(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの第一の貫通孔を設けた薄板と、第二の貫通孔を設けた保持プレートと、インナーウエルを内包したウエルからなり、前記第一の貫通孔に保持した細胞の細胞電位を電極により測定するための細胞電気生理センサであって、前記薄板を第二の貫通孔の内部に保持し、この第二の貫通孔の上部にウエルを配置して保持プレートに当接し、前記ウエルの内部に内包するように溶液または細胞を含んだ溶液を蓄積できるインナーウエルを設け、このインナーウエルには上部からインナーウエルの外壁面に通じる第三の貫通孔を設けるとともに、この第三の貫通孔に繋がる少なくとも一つの溝をインナーウエルの外壁面に設け、この溝の一方の開口部は前記保持プレートの第二の貫通孔に向かって開口している細胞電気生理センサ。
【請求項２】
インナーウエルの壁面部の保持プレート側の開口部の形状を薄板の外径よりも小さくした請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項３】
インナーウエルの壁面部の保持プレート側の開口部に第二の貫通孔の内部へ突出した突出部を設けた請求項１に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項４】
薄板の外周部に枠体部を設け、この枠体部を保持プレートの第二の開口部に前記枠体部をインナーウエル側となるよう保持し、このインナーウエルの突出部を前記枠体部によって構成したキャビティの内部へ挿入した請求項３に記載の細胞電気生理センサ。
【請求項５】
少なくとも一つの第一の貫通孔を設けた薄板と、第二の貫通孔を設けた保持プレートと、インナーウエルを内包したウエルからなり、前記薄板を第二の貫通孔の内部に保持し、この第二の貫通孔の上部にウエルを配置して保持プレートに当接し、前記ウエルの内部に内包するように溶液または細胞を含んだ溶液を蓄積できるインナーウエルを設け、このインナーウエルには第三の貫通孔を設けるとともに、この第三の貫通孔の一方の開口部は前記保持プレートの第二の貫通孔に向かって開口しており、前記第一の貫通孔に保持した細胞の細胞電位を電極により測定するための細胞電気生理センサを準備する工程と、前記インナーウエルの内部に第一の溶液を蓄積する工程と、第三の貫通孔の内部へ第二の溶液を投入する工程を少なくとも含む細胞電気生理現象の測定方法。
【請求項６】
インナーウエルの内部の第一の溶液を第二の溶液へ交換する請求項５に記載の細胞電気生理現象の測定方法。
【請求項７】
第二の溶液に細胞を含ませる請求項６に記載の細胞電気生理現象の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の薬剤に対する反応を測定するために用いられる細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、電気生理学におけるパッチクランプ法は、微細な先端を持つガラスマイクロピペットを用いて細胞膜に存在するイオンチャンネルを測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。
【０００３】
しかし、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なガラスマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要であり、高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。
【０００４】
このため、微細加工技術を利用した平板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。例えば、２つの領域を分離するキャリアに穴を有し、このキャリアの上下に設置した電極によって電界を発生させることで細胞の穴を効率よく保持し、上下の電極間で電気的測定を行うことで細胞状態量測定の一つである電気生理的測定を可能にする技術が開示されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００５】
一方、細胞と接触しうる細胞作用剤を含有する溶液を連続的または間欠的に流すのに適した微小流体室と、この微小流体室中に保持された生細胞と、この生細胞に生じる細胞媒介細胞外効果を測定する手段を用意することで、前記微小流体室中に流した細胞作用剤の効果を測定する技術について開示している（例えば、特許文献２参照）。特に、この技術を用いると細胞の極周辺に細胞作用剤を供給、または排出をすることができ、細胞周辺の溶液環境の切り替えを迅速に行いたいときに有効である。
【特許文献１】特表２００２−５０８５１６号公報
【特許文献２】特許第２９９３９８２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、前記従来の構成では、細胞周辺の溶液環境を迅速に交換するために、流体室は閉空間である必要があり、それぞれの細胞に合わせて、溶液の流動性、拡散係数、濃度等の種々の条件の溶液による細胞が発する電気生理的変化を高精度に測定したい場合、前記のような固定された閉空間では流体室の大きさを細胞の大きさによって変えることが困難である。
【０００７】
本発明は、前記従来の課題を解決するもので、種々の細胞に対しても高精度に効率よく電気生理現象を測定することができる細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記従来の課題を解決するために、本発明は、第一の貫通孔を設けた薄板と、第二の貫通孔を設けた保持プレートと、インナーウエルを内包したウエルからなり、薄板を第二の貫通孔の内部に保持し、この第二の貫通孔の上部にウエルを配置して保持プレートに当接し、ウエルの内部に内包するように溶液または細胞を含んだ溶液を蓄積できるインナーウエルを設け、このインナーウエルには上部からインナーウエルの外壁面に通じる第三の貫通孔を設けるとともに、この第三の貫通孔に繋がる少なくとも一つの溝をインナーウエルの外壁面に設け、この溝の一方の開口部は保持プレートの第二の貫通孔に向かって開口するように構成するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法は、形状、寸法精度、材質など所望のインナーウエルの上部に開放空間を持ちながら、薄板の第一の貫通孔へ保持させた種々の細胞に対しても細胞の近傍へ確実に薬剤供給を行うことができる構成を実現することによって、より高精度で効率的な測定を実現することができる細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法を提供することができるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法について図面を用いて説明する。
【００１１】
図１は本発明の細胞電気生理センサの斜視図であり、図２は図１のＡ−Ａ部における断面図である。
【００１２】
図１および図２において、１は細胞電気生理センサであり、シリコンからなる薄板２と、樹脂などの絶縁性材料からなる保持プレート４と、樹脂などの成型性に優れた材料からなるウエル６と、このウエル６に内包するように配置したインナーウエル８から構成しており、前記薄板２には少なくとも一つの第一の貫通孔３を１〜３μｍの直径で設けている。そして、この薄板２を保持プレート４の第二の貫通孔５の内部へ固定している。
【００１３】
さらに、ウエル６は保持プレート４の上部へ当接しているが、ウエル６または保持プレート４のいずれかが特定波長領域の光透過性を有し、どちらか一方を不透明体としておくことが好ましい。これによって、ウエル６と保持プレート４は特定波長領域の光透過性である面から特定波長領域のレーザ光線を照射し、不透明体がレーザ光を吸収して発熱することによって、その接合面を溶着させることができる。このような溶着方法によって、シール性に優れた強固な接着面を形成することが容易に可能となる。
【００１４】
また、ウエル６に開口部を設け、その開口部の内壁面に沿うようにインナーウエル８を挿入している。このインナーウエル８をウエル６の開口部へ保持する方法は圧入、接着剤、溶融接合などの接合方法によって保持することができる。また、このインナーウエル８をウエル６から取り外しができるようにすることも可能である。
【００１５】
また、このインナーウエル８には第三の貫通孔７をインナーウエル８の外壁面部に通じるように設けており、さらにこの第三の貫通孔７は前記インナーウエル８の下部に設けた溝１０に接続させている。このような構成とすることによって、特に小型のインナーウエル８の先端部を細くしなければならないとき、あるいは第三の貫通孔７を形成することが困難なときにおいて、溝１０を介することによって外部から溶液あるいは細胞などを容易に第一の貫通孔３近傍へ移動させることができる細胞電気生理センサを実現することができる。
【００１６】
ここで、第三の貫通孔７を設けずに溝１０のみによってインナーウエル８の上面まで形成することも可能であるが、ウエル６の内壁面とインナーウエル８の外壁面部におけるシール性が低下するという問題が発生する。これに対して、図２に示したようなインナーウエル８の構成とすることによってシール性に優れた細胞電気生理センサを実現することができるとともに、生産性の高い細胞電気生理センサを実現することができる。
【００１７】
また、前記インナーウエル８はウエル６へ密着接合されることで、第三の貫通孔７は一方の開口部が溝１０を介して第一の貫通孔３へ向かって開口することになるので、インナーウエル８の内部の溶液の交換を速やかに行うことができる。
【００１８】
そして、インナーウエル８は特定波長領域の光透過性樹脂とし、ウエル６は不透過性樹脂とし、保持プレート４は特定波長領域の光透過性樹脂とすることが好ましい。この構成によって、インナーウエル８、ウエル６および保持プレート４を組み合わせた後、インナーウエル８、保持プレート４側から特定波長領域のレーザ光線を照射する手段によって、溶融接合することによって強固に接合することができる。
【００１９】
このように、インナーウエル８を内包したウエル６を保持プレート４へ密着させることによって、インナーウエル８に形成した溝１０は一方の開口部が、保持プレート４の第二の貫通孔５もしくは第一の貫通孔３へ向かって開口している形状としている。
【００２０】
以上のような構成によって、本実施の形態１における細胞電気生理センサ１は、後に述べるようにインナーウエル８から細胞２３を含む溶液を投入しやすくなる。さらに、第三の貫通孔７から別の溶液を投入することもできることから、インナーウエル８の内部の溶液を効率よく他の溶液に交換することができる。
【００２１】
また、インナーウエル８の形状は微小な形状であり、設計が容易になるとともに高寸法精度に成型しておく必要があることからインナーウエル８のみを個別に寸法成型性に優れた樹脂材料を用いて高精度に成型し、その他の成型体（例えばウエル６など）は通常の精度で成型することも可能であり、これによって生産性を高めることができる。
【００２２】
次に、本実施の形態１の細胞電気生理センサを用いて細胞の電気生理現象の測定を行う方法について述べる。
【００２３】
図３〜図７は本実施の形態１における細胞の電気生理現象の測定を行う手順について説明するための断面図である。また図８〜図１０は別の例の細胞電気生理センサを説明するための断面図であり、図１１〜図１３はさらに他の例の細胞電気生理センサを説明するための断面図である。
【００２４】
まず初めに、図３に示すようにウエル６に内包したインナーウエル８の上部から第一の溶液２４を投入すると、図４に示すように第一の貫通孔３および保持プレート４の下部領域に第一の溶液２４が浸透し、それぞれの領域において第一の溶液２４は上部電極２７および下部電極２８と接触する。そして、この第一の溶液２４はＮａＣｌを含む電解液とした場合、上部電極２７と下部電極２８の間には通常１〜１０ＭΩ程度の導通抵抗が発生する。
【００２５】
なお、保持プレート４の下部領域には第一の溶液２４とは別の溶液（例えばＫｃｌを含む電解液として第三の溶液２６）をあらかじめ入れておいても良い。
【００２６】
一方、インナーウエル８から投入された第一の溶液２４はインナーウエル８の内部に設けられた第三の貫通孔７側にも少し進入するが、特に問題はない。
【００２７】
しかしながら、第一の貫通孔３の近傍に気泡が残っていると、先に述べた導通抵抗が確保できないことがあり、特に第三の貫通孔７の内部に空気が残っていると、後で第三の貫通孔７から別の溶液（例えば、第二の溶液２５）を投入すると第一の貫通孔３の近傍に気泡が発生してしまう。このようなことがないようにするためには、図７に示したように第一の溶液２４をインナーウエル８から投入する際、第三の貫通孔７から吸引することによって、気泡が第一の貫通孔３の付近に残ることが無くなるとともに、第一の溶液２４は十分な量で溝１０と第三の貫通孔７の内部を満たすことから、後で第三の貫通孔７に別の溶液を投入しても気泡の発生を防ぐことができる。
【００２８】
次に、図５に示すように細胞２３を含む第一の溶液２４をインナーウエル８の内部へ投入し、その後、図６に示すように保持プレート４の下部を減圧すると、第一の溶液２４および細胞２３が第一の貫通孔３へ引き込まれる。ここで、第一の溶液２４は第一の貫通孔３を通過するが、細胞２３は第一の貫通孔３を通り抜けることができず、第一の貫通孔３の開口部付近で保持される。そして、この細胞２３が適度な密着度で第一の貫通孔３を塞ぐように保持されると、第一の溶液２４は電気的に保持プレート４の上下で分断され、上部電極２７と下部電極２８の間では十分に高い抵抗値、例えば１００ＭΩ、好ましくは５００ＭΩ以上となる。
【００２９】
次に、上部電極２７と下部電極２８の間に、例えば１０ｍＶ程度の固定電圧を印加すると細胞２３の膜にかかる電位（膜電位）が固定され、この時の電流値を測定することで、細胞２３の内部に存在するイオンチャンネルを流れる電流を測定することができる。
【００３０】
なお、このイオンチャンネルを流れる電流を測定する詳細な手順については、従来の方法であるパッチクランプ法などで詳しく公開しているので、ここではその説明は省略する。
【００３１】
また、別の例の細胞電気生理センサの構成として、図８に示したように細胞を含む溶液を投入する箇所として第三の貫通孔７から投入することもできる。これによって、細胞２３は第一の貫通孔３の近傍へ確実に導入することができる。その後、図９に示すように保持プレート４の下部を減圧すると、第一の溶液２４および細胞２３が第一の貫通孔３へ引き込まれ、細胞２３は第一の貫通孔３を通り抜けることができず、第一の貫通孔３の開口部付近で保持される。この構成によって、少量の細胞２３であっても、確実に第一の貫通孔３を塞ぐように細胞２３を配置し、保持することができる。
【００３２】
さらに、別の例として、図１０に示すように第三の貫通孔７から第二の溶液２５を投入する。ここで、第三の貫通孔７の一方の開口部は第一の貫通孔３に向かって開口しているので、第一の貫通孔３付近の第一の溶液２４は速やかに第二の溶液２５へ交換することができる。
【００３３】
なお、このとき第三の貫通孔７を複数形成しておくことがより好ましい。これによって、一つの第三の貫通孔７ａから第二の溶液２５を投入し（矢印の方向）、他の第三の貫通孔７ｂから吸引（矢印の方向）を行うことによって、第一の溶液２４から第二の溶液２５への迅速な溶液交換が可能となる。このような構成とすることによって、イオンチャンネルを流れる電流を測定しながら保持プレート４の上部領域において溶液の交換を速やかに行うと、第一の溶液２４には含まれないが第二の溶液２５の中に含まれる薬剤成分（例えば特定のイオンチャンネルに対するチャンネル阻害剤）によるイオンチャンネル電流の変化を測定することで薬理効果判定が迅速に正確に行えるようになる。
【００３４】
さらに、本実施の形態１における細胞電気生理センサの他の例として、図１１に示すようにインナーウエル８の下方の開口部１３の形状を薄板２の外径より小さくすることによって、第三の貫通孔７から投入された液体（例えば第二の溶液２５）は、より確実に薄板２の第一の貫通孔３の近傍の第一の溶液２４を速やかに交換することができる。
【００３５】
また、さらに他の例として、図１２に示すように薄板２を保持プレート４の第二の貫通孔５の下方に保持した場合、インナーウエル８の下方の開口部１３に第二の貫通孔５の内下方へ突出する突出部１１を設けておくことによって、より確実に第一の貫通孔３の近傍の溶液を速やかに交換することができる。
【００３６】
また、さらに他の例として、図１３に示すように薄板２の外周部に枠体１２を接合し、この枠体１２を第二の貫通孔５の内部に設置するとともに、インナーウエル８の下方の開口部１３に枠体１２の内下方へ突出する突出部１１を設けておくことによって、より確実に第一の貫通孔３の近傍の溶液を速やかに交換することができる。
【００３７】
なお、本実施の形態１のようにインナーウエル８をウエル６の内部に内包させる場合、第三の貫通孔７の形成は、より多様な構成に簡単に換えることができる。すなわち、図１０〜図１３で示した例はすべてウエル６の形状は同じであり、インナーウエル８のみを変更して設置すればよい。
【００３８】
また、図１４はこの一例のインナーウエル８の斜視図であるが、このインナーウエル８をウエル６の内部へ設置することで、図１５はウエルプレートの斜視図であり、図１５に示したように異なった形状を有するインナーウエル８を比較的簡単に揃えることができる。
【００３９】
また、複数のウエル６に対して別形状のインナーウエル８を設置すれば複数の形状を持つウエルアレイを容易に作製することができる。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
以上のように、本発明にかかる細胞電気生理センサおよびこれを用いた細胞電気生理現象の測定方法は、高精度に効率良く細胞の電気生理現象の変化を測定できることから、例えば高速で薬理判定を行う、薬品スクリーニング等の測定器として用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサの斜視図
【図２】同図１のＡ−Ａ部における断面図
【図３】同センサを用いて細胞の電気生理現象の測定方法を説明するための断面図
【図４】同断面図
【図５】同断面図
【図６】同断面図
【図７】同断面図
【図８】同別の例の細胞電気生理センサの断面図
【図９】同断面図
【図１０】同断面図
【図１１】同別の例の細胞電気生理センサの断面図
【図１２】同別の例の細胞電気生理センサの断面図
【図１３】同別の例の細胞電気生理センサの断面図
【図１４】同インナーウエルの斜視図
【図１５】同ウエルプレートの斜視図
【符号の説明】
【００４２】
１  細胞電気生理センサ
２  薄板
３  第一の貫通孔
４  保持プレート
５  第二の貫通孔
６  ウエル
７、７ａ、７ｂ  第三の貫通孔
８  インナーウエル
１０  溝
１１  突出部
１２  枠体
１３  開口部
２３  細胞
２４  第一の溶液
２５  第二の溶液
２６  第三の溶液
２７  上部電極
２８  下部電極
【図１】
0004670713.tif 000002
【図２】
0004670713.tif 000003
【図３】
0004670713.tif 000004
【図４】
0004670713.tif 000005
【図５】
0004670713.tif 000006
【図６】
0004670713.tif 000007
【図７】
0004670713.tif 000008
【図８】
0004670713.tif 000009
【図９】
0004670713.tif 000010
【図１０】
0004670713.tif 000011
【図１１】
0004670713.tif 000012
【図１２】
0004670713.tif 000013
【図１３】
0004670713.tif 000014
【図１４】
0004670713.tif 000015
【図１５】
0004670713.tif 000016