(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨または軟骨組織の再構築において生体内で使用するのに適した多層膜であって、主としてコラーゲンIIから作られ、スポンジ様の開放性構造を有するマトリックス層および少なくとも一つの比較的不浸透性の閉鎖性構造を有し、主としてコラーゲンＩおよびIIIから作られたバリヤ層からなり、そしてコラーゲンIIスラリーを、比較的不浸透性の閉鎖性構造を有するバリヤ膜の表面に塗布し、次いで凍結乾燥して、スポンジ様の開放性構造を有するマトリックス層を得ることからなる製造方法によって製造されることを特徴とする膜。
【請求項２】
単一のバリヤ層からなる請求項１記載の膜。
【請求項３】
マトリックス層が二つのバリヤ層の間に供給される請求項１記載の膜。
【請求項４】
マトリックス層が、天然軟骨から誘導されるコラーゲンII物質によって得られる請求項１〜３のいずれか一項に記載の膜。
【請求項５】
コラーゲンII物質が、豚のヒアリン軟骨から誘導される請求項４記載の膜。
【請求項６】
コラーゲンII物質が熱またはＵＶ照射により物理的に架橋している請求項４または５記載の膜。
【請求項７】
バリヤ層が、子牛または豚の腹膜から誘導される請求項１記載の膜。
【請求項８】
マトリックス層が、骨髄由来の関節軟骨細胞、骨膜細胞、心膜細胞または間葉幹細胞から単離される軟骨細胞で含浸される請求項１〜７のいずれか一項に記載の膜。
【請求項９】
マトリックス層および／またはバリヤ層がグリコサミノグリカンで含浸される請求項１〜８のいずれか一項に記載の膜。
【請求項１０】
グリコサミノグリカンがヒアルロン酸、コンドロイチン６−サルフェート、ケラチンサルフェートまたはデルマタンサルフェートである請求項９記載の膜。
【請求項１１】
マトリックス層およびバリヤ層がプロテオグリカンを含有していない請求項１〜１０のいずれか一項に記載の膜。
【請求項１２】
コラーゲンIIスラリーを、比較的不浸透性の閉鎖性構造を有するバリヤ膜の表面に塗布し、次いで凍結乾燥して、スポンジ様の開放性構造を有するマトリックス層を得ることからなる請求項１記載の膜の製造方法。
【請求項１３】
組織再生誘導に使用するための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の膜。
【請求項１４】
骨または軟骨の組織の再生に使用するための請求項１〜１１のいずれか一項に記載の膜。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は組織再生誘導に使用するため、特に骨または軟骨組織の再生に生体内で使用するためのコラーゲン膜インプラントに関する。
組織再生では、例えば軟骨病変の場合のように軟骨組織を再構築することは難しいということが長い間分かっている。例えば膝および足関節のような比較的大きな関節が最も危険であるけれども、いずれもの関節で軟骨損傷は発生し得る。そのような損傷はトラウマ、変性疾患または離断性骨軟骨炎から生起し得る。軟骨損傷は関節症の発症の主要な病理力学的因子である。酵素が遊離すると滑液が炎症状態になり、次いで軟骨の表皮剥脱および関節表面の破壊が起こる。軟骨欠損において生体内で関節軟骨を再生するための最近の試みとしては、培養された自己発生性関節軟骨（ＣＡＣｓ）の移植がある。しかし、この技術の成果には限界があった。
【０００２】
現在、組織の再構築には諸細胞のための導子として役立つマトリックスの提供が必要であると一般的には認められており、そしてそのマトリックスの繊維に沿っておよび繊維間に諸細胞は成長する。つい最近、再吸収性の合成および天然双方のマトリックスに接種したＣＡＣｓの使用が提案された。しかし、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコラーゲンＩまたはIIIをベースとするマトリックスを用いて軟骨組織を再構築する試みは、移植前に生体外で軟骨細胞と一緒に詰め込むマトリックスを必要とした。これは軟骨細胞の滅菌培養に関しての合併症、すなわちインプラントと組織との間の界面における巨大細胞と繊維芽細胞による免疫学的炎症性反応を生じる。
【０００３】
WO−A−96／25961号には、生体内部位で移植でき、マトリックス表面での天然軟骨の成長により軟骨再生を行う、コラーゲンIIをベースとするマトリックスインプラントが提案されている。しかし、軟骨組織の完全な再生を行うためのこのようなマトリックスの能力は限定されている。
【０００４】
すなわち、生体内移植に続いて、天然軟骨の十分な内方成長およびそれによる軟骨組織の再生を可能にするようなマトリックスインプラントが必要とされている。そこで本発明者等は軟骨、および究極的には新規な骨組織が、周辺の結合組織からのみならず、下にある骨または軟骨の欠損からも生体内で保護されるコラーゲンIIマトリックスの使用により再構築され得るということを見いだした。考えられるところによれば、それ自体がマトリックス中へのあらゆる周辺組織の望ましくない内方成長を防止することができるか、またはこの効果を達成するためにその欠損の部位に外科的に移植してもよいような多層膜インプラントを使用することにより、これは成就され得る。
【０００５】
すなわち、本発明の一つの特徴によれば、主としてコラーゲンIIからなり、スポンジ様の開放性構造を有するマトリックス層および少なくとも一つの比較的不浸透性の閉鎖性構造を有するバリヤ層からなる多層膜が提供される。
【０００６】
使用する際の本発明膜の特別な利点は、天然細胞が比較的不浸透性の閉鎖性構造を有するバリヤ層の中に浸透したりまたはその層中に入って成長したりすることができないという点にある。
【０００７】
理論に縛られたくはないが、現在では、十分な軟骨再生には、例えば結合組織、血管等の天然組織細胞だけでなくあらゆる新規骨組織の、欠損部位中への迅速な内方成長が防止されることが必要であると信じられている。これは、一方の側の天然組織細胞の内方成長からコラーゲンマトリックスを保護するのに役立つ本発明の二重層膜を用いて成就され得る。外科移植中、これは、反対側の天然組織細胞の内方成長を防止するのに有効である組織移植片例えば骨膜移植片と組み合わせて使用することができる。すなわち、例えば、骨膜移植片が骨または軟骨欠損上のおおいになるように、最初にその移植片を正しい位置に縫合することができる。次いで本発明の二重層膜を、これが移植片と接触し、そしてそのマトリックス層が骨欠損に面するような方法で配置され得るようにして欠損部位に移植することができる。より好ましくは、本発明の二重層膜を、バリヤ層が骨または軟骨欠損に面するようにして、その欠損部位に最初に移植する。次いで骨膜移植片を、これがマトリックス層に接触しているように配置する。この移植片は例えばフィブリングルーのような生物学的に適合性の接着剤で付着されるか、または再吸収性のポリ乳酸の（polylactic）ピンで留めるか、または必要によりもしくは可能ならば、これが次いでいずれか周辺の結合組織の内方成長に対して不浸透性バリヤを提供するのに役立つような方法で縫合され得る。
【０００８】
本発明の別の態様において、膜それ自体が、いずれもの天然組織細胞の内方成長を防止するのに有効であることがある。すなわち、本発明のさらに別の特徴によれば、主としてコラーゲンIIからなり、スポンジ様の開放性構造を有するマトリックス層が、比較的不浸透性の閉鎖性構造を有する二つのバリヤ層の間に供給される少なくとも三つの層からなる膜が提供される。
【０００９】
前記マトリックス層は、天然軟骨の内方成長のための媒体として作用することができ、それにより軟骨組織の再生を行うことが可能である。しかし、軟骨組織の再生をさらに促進するためには、生体内移植の前または後のいずれかにマトリックス層に軟骨細胞を含浸させるのがよい。移植の直前に、例えば注射によりマトリックス層に軟骨細胞を含浸させてもよいが、一般には、その軟骨細胞は、移植後に軟骨細胞の懸濁液を直接注射することによりマトリックス層中に導入され得ることが考えられる。
【００１０】
本発明で使用する軟骨細胞は、骨髄由来の関節軟骨細胞、骨膜細胞、心膜細胞または間葉（間質の）幹細胞から単離される同種異系細胞または自己発生性細胞を含む細胞源から得ることができる。同種異系細胞は免疫反応および感染性合併症の可能性を有するので、自己発生性細胞、特に自己発生性関節軟骨から軟骨細胞を単離する方が好ましい。細胞を収集する技術は知られており、その例としては酵素による消化または増殖培養がある。次いで収集した細胞を、身体に再導入する前に細胞培養中で膨張させる。最適な軟骨組織再生を得るには、一般には少なくとも１０6個、好ましくは少なくとも１０7個の細胞をマトリックス層中に含浸すべきである。
【００１１】
一般に、本発明膜のマトリックス層は、軟骨細胞が埋められそして成長するようになり得るような天然媒体を提供するのに役立つグリコサミノグリカン（ＧＡＧｓ）、例えばヒアルロン酸、コンドロイチン６−サルフェート、ケラチンサルフェート、デルマタンサルフェート等を含有するのが望ましい。軟骨からの場合と同一の組成、分子量および物理学的性質を必ずしも有してはいない種々の供給源からのグリコサミノグリカンをコラーゲンマトリックス中に混入することは可能であるが、より好ましいグリコサミノグリカンは軟骨それ自体から抽出されるものである。一般に、マトリックス層は１〜１０重量％、例えば２〜６重量％のグリコサミノグリカンを含有するのが好ましい。いくらかのグリコサミノグリカンが不浸透性層に存在するかもしれないが、大部分はマトリックス層に存在する。
【００１２】
天然コラーゲン組織中にはＧＡＧｓが少なくとも部分的に、プロテオグリカン（ＰＧｓ）の一成分として存在する。ＰＧｓの形態でのＧＡＧｓの使用は、ＰＧｓのタンパク質含有量により惹起され得る潜在的な免疫学的問題を考慮すると望ましくない。したがって、マトリックス層は実質的にはいずれものプロテオグリカンを含まないのが好ましい。好都合には、これはテロペプチド（telopeptide）を含まない精製コラーゲンII物質とグリコサミノグリカンとの混合物からマトリックス層を製造することにより成就され得る。
【００１３】
マトリックス層にさらに存在してもよいその他の添加剤としては、例えば、軟骨細胞のコラーゲンII繊維への付着を助けるためのコンドロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、アルギン酸カルシウムまたはアンコリンII、および成長因子例えば軟骨誘導因子（ＣＩＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ホモダイマーまたはヘテロダイマーとして存在する形質転換誘発成長因子β（ＴＧＦβ）および骨形態発生因子（ＢＭＰ）例えば天然または組み換えのヒトＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３（オステオゲニン）、ＢＭＰ−４およびＢＭＰ−７（ＯＰ−１、骨形成性タンパク質−１）を挙げることができる。ＢＭＰ−２は独立して、骨形成の二つの経路、すなわち骨の直接的形成並びに後に除去されそして骨に置き換えられる軟骨の形成に影響を及ぼす。種々の供給源の皮質骨からの抽出により得られる骨マトリックスまたは脱ミネラルされた骨マトリックスを含む、ＢＭＰｓとコラーゲンとの複合物は、ＢＭＰ活性またはＢＭＰ／ＮＣＰ軟骨発生誘発に関して９０％コラーゲンおよび１０％非コラーゲン性タンパク質（ＮＣＰ）からなる。骨マトリックスに不溶性のコラーゲン性マトリックスおよびラミニンまたはフィブロネクチンは、 ＢＭＰｓのためのキャリヤーとして作用する。いくつかの成長因子もまた不浸透性層に存在することができる。しかし、大部分はマトリックス層に存在する。一般に、その膜は１００μg〜５mgの成長因子を含有する。
【００１４】
前述のように、その膜は異なる構造を有する少なくとも二つの層からなる。その膜のバリヤ層は、主としてコラーゲンＩおよびIIIから作られるのが好ましい。あるいはまた、これは合成物質、例えばＩ型コラーゲンおよび／またはIII型コラーゲンのようなコラーゲン物質で場合により被覆された再吸収性の合成ポリマー網状構造からなっていてもよい。
【００１５】
適当な合成物質の例としては、ポリエステル、ポリグリコール酸およびポリ乳酸（ＰＬＡ）のホモポリマーおよびコポリマー、グリコリドおよびラクチドのコポリマー、ポリオルトエステルおよびポリカプロラクトンがある。これらの多くの例は公に、例えばベーリンガーインゲルハイム社からそれらのＲＥＳＯＭＥＲ範囲で入手可能である。約６５０〜１２００の適当な分子サイズおよび余りに迅速すぎる程ではない劣化を有するワックスとしてのＰＬＡポリマーが好ましい。特に好ましい生分解性ポリマーは、Ｄ−ラクチド対Ｌ−ラクチドの比率が７０：３０であるポリ（Ｄ,Ｌ−乳酸）である。このような合成物質の利点は、これらが、引き裂かれずに膜インプラントを複雑な三次元の骨欠損上に伸ばすことを可能ならしめるような高い機械的安定性を有することができる点にある。このような物質はまた、縫合用にも適している。
【００１６】
有利には、バリヤ層は、非常にしっかりと結合されるが故に高分子物質がこのバリヤに浸透することができないような長いコラーゲン繊維からなる。これらの長い繊維は、高い引っ張り強度および引き裂き抵抗性を有するので、その物質は良好な分離膜であるだけではなく、さらにまた容易に縫合可能でもある。外科においては、膜インプラントは縫合可能であり、または正しい位置にピンで留めることが可能であることが重要である。従来提案された膜の多くではこの可能性は得られない。本発明膜は、移植に外科的に取り扱うことができる程十分に機械的に安定である。
【００１７】
マトリックス層は非常に多孔性であり、０.０２程度の小さな比重量を有することができ、細胞が非常に迅速にこの層の中に入って成長できるようになっている。膜のこの層は、通常さらにグリコサミノグリカンも含有するが、激しく膨張しそして５０００％もの多量の液体を吸収することができる。理想的には、このマトリックス層は、細胞の接着および成長を可能にし、そして接種された細胞が軟骨特異性タンパク質の合成により特徴づけられる軟骨細胞表現型を維持することができるような多孔性構造（孔の容量フラクションおよび孔のサイズ）を提供すべきである。孔のサイズは、コラーゲンIIマトリックスを製造するのに用いる凍結乾燥工程に左右されるが、しかし１０〜１２０μm、例えば２０〜１００μmであると考えられる。場合により、孔のサイズは約８５μmであるべきである。このような孔のサイズは、−５〜−１０℃で約２４時間徐々に凍結し次いで凍結乾燥することにより、または凍結乾燥前にスラリーに重炭酸アンモニウムを加えることにより容易に得られる。
【００１８】
膜のマトリックス層は軟骨、好ましくは豚のヒアリン軟骨から得られるコラーゲンII物質によって提供されるのが好ましい。
【００１９】
マトリックス層の望ましい厚さは、治療されるべき骨または軟骨の欠損の性質によるが、一般的には２〜１０mm、例えば４〜６mmであると考えられる。バリヤ層の厚さは０.２〜２mm、例えば０.２〜０.７mmであるのが好ましい。
【００２０】
バリヤ層はコラーゲンＩおよびIIIからなる天然の動物膜により提供され得る。天然源から誘導され、これは身体中で全体に再吸収性であって、有毒な分解生成物を形成しない。また、このような膜は、湿った状態または乾燥状態のいずれでも極めて高い引き裂き強度を有し、それが故に必要により、外科的に縫い合わせることができる。湿っている場合には、その物質は非常に弾性があり、それを不揃いな形の骨欠損上に伸ばすことができる。
【００２１】
コラーゲンの外に、天然の動物膜は多くのその他の生物学的物質を含有するが、それらは除去されなければならない。このような膜を酵素、溶媒または他の化学薬品で処理して精製すること、および医薬にこれらの膜を使用することは知られている。これらの物質の大部分は薄すぎるし、しかも使用が特に容易でないことが非常に多い。それらのコラーゲン原繊維はそれらの本来の性質を失ってしまっており、さらに別の不利点は、その物質が、縫合可能な物質として使用するには不十分な強度を有することが多いし、水膨潤性を有していないことが多いし、しかも平滑な銀面と繊維状の肉面との間に全く相違を与えない点である。テロペプチドを含まない精製されたコラーゲンＩ型またはIII型の繊維状形態は、溶解性がより少なく、生分解性であり、最も有利なキャリヤー物質になることが見いだされた。
【００２２】
本発明生成物のバリヤ層を提供する膜としては、天然のコラーゲン構造を保持している子牛または豚の腹膜を挙げることができる。６〜７週令の若い豚（６０〜８０kg重量）の腹膜が特に好ましい。
バリヤ層は好ましくは純粋な、天然の（変性されていない）不溶性コラーゲンからなるべきであり、WO−A−95／18638号に記載の方法にしたがって製造することができる。すなわち、最初に天然膜をアルカリ例えばＮaＯＨ水溶液０.２〜４重量％の濃度で処理する。これはアルカリに感受性であるいずれもの脂肪およびまたタンパク質をケン化するのに役立つ。第２工程はその物質を酸、通常は無機酸例えばＨＣlで処理することである。これにより酸感受性の汚染物が除去される。その物質を引き続き、pＨが２.５〜３.５になるまで洗浄する。次いでその膜は、平滑面または銀面、および比較的緩くて、より多く繊維状の面を有する。その膜を１００〜１２０℃に加熱することによって、いくらか架橋させることが有利であることがある。
【００２３】
膜のマトリックス層を提供するのに使用されるコラーゲンII物質は、主としてコラーゲンＩおよびIIIからなるバリヤ層について上述したのと同様の操作によって軟骨から得ることができる。アセトンで処理し、次いでｎ−ヘキサンのような炭化水素で脂肪を抽出することにより軟骨から水を除去するのが好ましい。ここでエタノールのようなアルカノール、ジエチルエーテルのようなエーテルまたはクロロホルムのような塩素化炭化水素またはこれらの混合物を使用してもよい。次いで脱脂した物質を、いずれもの残留脂肪をケン化しそして存在するタンパク質のいくらかを分解するアルカリでの処理に付す。最後に、その物質を、さらにタンパク質分解を行う酸で処理する。その物質を水中で膨張させ、次いでコロイドミルに通してスラリーを得る。
【００２４】
多層膜を製造するには、コラーゲンIIを含有するソフトスラリーを、例えばWO−A−95／18638号により製造した平滑膜の繊維状面に塗布する。通常、コラーゲンIIスラリーが容易に塗布され得るようにその膜を肉面を有する平滑表面上に、例えばその膜の繊維状面中にすり込むことによって置く。こうしてそのスラリーは、コラーゲン膜にしっかりと付着する所望の厚さを有する層を形成する。このようにして形成された二重層を次いで凍結および凍結乾燥に付して、所望の孔サイズを有する所望のスポンジ様構造を得る。必要により、均一の厚さを有する二重膜を得るためにマトリックス層のいくつかを除去してもよい。三重層を製造するには、次いで第２の平滑膜をマトリックス層と接触するその繊維状面を有するマトリックス層の頂上に置く。
【００２５】
膜に塗布すべきコラーゲンIIスラリーは、一般に１.０〜４.０重量％、有利には２〜３重量％のコラーゲンを含有する。好都合には、この混合物のｐＨ値は２.５〜４.５、有利には３.０〜４.０に調整されるべきである。
【００２６】
コラーゲンII物質は、マトリックス層を安定にするために、凍結乾燥後に架橋するのが有利である。これもまた、マトリックス層の機械的安定性を増加させそして身体によるそれの再吸収速度を減少させるのに役立つ。理想的には、架橋度はマトリックスの分解速度が組織再生の速度と釣り合うような程度であるべきである。物理的には、架橋は加熱により遂行され得るが、しかしこれは再吸収性の望ましくない損失を回避するために慎重に行う必要がある。３０分から５時間、１００〜１２０℃に加熱するのが好ましい。より好ましくは、架橋は例えば８時間までの、ＵＶランプを使用するＵＶ照射により遂行され得る。
【００２７】
コラーゲンII物質はグリコサミノグリカンを含有するのが有利である。このグリコサミノグリカンは実際にはコラーゲンIIと反応していくらかの架橋を遂行し、不溶性生成物を製造する。必要により、その物質を加熱することにより、または前述のようなＵＶ照射によりさらに架橋を行うことができる。グリコサミノグリカンとコラーゲンとの反応は、周囲温度でpＨ２.５〜３.５において遂行することができる。グリコサミノグリカンの量は１〜１０重量％であるのがよい。このような処理の直後にその物質を凍結または凍結乾燥に付すことができる。
【００２８】
あるいはまた、コラーゲンII塊状物のｐＨを上げることによりスラリー形成を行ってもよい。この方法ではその物質を約４℃に冷却し、そのｐＨ値を４℃でＮaＯＨの冷水溶液を添加することによりpＨ値６.５〜７.５まで徐々に上昇させる。引き続き、その物質を周囲温度で１５〜２５時間保持する。この時間の経過後にスラリーが形成され、そしてスラリー形成後にその物質を凍結または凍結乾燥させることができる。
【００２９】
さらに別の方法は、コラーゲンII塊状物を中和してｐＨ値６.８〜７.４にし、次いで空気を除去することである。この混合物を鋳型中に置き、３７℃で１５〜２０時間インキュベートする。微細スラリーが発生し、それを引き続き凍結し、凍結乾燥させることができる。
【００３０】
上記三つの方法のうちどれを使用するかは、所望生成物の諸性質による。第１の方法は最も安定な生成物を与える。しかし、沈殿が物質の塊を与えることがあり、その方法は極めて慎重に実施しなければならない。第２の方法はソフトで均一な生成物を与えるが、しかしそれは第１の方法の生成物よりも可溶性である。
【００３１】
スラリーの製造において、医薬のようなさらに別の望ましい物質、例えばタウロリジンのような抗菌剤またはゲンタマイシンのような抗生物質をさらに導入することも可能である。
【００３２】
スラリーを膜に塗布後、その物質を凍結する。再生可能な孔サイズを得るためには、凍結を慎重に調整し、凍結の速度および時間、pＨ値および粒径を正確に調整しなければならない。非常に小さな孔を得るには、その物質を非常に低い温度で衝撃凍結するのがよい。
【００３３】
次いで凍結した膜を凍結乾燥し、引き続き１１０〜１３０℃に加熱する。この方法で、いくらかの架橋が行われる。その後、凍結乾燥した生体膜をその必要とされる厚さに調整して、マトリックス層の厚さが一般に約２mmとなるようにすることができる。次いで二重膜を、例えばγ−照射によりまたはエチレンオキシドで滅菌する。強い照射、例えば２５ＫＧyの用量での60ＣＯによる滅菌は、ＢＭＰｓを不活性化することがある。そのような状況では、移植前にその滅菌マトリックスを滅菌塩水中でＢＭＰｓと一緒に含浸させるのがよい。
【００３４】
本発明膜は以下の方法で医薬に用いることができる。
−組織再生誘導用の物質として。細胞増殖はマトリックス層により促進される。バリヤ層は望ましくない細胞増殖を阻止する。
−軟骨欠損すなわち軟骨下プレートに浸透しない病変の修復用としておよび骨軟骨欠損の修復における物質として。
【００３５】
本発明はまた、組織再生誘導における前記のような多層コラーゲン膜の使用も提供する。膜のコラーゲンII含有量は、軟骨組織の再生に特に適しているが、しかしまたその他の組織型にも適している。
すなわち、さらに別の特徴を考慮すると、本発明は組織再生誘導インプラントとして使用するための前記の膜を提供する。
【００３６】
本発明はさらに、ヒトまたはヒトでない動物体の骨または軟骨欠損の治療方法を提供する。その方法は前記の膜を欠損に適用することからなるが、その膜はバリヤ層が、骨または軟骨の再生領域中における望ましくない組織型の内方成長を防止するように志向されている。
【００３７】
以下に、本発明を実施例により説明するが、それらは本発明を限定するものではない。
実施例中、すべての工程は例えばクリーンルームのような無菌状態の下で実施されなければならない。
【００３８】
実施例 １
(Ａ)  若い子牛の腹膜を機械的手段により肉および脂肪から完全に取り出し、流水下で洗浄し、２％ＮaＯＨ溶液で１２時間処理する。次いでその膜を流水下で洗浄し、０.５％ＨＣｌで酸性化する。その物質がその全厚さにわたって酸性化された（約３時間）後に、それをｐＨ３.５になるまで洗浄する。次いでその物質を７％塩水溶液で縮ませ、１％ＮaＨＣＯ3溶液で中和し、流水下で洗浄する。次いでその物質をアセトンで脱水し、ｎ−ヘキサンで脱脂する。
【００３９】
(Ｂ)  新たに屠殺した豚の凍結した軟骨を冷水に浸し、完全に洗浄し、肉残留物、骨および堅い切片から機械的に精製する。引き続き、その物質を流水下で３０分間洗浄する。
次いで、その物質をホモジナイザー中で３回粉砕する。サイズ減少終了時の視覚による粒径は約８mmであった。
各軟骨片をアセトンで４回、それぞれ８時間ずつ洗浄することにより脱水した。次いで軟骨をｎ−ヘキサンで４回抽出することにより脱脂する。各処理は少なくとも８時間続けた。ヘキサン対軟骨の比率は１：１０であった。
脱脂後、軟骨を飲料水中で膨張させた。水対軟骨物質の比率は１０：１であった。処理時間は２４時間であった。
次いでその物質をＮaＯＨ（５重量％）で処理し、その際軟骨対液体の比率は１：４であり、処理時間は３２時間であった。処理中、軟骨の各片を十分に撹拌した。引き続き、軟骨からアルカリを洗い落とした。これにより最初のpＨの１４は９〜１１に減少した。溶解した不純物を完全に洗浄し、軟骨から分離した。上記アルカリ処理から得られた液体をグリコサミノグリカン回収のために収集した。
次いでコラーゲン物質を、最初は１.０以下のpＨの強ＨＣl（約３重量％）で処理した。処理時間は４〜６時間であった。
引き続き、その物質をpＨ値が３〜３.５に上昇するのに十分な長い時間、冷水で洗浄した。全ての不純物は除去され、その生成物はスポンジまたは他のコラーゲン物質の製造に適した、塩を含まないコラーゲン塊状物であった。その目的に関して、その軟骨塊状物は意図する結果により、脱脂、凍結ないし凍結乾燥され得る。
前記アルカリ処理から得た抽出物はグリコサミノグリカン、アルカリ、変性タンパク質および塩を含有した。その抽出物を最初にＨＣlで中和したら、中和後のｐＨ値は６であった。次いでその抽出物をろ過助剤すなわち珪藻土で処理した。これは変性タンパク質を除去する効果を有した。０.５重量％の珪藻土を抽出物中に導入し、ろ過により変性タンパク質と一緒に除去した。
次いで上澄み液を、約１０,０００ダルトンで切断される分子量を有する膜を用いた限外ろ過に付した。この方法で塩を除去して、精製グリコサミノグリカンを得た。
こうして得られたグリコサミノグリカン溶液を前記のコラーゲン物質と混合して、グリコサミノグリカンを含有するコラーゲンIIマトリックスを得た。
このコラーゲンII物質は以下の性質：
ＴＧ＝２.８重量％
ＧＡＧ＝３重量％（コラーゲン基準で計算された）
pＨ値 ３.５
を有した。
【００４０】
(Ｃ)  前記(Ａ)のようにして製造した新たに製造された腹膜を均一に水中に浸し、繊維状面を上にしてガラスプレート上に平らに置いた。引き続き、その膜を、前記(Ｂ)のようにして製造したコラーゲンII塊状物で完全に湿らせた。その膜を、プレートに付着したままで全方向に平らに伸ばした。その際コラーゲンII塊状物は膜の中にすり込んだ。
上記の非常に厚い塊状物をその膜に塗布し、そのプレートを冷蔵庫中約４℃で一夜放置した。その後スラリーが形成された。
そのスラリーを下記の条件：
浴の温度＝−１２℃
時間＝４０分
で凍結した。
引き続き、その凍結したスラリーを凍結乾燥し、次いで１２５℃に加温した。
凍結乾燥時間＝１４時間
コラーゲンIIマトリックス層を引き続き分割して１mmの厚さにした。
【００４１】
実施例 ２
実施例１(Ａ)からの新しく製造した腹膜をガラスプレートに塗布し、実施例１に記載のような諸性質を有する厚いコラーゲンII塊状物をその膜の中にすり込んだ。５０ｇのコラーゲンII塊状物を蒸留水で１００mlに希釈し、完全に撹拌した。撹拌中、１００mlのグリコサミノグリカン溶液を徐々に加えた。コラーゲンがＧＡＧと一緒に塊の形態で沈殿した。沈殿後、その塊をホモジネートし、得られた分散液をその膜に塗布した。スラリーが一夜で形成し、その処理した膜を実施例１に記載のようにさらに加工した。