(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シガ毒素をキャリアーとして含む、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）クラスI経路にがん抗原を導入するための薬学的組成物であって、前記シガ毒素は前記がん抗原と共有結合し、アジュバントはキャリアーと共有結合していないアジュバントであって、前記シガ毒素-がん抗原および前記アジュバントが粘膜投与される、薬学的組成物。
【請求項２】
前記がん抗原複合体ががん性乳腫瘍抗原を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記がん性乳腫瘍抗原ががん性乳腫瘍ライセートに由来する、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記がん性乳腫瘍抗原が乳組織に由来する、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記がん抗原がメラノーマ抗原である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記シガ毒素-がん抗原のシガ毒素が組み換え的に産生される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記シガ毒素-がん抗原のシガ毒素がシガ毒素のBサブユニットである、請求項１乃至６のいずれか一つに記載の薬学的組成物。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか一つに記載の薬学的組成物であって、シガ毒素のC末端に結合したKDELの小胞体残留シグナルをさらに含む、薬学的組成物。
【請求項９】
請求項１乃至７のいずれか一つに記載の薬学的組成物であって、シガ毒素のC末端に結合したKDELGLの不活性化小胞体残留シグナルをさらに含む、薬学的組成物。
【請求項１０】
前記共有結合が臭化シアン結合である、請求項１乃至９のいずれか一つに記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記共有結合がペプチド結合である、請求項１乃至９のいずれか一つに記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれか一つに記載の薬学的組成物であって、薬学的に許容な担体をさらに含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
粉末、顆粒、または液体状である、請求項１乃至１２のいずれか一つに記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記シガ毒素-がん抗原が経鼻、膣内送達される、請求項１乃至１２のいずれか一つに記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
医学的に活性な成分としてシガ毒素-がん抗原およびアジュバントが含まれる、がんを処理するための医薬であって、前記シガ毒素がキャリアーであって前記がん抗原に共有結合しており、前記シガ毒素抗原とアジュバントが粘膜投与される、医薬。
【請求項１６】
前記粘膜投与が経鼻または膣内投与である、請求項１５に記載の医薬。
【請求項１７】
前記共有結合が臭化シアノ結合である、請求項１５に記載の医薬。
【請求項１８】
前記共有結合がペプチド結合である、請求項１５に記載の医薬。
【請求項１９】
前記シガ毒素-がん抗原のシガ毒素がシガ毒素のBサブユニットである、請求項１５乃至１８のいずれか一つに記載の医薬。
【請求項２０】
前記シガ毒素-がん抗原抱合体ががん性乳腫瘍抗原を含む、請求項１５乃至１９のいずれか一つに記載の医薬。
【請求項２１】
前記がん性乳腫瘍抗原ががん性乳腫瘍ライセートに由来する、請求項２０に記載の医薬。
【請求項２２】
前記がん性乳腫瘍抗原が乳組織に由来する、請求項２０に記載の医薬。
【請求項２３】
前記がん抗原がメラノーマ抗原である、請求項１５乃至１９のいずれか一つに記載の医薬。
【請求項２４】
前記シガ毒素-がん抗原のシガ毒素が組み換え的に産生される、請求項１５乃至２３のいずれか一つに記載の医薬。
【請求項２５】
請求項１５乃至２４のいずれか一つに記載の医薬であって、シガ毒素のC末端に結合したKDELの小胞体残留シグナルをさらに含む、医薬。
【請求項２６】
請求項１５乃至２４のいずれか一つに記載の医薬であって、シガ毒素のC末端に結合したKDELGLの不活性化小胞体残留シグナルをさらに含む、医薬。
【請求項２７】
粉末、顆粒、または液体状である、請求項１５乃至２６のいずれか一つに記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景  樹状細胞は免疫系の標識である。これらは骨髄前駆細胞を起源とし、血液を通じて移動して、皮膚などの非リンパ組織に接種される。樹状細胞は外来の抗原を捕獲し、処理して細胞表面上にペプチド−ＭＨＣ抱合体として現れた後、血液及び輸入リンパ球を介して二次性リンパ節に移動する。このリンパ節で、これらはＴリンパ球と相互作用してヘルパー細胞及びキラーＴ細胞の活性化を促す（Steinman, R. (1991)Annu. Rev. Immunol. 9:271; Cella et al. (1997) Curr. Opin. Immunol 9:10）。
【０００２】
樹状とは、それらの外観と身体への分布具合とに基づいて名付けられたものである。例えば表皮に位置する樹状細胞はランゲルハンス細胞として知られる。真皮及び間質に位置する樹状細胞は間質樹状細胞として知られる。血液、膜及びリンパ細胞はそれぞれ、循環系、輸入リンパ球及びリンパ節で見られる。さらに樹状細胞は成熟段階ではこれらの段階の機能的及び表現型という特徴で系統によって特徴付けられ、またそれらの移動及び機能に関与した機序によっても特徴付けられている（Cella et al., ; Austyn, J. (1996) J. Exp. Med. 183:1287）。
【０００３】
最近の研究により、コレラ毒素が、マウスで非侵襲性、経皮免疫処置において潜在的な経皮的アジュバントとして作用することができることが実証された（Glenn, G. M. et al. Nature (1998)391:851）。皮膚表面に塗布されたコレラ毒素は、ジフテリア又は破傷風トキソイドなどの同時投与された抗原に対する強い免疫反応を刺激する。この方法は、皮膚表面面積が大きい場合、そしてその中に潜在的に免疫細胞が存在する場合に特に重要である（例えばBos, J.D., Clin. Exp. Immunol., 107(Suppl. 1), 3-5, 1997）。
【０００４】
コレラ毒素を用いた研究の結果、ヘロ毒素がマクロファージ上の可溶性ペプチドの提示を高めるが、可溶性又は細菌性抗原の細胞内プロセッシングを阻害することが示唆された。対照的に、組換えＢサブユニットは抗原の表面提示を高めるが細胞内プロセッシングを阻害しなかった（Matousek, M.P., J.G. Nedrud and C.V. Harding, J. Immunol., 156, 4137-4145, 1996）。動物研究でも、樹状細胞が抗主要免疫性を誘起する潜在的可能性が実証されている（Nestle, F. O. et al. Nature Medicine, 4:328-332, 1998）。
【０００５】
発明の概要
一実施例では、本発明は、ほ乳類の免疫反応が刺激されるように、ほ乳類に対して毒素−抗原抱合体を投与することにより、ほ乳類の免疫反応を刺激する方法に関するものである。好ましくは、毒素−抗原抱合体を、皮膚又は粘膜を通じて経皮的に投与する。
【０００６】
有利な実施例では、本毒素−抗原抱合体は、例えば腫瘍抗原、ウィルス抗原、又は細菌抗原を含む。腫瘍抗原は肺組織、皮膚組織、乳房組織、胃組織、結腸組織、直腸組織又は脳組織を由来とするものでもよい。ある好適な実施例では、本腫瘍抗原は、例えばメラノーマ腫瘍を由来とする。有利なことに、本発明の毒素−抗原抱合体には、シガ毒素、ベロ毒素、又はコレラＢ毒素などの毒素を含めてもよい。好ましくは、この毒素はベロ毒素のＢフラグメントであるとよい。
【０００７】
別の実施例では、本発明は、有効量の抗原−毒素抱合体をほ乳類に投与し、このほ乳類の免疫反応を刺激することによって、ほ乳類における抗原の関連する状態を治療する方法を特徴とするものである。好ましくは、この毒素−抗原抱合体を、例えばほ乳類の呼吸器管、胃腸管又は生殖管など、皮膚又は粘膜を通じて経費的にほ乳類に投与するとよい。特に好適な実施例ではこのほ乳類はヒトである。さらにアジュバントを本発明の抱合体と一緒に投与しても有利である。
【０００８】
本発明はさらに、毒素−抗原抱合体及び薬学的に容認可能な担体を含む薬剤組成に関する。好ましくは、当該組成が、皮膚又は粘膜を通じて経費的にほ乳類に投与するのに適しているとよい。当該の薬学的に容認可能な担体が、経口、経皮又は気管支内投与に適していると有利である。好ましくは、当該薬剤組成が非侵襲的投与に適しているとよい。
【０００９】
本発明は、例えばシガ毒素又はベロ毒素Ｂサブユニットなどの毒素のレセプタ結合非毒性フラグメントと、例えばMage1などの腫瘍抗原のエピトープとを含む、毒素−抗原抱合体などの組換えたんぱく質に関するものである。本発明は、さらに、請求項に記載された抱合体を用いる方法をも特徴としている。この毒素−抗原抱合体を用いると、例えばほ乳類の免疫反応を刺激したり、又はほ乳類の抗原が関連する状態を治療することができる。さらに、抗原提示細胞上に抗原を提示させたり、また薬剤組成の調製のためにも、本毒素−抗原抱合体を用いることができる。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的には、免疫反応を刺激するための薬剤組成及び方法に関するものである。本発明は、例えば共有結合などによりシガ毒素、ベロ毒素などの毒素に結合させたMage1などの抗原又は抗原エピトープを含む、毒素−抗原抱合体などの組換えたんぱく質を特徴とする。好適な実施例の一つでは、当該薬剤組成は、例えば呼吸系、胃腸系又は生殖系などの皮膚又は粘膜のいずれかを通じて経皮投与するのに適しているとよい。
【００１１】
「抗原」という術語には、独立して免疫反応を起こさせる物質や、本発明の抱合体に組み込まれたときに免疫反応を起こさせるものが含まれる。「抗原エピトープ」という術語には、抗原性を決定することのできるたんぱく質のフラグメントが含まれる。エピトープは、例えば長さで６から８個の残基から成るペプチドを含んでいてもよい（Berzofsky, J. and I. Berkower, (1993) in Paul, W., Ed., Fundamental Immunology, Raven Press, N.Y., p.246)。エピトープの中にはかなり長いものもあるであろう。抗体分子のその認識エピトープへの親和性は低い方で例えば１０−６Ｍから高い方で例えば１０−１１Ｍの範囲がある。
【００１２】
例えば、抗原にはたんぱく質や、腫瘍細胞など特定の種類のガン細胞の表面に特異的関連のあるその他の分子が含まれる。多くの形のガンが、その疾患の形に関連したたんぱく質の産生で特徴付けることができる。しばしばこれらのたんぱく質は胚発達の特異的段階で用いられるが、正常な成人の一生では観察されない。これらの抗原は、抗ガンワクチンのエピトープの源として特に有用である。本発明の抱合体のための抗原として考えられている腫瘍抗原の例は、乳房、子宮、胚、皮膚、及び脳に罹患するガンに対応するものが含まれる。例えば、乳房の腫瘍は異常に発現したレセプタ、例えばヒトＥＧＦ様レセプタファミリ（ＨＥＲ）のもので特徴付けることができるかも知れない。加えて、正常なほ乳類の胎児発達の間に神経上皮幹細胞によって発現するネスチンたんぱく質もまた、大部分の型の脳のガンを含め、中枢神経系の腫瘍上で発現する（McKay, D.G. Ronald, U.S. Patent No. 5,338,839, 8/16/94）。それはまた皮膚で見られるメラノーマ、及び、その他の組織に転移したものの上でも発現する（V.A. Florenes, R. Holm, O. Myklebost, U. Lendahl, O. Fodstad, 1994, Cancer Res. 54:354-6）。本発明は、これらの抗原又はこれらの抗原のエピトープを本発明の化合物に組み込むことを考察するものである。好ましくは、本発明の毒素−抗原抱合体の抗原は、メラノーマに関連するペプチドであるとよく、またこのメラノーマは例えば組換えにより又は腫瘍細胞の溶解産物を由来としてもよい。
【００１３】
本発明の考察する抗原を発現する腫瘍のその他の例には、ウィルムス腫瘍（A.J. Buckler, K.M. Call, T.M. Glaser, D.A. Haber, D.E. Housman, C.Y. Ito, Ito, J. Pelletier, Rose, E.A. Rose, 米国特許第5,350,840号）、胃腸のガン（R. Fishel et al., 国際出願WO95/14085, 05/26/95）、化学療法中の多剤耐性の発達を特徴とするガン（J.M. Croop et al., 米国特許第5,198,344号）、及び、その配列は当業者であれば分析用に入手可能であるRb、ras、及びc-mycなど、当業者に公知の数多くの腫瘍遺伝子の少なくとも一つの存在を特徴とするガン、がある。
【００１４】
その代わりに、本発明の抗原を微生物又は病原体の表面又は分泌生成物に結び付けてもよい。「病原体」という術語は、疾患を発生させる生命体である、一つ又はそれ以上の特定の種の細菌、ウィルス、真菌、及びプロトゾアが発生させる異常を引き起こす生命体が含まれる。病原体の例には、エシェリヒアコリのセロタイプである0157:H7、ヘリコバクターピロリ、Ｈ．ムステラエ、ハエモフィリスインフルエンザ及びＨ．ジュクレー、シュードモナスアエルギノーザ、志賀赤痢菌、サルモネラチフィ及びＳ．パラチフィなどのグラム陰性細菌種、マイコバクテリウムツベルクローシス、Ｍ．レプレ、クロストリジウムテタニ、スタフィロコッカスアウレウス、及び、溶連菌などのグラム陽性細菌種、リケッチア及びクラミジア種などの偏性細胞内細菌生物や、ＨＩＶ−１及び−２を含む、しかしこれに限らない、逆転写酵素を用いて相補ＤＮＡを合成するＲＮＡ含有ウィルスであるレトロウィルス、ＨＳＶ−１及び−２、非−Ａ非−Ｂ非−Ｃ肝炎ウィルス、ポックスウィルス、及び狂犬病ウィルスなどのその他の病原性ウィルス、カンジダ及びアスペルギルス種などの真菌、クリプトスポリジウムパルヴム、赤痢アメーバ及びランブル鞭毛虫などのプロトゾア、及びニューキャッスル疾患ウィルスなどの動物病原体、が含まれる。たんぱく質をスクリーニングし、ペプチドを試験管内アッセイすることにより、これらの生物から固有のエピトープを得ることは当業者に公知であり、数多くの例が説かれており、また適切なアミノ酸残基配列をGenbankから得てもよい。
【００１５】
「感染」という術語は、当該のホストにおける病原体の生存及び成長を含むものとして意図されている。感染の存在を診断するのに用いられる症状には発熱、炎症、疼痛、感染部位又は感染部位近傍の関節及び筋肉の感覚があるが、これらの症状のうちの一つ又はそれ以上がなかったとしても、ホスト生物の被験体への感染の可能性を除外するものではない。「炎症」という術語は感染を伴う一組のホスト反応を示唆するが、さらに感染がない場合でも、例えば自己免疫反応、変性疾患、組織リモデリング異常、アレルゲンへの曝露、及び／又は、その他の状態として存在する可能性がある。炎症反応には、プロテアーゼ、ヒスタミンの放出、及びスーパーオキシド生成、及びインターフェロン及び腫瘍壊死因子などのサイトカインの産生及びサイトカインへの反応を伴った好中球、マスト細胞、及び好塩基球の脱顆粒など、細胞内のプロセスが含まれる。
【００１６】
抗原の種類の一つはアレルゲンであってもよい。「アレルゲン」とは、感受性のある被験体においてアレルギー反応又は喘息性反応を引き起こすことのできる物質である。ある一集団のうちのある一定の割合に感受性反応を引き起こすアレルゲンの数は膨大であり、その中には花粉、昆虫の毒液、動物の鱗屑、塵ダニたんぱく、真菌胞子及び薬剤（例えばペニシリン）が含まれる。天然の動物及び植物のアレルゲンの例には以下の属に特異的なたんぱく質がある。即ち、ネコ属（フェリスドメスティクス）、イヌ属（カニスファミリアリス）、デルマトファゴイデス属（例えばデルマトファゴイデスファリネ）、ワモンゴキブリ属（ワモンゴキブリ）、ブタクサ属（アンブロシアアルテミスフォリア）、ライグラス属（ロリウムペレン又はロリウムムルティフォーラム）、スギ属（ニホンスギ）、アルテルナリア属（アルテルナリアアルテルナータ）、ハンノキ（アルヌスグルティノーザ）、マカンバ属（ベツーラベルコーザ）、コナラ属（クエルカスアルバ）、オレア属（オレアエウロパ）、アルテミシア属（アルテミシアブルガリス）、プランタゴ属（例えばプランタゴランセオラータ）、パリエタリア属（例えばパリエタリアオフィシアナリス又はパリエタリアジュダイカ）、チャバネゴキブリ属（チャバネゴキブリ）、ミツバチ属（アピスムルチフローラム）、キュープレス属（キュープレッサスセンペルヴィレンス、キュープレッサスアリゾニカ、及びキュープレッサスマクロカルパ）、ビャクシン属（ジュニペルスサビノイデス、ニュニペルスヴィルギニアーナ、ジュニペルスコミュニス及びジュニペルスアスヘイ）、ツヤ属（例えばツヤオリエンタリス）、ヒノキ属（ヒノキ）、アグロパイロン属（シバムギ）、ライムギ属（例えばライムギ）、コムギ属（例えばトリティカムアエスチヴム）、ダクチリス属（例えばダクチリスグロメラータ）、フェスキュ属（例えばフェスキュエラチオール）、ポア属（例えばポアプラテンシス又はポアコンプレッサ）、カラスムギ属（例えばマカラスムギ）、ホルキュス属（ホルキュスラナタス）、アントキサンタム属（例えばハルガヤ）、アルヘナセラム属（例えばアルヘナセラムエラチウス）、アグロスチス属（例えばアグロスチスアルバ）、フレウム属（例えばチモシー）、ファラリス属（ファラリスアルンディナセア）、スズメノヒエ属（例えばバヒアグラス）、モロコシ属（例えばジョンソングラス）、及びブロムグラス属（例えばブロムスイネルミス）、である。「アレルゲンが関連する状態」には、アレルゲンに対するアレルギー反応又は喘息性反応から生ずる状態が含まれる。
【００１７】
「毒素」という術語には、抗原の免疫反応を促すことのできる化合物が含まれる。代表的な毒素には、コレラｂ鎖、シガ毒素、及び好ましくは、シガ様毒素、例えばベロ毒素など、が含まれる。シガ毒素は、志賀赤痢菌が分泌するＡＢ５サブユニットファミリーの細菌たんぱく毒素である。このＡＢサブユニットは、高等真核細胞において、細胞質内に移行した後に、２８ＳｒＲＮＡの逆転した残基を修飾することによって、たんぱく質生合成を阻害する。ホモペンタマー（0/0Ｂフラグメント）であるＢサブユニットは、標的細胞への結合及び内部移行において、これらの細胞の細胞膜に見られる糖脂質Ｇｂ３と相互作用することによって関与する。このＢフラグメントは毒性ではないが、細胞膜からエンドソームを経由して生合成／分泌の経路に輸送されるホロ毒素の細胞内輸送特性を、多くのＧｂ３発現細胞において逆行する態様で、逆転させる。
【００１８】
関連する実施例では、この毒素は志賀様毒素、例えばベロ毒素である。現在公知のベロ毒素には、Ｅ．コリのいくつかの株から作製されたサブユニット毒素のベロ毒素１、ベロ毒素２、ベロ毒素２ｃ及びベロ毒素２ｅがある。これらの毒素は、溶血性尿毒症症候群及び出血性大腸炎の病因に関与している。細胞の細胞毒性は、感受性細胞において、ホロ毒素のＢサブユニットがレセプタ糖脂質、グロボトリアシルセラミドに結合することが伝達している。有利なことに、本発明の毒素は非毒性であり、例えば好ましくはシガ毒素Ｂ又はベロ毒素Ｂである。
【００１９】
「結び付いた」という術語には、毒素と抗原との間の共有結合が含まれる。好適な共有結合には、例えばペプチド結合及びブロモシアン活性化が含まれる。この術語はさらに、たんぱく質対たんぱく質の相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用及びイオン相互作用を含む。例にはビオチンを含む共役がある。
【００２０】
実施例の一つでは、当該の毒素−抗原抱合体を組換えにより生成する。本発明の化合物を組換えにより作製する方法は当業者に公知であり、例に詳述されている。
【００２１】
更なる実施例では、本毒素−抗原抱合体はさらに活性又は不活性の小胞体検索シグナルを含んでいてもよい。「小胞体検索シグナル」という術語には、本発明の抱合体が免疫反応に関与する細胞と相互作用する能力を高めるようなペプチド配列が含まれる。活性小胞体検索シグナルの一例はＫＤＥＬであり、このシグナルは例えば当該毒素のＣ末端に結合すると有利である。適した不活性の小胞体検索シグナルの一例はＫＤＥＬＧＬである。ＫＤＥＬＧＬがこの毒素のＣ末端に結合していると有利である。
【００２２】
特に好適な実施例では、本発明の毒素−抗原抱合体はベロ毒素Ｂ及び腫瘍抗原、例えばメラノーマ関連ペプチドを含んでいる。この抱合体を組換えにより作製すると便利であろう。
【００２３】
さらに本発明は、ほ乳類に毒素−抗原抱合体を投与することによって、ほ乳類の免疫反応を刺激する方法を特徴とするものでもある。好ましくは、免疫反応の刺激には、樹状、例えばランゲルハンス細胞の関与が含まれる。「免疫反応」という術語には、本発明の抱合に対するほ乳類のあらゆる免疫学的反応が含まれる。有利なことに、この免疫反応には、例えば、Ｔ細胞の促進、抗原に対する抗体の産生、及び／又は、樹状細胞、例えば好ましくはランゲルハンス細胞による抗原の提示、を含めてもよい。この術語には、本発明の抱合体に対する、そのほ乳類の免疫系のあらゆる反応が含まれる。「刺激する」という術語には、例えば、免疫反応の開始又は促進が含まれる。
【００２４】
抗原のプロセッシング及びＴリンパ球への提示は、免疫反応の発生において重要な事象である。一般的なルールとして、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラス１の分子は、主に細胞質ゾル及び核たんぱくを由来とする内生のペプチドエピトープをＣＤ８＋Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に提示する（Monaco, J.J. Immunol. Today (1992) 13:173-179; Heemels, M.T. and Ploagh, H., Annu. Rev. Biochem. (1995) 64:463491）が、外生のたんぱく質を由来とするペプチドはエンドサイトーシス経路で産生し、ＣＤ４．Ｔリンパ球に対してＭＨＣクラス２分子上に提示される（Janeway, C.A. Jr., et al., Inf. Rev. Immnol. (1993) 10:301-311; Pieters, J., Curr. Opin. Immunol. (1997)9:89-96）。しかしながら、様々な報告によって、正常又は腫瘍組織が発現する自己内生抗原は、外生クラス１で制限された経路を通じて効率的にプロセッシングされてＣＤ８＋Ｔ細胞に提示されることが示されている。
【００２５】
膵臓島細胞及び腎尿細管細胞、のみにある膜に結合した型のオブアルブミン（ＯＶＡ）を発現するトランスジェニックマウスでは、ＯＶＡを由来とするペプチドは、骨髄由来細胞によって、腎臓及び膵臓の排出リンパ節で、クラス１で制限された態様で提示される（Kurts, C., et al. J. Exp. Med. (1996) 184:923-930）。ハン氏らが、Ｔ細胞のＭＨＣクラス１制限腫瘍抗原による初回抗原刺激には、これらの抗原が腫瘍細胞から、骨髄由来抗原提示細胞へ移行してプロセッシングされることが必要であると実証した（Huang, A. Y., et al. Science (1994) 264:961-965）。ＭＨＣクラス１分子に関連した提示と、外生プロセッシング経路を通じたＣＴＬの産生を実証したこれらの議論にも拘わらず、大半の研究は、試験管内でのクラス１制限された効率的な提示を実証したり、又は、異物の外生可溶性抗原による生体内でのＣＴＬ誘導を実証することに失敗している（Moore, M. W., et al., Cell (1988) 54: 777-785; Rock, K, L., Immunol. Today (1996) 17: 131-137; Watts, C., Annu. Rev. Immunol. (1997)15:821-850）。
【００２６】
ＣＴＬはウィルス感染及び腫瘍に対する防御的及び治療的免疫反応の重要な成分である（Sabzovari, H. et al. Cancer. Res. (1993) 53:4933-4937; Rosenburg, S.A., et al. J. Natl. Cancer. Inst. (1994) 86:1159-1166; Stevenson, P.G., et al. Virology (1997) 232:158-166; Feltkarnp, M. C. Eur. J. Immunol. (1995) 25:2638-2642）、ＭＨＣクラス１制限された提示、及び、外生の可溶性抗原によるＣＴＬの刺激を可能とする様々な戦略が開発されてきた。
【００２７】
ワクシニア、リステリア又はサルモネラが発現するウィルス抗原又は腫瘍抗原など、組換え生存ベクタは、これらの抗原を細胞質ゾルに効率的に運び、こうしてクラス１で制限される提示経路にそれらを導入させ、また生体内でのＣＴＬの感作を起こさせた（Gao, X. M. et al. Cancer. Res. (1995) 55:4776-4779; Tsang, K. Y. et al., J. Natl. Cancer. Inst. (1995) 87:952-990）。しかしながら、同様のベクタの利用は、用いるベクタの潜在的病原性があるために、特にガン及びＨＩＶ感染患者などの免疫抑制された患者において、レシピエントにとってリスクがある（Kavanaugh, D. Y. et al. Hematol. Oncol. Clin. North. Arnenca (1996)10:927-951; Redfield, R.R. et al. N. Eng. J. Med. (1987)316:673-676）。
【００２８】
ラテックス・ビードに結合させた微粒子抗原（Kovacsovics-Bankowski, M. et al., Pro. Nat. Acad. Sci. USA (1993) 90:4942-4946; Harding, C. C. et al. J. Immunol. (1994) 153:4925-4933）、リポソームに融合させた微粒子抗原（Nair, S., et al., J. Exp. Med. (1992)175:609-612）又はアジュバントに結び付けた微粒子抗原（Ke, Y. et al. Eur. J. Immunol. (1995)25:549-553; Lipford, G.B. et al. Eur. J. Immunol. (1997)27:2340-2344）を用いるその他の方法は、試験管内及び生体内でＭＨＣクラス１経路に外来の抗原を導入することに成功した。大半の場合では、食細胞活動がこのプロセスに関与しており、このクラス１の提示経路には高い抗原濃度が必要であり、かつ、その効率は低いように見えた（Reis e Sousa, C. et al. J. Exp. Med. (1995)1B2:841-851）。
【００２９】
「ほ乳類」という術語には、例えばげっ歯類（例えばラット、マウス、ハムスター、リス）、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ネコ、イヌ、クマ、ヤギ、及び霊長類（例えばサル、チンパンジー、ゴリラ、及び好ましくは、ヒト）などの温血動物が含まれる。
【００３０】
「樹状細胞」という術語には、ランゲルハンス細胞、間質樹状細胞、趾間樹状細胞、瀘胞樹状細胞及び循環樹状細胞が含まれる。ランゲルハンス細胞は表皮及び粘膜に見られる。間質樹状細胞は例えば心臓、肺臓、肝臓、腎臓、及び胃腸管など、大部分の臓器にその集団がある。趾間樹状細胞は第二リンパ様組織及び胸腺髄質のＴ細胞区域に存在する。循環樹状細胞には血液白血球の約０．１％を成す「膜化細胞」が含まれる。
【００３１】
一般的には、樹状細胞は、神経細胞の樹状突起に似た長い膜突起の迷路で覆われている。それらの樹状突起が長いために、樹状細胞は、リンパ球及び付属の免疫系細胞を単離する従来の手法を用いた研究には課題が多い。樹状細胞は高いレベルの両クラス２ＭＨＣ分子及び同時刺激Ｂ７分子を発現する傾向がある。この理由のために、ＡＰＣとして機能するには両方とも活性化が必要なマクロファージ及びＢ細胞よりも強力な抗原提示細胞である。食細胞活動及又はエンドサイトーシスによって組織内に抗原を捕獲した後は、樹状細胞はリンパ血液内に移動して様々なリンパ器官に循環し、そこでそれらは抗原をＴリンパ球に提示する。
【００３２】
さらに本発明は、ほ乳類に治療上有効量の抗原−毒素抱合体を投与し、それによってほ乳類の免疫反応を刺激することによって、ほ乳類において抗原の関連する状態を治療する方法にも関するものである。例えば、この方法は、抗原をベロ毒素Ｂサブユニットと一緒に同時投与するステップか、又は、ベロ毒素Ｂサブユニットに結合させた抗原を被験体、例えばほ乳類、に投与して樹状細胞の抗原提示能力を刺激するステップを含む。
【００３３】
「抗原関連状態」という術語は、微生物又は病原体感染、アレルゲン関連状態、及び、好ましくは、例えば乳房、子宮、脳、皮膚、肺、等々などの腫瘍が含まれる。好ましくは、抗原関連状態がメラノーマであるとよい。
【００３４】
「治療する」という術語は、抗原の関連する状態の少なくとも一つの症状を予防する及び治療する、並びに改善させることを含む。さらにそれは、そのほ乳類が感受性のある可能性がある、しかし必ずしもそれで苦しむとも限らないような抗原関連状態に対して免疫反応を開始させることも含む。例えば、メラノーマの危険性のあるほ乳類においては、本発明の抱合体をこのほ乳類に投与して、この潜在的メラノーマの開始を防止する又は送らせるよう、免疫反応を生じさせてもよい。
【００３５】
「投与する」という術語には、本発明の抱合体が、その意図された機能、例えば免疫反応を刺激するなど、を果たすことができるような投与経路が含まれる。好適な投与経路には、経口、気管支内、及び経皮が含まれるが、これらに限定されるものではない。投与経路に応じて、本発明の抱合体を、所定の材料で皮膜する、又は所定の材料内に配置することで、それに対して意図された機能をそれが果たす能力に悪影響を及ぼしかねない天然条件からそれを保護することができる。本発明の抱合体は、単独で投与しても、又は薬学的に容認可能な担体と一緒に投与してもよい。さらに、本発明の抱合体は、本発明の抱合体の混合物としても投与することができ、この混合物は、さらに、薬学的に容認可能な担体と一緒に同時投与してもよい。本発明の抱合体は、抗原の関連する状態の開始前に投与しても、又は抗原の関連する状態の開始後に投与してもよい。
【００３６】
好ましくは、本発明の抱合体を皮膚又は粘膜を通じて経皮的にほ乳類に投与するとよい。粘膜には、ほ乳類の数多くの内部系の内層の潤滑膜が含まれる。粘膜を持つ系の例には、呼吸系、胃腸管、及び生殖管が含まれるが、これらに限定されるものではない。好適な粘膜系には、例えば、ほ乳類の鼻の膜、鼻の通路、ノド、肺、口、胃、腸、結腸、直腸、尿道、及び膣が含まれる。理論に縛られるわけではないが、ほ乳類の粘膜又は皮膚へ塗布又はその他の手段によって本発明の化合物を投与することは、例えばランゲルハンス細胞などの樹状細胞など、特殊化した、かつ強力な免疫細胞の存在があるために、有用であると考えられる。
【００３７】
特に好適な実施例では、本発明は、本発明の抱合体経皮的に投与することによって、特異抗原に対してほ乳類を免疫処置するための、好ましくは侵襲的な方法を考察するものである。非侵襲的な形の免疫処置の利点の一つは、ほ乳類に対して薬剤組成を注射する必要が少なくとも部分的に避けられるために、注射の必要性が減少し、かつ、例えば外来の病原、例えばＨＩＶなどに対してほ乳類を曝露する危険性が減少することである。非侵襲性という術語には、皮膚及び粘膜を通じて経皮投与するなどの投与が含まれる。例には、呼吸管粘膜を通じて経皮投与のための当該薬剤組成の吸入、例えば胃腸管粘膜や、口、喉、胃、小腸、結腸及び直腸の膜など、の粘膜などを通じた経皮投与などによる投与に向けて当該薬剤組成を飲み込むことが含まれる。さらに本発明は、本発明の毒素−抗原抱合体と、当該抱合体の経皮投与に適した薬学的に容認可能な担体とを含む、ほ乳類の免疫処置のための薬剤組成に関する。
【００３８】
更なる実施例では、本発明は、アジュバントをさらに含む薬剤組成及び方法に関するものである。アジュバントの一例はＫＬＨである。成功裏に経皮投与する上での化合物の能力を高めるのに重要な役割はアジュバントが果たす（Edelman Rev. Infec. Dis. (1980) 2:370-383）。アジュバントは、例えば経皮又は粘膜などの経皮的経路の開発において、化合物をほ乳類に投与するための有用な及び容易に入手できる非侵襲的方法として以前より重要である（Snider, Crit. Rev. Immunol. (1995)14:317-348）。適したアジュバントは関連する分野の当業者に公知である。
【００３９】
更なる実施例では、本発明は、治療上有効量の本発明の毒素−抗原抱合体と、ほ乳類への投与に適した薬学的担体とを投与することによって、ほ乳類の免疫性を誘起する方法を考察する。好ましくは、この担体が、鼻孔投与、経口投与、又は局所投与に適しているとよい。有利なことに、本方法にはさらにアジュバントの投与を含めてもよい。さらに本発明は、有効量の本発明の毒素−抗原抱合体と薬学的な担体とを含む、ほ乳類の免疫性を誘起することのできる薬剤組成に関するものである。好適な担体には、本発明の抱合体をほ乳類に鼻孔投与、経口投与、又は局所投与するのに適したものが含まれる。
【００４０】
当該化合物の「治療上有効量」という言語は、例えば抗原が関連する状態の様々な形態学的及び身体上の症状を防止するなど、抗原が関連する状態を治療する又は防止するのに必要な又は充分な量である。有効量は、被験体の大きさ及び体重、病気の種類、又は、本発明に基づく特定の抱合体などの因子に基づいて変えることができる。例えば、本発明の抱合体の選択が、何が「有効量」に影響を与えるか、に作用することもあろう。当業者であれば、上述の因子を研究することができ、また本発明の抱合体の有効量に関する決定を過度の実験を行うことなく下すことができるであろう。
【００４１】
さらに本発明は、抗原提示細胞が抗原を提示するよう、抗原提示細胞を毒素−抗原抱合体に接触させるステップを含む、抗原提示細胞上に抗原を提示させる方法に関するものである。好ましくは、抗原が、例えばメラノーマ抗原などの腫瘍抗原であるとよい。例えば、ベロ毒素のＢサブユニットは、樹状細胞による抗原の表面提示と、細胞内抗原プロセッシングの両方を刺激することができる。
【００４２】
「抗原提示細胞」という術語には、抗原又は抗原フラグメントを表示するような細胞が含まれる。抗原提示細胞の例には、いくつかの末梢血単核細胞及び、好ましくはランゲルハンス細胞などの樹状細胞が含まれる。
【００４３】
別の実施例では、本発明は、毒素−抗原抱合体及び薬学的に容認可能な担体を含む薬剤組成を特徴とする。ここで用いられる「薬学的に容認可能な担体」という文言は、本発明の化合物がそれに意図された機能を果たさせるように被験体内又は被験体に運ばれる又は輸送させることに関与する、薬学的に容認可能な材料、組成又は伝播体、例えば液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又は封入剤など、を意味する。典型的には、このような化合物は、一つの臓器、又は身体の一部分から、別の臓器、又は身体部分へと運ばれる又は輸送される。各担体は、その調剤のその他の成分と適合性があり、かつ患者にとって有害でない、という意味において、「容認可能」でなければならない。薬学的に容認可能な担体として働くことのできる材料のいくつかの例には、ラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖類、コーンスターチ及びいもでんぷんなどのでんぷん類、セルロース、及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース及びセルロースアセテート、粉末トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、ココアバター及び座薬ろうなどの賦形剤、ピーナッツ油、綿実油、べにばな油、ごま油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油などの油脂、プロピレングリコールなどのグリコール、オレイン酸エチル及びラウリル酸エチルなどのエステル、寒天、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、アルギン酸、無発熱源水、等張食塩水、リンゲル溶液、エチルアルコール、リン酸緩衝液、及び、その他の、薬剤調製に用いられる非毒性適合性物質、がある。
【００４４】
上述したように、本抱合体のいくつかの実施例には、アミノ又はアルキルアミノなどの塩基性官能基を含めることができるため、薬学的に容認可能な酸で薬学的に容認可能な塩を形成することができる。この点において「薬学的に容認可能な塩類」という術語は、本発明の化合物の、比較的に非毒性の無機及び有機酸添加塩類を言う。これらの塩類は、本発明の化合物の最終的な単離及び精製の際にin situで調製するか、又は、本発明の精製された化合物をその遊離塩基型のまま、適した有機又は無機の酸に別々に反応させて、このように形成された塩を単離させることにより、調製することができる。代表的な塩類には、ヒドロブロミド、ヒドロクロリド、スルフェート、ビスルフェート、ホスフェート、ニトレート、アセテート、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ベンゾエート、乳酸塩、ホスフェート、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプト酸塩、ラクトビオネート、及び、ラウリルスルホネートの塩類等々がある（例えばBerge et al. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19）。
【００４５】
別の場合では、本発明の化合物には、一つ又はそれ以上の酸性官能基を含めることができるため、薬学的に容認可能な塩基で薬学的に容認可能な塩を形成することができる。この場合の「薬学的に容認可能な塩類」という術語は、本発明の化合物の、比較的に非毒性の無機及び有機塩基添加塩類を言う。これらの塩類は、本発明の化合物の最終的な単離及び精製の際にin situで調製するか、又は、本発明の精製された化合物をその遊離酸型のまま、適した塩基、例えば薬学的に容認可能な金属カチオンや、又は薬学的に容認可能な有機の第一級、第二級又は第三級アミンなどのヒドロキシド、炭酸塩又は重炭酸塩など、に反応させることにより、調製することができる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及びアルミニウム塩類、等々がある。塩基添加塩類の形成に有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、等々がある。
【００４６】
湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなど、や、着色剤、はく離剤、被膜剤、甘味料、着香料、及び芳香剤、保存剤及び抗酸化剤もまた、組成中にあってよい。
【００４７】
薬学的に容認可能な抗酸化剤の例には、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、等々の水溶性抗酸化剤、アスコルビン酸パルミテート、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファトコフェロール、等々などの油溶性抗酸化剤、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸、等々などの金属キレート剤、がある。
【００４８】
本発明の製剤には、経口、鼻孔、局所、経皮、バッカル、舌下、直腸、膣及び／又は非経口投与がある。本製剤は、便利なように単位投薬型で提供してもよく、また薬学の分野において公知のいかなる方法で調製してもよい。一回分の投薬型を作製するのに担体材料と配合することのできる有効成分の量は、治療効果を生じる化合物の量であることが一般的であろう。一般的には、百パーセントのうちで、この量は約１パーセントから約９９パーセントの有効成分、好ましくは約５パーセントから約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセントから約３０パーセントの範囲であろう。
【００４９】
これらの製剤又は組成を調製する方法には、本発明の化合物を担体、及び選択に応じて一つ又はそれ以上の付属成分に会合させるステップが含まれる。一般的には、本製剤は、本発明の化合物を液体の担体、又は微細に分割された固体の担体、又は両方、に均一かつ密接に会合させた後、必要に応じてこの生成物を成形することによって調製される。
【００５０】
経口投与に適した本発明の製剤は、カプセル、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（多くの場合スクロース及びアカシア又はトラガカントを用いた着香した基剤を用いて）、粉末、顆粒、又は、水性又は非水性の液体による溶液又は懸濁液として、あるいは水中油又は油中水乳濁液として、あるいはエリキシル又はシロップとして、あるいは香錠として（ゼラチン及びグリセリンなど、又はスクロース又はアカシアなど、の不活性の基剤を用いて）及び／又は、口内洗剤、等々の形で、それぞれに所定量の本発明の化合物が有効成分として含まれたものであってもよい。さらに本発明の化合物は、巨丸剤、し剤又はパスタとして投与してもよい。
【００５１】
経口投与用の本発明の固形投薬型（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣剤、粉末、顆粒、等々）においては、有効成分を、例えばクエン酸ナトリウム又はリン酸２カルシウム、及び／又は以下のうちのいずれかなどの一つ又はそれ以上の薬学的に容認可能な担体と一緒に混合する。即ち、充填剤又は増量剤、例えばでんぷん、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及び／又は、珪酸など、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース及び／又はアカシアなどの結着剤、グリセロールなどの湿潤剤、寒天、炭酸カルシウム、いも又はタピオカでんぷん、アルギン酸、特定の珪酸塩、及び炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、パラフィンなどの溶解遅延剤、第四級アンモニア化合物などの吸収促進剤、例えばセチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、カオリン及びベントナイトクレイなどの吸収剤、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物などの潤滑剤、及び着色剤、である。カプセル、錠剤及び丸剤の場合には、本薬剤組成にさらに緩衝剤を含めてもよい。同様の種類の固定の組成を、ラクトース又は乳糖などの賦形剤や、高分子量ポリエチレングリコール等々を用いて軟質及び硬質の充填ゼラチンカプセルの充填剤として利用してもよい。
【００５２】
錠剤は、選択に応じて一つ又はそれ以上の付属成分と一緒に圧縮又は鋳込みによって作製することができる。圧縮された錠剤は結着剤（例えばゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性の希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えばでんぷんグリコレートナトリウム又は架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤又は分散剤を用いて作製してもよい。鋳込み成形された錠剤は、不活性の液体希釈剤でしめらせた粉末状の化合物の混合物を適した機械で鋳込み成形することによって作製してもよい。
【００５３】
本発明の薬剤組成の錠剤、及びその他の固体の投薬形態、例えば糖衣錠、カプセル、丸剤及び顆粒など、には、選択に応じて切れ込みを入れてもよく、又は腸溶コーティング及びその他の製薬業で公知のコーティング剤など、コーティング及びシェルと一緒に調製してもよい。これらはさらに、所望の放出曲線、その他のポリマーマトリックス、リポソーム及び／又はマイクロスフィアを提供するために、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどを様々な比率で用いて、その中の有効成分の放出を遅延させる又は調節するように調製してもよい。それらは、例えば細菌保持フィルタを通した濾過や、又は、滅菌剤を、無菌水に溶解可能な無菌の固体組成の形状や、何らかのその他の無菌の注射可能な媒質に使用直前に取り入れることによって、無菌化してもよい。さらに本組成に、選択に応じて乳白剤を含めてもよく、また、有効成分を胃腸管の特定の部分のみ、又は特定の部分で選択的に、そして選択に応じて遅延する態様で放出させるような組成であってもよい。利用の可能な包埋組成の例には、ポリマー物質及びろうがある。有効成分はさらに、必要に応じて上述の賦形剤のうちの一つ又はそれ以上を備えたマイクロ封入型であってもよい。
【００５４】
本発明の化合物の経口投与のための液体投薬型には、薬学的に容認可能な乳濁液、マイクロ乳濁液、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが含まれる。有効成分に加え、液体投薬型には、例えば、水又はその他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、油脂類（特に綿実油、落花生、コーン、はい芽、オリーブ、ひまし及びごま油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、及びこれらの混合物を含めてもよい。不活性の希釈剤の他に、経口組成にはさらに湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味料、着香料、着色剤、芳香剤及び保存剤を含めることができる。
【００５５】
懸濁液は、有効化合物に加えて、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、重水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天及びトラガカント、及びこれらの混合物などの懸濁剤を含んでいてもよい。
【００５６】
直腸又は膣投与のための本発明の薬剤組成の処方は、座薬として提供してもよく、またこの座薬は本発明の一つ又はそれ以上の化合物を一つ又はそれ以上の適した非刺激性賦形剤又は担体と混合することで調製してもよく、この賦形剤又は担体には、ココアバター、ポリエチレングリコール、座薬ろう又はサリチル酸塩が含まれ、またこの賦形剤又は担体は室温では固形であるが、体温では液体であるため、直腸又は膣腔で融解して有効化合物を放出することとなる。
【００５７】
膣投与に適した本発明の製剤は、さらに、当業で適切であることが知られている担体などを含むペッサリ、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレー製剤が含まれる。
【００５８】
本発明の化合物の局所又は経皮投与用の投薬型には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤が含まれる。この有効化合物は無菌条件下で薬学的に容認可能な担体や、また必要な何らかの保存剤、緩衝剤、又は推進剤と混合してもよい。
【００５９】
軟膏、ペースト、クリーム及びゲルには、本発明の有効化合物に加え、動物性及び植物性油脂、ろう、パラフィン、でんぷん、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、珪酸、タルク及び酸化亜鉛、又はこれらの混合物が含まれていてもよい。
【００６０】
粉末及びスプレーには、本発明の化合物に加えて、ラクトース、タルク、珪酸、水酸化アルミニウム、珪酸カルシウム及びポリアミドの粉末、又はこれらの物質の混合物が含まれていてもよい。スプレーにはさらに通常の推進剤、例えばクロロフルオロ炭化水素及び揮発性の未置換炭化水素、例えばブタン及びプロパンなど、が含まれていてもよい。
【００６１】
経皮パッチには、本発明の化合物の身体への送達を調節できるという更なる利点がある。このような投薬型は、本化合物を適した媒質中に溶解又は分散させることで作製が可能である。さらに吸収促進剤を用いると、本化合物の皮膚の透過を増加させることができる。このような透過の速度は、速度調節膜を提供するか、又は、本有効化合物をポリマーマトリックス又はゲル中に分散させることによって、調節することができる。
【００６２】
眼用製剤、眼用軟膏、粉末、溶液、等々もまた、本発明の範囲内にあるものとして考察されるところである。
【００６３】
非経口投与に適した本発明の薬剤組成は、一つ又はそれ以上の本発明の化合物を、一つ又はそれ以上の薬学的に容認可能な無菌の等張水性又は非水性溶液、分散液、懸濁液又は乳濁液、又は無菌の粉末に組み合わせて含み、またこの無菌の粉末は使用直前に無菌の注射可能な溶液又は分散液に再構築してもよく、この注射可能な溶液又は分散液には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、製剤を予定のレシピエントの血液に等張にする溶剤、又は懸濁剤又は増粘剤が含まれていてもよい。
【００６４】
本発明の薬剤組成に利用可能な適した水性及び非水性の担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、等々）、及び適したこれらの混合物、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステル、が含まれる。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング材料を利用したり、分散液の場合には必要な粒子の大きさを維持したり、そしてサーファクタントを利用するなどによって維持することができる。
【００６５】
これらの組成はさらに、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などを含んでいてもよい。微生物の活動を抑えるには、様々な抗菌剤及び抗カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸、等々を含めて確実にすることができる。さらに、糖類、塩化ナトリウム、等々などの等張剤を組成に含めるのも好ましいであろう。加えて、注射可能な薬剤型の吸収を長引かせるには、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど、吸収を送らせる物質を含めるとよい。
【００６６】
場合によっては、薬剤の効果を長引かせるためには、皮下又は筋肉内注射から薬剤の吸収を遅らせることが好ましい。これは、水溶性の乏しい結晶質又は無晶質材料の液体懸濁液を利用して達成してもよい。こうして薬剤の吸収速度は溶解の速度に依存することとなり、ひいては結晶の大きさ及び結晶の形に依存することとなる。あるいは、非経口投与した薬剤型の吸収の遅延は、薬剤を油脂の伝播体に溶解又は懸濁させることにより達成される。
【００６７】
注射可能なデポー型は、当該化合物のマイクロ封入マトリックスを、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマ中に形成して作製する。薬剤のポリマーに対する割合に応じて、そして用いた特定のポリマーに応じて、薬剤放出の速度を調節することができる。その他の生分解性ポリマーの例にはポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）がある。デポーの注射可能な製剤は、さらに、薬剤を、身体組織と適合性のあるリポソーム又はマイクロ乳濁液中に捕獲することで作製する。
【００６８】
本発明の調剤は経口、非経口、局所、又は直腸を通じて与えてもよい。それらはもちろん、各投与経路に適した形で与える。例えば、それらは、錠剤又はカプセル型で、注射、吸入、眼用ローション、軟膏、座薬、等々、注射、輸注又は吸入による投与、ローション又は軟膏による局所、及び座薬による直腸投与によって投与される。経口投与が好ましい。
【００６９】
ここで用いられる「非経口投与」及び「非経口的に投与する」という文言は、多くの場合注射による腸内投与及び局所投与以外の投与形態を意味し、限定されるわけではないが静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、莢膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹膜内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内及び胸骨内注射及び輸注が含まれる。
【００７０】
ここで用いられる「全身投与」「全身投与する」「末梢投与」及び「末梢投与する」という文言は、化合物、薬剤又はその他を、患者の系に進入するように、従って代謝及びその他の同様のプロセスに向けられるよう、例えば皮下投与など、中枢神経系に直接届く以外の投与を意味する。
【００７１】
これらの化合物は、ヒト及びその他の動物に対し、例えばスプレー、直腸、膣内、非経口、槽内、及び局所による経口、鼻孔、また頬側及び舌下を含む粉末、軟膏又はドロップによるなど、いかなる適した投与経路による治療に向けて投与してもよい。
【００７２】
選択された投与経路に関係なく、本発明の化合物は適した水和型で用いてもよく、及び／又は、本発明の薬剤組成を、当業者に公知の従来の方法によって薬学的に容認可能な投薬型に調製してもよい。
【００７３】
本発明の薬剤組成中の有効成分の実際の投薬量は、患者に毒性となることなく、特定の患者、組成、及び投与経路にとって所望の治療反応を得るのに効果的な有効成分の量が得られるように変更してもよい。
【００７４】
選択される投薬量は、利用する本発明の特定の化合物、又はそのエステル、塩、又はアミドの活性、投与経路、投与時間、用いた特定の化合物の排出速度、治療の期間、用いた特定の化合物と組み合わせて用いるその他の薬剤、化合物及び／又は材料、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康及び以前の医療歴、及び医業で公知の同様の因子を含む様々な因子に依存することであろう。
【００７５】
当業の通常の技術を有する内科医又は獣医であれば、必要な当該薬剤組成の効果的な量を容易に決定かつ処方できる。例えば、内科医又は獣医であれば、薬剤組成中に用いる本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するのに必要なものよりも低いレベルで開始し、所望の効果が得られるまでこの用量を次第に増加させていってもよいかも知れない。
【００７６】
本発明の化合物を単独で投与することもできるが、薬剤組成として当該化合物を投与することが好ましい。好適な薬剤組成には、経口、経皮、又は気管支内に適したものが含まれる。
【００７７】
本発明に基づくと、ベロ毒素Ｂサブユニットなどの毒素と同時投与するか、又はこの毒素に共有結合などにより結合させた抗原、例えばMage1は、ランゲルハンス細胞などの樹状細胞の抗原提示能力を刺激してワクチンとして作用するために被験体に投与される。このようなワクチンは、経口、経皮又は気管支内投与することができ、それらが曝露された組織の樹状細胞を刺激することができる。
【００７８】
本発明はさらに、ほ乳類の抗原が関連する状態を治療するための薬剤組成に関するものである。この薬剤組成には、有効量の毒素−抗原抱合体と薬学的に容認可能な担体とが含まれる。好ましくは、抗原が関連する状態は腫瘍、例えばメラノーマであり、また毒素−抗原抱合体は、例えばベロ毒素のＢサブユニットを含む。
【００７９】
本発明は、さらに、毒素−抗原抱合体及び薬学的に容認可能な担体を含む、腫瘍などの抗原が関連する状態に対してほ乳類、例えばヒト、を予防接種するためのワクチンに関する。
【００８０】
本発明は、ベロ毒素Ｂサブユニット、及び、ベロ毒素Ｂサブユニットの全部又は一部を含むハイブリッド組成を利用して、例えば効果的な予防接種戦略を提供するためなど、免疫反応の抗原提示機能を刺激するなどのために免疫反応を刺激する方法に関する。
【００８１】
いくつかの実施例では、ベロ毒素（ＶＴ）のＢ毒素は、ホロ毒素（例えばＶＴ１、ＶＴ２、ＶＴ２ｃ、ＶＴ２ｅ）を被験体に投与することにより投与される。しかしながら、好適な実施例では、ベロ毒素のＢサブユニットをＶＴホロ毒素の毒性部分無しで投与して、ホロ毒素の毒性を避ける。ベロ毒素のＢサブユニットは、樹状細胞による抗原の表面提示と、細胞内抗原プロセッシングとの両方を刺激できると考えられる。
【００８２】
別の実施例では、ベロ毒素Ｂ鎖又はコレラＢ鎖に結合させたメラノーマ関連ペプチドを、樹状細胞を刺激し、このような抗原の活発な提示をリンパ球に行わせることにより、抗腫瘍ワクチンとして被験体に投与する。好適な実施例の一つでは、腫瘍溶解産物をベロ毒素Ｂ鎖に、共有結合、例えば臭化シアン活性化など、の技術を用いて結合させる。別の好適な実施例では、例えばＫＬＨなどのアジュバントを同時投与する。
【００８３】
以下の例で本発明をさらに説明するが、以下の例は限定的なものとして捉えられてはならない。本出願全体を通じて引用されたすべての参考文献、特許出願、特許、及び公開済みの特許出願の内容は、参考としてここに編入されたものである。
【００８４】
例
シガ毒素のＢフラグメントに融合させた外生可溶性腫瘍抗原の、主要組織適合生複合体クラスＩによる提示：シガ毒素ＢフラグメントはＭＨＣクラス１提示経路に外生抗原を向かわせる。
Mage1腫瘍抗原を由来とするＣＤ８エピトープに融合させたシガ毒素Ｂフラグメント（van der Bruggen, P. et al., Science (1991) 254:1643-1647)から成る組換えたんぱく質を構築した。最初にヒトメラノーマからクローンしたこの抗原は異なる起源の腫瘍で発現する。この遺伝子の発現は、ＭＨＣクラス１分子を発現しなかった睾丸を除き、正常組織の大型パネルでは全く見られなかった（van der Bruggen, P. et al., Science (1991) 254:1643-1647）。この操作された腫瘍抗原がクラス１制限経路で試験管内プロセッシングされ、提示される能力を調べた。
【００８５】
材料及び方法
細胞
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィッコール・ハイパック勾配で遠心分離してＨＬＡ−Ａ１＋の健康なドナーの末梢血液から分離した。本研究で用いられた樹状細胞は以前に説かれたプロトコル（Sallusto, F. and Lanzavecchia, A., J. Exp. Med. (1994) 179:1109-1118）に基づいてＰＢＭＣから生成させた。簡単に説明すると、フィッコール／ハイパック郊外で分離した単核細胞集団をプラスチック製の皿上で２時間インキュベートした後に付着細胞を得た。次にこれらの細胞を、１０％の加熱不活化ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、５０ＩＵ／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５％のピルビン酸ナトリウム（「完全培地」）及び５００Ｕ／ｍｌの組換えＧＭ−ＣＳＦ（Leucomax, Molgramostin, Sandoz Pharma, Basel, Switzerland）及び１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ４（Diaclone, Besancon, France）を補ったＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。３日目に、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ４を一回加え、６−７日目で得られた樹状細胞を抗原提示アッセイに用いた。
【００８６】
Ｂリンパ幼若細胞系ＬＢ７０５（ＨＬＡ−Ａ１、Ａ２、Ｂ８、Ｂ２７）は既に説かれている（van der Bruggen, P. et al., Eur. J. Immunol. (1994)24:3038-3043）。ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＢＭ２１は同型接合ＨＬＡ−Ａ１の個人から得た（Yang, S. Y. et al., Immunobiology of HLA. (Springer-Verlag, New York:1989)）。このＨＬＡ−Ａ２ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系Ｖ．１はＵ．ブランク博士より贈呈いただいた。Ｂリンパ幼若細胞系はすべて、１μＭの２−メルカプトエタノールを補った完全培地に維持した。
【００８７】
ＭＺ２ ＣＴＬ８２／３０及びＬＢ３７３ ＣＴＬ２４６／１５クローンは、それぞれ、ＨＬＡ−Ａ１制限態様でMage1たんぱく質の１６０−１６８ペプチド（Traversari, C. et al., J. Exp. Med. (1992) 176:1453-1457）及びＨＬＡ−Ａ２制限態様でMart1たんぱく質の２７−３５ペプチド（Coulle, P, G. et al., J. Exp. Med. (1994) 180:35-42）を認識した。
【００８８】
ＣＴＬの培養を、僅かに変更を加えたトラベルサリ氏らの説いたプロトコルの後に行った（Traversari, C. et al., Immunogenetics (1992) 35:145-152）。簡単に説明すると、３×１０５のＣＴＬを、健康なドナーから採った１０５のヒトプールＡ、Ｂ及びＯ血清（ＳＡＢ）を補った、Ｌ−アルギニン（１１６μｇ／ｍｌ）、Ｌ−アスパラギン（３６μｇ／ｍｌ）及びＬ−グルタミン（２１６μｇ／ｍｌ）を含有する２ｍｌの完全イスコーブ培地で、１０６の照射済み（１００Ｇｙ）ＬＧ−２ＥＢＶ支持細胞、１０６照射（３０Ｇｙ）アレゴリック（原語：allegoric）ＰＢＭＣ、ＰＨＡ−Ｌ（５μｇ／ｍｌ）ＩＬ−２（１５０ＩＵ／ｍｌ）の存在下で培養した。刺激後３から４日後に、ＣＴＬをＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍｌ）を補った培養培地で希釈した。ＣＴＬの支持細胞による刺激を一週間に一回、繰り返した。ＩＦＮγアッセイについては、ＣＴＬ培養株を最後の再刺激から６日後に用いた。
【００８９】
プラスミドの構築及び融合ペプチドの作製
シガ毒素のＢフラグメンを発現するpSU108を基にしたプラスミドか、又は、このＢフラグメントのＣ末端に、Ｎ−グリコシレーション部位及び活性（ＫＤＥＬ）又は不活性（ＫＤＥＬＧＬ）ＥＲ検索シグナルが導入された融合たんぱく質の構築が、既に説かれている（Johannes, L. et al., J. Biol. Chem. (1997) 272:19554-19561）。ＰＣＲを基にした戦略を用いてMage1エピトープ及びその５’及び３’フランキング配列（ＤＶＫＥＡＤＰＴＧＨＳＹＶＬＧ）を、予め構築されたB-Glyc-KDEL及びB-Glyc-KDELGL発現ベクタのNot1部位に導入した。その結果得られた融合たんぱく質はB-Mage1-Glyc-KDEL及びB-Mage1-Glyc-KDELGLと名付けられた。配列は二本鎖ＤＮＡ配列決定法によりチェックした。このたんぱく質はE.coli株DH5αで発現させ、精製は基本的には説かれたように行った（Johannes, L. et al., J. Biol. Chem. (1997) 272:19554-1956）。
【００９０】
簡単に説明すると、ペリプラスム抽出物の調製後、これらをQFFカラム（ファーマシア社製）に入れ、直線NaCl勾配（１２０から４００mM）によって２０mMTris／ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で溶出させた。シガB-Mage1融合たんぱく質を含有する画分を２０mMのTris／ＨＣｌ、ｐＨ７．５で透析し、モノＱカラム（ファーマシア社製）に入れ、前と同じに溶出させた。
【００９１】
アンテナペディア−Mage1（Antp-Mage1）融合遺伝子を、Mage1エピトープ及びその５’及び３’フランキング配列（上述を参照されたい）をコードする合成オリゴヌクレオチドを、ＰＡＨ６１ＳプラスミドのＸｈｏ１及びＢａｍＨ１制限部位間に、Ｒａｂ３コドン配列の代わりに挿入することで得た（Perez, F. et al., J. Cell. Sci. (1992) 102:717-722）。次に、Antp-Mage1配列を含むNdel-BamHI制限断片を、ノヴァゲンプラスミドpET2gb(＋）（英国ロンドン、ＲアンドＤシステム社製）内にサブクローンしたが、このプラスミド内ではこの融合たんぱく質の発現はT7プロモータの制御下にあり、そのＣ末端ではHis標識をされていた。この融合ペプチドを、E.coli株ＢＬ２１（ＤＥ３）Lys内で、説かれたようにＩＰＴＧ誘導を行った後に発現させた（Studier, F. W. et al., Methods in Enzymol. (1990) 185: 60-89）。次のこのAntp-Mage1たんぱく質をNi-NTAアガロースゲル（ドイツ、ヒルデン、キアゲン社製）上で、このメーカのプロトコルに基づいて変性条件下で精製した。その結果得られた融合たんぱく質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法及びクーマシー・ブルー染色法で９５％の純度であることが判定された（図１Ａ、Ｂ、及びＣ）。
【００９２】
ウェスタン・ブロット
高解析度のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法の後で、たんぱく質をニトロセルロースの膜（BA85、0.45mm、ドイツ、ダーゼル、シュライヒャー・アンド・シュエル社）に、移動緩衝液（192mMのグリシン、25mMのTris塩基pH8.3、20%のエタノール）中でトランス−ブロット細胞（バイオ−ラド社製）を用いて電気移動させた。次に、この膜を１時間、３７℃で２０ｍＭのTris（pH7.4）、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ウェスタン緩衝液（ＷＢ））、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％のトゥイーン２０内で飽和させ、シガＢ−Mage1融合たんぱく質を得るにはシガ毒素のＢフラグメントを狙ったマウスモノクローナル抗体１３Ｃ４（４μｇ／ｍｌ）（米国ロックビル、ＡＴＣＣ社）か、又は、Antp-Mage1融合たんぱく質を得るにはマウス抗-(His)6-標識抗体（１μｇ／ｍｌ）（フランス、ゲネヴィリエ、ディアノーヴァ、タカラバイオメディカルヨーロッパＳ．Ａ．社製）と一緒に１８時間、４℃でインキュベートする。この膜をＷＢ及び０．１％のトゥイーン２０で洗浄し、西洋わさびペルオキシダーゼ（フランス、レスウィリス、アマーシャム社製）に結合させた抗マウス免疫グロブリンと一緒に１時間、インキュベートした。ＷＢ及び０．１％のトゥイーン２０で洗浄した後、このフィルタをウェスタンブロッティング試薬ＥＣＬ（アマーシャム社製）と一緒にインキュベートし、化学発光を、この膜をバイオマックスＭＲフィルム（コダック社製）に露光させることで検出した。
【００９３】
抗原ペプチド
合成ペプチド２７−３５Mart1（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ）及び１６０−１６８Mage1（ＥＡＤＰＴＧＭＳＹ）をネオシステム社（フランス、ストラスブルグ）から得たが、これは既に公開済みの配列（Traversari, C. et al J. Exp. Med. (1992) 176:1453-1457; Kawakami, Y. et al., J. Exp. Med. (1994)180:347-352)に由来するものである。
【００９４】
抗原提示アッセイ
抗原提示細胞（ＰＢＭＣ、Ｂ−ＥＢＶ、Ｔ細胞又は樹状細胞）を９６ウェルの底の平らなマイクロプレートに１０５細胞／ウェルになるようにプレーティングし、３７℃で４時間又は１５時間、１００μｌのイスコーブ媒質中に抗原を入れた状態で、ＳＡＢは加えずにパルスした。インキュベートの最後に媒質を取り除き、２０，０００のＣＴＬクローンを、２５単位／ｍｌのＩＬ２を含有する１００μｌのＣＴＬ培養培地の各ウェルに加えた。２４時間後、５０μｌの上清を回収し、ＩＦＮγをＥＬＩＳＡで測定した（Diaclone, Basancon, France)。
【００９５】
いくつかの実験では、細胞を１％のパラホルムアルデヒドに１０分間、室温で固定し、入念に洗浄してからマイクロプレートに移した。適当な場合には、ブレフェルディンＡ（シグマ社製）又はクロロキン（シグマ社製）をそれぞれ２μｇ／ｍｌ及び２５０μＭになるように、３０分間加えてから、抗原を加え、また抗原提示インキュベーションの間、同じ最終濃度になるようにした。
【００９６】
ＤＴＡＦカップリング
B-Mage1-Glyc-KDELを、基本的には前に説明したようにＤＴＡＦ（5-(4,6-ジクロロトリアジン-2-イル）アミノ）フルオレセイン）に結合させた。簡単に説明すると、20mMのHEPES、pH7.4、150mMのNaClに溶かした６０μｇの組換えB-Mage1-Glyc-KDELを２５０ｍＭのＮａＨＣＯ３及び１０倍モル過剰のＤＴＡＦ（シグマ社製）に加え、３０分間、室温で逆さまに振って回転させてインキュベートした。次に０．２ｍＭのＮＨ４Ｃｌを加え、結合させたたんぱく質をＰＤ１０カラム（ファーマシア社製）で精製した。
【００９７】
内部移行及び免疫蛍光染色
ポリリシン予処理した１２−ｍｍの円形ガラス製カバースリップ上で成長させた１０５Ｂ−ＥＢＶ ＢＭ２１細胞を氷上で４５分間、１μｇ／ｍｌのＤＴＡＦ標識付組換えB-Mage1-Glyc-KDELと一緒にインキュベートした。洗浄後、細胞を１時間、３７℃でインキュベートし、３％のパラホルムアルデヒドで１０分間固定し、サポニン（０．０１％）で透過化し、モノクローナル抗Lamp２抗体H4B4（サンディエゴ社ファーミンゲン）で染色し、テキサス・レッドに結合させた抗マウスIgG抗体（米国ウェストグローブ、ジャクソン）で顕像させた。
【００９８】
共焦点レーザスキャニング顕微鏡法及び免疫蛍光分析を、アルゴン／クリプトンレーザを接続したＤＭ顕微鏡に基づいたＴＣＳ４Ｄ共焦点顕微鏡を用いて行った（Johannes, L. et al., J. Biol. Chem. (1997) 272:19554-19561）。
【００９９】
結果
シガＢ−Mage1及びAntp-Mage1融合たんぱく質の生化学的特徴付け
図１Ａに示すように、活性ＥＲ検索シグナル（テトラペプチドＫＤＥＬ）又はこのシグナルの不活性版（ヘキサペプチドＫＤＥＬＧＬ）を持つＢフラグメント融合たんぱく質を含有するMage1は、これらの予測される大きさに相当する約１１．３ｋＤａの分子量で還元条件下で泳動する。モノクローナル抗Ｂフラグメント抗体（１３Ｃ４）を用いたウェスタン・ブロット分析の結果、精製されたシガＢ融合たんぱく質（図１Ｂ）のすべての同一性が確認された。
【０１００】
二つのシガＢ-Mage1融合たんぱく質は、精製後、既に部分的に開裂しており、９．５ｋＤａのフラグメントが生じていた（図１Ａ−Ｂ）。しかしながら、Mage1配列はB-Mage1-Glyc-KDEL及びB-Mage1-Glyc-KDELGL内部にある。このように、もしＣ末端の開裂が、９．５ｋＤａフラグメントの生成に関係していたとしても、その分子量から判断されるように、それらにはやはりMage1エピトープが含まれている。
【０１０１】
別の融合たんぱく質を構築したが、その中ではMage1ペプチドを、アンテナペディアホメオドメイン（Perez, F. et al., J. Cell. Sci (1992)102717-722）の第三セグメントを由来とするポリペプチドに融合させた。クーマシーブルー・ポリアクリルアミドゲル染色法及びウェスタン・ブロット分析の結果、組換えAntp-Mage1たんぱく質が１５kDaのポリペプチドとして同定された（図１Ｃ）。
【０１０２】
クラス１分子による外生可溶性シガＢ−Mage1融合たんぱく質の提示：ＫＤＥＬ配列の役割
内部Mage1エピトープのＭＨＣクラス１提示を駆動する外生シガＢMage1融合たんぱく質の能力を評価するために、ＰＢＭＣをB-Mage1-Glyc-KDELと一緒にパルスした。図２に示されるように、これらのＰＢＭＣは、シガＢMage1融合たんぱく質を由来とするMage1ペプチドを、ＨＬＡ−Ａ１制限的態様で特異的ＣＴＬに効率的に提示させた。提示に効率に対するＫＤＥＬシグナルの影響を次にテストした。ＫＤＥＬと、ＫＤＥＬＧＬを持つシガＢMage1融合たんぱく質の両方がMage1特異的ＨＬＡクラス１制限されたＣＴＬ反応を活性化することができた（図２）。二つの分子の同様な活性が、異なる濃度の両たんぱく質をテストしたときも観察された（データは図示せず）。実験中のＰＢＭＣの存在が必要であったが、それはなぜなら、シガＢ-Mage1融合たんぱく質による直接のＣＴＬ活性化が起きなかったからである（データは図示せず）。
【０１０３】
以下の例については、BMage1-Glyc-KDELのみを用いたが、それはＫＤＥＬ及びＫＤＥＬＧＬを持つシガＢMage1融合たんぱく質の抗原提示能力が同等だったからである。
【０１０４】
異なる抗原提示細胞による可溶性ＢMage1-Glyc-ＫＤＥＬたんぱく質のＭＨＣクラス１提示の分析
均一の抗原提示細胞を、シガＢ−Mage1融合たんぱく質で感作した。Ｂリンパ幼若細胞及び樹状細胞をパルスした後、クラス１制限されたMage1特異ＣＴＬの活性化を実証した（図３）。これらの結果は、二人のＨＬＡ−Ａ１ドナーを由来とする二つの異なるＢ−ＥＢＶ細胞系（ＥＩＭ２１及びＬＢ７０５）及び樹状細胞で観察された。０．２μＭと低いシガＢMage1たんぱく質があれば、Mage1ペプチド提示のためにＢ−ＥＢＶ細胞及び樹状細胞を感作させるのに充分であった（図３）。反対に、シガＢ−Mage1融合たんぱく質で試験管内で感作させたＴ細胞クローンは、自己Ｔ細胞クローンを活性化させられなかった（図３）。この研究で抗原提示細胞として用いられた８２／３０クローンＴ細胞はＨＬＡ−Ａ１分子を発現し、合成Mage1ペプチドを提示した（データは図示せず）。
【０１０５】
Ｂリンパ幼若細胞系による外生可溶性シガＢ−Mage1融合たんぱく質を由来とするMage1ペプチドのＭＨＣクラス１提示の特異性の分析
外生クラス１制限抗原提示経路はＢ−ＥＢＶ細胞ではめったに観察されない（Rock, K, L., Immunol. Today (1996) 17:131-137; Watts, C., Annu. Rev. Immunol. (1997) 15:821-850）。このプロセスにおけるシガ毒素Ｂフラグメントの役割を実証するために、このＢフラグメントが、ショウジョウバエの転写因子であるアンテナペディアホメオドメインの三番目のセグメントにより置換された組換えたんぱく質を作製した。このドメインは、いくつかのペプチドを真核細胞の細胞質及び核に転位させることが示されてきた（Perez, F. et al., J. Cell. Sci (1992)102:717-722）。さらに、外生の抗原をいくつかの細胞種におけるＭＨＣクラス１プロセッシング経路に狙いうちした（Schutze-Redelmeier, M.P. et al., J. Immunol. (1996) 157:650-655）。図４Ａに示すように、Mage1ペプチドの提示は、antp-Mage1融合たんぱく質を用いてＨＬＡ−Ａ１  Ｂ−ＥＢＶ細胞をパルスした場合には何ら、検出できなかった。ＨＬＡ−Ａ２ハプロタイプのＢ−ＥＢＶ細胞をシガＢ−Mage1たんぱく質で感作したときには、Mage1特異ＣＴＬの活性化は何ら観察されなかった（図４Ａ）。この活性化の特異性は、さらにＨＬＡ−Ａ１又はＡ２Ｂ  ＥＢＶ細胞をシガＢMage1融合たんぱく質でパルスしたときに、Mart1特異的ＣＴＬクローンの刺激がないことでも裏付けられた（図４Ｂ）。Mage1エピトープのないB-Glyc-ＫＤＥＬはMage1特異的ＣＴＬクローンでは認識されなかった（図４Ａ）。まとめると、これらのデータは、シガＢ-Mage1融合たんぱく質を由来とするMage1の特異的ＨＬＡ-Ａ１制限提示を実証するものである。
【０１０６】
Ｂリンパ幼若細胞系による可溶性シガＢ-Mage1融合たんぱく質のＭＨＣクラス１提示における内部移行及び細胞内プロセッシングの役割
内部ペプチドエピトープをクラス１制限経路に向かわせる組換えシガＢ-Mage1融合たんぱく質の能力、そしてこのたんぱく質の内部移行に対するその依存性をテストした。
【０１０７】
パラホルムアルデヒドで固定したＢリンパ幼若細胞は、シガＢ-Mage1由来Mage1ペプチドの、クラス１制限Mage1特異ＣＴＬクローンへの提示を起こさせなかったが、固定したＢ-ＥＳＢＶ細胞と一緒にインキュベートした外生合成Mage1ペプチドはこのＣＴＬを活性化した（図５）。これによって、細胞外シガＢ-Mage1プロセッシングは、観察される外生ＨＬＡクラス制限抗原提示の説明としては除外された。さらに細胞内輸送又はプロセッシングがこの抗原提示モデルに関与していることを実証するために、生合成／分泌経路におけるたんぱく質輸送を遮断するブレフェルディンＡ（ＢＦＡ）、又は、エンドソームのｐＨを上げてエンドソームのたんぱく質分解を阻害するクロロキンを用いた。クロロキン又はＢＦＡのいずれも、外生合成Mage1ペプチドの提示に干渉しなかった（図５Ｂ）。これらの細胞の抗原提示能力を維持した。対照的に、可溶性シガＢ-Mage1融合たんぱく質のインキュベーション中にＢＦＡが存在すると、Mage1Ｔ細胞エピトープの提示が妨げられた（図５Ｃ）。この効果はクロロキンでは観察されなかった。対照実験では、同じ濃度のクロロキンが、破傷風毒素由来ペプチドのＨＬＡクラス２制限提示を阻害するのに効果があった（データは図示せず）。
【０１０８】
Ｂ−ＥＢＶ細胞におけるシガＢ−Mage1融合たんぱく質の内部移行：  ライソゾームマーカによる共局在化の分析  Ｂ−Mage1-Glyc-ＫＤＥＬのＢ−ＥＢＶ細胞中での細胞内輸送を追跡するために、このたんぱく質を蛍光体ＤＴＡＦに共有結合させた。それを氷上で細胞に結合させて１時間３７℃でインキュベートすると、このたんぱく質は著しい傍核染色を見せて細胞質構造内に内部移行した（図６）。この染色パターンは、ゴルジ及びＥＲ区画に相当しており、ヒーラ細胞に関するそれまでの研究と一致していた（Johannes, L. et al., J. Biol. Chem. (1997) 272:19554-19561）。二重標識免疫蛍光実験でライソゾーム関連膜たんぱく質−２（Lamp−２）に対する抗体を用いて（図６Ｂ）、このシガB-Mage1融合たんぱく質はLamp-2陽性ライソゾーム区画から概ね排除された（図６Ｃ）。
【０１０９】
Ｂ−ＥＢＶ細胞のうち、おおよそ１０から２０％がM-Mage-Glyc-ＫＤＥＬ内部移行後に中間から強いＢフラグメント特異的染色を呈した。ある一つの集団の中の細胞間のこのような不均質性については既に説明されて（Sandvig, K. et al. J. Cell Biol (1994) 126:53-64)おり、細胞周期の機能のうちの毒素レセプタ発現におけるばらつきが原因である（Pudymaitis, A. and Lingwood, C. A., J. Cell. Physiol. (1992) 150:632-639）。
【０１１０】
議論
シガ毒素のＢフラグメントに融合させた可溶性ＣＤ８腫瘍抗原がＨＬＡクラス１制限態様で特異ＣＴＬに効率的に提示されることが実証された。精製された組換えたんぱく質のうちのいくらか部分的なたんぱく質分解による開裂は観察されたが、細胞外プロセッシングは以下の理由から想定されない。即ち、ｉ）ＣＴＬMage1エピトープはシガＢ-Mage1融合たんぱく質内部にあり、従って二つ又はそれ以上の別々及び特異的な開裂事象が、ＨＬＡ−Ａ１結合Mage1ペプチドを生成させるには必要であること。シガＢ-Mage1融合たんぱく質を由来とするMage1ペプチドの提示が、同じ実験で合成Mage1ペプチドを結合させ、かつ提示する能力を維持したＴ細胞でなかったことは、細胞外での開裂があったことを割り引く（図３）；ｉｉｉ）パラホルムアルデヒドで固定した抗原提示細胞は、合成外生Mage1ペプチドを提示することができたが、それでもこれらはシガＢ-Mage1融合たんぱく質をプロセッシングしなかった。及びｉｖ）ブレフェルディンＡは、可溶性シガＢ-Mage1たんぱく質を由来とするMage1エピトープの提示を妨げた。ブレフェルディンＡは、シガＢ-Mage1の小胞体への輸送（Johannes, L. et al., J. Biol. Chem. (1997) 272:19554-19561)、及び、プロセッシングされたペプチドの発生期のクラス１分子の細胞膜への結合及び輸送（Monaco, J.J., Immunol. Today (1992) 13:173-179）の両方を阻害するため、その正確な阻害機序は確定されていないままである。しかしながら、ＢＦＡを用いた実験は、シガB-Mage1融合たんぱく質の内部移行がＨＬＡクラス１制限提示が効率的に行われるには必要であることを実証するものである。
【０１１１】
等価物  当業者であれば、ごく通常の実験を行うのみで、ここに説明した本発明の特定の実施例の等価物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような等価物は以下の請求の範囲が包含するところとして意図されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】  シガＢ−Mage1及びAnt-Mage1融合たんぱくの生化学的特徴付け。シガ毒素（＝Ｂ）又は組換えB-Glyc-KDEL、B-Mage1-Glyc-KDEL、又はB-Mage1-Glyc-KDELGLたんぱくのＢフラグメントを還元条件下のTris-tricineゲルによる電気泳動法で分析した。次にこのゲルをクーマシーブルー（Ａ）で染色するか、又は、シガ毒素（Ｂ）のＢフラグメントを狙ったモノクローナル抗体13C4を用いたウェスタン・ブロット分析で現像した。アンテナペディア−Mage1（Antp-Mage1、C）融合たんぱく質はクーマシー・ブルー染色（ａ)又は抗His Tag抗体（ｂ）を用いたウェスタン・ブロット分析で分析した。
【図２】  ＰＢＭＣに対する可溶性シガB-Mage1融合たんぱく質のＭＨＣクラス１の提示。ＫＤＥＬ配列の役割。ＰＢＭＣ（５×１０４）を一晩、活性（B-Mage1-Glyc-KDEL）又は不活性（B-Mage1-Glyc-KDELGL）ＥＲリトリーバル配列を加えた、ペプチド１９１age１（１μＭ）又はMart1（１１μＭ）又はシガＢ−Mage1融合たんぱく質（１μＭ）と一緒にパルスした。洗浄後、２×１０４のMage1特異細胞毒性Ｔ細胞を、パルス済みのＰＢＭＣと一緒に２４時間インキュベートした。次に上清を採集し、ＩＦＮγ産生についてテストした。このデータは三重±標準偏差（棒）の中間値であり、少なくとも二つの同様な実験を表したものである。
【図３】  異なる種類の抗原提示細胞による可溶性シガB-Mage1融合たんぱく質のＭＨＣクラス１の提示。Ｂリンパ球幼若細胞、樹状細胞、及びクローンしたＴ細胞を、可溶性シガB-Mage1融合たんぱく質と一緒に図２に示したようにパルスした。ペプチドMage1の提示を８２／３０ＣＴＬでテストした。
【図４】  Ｂリンパ球幼若細胞系による可溶性B-Mage1融合たんぱく質のＭＩＩＣクラスＩ提示の特異性の分析。Ｂリンパ球幼若細胞系ＢＭ２１（ＨＬＡ−Ａ１）又はＢ−Ｖ．１（ＨＬＡ−４２）を一晩、媒質のみ、合成ペプチドMage1（１μＭ）、合成ペプチドMart1（１μＭ）、シガＢ-Mage1融合たんぱく質（１μＭ）、組換えAntp-Mage1融合たんぱく質、及び野生型シガ毒素Ｂフラグメントと一緒にパルスした。洗浄後、Mage1特異CTL82/30(A)又はMart1特異ＬＢ３７３ＣＴＬ（Ｂ）をパルス済みのＢ−ＥＢＶと一緒に２４時間、インキュベートした。次に上清を採集し、ＩＦＮγ産生についてテストした。このデータは三重±標準偏差（棒）の中間値であり、少なくとも二つの同様な実験を表したものである。
【図５】  Ｂリンパ球幼若細胞系による可溶性シガＢ−Mage1融合たんぱく質のＭＨＣクラスＩの提示。内部移行（Ａ）及び細胞内プロセッシング（Ｂ−Ｃ）の極。Ａ：いくつかの未固定のＢ−ＥＢＶ（ＢＭ２１）をクロロキン（２５０μＭ）又はブレフェルディンＡ（２μｇ／ｍｌ）で３０分間、予処理してから、４時間、合成Mage1ペプチド（１μＭ）又はシガＢ-Mage1融合たんぱく質（１μＭ）又は媒質のみと一緒にパルスした。洗浄後、Mage1特異CTLをパルス済みのＢ−ＥＢＶと一緒に２４時間、インキュベートした。次に上清を採集し、ＩＦＮγ産生についてテストした。このデータは三重±標準偏差（棒）の中間値であり、少なくとも二つの同様な実験を表したものである。
【図６】  B-EBV細胞への内部移行後のシガＢ-Mage1融合たんぱく質局在化の分析。B-EBV細胞をDTAF標識したB-Mage1-Glyc-KDEL（Ａ）と一緒に氷上で４５分間インキュベートし、洗浄し、３７℃で１時間放置した。次に細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、サポニンで透過性化し、モノクローナル抗ランプ２抗体（Ｂ）で染色した。Ｃでは、Ｂフラグメント特異的標識（Ａ）及びランプ２標識（Ｂ）を上に重ねた。共焦点顕微鏡法で得られた代表的画像を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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