(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトクロムP450モノオキシゲナーゼと古細菌由来のPPIaseの両者を生産可能な微生物であって、古細菌由来のPPIase以外のシャペロンをコードする遺伝子が導入されていない微生物を培養し、培養物又は菌体からシトクロムP450モノオキシゲナーゼを採取することを特徴とするシトクロムP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【請求項２】
シトクロムP450モノオキシゲナーゼが、細菌由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼであることを特徴とする請求項１に記載のシトクロムP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【請求項３】
シトクロムP450モノオキシゲナーゼが、バチルス・メガテリウムBM-3株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼ、又はその一部を改変したシトクロムP450モノオキシゲナーゼであることを特徴とする請求項１に記載のシトクロムP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【請求項４】
バチルス・メガテリウムBM-3株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼの一部を改変したシトクロムP450モノオキシゲナーゼが、バチルス・メガテリウムBM-3株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼの87番目のフェニルアラニンをバリンに置換したシトクロムP450モノオキシゲナーゼであることを特徴とする請求項３に記載のシトクロムP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【請求項５】
微生物が、大腸菌である請求項１乃至４のいずれか一項に記載のシトクロムP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【請求項６】
シトクロムP450モノオキシゲナーゼのN末端側に古細菌由来のPPIaseを付加した融合タンパク質を生産可能な微生物であって、古細菌由来のPPIase以外のシャペロンをコードする遺伝子が導入されていない微生物を培養し、培養物又は菌体から、活性のあるシトクロムP450モノオキシゲナーゼを含む融合タンパク質を採取することを特徴とするシトクロムP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【請求項７】
融合タンパク質が、シトクロムP450モノオキシゲナーゼと古細菌由来のPPIaseとの間に切断部位を含む融合タンパク質であることを特徴とする請求項６に記載のシトクロムP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【請求項８】
シトクロムP450モノオキシゲナーゼが、細菌由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼであることを特徴とする請求項６又は７に記載のシトクロムP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【請求項９】
シトクロムP450モノオキシゲナーゼが、バチルス・メガテリウムBM-3株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼ、又はその一部を改変したシトクロムP450モノオキシゲナーゼであることを特徴とする請求項６又は７に記載のシトクロムP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【請求項１０】
バチルス・メガテリウムBM-3株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼの一部を改変したシトクロムP450モノオキシゲナーゼが、バチルス・メガテリウムBM-3株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼの87番目のフェニルアラニンをバリンに置換したシトクロムP450モノオキシゲナーゼであることを特徴とする請求項９に記載のシトクロムP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【請求項１１】
微生物が、大腸菌である請求項６乃至１０のいずれか一項に記載のシトクロムP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【請求項１２】
シトクロムP450モノオキシゲナーゼと古細菌由来のPPIaseの両者を生産可能な微生物であって、古細菌由来のPPIase以外のシャペロンをコードする遺伝子が導入されていない微生物。
【請求項１３】
シトクロムP450モノオキシゲナーゼのN末端側に古細菌由来のPPIaseを付加した融合タンパク質を生産可能な微生物であって、古細菌由来のPPIase以外のシャペロンをコードする遺伝子が導入されていない微生物。
【請求項１４】
シトクロムP450モノオキシゲナーゼのN末端側に古細菌由来のPPIaseを付加した融合タンパク質であって、古細菌由来のPPIase以外のシャペロンを含まない融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１４に記載の融合タンパク質をコードするDNA。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生触媒工学、すなわち生変換反応による有用物質合成領域に属するものである。より具体的には、本発明は、産業上有用な有機化合物の合成に使われている酵素であるシトクロムP450モノオキシゲナーゼ（以下、単に「P450モノオキシゲナーゼ」という場合がある。）を、機能を損なわない形で安定的に生産する方法を提供する。元来不安定な酵素であるP450モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を安定的に微生物内で機能発現することにより、種々の有用な生変換反応を効率的に行うことができる。
【背景技術】
【０００２】
P450モノオキシゲナーゼは、細菌から植物や哺乳動物に至る広範囲の生物種に分布している酸素添加酵素であり、酸素分子を還元して1分子の水を作ると共に、残りの酸素原子を様々な有機化合物(基質)に導入して、酸化生成物に変換する反応（一原子酸素添加反応）を触媒する鉄・イオウ酵素である。哺乳動物におけるP450モノオキシゲナーゼは非常によく研究されており、生体内に取り込まれた薬物や環境汚染毒物を酸化し水溶性を高め、体外への排出を促進する生体防御の役割を担う鍵酵素であり、また、生体内の二次代謝産物の生合成において水酸化反応等を担う鍵酵素でもある。P450モノオキシゲナーゼは、シトクロムP450本体タンパク質（CYP）以外に電子伝達タンパク質を必要とする複合酵素である。すなわち、P450が活性を発揮するには、NAD(P)Hから電子を伝達してくるタンパク質として、細菌や真核生物のミトコンドリアでは フェレドキシンレダクターゼとフェレドキシンの介在を必要とし、哺乳動物の肝臓ミクロソームでは NADPH-P450レダクターゼの介在を必要とする。P450モノオキシゲナーゼは部分的な構造の変化により多彩な化合物の代謝に多様化された酵素で、バイオテクノロジーの分野において既存の方法では難しいと思われている化合物の酸化処理が可能になると考えられている。したがって、本酵素は、新しい有機（低分子）化合物（たとえば，位置/立体特異的に導入された水酸化物など）の合成や、分解処理が難しい環境負荷物質の処理への応用に期待されている。
【０００３】
細菌をはじめとする微生物のP450研究は哺乳動物に比べると遅れていたが、細菌のゲノム解析の進展と相まって、細菌のP450研究が今日、盛んになってきている。細菌で最もよく研究されているP450モノオキシゲナーゼは、シュードモナス・プチダ由来のP450camで、本酵素は、樟脳（camphor）を基質として、5位に水酸基を導入する反応を触媒することが明らかにされており、P450cam遺伝子を導入・発現した組換え細菌を用いた解析も広く実施されている（Poulos, T.L., Finzel, B.C., and Howard, A,J., High-resolution crystal structure of cytochrome P450cam.  J. Mol. Biol., 195, 687-700 (1987)）。また、高脂血症薬プラバスタチン（pravastatin;三共株式会社 商品名メバロチン）は、コンパクチン（compactin）カルボン酸の立体特異的な水酸化反応により合成されるが、この反応を担う酵素は、土壌細菌ストレプトマイセス・カルボフィラス（Streptmyces carbophilus）由来のP450モノオキシゲナーゼである（Matsuoka, T., Miyakoshi, S., Tanzawa, K., Nakahara, K., Hosobuchi, M., and Serizawa, N., Eur. J. Biochem., 184, 707-713, 1989）。
【０００４】
P450酵素は、肝ミクロソーム画分のものに関しては広く研究が行われ、試験用酵素も売り出されている。また、放線菌ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）のゲノム配列がすでに決定され、本細菌が18個のP450配列を持っていることが明らかになったこともあり（D. C. Lamb et al, The cytochrome P450 complement (CYPome) of Streptomyces coelicolor A3 (2), J. Biol. Chem. 277, 24000-24005, 2002）、放線菌や他の細菌のP450を用いた研究も最近、盛んになりつつある。シトクロムP450モノオキシゲナーゼ遺伝子は、植物や動物由来のものと比べて、細菌（放線菌も細菌）由来のものは、大腸菌内で機能発現しやすいことがわかっていた。真核生物由来のもの（前者）が膜酵素であるのに対して、原核生物由来のもの（後者）が細胞質内の可溶性酵素ということが、その最大の理由であると考えられる。細菌バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）やミクロテトラスポラ（Microtetraspora）属放線菌由来のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子が大腸菌内で機能発現し、基質となる有機低分子化合物が水酸化されることが報告されている（小川 順ら, Bacillus megaterium由来のシトクロムP450 BM-3変異型酵素を用いるパラヒドロキノン類の酵素合成, 日本農芸化学会2003年大会講演要旨, p. 38, 2003、及び、有澤 章ら, 放線菌シトクロムP450および電子伝達タンパク質を共発現させた大腸菌による微生物変換系, 日本農芸化学会2003年大会講演要旨, p. 38, 2003）。しかし、細菌由来の同酵素でさえ、組換え大腸菌内で かなりの部分が正常に機能していないだけでなく、正常に機能していた酵素もしだいに失活していくことが観察された。P450モノオキシゲナーゼ酵素そのものが不安定酵素であると考えられている（H. Joo, Z. Lin, and F. H. Arnold, Laboratory evolution of peroxide-mediated cytochrome P450 hydroxylation. Nature 399, 670-673, 1999）。
【０００５】
発明者が所属する研究機関である(株)海洋バイオテクノロジー研究所では、積水化学工業(株)との共同研究により、免疫抑制剤FK506と結合するタンパク質であるPPIase（ペプチジルプロリルcis-transイソメラーゼ）遺伝子を好熱性古細菌ピロコッカス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）等より単離した。本PPIaseは、古細菌の不安定な酵素であるロダネーゼ（rhodanese）や、不溶化しやすい鶏卵のリゾチーム抗体のFab断片等を、本来の立体構造に巻き戻し 可溶化させることができた（特開平10-91号公報）。しかも、ロダネーゼは本PPIase共存下で100℃まで安定であった。したがって、本PPIaseは高温でも安定な分子シャペロンであることがわかった。また、安定的に機能発現させたいタンパク質のN末に、前記PPIaseまたは大腸菌のシャペロニンGroELを融合させることにより、そのタンパク質が本来の立体構造に巻き戻されることがわかった。この融合タンパク質系を用いて、毒性の強いB型肝炎ウィルス表面抗原や不溶性のヒトIgGの重鎖等をコードする遺伝子が、安定的に組換え大腸菌内で機能発現されることがわかった（特許文献１、特許文献２）。最近、三井化学もPPIaseのシャペロン活性に着目し、大腸菌のPPIaseを利用することにより、大腸菌で生産が難しかったヒトのミッドカインや組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）の生産量の増強に成功したと発表している（日経バイオテク、2003年5月21日）。
【０００６】
細菌バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium） BM-3株由来のP450モノオキシゲナーゼ（P450 BM-3）は、P450ドメインとNADPH-P450レダクターゼドメインが結合した、大変珍しい構造を有する酵素である。本酵素の塩基配列は、DDBJ Accession No. J04832に登録されている。本酵素は元々、C12〜C20の飽和脂肪酸のω末端（メチル基側）の1位、2位または3位を水酸化する酵素であったが、87番目のフェニルアラニンがバリンに変異したもの（以下、この変異酵素を「F87V」という場合がある。）は、ナフタレンや2-ブロモフェノール等の芳香族化合物を広く基質として認識し 水酸基を導入することができた（小川 順ら, Bacillus megaterium由来のシトクロムP450(BM-3)変異型酵素を用いるパラヒドロキノン類の酵素合成, 日本農芸化学会2003年大会講演要旨, p. 38, 2003、及び、Q. -W. Li, U. Schwaneberg, P. Fischer, and R. D. Schmid, Directed evolution of the fatty-acid hydoroxylase P450 BM-3 into an indole-hydroxylating catalyst.  Chem. Eur. J. 6, 1531-1536, 2000）。
【０００７】
【特許文献１】特開平2004-24102号公報
【特許文献２】国際公開第02/052029号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
P450モノオキシゲナーゼは、その構造だけでなく、基質特異性や反応特異性に関しても非常に多様であるので、生変換反応による有用物質合成領域への応用、すなわち、産業利用可能な様々な有機低分子化合物の合成に利用されることが期待されている酵素である。また実際に、高脂血症薬プラバスタチン（pravastatin；三共株式会社 商品名メバロチン）の製造に、放線菌が有するP450モノオキシゲナーゼの機能が利用されている。一方で、P450モノオキシゲナーゼは、失活しやすくターンオーバーが悪い不安定酵素として有名で、異種宿主中で安定的に生産する方法は知られていなかった。そのため、外来遺伝子としてP450モノオキシゲナーゼ遺伝子を導入・発現した組換え微生物を利用して、有用な有機化合物の実際の工業生産を行った例はほとんど存在しないと思われる。本発明では、実際の工業生産を可能にするため、外来のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子を安定的に機能発現する方法を開発することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
分子シャペロンとしては、GroEL等のシャペロニンやPPIase（ペプチジルプロリルcis-transイソメラーゼ）等多くのものが知られているが、発明者らは好熱性の古細菌由来のPPIaseに着目した。その理由は、古細菌由来のPPIaseは、失活しにくく、構造的にも真正細菌由来のPPIaseと異なっていること、さらには、ロダネーゼ遺伝子等の大腸菌での機能発現に実績があるからである。シャペロニンまたはPPIaseを利用したタンパク質の安定的生産の研究が盛んに行われてきたことは「背景技術」で述べたとおりである。一方、P450モノオキシゲナーゼに関する研究はきわめて盛んであることは言うまでもない。試しに、「PPIase」及び「P450」をキーワードとして、米国NCBI（National Center for Biotechnology Information）のEntrez-PubMedで検索すると、それぞれ、2,364件、及び、16,433件ヒットした。ところが、「PPIase & P450」で同データベースを検索すると、2件しかヒットがなく、しかもこの2件は、P450モノオキシゲナーゼの安定化には全く関係のない文献であった。P450モノオキシゲナーゼの安定化は、ニーズが多いはずにもかかわらず、今までPPIaseを利用した方法が存在しなかったのは、この方法の開発が困難であることを物語っている。本発明者らは、古細菌のPPIaseを利用するだけでなく、P450モノオキシゲナーゼの中では例外的に、１つのペプチドがP450モノオキシゲナーゼのホロ酵素である真正細菌バチルス・メガテリウム由来のP450モノオキシゲナーゼに着目してこれをP450モノオキシゲナーゼのモデルとして利用することにより、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１５）を提供するものである。
【００１１】
（１）シトクロムP450モノオキシゲナーゼと古細菌由来のPPIaseの両者を生産可能な微生物を培養し、培養物又は菌体からシトクロムP450モノオキシゲナーゼを採取することを特徴とするシトクロームP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【００１２】
（２）シトクロムP450モノオキシゲナーゼが、細菌由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼであることを特徴とする（１）に記載のシトクロームP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【００１３】
（３）シトクロムP450モノオキシゲナーゼが、バチルス・メガテリウムBM-3株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼ、又はその一部を改変したシトクロムP450モノオキシゲナーゼであることを特徴とする（１）に記載のシトクロームP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【００１４】
（４）バチルス・メガテリウムBM-3株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼの一部を改変したシトクロムP450モノオキシゲナーゼが、バチルス・メガテリウムBM-3株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼの87番目のフェニルアラニンをバリンに置換したシトクロムP450モノオキシゲナーゼであることを特徴とする（３）に記載のシトクロームP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【００１５】
（５）微生物が、大腸菌である（１）乃至（４）のいずれか一項に記載のシトクロームP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【００１６】
（６）シトクロムP450モノオキシゲナーゼのN末端側に古細菌由来のPPIaseを付加した融合タンパク質を生産可能な微生物を培養し、培養物又は菌体から、活性のあるシトクロームP450モノオキシゲナーゼを含む融合タンパク質を採取することを特徴とするシトクロームP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【００１７】
（７）融合タンパク質が、シトクロムP450モノオキシゲナーゼと古細菌由来のPPIaseとの間に切断部位を含む融合タンパク質であることを特徴とする（６）に記載のシトクロームP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【００１８】
（８）シトクロムP450モノオキシゲナーゼが、細菌由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼであることを特徴とする（６）又は（７）に記載のシトクロームP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【００１９】
（９）シトクロムP450モノオキシゲナーゼが、バチルス・メガテリウムBM-3株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼ、又はその一部を改変したシトクロムP450モノオキシゲナーゼであることを特徴とする（６）又は（７）に記載のシトクロームP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【００２０】
（１０）バチルス・メガテリウムBM-3株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼの一部を改変したシトクロムP450モノオキシゲナーゼが、バチルス・メガテリウムBM-3株由来のシトクロムP450モノオキシゲナーゼの87番目のフェニルアラニンをバリンに置換したシトクロムP450モノオキシゲナーゼであることを特徴とする（９）に記載のシトクロームP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【００２１】
（１１）微生物が、大腸菌である（６）乃至（１０）のいずれかに記載のシトクロームP450モノオキシゲナーゼの生産方法。
【００２２】
（１２）シトクロムP450モノオキシゲナーゼと古細菌由来のPPIaseの両者を生産可能な微生物。
【００２３】
（１３）シトクロムP450モノオキシゲナーゼのN末端側に古細菌由来のPPIaseを付加した融合タンパク質を生産可能な微生物。
【００２４】
（１４）シトクロムP450モノオキシゲナーゼのN末端側に古細菌由来のPPIaseを付加した融合タンパク質。
【００２５】
（１５）（１４）に記載の融合タンパク質をコードするDNA。
【発明の効果】
【００２６】
本発明は、古細菌由来のPPIaseを利用することによりP450モノオキシゲナーゼ遺伝子を大腸菌等の微生物宿主内で安定的に機能発現させる方法を提供する。そのような組換え微生物を用いて、生変換反応による産業上有用な有機（低分子）化合物の合成が可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２８】
最初にP450モノオキシゲナーゼとPPIaseについて説明する。
【００２９】
１．P450モノオキシゲナーゼ
P450モノオキシゲナーゼは、細菌から植物や哺乳動物に至る広範囲の生物種に分布している酸素添加酵素であり、酸素分子を還元して1分子の水を作ると共に、残りの酸素原子を様々な脂溶性の有機（低分子）化合物(基質)に導入して、酸化生成物に変換する反応（一原子酸素添加反応）を触媒する鉄・イオウ酵素である。哺乳動物のP450モノオキシゲナーゼは非常によく研究されており、本酵素は、生体内に取り込まれた薬物や環境汚染毒物を酸化し水溶性を高め、体外への排出を促進する生体防御の役割を担う鍵酵素（肝臓ミクロソーム型P450）であり、また、生体内の二次代謝産物の生合成において水酸化反応等を担う鍵酵素（ミトコンドリア型P450）でもある。ゲノム配列の解析からP450は、ヒトでは約57種類、細菌では、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）が5種類、放線菌ストレプトマイセス・セリカラー（Streptomyces coelicolor）が18種類、ストレプトマイセス・エバーミチリス（S. avermitilis）が33種類、マイコバクテリウム・ツベルクロシスが20種類あることが知られている。なお、大腸菌はP450を有していない。
【００３０】
P450モノオキシゲナーゼは、シトクロムP450本体タンパク質（CYP）以外に電子伝達タンパク質を必要とする複合酵素である。すなわち、P450が活性を発揮するには、NAD(P)Hから電子を伝達してくるタンパク質として、細菌や真核生物のミトコンドリアでは フェレドキシンレダクターゼとフェレドキシンの介在を必要とし、哺乳動物の肝臓ミクロソームでは NADPH-P450レダクターゼの介在を必要とする。また、CYPそのものも きわめて多様である。すなわち、CYPファミリー間のアミノ酸配列の相同性は40％以下であり、共通部分は、ヘム鉄と結合するシステイン残基部分と両末端の共通配列部分である。P450モノオキシゲナーゼがdiversozymeと言われる所以である。P450モノオキシゲナーゼは部分的な構造の変化により多彩な化合物の代謝に多様化された酵素で、先端の生物工学（バイオテクノロジー）を活用することにより、既存の方法では難しいと思われている化合物の酸化処理が可能になると期待されている。したがって、本酵素は、新しい有機（低分子）化合物（たとえば，位置/立体特異的に導入された水酸化物など）の合成や、分解処理が難しい環境負荷物質の処理への応用に期待されている。また、作物植物に新たなP450モノオキシゲナーゼを導入して残留農薬の分解を促すことなども期待されている。
【００３１】
細菌をはじめとする微生物のP450研究は哺乳動物に比べると遅れていたが、細菌のゲノム解析の進展と相まって、細菌のP450研究が今日、盛んになってきた。細菌で最もよく研究されているP450モノオキシゲナーゼは、シュードモナス・プチダ由来のP450camで、本酵素は、樟脳（camphor）を基質として、5位に水酸基を導入する反応を触媒することが明らかにされており、P450cam遺伝子を導入・発現した組換え細菌を用いた解析も広く実施されている（Poulos, T.L., Finzel, B.C., and Howard, A,J., High-resolution crystal structure of cytochrome P450cam.  J. Mol. Biol., 195, 687-700 (1987)）。また、高脂血症薬プラバスタチン（pravastatin;三共株式会社 商品名メバロチン）は、コンパクチン（compactin）カルボン酸の立体特異的な水酸化反応により合成されるが、この反応を担う酵素は、土壌細菌ストレプトマイセス・カルボフィラス（Streptmyces carbophilus）由来のP450モノオキシゲナーゼである（Matsuoka, T., Miyakoshi, S., Tanzawa, K., Nakahara, K., Hosobuchi, M., and Serizawa, N., Purification and characterization of cytochrome P-450sca from Streptomyces carbophilus. ML-236B (compactin) induces a cytochrome P-450sca in Streptomyces carbophilus that hydroxylates ML-236B to pravastatin sodium (CS-514), a tissue-selective inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase. Eur. J. Biochem., 184, 707-713, 1989）。最近、ロドコッカス属（Rhodococcus sp.）NCIMB 9784由来のP450モノオキシゲナーゼ（P450RhF）の構造が、P450本体タンパク質、及びフェレドキシンレダクターゼとフェレドキシン部分（電子伝達タンパク質）がすべて繋がった１つのポリペプチドであることが発見された。この酵素の遺伝子を発現した大腸菌は、7-エトキシクマリン（7-ethoxycoumarin）のO-脱アルキル化反応を触媒することが報告されている（Roberts, G.A., Grogan, G., Greter, A., Flitsch, S.L., and Turner, N.J., Identification of a new class of cytochrome P450 from a Rhodococcus sp.  J. Bacteriol., 184, 3898-3908 (2002)）。
【００３２】
細菌バチルス・メガテリウムBM-3株由来のP450モノオキシゲナーゼは、P450ドメインとNADPH-P450レダクターゼドメインが結合した、大変珍しい構造を有する酵素である。本酵素の塩基配列は、DDBJ Accession No. J04832に登録されている。本酵素は元々、C12〜C20の飽和脂肪酸のω末端（メチル基側）の1位、2位または3位を水酸化する酵素であったが、87番目のフェニルアラニンがバリンに変異したもの（F87V）は、ナフタレンや2-ブロモフェノール等の芳香族化合物を広く基質として認識し 水酸基を導入することができた（小川 順ら, Bacillus megaterium由来のシトクロムP450(BM-3)変異型酵素を用いるパラヒドロキノン類の酵素合成, 日本農芸化学会2003年大会講演要旨, p. 38, 2003、及び、Q. -W. Li, U. Schwaneberg, P. Fischer, and R. D. Schmid, Directed evolution of the fatty-acid hydoroxylase P450 BM-3 into an indole-hydroxylating catalyst.  Chem. Eur. J. 6, 1531-1536, 2000）。
【００３３】
２．PPIase
PPIase（ペプチジルプロリルcis-transイソメラーゼ）は、ペプチド中のプロリンイミド結合の回転を速めてタンパク質の折り畳みを促進する酵素で、免疫抑制剤のシクロスポリンAと結合するシクロフィリン、FK506と結合するFKBP、これらと結合しないパーブリンの3種類がある。超好熱古細菌のゲノムはPPIaseとしてFKBP遺伝子しか有していない。超好熱古細菌のPPIaseは他の生物種のPPIaseにはない、変性タンパク質の凝集を阻止して折りたたむシャペロン活性を有する（A. Ideno, T. Yoshida, T IIDA, M. Furutani, and T. Maruyama. FK506-binding protein of the hyperthermophilic archaeum, Thermococcus sp. KS-1, a cold-shock-inducible peptidyl-prolyl cis-trans isomerase with activities to trap and refold denatured proteins. Biochem J. 357(Pt 2):465-71, 2001）。またタンパク質が熱凝集することを抑制する凝集抑制活性も有している（A. Ideno, M. Furutani, Y. Iba, Y. Kurosawa, and T. Maruyama. FK506 binding protein from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii suppresses the aggregation of proteins in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. Feb;68(2):464-469, 2002.）。これらの性質はその高い熱安定性と併せて、変性しやすいタンパク質の安定化やタンパク質生産の際生じる不活性型タンパク質の再活性化など産業分野への応用が期待されているものである。
【００３４】
発明者が所属する研究機関である(株)海洋バイオテクノロジー研究所では、積水化学工業(株)との共同研究により、免疫抑制剤FK506と結合するタンパク質であるPPIase遺伝子を好熱性古細菌ピロコッカス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）等より単離した。本PPIaseは、古細菌の不安定な酵素であるロダネーゼ（rhodanese）や、不溶化しやすい鶏卵のリゾチーム抗体のFab断片等を、本来の立体構造に巻き戻し 可溶化させることができた（特開平10-91号公報）。しかも、ロダネーゼは本PPIase共存下で100℃まで安定であった。したがって、本PPIaseは高温でも安定な分子シャペロンであることがわかった。また、安定的に機能発現させたいタンパク質のN末に、前記PPIaseまたは大腸菌のシャペロニンGroELを融合させることにより、そのタンパク質が本来の立体構造に巻き戻されることがわかった。この融合タンパク質系を用いて、毒性の強いB型肝炎ウィルス表面抗原や不溶性のヒトIgGの重鎖等をコードする遺伝子が、安定的に組換え大腸菌内で機能発現されることがわかった（特許文献１、特許文献２）。最近、三井化学もPPIaseのシャペロン活性に着目し、大腸菌のPPIaseを利用することにより、大腸菌で生産が難しかったヒトのミッドカインや組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）の生産量の増強に成功したと発表している（日経バイオテク、2003年5月21日）。
【００３５】
次に、本発明のP450モノオキシゲナーゼの生産方法について説明する。
【００３６】
本発明のP450モノオキシゲナーゼの生産方法は、古細菌由来のPPIaseのシャペロン活性を利用することにより、機能のあるP450モノオキシゲナーゼを安定的に生産することができる。古細菌由来のPPIaseのシャペロン活性を利用する方法としては、以下の二通りの方法がある。
【００３７】
第一の方法は、P450モノオキシゲナーゼと古細菌由来のPPIaseの両者を生産可能な微生物を培養し、培養物又は菌体からP450モノオキシゲナーゼを採取することを特徴とするものである。
【００３８】
P450モノオキシゲナーゼと古細菌由来のPPIaseの両者を生産可能な微生物は、P450モノオキシゲナーゼ遺伝子を発現するベクターと古細菌由来のPPIase遺伝子を発現するベクターを作製し、これらを同一の宿主に導入することにより作製できる。
【００３９】
P450モノオキシゲナーゼが酵素活性を発揮するためには、酵素本体の他に電子伝達タンパク質も必要であり、また、酵素本体と電子伝達タンパク質は通常別々のタンパク質として生産される。従って、ベクター作製の際には、通常、P450モノオキシゲナーゼ遺伝子だけではなく、電子伝達タンパク質をコードする遺伝子も挿入しておく必要がある。
【００４０】
使用するP450モノオキシゲナーゼ遺伝子は、植物や動物などの真核生物由来のものであってもよいが、細菌由来のものであることが好ましい。細菌由来のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子は特に限定されないが、バチルス・メガテリウムBM-3株由来の遺伝子（DDBJ Accession No. J04832）、ロドコッカス属 NCIMB9784由来の遺伝子（GenBank Accession No. AF459424）、シュードモナス・プチダ由来の遺伝子（P450cam、DDBJ Accession No. M12546）などを使用するのが好ましい。また、天然のP450モノオキシゲナーゼ遺伝子の配列を一部改変した遺伝子を使用してもよい。このような配列の一部改変した遺伝子としては、バチルス・メガテリウムBM-3株由来のP450モノオキシゲナーゼの87番目のフェニルアラニンをバリンに置換した酵素をコードする遺伝子（DDBJ Accession No. J04832の塩基配列において、261番目のアデニンがグアニンに（アミノ酸には影響しない）、262番目のチミンがグアニンに置き換わり、その結果、P450モノオキシゲナーゼの87番目のフェニルアラニンがバリンに置き換わる。）を挙げることができる。
【００４１】
使用するPPIaseをコードする遺伝子は、古細菌由来のものであれば特に限定されず、例えば、ピロコッカス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）由来の遺伝子[遺伝子番号 PH1399; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）由来の遺伝子[遺伝子番号 MTH1125; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/]などを使用することができる。
【００４２】
宿主とする微生物は、両方の遺伝子を発現させることのできる微生物であれば特に限定されないが、大腸菌であることが好ましい。
【００４３】
大腸菌等の微生物内における上記の二つの遺伝子の発現は、遺伝子工学実験の常法に基づいて行うことができる。大腸菌や放線菌等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入・発現法は、多くの実験書に記載されているので（たとえば、Sambrook, J., Russel,D. W., Molecular Cloning  A Laboratory Manual, 3rd Edition, CSHL Press, 2001; Hopwood, D. A., Bibb, M. J., Chater, K. F., Bruton, C. J., Kieser, H. M., Lydiate, D. J., Smith, C. P., Ward, J. M., Schrempf, H.  Genetic manipulation of Streptomyces: A laboratory manual, The John Innes Institute, Norwich, UK, 1985）、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。
【００４４】
微生物の培養及び菌体等からの酵素の採取は、常法に従って行うことができる。
【００４５】
第二の方法は、P450モノオキシゲナーゼのN末端側に古細菌由来のPPIaseを付加した融合タンパク質を生産可能な微生物を培養し、培養物又は菌体から、活性のあるP450モノオキシゲナーゼを含む融合タンパク質を採取することを特徴とするものである。必要に応じて、この融合タンパク質からP450モノオキシゲナーゼを遊離させ、採取することもできる。
【００４６】
P450モノオキシゲナーゼのN末端側に古細菌由来のPPIaseを付加した融合タンパク質を生産可能な微生物は、P450モノオキシゲナーゼ遺伝子の5'末端側に古細菌由来のPPIase遺伝子を付加した融合遺伝子を発現するベクターを作製し、それを宿主微生物に導入することにより作製できる。
【００４７】
使用するP450モノオキシゲナーゼ遺伝子及び古細菌由来のPPIase遺伝子は、第一の方法と同様のものでよい。
【００４８】
上述したように、P450モノオキシゲナーゼ遺伝子を発現するベタクーには通常電子伝達タンパク質遺伝子も挿入しておく必要があるので、融合遺伝子を発現するベクターは、P450モノオキシゲナーゼ遺伝子、電子伝達タンパク質遺伝子、及び古細菌由来のPPIase遺伝子の三者を含むことになる。このようなベクターの作製には、図１に示すプラスミドを使用するのが好ましい。
【００４９】
具体的には、古細菌由来のPPIase遺伝子の後に適当な長さのリンカーを介して、電子伝達タンパク質遺伝子を繋ぐ。リンカー部分にλファージのatt配列を加えておけば、λファージの部位特異的組換え系（attB x attP または attL x attR）を利用して、対応するatt配列に囲まれたP450モノオキシゲナーゼ遺伝子を容易に挿入することができる。この部位特異的組換え実験には、インビトロジェン社のGateway Technologyキットを用いることができる。電子伝達タンパク質は種々のものを用いることができるが、たとえば、ロドコッカス属NCIMB 9784由来のP450モノオキシゲナーゼ（P450−フェレドキシンレダクターゼ−フェレドキシンの融合タンパク質のような構造をしている）におけるフェレドキシンレダクターゼ−フェレドキシン部分を用いればよい。
【００５０】
また、融合タンパク質中の古細菌由来のPPIaseとP450モノオキシゲナーゼの間には、酵素などによって切断される部位が挿入されていることが好ましい。このような切断部位としては、実施例で構築したトロンビン切断部位を例示できるが、これに限定されるわけではない。融合タンパク質からP450モノオキシゲナーゼを遊離させる方法は特に限定されないが、切断部位を挿入した場合には、その切断部位を切断する酵素等を作用させればよい。
【実施例】
【００５１】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５２】
〔実施例１〕  共発現系用プラスミドの構築
バチルス・メガテリウムBM-3株由来のP450モノオキシゲナーゼ（monooxygenase）（DDBJ Accession No. J04832）の変異酵素であるF87V（87番目のフェニルアラニンをバリンに置換したもの）は、その構造遺伝子をPCRにより増幅し、ベクタープラスミドpUC18のEcoRI−BamHI部位にクローニングした。以後、このプラスミドをpUC18-F87Vと呼ぶ。  PCRによる増幅の条件は以下の通りである。
【００５３】
PCR増幅に用いたプライマー
Primer1  (36mer)
5'- gTgAAAgAggAATTCCATgACAATTAAAgAAATgCC -3'（配列番号１）
Primer2  (42mer) 
5'- CgggATTCTTAATgATgATgATgATgATgCCCAgCCCACACg -3'（配列番号２）
下線部はEcoRIサイト（Primer1）、BamHIサイト（Primer2）をそれぞれ示している。
【００５４】
PCR増幅条件
９４℃  ２分処理後、９４℃ １５秒、６１℃ ３０秒、６８℃ ４分を２５サイクル行った。KOD Plus DNA polymerase (TOYOBO)を用いた。
【００５５】
ピロコッカス・ホリコシ（Pyrococcus horikoshii）由来のPPIase遺伝子はPCRにより増幅し、ベクタープラスミドpET21aベクターのNdeI-HindIII部位にクローニングした後、PPIase遺伝子とこれに隣接するT7プロモーターをSphI−SalIで切り出し、pACYC184の同部位にクローニングし、PPIase発現プラスミドを作製した。以後、このプラスミドをpACPhFK-１と呼ぶ（Ideno, A., Furutani, M., Iba, Y., Kurosawa, Y., and Maruyama, T., FK506 binding protein from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii suppresses the aggregation of proteins in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 68(2):464-469 (2002)）。
【００５６】
大腸菌JM109(DE3)株をはじめにpACPhFK-１で形質転換した。得られた大腸菌を用いてコンピテントセルを作製し、更にpUC18-F87Vで形質転換した。この操作により、pACPhFK-１とpUC18-F87Vの２つを有した大腸菌JM109(DE3)/ pACPhFK-１/ pUC18-F87Vが得られた。
【００５７】
また比較の対象としてPPIase遺伝子を持たない大腸菌も作製した。これはPPIase遺伝子が入っていないベクターであるpACYC184とpUC18-F87Vの２プラスミドを有するJM109(DE3)/ pACYC184/ pUC18-F87Vである。
【００５８】
〔実施例２〕  共発現系による化合物の生変換能力の解析
構築した共発現系JM109(DE3)/ pACPhFK-１/ pUC18-F87V及びP450単独発現系JM109(DE3)/ pACYC184/ pUC18-F87Vは各々LB培地（アンピシリン100 μg/ml及びクロラムフェニコール25 μg/mlを含む）4 mLで16時間、30℃で培養した。この前培養液全量をM9＋グルコース培地（アンピシリン100 μg/ml及びクロラムフェニコール25 μg/mlを含む）100 mLに全量植菌し、4時間培養した。この培養液に誘導物質としてIPTGを1 mMになるよう加え、更に30℃で16時間培養した。その後集菌し、10 mMトリスバッファー（ｐH＝7.5）40 mLに懸濁、基質としてインドールを1 mM、または5 mMになるよう添加した。30℃で16時間振盪培養し基質との反応を行わせた後、細胞懸濁液と等量、すなわち40 mLのメタノールを入れ、30分間攪拌した。次に8,000回転で5分間遠心を行い、上清80 μlをHPLCでの解析に用いた。
【００５９】
インドールはP450モノオキシゲナーゼ(F87V)により水酸化反応を触媒され、インディゴに変換される。共発現系、及びP450単独発現系でのインディゴ生成をHPLCで検出、比較した結果を表１に示す。実験は３回行い、その平均値が示してある。なお、インドール及びインディゴにおけるHPLCでの保持時間はそれぞれ、９.５分、及び、４.８分であった。
【００６０】
【表１】
0004750430.tif 000002
【００６１】
表１に示すように、PPIaseとの共発現系はP450単独発現系と比較し、１ｍMインドールを基質とした場合で約１．７倍、５ｍMインドールで約３．３倍の変換効率を示した。
【００６２】
〔実施例３〕  融合タンパク質作製用発現プラスミドの構築
バチルス・メガテリウムBM-3株由来のP450モノオキシゲナーゼの変異酵素であるF87V は、その構造遺伝子1.3 kbをPCRにより増幅した。用いたプライマーの配列を以下に示す。
【００６３】
Primer1  (30mer)
5'- GGAGCTCACAATTAAAGAAATGCCTCAGCC-3'（配列番号３）
Primer2  (36mer) 
5'- CGCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGCCCAGC -3'（配列番号４）
下線部はSacIサイト（Primer1）、XhoIサイト（Primer2）をそれぞれ示している。
【００６４】
PCR増幅条件
９４℃  ２分処理後、９４℃ １５秒、６１℃ ３０秒、６８℃ ４分を２５サイクル行った。KOD Plus DNA polymerase (TOYOBO)を用いた。
【００６５】
サーモコッカス属（Thermococcus sp.） KS-1由来のPPIase遺伝子18 kbはPCRにより増幅した。用いたプライマーの配列を以下に示す。
【００６６】
Primer3  (28mer)
5'- GGCCATGGGAAAAGTTGAAGCTGGTGAT -3'（配列番号５）
Primer4  (26mer) 
5'- CCACTAGTAGCTTCTGAGTCCTCCTC -3'（配列番号６）
下線部はNcoIサイト（Primer3）、SpeIサイト（Primer4）をそれぞれ示している。
【００６７】
PPIase遺伝子とP450モノオキシゲナーゼ遺伝子の間にトロンビン切断部位を構築するため、相互に相補的な次の配列を持つ2本のオリゴヌクレオチド(Throm-F、Throm-R)を合成しハイブリダイズさせ2本鎖DNA断片を作製した。以下この2本鎖DNA断片をThrom断片と呼ぶ。
【００６８】
Throm-F
5'- GGACTAGTCTGGTTCGGCGTGGATCC CATATG GAATTCGG -3'（配列番号７）
Throm-R
5'- CCGAATTC CATATG GGATCCACGCCGAACCAGACTAGTCC -3'（配列番号８）
この断片はSpeI（ACTAGT）、BamHI(GGATCC)、 NdeI(CATATG)、 EcoRI(GAATTC)の制限酵素サイトを含んでいる。上記Throm-F及び Throm-Rの配列においてこれらのサイトは下線で示している。
【００６９】
上述の方法で増幅したPPIase遺伝子はNcoI及びSpeI、 Throm断片はSpeIとEcoRIで各々処理し、ベクタープラスミドpET21dのNcoI-EcoRIサイトへタンデムに挿入した。得られた発現プラスミドのSacI−XhoIサイトへ更にP450遺伝子をクローニングし、PPIaseとP450の融合タンパク質遺伝子発現系を構築した。以下、このプラスミドをpFusionP450と呼ぶ。pFusionP450のマップは図２に示されている。なお、プラスミドpFusionP450により作られるFKBPとP450の分子間にはリンカーペプチドがあり（アミノ酸配列  TSLVPRGSHMEFEL）トロンビン切断部位（下線部）を有している。
【００７０】
比較対象として、P450遺伝子のみをpET21dのSacI−XhoI部位へクローニングしたプラスミドpETP450も作製した。
【００７１】
〔実施例４〕  融合タンパク質法によるF87Vの安定発現
大腸菌BL21 (DE3)株をpFusionP450またはpETP450で形質転換し、各々LB培地（アンピシリン100 μg/mlを含む）3 mLで4時間、30℃で培養した。この前培養液全量をLB培地（アンピシリン100 μg/ml含む）40 mLに全量植菌し、3時間培養した。この培養液に誘導物質としてIPTGを0.5 ｍMになるよう加え、更に30℃で16時間培養した。その後集菌し、10 ｍMリン酸ナトリウムバッファー（ｐH＝8.0）2 ｍLに懸濁、氷上で超音波破砕を行い32,000回転で30分間超遠心を行い、得られた上清を無細胞抽出液とした。BL21(DE3)/pFusionP450または/pETP450より調製した無細胞抽出液のタンパク質濃度を測定し、約6 μgをSDS/PAGEゲル（7.5-15％）で泳動した。得られたバンドを解析したところ、pFusionP450を用いた系はpETP450の系と比較して約2.7倍量のP450が発現していることが明らかとなった。
【００７２】
次に、P450単独発現系及びPPIase-P450融合タンパク質の無細胞抽出液について、P450の熱安定性を検討した。実際には、前もって、各無細胞抽出液のP450モノオキシゲナーゼ活性を測定し、60℃、20分の処理を行った後に、残存活性を測定した。活性の測定は、0.1 Mリン酸ナトリウムバッファー(pH8.0)に無細胞抽出液（タンパク量200〜400μg）及び基質としてラウリン酸ナトリウムを最終濃度0.5 ｍMになるよう加え、NADPH（終濃度0.2 μM）を添加後素早く混合し、分光光度計で340 nmに示されるNADPHの吸光度の減少を追うことによって行った。各々の無細胞抽出液の活性を熱処理前と後で比較した結果、表２に示すように、PPIaseとの融合タンパク質化したP450BM-3モノオキシゲナーゼF87V[大腸菌(pFusionP450)の無細胞抽出液]の方が、単独のP450BM-3モノオキシゲナーゼF87V[大腸菌(pETP450)の無細胞抽出液]よりも熱安定性に優れていることが判明した。
【００７３】
【表２】
0004750430.tif 000003
【００７４】
〔実施例５〕  融合タンパク質法によるP450camの安定発現
シュードモナス・プチダ由来のP450cam（DDBJ Accession No. M12546）は、その構造遺伝子1.3 kbをPCRにより増幅した。用いたプライマーの配列を以下に示す。
【００７５】
Primer1  (30mer)
5'- GGACTAGTATGACGACTGAAACCATACAAA-3'（配列番号９）
Primer2  (30mer) 
5'- CATATGTTATACCGCTTTGGTAGTCGCCGG -3'（配列番号１０）
下線部はSpeIサイト（Primer1）、NdeIサイト（Primer2）をそれぞれ示している。
【００７６】
PCR増幅条件
９４℃  ２分処理後、９４℃ １５秒、６１℃ ３０秒、６８℃ ４分を２５サイクル行った。KOD Plus DNA polymerase (TOYOBO)を用いた。〔実施例３〕で構築した発現プラスミドのSpeI−NdeIサイトにこの断片をクローニングし、融合プラスミドpFusionP450camを作製した。また比較対象としてP450cam遺伝子をpET21aにクローニングしたpETP450camプラスミドも作製した。大腸菌BL21 (DE3)株をpFusionP450camまたはpETP450camで形質転換し、実施例４と同様の手法で培養、無細胞抽出液を調製した。各無細胞抽出液のタンパク質濃度を測定し、約6 μgをSDS/PAGEゲル（7.5-15％）で泳動し得られたバンドを解析したところ、pFusionP450camを用いた系はpETP450の系と比較して約2.１倍量のP450camが発現していることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】PPIase−P450モノオキシゲナーゼ−電子伝達タンパク質の融合タンパク質生産用プラスミドの構造を示す図である。
【図２】PPIase-P450モノオキシゲナーゼの融合タンパク質生産用プラスミドpFusionP450の構造を示す図である。
【図１】
0004750430.tif 000004
【図２】
0004750430.tif 000005
【配列表】
0004750430000001.app