(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
香粧用、医薬用または獣医用で、かつ皮膚または粘膜の病原菌フローラを安定化および／または調整する治療または予防の目的で、ヒトまたは動物に投与するための組成物の製造のためのラクトバチルス・ジョンソニイＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５またはミクロコッカス・バリアンスＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６菌株から選択される細菌剤の使用であって、
細菌剤は皮膚または粘膜の病原菌について皮膚細胞に対する付着性およびその抗付着性で選択した細菌抽出物または細菌であり、
病原菌はスタフィロコッカスまたはストレプトコッカスである、使用。
【請求項２】
細菌は生存可能形、半活性形、または不活性形である、請求項１記載の使用。
【請求項３】
細菌は９０℃で２時間熱処理により不活性化させる、請求項２記載の使用。
【請求項４】
凍結乾燥形の細菌剤は１０８〜１０１１ｃｆｕ／ｇを含有する、請求項１から３のいずれか１項記載の使用。
【請求項５】
香粧用、医薬用または獣医用で、かつ皮膚または粘膜の病原菌フローラを安定化および／または調整する治療または予防の目的で、ヒトまたは動物に投与するための局所用組成物であって、
少なくとも１つのミクロコッカス・バリアンスＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６菌株である細菌剤を含有し、
細菌剤は皮膚細胞に対する付着性および皮膚または粘膜の病原菌に対するその抗付着性で選択した細菌抽出物または細菌であり、
病原菌はスタフィロコッカスまたはストレプトコッカスである、組成物。
【請求項６】
医薬用または獣医用で、かつ皮膚または粘膜の病原菌フローラを安定化および／または調整する治療または予防の目的で、ヒトまたは動物に投与するための局所用組成物であって、
少なくとも１つのラクトバチルス・ジョンソニイＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５菌株である細菌剤を含有し、
細菌剤は皮膚細胞に対する付着性および皮膚または粘膜の病原菌に対するその抗付着性で選択した細菌抽出物または細菌であり、
病原菌はスタフィロコッカスまたはストレプトコッカスである、組成物。
【請求項７】
細菌は生存可能形、半活性形、不活性形である、請求項５または６記載の組成物。
【請求項８】
細菌は９０℃で２時間熱処理により不活性化させる、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
組成物全重量に対し１０重量％までの細菌剤を含有する、請求項５から８のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
組成物全重量に対し０．０５〜５重量％の細菌剤を含有する、請求項５から９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
・重感染アトピー性皮膚炎、湿疹を伴なう膿痂疹、潰瘍、傷、火傷、重感染炎症性ざ瘡を含む感染性合併症、
・膿痂疹、表皮毛のう炎を含む皮膚炎、
・抗生物質による治療に関連するもの、
・ホルモン不均衡またはふけに基因するもの、
を含む皮膚疾病の治療または予防用に意図された請求項５から１０のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１２】
過敏な皮膚または脂じみた皮膚に適用するための、請求項５から１１のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１３】
動物のスタフィロコッカスおよびストレプトコッカス感染に関連する機能障害の治療または予防用に意図された請求項５から１２のいずれか１項記載の獣医用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は香粧用、医薬用または獣医学用で、哺乳動物の皮膚生態系を安定化しおよび／または調整するための組成物の製造に対し、皮膚病原菌の抗粘着性用に選択された細菌剤の使用、およびこのような菌剤を含有する組成物に関する。
【０００２】
（技術の状態）
スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ピオゲネスまたはプロピオニバクテリウム・アクネスのような病原菌、または或る種の酵母の増殖により皮膚系の不均衡、または湿疹、カンジダ症、皮膚炎などの皮膚または粘膜の一層重大な疾病を起こしうる。
【０００３】
これらの病原菌の治療方法は多く知られている。もっとも通例的には抗生物質または化学抗菌剤が使用される。これらは、例えばアルデヒドや誘導体をベースとする組成物である。
【０００４】
ＦＲ２７４００３９号明細書はスタフィロコッカス・アウレウスのような病原菌株がケラチノサイトおよび角膜細胞に付着するのを阻害するアルデヒドおよび２官能価化合物、好ましくはグルタルアルデヒドから選択される物質の使用を記載する。
【０００５】
ヘキサクロロフェンおよびその誘導体は抗菌物質として既知であり、特にプロピオニバクテリウム・アクネスに対し使用される。
これらの処置は一般に高価であり、かつ健康および環境の双方に有害である。
【０００６】
別法では、微生物の或る菌株の抗真菌性、殺菌性または制菌性を使用する無毒性処置も知られている。
すなわち、ＰＣＴ出願ＷＯ９７／３６６６０３号明細書はラクトバチルス・カゼイ菌株の抗真菌性について開示する。
【０００７】
バチルスのような他の細菌剤も皮膚または粘膜に使用することができる。具体的には、ＷＯ９８／４７３７４号明細書では、バチルス・コアギュランス、バチルス・サブチリス、バチルス・ラテロスポラスおよびバチルス・ラエボラクチカスの菌株は皮膚または粘膜の細菌、ウイルスまたは真菌感染予防用組成物に使用される。
【０００８】
本発明は皮膚生態系を管理し、かつ調整しうる新規細菌剤を見出すことを目的とする。
【０００９】
（発明の要約）
このため、本発明は香粧用、医薬用または獣医用で、皮膚系の病原菌により誘発される疾病を予防し、または治療する目的でヒトまたは動物に投与される組成物の製造に対する細菌剤の使用に関し、この細菌剤は皮膚細胞への付着性および皮膚病原菌の付着調整性、特にその付着阻害により選択された乳酸菌の抽出物、または乳酸菌である。
【００１０】
細菌剤はラクトバチルス、ミクロコッカスまたはビフィドバクテリウムの菌株から、好ましくは例えばラクトバチルス・ジヨンソニイＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５、ミクロコッカス・バリアンスＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６、ミクロコッカス・バリアンスＣＮＣＭ−Ｉ−１５８７またはビフィドバクテリウム・ラクチスＡＴＣＣ２７５３６菌株から選択することができる。
当該菌株は生存可能形、不活性形または半活性形で使用できる。
【００１１】
細菌剤は例えば凍結乾燥粉末形で使用でき、これは約１０×１０8〜１０×１０11ｃｆｕ／ｇを含むことができる。
【００１２】
本発明は香粧用、医薬用または獣医用で、かつ皮膚系の病原性フローラを安定化し、および／または調整しうる少なくとも１つの細菌剤を含有する組成物にも関し、この細菌剤は皮膚細胞への付着性および皮膚系の病原菌に関しその抗付着性に対し選択された細菌抽出物、または細菌である。
【００１３】
この組成物は眼にも、または鼻の適用に使用することもできる。
この組成物は特に例えば、クリーム、ローション、アレルギー性の低いクレンジングバー、シャンプーまたは粉末形とすることができる。
【００１４】
（発明の詳細な記載）
「皮膚系」の名称下でグループ化されたものはすべての皮膚細胞（すなわち、ケラチノサイト）であるが、また角質細胞でもある。
【００１５】
本発明は皮膚細胞に対するその付着性、および皮膚系の病原菌フローラの安定化および調整性に対し、特に例えばスタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・パイオゲネスまたはプロピオニバクテリウム・アクネスのような病原菌の付着を阻害することにより、選択された細菌剤を供する。
このため、多数の細菌菌株がヒトケラチノサイト（例１参照）への付着性について試験された。
【００１６】
こうして試験した各種細菌菌株からラクトバチルス、ミクロコッカスおよびビフィドバクテリウムの菌株、特にラクトバチルス・ジョンソニイの１つの菌株（ＮＣＣ５３３）、ミクロコッカス・バリアンスの２つの菌株（ＮＣＣ１４８２、ＮＣＣ１５２０）およびビフィドバクテリウム・ラクチス（ＡＴＣＣ２７５３６）の１菌株を選択できる。
【００１７】
ラクトバチルス・ジョンソニイ菌株（ＮＣＣ５３３）およびミクロコッカス・バリアンス菌株（ＮＣＣ１４８２およびＮＣＣ１５２０）はブダペスト条約により（ＣＮＣＭ）［国立微生物カルチャー寄託機関］、パストゥール研究所、７５７２４パリＣｅｄｅｘ１５、ドクター通り２８に、１９９２年６月３０日にラクトバチルス・ジョンソニイはＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５として、１９９５年６月７日にミクロコッカス・バリアンスＮＣＣ１４８２およびＮＣＣ１５２０はＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６およびＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７としてそれぞれ寄託された。
【００１８】
ビフィドバクテリウム・ラクチス菌株（ＡＴＣＣ２７５３６）はハンセン（Ｃｈｒ．Ｈａｎｓｅｎ  Ａ／Ｓ，１０〜１２Ｂｏｅｇｅ  Ａｌｌｅ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ４０７，ＤＫ−２９７０ホースホルム、デンマーク）から入手できる。
【００１９】
菌株の形態学的および一般的性質について以下に詳述する。
ラクトバチルス・ジョンソニイＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５
形態学的性質
・非運動性、グラム陽性、胞子を形成しない。
・かなり短かい、ずんぐりした分離桿菌。
代謝的性質
・微量好気性菌、同種発酵代謝によりＬ（＋）およびＤ（−）乳酸を産生する。・他の特徴：カタラーゼ（−）、ＣＯ2産生（−）、アルギニン加水分解（−）。
糖の発酵
アミグダリン（＋）、アラビノース（−）、セロビオース（＋）、エスクリン（＋）、フラクトース（＋）、ガラクトース（−）、グルコース（＋）、ラクトース（＋）、マルトース（＋／−）、マンニトール（−）、マンノース（＋）、メリビオース（−）、ラフィノース（＋）、リボース（−）、サリシン（＋）、シュクロース（＋）、トレハロース（＋）。
ミクロコッカス・バリアンスＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６（ＮＣＣ１４８２）および ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７（ＮＣＣ１５２０）
形態学的性質
・グラム陽性菌、恒常的に非運動性。
・球形、不規則配列の四面体形。
代謝的性質
・好気性菌、カタラーゼ（＋）。
・他の特徴：ＢＨＩ培地で黄色、この菌株の最適生育温度は２５〜３７℃。
糖の発酵
フラクトース（＋）、グルコース（＋）。
【００２０】
本発明による細菌は例えばスタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・パイオゲネスまたはプロピオニバクテリウム・アクネスまたは酵母のような皮膚系の病原菌に関連する疾病を予防または治療する組成物の製造に使用される。
【００２１】
これらの皮膚疾病は特に過敏性皮膚炎（維持治療として軽快相で）、ざ瘡、カンジダ症、脂漏性皮膚炎、でん風、膿痂疹または湿疹二次感染である。
【００２２】
皮膚系の疾病は抗生物質または抗真菌剤による治療、糖尿病（カンジダ症）、粘膜の病理学（腟カンジダ症）、慢性湿疹（恒常性不均衡）、感受性皮膚（未熟乳児、小児）または脂ぎった皮膚（細菌の生育を促進できるホルモン不均衡に関連する）またはふけに関連する。
【００２３】
本発明による細菌は生存可能形または半活性形、または非活性形で使用できる。「半活性形細菌」とは低生理活性を有する細菌を意味する。この活性は例えばより長い指数生育相または世代時間、遅れる代謝または環境の修正に対する不完全な生理応答により測定できる。極端な場合、細菌がもはや環境の変化に耐えることができないので、細菌数は減少する。
細菌の培養上澄液も使用できる。
【００２４】
本発明の第１態様によれば、細菌剤は細菌抽出物、または細菌であり、この細菌は生存可能な活性形である。その場合細菌剤は好ましくは、例えばＥＰ８１８５２９号明細書記載の方法により得た凍結乾燥粉末形である。粉末は１０×１０8〜１０×１０11ｃｆｕ／ｇを含有できる。
【００２５】
別の態様によれば、細菌剤は細菌抽出物、または半活性形の細菌である。菌株の部分不活性化はいくつかの方法で行なうことができ、特に、
・  液体窒素で凍結／３７℃で解凍のサイクルから成る凍結乾燥。その場合１ｌｏｇの減少で得ることができる、
・  紫外線の作用（２５４ｎｍで１５〜６０分、距離２０ｃｍ）、２〜３ｌｏｇの減少、
・  熱の作用（７０℃３時間）、例えば約３〜４ｌｏｇの減少、
により行なうことができる。
【００２６】
細菌剤は少なくとも１０×１０6ｃｆｕ／ｇを含有する粉末形で、好ましくは１０％までの細菌抽出物を含有できる乾燥シャンプーまたは他の粉末組成物のような乾燥組成物で使用できる。
【００２７】
最後に、細菌剤は細菌抽出物、または不活性形の細菌であることもできる。細菌は好ましくは約９０℃で約２時間熱処理により不活性化される。細菌剤は１０×１０8〜１０×１０12ｃｆｕ／ｇを含有する凍結乾燥粉末形である。細菌剤は液体組成物では５％まで、好ましくは０．０５〜３％で、および粉末組成物では１０％で使用できる。
【００２８】
本発明は香粧用、医薬用または獣医用で、かつ上記性質を有する細菌剤を含有する組成物に関する。
【００２９】
このような組成物を製造するために、生存可能性、半活性または不活性形の少なくとも１つの細菌菌株を医薬的または香粧的に許容しうる支持体に所望用途の関数として変化する量で添加する。細菌剤は組成物全重量に対し約５％まで、および粉末形の組成物に対し１０％まで、好ましくは０．５〜２％を含むことができる。
【００３０】
本発明組成物は局所的にまたは目を介して投与できる。
局所的経路では、本発明化合物を主剤とする医薬組成物は好ましくは皮膚および粘膜の治療をするためのものであり、サルブ、クリーム、乳液、軟膏、粉末、含浸綿棒、溶液、ゲル、スプレー、ローションまたはサスペンジョン形である。これらはミクロ球またはナノ球、または脂質またはポリマー小胞、またはポリマー貼剤およびハイドロゲル形でよく、これらは調整放出できる。局所的経路で投与するこれらの組成物は臨床的には無水形または水性形でよい。
目を介する場合、主として洗眠剤である。
【００３１】
好ましい態様では、本発明は香粧的に許容しうる支持体に上記の少なくとも１つの細菌剤を含有する香粧組成物に関する。香粧組成物は組成物全重量に対し少なくとも０．００１重量％、好ましくは０．０５〜３重量％の割合で細菌剤を含有できる。
【００３２】
この香粧組成物は特にボディおよび毛髪衛生のためのものである。特に、クリーム、乳液、ローション、ゲル、ミクロ球またはナノ球、または脂質またはポリマー小胞、石鹸またはシャンプー形であることができる。
【００３３】
本発明組成物では、生存可能性または不活性細菌剤はレチノイドまたはコルチコステロイドと併用でき、または抗−遊離基剤と、α−ヒドロキシまたはα−ケト酸またはその誘導体と、またはイオンチャンネル遮断剤と組合せることができる。
【００３４】
本発明による医薬および香粧組成物は不活性添加剤または薬学的に活性または香粧的に活性な添加剤も、またはこれらの添加剤、特に湿潤剤、ハイドロキノン、アゼライン酸、カフェイン酸または麹酸のような脱色剤、緩和剤、グリセロール、ＰＥＧ−４００、チアモルフォリノンおよびその誘導体、または尿素のような吸湿剤、Ｓ−カルボキシメチルシステイン、Ｓ−ベンジルシステアミン、その塩およびその誘導体、またはベンゾイルパーオキシドのような抗皮脂漏または抗ざ瘡剤、エリスロマイシンおよびそのエステル、ネオマイシン、クリンダマイシンおよびそのエステル、テトラサイクリンのような抗生物質、ケトコナゾールまたは４，５−ポリメチレン−３−イソチアゾリノンのような抗真菌剤、ミノキシジル（２，４−ジアミノ−６−ピペリジノピリミジン３−オキシド）およびその誘導体、ジアゾキシド（７−クロロ−３−メチル−１，２，４−ベンゾチアジアジン１，１−ジオキシド）およびフェニトイン（５，４−ジフェニルイミダゾリジン−２，４−ジオン）のような毛髪の再生長促進剤、非ステロイド抗炎症剤、カロチノイドおよび特にβ−カロテン；アンスラリンおよびその誘導体のような抗乾癬剤、最後にエイコサ−５，８，１１，１４−テトライノン酸およびエイコサ−５，８，１１−トリイノン酸、そのエステルおよびアミドの組合せを含有することもできる。
【００３５】
本発明組成物はパラ−ヒドロキシ安息香酸エステルのような保存料、安定剤、水分調整剤、ｐＨ調整剤、浸透圧修正剤、乳化剤、紫外線−Ａおよび紫外線−Ｂ遮断剤、およびα−トコフェロール、ブチルヒドロキシアニソールまたはブチルヒドロキシトルエンのような抗酸化剤を含有することもできる。
【００３６】
最後に、本発明は獣医用または動物に対する香粧用で、上記の少なくとも１つの細菌剤を含有する組成物にも関する。このような組成物は例えば、乾燥または液体シャンプー、粉末、泡沫またはローションであることができる。１０％までの細菌剤を含有できる。
【００３７】
本発明組成物は皮膚系の疾病、特に、
・  重感染アトピー性皮膚炎、湿疹に基づく膿痂疹、潰瘍、傷、火傷、重感染炎症ざ瘡のような感染合併症、
・  膿痂疹、表皮毛のう炎のような皮膚炎、
・  脂漏性皮膚炎、でん風、
・  皮膚糸状菌症（頭部白せん症、躯部白せん症、みずむし、ヘブラの湿疹、ヘルペスカルシネイタス、
・  カンジダ症（腟、指間の、危険な売春または糖尿病に関連する）、
・  抗生物質または抗真菌剤による治療に関連する疾病、
・  ホルモンの不均衡により生ずる疾病（脂じみた皮膚）、
・  敏感な皮膚（未熟乳児、子供）
などを示すことができる健康な、敏感な、および／または疾病の皮膚および／または粘膜の治療または予防処置に対するものである。
【００３８】
獣医用の組成物は特にスタフィロコッカス感染（スタフィロコッカス・アウレウス、Ｓ．インターメディアンスによる）、ストレプトコッカス感染（Ｓ．パイロゲンスによる）および真菌感染（Ｃ．アルビカンスによるカンジダ症およびＰ．カニスによるピチロスポロセス）に基づく機能不良を治療し、または予防するためのものである。
【００３９】
本発明の他の特徴は態様の次の記載中に明らかであり、これらは本発明を説明する目的で供され、限定するためのものではない。
【００４０】
例
例１  細菌剤の選択
本発明において、１２の異る細菌菌株の皮膚細胞、特に培養中ＨａＣａｔヒトゲラチノサイトへの付着性を研究する。これらの菌株はラクトバチルス、ビフィドバクテリウム、ミクロコッカス、スタフィロコッカス、ストレプトコッカスおよびプロピオニバクテリウム属に属する。
細菌培養物（１ｍｌ）を１０ｍｌの培地（表１参照）に一晩培養する。付着試験では、細菌は５．０×１０8〜１０9ｃｆｕ／ｍｌが得られるまで予備培養する。ｃｆｕは各菌株の光学的濃度（１０8ｃｆｕ／ｍｌのＯＤ、表１参照）を測定して標準化する。
次に、細菌菌株の付着性を試験する。
0004828759.tif 000002
ＮＣＣ５３３，ＮＣＣ９０，ＮＣＣ５３６およびＮＣＣ５８５は嫌気条件下で培養した（ガス充填Ｈ2＋ＣＯ2）。
ヒトケラチノサイトライン：
細菌の付着性は３ケラチノサイト系で研究した。
・  ＳＶ４０Ｔ−Ａｇ不死化細胞：ＥＰ７８０４６９号明細書に記載のＤＫ２−ＮＲおよびＦＫ２−ＮＲ細胞、および
・  ＨＰＶ（ヒト乳頭腫ウイルス）Ｅ６／Ｅ７およびＳＶ４０Ｔ−Ａｇ不死化細胞系：ＤＫ７−ＮＲ細胞系、ＷＯ９９／０２３４７号出願明細書に記載。
細胞系の培養培地：
ＤＫ７−ＮＲ，ＦＫ２−ＮＲ：ＮＲ−２（バイオフルイズ社、ロックヴィル、ＭＤ２０８５０）（ＥＰ７８０４６９号明細書）。
ＤＫ２−ＮＲ：ＮＲ−Ｍ（バイオフルイズ社、ロックヴィル、ＭＤ２０８５０）。
ケラチノサイト系は５×１０5ケラチノサイト／ｃｍ2の割合で培養し、被覆した６−穴クラスターに接種した（ベクトンディキンソン社、リンカーンパーク、ＮＪ）。被覆溶液は１０μｇ／ｍｌのヒトフィブロネクチン（ベクトンディキンソン）、３１μｇの牛コラーゲンＩ（ビトロゲン、コラーゲン社、フレモント、ＣＡ）および０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（バイオフルイーズ社、ロックヴィル、ＭＤ２０８５０）を補充した基本培地から成る。６〜８日後、細胞培養物は単層（集密）を形成する。次に、培地のＣａ2+濃度は細胞の分化を誘起するために１．５ｍＭにする。細胞は抗生物質を含まない高Ｃａ濃度培地で４日間培養する。付着試験に対しては、細胞培養物は緩衝液（ＨＢＳＳ，Ｃａ2+：１．０ｍＭ）で３回洗浄する。
放射線標識
細菌菌株は培養培地に１００μＣｉ／１０ｍｌの２−3Ｈ−アデニン（アメルシャム、ＴＲＫ３１１）を添加することにより一夜標識する。細菌の試料画分は3Ｈ−アデニンを含まない培地で培養する。無標識（冷）上澄は付着試験のｃｆｕ／ｍｌを調整するため無視する。
付着試験
細菌サスペンジョンは４０００ｒｐｍで１０分遠心分離する。光学的濃度（ＯＤ）の調整前に、ペレットを２回ＨＢＳＳで洗浄する。細菌の最終濃度を１０6，１０7，１０8および１０9ｃｆｕ／ｍｌに調整するために、各菌株のＯＤを測定する。付着試験用培地はケラチノサイト培養培地と細菌培地の無標識上澄の１：１混合物である。
ケラチノサイトを含まない基質で細菌の付着性を分析するために、細菌サスペンジョンはプラスチック皿および細胞で被覆したプラスチック皿で培養する。
分析
ＨＢＳＳ（Ｃａ2+，１．０ｍＭ）で３回カルチャーを洗浄後、ケラチノサイトと関連する細菌は室温で３０分ＩＮ  ＮａＯＨ溶液に溶解する。溶液は１ｍｌの水酸化ベンゼソニウム（シグマ、セントルイス、ＵＳＡ）を含むシンチレーションびんに移す。６０℃で１時間後、標識細菌の3Ｈ活性は液体シンチレーションカウンターにより測定する（ｄｐｍ）。
付着指数（ＡＩ）は細菌サスペンジョンの全3Ｈ活性の％（ｄｐｍ／ｍｌ）として、3Ｈ活性（ｄｐｍ／孔）として計算する。
結果
付着指数（ＡＩ）
１３の異る細菌菌株の付着指数は放射能標識微生物の3Ｈ−アデニン活性を測定して計算する。結果は表２に示す。
0004828759.tif 000003
結果は最高付着指数が次の菌株：ビフィドバクテリウム・ラクチスＡＴＣＣ２７５３６、ラクトバチルス・ジョンソニイＮＣＣ５３３（ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５）菌株およびミクロコッカス・バリアンスＮＣＣ１４８２（ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６）、ＮＣＣ１５２０（ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７）およびＮＣＣ１５８３菌株で得られることを示す。
【００４１】
例２  ミクロコッカス・バリアンスＮＣＣ１４８２またはラクトバチルス・ジョンソニイＮＣＣ５３３によるスタフィロコッカス・アウレウスおよびストレプトコッカス・パイオゲネスの付着阻害の試験管内試験
微生物および培養方法
病源菌スタフィロコッカス・アウレウスおよびストレプトコッカス・パイオゲネスは指数生育相の培養物から継代培養することによりブロスで培養する（表３）。ＯＤ／細菌濃度の相応関係は連続稀釈および寒天培地上の計数に基づいて各試験微生物に対し確定した。
0004828759.tif 000004
培養培地：
ＴＣＳ（ＡＥＳ、コンブルグ、番号ＡＥＢ１４１５０２）
ＢＨＩ（ユニパス社、ダルディリ、番号ＣＭ２２５）。
形質転換したヒトケラチノサイト
ＨａＣａＴラインの不死化ヒトケラチノサイトを使用する（ボウカンプ、ピーら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０６，７６１〜７７１，１９８８）。ＨａＣａＴ細胞は１０％の牛胎児血清を補充したＤＭＥＭ培地で３７℃で５％ＣＯ2下で培養する。
６−穴クラスター（ベクトンディキンソン）に１０4細胞／ｃｍ2の割合で接種する。４〜５日後、細胞は集密化する。付着試験は集密後４〜５日で行なう。単層はこれらの試験前ＰＢＳにより３回洗浄する。
放射線標識
細菌は１００μＣｉ／１０ｍｌブロスの割合で２−3Ｈ−アデニン（アメルシャム、ＴＲＫ３１１）により標識する。サスペンジョンは３回洗浄し、次にＰＢＳに再懸濁する。細胞濃度は同じこの緩衝液で調整する。
培養ケラチノサイトに対する付着試験
１ｍｌの放射線標識細菌サスペンジョンは１時間３５℃で培養する。単層はＰＢＳ緩衝液で３回洗浄し、室温で３０分１Ｎ  ＮａＯＨを添加して溶解する。溶解物はシンチレーションびんに移し、６０℃で１時間１ｍｌの水酸化ハイアミンを加えて培養する（カルロエルバ、番号４６４９５１）。3Ｈ活性は液体シンチレーションカウンターで計数する。各試験は３重反復試験で行なう。プラスチック支持体を有する対照も行なう。
付着した放射能と導入した放射能間の比を１００倍して、付着率を規定する。
付着阻害試験
洗浄およびＰＢＳに再懸濁後、放射性標識病原菌および冷細菌菌株は単層で同時に培養する。試験は３ｌｏｇを含む細菌剤濃度に対し３重反復試験で行なう。
結果
スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・パイオゲネス、ラクトバチルス・ジョンソニイＮＣＣ５３３およびミクロコッカス・バリアンスＮＣＣ１４８２はＨａＣａＴｅｎ培養ケラチノサイトに対するその付着性を試験した。
0004828759.tif 000005
結果はスタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・パイオゲネス、ラクトバチルス・ジョンソニイＮＣＣ５３３およびミクロコッカス・バリアンスＮＣＣ１４８２は培養ケラチノサイトに付着することを示す。細菌剤濃度が増加すると、病原菌はますます排除される。
【００４２】
例３  活性または不活性化ラクトバチルス・ジョンソニイＮＣＣ５３３によるＳ．アウレウスの付着阻害の試験管内試験
試験管内付着モデルは不死化ヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ系）の単層を含む皮膚病原微生物（スタフィロコッカス・アウレウス）の放射線標識した、検量サスペンジョンの培養に基づく（ボウカンプ・ピーら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０６，７６１〜７７１，１９８８）。
この付着に関し、細菌剤（ラクトバチルス・ジョンソニイＮＣＣ５３３、生存可能形または不活性形）の阻害活性は単層に保有される放射能を測定することにより病原菌と試験化合物を単層で共−培養することに関連して評価される。
ケラチノサイト
これに対し、ＨａＣａＴ細胞は１０％の牛胎児血清を補充したＤＭＥＭで、３７℃、５％ＣＯ2下で培養する。これらは６−穴クラスターに１０4細胞／ｃｍ2の割合で接種する。付着試験は集密後５日に行なう。単層は微生物の培養前ＰＢＳにより３回洗浄する。
微生物
スタフィロコッカス・アウレウスは好気条件下で３５℃でＴＣＳ培地に培養する。
ラクトバチルス・ジョンソニイＮＣＣ５３３は嫌気条件下で３７℃でＭＲＳ培地に培養する。付着阻害試験では、細菌の濃厚サスペンジョンを４８時間培養物からＰＢＳ緩衝液に製造する。サスペンジョンは２×１０8ｃｆｕ／ｍｌ（５２５ｎｍのＯＤ＝１．５）に調整する。２．０×１０7および２．０×１０6ｃｆｕ／ｍｌのサスペンジョンを得るためにＰＢＳ緩衝液に連続稀釈物を製造する。各種サスペンジョンは嫌気条件で３７℃で培養したＭＲＳ寒天上で計数する。
ＮＣＣ５３３の不活性形は液体窒素による凍結／室温での解凍の数サイクル処理したラクトバチルスの濃サスペンジョンを凍結乾燥することにより得る。試験用調製品は４．０×１０10ｃｆｕ／ｇのバイオマスに相当する。
放射線標識
スタフィロコッカス・アウレウスの放射線標識はＴＣＳブロスに２４時間培養中１００μＣｉ／１０ｍｌの3Ｈアデニンを添加して得る。次にサスペンジョンは３０００ｒｐｍで１０分遠心分離し、３回ＰＢＳで洗浄する。細胞濃度はＰＢＳ緩衝液により約２．０×１０8ｃｆｕ／ｍｌ（５２５ｎｍのＯＤ＝０．５）に調整する。比放射能は１００μｌのサスペンジョンに対しシンチレーションカウンターにより測定する。
付着阻害試験
ＨａＣａＴ細胞カルチャーの穴につき、１ｍｌのスタフィロコッカス・アウレウスの放射線標識サスペンジョンおよび１ｍｌのＮＣＣ５３３サスペンジョンを、同時に添加する。３７℃で１時間の培養後、単層は３回ＰＢＳ緩衝液で洗浄し、１ｍｌの１Ｎ  ＮａＯＨを添加して室温で３０分溶解する。溶解物はシンチレーションびんに移し、６０℃で１時間１ｍｌの水酸化ベンゼソニウムを加えて培養する。冷却後、１０ｍｌのハイオニックフルオア（Ｈｙｏｎｉｃ  ｆｌｕｏｒ）シンチレーション液を添加し、放射能は液体シンチレーションカウンターで計算する。対照は１ｍｌの放射線標識したスタフィロコッカス・アウレウスサスペンジョンおよび１ｍｌのＰＢＳ緩衝液を添加することにより得られ、１００％の付着に相当する。結果は表５に示す。
0004828759.tif 000006
【００４３】
例４  不活性化ラクトバチルス・ジョンソニイによる皮膚病原菌の付着阻害の生体内試験
材料および方法
動物
１５匹の７〜８令ＳＫＨ雌マウス、体重約３０ｇでＣ．リバー供給、は異る局所適用試験に対し５匹を１群として使用した。
微生物
ヒト皮膚病（脚潰瘍）から単離したスタフィロコッカス・アウレウス菌株（菌株１と命名）を使用する。この菌株はメチシリンに敏感である。
接種物の製造
細菌のサスペンジョンはマウスに接種するために製造する。これに対し、菌株１の指数生育相の予備カルチャーを３５℃で１８〜２４時間固体培地（ＡＥＳ，ＡＥＢ  １２２８５９）で調製する。培養後、細菌は１０ｍｌの無菌塩水に再懸濁し、次に３０００ｒｐｍで１０分遠心分離後回収する。次に上澄を除き、ペレットを１０ｍｌの塩溶液と一緒に採取する。この操作は２回反復する。接種物サスペンジョンは洗浄細菌を４ｍｌの無菌塩溶液に再懸濁することにより製造する。５２５ｎｍのＯＤは約０．１４に調整する。これは約１０8ｃｆｕ／ｍｌを含有する。
マウスの接種
マウスの皮膚は９５エタノール（メルク）により脇腹を脱脂する。Ｓ．アウレウス接種物、１０7ｃｆｕ／ｍｌおよび試験製品の５０／５０混合物を含有する５０μｌのサスペンジョンをミクロピペットを使用して脱脂区域（６．２５ｃｍ2）にゆっくり適用した。接種部分は無菌プラスチック包帯下で１時間閉塞保護した（デルマフィルム３３×１５、番号３８，３０１５、Ｖｙｇｏｎ研究所）。
傷害部の生存可能な細菌の計数
サスペンジョン適用４時間後に、マウスはフォーレン（ｆｏｒｅｎｅ）による麻酔下で（アボット  フランス）屠殺する。接種部分はブロック（１２ｍｍ直径）として切り取った。切り取った皮膚バイオプシーは磨砕し、２ｍｌの無菌塩溶液により、ポリトロン（ＰＴ２１００、バイオブロック  サイエンティフィック）（５ｒｐｍ、５分）を使用して均質化した。
１ｍｌの均質化組織試料は９ｍｌの無菌塩溶液に添加し、０．１ｍｌのこの混合物はスタフィロコッカス培地１１０号で１０倍稀釈方法を使用して培養する。３５℃で４８時間の培養後、発現コロニーを計数し、ｃｆｕ（コロニー形成単位）を測定する。
結果
結果は表６に示す。
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１％のＮＣＣ５３３の存在は４時間の接触後約１ｌｏｇ、見出される細菌数を減少できる。差は対照に関し有意であることは明らかである（ｐ＝０．０９８）。
グルタルアルデヒドの存在では、細菌数の減少は対照に関し一層有意であるが、この活性は防腐活性によるもので、混合物にＳ．アウレウスを添加するとすぐに作用し、こうして４時間後観察された活性は抗付着効果によるものではなく、製品の抗菌活性によるものであることは論をまたない。
結果は表７に示す。
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０．５％および１％のＮＣＣ５３３の存在は１０6ｃｆｕ／ｍｌおよび１０7ｃｆｕ／ｍｌの接種に対し約１ｌｏｇ見出されるＳ．アウレウス菌数を減少させる。１０6ｃｆｕ／ｍｌ接種または１０7ｃｆｕ／ｍｌ接種で量の効果は認められない。
０．０４５％のグルタルアルデヒドの存在では、減少は対照に関し非常に大きい。約３である。
これらの結果はＳ．アウレウスの付着阻害剤として０．５％および１％の不活性化ＮＣＣ５３３の活性を確証する。
【００４４】
例５：ボディローション
次の組成：８．０％の鉱油、５．０％のイソプロピルパルミテート、２．０％のポリグリセリル−３ジイソステアレート、４．０％のオクチルドデカノール、０．３％のカルボマー、０．２％のナトリウムココイルグルタメート、１．２％の１０％水酸化ナトリウム、保存剤、香料、ラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５）、ミクロコッカス・バリアンス（ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６またはＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７）またはビフィドバクテリウム・ラクチス（ＡＴＣＣ  ２７５３６、ハンセン）から選択し、約９０℃で約２時間熱処理して不活性化した少なくとも１つの細菌菌株１０×１０8〜１０〜１０12ｃｆｕ／ｇを含有する０．５〜３％の凍結乾燥物、を有するボディローションを製造する。混合物は水により１００％にする。
こうして得たボディローションは病原菌に関し抗付着性により皮膚病原菌相を安定化および／または調整するためのものである。
【００４５】
例６  シャンプー
次の組成：７．０％のラウリル硫酸ナトリウム、２．０％のココアミドプロピルベタイン、２．０％のナトリウムラウリルスルホノサクシネート、食塩、保存剤、香料およびラクトバチルス・ジョンソニイ（ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５）、ミクロコッカス・バリアンス（ＣＮＣＭ  Ｉ−１５８６またはＣＮＣＭ  Ｉ−１５８７）またはビフィドバクテリウム・ラクチスＡＴＣＣ  ２７５３６から選択し、約９０℃で約２時間熱処理して不活性化した、少なくとも１つの菌株１０8〜１０12ｃｆｕ／ｇを含有する０．５〜３％の凍結乾燥物、を有するシャンプーを製造する。混合物は水で１００％にする。
こうして製造したシャンプーは頭皮病原菌フローラを調整する性質を有する。特にふけの処理で示される。
【００４６】
例  ７
皮膚病原菌相を調整する性質を有する薬剤を得るために、次の組成：
脂肪相：Ｌ．ジョンソニイ（ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５）
例５に記載                                １％
アラキジルベヘニルアルコール／
アラキジルグルコシド                    ３％
イソヘキサデカン                            ７％
スイートアーモンド油                        ３％
カライトバター                              ２％
Ｂ．Ｈ．Ｔ．                                ０．０５％
プロピルＰＯＢ                              ０．０５％
水性相：水                                      １００％まで
グリセロール                                ５％
メチルＰＯＢ                                ０．１％
を有する脂肪および水性相を調製する。
脂肪および水性相は７５℃に加熱する。次に、乳化は水性相を脂肪相に添加して１０００ｒｐｍでレイネリ（Ｒａｙｎｅｒｉ）混合により行なう。乳化後３０分で、混合物は１分ポリトロン（速度４〜５）で均質化する。
【００４７】
例  ８
例７と同じ方法で次の組成：
脂肪相：Ｌ．ジョンソニイ（ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５）
例５に記載                                １％
グリセリルステアレートおよび
ＰＥＧ１００ステアレート                ５％
イソヘキサデカン                            ８％
カライトバター                              ５％
Ｂ．Ｈ．Ｔ．                                ０．０５％
ＤＣ１５０３                                １％
水性相：水                                      １００％まで
グリセロール                                ３％
カルボポール９８１                          ０．２％
ルブラジェル（Ｌｕｂｒａｊｅｌ）            ５％
フェノキシエタノール                        １％
水酸化ナトリウム                          ｐＨ６まで
を有する組成物を製造する。
【００４８】
例  ９
例７と同じ方法で、次の組成：
脂肪相：Ｌ．ジョンソニイ（ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５）
例５に記載                                １％
ポリグリセリル−３ジイソステアレート        ５％
シクロメチコンＣＭ５                      ２０％
水性相：水                                      １００％まで
グリセロール                                ５％
ＮａＣｌ                                    ０．５％
ＭｇＳＯ4                                    ０．５％
を有する組成物を製造する。
【００４９】
例１０  ペット用シャンプー
次の組成：５％のラウリル硫酸ナトリウム、２％のココアミドプロピルベタイン、２％のナトリウムラウリルスルホノサクシネート、２％の食塩、１．５％のＰＥＧ−７グリセリルココエート、０．７５％のプロピレングリコール、パンテノール、グリセロール、リン酸２ナトリウム、保存剤、香料および例５記載の１％のＬ．ジョンソニイ（ＣＮＣＭ  Ｉ−１２２５）を有するペット用シャンプーを製造する。混合物は水で１００％にする。
こうして製造したシャンプーはペットの皮膚系の病原菌相を調整する性質を有する。