(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラニルグリシン又はロイシルグリシンをγ−グルタミル基受容体として含有させることを特徴とする、ヒト血液中のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定用試薬の安定化方法。
【請求項２】
アラニルグリシン又はロイシルグリシンをγ−グルタミル基受容体として含んで成り、２ヶ月以上安定に保存できる、ｐＨ７〜９のヒト血液中のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定用試薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト血液中のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−ＧＴＰ）活性測定用γ−グルタミル基受容体及びこれを用いたγ−ＧＴＰ活性測定用試薬に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血中のγ−ＧＴＰ活性の測定は、肝疾患の診断等に広く利用されており、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ）、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）等と共に、肝、胆道系の主要な検査項目の１つとなっている。
【０００３】
γ−ＧＴＰ活性の測定には、従来γ−グルタミル基供与体及びγ−グルタミル基受容体から成る試薬が使用されており、γ−グルタミル基受容体としてはグリシルグリシンが一般的に用いられている。
【０００４】
しかしながら、グリシルグシリンはγ−ＧＴＰ活性の至適ｐＨであるｐＨ８付近の溶液中では長期保存により加水分解され易く、更に分解生成物であるグリシンは微量でもγ−ＧＴＰ活性を阻害することが知られている。
【０００５】
そこで、グリシルグリシン溶液を長期間に亘って安定に保存しておくために、そのｐＨを３〜７に保っておき、γ−ＧＴＰ活性の測定を行う際に、この溶液にアルカリ性物質を添加して溶液のｐＨをγ−ＧＴＰ活性の至適ｐＨ範囲であるｐＨ８付近にするという工夫がなされている（特開平４−２９９９９７号）。
【０００６】
しかしながら、このようなｐＨ調整が煩雑な操作を伴うことは言うまでもなく、長期間に亘って保存安定性を確保でき、且つγ−ＧＴＰ活性測定時にｐＨの調整等の煩雑な操作を必要としないγ−ＧＴＰ活性測定方法の開発が望まれている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、長期に亘る保存安定性を示すヒト血液中のγ−ＧＴＰ活性測定用γ−グルタミル基受容体及びこれを用いたγ−ＧＴＰ活性測定用試薬を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、「アラニルグリシン又はロイシルグリシンをγ−グルタミル基受容体として含有させることを特徴とする、ヒト血液中のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定用試薬の安定化方法。」、の発明である。
【００１０】
また、本発明は、「アラニルグリシン又はロイシルグリシンをγ−グルタミル基受容体として含んで成り、２ヶ月以上安定に保存できる、ｐＨ７〜９のヒト血液中のγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性測定用試薬。」、の発明である。
【００１１】
即ち、本発明は、γ−グルタミル基受容体として、アラニルグリシン又はロイシルグリシンを用いることに特徴を有するものであり、これらをγ−グルタミル基受容体として用いることによりヒト血液中のγ−ＧＴＰ活性の至適ｐＨにおいて、γ−グルタミル基受容体を含む試薬を溶液状態で長期間安定に保存できることを見出したことにより完成されたものである。
【００１２】
本発明は自体公知のγ−ＧＴＰ活性測定試薬中のγ−グルタミル基受容体を、アラニルグリシン又はロイシルグリシンに代えたものであり、その他の試薬等並びにその使用量等はこの分野で通常用いられるもののうちから適宜選択すればよい。
【００１３】
本発明におけるアラニルグリシン又はロイシルグリシンは、市販品、或いは常法に従ってアラニンとグリシン又はロイシンとグリシンとを夫々反応させることによって得られるものの何れでもよい。
【００１４】
本発明のγ−ＧＴＰ活性測定用試薬に於いて用いられるγ−グルタミル基供与体としては、通常この分野で用いられるγ−グルタミル基を供与し得るものであればよく、中でもγ−グルタミル基を供与した残基が発色する性質を有するものが好ましい。その様なγ−グルタミル基供与体の好ましい具体例としては、Ｌ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリド、γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド等が挙げられる。
【００１５】
本発明のヒト血液中のγ−ＧＴＰ活性測定用試薬は、利便性の面から考えると、溶液状態のものが好ましい。
【００１６】
本発明に係る試薬を用いて測定を行う場合、所謂一液法又は二液法の何れによってもよく、また所謂エンド法又はレート法の何れによってもよい。そして、これら測定に用いるための試薬としては、具体的な測定法に対応するものを、γ−グルタミル基受容体としてアラニルグリシン又はロイシルグリシンを用いる以外は公知の試薬等に準じて適宜調製すればよい。
【００１７】
例えば該試薬が所謂一液法によるγ−ＧＴＰ活性測定に使用される場合に用いる試薬としては、例えばγ−グルタミル基受容体であるアラニルグリシン又はロイシルグリシンと、上記した如きγ−グルタミル基供与体とを含有する緩衝溶液等が挙げられる。また、二液法に使用される場合に用いる試薬としては、上記の如くして公知のものに準じて適宜調製されたものが何れも使用できるが、その測定が所謂レート法によって行われる場合は、第１試薬に含まれる成分としては、ヒト由来γ−ＧＴＰを含有するヒト血漿或いはヒト血清等のヒト血液由来の試料と混合してもγ−ＧＴＰによる酵素反応を開始しないものとし、且つ第２試薬に含まれる成分としては、該試料及び第１試薬と混合した場合にγ−ＧＴＰによる酵素反応を開始するものとするのが好ましい。
【００１８】
また、レート法且つ二液法に用いられる場合の好ましい第１試薬としては、例えばγ−グルタミル基受容体であるアラニルグリシン又はロイシルグリシンを水又は適当な緩衝液等に溶解したものが挙げられ、第２試薬としては、例えば上記した如きγ−グルタミル基供与体を水又は適当な緩衝液等に溶解したものが挙げられる。
【００１９】
上記した如き試薬のうち、アラニルグリシン又はロイシルグリシンの水溶液は、例えば塩酸、水酸化ナトリウム等でそのｐＨが通常７〜９、好ましくは８付近となるように調整される。
【００２０】
本発明における上記した如き試薬に用いられる緩衝剤としては、通常この分野で用いられる例えばＮ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン(Tricine)、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−３−アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、３−［（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸］(AMPSO)、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタンスルホン酸(CHES)、Ｎ−シクロヘキシル−２−ヒドロキシ−３−アミノプロパンスルホン酸(CAPSO)、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール(AMP)、Ｎ−シクロヘキシル−３−アミノプロパンスルホン酸(CAPS)、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）(PIPES)等のグッド緩衝剤、例えば酢酸塩、グリシン、クエン酸塩、リン酸塩、ベロナール、ホウ酸塩、コハク酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン(Tris)、イミダゾール等が挙げられる。
【００２１】
これら緩衝剤の中でもγ−グルタミル受容体を含む試薬に用いる場合には通常７〜９、好ましくは８付近のｐＨ範囲で緩衝能を有するものが好ましく、その使用濃度は通常２０〜３００ｍＭ、好ましくは５０〜１５０ｍＭであり、γ−グルタミル供与体を含む試薬に用いる場合には通常３〜９、好ましくは４〜８のｐＨ範囲で緩衝能を有するものが好ましく、その使用濃度は通常１〜２００ｍＭ、好ましくは１０〜１００ｍＭである。
【００２２】
また、本発明の試薬には、通常γ−ＧＴＰ活性測定用試薬に必要に応じて適宜添加される、例えばエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩等のキレート剤、例えばアジ化ナトリウム等の防腐剤、例えばポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル等の界面活性剤、濁り防止剤、安定化剤、賦活剤等が更に含有されていてもよく、これらの使用濃度としては、この分野に於ける使用濃度範囲から適宜選択すればよい。
【００２３】
本発明の方法が１液法である場合に使用される試薬は、通常ｐＨ７〜９、好ましくはγ−ＧＴＰ活性の至適ｐＨであるｐＨ８付近になるように調製される。
【００２４】
本発明の方法が２液法である場合は、γ−グルタミル基受容体を含有する試薬は通常ｐＨ７〜９、好ましくはγ−ＧＴＰ活性の至適ｐＨであるｐＨ８付近になるよう調整され、γ−グルタミル基供与体を含有している試薬は通常ｐＨ３〜９、好ましくは４〜８になるように調整される。尚、２液法に於いては、試料の測定時にγ−グルタミル受容体を含む試薬とγ−グルタミル基供与体を含む試薬とを混合させた後のｐＨが通常７〜９、好ましくは８付近となるように、使用する夫々の試薬の混合比、緩衝剤濃度等が設定される。
【００２５】
本発明の試薬を用いたγ−ＧＴＰ活性測定時における反応液中のγ−グルタミル基供与体の濃度は、通常１〜１０ｍＭ、好ましくは３〜８ｍＭであり、またγ−グルタミル基受容体の濃度は、通常２５〜５００ｍＭ、好ましくは５０〜２００ｍＭである。
【００２６】
測定法が１液法である場合、本発明の試薬のγ−グルタミル基供与体の濃度は通常１〜１０ｍＭ、好ましくは３〜８ｍＭであり、γ−グルタミル基受容体の濃度は通常２５〜５００ｍＭ、好ましくは５０〜２００ｍＭである。
【００２７】
測定法が２液法である場合、γ−グルタミル基供与体を含有している試薬に於けるγ−グルタミル基供与体の濃度は、γ−ＧＴＰ活性測定時の反応液中の濃度が通常１〜１０ｍＭ、好ましくは３〜８ｍＭとなるように選択され、γ−グルタミル基受容体を含有している試薬に於けるγ−グルタミル基受容体の濃度は、γ−ＧＴＰ活性測定時の反応液中の濃度が通常２５〜５００ｍＭ、好ましくは５０〜２００ｍＭとなるように選択される。
【００２８】
本発明のヒト血液中のγ−ＧＴＰ活性測定方法としては、例えばγ−グルタミル基受容体及びγ−グルタミル基供与体を含むヒト血液中のγ−ＧＴＰ活性測定用試薬にヒト血液由来試料を添加して一定時間インキュベーションした後、試料中のγ−ＧＴＰの作用によってγ−グルタミル基供与体から遊離する発色性化合物を測定し、予め作成しておいた検量線或いは分子吸光係数より試料に含まれるγ−ＧＴＰの活性を測定する所謂一液法や、或いは、ヒト血液中のγ−ＧＴＰ活性測定に必要な成分を上記した如く適宜２液に分けて使用する所謂二液法で行うのが好ましい。
【００２９】
上記以外の測定操作或いは条件等については自体公知のそれに準じて適宜選択すればよい。
【００３０】
本発明の方法に於いて発色性化合物を測定する方法としては、遊離する発色性化合物の吸光度を直接測定する方法が主流であるが、該発色性化合物に更にジアゾニウム塩等の適当な縮合性化合物等を縮合させて発色させ、比色する方法によっても測定し得る。
【００３１】
本発明の方法の中で、好ましい実施態様は以下の通りである。
【００３２】
ヒト血清或いはヒト血漿等のヒト血液由来試料とγ−グルタミル基受容体であるアラニルグリシン又はロイシルグリシンを含有する緩衝液(pH約８)とを混合し、通常２５〜４０℃、好ましくは３７℃付近で通常２〜１０分間、好ましくは３〜５分間プレインキュベーションした後、γ−グルタミル基供与体である例えばＬ−γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ニトロアニリド等を添加し、試料中のγ−ＧＴＰの作用によって生じる発色性化合物である芳香族化合物の特性に応じた波長において反応液の単位時間あたりの吸光度変化を測定する。そして予めγ−ＧＴＰを添加した標準液を用いて作成しておいた検量線を利用するか或いは当該芳香族化合物の分子吸光係数に基づいて、試料に含まれるγ−ＧＴＰの活性を算出する。
【００３３】
上記以外の測定操作或いは条件等については自体公知のそれに準じて適宜選択すればよい。
【００３４】
本発明のγ−ＧＴＰ活性測定試薬は、γ−ＧＴＰの至適ｐＨでも安定に存在し得るアラニルグリシン或いはロイシルグリシンを基質として含んで成るものであり、試薬自体、γ−ＧＴＰ活性の至適ｐＨで分解することなく長期間安定に保存できる。
【００３５】
従ってまた、本発明の方法においては、長期間保存されたアラニルグリシン或いはロイシルグリシンをγ−グルタミル受容体として含んで成る本発明の試薬をｐＨの調整等の煩雑な操作をすることなくそのまま用いてγ−ＧＴＰ活性を測定することができる。
【００３６】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００３７】
【実施例】
実施例１．γ−ＧＴＰ活性測定試薬の経時変化（40℃）
［試料］ヒト血清
［試薬］（１）下記のＲ−１を調製し、40℃で所定期間保存した後使用した。
Ｒ−１：下記のものから選ばれた所定のジペプチド体65mM水溶液を水酸化ナトリウムでｐＨ７.９に調整したもの。
＜ジペプチド体＞
(1)アラニルグリシン
(2)ロイシルグリシン
(3)グリシルグリシン
（２）下記の組成からなるＲ−２を用時調製して使用した。
Ｒ−２：Ｌ-γ-グルタミル-3-カルボキシ-4-ニトロアニリド 15.6mMを含有する10mMクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.6）。
［測定条件］日立7170形自動分析装置［（株）日立製作所製］を使用し、測定パラメータを以下のように設定して試料中のγ−ＧＴＰ活性を測定した。
測定方法：レートＡ［２２］−［３４］
試料量  ：１０μＬ
Ｒ−１  ：２００μＬ
Ｒ−２  ：５０μＬ
測定波長：５７０／４０５ｎｍ
測定温度：３７℃
［結果］所定期間保存されたＲ−１を用いて測定したγ−ＧＴＰ活性の相対値を図１に示す。尚、ここでいう相対値とは、試料血清中のγ−ＧＴＰ活性を用時調製されたＲ−１及びＲ−２を用いて測定した際の測定値を１００％とした場合の、試料血清中のγ−ＧＴＰ活性を所定期間保存されたＲ−１を用いて測定したときの測定値の相対値を示すものである。
【００３８】
尚、図１において、−◆−は、Ｒ−１としてグリシルグリシンを含む試薬を用いた場合、−●−は、Ｒ−１としてアラニルグリシンを含む試薬を用いた場合、−○−は、Ｒ−１としてロイシルグリシンを含む試薬を用いた場合の４０℃での保存期間に対するγ−ＧＴＰ活性相対値を夫々示す。
【００３９】
図１から明らかな如く、Ｒ−１として約２ヶ月間40℃で保存されていたグリシルグリシンを含む試薬を用いてγ−ＧＴＰ活性の測定をした場合、活性の相対値は約４％も低下した。一方、Ｒ−１として同条件で保存されたアラニルグリシン或いはロイシルグリシンを含む試薬を用いてγ−ＧＴＰ活性測定した場合、活性の相対値は測定誤差と考えられる程度の変化しか見られなかった。
【００４０】
即ち、図１から明らかな如く、本発明の試薬は長期間安定に保存し得ることがわかる。
【００４１】
実施例２．アラニルグリシンを用いたγ−ＧＴＰ活性測定
［試料］新鮮ヒト血清１０検体を試料とした（検体１〜１０）。
［試薬］Ｒ−１：アラニルグリシン65mM水溶液を水酸化ナトリウムでｐＨ調整したもの（pH 7.9 、at30℃）
Ｒ−２：Ｌ-γ-グルタミル-3-カルボキシ-4-ニトロアニリド 15.6mMを含有する10mMクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液（pH 5.6、at 30℃）
［測定条件］日立7170形自動分析装置［（株）日立製作所製］を使用し、測定パラメータを以下のように設定して試料中のγ−ＧＴＰ活性を測定した。
測定方法：レートＡ［２２］−［３４］
試料量  ：１０μＬ
Ｒ−１  ：２００μＬ
Ｒ−２  ：５０μＬ
測定波長：５７０／４０５ｎｍ
測定温度：３７℃
［結果］得られた測定結果を表１に示す。
【００４２】
実施例３．ロイシルグリシンを用いたγ−ＧＴＰ活性測定
試料として新鮮ヒト血清検体１０検体（検体１１〜２０）及びＲ−１としてロイシルグリシン65mM水溶液を水酸化ナトリウムでｐＨ調整したもの（pH 7.9、at 30℃）を用いた以外は実施例１と同様にして試料中のγ−ＧＴＰ活性を測定した。得られた結果を表２に示す。
【００４３】
比較例１．グリシルグリシンを用いたγ−ＧＴＰ活性測定
試料として新鮮ヒト血清検体２０検体（１〜２０）及びＲ−１としてグリシルグリシン65mM水溶液を水酸化ナトリウムでｐＨ調整したもの（pH 7.9、at 30℃）を用いた以外は実施例１と同様にして試料中のγ−ＧＴＰ活性を測定した。得られた結果を表１及び２に併せて示す。
【００４４】
【表１】
0004815699.tif 000002
【００４５】
【表２】
0004815699.tif 000003
【００４６】
表１及び２から明らかな如く、本発明の方法は、既存のγ−ＧＴＰ活性測定法と良好な相関性を示すことがわかる。
【００４７】
【発明の効果】
本発明のγ−ＧＴＰ活性測定試薬は、γ−ＧＴＰ活性の至適ｐＨで安定に存在し得るアラニルグリシン或いはロイシルグリシンを基質として含んで成るものであり、試薬自体、γ−ＧＴＰ活性の至適ｐＨで分解することなく長期間安定に保存できる。従ってまた、該試薬を使用する本発明の方法においては、長期間保存されたアラニルグリシン或いはロイシルグリシンをγ−グルタミル基受容体として含んで成る本発明の試薬をｐＨの調整等の煩雑な操作をすることなくそのまま用いてγ−ＧＴＰの活性を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】４０℃での保存期間を横軸とし、用時調製した試薬により測定した、試料のγ−ＧＴＰ活性測定値を１００％とした際の、４０℃で所定期間保存した試薬により測定した、試料のγ−ＧＴＰ活性測定値の相対値を縦軸として表した図である。
【符号の説明】
図１において、−◆−は、Ｒ−１としてグリシルグリシンを含む試薬を用いた場合、−●−は、Ｒ−１としてアラニルグリシンを含む試薬を用いた場合、−○−は、Ｒ−１としてロイシルグリシンを含む試薬を用いた場合の４０℃での保存期間に対するγ−ＧＴＰ活性相対値を夫々示す。
【図１】
0004815699.tif 000004