(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１カラム、
前記第１カラムに第１流体を輸送するための第１流体輸送システム、および、
前記第１カラムに第２の異なる流体を輸送するための第２流体輸送システムを含む液体クロマトグラフィーシステムであり、
オペレーションの第１モードで、前記第１流体輸送システムが、前記第１流体を、ある第１流速で前記第１カラムを通過させ、および、
オペレーションの第２モードで、前記第１流体が、その進路を前記第１カラムから実質的にそらされ、および、前記第２流体輸送システムが、前記第２の異なる流体を、第２の異なる流速で前記第１カラムを通過させる、
液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項２】
前記第１カラムが、逆相高速液体クロマトグラフィー(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)カラムを含む、請求項１に記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項３】
前記第１カラムが、(i) <50 μm; (ii) 50-100 μm; (iii) 100-200 μm; (iv) 200-300μm; (v) 300-400 μm; (vi) 400-500 μm; (vii) 500-600 μm; (viii) 600-700 μm; (ix) 700-800 μm; (x) 800-900 μm; (xi) 900-1000 μm; (xii) 1.0-1.5 mm; (xiii) 1.5-2.0 mm; (xiv) 2.0-2.5 mm; (xv) 2.5-3.0 mm; (xvi) 3.0-3.5 mm; (xvii) 3.5-4.0 mm; (xviii) 4.0-4.5 mm; (xix) 4.5-5.0 mm; (xx) 5.0-5.5 mm; (xxi) 5.5-6.0 mm; (xxii) 6.0-6.5 mm; (xxiii) 6.5-7.0 mm; (xxiv) 7.0-7.5mm; (xxv) 7.5-8.0 mm; (xxvi) 8.0-8.5 mm; (xxvii) 8.5-9.0 mm; (xxviii) 9.0-9.5 mm; (xxix) 9.5-10.0 mm; および (xxx) >10.0 mmからなる群から選択される内部直径を有する、請求項１または２に記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項４】
前記第１流体輸送システムが、１の、２の、または２よりも多いポンプを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項５】
前記第１流体輸送システムが、水性溶媒輸送デバイスもしくは水性溶液輸送デバイスおよび／または有機溶媒輸送デバイスを含み、
前記水性溶媒輸送デバイスが、使用時に水性溶媒を分配し、
前記水性溶液輸送デバイスが、使用時に水性溶液を分配し、
前記有機溶媒輸送デバイスが、使用時に有機溶媒を分配する請求項１〜４のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項６】
前記有機溶媒が、(i) アセトニトリル; (ii) メタノール; (iii) プロパノール; (iv) １つのアルコール; および (v) テトラヒドロフラン(THF)からなる群から選択される、請求項５に記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項７】
前記水性溶媒輸送デバイスまたは前記水性溶液輸送デバイスおよび前記有機溶媒輸送デバイスからの流れを使用時に混合し、アイソクラチックな流体の流れを前記第１カラムに提供する、請求項５または６に記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項８】
前記第２流体輸送システムが、サンプル輸送デバイスを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項９】
前記第２流体輸送システムが、使用時に、アイソクラチックな流体の流れを前記第１カラムに提供する、請求項１〜８のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項１０】
前記第２流速が、前記第１流速よりも実質的に低い、請求項１〜９のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項１１】
前記第２流速対前記第１流速の比が、 (i) <1; (ii) 0.1-1; (iii) 0.01-0.1; (iv) 0.001-0.01; (v) 0.0001-0.001; (vi) 0.00001-0.0001; (vii) 0.000001-0.00001; (viii) 0.0000001-0.000001; (ix) <0.0000001 からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項１２】
オペレーションの前記第２モードにおける前記第２流速がゼロでない、請求項１〜１１のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項１３】
前記液体クロマトグラフィーシステムが、使用時に、１もしくはそれ以上の重要な分析物または１もしくはそれ以上の成分が前記第１カラムから出現、溶出または伝達されたことを決定、分析、測定、検出、予測または評価する際に、オペレーションの前記第１モードからオペレーションの前記第２モードに切り替える、請求項１〜１２のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項１４】
前記液体クロマトグラフィーシステムが、使用時に、あらかじめ決定した時間後に、オペレーションの前記第２モードからオペレーションの前記第１モードに切り替える、請求項１〜１３のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項１５】
前記液体クロマトグラフィーシステムが、使用時に、時間ｔ1でオペレーションの前記第１モードからオペレーションの前記第２モードに切り替え、
ｔ1が、(i) ≦ 10 秒; (ii) ≦ 9 秒; (iii) ≦ 8 秒; (iv) ≦ 7 秒; (v) ≦ 6 秒; (vi) ≦ 5 秒; (vii) ≦ 4 秒; (viii) ≦ 3 秒; (ix) ≦ 2 秒; (x) ≦ 1 秒; (xi) ≦ 0.75 秒; (xii) ≦ 0.5 秒; (xiii) ≦ 0.25 秒; (xiv) ≦ 0.1 秒; および (xv) 実質的に瞬時、からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項１６】
オペレーションの前記第２モードで、前記第１流体輸送システムから分配された流体を、実質的に前記第１カラムから進路をそらし、捨てる、請求項１〜１５のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項１７】
オペレーションの前記第２モードで、前記第１流体輸送システムから分配された前記第１流体のうち、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または９９．９％が、実質的に前記第１カラムに伝達されないか、または、
前記第１流体輸送デバイスから分配された流体のうち実質的に１００％を、前記第１カラムから進路をそらし、または実質的に前記第１カラムに伝達しない請求項１〜１６のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項１８】
前記液体クロマトグラフィーシステムがオペレーションの前記第１モードからオペレーションの前記第２モードに切り替える時、前記第１カラムに関するカラムヘッド圧が、時間ｔ2で実質的に減少されるか、または除去され、
ｔ2が、(i) ≦ 10 秒; (ii) ≦ 9 秒; (iii) ≦ 8 秒; (iv) ≦ 7 秒; (v) ≦ 6 秒; (vi) ≦ 5 秒; (vii) ≦ 4 秒; (viii) ≦ 3 秒; (ix) ≦ 2 秒; (x) ≦ 1 秒; (xi) ≦ 0.75 秒; (xii) ≦ 0.5 秒; (xiii) ≦ 0.25 秒; (xiv) ≦0.1 秒; および (xv) 実質的に瞬時、からなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項１９】
オペレーションの前記第１モードで、前記第１流体輸送システムによって分配される流体により、第２カラムから前記第１カラムへの分析物の通過が引き起こされる、請求項１〜１８のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項２０】
オペレーションの前記第１モードで、前記第１流体が、x ml/分の流速で前記第１カラムを通過し、および、オペレーションの前記第２モードで、前記第１流体が、y ml/分の流速で前記第１カラムを通過し、かつ、
yが、(i) ≦ 0.2 x; (ii) 0.15-0.20 x; (iii) 0.10-0.15 x; (iv) 0.05-0.10 x; (v) 0.01-0.05 x; (vi) ≦ 0.01 x; (vii) 実質的にゼロ、; および (viii) 0からなる群から選択される請求項１〜１９のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項２１】
特定の質量対電荷比を有する分析物が、オペレーションの前記第１モードで、 (i) <1 秒; (ii) 1-2 秒; (iii) 2-3 秒; (iv) 3-4 秒; (v) 4-5 秒; (vi) 5-6 秒; (vii) 6-7 秒; (viii) 7-8 秒; (ix) 8-9 秒; (x) 9-10 秒; (xi) 10-15 秒; (xii) 15-20 秒; (xiii) 20-25 秒;(xiv) 25-30 秒; (xv) 30-35 秒; (xvi) 35-40 秒; (xvii) 40-45 秒; (xviii) 45-50 秒; および (xix) >50 秒からなる群から選択されるピーク溶出時間を有する、請求項１〜２０のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項２２】
特定の質量対電荷比を有する分析物が、オペレーションの前記第２モードで、(i) <1 秒; (ii) 1-10 秒; (iii) 10-20 秒; (iv) 20-30 秒; (v) 30-40 秒; (vi) 40-50 秒; (vii) 50-60 秒; (viii) 60-70秒; (ix) 70-80 秒; (x) 80-90 秒; (xi) 90-100 秒; (xii) 100-110 秒; (xiii) 110-120 秒; (xiv) 120-130 秒; (xv) 130-140 秒; (xvi) 140-150 秒; (xvii) 150-160 秒; (xviii) 160-170 秒; (xix) 170-180 秒; (xx) 180-190 秒; (xxi) 190-200 秒; (xxii) 200-210 秒; (xxiii) 210-220 秒; (xxiv)220-230 秒; (xxv) 230-240 秒; (xxvi) 240-250 秒; (xxvii) 250-260 秒; (xxviii) 260-270 秒; (xxix) 270-280 秒; (xxx) 280-290 秒; (xxxi) 290-300 秒; および (xxxii) >300 秒からなる群から選択されるピーク溶出時間を有する、請求項１〜２１のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項２３】
オペレーションの第３モードで、分析物を含むサンプル混合物が、前記第２流体輸送システムから分配される、請求項１〜２２のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項２４】
オペレーションの前記第３モードで、前記分析物が、第２カラム中に保管され、第２カラムにより保管され、または、そうでなければ、第２カラムにより保持されるか、もしくは第２カラム中に保持される、請求項２３に記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項２５】
前記第２カラムが、逆相高速液体クロマトグラフィー(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)カラムを含む、請求項２４に記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項２６】
オペレーションの前記第３モードで、サンプル混合物から、塩および／または他の汚染物質が、少なくとも一部、または実質的に除去され、前記第２カラムから出る、請求項２４または２５に記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項２７】
オペレーションの前記第３モードで、前記サンプル混合物中における分析物の相対濃度が、前記第２カラム中に保管され、前記第２カラムにより保管され、または、そうでなければ、前記第２カラムにより保持されるか、もしくは前記第２カラム中に保持される間、実質的に増加する、請求項２４〜２６のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項２８】
前記液体クロマトグラフィーシステムが、オペレーションの前記第３モード後、オペレーションの前記第１モードに切り替える、請求項２４〜２７のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステム。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステムを含む分析機器であって、
前記分析機器が、(i) 紫外線 (UV) 検出器; (ii) 紫外線 (UV) 配列検出器; (iii) 赤外線 (IR) 検出器; (iv) イオン移動度セパレータ; (v) イオン移動度スペクトロメータ; (vi) 可視紫外(UV) 検出器; (vii) 核磁気共鳴 (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) 検出器; (viii) 電子スプレー光散乱検出器 (Electrospray Light Scattering Detector, ELSD); (ix) さらなる液体クロマトグラフィーシステム (LC-LC); (x) 屈折率 (RI) 検出器; (xi) 可視光検出器; (xii) 化学ルミネッセンス検出器; および (xiii) 蛍光検出器からなる群から選択される分析機器。
【請求項３０】
請求項１〜２８のいずれかに記載の液体クロマトグラフィーシステムと、前記第１カラムに連結されたイオン源とを含むマススペクトロメータ。
【請求項３１】
前記イオン源が、(i) 電子スプレー(Electrospray, "ESI") イオン源; (ii) 大気圧化学イオン化(Atmospheric Pressure Chemical Ionisation, "APCI") イオン源; (iii) 大気圧光イオン化(Atmospheric Pressure Photo Ionisation, "APPI") イオン源; (iv) レーザーディソープションイオン化 (Laser Desorption Ionisation, "LDI") イオン源; (v) 誘導結合プラズマ(Inductively Coupled Plasma, "ICP") イオン源; (vi) 電子衝撃 (Electron Impact , "EI") イオン源; (vii) 化学イオン化 (Chemical Ionisation, "CI") イオン源; (viii) フィールドイオン化 (Field Ionisation, "FI") イオン源; (ix) 高速原子衝突 (Fast Atom Bombardment, "FAB") イオン源;(x) 液体二次イオンマススペクトロメトリー (Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry, "LSIMS") イオン源; (xi) 大気圧イオン化 (Atmospheric Pressure Ionisation, "API") イオン源; (xii) フィールドディソープション (Field Desorption, "FD") イオン源; (xiii) マトリックス補助レーザーディソープションイオン化 (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation, "MALDI") イオン源; (xiv) シリコン上ディソープション／イオン化 (Desorption/Ionisation on Silicon, "DIOS") イオン源; (xv) ディソープション電子スプレーイオン化 (Desorption Electrospray Ionisation, "DESI") イオン源; および (xvi) ニッケル-63放射性イオン源からなる群から選択される、請求項３０に記載のマススペクトロメータ。
【請求項３２】
重要な分析物イオンが前記イオン源に対し溶出したか、または前記イオン源から放出されたかを決定する際に、前記液体クロマトグラフィーシステムが、オペレーションの前記第１モードからオペレーションの前記第２モードに切り替える、請求項３０または３１に記載のマススペクトロメータ。
【請求項３３】
質量分析器をさらに含み、
前記質量分析器が、(i) 直交加速式飛行時間質量分析器; (ii) 軸加速式飛行時間質量分析器; (iii) 四重極質量分析器; (iv) ぺニング質量分析器; (v) フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴 (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance, "FTICR") 質量分析器; (vi) 2Dまたは直線式四重極イオントラップ; (vii) パウル式または3D四重極イオントラップ; および (viii) 磁気セクタ質量分析器からなる群から選択される、請求項３０〜３２のいずれかに記載のマススペクトロメータ。
【請求項３４】
第１カラム、前記第１カラムに第１流体を輸送するための第１流体輸送システム、および、前記第１カラムに第２の異なる流体を輸送するための第２流体輸送システムを提供する工程、
前記第１流体輸送システムにより、流体を、ある第１流速で前記第１カラムを通過させる工程、ならびに、続いて、
前記第１流体を前記第１カラムから実質的にそらし、および、前記第２流体輸送システムにより、前記第２の異なる流体を、第２の異なる流速で前記第１カラムを通過させる工程を含む、
液体クロマトグラフィー方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の液体クロマトグラフィー方法を含むマススペクトロメトリー方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィーシステム、マススペクトロメータ、液体クロマトグラフィー方法およびマススペクトロメトリー方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
液体クロマトグラフィーは、その方法により、複雑な混合物に由来する様々な種をそれらの個々の成分に分離できる方法である。前記個々の種または成分は、実質的に異なる時間で液体クロマトグラフィーから溶出する。
【０００３】
公知の液体クロマトグラフィーシステムは、２の溶媒チャンネルA,Bを含むポンピングシステムを組み込んだ高速液体クロマトグラフィー(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)システムを含む。伝統的には、溶媒チャンネルAは、水性溶媒または溶液（例えば、0.1% の酸を含むHPLCグレード水）を含み、そして、溶媒チャンネルBは、有機溶媒（例えば、0.1% の酸を含むアセトニトリルまたはメタノール）を含む。前記水性溶媒または溶液Aおよび前記有機溶媒Bは、アイソクラチックな流れを提供するために混合される。続いて、前記混合溶媒の流れに、サンプルまたは分析しようとする分析物を導入する。前記サンプルは、前記混合溶媒の流れの中に、手動で導入しても良いし、または、オートサンプラーにより導入しても良い。
【０００４】
溶媒混合物と一緒になった前記サンプルまたは分析物は、続いて、分析カラムを通過させられる。前記分析カラムは、一般に、固定相（例えば、5 μmシリコンビーズ）が充填されている。最初は、前記混合溶媒の組成を、溶媒チャンネルA由来の水性溶媒または溶液を大部分含むようにセットする。しかしながら、水性溶媒または溶液Aに対する有機溶媒Bの割合は、一定時間以上、直線的性質で緩やかに増加する。最初に分析カラム中にトラップされた液体中の成分は、前記有機溶媒の勾配が増加するにしたがって、すなわち、前記溶媒混合物中の有機溶媒Bの割合が増加するにしたがって、再度、移動可能になり始める。例えば、前記２の溶媒チャンネルに由来する流速の相対比は直線的に変化させても良く、それにより、例えば、最初に１％以下の有機溶媒を含む前記溶媒混合物の濃度を、一定時間、例えば60分後まで累進的に増加させ、その時に前記溶媒混合物が60％の有機溶媒Bを含むようにしても良い。２の溶媒A,Bの混合物における相対的組成が変化すると、前記カラムの固定相から異なる種が放出され始め、さらにその後、前記分析カラム出口に位置する種々の手段により検出される。
【０００５】
液体クロマトグラフィーアプリケーションに使用する分析カラムの内側または内部直径は、かなりの程度変化させることができる。例えば、分析カラムの内側または内部直径は、あるアプリケーションでは50μm未満でも良いし、他のアプリケーションでは、前記内側または内部直径は、4.6 mmを超えていても良い。前記ポンピングシステムに必要とされる輸送流速は、前記分析カラムの内側または内部直径が増加するにしたがって増加し、そして、前記輸送流速は、例えば、数ナノリットル／分から数ミリリットル／分まで変化しても良い。
【０００６】
前記輸送の流れが前記分析カラムを直接通過し、さらにその後前記流れが分割されることなく分析機器（例えばマススペクトロメータ）を通過する場合、直接的な流れ配置を用いるのが一般的である。しかしながら、直接的な流れ配置が好適ではない環境がある。
【０００７】
低流速（例えば数ナノリットル／分）で正確な勾配を提供するためには、しばしば、液体クロマトグラフからの輸送の流れを前記分析機器手前で分割することが必要である。例えば、前記輸送の流れの分割が必要になるかもしれない状況として、比較的に一般的な２つがある。第１の状況は、大直径のHPLC分析カラムを用いる場合である。伝統的な標準大直径HPLC分析カラムは、4.6 mmの内部直径を有する。4.6 mmの内部直径を有するカラムは、業界標準であり、信頼性があって丈夫である。そのようなカラムは、さらに、大量処理が可能であり、フラクション収集等の精製工程に有効に用いることができる。しかしながら、そのような大直径カラムは、一般的に、数ミリリットル／分の比較的高い流速を必要とする。そのような流速を前記分析カラムに提供することは問題ではないが、例えば、前記カラムから溶出する流れを受け取りイオン化するように配置される場合がある電子スプレーイオン化イオン源で直接処理する流速としては、数ミリリットル／分の流速は高すぎるおそれがある。比較的高い流速は、特に、前記サンプルを前記分析カラム内を押し通すために用いる前記溶媒混合物が比較的高いパーセンテージまたは割合の水を含む場合は、電子スプレーイオン化イオン源には特に不適な場合がある。それゆえに、続いて、前記流れを前記HPLCカラムの上流または下流で分割し、その後、前記流れの一部のみが前記電子スプレーイオン化イオン源を直接通過するようにする必要がある。前記流れの残りは、単に廃棄しても良いし、または、それに代えて、フラクション収集として知られる工程中で重要な特定成分をバイアル内に収集しても良い。
【０００８】
第２の状況としては、ナノフローHPLCシステム（nano-flow HPLC system）を用いるとき、前記輸送の流れの分割が必要な場合がある。ナノフローHPLCシステムは、一般に小内部直径カラムを用い、そのカラムは、典型的には360 μm未満の内部直径を有する。ナノフローHPLCシステムは、それゆえに、それらの性質により、典型的には100 nl/分 から 1000 nl/分の範囲の比較的低流速、すなわち、4.6 mm内部直径カラムとともに用いられる典型的流速よりは３〜４等級低い流速で操作する。例えば、極めて少量のサンプルしか用意できない場合は、小内部直径を有するカラムを用いても良い。例えば、ナノフローHPLCシステムは、ヒト細胞から抽出されたタンパク質消化物における100フェムトモル未満のサンプルを分析する場合に用いることができる。しかしながら、HPLCポンプは、正確で、安定で、かつ再現性のある溶媒勾配をそのような比較的低流速において提供するには比較的貧弱である。そのため、溶媒チャンネルA,Bからの前記ポンプを比較的高流速で運転し、しかしその後、前記輸送の流れを前記ナノフローカラム手前で分割し、輸送流体よりも極めて低い流速のみを前記ナノフローHPLCカラム内を通過させることが知られている。
【０００９】
電子スプレーイオン化は、マススペクトロメトリーで一般に用いられている技術であり、流れている溶液中に存在する種は、電子スプレープローブに高電圧を適用することでイオン化される。
電子スプレーイオン化は、時々、穏やかなイオン化の技術として引き合いに出される。なぜならば、イオン源から生成された結果としてのイオンが、典型的には、その後質量分析器により無傷イオンとして検出できる比較的大分子量の種（例えばペプチド）を含むからである。電子スプレーイオン化は、数nl/分（すなわちナノフローレート）から数ml/分の流速の範囲におけるいくつかの異なる流速で達成することができる。
【００１０】
マススペクトロメータで電子スプレーイオン化中に観測されるイオン数は、少なくとも第１近似では流速依存性でなく、そして、それゆえに、極めて低いサンプル消費による比較的低い流速で、同一のシグナル対ノイズ比に適する高感度が達成できる。
【００１１】
電子スプレーイオン化イオン源マススペクトロメータ(LCMS)またはタンデムマススペクトロメータ(LCMS/MS)と共に用いられる液体クロマトグラフィーシステムは、世界中の多数の研究室で広く用いられている強力な分析機器を代表する。しかしながら、液体クロマトグラフィーシステムをマススペクトロメータと組み合わせて用いた場合、低存在量化学種により達成できるデータの質の限界は、任意の特定の分析物種が電子スプレーイオン化イオン源中に実際に存在する時間が比較的短いことである。そのことは、さらに、親イオンの任意の種が前記イオン源中に存在する時間の長さにより、実行し記録することができる異なるMS/MS生成物イオンマススペクトルの数が制限されるという結果をもたらす。この時間の長さは、用いられる特定のカラムのピーク溶出プロフィルにより決定される。
【００１２】
ピーク溶出時間を効果的に延長するために、重要な化学種がマススペクトロメータにより同定される時の流速を減少させる試みが知られている。この技術は、ピークパーキングまたは変流量クロマトグラフィーとして知られている。流速を減少させることは、少なくとも理論的には、スキャン毎のイオン数をロスせずに、重要な化学種がより長い時間イオン源中に存在することを可能にする。
【００１３】
米国特許第６１３９７３４号明細書（US-6139734）は、異なるリストリクターの分割比に基づいて流量が変化する変流量クロマトグラフィー方法について記述する。ここに記述された方法は、１の標準流速および１の減少流速を決定するための、２の異なる輸送分流比の使用に依存する。しかしながら、このアプローチは、圧力の平衡が即時にはされないという問題を欠点として有する。さらに、前記リストリクターが詰まり、流速の変化を引き起こすおそれがある。前記開示された変流量アプローチにおけるさらにもう一つの問題は、狭いピーク溶出時間、例えば75μmの内部直径を有するカラムについて0.5分未満では、前記減少流速が実際に完全に確立される前に、前記溶出ピークに対応する分析物がすでに完全にイオン源を通過している可能性があることである。
【００１４】
米国特許出願公開第２００２／００７２１２６号明細書（US 2002/0072126）は、他のもう一つのアプローチについて記述する。ここでは、バルブが配置されたポストカラムをスイッチし、そして、種（化学種）は、シリンジポンプを用いて低流速でマススペクトロメータ内に溶出される。前記ポストカラムのバルブは、重要な種が検出された時にスイッチする。パークを行なう間、勾配輸送ポンプ流速を停止し、および、カラムからのアウトプットをブロックする。その後、シリンジポンプは、減少流速で、イオン源内への前記種の溶出を続ける。しかしながら、ポストカラムバルブの使用は、デッドボリュームの導入につながり、そのことは、クロマトグラフィー実行およびクロマトグラフィー分離の両方に不利益となる。変流量クロマトグラフィーを可能にするための、ポストカラムバルブを用いる前記公知の方法は、それゆえに、特に不利である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、改良された液体クロマトグラフィーシステムの提供が望まれており、その液体クロマトグラフィーシステムは、変流量を採用する公知の液体クロマトグラフィーに伴う問題のいくつか、または全てに由来する不利益を有しないことが好ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明により、
第１カラム、
前記第１カラムに第１流体を輸送するための第１流体輸送システム、および、
前記第１カラムに第２の異なる流体を輸送するための第２流体輸送システムを含む液体クロマトグラフィーシステムであり、
オペレーションの第１モードで、前記第１流体輸送システムが、前記第１流体を、ある第１流速で前記第１カラムを通過させ、および、
オペレーションの第２モードで、前記第１流体が、その進路を前記第１カラムから実質的にそらされ、および、前記第２流体輸送システムが、前記第２の異なる流体を、第２の異なる流速で前記第１カラムを通過させる、
液体クロマトグラフィーシステムを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
前記第１カラムは、逆相高速液体クロマトグラフィー(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)カラムを含むことが好ましい。それよりも好ましくない実施形態によれば、前記カラムは順相カラムを含んでいても良い。前記第１カラムは、(i) < 50 μm; (ii) 50-100 μm; (iii) 100-200 μm; (iv) 200-300 μm; (v) 300-400 μm; (vi) 400-500 μm; (vii) 500-600 μm; (viii) 600-700 μm; (ix) 700-800 μm; (x) 800-900 μm; (xi) 900-1000 μm; (xii) 1.0-1.5 mm; (xiii) 1.5-2.0 mm; (xiv) 2.0-2.5 mm; (xv) 2.5-3.0 mm; (xvi) 3.0-3.5 mm; (xvii) 3.5-4.0 mm; (xviii) 4.0-4.5 mm; (xix) 4.5-5.0 mm; (xx) 5.0-5.5 mm; (xxi) 5.5-6.0 mm; (xxii) 6.0-6.5 mm; (xxiii) 6.5-7.0 mm; (xxiv) 7.0-7.5 mm; (xxv) 7.5-8.0 mm; (xxvi) 8.0-8.5 mm; (xxvii) 8.5-9.0 mm; (xxviii) 9.0-9.5 mm; (xxix) 9.5-10.0 mm; および (xxx) > 10.0 mmからなる群から選択される内部直径を有していても良い。
【００１８】
前記第１カラムは、(i) < 10 mm; (ii) 10-20 mm; (iii) 20-30 mm; (iv) 30-40 mm; (v) 40-50 mm; (vi) 50-60 mm; (vii) 60-70 mm; (viii) 70-80 mm; (ix) 80-90 mm; (x) 90-100 mm; (xi) 100-110 mm; (xii) 110-120 mm; (xiii) 120-130 mm; (xiv) 130-140 mm; (xv) 140-150 mm; (xvi) 150-160 mm; (xvii) 160-170 mm; (xviii) 170-180 mm; (xix) 180-190 mm; (xx) 190-200 mm; (xxi) 200-210 mm; (xxii) 210-220 mm; (xxiii) 220-230 mm; (xxiv) 230-240 mm; (xxv) 240-250 mm; (xxvi) 250-260 mm; (xxvii) 260-270 mm; (xxviii) 270-280 mm; (xxix) 280-290 mm; (xxx) 290-300 mm; および (xxxi) > 300 mmからなる群から選択される長さを有することが好ましい。
【００１９】
前記第１カラムは、C4, C8 または C18固定相を含むことが好ましい。
【００２０】
前記第１カラムは、(i) < 1 μm; (ii) 1-2 μm; (iii) 2-3 μm; (iv) 3-4 μm; (v) 4-5 μm; (vi) 5-6 μm; (vii) 6-7 μm; (viii) 7-8 μm; (ix) 8-9 μm; (x) 9-10 μm; (xi) 10-15 μm; (xii) 15-20 μm; (xiii) 20-25 μm; (xiv) 25-30 μm; (xv) 30-35 μm; (xvi) 35-40 μm; (xvii) 40-45 μm; (xviii) 45-50 μm; (xix) > 50 μmからなる群から選択されるサイズを有する粒子を含むことが好ましい。
【００２１】
前記第１カラムは、(i) < 100 オングストローム; (ii) 100-200 オングストローム; (iii) 200-300 オングストローム; (iv) 300-400 オングストローム; (v) 400-500 オングストローム; (vi) 500-600 オングストローム; (vii) 600-700 オングストローム; (viii) 700-800 オングストローム; (ix) 800-900 オングストローム; (x) 900-1000 オングストローム; および (xi) > 1000 オングストロームからなる群から選択される孔径を有する粒子を含むことが好ましい。
【００２２】
前記第１流体輸送システムは、１の、２の、または２よりも多いポンプを含むことが好ましい。前記ポンプは、１またはそれ以上のピストンポンプ、シリンジポンプまたは蠕動ポンプを含んでいても良い。
【００２３】
前記第１流体輸送システム（すなわち溶媒チャンネルA）は、水性溶媒または溶液輸送デバイスを含むことが好ましい。前記水性溶媒または溶液輸送デバイスAは、使用時に水性溶媒または溶液Aを分配することが好ましい。前記水性溶媒または溶液Aは、HPLCグレード水を含むことが好ましく、前記HPLCグレード水は、任意に少量の酸、例えば1％のギ酸を含んでいても良い。前記第１流体輸送システムは、有機溶媒輸送デバイス（すなわち溶媒チャンネルB）を含むことが好ましい。前記有機溶媒輸送デバイスBは、使用時に有機溶媒Bを分配することが好ましい。前記有機溶媒Bは、メタノールもしくはプロパノール等のアルコール、またはアセトニトリルまたはテトラヒドロフラン(THF)を含むことが好ましい。
【００２４】
前記水性溶媒または溶液輸送デバイスAおよび前記有機溶媒輸送デバイスBからの流れは、使用時に混合することが好ましく、それにより、アイソクラチックな流体（例えば溶媒A,B）の流れを前記第１（分析）カラムに提供することが好ましい。
【００２５】
前記第２流体輸送システムは、１の、２のまたは２よりも多いポンプを含むことが好ましい。前記ポンプは、１またはそれ以上のピストンポンプ、シリンジポンプまたは蠕動ポンプを含むことが好ましい。
【００２６】
前記第２流体輸送システムB-Cは、サンプル輸送デバイスを含むことが好ましい。前記第２流体輸送システムCは、使用時に、アイソクラチックな流体の流れを前記第１カラムに提供することが好ましい。前記第２流体輸送システムCは、水性溶媒または溶液を提供することが好ましく、前記水性溶媒または溶液はHPLCグレード水を含むことが好ましく、前記HPLCグレード水は、任意に少量の酸（例えば1％のギ酸）を含んでいても良い。
【００２７】
前記第１流速は、(i) < 10 nl/分; (ii) 10-20 nl/分; (iii) 20-30 nl/分; (iv) 30-40 nl/分; (v) 40-50 nl/分; (vi) 50-60 nl/分; (vii) 60-70 nl/分; (viii) 70-80 nl/分; (ix) 80-90 nl/分; (x) 90-100 nl/分; (xi) 100-200 nl/分; (xii) 200-300 nl/分; (xiii) 300-400 nl/分; (xiv) 400-500 nl/分; (xv) 500-600 nl/分; (xvi) 600-700 nl/分; (xvii) 700-800 nl/分; (xviii) 800-900 nl/分; (xix) 900-1000 nl/分; (xx) 1-100 μl/分; (xxi) 100-200 μl/分; (xxii) 200-300 μl/分; (xxiii) 300-400 μl/分; (xxiv) 400-500 μl/分; (xxv) 500-600 μl/分; (xxvi) 600-700 μl/分; (xxvii) 700-800 μl/分; (xxviii) 800-900 μl/分; (xxix) 900-1000 μl/分; (xxx) 1.0-2.0 ml/分; (xxxi) 2.0-3.0 ml/分; (xxxii) 3.0-4.0 ml/分; (xxxiii) 4.0-5.0 ml/分; (xxxiv) 5.0-6.0 ml/分; (xxxv) 6.0-7.0 ml/分; (xxxvi) 7.0-8.0 ml/分; (xxxvii) 8.0-9.0 ml/分; (xxxviii) 9.0-10.0 ml/分; および (xxxix) > 10.0 ml/分 からなる群から選択されることが好ましい。
【００２８】
前記第２流速は、(i) < 10 nl/分; (ii) 10-20 nl/分; (iii) 20-30 nl/分; (iv) 30-40 nl/分; (v) 40-50 nl/分; (vi) 50-60 nl/分; (vii) 60-70 nl/分; (viii) 70-80 nl/分; (ix) 80-90 nl/分; (x) 90-100 nl/分; (xi) 100-200 nl/分; (xii) 200-300 nl/分; (xiii) 300-400 nl/分; (xiv) 400-500 nl/分; (xv) 500-600 nl/分; (xvi) 600-700 nl/分; (xvii) 700-800 nl/分; (xviii) 800-900 nl/分; (xix) 900-1000 nl/分; (xx) 1-100 μl/分; (xxi) 100-200 μl/分; (xxii) 200-300 μl/分; (xxiii) 300-400 μl/分; (xxiv) 400-500 μl/分; (xxv) 500-600 μl/分; (xxvi) 600-700 μl/分; (xxvii) 700-800 μl/分; (xxviii) 800-900 μl/分; (xxix) 900-1000 μl/分; (xxx) 1.0-2.0 ml/分; (xxxi) 2.0-3.0 ml/分; (xxxii) 3.0-4.0 ml/分; (xxxiii) 4.0-5.0 ml/分; (xxxiv) 5.0-6.0 ml/分; (xxxv) 6.0-7.0 ml/分; (xxxvi) 7.0-8.0 ml/分; (xxxvii) 8.0-9.0 ml/分; (xxxviii) 9.0-10.0 ml/分; および (xxxix) > 10.0 ml/分 からなる群から選択されることが好ましい。
【００２９】
前記第２流速は、前記第１流速よりも実質的に低いことが好ましい。
【００３０】
前記第２流速対前記第１流速の比は、 (i) < 1; (ii) 0.1-1; (iii) 0.01-0.1; (iv) 0.001-0.01; (v) 0.0001-0.001; (vi) 0.00001-0.0001; (vii) 0.000001-0.00001; (viii) 0.0000001-0.000001; (ix) < 0.0000001 からなる群から選択されることが好ましい。オペレーションの前記第２モードにおける前記第２流速は、ゼロでないか、または実質的にゼロでないことが好ましい。
【００３１】
前記液体クロマトグラフィーシステムは、使用時に、１もしくはそれ以上の重要な分析物または１もしくはそれ以上の成分が前記第１カラムから出現、溶出または伝達されたことを決定、分析、測定、検出、予測または評価する際に、オペレーションの前記第１モードからオペレーションの前記第２モードに切り替えることが好ましい。
【００３２】
前記液体クロマトグラフィーシステムは、使用時に、あらかじめ決定した時間後に、オペレーションの前記第２モードからオペレーションの前記第１モードに切り替えることが好ましい。
【００３３】
前記あらかじめ決定した時間は、: (i) < 1 秒; (ii) 1-10 秒; (iii) 10-20 秒; (iv) 20-30 秒; (v) 30-40 秒; (vi) 40-50 秒; (vii) 50-60 秒; (viii) 60-70 秒; (ix) 70-80 秒; (x) 80-90 秒; (xi) 90-100 秒; (xii) 100-110 秒; (xiii) 110-120 秒; (xiv) 120-130 秒; (xv) 130-140 秒; (xvi) 140-150 秒; (xvii) 150-160 秒; (xviii) 160-170 秒; (xix) 170-180 秒; (xx) 180-190 秒; (xxi) 190-200 秒; (xxii) 200-210 秒; (xxiii) 210-220 秒; (xxiv) 220-230 秒; (xxv) 230-240 秒; (xxvi) 240-250 秒; (xxvii) 250-260 秒; (xxviii) 260-270 秒; (xxix) 270-280 秒; (xxx) 280-290 秒; (xxxi) 290-300 秒; および (xxxii) > 300 秒からなる群から選択されることが好ましい。
【００３４】
前記液体クロマトグラフィーシステムは、使用時に、時間t1でオペレーションの前記第１モードからオペレーションの前記第２モードに切り替えることが好ましく、t1は、(i) ≦ 10 秒; (ii) ≦ 9 秒; (iii) ≦ 8 秒; (iv) ≦ 7 秒; (v) ≦ 6 秒; (vi) ≦ 5 秒; (vii) ≦ 4 秒; (viii) ≦ 3 秒; (ix) ≦ 2 秒; (x) ≦ 1 秒; (xi) ≦ 0.75 秒; (xii) ≦ 0.5 秒; (xiii) ≦ 0.25 秒; (xiv) ≦ 0.1 秒; および (xv) 実質的に瞬時、からなる群から選択される。
【００３５】
オペレーションの前記第２モードで、前記第１流体輸送システムA,Bから分配された流体は、実質的に前記第１（分析）カラムから進路をそらし、捨てることが好ましい。
【００３６】
オペレーションの前記第２モードで、前記第１流体輸送システムA,Bから分配された前記第１流体A,Bのうち、少なくとも50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%または99.9%が、実質的に前記第１（分析）カラムに伝達されないことが好ましい。
【００３７】
オペレーションの前記第２モードで、前記第１流体輸送デバイスA,Bから分配された流体のうち実質的に100%を、前記第１（分析）カラムから進路をそらし、または実質的に前記第１（分析）カラムに伝達しないことが好ましい。
【００３８】
前記液体クロマトグラフィーシステムがオペレーションの前記第１モードからオペレーションの前記第２モードに切り替える時、前記第１（分析）カラムに関するカラムヘッド圧は、時間t2で実質的に減少されるか、または除去されることが好ましく、t2は、(i) ≦ 10 秒; (ii) ≦ 9 秒; (iii) ≦ 8 秒; (iv) ≦ 7 秒; (v) ≦ 6 秒; (vi) ≦ 5 秒; (vii) ≦ 4 秒; (viii) ≦ 3 秒; (ix) ≦ 2 秒; (x) ≦ 1 秒; (xi) ≦ 0.75 秒; (xii) ≦ 0.5 秒; (xiii) ≦ 0.25 秒; (xiv) ≦ 0.1 秒; および (xv) 実質的に瞬時、からなる群から選択される。
【００３９】
オペレーションの前記第１モードで、前記第１流体輸送システムA,Bによって分配される流体により、第２カラム（例えば、プレカラム）から前記第１（分析）カラムへの分析物の通過が引き起こされることが好ましい。
【００４０】
オペレーションの前記第１モードで、前記第１流体輸送システムA,Bは、前記第１（分析）カラムを通過する流体（例えば、溶媒）の流れを実質的に一定にまたは規則正しく保つ役割をすることが好ましい。
【００４１】
オペレーションの前記第１モードで、前記第１流体（例えば、溶媒）が、x ml/分の流速で前記第１（分析）カラムを通過し、および、オペレーションの前記第２モードで、前記第１流体が、y ml/分の流速で前記第１カラムを通過することが好ましい。yは、(i) ≦ 0.2 x; (ii) 0.15-0.20 x; (iii) 0.10-0.15 x; (iv) 0.05-0.10 x; (v) 0.01-0.05 x; (vi) ≦ 0.01 x; (vii) 実質的にゼロ、; および (viii) 0からなる群から選択されることが好ましい。
【００４２】
特定の質量対電荷比を有する分析物が、オペレーションの前記第１モードで、 (i) < 1 秒; (ii) 1-2 秒; (iii) 2-3 秒; (iv) 3-4 秒; (v) 4-5 秒; (vi) 5-6 秒; (vii) 6-7 秒; (viii) 7-8 秒; (ix) 8-9 秒; (x) 9-10 秒; (xi) 10-15 秒; (xii) 15-20 秒; (xiii) 20-25 秒; (xiv) 25-30 秒; (xv) 30-35 秒; (xvi) 35-40 秒; (xvii) 40-45 秒; (xviii) 45-50 秒; および (xix) > 50 秒からなる群から選択されるピーク溶出時間を有することが好ましい。
【００４３】
特定の質量対電荷比を有する分析物が、オペレーションの前記第２モードで、(i) < 1 秒; (ii) 1-10 秒; (iii) 10-20 秒; (iv) 20-30 秒; (v) 30-40 秒; (vi) 40-50 秒; (vii) 50-60 秒; (viii) 60-70 秒; (ix) 70-80 秒; (x) 80-90 秒; (xi) 90-100 秒; (xii) 100-110 秒; (xiii) 110-120 秒; (xiv) 120-130 秒; (xv) 130-140 秒; (xvi) 140-150 秒; (xvii) 150-160 秒; (xviii) 160-170 秒; (xix) 170-180 秒; (xx) 180-190 秒; (xxi) 190-200 秒; (xxii) 200-210 秒; (xxiii) 210-220 秒; (xxiv) 220-230 秒; (xxv) 230-240 秒; (xxvi) 240-250 秒; (xxvii) 250-260 秒; (xxviii) 260-270 秒; (xxix) 270-280 秒; (xxx) 280-290 秒; (xxxi) 290-300 秒; および (xxxii) > 300 秒 からなる群から選択されるピーク溶出時間を有することが好ましい。
【００４４】
前記特定の質量対電荷比を有する前記分析物は、(i) < 100; (ii) 100-200; (iii) 200-300; (iv) 300-400; (v) 400-500; (vi) 500-600; (vii) 600-700; (viii) 700-800; (ix) 800-900; (x) 900-1000; (xi) 1000-1100; (xii) 1100-1200; (xiii) 1200-1300; (xiv) 1300-1400; (xv) 1400-1500; (xvi) 1500-1600; (xvii) 1600-1700; (xviii) 1700-1800; (xix) 1800-1900; (xx) 1900-2000; および (xxi) > 2000からなる群から選択される質量対電荷比を有することが好ましい。
【００４５】
オペレーションの第３（プレローディング）モードでは、分析物を含むサンプル混合物が、前記第２流体輸送デバイスCから分配されることが好ましい。
【００４６】
オペレーションの前記第３モードでは、前記分析物が、第２カラム（すなわち、プレカラム）中に保管され、第２カラムにより保管され、または、そうでなければ、第２カラムにより保持されるか、もしくは第２カラム中に保持されることが好ましい。
【００４７】
前記第２カラム（すなわち、プレカラム）は、逆相高速液体クロマトグラフィー(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)カラムを含むことが好ましい。それよりも好ましくないが、前記第２カラム（すなわち、プレカラム）は、順相カラムを含んでいても良い。
【００４８】
前記第２カラム（すなわち、プレカラム）は、(i) < 50 μm; (ii) 50-100 μm; (iii) 100-200 μm; (iv) 200-300 μm; (v) 300-400 μm; (vi) 400-500 μm; (vii) 500-600 μm; (viii) 600-700 μm; (ix) 700-800 μm; (x) 800-900 μm; (xi) 900-1000 μm; (xii) 1.0-1.5 mm; (xiii) 1.5-2.0 mm; (xiv) 2.0-2.5 mm; (xv) 2.5-3.0 mm; (xvi) 3.0-3.5 mm; (xvii) 3.5-4.0 mm; (xviii) 4.0-4.5 mm; (xix) 4.5-5.0 mm; (xx) 5.0-5.5 mm; (xxi) 5.5-6.0 mm; (xxii) 6.0-6.5 mm; (xxiii) 6.5-7.0 mm; (xxiv) 7.0-7.5 mm; (xxv) 7.5-8.0 mm; (xxvi) 8.0-8.5 mm; (xxvii) 8.5-9.0 mm; (xxviii) 9.0-9.5 mm; (xxix) 9.5-10.0 mm; および (xxx) > 10.0 mmからなる群から選択される内部直径を有することが好ましい。
【００４９】
前記第２カラム（プレカラム）は、(i) < 10 mm; (ii) 10-20 mm; (iii) 20-30 mm; (iv) 30-40 mm; (v) 40-50 mm; (vi) 50-60 mm; (vii) 60-70 mm; (viii) 70-80 mm; (ix) 80-90 mm; (x) 90-100 mm; (xi) 100-110 mm; (xii) 110-120 mm; (xiii) 120-130 mm; (xiv) 130-140 mm; (xv) 140-150 mm; (xvi) 150-160 mm; (xvii) 160-170 mm; (xviii) 170-180 mm; (xix) 180-190 mm; (xx) 190-200 mm; (xxi) 200-210 mm; (xxii) 210-220 mm; (xxiii) 220-230 mm; (xxiv) 230-240 mm; (xxv) 240-250 mm; (xxvi) 250-260 mm; (xxvii) 260-270 mm; (xxviii) 270-280 mm; (xxix) 280-290 mm; (xxx) 290-300 mm; および (xxxi) > 300 mmからなる群から選択される長さを有することが好ましい。
【００５０】
前記第２カラムは、C4, C8 または C18固定相を含むことが好ましい。
【００５１】
前記第２カラムは、(i) < 1 μm; (ii) 1-2 μm; (iii) 2-3 μm; (iv) 3-4 μm; (v) 4-5 μm; (vi) 5-6 μm; (vii) 6-7 μm; (viii) 7-8 μm; (ix) 8-9 μm; (x) 9-10 μm; (xi) 10-15 μm; (xii) 15-20 μm; (xiii) 20-25 μm; (xiv) 25-30 μm; (xv) 30-35 μm; (xvi) 35-40 μm; (xvii) 40-45 μm; (xviii) 45-50 μm; (xix) > 50 μm からなる群から選択されるサイズを有する粒子を含むことが好ましい。
【００５２】
前記第２カラムは、(i) < 100 オングストローム; (ii) 100-200 オングストローム; (iii) 200-300 オングストローム; (iv) 300-400 オングストローム; (v) 400-500 オングストローム; (vi) 500-600 オングストローム; (vii) 600-700 オングストローム; (viii) 700-800 オングストローム; (ix) 800-900 オングストローム; (x) 900-1000 オングストローム; および (xi) > 1000 オングストロームからなる群から選択される孔径を有する粒子を含むことが好ましい。
【００５３】
オペレーションの前記第３（プレローディング）モードでは、サンプル混合物から、塩および／または他の汚染物質が、少なくとも一部、または実質的に除去され、前記第２カラム（すなわち、プレカラム）から出ることが好ましい。
【００５４】
オペレーションの前記第３モードでは、前記サンプル混合物中における分析物の相対濃度が、前記第２カラム中に保管され、前記第２カラムにより保管され、または、そうでなければ、前記第２カラムにより保持されるか、もしくは前記第２カラム中に保持される間、実質的に増加することが好ましい。
【００５５】
前記液体クロマトグラフィーシステムは、オペレーションの前記第３モード後、オペレーションの前記第１モードに切り替えることが好ましい。
【００５６】
本発明の他の一側面によれば、前述の液体クロマトグラフィーシステムを含む分析機器を提供する。
【００５７】
前記分析機器は、(i) 紫外線 (UV) 検出器; (ii) 紫外線 (UV) 配列検出器; (iii) 赤外線 (IR) 検出器; (iv) イオン移動度セパレータ; (v) イオン移動度スペクトロメータ; (vi) 可視紫外 (UV) 検出器; (vii) 核磁気共鳴 (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) 検出器; (viii) 電子スプレー光散乱検出器 (Electrospray Light Scattering Detector, ELSD); (ix) さらなる液体クロマトグラフィーシステム (LC-LC); (x) 屈折率 (RI) 検出器; (xi) 可視光検出器; (xii) 化学ルミネッセンス検出器; および (xiii) 蛍光検出器からなる群から選択されることが好ましい。
【００５８】
本発明の他の一側面によれば、前述の液体クロマトグラフィーシステムを含むマススペクトロメータを提供する。
【００５９】
前記マススペクトロメータは、前記第１カラムに連結されたイオン源をさらに含むことが好ましい。
【００６０】
前記イオン源は、(i) 電子スプレー(Electrospray, "ESI") イオン源; (ii) 大気圧化学イオン化(Atmospheric Pressure Chemical Ionisation, "APCI") イオン源; (iii) 大気圧光イオン化(Atmospheric Pressure Photo Ionisation, "APPI") イオン源; (iv) レーザーディソープションイオン化 (Laser Desorption Ionisation, "LDI") イオン源; (v) 誘導結合プラズマ(Inductively Coupled Plasma, "ICP") イオン源; (vi) 電子衝撃 (Electron Impact , "EI") イオン源; (vii) 化学イオン化 (Chemical Ionisation, "CI") イオン源; (viii) フィールドイオン化 (Field Ionisation, "FI") イオン源; (ix) 高速原子衝突 (Fast Atom Bombardment, "FAB") イオン源; (x) 液体二次イオンマススペクトロメトリー (Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry, "LSIMS") イオン源; (xi) 大気圧イオン化 (Atmospheric Pressure Ionisation, "API") イオン源; (xii) フィールドディソープション (Field Desorption, "FD") イオン源; (xiii) マトリックス補助レーザーディソープションイオン化 (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation, "MALDI") イオン源; (xiv) シリコン上ディソープション／イオン化 (Desorption/Ionisation on Silicon, "DIOS") イオン源; (xv) ディソープション電子スプレーイオン化 (Desorption Electrospray Ionisation, "DESI") イオン源; および (xvi) ニッケル-63放射性イオン源からなる群から選択されることが好ましい。
【００６１】
前記イオン源は、連続的イオン源またはパルスイオン源を含むことが好ましい。
【００６２】
前記液体クロマトグラフィーシステムは、重要な分析物イオンが前記イオン源に対し溶出したか、または前記イオン源から放出されたかを決定する際に、オペレーションの前記第１モードからオペレーションの前記第２モードに切り替えることが好ましい。
【００６３】
前記マススペクトロメータは、質量分析器をさらに含むことが好ましい。前記質量分析器は、(i) 直交加速式飛行時間質量分析器; (ii) 軸加速式飛行時間質量分析器; (iii) 四重極質量分析器; (iv) ぺニング質量分析器; (v) フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴 (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance, "FTICR") 質量分析器; (vi) 2Dまたは直線式四重極イオントラップ; (vii) パウル式または3D四重極イオントラップ; および (viii) 磁気セクタ質量分析器からなる群から選択されることが好ましい。
【００６４】
本発明の他の一側面によれば、
第１カラム、前記第１カラムに第１流体を輸送するための第１流体輸送システム、および、前記第１カラムに第２の異なる流体を輸送するための第２流体輸送システムを提供する工程、
前記第１流体輸送システムにより、流体を、ある第１流速で前記第１カラムを通過させる工程、ならびに、続いて、
前記第１流体を前記第１カラムから実質的にそらし、および、前記第２流体輸送システムにより、前記第２の異なる流体を、第２の異なる流速で前記第１カラムを通過させる工程を含む、
液体クロマトグラフィー方法を提供する。
【００６５】
本発明の他の一側面によれば、前述の液体クロマトグラフィー方法を含むマススペクトロメトリー方法を提供する。
【００６６】
前記好ましい実施形態は、都合よく、液体クロマトグラフィーカラムから溶出する重要な分析種または分析物にかける時間の延長を可能にし、それゆえに、観測されるイオン数の増加およびシグナル対ノイズ比の増加を可能にする（または、複数の成分が共溶出するとき、さらなる実験の実行を可能にする）。
【００６７】
前記好ましいクロマトグラフィーシステムは、３のポンピングトレーA,B,Cを有する液体クロマトグラフィーポンプを含む。前記ポンピングトレーのうちA,Bの２つは、溶媒勾配形成に用いることが好ましく、第３のCは、サンプルの装填（ローディング）および溶出を比較的低流速で行なうために用いるのが好ましい。前記好ましいクロマトグラフィーシステムの利点は、前記好ましいシステムが、流速コントロールのためにリストリクターを全く必要としない点である。さらに、ポストカラムバルブは必要とされず、そして、デッドボリュームの導入により引き起こされるクロマトグラフィー性能に対する不利な影響を前記好ましいシステムが受けないために、ポストカラムバルブは用いないことが好ましい。
【００６８】
前記好ましい実施形態は、ピークパーキングに対する他の公知のアプローチと比較して進歩した方法で、ピークパーキングの実行を可能にする。特に、質量分析器、マススペクトロメータまたは他の分析機器が重要な種または分析物の存在を同定する時、パルス、シグナルまたは他の指標を液体クロマトグラフィーポンプA,Bに送ることが好ましい。溶媒チャンネルA,Bに依存する溶媒勾配は、続いて、好ましくは実質的に瞬時に停止することが好ましく、そして、ポンプA,Bからの流れは、共に、減少させるかまたは実質的に停止させることが好ましい。バルブは、スイッチすることが好ましく、それにより、カラムヘッド圧を実質的に除去する（または、それよりは好ましくないが、顕著に減少させる）効果があることが好ましい。前記バルブは、補助ポンプCからのサンプルの流れを、カラムへのインプットへ向けてより低い流速で操作することをも可能にする。続いて、低圧での立ち上がりが起こることが好ましく、それにより、前記サンプルまたは分析物の、前記分析カラムの通過またはそこからの溶出が比較的低圧で起こり、それゆえにピークパーキング効果が効果的に起こることが好ましい。
【００６９】
前記システムは、さらなるパルス、シグナルまたは他の指標を受け取った時、オペレーションのピークパーキングモードからスイッチしても良い。前記さらなるパルス、シグナルまたは指標は、例えば、質量分析器、マススペクトロメータまたは他の分析機器から送られても良い。しかしながら、他の一実施形態によれば、前記システムは、セット後もしくはあらかじめ決定した時間後、または１もしくはそれ以上の他の予備決定した基準により、もしくはそれに応答し、オペレーションのピークパーキングモードから自動的にスイッチしても良い。前記システムがオペレーションのピークパーキングモードからスイッチする時、続いて、前記バルブを元の位置に戻すように切り替えることが好ましい。続いて、セットした流速を再開することが好ましく、および、続いて、溶媒チャンネルA,Bに依存する溶媒勾配を、あらかじめ停止したところから続けることが好ましい。
【００７０】
前記好ましい実施形態の特に有利な性質は、ヘッド圧が、好ましくは、ほとんどまたは実質的に瞬時に消されるために、前記好ましい液体クロマトグラフィーシステムが圧力緩和の問題による不利益を受けないことである。カラム圧は、続いて、比較的低流速で操作する補助アイソクラチックポンプCの流速に依存して立ち上げを許容されることが好ましい。前記好ましいシステムのさらなる利点は、ポストカラムバルブを全く必要とせず、および、それゆえに、クロマトグラフィー分離が前記システム内で維持されることである。
【００７１】
以下、本発明の種々の実施形態について、添付の図面を参照しながら記述するが、これらは単なる例示に過ぎない。
【００７２】
図１Ａは、オペレーションのプレカラムローディングモード中における好ましい実施形態にしたがった液体クロマトグラフィースプリットフローシステムを示す。図１Ｂは、オペレーションの標準流速溶出モード中における好ましい実施形態にしたがった液体クロマトグラフィースプリットフローシステムを示す。そして、図１Ｃは、オペレーションの減少流速溶出モード中における好ましい実施形態にしたがった液体クロマトグラフィースプリットフローシステムを示す。
【００７３】
図２Ａは、オペレーションのプレカラムローディングモード中における好ましい実施形態にしたがった液体クロマトグラフィーダイレクトフローシステムを示す。図２Ｂは、オペレーションの標準流速溶出モード中における好ましい実施形態にしたがった液体クロマトグラフィーダイレクトフローシステムを示す。そして、図２Ｃは、オペレーションの減少流速溶出モード中における好ましい実施形態にしたがった液体クロマトグラフィーダイレクトフローシステムを示す。
【００７４】
図３は、図１Ａ〜１Ｃに示したスプリットフロー液体クロマトグラフィーシステムを用いて得られた実施例データを示し、そして、
図４は、図２Ａ〜２Ｃに示したダイレクトフロー液体クロマトグラフィーシステムを用いて得られた実施例データを示す。
【００７５】
以下、スプリットフロークロマトグラフィーシステムで変流量クロマトグラフィーを実行するための好ましい実施形態について、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃを参照しながら記述する。前記好ましいクロマトグラフィーシステムは、１０ポートスイッチングバルブV1,V2を含むことが好ましい。前記システムを完成するために、異なるサイズの管およびキャピラリーを用いても良い。各図中において、バルブロータの位置は太線で示している。例えば、図１Ａに示しているバルブV1については、ポート１がポート２に連結され、ポート３がポート４に連結され、ポート５がポート６に連結され、ポート７がポート８に連結され、ポート９がポート１０に連結されている。
【００７６】
図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示しているスプリットフロークロマトグラフィーシステムは、例えば、180μm以下の内側または内部直径を有する分析カラム２１と共に用いられる。分割（スプリット）比は、プレカラム６に分析カラム２１を加えた背圧と比較したリストリクターの背圧に依存することが好ましい。
【００７７】
図１Ａは、オペレーションのプレカラムローディングモードにおけるバルブロータの位置を示す。サンプルは、前記システム中に、補助ポンプおよびオートサンプラー１経由で、好ましくは１分当たり数十マイクロリットルの流速で注入（インジェクト）することが好ましい。前記サンプルは、続いて、管２、フィルター３および管４を通過し、第１の１０ポートスイッチングバルブV1におけるポートV1(4)へ向かうことが好ましい。前記サンプルは、続いて、ポートV1(3)へ向かって通過し、そして、ポートV1(3)を経由して前記バルブを離れ、その後管５を通過し、さらに、ポートV1(6)に連結されたプレカラム６中にトラップされる。前記サンプルまたは分析物は、流体が前記プレカラム６を通過してポートV1(5)へ向かう間、プレカラム６中にトラップされることが好ましい。前記流体は、続いて、ポートV1(5)を経由し、前記バルブを離れる。前記流体は、続いて、管７を通過し、第２の１０ポートスイッチングバルブV2におけるポートV2(1)へ向かう。前記流体は、続いて、ポートV2(10)へ向かって通過し、その後、管８を経由して捨てられる。
【００７８】
図１Ａに示し、および上述したオペレーションのプレカラムローディングモードでは、溶媒の流れ（フロー）は、この間、マススペクトロメータのイオン源に連結された分析カラム２１を通過し続ける。前記溶媒の流れは、溶媒チャンネルA,Bの一部を形成する２つのポンプトレー９、１０により維持される。前記２つのポンプトレー９、１０からの液体または溶媒は、管１１、１２を通じ、混合用のＴ部１３に移動させられることが好ましい。前記２の溶媒は、続いて、混合用Ｔ部内で混合されることが好ましく、さらに、得られた混合溶媒は、続いて管１４を通過し、バルブポートV2(4)へ向かい、そしてポートV2(5)中へ向かうことが好ましい。前記混合溶媒は、続いて、管１５を通過し、分割（スプリット）用のＴ部１６へ向かう。前記分割用Ｔ部１６のリストリクターアームは、管１７を経由し、ポートV2(2)へ向かう。ポートV2(2)からの流体は、ポートV2(3)へ向かって流れ、そして次にリストリクター１８を通過し、その後、最終的に捨てられる。しかしながら、分析用の流れ（フロー）は、前記分割用Ｔ部１６を通過し、そして、そこから管１９を経由し、前記第１の１０ポートスイッチングバルブV1におけるポートV1(7)へ向かう。前記分析用フローは、続いて、ポートV1(7)を通過してそこからポートV1(8)へ向かい、その後、管２０を通過し、そしてポートV1(1)中へ向かう。前記分析用フローは、続いて、ポートV1(1)を通過してそこからV1(2)へ向かい、その後、分析カラム２１中へ向かって通過する。
【００７９】
前記分析カラム２１は、電子スプレーイオン化イオン源または他のイオン源等のナノフロースプレーデバイスに連結されていることが好ましく、前記ナノフロースプレーデバイスは、そのような比較的低流速での操作に最適にアレンジされていることが好ましい。前記スプレーデバイスまたはイオン源により生成されて得られた分析物イオンのうち少なくともいくつかは、続いて、その後の質量分析（または、さらに広く一般の分析）のために、マススペクトロメータの本体（または、それよりは好ましくないが、他の形態の分析機器）へ向かって通過することが好ましい。
【００８０】
図１Ａに関連して前述したオペレーションの前記プレカラムローディングモードでは、ポートV2(6)に連結されたプラグ２２は、オペレーションの前記特定モードのためには使われない。しかしながら、前記プラグ２２は、オペレーションの減少流速溶出モードで使われ、それについては、後に図１Ｃと関連してより詳細にディスカッションする。
【００８１】
プレカラム６中に保管されているサンプルから塩または他の汚染物質が除去され、ローディング（装填）／脱塩期間が起こった後、バルブV1は、続いて、図１Ａに示すオペレーションのプレカラムローディングモードから、図１Ｂに示しそして以下でより詳細にディスカッションするオペレーションの標準流速溶出モードにスイッチすることが好ましい。
【００８２】
図１Ｂは、オペレーションの標準流速溶出モードにおける好ましいスプリットフロークロマトグラフィーシステムを示す。流体は、例えば１分間当たり0.4マイクロリットルの流速で、補助ポンプおよびオートサンプラー１から流れるようにアレンジする。前記流体は、管２を経由して通過し、フィルター３へ向かう。フィルター３を通過後、前記流体は、続いて、管４を経由して通過し、前記第１の１０ポートスイッチングバルブV1におけるポートV1(4)へ向かう。前記流体は、続いて、ポートV1(4)を通過してそこからポートV1(5)へ向かい、そして次に、管７を経由して通過し、ポートV2(1)へ向かう。前記流体は、続いて、ポートV2(1)を通過してそこからポートV2(10)へ向かい、その後、管８を経由して通過し、捨てられる。このモードでは、前述のフローパス（流路）における背圧は極めて低い。
【００８３】
液体クロマトグラフィーの溶媒勾配は、オペレーションの標準流速溶出モードの間、実行されまたは維持されることが好ましく、そして、分析カラム２１を通って流れる前にプレカラム６を通って流れるように、下記の方法によりアレンジすることが好ましい。溶媒チャンネルA,Bにおける２のポンプトレー９、１０からの液体または溶媒は、管１１、１２を通じて混合用のＴ部１３に移動させられることが好ましい。得られた混合溶媒は、続いて、管１４を通過してバルブポートV2(4)へ向かい、その後、ポートV2(5)中へ向かって通過する。前記混合溶媒は、続いて、ポートV2(5)を通過し、そこから出て管１５を通過し、分割用のＴ部１６へ向かうことが好ましい。前記分割用部位（スプリット）のリストリクターアームは、管１７を経由してポートV2(2)へ向かう。流体は、続いて、ポートV2(2)を通過してそこからポートV2(3)へ向かい、その後、リストリクター１８を通過して捨てられる。しかしながら、分析用の流れ（フロー）は、管１９を経由して通過し、ポートV1(7)へ向かう。前記混合溶媒は、続いて、ポートV1(6)中へ向かって通過する。前記分析用フローまたは混合溶媒は、続いて、ポートV1(6)を通過してそこからプレカラム６を通過し、そして次に、管５を通過してポートV1(3)中へ向かう。混合溶媒および前記プレカラムから放出された任意の分析物を含む前記分析用フローは、続いて、ポートV1(3)を通過してそこからポートV1(2)へ向かい、そして次に、分析カラム２１中へ向かう。前記分析カラム２１は、電子スプレーイオン化イオン源または他のイオン源等のナノフロースプレーデバイスに連結されていることが好ましく、前記イオン源は、そのような比較的低流速での操作に最適にアレンジされていることが好ましい。得られた分析物イオンのうち少なくともいくつかは、続いて、その後の質量分析のためにマススペクトロメータ内を通過させることが好ましい。
【００８４】
上述したオペレーションの標準流速溶出モードでは、バルブポートV1(1)およびV1(8)と相互に連結している管２０は用いず、そして、同様に、ポートV2(6)に連結されたプラグ２２も用いない。
【００８５】
重要な種または重要な分析物がマススペクトロメータ、質量分析器または他の分析機器により検出された時、パルス、シグナルまたは他の指標をポンプA,Bに送ることが好ましい。そして、前記システムは、続いて、以下で図１Ｃを参照しながらより詳細に記述するオペレーションの減少流速溶出モードにスイッチすることが好ましい。
【００８６】
図１Ｃは、オペレーションの減少流速溶出モードにおける好ましいスプリットフロークロマトグラフィーシステムを示す。オペレーションの前記減少流速溶出モードでは、バルブV2は、図１Ｂを参照して前述したオペレーションの前記標準流速溶出モードの時にあった位置からスイッチする。このバルブV2のスイッチングは、プレカラム６および分析カラム２１への背圧を効果的に除去する効果がある。溶媒チャンネルA,Bにおける２のポンプ９、１０からの流速は、プログラム化可能な分割（スプリット）比にしたがって減少させても良く、または、溶媒勾配は、ある一定の溶媒濃度で停止またはストップさせても良い。効果的な溶媒流速は、それゆえに、効果的に減少される。前記２の溶媒チャンネルA,Bからの溶媒は、管１１、１２を経由して通過し、混合用のＴ部１３へ向かうことが好ましい。前記混合溶媒は、続いて、管１４を経由して通過し、第２の１０ポートスイッチングバルブV2におけるポートV2(4)へ向かうことが好ましい。前記混合溶媒は、続いて、ポートV2(4)を通過してポートV2(3)へ向かい、その後、リストリクター１８へ向かって通過することが好ましく、そして、捨てられることが好ましい。
【００８７】
オペレーションにおけるこのモードでは、前記補助ポンプおよびオートサンプラー１からの流れは、以下に記述するように、プレカラム６および分析カラム２１を通じて減少流速を生じさせる役割をすることが好ましい。流体の流れは、管２を通過し、フィルター３へ向かう。前記流体は、続いて、管４を経由して通過し、ポートV1(4)へ向かう。前記流体は、続いて、ポートV1(4)からポートV1(5)へ流れる。前記流体は、続いて、管７を通過し、V2(1)へ向かって流れることが好ましい。前記流体は、続いて、ポートV2(1)からポートV2(2)へ向かって通過し、そして次に、管１７を経由して分割用Ｔ部１６へ向かうことが好ましい。管１５を含むアームは、ポートV2(5)に連結されていることが好ましく、そして、ポートV2(6)のプラグ２２により行き止まりになっていることが好ましい。結果として、圧力の緩やかな立ち上がりが起こる。前記流体は、続いて、管１９を通過し、ポートV1(7)へ向かう。前記流体は、続いて、ポートV1(6)へ向かって通過し、そして、プレカラム６中へ向かう。プレカラム６から溶出する任意の分析物は、溶出し続け、そして、溶媒の流れにより管５を通過してポートV1(3)へ向かうことが好ましい。前記分析物および溶媒は、続いて、ポートV1(2)および分析カラム２１中へ向けて通過する。これにより、任意の溶出種に対し効果的な溶出時間の延長が引き起こされる。
【００８８】
オペレーションの前記減少流速溶出モードでは、第３のポンプにより提供され管２内に導入される流体は、水性溶液または溶媒（好ましくは1％ギ酸を含む）を含むことが好ましい。前記水性溶液または溶媒は、溶媒チャンネルAから好ましく分配される水性溶液または溶媒と同一でない場合は、それと実質的に同じであることが好ましい。それゆえに、オペレーションにおけるこのモードでは、システムは、効果的に、一時的に切り替えられ、それにより、プレカラム６を通過する溶媒は、溶媒勾配工程の開始時に用いられる溶媒とほぼ等価である。そのため、オペレーションにおけるこのモードでは、液体クロマトグラフィー分離の進行は、一時的にストップするか、または、そうでなければ停止することが好ましい。
【００８９】
上述した、オペレーションの減少流速溶出モードでは、管８および管２０は、用いないことが好ましい。
【００９０】
あらかじめ決定した、好ましくはプログラム化可能な時間の後、前記クロマトグラフィーシステムは、切り替えにより、オペレーションの前記減少流速溶出モードから、図１Ｂを参照して前述したオペレーションの標準流速溶出モードに戻ることが好ましい。
【００９１】
以下、他のもう一つの実施形態としてのダイレクトフローについて、図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃを参照しながら記述する。ダイレクトフローモードは、典型的には、内側または内部直径が320μm以上の分析カラム２１を用いて行なうことができる。
【００９２】
図２Ａは、ダイレクトフロークロマトグラフィーシステムの、オペレーションのプレカラムローディングモードにおける好ましいバルブロータ位置を示す。サンプルは、補助ポンプおよびオートサンプラー１を経由し、好ましくは１分当たり数十マイクロリットルの流速で、前記システム内に注入（インジェクト）されることが好ましい。前記サンプルは、管２を通過し、フィルター３へ向かう。前記サンプルは、続いて、管４を経由し、第１の１０ポートスイッチングバルブにおけるポートV1(4)へ向かう。前記サンプルは、続いて、ポートV1(4)からポートV1(3)へ向かって通過し、その後、管５を通過する。前記サンプルは、続いて、プレカラム６中にトラップされる。流体は、プレカラム６を通過し続け、ポートV1(6)へ向かう。前記流体は、続いて、ポートV1(5)を通過する。前記流体は、続いて、管２３を通過して移動し、ポートV2(6)へ向かう。前記流体は、続いて、ポートV2(7)へ向かって通過し、その後、好ましくは、管２４を経由して捨てられる。
【００９３】
オペレーションにおけるこのモードでは、溶媒の流れは、下記の方法により、分析カラム２１を通過し続けることが好ましい。溶媒チャンネルA,Bにおける２のポンプトレー９、１０からの液体は、管１１、１２を通過して混合用Ｔ部１３に移動させられることが好ましい。前記溶媒は、Ｔ部１３内で混合され、そして、その混合溶媒は、続いて、管１４を通過し、バルブポートV2(4)へ向かうことが好ましい。前記混合溶媒は、続いて、ポートV2(5)へ向かって通過し、その後、管２５を通過してポートV1(7)へ向かうことが好ましい。前記混合溶媒は、続いて、ポートV1(8)へ向かって通過し、そして、管２０を経由して通過し、ポートV1(1)へ向かうことが好ましい。続いて、前記混合溶媒は、最終的に、ポートV1(1)からポートV1(2)へ向かって通過し、その後、分析カラム２１へ向かって通過することが好ましい。前記分析カラム２１は、電子スプレーイオン化イオン源または他のイオン源等のナノフロースプレーデバイスに連結されていても良く、前記ナノフロースプレーデバイスは、比較的高流速で操作するようにアレンジされていても良い。前記スプレーデバイスまたはイオン源により生成されて得られた分析物イオンのうち少なくともいくつかは、続いて、その後の質量分析（または、さらに広く一般の分析）のために、マススペクトロメータの本体（または、それよりは好ましくないが、他の形態の分析機器）へ向かって通過することが好ましい。
【００９４】
上述したオペレーションのプレカラムローディングモードでは、プラグ２６は用いないことが好ましい。
【００９５】
プレカラム６中に保管されているサンプルから、好ましくは塩または他の汚染物質が除去され、ローディング（装填）／脱塩期間が起こった後、バルブV1は、続いて、図２Ａに示すオペレーションのプレカラムローディングモードから、図２Ｂに示しそして以下でより詳細にディスカッションするオペレーションの標準流速溶出モードにスイッチすることが好ましい。
【００９６】
図２Ｂは、オペレーションの標準流速溶出モードにおける好ましいダイレクトフロークロマトグラフィーシステムを示す。流体は、例えば１分間当たり0.4マイクロリットルの流速で、補助ポンプおよびオートサンプラー１から流れるようにアレンジする。前記流体は、管２を経由して通過し、フィルター３へ向かうことが好ましい。前記流体は、続いて、管４を経由して通過し、前記第１の１０ポートスイッチングバルブV1におけるポートV1(4)へ向かうことが好ましい。前記流体は、続いて、ポートV1(5)へ向かって通過し、そして、管２３を経由して通過し、ポートV2(6)へ向かうことが好ましい。前記流体は、続いて、ポートV2(6)を通過してそこからポートV2(7)へ向かうことが好ましく、その後、管２４を経由して通過し、捨てられることが好ましい。このモードでは、前述のフローパス（流路）における背圧は極めて低い。
【００９７】
液体クロマトグラフィーの溶媒勾配は、オペレーションの標準流速溶出モードの間、実行されおよび維持されることが好ましく、そして、分析カラム２１を通って流れる前にプレカラム６を通って流れるように、下記の方法によりアレンジすることが好ましい。溶媒チャンネルA,Bにおける２のポンプトレー９、１０からの液体または溶媒は、管１１、１２を通じて混合用のＴ部１３に移動させられることが好ましい。前記溶媒は、続いて、混合用Ｔ部１３内で混合されることが好ましく、そして、その混合溶媒は、続いて、管１４を通過してバルブポートV2(4)へ向かい、その後、ポートV2(5)中へ向かって通過することが好ましい。前記混合溶媒は、続いて、ポートV2(5)を通過し、そこから管２５を経由し、ポートV1(7)へ向かうことが好ましい。前記混合溶媒は、続いて、ポートV1(7)からポートV1(6)中へ向かって通過することが好ましい。前記混合溶媒は、続いて、プレカラム６を通過することが好ましい。プレカラム６から溶出した任意の分析物は、前記溶媒とともに管５を通過して流れ、ポートV1(3)へ向かうことが好ましい。前記溶媒および放出された分析物は、続いて、バルブV1(2)を通過することが好ましく、その後、分析カラム21を通過することが好ましい。
【００９８】
前記分析カラム２１は、電子スプレーイオン化イオン源または他のイオン源等のナノフロースプレーデバイスに連結されていることが好ましく、前記イオン源は、比較的高流速での操作に最適にアレンジされていることが好ましい。前記スプレーデバイスまたはイオン源により生成されて得られた分析物イオンのうち少なくともいくつかは、続いて、その後の質量分析（または、さらに広く一般の分析）のために、マススペクトロメータの本体（または、それよりは好ましくないが、他の形態の分析機器）へ向かって通過することが好ましい。図２Ｂに関して上述したオペレーションの標準溶出モードでは、管２０およびプラグ２６は用いない。
【００９９】
重要な種または重要な分析物がマススペクトロメータ、質量分析器または他の分析機器により検出された時、パルス、シグナルまたは他の指標を溶媒チャンネルA,Bのポンプ９、１０に送ることが好ましい。そして、前記システムは、続いて、以下で図２Ｃを参照しながらより詳細に記述するオペレーションの減少流速溶出モードにスイッチすることが好ましい。
【０１００】
図２Ｃは、オペレーションの減少流速溶出モードにおける好ましいダイレクトフロークロマトグラフィーシステムを示す。オペレーションの前記減少流速溶出モードでは、バルブV2は、図２Ｂを参照して前述したオペレーションの前記標準流速溶出モードの時にあった位置からスイッチすることが好ましい。このバルブV2のスイッチングは、プレカラム６および分析カラム２１への背圧を効果的に除去する。溶媒チャンネルA,Bにおける２のポンプ９、１０からの流速は効果的にストップされ、および、液体クロマトグラフィー勾配は、現在の組成物または溶媒勾配で効果的に停止またはストップされる。ポンプ９、１０からの溶媒は、管１１、１２を経由して通過し、混合用のＴ部１３へ向かう。前記溶媒は、前記混合用Ｔ部１３内で混合され、そして、その混合溶媒は、続いて、管１４を経由して通過し、ポートV2(4)へ向かう。前記混合溶媒は、続いて、ポートV2(3)へ向かう。ポートV2(3)は、オペレーションのこのモードでは、プラグ２６に連結されている。この流速は、続いて、ポンプのヘッド圧を維持するためにストップすることが好ましい。
【０１０１】
ここで、管２に連結されている補助ポンプからの流れは、以下に記述するように、プレカラム６および分析カラム２１を通じて溶媒流速の減少を生じさせる役割をすることが好ましい。水性溶媒は、管２を通過し、フィルター３へ向かって流れることが好ましい。前記流体は、続いて、管４を経由して通過し、ポートV1(4)へ向かうことが好ましい。前記流体は、続いて、ポートV1(4)からポートV1(5)へ流れることが好ましい。前記流体は、続いて、管２３を経由して通過し、ポートV2(6)へ向かう。前記流体は、続いて、ポートV2(5)へ向かって流れる。前記流体は、続いて、管２５を経由して流れ、ポートV1(7)へ向かう。前記流体は、続いて、ポートV1(6)へ向かって通過し、そして、プレカラム６中へ向かう。プレカラム６から溶出する任意の分析物は、続いて、溶出し続け、そして、溶媒の流れにより管５を通過してポートV1(3)へ向かうことが好ましい。前記溶媒および任意の溶出分析物は、続いて、ポートV1(2)および分析カラム２１中へ向けて通過することが好ましい。これにより、任意の溶出種に対し効果的な溶出時間の延長が引き起こされる。
【０１０２】
オペレーションの前記減少流速溶出モードでは、第３のポンプにより管２内に提供される流体は、水性溶液または溶媒（好ましくは1％ギ酸を含む）を含むことが好ましい。前記水性溶液または溶媒は、溶媒チャンネルAにより、またはそこから分配される水性溶液または溶媒と同一でない場合は、それと実質的に同じであることが好ましい。それゆえに、オペレーションにおけるこのモードでは、システムは、溶媒勾配工程の開始時に用いられる溶媒とほぼ等価な溶媒を用いるように一時的に切り替えられる。そのため、オペレーションにおけるこのモードでは、液体クロマトグラフィー分離の進行は、効果的に一時的にストップするか、または、そうでなければ停止することが好ましい。
【０１０３】
上述した、オペレーションの減少流速溶出モードでは、管２０および管２４は、用いないことが好ましい。
【０１０４】
あらかじめ決定した、好ましくはプログラム化可能な時間の後、前記クロマトグラフィーシステムは、切り替えにより、オペレーションの前記減少流速溶出モードから、図２Ｂを参照して前述したオペレーションの標準流速溶出モードに戻ることが好ましい。
【０１０５】
図３は、スプリットフローモードで操作するWaters CapLC (RTM) HPLCシステムの一部として形成された内部直径75μmのカラム中に、200 fmolのBSA消化物を注入（インジェクト）して得られたクロマトグラムを示す。
【０１０６】
図４は、同様に、ダイレクトフローモードで操作するWaters CapLC (RTM) HPLCシステムの一部として形成された内部直径180μmのカラム中に、500 fmolのBSA消化物を注入（インジェクト）して得られたクロマトグラムを示す。
【０１０７】
両方のケースにおいて、データ依存取得(Data Dependent Acquisition, DDA)実験は、MS/MSから４のイオンが選ばれるようにセットアップした。図３および４におけるトレース１は、TICを示し、そして、MSのベースピークである。図３および４におけるトレース２は、TICを示し、そして、MS/MSのベースピークである。
MS/MSモードにおける衝突エネルギーは、前記MS/MSモードにおける親イオンを保存するように、比較的低く保った。図３および４におけるトレース３および４は、MSモードにおけるイオンでMS/MSのために選ばれなかったものを示す。
【０１０８】
このデータは、オペレーションのMS/MSモードで顕著なピークパーキング効果が達成され、かつ、MS/MSのために選ばれなかったイオンについてもクロマトグラフィー分離がよく維持されたことを示す。
【０１０９】
バルブV1に異なる接続配置を用い、標準流速溶出モードで補助ポンプCからの流れをリストリクターを通じてそらすことを可能にする、さらなる実施形態も企図される（図示せず）。これにより、背圧を生じさせるかまたは増加させる効果があり、その背圧は、オペレーションの減少流速溶出モードに入る時にポンプにより見られる圧力ショックを減少させる。
【０１１０】
流れ選択バルブV1,V2は、他のより好ましくない実施形態によれば、他の数のポートを有するバルブを含んでいても良い。例えば、バルブV1,V2は、６、７、８、９のまたは１０よりも多いポートを含んでいても良い。
【０１１１】
オペレーションの標準流速溶出モードにおけるポンプ９、１０による、およびオペレーションの減少流速溶出モードにおける補助ポンプによる効果的なアイソクラチックポンプの流れは、異なる実験においてピーク溶出プロフィルを変化させるために変化させて良いことも、また企図される。
【０１１２】
前記好ましい実施形態およびそれより好ましくない実施形態は、液体クロマトグラフィーシステムに関して述べたが、前記開示したクロマトグラフィーシステムは、ガスクロマトグラフィーシステムの一部として使用できることも企図している。
【０１１３】
本発明を、好ましい実施形態に関して記述したが、添付の特許請求の範囲に述べる本発明の範囲から逸脱しない限り、形態および詳細における種々の変更が可能であることは、当業者には理解可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１４】
【図１Ａ】オペレーションのプレカラムローディングモード中における好ましい実施形態にしたがった液体クロマトグラフィースプリットフローシステムを示す。
【図１Ｂ】オペレーションの標準流速溶出モード中における好ましい実施形態にしたがった液体クロマトグラフィースプリットフローシステムを示す。
【図１Ｃ】オペレーションの減少流速溶出モード中における好ましい実施形態にしたがった液体クロマトグラフィースプリットフローシステムを示す。
【図２Ａ】オペレーションのプレカラムローディングモード中における好ましい実施形態にしたがった液体クロマトグラフィーダイレクトフローシステムを示す。
【図２Ｂ】オペレーションの標準流速溶出モード中における好ましい実施形態にしたがった液体クロマトグラフィーダイレクトフローシステムを示す。
【図２Ｃ】オペレーションの減少流速溶出モード中における好ましい実施形態にしたがった液体クロマトグラフィーダイレクトフローシステムを示す。
【図３】図１Ａ〜１Ｃに示したスプリットフロー液体クロマトグラフィーシステムを用いて得られた実施例データを示す。
【図４】図２Ａ〜２Ｃに示したダイレクトフロー液体クロマトグラフィーシステムを用いて得られた実施例データを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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