456.tif 000002
【００１７】
比較例II
ホスホリパーゼC分析
酵素基質の調製: 3H標識固相脂質層の調製のスフィンゴミエリン-[3H]の代わりにPIP2、[イノシトール-2-3H(N)](NEN(登録商標)Life Science Products)を添加した以外は実施例1と同じようにFlashPlateを調製した。
PLCの部分的精製: (Campsら1992; Campsら1990; Glorschikら1989)。維持のために、20％ウシ胎児血清(FBS)、1％L-グルタミン及び0.1％ゲンタマイシンで補足したイスコブ(Iscove)の培養液中の10％CO2の1リットルの撹拌フラスコでHL-60細胞(ATCC CCL-240)を培養した。ホスホリパーゼCを誘導するために、1.25％のジメチルスルホキシド(DMSO)で補足した培養液中で5日間、又は約2〜3×106生細胞の密度に達するまで細胞を培養した。遠心分離及び洗浄緩衝液(20mMトリス-HCl(pＨ7.5))、1mM EDTA、1mMジチオトレイトール、3mMベンズアミジン、1mMロイペプチン、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)及び0.002mMダイズトリプシンインヒビターで2回洗浄することにより収集した後、約2×1010細胞を含有する最終沈降物(30mlの圧縮細胞容積)を50〜100mlの溶解緩衝液(250mMスクロース、20mMトリス-HCl[pＨ7.5]、1.5mM MgCl2、1mM ATP、3mMベンズアミジン、0.001mMロイペプチン、1mM PMSF、0.002mMダイズトリプシンインヒビター)に再懸濁した。細胞を、ポリトロンホモジェナイザで各回1分間4回冷所で処理し、処理の間に1分間停止し、続いて氷浴で各回1分間4回音波処理し、処理の間に1分間停止することにより溶解した。溶解物をEGTAで1.25mMまで補足し、4℃、1445×gで20分間遠心することにより残渣を除去した。得られた上清を4℃、17.593×gで20分間遠心した。この工程からの上清を4℃、112,594×gで60分間遠心した。最終上清(サイトゾル)を0.45マイクロメートル孔径フィルタに通過させた。タンパク質濃度を求めた後、サイトゾルを急速冷凍し、ホスホリパーゼCの供給源として用いるまで-80℃で貯蔵した。
【００１８】
酵素分析: ホスホリパーゼC活性を分析するために、解凍したHL-60サイトゾルを、0.4mM CaCl2及び0.21mM GTPγSを含有するPBSで種々のタンパク質濃度まで希釈した。希釈したサイトゾル(0.1ml)を固相脂質層を含有する各FlashPlate(登録商標)ウェルにPIP2-[3H]と共に添加し、室温で一晩インキュベートした。疎水性固相脂質層から水溶液に移動したホスホリパーゼCの活性によってPIP2から親水性3H標識断片を切断し、計数すべきシンチラントから十分近い3H標識量が減少した。表2の結果から、ホスホリパーゼC量が増加するとウェル内に検出される放射能量の減少が生じることがわかる。ホスホリパーゼCを含まないウェルを負の対照として用いた。
【００１９】
【表２】
0004680456.tif 000003
【００２０】
実施例III
ホスファチジルエタノールアミンの共有結合
本実施例においては、本発明の共有結合化学が用いられる。
2種類の化学が含まれる。1つはジビニルスルホン(DVS)を用い、もう1つは1,3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)を用いる。DVSは、一般的には、アミン基、スルフヒドリル基又はヒドロキシル基と反応性であり、EDACはカルボキシル基やヒドロキシル基と反応性である。
ジビニルスルホンプレートの活性化: 使用直前に、0.1M炭酸ナトリウム、pＨ11.5中の1％DVS溶液を調製する。アリコート(0.2ml)を個々のウェルに配分し、プレートを室温で少なくとも30分間放置する。次に、プレートを0.1M炭酸ナトリウム、pＨ10.5で3回洗浄し、脂質を添加する前に簡単に風乾する。25〜50mM炭酸ナトリウム、pＨ9.8〜10.2中のホスファチジルエタノールアミン(PE)の25μg/ml溶液を調製し、0.2mlを各ウェルに配分する。プレートを室温で少なくとも3時間再びインキュベートする。最後に、プレートをリン酸塩緩衝食塩水(PBS)で2回、0.04％デオキシコール酸塩、PBSのみで2回洗浄する。次に、プレートを風乾し、密閉バッグ内に室温で暗所に貯蔵する。被覆したプレートは、少なくとも6ヵ月間貯蔵安定である。
EDACプレート活性化: 25μg/mlのPEを含有する10〜50mM MES、pＨ6.8〜7.2中の0.5mg/ml HDAC溶液を調製し、0.2mlを個々のウェルに配分する。プレートを室温で暗所に一晩放置する。最後に、プレートをリン酸塩緩衝食塩水(PBS)で2回、0.04％デオキシコール酸塩及びPBSのみで2回洗浄する。次に、プレートを風乾し、密閉バッグ内に室温で暗所に貯蔵する。
【００２１】
実施例IV
ストレプトアビジンの共有結合
使用直前に、0.1M炭酸ナトリウム、pＨ11.5中の1％DVS溶液を調製する。アリコート(0.2ml)を個々のウェルに配分し、プレートを室温で少なくとも15分間放置する。次に、プレートを0.1Mホウ酸塩、pＨ9.2で3回洗浄し、ストレプトアビジンを添加する前に簡単に風乾する。25〜50mM炭酸ナトリウム、pＨ9.8〜10.2中の5.50μg/mlストレプトアビジン溶液を調製し、0.2mlを各ウェルに配分する。プレートを室温で少なくとも3時間再びインキュベートする。最後に、プレートを0.02％トウィーン-20を含有するPBSで2回及びPBSのみで2回洗浄する。次に、プレートを風乾し、密閉バッグ内に室温で暗所に貯蔵する。
【００２２】
実施例V
コムギ胚芽凝集素(WGA)の共有結合
25μg/mlのWGAを含有する10mM MES、pＨ5.2〜7.2中の0.5mg/mlEDAC溶液を調製する。アリコート(0.2ml)を個々のウェルに配分し、プレートを室温で一晩暗所に放置する。次に、プレートを0.02％トウィーン-20を含有するPBSで2回及びPBSのみで2回洗浄する。次に、プレートを風乾し、密閉バッグに室温で暗所に貯蔵する。
分析プレートの性能評価: イノシトール特異的ホスホリパーゼC(PLC)は、ぺプチドホルモンや神経伝達物質のように多様な多くの細胞仲介応答のシグナル導入において鍵となる酵素である(Rhee & Choi, 1992)。これらの酵素は、ホスホイノシチドに特異的なヒドロラーゼである。PLCとホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスフェート(PIP2)との酵素反応の結果、イノシトール1,4,5-トリスホスフェート(IP3)とジアシルグリセロールが生産する。細胞全体に調節シグナルのカスケードを生じる生産物が生成する。IP3は、IP3受容体との特異的相互作用によって小胞体からCa2+貯蔵の細胞内放出を誘導するが、ジアシルグリセロールはタンパク質キナーゼCの強力な活性化因子である。これらの細胞因子の活性化により、細胞活性をモジュレートする一連の経路が促進されることになる。
【００２３】
古典的には、PLC酵素は、β、δ及びγに設計された3つのファミリーに分けられる。βとγは、それぞれGタンパク質結合経路か又は受容体仲介チロシンキナーゼ経路によって調節される。これらの酵素の活性は、歴史的には微量の[3H、イノシトール]PIP2を含有するリン脂質小胞による溶液系分析を用いて実験された(DeVivo, 1994)。加水分解反応を、酸性にした有機溶媒を添加し、続いて相分離することによりモニターする。酸性標識脂質は有機層に分割するが、[3H]IP3は水相内に残る。従って、水層の簡単な放射分析によってPLC活性を測定する便利な方法が得られる。しかしながら、高スループットスクリーニング(HTS)法が容易に受け入れられない分析の限界がある。
これらの酵素を高スループット方式で酵素を実験するために、結合した[3H]ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸を含有するFlashPlate(登録商標)上のPLC活性をモニターする方法が開発された。標識したリン脂質を表面上に捕捉し、よってPLC活性を測る機能基質を得るように、FlashPlate(登録商標)が改良された。
【００２４】
方法: リン脂質変性FlashPlate(登録商標)を種々の異なる方法によってつくり、種々のコーティング表面を試験した。96ウェルリン脂質FlashPlate(登録商標)を、[1-3H、イノシトール] PIP2(〜20Ci/ミリモル、NEN)を含有する0.2mlの溶液で0.25〜1μCi/mlの濃度において少なくとも3時間被覆した。次に、ウェルを0.04％デオキシコール酸ナトリウムを含有するリン酸塩緩衝食塩水(PBS)で2回、最後にPBSのみで洗浄した。典型的には、変動係数は、8〜12％の範囲にあった。反応は、ウェル内で説明文に示された緩衝液中で直接行われ、Packard TopCount(登録商標)機器によりモニターした。
PLC活性の1単位は、典型的な溶液系分析を用いて毎分1mgの酵素に対して生じる1ナノモルの[3H]IP3として定義される(DeVivo, 1994)。
HL60細胞は、以前に記載されているように(Campsら1990; Campsら1992)、収集する前に後期対数期まで増殖させサイトゾル画分を調製したもの又はHL60サイトゾル抽出物をABS社から購入したものである。A431ヒト類表皮がん細胞を、収集前にダルベッコの修飾イーガル培地(DMEM)を10％ウシ胎児血清(FCS)と共に含有する150cm2培養フラスコ中で増殖した。A431細胞を〜50％集密に達するまで培養した。フラスコの底から付着した細胞塊を削り低速遠心で沈降することにより細胞を収集した。次に、細胞沈降物をPBSで2回すすいだ。細胞を、10単位/mlストレプトリシンSを含有する反応緩衝液の最少量に再懸濁し、個々のウェルに分割する前に計数した。
他のすべての化学薬品又は試薬は、試薬グレード以上のものとした。
【００２５】
結果: 我々の最初の実験は、リン脂質FlashPlate(登録商標)の標識表面が加水分解の酵素に対するイノシトール頭部基を効果的に存在させ得ることを証明するために役立った。17.5時間の反応の過程にわたって、精製した組換えPLCγ1によって、濃度依存方式で結合したカウントの放出能が示された(図1を参照されたい)。すべての例において、PLCγ1の反応は、反応の最初の5時間以内にプラトーに達し、その後カウントはほとんど放出しなかった。試験した酵素の最大濃度、130μgで、75％を超える放射能がプレート表面から放出した。これらの結果から、大多数の表面結合した[3H]PIP2が酵素の基質として容易に利用できことが示された。表面結合カウントの放出が実際に[3H]PIP2の加水分解よることを証明するために、個々のウェルを吸引し、酸性条件下での2容量のクロロホルム-メタノール(CHCl3:CH3OH:HCl, 2:1:0.01)で抽出した。有機相と水相中の放射能の相対分布は、それぞれ標識PIP2とIP3を示すものである。表3に示されるように、標識リン脂質FlashPlate(登録商標)からの放射能の放出は、主としてHL60サイトゾル抽出液と組換えPLCからの両粗PLC標品による結合[3H]PIP2の加水分解によるものであった(対照ウェルは、放射能の放出をほとんど又は全く示さなかった)。いずれの場合も、放射能は、[3H]PIP3を示す水相(〜90％以上)にほとんど分布した。この結果から、標識IP3がリン脂質FlashPlate(登録商標)から特異的に放出されること及び表面結合標識PIP2が実際にHL60サイトゾル抽出物の粗酵素PLC標品及び精製組換えPLC双方の生存できる基質であったことがわかる。
【００２６】
【表３】
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【００２７】
反応は、デオキシコール酸塩(Crooke & Bennett, 1989)か又はスペルミン(Haberら, 1991)の存在下に混合ミセルを用いた溶液系分析について以前に示されたのと同じ多くの特性を示した。これらの分析について、組換えPLCδ1は、デオキシシコール酸ナトリウムの添加時に(図2Aを参照されたい)又は添加スペルミンの存在下に(図2Bを参照されたい)濃度依存方法で高加水分解活性を示した。結果から、以前に発表された(Crooke & Bennett, 1989; Gaberら, 1989) PLC活性の刺激に対するこれらの化合物の影響が確認され、溶液系ミセル分析と比べた場合にプレート形式の有用性が確証される。
他の実験は、粗細胞抽出液からのPLC活性の刺激が以前に記載されたプロトコール(Rhee & Choi 1992; DeVivo 1994)を用いてリン脂質FlashPlate(登録商標)上でモニターし得るかを調べるように設計された。種々のタンパク質濃度のHL60サイトゾル抽出液を非加水分解性類縁体GTPγSの存在下又は不在下に処理し、放射能の減少が速度論的にモニターされた。図3に示されるように、類縁体の不在下に、結合したカウントの放出は濃度がタンパク質の添加量に依存することを示し、反応は3時間で〜15％に減少し始めた。GTPγSを試料に添加すると、試験したすべてのタンパク質濃度でPLC活性の刺激が生じた。しかしながら、添加タンパク質の濃度依存性は、おそらく低レベル基質だけが表面上で利用できるという事実のために消失するようであった。それにもかかわらず、使用した各タンパク質濃度について正味2〜3倍の刺激が明らかであった。
【００２８】
この形式の試験として、我々は、透過性を上げたA431ヒト類表皮がん細胞から遊離したPLCの活性を分析した(図4参照)。この場合には、種々の量の細胞を[3H]PIP2被覆したリン脂質FlashPlateに添加すると、細胞数依存方法で放射能の放出が生じる。2×105細胞/ml以下の細胞数は、細胞からPLC活性の放出の遅れを意味する反応の初期の遅滞期を示した。更に、約2×105細胞/mlの細胞数の表面からの放射能の放出は、無傷脂質とIP3双方の放出によるものであることがわかった(データは示されていない)。従って、高細胞数においては、この結果から、他の細胞成分は非加水分解反応において表面から脂質を除去できることが示される。累積的に、これらの結果から、透過性を上げた細胞及びサイトゾル抽出液双方から[3H]PIP2被覆リン脂質FlashPlate(登録商標)により高スループット方式でPLC活性がモニターし得ることが証明される。
【００２９】
結論: 本実験から、受容体結合機能分析の高スループットスクリーニングのPLC活性をモニターするための[3H]PIP2被覆したリン脂質FlashPlate(登録商標)の有用性が明らかに証明される。結果から、粗細胞溶解物や透過性を上げた細胞に対する精製組換え酵素標品を含む種々の供給源からPLC活性が容易にモニターし得ることが示される。更に、この形式によって、古典的な標識ミセル実験に用いられたものに匹敵する表面が得られ、様々な異なる薬剤スクリーニング分析においてPLC活性を測定するこの分析の実行可能性が示される。
個々の種類の分析に関して本発明を説明してきたが、種々の物質を支持体に共有結合するための適用が広範囲であることは理解されるべきである。
従って、本発明の原理は、様々な適用に修正することができ、いずれも当業者に明らかである。上記の観点から、上記発明の多くの修正や変更が容易に実施することができることは理解及び評価される。本明細書に示された考察、説明及び実施例は、本発明の具体的な実施態様を示すものであるが、その実施に限定することを意味しない。すべての等価物を含む前述の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義するものである。
【００３０】
引用文献
Campsら(1992) Eur. J. Biochem. 206:821-831.
Campsら(1990) Biochem. J. 271:743-748.
Crooke & Bennett (1989) Cell Calcium, 10:309-23.
De Vivo (1994) ホスホリパーゼC活性のGタンパク質調節の分析. Methods in Enzymology 238:131-141.
Gierschikら(1989) Eur. J. Biochem. 183:97-105.
Haberら(1991) Arch. Biochem. Biophys., 288(1):243-6.
Hianikら(1996) 金属支持体上の脂質二重層に酵素を固定化すると酵素反応の生物物理的メカニズムの研究が可能である. Bioelectrochemistry & Bioenergetics 41:221-225.
Hoekstra & Duzgunes (1993) リポソーム系の融合を求める脂質混合分析. Meth. Enz. 220:15-32.
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Miller & Racker (1976) J. Membr. Biol. 26:319.
Muellerら(1962) Circulation 26:1167.
Ottova & Tien(1997) 自己構築二重層脂質膜: 模擬生物膜から実用的応用まで. Bioelectrochemistry & Bioenergetics 42:141-152.
Rhee & Choi (1992) J. Biol. Chem. 267(18):12393-6.
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【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、[3H]PIP2が被覆された96ウェルリン脂質FlashPlate(登録商標)上の種々の量の精製した組換えPLCγ1の動力学的活性を示すグラフである。
【図２Ａ】  図２Ａは、[3H]PIP2が被覆された96ウェルリン脂質FlashPlate(登録商標)に対するPLCδ1への添加剤の影響を示すグラフである。
【図２Ｂ】  図２Ｂは、0.2mlの50mM HEPES-NaOH、pＨ6.7、0.15M KCl、0.1mM CaCl2、0.1mM EGTA、0.04％デオキシコール酸塩(wt/vol)中の100mU PLC活性に対する0.2mMスペルミン添加の影響を示すグラフである。
【図３】  図３は、[3H]PIP2が被覆された96ウェルリン脂質FlashPlate(登録商標)上で測定した場合のGTPγSによる粗HL60サイトゾル標品にGTPγSを添加することによるPLC活性の刺激を示すグラフである。
【図４】  図４は、[3H]PIP2が被覆された96ウェルリン脂質FlashPlate(登録商標)上で測定した場合のストレプトリシンSの透過性を上げたA431ヒトがん細胞からの細胞内PLC活性の放出を示すグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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