(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体を浸透しない材料からなる基材上に固定された多孔体に、一個の磁気粒子の表面にｎ種（ｎは２以上の整数）の抗体が結合されている磁気粒子の集合体からなる標識付き試薬を、湿潤状態で移動可能に保持し、
前記基材上の前記多孔体の下流側に、前記ｎ種の抗体がそれぞれ固定されたｎ個の反応部を形成し、
液状試料を、前記多孔体に吸収させて前記標識付き試薬とともに毛細管現象により移動させた後、前記ｎ個の反応部に接触させ、前記反応部に生じた前記標識付き試薬が有する前記磁気粒子の凝集を検出することにより、前記液体試料に前記磁気粒子の表面に結合されているｎ種の抗体に対応するｎ種の抗原が含まれているかどうかを検出する、抗原抗体反応を利用した分析方法。
【請求項２】
液体を浸透しない材料からなる基材上に固定された多孔体に、一個の磁気粒子の表面にｎ種（ｎは２以上の整数）の抗体が結合されている磁気粒子の集合体からなる標識付き試薬が、湿潤状態で移動可能に保持され、
前記基材上の前記多孔体の下流側に、前記ｎ種の抗体がそれぞれ固定されたｎ個の反応部が形成され、
液状試料を導入して毛細管現象により前記多孔体に向かわせる試料導入部と、前記多孔体に吸収された液状試料を前記ｎ個の反応部に接触して移動させる流路と、前記ｎ個の反応部の状態を検出する磁気検出装置と、を備えたことを特徴とする分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、抗原抗体反応を利用した分析装置で使用する標識付き試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査、環境分析、食品分析等に好適に用いられる分析装置として、抗原抗体反応を利用した分析装置が提案されている。
特許文献１に記載された分析装置では、検体（抗原）に対して特異的に結合する試薬（抗体）が、標識が付いた状態で、多孔質キャリヤ（帯状の多孔質体）の第一区域に湿潤状態で移動可能に保持されている。また、同じ多孔質キャリヤの第一区域から空間的に区別される検出区域（反応部）に、検体に対して特異的に結合する試薬（抗体）が標識無しで固定されている。
【０００３】
また、この分析装置は、適用された液状試料が標識付き試薬を吸収した後に検出区域に浸透するように構成され、標識付き試薬が検出区域に結合された程度を観察できる手段を有している。この分析装置において、多孔質キャリヤは、不透湿性固体材料からなる中空ケーシング（箱体）内に収容されている。さらに、特許文献１には、標識の例として、染色ゾル、金属ゾル、および着色ラテックス粒子が挙げられている。そして、特許文献１の第１２図に示された分析装置は、液状試料を横方向に移動させるラテラルフロー方式の装置である。
【０００４】
特許文献２に記載された分析装置では、標識として磁性微粒子（磁気粒子）を用い、磁性微粒子の凝集を磁気センサで測定することにより分析を行っている。
特許文献３には、この種の分析装置で検体の検出感度を向上させる目的で、標識として着色ラテックス粒子を使用することが記載されている。
【０００５】
特許文献４には、複数の分子（例：核酸）の存在を同時に検出する方法として、複数の検出対象分子に対してそれぞれ特異的にハプテン標識分子（検出対象分子と特異的に結合する分子（例：核酸プローブ）にハプテン（抗原）を結合したもの）を結合させ、得られた各「検出対象分子＋ハプテン標識分子」に、異なる酵素で標識した酵素標識抗ハプテン抗体を抗原抗体反応で結合させた後、各酵素に発色の異なる蛍光基質を反応させる方法が記載されている。この方法によれば、複数の検出対象分子の存在が異なる蛍光色で同時に検出できるが、蛍光分析装置等の非常に高価な装置が必要である。
【０００６】
特許文献５には、デキストランが被覆された磁性粒子（マグネタイト微粒子）の表面に複数個のアビジンが結合された磁性微粒子標識材料（「磁性粒子／デキストラン／アビジン」）が記載されている。この磁性微粒子標識材料は、磁気標識された検体の有無を干渉縞から検出するレーザ磁気免疫測定法で使用される。
その手順としては、先ず、検体（抗原）と予め検体用の抗体が結合されたアクリル樹脂製マイクロビーズを反応させた後、これを更に、予めビオチンが結合された検体用の抗体と反応させることで、「マイクロビーズ／抗体／検体（抗原）／抗体／ビオチン」を得る。次に、これと「磁気粒子／デキストラン／アビジン」を反応させてアビジン／ビオチン結合を生じさせることにより、抗体でサンドイッチされた検体（抗原）を磁気粒子に結合する。この磁気粒子を特定の場所に磁力で引き寄せ、この引き寄せられた磁気粒子にレーザを照射し、その干渉縞の強度から検体（抗原）濃度を検出する。
【特許文献１】特公平７−４６１０７号公報
【特許文献２】特開昭６３−３０２３６７号公報
【特許文献３】特開昭６０−１９２２６１号公報
【特許文献４】特開平１１−５１９３５号公報
【特許文献５】特開平４−３２３５６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
抗原抗体反応を利用した分析では、分析対象成分毎に専用の分析装置を用いるのが普通であるが、複数の分析対象成分に併用できる分析装置も要求されている。
本発明の課題は、複数の分析対象成分に併用できる分析装置用として好適な標識（磁気粒子）付き試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明は、液体を浸透しない材料からなる基材上に固定された多孔体に、一個の磁気粒子の表面にｎ種（ｎは２以上の整数）の抗体が結合されている磁気粒子の集合体からなる標識付き試薬を、湿潤状態で移動可能に保持し、前記基材上の前記多孔体の下流側に、前記ｎ種の抗体がそれぞれ固定されたｎ個の反応部を形成し、液状試料を、前記多孔体に吸収させて前記標識付き試薬とともに毛細管現象により移動させた後、前記ｎ個の反応部に接触させ、前記反応部に生じた前記標識付き試薬が有する前記磁気粒子の凝集を検出することにより、前記液体試料に前記磁気粒子の表面に結合されているｎ種の抗体に対応するｎ種の抗原が含まれているかどうかを検出する、抗原抗体反応を利用した分析方法を提供する。
また、標識として磁気粒子を用いた、複数種の抗原が結合可能な標識付き試薬であって、「複数種の抗原と特異的に結合する複数種の抗体が、一個の磁気粒子の表面に結合されている磁気粒子」の集合体からなることを特徴とする標識付き試薬を提供する。
本発明は、また、一個の磁気粒子の表面にｎ種（ｎは２以上の整数）の抗体が結合されている磁気粒子の集合体からなる標識付き試薬の製造方法であって、アビジン化された磁気粒子とビオチン化された第１の抗体とを反応させて、磁気粒子の表面にアビジン／ビオチン結合を介して第１の抗体が所定量結合された「第１の状態の磁気粒子」を得た後、「第１の状態の磁気粒子」とビオチン化された第２の抗体とを反応させて、「第１の状態の磁気粒子」の表面にアビジン／ビオチン結合を介して第２の抗体が所定量結合された「第２の状態の磁気粒子」を得ることを、「第ｎの状態の磁気粒子」が得られるまで繰り返すことを特徴とする標識付き試薬の製造方法を提供する。この方法は、本発明の標識付き試薬を製造する方法として好適である。
【０００９】
この方法では、ビオチン化された抗体として、ポリアルキレングリコールを介して抗体がビオチン化されたものを使用することが好ましい。
ポリアルキレングリコールは、磁気粒子（以下「磁気ビーズ」とも称する。）と、これに結合する抗体との間で、直鎖状の親水性スペーサーとして機能する。使用可能なポリアルキレングリコールとしては、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール等が挙げられるが、特にポリエチレングリコール（以下「ＰＥＧ」と略称する。）を使用することが好ましい。
【００１０】
ポリアルキレングリコールを介して二次抗体に磁気ビーズを結合させることにより、二次抗体が反応液中でより自由に稼動可能となり、二次抗体としての反応性が増大し、結果的に大径、高比重の磁気ビーズで標識された二次抗体の免疫反応速度を飛躍的に向上することができる。
さらに、非特異吸着の少ないＰＥＧを介して磁気ビーズと二次抗体を結合することにより、磁気ビーズの基材や一次抗体への非特異吸着特性を抑制することが可能であり、抗体の反応性向上とあわせて磁気標識化二次抗体反応の免疫反応Ｓ／Ｎ向上に寄与する。
【００１１】
本発明で使用されるＰＥＧの分子量は種々の範囲のものが使用可能であるが、比較的分子量の小さいＭＷ３０００前後のＰＥＧ化合物でも充分に磁気ビーズ標識化二次抗体の反応性向上の効果を発揮することが可能である。
一個の磁気粒子の表面に結合するｎ種の抗体のアビジン／ビオチン結合について、ｎ＝２の場合（抗体Ａと抗体Ｂ）を例にとって説明する。抗体Ａへのビオチン導入量および抗体Ｂへのビオチン導入量は、抗体１分子に対してビオチン０．５分子〜２分子となる範囲とする。磁気粒子が凝集した状態では、抗体１分子に対してビオチン０．８分子〜１．５分子とすることが好ましい。また、抗体−ＰＥＧ−ビオチンとアビジン化された磁気粒子を反応させる際に、抗体−ＰＥＧ−ビオチンを、磁気粒子１個の表面積当たり０．１〜１５μｇ／ｃｍ２  の割合で反応させることが好ましい。
【００１２】
本発明はまた、液体を浸透しない材料からなる基材上に固定された多孔体に、一個の磁気粒子の表面にｎ種（ｎは２以上の整数）の抗体が結合されている磁気粒子の集合体からなる標識付き試薬（ｎ種の二次抗体を表面に有する磁気粒子）が、湿潤状態で移動可能に保持され、前記基材上の前記多孔体の下流側に、前記ｎ種の抗体（一次抗体）がそれぞれ固定されたｎ個の反応部が形成され、液状試料を導入して毛細管現象により前記多孔体に向かわせる試料導入部と、前記多孔体に吸収された液状試料を前記ｎ個の反応部に接触して移動させる流路と、前記ｎ個の反応部の状態を検出する磁気検出装置と、を備えたことを特徴とする分析装置を提供する。
【００１３】
この分析装置によれば、試料導入部から導入された液状試料は前記多孔体に吸収された後に、この多孔体に保持されている標識付き試薬とともに前記流路に入って、前記ｎ個の反応部に接触して移動する。
磁気粒子表面に結合されているｎ種の抗体（二次抗体）のいずれかと特異的に結合する抗原が、試料導入部から導入された液状試料に含まれている場合には、前記多孔体で、磁気粒子表面の対応する二次抗体と特異的に結合し、複合体となって前記流路に入る。そして、ｎ個の反応部のうちの前記抗原に対応する反応部で、前記複合体の抗原と一次抗体が特異的に結合し、一次抗体、抗原、二次抗体を有する磁気粒子がサンドイッチ状となり、対応する反応部に標識が固定される。
そのため、この分析装置によれば、磁気粒子の表面に結合されているｎ種の二次抗体に対応するｎ種の抗原の検出が可能となる。
【００１４】
本発明で用いる磁気ビーズとしては、少なくとも外部から磁界を作用させている間は磁化する粒子であれば良い。この磁気ビーズとしては、磁性体を単独で粒子状に成形した粒子、磁性体を核としてその表面をポリスチレン、シリカゲル、ゼラチン、若しくはポリアクリルアミドなどの高分子物質で被覆した粒子、ポリスチレン、シリカゲル、ゼラチン、若しくはアクリルアミドなどの高分子物質の粒子を核として、磁性体を被覆した粒子、赤血球、リポソーム若しくはマイクロカプセルなどの閉じた袋状の物質に磁性体を封入した粒子等を挙げることができる。
【００１５】
尚、前記の磁性体としては、例えば、鉄、コバルト、ニッケル等の強磁性金属やそれらを含む合金、非磁性体中に前記強磁性金属やそれらを含む合金を含有するもの、前記強磁性金属中若しくは前記強磁性金属を含む合金中に非磁性体を含有するもの等を挙げることができる。
本発明の分析装置を構成する磁気検出装置としては、市販の装置、例えば、ホール素子、半導体ＭＲ素子（ＳＭＲ素子）、ＧＭＲ (Giant magneto resistance) 素子等を備えたものを使用することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の標識付き試薬は複数種の抗原が結合可能である。そして、これを用いた本発明の分析装置によれば、磁気粒子の表面に結合されているｎ種の二次抗体に対応するｎ種の抗原の検出が可能となるため、複数の成分の分析に併用できる。したがって、本発明の分析装置は、医療診断や健康診断のために行われる臨床検査用の装置として好適に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
図１〜５を用いて、本発明の実施形態に相当する分析装置を説明する。
図１は、この分析装置を構成する本体を示す縦断面図である。図２は、この本体を構成する箱体の、組立前の状態を示す斜視図である。図３は、第１多孔体１、第２多孔体２、反応部３ａ，３ｂ、および吸収体４の、箱体内での配置を示す斜視図である。図４は、この分析装置を構成する磁気検出装置を示す概略構成図である。図５は、図４の磁気検出装置による信号処理を説明するための模式図である。
【００１８】
〔本体について〕
図１および２に示すように、この箱体は、ポリカーボネート（液体を浸透しない性質の材料）製の底板６と、ポリスチレン（液体を浸透しない性質の材料）製の蓋部７とで構成されている。
底板６の内面には、周縁部の６カ所に、蓋部７との連結用のピン６７が固定されている。これらのピン６７を入れる筒状のピン受け７６が、蓋部７の内面に固定されている。蓋部７には、液状試料を入れるための試料導入口（試料導入部）７１と、反応部３ａ，３ｂの上部に流路３１を形成する流路形成部７２が形成されている。これらの底板６および蓋部７は、汎用の射出成形機を用い、通常の条件で成形することができる。
【００１９】
図２および３に示すように、底板６の内面に、第１多孔体（試料導入部）１、第２多孔体２、反応部３ａ，３ｂ、および吸収体４が配置されている。
底板６の内面は、反応部３ａ，３ｂを形成する部分（反応部形成面）３０が、第１多孔体１を固定する部分１０、第２多孔体２を固定する部分２０、および吸収体４を固定する部分４０よりも低く形成されている。符号５０は、底板６の内面で最も低い面を示す。また、第１多孔体１を固定する部分１０と第２多孔体２を固定する部分２０は同じ高さで、吸収体４を固定する部分４０は、これらの部分１０，２０よりも高くなっている。そのため、図２に示すように、底板６内面の吸収体４を固定する部分４０は、周縁部と同じ高さの面６Ａとして形成し、反応部形成面３０、第１多孔体１を固定する部分１０、および第２多孔体２を固定する部分２０は、この面６Ａに凹部１０Ａ，２０Ａ，３０Ａを設けることにより形成した。
【００２０】
底板６の内面の、第２多孔体２を固定する部分２０と反応部形成面３０の間は、斜面２３になっている。反応部形成面３０と吸収部４を固定する部分４０の間は、斜面３４になっている。これらの斜面２３，３４に、それぞれ複数の流路形成部材２３１，３４１を配置することで、溝状の流路２３２，３４２が形成される。流路形成部材２３１，３４１は、蓋部７の流路形成部７２の傾斜部に固定されている。また、第１多孔体１と第２多孔体２は接触状態で配置される。
【００２１】
第１多孔体１は、グラスファイバーの不織布を長方形に打ち抜くことで作製し、これを両面テープで底板６の凹部１０Ａに固定する。
第２多孔体２は、グラスファイバーの不織布に、下記の方法で得られた液体（濃度が０．０５％の磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ＆Ａ分散液）を含浸した後に風乾することで得、これを両面テープで底板６の凹部２０Ａに固定する。
【００２２】
反応部３ａは一次抗体Ａが、反応部３ｂは一次抗体Ｂが、それぞれ固定された部分であって、下記の方法で底板６の凹部３０Ａに形成する。
吸収体４は、セルロースの不織布を長方形に打ち抜くことで作製し、これを両面テープで底板６の凹部３０Ａに隣接する面６Ａに固定する。
この状態の底板６の上に蓋部７を載せて、底板６のピン６７を蓋７のピン受け７６に入れることにより、図１に示すように分析装置の本体１０１が得られる。そして、この実施形態の分析装置は、本体１０１の反応部３ａ，３ｂの状態を、図４に示す磁気検出装置を用いて図１の矢印Ｂ方向から検出することで、試料導入口７１から導入された液状試料の特定成分（抗体Ａ，Ｂと特異的に結合する抗原）を分析する。
【００２３】
この実施形態の分析装置によれば、磁気ビーズ標識化二次抗体Ａ＆Ｂ（１個の磁気粒子にアビジン／ビオチン結合を介して「ＰＥＧ−抗体Ａ」と「ＰＥＧ−抗体Ｂ」が結合されている粒子の集合体）が第２多孔体２に保持され、一次抗体Ａ，Ｂが反応部３ａ，３ｂに固定されているため、Ａ，Ｂ二種類の抗体と特異的に結合する二種類の抗原（インフルエンザＡウイルスおよびインフルエンザＢウイルス）の分析に併用できる。
【００２４】
また、反応部３ａ，３ｂを底板６の内面の最も低い凹部３０Ａに形成することにより、図１に示すように、箱体の底板６の厚さを反応部３ａ，３ｂの位置で極めて薄くして、第１多孔体１、第２多孔体２、および吸収体４が固定されている部分の厚さを機械的強度が確保できる十分な厚さにすることができる。
そして、例えば、第１多孔体１および第２多孔体２を固定する部分の厚さを１．０ｍｍとし、反応部形成面３０の部分の厚さを０．２ｍｍとし、吸収体４を固定する部分の厚さを１．５ｍｍとすることで、磁気センサによる検出感度および検出精度を良好にしながら、底板６の機械的強度を確保することができる。
また、蓋部７の流路形成部７２により、反応部３ａ，３ｂの上部に流路３１を形成することで、反応部３ａ，３ｂの汚染が防止される。
【００２５】
〔第２多孔体に含浸させる液体（標識付き試薬を含有する液体）の作製方法〕
(1) 第１の抗体のＰＥＧを介したビオチン化工程（「ビオチン−ＰＥＧ−抗体Ａ」を得る工程）
Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＮＨＳ（米国シェアーウオーター社製、ＭＷ３４００）を９．１ｍｇ計量して、４００μｌの蒸留水に溶解することにより、濃度が６．６９ｍＭである水溶液を調製した。この水溶液１５．３μｌと、抗体Ａ（抗インフルエンザＡウイルス抗体、フィッツジェラルド社製、Mouse IgG ）をＰＢＳに脱塩・ｂｕｆｆｅｒ交換したもの（抗体濃度６．１１ｍｇ／ｍｌ）０．６２５ｍｌを混合して、室温で４時間反応させた。これにより、抗体ＡにＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ鎖を結合した。
【００２６】
上記反応液を、遠心型限外ろ過装置（アミコン社、分子量３万カット）を用いて回転速度７５００ｒｐｍ、１０分間の条件で濃縮し、得られた濃縮液にＰＢＳを３ｍｌ添加して、同限外ろ過装置で同様の条件で再び濃縮した。さらに、得られた濃縮液にＰＢＳを３ｍｌ添加して、同限外ろ過装置で同様の条件で濃縮する操作を２回繰り返した。これにより、未反応のＢｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＮＨＳが除去された、精製ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ化抗体Ａ（「ビオチン−ＰＥＧ−抗体Ａ」）液を得た。
得られた「ビオチン−ＰＥＧ−抗体Ａ」の「抗体Ａ」１分子あたりのビオチン化率を「EZ-link Sulfo-NHS-Biotinylation  Kit試薬( 米国ピアース社製) 」中のbiotin定量試薬を用いて測定したところ、１．１分子（IgG 濃度は７．９７mg/ml ）であった。
【００２７】
(2) 第２の抗体のＰＥＧを介したビオチン化工程（「ビオチン−ＰＥＧ−抗体Ｂ」を得る工程）
抗体Ａに代えて抗体Ｂ（抗インフルエンザＢウイルス抗体、フィッツジェラルド社製、Mouse IgG ）を用いた以外は(1) の工程と同じ方法で、精製ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ化抗体Ｂ（「ビオチン−ＰＥＧ−抗体Ｂ」）液を得た。
得られた「ビオチン−ＰＥＧ−抗体Ｂ」の「抗体Ｂ」１分子あたりのビオチン化率を(1) と同じ方法で測定したところ、０．８分子（IgG 濃度は３．５３mg/ml ）であった。
【００２８】
(3) アビジン化された磁気粒子とビオチン−ＰＥＧ−抗体Ｂとの反応工程（第１の状態の磁気粒子：「磁気粒子−アビジン−ビオチン−ＰＥＧ−抗体Ｂ」を得る工程）
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製の磁気ビーズ、直径１．０μｍ、超常磁性高分子ポリマービーズにストレプトアビジンを結合させたもの）を１％含有するＰＢＳ溶液を１００μｌ、エッペンドルフチューブに計量し、これに、(2) 工程で得られた精製ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ化抗体Ｂ（「ビオチン−ＰＥＧ−抗体Ｂ」）液を１７．８μｌ添加した。さらに、ＰＢＳを３２．２μｌ入れて、全液量を１５０μｌとした後、室温で４時間攪拌しながら反応を行った。これにより、磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ（「磁気粒子−アビジン−ビオチン−ＰＥＧ−抗体Ｂ」）液を得た。
【００２９】
この磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ液から、ノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製のＭＰＣ（磁石を用いた磁性粒子収集装置）を用いて、磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂのみを回収した。回収された磁気ビーズ標識化二次抗体ＢにＰＢＳを１ｍｌ添加して洗浄し、この液体から同じ方法で磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂのみを回収した。最終的に、この磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂに、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を入れて、濃度が０．５％の磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ分散液を得た。
このようにして得られた磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ分散液を５０μｌ採取して、この分散液から、前記と同じ方法で磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂのみを回収した。回収された磁気ビーズ標識化二次抗体ＢにＰＢＳを２００μｌ添加して洗浄し、この液体から同じ方法で磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂのみを回収した。
【００３０】
(4) 第１の状態の磁気粒子である「磁気粒子−アビジン−ビオチン−ＰＥＧ−抗体Ｂ」と「ビオチン−ＰＥＧ−抗体Ａ」を反応させて、図６に示す第２の状態の磁気粒子「第１の状態の磁気粒子−アビジン−ビオチン−ＰＥＧ−抗体Ａ」を得る工程
(3) 工程で最終的に回収された磁気ビーズ標識化二次抗体ＢにＰＢＳを１００μｌ添加し、これに、(1) 工程で得られた精製ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ化抗体Ａ（「ビオチン−ＰＥＧ−抗体Ａ」）液を２６．３μｌ添加した。さらに、ＰＢＳを２３．７μｌ入れて、全液量を１５０μｌとした後、室温で４時間攪拌しながら反応を行った。これにより、図６に示す第２の状態の磁気粒子（磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ＆Ａ）を含有する液を得た。
【００３１】
この磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ＆Ａ液から、ノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製のＭＰＣ（磁石を用いた磁性粒子収集装置）を用いて、磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ＆Ａのみを回収した。回収された磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ＆ＡにＰＢＳを２００μｌ添加して洗浄し、この液体から同じ方法で磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ＆Ａのみを回収した。最終的に、この磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ＆Ａに、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を入れて、濃度が０．０５％の磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ＆Ａ分散液を得た。
この分散液に含まれている磁気ビーズ標識化二次抗体Ａ＆Ｂは、１個の磁気粒子にアビジン／ビオチン結合を介して「ＰＥＧ−抗体Ａ」と「ＰＥＧ−抗体Ｂ」が結合されている粒子の集合体であって、「ＰＥＧ−抗体Ａ」の結合比率が約７０％で「ＰＥＧ−抗体Ｂ」の結合比率が約３０％である。
【００３２】
〔反応部３ａ，３ｂの形成方法〕
前記と同じ抗体Ａを、０．１質量％のシュークロースを含有する０．１ｍｏｌｅ／ｌのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）緩衝液で、濃度が１０μｇ／ｍｌになるように希釈して希釈液Ａを得た。また、抗体Ａに代えて前記と同じ抗体Ｂを用い、同じ方法で、希釈液Ｂを得た。
次に、これらの希釈液Ａ，Ｂを、底板６の内面の凹部３０Ａ上に５μｌずつ、３ｍｍ開けて滴下した。この底板６を、直ぐに、予め４５℃に加温しておいた減圧インキュベーター（ＥＹＥＬ社製、型番ＶＯＳ−３０１ＳＤ）中に入れ、０．０８ＭＰａとなるまで減圧し、この圧力で正確に３０分間保持することで減圧乾燥処理を行った。これにより、底板６の内面の凹部３０Ａに、反応部３ａ，３ｂを形成した。
【００３３】
〔図４の磁気検出装置の説明〕
この実施形態では、分析装置の本体１０１を保持する台１２にモータ１０２を接続し、このモータ１０２の駆動により、台１２に保持された本体１０１が、磁場中で図中の矢線Ａで示す方向に移動されるようにした。本体１０１の下面が露出されるように、台１２の底面は開口部１２ａとなっている。
【００３４】
磁気検出装置は、本体１０１の反応部に固定された磁性粒子によって出力される磁気的な変化を検出し、この変化をアナログ信号として出力する磁気センサ１０６と、磁気センサ１０６によって出力されたアナログ信号を増幅し、増幅されたアナログ信号をフィルタ処理するアナログ信号処理部１０８と、アナログ信号処理部１０８によってフィルタ処理されたアナログ信号をデジタル信号に変換するＡ／Ｄ変換素子１０９、Ａ／Ｄ変換素子１０９から出力されたデジタル信号に含まれるノイズを除去するデジタルフィルタ１１０と、ノイズが除去されたデジタル信号のプラス出力またはマイナス出力のいずれか一方を出力する信号出力部１１１と、を備えている。
【００３５】
磁気センサ１０６は、磁場の変化によって電気特性が変化する半導体薄膜を有するセンサ部１０３と、センサ部１０３および本体１０１の反応部に静磁場を印加する静磁場発生部１０４と、を備えている（印加される静磁場の磁力線をＢとして示す）。センサ部１０３および静磁場発生部１０４は、基体１０５にそれぞれ固定されてユニット化されている。なお、センサ部１０３の半導体薄膜としては、インジウムアンチモンなどの化合物半導体、シリコンなどの半導体からなる薄膜が適用できる。
【００３６】
静磁場発生部１０４には、永久磁石またはコイルに直流電流を流す形態の電磁石等が適用できるが、磁場の安定性の点から永久磁石がより好ましい。静磁場発生部１０４に用いられる永久磁石には、小型であって強い磁場がかけられるサマリウムコバルト磁石やネオジウム磁石などが好ましい。また、磁場発生源の磁場強度は、センサ部１０３である半導体磁気抵抗薄膜が強磁場下で高感度であるという特性を考慮すると、５００エルステッド以上、好ましくは１０００エルステッド以上が望ましく、より好ましくは１５００エルステッド以上が望ましい。
【００３７】
静磁場発生部１０４は、図中のＢで示す方向の磁力線で表される磁場を発生する。磁場は、本体１０１の少なくとも一部およびセンサ部１０３を含む領域に形成される。磁場が形成された領域を本体１０１の反応部３ａ，３ｂが移動することによって、反応部３ａ，３ｂに磁気粒子が固定されている場合にはその量に応じて、形成された磁場に変化が生じる。
センサ部１０３は、磁場の変化によって例えば電気抵抗が変化する半導体素子である。センサ部１０３から出力される信号は、磁場の変化の程度に応じて変化し、アナログ信号処理部１０８にアナログ信号ａとして出力される。
【００３８】
アナログ信号処理部１０８は、増幅回路および微分型アナログフィルタを備えている。アナログ信号ａは、アナログ信号処理部１０８によって増幅処理とフィルタ処理される。微分型アナログフィルタは、磁気センサおよび回路部品の１／ｆノイズを除去するために使用されるフィルタであって、低周波数ノイズを除去している。微分型アナログフィルタの周波数特性は、磁気センサおよび回路部品のノイズ特性、高分子基材１０１の速度、出力される信号とノイズとの比から決定される。
【００３９】
アナログ信号処理部１０８によって処理されたアナログ信号ａは、アナログ信号処理部１０８からＡ／Ｄ変換素子１０９にアナログ信号ｂとして出力される。
Ａ／Ｄ変換素子１０９は、アナログ信号ｂを入力し、デジタル変換した後にデジタル信号ｃとしてデジタルフィルタ１１０に出力する。このようなＡ／Ｄ変換素子１０９は、Ａ／Ｄコンバータ等を用いることによって実現可能である。デジタル信号ｃは、Ａ／Ｄ変換素子１０９からデジタルフィルタ１１０へ出力される。
【００４０】
デジタルフィルタ１１０は、デジタル信号ｃのオフセットやオフセットドリフトなどを除去し、デジタル信号ｄとして出力する。デジタルフィルタ処理は、高速フーリエ変換によって実現可能であるが、このような手法によってなされる処理に限定されるものではない。
また、信号出力部１１１は、デジタル信号ｄのプラス信号またはマイナス信号のいずれか一方だけを出力する。
【００４１】
図５は、デジタル変換されるアナログ信号のプラス信号またはマイナス信号を説明するための模式図である。すなわち、この実施形態の磁気検出装置では、図５（ａ）および（ｂ）に示すように、アナログ信号の振幅ｅをデジタル化した信号（プラス信号）または振幅ｆをデジタル化した信号（マイナス信号）だけを検出信号として採用している。図５（ｃ）は、従来の信号の検出方法であって、信号のＰｅａｋ  ｔｏ  Ｐｅａｋを使って得たデジタル信号を検出値としている。図５（ｃ）に示した振幅ｇは、信号のプラス方向の振幅のみを示し、振幅ｈは、同じ信号のＰｅａｋ  ｔｏ  Ｐｅａｋであって従来の検出値とされていた値である。
【００４２】
この実施形態の磁気検出装置は、Ａ／Ｄ変換素子１０９におけるアナログデジタル変換の際に信号オフセットやドリフトが除去されて信号の０レベルが調整されることに着目して、０レベルを基準として表される信号のプラスまたはマイナスの一方だけを検出値としている。よって、信号のＰｅａｋ  ｔｏ  Ｐｅａｋで値を検出してデジタル変換する従来の磁気検出装置よりも、ノイズの影響が少ない正確なデジタル信号を検出値として得ることができる。
【００４３】
具体的には、磁気センサ１０６のセンサ部１０３として、インジウムアンチモンからなる化合物半導体を使用し、磁場発生源１０４として、サマリウムコバルトからなる永久磁石（磁場発生源の図中上面において約２０００エルステッド）を使用した。そして、磁気センサ１０６から出力されたアナログ信号を高インピーダンスアンプによって約２００万倍に増幅した。信号処理のための微分型アナログフィルタとしては、二次型のフィルタを用いた。このフィルタの低周波数領域における特性を図７に示す。
また、微分型アナログフィルタから出力されたアナログ信号をＡ／Ｄコンバータによりデジタル信号化し、デジタル信号の出力の際に高速フーリエ変換によりオフセット周波数を除去し、さらに逆フーリエ変換して出力した。
【００４４】
〔磁気粒子表面の抗体結合比率と磁気センサによる検出信号との関係を調べる実験〕
(A1)ビオチン濃度が異なる４種類の「磁気粒子−アビジン−ビオチン−ＢＳＡ」溶液の調製工程
先ず、２５０ｍｌのＰＢＳに、米国ピアース社製のビオチン化牛血清アルブミン（以下、「ビオチン化ＢＳＡ」と称する。）試薬「Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｕｒｅ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ」２５ｍｇを溶解し、濃度が１００μｇ／ｍｌのビオチン化ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）溶液を得た。また、この溶液をＰＢＳで希釈して、濃度が５０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、１２．５μｇ／ｍｌである各ビオチン化ＢＳＡ溶液を得た。このようにして、４種類の濃度のビオチン化ＢＳＡ溶液を調製した。
【００４５】
次に、ノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製の磁気ビーズ「Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅ
ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ」（直径１．０μｍ、超常磁性高分子ポリマービーズにストレプトアビジンを結合させたもの）を１％含有するＰＢＳ溶液を２００μｌずつ、４本のエッペンドルフチューブに入れた。各チューブに、各濃度のビオチン化ＢＳＡ溶液を３５８μｌ添加し、さらにＰＢＳを４２μｌ入れて全液量６００μｌとした後、室温で４時間攪拌しながら反応を行った。これにより、ビオチン濃度が異なる４種類の磁気ビーズ標識化ＢＳＡ（「磁気粒子−アビジン−ビオチン−ＢＳＡ」）溶液を得た。
【００４６】
この４種類の磁気ビーズ標識化ＢＳＡ液から、ノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製のＭＰＣ（磁石を用いた磁性粒子収集装置）を用いて、それぞれ磁気ビーズ標識化ＢＳＡのみを回収した。各回収された磁気ビーズ標識化ＢＳＡにＰＢＳを１ｍｌ添加して洗浄し、各液体から同じ方法でそれぞれ磁気ビーズ標識化ＢＳＡのみを回収した。最終的に、各磁気ビーズ標識化ＢＳＡを１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に入れて、磁気ビーズ標識化ＢＳＡの濃度を０．５％とした。これにより、含まれるビオチン濃度が異なる４種類の磁気ビーズ標識化ＢＳＡ（No. １〜No. ４の磁気ビーズ）分散液を得た。
【００４７】
(A2)磁気ビーズの未反応ストレプトアビジン量の測定
(A2-1)磁気ビーズ標識化ＢＳＡのＨＲＰ−Ｂｉｏｔｉｎ標識化
先ず、１．２５ｍｌのＰＢＳに、米国ピアース社製のビオチン化西洋わさび過酸化酵素（以下、「ビオチン化ＨＲＰ」と称する。）「Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｕｒｅ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ」試薬を５ｍｇ溶解して、濃度が４ｍｇ／ｍｌのビオチン化ＨＲＰ溶液を調製した。
【００４８】
次に、(A1)工程で得られた４種類の磁気ビーズ標識化ＢＳＡ分散液を４０μｌ、それぞれエッペンドルフチューブに入れた。また、前記磁気ビーズを１％含有するＰＢＳ溶液を２０μｌ、エッペンドルフチューブに入れた。
これらのエッペンドルフチューブをノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製のＭＰＣ（磁石を用いた磁性粒子収集装置）にかけて、上澄み液を除去することにより、それぞれ磁気ビーズ（磁気ビーズ標識化ＢＳＡ、ＢＳＡが結合されていない磁気ビーズ）を回収した。次に、各エッペンドルフチューブにＰＢＳを１００μｌ添加して洗浄し、各液体から同じ方法でそれぞれ磁気ビーズを回収した。最終的に、各エッペンドルフチューブ（４種類の磁気ビーズ標識化ＢＳＡがそれぞれ入った４本と、ＢＳＡが結合されていない磁気ビーズが入った１本の計５本）に、１％ＰＢＳを４２μｌ入れた。
【００４９】
次に、各エッペンドルフチューブに、前述のビオチン化ＨＲＰ溶液を４２μｌ入れ、さらにＰＢＳを１６μｌ入れて全液量を１００μｌにした後、室温で４時間攪拌しながら反応を行った。これにより、５本のエッペンドルフチューブに入っている各磁気ビーズ（磁気粒子−ストレプトアビジン−ビオチン化ＢＳＡまたは磁気粒子−ストレプトアビジン）について、ビオチン化ＢＳＡと結合していないアビジンに、ビオチン化ＨＲＰを結合させた。
次に、これらのエッペンドルフチューブに対して前記と同じ処理を行うことにより、磁気ビーズの回収と洗浄を行い、最終的に１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を入れて濃度０．５％とされた５種類の磁気ビーズ分散液を得た。
【００５０】
(A2-2)呈色反応による未反応ストレプトアビジン量の測定
得られた５種類の磁気ビーズ分散液４μｌにＰＢＳを２５０μｌ添加して希釈し、各希釈液を１００μｌずつ別の５本のエッペンドルフチューブに入れた。次に、これらのエッペンドルフチューブをノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製のＭＰＣにかけて、上澄み液を除去することにより、それぞれのエッペンドルフチューブに磁気ビーズを回収した。次に、これらのエッペンドルフチューブに、ＴＭＢ（3,3',5,5' -Tetra Methyl Benzidine ）ＫＩＴ（米国ＫＰＬ社製）を添加して３分間攪拌した後、１ｍｏｌｅ／ｌ硫酸（和光純薬社製）１００μｌを添加して呈色反応を停止させた。
【００５１】
次に、これらのエッペンドルフチューブをノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製のＭＰＣにかけて上澄みを１００μｌずつ採取して、９６穴のマイクロプレート（デンマーク国Ｎｕｎｃ社製）に入れ、米国Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製のマイクロプレートリーダー「ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ」により、波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。
そして、各測定値についてNo. ５の吸光度を「１００％」とした相対値を算出して、その値を呈色強度とした。その結果を下記の表１に示す。No. ５の磁気ビーズでは、全てのアビジンがビオチン化ＢＳＡと結合していないため、「未反応ストレプトアビジン量」は１００％である。よって、呈色強度の相対値は各磁気ビーズの「未反応ストレプトアビジン量」に相当する。
【００５２】
【表１】
0004694952.tif 000002
【００５３】
この結果より、ビオチン化ＢＳＡと結合していないストレプトアビジン量は、No. １の磁気ビーズでは１２％、No. ２では２０％、No. ３では７２％、No. ４では９０％であることが分かる。
(A3)磁気ビーズ標識化ＢＳＡ（磁気粒子−アビジン−ビオチン−ＢＳＡ）の「ビオチン−ＢＳＡ」が結合されていないアビジンに抗体Ａを結合させる工程
(A1)工程で得られた４種類の磁気ビーズ標識化ＢＳＡ分散液を４０μｌ、それぞれエッペンドルフチューブに入れた。このエッペンドルフチューブをノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製のＭＰＣにかけて、上澄み液を除去することにより、それぞれ磁気ビーズを回収した。次に、各エッペンドルフチューブにＰＢＳを２００μｌ添加して洗浄し、各液体から同じ方法でそれぞれ磁気ビーズを回収した。最終的に、各エッペンドルフチューブ（No. １〜４の磁気ビーズ標識化ＢＳＡがそれぞれ入った４本）に、ＰＢＳを４０μｌ入れた。
【００５４】
次に、これらのエッペンドルフチューブに、前記(1) 工程で得られた精製ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ化抗体Ａ（「ビオチン−ＰＥＧ−抗体Ａ」、抗体濃度７．９７ｍｇ／ｍｌ）を、１０．５μｌずつ添加し、さらにＰＢＳを４９．５μｌ入れて、全液量を１００μｌにした後、室温で４時間攪拌しながら反応を行った。これにより、４種類の磁気ビーズ標準化ＢＳＡ＆抗体Ａ（１個の磁気粒子にアビジン／ビオチン結合を介して「ＢＳＡ」と「ＰＥＧ−抗体Ａ」が結合されている粒子の集合体であって、「ＰＥＧ−抗体Ａ」の結合比率が１２％、２０％、７２％、９０％であるもの）分散液を得た。
【００５５】
各磁気ビーズ標準化ＢＳＡ＆抗体Ａ分散液から、ノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製のＭＰＣを用いて磁気ビーズ標準化ＢＳＡ＆抗体Ａのみを回収し、回収された磁気ビーズ標準化ＢＳＡ＆抗体ＡにＰＢＳを２００μｌ添加して洗浄し、この液体から同じ方法で磁気ビーズのみを回収した。最終的に、この磁気ビーズに、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を入れて、ビーズ含有率が０．５％で「ＰＥＧ−抗体Ａ」の結合比率が異なるNo. １〜No. ４の磁気ビーズ標準化ＢＳＡ＆抗体Ａ分散液を得た。
【００５６】
(A4)磁気ビーズ標識化ＢＳＡ（磁気粒子−アビジン−ビオチン−ＢＳＡ）の「ビオチン−ＢＳＡ」が結合されていないアビジンに抗体Ｂを結合させる工程
(A1)工程で得られた４種類の磁気ビーズ標識化ＢＳＡ分散液を４０μｌ、それぞれエッペンドルフチューブに入れた。このエッペンドルフチューブをノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製のＭＰＣにかけて、上澄み液を除去することにより、それぞれ磁気ビーズを回収した。次に、各エッペンドルフチューブにＰＢＳを２００μｌ添加して洗浄し、各液体から同じ方法でそれぞれ磁気ビーズを回収した。最終的に、各エッペンドルフチューブ（No. １〜４の磁気ビーズ標識化ＢＳＡがそれぞれ入った４本）に、ＰＢＳを４０μｌ入れた。
【００５７】
次に、これらのエッペンドルフチューブに、前記(2) 工程で得られた精製ＰＥＧ−ｂｉｏｔｉｎ化抗体Ｂ（「ビオチン−ＰＥＧ−抗体Ｂ」、抗体濃度３．５３ｍｇ／ｍｌ）を、１０．５μｌずつ添加し、さらにＰＢＳを４９．５μｌ入れて、全液量を１００μｌにした後、室温で４時間攪拌しながら反応を行った。これにより、４種類の磁気ビーズ標準化ＢＳＡ＆抗体Ｂ（１個の磁気粒子にアビジン／ビオチン結合を介して「ＢＳＡ」と「ＰＥＧ−抗体Ｂ」が結合されている粒子の集合体であって、「ＰＥＧ−抗体Ｂ」の結合比率が１２％、２０％、７２％、９０％であるもの）分散液を得た。
【００５８】
各磁気ビーズ標準化ＢＳＡ＆抗体Ｂ分散液から、ノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製のＭＰＣを用いて磁気ビーズ標準化ＢＳＡ＆抗体Ｂのみを回収し、回収された磁気ビーズ標準化ＢＳＡ＆抗体ＢにＰＢＳを２００μｌ添加して洗浄し、この液体から同じ方法で磁気ビーズのみを回収した。最終的に、この磁気ビーズに、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を入れて、ビーズ含有率が０．５％で「ＰＥＧ−抗体Ｂ」の結合比率が異なるNo. １〜No. ４の磁気ビーズ標準化ＢＳＡ＆抗体Ｂ分散液を得た。
【００５９】
(A5)平板への反応部（抗体Ａ用）の形成
先ず、前記(1) 工程で用意した抗体Ａを０．１Ｍの燐酸ナトリウムｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７）に１０μｇ／ｍｌ濃度になるよう溶解し、この溶液を５０μｌ、ポリスチレン製の平板（１ｃｍ×１ｃｍ×厚さ１ｍｍ）上に滴下した。次に、この平板を室温・湿潤箱に入れて１時間保持することにより、ポリスチレン平板の上に抗体Ａを固定した。
【００６０】
次に、蒸留水で、この平板の表面（抗体Ａが固定された側の面）を洗浄した後、牛血清アルブミンを０．１Ｍの燐酸ナトリウムｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７）に溶解させた１％溶液を５０μｌ、ポリスチレン平板上の抗体Ａ溶液を滴下した位置と同じ位置に滴下した。次に、この平板を室温・湿潤箱に入れて１時間保持した。これにより、ポリスチレン平板上の抗体Ａ溶液が滴下された位置の抗体Ａが固定されなかった部分に、牛血清アルブミンを固定した。
次に、蒸留水で各平板の表面（抗体Ａおよび牛血清アルブミンが固定された側の面）を洗浄し、１０分間ドラフト内で風乾した。
このようにして、ポリスチレン平板の表面に反応部（抗体Ａおよび牛血清アルブミンが固定された部分）を形成した。同様にして、反応部が形成された８枚の平板１Ａ〜８Ａを用意した。
【００６１】
(A6)反応部への抗原および磁気ビーズ標識化ＢＳＡ＆抗体Ａの結合
８枚のうちの４枚の平板１Ａ〜４Ａには、インフルエンザＡウィルス（Ａ／北九州／１５９／９３、１０７．７５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）の生理食塩水による２倍希釈液を、残りの４枚の平板５Ａ〜８Ａには生理食塩水を、反応部にそれぞれ２０μｌ滴下して、室温にて１０分間反応させた。
次に、各平板の表面を蒸留水にて洗浄し、ペーパーパッドにて軽く水分をふき取った。これにより、４枚の平板１Ａ〜４Ａについては、平板の表面に固定された抗体Ａ上にインフルエンザＡウィルス（抗原）が捕捉された。
【００６２】
次に、４枚の平板１Ａ〜４Ａの反応部に、(A3)工程で得られた「磁気ビーズ標準化ＢＳＡ＆抗体Ａ分散液No. １〜No. ４」をそれぞれ１０μｌ滴下し、室温にて１０分間反応させた。また、４枚の平板５Ａ〜８Ａの反応部に、(A3)工程で得られた「磁気ビーズ標準化ＢＳＡ＆抗体Ａ分散液No. １〜No. ４」をそれぞれ１０μｌ滴下し、室温にて１０分間反応させた。この反応により、インフルエンザＡウィルス（抗原）が捕捉された反応部では、抗原抗体反応が生じて、抗原の上に磁気ビーズ標準化ＢＳＡ＆抗体Ａが結合される。
【００６３】
(A7)平板への反応部（抗体Ｂ用）の形成
先ず、前記(1) 工程で用意した抗体Ｂを０．１Ｍの燐酸ナトリウムｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７）に１０μｇ／ｍｌ濃度になるよう溶解し、この溶液を５０μｌ、ポリスチレン製の平板（１ｃｍ×１ｃｍ×厚さ１ｍｍ）上に滴下した。次に、この平板を室温・湿潤箱に入れて１時間保持することにより、ポリスチレン平板の上に抗体Ｂを固定した。
【００６４】
次に、蒸留水で、この平板の表面（抗体Ｂが固定された側の面）を洗浄した後、牛血清アルブミンを０．１Ｍの燐酸ナトリウムｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７）に溶解させた１％溶液を５０μｌ、ポリスチレン平板上の抗体Ｂ溶液を滴下した位置と同じ位置に滴下した。次に、この平板を室温・湿潤箱に入れて１時間保持した。これにより、ポリスチレン平板上の抗体Ｂ溶液が滴下された位置の抗体Ｂが固定されなかった部分に、牛血清アルブミンを固定した。
【００６５】
次に、蒸留水で各平板の表面（抗体Ｂおよび牛血清アルブミンが固定された側の面）を洗浄し、１０分間ドラフト内で風乾した。
このようにして、ポリスチレン平板の表面に反応部（抗体Ｂおよび牛血清アルブミンが固定された部分）を形成した。同様にして、反応部が形成された８枚の平板１Ｂ〜８Ｂを用意した。
【００６６】
(A8)反応部への抗原および磁気ビーズ標識化ＢＳＡ＆抗体Ｂの結合
８枚のうちの４枚の平板１Ｂ〜４Ｂには、インフルエンザＢウィルス（Ｂ／門真／５０６／９９、１０７．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）の生理食塩水による１０倍希釈液を、残りの４枚の平板５Ｂ〜８Ｂには生理食塩水を、反応部にそれぞれ２０μｌ滴下して、室温にて１０分間反応させた。
次に、各平板の表面を蒸留水にて洗浄し、ペーパーパッドにて軽く水分をふき取った。これにより、４枚の平板１Ｂ〜４Ｂについては、平板の表面に固定された抗体Ｂ上にインフルエンザＢウィルス（抗原）が捕捉された。
【００６７】
次に、４枚の平板１Ｂ〜４Ｂの反応部に、(A4)工程で得られた「磁気ビーズ標準化ＢＳＡ＆抗体Ｂ分散液No. １〜No. ４」をそれぞれ１０μｌ滴下し、室温にて１０分間反応させた。また、４枚の平板５Ｂ〜８Ｂの反応部に、(A4)工程で得られた「磁気ビーズ標準化ＢＳＡ＆抗体Ｂ分散液No. １〜No. ４」をそれぞれ１０μｌ滴下し、室温にて１０分間反応させた。この反応により、インフルエンザＢウィルス（抗原）が捕捉された反応部では、抗原抗体反応が生じて、抗原の上に磁気ビーズ標準化ＢＳＡ＆抗体Ｂが結合される。
【００６８】
(A9)磁気ビーズの検出
(A6)工程後の平板１Ａ〜８Ａおよび(A8)工程後の平板１Ｂ〜８Ｂの表面を、反応部に結合された磁気ビーズが剥がれないように蒸留水で洗浄し、風乾した。
次に、各平板の反応部を、斜めからの散乱光の存在下、ＣＣＤカメラで１０倍に拡大して観察し、磁気ビーズが存在しているかどうかを調べた。
また、図４の磁気検出装置を用いて、各平板の反応部の下側に磁気センサ１０６を配置し、反応部に存在する磁気ビーズの量を示す出力信号を検出した。
これらの結果を表２〜５に示す。
【００６９】
【表２】
0004694952.tif 000003
【００７０】
【表３】
0004694952.tif 000004
【００７１】
【表４】
0004694952.tif 000005
【００７２】
【表５】
0004694952.tif 000006
【００７３】
この結果から、磁気ビーズ標準化ＢＳＡ＆抗体Ａ（１個の磁気粒子にアビジン／ビオチン結合を介して「ＢＳＡ」と「ＰＥＧ−抗体Ａ」が結合されている粒子の集合体）であって、「ＰＥＧ−抗体Ａ」の結合比率が１２％、２０％、７２％、９０％であるものは、同じ抗体Ａが固定された反応部に抗原Ａ（抗体Ａと特異的に結合する抗原）が捕捉されている場合、この抗原Ａと結合してＣＣＤカメラにより磁気ビーズの存在が確認でき、図４の磁気検出装置により磁気信号が検出できることが分かる。
【００７４】
同様に、磁気ビーズ標準化ＢＳＡ＆抗体Ｂ（１個の磁気粒子にアビジン／ビオチン結合を介して「ＢＳＡ」と「ＰＥＧ−抗体Ｂ」が結合されている粒子の集合体）であって、「ＰＥＧ−抗体Ｂ」の結合比率が１２％、２０％、７２％、９０％であるものは、同じ抗体Ｂが固定された反応部に抗原Ｂ（抗体Ｂと特異的に結合する抗原）が捕捉されている場合、この抗原Ｂと結合してＣＣＤカメラにより磁気ビーズの存在が確認でき、図４の磁気検出装置により磁気信号が検出できることが分かる。
【実施例】
【００７５】
実施形態の分析装置を用いて、実際の分析を行った例を以下に示す。
底板６の厚さは、第１多孔体１および第２多孔体２を固定する部分の厚さを１．０ｍｍとし、反応部形成面３０の部分の厚さを０．２ｍｍとし、吸収体４を固定する部分の厚さを１．５ｍｍとした。また、第１多孔体１の大きさは１２ｍｍ×８ｍｍ×厚さ２ｍｍ、第２多孔体２の大きさは１２ｍｍ×５ｍｍ×厚さ２ｍｍ、吸収体４の大きさは１２ｍｍ×１１ｍｍ×厚さ２ｍｍとした。
【００７６】
第１のサンプルを以下の方法で調製した。インフルエンザＡウィルス（Ａ／北九州／１５９／９３、１０７．７５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を生理食塩水により２０倍に希釈し、この希釈液１０μｌに、界面活性剤「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００」を１．０％含有する生理食塩水を１９０μｌ添加した。
このようにして得られた２００μｌの液状試料（第１のサンプル）を、分析装置の本体１０１の試料導入口７１に滴下した。
【００７７】
滴下された液状試料は、第１多孔体１に吸収された後、毛細管現象で横方向に移動して第２多孔体２に入り、流路２３２を通って流路３１に入り、反応部３ａ，３ｂの両方に接触してから、流路３４２を通って吸収体４に吸収された。
ここで、第２多孔体２には、前述のように、磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ＆Ａが湿潤状態で移動可能に保持されている。この磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ＆Ａは、１個の磁気粒子にアビジン／ビオチン結合を介して「ＰＥＧ−抗体Ａ」と「ＰＥＧ−抗体Ｂ」が結合されている粒子の集合体であって、「ＰＥＧ−抗体Ａ」の結合比率が約７０％で「ＰＥＧ−抗体Ｂ」の結合比率が約３０％である。
【００７８】
よって、第２多孔体２で、液状試料に含まれているインフルエンザＡウィルス（抗原Ａ）と磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ＆Ａの抗体Ａが結合する。次いで、この液状試料は第２多孔体２から流路２３２に移動し、この液状試料が反応部３ａ，３ｂの流路３１を移動する間に、この結合体のインフルエンザＡウィルス（抗原Ａ）が反応部３ａの抗体Ａと結合して、反応部３ａに磁気ビーズの凝集が生じる。
【００７９】
この装置の板材６はポリカーボネート製であるため、板材６から箱体内の状態を見ることができるが、図１のＢ方向からの目視で、この磁気ビーズの凝集が反応部３ａでは確認され、反応部３ｂでは確認されなかった。また、図４の磁気検出装置を用いて、反応部３ａ，３ｂに存在する磁気ビーズの量を示す出力信号を検出した。その結果、反応部３ａの出力信号値は３０４ｍＶであり、反応部３ｂの出力信号値は５９ｍＶであった。
【００８０】
第２のサンプルを以下の方法で調製した。インフルエンザＢウィルス（Ｂ／門真／５０６／９９、１０７．０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を生理食塩水により１００倍に希釈し、この希釈液１０μｌに、界面活性剤「Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００」を１．０％含有する生理食塩水を１９０μｌ添加した。
このようにして得られた２００μｌの液状試料（第２のサンプル）を、分析装置の本体１０１の試料導入口７１に滴下した。
【００８１】
滴下された液状試料は、第１多孔体１に吸収された後、毛細管現象で横方向に移動して第２多孔体２に入り、流路２３２を通って流路３１に入り、反応部３ａ，３ｂの両方に接触してから、流路３４２を通って吸収体４に吸収された。
ここで、第２多孔体２には、前述のように、磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ＆Ａが湿潤状態で移動可能に保持されている。この磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ＆Ａは、１個の磁気粒子にアビジン／ビオチン結合を介して「ＰＥＧ−抗体Ａ」と「ＰＥＧ−抗体Ｂ」が結合されている粒子の集合体であって、「ＰＥＧ−抗体Ａ」の結合比率が約７０％で「ＰＥＧ−抗体Ｂ」の結合比率が約３０％である。
【００８２】
よって、第２多孔体２で、液状試料に含まれているインフルエンザＢウィルス（抗原Ｂ）と磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ＆Ａの抗体Ｂが結合する。次いで、この液状試料は第２多孔体２から流路２３２に移動し、この液状試料が反応部３ａ，３ｂの流路３１を移動する間に、この結合体のインフルエンザＢウィルス（抗原Ｂ）が反応部３ｂの抗体Ｂと結合して、反応部３ｂに磁気ビーズの凝集が生じる。
【００８３】
この装置の板材６はポリカーボネート製であるため、板材６から箱体内の状態を見ることができるが、図１のＢ方向からの目視で、この磁気ビーズの凝集が反応部３ｂでは確認され、反応部３ａでは確認されなかった。また、図４の磁気検出装置を用いて、反応部３ａ，３ｂに存在する磁気ビーズの量を示す出力信号を検出した。その結果、反応部３ａの出力信号値は９９ｍＶであり、反応部３ｂの出力信号値は１６４ｍＶであった。
【００８４】
第３のサンプルとして生理食塩水を用意し、２００μｌの生理食塩水からなる液状試料（第３のサンプル）を、分析装置の本体１０１の試料導入口７１に滴下した。
滴下された液状試料は、第１多孔体１に吸収された後、毛細管現象で横方向に移動して第２多孔体２に入り、流路２３２を通って流路３１に入り、反応部３ａ，３ｂの両方に接触してから、流路３４２を通って吸収体４に吸収された。
【００８５】
しかし、この液状試料には抗原Ａ，Ｂのいずれもが含まれていないため、液状試料が磁気ビーズとともに第２多孔体２から流路２３２に出て反応部３ａ，３ｂの流路３１を移動する間に、前述の第１および第２のサンプルの場合のような結合が生じない。よって、図１のＢ方向からの目視で、磁気ビーズの凝集が反応部３ａ，３ｂの両方で確認されなかった。
また、図４の磁気検出装置を用いて、反応部３ａ，３ｂに存在する磁気ビーズの量を示す出力信号を検出した。その結果、反応部３ａの出力信号値は８０ｍＶであり、反応部３ｂの出力信号値は４５ｍＶであった。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】実施形態の分析装置を示す図であって、本体の縦断面図である。
【図２】図１の本体の組立前の状態を示す斜視図である。
【図３】第１多孔体、第２多孔体、反応部、および吸収体の、箱体内での配置を示す斜視図である。
【図４】実施形態で使用した磁気検出装置を示す概略構成図である。
【図５】図４の磁気検出装置による信号処理を説明するための模式図である。
【図６】第２の状態の磁気粒子（磁気ビーズ標識化二次抗体Ｂ＆Ａ）を示す図である。
【図７】実施形態で使用した微分型アナログフィルタの低周波数領域における特性を示すグラフである。
【符号の説明】
【００８７】
１  第１多孔体
１０  第１多孔体を固定する部分
１０Ａ  凹部
２  第２多孔体
２０  第２多孔体を固定する部分
２０Ａ  凹部
２３１  流路形成部材
２３２  溝状の流路
３Ａ，３ｂ  反応部
３０  反応部を形成する部分（反応部形成面）
３０Ａ  凹部
３１  反応部上部の流路
３４１  流路形成部材
３４２  溝状の流路
４  吸収体
４０  吸収体を固定する部分
５０  底板の内面で最も低い面
６  箱体の底板
６７  ピン
７  箱体の蓋部
７１  試料導入口
７２  流路形成部
７６  ピン受け
６Ａ  底板内面の周縁部と同じ高さの面
１０１  本体
１２  台
１２ａ  開口部
１０２  モータ
１０３  センサ部
１０４  静磁場発生部
１０５  基体
１０６  磁気センサ
１０８  アナログ信号処理部
１０９  Ａ／Ｄ変換素子
１１０  デジタルフィルタ
１１１  信号出力部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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