(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
網膜浮腫に罹患した個体における網膜浮腫の処置のための薬学的組成物であって、以下：
エンドスタチン、エンドスタチンをコードする核酸を含むウイルスベクター、またはエンドスタチンを分泌する細胞を含む少なくとも１つのマイクロカプセル
を含む、薬学的組成物。
【請求項２】
前記エンドスタチンが、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記エンドスタチンが、外因性エンドスタチンである、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記エンドスタチンが、前記個体内で産生される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記エンドスタチンが、エンドスタチンをコードする核酸を含む有効量のウイルスベクターによって産生される、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、およびレンチウイルスからなる群より選択される、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記エンドスタチンが、少なくとも１つのマイクロカプセルによって産生され、ここで、該マイクロカプセルが、エンドスタチンを分泌する細胞を含む、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記マイクロカプセルが、アルギン酸塩を含む、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記マイクロカプセルが、アルギン酸ナトリウムを含む、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記マイクロカプセルが、アルギン酸カルシウムを含む、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記マイクロカプセルが、ポリＬ−リジンを含む、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記細胞が、外因性エンドスタチンをコードする核酸を含む、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記細胞が、内因性エンドスタチンコード遺伝子を過剰発現する、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記外因性エンドスタチンが、２．５ｍｇ／ｋｇ／日と２０ｍｇ／ｋｇ／日との間のエンドスタチンの濃度で前記個体に投与されるように処方される、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記アデノウイルスベクターが、前記個体の血清中で１，０００，０００ｎｇ／ｍｌまでのエンドスタチン濃度をもたらすエンドスタチンの発現を提供するに有効な量での投与のために処方される、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記アデノウイルスベクターが、前記個体の血清中で少なくとも３００ｎｇ／ｍｌのエンドスタチン濃度をもたらすエンドスタチンの発現を提供するに有効な量での投与のために処方される、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記エンドスタチンが、前記個体の血清中で３００ｎｇ／ｍｌ〜３０００ｎｇ／ｍｌのエンドスタチン濃度をもたらすに充分な量にて該個体中で発現される、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記エンドスタチンが、前記個体の血清中で３００ｎｇ／ｍｌ〜１５００ｎｇ／ｍｌのエンドスタチン濃度をもたらすに充分な量にて該個体中で発現される、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記ベクターが、１０８プラーク形成単位〜１０１４プラーク形成単位の量での投与のために処方される、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記ベクターが、１０８プラーク形成単位〜１０１４プラーク形成単位の量での投与のために処方される、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
マイクロカプセルが、前記個体の血清中で１，０００，０００ｎｇ／ｍｌまでのエンドスタチン濃度をもたらす、前記細胞によるエンドスタチンの発現を提供するに有効な量での移植のために処方される、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
マイクロカプセルが、前記個体の血清中で少なくとも３００ｎｇ／ｍｌのエンドスタチン濃度をもたらすエンドスタチンの発現を提供するに有効な量での移植のために処方される、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
前記マイクロカプセルが、前記個体の血清中で３００ｎｇ／ｍｌ〜３０００ｎｇ／ｍｌのエンドスタチン濃度をもたらすに充分な量での該個体中での移植のために処方される、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
マイクロカプセルが、前記個体の血清中で３００ｎｇ／ｍｌ〜１５００ｎｇ／ｍｌのエンドスタチン濃度をもたらすに充分な量での該個体中での移植のために処方される、請求項２４に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
エンドスタチンをコードする核酸が、配列番号２に示す配列を有する、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記ウイルスベクターが、眼内での投与のために処方される、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
前記ウイルスベクターが、網膜下での投与のために処方される、請求項２７に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記ウイルスベクターが、硝子体内での投与のために処方される、請求項２７に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
前記レンチウイルスベクターが、前記個体の血清中で１，０００，０００ｎｇ／ｍｌまでのエンドスタチン濃度をもたらすエンドスタチンの発現を提供するに有効な量での投与のために処方される、請求項３０に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
前記レンチウイルスベクターが、前記個体の血清中で少なくとも３００ｎｇ／ｍｌのエンドスタチン濃度をもたらすエンドスタチンの発現を提供するに有効な量での投与のために処方される、請求項３１に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
エンドスタチンが、前記個体の血清中で３００ｎｇ／ｍｌ〜３０００ｎｇ／ｍｌのエンドスタチン濃度をもたらすに充分な量にて該個体中で発現される、請求項３２に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
エンドスタチンが、前記個体の血清中で３００ｎｇ／ｍｌ〜１５００ｎｇ／ｍｌのエンドスタチン濃度をもたらすに充分な量にて該個体中で発現される、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
前記レンチウイルスベクターが、ウシ免疫不全ウイルスベクターである、請求項３０に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
前記ウシ免疫不全ウイルスベクターが、眼内での投与のために処方される、請求項３５に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
前記ウシ免疫不全ウイルスベクターが、網膜下での投与のために処方される、請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
前記ウシ免疫不全ウイルスベクターが、硝子体内での投与のために処方される、請求項３６に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
エンドスタチンのコード領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターをさらに含む、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
前記ウシ免疫不全ウイルスベクターが、眼周囲での投与のために処方される、請求項３５に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
前記ウイルスベクターが、眼周囲での投与のために処方される、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
網膜浮腫に罹患した個体における網膜浮腫の処置のための医薬の製造におけるエンドスタチン、エンドスタチンをコードする核酸を含むウイルスベクター、またはエンドスタチンを分泌する細胞を含む少なくとも１つのマイクロカプセルの使用。
【請求項４３】
前記エンドスタチンが、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
眼組織におけるエンドスタチン量の増加がもたらされる、請求項４２または請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
前記増加が、エンドスタチンをコードする核酸を含む有効量のウイルスベクターを投与することによってもたらされる、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、およびレンチウイルスからなる群より選択される、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
前記増加が、網膜浮腫に罹患した前記個体内に、少なくとも１つのマイクロカプセルを移植することによってもたらされ、該マイクロカプセルが、エンドスタチンを分泌する細胞を含む、請求項４４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、遺伝子治療を用いて網膜の障害を処置するための方法に関する。本発明はまた、網膜障害を処置するために用いられ得るベクター（より詳細には、レトロウイルスベクター）に関する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
（発明の要旨）
本発明は、網膜障害に罹患した個体における、この個体の眼組織中のインビボでのエンドスタチン濃度の、網膜障害を処置するために有効な量までの増加をもたらす工程を包含する、個体における網膜障害の処置のための方法を提供する。
【０００３】
好ましい局面では、エンドスタチンは、エンドスタチンまたはエンドスタチンの活性なフラグメントである。
【０００４】
別の好ましい局面では、本発明の方法において用いられるエンドスタチンは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドである。別の好ましい局面では、このエンドスタチンは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドのポリペプチドフラグメント、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドの誘導体、または配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドの改変体である。このような活性なフラグメントおよび改変体の例は、例えば、本明細書中にその全体が参考として援用される、米国特許第６，１７４，８６１号に示される。
【０００５】
別の好ましい局面では、本発明は、網膜障害に罹患した個体における、個体の眼組織（特に、網膜組織）中のインビボでのエンドスタチン濃度の、有効量への増加をもたらす工程を包含する、個体における網膜障害の処置のための方法に関し、ここで、この増加は、この個体へと外因性エンドスタチンを投与することによりもたらされる。
【０００６】
なお別の好ましい局面では、本発明は、網膜障害に罹患した個体における、個体の眼組織（特に、網膜組織）中のインビボでのエンドスタチン濃度の、有効量への増加をもたらす工程を包含する、個体における網膜障害の処置のための方法に関し、ここで、この増加は、エンドスタチンをこの個体内で産生されることによりもたらされる。より好ましい局面では、この増加は、エンドスタチンをコードする核酸を含む有効量のウイルスベクターをこの個体へと投与することによりもたらされる。最も好ましい局面では、このウイルスベクターは、アデノウイルス（例えば、ｇｕｔｌｅｓｓアデノウイルス）、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、およびレンチウイルスからなる群より選択され、そして眼内または眼周囲に投与される。
【０００７】
なお別の好ましい局面では、本発明は、網膜障害に罹患した個体における、個体の眼組織（特に、網膜組織）中のインビボでのエンドスタチン濃度の、有効量への増加をもたらす工程を包含する、個体における網膜障害の処置のための方法に関し、ここで、この増加は、少なくとも１つのマイクロカプセルをこの個体内に移植することによりもたらされ、ここで、このマイクロカプセルは、エンドスタチンを分泌する細胞を含む。
【０００８】
網膜障害としては、例えば、網膜剥離および網膜浮腫（黄斑水腫が挙げられる）が挙げられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（発明の詳細な説明）
エンドスタチンは、腫瘍新脈管形成および腫瘍増殖を阻害することが見出されている、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの切断産物である。インターフェロンα２ａもまた、腫瘍新脈管形成をブロックして、血管腫の後退を引き起こすが、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）に対する効果は有さない。本発明者らは、驚くべきことに、そして予想外にも、個体の眼組織中のインビボでのエンドスタチン濃度の増加が、網膜障害（例えば、網膜剥離および網膜浮腫（黄斑水腫が挙げられる））を処置し得ることを見出した。
【００１０】
従って、本発明は、網膜障害（例えば、網膜剥離および網膜浮腫（黄斑水腫が挙げられる）の予防的処置および治療的処置のための方法を提供する。「処置」とは、予防的処置および治療的処置の両方を包含する。「予防的」によって、網膜障害（例えば、網膜剥離および網膜浮腫（黄斑水腫が挙げられる））に対する全体または部分での保護を意味する。「治療的」によって、網膜障害自体の改善、およびさらなる網膜障害または既存の障害の増悪に対する全体または部分での保護を意味する。本発明は、網膜剥離および網膜浮腫（黄斑水腫が挙げられる）の処置において特に有用である。
【００１１】
本明細書中で用いられる場合、エンドスタチンの「網膜障害阻害有効量」は、以下のいずれかまたは全てを引き起こすエンドスタチン量である：１）網膜脈管透過性の低下；２）網膜の厚さの低下；または３）網膜剥離の絶対的阻害もしくは程度低下。
【００１２】
用語「エンドスタチンをコードするＤＮＡ配列」は、本明細書中で用いられる場合、全長エンドスタチンまたはエンドスタチンの活性なフラグメント、誘導体、もしくはアナログをコードするＤＮＡを意味し、例えば、このようなＤＮＡは、全長エンドスタチンをコードする全長遺伝子、またはエンドスタチン活性を有する、このようなエンドスタチンのフラグメントもしくは誘導体もしくはアナログをコードする、短縮遺伝子もしくは変異遺伝子であり得る。用語「ＤＮＡ配列」とは、一般に、ポリデオキシリボヌクレオチド分子をいい、より詳細には、３’と隣接する五炭糖の５’炭素との間でのホスホジエステル結合によって互いに連結されたポリデオキシリボヌクレオチドの直鎖シリーズをいう。
【００１３】
従って、１つの実施形態では、本発明は、エンドスタチン、またはエンドスタチン活性を有する、それらのフラグメント、誘導体、もしくはアナログをコードするＤＮＡ配列に関する。
【００１４】
エンドスタチンおよびそれらのフラグメントまたは誘導体をコードするＤＮＡ配列は、その全体が本明細書中に参考として援用される、米国特許第５，８５４，２０５号に示されて記載されている。
【００１５】
用語「エンドスタチン」とは、それぞれ非還元ゲル電気泳動および還元ゲル電気泳動によって決定した場合にサイズが好ましくは１８ｋＤａ〜２０ｋＤａであるタンパク質をいう。用語エンドスタチンはまた、活性な前駆体形態の１８  ｋＤａ〜２０ｋＤａのタンパク質を包含する。全長ヒトエンドスタチンのアミノ酸配列を、配列番号１に示す。ヒトエンドスタチンをコードする核酸配列を、配列番号２に示す。マウスエンドスタチン＋マウスＩｇκリーダー配列のアミノ酸配列を、配列番号３に示す。マウスＩｇκリーダー配列とともにマウスエンドスタチンをコードする核酸配列を、配列番号４に示す。
【００１６】
用語エンドスタチンはまた、１８ｋＤａ〜２０ｋＤａのタンパク質および改変タンパク質のフラグメント、ならびに実質的に類似のアミノ酸配列を有して内皮細胞の増殖を阻害し得るペプチドを包含する。例えば、構造的または化学的に類似のアミノ酸による特定のアミノ酸の置換が、タンパク質の構造もコンホメーションも活性も有意には変更しない、アミノ酸のサイレント置換は、当該分野で周知である。このようなサイレント置換は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【００１７】
用語「エンドスタチン」が、１以上のアミノ酸が全長エンドスタチン（すなわち、配列番号１を有するポリペプチド）のいずれかもしくは両方の末端から除去されているかまたはこのタンパク質の内部領域から除去されているが、得られる分子は内皮細胞の増殖を阻害するためにおよび／または網膜剥離、網膜浮腫および／もしくは眼の血管新生を処置するために有効なままである、短縮タンパク質を包含することが認識される。このような短縮ポリペプチドは、本明細書中では、「フラグメント」と呼ばれる。用語「エンドスタチン」はまた、１以上のアミノ酸がエンドスタチンのいずれかもしくは両方の末端に付加されているかまたはこのタンパク質中の内部位置に付加されているが、得られる分子は、内皮増殖阻害活性を保持する、延長タンパク質または延長ペプチドを包含する。例えば、チロシンが１位に付加された、このような分子は、例えば、１２５Ｉを用いて標識するために有用である。他の放射性同位体を用いた標識は、エンドスタチンレセプターを含む標的細胞を破壊するための分子ツールを提供する際に有用であり得る。「標識」分子（例えば、リシン）を用いた標識は、エンドスタチンレセプターを有する細胞を破壊する機構を提供し得る。延長エンドスタチンポリペプチド、または共有結合により改変されたエンドスタチンポリペプチドは、本明細書中で集合的に、エンドスタチンの「誘導体」といわれる。
【００１８】
「実質的配列相同性」とは、エンドスタチンアナログ配列中のアミノ酸残基配列と、エンドスタチンのアミノ酸残基配列との間の少なくとも約７０％の相同性（好ましくは少なくとも約８０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性）を意味する。
【００１９】
用語エンドスタチンの定義にまた含まれるのは、エンドスタチンタンパク質およびそのペプチドフラグメントの改変物である。このような改変としては、他の分子（天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸が挙げられるがこれらに限定されない）による、特定の部位での天然に存在するアミノ酸の置換が挙げられる。このような置換は、エンドスタチンの生体活性を改変し得、そして生物学的または薬理学的なアゴニストまたはアンタゴニストを生成し得る。このような改変されたポリペプチドは、本明細書中で、「改変体」といわれる。抗腫瘍効果および／または抗脈管形成効果を有することが示された、エンドスタチンの改変体、誘導体、およびフラグメントが公知であり、例えば、公開された国際特許出願番号ＷＯ００６７７７１、ＷＯ００６３２４９、ＷＯ９９３１６１６、ＷＯ９９２９８５５、およびＷ０９９４８９２４（これらの開示は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される）において報告されている。エンドスタチンのこのような改変体、誘導体、およびフラグメントもまた、本発明の方法において有用である。
【００２０】
本発明の実施において有用なポリペプチドは、従来の薬学的処方物を用いて、処置の必要がある個体に送達され得る。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態は、上記で考察した治療的効果のいずれかのための、薬学的に受容可能なキャリアに関連した、薬学的組成物の投与に関する。このような薬学的組成物は、エンドスタチン（例えば、エンドスタチン）、またはエンドスタチンに対する抗イディオタイプ抗体、またはエンドスタチンの模倣物からなり得る。この組成物は、単独で、少なくとも１つの他の薬剤（例えば、安定化化合物）とまたは組み合わせて投与され得、これらは、任意の無菌の生体適合性の薬学的キャリア（生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロースおよび水が挙げられるがこれらに限定されない）中で投与され得る。この組成物は、患者に、単独で、または他の薬剤、薬物もしくはホルモンと組み合わせて投与され得る。
【００２２】
本発明によって包含される薬学的組成物は、以下を含むがこれらに限定されない任意の数の経路によって投与され得る：眼内手段、眼周囲手段、経口手段、静脈内手段、筋肉内手段、関節内手段、動脈内手段、髄内手段、クモ膜下腔内手段、心室内手段、経皮手段、皮下手段、腹腔内手段、鼻腔内手段、腸内手段、局所手段、舌下手段、または直腸手段。
【００２３】
有効成分に加えて、これらの薬学的組成物は、薬学的に用いられ得る調製物への活性な化合物の処理を促進する、賦形剤および補助剤を含む、適切な約学的に受容可能なキャリアを含み得る。処方および投与に関する技術のさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）の最新版に見出され得る。
【００２４】
経口用途についての薬学的調製物は、活性な化合物と固体賦形剤との組み合わせ（必要に応じて、得られる混合物を粉砕する工程および（所望の場合、適切な補助剤を添加した後に）顆粒の混合物を処理して錠剤または糖衣丸のコアを得る工程を包含する）を通して入手され得る。適切な賦形剤は、以下である：糖質またはタンパク質の充填剤（例えば、糖（ラクトース、スクロース、マンニトールもしくはソルビトールが挙げられる）；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモまたは他の植物由来の澱粉；セルロース（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム）；ゴム（アラビアゴムおよびトラガカントゴムを含む）；ならびにタンパク質（例えば、ゼラチンおよびコラーゲン）。所望の場合、崩壊剤または可溶化剤（例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはそれらの塩（例えば、アルギン酸ナトリウム））が添加され得る。
【００２５】
糖衣丸コアは、適切なコーティング（例えば、濃縮した糖溶液）に関連して用いられ得、このコーティングはまた、アラビアゴム、滑石、ポリビニルピロリドン、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物を含む。染料または色素は、製品の識別または活性化合物の量（すなわち、投薬量）の特徴付けのために、錠剤または糖衣丸コーティングに添加され得る。
【００２６】
経口的に用いられ得る薬学的調製物としては、ゼラチンから作製された押し込みばめ式カプセル剤、ならびにゼラチンおよびコーティング（例えば、グリセロールまたはソルビトール）から作製された軟質のシールされたカプセル剤が挙げられる。押し込みばめカプセル剤は、充填剤または結合剤（例えば、ラクトースまたは澱粉）、滑沢剤（例えば、滑石またはステアリン酸マグネシウム）、および必要に応じて安定剤と混合された、活性成分を含み得る。軟質カプセル剤では、この活性な化合物は、安定剤を含むかまたは含まない、適切な液体（例えば、脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコール）中に溶解または懸濁され得る。
【００２７】
非経口投与に適切な薬学的処方物は、水溶液（好ましくは生理学的に適合性の緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的に緩衝化された生理食塩水））中に処方され得る。水性注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を上昇させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストラン）を含み得る。さらに、活性な化合物の懸濁物は、適切な油性注射用懸濁物として調製され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）、またはリポソームが挙げられる。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーもまた、送達のために用いられ得る。必要に応じて、この懸濁物はまた、高度に濃縮された溶液の調製を可能にする、適切な安定剤または化合物の溶解度を上昇させる薬剤を含み得る。
【００２８】
局所投与または鼻腔投与については、透過されるべき特定の関門に適切な浸透剤が、この処方物中で用いられる。このような浸透剤は一般に当該分野で公知である。
【００２９】
本発明の薬学的組成物は、例えば、従来の混合プロセス、溶解プロセス、顆粒化プロセス、糖衣作製プロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、封入プロセスまたは凍結乾燥プロセスによって、当該分野で公知の様式で製造され得る。
【００３０】
この薬学的組成物は、塩として提供され得、そして以下を含むがこれらに限定されない多くの酸を用いて形成され得る：塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸など。塩は、水性溶媒または他のプロトン溶媒中に、対応する遊離塩基形態よりも可溶性である傾向がある。他の場合には、好ましい調製物は、以下のうちのいずれかまたは全てを含み得る、使用前に緩衝液と合わされる、凍結乾燥粉末であり得る：４．５〜５．５のｐＨ範囲にある、１〜５０ｍＭヒスチジン、０．１％〜２％スクロース、および２〜７％マンニトール。
【００３１】
薬学的組成物が調製された後、これらは、適切な容器中に配置され得、そして処置について示した状態の処置に関してラベルされ得る。エンドスタチンの投与に関して、このようなラベル付けとしては、投与の量、頻度および方法が挙げられる。
【００３２】
本発明における使用に適切な薬学的組成物としては、活性な成分が、意図される目的を達成するための有効量で含まれる組成物が挙げられる。有効量の決定は、充分に当業者の能力内である。
【００３３】
治療的に有効な用量の活性薬剤は、（例えば、内皮細胞の）細胞培養アッセイまたは動物モデル（通常、マウス、ウサギ、イヌまたはブタ）のいずれかで最初に評価され得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するために用いられ得る。次いで、このような情報は、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定するために用いられ得る。
【００３４】
治療有効用量とは、症状または状態を改善する有効成分（例えば、エンドスタチンまたはそのフラグメント、エンドスタチンに対する抗体、エンドスタチンのアゴニスト、アンタゴニストもしくはインヒビター）の量をいう。治療効力および毒性は、細胞培養物または実験動物中の標準的な薬学的手順（例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量））によって決定され得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、そしてこれは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現され得る。大きな治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトでの使用について一定範囲の投薬量を処方する際に有用である。このような組成物中に含まれる投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどまたはまったくないＥＤ５０を含め、一定の循環濃度範囲内にある。投薬量は、用いられる投薬形態、患者の感受性および投与経路に依存して、この範囲内で変化する。
【００３５】
正確な投薬量は、処置を必要とする被験体に関連した因子に照らして、実施者によって決定される。投薬量および投与は、充分なレベルの活性部分を提供するように、または所望の効果を維持するように、調整される。考慮され得る因子としては、疾患状態の重篤度、被験体の一般的健康状態、被験体の年齢、体重および性別、食事、投与時間および投与頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、ならびに治療に対する寛容／応答が挙げられ得る。長期作用性薬学的組成物は、特定の処方物の半減期およびクリアランス速度に依存して、３〜４日間毎に、毎週、または２週間に一度、投与され得る。
【００３６】
正常な投薬量は、例えば、外因的に生成されたエンドスタチンが投与される場合、投与経路および投与方法に依存して、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは２．５ｍｇ／ｋｇ／日〜２０ｍｇ／ｋｇ／日で変動し得る。特定の投薬量および送達方法についての指針は、文献に提供され、そして当該分野の実施者に一般的に利用可能である。当業者は、タンパク質またはそれらのインヒビターについてとは異なる、ヌクレオチドについての処方物を用いる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、条件、位置などについて特異的である。種々の生分解性ポリマーマトリクスおよび生体適合性ポリマーマトリクス（マイクロカプセル、ナノスフェアおよびインプラントが挙げられる）は、本発明の実施において有用である。
【００３７】
マイクロスフェアは、活性薬物を含む細かい球状粒子である。これらは、主に粒子のサイズによってナノスフェアと区別される；マイクロスフェアは、約１０００μｍ未満の直径を有し、一方、ナノスフェアは、サブミクロン（＜１μｍ）である。マイクロスフェア系は、均質なモノリシックなマイクロスフェア（ここでは、薬物が、ポリマーマトリクス全体に均質に溶解または分散されている）またはレザバ型マイクロスフェア（ここでは、薬物が、ポリマーマトリクス膜殻によって取り囲まれている）のいずれかを含む。
【００３８】
モノリシックな系およびレザバ系はまた、組み合わされ得る。例えば、活性な薬物は、レザバ型マイクロスフェア中のポリマー表面中に分散され得るかまたはこのポリマー表面に吸着され得る。
【００３９】
生分解性ポリマーは、純度が様々な、天然物質または合成物質のいずれかから構成され得る。天然のポリマーとしては、以下が挙げられる：ポリペプチドおよびタンパク質（例えば、アルブミン、フィブリノーゲン、ゼラチン、コラーゲン）、多糖（例えば、ヒアルロン酸、澱粉、キトサン）、およびウイルスエンベロープおよび生存細胞（例えば、赤血球、線維芽細胞、筋芽細胞）。天然の物質は、マイクロカプセル化プロセスにおいて架橋を必要とし、このことは、ポリマーおよび包埋される薬物の変性をもたらす。その結果、合成ポリマーは、最も一般的に用いられる。頻繁に用いられる合成ポリマーとしては、ポリ（−ヒドロキシ）酸（例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシ酪酸、およびコポリ（乳酸／グリコール酸）（ＰＬＧＡ）が挙げられる。これらの化合物は、生体適合性であり、免疫原性を欠き、そしてこれらが（生体侵食速度を制御するために）容易に成形されることを可能にする物理的特性を有する。
【００４０】
コロイド粒子状キャリアもまた、エンドスタチンを送達するための本発明の方法において有用であり得る。リポソームは、好ましいコロイド状ビヒクルであり、親水性薬および疎水性薬の両方についてキャリアとして作用し得るリン脂質二重層から構成される。リポソームは、例えば、中性脂質、荷電したリン脂質、およびコレステロールから形成され得る。リポソームの表面への両染性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））の付加は、リポソームのクリアランスを緩慢にし得る。
【００４１】
ＰＥＧで改変したエンドスタチンの投与もまた、本発明の範囲内にある。ＰＥＧは、反復するエチレンオキシドサブユニットおよび化学的に活性化され得る２つの末端ヒドロキシル基から構成されるポリマーである。ＰＥＧ分子は、多数の異なる配置で入手される。ＰＥＧ鎖は、１以上のＰＥＧ鎖がリンカー（例えば、リジンまたはトリアジン）によって連結された、直鎖構造および分枝構造を含む。ＰＥＧは、単一の部位または複数の部位において、エンドスタチンに結合（好ましくは共有結合）され得る。分枝鎖ＰＥＧが単一の部位または直鎖ＰＥＧよりも少ない部位において結合するので、分岐したＰＥＧは、ネイティブな分子の生物学的活性と相互作用する可能性が、複数の小さな直鎖状ＰＥＧの結合よりも低いかもしれず、それゆえ、好ましい。タンパク質の経口投与に適切な薬学的処方物は、例えば、米国特許第５，００８，１１４号；同第５，５０５，９６２号；同第５，６４１，５１５号；同第５，６８１，８１１号；同第５，７００，４８６号；同第５，７６６，６３３号；同第５，７９２，４５１号；同第５，８５３，７４８号；同第５，９７２，３８７号；同第５，９７６，５６９号；および同第６，０５１，５６１号に開示され、これらの全ては、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【００４２】
エンドスタチンは、遺伝子治療法を用いて、処置の必要がある固体に送達され得る。当該分野で利用可能な遺伝子治療に関する方法のいずれかが、本発明に従って用いられ得る。例示的な方法は、以下に記載される。
【００４３】
好ましい局面では、この治療剤は、エンドスタチンまたはそのフラグメントもしくはキメラタンパク質を適切な宿主中で発現する発現ベクターの一部である、エンドスタチンをコードする核酸を含む。特に、このような核酸は、ポリペプチドコード領域に作動可能に連結されたプロモーターを有し、このプロモーターは、誘導性または構成性であり、そして必要に応じて組織特異的である。別の特定の実施形態では、ポリペプチドコード配列および任意の他の所望の配列が、ゲノム中での所望の部位での相同組換えを促進する領域と隣接しており、従って、所望の核酸の染色体内発現を提供する、核酸分子が用いられる。
【００４４】
エンドスタチンをコードする核酸の、患者への送達は、直接的（この場合、患者は、直接的にこの核酸または核酸保有ベクターに曝露される）または間接的（この場合、細胞が最初にこの核酸でインビトロにて形質転換され、次いで患者内に移植される）のいずれであってもよい。これらの２つのアプローチは、それぞれ、インビボでの遺伝子治療またはエキソビボでの遺伝子治療として公知である。
【００４５】
特定の実施形態では、エンドスタチンをコードする核酸は、インビボで直接的に投与され、ここで、この核酸は発現されて、コードされた産物を生成する。これは、当該分野で公知の多数の方法のうちのいずれかによって（例えば、これを、適切な核酸配列を適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、そしてこれを（例えば、欠損または減弱したレトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いた感染により）投与して細胞内になるようにすること（例えば、米国特許第４，９８０，２８６号および以下で言及する他のものを参照のこと）によって、または裸のＤＮＡの直接注射（例えば、Ｂｌｅｚｉｎｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，３４３−３４８（１９９９）を参照のこと）によって、または微粒子ボンバードメントの使用（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）によって、または脂質または細胞表面レセプターまたはトランスフェクト剤でコーティングすることによって、リポソーム（例えば、Ｃｈｅｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５９，３３０８−３３１２（１９９９）を参照のこと）、微粒子もしくはマイクロカプセル中にカプセル化することによって、またはこれを、核に侵入することが公知のペプチドに連結した状態で投与することによって、レセプター媒介エンドサイトーシスを受けるリガンドに結合した状態で投与すること（例えば、米国特許第５，１６６，３２０号；同第５，７２８，３９９号；同第５，８７４，２９７号；および同第６，０３０，９５４号（これらは全て、それらの全体が、本明細書中に参考として援用される））（これは、レセプターを特異的に発現する細胞型を標的化するために用いられ得る）などによって）達成され得る。別の実施形態では、リガンドがエンドソームを破壊して核酸がリソソーム分解を回避するのを可能にする膜融合性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ウイルスペプチドを含む核酸−リガンド複合体が形成され得る。なお別の実施形態では、この核酸は、特異的レセプターを標的化することにより、細胞特異的取り込みおよび発現にインビボで標的化され得る（例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ９２／０６１８０；ＷＯ９２／２２６３５；ＷＯ９２／２０３１６；ＷＯ９３／１４１８８；およびＷＯ９３／２０２２１）。あるいは、この核酸は、細胞内に導入されて、相同組換えによって発現に関する宿主細胞のＤＮＡ内に取り込まれ得る（例えば、米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，４１６，２６０号；同第５，５７４，２０５号を参照のこと）。
【００４６】
特定の実施形態では、エンドスタチンをコードする核酸を含むウイルスベクターが用いられる。例えば、レトロウイルスベクターが用いられ得る（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；同第５，６０４，０９０号；および同第５，８３４，１８２号を参照のこと）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングおよび宿主細胞のＤＮＡへの組み込みに必要ではないレトロウイルス配列を欠失するように改変されている。遺伝子治療において用いられるべき、エンドスタチンをコードする核酸は、ベクター中にクローニングされ、このベクターは、患者へのこの遺伝子の送達を容易にする。
【００４７】
アデノウイルスは、遺伝子治療において用いられ得る別の型のウイルスベクターである。アデノウイルスゲノムは、約３６キロベース対の直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分枝である。ウイルスゲノムの各末端は、逆方向末端反復配列（すなわち、ＩＴＲ）として公知の短い配列を有する。ＩＴＲは、ウイルス複製に必要である。アデノウイルスの十分に特徴付けられた分子遺伝学により、遺伝子移入についてこれを有利なベクターとする。このウイルスゲノムの一部は、外来起源のＤＮＡで置換され得る。さらに、組換えアデノウイルスは、構造的に安定であり、再配置されたウイルスが、多量の増幅後に観察されない。
【００４８】
アデノウイルスは、遺伝子を気道上皮に送達するための特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは天然において、気道上皮に感染し、この場所でこれらは、軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく系の他の標的は、肝臓細胞、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは、分裂していない細胞に感染し得るという利点を有する。アデノウイルスに基づく遺伝子治療を実施するための方法は、例えば、米国特許第５，８２４，５４４号；同第５，８６８，０４０号；同第５，８７１，７２２号；同第５，８８０，１０２号；同第５，８８２，８７７号；同第５，８８５，８０８号；同第５，９３２，２１０号；同第５，９８１，２２５号；同第５，９９４，１０６号；同第５，９９４，１３２号；同第５，９９４，１３４号；同第６，００１，５５７号；および同第６，０３３，８８４３号に記載される。これらは全て、それらの全体が、本明細書中に参考として援用される。
【００４９】
特定の実施形態では、アデノウイルスベクターを用いて遺伝子治療の目的で導入されるべき核酸は、コード領域に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含み、その結果、この核酸の発現は、適切な転写インデューサーの存在または不存在を制御することによって制御可能である。
【００５０】
アデノウイルスベクターへのゲノムエレメントの組み込みは、エンドスタチンをコードするＤＮＡ配列の増強された発現を提供し得る。従って、本発明の別の局面によれば、エンドスタチンをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列、およびこのようなＤＮＡ配列の発現に影響を与える少なくとも１つのゲノムエレメントを含むアデノウイルスベクターが提供される。用語「ゲノムエレメント」は、上記で定義されたとおりに用いられる。このようなゲノムエレメントとしては、イントロン、５’非翻訳領域、および３’非翻訳領域、ならびにイントロンならびに３’非翻訳領域および５’非翻訳領域の一部が挙げられるがこれらに限定されない。これらのアデノウイルスベクターは、本明細書中上記に記載の通りであり得る。このＤＮＡ配列を制御するプロモーターは、本明細書中に記載されるプロモーターおよび当業者に公知のプロモーターから選択され得る。
【００５１】
エンドスタチンをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を含む、感染性であるが複製欠損性のウイルス粒子からなるベクターは、宿主における脈絡膜血管新生を処置するために有効な量で、インビボで宿主に投与される。この宿主は、哺乳動物宿主（ヒト宿主および非ヒト霊長類宿主）であり得る。
【００５２】
このアデノウイルスベクターは、哺乳動物宿主に、血液１ｍｌあたり１，０００，０００ｎｇ／ｍｌまでまたは血液１ｍｌあたり１ｍｇのエンドスタチンレベルを提供するために有効な量で投与され得る。このアデノウイルスベクターは、１，０００，０００ｎｇ／ｍｌまでのエンドスタチンレベルを提供するに有効な量で哺乳動物宿主へと投与され得るが、いくつかのエンドスタチン（例えば、エンドスタチン）は、本発明のアデノウイルスベクターで形質導入された哺乳動物細胞によって発現された場合、非哺乳動物細胞（例えば、酵母細胞または細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）によって発現されたエンドスタチンよりも顕著に活性が高い（約１，０００倍活性が高い）ことが見出されている。従って、所望の抗血管新生効果を得るためには、一般に、酵母または細胞によって発現された顕著により高いレベルのエンドスタチンを哺乳動物に提供することとは対照的に、アデノウイルスベクターを哺乳動物宿主に投与することにより、哺乳動物宿主にエンドスタチンをより低いレベルで提供し得る。
【００５３】
１つの実施形態では、哺乳動物宿主に投与された場合、このアデノウイルスベクターは、宿主中の基底エンドスタチンレベルの約２〜２０倍であるエンドスタチンレベルを提供するために有効な量で投与される。一般に、このような実施形態では、このアデノウイルスベクターは、血液１ｍｌあたり少なくとも約３００ｎｇ、好ましくは約３００ｎｇ／ｍｌ〜約３０００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約５００ｎｇ／ｍ〜約１５００ｎｇ／ｍｌのレベルで活性なポリペプチドの発現を提供するために有効な量で哺乳動物宿主に投与される。
【００５４】
別の実施形態では、ウイルスベクターは、約１０８プラーク形成単位〜約１０１４プラーク形成単位、好ましくは約１０８プラーク形成単位〜約１０１１プラーク形成単位、より好ましくは約１０９プラーク形成単位〜約１０１０プラーク形成単位の量で投与される。上記の量のアデノウイルスベクターが好ましい。
【００５５】
感染性ベクター粒子は、（例えば、静脈内投与（例えば、末梢静脈注射を介して）によって）全身投与され得るか、または門脈を介して、胆管へと、筋肉内に、腹腔内にもしくは鼻腔内に投与され得る。あるいは、感染性ベクター粒子は、例えば、眼内注射または眼周囲注射によって局所的に投与され得る。このような注射は、前眼房または後眼房のいずれかに対して（例えば、眼房水または硝子体液に対して）であり得る。あるいは、この注射は、例えば、網膜の後ろへのベクター含有溶液のアリコート（例えば、１アリコートあたり１〜１０マイクロリットル）の注射によって、網膜下においてであり得、その後、この溶液は吸収され、そしてこの感染性ベクター粒子は眼組織の局所細胞に感染して活性なポリペプチドを生成する。このような投与は、単回注射、同日に投与される複数回注射、数週間もしくは数ヶ月の期間にわたって投与される単回注射、または数週間もしくは数ヶ月の期間にわたって投与される複数回注射のいずれかを含み得る。
【００５６】
このベクター粒子は、患者への投与に適切な、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて投与され得る。このキャリアは、液体キャリア（例えば、生理食塩水溶液）または固体キャリア（例えば、マイクロキャリアビーズ）であり得る。
【００５７】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）もまた、腫瘍についてのエンドスタチン遺伝子治療（例えば、Ｎｇｕｙｅｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５８，５６７３−５６７７（１９９８）を参照のこと）を含め、遺伝子治療における使用が提唱されている。ＡＡＶを生成して利用するための方法は、例えば、米国特許第５，１７３，４１４号；同第５，２５２，４７９号；同第５，５５２，３１１号；同第５，６５８，７８５号；同第５，７６３，４１６号；同第５，７７３，２８９号；同第５，８４３，７４２号；同第５，８６９，０４０号；同第５，９４２，４９６号；および同第５，９４８，６７５号に記載される。これらは全て、それらの全体が、本明細書中に参考として援用される。
【００５８】
遺伝子治療に対する別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染のような方法によって、組織培養中の細胞に遺伝子を移入することを含む。通常、移入の方法は、選択マーカーを細胞に移入することを含む。次いで、これらの細胞は選択下に配置されて、移入された遺伝子を取り込んで発現している細胞が単離される。次いで、これらの細胞は、患者に送達される。
【００５９】
この実施形態では、この核酸は、得られる組換え細胞のインビボでの投与の前に細胞中に導入される。このような導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスベクターもしくはバクテリオファージベクターの感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子移入、マイクロセル媒介遺伝子移入、スフェロプラスト融合などを含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の任意の方法によって実施され得る。多数の技術が、細胞内への外来遺伝子の導入について当該分野で公知であり、本発明に従って用いられ得る。ただし、レシピエント細胞の必要な発生機能および生理学的機能は破壊されない。この技術は、細胞へのこの核酸の安定な移入を提供すべきであり、その結果、この細胞は、この細胞によって発現可能であり、好ましくはその細胞の子孫に遺伝可能でかつ発現可能である。別の実施形態では、その細胞によって通常は発現されないかまたは低いレベルで発現される細胞において、内因性遺伝子は、強力なプロモーターをこの内因性遺伝子に作動可能に連結することによって活性化され得、従って、内因性遺伝子を高レベルで発現する細胞を提供し得、このことにより、その細胞によるエンドスタチンの合成および分泌がもたらされ得る。
【００６０】
このような細胞（すなわち、内因性または外因性の遺伝子または核酸のいずれかから高レベルのタンパク質を生成する細胞）の生成および投与のための方法は、とりわけ、米国特許第５，６４１，６７０号；同第５，７３３，７６１号；同第５，９６８，５０２号；同第６，０４８，７２９号；同第６，０５４，２８８号；同第６，０６３，６３０号；および同第６，１８７，３０５号に記載される。好ましい実施形態では、エンドスタチン産生細胞は、マイクロカプセル化された形態で（例えば、アルギン酸ナトリウムまたはアルギン酸カルシウムポリＬ−リジンアルギネート中にマイクロカプセル化された細胞の形態で）送達される（例えば、Ｒｅａｄら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９，２９−３４（２００１年１月）およびＪｏｋｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９，３５−３９（２００１年１月）を参照のこと）。マイクロカプセル化された細胞は、眼の近位に、またはこれらの細胞によって生成されたエンドスタチンが被験体の（例えば、肝臓における）血流に最も迅速に入る部位に移植され得る。使用が想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、そして当業者によって決定され得る。
【００６１】
遺伝子治療の目的で核酸が導入され得る細胞は、任意の所望の、利用可能な細胞型を包含し、そして以下が挙げられるがこれらに限定されない：上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；血球（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核芽球、顆粒球）；種々の幹細胞または前駆細胞（特に、（例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られたような）造血幹細胞または造血前駆細胞）。
【００６２】
好ましい実施形態では、遺伝子治療に用いられる細胞は、患者に対して自己である。
【００６３】
組換え細胞が遺伝子治療に用いられる実施形態では、エンドスタチンをコードする核酸は細胞に導入され、その結果、この核酸は、この細胞またはその子孫によって発現され得、次いで組換え細胞は、治療効果についてインビボで投与される。特定の実施形態では、幹細胞または前駆体細胞が用いられる。単離されてインビトロで維持され得る、任意の幹細胞および／または前駆細胞は、本発明のこの実施形態に従って潜在的に用いられ得る。このような幹細胞としては、造血幹細胞（ＨＳＣ）、上皮組織（例えば、皮膚および腸の内層）の幹細胞、胚性心臓筋肉細胞、肝臓幹細胞（例えば、ＷＯ９４／０８５９８を参照のこと）および神経幹細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６４】
上皮幹細胞（ＥＳＣ）またはケラチノサイトは、皮膚および腸の内層のような組織から、公知の手順によって入手され得る。皮膚のような重層上皮組織では、基底膜に最も近い層である胚層内で幹細胞の有糸分裂によって更新が生じる。腸の内層内の幹細胞は、この組織の迅速な更新速度を提供する。患者またはドナーの皮膚または腸の内層から得られたＥＳＣまたはケラチノサイトは、組織培養において増殖され得る。ＥＳＣがドナーによって提供される場合、移植片対宿主反応性の抑制のための方法（例えば、照射、中程度の免疫抑制を促進する薬物投与または抗体投与）もまた用いられ得る。
【００６５】
造血幹細胞（ＨＳＣ）に関しては、単離、増殖および維持を提供する任意の技術が本発明のこの実施形態において用いられ得る。これが達成され得る技術としては、以下が挙げられる：（ａ）将来の宿主（すなわち、ドナー）から単離された骨髄細胞からのＨＳＣの単離およびＨＳＣ培養物の確立、または（ｂ）同種異系もしくは異種であり得る、以前に確立された長期ＨＳＣ培養物の使用。非自己ＨＳＣは、好ましくは、詳細の宿主／患者の移植免疫反応を抑制する方法に関連して用いられる。本発明の特定の実施形態では、
ヒト骨髄細胞は、針吸引によって後部腸骨稜から入手され得る（例えば、Ｋｏｄｏら，１９８４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．７３：１３７７−１３８４を参照のこと）。ＨＳＣは、高度に富化され得るかまたは実質的に純粋な形態にされ得る。この富化は、長期培養の前、間または後に達成され得、そして当該分野で公知の任意の技術によって実施され得る。骨髄細胞の長期培養物は、例えば、改変されたＤｅｘｔｅｒ細胞培養技術（Ｄｅｘｔｅｒら，１９７７，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９１：３３５）またはＷｉｔｌｏｃｋ−Ｗｉｔｔｅ培養技術（ＷｉｔｌｏｃｋおよびＷｉｔｔｅ，１９８２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：３６０８−３６１２）を用いて確立および維持され得る。
【００６６】
本明細書において参照した全ての特許、刊行物（公開された特許出願を含む）ならびにデータベース登録番号および寄託登録番号の全ての開示は、その全体が、あたかも各々のこのような個々の特許、刊行物、ならびにデータベース登録番号および寄託登録番号が具体的かつ個々に参考として援用されると示されたかのように、本明細書中に参考として特に援用される。
【００６７】
しかし、本発明の範囲は、上記の特定の実施形態に限定されるべきではないことが理解される。本発明は、特に記載した以外にも実施され得、そして添付の特許請求の範囲の範囲に依然として存在し得る。
【００６８】
なおさらなる局面は、網膜剥離または網膜浮腫に罹患した個体における網膜剥離または網膜浮腫の処置のための薬の製造におけるエンドスタチンの使用に関し、ここで、このエンドスタチンは、特に、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、またはこのエンドスタチンは、この開示全体を通して定義され、そして記載される。
【実施例】
【００６９】
（実施例１：アデノウイルスベクターの作製：方法１）
マウスエンドスタチン（ｍＥｎｄｏ）ｃＤＮＡを、プライマー５’−ＡＣＴ  ＧＧＴ  ＧＡＣ  ＧＣＧ  ＧＣＣ  ＣＡＴ  ＡＣＴ  ＣＡＴ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＣＣ−３’（配列番号６）および５’−ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＴＡＴ  ＣＧＡ  ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＡＧＧ  ＣＣＴ  ＡＴ−３’（配列番号７）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からのマウスＸＶＩＩＩ型コラーゲンクローンＩＤ  ７４８９８７から増幅する（５９８ｂｐのＦ１フラグメント）。このマウス免疫グロブリンｋ鎖リーダー配列（Ｉｇ−ｋリーダー）を、プライマー５’−ＣＡＣ  ＴＧＣ  ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＴＡＴ  ＣＧ−３’（配列番号８）および５’−ＣＴＧ  ＡＴＧ  ＡＧＴ  ＡＴＧ  ＧＧＣ  ＣＧＣ  ＧＴＣ  ＡＣＣ  ＡＧＴ  ＧＧ−３’（配列番号９）（１４７ｂｐのＦ２フラグメント）を用いてｐＳｅｃＴａｇ２（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からＰＣＲ増幅する。ＰＣＲを、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、以下の条件下で３５サイクル実施する：９５℃のホットスタートを３分間、９５℃の変性を１分間、５５℃のアニーリングを１分間、および７２℃の伸長を２分間。これらのＤＮＡフラグメントをゲル精製する。ｓｉｇ−ｍＥｎｄｏキメラＤＮＡ（７１８ｂｐ）を、上記で作製したＦ１  ＤＮＡフラグメントおよびＦ２  ＤＮＡフラグメントを、マウスＩｇ−ｋリーダー配列およびマウスエンドスタチンｃＤＮＡをアセンブリするためのテンプレートとして用いて、ＰＣＲスプライスオーバーラップ伸長によって生成する。ＰＣＲを、プライマー５’−ＣＡＣ  ＴＧＣ  ＴＴＡ  ＣＴＧ  ＧＣＴ  ＴＡＴ  ＣＧ−３’（配列番号８）および５’−ＡＡＧ  ＧＧＣ  ＴＡＴ  ＣＧＡ  ＴＣＴ  ＡＧＣ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＡＧＧ  ＣＣＴ  ＡＴ−３’（配列番号１０）を用い、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて実施する。ＰＣＲを、以下の条件下で３５サイクル行う：９５℃のホットスタートを３分間、９５℃の変性を１分間、６０℃のアニーリングを１分間、および７２℃の伸長を２分間。
【００７０】
ｐＡｖｍＥｎｄｏＬｘｒアデノウイルスシャトルプラスミドを、７１８−ｂｐのｓｉｇ−ｍＥｎｄｏキメラＤＮＡを、アデノウイルスシャトルプラスミドｐＡｖＦ９ｌｘｒのＮｈｅｌ−Ｃｌａｌ部位に挿入することによって構築する。Ｎｈｅｌ−Ｃｌａｌ部位は、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターの下流にあり、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ポリアデニル化シグナルの上流にある。ＡｓｃＩおよびＮｈｅ１で消化されたシミアンサイトメガロウイルス（ｓＣＭＶ）プロモーターフラグメントで、ｐＡｖｍＥｎｄｏＬｘｃ中のＲＳＶプロモーターを置換する。これは、他の点では、ｐＡｖｍＥｎｄｏＬｘｒと同一である。両方のシャトルプラスミドは、Ｃｒｅ／ｌｏｘ媒介組換えのためのＬｏｘＰ部位を含む。ｐＡｖｍＥｎｄｏＬｘｒアデノウイルスプラスミドおよびｐＡｖｍＥｎｄｏＬｘｃアデノウイルスプラスミドにおける導入遺伝子の配列は、直接的配列決定分析によって確認される。
【００７１】
ｓｉｇ−ｍＥｎｄｏキメラをコードする組換えＡｖ３ｍＥｎｄｏ（Ｅ１、Ｅ２ａおよびＥ３が欠失している）を、２つのプラスミドｐＳＱ３およびｐＡｖｍＥｎｄｏＬｘｒのＣｒｅ／ｌｏｘ媒介組換えによって作製する。ｐＳＱ３プラスミドは、ｌｏｘＰ部位、続いてＡｖ３ゲノムを含み、左末端の逆方向反復配列（ＩＴＲ）からＥ１ａの末端までの領域が欠失している。ｐＡｖｍＥｎｄｏＬｘｒおよびｐＳＱ３を、それぞれ、ＮｏｔＩ制限酵素およびＣｌａＩ制限酵素によって最初に線状化する。一過性トランスフェクションを、リン酸カルシウム哺乳動物トランスフェクション系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、２９３細胞（６ウェルプレートの１ウェルあたり４×１０５細胞）を用いて実施する。リン酸化ルシム−ＤＮＡ沈澱を、４．８ｍｇの線状化ｐＡｖｍＥｎｄｏＬｘｒ、１２ｍｇの線状化ｐＳＱ３、６ｍｇのｐｃｍｖＣｒｅ、および６ｍｇのｐｃｍｖＥ２ａを、合計体積１．８ｍｌにおいて調製する。０．６ｍｌのリン酸カルシウム−ＤＮＡ沈澱を各ウェルに添加する。２９３細胞を、リン酸カルシウム−ＤＮＡ沈澱とともに３７℃にて１６時間インキュベートする。この沈澱を除去し、そして細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で線状する。トランスフェクションの１５日後、細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察する。次いで、これらの細胞および培地を、掻き取りによって収集する。粗製ウイルス溶解産物を、５サイクルの凍結および解凍によって調製する。
【００７２】
このＡｖ３ｍＥｎｄｏベクターを、ＣＰＥが観察されるまで、５％  ＦＢＳを含むＲｉｃｈｔｅｒ  ＣＭ中で０．３ｍＭデキサメタゾンを用いてＳ８細胞中で再増幅する。アデノウイルスベクター力価（１ミリリットルあたりの粒子）および生物学的力価（１ミリリットルあたりのプラーク形成単位［ＰＦＵ］）を、記載の通りに決定する（Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら，１９９６）。ＣＭＶプロモーターによって駆動される、ｓｉｇ−ｍＥｎｄｏを含む組換えＡｖ３ＣｓｍＥｎｄｏを、ｐＳＱ３およびｐＡｖｍＥｎｄｏＬｘｃのＣｒｅ／ｌｏｘ媒介組換えによって同じ様式で作製する。精製されたＡｖ３ｍＥｎｄｏ、Ａｖ３ＣｓｍＥｎｄｏ、およびコントロールＡｖ３Ｎｕｌｌの適切なゲノム構造を、制限消化およびサザンブロット分析によって確認する。Ａｖ３ｍＥｎｄｏおよびＡｖ３ＣｓｍＥｎｄｏシードロットを、複製能力のあるアデノウイルス（ＲＣＡ）についてネガティブであることを確認する。
【００７３】
Ａｖ３ｍＥｎｄｏ形質転換Ｓ８細胞からの上清は、エンドスタチンの推定サイズである２０ｋＤａのタンパク質を含み、これは、ＨＵＶＥＣ細胞のＶＥＧＦ１６５誘導性移動を強力に阻害し、そしてＥＬＩＳＡは、１０６個のＡｖ３ｍＥｎｄｏ形質導入Ｈｅｐ３Ｂ細胞が、２４時間あたり１〜２μｇのマウスエンドスタチンを分泌することを実証した。
【００７４】
（アデノウイルスベクターの作製：方法２）
マウスｃＤＮＡを、急速凍結した２週齡のＣ５７ＢＵ６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の肝臓からＲＮＡを単離（ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）し、そしてモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）によって処理することによって入手する。マウスエンドスタチン遺伝子を、センスプライマー５’−ＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＣＡＴＡＣＴＣＡＴＣＡＧＧＡＣＴＴ−３’（配列番号１１）およびアンチセンスプライマー５’−ＡＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＴＴＡＴＣＴＡＧＣＴＡＣＴＡＧ−３’（配列番号１２）を用いたＰＣＲによってＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローニングする。１８アミノ酸のＥ３／１９Ｋシグナル配列ＭＲＹＭＩＬＧＬＬＡＬＡＡＶＣＳＡＡ（配列番号１３）を、センスプライマー５’−ＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＣＡＴＧＡＴＴＴＴＡＧＧＣＴＴＧＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧＣＧＧＣＡＧＴＣＴＧＣＡＧＣＧＣＧＧＣＣＣＡＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＡＴＣＡＧＧＡＣＴＴＴＣＡＧ−３’（配列番号１４）およびアンチセンスプライマー（上記の通り）を用いたＰＣＲによってエンドスタチン配列から上流に挿入する。プラスミドＤＮＡをＤＨ５細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で増幅し、そしてシグナル配列−マウスエンドスタチン（ｓｓ−ｍＥｎｄｏ）配列を確認する（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ３１０自動シークエンサー；ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。
【００７５】
このｓｓ−ｍＥｎｄｏ構築物をＥｃｏＲＩで消化し、そしてアデノウイルスシャトルプラスミドｐＡｄ／ＣＭＶ．１のマルチプルクローニングサイトへの平滑末端連結によってクローニングする。得られたプラスミドを５型Ｅ１  Ａ／Ｂ欠損Ａｄ２と組換え、そしてこれを用いて２９３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）に感染させる。プラークＤＮＡを、プロテイナーゼＫ消化、フェノール抽出およびエタノール沈澱を用いて抽出し、そしてＰＣＲによってｓｓ−ｍＥｎｄｏについてスクリーニングする。得られたウイルスＡｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏを、２９３細胞中で増幅する。類似のストラテジーを用いて、β−ｇａｌについての遺伝子を含むコントロールの組換えウイルス（Ａｄ−ｆ３−ｇａｌ）およびホタルルシフェラーゼについての遺伝子を含むコントロールの組換えウイルス（Ａｄ−ｌｕｃ）を作製する。ウイルスを、２９３細胞において標準的なプラーク形成アッセイを用いて力価測定する。細胞を、１０％  ＦＣＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、０．５μｇ／ｍｌ  Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ、および４ｍＭグルタミン（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を含むＤＭＥＭからなる完全培地中で増殖させる。細胞を、Ａｄ−ｓｓ−ｍＥｎｄｏ、Ａｄ−ｌｕｃまたはウイルスなしで０．１〜１００の範囲のＭＯＩ（１．０ｍｌの完全培地中１０６細胞あたり１０５〜１０８ｐｆｕ）で感染させ、そして３７℃にて２４時間インキュベートする。上清を２×ｇにて５分間遠心分離し、そして競合ＥＩＡ（Ｃｙｔｉｍｍｕｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐａｒｋ，ＭＤ）を製造業者の指示に従って用いて、エンドスタチンについてアッセイする。２９３細胞の上清をセルロースカラム（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−１０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）において１０倍濃縮し、そして５７０ｎｇ／ｍｌのウサギ抗マウスエンドスタチンポリクローナルＩｇＧ抗体（Ｃｙｔｉｍｍｕｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから贈与された）を用いたウェスタンブロッティング（ＮｕＰＡＧＥ；Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって分析する。ＥＩＡマウスエンドスタチン標準をポジティブコントロールとして用いる。このマウス結腸腺癌細胞株ＭＣ３８（Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｂｒａｎｃｈ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにおいて開発された）のアデノウイルス感染に対する感受性を、上記の通り細胞をＡｄ−β−ｇａｌに感染させ、そして染色キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて２４時間後にβ−ｇａｌについてアッセイすることにより試験する。マウス肝細胞株ＮＭｕＬｉ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のＡｄ−β−ｇａｌ感染に対する感受性を、ポジティブコントロールとして用いる。
【００７６】
（アデノウイルスベクターの作製：方法３）
ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の肝臓組織をホモジネートし、そして総ＲＮＡを抽出する（ＲＮｅａｓｙキット；Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）。第１鎖ｃＤＮＡを、オリゴ（ｄＴ）プライマー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いた逆転写−ＰＣＲによって増幅する。全長マウスエンドスタチンｃＤＮＡを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へのサブクローニングのために、ＰＣＲ（ＣｌａＩリンカーを有するセンスプライマー：５’−ＡＴＣＧＡＴＣＡＴＡＣＴＣＡＴＣＡＧＧＡＣＴＴＴＣＡＧＣＣ−３’（配列番号１５）；ＮｏｔＩリンカーを有するアンチセンスプライマー：５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＣＡＴ−３’（配列番号１６））によって増幅する。ラットインスリンリーダー配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを、エンドスタチン遺伝子の前にクローニングする。配列を確認した後、このラットインスリンリーダー−エンドスタチンｃＤＮＡを、Ｂａｕｔｉｓｔａ，Ｄ．Ｓ．ら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８２，５７８−５９６によって記載される通り、組換えアデノウイルスのレスキューのために組換えアデノウイルス（ＡＤＶ）シャトルベクターｐＡＤＶ．ｈＥＦ１−α（ヒト伸長因子１−α）中にクローングする。ウイルス粒子を吸収（Ａ２６０）によって測定し、そしてプラーク形成単位を、２９３細胞において標準的なアガロース重層プラークアッセイによって決定する。ＡＤＶ．ｈＶＥＧＦ１６５の構築のためのこのｃＤＮＡを、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）から単離したＲＮＡの逆転写ＰＣＲによって入手する。ＪＣ細胞株およびＬＬＣ細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手する。細胞をＲＰＭＩ培地１６４０（ＪＣ）およびＤＭＥＭ（ＬＬＣ）中で培養する。全ての培地に、１０％  ＦＢＳ、０．２ｍＭグルタミンおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充する。ＨＵＶＥＣを、室温にて２０分間のＩＶ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）灌流（ハンクス平衡塩溶液中０．２％）によって臍帯から単離する。次いで、細胞を、２０％  ＦＢＳ、０．２ｍＭグルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを補充したＭ１９９培地中で、コラーゲン（ＰＢＳ中１％）でコーティングしたプレートで培養する。
【００７７】
（実施例２：マウスへの遺伝子移入およびＣＮＶの誘導）
ウイルスベクターを、成体Ｃ５７ＢＵ６マウスの尾静脈に注射する。マウスに、Ａｖ３ｍＥｎｄｏ（ｎ＝１８）もしくはＡｖ３ｍＮｕｌｌ（ｎ＝１７）のいずれかを２×１０１１個の粒子、またはＡｖ３ＣｓｍＥｎｄｏもしくはＡｖ３ＣｓＮｕｌｌのいずれかを６×１０１０個の粒子を注射する。ウイルスベクター注射の４日後、これらのマウスに塩酸ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ体重）を麻酔し、１％トロピカミドで瞳孔を拡大させ、そしてクリプトンレーザー光凝固を用いて、ＴｏｂｅらＡｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５３，１６４１−１６４６（１９９８）によって以前に記載された通りに各マウスの各々の眼の３箇所でブルッフ膜を破断させる。手短に述べると、クリプトンレーザー光凝固（１００μｍのスポットサイズ、０．１秒間の持続時間、１２０ｍＷ）を、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  ９２０  Ｐｈｏｔｏｃｏａｇｕｌａｔｏｒの細隙灯送達系およびコンタクトレンズとして携帯型カバースライドを用いて送達する。熱傷を、視神経から２〜３ディスク直径にて、９時、１２時および３時の位置において行う。ブルッフ膜の破断を示す、レーザーの際の気化泡の生成は、ＣＮＶを得る際に重要な因子であり、それゆえ、泡が生成された熱傷のみをこの研究に含める。泡は、Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスにおける１つの熱傷、およびＡｖ３ｍＮｕｌｌを注射したマウスにおける３つの熱傷については生成されない。Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスの１つの眼の角膜は、角膜瘢痕を有し、このことが、レーザーの使用を妨げ、それゆえ、この眼を使用しない。
【００７８】
（実施例３：レーザー誘発性ＣＮＶ損傷のサイズ測定）
レーザー処置の２週間後、ＣＮＶ損傷のサイズを、２つの異なる技術（Ｓｅｏら，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５４，１７４３−１７５３（１９９９）によって以前に報告された通りの連続切片についてのＣＮＶの積分面積測定値またはＥｄｅｌｍａｎら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４１，Ｓ８３４（２０００）によって記載される通りの脈絡膜の平坦な積載のＣＮＶの面積測定値）のうちの１つによって評価する。Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスについては、１０匹のマウスを、平坦積載技術によって評価し、そして８匹を連続切片によって評価し、そしてＡｖ３ｍＮｕｌｌを注射したマウスについては、１０匹のマウスを平坦積載技術によって評価し、そして７匹を連続切片によって評価する。
【００７９】
平坦積載技術について使用するマウスを麻酔し、そしてＴｏｂｅら，Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３９，１８０−８（１９９８）によって以前に記載された通り、５０ｍｇ／ｍｌのフルオレセイン標識デキストラン（平均分子量２×１０６、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む１ｍｌのリン酸緩衝化生理食塩水で灌流する。眼を取り出し、そして１０％リン酸緩衝化ホルマリン中で１時間固定する。角膜および水晶体を取り出し、そして網膜全体をアイカップから注意深く切開する。半径方向の切片（４〜７枚、平均５枚）を、このアイカップの縁部から赤道に向かって作製し、そしてこのアイカップを、強膜が下向きになり、脈絡膜が上向きになるようにＡｑｕａｍｏｕｎｔに平坦に積載する。平坦積載物を蛍光顕微鏡によって検鏡し、そして３ＣＣＤカラービデオカメラおよびフレームグラッバーを用いて画像をディジタル化する。Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓを用いて、線維血管（ｆｉｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ）瘢痕の合計に対応する、各熱傷に関連した超蛍光の面積の合計を測定する。
【００８０】
Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスについては、合計１９個の眼を評価（１つの眼は、レーザー処置を不可能にする既存の角膜瘢痕を有した）し、泡に関連していない１つの熱傷が存在し、それゆえ、５６の損傷を測定する。Ａｖ３ｍＮｕｌｌを注射したマウスについては、合計２０個の眼を評価し、そして泡に関連していない３つの熱傷が存在するので、５７個の損傷を測定する。各眼内の面積を平均化し、そして対数変換後、一般化評価式（ＧＥＥ）を用いた後退分析を実施する。この分析は、各マウスの右眼と左眼との間の補正を調整する。
【００８１】
連続切片のＣＮＶの積分面積を測定するために用いられるマウスを、レーザー処置の２週間後に屠殺し、そして眼を迅速に取り出し、そして最適な切断温度の包埋化合物（ＯＣＴ；Ｍｉｌｅｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）中で凍結する。凍結した連続切片（１０μｍ）を、各熱傷の全範囲を通して切断し、そして脈管細胞に選択的に結合するビオチン化ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａレクチンＢ４  （ＧＳＡ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で組織化学的に染色する。スライドを、メタノール／Ｈ２Ｏ２中で１０分間、４℃にてインキュベートし、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．６）（ＴＢＳ）で洗浄し、そして１０％正常ブタ血清中で３０分間インキュベートする。スライドを、ビオチン化ＧＳＡとともに室温にて２時間インキュベートし、そして０．０５Ｍ  ＴＢＳでリンスした後、これらを、ペルオキシダーゼにカップリングしたアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに室温にて４５分間インキュベートする。０．０５Ｍ  ＴＢＳで１０分間洗浄した後、スライドを、Ｈｉｓｔｏｍａｒｋ  Ｒｅｄ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ）とともにインキュベートして、メラニンと区別できない赤色反応生成物を得た。いくつかのスライドをＣｏｎｔｒａｓｔ  Ｂｌｕｅ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ）で対比染色する。
【００８２】
定量的評価を行うために、ＧＳＡ染色した切片をＡｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡で検鏡し、そして３  ＣＣＤカラービデオカメラおよびフレームグラッパーを用いて画像をディジタル化する。Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェアを用いて、網膜下腔中のＧＳＡ染色血管の面積を描写および測定する。各損傷について、面積の測定を、全ての切片について行い、この切片には損傷のいくつかが現れ、そして一緒に添加されて、積分面積測定値が得られる。各眼内の測定値を平均化し、そしてＧＥＥを用いて後退分析を行う。
【００８３】
最初の実験では、ブルッフ膜のレーザー誘発性破損部位でのＣＮＶ量を、Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスおよびＡｖ３ｍＮｕｌｌを注射したマウスにおいて比較する。ＣＮＶの量を、２つの異なる技術（脈絡膜平坦積載物についてフルオレセイン標識デキストランによって灌流されたＣＮＶ面積の測定および損傷全体を通しての連続切片についてのＣＮＶ面積の測定）によって評価する。脈絡膜平坦積載物におけるレーザー誘発性ＣＮＶの面積は、未注射のマウスまたはＡｖ３Ｎｕｌｌを注射したマウスと比較して、Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスにおいて少ないようである。視覚的比較によって見られる相違を、処置群に関してマスクされた調査者によって行われる画像解析によって確認する。この画像解析は、Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスにおいて、Ａｖ３Ｎｕｌｌを注射したコントロールにおける平均面積よりも有意に小さい、灌流されたＣＮＶ損傷の平均面積を示した（表１）。
【００８４】
【表１】
0004612417.tif 000002
ＣＮＶ損傷を通しての連続切片はまた、Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスにおける、Ａｖ３Ｎｕｌｌを注射したマウスと比較して、より小さな損傷を示した。３次元でのサイズを評価する、各連続切片についてＣＮＶ面積と一緒に添加することにより得られるＣＮＶの積分面積により、Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスにおいて、Ａｖ３Ｎｕｌｌ注射マウスと比較して有意に少ないＣＮＶがブルッフ膜破損部位に存在することが確認された（表１）。両方の測定技術は非常に類似の情報を提供するので、脈絡膜平坦積載物のみが、次の実験で用いられる。
【００８５】
エンドスタチン血清レベルと、ＣＮＶの面積との間には、逆の相関が存在する。エンドスタチンの血清レベルは、ベクターの静脈内注射の４〜７日後に最適である。一群のマウスに、Ａｖ３ｍＥｎｄｏ、Ａｖ３ＣｓｍＥｎｄｏ、Ａｖ３Ｎｕｌｌ、またはＡｖ３ＣｓＮｕｌｌを注射する。レーザー処置を４日目に行い、そして血清を注射の７日後に得る。調査者にはベクター群およびエンドスタチン血清に関してマスクした状態で、ＣＮＶのレベルを、レーザー光凝固の１４日後に脈絡膜平坦積載物について測定する。Ａｖ３ＣｓｍＥｎｄｏを注射したマウスは、未注射のマウスまたはＡｖ３ＣｓＮｕｌｌを注射したマウスよりも少ないＣＮＶを有するようである。画像解析により、ＣＮＶ損傷の面積が、Ａｖ３ＣｓｍＥｎｄｏまたはＡｖ３ｍＥｎｄｏのいずれかを注射したマウスにおいて、コントロールと比較して有意に小さいことを確認する（表２）。
【００８６】
【表２】
0004612417.tif 000003
各マウスにおけるエンドスタチン血清レベルに対してＣＮＶ損傷の平均面積をプロットすることにより、ｒ＝−０．６６という強い逆の相関が示される。
【００８７】
（実施例４：眼および肝臓におけるエンドスタチンの発現分析）
アデノウイルスベクターの全身投与が眼の有意な形質導入をもたらすか否かを決定するために、一群のマウスにＡｖ３ｎＢｇを注射する。このベクターは、ＲＳＶプロモーターからβ−ガラクトシダーゼを発現する。５日後、これらのマウスを屠殺し、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性を、化学発光アッセイを用いて眼および肝臓のホモジネートにおいて測定する。肝臓および眼を、マウスからの取り出し後、急速凍結する。アッセイの当日に、肝臓または眼を溶解緩衝液（４０：１  ｖ／ｖ  １×  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｌ）：Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ））中でホモジネートする。タンパク質含有量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ）によって決定する。β−ガラクトシダーゼ活性を、Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ系（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ  ＭＡ）を用いて決定する。
【００８８】
ベクターを受けたマウスの肝臓において、β−ガラクトシダーゼ活性のレベルは、未注射のコントロールよりも約１０００倍高く、一方、眼では、この酵素活性のレベルは、ベクターを注射した動物とコントロール動物との間で同様である。この酵素を発現するアデノウイルスの投与後に、検出可能なβ−ガラクトシダーゼ活性が眼に存在しないことは、エンドスタチンベクターの脈管内注射後の抗血管新生効果が、局所産生されたエンドスタチンというよりも、全身で産生されたエンドスタチンに起因することを示唆する。
【００８９】
（実施例５：Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスと、Ａｖ３ＣｓｍＥｎｄｏを注射したマウスとの比較）
マウスに、Ａｖ３ｍＥｎｄｏ（ｎ＝１０）もしくはＡｖ３ｍＮｕｌｌ（ｎ＝９）を２×１０粒子、尾静脈に注射するか、またはこれらにＡｖ３ＣｓｍＥｎｄｏ（ｎ＝１１）もしくはＡｖ３ＣｓｍＮｕｌｌ（ｎ＝１１）を６×１０１０粒子注射する。注射なしのコントロール群（ｎ＝１１）もまた含める。注射の４日後、ブルッフ膜を、各々のマウスの各眼において３箇所、レーザーで破断する。注射の７日後、血液を各マウスの尾静脈から採血し、そして血清を、ＥＬＩＳＡのために−８０℃にて保存する。注射の１８日後およびレーザーの１４日後、ＣＮＶの面積を、脈絡膜平坦積載物について上記の通り評価する。
【００９０】
エンドスタチン血清レベルを、マウスエンドスタチン酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（ＡＣＣＵＣＹＴＥマウスエンドスタチン：Ｃｙｔｌｍｍｕｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐａｒｋ，ＭＤ）を製造業者の指示に従って用いて決定する。
【００９１】
第２のベクター構築物Ａｖ３ＣｓｍＥｎｄｏの特徴付けは、その脈管内注射が、Ａｖ３ｍＥｎｄｏ粒子の最大耐性用量（２×１０１１ｐｆｕ）を注射したマウスにおけるレベルと比較して約１０倍高い最大エンドスタチンレベルをもたらすことを実証した。エンドスタチンの血清レベルは、Ａｖ３ｍＥｎｄｏを注射したマウスおよびＡｖ３ＣｓｍＥｎｄｏを注射したマウスにおいて、注射をしないかまたはヌルのベクター注射をしたコントロールにおいてよりも有意に高い。マウスにおけるエンドスタチンの規定レベルは、血清１ｍｌあたり約３０〜１５０ｎｇであることが見出される。
【００９２】
従って、ｓｉｇ−ｍＥｎｄｏ発現がラウス肉腫ウイルスプロモーターによって駆動される構築物を注射するマウスは、エンドスタチンの中程度に高い血清レベルおよびヌルウイルスを注射したマウスよりも有意により低いＣＮＶ損傷を、ブルッフ膜のレーザー誘発性破損の部位に有する。ｓｉｇ−ｍＥｎｄｏがシミアンサイトメガロウイルスプロモーターによって駆動される構築物を注射したマウスは、ほぼ１０倍高いエンドスタチン血清レベルを有し、そして有意に低いＣＮＶを有し、ほぼ完全に阻害される。
【００９３】
（実施例６：ヒトエンドスタチンをコードする組換えアデノウイルスベクターの作製）
ヒトエンドスタチンｃＤＮＡを、ヒトα１（ＸＶＩＩＩ）コラーゲンのｃＤＮＡからＰＣＲ増幅する。ヒト肝臓ｃＤＮＡを、ヒト肝臓ポルＡ  ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって作製する。逆転写を、プライマー５’−ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＣＡＧ  ＴＧＴ  ＡＡＡ  ＡＧＧ  ＴＣ−３’（配列番号１７）を用い、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、以下の条件で１サイクル実施する：室温にて１０分間、４２℃で逆転写を３分間、９９℃で変性を５分間、５℃での冷却を５分間、そしてｃＤＮＡをエタノール沈殿して再懸濁するまでは、４℃で保つ。７９０ｂｐのヒトエンドスタチンｃＤＮＡフラグメントを、プライマー５’−ＣＡＧ  ＡＴＧ  ＡＣＡ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＣＣＡ  Ｇ−３’（配列番号１８）および５’−ＣＴＡ  ＴＡＣ  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＧＴＡ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  Ｃ−３’（配列番号１９）を用いて、この調製されたｃＤＮＡからＰＣＲ増幅する。ＰＣＲを以下の条件で３５サイクル実施する：９５℃でのホットスタートを３分間、８０℃にて３分間、続いてＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の添加、９５℃での変性を１分間、５５℃でのアニーリングを１分間、および７２℃での伸長を３分間。７９０ｂｐのヒトエンドスタチンｃＤＮＡフラグメントをゲル精製し、そして５８℃のアニーリング温度であること以外は記載の通りに再度増幅する。７９０ｂｐのヒトエンドスタチンｃＤＮＡフラグメントをゲル精製し、そしてＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造業者の手順に従って用いてＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ＋中にクローニングして、ｐｃｒｈｅｎｄＩを作製する。ｐｃｒｈｅｎｄＩプラスミドのヒトエンドスタチンｃＤＮＡ領域を、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｉｎｃ．Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤにおけるＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによって直接的配列決定分析を用いて確認する。
【００９４】
ヒトエンドスタチンｃＤＮＡフラグメントを、以下の手順に従ってヒトＢＭ４０基礎タンパク質リーダーを用いてアセンブリする。ＢＭ４０基礎タンパク質リーダーを、２片の合成オリゴヌクレオチド５’−ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＣＡ  ＴＧＡ  ＧＧＧ  ＣＣＴ  ＧＧＡ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＴＴＣ  ＴＣＣ  ＴＴＴ  ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＣＣＧ  ＧＧＡ  ＧＧＧ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＣＡＧ  ＣＣＣ  ＣＴＣ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＣＧＣ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＡＣＡ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＧＣＧ  ＡＣＴ  ＴＣＣ  ＡＧＣ  ＣＧＧ  ＴＧＣ  ＴＣＣ  Ａ−３’（センス）（配列番号２０）および５’−ＣＣＡ  ＧＧＴ  ＧＧＡ  ＧＣＡ  ＣＣＧ  ＧＣＴ  ＧＧＡ  ＡＧＴ  ＣＧＣ  ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＣＧＡ  ＧＣＧ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＧＣＴ  ＧＡＧ  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＣＣＡ  ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＡＡＡ  ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＡＧＡ  ＴＣＣ  ＡＧＧ  ＣＣＣ  ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＣ−３’（アンチセンス）（配列番号２１）をアニーリングし、続いてＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｅｘ  Ａ１で消化することにより作製する。消化したＢＭ４０基礎タンパク質リーダーをｐｃｒｈｅｎｄ  ＩのＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓｅｘ  Ａ１部位に挿入してｐＢｍｐｃｒｈｅｎプラスミドを作製する。ｐＢｍｐｃｒｈｅｎプラスミドのｓｉｇ−ｈＥｎｄｏ領域全体を、直接的配列決定分析を用いて確認する。
【００９５】
アデノウイルスシャトルプラスミドｐＡＶ１ｂｍｈｅｎｄ１ｘを、以下の手順でｐＡｖＦ９Ｌｘｒアデノウイルスシャトルプラスミド中のｓｉｇ−Ｅｎｄｏ含有配列での第ＩＸ因子（Ｆ９）含有配列の置換によって作製する。ｓｉｇ−ｈＥｎｄｏ配列を含む８００ｂｐのフラグメントを、ＳａｃＩ消化、続いてＫｌｅｎｏｗフィルインおよびＳａｌＩ消化によってｐＢｍｐｃｒｈｅｎから作製する。ｐＡｖＦ９Ｌｘｒプラスミドを、ＢａｍＨＩ制限酵素を用いて消化し、続いてＫｌｅｎｏｗフィルインをし、そしてＳａｌＩ制限酵素で消化して、Ｆ９含有配列を除去する。消化されたこれらの２つのフラグメントをゲル精製し、そして連結してｐＡＶ１ｂｍｈｅｎｄｌｘを作製する。
【００９６】
ヒトエンドスタチンｃＤＮＡを、ヒト肝臓ポリＡ  ＲＮＡ由来のヒトα１（ＸＶＩＩＩ）コラーゲンのｃＤＮＡのＣ末端からＲＴ−ＰＣＲによって作製する。このヒトＢＭ４０基礎タンパク質リーダーを、２片の合成オリゴヌクレオチドから作製する。アニーリングしたヒトＢＭ４０基礎タンパク質リーダーをヒトエンドスタチンｃＤＮＡの５’にクローニングして、ヒトエンドスタチンタンパク質の分泌のために、ｓｉｇ−ｈＥｎｄｏキメラタンパク質を作製する。ｓｉｇ−ｈＥｎｄｏキメラＤＮＡを、アデノウイルスシャトルプラスミドｐＡｖＦ９ｌｘｒ中にクローニングして、ｐＡＶ１ｂｍｈｅｎｄｌｘを作製する（図１２Ａ）。ｓｉｇ−ｈＥｎｄｏキメラ配列全体を、自己配列決定分析によって確認する。
【００９７】
ｓｉｇ−ｈＥｎｄｏキメラタンパク質をコードする組換えＡｖ３ｂｍｈｅｎｄｌｘ（Ｅ１、Ｅ２ａおよびＥ３が欠失している）を、以下の手順に従って「Ｑｕｉｃｋ  Ｃｒｅ／Ｌｏｘ２プラスミド系」によって作製する。プラスミドｐＡＶ１ｂｍｈｅｎｄｌｘおよびｐＳＱ３を、それぞれ、Ｎｏｔ  ＩおよびＣｌａ  Ｉ制限酵素で最初に線状化する。Ｓ８細胞を０．３μＭデキサメタゾンで２４時間前処理し、その後、一過性トランスフェクションを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて、１ウェルあたり４×１０５個のＳ８細胞において６ウェルプレートで行う。リポフェクトアミン複合体化ＤＮＡを、１μｇの線状化ｐＳＱ３、０．５μｇ  ｐＣｒｅ、０．５μｇの線状化ｐＡＶ１ｂｍｈｅｎｄｌｘおよび６μｌのリポフェクトアミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）製造業者の手順に従って用いて調製する。Ｓ８細胞を、リポフェクトアミン複合体化ＤＮＡとともに３７℃で４．５時間にわたって遺伝子キュベートする。リポフェクトアミン複合体化ＤＮＡを除去し、そして細胞をＰＢＳで洗浄（ｉｓｈ）する。トランスフェクトしたＳ８細胞を、細胞変性効果が観察されるまで、５％  ＣＯ２を用い、３７℃にて培養する。細胞および培地を掻き取りによって収集する。粗製ウイルス溶解産物を、５サイクルの凍結および解凍によって調製する。Ａｖ３ｂｍｈｅｎｄｌｘを、細胞変性効果が観察されるまで、５％  ＦＢＳ含有Ｒｉｃｈｔｅｒ  ＣＭ培地中で０．３μＭデキサメタゾンを用いてＳ８細胞中で再増幅する。
【００９８】
Ａｖ３ｂｍｈｅｎｄｌｘ媒介ヒトエンドスタチンの発現および分泌を、ベクターを形質導入したＳ８細胞中で特徴付けする。Ａｖ３ｂｍｈｅｎｄｌｘに感染させた細胞の上清タンパク質、すなわち、ヒトエンドスタチンをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。各２０μｇの上清タンパク質を、４〜１２％の線形勾配事前成形ゲルで分析する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥをポリフッ化ビニリデン膜に転写する。この膜をクーマシーブルーＲ−２５０で染色する。ヒトエンドスタチンの正確なサイズに対応する２０ｋＤａのタンパク質バンドを膜ブロットから切り出し、そしてＮ末端タンパク質配列決定分析に供する。３つの主な分泌タンパク質のタンパク質配列を決定したところ、５０％は、ヒトエンドスタチン＋さらなるアミノ酸残基ＡＰＱＱＥＡＬＡのアミノ酸配列（配列番号５）を含み、２５％は残基ＬＡを含み、そして２５％はヒトＢＭ４０基礎タンパク質シグナルペプチド由来の残基を含まない。２０ｋＤａのタンパク質は、Ａｖ３Ｎｕｌｌ細胞由来の上清タンパク質中に見出されない。この結果は、Ａｖ３ｂｍｈｅｎｄｌｘで形質導入したＳ８細胞が、ヒトＢＭ４０基礎タンパク質シグナルペプチドからヒトエンドスタチンをプロセシングした後にヒトエンドスタチンを発現および分泌することを実証する。
【００９９】
（実施例７：ＢＩＶベクター媒介抗新脈管形成遺伝子の発現による、インビボでの網膜漏出、網膜肥厚化、網膜剥離、および網膜血管新生の阻害）
ｅＧＦＰをコードするウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）ベクターを、３成分系（その開示全体が本明細書中に参考として援用される、公開された国際特許出願番号Ｗ００１４４４５８に記載される）から作製する。移入ベクターＢＩＶエンドスタチンを、Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３，１３０５−１３１６（２００２）に従って、ＭＮＤ  Ｕ３プロモーターの下でｅＧＦＰをコードするＢＩＶに基づく移入ベクター構築物であるｐＢＳＶ４ＭＧｐｐｔＧＡＧから誘導した。このｅＧＦＰコード配列を、マウスエンドスタチン（ｍＥｎｄｏ）で置換した。具体的には、ｅＧＦＰを親プラスミドｐＢＳＶ４ＭＧｐｐｔＧＡＧから欠失させるために、ｅＧＦＰおよびいくつかの隣接配列をＰＣＲによって増幅した。用いたプライマーは以下であった：ｅＧＦＰ１ＦＯＲ５’−ＧＣＧＣＡＴＧＴＣＧＡＣＡＧＡＡＴＡＴＧＧＧＣＣＡＡＡＣ−３’（これは、ＰＣＲ産物の５’末端にＳａｌＩ部位を組み込む）およびｅＧＦＰ１ＲＥＶ  ５’−ＧＣＧＣＴＡＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＡＡＴＧＡＧＣＴＡＣＡＣ−３’（これは、ＰＣＲ産物の３’末端にＰｓｔＩ部位を組み込む）。このフラグメントをＳａｌＩおよびＰｓｔＩで切断し、そしてｐＢＳＩＩ（ＫＳ＋）と連結して、ｐＢＳ２ｅＧＦＰを作製した。ｐＢＳＩＩ（ＫＳ＋）もまた、ＳａｌＩおよびＰｓｔＩで予め消化した。ＥｘＳｉｔｅ  ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて、ｅＧＦＰをｐＢＳ２ｅＧＦＰから欠失させた。ｅＧＦＰ遺伝子の外側の部分に隣接して外側に向き、従ってｅＧＦＰ以外の隣接配列およびプラスミドの全体を含む全体を増幅するＰＣＲプライマーを設計した。用いたプライマーは以下であった：ＤＥＬｅＧＦＰ１ＦＯＲ：５’−ＣＣＧＧＣＴＡＧＣＴＴＡＡＧＧＧＴＧＧＣＧＡＣＣＧＧＴ−３’（これは、ＮｈｅＩ制限部位およびＡｆｌＩＩ制限部位を付加した）およびＤＥＬｅＧＦＰＩＲＥＶ：５’−ＧＣＴＴＣＧＡＡＣＧＣＧＴＡＧＣＧＧＣＣＡＡＣＣＣＴＣ−３’（これは、ＢｓｔＢＩ制限部位およびＭｌｕＩ制限部位を付加した）。このアンプリコンを、製造業者の指示に従って処理し、そして連結して、ｅＧＦＰが欠失しているが、親プラスミド由来の隣接配列が残っているｐＢＳ２ｄｅｌｅＧＦＰを形成した。このストラテジーはまた、４つの新たな制限部位を中間部に作製した。このフラグメントを配列決定して、変異が導入されていないことを確認した。ｍＥｎｄｏ遺伝子挿入物をアデノウイルスシャトルプラスミドｐＡＶｍＥｎｄｏｌｘｒから、Ｍｏｒｉ，Ｋ．ら，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５９，３１３−３２０（２００１）に従って調製した。このプラスミドをＮｈｅＩおよびＣｌａＩで消化して、ｍＥｎｄｏフラグメントを遊離させた。このフラグメントを、ＮｈｅＩおよびＢｓｔＢＩ（ＣｌａＩと適合性の末端）で予め消化したｐＢＳ２ｄｅｌｅＧＦＰと連結して、ｐＢＳ２ｄｅｌｅＧＦＰｍＥｎｄｏを作製した。ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を、ＭｌｕＩ部位においてｍＥｎｄｏの下流に挿入して、ｐＢＳ２ｄｅｌｅＧＦＰｍＥｎｄｏＰＲＥを作���した。最後に、このプラスミドｐＢＳ２ｄｅｌｅＧＦＰｍＥｎｄｏＰＲＥをＢｓｕ３６ＩおよびＢｂｖＣｌによって消化して、ｍＥｎｄｏコード配列および元々のｅＧＦＰ隣接配列を放出し、そしてこのフラグメントを、Ｂｓｕ３６ＩおよびＢｂｖＣＩで予め消化したｐＢＳ４ＭＧｐｐｔＧＡＧと連結して、ｐＢｖＭＮＤｍＥｎｄｏＰＲＥを作製した。ヌルＢＩＶベクターであるｐＢｖＭＮＤＰＲＥもまた作製し、そしてネガティブコントロールベクターとして供した。ＰＢｖＭＮＤＰＲＥは、ｍＥｎｄｏコード配列が存在しないこと以外、ｐＢｖＭＮＤｍＥｎｄＰＲＥと同一であった。
【０１００】
手短に述べると、ｍＥｎｄｏをコードするＢＩＶベクター粒子（ＢＩＶエンドスタチン）を作製するために、１５０ｍｍディッシュ（２×１０７細胞／ディッシュ）中の２９３Ｔ細胞を、４５μｇのｐＢｖＭＮＤｍＥｎｄｏＰＲＥ、４５μｇのＢＩＶベースのパッケージング構築物ｐＢＩＶｍｉｎｉｐａｃｋ、および１３．５μｇのシュードタイピングエンベロープ発現構築物ｐＶＳＶ−Ｇでトランスフェクトした。ＢＩＶヌルベクター（ＢＩＶＮｕｌｌ）を作製するために、ｐＢｖＭＮＤｍＥｎｄｏＰＲＥを、ｐＢｖＭＮＤＰＲＥ構築物で置換した。トランスフェクションの４８時間後、このベクターを収集し、そし０．４５μｍフィルターを通して濾過した。次いで、このベクター上清を、超遠心分離によって濃縮した。この濃縮したベクターをアリコートに分け、そして使用するまで−８０℃で保存した。
【０１０１】
この濃縮したベクターを、ベクター粒子の尺度である逆転写酵素（ＲＴ）活性についてアッセイした。ＢＩＶエンドスタチンベクターおよびＢＩＶＮｕｌｌベクターの両方は、１ｍｌあたり約１５μｇのＲＴ活性とスコア付けされた。本発明者らは以前に、ｅＧＦＰをコードするＢＩＶベースのベクターについて、１ｎｇのＲＴが、約１×１０５形質導入単（Ｔ．Ｕ．）に等しいことを示した。それゆえ、ＢＩＶエンドスタチンベクターの評価された力価は、１．５×１０９Ｔ．Ｕ．／ｍｌであった。このＢＩＶエンドスタチンベクターがｍＥｎｄｏの効率的な産生を媒介し得るか否かを調べるために、６ウェルプレート中のＣｆ２Ｔｈ細胞（４×１０５細胞／ウェル）を、１μｌ（１５ｎｇのＲＴ当量ベクター粒子）のＢＩＶＮｕｌｌベクターまたは同じ量のＢｌＶエンドスタチンベクターのいずれかで形質導入した。形質導入の４８時間後、細胞上清を、市販のエンドスタチンアッセイキットＡｃｃｕｃｙｔｅマウスエンドスタチンアッセイ系を製造業者の指示（Ｃｙｔｉｍｍｕｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐａｒｋ，ＭＤ）に従って用いてエンドスタチン発現についてアッセイした。ＢＩＶエンドスタチンベクターで形質導入した細胞は、４１２ｎｇ／ｍｌのエンドスタチンを産生し、一方、ＢＩＶＮｕｌｌベクターは、検出可能なレベルのエンドスタチンのスコアが得られなかった。
【０１０２】
Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら，Ｃｅｌｌ；８８（２）：２７７−８５（１９９７）に従って調製したマウスエンドスタチンをコードするＢＩＶベクターを、ドキシサイクリンを用いて誘導した際にマウス光受容体細胞由来の脈管内皮増殖因子を発現する、単一のトランスジェニックマウス（ＩＲＢＰ／ｒｔＴＡ−ＴＲＥ／ＶＥＧＦ  ｔｇＭＩＣＥ）の網膜下注射を介して投与する。ＢＩＶベクターをマウスの右眼に注射し、一方、ベクターの注射を伴わずに左眼をコントロールとして供する。ベクター注射の３週間後、０．５ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンを、トランスジェニックマウスについて飲料水中に配置する。フルオレセイン血管造影図の検査によって、ドキシサイクリン誘発性ＶＥＧＦ発現が、トランスジェニックマウスの左眼において重篤な血管新生をもたらすことが見出される。ＶＥＧＦ誘発性血管新生は、同じ動物の右眼において、ＢＩＶベクター媒介エンドスタチン発現によって完全にブロックされる。
【０１０３】
１．５×１０６形質導入単位（ＴＵ）のＢＩＶエンドスタチンの網膜下注射を右眼に与え、そして１．５×１０６ＴＵのＢＩＶＮｕｌｌを左眼に与え、ベクター注射の４週間後に安楽死させた成体Ｃ５７ＢＵ６マウス由来の免疫組織化学的に染色した眼の凍結切片は、ＢＩＶエンドスタチンを注射した眼が、ＲＰＥ細胞においてエンドスタチンについて重度の染色を示し、いくつかの血管壁の内部核層全体が濃く染色されることを示した。内部網状層中の線形に染色された構造体は、ミューラー細胞突起の典型である。ＢＩＶＮｕｌｌを注射した眼は、内部の境界膜およびブルッフ膜に沿って反応産物を示した（これは、コラーゲンＸＶＩＩＩとの交差反応性に起因するようである）。
【０１０４】
１．５×１０６形質導入単位（ＴＵ）のＢＩＶエンドスタチンの網膜下注射を右眼に与え、そして１．５×１０６ＴＵのＢＩＶＮｕｌｌを左眼に与え、そしてベクター注射の４週間後にその飲料水中２ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンを開始した成体二重トランスジェニックｒｈｏ／ｒｔＴＡ−ＴＲＥ／ＶＥＧＦマウスを、３日間のドキシサイクリン後に［３Ｈ］マンニトールを用いて網膜脈管透過性についてアッセイした。網膜対肺（ＲＬＬＲ）は、ヌルベクターを注射した同様の眼と比較して、エンドスタチンを発現する眼では有意に低下する。このことは、２つの異なるベクター系のいずれかを用いてのエンドスタチンの発現が、網膜におけるＶＥＧＦ誘発性脈管透過性の抑制をもたらすことを示す。
【０１０５】
右眼に１．５×１０６ＴＵのＢＩＶエンドスタチンの網膜下注射を与え、そして左眼に１．５×１０６ＴＵのＢＩＶＮｕｌｌを与え、そしてベクター注射の４週間後にそれらの飲料水中での０．５ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンを開始した成体ｒｈｏ／ｒｔＴＡ−ＴＲＥ／ＶＥＧＦマウスを、ドキシサイクリン開始の４日後にフルオレセイン血管造影法に供する。ＢＩＶエンドスタチンを注射したマウスは、別個の壁を有する、正常に見える網膜結果を示し、このことは、ＢＩＶエンドスタチンを注射した眼においてフルオレセインの浸透がほとんどまたは全くないことを示す。一方、ＢＩＶＮｕｌｌを注射した眼は、網膜全体に拡散した蛍光を示す。このことは、フルオレセインの多量の血管外遊出を示す。ドキシサイクリンの開始７日後に、ＢＩＶＮｕｌｌを注射した眼における大量の漏出と比較して、ＢＩＶエンドスタチンを注射した眼においてフルオレセイン漏出の証拠は依然としてほとんど存在しない。網膜脈管透過性が増大した場合、流体は、網膜中に集まり、網膜の肥厚化をもたらす。黄斑における肥厚化は、黄斑水腫と呼ばれ、そして異常な肥厚化と視力との間には逆の相関が存在する。従って、網膜肥厚化は、評価するために生理学的に適切な変数であり、インビボでの画像化技術（例えば、光学コヒーレンス断層撮影法（ＯＣＴ）または網膜の厚さの分析（ＲＴＡ））を用いて、それ自体を正確な定量とする。ＶＥＧＦ発現を誘導する飲料水中での０．５ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンの開始の７日後に、ＢＩＶエンドスタチンを注射した眼の凍結切片は、ＢＩＶＮｕｌｌを注射した眼よりも程度の低い肥厚化を示す。８匹のｒｈｏ／ｒｔＴＡ−ＴＲＥ／ＶＥＧＦマウスを用いて、ＶＥＧＦ誘発性網膜厚さに対するエンドスタチンの効果を定量的に評価する。右眼での１．５×１０６ＴＵのＢＩＶエンドスタチンおよび左眼での１．５×１０６ＴＵのＢＩＶＮｕｌｌの網膜下注射の４週間後、マウスを、それらの飲料水中の０．５ｍｇ／ｍｌドキシサイクリンについて開始した。ドキシサイクリンを開始してから７日後、網膜の厚さを、水平子午線に沿った視神経の各縁部から３００μｍでの画像解析によって測定し、そして平均化して、各眼について単一の実験値を得る。平均網膜厚さは、ＢＩＶエンドスタチンを注射した眼においてよりも、ＢＩＶＮｕｌｌを注射した眼において有意に厚い。
【０１０６】
右眼での１．５×１０６ＴＵのＢＩＶエンドスタチンおよび左眼での１．５×１０６ＴＵのＢＩＶＮｕｌｌの網膜下注射の４週間後、マウスを、それらの飲料水中での０．５ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンについて開始する。ドキシサイクリンを開始してから７日後、網膜血管新生の量は、ＢＩＶエンドスタチンを注射した眼と比較して、ＢＩＶＮｕｌｌを注射した眼において顕著に多い。
【０１０７】
ｒｈｏ／ｒｔＴＡ−ＴＲＥ／ＶＥＧＦマウスにそれらの飲料水中に２ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンを５日以上与えた場合、これらは、高レベルのＶＥＧＦを発現し、そして重篤な血管新生および網膜剥離を発症する。１１匹のｒｈｏ／ｒｔＴＡ−ＴＲＥ／ＶＥＧＦマウスを用いて、高レベルの網膜ＶＥＧＦからもたらされるそれらの重篤な表現型に対するＢＩＶベクター化エンドスタチンの効果を評価する。右眼における１．５×１０６ＴＵのＢＩＶエンドスタチンおよび左眼における１．５×１０６ＴＵのＢＩＶＮｕｌｌの網膜下注射の４週間後、マウスを、それらの飲料水中での２ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンについて開始する。ドキシサイクリンを開始してから７日後、マウスを安楽死させる。そして眼を２％パラホルムアルデヒド中で固定した。肉眼により病理学的検査の後、これらをＯＣＴ中で凍結し、そして切片にする。連続切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色する。ベクター群に関してマスクした観察者が、各眼が全体的網膜剥離を有するか、部分的網膜剥離を有するか、または網膜剥離を有さないかを決定する。ＢＩＶエンドスタチンを注射した眼においては、ＢＩＶＮｕｌｌを注射した眼よりも有意に少ない全体的網膜剥離が存在する。ほんの１つのＢＩＶＮｕｌｌを注射した眼と比較して、ＢＩＶエンドスタチンを注射した４つの眼は、網膜剥離を有さない。
【０１０８】
（実施例８：眼内注射）
アデノウイルスベクターを用いた研究のために、成体マウスに、一方の眼にはＡＧＶＣ７ｍＥｎｄｏおよびＡＧＶａｓ５２１の１：１混合物を６×１０７粒子、他方の眼にはＡＧＶｎｕｌｌを６×１０７粒子、網膜下注射によって与えた。レンチウイルスベクターを用いた研究については、これらのマウスは、５×１０６形質導入単位（ＴＵ）のＢＩＶエンドスタチンを一方の眼に、そして５×１０６ＴＵのＢＩＶＮｕｌｌを他方の眼に受け取った。引っ張ったガラスマイクロピペットを、足踏みスイッチを踏んだ際に１μｌのビヒクルを送達するために較正した。解剖顕微鏡における集光レンズ系（ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ  ｌｅｎｓ  ｓｙｓｔｅｍ）およびコンタクトレンズを用いて注射を行った。このことは、注射の間の網膜の可視化を可能にした。これらのマウスを麻酔し、瞳孔を拡大させ、そして解剖顕微鏡下で、マイクロピペットの尖らせた先端を、縁部の前の強膜を通して通過させ、そして網膜のすぐ上に配置した。足踏みスイッチを踏むことにより、注射流体のジェットを網膜に浸透させた。この技術は非常に無外傷性であり、直接的可視化は、小さな網膜剥離（小水胞）の出現により、この注射が成功したかの確認を可能にする。この小水胞は、サイズが極めて均一であり、そして網膜の半分よりわずかに少なく含まれていた。
【０１０９】
（実施例９：眼における、ｇｕｔｌｅｓｓアデノウイルスベクター媒介性の調節されたエンドスタチン発現）
アデノウイルスベクター送達系を用いたインビボでのエンドスタチンの調節された発現を、Ｘｕら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ；３：２６２（２００１）によって記載された方法に従って達成する。タモキシフェン誘導性キメラ転写因子をコードするＡＧＶベクターであるＡＧＶａｓ５２１および調節性エンドスタチン導入遺伝子をコードするＡＧＶベクターであるＡＧＶＣ７ｍＥｎｄｏを、それぞれ、プラスミドｐＡＧＶａｓ５２１およびｐＡＧＶＣ７ｍＥｎｄｏから作製した。導入遺伝子発現カセット（以下を参照のこと）に加え、ＡＧＶプラスミドは、独特のＰａｃＩ部位が隣接した左および右のＩＴＲ（Ａｄ５のパッケージングシグナル）およびＲｅｄｄｙ，Ｐ．Ｓ．ら，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．５，６３−７３（２００２）による約２５ｋｂのヒトαシヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）イントロン領域をＤＮＡ「スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）」として含む。プラスミドｐＡＧＶａｓ５２１は、独特のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン、ヒトエストロゲンレセプターに基づく改変されたリガンド結合ドメイン、およびＶＰ１６由来のトランス活性化領域から構成され、ＣＭＶプロモーターによって駆動される、タモキシフェン誘導性キメラ転写因子を含む。ｐＡＧＶａｓ５２１を構築するために、キメラ転写因子発現カセットを、ＮｒｕＩおよびＢａｍＨＩを用いた消化によってｐＡｖＣｖ−Ｃ７ＬＢＤから単離し、そしてｐＢＬＳＶ２中に挿入した。このプラスミドｐＢＬＳＶ２を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から誘導した。このプラスミドｐＢＬＳＶ２は、２つのマルチプルクローニングサイトポリリンカーを含む。得られたプラスミドｐＢＬＳＶ２ａｓ５２１をＢｓｐｅＩで消化し、そしてＸｍａＩで消化したｐＧＴＩ．２４ａＰＬ２に連結して、ｐＧＴＩ２４ａｓ５２１を作製した。ｐＧＴＩ２４ａＰＬ２は、ヒトシヌクレインスタッファーＤＮＡが隣接したマルチプルクローニング部位ポリリンカーを含む。次にｐＧＴＩ２４ａｓ５２１をＰａｃＩで消化して、プラスミド骨格を遊離させ、そしてＰｍｅＩ−ＭｌｕＩで消化したｐＢＶ２と組み合わせ、Ｔｏｉｅｔｔａ，Ｇ．ら，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５，２０４−２１０（２００２）に従ってＢＪ５１３８  Ｅ．ｃｏｌｉにおける相同組換えを用いて、ｐＡＧＶａｓ５２１を作製した。プラスミドｐＢＶ２は、２６６２５ｂｐのヒトシヌクレインスタッファーＤＮＡを含む。
【０１１０】
プラスミドｐＡＧＶＣ７ｍＥｎｄｏは、マウスエンドスタチンの発現を駆動する、リガンド誘導性転写因子調節性プロモーターを含む。ｐＡＧＶＣ７ｍＥｎｄｏを構築するために、プラスミドｐａｖ−６Ｘ２Ｃ７ｔａｔａｍｅｎｄｏをＡｓｃＩ（平滑化）およびＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＢＬＳＶ２Ｃ７ｅｎｄｏ中に挿入した。プラスミドｐＢＬＳＶ２Ｃ７ｅｎｄｏをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、末端をフィルインし、そしてＳｍａＩで消化したｐＧＴ１２４５．ａＰＬ２に連結して、ｐＧＴＩ２４Ｃ７ｅｎｄｏを作製した。最終的に、ｐＧＴＩ２４５．ａＰＬ２をＰａｃＩで消化してプラスミド骨格を遊離させ、そしてＰｍｅＩおよびＭｌｕＩで消化したｐＢＶ４と組み合わせ、Ｔｏｉｅｔｔａ，前出によるＢＪ５１３８  Ｅ．ｃｏｌｉにおける相同組換えを用いて、ｐＡＧＶＣ７ｍＥｎｄｏを作製した。プラスミドｐＢＶ４は、２７１９１ｂｐのヒトシヌクレインスタッファーＤＮＡを含む。
【０１１１】
ｇｕｔｌｅｓｓベクター作製および大規模産生および大規模精製を、Ｒｅｄｄｙらによって記載された通りに実施した。粒子の力価を、光学密度測定によって決定した。ＣｓＣｌ精製ベクターから抽出したＤＮＡを、制限酵素消化によって分析して、ベクターの完全性を確認した。ヘキソンに基づく定量的ＰＣＲアッセイを用いて、ＡＧＶ調製物におけるヘルパーウイルス夾雑のレベルを決定した。本研究で用いたＡＧＶＮｕｌｌ調製物、ＡＧＶａｓ５２１調製物、およびＡＧＶＣ７ｍＥｎｄｏ調製物のヘルパー夾雑レベルは、それぞれ、０．０９％、１．９％、および１．４％であった。
【０１１２】
このタモキシフェン誘導性系は、誘導性転写因子または調節性エンドスタチン導入遺伝子のいずれかをコードする初期世代のＥ１／Ｅ２ａ／Ｅ３欠損ベクターの全身投与後に、Ｃ５７ＢＵ６マウスの血清において、高レベルの誘導性エンドスタチン発現を示す。
【０１１３】
この調節系は、誘導性転写因子と、マウスエンドスタチンの発現を駆動する応答性プロモーターという２成分から構成される。この転写因子は、タモキシフェンに対して応答性である、改変されたヒトエストロゲンリガンド結合ドメイン、独特のシステイン２−ヒスチジン２ジンクフィンガーＤＮＡ結合モチーフ、およびＶＰ１６由来の最小トランス活性化ドメインからなる。この応答性プロモーターは、転写因子ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）によって認識されるＤＮＡ配列の６個の繰返しおよびエンドスタチンをコードするＤＮＡからなる。タモキシフェンの存在下では、この転写因子は、最小プロモーターに連結された独特の標的核酸配列からの転写を活性化する。インビトロでルシフェラーゼレセプターを用いて評価された場合、タモキシフェンは、発現を２５０倍まで誘導する。この系を、２つのｇｕｔｌｅｓｓアデノウイルスベクター中に組み込む。ｇｕｔｌｅｓｓアデノウイルスには、全てのウイルスコード領域がない。１つのベクターはこの転写因子をコードし、そして第２のベクターは、エンドスタチンをコードする核酸の転写を駆動する標的プロモーターをコードする。これらの２つのベクターをマウス中に注射する。このことは、効率的な肝臓形質導入をもたらす。これらのマウスに対するタモキシフェンの投与は、エンドスタチンの誘導性発現をもたらし、２０μｇ／ｍｌまでの極めて高い血漿レベルを生じる。タモキシフェン誘導を、２ヶ月間の期間にわたって４回達成する。タモキシフェンの不存在下では、エンドスタチンのバックグラウンドレベルが観察される。
【０１１４】
誘導性の系を構成するＡＧＶＣ７ｍＥｎｄｏおよびＡＧＶａｓ５２１のベクター対を注射し、タモキシフェンで処置されたマウスは、網膜全体にわたって、エンドスタチンについての顕著な染色を示した。このことは、網膜におけるエンドスタチン発現の強力な誘導を実証する。
【０１１５】
網膜脈管透過性を、右眼においてＡＧＶＣ７ｍＥｎｄｏおよびＡＧＶａｓ５２１の１：１混合物を６×１０７粒子、そして左眼においてＡＧＶＮｕｌｌを６×１０７粒子、網膜下注射で与え、続いてタモキシフェンで６日間処置して（最後の３日間は、マウスは、ＶＥＧＦ発現を誘導するためにドキシサイクリンもまた受けた）エンドスタチン発現を誘導した成体ＩＲＢＰ／ｒｔＴＡ−ＴＲＥ／ＶＥＧＦマウスにおいてトレーサーとして［３Ｈ］マンニトールを用いて測定した。網膜対肺漏出比（ＲＬＬＲ）および網膜対腎臓漏出比（ＲＲＬＲ）は、エンドスタチンおよびＶＥＧＦの両方の発現が誘導された眼において、同ＢＥＧＦのみの発現が誘導された様の眼と比較して有意に低下する。これは、エンドスタチンが、網膜血管の透過性のＶＥＧＦ誘発性の増加を抑制することを実証する。
【０１１６】
（実施例１０  ：トランスジェニックマウスおよびアッセイ方法）
Ｏｈｎｏ−Ｍａｔｓｕｉ，Ｋ．らＡｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６０，７１１−７１９  （２００２）によって作製された網膜におけるＶＥＧＦの誘導性発現を有する２系統の二重トランスジェニックマウスを本研究に用いた。これらの系統のうちの１つにおいて、内部光受容体レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）プロモーターを、逆テトラサイクリントランスアクチベーター（ｒｔＴＡ）系と合わせて、光受容体におけるＶＥＧＦのドキシサイクリン誘導性発現を指向する。これらを、ＩＲＢＰ／ｒｔＴＡ−ＴＲＥ／ＶＥＧＦマウスという。第２系統の二重トランスジェニックマウスにおいて、ＩＲＢＰプロモーターというよりはロドプシンプロモーターを逆テトラサイクリントランスアクチベーター系と合わせて、光受容体におけるＶＥＧＦのドキシサイクリン誘導性発現を指向する。これらを、ｒｈｏ／ｒｔＴＡ−ＴＲＥ／ＶＥＧＦマウスという。
【０１１７】
（１）エンドスタチンについての免疫組織化学）
眼に穿刺し、そして４％パラホルムアルデヒド／５％スクロース中に配置し、次いで０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で一晩、４℃にて１．５時間インキュベートする。次いで、眼をリンスし、そしてＯＣＴ中の０．１Ｍリン酸緩衝液／２０％スクロースの２：１混合物において迅速に凍結する。１０μｍの凍結切片を乾燥し、そして冷４％パラホルムアルデヒド中で３０分間事後固定した。リンス後、スライドを、６．２５％  Ｈ２Ｏ２含有冷メタノールで１５分間ブロックし、次いででＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）中の２％スキムミルクで室温にて３０分間ブロックした。スライドを、２％乳汁／ＴＢＳ中のマウスエンドスタチンに対するポリクローナルヤギｇＧ（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）（１．５μｇ／ｍｌ）中で室温にて１時間インキュベートした。０．１％乳汁／ＴＢＳ中で１０分間洗浄した後、スライドを、２％乳汁／ＴＢＳ中の２μｇ／ｍｌビオチン結合体化抗ヤギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）中で室温にて３０分間インキュベートした。０．１％乳汁／ＴＢＳ中で１０分間洗浄した後、スライドを、ストレプトアビジン−ホスファターゼ（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄおよびＰｅｒｒｙ，Ｃａｂｉｎ  Ｊｏｈｎ，ＭＤ）中で室温にて３０分間インキュベートした。０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ中での３回の５分間の洗浄後、スライドを、ＨｉｓｔｏＭａｒｋ  Ｒｅｄ（ＫｉｒｋｅｇａａｒｄおよびＰｅｒｒｙ）を用いて発色させ、積載した。
【０１１８】
（２）［３Ｈ］マンニトールをトレーサーとして用いた網膜脈管透過性の測定）
成体二重トランスジェニックＩＲＢＰ／ｒｔＴＡ−ＴＲＥ／ＶＥＧＦマウス（ｎ＝１１）に、右眼にはＡＧＶＣ７ｍＥｎｄｏおよびＡＧＶａｓ５２１の１：１混合物を６×１０７粒子、そして左眼にはＡＧＶＮｕｌｌを６×１０７粒子、網膜下注射によって与えた。翌日、マウスを、ヒマワリ油中５％  ＤＭＳＯ中の５００μｇのタモキシフェンの毎日の腹腔内注射を開始し、そして３日後に、これらにそれらの飲料水中で２ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンを与えた。ドキシサイクリンを開始してから３日後、網膜脈管透過性を、［３Ｈ］マンニトールを用いて測定した。手短に述べると、マウスに、１μＣｉ／ｇ体重の［３Ｈ］マンニトール（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）の腹腔内注射を与えた。１時間後、マウスを屠殺し、そして眼を取り出した。角膜および水晶体を取り出し、そして網膜全体をアイカップから注意深く切開し、そして予め計量したシンチレーションバイアル中に配置した。胸腔を開け、そして左の上葉を取り出し、そして別の計量したシンチレーションバイアル中に配置した。左の背側切開部を作製し、そして腹腔に入ることなく腹膜後隙に入った。腎臓脈管を鉗子でとめ、そして左腎臓を取り出し、全ての脂肪を除去し、そして予め計量したシンチレーションバイアル中に配置した。全ての液体をバイアルから除去し、そして残りの小滴を２０分間かけてエバポレートさせた。バイアルを計量し、そして組織の重量を記録した。１ｍｌのＮＣＳＩＩ可溶化溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を各バイアルに添加し、そしてこれらのバイアルを５０℃の水浴中で一晩インキュベートした。可溶化した組織を室温にし、そして５０℃の水浴においてトルエン中の２０％過酸化ベンゾイルで脱色した。これらのバイアルを室温にし、そして５ｍｌのＣｙｔｏｓｃｉｎｔ  ＥＳ（ＩＣＮ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）および３０μｌの氷酢酸を添加した。これらのバイアルを暗所で４℃にて数時間保存して、化学発光を除去した。Ｗａｌｌａｃ  １４０９  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて放射能をカウントした。
【０１１９】
（３）フルオレセイン漏出を用いた網膜脈管透過性の評価）
成体ｒｈｏ／ｒｔＴＡ−ＴＲＥ／ＶＥＧＦ二重トランスジェニックマウスに、右眼には１．５×１０６形質導入単位（ＴＵ）のＢＩＶエンドスタチンを、そして左眼には１．５×１０６ＴＵのＢＩＶＮｕｌｌを網膜下注射によって与えた。ベクター注射の４週間後、マウスを、それらの飲料水中０．５ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンを開始した。７日後、マウスに、１２μｌ／ｇ体重の１％フルオレセインナトリウム（Ａｌｃｏｎ，Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ，Ｔｅｘａｓ）の腹腔内注射を与え、そして１分後、インビボでの蛍光顕微鏡法を用いて各眼の写真を撮った。ＶＥＧＦ発現を開始してから７日後に、別のマウスを安楽死させ、そして網膜凍結切片を、各眼において同じ位置にある視神経に隣接する網膜の後ろ部分全体を通して切断した。これらの切片をＧｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａレクチン、ヘマトキシリン、およびエオシンで染色した。ＢＩＶＮｕｌｌを注射した眼における網膜（ＦおよびＨ）は、ＢＩＶエンドスタチンを注射した眼における網膜（ＥおよびＧ）よりもずっと厚い。
【０１２０】
（４）網膜の厚さの測定）
成体ｒｈｏ／ｒｔＴＡ−ＴＲＥ／ＶＥＧＦ二重トランスジェニックマウスに、右眼には１．５×１０６ＴＵのＢＩＶエンドスタチンを、そして左眼には１．５×１０６ＴＵのＢＩＶＮｕｌｌを網膜下注射によって与えた。ベクター注射の４週間後、マウスを、それらの飲料水中０．５ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンについて開始した。ドキシサイクリンを開始してから７日後、マウスを安楽死させ、そして１０μｍの網膜凍結切片を、各眼において同じ位置にある視神経に隣接する網膜の後ろ部分全体を通して切断した。これらの切片を、ビオチン化Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａレクチンＢ４（ＧＳＡ，Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。このレクチンは、脈幹細胞２２に選択的に結合する。スライドを、４℃にてメタノール／Ｈ２Ｏ２中で１０分間インキュベートし、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．６）（ＴＢＳ）で洗浄し、そして１０％正常ブタ血清中で３０分間インキュベートした。スライドを、ビオチン化ＧＳＡとともに室温にて２時間インキュベートし、そして０．０５Ｍ  ＴＢＳでリンスした後、これらをペルオキシダーゼに結合したアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに室温いて４５分間インキュベートした。これらのスライドをＨｉｓｔｏＭａｒｋ  Ｒｅｄ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ）で発色させて、赤色反応産物を得て、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色した。網膜の厚さを、視神経の各縁部から３００μｍの部分での画像解析によって測定し、そして平均化して単一の実験値を得た。
【０１２１】
（５）二重トランスジェニックマウスにおける網膜血管新生の評価）
３匹のｒｈｏ／ｒｔＴＡ−ＴＲＥ／ＶＥＧＦマウスを用いて、ＶＥＧＦ誘発性網膜血管新生に対するエンドスタチンの効果を評価した。右眼での１．５×１０６ＴＵのＢＩＶエンドスタチン、そして左眼での１．５×１０６ＴＵのＢＩＶＮｕｌｌの網膜下注射の４週間後、マウスを、それらの飲料水中０．５ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンについて開始した。ドキシサイクリンを開始してから７日後、マウスを安楽死させ、そして各眼を、虹彩の末梢縁部から１８０°離れた他の末梢縁部への切片（１０μｍ切片）とした。切片を、Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａレクチン（ＧＳＡ）、ヘマトキシリン、およびエオシンで染色した。
【０１２２】
光受容体層におけるＧＳＡ染色の面積は、血管新生量の指標であり、そして虹彩の１つの縁部から他の縁部に対して１００μｍ離れた切片について測定した（一般に、１つの眼あたり１３切片）。これらの１３の測定値の平均は、１切片あたりの血管新生の面積という、単一の実験値を構成した。
【０１２３】
（６）二重トランスジェニックマウスにおける網膜剥離の評価）
１１匹の成体ｒｈｏ／ｒｔＴＡ−ＴＲＥ／ＶＥＧＦ二重トランスジェニックマウスに、右眼には１．５×１０６ＴＵのＢＩＶエンドスタチンを、そして左眼には１．５×１０６ＴＵのＢＩＶＮｕｌｌを網膜下注射によって与えた。ベクター注射の４週間後、マウスを、それらの飲料水中にて２ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンについて開始した。４日後、マウスに麻酔し、瞳孔を拡大させ、そして全網膜剥離もしくは部分的網膜剥離が存在するかまたは剥離が存在しないかに注目する検眼鏡検査を各眼について、２人の独立した観察者によって実施した。
【配列表】
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