(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド、
（Ａ）ＡＰＰＢＰ１とＵＢＥ1Ｃの間に３個のアラニンが入ったＮＥＤＤ８を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ＮＥＤＤ８と標的蛋白質の結合酵素（ＵＢＥ２Ｍ）
（Ｃ）ＮＥＤＤ８と標的蛋白質の連結酵素（ＲＢＸ１）
（Ｄ）ＮＥＤＤ８。
【請求項２】
以下の（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド、
（Ａ）ＡＰＰＢＰ１とＵＢＥ1Ｃの間に３個のアラニンが入ったＮＥＤＤ８を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ＮＥＤＤ８と標的蛋白質の結合酵素（ＵＢＥ２Ｍ）
（Ｃ）ＮＥＤＤ８と標的蛋白質の連結酵素（ＲＢＸ１）
（Ｄ）ＮＥＤＤ８
及び以下の（Ｅ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド、
（Ｅ）標的蛋白質
を有する形質転換された大腸菌。
【請求項３】
受託番号がＦＥＲＭ−ＡＰ２０７１６又はＦＥＲＭ−ＡＰ２０７１７である請求項１に記載の組換えプラスミド。
【請求項４】
請求項２に記載の形質転換された大腸菌を使用したＮＥＤＤ化蛋白質のスクリーニング方法。
【請求項５】
請求項２に記載の形質転換された大腸菌を使用したＮＥＤＤ化蛋白質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えプラスミド及びこれにより形質転換された大腸菌並びにこれを使用したＮＥＤＤ化蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ユビキチン様蛋白質の一つであるＮＥＤＤ８（Neural  precursor  cell  expressed,
developmentally  down-regulated  8）は、ユビキチン・ＳＵＭＯと同様に標的蛋白質に連結して蛋白質の機能変換を触媒する修飾分子である。
この蛋白質修飾は蛋白質の細胞内局在の変化、他の蛋白質との結合の変化、ユビキチン・ＳＵＭＯ化との拮抗など蛋白質の生理作用に大きな影響を与えていると考えられている。
ＮＥＤＤ８はSCF複合体（Skp1/Cullin-1/F-boxprotein）の構成サブユニットであるＣｄｃ５３（cell  division  cycle  53）の修飾分子として、また、神経細胞分化とともに発現の減少する遺伝子として知られており、酵母からヒトまで高度に保存されている。
また、ＮＥＤＤ化を触媒する活性化酵素Ｅ１の活性サブユニットを失活させたノックアウトマウスが早期の胎生致死にあることから、ＮＥＤＤ化による蛋白質の機能変換システムが哺乳類においても生理的に重要な役割を担っていることがわかる。
ＮＥＤＤ化の反応はＥ１、Ｅ２及びＥ３酵素の３つの酵素により触媒される基質修飾反応である。
ＮＥＤＤ化される標的蛋白質を同定するには試験管内におけるＮＥＤＤ化反応が重要であるが、このためにはＮＥＤＤ８活性化酵素（Ｅ１）、結合酵素（Ｅ２）、連結酵素（Ｅ３）、さらにはＮＥＤＤ８が必要となる。
ＮＥＤＤ８活性化酵素（Ｅ１）はＡＰＰＢＰ１（Amyloid  beta  precursor  protein binding  protein  1）及びＵＢＥ１Ｃ（Ubiquitin-activating  enzyme  E1C）の蛋白質ヘテロ二量体である。
従って、新規のＮＥＤＤ化標的蛋白質を試験管内におけるＮＥＤＤ化反応を用いてスクリーニングすることは多大な労力が必要となり非常に困難であった。
また、修飾を受けた蛋白質の立体構造を決定することは興味深いテーマであるが、目的蛋白質の大量調整が立体構造決定において必要となりスクリーニングと同様に試験管内におけるＮＥＤＤ化反応を用いて大量の標的蛋白質を得るのは多大な労力が必要であった。
前記ＳＵＭＯ化については、組換えベクターを利用して細菌などの宿主細胞中で標的蛋白質をＳＵＭＯ化し蛋白質ポリマー等を大量に生産する方法が知られているがＮＥＤＤ化については知られていなかった（例えば特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第０４／０３１１２４３号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、本発明の目的は、ＮＥＤＤ８と標的蛋白質を大腸菌内で同時に発現させ、大腸菌内で両蛋白質を結合（ＮＥＤＤ化）させるために使用する組換えプラスミド及び前記組換えプラスミドにより形質転換された大腸菌並びに前記形質転換された大腸菌を使用して未知の標的蛋白質をスクリーニング（同定・検出）する方法及びＮＥＤＤ化された標的蛋白質を大量調整・精製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記の目的を達成するために鋭意研究を重ねた結果、大腸菌内でＮＥＤＤ化に必要な（Ａ）ＮＥＤＤ８を活性化する酵素（Ｅ１）、（Ｂ）ＮＥＤＤ８と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）、（Ｃ）ＮＥＤＤ８と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）、（Ｄ）ＮＥＤＤ８を発現することができる組換えプラスミドを使用して大腸菌内で標的蛋白質のＮＥＤＤ化ができることを見出し、本発明を完成するに至った。
従って、本発明は、
（１）  以下の（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミドである。
（Ａ）ＡＰＰＢＰ１とＵＢＥ1Ｃの間に３個のアラニンが入ったＮＥＤＤ８を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ＮＥＤＤ８と標的蛋白質の結合酵素（ＵＢＥ２Ｍ）
（Ｃ）ＮＥＤＤ８と標的蛋白質の連結酵素（ＲＢＸ１）
（Ｄ）ＮＥＤＤ８。
（２）  以下の（Ａ）〜（Ｄ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド、
（Ａ）ＡＰＰＢＰ１とＵＢＥ1Ｃの間に３個のアラニンが入ったＮＥＤＤ８を活性化する酵素（Ｅ１）
（Ｂ）ＮＥＤＤ８と標的蛋白質の結合酵素（ＵＢＥ２Ｍ）
（Ｃ）ＮＥＤＤ８と標的蛋白質の連結酵素（ＲＢＸ１）
（Ｄ）ＮＥＤＤ８
及び以下の（Ｅ）をコードする遺伝子を含み大腸菌内で同時に発現できる組換えプラスミド、
（Ｅ）標的蛋白質
を有する形質転換された大腸菌である。
（３）受託番号がＦＥＲＭ−ＡＰ２０７１６又はＦＥＲＭ−ＡＰ２０７１７であるである前記（１）に記載の組換えプラスミドである。
（４）前記（２）に記載の形質転換された大腸菌を使用したＮＥＤＤ化蛋白質のスクリーニング方法である。
（５）前記（２）に記載の形質転換された大腸菌を使用したＮＥＤＤ化蛋白質の製造方法である。
【発明の効果】
【０００６】
多大な労力なくしてＮＥＤＤ化された標的蛋白質を得ることが出来るようになったことから、ＮＥＤＤ８による標的蛋白質の機能変換システム、そこから生じる生理作用を研究する上で非常に大きく貢献することができる。
また、本発明のスクリーニング方法は、未知の標的蛋白質を効率良く同定できる方法であり、ＮＥＤＤ８の新たな作用機序、生理的重要性を発見する上で大きく貢献すると考えられる。
同様に構造解析の為のＮＥＤＤ化標的蛋白質の大量調整法は、従来の煩雑な操作を用いることなく融合蛋白質を回収することができる為、構造を解析する上で非常に大きく貢献することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明する。
ＮＥＤＤ８は、ＮＥＤＤ８を活性化する酵素（Ｅ１）、ＮＥＤＤ８と標的蛋白質の結合酵素（Ｅ２）、ＮＥＤＤ８と標的蛋白質の連結酵素（Ｅ３）からなる複合酵素系によって標的蛋白質に結合する。
このＥ１はＡＰＰＢＰ１とＵＢＥ1Ｃの異なる２種類の蛋白質から構成されるヘテロ複合体である。
Ｅ２としてＵＢＥ２Ｍ（ubiquitin-conjugating enzyme E2M）、Ｅ３としてＲＢＸ１（ring-box protein 1）が知られている。
【０００８】
ＮＥＤＤ８は標的蛋白質と結合する際、成熟型の構造をとり、そのＣ末端はＧｌｙ−Ｇｌｙで終わっている。
このＣ末端Ｇｌｙ 残基が、標的蛋白質のLysのε‐アミノ基とＡＴＰ-Ｍｇ２+存在下にてイソペプチド結合して連結することが知られている。
【０００９】
ＮＥＤＤ８を活性化する酵素（Ｅ１）はＡＰＰＢＰ１、ＵＢＥ１Ｃの融合蛋白質とし、大腸菌内で発現したとき、活性を有するように構築する。
【００１０】
また、ＮＥＤＤ８は成熟型の状態、つまりＣ末端がＧｌｙ−Ｇｌｙとなるように発現するように組換えプラスミドを構築する。
【００１１】
ＮＥＤＤ８、ＡＰＰＢＰ１、ＵＢＥ１Ｃ、ＵＢＥ２Ｍ、ＲＢＸ１をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてそれぞれＤ２３６６２、ＢＣ０００４８０、ＡＬ１１７５６６、ＢＣ０５８９２４、ＡＦ１４０５９８として登録されている。
ＮＥＤＤ８、ＡＰＰＢＰ１、ＵＢＥ１Ｃ、ＵＢＥ２Ｍ、ＰＢＸ１及び標的蛋白質をコードする遺伝子にＰＣＲ法によって制限酵素により切断できる配列を付加し、これらを発現することができるプラスミドのプロモーターの下流に挿入し、次いでプロモータごと切り出し、これを別のプラスミドに組み込み組換えプラスミドを得て、該組換えプラスミドを大腸菌に導入する。
【００１２】
組換えプラスミドに組み込む遺伝子の組合せは、１つのプラスミドにＮＥＤＤ８、ＡＰＰＢＰ１、ＵＢＥ１Ｃ、ＵＢＥ２Ｍ、ＲＢＸ１及び標的蛋白質をコードする遺伝子を組み込んでもよく、２つのプラスミドに適宜選択して組み込んでも良い。
また、組み込む遺伝子は同種のものを複数組み込んでもよい。
【００１３】
ＮＥＤＤ化蛋白質を大量に製造する場合は、前記のとおりコードする遺伝子を適宜組み込めばよいが、スクリーニングに使用する場合は、ＮＥＤＤ８、ＡＰＰＢＰ１、ＵＢＥ１Ｃ、ＵＢＥ２Ｍ、ＲＢＸ１をコードする遺伝子は、第１のプラスミドに、標的蛋白質をコードする遺伝子を第２のプラスミドに組み込む組合せが好ましい。
【００１４】
第１のプラスミドを導入し形質転換した大腸菌に第２のプラスミドを後から導入することができる。
また、逆に第２のプラスミドを導入し形質転換した大腸菌に第１のプラスミドを後から導入することもできる。
【００１５】
２種類のプラスミドを同一大腸菌内へ導入する場合には、プラスミドのＤＮＡ複製開始領域はｐＢＲ３２２とｐ１５Ａ由来のＤＮＡ複製開始領域を持つ組み合わせなど、互換性を持つ組み合わせで用いる。
また、プラスミドには薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを組み込んでおく。選択マーカーとしては、例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子等を使用することができる。
【００１６】
プラスミドとしては、大腸菌において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、上記目的とする遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
プロモーターはＴａｑプロモーターやＴ7プロモーターを用い、それぞれの遺伝子産物がＩＰＴＧ（isopropyl-1-thio-βloch-D-galactopyranoside）により発現誘導可能となるように設計する。
なお、プラスミドの導入は、従来公知の方法が使用できる、
【００１７】
発現のためのプロモータは、各蛋白質をコードする遺伝子の上流に個々に組み込みそれぞれが別に発現するように組み込むほか、一括して融合状態で発現するように組み込むこともできるが、融合して発現した場合は蛋白質を切断する等の調整が必要であり、個々に組み込むことが好ましい。
また、プロモータをプラスミドに個々の蛋白質が発現するように組み込んだ場合は、ターミネーターを特に組み込まなくても終止コドンを遺伝子配列に付加すれば活性を有する酵素を得ることができる。
【００１８】
前記ＮＥＤＤ８には、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）、Ｈｉｓ（ポリヒスチジン）などの容易に精製したり検出したりできるように目印となるアミノ酸配列（タグ配列）を付加することができる。
また、標的蛋白質自体に、前記アミノ酸配列（タグ配列）を融合し精製したり検出したりできるようにすることもできる。
【００１９】
構造解析用の大量調整の場合は小さい分子量のタグ配列を用いるか、もしくは精製後に融合部位を特異的なプロテアーゼで切断し目的蛋白質のみを本来の形で取得できるようにプロテアーゼ切断配列を組み込んでおくことが好ましい。
【００２０】
形質転換した大腸菌の選択は、大腸菌を前記選択マーカーに対応する薬剤耐性選択寒天培地プレート等に塗抹して培養し、生じた単一のコロニーを選択することで行うことができる。
【００２１】
形質転換した大腸菌の培養方法は通常の方法に従って行うことができる。
培養する培地は該微生物が資化し得る炭素原、窒素原、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養には天然培地、合成培地のいずれも使用することができる。
培養形式、培養温度、培養時間、培地ｐＨ等は、用いる大腸菌に応じて通常行われる条件を採用することができる。
【００２２】
ＮＥＤＤ化標的蛋白質の単離は、組換プラスミドを導入し形質転換した大腸菌を３７℃にてＯＤが０．５になるまで培地に培養し、さらにＩＰＴＧを加えて各遺伝子の発現を誘導しながら２５℃にて１６時間以上培養をおこない、培養中にＮＥＤＤ化標的蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該ＮＥＤＤ化標的蛋白質を採取することにより行うことができる。
【００２３】
例えば、菌体を遠心分離で沈殿回収し、水系緩衝液中に懸濁後、超音波破砕機等により大腸菌を破砕する。
遠心分離の後、上澄み液を取り出しＮＥＤＤ化標的蛋白質を得ることができる。
スクリーニングの場合は、例えば上澄み液をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン法にてタグ配列の抗体を使用してＮＥＤＤ化標的蛋白質を検出する。
大量調整の場合は、例えばＧＳＴがタグとして使用されている場合には、上澄み液を取り出し、グルタチオンセファロースビーズとインキュベートし、ビーズに結合した蛋白質を溶出、もしくはプロテアーゼ切断配列の使用など、タグ配列特異的な精製方法にて通常行われる条件で精製することができる。
【実施例】
【００２４】
以下本発明を実施例により具体的に説明する。
［実施例１］
１．ＮＥＤＤ８を活性化する酵素（Ｅ１）をコードする遺伝子の調製
ＮＥＤＤ８を活性化する酵素（Ｅ１）はＡＰＰＢＰ１とＵＢＥ１Ｃの融合蛋白質であり、ＡＰＰＢＰ１をコードする遺伝子はＧｅｎＢａｎｋにおいてＢＣ０００４８０として登録されている。
ＡＰＰＢＰ１をコードする遺伝子は融合蛋白質として発現した場合、活性を有するように終止コドンを除いている（配列番号２）。
又、ＵＢＥ１Ｃをコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＡＬ１１７５６６として登録されている（配列番号３）。
【００２５】
本発明では、これらの遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
本発明ではＮＥＤＤ８を活性化する酵素（Ｅ１）を融合蛋白質として活性を有する状態で発現させるため、ＡＰＰＢＰ１にはＮｃｏIにより切断できる配列「５’−ＣＣＡＴＧＧ−３’」及びその上流に「５’−ＧＴＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号６）及びＮｏｔＩにより切断できる配列「５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’」及びその上流に「５’−ＣＡＣ−３’」を付加したプライマー（配列番号７）を使用してＰＣＲを行った。
また、ＵＢＥ1ＣにはＮｄｅＩ及びＮｏｔＩにより切断できる配列「５’−ＣＡＴＡＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’」及び「５’−ＧＴＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号８）及びＢａｍＨＩにより切断できる配列「５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’」及びその上流に「５’−ＣＡＣ−３’」を付加したプライマー（配列番号９）を使用してＰＣＲを行った。
【００２６】
このプライマーによりｐＥＴ１５ｂプラスミドにＡＰＰＢＰ１とＵＢＥ1Ｃをコードする遺伝子を組み込んだときＡＰＰＢＰ１とＵＢＥ1Ｃの間に３個のアラニンが入ったＮＥＤＤ８を活性化する酵素（Ｅ１）をコードする遺伝子を得ることができた（図１）。
同様の工程により参考のため、ＡＰＰＢＰ１のエクソン４および５が欠損しているミュータントＥ１を作製した(図２)。
【００２７】
２．ＮＥＤＤ８をコードする遺伝子の調製
ＮＥＤＤ８をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＤ２３６６２として登録されている
本発明では、発現したとき成熟型になるよう遺伝子を選択し終止コドンを付加した（配列番号１）。
また、発現したとき成熟型になるようＣ末端はＧｌｙ‐Ｇｌｙで終わるように遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
さらにスクリーニングに使用できるよう、ＮＥＤＤ８の前方に検出できるようにＨＡタグ配列を付加した。
ＮｄｅＩにより切断できる配列「５’−ＣＡＴＡＴＧ−３’」及びその上流に「５’−ＧＣＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１０）及びＢａｍＨＩにより切断できる配列「５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’」及びその上流に「５’−ＣＡＣ−３’」を付加したプライマー（配列番号１１）を使用してＰＣＲを行った。
このプライマーによりプラスミドにＮＥＤＤ８をコードする遺伝子を組み込んだときＣ末端はＧｌｙ‐Ｇｌｙとなる成熟型ＮＥＤＤ８をコードする遺伝子を得た。
【００２８】
３．ＵＢＥ２Ｍをコードする遺伝子の調製
ＵＢＥ２Ｍをコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＢＣ０５８９２４として登録されている（配列番号４）。
本発明では、これらの遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
ＮｄｅＩにより切断できる配列「５’−ＣＡＴＡＴＧ−３’」及びその上流に「５’−ＧＴＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１２）及びＨｉｎｄIIIにより切断できる配列「５’−ＡＡＧＣＴＴ−３’」及びその上流に「５’−ＣＡＣ−３’」を付加したプライマー（配列番号１３）を使用してＰＣＲを行った。
【００２９】
４．ＲＢＸ１をコードする遺伝子の調製
ＲＢＸ１をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＡＦ１４０５９８として登録されている（配列番号１４）。
本発明では、これらの遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
ＮｄｅＩにより切断できる配列「５’−ＣＡＴＡＴＧ−３’」及びその上流に「５’−ＧＴＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１５）及びＳａｃＩにより切断できる配列「５’−ＧＡＧＣＴＣ−３’」及びその上流に「５’−ＣＡＣ−３’」を付加したプライマー（配列番号１６）を使用してＰＣＲを行った。
【００３０】
５．プロモーターの付加
５−１．ＮＥＤＤ８を活性化する酵素（Ｅ１）をコードする遺伝子
前記制限酵素により切断できる配列を付加したＵＢＥ１Ｃを発現プラスミド（ 商品名ｐＥＴ１５ｂ  Ｎｏｖａｇｅｎ社製） のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位に組み込み、その後Ｔ７プロモーターの下流のＮｃｏI−ＮｏｔＩ部位にＡＰＰＢＰ１を組み込んだ。
その後、Ｔ７プロモータとともにＢｇｌII−ＢａｍＨIで切り出しＡＰＰＢＰ１とＵＢＥ１Ｃの融合蛋白質をコードする遺伝子を得た（図１）。
【００３１】
５−２．ＮＥＤＤ８をコードする遺伝子
前記制限酵素により切断できる配列を付加したＮＥＤＤ８をコードする遺伝子を発現プラスミド（ 商品名ｐＥＴ２３ｂ  Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位に組み込んだ。
その後、Ｔ７プロモータとともにＢｇｌII−ＢａｍＨIで切り出した（図３）。
その際、ＢｇｌIIサイトを先に切断しＴ４ポリメラーゼで平滑化しその後ＢａｍＨIサイトを切断した。
【００３２】
５−３．ＵＢＥ２Ｍをコードする遺伝子
前記制限酵素により切断できる配列を付加したＵＢＥ２Ｍをコードする遺伝子を発現プラスミド（ 商品名ｐＥＴ２３ｂ  Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄIII部位に組み込んだ。
その後、Ｔ７プロモータとともにＢｇｌII−ＨｉｎｄIIIで切り出した（図４）。
その際、ＢｇｌIIサイトを先に切断しＴ４ポリメラーゼで平滑化しその後ＨｉｎｄIIIサイトを切断した。
【００３３】
５−４．ＲＢＸ１をコードする遺伝子
前記制限酵素により切断できる配列を付加したＲＢＸ１をコードする遺伝子を発現プラスミド（ 商品名ｐＥＴ２３ｂ  Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＮｄｅＩ−ＳａｃＩ部位に組み込んだ。
その後、ｐＥＴ２３ｂのＴ７プロモータとともにＢｇｌII−ＳａｌIで切り出した（図５）。
その際、ＢｇｌIIサイトを先に切断しＴ４ポリメラーゼで平滑化しその後ＳａｌIサイトを切断した。
【００３４】
６．組換え発現プラスミドの調製
前記プロモータを付加した配列をｐ１５Ａ由来のＤＮＡ複製開始領域を持ち、クロラムフェニコール耐性を持つ発現プラスミド（商品名ｐＡＣＹＣ１８４  ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社製）へ以下の順番で組み込み本発明の組換えプラスミドを得た（図６）。
まずｐＡＣＹＣ１８４のＥａｇIサイトを切断しＴ４ポリメラーゼで平滑化しその後ＳａｌIサイトを切断し、前記５−４で得られたＲＢＸ１をコードする遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４にライゲーション法により組み込んだ。
【００３５】
次に、ｐＡＣＹＣ１８４へＮＥＤＤ８をコードする遺伝子を組み込んだ。
まずｐＡＣＹＣ１８４をＳｐｈIで切断しＴ４ポリメラーゼで平滑化しその後ＢａｍＨIサイトを切断し、前記５−２で得られたＮＥＤＤ８をコードする遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４にライゲーション法により組み込んだ。
【００３６】
次に、ｐＡＣＹＣ１８４へＵＢＥ２Ｍをコードする遺伝子を組み込んだ。
まずｐＡＣＹＣ１８４をＥｃｏＲＶで切断しその後ＨｉｎｄIIIサイトを切断し、前記５−３で得られたＵＢＥ２Ｍをコードする遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４にライゲーション法により組み込んだ。
【００３７】
次に、ｐＡＣＹＣ１８４へ前記５−１で得られたＡＰＰＢＰ１とＵＢＥ１Ｃの融合蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ。
まずｐＡＣＹＣ１８４をＢａｍＨIで切断した。
【００３８】
このとき、前記ＵＢＥ２Ｍをコードする遺伝子内にＢａｍＨIサイトが存在するためＵＢＥ２Ｍの一部が切り出されてしまう。
この切り出された一部は取り除き保存した。
前記５−１で得られたＵＢＥ１ＣとＡＰＰＢＰ１の融合蛋白質をコードする遺伝子をｐＡＣＹＣ１８４に組み込んだ。
ＢｇｌIIとＢａｍＨIは切断部位が同じ形をしているのでＢａｍＨIサイトに組み込むことができる。
その後、再びＢａｍＨIで切断し、前記保存しておいたＵＢＥ２Ｍの一部を組み込んだ。
【００３９】
以上のとおり、ｐＡＣＹＣ１８４に前記５．プロモーターの付加により得られた遺伝子を組み込むには組み込む順番が重要である。
前記の順番を変更した場合、例えば、ＮＥＤＤ８を活性化する酵素（Ｅ１）をコードする遺伝子を組み込んだ後にＵＢＥ２Ｍをコードする遺伝子を組み込もうとすると、ＥｃｏＲＶはＥ１を切断してしまう。
また、ＮＥＤＤ８とＮＥＤＤ８を活性化する酵素（Ｅ１）の組み込む順番を逆にするとＢａｍＨIサイトがつぶれてしまいＮＥＤＤ８を組み込む際に使用できなくなってしまう。
【００４０】
なお、本プラスミドは独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、２００５年（平成１７年）１１月１８日  受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７１６として寄託している。
【００４１】
［実施例２］
[標的蛋白質のスクリーニング１]
１．ＣＵＬ１を発現できる組換えプラスミドの調製
ＮＥＤＤ８の標的蛋白質であることが知られているＣＵＬ１（Cullin1）をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＢＸ５３７４０９（配列番号１７）として登録されている。
本発明では、これらの遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
ＢａｍＨＩにより切断できる配列「５’−ＧＧＡＴＣＣ−３’」及びその上流に「５’−ＧＴＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号１８）及びＳｍａＩにより切断できる配列「５’−ＣＣＣＧＧＧ−３’」及びその上流に「５’−ＣＡＣ−３’」を付加したプライマー（配列番号１９）を使用してＰＣＲを行った。
増幅した前記両端部に制限酵素で切断できる配列を付加したＣＵＬ１をコードする遺伝子を発現プラスミド(商品ｐＧＥＸ６ｐ２  Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）のＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ部位に導入し、ＧＳＴ− ＣＵＬ１ 蛋白質を大腸菌で発現できる組換えプラスミドを構築した。
【００４２】
２．大腸菌への導入
実施例１で得た組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３株に導入した。
前記組換えプラスミドが導入された大腸菌はクロラムフェニコールを含む培地で選別した。
この培地で得られたコロニーより、コンピタントセルを作成した。
前記ＣＵＬ１を発現できる組換えプラスミドを前記コンピタントセルに導入し大腸菌を形質転換しクロラムフェニコール及びアンピシリンを含む培地で選別した。
２つの組換えプラスミドを同時に取り込んだ大腸菌はアンピシリンとクロラムフェニコールの両方を含む培地で選別できる。
【００４３】
３．ＮＥＤＤ化蛋白質のスクリーニング
前記培地で得られたコロニーを別個のＬＢ液体培地で３７℃でＯＤが０．５になるまで振盪培養した後０．２ｍＭ  ＩＰＴＧを加え、２５℃でさらに１６時間振盪培養した。
遠心分離により培養液から集菌し、緩衝液に懸濁し、超音波処理により菌体を破砕し遠心分離の後、上澄み液を取り出した。
【００４４】
タグ配列の抗体の反応を用いてＮＥＤＤ化蛋白質をウエスタンブロット法で検出した。
ポリアクリルアミドゲルのウェルに前記上澄み液をアプライしＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、分離した蛋白質をゲルからＰＶＤＦ膜に転写した。
ＰＶＤＦ膜を５％スキムミルク／ＰＢＳに浸し、４℃で一夜放置しブロッキングした。
ＨＡタグモノクローナル抗体：１％スキムミルク／ＰＢＳ=１：１５００（Ｗ／Ｖ）の溶液をつくり、室温で１時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。
パーオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体：１％スキムミルク／ＰＢＳ=１：１５00（Ｗ/Ｖ）の溶液をつくり、室温で１時間反応させ、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した。
ＥＣＬ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製) を用い、プロトコルに従い化学発光法で検出した。
【００４５】
結果を図７に示す。
レーン１はＣＵＬ１を発現する実施例２で得られた発現ベクターのみ導入したものである。
レーン２は変異Ｅ１の入ったＮＥＤＤ８、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３を発現できる前記発現ベクターとＣＵＬ１を発現できる前記発現ベクターを導入したものである。
レーン３はＮＥＤＤ８、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３を発現する実施例１で得られた発現ベクターとＣＵＬ１を発現できる前記発現ベクターを導入したものである。
実施例１で得られた発現ベクターによりＮＥＤＤ化されたＣＵＬ１を得ることができた。
ミュータントＥ１の入ったＮＥＤＤ８、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３を発現できる前記発現ベクターではＮＥＤＤ化されたＣＵＬ１を得ることができなかった。
【００４６】
［実施例３］
［標的蛋白質のスクリーニング２］
実施例２においてＣＵＬ１をＮＥＤＤ８の標的蛋白質であることが知られているＭＤＭ２（Mdm2,  transformed  T3  cell  double  minute  2,  p53  binding  protein）に換えた以外は実施例１と同様にして標的蛋白質のスクリーニングを行った。
ＭＤＭ２を発現できる組換えプラスミドの調製の調整は以下のとおり行った。
ＭＤＭ２をコードする遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＢＴ００７２５８（配列番号２０）として登録されている。
本発明では、これらの遺伝子をプラスミドに組み込むために両端部に制限酵素で切断できる配列を付加した。
ＮｄｅＩにより切断できる配列「５’−ＣＡＴＡＴＧ−３’」及びその上流に「５’−ＧＴＧ−３’」を付加したプライマー（配列番号２１）及びＸｈｏＩにより切断できる配列「５’−ＣＴＣＧＡＧ−３’」及びその上流に「５’−ＣＡＣ−３’」を付加したプライマー（配列番号２２）を使用してＰＣＲを行った。
増幅した前記両端部に制限酵素で切断できる配列を付加したＣＵＬ１をコードする遺伝子を発現プラスミド(商品名ｐＥＴ１５ｂ  Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製)のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位に導入し、Ｈｉｓ− ＭＤＭ２ 蛋白質を大腸菌で発現できる組換えプラスミドを構築した。その後、実施例２と同様の方法により発現プラスミドを大腸菌へ導入し、蛋白質を発現させ、タグ配列の抗体の反応によりＮＥＤＤ化蛋白質をウエスタンブロット法で検出した。
【００４７】
結果を図８に示す。
レーン１は変異Ｅ１の入ったＮＥＤＤ８、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３を発現する実施例１で得られた発現ベクターとＭＤＭ２を発現できる前記発現ベクターを導入したものである。
レーン２はＮＥＤＤ８、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３を発現する実施例１で得られた発現ベクターとＭＤＭ２を発現できる前記発現ベクターを導入したものである。
実施例１で得られた発現ベクターによりＮＥＤＤ化されたＭＤＭ２を得ることができた。
ミュータントＥ１の入ったＮＥＤＤ８、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３を発現できる前記発現ベクターではＮＥＤＤ化されたＭＤＭ２を得ることができなかった。
以上、実施例２および３より、ＮＥＤＤ標的蛋白質の候補群を用いたスクリーニングに利用することが出来る。
【００４８】
［実施例４］
［ＮＥＤＤ化蛋白質の大量製造］
実施例１の２．ＮＥＤＤ８をコードする遺伝子の調製において、ＮＥＤＤ化蛋白質を大量に得ることができるよう、ＮＥＤＤ８の前方をＨＡタグに換えてＨｉｓタグ配列「５’−ＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＣ−３’」およびｔｈｒｏｍｂｉｎ配列「５’−ＣＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧＣＡＧＣ−３’」を付加したプライマー（配列番号５）を使用した以外は実施例１と同様にして本発明の組換えプラスミドを得た（図６）。
【００４９】
なお、本プラスミドは独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に、２００５年（平成１７年）１１月１８日  受託番号  ＦＥＲＭ  ＡＰ−２０７１７として寄託している。
【００５０】
実施例４の組換えプラスミドを使用して実施例２と同様に大腸菌より上澄み液を取り出した。
ＧＳＴ用精製ビーズ（商品名  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂビーズ  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）とインキュベーションし、ビーズに結合した蛋白質を溶出し精製した。その後精製した蛋白質溶液をＨｉｓ用精製ビーズ（商品名  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎｓ  ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）とインキュベーションし、ビーズに結合した蛋白質を溶出し精製した。
ポリアクリルアミドゲルのウェルに前記上澄み液および上記蛋白質溶液をアプライしＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、分離した蛋白質をＣＢＢ染色（０．２５％  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ  Ｒ−２５０/５０％メタノール/１０％酢酸）にて染色し検出した。
【００５１】
結果を図９に示す。
レーン１は大腸菌より上澄み液をそのまま流したものである。
レーン２は大腸菌上澄み液をＧＳＴ用精製ビーズにて精製した蛋白質溶液を流したものである。
レーン３はＧＳＴ用精製ビーズにて精製した蛋白質溶液をＨｉｓ用精製ビーズにおいても精製した蛋白質溶液を流したものである。
レーン２ではＮＥＤＤ化していないＣＵＬ１も精製されてしまっているが、レーン３ではＮＥＤＤ化したＣＵＬ１のみが精製されている。
実施例４で得られた発現ベクターによりＮＥＤＤ化されたＣＵＬ１のみを精製することができた。これはＮＥＤＤに融合させたＨｉｓタグ、ＣＵＬ１に融合させたＧＳＴタグを用いたためである。
【００５２】
実施例４で精製した蛋白質が本当にＮＥＤＤ化したＣＵＬ１であるかを調べる為、実施例２と同様の方法を用いて蛋白質を発現させ、実施例４と同様にＧＳＴ用精製ビーズにて精製した後、ＣＢＢ染色の代わりにタグ配列の抗体の反応を用いてＮＥＤＤ化蛋白質をウエスタンブロット法で検出した。
【００５３】
結果を図１０に示す。
レーン１はＮＥＤＤ８、Ｅ１, Ｅ２, Ｅ３を発現する実施例４で得られた発現ベクターのみ導入したものである。        
レーン２は変異Ｅ１の入ったＮＥＤＤ８、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３を発現する実施例１で得られた発現ベクターとＣＵＬ１を発現できる実施例２で得られた発現ベクターを導入したものである。
レーン３はＮＥＤＤ８、Ｅ１, Ｅ２, Ｅ３を発現する実施例４で得られた発現ベクターとＣＵＬ１を発現できる実施例２で得られた発現ベクターを導入したものである。
【００５４】
レーン１ではＮＥＤＤにはＧＳＴタグがついていない為、ＧＳＴ用精製ビーズではなにも精製されないことを示す。レーン２ではＮＥＤＤ化が起こらない為、通常のＣＵＬ１のみ精製されていることを示す。レーン３ではＮＥＤＤ化したＣＵＬ１、通常のＣＵＬ１が精製されていることを示す。
実施例４で得られた発現ベクターによりＮＥＤＤ化されたＣＵＬ１（標的蛋白質）のみを精製することができた。
精製後にＮＥＤＤ化されたＣＵＬ１を大量に回収できた。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】組換えプラスミドに導入する遺伝子（Ｅ１）を示す図である。
【図２】通常のＥ１、組換えプラスミドに導入する遺伝子（Ｅ１）およびエクソン４−５部位に変異の入った遺伝子（Ｅ１）を示す図である。
【図３】組換えプラスミドに導入する遺伝子（ＮＥＤＤ８）を示す図である。
【図４】組換えプラスミドに導入する遺伝子（Ｅ２）を示す図である。
【図５】組換えプラスミドに導入する遺伝子（Ｅ３）を示す図である。
【図６】本発明の組換えプラスミドを示す図である。
【図７】ＮＥＤＤ化蛋白質（ＣＵＬ１）のスクリーニング結果を示す写真である。
【図８】ＮＥＤＤ化蛋白質（ＭＤＭ２）のスクリーニング結果を示す写真である。
【図９】ＮＥＤＤ化蛋白質（ＣＵＬ１）の精製結果を示す写真である。
【図１０】ＮＥＤＤ化蛋白質（ＣＵＬ１）の精製結果を示す写真である。
【配列表フリーテキスト】
【００５６】
配列番号５ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号６ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号７ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号８ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号９ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１０ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１１ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１２ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１３ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１５ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１６ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１８ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号１９ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号２１ ： ＰＣＲ用プライマー
配列番号２２ ： ＰＣＲ用プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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