(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＶ４０のカプシドタンパク質のＤＥループ及びＨＩループの少なくとも一方に、１〜数個ずつのグリシン残基により挟まれた外来性ペプチドが挿入されている、改変されたＳＶ４０のカプシドタンパク質。
【請求項２】
前記ＳＶ４０カプシドタンパク質がＳＶ４０  ＶＰ１カプシドタンパク質である、請求項１に記載の改変されたＳＶ４０のカプシドタンパク質。
【請求項３】
前記ＤＥループにおける外来ペプチド挿入部位が、ＳＶ４０  ＶＰ１カプシドタンパク質のＮ−末端から数えて１２７位のアミノ酸と１４６位のアミノ酸との間であり、そして前記ＨＩループにおける外来ペプチド挿入部位が、ＳＶ４０  ＶＰ１カプシドタンパク質のＮ−末端から数えて２６８位のアミノ酸と２７７位のアミノ酸との間である、請求項２に記載の改変されたＳＶ４０のカプシドタンパク質。
【請求項４】
前記グリシン残基の数が、前記外来性ペプチドの一方の端につき１〜６個である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変されたＳＶ４０のカプシドタンパク質。
【請求項５】
前記グリシン残基の数が、前記外来性ペプチドの一方の端につき３〜６個である、請求項４に記載の改変されたＳＶ４０のカプシドタンパク質。
【請求項６】
前記外来性ペプチドが、Ｆｌａｇ配列（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）（配列番号：１）、Ｍｙｃ配列（Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ）（配列番号：４）、ＨＡ配列（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ）（配列番号：５）、Ｔａｔ−ＰＴＤ配列（Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）（配列番号：６）、ポリリジン配列（３）（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）（配列番号：７）、ポリリジン配列（６）（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）（配列番号：８）、ポリリジン（１２）（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）（配列番号：９）、ＮＧＲ配列（Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）（配列番号：１０）、６ｘＨｉｓ配列（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−  Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ）（配列番号：１１）又はポリリジン配列（８）（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）（配列番号：１２）である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の改変されたＳＤ４０のカプシドタンパク質。
【請求項７】
前記外来性ペプチドが、抗原エピトープを含んで成る、請求項１〜５のいずれか１項に記載の改変されたＳＶ４０のカプシドタンパク質。
【請求項８】
前記抗原エピトープが、ヒト免疫不全症候群（ＨＩＶ）のＴＡＴ−ＰＴＤ配列（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）（配列番号：２）又はインテグリン認識配列（ＲＧＤ）を含むアミノ酸配列３ｘＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）（配列番号：３）である、請求項７のいずれか１項に記載の改変されたＳＶ４０のカプシドタンパク質。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の改変されたＳＶ４０のカプシドタンパク質から形成されるウイルス様粒子。
【請求項１０】
生理活性物質を封入している請求項９に記載のウイルス様粒子。
【請求項１１】
前記生理活性物質が医薬活性成分である、請求項１０に記載のウイルス様粒子。
【請求項１２】
前記生理活性物質が遺伝子治療用核酸である、請求項１０に記載のウイルス様粒子。
【請求項１３】
請求項１１に記載のウイルス様粒子を含んで成る医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変されたＳＶ４０のカプシドタンパク質及びその使用に関する。本発明によれば、遺伝子治療、ドラッグデリバリーなどの応用が期待されるウイルスカプシドタンパク質の細胞指向性を生物工学的な手法により改変することが出来る。こうして改変されたウイルスカプシドタンパク質はウイルス様粒子を形成することが出来、このウイルス様粒子に特定の遺伝子核酸や医薬活性成分を封入して、それらを特定の細胞組織臓器に導入する事ができる。
【背景技術】
【０００２】
従来のウイルスベクター及びウイルス様粒子による遺伝子導入またはドラッグデリバリーは、ウイルス粒子が本来持つ標的細胞への効率的な指向性に依存していた。従ってこれらの方法で各生理活性物質の導入できる細胞種はウイルス粒子自身の細胞指向性又は組織指向性により限定されるものであった。このため、一般に安定で、長期保存に耐える、主に蛋白質と核酸のみで構成されるノンエンベロープウイルスにつき、このウイルス自身のもつ細胞指向性を変えようという技術開発は以前から行われている。この方法の一つとして、細胞指向性の高い外来性ペプチドをウイルスカプシドタンパク質に挿入することが考えられる。
【０００３】
なお、マウスポリオーマウイルス（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ３５６：８６７−８７３；Ｓｈｉｎ  ＹＣ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．，  ７７：１１４９１−１１４９８）、及びヒトパピローマウイルス（Ｓｌｕｐｅｔｚｋｙ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．  ８２：２７９９−８０４；  Ｓａｄｅｙｅｎ  ＪＲ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  ３０９：３２−４０）において、類似した方法を用いておのおののウイルスカプシドタンパク質にペプチド鎖を挿入し、一部の挿入体では粒子を形成するものがあった。しかしながら挿入されたペプチド鎖の提示、改変カプシドタンパク質の粒子形成能、細胞指向性などについて同時に確認したものはなく、またＳＶ４０ではこの研究が初めてである。
【発明の開示】
【０００４】
しかしながら、ウイルスカプシドタンパク質の細胞指向性を改変するために、ウイルスカプシドタンパク質のアミノ酸配列への外来ペプチドの導入によるアミノ酸配列の改変を行なえば、改変されたウイルスカプシドタンパク質の殆どが粒子形成能を喪失する、導入した外来性ペプチドがウイルス粒子の表面に提示されないために外来ペプチドの期待される性質が表現されない、などのおそれがあった。そこで、本発明は、霊長類に感染するパポバウイルス、特にヒトへの高い安全性及び高い構造安定性が期待できるＳＶ４０ウイルスカプシドタンパク質中の、外来性ペプチドの適切な挿入部位を見出し、その部位に外来性ペプチドを走注することにより、その改変カプシドタンパク質から形成される粒子の細胞指向性を制御して、細胞への遺伝子または薬剤などの導入の特異性と効率の制御を行おうとするものである。
【０００５】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、カプシドタンパク質の様々な領域（図１及び図２を参照のこと）に外来性ペプチドを挿入してカプシドタンパク質の改変体を作製し、そのペプチド鎖を提示しつつ粒子を形成しうる挿入部位を探索した。その結果、約４０の改変体（その一部を図２に示す）を解析したところ、そのうちの２種類の改変体、即ち、ＳＶ４０のカプシドタンパク質のＤＥ−ループ又はＨＩ−ループに、１〜数個のグリシン残基から成るスペーサーにより挟まれた外来性ペプチドを挿入した改変体が、粒子を正常に形成し、かつペプチド鎖が提示されている挿入部位を見出し（図２及び図３）、この具体的な改変を適用することができるウイルスやスペーサーアミノ酸の範囲を考慮しながら、本件発明を完成した。
【０００６】
従って、本発明は、霊長類に感染するパポバウイルスのカプシドタンパク質のカプシド粒子表面を形成するアミノ酸残基に、１〜数個のスペーサーアミノ酸残基により挟まれた外来遺伝子が挿入されている、改変されたカプシドタンパク質を提供する。前記霊長類に感染するパポバウイルスとしては、例えばＳＶ４０、ＪＣＢ、ＢＫＶなどが挙げられる。また。前記スペーサーアミノ酸残基としては、例えばグリシン、セリン、アラニンなどが挙げられる。
【０００７】
より具体的には、本発明は、ＳＶ４０のカプシドタンパク質のＤＥループ及びＨＩループの少なくとも一方に、１〜数個ずつのグリシン残基により挟まれた外来性ペプチドが挿入されている、改変されたＳＶ４０のカプシドタンパク質を提供する。
【０００８】
前記ＳＶ４０カプシドタンパク質は、好ましくはＳＶ４０  ＶＰ１カプシドタンパク質（配列番号：１３）である。前記ＤＥループにおける外来ペプチド挿入部位は、好ましくは、ＳＶ４０  ＶＰ１カプシドタンパク質のＮ−末端から数えて１２７位のアミノ酸と１４６位のアミノ酸との間であり、そして前記ＨＩループにおける外来ペプチド挿入部位が、ＳＶ４０  ＶＰ１カプシドタンパク質のＮ−末端から数えて２６８位のアミノ酸と２７７位のアミノ酸との間である。
【０００９】
更に、本発明で使用でとる他のカプシドタンパク質として、ＪＣＶ（そのアミノ酸配列を配列番号：１３に示す）、ＢＫＶ（そのアミノ酸配列を配列番号：１４に示す）などが挙げられる。ＪＣＶの予想される外来ペプチド挿入可能部位は、Ｎ−末端から数えて１１９位−１３８位のアミノ酸間、又は２６０位−２６９位のアミノ酸間である。また、ＢＫＶの予想される外来ペプチド挿入可能部位は、Ｎ−末端から数えて１２７位−１４６位のアミノ酸間、又は２６８位−２７７位のアミノ酸間である。
【００１０】
前記グリシン残基の数は、好ましくは、前記外来性ペプチドの一方の端につき１〜６個であり、例えば３〜６個である。
【００１１】
前記外来性ペプチドは、例えば、Ｆｌａｇ配列（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）（配列番号：１）、Ｍｙｃ配列（Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ）（配列番号：４）、ＨＡ配列（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ）（配列番号：５）、Ｔａｔ−ＰＴＤ配列（Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）（配列番号：６）、ポリリジン配列（３）（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）（配列番号：７）、ポリリジン配列（６）（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）（配列番号：８）、ポリリジン（１２）（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）（配列番号：９）、ＮＧＲ配列（Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）（配列番号：１０）、６ｘＨｉｓ配列（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−  Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ）（配列番号：１１）又はポリリジン配列（８）（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）（配列番号：１２）あるいは抗原エピトープである。前記抗原エピトープの例としては、ヒト免疫不全症候群（ＨＩＶ）のＴＡＴ−ＰＴＤ配列（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）（配列番号：２）及びインテグリン認識配列（ＲＧＤ）を含むアミノ酸配列３ｘＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）（配列番号：３）が挙げられる。
【００１２】
本発明はまた、上に記載の改変されたＳＶ４０のカプシドタンパク質から形成されるウイルス様粒子を提供する。
【００１３】
本発明は更に、生理活性物質を封入している、上記のウイルス様粒子を提供する。この生理活性物質は、例えば、医薬活性成分、又は遺伝子治療用核酸である。
【００１４】
本発明は更に、上記のウイルス粒子を含んで成る医薬組成物を提供する。
【００１５】
発明を実施するための具体的な形態
ウイルスを用いて医薬活性成分や遺伝子治療用核酸を導入する場合に問題となるのはその安全性である。導入ベクターとして用いられているウイルス自身が病原性を持つものが多く、またその構造タンパク質に細胞障害性を持つものもある。一方、ＳＶ４０などのパポバウイルスの多くは宿主に感染しても殆ど病理的変化が見られることはない。特にＳＶ４０に関してはポリオワクチンの混入ウイルスとして発見された経緯から、大規模にヒトに接種された例があるが、ＳＶ４０の接種が原因での病理疾患発生に関しては否定的な報告がなされている。
【００１６】
現在ではこれらのウイルスはヒトには無害あるいは非常に病原性が低いと考えられており、そのウイルスのカプシドタンパク質の細胞指向性を制御することが出来れば、ヒトへの遺伝子導入、ドラッグデリバリー等において、高い安全性が期待できる。従って、本発明のおいては、ＳＶ４０のカプシドタンパク質を用い、好ましくは、ＳＶ４０  ＶＰ１カプシドタンパク質を用いる。
【００１７】
本発明において、外来性ペプチドが挿入される部位は、ＳＶ４０のカプシドタンパク質のＤＥ−ループ内又はＨＩ−ループ内であり、ＳＶ４０  ＶＰＩカプシドタンパク質の場合、ＤＥ−ループは当該タンパク質のＮ−末端から数えて１２７−１４６位にあり、ＨＩ−ループは２６８−２７７位にある。好ましくは、外来性ペプチドは、ＳＶ４０  ＶＰＩカプシドタンパク質の、ＤＥ−ループ内の１３７位と１３８位の間、あるいはＨＩ−ループ内の２７２位と２７５位との間に挿入される。
【００１８】
挿入される外来性ペプチドのそれぞれの端には１〜数個のスペーサーアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、セリンなどが存在する必要があり、好ましくは１〜９個、更に好ましくは１〜６個、例えば３〜６個のアミノ酸が存在する。上記のスペーサーアミノ酸が存在しない場合、ウイルス様粒子の形成は困難である。
【００１９】
外来性ペプチドとしては、上記の部位に挿入することによりウイルス様粒子の細胞指向性を変更するものが好ましく、Ｆｌａｇ配列（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）（配列番号：１）、あるいは抗原エピトープであるヒト免疫不全症候群（ＨＩＶ）のＴＡＴ−ＰＴＤ配列（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）（配列番号：２）又はインテグリン認識配列（ＲＧＤ）を含むアミノ酸配列３ｘＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）（配列番号：３）が挙げられる。
【００２０】
更に、外来性ペプチドとして、Ｍｙｃ配列（Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ）（配列番号：４）、ＨＡ配列（Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｌａ）（配列番号：５）、６ｘＨｉｓ配列（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ）（配列番号：１１）、ポリリジン配列（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）（配列番号：１２）、Ｔａｔ−ＰＴＤ配列（Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）（配列番号：６）、ポリリジン配列（３）（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）（配列番号：７）、ポリリジン配列（６）（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）（配列番号：８）、ポリリジン（１２）（Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）（配列番号：９）、ＮＧＲ配列（Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）（配列番号：１０）等があげられる。
【００２１】
本発明はまた、上記の改変されたカプシドタンパク質から形成されるウイルス様粒子に関する。実用的には、このウイルス様粒子には、生理活性物質、典型的には医薬活性物質又は遺伝子治療のための核酸を封入させる。医薬活性物質としては、低分子化合物、特に低分子有機化合物、又はポリペプチド、タンパク質、多糖類などの高分子化合物であっても良い。このような物質の例として、アドリアマイシン、シクロフォスファミドなどの抗がん剤、ＴＮＦα、Ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂなどの抗がん作用のあるタンパク質などがあげられる。
【００２２】
また、遺伝子治療用の遺伝子（核酸）としては、特に限定されず、例えばアデノシンデアミダーゼ遺伝子、ｐ５３遺伝子、等のヒトの正常遺伝子、またはｓｉＲＮＡを発現して特定の遺伝子をＲＮＡ干渉によって発現抑制することができるＤＮＡ、そしてｓｉＲＮＡ自身などがあげられる。
実施例
次に、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
【００２３】
実施例１． 改変型ＶＰ１タンパク質の調製
本実施例では、ＳＶ４０の外部に提示されるドメインの中でＢＣ−ループ、ＨＩ−ループ、及びＤＥ−ループの３つのドメイン（図１を参照のこと）を対象にして、外来のエピトープを挿入した改変型ＳＶ４０−ＶＰ１遺伝子の作製を行った。ＳＶ４０−ＶＰ１タンパク質においてその一部が外部に提示されるループ上の特定のアミノ酸残基を、両側に３残基ずつグリシンを有するＦｌａｇ配列に置換した改変型ＳＶ４０−ＶＰ１遺伝子を作製し、ｐＦａｓｔＢａｃ１ベクターに組込み、大腸菌ＤＨ５α株に導入した。
【００２４】
次に、Ｓｆ９細胞を１×１０７個づつ蒔いた１０ｃｍ径の組織培養用ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）に、それぞれの改変型ＳＶ４０のウイルスタンパク質（ＶＰ１）を発現する組換えバキュロウイルスを、ｍ．ｏ．ｉ．  （Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ；  重複感染度）５〜１０で感染させた。各々の改変型ＶＰ１タンパク質を発現する組み換えバキュロウィルスはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓを用いて作製した。
【００２５】
組み換えバキュロウィルスによる感染の７２時間後に、Ｓｆ−９細胞を回収し、冷却したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）により２回洗浄した。氷冷したソニケーション用緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．９），１％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）、２ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍＬ  キモスタチン（ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ）、アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）、ロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、アンチパイン（ａｎｔｉｐａｉｎ）、ぺプスタチン（ｐｅｐｓｔａｔｉｎ））２００μＬに回収した細胞を懸濁させ、氷冷しながら２０秒間超音波破砕し、その後２０秒氷上に置いた。この操作を三回繰り返した後に、その細胞破砕液を１５，０００ｇ、４℃にて１０分間の遠心分離を行い、その上清を回収した。回収したＶＰ１タンパク質２μｌを抗ＶＰ１抗体を用いてウエスタンブロッティングを行い、その発現を確認した（図３）。
【００２６】
実施例２． 改変型ＶＰ１タンパク質のＳｆ−９細胞内ウイルス様粒子形成の解析
発現を確認した後、ＳＷ５１Ｔｉ用Ｏｐｅｎ  Ｔｏｐ  Ｕｌｔｒａｃｌｅａｒ  Ｔｕｂｅ  （Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて、上記の細胞破砕液２μＬを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）で１０倍希釈し２０μＬとし２０−４０％（ｗ／ｖ）ショ糖密度勾配遠心（５５，０００  ｒｐｍ、４℃にて１時間）で分画した。
【００２７】
２０−４０％（ｗ／ｖ）ショ糖密度勾配遠心により分画したサンプルを抗ＶＰ１抗体を用いてウエスタンブロッティングを行い、改変型ＶＰ１のＶＬＰ形成能を解析した。野生型ＶＰ１タンパク質により形成されたＶＰ１−ＶＬＰ（以下Ｗｔ−ＶＬＰ）は８番目から１０番目にそのピークが検出された（図３）。同様のピークがＤＥ−ループ及びＨＩ−ループにＦｌａｇ配列を挿入した改変型でも確認できた。
【００２８】
ＳＷ５１Ｔｉ用Ｏｐｅｎ  Ｔｏｐ  Ｕｌｔｒａｃｌｅａｒ  Ｔｕｂｅ  （Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて、２００μＬとし２０−５０％（ｗ／ｖ）塩化セシウム密度勾配遠心（３５，０００  ｒｐｍ、４℃にて３時間）で分画した。超遠心後のサンプルのうち５μＬをカーボン−コロジオン膜を張った銅メッシュを上に吸着させた後、メッシュを純水で洗浄し２−６％酢酸ウラン溶液で染色し乾燥させた。観察は日立社製Ｈ−７５００電子顕微鏡を用いて行った。前述のＤＥ−ループ又はＨＩ−ループにＦＬＡＧ配列を挿入した改変型ＶＰ１がＷｔ−ＶＬＰとほぼ同じ形状と大きさのウイルス様粒子を形成することを確認した。下の表１に改変型−ＶＰ１のウイルス様粒子の形成能を解析した結果を示す（図４）。
【００２９】
【表１】
0004819792.tif 000002
【００３０】
実施例３． ウイルス様粒子の形成におけるグリシン残基の機能的役割の解析
さらに、本実施例では改変型ＶＰ１によるウイルス様粒子の形成に、ループドメインに挿入したＦｌａｇ配列の両側に付加するグリシン残基の数がどのような影響を与えるかを検討した。
【００３１】
前述したループドメインの内、ＨＩ−ループを対象としてＦｌａｇ配列の両側にグリシン残基０〜６残基まで付加させた改変型ＶＰ１遺伝子（図５）を、実施例１及び実施例２に記載した方法とと同様にして作製した。図６及び図７並びに以下の表２にその結果を示す。
【００３２】
【表２】
0004819792.tif 000003
【００３３】
また、ショ糖密度勾配遠心により分画したサンプルを抗ＶＰ１抗体を用いてウエスタンブロッティングした結果から、グリシンを３残基付加したものの方が１残基または２残基付加した場合よりウイルス様粒子の形成効率が良いこともわかった。以上のことからＦｌａｇ配列を挿入した改変型ＶＰ１がウイルス様粒子を形成するには両側にスペーサーとしてグリシン残基が必要であり、その数は少なくとも３残基が好ましいことが示された。
【００３４】
実施例４． 改変型ＶＰ１タンパク質におけるＦｌａｇ配列の機能解析
Ｆｌａｇ配列を挿入した改変型ＶＰ１上でエピトープとして挿入したＦｌａｇ配列がエピトープとして作用するかを検討するために、抗Ｆｌａｇ抗体を用いて免疫沈降を行った。実施例２の最終パラグラフに記載した方法と同様にして回収した改変型ウイルス様粒子（改変型ＶＬＰ）２０μＬにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を加えて全量１００μＬにし、それを５０μＬの抗−Ｆｌａｇ  Ｍ２アフィニティーゲル（Ｓｉｇｍａ）と共に４℃で１時間穏やかに攪拌した。攪拌後、２５０μＬのリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で二回洗浄し１μｇ／μＬのＦｌａｇペプチドで溶出した。溶出したサンプルを抗ＶＰ１抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。この実験よりＤＥループにＦｌａｇ配列を挿入した改変型ＶＰ１及びＨＩ−ループにＦｌａｇ配列を挿入した改変型ＶＬＰだけが、抗Ｆｌａｇ抗体に結合することが確認された（図８）。
【００３５】
実施例５． 改変型ＶＰ１からのウイルス様粒子におけるＦｌａｇ配列の機能解析
改変型ＶＬＰにおいて、ＶＬＰ形成時でも挿入したＦｌａｇ配列がエピトープとしての機能を有するかを検討するために以下のような実験を行った。実施例１及び実施例２に記載した方法と同様にして改変型ＶＬＰを６０ｎｇずつ調製し、それぞれを抗−Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）および抗Ｈｉｓ抗体（Ｓｉｇｍａ）  ９μｇと共に４℃で１時間穏やかに攪拌した。攪拌後、２０−４０％（ｗ／ｖ）ショ糖密度勾配遠心により分画しウエスタンブロッティングを行った。抗Ｆｌａｇ抗体を用いた場合は、ピーク画分である９及び１０画分にＶＰＩおよび抗Ｆｌａｇ抗体の両方が検出されたのに対し、抗Ｈｉｓ抗体を用いた場合はピーク画分にＶＰＩのみが検出された（図９）。
【００３６】
実施例７． 改変型ＶＰ１タンパク質の大量精製
改変型のウイルス様粒子を大量調製するため、Ｓｆ９細胞を３×１０７個づつ蒔いた１５ｃｍ径の組織培養用ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）１０枚に、それぞれの改変型ＳＶ４０のウイルスタンパク質（ＶＰ１）を発現する組換えバキュロウイルスを、ｍ．ｏ．ｉ．  （Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ；  重複感染度）５〜１０で感染させた。
【００３７】
組み換えバキュロウィルスによる感染７２時間後に、Ｓｆ−９細胞を回収し、冷却したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）により２回洗浄した。氷冷したソニケーション用緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  （ｐＨ７．９），  １％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム  （ＤＯＣ），  ２ｍＭ  ＰＭＳＦ、１μｇ／ｍＬ  キモスタチン、アプロチニン、ロイペプチン、アンチパイン、ぺプスタチン）１０ｍＬに、回収した細胞を懸濁させ、氷冷しながら１０分間超音波破砕した。この操作を２回繰り返した後に、その細胞破砕液を１５，０００ｇ、４℃にて１０分間の遠心分離にかけ、その上清を回収した。
【００３８】
ＳＷ４１Ｔｉ用Ｏｐｅｎ  Ｔｏｐ  Ｕｌｔｒａｃｌｅａｒ  Ｔｕｂｅ  （Ｂｅｃｋｍａｎ）に密度の異なる塩化セシウム溶液（５０％，  ４０％，  ３０％，  ２０％  （ｗ／ｖ））を密度の高いほうから順番に１．５ｍｌづつ重層し、その上に、上記の細胞破砕液５ｍＬを重層し、ＳＷ４１Ｔｉローターを用いて３０，０００  ｒｐｍ、４℃にて３時間の遠心分離を行った。この操作の後に、密度勾配の中程に白く形成されるＳＶ４０ウイルスのウイルス様粒子の層を回収し３７％（ｗ／ｖ）塩化セシウム溶液で希釈した後、ＳＷ５５Ｔｉ用Ｏｐｅｎ  Ｔｏｐ  Ｕｌｔｒａｌｅａｒ  Ｔｕｂｅに移し、これをＳＷ５５Ｔｉローターで５０，０００  ｒｐｍ、４℃にて２０時間遠心分離を行い、再度形成されたウイルス様粒子の層を回収した。
【００３９】
実施例８． 改変型ウイルス様粒子の機能解析
挿入した各々のｍｏｔｉｆが改変型ウイルス様粒子（Ｆｌａｇ−ウイルス様粒子、３ｘＲＧＤ−ウイルス様粒子、ＴＡＴ−ＰＴＤ−ウイルス様粒子）の細胞に対する吸着と侵入過程にどのような影響を及ぼすのかを検討する目的で以下のような実験を行った。
【００４０】
１０ｃｍ径の組織培養用ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）にＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌細胞）を１ｘ１０６個になるように蒔いた。また、野生型ウイルス様粒子及び実施例７において調製した改変型ウイルス様粒子を、その濃度が１細胞あたり４ｘ１０４、４ｘ１０５、及び４ｘ１０６個になるようにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で希釈した。
【００４１】
上記のようにして調製した野生型ウイルス様粒子及び改変型ウイルス様粒子（４ｘ１０４、４ｘ１０５、４ｘ１０６  ＶＬＰｓ／細胞）に培地を加えて１ｍＬ（ＤＭＥＭ培地、１０％ＦＢＳ）としたものを前述したＨｅＬａ細胞に接種し、室温で１５分おきにロッキングした。ロッキングを４回行った後、９ｍＬの培地を加え３７℃で１時間インキュベートした。次に、サンプルを回収し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で二回洗浄した。以下、目的に応じて２種類の方法でＨｅＬａ細胞を回収した。
【００４２】
（１）スクレーパーによる回収
ＨｅＬａ細胞表面に付着したウイルス様粒子及び細胞内に取り込まれたウイルス様粒子の両方を検出するためにスクレーパー（ＩＷＡＫＩ）を用いて回収した。
【００４３】
（２）トリプシンによる回収
ＨｅＬａ細胞内に取り込まれたウイルス様粒子のみを検出する目的で１０ｃｍ径の組織培養用ディッシュ（ＩＷＡＫＩ）１枚につき０．２５％  Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を１ｍＬ加え、３７℃で５分間インキュベートしディッシュから剥がれた細胞を回収した。
【００４４】
前述の方法で回収した細胞を冷却したリン酸緩衝液（ＰＢＳ）により２回洗浄し、回収した細胞を氷冷しておいたソニケーション用緩衝液２００μＬに懸濁し、６０秒間超音波破砕した。これをウェスタンブロッティング法にかけ、抗ＶＰ１抗体を用いて、ＨｅＬａ細胞に吸着したＶＰ１タンパク質及び取り込まれたＶＰ１タンパク質の検出を行った。表３にその結果を示す。
【００４５】
更に、結果を図１０に示す。図１０において：
Ａは、ＴＡＴ−ＰＴＤまたは３ｘＲＧＤアミノ酸配列をＨＩ−Ｌｏｏｐに挿入されたウイルスカプシドタンパク質からなる粒子の電子顕微鏡写真を示す。各粒子は直径約５０ｎｍの約ほぼ球形で、野生型の粒子（ここでは示さず）と見かけ上差は認められない。下の黒い線は１００ｎｍを示す。
【００４６】
Ｂ及びＣは、野生型粒子（Ｗｔ）、Ｆｌａｇ、３ｘＲＧＤ、ＴＡＴ−ＰＴＤの各アミノ酸配列を挿入されたウイルスカプシドタンパク質からなる各粒子をＣＶ−１細胞に感染させ、１時間後に細胞を回収し、細胞に侵入した粒子量（ＶＰ１の量）をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔで検出した。Ｉｎｐｕｔで示されるように感染させる粒子量を変え、細胞内で検出されるＶＰ１量の比較を試みた。Ｃｅｌｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄとは感染させた細胞をトリプシンなどのタンパク質分解酵素を用いずに回収したもので、細胞表面に接着あるいは細胞内に侵入した粒子の検出を試みた。Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄとは感染させた細胞をトリプシン処理で回収する事により、細胞表面に結合した粒子を消化し、細胞内に残る粒子（ＶＰ１）のみの定量を目的とした。
【００４７】
ＷｔはＢおよびＣでみられるように細胞に接着（ｃｅｌｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ参照）、そして侵入（Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ参照）できるが、Ｆｌａｇを導入した粒子は細胞への接着の段階で阻害がみられる（Ｂ）。また３ＸＲＧＤはＷｔと同様に細胞に接着できるが、侵入は非常に効率が悪かった（Ｃ）。一方、ＴＡＴ−ＰＴＤを導入した粒子はＷｔと同様に細胞内に侵入できる事が明らかであった（Ｃ）。
【００４８】
このことは、ペプチド鎖の導入自体が元々のカプシドタンパク質の細胞指向性を失わせる結果になること、そしてＴＡＴ−ＰＴＤのようなペプチド鎖の導入により、新たな細胞指向性を獲得できる事を示している。
【００４９】
実施例９． アミノ酸の導入による細胞指向性の変更
野生型粒子（Ｗｔ）、あるいはＦｌａｇ（Ｆｌａｇ−ＤＥ２）又はＴＡＴ−ＰＴＤ（Ｔａｔ−ＰＴＤ−ＤＥ２）の各アミノ酸をＤＥループに挿入されたウイルスタンパク質からなる各粒子を、ＨｅＬａ細胞に感染させ、２時間後に細胞を回収し、細胞に侵入した粒子量（ＶＰ１の量）をＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔで検出した。細胞の回収の際にトリプシンで細胞表面に付着する粒子を分解し、細胞内に侵入した粒子のみを検出した。Ｉｎｐｕｔで示されるようにほぼ同量の粒子を細胞導入に用いたが、Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄで示されるように細胞内に検出されたＶＰ１の量はＷｔに比べ、Ｆｌａｇ−ＤＥ２は殆ど検出できず、またＴＡＴ−ＰＴＤ−ＤＥ２はＷｔよりわずかに低いが、ＶＰ１を細胞内に検出できた。この結果は、ＨＩループへのペプチド鎖導入の場合と同様に、ＤＥループにペプチド鎖を導入すること自体が元々のカプシドタンパク質の細胞指向性を失わせ、そしてＴＡＴ−ＰＴＤのようなペプチド鎖の導入により新たな細胞指向性が獲得できる事を示している（図１１）。
【００５０】
実施例１０． 改変型ウイルス様粒子の機能解析（２）
実施例８に記載の実験を反復した。但し、トリプシンを用いる方法に代えて、共焦点顕微鏡を用いて観察を行なった。ＨＩループにＦｌａｇ配列を挿入したＦｌａｇ−ＨＩ１、ＨＩループに３×ＲＧＤ配列（ＲＧＤ−ＲＧＤ−ＲＧＤ）を挿入した３×ＲＧＤ−ＨＩ１、ＤＥループにＦＦｌａｇ配列を挿入したＦｌａｇ−ＤＥ２及びＤＥループに３×ＲＧＤ配列（ＲＧＤ−ＲＧＤ−ＲＧＤ）を挿入した３×ＲＧＤ−ＤＥ２、並びに野生型ＶＬＰ（Ｗｔ）を試験した。抗−Ｖｐ１抗体により検出した結果を図１２に示し、共焦点顕微鏡を用いて観察した結果を図１３に示す。
【００５１】
図１３において、白い球状体は細胞核を示し、その周囲に雲状に分布する灰白色領域は細胞に取り込まれたＶＬＰの集合を示す。
【００５２】
上記の結果、ＨＩループ又はＤＥループに３×ＲＧＤ配列（ＲＧＤ−ＲＧＤ−ＲＧＤ）を挿入した３×ＲＧＤ−ＤＥ２は、野生型ＶＬＰと同等に細胞に取り込まれた。結果を表３にまとめる。
【００５３】
【表３】
0004819792.tif 000004
【００５４】
実施例の結果のまとめ
ヒト免疫不全症候群ウイルス（ＨＩＶ）のＴＡＴ−ＰＴＤ  配列（Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ）（配列番号：２）又はインテグリン認識配列（ＲＧＤ）を含むアミノ酸配列３ｘＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）（配列番号：３）、あるいはＦｌａｇ配列（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）（配列番号：１）などをＳＶ４０  ＶＰ１カプシドタンパク質の表面ループ、具体的にはＶＰ１アミノ酸１３６番目から１３９番目の間、あるいは２７２番目から２７５番目の間に導入し、そしてその改変型ＶＰ１で粒子を形成させた。導入したアミノ酸配列の如何に関わらず、改変型ＶＰ１は粒子を形成することができた。
【００５５】
また挿入されたアミノ酸配列は、改変型ＶＰ１を変性しなくても抗体などで認識させる事ができ、粒子表面に提示されていた。この粒子を用いてＣＶ−１あるいはＨｅＬａ細胞などに導入させたところ、Ｆｌａｇを導入した改変型粒子は細胞に接着する事が殆どできなかった。一方３ｘＲＧＤを導入した粒子は細胞に接着はできたが、野生型に比べて侵入の効率は低かった。ところが、ＴＡＴ−ＰＴＤ配列を導入した粒子は細胞に接着、そして侵入できその効率は野生型ＶＰ１で構成された粒子より少しであるが上回っていた。つまり野生型のウイルスカプシドタンパク質がもともと持つ細胞指向性がペプチド鎖挿入によって不活化されていたが、挿入したペプチド鎖の機能によって新しい細胞指向性が与えられた事を示している。
【００５６】
産業上の利用可能性
外来性ペプチド鎖をウイルスカプシドタンパク質の適所に挿入する事により、そのカプシドタンパク質の粒子形成を阻害することなく効率的なペプチド鎖の提示を行うことができた。このペプチド鎖の挿入により、ウイルスカプシドタンパク質がもつ元々の細胞指向性が阻害され、そして導入したペプチド鎖で粒子の細胞指向性を制御することができた。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、ＳＶ４０  ＶＰ１カプシドタンパク質の構造を示す。
【図２】図２は、ＳＶ４０  ＶＰ１カプシドタンパク質のＤＥループ、ＨＩループ及びＢＣループ中の、Ｆｌａｇ配列を挿入した部位を示す。挿入部位を、白抜き文字で示す。
【図３】図３は、図２に示す部位にＦｌａｇ配列が挿入された改変型ＶＰ１カプシドタンパク質からウイルス様粒子が形成されるか否かを示す。８〜１０の位置のバンドがウイルス様粒子の形成を示す。
【図４】図４は、野生型ＶＰ１カプシドタンパク質（ｗｔ）、並びにＤＥループの１３６−１３９位にＦｌｏｇ配列が挿入された改変型ＶＰ１カプシドタンパク質（ＤＥ２）及びＨＩループの２７２−２７５位にＦｌａｇ配列が挿入された改変型ＶＰ１カプシドタンパク質（ＨＩ１）から形成されたウイルス様粒子の顕微鏡写真を示す。
【図５】図５は、ＨＩ１ループの２７２−２７５位にｎ個のグリシンに挟まれたＦｌａｇ配列が挿入されたＶＰＩカプシドタンパク質の構造を模式的に示す。
【図６】図６は、グリシンの数とウイルス様粒子の形成との関係を示す。８又は９の位置のバンドがウイルス様粒子の形成を示す。
【図７】図７は、グリシンの数とウイルス様粒子の形成との関係を示す電子顕微鏡写真である。Ｇ３（グリシン３個）〜Ｇ６（グリシン６個）の範囲で粒子の形成が明瞭に観察される。
【図８】図８は、野生型粒子（Ｗｔ）およびＦｌａｇ−ｔａｇを挿入されたウイルスカプシドタンパク質（ＨＩ１、ＤＥ２）から構成される粒子の抗Ｆｌａｇ抗体での免疫沈降の結果を示す。
【図９】図９は、Ｆｌａｇ−ｔａｇを挿入されたウイルスカプシドタンパク質で構成される粒子を抗Ｆｌａｇ抗体（上のパネル）または抗Ｈｉｓ抗体（下のパネル）と混合し、ショ糖密度勾配遠沈後に分画し各フラクションについて存在するタンパク質を検出した結果を示す。
【図１０】図１０において、ＡはＴＡＴ−ＰＴＤ（ＴＡＴ−ＰＴＤ−ＨＩ１）（左）または３ｘＲＧＤ（３ｘＲＧＤ−ＨＩ１）（右）を提示するウイルスカプシドタンパク質からなる粒子の電子顕微鏡写真である。ＢはＷｔ粒子、あるいはＦｌａｇ−ｔａｇを挿入された粒子（Ｆｌａｇ−ＨＩ１）のＣＶ−１細胞への導入を示す。Ｆｌａｇ−ｔａｇの導入により粒子の細胞への導入能力は消失している。Ｃは、Ｗｔ粒子、あるいは３ｘＲＧＤ、ＴＡＴ−ＰＴＤを導入された粒子のＣＶ−１細胞への導入を示す。３ｘＲＧＤを提示する粒子は細胞に接着はできるが、トリプシン処理した場合には侵入は検出できなかった。このため共焦点顕微鏡による観察を行った。Ｔａｔ−ＰＴＤをもつ粒子は野生型とほぼ同じかそれ以上の導入能を持つ。
【図１１】図１１は、Ｗｔ粒子、あるいはＦｌａｇ（Ｆｌａｇ−ＤＥ２）またはＴＡＴ−ＰＴＤ（ＴＡＴ−ＰＴＤ−ＤＥ２）を導入された粒子の、ＨｅＬａ細胞への導入による細胞指向性の変化をＤＥループへのＦｌａｇ−Ｔａｇの導入によりＶＰ１粒子の細胞内への導入が阻害されている。ＴＡＴ−ＰＴＤをＤＥループに導入された粒子では導入能力が獲得されている。
【図１２】図１２は、実施例１０の結果を示す図である。
【図１３】図１３は、実施例１１の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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