(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験試料中のグルコースの濃度測定法であって：
導電性ダイヤモンド上に、ニッケル、銅、金、白金、パラジウム、ルテニウム、イリジウム、コバルト、およびロジウムからなる群から選択される１種以上を担持してなるダイヤモンド電極と、対電極とを用意し、
前記ダイヤモンド電極と、前記対電極とを被験試料に接触させ、
前記ダイヤモンド電極と、前記対電極との間に、前記ダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧を印加し、該電圧下における電流値を測定し、
得られた電流値から前記被験試料中のグルコースの濃度を算出すること
を含んでなり、前記被験試料のｐＨが１０〜１４である、方法。
【請求項２】
得られた電流値から前記被験試料中のグルコースの濃度を算出する工程が、予め作成されたグルコースの濃度と電流値との検量線と、得られた電流値とを対比することにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記電流値の測定に先立ち、前記被験試料のｐＨを１０〜１４に調整する工程をさらに含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記電流値の測定の際の前記ニッケルおよび／または銅の価数が３である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記電流値の測定に先立ち、前記ニッケルおよび／または銅の価数を３にする工程をさらに含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記被験試料が尿である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記グルコース測定に先立ち、前記尿から尿酸およびアスコルビン酸を分離する工程をさらに含んでなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記分離が分離カラムにより行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧が、ピーク電流を与える電圧である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧が、バックグラウンド電流と酸化反応により生じる電流との差が最も大きくなる電圧である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
参照電極を被験試料中に接触させ、前記ダイヤモンド電極と、前記対電極との間に、前記ダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧の絶対値を制御することをさらに含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ダイヤモンド電極の表面積の１０倍以上の表面積を有する対電極を用いる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、臨床学的または食品学的に重要なグルコースの濃度を測定するためのダイヤモンド電極、ならびにそれを用いたグルコース濃度を測定する方法およびそのための装置に関する。
【０００２】
背景技術
ダイヤモンドは本来抵抗率が１０１３Ωｃｍ程度の絶縁材料であるが、微量不純物のドープにより導電性を獲得する。この導電性ダイヤモンドには、種々の用途が期待されている。その一つに電気化学用の電極としての利用がある。導電性とされたダイヤモンドを電気化学用の電極として見ると、広い電位窓を有し、かつバックグラウンド電流が極めて小さいという優れた特長を有する。さらに、物理的、化学的に安定であり、耐久性に優れるとの特長もまた有する。導電性ダイヤモンド（好ましくはその薄膜）を有する電極は、ダイヤモンド電極と一般的に呼ばれるに至っている。
【０００３】
ダイヤモンド電極に関する先駆的研究はIwakiらによって行われた（Iwaki et al., Nuclear Instruments and Methods, 209-210, 1129(1983)）。彼らは、アルゴンや窒素イオンを打ち込んで表面導電性を付与した単結晶ダイヤモンドの電気伝導材料としての性質を研究したものである。同時に、電解質溶液中におけるサイクリックボルタモグラムも示した。その後、ホットフィラメントを用いて気相合成した多結晶ダイヤモンド電極の特性が報告されている（Pleskov et al., J. Electroanal. Chem., 228, 19(1993)）。
【０００４】
本発明者らの一部は、気相合成したダイヤモンド電極を用いて、窒素酸化物の還元について先に報告した（Tenne et al., J. Electroanal. Chem., 347, 409(1993)）。この研究では、ドーパントとしてホウ素を導入したｐ型半導体ダイヤモンドを電極として使用した。その後、ダイヤモンド電極としては、ホウ素をドーパントとするｐ型半導体またはより導電性の高い金属様導電性ダイヤモンドの利用が主流となるに至る。１９９０年代に入って、ダイヤモンド電極の研究が複数のグループにより行われ、１９９５年以降は、より大面積のダイヤモンド薄膜が得られるプラズマＣＶＤ（ＰＣＶＤ）装置を用いて得られたダイヤモンド電極の研究が、電気化学分野にも散見されるに至っている。
【０００５】
ところで、近年、糖尿病の患者数が増加の一途を辿っている。この糖尿病の診断は、従来、血糖値を測定することにより行われるのが一般的であったが、採血を要し、その分析にも時間を要することから、簡便な方法であるとは言い難いものであった。
これに対し、近年、尿糖値測定による糖尿病診断が実用化されるようになってきた。この尿糖値の測定は、苦痛を伴う採血を行う必要がなく、排尿により得られた尿を用いるという簡便性のために、今後利用者が増大していくものと思われる。このような尿糖値の測定に用いられているセンサとしては、現在、グルコースオキシダーゼ等の酵素電極を用いたバイオセンサが知られている。
【０００６】
また、このような医学薬学の分野のみならず、食品の分野においても、グルコースの濃度を簡便に測定することができれば、食品の製造および栄養学上、利用価値が高いものと考えられる。このように、このグルコースの生体中または生体由来の試料中あるいは食品中の存在量を簡便に知ることが出来れば、医学薬学上または食品製造上極めて有意義なことである。
【０００７】
【発明の概要】
本発明者らは、今般、ニッケル、銅、金、白金、パラジウム、ルテニウム、イリジウム、コバルト、およびロジウムからなる群から選択される１種以上が担持されてなるダイヤモンド電極がグルコースに特異的に感応し、その酸化電位における電流値から、その存在量を定量出来るとの知見を得た。本発明はかかる知見に基づくものである。
従って、本発明は、グルコースの濃度を特異的かつ短時間で容易に測定可能なダイヤモンド電極の提供をその目的としている。
また、本発明は、上記ダイヤモンド電極を用いた、被験試料中のグルコースの濃度測定法およびそのための装置の提供をその目的としている。
【０００８】
そして、本発明の第一の態様によれば、好ましくはグルコース濃度を測定するために用いられるダイヤモンド電極が提供され、そのダイヤモンド電極は、導電性ダイヤモンドと、その上に担持される、ニッケル、銅、金、白金、パラジウム、ルテニウム、イリジウム、コバルト、およびロジウムからなる群から選択される１種以上とを有してなるものである。
【０００９】
また本発明の別の態様によれば、上記ダイヤモンド電極を用いた、被験試料中のグルコースの濃度測定法が提供され、その方法は、
上記ダイヤモンド電極と、対電極とを用意し、
前記ダイヤモンド電極と、前記対電極とを被験試料に接触させ、
前記ダイヤモンド電極と、前記対電極との間に、前記ダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧を印加し、該電圧下における電流値を測定し、
得られた電流値から前記被験試料中のグルコースの濃度を算出すること
を含んでなるものである。
【００１０】
さらに、本発明の別の態様によれば、上記ダイヤモンド電極を用いた、被験試料中のグルコースの濃度を測定する装置が提供され、その装置は、
上記ダイヤモンド電極と、
対電極と、
前記ダイヤモンド電極と、対電極とを被験試料に接触させる手段と、
前記ダイヤモンド電極と、前記対電極との間に、前記ダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧を印加する手段と、
該印加電圧下における電流値を測定する手段と、
得られた電流値から前記被験試料中のグルコースの濃度を算出する手段と
を少なくとも備えてなるものである。
【００１１】
【発明の具体的説明】
被検化合物
本発明による方法によれば、試料溶液中におけるグルコースの濃度を選択的に知ることが出来る。本発明者らは、前記したように、ニッケル、銅などの触媒金属が担持されてなるダイヤモンド電極上において、グルコースが電気化学的に特異的に酸化されること、さらには、このダイヤモンド電極を作用電極とし、対電極との間に生じる電流値が系内のグルコースの濃度に正比例するとの関係も確認出来た。その結果、被験試料中のグルコースを定量的に検出することが可能となった。
【００１２】
被験試料は、グルコースが含まれていると考えられる生体由来の血液、体液等、または食品もしくは食品の希釈溶液または懸濁液であってよい。尿を被験試料とすることで、本発明によるダイヤモンド電極を尿糖値測定による糖尿病診断に活用することができる。一般的に、尿糖値（すなわち尿中のグルコース濃度）に関し、以下のような基準が知られている；
ｉ）食前に尿糖値が５０ｍｇ／ｄｌ以下であり、かつ食後に１００ｍｇ／ｄｌ以下であると正常であり、
ii）食後に１００〜５００ｍｇ／ｄｌであると対糖能障害（境界型）であり、  iii）食前に５０ｍｇ／ｄｌ以上であり、かつ食後に５００ｍｇ／ｄｌ以上であると糖尿病である可能性が高い。
【００１３】
本発明のダイヤモンド電極によれば、上記濃度範囲内で尿糖値（グルコース濃度）を知ることができるので、苦痛を伴う採血を行うことなく、糖尿病および対糖能障害（境界型）の診断を、短時間で簡便に行うことができる。このように、グルコースの尿中濃度を短時間で簡便に測定可能とする本発明によるダイヤモンド電極は、その診断および治療に有用である。さらにまた、グルコースは、多くの食品にも含まれ、食品の製造および栄養学上、その濃度を簡便に知ることが出来ることの意義は大きいと言える。
【００１４】
ダイヤモンド電極およびその製造
ダイヤモンドは本来優れた絶縁体である。しかしながら、３族や５族の不純物を添加することによって、半導体〜金属様の導電性を示すようになる。本発明にあっては、半導体〜金属様の導線性を示すダイヤモンドを電極として使用する。
このような導線性を付与するために添加される物質としては、上記の通り３族および５族の元素が挙げられ、さらに好ましくはホウ素、窒素、リンが挙げられ、最も好ましくはホウ素または窒素である。この導電性を付与するために添加される物質の添加量は、ダイヤモンドに導電性を付与できる範囲で適宜決定されてよいが、例えば１×１０−２〜１０−６Ωｃｍ程度の導電性を与える量添加されることが好ましい。この導電性を付与するために添加される物質の添加量は、導電性ダイヤモンドの製造工程における添加量により制御されることが一般的である。
【００１５】
本発明によるダイヤモンド電極は、この導線性ダイヤモンドを電極として用い、その上にさらに触媒金属を担持させたものである。そして、触媒金属としては、ニッケル、銅、金、白金、パラジウム、ルテニウム、イリジウム、コバルト、ロジウム、およびこれらの組み合わせを用いるものとし、好ましくは銅および／またはニッケルである。これらの触媒金属が担持されたダイヤモンド電極は、電気化学反応を水中で行うと、酸化反応として水の電気分解により酸素が発生せず、グルコースの酸化反応を特異的に生じさせるとの極めて興味深い特性を有していた。この特性は、触媒金属がどのような形態であれ、導電性ダイヤモンド上に担持されていれば得られるものと考えられる。また、上記触媒金属のいずれかを単独で導電性ダイヤモンド上に担持させてもよいし、上記触媒金属の２種以上を、別個の金属として、あるいは合金として、導電性ダイヤモンド上に担持させてもよい。
【００１６】
本発明の好ましい態様によれば、ニッケルは導電性ダイヤモンド表面の少なくとも一部に薄膜状に担持されてなる。ニッケル薄膜は導電性ダイヤモンド上に全面的ではなく部分的にのみ形成される傾向が強く、導電性ダイヤモンド電極全面にニッケル薄膜が形成されなくとも、グルコースの検出に支障はない。単位面積あたりのニッケルの重量は、特に限定されないが、５〜１００μｇ／ｃｍ２程度が好ましく、より好ましくは２０〜３０μｇ／ｃｍ２程度である。
また、本発明の別の好ましい態様によれば、銅が導電性ダイヤモンド上に粒子状に担持されてなることができる。銅粒子の粒径は、特に限定されないが、走査線電子顕微鏡（ＳＥＭ）により測定された粒子個々の粒径が１０〜５００ｎｍであるのが好ましく、より好ましくは５０〜３００ｎｍである。単位面積あたりの銅の重量は、特に限定されないが、５〜１００μｇ／ｃｍ２程度が好ましく、より好ましくは２０〜３０μｇ／ｃｍ２程度である。
【００１７】
ニッケル、銅などの触媒金属が担持された導電性ダイヤモンドそれ自体を基材の支持によらず電極とすることも可能であるが、本発明の好ましい態様によれば、基材上に導線性ダイヤモンドの薄膜を形成し、さらにこの導電性ダイヤモンド薄膜に触媒金属を担持させるとともに、導線を接続させ、電極とすることが好ましい。基材としては、Ｓｉ（例えば、単結晶シリコン）、Ｍｏ、Ｗ、Ｎｂ、Ｔｉ、Ｆｅ、Ａｕ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ａｌ２Ｏ３、ＳｉＣ、Ｓｉ３Ｎ４、ＺｒＯ２、ＭｇＯ、黒鉛、単結晶ダイヤモンド、ｃＢＮ、石英ガラス等が挙げられ、特に単結晶シリコン、Ｍｏ、Ｗ、Ｎｂ、Ｔｉ、ＳｉＣ、単結晶ダイヤモンドの利用が好ましい。
【００１８】
この態様の電極を図１を用いて更に説明する。図１（ａ）は、ニッケル担持型ダイヤモンド電極１の断面図であり、この電極は、基材２の上に形成された導電性ダイヤモンド薄膜３と、その上に薄膜状に担持されたニッケル薄膜４とからなり、さらにこの導電性ダイヤモンド薄膜３には導線６が例えば金コーティング５を介して接続される。図１（ｂ）は、ダイヤモンド電極１の斜視図であり、基材２の上に形成された導電性ダイヤモンド薄膜３と、その上に担持されたニッケル薄膜４からなり、さらにこの導電性ダイヤモンド薄膜３を電極とするための金コーティング５を介して導線６が接続される。また、図１（ｂ）に点線で示されるように、ダイヤモンド電極１のニッケル薄膜４側の最表面の外縁および端部側面に、保護膜７を形成してもよい。この保護膜７は、エポキシ樹脂等の絶縁性の樹脂で形成されるのが好ましく、これによりダイヤモンド電極１の端部側面、金コーティング５、および導線６を電気化学的に安定な状態が確保されるように保護して、より安定かつ正確な測定を可能にする。
【００１９】
導電性ダイヤモンド薄膜の厚さは、特に限定されないが、１〜１００μｍ程度の厚さが好ましく、より好ましくは５〜５０μｍ程度である。
さらに本発明の好ましい態様によれば、本発明によるダイヤモンド電極は、マイクロ電極の形態をとることが出来る。マイクロ電極の概念は既に公知であり、本発明においてマイクロ電極形態のダイヤモンド電極とは、Ｐｔ、Ｗ、Ｍｏ等の細線の末端を鋭利に切断し、電解研磨により末端をさらに鋭利にした後、その末端表面に導電性ダイヤモンドの薄膜を形成した構成のものを意味する。
【００２０】
本発明の好ましい態様によれば、導電性ダイヤモンド薄膜は、化学気相成長法により好ましく製造される。化学気相成長法とは、気相中で気体原料を化学反応させて物質を合成する方法であり、ＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition )法と一般に呼ばれる。この方法は、半導体製造プロセスにおいて広く利用されており、本発明における導電性ダイヤモンド薄膜の製造にも合目的的な改変のもと利用可能である。
【００２１】
ダイヤモンドの化学気相合成は、メタンなどの含炭素気体と水素を混合したものを原料気体として、それを励起源により励起させ、基板上に供給して堆積させることにより行われる。
励起源としては、熱フィラメント、マイクロ波、高周波、直流グロー放電、直流アーク放電、燃焼炎などが挙げられる。また、これらを複数組み合わせて核生成密度を調整したり、大面積化や均一化を図ることも可能である。
原料としては、炭素の含まれている多くの種類の、励起源により分解、励起されて、Ｃ、Ｃ２などの活性な炭素、およびＣＨ、ＣＨ２、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ２などの炭化水素ラジカルを生じさせる化合物を利用可能である。好ましい具体例としては、気体としてＣＨ４、Ｃ２Ｈ２、Ｃ２Ｈ４、Ｃ１０Ｈ１６、ＣＯ、ＣＦ４、液体としてＣＨ３ＯＨ、Ｃ２Ｈ５ＯＨ、（ＣＨ３）２ＣＯ、固体として黒鉛、フラーレンなどが挙げられる。
【００２２】
気相合成法にあって、ダイヤモンドに導電性を付与する物質の添加は、例えば添加物質のディスクを系内に置き、炭素源原料と同様に励起させ、炭素気相に添加物質を導入する方法、炭素源に予め添加物質を添加し、系内に炭素源と共に導入し、励起源により励起し、炭素気相に添加物質を導入する方法等により行うことが出来る。本発明の好ましい態様によれば、後者の方法が好ましい。とりわけ、炭素源としてアセトン、メタノールなどの液体を用いる場合、これに酸化ボロン（Ｂ２Ｏ３）を溶解してボロン源とする方法が、ボロンの濃度の制御が容易で、かつ簡便であることから好ましい。例えば、気相合成法にあって、炭素源にホウ素を添加する場合、１０〜１２，０００ｐｐｍ程度が一般的であり、また１，０００〜１０，０００ｐｐｍ程度が好ましい。
【００２３】
本発明の好ましい態様によれば、導電性ダイヤモンド薄膜の製造はプラズマ化学気相合成法により行われることが好ましい。このプラズマ化学気相合成法は、化学反応を引き起こす活性化エネルギーが大きく、反応が速いとの利点を有する。さらに、この方法によれば、熱力学的に高温でなければ存在しない化学種を生成して、低い温度での反応が可能となる。プラズマ化学気相合成法による導電性ダイヤモンド薄膜の製造は、本発明者らの一部を含めいくつかの報告が既にあり（例えば、Yano et al., J. Electrochem. Soc., 145(1998) 1870）、これら報告に記載の方法に従って行うことが好ましい。
【００２４】
本発明において、触媒金属を導電性ダイヤモンド上に担持させる方法は、特に限定されず、種々の方法により行うことができる。
本発明の好ましい態様によれば、ニッケルを導電性ダイヤモンド上に担持させる場合、ニッケルイオンを含む溶液（例えば、硝酸ニッケル溶液、硫酸ニッケルアンモニウム溶液）を導電性ダイヤモンド上に滴下して乾燥させることにより行うことができる。こうして導電性ダイヤモンド上に担持されたニッケルは部分的に形成された薄膜状であるのが一般的である。なお、乾燥の際には加熱を行ってもよい。また、ニッケルを電着法により導電性ダイヤモンド上に担持させてもよい。
【００２５】
本発明の好ましい態様によれば、銅を導電性ダイヤモンド上に担持させる場合、導電性ダイヤモンドを銅イオンを含有する溶液に浸漬し、負の電圧を導電性ダイヤモンドに印加して、導電性ダイヤモンド上に銅を析出させることにより行うことができる。このような溶液としては、硫酸中に硫酸銅を溶解させた溶液が好ましい。こうして導電性ダイヤモンド上に担持された銅は粒子状であるのが一般的である。
なお、銅粒子の導電性ダイヤモンドへの密着性を高めるために、銅を析出させる前に、硫酸中で導電性ダイヤモンドに正の電圧を印加して、ダイヤモンドを酸化させておくのが好ましい。このようなダイヤモンドの陽極酸化は０．１Ｍ程度の水酸化ナトリウム中で、＋２．５Ｖ（対ＳＣＥ）で１時間以上酸化させておくのが好ましい。
【００２６】
測定法およびそのための装置
本発明にあっては、ダイヤモンド電極がグルコースを電気化学的に特異的に酸化し、ダイヤモンド電極を作用電極とし、対電極との間に生じる電流値が系内のグルコースの濃度に正比例するとの性質を利用して、被験試料中のグルコースを定量的に検出する。その測定は電流値を知ることにより行われるため、測定時間は短くかつ簡便であり、本発明による方法は短時間の内に容易にグルコースの濃度を知ることが出来る点で極めて有利である。
【００２７】
また、本発明のダイヤモンド電極は、グルコース以外の化合物を酸化する可能性を有するが、グルコースに極めて特異的に感応する。本発明者らの知る限り、グルコースの存在が予想される生体または食品由来の試料の多くにおいて、グルコース以外の物質が存在していても、それらには反応せず、グルコースのみをダイヤモンド電極は酸化する。従って、本発明による測定法は、グルコースのみを特異的に測定することを可能にする。
【００２８】
ただし、グルコース以外にダイヤモンド電極に応答性を有する物質が被験試料中に存在しているまたはその可能性がある場合には、グルコース測定に先立ち、グルコース以外の応答性物質を分離する前処理を行い、グルコースをそれ以外の応答性物質と峻別して、本発明による測定法に付することが好ましい。特に、本発明のダイヤモンド電極は触媒金属が担持されずに導電性ダイヤモンドが露出する部分が存在しうるため、導電性ダイヤモンドに応答してしまう物質も前もって分離しておくのが望ましい。例えば、尿を被験試料とする場合には、グルコース以外にも尿酸およびアスコルビン酸がダイヤモンド電極に反応しうるため、グルコース測定に先立ち、尿から尿酸およびアスコルビン酸を分離しておくのが望ましい。グルコース以外のダイヤモンド電極に反応しうる物質を分離する方法は特に限定されないが、分離カラムを用いた分離方法（例えば、液体クロマトグラフィー、好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））が迅速かつ簡便に応答性物質を分離できる点で好ましい。また、クーロメトリックセル、前電解処理等も好ましく挙げることができる。
【００２９】
また、本発明によるダイヤモンド電極を用いた測定法によれば、グルコースを約０．１ｍｇ／ｄｌ〜飽和濃度、好ましくは約０．１〜１５０ｍｇ／ｄｌ、より好ましくは約０．１〜１００ｍｇ／ｄｌ、さらに好ましくは約０．１〜２０ｍｇ／ｄｌ、最も好ましくは約０．１〜２ｍｇ／ｄｌ、まで広い濃度範囲で測定することが出来る。
【００３０】
本発明によるグルコースの濃度測定法において、グルコースの定量のための電気化学的系は、ダイヤモンド電極を作用電極とした以外は、一般的な電気化学的な系であることが出来る。
すなわち、本発明によるグルコースの濃度測定法にあっては、ダイヤモンド電極を作用電極とし、対電極とともに被験試料に接触させ、この二つの電極間に、ダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧を印加し、この電圧下における電流値を測定する。そして、この得られた電流値から被験試料中のグルコースの濃度を算出する。上記したように、グルコースの酸化により、ダイヤモンド電極と対電極との間に生じる電流値は、系内のグルコースの濃度に正比例する。従って、一旦ある電圧値における電流値とグルコースの濃度との関係を求めておけば、その関係から、得られた電流値に対応する被験試料中のグルコースの濃度を容易に知ることが出来る。すなわち、本発明の好ましい態様にあっては、グルコースの濃度と電流値との検量線を予め作成しておき、この検量線と、得られた電流値とを対比することにより、グルコースの濃度を知ることが出来る。
【００３１】
本発明にいて対電極としては、白金、炭素、ステンレス、金、ダイヤモンド、ＳｎＯ２等の利用が好ましい。
本発明の好ましい態様によれば、対電極の表面積が、ダイヤモンド電極の表面積の１０倍以上であるのが好ましく、より好ましくは１００倍以上、さらに好ましくは１０００倍以上、である。これにより、参照電極を用いることなく、高い測定精度を実現することができる。このような大表面積の対電極の好ましい例としては、白金電極上にさらに白金めっきが施されてなる白金黒などが挙げられる。
【００３２】
本発明において、作用電極であるダイヤモンド電極と、対電極との間に印加される電圧は、ダイヤモンド電極上でグルコースの酸化反応が生じるものであれば限定されないが、測定効率および精度の観点から、この印加電圧は、グルコースの酸化のピーク電流を与える電圧であることが好ましい。ここで、ピーク電流とは、例えばサイクリックボルタンメトリーにより、最大電流値を与える電圧として求めることが出来る。ただし、ピーク電流付近でバックグランド電流が著しく増大してしまう場合においては、バックグランド電流が測定に悪影響を及ぼさない程度に低い範囲内で最もピーク電流に近い電圧、すなわちバックグラウンド電流と酸化反応により生じる電流との差が最も大きくなる電圧、を選択するのが、安定かつ高感度の測定を行える点で好ましい。さらに、本発明の別の好ましい態様によれば、最大電流値を与える電圧は、回転電極法またはマイクロ電極法により求めることが出来る。回転電極法またはマイクロ電極法によれば、測定条件等による測定誤差の可能性をより排除出来る点で有利である。
【００３３】
さらに、本発明の好ましい態様によれば、参照電極を被験試料中に接触させ、ダイヤモンド電極と、対電極との間に、ダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧の絶対値を制御することが、測定精度の観点から好ましい。参照電極は公知のものを利用することが出来、飽和カロメル電極（ＳＣＥ）、標準水素電極、銀塩化銀電極、水銀塩化水銀電極、水素パラジウム電極等が利用可能である。
【００３４】
本発明による測定方法において、電気化学的系は、ダイヤモンド電極を作用電極とした以外は、一般的な電気化学的な系であることが出来るが、本発明の好ましい態様によれば、所定の溶液を一定流速でキャリアとして系内を流し、そのキャリア溶液中に被験試料を注入して測定を行う、フローセルを用いたフローインジェクション法による測定が好ましい。
フローセルを用いたフローインジェクション法の概略は図２（ａ）に示される通りである。フローセル２１には、キャリア溶液溜８から、ポンプ９によりキャリア溶液が注入される。ポンプ９とフローセル２１との間には、被験試料注入口１０が設けられ、キャリア溶液に被験試料が注入可能とされる。フローセル２１を通過したキャリア溶液は、廃液溜１１に集められる。また、グルコース測定に先立ち、グルコース以外の応答性物質を分離する前処理を行う場合には、被験試料注入口１０とフローセル２１との間に、分離カラムまたは前電解装置等の分離装置（図示せず）が設けられる。
【００３５】
フローセル２１の基本構造は図２（ｂ）に示されるとおりである。フローセル２１は、ダイヤモンド電極１、対電極２２、および参照電極２３が、キャリア溶液および被験試料が流れる流路２４内に露出され、被験試料と接触出来るよう構成されている。なお、図２（ｂ）において、対電極２２が紙面垂直方向に延在してなる。ダイヤモンド電極２１は、基本的に図１に示される構造を有し、図１におけるニッケル薄膜４が、流路２４内に露出され、キャリア溶液および被験試料と接触する。キャリア溶液は、流路２４の流入口２５から入り、図中の矢印のように流れ、流出口２６に至る。ダイヤモンド電極１の導線Ａおよび対電極２２の導線Ｂの間に、グルコースをダイヤモンド電極１上で酸化を生じさせる電圧、好ましくはピーク電流、またはバックグランド電流が測定に悪影響を及ぼさない程度に低い範囲内で最もピーク電流に近い電圧を印加する。
【００３６】
測定は以下のように行われる。まず、被験試料を注入しないキャリア溶液のみを流し、いわゆるバックグラウンド電流を出来るだけ小さくし、かつ安定させる。ダイヤモンド電極はバックグラウンド電流が小さいことを特長とする。次に、被験試料を被験試料注入口１０より注入する。この注入は継続して行われてもよいが、ピーク電流を測定可能な程度の量を一時期に注入してもよい。グルコースが被験試料中に含まれている場合、グルコースがダイヤモンド電極１上で酸化され、酸化反応に伴う電流値が測定できる。この電流値より、グルコースの濃度を知る。
【００３７】
本発明においてニッケルおよび／または銅を触媒金属とする場合にあっては、以下の式により示されるように、電流値測定の際のニッケルおよび／または銅の価数が３であることにより、グルコースとの酸化反応が起きると考えられる。
Ｎｉ（II）  →  Ｎｉ（III）  ＋  ｅ−  （ＯＨ−中）
Ｎｉ（III）  ＋  グルコース  →  Ｎｉ（II）  ＋  生成物
Ｃｕ（II）  →  Ｃｕ（III）  ＋  ｅ−  （ＯＨ−中）
Ｃｕ（III）  ＋  グルコース  →  Ｃｕ（II）  ＋  生成物
すなわち、２価よりも３価のニッケルおよび／または銅がグルコースとの酸化反応に寄与するものと考えられる。したがって、電流値測定の際にニッケルおよび／または銅の価数が３ではない（例えば２価）の場合には、３価にしておくことが望ましい。
【００３８】
ニッケルおよび／または銅を３価にするためには、被験試料のｐＨを高く設定することが有効であり、好ましいｐＨは１０〜１４、より好ましくはｐＨ１１〜１３である。本発明の好ましい態様によれば、電流値の測定に先立ち、被験試料のｐＨを１０〜１４に調整する工程を行うのが好ましい。また、このｐＨの調整は、フローインジェクションのキャリアとしてｐＨ１０〜１４に調整された溶媒を用いることにより行ってもよい。
【００３９】
本発明の別の好ましい態様によれば、フローセル２１におけるダイヤモンド電極１をマイクロ電極の形態とすることも好ましい。また、本発明の別の好ましい態様によれば、ダイヤモンド電極１を回転電極としてもよい。
【００４０】
さらに、本発明の別の態様によれば、被験試料中のグルコースの濃度を測定する装置が提供される。この装置の基本構成は図３に示される通りである。図３の装置において、電源・電流計３１には、図２に記載のフローセルより、ダイヤモンド電極１に接続される導線Ａ、対電極２２に接続される導線Ｂ、および参照電極２３に接続される導線Ｃが接続される。この電源・電流計３１は、ダイヤモンド電極と対電極との間にダイヤモンド電極上で酸化反応の生じる電圧を印加する手段と、この印加電圧下における電流値を測定する手段とを兼ねるものである。すなわち、この電源・電流計３１によって、ダイヤモンド電極１および対電極２２の間に、グルコースをダイヤモンド電極１上で酸化を生じさせる電圧を印加し、さらにグルコースのダイヤモンド電極１上での酸化反応に伴う電流値を測定する。この電流値は、電流値比較・濃度算出装置３２に送られる。この装置３２には、検量線データ３３が送られ、この装置内において、電源・電流計３１から送られた電流値と、検量線データを比較し、グルコースの濃度を算出する。すなわち、得られた電流値から被験試料中のグルコースの濃度を算出する手段を備える。得られたグルコース濃度は、表示装置３４により表示される。
【００４１】
【実施例】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例において、参照電極として飽和カロメル電極（ＳＣＥ）およびＡｇ／ＡｇＣｌ電極のいずれかを使用したが、これらのいずれの電極であってもほぼ同等の電位が得られるため、測定上実質的な差異はないものと考えられる。
【００４２】
実施例１：ニッケル担持型ダイヤモンド電極を用いたグルコース濃度の測定
ニッケル担持型ダイヤモンド電極の作製
まず、導電性ダイヤモンド薄膜を、ＡＳＴｅＸ社製、マイクロ波ＣＶＤ成膜装置を用い、マイクロ波プラズマアシストＣＶＤ法により調製した。具体的には以下の通りである。
【００４３】
シリコン基板（Ｓｉ（１００））の表面を、０．５μｍのダイヤモンド粉で研磨した後、ＣＶＤ成膜装置の基板ホルダにセットした。炭素源としてアセトンとメタノールとの混合物（混合比９：１（体積比））を用いた。さらに、この混合物に酸化ホウ素（Ｂ２Ｏ３）を、ホウ素／炭素比で１０４ｐｐｍとなる量溶解した。炭素源の混合物に純水素ガスを通し、溶存気体と置換した。一方、チャンバー内に純水素ガスを５３２ｃｃ／分の流速で流し、さらにその圧力を１１５×torr（１１５×１３３．３２２Ｐａ）とした。次に、２．４５ＧＨｚのマイクロ波をチャンバー内に注入し、放電させ、出力が５ＫＷとなるよう調製した。装置が安定したことを確認した後、炭素源混合物にキャリアガスとして純水素ガスを１５ｃｃ／分の流速で流し、チャンバー内に導入し、成膜を行った。成膜速度は１〜４μｍ／時であった。約３０μｍの厚さとなるまで成膜を行った。基板の加熱は行わなかったが、定常状態において約８５０〜９５０℃の温度となっていることが観察された。
【００４４】
得られた導電性ダイヤモンド薄膜のラマンスペクトルをとると、１３３３ｃｍ−１に単一ピークのみが観察された。また、電気伝導度は約１０−３Ωｃｍ程度であった。また、ダイヤモンド薄膜中に含まれるホウ素の濃度を測定したところ、１００００ｐｐｍであった。
【００４５】
次に、得られた導電性ダイヤモンド薄膜上にニッケルを以下のようにして担持させた。導電性ダイヤモンド薄膜上に、１０ｍＭの硝酸ニッケルＮｉ（ＮＯ３）２）を約１００μｌ滴下し、１００℃で２〜３時間乾燥させた。その後、導電性ダイヤモンド薄膜を純水で軽くすすぎ、０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液中で０．０〜０．８Ｖ（対ＳＣＥ）の電位範囲で２００回スイープさせることによって、電気化学的に触媒金属を活性化させた。
【００４６】
得られたニッケル担持型ダイヤモンド電極の表面を走査線電子顕微鏡（ＳＥＭ）により観察するとともに、電子光分光法（ＸＰＳ）により分析した。図４に得られたダイヤモンド電極表面のＳＥＭ写真を示す。同図において、白色の部分がニッケルである。図４に示されるように、ニッケルが導電性ダイヤモンド上に薄膜状に付着されているのが観察された。また、ＸＰＳ測定ではニッケルに由来するピークが８５５ｅＶ付近に観察された。
【００４７】
測定条件の選定
作製したニッケル担持型ダイヤモンド電極について、グルコース濃度の最適な測定条件を選定するために、サイクリックボルタンメトリーおよびハイドロダイナミックボルタンメトリーを行った。
まず、０．２Ｍの水酸化ナトリウム溶液中（ｐＨ１３．３程度）において電位掃引速度を１００ｍＶｓ−１とするサイクリックボルタモグラムを測定した。具体的には、ガラスセル中において、Hokuto Denko HA-502 ポテンショスタット、Hokuto Denko HB-11ファンクションジェネレーター、およびRiken Denshi x-yレコーダーを用いて、室温にて行った。このとき、上記のようにして得られたニッケル担持型ダイヤモンド電極を作用電極として用い、また白金箔を対電極として用いた。参照電極として、飽和カロメル電極（ＳＣＥ）を用いた。その結果、ピーク電位が＋０．５Ｖ付近であることが確認出来た。また、複数回のサイクルを繰り返しても、著しいピークの減少は見られなかった。
【００４８】
次に、０．２Ｍの水酸化ナトリウム溶液中にグルコースが１ｍＭ溶解した溶液２０μｌについて流速１ｍｌ／ｓの条件でハイドロダイナミックボルタンメトリーを測定した。具体的には、電位を固定させ、その電位のバックグラウンド電流が定常状態になった後、サンプル溶液を注入してそのシグナル電流を測定した。このとき、電位は０．０〜＋０．６Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）の間で０．０５〜０．１Ｖの間隔で変化させて行った。その結果、シグナル電流は電位とともに増大していったが、＋０．５Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）に達しようとする辺りバックグラウンド電流が著しく増加した。したがって、グルコース濃度測定の際の最適な検出電位として、バックグランド電流が測定に悪影響を及ぼさない程度に低い範囲内で最も高いシグナル電流が得られる、＋０．４５Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）を選定した。
【００４９】
グルコース濃度の測定
上述のようにして得られたニッケル担持型ダイヤモンド電極を用いて、尿中のグルコース濃度の測定を行った。具体的には以下の通りである。
（ａ）装置の準備
図２および図３に示される装置を準備した。このとき、尿中からグルコース以外の応答性物質である尿酸およびアスコルビン酸を分離することを目的として、被験試料注入口１０とフローセル２１との間に、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）カラム（HAMILTON社製；RCX-10(Part No.79940)）、カラムの全長；２４０ｍｍ、カラムの直径；４．１ｍｍ）を設けた。また、図３に示される測定装置として、BAS(LC-4C)ポテンショスタット、およびScientific Software,Inc EZChrom Elite Client/Serverを用いた。このとき、上記のようにして得られたダイヤモンド電極を作用電極１として用い、また白金箔を対電極２２として用いた。参照電極２３として、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を用いた。
【００５０】
（ｂ）検量線の作成
まず、検量線を作成するにあたり、尿を３０ｍＭ水酸化ナトリウム（ｐＨ１２．５程度）で１０倍に希釈して測定することを想定して、測定しようとするグルコースの濃度範囲を０〜１００ｍｇ／ｄｌの範囲に設定した。ここで尿を１０倍に希釈することとしたのは、実際の尿中での濃度が０〜１０００ｍｇ／ｄｌであることを想定し、本発明のダイヤモンド電極の好ましい測定濃度の範囲内で測定できるようにするためである。次いで、０〜１００ｍｇ／ｄｌの濃度範囲内において、種々の濃度のグルコース溶液を調製した。
【００５１】
得られた各濃度のグルコース溶液を、被験試料注入口１０に注入し、ＨＰＬＣカラムを介してフローセル２１を通過させながら、図３に示される装置を介して＋０．４５Ｖという検出電位で反応電流を検出した（アンペロメトリック測定）。このときキャリア溶液として３０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液（ｐＨ１２．５程度）を用いた。得られた電流の値とグルコース濃度との関係を得て、検量線を作成した。得られた検量線は図５の通りであった。図５に示されるように、０〜１００ｍｇ／ｄｌの範囲では濃度に比例して、検出電流も推移した。
【００５２】
（ｃ）グルコースの定量
まず、以下の３種類の試料溶液を調製した；
ｉ）試料溶液Ａ；人間の尿を３０ｍＭ水酸化ナトリウム（ｐＨ１２．５程度）で１０倍に希釈したサンプル液
ii）試料溶液Ｂ；上記試料溶液Ａにグルコース１０ｍｇ／ｄｌを加えた溶液、
iii）試料溶液Ｃ；上記試料溶液Ａにおよびグルコース５０ｍｇ／ｄｌ加えた溶液。
【００５３】
上記試料溶液Ａ〜Ｃのそれぞれについて、図２に示されるフローセルを用いた、フローインジェクション法により、シグナル電流値を求めた。試料溶液を被験試料注入口１０に注入し、ＨＰＬＣカラムを介してフローセル２１を通過させながら、図３に示される装置を介して＋０．４５Ｖという検出電位で反応電流を検出した（アンペロメトリック測定）。このとき、キャリア溶液として３０ｍＭの水酸化ナトリウム溶液を使用した。印加電圧は、対塩化銀電極で＋０．４５Ｖとした。あらかじめ調べておいたグルコースに由来するシグナル電流が現れる時間が経過したところで、シグナル電流値を測定した。
【００５４】
得られたシグナル電流値は、試料溶液Ａが４ｎＡ、試料溶液Ｂが１４ｎＡ、試料溶液Ｃが７２ｎＡであった。これらのシグナル電流値を図５に示される検量線に当てはめることにより各溶液のグルコース濃度を算出したところ、試料溶液Ａが２ｍｇ／ｄｌ、試料溶液Ｂが１２ｍｇ／ｄｌ、試料溶液Ｃが５２ｍｇ／ｄｌであった。これらの結果より、試料溶液Ａの濃度の１０倍に相当する２０ｍｇ／ｄｌは正常値であり、被験者は糖尿病ではないと判定した。また、試料溶液Ｂは、グルコースを添加した分だけ試料溶液Ａよりも濃度が高く、試料溶液Ｃについても同様に、グルコース添加分だけ試料溶液Ａよりも濃度が高いという結果が得られた。
【００５５】
実施例２：銅担持型ダイヤモンド電極を用いた検量線の作成
銅担持型ダイヤモンド電極の作製
まず、実施例１と同様にして、導電性ダイヤモンド薄膜を、マイクロ波プラズマアシストＣＶＤ法により調製した。
【００５６】
次に、得られた導電性ダイヤモンド薄膜上に銅を以下のようにして担持させた。まず、０．０５Ｍの硫酸溶液中で導電性ダイヤモンド薄膜に＋２Ｖ（対ＳＣＥ）の電圧を１５分間印加して酸化させた。この酸化された導電性ダイヤモンド薄膜を、５０ｍＭの硫酸中に１ｍＭの硫酸銅が溶解されてなる溶液に浸漬させて、−０．１２Ｖ（対ＳＣＥ）の電圧で６０μＡの電流を２２分間流し、導電性ダイヤモンド上に銅粒子を析出させた。得られた導電性ダイヤモンド薄膜上の銅の密度は、３６μｇ／ｃｍ２であった。その後、導電性ダイヤモンド薄膜を純水で軽くすすぎ、０．２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液中で０．０〜０．８Ｖ（対ＳＣＥ）の電位範囲で２００回スイープさせることによって、電気化学的に触媒金属を活性化させた。
【００５７】
得られた銅担持型ダイヤモンド電極の表面を走査線電子顕微鏡（ＳＥＭ）により観察した。図６に得られたダイヤモンド電極表面のＳＥＭ写真を示す。同図において、白色の粒子が銅である。図６に示されるように、銅が導電性ダイヤモンド上に粒子状に付着しているのが観察された。
【００５８】
測定条件の選定
作製した銅担持型ダイヤモンド電極について、グルコース濃度の最適な測定条件を選定するために、サイクリックボルタンメトリーおよびハイドロダイナミックボルタンメトリーを行った。
まず、０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液中（ｐＨ１３．０程度）において電位掃引速度を１００ｍＶｓ−１とするサイクリックボルタモグラムを測定した。具体的には、ガラスセル中において、Hokuto Denko HA-502 ポテンショスタット、Hokuto Denko HB-11ファンクションジェネレーター、およびRiken Denshi x-yレコーダーを用いて、室温にて行った。このとき、上記のようにして得られた銅担持型ダイヤモンド電極を作用電極として用い、また白金箔を対電極として用いた。参照電極として、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極を用いた。その結果、ピーク電位が＋０．６２５Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）付近であることが確認出来た。また、複数回のサイクルを繰り返しても、著しいピークの減少は見られなかった。
【００５９】
次に、０．１Ｍの水酸化ナトリウム溶液中（ｐＨ１３．０程度）にグルコースが１ｍＭ溶解した溶液について、ハイドロダイナミックボルタンメトリーを測定した。具体的には、電位を固定させ、その電位のバックグラウンド電流が定常状態になった後、サンプル溶液を注入してそのシグナル電流を測定した。このとき、電位は０．０〜＋０．８Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）の間で０．０５〜０．１Ｖの間隔で変化させて行った。その結果、シグナル電流は電位とともに増大していったが、＋０．８Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）に達した辺りバックグラウンド電流が著しく増加した。このように、ピーク電流が得られる＋０．６２５Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）においてバックグラウンド電流が非常に低いことから、グルコース濃度測定の際の最適な検出電位として、この＋０．６２５Ｖ（対Ａｇ／ＡｇＣｌ）を選定した。
【００６０】
検量線の作成
上述のようにして得られた銅担持型ダイヤモンド電極を用いて、尿中のグルコース濃度の測定を行った。具体的には以下の通りである。
（ａ）装置の準備
作用電極１として上記銅担持型ダイヤモンド電極を、参照電極２３として飽和カロメル（ＳＣＥ）電極を用いたこと、および分離カラムを設けなかったこと以外は、実施例１と同様にして装置を準備した。
【００６１】
（ｂ）検量線の作成
まず、検量線を作成するにあたり、測定しようとするグルコースの濃度範囲を０〜２０ｍｇ／ｄｌの範囲に設定した。次いで、この濃度範囲内において、種々の濃度のグルコース溶液を調製した。
【００６２】
得られた各濃度のグルコース溶液を、被験試料注入口１０に注入し、フローセル２１を通過させながら、図３に示される装置を介して＋０．６２５Ｖ（対ＳＣＥ）という検出電位で反応電流を検出した（アンペロメトリック測定）。このとき、キャリア溶液として０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（ｐＨ１３．０程度）を使用した。得られた電流の値とグルコース濃度との関係を得て、検量線を作成した。得られた検量線は図７（ａ）および（ｂ）の通りであった。図７（ａ）に示されるように、０〜２ｍｇ／ｄｌの範囲では濃度に比例して検出電流も推移した。また、図７（ｂ）に示されるように、０〜２０ｍｇ／ｄｌの範囲では濃度にほぼ比例して検出電流も推移した。
【００６３】
このように、銅担持型ダイヤモンド電極についても、ニッケル担持型ダイヤモンド電極の場合と同様に、グルコース濃度に対して比例関係を有する検量線が得られた。したがって、銅担持型ダイヤモンド電極についても、ニッケル担持型ダイヤモンド電極の場合と同様、グルコースの濃度を迅速かつ簡便でありながら、極めて正確に測定できることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ダイヤモンド電極の構造を示す図であり、（ａ）はダイヤモンド電極１の断面図であり、この電極は、基材２の上に形成された導電性ダイヤモンド薄膜３とからなる。（ｂ）は、ダイヤモンド電極１の斜視図であり、基材２の上に形成された導電性ダイヤモンド薄膜３と、その上に形成されたニッケル薄膜４からなる。
【図２】本発明による測定法に用いられるフローセルの基本構造を示す図である。
【図３】本発明による測定装置の基本構成を示す図である。
【図４】実施例１において作製された、本発明のニッケル担持型ダイヤモンド電極表面の走査線電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。
【図５】図４に示されるニッケル担持型ダイヤモンド電極を用いて作成された、グルコース濃度と、シグナル電流の値との検量線である。
【図６】実施例２において作製された、本発明の銅担持型ダイヤモンド電極表面の走査線電子顕微鏡（ＳＥＭ）写真である。
【図７】図６に示される銅担持型ダイヤモンド電極を用いて作成された、グルコース濃度と、シグナル電流の値との検量線であり、（ａ）はグルコース濃度が０〜２ｍｇ／ｄｌの範囲の検量線を示し、（ｂ）はグルコース濃度が０〜２０ｍｇ／ｄｌの範囲の検量線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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