(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、ホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニット及び一級アミノ基を有するユニットを含むバイオアッセイ用高分子化合物であって、
該バイオアッセイ用高分子化合物が、下記一般式［１］（式中Ｒ1Ｒ2、Ｒ3は水素原子ま
たはメチル基を、Ｒ４は疎水性基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基を示し、ｐは１〜２０の整数を示す。ｐが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサーであり、Ｚ は酸素原子またはＮＨである。ｌ、ｍ、ｎは自然数である。）で
表され、
前記一般式［１］において、Ｙが下記一般式［２］または［３］（式中ｑ、ｒは１〜２０の整数である。）であり、疎水性基がアルキル基であることを
特徴とするバイオアッセイ用高分子化合物。
【化１】
0004821444.tif 000014
【化２】
0004821444.tif 000015
【化３】
0004821444.tif 000016
【請求項２】
前記一級アミノ基がオキシルアミノ基及び／ またはヒドラジド基である請求項１記載の
バイオアッセイ用高分子化合物。
【請求項３】
高分子化合物の主鎖が（メタ）アクリル骨格である請求項１又は２記載のバイオアッセイ用高分子化合物。
【請求項４】
前記一般式［１］において、Ｘがエチレンオキシ基である請求項１記載のバイオアッセイ用高分子化合物。
【請求項５】
前記一般式［１］において、Ｒ４がアルキル基である請求項１又は４記載のバイオアッセイ用高分子化合物。
【請求項６】
前記アルキル基の炭素数が２〜１０である請求項５記載のバイオアッセイ用高分子化合物。
【請求項７】
請求項１〜６いずれか記載のバイオアッセイ用高分子化合物の製造方法であって、少なくとも、ホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、及び一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーとをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物から前記保護基を除去する工程、を含むことを特徴とするバイオアッセイ用高分子化合物の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか記載のバイオアッセイ用高分子化合物の製造方法であって、少なくとも、ホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、及び一級アミノ基を導入しうる官能基を有するモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物の前記官能基に一級アミノ基を導入する工程、を含むバイオアッセイ用高分子化合物の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜５いずれか記載のバイオアッセイ用高分子化合物を含む表面コーティング材料。
【請求項１０】
請求項９記載の表面コーティング材料を含む層を基材の表面に形成したバイオアッセイ用基材。
【請求項１１】
前記基材の形状が、スライド形状基板、９６穴プレート、容器、マイクロフルイディスク基板のいずれかである請求項１０記載のバイオアッセイ用基材。
【請求項１２】
前記基材の材質がプラスチック製である請求項１０または１１記載のバイオアッセイ用基材。
【請求項１３】
前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンまたはポリスチレンを含むものである請求項１２記載のバイオアッセイ用基材。
【請求項１４】
請求項１０〜１３いずれか記載のバイオアッセイ用基材に生理活性物質を固定化したバイ
オアッセイ用基材。
【請求項１５】
前記生理活性物質が糖、糖鎖、及びこれらを有する生理活性物質から選ばれる少なくとも一つである請求項１４記載のバイオアッセイ用基材。
【請求項１６】
前記生理活性物質が糖ペプチド又はまたは抗体である請求項１５記載のバイオアッセイ用基材。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、基材に固定された生理活性物質等を利用して、生体試料中の対象物質の並列検出および分析等に用いるバイオアッセイ用高分子化合物、およびこれを用いたバイオアッセイ用基材に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子活性の評価や、薬物効果の分子レベルでの生理的プロセスを解読するための試みは、伝統的にゲノミクスに焦点が当てられてきたが、プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供する。プロテオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、蛋白質レベルでの発現を検出しそして定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、蛋白質の翻訳後修飾、蛋白質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象の研究を含む。一方、近年、糖鎖が生体内の第３の鎖として注目を浴びるようになってきている。特に、細胞分化やガン化、免疫反応や受精などとの関わりが研究され、新たな医薬や医療材料を創製しようとする試みが続けられている。また、糖鎖は多くの毒素、ウイルスおよびバクテリアなどの受容体であり癌のマーカーとしても注目されおり、最近では癌細胞の転移やアルツハイマー病の原因と考えられているアミロイド蛋白質との相互作用も報告されている。
【０００３】
「生命の設計図」であるゲノムの構造が明らかにされ、膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究や糖鎖の研究はますます盛んになっており、それに伴って生理活性物質検出の迅速高効率（ハイスループット）化が求められている。そのため、この目的の分子アレイとして、抗体、糖ペプチド、糖鎖といった、糖を有する生理活性物質を固定化した基材の開発・研究が進められている。抗体チップなどを含むプロテインチップや糖鎖チップなどはその好例である。
【０００４】
しかし、プロテインチップなどは一般にＤＮＡチップの延長線上に位置付けられて開発がなされているため、ガラス基板上に蛋白質、またはそれを捕捉する分子をチップ表面に固定化する検討がなされている（例えば特許文献１参照）。
【０００５】
蛋白質等の検体の検出および定量において一般的に用いられている方法にサンドイッチ法がある。この方法は、固相に抗体（一次抗体）を結合させ、不溶化した抗体に標的となる蛋白をトラップさせ、次いで標的蛋白の別のエピトープを認識して結合する標識抗体（二次抗体）を反応させて、この標識物を測定することで蛋白を定量的に測定する方法である（例えば非特許文献１参照）。しかしこの方法では、例えばプロテインチップのように、一度に大量種の蛋白を検出しようとした場合、各々の標的蛋白に対して互いに競合しない複数種の抗体が必要となるため、条件の最適化は解決すべき多くの問題を含んでいる。
【０００６】
また、蛋白質を捕捉する分子（以下、捕捉分子と略す）を基板上に固定化した後、例えばサンドイッチ法のように該表面上で他の蛋白質（抗原抗体反応の場合、抗原に相当）と反応させ、更に、標識された蛋白質を反応させ最終的に検出機等で検出する場合、捕捉分子が固定されていない部分に該分子以外の蛋白質、すなわち、抗原や標識された蛋白質が固定されると、検出時にノイズとなり信号対雑音比（Ｓ／Ｎ比）を低下させる原因となり、検出精度を低下させる（例えば非特許文献２参照）。特に、本発明者らが行った実験では、臨床診断等で用いられる血清や血漿においては、夾雑蛋白の非特異的吸着が多くノイズが高く出てしまい、Ｓ／Ｎ比が低くなる傾向にあった。
【０００７】
このため通常のサンドイッチ法では、一次抗体を固定化した後に抗原および二次抗体の非特異的吸着を防止するため、吸着防止剤のコーティングが行われるが、これらの非特異的吸着防止能は十分でない。また、一次抗体を固定化した後に吸着防止剤をコーティングするため、固定化した蛋白質の上にコーティングされてしまう場合があり、二次抗体と反応できないという問題があった。このため、一次抗体固定化後の吸着防止剤コーティング工程がなく、かつ生理活性物質の非特異的吸着量の少ないバイオチップが求められている。
【０００８】
一方、一次抗体を固定化する際、抗体の抗原結合部位が機能しやすいように固定化することが重要である。たとえば特許文献２には、特定の固定化物質を、基盤に作製した微細穴に結合させる方法が記載されている。しかし、この方法では、固定化物質が抗体の場合、アミノ基末端（Ｎ末端）とを用いて基盤とペプチド結合させることになり、抗原結合部位が十分に機能しない場合があった。
【特許文献１】特開２００１−１１６７５０号公報
【特許文献２】特開２００５−２１４８８９号公報
【非特許文献１】「酵素免疫測定法」、石川榮治、河合忠、宮井潔編、医学書院、1987年、p.44-45
【非特許文献２】「ＤＮＡマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土社、2000年、p.57
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑制し、糖、糖鎖、糖ペプチド、抗体、及び／又はこれらを有する生理活性物質を固定化できるバイオアッセイ用高分子化合物およびこれを用いた基材を提供することを目的とする。ここで言う基材とは、各種チップ、プレート、粒子、容器等、バイオアッセイに利用可能なあらゆる材料を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、
（１）少なくとも、ホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニット及び一級アミノ基を有するユニットを含むバイオアッセイ用高分子化合物であって、
該バイオアッセイ用高分子化合物が、下記一般式［１］（式中Ｒ1Ｒ2、Ｒ3は水素原子ま
たはメチル基を、Ｒ４は疎水性基を示す。Ｘは炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基を示し、ｐは１〜２０の整数を示す。ｐが２以上２０以下の整数である場合、繰り返されるＸは、同一であっても、または異なっていてもよい。Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサーであり、Ｚ は酸素原子またはＮＨである。ｌ、ｍ、ｎは自然数である。）で
表され、
前記一般式［１］において、Ｙが下記一般式［２］または［３］（式中ｑ、ｒは１〜２０の整数である。）であり、疎水性基がアルキル基であることを
特徴とするバイオアッセイ用高分子化合物、
【化１】
0004821444.tif 000002
【化２】
0004821444.tif 000003
【化３】
0004821444.tif 000004
（２）前記一級アミノ基がオキシルアミノ基及び／ またはヒドラジド基である（１）記
載のバイオアッセイ用高分子化合物、
（３）高分子化合物の主鎖が（メタ）アクリル骨格である（１）又は（２）記載のバイオアッセイ用高分子化合物、
（４）前記一般式［１］において、Ｘがエチレンオキシ基である（１）記載のバイオアッセイ用高分子化合物、
（５）前記一般式［１］において、Ｒ４がアルキル基である（１）又は（４）記載のバイオアッセイ用高分子化合物、
（６）前記アルキル基の炭素数が２〜１０である（５）記載のバイオアッセイ用高分子化合物、
（７）（１）〜（６）いずれか記載のバイオアッセイ用高分子化合物の製造方法であって、少なくとも、ホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、及び一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーとをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物から前記保護基を除去する工程、を含むことを特徴とするバイオアッセイ用高分子化合物の製造方法、
（８）（１）〜（７）いずれか記載のバイオアッセイ用高分子化合物の製造方法であって、少なくとも、ホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、及び一級アミノ基を導入しうる官能基を有するモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物の前記官能基に一級アミノ基を導入する工程、を含むバイオアッセイ用高分子化合物の製造方法、
（９）（１）〜（５）いずれか記載のバイオアッセイ用高分子化合物を含む表面コーティング材料、
（１０）（９）記載の表面コーティング材料を含む層を基材の表面に形成したバイオアッセイ用基材、
（１１）前記基材の形状が、スライド形状基板、９６穴プレート、容器、マイクロフルイディスク基板のいずれかである（１０）記載のバイオアッセイ用基材、
（１２）前記基材の材質がプラスチック製である（１０）または（１１）記載のバイオアッセイ用基材、
（１３）前記プラスチックが飽和環状ポリオレフィンまたはポリスチレンを含むものである（１２）記載のバイオアッセイ用基材、
（１４）（１０）〜（１３）いずれか記載のバイオアッセイ用基材に生理活性物質を固定化したバイオアッセイ用基材、
（１５）前記生理活性物質が糖、糖鎖、及びこれらを有する生理活性物質から選ばれる少なくとも一つである（１４）記載のバイオアッセイ用基材、
（１６）前記生理活性物質が糖ペプチド又はまたは抗体である（１５）記載のバイオアッセイ用基材、
である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の高分子化合物を用いれば、吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着・結合を抑制し、生理活性物質を固定化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の高分子化合物は、少なくとも、ホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニット及び一級アミノ基を有するユニットとを含むことを特徴とする。この高分子化合物は、検出対象物質の基材への物理的吸着（非特異的吸着）を抑制する性質を有する。さらに、生理活性物質を固定化する性質を併せ持つ。ホスホリルコリン基が非特異的吸着を抑制する役割を果たし、一級アミノ基が生理活性物質を固定化する役割を果たす。特に、抗体を固定化する場合、抗体のＦｃ部位の糖鎖が高分子化合物のアミノ基と反応するため、抗原結合部位が十分機能できる状態になりやすい。
【００１３】
本発明の高分子化合物に含まれるホスホリルコリン基を有するユニットは、特に構造を限定しないが、下記一般式［１］の構成単位の左部の構成単位で示されるように、（メタ）アクリル残基とホスホリルコリン基が炭素数１〜１０のアルキレンオキシ基Ｘの連鎖を介して結合した構造であることが好ましい。なかでもXはエチレンオキシ基であることが最も好ましい。式中のアルキレンオキシ基Ｘの繰り返し数は１〜２０の整数であり、繰り返し数２以上２０以下の場合は、繰り返されるアルキレンオキシ基の炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。ｌは本来自然数であるが、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。
【００１４】
【化４】
0004821444.tif 000005
【００１５】
本発明の高分子化合物に含まれるホスホリルコリン基を有するユニットの組成割合（ｌ、ｍ、ｎの和に対するｌの比率）は特に制限されるものではないが、高分子化合物の全ユニットに対して５〜９８ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１０〜９０ｍｏｌ％、最も好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％である。組成比が下限値を下回ると、非特異的吸着が多くなる。一方、上限値を上回ると水溶性が高まり、アッセイ中高分子化合物が溶出してしまう恐れが出てくる。ただし、高分子化合物のいずれかの部分に、基材と共有結合できる官能基類を導入し、基材と化学的に結合させる場合はこの限りではない。たとえば、高分子化合物中にシランカップリング剤を導入しておく方法などが簡便で好ましい。
【００１６】
本発明の高分子化合物に含まれる疎水性基を有するユニットは、特に構造を限定しないが、前記一般式［１］の構成単位の中央部の構成単位で表されるように、（メタ）アクリル基残基に疎水性基が結合した構造であることが好ましい。疎水基は特に限定されないが、アルキル基や芳香族類が挙げられる。より好ましくは、前記アルキル基が炭素数２〜２０のアルキル基である。アルキル基は特に構造を限定されるものではなく、直鎖であっても、分岐していても、環状になっていてもよい。高分子化合物に疎水性基を有するユニットが含まれていることにより、プラスチック等、疎水性の基材に対しても濡れ性が向上し、ムラなく塗布できるようになる。また、疎水性が増すことから、アッセイ中に該高分子化合物が溶出してしまうことを防止することができる。式中、ｍは本来自然数であるが、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。
【００１７】
本発明の高分子化合物に含まれる疎水性基を有するユニットの組成割合（ｌ、ｍ、ｎの和に対するｍの比率）は特に制限されるものではないが、高分子化合物の全ユニットに対して、１〜９０ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１０〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは２０〜８０ｍｏｌ％である。上限値を上回ると非特異的吸着が増加する恐れが出てくる。
【００１８】
本発明の高分子化合物に含まれる一級アミノ基を有するユニットは、特に構造を限定されるものではないが、前記一般式［１］の構成単位の右部の構成単位で表されるように、（メタ）アクリル基残基とオキシルアミノ基またはヒドラジド基が、アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹを介した構造であることが好ましい。オキシルアミノ基の場合、Ｚは酸素原子を、ヒドラジド基の場合、ＺはＮＨを示す。ｎは本来自然数であるが、各構成成分の組成割合として表記される場合がある。アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹの構造は特に制限されるものではないが、下記一般式［２］または［３］（式中ｑ、ｒは１〜２０の整数である。）であることが好ましい。
【００１９】
【化５】
0004821444.tif 000006
【００２０】
【化６】
0004821444.tif 000007
【００２１】
前記オキシルアミノ基またはヒドラジド基は、糖、糖鎖、糖ペプチド、抗体、及び／又はこれらを有する生理活性物質を固定化することができる。また、スペーサーがあることにより、アミノ基が主鎖部分から離れるため、生理活性物質が固定化されやすい。さらにスペーサーにアルキレングリコール残基が含まれていることから非特異的吸着性を発現させることができる。アルキレングリコール残基の炭素数は制限されるものではないが、炭素数２のエチレングリコール残基が最も好ましい。
【００２２】
本発明の高分子化合物に含まれる一級アミノ基を有するユニットの組成割合（ｌ、ｍ、ｎの和に対するｎの比率）は特に制限されるものではないが、高分子化合物の全ユニットに対して、１〜９４ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは２〜９０ｍｏｌ％、最も好ましくは５〜８０ｍｏｌ％である。組成比が下限値を下回ると、糖、糖鎖および／またはこれらを有する生理活性物質を十分に固定化できなくなる。一方、上限値を上回ると非特異的吸着が増加する恐れが出てくる。      
【００２３】
本発明の高分子化合物の化学構造は、少なくともホスホリルコリン基を有するユニット、疎水性基を有するユニット及び一級アミノ基を有するユニットを含む構造であれば、その結合方式がランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。
【００２４】
本発明の高分子化合物の合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、少なくともホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物から保護基を除去する工程、を含む製造方法が好ましい。あるいは、少なくともホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、および一級アミノ基を導入しうる官能基を有するモノマーをラジカル共重合する工程、該工程により得られた高分子化合物に一級アミノ基を導入する工程、を含む製造方法が好ましい。
【００２５】
ホスホリルコリン基を有する単量体としては、特に構造を限定しないが、例えば２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン等を挙げられるが、入手性から２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。
【００２６】
疎水性基を有するモノマーの具体的な例としては、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、iso−ブチル（メタ）アクリレート、sec−ブチル（メタ）アクリレート、t−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、iso−ネオペンチル（メタ）アクリレート、sec−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、iso−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、iso−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、iso−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、iso−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレート、iso−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ）アクリレート、iso−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、iso−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、iso−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、iso−オクタデシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。これらのなかで最も好ましいのが、ｎ―ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレートである。
【００２７】
一級アミノ基を予め保護基にて保護したモノマーは、特に構造を限定しないが、下記一般式［４］（式中、Ｒ３は水素原子またはメチル基、Ｙはアルキレングリコール残基を含むスペーサー、Ｚは酸素原子またはＮＨ、Ｗは保護基を示す。）で表されるように、（メタ）アクリル基と、オキシルアミノ基またはヒドラジド基が、アルキレングリコール残基を含むスペーサーＹを介した構造であることが好ましい。
【００２８】
【化７】
0004821444.tif 000008
【００２９】
保護基Ｗとしてはアミノ基を保護基できるものであれば何ら制限を受けるものではなく、任意に用いることができる。なかでもｔ―ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）やベンジロキシカルボニル基（Ｚ基、Ｃｂｚ基）、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）などが好適に用いられる。
【００３０】
具体的なモノマーの例としては、下記式で表されるようなものである。
【化８】
0004821444.tif 000009
【００３１】
脱保護化は、トリフルオロ酢酸や塩酸、無水フッ化水素を用いれば、一般的な条件で行うことができる。
【００３２】
一方、高分子化合物を重合した後に一級アミノ基を導入する方法としては、何ら制限を受けるものではないが、少なくともホスホリルコリン基を有するモノマー、疎水性基を有するモノマー、およびアルコキシ基を有するモノマーをラジカル共重合した後に、該高分子化合物に導入されたアルコキシ基とヒドラジンを反応させて、ヒドラジド基を生成する方法が簡便で好ましい。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ｔ−ブトキシ基等が好適である。
【００３３】
具体的なアルコキシ基を有するモノマーの例としては、下記式で表されるようなものである。
【化９】
0004821444.tif 000010
【００３４】
本発明の高分子化合物の合成溶媒としては、それぞれの単量体が溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、シクロヘキサノン、N，N−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。
【００３５】
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、２，
２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。
【００３６】
本発明の高分子化合物の分子量は、高分子化合物と未反応の単量体との分離精製が容易になることから、数平均分子量は５０００以上が好ましく、１００００以上がより好ましい。
【００３７】
本発明の高分子化合物で基材表面を被覆することにより、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質、及び生理活性物質を固定化する性質を容易に付与することが可能である。
【００３８】
基材表面への高分子化合物の被覆は、例えば有機溶剤に高分子化合物を０．０５〜５０重量％濃度になるように溶解した高分子溶液を調製し、浸漬、吹きつけ等の公知の方法で基材表面に塗布した後、室温下ないしは加温下にて乾燥させることにより行われる。
【００３９】
有機溶剤としてはエタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール、シクロヘキサノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、シクロヘキサノン等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。中でも、エタノール、メタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール、シクロヘキサノール等アルコール類がプラスチック基材を変性させず、乾燥させやすいため好ましい。
【００４０】
本発明に用いる基材としては、スライド形状基板、９６穴プレート、容器、マイクロフルイディスク基板が好ましい。例えばプラスチック製基板、ガラス製基板、金属蒸着膜を有する基板などがあげられる。プラスチック製基板の具体例としては、シクロオレフィンポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリサロフォン、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレートを素材とした基板などがあげられる。
【００４１】
前記高分子化合物を塗布した基材は糖、糖鎖、糖ペプチド、抗体、及び／又はこれらを有する生理活性物質を固定化することができ、バイオアッセイ用途に好適に用いることができる。生理活性物質としては、糖蛋白質、糖脂質、糖鎖遺伝子などが上げられる。これらの生理活性物質の基材への固定化方法としては、スポッターを使用して生理活性物質が溶解した溶液を点着する方法、生理活性物質が溶解した溶液を容器などに分注して固定化する方法などがある。
【００４２】
固定化に際して、糖蛋白質、糖脂質、糖鎖遺伝子、抗体を酸化剤により糖部分をアルデヒドに酸化することにより、より効果的に基材に生理活性物質を固定化できる。使用する酸化剤 としては、特に限定されないが、過ヨウ素酸を使用する。これらの濃度は、０．０４〜０．１６Ｍである。また、該酸化反応の緩衝液としては、通常、重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．１）を使用する。このようにして酸化された生理活性物質のアルデヒド基と基板上の一級アミノ基とを反応させ、シッフ塩基を生成することにより、化学的に固定化することが出来る。
【００４３】
生理活性物質を溶解する溶液としては各種緩衝材が好適に用いられる。特に限定されないが、たとえば炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、トリス‐塩酸緩衝剤、トリス酢酸緩衝剤、ＰＢＳ緩衝剤、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）緩衝剤、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｐｈｏｎｉｃａｃｉｄ）緩衝剤などが用いられる。
【００４４】
生理活性物質を溶解する溶液のｐHとしては、糖又は糖鎖を溶解する場合はｐHが２〜８であることが好ましい。糖蛋白質を溶解する場合はｐHが４〜９であることが好ましい。糖核酸を溶解する場合はｐHが２〜８であることが好ましい。糖脂質を溶解する場合はｐH２〜８であることが好ましい。
【００４５】
生理活性物質の溶液中の濃度としては特に限定されないが、０．０００１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。
【００４６】
生理活性物質の溶液を固定化する温度としては０℃から１００℃が好ましい。
【実施例】
【００４７】
（高分子化合物の合成例１）
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）、ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）、Ｎ−［２−［２−［２−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノオキシアセチルアミノ）エトキシ］エトキシ］エチル］−メタクリルアミド（ＯＡ、式［５］で示した化合物）をそれぞれ順に０．２５ｍｏｌ／Ｌ、０．５５ｍｏｌ／Ｌ、０．２０ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらにＡＩＢＮを０．０１ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテル中に滴下し、沈殿を回収した。得られた高分子化合物を１Ｈ―ＮＭＲで測定し、この高分子化合物の組成比を算出した。表１に結果を示した。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
（高分子化合物の脱保護）
前記高分子化合物を２ＮのＨＣｌ−ジオキサン−エタノール溶液で室温４時間処理することにより、ＢＯＣ基の除去を行った。脱保護後の高分子化合物の１Ｈ―ＮＭＲ測定を行い、ＢＯＣ基のトリメチルに起因するピークが消失していることより脱保護を確認した。
【００５０】
（比較高分子化合物の合成例２）
ＭＰＣ、ＢＭＡ、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−４．５−エチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯ４．５ＮＰ）、をそれぞれ順に０．２５ｍｏｌ／Ｌ、０．６０ｍｏｌ／Ｌ、０．１５ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。そこにさらに０．０１ｍｏｌ／ＬのＡＩＢＮを添加し、均一になるまで撹拌した。その後、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で４時間反応させた後、反応溶液をジエチルエーテルとクロロホルムの混合溶媒中に滴下し、沈殿を回収した。得られた高分子化合物を１Ｈ―ＮＭＲで測定し、この高分子化合物の組成比を算出した。表２に結果を示した。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
（実施例）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物、ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃）をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作成した。この固相基板を高分子化合物の合成例１にて得られた高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液に浸漬、乾燥することにより、基板表面に合成例１のポリマーを含む層を導入した。
【００５３】
（比較例）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物、ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度１２３℃）をスライドガラス形状（寸法：７６ｍｍ×２６ｍｍ×１ｍｍ）に加工して固相基板を作成した。この固相基板を高分子化合物の合成例２にて得られた高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液に浸漬、乾燥することにより、基板表面に合成例２のポリマーを含む層を導入した。
【００５４】
《実験１》
工程１（１次抗体の固定化）
実施例で得られた基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、一次抗体である抗マウスＩｇＧ２ａ（５ｍｇ）を、０．１M過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬製：１９９−０８０６２）および０．１M重炭酸ナトリウムを含む水溶液（ｐＨ８．１）（和光純薬製：１９７−０１３０２）１ｍｌに溶解して３０分静値した。次いで反応溶液をＰＩＥＲＣＥ社製脱遠プラスチック製カラム（商品コード：２０４３９）に掛けることで塩を除去した。該基板に自動スポッターによりＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を純水１リットル中に９．６ｇを溶解したバッファ）ｐＨ７．４）で１ｍｇ／ｍｌに調製された該酸化済み抗マウスＩｇＧ２ａをスポット後、室温の環境下に２４時間静置することにより一次抗体を固定化した。
次に比較例で得られた基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッターにより炭酸バッファ（和光純薬製ｐＨ９．５）で１ｍｇ／ｍｌに調製された一次抗体である抗マウスＩｇＧ２ａをスポット後、室温の環境下に２４時間静置することにより一次抗体を固定化した。
【００５５】
工程２（吸着防止処理）
その後、実施例の基板は１０ｍｇ／ｍｌの無水コハク酸（和光純薬製：１９４−０４３５２）水溶液に１時間処理することにより残りのオキシルアミンを失活させた。
比較例の基板は０．１ｍｏｌ／リットルのエタノールアミン（和光純薬製、鹿特級）、０．１ｍｏｌ／リットルのトリスバッファ（ＳＩＧＭＡ製）水溶液（ｐＨ９．５）に１時間浸漬することにより残りの活性エステル部を失活させた。
【００５６】
工程３（抗原抗体反応１）
その後、ＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を純水１リットル中に９．６ｇを溶解したバッファ）で１０％に希釈したＦＢＳ（子牛血清）溶液を作製した。この溶液中に抗原であるマウス  IgG2aを添加し２０ｎｍｏｌ／リットルとした溶液を作製した。この溶液を３７℃にて２時間、各基板と接触させることにより抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄した。
【００５７】
工程４（抗原抗体反応２）
洗浄後、二次抗体であるビオチン標識抗マウスＩｇＧ２ａをＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を純水１リットル中に９．６ｇを溶解したバッファ）に添加することにより２０ｎｍｏｌ／リットルの溶液を作製した。この溶液と各基板とを３７℃にて２時間、抗原抗体反応を実施した。抗原抗体反応後０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄した。
【００５８】
工程５（標識化）
最後にＣｙ５標識されたストレプトアビジンをＰＢＳバッファ（日水製薬製：組織培養用ダルベッコＰＢＳ（−）を純水１リットル中に９．６ｇを溶解したバッファ）に添加することにより２０ｎｍｏｌ／リットルの溶液を作製した。この溶液と基板とを３７℃にて３０分反応させた後、０．０５ｗｔ％の非イオン性界面活性剤Ｔｗｅｅｎ２０（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製）を添加した１×ＳＳＣバッファ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．製ＳＳＣ２０×Ｂｕｆｆｅｒを希釈して使用）で室温にて５分間洗浄することにより標識化をした。
【００５９】
各基板について蛍光量測定を行いスポットシグナル強度値とバックグランド値を評価した。バックグランド値の結果を表３に示す。
【００６０】
実施例および比較例における蛍光量の測定には、ＰａｃｋａｒｄＢｉｏＣｈｉｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製マイクロアレイスキャナー「ＳｃａｎＡｒｒａｙ」を用いた。測定条件は、レーザー出力９０％、ＰＭＴ感度５０％、励起波長６４９ｎｍ、測定波長６７０ｎｍ、解像度５０μｍであった。
実施例は、いずれの比較例よりもスポットシグナル値が強く、Ｓ／Ｎ比が大きい結果になった。
【００６１】
【表３】
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