(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マンノース及びマンノースの腸管吸収抑制糖を必須成分とする有害菌感染抑制剤であって、該腸管吸収抑制糖として、フラクトースを含有し、腸管吸収抑制糖のマンノースに対する重量比が、１／１９〜１９／１になるように含有させることにより、マンノースの腸管吸収抑制作用を向上させたことを特徴とする有害菌感染抑制剤。
【請求項２】
マンノース及びマンノースの腸管吸収抑制糖を必須成分とする有害菌感染を抑制する方法であって、該腸管吸収抑制糖としてフラクトースを含有し、腸管吸収抑制糖のマンノースに対する重量比が、１／１９〜１９／１になるように含有させることにより、マンノースの腸管吸収抑制作用を向上させたことを特徴とする有害菌感染抑制方法。
【請求項３】
請求項１記載の有害菌感染抑制剤を含有することを特徴とする有害菌感染防止用飼料。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マンノースの腸管吸収が抑制されたマンノース組成物を有効成分とする有害菌感染抑制剤または有害菌感染防止用飼料に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来より、鶏卵や畜肉などがサルモネラ菌をはじめとする有害細菌により汚染されることが問題となっている。
【０００３】
このような有害細菌抑制対策としては、抗生物質や、乳酸菌を初めとする生菌剤、ワクチン、オリゴ糖の添加など種々の方法が開発されてきたが、どれも効果や手間、コスト等の問題があり、有効な手段は確立されていない。
【０００４】
このような環境下、アメリカ農務省により、マンノースがサルモネラ菌の腸管上皮細胞への定着を阻害する作用を有することが報告されている（Poultry Science  68、 p1351〜1360（1989））。
【０００５】
しかし、マンノースは、生体では代謝利用されるため、試験管内で得られる効果に対し、実際の効果が小さく（養鶏の友、No412、p14〜18（1996））、充分な効果を発揮するためには添加量を多くする必要がある。この場合、コストが問題となる（鶏病研究会報第34巻p20〜23（1998））。
【０００６】
ところで、マンノースの小腸における吸収機構は、従来より、濃度勾配の差による単純拡散によると言われていたが、近年になり、ラットやヒトで腸管細胞膜にマンノーストランスポーターの存在を示唆する報告（J．B．C．Vo1.269、No6、p4285−4290（1994））がある。
【０００７】
このJ．B．C．では、ラットやヒトの腸管上皮細胞（Caco−2細胞）の刷子緑膜側と基底膜側にマンノーストランスポーターが存在しており、その作用はそれぞれ刷子緑膜側はフラクトースで基底膜側はグルコ−スで抑制されると主張したものである。そして、実際に、マンノース1に対してフラクトース及びグルコースが５０００という濃度比で細胞に作用させた場合、マンノースの吸収阻害がみられることを示している。
【０００８】
しかし、この場合の糖の作用比をみると、マンノースに１に対しフラクトース及びグルコースが５０００であるので、糖組成物中のマンノース含有率は０．０２％となるが、マンノースの吸収が完全に阻害されたとしてもマンノースの濃度は非常に低いため、マンノースの有害菌の感染抑制作用を利用する技術としては、このままでは実用性に欠けるものと言えよう。
【０００９】
このように、J．B．C．においては、マンノースの腸管吸収を抑制する物質として、フラクトース、グルコースが開示されているものの、マンノース自体の有害菌抑制作用を生かした具体的手法に関する記載がない。
【００１０】
よって、マンノースの有害菌感染抑制作用を生かした実用性のある技術の開発が待たれているのが現状である。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、マンノースの腸管吸収を抑制し、その感染抑制効果を効率よく発揮するためのマンノースの腸管吸収抑制作用を向上させる有害菌感染抑制剤を提供することを目的とするものである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意研究を重ねたところ、サルモネラ菌をはじめとする有害菌の感染抑制作用を有するマンノースに、マンノースの腸管吸収抑制糖を特定量以上配合したものは、マンノースの腸管吸収が抑制され、その感染抑制効果を効率よく発揮できることを見出し、更に研究を重ねた結果、本発明を完成した。
【００１３】
即ち、本発明は、以下の通りのものである。
【００１４】
以下の１又は２は、マンノースとマンノースの腸管吸収糖とを必須成分とする、有害菌感染抑制剤又は有害菌感染防止用飼料に関するものである。
【００１５】
以下の３は、マンノースとマンノースの腸管吸収糖とを必須成分とする、有害菌感染抑制剤を含有する有害菌感染防止用飼料に関するものである。
【００１６】
１．マンノース及びマンノースの腸管吸収抑制糖を必須成分とする有害菌感染抑制剤であって、該腸管吸収抑制糖として、フラクトースを含有し、腸管吸収抑制糖のマンノースに対する重量比が、１／１９〜１９／１になるように含有させることにより、マンノースの腸管吸収抑制作用を向上させたことを特徴とする有害菌感染抑制剤。
【００１７】
マンノース及びマンノースの腸管吸収抑制糖を必須成分とする有害菌感染抑制する方法であって、該腸管吸収抑制糖として、フラクトースを含有し、腸管吸収抑制糖のマンノースに対する重量比が、１／１９〜１９／１になるように含有させることにより、マンノースの腸管吸収抑制作用を向上させたことを特徴とする有害菌感染抑制方法。
【００１８】
上記１記載の有害菌感染抑制剤を含有することを特徴とする有害菌感染防止用飼料。
【００１９】
前述したように、マンノースやその誘導体には、サルモネラ菌などの有害菌感染抑制作用のあることは公知であるが、このマンノースの有害菌抑制作用のメカニズムは、次のように考えられている。
【００２０】
サルモネラ菌など病原性を持つ有害菌の多くは、腸管壁上皮細胞のマンノース残基（受容体）に結合できる付着因子を保有しているので、この付着因子をマンノース（誘導体）などでブロックすることで、有害菌は腸管に付着できなくなり、感染を阻止できる。
【００２１】
従って、マンノースの腸管吸収を抑制できれば、マンノースを腸管内により留めることができることになり、上述した有害菌の腸管付着抑制作用をより効果的に発揮することが可能になる。
【００２２】
ところで、マンノースの腸管吸収を抑制する物質としては、前述した、Ｊ．Ｂ．Ｃ．に、フラクトースとグルコースが示されている。しかし、フラクトース及びグルコースはマンノースに対して極めて多量に用いている（マンノース1に対して５０００）ので、この場合のマンノースの濃度は、全糖中０．０２重量％となる。
【００２３】
従って、このJ．B．C．に記載された方法は、肝心のマンノース自体の濃度が極端に低いので、マンノースを腸管内により多く留めることにより、有害菌の腸管付着抑制を生体内で図るという方法においては、そのまま、採用できるものではない。
【００２４】
このような状況下、本発明者らは、以下のような新事実を発見した。
【００２５】
「吸収抑制糖によるマンノースの腸管吸収抑制において、該抑制糖は、先のJ．B．C．に示されている量まで用いる必要はなく（マンノースの５０００倍）、特定量以上用いていれば、マンノースの吸収抑制は十分に達成できること。
【００２６】
すなわち、マンノースの吸収抑制は、吸収抑制糖（フラクトース）がマンノースに対して１／１９倍存在していれば約１０％の吸収抑制率を示し、また、１／９倍であれば約２０％の吸収抑制率を示す。この値は、Ｊ．Ｂ．Ｃ．に記載のある、５０００倍もの吸収抑制糖を使った場合の吸収抑制率２９％と大きな違いはない。」
更に、例えばマンノースに対しマンノース吸収抑制糖を３倍〜８倍程度含むマンノース含有糖組成物は後述する酵素法によって安価に製造することが可能である。この場合の吸収抑制率は、マンノースに対し５０００倍もの吸収抑制糖を用いた場合と数％しか差がなく、糖組成物中のマンノース含量は高く、有害菌の定着を阻害する有効成分であるマンノースを効率よく腸管に滞留させ得る組成物としては、本発明のものが優れていることは明らかである。
【００２７】
本発明は、このような新事実の発見に基づいてなされたものであって、本発明の特徴とするところは、吸収抑制糖を必要以上に多く用いることなく、特定量以上用いることにより、マンノースの吸収抑制を達成しつつ、しかも、その結果、腸管内のマンノース量を有害菌を効率よく抑制する量にすることをも同時に可能とした点において極めて価値の高いものである。
【００２８】
本組成物は、マンノースを効果的に腸管に滞留させることができるため、飼料等に添加することで、家禽、家畜類等の有害菌の感染予防、抑制に有用である。
【００２９】
以下、本発明を更に詳細に説明する。
【００３０】
本発明のマンノースの腸管吸収が抑制された有害菌感染抑制剤は、マンノースとマンノースの腸管吸収抑制糖とを必須成分とするものである。そして、該腸管吸収抑制糖の量は、マンノースに対して重量比で１／１９〜１９／１にする必要がある。この下限を逸脱すると、所期の目的であるマンノースの吸収抑制作用が達成されたものにはならない。一方、腸管吸収抑制糖の割合が多くなり過ぎると、マンノースの量が減少する結果、マンノースによる有害菌感染抑制作用の発現が期待できなくなる。
【００３１】
従って、マンノースの腸管吸収抑制糖の割合は、マンノースによる有害菌感染抑制作用の発現が保持される範囲内のものとする必要がある。
【００３２】
本組成物の必須成分等については、以下に示すものが使用可能である。
【００３３】
（１）マンノース
マンノースは、マンノースを含有する多糖類（グルコマンナンやガラクトマンナンなど）の酸分解や酵素分解、又はモリブデン酸塩を触媒として高温下でグルコースに作用させることにより製造することができる。
【００３４】
また、マンノースは、フラクトースにマンノースイソメラーゼという酵素を作用させて得ることもできる。我々は、新規なマンノースイソメラーゼをある微生物から見出したが、本酵素は、従来知られているマンノースイソメラーゼより耐熱性が高く、工業的に利用が可能である点において有利である（特願平11-158911）。
【００３５】
（２）マンノースの腸管吸収抑制糖マンノースの腸管吸収抑制糖としては、フラクトースが用いられる、また、これら以外の糖が混入していても、上記した吸収抑制糖がマンノースに対して１／１９〜１９／１であれば吸収抑制作用は発揮される。
【００３６】
分岐オリゴ糖としては、イソマルトース、イソマルトトリオース、パノースなどのようなグルコースのα−１，４結合以外の結合を分子内に１つでも有するオリゴ糖であれば、何れのものでも使用可能である。例えば、イソマルト９００（昭和産業（株）製）などの市販のものは分岐オリゴ糖成分を多く含有するので好適である。
【００３７】
また、フラクトオリゴ糖としては、砂糖にフラクトースがβ−１，２結合により数分子結合した、例えば、１−ケストース、ニストース、１−フラクトフラノシルニストースなどのオリゴ糖であれば、何れのものでも使用可能である。例えば、メイオリゴＰ（明治製菓（株）製）などの市販のものはフラクトオリゴ糖成分を多く含有するので好適である。
【００３８】
（３）マンノース組成物の製法
本発明のマンノース組成物の製造法は、特に限定するものではないが、例えば、以下のような方法が挙げられる。
【００３９】
▲１▼  耐熱性マンノースイソメラーゼを使用した方法
グルコースに、耐熱性マンノースイソメラーゼ及びグルコースイソメラーゼを加え、例えば、５０℃で反応させることにより、マンノースの腸管吸収抑制糖がグルコースとフラクトースであるマンノース組成物を得ることができる。
【００４０】
また、 フラクトースに耐熱性マンノースイソメラーゼを加え、例えば、５０℃で反応させることにより、マンノースの腸管吸収抑制糖がフラクトースであるマンノース組成物を得ることができる。
【００４１】
▲２▼  マンノースにマンノースの腸管吸収抑制糖を添加する方法
マンノースの腸管吸収抑制糖を選択することにより、目的とするマンノース組成物を得ることができる。
【００４２】
例えば、グルコースシラップ（固形分７０％）１００ｇにマンノース結晶７０ｇを混ぜることにより、組成比がグルコース５０％、マンノース５０％の組成物を得ることができる。
【００４３】
（４）有害菌
腸管への定着が抑制される有害細菌は、マンノースにより凝集される細菌、例えばEscherchia coli、Vibrio cholerae、Klebsiella pneumoniae、Salmonella typhimurium、Aeromonas hydrophila、Shigella（「呼吸」8巻6号p．273〜283（1989））等が挙げられる。
【００４４】
（５）飼料
本発明の組成物を飼料中に添加すると、有害菌感染防止用飼料が得られるが、その場合の添加量は、特に限定されず、通常、有効成分であるマンノースが０．０１〜４０重量％でよい。少なすぎると目的の効果が達成することができない。また、多すぎると経済的に不利となる。
【００４５】
ベースとなる飼料成分は、通常、飼料用に使われているものであれば何れでもよい。例えば、鶏用の飼料を例にとれば、炭水化物源としては、とうもろこし、マイロ、小麦粉など、脂肪源としては、コーン油、大豆油などの植物性油脂や動物性油脂、タンパク質源としては、大豆粕、菜種粕、魚粕、ミートボーンミール等が挙げられる。また、カルシウム源として炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等を用いることができる。更に、アミノ酸インバランスを補うため、メチオニン、リジン、トリプトファンを添加したり、微量成分としてリン源、ビタミン、ミネラル類を含有させることもできる。
【００４６】
飼料成分の含有量は、ＣＰ（粗蛋白質量）１２〜２５％、カルシウム１〜４．５％（炭酸カルシウムとして２．５〜１１．２５％に相当）、ＭＥ（代謝エネルギー量）２７００〜３３００Kcal／Kgが好ましい。
【００４７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を実施例に基づいて更に説明するが、本発明はこれらに限定されない。なお、以下の実施例等において、「％」は、特に断らない限り「重量％」を意味する。
【００４８】
［腸管のマンノース吸収率測定試験］
イ）  試験方法
試験は、以下のように行った。
【００４９】
実験動物は採卵鶏を使用し、腸管の回腸部分を１５cm程度に切り出して反転させ、この反転小腸の中に糖液を含まない１０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH７．０）５mlを入れ、これを、試験区の糖液を混ぜた緩衝液（反転小腸内の緩衝液と同等）中で、酵素をパブリングしながら３７℃で３０分間保持した。反転小腸は１試験区で１０個使用した。３０分後、反転小腸を取り出し反転小腸内の緩衝液を回収した。精製は熱失活、活性炭処理、膜濾過で行い、濃縮後HPLC（カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK UG８０、カラム温度３０℃、溶媒８０％アセトニトリル、流速０．５mＬ／min）を用いて分析を行った。
【００５０】
ロ）  試験例１
マンノースとフラクトースを混合した系のマンノースの反転小腸内への吸収を調べた。マンノース及びフラクトースは、純度１００％の試薬を用いた。試験は、緩衝液内の糖濃度を０．９％に設定し、マンノースとフラクトースの比率を変えた９試験区で行った。なお、試験区に対し抑制糖（フラクトース）を用いない対照区を設けた。また、グリセロールを用いて各試験区と対照区の浸透圧が一定となるように調整した。
【００５１】
試験区の糖組成とマンノースの吸収抑制率を表１に示した。なお、結果は、反転小腸の外側の緩衝液に含まれるマンノースの濃度に対する反転小腸内の緩衝液に移行してきたマンノースの濃度の割合を算出し、対照区に対する相対値で示した。
【００５２】
なお、試験区１は、先のＪ．Ｂ．Ｃ．に記載されたものに該当するものである。
【００５３】
【表１】
0004694667.tif 000002
この結果から、マンノースに対してフラクトースが１／１９倍以上、好ましくは１／９倍以上存在すれば、マンノースの吸収が十分に抑制されることが分かった。
【００５４】
ハ）  試験例２
フラクトース以外の糖でのマンノースの吸収抑制を調べた。試験糖は、グルコース（純度１００％試薬）、分岐オリゴ糖（イソマルト９００（分岐オリゴ糖８９．５％、グルコース１．９％、その他の糖８．６％）；昭和産業（株）製）、フラクトオリゴ糖（メイオリゴ糖Ｐ（フラクトオリゴ糖９６％、その他の糖４％）；明治製菓（株）製）、および、消化・吸収されない糖質であるジ−β−Ｄ−フラクトフラノース１，２′：２，１′ジアンヒドリド（β−ＤＦＡ；純度９８％、その他の糖２％）を使用した。β−ＤＦＡは、イヌロビオースに、イヌロビオースを分子内縮合させる酵素を作用させた後、ＨＰＬＣで分離精製して調製した（特開平１１−１５５５６４）。
【００５５】
試験区の糖組成とマンノースの吸収抑制率を表２に示した。なお、結果は、試験例１と同様に、マンノースのみの対照区に対する相対値で示した。
【００５６】
【表２】
0004694667.tif 000003
この結果から、グルコースも上記のフラクトースと同様な抑制効果を示した。また、オリゴ糖である分岐オリゴ糖やフラクトオリゴ糖の場合も、上記の単糖に比べ若干吸収抑制が低くなるものの、マンノースに対して１／９倍以上の添加量で同様の効果が得られることが分かった。しかし、消化・吸収されないオリゴ糖であるβ−ＤＦＡでは殆ど効果がなかった。
【００５７】
以上の試験結果から、本発明の特定量（マンノースに対して１／１９倍以上、好ましくは１／９倍以上）のフラクトースやグルコース及び特定のオリゴ糖（分岐オリゴ糖、フラクトオリゴ糖）を含有するマンノース組成物は、マンノースの有効量の存在下において、十分にマンノースの腸管吸収が抑制されていることが分かる。
【００５８】
また、特定の糖成分においてのみ、所期の目的が達成できることも分かる。
【００５９】
次に、本組成物の製造方法を示す。
【００６０】
〔製造例１〕（耐熱性マンノースイソメラーゼを使用した方法）
グルコース４００ｍｇに、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、耐熱性マンノースイソメラーゼ０．４単位及びグルコースイソメラーゼ０．４単位を加え、全量を１mlとし、５０℃で７２時間反応させることにより、マンノース含有糖組成物（固形分４０％、組成：マンノース１２％、フラクトース３８％、グルコース５０％）を得た（マンノースに対しマンノース吸収抑制糖が７．３倍）。
【００６１】
〔製造例２〕
フラクトース高含有シロップ（固形分７５％、組成：フラクトース９５％、グルコース５％）２mlに耐熱性マンノースイソメラーゼ３単位を加え、２００ｍMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で全量３mlとし、５５℃で４８時間反応させることにより、マンノース含有糖組成物（固形分５０％、組成：マンノース２４％、フラクトース７１％、グルコース５％））を得た（マンノースに対してマンノース吸収抑制糖が３．２倍）。
【００６２】
〔製造例３〕（グルコースにマンノースを添加する方法）
グルコースシラップ（固形分７０％）１００ｇに、マンノース結晶７０ｇを混ぜることにより、糖組成がグルコース５０％、マンノース５０％の組成物を得た（マンノースに対しマンノース吸収抑制糖が等倍）。
【００６３】
以下、 有害菌感染防止用飼料の実施例を示す。
【００６４】
【実施例１】
市販の採卵鶏用飼料に、製造例１で製造した、マンノース含有糖組成物を１．０％添加し、飼料に対し有害菌感染防止に対し有効成分であるマンノースを０．０４８％含有する飼料を製造した。
【００６５】
【実施例２】
ブロイラー用試験飼料に、製造例２で製造したマンノース含有糖組成物を１％添加し、飼料に対しマンノースを０．１２％含有する飼料を製造した。
【００６６】
【発明の効果】
本組成物は、有害菌感染抑制作用のあるマンノースを効果的に腸管に滞留させることができるため、飼料等に添加することで、家禽、家畜類等の有害菌の感染予防、抑制に有用である。
【００６７】
また、本組成物を構成する成分は、いずれも、天然から得られるものを原料とするものであることから、安全性や経済性等からみて有利である。