(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖相補性決定領域（Ｌ−ＣＤＲ）；ならびにＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖相補性決定領域（Ｈ−ＣＤＲ）を含むヒト化ＣＣ４９抗−ＴＡＧ−７２抗体であって、
Ｌ−ＣＤＲ３、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３がネズミモノクローナルＣＣ４９抗体由来であって（当該Ｌ−ＣＤＲ３は配列番号：３に示されるアミノ酸配列であり、当該Ｈ−ＣＤＲ１は配列番号：４に示されるアミノ酸配列であり、当該Ｈ−ＣＤＲ２は配列番号：５に示されるアミノ酸配列であり、そして当該Ｈ−ＣＤＲ３は配列番号：６に示されるアミノ酸配列である）、（ｉ）Ｌ−ＣＤＲ１がヒトモノクローナル抗体ＬＥＮに由来し（当該Ｌ−ＣＤＲ１は配列番号：７に示されるアミノ酸配列である）、Ｌ−ＣＤＲ２がネズミモノクローナルＣＣ４９抗体に由来するか（当該Ｌ−ＣＤＲ２は配列番号：２に示されるアミノ酸配列である）、（ｉｉ）Ｌ−ＣＤＲ１がネズミモノクローナルＣＣ４９抗体に由来し（当該Ｌ−ＣＤＲ１は配列番号：１に示されるアミノ酸配列である）、Ｌ−ＣＤＲ２がヒトモノクローナル抗体ＬＥＮに由来するか（当該Ｌ−ＣＤＲ２は配列番号：８に示されるアミノ酸配列である）、あるいは（ｉｉｉ）Ｌ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２がヒトモノクローナル抗体ＬＥＮに由来する（当該Ｌ−ＣＤＲ１は配列番号：７に示されるアミノ酸配列であり、当該Ｌ−ＣＤＲ２は配列番号：８に示されるアミノ酸配列である）、抗体。
【請求項２】
Ｌ−ＣＤＲ１がヒトモノクローナル抗体ＬＥＮに由来し、Ｌ−ＣＤＲ２がネズミモノクローナルＣＣ４９抗体に由来する、請求項１記載のヒト化抗体。
【請求項３】
Ｌ−ＣＤＲ１がネズミモノクローナルＣＣ４９抗体に由来し、Ｌ−ＣＤＲ２がヒトモノクローナル抗体ＬＥＮに由来する、請求項１記載のヒト化抗体。
【請求項４】
Ｌ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２がヒトモノクローナル抗体ＬＥＮに由来するヒト抗体配列である、請求項１記載のヒト化抗体。
【請求項５】
Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖相補性決定領域（Ｌ−ＣＤＲ）；ならびにＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖相補性決定領域（Ｈ−ＣＤＲ）を含むヒト化ＣＣ４９抗−ＴＡＧ−７２抗体であって、
Ｌ−ＣＤＲ３、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３がネズミモノクローナルＣＣ４９抗体由来であって（当該Ｌ−ＣＤＲ３は配列番号：３に示されるアミノ酸配列であり、当該Ｈ−ＣＤＲ１は配列番号：４に示されるアミノ酸配列であり、当該Ｈ−ＣＤＲ２は配列番号：５に示されるアミノ酸配列であり、そして当該Ｈ−ＣＤＲ３は配列番号：６に示されるアミノ酸配列である）、Ｌ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２の両方がネズミモノクローナルＣＣ４９抗体に由来するか（当該Ｌ−ＣＤＲ１は配列番号：１に示されるアミノ酸配列であり、当該Ｌ−ＣＤＲ２は配列番号：２に示されるアミノ酸配列である）、またはＬ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２の両方がヒトモノクローナル抗体ＬＥＮに由来するものであって（当該Ｌ−ＣＤＲ１は配列番号：７に示されるアミノ酸配列であり、当該Ｌ−ＣＤＲ２は配列番号：８に示されるアミノ酸配列である）、
Kabat番号付けを用いてＨ−ＣＤＲ２中の位置６０、６１、６２、または６４の少なくとも１つのアミノ酸がヒトモノクローナル２１／２８’ＣＬ抗体由来のＨ−ＣＤＲ２（配列番号：１１）の対応アミノ酸で置換されている、抗体。
【請求項６】
Kabat番号付けを用いてＬ−ＣＤＲ３の位置９７のアミノ酸がヒトモノクローナル抗体ＬＥＮ由来のＬ−ＣＤＲ３（配列番号：９）の対応アミノ酸で置換されている、請求項５記載のヒト化抗体。
【請求項７】
Ｌ−ＣＤＲ１がヒトモノクローナル抗体ＬＥＮに由来する、請求項５記載のヒト化抗体。
【請求項８】
Ｌ−ＣＤＲ２がヒトモノクローナル抗体ＬＥＮに由来する、請求項５記載のヒト化抗体。
【請求項９】
Ｌ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２がヒトモノクローナル抗体ＬＥＮに由来する、請求項５記載のヒト化抗体。
【請求項１０】
Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖相補性決定領域（Ｌ−ＣＤＲ）；ならびにＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖相補性決定領域（Ｈ−ＣＤＲ）を含むヒト化ＣＣ４９抗−ＴＡＧ−７２抗体であって、
Ｌ−ＣＤＲ３、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３がネズミモノクローナルＣＣ４９抗体由来であって（当該Ｌ−ＣＤＲ３は配列番号：３に示されるアミノ酸配列であり、当該Ｈ−ＣＤＲ１は配列番号：４に示されるアミノ酸配列であり、当該Ｈ−ＣＤＲ２は配列番号：５に示されるアミノ酸配列であり、そして当該Ｈ−ＣＤＲ３は配列番号：６に示されるアミノ酸配列である）、Ｌ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２の両方がネズミモノクローナルＣＣ４９抗体に由来するか（当該Ｌ−ＣＤＲ１は配列番号：１に示されるアミノ酸配列であり、当該Ｌ−ＣＤＲ２は配列番号：２に示されるアミノ酸配列である）、またはＬ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２の両方がヒトモノクローナル抗体ＬＥＮに由来するものであって（当該Ｌ−ＣＤＲ１は配列番号：７に示されるアミノ酸配列であり、当該Ｌ−ＣＤＲ２は配列番号：８に示されるアミノ酸配列である）、
Kabat番号付けを用いてＬ−ＣＤＲ３の位置９７のアミノ酸がヒトモノクローナル抗体ＬＥＮ由来のＬ−ＣＤＲ３（配列番号：９）の対応アミノ酸で置換されている、抗体。
【請求項１１】
Kabat番号付けを用いてＨ−ＣＤＲ２中の位置６０、６１、６２、または６４の少なくとも１つのアミノ酸がヒトモノクローナル２１／２８’ＣＬ抗体由来のＨ−ＣＤＲ２（配列番号：１１）の対応アミノ酸で置換されている、請求項１０記載のヒト化抗体。
【請求項１２】
Ｌ−ＣＤＲ１がヒトモノクローナル抗体ＬＥＮに由来する、請求項１０記載のヒト化抗体。
【請求項１３】
Ｌ−ＣＤＲ２がヒトモノクローナル抗体ＬＥＮに由来する、請求項１０記載のヒト化抗体。
【請求項１４】
Ｌ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２がヒトモノクローナル抗体ＬＥＮに由来するヒト抗体配列に由来するものである、請求項１０記載のヒト化抗体。
【請求項１５】
Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２およびＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖相補性決定領域（Ｌ−ＣＤＲ）；ならびにＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖相補性決定領域（Ｈ−ＣＤＲ）を含むヒト化ＣＣ４９抗−ＴＡＧ−７２抗体であって、
Ｌ−ＣＤＲ３、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２およびＨ−ＣＤＲ３がネズミモノクローナルＣＣ４９抗体由来であって（当該Ｌ−ＣＤＲ３は配列番号：３に示されるアミノ酸配列であり、当該Ｈ−ＣＤＲ１は配列番号：４に示されるアミノ酸配列であり、当該Ｈ−ＣＤＲ２は配列番号：５に示されるアミノ酸配列であり、そして当該Ｈ−ＣＤＲ３は配列番号：６に示されるアミノ酸配列である）、Ｌ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２の両方がネズミモノクローナルＣＣ４９抗体に由来するか（当該Ｌ−ＣＤＲ１は配列番号：１に示されるアミノ酸配列であり、当該Ｌ−ＣＤＲ２は配列番号：２に示されるアミノ酸配列である）、またはＬ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２の両方がヒトモノクローナル抗体ＬＥＮに由来するものであって（当該Ｌ−ＣＤＲ１は配列番号：７に示されるアミノ酸配列であり、当該Ｌ−ＣＤＲ２は配列番号：８に示されるアミノ酸配列である）、
Kabat番号付けを用いてＬ−ＣＤＲ３中の位置９４の残基がヒトモノクローナル抗体ＬＥＮ由来のＬ−ＣＤＲ３（配列番号：９）の対応アミノ酸で置換されている、抗体。
【請求項１６】
請求項１、５、１０または１５のいずれか１項記載のヒト化抗体を発現する核酸。
【請求項１７】
請求項１、５、１０または１５のいずれか１項記載のヒト化抗体を発現するベクター。
【請求項１８】
請求項１、５、１０または１５のいずれか１項記載のヒト化抗体を含有する、癌治療のための組成物。
【請求項１９】
請求項１、５、１０または１５のいずれか１項記載のヒト化抗体を含有する、癌細胞を検出するための組成物。
【請求項２０】
ＴＡＧ−７２に特異的に結合できるポリペプチドを含有し、該ポリペプチドが請求項１、５、１０または１５のいずれか１項記載のヒト化抗体の機能的フラグメントを含むものである、癌細胞を検出するための組成物。
【請求項２１】
ポリペプチドがＦｖ、Ｆａｂ、およびＦ(ａｂ’)2からなる群より選択されるフラグメントを含むものである、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１、５、１０または１５のいずれか１項記載のヒト化抗体に、対象から得た細胞を接触させることを含む、癌細胞の検出方法。
【請求項２３】
ヒト化抗体が標識されている、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
標識二次抗体を用いてヒト化抗体が検出される、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
ＴＡＧ−７２に特異的に結合できるポリペプチドを含有し、該ポリペプチドが請求項１、５、１０または１５のいずれか１項記載のヒト化抗体の機能的フラグメントを含むものである組成物に、対象から得た細胞を接触させることを含む、癌細胞の検出方法。
【請求項２６】
ポリペプチドがＦｖ、Ｆａｂ、およびＦ(ａｂ’)2からなる群より選択されるフラグメントを含むものである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ヒト化ＣＣ４９抗−ＴＡＧ−７２抗体が、親のＨｕＣＣ４９抗体と比較して、ＴＡＧ−７２に対する結合親和性を保持している、請求項１〜１５のいずれか１項記載のヒト化抗体。
【請求項２８】
ヒト化ＣＣ４９抗−ＴＡＧ−７２抗体が、親のＨｕＣＣ４９抗体と比較して、低下した免疫原性を示すものである、請求項１〜１５のいずれか１項記載のヒト化抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
背景
抗体は、外来性の蛋白、糖蛋白、細胞、または他の抗原性外来物質による攻撃に応答して、脊椎動物の免疫系により産生される特異的な免疫グロブリン（Ｉｇ）ポリペプチドである。特定抗原に対するかかるポリペプチドの結合特異性は非常に厳格であり、各抗体はそれが誘導されることとなった特定抗原に対してほとんど排他的に指向されている。この特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間に構造上の相補性に存する。抗体結合部位は、主として超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基から構成されている。場合によっては、非超可変またはフレームワーク領域に由来する残基がドメイン全体の構造に影響し、それゆえ結合部位に影響することがある。
【０００２】
脊椎動物の抗体を得るための２つの主要方法がある：それらは哺乳動物Ｂリンパ球によるin situでのポリクローナル抗体の生成ならびにＢ細胞ハイブリッドによる細胞培養物中におけるモノクローナル抗体の生成である。
in situで抗体を得るためには、動物（マウスまたはウサギのごとき）に抗原を注射する。数週間後、動物から採血し、遠心分離する。得られる血清は注射した抗原に対する抗体を含んでいる。得られる抗体はポリクローナル抗体である。なぜなら、それらは抗体産生細胞の多くの異なった集団であり、それゆえ抗原に対するそれらの正確な特異性および親和性がいくぶん異なっているからである。
抗体産生細胞を無制限の増殖能を有する腫瘍細胞と融合させるハイブリドーマ法を用いてモノクローナル抗体を得る。ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は均一である。なぜなら、それらは単一のハイブリドーマ細胞に由来する同じ細胞の集団により合成されるからである。
しかしながら、モノクローナル抗体が非−ヒト動物において産生される場合には、ヒトにおけるモノクローナル抗体の使用は厳格に制限されている。マウス抗体のごとき「外来」抗体のヒトにおける繰り返し注射は有害な過敏性反応、すなわち、抗−マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答または抗−イディオタイプ応答を引き起こす可能性がある。ＨＡＭＡ応答は、患者血清からのクリアランス速度を増大させ、そして／あるいは患者によるアレルギー反応を増大させるので、繰り返し投与を無効なものにする。
【０００３】
ヒトハイブリドーマを用いてヒト由来のモノクローナル抗体を製造するための試みがなされている。不幸なことに、ヒトハイブリドーマ細胞系からのモノクローナル抗体の収量は、マウスハイブリドーマと比較すると少量である。さらに、免疫グロブリンを発現するヒト細胞系は、マウス細胞系と比較すると不安定であり、これらのヒト細胞系の抗体産生能は一過性のものである。よって、ヒト免疫グロブリンが非常に望まれているが、ヒトハイブリドーマ法は、所望の抗原特異性を有するヒトモノクローナル抗体を容易に得ることができる段階にはまだ達していない。
【０００４】
よって、非ヒト起源の抗体を遺伝子操作してキメラ抗体またはヒト化抗体が作成されている。かかる遺伝子操作により、ヒト患者にマウス抗体を注射した後に考えられるＨＡＭＡ応答と比較して、ＨＡＭＡ応答の危険性が低下する。例えば、非ヒト可変領域をヒト不変領域に移植することによりキメラ抗体を得ることができる。Khazaeli et al. (1991), J. Immunotherapy 15: 42-52。一般的には、ヒト化抗体は、非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトフレームワーク領域（ＦＲ）上に移植することにより得られる（欧州特許出願第０２３９４００号；Jones et al. (1986), Nature (London), 321: 522-525；およびReichman et al. (1988), Nature (London), 332: 323-327参照）。典型的には、非ヒト抗体由来の６個のＣＤＲ全部（３個の軽鎖および３個の重鎖）をヒト抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）中に移植することによりヒト化モノクローナル抗体を得る。別法として、Ｆｖ抗体（米国特許第４６４２３３４号参照）または１本鎖Ｆｖ（ＳＣＦＶ）抗体（米国特許第４９４６７７８号）を用いてＨＡＭＡ応答の危険性を低下させることもできる。
【０００５】
しかしながら、これらの修飾抗体はやはり種々の非ヒト軽鎖および重鎖可変領域を保持している：キメラなＦｖおよび１本鎖Ｆｖ抗体は非ヒト可変領域全体を保持しており、ＣＤＲを移植された抗体は非ヒト起源のＣＤＲを保持している。かかる非ヒト領域は、ヒト患者に投与された場合、免疫原性反応を誘発する可能性がある。よって、多くのヒト化ＭＡＢはヒトよりも下等な霊長類およびヒトにおいて免疫原性のままであり、これらのＭａｂの可変領域に指向された宿主の体液性応答を生じさせる（Hakimi et al. (1991), J. Immunol., 147: 1352-1359; Stephens et al. (1995), Immunology, 85: 668-674; Singer et al. (1993), J. Immunol., 150: 2844-2857;およびSharkey et al. (1995), Cancer Res. 55: 5935s-5945s）。
【０００６】
ＴＡＧ−７２に対する結合特異性を有する多くのネズミモノクローナル抗体が開発されている。典型的なネズミモノクローナル抗体は「ＣＣ」モノクローナル抗体を包含し、それらはＴＡＧ−７１を用いて得られたネズミモノクローナル抗体のライブラリーである。特定のＣＣ抗体はＡＴＣＣに寄託されており、ＣＣ４９（ＡＴＣＣ番号ＨＢ９４５９）を包含する。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）ＣＣ４９は、パンカルシノーマ腫瘍結合抗原ＴＡＧ−７２と反応するＢ７２．３の第２世代の抗体である。放射性標識ＭＡｂ ＣＣ４９は、動物モデルならびに進行中の放射線免疫治療および放射線免疫診断の臨床試験の両方において腫瘍を標的とすることが示されている（Divgi et al. (1994) Nucl. Med. Biol., 21: 9-15; Meredith et al. (1994), J. Nucl. Med., 35: 1017-1022; Mulligan et al. (1995), Clin. Cancer Res., 1: 1447-1454; Arnold et al. (1992), Ann. Surgey, 216: 627-632）。ＭＡｂ ＣＣ４９の潜在的臨床有用性は、当該抗体を用いる動物実験ならびに進行中の臨床試験の両方から明らかである。しかしながら、ＭＡｂ ＣＣ４９を投与された患者はＨＡＭＡ応答を発生させる（Divgi et al. (1994) Nucl. Med. Biol., 21: 9-15; Mulligan et al. (1995), Clin. Cancer Res., 1: 1447-1454）。
【０００７】
ヒト化モノクローナル抗体（ＨｕＣＣ４９）は、モノクローナル抗体ＣＣ４９由来の超可変領域をヒトモノクローナル抗体ＬＥＮおよび２１／２８’のそれぞれ可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）フレームワーク中に移植することにより得られたものであるが、抗原結合部位の構造の完全性に必要なネズミフレームワーク残基を保持している（Kashmiri et al., (1995) Hybridoma, 14(5): 461-473参照）。このＨｕＣＣ４９は、低親和性にもかかわらずＴＡＧ−７２抗原に結合することが示された、ヒト腫瘍異種移植片を有する動物モデルにおいて同等の腫瘍標的化を示した。
【０００８】
抗原／抗体表面の相補性においてＣＤＲのすべての残基が重要であるとは限らないことが示されている。抗原−抗体複合体の既知構造は、ＣＤＲ残基のわずか２０〜３３％のみが抗原接触に関与している（Padlan, (1994) Mol. Immunol., 31: 169-217）。公知結合部位の配列および３次元構造の利用可能なデータの包括的な分析により、抗原抗体相互作用において最も重要でありうるＣＤＲ残基の同定が促進された（Padlan et al., (1995) FASEB J. 9: 133-139）。これらの残基は特異性決定残基（ＳＤＲ）と命名されている。特異性決定残基は抗体ごとに異なる。
【０００９】
概要
本発明は、最小のネズミ抗体含量を有するＣＣ４９モノクローナル抗体のマウス−ヒトキメラ変種であって、ヒト患者に投与された場合、最小の不利な応答を誘発する変種に指向される。また本発明は、変種の生物工学的製造方法ならびに変種を用いる治療方法にも指向される。
【００１０】
本発明の第１の態様は、ＣＣ４９の全部で６個（３個の重鎖および３個の軽鎖）の相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち６個未満が存在しているヒト化モノクローナル抗体（ＨｕＣＣ４９）のＣＤＲ変種を提供する。本発明の第２の態様は、ＣＣ４９由来の少なくとも１個のＣＤＲの特異性決定領域（ＳＤＲ）のみが存在しているヒト化モノクローナル抗体（ＨｕＣＣ４９）のＳＤＲ変種を提供する。驚くべきことに、本発明のＣＣ４９変種は、全部で６個（３個の重鎖および３個の軽鎖）のＣＤＲを含むヒト化ＣＣ４９モノクローナル抗体と同じかまたは類似の結合親和性を有する。
【００１１】
詳細には、本発明は、Ｌ−ＣＤＲ１またはＬ−ＣＤＲ２、あるいは両方がヒトモノクローナル抗体（ＬＥＮ）（ＬＥＮ  Ｌ−ＣＤＲ１およびＬＥＮ  Ｌ−ＣＤＲ２は、それぞれ配列番号：７および８に対応する）に由来するものであるＨｕＣＣ４９の変種に関する。これらのＨｕＣＣ４９変種はＨｕＣＣ４９と実質的に同じ親和性を有するか、あるいは低くともＨｕＣＣ４９の２分の１の相対親和性を示す。
【００１２】
他の適当な変種は、ＣＣ４９由来のＬ−ＣＤＲ１および／またはＬ−ＣＤＲ２がヒト抗体由来の対応ＣＤＲに置換されていること以外に軽鎖の位置９７において対応ヒト残基を含んでいる。もう１つの具体例において、変種は、ＣＣ４９由来のＬ−ＣＤＲ１および／またはＬ−ＣＤＲ２がヒト抗体由来の対応ＣＤＲに置換されている以外に軽鎖の位置９７において置換されており、重鎖の位置６０、６１、６２および６４における置換と組み合わされている。もう１つの具体例において、変種は、重鎖の位置６０、６１、６２および６４における置換と組み合わされた軽鎖の位置９７における置換を含む。
配列表
添付の配列表に記載される核酸およびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基に関する一般的な文字略号およびアミノ酸に関する三文字表記を用いて表される。添付の配列表において、
配列番号：１は、ネズミ抗体ＣＣ４９およびヒト化抗体ＨｕＣＣ４９の軽鎖に由来するＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号：２は、ネズミ抗体ＣＣ４９およびヒト化抗体ＨｕＣＣ４９の軽鎖に由来するＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号：３は、ネズミ抗体ＣＣ４９およびヒト化抗体ＨｕＣＣ４９の軽鎖に由来するＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号：４は、ネズミ抗体ＣＣ４９およびヒト化抗体ＨｕＣＣ４９の重鎖に由来するＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号：５は、ネズミ抗体ＣＣ４９およびヒト化抗体ＨｕＣＣ４９の重鎖に由来するＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号：６は、ネズミ抗体ＣＣ４９およびヒト化抗体ＨｕＣＣ４９の重鎖に由来するＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号：７は、ヒト抗体ＬＥＮの軽鎖に由来するＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号：８は、ヒト抗体ＬＥＮの軽鎖に由来するＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号：９は、ヒト抗体ＬＥＮの軽鎖に由来するＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１０は、ヒト抗体２１／２８’ＣＬの重鎖に由来するＣＤＲ１のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１１は、ヒト抗体２１／２８’ＣＬの重鎖に由来するＣＤＲ２のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１２は、ヒト抗体２１／２８’ＣＬの重鎖に由来するＣＤＲ３のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１３は、ヒト化ネズミ抗体ＨｕＣＣ４９のＶＬ領域のアミノ酸配列を表す。
配列番号：１４は、ヒト化ネズミ抗体ＨｕＣＣ４９のＶＨ領域のアミノ酸配列を表す。
配列番号：３３〜３６は、ヒト抗体ＬＥＮのＶＬ領域のフレームワークの連続部分のアミノ酸配列を表す。
配列番号：３７〜４０は、ヒト抗体２１／２８’ＣＬのＶＨ領域のフレームワークの連続部分のアミノ酸配列を表す。
【００１３】
定義
本発明を説明する前に、本開示に使用する特定の用語の定義を以下に説明する：
抗体：この用語は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラおよびヘテロ免疫グロブリン（モノクローナル抗体が好ましい）に属する１本鎖、２本鎖、および複数鎖の蛋白ならびに糖蛋白をいう。また、該用語は、合成および遺伝子操作によるこれらの免疫グロブリンの変種も包含する。「抗体フラグメント」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ’)2、およびＦｖフラグメント、ならびに所望標的エピトープに対する特異性を有する抗体のいずれかの部分を包含する。
キメラ抗体：この用語は、典型的には異なる種である２種の異なる抗体に由来する配列を含む抗体をいう。最も典型的には、キメラ抗体はヒトおよびネズミ抗体フラグメント、一般的にはヒト不変およびネズミ可変領域を含む。
ヒト化抗体：この用語は非ヒト抗体、典型的には、ネズミ由来の抗体をいい、そして、親抗体の抗原結合特性を保持または実質的に保持しているが、ヒトにおいてより免疫原性が低いヒト抗体をいう。
相補性決定領域、またはＣＤＲ：この用語は、一緒になって本来の免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を定義するアミノ酸配列をいう。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖はそれぞれ３個のＣＤＲを有し、それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と命名されている。Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda (ＮＩＨ出版物No. 91-3242)によりによる番号付け協定を用いた定義によれば、軽鎖のＣＤＲは位置２４および３４（Ｌ−ＣＤＲ１）、５０および５６（Ｌ−ＣＤＲ２）、８９および９７（Ｌ−ＣＤＲ３）における残基により結合されている。重鎖のＣＤＲは位置３１および３５ｂ（Ｈ−ＣＤＲ１）、５０および６５（Ｈ−ＣＤＲ２）、９５および１０２（Ｈ−ＣＤＲ３）における残基により結合されている。
フレームワーク領域：この用語はＣＤＲ間に挟まれたアミノ酸配列をいう。抗体のこれらの部分は、抗原結合のために正しい方向にＣＤＲを保持することに役立つ。
特異性決定残基、またはＳＤＲ：この用語は、抗原接触に直接関与する免疫グロブリンのアミノ酸残基をいう。
不変領域：この用語は、エフェクター機能を付与する抗体分子の部分をいう。本発明において、変種抗体はヒト免疫グロブリン由来の不変領域を包含する。重鎖不変領域を５種のイソタイプ：アルファ、デルタ、エプシロン、ガンマまたはミューのいずれからも選択することができる。種々のサブクラス（ＩｇＧサブクラスの重鎖のごとき）の重鎖は異なるエフェクター機能の原因となる。よって、所望重鎖不変領域を選択することにより、所望エフェクター機能を有するヒト化抗体を得ることができる。軽鎖不変領域はカッパまたはラムダタイプであってもよく、好ましくはカッパタイプである。
哺乳動物：この用語は、乳腺により分泌される乳で乳幼児を育てる動物をいい、好ましくは温血哺乳動物をいう。
免疫原性：蛋白標的化能の尺度あるいはレシピエントに投与された場合の免疫応答（体液性または細胞性）を誘発する治療的部分の能力の尺度である。本発明は、ヒト化抗体ＣＣ４９の免疫原性に関する。
低下した免疫原性：この用語は、親抗体と比較して低下した免疫原性を示す抗体、典型的にはヒト化抗体をいう。
免疫反応性：特異的抗原を認識し、結合する免疫グロブリンの能力の尺度である。
実質的に類似の結合特性：この用語は、ヒト化抗体を製造するのに使用される親抗体により認識される抗原に特異的に結合する能力を保持しているヒト化抗体をいう。好ましくは、ヒト化抗体の親和性は親抗体の少なくとも約１０％、より好ましくは少なくとも約２５％、さらにより好ましくは少なくとも約５０％である。最も好ましくは、ヒト化抗体は親抗体の親和性の少なくとも約７５％の抗原結合親和性を示す。抗原結合親和性のアッセイ方法は当該分野においてよく知られており、半−最大結合アッセイ、競合アッセイ、およびスキャッチャード分析（Scatchard analysis）を包含する。
実質的に均一：対照免疫グロブリンに対して少なくとも約８５％の同一性、より好ましくは約９０％の同一性、最も好ましくは約９５％の同一性を示す免疫グロブリン配列をいう。ここに同一性％は２つの免疫グロブリン間の同一アミノ酸残基数を比較することにより決定され、アミノ酸残基の位置はKabat番号付けスキームを用いて示される。
命名法：核酸、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性基等を略号で示す場合には、ＩＵＰＡＣ ＩＵＢ（Commission on Biological Nomenclature）または当該分野における慣習に従って略号で示す。
【００１４】
詳細な説明
本発明の理解を容易にするために、典型的な抗体分子の構造に関する議論を最初に提供する。基本的な免疫学的構造単位を図１に示す。抗体（免疫グロブリンともいう）は４本のポリペプチド鎖、すなわち２本の重鎖および２本の軽鎖から構築されている。２本の重鎖はジスルフィド結合により互いに結合しており、各重鎖はジスルフィド結合により軽鎖に結合している。２つのタイプの軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）がある。抗体分子の機能活性を決定する５つの主要な重鎖のクラス（またはイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥがある。
【００１５】
各鎖は別個の配列ドメインを含む。軽鎖は２つのドメイン、可変ドメイン（ＶＬ）および不変ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は４つのドメイン、１つの可変ドメイン（ＶＨ）および３つの不変ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、あわせてＣＨという）を含む。軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の可変領域は抗原に対する結合認識および特異性を決定する。軽（ＣＬ）および重（ＣＨ）鎖の不変領域ドメインは、抗体鎖結合、分泌、経胎盤移動性、相補的結合、およびＦｃ受容体への結合のごとき重要な生物学的特性を付与する。Ｆｖフラグメントは、１本の軽鎖および１本の重鎖の可変部分からなる免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分である。抗体の特異性は抗体結合部位と抗原決定基との間の構造上の相補性に存する。抗体結合部位は、主として超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基から構成されている。場合によっては、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基がドメイン構造全体に影響し、それゆえ結合部位に影響する。
【００１６】
本発明の変種はヒト化ＣＣ４９（「親のＨｕＣＣ４９」という）に由来するものである。親のＨｕＣＣ４９は、全部で６個（３個の重鎖および３個の軽鎖）のＭＡｂ ＣＣ４９の超可変領域を、それぞれ、ヒトＭＡｂ ＬＥＮおよび２１／２８’ＣＬの可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）フレームワークに移植することにより得られ、抗原結合部位構造の完全性に必要とされうるネズミフレームワーク残基を保持している（図１１）。（Kashmiri et al., (1995) Hybridoma 14: 461-473）。本発明の変種はＨｕＣＣ４９と比較するとネズミ含量が低く、結果的に免疫原性が低い。それにもかかわらず、本発明の変種は、ＨｕＣＣ４９と実質的に同様の結合親和性を有している。好ましくは、結合親和性は少なくとも約１０８Ｍ−１である。本明細書においてＨｕＣＣ４９はKashmiriらによって得られたヒト化抗体をいう。用語「変種ＨｕＣＣ４９」または「変種」は本発明の免疫グロブリンをいう。
【００１７】
本発明の第１の態様は、ＣＣ４９の全部で６個（３個の重鎖および３個の軽鎖）の相補性決定領域（ＣＤＲ）のうち６個未満が存在するヒト化モノクローナル抗体（ＨｕＣＣ４９）のＣＤＲ変種を提供する。本発明の第２の態様は、ＣＣ４９由来の少なくとも１個のＣＤＲの特異性決定領域（ＳＤＲ）のみが存在するヒト化モノクローナル抗体（ＨｕＣＣ４９）のＳＤＲ変種を提供する。
【００１８】
ＣＤＲ変種
本発明によれば、ＨｕＣＣ４９中のＣＣ４９の少なくとも１個のＣＤＲをヒト抗体由来の対応ＣＤＲに置換することによりＣＤＲ変種が得られる。好ましくは、ＣＣ４９由来のＬ−ＣＤＲ１またはＬ−ＣＤＲ２、あるいは両方を、ヒト抗体由来の対応ＣＤＲに置き換える。本発明者は、ＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ３、Ｈ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２またはＨ−ＣＤＲ３のいずれかがヒト抗体由来の対応ＣＤＲによって置換されている変種が有意な結合親和性を保持していないことを見出した。
【００１９】
ＣＤＲ変種の結合親和性
本発明によれば、ＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ１またはＬ−ＣＤＲ２、あるいは両方がヒト抗体由来の対応ＣＤＲによって置換されているＣＤＲ変種は、親のＣＣ４９の結合親和性と実質的に同様の生物学的活性を保持している。一般的には、本発明のＣＤＲ変種は、親のＣＣ４９の結合親和性の約２５％ないし約５０％、より好ましくは約５０％ないし７５％、最も好ましくは約７５％ないし約１００％を有している。
Ｈ−ＣＤＲ２がヒト抗体由来の対応ＣＤＲに置換されているＣＤＲ変種はＴＡＧ−７２とわずかに免疫反応する。詳細には、かかる変種はＣＣ４９の約３００分の１未満の相対結合親和性を有する。
Ｌ−ＣＤＲ３、Ｈ−ＣＤＲ１、またはＨ−ＣＤＲ３がヒト抗体の対応ＣＤＲによって置換されているＣＤＲ変種はＴＡＧ−７２に対する結合親和性を保持していないと思われる。
【００２０】
ＣＤＲ変種の免疫原性
ＨｕＣＣ４９と比較した場合に低下した免疫原性を有するＣＤＲ変種は、ＣＣ４９由来の全部で６個（３個の重鎖および３個の軽鎖）ＣＤＲを、それぞれ、ヒトＭＡｂ ＬＥＮおよび２１／２８’ＣＬの可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）フレームワーク上に移植することにより得られる。すなわち、本発明のＣＤＲ変種は抗−イディオタイプまたはＨＡＭＡ応答を誘発する可能性が低い。親のＣＣ４９を認識する「抗−ＣＣ４９」抗体が親のＭＡｂおよび変種の両方に曝露される当該分野において知られた競合ラジオイムノアッセイを用いて免疫原性を特徴づけることができる。一般的には、免疫原性の低下は抗−ＣＣ４９抗体による変種への結合の低下により反映される。
ＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ１またはＬ−ＣＤＲ２、あるいは両方がヒト抗体由来の対応ＣＤＲによって置換されているＣＤＲ変種はわずかに低下した免疫原性を示し、すなわち、該変種は抗−ＣＣ４９ならびにＨｕＣＣ４９に結合しない。
ＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ３またはＨ−ＣＤＲ２がヒト抗体由来の対応ＣＤＲによって置換されているＣＤＲ変種は実質的に低下した免疫原性を示す。しかしながら、本発明者は、かかる変種が実質的に低下した免疫反応性も示すことを見出した。
ＣＣ４９のＨ−ＣＤＲ１またはＨ−ＣＤＲ３がヒト抗体由来の対応ＣＤＲによって置換されているＣＤＲ変種は免疫原性の測定可能な変化を示さない。
【００２１】
ＳＤＲ変種
本発明者は、活性を保持するにはヒト化抗体においてＣＣ４９の６個のＣＤＲの全部が完全である必要はないことを見出した。抗原接触に直接関与する残基のみ、すなわち、特異性決定残基（ＳＤＲ）のみが必要である。ＳＤＲ変種は、ＨｕＣＣ４９中のＣＣ４９の少なくとも１個のＳＤＲを、ヒト抗体の対応位置の残基に置き換えることにより得られる。
すべてのＣＤＲがＳＤＲを含んでいるわけではないことに注意すべきである。それゆえ、本発明の１の変種において、Ｌ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２がヒトＣＤＲに完全に置換される。しかしながら、これらのＣＤＲ中の残基を対応ヒト残基に置き換えることによりＳＤＲ変種を得ることができる。ＣＣ４９およびＬＥＮ由来のＬ−ＣＤＲ１は３つの位置、すなわち２７ｂ、２７ｆおよび２９において異なる。残基２７ｂ、２７ｆおよび２９はＣＣ４９の結合親和性により重要であるので、適当なＳＤＲ変種はこれらの位置のいずれかにおいて、あるいはこれらの位置のいずれかの組み合わせにおいて対応ヒト残基を含んでいてもよい。ＣＣ４９およびＬＥＮ由来のＬ−ＣＤＲ２は位置５３においてのみ異なる。残基５３はＣＣ４９の結合親和性にとり重要であるとは考えられない。よって、適当な変種は位置５３に対応ヒト残基を含んでいてもよい。
【００２２】
ＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ３は３つの位置、すなわち９４、９６および９７においてＬＥＮとは異なる。位置９７における部分的に埋まっている残基はＣＣ４９の抗原結合活性にとり重要ではない。よって、適当なＳＤＲ変種は位置９７において対応ヒト残基を含んでいてもよい。しかしながら、Ｌ−ＣＤＲ３の位置９４および９６はリガンド接触に関与しており、機能的なＳＤＲ変種を得るためには置換すべきでない。
【００２３】
ＣＣ４９および２１／２８’ＣＬのＨ−ＣＤＲ１は３つの位置、すなわち２１、３２および３４において異なる。しかしながら、位置３２および３４において対応ヒト残基を含むＳＤＲ変種は抗原結合親和性を示さない。よって、機能的なＳＤＲ変種はこれらの位置のいずれにも対応ヒト残基を含むべきでない。
【００２４】
ＣＣ４９のＨ−ＣＤＲ２は１１個の位置においてヒトＭＡｂ ２１／２８’ＣＬと異なる。位置６０、６１、６２および６４における残基は抗原結合活性に必要ない。それゆえ、本発明のＳＤＲ変種は位置６０、６１、６２および６４のいずれの位置において、あるいはそれらのいずれかの組み合わせにおいて対応ヒト残基を含んでいてもよい。
一般的には、Ｈ−ＣＤＲ３は、ＳＤＲ変種の設計において考慮される必要はない。なぜなら、それは親の血清に対して反応性を示さないからである。
【００２５】
好ましい具体例において、変種は低下した免疫原性および親のＣＣ４９と実質的に同様の結合親和性を得るためのＣＤＲおよび／またはＳＤＲ置換の組み合わせを含んでいる。適応な組み合わせは、ＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２の両方がヒト抗体由来の対応ＣＤＲによって置換されているＣＤＲ変種を含む。他の適当な変種はＳＤＲおよびＣＤＲ置換の組み合わせを含むものである。例えば、適当な変種は、ＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ１および／またはＬ−ＣＤＲ２のヒト抗体由来の対応ＣＤＲでの置換のほかに、軽鎖の位置９７において対応ヒト残基を含む。もう１つの好ましい具体例において、変種は、重鎖上の位置６０、６１、６２および６４における置換と組み合わせられた軽鎖上の位置９７における置換を含む。さらにもう１つの具体例において、変種は、重鎖上の位置６０、６１、６２および６４における置換と組み合わされた、ＣＣ４９由来のＬ−ＣＤＲ１および／またはＬ−ＣＤＲ２のヒト抗体由来の対応ＣＤＲでの置換のほかに軽鎖上の位置９７における置換を含む。
【００２６】
ここで詳細に説明する変種のほかに、当業者によく知られた種々の組み換えＤＮＡ法を用いて他の「実質的に相同的な」修飾された免疫グロブリンを容易に設計し、製造することができる。例えば、フレームワーク領域を１次構造レベルで変化させてもよい。そのうえ、変種作成の基礎として種々の異なるヒトフレームワーク領域を単独または組み合わせて用いてもよい。一般的には、部位特異的突然変異法のごとき種々のよく知られた方法により遺伝子の修飾を容易に行うことができる。
【００２７】
別法として、変種の免疫反応特性を実質的に保持している１次抗体構造の一部分のみを含むポリペプチドフラグメントを製造してもよい。これらのポリペプチドフラグメントは、当該分野においてよく知られた方法による無処理の抗体の蛋白分解的開裂により得られるフラグメント、あるいは部位特異的突然変異を用いてヌクレオチド配列の所望位置に停止コドンを挿入することにより得られるフラグメントを包含する。例えば、停止コドンをＣＨ１の後に挿入してＦａｂフラグメントを得ることができ、あるいはヒンジ領域の後に挿入してＦ(ａｂ’)2フラグメントを得てもよい。１本鎖抗体ならびに変種の少なくとも１つの免疫反応性フラグメントを含む融合蛋白も本発明の範囲内に含まれる。例えば、変種を治療活性を有するエフェクター部分に直接または間接的に結合させてもよい。適当なエフェクター部分はサイトカイン、細胞毒素、放射性核種、薬剤、イムノモジュレーター、治療的酵素、抗−増殖剤等を包含する。かかるエフェクターに抗体を結合させる方法は当該分野においてよく知られている。
【００２８】
ＳＤＲ変種の結合親和性
ＣＣ４９およびＬＥＮ由来のＬ−ＣＤＲ１は３つの位置、すなわち２７ｂ、２７ｆおよび２９において異なる。抗原結合反応性を有意に失わせることなくＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ１をＬＥＮ由来の対応ＣＤＲに置換することができるので、残基２７ｂ、２７ｆ、２９はＣＣ４９の結合親和性にとり重要であるとは考えられない。よって、本発明の変種は、これら３つの位置のいずれかにおいて、あるいはそれらのいずれかの組み合わせにおいて対応ヒト残基を含んでいてもよく、親のＨｕＣＣ４９の結合親和性と実質的に同様の結合親和性を保持しているものである。
【００２９】
Ｌ−ＣＤＲ２において、ＣＣ４９およびＬＥＮは位置５３においてのみ異なる。抗原結合活性を有意に失わせることなくＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ２をＬＥＮ由来の対応ＣＤＲに置換することができるので、残基５３はＣＣ４９の結合親和性にとり重要でないと考えられる。よって、本発明のヒト化抗体は位置５３において対応ヒト残基を含んでいてもよく、親のＨｕＣＣ４９の結合親和性と実質的に同様の結合親和性を有するものである。
【００３０】
ＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ３は３つの位置、すなわち９４、９６および９７においてＬＥＮと異なる。位置９７における部分的に埋まっている残基はＣＣ４９の抗原結合活性にとり重要ではない。よって、本発明のヒト化抗体は位置９７において対応ヒト残基を含んでいてもよく、ＨｕＣＣ４９の相対結合親和性と実質的に同様の結合親和性を有するものである。しかしながら、Ｌ−ＣＤＲ３の位置９４および９６はリガンド接触に関与していると思われる。それゆえ、一般的には、位置９４または９６のいずれか、あるいは両方において対応ヒト残基を含むＳＤＲ変種は、抗原結合反応性を完全にあるいはほとんど完全に失っているであろう。
【００３１】
ＣＣ４９および２１／２８’ＣＬのＨ−ＣＤＲ１は３つの位置、すなわち３１、３２および３４において異なる。位置３２および３４において対応ヒト残基を含むＳＤＲ変種は抗原結合親和性を示さない。
【００３２】
ＣＣ４９のＨ−ＣＤＲ２は１１個の位置においてヒトＭＡｂ ２１／２８’ＣＬと異なる。位置６０、６１、６２および６４における残基は抗原結合活性にとり必要でないと思われる。それゆえ、本発明のヒト化抗体は、位置６０、６１、６２および６４のいずれかにおいて、あるいはそれらのいずれかの組み合わせにおいて対応ヒト残基を含み、該変種はＣＣ４９と実質的に同様の結合親和性を保持しているであろう。
【００３３】
ＳＤＲ変種の免疫原性
免疫反応性にとり重要ないくつかのＣＤＲ（例えば、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２）は免疫原性でもあるので、ＳＤＲ変種は特に有益である。よって、Ｌ−ＣＤＲ３およびＨ−ＣＤＲ２中の種々のＳＤＲ置換体の免疫原性を調べた。
図２に示すように、Ｌ−ＣＤＲ３は残基８９〜９７からなり、Ｈ−ＣＤＲ２は残基５０〜６５からなる。本発明者は、位置３２および３４（Ｈ−ＣＤＲ１中に見出される）に対応ヒト残基を含むＳＤＲ変種がやはり免疫原性であることを見出した。一方、位置６０、６１、６２および６４（Ｈ−ＣＤＲ２中に見出される）あるいは位置９４（Ｌ−ＣＤＲ３中に見出される）に対応ヒト残基を含むＳＤＲ変種は免疫原性の低下を示す。位置９６（Ｌ−ＣＤＲ３中に見出される）に対応ヒト残基を含むＳＤＲ変種は免疫原性であるとは思われない。
一般的には、ＳＤＲ変種の設計の際に、Ｈ−ＣＤＲ３中に見出される残基は考慮される必要がない。なぜなら、それは親の血清の反応性を示さないからである。
【００３４】
ヒト抗体
適当なヒト抗体は、ROY、 AU、 REI、 HAU、 HK101'CL、 SCW、 WEA、 HK137'CL、 HK134'CL、 DAUDI'CL、 WALKER'CL、 GAL(1)、 LAY、 WES、 Vb'CL、 HK102'CL、 EU、 DEN、 AMYLOID BAN、 MEV、 Vd'CL、 Va'CL、 KUE、 Ve'CL、 V13'CL、 V18A'CL、 V19A'CL、 V19B'CL、 V18C'CL、 NIM、 CUM、 GM603CL、 FR、 RP M1-6410'CL、 TI、 WOL、 SIE、 NG9'CL、 NEU、 GOT、 PAY、 SON. GAR'、 PIE、 FLO、 GLO、 CUR、 IARC/BL41'CL、 POM、 REE、 K-EV15'CL、 VJI'CL、 VKAPPAIV、 GERMLINE'CL、 PB171'CL、 LEN、 NEWM、 HA、 NIG-64、 NEW、 BL2'CL、 WAH、 NIG-77、 VOR、 RHE、 LOC、OKA、 COX、 NIG-51、 NIG-84、 MES、 WH、 NEI、 WEIR、 TOG、 TRO、 BOH、 NIG-58、 VIL、 WIN、 41'CL、 HIL、 LAP、 GAR、 MOT、 BO、 MDG、 AMYLOID-AR、 SUT、 THO、 LBV'CL、 NIG-48、 HG3'CL、 ND'CL、 COR、 DAW、 OU、 MCE'、 CE-1'CL、 HE、 SUP-T1、 VH-JA'CL、 HIG1'CL、 TUR、 LAMDA-VH26'CL、 WAS、 H11'CL、 TEI、 BRO'IGM、 GRA'、 ZAP、 JON、 DOB、 NIE、 333'CL、 1H1'CL、 1B11'CL、 126'CL、 112'CL、 115'CL、 KOL および 21/28'CLを包含るが、これらに限らない。新たなヒト抗体が見出され、配列決定されているが、今のところ未知であるそれらの中の多くの抗体も適当であるかもしれない。好ましくは、ヒト抗体は、ヒト生殖系配列と同一または実質的に類似（出来る限り少ない変異を含む）の配列を有する。例えば、ＨｕＣＣ４９中のＣＣ４９の軽鎖ＣＤＲをＬＥＮ（Kabat et al., 1991）由来の対応ＣＤＲに置換することができ、重鎖ＣＤＲを２１／２８’ＣＬ（Kabat et al., 1991）由来の対応ＣＤＲに置換することができる。
【００３５】
製造方法
適切なＤＮＡ配列を発現制御配列に作動可能に連結（発現制御配列の機能を確実に発揮させるように配置）した後、適当なＤＮＡ配列を宿主において発現させることにより本発明の変種を得ることができる。典型的には、かかる発現ベクターは、エピソームとして、あるいは宿主染色体ＤＮＡの必須の一部として、宿主において複製可能である。典型的には、発現ベクターは、複製開始点のごとき宿主細胞に適合する発現制御配列を含む。さらに、典型的には、発現ベクターはプロモーターを含む。適当なプロモーターはポリヘドリンプロモーター、ラクトースプロモーター系、トリプトファンプロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはラムダファージ由来のプロモーター系を包含する。典型的には、プロモーターは、場合によってはオペレーター配列とともに遺伝子の発現を制御し、転写および翻訳を開始および完了させるためのリボソーム結合部位等を有している。通常には、発現ベクターは選択マーカーを含むであろう。抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡ配列を別々の発現ベクター中に挿入してもよく、あるいは同じ発現ベクター中に挿入してもよい。
【００３６】
適当な宿主は、E. coli；Bacillus subtilisを包含するBacilli；Salmonella、SerratiaおよびPseudomonasを包含する腸内細菌のごとき原核細胞を包含する。また適当な宿主は、Saccharomycesを包含する酵母；Pichia pastoris；Ｓｆ９昆虫細胞；Sp2/0、VEROおよびHeLa細胞、Chinese hamster卵巣（ＣＨＯ）細胞系；W138、BHK、COS-7およびMDCK細胞系を包含する。
【００３７】
細胞宿主のタイプに応じたよく知られている方法により目的のＤＮＡセグメントを含むベクターを宿主細胞中に移すことができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクション、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーションまたはカチオン性リポソームにより媒介されるトランスフェクション（DOTAPのごとき）がある。リガンドへの受容体の結合を検出するための当該分野でよく知られた種々の方法によって、うまく形質転換された細胞を同定することができる。
発現されたならば、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、およびゲル電気泳動を包含する当該分野の標準的方法によって遺伝子産物を精製することができる。少なくとも約９０％ないし約９５％の均質性を有する実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８％ないし９９％、あるいはそれよりも高い均質性を有するものが医薬用途に最も好ましい。
【００３８】
使用方法
精製されたならば、本発明の変種を治療的に用いてもよく、あるいはアッセイの開発および実行、インビボまたはインビトロ診断法、ならびに造影に使用してもよい。本発明の変種は、癌のごとき疾病の治療、詳細には、癌の治療または検出に有用である。変種を単独であるいは医薬処方中に含ませて患者に投与することができる。典型的には、医薬上許容される、無毒の滅菌済み担体中に変種を含ませて懸濁液または溶液とする。本発明の抗体を、別々に投与される組成物として使用することができ、あるいは化学療法剤または免疫抑制剤と組み合わせて投与することができる。
【００３９】
変種は、癌の治療に使用した場合、ユニークな利益を提供する。悪性細胞に特異的に結合し、非癌細胞に結合することなく腫瘍をくい止める能力のほかに、変種はＨｕＣＣ４９と比較した場合、低下した免疫原性を有する。
診断目的には、抗体を標識してもよく、標識しなくてもよい。未標識抗体を、ヒト免疫グロブリン不変領域に特異的な抗体のごときヒト化抗体と反応する他の標識抗体（第２抗体）と組み合わせて使用することができる。別法として、抗体を直接標識することもできる。放射性核種、蛍光物質、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素阻害剤、リガンド（特に、ハプテン）等のごとき広範な標識を用いることができる。多くのタイプのイムノアッセイが利用可能であり、当業者によく知られている。
【００４０】
本発明のキットは、融解するこよにより、あるいは液体担体中に懸濁することにより復元される凍結または凍結乾燥変種を含む。キットは担体またはバッファーを含んでいてもよい。好ましくは、キットは変種抗体を復元させて使用するための説明書も含む。
【００４１】
実施例
結合に必須のＣＤＲを同定するために、バキュロウイルス発現系を用いて変種ＨｕＣＣ４９ ＭＡｂのパネルを得た。Kashmiri et al., (1995) Hybridoma, 14: 461-473に記載されたようにして、ＭＡｂ ＣＣ４９ ＣＤＲを、それぞれ、ヒトＭＡｂ ＬＥＮおよび２１／２８’ＣＬのＶＬおよびＶＨフレームワーク上に移植することによりＨｕＣＣ４９を調製した。軽鎖または重鎖いずれかの１個のＣＣ４９ ＣＤＲを対応ヒト抗体ＣＤＲ（それぞれ、ＬＥＮおよび２１／２８’ＣＬ）に置換することにより６個のＣＤＲ変種を構築した。変種をＬ−１、Ｌ−２、Ｌ−３、Ｈ−１、Ｈ−２またはＨ−３と命名した。２個のＣＣ４９の軽鎖ＣＤＲ（Ｌ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２）をヒト抗体ＬＥＮの対応ＣＤＲに置換することにより７番目の変種Ｌ−１，２を作成した。
ネズミＣＤＲをヒト抗体超可変領域に置換することのみによって７個のＣＤＲ変種を誘導体化し、すべての変種は同一のＶＨおよびＶＬフレームワークならびにγ１およびκ鎖不変領域を担持している。
ＣＤＲ中またはＣＤＲ付近の置換突然変異ヌクレオチドによりＳＤＲ重鎖および軽鎖変種を構築した。
【００４２】
実施例Ｉ：ＣＤＲ置換されたＭＡｂ ＣＣ４９の調製
本発明によれば、ＨｕＣＣ４９中の少なくとも１個のＣＣ４９のＣＤＲをヒト抗体由来の対応ＣＤＲに置換することによりＣＤＲ変種を得る。本発明のＣＤＲ変種は下記のものを包含する：
・変種Ｌ−１：ＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ１（配列番号：１）がＬＥＮのＬ−ＣＤＲ１に置換されたもの（配列番号：７）。
・変種Ｌ−２：ＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ２（配列番号：２）がＬＥＮのＬ−ＣＤＲ２に置換されたもの（配列番号：８）。
・変種Ｌ−３：ＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ３（配列番号：３）がＬＥＮのＬ−ＣＤＲ３に置換されたもの（配列番号：９）。
・変種Ｌ−１，２：ＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２（それぞれ配列番号：１および２）がＬＥＮのＬ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２に置換されたもの（それぞれ配列番号：７および８）。
・変種Ｈ−１：ＣＣ４９のＨ−ＣＤＲ１（配列番号：４）が２１／２８’ＣＬのＨ−ＣＤＲ１に置換されたもの（配列番号：１０）。
・変種Ｈ−２：ＣＣ４９のＨ−ＣＤＲ２（配列番号：５）が２１／２８’ＣＬのＨ−ＣＤＲ２に置換されたもの（配列番号：１１）。
・変種Ｈ−３：ＣＣ４９のＨ−ＣＤＲ３（配列番号：６）が２１／２８’ＣＬのＨ−ＣＤＲ３に置換されたもの（配列番号：１２）。
【００４３】
ＶＨ変種を得るためのオリゴマーの製造
Kashmiri et al., (1995) Hybridoma 14: 461-473により記載された重複伸長ＰＣＲ法を用いて３種の変種ＶＨ遺伝子の合成を行った。１２４〜１３７塩基対の長さの４種の重複オリゴヌクレオチド（それらの鎖を互い違いにすると、それらは一緒になってＶＨ遺伝子の配列全体を含む）を用いて変種ＶＨ遺伝子を得た（図１２Ｂ）。オリゴマーはMidland Certified Reagent Co., Midland, TXから得た。鋳型ＤＮＡのかわりに、ＰＣＲ混合物は２ピコモルの４種のオリゴヌクレオチドを含有していた。９４℃で１分の変性、５５℃で２分のプライマーアニーリング、次いで７０℃で２分の伸長工程からなるサイクルを３サイクル行い、その後、変性（９４℃、１分）、プライマー伸長（５５℃２分）、次いで伸長（７２℃、１分）からなるサイクルを１７サイクル行うことによりＰＣＲを行った。１００μＭの各ｄＮＴＰ、５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）および２０ｐｍｏｌの各末端プライマーを含有する最終体積１００μｌのＰＣＲバッファー中ですべてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。
【００４４】
ＶＬ変種を得るためのオリゴマーの製造
３０〜４３塩基のオリゴヌクレオチドを突然変異プライマーとして使用して３種の変種ＶＬ遺伝子を得た。オリゴヌクレオチドは標的ＣＤＲ中に所望の塩基変化を含んでいた。８７００型ＤＮＡ合成装置（Miligen/Biosearch, Burlington, VT）を用いてＶＬ遺伝子用の突然変異誘発プライマーを合成した（図１２Ａ）。Landt et al., (1990) Gene, 96: 125-128により記載されたようにして２工程ＰＣＲ法によりプライマー誘発突然変異を行った。ｐＬＮＸＣＨｕＣＣ４９ＨｕＫ（Kashmiri et al., (1995) Hybridoma 14: 461-473）（図２）を両工程の鋳型として使用した。第１工程において、突然変異誘発プライマーを３’プライマーとして使用し、２０ヌクレオチドの長さの末端プライマーは５’プライマーとして役立った。第１ＰＣＲの生成物をゲル精製し、第２ＰＣＲの５’プライマーとして使用し、２０ヌクレオチドの長さの末端プライマーを３’プライマーとして使用した。ＤＮＡ増幅に使用した２０ヌクレオチドの長さの末端プライマーをMidland Certified Reagent Co., Midland, TXから得た。これらのプライマーの配列はKashmiri et al., (1995) Hybridoma 14: 461-473により報告されており、以下のとおりである：
1.            5' VH, 5'-CTA AGC TTC CAC CAT GGA G-3'（配列番号：２３）
2.            3' VH, 5'-ATG GGC CCG TAG TTT GGC G-3'（配列番号：２４）
3.            5' VL, 5'-GCA AGC TTC CAC CAT GGA TA-3'（配列番号：２５）
4.            3' VL, 5'-AGC CGC GGC CCG TTT CAG TT-3'（配列番号：２６）
各プライマーはその端の方に単一の制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。５’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を有し、３’ＶＨプライマーはＡｐａＩ部位を有し、３’ＶＬプライマーはＳａｃＩＩ部位を有する。制限エンドヌクレアーゼ認識配列に下線を付してある。
１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ、それぞれ２０ｐｍｏｌの３’および５’プライマー、１００μｌＭの各ｄＮＴＰおよび５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN）を含有する最終体積１００μｌ中において第１ＰＣＲを行った。ＰＣＲの各工程には、変性（９４℃、１分）、プライマーアニーリング（４５℃、２分）、次いで伸長（７２℃、２分）からなるサイクルが２５サイクル含まれていた。ＰＣＲ生成物をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させ、ベクターに挿入する前にゲル精製した。
【００４５】
実施例ＩＩ．ＣＤＲ置換ＭＡｂ ＣＣ４９ＰＣＲ生成物のアッセンブリー
ＶＨをコードしているＰＣＲ生成物をＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩで処理した。配列決定するために、適当な制限エンドヌクレアーゼ用いてプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ／Ｋ＋（Stratagene, LaJolla, CA）を直鎖状にした後、ＰＣＲ生成物を該プラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩ部位中にサブクローニングした。インサートを配列決定してそれらの鋳型に対する忠実度をチェックした。
可変および不変領域をアッセンブリーするために、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩインサートをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから遊離させた。ヒトγ１不変領域をコードしているＤＮＡフラグメントを、ＡｐａＩ／ＣｌａＩ開裂によりｐＬｇｐＣＸＨｕＣＣ４９ＨｕＧ１（Kashmiri et al., (1995) Hybridoma 14: 461-473）から切り出した（図３）。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩおよびＡｐａＩ／ＣｌａＩフラグメントを連結した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＨｉｎｄＩＩＩおよびＣｌａＩ部位間の３ウェイ連結により、組み換え配列を一方向に挿入した。次いで、重鎖全体をコードするＤＮＡ配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩ消化によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから開裂した。ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントを用いてその末端をフィル・イン（filled in）した。ｐＡｃＵＷ５１ｃの軽鎖構築物のポリヘドリンプロモーターの下流に存在する平滑末端化ＢａｍＨＩ部位にインサートをサブクローニングした（図４）。
ＶＬをコードするＰＣＲ生成物をＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩＩで処理した。配列決定するために、適当な制限エンドヌクレアーゼ用いてプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｓ／Ｋ＋（Stratagene, LaJolla, CA）を直鎖状にした後、ＰＣＲ生成物を該プラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩＩ部位中にサブクローニングした。インサートを配列決定してそれらの鋳型に対する忠実度をチェックした。
軽鎖の可変および不変領域をアッセンブリーするために、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩＩインサートをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔから遊離させた。ヒトカッパ不変領域をコードしているＤＮＡフラグメントを、ＳａｃＩＩ／ＣｌａＩ処理によりｐＬＮＣＸＨｕＣＣ４９ＨｕＫ（Kashmiri et al., (1995) Hybridoma 14: 461-473）から切り出した（図２）。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩフラグメントを、３ウェイ連結法によりＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩにより直鎖状にしたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに連結した。ＥｃｏＲＩを用いて軽鎖全体をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔからか開裂させた。ＥｃｏＲＩフラグメントをバキュロウイルス発現ベクターｐＡｃＵＷ５１（Pharmingen, San Diego, CA）のｐ１０プロモーターの下流にあるＥｃｏＲＩ部位中に挿入した。
ＰＬＮＣＸＨｕＣＣ４９ＨｕＫおよびｐＬｇｐＣＸＨｕＣＣ４９ＨｕＧ１から得たＨｕＣＣ４９重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡフラグメントを用いて、親のＨｕＣＣ４９のバキュロウイルス発現構築物を得た。ＰＬＮＣＸＨｕＣＣ４９ＨｕＫをＨｉｎｄＩＩＩで開裂させた。得られたＨｕＣＣ４９Ｈｕｋをコードする〜１．０ＫｂのＤＮＡフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。次いで、得られた構築物をＢａｍＨＩで開裂させ、フラグメントを、ポリヘドリンプロモーターの下流にあるバキュロウイルスベクターｐＡｃＵＷ５１のＢａｍＨＩ部位にクローニングした。ＨｕＣＣ４９ＨｕＧ１をコードする〜１．４ＫｂのＤＮＡフラグメントを、ＨａｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩを用いてｐＬｇｐＣＸＨｕＣＣ４９ＨｕＧ１からクローニングした。ＤＮＡポリメラーゼのクイレウフラグメントを用いてＤＮＡフラグメントを充填した。ＢｇｌＩＩを用いてｐＡｃＵＷ５１を直鎖状にし、クレノウフラグメントを用いてその末端を平滑化した。次いで、ＤＮＡフラグメントを、ＨｕＣＣ４９ＨｕＫのｐＡｃＵＷ５１発現構築物のｐ１０プロモーターの下流に挿入した。
【００４６】
実施例ＩＩＩ．バキュロウイルス組み換えＣＤＲ置換ＣＣ４９ ＭＡｂの取得
Salgaller et al, (1993) Canver Res., 53: 2154-2161により記載されたようにして、無血清に適応したＳｆ９昆虫細胞（Gibco BRL, Gaithersburg）を補足物なしのＳｆ９００−ＩＩ培地（Gibco BRL）中、２８℃で培養した。組み換えバキュロウイルスを得るために、示唆されたプロトコルに従ってカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション系ＤＯＴＡＰ（Boeringer Mannheim）を用いて、３５ｍｍディッシュ中の１ｘ１０６個のＳｆ９細胞を、ｐＡｃＵＷ５１由来に由来するＣＤＲ置換軽鎖遺伝子およびＨｕＣＣ４９重鎖遺伝子のバキュロウイルス発現構築物ならびに直鎖状にされたＢＡＣＵＬＯＧＯＬＤ野生型バキュロウイルスＤＮＡ（Pharmingen）０．５ｍｌで同時トランスフェクションさせた。同様に、BACULOGOLDバキュロウイルスＤＮＡならびにＣＤＲ置換重鎖およびＨｕＣＣ４９軽鎖遺伝子を担持するバキュロウイルス二重発現構築物でＳｆ９細胞を同時トランスフェクションすることにより、ＣＤＲ置換重鎖を含む変種抗体を得た。バキュロウイルス組み換えＨｕＣＣ４９（以下、ＨｕＣＣ４９という）を対照抗体として使用した。ＨｕＣＣ４９軽鎖および重鎖を担持するｐＡｃＵＷ５１で昆虫細胞をトランスフェクションすることによりＨｕＣＣ４９を得た。
トランスフェクションから５日後、トランスフェクション体から感染性上清を集めた。この上清１ｍｌを系列希釈し、１００ｍｍディッシュ中の５ｘ１０６個のＳｆ９細胞単層に感染させるために使用した。次いで、Bei et al., (1995) J. Immunol. Methods, 186: 245-255により記載されたようにして０．５％Baculovirus Agarose（Invitrogen, Carlsbad, CA）を細胞に重層した。３ラウンドの感染によりウイルスプラークを増殖させた。増殖の各ラウンドにおいて、種培養源（source of inoculum）として最高産生クローン（highest producing clone）を用いて、新たに撒いた多数のＳｆ９細胞単層に感染させた。推定組み換えウイルスプラークを精製し、１ｍｌのＳｆ９００培地中に単離した。必要な場合には、感染の多重度（ＭＯＩ）０．１にて細胞に感染させることによりウイルスをさらに増幅した。組み換え抗体を得るために、６．０ｘ１０８個のＳｆ９細胞をＭＯＩ ０．５にて感染性上清に感染させた。
【００４７】
ＣＤＲ置換ＭＡｂの精製
１００００ｘｇで細胞残渣をペレット化させることにより培養上清を清澄化させ、ｐＨ７．２においてイオン交換カラム（DE52; Whatman, Hillsboro, OR）にかけて余分な蛋白を除去した。未結合蛋白フラクションを蛋白Ｇ（Gibco BRL）アフィニティークロマトグラフィーにかけた。蛋白Ｇに結合した物質を、０．１Ｍグリシン塩酸バッファー，ｐＨ２．６を用いてカラムから溶離させ、１．０Ｍ Ｔｒｉｓバッファー，ｐＨ８．０を用いて溶離物質のｐＨを即座に７．４とした。バッファーをリン酸塩緩衝化セイラインに置換し、Centricon 30マイクロコンセントレーター（Amicon, Bevery, MA）を用いて溶離物質を濃縮した。Lowry et al., (1951) J. Biol. Chem. 193: 265-275により蛋白濃度を調べた。プレキャスト連続４〜１５％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミド Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Novex Systems,San Diego, CA）を用いて抗体調合品の純度を分析し、Kashmiri et al., (1995) Hybridoma 14: 461-473により記載されたようにしてクーマシーブルー染色により可視化した。
【００４８】
ＭＡｂの放射性標識
Fraker (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun., 80: 849-857およびColcher (1988) Cancer Res., 48: 4597-4603に記載されたようにヨードジェン（Pierce, Rockfield, IL）法を用いてネズミＭＡｂ ＣＣ４９およびＨｕＣＣ４９をＮａ１２５Ｉで標識した。当該プロトコルは通常、５〜１０μＣｉ／μｇの比活性を生じる。固体支持体（Reacti-gel HW 65F; Pierce）上に固定化されたウシ顎下腺ムチン（ＢＳＭ）を用いて、Schott et al., (1992) Cancer Res., 52:6413-6417により記載されたラジオイムノアッセイにより放射性標識ＭＡｂのの免疫反応性を評価した。
【００４９】
免疫グロブリンの製造
Bei et al., (1995) J. Immunol. Methods, 186:245-255により記載されたようにヤギ抗−ヒトＦｃ（γ１）およびヤギ抗−ヒトカッパ抗体と試験部分試料との反応性に基づく酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により、トランスフェクション体および推定ウイルスプラークの力価を免疫グロブリン産生に関してアッセイした。各発現構築物に由来するトランスフェクション体およびウイルスプラークは免疫グロブリン産生に関して陽性であった。
しかしながら、トランスフェクション体およびウイルスプラークを、ＴＡＧ−７２陽性ウシ顎下腺ムチン（ＢＳＭ）との免疫反応性に関してアッセイした場合、Ｌ−１、Ｌ−２およびＬ−１，２を担持する発現構築物由来のクローンは陽性であったが、Ｈ−２発現構築物により得られたクローンはわずかに免疫反応性であった。Ｌ−３、Ｈ−１およびＨ−３のいずれかを担持する構築物由来のクローンはＢＳＭとは全く免疫反応性を示さなかった。
次いで、Ｌ−３、Ｈ−１、Ｈ−２およびＨ−３由来のクローンの乏しいＢＳＭ反応性あるいはＢＳＭ反応性の欠如がそれらのクローンによる低レベルの免疫グロブリン分泌によるものであるかどうかを調べた。その目的のために、Ｓｆ９細胞をＭＯＩ ５にて感染性上清に感染させ、上記条件下で培養した。各感染培養物から得た同体積の培養上清から分泌抗体を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。非還元条件下でのゲルのプロファイルは、変種抗体の移動度は約１６０ｋＤａの分子量を有するＨｕＣＣ４９の移動度と同じであることを示した（データ示さず）。還元条件下において、変種抗体はＨｕＣＣ４９ ＭＡｂと同様に約２５〜２８ｋＤａおよび５０〜５５ｋＤａの２つの蛋白バンドを生じた（図６）。これらの移動度は免疫グロブリン重鎖および軽鎖の分子量と一致している。さらに重要なことに、クローンのＢＳＭ反応性とは関係なく、ＣＤＲ置換重鎖または軽鎖をコードする各構築物に由来するクローンは、親のヒト化重鎖および軽鎖をコードしている構築物に由来するクローンと同様な量の免疫グロブリンを産生することが明らかである。
【００５０】
実施例ＩＶ．ＣＤＲ置換変種に関する競合ラジオイムノアッセイ
変種抗体の結合アフィニティー
ＴＡＧ−７２に対するＨｕＣＣ４９およびＣＤＲ置換変種抗体の相対結合親和性を、Milenic et al., (1991) Cancer Res., 51:6363-6371により記載された競合ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を用いて調べた。精製変種ＭＡｂならびに親のＨｕＣＣ４９の系列希釈物を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸塩緩衝化セイライン（ＰＢＳ）中に調製した。１０ｎｇのＢＳＭの入ったマイクロタイタープレートのウェルに２５μｌを添加した。次いで、１２５Ｉ−標識ＨｕＣＣ４９（２５μｌ中５００００ｃｐｍ）を各ウェルに添加した。プレートを４℃で一晩インキュベーションし、次いで、洗浄し、γ−シンチレーションカウンターでカウントした。
ＴＡＧ−７２陽性ＢＳＭへの１２５Ｉ−ＨｕＣＣ４９の結合に競合させるために未標識ＨｕＣＣ４９またはその変種を用いた。変種Ｌ−１、Ｌ−２およびＬ−１，２は、ＴＡＧ−７２に対する１２５Ｉ−標識ＨｕＣＣ４９の結合を完全に阻害したが、Ｌ−３は全く競合しなかった（図７）。
Frankel et al., (1979) Mol. Immunol., 16:101-106により記載されたScatchard法の変法により相対親和性定数を計算した。１２５Ｉ−ＨｕＣＣ４９の比活性の近似を行い、これを用いて変種ＭＡｂの各希釈率に対する最終濃度を決定した。Milenic et al., (1991) Cancer Res., 51: 6363-6371により記載されたように計算を行った。
変種の相対親和性定数（Ｋａ）は以下のとおり：
・Ｌ−１は３．３ｘ１０−８ＭのＫａを有していた（ＨｕＣＣ４９のわずか約２分の１）。
・Ｌ−２は６．８１ｘ１０−８ＭのＫａを有していた（ＨｕＣＣ４９と同等）。
・Ｌ−１，２は２．９ｘ１０−８ＭのＫａを有していた（ＨｕＣＣ４９のわずか約２分の１）。
・Ｈ−１およびＨ−３は競合を示さなかった。
・Ｈ−２はＨｕＣＣ４９とわずかに競合しただけであった。Ｈ−２のＫａは０．０１８ｘ１０−８Ｍであった（ＨｕＣＣ４９のＫａの約３００分の１）。
【００５１】
変種抗体に対するＣＣ４９抗−イディオタイプ抗体の反応性
ＭＡｂ ＣＣ４９に対して生成したマウス抗−イディオタイプＭＡｂを用いて、Irvine et al., (1993) Cancer Immunol. Immunother., 36:281-292により記載された競合ラジオイムノアッセイＲＩＡにおいても変種ＭＡｂを特徴づけた。３種の抗−イディオタイプ（ＡＩ４９−８、ＡＩ４９−３およびＡＩ４９−１）を選択し、それぞれ抗−イディオタイプサブセットα、β、およびγであった。上と同様の方法で、１００ｎｇのＭＡｂ ＡＩ４９−３（β−サブセット）、ＡＩ４９−１（γ−サブセット）またはＡＩ４９−８（α−サブセット）を９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに吸着させた。２５μｌの系列希釈した変種ＭＡｂまたはＨｕＣＣ４９を、２５μｌの１２５Ｉ−ネズミＣＣ４９とともに各ウェルに添加した。プレートを洗浄し、４℃で一晩インキュベーションした後、カウントした。
軽鎖変種に関する結果を図８に示す。ＡＩ４９−３（β−サブセット）に関して：Ｌ−ＣＤＲ１はＡＩ４９−３によるＣＣ４９の認識にわずかに関与していると考えられ；Ｌ−ＣＤＲ２はＡＩ４９−３によるＣＣ４９の認識に関与しているとは考えられず；Ｌ−ＣＤＲ３はＡＩ４９−３によるＣＣ４９の認識に重要であると考えられる。ＡＩ４９−１（γ−サブセット）に関して：Ｌ−ＣＤＲ１はＡＩ４９−１によるＣＣ４９の認識に必要ではないと考えられ；Ｌ−ＣＤＲ２はＡＩ−４９によりＣＣ４９の認識に中程度に関与していると考えられ；Ｌ−ＣＤＲ３はＡＩ４９−１によるＣＣ４９の認識に重要であると考えられる。ＡＩ４９−８（α−サブセット）に関して：Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３はいずれもＡＩ４９−８とＣＣ４９との相互作用に影響しないと考えられる。
重鎖変種に関する結果を図９に示す。ＡＩ４９−３（β−サブセット）に関して：Ｈ−ＣＤＲ１およびＨ−ＣＤＲ３はＨｕＣＣ４９のＡＩ４９−３への結合に関与しているとは考えられないが、Ｈ−ＣＤＲ２はＡＩ４９−３によるＣＣ４９の認識に重要であると考えられる（ＨｕＣＣ４９と比較するとＨ−２による５０％阻害には約４〜１５倍多くの競合物質が必要である）。ＡＩ４９−１（γ−サブセット）に関して：Ｈ−ＣＤＲ１およびＨ−ＣＤＲ３はＨｕＣＣ４９のＡＩ４９−１への結合に関与しているとは考えられないが、Ｈ−ＣＤＲ２はＡＩ４９−１によるＣＣ４９の認識に重要であると考えられる（ＨｕＣＣ４９と比較するとＨ−２による５０％阻害には約４〜１５倍多くの競合物質が必要である）。ＡＩ４９−８（α−サブセット）に関して：Ｈ−ＣＤＲ１およびＨ−ＣＤＲ３はＨｕＣＣ４９のＡＩ４９−８への結合に関与しているとは考えられないが、Ｈ−ＣＤＲ２はＡＩ４９−８によるＣＣ４９の認識の重要であると考えられる（変種による阻害が完全に消失する）。
ＨｕＣＣ４９の変種に対する患者の反応性の分析から、６つのＣＤＲのうち３つ（Ｌ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ１およびＨ−ＣＤＲ３）は親により認識されるとは考えられないが、Ｌ−ＣＤＲ１およびＨ−ＣＤＲ２は親のＨｕＣＣ４９の認識にある程度関与していると考えられる。Ｌ−ＣＤＲ３（抗原結合に重要である）は親により認識される免疫優性ＣＤＲである。同様にＬ−ＣＤＲ３はマウスにおいて免疫優性である（ＡＩ４９−１およびＡＩ４９−３、ＨｕＣＣ４９の抗原結合を阻害する２種の抗−イディオタイプ抗体はＨｕＣＣ４９の認識にＬ−ＣＤＲ３を必要とする）。
【００５２】
実施例Ｖ．高品質液体クロマトグラフィー
フェーズ１の放射線免疫治療臨床試験（Mulligan et al., (1995) Clin. Cancer Res., 1: 1447-1454）において１７７Ｌｕ−ＣＣ４９を投与された患者から得た血清を用いてＣＤＲ変種をさらに特徴づけた。この研究において数人の患者はＭＡｂ ＣＣ４９に対する抗−イディオタイプ抗体を有することがわかった。１人の患者を選択して、ＣＣ４９ ＣＤＲが免疫優性かどうかを確認するための予備研究を行った。
Colcher et al., (1990) J. Nucl. Med., 31: 1133-1142およびMulligan et al., (1995) Clin. Cancer Res., 1: 1447-1454により報告された方法の変法を用いて、精製ＣＤＲ変種の系列希釈物を患者血清ならびに１２５Ｉ−標識ＨｕＣＣ４９とともにインキュベーションした。詳細には、ColchercおよびMulliganの方法は下記のように修飾された：研究に先だって、ＣＣ９２抱合固体支持体での吸着によりＨＡＭＡおよびＴＡＧ−７２を血清から除去した。次いで、ＨｕＣＣ４９との間に形成される複合体の最大量の半分を形成するに必要な血清量を決定した。詳細には、８μｌの血清を〜５０００００ｃｐｍの１２５Ｉ−ＨｕＣＣ４９および精製ＨｕＣＣ４９もしくはその変種の系列希釈物と混合した。調合物の最終体積を５０μｌとした。
患者血清と１２５Ｉ−標識ＨｕＣＣ４９との複合体形成を阻害する変種の能力を、ＨＰＬＣ分析を用いてモニターした。２５μｌの各溶液をＴＳＫ３０００分析用カラム（7.8mmx30cm;Tosohaas, Montgomeryville, PA）にかけ、６７ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）中１００ｍＭ ＫＣｌを用いて０．５ｍｌ／分の流速にて溶離させた。フロー−スルーγ−シンチレーション検出器（Beckman、１７０型）を用いて放射活性をモニターした。
変種が患者により認識されるＣＤＲを含む場合、変種は放射性標識ＨｕＣＣ４９と競合し、複合体形成は起こらず、１２５Ｉ−ＨｕＣＣ４９の保持時間の変化はないであろう。変種がもはや患者により認識されるＣＤＲを含んでいない場合には、複合体形成が起こるであろう。よって、患者血清と放射性標識ＨｕＣＣ４９との複合体形成を阻害するＣＤＲ変種の能力を、１２５Ｉ−ＨｕＣＣ４９の保持時間により調べた。複合体形成の阻害％を計算し、各競合物質の濃度に対してプロットして個々のＣＤＲ変種との患者の反応性の程度を評価した。図１５は、ＨｕＣＣ４９およびＣＤＲ変種との患者の反応性を比較したものである。
・Ｌ−１（ＣＣ４９ Ｌ−ＣＤＲ１を有しない変種）は、複合体形成の阻害においてある程度無能であることが示された。よって、Ｌ−ＣＤＲ１は免疫原性にいくぶんか関与していると考えられる（複合体形成を５０％阻害するには０．７μｇの競合物質が必要であった）。
・Ｌ−２は親のＨｕＣＣ４９よりも２倍競合すると考えられた（親による促進された認識）。
・Ｌ−３は複合体形成に対する阻害を示さず、よって、Ｌ−ＣＤＲ３は免疫原性に必要であると考えられる。
・Ｌ−１，２は複合体形成の阻害においていくぶんか無能であることが示され、Ｌ−ＣＤＲ１および／またはＬ−ＣＤＲ２が免疫原性にいくぶんか関与していることが示される。
・Ｈ−１は複合体形成を阻害し、それゆえ、免疫原性に貢献している。
・Ｈ−２は複合体形成をほとんど示さず、よって、Ｈ−ＣＤＲ２は免疫原性に必要であるとは考えられない（１０μｇの競合物質では複合体形成を５０％阻害することができなかった）。
・Ｈ−３は複合体形成の阻害においていくぶんか無能であることが示され、よって、Ｈ−ＣＤＲ３は免疫原性にいくぶんか関与していると考えられる（複合体形成を５０％阻害するには０．４μｇの競合物質が必要であった）。
【００５３】
実施例ＶＩＩ．ＳＤＲ置換ＭＡｂ ＣＣ４９の調製
Padlan et al., (1995) FASEB J., 9:133-139には、軽鎖のＳＤＲが位置２７ｄおよび３４；５０および５５；ならびに８９および９６によって結合されていることが開示されている。重鎖ＳＤＲは位置３１および３５ｂ；５０および５８；ならびに９５および１０１中に含まれている。
図２は、ＣＣ４９およびＬＥＮの軽鎖ＣＤＲのアミノ酸残基と、ＣＣ４９および２１／２８’ＣＬの重鎖ＣＤＲのアミノ酸残基との間の相違を示す。
Ｌ−ＣＤＲ１において、ＣＣ４９およびＬＥＮは３つの残基：位置２７ｂ、２７ｆおよび２９において異なる。位置２７ｂにおける残基（埋もれた残基）および２７ｆにおける残基はリガンド接触に直接関与していないことがわかったが、位置２９における残基は２つの複合体においてリガンドと相互作用し、１の複合体においては主鎖原子によってのみ相互作用することがわかった。残基２７ｂは示唆されたＳＤＲ境界の外側に存在する。残基２７ｆおよび２９は示唆されたＳＤＲ境界中にある。
Ｌ−ＣＤＲ２において、ＣＣ４９およびＬＥＮは位置５３においてのみ異なり、この位置は既知構造を有する３１種の複合体のわずか３種においてリガンド接触に関与している。残基５３は示唆されたＳＤＲ境界中にある。
抗原結合反応性（上記）の有意な損失なしに、ＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ１および２がＬＥＮ由来のそれらのカウンターパートに置換されたので、残基２７ｂ、２７ｆ、２９および５３は、ＣＣ４９のその抗原への結合には重要でないと結論された。ＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２は変異実験関して考慮されなかった。なぜなら、それらは抗原結合反応性の有意な損失なしにヒトＭＡｂ ＬＥＮ由来の対応ＣＤＲにより置換されたからである。
【００５４】
３つの位置９４、９６および９７において、ＣＣ４９の免疫優性Ｌ−ＣＤＲ３はＬＥＮと異なる。ＣＣ４９ Ｌ−ＣＤＲ３の３つの残基それぞれを、ＬＥＮ ＣＤＲ中の対応位置に存在する残基と置換して、軽鎖変種９４Ｌ、９６Ｌおよび９７Ｌをそれぞれ得た。２つの変異を有するもう１つの軽鎖変種９４，９７Ｌを得、これは１の変異を位置９４に、もう１つの変異を位置９７に有する。ＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２がすでにヒトＭＡｂ ＬＥＮ由来のそれらのカウンターパートに置換されているＨｕＣＣ４９軽鎖変種Ｌ１，２から、さらに２つの変種を誘導した。１の変種は９７Ｌ１，２であり、位置９７に単一の置換を担持していた。他方は９４，９７Ｌ１，２であり、２つの位置９４および９７に置換を有していた。
ＣＣ４９およびＬＥＮのＬ−ＣＤＲ３において異なる３つの残基のうち、位置９７の部分的に埋もれている残基はＣＣ４９の抗原結合活性にとり重要でない。この残基は示唆されたＬ−ＣＤＲ３のＳＤＲの境界中には存在しない。よって、変種９７Ｌは抗原結合活性の損失を示さなかった。変種９７Ｌ１，２は有意でないわずかな抗原結合活性の損失を示した。
Ｌ−ＣＤＲ３の位置９４および９６はそれぞれ１９種および２２種の既知抗体：抗原複合体におけるリガンド接触に関与している。よって、変種９６Ｌおよび９４Ｌは抗原結合反応性を完全に、あるいはほぼ完全になくすことは矛盾のないことである。位置９４における変異が変種９７Ｌおよび９７Ｌ１，２に導入された場合、その変異はそれらの抗原結合機能を破壊した。
【００５５】
ＣＣ４９および２１／２８’ＣＬのＨ−ＣＤＲ１は３つの位置３１、３２および３４において異なる。位置３１の残基は、３１種の複合体のうち１２種においてリガンド結合に直接関与しており；それらのうち５種において、主鎖原子のみが関与している。位置３２の残基は、３１種の既知構造複合体のうち８種においてリガンド接触性である。位置３４の残基は、３１種の既知構造複合体のいずれにおいてもリガンド接触に関与していなかった。ＣＣ４９ Ｈ−ＣＤＲ１の位置３２および３４の残基を２１／２８’ＣＬ ＭＡｂの対応残基に置換して（３２，３４Ｈ）、位置３２がリガンド接触および抗−イディオタイプ応答に重要であるかどうかを調べた。
ＣＣ４９のＨ−ＣＤＲ２は１１個の位置においてヒトＭＡｂ ２１／２８’ＣＬと異なる。位置６０、６１、６２および６４の残基は既知構造の複合体のいずれにおいてもリガンド接触性でなかった。それゆえ、ＣＣ４９のこれらの残基は置換のための主たる候補である。したがって、ＨｕＣＣ４９のこれらの残基をヒトＭＡｂ ２１／２８’ＣＬ中のカウンターパートに置換することによりＨｕＣＣ４９の重鎖変種６０−６２，６４Ｈを得た。
Ｈ−ＣＤＲ３は変異に関して考慮されなかった。なぜなら、それは患者の血清と反応性を示さなかったからである（上記）。
【００５６】
以下のＳＤＲ変種を作成した：
・変種９４Ｌ：ＣＣ４９ Ｌ−ＣＤＲ３の残基９４がＬＥＮ中の対応位置に存在する残基に置換されたもの。
・変種９６Ｌ：ＣＣ４９ Ｌ−ＣＤＲ３の残基９６がＬＥＮ中の対応位置に存在する残基に置換されたもの。
・変種９７Ｌ：ＣＣ４９ Ｌ−ＣＤＲ３の残基９７がＬＥＮ中の対応位置に存在する残基に置換されたもの。
・変種９４，９７Ｌ：ＣＣ４９ Ｌ−ＣＤＲ３の残基９４および９７がＬＥＮ中の対応位置に存在する残基に置換されたもの。
・変種９７Ｌ１，２：ＨｕＣＣ４９軽鎖変種Ｌ１，２から誘導されたものであり；ＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２がヒトＭＡｂ ＬＥＮ由来のカウンターパートで置換されており；ＣＣ４９ Ｌ−ＣＤＲ３の残基９７がＬＥＮ中の対応位置に存在する残基で置換されているもの。
・変種９４，９７Ｌ１，２：ＨｕＣＣ４９軽鎖変種Ｌ１，２から誘導されたものであり；ＣＣ４９のＬ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２がヒトＭＡｂ ＬＥＮ由来のカウンターパートで置換されており；ＣＣ４９ Ｌ−ＣＤＲ３の残基９４および９７がＬＥＮ中の対応位置に存在する残基で置換されているもの。
・変種３２，３４Ｈ：ＣＣ４９ Ｈ−ＣＤＲ１の位置３２および３４の残基が２１／２８’ＣＬ ＭＡｂの対応残基で置換されたもの。
・変種６０−６２，６４Ｈ：ＣＣ４９ Ｈ−ＣＤＲ２の位置６０、６１、６２および６４の残基が２１／２８’ＣＬ ＭＡｂの対応残基で置換されたもの。
【００５７】
オリゴマーの製造
本質的には実施例１に記載したようにオリゴマーを製造した。親のＨｕＣＣ４９重鎖遺伝子の発現構築物であるｐＬｇｐＣＸＨｕＣＣ４９Ｈｕγ１を、重（３２，３４Ｈおよび６０−６２，６４Ｈ）鎖変種遺伝子合成のための鋳型として使用した。親のＨｕＣＣ４９軽鎖遺伝子の発現構築物であるｐＬＮＣＸＨｕＣＣ４９ＨｕＫを、軽（９４Ｌ、９６Ｌ、９７Ｌおよび９４，９７Ｌ）鎖変種遺伝子合成のための鋳型として使用した。Ｌ−ＣＤＲ１のみ、あるいはＬ−ＣＤＲ１およびＬ−ＣＤＲ２の両方をそれらのＬＥＮカウンターパートに置換することにより変種Ｌ１およびＬ１，２を得た。９４Ｌ１，２および９４，９７Ｌ１，２遺伝子の合成のために、バキュロウイルス発現構築物中のＬ１，２変種の発現構築物を鋳型として使用した。
８７００型ＤＮＡ合成装置（Milligen/Bioresearch, Burlington, VT）を用いて３７ないし５６ヌクレオチドのサイズ範囲の変異原性オリゴヌクレオチドプライマーを合成した。供給者の推奨に従ってそれらをoligo-Pakカラム（Milligen/Bioresearch）で精製した。変異原性プライマーの配列は下記のとおりであり、突然変異による変化に下線を付した：
VL CDR3:
5'-GCC AGC GCC GAA GCT GAG GGG ATA GCT ATA ATA CTG CTG ACA-3'（配列番号：２７）
5'-GGT GCC AGC GCC GAA GCT GAG GGG GGT GCT ATA ATA CTG CTG ACA-3'（配列番号：２８）
5'-GCC ACG GCC GAA TGT GTA GGG ATA GCT ATA ATA CTG CTG ACA -3'（配列番号：２９）
5'-GCC GAA TGT GAG GGG GGT GCT ATA ATA CTG CTG ACA ATA-3'（配列番号：３０）
VH CDR1:
5'-GTT TCA CCC AGT GCA TTG CAT AAT CAG TGA AGG TGT A-3'（配列番号：３１）
VH CDR2:
5'-GTG GCC TTG CCC TGG AAC TTC TGT GAG TAC TTA AAA TCA TCG TTT CCG GGA GAG AA-3'（配列番号：３２）
【００５８】
実施例ＶＩＩＩ．ＰＣＲ生成物のアッセンブリー
実施例ＩＩに記載のごとくＰＣＲ生成物をアッセンブリーし、配列決定した。ＨｕＣＣ４９軽鎖構築物を鋳型として用いて得られた４２５塩基対（ｂｐ）のＰＣＲ生成物は、リーダーペプチド、ＣＣ４９ＶＬドメインおよび該ＶＬの１０ｂｐ下流にあるＳａｃＩＩ部位にて終結するカッパ（κ）不変領域のアミノ末端をコードする配列を担持していた。同様に、重鎖鋳型由来の４３２塩基対（ｂｐ）のＰＣＲ生成物は、リーダー、ＶＨおよびＣＨ１ドメインの出発点から１７ｂｐ下流にあるＡｐａＩ部位まで伸長しているＣＨ１ドメインのアミノ末端をコードする配列を含んでいた。
【００５９】
組み換えＳＤＲ置換ＣＣ４９ＭＡｂの取得
Ｓｆ９００−ＩＩ培地は５０μｇ／ｍｌの抗生物質ゲンタマイシンを含み、トランスフェクションから６日後に感染性上清を得たことを除き、本質的には実施例ＩＩＩに記載したようにしてＳＤＲ置換変種を得た。
【００６０】
ＳＤＲ置換ＣＣ４９ ＭＡｂの精製
感染から３日後に、組織培養上清を集め、２０００ｘｇ、１０分間の遠心分離により清澄化させた。Ｔｒｉｓバッファーを上清に添加して最終濃度を２０ｍＭとした。４℃で２〜３時間インキュベーションした後、１５分間遠心分離することにより混入蛋白をペレット化させた。上清を蛋白Ｇアガロースカラム（Gibco BRL）にかけ、０．１Ｍグリシン塩酸塩，ｐＨ２．５を用いて結合蛋白をカラムから溶離させた。１．０Ｍ Ｔｒｉｓバッファー，ｐＨ８．０を用いて、溶出した物質のｐＨを即座に７．０とした。Centriplus30マイクロコンセントレーター（Amicon, Bevery, MA）を用いて蛋白を濃縮し、３０００ｘｇで８０分間遠心分離した。濃縮された蛋白をリン酸塩緩衝化セイライン（ＰＢＳ）中に回収した。実施例ＩＩＩで説明したようにして蛋白濃度を調べた。還元条件下および非還元条件下における４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動により抗体調合品の純度を評価した。実施例ＩＩＩで説明したようにしてクーマシーブルーで染色することにより蛋白を可視化した。
【００６１】
実施例ＩＸ．ＳＤＲ置換変種に関する競合ラジオイムノアッセイ
ＥＬＩＳＡ
変種の免疫グロブリン分子を発現能ならびに重（３２，３４Ｈおよび６０−６２，６４Ｈ）鎖変種または軽（９４Ｌ、９６Ｌ、９７Ｌ、９４，９７Ｌ、９７Ｌ１，２および９４，９７Ｌ１，２）鎖変種の抗原反応性を、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて評価した。
９６ウェルポリビニルマイクロタイタープレートの各ウェルを１μｇ／ウェルのＴＡＧ−７２陽性ウシ顎下腺ムチン（ＢＳＭ）（Sigma Chem. Co., St. Louis, MO）で被覆し、Bei et al., (1995) J. Immunol. Methods, 186:245-255により記載された方法に従ってＥＬＩＳＡアッセイを行った。
変種抗体がすべて抗原結合活性に関して陽性であったわけではない。ＴＡＧ−７２陽性ＢＳＭに対する結合活性に関するＥＬＩＳＡアッセイの結果は、変種遺伝子３２，３４Ｈおよび９６Ｌを担持する発現構築物により特定される変種抗体はＢＳＭと反応しないことを示した。対照的に、９７Ｌおよび６０−６２，６４Ｈ構築物により発現される変種抗体は強いＢＳＭ結合活性を示した。９４Ｌおよび９４Ｌ１，２構築物により発現された免疫グロブリン分子は中程度の陽性抗原結合反応性を示したが、９４，９７Ｌ１，２により発現された免疫グロブリン分子はごく弱い陽性であった（図１３）。
変種免疫グロブリンの抗原結合活性の不完全または完全な消失は、ＨｕＣＣ４９の結合部位上のＳＤＲ置換の不利益な効果によるものかもしれない。あるいはまた、プラークは低い抗原結合反応性を示すか、あるいは抗原結合反応性を示さないかもしれない。なぜなら、発現構築物のいくつかは発現せず、あるいは有意に低レベルの発現しかせず、あるいは物理的に正常でない抗体を生じたからである。これらの可能性を調べるために、各構築物を最大に生成するクローンに由来する接種物で新たに感染させた細胞の大きなバッチから変種抗体を得て、精製した。培養上清中の分泌変種抗体の濃度は２〜３μｇ／ｍｌの範囲であった。精製免疫グロブリン分子をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴づけた。各構築物により発現された免疫グロブリン分子は、還元条件下においてＨｕＣＣ４９ ＭＡｂの重鎖および軽鎖とともに移動する２つのバンドを生じた（データ示さず）。ＨｕＣＣ４９重鎖遺伝子とペアーになった９７Ｌ１，２および９４，９７Ｌ１，２遺伝子を有する発現構築物を含む昆虫細胞により生成された抗体は同様の結果を示した（データ示さず）。これらの結果は、すべての構築物が相当なレベルの適当なサイズの免疫グロブリン分子を発現し産生したことの証拠となる。それゆえ、９６Ｌおよび３２，３４Ｈ置換を有する変種ＨｕＣＣ４９ ＭＡｂは抗原結合活性を総体的に失うこと、安全に結論できる。
【００６２】
競合ラジオイムノアッセイ
競合ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を行って、ＢＳＭに対する変種ＭＡｂおよび親のＨｕＣＣ４９の相対結合能を調べた。手順の詳細はKashmiri et al., (1995) Hybridoma, 14: 461-473に記載されている。精製未標識変種抗体または親のＨｕＣＣ４９ ＭＡｂの系列希釈物を用いて、ＴＡＧ−７２陽性ＢＳＭへの結合に関して放射性標識ＨｕＣＣ４９と競合させた。簡単に説明すると、精製ＳＤＲ置換変種または親のＨｕＣＣ４９の１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中系列希釈物２５μｌを、１０ｎｇのＢＳＭの入った９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに添加した。２５μｌの１２５Ｉ−標識ＨｕＣＣ４９（５００００ｃｐｍ）を各ウェルに添加して、プレート上に被覆されたＢＳＭへの結合に関して未標識の親または変種ＨｕＣＣ４９と競合させた。プレートを４℃で一晩インキュベーションし、次いで、洗浄し、γ−シンチレションカウンターでカウントした。
パネルＡに示した軽鎖変種の競合プロファイルは、変種９６Ｌは競合しないが、他のすべての抗体は親のＨｕＣＣ４９を完全に競合し、同様のスロープを有することを示す（図１３）。しかしながら、９７Ｌを除くすべての変種の競合曲線は有意に右へシフトしており、抗原（ＢＳＭ）との反応性の損失が示される。このシフトは９７Ｌ１，２に関してはあまり明らかでない。同様に、Ｈ−ＣＤＲ１中に置換を有する変種ＭＡｂ３２，３４ＨはＨｕＣＣ４９ ＭＡｂのＢＳＭへの結合を阻害せず、Ｈ−ＣＤＲ２中に置換を有する変種６０−６２，６４Ｈは完全に競合し、そのプロファイルは親のＨｕＣＣ４９のプロファイルとほとんど同じであったことが、重鎖変種の競合プロファイル（パネルＢ）から明らかである。
実施例ＩＶにて説明したように相対親和性定数を計算した。競合曲線の直線部分から変種の相対親和性定数（Ｋａ）を計算した。９７Ｌおよび６０−６２，６４Ｈ ＭＡｂのＫａはそれぞれ３．６ｘ１０８Ｍ−１および２．２ｘ１０８Ｍ−１であった。これらの値は親のＨｕＣＣ４９のＫａ値である３．２ｘ１０８Ｍ−１に匹敵するものである。変種９７Ｌ１，２は１．４ｘ１０８Ｍ−１のＫａ値を有することがわかり、ＨｕＣＣ４９ ＭＡｂのＫａの約２〜３分の１である。
その後、２つの新たな構築物を得て、Ｓｆ９細胞中で発現させた。それらの一方において、変種重鎖６０−６２，６４Ｈをコードする遺伝子が軽鎖変種９７Ｌをコードする遺伝子とペアーになっていた。他方の構築物において、遺伝子６０−６２，６４Ｈは９７Ｌ１，２軽鎖遺伝子とペアーになっていた。精製抗体の競合プロファイルは、これらの変種ＭＡｂが抗原結合に関してＨｕＣＣ４９ ＭＡｂと完全に競合し、ＨｕＣＣ４９と同じスロープの競合曲線を生じたことを示す（図１３）。変種ＭＡｂ９７Ｌ／６０−６２，６４Ｈの相対親和性定数は５．４８ｘ１０８Ｍ−１であり、ＨｕＣＣ４９の相対親和性定数に匹敵するものであるが、変種ＭＡｂ９７Ｌ１，２／６０−６２，６４ＨのＫａは１．１５ｘ１０８Ｍ−１であり、親のＨｕＣＣ４９ ＭＡｂの約３分の１である。
【００６３】
実施例Ｘ．高品質液体クロマトグラフィー
１７７Ｌｕ−標識ＭＡｂ ＣＣ４９をアデノカルシノーマ患者に投与した、報告されたフェーズＩの臨床試験において、数人の患者がＭＡｂ ＣＣ４９に対する抗−イディオタイプ抗体を有することがわかった。研究により集められた血清を用いて変種の潜在的免疫原性を試験した。遠心分離により血液を分離することにより血清を得た。高品質液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、患者血清中の抗体と変種ＭＡＢとの間の複合体形成をモニターすることにより、変種の抗原反応性を調べた。
ＨＰＬＣ分析の前に、遊離ＴＡＧ−７２およびヒト抗−ネズミ抗体（患者血清中に存在するＣＣ４９に対する抗−イディオタイプ抗体を除く）を、固体支持体に結合したＭＡｂ ＣＣ９２を用いて吸着除去した。ＭＡｂ ＣＣ９２はＣＣ４９と同じイソタイプのネズミ抗−ＴＡＧ−７２抗体であり、ＣＣ４９により認識されるエピトープ以外のＴＡＧ−７２のエピトープを認識する。次いで、患者血清を１２５Ｉ−標識ＨｕＣＣ４９（約５０００００ｃｐｍ）および５μｇのコールド競合物質（ＨｕＣＣ４９または変種ＭＡｂのいずれか）とともにインキュベーションした。
競合アッセイは実施例Ｖに記載したものである。簡単に説明すると、患者血清を〜０．３μＣｉの１２５Ｉ−ＨｕＣＣ４９および精製ＨｕＣＣ４９もしくはその変種の系列希釈物と混合した。アッセイの前に、最大免疫複合体精製料の半分を精製するに必要な血清量を決定した。混合物の最終体積を５０μｌとした。最終溶液２５μｌを７．８ｍｍｘ３０ｃｍ ＴＳＫ３０００分析カラム（Tosohaas, Montgomeryville, PA）にかけ、溶離バッファー（６７ｍＭリン酸ナトリウム中１００ｍＭ ＫＣｌ，ｐＨ６．８）を用いて流速０．５ｍｌ／分で溶離させた。フロースルー１７０型γ−シンチレーション検出器（Beckman）を用いて放射活性をモニターした。
放射性標識ＨｕＣＣ４９と患者血清中の抗−イディオタイプ抗体との複合体形成はカラム上の放射性標識の保持時間を短縮した。コールド競合物質とともにインキュベーションされた、あるいはされなかった血清および１２５Ｉ−標識ＨｕＣＣ４９の混合物をカラムにかけた場合の、ＨＰＬＣカラム上の放射性標識の保持時間の相違により、１２５Ｉ−標識ＨｕＣＣ４９との複合体形成を阻害する変種の能力を調べた。競合物質による複合体形成の阻害は、競合物質がＨｕＣＣ４９と共通した免疫原性エピトープを有することを示す（図１４）。
【００６４】
複合体として回収されたインプットのカウントに対するパーセント値についての分析から、１２５Ｉ−標識ＨｕＣＣ４９および４人の患者それぞれからの血清の混合物を５μｇのコールド競合物質とともにインキュベーションし、ＨＰＬＣ分析に供した場合、変種抗体９７Ｌおよび３２，３４ＨはＨｕＣＣ４９と同様に複合体形成を阻害したことが明らかである。対照的に、変種ＭＡｂ９６Ｌおよび９４，９７Ｌ１，２は非特異的ヒト免疫グロブリンと同様に、ＥＡ以外の患者から得た血清とＨｕＣＣ４９との複合体形成を阻害しなかった。ＥＡの血清との複合体形成はこれら２種の変種によりわずかに不完全に阻害された。変種ＭＡｂ９４Ｌ、９４，９７Ｌ、９７Ｌ１，２および６０−６２，６４Ｈは、すべての患者から得た血清との複合体形成を阻害した。親のＨｕＣＣ４９の抗原結合活性の匹敵する抗原結合活性を有する変種９７Ｌ／６０−６２，６４Ｈは、３人の患者（ＤＧ、ＣＰおびＤＳ）の血清をわずかに不完全に阻害したが、患者ＥＡからの血清とＨｕＣＣ４９との複合体形成を完全に阻害した。より重要なことに、変種９７Ｌ１，２／６０−６２，６４Ｈは、２人の患者（ＣＰおよびＤＳ）からの血清中に存在する抗−イディオタイプ抗体とＨｕＣＣ４９との複合体形成に競合せず、他の２人の患者（ＤＧおよびＤＳ）からの血清とわずかに不完全に競合した。
【００６５】
競合物質の系列希釈物を用いて競合プロファイルを得て、患者の１人（ＣＰ）からの血清中に存在する抗−イディオタイプ抗体への１２５Ｉ−標識ＨｕＣＣ４９の結合を５０％阻害するのに必要な未標識競合抗体の相対量を決定した。複合体形成の阻害％を計算し、競合物質濃度に対してプロットした。
競合プロファイルは、コールドＨｕＣＣ４９が完全に競合し、５０％の競合を達成するには約２５０ｎｇの親のＨｕＣＣ４９が必要であったことを示す。対照的に、変種９７Ｌ１，２／６０−６２，６４Ｈは、血清の抗−イディオタイプ抗体への放射性標識ＨｕＣＣ４９の結合を最小限にしか阻害せず、１μｇの変種でさえ、２５％以上の競合を達成することができなかった（２５％の競合は６０ｎｇのＨｕＣＣ４９により達成された）。中程度の抗原結合活性を保持しており、患者の血清と最小限にしか反応しないこの変種は、臨床への適用に最も有利である可能性がある。動物モデルにおける血漿クリアランスおよび生体内分布に関してこの変種をさらに研究した。
図１６は、抗−ネズミＣＣ４９可変領域抗体を含むヒト血清に対する変種９７Ｌ１，２／６０−６２，６４Ｈの免疫反応性を、ＨＰＬＣ分析により評価して示すグラフである。複合体形成の阻害％を計算し、競合物質のｎｇ数に対してプロットした。競合物質はＨｕＣＣ４９（四角）および変種（□）であった。
【００６６】
実施例ＸＩ．生体内分布および薬物動態の研究
薬物動態
血漿クリアランス速度はインビボ腫瘍標的化に影響するので、Kashmiri et al., (1995) Hybridoma, 14: 461-473により記載された方法を用いて親のＨｕＣＣ４９に対する変種の薬物動態を比較して評価した。
薬物動態を研究するために、ＴＡＧ−７２陽性ＬＳ−１７４Ｔ腫瘍（Colcher et al., (1983) Cancer Res., 43:736-742）を有する胸腺切除マウスの尾静脈に、１．４μＣｉの１３１Ｉ−標識ＨｕＣＣ４９および４．４μＣｉの１２５Ｉ−標識変種ＭＡｂ９７Ｌ１，２／６０−６２，６４Ｈを含有する混合物を注射した。種々の時点で尾静脈から血液試料を１０μｌのヘパリン処理毛細管（Drummond, Broomall, PA）中に集めた。血漿中の１３１Ｉおよび１２５Ｉの量を調べ、２種の放射性核種の崩壊速度に関して修正した。各放射性核種の注射用量に対する血漿中に残存しているパーセント値を各時点について計算した。結果は、２種の抗体の血液クリアランスパターンは有意には異ならないことを示す（図１７）。ＨｕＣＣ４９または変種の注射用量の５０％を血液コンパートメントから除去するには、それぞれ１時間および２時間必要であった。２４時間目において、それぞれ８５％および８０％の放射性標識ＨｕＣＣ４９および変種が血液から除去された。４８時間目には、血液から除去されたＨｕＣＣ４９および変種のパーセント値ははそれぞれ９２％および８８％であった。
【００６７】
生体内分布
Kashmiri et al., (1995) Hybridoma, 14: 461-473により記載されたようにして生体内分布アッセイを行った。ヒト腫瘍異種移植片に局在化する変種ＨｕＣＣ４９ ＭＡｂの能力を調べ、放射性局在化指数（ＲＩ）を決定するために、ＴＡＧ−７２陽性ＬＳ−１７４Ｔ腫瘍（Colcher et al., (1983) Cancer Res., 43:736-742）を有する胸腺切除マウスの尾静脈に、１．４μＣｉの１３１Ｉ−標識ＨｕＣＣ４９および４．４μＣｉの１２５Ｉ−標識変種ＭＡｂ９７Ｌ１，２／６０−６２，６４Ｈを含有する混合物を注射した。特定の時間に尾静脈から集めた血液試料中の１３１Ｉおよび１２５Ｉの量を調べた。各時点において、５匹のマウスを殺して腫瘍、血液および他の主要器官を集め、秤量した。γ−シンチレーションカウンターにて放射活性を測定し、それを崩壊に関して修正した。各器官に関して１グラムあたりの注射用量に対するパーセント値（％ＩＤ／ｇｍ）を決定した。
異なる時点で集めた１グラムの腫瘍または異なる正常組織１グラムあたりの２種の抗体の注射用量に対する％は、２種の抗体の生体内分布パターンが本質的に同じであることを示す。いずれの抗体も、２４時間までには有意な腫瘍局在化を示した（図１８）。４８時間までにはＨｕＣＣ４９および変種の注射用量のわずか８％および１２％がそれぞれ血中に存在していたが、腫瘍中にはそれぞれ１７．６％および２３．８％ ＩＤ／ｂが存在していた。
【００６８】
実施例ＸＩＩ．ＣＣ４９に対する体液性免疫応答の特徴づけ
この実施例において、ＨｕＣＣ４９ ＣＤＲ−置換変種に対する体液性免疫応答を調べる。
ヒト化ＣＣ４９（ＨｕＣＣ４９）およびヒト化ＣＣ４９ ＣＤＲ−置換変種（ＣＤＲ変種）の取得
Kashmiri (1985), Hybridoma, 14: 461-473により記載されたように、ヒト化ＣＣ４９（ＨｕＣＣ４９）を産生するクローンを、蛋白不含ハイブリドーマ培地ＰＦＨＭ−ＩＩ（GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD）中で増殖させた。Kashmiri (1985), Hybridoma, 14: 461-473により記載されたように、蛋白Ｇにより組織培養上清からヒト化ＣＣ４９モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を精製した。
実施例Ｉ〜ＩＩＩにて説明したようにして、７種のＨｕＣＣ４９ ＣＤＲ変種を得た。
【００６９】
放射性標識
Fraker et al. (1978), Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 849-857;およびColcher et al. (1988), Cancer Res., 48: 4597-4603により記載されたようにして、ヨードジェン法（Pierce, Rockford, IL）を用いてＭＡｂ ＨｕＣＣ４９、ＢＬ−３およびＨｕＣＣ４９のＣＤＲ−置換変種をＮａ１２５Ｉで標識した。ＢＬ−３はＣＣ４９に関するイソタイプにマッチした対照である（Colcher et al. (1988), Cancer Res., 47:4218-4224）。典型的には、当該標識方法は５〜１０μＣｉ／μｇの比活性を生じさせた。
【００７０】
患者および試料収集
再発性の転移性アデノカルシノーマ患者をフェーズＩの研究に参加させて、静脈投与された１７７ルテニウム放射性標識ＭＡｂ ＣＣ４９（Mulligan, (1995) Clin. Cancer Res. 1: 1447-1454）の最大耐性用量を調べた。
フェーズＩの研究において、アデノカルシノーマ患者に試験用量０．１ｍｇのＭＡｂ ＣＣ４９を与え（静脈内ボーラス）、１７７Ｌｕ−標識Ｍａｂ ＣＣ４９の投与前３０分間にわたり観察した。放射性標識ＭＡｂを１時間の静脈輸液として与えた。輸液前および終了時、ならびに輸液から０．５、１および２時間後、そしてその後７日間にわたり毎日、血液試料を集めた。患者をフォロー−アップ試験に戻し、３、６または８週間目に血液試料を集めた。血清を分離し、分析するまで−２０℃で保存した。これらの患者から得た血清は、ネズミＭＡｂ ＣＣ４９に対する患者の体液性応答を評価するための源となった。患者の特徴を下表１に示す。
【００７１】
【表１】
0004803879.tif 000002
a 177Lu-PA-DOTA-CC49 を患者に静脈注射した。
b Mulligan et al. (1995), Clin. Cancer Res. 1:1447-1454 により記載された方法の変法を用いて標識された 177Lu-PA-DOTA-CC49 の新たな処方を患者に与えた。
【００７２】
ＰＡ−ＤＯＴＡをヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に抱合させ、Ｎａ１２５Ｉで放射性標識し、患者血清とともにインキュベーションし、サイズ排除ＨＰＬＣにより免疫複合体形成に関して分析した。ＰＡ−ＤＯＴＡ−ＨＳＡ抱合体と検出可能な反応性を示した血清はなかった（データ示さず）。
【００７３】
患者の体液性応答の調査
Mulligan et al.(1996) Clin. Cancer Res., 1: 1447-1454により記載されたようにして、高品質液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を用いて、Ｍａｂ ＣＣ４９に応答するヒト抗−ネズミ抗体（ＨＡＭＡ）の存在に関して１２人の患者から得た血清を評価した。５０μｌの患者血清に約５０００００ｃｐｍ（０．４μＣｉ）の１２５Ｉ−ＢＬ−３を添加することにより分析を行った。３７℃で６０分インキュベーションした後、２５μｌの混合物を、１００ｍＭ ＫＣｌ含有リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）中で平衡化されたサイズ−排除カラム（ＴＳＫ ３０００ＳＷ；TosoHaas, Montgpmeryville, PA）にかけた。血清試料を流速０．５ｍｌ／分で溶離させた。２８０ｎｍにおける吸光度により蛋白を検出し、フロー−スルーγ−シンチレーションカウンター（１７０型，Beckman Instruments, Inc., Berkley, CA）を用いて放射活性を測定した。１２５Ｉ−ＢＬ−３の溶離パターンのシフトによりＨＡＭＡの存在が示された。なぜなら、放射性標識ＢＬ−３との免疫複合体の形成は保持時間を短くするからである。患者の研究前の血清、正常ヒト血清および１２５Ｉ−ＢＬ−３を含有するリン酸塩緩衝化セイラインを対照として使用した。以前の研究（Colcher et al. (1990), J. Nucl. Med., 31: 1133-1142）からの既知ＨＡＭＡ応答を有する患者は陽性対照として役立った。患者の血清は、ネズミＣＣ４９の可変領域に対する抗体を有することが示された。
【００７４】
図１９は、１７７Ｌｕ−ＣＣ４９静脈注射後の患者のＨＡＭＡのＨＰＬＣ分析を示す。２０ｍｇの１７７Ｌｕ−標識ＣＣ４９の注射前後の種々の時点において、ＬＱから得た血清試料をＨＡＭＡの存在について分析した。研究前の血清（Ａ）、７日目（Ｂ）、３週間目（Ｃ）、および６週間目（Ｄ）に集めた試料を１２５Ｉ−ＢＬ−３と混合し、サイズ排除カラムにかけた。バッファー中の１２５Ｉ−ＢＬ−３の移動（Ｅ）と比較した場合の放射性標識ＢＬ−３の保持時間の短縮は、免疫複合体の形成を示すものであり、それゆえ、ＨＡＭＡの存在を示すものであった。
患者ＬＱの研究前の血清を１２５Ｉ−ＢＬ−３とともにインキュベーションすると、複合体形成の欠如が明らかである（図１９Ａ）。すべての放射活性が約１８．５分のピークに関連しており、バッファー中の１２５Ｉ−ＢＬ−３（図１９Ｅ）と同じ保持時間である。さらに、７日目に集めた血清を１２５Ｉ−ＢＬ−３とともにインキュベーションした場合、複合体形成はみられない（図１９Ｂ）。しかしながら、３週間目に集めた血清に関しては（図１９Ｃ）、より短い保持時間の２つのピークが出現し、複合体形成（４６％）が示される。より短い保持時間のピークは、血清中の高分子種の発生を示す。６週間目において（図１９Ｄ）、ＨＡＭＡ応答が増大し、複合体に結合した放射活性量は６６％である。
【００７５】
図２０は、ＭＡｂ ＣＣ４９の可変領域に対する患者の体液性応答に関するＨＰＬＣ分析を示す。患者ＤＳ（○）、ＬＷ（□）、ＪＪ（△）、ＤＧ（●）、ＬＪ（四角）、ＴＤ（黒三角）（以上、実線）；ＪＧ（○）、ＲＷ（□）、ＪＭ（△）、ＥＡ（●）、ＣＰ（四角）、ＬＱ（黒三角）（以上、点線）に関して、複合体形成％を時間に対してプロットした。
１週間目ににおいて、ＨｕＣＣ４９に対して検出可能な応答を示した患者はいなかった（図２０）。３週間目において、１２人のうち９人の患者（７５％）がＣＣ４９の可変領域に対する抗体を有していると思われ、１人の患者が他の患者よりも著しく高い応答を有していた。６週間目に評価した１１人の患者については、ＣＣ４９に対するヒト抗可変領域抗体応答（ＨＡＶＲＡ）を誘導されなかったのはわずか２人であり、すなわち、１１人の評価可能な患者のうち９人（８２％）がネズミＭＡｂ ＣＣ４９の可変領域に対する抗体を有していた。
３パターンのＨＡＭＡ−ＨＡＶＲＡ応答が明らかである。各患者において誘導されたＨＡＭＡおよびＨＡＶＲＡ応答のパターンは非常に類似しており、抗体の見かけのレベルにおいてのみ異なっていた。患者ＤＧ、ＬＷ、ＬＱおよびＣＰはＨＡＭＡと同時にＨＡＶＲＡを生じた。患者ＤＳおよびＪＭは強力なＨＡＶＲＡを有するが、ＨＡＭＡ応答は中程度である。患者ＴＤ、ＪＧおよびＥＡにおいて、３週間目のＨＡＶＲＡレベルはＨＡＭＡよりも低いが、その後の時点においてＨＡＭＡおよびＨＡＶＲＡが高レベルに達した。ＨＡＭＡを生じることなくＨＡＶＲＡ応答を有している患者はいなかった。
１２人の患者に関するＨＡＭＡの結果を下表２にまとめる。
【００７６】
【表２】
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a 値は、患者血清とともに短時間インキュベーションし、サイズ排除クロマトグラフィーにより分離した後の複合体中に検出された 125I-BL-3 のパーセント値。各時点において各患者の研究前の血清を用いてバックグラウンドを修正した。
【００７７】
ＨＡＭＡ応答のパターンは様々であり、Colcher et al. (1990), J. Nucl. Med. 31: 1133-1142による以前の知見と矛盾しない。１２人の患者のうち１０人（８３％）が２０ｍｇの１７７Ｌｕ−標識ＣＣ４９の静脈注射から３週間目においてＨＡＭＡ応答を示し、２人の患者（ＬＷおよびＪＧ）が７日目において明らかな最小の応答を有し、それぞれ３％および４％の複合体を伴っていた。１人の患者（ＲＷ）は無応答者の可能性がある。増大していくＨＡＭＡ応答を示す患者もいるが、平坦なＨＡＭＡ応答を示す患者もいる。しかし、別の患者（ＪＪ）のＨＡＭＡレベルは３週間目にピークに達し、その後、明らかに低下している。総体的に、３週間目において１２人中８人（５７％）の患者が、６週間目において１１人中９人（８２％）の患者がＨＡＭＡ陽性であった。
【００７８】
患者応答の特異性
１２５Ｉ−標識ＨｕＣＣ４９およびＨｕＣＣ４９ ＣＤＲ−置換変種を用いてＣＣ４９に対する患者の抗体応答の特異性を調べて、ＣＣ４９の可変領域に対して応答が指向されるかどうかを調べた。これを行うために、１２５Ｉ−ＨｕＣＣ４９をプローブとして使用するＨＰＬＣ法（Kashmiri et al. (1995), Hybridoma, 14: 461-473参照）を用いた。
患者血清中に見出される抗−ＣＣ４９抗体応答に関するＨＰＬＣ分析におけるＴＡＧ−７２の人工的影響を除去するために、Ferroni et al. (1992) J. Clin. Lab. Analysis, 4: 465-473により報告されたように免疫吸着剤を調製した。これらの研究を目的として、Heam et al. (1979), J. Chromatog,. 185:463-470の方法に従って精製ＭＡｂ ＣＣ９２をReacti-gel（HW65F, Pierce）にカップリングさせた。ＭＡｂ ＣＣ９２は第２世代のモノクローナル抗体であり、ＴＡＧ−７２と反応するが、ＣＣ４９により認識されるエピトープとは異なるエピトープと反応する。
１２５Ｉ−ＨｕＣＣ４９で患者血清をプローブする前に、１２５Ｉ−ＢＬ−３および１２５Ｉ−Ｂ７２．３を用いてそれぞれＨＡＭＡおよび循環ＴＡＧ−７２の除去を確認した（データ示さず）。ＭＡｂ Ｂ７２．３は抗−ＴＡＧ−７２ ＭＡｂであり、患者血清中のＴＡＧ−７２と複合体を形成することが示されている（Colcher et al. (1990), J. Nucl. Med. 31: 1133-1142）。
競合アッセイにおいて、５μｇのコールド競合物質（精製ＨｕＣＣ４９またはその変種の１つのいずれか）を、患者血清（１７７Ｌｕ−ＣＣ４９を静脈注射してから８週間目に集めた）および１２５Ｉ−ＨｕＣＣ４９混合物に添加し、次いで、複合体の不存在または存在に関してサイズ排除クロマトグラフィーにより分析した。複合体形成の阻害％を計算した。変種が１２５Ｉ−標識ＭＡｂと競合して複合体形成が阻害された場合、変種はやはり免疫優性ＣＤＲを含んでいる。変種が複合体形成を阻害しなかった場合、変種中にもはや存在しないＣＤＲが患者により認識され、それゆえ、それは免疫原性ＣＤＲである。このアッセイ（患者ＬＱから得た血清を使用）の例を図２１に示す。パネルＡはバッファーのみの中の１２５ＨｕＣＣ４９のプロファイルである。パネルＢは、１２５Ｉ−ＨｕＣＣ４９とともにインキュベーションされた患者血清（ＬＱ）による複合体形成（４２．９％）を示すプロファイルである。ＨｕＣＣ４９を競合物質として添加した場合、１２５Ｉ−ＨｕＣＣ４９に対する競合ならびに複合体の損失または不存在が観察される（パネルＣ）。免疫原性ＣＤＲを有している変種についてもあてはまる（例えば、軽鎖ＣＤＲ２を競合物質とした場合）（パネルＤ）。対照的に、軽鎖ＣＤＲ１またはＣＤＲ３変種が競合物質である場合、それぞれ不完全（パネルＦ）または完全な複合体の維持（パネルＥ）が存在する。
結果は非常に衝撃的であり、表３を参照のこと。
【００７９】
【表３】
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a 177Lu-CC49 を注射した患者から得た血清を、HuCC49の重鎖および軽鎖の両方において個々のＣＤＲがヒト配列で置換されているHuCC49の変種との反応性に関して試験した。精製ＣＤＲ−置換変種５μｇを125I-HuCC49および患者血清の混合物に添加し、次いで、免疫複合体形成の存在または不存在について分析した。b 数値は、HuCC49中のいずれのCDRがヒトCDR配列で置換されているのかを示す。c 数値は、サイズ排除クロマトグラフィーにより分離した場合の複合体のパーセント、すなわち高分子種のパーセントである。
【００８０】
分析した６人の患者のうち、６人すべてがＣＤＲ３軽鎖との反応性を示し、軽鎖ＣＤＲ３がネズミＣＣ４９ ＭＡｂにおいて免疫優性である可能性が示された。重鎖において、ＣＤＲ２は優性であるように思われるが、コンセンサスが得られる同じレベルではないと思われる（６人の患者のうち４人が同じレベルの反応性を示し、他の２人は不完全な反応性を示した）。ＭＡｂの免疫原性に貢献するとは思われない軽鎖のＣＤＲ２ならびに重鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ３に関して６人の患者において一致が得られた。このことは軽鎖ＣＤＲ１にもあてはまり、さらに軽鎖中のＣＤＲ１および２の二重置換を有する変種にもあてはまり、その場合６人の患者すべてが変種の不完全な認識を示した。２人の患者の重鎖ＣＤＲ２変種に関する不完全な認識は、認識エピトープの不完全な（完全でない）消失、コンホーメーションまたはコンホーメーションエピトープの変化、あるいは抗体：抗体相互作用を安定化させる可能性のあるアミノ酸残基の消失によるものである可能性がある。
【００８１】
患者の抗体応答の定量
４人の患者におけるＨＡＭＡまたは抗−可変領域抗体レベルの定量を、ＨＰＬＣ分析を用いて行った。それぞれ５００ｎｇの未標識ＢＬ−３または２５０ｎｇのＨｕＣＣ４９のいずれかを患者血清および１２５Ｉ−ＨｕＣＣ４９の混合物に添加し、複合体中に結合されたＢＬ−３またはＨｕＣＣ４９の量を計算することにより定量的研究を行った。
下表４に示すように、６週間目において、ＨＡＭＡ量は患者により４３倍異なっていたが、ＨＡＶＲＡの相違は４倍以内であった。そのうえ、ＨＡＶＲＡに対するＨＡＭＡのレベルは１０ないし１４５倍異なる可能性がある。明らかに、３週間目にＨＡＶＲＡを検出でき、ＨＡＭＡと同じレベルにならないと考えられるが、驚くべきことではない。患者ＥＡにおいて、６ないし８週間目においてＨＡＶＲＡレベルの劇的な１０倍の増加があり、注目すべきことである。
【００８２】
【表４】
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【００８３】
競合ラジオイムノアッセイ
実際にＨＡＶＲＡがネズミＭＡｂ ＣＣ４９に対するインターナルイメージ抗−イディオタイプ抗体を含む抗−イディオタイプ応答であるかどうかを確認するために、１人の患者（ＥＡ）から得た血清を選択し、ＢＭＳに対する１２５Ｉ−ＨｕＣＣ４９の結合のブロックに関してラジオイムノアッセイで評価した。
Heam et al. (1979), J. Chromatog., 185: 463-470およびSchott (1992) Cancer Res., 52: 6413-6417 により報告された方法を修飾して、固体支持体（Reacti-Gel HW65, Pierce）上に固定化されたウシ顎下腺ムチン（ＢＳＭ）を用いて放射性標識ＭＡｂの免疫反応性を評価した。簡単に説明すると、Horan Hand et al. (1992), Cancer Immunol. Imunother., 353: 165-174により記載されたように、ＴＡＧ−７２陽性であるウシ顎下腺ムチン（ＢＳＭ）を、リン酸塩緩衝化セイライン（ｐＨ７．２）５０μｌ中１０ｎｇとして９６ウェル塩化ポリビニルマイクロタイタープレートの各ウェルに吸着させた。ＰＢＳ中５％ ＢＳＡでウェルを処理した後、患者血清の系列希釈物（ＰＢＳ中１％ ＢＳＡ中に希釈、２５μｌ）を各ウェルに添加し、１２５Ｉ−ＣＣ４９（２５μｌ中３８ｎＣｉ）も添加した。４℃で１８時間インキュベーション後、プレートを洗浄し、γ−シンチレーションカウンターでウェルをカウントした。阻害％を計算し、未標識ＣＣ４９のそれと比較した。ＴＡＧ−７２と反応しないヒトＩｇＧ（Organon Teknika, Durham, NC）を対照抗体として用いた。
患者血清が１２５Ｉ−ＨｕＣＣ４９とＢＳＭとの結合をブロックしうることがわかり（図２２）、実際に患者がインターナルイメージ抗−イディオタイプ抗体からなる抗−イディオタイプ応答を示すことが示唆された。そのうえ、抗−イデイオタイプ応答が８週間の期間にわたり増大することが観察された。図２２は、ネズミＣＣ４９：研究前に患者ＥＡから得た血清（□）に対する患者（ＥＡ）の抗−イディオタイプ抗体応答の検出を示す。血清を３週間目（Ａ）、６週間目（Ｂ）、および８週間目（Ｃ）に集めた。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は基本的な免疫グロブリン構造を示す。
【図２】  図２は、ネズミＭＡｂ ＣＣ４９およびヒト化ＭＡｂ  ＨｕＣＣ４９のＣＤＲ配列と、ヒトＭＡｂ ＬＥＮおよび２１／２８’ＣＬの対応ＣＤＲ配列を比較したものである。下線を付した番号は特異性決定残基（ＳＤＲ）を示す。ＨｕＣＣ４９およびＣＣ４９の軽鎖内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号：１〜３に対応する。ＨｕＣＣ４９およびＣＣ４９の重鎖内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号：４〜６に対応する。ヒト抗体ＬＥＮの軽鎖内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号：７〜９に対応する。ヒト抗体２１／２８’ＣＬの重鎖内のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は、それぞれ配列番号：１０〜１２に対応する。
【図３】  図３は、ＨｕＣＣ４９のヒト化重（Ｂ）鎖の真核発現構築物を図式的に示す。細線は原核ベクターｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、またはｐＣＲＩＩ由来の配列を示す。太線はヒトγ不変領域を示す。縦線、横線、または交差した線の入ったボックスはネオマイシン、ミコフェノリックアシッド、またはヒグロマイシン耐性遺伝子を示す。細い矢印はそれらの転写方向を示す。空のボックスはレトロウイルスＬＴＲであり、太い矢印はＨＣＭＶプロモーターおよびその転写方向を示す。重要な制限酵素部位のみを示す。Ａ：ＡｐａＩ；Ｂ：ＢａｍＨＩ；Ｃ：ＣｌａＩ；Ｈｄ：ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｈｐ：ＨｐａＩ；Ｎ：ＮｈｅＩ；Ｒ：ＥｃｏＲＩ；およびＳ：ＳａｃＩＩ。
【図４】  図４は、ＨｕＣＣ４９のヒト化軽鎖の真核発現構築物を図式的に示す。図３と同様に、細線は原核ベクターｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、またはｐＣＲＩＩ由来の配列を示す。太線はヒトκ不変領域を示す。縦線、横線、または交差した線の入ったボックスはネオマイシン、ミコフェノリックアシッド、またはヒグロマイシン耐性遺伝子を示す。細い矢印はそれらの転写方向を示す。空のボックスはレトロウイルスＬＴＲであり、太い矢印はＨＣＭＶプロモーターおよびその転写方向を示す。重要な制限酵素部位のみを示す。Ａ：ＡｐａＩ；Ｂ：ＢａｍＨＩ；Ｃ：ＣｌａＩ；Ｈｄ：ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｈｐ：ＨｐａＩ；Ｎ：ＮｈｅＩ；Ｒ：ＥｃｏＲＩ；およびＳ：ＳａｃＩＩ。
【図５】  図５は、バキュロウイルスベクターｐＡｃＵＷ５１由来の変種重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖遺伝子の二重発現構築物を図式的に示す。Ｐ１０およびｐｏｌｈはｐ１０プロモーターおよびポリヘドリンプロモーターを示し、矢印はそれらの転写方向を示す。ＯｒｉおよびＦ１はＳＶ４０およびＦ１複製開始点である。ＡｍｐＲはアンピシリン耐性遺伝子を示す。
【図６】  図６は、精製されたＭＡｂ ＨｕＣＣ４９およびその変種のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。すべての試料を還元条件下において示す。レーン１：分子量マーカー（Gibco Brl）；レーン２〜８：変種Ｌ−１、Ｌ−２、Ｌ−３Ｌ−１，２、Ｈ−１、Ｈ−２およびＨ−３；レーン９：ＨｕＣＣ４９。
【図７】  図７は、競合ＲＩＡにおけるＨｕＣＣ４９の親形態および変種形態の分析を示す。軽鎖（Ａ）および重鎖（Ｂ）ＣＤＲ変種の抗原結合を、１２５Ｉ−標識 ＨｕＣＣ４９を用いて評価した。パネルＡにおいて、競合物質は：ＨｕＣＣ４９、Ｌ−１、Ｌ−２、Ｌ−３、Ｌ−１，２である。パネルＢにおいて、競合物質は：Ｈ−１、Ｈ−２およびＨ−３である。
【図８】  図８は、抗−イディオタイプＭＡｂの結合に対する軽鎖ＣＤＲの影響を示す。１２５Ｉ−ＨｕＣＣ４９およびＣＣ４９抗−イディオタイプＭＡｂ ＡＩ４９−３（パネルＡ）、ＡＩ４９−１（パネルＢ）およびＡＩ４９−８（パネルＣ）を用いる競合ＲＩＡにおいてＨｕＣＣ４９ ＣＤＲ変種を特徴づけた。競合物質は：ＨｕＣＣ４９、Ｌ−１、Ｌ−２、Ｌ−３、Ｌ−１，２である。
【図９】  図９は、抗−イディオタイプＭＡｂの結合に対する重鎖ＣＤＲの影響を示す。１２５Ｉ−ＣＣ４９およびＣＣ４９抗−イディオタイプＭＡｂ ＡＩ４９−３（パネルＡ）、ＡＩ４９−１（パネルＢ）およびＡＩ４９−８（パネルＣ）を用いる競合ＲＩＡにおいてＨｕＣＣ４９ ＣＤＲ変種を特徴づけた。競合物質は：ＨｕＣＣ４９、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３である。
【図１０】  図１０は、ＨＰＬＣ法による競合ＲＩＡを用いるＨｕＣＣ４９変種に対するヒト抗−イディオタイプ抗体の分析を示す。精製された親ＨｕＣＣ４９およびＣＤＲ変種を１２５Ｉ−ＨｕＣＣ４９との競合物質として用いて、ＣＣ４９に対する患者の抗−イディオタイプ応答を特徴づけた。変種が患者の血清と１２５Ｉ−ＨｕＣＣ４９との複合体形成を阻害できないことは、変種から置換されたＣＤＲが免疫原性であったことを示す。パネルＡにおいて、競合物質は：ＨｕＣＣ４９、Ｌ−１、Ｌ−２、Ｌ−３、Ｌ−１，２である。パネルＢにおいて、競合物質は：Ｈ−１、Ｈ−２およびＨ−３である。
【図１１】  図１１は、ヒトＭＡｂ ＬＥＮのＶＬフレームワーク（配列番号：３３〜３６）およびＣＣ４９のヒト化ＶＬ（ＨｕＣＣ４９）（配列番号：１３）のアミノ酸配列をパネルＡに示す。パネルＢはヒトＭＡｂ ２１／２８’ＣＬのＶＨフレームワーク（配列番号：３７〜４０）およびＣＣ４９のヒト化ＶＨ（ＨｕＣＣ４９）（配列番号：１４）のアミノ酸配列を示す。ＣＣ４９の結合部位構造の維持に重要であると思われるフレームワーク残基をアステリスクでマークしてある。
【図１２】  図１２は、ＨｕＣＣ４９可変部軽鎖（ＶＬ）および可変部重鎖（ＶＨ）領域のヌクレオチド配列をそれぞれパネルＡおよびＢに示す。可変領域ドメインをコードしない隣接オリゴマーまたはそれらのリーダーペプチドの配列を小文字で示す。ＶＬ領域（Ａ）は位置７４から４１２までのヌクレオチドによりコードされており、位置７０から４１５までのヌクレオチド（Ｂ）はＶＨ領域を含む。
【図１３】  図１３はＨｕＣＣ４９の変種を用いる競合アッセイの結果のグラフである。
【図１４】  図１４は、ＨｕＣＣ４９の変種に対する親の反応性に関するＨＰＬＣ分析の結果を示す。競合物質は反応あたり５μｇであった。値は、サイズ排除クロマトグラフィーにより分離された複合体、高分子種のパーセント値である。複合体形成は、親抗体により認識されるエピトープの除去を示す。複合体形成の阻害は、免疫原性エピトープがＨｕＣＣ４９変種中にまだ存在していることを示す。
【図１５】  図１５は、ＨｕＣＣ４９およびその種々の変種と親との反応性の比較を示すグラフである。
【図１６】  図１６は変種９７Ｌ１，２／６０−６２，６４Ｈの免疫反応性を示すグラフである。
【図１７】  図１７はＨｕＣＣ４９およびその変種の血漿における維持に関する薬剤動態を示すグラフである。
【図１８】  図１８は、ＬＳ−１７４Ｔヒト結腸癌腫異種移植片を有する胸腺切除マウスに静脈内投与された放射性標識ＨｕＣＣ４９および変種の体内分布を示す表である。ＬＳ−１７４Ｔヒト結腸癌腫異種移植片（皮下移植）を有する胸腺除去マウスに１．４μＣｉの１３１Ｉ−ＨｕＣＣ４９および４．４μＣｉの１２５Ｉ−変種を同時注射した。示された時点でマウスを殺し、器官を集め、湿重量を測定し、γシンチレーションカウンターにおいて放射活性を検出した。各組織に関して１グラムあたりの注射用量に対する重量パーセントを計算した。平均値の標準偏差も計算したところ、０．０６％ＩＤ／ｇまたはそれ未満であった。
【図１９】  図１９は１７７Ｌｕ−ＣＣ４９を静脈内注射した後の患者のＨＡＭＡに関するＨＰＬＣ分析である。
【図２０】  図２０はＭＡｂ ＣＣ４９の可変領域に対する患者の体液性応答に関するＨＰＬＣ分析である。（実線）患者ＤＳ（〇）、ＬＷ（□）、ＪＪ（△）、ＤＧ（●）、ＬＪ（四角）、ＴＤ（黒三角）；（点線）ＪＧ（〇）、ＲＷ（□）、ＪＭ（△）、ＥＡ（●）、ＣＰ（四角）、ＬＱ（黒三角）に関して複合体形成パーセント値を時間に対してプロットした。
【図２１】  図２１はネズミＣＣ４９に対する抗−イディオタイプ抗体応答の検出である。
【図２２】  患者ＬＱのＣＤＲ特異性を示すＨＰＬＣ分析である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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