(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
sucAB遺伝子を最適レベルに発現し、Ｌ−プロリンおよびＬ−ロイシンからなる群から選択されるＬ−アミノ酸を生産するエシェリヒア・コリを得る方法であって、以下の工程：
（１）エシェリヒア・コリの染色体において、sucAB遺伝子自身のプロモーターの代わりにsucAB遺伝子発現用のプロモーターを含むｉｎ ｖｉｔｒｏで構築されたＤＮＡフラグメントのセットを導入する工程、および
（２）親株よりも大量に前記Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有するエシェリヒア・コリを選択する工程を含む方法。
【請求項２】
前記ｉｎ ｖｉｔｒｏで構築されたＤＮＡフラグメントのセットは、無作為化配列を有するプロモーターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｉｎ ｖｉｔｒｏで構築されたＤＮＡフラグメントのセットは、既知の配列を有するプロモーターから構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
sucAB遺伝子を最適レベルに発現し、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、およびＬ−ロイシンからなる群から選択されるＬ−アミノ酸を生産するエシェリヒア・コリであって、ｓｕｃＡＢ遺伝子のプロモーターの−３５領域の配列が、配列番号１０において２４番目から２７番目の塩基がＡＧＡＴまたはＴＴＧＣである配列を含む、エシェリヒア・コリ。
【請求項５】
Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、およびＬ−ロイシンからなる群から選択されるＬ−アミノ酸を製造する方法であって、培地中で請求項４に記載のエシェリヒア・コリを培養し、該培地中に前記Ｌ−アミノ酸を蓄積させる工程、および前記培地から前記Ｌ−アミノ酸を採取する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノ酸または核酸生産に有用な遺伝子を最適レベルに発現する細菌を得る方法、および上記細菌を用いて、Ｌ−アミノ酸または核酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝統的に、Ｌ−アミノ酸または核酸の生合成経路に関与する遺伝子産物の活性を高めることは、Ｌ−アミノ酸または核酸生産を増大するために使用される一般的な方法であった。この方法は、しばしば、標的化合物または類縁体に耐性である突然変異体を創出すること、生合成遺伝子の発現を高めること、生合成の産物および中間体によるフィードバック阻害に対する生合成酵素の感受性を解除すること、および他の経路のための標的化合物の前駆体を用いる酵素をコードする遺伝子を欠損した細菌株を創出すること、あるいは標的化合物の分解に関する遺伝子を欠損した細菌株を創出することにより達成されてきた。
【０００３】
これらの操作は通常、生育できないか、または相当減じられた速度でのみ生育する株、あるいはアミノ酸のようなさらなる栄養素を必要とする株の創出をもたらす。例えば、幾つかの遺伝子が過度に高発現されると、細菌の生育が重度に阻害され、その結果、細菌の標的化合物を生産する能力を低減させることがある。
【０００４】
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼを欠損するか、または減少したレベルのα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼを保有するエシェリヒア属に属する微生物は、Ｌ−グルタミン酸を生産する能力を有することが知られている（米国特許第５，５７３，９４５号および同第５，９０８，７６８号）。しかし、これらの突然変異体は、好気性条件下でグルコース最小培地中において、生育することができないか、あるいは相当減少した速度でのみ生育する。メチオニンを補充したコハク酸またはリシンの添加は、生育を回復させるのに必要である。したがって、細菌がグルタミン酸を生産し、かつコハク酸、リシンまたはメチオニンのようなさらなる補充成分を含まない培地中で生育する能力を獲得するためには、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼに関する最適な発現レベルの選択が必要である。
【０００５】
他方で、コハク酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ｓｄｈＣＤＡＢ遺伝子）ならびにα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ（ｓｕｃＡＢ遺伝子）およびスクシニル−ＣｏＡシンターゼ（ｓｕｃＣＤ遺伝子）をコードする遺伝子は、エシェリヒア・コリの染色体中に２つのプロモーターを含むクラスター：Ｐｓｄｈ−ｓｄｈＣＤＡＢ−Ｐｓｕｃ−ｓｕｃＡＢ−ｓｕｃＣＤを形成することが知られている(Park, S.J., Chao, G., and Gunsalus, R.P., J. Bact. 179, 4138-4142, 1997; Cunningham, L., and Guest, G.R., Microbiology, 144, 2113-2123, 1998)。このオペロン構築物に関する主要プロモーターは、ｓｄｈＣ遺伝子の上流に位置する調節領域、すなわちＰｓｄｈである。σ３８と複合体を形成するエシェリヒア・コリＲＮＡポリメラーゼにより認識されるより弱いＰｓｕｃプロモーターは、さらなる弱い構成的レベルのｓｕｃＡＢＣＤ遺伝子発現を提供する。後者のプロモーターの活性は、生育基質により比較的影響を受けない。さらに、嫌気環境およびａｒｃＡまたはｆｎｒ突然変異の影響は比較的小さい。ＡｒｃＡタンパク質は、好気的経路における遺伝子のネガティブ応答調節因子であり、Ｆｎｒ（フマル酸および硝酸還元）タンパク質は、好気呼吸、嫌気呼吸および浸透圧平衡の転写調節に関与する。試験された潜在的な調節因子の中でも、ＩＨＦタンパク質（組込み宿主因子、ｈｉｍＡ遺伝子の産物）が、Ｐｓｕｃ活性抑制に主要な役割を果たすと考えられる。ＡｒｃＡおよびＦｒｎタンパク質は、Ｐｓｄｈプロモーターと相互作用し、ＩＨＦタンパク質は、より弱いＰｓｕｃプロモーターと相互作用する。
【０００６】
種々の強度を有するラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)に関する合成プロモーターのライブラリーの取得について記載されている(Jensen P.R., and Hammer K.,
Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64, No.1. 82-87 Biotechnol. Bioeng., 1998, 58,
2-3, 191-5)。ライブラリーは、−３５から−１５までの位置においてコンセンサス配列間に無作為化スペーサーを有する３８個のオリゴヌクレオチドから構成される。得られたプロモーターの強度を評価するために、ライブラリーからのオリゴヌクレオチドが、β−ガラクトシダーゼを含む発現ベクターｐＡＫ８０にクローニングされた。人工プロモーターの大部分が非常に弱く（５００以下）、それらのうちたった３つが、約２，０００相対ユニットの強度を有することが示された。しかし、合成プロモーターのライブラリーに関する実用的な応用は開示されていない。
【０００７】
アミノ酸または核酸生合成用遺伝子のプロモーター配列中に突然変異を導入することによりアミノ酸または核酸の生産性が改善されたコリネ型細菌を創製する方法は、欧州特許出願１０３３４０７Ａ１に開示されている。突然変異プロモーターの最大８個の異なるバリアントが、以下の遺伝子それぞれに使用された：グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈ）遺伝子、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｃｄ）遺伝子、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｄｈＡ）遺伝子およびアルギニノコハク酸シンターゼ（ａｒｇＧ）遺伝子。欧州特許出願第１０３３４０７Ａ１に記載される方法の欠点は、記載される突然変異それぞれが別個に、すなわち１つずつ調製されることである。また、この特許出願で開示される事例すべてにおけるＬ−アミノ酸生産の増大は、酵素をコードする遺伝子のために限られた量の異なるプロモーターを用いて、ある特定の酵素の活性を増大させることにより達成された。このアプローチは、Ｌ−アミノ酸または核酸生産細菌を調製することに焦点を置いた作業の主流であり、Ｌ−アミノ酸または核酸の生産に必須の遺伝子のプロモーター活性の最適化または微調整に関連しない。
【０００８】
最適レベルに標的遺伝子を発現するように改変された細菌を用いた発酵による代謝産物生産のための遺伝子発現の最適化について記載する報告はない。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の目的は、細菌内の炭素または窒素の流れの分布に影響を及ぼすタンパク質をコードする標的遺伝子を最適レベルに発現する細菌を得る方法であって、（１）上記細菌の染色体に、上記標的遺伝子自身の調節配列の代わりに上記標的遺伝子発現用の調節配列を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏで構築されたＤＮＡフラグメントのセットを導入する工程、および（２）所望の表現型を有する細菌を選択する工程を含む方法を提供することである。
【００１０】
本発明の更なる目的は、Ｌ−アミノ酸生産に影響を及ぼすタンパク質をコードする遺伝子を最適レベルで発現するＬ−アミノ酸生産細菌であって、上記の方法により得られるＬ−アミノ生産細菌を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる目的は、Ｌ−アミノ酸を生産する方法であって、（１）培地中で上述の細菌を培養し、該培地中にＬ−アミノ酸を蓄積させる工程、および（２）上記培地からＬ−アミノ酸を採取する工程を含む方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、細菌内の炭素または窒素の流れの分布に影響を及ぼし、Ｌ−アミノ酸または核酸生産に影響を及ぼす遺伝子を最適レベルに発現するＬ−アミノ酸生産細菌を得るための単純かつ明快な一段階の方法を提供する。本発明はさらに、生産を増大させることにより、Ｌ−アミノ酸または核酸生産に影響を及ぼす遺伝子を最適レベルに発現する細菌を提供する。本発明はまた、Ｌ−グルタミン酸のようなＬ−アミノ酸、またはＬ−アルギニン
、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ロイシンなどのＬ−グルタミン酸に由来するＬ−アミノ酸を生産する方法、Ｌ−リシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシンおよびＬ−フェニルアラニンのような、その生合成においてアミノ基の供与体としてＬ−グルタミン酸を必要とするＬ−アミノ酸を生産する方法、および核酸を生産する方法を提供する。
【００１３】
本発明は、細菌染色体上において、標的遺伝子の天然型プロモーターを、「無作為化」プロモーター様配列で直接置換することにより達成された。この概念は、エシェリヒア・コリＲＮＡポリメラーゼとσ７０との複合体により認識されるプロモーターの改変された「−３５領域」を有する突然変異体が、転写開始の効率を有意に変化させるという十分確立された事実に基づいている。したがって、初期ランダムプロモーター様配列を用いて創出されるプロモーターの中で、種々の強度を有するプロモーターが得られ、プラスミドなしの株の生産性の直接評価により（および他の生理学的特性によっても）、最適な構築物が選択される。
【００１４】
この一般的なアプローチは、Ｌ−グルタミン酸生産レベルを増大させるための組換えエシェリヒア・コリモデル株におけるｓｕｃＡＢ遺伝子の発現の微調整に利用されている。遺伝子またはオペロンの発現の最大化ではなく最適化を達成することは、特に標的遺伝子の低発現が最終目的を達成するのに不十分であり、他方で相当する遺伝子の過剰発現が中性的な影響だけでなく、マイナスの影響も引き起こし得る場合、生物学的に活性な代謝産物を生産することが可能な種々の細菌株の構築において現実的な問題である。さらに、この重要な遺伝子活性の所望のレベルは未知である。微調整は、最適化を提供するのに極めて望ましく、したがって多数の変異体を試験しなくてはならない。この種の微調整を実施するための伝統的なアプローチには、組換えプラスミドへの標的遺伝子の分子クローニング、およびそれを種々のプロモーターの制御下に配置させること、得られた組換え株の評価が含まれる。プラスミドなしの改善された生産株が望ましい場合には、最良の変異体の選択後、多数の付加的な作業が必要である。
【００１５】
１．本発明の方法
本発明の方法は、細菌内の炭素の流れの分布に影響を及ぼし、結果としてＬ−アミノ酸生産に影響を及ぼす標的遺伝子を最適レベルに発現するＬ−アミノ酸生産細菌を得ることを包含し、これは、（１）細菌染色体に、上記標的遺伝子自身の調節配列の代わりに、上記標的遺伝子発現用の調節配列を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏで構築したＤＮＡフラグメントのセットを導入すること、および（２）所望の表現型を有する細菌を選択することを包含する。
【００１６】
本明細書中で使用する場合「発現」という用語は、遺伝子によりコードされるタンパク質産物の産生を意味する。
【００１７】
「最適レベルに発現する」という用語は、所望の表現型を有する細菌をもたらす１又は複数の標的遺伝子の発現を意味する。
【００１８】
「所望の表現型」という用語は、改善の対象である細菌の１つまたは幾つかの特徴を包含する。好ましくは、所望の表現型は、細菌の、親株よりも大量にＬ−アミノ酸を生産する能力であり得る。また、所望の表現型は、栄養要求性または成長因子に関する他の要求性、あるいはそれらの組合せを補完するのに通常使用される添加剤を含有しない最小培地で生育する能力であり得る。
【００１９】
「炭素または窒素の流れの分布に影響を及ぼすタンパク質をコードする遺伝子」という用語は、炭素または窒素の代謝経路に関与するタンパク質をコードする遺伝子を意味する
。かかる遺伝子の例としては、解糖または窒素同化作用遺伝子、ペントースサイクル遺伝子、ＴＣＡサイクル遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、例としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホルホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、グルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ、イソプロピルリンゴ酸シンターゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。Ｌ−アミノ酸の生合成経路、核酸およびそれらの前駆体に関与する細菌遺伝子もまた包含される。
【００２０】
「ｉｎ  ｖｉｔｒｏで構築されたＤＮＡフラグメントのセット」という語句は、新たに合成されたＤＮＡフラグメントの混合物または天然もしくは突然変異体の微生物から得られる既知のＤＮＡフラグメントの混合物、ＤＮＡライブラリー、GenBank等を意味する。ＤＮＡフラグメントのセットは、新たに合成されたＤＮＡフラグメントと、既知の配列、上述の種々の供給源から得られるＤＮＡフラグメント、または化学合成により得られかつ無作為化配列を含む領域を有するＤＮＡフラグメントとの直接混合により形成されてもよい。
【００２１】
「無作為化配列」という語句は、ＤＮＡフラグメントの標準的な化学合成中に、ランダムヌクレオチド（通常、Ｎと称される、ここでＮは、アデニン、グアニン、シトシンまたはチミンである）が、ＤＮＡフラグメントのある特定の位置、またはランダムヌクレオチド配列を有するＤＮＡフラグメントの幾つかの領域に導入されることを意味する。ＤＮＡフラグメントは、「調節配列（regulatory element）」と呼ばれる配列を含む。
【００２２】
「調節配列」という語句は、コード領域の上流、コード領域内、および／またはコード領域の下流に位置するヌクレオチド配列であって、細胞のタンパク質生合成機構とともにコード領域の転写および／または発現を制御する配列を指す。この語句は通常、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、オペレーターまたはゲノムの他の配列を称する場合に使用され、これらは遺伝子発現レベルに影響を及ぼす。
【００２３】
調節配列を含む上記ＤＮＡフラグメントの混合物は、自身の調節配列の代わりに、細菌の染色体に導入され、標的遺伝子を種々のレベルに発現する細菌細胞の集団を生じる。所望の表現型を有する細菌の選択は、標準的な最小培地中で生産されるＬ−アミノ酸の量の直接的な評価、または所望の表現型に必須の特徴を推定するのに適した他の方法により行われ得る。
【００２４】
本明細書中で使用する場合「Ｌ−アミノ酸生産細菌」という語句は、野生型または親株よりも大量に、培地中で標的Ｌ−アミノ酸の蓄積をもたらすことが可能である細菌を意味し、好ましくは、微生物が、培地中で０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは１．０ｇ／Ｌ以上の標的Ｌ−アミノ酸の蓄積をもたらすことが可能であることを意味する。
【００２５】
「エシェリヒア属に属する細菌」という語句は、細菌が、微生物学の技術分野の当業者に既知の分類に従ってエシェリヒア属と分類されることを意味する。本発明で使用されるエシェリヒア属に属する微生物の例としては、エシェリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）が挙げられるが、これに限定されない。
【００２６】
酵素活性のレベルの決定、およびある特定条件に対する最適調節配列の選択には、当該
技術分野でより高度な技術を必要とし、科学的推測または洞察に基づく調節配列の選択は、所望の結果または最適な結果を導き得ないこともありうる。さらに、種々の酵素活性レベルを有する限定された量の突然変異体を調製することは、かかる突然変異体は伝統的には１つずつ調製されることから、複雑でかつ時間を消費する。対照的に、本発明の方法は好適なことに、標的遺伝子に関して広範囲の発現レベルを有する細菌細胞の集団を生成する、染色体への人工または天然ＤＮＡフラグメントの組込みの単純かつ明快な一段階プロセスを提供する。例えば、化学的に合成した調節配列のある特定の領域における４個のヌクレオチドの無作為化は、４４個、すなわち２５６個の理論的に考え得る領域の変異体を提供する。
【００２７】
さらに、酵素をコードする遺伝子を、細菌を宿主とするプラスミドへ導入することにより、標的酵素の活性を評価することは典型的である。しかし、細菌染色体に組み込まれた遺伝子の発現レベルと細菌を宿主とするプラスミドに導入された同遺伝子の発現レベルは同じでない場合がある。したがって、本発明の別の利点は、上記方法が、標的遺伝子の発現に関する最適条件下で細菌の評価および選択をし、次いで、さらなる操作なしでＬ−アミノ酸生産のために細菌を直接使用することが可能であることである。
【００２８】
プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化および連結、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等の方法は、当業者に既知である。これらの方法は、例えばSambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis. T., 「Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition」; Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている。
【００２９】
２．本発明の細菌
本発明の細菌は、Ｌ−アミノ酸生産に影響を及ぼす遺伝子を最適レベルに発現するＬ−アミノ酸生産細菌である。かかる細菌は、本発明の方法により得られる。
【００３０】
より具体的には、本発明の細菌は、Ｌ−グルタミン酸に由来するＬ−アミノ酸を生産し、かつＬ−グルタミン酸生産に影響を及ぼす遺伝子を最適レベルに発現する細菌である。Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリンおよびＬ−グルタミンはすべて、Ｌ−グルタミン酸に由来する。また、本発明の細菌は、Ｌ−グルタミン酸生産に影響を及ぼす遺伝子を最適レベルに発現するＬ−グルタミン酸生産細菌を包含する。さらに、Ｌ−グルタミン酸は、アミノ基の供与体として、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシンおよびＬ−フェニルアラニンの生合成において重要な役割を果たす。したがって、遺伝子にコードされるアミノトランスフェラーゼへの窒素供与の向上は、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシンおよびＬ−フェニルアラニンのような他のアミノ酸の生産に有効である。したがって、本発明の細菌は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ロイシンを生産する細菌、およびＬ−リシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニンを生産する細菌を包含する。
【００３１】
本発明の特定の実施形態は、組換えプラスミドｐＡＹＣＴＥＲ１−ｃｐｇを含み、かつｓｕｃＡＢ遺伝子を最適レベルに発現するようにさらに改変されたＬ−グルタミン酸生産エシェリヒア・コリ株７０２ｉｌｖＡ（ＶＫＰＭ  Ｂ−８０１２）（欧州特許出願１７７２４３３Ａ１）である。プラスミドｐＡＹＣＴＥＲ１−ｃｐｇは、標準的な方法により、エシェリヒア・コリ株Ｋ−１２からクローニングされた、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ遺伝子）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｃ遺伝子）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈＡ遺伝子）およびｐｒｏＢＡ−オペロン（グルタミン酸−５−
セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸５−キナーゼ）をコードする天然型遺伝子を有するＲＳＦ１０１０レプリコンの誘導体である。ｓｕｃＡＢ遺伝子発現の最適化は、本発明の方法により実施される。組換え株７０２ｉｌｖＡ［ｐＡＹＣＴＥＲ１−ｃｐｇ］は、スレオニンデアミナーゼを欠損しており、生育のためにＬ−イソロイシンを要し、かつ培養中にＬ−プロリンおよびＬ−グルタミン酸を生産することが可能である。
【００３２】
Ｌ−グルタミン酸を生産することが可能であり、かつ遺伝子発現の最適化の対象であり得るエシェリヒア属に属する細菌は、以下のエシェリヒア・コリ株により例示される：アスパラギン酸代謝拮抗物質に耐性であり、かつα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を欠損する株、例えば、ＡＦ１３１９９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５８０７）（米国特許第５，９０８，７６８号）、さらにＬ−グルタミン酸分解能が低下した株ＦＥＲＭ  Ｐ−１２３７９（米国特許第５，３９３，６７１号）、エシェリヒア・コリ株ＡＪ１３１３８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５５６５）（米国特許第６，１１０，７１４号）等。Ｌ−グルタミン酸生産能は、例えば、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（日本国特許出願公開第６１−２６８１８５、１９８６年）、グルタミンシンテターゼ、グルタミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（日本国特許出願公開第６２−１６６８９０、１９８７年；同第６３−２１４１８９、１９８８年）、アコニット酸ヒドラターゼ（日本国特許出願公開第６２−２９４０８６、１９８７年）、クエン酸シンターゼ（日本国特許出願公開第６２−２０５８５、１９８７年；同第６３−１１９６８８、１９８８年）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（日本国出願公開第６０−８７７８８、１９８５年；同第６２−５５０８９、１９８７年）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ、エノラーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ（日本国特許出願公開第６３−１０２６９２、１９８８年）、グルコースリン酸イソメラーゼ、グルタミン−オキソグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（国際公開９９／０７８５３号パンフレット）等を含むが、これらに限定されない酵素をコードするＤＮＡを導入することにより付与され、あるいは高められる。さらに、本発明の細菌は、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐しＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成するための反応を触媒する酵素の活性を欠如するように変更されてもよい。Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐しＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成するための反応を触媒する酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸リアーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シンターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピロリンデヒドロゲナーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
また、４−アザロイシンまたは５，５，５−トリフルオロロイシンに耐性であるエシェリヒア・コリ株Ｈ−９０６８（ＡＴＣＣ  ２１５３０）、Ｈ−９０７０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７０４）およびＨ−９０７２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７０６）（米国特許第５，７４４，３３１号）、Ｌ−ロイシンによるイソプロピルリンゴ酸シンターゼのフィードバック阻害が脱感作されたエシェリヒア・コリ株（欧州特許１０６７１９１）、β−２−チエニルアラニンおよびβ−ヒドロキシロイシンに耐性であるエシェリヒア・コリ株ＡＪ１１４７８（米国特許第５，７６３，２３１号）、Ｌ−ロイシンに耐性であるエシェリヒア・コリ株５７（ＶＫＰＭ  Ｂ−７３８６、ロシア国特許第２１４０４５０）等のようなエシェリヒア属に属するＬ−ロイシン生産細菌を使用することが可能である。
【００３４】
Ｌ−グルタミン酸およびＬ−ロイシンに関する上記のような方法は、他の既知のＬ−アミノ酸を生産する細菌を得るために用いることもできる。
【００３５】
３．Ｌ−アミノ酸の製造方法
Ｌ−アミノ酸を製造する方法は、培地中で本発明の細菌を培養し、培地中にＬ−アミノ酸を蓄積させる工程、および上記培地からＬ−アミノ酸を採取する工程を含む方法である。より具体的には、Ｌ−アミノ酸の製造方法は、培地中で本発明の細菌を培養し培地中にＬ−グルタミン酸を蓄積させる工程、および上記培地からＬ−グルタミン酸を採取する工程を含むＬ−グルタミン酸の製造方法を包含する。同様に、Ｌ−アミノ酸を生産する方法は、培地中で本発明の細菌を培養し培地中にＬ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリンまたはＬ−ロイシンを蓄積させる工程、および上記培地からＬ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリンまたはＬ−ロイシンを採取する工程を含む、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリンまたはＬ−ロイシンの製造方法を包含する。
【００３６】
本発明では、培養、培地からのＬ−アミノ酸の採取および精製等は、アミノ酸が細菌を用いて生産される従来の発酵方法と同様の方法で実施される。
【００３７】
培養に使用される培地は、炭素源、窒素原、ミネラルおよび必要に応じて細菌が生育に要求する適切量の栄養分を含むものであれば、合成培地または天然培地のいずれかであってもよい。炭素源としては、グルコースおよびスクロースのような各種炭水化物、および各種有機酸が挙げられる。選択した微生物の同化作用様式に応じて、エタノールおよびグリセロールを含むアルコールを使用してもよい。窒素源は、アンモニアおよび硫酸アンモニウムのような各種アンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトン、ダイズ加水分解産物および消化された発酵微生物のような天然窒素源が挙げられる。ミネラルとしては、一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等が挙げられる。ビタミンとしては、チアミン、酵母抽出物等が挙げられる。
【００３８】
培養は、好ましくは、通気を伴う振とう培養または攪拌培養のような好気性条件下で、２０〜４０℃、好ましくは３０〜３８℃の温度で実施される。培地のｐＨは、通常５〜９、好ましくは６．５〜７．２である。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、各種酸、各種塩基、および緩衝液を用いて調整することができる。通常、１〜５日の培養期間により、液体培地中に標的Ｌ−アミノ酸が蓄積する。
【００３９】
培養後、細胞のような固形分を、遠心分離または膜濾過により液体培地から除去することができ、Ｌ−アミノ酸は、イオン交換、濃縮および結晶化方法により採取および精製することができる。
【００４０】
＜実施例＞
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して、より具体的に説明される。
【実施例１】
【００４１】
エシェリヒア・コリ染色体上のｓｕｃＡＢ遺伝子の天然型上流領域の、合成Ｐｔａｃ＊−プロモーターおよびＳＤｌａｃＺを有するハイブリッド調節配列による置換
「Ｒｅｄ媒介性組換え（Red-mediated recombination）」または「Ｒｅｄ駆動型組込み(Red-driven integration)」とも呼ばれるDatsenko, K.A. and Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,6640-6645,2000)に記載された方法により、エシェリヒア・コリに由来するｌａｃＺ遺伝子のシャイン−ダルガーノ配列（ＳＤ配列）に連結させた改変Ｐｔａｃ＊−プロモーターを、天然型領域に代えて、ｓｕｃＡＢコード領域の上流で、エシェリヒア・コリ株７０２ｉｌｖＡ［ｐＡＹＣＴＥＲ−ｃｐｇ］の染色体に組み込んだ。改変Ｐｔａｃ＊−プロモーターは、２１ｂｐのラクトースオペレーター（Ｏｌａｃ）の最初の１１ｂｐのみを含んでおり、特異的なＤＮＡ−タンパク質相互作用に必須のヌクレオチドの非存在により、ラクトースレプレッサーと相互作用することができない。また、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍＲ、またはｃａｔ）を含む人工ＤＮＡフラグメントを
、改変Ｐｔａｃ＊−プロモーターの５’部分に連結させ、細菌染色体の相当する領域へ選択的に組込んだ。人工ＤＮＡフラグメントの構築の方法を図１に表す。ｓｕｃＡＢ遺伝子の上流に位置する置換された天然型領域の塩基配列を配列表（配列番号１）に示す。
【００４２】
クロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍＲ）を有する上述の人工ＤＮＡフラグメントのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの構築は、複数の段階により実行された。まず、Ｐｔａｃ＊−プロモーターのＰＣＲによるＤＮＡ増幅を行い、上流にＢｇｌＩＩ制限部位を有し（次の遺伝子組換え構築の便宜のため、後述のとおり）、ｓｕｃＡＢコード領域のＮ末端に直接連結させたエシェリヒア・コリｌａｃＺ遺伝子のＳＤ配列およびＡＴＧ開始コドンが下流に位置するようなプロモーターを含むフラグメントを得た。市販の組換えプラスミドであるｐＤＲ５４０（GenBank/EMBLアクセッション番号Ｕ１３８４７号、「Pharmacia」、ＵＳＡ）をＰＣＲ用の鋳型として使用した。化学的に合成したオリゴヌクレオチドＰ１（配列番号２）およびＰ２（配列番号３）をプライマーとして用いて、ＰＣＲを行った。
【００４３】
すべての場合で、ＰＣＲは、サーマルサイクラーＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ２４００
ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステムを用いて行った。反応混合物は、総容量５０μｌとし、１０×ＰＣＲ緩衝液（「Fermentas」、リトアニア）を５μｌ、ＭｇＣｌ２を最終濃度１．５ｍＭまで添加し、ｄＮＴＰをそれぞれ２００μＭ、プライマーをそれぞれ４００ｎＭおよびＴａｑ−ポリメラーゼ（「Fermentas」、リトアニア）を２Ｕ加えた。ＰＣＲ増幅に添加した鋳型ＤＮＡの量は、標的ＤＮＡフラグメント０．２ｎｇを生じるように算出した。ＰＣＲの温度プロフィールは、以下の通りであった：９５℃で５分の初期のＤＮＡ変性、続いて９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃での伸長を２０サイクル；７２℃で２分の最終的な重合。伸長時間は、Ｔａｑ−ポリメラーゼに関する製造業者の指示に従って、かつ所望の増幅ＤＮＡフラグメントの長さに応じて選択した。実施例では、伸長時間は１．５分であった。
【００４４】
同時に、目的の第２ＤＮＡフラグメントの構築を行った。ＣｍＲ遺伝子は、市販のプラスミドｐＡＣＹＣ１８４（Genbank／ＥＭＢＬアクセッション番号Ｘ０６４０３号、「Fermantas」、リトアニア）を鋳型として、かつ化学的に合成したオリゴヌクレオチドＰ３（配列番号４）およびＰ４（配列番号５）をプライマーとして用いて増幅した。プライマーＰ３は、ＢｇｌＩＩ制限部位を含み、Ｐｔａｃ＊プロモーターを有する先に得られたＤＮＡフラグメントを連結するために使用される。プライマーＰ４は、細菌染色体への目的フラグメントのさらなるＲｅｄ媒介性組換えに必要な、エシェリヒア・コリ染色体中のｓｕｃＡＢ遺伝子の調節領域の上流に位置するヌクレオチドに相補的な３６個のヌクレオチドを含む。プライマー４は、配列番号５で表され、５７個のヌクレオチドから構成される。
【００４５】
２つの上述の増幅ＤＮＡフラグメントを、ＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼで処理した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した(Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)。最終的に、連結産物を、プライマーＰ１およびＰ４を用いたＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡフラグメントをエタノールで精製して、エシェリヒア・コリ株７０２ｉｌｖＡ［ｐＡＹＣＴＥＲ１−ｃｐｇ］の細菌染色体へのエレクトロポレーションおよびＲｅｄ媒介性組換えに使用した。エシェリヒア・コリ株７０２ｉｌｖＡ［ｐＡＹＣＴＥＲ１−ｃｐｇ］は、Ｌ−グルタミン酸生産エシェリヒア・コリ株７０２ｉｌｖＡ（ＶＫＰＭ  Ｂ−８０１２）（欧州特許公開公報第１７７２４３３号）の誘導体であり、組換えプラスミドｐＡＹＣＴＥＲ１−ｃｐｇを含む。プラスミドｐＡＹＣＴＥＲ１−ｃｐｇは、ｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターの誘導体であり、これは、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ遺伝子）、ＰＥＰカルボキシラーゼ（ｐｐｃ遺伝子）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｄｈＡ遺伝子）をコードする天然型遺伝子、ならびにｐｒｏＢＡオペロンを含む。なお、これらの遺伝子は、鋳型にエシェリヒア・コリ株Ｋ−１２
の染色体ＤＮＡを用い、ＰＣＲ産物のさらなるクローニングおよび構築に適した制限部位を隣接したプライマーを用いたＰＣＲのような標準的な方法によりエシェリヒア・コリ株Ｋ−１２からクローニングすることができる。ｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターは、ｐＡＹＣ３２の誘導体であり、中程度のコピー数であり、プラスミドＲＳＦ１０１０に基づいて構築された非常に安定なベクターであり(Christoserdov, A.Y., Tsygankov, Y.D., Plasmid, 1986, v. 16, pp. 161-167)、ストレプトマイシン耐性マーカーを含む。ｐＡＹＣＴＥＲ３ベクターは、以下のように、ｐＡＹＣ３２プラスミドに、そのプロモーターに代わって、ｐＵＣ１９プラスミド由来のポリリンカーおよび強力なターミネーターｒｒｎＢを導入することにより構築された。まず、ｐＵＣ１９プラスミド由来のポリリンカーは、配列番号６および７で表されるプライマーを用いたＰＣＲにより得られた。得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼで処理した。ターミネーターｒｒｎＢもまた、配列番号８および９で表されるプライマーを用いたＰＣＲにより得られた。得られたＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩおよびＢｃｌＩ制限エンドヌクレアーゼで処理した。次に、これらの２つのＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＢｃｌＩ制限エンドヌクレアーゼであらかじめ処理したｐＡＹＣ３２プラスミドに連結させた。このようにして、ｐＡＹＣＴＥＲ３プラスミドが得られた。
【００４６】
熱感受性レプリコンを有する組換えプラスミドｐＫＤ４６(Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645, 2000)を、Ｒｅｄ媒介性組換え系に用いられるファージλ由来遺伝子のドナーとして使用した。Ｃａ形質転換の標準的なプロトコル(Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ndedn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)にしたがって、株７０２ｉｌｖＡ［ｐＡＹＣＴＥＲ１−ｃｐｇ］の細胞をｐＫＤ４６プラスミドで形質転換し、続いて１００μｇ／ｍｌにまでアンピシリンを添加したＬ−寒天（トリプトン  １０ｇ／ｌ、酵母抽出物  ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／ｌ、寒天  １．５％）を有する対象プレートで形質転換体を選択した。プレートを３０℃で一晩インキュベートして、得られたクローンをエレクトロコンピテント培養用に調製した。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびＳＯＢ培地（酵母抽出物  ５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ／ｌ、トリプトン  ２０ｇ／ｌ、ＫＣｌ  ２．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ）で１：１００に希釈したアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（２５μｇ／ｍｌ）、及びアラビノース（１０ｍＭ）（アラビノースは、ファージλ相同組換え系の遺伝子をコードするプラスミドを誘導するために使用される）を添加した液体ＬＢ培地中にて３０℃で一晩、光学密度がＯＤ６００＝０．８〜１．０に達するように生育させた。細菌培養物１０ｍｌからの細胞を、新鮮な氷冷脱イオン水で３度、続いてグリセロール（１０％）２００μｌで洗浄して、グリセロール（１０％）４０μｌ中に懸濁させた。脱イオン水５μｌ中に溶解した上述の増幅ＤＮＡフラグメント０．５μｇを上記細菌培養物に直接添加した後、エレクトロポレーション手順を行った。エレクトロポレーションは、エシェリヒア・コリ細胞に関する製造業者の指示に従い（パルス時間−４〜５ミリ秒、電界の強度−１２．５ｋＶ／ｓｍ）、「Bio-Rad」（米国）（第１６５−２０９８、バージョン２−８９）製の細菌エレクトロ形質転換装置で行った。
【００４７】
ＳＯＣ培地（酵母抽出物  ５ｇ／ｌ、トリプトン  ２０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ０．５ｇ／ｌ、ＫＣｌ  ２．５ｍＭ，ＭｇＣｌ２  １０ｍＭ、グルコース２０ｍＭ）１ｍｌを、エレクトロポレーションの直後に細胞懸濁液に添加した。続いて、電気ショックを受けた細胞を、攪拌しながら３７℃で２時間生育させて、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含有するＬ−寒天を有するプレート上で、３７℃で一晩プレート培養した後、組換え体を選択した。
【００４８】
得られたＣｍＲおよびＳｍＲクローンを、Ｌ−寒天を有するプレート上でレプリカ平板
培養を行い、４２℃で一晩生育させて、熱感受性「ヘルパー」プラスミドｐＫＤ４６を脱落させた。７０２ｉｌｖＡ［ｐＡＹＣＴＥＲ１−ｃｐｇ］株から選択されたＡｐＳＣｍＲＳｍＲクローン中において、ｓｕｃＡＢ遺伝子の天然調節領域の上記ｉｎ  ｖｉｔｒｏで構築された人工ＤＮＡフラグメントによる置換をＰＣＲで確認した。
【実施例２】
【００４９】
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性ならびにＬ−グルタミン酸およびＬ−プロリンの生産に対するＰｔａｃ＊プロモーターの影響
Ｌ-寒天プレートからの各株７０２ｉｌｖＡ［ｐＡＹＣＴＥＲ１−ｃｐｇ］および７０２ｉｌｖＡｔａｃ＊［ｐＡＹＣＴＥＲ１−ｃｐｇ］の１掻き分を、１０ｇ／ｌ  トリプトン、５ｇ／ｌ  酵母抽出物、４ｇ／ｌ  ＮａＣｌおよび組換えプラスミドｐＡＹＣＴＥＲ１−ｃｐｇの安定化用の２５μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを含有する培地７５ｍｌを入れたエルレンマイヤーフラスコに接種して、攪拌しながら（回転速度：１４０ｒｐｍ）３７℃で６時間インキュベートした。次に、得られた培養物５０ｍｌをＪａｒ発酵器（「Marubishi」、日本）に接種した。Ｊａｒ発酵器用の培地（総容量５００ｍｌ）は、１００ｇ／ｌ  グルコース、２ｇ／ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．４ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ／ｌ  ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／ｌ  Ｌ−イソロイシン、ダイズ加水分解産物（総窒素０．２ｇ／ｌ）、０．０００４ｇ／ｌ  チアミン・ＨＣｌから構成される（ｐＨ６．７）。発酵工程では、３５℃にて９００ｒｐｍで攪拌通気し、ｐＨは、ＮＨ４ＯＨ溶液を添加することにより維持した。
【００５０】
Ｌ−プロリンおよびＬ−グルタミン酸の量を、以下の条件下で高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により測定した：Ｌｕｎａ  Ｃ１８（２）、１５０×３ｍｍ、５Ｕ、温度：１７℃。溶離液：ＣＨ３ＣＮ−０．８％（ｖ／ｖ）、Ｈ３ＰＯ４−０．１％（ｖ／ｖ）、ＫＨ２ＰＯ４−１０ｍＭ、ｎ−Ｃ８Ｈ１７ＳＯ３Ｎａ−３ｍＭ。流速−０．４ｍｌ／ｍｍ、注入容量１０μｌ。２００ｎｍで検出。保持時間：グルタミン酸−９．３、プロリン−１２．１。
【００５１】
得られた株中のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼの活性は、Ｌ−プロリンおよびＬ−グルタミン酸蓄積の測定に使用したのと同じ条件下で細胞を生育させた後に、標準的な手順に従って測定した(Amarasingham, C.R. & Davis, B.D., J. Biol. Chem. 1965. 240,
3664-3668)。データを表１に示す。
【００５２】
表１のデータからわかるように、天然型Ｐｓｕｃに代わる効率的なＰｔａｃ＊プロモーターの置換は、新規株の細胞において、その前駆体と比較した場合に最大３倍のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の増加をもたらした。
【００５３】
しかしながら、新規株はほぼ完全に、Ｌ−グルタミン酸を過剰生産する能力を失った。Ｌ−プロリン蓄積は、非改変株と比較した場合に、新規株においてわずかに増加したが、Ｌ−グルタミン酸ファミリーのアミノ酸、例えばＬ−グルタミン酸およびＬ−プロリンへのグルコース由来の炭素の総変換は、有意に減少した。
【００５４】
これらの結果は、コンセンサス「−１０」および「−３５」領域を有する強力な構成的Ｐｔａｃ＊プロモーターの使用が、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の最大３倍の増加、および付随してＬ−グルタミン酸生産の減少をもたらすことを明らかに示した。野生型Ｐｓｕｃプロモーターを含む株と比較した場合の上記株の生育速度の増加も観察された（表１）。これらの影響は、おそらくＴＣＡサイクルを通した流束の増加と、それに伴うより高レベルのＡＴＰ合成に起因する。
【００５５】
関連技術の説明で記載するように、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼを欠損するか、または低レベルのα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼを保有するエシェリヒア属に属するグルタミン酸生産突然変異体は、グルコース最小培地中で好気性条件下では生育することができないか、あるいは相当減じられた生育速度でのみ生育することが可能である。メチオニンを補充したコハク酸またはリシンの添加が生育の回復に必要である。したがって、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼに関する最適な発現レベルの選択は、細菌に、グルタミン酸を生産し、かつコハク酸、リシンまたはメチオニンなどのサプリメントを含有しない培地上で生育する能力を獲得させるために必要である。
【００５６】
高レベルのＬ−グルタミン酸過剰生産および十分な生育速度を有する原栄養株を得るために、Ｐｔａｃ＊プロモーターのコンセンサス「−３５」領域を無作為化することによるｓｕｃＡＢ遺伝子発現の最適化は、Ｐｔａｃ＊プロモーターと比較して、転写開始効率の減少、それによるα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の減少およびＬ−グルタミン酸収率の増加をもたらすであろう。
【実施例３】
【００５７】
無作為化領域を含む人工調節配列の調製、およびエシェリヒア・コリ染色体中における該人工配列によるｓｕｃＡＢ遺伝子の天然型上流領域の置換
無作為化「−３５」領域を含む人工調節配列セットは、合成プライマーＰ１（配列番号２）およびＰＳ（配列番号１０）ならびに鋳型プラスミドｐＤＲ５４０を用いたＰＣＲにより得られた。プライマーＰＳ（配列番号１０）は、５１個のヌクレオチドを有し、該配列中で「ｎ」という文字で表される４個のランダムヌクレオチドを有する領域を有する。得られた人工ＤＮＡフラグメントは、無作為化領域およびクロラムフェニコール耐性遺伝子（ＣｍＲ）を有するハイブリッド調節配列を含んでいた。染色体へのこのフラグメントの組込みは、実施例１に記載した方法で実施した。
【００５８】
Ｌ−寒天上で生育させた組換え体のコロニーは、種々のサイズおよび生育速度を有していた。選択は、Ｌ−グルタミン酸生産に基づいた。２つの最良のクローンである番号２および番号２１は、それらがそれぞれ最高レベルのＬ−グルタミン酸生産を有したことから選択した。これらのクローンはまた、グルコース由来の炭素のＬ−グルタミン酸ファミリーのアミノ酸、例えばＬ−グルタミン酸およびＬ−プロリンへの高レベルの総変換を示した。これらのクローン由来のゲノムＤＮＡを、ゲノムＤＮＡ単離キット(Sigma, USA)を用いて、製造業者の推奨に従って単離した。無作為化領域を含む人工調節配列を増幅するために、鋳型として単離ＤＮＡならびにプライマーＰ１（配列番号２）およびＰ４（配列番号５）を用いてＰＣＲを実施した。両方の増幅産物の配列をサンガー法により決定した。クローン２および２１の人工プロモーターをそれぞれＰｔａｃ−２およびＰ−ｔａｃ−２１と称した。無作為化により得られる四量体の配列は、それぞれＡＧＡＴおよびＴＴＧＣであった。
【実施例４】
【００５９】
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性ならびにＬ−グルタミン酸およびＬ−プロリン生産に対する人工調節配列の影響
クローン２および２１を用いた発酵、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−プロリン量の測定、ならびにα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の測定を、実施例２に記載するようにして行った。
【００６０】
表１のデータから、より弱い天然型Ｐｓｕｃに代わる最適化した長さを有するｔａｃ様構成プロモーターの挿入は、Ｌ−グルタミン酸生産、およびグルコース由来の炭素のＬ−グルタミン酸ファミリーのアミノ酸、例えばＬ−グルタミン酸およびＬ−プロリンへの総変換が向上した変異株を選択することに役立つということが考えられた。さらに、該変異
株は、好ましくは、コハク酸、リシンまたはメチオニンのようなさらなるサプリメントを含有せず、かつ炭素源としてグルコースを有する最小培地で良好に生育する能力を保有するであろう。表１でわかるように、Ｐｔａｃ−２またはＰｔａｃ−２１プロモーターを含む選択された株に関して標準的な発酵条件下での培養により達成された光学密度は、野生型Ｐｓｕｃプロモーター領域を含む株よりもほんのわずかに低かった。
【００６１】
【表１】
0004821606.tif 000002
＊収量はL-グルタミン酸とL-プロリンの分子量（MW）を考慮してL-グルタミン酸の量を元に次の式により計算した。
全収量（％）＝L-グルタミン酸の量×１００／グルコース量＋L-プロリンの量×L-グルタミン酸の分子量×１００／［グルコース量×L-プロリンの分子量］
【実施例５】
【００６２】
α−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性およびＬ−ロイシン生産に対する人工Ｐｔａｃ−２１の影響
表１からわかるように、人工プロモーターＰｔａｃ−２１は、最小のα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性を提供し、最良のＬ−グルタミン酸生産をもたらした。ＴＣＡサイクルに関与するＳｕｃＡＢ酵素の活性の減少により、ＴＣＡサイクルにおけるアセチル−ＣｏＡの消費が減少される。アセチル−ＣｏＡは、Ｌ−ロイシンの前駆体であり、その結果アセチル−ＣｏＡの変更されたプールをＬ−ロイシン生合成に使用することができ、したがってＬ−ロイシン生産にプラスの影響を与えると考えられる。
【００６３】
この説を支持するために、Ｐ１形質導入の標準的な手順(Sambrook et al., 「Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition」, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))により、ドナーとしてエシェリヒア・コリ株２１を用いて、sｕｃＡＢ遺伝子の人工Ｐｔａｃ−２１プロモーターを、Ｃｍ耐性を利用して、Ｌ−ロイシン生産エシェリヒア・コリ株へ形質導入した。Ｌ−ロイシン生産を変化させることの影響は、効率的な
Ｌ−ロイシン生産株であるＬ−ロイシン生産エシェリヒア・コリ株５７（ＶＫＰＭ  Ｂ−７３８６、ロシア国特許第２１４０４５０号）のみで見られたため、その生産性はさらに改善された。株５７は、試験管発酵で１．５〜１．７ｇ／ｌのＬ−ロイシンを生産する。上述したように、この目的で、ロイシン栄養要求性は、Ｐ１ファージにより、エシェリヒア・コリ株Ｃ６００（ｌｅｕ−）(Appleyard R.K., Genetics, 39, 440-452 (1954))から株５７の染色体へ導入された。続いて、株５７（ｌｅｕ−）におけるロイシンの欠損を、ドナーエシェリヒア・コリ株５５由来のｌｅｕＡ＊ＢＣＤ遺伝子によるＰ１形質導入によって補完した。株５５は、ｌｅｕＡ＊遺伝子を保有し、これはロイシンによるフィードバック阻害を免れた変異型α−イソプロピルリンゴ酸シンターゼをコードする（ロシア国特許第２２０１４５４号）。株５７ｌｅｕＡ＊において分岐鎖アミノ酸トランスアミナーゼの活性をコードするｉｌｖＥ遺伝子を不活性化し、さらに、得られた株５７ｌｅｕＡ＊ｉｌｖＥ−において、ｔｙｒＢでコードされる芳香族アミノ酸トランスアミナーゼの活性を、組換えプラスミドｐＡＣＹＣ−ｔｙｒＢによる形質転換により高めた（ロシア国特許出願第２００２１１６７７３号）。得られた株５７ｌｅｕＡ＊ｉｌｖＥ−／ｐＡＣＹＣ−ｔｙｒＢは、試験管発酵で約９ｇ／ｌのＬ−ロイシンを生産した。
【００６４】
Ｐｔａｃ−２１プロモーターを、Ｐ１形質導入の標準的な手順により、株５７ｌｅｕＡ＊ｉｌｖＥ−／ｐＡＣＹＣ−ｔｙｒＢの染色体に導入した。得られた５７ｓｕｃｌｅｕＡ＊ｉｌｖＥ−／ｐＡＣＹＣ−ｔｙｒＢ株によるＬ−ロイシン生産は、試験管発酵で最大１１．４ｇ／ｌにまで増大した。
【００６５】
Ｌ−寒天を有するプレートからの株５７ｌｅｕＡ＊ｉｌｖＥ−／ｐＡＣＹＣ−ｔｙｒＢおよび５７ｓｕｃｌｅｕＡ＊ｉｌｖＥ−／ｐＡＣＹＣ−ｔｙｒＢそれぞれの１掻き分を、６０ｇ／ｌ  グルコース、１５ｇ／ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１．５ｇ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／ｌ  チアミン・ＨＣｌ、２ｇ／ｌ  ＣａＣＯ３を含有する培地２ｍｌを入れた２０×２００ｍｍの試験管に接種して、攪拌しながら（回転速度−２５０ｒｐｍ）３４℃で７２時間インキュベートした。
【００６６】
Ｌ−ロイシンの量を高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）で測定した。ＨＰＬＣに関する条件：Ｓｅｐａｒｏｎ  ＳＧＸ  Ｃ１８、１５０×３．３ｍｍ、５ｍｋｍ、温度：２２℃。溶離液：ＣＨ３ＣＮ−１５％（ｖ／ｖ）、Ｃｕ（ＣＨ３ＣＯＯ）２−０．１Ｍ。流速−０．３ｍｌ／分、注入容量  ０．５μｌ。２３２ｎｍで検出。
【００６７】
表２でわかるように、株５７ｓｕｃｌｅｕＡ＊ｉｌｖＥ−／ｐＡＣＹＣ−ｔｙｒＢの染色体上における人工Ｐｔａｃ−２１プロモーターによる天然型プロモーターの置換は、ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ活性の減少およびＬ−ロイシン生産の向上をもたらすことがわかった。
【００６８】
【表２】
0004821606.tif 000003
【００６９】
本発明をその好ましい実施形態を参照して記載してきたが、本発明の範囲を逸脱するこ
となく、様々な変更を行うことができ、また等価物を使用することができることは当業者に明らかであろう。外国の優先権文書であるＲＵ２００３１３６４１２号を含む本明細書中で引用した参照文献はすべて、その全体が参照により本願の一部として援用される。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明によれば、アミノ酸または核酸生産に有用な、最適レベルに遺伝子を発現する細菌、および当該細菌を用いてＬ−アミノ酸または核酸を製造する方法が提供される。本発明は、発酵産業において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】無作為化領域を有するハイブリッド調節配列およびクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ）を含む人工ＤＮＡフラグメントの構築、ならびにハイブリッド調節配列のＲｅｄ駆動型組込み（Red-driven integration）を示す。
【図１】
0004821606.tif 000004
【配列表】
0004821606000001.xml