(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織試料の培養上清、体液試料または細胞培養上清からの試料における、グアニル酸結合タンパク質−１またはこのタンパク質の断片の同定及び／又は定量化のインビトロの方法であって、該方法が
（ａ）試料と、グアニル酸結合タンパク質−１またはこのタンパク質の断片に特異的に結合する第一受容体とを接触し；そして
（ｂ）受容体とグアニル酸結合タンパク質−１またはこのタンパク質の断片との特異的結合を検出する
工程を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
第一受容体と接触する前に、
（ａ’）サンプル中に含まれるタンパク質を標識する；又は
（ａ’’）第一受容体を標識する
工程（ａ’）又は（ａ’’）をさらに含んでなる、請求項１の方法。
【請求項３】
グアニル酸結合タンパク質−１またはこのタンパク質の断片と接触する前に、受容体を膜、ビーズ、チップ又はプレートである表面に固定する、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
グアニル酸結合タンパク質−１またはこのタンパク質の断片と接触した後に、受容体を膜、ビーズ、チップ又はプレートである表面に固定する、請求項１又は２の方法。
【請求項５】
表面の材料が、セファロース、ラテックス、ガラス、ポリスチレン、ポリビニル、ニトロセルロース及びシリコンからなる群より選択される、請求項３または４のいずれか１つの方法。
【請求項６】
特異的結合の検出の工程の前に、
（ａ’’’）ビーズを、そこに結合した第一受容体とグアニル酸結合タンパク質−１またはこのタンパク質の断片の複合体と沈殿させる
工程（ａ’’’）をさらに含んでなる、請求項３ないし５のいずれか１つの方法。
【請求項７】
工程（ｂ）における特異的結合の検出が、ゲル電気泳動的分割及びウエスタンブロット解析を含んでなる、請求項６の方法。
【請求項８】
工程（ａ）における、グアニル酸結合タンパク質−１またはこのタンパク質の断片と第一受容体との特異的結合の検出のために、試料がグアニル酸結合タンパク質−１またはこのタンパク質の断片に対する第二受容体と接触される、第二受容体はグアニル酸結合タンパク質−１またはこのタンパク質の断片のエピトープに結合し、第二受容体は、第一受容体のグアニル酸結合タンパク質−１またはこのタンパク質の断片への結合後に接近可能である、請求項１ないし７のいずれか１つの方法。
【請求項９】
グアニル酸結合タンパク質−１又はこのタンパク質の断片に対する第二受容体が標識される、請求項８の方法。
【請求項１０】
グアニル酸結合タンパク質−１又はこのタンパク質の断片に対する第二受容体の標識が、シグナルを放出する系を含むか、あるいはシグナルを放出する系を含んでなるさらなる第三受容体により特異的に認識されるものである、請求項９の方法。
【請求項１１】
シグナルを放出する系が、該シグナルを放出する酵素を含んでなる、請求項１０の方法。
【請求項１２】
第一受容体及び第二受容体が、ペプチド、ポリペプチド、低分子物質、抗体又はそれらの断片若しくは誘導体およびアプタマーからなる群より選択される、請求項８ないし１１のいずれか１つの方法。
【請求項１３】
第三受容体が、ペプチド、ポリペプチド、低分子物質、抗体又はそれらの断片若しくは誘導体およびアプタマーからなる群より選択される、請求項１０ないし１２のいずれか１つの方法。
【請求項１４】
方法がＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ又はＲＩＡである、請求項１ないし１３のいずれか１つの方法。
【請求項１５】
方法が自動的に実行される、請求項１ないし１４のいずれか１つの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織試料の培養上清、体液試料又は細胞培養上清からの試料における、ＧＢＰ−１又はこのタンパク質の断片の同定及び／又は定量化の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の文献が本明細書の文章中に引用される。従って、引用文献（すべての製造業者の説明書、情報などを含む）の開示内容は、参照として本明細書の一部である。
内皮は、細胞に向けられた免疫反応、月経、創傷治癒、炎症、アレルギー、心臓血管疾患及び腫瘍成長などの多くの生理学的過程並びに病態生理学的過程において重要な器官である。内皮の病態機能は、内皮細胞の活性化に密接に関係する。
【０００３】
内皮の活性化は、血液中に循環する又は近傍の細胞により放出される種々の可溶性因子の多くにより制御される複雑な過程である（図１Ａ）。この過程は、組織における関連した要求に調整された内皮細胞の生理機能および形態をもたらす。この文脈において、主な重要な要因は、内皮細胞の細胞増殖、アポトーシス、浸潤、移動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）及び白血球接着能力の制御であり、それらによって血管の再生および退縮並びに白血球の管外遊出が調節される（図１Ａ）。
【０００４】
関与する因子の多くは、いくつかの因子が同様の表現型を制御し、そして同様の効果を有する群において要約されうることを示す（図１Ｂ）。例えば、血管新生成長因子の塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）および血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）は、内皮細胞増殖を活性化し、一方、炎症性サイトカインのインターロイキン（ＩＬ）−１α、ＩＬ−１β、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α及びインターフェロン（ＩＦＮ）−γは、増殖を阻害しそして内皮細胞の白血球接着能力を増加させる。
【０００５】
今のところ、炎症性組織において、どこでそしていつ異なった因子が内皮細胞に効果を有するのかを、決定できる適した方法はない。従って、炎症性疾患に関して、内皮細胞の異なった活性化状態の空間及び時間の配置は、ほんの少しだけしか知られていない。
【０００６】
炎症性反応の発生及び結果生じた炎症性疾患は、サイトカインなどの炎症性因子の異なった効果及び相乗効果のとても複雑な順序（カスケード）であり、これにより炎症性反応の明確な期の分析及び／又はさらなる発生に関する信頼できる予測はほとんど不可能である。この文脈において、反応のこの複雑性が起こることから、いわゆるサイトカインネットワークと言われる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
組織における、上述の炎症性サイトカインによる内皮細胞の活性化を示す分子マーカーを同定する最初の試みは、異なった活性化状態での培養内皮細胞における遺伝子発現の比較研究に至った。このアプローチにより、遺伝子を内皮細胞における炎症性サイトカインにより選択的に誘導される発現で単離することができた（図２Ａ）（Ｇｕｅｎｚｉら、２００１；Ｌｕｂｅｓｅｄｅｒ−Ｍａｒｔｅｌｌａｔｏら、２００２）。この遺伝子は、巨大なＧＴＰアーゼタンパク質ファミリーに属するグアニル酸結合タンパク質−１（ＧＢＰ−１）をコードする。
【０００８】
ＧＢＰ−１も、培養細胞でされたように、ヒト組織での血管内皮細胞においても、炎症性サイトカインによる活性化を示すか否かを決定するために、免疫組織化学解析が、特異的モノクローナル抗体を用いてＧＢＰ−１の検出のために行われた。この目的のために、健康な皮膚の組織学的部分、並びに乾癬、医薬組成物に対する対向反応及びカポジ肉腫などの炎症性成分を持つ皮膚疾患の組織学的部分が解析された（図２Ｂ）。上述のすべての皮膚疾患は共通して、損傷において、多くの炎症性細胞が局所的に濃縮した方式で存在し、それはＧＢＰ−１発現の増加にも至る同様な炎症性サイトカインを放出する。健康な皮膚の血管において、いずれの場合においてもＧＢＰ−１は検出されなかった。反対に、検査されたすべての炎症性疾患において、個々の血管は明らかにＧＢＰ−１陽性であった（図２Ｂ、矢印）。実際に、これらの結果は、ＧＢＰ−１がヒト組織における内皮細胞の炎症性活性化を示し、さらにそして組織におけるこの活性化の検出のための分子マーカーとして使用できることを示す（Ｌｕｂｅｓｅｄｅｒ−Ｍａｒｔｅｌｌａｔｏら、２００２、  Ｇｕｅｎｚｉら、２００１）。しかしながら、記載された結果がタンパク質ＧＢＰ−１は細胞内で有効なタンパク質でありそして細胞の細胞質中に位置するタンパク質であることを示すので、この分子マーカーとしての使用は、固体の組織試料に限られる。従って、関連した検出は、例えば患者から固体の組織試料を調達することを含んでなる。しかしながら、炎症性組織からの固体の組織試料を得ることは患者に不利な効果を有し、そして困難である。
【０００９】
内皮細胞において、炎症性サイトカインによるＧＢＰ−１の発現の誘導は、細胞増殖の阻害を意味する。従って、ＧＢＰ−１が炎症性サイトカインにより誘導された増殖阻害を仲介するか否かが検討された。この目的のために、内皮細胞は、ＧＢＰ−１の構成的な発現（ＧＢＰ−１ベクター）又はアンチセンスＧＢＰ−１  ＲＮＡ（ＡＳベクター）の発現を引き起こすレトロウイルスベクターで形質導入された（図３Ａ）。ウエスタンブロット解析で、ＧＢＰ−１ベクターで形質導入された内皮細胞が非常に強くＧＢＰ−１を発現することを確認した（図３Ｂ）。ＡＳベクターで形質導入された細胞において、ＩＬ−１βによるＧＢＰ−１発現の誘導は効果的に遮断された（図３Ｂ）。異なって形質導入された細胞培養での続く増殖実験は、ＧＢＰ−１が実際に血管新生成長因子により誘導された細胞増殖を阻害し（図３Ｃ、白いバー）、そしてさらに炎症性サイトカインが内皮細胞の増殖を阻害することができるために必要であることを示した（図３Ｄ）。最後の事実は、アンチセンスＧＢＰ−１  ＲＮＡを発現する細胞培養において、細胞増殖に対する炎症性サイトカインの阻害効果が明らかに減少する事実から見られた（図３Ｄ、黒いバー）（Ｇｕｅｎｚｉら、２００１を参照されたい）。
【００１０】
さらに、ＧＢＰ−１はマトリックスメタロプロテアーゼ−１の発現を阻害し、そして従って内皮細胞の浸潤を阻害する（Ｇｕｅｎｚｉら、２００３を参照されたい）。
ＧＢＰ−１の構造／機能関係に関するさらに詳細な解析は、興味深いことに炎症性サイトカインによっても誘導される白血球に対する内皮細胞の接着能力が、ＧＢＰ−１により影響されないことを示した（Ｇｕｅｎｚｉら、２００１）。従って、ＧＢＰ−１は、内皮細胞に対する炎症性サイトカインの抗増殖効果を選択的制御する、炎症性組織活性化に対する新たな分子マーカーである。
【００１１】
今までのところ、ＧＢＰ−１は炎症性サイトカインにより選択的に誘導され、そしてこの過程は関わりのある細胞への抗血管新生効果（Ｌｕｂｅｓｅｄｅｒ−Ｍａｒｔｅｌｌａｔｏら、２００２及びＧｕｅｎｚｉら、２００１）と関係があることが示すことができた。原則として、抗血管新生療法の形で医用目的のために抗増殖効果を通じたＧＢＰ−１の誘導を活用することができる一方、そのような目的のための炎症性サイトカインの使用は、これらのサイトカインの多面的な効果、及びそれ故の不利な効果のため問題外である。
【００１２】
炎症性疾患に適した分子マーカーの必要性がある事実にも関わらず、先行技術において、炎症性疾患の形成および発展に参加する多くのサイトカイン及び因子は、その不安定性のためこの目的には不適切として記載された。さらに、個々の炎症性サイトカイン又は因子の定量化は明確な結果に十分ではなく、そして従ってそれぞれいわゆる“サイトカインネットワーク”のみにその効果を示す多数の異なったサイトカイン及び因子の同定を必要とする。
【００１３】
従って、本発明の課題は、ＧＢＰ−１の発現の簡単で直接的な解析を可能にする方法の提供である。本方法は、必要とされるいわゆるサイトカインネットワークの多くの異なった炎症性因子の時間がかかりそしてお金がかかる解析及び定量化なしで、個体における又はインビトロモデルにおける炎症性反応の期及び進行の記述を可能にすることを支持する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本課題は、請求の範囲に特徴づけられる態様の提供により解決された。
従って、本発明は、組織試料の培養上清、体液試料又は細胞培養上清からの試料における、ＧＢＰ−１またはこのタンパク質の断片の同定及び／又は定量化のインビトロの方法であって、本方法が
（ａ）試料と、ＧＢＰ−１又はこのタンパク質の断片に特異的に結合する第一受容体とを接触させ；そして
（ｂ）受容体とＧＢＰ−１又はこのタンパク質の断片との特異的結合を検出する
工程を含んでなる、前記方法に関する。
【００１５】
本発明の文脈において、用語“ＧＢＰ−１の断片”は、先行技術及び本願において記載されるようにＧＢＰ−１の生物学的活性を有するこのタンパク質の断片、並びに例えば酵素切断などの切断により生じ、そして炎症性疾患の指標となるタンパク質の断片の両方とも好ましくは記載する。
【００１６】
本発明の文脈において、用語“体液”は、所望により希釈した又は濃縮した、すべての種類の体液を含んでなる。例は、血液／血清、血漿、羊水、脳／脊髄液（ｂｒａｉｎ／ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｆｌｕｉｄ）、分泌液（ｌｉｑｕｏｒ）、脳脊髄液（ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）、唾液、のど及び咽頭の分泌液並びに他の粘膜分泌液、関節液、腹水、涙液、リンパ液並びに尿である。
【００１７】
本発明によれば、用語“特異的結合”は、受容体とリガンドの間の特異的相互作用を記載する。そのようなリガンドの１つの例は、ＧＢＰ−１またはこのタンパク質の断片である。特異的相互作用は“鍵と錠の原則”で特徴づけられる。受容体及びリガンドは、例えば、抗体の抗原結合部位と相互作用する抗原決定基（エピトープ）など、お互いに特異的に適合する構造またはモチーフを有する。従って、特異的結合は、より普遍的で、より非特異的な相互作用と反対である。
【００１８】
ＧＢＰ−１は炎症性反応のマーカータンパク質であり、驚くべきことにとりわけ内皮細胞及び単球により分泌されることが示された。この驚くべき結果は、組織試料の培養上清、体液試料または細胞培養上清からの試料におけるＧＢＰ−１の解析を可能にし、炎症性疾患の期について記述を可能にする。本発明に関する方法を用いて、分泌されたＧＢＰ−１は簡単で早い方式で検出でき、そして従って病気に関連した診断上のパラメーターとして役立つ。
【００１９】
驚くべき結果に基づいて、本発明による方法を用いた、患者の体液中の内皮細胞および単球の炎症性活性化の検出は、特に炎症性疾患、細菌性の及びウイルス性の疾患（ＡＩＤＳ、髄膜炎）、アレルギー、移植反応、心臓血管のおよび腫瘍性の疾患などについて重要である。さらに、これらは、炎症性サイトカイン（例えば、インターフェロン−α）で処理された患者の応答性反応の決定に重要である；図５を参照されたい。
【００２０】
患者の体液の試料におけるＧＢＰ−１の検出又は定量化された量は、内皮細胞及び単球の活性化レベルに関して描かれる結果を可能にし、そして従って患者の臨床像についての記述を可能にする。
【００２１】
述べられた試料を入手する方法は、当業者に知られている。所望により、本発明による方法は、さらにそれぞれの方法工程の前又は後に１つ又はいくつかの洗浄工程を含んでなる。これらの洗浄工程は明確でない反応（擬陽性検出又は擬陰性検出）の最小化に役立ち、そして方法の感度を改善できる。
【００２２】
適した洗浄緩衝液及びその組成物は、原理上当業者に知られており；例えばＨａｒｌｏｗとＬａｎｅを参照されたい。生理学的な緩衝溶液が好ましい。
本発明による方法の好ましい態様は、さらに第一受容体と接触する前に：
（ａ’）サンプル中に含まれるタンパク質を標識する；または
（ｂ’）第一受容体を標識する
工程（ａ’）または（ａ’’）を含んでなる。
【００２３】
例えば、試料中に含まれるタンパク質及び／又は第一受容体は、化学的に標識されてもよく、例えば、タンパク質中に含まれるシステインのフリーのアミノ基への標識された化学群又はマーカーのカップリングによる。そのようなマークされた化学群の例は、特別な、検出できる放射性同位体を含む群である。例えば、蛍光色素は、マーカーとして役立つこともできる。適切なマーカーのさらなる例は、核酸である。次いでそのような方法で標識された試料中のタンパク質又は受容体の存在は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の適切なプライマーで検出できる。
【００２４】
さらに、タンパク質を生理学的に標識する、即ち、標識された分子の代謝的取り込みによることも可能である。この目的にため、例えば、細胞を放射活性で標識された代謝体とインキュベートする。このインキュベーションの間、これらの細胞の生合成から生じたタンパク質、及び標識された代謝体が取り込まれたタンパク質がマークされる。この方法は、例えば抗体を産生する細胞により分泌された標識抗体に適する。
【００２５】
本発明による方法のさらに好ましい態様において、受容体は、ＧＢＰ−１又はこのタンパク質の断片に接触する前に表面に固定される。
本発明の方法の代わりの態様によれば、受容体は、ＧＢＰ−１又はこのタンパク質の断片に接触した後に表面に固定される。受容体は、種々の手段により固定化される。適切な方法は、例えば受容体の型又は表面の材料など、種々の因子に依存する。固定化は、共有的に又は吸着により行いうる。本発明に関する方法の好ましい態様によれば、受容体はタンパク質であり、特に好ましくは抗体である。また好ましいのは、受容体としてのペプチド又は有機分子の使用である。
【００２６】
タンパク質である受容体の固定化のために、方法は、受容体が受動的な吸着を用いて表面に直接的に固定化されることを記載する。普通は、適切な表面は、ポリマープラスティック材料（例えば、ポリスチレン、ポリビニル、ラテックス）からなり、そして例えばマイクロタイタープレート又はマルチウェルプレート、膜又は球形の“ビーズ”（粒子型中でクロスリンクしたポリマー）の形が、この目的のために使用される（Ｌｏｗｍａｎ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  ２６（１９９７），  ４０１−２４）。
【００２７】
本発明による方法のさらに好ましい態様において、表面の材料は、セファロース、ラテックス、ガラス、ポリスチレン、ポリビニル、ニトロセルロース及びシリコンからなる群より選択される。
【００２８】
さらに好ましいのは、本発明による方法の表面は、膜、ビーズ、チップ又はプレートである。
ビーズの例は、所望によりリガンドが結合し、受容体の表面への固定化を推進する、セファロースビーズ又はラテックスビーズである。例えば、そのようなリガンドは、抗体のＦｃ部分を介して抗体の表面への結合を推進するプロテインＡ又はプロテインＧである。受容体の担体材料への結合は、共有化学カップリング反応（例えば、ヒドラジドカップリング）によっても達成可能である。実施例３は、対応する方法を記載する。リガンドを用いた受容体の表面への固定化の他の例は、ビオチン及びアビジン又はストレプトアビジンの使用である。
【００２９】
チップの例は、多数の異なった受容体又は同じ受容体が体系的にその上に固定化されうるシリコンプレートである。これは、試料における多数の異なったパラメーターの解析を可能にし、あるいは１つまたはいくつかのパラメーターに関して、例えば、異なった組織試料、体液の試料又は細胞培養上清の試料における、ＧＢＰ−１又はこのタンパク質の断片の同定及び／又は定量化のような、多くの異なった試料の解析を可能にする。
【００３０】
言及されたプレートの例は、マイクロタイタープレート又はマルチウェルプレートである。好ましくは、これらは、６、１２、２４、４８、９６、３５６、１０２４またはそれより多くのウェルを有する。実施例４において、９６ウェルプレートを使用した方法が記載される。
【００３１】
本方法のさらに好ましい態様によれば、特異的結合の検出の工程の前に：
（ａ’’’）ビーズを、そこに結合した第一受容体とＧＢＰ−１又はこのタンパク質の断片の複合体とともに沈殿させる
工程（ａ’’’）をさらに含んでなる。
【００３２】
ビーズは、例えば重量の方式（ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ  ｍａｎｎｅｒ）で、試料から沈殿しうる。例えば、これは遠心分離によって促進されうる。適切な方法は当業者に知られており、とりわけＲｅｈｍ、  Ｄｅｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｏｒ：Ｐｒｏｔｅｉｎｂｉｏｃｈｅｍｉｅ／Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、２００２から知られている。さらに、適切な沈殿は、実施例３に記載される。
【００３３】
本発明による方法のさらに好ましい態様において、工程（ｂ）の特異的結合の検出が、ゲル電気泳動分割（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ）、所望によりさらにウエスタンブロット解析（実施例３を参照されたい）を含んでなる。適切な方法は、当業者に知られており、とりわけＲｅｈｍの引用文中から知られている。
【００３４】
工程（ａ）におけるＧＢＰ−１又はこのタンパク質の断片と第一受容体との特異的な結合の検出の、本発明による方法のさらに好ましい態様において、試料がＧＢＰ−１又はこのタンパク質の断片に対する第二受容体と接触される、第二受容体はＧＢＰ−１又はこのタンパク質の断片のエピトープに結合し、第二受容体は、第一受容体とＧＢＰ−１又はこのタンパク質の断片の結合後に接近可能である。
【００３５】
例えば、この好ましい態様は、サンドイッチＥＬＩＳＡの機械的原理の利点がある方法に関する。この原理は、当業者に一般的に知られており、そしてとりわけＳｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ、Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、１９９６に記載される。さらに対応する方法は、実施例４の中に記載される。
【００３６】
さらに、本発明の方法の好ましい態様において、ＧＢＰ−１又はこのタンパク質の断片に対する第二受容体が標識される。受容体の可能な標識の方法は以上に記載され、そしてここでも使用可能である。
【００３７】
その上、ＧＢＰ−１又はこのタンパク質の断片に対する第二受容体の標識は、シグナルを放出する系を含んでなる。また好ましいのは、他の、シグナルを放出する系を含んでなる第三受容体を用いた標識の特異的認識である。
【００３８】
そのようなシグナルを放出する系の例は、シグナルが放射活性のある放射線の放出である、上述の同位体標識である。同様に、対応する受容体の蛍光標識は、シグナルが色素の適切な刺激の後の蛍光シグナルの放出である、本発明によるシグナルを放出する系の標識に帰着する。
【００３９】
本発明によれば、さらに好ましいシグナルを放出する系はシグナルを放出する酵素を含んでなる。そのような酵素の例は、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、ウレアーゼ及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを含んでなる。酵素反応を用いた適切な例及び検出に必要な基質の使用は、当業者に知られており、とりわけ商業的に入手できる検出キットの添付書類から、又はＲｅｈｍの引用文中から知られている。そのような商業的に入手できるキットは、例えば抗マウスのような、特定の種の抗体を認識する抗体をしばしば含み、そしてそれはシグナルを放出する酵素をカップルする。従って、対応する抗体は、第三受容体の例であり、それは第二受容体の特定の標識を認識し、それはそのＦｃ部分である。
【００４０】
本発明による方法のもう１つの好ましい態様において、第一受容体及び第二受容体、並びに所望により第三受容体は、ペプチド、ポリペプチド、低分子物質、抗体又はそれらの断片若しくは誘導体及びアプタマーからなる群より選択される。
【００４１】
用語ペプチドは、通常３０アミノ酸までのアミノ酸鎖を言う。
用語ポリペプチドは、３０アミノ酸より多くのアミノ酸鎖を通常含んでなるペプチドを言い、タンパク質を含む。
【００４２】
用語“低分子物質”又は低分子は、以上で定義した巨大分子よりも低分子複合体である分子を言う。文字通り、用語“低分子物質”は一定の形で使用されない。ＷＯ  ８９／０３０４１及びＷＯ  ８９／０３０４２において、７０００ｇ／ｍｏｌまでの分子量の分子は、低分子として記載される。しかしながら、通常、５０と３０００ｇ／ｍｏｌの間の分子量、しかし、しばしば７５と２０００ｇ／ｍｏｌそして主に１００と１０００ｇ／ｍｏｌの間の範囲において記述される。例は、当業者に、（ＷＯ８６／０２７３６、ＷＯ９７／３１２６９、ＵＳ−Ａ−５９２８８６８、ＵＳ−Ａ−５２４２９０２、ＵＳ−Ａ−５４６８６５１、ＵＳ−Ａ−５５４７８５３、ＵＳ−Ａ−５６１６５６２、ＵＳ−Ａ−５６４１６９０、ＵＳ−Ａ−４９５６３０３及びＵＳ−Ａ−５９２８６４３から知られている。低分子物質は、有機性又は無機性であってよい。
【００４３】
本発明によれば、用語“抗体”は、ポリクローナル血清とともにモノクローナル抗体を含んでなる。
モノクローナル抗体及びその産生方法は、当業者に知られている。これらは、Ｋｏｈｌａｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）により初めて記載された方法に基づく。この方法は、とりわけ、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅによる研究室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；（１９８８）；第６章）に詳細に記載される。この定義により、二特異性抗体、合成抗体及びそれらの抗体の断片又は誘導体も含んでなる。これらは、Ｆａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦｃのような断片、及びそれらの抗体又はそれらの抗体の断片の化学的に修飾された誘導体を含んでなる。
【００４４】
アプタマーは、原則として先行技術から当業者に知られている。
好ましくは、本発明による方法は、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡ又はＲＩＡである。
適切な方法は、原則としてＨａｒｌｏｗとＬａｎｅの引用文中、及びＲｅｈｍの引用文中から、当業者に知られている。
【００４５】
本発明による方法は、好ましくは自動的に実行される。これは、とりわけピペッティングロボットの使用により、そして最適化された工程の自動分析のためになし得る。
さらに、本発明は、陽性の検出が炎症性疾患の存在の指標である、ＧＢＰ−１又はこのタンパク質の断片の検出のために、以上で定義された体液又は細胞培養上清の試料の使用を言う。
【００４６】
本発明による使用のさらなる（好ましい）態様は、上述された方法の態様に対応する。
【実施例】
【００４７】
実施例は本発明を説明する。
実施例１：ベクター構築体の産生
２３７ｂｐのＧＢＰ−１プロモーター断片（ｐｒｏ２３７−ＧＢＰ−１）を、オリゴヌクレオチド５’−ＡＴＴＴＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＧＴＴＧＡＧ−３’［ＨｉｎｄＩＩＩ切断部位（下線）の挿入］又は５’−ＴＧＧＣＴＴＣＴＡＧＣＡＣＴＴＣＴＧ−３’と構築体ｐｒｏ３７５７−ＧＢＰ−１から、ＰＣＲ増幅（ＰＣＲ２  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｋｉｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて生成した。構築体ｐｒｏ３７５７−ＧＢＰ−１は、ベクターｐＴ−Ａｄｖ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）中に、３７５７ｂｐの５’調節配列をＧＢＰ−１遺伝子（ｇｉ：４５０３９３８、ＮＭ＿００２０５３）のＡＴＧコドンの上流に含む。２３７ｂｐの断片を、アンチセンスの方向性でベクターｐＴ−Ａｄｖとライゲーションし、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そしてｐＧＬ３  Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の中にサブクローニングした。すべての構築体をＥｎｄｏｆｒｅｅ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、そして検証のためにシークエンスした。
【００４８】
実施例２：適した細胞株の確立
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒトアデノウイルスタイプ５（Ａｄ５）ＤＮＡで形質転換され（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５７３）、ＳＶ４０  Ｔ抗原でさらに形質転換したヒト胎児上皮腎臓細胞株）を、トランスフェクションの２４時間前に３×１０５細胞／ウェル（６マルチウェルプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でまいた。選択プラスミドｐＢＡＢＥ−Ｐｕｒｏ（Ｐ．Ｍｏｎｉｎｉ、ウイルス学研究室、Ｉｎｓｉｔｕｔｏ  Ｓｕｐｅｒｉｏｒｅ  ｄｉ  Ｓａｎｉｔａ、イタリア、ローマ）と１：５の比率で使用される試験プラスミドｐｒｏ２３７−ＧＢＰ−１の、合計０．８μｇのプラスミドを、６ウェルプレートのウェルごとに使用した。試験プラスミドｐｒｏ２３７−ＧＢＰ−１は、指標遺伝子のホタルのルシフェラーゼに連結した２３７ｂｐプロモーター断片を含有し、選択プラスミドｐＢＡＢＥ−Ｐｕｒｏは、その後の選択が実行されるピューロマイシン耐性遺伝子を含有する。細胞のトランスフェクションを、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）の製造業者の説明書に従い実行し、そして選択を２４時間後に０．７μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ）で開始した。８−１０日に、個々のクローンの増殖を観察し、それらをその後クローニングリングでトリプシン処理し、そして９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ）の１つのウェルに移した。相当するコンフルエンスにおいて、クローンをさらに継代し、そしてルシフェラーゼアッセイにおいてレポーター遺伝子活性を検討した。クローンを、炎症性サイトカインＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β及びＴＦＮ−αで刺激し、そして５時間緩衝し、そして１×受動的（ｐａｓｓｉｖｅ）溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で回収した。溶解物をホタルのルシフェラーゼ活性についての検討し、そして対応する安定クローンを確立した。
【００４９】
実施例３：ＧＢＰ−１の免疫沈降
新鮮に調製された細胞溶解物を、ＧＢＰ−１と反応しない２μｌのウサギの前血清（ｐｒｅ−ｓｅｒｕｍ）、及び２５μｌのプロテインＡ／Ｇアガロースビーズと、少なくとも３時間４℃で振動台において前精製した。ビーズをペレットにした後に、上清を、２５μｌプロテインＡ／Ｇアガロースビーズ、及び１μｌのＧＢＰ−１に対するポリクローナルウサギ血清とともに、一晩、４℃にて振動台上でインキュベートした。ビーズを４、５回、ＰＢＳで洗浄した。その後に、ビーズを、３０μｌのＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（２×）で再懸濁し、そして５分煮沸した。試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）で分離し、そしてウエスタンブロット又はオートラジオグラフィーで解析した。
【００５０】
細胞培養上清からのＧＢＰ−１又はＭＭＰ−１の免疫沈降のために、１０ｍｌの培養培地を氷上に置き、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、４５μｍのメッシュサイズのフィルターでろ過し、そしていくつかの場合においてタンパク質分解酵素阻害剤カクテル（ｃｏｃｋｔａｉｌ）（０．０２ｍｇ／ｍｌ膵臓抽出物、５μｇ／ｍｌプロナーゼ、０．５μｇ／ｍｌサーモリシン、３μｇ／ｍｌキモトリプシン、及び０．３３ｊｍ／ｍｌパパイン（ｐａｐｉｎｅ））を加えた。１０μｌウサギ血清及び１２０μｌのプロテインＡ／Ｇアガロースビーズとの、４℃で３時間以上の振動台上でのインキュベーションにより、前精製を実行した。ビーズをペレットにした後、上清を、１２０μｌのプロテインＡ／Ｇアガロースビーズ及び６μｌのＧＢＰ−１に対するポリクローナルウサギ血清と、４℃で一晩、振動台上でインキュベートした。ビーズを４、５回、ＰＢＳ中で洗浄した。次いで、ビーズを、６０μｌのＰＢＳ＋６０μｌのＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（２×）中で再懸濁し、そして５分間煮沸した。通常、それぞれの試料の１５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そしてウエスタンブロットで解析した。
【００５１】
図４Ｂは、培養培地からの免疫沈降によるＧＢＰ−１の検出の結果の例を示す。
実施例４：ＧＢＰ−１ＥＬＩＳＡ
以下の緩衝液を、開発したＧＢＰ−１ＥＬＩＳＡのために使用した：
０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）並びに０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−ＴＢ）。
【００５２】
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  Ｐｌａｔｅｓ）を、１００μｌ／ウェル抗ＧＢＰ−１ハイブリドーマ上清（ＰＢＳで１：５の比率で希釈された）、又は１−５μｇ／ｍｌの濃度で精製した受容体で、コートした（４℃で１６時間インキュベーション）。プレートをＰＢＳ−Ｔで洗浄し、そしてＰＢＳ−ＴＢで少なくとも３０分室温でブロッキングした。ウェルから吸いだし、そして１００μｌの標準（ＧＢＰ−１−Ｈｉｓ、５％ＦＢＳを含有する細胞培養培地で希釈した）、コントロールとして同濃度のＢＳＡ、又は適した希釈での１００μｌの試料（ＰＢＳで希釈した）で、２時間、室温で重複してインキュベートした。ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、そしてＰＢＳ−ＴＢで１：５００に希釈したＧＢＰ−１に対する１００μｌのポリクローナル抗体と、２時間、室温でインキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、そして１００μｌのＰＢＳ−ＴＢで１：５００に希釈したウサギ抗体に共役させたアルカリフォスフォターゼ（Ｚｙｍｅｄ、ドイツ、ベルリン）と、１時間、室温でインキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、そして１００μｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート（Ｚｙｍｅｄ）とインキュベートした。吸光度を、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｒａｄ）において４０５ｎｍで測定した。試料中のＧＢＰ−１の濃度を、標準曲線を用いて計算した。その方法は、ＧＢＰ−１／ウェルの０．１から１００ｎｇ／ｍｌの直線性を示した。異なったアッセイにおける結果のばらつきは、２．３から６％の間であった。
【００５３】
ＥＬＩＳＡによる培養上清におけるＧＢ−１の検出の結果の例を、図４Ａに示す。
ＥＬＩＳＡの感度を、ＧＢＰ−１−Ｈｉｓ（細菌から精製し、そして精製のために６ヒスチジン残基がカルボキシ末端に追加されているＧＢＰ−１タンパク質）の希釈連続を用いてＰＢＳ中で決定した。
【００５４】
ＥＬＩＳＡの感度を、ＧＢＰ−１−Ｈｉｓ無しのアッセイにおいて得られる計測値（プラス２つの標準偏差）から対応する計測値が有意に異なる、即ち、少なくとも２つの標準偏差による、ＧＢＰ−１−Ｈｉｓの最も低い濃度として固定した。この点において、本明細書に記載されるＥＬＩＳＡの感度を、１２．３ｎｇ／ｍｌとして決定した。
【００５５】
１．アッセイ内のばらつき：
試験内の結果の再現性を、３重の測定により決定した。従って、ばらつきを以下のように計算した：
ばらつき＝（標準偏差／平均値）×１００％
ＧＢＰ−１を健康な被験者の血清（ＰＢＳ中で１：２に希釈）に加えることにより、異なったＧＢＰ−１−Ｈｉｓ濃度の３つの試験溶液（４００ｎｇ／ｍｌ、１８０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ）を生産した。アッセイ内のばらつきをそれぞれの溶液で決定した：
ＧＢＰ−１−Ｈｉｓ  ４００ｎｇ／ｌ；アッセイ内のばらつき＝２．７％
ＧＢＰ−１−Ｈｉｓ  １８０ｎｇ／ｌ；アッセイ内のばらつき＝２．８％
ＧＢＰ−１−Ｈｉｓ  ４０ｎｇ／ｌ；アッセイ内のばらつき＝２．０％
２．アッセイ間のばらつき：
ＥＬＩＳＡの再現性を、アッセイ間のばらつきを決定するために、異なった試験において決定した。この効力のために、上に示した溶液のそれぞれを６回測定した。アッセイ間のばらつきを以上に記載するように計算した。
ＧＢＰ−１−Ｈｉｓ  ４００ｎｇ／ｌ；アッセイ間のばらつき＝４．４％
ＧＢＰ−１−Ｈｉｓ  １８０ｎｇ／ｌ；アッセイ間のばらつき＝２．８％
ＧＢＰ−１−Ｈｉｓ  ４０ｎｇ／ｌ；アッセイ間のばらつき＝３．０％
【００５６】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図は以下を示す：  図１：炎症性内皮細胞の活性化の複雑性及び重複性。  （Ａ）炎症性過程の内皮細胞の活性化は、血液からの及び近傍の細胞からの多数の異なった可溶性因子により制御される。血管の再生及び退縮並びに白血球の管外遊出に関して、細胞増殖、アポトーシス、浸潤、移動及び白血球への接着能力の制御が、最も重要である。  （Ｂ）関与する因子の多くは、いくつかの因子が同じ活性化に影響を及ぼし、そして同じ効果を有する群にくくることができるという仮説に至る。現在のところ、いつそしてどこで異なった因子が個々の内皮細胞に影響を有するのか決定できない。その上、たいていの活性化型のお互いに対する関係は不明である。すべての活性化が、細胞内で同時に起こりうるのか否か（Ｉ）、又はそれらは細胞の生物学的本質の制限のために時間及び空間に関して分離されなければならないのか否か（ＩＩ）を決定しなければならない。
【図２】図２：培養内皮細胞における及び炎症性皮膚疾患におけるＧＢＰ−１の発現。  （Ａ）指示された因子で２４時間の刺激した内皮細胞におけるＧＢＰ−１の発現のウエスタンブロット解析。以下の濃度で使用した：ＩＦＮ−γ（１００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１α（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（２００Ｕ／ｍｌ）、ＴＮＦ−α（３００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−４（１０Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（５０Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１８（１００ｎｇ／ｍｌ）、オンコスタチンＭ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＭＣＰ−１（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＰＦ４（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＳＤＦ−１α（２００ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ａｎｇ−２（８００ｎｇ／ｍｌ）及びＰＤＧＦ  Ｂ／Ｂ（１００ｎｇ／ｍｌ）。細胞骨格タンパク質アクチンの同時検出は、同量のタンパク質が適用されたことを示す。（Ｂ）炎症性成分を伴う皮膚疾患の血管内皮におけるＧＢＰ−１の発現誘導。健康な皮膚、カポジ肉腫、皮膚の医薬調整物への炎症性対向反応および乾癬の組織部分における、ＧＢＰ−１（緑）及び内皮細胞に関連した抗原ＣＤ３１（赤）の間接免疫蛍光染色。写真の重ね合わせは、ＧＢＰ−１及びＣＤ３１の共発現（黄色）を示す（白矢印）。（（Ｌｕｂｅｓｅｄｅｒ−Ｍａｒｔｅｌｌａｔｏ、Ｇｕｅｎｚｉら、２００２）に基づいて修正した）。
【図３】図３：ＧＢＰ−１は、内皮細胞において炎症性サイトカインの抗増殖的効果を仲介する。  （Ａ）ＧＢＰ−１のｃＤＮＡが、ＧＢＰ−１の構成的発現（ＧＢＰ−１−ベクター）及びＧＢＰ−１−アンチセンス−ＲＮＡの発現（ＡＳ−ベクター）の両方の方向性で挿入された、レトロウイルス発現ベクターｐＢａｂｅＰｕｒｏの概要図。  （Ｂ）非処理又は２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−１βで２４時間以上刺激した、Ｋ−ベクター、ＧＢＰ−１−ベクター、及びＡＳ−ベクターで形質導入された内皮細胞におけるＧＢＰ−１の発現。ＧＢＰ−１発現の検出は、ポリクローナル抗ＧＢＰ−１とのウエスタンブロット解析を用いて実行した。アクチンの同時染色は、同量のタンパク質が適用されたことを示す。  （Ｃ）血管新生成長因子（ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦの組み合わせ）の増加する濃度の存在下での、Ｋ−ベクター及びＧＢＰ−１−ベクターで形質導入された内皮細胞の増殖実験。  （Ｄ）血管新生成長因子及びＩＬ−１βの増加する濃度の存在下での、Ｋ−ベクター及びＡＳ−ベクターで形質導入された内皮細胞の増殖実験（（Ｇｕｅｎｚｉ，Ｔｏｐｏｌｔら、２００１）に基づいて修正した）。
【図４】図４：ＥＬＩＳＡ及び免疫沈降による、ＩＦＮ−γで刺激されたＨＵＶＥＣの培養培地におけるＧＢＰ−１の検出。  ＨＵＶＥＣは、１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γで刺激し（ＩＦＮ−γ）、又は非処理のままとした（ｍｅｄｉｕｍ）。２４時間の培養した後、培養培地をＥＬＩＳＡ（Ａ）又は免疫沈降（Ｂ）により解析した。  （Ａ）組換え体精製ＧＢＰ−１の希釈連続を、標準として使用した（白柱）。分泌されたＧＢＰ−１タンパク質の量を、ＥＬＩＳＡを用いて決定した（灰色柱）。吸光度は４０５ｎｍで測定した。  （Ｂ）（Ａ）と同様の培養上清からの、モノクローナル抗ＧＢＰ−１抗体（クローン１Ｂ１）での、免疫沈降されたヒトＧＢＰ−１タンパク質のウエスタンブロット解析。
【図５】図５：ＩＦＮ−αで処理した患者の血漿中における、循環するＧＢＰ−１の測定。  血漿中における循環するＧＢＰ−１の濃度を、９日間又は２８日間ＩＦＮ−αで処理されたメラノーマに罹患した患者でＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＧＢＰ−１濃度の増加は、３人の患者で９日から２８日までで見られた。ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートを、モノクローナルラット抗ＧＢＰ−１抗体、クローン１Ｂ１で１６時間、４℃にてコートした。その後に、プレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ中に０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）に３０分間供し、フリーの結合部位をＰＢＳ−Ｔ／ＢＳＡ  ２％（ＰＢＳ−ＴＢ）で室温（ＲＴ）にて飽和した。ＰＢＳ−ＴＢを吸引した後、インキュベーションを１００μｌの異なった血漿試料（１：２）でそれぞれを室温にて続けた（２時間）。細胞培養培地（ＥＭＢ−０．５％ＦＣＳ）で希釈した精製ＧＢＰ−１Ｈｉｓタンパク質を標準として使用した。ＢＳＡをネガティブコントロールとした。試料をＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、それぞれの場合において、１００μｌのポリクローナルウサギ抗ＧＢＰ−１抗体（１：５００）を加え、そして２時間室温でインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、インキュベーションをそれぞれの場合で、１００μｌのＰＢＳ−ＴＢで希釈したＡＰ−共役抗ウサギ抗体（１：５００）とともに続けた（１時間、室温）。もう一度の４洗浄工程の後、ＧＢＰ−１タンパク質／抗体複合体を、１００μｌのｐ−ニトロフェニルホスフェートとのインキュベーションにより可視化した。吸光度をマイクロプレートリーダーの４０５ｎｍにて測定した。濃度の決定を、精製ＧＢＰ−１Ｈｉｓの増加する濃度を使用した標準曲線を使用して実行した。測定の直線性は、０．１から１００ｎｇ／ｍｌの範囲で示された。
【図６】図６：ＩＦＮ−γで処理したＨＵＶＥＣからのＧＢＰ−１タンパク質の分泌は、細胞膜の透過度又はアポトーシスの増加によらない。  膜に進入できない色素“Ｄｅａｄ−Ｒｅｄ”でのＨＵＶＥＣの染色（Ｍｏｌｅｋｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）。  ＨＵＶＥＣを、一晩、０．５％ＦＢＳを含有するＥＢＭ培地で培養し、そして１００Ｕ／ｍｌインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ、ロシュ）で刺激した。コントロール細胞（培地）は非処理のままとした。刺激後２４時間で、細胞をＤｅａｄ−Ｒｅｄ色素で染色した。変化した膜の透過度を示す細胞（黒バー）を、総数のパーセンテージ（白バー）として示した。
【図７】図７：ＥＬＩＳＡはＧＢＰ−１と特異的に反応し、そして異種タンパク質ＢＳＡ及びｅＧＦＰとは反応しない。  （Ａ）ＧＢＰ−１−ＥＬＩＳＡの特異性を、いくつかのコントロール実験において測定した。初めに、精製されたＧＢＰ−１−Ｈｉｓ（細菌から精製され、そして精製のために６ヒスチジン残基がカルボキシ末端に追加されたＧＢＰ−１タンパク質）の希釈連続を、指示した濃度にてＰＢＳ中で生成し、ＥＬＩＳＡで測定した。この文脈において、４０５ｎｍ（Ａ４０５）での吸光度の濃度依存的増加が観察される（黒バー）。もし、抗ＧＢＰ−１−ウサギ血清（結合ＧＢＰ−１の検出のために使用される第二抗体）の代わりに、ウサギの免疫前の血清を使用するならば、シグナルは得られなかった（白バー）。異種タンパク質［ＢＳＡ（灰色バー）、Ｈｉｓ−ｅＧＦＰ（ストライプバー）］の増加する濃度を加えたとき、ＧＢＰ−１特異的ＥＬＩＳＡで観察されたシグナルもなくなった。  （Ｂ）ＧＢＰ−１−ＥＬＩＳＡは、ＧＢＰ−１と同種のＧＢＰ−２に低い反応性を示す。  ＧＢＰ−１−Ｈｉｓ（黒バー）、Ｈｉｓ−ＧＢＰ−１（白バー、細菌から精製され、そして精製のために６ヒスチジン残基がアミノ末端に追加したＧＢＰ−１タンパク質）及びＨｉｓ−ＧＢＰ−２［灰色バー、アミノ末端に６ヒスチジン残基を持つＧＢＰ−１と同族のタンパク質（アミノ酸レベルで７６％の相同性、核酸レベルで８２％の相同性）］の増加する量の含有を、ＧＢＰ−１−ＥＬＩＳＡ溶液と検討した。ＧＢＰ−１−Ｈｉｓ（黒バー）、Ｈｉｓ−ＧＢＰ−１（白バー）及びＨｉｓ−ＧＢＰ−２（灰色バー）の測定値における増加の比較は、このＥＬＩＳＡのＧＢＰ−２との反応性がＧＢＰ−１との反応性に比べて減少し、そしてアミノ末端又はカルボキシ末端のヒスチジン残基が組換え体ＧＢＰ−１の反応性に影響を及ぼさないことを示した。  さらに、精製されたＧＢＰ−１−Ｈｉｓのラット抗ＧＢＰ−１抗体でコートしたＥＬＩＳＡプレートとの結合の特異性を測定するために、免疫化学ブロッキング実験を実行した。この効用のために、ＧＢＰ−１−Ｈｉｓを、ラット抗ＧＢＰ−１抗体ありの（黒及び白バー）又は無しの（黒バー）異なった希釈でインキュベートし、そしてその後プレートの上に置いた。ＧＢＰ−１−Ｈｉｓを抗体と共のプレインキュベートしないアッセイにおいて、シグナル強度での濃度依存的増加を観察した（黒バー）。しかしながら、ＧＢＰ−１のプレートの表面への結合は、抗ＧＢＰ−１抗体と共のプレインキュベーションによりブロックすることができる（黒及び白バー）。比較できる方式で実行されたアッセイにおいて、Ｈｉｓ−ＧＢＰ−２の結合も、ラット抗ＧＢＰ−１抗体と共のプレインキュベーションによりブロックすることができる（灰色及び白バー）。
【図８】図８：ＥＬＩＳＡの直線検出幅（ｌｉｎｅａｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒａｎｇｅ）の決定  （Ａ）健康人のプールされた血清を、ＰＢＳ／２％ＢＳＡで１：２（四角）、１：４（円）、１：８（三角）及び１：１６（菱形）で希釈した。いずれの場合において、ＧＢＰ−１−Ｈｉｓの増加する濃度を、異なった希釈に加えた。その後、すべてのサンプルをＧＢＰ−１−ＥＬＩＳＡで測定した。結果は、異なった血清希釈のそれぞれにおいて、検出シグナル（Ａ４０５）がＧＢＰ−１と共に増加したものであった。  （Ｂ）（Ａ）に記載したアッセイにおいて、０と２００ｎｇ／ｍｌの間のシグナルの直線増加を観察した。
【図９】図９：血清中の増加したＧＢＰ−１濃度が、炎症性疾患の患者で検出できる。  ＧＢＰ−１の濃度を、健康人のコントロール（ｎ＝２０）並びに異なった炎症性疾患の患者の血清（ｎ＝１０）、及び皮膚の局所に限られた炎症である丹毒の患者（ｎ＝８）においてＥＬＩＳＡを用いて測定した、ここで炎症性疾患は以下である：全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）（ｎ＝５）及び関節炎（ｎ＝５）、これらの疾患は炎症を一般化する。  ＧＢＰ−１血清濃度を、１：２で希釈した血清試料で決定した。試料中のＧＢＰ−１濃度を、標準曲線の助けで計算した。ＥＬＩＳＡ方法はＧＢＰ−２も認識し、そしてＧＢＰ−２は血清中におそらく存在もするので、測定された濃度を相対的単位で示した。  ＧＢＰ−１血清濃度は、コントロールの人（平均：１３．３相対的単位）と比べてＳＬＥの患者（平均：４６．１相対的単位）及び関節炎の患者（平均：５８．２相対的単位）で顕著に増加したが、丹毒の患者（平均：８．６相対的単位）では増加しなかった。ＳＬＥ及び関節炎の患者のＧＢＰ−１濃度と健康なコントロール対象のＧＢＰ−１濃度の違いは、統計学的に有意であった（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｔｅｓｔ  ＳＬＥ及び関節炎でｐ＜０．０１）。
【図１０】図１０：増加したＧＢＰ−１濃度は、細菌性髄膜炎の患者の分泌液において検出できる。  ブラインドテストにおいて、ＧＢＰ−１濃度をＥＬＩＳＡを用いて１７の分泌液試料中に検出した（図１０）。試験のブラインドをはずした後に、健康人のコントロール（ｎ＝９）に比べて有意に高い（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｔｅｓｔ  ｐ＜０．０３）ＧＢＰ−１濃度を、細菌性（ニューモコッカス（Ｐｎｅｕｍｏｋｏｋｋｕｓ）、スタフィロコッカス  アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、シュードモナス  アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））髄膜炎の患者（ｎ＝８）の分泌液中に検出できた（コントロールの人＝３６．６相対的単位、及び細菌性髄膜炎＝１０５．８相対的単位）ことが明らかとなった。ＧＢＰ−１分泌液濃度を、記載されたように測定した。分泌液試料を、ＰＢＳ中で１：２に希釈した。試料中のＧＢＰ−１の濃度を、標準曲線を用いて計算した。ＥＬＩＳＡ方法はＧＢＰ−２も認識し、そしてＧＢＰ−２は分泌液中におそらく存在もするので、決定された濃度を相対的単位で示した。  健康人のコントロールの分泌液中のＧＢＰ−１濃度は、血清中のＧＢＰ−１濃度に対して統計学的に有意な差（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｔｅｓｔ  ｐ＞０．０５）を示さなかった。これは、ＧＢＰ−１が健康人の分泌液中に蓄積せず、そして髄膜炎の患者におけるＧＢＰ−１濃度の増加が疾患に誘導される事実を提示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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