(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において２０個以内のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ-イオノン環-4-ケトラーゼ活性を有するペプチド、又は（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、β-イオノン環-4-ケトラーゼ活性を有するペプチドをコードするβ-イオノン環-4-ケトラーゼ遺伝子、並びに、（ｄ）配列番号１０記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｅ）配列番号１０記載のアミノ酸配列において１０個以内のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド、又は（ｆ）配列番号９記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、β-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチドをコードするβ-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ遺伝子を導入して得られる微生物または植物であって、アスタキサンチンまたはその代謝物を合成できる微生物または植物。
【請求項２】
β-イオノン環-4-ケトラーゼ遺伝子及びβ-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ遺伝子を、他のカロテノイド生合成遺伝子とともに導入して得られる請求項１に記載の微生物または植物。
【請求項３】
微生物が大腸菌であることを特徴とする請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
請求項１乃至３に記載の微生物を、培地で培養して培養物又は菌体からアスタキサンチンまたはその代謝物を得ることを特徴とする、アスタキサンチンまたはその代謝物の製造法。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の植物を、栽培して植物体からアスタキサンチンまたはその代謝物を得ることを特徴とする、アスタキサンチンまたはその代謝物の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β-イオノン環（β環）を有するカロテノイドの4位（4’位）のメチレン基をケト基に変換するオキシゲナーゼ遺伝子、及び、β-イオノン環（β環）を有するカロテノイドの3位（3’位）の炭素に水酸基を導入するヒドロキシラーゼ遺伝子が導入された微生物または植物を利用したアスタキサンチンまたはその代謝物の製造法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
カロテノイド（carotenoid、カロチノイドとも呼ばれる）は、炭素鎖が40のイソプレン骨格からなる自然界に豊富に存在する色素の総称である。現在までに600種以上のカロテノイドが単離されている（Pfander, H., ed., Key to Carotenoids, Basel, Birkhauser, 1987）。最近ではカロテノイドの持つ種々の癌（がん）等の慢性病に対する予防効果が注目されており、数多くの報告がなされている（たとえば、西野輔翼, 村越倫明, 矢野昌充, Food Style 21, 4, 53-55, 2000;  Nishino, H. et al, Carotenoids in cancer chemoprevention. Cancer Metastasis Rev. 21, 257-264, 2002;  Mayne, S.T., β-Carotene, carotenoids, and disease prevention in humans. FASEB J., 10, 690-701, 1996参照）。その中でもアスタキサンチン（astaxanthin）は、健康食品原料として最近、特に注目を集めているカロテノイドである（魚躬隆敏，史上最強のカロテノイド「アスタキサンチン」の抗酸化作用とがん転移抑制効果，Food Style 21, 4, 70-75, 2000）。活性酸素の1種である一重項酸素の消去能に関してin vitroの評価系では、アスタキサンチンは、ビタミンEの500倍、β-カロテンの40倍、リコペンの10倍の効果を有している。また、ヒトの疫学・臨床試験において、アスタキサンチンは血中のLDLの酸化を抑制することにより、動脈硬化を抑制することが明らかにされている（前述の文献：魚躬隆敏， Food Style 21, 4, 70-75, 2000）。また、アスタキサンチンは、NK細胞の活性の亢進、白内障や黄斑変性症の予防、膀胱がん等がんの予防に効果があることが明らかにされつつある（前述の文献：魚躬隆敏， Food Style 21, 4, 70-75, 2000; Tanaka, T. et al, Chemoprevention of mouse urinary bladder carcinogenesis by the naturally occurring carotenoid astaxanthin. Carcinogenesis 15, 15-19, 1994）。
【０００３】
アスタキサンチンは、工業的には、オキアミやアメリカザリガニなどの甲殻類から抽出されており、また、アスタキサンチン産生緑藻Haematococcus pluvialisの培養物からも抽出されている。しかしながら、前者の場合は 色素濃度の均一性や原料特有の臭気などの品質的問題および低収率から来るコスト高などにより、後者の場合は 中温、中性での長期間培養から来る供給の不安定性などにより、安価な安定的供給に至っていないのが現状である。したがって、アスタキサンチンを安価に安定的に供給することができれば、ヒトの健康への好影響に関する種々の生理試験を新たに実施することも可能になり、現在の健康食品市場を大きく拡大することができると思われる。
【０００４】
上記の目的を達成するには、遺伝子組換え技術により、代謝工学的にアスタキサンチンを高生産するようになった微生物や植物を作出し、これらによるアスタキサンチンの製造・販売が考えられる。微生物や植物にアスタキサンチンを生産させるのに必要な遺伝子はすでに取得されており、それらを利用して、本来はカロテノイドを作らない細菌や酵母等の微生物や、植物の特殊な器官にアスタキサンチンを合成させることはすでに可能になっている（非特許文献1;  Miura, Y., Kondo, K., Saito, T., Shimada, H., Fraser. P. D., and Misawa, N., Production of the carotenoids, lycopene, β-carotene, and astaxanthin in the food yeast Candida utilis. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1226-1229, 1998;  Mann, V., Harker, M., Pecker, I., and Hirschberg, J., Metabolic engineering of astaxanthin production in tobacco flowers. Nat. Biotechnol. 18, 888-892, 2000）。しかしながら、アスタキサンチンまでの合成に必要な遺伝子をすべて導入し発現させても、最終産物のアスタキサンチンに加えて、アスタキサンチンの合成中間体が多く貯まるのが現状であった。これらは、β-カロテンからアスタキサンチンまでの経路における合成中間体のカロテノイドであり（図１参照）、この経路がアスタキサンチン合成の律速段階である。組換え大腸菌を用いた例では、最終産物のアスタキサンチン（36〜50％）に加えて、アドニキサンチン(adonixanthin;4-ケトゼアキサンチン)、アドニルビン（adonirubin;フェニコキサンチン）、カンタキサンチン（canthaxanathin）、3-ヒドロキシエキネノン（3-hydroxyechinenone）、3’-ヒドロキシエキネノン（3’-hydroxyechinenone）等の合成中間体が検出された（非特許文献1）。最近、緑藻Haematococcus pluvialis由来のβ-イオノン環-4-ケトラーゼ（β-C4-ketolase）遺伝子（crtO）がシロイヌナズナ（Arabidopsis）に導入され、その種子で発現されたが、生成した主要なカロテノイドはすべて、アスタキサンチンの合成中間体（アドニルビンやカンタキサンチン等）であった。β-カロテンからアスタキサンチン合成までの経路は、２つの酵素、すなわち、β-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ（β-C3-hydroxylase）（CrtZ）とβ-イオノン環-4-ケトラーゼ（β-C4-ketolase）（CrtW, CrtO, またはBkt）によって担われることがわかっている（図1参照）。アスタキサンチンの高生産のためには、この2つの酵素の効率化が望まれていた。たとえば、β-イオノン環-4-ケトラーゼは、アドニキサンチンからアスタキサンチンへの変換効率が特に悪く、多くの場合、アドニキサンチンが蓄積されることがわかっていた（非特許文献2; Yokoyama, A. and Miki, W., Composition and presumed biosynthetic pathway of carotenoids in the astaxanthin-producing bacterium Agrobacterium aurantiacum. FEMS Microbiol. Lett. 128, 139-144, 1995）。
【０００５】
【非特許文献１】Misawa, N., Satomi, Y., Kondo, K., Yokoyama, A., Kajiwara, S., Saito, T., Ohtani, T., and Miki, W., Structure and functional analysis of a marine bacterial carotenoid biosynthesis gene cluster and astaxanthin biosynthetic pathway proposed at the gene level.  J. Bacteriol. 177, 6575-6584, 1995
【非特許文献２】Fraser, P. D., Shimada, H., and Misawa, N., Enzymic confirmation of reactions involved in routes to astaxanthin formation, elucidated using a direct substrate in vitro assay.  Eur. J. Biochem. 252, 229-236, 1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、β-イオノン環の4位のメチレン基をケト基に変換する酵素［β-イオノン環-4-ケトラーゼ（β-C4-ketolase）；カロテノイド 4,4’-β-オキシゲナーゼ（carotenoid 4,4’-β-oxygenase）］やβ-イオノン環の3位の炭素に水酸基を導入する酵素［β-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ（β-C3-hydroxylase）；カロテノイド 3,3’-β-ヒドロキシラーゼ（carotenoid 3,3’-β-hydroxylase）］をコードする遺伝子を導入・発現させた組換え微生物や植物を利用した、アスタキサンチンやその代謝物の効率的な製造法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、海洋細菌ブレバンディモナス属（Brevundimonas sp.）SD-212株（SD212株；MBIC 03018）がアスタキサンチンやその代謝物を作ることができるにもかかわらず、未だカロテノイド生合成酵素の性質が明らかにされていないことに着目した。鋭意研究を重ねた結果、本海洋細菌よりクローニングされた、β-イオノン環の4位のメチレン基をケト基に変換するオキシゲナーゼ［CrtW：β-イオノン環-4-ケトラーゼ（β-C4-ketolase）；カロテノイド 4,4’-β-オキシゲナーゼ（carotenoid 4,4’-β-oxygenase）］がアドニキサンチンから効率的にアスタキサンチンを合成できる酵素であることを見出した。さらに、本発明者らは、本海洋細菌よりクローニングされた、β-イオノン環の3位の炭素に水酸基を導入するヒドロキシラーゼ［CrtZ：β-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ（β-C3-hydroxylase）；カロテノイド 3,3’-β-ヒドロキシラーゼ（carotenoid 3,3’-β-hydroxylase）］が、他細菌由来の同酵素（CrtZ）より、アスタキサンチンの合成を効率的に行う酵素であることを見出した。
【０００８】
まず、ブレバンディモナス属SD-212株の染色体DNAを用いて、大腸菌におけるコスミドライブラリーを作製した。次に、フィトエンデサチュラーゼ（crtI）遺伝子がカロテノイド産生細菌間で2つの保存領域を有していることを見出し、PCR用プライマーを設計した。このプライマーを用いて、ブレバンディモナス属SD-212株の染色体DNAを鋳型としたPCRを行ったところ、1.1 kbのDNA断片が増幅された。この配列の塩基配列を決定したところ、crtIの部分配列であることがわかった。このcrtI部分配列断片をプローブとして、SD-212株のコスミドライブラリーを用いたコロニーハイブリダイゼーション（colony hybridization）法を行ったところ、数個の陽性コロニーが得られた。陽性コロニーからプラスミドDNAを調製し、サザンハイブリダイゼーション（Southern hybridization）法を行い、陽性の12 kbのEcoRIのDNA断片を得た。この12 kbのEcoRI断片の塩基配列を決定したところ、この断片内にカロテノイド生合成遺伝子群［crtWとcrtZを含む既存のcrt遺伝子（6個）及びidi遺伝子（1つ）とホモロジーがあるORF（オープンリーディングフレーム、open reading frame）が７つ］が存在することが明らかとなった。次に、本細菌由来のcrtW遺伝子を、大腸菌ベクタ-pUC18におけるlac遺伝子のプロモータの利用とLacZのリーダ配列を利用した融合タンパク質法により大腸菌で強制発現させるためのコンストラクトを作製した。コントロールとして、パラコッカス属細菌由来の2種類のcrtW遺伝子も同様にコンストラクトを作製した。そして、エルウィニア属細菌のcrt遺伝子群（crtE, crtB, crtI, crtY, crtZ）の利用によりゼアキサンチンを産生する大腸菌を宿主として、各種CrtWの機能の比較を行った。その結果、ブレバンディモナス属SD-212株由来のCrtWがアドニキサンチンからアスタキサンチンを効率的に変換できる酵素であり、その結果としてアスタキサンチンを効率的に合成できることを突き止めた。さらに、本細菌由来のcrtZ遺伝子を、大腸菌ベクタ-pUC18におけるlac遺伝子のプロモータの利用とLacZのリーダ配列を利用した融合タンパク質法により大腸菌で強制発現させるためのコンストラクトを作製した。コントロールとして、パラコッカス属細菌由来の2種類のcrtZ遺伝子も同様にコンストラクトを作製した。さらにコントロールとして、エルウィニア属細菌及びフラボバクテリウム属P99-3株由来のcrtZも同様にコンストラクトを作製した。ただし、後者のP99-3株のcrtZの場合は、pUC18の代わりにpUC8を用いた。そして、エルウィニア属細菌のcrt遺伝子群（crtE, crtB, crtI, crtY）及びパラコッカス属細菌のcrtW遺伝子の利用によりカンタキサンチンを産生する大腸菌を宿主として、各種CrtZの機能の比較を行った。その結果、ブレバンディモナス属SD-212株由来のCrtZを用いた場合がアスタキサンチンの生産量が最も多いこと、すなわち、本CrtZがアスタキサンチンを最も効率的に合成できることを突き止め、本発明を完成するに至ったのである。
【０００９】
即ち、本発明は、以下の（１）〜（１２）を提供するものである。
（１）（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ-イオノン環-4-ケトラーゼ活性を有するペプチド、又は（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、β-イオノン環-4-ケトラーゼ活性を有するペプチドをコードするβ-イオノン環-4-ケトラーゼ遺伝子を導入して得られる微生物または植物であって、アスタキサンチンまたはその代謝物を合成できる微生物または植物。
【００１０】
（２）β-イオノン環-4-ケトラーゼ遺伝子を、他のカロテノイド生合成遺伝子とともに導入して得られる（１）に記載の微生物または植物。
（３）他のカロテノイド生合成遺伝子が、ファルネシルピロリン酸から、３位が水酸化されたβ-イオノン環を有するカロテノイドを合成するのに必要とされる遺伝子群の全部又は一部であることを特徴とする（２）に記載の微生物または植物。
（４）微生物が大腸菌であることを特徴とする上記（１）乃至（３）に記載の微生物。
【００１１】
（５）（１）乃至（４）に記載の微生物を、培地で培養して培養物又は菌体からアスタキサンチンまたはその代謝物を得ることを特徴とする、アスタキサンチンまたはその代謝物の製造法。
（６）（１）乃至（３）に記載の植物を、栽培して植物体からアスタキサンチンまたはその代謝物を得ることを特徴とする、アスタキサンチンまたはその代謝物の製造法。
【００１２】
（７）（ｄ）配列番号１０記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｅ）配列番号１０記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド、又は（ｆ）配列番号９記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、β-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチドをコードするβ-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ遺伝子を導入して得られる微生物または植物であって、アスタキサンチンまたはその代謝物を合成できる微生物または植物。
【００１３】
（８）β-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ遺伝子を、他のカロテノイド生合成遺伝子とともに導入して得られる（７）に記載の微生物または植物。
（９）他のカロテノイド生合成遺伝子が、ファルネシルピロリン酸から、４位がケト化されたβ-イオノン環を有するカロテノイドを合成するのに必要とされる遺伝子群の全部又は一部であることを特徴とする（８）に記載の微生物または植物。
（１０）微生物が大腸菌であることを特徴とする（７）乃至（９）に記載の微生物。
【００１４】
（１１）（７）乃至（１０）に記載の微生物を、培地で培養して培養物又は菌体からアスタキサンチンまたはその代謝物を得ることを特徴とする、アスタキサンチンまたはその代謝物の製造法。
（１２）（７）乃至（９）に記載の植物を、栽培して植物体からアスタキサンチンまたはその代謝物を得ることを特徴とする、アスタキサンチンまたはその代謝物の製造法。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
１．遺伝子源の海洋細菌ブレバンディモナス属SD-212 株（MBIC 03018）
目的とする遺伝子の供給源となった海洋細菌ブレバンディモナス属（Brevundimonas sp.）SD-212 株（SD212；MBIC 03018）は、火山列島の海水中より単離されたα-プロテオバクテリアであり、GC含量は67.1（mol）%である。本海洋細菌が作るカロテノイドは、アスタキサンチン、2-ヒドロキシアスタキサンチン（2-hydroxyastaxanthin）や2-ヒドロキシアドニキサンチン（2-hydroxyadanixanthin）等であることが（株）海洋バイオテクノロジー研究所の横山らにより報告されている（Yokoyama, A., Miki, W., Izumida, H., and Shizuri, Y., New trihydroxy-keto-carotenoids isolated from an astaxanthin-producing marine bacterium.  Biosci. Biotech. Bioche. 60, 200-203, 1996参照）。なお、本細菌は、MBIC 03018として（株）海洋バイオテクノロジー研究所より公開・分譲されている。また、本細菌の16S rDNA配列とgyrB遺伝子配列はそれぞれ、アクセッション番号AB016849、AB014993としてGenBank/DDBJに登録されている。
【００１６】
２．β-イオノン環-4-ケトラーゼをコードする遺伝子
本発明は、以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すペプチドをコードする遺伝子（以下、この遺伝子を「本発明のcrtW遺伝子」という場合がある。）を利用する。
（ａ）配列番号２記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｂ）配列番号２記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ-イオノン環-4-ケトラーゼ活性を有するペプチド。
【００１７】
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、β-イオノン環-4-ケトラーゼ活性を有するペプチド。
（ａ）のペプチドは、ブレバンディモナス属SD-212株から得られたβ-イオノン環-4-ケトラーゼ活性を有する244個のアミノ酸配列からなるペプチド（CrtWとも呼ぶ）である。
【００１８】
（ｂ）のペプチドは、（ａ）のペプチドに、効率的なβ-イオノン環-4-ケトラーゼ活性を失わせない程度の変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500, 1982）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、β-イオノン環-4-ケトラーゼ活性を失わせない限り、その個数は制限されないが、通常は、20アミノ酸以内であり、好ましくは10アミノ酸以内であり、さらに好ましくは5アミノ酸以内である。
【００１９】
（ｃ）のペプチドは、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる細菌由来のβ-イオノン環-4-ケトラーゼ活性を有するペプチドである。（ｃ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるDNAは、配列番号１記載の塩基配列により表されるDNAと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、90％以上の相同性を指す。
【００２０】
本発明のcrtW遺伝子は、例えば、以下のようにして得ることができる。まず、海洋細菌ブレバンディモナス属SD-212株のコスミドライブラリーを大腸菌において作製する。次に、実施例６に示したようなカロテノイド生合成遺伝子の相同配列を利用したコロニーハイブリダイゼーション法やPCRクローニング法により得ることができる。
【００２１】
３．β-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼをコードする遺伝子
本発明は、以下の（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）に示すペプチドをコードする遺伝子（以下、この遺伝子を「本発明のcrtZ遺伝子」という場合がある。）を利用する。
（ｄ）配列番号１０記載のアミノ酸配列からなるペプチド。
（ｅ）配列番号１０記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつβ-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチド。
【００２２】
（ｆ）配列番号９記載の塩基配列からなるDNA又はそれと相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAがコードする細菌由来のペプチドであって、β-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼを有するペプチド。
（ｄ）のペプチドは、ブレバンディモナス属SD-212株から得られたβ-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ活性を有する161個のアミノ酸配列からなるペプチド（CrtZとも呼ぶ）である。
【００２３】
（ｅ）のペプチドは、（ｄ）のペプチドに、効率的なβ-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ活性を失わせない程度の変異が導入されたペプチドである。「変異」の意味は、前述した本発明のcrtW遺伝子の場合と同様である。
（ｆ）のペプチドは、DNA同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる細菌由来のβ-イオノン環-3-ヒドロキシラーゼ活性を有するペプチドである。（ｆ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」の意味は、前述した本発明のcrtW遺伝子の場合と同様である。
【００２４】
本発明のcrtZ遺伝子は、例えば、以下のようにして得ることができる。まず、海洋細菌ブレバンディモナス属SD-212株のコスミドライブラリーを大腸菌において作製する。次に、実施例６に示したようなカロテノイド生合成遺伝子の相同配列を利用したコロニーハイブリダイゼーション法やPCRクローニング法により得ることができる。
【００２５】
なお、本発明のcrtW遺伝子及びcrtZ遺伝子は、ブレバンディモナス属SD-212株のカロテノイド生合成遺伝子群を含む12 kb EcoRI DNA断片中に含まれており、このDNA断片が大腸菌ベクターpBluescript II KS-に挿入されたプラスミドp5Bre2-15を有する大腸菌は受託番号P-19580として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００２６】
４．アスタキサンチンまたはその代謝物を生産する微生物または植物
本発明には、２に記載の本発明のcrtW遺伝子を導入して得られる微生物または植物、及び、３に記載の本発明のcrtZ遺伝子を導入して得られる微生物または植物を含む。微生物または植物には、本発明の遺伝子だけでなく、他のカロテノイド生合成遺伝子も導入する場合が多いが、微生物 または植物で発現させたい器官がもともと基質となるカロテノイドを生産している場合には、他のカロテノイド生合成遺伝子を導入する必要はないか、或いは一部のみ導入すればよい。
【００２７】
宿主とする微生物は大腸菌を例示できるが、これ以外の微生物であってもよい。宿主とする植物はナタネを例示できるが、これ以外の植物であってもよい。
【００２８】
他のカロテノイド生合成遺伝子は、通常、ファルネシルピロリン酸（FPP）からβ-カロテン（β-carotene）を合成するのに必要とされる遺伝子群の全部または一部を含む。このような遺伝子群の具体例としては、FPPからゲラニルゲラニルピロリン酸（GGPP）を合成する酵素遺伝子crtE、2分子のGGPPからフィトエン（phytoene）を合成する遺伝子crtB、フィトエンからリコペン（lycopene）を合成する遺伝子crtI、リコペンからβ-カロテン（β-carotene）を合成する遺伝子crtY（通常、エルウィニア属細菌由来のもの）等を例示できる。β-カロテンからアスタキサンチンを合成するには、本発明のcrtW遺伝子とcrtZ遺伝子の両方を用いるのが好ましいが、片方のみを用いることも可能である。本発明のcrtW遺伝子のみを用いる場合は、β-カロテンに3（3’）-ヒドロキシ基を導入する他生物由来のcrtZ遺伝子（通常、エルウィニア属細菌またはパラコッカス属細菌由来のもの）またはそれと同等の遺伝子を用いる必要がある。本発明のcrtZ遺伝子のみを用いる場合は、β-カロテンの4（4’）位にケト基を導入する他生物由来のcrtW遺伝子（通常、パラコッカス属細菌由来のもの）またはそれと同等の遺伝子を用いる必要がある。
【００２９】
これら他のカロテノイド生合成遺伝子群のすべて又は一部を適当な発現ベクターに挿入し、発現させたい微生物に導入すれば、その組換え微生物は、β-イオノン環を有するカロテノイド（β-カロテンまたはその代謝物）、または3-ヒドロキシ-β-イオノン環を有するカロテノイド（ゼアキサンチンまたはその代謝物）、または4-ケト-β-イオノン環を有するカロテノイド（カンタキサンチンまたはその代謝物）を作るようになる（基質のFPPはすべての微生物が作ることができる。GGPPも微生物によっては合成量が少ないものもあるが、すべての微生物が作ることができる）。
【００３０】
また、上記の遺伝子群の一部を、発現させたい器官で発現するプロモータ（たとえば、種での発現にはナピンプロモータ）と葉緑体等プラスチドへの移行ペプチド（transit peptide；たとえば、Rubiscoの小サブユニットの移行ペプチド）を利用して適当な植物用ベクターに挿入し、植物に導入すれば、その組換え植物はβ-イオノン環を有するカロテノイド（β-カロテンまたはその代謝物）、または3-ヒドロキシ-β-イオノン環を有するカロテノイド（ゼアキサンチンまたはその代謝物）、または4-ケト-β-イオノン環を有するカロテノイド（カンタキサンチンまたはその代謝物）を作るようになる。通常、ナタネの種など植物のカロテノイドを産生する器官はβ-イオノン環を有するカロテノイドを作るのに必要な大部分の遺伝子を有している場合が多いが、crtB遺伝子の導入・発現がカロテノイドの生産量全体を上げる可能性が高い（Shewmaker, C.K. et al, Seed-specific overexpression of phytoene synthase: increase in carotenoids and other metabolic effects. Plant J. 20, 401-412, 1999）。
【００３１】
以上のようにして作製された、β-イオノン環を有するカロテノイド（β-カロテンまたはその代謝物）、または3-ヒドロキシ-β-イオノン環を有するカロテノイド（ゼアキサンチンまたはその代謝物）、または4-ケト-β-イオノン環を有するカロテノイド（カンタキサンチンまたはその代謝物）の生産能のある微生物または植物に、本発明のcrtW遺伝子及び／又はcrtZ遺伝子（植物の場合は、前述の移行ペプチド配列をN末配列に付ける必要がある）をさらに導入・発現させれば、その微生物または植物は、β-カロテンにおける4位（4’位）のメチレン基がケト基に変換され且つ3位（3’位）の炭素に水酸基が導入されたカロテノイドであり、また、ゼアキサンチンにおける4位（4’位）のメチレン基がケト基に変換されたカロテノイドでもあり、また、カンタキサンチンにおける3位（3’位）の炭素に水酸基が導入されたカロテノイドでもあるアスタキサンチンや、内在のアスタキサンチン代謝酵素により変換されたアスタキサンチン代謝物（たとえば、2-ヒドロキシアスタキサンチンやアスタキサンチンのエステル体）を作るようになる。
【００３２】
大腸菌や酵母等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入・発現法は、多くの実験書に記載されているので（たとえば、Sambrook, J., Russel,D. W., Molecular Cloning  A Laboratory Manual, 3rd Edition, CSHL Press, 2001）、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。
【００３３】
植物のベクターの情報や外来遺伝子の導入・発現法も、多くの実験書に記載されているので（たとえば、石田功、三沢典彦、細胞工学実験操作入門、講談社サイエンティフィク、1992）、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。
【００３４】
４．アスタキサンチンまたはその代謝物の製造法
本発明は、上記に記載の微生物を、培地で培養して培養物又は菌体から、アスタキサンチンやその代謝物を得ることを特徴とする、効率的なアスタキサンチンやその代謝物の製造法を提供する。さらに、本発明には、上記に記載の植物を栽培して、種等の器官からアスタキサンチンやその代謝物を得ることを特徴とする、効率的なアスタキサンチンやその代謝物の製造法を提供する。
【００３５】
アスタキサンチンの代謝物とは、2-ヒドロキシアスタキサンチンやアスタキサンチンのエステル体などを例示できるが、これらに限定されるわけではない。また、アスタキサンチン代謝物が存在しない場合もある。
本明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を表す。
【００３６】
配列番号１：ブレバンディモナス属SD-212株のcrtW遺伝子の配列及びそれがコードするアミノ酸配列。
配列番号２：ブレバンディモナス属SD-212株のcrtW遺伝子がコードするアミノ酸配列。
配列番号３：ブレバンディモナス属SD-212株由来のcrtWの増幅用のプライマー（フォワード）
配列番号４：ブレバンディモナス属SD-212株由来のcrtWの増幅用のプライマー（リバース）
配列番号５：パラコッカス属細菌PC1株由来のcrtWの増幅用のプライマー（フォワード）
【００３７】
配列番号６：パラコッカス属細菌PC1株由来のcrtWの増幅用のプライマー（リバース）
配列番号７：パラコッカス属細菌N81106株由来のcrtWの増幅用のプライマー（フォワード）
配列番号８：パラコッカス属細菌N81106株由来由来のcrtWの増幅用のプライマー（リバース）
配列番号９：ブレバンディモナス属SD-212株のcrtZ遺伝子の配列及びそれがコードするアミノ酸配列。
【００３８】
配列番号１０：ブレバンディモナス属SD-212株のcrtZ遺伝子がコードするアミノ酸配列。
配列番号１１：ブレバンディモナス属SD-212株由来のcrtZの増幅用のプライマー（フォワード）
配列番号１２：ブレバンディモナス属SD-212株由来のcrtZの増幅用のプライマー（リバース）
配列番号１３：エルウィニア・ウレドボラ由来のcrtZの増幅用のプライマー（フォワード）
配列番号１４：エルウィニア・ウレドボラ由来のcrtZの増幅用のプライマー（リバース）
配列番号１５：パラコッカス属細菌PC1株由来のcrtZの増幅用のプライマー（フォワード）
【００３９】
配列番号１６：パラコッカス属細菌PC1株由来のcrtZの増幅用のプライマー（リバース）
配列番号１７：パラコッカス属細菌N81106株由来のcrtZの増幅用のプライマー（フォワード）
配列番号１８：パラコッカス属細菌N81106株由来由来のcrtZの増幅用のプライマー（リバース）
配列番号１９：フラボバクテリウム属P99-3株由来のcrtZの増幅用のプライマー（フォワード）
配列番号２０：フラボバクテリウム属P99-3株由来由来のcrtZの増幅用のプライマー（リバース）
【発明の効果】
【００４０】
本発明により、ブレバンディモナス属SD-212株のcrtW遺伝子及び／又はcrtZ遺伝子を利用して、アスタキサンチンやその代謝物を大量に製造できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下、実施例により本発明について具体的に説明する。もっとも、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００４２】
〔実施例1〕菌株,  プラスミド、生育条件
本発明（crtW）に用いられた菌株とプラスミドを表１に示す。菌株の培養は37℃あるいは30℃でLB（Luria-Bertani）培地を用いて行った。必要に応じて、アンピシリン（ampicillin；Ap ，100μg/ml）または、クロラムフェニコール（chloramphenicol；Cm，30 μg/ml）を培地に添加した。
【表１】
0004803739.tif 000002
【００４３】
Misawa, N., Satomi, Y., Kondo, K., Yokoyama, A., Kajiwara, S., Saito, T., Ohtani, T., and Miki, W. 1995. Structure and functional analysis of a marine bacterial carotenoid biosynthesis gene cluster and astaxanthin biosynthetic pathway proposed at the gene level. J. Bacteriol. 177: 6575-6585：非特許文献1
【００４４】
〔実施例2〕  遺伝子操作実験
プラスミドの調製、制限酵素処理、ライゲーション反応、形質転換などの通常の遺伝子操作実験は、Sambrookら（1989）のMolecular Cloningに示された方法により行った。
Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
【００４５】
〔実施例3〕  ブレバンディモナス属SD-212株からの染色体DNAの調製
ブレバンディモナス属（Brevundimonas sp.）SD-212 株（SD212；MBIC 03018）を300 mlのMarine Broth (MB)培地（Difco）で25℃、3日間培養した。菌体を集菌後、STE緩衝液（100 mM NaCl, 10 mM Tris・HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）で二回洗浄し、68℃で15分間熱処理をした後、5 mg/ml のリゾチーム（Sigma）と100 μg/mlのRNase A (Sigma)を含むI液 (50 mM グルコース、25 mM Tris・HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0)に懸濁した。37℃で一時間インキュベートした後、250 μg/mlになるようにProtenase K (Sigma)を加え、37℃で10分間インキュベートした。さらに最終濃度が1% になるようにN-Lauroylsarcosin・Naを添加し、転倒混和により穏やかに完全に混合した後37℃で3時間インキュベートした。さらにフェノール/クロロホルム抽出を数回行った後、2倍量のエタノールをゆっくりと添加しながら、析出してきた染色体DNAをガラス棒で巻きつけ、70% エタノールでリンスした後、2 mlのTE緩衝液（10 mM Tris・HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0）に溶解して、染色体DNA溶液とした。
【００４６】
〔実施例4〕  PCR法によるフィトエンデサチュラーゼ遺伝子(crtI)の部分断片の増幅
カロテノイド産生細菌間のフィトエンデサチュラーゼ（phytoene desaturase；フィトエン脱水素酵素）遺伝子(crtI)の相同性を利用して得られたcrtI-Foプライマー（5’-TTY GAY GCI GGI CCI ACI GT -3’）、crtI-Reプライマー（5’-CCI GGR TGI GTI CCI GCI CC-3’）を合成し、前出した方法により得られた、ブレバンディモナス属SD-212株の染色体DNAを鋳型として用い、PCR法により増幅した。耐熱性DNAポリメラーゼはLa-Taq (TaKaRa)を用い、96℃で5分間熱変性後、98℃で20秒、58℃で30秒、72℃で1分の条件で35サイクルの増幅を行った。増幅産物は、1% アガロースゲル電気泳動で確認後、1.1 kbの長さのDNAをアガロースゲルから切り出し、精製（Qiagene Gel Extraction kit、QIAGENE、もしくはGene Clean II Kit、BIO101）を行った。精製されたDNA断片は、pGEM-T Easyに連結し、大腸菌（DH5α）に形質転換した。このプラスミドをpCRTI-SD212と名づけ、アンピシリンを添加した2 mlのLB液体培地で37℃、一晩培養後、プラスミドを抽出した。抽出されたプラスミドは Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ver.2 (Perkin-Elmer)とmodel 3700 DNA sequencer (Perkin-Elmer)を用い付属のプロトコールに従って塩基配列（部分配列）の決定を行った。決定されたDNA配列はBlast (Altschul and Lipman, 1990)を用いホモロジー検索を行いフィトエンデサチュラーゼ（phytoene desaturase）遺伝子(crtI)とホモロジーを持つDNA断片であることを確認した。また、PCR後、精製されたDNA断片の一部は実施例６、７に示すコロニーハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーションのプローブとして用いた。
Altschul, S. F. and Lipman, D. J., Protein database search for multiple alignments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5509-5513, 1990.
【００４７】
〔実施例5〕  コスミドライブラリーの作製
ブレバンディモナス属SD-212株の染色体DNAの調製液からファージ粒子を得るところまでの実験方法はStratagene社のSuperCos 1 Cosmid Vector Kitの取扱説明書に従って行った。すなわちブレバンディモナス属SD-212株から得られた染色体DNAをSau3AIで部分消化を行いコスミドベクターのBamHI部位に連結し、LAMBDA INN (Nippon Gene)を用いてファージ粒子にパッケージングした。そして、大腸菌（Escherichia coli）XL1-Blue MR株に、そのファージを感染させ、抗生物質Ap耐性のコロニーを、Apを含むLBプレート上に約1,000個得た。得られたコロニーは滅菌した楊枝を用いて、新たに抗生物質を含むLBプレート上に植え継いだ。このコスミドベクターSuperCos 1は7.9 kbのベクターで、30〜45 kbのDNA断片を挿入することができる。
【００４８】
〔実施例6〕  コロニーハイブリダイゼーション
実施例5で作製した大腸菌XL1-Blue MRを宿主として作製したコスミドライブラリー500コロニーを用いて、実施例4で示したPCR法により増幅したフィトエンデサチュラーゼ遺伝子（crtI）の部分断片をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション（colony hybridization）法を行い、crtI遺伝子を含むクローンのスクリーニングを行った。まず、大腸菌をプレート上に植え37℃で培養した。このとき、大腸菌は一枚のプレートあたり、48コロニーずつ植え付けた。一晩培養後、直径82 mmのHybond-N+メンブレン（Amersham Pharmacia）をプレートに乗せ、注射針で目印をつけた。メンブレンをはがし、菌体が付着した面を上に向け、10%  SDS溶液を含んだ3 mmろ紙（Whattman）で5分間インキュベート後、さらに変性溶液（1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH）を含んだ3 mmろ紙で5分間インキュベートを行い、その後メンブレンを中和液（1.5 M NaCl, 0.5M Tris・HCl）に5分間つけた（2回）。さらに2×SSCで2回洗浄した。このとき、細胞の破片を残さないようにキムタオルでメンブレンを強くこすった。処理後、メンブレンは、キムタオル、キムワイプ上で30分間風乾後、80℃で2時間ベーキング（baking）を行い、メンブレンにDNAを固定した。プローブDNAは、Alkphos Direct Labeling and Detection System (Amersham Pharmacia)を用いて作製し、添付のプロトコールに従って、コロニーハイブリダイゼーションを行った。その結果、500株のクローンから、フィトエンデサチュラーゼ遺伝子（crtI）の部分断片をプローブとして用いたコロニーハイブリダイゼーション法により6個のポジティブクローンが得られた。6個のポジティブクローンに存在するプラスミドを、pCos5-1、pCos5-2、pCos7-1、pCos8-1、pCos9-1、pCos10-1と名づけた。
【００４９】
〔実施例７〕  サザンハイブリダイゼーション
実施例６で選抜された、6つのポジティブクローンを、Apを添加した2 mlのLB液体培地で37℃、一晩培養した後、プラスミドDNAを抽出した。抽出後のプラスミドDNAは、EcoRIで完全消化した後、電気泳動を行った。その後0.4M NaOH溶液を用いてキャピラリーブロッティングを行うことによりナイロンメンブレン（Hybond N+）にトランスファーした。処理後、メンブレンを80℃で2時間、ベーキング（baking）を行い、メンブレンにDNAを固定した。その後、Alkphos Direct Labeling and Detection System (Amersham Pharmacia)を用い、添付のプロトコールに従って、サザンハイブリダイゼーションを行った。また、プローブには、前述したフィトエンデサチュラーゼ遺伝子（crtI）の部分断片をプローブとして用いた。その結果、6つのポジティブクローンのうちpCos5-2、pCos7-1、pCos9-1の3つのクローンにおいて、12 kbのEcoRI断片にポジティブシグナルが認められた。
【００５０】
〔実施例８〕  カロテノイド遺伝子群の解析
実施例７で選抜された陽性クローンの１つ（pCos5-2）を用い、12 kbの挿入断片をEcoRIで切り出し、プラスミドベクターpBluescript II KS-のEcoRI部位に連結し、大腸菌（E. coli）DH5α株を形質転換した。このプラスミドをp5Bre2-15と名づけた。この大腸菌を、Apを添加した2 mlのLB液体培地で37℃、一晩培養後、プラスミドを抽出した。抽出されたプラスミドはBig Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ver.2 (Perkin-Elmer)とmodel 3700 DNA sequencer (Perkin-Elmer)を用い付属のプロトコールに従って塩基配列の決定を行った。決定された11,991 bpのDNA配列はGeneMark.hmm（Lukashin A. and Borodovsky M.）を用い遺伝子コード領域を推定し、SD様配列の確認などを行い、12 kbの断片中に12個のORF（open reading frame）を発見した（図2）。Blast を用い、各ORFのアミノ酸配列レベルでのホモロジー検索を行い、12個のうち7個は、既知のカロテノイド生合成遺伝子（crtW, crtY, crtI, crtB, crtE, crtZ, idi）と相同性を示していたので（表2）、同様に、crtW, crtY, crtI, crtB, crtE, crtZ, idi遺伝子と名づけた。残りの5個の遺伝子は、既存のどんな遺伝子とも全体的な相当性は有さない未知遺伝子であった。
プラスミドp5Bre2-15を有する大腸菌は受託番号P-19580として独立行政法人産業技術総合合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【表２】
0004803739.tif 000003
【００５１】
Lukashin A. and Borodovsky M., 1998, GeneMark.hmm: new solutions for gene finding, NAR, Vol. 26, No. 4, pp. 1107-1115.
Misawa,N., Nakagawa,M., Kobayashi,K., Yamano,S., Izawa,Y.,Nakamura,K. and Harashima,K., Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli. J. Bacteriol. 172, 6704-6712, 1990
Misawa, N., Satomi, Y., Kondo, K., Yokoyama, A., Kajiwara, S., Saito, T., Ohtani, T., and Miki, W., Structure and functional analysis of a marine bacterial carotenoid biosynthesis gene cluster and astaxanthin biosynthetic pathway proposed at the gene level. J. Bacteriol. 177, 6575-6585, 1995 (非特許文献1)
Hannibal, L., Lorquin, J., D'Ortoli, N.A., Garcia, N., Chaintreuil, C., Masson-Boivin, C., Dreyfus, B. and Giraud, E., Isolation and characterization of canthaxanthin biosynthesis genes from the photosynthetic bacterium Bradyrhizobium sp. strain ORS278. J. Bacteriol. 182, 3850-3853, 2000
Larsen, R.A., Wilson, M.M., Guss, A.M. and Metcalf, W.W., Genetic analysis of pigment biosynthesis in Xanthobacter autotrophicus Py2 using a new, highly efficient transposon mutagenesis system that is functional in a wide variety of bacteria Arch. Microbiol. 178, 193-201, 2002
ブレバンディモナス属SD-212株のcrtW遺伝子によりコードされる酵素CrtWは244アミノ酸からなるペプチドであり、そのアミノ酸配列は配列番号２に、crtW遺伝子の塩基配列とコードされるアミノ酸配列は配列番号１に示されている。ブレバンディモナス属SD-212のCrtWは、パラコッカス属Ｎ81106株のCrtW（DDBJ/Genbank accession no. D58420）及び パラコッカス属PC-１株のCrtW（DDBJ/Genbank accession no. D58422）とアミノ酸配列レベルで、両方とも46％の同一性（identity）しか示さなかった。なお、表２において、ブレバンディモナス属SD-212株のCrtWは、Brevundimonas aurantiacaのCrtWと96%の相同性（同一性）があることがわかるが、後者の配列はそれのみがネット上にのみ公開されているものであり、この酵素の機能や性質は全く不明であった。
【００５２】
〔実施例９〕  β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質発現用プラスミドの構築
大腸菌ベクターpUC18（TOYOBO）のコードするβ-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）のリード配列との融合タンパク質となるように各crtW遺伝子をPCRで増幅し、β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質発現用の各種プラスミドの構築を行った。具体的には、プラスミド
p5Bre2-15、pPC17、及び、pAK96Kを鋳型DNAとして用い、5’末端側にEcoRI部位を、3’末端側にBamHI部位を有する各crtW増幅産物が得られるように設計された配列番号（３〜８）のプライマーを用いたPCRにより、目的とするDNA断片を増幅した。なお、pPC17、及び、pAK96Kはそれぞれ、パラコッカス属PC-1株、及び パラコッカス属N81106由来のcrtW遺伝子を含むプラスミドである。
耐熱性DNAポリメラーゼはPfuTurbo Hotstart DNA Polymerase (Stratagene)を用い、各々95℃で20秒間熱変性後、95℃で20秒、51℃で30秒、72℃で1分30秒の条件で30サイクルの増幅を行った。増幅産物の一部は、1%アガロースゲル電気泳動で確認した。残りの増幅産物はエタノール沈殿後、EcoRIによる消化と、BamHIによる消化を行い、1%アガロースゲル電気泳動を行った。次に目的の長さのDNAをアガロースゲルから切り出し、精製（Gene Clean Turbo Kit、Q-BIOgene）を行った。切り出されたDNAはpUC18のEcoRIとBamHI部位に連結し、大腸菌JM109に形質転換した。このβ-ガラクトシダーゼ融合タンパク質発現用プラスミドでは、各CrtWの本来の開始のアミノ酸配列Metの前に、β-ガラクトシダーゼの7個のアミノ酸からなるリーダ配列MetThrMetIleThrAsnSerが付加されるようにデザインされている。
【００５３】
〔実施例１０〕ゼアキサンチン及びアスタキサンチン産生大腸菌の構築
各crtW遺伝子を含むプラスミドを有する大腸菌を、Apを添加した4 mlのLB液体培地で37℃、一晩培養後、プラスミドを抽出した。抽出されたプラスミドはBig Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ver.2 (Perkin-Elmer)とmodel 3700 DNA sequencer (Perkin-Elmer)を用い付属のプロトコールに従って塩基配列の確認を行った。正しい塩基配列が確認されたブレバンディモナス属SD-212株、パラコッカス属PC-１株、及び、パラコッカス属N81106株由来のcrtW遺伝子を有する各プラスミドの名前を、それぞれpUCBreW (lacZ::crtW), pUCParaPC1W  (lacZ::crtW)、pUCParaN8W (lacZ::crtW)と名づけた。プラスミドpACCAR25ΔcrtXを大腸菌JM109に導入し、Cm耐生コロニーを選択することによりゼアキサンチン産生大腸菌を構築した。また、プラスミドpACCAR25ΔcrtXとpUCBreW,pUCParaPC1WあるいはpUCParaN8W を共に大腸菌に導入し、Ap及びCm耐生コロニーを選択することによりアスタキサンチン産生大腸菌を構築した。それぞれ、JM109Ercrt-zea, JM109BreW-asta, JM109ParaPC1W-asta及びJM109ParaN8W-astaと名づけた。
【００５４】
〔実施例１１〕各crtW遺伝子を発現した大腸菌におけるアスタキサンチン生産効率の解析
JM109Ercrt-zeaはCmを添加した4 mlのLB液体培地で、JM109BreW-asta、 JM109ParaPC1W-asta及びJM109ParaN8W-asta はそれぞれAp及びCmを添加した4 mlのLB液体培地で37℃、一晩前培養し、50 μlを４ mlのLB液体培地で植菌し、30℃で本培養した。A600 ＝約0.5 になった時に、0.5 mMのIPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）を添加し、さらに30℃で培養した。培養液は遠心分離により集菌し、菌体をSTEで二回洗浄後、400 μlのアセトンを添加し、ボルテックすることにより色素を菌体からアセトンへ移した。その後、遠心分離を行い、上清をろ過し、HPLC-PDAシステム（Waters Alliance 2695および2996フォトダイオードアレィ検出器）またはHPLC-PDA-MSシステム（資生堂Nano Space SI-2およびThermoQuest LCQ advantage）で色素の分析を行った。HPLC-PDAのカラムにはTSK gel ODS-80Ts (TOSOH)を用い、送液条件は、A液（95%メタノール）、B液［メタノール：テトラヒドロフラン (tetrahydrofuran; THF), 7 : 3］を用い、1.0 ml/minの流速で、5分間A液100%を送液し、5分から10分の間 A液 100 %からB液 100 % に直線グラジエントを行い、その後B液を8分間送液した。なお、検出はフォトダイオードアレィ検出器で行い、付属のEmpowerソフトウェアで解析を行った。HPLC-PDA-MSのカラムはC30カラムである野村化学社製Deverosil C30-UG-3(1.0 mm i.d. x 150 mm)を用い、プレカラムとしてDevorosil C30-UG-Sを用いた。送液条件は、A液（95%メタノール）、B液［メタノール：tert-ブチルメチルエーテル（tBME）, 3 : 7］を用い、0.09 ml/minの流速で、15分間A液100%を送液し、15分から115分の間でA液 100 %からB液 100 % に直線グラジエントを行い、その後B液を20分間送液した。
IPTG添加後48時間後における各種大腸菌が生産した色素のHPLC-PDAシステムおよびHPLC-PDA-MSシステムによる色素分析を行った（図3参照）。その結果、JM109Ercrt-zeaが生産する色素は、ほとんどすべて、ゼアキサンチン（zeaxanthin）（HPLC/PDA、 RT 8.5 min、λmax 450、479 nm; HPLC/PDA/MS、RT 25.55 min、λmax 450、476 nm、m/z  569.2 [M+H]+）であった（図3a）。JM109BreW-astaでは、主要色素のアスタキサンチン（astaxanthin）（HPLC/PDA、 RT 5.8 min、 λmax 473nm; HPLC/PDA/MS、RT 13.28, λmax 476 nm、m/z 597.2 [M+H]+）の他に、アドニルビン（adonirubin；Poenicoxanthin）（HPLC/PDA、 RT 8.1 min; HPLC/PDA/MS、RT 20.92 min、 λmax 469 nm、 m/z 581.2 [M+H]+）、3’-ヒドロキシエキネノン（3’-hydroxyechinenone）（HPLC/PDA、 RT 11.5 min、λmax 473; HPLC/PDA/MS、RT 62.10 min、λmax 469、m/z 567.2 [M+H]+）、3-ヒドロキシエキネノン（3-hydroxyechinenone）（HPLC/PDA、 RT 11.7 min; HPLC/PDA/MS、RT 62.72 min、m/z 567.2 [M+H]+）、リコペン（lycopene）（HPLC/PDA、 RT 13.4 min、 λmax  446、473、505 nm; HPLC/PDA/MS、RT 90.27 min、λmax  444、471、501 nm、 m/z 537.1）のピークが観察された（図3b）。JM109ParaPC1W-astaとJM109ParaN8W-astaでは、上記のカロテノイドに加えて、アドニキサンチン（adonixanthin）（HPLC/PDA: RT 7.6 min; HPLC/PDA/MS:RT 17.45 min、λmax 460、482 nm、 m/z 583.2 [M+H]+）のピークが観察された（図3c及びd）。JM109BreW-asta、JM109ParaPC1W-asta及びJM109ParaN8W-astaにおいて蓄積したカロテノイド中のアスタキサンチンの含量はそれぞれ、75%, 65%および47%であり、JM109BreW-astaのアスタキサンチンの含量が一番高かった（図3）。また、JM109BreW-asta、JM109ParaPC1W-asta、JM109ParaN8W-astaのいずれの組換え大腸菌の色素抽出液においても、3’-ヒドロキシエキネノンが蓄積する傾向が見られ、組換え大腸菌間で差異は認められなかった。一方、JM109BreW-astaの色素抽出液では、JM109ParaPC1W-asta及びJM109ParaN8W-astaの色素抽出液で見られたアドニキサンチンのピークが見られないことから、アドニキサンチンからアスタキサンチンへの変換効率が高く、結果としてアスタキサンチンの生産効率がよいことが予想された。そのことをさらに確認するために、アスタキサンチンの培養時間による生成効率を調べた。IPTG添加後 10, 17, 24時間後に大腸菌を回収し、蓄積した色素の分析を行った（図4）。定常期（stationary phase）までのJM109BreW-asta（図中の記号：◆）のアスタキサンチンの生合成効率がJM109ParaPC1W-asta（図中の記号：■）とJM109ParaN8W-asta（図中の記号：▲）に比べ、顕著に高く、死滅期（death phase）に入るとその差は少しずつ縮まる傾向があった。
さらに、JM109ParaPC1W-astaとJM109ParaN8W-astaではアドニキサンチンが蓄積するがJM109BreW-astaではアドニキサンチンの蓄積が認められない傾向は全培養期間で観察された。特に、６時間後の色素分析の結果では、JM109ParaPC1W-astaとJM109ParaN8W-astaではアドニキサンチンが多く（アスタキサンチンと同じくらい）蓄積されたが（図5b及びc）、JM109BreW-asta はアドニキサンチンの蓄積が全く見られず、その分、アスタキサンチンの生成量が増えていた(図5a)。
本研究により、ブレバンディモナス属SD-212株（Brevundimonas sp. SD212）由来のCrtWはアドニキサンチン（adonixanthin）からアスタキサンチン（astaxanthin）への変換効率が高く、最も効率的にアスタキサンチンを生産することが示された。これらの結果は、産業的利用を目的としたアスタキサンチンやその代謝物（アスタキサンチンエステル体等）の組換え微生物や組換え植物による大量生産に、ブレバンディモナス属SD-212株由来のcrtW遺伝子が有効であることを示している。
【００５５】
〔実施例１２〕菌株,  プラスミド、生育条件
本発明（crtZ）に用いられた菌株とプラスミドを表３に示す。菌株の培養は37℃あるいは30℃でLB（Luria-Bertani）培地を用いて行った。必要に応じて、アンピシリン（ampicillin；Ap ，100μg/ml）または、クロラムフェニコール（chloramphenicol；Cm，30 μg/ml）を培地に添加した。
【表３】
0004803739.tif 000004
Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., Yamano, S., Izawa, Y., Nakamura, K., and Harashima, K. 1990. Elucidation of the Erwinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli. J. Bacteriol. 172: 6704-6712
Misawa, N., Satomi, Y., Kondo, K., Yokoyama, A., Kajiwara, S., Saito, T., Ohtani, T., and Miki, W. 1995. Structure and functional analysis of a marine bacterial carotenoid biosynthesis gene cluster and astaxanthin biosynthetic pathway proposed at the gene level. J. Bacteriol. 177: 6575-6585：非特許文献1
Teramoto, M., Takaichi, S., Inomata, Y., Ikenaga, H., and Misawa, N. 2003. Structural and functional analysis of a lycopene β-monocyclase gene isolated from a unique marine bacterium that produces myxol. FEBS Lett. 545: 120-126
【００５６】
〔実施例１３〕β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質発現用プラスミドの構築
大腸菌ベクターpUC18あるいはpUC8（TOYOBO）のコードするβ-ガラクトシダーゼ遺伝子（lacZ）のリード配列との融合タンパク質となるように各crtZ遺伝子をPCRで増幅し、β-ガラクトシダーゼ融合タンパク質発現用の各種プラスミドの構築を行った。具体的には、プラスミドp5Bre2-15、pCAR25、pPC17、pAK96K、および、pBS606を鋳型DNAとして用い、5’末端側にEcoRI部位を、3’末端側にBamHI部位を（p5Bre2-15、pCAR25、pPC17、pAK96K）、あるいは5’末端側にSmaI部位を、3’末端側にHindIII部位を（pBS606）有する各crtZ増幅産物が得られるように設計された配列番号（１１〜２０）のプライマーを用いたPCRにより、目的とするDNA断片を増幅した。なお、pCAR25、pPC17、pAK96K、および、pBS606はそれぞれ、パントエア・アナナチス20D3株[Pantoea ananatis（旧名：Erwinia uredovora）]、パラコッカス属（Paracoccus sp.）PC-1株、 パラコッカス属（Paracoccus sp.）N81106株、およびフラボバクテリウム属（Flavobacterium sp.） P99-3株由来のcrtZ遺伝子を含むプラスミドである。
耐熱性DNAポリメラーゼはPfuTurbo Hotstart DNA Polymerase (Stratagene)を用い、各々95℃で20秒間熱変性後、95℃で20秒、51℃で30秒、72℃で1分30秒の条件で30サイクルの増幅を行った。増幅産物の一部は、1%アガロースゲル電気泳動で確認した。残りの増幅産物はエタノール沈殿後、EcoRIとBamHIによる消化を行い（p5Bre2-15、pCAR25、pPC17、pAK96Kを鋳型とした場合）、または、SmaIとHindIIIによる消化を行い（pBS606を鋳型とした場合）、1%アガロースゲル電気泳動を行った。次に目的の長さのDNAをアガロースゲルから切り出し、精製（Gene Clean Turbo Kit、Q-BIOgene）を行った。切り出されたDNAはpUC18のEcoRIとBamHI部位に、あるいはpUC8の SmaIとHindIII部位に連結し、大腸菌JM109に形質転換した。このβ-ガラクトシダーゼ融合タンパク質発現用プラスミドでは、各CrtZの本来の開始のアミノ酸配列Metの前に、β-ガラクトシダーゼの7個または9個のアミノ酸からなるリーダ配列MetThrMetIleThrAsnSer（p5Bre2-15、pCAR25、pPC17、pAK96Kを鋳型とした場合）あるいはMetThrMetIleThrAsnSerArgGly（pBS606を鋳型とした場合）が付加されるようにデザインされている。
【００５７】
〔実施例１４〕カンタキサンチン及びアスタキサンチン産生大腸菌の構築
各crtZ遺伝子を含むプラスミドを有する大腸菌を、Apを添加した4 mlのLB液体培地で37℃、一晩培養後、プラスミドを抽出した。抽出されたプラスミドはBig Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ver.2 (Perkin-Elmer)とmodel 3700 DNA sequencer (Perkin-Elmer)を用い付属のプロトコールに従って塩基配列の確認を行った。正しい塩基配列が確認されたブレバンディモナス属（Brevundimonas sp.）SD-212株、パントエア・アナナチス（Pantoea ananatis）20D3株、パラコッカス属（Paracoccus sp.）PC１株、パラコッカス属（Paracoccus sp.）N81106株、および、フラボバクテリウム属（Flavobacterium sp.）P99-3株由来のcrtZ遺伝子を有する各プラスミドの名前を、それぞれpUCBreZ、pUCPanZ、pUCParaPC1Z、pUCParaN8Z、pUCP99Zと名づけた。プラスミドpAC-Canthaを大腸菌JM109に導入し、Cm耐生コロニーを選択することによりカンタキサンチン産生大腸菌(JM109Pancrt-Canthaと呼ぶ)を構築した。また、プラスミドpAC-Canthaと、pUCBreZ、 pUCPanZ 、pUCParaPC1Z、pUCParaN8ZあるいはpUCP99Z を共に大腸菌に導入し、Ap及びCm耐生コロニーを選択することによりアスタキサンチン産生大腸菌を構築した。それぞれの大腸菌形質転換体を、JM109BreZ-asta、JM109PanZ-asta、 JM109ParaPC1Z-asta、JM109ParaN8Z-asta、及びJM109P99Z-astaと名づけた。
【００５８】
〔実施例１５〕各crtZ遺伝子を発現した大腸菌におけるアスタキサンチン生産効率の解析
JM109Pancrt-CanthaはCmを添加した4 mlのLB液体培地で、JM109BreZ-asta, JM109PanZ-asta,  JM109ParaPC1Z-asta, JM109ParaN8Z-asta及びJM109P99Z-astaはそれぞれAp及びCmを添加した4 mlのLB液体培地で37℃、一晩前培養し、50 μlを４ mlのLB液体培地で植菌し、30℃で本培養した。A600 ＝約0.5 になった時に、0.5 mMのIPTG（イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド）を添加し、さらに30℃で培養した。培養液は遠心分離により集菌し、菌体をSTEで二回洗浄後、400 μlのアセトンを添加し、ボルテックすることにより色素を菌体からアセトンへ移した。その後、遠心分離を行い、上清をろ過し、HPLC-PDAシステム（Waters Alliance 2695および2996フォトダイオードアレィ検出器）で色素の分析を行った。HPLC-PDAのカラムにはTSK gel ODS-80Ts (TOSOH)を用い、送液条件は、A液（95%メタノール）、B液［メタノール：テトラヒドロフラン (tetrahydrofuran; THF), 7 : 3］を用い、1.0 ml/minの流速で、5分間A液100%を送液し、5分から10分の間 A液 100 %からB液 100 % に直線グラジエントを行い、その後B液を8分間送液した。なお、検出はフォトダイオードアレィ検出器で行い、付属のEmpowerソフトウェアで解析を行った。
IPTG添加後48時間後における各種大腸菌が生産した色素のHPLC-PDAシステムによる色素分析を行った（図6参照）。その結果、JM109Pancrt-Canthaが生産する色素は、ほとんどすべて、カンタキサンチン（canthaxanthin）（RT 10.2 min、λmax 478 nm）であった（図6a）。JM109BreZ-asta、JM109PanZ-asta、JM109ParaPC1Z-asta、JM109ParaN8Z-astaでは、主要色素のアスタキサンチン（astaxanthin）（ RT 5.7 min、 λmax 476nm）の他に、アドニキサンチン（adonixanthin）（RT 7.2 min、λmax 463 nm）のピークが観察された（図6b、c、d、及びe）。JM109P99Z-astaでは、カンタキサンチン（canthaxanthin）、アドニルビン（adonirubin；Poenicoxanthin）（RT 8.6 min、λmax 470）が主要色素であった（図6f）。また、図7に示すように、JM109BreZ-asta（図中の記号：◆）、JM109PanZ-ast（図中の記号：□）a、JM109ParaPC1Z-asta（図中の記号：▲）、JM109ParaN8Z-asta（図中の記号：▼）及びM109P99Z-asta（図中の記号：●）において蓄積したカロテノイド中のアスタキサンチンの含量は全培養期間中JM109BreZ-astaが一番高く、４８時間後はそれぞれ、42%、29%、21%、17%および4%であった。
本研究により、ブレバンディモナス属SD-212株（Brevundimonas sp. SD212）由来のCrtZは、最も、効率的にアスタキサンチンを生産することが示された。これらの結果は、産業的利用を目的としたアスタキサンチンやその代謝物（アスタキサンチンエステル体等）の組換え微生物や組換え植物による大量生産に、ブレバンディモナス属SD-212株由来のcrtZ遺伝子が有効であることを示している。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願（特願2004-166625号）の明細書および／または図面に記載されている内容を包含する。また、本発明で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】アスタキサンチン産生大腸菌におけるアスタキサンチン生合成経路と各種Crt酵素の機能を示す図。
【図２】ブレバンディモナス属SD-212のカロテノイド生合成遺伝子群の構造を示す図。
【図３】各種組換え大腸菌（IPTG添加後48時間培養）に蓄積した色素のHPLC-PDA分析の結果を示す図（図中の１はアスタキサンチン、２はアドニキサンチン、３はアドニルビン、４はゼアキサンチン、５は3'-ヒドロキシエキネノン、６は3-ヒドロキシエキネノン、７はリコペンのピークをそれぞれ示す。）。a) JM109Ercrt-zeaの産生色素のHPLCクロマトグラム（470 nm）。b) JM109BreW-astaの産生色素のHPLCクロマトグラム（470 nm）。c) JM109ParaPC1W-astaの産生色素のHPLCクロマトグラム（470 nm）。d) JM109ParaN8W-astaの産生色素のHPLCクロマトグラム（470 nm）。
【図４】各種組換え大腸菌によるアスタキサンチン蓄積量の培養時間による変動を示す図。
【図５】各種組換え大腸菌（IPTG添加後6時間培養）に蓄積した色素のHPLC-PDA分析の結果を示す図。a) JM109BreW-astaの産生色素のHPLCクロマトグラム（470 nm）。b) JM109ParaPC1W-astaの産生色素のHPLCクロマトグラム（470 nm）。c) JM109ParaN8W-astaの産生色素のHPLCクロマトグラム（470 nm）。
【図６】各種組換え大腸菌（IPTG添加後48時間培養）に蓄積した色素のHPLC-PDA分析の結果を示す図（図中の１はアスタキサンチン、２はアドニキサンチン、３はアドニルビン、４はカンタキサンチンのピークをそれぞれ示す。）。a) JM109Pancrt-Canthaの産生色素のHPLCクロマトグラム（470 nm）。b) JM109BreZ-astaの産生色素のHPLCクロマトグラム（470 nm）。c) JM109PanZ-astaの産生色素のHPLCクロマトグラム（470 nm）。d) JM109ParaPC1Z-astaの産生色素のHPLCクロマトグラム（470 nm）。e) JM109ParaN8Z-astaの産生色素のHPLCクロマトグラム（470 nm）。f) JM109P99Z-astaの産生色素のHPLCクロマトグラム（470 nm）。
【図７】各種組換え大腸菌によるアスタキサンチン蓄積量の培養時間による変動を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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