(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド中の第５２番目のアスパラギン及び第６６番目のアスパラギンを、側鎖にアミド基を含まないアミノ酸で置換したポリペプチド、又は該ポリペプチドにおいて１個ないし数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該ポリペプチドに１個ないし数個のアミノ酸が付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ただし、配列番号１に示されるアミノ酸配列中の第５２番目のアスパラギン及び第６６番目のアスパラギンに対応するアスパラギンは側鎖にアミド基を含まないアミノ酸で置換されている）であって、アポトーシスの抑制に有効なポリペプチドを有効成分として含有する、アポトーシスを伴う疾患の予防又は治療剤。
【請求項２】
配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド中の第５２番目のアスパラギン及び第６６番目のアスパラギンを、側鎖にアミド基を含まないアミノ酸で置換したポリペプチドを有効成分として含有する請求項１記載の予防又は治療剤。
【請求項３】
前記側鎖にアミド基を含まないアミノ酸がアラニンである請求項１又は２記載の予防又は治療剤。
【請求項４】
前記アポトーシスを伴う疾患が、心筋梗塞、脳梗塞、肝炎又は心臓・肺・肝臓・小腸・膵臓若しくは腎臓の虚血再灌流障害等である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の予防又は治療剤。
【請求項５】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸を含み、哺乳動物細胞中で該ポリペプチドを発現することができるベクターから成る、アポトーシスを伴う疾患の予防又は治療用ベクター。
【請求項６】
前記アポトーシスを伴う疾患が、心筋梗塞、脳梗塞、肝炎又は心臓・肺・肝臓・小腸・膵臓若しくは腎臓の虚血再灌流障害等である請求項５記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋梗塞、脳梗塞、肝炎肝炎又は心臓・肺・肝臓・小腸・膵臓・腎臓の虚血再灌流障害等の、アポトーシスを伴う疾患の予防又は治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
心筋梗塞、脳梗塞の予防又は治療薬としては、ウロキナーゼ等の血栓溶解剤が用いられている。しかしながら、心筋梗塞や脳梗塞における、心筋細胞や脳細胞のアポトーシスを防止することによる予防又は治療薬は全く知られていない。
【０００３】
Bcl-xLは、Bcl-2ファミリーに属する抗アポトーシス物質のメンバーであり、主としてミトコンドリアの外膜上に存在し、少なくとも部分的にチトクロームcの細胞質への放出を妨げることにより、アポトーシスの一般的な経路を阻害する（非特許文献１及び２）。本願発明者らは、先に、Bcl-xLが肝癌細胞中で発現しており、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより、Bcl-xLの発現を抑制すると、血清飢餓、p53活性化及びスタウロスポリン(staurosporine)処理のような細胞性ストレスに応答する肝癌細胞のアポトーシスが増大することを示した（非特許文献３）。内因性に発現されるBcl-xLの発現を抑制することだけで、種々の細胞性ストレスによる肝癌細胞のアポトーシスの誘起に十分であったことから、Bcl-xLは、細胞がアポトーシス的条件下にさらされた際にアポトーシスを抑制することと一体的な役割を果たしていることは間違いない。このように、肝細胞癌(HCC)細胞中で内因性に発現されるBcl-xLは、アポトーシスに対する中心的なアンタゴニストである。しかしながら、HCC組織の一部においてのみ、Bcl-xLの発現量が、隣接する非腫瘍組織又は正常肝臓組織のBcl-xLの発現量よりも大きかったことから（非特許文献３）、Bcl-xLの過剰発現のみでは、Bcl-xLにより媒介されるアポトーシスに対する耐性がHCC中で増大することを完全に説明することはできないと思われる。
【０００４】
一方、Devermanらは、最近、いくつかの腫瘍セルラインでは、ＤＮＡ損傷性化学療法剤により、Bcl-xLの第５２番目のアスパラギン及び第６６番目のアスパラギンの脱アミド化が惹起されることを報告した（非特許文献４）。しかしながら、この文献には、アポトーシスを防止することによる医薬の開発等は全く記載も示唆もされていない。
【０００５】
【非特許文献１】Adams, J. M., and Cory, S. The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science   (Wash. DC), 281: 13221326, 1998.
【非特許文献２】Gross, A., McDonnell, J. M., and Korsmeyer, S. J. BCL-2 family members and the mitochondria in apoptosis. Genes Dev., 13: 18991911, 1999.
【非特許文献３】Takehara, T., Liu, X., Fujimoto, J., Friedman, S. L., and Takahashi, T. Expression and role of Bcl-xL in human hepatocellular carcinomas. Hepatology, 34: 5561, 2001.
【非特許文献４】Deverman, B. E., Cook, B. L., Manson, S. R., Niederhoff, R. A., Langer, E. M., Rosova′, I., Kulans, L. A., Fu, X., Weinberg, J. S., Heinecke, J. W., Roth, K. A., and Weintraub, S. J. Bcl-xL deamidation is a critical switch in the regulation of the response to DNA damage. Cell, 111: 5162, 2002.
【非特許文献５】Puisieux, A., Galvin, K., Troalen, F., Bressac, B., Marcais, C., Galun, E., Ponchel, F., Yakicier, C., Ji, J., and Ozturk, M. Retinoblastoma and p53 tumor suppressor genes in human hepatoma cell lines. FASB J., 7: 14071413, 1993.
【非特許文献６】Hu, Y., Benedict, M. A., Wu, D., Inohara, N., and Nunez, G. Bcl-XL interacts with Apaf-1 and inhibits Apaf-1-dependent caspase-9 activation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 43864391, 1998.
【非特許文献７】Paranandi, M. V., Guzzetta, A. W., Hancock, W. S., and Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation during in vitro aging of recombinant tissue plasminogen activator. J. Biol. Chem., 269: 243253, 1994.
【非特許文献８】Poruchynsky, M. S., Wang, E. E., Rudin, C. M., Blagosklonny, M. V., and Fojo, T. Bcl-xL is phosphorylated in malignant cells following microtubule disruption. Cancer Res., 58: 33313338, 1998.
【非特許文献９】Aritomi, M., Kunishima, N., Inohara, N., Ishibashi, Y., Ohta, S., and Morikawa, K.Crystal structure of rat Bcl-xL. J. Biol. Chem., 272: 2788627892, 1997.
【非特許文献１０】Robinson, A. B., and Rudd, C. J. Deamidation of glutaminyl and asparaginyl residues in peptides and proteins. Curr. Top. Cell. Regul., 8: 247295, 1974.
【非特許文献１１】Aswad, D. W., Paranandi, M. V., and Schurter, B. T. Isoaspartate in peptides and proteins: formation, significance, and analysis. J. Pharm. Biomed. Anal., 21: 1129-1136, 2000.
【非特許文献１２】Marchuk, D., Drumm, M., Saulino, A., and Collins, F.C. Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products. Nucl. Acids Res.19: 1154, 1990.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、心筋梗塞、脳梗塞、肝炎又は心臓・肺・肝臓・小腸・膵臓・腎臓の虚血再灌流障害等の、アポトーシスを伴う疾患の予防又は治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本願発明者らは、鋭意研究の結果、ヒトBcl-xL中の第５２番目（Ｎ末端から数えて５２番目。以下同様）のアスパラギン（以下、例えば第５２番目のアスパラギンを「アスパラギン５２」のように記載することがある）及び第６６番目のアスパラギンを、アラニンのような、側鎖の脱アミド化が起きないアミノ酸に置換することにより、細胞のアポトーシスが阻害され、さらに、このように置換したBcl-xLを細胞に投与又は細胞内で発現させることにより細胞のアポトーシスを阻害することができ、これを用いてアポトーシスを伴う疾患の予防又は治療を行うことができることに想到して本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド中の第５２番目のアスパラギン及び第６６番目のアスパラギンを、側鎖にアミド基を含まないアミノ酸で置換したポリペプチド、又は該ポリペプチドにおいて１個ないし数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、若しくは該ポリペプチドに１個ないし数個のアミノ酸が付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチド（ただし、配列番号１に示されるアミノ酸配列中の第５２番目のアスパラギン及び第６６番目のアスパラギンに対応するアスパラギンは側鎖にアミド基を含まないアミノ酸で置換されている）であって、アポトーシスの抑制に有効なポリペプチドを有効成分として含有する、アポトーシスを伴う疾患の予防又は治療剤を提供する。また、本発明は、上記ポリペプチドをコードする核酸を含み、哺乳動物細胞中で該ポリペプチドを発現することができるベクターから成る、アポトーシスを伴う疾患の予防又は治療用ベクターを提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、アポトーシスを抑制することによる、心筋梗塞、脳梗塞、肝炎又は心臓・肺・肝臓・小腸・膵臓・腎臓の虚血再灌流障害等の、アポトーシスを伴う疾患の予防又は治療剤が初めて提供された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列は、ヒトBcl-xLのアミノ酸配列である。本発明で用いられるポリペプチドは、このアミノ酸配列のアスパラギン５２及びアスパラギン６６の両方を、側鎖にアミド基を含まないアミノ酸で置換したポリペプチドである。側鎖にアミド基を含まないアミノ酸の例としては、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸のうち、アスパラギン及びグルタミン以外のアミノ酸を挙げることができる。下記実施例では、上記２つのアスパラギンをアラニンに置換しており、アラニンは好ましい例であるが、置換に用いられるアミノ酸は、アラニンに限定されるものではない。
【００１１】
また、一般に、生理活性を有するポリペプチドにおいて、少数のアミノ酸を置換し若しくは欠失させ、又は少数のアミノ酸を付加若しくは挿入しても、その生理活性が維持される場合があることは広く知られている。従って、配列番号１に示されるアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が置換し若しくは欠失し、又は該ポリペプチドに１個ないし数個（すなわち１個ないし９個）のアミノ酸が付加若しくは挿入されたアミノ酸配列を有するポリペプチドであって、アポトーシスの抑制に有効なポリペプチドも本発明において用いることができる。なお、この場合でも、配列番号１に示されるアミノ酸配列中の第５２番目のアスパラギン及び第６６番目のアスパラギンに対応するアスパラギンは側鎖にアミド基を含まないアミノ酸で置換されている必要がある。このようなポリペプチドの具体例として、下記実施例で作製した、アスパラギン５２及びアスパラギン６６に加えて、アスパラギン１８５をアラニンに置換したポリペプチドを挙げることができる。下記実施例に具体的に記載されるように、３つのアスパラギンが置換されたこのようなポリペプチドも、２つのアスパラギンのみが置換されたポリペプチドと同様に、細胞中でのタンパク質の脱アミド化が防止された。
【００１２】
本発明の治療又は予防剤の対象となる疾患は、アポトーシスを伴う疾患は、アポトーシスを伴うものであれば特に限定されないが、好ましい例として心筋梗塞、脳梗塞、肝炎又は心臓・肺・肝臓・小腸・膵臓・腎臓の虚血再灌流障害を挙げることができる。
【００１３】
上記ポリペプチドは、非経口投与することにより適用することができる。特に、患部組織への直接的な注射や、患部組織近傍の動脈への注入等の投与経路で投与することが好ましい。投与量は、疾患の種類や程度により適宜設定することができるが、通常、成人１日当たり、ポリペプチド 0.0001 ｍｇ〜100,000 ｍｇ、好ましくは 0.001 ｍｇ〜1,000 ｍｇ 程度である。
【００１４】
製剤化は、注射剤等の非経口投与に通常用いられる製剤方法により行うことができる。例えば、生理食塩水に上記ポリペプチドを溶解した注射液等を用いることができる。
【００１５】
上記ポリペプチドを直接投与することの他に、該ポリペプチドを細胞内で発現するベクターを投与することにより、上記ポリペプチドを細胞内で生産させてもよい。従って、本発明は、ポリペプチドをコードする核酸を含み、哺乳動物細胞中で該ポリペプチドを発現することができるベクターから成る、アポトーシスを伴う疾患の予防又は治療用ベクターをも提供する。ヒトの遺伝子治療に用いることができる哺乳動物細胞用ベクターとしては、アデノウイルスベクターのようなウイルスベクターや、プラスミドベクター、リポソーム性ベクター及びミセル性ベクターが知られており、市販もされており、これらのいずれをも用いることができる。例えば、プロメガ社のpCLベクター、pCIベクター、pSIベクター及びpTARGETベクター並びにインビトロジェン社のpcDNA5/TO等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１７】
１．材料と方法
(1)  ヒト肝臓組織及びセルライン
外科的切除の際に、肝臓細胞癌(HCC)組織とその隣接非腫瘍組織との組を２０組得た。結腸癌が転移した肝腫瘍に隣接する、１０例のヒト正常肝臓組織を手術の際に得た。全ての組織は使用時まで−８０℃で保存した。ヒト肝癌セルラインHepG2及びFOCUS（文献５）を、１０％熱不活化ウシ胎児血清添加DMEM（米国ミズーリー州St. LouisのSigma社製）中で培養した。
【００１８】
(2)  ウェスタン免疫ブロット
1% NP40, 0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、50μｇ/mlアプロチニン、100μｇ/mlフェニルメチルスルホニルフロリド、1 mMオルソバナジウム酸ナトリウム、50 mMフッ化ナトリウム及びPBSを含む溶解バッファー中で細胞又は組織をホモジナイズした。細胞溶解物は、10000 x gで４℃で２０分間遠心した。上清中のタンパク含量を、BCAタンパクアッセイキット（米国イリノイ州RockfordのPierce社製）により測定した。１レーン当たり２０μｇのタンパクを、10〜20% SDS-PAGE上で電気泳動により分離し、ニトロセルロース膜に転写した。該ニトロセルロース膜を、ウサギ抗Bcl-xポリクローナル抗体（米国カリフォルニア州Santa CruzのSanta Cruz Biotechnology社製）と共にインキュベートした。セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギ抗体及び強化化学発光装置（米国マサチューセッツ州BostonのNEN Life Science Products社製）を用いて、結合した一次抗体を可視化した。バンドの光学密度は、NIH Image Program, Version 1.61を用いて分析した。
【００１９】
(3)  インビトロでのフォスファターゼ処理
ビンクリスチン若しくはパクリタクセル(paclitaxel)(150〜500 ng/ml)で１８時間処理したHepG2細胞又は溶解バッファー[150 mM NaCl, 1% Triton X-100（商品名）, 50μｇ/mlアプロチニン、100μｇ/mlフェニルメチルスルホニルフロリド及び10 mM Tris-Cl (pH7.4)]で処理したヒト肝臓組織をホモジナイズした。細胞溶解物は、10000 x gで４℃で２０分間遠心した。２００単位のλ−ホスファターゼ（米国マサチューセッツ州BeverlyのEngland BioLabs社製）を添加し、又は添加することなく、２０μｇのタンパク溶解物を３０℃で２時間インキュベートしウェスタン分析に供した。
【００２０】
(4)  インビトロでの脱アミド化反応及びイソアスパラギン酸分析
組換えBcl-xLタンパク（ヒトBcl-xL全長並びにＮ末端ヒスチジン及びヘマグルチニンエピトープを含む（文献６））又は組織溶解物を、アルカリ性バッファー[25 mMグリシン-NaOH(pH10)]又は中性バッファー[50 mM Tris-Cl(pH7.2)]で、４℃又は３０℃で、６時間又は１６時間インキュベートした。SDS-PAGE上の移動度は、ウェスタン免疫ブロット又はクマシーブリリアントブルー染色により決定した。
【００２１】
組換えタンパク中のイソアスパラギン酸量は、L-イソアスパラチルメチルトランスフェラーゼにより触媒される、S-アデノシル-L-メチオニンからの3H-標識メチル基の酵素的転移により検出した（ISOQUANT（登録商標）イソアスパラギン酸検出キット（米国ワイオミング州MadisonのPromega社製、文献７）を使用）。結果は、イソアスパラギン酸含有ペプチドを標準として用いた、イソアスパラギン酸残基／タンパク(mol/mol)により表した。
【００２２】
(5)  部位特異的変異
QuickChange Site-Directed Mutagenesis System (商品名、米国カリフォルニア州La JollaのStratagene社製)を用いた部位特異的変異により、ヘマグルチニン(HA)−タグ化ヒトbcl-xL発現プラスミドpcDNA3HAbcl-xLから、アスパラギンに代えてアラニン５２、アラニン６６及び／又はアラニン１８５を含む変異bcl-xL(N52A, N66A, N185A, N52A/N66A, N66A/N185A, N52A/N185A及びN51K2A/N66A/N185A)を生成させ、その配列を確認した（「N52A」は、５２番目のアスパラギン（一文字表記でＮ）が、アラニン（一文字表記でＡ）に変異したことを示す。他も同様）。リポフェクチン試薬（米国メリーランド州GaithersburgのLife Technologies, Inc.製）を用い、FOCUS細胞を元のプラスミド又は変異プラスミドでトランスフェクトした。細胞溶解物はトランスフェクションの２日後に調製し、上記の通りウェスタンブロットに供した。なお、N52Aの変異の作出には、5'-gacccccagtgccatcgatggcaacccatcctgg-3'とそれに対応するアンチセンスプライマーを用い、N66Aの変異の作出には、5'-cagacagccccgcggtggatggagccactggccac-3' とそれに対応するアンチセンスプライマーを用いた。したがって、塩基配列の変異は、いずれも、aatがgatになったものであった。また、トランスフェクトの際のDNAとリポフェクチンの比は１：６であった。
【００２３】
(6)  トランスフェクション用組換えベクターの作製
5'側にHAタグ配列が付加された天然型ヒトbcl-xL cDNAおよびアスパラギン５２と６６残基をアラニンに置換した変異型ヒトbcl-xL cDNA（N52A/N66A）を、EcoRI制限酵素サイトにて挿入したpcDNA3ベクター(Invitrogen社製)をテンプレートとし、PCR法を用いてヒトbcl-xL cDNAフラグメントを作成した。PCR法による増幅の際、プライマーDNAにはセンス鎖、アンチセンス鎖にそれぞれSpeI、EcoRI制限酵素サイトを付加した。用いたセンス鎖プライマー及びアンチセンス鎖プライマーの塩基配列は、それぞれ次の通りであった。すなわち、センス鎖プライマーには5'-gactagtccaccatggcttctcagagcaaccgg-3'、アンチセンス鎖プライマーには5'-cggaattctggtcatttccgactgaag-3'を用いた。次に、pBluescriptII SK(+)(Stratagene社製)をEcoRV制限酵素サイトにて平滑末端に線状化し、3'末端にデオキシチミジン３リン酸を付加したものをベクターとし、変異型ヒトbcl-xL cDNA（N52A/N66AフラグメントをTAクローニング法（文献１２）にて挿入し、pBKT-Bcl-xL-N52A/N66A（変異型）を作成した。次に、このpBKT-bcl-xL-N52A/N66A（変異型）ベクターより、SpeI、EcoRI制限酵素を用いてbcl-xL-N52A/N66A（変異型）cDNAを切り出し、抽出・精製後に真核細胞発現ベクターであるpCL-neoベクター(Promega社製)に挿入しpCL-bcl-xL-N52A/N66A（変異型）を作成した。この発現ベクタープラスミドで大腸菌を形質変換し、その大腸菌を大量培養後GigaPrepまたはMaxiPrep（QIAGEN社）を用いて、pCL-bcl-xL- N52A/N66A（変異型）発現ベクターのプラスミドを精製し、トランスフェクションに供した。
【００２４】
(7)   bcl-xL-N52A/N66A（変異型）の遺伝子の安定発現細胞の樹立
Saos-2細胞（セルライン化したヒト骨肉腫細胞：ATCC No. HTB-85）にpCL-bcl-xL-N52A/N66A（変異型）をLipofectamine 2000 Reagent（Invitorogen社）を使用し、製品の添付文書に従って遺伝子導入した。遺伝子導入後、10%ウシ胎仔血清含有DMEM培地（SIGMA社）に選択抗生物質（G418 sulfate 1500μg/ml）を加えて培養し、bcl-xL-N52A/N66A（変異型）遺伝子の安定発現細胞を樹立した。さらに、この安定発現細胞をサブクローンして、bcl-xL-N52A/N66A（変異型）遺伝子の安定発現細胞クローン（52/66A細胞）を得た。
【００２５】
(8)   bcl-xL-N52A/N66A（変異型）遺伝子の安定発現細胞（52/66A細胞）の低酸素条件での検討
変異型ヒトBcl-xLを安定発現する52/66A細胞と遺伝子導入していないSaos-2親細胞(parent)を96 wellプレートに5 x 103細胞/wellずつ播種、0.５％ウシ胎仔血清含有DMEM（SIGMA社）培地中で、GasPackPlus（ベクトン・ディッキンソン社）を用いて低酸素条件（酸素濃度：10〜100 ppm）、３７℃にて４８時間培養した。培養後、細胞数を水溶性テトラゾリウム塩WST-8を用いたMTT変法（Cell Clounting Kit-8：同仁化学研究所社）により測定した。また、さらに、HistonDNA assay（Cell Deth Detection ELSAPLUS, Roche Diagnostics GmbH, Germany）を用いて、アポトーシスによるDNA断片化を検討した。
【００２６】
２．  結果
(1)  Bcl-xLは、ヒト肝臓組織中で二重バンドとして移動した
上記の通り、２０例の外科的に得られたヒトHCC組織、それに隣接する２０例の非腫瘍肝臓組織、及び１０例の正常肝臓組織におけるBcl-xLの発現を調べた。Bcl-xに対する抗体を用いたウェスタンブロットにおいて、これらのヒト肝臓組織から、見かけの分子量がそれぞれ30 kDa及び32 kDaの２種類の主なバンドが生じることがわかった。なお、これら２つのバンドは、抗Bcl-xL抗体の中和ペプチドの存在下では検出されなくなるので、いずれも抗Bcl-xL抗体と特異的に反応したものである。よりゆっくりと移動するバンド（32 kDaのバンド）は、正常ヒト肝臓組織及びHCC組織の隣接非腫瘍組織において、速く移動するバンド(30 kDaのバンド)よりも高レベルに発現していた。対照的に、過半数のHCC組織では、速く移動する30 kDaのBcl-xLバンドが32 kDaのBcl-xLバンドよりも高レベルに発現していた。32 kDaのバンドの吸光度に対する30 kDaのバンドの吸光度の比率（30 kDa/32 kDa）が１よりも大きい例は、２０例のHCC組織中１１例、２０例の隣接非腫瘍組織中１例、１０例の正常肝臓組織中０例であった(HCC対隣接非腫瘍組織又は正常組織の、有意ANOVA後のBonferroniの検定による有意差あり(P<0.01))。この結果を図１に示す。図１中の横軸中、「Normal」は正常肝臓組織、「NT」は隣接非腫瘍組織、「T」はHCC組織を示す。このように、過半数のHCC組織では、30 kDaバンドがBcl-xLの主な形態であり、正常組織及び非腫瘍肝臓組織中では、32 kDaのBcl-xLの相対量が増加する。
【００２７】
(2)  よりゆっくりと移動する32 kDaのBcl-xLは、リン酸化されていない
微小管破壊剤がBcl-xLのリン酸化を誘起し、このリン酸化により、ゲル電気泳動においてよりゆっくりと移動するBcl-xLが生産されることが最近報告されている（文献８）。このため、観察された32 kDaのバンドが、Bcl-xLタンパクがリン酸化されたものであるか否かを調べた。30 kDa及び32 kDaのバンドのBcl-xLの両方を内因性に発現している肝癌細胞HepG2を、微小管破壊剤であるビンクリスチン又はパクリタクセルで処理した。ビンクリスチン又はパクリタクセルでHepG2細胞を処理することにより、内因性の30 kDa及び32 kDaのBcl-xLよりもゆっくりと移動する約33 kDaのバンドがSDS-PAGEで現れた。この33 kDaのバンドは、電気泳動前にインビトロでλ−ホスファターゼ処理を行うことにより完全に消失したが、HepG2細胞内で内因性に発現した30 kDa及び32 kDaのBcl-xLの泳動パターンは当該処理によって何の影響も受けなかった。注目すべきことに、組織溶解物をλ−ホスファターゼで処理した場合でも、HCC組織内で内因性に発現した30 kDa及び32 kDaのBcl-xLの泳動パターンは当該処理によって影響を受けなかった。したがって、ヒト肝癌セルライン中及びヒト肝臓組織中で観察される30 kDa及び32 kDaのBcl-xLはリン酸化されたものではなく、従って、32 kDaのBcl-xLは、ビンクリスチン又はパクリタクセル処理により生じるリン酸化形態のBcl-xLとは異なるものである。
【００２８】
(3)  よりゆっくりと移動するバンドは、Bcl-xLの脱アミド化と関連する
組換えラットBcl-xLは、脱アミド化されることが示されている（文献９）。グリシンの１つ上流（Ｎ末端側）のアスパラギンは脱アミド化されることがあり、ヒトBcl-xLタンパクは、このような部位を３箇所含んでいる（アスパラギン５２、６６及び１８５（文献１０））。従って、30 kDa及び32 kDaのBcl-xLの電気泳動における移動度の相違は、タンパク質の脱アミド化の結果である可能性が考えられた。アルカリ条件下では、脱アミド化速度が早くなり、アスパラギンの脱アミド化により、アスパラギン酸とイソアスパラギン酸の混合物が生じる（文献１０、１１）。HCC組織溶解物を、アルカリ性バッファーで処理し、インビトロにおけるアスパラギンの脱アミド化を促進し、次いでウェスタンブロット分析によりBcl-xLの発現を調べた。組織溶解物をアルカリ性バッファー（ｐＨ１０）で３０℃、６時間処理すると、32 kDaバンドが増加し、30 kDaバンドが減少したが、４℃、６時間の処理では変化がなかった。同じアルカリ性緩衝液で、より長いインキュベーション時間（１６時間）、３０℃で処理すると、32 kDaバンドの強度がさらに増加し、30 kDaのバンドが消失した。同じ溶解物を中性バッファー（ｐＨ7.4）で、４℃又は３０℃で１６時間処理してもSDS-PAGE上のBcl-xLの移動度に影響はなかった。従って、タンパク質の脱アミド化を促進するアルカリ性条件により、30 kDaのBcl-xLが修飾されて32 kDaのBcl-xLが生じるものと考えられる。
【００２９】
Bc-xLの脱アミド化を確認するために、同一の実験条件下でアルカリ性バッファー処理されていた組換えヒトBcl-xLのイソアスパラギン酸含量を調べた。なぜなら、脱アミド化によってポリペプチド中のアスパラギン残基がアスパラギン酸とイソアスパラギン酸の混合物に転換され、残るアスパラギン酸は自発的にイソアスパラギン酸に転換されるからである。タンパク質のイソアスパラギン酸含量に相関する、タンパクイソアスパラチルメチルトランスフェラーゼに対する組換えBcl-xLのメチル−受容容量は、アルカリ処理後、有意に増加した(アルカリ処理前の0.04±0.01 mol/molタンパクに対して0.43±0.09 mol/molタンパク、Student'sのt検定でP<0.01)。このように、インビトロのアルカリ処理により、Bcl-xLタンパクの脱アミド化が生じ、アスパラギンの脱アミド化産物であるイソアスパラギン酸含量が増大した。さらに、同じアルカリ処理により、組換えBcl-xLが修飾されて、SDS-PAGE上でよりゆっくりと移動するようになった。これらの結果は、よりゆっくりと移動するBcl-xL分子が脱アミド化Bcl-xLタンパクであることを示唆している。
【００３０】
(4)  Bcl-xLは、アスパラギン５２及び６６で脱アミド化される。
「材料及び方法」の項で記載したように、アスパラギン５２、６６又は１８５をアラニンで置換した７種類のbcl-xL構築物(N52A, N66A, N185A, N52A/N66A, N66A/N185A, N52A/N158A及びN52A/N66A/N185A)を調製した。アラニンは脱アミド化されないので、アスパラギンをアラニンで置換することによりBcl-xLの脱アミド化が防止される。次に、変異bcl-xL発現プラスミドを、FOCUS肝癌細胞にトランスフェクトした。野生型bcl-xLプラスミドでトランスフェクトされたFOCUS細胞は、Bcl-xLを二重バンドとして発現した。一方、N52A, N66A, N185A, N66A/N185A又はN52A/N185AプラスミドでトランスフェクトされたFOCUS細胞はBcl-xLを二重バンドとして発現したが、N52A/N66A又はN52A/N66A/N185AプラスミドでトランスフェクトされたFOCUS細胞では、よりゆっくりと移動するBcl-xLバンドは検出されなかった。このように、アスパラギン５２及び６６の両方をアラニンで置換することにより、よりゆっくりと移動するBcl-xLの生産が阻害されたが、アスパラギン５２、６６若しくは１８５単独；アスパラギン６６と１８５の両方；又はアスパラギン５２と１８５の両方をアラニンで置換してもよりゆっくりと移動するBcl-xLタンパクの生成は阻害されなかった。これらの結果は、アスパラギン５２及び６６残基が、タンパクの脱アミド化を受ける部位であり、SDS-PAGEにおいてよりゆっくりと移動する形態のBcl-xLの生産に必要であることを示している。
【００３１】
アスパラギン５２及び６６残基が、Bcl-xLタンパクの脱アミド化による修飾を受ける部位であることを確認するために、野生型又は変異bcl-xLプラスミドをトランスフェクトしたFOCUS細胞の溶解物を、ウェスタン分析の前にアルカリ条件下で処理した。アルカリ処理により、野生型bcl-xLプラスミド、N52A, N66A, N185A, N66A/N185A又はN52A/N185AプラスミドをトランスフェクトしたFOCUS細胞中のよりゆっくりと移動するBcl-xLバンドの密度が増したが、N52A/N66A又はN52A/N66A/N185AプラスミドでトランスフェクトしたFOCUS細胞中のよりゆっくりと移動するBcl-xLバンドは全く増加しなかった。これらの結果により、インビトロでのアルカリ処理によってタンパクの脱アミド化が促進される実験条件下であっても、アスパラギン５２と６６の両方をアラニンで置換することにより、SDS-PAGE上でよりゆっくりと移動するBcl-xLバンドの生成が妨げられることが確認された。これにより、Bcl-xLのアスパラギン５２及び６６が、脱アミド化を受ける部位であると結論できる。
【００３２】
(5)   bcl-xL-N52A/N66A（変異型）遺伝子の安定発現細胞（52/66A細胞）の低酸素条件での検討
変異型ヒトBcl-xLを安定発現する細胞（52/66A）と遺伝子導入していないSaos-2親細胞（parent）を96 wellプレートに5 x 103細胞/wellずつ播種し、0.５％ウシ胎仔血清含有DMEM（SIGMA社）培地中で、GasPackPlus（ベクトン・ディッキンソン社）を用いて低酸素条件（酸素濃度：10〜100 ppm）、３７℃にて４８時間培養した。培養後、細胞数を水溶性テトラゾリウム塩WST-8を用いたMTT変法（Cell Clounting Kit-8：同仁化学研究所社）で測定すると、52/66A細胞はparent細胞に比べ有意に高い増殖能を示した（図２）。また、parent細胞は低酸素条件（hypoxia）ではアポトーシスにより細胞数が減少したが、52/66A細胞は低酸素条件によって細胞数および増殖能に影響を受けなかった（図２）。さらに、Cell Death Detection ELISAPLUSを用いて、アポトーシスにより断片化を起こしたヒストン結合性DNAを測定すると、 parent細胞は正常酸素濃度においても増殖に伴いアポトーシスを起こすことから、DNAの断片化が認められたが（図３，control）、低酸素ではDNAの断片化がさらに有意に増加した（図３，hypoxia）。これに対して、52/66A細胞はparent細胞に比べDNAの断片化を起こしにくく、低酸素の条件下においてもDNAの断片化量がparent細胞に比べ有意に少ないことが明らかになった（図３）。従って、52/66A 細胞はparent細胞に比べ、低酸素条件およびアポトーシスに抵抗性を有することが示された。なお、図２及び図３中のコントロール（control）の条件は、酸素濃度20%、二酸化炭素濃度５％、３７℃にて４８時間培養であった。
【００３３】
以上より変異型ヒトBcl-xLは低酸素条件における耐性を高め、細胞のアポトーシスを抑制することが証明された。従って、変異型ヒトBcl-xLは心筋梗塞、脳梗塞および各種臓器虚血に対して臓器保護と抗アポトーシス効果を示すことを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】正常肝臓組織、隣接非腫瘍組織、HCC組織における、Bcl-xLの30 kDaのバンドと32 kDaのバンドの吸光度の比率を示す図である。
【図２】本発明の予防又は治療剤の実施例である変異型Bcl-xLを発現する組換えベクターをヒト骨肉腫細胞株に導入した細胞（52/66A）又は導入しない親細胞（parent）を、通常条件下（control）又は低酸素条件下（hypoxia）で培養した後の生存細胞数を、水溶性テトラゾリウム塩WST-8を用いたMTT変法により測定した結果を示す図である。
【図３】本発明の予防又は治療剤の実施例である変異型Bcl-xLを発現する組換えベクターをヒト骨肉腫細胞株に導入した細胞（52/66A）又は導入しない親細胞（parent）を、通常条件下（control）又は低酸素条件下（hypoxia）で培養した後のＤＮＡ断片化の程度を、Cell Death Detection ELISAPLUSを用いて測定した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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