(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の検出工程１、検出工程２および推定工程を含む、リシンの検出方法；
（１）検出工程１：
下記一般式（I）
0004815576.tif 000030
〔式中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示し；側鎖部位中のｐは１〜１７の整数を示す。〕で表されるラクトース含有化合物が、Ｙを介して基材１の表面に固定されている検出基材１の表面に、試験化合物を接触させ、検出基材１に結合した化合物を検出する工程、
（２）検出工程２：
下記一般式（II）
0004815576.tif 000031
〔式中、ｍは２〜２０の整数を示し、Ｚは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示し；側鎖部位中のｑは１〜１７の整数を示す。〕で表されるガラクトース含有化合物が、Ｚを介して基材２の表面に固定されている検出基材２の表面に、前記検出工程１で用いたのと同一の試験化合物を接触させ、検出基材２に結合した化合物を検出する工程、
（３）推定工程：
(a)前記検出工程１において、検出基材１の表面に結合した化合物が実質的に検出されない場合、試験化合物にリシン６０が含有されていないと推定し；
(b)前記検出工程１において、検出基材１の表面に結合した化合物が実質的に検出され、前記検出工程２において、検出基材２の表面に結合した化合物が実質的に検出されない場合に、試験化合物にリシン６０が含有されていると推定し；
(c)前記検出工程１および検出工程２において、検出基材１および２のいずれにおいても表面に結合した化合物が実質的に検出される場合、試験化合物にリシン１２０が含有されていると推定する。
【請求項２】
検出工程１および／または検出工程２の前に、さらに試験化合物を分離精製する分離工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（３）推定工程において、(c)前記検出工程１および検出工程２において、検出基材１および２のいずれにおいても表面に結合した化合物が実質的に検出される場合、さらに前記分離工程を行い、該分離工程を経て得られた各化合物それぞれについて前記検出工程１および／または検出工程２を行う、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記分離精製した各化合物について、検出工程後の推定工程（３’）が下記のとおりである、請求項２または３に記載の方法；
(a’)前記検出工程１において、検出基材１の表面に結合した化合物が実質的に検出されない場合、該化合物はリシン６０ではないと推定し；
(b’)前記検出工程１において、検出基材１の表面に結合した化合物が実質的に検出され、前記検出工程２において、検出基材２の表面に結合した化合物が実質的に検出されない場合、該化合物はリシン６０であると推定し：
(c’) 前記検出工程１および検出工程２において、検出基材１および２のいずれにおいても表面に結合した化合物が実質的に検出される場合、該化合物はリシン６０ではないと推定する。
【請求項５】
前記基材１および２がそれぞれ金属基板１および２であり、前記ラクトース含有化合物が金属基板１に固定された検出基材１がセンサーチップ１、前記ガラクトース含有化合物が金属基板２に固定された検出基材２がセンサーチップ２である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ラクトース含有化合物および前記ガラクトース含有化合物が、それぞれ金属基板１および２に固定されたときの密度が０．１〜１０個／ｎｍ2である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記金属基板１および２が、金基板である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記センサーチップがＳＰＲセンサー用である、請求項５〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記基材１および２がそれぞれ微粒子１および２であり、前記ラクトース含有化合物が該微粒子１に固定されたリシン検出用微粒子１、および前記ガラクトース含有化合物が該微粒子２に固定されたリシン検出用微粒子２が、それぞれ溶液中にコロイドで存在している、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記微粒子１および２の平均粒子径が、１〜１００ｎｍの範囲にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記微粒子１および２が、金属微粒子または半導体微粒子である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
下記検出基材１および下記検出基材２を含む、リシン検出用基材；
（１）下記一般式（I）
0004815576.tif 000032
〔式中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示し；側鎖部位中のｐは１〜１７の整数を示す。〕で表されるラクトース含有化合物が、Ｙを介して基材１の表面に固定された、検出基材１：
（２）下記一般式（II）
0004815576.tif 000033
〔式中、ｍは２〜２０の整数を示し、Ｚは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示し；側鎖部位中のｑは１〜１７の整数を示す。〕で表されるガラクトース含有化合物が、Ｚを介して基材２の表面に固定された、検出基材２。
【請求項１３】
下記のセンサーチップ１およびセンサーチップ２を含む、リシン検出用センサーチップ；
（１）下記一般式（I）
0004815576.tif 000034
〔式中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示し；側鎖部位中のｐは１〜１７の整数を示す。〕で表されるラクトース含有化合物が、Ｙを介して金属基板１の表面に固定された、センサーチップ１；
（２）下記一般式（II）
0004815576.tif 000035
〔式中、ｍは２〜２０の整数を示し、Ｚは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示し；側鎖部位中のｑは１〜１７の整数を示す。〕で表されるガラクトース含有化合物が、Ｚを介して金属基板２の表面に固定された、センサーチップ２。
【請求項１４】
前記ラクトース含有化合物と前記ガラクトース含有化合物とが、同一の金属基板表面に固定されている、請求項１３に記載のセンサーチップ。
【請求項１５】
前記ラクトース含有化合物および前記ガラクトース含有化合物が、それぞれ金属基板１および２に固定されたときの密度が０．１〜１０個／ｎｍ2である、請求項１３または１４に記載のセンサーチップ。
【請求項１６】
前記金属基板１および２が、金基板である、請求項１３〜１５のいずれかに記載のセンサーチップ。
【請求項１７】
前記センサーチップがＳＰＲセンサー用である、請求項１３〜１６のいずれかに記載のセンサーチップ。
【請求項１８】
下記検出試薬１および下記検出試薬２を含む、リシン検出用キット；
（１）下記一般式（I）
0004815576.tif 000036
〔式中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示し；側鎖部位中のｐは１〜１７の整数を示す。〕で表されるラクトース含有化合物が、Ｙを介して微粒子１の表面に固定された、リシン検出用微粒子１を含有する検出試薬１：
（２）下記一般式（II））：
0004815576.tif 000037
〔式中、ｍは２〜２０の整数を示し、Ｚは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示し；側鎖部位中のｑは１〜１７の整数を示す。〕で表されるガラクトース含有化合物が、Ｚを介して微粒子２の表面に固定された、リシン検出用微粒子２を含有する検出試薬２。
【請求項１９】
前記検出試薬１および検出試薬２において、前記リシン検出用微粒子１およびリシン検出用微粒子２がそれぞれ溶液中にコロイドで存在している、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記微粒子１および２の平均粒子径が、１〜１００ｎｍの範囲にある、請求項１８または１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記微粒子１および２が金属微粒子または半導体微粒子である、請求項１８〜２０のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リシンの検出方法、リシン検出用キット、リシン検出用センサーチップに関する。より詳しくは、リシン６０とリシン１２０とを区別してリシンを検出する方法、キット、センサーチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
植物由来のタンパク性毒素であるリシンは、トウゴマ（ヒマ：Ricinus communis）の種子から抽出され、２種の構造的に関連した蛋白質の混合物として得られる。一つは分子量が６０ｋＤａのリシン６０、他の一つはリシン６０とホモロジーが高度に類似（アミノ酸配列のホモロジーが約９０％）した極めて類似なタンパク質の２量体である分子量１２０ｋＤａのリシン１２０である。【０００３】
分子量６０ｋＤａのリシン（リシン６０）の場合、Ａ鎖（分子量２８ｋＤａ）とＢ鎖（分子量３２ｋＤａ）の２つのサブユニットで構成され、両者は、ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）でつながっている。Ｂ鎖は、細胞表面のオリゴ糖に結合し、−Ｓ−Ｓ−結合を還元した後、エンドサイトーシスによって、Ａ鎖を細胞の中に取り込む。Ａ鎖は、２８ＳリボソームＲＮＡに作用し、Ａ4324を加水分解することで、タンパク質の生合成を阻害し、細胞を死滅させる。このような性質を持つリシン６０は、３〜５μｇ／ｋｇ（吸引）投与量で死に至らしめる強力な毒素であり、その原料であるトウゴマは温帯地域に広く分布していて比較的入手しやすく、リシン６０を生産することも容易である。また、リシン６０は安定したエアロゾルが可能であり、中毒症状に対する治療法や予防ワクチンも十分に存在しないことから、潜在的な生物化学兵器の構成要素となる危険性もある。リシン６０は、現在化学兵器の禁止及び特定物質の規制等に関する法律において特定物質に指定されており、その製造、所持、使用は規制されている。【０００４】
このため、リシン６０の検出方法の確立が近年重要になってきている。これまで、リシン６０の検出方法としては、たとえば抗原抗体法が挙げられる。そのうちで、免疫クロマトグラフィー法を原理とした免疫ストリップは現場使用用に市販されており、１５分程度のマニュアル操作で、現場試料から検出することが可能であるが、検出感度は高いものではなく、概ね100ng/mlである（非特許文献１）。さらに、抗原抗体法の場合、使用する抗体は蛋白質であり変性を受ける可能性があるために、低温での管理が必要であったり、また室温保管が可能であっても保証有効期限が短いなどの課題がある。特に、温度管理が困難であったり、長期の使用を余儀なくされる地域においては、より簡便でどこでも使用できる検出方法の開発が望まれていた。【０００５】
また、通常、リシン６０等の検出においては、一つの方法のみによるのではなく、必要に応じ複数の検出方法を組み合わせることにより、検出確度を向上させる。このため、抗原抗体法に加え、さらに有効な検出方法の確立も望まれていた。【０００６】
一方、上述のとおり、リシン毒素にはリシン６０とリシン１２０の２種類存在するが、これらは分子量が大きく異なるものの、同一原料から得られ、しかも、タンパク質のホモロジーが極めて高く、これらが混在した場合には、猛毒であるリシン６０が含まれるか否かを短時間で正確に検出する有効な方法がこれまで存在していなかった。【０００７】
ところで、これまで天然の糖脂質を何ら修飾することなく、ラクトースセラミドおよびガラクトースセラミド等を用いたリポソームによるリシン６０の検出に関する報告されている（非特許文献２）。ここでは、ラクトースセラミドおよびガラクトースセラミドのいずれでもリシン６０の検出ができたことが記載されているが、これら両化合物の検出感度は低く、また感度は同程度であり、リシン１２０の検出についての記載はない。【０００８】
また、別の報告では、糖脂質を用いたリポソームによる表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：SPR）を用いたリシン６０の計測の報告がなされている（非特許文献３）。しかしこの報告では、測定感度が低く、またラクトースセラミドおよびガラクトースセラミドを用いた場合には、リシン６０とのインターラクションが観測されないか、または極めて低いと記載されている。また、リシン１２０の検出についての記載はない。
【非特許文献１】Japanese Journal of Forensic Toxicology, Vol. 22, 13-16, 2004
【非特許文献２】Analytical Chemistry, Vol. 73, 72-79, January 1, 2001
【非特許文献３】Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 30 (2003) 13-24
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、特定の糖化合物を用いて、簡便かつ迅速に高い検出感度でリシンを検出する方法を提供することを課題とする。特に、リシン６０と極めて類似なタンパク質の２量体であるリシン１２０との混合物においても、これらを区別して簡便かつ迅速にリシンを検出できる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題を鑑み鋭意研究の結果、ラクトース型の糖鎖部位を有するセラミド化合物（ラクトース含有化合物）、ガラクトース型の糖鎖部位を有するセラミド化合物（ガラクトース含有化合物）を、それぞれ、金属基板や金属微粒子等の基材に固定化すると、高度な配向性で高密度に固定を行うことができることを見出した。
さらに、（１）ラクトース含有セラミド化合物を含有する基材をセンサーあるいは検出試薬等として用いると、極微量のリシン６０およびリシン１２０を高感度で迅速に検出・定量でき、（２）ガラクトース含有セラミド化合物を含有する基材をセンサーあるいは検出試薬等として用いると、極微量のリシン１２０のみを高感度で迅速に検出・定量することができることを見出した。（１）および（２）の結果により、猛毒のリシン６０のみを選択的に、高感度で迅速に検出・定量・判定することができることを見出し、本発明を完成した。【００１１】
すなわち本件発明は以下を含む。
〔１〕  
下記の検出工程１、検出工程２および認定工程を含む、リシンの検出方法；
（１）検出工程１：
下記一般式（I）
0004815576.tif 000002
〔式中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示し；側鎖部位中のｐは１〜１７の整数を示す。〕で表されるラクトース含有化合物が、Ｙを介して基材１の表面に固定されている検出基材１の表面に、試験化合物を接触させ、検出基材１に結合した化合物を検出する工程、
（２）検出工程２：
下記一般式（II）
0004815576.tif 000003
〔式中、ｍは２〜２０の整数を示し、Ｚは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示し；側鎖部位中のｑは１〜１７の整数を示す。〕で表されるガラクトース含有化合物が、Ｚを介して基材２の表面に固定されている検出基材２の表面に、前記検出工程１で用いたのと同一の試験化合物を接触させ、検出基材２に結合した化合物を検出する工程、
（３）推定工程：
(a)前記検出工程１において、検出基材１の表面に結合した化合物が実質的に検出されない場合、試験化合物にリシン６０が含有されていないと推定し；
(b)前記検出工程１において、検出基材１の表面に結合した化合物が実質的に検出され、前記検出工程２において、検出基材２の表面に結合した化合物が実質的に検出されない場合に、試験化合物にリシン６０が含有されていると推定し；
(c)前記検出工程１および検出工程２において、検出基材１および２のいずれにおいても表面に結合した化合物が実質的に検出される場合、試験化合物にリシン１２０が含有されていると推定する。
〔２〕
検出工程１および／または検出工程２の前に、さらに試験化合物を分離精製する分離工程を含む、〔１〕に記載の方法。
〔３〕
前記（３）推定工程において、(c)前記検出工程１および検出工程２において、検出基材１および２のいずれにおいても表面に結合した化合物が実質的に検出される場合、さらに前記分離工程を行い、該分離工程を経て得られた各化合物それぞれについて前記検出工程１および／または検出工程２を行う、〔２〕に記載の方法。
〔４〕
前記分離精製した各化合物について、検出工程後の推定工程（３’）が下記のとおりである、〔２〕または〔３〕に記載の方法；
(a’)前記検出工程１において、検出基材１の表面に結合した化合物が実質的に検出されない場合、該化合物はリシン６０ではないと推定し；
(b’)前記検出工程１において、検出基材１の表面に結合した化合物が実質的に検出され、前記検出工程２において、検出基材２の表面に結合した化合物が実質的に検出されない場合、該化合物はリシン６０であると推定し：
(c’) 前記検出工程１および検出工程２において、検出基材１および２のいずれにおいても表面に結合した化合物が実質的に検出される場合、該化合物はリシン６０ではないと推定する。
〔５〕  
前記基材１および２がそれぞれ金属基板１および２であり、前記ラクトース含有化合物が金属基板１に固定された検出基材１がセンサーチップ１、前記ガラクトース含有化合物が金属基板２に固定された検出基材２がセンサーチップ２である、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔６〕
前記ラクトース含有化合物および前記ガラクトース含有化合物が、それぞれ金属基板１および２に固定されたときの密度が０．１〜１０個／ｎｍ2である、〔５〕に記載の方法。
〔７〕
前記金属基板１および２が、金基板である、〔５〕または〔６〕に記載の方法。
〔８〕
前記センサーチップがＳＰＲセンサー用である、〔５〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕
前記基材１および２がそれぞれ微粒子１および２であり、前記ラクトース含有化合物が該微粒子１に固定されたリシン検出用微粒子１、および前記ガラクトース含有化合物が該微粒子２に固定されたリシン検出用微粒子２が、それぞれ溶液中にコロイドで存在している、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕
前記微粒子１および２の平均粒子径が、１〜１００ｎｍの範囲にある、〔９〕に記載の方法。
〔１１〕  
前記微粒子１および２が、金属微粒子または半導体微粒子である、〔９〕または〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕
下記検出基材１および下記検出基材２を含む、リシン検出用基材；
（１）下記一般式（I）
0004815576.tif 000004
〔式中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示し；側鎖部位中のｐは１〜１７の整数を示す。〕で表されるラクトース含有化合物が、Ｙを介して基材１の表面に固定された、検出基材１：
（２）下記一般式（II）
0004815576.tif 000005
〔式中、ｍは２〜２０の整数を示し、Ｚは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示し；側鎖部位中のｑは１〜１７の整数を示す。〕で表されるガラクトース含有化合物が、Ｚを介して基材２の表面に固定された、検出基材２。
〔１３〕
下記のセンサーチップ１およびセンサーチップ２を含む、リシン検出用センサーチップ；
（１）下記一般式（I）
0004815576.tif 000006
〔式中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示し；側鎖部位中のｐは１〜１７の整数を示す。〕で表されるラクトース含有化合物が、Ｙを介して金属基板１の表面に固定された、センサーチップ１；
（２）下記一般式（II）
0004815576.tif 000007
〔式中、ｍは２〜２０の整数を示し、Ｚは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示し；側鎖部位中のｑは１〜１７の整数を示す。〕で表されるガラクトース含有化合物が、Ｚを介して金属基板２の表面に固定された、センサーチップ２。
〔１４〕
前記ラクトース含有化合物と前記ガラクトース含有化合物とが、同一の金属基板表面に固定されている、〔１３〕に記載のセンサーチップ。
〔１５〕
前記ラクトース含有化合物および前記ガラクトース含有化合物が、それぞれ金属基板１および２に固定されたときの密度が０．１〜１０個／ｎｍ2である、〔１３〕または〔１４〕に記載のセンサーチップ。
〔１６〕
前記金属基板１および２が、金基板である、〔１３〕〜〔１５〕のいずれかに記載のセンサーチップ。
〔１７〕
前記センサーチップがＳＰＲセンサー用である、〔１３〕〜〔１６〕のいずれかに記載のセンサーチップ。
〔１８〕
下記検出試薬１および下記検出試薬２を含む、リシン検出用キット；
（１）下記一般式（I）
0004815576.tif 000008
〔式中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示し；側鎖部位中のｐは１〜１７の整数を示す。〕で表されるラクトース含有化合物が、Ｙを介して微粒子１の表面に固定された、リシン検出用微粒子１を含有する検出試薬１：
（２）下記一般式（II））：
0004815576.tif 000009
〔式中、ｍは２〜２０の整数を示し、Ｚは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示し；側鎖部位中のｑは１〜１７の整数を示す。〕で表されるガラクトース含有化合物が、Ｚを介して微粒子２の表面に固定された、リシン検出用微粒子２を含有する検出試薬２。
〔１９〕
前記検出試薬１および検出試薬２において、前記リシン検出用微粒子１およびリシン検出用微粒子２がそれぞれ溶液中にコロイドで存在している、〔１８〕に記載のキット。
〔２０〕
前記微粒子１および２の平均粒子径が、１〜１００ｎｍの範囲にある、〔１８〕または〔１９〕に記載のキット。
〔２１〕  
前記微粒子１および２が金属微粒子または半導体微粒子である、〔１８〕〜〔２０〕のいずれかに記載のキット。【００１２】
<リシンの検出方法>
本発明に係るリシンの検出方法は、下記の検出工程１、検出工程２および認定工程を含む。【００１３】
下記の検出工程１、検出工程２および認定工程を含む、リシンの検出方法；
（１）検出工程１：
下記一般式（I）
0004815576.tif 000010
〔式中、ｎは２〜２０の整数を示し、Ｙは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示し；側鎖部位中のｐは１〜１７の整数を示す。〕で表されるラクトース含有化合物が、Ｙを介して基材１の表面に固定されている検出基材１の表面に、試験化合物を接触させ、検出基材１に結合した化合物を検出する工程、
（２）検出工程２：
下記一般式（II）
0004815576.tif 000011
〔式中、ｍは２〜２０の整数を示し、Ｚは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示し；側鎖部位中のｑは１〜１７の整数を示す。〕で表されるガラクトース含有化合物が、Ｚを介して基材２の表面に固定されている検出基材２の表面に、前記検出工程１で用いたのと同一の試験化合物を接触させ、検出基材２に結合した化合物を検出する工程、
（３）推定工程：
(a)前記検出工程１において、検出基材１の表面に結合した化合物が実質的に検出されない場合、試験化合物にリシン６０が含有されていないと推定し；
(b)前記検出工程１において、検出基材１の表面に結合した化合物が実質的に検出され、前記検出工程２において、検出基材２の表面に結合した化合物が実質的に検出されない場合に、試験化合物にリシン６０が含有されていると推定し；
(c)前記検出工程１および検出工程２において、検出基材１および２のいずれにおいても表面に結合した化合物が実質的に検出される場合、試験化合物にリシン１２０が含有されていると推定する。【００１４】
すなわち、本発明で用いるラクトース含有化合物が固定された検出基材１は、リシン６０およびリシン１２０に対する結合能が極めて高く、本発明で用いるガラクトース含有化合物が固定された検出基材２はリシン１２０に対してのみ結合能が極めて高い。
このため、前記推定工程（ａ）に該当する場合は、検出基材１の表面に結合した化合物が実質的に検出されない場合、試験化合物にリシン６０が含有されていないと推定できる。
また、前記推定工程（ｂ）に該当する場合は、前記検出工程１において、基材１の表面に結合した化合物が実質的に検出され、前記検出工程２において、基材２の表面に結合した化合物が実質的に検出されない場合に、試験化合物にリシン６０が含有されていると推定することができる。
さらに、前記推定工程（ｃ）に該当する場合は、前記検出工程１および検出工程２において、検出基材１および２のいずれにおいても表面に結合した化合物が実質的に検出される場合、試験化合物にリシン１２０が含有されていると推定することができる。【００１５】
ここで、前記推定工程（ｃ）に該当する場合、リシン１２０の存在を推定できるが、リシン１２０が存在する場合にさらにリシン６０が混入しているか否かは判定できない。しかし、リシン１２０はリシン６０に類似したタンパク質の２量体で、それぞれ分子量が１２０ｋＤａ、６０ｋＤａと著しく異なるため、分子量１０万程度の分画フィルターなどによる除去や、分子ふるいによる分離を行なうことによって、これらを容易に短時間で分離精製することができる。したがって、推定工程（ｃ）に該当する場合は、試験化合物を分離工程に供し、リシン６０が含有されている場合でもリシン１２０とリシン６０とを分離精製し、分離した化合物それぞれについて、再び、検出工程１および／または検出工程２を実施すればよい。あるいは、予め、試験化合物を分離精製して、各化合物について、上記検出工程１および検出工程２を実施してもよい。【００１６】
このような分離工程を行って、各化合物について検出工程を行う場合、下記(a’)、（b’）、（c’）の推定工程（３’）に従って、各化合物がリシン６０と推定できるのか、リシン１２０と推定できるのかを判断できる。【００１７】
推定工程（３’）
(a’)前記検出工程１において、検出基材１の表面に結合した化合物が実質的に検出されない場合、該化合物はリシン６０ではないと推定する。
(b’)前記検出工程１において、検出基材１の表面に結合した化合物が実質的に検出され、前記検出工程２において、検出基材２の表面に結合した化合物が実質的に検出されない場合、該化合物はリシン６０であると推定することができる。
(c’) 前記検出工程１および検出工程２において、検出基材１および２のいずれにおいても表面に結合した化合物が実質的に検出される場合、該化合物はリシン６０ではないと推定することができる。【００１８】
本明細書において「実質的に検出」とは、ノイズ程度の検出を除くことを意味する。【００１９】
本明細書において「リシン６０」とは、トウゴマ（ヒマ：Ricinus communis）の種子から抽出されるタンパク質であり、分子量が６０ｋＤａで、Ａ鎖（分子量２８ｋＤａ）とＢ鎖（分子量３２ｋＤａ）の２つのサブユニットで構成され、−Ｓ−Ｓ−結合でつながっている化合物である。「リシン１２０」はリシン６０とホモロジーが極めて類似なタンパク質の２量体であり、トウゴマからリシン６０とともに抽出される。なお、本明細書において、「リシン６０」および「リシン１２０」を、まとめて「リシン」という。【００２０】
<ラクトース含有化合物>
前記ラクトース含有化合物は、下記一般式（I）で表される。
0004815576.tif 000012
【００２１】
式中、ｎは２〜２０の整数を示し、好ましくは２〜１０、さらに好ましくは３〜８、特に好ましくは３〜５である。前記ｐは、好ましくは１〜１７の整数を示し、より好ましくは７〜１７、さらに好ましくは１０〜１５である。【００２２】
このような式（I）で表されるように、リンカー部位（−ＣＯＣnＨ2nY）と側鎖部位（−ＣＨ（ＯＨ）Ｃ＝ＣＣpＨ2pＣＨ3）とを有すると、ラクトース含有化合物をセンサーに適した配向性で高密度に基板や微粒子に固定することができるとともに、ラクトース含有化合物を含有するバイオセンサー、あるいはラクトース含有化合物が固定された微粒子を含有する検出試薬を用いると、極微量のリシン６０およびリシン１２０でも高感度に検出・定量できる。【００２３】
特に、式（I）において、ｎが上記範囲にあると、ラクトース含有化合物を、基板表面あるいは微粒子表面に結合したときのセンサーの感度が向上するとともに、リシン６０およびリシン１２０との結合に適した密度・配向性をもって基板表面または微粒子表面に効果的に結合させることができる。【００２４】
前記式中、Ｙは１個又は２個以上のチオール基または１個又は２個以上ジスルフィド基を有する基を示す。本明細書において「チオール基」とは−ＳＨで表される基であり、「ジスルフィド基」とは、−Ｓ−Ｓ−で表される構造を有する基である。【００２５】
前記ジスルフィド基としては、好ましくは環状ジスルフィド基が挙げられ、このうち５員環のジチオラニル基、たとえば１，２−ジチオラン−３−イル基、１，２−ジチオラン−４−イル基など、６員環のジチアニル基、たとえば１，２−ジチアン−３−イル基、１，２−ジチアン−４−イル基などが挙げられる。これらのうちでは、５員環のジチオラニル基が好ましく、１，２−ジチオラン−３−イル基がより好ましい。また、チオクト酸（リポ酸）から誘導される基を用いることもできる。【００２６】
これらのうちでは、ジスルフィド基が好ましい。ジスルフィド基の場合、ラクトース含有化合物を基板表面又は微粒子表面に強固に安定に固定化することができる。特に、前記式（I）で表される基では、通常ならば、ラクトース含有化合物のラクトース部位、リンカー部位、および側鎖部位の立体障害が予測され、結合密度の低下、感度低下などが考えられるが、本発明のように特定のリンカーと側鎖とジスルフィド基の組み合わせにより、強固で安定な固定化が可能となり、立体障害の影響がなく高感度のセンサーとすることができる。
これは、側鎖部位がリンカー部位の長さに応じて折り畳み構造をとり、折りたたまれた側鎖部位によって、糖脂質含有化合物同士がリシンのような糖結合性化合物との結合に適した高配向性をもって基板表面や微粒子表面に効果的に結合するためではないかと推測される。【００２７】
さらに、式（I）において、前記−ＣＯＣnＨ2nYの主鎖に含まれる原子の合計数（Ｎ１）と、前記−ＣＨ（ＯＨ）Ｃ＝ＣＣpＨ2pＣＨ3の主鎖に含まれる原子の合計数（Ｎ２）とは、好ましくはＮ１：Ｎ２＝１：１．５〜１：５、さらに好ましくは１：２〜１：３の範囲にある。【００２８】
なお、Ｎ１においては、前記−ＣＯＣnＨ2nYにおいてＹ中の硫黄原子と−ＣＯとを最長で結合する複数の原子を、主鎖を構成する原子とし、Ｙがジスルフィド基の場合はそのうちの−ＣＯに近い硫黄原子側を主鎖上の原子とし、合計数Ｎ１には硫黄原子を含まない。また、Ｎ２においては、前記−ＣＨ（ＯＨ）Ｃ＝ＣＣpＨ2pＣＨ3において末端の−ＣＨ3と−ＣＨ（ＯＨ）を最長で結合する複数の原子を、主鎖を構成する原子とする。【００２９】
式（I）中、−ＮＨとこれに隣接する−ＯＨは、Ｄ−エリスロ体であることが好ましい。【００３０】
このような式（I）の側鎖部位が含まれていると、側鎖部位が存在しない場合と比較して、検出感度を格段に向上させることができる。さらに、このような炭素数あるいは原子数で側鎖部位が構成され、側鎖部位が前記リンカー部位の長さよりも大きい長さとなる場合、ラクトース含有化合物をよりセンサーに適した配向性で基板や微粒子に固定することができるとともに、該ラクトース含有化合物を含有するセンサーチップ（バイオセンサー）あるいはラクトース含有化合物が固定された微粒子を含有する検出試薬を用いると、より微量のリシン６０およびリシン１２０でも高感度に検出・定量できる。【００３１】
<ガラクトース含有化合物>
前記ガラクトース含有化合物は、下記一般式（II）で表される。
0004815576.tif 000013
【００３２】
式中、ｍは２〜２０の整数を示し、好ましくは２〜１０、さらに好ましくは３〜８、特に好ましくは３〜５である。前記ｑは、好ましくは１〜１７の整数を示し、より好ましくは７〜１７、さらに好ましくは１０〜１５である。【００３３】
このような式（II）で表されるように、リンカー部位（−ＣＯＣｍＨ2ｍＺ）と側鎖部位（−ＣＨ（ＯＨ）Ｃ＝ＣＣｑＨ2ｑＣＨ3）とを有すると、ガラクトース含有化合物をセンサーに適した配向性で高密度に基板や微粒子に固定することができるとともに、ガラクトース含有化合物が固定されたバイオセンサーあるいは微粒子を含有する検出試薬を用いると、極微量のリシン１２０でも高感度に検出・定量できる一方、リシン６０については実質的に検出されない。【００３４】
特に、式（II）において、ｍが上記範囲にあると、ガラクトース含有化合物を、基板表面あるいは微粒子表面に結合したときのセンサーの感度が向上するとともに、リシン１２０との結合に適した密度・配向性をもって基板表面または微粒子表面に効果的に結合させることができる。【００３５】
前記式（II）中、Ｚは式（I）中のＹと同様であり、好ましい態様も同様である。【００３６】
さらに、式（II）において、前記−ＣＯＣｍＨ2ｍＺの主鎖に含まれる原子の合計数（Ｎ１）と、前記−ＣＨ（ＯＨ）Ｃ＝ＣＣｑＨ2ｑＣＨ3の主鎖に含まれる原子の合計数（Ｎ２）とは、好ましくはＮ１：Ｎ２＝１：１．５〜１：５、さらに好ましくは１：２〜１：３の範囲にある。【００３７】
なお、Ｎ１においては、前記−ＣＯＣｍＨ2ｍＺにおいてＺ中の硫黄原子と−ＣＯとを最長で結合する複数の原子を、主鎖を構成する原子とし、Ｚがジスルフィド基の場合はそのうちの−ＣＯに近い硫黄原子側を主鎖上の原子とし、合計数Ｎ１には硫黄原子を含まない。また、Ｎ２においては、前記−ＣＨ（ＯＨ）Ｃ＝ＣＣｑＨ2ｑＣＨ3において末端の−ＣＨ3と−ＣＨ（ＯＨ）を最長で結合する複数の原子を、主鎖を構成する原子とする。【００３８】
式（II）中、−ＮＨとこれに隣接する−ＯＨは、Ｄ−エリスロ体であることが好ましい。【００３９】
このような式（II）の側鎖部位が含まれていると、側鎖部位が存在しない場合と比較して、検出感度を格段に向上させることができる。さらに、このような炭素数あるいは原子数で側鎖部位が構成され、側鎖部位が前記リンカー部位の長さよりも大きい長さとなる場合、ガラクトース含有化合物をより高度な配向性で基板や微粒子に固定することができるとともに、該ガラクトース含有化合物を含有するセンサーチップ（バイオセンサー）あるいはガラクトース含有化合物が固定された微粒子を含有する検出試薬を用いると、より微量のリシン１２０でも高感度に検出・定量でき、リシン６０は検出されない。【００４０】
以上のように、本発明で用いるラクトース含有化合物が固定された検出基材は、リシン６０およびリシン１２０に対する結合能が極めて高く、本発明で用いるガラクトース含有化合物が固定された検出基材はリシン１２０に対してのみ結合能が極めて高い。【００４１】
<ラクトース含有化合物、ガラクトース含有化合物の製造方法>
本発明で用いるラクトース含有化合物（I）、ガラクトース含有化合物（II）の製造方法に限定はないが、細胞二重層膜の表側に多く存在するスフィンゴ糖脂質（親水性基として糖、脂溶性基としてセラミド部位を有する糖脂質）などから誘導することができ、原料入手の容易性からも好適である。以下にラクトース含有化合物（I）を例にとって製造方法を説明する。ガラクトース含有化合物（II）も同様の方法で製造できる。
たとえば、下記工程１に示すような、出発原料として天然に由来するスフィンゴ糖脂質を用いる方法が挙げられる。【００４２】
工程１
0004815576.tif 000014
スフィンゴ糖脂質（Ａ）（式中、ＧNは式（I）中のラクトース部分と同様であり、Ｒ4は−Ｃ10〜18Ｈ20〜30−ＣＨ3であり、Ｒ’は−Ｃ10〜20Ｈ20〜40−ＣＨ3である。）は、ガラクトースとグルコースがβ１−４結合した糖鎖部位（ラクトース部位）と、スフィンゴシン塩基に脂肪酸がアミド結合したセラミドと呼ばれる脂質を骨格としている。該スフィンゴ糖脂質は、脊椎動物、無脊椎動物、植物などに広く存在する化合物である。【００４３】
たとえば、該スフィンゴ糖脂質（Ａ）を公知の方法を用いて酵素処理することにより（J. Biol. Chem.、Vol.250、P.24370、1995年）、セラミド部位にあるアミド結合を選択的に加水分解し、遊離のアミノ基をもつスフィンゴシン塩基が疎水性部となる一本鎖糖脂質である化合物（Ｂ）（リゾ体）を得ることができる。該酵素反応は、スフィンゴ糖脂質やスフィンゴミエリンに特異的作用することのできる酵素、スフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーゼ(Sphingolipid ceramide N-deacylase: SCDase, E.C. 3.5.1.69)を用いる。当該酵素はすべてのスフィンゴ糖脂質とスフィンゴミエリンに作用する。【００４４】
前記SCDaseは、反応液のpHや界面活性剤濃度により、加水分解以外に、縮合反応と脂肪酸交換反応も効率よく触媒することができる（J. Lipid Res.、Vol.38、P.1923、1997年）。【００４５】
前記酵素による加水分解反応は、スフィンゴ糖脂質10μmolに対してSCDaseを好ましくは1〜5U添加し、好ましくはpH5.5〜6.5の酢酸緩衝液中で、界面活性剤としてたとえばタウロデオキシコール酸ナトリウム0.5%〜2.0%の存在下、30〜40℃で実施することが好ましい。さらに反応液の上層部に、好ましくは反応液の１０倍量に相当する炭素数１０〜１８の炭化水素溶媒を加えることにより高い収率で化合物（Ｂ）を得ることができる。【００４６】
次に、得られた化合物（Ｂ）のアミノ基に、金属基板または微粒子表面と、金属−チオール結合による固定もしくは化学的および／または物理化学的な固定が可能なリンカー部位となる化合物（Ｃ）を化学結合により結合させて化合物（Ｄ）を得ることができる。このような化合物としては、たとえば、ＨＯＯＣ−ＣnＨ2nＹ（Ｃ）（式中、ｎ、Ｙは前記式（I）中のｎ、Ｙと同意義である。）で表される、チオオクト酸、チオール基を末端に有する脂肪酸、ジスルフィド基を有する脂肪酸が挙げられる。【００４７】
また、リンカー部位を誘導する化合物（Ｃ）は、あらかじめカルボン酸をN-ヒドロキシコハク酸イミド（NHS）などで活性化したものを用いてもよい。
リゾ体（Ｂ）のアミノ基と化合物（Ｃ）のカルボキシル基との反応は、溶媒中、必要に応じ縮合剤の存在下で実施する。化合物（Ｃ）の使用量は、リゾ体（Ｂ）に対して、１〜３当量の範囲にあることが好ましい。
前記溶媒としては、たとえば、N,N-ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、アセトニトリル、エタノールなどの有機溶媒、水などが挙げられる。溶媒は、１種単独であるいは２種以上を混合して用いることができる。【００４８】
縮合剤を用いる場合、たとえば、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリン塩（DMT-MM）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDCまたはWSC）などが挙げられる。また、N-メチルモルホリン（NMP）、NHS等の活性化剤を上記縮合剤と併用して用いることもできる。
反応は、好ましくは０℃から６０℃の範囲の温度で、好ましくは１〜４８時間程度行う。【００４９】
ラクトース含有化合物（I）は、工程２に示すように、さらに側鎖部分の２重結合に、エポキシ基、水酸基の導入やアルデヒドに変換することにより、側鎖部分の炭素数を変換することができる。
工程２
0004815576.tif 000015
【００５０】
上記工程２において、Ｒ5は−ＣnＨ2n−Ｙである。Ｒ4は、−ＣpＨ2p−ＣＨ3で表される基である。Ｒ4’は、Ｒ4と異なる−ＣpＨ2p−ＣＨ3で表される基である。
ＧN、ｎ、ｐは、前記と同義である。【００５１】
オレフィン部分にエポキシ基を導入するには、アルカリ性過酸化水素（Ｐｒｉｌｅｚｈａｅｖエポキシ化反応）、m-クロロ過安息香酸(m-chloro perbenzoic acid；MCPBA酸化)、Ti(O-i-Pr)4と酒石酸ジエチルメタノールの存在下tert-ブチルヒドロペルオキシド（香月−Sharpless不斉酸化）などを用いて行うことができる。【００５２】
オレフィンに水酸基を導入するには、カンファースルホン酸(CSA)やｐ−トルエンスルホン酸(pTsOH)のような酸、もしくは、水酸化ナトリウム(NaOH)や水酸化カリウム(KOH)のような塩基の存在下、先のエポキシ基を開裂させ水酸基（ジオール）を導入できる。【００５３】
また、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（NaBH3CN）により、還元的に開裂させてもよい。あるいは、オレフィンにBH3を作用させ、その後、過酸化水素水で処理して、モノオール（モノアルコール）に変換できる（ヒドロボレーション）。【００５４】
さらに、オレフィンをオゾン気流下でオゾン酸化すると、アルデヒドが得られる。エポキシ基を開裂させて得られる水酸基（ジオール）を、過ヨウ素酸酸化して同様の誘導体を得ることもできる（但し、糖水酸基は、例えば、アセチル基などのアシル系保護基で保護しておく必要がある）。【００５５】
得られるアルデヒドは、その後、Wittig反応により、任意の長さの炭化水素を有するリンイリドと反応させて、式（５）中の側鎖の長さを任意に変換することができる。【００５６】
前記ラクトース含有化合物およびガラクトース含有化合物における糖鎖部位が、ラクトース、ガラクトースで記載されるセラミド型の糖脂質は、いずれも市販品（コスモバイオ、SIGMA、生化学工業、タカラバイオなど）から誘導できる。これらのセラミド誘導体は、sphingolipid ceramide N-deacylase (E.C. 3.5.1.69)による選択的な加水分解により、リゾ体へと変換でき、遊離したアミノ基にリポ酸のようなチオカルボン酸を反応させた後、センサーチップに固定化できる。【００５７】
<検出基材>
本発明に係るリシン検出用基材は、検出基材１および検出基材２を含むキットである。
前記検出基材１は、前記式（I）で表されるラクトース含有化合物が、Ｙを介して基材１の表面に固定されている。また、前記検出基材２は、前記式（II）で表されるガラクトース含有化合物が、Ｚを介して基材２の表面に固定されている。
なお、本明細書中、検出基材１および２を検出基材と総称し、基材１および２を基材と総称することがある。【００５８】
基材としては、金属基板、ガラス基板、微粒子などが挙げられる。微粒子としては、金属微粒子、半導体微粒子などが挙げられる。
基材が金属基板の場合、検出基材は下記のセンサーチップとして用いることができ、ＳＰＲなどの方法により、測定を行う。検出基材１は下記のセンサーチップ１として、検出基材２は下記のセンサーチップ２として用いられる。
基材がガラス基板の場合、あらかじめシランカップリング法などにより、ガラス基板表面にチオール基あるいはジスルフィド基と反応可能な官能基を導入し、それを介して前記ラクトース含有化合物および前記ガラクトース含有化合物が固定化される。この検出基材は分光分析法によるタンパク質定量や光導波路による光学的方法などで用いられる。
基材が金属微粒子や半導体微粒子などの微粒子の場合、検出基材は検出試薬に適用することができる。具体的には、検出基材１は微粒子１の表面に前記ラクトース含有化合物が固定されたリシン検出用微粒子１であり、検出基材２は微粒子２の表面に前記ガラクトース含有化合物が固定されたリシン検出用微粒子２である。これらは検出試薬やテストストリップ（例えば、ペーパークロマトや試験紙など）として用いられる。
以下に、センサーチップおよび検出試薬の場合について詳説する。【００５９】
<センサーチップ１および２、リシン検出用センサーチップ>
本発明に係るリシン検出用センサーチップは、下記のセンサーチップ１およびセンサーチップ２を含む。
該センサーチップ１および２は、それぞれ前記ラクトース含有化合物または前記ガラクトース含有化合物がリンカー部位を介して金属基板表面に固定されている。
具体的には、本発明で用いるセンサーチップ１は、前記式（I）で表されるラクトース含有化合物が、Ｙを介して金属基板１の表面に固定されている。また、本発明で用いるセンサーチップ２は、前記式（II）で表されるガラクトース含有化合物が、Ｚを介して金属基板２の表面に固定されている。【００６０】
これらセンサーチップ１とセンサーチップ２とは、前記ラクトース含有化合物およびガラクトース含有化合物が別々の金属基板に固定されて、センサーチップ１とセンサーチップ２とが独立して存在していてもよいし、前記ラクトース含有化合物およびガラクトース含有化合物が同一の金属基板上に固定されて、センサーチップ１とセンサーチップ２とが同一基板上で共存していてもよい。同一基板上に共存する場合、前記ラクトース含有化合物およびガラクトース含有化合物の固定をアレイ状に行うこともできる。【００６１】
前記金属基板の素材としては、たとえば、好ましくは金、銀、白金、銅、パラジウムなどが挙げられ、これらのうちさらに好ましくは金または白金、特に好ましくは金が挙げられる。基板の形状は限定されず、板状、管状、棒状、球状などの形状が挙げられる。このうち板状の形状を有する基板を好ましく用いることができる。【００６２】
金属基板への固定化は、好ましくは、金属表面と、チオール基（-SH）あるいはジスルフィド基（-S-S-）の直接的な金属−チオール結合や吸着により行うことができる。
したがって、この場合、前記ラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物のうち、配糖体の末端に、−ＳＨまたはジスルフィド基を末端に有する化合物が好ましい。【００６３】
前記ラクトース含有化合物およびガラクトース含有化合物の場合、側鎖部位の自己組織化による相乗効果により、高度な配向性と高密度な固定が可能となる。さらに、この自己組織化は、スフィンゴシン塩基のような天然由来の側鎖を有することが望ましい。これは、センサーチップの基板表面が、細胞膜の表面状態に近似した状態にあるためではないかと推測される。【００６４】
基板との結合は、自己組織化単分子膜(SAM：Self-Assembled Monolayer)法などを用いて行うことができる。すなわち、チオール基あるいはジスルフィド基を有する化合物が、金などと金属−チオール結合により特異的に吸着し、アルキル鎖間のvan der Waals 力によりＳＡＭを形成させる方法である。【００６５】
前記ラクトース含有化合物およびガラクトース含有化合物が、−ＳＨまたはジスルフィド基を末端に有する場合、前記ラクトース含有化合物およびガラクトース含有化合物による金属基板表面への単分子膜の構築は、特殊な装置を必要とせず、これら誘導体の溶液中に基板を浸漬するだけで容易に実施できる。また、浸漬条件（溶媒、濃度、温度、時間）によって構造、配向の制御も可能である。ここで用いられる溶媒は特に限定されるものではないが、固定化させる誘導体が溶解する有機溶媒あるいは緩衝液であることが好ましい。【００６６】
通常、金属基板表面における前記ラクトース含有化合物およびガラクトース含有化合物の結合割合は、それぞれ好ましくは0.1〜10個／nm2、さらに好ましくは1〜10個／nm2の範囲である。このような結合割合であると、優れた検出感度を発揮することができる。
特に、前記ラクトース含有化合物およびガラクトース含有化合物において、側鎖部位が前記リンカー部位よりも長くなると、側鎖部位がリンカー部位の長さに応じて折り畳み構造をとり、折りたたまれた側鎖部位によって、前記ラクトース含有化合物およびガラクトース含有化合物同士がリシン６０あるいはリシン１２０との結合に適した配向性をもって基板表面や微粒子表面に効果的に結合するためではないかと推測される。それにより、上記のような好ましい結合割合が達成されたものと推測される。【００６７】
このような、本発明で用いるラクトース含有化合物が固定化されたセンサーチップ１は、リシン６０およびリシン１２０に対する検出感度が極めて高く、本発明で用いるガラクトース含有化合物が固定化されたセンサーチップ２はリシン１２０に対してのみ検出感度が極めて高い。【００６８】
<リシン検出用センサーチップを用いるリシンの検出方法>
本発明に係る各センサーチップ（センサーチップ１および２）を用いるリシンの検出方法は、試験化合物を、センサーチップの基板表面に接触させ、基板表面に結合したリシン６０あるいはリシン１２０を検出し、存在を推定するというものである。【００６９】
検出の基本工程は下記の通りである。
（１）試験化合物を、前記センサーチップの表面に接触させる工程。
（２）センサーチップに結合したリシン６０またはリシン１２０を検出する工程。【００７０】
前記センサーチップ１または２と、試験化合物との接触は通常、溶媒の存在下で行うことが好ましい。前記センサーチップを用いるリシンの検出においては、これらが変性しない溶媒を選択することが必要であり、たとえば水または緩衝液などを用いる。
溶媒のｐHは、好ましくは４〜８の範囲であり、温度は好ましくは０〜６０℃、さらに好ましくは２５〜４０℃の範囲である。【００７１】
緩衝液は、たとえば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、HEPES緩衝液、またはトリス緩衝液、より好ましくはHEPES緩衝液（10mM、pH：7.5、NaCl：0.15N）などが挙げられる。【００７２】
以下に、本発明に係るセンサーチップのうち、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：SPR）による、リシンの検出方法の一例を示す。ＳＰＲによる検出方法では、標識物質を用いることなく試験化合物（アナライト、分析対象化合物ともいう）の変化を検出することができる。このＳＰＲの現象は、表面プラズモン（ＳＰ）とｐ偏向単色光を臨界角以上で入射することにより金属／液体界面で生じるエバネッセント波が共鳴することで、反射光に急峻な減衰を示す光学現象であり、これにより、センサーチップ表面／液体界面の誘電率変化をプラズモン共鳴角（ＳＰＲシグナル）から検出できる。すなわち、金属表面に固定化した物質と検体との間の二分子間結合および解離の変化をＳＰＲシグナルから定量的に得られる。【００７３】
このようなＳＰＲシグナルを計測することにより、高感度に、センサーチップ１の場合、リシン６０およびリシン１２０を、センサーチップ２の場合、リシン１２０を検出することができる。【００７４】
リシンの検出は、温度を好ましくは０〜６０℃、さらに好ましくは２５〜４０℃の範囲で一定に保持し、好ましくはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、HEPES緩衝液、またはトリス緩衝液、より好ましくはHEPES緩衝液で行う。【００７５】
これに試験化合物を含む溶液をゆっくりと注入する。アフィニティー定数を求める場合には、リシンの濃度を変化させ、２〜８回の測定をすることが望ましい。反応時間は結合・解離反応ともに３〜３０分程度が好ましいが、目的の相互作用によっては測定時間を変更する場合がある。【００７６】
また、緩衝液の流速は好ましくは３〜５０μL/minで、検体量はpM〜μMを1回の測定につき５〜１０００μL程度にするのが好ましい。アフィニティー定数は２〜８点の測定濃度をとり、各濃度のセンサーグラムにおいて、平衡状態よりスキャッチャードプロットを作成してアフィニティー定数（KdおよびKa）を算定する。【００７７】
このような、本発明のセンサーチップを用いる、表面プラズモン共鳴バイオセンサーは、極微量（1ng程度）のリシンでも、前処理あるいは標識物質を用いないで、高感度に検出できることができる。
すなわちセンサーチップ１とリシン６０および１２０との結合速度定数（Ka）および解離定数（KD）は、前記式（I）で表されるラクトースセラミド化合物の場合において高い値および小さい値を示す。
またセンサーチップ２とリシン１２０との結合速度定数（Ka）および解離定数（KD）は、前記式（II）で表されるガラクトースセラミド化合物の場合において高い値および小さい値を示す。【００７８】
このような効果はスフィンゴシン塩基などの側鎖部位の自己組織化機能により、高度な配向性と高密度な固定化が行われ、複数の近接する糖鎖部位が効率よくリシンを強く結合させるためである。【００７９】
通常、センサーチップ１によるリシン６０およびリシン１２０の検出、センサーチップ２によるリシン１２０の検出において、「化合物が実質的に結合している」場合には、ノイズ程度の結合は含まない。この場合、具体的にノイズと判断し結合していないと判定するか、実質的に結合しているかの判定は、予め、それぞれのセンサーチップ１および２毎の絶対感度を測定し、ノイズと判定する基準となる標準敷居値を設定しておくことにより、十分な確度を持って判定可能である。標準敷居値としては、たとえば下記のいずれかに該当する場合が挙げられる。【００８０】
(i)    センサーチップ１を用いて、ＳＰＲ法により特定条件下でリシン６０を測定した場合のレスポンス（ＲＵ）値を標準敷居値とし、該標準敷居値の（１／３〜１／２）以下である場合、ノイズと判定する。
(ii)   センサーチップ１を用いて、ＳＰＲ法により特定条件下でリシン１２０を測定した場合のレスポンス（ＲＵ）値を標準敷居値とし、該標準敷居値の（１／３〜１／２）以下である場合、ノイズと判定する。
(iii)  センサーチップ２を用いて、ＳＰＲ法により特定条件下でリシン１２０を測定した場合のレスポンス（ＲＵ）値を標準敷居値とし、該標準敷居値の（１／３〜１／２）以下である場合、ノイズと判定する。【００８１】
標準敷居値の設定における特定条件としては、たとえば、上記(i)〜(iii)のセンサーチップ１、２において、式中、ｎ＝ｍ＝４、ｐ＝ｑ＝１３、Ｙ＝Ｚ＝１，２−ジチオラン−３−イル基であり、タンパク質濃度が１０μｇ／ｍＬ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５、ＮａＣｌ０．１５Ｍ）、流速１０μＬ／ｍｉｎ、温度２５℃（Biacore2000：商品名）の条件下で行ったものが挙げられる。特に、高度な分析（検出）を行う場合には、上記タンパク質濃度が１〜１０ｎｇ／ｍＬの条件で行うことが好ましい。また、必要に応じ、タンパク質濃度に対する検量線を作成してもよい。この検量線により未知試料のタンパク質濃度を決定することもできる。【００８２】
また、非特異的な結合かどうかの判定は、ラクトースあるいはガラクトースを阻害剤として試験化合物に添加した後、測定することでシグナルが抑制又はノイズ程度になることから推測できる。さらに、ノイズであるかどうかは、試験化合物に含まれるリシン６０や１２０の濃度にも依存するが、通常、公知の分析手法に従い、一定条件における検出値に換算して、検出確度を推測することもできる。【００８３】
<リシン検出用微粒子、検出試薬、リシン検出用キット>
リシン検出用微粒子
本発明で用いるリシン検出用微粒子１は、前記ラクトースセラミド化合物が、微粒子１の表面に固定されている微粒子である。
本発明で用いるリシン検出用微粒子２は、前記ガラクトースセラミド化合物が、微粒子２の表面に固定されている微粒子である。
本明細書中、微粒子１および２を微粒子と、リシン検出用微粒子１および２を、リシン検出用微粒子と、検出試薬１および２を検出試薬と総称することがある。【００８４】
前記のとおり、微粒子としては、金属微粒子、半導体微粒子が挙げられる。【００８５】
金属微粒子の素材としては、好ましくは金、銀、白金、銅、パラジウムなどが挙げられ、これらのうちより好ましくは金または白金、特に好ましくは金である。
半導体微粒子の素材としては、好ましくはＺｎ、Ｃｄ等のII族元素と、Ｏ、Ｓ等のVI族元素とを組み合わせたII−VI族系化合物であるZnS系、CdSe系ナノ粒子あるいは複合体粒子などが挙げられる。【００８６】
このような微粒子は、平均粒子径が、好ましくは１〜１００ｎｍ、さらに好ましくは１〜５０ｎｍの範囲にある。【００８７】
金属微粒子は、単分散な粒子径であることが好ましい。この範囲の金属微粒子を用いることで、視覚的に検出可能なシグナル色（例えば、金の場合：オレンジ〜赤色、銀の場合：黄色）が得られ、かつ溶媒中における分散安定性が良好になり、高感度で検出時間の短縮が図ることができる。【００８８】
本発明で用いる金属微粒子は、公知の方法により製造することができる。たとえば、金微粒子は、Frensの方法を用いることにより、種々の大きさの微粒子を容易に製造することができる（Nature Phys. Sci.、Vol.241、P.20、1973年）。【００８９】
具体的には、たとえば金微粒子の製造方法としては、塩化金の溶液を加熱沸騰させ、ついで、クエン酸ナトリウムの溶液と混合して塩化金を還元する方法により行うことができる。上記二つの溶液を混合するとすぐに沸騰溶液は薄い青色に変色して核生成が開始される。ついで、すぐに青色から赤色に変わって単一分散微粒子の生成が起こり、塩化金の還元は沸騰をさらに続けることで完了する。
得られる金属微粒子の粒子径は、クエン酸ナトリウム溶液の濃度を変化させることにより調整することができる。このような金微粒子は溶液中に分散して存在できることが好ましく、その状態は特に限定されないが、金微粒子が安定な分散状態で存在していることが好ましい。例えば、コロイド状態（分散コロイド状態）となることがより好ましい。【００９０】
また、本発明で用いる半導体微粒子は、公知の方法により製造することができる。例えば、メルカプトエタノールやメタクリル酸のような水溶性の有機配位子を含む水溶液により半導体超微粒子を合成する方法がある。中でも、特開２００２−２０１４７１号公報に示すような中和共沈法と称される方法は、表面配位された半導体微粒子が水中に分散した形態で合成されることから、特に、ZnS微粒子を合成する際によく用いられている。このZnS微粒子は、Ｚｎ及び有機配位子を含む水溶液に硫化ナトリウムを投入し、中和共沈反応を生じさせることにより、水中に分散した形態で合成される。得られる半導体微粒子の粒子径は、有機配位子濃度などを変化させることにより調整することができる。このような半導体微粒子の状態は特に限定されないが、乾燥もしくは溶液中に分散した状態が好ましい。特に、コロイド状態（分散コロイド状態）となることがより好ましい。【００９１】
金属微粒子や半導体微粒子などの微粒子に、ラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物を固定化する方法としては、前記センサーチップにラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物を固定化した方法を応用することが可能である。すなわち、微粒子を分散させた溶液とラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物の溶液を5分以上混合する。この時、微粒子に対して十分量のラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物が固定されれば、金属コロイドは安定に分散され、リシン検出用微粒子を得ることができる。ここで、微粒子表面におけるラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物の結合割合は、溶液中のラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物の濃度やその他条件（例えば、溶媒、温度、時間など）でコントロールすることができる。【００９２】
通常、微粒子表面におけるラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物の結合割合は、好ましくは0.1〜10個／nm2、さらに好ましくは1〜10個／nm2の範囲である。このような結合割合であると、優れた検出感度を発揮することができる。
特に、本発明で用いる式（I）、（II）の前記ラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物においては、特定の原子数で側鎖部位、リンカー部位が構成される。この場合、特に、側鎖部位が前記リンカー部位よりも長い場合、側鎖部位がリンカー部位の長さに応じて折り畳み構造をとり、折りたたまれた側鎖部位によって、ラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物同士がリシンとの結合に適した配向性をもって基板表面や微粒子表面に効果的に結合するためではないかと推測される。それにより、上記のような好ましい結合割合が達成されたものと推測される。【００９３】
また、このようなリシン検出用微粒子は、溶液形態で保存することが、該微粒子の保存安定性の観点から好ましい。
この場合、前記式（I）または（II）で表されるラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物が結合したリシン検出用微粒子は、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣnＨ2n−Ｙまたは−Ｃ（＝Ｏ）−ＣｍＨ2ｍ−Ｚで表されるリンカー部位において、ｎおよびｍが、それぞれ、２〜２０の整数、好ましくは２〜１０の整数、さらに好ましくは３〜８、特に好ましくは３〜５であり、リンカー部位の長さが特定範囲以内にあるため、溶液中での分散安定性に極めて優れている。したがって、本発明で用いるラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物が結合したリシン検出用微粒子は、特に溶液中での使用に優れる。【００９４】
前記ラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物の微粒子への固定化においては、ラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物の高度な配向性と高密度な固定を目的にしていることから、必要十分量のラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物を混合して固定化を図ることが好ましいが、過剰量のラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物を混合すると、混合溶液中からの除去作業が必要となる。【００９５】
たとえば、金微粒子の場合、ラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物を固定化した金微粒子の分散溶液の分散安定性と色調変化の関係から、ラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物の最適な混合量を決定することができる。
すなわち、添加した化合物が最適量以下の場合、ラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物を自己組織化するための十分な量に達しないため、金微粒子表面の疎水性が増加して分散安定性の低下し、色調の変化および凝集−沈殿を生じる。
また、添加した化合物が最適量以上の場合、リシンを添加した後、凝集反応が過剰に添加した化合物によって阻害され、色調変化が小さくなることから、過剰量の化合物を除去する必要がある。したがって、分散安定性に優れ、かつリシン添加後の凝集反応が明確な添加量が最適添加量となる。【００９６】
また、CdSe/ZnS複合などの半導体微粒子の場合でも、上記手法を用いることでラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物のの最適な混合量を決定することができる。【００９７】
検出試薬
前記微粒子へのラクトース含有化合物またはガラクトース含有化合物の固定化により、リシン検出用微粒子を得ることができるが、該微粒子を含む溶液は、そのまま本発明のリシンの検出試薬として使用することができる。
このため、前記固定化に使用する溶媒は、検出対象となるリシンが変性しないことが必要であり、たとえば水または緩衝液などを用いる。
溶媒のｐHは、好ましくは６〜８の範囲であり、温度は好ましくは０〜６０℃、さらに好ましくは２５〜４０℃の範囲である。【００９８】
緩衝液は、たとえば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、HEPES緩衝液、またはトリス緩衝液、より好ましくはHEPES緩衝液（10mM、pH：7.5、NaCl：0.15N）などが挙げられる。【００９９】
このようにして、リシン検出用微粒子の合成に伴って、リシン検出用微粒子を溶媒中に含有する検出試薬が得られることとなる。【０１００】
金属微粒子の場合、このような検出試薬においては、溶液中に微粒子がコロイドになって存在していることが好ましく、該コロイドは分散して存在していることがより好ましい。【０１０１】
金属微粒子の金属コロイドが安定化されたかの確認は、たとえば、金コロイドの場合、混合溶液に等量の１０％塩化ナトリウム水溶液を加えて、金コロイドの色調に変化がなければ安定化されていると認定することができる。【０１０２】
半導体微粒子の場合も同様に、溶液中に微粒子がコロイドになって存在していることが好ましく、該コロイドは分散して存在していることがより好ましい。【０１０３】
半導体微粒子の分散が安定化されたかの確認は、たとえば、混合溶液に等量の１０％塩化ナトリウム水溶液を加えて、分散溶液に紫外線を照射した時に得られる蛍光の強度に変化が無ければ安定化されていると認定することができる。【０１０４】
検出試薬中のリシン検出用微粒子の濃度は、好ましくは１．０×１０5〜１．０×１０15個／Ｌ、さらに好ましくは１．０×１０7〜１．０×１０13個／Ｌの範囲である。
このような濃度範囲であると、リシン検出用微粒子のコロイドが分散して安定に存在し、保存安定性を向上させることができるとともに、リシンの検出感度を向上させることができる。【０１０５】
このような、本発明で用いるラクトース含有化合物が固定化されたリシン検出用微粒子１を含む検出試薬１は、リシン６０およびリシン１２０に対する検出感度が極めて高く、本発明で用いるガラクトース含有化合物が固定化されたリシン検出用微粒子２を含む検出試薬２は、リシン１２０に対してのみ検出感度が極めて高い。【０１０６】
本発明に係るリシン検出用キットは、前記検出試薬１および２を含む。【０１０７】
<検出試薬を用いるリシンの検出方法>
本発明で用いる各検出試薬（検出試薬１および２）を用いるリシンの検出方法は、試験化合物を、検出試薬中のリシン検出用微粒子表面に接触させ、さらに、微粒子表面に結合したリシン６０あるいはリシン１２０を検出するというものである。【０１０８】
検出の基本工程は下記の通りである。
（１）試験化合物を、前記検出試薬に添加して、リシン検出用微粒子に接触させる工程。
（２）リシン検出用微粒子に結合したリシン６０またはリシン１２０を検出する工程。【０１０９】
リシン検出用微粒子に結合したリシンの検出手段としては、たとえば、金属微粒子を用いる場合、リシン検出用微粒子のコロイド溶液において、該微粒子がリシンと結合する際の色調変化から該リシンの検出を行う方法が挙げられる。
具体的には、たとえば、金微粒子の場合、リシンがリシン検出用微粒子と結合していない状態において、前記微粒子のコロイド粒子が分散した状態で溶液は赤色を示すが、リシンが結合すると前記微粒子が凝集して赤色が薄れるあるいは無色透明に変化する、または、凝集体（沈殿物）が生じる。
したがって、前記検出工程１において、赤色の凝集沈殿が薄れるか無色透明になった場合、リシン６０またはリシン１２０の存在を推定でき、前記検出工程２において、赤色の凝集沈殿が薄れるか無色透明になった場合、リシン１２０の存在を推定できる。【０１１０】
色調変化の計測手法としては、目視により観測し、その結果に基づいて測定対象物質の存在を簡便に半定量することができる。【０１１１】
また、色調変化を分光光度計により高感度検出することも可能である。その場合、色調変化を測定するための波長としては、色調変化を測定可能な波長であれば、特に限定されないが、たとえば、金微粒子の場合、金微粒子の極大吸収波長付近500〜550nm付近が測定感度を高くすることができるので望ましい。多波長による吸光度測定を行うことで、精度の高い検出が可能であることは言うまでもない。
色調変化の測定を行える装置としては、比色計、分光光度計、マイクロプレートリーダー、生化学自動分析機等が挙げられる。【０１１２】
また、半導体微粒子を用いる場合、リシン検出用微粒子の溶液において、該微粒子がリシンと結合する際の蛍光強度の変化から該リシンの検出を行う方法が挙げられる。【０１１３】
このような色調変化あるいは蛍光強度の変化を計測することにより、高感度に、リシン検出用微粒子１を含む検出試薬１の場合、リシン６０およびリシン１２０を、リシン検出用微粒子２を含む検出試薬２の場合、リシン１２０を、極めて簡便に短時間で検出することができる。
<テストストリップ>
前記ラクトース含有化合物は、リシン６０および１２０と特異的に結合し、前記ガラクトース含有化合物は、リシン１２０と特異的に結合するので、これら化合物を固定化した金属微粒子および半導体微粒子はテストストリップ（例えば、ペーパークロマトや試験紙など）に用いることができる。
ここでテストストリップとは、試験化合物の溶液をろ紙や高分子膜に浸透させることで簡便にかつ短時間で判定する検査キットを意味する。具体的には、ろ紙や高分子膜の一部に標的物質(リシン)が結合しうる処理（例えば、化学的結合、糖鎖や抗体を用いた特異的結合など）を行い、テストストリップに試験化合物の溶液を浸透させることで、その処理部分に試験化合物が保持される。つぎに、前記ラクトース含有化合物および前記ガラクトース含有化合物を固定化した金属微粒子あるいは半導体微粒子と接触させることで、処理部分が着色され、目視あるいは分光計測機器などで検出することができる。【０１１４】
また、毛細管現象を利用したいわゆるクロマト法によるテストストリップを用いた検出方法も行うことができる。すなわち、メンブレン上に標的物質(リシン)が結合しうる処理（例えば、化学的結合、糖鎖や抗体を用いた特異的結合など）を行う。テストストリップに添加された試験化合物の溶液は、毛細管現象によりストリップ上を移動する。その移動過程で、前記ラクトース含有化合物および前記ガラクトース含有化合物を固定化した金属微粒子あるいは半導体微粒子を接触させることで、これら微粒子は標的物質(リシン)と結合する。つぎに、メンブレン上に処理した部分は標的物質(リシン)と結合を起こし、その結果、メンブレン上に微粒子による有色あるいは蛍光発光の判定ラインが現れることで検出される。
このような検出・判定キットは簡便でかつ短時間で検出することができる。
なお本明細書において引用されたすべての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】化合物（Iａ）、化合物（IIａ）、化合物（IIIａ）を固定化したセンサーチップによるリシン６０との相互作用を表したSPRセンサーグラムである。ここで、リシン６０溶液の注入量は1μg/mL溶液を100μLであり、流速10μL/min、温度25℃の結果である。
【０１１６】
【図２】化合物（Iａ）、化合物（IIａ）、化合物（IIIａ）を固定化したセンサーチップによるリシン１２０との相互作用を表したSPRセンサーグラムである。ここで、リシン１２０溶液の注入量は1μg/mL溶液を100μLであり、流速10μL/min、温度25℃の結果である。
【０１１７】
【図３】化合物（Iａ）を固定化したセンサーチップ(１ａ)によるリシン６０との相互作用を表したSPRセンサーグラムである。ここで、リシン６０濃度を0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mLと変化させた溶液を100μL注入し、流速10μL/min、温度25℃の結果である。
【０１１８】
【図４】化合物（IIａ）を固定化したセンサーチップ(２ａ)によるリシン６０との相互作用を表したSPRセンサーグラムである。ここで、リシン６０濃度を0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mLと変化させた溶液を100μL注入し、流速10μL/min、温度25℃の結果である。
【０１１９】
【図５】化合物（IIIａ）を固定化したセンサーチップ(３ａ)によるリシン６０との相互作用を表したSPRセンサーグラムである。ここで、リシン６０濃度を0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mLと変化させた溶液を100μL注入し、流速10μL/min、温度25℃の結果である。
【０１２０】
【図６】化合物（Iａ）を固定化したセンサーチップ(１ａ)によるリシン１２０との相互作用を表したSPRセンサーグラムである。ここで、リシン１２０濃度を0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mLと変化させた溶液を100μL注入し、流速10μL/min、温度25℃の結果である。
【０１２１】
【図７】化合物（IIａ）を固定化したセンサーチップ(２ａ)によるリシン１２０との相互作用を表したSPRセンサーグラムである。ここで、リシン１２０濃度を0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mLと変化させた溶液を100μL注入し、流速10μL/min、温度25℃の結果である。
【０１２２】
【図８】化合物（IIIａ）を固定化したセンサーチップ(３ａ)によるリシン１２０との相互作用を表したSPRセンサーグラムである。ここで、リシン１２０濃度を0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mLと変化させた溶液を100μL注入し、流速10μL/min、温度25℃の結果である。
【０１２３】
【図９】化合物（Iａ）、化合物（IIａ）、化合物（IIIａ）を固定化したセンサーチップによる各種タンパク質との相互作用を表したグラフである。ここで、タンパク質溶液の濃度を10μg/mLとして、タンパク質溶液10μLを流速10μL/minで注入したときのSPRシグナルの値を示している。
【０１２４】
【図１０】化合物（Iａ）、化合物（IIａ）、化合物（IIIａ）を金微粒子に固定化した検出試薬を用いたリシン検出試験の結果を示した図である。試験条件は、試薬（１ｂ）〜（３ｂ）200μLにリシン溶液10μg/mL溶液を100μL添加、室温で10分間静置した。
【０１２５】
【図１１】化合物（Iａ）、化合物（IIａ）、化合物（IIIａ）を金微粒子に固定化した検出試薬を用いた各種タンパク質によるリシン特異性評価試験の結果を示した図である。試験条件は、試薬（１ｂ）〜（３ｂ）200μLに各種タンパク質溶液10μg/mL溶液を100μL添加、室温で10分間静置した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１２６】
以下に、本発明の実施例および比較例を挙げ、具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。【０１２７】
<糖脂質含有化合物の合成>
【実施例１】
【０１２８】
0004815576.tif 000016
【０１２９】
〔酵素反応によるセラミド部位の選択的加水分解〕
Lactosyl-ceramide 10.0mg（11.0μmol）（SIGMA社製）を1.0%タウロデオキシコール酸ナトリウムの50mM酢酸緩衝液（pH6.0）10mLに溶かし500mL梨型フラスコに入れた。次にスフィンゴ脂質セラミドN-デアシラーゼ（SCDase）1.5U（タカラバイオ社製）を加え、N-デカン100mLを反応液と混ざらないように静かに加えて37℃で24時間反応させた後、さらにSCDase0.5Uを加えて37℃で24時間反応させた。上層部であるN-デカンを取り除いた後、反応液を沸騰した水浴中で3分間熱した。さらに、反応液はフィルターで濾過した後、濃縮した。【０１３０】
ODSカラムクロマトグラフィーで精製した。その結果、Lyso-ｌactosyl-ceramideを収率73%（5.0mg）で得た。【０１３１】
１H-NMR(600MHz, CD3OD):δ5.756(dt, 1H, -CH(OH)-CH=CH-CH2-, J=6.8Hz, 15.4Hz), 5.486(dd, 1H, -CH(OH)-CH=CH-CH2-, J=7.6Hz, 15.4Hz), 4.352(d, 1H, Gal H-1, J=7.7Hz), 4.297(d, 1H, Glc H-1, J=7.7Hz), 3.988(t, 1H, -CH(NH2)-CH(OH)-, J=6.8Hz), 3.899(dd, 1H, Glc H-6, J=2.4Hz, 12.1Hz), 3.832(dd, 1H, Glc H-6’, J=4.4Hz, 12.1Hz), 3.85-3.82(m, 1H, -O-CH2-CH(NH2)-), 3.812(brd, 1H, Gal H-4, J=3.3Hz), 3.777(dd, 1H, Gal H-6, J=7.4Hz, 11.4Hz), 3.77-3.74(m, 1H, -O-CH2-CH(NH2)-), 3.695(dd, 1H, Gal H-6’, J=4.7Hz, 11.4Hz), 3.59-3.50(m, 4H, Glc H-3, H-4, Gal H-2, H-5), 3.476(dd, 1H, Gal H-3, J=3.3Hz, 9.5Hz), 3.43-3.39(m, 1H, Glc H-5), 3.28(overlap, 1H, Glc H-2), 2.94-2.89(m, 1H, -CH(NH2)-CH(OH)-), 2.11-2.06(br, 2H, -CH=CH-CH2-CH2-), 1.37-1.25 (m, 22H, -(CH2)-), 0.897(t, 3H, -CH2-CH3, 7.0Hz).
ESI(+)-MS m/z=624.5(M+H)+
ESI(-)-MS m/z= 622.5 (M-H)-, 668.5 (M+HCOO)-【０１３２】
〔ラクトース含有化合物（Iａ）の合成〕
得られたLyso-ｌactosyl-ceramide 5.0mg（8.0μmol）をDMF3mLに溶かし、撹拌しながらあらかじめN-ヒドロキシこはく酸イミド、ジシクロヘキシルカルボジイミドで活性化させたチオオクト酸5.0mg（16.0μmol）を含むDMF溶液2mLを加え室温で24時間反応させた。反応液は濃縮した後、ODSカラムクロマトグラフィーで精製した。その結果、化合物（Iａ）を収率71％（4.6mg）で得た。【０１３３】
１H-NMR(600MHz, CD3OD):δ5.642(dt, 1H, -CH(OH)-CH=CH-CH2-, J=6.6Hz, 15.4Hz), 5.444(dd, 1H, -CH(OH)-CH=CH-CH2-, J=7.7Hz, 15.4Hz), 4.354(d, 1H, Gal H-1, J=7.7Hz), 4.302(d, 1H, Glc H-1, J=7.7Hz), 4.16-4.14(m, 1H, -O-CH2-CH(NH-)-, 4.073(t, 1H, -CH(NH-)-CH(OH)-, J=7.7Hz), 3.98-3.97(m, 1H, -CH(NH-)-CH(OH)-),  3.898(brd, 1H, Glc H-6, J=12.1Hz), 3.833(dd, 1H, Glc H-6’, J=4.4Hz, 12.1Hz), 3.806(d, 1H, Gal H-4, J=3.3Hz), 3.770(dd, 1H, Gal H-6, J=7.5Hz, 11.6Hz), 3.692(dd, 1H, Gal H-6’, J=4.6Hz, 11.6Hz), 3.60-3.51(m, 6H, Glc H-3, H-4, Gal H-2, H-5, -Glc-O-CH2-CH(NH-)-, CH2-CH(S-)- ), 3.471(dd, 1H, Gal H-3, J=3.3Hz, 9.5Hz), 3.43-3.40(m, 1H, Glc H-5), 3.28(overlap, 1H, Glc H-2), 3.19-3.15(m, 1H, -CH2-CH2-S-), 3.12-3.07(m, 1H, -CH2-CH2-S-), 2.49-2.43(m, 1H, -CH2-CH2-S-), 2.21-2.16(m, 2H, -C(O)-CH2-CH2-), 2.04-2.00(br, 2H, -CH=CH-CH2-CH2-), 1.91-1.85(m, 1H, -CH2-CH2-S-), 1.75-1.57, 1.50-1.41(2xm, 6H, N-thioctyl), 1.39-1.25 (m, 22H, -(CH2)-), 0.891(t, 3H, -CH2-CH3, 7.0Hz).
ESI(+)-MS m/z=812.6(M+H)+
ESI(-)-MS m/z=810.7(M-H)-, 856.6(M+HCOO)-
【実施例２】
【０１３４】
0004815576.tif 000017
【０１３５】
〔ガラクトース含有化合物（IIａ）の合成〕
上記の方法と同様にして得られたLyso-gaｌactosyl-ceramide 5.0mg（10.8μmol）をDMF3mLに溶かし、撹拌しながらあらかじめN-ヒドロキシこはく酸イミド、ジシクロヘキシルカルボジイミドで活性化させたチオオクト酸5.0mg（16.0μmol）を含むDMF溶液2mLを加え室温で24時間反応させた。反応液は濃縮した後、ODSカラムクロマトグラフィーで精製した。その結果、化合物（Iａ）を収率80％（5.5mg）で得た。【０１３６】
１H-NMR(600MHz, CD3OD):δ5.680(dt, 1H, -CH(OH)-CH=CH-CH2-, J=6.6Hz, 15.4Hz), 5.465(dd, 1H, -CH(OH)-CH=CH-CH2-, J=7.7Hz, 15.4Hz), 4.230(d, 1H, H-1, J=7.6Hz), 4.16-4.13(m, 1H, -O-CH2-CH(NH-)-, 4.048(t, 1H, -CH(NH-)-CH(OH)-, J=7.7Hz), 4.00-3.97(m, 1H, -CH(NH-)-CH(OH)-), 3.830(brd, 1H, H-4, J=3.4Hz), 3.780(dd, 1H, H-6, J=6.9Hz, 11.4Hz), 3.724(dd, 1H, H-6’, J=5.2Hz, 11.3Hz), 3.65-3.61(m, 1H, -O-CH2-CH(NH-)-), 3.60-3.50(m, 3H, H-2, H-5, CH2-CH(S-)- ), 3.480(dd, 1H, H-3, J=3.3Hz, 9.7Hz), 3.19-3.15(m, 1H, -CH2-CH2-S-), 3.12-3.08(m, 1H, -CH2-CH2-S-), 2.48-2.45(m, 1H, -CH2-CH2-S-), 2.21-2.18(m, 2H, -C(O)-CH2-CH2-), 2.05-2.01(br, 2H, -CH=CH-CH2-CH2-), 1.91-1.87(m, 1H, -CH2-CH2-S-), 1.73-1.61, 1.49-1.44(2xm, 6H, N-thioctyl), 1.39-1.28 (m, 22H, -(CH2)-), 0.898(t, 3H, -CH2-CH3, 7.0Hz).
ESI(+)-MS m/z=650.3(M+H)+
ESI(-)-MS m/z=648.3(M-H)-, 694.4(M+HCOO)-【０１３７】
〔比較例１〕
0004815576.tif 000018
【０１３８】
〔グルコース含有化合物（IIIａ）の合成〕
上記の方法と同様にして得られたLyso-glucosyl-ceramide 5.0mg（10.8μmol）をDMF3mLに溶かし、撹拌しながらあらかじめN-ヒドロキシこはく酸イミド、ジシクロヘキシルカルボジイミドで活性化させたチオオクト酸5.0mg（16.0μmol）を含むDMF溶液2mLを加え室温で24時間反応させた。反応液は濃縮した後、ODSカラムクロマトグラフィーで精製した。その結果、化合物（Iａ）を収率77％（5.4mg）で得た。【０１３９】
１H-NMR(600MHz, CD3OD):δ5.696(dt, 1H, -CH(OH)-CH=CH-CH2-, J=6.6Hz, 15.4Hz), 5.466(dd, 1H, -CH(OH)-CH=CH-CH2-, J=7.7Hz, 15.4Hz), 4.270(d, 1H, H-1, J=7.7Hz), 4.14-4.11(m, 1H, -O-CH2-CH(NH-)-), 4.0874 (t, 1H, -CH(NH-)-CH(OH)-, J=7.7Hz), 4.01-3.98(m, 1H, -CH(NH-)-CH(OH)-),  3.898(brd, 1H, H-6, J=10.6Hz), 3.68-3.62(m, 2H, H-5, -O-CH2-CH(NH-)-), 3.60-3.56(m, 1H, CH2-CH(S-)- ), 3.40-3.50(m, 1H, H-3), 3.29-3.27(m, 2H, H-4, H-6’), 3.23-3.20(m, 1H, H-2), 3.19-3.16(m, 1H, -CH2-CH2-S-), 3.12-3.08(m, 1H, -CH2-CH2-S-), 2.48-2.45(m, 1H, -CH2-CH2-S-), 2.21-2.18(m, 2H, -C(O)-CH2-CH2-), 2.05-2.01(br, 2H, -CH=CH-CH2-CH2-), 1.91-1.85(m, 1H, -CH2-CH2-S-), 1.75-1.57, 1.50-1.41(2xm, 6H, N-thioctyl), 1.39-1.25 (m, 22H, -(CH2)-), 0.896(t, 3H, -CH2-CH3, 7.0Hz).
ESI(+)-MS m/z=650.4(M+H)+
ESI(-)-MS m/z=648.3(M-H)-, 694.3(M+HCOO)-【０１４０】
<SPRセンサーによるリシン６０およびリシン１２０の検出>
（センサーチップの作成）
Biacore社より市販されているSIA kit Auの金基板をオゾンクリーナーで洗浄し、実施例１で合成した化合物（Iａ）100nmolを溶解させたメタノール溶液2mLに室温で24時間浸漬した。その後、メタノール、水の順で3回洗浄してセンサーチップ（１a）を作成した。また、上記と同様な方法で実施例２の化合物（IIａ）、比較例１の化合物（IIIａ）を用いて、それぞれセンサーチップ（２ａ）、センサーチップ（３ａ）を作成した。【０１４１】
（SPR測定）
得られたセンサーチップに対するリシン６０およびリシン１２０の特異的吸着の特性を計測するため、実施例１の化合物（Iａ）を固定化したセンサーチップ（１ａ）を市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Biacore2000、Biacore社製）に装着して、設定温度25℃、流速10μL/minでHEPES（10mM、pH：7.5、NaCl：0.15M）緩衝液を流した。計測前にセンサーグラムが安定したことを確認した。【０１４２】
次に、リシン６０（Ricinus communis agglutinin 60、ホーネン製）およびリシン１２０（Ricinus communis agglutinin 120、和光純薬製）を用いて、HEPES（10mM、pH：7.5、NaCl：0.15M）緩衝液で1μg/mLに調製した。リシン溶液は流速10μL/min で100μLインジェクトした。同様にして、実施例２の化合物（IIａ）、比較例１の化合物（IIIａ）をそれぞれ固定化したセンサーチップ（２ａ）、センサーチップ（３ａ）も測定した。【０１４３】
その結果をリシン６０について図１およびリシン１２０について図２に示す。リシン６０の検出強度は、実施例１の化合物（Iａ）で1400ＲＵ、実施例２の化合物（IIａ）で65ＲＵ、比較例１の化合物（IIIａ）で53ＲＵであった。また、リシン１２０の検出強度は、実施例１の化合物（Iａ）で1642ＲＵ、実施例２の化合物（IIａ）で1217ＲＵ、比較例１の化合物（IIIａ）で118ＲＵであった。なお、「ＲＵ」は「Resonance unit」の略で、基盤表面に物質が吸着、付着、固定化されると、その量に応じて値が増大することを意味する。Biacore社によると1RU＝約1pg/mm2である。【０１４４】
この結果から、リシン６０に対しては実施例１の化合物（Iａ）を固定化したセンサーチップ（１ａ）のみが強いシグナルを示し、リシン１２０に対しては実施例１の化合物（Iａ）を固定化したセンサーチップ（１ａ）および実施例２の化合物（IIａ）を固定化したセンサーチップ（２ａ）が強いシグナルを示した。すなわち、センサーチップ上に化合物（Iａ）および化合物（IIａ）を固定化すれば、特異的かつ高感度にリシン６０およびリシン１２０を検出できることを示唆している。【０１４５】
（リシン６０およびリシン１２０の各種濃度におけるSPR測定）
実施例１の化合物（Iａ）を固定化したセンサーチップ（１ａ）を上記と同様の方法で表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Biacore2000、Biacore社製）に装着して、設定温度25℃、流速10μL/minでHEPES（10mM、pH：7.5、NaCl：0.15M）緩衝液を流した。計測前にセンサーグラムが安定したことを確認した。【０１４６】
測定は、リシン６０（Ricinus communis agglutinin 60、ホーネン製）およびリシン１２０（Ricinus communis agglutinin 120、和光純薬製）を用い、HEPES（10mM、pH：7.5、NaCl：0.15M）緩衝液でそれぞれ0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mLおよび10μg/mLに調製した。リシン溶液は流速10μL/min で100μLインジェクトした。化合物（Ｉａ）を固定化したセンサーチップ（１ａ）について、結果を図３（リシン６０）、図６（リシン１２０）に示す。
同様にして、実施例２の化合物（IIａ）を固定化したセンサーチップ（２ａ）についても測定した。その結果を図４（リシン６０）、図７（リシン１２０）に示す。さらに、比較例１の化合物（IIIａ）を固定化したセンサーチップ（３ａ）についても測定した。その結果を図５（リシン６０）、図８（リシン１２０）に示す。【０１４７】
その結果、図３〜図５に示すように、リシン６０に対しては実施例１の化合物（Iａ）を固定化したセンサーチップ（１ａ）のみが強いシグナルを示し、その検出限界は約1ng/mLであると推測される。また、図６〜図８に示すように、リシン１２０に対しては実施例１の化合物（Iａ）を固定化したセンサーチップ（１ａ）および実施例２の化合物（IIａ）を固定化したセンサーチップ（２ａ）が強いシグナルを示し、その検出限界はともに約0.1ng/mLであると推測される。このことは、極微量（1ng程度）のリシンでも、前処理あるいは標識物質を用いないで、高感度に検出できることを意味している。【０１４８】
（結合定数の算出）
上記SPR測定結果から、結合定数を求める最適な条件を推定した。すなわち、実施例１の化合物（Iａ）を固定化したセンサーチップ（１ａ）を表面プラズモン共鳴バイオセンサーに装着して、設定温度25℃、流速30μL/minのHEPES（10mM、pH：7.5、NaCl：0.15M）緩衝液を流した。計測前にセンサーグラムが安定したことを確認した。結合定数はリシン６０（Ricinus communis agglutinin 60、ホーネン製）およびリシン１２０（Ricinus communis agglutinin 120、和光純薬製）を用い、HEPES（10mM、pH：7.5、NaCl：0.15M）緩衝液で調製した。リシン濃度は、強いシグナルが得られる場合は、0.1μg/mL、0.5μg/mL、0.75μg/mLおよび1μg/mLに調製し、弱いシグナルの場合では、10μg/mL、50μg/mL、75μg/mLおよび100μg/mLに調製した。実施例２の化合物（IIａ）を固定化したセンサーチップ（２ａ）、比較例１の化合物（IIIａ）を固定化したセンサーチップ（３ａ）についても同様な方法で行った。得られたセンサーグラムから１：１反応の結合定数を求めた結果をリシン６０については表１に、リシン１２０については表２に示す。【０１４９】
リシン６０に対する解離定数（KＤ）は、センサーチップ（１ａ）で6.7×10-10Ｍ、リシン１２０に対する解離定数（KＤ）は、センサーチップ（１ａ）で4.7×10-11Ｍ、センサーチップ（２ａ）で1.0×10-10Ｍであり、非常に強い結合をしていることがわかる。この効果はスフィンゴシン塩基などの側鎖部位の自己組織化機能により、高度な配向性と高密度な固定化が行なわれ、複数の近接する糖鎖部位が効率よくリシンを強く結合させるためである。さらに、センサーチップ（１ａ）およびセンサーチップ（２ａ）を用いてあらかじめノイズと判定する基準、すなわち標準敷居値を設定しておくことで、十分な確度を持って高感度なリシンの定性および定量が可能となる。【０１５０】
【表１】
0004815576.tif 000019
【０１５１】
【表２】
0004815576.tif 000020
【０１５２】
（SPRセンサーによる各種タンパク質の検出試験）
得られたセンサーチップに対するリシン６０およびリシン１２０の特異性を評価するために、各種タンパク質を用いた検出試験を行なった。実施例１の化合物（Iａ）を固定化したセンサーチップ（１ａ）を市販の表面プラズモン共鳴バイオセンサー（Biacore2000、Biacore社製）に装着して、設定温度25℃、流速10μL/minでHEPES（10mM、pH：7.5、NaCl：0.15M）緩衝液を流した。計測前にセンサーグラムが安定したことを確認した。【０１５３】
次に、下記に示す各種タンパク質を用いて、HEPES（10mM、pH：7.5、NaCl：0.15M）緩衝液で10μg/mLに調製した。リシン溶液は流速10μL/min で10μLインジェクトした。同様にして、実施例２の化合物（IIａ）、比較例１の化合物（IIIａ）をそれぞれ固定化したセンサーチップ（２ａ）、センサーチップ（３ａ）も測定した。【０１５４】
[試験に用いたタンパク質]
リシン６０：Ricinus communis agglutinin 60、ホーネン製
リシン１２０：Ricinus communis agglutinin 120、和光純薬製
アルブミン：Albumin from bovine serum、ＳＩＧＭＡ製
グロブリン：γ-Globulins from bovine blood、ＳＩＧＭＡ製
ＣｏｎＡ：Canavalia ensiformis(jack bean)、和光純薬製
ＳＢＡ：Glycine max(soybean, soya bean)、和光純薬製
ＰＮＡ：Arachis hypogaea(peanuts)、和光純薬製
ＭＰＬ：Maclura pomifera(osage orange tree)、Ｖｅｃｔｏｒ製
ＭＡＭ：Maackia amurensis、生化学工業製
ＳＳＡ：Sambucus sieboldiana、生化学工業製【０１５５】
測定結果を図９に示す。実施例１の化合物（Iａ）を固定化したセンサーチップ（１ａ）ではリシン６０およびリシン１２０に対してのみ強いシグナルを示し、実施例２の化合物（IIａ）を固定化したセンサーチップ（２ａ）ではリシン１２０に対してのみ強いシグナルを示した。その他のタンパク質においては、小さなシグナルを検出したものの、標準敷居値を設定しておくことで、ノイズレベルで処理される程度であった。【０１５６】
<金微粒子を用いた検出試薬によるリシン６０およびリシン１２０の検出>
（金微粒子を用いた検出試薬の調製）
粒子径20nmの金微粒子分散溶液（SIGMA製：微粒子濃度：5.0×1011個/mL）500μLを十分に超音波処理したのち、0〜10μgの実施例１の化合物（Iａ）を溶解させた100μLメタノール溶液を撹拌しながら添加し、50℃で1時間、固定化反応した。この間、化合物（Iａ）添加直後から金微粒子分散溶液の色調は変化し、その変化は添加濃度によって異なった。分散安定性の結果は、金微粒子分散溶液の色調変化から目視にて評価した。同様にして、実施例２の化合物（IIａ）および比較例１の化合物(IIIａ)についても行なった。ここで、分散安定性結果は化合物（Iａ）〜（IIIａ）を固定した１時間後の結果である。【０１５７】
表３の結果から、添加した化合物量が1.5μg以下の場合、金微粒子表面で構築される自己組織化膜を形成するための十分な化合物量に達しないことで、金微粒子表面の疎水性が増加したことによる分散安定性の低下が確認できた。また、添加した化合物量が5.0μg以上の場合、過剰に添加した化合物がリシンとの凝集反応を阻害するため、取り除く必要がある。したがって、簡便かつ分散安定性に優れた検出試薬を調製するためには、粒子径20nmの金微粒子（SIGMA製：微粒子濃度：5.0×1011個/mL）分散溶液500μL当たりの最適固定化量は2.0μg 〜2.5μgと決定した。【０１５８】
【表３】
0004815576.tif 000021
（検出試薬によるリシン６０、リシン１２０の判定試験）【０１５９】
粒子径20nmの金微粒子分散溶液（SIGMA製：微粒子濃度：5.0×1011個/mL）5000μLを十分に超音波処理したのち、25μgの化合物（Iａ）を溶解させた500μLメタノール溶液を撹拌しながら添加、50℃で1時間、固定化反応して化合物（Iａ）固定化の金微粒子分散溶液：試薬（１ｂ）を調製した。同様にして、実施例２の化合物（IIａ）固定化の金微粒子分散溶液：試薬（２ｂ）および比較例１の化合物(IIIａ) 固定化の金微粒子分散溶液：試薬（３ｂ）についても調製した。【０１６０】
次に、得られた試薬（１ｂ）〜（３ｂ）200μLにリシン６０（Ricinus communis agglutinin 60、ホーネン製）をHEPES（10mM、pH：7.5、NaCl：0.15N）緩衝液で調製した10μg/mL溶液を100μL添加、室温で一定時間静置した。各時間における金微粒子分散溶液の色調変化を目視にて評価した。【０１６１】
10分後の結果を図１０および表４に示す。試薬（１ｂ）ではリシン６０およびリシン１２０に対して強い色調変化を示し、試薬（２ｂ）ではリシン１２０に対してのみ強い色調変化を示した。また、添加後1時間まで観察したが、10分後以降大きな変化は認められなかった。したがって、試薬（１ｂ）、試薬（２ｂ）を用いることで、短時間（10分間）かつ簡便にリシンを検出できることが認められた。【０１６２】
【表４】
0004815576.tif 000022
【０１６３】
（検出試薬によるリシン６０の検出限界濃度試験）
上記の方法によって調製した試薬（１ｂ）〜（３ｂ）２00μLにリシン６０（Ricinus communis agglutinin 60、ホーネン製）をHEPES（10mM、pH：7.5、NaCl：0.15N）緩衝液で調製した1.0〜50μg/mL溶液を100μL添加、室温で一定時間静置した。各時間における金微粒子分散溶液の色調変化を目視にて評価した。【０１６４】
試薬（１ｂ）、試薬（２ｂ）および試薬（３ｂ）の結果を、それぞれ、表５、表６、および表７に示す。この結果から、リシン６０に対しては試薬（１ｂ）のみ変化し、検出限界濃度は時間に依存していることがわかった。検出時間10分間における限界濃度は約5μg/mLであった。【０１６５】
【表５】
0004815576.tif 000023
【０１６６】
【表６】
0004815576.tif 000024
【０１６７】
【表７】
0004815576.tif 000025
【０１６８】
（検出試薬によるリシン１２０の検出限界濃度試験）
上記の方法によって調製した試薬（１ｂ）〜（３ｂ）２00μLにリシン１２０（Ricinus communis agglutinin 120、和光純薬）をHEPES（10mM、pH：7.5、NaCl：0.15N）緩衝液で調製した1.0〜50μg/mL溶液を100μL添加、室温で一定時間静置した。各時間における金微粒子分散溶液の色調変化を目視にて評価した。
試薬（１ｂ）、試薬（２ｂ）および試薬（３ｂ）の結果を、それぞれ、表８、表９、および表１０に示す。この結果から、リシン１２０に対しては試薬（１ｂ）試薬（２ｂ）のみ変化し、検出限界濃度は時間に依存していることがわかった。検出時間10分間における限界濃度は約5μg/mLであった。【０１６９】
【表８】
0004815576.tif 000026
【０１７０】
【表９】
0004815576.tif 000027
【０１７１】
【表１０】
0004815576.tif 000028
【０１７２】
（検出試薬による各種タンパク質の検出試験）
得られた検出試薬に対するリシン６０およびリシン１２０の特異性を評価するために、各種タンパク質を用いた検出試験を行なった。得られた試薬（１ｂ）〜（３ｂ）200μLに下記に示す各種タンパク質をHEPES（10mM、pH：7.5、NaCl：0.15N）緩衝液で調製し、10μg/mL溶液を100μL添加、室温で一定時間静置した。各時間における金微粒子分散溶液の色調変化を目視にて評価した。【０１７３】
ここで用いたタンパク質は以下の通りである。
リシン６０：Ricinus communis agglutinin 60、ホーネン製
リシン１２０：Ricinus communis agglutinin 120、和光純薬製
アルブミン：Albumin from bovine serum、ＳＩＧＭＡ製
グロブリン：γ-Globulins from bovine blood、ＳＩＧＭＡ製
ＣｏｎＡ：Canavalia ensiformis(jack bean)、和光純薬製
ＳＢＡ：Glycine max(soybean, soya bean)、和光純薬製
ＰＮＡ：Arachis hypogaea(peanuts)、和光純薬製
ＭＰＬ：Maclura pomifera(osage orange tree)、Ｖｅｃｔｏｒ製
ＭＡＭ：Maackia amurensis、生化学工業製
ＳＳＡ：Sambucus sieboldiana、生化学工業製【０１７４】
10分後の結果を図１１に示す。試薬（１ｂ）ではリシン６０およびリシン１２０に対してのみ強い色調変化を示し、試薬（２ｂ）ではリシン１２０に対してのみ強い色調変化を示した。その他のタンパク質においては、殆ど変化が認められなかった。さらに、添加後1時間まで観察したが、すべての結果において10分後以降大きな変化は認められなかった。したがって、試薬（１ｂ）、試薬（２ｂ）はリシンに対して優れた特異性を有しており、短時間（10分間）かつ簡便にリシンを検出できることが認められた。さらに、試薬（１ｂ）および試薬（２ｂ）の組み合わせにより、タンパク質のホモロジーが極めて高いリシン６０とリシン１２０の混合物でも、リシン６０の有無を短時間で正確に検出できることが認められた。【０１７５】
【表１１】
0004815576.tif 000029
【産業上の利用可能性】
【０１７６】
本発明のリシン６０の検出方法によれば、簡便かつ迅速に高い検出感度でリシン６０を検出することができる。特に、リシン６０とその２量体であるリシン１２０との混合物においても、リシン６０を簡便かつ迅速に検出できる。
【図１】
0004815576.tif 000038
【図２】
0004815576.tif 000039
【図３】
0004815576.tif 000040
【図４】
0004815576.tif 000041
【図５】
0004815576.tif 000042
【図６】
0004815576.tif 000043
【図７】
0004815576.tif 000044
【図８】
0004815576.tif 000045
【図９】
0004815576.tif 000046
【図１０】
0004815576.tif 000047
【図１１】
0004815576.tif 000048