(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１０個以内のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
下記の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１０個以内のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
下記の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡである請求項２に記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６８〜５９２からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６８〜５９２からなるＤＮＡと、９０％以上の相同性を有する２つのＤＮＡ同士がハイブリダイズするが、それより相同性の低い２つの核酸同士がハイブリダイズしない、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項４】
請求項２又は３に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項２又は３に記載のＤＮＡ、又は請求項４に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換植物細胞。
【請求項６】
請求項２又は３に記載のＤＮＡ、又は請求項４に記載の組換えベクターで形質転換された形質転換植物。
【請求項７】
請求項６に記載の形質転換植物から得られる種子。
【請求項８】
請求項２又は３に記載のＤＮＡ、又は請求項４に記載の組換えベクターで形質転換され、前記ＤＮＡ又は組換えベクターに含まれる前記ＤＮＡが発現することにより、除草剤耐性を示す除草剤耐性植物体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、除草剤耐性遺伝子及びその利用に関し、詳細には除草剤耐性に関与するタンパク質、及びそれをコードする新規な遺伝子に関する。さらには、該遺伝子により形質転換された植物細胞、植物体および種子に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子工学的技術を用いて除草剤の影響を受けない除草剤耐性植物が開発されてきている。除草剤ホスフィノスリシン（PPT）は、非選択性の除草剤として利用されており、その作用機序としては、PPTが植物体に吸収された後、PPTによってグルタミン合成酵素が阻害され、植物体に有害なNH3が蓄積することにより植物が枯死することが知られている。【０００３】
PPTに対する耐性に関与する遺伝子として、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が知られており、当該遺伝子産物は酵素反応によりPPTをアセチル化することにより除草効果を不活化することが知られている。【０００４】
PPT耐性遺伝子としては、
（１）ストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）から取得されたホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（特許文献１、２、３、非特許文献１）、
（２）ストレプトミセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）から取得されたホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（非特許文献２、３）、
（３）放線菌ＡＢ２２５３株から取得されたホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（特許文献４）、
（４）ストレプトミセス・コエリカラー（Stereptomyces coelicolor）から取得されたホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（非特許文献４）、
（５）大腸菌（Escherichia coli）から取得されたホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（NCBI  No.7427901）、
（６）アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）から取得されたホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（NCBI  No.17739287）、
（７）バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）から取得されたホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（NCBI No.2636181）、
などが知られている。
【特許文献１】特開昭６３−７１１８３号公報
【特許文献２】特許第３０６２１２５号公報
【特許文献３】特開平９−１０７９８１号公報
【特許文献４】特許第２５３９９０１号公報
【非特許文献１】「ジーン（Gene）」、１９８８年、６３巻、６５〜７４頁
【非特許文献２】「モレキュラー  ジェネラル  ジェネティックス（Molecular  General  Genetics）」、１９８６年、２０５巻、４２〜５０頁
【非特許文献３】「ザ  エンボ  ジャーナル（The  EMBO  Journal）」１９８７年、６巻、２５１９〜２５２３頁
【非特許文献４】「ジーン（Gene）」、１９９１年、１０４巻、３９〜４５頁
【発明の開示】
【０００５】
本発明の課題は、新規な除草剤耐性遺伝子を提供することであり、また該遺伝子でコードされるタンパク質を提供することにある。
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意努力した。そして後述される除草剤ホスフィノスリシン（PPT）に対する耐性遺伝子および該遺伝子が導入されて除草剤耐性が増強された形質転換体を構築することに成功した。すなわち、本発明の要旨とするところは、以下のとおりである。
（１）下記の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、除草剤耐性活性を有するタンパク質。
（２）下記の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、除草剤耐性活性を有するタンパク質。
（３）下記の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡである前記ＤＮＡ。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６８〜５９２からなるＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６８〜５９２からなるＤＮＡまたは同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
（４）前記ＤＮＡを含む組換えベクター。
（５）前記ＤＮＡ、又は前記組換えベクターで形質転換された形質転換植物細胞。
（６）前記ＤＮＡ、又は前記組換えベクターで形質転換された形質転換植物。
（７）前記形質転換植物から得られる種子。
（８）前記ＤＮＡ、又は前記組換えベクターで形質転換され、前記ＤＮＡ又は組換えベクターに含まれる前記ＤＮＡが発現することにより、除草剤耐性を示す除草剤耐性植物体。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の除草剤耐性遺伝子を内部に保有するDNA鎖を含有するストレプトミセス・エスピーＡＢ３５３４株由来５．７ｋｂＢｇｌＩＩ断片の制限酵素地図。
【図２】本発明の除草剤耐性遺伝子が導入された組換えイネ植物体（Ａ）および対照の非組換え体「日本晴」植物体（Ｂ）にバスタ（ＰＰＴ１８．５％含有）液剤（バイエルクロップサイエンス社製）の２００倍希釈液（雑草生育期処理濃度）を散布した２ヵ月後の生育状況を示す図（写真）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のタンパク質は、下記の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質である。
（Ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質。
（Ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ、除草剤耐性活性を有するタンパク質。【０００９】
配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質は、ストレプトミセス・エスピー．（Streptomyces sp.）ＡＢ３５３４と命名された放線菌菌株から、除草剤耐性に関与する遺伝子として取得された遺伝子がコードするタンパク質である。【００１０】
一般に、特定の機能や生理活性を有するタンパクをコードするアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加が生じた場合であっても、その機能や生理活性が維持される場合があることは当業者において広く認識されているところである。本発明には、このような修飾が加えられ、かつ除草剤耐性活性を有するタンパク質も含まれる。すなわち、配列表の配列番号２において、１若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつ除草剤耐性活性を有するタンパク質も、本発明の範囲に含まれるものである。そのような改変されたタンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡに、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されるように変異を導入することによって、取得することができる。【００１１】
前記「複数」としては、好ましくは２〜２５個、より好ましくは２〜１０個、特に好ましくは２〜５個である。あるいは、前記「複数」は、配列番号２のアミノ酸配列との相同性が、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上となるような値である。【００１２】
本発明のタンパク質は、以下に説明する本発明のＤＮＡを、適当な宿主で発現させることにより製造することができる。前記宿主としては、大腸菌、枯草菌などの細菌、酵母、昆虫培養細胞、動物培養細胞、植物培養細胞等が挙げられる。宿主細胞内で機能するプロモーター等の発現調節配列の下流に発現可能に連結された本発明のタンパク質をコードする本発明ＤＮＡを、宿主細胞に導入することにより宿主細胞を形質転換させる。このような形質転換は、本発明のＤＮＡをプラスミドに連結して組換えプラスミドを構築し、そして、その得られた組換えプラスミドを宿主に導入することによって行うことができる。あるいは、相同組換え等によって本発明ＤＮＡを宿主内の染色体ＤＮＡに組込むことによって宿主を形質転換することもできる。得られる形質転換細胞を、前記プロモーター発現調節配列が機能する条件で培養することによって、本発明のタンパク質が産生される。【００１３】
本発明のＤＮＡは、前記本発明のタンパク質（Ａ）又は（Ｂ）をコードするＤＮＡである。タンパク質（Ａ）をコードするＤＮＡとして、配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６８〜５９２からなるＤＮＡが挙げられる。【００１４】
また、タンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡとしては、配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号６８〜５９２からなるＤＮＡまたは同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが挙げられる。ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。具体的に、相同性が高い２つの核酸同志、例えば７０％以上、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、特に好ましくは９５％以上の相同性を有する２つのＤＮＡ同志がハイブリダイズするが、それより相同性の低い２つの核酸同志がハイブリダイズしないという条件が挙げられる。より具体的には、例えば６８℃のハイブリダイゼーション溶液（５００ｍＭ  ＮａＰｉバッファー（ｐＨ７．２）、７％  ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中において、核酸同士がハイブリダイズする条件が挙げられる。【００１５】
上記ような、タンパク質（Ｂ）をコードするＤＮＡは、タンパク質（Ａ）をコードするＤＮＡまたはこれを含有する細胞に対して変異処理を行い、その後に、変異したＤＮＡまたはこれを含む細胞から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基番号６８〜５９２塩基配列を有するＤＮＡに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを選択的に分離することによっても、取得することができる。【００１６】
タンパク質（Ａ）をコードするＤＮＡは、本発明を完成する過程においては、後記実施例に示すように、ビアラホスを含む選択培地に放線菌を接種し、生育可能な菌株として選択されたストレプトミセス属に属する菌株から単離されたものである。尚、ビアラホスは、細胞内に取り込まれた後、加水分解を受け活性体PPTに変換される。上記菌株は、ストレプトミセス・エスピー．（Streptomyces sp.）ＡＢ３５３４と命名され、２００４年１０月２６日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０２７３として寄託され、２００５年１０月５日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４３０が付与されている。【００１７】
タンパク質（Ａ）をコードするＤＮＡは、上記ストレプトミセス・エスピー．ＡＢ３５３４株又は同株と近縁の放線菌の染色体ＤＮＡから、配列番号１に示す塩基配列に基づいて調製されたオリゴヌクレオチドをプライマー又はプローブとするＰＣＲ又はハイブリダイゼーションによって、単離することができる。【００１８】
本発明のＤＮＡを保持する大腸菌の形質転換株は、非形質転換株が生育できない濃度のビアラホスを含む培地で生育することができる。【００１９】
タンパク質（Ａ）をコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＵＣ１８−Ｂ２で形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９は、エシェリヒア・コリＪＭ１０９/ｐＵＣ１８−Ｂ２と命名され、２００４年１０月２６日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−２０２７２として寄託され、２００５年１０月５日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０４２９が付与されている。【００２０】
本発明のＤＮＡ又はこれを含む組換えベクターを、本発明のＤＮＡが発現可能な形態で植物細胞に導入することにより、同植物細胞又はこの細胞から再生させた植物体に除草剤に対する耐性を付与することができる。【００２１】
植物細胞への本発明のＤＮＡの導入は、既に確立されている公知の方法（「細胞工学別冊、モデル実験のプロトコール、イネ・シロイヌナズナ編」１９９６年、７８〜８１頁、秀潤社発行）により行うことができ、例えばアグロバクテリウム法、ウイスカ導入法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法が挙げられる。【００２２】
また、本発明のＤＮＡを植物細胞内で発現させるためのプロモーターとしては、植物細胞において発現するものであればよく、ユビキチンプロモーター（「プラント  モレキュラ  バイオロジー（Plant Molecular Biology）」１９９２年、第１８巻、６７５〜６８９）、CaMV３５Sプロモーター（「ザ  エンボ  ジャーナル（Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ．）」、第６巻、３９０１〜３９０７頁、（１９８７年））などが挙げられる。また、植物細胞内で機能するプロモーターを含むプラスミドとしてば、例えばpUBA（「プラント  モレキュラ  バイオロジー（Plant Molecular Biology）」１９９２年、１８巻、６７５〜６８９）やpIG121Hm（「プラント  セル  フィジオロジー（Plant Cell Phisiology）」１９９０年、第３１巻、８０５〜８１３）等が知られている。本発明のＤＮＡを発現させるためのプロモーターは、構成的なプロモーターであってもよく、誘導可能なプロモーターであってもよい。【００２３】
なお、本発明が適用できる植物として、例えばイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、芝草、その他の単子葉植物、または、ダイズ、ワタ、ナタネ、ジャガイモ、テンサイ、シロイヌナズナ、タバコ、トマト、ハクサイ、キュウリなどの双子葉植物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。植物細胞から植物体への再生は、公知の方法によって行うことができる（「プラント  ジャーナル（Plant Journal）」１９９４年、第６巻、２７１〜２８２）。【００２４】
遺伝子導入後の細胞を、ビアラホスまたはＰＰＴを含んだ培地上で一定期間培養することにより、形質転換細胞のみを選抜することが可能である。また、選抜された細胞からは、ビアラホスまたはＰＰＴを含んだ培地上で一定期間培養することにより、除草剤耐性を有する植物体を再生させることが可能である。【００２５】
上記のように得られる本発明のＤＮＡを保持する植物体から種子を採取することにより、本発明のＤＮＡを保持する植物種子が得られる。
【実施例】
【００２６】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
〔実施例１〕除草剤耐性遺伝子のクローニング
（１）除草剤耐性菌のスクリーニング
ビアラホスを添加した選択培地に、出願人が保存する放線菌約５００株を接種し、２７℃で７日間培養した後、各菌の生育状態を調査した。前記選択培地は、グルコース １％、Ｌ−アスパラギン ０．２％、ＮａＣｌ ０．０３％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、微量元素溶液０．５％（Ｖ／Ｖ）（水１Ｌ中にＺｎＣｌ2 ４０ｍｇ、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ ２００ｍｇ、ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ １００ｍｇを含む）、バクトアガー１．８％からなる組成の培地に、ビアラホスを５０ｍｇ／ｌになるように加えた培地２０ｍｌを、直径９ｃｍのプラスチックシャーレに入れ、固化させた寒天培地である。【００２７】
その結果、選択培地上で生育の可能な菌株としてＡＢ３５３４株を選別した。本スクリーニングにより得られたＡＢ３５３４株の分類学的性質は下記のとおりである。なお、実験方法は「放線菌の分類と同定」（日本学会事務センター、２００１年）に従った。【００２８】
（ａ）菌体分析
全菌体加水分解物中のジアミノピメリン酸はＬＬ型であった。【００２９】
（ｂ）１６ＳｒＲＮＡ遺伝子解析
16SリボゾームRNAの塩基配列の相同性は、配列番号３に示す配列を有するプライマーを用いて、５８６塩基の配列を決定し、ＤＮＡデータベースに登録された公知菌株のデータと比較した。この結果、本菌株の塩基配列は以下に示したとおりストレプトミセス属放線菌の１６ＳｒＲＮＡと高い相同性を示した。【００３０】
【表１】
0004823919.tif 000002
【００３１】
以上の結果から、本菌株は、放線菌ストレプトミセス属に属する一菌株と同定した。この放線菌ＡＢ３５３４株は、ストレプトミセス・エスピー．(Streptomyces sp.)ＡＢ３５３４と命名した。【００３２】
（２）ハイブリッドプラスミドの作製
ストレプトミセス・エスピーＡＢ３５３４を、ＴＲＹＰＴＩＣ  ＳＯＹ  ＢＲＯＴＨ（ＤＩＦＣＯ社製）１００ｍｌを分注した５００ｍｌ容坂口フラスコにて２７℃で３日間培養した。培養液を６０００回転／分で、１５分間遠心分離して菌体を集めた後、凍結乾燥し乳鉢で粉砕した。粉砕した菌体から、ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）にて全ＤＮＡを抽出した。このようにして得たＤＮＡ５μｇを制限酵素ＢｇｌＩＩ ２０単位で３７℃で２時間処理してＤＮＡフラグメントを得た。一方、ストレプトミセス・リビダンス３１３１（ＡＴＣＣ３５２８７）の菌体より抽出精製したプラスミドｐＩＪ７０３のＤＮＡ１μｇを、同様にＢｇｌＩＩで切断した。この両者のフラグメントを、ジーンクリーン（Ｂｉｏ１０１社製）にて精製した後、Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ社製）を用いて、１６℃で３時間反応させた。このようにしてプラスミドｐＩＪ７０３のＢｇｌＩＩ切断ＤＮＡフラグメントに、ストレプトミセス・エスピーＡＢ３５３４の全ＤＮＡのＢｇｌＩＩ切断フラグメントを組み込んだ各種のハイブリッドプラスミドの混合物を得た。【００３３】
（３）除草剤耐性遺伝子の検出とクローニング
上記のようにして得たハイブリッドプラスミド混合物を用い、ストレプトミセス・リビダンスのプロトプラストを形質転換した。プロトプラストを再生後、ビアラホス１０ｍｇ／Ｌを添加した選択培地上で、ビアラホス耐性となった形質転換株を選別した。なお、宿主として用いたストレプトミセス・リビダンスは、ストレプトミセス・リビダンス３１３１から、プロトプラスト化及び再生によりプラスミドｐＩＪ７０３を除去した菌株である。ストレプトミセス・リビダンス３１３１は、昭和６０年に国立予防衛生研究所抗生物質部より入手したものである（「ザ  ジャーナル  オブ  アンチバイオティクス（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）」１９８５年、第３８巻、３９０〜４００頁）。【００３４】
形質転換に用いたストレプトミセス・リビダンスの上記プロトプラストの調製は、下記の通り行った。ストレプトミセス・リビダンスを、グルコース １％、ポリペプトン（ＤＩＦＣＯ社製） ０．４％、イーストエキストラクト（ＤＩＦＣＯ社製） ０．４％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．１％、グリシン ０．０５％よりなる組成の培地２５ｍｌに接種し、長さ１．５ｃｍ、直径１ｃｍのステンレス製スプリングとともに１００ｍｌ容の坂口フラスコに入れて、２７℃で２日間培養した。この培養液２ｍｌを、グルコース １％、イーストエキストラクト（ＤＩＦＣＯ社製） ０．３％、バクトペプトン（ＤＩＦＣＯ社製） ０．５％、マルトエキストラクト（ＤＩＦＣＯ社製） ０．３％、ショ糖 ３４％、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．１％、グリシン ０．５％よりなる組成の培地１００ｍｌの入った５００ｍｌ容坂口フラスコに加え、さらに２７℃で２日間培養した。その培養液５ｍｌより８０００回転／分で１０分間遠心分離して菌体を集め、０．５Ｍショ糖溶液で洗浄した後、７０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、５ｍＭ ＣａＣｌ2、０．４Ｍ ショ糖、２５ｍＭ Ｇｏｏｄ’ＴＥＳバッファー（ｐＨ７．２）よりなる組成の緩衝液４ｍｌに懸濁した。【００３５】
上記細胞懸濁液に、４０ｍｇ／ｍｌ卵白リゾチーム溶液を１００μｌ加え、３０℃で９０分間保温してプロトプラストを得た。プロトプラスト化しない菌体を綿ろ過で除き、３５００回転／分、１０分間の遠心分離により、プロトプラストを集めた。集めたプロトプラストを７０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2、２０ｍＭ ＣａＣｌ2、０．４Ｍ ショ糖、２５ｍＭ Ｇｏｏｄ’ＴＥＳバッファー（ｐＨ７．２）よりなる組成の緩衝液（ＰＷＰ緩衝液）で１回洗浄後、同緩衝液に約１×１０9個／ｍｌとなるように懸濁した。【００３６】
上記のプロトプラスト懸濁液２５０μｌに、前記（１）項で得たハイブリッドプラスミド混合物の溶液５０μｌと４０％ポリエチレングリコール４０００（和光純薬社製）溶液３００μｌを加えて、氷中で２分間放置した後、前記のＰＷＰ緩衝液を９００μｌを加えてポリエチレングリコールの濃度を下げた。この混合液を、直径９ｃｍのプラスチックシャーレに分注し固化させた寒天培地（グルコース １％、ＫＣｌ ０．０５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．０１％、ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．２％、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．０７％、ポリペプトン（ＤＩＦＣＯ社製） ０．１％、イーストエキストラクト（ＤＩＦＣＯ社製） ０．４％、微量元素溶液 ０．０５％（Ｖ／Ｖ）、２５ｍＭＧｏｏｄ’ＴＥＳバッファー（ｐＨ７．２）、バクトアガー（ＤＩＦＣＯ社製）） １．８％に、１５０μｌずつ塗布して、２７℃で１０日間培養し、プロトプラストの再生および気中菌糸の形成を行った。なお上記微量元素溶液は、水１Ｌ中にＺｎＣｌ2 ４０ｍｇ、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ ２００ｍｇ、ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ、ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ、（ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ２０ｍｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ １００ｍｇを含む水溶液である。【００３７】
再生した菌層を、グルコース １％、Ｌ−アスパラギン ０．２％、ＮａＣｌ ０．０３％、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、Ｋ2ＨＰＯ4 ０．０５％および上記微量元素溶液０．５％（Ｖ／Ｖ）、バクトアガー １．８％よりなる組成物にチオストレプトンおよびビアラホスをともに１０ｍｇ／Ｌになるように加えて調製した選択培地にレプリカし、２７℃、３日間培養を行い、生育のよいクローンの２株を選択した。【００３８】
得られた２株のビアラホス耐性株より、公知の方法（「カレント  トピックス  イン  マイクロバイオロジー  アンド  イムノロジー（ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」１９８２年、９６巻、６９頁）にならってプラスミドを抽出した。その結果、この２株は、同じ分子量約１１．４ｋｂのプラスミドを保持していた。これら２株由来のプラスミドを、夫々に制限酵素ＢｇｌＩＩで切断しアガロース電気泳動で分析した結果、どちらもベクターに用いたｐＩＪ７０３のＤＮＡ断片に加えて、約５．７ｋｂのＤＮＡ断片が検出された。さらに、前記２株より得た夫々のプラスミドを他の制限酵素（ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩなど）で切断した時に生じる断片の大きさがいずれも同一であったことから、この２つのプラスミドは同一のプラスミドであることが判明し、プラスミドｐＢＲＢ１と命名した。このハイブリッドプラスミドｐＢＲＢ１を用いて、これを再度ストレプトミセス・リビダンスに導入した結果、形質転換株は全てビアラホス耐性を示した。この事実は、ハイブリッドプラスミドｐＢＲＢ１内のストレプトミセス・エスピーＡＢ３５３４由来の分子量約５．７ｋｂのＤＮＡ鎖には、除草剤耐性遺伝子がコードされていることを示す。【００３９】
（４）除草剤耐性遺伝子のコード領域の判定
上記のようにして得られた除草剤耐性をになう遺伝子のコード領域は、図１のＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメント中に位置する。このことは、プラスミドｐＢＲＢ１から作製された欠失プラスミドのビアラホス耐性を調査することにより確認された。すなわち、約５．７ｋｂＤＮＡ断片中、約１．２ｋｂのＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩフラグメントを保持したプラスミドのみが、ビアラホス耐性を示すことで確認された。さらに詳細な遺伝子の存在位置を確認するため、大腸菌の形質転換系を用いて試験を行った。【００４０】
ビアラホス耐性遺伝子の存在が確認された約１．２ｋｂＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片を市販のプラスミドベクタ−ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩサイトに連結し、得られたプラスミドを大腸菌に導入することにより、形質転換大腸菌株はビアラホス耐性を示す。約１．２ｋｂＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ断片内に存在するＳｍａＩサイトを用いて、欠失プラスミドを作製し、大腸菌の形質転換を行った結果、本願の除草剤耐性遺伝子は約０．６ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ断片上に存在することが確認された。すなわち、ハイブリッドプラスミドｐＢＲＢ１の２μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩの２０単位ずつで３７℃、２時間切断した後、アガロース電気泳動を行い、１．２ｋｂの断片のみを切り出し、ジーンクリーンにより精製した。一方ｐＵＣ１８プラスミド２μｇをＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ ２０単位ずつで３７℃、２時間切断した後、ジーンクリーン（Ｂｉｏ１０１社製）により精製した。夫々のＤＮＡフラグメントを、Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて、１６℃、３時間反応させた。このようにしてプラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ切断ＤＮＡフラグメントに、ｐＢＲＢ１由来の約１．２ｋｂＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ切断フラグメントを組み込んだプラスミド溶液を得た。この溶液を、コンピテントセルＪＭ１０９（Ｔａｋａｒａ社製）に導入した。すなわち、コンピテントセル溶液６０μｌにライゲーション反応溶液を５μｌ加え、０℃ ３０分後、４２℃ ４５秒、０℃ ２分の処理を行い、これにＳＯＣ溶液５００μｌを加えて、３６℃で１時間回復培養させ、これを、寒天培地（ＬＢ培地、１．５％寒天、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ）に広げて３６℃で培養した。１６時間後、形成したコロニーを個別に分離し、培養を行い、目的遺伝子の挿入されたプラスミドを有する菌株を単離した。こうして、プラスミドｐＵＣ１８にｐＢＲＢ１由来の約１．２ｋｂＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ切断フラグメントをクローニングしたベクター（ｐＵＣ１８−Ｂ１）を形質転換した大腸菌を得た。【００４１】
ｐＵＣ１８−Ｂ１で形質転換された大腸菌は、１ｍＭチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、１０ｍｇ／Ｌビアラホスをともに含むＭ９寒天培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）上で生育が認められた。さらに、詳細な遺伝子の位置を確認するため、約１．２ｋｂＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ切断フラグメントを保持するｐＵＣ１８−Ｂ１の種々の欠失プラスミドを形質転換した大腸菌のビアラホス耐性の調査から、本願の除草剤耐性遺伝子は約０．６ｋｂ  ＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩ断片を保持したｐＵＣ１８−Ｂ２プラスミド上に存在することが確認された。すなわち、プラスミドｐＵＣ１８−Ｂ１を制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ ２０単位ずつで３７℃、２時間切断した後、アガロース電気泳動を行い、０．６ｋｂの断片のみを切り出し、ジーンクリーンにより精製した。一方ｐＵＣ１８プラスミド２μｇをＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ ２０単位ずつで３７℃、２時間切断した後、ジーンクリーン（Ｂｉｏ１０１社製）により精製した。夫々のＤＮＡフラグメントを、Ｔａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔにて、１６℃、３時間反応させた。このようにしてプラスミドｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ切断ＤＮＡフラグメントに、ｐＢＲＢ１由来の約０．６ｋｂＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ切断フラグメントを組み込んだプラスミドｐＵＣ１８−Ｂ２溶液を得た。ｐＵＣ１８−Ｂ２形質転換大腸菌は、１ｍＭチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、１０ｍｇ／Ｌビアラホスをともに含むＭ９寒天培地（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）上で生育が認められた。この約０．６ｋｂのＤＮＡ断片の塩基配列を解読した結果、約０．６ｋｂのＤＮＡ断片中に、配列番号２に記載の１７４残基のタンパク質をコードする配列番号１で表される塩基配列が確認された。塩基配列の決定はDNAシークエンス受託サービス（北海道システムサイエンス(株)）を利用して行った。【００４２】
（５）耐性機序の確認
本発明の除草剤耐性遺伝子を保持するｐＵＣ１８−Ｂ２により形質転換された大腸菌をＬＢ培地５０ｍｌ、アンピシリン５０ｍｇ／Ｌの液体培地に移植し、３７℃で１時間培養し、この培養液に１Ｍチオガラクトピラノシド溶液を５０μｌ加え、さらに３７℃で３時間培養した。培養終了後、５０００回転／分、１５分の遠心分離により、菌体を集め、これを生理食塩水で１回洗浄した。さらに、洗浄菌体を２０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）溶液２ｍｌに懸濁し４℃で超音波により菌を破砕した。この溶液を１５０００回転／分、１５分の遠心分離により上清を回収した。これを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）にて１０倍濃度に希釈して、粗酵素液とした。粗酵素液２μｌを反応溶液９８μｌに加え、２８℃で１時間反応後、４１２ｎｍの吸光度を測定し、アセチル化反応を測定した。補酵素アセチルＣｏＡの存在下でＰＰＴと反応させることにより、本発明の除草剤耐性遺伝子はＰＰＴをアセチル化する酵素をコードしていることが確認された。なお上記のアセチル化反応溶液の組成は、２ｍＭ ＤＬ−ホスフィノスリシン、０．２ｍＭ ＡｃｅｔｙｌＣｏｅｎｚｙｍｅＡ（Ｓｉｇｍａ社製）、０．２ｍＭ ５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（和光純薬社製）、１００ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８．０）から成る。【００４３】
本発明のＰＰＴのアセチル化酵素の特性を解析するとともに、公知のストレプトミセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）（「ザ  エンボ  ジャーナル（The EMBO Journal）」１９８７年、第６巻、２５１９〜２５２３頁）、および放線菌ＡＢ２２５３株（特許第２５３９９０１号）由来のＰＰＴのアセチル化酵素遺伝子と比較した。ストレプトミセス・ハイグロスコピカスおよび放線菌ＡＢ２２５３株由来のアセチル化酵素遺伝子は、両菌株から実施例１（２）に記載の方法により抽出した全ＤＮＡを用いて公知の方法により単離した。【００４４】
こうして得られた、それぞれのＰＰＴアセチル化酵素遺伝子を含む、本実施例のｐＵＣ１８−Ｂ２、ストレプトミセス・ハイグロスコピカス由来ｐＵＣ１９−ＳＨ、放線菌ＡＢ２２５３株由来ｐＵＣ１９−ＡＢで形質転換した大腸菌より上記の手法により粗酵素液を抽出し、アセチル化反応特性を解析した。至適ｐＨ、ＰＰＴおよびその構造類似体であるメチオニンスルホン（ＭＳ）に対する基質特異性（Ｋｍ値）を測定した結果を表２に示す。この３菌株由来の酵素は、いずれもＰＰＴアセチル化酵素活性を保持するが、至適ｐＨおよび基質特異性が明らかに異なることから、本発明のアセチル化酵素遺伝子は新規な酵素遺伝子であることが確認された。【００４５】
【表２】
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【００４６】
〔実施例２〕除草剤耐性遺伝子の植物細胞への導入
（１）植物遺伝子導入用ベクターの構築
ストレプトミセス・エスピーＡＢ３５３４株由来除草剤耐性遺伝子を植物細胞内で発現させるために、配列番号４及び５の配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行い、除草剤耐性遺伝子を増幅した。反応液組成はＴａｋａｒａ ＥｘＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ ×１０倍液  ５μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ  ４μｌ、鋳型ＤＮＡ  ３０ｎｇ、１０μＭ  プライマー溶液  各１μｌ、Ｔａｋａｒａ  ＥｘＴａｑ  ０．５μｌに、５０μｌになるように水を加え、調製した。反応条件は、９４℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃４５秒を、３５サイクル行った。【００４７】
反応後、ジーンクリーンでＰＣＲ断片を精製した。このＰＣＲ断片と植物細胞形質転換用ベクターｐＢＩ２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）の０．５μｇ夫々に、制限酵素ＸｂａＩとＳａｃＩを各０．５μｌ、Ｔ  ｂｕｆｆｅｒ×１０倍液  ２μｌを加え、全量２０μｌになるように水を加え、３６℃で１６時間反応させた。制限酵素反応後、ジーンクリーンでDNA断片を単離し、これらをライゲーションさせた。すなわち、DNA断片溶液１０μｌにＴａｋａｒａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ−Ｉ溶液を１０μｌ加え、１６℃、１時間反応させた。この溶液を、コンピテントセル（Ｔａｋａｒａ社製ＤＨ５α）に導入した。すなわち、コンピテントセル溶液６０μｌにライゲーション反応溶液を５μｌ加え、０℃ ３０分後、４２℃ ４５秒、０℃ ２分の処理を行い、これにＳＯＣ溶液５００μｌを加えて、３７℃で１時間回復培養させ、これを、寒天培地（ＬＢ培地、寒天１．５％、アンピシリン １００ｍｇ／Ｌ）に広げて３７℃で培養した。１６時間後、形成したコロニーを個別に分離し、培養を行い、目的遺伝子の挿入されたプラスミドを有する菌株を単離した。このようにしてプラスミドベクターｐＢＩ２２１の切断断片に前記のストレプトミセス・エスピーＡＢ３５３４由来除草剤耐性遺伝子を連結してなる環状の組換えベクターを作製した。この組換えベクターをp３５ＳＨＰＡＴと称する。
ベクターｐ３５ＳＨＰＡＴは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの下流に、本発明の除草剤耐性遺伝子を持ち、さらに下流にＮＯＳターミネーターが連結されてなる、約４．２ｋｂｐのサイズを有する。【００４８】
（２）イネのカルス細胞への組換えベクターの導入
上記で得られた組換えベクターp３５ＳＨＰＡＴをイネのカルス細胞へ導入を行った（特許第３３１２８６７号参照）。【００４９】
まず、イネ（品種：日本晴）の完熟種子から籾殻を取り除いた。得られた種子を７０％エタノール溶液に１分間、次いで次亜塩素酸ナトリウム１％（有効塩素濃度）溶液に６０分間浸漬して種子を殺菌処理した。公知のＭＳ培地の無機成分組成にショ糖３０ｇ／Ｌ、植物ホルモンとして２，４−Ｄ２ｍｇ／Ｌ、寒天８ｇ／Ｌを添加してなる培地に、上記で殺菌したイネ種子を置床した。２８℃で４５日間、２０００ルックスの光を１日あたり１６時間照明しながらインキュベートした。カルスが形成された後、それらカルスを胚乳部分から切り出し、孔１ｍｍのステンレスメッシュの篩を用いて、１ｍｍ以下のカルスをＰＣＶ（Ｐａｃｋｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｖｏｌｕｍｅ；圧縮細胞量）として３ｍｌの量を得た。【００５０】
チタン酸カリウム製ウイスカＬＳ２０（チタン工業社製）５ｍｇを１．５ｍｌ容のチューブに入れ、エタノールを１ｍｌ加え１時間放置した後、エタノールを除去し、完全に蒸発させて、殺菌されたウイスカを得た。このウイスカの入ったチューブに滅菌水１ｍｌを入れ、良く攪拌した。ウイスカと滅菌水を遠心分離し、上清の水を捨てた。このようにしてウイスカを洗浄した。このウイスカ洗浄操作を３回行った。その後、同チューブに公知のＲ２液体培地の０．５ｍｌを加えてウイスカ懸濁液を得た。【００５１】
上記で得られたウイスカ懸濁液の入ったチューブに１ｍｍ以下のイネのカルスを２５０μｌ入れて攪拌した後、混合物を１０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離し、カルスとウイスカを沈殿させ、上清を捨て、カルスとウイスカの混合物を得た。【００５２】
この混合物を入れたチューブに、前記の組換えベクターｐ３５ＳＨＰＡＴの１０μｌ（１０μｇ）を加え、十分振り混ぜて均一な混合物を得た。【００５３】
次に、この均一な混合物の入ったチューブを１８０００ｘｇで５分間遠心分離した。遠心分離した混合物を再度振り混ぜ、この操作を３回反復した。【００５４】
上記のようにして得られた、カルス細胞と、ウイスカと、本発明ＤＮＡ配列を有する組換えベクターを収容しているチューブを超音波発生機の浴槽にチューブが十分浸るように設置した。周波数４０ｋＨｚの超音波を強度０．２５ｗ／ｃｍ2で１分間照射した。照射後、１０分間、４℃でこの混合物を保持した。このように超音波処理した混合物を前記のＲ２液体培地で洗浄し、組換えベクターp３５ＳＨＰＡＴを導入した目的の形質転換細胞を得た。【００５５】
上記で組換えベクターを導入して得た形質転換細胞を有するカルスを、３．５ｃｍシャーレに入れた。さらに、Ｒ２培地の無機成分組成にショ糖３０ｇ／Ｌ、２，４−Ｄ ２ｍｇ／Ｌを添加して得た液体培地を３ｍｌ加えた。その後に、２８℃で２０００ルックスの光を１日当たり１６時間照射しながらロータリーシェーカー（５０ｒｐｍ）上でカルス細胞を培養しながら分裂細胞を得た。【００５６】
培養３日目に、得られた分裂細胞の懸濁液３ｍｌを、公知のＮ６培地の無機成分組成に、ショ糖３０ｇ／Ｌ、２，４−Ｄ ２ｍｇ／Ｌ、ゲルライト３ｇ／Ｌおよび選抜用薬剤としてビアラホス３ｍｇ／Ｌを添加してなる培地上に均一に広げた。培地上の細胞を、２８℃で２０００ルックスの光を１日あたり１６時間照射しながら１ヶ月間培養した。【００５７】
１ヶ月後に、ビアラホス含有培地上で健全に生育している形質転換カルスを選抜し、組換えベクターp３５ＳＨＰＡＴが形質転換されているイネのカルス細胞を得た。【００５８】
（３）形質転換イネカルス細胞からの植物体の再生
上記で得られたビアラホス耐性である形質転換培養細胞を、ＭＳ培地の無機成分組成にショ糖３０ｇ／Ｌ、ベンジルアデニン２ｍｇ／Ｌ、ナフタレン酢酸１ｍｇ／Ｌ、ゲルライト３ｇ／Ｌ、ビアラホス３ｍｇ／Ｌを添加してなる培地上に移殖した。２８℃で２０００ルックスの光を１日当たり１６時間照射しながら培養した。３０日後に形成された再生植物体（幼芽）を、ショ糖３０ｇ／Ｌ、ゲルライト３ｇ／Ｌを含むＭＳ培地を入れた試験管に移殖した。移殖された幼芽を２０日間培養して形質転換イネ植物体を得た。こうして、イネのカルス３ｍｌから合計１７個体の形質転換体が作製された。１７個体のイネ植物体から公知の方法（「細胞工学別冊  植物のＰＣＲ実験プロトコール」１９９５年、３０〜３３頁、秀潤社発行）によりゲノムＤＮＡを抽出し、前記（１）の条件でＰＣＲを行った結果、いずれの個体においても除草剤耐性遺伝子由来の約０．６ｋｂのバンドの増幅が見られ、本発明の除草剤耐性遺伝子の存在が確認された。【００５９】
（４）形質転換植物体の除草剤耐性の評価
本発明の除草剤耐性遺伝子が導入された植物体における除草剤耐性を評価するため、市販のＰＰＴを主成分とした除草剤（商品名：バスタＰＰＴ１８．５％含有液剤（バイエルクロップサイエンス社製））を所定濃度（２００倍希釈、ＰＰＴ ０．０９２５％）散布処理し、生育状況を観察した。前記によって得られた組換えイネ植物体を閉鎖系温室内で２週間順化、栽培後、非閉鎖系温室に移し、草丈約２５ｃｍまで育成を継続した。こうして育成した組換えイネ植物体と、対照として同一生育ステージの「日本晴」植物体に、前記除草剤の２００倍希釈液（雑草生育期処理濃度）をそれぞれ散布した。散布１日後以降、対照である「日本晴」は葉の緑色の退色が進行し、１週間後には完全に枯死したのに対し、本発明の除草剤耐性遺伝子組換えイネ植物体は健全な生育を示した。除草剤散布後の植物体の葉枯れの程度（全ての葉に対して緑色の退色した葉の占める面積率（％））を表３に示す。また、組換えイネ植物体は散布２ヵ月後に正常に出穂、開花、結実が見られた（図２）。【００６０】
【表３】
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【産業上の利用の可能性】
【００６１】
本発明の除草剤耐性遺伝子は、除草剤耐性植物体の作製に利用できる。
本発明の除草剤耐性遺伝子を植物に遺伝子導入することにより、除草剤に対する耐性が増強された除草剤耐性植物が提供される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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