(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、該基板表面上に配置されたカルボキシル基を有するポリマーと、該ポリマー表面に前記カルボキシル基と直接または間接に結合したポリアミノ基と、前記カルボキシル基と直接または間接に結合した長鎖アルキル基とを備えてなることを特徴とするバイオセンサー用チップ。
【請求項２】
前記ポリアミノ基が末端にアシル基を有することを特徴とする請求項１記載のバイオセンサー用チップ。
【請求項３】
前記長鎖アルキル基が、前記ポリマー表面に結合したポリアミノ基と結合していることを特徴とする請求項１記載のバイオセンサー用チップ。
【請求項４】
前記ポリマー表面に、さらに直接または間接に結合したポリアミノ基を備えてなることを特徴とする請求項３記載のバイオセンサー用チップ。
【請求項５】
前記ポリアミノ基がジアミノアルキレン基またはジ（アミノアルキル）エーテル基であることを特徴とする請求項１〜４いずれか１項記載のバイオセンサー用チップ。
【請求項６】
前記長鎖アルキル基が炭素数10〜22のアルキル鎖であることを特徴とする請求項１〜５いずれか１項記載のバイオセンサー用チップ。
【請求項７】
前記カルボキシル基を有するポリマーがカルボキシメチルデキストランであることを特徴とする請求項１〜６いずれか１項記載のバイオセンサー用チップ。
【請求項８】
前記カルボキシル基を有するポリマーが金属膜を介して前記基板上に配置されていることを特徴とする請求項１〜７いずれか１項記載のバイオセンサー用チップ。
【請求項９】
前記金属膜が、金、銀、銅、白金、またはアルミニウムから選択される少なくとも１つの金属からなることを特徴とする請求項８記載のバイオセンサー用チップ。
【請求項１０】
基板表面上に配置されたカルボキシル基を有するポリマーの前記カルボキシル基を活性化し、該活性化したカルボキシル基にポリアミノ基を有する化合物を結合させ、その後、長鎖アルキル基を有する化合物を結合させることを特徴とするバイオセンサー用チップの製造方法。
【請求項１１】
請求項１〜９記載のバイオセンサー用チップを備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴分析用センサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生理活性物質を固定するのに有用なバイオセンサー用チップおよびその製造方法、並びにバイオセンサー用チップを利用した表面プラズモン共鳴分析用センサーに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、臨床検査等で免疫反応など分子間相互作用を利用した測定が数多く行われているが、中でも煩雑な操作や標識物質を必要とせず、測定物質の結合量変化を高感度に検出することのできるいくつかの技術が使用されている。例えば、表面プラズモン共鳴（SPR）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（QCM）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などがあげられる。
【０００３】
表面プラズモン共鳴を利用した測定に使用される測定チップは、透明基板（例えば、ガラス）上に、蒸着された金属膜、タンパク質等の生理活性物質を固定化できる官能基を有する薄膜を順に有し、官能基を介して金属表面に生理活性物質を固定化されている。そして、生理活性物質と検体物質間の特異的な結合反応を測定することによって、生体分子間の相互作用を分析することが可能である。
【０００４】
上記生理活性物質は、生体を構成する基本材料である生体高分子（核酸、タンパク、多糖等）や、これらの構成要素であるヌクレオチドやヌクレオシド、アミノ酸、糖、さらに脂質やビタミン、ホルモンなどの、生体の調節や生体の機能を変化させる物質であり、これらは医薬成分や機能性食品の開発等において重要である。
【０００５】
例えば、脂質は分子内に長鎖脂肪酸や類似の炭化水素鎖を持つ物質で、エネルギー源や膜構成分子となるだけでなく、細胞内、核内のシグナル伝達に関与するなど多彩な機能を有している。脂質は単純脂質、複合脂質および誘導脂質に分類されるが、中でもリン脂質や糖脂質は脂質代謝において注目されている。また、リン脂質は水に不溶の性質を持つが、極性基と非極性基を含む両親媒性の分子構造から、水に不溶なミセルを形成する。リン脂質のリン酸部分は親水性で溶媒と接触すると、可溶性ミセルである人工的リン脂質膜、リポソーム（脂質膜小胞体）を形成する。このような性質を有するリン脂質は生体膜モデルの研究として、あるいは医薬品のドラッグデリバリーシステムの材料として実用化が進み、盛んに研究されている。
【０００６】
脂質やリポソームなどをトラップすることができるチップとしてBiacore L1チップが知られている。このチップは基板表面に設けられたデキストランを長鎖アルカンで修飾したもので、この長鎖アルカンによって脂質リポソームなどを吸着することが可能である（非特許文献１および２）。
【非特許文献１】Analytical Biochemistry 277,196-205（2000）
【非特許文献２】Analytical Biochemistry 280,29-35（2000）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のBiacore L1チップはアニオン性のカルボキシル基を有するため、カチオン性の脂質やリポソームは効率よくトラップすることができるものの、アニオン性あるいはノニオン性の脂質やリポソームを吸着することはできない。
【０００８】
本発明はこのような事情に鑑みなされたものであって、電荷の反発に影響されることなく、生理活性物質を表面に固定することが可能なバイオセンサー用チップおよびその製造方法を提供することを目的とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明のバイオセンサー用チップは、基板と、該基板表面上に配置されたカルボキシル基を有するポリマーと、該ポリマー表面に前記カルボキシル基と直接または間接に結合したポリアミノ基と、前記カルボキシル基と直接または間接に結合した長鎖アルキル基とを備えてなることを特徴とするものである。
【００１０】
ここで、ポリマー表面に直接に結合するとは、連結基を介さずに直接結合していることを意味し、ポリマー表面に間接に結合するとは、連結基を介して間接的に結合していることを意味する。なお、ここにいう連結基はポリマー由来のものであっても、ポリアミノ基や長鎖アルキル基を結合するためにポリマーに別に結合されたものであってもよい。
【００１１】
前記ポリアミノ基は末端にアシル基を有することが好ましい。  
前記長鎖アルキル基は、前記ポリマー表面に結合したポリアミノ基と結合していてもよい。この場合、前記ポリマー表面に、さらに別に直接または間接に結合したポリアミノ基を備えていてもよい。
【００１２】
前記ポリアミノ基はジアミノアルキレン基またはジ（アミノアルキル）エーテル基であることが好ましい。  
前記長鎖アルキル基は炭素数10〜22のアルキル鎖であることが好ましい。
【００１３】
前記カルボキシル基を有するポリマーはカルボキシメチルデキストランであることが好ましい。  
前記カルボキシル基を有するポリマーは金属膜を介して前記基板上に配置されていることが好ましい。  
前記金属膜は、金、銀、銅、白金、またはアルミニウムから選択される少なくとも１つの金属からなることが好ましい。
【００１４】
本発明のバイオセンサー用チップの製造方法は、基板表面上に配置されたカルボキシル基を有するポリマーの前記カルボキシル基を活性化し、該活性化したカルボキシル基にポリアミノ基を有する化合物を結合させ、その後、長鎖アルキル基を有する化合物を結合させることを特徴とするものである。
【００１５】
前記バイオセンサー用チップは、表面プラズモン共鳴分析用センサー用のセンサー用チップとして好適に用いられる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のバイオセンサー用チップは、基板と、該基板表面上に配置されたカルボキシル基を有するポリマーと、該ポリマー表面に前記カルボキシル基と直接または間接に結合したポリアミノ基と、前記カルボキシル基と直接または間接に結合した長鎖アルキル基とを備えてなるので、長鎖アルキル基によって生理活性物質を表面に安定に固定することが可能であるとともに、ポリアミノ基によって、ポリマーのカルボキシル基が有する電荷を相殺することができるので、電荷の反発に影響されることなく、生理活性物質を表面に固定することが可能である。また、非特異性吸着は電荷に起因することが多いが、本発明のバイオセンサー用チップは電荷の反発が抑制されているので、生理活性物質を固定する際の非特異性吸着を軽減することが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、図面を参照して本発明のバイオセンサー用チップについて説明する。図１〜３は、本発明のバイオセンサー用チップの構成を模式化して示した概略模式図である。
【００１８】
本発明のバイオセンサー用チップは第１の態様として、図１に示すように、基板と、この基板表面上に配置されたカルボキシル基を有するポリマーと、ポリマー表面に、Ｒ1を介して結合した長鎖アルキル基と、ポリマー表面にＲ2を介して結合した末端にアシル基を有するポリアミノ基とを備えてなる。この第１の態様のバイオセンサー用チップにおいては、ポリマー表面に結合した末端にアシル基を有するポリアミノ基によってポリマーのカルボキシル基が有する電荷を相殺することができ、ポリマー表面に結合した長鎖アルキル基によって生理活性物質を表面に安定に固定することが可能である。
【００１９】
また、本発明のバイオセンサー用チップは第２の態様として、図２に示すように、基板と、この基板表面上に配置されたカルボキシル基を有するポリマーと、ポリマー表面に、Ｒ2を介して結合したポリアミノ基と、このポリアミノ基にＲ3を介して結合した長鎖アルキル基とを備えてなる。この第２の態様のバイオセンサー用チップにおいては、ポリマー表面に結合したポリアミノ基によってポリマーのカルボキシル基が有する電荷を相殺することができ、長鎖アルキル基によって生理活性物質を表面に安定に固定することが可能である。
【００２０】
本発明のバイオセンサー用チップは第３の態様として、図３に示すように、基板と、この基板表面上に配置されたカルボキシル基を有するポリマーと、ポリマー表面に、Ｒ2を介して結合したポリアミノ基とこのポリアミノ基にＲ3を介して結合した長鎖アルキル基と、ポリマー表面にＲ2を介して結合したポリアミノ基とを備えてなる。この第３の態様のバイオセンサー用チップにおいては、ポリマー表面に結合したポリアミノ基によってポリマーのカルボキシル基が有する電荷を相殺することができ、連結基を介して結合した長鎖アルキル基によって生理活性物質を表面に安定に固定することが可能である。
【００２１】
図１〜３に示すように、本発明のバイオセンサー用チップは、基本構造として、ポリマー表面に直接または間接に結合したポリアミノ基と、直接または間接に結合した長鎖アルキル基とを備えてなるものである。なお、図１〜３では、長鎖アルキル基はＲ1を介して、ポリアミノ基はＲ2を介して間接的にポリマー表面に結合している態様を示しているが、カルボキシル基を有するポリマーは、ポリマーのカルボキシル基と長鎖アルキル基あるいはポリアミノ基が結合可能であるので、Ｒ1やＲ2は省略することが可能である。また、図２では、ポリアミノ基と長鎖アルキル基がＲ3を介して結合した態様を示しているが、ポリアミノ基と長鎖アルキル基のいずれか、または双方がポリアミノ基と長鎖アルキル基を結合可能な連結基となる官能基を有していれば、Ｒ3はあってもなくてもよい。
【００２２】
なお、ポリアミノ基が末端の場合にはそのままの状態では非特異吸着が生じるのでそれを抑制するためにアシル基を結合させる必要があるが、ポリアミノ基に長鎖アルキル基が結合している場合（図２や３に示す態様）には、長鎖アルキル基が非特異吸着を抑制するのでアシル基はあってもなくてもよい。
【００２３】
ここで、Ｒ1としては、アミノカルボニル基、カルバモイル基、オキシカルボニル基、カルボニルオキシ基、カルボニル基、エーテル基、チオエーテル基が好ましくあげられ、Ｒ2としてはカルバモイル基、カルボニルオキシ基、カルボニル基等が好ましくあげられ、Ｒ3としてはカルバモイル基、カルボニルオキシ基、カルボニル基等が好ましくあげられる。中でも、反応性と結合の安定性の観点からは、Ｒ1としてはアミノカルボニル基、カルバモイル基が、Ｒ2としてはカルボニル基が、Ｒ3としてはカルボニル基がより好ましい。
【００２４】
長鎖アルキル基は、場合によりヘテロ原子により中断されていてもよく、好ましくは直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含む炭化水素鎖であり、炭素数10〜22のアルキル鎖であることが好ましく、より好ましくは炭素数12〜18のアルキル鎖であることが好ましい。具体的には、ラウリル基、ミリスチル基、セチル基、ステアリル基、アラキジル基、べへニル基、オレイル基等を好ましく挙げることができ修飾反応の簡便性と脂質の吸着を両立する点からステアリル基、オレイル基がより好ましい。
【００２５】
ポリアミノ基は１つの基内に２〜４個のアミノ基を有するものであって、好ましくは２〜３個のアミノ基を有するものであることが望ましく、ジアミノアルキレン基やジ（アミノアルキル）エーテル基が好ましい。具体的には、エチレンジアミン基、テトラエチレンジアミン基、オクタメチレンジアミン基、デカメチレンジアミン基、ピペラジン基、トリエチレンジアミン基、ジエチレントリアミン基、トリエチレンテトラアミン基、ジヘキサメチレントリアミン基、1,4−ジアミノシクロヘキサン基等の脂肪族ジアミン基、パラフェニレンジアミン基、メタフェニレンジアミン基、パラキシリレンジアミン基、メタキシリレンジアミン基、4,4’−ジアモノビフェニル基、4,4’−ジアミノジフェニルメタン基、4,4’−ジアミノジフェニルケトン基、4,4’−ジアミノジフェニルスルホン酸基等の芳香族ジアミン基、ジエチレントリアミン基、トリエチレンテトラミン基、テトラエチレンペンタミン基、ペンタエチレンヘキサミン基、スペルミジン基、スペルミン基、ポリエチレンイミン基等のポリアミン基を好ましく用いることができる。中でも、水溶性、および修飾反応の反応性の高さからはエチレンジアミン基、ジ（２-アミノエチル）エーテル基、ジ（３-アミノプロピル）エーテル基がより好ましい。
【００２６】
アシル基は一般式Ｒ4ＣＯ−で表される基であって、Ｒ4は場合によりヘテロ原子により中断されていてもよく、好ましくは直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含む炭化水素鎖であり、炭素数１〜21のアルキル鎖であることが好ましく、より好ましくは炭素数1〜11のアルキル鎖であることが好ましい。具体的なアシル基としては、ホルミル基、アセチル基、プロパノイル基、イソプロパノイル基、ブタノイル基、ラウリル基、ミリスチル基、ステアリル基、オレイル基等があげられる。中でも反応性の観点から、ホルミル基、アセチル基、プロパノイル基が好ましい。
【００２７】
（本発明のバイオセンサー用チップの製造方法）
本発明のバイオセンサー用チップは、基板表面上に配置されたカルボキシル基を有するポリマーのカルボキシル基を、後述する自己組織化膜で被覆された基板に結合する際のポリマーの活性化と同様にして活性化し、この活性化したカルボキシル基にポリアミノ基を有する化合物を結合させ、その後、長鎖アルキル基を有する化合物を結合させることにより製造することができる。ポリアミノ基を有する化合物を先に結合させた後に、長鎖アルキル基を有する化合物を結合させることにより、長鎖アルキル基を容易に導入することが可能になるとともに、反応効率を向上させることによりポリマー表面の正電荷をより減少させることができる。
【００２８】
例えば、第１の態様のバイオセンサー用チップは、ポリマー表面上のカルボキシル基を活性化後、ポリアミノ化合物を反応させ、次いで、未反応のカルボキシル基を再活性化した後、長鎖アルキル基を有する化合物を反応させ、最後にアセチル化することにより製造することができる。ここで、アセチル化とは、チップ上に、アシル基を付与する工程であり、アシルクロリド、酸無水物などの誘導体として活性化したアシル基を反応させることにより、アシル基を付与することができる。なお、未反応のカルボキシル基を再活性化した後、末端にアシル基を有するポリアミノ化合物を直接反応させることによっても製造は可能である。
【００２９】
第２の態様のバイオセンサー用チップでは、ポリマー表面上のカルボキシル基を活性化後、ポリアミノ化合物を結合させ、その後、ポリアミノ化合物に長鎖アルキル基を有する化合物を反応させることにより製造することができる。
【００３０】
第３の態様のバイオセンサー用チップでは、ポリマー表面上のカルボキシル基を活性化後、ポリアミノ化合物と、末端にアシル基を有するポリアミノ化合物を反応させ、その後、ポリアミノ化合物を活性化して長鎖アルキル基を有する化合物を反応させることにより製造することができる。
【００３１】
なお、上記第１〜３の態様において、ポリアミノ化合物は、ジアミノアルキレンやジ（アミノアルキル）エーテルのことを言い、具体的には、エチレンジアミン、テトラエチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン、ピペラジン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、ジヘキサメチレントリアミン、1,4−ジアミノシクロヘキサン等の脂肪族ジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、パラキシリレンジアミン、メタキシリレンジアミン、4,4’−ジアモノビフェニル、4,4’−ジアミノジフェニルメタン、4,4’−ジアミノジフェニルケトン、4,4’−ジアミノジフェニルスルホン酸基等の芳香族ジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、スペルミジン、スペルミン、ポリエチレンイミン等のポリアミンのことを指す。中でも、水溶性、および修飾反応の反応性の高さからはエチレンジアミン、ジ（２-アミノエチル）エーテル基、ジ（３-アミノプロピル）エーテルがより好ましい。
【００３２】
また、長鎖アルキル基を有する化合物は、場合によりヘテロ原子により中断されていてもよく、好ましくは直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含む炭化水素鎖であり、炭素数10〜22のアルキル鎖を有する脂肪酸であり、より好ましくは炭素数12〜18の脂肪酸である。具体的には、ラウリル酸、ミリスチル酸、パルミチン酸、ステアリル酸、アラキジル酸、べへニル酸、オレイル酸等挙げることができ、修飾反応の簡便性と脂質の吸着を両立する点からステアリル酸、オレイル酸がより好ましい。
【００３３】
末端にアシル基を有するポリアミノ化合物は、モノアシルアルキルジアミン、モノアシルアルキレンジアミン、ジアシルアルキルトリアミンなどであり、具体的にはモノステアロイルエチレンジアミン、モノオレオイルエチレンジアミン、モノパルミトイルエチレンジアミン、モノラウロイルエチレンジアミン、モノステアロイルフェニレンジアミン、モノオレオイルフェニレンジアミン、モノパルミトイルフェニレンジアミン、モノラウロイルフェニレンジアミン、1,2, -オレオイルプロパントリアミン、モノステアロイル(ジアミノエチルエーテル)、モノオレオイル(ジアミノエチルエーテル)、より好ましくはモノステアロイルエチレンジアミン、モノオレオイルエチレンジアミン、モノステアロイル(ジアミノエチルエーテル)、モノオレオイル(ジアミノエチルエーテル)があげられる。
【００３４】
なお、上述した化合物は、後述するポリマーの活性化方法で活性化した反応性基と反応させることによって、チップ上に付与することができる。
【００３５】
続いて本発明のバイオセンサー用チップを構成する基板、ポリマー等の詳細について説明する。
【００３６】
（基板と金属膜）
本発明のバイオセンサー用チップにおける基板は、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。
【００３７】
基板上には金属膜が配置される。ここで、基板上に配置されるとは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されないが、好ましくは金、銀、銅、白金、パラジウムおよびアルミニウムからなる群より選ばれる少なくとも１つの金属であることが好ましく、特に金が好ましい。これらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にはクロム等からなる介在層を設けてもよい。
【００３８】
金属膜の膜厚は任意であるが、0.1nm以上500nm以下であることが好ましく、特に１nm以上200nm以下であることが好ましい。500nmを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、0.1nm以上10nm以下であることが好ましい。
【００３９】
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。
【００４０】
（ポリマー）
金属膜が形成された基板上には、ポリマー（高分子膜）が結合される。高分子膜は、親水性ポリマー、疎水性ポリマー、又はその組み合わせから構成することができ、生理活性物質を３次元的に結合可能であるという観点からは、親水性ポリマーが結合していることがより好ましい。この高分子膜は基板上に直接結合されても、間接的に結合されていてもよいが、自己組織化膜上に形成されることがより好ましい。
【００４１】
なお、本発明のバイオセンサー用チップのポリマーはカルボキシル基を有するものであるが、このカルボキシル基は最初からポリマーが有するものであってもよいし、オゾン処理・プラズマ処理・NaOHなどのアルカリによるポリマーの加水分解処理・カルボキシル基を有するリンカーの結合などによりカルボキシル基を付与することによって合成してもよい。
【００４２】
また、本発明のバイオセンサー用チップのポリマーはカルボキシル基を有するものであるが、カルボキシル基のほかに、スルホン酸基、スルフィン酸基などの負電荷を有する官能基を有するポリマーについても、ポリマー表面にポリアミノ基を結合させることによって、ポリマー表面の負電荷を相殺することができるので、このようなポリマーを有するバイオセンサー用チップにも同様に適用することが可能である。
【００４３】
（自己組織化膜形成分子）
自己組織化膜とは、外からの細かい制御を加えていない状態で、膜材料そのものがもつ機構によって形成される一定の秩序をもつ組織をもった単分子膜やＬＢ膜などの超薄膜のことを言う。この自己組織化により、非平衡な状況で長距離にわたって秩序がある構造やパターンが形成される。
【００４４】
自己組織化膜は、一般式Ｘ-Ｒ5-Ｙで表される化合物により形成されていることが好ましい。ここで、Ｘは金属膜と結合可能な基、具体的には−SH、−SS、−SeH、−SeSe、−COSH 基などの金属膜と結合可能な基を表す。Ｒ5は２価の有機連結基であり、場合によりヘテロ原子により中断されていてもよく、好ましくは適当に密な詰め込みのため直鎖（枝分かれしていない）であり、場合により二重及び／又は三重結合を含む炭化水素鎖である。炭素鎖は場合により過フッ素化されることができ、Ｒ5のアルキル鎖長は炭素数２〜８であることが好ましい。Ｙは親水性ポリマーやNTA等と結合可能な基、具体的には、水酸基、ヒドロキシカルボニル基、アルコキシ基、アルキル基からなる群より選ばれる官能基を表す。
【００４５】
より詳細には、自己組織化膜の形成分子としては、金表面においてはアルカンチオール類、ガラス表面においてはアルキルシラン類、シリコン表面においてはアルコール類等が好ましく挙げられる。アルカンチオール類の具体例としては、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチル酸、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。アルキルシラン類の具体例としてはアミノプロピルトリメトキシシラン、アミノエチルアミノトリエトキシシラン、ヒドロキシプロピルトリエトキシシランなどを使用することができる。
【００４６】
（親水性ポリマー）
親水性ポリマーとしては、デキストラン誘導体、デンプン誘導体、セルロース誘導体、ゼラチン等の天然高分子、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド誘導体、ポリメチルビニルエーテル等の合成高分子等が挙げられる。
【００４７】
また、カルボキシル基を含有するポリマーとしては、カルボキシル基含有合成高分子およびカルボキシル基含有天然高分子を用いることも可能である。カルボキシル基含有合成高分子としては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、およびこれらの共重合体、例えば特開昭59-44615号、特公昭54-34327号、特公昭58-12577号、特公昭54-25957号、特開昭59-53836号、特開昭59-71048号明細書に記載されているようなメタクリル酸共重合体、アクリル酸共重合体、イタコン酸共重合体、クロトン酸共重合体、マレイン酸共重合体、部分エステル化マレイン酸共重合、水酸基を有するポリマーに酸無水物を付加させたものなどが挙げられる。カルボキシル基含有天然高分子としては、天然植物からの抽出物、微生物発酵の生産物、酵素による合成物、または化学合成物の何れであってもよく、具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン酸硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、セロウロン酸、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルデンプン等の多糖類、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等のポリアミノ酸が挙げられる。カルボキシル基含有天然多糖類は、市販の化合物を用いることが可能であり、具体的には、カルボキシメチルデキストランであるCMD、CMD-L、CMD-D40（名糖産業社製）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（和光純薬社製）、アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、等を挙げることができる。
【００４８】
カルボキシル基を含有するポリマーは、好ましくはカルボキシル基を含有する多糖類であり、より好ましくはカルボキシメチルデキストランであることが望ましい。
【００４９】
本発明に用いるカルボキシル基を含有するポリマーの分子量は特に制限されないが、平均分子量が1000〜5000000であることが好ましく、平均分子量が10000〜2000000であることがより好ましく、平均分子量が100000〜1000000であることがさらに好ましい。この範囲より平均分子量が小さい場合には生理活性物質の固定量が小さくなってしまい、この範囲より平均分子量が大きい場合には高い溶液粘度のため取り扱いが困難となる。
【００５０】
上記したような親水性ポリマーは、上述の自己組織化膜又は疎水性ポリマーを介して基板に結合させてもよいし、あるいはモノマーを含む溶液から直接基板上に形成させることもできる。さらに、上記した親水性ポリマーは架橋することもできる。
【００５１】
なお、疎水性ポリマーを用いる場合には、ポリアクリル酸誘導体、ポリメタクリル酸誘導体、ポリエチレン（PE）、ポリプロピレン（PP）、ポリブタジエン、ポリメチルペンテン、シクロオレフィンポリマー、ポリスチレン（PS）、アクリロニトリル／ブタジエン／スチレン共重合体（ABS）、スチレン／無水マレイン酸共重合体・ポリ塩化ビニル（PVC）、ポリエチレンテレフタレート（PET）、ポリエチレンナフタレート（PEN）、ナイロン６、ナイロン６６、酢酸セルロース（TAC）、ポリカーボネート（PC）、変性ポリフェニレンエーテル（m-PPE）、ポリフェニレンサルファイド（PPS）、ポリエーテルケトン（PEK）、ポリエーテルエーテルケトン（PEEK）、ポリスルホン（PSF）、ポリエーテルスルホン（PES）、ポリフェニレンサルファイド（PPS）、液晶ポリマー（LCP）などを好適に挙げることができる。これらの疎水性ポリマーも、カチオン性基の導入率が高い場合は親水性ポリマーとすることができる。
【００５２】
疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。
【００５３】
（ポリマーの活性化）
親水性ポリマーとしてカルボキシル基を含有するポリマーを使用する場合、カルボキシル基を活性化することによって、自己組織化膜で被覆された基板に結合することができる。カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法としては、公知の手法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化する方法、特開2006-58071号に記載の方法（即ち、特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いてカルボキシル基を活性化する方法）、特開2006-90781号に記載の方法（即ち、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物を用いてカルボキシル基を活性化する方法）等を好ましく用いることができる。
【００５４】
活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーは、溶液として基板と反応させてもよく、また、スピンコート等の手法を用いて基板上の薄膜を形成させた状態で反応させてもよい。好ましくは、薄膜を形成させた状態での反応である。
【００５５】
上記手法で活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーに対し、ポリアミノ基を有する化合物、長鎖アルキル基を有する化合物を反応させることにより、本発明のバイオセンサー用チップを製造することが可能となる。
【００５６】
（生理活性物質）
生理活性物質は、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂質、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいは配位子結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。生理活性物質の固定化は、生理活性物質を含む溶液を塗布することによって、あるいは生理活性物質を含む溶液に浸漬する方法によって行うことができる。
【００５７】
（バイオセンサー）
本発明にいうバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用するものである。
【００５８】
本発明のバイオセンサー用チップは、バイオセンサー用チップ基板上に固定化した生理活性物質と被験物質との相互作用を検出及び／又は測定するのに用いることができる。バイオセンサーとしては、先に記載したように、例えば表面プラズモン共鳴（SPR）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（QCM）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。
【００５９】
好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサー用チップは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えた表面プラズモン共鳴用バイオセンサーのチップとして用いることができる。表面プラズモン共鳴バイオセンサーは、センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材からなるが、本発明のバイオセンサー用チップは生理活性物質を固定する部分を含む部材として用いることができる。
【００６０】
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平6-167443号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰(ATR)の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。
【００６１】
図面を用いて説明する。図４は本発明のバイオセンサー用チップを備えた表面プラズモン共鳴分析用センサーの一実施の形態を側面形状で示す概略図である。表面プラズモン共鳴分析用センサーは、図４に示す構成の複数の表面プラズモン測定ユニットから構成され、測定ユニットは、バイオセンサー用チップ10と、光ビーム13を発生する光源であるレーザ光源14と、上記光ビーム13をチップ10に対して入射させる入射光学系15と、チップ10で反射された光ビーム13を平行光化して光検出器17に向けて射出するコリメータレンズ16と、コリメータレンズ16より出射された光ビーム13を受光して光強度を検出する光検出器17と、光検出器17に接続された差動アンプアレイ18と、差動アンプアレイ18に接続されたドライバ19と、ドライバ19に接続されたコンピュータシステム等からなる信号処理部20とからなる。なお、信号処理部20は、チップ10毎になされる感度補正を行う感度補正手段としても機能するものである。なお、光検出器17、差動アンプアレイ18、ドライバ19および信号処理部20により光ビーム中の暗線位置を測定する測定手段が構成されている。
【００６２】
チップ10は、四角錐の４つの稜線が集まる頂角を含む一部分が切り取られ、かつこの四角錐の底面に試料液を貯える試料保持機構として機能する凹部が形成された形状の誘電体ブロック11と、この誘電体ブロック11の凹部の底面に形成された金属膜12とからなっており、図示は省略しているが、この金属膜12上には上述したようにポリマーが結合され、このポリマー表面にはポリアミノ基と長鎖アルキル基とが直接または間接に結合している。
【００６３】
また、全反射減衰（ATR）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第47巻 第１号（1998）の第21〜23頁および第26〜27頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものであるが、本発明のバイオセンサー用チップはこのような漏洩モード測定装置にも用いることができる。
【００６４】
また、本発明のバイオセンサー用チップは、例えば基板表面に、回折格子と場合によっては付加層とを有している導波路構造を保持した、屈折率変化を導波路を用いて検出するバイオセンサーのチップとしても用いることができる。この方式のバイオセンサーの構成については、例えば特公平6-27703号公報４ページ48行目から14ページ15行目および第１図から第８図、米国特許第 6,829,073号のcolumn6の31行目からcolumn7の47行目および第9図A,Bに記載されている。また、別の実施形態として、回折格子導波路のアレイがマイクロプレートのウェル内に組み込まれる形態も可能である（特表2007-501432号）。すなわち回折格子導波路がマイクロプレートのウェル底面にアレイ状に配列されていれば、スループットの高い薬物または化学物質のスクリーニングを可能にすることができる。  
以下に本発明のバイオセンサー用チップについての実施例を示す。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
2.8mM のHODhbt(3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン)水溶液と0.4M のEDC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（(株）同仁化学製）)水溶液の1:1混合溶液100μlを、Biacore社センサーチップCM-5（research grade）表面に接触させ、室温で10分間反応させた。水洗後、真空乾燥機を用いて室温で10分間乾燥させた。この表面に対し、1,2-ビス（2-アミノエトキシ）エタン100μlを接触させ、室温で10分間反応させた後、水洗した。次ぎに、1.0gのステアリン酸(Aldrich製)と0.1gのTween20（東京化成(株)製）を1.0mlのDMFに溶解した溶液に0.1M N-ヒドロキシコハク酸イミド（(株)同仁化学製）の水溶液を0.5ml、0.4M 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（(株)同仁化学製）水溶液0.5mlを添加し混合して、室温で10分間反応させた後、DMFで洗浄後、続いて水洗してチップを作製した。
【００６６】
（実施例２）
実施例１において、ステアリン酸のかわりにオレイン酸を用いた以外は実施例１と同様にしてチップを作製した。
【００６７】
（実施例３）
0.1mMのNHS（N-hydroxysuccinamide）水溶液と0.4MのEDC水溶液の1:1(v/v)混合液100μlを、Biacore社センサーチップCM5（Research Grade）表面に接触させ水洗後、0.1mgのオレイルアミンを1mlのDMFに溶解した液と室温で10分間反応させ、水洗乾燥した。この表面に対して2.8mMのHODhbt(3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン)水溶液と0.4MのWSC水溶液の1:1(v/v)混合液100μl を反応させ水洗後、真空乾燥機を用いて室温で10分間乾燥させた。次ぎに、1,2-ビス（2-アミノエトキシ）エタン100μlを接触させ、室温で10分間反応させた後、水洗した。さらに0.1mgのアセチルクロリドの1mlDMF溶液をこの表面に反応させ、室温で1時間静置した後、DMF洗浄後、水洗してチップを作製した。
【００６８】
（実施例４）
2.8mM のHODhbt水溶液と0.4M のEDC水溶液の1:1混合溶液100μlを、Biacore社センサーチップCM-5表面に接触させ、室温で10分間反応させた。水洗後、真空乾燥機を用いて室温で10分間乾燥させた。この表面に対し、1,2-ビス（2-アミノエトキシ）エタン100μlを接触させ、室温で10分間反応させた後、水洗した。次ぎに、1.0gのステアリン酸を1.0mlのDMFに溶解した溶液に0.1M N-ヒドロキシコハク酸イミドの水溶液を0.5ml、0.4M 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩水溶液0.5mlを添加し混合して、室温で10分間反応させた後、DMFで洗浄後、続いて水洗した。さらに0.1mgのアセチルクロリドの1mlDMF溶液をこの表面に反応させ、室温で1時間静置した後、DMF洗浄後、水洗してチップを作製した。
【００６９】
（センサーグラムの測定）
実施例１のチップと、比較例としてBiacore社センサーチップL1（基板表面に設けられたデキストランを長鎖アルカンで修飾したもの）をBiacore社製の表面プラズモン共鳴装置であるBiacore3000にセットし、カチオン、アニオン、ノニオンの３種リポソーム（コートソーム：日本油脂(株)製）の吸着量を測定した。得られたセンサーグラムを図５および図６に示す。
【００７０】
（汚染防止能の評価）
実施例１〜４のチップと、比較例としてBiacore社センサーチップL1をBiacore社製の表面プラズモン共鳴装置であるBiacore3000にセットし、メチレンブルーの吸着により汚染防止性能を測定した。０〜200RU以下の吸着を○、200RUより大きい吸着を×として評価した。結果を表１に示す。
【００７１】
【表１】
0004777315.tif 000002
【００７２】
図５、６および表１から明らかなように、比較例１のチップではアニオンやノニオンののリポソーム吸着量が極端に少なく、荷電の種類によって吸着量に大きな開きがあるのに対し、実施例１〜４の本発明のチップはカチオン、アニオン、ノニオンいずれのリポソームも吸着していた。従って、本発明のチップは荷電の種類によらずリポソームを吸着することから極めて汎用性が高いことがわかる。また、表１に示すように、本発明のチップでは低分子化合物の吸着が少ないことから汚染防止能が高いことが示された。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明のバイオセンサー用チップの一実施の形態を示す模式概略図
【図２】本発明のバイオセンサー用チップの別の実施の形態を示す模式概略図
【図３】本発明のバイオセンサー用チップのさらに別の実施の形態を示す模式概略図
【図４】本発明のバイオセンサー用チップを備えた表面プラズモン共鳴分析用センサーの概略図
【図５】実施例１のセンサーグラムを示すグラフ
【図６】比較例１のセンサーグラムを示すグラフ
【図１】
0004777315.tif 000003
【図２】
0004777315.tif 000004
【図３】
0004777315.tif 000005
【図４】
0004777315.tif 000006
【図５】
0004777315.tif 000007
【図６】
0004777315.tif 000008