(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列識別番号２６６のＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓの４−クマラートＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）配列と、（２）配列識別番号２６６の該配列の相補体と、（３）配列識別番号２６６の該配列の逆相補体と、（４）配列識別番号２６６の該配列の逆配列と、（５）配列識別番号２６６の該配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつ４ＣＬをコードするヌクレオチド配列と、（６）配列識別番号２６６の該配列と、これらの該配列の相補体、逆相補体及び逆配列とのうちの１つとストリンジェントなハイブリダイズ形成条件下でハイブリダイズ形成し、かつ４ＣＬをコードするヌクレオチド配列と、（７）配列識別番号２６６の該配列の対立遺伝子変異体のヌクレオチド配列とからなるグループから選択されたヌクレオチド配列を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列識別番号２６６のヌクレオチド配列の、２０個の連続した残基に相補的な、少なくとも２０個の連続した残基を含む、単離オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー。
【請求項３】
請求項２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを複数含む、キット。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを含む、コンストラクト。
【請求項５】
請求項４に記載のコンストラクトを含む、トランスジェニック細胞。
【請求項６】
（ａ）遺伝子プロモーター配列と、
（ｂ）請求項１に記載のヌクレオチド配列と、
（ｃ）遺伝子ターミネーション配列とを５’から３’への方向で含む、コンストラクト。
【請求項７】
ポリヌクレオチドがセンス方向に配向される、請求項６に記載のコンストラクト。
【請求項８】
ポリヌクレオチドがアンチセンス方向に配向される、請求項６に記載のコンストラクト。
【請求項９】
遺伝子プロモーター配列が木部での転写を与えるために植物宿主で機能する、請求項６に記載のコンストラクト。
【請求項１０】
請求項６に記載のコンストラクトを含む、トランスジェニック植物細胞。
【請求項１１】
請求項１０に記載のトランスジェニック植物細胞を含む植物、その部分、栄養分体又は子孫。
【請求項１２】
請求項１に記載のポリヌクレオチドを植物のゲノムに安定的に取り込むことを含む、リグニン量、リグニン組成及びリグニン構造のうち１つ以上を改変するための方法。
【請求項１３】
植物がユーカリ及びマツの種からなるグループから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項６に記載のコンストラクトを前記植物のゲノムに安定的に取り込むことを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）トランスジェニック細胞を提供するために、請求項６に記載のコンストラクトで植物細胞を形質転換すること、及び、
（ｂ）再生及び成熟植物の成長をもたらす条件下で前記トランスジェニック細胞を培養することを含む、変化されたリグニン量、変化されたリグニン組成及び変化されたリグニン構造の１つまたは２つ以上を有する植物を作成する方法。
【請求項１６】
請求項６に記載のコンストラクトを植物ゲノムに安定的に取り込むことを含む、植物リグニン生合成経路に関与するポリペプチド活性を改変する方法。
【請求項１７】
（ａ）配列識別番号３４９の配列と、（ｂ）配列識別番号３４９と少なくとも９０％の同一性を有する配列からなり、かつ４ＣＬをコードする配列とからなるグループから選択されたアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド配列にエンコードされる、単離ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【本発明の技術分野】
本発明は、プローブ及びプライマーとともに部分配列及び拡張配列を含む、新規と信じられるポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドを含むコンストラクトと、該ポリヌクレオチドを取り込んでいる（植物、微生物、及び多細胞生物を含む）生物学的材料と、該ポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチドと、前記ポリヌクレオチド及びポリペプチドを使用する方法に関する。本発明は、さらにとりわけ、植物を含む生物学的材料におけるリグニン量及び組成を改変することと、該リグニン生合成経路に関与するポリペプチドと、かかる酵素をエンコードするポリヌクレオチドとに関する。
【０００２】
【本発明の背景】
リグニンは、植物の幹の剛性をもたらす主要な要因となる不溶性高分子である。特に、リグニンは、一部の植物細胞壁の多糖類成分をとりまくマトリクスの役割を果たす。リグニン量が多いほど、植物の剛性が高い。例えば、木本種は大量のリグニンを合成し、リグニンが木材の乾燥重量の２０％から３０％の間の割合を構成する。剛性を与えるのに加えて、リグニンは、細胞壁を疎水性にし水が透過できないようにして、植物内部での水の輸送を促進する。リグニンは病原体の浸透と増殖を妨げることにより、植物の疾病抵抗性にも役割を果たす。
【０００３】
木に高濃度のリグニンが含まれることは、紙の製造のために必要なセルロース繊維からリグニンを分離するのにかなりの資源を費やさなければならない製紙業において、重要な問題である。リグニン除去に典型的に用いられる方法は高度にエネルギー及び化学集約的で、コストの上昇と望ましくない廃棄物のレベルの増加をもたらす。米合衆国だけで毎年約２千万トンのリグニンが木材から除去される。
【０００４】
リグニンは、飼料作物の消化率の、あるいは消化率の欠如の、大きな原因となっており、植物リグニン量の少しの増加が消化率の比較的大きな減少をもたらす。例えば、リグニンの減少した飼料は牛にとってより効率的な糧秣を提供し、消費された飼料作物量に比較して乳と肉の収量がより高くなる。正常の植物の成長の過程では、乾燥量の増加は対応する消化率の減少を伴う。
【０００５】
飼料作物を収穫する最適な時を決定するとき、農園主は、消化率は低いが収量が多いことと、消化率は高いが収量が低いことの間で、選択をしなければならない。いくつかの応用には、リグニン量の増加は、木材の機械的強度の増加と色の変化と腐敗抵抗性の増大とをもたらすため、リグニン量の増加が望ましい。菌根種の組成と存在量もまた、リグニン量と構造的組成とを改変することにより、有利に操作される。
【０００６】
以下に詳細に説明する通り、リグニンは、異なる酵素が触媒する多段階経路で合成される、３つ以上の異なるモノリグノールの重合により形成される。シンナミルアルコール脱水素酵素（ＣＡＤ）及びカフェー酸３−Ｏ−メチル転移酵素（ＣＯＭＴ）のようなある種の酵素をエンコードする遺伝子のコピー数の操作が、産生されたリグニン量の改変をもたらすことは、既に示されており、例えば米国特許第５、４５１、５１４号明細書及び国際公開第９４／２３０４４号パンフレットを参照のこと。さらに、ポプラにおいては、ＣＡＤをエンコードする配列のアンチセンス発現が改変された組成を有するリグニンの生産につながることは既に示されている（Ｇｒａｎｄ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｌａｎｔａ  （Ｂｅｒｌ．）  １６３、２３２−２３７、１９８５）。
【０００７】
リグニン生合成経路に関与する酵素のいくつかをエンコードするポリヌクレオチドは植物の種によっては単離されてきたが、広範囲の植物種における多くの酵素をエンコードする遺伝子は未同定である。したがって、本分野には、植物リグニン量及び組成の改変に有用な材料とその利用方法との必要性が、今も存在している。
【０００８】
【発明の概要】
簡潔にいうと、本発明は、添付した配列リストにおいて配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番として表された単離されたポリヌクレオチドと、これらの配列の変異体と、かかる配列を含むコンストラクトと、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番の配列を含む拡張配列と、これらの変異体と、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番に示された配列に対応するプローブ及びプライマーと、これらの変異体と、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番として同定されたポリヌクレオチドのいずれかの、特定の数以上の連続した残基を含むポリヌクレオチド（ｘ−マー）とを提供するものであり、これらの全ては、ここでは集合的に「本発明のポリヌクレオチド」と言及される。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくはユーカリ及びマツの種から得ることができ、好ましくは、リグニン生合成経路に関与する酵素をエンコードする。かかる配列を取り込んだコンストラクトと、かかる配列及びコンストラクトの使用方法と、ゲノム及び／又はリグニンの量及び組成が改変された植物細胞及び植物を含む、生物学的材料とが提供される。また本発明は、添付された配列リストにおいて配列識別番号第２６７ないし３４９番及び第３７６ないし４０１番として同定された、単離ポリペプチドと、これらの配列のポリペプチド変異体と、該ポリペプチド配列及びこれらの配列の変異体を含むポリペプチドとをも提供する。
【０００９】
ある局面から見ると、本発明は以下の酵素又は以下の酵素の一部をエンコードする単離ポリヌクレオチドを提供する、すなわち、シンナマート４−水酸化酵素（ｃｉｎｎａｍａｔｅ  ４−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ、Ｃ４Ｈ）、クマラート３−水酸化酵素（ｃｏｕｍａｒａｔｅ  ３−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ、Ｃ３Ｈ）、フェノラーゼ（ｐｈｅｎｏｌａｓｅ、ＰＮＬ）、Ｏ−メチル基転移酵素（Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＯＭＴ）、シンナミルアルコール脱水素酵素（ｃｉｎｎａｍｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＣＡＤ）、レダクターゼ（ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＣＣＲ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  ａｍｍｏｎｉａ−ｌｙａｓｅ、ＰＡＬ）、４−クマラートＣｏＡリガーゼ（４−ｃｏｕｍａｒａｔｅ、ＣｏＡ  ｌｉｇａｓｅ、４ＣＬ）、コニフェロールグルコース転移酵素（ｃｏｎｉｆｅｒｏｌ  ｇｌｕｃｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＣＧＴ）、コニフェリンベータグルコシダーゼ（ｃｏｎｉｆｅｒｉｎ  ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ、ＣＢＧ）、ラッカーゼ（ｌａｃｃａｓｅ、ＬＡＣ）、過酸化酵素（ＰＯＸ）、フェルラ酸−５−水酸化酵素（ｆｅｒｕｌａｔｅ−５−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ、Ｆ５Ｈ）アルファアミラーゼ（ａｍｙｌａｓｅ）、カフェー酸メチル基転移酵素（ｃａｆｆｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｅｔｈｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、カフェオイルＣｏＡメチル基転移酵素（ｃａｆｆｅｏｙｌ  ＣｏＡ  ｍｅｔｈｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、クメラート６Ａリガーゼ（ｃｏｕｍｅｒａｔｅ  ６Ａ  ｌｉｇａｓｅ）、シトクロムＰ４５０ＬＸＸ１Ａ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＬＸＸ１Ａ）ジフェノール酸化酵素（ｄｉｐｈｅｎｏｌ  ｏｘｉｄａｓｅ）フラボノールグルコース転移酵素（ｆｌａｖｏｎｏｌ  ｇｌｕｃｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、フラボノイド水酸化酵素（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）及びイソフラボン還元酵素（ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）である。
【００１０】
１の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、（ａ）配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番に列挙されたポリヌクレオチドと、（ｂ）配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番に列挙されたポリヌクレオチドに相補的なものと、（ｃ）配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番に列挙されたポリヌクレオチド逆相補的なものと、（ｄ）配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番に列挙されたポリヌクレオチドと逆なものと、（ｅ）配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番に列挙されたポリヌクレオチドの変異体とからなるグループから選ばれたヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む。本発明の別の実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番のポリヌクレオチドのいずれかの、特定の数以上の連続した残基（ｘ−マー）を含む。さらに別の局面から見ると、ポリヌクレオチドは配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番のポリヌクレオチドのいずれかに対応するプローブ及びプライマーを含む。
【００１１】
別の局面から見ると、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを単独で、あるいは１以上の本発明の配列との組み合わせ又は１以上の既知のポリヌクレオチドとの組み合わせで含むコンストラクトを、宿主細胞及びかかるコンストラクトを含むトランスジェニックな細胞とともに提供する。関連した局面からは、本発明は５’から３’への順に、遺伝子プロモーター配列と、本発明のポリヌクレオチドにエンコードされた酵素の少なくとも機能的な部分をコードするオープン・リーディング・フレームと、遺伝子ターミネーション配列とを含むコンストラクトを提供する。オープン・リーディング・フレームは、センス方向に配置されてもアンチセンス方向に配置されてもよい。前記のポリヌクレオチドにエンコードされた酵素をコードする遺伝子のノンコーディング領域、又はノンコーディング領域に相補的なポリヌクレオチドを、遺伝子プロモーター配列及び遺伝子ターミネーション配列とともに含むＤＮＡコンストラクトもまた提供される。前記遺伝子プロモーター及びターミネーション配列は植物細胞のような宿主細胞において機能することが好ましい。最も好ましいのは、前記遺伝子プロモーター及びターミネーション配列が本来の酵素のものであるが、カリフラワーモザイクウイルス（ＣＭＶ）プロモーター及びアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌のノパリンシンターゼのターミネーターのような本分野において一般的に用いられる他のものを、コザック（Ｋｏｚａｋ）配列又はオメガエンハンサーのようなエンハンサーとともにあるいはともにせずに、本発明において有効にもちいることができる。組織特異的なプロモーターは、１以上の希望する組織に的を絞って発現させるために用いることができる。ある好ましい実施態様では、遺伝子プロモーター配列が木部での転写を可能にしている。前記コンストラクトは更に形質転換された細胞の同定用のマーカーを含むこともある。
【００１２】
さらなる局面では、本発明のコンストラクトを含むトランスジェニック植物細胞のようなトランスジェニック細胞が、かかるトランスジェニック細胞を含む植物とかかる植物の果実及び種子とともに、提供される。
【００１３】
また別の局面では、植物のような標的生物のリグニン量と組成を改変する方法であって、本発明のポリヌクレオチドを含むコンストラクトを標的植物ゲノムに安定的に取り込むことを含む方法が提供される。好ましい実施態様では、標的植物は木本植物で、好ましくはユーカリ属及びマツ属の種からなるグループから選択され、最も好ましくはＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓとＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａとからなるグループから選択される。関連した局面では、改変されたリグニン量を有する植物を作成する方法であって、本発明のポリヌクレオチドを含むコンストラクトで植物細胞を形質転換することと、再生及び成熟植物の成長をもたらす条件下でトランスジェニック細胞を培養することとを含む方法が提供される。
【００１４】
さらに別の局面では、本発明は、植物のような標的生物中の酵素活性を回線する方法であって、本発明のコンストラクトを標的生物のゲノムに安定的に取り込むことを含む方法を提供する。好ましい実施態様では、標的植物は木本植物で、好ましくはユーカリ属及びマツ属の種からなるグループから選択され、最も好ましくはＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓとＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａとからなるグループから選択される。
【００１５】
本発明は、配列識別番号第２６７ないし３４９番及び第３７６ないし４０１番として同定された単離されたポリペプチドとこれらのポリペプチドの変異体とを含むポリペプチドをも提供する。
【００１６】
【詳細な説明】
リグニンは主としてパラクマリルアルコール（ｐａｒａ−ｃｏｕｍａｒｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）とコニフェリルアルコール（ｃｏｎｉｆｅｒｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）とシナピルアルコール（ｓｉｎａｐｙｌ  ａｌｃｏｈｏｌ）という３つ以上の異なるモノリグノールの重合によって形成される。これら３つのタイプのリグニンサブユニットは周知であるが、様々な植物のリグニン生合成経路には、これらのサブユニットの少し異なる変異体が関与することもありうる。リグニン中のこれらの残基の相対的な濃度は異なる植物種の間及び同一種内においても一様ではない。更に、リグニン組成は特定の植物の異なる組織の間でも違いがある。前記の３つのモノリグノールはフェニルアラニンから多段階プロセスを経て由来し、フリーラジカル機構により重合してリグニンになると信じられている。
【００１７】
図１はコニフェリルアルコールの生合成経路の異なる段階を各段階を触媒する酵素とともに示す。パラクマリルアルコール及びシナピルアルコールも同様な経路で合成される。フェニルアラニンはまずフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）により脱アミノ化されてシンナマートになり、シンナマートは次にシンナマート４−水酸化酵素（Ｃ４Ｈ）により加水分解されてｐ−クマラートができる。ｐ−クマラートはクマラート３−水酸化酵素により加水分解されてカフェー酸になる。新たに付加された水酸基は次にＯ−メチル基転移酵素（ＯＭＴ）によりメチル化されてフェルラ酸となり、フェルラ酸は４−クマラートＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）により補酵素Ａと結合されてフェルロイルＣｏＡができる。フェルロイルＣｏＡからコニフェルアルデヒドへの還元は、シンナモイルＣｏＡレダクターゼ（ＣＣＲ）により触媒される。コニフェルアルデヒドはシンナミルアルコール脱水素酵素（ＣＡＤ）の活性によりさらに還元されてコニフェリルアルコールとなり、コニフェリルアルコールはコニフェロールグルコース転移酵素（ＣＧＴ）により細胞質から細胞壁への輸送のためにグルコシル型に変換される。輸送の後、コニフェリンベータグルコシダーゼ（ＣＢＧ）の作用によりコニフェリルアルコールの脱グルコシル型が得られる。最後に、フェノラーゼ（ＰＮＬ）とラッカーゼ（ＬＡＣ）と過酸化酵素（ＰＯＸ）により、リグニンを提供する前記の３つのモノリグノールの重合があ触媒される。
【００１８】
シナピルアルコールの合成にはフェルラ酸−５−水酸化酵素（Ｆ５）という酵素も関与する。さらに詳細なリグニン生合成経路の総説としては、Ｗｈｅｔｔｏｎ  ＲとＳｅｄｅｒｏｆｆ  Ｒ、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ、７、１００１−１０１３、１９９５を参照のこと。
【００１９】
植物リグニン量の定量的および定性的な改変は、光刺激、低カルシウムレベル及び機械的ストレスのような外部的な要因によって誘発されることが知られている。正常では木質化しない組織で時々起こる、新規なタイプのリグニンの合成は、病原体の感染によっても誘発されうる。リグニンに加えて、フラボノイド類、クマリン、スチルベン誘導体及び安息香酸誘導体を含むいくつかの他のクラスの植物生産物がフェニルアラニンに由来し、これら全ての化合物の合成の初期段階は同じである。すなわち、ＰＡＬ、Ｃ４Ｈ、４ＣＬその他のリグニン生合成経路に関与する酵素の改変は、リグニンに加えて他の植物生産物の生合成にも影響を与える。
【００２０】
本発明の方法と材料を用いると、植物リグニン量は、本発明のポリヌクレオチドの発現を改変すること又は本発明のポリヌクレオチドにエンコードされるポリペプチド又はポリヌクレオチドを改変することにより改変できる。植物のような標的生物のリグニン量は、例えば、リグニン生合成に関与する酵素をエンコードする遺伝子の追加的なコピーを標的植物のゲノムに取り込むことにより、改変できる。同様に、リグニン量の改変は、かかる遺伝子のアンチセンスコピーで標的植物を形質転換することにより達成できる。さらに、合成された各モノリグノールの相対量を改変し、これにより組成が変更されたリグニンの生成をもたらすために、リグニン生合成経路の異なる酵素をエンコードする遺伝子のコピー数が操作されることも可能である。リグニン組成の変更は、例えば、製紙用の材木処理に応用するうえで有利であり、木材製品の腐敗真菌への嗜好性を変更するのにも有効である。
【００２１】
第１の局面では、本発明は添付された配列リストにおいて配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番として表された単離されたポリヌクレオチドと、これらの配列の変異体と、かかる配列を含むコンストラクトと、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番の配列を含む拡張配列と、これらの変異体と、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番に示された配列に対応するプローブ及びプライマーと、これらの変異体と、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番として同定されたポリヌクレオチドのいずれかの、特定の数以上の連続した残基を含むポリヌクレオチド（ｘ−マー）と、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番に示された配列の部分を含む拡張配列を提供し、これら全てはここで集合的に「本発明のポリヌクレオチド」と言及する。本発明は、配列識別番号第２６７ないし３４９番及び第３７６ないし４０１番に同定された、単離されたポリペプチド配列と、これらの配列のポリペプチド変異体と、前記単離されらポリペプチド配列及びこれらの配列の変異体を含むポリペプチドとをも提供する。
【００２２】
ここで開示されたポリヌクレオチドは林産植物資源、すなわちＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ及びＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａから由来した。本発明のポリヌクレオチドのいくつかは、完全長ポリペプチドをエンコードする完全長遺伝子を表すものではないという意味で、「部分」配列である。かかる部分配列は、プロモーター及び／又はプローブと周知のハイブリダイゼーション及び／又はＰＣＲ技術とを用いて様々なＤＮＡライブラリを解析し配列決定することにより、拡張することが可能である。部分配列は、ポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレームか、完全長ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを発現可能な遺伝子か、ゲノムの別な有用性のある部分かが同定されるまで、拡張することができる。完全長ポリヌクレオチド及び遺伝子を含めて、該拡張ポリヌクレオチドが、同定された配列又はその変異体か、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番の配列の１つの同定された連続した部分（ｘ−マー）を含むときは、かかる拡張配列は、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番の配列の１つとして同定された配列か、これらの変異体か、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番の配列の１つの部分か、又はこれらの変異体かに「対応する」ものと記述される。同様に、本発明のポリヌクレオチドに対応する、ＲＮＡ配列と、逆配列と、相補配列と、アンチセンス配列とその他これらに類するものは、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番として同定されたｃＤＮＡ配列を用いて慣用的手法で確かめ入手することができる。
【００２３】
配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番として同定されたポリヌクレオチドはオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦｓ）又はポリペプチドをエンコードする部分オープン・リーディング・フレームを含むことがある。オープン・リーディング・フレームは本分野で周知の技術を用いて同定することができる。これらの技術は、例えば、既知の開始及び終始コドンの位置の解析とコドン頻度にもとづく最も可能性の高い読み枠の同定等とを含む。ＯＲＦ解析用の適当なツール及びソフトウェアは、例えば、インターネット上でｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｇｏｒｆ．ｈｔｍｌで入手可能である。オープン・リーディング・フレーム及びオープン・リーディング・フレームの部分は本発明のポリヌクレオチド中に同定することができる。部分オープン・リーディング・フレームが同定されたときは、当該ポリヌクレオチドは、完全長オープン・リーディング・フレームのポリヌクレオチドが同定されるまで、本発明の分野で周知の技術を用いて当該部分オープン・リーディング・フレームの領域に拡張することができる。すなわち、ポリペプチドをエンコードするオープン・リーディング・フレームは本発明のポリヌクレオチドを用いて同定することができる。
【００２４】
オープン・リーディング・フレームが本発明のポリヌクレオチド中に同定されたときは、該オープン・リーディング・フレームは単離及び／又は合成できる。次に、当該オープン・リーディング・フレーム及び適当なプロモーターと、イニシエーターとターミネーター等を含む、本発明の分野で周知の発現可能な遺伝子コンストラクトが構築できる。かかる遺伝子コンストラクトは前記オープン・リーディング・フレームにエンコードされたポリペプチドを発現するために宿主細胞に導入される。適当な宿主細胞には植物細胞、哺乳類細胞、藻類等を含む様々な原核細胞と真核細胞が含まれる。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチドは、その生物学的活性を決定するために、発現され様々な検定法に用いられる。かかるポリペプチドは、抗体作成と、対応した相互作用するタンパクその他の化合物の単離と、相互作用するタンパクその他の化合物の量の定量的な決定とに用いられる。
【００２６】
本発明は、林木品種の前記ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの量と組成を改変するための方法であって、本発明のポリヌクレオチドの１以上のポリヌクレオチドを含む遺伝子コンストラクトを生物のゲノムに安定的に取り込むことに関する方法をも意図する。１の実施態様では、標的植物は林産品種で、好ましくは木本植物で、より好ましくはユーカリ属又はマツ属の種木本植物で、最も好ましくはＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ又はＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａである。関連した局面では、改変された遺伝子型又は表現型を有する植物を作成する方法であって、本発明の遺伝子コンストラクトで植物細胞を形質転換することと、再生及び成熟植物の成長をもたらす条件下でトランスジェニック細胞を培養することとを含む方法が提供される。本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドのレベル又は量の改変の結果として、野生型生物に比べて変更された遺伝子型又は表現型を有する林産植物と、かかる林産植物の要素（種子等）と、かかる林産植物の子孫とが、本発明により意図され、又は本発明に含まれる。
【００２７】
本発明の前記単離されたポリヌクレオチドは、ゲノムマッピングと、遺伝子の物理的地図作成と、ポジショナルクローニングとにおいて有用性がある。さらに、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番として同定されたポリヌクレオチド配列とその変異体は、オリゴヌクレオチドプローブとプライマーの設計に利用できる。オリゴヌクレオチドプローブとプライマーは、関心のあるポリヌクレオチドに、該ポリヌクレオチドの特定の部分にわたっておおよそ相補的な配列を有する。本発明のポリヌクレオチドを利用して設計されたオリゴヌクレオチドプローブは、スロットブロットＤＮＡ雑種形成技術のような本発明の分野で周知の技術を用いて、十分に類似性のあるＤＮＡ及びＲＮＡ配列をその細胞内に有する、いかなる生物の遺伝子の存在の検出及び発現パターンの検査にも利用される。本発明のポリヌクレオチドを用いて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲ増幅に利用できる。本発明のポリヌクレオチドを用いて設計されたオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーは、Ｓｙｎｔｅｎｉ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって用いられたマイクロアレイ技術を含む様々なマイクロアレイ技術との関連でも利用できる。
【００２８】
本発明のポリヌクレオチドは、生物又はこれに由来する生殖材料にタグを付け、又は同定するためにも用いられる。かかるタグ付けは、例えば、非破壊的で非機能性の異種のポリヌクレオチド識別子であって、本発明のポリヌクレオチドの１つを含む識別子を安定的に導入することにより、達成される。
【００２９】
本発明のポリペプチドと該ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドは、植物のリグニン生合成経路で活性を有する。当該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ及びポリペプチドの類似性検索により、推測的に同定される。本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドは、リグニン生合成プロセスに関与することが知られている以下のポリペプチドとの類似性が証明されている。
【００３０】
【表１】
0004793963.tif 000002
0004793963.tif 000003
0004793963.tif 000004
【００３１】
１の実施態様では、単離された本発明のポリヌクレオチドは、（ａ）配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番に列挙された配列と、（ｂ）配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番に列挙された配列に相補的なものと、（ｃ）配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番に列挙された配列と逆相補的なものと、（ｄ）配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番に列挙されたポリヌクレオチドと逆のものと、（ｅ）（ａ）ないし（ｄ）の配列又は（ａ）ないし（ｄ）の配列の特定の領域と、本明細書で定義したところにより、５０％、７５％、９０％又は９８％以上の同一性を有する配列とからなるグループから選択された配列を含む。
【００３２】
さらなる局面では、本発明のポリヌクレオチドにエンコードされた単離されたポリペプチドが提供される。１の実施態様では、かかるポリペプチドは、配列識別番号第２６７ないし３４９番及び第３７６ないし４０１番に列挙されたアミノ酸配列と、その変異体と、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番の配列を含むポリヌクレオチドを含む、本発明のポリヌクレオチドにより発現されたポリペプチドとを含む。
【００３３】
別の局面では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを、単独で、あるいは本発明の１以上の追加のポリヌクレオチドとの組み合わせで、又は１以上の既知のポリヌクレオチドとの組み合わせで含む遺伝子コンストラクトを、かかるコンストラクトを含む細胞及び標的生物とともに提供する。
関連する局面では、本発明は、５’から３’の方向に、遺伝子プライマー配列と、本発明のポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチドの少なくとも機能的な部分をコードするオープン・リーディング・フレームと、遺伝子ターミネーション配列とを含む遺伝子コンストラクトを提供する。当該オープン・リーディング・フレームは、センス方向に配置されても、アンチセンス方向に配置されてもよい。遺伝子プロモーター配列と、本発明のポリヌクレオチドと、遺伝子ターミネーション配列とを含む遺伝子コンストラクトも意図され、遺伝子プロモーター配列と本発明のポリヌクレオチドの非翻訳領域又は非翻訳領域に相補的なヌクレオチド配列と、遺伝子ターミネーション配列とを含む遺伝子コンストラクトも意図されている。さらに、遺伝子コンストラクトは形質転換された細胞を同定するためのマーカーを含む場合もある。
【００３４】
前記遺伝子プロモーター及びターミネーション配列は、宿主細胞で機能性を有することが好ましく、宿主植物と同種のものが最も好ましい。コザック（Ｋｏｚａｋ）配列又はオメガエンハンサーのようなエンハンサーとともにあるいはともにせずに、カリフラワーモザイクウイルス（ＣＭＶ）プロモーターと、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌のノパリンシンターゼのターミネーターとのような本分野において一般的に用いられるプロモーター及びターミネーション配列が役に立つ。組織特異的なプロモーターは、１以上の希望の組織に的を絞って発現させるために用いられる。
【００３５】
さらなる局面では、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドの量を本来の生物と比べて改変した林産植物を作成する方法が提供される。当該方法には、トランスジェニック細胞を提供するために本発明の遺伝子コンストラクトで標的林産植物を形質転換することと、再生と成熟植物の成長をもたらす条件下で該トランスジェニック細胞を培養することとを伴う。本発明の遺伝子コンストラクトを含む細胞が、かかるトランスジェニック細胞を含む組織及び林産植物と、果実、種子その他の産物と、かかる林産植物の派生物又は子孫とともに、提供される。本発明のトランスジェニック植物の栄養分体も本発明に含まれる。ここで使用されたところの「栄養分体」という語は、有性的な又は挿し木のような無性的な、生殖又は繁殖に利用されるいかなる植物の部分をも意味する。
【００３６】
植物品種、特に植物育種家の権利にもとづく登録可能な植物品種は、本発明から除外されうる。植物は、単に、外来遺伝子をその植物又はその先祖の細胞に導入されて、そのゲノムに安定的に含むという理由では、「植物品種」とみなす必要はない。
【００３７】
ここで使用されたところの「ポリヌクレオチド（単数又は複数）」の語は、ヌクレオチドのポリマーの全体を意味し、ＨｎＲＮＡ及びｍＲＮＡ分子と、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖と、ｃＤＮＡとゲノムＤＮＡと全合成された又は部分合成されたポリヌクレオチドとを含む、１本鎖及び２本鎖分子の両方の、ＤＮＡと対応するＲＮＡ分子とを含む。ＨｎＲＮＡはイントロンを含み、一般的には１対１対応でＤＮＡ分子と「対応」する。ｍＲＮＡ分子はイントロンが切り出されたＨｎＲＮＡ及びＤＮＡ分子に「対応」する。本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子全体であっても、そのいかなる部分であってもよい。遺伝子とは、機能性を有するタンパク又はＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列をいう。動作可能なアンチセンスポリヌクレオチドは対応するポリヌクレオチドの断片を含み、「ポリヌクレオチド」の定義は全ての動作可能なアンチセンス断片を含む。アンチセンスポリヌクレオチドとアンチセンスポリヌクレオチドに係る技術は本発明の分野で周知であり、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ−Ｂｅｎｉｏｎ  ら、“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２５４（２３）、３６３−３７５、１９９５及びＫａｗａｓａｋｉら、Ａｒｔｉｆｉｃ．  Ｏｒｇａｎｓ  ２０（８）、８３６８４８、１９９６に記載されている。
【００３８】
かかる単離されたポリヌクレオチドの相補体、かかる単離されたポリヌクレオチドの逆相補体と、かかる単離されたポリヌクレオチドの逆配列とが、かかる配列の変異体とともに、提供されている。ここで使用されたところの「相補体」、「逆相補体」、及び「逆配列」という用語の定義は以下の例で最も良く示されている。５’ＡＧＧＡＣＣ３’という配列に対して、相補体、逆相補体及び逆配列は以下の通りである。
相補体                ３’ＴＣＣＴＧＧ５’
逆相補体              ３’ＧＧＴＣＣＴ５’
逆配列                ５’ＣＣＡＧＧＡ３’
【００３９】
ここで使用されたところの「オリゴヌクレオチド」は、ポリヌクレオチド配列の比較的短い分節であって、一般的には６個と６０個の間のヌクレオチドを含み、雑種形成検定法に使用するプローブとポリメラーゼ連鎖反応によるＤＮＡ増幅に使用するプライマーとの両方を含む。
【００４０】
ゲノムＤＮＡ及び異種ＤＮＡの同定は、標準的なＤＮＡ／ＤＮＡ雑種形成技術により、適当にストリンジェントな条件下で、ｃＤＮＡ配列の全部又は一部を適当なライブラリをスクリーンするためのプローブとして用いることにより達成される。代替策として、既知のゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びタンパク配列にもとづいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ技術が、ゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの配列を増幅し同定するために利用できる。前記同定された配列と変異体とに対応する合成ＤＮＡは、通常の合成法により製造される。本発明の分野で普通に用いられる条件で、ここに記載したポリヌクレオチドの全ては単離され精製される。
【００４１】
別の局面では、本発明は、上記のポリヌクレオチドにエンコードされ、又は部分的にエンコードされた、単離されたポリペプチドを提供する。ここで使用されたところの「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸残基が共有結合で連結された、完全長を含むいかなる長さのアミノ酸鎖をも含む。ここで使用されるところの「ポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチド」という用語は、ここで提供された、単離されたＤＮＡ配列又は変異体を含むポリヌクレオチドによりエンコードされたポリペプチドを含む。特定の実施態様では、本発明のポリペプチドは配列識別番号第２６７ないし３４９番及び第３７６ないし４０１番に提供された配列からなるグループから選択されたアミノ酸配列を含む。
【００４２】
本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列を発現ベクターに挿入し、該ポリペプチドを適当な宿主中で発現されることにより、組み替え法で生産することができる。本発明の分野の通常の技量を有する者に知られた様々な発現ベクターのいずれも使用できる。発現は、組み換えポリペプチドをエンコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターを形質転換し又はトランスフェクションした、いかなる適当な宿主細胞でも達成できる。適当な宿主細胞には原核細胞、酵母及び高等真核細胞が含まれる。使用する宿主細胞は、大腸菌、昆虫、酵母又はＣＯＳやＣＨＯのような哺乳類の細胞株が好ましい。この手法で発現されたＤＮＡ配列は、自然界に存在するポリペプチド、自然界に存在するポリペプチドの部分又はこれらのその他の変異体をエンコードするものであってもよい。
【００４３】
関連する局面では、ポリペプチドは、配列識別番号第２６７ないし３４９番及び第３７６ないし４０１番に提供された配列からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの、少なくとも機能性のある部分を含むものとして提供される。ここで使用されるところのポリペプチドの「機能性のある部分」とは、例えば１以上の反応物と結合可能な分子の部分のように、当該ポリペプチドの機能に影響を与える必須の活性部位を含む部分をいう。前記活性部位は、１以上のポリペプチド鎖上に存在する分離された部分から構成されることもあり、一般的に高い結合親和性を示す。
【００４４】
ポリペプチドの機能性のある部分は、始めに化学的又は酵素的にポリペプチドを消化して該ポリペプチドの断片を調製することにより、あるいは該ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドの突然変異解析とこれに続く得られた突然変異体ポリペプチドの発現とにより、同定することができる。当該ポリペプチド断片又は突然変異ポリペプチドは、例えば、以下に提示する代表的な検定法を用いて、どの部分が生物学的な活性を保持しているかを決定するためにテストされる。
【００４５】
活性部位を含む機能性を有する部分は、１以上のポリペプチド鎖上に存在する離れた部分から構成されることもあり、一般的には高い結合親和性を示す。「ポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチド」という用語には、本発明の部分的に単離されたポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチドを含む。
【００４６】
本発明のポリペプチドの部分及びその他の変異体は、人工合成又は組み換えの手段により生成することもできる。約１００個未満、一般的には約５０個未満の、アミノ酸を有する合成ポリペプチドは、本発明の分野の通常の技量を有する者に周知の技術を用いて、合成することができる。例えば、かかるポリペプチドは、アミノ酸が次々に伸長中のアミノ酸鎖に付加されていくメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）固相合成法のような、商業的に利用可能な固相技術のいずれかを用いて合成することが可能である。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５、２１４９−２１４６、１９６３を参照のこと。ポリペプチド自動合成装置は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のような供給者から商業的に入手可能であり、製造者の指示に従って操作することができる。本来のポリペプチドの変異体は、オリゴヌクレオチド指定部位特異的突然変異誘発法のような標準的な突然変異誘発技術を用いて調製できる（Ｋｕｎｋｅｌ、Ｔ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２、４８８−４９２、１９８５）。ＤＮＡ配列の断片は、末端を切除したポリペプチドを調製する標準的な技術を用いて除去することもできる。
【００４７】
一般に、ここで開示されたポリペプチドは、単離され、十分に純粋な形で調製される。ポリペプチドは、約８０％以上純粋であることが好ましく、９０％以上純粋であることがより好ましく、９９％以上純粋であることが最も好ましい。以下に記載された、ある好ましい実施態様では、単離されたポリペプチドは、医薬品の組成又は皮膚疾患の治療用のワクチンに取り込まれる。
【００４８】
ここで使用されるところの「変異体」という用語は、特異的に同定された配列と異なるヌクレオチド又はアミノ酸配列を含むものであって、１以上のヌクレオチド又はアミノ酸配列が欠失、置換又は付加されたものをいう。変異体は、自然界に存在する対立遺伝子の変異体でも、自然界に存在しない変異体でもよい。（ポリヌクレオチド又はポリペプチドの）変異体配列は、好ましくは５０％以上、より好ましくは７５％以上、最も好ましくは９０％以上本発明の配列と同一性を示すものをいう。同一性の百分率は、以下に記載の通り比較する２つの配列のアライメントをとり（ａｌｉｇｎ）、アライメントがとれた部分の同一残基の数を決定し、該同一残基の数を本発明の（クエリーの）配列中の全残基数で除算し、その結果を１００倍したものをいう。
【００４９】
ポリヌクレオチド配列とポリペプチド配列との間のアライメントをとることもでき、特定の部分の同一ヌクレオチドの百分率は、公開で入手可能なコンピューターアルゴリズムを用いて、別のポリヌクレオチドに対して決定できる。アライメントとポリヌクレオチド配列の類似性同定とのための代表的なアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡアルゴリズムである。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）の６つの読み枠の概念的な翻訳産物をタンパク配列データベースに対して比較するＢＬＡＳＴＸアルゴリズムを用いても解析できる。ポリペプチドの類似性は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いて検索することができる。前記ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＰプログラムは、ＮＣＢＩのアノニマスＦＴＰサーバー（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）上の／ｂｌａｓｔ／ｅｘｅｃｕｔａｂｌｅｓ／で入手可能である。説明書に記載され、プログラムとともに配布されたデフォルトのパラメーター値に設定した、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズムバージョン２．０．４（１９９８年２月２４日）及びバージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）を本発明によるポリヌクレオチド変異体の決定に用いるのが好ましい。説明書に記載され、プログラムとともに配布されたデフォルトのパラメーター値に設定した、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを、本発明によるポリペプチド変異体の決定に用いるのが好ましい。ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＸを含むＢＬＡＳＴファミリーのアルゴリズムは、ＮＣＢＩのウェッブサイトのＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｎｅｗｂｌａｓｔ．ｈｔｍｌと、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ、ら、“Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ、  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ、”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５、３３８９−３４０２、１９９７の刊行物とに記載されている。
【００５０】
コンピューターアルゴリズムのＦＡＳＴＡは、インターネット上のｆｔｐサイトｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｆａｓｔａ／で入手可能である。説明書に記載され、プログラムとともに配布されたデフォルトのパラメーター値に設定した、１９９６年２月のバージョン２．０．４を、本発明による変異体の決定に用いるのが好ましい。ＦＡＳＴＡアルゴリズムの使用法は、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＷＲとＬｉｐｍａｎ  ＤＪ、“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、”  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５、２４４４−２４４８、１９８８と、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＷＲ、“Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ＦＡＳＴＰ  ａｎｄ  ＦＡＳＴＡ、”  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８３、６３−９８、１９９０とに記載されている。
【００５１】
以下のランニングパラメーターを、ポリヌクレオチド配列のＥ値（Ｅ  ｖａｌｕｅｓ）及び同一性百分率に寄与する、ＢＬＡＳＴＮを使うアライメント及び類似性の決定に用いるのが好ましい。Ｕｎｉｘのランニングコマンド、ｂｌａｓｔａｌｌ  −ｐ  ｂｌａｓｔｎ  −ｄ  ｅｍｂｌｄｂ  −ｅ  １０  Ｇ０    −Ｅ０    −ｒ  １  −ｖ  ３０  −ｂ  ３０    −ｉ    ｑｕｅｒｙｓｅｑ  ｏ  ｒｅｓｕｌｔｓ、パラメーターは、−ｐ    Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｎａｍｅ  ［Ｓｔｒｉｎｇ］；  −ｄ    Ｄａｔａｂａｓｅ  ［Ｓｔｒｉｎｇ］；  −ｅ    Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ  （Ｅ）  ［Ｒｅａｌ］；  −Ｇ    Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ａ  ｇａｐ  （ｚｅｒｏ  ｉｎｖｏｋｅｓ  ｄｅｆａｕｌｔ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）  ［Ｉｎｔｅｇｅｒ］；  −Ｅ    Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ａ  ｇａｐ  （ｚｅｒｏ  ｉｎｖｏｋｅｓ  ｄｅｆａｕｌｔ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）  ［Ｉｎｔｅｇｅｒ］；  −ｒ    Ｒｅｗａｒｄ  ｆｏｒ  ａ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍａｔｃｈ  （ｂｌａｓｔｎ  ｏｎｌｙ）  ［Ｉｎｔｅｇｅｒ］；  −ｖ    Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｏｎｅ−ｌｉｎｅ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ  （Ｖ）  ［Ｉｎｔｅｇｅｒ］；  −ｂ    Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ｓｈｏｗ  （Ｂ）  ［Ｉｎｔｅｇｅｒ］；  −ｉ    Ｑｕｅｒｙ  Ｆｉｌｅ  ［Ｆｉｌｅ  Ｉｎ］；  ａｎｄ  −ｏ    ＢＬＡＳＴ  ｒｅｐｏｒｔ  Ｏｕｔｐｕｔ  Ｆｉｌｅ  ［Ｆｉｌｅ  Ｏｕｔ］    Ｏｐｔｉｏｎａｌ。以下のランニングパラメーターを、ポリペプチド配列のＥ値及び同一性百分率に寄与する、ＢＬＡＳＴＰを使うアライメント及び類似性の決定に用いるのが好ましい。ｂｌａｓｔａｌｌ  ｐ  ｂｌａｓｔｐ  ｄ  ｓｗｉｓｓｐｒｏｔｄｂ  ｅ  １０  Ｇ０Ｅ  ０  ｖ  ３０  ｂ  ３０  ｉ  ｑｕｅｒｙｓｅｑ    ｏ  ｒｅｓｕｌｔｓ；  ｔｈｅ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ａｒｅ、  −ｐ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｎａｍｅ  ［Ｓｔｒｉｎｇ］；  −ｄ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ［Ｓｔｒｉｎｇ］；  −ｅ  Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  ｖａｌｕｅ  （Ｅ）  ［Ｒｅａｌ］；  −Ｇ  Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ａ  ｇａｐ  （ｚｅｒｏ  ｉｎｖｏｋｅｓ  ｄｅｆａｕｌｔ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）  ［Ｉｎｔｅｇｅｒ］；  −Ｅ  Ｃｏｓｔ  ｔｏ  ｅｘｔｅｎｄ  ａ  ｇａｐ  （ｚｅｒｏ  ｉｎｖｏｋｅｓ  ｄｅｆａｕｌｔ  ｂｅｈａｖｉｏｒ）  ［Ｉｎｔｅｇｅｒ］；  −ｖ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｏｎｅ−ｌｉｎｅ  ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ  （ｖ）  ［Ｉｎｔｅｇｅｒ］；  −ｂ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｔｏ  ｓｈｏｗ  （ｂ）  ［Ｉｎｔｅｇｅｒ］；  −Ｉ  Ｑｕｅｒｙ  Ｆｉｌｅ  ［Ｆｉｌｅ  Ｉｎ］；  −ｏ  ＢＬＡＳＴ  ｒｅｐｏｒｔ  Ｏｕｔｐｕｔ  Ｆｉｌｅ  ［Ｆｉｌｅ  Ｏｕｔ］  Ｏｐｔｉｏｎａｌ。ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＰ又は同様のアルゴリズムにより作成された、クエリー配列による１以上のデータベース配列への「ヒット」は、配列の類似部分のアライメントをとって同定する。データベース配列へのヒットは、前記クエリー配列の配列長の一部としか重複しないことを意味するのが一般的である。
【００５２】
ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴＰアルゴリズムは、アライメントの「期待」（Ｅ）値をも作成する。Ｅ値は、一定の規模のデータベースを検索したときに偶然一定数の隣接した配列にわたって発見が「期待」できるヒットの数を示す。Ｅ値は、好ましいＥＭＢＬデータベースのようなデータベースへのヒットが真の類似性を表すかどうかを決定するための、有意性の閾値として用いられる。例えば、あるポリヌクレオチドのヒットに付与されたＥ値０．１は、ＥＭＢＬデータベースの規模のデータベースにおいて、同様のスコアの配列のアライメントをとった部分にわたって、偶然０．１回マッチすることが期待できると解釈される。この判定基準により、当該ポリヌクレオチド配列のアライメントがとれてマッチした部分は、９０％が同一である確率を有することになる。アライメントがとれてマッチした部分にわたって０．０１未満のＥ値を有する配列については、ＢＬＡＳＴＮ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いてＥＭＢＬデータベースで偶然マッチするものを見つける確率は１％未満である。
【００５３】
１の実施態様によると、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドのそれぞれに関して、「変異体」のポリヌクレオチド及びポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドのそれぞれよりも、核酸又はアミノ酸の数が同じか少なく、かつ本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドと比べて０．０１未満のＥ値を作成する、配列を含むのが好ましい。すなわち、変異体ポリヌクレオチド又はポリペプチドは、本発明のポリヌクレオチド又はポリペプチドと同一である確率が９９％以上あり、上記のパラメーター設定でＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いてＥ値が０．０１以下となる、いかなる配列をもいう。好ましい実施態様によると、変異体ポリヌクレオチドとは、上記のパラメーター設定でＢＬＡＳＴＮ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムを用いるとＥ値が０．０１以下となり、９９％以上の確率で本発明のポリヌクレオチドと同一となる、本発明のポリヌクレオチドより核酸の数が同じか少ない配列をいう。同様に、好ましい実施態様によると、変異体ポリペプチドとは、上記のパラメーター設定でＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを用いるとＥ値が０．０１以下となり、９９％以上の確率で本発明のポリペプチドと同一となる、本発明のポリペプチドよりアミノ酸の数が同じか少ない配列をいう。
【００５４】
代替策として、本発明の変異体ポリヌクレオチドは、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番に列挙されたポリヌクレオチド配列又はこれらの配列の、相補体、逆配列又は逆相補体と、ストリンジェントな条件下で雑種形成するものである。ここで使用されるところの「ストリンジェントな条件」とは、６Ｘ  ＳＳＣと０．２％ＳＤＳの溶液で前洗浄し、６５°Ｃ、一晩、６Ｘ  ＳＳＣと０．２％ＳＤＳ中で雑種形成させ、その後６５°Ｃ、１Ｘ  ＳＳＣと０．１％ＳＤＳで各３０分ずつ２回洗浄し、６５°Ｃ、０．２Ｘ  ＳＳＣと０．１％ＳＤＳで各３０分ずつ２回洗浄することを指す。
【００５５】
また本発明は、開示された配列とは異なるが、遺伝暗号の縮退の結果、本発明により意図されたアミノ酸配列と同一の配列をエンコードするポリヌクレオチドをも含む。かかるポリヌクレオチドは、ここで開示されたポリヌクレオチドと「縮退的に等価」といわれる。同様に、開示された配列とは異なるが、本発明のポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチドと同様の酵素活性を有する、ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドは、本発明に含まれる。したがって、保存的な置換の結果、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番に列挙されたポリヌクレオチド配列、又はこれらの配列の相補体、逆配列又は逆相補体と、異なる配列を含むポリヌクレオチドは、本発明により意図され、かつ本発明に含まれる。さらに、合計が前配列長の１０％未満の欠失及び／又は挿入の結果として、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番に列挙されたポリヌクレオチド配列、又はこれらの配列の相補体、逆配列又は逆相補体と異なる配列を含むポリヌクレオチドも本発明により意図され、かつ本発明に含まれる。同様に、合計が全配列長の１０％未満のアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失の結果として、配列識別番号第２６７ないし３４９番及び第３７６ないし４０１番に列挙されたポリペプチド配列と異なる配列を含むポリペプチドは、当該変異体ポリペプチドがリグニン生合成経路で活性を有することを条件として、本発明により意図され、かつ本発明に含まれる。
【００５６】
変異体を含めて本発明のポリヌクレオチドは、植物又は非植物生物から構築された様々なライブラリから単離することができ、又は、本発明の分野で周知の技術を用いて合成できる。本発明のポリヌクレオチドは、実施例１及び２に記載の通り、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ及びＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａから調製されたｃＤＮＡライブラリの高スループットな配列決定により単離されたものでもよい。代替策として、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番に提供された配列にもとづくオリゴヌクレオチドプローブを合成して、雑種形成又はＰＣＲ技術により、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ及びＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ由来のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリ中の陽性クローンを同定するのに用いることも可能である。プローブは、ここで提供された配列より短くてもよいが、約１０個以上の、好ましくは約１５個以上の、最も好ましくは約２０個以上の、ヌクレオチド長とすべきである。かかるオリゴヌクレオチドプローブについて利用するのに適当な、雑種形成及びＰＣＲ技術は、本発明の分野で周知である。陽性クローンは、制限酵素消化、ＤＮＡ配列決定その他これらに類する技術により、解析できる。
【００５７】
他のユーカリ及びマツの種と、製材事業に有用なその他の商業的に重要な種とから由来した本発明のポリヌクレオチドの変異体が意図されている。これらには、例として、テーダマツ（ｌｏｂｌｏｌｌｙ  ｐｉｎｅ  Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ）、スラッシュマツ（ｓｌａｓｈ  ｐｉｎｅ  Ｐｉｎｕｓ  ｅｌｌｉｏｔｔｉ）、サンドパイン（ｓａｎｄ  ｐｉｎｅ  Ｐｉｎｕｓ  ｃｌａｕｓａ）、ロングリーフパイン（ｌｏｎｇｌｅａｆ  ｐｉｎｅ  Ｐｉｎｕｓ  ｐａｌｕｓｔｒｕｓ）、エキナータパイン（ｓｈｏｒｔｌｅａｆ  ｐｉｎｅ  Ｐｉｎｕｓ  ｅｃｈｉｎａｔａ）、ポンデローサマツ（ｐｏｎｄｅｒｏｓａ  ｐｉｎｅ  Ｐｉｎｕｓ  ｐｏｎｄｅｒｏｓａ）、ジェフリーパイン（Ｊｅｆｆｒｅｙ  ｐｉｎｅ  Ｐｉｎｕｓ  ｊｅｆｆｒｅｙ）、レッドパイン（ｒｅｄ  ｐｉｎｅ  Ｐｉｎｕｓ  ｒｅｓｉｎｏｓａ）、ピッチパイン（ｐｉｔｃｈ  ｐｉｎｅ  Ｐｉｎｕｓ  ｒｉｇｉｄａ）、ジャックパイン（ｊａｃｋ  ｐｉｎｅ  Ｐｉｎｕｓ  ｂａｎｋｓｉａｎａ）、ポンドパイン（ｐｏｎｄ  ｐｉｎｅ  Ｐｉｎｕｓ  ｓｅｒｏｔｉｎａ）、イースタンホワイトパイン（  Ｅａｓｔｅｒｎ  ｗｈｉｔｅ  ｐｉｎｅ  Ｐｉｎｕｓ  ｓｔｒｏｂｕｓ）、ウェスタンホワイトパイン（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｗｈｉｔｅ  ｐｉｎｅ  Ｐｉｎｕｓ  ｍｏｎｔｉｃｏｌａ）、シュガーパイン（ｓｕｇａｒ  ｐｉｎｅ  Ｐｉｎｕｓ  ｌａｍｂｅｒｔｉａｎａ）、バージニアパイン（Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ｐｉｎｅ  Ｐｉｎｕｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）、ロッジポールパイン（ｌｏｄｇｅｐｏｌｅ  ｐｉｎｅ  Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ）、カリビアンパイン（Ｃａｒｉｂｂｅａｎ  ｐｉｎｅ  Ｐｉｎｕｓ  ｃａｒｉｂａｅａ）、Ｐ．ｐｉｎａｓｔｅｒ、カラブリアンパイン（Ｃａｌａｂｒｉａｎ  ｐｉｎｅ  Ｐ．  ｂｒｕｔｉａ）、アフガンパイン（Ａｆｇｈａｎ  ｐｉｎｅ  Ｐ．ｅｌｄａｒｉｃａ、コールターパイン（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ｐｉｎｅ  Ｐ．ｃｏｕｌｔｅｒｉ）、ヨーロピアンパイン（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｐｉｎｅ  Ｐ．  ｎｉｇｒａ）及びＰ．  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓと、ダグラスモミ（Ｄｏｕｇｌａｓ−ｆｉｒ  Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）と、ウェスタンヘムロック（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｈｅｍｌｏｃｋ  Ｔｓｕｇａ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）、イースタンヘムロック（Ｅａｓｔｅｒｎ  ｈｅｍｌｏｃｋ  Ｔｓｕｇａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、マウンテンヘムロック（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｈｅｍｌｏｃｋ  Ｔｓｕｇａ  ｍｅｒｔｅｎｓｉａｎａ）を含むツガと、ノルウェイスプルース（ｔｈｅ  Ｎｏｒｗａｙ  ｓｐｒｕｃｅ  Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ）、レッドスプルース（ｒｅｄ  ｓｐｒｕｃｅ  Ｐｉｃｅａ  ｒｕｂｅｎｓ）、ホワイトスプルース（ｗｈｉｔｅ  ｓｐｒｕｃｅ  Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ）、ブラックスプルース（ｂｌａｃｋ  ｓｐｒｕｃｅ  Ｐｉｃｅａ  ｍａｒｉａｎａ）、シトカスプルース（Ｓｉｔｋａ  ｓｐｒｕｃｅ  Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ）、エンゲルマンスプルース（Ｅｎｇｌｅｍａｎｎ  ｓｐｒｕｃｅ  Ｐｉｃｅａ  ｅｎｇｅｌｍａｎｎｉ）及びブルースルプールス（ｂｌｕｅ  ｓｐｒｕｃｅ  Ｐｉｃｅａ  ｐｕｎｇｅｎｓ）とを含むトウヒと、アメリカスギ（ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）と、アル���ンファー（ｔｈｅ  Ａｌｐｉｎｅ  ｆｉｒ  Ａｂｉｅｓ  ｌａｓｉｏｃａｒｐａ）、シルバーファー（ｓｉｌｖｅｒ  ｆｉｒ  Ａｂｉｅｓ  ａｍａｂｉｌｉｓ）、グランドファー（ｇｒａｎｄ  ｆｉｒ  Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ）、ノーベルファー（ｎｏｂｅｌ  ｆｉｒ  Ａｂｉｅｓ  ｐｒｏｃｅｒａ）、ホワイトファー（ｗｈｉｔｅ  ｆｉｒ  Ａｂｉｅｓ  ｃｏｎｃｏｌｏｒ）、カリフォルニアレッドファー（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ｒｅｄ  ｆｉｒ  Ａｂｉｅｓ  ｍａｇｎｉｆｉｃａ）及びバルサムモミ（ｂａｌｓａｍ  ｆｉｒ  Ａｂｉｅｓ  ｂａｌｓａｍｅａ）を含む真正のモミと、ウェスタンレッドシーダー（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｒｅｄ  ｃｅｄａｒ  Ｔｈｕｊａ  ｐｌｉｃａｔａ）、インセンスシーダー（ｉｎｃｅｎｓｅ  ｃｅｄａｒ  ｌｉｂｏｃｅｄｒｕｓ  ｄｅｃｕｒｒｅｎｓ）、ノザンホワイトシーダー（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  ｗｈｉｔｅ  ｃｅｄａｒ  Ｔｈｕｊａ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、ポートオーフォードシーダー（Ｐｏｒｔ  Ｏｒｆｏｒｄ  ｃｅｄａｒ  Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｌａｗｓｏｎｉｏｎａ）、アトランティックホワイトシーダー（ｔｈｅＡｔｌａｎｔｉｃ  ｗｈｉｔｅ  ｃｅｄａｒ  Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｔｈｙｏｉｄｅｓ）、アラスカスギ（Ａｌａｓｋａ  ｙｅｌｌｏｗ−ｃｅｄａｒ  Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ）及びイースタンレッドシーダー（Ｅａｓｔｅｒｎ  ｒｅｄ  ｃｅｄａｒ  Ｈｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ）を含むシーダーと、イースタンラーチ（Ｅａｓｔｅｒｎ  ｌａｒｃｈ  Ｌａｒｉｘ  ｌａｒｉｃｉｎａ）、ウェスタンラーチ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｌａｒｃｈ  Ｌａｒｉｘ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、ユーロピアンラーチ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｌａｒｃｈ  Ｌａｒｉｘ  ｄｅｃｉｄｕａ）、ニホンカラマツ（Ｊａｐａｎｅｓｅ  ｌａｒｃｈ  Ｌａｒｉｘ  ｌｅｐｔｏｌｅｐｉｓ）及びシベリアラーチ（Ｓｉｂｅｒｉａｎ  ｌａｒｃｈ  Ｌａｒｉｘ  ｓｉｂｅｒｉｃａ）を含むカラマツと、ラクウショウ（ｂaｌｄ  ｃｙｐｒｅｓｓ  Ｔａｘｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ）とセカイヤオスギ（Ｇｉａｎｔ  ｓｅｑｕｏｉａ  Ｓｅｑｕｏｉａ  ｇｉｇａｎｔｅａ）との裸子植物と、例として、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ａｌｂａ、Ｅ．  ｂａｎｃｒｏｆｔｉｉ、Ｅ．  ｂｏｔｙｒｏｉｄｅｓ、Ｅ．  ｂｒｉｄｇｅｓｉａｎａ、Ｅ．  ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ、Ｅ．  ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ、Ｅ．  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ、Ｅ．  ｃｌａｄｏｃａｌｙｘ、Ｅ．  ｃｏｃｃｉｆｅｒａ、Ｅ．  ｃｕｒｔｉｓｉｉ、Ｅ．  ｄａｌｒｙｍｐｌｅａｎａ、Ｅ．  ｄｅｇｌｕｐｔａ、Ｅ．  ｄｅｌａｇａｔｅｎｓｉｓ、Ｅ．  ｄｉｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｅ．  ｄｕｎｎｉｉ、Ｅ．  ｆｉｃｉｆｏｌｉａ、Ｅ．  ｇｌｏｂｕｌｕｓ、Ｅ．  ｇｏｍｐｈｏｃｅｐｈａｌａ、Ｅ．  ｇｕｎｎｉｉ、Ｅ．  ｈｅｎｒｙｉ、Ｅ．  ｌａｅｖｏｐｉｎｅａ、Ｅ．  ｍａｃａｒｔｈｕｒｉｉ、Ｅ．  ｍａｃｒｏｒｈｙｎｃｈａ、Ｅ．  ｍａｃｕｌａｔａ、Ｅ．  ｍａｒｇｉｎａｔａ、Ｅ．  ｍｅｇａｃａｒｐａ、Ｅ．  ｍｅｌｌｉｏｄｏｒａ、Ｅ．  ｎｉｃｈｏｌｉｉ、Ｅ．  ｎｉｔｅｎｓ、Ｅ．  ｎｏｖａ−ａｎｇｅｌｉｃａ、Ｅ．  ｏｂｌｉｑｕａ、Ｅ．  ｏｂｔｕｓｉｆｌｏｒａ、Ｅ．  ｏｒｅａ���ｅｓ、Ｅ．  ｐａｕｃｉｆｌｏｒａ、Ｅ．  ｐｏｌｙｂｒａｃｔｅａ、Ｅ．  ｒｅｇｎａｎｓ、Ｅ．  ｒｅｓｉｎｉｆｅｒａ、Ｅ．  ｒｏｂｕｓｔａ、Ｅ．  ｒｕｄｉｓ、Ｅ．  ｓａｌｉｇｎａ、Ｅ．  ｓｉｄｅｒｏｘｙｌｏｎ、Ｅ．  ｓｔｕａｒｔｉａｎａ、Ｅ．  ｔｅｒｅｔｉｃｏｒｎｉｓ、Ｅ．  ｔｏｒｅｌｌｉａｎａ、Ｅ．  ｕｒｎｉｇｅｒａ、Ｅ．  ｕｒｏｐｈｙｌｌａ、Ｅ．  ｖｉｍｉｎａｌｉｓ、Ｅ．  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｅ．  ｗａｎｄｏｏ  ａｎｄ  Ｅ．  ｙｏｕｍａｎｎｉとの被子植物とが含まれる。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドは、代替策として、例えば、５０個以上の核酸のオリゴヌクレオチド断片を得るために、自動オリゴヌクレオチド合成機（例としてベックマン社オリゴ１０００ＭＤＮＡシンセサイザー）を使用して合成してもよい。複数のかかるポリヌクレオチド断片は、分子生物学の分野で周知の標準的なＤＮＡ操作技術を用いて結合することができる。１つの通常の代表的なポリヌクレオチド合成技術は、例えば８０個の核酸を有する１本鎖ポリヌクレオチド断片の合成と、該断片の相補的な８５個の核酸断片との雑種形成により５ヌクレオチドのオーバーハングを作り出すことである。次の断片も同様の手法で反対側の鎖に５ヌクレオチドのオーバーハングを持つように合成される。この「粘着」末端が、前記の２つの部分が雑種形成したときに適当な結合を確保する。このようにして、本発明の完全なポリヌクレオチドが、全て試験管内で合成できる。
【００５９】
配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番として同定されたポリヌクレオチドは、「部分」配列かもしれないし、完全長配列かもしれない。部分配列は、自然界に存在するポリペプチドをエンコードする遺伝子の完全なコーディング部分を表すものではない。ここで開示された部分ポリヌクレオチド配列は、例えば本発明のポリヌクレオチドにもとづいた雑種形成用プローブを用いたＤＮＡ発現ライブラリのスクリーニングにより又は本発明のポリヌクレオチドにもとづくプライマーでのＰＣＲ増殖により、様々な種と生物の対応する完全長遺伝子を得るために用いることができる。このようにして、本発明の分野で周知の方法を用いて、本発明のポリヌクレオチドを、これに対応するｍＲＮＡの上流及び下流に拡張し、プロモーター及びエンハンサー領域を含めた、完全な遺伝子に対応する、ゲノムＤＮＡを同定することが可能である。
【００６０】
本発明には、完全長遺伝子を含めて、機能性のあるポリペプチドをエンコードする、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番中に同定された配列又は特定された配列の１つの変異体を含む単離されたポリヌクレオチドを含む。かかる拡張されたポリヌクレオチドは約５０個ないし約４、０００個の核酸又は塩基対の長さを有するものであってもよいが、約４、０００個以下の核酸又は塩基対の長さを有するのが好ましく、約３、０００個の核酸又は塩基対の長さを有するのがより好ましく、約２、０００個の核酸又は塩基対の長さを有するのがさらに好ましい。ある状況の下では、本発明の拡張ポリヌクレオチドは、約１、８００個未満の核酸又は塩基対を有するものでもよいが、約１、６００個未満の核酸又は塩基対を有するのが好ましく、約１、４００個未満の核酸又は塩基対を有するのがより好ましく、約１、２００個未満の核酸又は塩基対を有するのがさらに好ましく、約１、０００個未満の核酸又は塩基対を有するのが最も好ましい。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチドは、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番として同定されたポリヌクレオチド又はそれらの変異体のいずれかの、少なくとも特定の数の連続した残基を含むポリヌクレオチド（ｘ−マー）を含むポリヌクレオチドを含む。好ましい実施態様によると、ｘの値は２０以上が好ましく、４０以上がより好ましく、６０以上がさらに好ましく、８０以上が最も好ましい。よって、本発明のポリヌクレオチドは、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番として同定されたポリヌクレオチドの２０マー、４０マー、６０マー、８０マー、１００マー、１２０マー、１５０マー、１８０マー、２２０マー、２５０マー又は３００マー、４００マー、５００マー又は６００マー又はいずれかのｘマーの変異体を含むポリヌクレオチドを含む。
【００６２】
配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番及びこれらの配列に相補的な及び／又は対応するポリヌクレオチドプローブ及びプライマーも、本発明に含まれる。かかるオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーは、関心のあるポリヌクレオチドに十分な相補性がある。オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーが、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番として提示された配列の１つ又は変異体を含む、本発明のポリヌクレオチドに、「対応」すると記述されるのは、該オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマー、あるいはその相補体が、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番として提示された配列の１つか、又は特定された配列の１つの変異体かに含まれるときである。
【００６３】
２つの１本鎖配列が十分に相補的であると言えるのは、最適なアライメントをとって比較すると、適当なヌクレオチド挿入及び／又は欠失を有する一方の鎖のヌクレオチドが、相手方の鎖のヌクレオチドの８０％以上、好ましくは９０％ないし９５％以上、そしてより好ましくは９８％ないし１００％以上対合するときである。代替策として、十分な相補性が存在するのは、第１のＤＮＡ鎖が、第２のＤＮＡ鎖と、ストリンジェントな雑種形成条件下で選択的に雑種形成するときである。相補性を決定するためのストリンジェントな雑種形成条件は、塩類の条件が約１Ｍ未満で、より通常的なのは約５００ｍＭ未満で、好ましくは約２００ｍＭ未満である。雑種形成の温度は、５°Ｃでもよいが、一般的には約２２°Ｃ以上で、より好ましいのは約３０°Ｃ以上で、最も好ましいのは約３７°Ｃ以上である。長いＤＮＡ断片ほど、特異的な雑種形成には高い雑種形成温度が必要である。雑種形成のストリンジェントさは、プローブ組成、有機溶媒の存在及び塩基のミスマッチングの程度のような他の要因の影響を受けるため、パラメーターの組み合わせが、どれか１つのパラメーターだけの絶対的な基準よりも重要である。植物又はサンプル又は植物材料を含む生産物由来のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡか、又はサンプル中に存在するＲＮＡ由来のｃＤＮＡを調製することにより得られたＤＮＡかのどちらかである。
【００６４】
ＤＮＡ―ＤＮＡ雑種形成に加えて、ＤＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＲＮＡ雑種形成検定法も可能である。第１の場合では、発現した遺伝子由来のｍＲＮＡがゲノムＤＮＡ又はサンプルのｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡの代わりに検出される。第２の場合では、ＲＮＡプローブが用いられる。さらに、標的配列と特異的に雑種形成するＤＮＡの人工類似体も用いられる。
【００６５】
特定の実施態様では、オリゴヌクレオチドプローブ及び／又はプライマーは、本発明のポリヌクレオチド配列に相補的な、約６個以上の連続した残基を含み、より好ましくは約１０個以上の連続した残基を含み、最も好ましくは約２０個以上の連続した残基を含む。本発明のプローブ及びプライマーは８個から１００個までの塩基対の長さであってもよいが、約１０個から５０個の塩基対の長さが好ましく、約１５個から４０個の長さがより好ましい。ＤＮＡ−ＤＮＡ雑種形成のストリンジェントさと、アニーリング及び融解の温度と、ループ形成の可能性と、本発明の分野で周知のその他の要因とを考慮して、本発明の分野で周知の手順を用いて容易に選択できる。プローブの設計に適した、そして特にＰＣＲプライマーの設計に適したツール及びソフトウェアは、インターネット上で、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｏｒｉｚｏｎｐｒｅｓｓ．ｃｏｍ／ｐｃｒ／で入手可能である。ＰＣＲプライマーの設計のための好ましい技術は、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ＣＷとＤｖｋｓｌｅｒ  ＧＳ、ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒ、  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９９５にも開示されている。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチドに対応する複数のオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーは、キットの形で提供されるかもしれない。かかるキットは、一般的には複数のＤＮＡ又はオリゴヌクレオチドプローブを含み、それぞれのプローブは、あるポリヌクレオチド配列に特異的である。本発明のキットは、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番に同定されたポリヌクレオチド配列を含む、本発明のポリヌクレオチドに対応する１以上のプローブ又はプライマーを含む。
【００６７】
高スループット検定法に有用な１の実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドプローブキットは、各プローブが固体の表面上に予め定められた空間で番地で位置を指示できるように不動化された、アレイ状のフォーマットの複数のプローブを含む。本発明で有効に用いられるアレイ状フォーマットは、例えば米国特許明細書第５、４１２、０８７、５、５４５、５３１号及び国際公開パンフレット第ＷＯ  ９５／００５３０号に開示されており、その開示内容は、ここでは引用文献として取り込まれている。
【００６８】
高スループットスクリーニングの意義は、多数の種子のロット及び植物幼苗を同定し、望ましくない植物材料がないかどうかサンプル又は製品を検査したり、検疫の目的等のために植物又はサンプル又は植物材料を含む生産物を同定したり、又は植物又はサンプル又は植物材料を含む生産物の真の出所を確かめたりといった、植物育種及び品質管理のような応用には明らかである。植物にタグを付ける識別子として用いられた本発明のポリヌクレオチドの存在又は非存在のスクリーニングは、植物育種での遺伝子の流動量、花粉の飛散による遺伝子の移入、その他を今後検出する上で価値がある。
【００６９】
この手法で、本発明のオリゴヌクレオチドプローブキットは、異なるサンプル中又は異なる材料を含む生産物中の本発明のポリヌクレオチドの存在の有無（又は混合物の場合には相対的な量）を、迅速かつ費用効果よく検査するために用いることができる。本発明を利用して検査できる植物種の例には、マツ及びユーカリの種のような林産種と、その他の木本種と、作物及び飼料用植物を含む農業用植物と、園芸用植物とを含む。
【００７０】
本発明の別の局面は、本発明のポリヌクレオチドのコレクションに関する。本発明のポリヌクレオチドのコレクション、特に配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番として同定されたポリヌクレオチド及びこれらの変異体及びｘ−マーは、記録され及び／又は記録媒体上で保管され、後に解析、比較等の目的のためにアクセスされてもよい。適当な記録媒体には、磁気ディスケット、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ記録媒体、光学記録媒体等が含まれる。適当な記録媒体と、情報の記録及び保管及びかかる媒体上に記録されたポリヌクレオチド配列のような情報のアクセスの方法とは、本発明の分野で周知である。前記記録媒体上に保管されたポリヌクレオチド情報は、コンピューターで読めることが好ましく、ポリヌクレオチド情報の解析及び比較に使用できる。
【００７１】
したがって、本発明の別の局面は、本発明のポリヌクレオチドのコレクションが、特に配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番として同定されたポリヌクレオチドと、これらの変異体と、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番のポリヌクレオチドのｘ−マーと、拡張配列と、配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番のポリヌクレオチドを含むか又は対応するプローブ及びプライマーとのコレクションが記録された、記録媒体に関する。１の実施態様によると、前記記録媒体は、２０個以上の、好ましくは５０個以上の、より好ましくは１００個以上の、最も好ましくは２００個以上の、本発明のポリヌクレオチド、すなわち、好ましくは配列識別番号第１ないし２６６番及び第３５０ないし３７５番として同定されたポリヌクレオチド又はこれらのポリヌクレオチドの変異体を含む。
【００７２】
別の局面では、本発明は、５’から３’の方向に、遺伝子プロモーター配列と、本発明のポリヌクレオチドにエンコードされたポリペプチドの少なくとも機能性のある部分をコードするオープン・リーディング・フレームと、遺伝子ターミネーション配列とを含む及びコンストラクトを提供する。ここで使用されるところの、酵素の「機能性を有する部分」とは、代謝段階に影響を与える必須の活性部位、すなわち、１以上の反応物と結合可能か又は反応速度を改善又は制御可能な分子の部分をいう。活性部位は、１以上のペプチド鎖上に存在する離れた部分から構築されるものでもよいが、一般には高い基質特異性を示す。ここで使用されるところの「ヌクレオチド配列にエンコードされた酵素」という用語には、前記部分的に単離された本発明のヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列にエンコードされた酵素を含む。
【００７３】
オープン・リーディング・フレームはセンス方向かアンチセンス方向のいずれに配置されていてもよい。リグニン合成の増幅が望ましい応用のためには、コンストラクトの標的生物への形質転換により、遺伝子コピー数の増加、さらには酵素量の増加が生じるように、オープン・リーディング・フレームはセンス方向でコンストラクトに挿入するとよい。リグニン合成のダウンレギュレーションが望ましいときは、ポリヌクレオチドの転写により産生されるＲＮＡが内在するｍＲＮＡに相補的になるように、オープン・リーディング・フレームはアンチセンス方向でコンストラクトに挿入するとよい。これが、遺伝子コピー数の減少、ひいては酵素量の減少をもたらす。代替策として、調節は、リボザイムコンストラクトに適当な配列またはサブ配列（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を挿入することにより達成されてもよい。
【００７４】
上記ＤＮＡ配列にエンコードされた酵素をコードする遺伝子のノンコーディング領域又はノンコーディング領域に相補的なヌクレオチド配列を遺伝子プロモーター配列及び遺伝子ターミネーション配列とともに含む遺伝子コンストラクトも提供される。ここで使用されるところの「ノンコーディング領域」には、翻訳されないが転写される配列と翻訳された配列又はオープン・リーディング・フレームの５’又は３’側約２０００ｂｐ以内の転写されない配列との両方を含む。本発明のコンストラクトに有効に利用されうるノンコーディング領域の例にはイントロン及び５’ノンコーディングリーダー配列が含まれる。かかるＤＮＡコンストラクトによる標的植物の形質転換は、例えばＮａｐｏｌｉら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２、２７９−２９０、１９９０；及びｄｅ Ｃａｒｖａｌｈｏ Ｎｉｅｂｅｌら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７、３４７−３５８、１９９５によって論じられたのと同様の手法の、コサプレッションのプロセスによる、植物の合成するリグニン量の減少をもたらすことができる。
【００７５】
本発明の遺伝子コンストラクトは、さらに、転写されるべきポリヌクレオチドに操作可能に結合させて、遺伝子プロモーター配列及び遺伝子ターミネーション配列を含み、遺伝子発現を制御する。遺伝子プロモーター配列は一般的には転写されるポリヌクレオチドの５’末端に位置して、該ポリヌクレオチドの転写の開始に用いられる。遺伝子プロモーター配列は一般的には遺伝子の５’ノンコーディング領域にあるが、イントロン内に存在することもあり（Ｌｕｅｈｒｓｅｎ  ＫＲ、Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．２２５、８１−９３、１９９１）、例えばトマトのＰＡＬのように（Ｂｌｏｋｓｂｅｒｇ、Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ  Ａｍｍｏｎｉａ  Ｌｙａｓｅ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ、学位請求論文、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｄａｖｉｓ、１９９１、大学マイクロフィルム国際請求番号９２１７５６４）、コーディング領域に存在することもある。コンストラクトがセンス方向にオープン・リーディング・フレームを含むときは、遺伝子プロモーター配列はオープン・リーディング・フレームの翻訳も開始する。アンチセンス方向のオープン・リーディング・フレーム又はノンコーディング領域を含むＤＮＡコンストラクトでは、遺伝子プロモーター配列はＲＮＡポリメラーゼ結合部位を有する転写開始点のみからなる。
【００７６】
本発明のＤＮＡコンストラクトに有効に利用できる様々な遺伝子プロモーター配列は本発明の分野で周知である。遺伝子プロモーター配列及び遺伝子ターミネーション配列は、標的植物宿主に内在するものでもよく、該標的宿主内で機能性を有するときは、外来のものでもよい。例えば、プロモーター及びターミネーション配列は他の植物種、植物ウィルス、最近プラスミドその他これらに類するものからのものでもよい。遺伝子プロモーター及びターミネーション配列は本発明の配列自体からのものであることが好ましい。
【００７７】
プロモーターの選択に影響を与える要因には、コンストラクトの望ましい組織特異性及び転写と翻訳のタイミングが含まれる。例えば、３５Ｓカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ３５Ｓ）プロモーターのような構成的なプロモーターは、植物の全ての部分での酵素活性に影響を与える。組織特異的なプロモーターを使うことは、関心のある組織においてのみ望みのセンス又はアンチセンスＲＮＡを産生することになる。誘導可能な遺伝子プロモーター配列を用いるＤＮＡコンストラクトでは、ＲＮＡポリメラーゼ結合及び転写開始の速度は、光、嫌気性ストレス、栄養条件の変化等のような外界の刺激により変動させられる。時間的に調節されたプロモーターは、形質転換細胞の発生の特定の時にＲＮＡポリメラーゼ結合及び転写開始の速度の変動に影響を与えるために用いられる。問題の酵素遺伝子由来の本来のプロモーター又は、ユーカリ又はマツのような、形質転換される生物の特定の組織にだけ発現する遺伝子由来のプロモーターを使うのが好ましい。本発明に有効に利用できる遺伝子プロモーターの他の例には、マンノピンシンターゼ（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ｍａｓ）、オクトピンシンターゼ（ｏｃｔｏｐｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ、ｏｃｓ）及びＣｈｕａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４、１７４１８１、１９８９に総説されたものが含まれる。
【００７８】
転写されるポリヌクレオチドの３’側に位置する遺伝子ターミネーション配列は、遺伝子プロモーター配列と同じ遺伝子由来のものでもよく、異なる遺伝子由来のものでもよい。アグロバクテリウム・ツメファシエンスのノパリンシンターゼ遺伝子の３’末端のような、本発明の分野で周知の多くの遺伝子ターミネーション配列が本発明に有効に利用できる。しかし、好ましい遺伝子ターミネーター配列は、本来の酵素遺伝子又は形質転換される標的の種に由来するものである。
【００７９】
本発明の遺伝子コンストラクトは、また、本発明のコンストラクトを含む形質転換細胞の検出ができるように、植物細胞で有効な選択マーカーも含むことがある。かかるマーカーは、本発明の分野で周知で、典型的には、１以上の毒素の耐性を有する。かかるマーカーの一例は、その発現により、中程度の濃度で植物細胞に通常は毒性のある、カナマイシン又はハイグロマイシン耐性をもたらすＮＰＴＩＩ遺伝子である（Ｒｏｇｅｒｓら、ｉｎ  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  Ａ  ａｎｄＨ、ｅｄｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、１９８８）。代替策として、形質転換細胞中に希望のコンストラクトが存在することは、サザン及びウェスタンブロット法のような本発明の分野に周知の他の技術によって決定することができる。
【００８０】
本発明の遺伝子コンストラクトの部材を操作可能に結合させるための技術は本発明の分野で周知であり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ、  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９）に記載された、１以上の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーの利用を含む。本発明のＤＮＡコンストラクトは、例えば、各操作毎の後に出来上がったコンストラクトをクローン化して、配列決定され、操作の正確さを決定することが可能な、大腸菌のような１以上の複製システムを有するベクターと連結されてもよい。
【００８１】
本発明の遺伝子コンストラクトは、単子葉類（例、牧草、トウモロコシ、穀類、カラスムギ、コムギ、オオムギ）や、双子葉類（例、シロイヌナズナ、タバコ、マメ科植物、アルファルファ、オーク、ユーカリ属、カエデ）、及び裸子植物（例、オウシュウアカマツ（Ａｒｏｎｅｎ、Ｆｉｎｎｉｓｈ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｒｅｓ．  Ｐａｐｅｒｓ、Ｖｏｌ．  ５９５、１９９６参照）、ホワイトスプルース（Ｅｌｌｉｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１、８４−８９、１９９３）、及びカラマツ（Ｈｕａｎｇら、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  ２７、２０１−２０７、１９９１）を含む様々な植物の形質転換に使われるであろう。好ましい実施態様においては、遺伝子コンストラクトは、その茎が複数年生存して木材組織の追加により毎年直径が増大するような樹木又は潅木とここでは定義される、「木本植物」の形質転換に用いられる。標的植物は、好ましくはユーカリ属及びマツ属の種を含むグループから、最も好ましくはＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ及びＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａを含むグループから、選択される。上に説明した通り、本発明のポリヌクレオチドによりエンコードされた酵素をコードするオープン・リーディング・フレームを含む、該オープン・リーディング・フレームがセンス方向に配置された遺伝子コンストラクトで、植物を形質転換することは、該植物のリグニン量の改変をもたらす。アンチセンス方向に配置されたオープン・リーディング・フレーム又は遺伝子のノンコーディング（非翻訳）領域を含む遺伝子コンストラクトで、植物を形質転換することも、形質転換された植物のリグニン量の改変をもたらす。
【００８２】
標的細胞中のＲＮＡ産生は、プロモーター配列の選択により、又は標的生物のゲノムに取り込まれたポリヌクレオチドの、機能性を有するコピー数又はインテグレーション部位の選択により、コントロールされることがある。
標的植物は、１以上の本発明のコンストラクトで形質転換され、１以上の酵素の活性によりリグニン生合成経路を改変され、１以上の組織での酵素活性に影響を与えられ、又は１以上の発現時での酵素活性に影響を与えられてもよい。同様に、コンストラクトは、本発明のポリヌクレオチドにエンコードされた酵素をコードする、１以上のオープン・リーディング・フレームを含むように、又はかかる酵素をコードする遺伝子の１以上のノンコーディング領域を含むように、構築されてもよい。本発明のポリヌクレオチドは、また、リグニン生合成経路に関与する酵素をエンコードする他の既知の配列との組み合わせで用いてもよい。このようにして、リグニン生合成経路を非木本植物に付加して、新規な木本植物を作出することも可能である。
【００８３】
遺伝子コンストラクトを標的植物のゲノムに安定的に取り込むための技術は周知であり、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介した導入法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト融合法、生殖器官注入法、未熟胚注入法、高速発射体導入法（ｈｉｇｈ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）、その他これらに類するものが含まれる。技術の選択は、形質転換される標的植物に依存する。例えば、双子葉類植物及びいくつかの単子葉類及び裸子植物は、例えばＢｅｖａｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２、８７１１−８７２１、１９８４）により記載されたように、アグロバクテリウムＴｉプラスミド技術によって形質転換できる。本発明の遺伝子コンストラクトの導入の標的には、葉組織のような組織、散布された細胞、プロトプラスト、種子、胚、成長点領域、子葉、胚軸およびこれらに類するものが含まれる。ユーカリ及びマツを形質転換する１つの好ましい方法は、花粉又は容易に再生可能な胚組織を用いるバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）な方法（例えば、Ａｒｏｎｅｎ、Ｆｉｎｎｉｓｈ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｒｅｓ．  Ｐａｐｅｒｓ、Ｖｏｌ．  ５９５、５３、１９９６を参照）である。本発明の方法に有効に利用できそうなその他の形質転換技術には、Ｅｌｌｉｓら（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、８、１６−２０、１９８９）、Ｗｉｌｓｏｎら（Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ７、７０４−７０７、１９８９）及びＴａｕｔｏｒｕｓら（Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  ７８、５３１−５３６、１９８９）により教示されたものが含まれる。
【００８４】
細胞が形質転換されると、ゲノムに取り込まれた本発明のＤＮＡコンストラクトを有する細胞は、上で説明したカナマイシン耐性マーカーのようなマーカーにより選択できる。トランスジェニックな細胞は、本発明の分野で周知の技術を用いて、植物全体を再生するための適当な培地中で培養される。種子又は胚の場合には、適当な発芽又はカルス誘導培地が用いられる。外植体については適当な再生培地が用いられる。植物の再生は、多くの種について十分に確立している。林木の再生の総説としては、Ｄｕｎｓｔａｎら、“Ｓｏｍａｔｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｗｏｏｄｙ  ｐｌａｎｔｓ、”  ｉｎ  Ｔｈｏｒｐｅ  ＴＡ、ｅｄ．、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｌａｎｔｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ２０（１２）、４７１−５４０、１９９５を参照のこと。得られた形質転換植物は、本発明の分野で周知の技術を用いて、次世代以降のトランスジェニック植物を得るために、有性的又は無性的な生殖で増やされることもある。
【００８５】
さらなる局面では、本発明は宿主生物におけるポリペプチドのレベル（濃度）又は活性を改変する方法であって、本発明のポリヌクレオチドを含むコンストラクトを植物ゲノムに安定的に取り込むことを含む方法を提供する。本発明のＮＡ遺伝子コンストラクトは、様々な生物を形質転換するのみ用いることができる。かかる生物には、単子葉類被子植物（例、牧草、トウモロコシ、穀類、カラスムギ、コムギ、オオムギ）、双子葉類被子植物（例、シロイヌナズナ、タバコ、マメ科植物、アルファルファ、オーク、ユーカリ属、カエデ）及び裸子植物（例、オウシュウアカマツ（Ａｒｏｎｅｎ、Ｆｉｎｎｉｓｈ  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｒｅｓ．  Ｐａｐｅｒｓ、Ｖｏｌ．  ５９５、１９９６参照）、ホワイトスプルース（Ｅｌｌｉｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１、８４−８９、１９９３）及びカラマツ（Ｈｕａｎｇら、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  ２７、２０１−２０７、１９９１）が含まれる。
【００８６】
好ましい実施態様では、本発明の遺伝子コンストラクトは、その茎が複数年生存して木材組織の追加により毎年直径が増大するような、樹木又は潅木とここでは定義される、「木本植物」の形質転換に用いられる。標的植物は、好ましくはユーカリ属及びマツ属の種を含むグループから、最も好ましくはＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ及びＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａを含むグループから、選択されるが、以下のリストのいずれの種をも含む。
【００８７】
マツ、Ｐｉｎｕｓ  ｂａｎｋｓｉａｎａ、Ｐｉｎｕｓ  ｂｒｕｔｉａ、Ｐｉｎｕｓ  ｃａｒｉｂａｅａ、Ｐｉｎｕｓ  ｃｌａｕｓａ、Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｎｔｏｒｔａ、Ｐｉｎｕｓ  ｃｏｕｌｔｅｒｉ、Ｐｉｎｕｓ  ｅｃｈｉｎａｔａ、Ｐｉｎｕｓ  ｅｌｄａｒｉｃａ、Ｐｉｎｕｓ  ｅｌｌｉｏｔｉ、Ｐｉｎｕｓ  ｊｅｆｆｒｅｙｉ、Ｐｉｎｕｓ  ｌａｍｂｅｒｔｉａｎａ、Ｐｉｎｕｓ  ｍｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｐｉｎｕｓ  ｎｉｇｒａ、Ｐｉｎｕｓ  ｐａｌｕｓｔｒｕｓ、Ｐｉｎｕｓ  ｐｉｎａｓｔｅｒ、Ｐｉｎｕｓ  ｐｏｎｄｅｒｏｓａ、Ｐｉｎｕｓ  ｒｅｓｉｎｏｓａ、Ｐｉｎｕｓ  ｒｉｇｉｄａ、Ｐｉｎｕｓ  ｓｅｒｏｔｉｎａ、Ｐｉｎｕｓ  ｓｔｒｏｂｕｓ、Ｐｉｎｕｓ  ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｐｉｎｕｓ  ｔａｅｄａ、Ｐｉｎｕｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ及び上記のいずれかの種の雑種。
【００８８】
他の裸子植物、Ａｂｉｅｓ  ａｍａｂｉｌｉｓ、Ａｂｉｅｓ  ｂａｌｓａｍｅａ、Ａｂｉｅｓ  ｃｏｎｃｏｌｏｒ、Ａｂｉｅｓ  ｇｒａｎｄｉｓ、Ａｂｉｅｓ  ｌａｓｉｏｃａｒｐａ、Ａｂｉｅｓ  ｍａｇｎｉｆｉｃａ、Ａｂｉｅｓ  ｐｒｏｃｅｒａ、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｌａｗｓｏｎｉｏｎａ、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ、Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ  ｔｈｙｏｉｄｅｓ、Ｈｕｎｉｐｅｒｕｓ  ｖｉｒｇｉｎｉａｎａ、Ｌａｒｉｘ  ｄｅｃｉｄｕａ、Ｌａｒｉｘ  ｌａｒｉｃｉｎａ、Ｌａｒｉｘ  ｌｅｐｔｏｌｅｐｉｓ、Ｌａｒｉｘ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｌａｒｉｘ  ｓｉｂｅｒｉｃａ、Ｌｉｂｏｃｅｄｒｕｓ  ｄｅｃｕｒｒｅｎｓ、Ｐｉｃｅａ  ａｂｉｅｓ、Ｐｉｃｅａ  ｅｎｇｅｌｍａｎｎｉ、Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ、Ｐｉｃｅａ  ｍａｒｉａｎａ、Ｐｉｃｅａ  ｐｕｎｇｅｎｓ、Ｐｉｃｅａ  ｒｕｂｅｎｓ、Ｐｉｃｅａ  ｓｉｔｃｈｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ、Ｓｅｑｕｏｉａ  ｇｉｇａｎｔｅａ、Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ、Ｔａｘｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ、Ｔｓｕｇａ  ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｔｓｕｇａ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ、Ｔｓｕｇａ  ｍｅｒｔｅｎｓｉａｎａ、Ｔｈｕｊａ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ、Ｔｈｕｊａ  ｐｌｉｃａｔａ及び上記のいずれかの種の雑種。
【００８９】
ユーカリ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ａｌｂａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｂｏｔｙｒｏｉｄｅｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｂｒｉｄｇｅｓｉａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃａｌｏｐｈｙｌｌａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃｉｔｒｉｏｄｏｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃｌａｄｏｃａｌｙｘ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃｏｃｃｉｆｅｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｃｕｒｔｉｓｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｄａｌｒｙｍｐｌｅａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｄｅｇｌｕｐｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｄｅｌａｇａｔｅｎｓｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｄｉｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｄｕｎｎｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｆｉｃｉｆｏｌｉａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｌｏｂｕｌｕｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｏｍｐｈｏｃｅｐｈａｌａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｕｎｎｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｈｅｎｒｙｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｌａｅｖｏｐｉｎｅａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｍａｃａｒｔｈｕｒｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｍａｃｒｏｒｈｙｎｃｈａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｍａｃｕｌａｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｍａｒｇｉｎａｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｍｅｇａｃａｒｐａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｍｅｌｌｉｏｄｏｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｎｉｃｈｏｌｉｉ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｎｉｔｅｎｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｎｏｖａ−ａｎｇｌｉｃａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｏｂｌｉｑｕａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｏｂｔｕｓｉｆｌｏｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｏｒｅａｄｅｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｐａｕｃｉｆｌｏｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｐｏｌｙｂｒａｃｔｅａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｒｅｇｎａｎｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｒｅｓｉｎｉｆｅｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｒｏｂｕｓｔａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｒｕｄｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓａｌｉｇｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｉｄｅｒｏｘｙｌｏｎ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｓｔｕａｒｔｉａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｔｅｒｅｔｉｃｏｒｎｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｔｏｒｅｌｌｉａｎａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｕｒｎｉｇｅｒａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｕｒｏｐｈｙｌｌａ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｖｉｍｉｎａｌｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｗａｎｄｏｏ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｙｏｕｍａｎｎｉ、及び上記のいずれかの種の雑種。
【００９０】
さらに、本発明のポリヌクレオチドには、生物、特に植物の非破壊的なタグとして用いる特別な用途がある。しかし、商業的に価値のある、動物、魚、細菌及び酵母を含む、他の生物に本発明のポリヌクレオチドでタグをつけてもよい。本発明のポリヌクレオチドを含むコンストラクトを、異種の、機能のない、非破壊的なタグとして、生物に安定的に導入してもよい。そして、後日、材料のサンプル中に当該タグが存在するか否かを決定することによって、当該生物の起源または出所を同定することが可能である。
【００９１】
タグの検出は、様々な通常の技術を用いて達成でき、一般的には核酸プローブの使用を伴う。プローブの存在を検定する際の感度は、Ｈｏｒｎ  Ｔ、Ｃｈａｎｇ  ＣＡ及びＵｒｄｅａ  ＭＳ、“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  （ｂＤＮＡ）  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ｓｉｇｎａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ、”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５（２３）、４８４２−４８４９、１９９７）に記載の通り、分岐型（ｂｒａｎｃｈｅｄ）オリゴヌクレオチドを用いることにより、有効に増大させることができ、サンプル中のたった５０個のＤＮＡ分子でも検出可能になる。
【００９２】
以下の実施例は、例示として提供されるものであり、限定として提供されるものではない。
【００９３】
実施例１
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ由来のｃＤＮＡクローンの単離と解析
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓの２つのｃＤＮＡ発現ライブラリ（１本の木の様々な組織の混合由来のものと、１本の木の葉由来のもの）が、以下の通り、構築されスクリーニングされた。
【００９４】
ｍＲＮＡは、Ｃｈａｎｇら（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  １１、１１３−１１６、１９９３）のプロトコールに少し修正を加えたものを用いて植物組織から抽出された。具体的には、サンプルは、ＣＰＣ−ＲＮＡＸＢ（１００  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ  ８、０、２５  ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．０  Ｍ  ＮａＣｌ、２％  ＣＴＡＢ、２％  ＰＶＰ及び０．０５％  スペルミジン３塩酸塩）に溶解し、クロロフォルム：イソアミルアルコールが２４：１の混合液で抽出された。ｍＲＮＡはエタノールで沈殿され、全ＲＮＡ調製物は、ポリ（Ａ）クイックｍＲＮＡアイソレーションキット（ストラタジーン、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて精製された。ｃＤＮＡ発現ライブラリは、前記精製ｍＲＮＡから、逆転写酵素合成の後、製造者のプロトコールに従い、ＺＡＰエキスプレスｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン）を用いて、ｃＤＮＡクローンをラムダＺＡＰへ挿入して構築された。得られたｃＤＮＡは、５μｌのライゲーションミックスに１μｌのサンプルＤＮＡを用いて、ギガパックＩＩパッケージングエキストラクト（ストラタジーン）でパッケージングをした。ライブラリの大量切り出し（ｍａｓｓ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ）は、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ細胞及びＸＬＯＬＲ細胞（ストラタジーン）をＥｘＡｓｓｉｓｔヘルパーファージ（ストラタジーン）とともに用いて行われた。切り出されたファージミドは、ＮＺＹブロス（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で希釈され、Ｘ−ｇａｌ及びイソプロピルチオ−ベータ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＬＢ−カナマイシン寒天プレート上に播かれた。
【００９５】
プレートに播かれてＤＮＡミニプレップ用に釣り上げられたコロニーのうち９９％は、配列決定に適したインサートを含んでいた。陽性クローンはカナマイシン入りのＮＺＹブロス中で培養され、ｃＤＮＡがアルカリ溶解法及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法により精製された。１％のアガロースゲルが、染色体の混入がないかどうか、配列決定用の鋳型をスクリーニングするのに用いられた。ダイプライマー配列決定反応物は、製造者のプロトコールにより、ターボカタリスト８００装置（パーキンエルマー／アプライドバイオシステムズ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて調製された。
【００９６】
陽性クローンのＤＮＡ配列は、パーキンエルマー／アプライドバイオシステムズ社プリズム３７７シーケンサーを用いて得られた。ｃＤＮＡクローンは、まず５’末端側から、そして場合によっては３’末端側からも配列決定された。いくつかのクローンについては、サブクローニングした断片から内部の配列が決定された。サブクローニングは、制限酵素切断部位マッピングとｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋へのサブクローニングという標準的な手順を用いて行われた。
【００９７】
決定されたｃＤＮＡ配列は、ＥＭＢＬデータベース（リリース４６、１９９６年３月）中の既知配列と、１９９６年２月（バージョン２．０．４）のＦＡＳＴＡアルゴリズム（インターネット上のｆｔｐサイトｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｆａｓｔａ／にて入手可能）又はＢＬＡＳＴＮアルゴリズムバージョン２．０．４（１９９８年２月２４日）又はバージョン２．０．６（１９９８年９月１６日）を、上記の好ましいパラメーター設定で用いて比較した。重複配列の多重アライメントが、信頼できるコンセンサス配列の作成に用いられた。他の植物種由来の既知配列との類似性にもとづき、本発明の単離されたポリペプチドは、特定の酵素をエンコードするものと同定された。
【００９８】
上記の手順を用いて、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｇｒａｎｄｉｓのライブラリ由来の、ＰＡＬ（配列識別番号１６、１００、２４２−２４６）、Ｃ４Ｈ（配列識別番号１７、１５３、１５４、及び１６１）、Ｃ３Ｈ（配列識別番号１８、１０１、１４９及び１５０）、Ｆ５Ｈ（配列識別番号１９−２１、１０２、１０３及び１６９−１７１）、ＯＭＴ（配列識別番号２２−２５、１０４−１０７、１７３及び１７４）、ＣＣＲ（配列識別番号２６−２９及び１０８−１１１）、ＣＡＤ（配列識別番号１、３０及び１１２）、ＣＧＴ（配列識別番号３１−３３及び１１３−１１５）、ＣＢＧ（配列識別番号３４、１６５及び１６６）、ＰＮＬ（配列識別番号３５、３６及び１１６）、ＬＡＣ（配列識別番号３７−４１、１１７及び１１８）、ＰＯＸ（配列識別番号４２−４４、１１９−１２１、１７９、２４９−２５０及び３５０−３５８）、４ＣＬ（配列識別番号２６６）、カフェー酸メチル基転移酵素（配列識別番号１８７−１９２）、カフェオイルＣｏＡメチル基転移酵素（配列識別番号１９３−１９５）、クマラートＣｏＡリガーゼ（配列識別番号１９６−１９８）、シトクロムＰ４５０ ＬＸＸ１Ａ（配列識別番号２０１−２０６）、ジフェノール酸化酵素（配列識別番号２０７−２１７）、フラボノールグルコース転移酵素（配列識別番号２１８）、フラボノイド水酸化酵素（配列識別番号２１９−２２３）、及びイソフラボン還元酵素（配列識別番号２３４−２４０）ポリペプチドをエンコードするｃＤＮＡ配列が単離された。
【００９９】
実施例２
Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ由来ｃＤＮＡの単離と解析
ａ）高スループットスクリーニングによるｃＤＮＡクローンの単離
Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａのｃＤＮＡライブラリは木部から構築され、上記実施例１の通りスクリーニングされた。陽性クローンのＤＮＡ配列は、パーキンエルマー／アプライドバイオシステムズ社プリズム３７７シーケンサーで、順方向及び逆方向プライマーを用いて決定され、決定された配列は、上記の通りＥＭＢＬデータベース中の既知配列と比較された。
【０１００】
他の植物種由来の既知配列への類似性にもとづき、単離ＤＮＡ配列は、Ｃ４Ｈ（配列識別番号２、３、４８、４９、９２、１２４、１２５、１５５−１６０、１６２及び１６３）、Ｃ３Ｈ（配列識別番号４、５０−５２、９３、１２６、１２７、１５１及び１５２）、ＰＮＬ（配列識別番号５、８１及び１８３ ）、ＯＭＴ（配列識別番号６、５３−５５、９４及び１７５）、ＣＡＤ（配列識別番号７、７１、９５及び１６４）、ＣＣＲ（配列識別番号８、５８−７０、９６、１２８−１３４及び１６７）、ＰＡＬ（配列識別番号９−１１、４５−４７、９７、９８、１２２、１２３及び１７６、２４７及び２４８）、４ＣＬ（配列識別番号１２、５６、５７、９０、９９、１４７、１４８、２６５）、ＣＧＴ（配列識別番号７２、１３５及び１６８）、ＣＢＧ（配列識別番号７３−８０及び１３６−１４１）、ＬＡＣ（配列識別番号８２−８４、１４２−１４４及び１７２）、ＰＯＸ（配列識別番号８５−８９、９１、１４５、１４６、１７７、１７８、１８０−１８２、２６４、３５９−３７５）、アルファアミラーゼ（配列識別番号１８４−１８６）、クマラート６Ａリガーゼ（配列識別番号１９９及び２００）、フラボノイド水酸化酵素（配列識別番号２２４−２３３）、イソフラボン還元酵素（配列識別番号２４１）及びジフェノール酸化酵素（配列識別番号２５１−２６３）の酵素をエンコードするものとして同定された。
【０１０１】
ｂ）ＰＣＲによるｃＤＮＡクローンの単離
ここでＬＮＢ０１０及びＬＮＢ０１１（それぞれ配列識別番号１４及び１５）として言及された２つのＰＣＲプローブは、他の種で既に同定された、ｖａｎｐｏｘ、ｈｖｕｐｏｘ６、ｔａｅｐｏｘ、ｈｖｕｐｏｘ１、ｏｓａｐｏｘ、ｎｔｏｐｏｘ２、ｎｔｏｐｏｘ１、ｌｅｓｐｏｘ、ｐｏｋｐｏｘ、ｌｕｓｐｏｘ、ａｔｈｐｏｘ、ｈｒｐｏｘ、ｓｐｏｐｏｘ及びｔｖｅｐｏｘ  （それぞれジーンバンクアクセッション番号Ｄ１１３３７、Ｍ８３６７１、Ｘ５６０１１、Ｘ５８３９６、Ｘ６６１２５、Ｊ０２９７９、Ｄ１１３９６、Ｘ７１５９３、Ｄ１１１０２、Ｌ０７５５４、Ｍ５８３８１、Ｘ５７５６４、Ｚ２２９２０、及びＺ３１０１１）の過酸化酵素の配列に保存されたドメインにもとづいて設計された。
【０１０２】
ＲＮＡはマツの木部から単離され、ファーストストランドｃＤＮＡが上記の通り合成された。このｃＤＮＡは、４μＭ  ＬＮＢ０１０、４μＭ  ＬＮＢ０１１、１ｘ  Ｋｏｇｅｎバッファー、０．１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２００ｍＭ  ｄＮＴＰ、２ｍＭ  Ｍｇ２＋、及び０．１  Ｕ／μｌ  Ｔａｑポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）をもちいるＰＣＲにかけられた。条件は、ストラタジーン社ロボサイクラーにおいて、２分９４°Ｃ、１分５５°Ｃ及び１分７２°Ｃを２サイクル、１分９４°Ｃ、１分５５°Ｃ及び１分７２°Ｃを２５サイクル、１分９４°Ｃ、１分５５°Ｃ及び３分７２°Ｃを１８サイクルであった。遺伝子は同じ手法で再増幅された。約２００ｂｐのバンドがＴＡＥアガロースゲルからＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｅｌｌ社Ｅｌｕ−Ｑｕｉｋ  ＤＮＡ精製キットを用いて精製され、Ｔテイリングされた（Ｔ−ｔａｉｌｅｄ）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにクローン化された（Ｍａｒｃｈｕｋ  Ｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９、１１５４、１９９１）。既知配列との類似性にもとづき、単離された遺伝子（配列識別番号１３）はマツ過酸化酵素（ＰＯＸ）と同定された。
【０１０３】
実施例３
リグニン生合成改変のためのＯ−メチル基転移酵素（ＯＭＴ）の利用
Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａＯＭＴ遺伝子によるタバコ植物の形質転換
Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ由来のＯＭＴ（配列識別番号５３）のコーディング領域を含むポリヌクレオチドを含むセンス及びアンチセンスコンストラクトは、公表された方法（Ａｎ  Ｇ、Ｅｂｅｒｔ  ＰＲ、Ｍｉｔｒａ  Ａ、Ｈａ  ＳＢ、“Ｂｉｎａｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、”  ｉｎ  Ｇｅｌｖｉｎ  ＳＢ、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ  ＲＡ、ｅｄｓ．、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、１９８８を参照のこと）を用いる直接形質転換法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌ＬＢＡ４３０１株（カリフォルニア大デービス校、ＣＡ、Ｃ．Ｋａｄｏ博士より贈与）に挿入された。トランスジェニックコンストラクトの存在と状態は制限酵素消化及びＤＮＡ配列決定により確認された。
【０１０４】
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ）の葉の切片は、Ｈｏｒｓｃｈら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７、１２２９−１２３１、１９８５）の方法を用いて形質転換された。５つの独立の形質転換植物株がＯＭＴのセンスコンストラクトについて確立され、８つの独立の形質転換植物株がＯＭＴのアンチセンスコンストラクトについて確立された。適当なリグニン遺伝子コンストラクトを含む形質転換植物は、サザンブロット法を用いて確認された。表２の「サザン」と表記された段の「＋」は、当該形質転換植物が独立した形質転換株であると確認されたことを表す。
【０１０５】
形質転換植物におけるマツ属ＯＭＴの発現
全ＲＮＡが、前記のＯＭＴセンス及びアンチセンスコンストラクトで形質転換された、それぞれの独立の形質転換植物株から単離された。ＲＮＡサンプルは、それぞれの形質転換株での外来遺伝子の発現レベルを決定するために、ノザンブロット法で解析された。表２において、「ノザン」と表記された段に示されたデータは、前記のＯＭＴのセンス及びアンチセンスコンストラクトを含む形質転換植物株が、ノザンブロットのバックグランドに比べて高いレベルで発現していることを示した。ＲＮＡサンプルが分解の兆候を示したため、第２番のセンス植物株でのＯＭＴ発現は測定しなかった。エンプティベクター（何も挿入されていないベクター）で形質転換された対照実験の植物由来のＲＮＡサンプルとの雑種形成は検出できなかった。
【０１０６】
形質転換植物でのＯＭＴ酵素活性の改変
前記マツ属ＯＭＴ遺伝子及び内在するタバコのＯＭＴ遺伝子にエンコードされたＯＭＴ酵素の全活性が、前記ＯＭＴセンス及びアンチセンスコンストラクトを用いて作出されたそれぞれの形質転換植物株について解析された。タンパク粗抽出液はそれぞれの形質転換植物から調製され、Ｚｈａｎｇら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１３、６５−７４、１９９７）の方法で検定された。表１の「酵素」と表記された段に含まれるデータは、ＯＭＴセンスコンストラクトを含む形質転換植物株は一般にＯＭＴ酵素活性が増大し、エンプティベクターで形質転換された対照実験の植物に比べて、最大１９９％になるが、ＯＭＴアンチセンスコンストラクトを含む形質転換植物株は一般にＯＭＴ酵素活性が減少し、最小３５％になっていることを示す。ＯＭＴ酵素活性は、第３のセンス植物株では推定されなかった。
【０１０７】
マツ属ＯＭＴの形質転換植物におけるリグニン濃度に及ぼす影響
形質転換されたタバコ植物におけるリグニン濃度は、チオグリコール酸抽出（Ｆｒｅｕｄｅｎｂｅｒｇら、Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌｉｇｎｉｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、  Ｂｅｒｌｉｎ、１９６８参照）という十分に確立された手順を用いて決定された。簡潔には、平均３８日齢のタバコの植物全体が液体窒素で凍結され、乳鉢と乳棒で微粉末に破砕された。エンプティベクターで形質転換された対照実験の１つの植物株と、ＯＭＴのセンスコンストラクトを含む前記の５つの独立した形質転換植物株と、ＯＭＴのアンチセンスコンストラクトを含む前記の８つの独立した形質転換植物株とからの１００ｍｇの凍結粉末は、個別にメタノールで抽出され、次に１０％チオグリコールで抽出され、最後に１Ｍ  ＮａＯＨに溶解された。最後の抽出液は２８０ｎｍの吸光度で検定された。表２の「ＴＧＡ」と表記された段に示されたデータはセンス及びアンチセンスのＯＭＴ遺伝子コンストラクトを含む形質転換植物株は、エンプティベクターで形質転換された対照実験の植物株に比べて、全て有意にリグニンレベルが低下していた。
【０１０８】
【表２】
0004793963.tif 000005
【０１０９】
これらのデータは、ＴＧＡ検定法で測定されたリグニン濃度が、ＯＭＴのようなリグニン生合成の遺伝子のセンス又はアンチセンス発現により、直接操作可能であることを明らかに示している。
【０１１０】
実施例４
リグニン生合成を改変するための４−クマラートＣｏＡリガーゼ（４ＣＬ）遺伝子の利用
Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ４ＣＬ遺伝子によるタバコ植物の形質転換
Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ由来４ＣＬ（配列識別番号５６）のコーディング領域を含むポリヌクレオチドを含むセンス及びアンチセンスコンストラクトは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌ＬＢＡ４３０１に、上記の直接形質転換法により挿入された。トランスジェニックコンストラクトの存在及び状態は、制限酵素消化及びＤＮＡ配列決定により確認された。
【０１１１】
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．  Ｓａｍｓｕｎ）の葉の切片は上記の通り形質転換された。４ＣＬのセンスコンストラクトについて５つの独立した形質転換植物株が確立され、アンチセンスコンストラクトについて８つの独立した形質転換植物株が確立された。適切なリグニン遺伝子コンストラクトを含む形質転換植物はサザンブロット法を用いて確認された。表３の「サザン」と表記された段における「＋」は、列挙された形質転換植物株は独立した形質転換株であることが確認されたことを示す。
【０１１２】
マツ属４ＣＬの形質転換植物での発現
全ＲＮＡが、４ＣＬセンス及びアンチセンスコンストラクトで作出されたそれぞれの独立した形質転換植物株から単離された。ＲＮＡサンプルは、各形質転換株における外来遺伝子の発現レベルを決定するために、ノザンブロット法により解析された。表３の「ノザン」と表記された段に示されたデータは、４ＣＬについてのセンス及びアンチセンスコンストラクトを含む形質転換植物株が、ノザンブロットのバックグランドと比べて、全て高い発現レベルであることを示している。ＲＮＡが実験の時点で入手可能でなかったため、第１のアンチセンス植物株での４ＣＬ発現は測定されなかった。エンプティベクターを形質転換した対照実験の植物からのＲＮＡサンプルとの雑種形成は検出できなかった。
【０１１３】
形質転換植物における４ＣＬ酵素活性の改変
形質転換されたタバコ植物における、マツ属４ＣＬ遺伝子及び内在するタバコの４ＣＬ遺伝子にエンコードされた４ＣＬ酵素の全活性は、４ＣＬセンス及びアンチセンスコンストラクトで作出されたそれぞれの形質転換植物株について解析された。それぞれの形質転換植物からタンパク粗抽出液が調製され、Ｚｈａｎｇら（Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１３、６５−７４、  １９９７）の方法を用いて検定された。表３の「酵素」と表記された段に含まれたデータは、４ＣＬセンスコンストラクトを含む形質転換植物株は、エンプティベクターで形質転換された対照実験の植物と比べて、最大２５８％に４ＣＬ酵素活性が上昇し、４ＣＬアンチセンスコンストラクトを含む形質転換植物株は、最小５９％に４ＣＬ酵素活性が減少したことを示す。
【０１１４】
マツ属４ＣＬの形質転換植物中のリグニン濃度に及ぼす影響
形質転換植物材料のサンプル中のリグニン濃度は実施例３に記載の通り決定された。表３の「ＴＧＡ」と表記された段に示されたデータは、センス及びアンチセンス４ＣＬ遺伝子コンストラクトを含む形質転換植物株は、エンプティベクターで形質転換された対照実験の植物株に比べて、全て有意に減少したリグニンレベルにあることを示す。これらのデータは、ＴＧＡ検定法で測定されたリグニン濃度が、４ＣＬのようなリグニン生合成遺伝子のセンス又はアンチセンス発現により、直接操作されうることを明らかに示す。
【０１１５】
【表３】
0004793963.tif 000006
【０１１６】
実施例５
本発明のリグニン生合成の遺伝子を用いるタバコの形質転換
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ由来のＣ３Ｈ（配列識別番号１８）、Ｆ５Ｈ（配列識別番号１９）、ＣＣＲ（配列識別番号２６）及びＣＧＴ（配列識別番号３１）と、Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ由来のＯＭＴ（配列識別番号６）、ＰＡＬ（配列識別番号４５及び４７）、Ｃ４Ｈ（配列識別番号４８及び４９）、ＰＮＬ（配列識別番号８１）及びＬＡＣ（配列識別番号８３）とのコーディング領域を含むポリヌクレオチドを含むセンス及びアンチセンスコンストラクトは、上記の直接形質転換法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌ＬＢＡ４３０１株に挿入された。トランスジェニックコンストラクトの存在と状態は、制限酵素消化及びＤＮＡ配列決定により確認された。
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ）の葉の切片は、実施例３記載の通り形質転換された。次の段落において列挙されたセンスコンストラクトのそれぞれ及びアンチセンスコンストラクトのそれぞれについて、１２個以内の独立した形質転換植物株が確立された。適切なリグニン遺伝子コンストラクトを含む形質転換植物は、サザンブロット法を用いて確認された。解析された全ての形質転換植物株は独立した形質転換株であることが確認された。
【０１１７】
形質転換植物におけるリグニン量の操作
ノザンブロット法による外来遺伝子発現の決定
実施例５に記載されたそれぞれの独立した形質転換植物株から、全ＲＮＡが単離された。ＲＮＡサンプルは、それぞれの形質転換株における外来遺伝子の発現レベルを決定するために、ノザンブロット法で解析された。表４の「ノザン」と表記された段は、ノザンブロットのバックグランドと比べた、検定された全ての植物株における外来遺伝子の発現レベルを示す。エンプティベクターで形質転換された対照実験の植物由来のＲＮＡサンプルとの雑種形成は検出できなかった。
【０１１８】
形質転換植物におけるリグニン濃度の決定
エンプティベクターで形質転換された対照実験の植物株と、実施例５に記載された、各センスコンストラクト及び各アンチセンスコンストラクトについての１２個以内の独立した形質転換株とにおけるリグニン濃度は、実施例３に記載の通り決定された。表４の「ＴＧＡ」と表記された段は、Ｃ３Ｈ、Ｆ５Ｈ、ＣＣＲ、ＰＡＬ、Ｃ４Ｈ、ＰＮＬ及びＬＡＣで形質転換された植物株についてのチオグリコール酸で抽出可能なリグニンを、対照実験の植物に対する形質転換植物におけるＴＧＡ抽出可能リグニンの平均百分率で表して示す。変異の幅はかっこ内に示す。
【０１１９】
【表４】
0004793963.tif 000007
【０１２０】
図５は実施例５記載の通りの、ＰＡＬ（センス及びアンチセンス）、Ｃ４Ｈ（アンチセンス）、Ｃ３Ｈ（センス）、Ｆ５Ｈ（センス及びアンチセンス）、Ｃ５Ｈ（センス及びアンチセンス）、Ｃ３Ｈ  （センス、図５中ＣＯＭＴとして言及）、ＯＭＴ（センス及びアンチセンス、図５中ＣＣＯＭＴとして言及）、４ＣＬ（センス及びアンチセンス）、ＣＣＲ（センス及びアンチセンス）及びＣＧＴ（アンチセンス）コンストラクトで形質転換されたタバコ植物における抽出可能なリグニンの量を、野生型リグニン量の百分率として示す。チオグリコール酸で抽出可能な量は、エンプティベクター対照実験植物で正規化され、トランスジェニック植物において測定された。約１０の独立して得られたトランスジェニック植物のそれぞれから独立に３回抽出を行った。３回の抽出物の平均値は、その植物についてのリグニン値として、黒丸で示される。あるｃＤＮＡコンストラクトで形質転換された、１０の独立したトランスジェニック植物の平均値は棒で示される。エンプティベクターで形質転換された対照実験の植物の平均値はＸで示される。当該対照実験についての値は、比較しやすいように図全体にわたり外挿される。黒い棒は、対照実験植物に比べてリグニン量が有意に（ｐ＜０．０５）減少している平均を示す。灰色の棒は、対照実験植物から有意には変化していない平均を示す。
【０１２１】
センス及びアンチセンス方向のリグニン生合成遺伝子コンストラクトを含む形質転換植物株は、エンプティベクターで形質転換された対照実験の植物のリグニン量より有意に低いリグニン量の平均レベルを示した。最も劇的なリグニン濃度への効果はＯＭＴセンス植物及びＰＡＬセンス植物において見られる。これらのデータは、ＴＧＡ検定法により測定されたリグニン濃度が、本発明のリグニン生合成遺伝子を用いる、通常のアンチセンス法及びセンス過剰発現法によって、直接操作可能であることを明らかに示す。
【０１２２】
実施例７
形質転換植物におけるリグニン酵素活性の改変
選択されたリグニン生合成酵素の活性及び基質特異性は、Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ由来のＰＡＬ（配列識別番号４５）、ＰＮＬ（配列識別番号８１）及びＬＡＣ（配列識別番号８３）と、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ由来のＣＧＴ（配列識別番号３１）とについてのセンス及びアンチセンスコンストラクトを含む形質転換タバコ植物からの粗抽出物で検定された。
【０１２３】
酵素検定法は、ＰＡＬ（Ｓｏｕｔｈｅｒｔｏｎ  ＳＧ及びＤｅｖｅｒａｌｌ  ＢＪ、Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈ．３９、２２３−２３０、１９９０）、ＣＧＴ（Ｖｅｌｌｅｋｏｏｐ  Ｐら、ＦＥＢＳ、３３０、３６−４０、１９９３）、ＰＮＬ（Ｅｓｐｉｎ  ＣＪら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４、１７−２２、１９９７）及びＬＡＣ（Ｂａｏ  Ｗら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０、６７２−６７４、１９９３）について公表された方法で行われた。表５の「酵素」と表記された段に記載されたデータは、検定された全植物株について測定を繰り返したうえ平均した酵素活性を、エンプティベクターで形質転換された対照実験の植物における酵素活性の百分率で表す。変異の幅はかっこ内に示す。
【０１２４】
【表５】
0004793963.tif 000008
【０１２５】
ＰＮＬアンチセンス形質転換植物株を除く全ての形質転換植物株は、平均リグニン酵素活性が、エンプティベクターで形質転換された対照実験の植物で得られた活性よりも有意に低い値を示した。リグニン酵素活性への最も劇的な効果は、全ての株のＰＡＬ活性が減少したＰＡＬアンチセンス形質転換植物株と、エンプティベクターで形質転換された対照実験の植物のＬＡＣ活性の１４％を示したＬＡＣアンチセンス形質転換植物株とにおいて見られた。
【０１２６】
実施例８
リグニン生合成遺伝子の機能的同定
Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ由来の、ＰＡＬ（配列識別番号４７）、ＯＭＴ（配列識別番号５３）、４ＣＬ（配列識別番号５６及び５７）及びＰＯＸ（配列識別番号８６）と、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ由来の、ＯＭＴ（配列識別番号  ２３及び２４）、ＣＣＲ（配列識別番号２６−２８）、ＣＧＴ（配列識別番号３１及び３３）及びＰＯＸ（配列識別番号４２及び４４）のコーディング領域を含むポリヌクレオチドを含むセンスコンストラクトが商業的に入手可能なタンパク発現ベクターｐＰｒｏＥＸ−１（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）に挿入された。得られたコンストラクトは、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ストラタジーン）を形質転換して、ＩＰＴＧ添加により組み換えタンパクの産生を誘導された。マツ属ＯＭＴ及び４ＣＬコンストラクトとユーカリ属ＯＭＴ及びＰＯＸコンストラクトとについて、Ｎｉカラムクロマトグラフィー（Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ  Ｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８８、８９７２−８９７６、１９９１）を用いて精製タンパクが作成された。精製タンパクのそれぞれの酵素検定は、テストされた遺伝子に予想された基質特異性及び酵素活性があることを決定的に証明した。
【０１２７】
Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａ４ＣＬ遺伝子（配列識別番号５６）及びＰｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａＯＭＴ遺伝子（配列識別番号５３）の酵素活性の確認を示す、２つの代表的な酵素検定実験のデータが表６に示される。４ＣＬ酵素については、１ユニットは毎分０．１吸光度単位の速度で基質を生成物に転換するのに必要なタンパク量に等しい。ＯＭＴ酵素については、１ユニットは毎分１ピコモルの基質を生成物に転換するのに必要なタンパク量に等しい。
【０１２８】
【表６】
0004793963.tif 000009
【０１２９】
表６に示されたデータは、精製４ＣＬ酵素及び精製ＯＭＴ酵素の両方とも、酵素検定で高い活性を示し、本出願に記載された４ＣＬ及びＯＭＴ遺伝子の正体を確認した。
【０１３０】
実施例９
植物におけるユニーク配列識別子の存在／非存在の証明
トランスジェニックタバコ植物が、タバコには見つからないユニークな識別子配列を用いて作成された。挿入されたユニーク識別子配列は、Ｐｉｎｕｓ  ｒａｄｉａｔａから単離された配列識別番号４０２及びＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓから単離された配列識別番号４０３であった。前記ユニーク識別子配列は、公表された方法（Ａｎ  Ｇ、Ｅｂｅｒｔ  ＰＲ、Ｍｉｔｒａ  Ａ、Ｈａ  ＳＢ、“Ｂｉｎａｒｙ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、”  ｉｎ  Ｇｅｌｖｉｎ  ＳＢ、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ  ＲＡ、ｅｄｓ．、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ、１９８８）を用いる直接形質転換法により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌ＬＡＢ４３０１株（カリフォルニア大デービス校、ＣＡのＣ．Ｋａｄｏ博士より贈与）に挿入された。アグロバクテリウムトランスジェニックコンストラクト中のユニーク識別子配列の存在と状態は、制限酵素消化及びＤＮＡ配列決定により確かめられた。
【０１３１】
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ）の葉の切片は、Ｈｏｒｓｃｈら（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７、１２２９−１２３１、１９８５）の方法を用いて形質転換された。用いられたそれぞれのユニーク配列識別子について、３つの独立した形質転換植物株が確立された。エンプティベクター対照実験の２つの植物株が、ユニーク配列識別子を欠く何も挿入されていない遺伝子導入ベクターを用いて確立された。
【０１３２】
前記植物のゲノムに前記配列識別子が存在するかどうかテストするために、配列識別子のユニークさがサザンブロット解析を用いて検定された。配列識別子がユニークでタグとして有効なときは、該配列識別子は、タグが付いていない植物では明らかに存在せず、タグが付いた植物では明らかに存在するはずである。本実施例では、エンプティベクターで形質転換された対照実験の植物にはユニーク識別子は存在しないと予想される。ユニーク識別子は、該ユニーク識別子で形質転換されたトランスジェニック植物には存在すると予想される。
【０１３３】
ゲノムＤＮＡは、 Ｍｕｒｒａｙ及びＴｈｏｍｐｓｏｎのセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）抽出法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８、４３２１−４３２５、１９８０）を用いて、エンプティベクターで形質転換された対照実験の植物及びユニーク識別子で形質転換された植物から調製された。マツ属ユニーク配列識別子（配列識別番号４０２）で形質転換された植物の場合は制限酵素ＥｃｏＲＩで、ユーカリ属ユニーク配列識別子（配列識別番号４０３）で形質転換された植物の場合は制限酵素ＸｂａＩで、ＤＮＡサンプルは消化された。前記制限酵素消化でできたＤＮＡ断片は、１％アガロースゲルで分離された。図２の左のパネルと図２の右のパネルは、それぞれマツ属とユーカリ属の実験由来のＤＮＡサンプルのＤＮＡ断片パターンを示す。
【０１３４】
アガロースゲル電気泳動の段階の後、前記ＤＮＡサンプルは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  により確立された方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．９８、５０３−５１７）を用いて、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ブランドのナイロンメンブレン（アマシャムライフサイエンス、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）に転写された。当該ナイロンメンブレンは、上記で同定されたユニーク配列識別子用の放射能標識されたプローブと反応され、高ストリンジェンシー（最終洗浄、０．５Ｘ塩クエン酸ナトリウムバッファー（ＳＳＣ）プラス０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１５分６５°Ｃ）で洗浄された。ゲノムＤＮＡサンプル中の相補的な配列との前記プローブの雑種形成は、オートラジオグラフィーを用いて検出された。その結果が図３及び４に示される。
【０１３５】
図３（図２の左パネルに対応）はマツ属配列識別子（配列識別番号４０２）由来のプローブを用いるサザンブロット解析で検出された雑種形成パターンを示す。レーンＡ及びＢはエンプティベクターで形質転換された対照実験の植物由来のＤＮＡサンプルを含み、レーンＣないしＥは配列識別番号４０２で形質転換された植物由来のＤＮＡを含む。レーンＡ及びＢには雑種形成がなく、配列識別番号４０２は、エンプティベクターで形質転換された対照実験の植物には存在しないことを示す。すなわち、配列識別番号４０２はタバコ植物を曖昧なところなしにマークするのに適したユニークなタグである。レーンＣないしＥは強い雑種形成が見られ、配列識別番号４０２を形質転換により受け取った植物は、明確かつ曖昧なところなしに配列識別番号４０２に含まれるユニーク配列でタグづけされたことを示す。
【０１３６】
図４（図２の右パネルに対応）は、ユーカリ属配列識別子（配列識別番号４０３）由来のプローブを用いるサザンブロット解析で検出された雑種形成パターンを示す。レーンＡ及びＢは、エンプティベクターで形質転換された対照実験の植物由来のＤＮＡサンプルを含み、レーンＣないしＥは、配列識別番号４０３で形質転換された植物由来のＤＮＡを含む。レーンＡ及びＢは雑種形成が見られず、配列識別番号４０３が、エンプティベクターで形質転換された対照実験の植物には存在しないことを示す。すなわち、配列識別番号４０３は、タバコ植物を曖昧なところなしにマークするのに適したユニークなタグである。レーンＣないしＥは強い雑種形成が見られ、形質転換により配列識別番号４０３を受け取った植物は、配列識別番号４０３に含まれたユニークな配列で、明確かつ曖昧なところなくタグ付けされたことを示す。
【０１３７】
本実施例は、トランスジェニックな材料を、曖昧なところなくタグ付けする目的のために、本明細書に開示された配列の有用性を明らかに示している。タグはタグ付けされる生物のゲノムに挿入され、十分に確立されたＤＮＡ検出方法が、該タグとして用いられたユニーク配列識別子の明確な検出のために、用いられた。
【０１３８】
本実施例に用いられた配列特異的な検出方法のため、本明細書に開示された発明の使用者は、開示されたリスト中に、いかなる生物をタグ付けするのにも有用な配列識別子を見いだす高い可能性と、タグ付けされる生物のゲノムにユニークな配列を意図的に付加することによってのみ、タグ付けされた生物はある特定のタグを獲得することができたことを証明する明快な方法との両方を有する。本発明の使用者がある生物に用いたタグの正確な配列を秘密に保つ場合は、該生物の起源及び来歴に関するいかなる争点も、本実施例に開示されたタグ検出技術を用いて曖昧なところなく解決することができる。
【０１３９】
配列識別番号１ないし４０３は、添付された配列リストに提示されている。添付された配列リストに用いられたヌクレオチド配列の符号は、記号「ｎ」を含めて、ＷＩＰＯ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＳＴ．２５  （１９９８）、Ａｐｐｅｎｄｉｘ  ２、Ｔａｂｌｅ  １に準拠している。
【０１４０】
ここで引用された全ての文献は、特許文献及び非特許文献を含め、省略されることなく全引用事項を含むように、本文中に全体として掲載されている。
【０１４１】
この明細書において、本発明はいくつかの好ましい実施態様との関連で説明しており、例示の目的で多くの詳細が明らかにされているが、本発明は更なる実施態様が可能であること、及び、この中で説明された前記詳細事項は本発明の基本的原理から逸脱することなく広く変更されうることは、当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
本発明の上記の及び追加的な特長とこれらを得るための手法とは、添付図面と関連づけて読まれた以下のより詳細な説明を参照することにより、最もよく理解されるであろう。
【図１】  図１は、リグニン生合成経路の概要図である。
【図２】  図２は、マツ属由来のユニーク配列識別子を用いるタグ付け実験で作出されたタバコ植物由来のゲノムＤＮＡサンプル（左パネル）及びユーカリ属由来のユニーク配列識別子を用いるタグ付け実験で作出されたタバコ植物由来のゲノムＤＮＡサンプル（右パネル）を示す。両パネルとも、レーンＡ及びＢはエンプティベクターで形質転換された対照実験の植物由来のＤＮＡサンプルを含み、レーンＣないしＥはユニーク配列識別子で形質転換された植物由来のＤＮＡサンプルを含む。
【図３】  図３は、形質転換タバコ植物におけるマツ属ユニーク配列識別子の検出を示す。レーンＡ及びＢは、配列識別番号４０２由来のプローブの雑種形成を示す。レーンＣないしＥは、当該マツ属ユニーク配列識別子の１ないし３コピーを含むタバコ植物のゲノムＤＮＡと前記プローブの雑種形成を示す。
【図４】  図４は、形質転換タバコ植物におけるユーカリ属ユニーク配列識別子の検出を示す。レーンＡ及びＢは、配列識別番号４０３由来のプローブとユーカリ属ユニーク配列識別子を欠くタバコ植物（エンプティベクターで形質転換された対照実験の植物）のゲノムＤＮＡとの雑種形成を示す。レーンＣないしＥは、１ないし２コピーのユーカリ属ユニーク配列識別子を含むタバコ植物のゲノムＤＮＡとの雑種形成を示す。
【図５】  図５は、本発明のセンス及びアンチセンス遺伝子コンストラクトで形質転換されたタバコ植物に存在する抽出可能なリグニン量を野生型リグニン量の百分率で示す。
【配列表】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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