(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホエーに次のａ）〜ｄ）の成分を添加することを特徴とする乳酸桿菌用培地。
ａ）グルコース
ｂ）カゼイン酵素分解物
ｃ）Ｔｗｅｅｎ(登録商標)８０、オレイン酸ナトリウムまたはデカグリセリンモノオレエート
ｄ）  酵母エキス
【請求項２】
さらに、ＭｇＳＯ4、ＭｎＳＯ4を含む請求項１に記載の乳酸桿菌用培地。
【請求項３】
さらに、ＭｇＳＯ4、ＭｎＳＯ4、Ｋ2ＨＰＯ4、（ＮＨ4）3Ｃ6Ｈ5Ｏ7、ＮａＣ2Ｈ3Ｏ2を含む請求項１に記載の乳酸桿菌用培地。
【請求項４】
酵母エキスを０．３〜０．９％含有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の乳酸桿菌用培地。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の乳酸桿菌用培地を用いて乳酸桿菌を培養する方法。
【請求項６】
乳酸桿菌がＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ、Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．ｃａｓｅｉ、Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓのいずれかである請求項５に記載の培養方法。
【請求項７】
ジャーファーメンターまたはインキュベーターを用いて培養を行う、請求項５または６に記載の培養方法。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかの方法で乳酸桿菌を培養し、該方法によって培養された乳酸菌を用いて食品、健康食品、特定保健用食品、栄養機能性食品、医薬を製造する方法。
【請求項９】
製造する食品、健康食品、特定保健用食品、栄養機能性食品、医薬がヨーグルト、チーズ、乳酸桿菌を含有する錠剤である請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はチーズ製造やカゼイン製造の副産物として産出されるホエーを含有する乳酸菌培地に関する。さらに詳しくは窒素源を強化したホエーを含有することを特徴とする乳酸菌培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
チーズ製造やカゼイン製造の副産物として産出されるホエーは、乳糖、水溶性蛋白質、無機質、有機酸、水溶性ビタミン等を含む栄養価の高い物質である。ホエーは、濃縮ホエーやホエーパウダーとして製菓材料や乳糖の原料に利用されるほか、健康食品、美容品等へも利用されている。しかし、これらは多量に産出されるホエーの一部でしかなく、多くは使途に困っている状況にある。【０００３】
一方、近年、食品は栄養的な価値だけでなく、健康効果も求められるようになってきている。そのような中で、生きたまま腸管に到達し、有益な作用をもたらすプロバイオティク乳酸菌が注目されている。
プロバイオティク乳酸菌の一つとして知られるL.acidophilusグループ(L.acidophilus,
L.gasseri, L.amylovorus, L.crispatus, L.gallinarum,そしてL.johnsoniiの6菌種)のうちヒト腸管由来の菌株はその成育に強い嫌気条件を必要とせず、生菌の生存性も高いことから、利用価値が高い。しかしながらL.acidophilusグループは一般に乳中での増殖が緩慢なため、例えばヨーグルト等の製品に用いる場合、ヨーグルト等の製品とは別の培地で増殖させて、その菌を製品に添加する方法がとられることが多い。【０００４】
これらの乳酸菌の培養には、市販のMRS培地が用いられるが、この培地は非常に高価（1kgあたり30,000円以上）なため、工業的に利用することは難しい。そこで、MRS培地に変わる安価で優れた培地が望まれている。
ホエーは栄養価が高く、安価である。また乳から得られる成分であるため安全な食品原料として利用できる。従って、廃棄されているホエーを有効に利用して、MRS培地に変わり得る乳酸菌培地を得ることができれば、安価で工業的に利用可能な培地を得ることができる。【０００５】
乳酸菌等の微生物の培地としてホエーを用いた例としては、ホエーに酵母エキスを加えた培地を用いた乳酸菌の培養装置（特許文献1）や、スィートホエーと酵母抽出物、カゼイン加水分解物等を混合した培地を用い、ウレアーゼ陰性菌を増殖させることで動物排泄物からの臭気発生を抑制するペットリター（特許文献2）等があげられるが、これらはいずれも乳酸菌の培養率等についての記載はしておらず、MRS培地に変わりうるホエーを原料とした乳酸菌培地を得るには至っていない。
【特許文献１】特開平6−253816
【特許文献２】特表平10−507358
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明が解決しようとする課題は、安価かつ安全な乳酸菌培地の提供に関する。さらに詳しくは、ホエーを原料として、MRS培地に変わり得る乳酸菌培地を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究した結果、ホエーを乳酸菌培地の原料として有効に利用するために、ホエーが元から有する栄養源に加え、培地の窒素源を強化することで、乳酸菌を効率よく培養できる培地を得ることができることを見出した。また、さらに添加成分を認可されている食品添加物に代替することにより、人体に安全な成分のみからなる培地を得ることができることを見出した。
ここで得られた安価かつ安全な培地により、乳酸菌を大量に培養することが可能となるだけでなく、この培地によって培養される乳酸菌を用い、食品、医薬等の開発や製造が可能となることから、工業的に価値の高い培地が得られる。【０００８】
本発明の培地はホエーが元から有する栄養源に加え、培地の窒素源を強化することを特徴とする。本発明で窒素源を強化したホエーとは、ホエー自体を酵素分解することによりホエーの窒素源を強化することと、窒素源となる物質を添加することとの両方を意味する。
さらに詳しくは窒素源として、酵母エキス及び/又はホエーやカゼインの酵素分解物を含有せしめることにより、培地の窒素源を強化することを特徴とする。また、添加成分を認可されている食品添加物のみとすることで、安価かつ安全な培地を得ることを特徴とする。【０００９】
すなわち、本発明は次の（１）〜（１３）のいずれかの培地およびそれを用いた培養方法に関する。
（１）窒素源を強化したホエーを含有することを特徴とする培地。
（２）窒素源の強化が酵母エキス及び/又は蛋白質酵素分解物の含有によるものである(１)に記載の培地。
（３）窒素源の強化が酵素分解ホエーの含有によるものである(２)に記載の培地。
（４）窒素源の強化がカゼイン酵素分解物の含有によるものである(２)に記載の培地。
（５）酵素分解ホエー又はカゼイン酵素分解物がプロテアーゼで分解されたものである（３） 又は（４）のいずれかに記載の培地。
（６）プロテアーゼがプロテアーゼPである（５）に記載の培地。
（７）さらにグルコース及びオレイン酸化合物を含有する（１）〜（６）のいずれかに記載の培地。
（８）オレイン酸化合物が、Tween(登録商標)80、オレイン酸ナトリウム、ショ糖オレイン酸エステル、グリセリンオレエートである（１）〜（７）のいずれかに記載の培地。
（９）成分が全て認可された食品添加物からなる（１）〜（８）のいずれかに記載の培地。
（１０）（１）〜（９）のいずれかに記載の培地を用いて乳酸菌を培養する方法。
（１１）乳酸菌がL.acidophilus、L.gasseri、L.amylovorus、L.crispatus、L.helveticus、L.rhamnosus、L.casei、L.bulgaricus等の乳酸桿菌である（１０）に記載の培養方法。
（１２）（９）〜（１１）のいずれかの方法で培養された乳酸菌を用いる食品、健康食品、特定保健用食品、栄養機能性食品、医薬の製造方法。
（１３）製造する食品、健康食品、特定保健用食品、栄養機能性食品、医薬がヨーグルト、チーズ、乳酸菌を含有する錠剤である（１２）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の培地は、ホエー及び認可されている食品添加物を原料として用いることにより、安価かつ安全に乳酸菌を大量に培養することを可能とするだけでなく、この培地によって培養される乳酸菌を用い、食品、医薬等の開発や製造を可能とし、工業的かつ経済的に効果が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】酵素分解ホエー培地における供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例1）
【図２】酵素反応時間の違いによる酵素分解ホエー培地における供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例1）
【図３】カゼイン酵素分解物の添加量の違いによるカゼイン酵素分解物添加培地における供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例2）
【図４】種々の供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例2）
【図５】種々のオレイン酸化合物を添加したホエー培地における供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例3）
【図６】種々のオレイン酸化合物を添加したホエー培地における供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例3）
【図７】培地用又は食品用の酵母エキスを添加したホエー培地における供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例3）
【図８】培地用又は食品用の酵母エキスを添加したホエー培地における供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例3）
【図９】培地用又は食品用の酵母エキスを添加したホエー培地における供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例3）
【図１０】酵母エキスの違い及び添加量の違いによるホエー培地の種々の供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例3）
【図１１】各種培地における供試菌の生育性を乾燥菌体重量で示した図である。（試験例4）
【図１２】ジャーファーメンター及びインキュベーターで培養した時の供試菌の生育性を濁度の変化により示した図である。（試験例4）
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明の培地の調製にあたり、ホエーが元から有する栄養源に加え、酵母エキス及び/又は蛋白質酵素分解物により、培地中の窒素源を高めることを特徴とする。蛋白質酵素分解物としては、ホエーを酵素分解して、ホエー由来の蛋白質分解物の含有率を高めた酵素分解ホエーや、カゼインを酵素分解して得られたカゼイン酵素分解物等が挙げられる。
窒素源の強化にあたり、培地に含まれる酵母エキスの濃度は、培養する乳酸菌に有効な量であれば特に限定されないが、0.3％以上であることが好ましく、高い生育促進効果を得るためには、0.6％以上、さらに0.9％以上であることが好ましい。【００１３】
また、本発明の培地を調製するために、ホエー及びカゼインを酵素分解するときには、食品添加物として認可されているプロテアーゼであればいずれも用いることができるが、例えばプロテアーゼPを用いることができる。
また、酵母エキスは食品用に市販されているものであればいずれも用いることができるが、例えば酵母エキス協和C(商標)、酵母エキス協和H(商標)、酵母エキス協和L(商標)、酵母エキス協和W(商標)、酵母エキス武田HR(商標)、酵母エキス武田SL‐W(商標)、酵母エキスJT‐21A(商標)等の酵母エキスを用いることができる。
オレイン酸化合物としてTween(登録商標)80は食品添加物として認可されていないので、認可されている食品添加物である例えばオレイン酸ナトリウム、ショ糖オレイン酸エステル、デカグリセリンモノオレエート及びその他のオレイン酸のグリセリンエステル（グリセリンオレート）等をTween(登録商標)80の代替物として用いることがより好ましい。これらの成分を用いることにより、安価かつ安全な培地を提供することができる。
本発明の培地には、さらに、必要に応じてMgSO4、MnSO4、K2HPO4、(NH4)3C6H5O7、NaC2H3O2等も加えることができる。
【００１４】
本発明の培地の調製にあたり、原料となるホエーから除蛋白質を行う方法としては、加熱によって蛋白質を凝固除去する以外に、限外濾過法によって除去する方法を用いることもできる。これにより清澄な培地を調製することができる。【００１５】
［参考例１］
本発明の乳酸菌培地において比較に用いたMRS培地の組成及び調製方法を参考例として次に示す。【００１６】
MRS培地の調製
26ｇのMRS粉末（M.R.S.BROTH;オキソイド社製）に蒸留水500mlを加え60℃で加温溶解後、1N-NaOHを用いてpHを6.5に調整して滅菌（121℃、15min）した。MRS培地の組成を表１に示した。【００１７】
【表１】
0004780565.tif 000002
【００１８】
本発明の乳酸菌培地及びこの培地を用いた乳酸菌を培養する方法を以下の実施例で示す。
【実施例１】
【００１９】
酵素分解ホエー培地の調製
１）酵素分解ホエー溶液
125gのチーズホエーパウダーに375mlの蒸留水を加え溶解し、0.6gのプロテアーゼP「アマノ3G」（天野エンザイム株式会社）を加え（蛋白質：プロテアーゼP＝25：1）、攪拌しながら37℃で反応させた。酵素反応の時間は、2時間と6時間の2つの条件で行った。反応後、オートクレーブで加熱（110℃、15min）し、酵素の失活及び蛋白質を凝固させた。冷却後、溶液を遠心分離（8000rpm、5℃、15min）し、上清を濾紙（No.131、90mm）を二枚重ねにして吸引濾過をした。
２）酵素分解ホエー培地
酵素分解ホエー溶液に蒸留水を加えて、3.5倍（固形分約7％）に希釈し、1N-NaOHを用いてpHを6.5に調整した。その後培地成分をそれぞれ添加し、オートクレーブで加熱滅菌（115℃、15min）を行った。調製した培地の組成を表2に示した。【００２０】
【表２】
0004780565.tif 000003
【実施例２】
【００２１】
１）除蛋白質ホエー溶液の調製
125ｇのチーズホエーパウダーを375mlの蒸留水に溶解し25％のホエー溶液を調製した。これをオートクレーブで加熱滅菌（110℃、15min）し、冷却・攪拌後、冷却高速遠心機を用いて遠心分離（8000rpm、5℃、15min）を行い、上清を、濾紙を二枚重ねにして吸引濾過し、加熱変性した蛋白質を取り除いた。
2）基礎ホエー培地の調製
除蛋白質ホエー溶液に蒸留水を加えて3.5倍（固形分約7％）に希釈し、1N-NaOH試薬を用いてpHを6.5に調整し、基礎ホエー培地として用いた。【００２２】
３）培地添加成分
a, カゼイン酵素分解物
3ｇのカゼイン（Casein From Bovine Milk Purified
Powder :シグマ社）に100ｍｌの蒸留水を加え分散させ、1N-NaOHを用いてpHを7.0に調整しながら溶解させた。その後、冷却遠心機を用いて遠心分離（8000rpm、5℃、15min）を行い、上清に0.12gのプロテアーゼPを加え、攪拌しながら37℃で2時間反応させた。反応後、カゼイン溶液を加熱して酵素を失活させた（内温90℃、15min保持）。冷却後、その溶液をナス型フラスコに分注し、−38℃で予備凍結した後、凍結乾燥した。
b, グルコース
グルコースはD(+)-Glucose（Dextrose, Anhydrous：和光純薬株式会社）を使用した。
c, 酵母エキス
酵母エキスは、培地用Yeast Extract（バクト社）と、食品用に市販されている酵母エキス協和C(商標)、酵母エキス協和H(商標)、酵母エキス協和L(商標)、酵母エキス協和W(商標)（いずれも協和発酵工業株式会社）、酵母エキス武田HR(商標)、酵母エキス武田SL‐W(商標)（いずれも武田キリン食品株式会社）又は酵母エキスJT‐21A(商標)（JTフーズ株式会社）を使用した。
d, オレイン酸化合物
オレイン酸化合物は、Tween(登録商標)80(ディフコ社)と、認可されている食品添加物であるオレイン酸ナトリウム（関東化学株式会社）、リョートシュガーエステルO-1570（食品添加物・ショ糖オレイン酸エステル 三菱化学フーズ株式会社）又はデカグリセリンモノオレエート（理研ビタミン株式会社）を使用した。
【実施例３】
【００２３】
カゼイン酵素分解物添加培地の調製
参考例2で調製した基礎ホエー培地に培地成分をそれぞれ添加し、オートクレーブで加熱滅菌（115℃、15min）を行った。調製した培地の組成を表3に示した。【００２４】
【表３】
0004780565.tif 000004
【実施例４】
【００２５】
Tween(登録商標)80代替物添加培地の調製
Tween(登録商標)80代替物添加培地として、参考例2で調製した基礎ホエー培地にグルコース、カゼイン酵素分解物、酵母エキスを添加し、オレイン酸化合物としてオレイン酸ナトリウム、リョートシュガーエステルO-1570又はデカグリセリンモノオレエートのいずれかをそれぞれ添加して培地を調製した。比較としてオレイン酸化合物無添加培地及びTween(登録商標)80添加培地を調製した。培地の組成は表4に示した。
表4のアルファベットは、次の成分の略を示す。G=グルコース、C=カゼイン酵素分解物、YEB=培地用Yeast Extract（バクト社）、YE=食品添加用酵母エキス、O=オレイン酸化合物。
T80=Tween(登録商標)80、SO=ショ糖オレイン酸エステル、ON=オレイン酸ナトリウム、DM＝デカグリセリンモノオレエート、（W）=酵母エキス協和W(商標)。
【００２６】
【表４】
0004780565.tif 000005
【実施例５】
【００２７】
培地用Yeast Extract代替物添加培地の調製
培地用Yeast Extract代替物添加培地は基礎ホエー培地にグルコース、カゼイン酵素分解物、Tween(登録商標)80を添加し、酵母エキスとして、酵母エキス協和C(商標)、酵母エキス協和H(商標)、酵母エキス協和L(商標)、酵母エキス協和W(商標)、酵母エキス武田HR(商標)、酵母エキス武田SL-W(商標)又は酵母エキスJT-21A(商標)のいずれかをそれぞれ添加して培地を調製した。比較として培地用Yeast Extract添加培地を調製した。調製した培地の組成は表5に示し、培地番号1、3、5、7、9、11〜13の培地には、さらにMgSO4 0.05%、MnSO4 0.025%、K2HPO4 0.2%、(NH4)3C6H5O7 0.2%、NaC2H3O2 0.5%を添加した。
表5のアルファベットは、次の成分の略を示す。G=グルコース、C=カゼイン酵素分解物、YEB=培地用Yeast Extract（バクト社）、YE=食品添加物用酵母エキス、O=オレイン酸化合物。
(YEB)=培地用Yeast Extract（バクト社）、(C)=酵母エキス協和C(商標)、(H)=酵母エキス協和H(商標)、(L)=酵母エキス協和L(商標)、(W)=酵母エキス協和W(商標)、(HR)=酵母エキス武田HR(商標)、(SL-W)=酵母エキス武田SL-W(商標)、(21A)=酵母エキスJT-21A(商標)、T80=Tween(登録商標)80。
【００２８】
【表５】
0004780565.tif 000006
【実施例６】
【００２９】
基礎ホエー培地に食品添加物用酵母エキスを添加した培地の調製
酵母エキス添加培地は基礎ホエー培地にグルコース、カゼイン酵素分解物、Tween(登録商標)80と、酵母エキスとして、酵母エキス協和W(商標)又は酵母エキス武田HR(商標)をそれぞれ0.3%添加した培地と、カゼイン酵素分解物を添加せず、酵母エキス協和W(商標)又は酵母エキス武田HR(商標)をそれぞれ0.3%、0.6%又は0.9%添加した培地を調製した。調製した培地の組成は表6に示した。
表6のアルファベットは、次の成分の略を示す。G=グルコース、C=カゼイン酵素分解物、YE=食品添加物用酵母エキス、O=オレイン酸化合物。(W)=酵母エキス協和W(商標)、(HR)=酵母エキス武田HR(商標)、T80=Tween(登録商標)80。
【００３０】
【表６】
0004780565.tif 000007
【実施例７】
【００３１】
供試菌の前培養
供試菌にはL.  acidophilus  JCM11047又はL.  gasseri  JCM1131を用いた。凍結保存しておいた供試菌液を5mlのMRS培地に3％量接種した。インキュベーターで培養（37℃、24hr）した。その後その培養液をさらに5mlのMRS培地に3％量接種し、培養を行った。【００３２】
インキュベーターによる培養
実施例1〜６記載の培地に供試菌の前培養後菌液を3％接種し、攪拌後、ねじ口試験管に分注した。37℃のインキュベーターで培養し、培地を培養0、4、8、16、24時間後と経時的にサンプリングし、培地の濁度及びpHを測定することで、培地における供試菌の生育性を検討した。
【実施例８】
【００３３】
ジャーファーメンターによる培養
基礎ホエー培地にグルコース、カゼイン酵素分解物、酵母エキス協和C(商標)、Tween(登録商標)80を添加した培地と、さらにMgSO4、MnSO4の無機塩を添加した培地とを調製し、MRS培地で前培養した供試菌液を3%量接種し、ミニジャーファーメンター（株式会社高杉製作所）を用いて37℃、80rpmで培養した。また、3N-NaOH溶液を滴下することにより、pH5.5に保持するようにした。培地を経時的にサンプリングし、濁度を測定することで、培地における供試菌の生育性を検討した。
【００３４】
本発明の乳酸菌培地を用いた試験の例を試験例として次に示す。【００３５】
［試験例１］
酵素分解ホエー培地における供試菌の生育性の検討
（１）培地
実施例1で調製した表2の酵素分解ホエー培地を用いた。比較としてMRS培地を用いた。
（２）培養
50ｍｌの培地に実施例７に記載の方法で前培養したL.  acidophilus  JCM11047の菌液を3％量接種し、攪拌後、7mlずつねじ口試験管7本に分注した。3本は37℃のインキュベーターで培養し、0、4、8、16、24時間後に濁度及びpHを測定し、酵素分解ホエー培地における供試菌の生育性を検討した。【００３６】
（３）測定
供試菌を接種した3本の試験管の濁度をデジタル比色計（mini photo 10：三紳工業株式会社）を用いて経時的に測定（測定波長：620nm）し、3本の測定値の平均から培養開始前の濁度（ブランク）を差し引いた値で比較を行った。また、pHはpHメーター（F―21型：株式会社堀場製作所）を用いて経時的に測定した。【００３７】
（４）結果
結果を図1及び図2に示した。図1において、酵素分解を2時間行った酵素分解ホエー培地にさらにカゼイン酵素分解物を添加した培地と添加しなかった培地では、培養後24時間の濁度には差がみられず、酵素分解を行ったホエーのみでも低分子化した窒素化合物が充分存在することが示された。また、図2において、酵素分解を2時間行った酵素分解ホエー培地と6時間行った酵素分解ホエー培地の比較では、培養後24時間の濁度には差がみられなかった。【００３８】
［試験例２］
カゼイン酵素分解物添加培地における供試菌の生育性の検討
（１）カゼイン酵素分解物を添加した基礎ホエー培地
実施例３で調製した表3のカゼイン酵素分解物添加培地を用いた。【００３９】
（２）培養及び濁度、pHの測定
前培養したL.acidophilus  JCM11047の菌液を3%量接種して、試験例1と同様の方法で培養した。濁度、pHの測定は試験例1と同様の方法で行った。【００４０】
（３）結果
結果を図3に示した。図3において、カゼイン酵素分解物を基礎ホエー培地中に添加し培養を行ったものは添加しなかったものに比べ高い濁度を示し、カゼイン酵素分解物を添加することで、供試菌の生育が促進されることが確認された。【００４１】
種々の供試菌の生育性の検討
供試菌として、L.acidophilus  JCM11047、L.acidophilus  JCM1132T、L.gasseri  JCM1131T、L.gasseri  JCM11657、L.amylovorus  JCM5811、L.crispatus  JCM8779、L.helveticus  JCM1120T、L.rhamnosus  JCM1136、L.casei  JCM1134T又はL.bulgaricus  B5bを用い、カゼイン酵素分解物及び酵母エキスを添加した基礎ホエー培地における生育性を調べた。菌はそれぞれMRS培地（M.R.S.BROTH;オキソイド社製）で実施例７と同様の方法で前培養を行った。【００４２】
（１）培地の調製
培地は基礎ホエー培地に、グルコース1.0%、カゼイン酵素分解物0.3%、Tween(登録商標)80 0.1%、培地用Yeast Extractの代替物として酵母エキス協和W(商標) 0.3%を添加したものであり、さらにMgSO4 0.05%、MnSO4 0.025%、K2HPO4 0.2%、(NH4)3C6H5O7 0.2%、NaC2H3O2 0.5%を添加して調製した。比較として参考例１のMRS培地を用いた。
（２）培養及び濁度の測定
菌ごとに前培養した菌液を3%量接種して、試験例１と同様の方法で37℃、16時間培養を行い、培養終了後に濁度を測定し、培地における各供試菌の生育性を検討した。
【００４３】
（３）結果
結果を図4に示した。図4において、いずれの菌も、MRS培地で培養した場合と同等又はそれ以上の濁度を示した。特に、L.bulgaricus  B5bはMRS培地ではほとんど濁度が変化しないが、本発明の培地では高い濁度を示した。従って、培地は、種々の乳酸菌の培養において充分な生育促進効果を有することが示された。【００４４】
［試験例３］
食品添加物を添加した培地における供試菌の生育性の検討
（１）Tween(登録商標)80の代替による供試菌の生育性の検討
１）培地
実施例４で調製した表4のTween(登録商標)80代替物添加培地を用いた。比較として参考例１のMRS培地を用いた。
【００４５】
２）培養及び濁度、pHの測定
MRS培地及び表4の培地番号1及び3〜5の培地に前培養したL. acidophilus JCM11047の菌液を3%量接種して、試験例1と同様の方法で培養した。濁度、pHの測定を試験例1と同様の方法で測定した。Tween(登録商標)80の代替物としてオレイン酸ナトリウムを添加した培地は濁度が高いため、蒸留水で3倍に希釈してから測定し、その濁度を3倍した値を結果として用いた。
また、表4の培地番号2、6、7の培地を用いて、培養後16、24時間後に濁度及びpHを測定し、培地における供試菌の生育性を確認した。
【００４６】
３）結果
結果を 図5及び 図6に示した。 図5において、Tween(登録商標)80の代替物としてオレイン酸ナトリウムを添加した培地はTween(登録商標)80を添加した培地よりも高い濁度を示した。また、培養後16時間、24時間目ではMRS培地よりも高い濁度を示した。一方、ショ糖オレイン酸エステルを添加した培地は、他のオレイン酸化合物を添加した培地に比べ、低い濁度を示した。
また図6において、0.1%又は0.2%のデカグリセリンモノオレエートを添加した培地はTween(登録商標)80を添加した培地と同等程度の濁度を示した。従って、Tween(登録商標)80の代替物として、オレイン酸ナトリウム及びデカグリセリンモノオレエートを用いた培地は、供試菌に対して充分な生育促進効果を有することが示された。
【００４７】
（２）食品添加物用酵母エキスを培地用酵母エキスの代替とする培地における供試菌の生育性の検討
１）培地
実施例５で調製した表5の培地用Yeast  Extract代替物添加培地を用いた。コントロールとして、MRS培地を用いた。【００４８】
２）培養及び濁度、pHの測定
MRS培地及び表5の培地番号2、4、6、8及び10の調製した培地にL.  acidophilus  JCM11047の前培養後菌液を3%量接種して、試験例１と同様の方法で培養した。濁度は試験例1と同様の方法で測定した。
また、その他の酵母エキス添加培地は表5の培地番号1、3、5、7、9及び11〜13の培地を用いた。この培地において、L.  acidophilus  JCM11047又はL.  gasseri  JCM1131の前培養後菌液を3％量接種して、試験例１と同様の方法で培養した。濁度を試験例1と同様の方法で測定した。これらの培地の濁度より、各培地における供試菌の生育性を確認した。【００４９】
3）結果
結果を図7〜 図9に示した図7において、表5の培地番号2、4、6、8及び10の培地として酵母エキス協和C(商標)、酵母エキス協和H(商標)、酵母エキス協和L(商標)、酵母エキス協和W(商標)のいずれかをそれぞれ添加した培地は培地用Yeast Extractを添加した培地よりもいずれも高い濁度を示し、各培地におけるL. acidophilus JCM11047の生育が促進されることが確認された。
また、図8において、表5の培地番号1、3、5、7、9及び11〜13の培地として、酵母エキス協和C(商標)、酵母エキス協和H(商標)、酵母エキス協和L(商標)、酵母エキス協和W(商標)、酵母エキス武田HR(商標)、酵母エキス武田SL-W(商標)又は酵母エキスJT-21A(商標)のいずれかをそれぞれ添加した培地は、培地用Yeast Extractを添加した培地よりも高い濁度を示し、培地におけるL. acidophilus JCM11047の良好な生育が確認された。
また、図9において、 図8と同様に酵母エキス協和C(商標)、酵母エキス協和L(商標)、酵母エキス協和W(商標)、酵母エキス武田HR(商標)、酵母エキス武田SL-W(商標)又は酵母エキスJT-21A(商標)のいずれかをそれぞれ添加した培地は、培地用Yeast Extractを添加した培地と比べて同等又はそれ以上の濁度を示し、培地におけるL. gasseri JCM1131の良好な生育が確認された。
従って、培地用Yeast Extractの代替物として、酵母エキス協和C(商標)、酵母エキス協和H(商標)、酵母エキス協和L(商標)、酵母エキス協和W(商標)、酵母エキス武田HR(商標)、酵母エキス武田SL-W(商標)及び酵母エキスJT-21A(商標)を用いた培地は、供試菌に対する充分な生育促進効果を有することが示された。
【００５０】
（３）基礎ホエー培地に食品添加物用酵母エキスのみを添加した培地における供試菌の生育性の検討
１）基礎ホエー培地に食品添加物用酵母エキスのみを添加した培地
実施例６で調製した表6の食品添加物用酵母エキス添加培地を用いた。比較として参考例と同様の方法で調製したMRS培地を用いた。【００５１】
２）培養及び濁度の測定
酵母エキス添加培地として、表6の培地番号1〜8の培地を用いてL.  acidophilus  JCM11047の前培養後の菌液を3％量接種して、試験例１と同様の方法で培養した。濁度の測定も試験例1と同様の方法で行った。これらの培地の濁度より、各培地における供試菌の生育性を確認した。【００５２】
３）結果
結果を図10に示した。図10において、表6の培地番号1〜8の培地として、酵母エキス協和W(商標)、酵母エキス武田HR(商標)又はのいずれかをそれぞれ添加した培地は、L. acidophilus JCM11047及びL. gasseri JCM1131のいずれにおいても、高い濁度が示された。
従って酵母エキスを0.6%又は0.9％添加した培地は0.3％のカゼイン酵素分解物を添加した培地より高い濁度を示し、供試菌に対する充分な生育促進効果を有することが示された。
【００５３】
［試験例４］
乾燥菌体重量の比較による供試菌の生育性の検討
（１）培地の調製
基礎ホエー培地にグルコース、カゼイン酵素分解物、酵母エキス協和C(商標)
、Tween(登録商標)80を添加したホエー培地Aと、さらにMgSO4、MnSO4の無機塩を添加したホエー培地Bを調製した。調製した培地の組成は表7に示した。比較として参考例と同様の方法で調製したMRS培地を用いた。
【００５４】
【表７】
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【００５５】
（２）培養及び濁度、pHの測定
参考例に記載の方法で前培養した供試菌をさらにMRS培地で16時間培養した菌液を用いた。MRS培地及び調製した培地にL.  acidophilus  JCM11047の菌液を3%量接種して、ミニジャーファーメンターを用いて37℃、80rpmで培養した。また、3N-NaOH溶液を滴下することにより、pH5.5に保持するようにした。培地を経時的にサンプリングし、濁度を試験例1と同様の方法で測定し、また培養終了後の菌体の重量を測定することで供試菌の生育性を検討した。【００５６】
（３）菌体の回収及び乾燥
培養24時間目で培養を終了し、培地を冷却高速遠心機を用いて遠心分離（3000rpm、5℃、15min）し、沈殿した菌体を回収し、滅菌蒸留水を加え、遠心分離（3000rpm、5℃、15min）で2回洗浄を行った。洗浄後の菌体分散溶液をナス型フラスコに分注し、‐38℃で予備凍結した後、凍結乾燥をして、菌体の重量を測定した。【００５７】
（４）結果
培養後の菌体の重量を図11に示した。図11において、MRS培地で培養した菌体の重量と比較して、ホエー培地Aでは2倍以上、ホエー培地Bでは3倍以上の乾燥菌体重量を示した。
また、培養後0、4、8、16、24時間目の濁度と16、24時間目のpHを表8に示した。培養後24時間目の濁度は、図12に示したように、試験管を用いてインキュベーターで培養した場合と比較して高い濁度を示し、ジャーファーメンターによって、pHを生育に適した状態に保つことで、ホエーを用いた培地における供試菌の生育の効果がさらに高められることが示された。【００５８】
【表８】
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【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明で得られた培地は、廃棄されていたホエーを有効に利用し、認可されている食品添加物を添加成分とすることで、安価かつ安全に乳酸菌を大量に培養することができる。また、この培地によって培養された乳酸菌を用い、食品、医薬等の開発や製造に用いることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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