(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンを有効成分とする、骨形成の促進と骨吸収の抑制の２つの作用を併せもつ代謝性骨疾患の予防治療薬。
【請求項２】
代謝性骨疾患が骨粗鬆症である請求項１記載の予防治療薬。
【請求項３】
２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンがプロピオン酸菌の培養物から得られたものである請求項１又は２記載の予防治療薬。
【請求項４】
培養物が培養上清及び／又は菌体である請求項３記載の予防治療薬。
【請求項５】
プロピオン酸菌がプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）である請求項３又は４記載の予防治療薬。
【請求項６】
有効成分としてさらに乳酸菌培養物を含む請求項１〜５のいずれか１項記載の予防治療薬。
【請求項７】
乳酸菌がラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）である請求項６記載の予防治療薬。
【請求項８】
２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンを有効成分とする、骨形成の促進と骨吸収の抑制のための医薬。
【請求項９】
２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンがプロピオン酸菌の培養物から得られたものである請求項８記載の医薬。
【請求項１０】
培養物が培養上清及び／又は菌体である請求項９記載の医薬。
【請求項１１】
プロピオン酸菌がプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）である請求項９又は１０記載の医薬。
【請求項１２】
有効成分としてさらに乳酸菌培養物を含む請求項８〜１１のいずれか１項記載の医薬。
【請求項１３】
乳酸菌がラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）である請求項１２記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は骨粗鬆症に代表される代謝性骨疾患の予防および改善に有用な飲食品及び予防治療用医薬に関する。
背景技術
骨は、生体の支持組織であるとともに、カルシウムやリンなど各種ミネラルの貯蔵庫として、さらに、体液のミネラル調節機構をも担っている重要な組織である。この骨組織では骨形成と骨吸収が常に活発に行われ、古い骨が新しい骨で置き換えられている。特に成長の終わった骨では、骨形成系の骨芽細胞と骨吸収系の破骨細胞とが密接に関連し合って、骨組織の維持と体液のミネラルを一定に保つため、骨吸収と骨形成を繰り返している。この骨の再構築を骨のリモデリングと呼ぶ。この骨のリモデリングは、物理的因子、ホルモン、サイトカインなどによって精密に一定のバランスを保って調節されている。しかし、このバランスが崩れ、骨吸収が骨形成を上回ると骨量が減少する。この病的骨量の減少の中で骨成分が正常なものを骨粗鬆症という。
骨粗鬆症は、高齢化の進展とともに最もその数が増大している健康障害の１つであり、特に閉経後の女性に多いことはよく知られている。骨粗鬆症は、大腿骨頸部骨折を起こしやすく、脳血管障害とともに多くの“寝たきり老人”をつくる要因ともなっており、社会的負担が大きい。したがって、骨粗鬆症に対して適切な治療を行い、悪化を予防するとともに、有効な予防方法を確立することが社会的に強く求められている。現在まで、骨粗鬆症に対する薬剤としてビタミンＤ製剤、カルシトニン製剤、ビスホスホネート製剤などが開発され臨床応用されてきた。しかし、特効薬の開発には到達していないのが現状である。
このように骨粗鬆症の十分な治療法が確立されていない現状では、予防が最も重要である。理論的には、青年期、壮年期の骨量をできるだけ高め、それを長く維持して、さらに、閉経後の骨量の減少を少しでも抑制できれば、高齢になっても高い骨量を保つことが可能となる。そのためには小児期、青年期、壮年期に適切なカルシウムを摂取し続けることが不可欠であるが、カルシウムの摂取のみでは不十分である。そこで、骨粗鬆症などを予防あるいは改善する作用を有する食品素材があれば、それを日常摂取する食品に添加することにより、日常の食生活のなかで骨粗鬆症の予防あるいは改善が期待できる。また、この食品素材中の有効成分を同定・分離し、骨粗鬆症の予防あるいは治療薬として用いることが期待できる。
このような中で、血液凝固因子として一般的に知られているビタミンＫが、骨代謝にも関与することが明らかとなり注目されている。そして、ビタミンＫ２製剤が骨粗鬆症における骨量・疼痛の改善薬として日本国内で発売された。また、ビタミンＫ１あるいはビタミンＫ２を含有する食品素材も市場に投入されつつある。
そこで、本発明は、代謝性骨疾患、とりわけ骨粗鬆症の予防や改善に有用な新たな食品素材を提供することを課題とする。また、本発明は代謝性骨疾患の予防および治療に有用な医薬を提供することを課題とする。
発明の開示
本発明者らは、上記課題を解決すべく、食品素材を中心に広く検索・研究を行った結果、プロピオン酸菌及び乳酸菌の培養物を経口摂取すると骨量および骨強度が高められることを見出した。そして該培養物の有効量を含有する食品は骨粗鬆症に代表される代謝性骨疾患の予防あるいは改善に有効であることを見出した。さらに、該培養物中に含まれる２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン及びその類縁体が骨芽細胞の分化と機能発現を促進し、一方破骨細胞の形成を抑制する作用を有することを見出し、これらの化合物が代謝性骨疾患の予防治療薬として有用であることを見出した。
すなわち、本発明は、
（１）  プロピオン酸菌及び／又は乳酸菌の培養物（以下、「発酵産物」ということがある。また、プロピオン酸菌培養物を「ＢＧＳ」ということがある。）２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン、１，４−ナフトキノン、２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２，３−ジクロロ−１，４−ナフトキノン、５−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、８−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２−（α−ヒドロキシ−δ−メチルペンテニル）−５，８−ジヒドロキシ−１，４−ナフトキノン及びそれらの塩からなる群より選ばれたナフトキノン化合物を有効成分として含有する骨形成促進機能を有する飲食品、
（２）  有効成分が、プロピオン酸菌及び／又は乳酸菌の培養物である（１）の飲食品、
（３）  培養物が培養上清及び／又は菌体である（１）の飲食品、
（４）  有効成分が２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンである（１）（以下、「ＡＣＮＱ」ということがある）の飲食品、
（５）  プロピオン酸菌がプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）である（１）の飲食品、
（６）  乳酸菌がラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）である（１）の飲食品、
（７）  プロピオン酸菌及び／又は乳酸菌の培養物、あるいは２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン、１，４−ナフトキノン、２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２，３−ジクロロ−１，４−ナフトキノン、５−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、８−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２−（α−ヒドロキシ−δ−メチルペンテニル）−５，８−ジヒドロキシ−１，４−ナフトキノン及びそれらの塩からなる群より選ばれたナフトキノン化合物の骨形成促進機能を有する飲食品製造のための使用、
（８）  プロピオン酸菌及び／又は乳酸菌の培養物である（７）の使用、
（９）  培養物が培養上清及び／又は菌体である（７）の使用、
（１０）  プロピオン酸菌がプロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）である（７）の使用、
（１１）  乳酸菌がラクトコッカス・ラクチス・サブスピーシス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）である（７）の使用、
（１２）  ２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン、１，４−ナフトキノン、２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２，３−ジクロロ−１，４−ナフトキノン、５−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、８−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２−（α−ヒドロキシ−δ−メチルペンテニル）−５，８−ジヒドロキシ−１，４−ナフトキノン及びそれらの塩からなる群より選ばれたナフトキノン化合物、あるいはプロピオン酸菌及び／又は乳酸菌の培養物を有効成分とする代謝性骨疾患の予防治療薬、
（１３）  ナフトキノン化合物が２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンである（１２）の代謝性骨疾患の予防治療薬、
（１４）  代謝性骨疾患が骨粗鬆症である（１２）又は（１３）の予防治療薬、１３．  ２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン、１，４−ナフトキノン、２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２，３−ジクロロ−１，４−ナフトキノン、５−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、８−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２−（α−ヒドロキシ−δ−メチルペンテニル）−５，８−ジヒドロキシ−１，４−ナフトキノン及びそれらの塩からなる群より選ばれたナフトキノン化合物、あるいはプロピオン酸菌及び／又は乳酸菌の培養物の代謝性骨疾患の予防治療用の医薬製造のための使用、
（１６）  ナフトキノン化合物が２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンである（１５）の使用、
（１７）  代謝性骨疾患が骨粗鬆症である（１５）の使用、
（１８）  ２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン、１，４−ナフトキノン、２−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２，３−ジクロロ−１，４−ナフトキノン、５−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、８−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノン、２−（α−ヒドロキシ−δ−メチルペンテニル）−５，８−ジヒドロキシ−１，４−ナフトキノン及びそれらの塩からなる群より選ばれたナフトキノン化合物、あるいはプロピオン酸菌及び／又は乳酸菌の培養物を投与することを特徴とする代謝性骨疾患の処置方法、
（１９）  ナフトキノン化合物が２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンである（１８）の処置方法、
（２０）  代謝性骨疾患が骨粗鬆症である（１８）の処置方法、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の医薬及び飲食品には、前記ナフトキノン化合物、プロピオン酸菌培養物、及び乳酸菌培養物のいずれも用いることができる。ここで、前記のナフトキノン化合物のうち、２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノン（ＡＣＮＱ）が特に好ましい。このＡＣＮＱは、例えばプロピオン酸菌（プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物）の培養物から得られることが知られている（特開平０７−２２７２０７号、特開平０７−２８９２７３号、特開平１０−３０４８７１号）。また、ＡＣＮＱ以外のナフトキノン化合物についても、プロピオン酸菌の培養物から得られる（特開平０８−９８６７７号）。これらのナフトキノン化合物及びプロピオン酸菌培養物が、ビフィズス菌の増殖活性を有することについては知られているが、代謝性骨疾患に作用があるか否かについては全く知られていない。
プロピオン酸菌としては、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、プロピオニバクテリウム・トエニー（Ｐ．ｔｈｏｅｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Ｐ．ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）、プロピオニバクテリウム・ジェンセニー（Ｐ．ｊｅｎｓｅｎｉｉ）などのチーズ用、プロピオニバクテリウム・アビダム（Ｐ．ａｖｉｄｕｍ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐ．ａｃｎｅｓ）、プロピオニバクテリウム・リンホフィラム（Ｐ．ｌｙｍｐｈｏｐｈｉｌｕｍ）、プロピオニバクテリウム・グラニュロサム（Ｐ．ｇｒａｎｕｌｏｓａｍ）などが挙げられる。プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒとしては、例えばＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＩＦＯ  １２４２４、あるいはＰ．ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＡＴＣＣ  ６２０７が挙げられる。
乳酸菌としては、例えばラクトバチルス属（ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）に属する菌が挙げられる。ラクトバチルス属としては、例えばＬｂ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌｂ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｌｉｃｕｓ、ストレプトコッカス属としては、例えばＳｔｒ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ラクトコッカス属としては、例えばＬｃ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ，ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｌｃ．ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ、ロイコノストック属としては、例えばＬｅｕｃ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ、Ｌｅｕｃ．ｌａｃｔｉｓなどが挙げられる。
プロピオン酸菌又は乳酸菌の培養物は、公知の手段により得られる。例えば、プロピオン酸菌を高濃度に培養する方法として、ホエイタンパク濃縮物（Ｗｈｅｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ：ＷＰＣ）又はその酵素分解物にミネラルと単糖を添加した培地でプロピオン酸菌を培養する方法がある（特開平１０−３０４８７１号公報）。あるいはプロピオン酸菌の効率的な培養法としてビフィズス菌とプロピオン酸菌を異なる培養槽で培養液を循環させながら培養する方法がある（特開平８−６６１７８号公報）。これらの培養方法は本発明の実施に用いることができる。さらに当業者であれば、これら公知の方法をさらに最適化するために、培地組成及び培養条件等（溶存酸素濃度等）を変更することが可能である。例えば、窒素源については、カゼインタンパク、ＷＰＣなどの他に、さらに各種アミノ酸（塩）の添加効果の検討や、培養条件（嫌気培養と好気培養）の検討などを行い、最適化（菌体の増加やＢＧＳの骨代謝活性向上）することが可能である。したがってこれらの変更された方法も本発明に包含される。
ＢＧＳのビフィズス菌増殖活性は、培養物の菌体を除いた濾過物及び菌体のメタノール抽出物中に存在している（Ｋａｎｅｋｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．：Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．，７７：３９３−４０４，１９９４）。骨代謝活性も、培養上清及び菌体の双方に含まれていると考えられる。したがって、本発明の「ＢＧＳ」は、例えばプロピオン酸菌及び／又は乳酸菌の培養物そのもの、培養上清、菌体、それらの抽出物、それらの乾燥粉末、あるいはそれらの希釈物等すべてが含まれる。
ＢＧＳの加工形態は、粉末状と液状に大別される。粉末状とするには、培養液に賦形剤として脱脂粉乳もしくはホエイ粉、生デンプン、デキストリン等を直接添加し、培養固形分を３０〜４０重量％とした後、噴霧乾燥するか、培養液と賦形剤の還元液を混合し、固形分が３０〜４０重量％となるまで濃縮後、噴霧乾燥する。充填時に脱酸素処理（窒素封入や脱酸素剤添加など）することで長期保存が可能である。賦形剤としては、上記の他、必要に応じてＷＰＣ、ホエイタンパク分離物（Ｗｈｅｙ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｓｏｌａｔｅ：ＷＰＩ）、加工デンプン（デキストリンの他、ソリューブルスターチ、ブリティシュガム、酸化デンプン、デンプンエステル、デンプンエーテルなど）も使用できる。また、食品に使いやすいように、倍散した製剤（０．２％倍散末）に加工してもよい。
一方、ナフトキノン化合物は、プロピオン酸菌の培養物から抽出、精製して採取することができる（特開平０７−２８９２７３号）。ナフトキノン化合物を含む発酵産物を産生する微生物としては、その他にＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｖｕｌｇａｔｕｓ  ＪＣＭ５８２６Ｔ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ  ２３７４５などのＢａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ属、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｃａｅなどが挙げられる。
また、ナフトキノン化合物は化学合成によっても得ることができ、例えばＡＣＮＱは市販の１，４−ジヒドロキシナフトエ酸を出発物質として、４段階の工程により得ることができる（特開平１０−３６３２８号）。
ナフトキノン化合物の塩としては、薬学的又は食品学的に許容できる塩が挙げられ、代表的な塩には、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、乳酸塩、クエン酸塩などが含まれるが、これらは例示であって、本発明はこれらの塩に限定されない。
本発明で用いるナフトキノン化合物には、立体異性体、光学異性が存在する場合もあるが、これらは全く本発明に用いることができる。
前記のナフトキノン化合物は、骨形成の指標である骨芽細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を促進させ石灰化を促進する。そして破骨細胞の分化・成熟を抑制する一方で、破骨細胞活性を阻害せず、破骨細胞に対する細胞毒性を示さない。すなわち、これらのナフトキノン化合物及び培養物は、骨形成の促進と骨吸収の抑制の２つの作用を併せもつ極めてユニークな代謝性骨疾患の予防・治療薬又は代謝性骨疾患の予防改善用飲食品として有用である。
以上、ＢＧＳ及びＡＣＮＱについて、骨代謝の側面、すなわち、骨形成と骨吸収作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価系及びｉｎ  ｖｉｖｏ評価系で調べた結果を示す。
ＢＧＳのｉｎ  ｖｉｖｏ評価系において、ＢＧＳを経口摂取すると、大腿骨及び脛骨の骨密度、大腿骨破断エネルギー、及び大腿骨Ｃａ量は対照群に対して有意に増強した。すなわち、ＢＧＳの経口摂取により、骨量及び骨強度が有意に増強することがｉｎ  ｖｉｖｏ実験で示された（図１、２及び３）。そこで、ＢＧＳのこの骨形成促進作用を分析するために、ビフィズス菌の増殖活性成分であるＡＣＮＱの骨代謝に与える影響をｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験で調べた。
骨は、骨芽細胞などの骨形成系細胞、破骨細胞などの骨吸収系細胞、さらに各種の間質細胞（繊維芽細胞、脂肪細胞、細網細胞）や造血細胞で構成され、それらの細胞がたがいに連携し合ったネットワークの下で骨組織が構築されている。
先ず、ＡＣＮＱの骨形成に与える影響について調べた。骨形成において主要な役割を果たすのは骨芽細胞である。成長後の骨では、破骨細胞による骨吸収窩に骨芽細胞が動員され、吸収された骨を補填するべく骨形成が開始される。骨芽前駆細胞は活発に増殖するとともに、次第に骨芽細胞の分化形質を獲得する。さらに、分化が進展し成熟した骨芽細胞により、形成された骨基質の石灰化が起こり骨形成が完了する。骨芽細胞の分化の指標としては、各種基質タンパクの合成の他にＡＬＰの発現及びその活性の上昇が最も重要である。
そこで、骨髄ストローマ細胞の株細胞であるＳＴ−２をＡＣＮＱを添加した培地で培養し、骨芽細胞の分化に伴う指標であるＡＬＰ活性を測定した。ＡＣＮＱは１μｇ／ｍｌの濃度まで、濃度依存的に骨芽細胞形成を促進した（図４）。すなわち、ＡＣＮＱは骨髄ストローマ細胞から骨芽細胞への分化を濃度依存的に促進した。また、ＡＣＮＱは１μｇ／ｍＬの濃度まで細胞毒性を示さなかった（図５）。
ＡＬＰ活性と石灰化との関係は未だ明確ではないが、ＡＬＰに遺伝的欠陥があると、骨格の発達に異常をきたすことから、この酵素が重要な役割を演じていることが示唆されている。したがって、ＡＬＰ活性の上昇は、骨芽細胞の石灰化を促進していると考えられる。そこでＡＣＮＱの骨形成作用を、ヒト骨芽細胞（ＳａＭ−１）による石灰化促進作用により評価した。ＳａＭ−１は骨芽細胞の特徴をすべて保持しており、２ｍＭ  α−グリセロリン酸存在下で、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３（活性型ビタミンＤ３）の濃度に依存して石灰化することが知られている（Ｋｏｓｈｉｈａｒａ，Ｙ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４５：６５１−６５７，１９８７）。そこで、各種濃度のＡＣＮＱの存在下でＳａＭ−１を培養して、マトリックス上に蓄積されたＣａ量及びＰ量を測定した。ＡＣＮＱは１０−５Ｍ〜１０−７Ｍにおいて濃度依存的に石灰化を促進した（図６及び７）。一方、ＡＣＮＱは１０−５Ｍ〜１０−７Ｍにおいて、培養上清中の遊離ＬＤＨを測定した結果では細胞毒性を示さなかった（図８）。
以上の結果から、ＡＣＮＱは、１０−５Ｍ〜１０−７Ｍといった極めて低濃度で骨形成を促進し、そしてこの濃度において細胞毒性を示さないことが明らかとなった。
つぎに、ＡＣＮＱの骨吸収に与える影響について調べた。破骨細胞はマクロファージ系の造血細胞に由来し、骨組織特有の環境下で骨吸収因子の刺激により形成される骨吸収系細胞である。骨髄に存在する破骨細胞前駆細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで破骨細胞を形成させることにより、その機能解析が可能である。破骨細胞を形成させる培養系としては、骨髄細胞培養、骨髄細胞と骨芽細胞の共存培養、脾細胞と骨芽細胞の共存培養などが用いられている。骨髄細胞を１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３とともに培養すると、破骨細胞の標識酵素である酒石酸耐性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）陽性の多核破骨細胞が形成される。
そこで、ヒト単核細胞を１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３及びＡＣＮＱの存在下で培養し、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３によって惹起されたＴＲＡＰ陽性多核破骨細胞形成に与えるＡＣＮＱの影響を調べた。ＡＣＮＱは１０−８Ｍ〜１０−５Ｍにおいて濃度依存的に破骨細胞形成を抑制した（図９）。その抑制作用は、同じ濃度のビタミンＫ１よりも著しく強かった。
また、マウス新生仔の頭蓋骨由来の初代骨芽細胞様間質細胞とマウスの骨髄細胞との共存培養系により形成されるＴＲＡＰ陽性細胞を調べた。ＡＣＮＱは１．５μｇ／ｍｌ以上で破骨細胞形成を著しく抑制した（図１０）。そこで、ＡＣＮＱの骨吸収系活性に与える影響を調べた。同上マウスの初代骨芽細胞様間質細胞とマウスの骨髄細胞との共存培養による破骨細胞形成系における象牙切片上の吸収窩形成及び細胞毒性を測定した。ＡＣＮＱは、分化・成熟した破骨細胞の骨吸収活性を抑制しなかった（図１１）。また、ＡＣＮＱは破骨細胞に対して毒性を示さなかった（図１１）。このことはＡＣＮＱは分化・成熟した破骨細胞に対してその機能を損なわないことを示している。
以上の結果から、ＢＧＳは、これを経口摂取すると、骨量を増やすとともに骨強度を高める作用を示すことが明らかとなった。一方その主要な活性成分の１つと考えられるＡＣＮＱは、骨芽細胞形成を高めるとともに骨形成を促進し、一方では、破骨細胞の形成を抑制するが、形成された破骨細胞は正常に機能する（骨吸収活性を有する）、といった極めてユニークな骨代謝作用を示した。前記ＢＧＳの骨形成促進活性は、ＢＧＳ中のさまざまな成分が複合した作用によるものとも考えられるが、しかしその大部分はＢＧＳ中に極微量含まれるＡＣＮＱの作用に基づくものであることは間違いないと考えられる。
ところで、血液凝固因子として一般的に知られているビタミンＫが骨代謝にも関連することが明らかにされ注目されている。天然にはビタミンＫ１とＫ２が存在する。ビタミンＫ１及びＫ２はナフトキノン骨格を共有し、該骨格の３位に結合する側鎖のみが異なり、１位にはともに同じメチル基が結合している。ビタミンＫ１は単一化合物であるが、ビタミンＫ２は、３位に結合するイソプレン数により１４の同族体があり、この内イソプレン単位数４（ゲラニルゲラニオール）のビタミンＫ２−４のみが骨形成を促進し、骨吸収を抑制して骨量の減少を抑制する。ビタミンＫ１あるいはビタミンＫ２の側鎖による骨吸収への影響が調べられた結果、ビタミンＫ２−４の側鎖であるゲラニルゲラニオールには、ビタミンＫ２−４と同程度の破骨細胞形成抑制作用が認められた。ところが、ビタミンＫ１の側鎖であるフィトールは抑制活性が弱く、また、ビタミンＫ２のイソプレン単位数が２〜７（４を除く）の側鎖は、抑制作用を示さずむしろ促進した（Ｈａｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｏｎｅ，１６：１７９−１８４，１９９５）。
本発明のＡＣＮＱもビタミンＫ１あるいはＫ２と同様にナフトキノン骨格を有するが、該骨格の２位にはアミノ基がそして３位にはカルボキシル基が結合しており、上記したようにビタミンＫ１あるいはビタミンＫ２の骨代謝活性は側鎖に依存していることを考慮すると、両者は全く異なると考えられる。
前記培養物またはナフトキノン化合物は骨代謝を促進し、骨粗鬆症の予防あるいは改善に有用な食品の製造のために、その有効量を日常摂取する食品に添加することができる。添加対象の食品は特に限定されないが、好ましくは日本においては、保健の用途の表示や限定された用途について表示許可された特別用途食品（病者用食品、高齢者用食品、特定保健用食品）が挙げられる。外国ではヘルスクレイム（健康強調表示）が許可された食品などが挙げられる。
代謝性骨疾患の予防又は改善用飲食品には、前記ナフトキノン化合物を用いることもできるが、安全性、健康衛生上の面から、天然物由来、とりわけ、プロピオン酸菌培養物を用いることが好ましい。培養物は、それ自体のみならず、その溶媒抽出物、その処理物（例えば、菌体を含む培養液、菌体の抽出物、培養液の上清、これらの濃縮物、乾燥物、希釈物など）などを含む。
食品中の有効成分の活性を維持するために、安定化剤として、例えば、アスコルビン酸ナトリウムなどを添加するとよい。培養物の添加量は、有効成分のナフトキノン化合物の含有量から計算されるが（例えば参考例２参照）、培養物を、例えば０．５〜１０重量％添加すればよい。
本発明の飲食品用組成物は、単独で使用してもよいが、食品学的に許容される担体、さらには１つ以上の他の食品栄養素、例えばビタミン、ミネラル、アミノ酸などとともに配合してもよい。ここで食品学的に許容される担体としては、結合剤、賦形剤、保存剤、着色剤などが挙げられる。
前記ナフトキノン化合物及び培養物は、通常一般的な医薬組成物の形態で用いられる。
医薬組成物は、薬学的に許容される担体、例えば充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤などの希釈剤、あるいは賦形剤を用いて調製される。この医薬組成物としては、各種の形態が治療目的に応じて選択でき、その代表的なものとして、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、膣坐剤、注射剤（液剤、懸濁剤）などが挙げられる。
代謝性骨疾患予防治療薬の投与量は、年齢、体重等の患者の状態、投与経路、病気の性質と程度等を考慮して設定することが望ましいが、通常は、成人に対して、ナフトキノン化合物量として、１日当たり、経口投与の場合、０．５〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲が一般的である。場合によっては、これ以下で十分であるし、また、逆にこれ以上の用量を必要とすることもある。また１日に２〜４回に分割して投与することもできる。
本発明の医薬を投与するに際しては、骨形成にはカルシウムが必要とされることから、カルシウム剤を併用して投与してもよい。また、骨吸収抑制剤［例、活性型ビタミンＤ２、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン、エストロジェン、イプリフラボン（オステン（商品名））など］と併用して投与してもよい。
実施例
以下、本発明の特定の態様を参考例及び試験例により説明するが、当業者であればさまざまな修飾が本発明の範囲内で実施しえることが認識されるであろう。［参考例１］  ＢＧＳ粉末の製造
１０ｗ／ｗ％ホエイ粉還元液を８Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ７．０に調整後、プロテアーゼ（アマノＡ（アマノ製薬））をホエイ粉１ｇにつき６．７９ｍｇ添加し、５０℃で２時間酵素分解した。反応期間中は８Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ７．０に保持した。８５℃、１０分間加熱し酵素を失活させた後３５℃まで冷却した。酵母エキス０．１ｗ／ｗ％を加え、４Ｎ−ＨＣｌでｐＨ６．７に調整した後、１２１℃、７分間滅菌して培地とした。
Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＡＴＣＣ  ６２０７株（菌株番号は一例）をあらかじめＴＰＹ培地（特開平７−２８９２７３公開公報実施例１参照）で静置培養（３７℃，３日）しておき、これを種菌として上記培地に２％植菌した。培養温度は３５℃とし、８Ｎ炭酸カリウム水溶液でｐＨ６．０に保ちながら７２時間培養した。なお培養槽のヘッドスペースは窒素で置換し、攪拌は１００〜１５０ｒｐｍとした。この培養液にアスコルビン酸ナトリウム０．５ｗ／ｗ％添加した後、１２１℃，１５秒で殺菌した。培養液固形分の４倍量の脱脂粉乳を添加して、噴霧乾燥した。この乾燥粉末中のＡＣＮＱの含量は、０．５６μｇ／ｇであった。
［参考例２］  ＡＣＮＱの分析
（１）  培養液の場合
菌体を含む培養液０．５ｍに、１Ｎ塩酸０．０５ｍ、精製水２ｍｌ、およびアセトン２．５ｍｌを加え、２００ｒｅｖ／ｍｉｎで６０分間振盪した。酢酸エチル２．５ｍｌを加え、２００ｒｅｖ／ｍｉｎで３０分間振盪後、遠心（２，５００ｒｐｍ、４℃、５分間）した。さらに、水層について酢酸エチル７．５ｍｌで２回抽出した。有機溶媒層を濃縮後、メタノール２００μＬで溶解し、ＨＰＬＣで分析した。
ＨＰＬＣ条件は以下のとうり
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ  ＰＡＫ  Ｃ１８  ＳＧ１２０（φ４．６×２５０ｍｍ、資生堂）
カラム温度：４５℃
移動相：アセトニトリル／メタノール／７．９４ｍｍｏｌ／Ｌ過塩素酸ナトリウム溶液／酢酸（２５０／１００／９００／０．６、ｐＨ５．６）
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
検出：多電極型電気化学検出器：Ｃｏｕｌｏｃｈｅｍ  ＩＩ（ＥＳＡ，Ｉｎｃ）
ガードセル                      −６５０ｍＶ
アナリティカルセル  ＤＥＴ．１  −６００ｍＶ
ＤＥＴ．２  ＋１５０ｍＶ
試料温度：室温
注入量：２０μＬ
（２）  凍結乾燥粉末の場合
粉末１ｇにメタノール５０ｍｌを加えて１時間振盪した後、酢酸エチル５０ｍｌを加えて更に３０分間振盪した。懸濁液を濾過し、濾液を濃縮後、メタノール５ｍｌで溶解し、ＨＰＬＣで分析した。
［試験例１］  ＢＧＳの骨量及び骨強度に及ぼす効果（ｉｎ  ｖｉｖｏ試験）
参考例１で得たＢＧＳ粉末を２％又は１０％含む精製飼料（ＡＩＮ−９３Ｇ組成準拠）を雄性ＳＤラットに４週間自由摂取させた。試験飼料の調製にあたっては、ＢＧＳ粉末に由来するタンパク質、乳糖、カルシウム、リン、マグネシウムを考慮し、各試験飼料間で平準化させた。対照の飼料は２０％のカゼインを含むＡＩＮ−９３Ｇ組成に準拠した。
その結果、飼育後の体重増加、飼料効率は３群間に差を認めなかった。大腿骨と脛骨の乾燥重量に関しては３群間に差を認めなかった。骨密度は、１０％ＢＧＳ粉末を与えた群は対照群に対して有意に高値を示し、２％ＢＧＳ粉末を与えた群は対照群に対して有意ではないものの高値傾向を示した（図１）。大腿骨破断エネルギーは、１０％ＢＧＳ粉末を与えた群は対照群及び２％ＢＧＳ粉末を与えた群に対して有意に高値を示し、また、２％ＢＧＳ粉末を与えた群は対照群に対して有意ではないものの高値傾向を示した（図２）。大腿骨カルシウム量は、１０％ＢＧＳ粉末を与えた群は対照群に対して有意に高値を示し、２％ＢＧＳ粉末を与えた群は対照群に対して有意ではないものの高値傾向を示した（図３）。
これらのｉｎ  ｖｉｖｏ試験結果から、ＢＧＳを経口摂取することにより骨密度が高まり、破断応力が増強し、そしてカルシウム蓄積が高められることが明らかとなった。すなわち、ＢＧＳを経口摂取すると骨形成を促進し、骨量と骨強度を高める効果を有することが明らかとなった。
［試験例２］  ＡＣＮＱの骨形成促進作用
骨芽細胞としてマウス骨髄由来のストローマセルラインＳＴ−２細胞
（Ｕｄａｇａｗａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２５：１８０５−１８１３，１９８９）を用いた。この細胞は骨髄細胞に対して骨芽細胞と同等の破骨細胞分化誘導能を有している。
細胞を９６ウエルマイクロプレートの各ウェルに４×１０４細胞／ウエル播き、１０％ＦＢＳ、ペニシリンＧ、及びストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１日培養した。
ＡＣＮＱを含む同培地で培地交換し、さらに３日間培養した。培養後、細胞のＡＬＰ活性を測定した。
細胞をＰＢＳで洗浄後、エタノールで１分間固定した。３７℃の酵素反応液（基質としてｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．１Ｍグリシン、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び０．１ｍＭ  ＺｎＣｌ２を含む緩衝液，ｐＨ１０．５）を加えて３７℃で３０分間反応させた。等量の０．０５Ｎ  ＮａＯＨを添加して反応を停止させた。ＡＬＰ活性は、タンパク質１ｍｇあたり、１分間に生成されるｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ量（４１５ｎｍの吸光度で測定）を１Ｕとして表した。タンパク質含量は、タンパク質測定試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂ．）を用いて測定した。また、ＡＣＮＱの細胞毒性をＭＴＴアッセイにより測定した（図５）。
細胞のＡＬＰ活性は、ＡＣＮＱの濃度１μｇ／ｍＬまでは、濃度依存的に増加し、濃度１μｇ／ｍＬ近辺において、ＡＬＰ活性がピークに達した（図４）。このＡＬＰ活性のピーク濃度において細胞毒性は全く認められなかった（図５）。
［試験例３］  ＡＣＮＱの石灰化能促進効果
骨折手術時に得られた２０歳男性の長管骨骨膜より樹立した培養ヒト骨芽細胞（ＳａＭ−１）を使用した。このＳａＭ−１細胞は骨芽細胞の特徴をすべて保持していた（Ｋｏｓｈｉｈａｒａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２５：３７−４３，１９８９）。ＳａＭ−１は、２ｍＭのα−グリセロリン酸存在下で、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３の濃度に依存して石灰化を促進することが知られている（Ｋｏｓｈｉｈａｒａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．ｃｏｍｍｕｎ．，１４５：６５１−６５７，１９８７）。
１８ＰＤＬ（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｄｏｕｂｌｉｎｇ  ｌｅｖｅｌ）のＳａＭ−１を１２穴プレートに播き、コンフルエントになるまで培養した。つぎに石灰化促進剤である、α−グリセロリン酸を２ｍＭになるように添加した。この培養系に、１０−８Ｍ〜１０−９Ｍの１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３、１０−５〜１０−６ＭのビタミンＫ２（２−ｍｅｔｈｙｌ−３−ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−ｔｅｔｒａｐｈｅｎｙｌ−１，４−ｎａｐｈｔｏｑｕｉｎｏｎｃ；ｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅ）、１０−５Ｍ〜１０−７ＭのＡＣＮＱ、あるいは１０−９Ｍの１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３＋１０−５Ｍ〜１０−６ＭのＡＣＮＱをそれぞれ添加し３２日間培養した。対照には溶媒のＤＭＳＯを培養液の０．１％になるように加えた。培地はそれぞれの試験物質を含む培地で１日おきに交換した。石灰化度はヒドロキシアパタイトの構成成分であるＣａおよびＰ量で表した。
（１）細胞外マトリックス中のカルシウムの測定
細胞外マトリックス中のＣａは、ｏ−ｃｒｅｓｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｏｎｅ法（ＯＣＰＣ法）（Ｇｉｔｌｅｍａｎ，Ｈ．Ｊ．：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８：５２０−５３１，１９６７）に基づいたキット（カルシウムＣテストワコー）により定量した。
培養終了後Ｈａｎｋ’ｓ液にて細胞を洗浄した。冷５％過塩素酸０．５ｍＬ／ウエルを加えて、４℃で１５分間振盪抽出した。抽出液２５μＬと緩衝液２．５ｍＬを混合後、発色液（ＯＣＰＣ０．４ｍｇ／ｍＬ、８−キノリノール含有）２５０μＬを加えて攪拌し、５分後にその反応液を吸光度計（５７０ｎｍ）にて測定した（図６）。
（２）細胞外マトリックス中のリンの測定
細胞外マトリックス中のＰは、Ｃｈｅｎらの方法（Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．：Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２８：１７５６−１７５８，１９５６）で定量した。
０．８４％モリブデン酸アンモニウム、２Ｎ−硫酸、１０％アスコルビン酸を３：３：１（容積比）で混合して反応試薬を調製した。上記Ｃａ測定で抽出した抽出液１００μＬを蒸留水８００μＬで希釈した後、反応試薬２．１ｍｌを加えて、４５℃で２０分間インキュベートした。水で冷却後、反応液を吸光度計（５７０ｎｍ）にて測定した（図７）。
図６および図７から、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、既報のように１０−８Ｍ〜１０−９Ｍの濃度において、濃度に依存して石灰化を促進することが確認された。一方、ＡＣＮＱは、１０−５Ｍ〜１０−７Ｍの濃度において、濃度に依存して石灰化を促進することが確認された。
（３）ＡＣＮＱの細胞毒性
ＬＤＨ−Ｃｙｔｏｌｏｘｉｃ  Ｔｅｓｔ  Ｗａｋｏ（細胞毒性測定用キット）を用いて培地上清中の遊離ＬＤＨを測定し、ＡＣＮＱの細胞毒性を調べた。培養３２日目の培地上清を採取し、発色反応後にマイクロプレートリーダー（５４０ｎｍ）を用いてＬＤＨを測定した。
結果、ＡＣＮＱは１０−５Ｍ〜１０−７Ｍの濃度において、対照に比較して有意な差は認められず、この濃度において細胞毒性の可能性はないものと判断した（図８）。
［試験例４］  ＡＣＮＱの破骨細胞形成抑制作用
（１）  人工骨頭置換手術時に得られたヒト骨髄細胞を密度勾配遠心法に供し、単核細胞
を採取した。この単核細胞を、２０％ウマ血清及び１０−８Ｍの１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３を含有するα−ＭＥＭ培地中８×１０５細胞／ウエル（０７９ｃｍ２）になるように播種して、１７日間培養した。培養液は週２回、１／２づつ交換した。ＡＣＮＱの添加は開始時に行った。
培養１６日目にプロナーゼ／ＥＤＴＡ処理を行ってストローマ細胞を除去した。翌日に細胞をＰＢＳ（−）で洗浄後、細胞をホルマリン固定した。ホルマリン固定細胞はＴＲＡＰ染色を行って、各ウエルのＴＲＡＰ陽性多核細胞数を計測した。対照としてビタミンＫ１を用いた。
ＡＣＮＱは１０−８Ｍ〜１０−５Ｍの濃度において、濃度に依存して破骨細胞形成を抑制した。（図９）。
（２）  ｄｄＹマウス新生仔の頭蓋骨を酵素処理（コラゲナーゼとディスパーゼの混合溶液）して初代骨芽細胞様間質細胞を得た。一方、同マウス（６〜９週齢雄）の大腿骨と脛骨より骨髄細胞を単離した。初代骨芽細胞様間質細胞と骨髄細胞とを、ＡＣＮＱの存在下で共存培養し、ＡＣＮＱの破骨細胞への分化誘導作用を調べた。
初代骨芽細胞様間質細胞と骨髄細胞とを、およそ１：２０の比率の細胞数で含むものを、１０％ＦＢＳ添加αＭＥＭを用いて、１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍの１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３存在下、６〜８日間共存培養した。培養期間中に、各種濃度のＡＣＮＱ、あるいは比較対照として、破骨細胞形成を抑制することが知られているビタミンＫ２を、培地交換（培地交換半量、交換日は２日おき）ごとに添加した。
ＴＲＡＰ染色に陽性の細胞で、かつ、細胞内の核数が３以上の細胞を分化した破骨細胞とした。ＴＲＡＰ染色液は、使用時直前に、基質（ナフトールＡＳ−ＭＸリン酸）５ｍｇ、及び色素（Ｆａｓｔ  ｒｅｄ  ｖｉｏｌｅｔ  ＬＢ  ｓａｌｔ）２５ｍｇをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド約０．５ｍｌに溶解し、これに５０ｍＭ酒石酸ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）５０ｍｌを加えて調製した。培養した細胞の培地を除去後ＰＢＳにて洗浄し、１０％ホルマリン含有ＰＢＳにて５分間固定後、１：１のエタノール・アセトンで１分間再固定した。風乾後、ＴＲＡＰ染色液にて室温で１０〜１５分間反応させた後水洗・乾燥させた。このものを検鏡し破骨細胞数を計測した。ＡＣＮＱは、骨髄細胞中に存在する単核細胞の破骨細胞への分化・成熟を０．１５〜１５μｇ／ｍｌの濃度において、濃度依存的に抑制した（図１０）。
［試験例５］  ＡＣＮＱの骨吸収に与える影響
象牙切片上での破骨細胞による吸収窩形成に与えるＡＣＮＱの影響を調べた。
試験例４の（２）と同様に、ｄｄＹマウス新生仔の頭蓋骨由来の初代骨芽細胞様間質細胞と、同マウス（６〜９週齢雄）の大腿骨と脛骨より単離した骨髄細胞を、１００ｍｍデイッシュ／２０ｍＬ中、１×１０６細胞：１×１０７細胞の比率で含むものを、コラーゲンゲル上、１０％ＦＢＳ、及び１０−８Ｍの１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３を添加したαＭＥＭ培地で、６〜８日間共存培養した。培地交換は２日ごとに行った。培養後、０．２％コラゲナーゼ溶液を加え、３７℃２０分間ゆっくり振とうしてコラーゲンゲルを消化して、分化誘導された破骨細胞様多核細胞を回収した。この方法で得られた破骨細胞数は、最大４×１０４細胞／１００ｍｍデイッシュであった。
この破骨細胞様多核細胞は、１０％ＦＢＳ添加αＭＥＮＭ培地で４×１０３細胞／ｍＬに調製して、象牙切片を入れたウエル（９６穴）に、ウエルあたり１００μｌ播種し、３７℃で２時間培養した。培養後、０．５〜１．０ｍＬ／ウエルの培地を入れた２４、又は４８ウエルに移した。同時に、各種濃度のＡＣＮＱを各ウエルに添加し、３７℃で２４時間培養した。培養後、培地を除去し、象牙切片をマイヤーの酸性ヘマラウン染色液にて短時間染色した。染色液を除去後、骨芽細胞の貧食により形成された象牙質切片表面の吸収窩の数を、顕微鏡下でカウントした。結果は対照（ＡＣＮＱ無添加）の吸収窩の数を１００％としたときのそれぞれの吸収窩の数（％）で示した。ＡＣＮＱは、最高濃度の７．５μｇ／ｍＬ濃度でも破骨細胞の骨吸収活性を低下させなかった（図１１）。このことは、ＡＣＮＱは、分化・成熟した破骨細胞の骨吸収活性を抑制しないことを示しており、それは破骨細胞への細胞毒性を示していないことからもいえる。
産業上の利用可能性
本発明のプロピオン酸菌及び／又は乳酸菌の培養物は、食品に添加することができ、そして該食品を摂取することにより、代謝性骨疾患、とりわけ、骨粗鬆症を予防あるいは改善することが期待できる。また、該培養物中に含まれる２−アミノ−３−カルボキシ−１，４−ナフトキノンおよびナフトキノンの誘導体は代謝性骨疾患の予防治療薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、ＢＧＳ粉末を２％又は１０％含む精製飼料をＳＤラットに４週間自由摂取させた後のＳＤラットの脛骨骨密度（ｍｇ／ｃｍ２）を示す図であり、図２は、そのラットの大腿骨破断エネルギー（ｍＪ）を示す図であり、図３は、そのラットの大腿骨乾燥重量当たりのカルシウム量（ｍｇ／ｇ）を示す。図１〜３においてバーは平均値±標準誤差を示す（ｐ＜０．０５）。
図４は、マウス骨髄由来ストローマセルラインＳＴ−２細胞を各種濃度のＡＣＮＱの存在下で３日間培養後の、該細胞のアルカリホスファターゼ活性を示す図であり、図５は、該細胞のＭＴＴアッセイによる生細胞数（５９５ｎｍにおける吸光度）を示す図である。
図６は、ヒト骨芽細胞（ＳａＭ−１）における、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３、ビタミンＫ２、ＡＣＮＱ、及び１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３とＡＣＮＱとの組み合わせによるＣａ蓄積の影響を示す図である。
図７は、ヒト骨芽細胞（ＳａＭ−１）における、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３、ビタミンＫ２、ＡＣＮＱ、及び活性型１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３とＡＣＮＱとの組み合わせによるＰ蓄積の影響を示す図である。
図８は、ヒト骨芽細胞（ＳａＭ−１）における、１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３、ビタミンＫ２、ＡＣＮＱ、及び１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３とＡＣＮＱとの組み合わせによる細胞毒性を示す図である。
図９は、ヒト骨髄細胞（ＳａＭ−１）培養におけるＡＣＮＱ及びビタミンＫ１のＴＲＡＰ陽性多核細胞に与える影響を示す図である。
図１０は、ｄｄＹマウス新生仔の頭蓋骨由来の骨芽細胞様間質細胞と同マウス由来の骨髄細胞を１α，２５（ＯＨ）２Ｄ３あるいはＡＣＮＱ存在下で共存培養した場合の破骨細胞形成に与える影響を示す図である。
図１１は、ｄｄＹマウス新生仔の頭蓋骨由来の骨芽細胞様間質細胞と同マウス由来の骨髄細胞をＡＣＮＱ存在下で共存培養した場合の破骨細胞活性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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