(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程（ａ）：
（ａ）  塩基部分として、次の式Ｉ：
【化１】
0004777373.tif 000042
（ただし、式Ｉ中、Xは、O、SまたはNHを示し、
Ａ１は、ハロゲン原子を示す。）
で表される基を有する核酸と、
次の式ＩＩ：
【化５】
0004777373.tif 000043
（ただし、式ＩＩ中、Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
で表される化合物とを、
パラジウム錯体触媒、塩基性物質、溶媒の存在下で、マイクロウェーブにより加熱して、反応させる工程、
を含む、
次の式ＸＩ： 
【化１０】
0004777373.tif 000044
（ただし、式ＸＩ中、Xは、O、SまたはNHを示し、
Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
で表わされる基を含む核酸の製造方法、
又は、次の工程（ｂ）：
（ｂ）  塩基部分として、次の式ＶＩ：
【化６】
0004777373.tif 000045
（ただし、式ＶＩ中、Xは、O、SまたはNHを示し、
Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ａ２は、ハロゲン原子を示す。）
で表される基を有する核酸と、
次の式ＶＩＩ：
Ｒ３−Ｂ（ＯＨ）２          （ＶＩＩ）
（ただし、式ＶＩＩ中、Ｒ３は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、又はアルコキシカルボニル基を示す。）
で表される化合物とを、
パラジウム錯体触媒、塩基性物質、溶媒の存在下で、マイクロウェーブにより加熱して、反応させる工程、
を含む、
次の式ＸＶ：
【化１４】
0004777373.tif 000046
（ただし、式ＸＶ中、Xは、O、SまたはNHを示し、
Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ｒ３は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、又はアルコキシカルボニル基を示す。）
で表わされる基を含む核酸の製造方法。
【請求項２】
工程（ａ）を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｂ）を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）が、パラジウム錯体触媒、塩基性物質、溶媒、及びカルボン酸塩水溶液の存在下で、マイクロウェーブにより加熱して行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｂ）が、パラジウム錯体触媒、塩基性物質、溶媒、及びカルボン酸塩水溶液の存在下で、マイクロウェーブにより加熱して行われる、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項６】
塩基性物質が、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基を有するトリアルキルアミンである、請求項１〜５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）が、パラジウム錯体触媒、溶媒、及びカルボン酸塩水溶液の存在下で、マイクロウェーブにより加熱して行われる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）が、パラジウム錯体触媒、溶媒、及びカルボン酸塩水溶液の存在下で、マイクロウェーブにより加熱して行われる、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項９】
カルボン酸塩水溶液が、Ｃ１〜Ｃ３のカルボン酸のアルカリ金属塩の水溶液である、請求項４〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
カルボン酸塩水溶液が、ｐＨ４．５〜６．０の範囲にある緩衝液である、請求項４〜９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
マイクロウェーブによる加熱が、７０〜１４０℃の範囲の温度で行われる、請求項４〜１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
マイクロウェーブによる加熱が、１〜３０分の範囲の時間で行われる、請求項４〜１１の何れかに記載の方法。
【請求項１３】
溶媒が、非プロトン性極性溶媒である、請求項１〜１２の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光応答性核酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子生物学の分野の基本的な技術に、核酸の連結がある。核酸の連結は、例えば、ハイブリダイゼーションと組みあわせて、遺伝子の導入や、塩基配列の検出のために使用される。そのために、核酸の連結は、分子生物学の基礎研究だけではなく、例えば、医療分野における診断や治療、あるいは治療薬や診断薬等の開発や製造、工業及び農業分野における酵素や微生物等の開発や製造に使用される極めて重要な技術である。
【０００３】
核酸の連結は、例えば、ＤＮＡリガーゼ等を使用して従来から行われている。しかし、このような生体内の酵素反応を取り出した反応は、特別な条件設定を行わなければならず、さらに、使用される酵素類が比較的高価で、安定性に乏しい等の欠点を有する。このような欠点を克服するために、酵素類を使用しない核酸の連結の技術が研究されてきた。
【０００４】
酵素類を使用しない核酸の連結の技術として、核酸と反応性のある有機化合物を使用する方法がある。近年、光反応を利用した核酸連結技術が、反応の時間的空間的な制御が自由であること、一般的な有機化学反応よりも緩和な条件で反応可能であること等の利点から、注目されるようになってきた。
【０００５】
このような光連結技術として、５−シアノビニルデオキシウリジン及びその誘導体（光連結性核酸類、又は光応答性核酸類）を使用した光連結技術（特許文献１：特許第３７５３９３８号公報、特許文献２：特許第３７５３９４２号公報）が知られている。
【０００６】
このような光応答性核酸類は、優れた特性を有している一方で、その合成は容易ではなく、充分な量の目的化合物を得るには数時間から数日間の長い反応時間が必要であり、さらに副反応を伴うため收率も50%から60%と高いものではなかった。
【特許文献１】特許第３７５３９３８号公報
【特許文献２】特許第３７５３９４２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上述のように、５−シアノビニルデオキシウリジン及びその誘導体をはじめとする、光応答性（光連結性）核酸類として知られる化合物は、その合成が容易ではなく、長い反応時間を必要とし、収率も低いものであった。
【０００８】
このために、光応答性（光連結性）核酸類として知られる化合物を、従来よりも短時間で、高い収率で、簡便に得ることができる製造方法が求められていた。
【０００９】
従って、本発明の目的は、光応答性（光連結性）核酸類として知られる化合物を、従来よりも短時間で、高い収率で、簡便に得ることができる製造方法を提供することにある。
【００１０】
さらに、従来は、光応答性（光連結性）核酸類である化合物を、例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）の一部の塩基が修飾された誘導体として得ようとする場合には、あらかじめ修飾した塩基部分を有する修飾ヌクレオシドから出発してフォスフォロアミダイト体を経て、ＤＮＡ合成装置等により得るしかなかった。すなわち、従来は、同じ塩基配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドであっても、異なった修飾塩基を有する光応答性核酸類としたい場合に、所望の塩基配列のオリゴデオキシリボヌクレオチドとした後に目的の塩基に対して所望の修飾を行って所望の光応答性核酸類を得るという方法（ポスト合成法）はとることができず、異なった修飾塩基を有する光応答性核酸類を得たい場合には、あらかじめ修飾した塩基部分を有する修飾ヌクレオシドから出発してフォスフォロアミダイト体を経て、オリゴデオキシリボヌクレオチドの全体をその都度合成することが必要であった。
【００１１】
このために、所望の塩基配列のオリゴデオキシリボヌクレオチドとした後に目的の塩基に対してその都度所望の修飾を行って所望の光応答性核酸類を得ることのできる製造方法（ポスト合成法）が求められていた。
【００１２】
従って、本発明の目的は、所望の塩基配列のオリゴデオキシリボヌクレオチドとした後に目的の塩基に対してその都度所望の修飾を行って所望の光応答性核酸類を得ることのできる、光応答性（光連結性）核酸類として知られる化合物の製造方法を提供することにもある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者等は、光応答性核酸の合成方法を鋭意研究してきた結果、上記目的が、次の製造方法によって達成されることを見出して、本発明を完成するに至った。
【００１４】
従って、本発明は、次の［１］〜［１６］にある。
［１］
次の工程（ａ）：
（ａ）  塩基部分として、次の式Ｉ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、又は式Ｖ：
【化１８】
0004777373.tif 000002
（ただし、式Ｉ中、Xは、O、SまたはNHを示し、
Ａ１は、ハロゲン原子を示す。）
【化１９】
0004777373.tif 000003
（ただし、式ＩＩＩ中、Ａ１は、ハロゲン原子を示す。）
【化２０】
0004777373.tif 000004
（ただし、式ＩＶ中、Yは、O、SまたはNHを示し、
Zは、YがOまたはSであるときNH2を示し、YがNHであるときは水素原子を示し、
Ａ１は、ハロゲン原子を示す。）
【化２１】
0004777373.tif 000005
（ただし、式Ｖ中、Ａ１は、ハロゲン原子を示す。）
で表される基を有する核酸類（ただし、核酸類には、核酸、モノヌクレオチド及びペプチド核酸が含まれる）と、
次の式ＩＩ：
【化２２】
0004777373.tif 000006
（ただし、式ＩＩ中、Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
で表される化合物とを、
金属触媒、塩基性物質、溶媒の存在下で、マイクロウェーブにより加熱して、反応させる工程、
又は、次の工程（ｂ）：
（ｂ）  塩基部分として、次の式ＶＩ、式ＶＩＩＩ、式ＩＸ、又は式Ｘ：
【化２３】
0004777373.tif 000007
（ただし、式ＶＩ中、Xは、O、SまたはNHを示し、
Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ａ２は、ハロゲン原子を示す。）
【化２４】
0004777373.tif 000008
（ただし、式ＶＩＩＩ中、Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ａ２は、ハロゲン原子を示す。）
【化２５】
0004777373.tif 000009
（ただし、式ＩＸ中、Yは、O、SまたはNHを示し、
Zは、YがOまたはSであるときNH2を示し、YがNHであるときは水素原子を示し、
Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ａ２は、ハロゲン原子を示す。）
【化２６】
0004777373.tif 000010
（ただし、式Ｘ中、Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ａ２は、ハロゲン原子を示す。）
で表される基を有する核酸類（ただし、核酸類には、核酸、モノヌクレオチド及びペプチド核酸が含まれる）と、
次の式ＶＩＩ：
Ｒ３−Ｂ（ＯＨ）２          （ＶＩＩ）
（ただし、式ＶＩＩ中、Ｒ３は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、又はアルコキシカルボニル基を示す。）
で表される化合物とを、
金属触媒、塩基性物質、溶媒の存在下で、マイクロウェーブにより加熱して、反応させる工程、
を含む、光応答性核酸類（ただし、核酸類には、核酸、モノヌクレオチド及びペプチド核酸が含まれる）の製造方法。
［２］
工程（ａ）を含んでなる、［１］に記載の方法。
［３］
工程（ｂ）を含んでなる、［１］に記載の方法。
［４］
工程（ａ）によって製造される光応答性核酸類が、次の式ＸＩ、式ＸＩＩ、式ＸＩＩＩ、又は式ＸＩＶ：
【化２７】
0004777373.tif 000011
（ただし、式ＸＩ中、Xは、O、SまたはNHを示し、
Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
【化２８】
0004777373.tif 000012
（ただし、式ＸＩＩ中、Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
【化２９】
0004777373.tif 000013
（ただし、式ＸＩＩＩ中、Yは、O、SまたはNHを示し、
Zは、YがOまたはSであるときNH2を示、YがNHであるときは水素原子を示し、
Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
【化３０】
0004777373.tif 000014
（ただし、式ＸＩＶ中、Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
で表される基（ただし、式ＸＩで表される基は式Ｉ及び式ＩＩで表される基の反応から、式ＸＩＩで表される基は式ＩＩＩ及び式ＩＩで表される基の反応から、式ＸＩＩＩで表される基は式ＩＶ及び式ＩＩで表される基の反応から、式ＸＩＶで表される基は式Ｖ及び式ＩＩで表される基の反応から、それぞれ製造される）を含む光応答性核酸類である、［１］又は［２］に記載の方法。
［５］
工程（ｂ）によって製造される光応答性核酸類が、次の式ＸＶ、式ＸＶＩ、式ＸＶＩＩ、又は式ＸＶＩＩＩ：
【化３１】
0004777373.tif 000015
（ただし、式ＸＶ中、Xは、O、SまたはNHを示し、
Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ｒ３は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、又はアルコキシカルボニル基を示す。）
【化３２】
0004777373.tif 000016
（ただし、式ＸＶＩ中、Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ｒ３は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、又はアルコキシカルボニル基を示す。）
【化３３】
0004777373.tif 000017
（ただし、式ＸＶＩＩ中、Yは、O、SまたはNHを示し、
Zは、YがOまたはSであるときNH2を示、YがNHであるときは水素原子を示し、
Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ｒ３は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、又はアルコキシカルボニル基を示す。）
【化３４】
0004777373.tif 000018
（ただし、式ＸＶＩＩＩ中、Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ｒ３は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、又はアルコキシカルボニル基を示す。）
で表される基（ただし、式ＸＶで表される基は式ＶＩ及び式ＶＩＩで表される基の反応から、式ＸＶＩで表される基は式ＶＩＩＩ及び式ＶＩＩで表される基の反応から、式ＸＶＩＩで表される基は式ＩＸ及び式ＶＩＩで表される基の反応から、式ＸＶＩＩＩで表される基は式Ｘ及び式ＶＩＩで表される基の反応から、それぞれ製造される）を含む光応答性核酸類である、［１］又は［３］に記載の方法。
［６］
工程（ａ）が、金属触媒、塩基性物質、溶媒、及び反応活性化物質の存在下で、マイクロウェーブにより加熱して行われる、［１］、［２］、又は［４］に記載の方法。
［７］
工程（ｂ）が、金属触媒、塩基性物質、溶媒、及び反応活性化物質の存在下で、マイクロウェーブにより加熱して行われる、［１］、［３］、又は［５］に記載の方法。
［８］
金属触媒が、パラジウム錯体触媒である、［１］〜［７］の何れかに記載の方法。
［９］
溶媒が、非プロトン性極性溶媒である、［１］〜［８］の何れかに記載の方法。
［１０］
塩基性物質が、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基を有するトリアルキルアミンである、［１］〜［９］の何れかに記載の方法。
［１１］
反応活性化物質が、カルボン酸塩水溶液である、［６］〜［１０］の何れかに記載の方法。
［１２］
塩基性物質と反応活性化物質とを兼ねて、カルボン酸塩水溶液が使用される、［６］〜［１１］の何れかに記載の方法。
［１３］
カルボン酸塩水溶液が、Ｃ１〜Ｃ３のカルボン酸のアルカリ金属塩の水溶液である、［１１］〜［１２］の何れかに記載の方法。
［１４］
カルボン酸塩水溶液が、ｐＨ４．５〜６．０の範囲にある緩衝液である、［１１］〜［１３］の何れかに記載の方法。
［１５］
マイクロウェーブによる加熱が、７０〜１４０℃の範囲の温度で行われる、［１］〜［１４］の何れかに記載の方法。
［１６］
マイクロウェーブによる加熱が、１〜３０分の範囲の時間で行われる、［１］〜［１５］の何れかに記載の方法。
【００１５】
さらに、本発明は、次の［１７］〜［２１］にもある。
［１８］  工程（ａ）において、式Ｉ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、又は式Ｖで表される基と水素原子とが結合してなる化合物と、式ＩＩで表される化合物とを、反応させて、式ＸＩ、式ＸＩＩ、式ＸＩＩＩ、又は式ＸＩＶで表される基と水素原子とが結合してなる光応答性塩基を製造する方法。
［１９］  工程（ｂ）において、式ＶＩ、式ＶＩＩＩ、式ＩＸ、又は式Ｘで表される基と水素原子とが結合してなる化合物と、式ＶＩＩで表される化合物とを、反応させて、式ＸＶ、式ＸＶＩ、式ＸＶＩＩ、又は式ＸＶＩＩＩで表される基と水素原子とが結合してなる光応答性塩基を製造する方法。
［２０］  工程（ａ）において、塩基部分として式Ｉ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、又は式Ｖで表される基を有するヌクレオシド又はその誘導体と、式ＩＩで表される化合物とを、反応させて、式ＸＩ、式ＸＩＩ、式ＸＩＩＩ、又は式ＸＩＶで表される光応答性のヌクレオシド又はその誘導体を製造する方法。
［２１］  工程（ｂ）において、塩基部分として式ＶＩ、式ＶＩＩＩ、式ＩＸ、又は式Ｘで表される基を有するヌクレオシド又はその誘導体と、式ＶＩＩで表される化合物とを反応させて、式ＸＶ、式ＸＶＩ、式ＸＶＩＩ、又は式ＸＶＩＩＩで表される光応答性のヌクレオシド又はその誘導体を製造する方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、光応答性（光連結性）核酸類として知られる化合物を、従来よりも短時間で、高い収率で、簡便に得ることができる。例えば、光応答性核酸類のモノマーの合成において、従来の方法では数時間を要した反応を、わずか数分で完了することができ、その収率も従来よりも数十％向上し、あらゆる点から効率のよい製造を行うことができる。
【００１７】
さらに、従来は、光応答性（光連結性）核酸類である化合物を、例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）の一部の塩基が修飾された誘導体として得ようとする場合には、あらかじめ修飾した塩基部分を有する修飾ヌクレオシドから出発してフォスフォロアミダイト体を経て、ＤＮＡ合成装置等により得るしかなく、同じ塩基配列を有するオリゴデオキシリボヌクレオチドであっても、異なった修飾塩基を有する光応答性核酸類としたい場合に、所望の塩基配列のオリゴデオキシリボヌクレオチドとした後に目的の塩基に対して所望の修飾を行って所望の光応答性核酸類を得るという方法（ポスト合成法）はとることができず、異なった修飾塩基を有する光応答性核酸類を得たい場合には、あらかじめ修飾した塩基部分を有する修飾ヌクレオシドから出発してフォスフォロアミダイト体を経て、オリゴデオキシリボヌクレオチドの全体をその都度合成することが必要であった。
【００１８】
これに対して、本発明は、所望の塩基配列のオリゴデオキシリボヌクレオチドとした後に目的の塩基に対してその都度所望の修飾を行って所望の光応答性核酸類を得ることのできる製造方法（ポスト合成法）を、初めて提供するものである。
【００１９】
本発明によるポスト合成法によれば、従来のフォスホアミダイト法による合成法であれば１週間は要する光応答性核酸類のオリゴマーの製造を、わずか１日間で行うことができ、その収率も極めて高いために、本発明は、あらゆる点から効率がよい画期的な製造方法を初めて提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明について、以下に具体的な実施の形態をあげて、詳細に説明する。本発明は、以下に例示する具体的な実施の形態に限定されるものではない。
【００２１】
本発明は、次の工程（ａ）：
（ａ）  塩基部分として、次の式Ｉ、式ＩＩＩ、式ＩＶ、又は式Ｖ：
【化３５】
0004777373.tif 000019
（ただし、式Ｉ中、Xは、O、SまたはNHを示し、
Ａ１は、ハロゲン原子を示す。）
【化３６】
0004777373.tif 000020
（ただし、式ＩＩＩ中、Ａ１は、ハロゲン原子を示す。）
【化３７】
0004777373.tif 000021
（ただし、式ＩＶ中、Yは、O、SまたはNHを示し、
Zは、YがOまたはSであるときNH2を示し、YがNHであるときは水素原子を示し、
Ａ１は、ハロゲン原子を示す。）
【化３８】
0004777373.tif 000022
（ただし、式Ｖ中、Ａ１は、ハロゲン原子を示す。）
で表される基を有する核酸類（ただし、核酸類には、核酸及びペプチド核酸が含まれる）と、
次の式ＩＩ：
【化３９】
0004777373.tif 000023
（ただし、式ＩＩ中、Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
で表される化合物とを、
金属触媒、塩基性物質、溶媒の存在下で、マイクロウェーブにより加熱して、反応させる工程、
又は、次の工程（ｂ）：
（ｂ）  塩基部分として、次の式ＶＩ、式ＶＩＩＩ、式ＩＸ、又は式Ｘ：
【化４０】
0004777373.tif 000024
（ただし、式ＶＩ中、Xは、O、SまたはNHを示し、
Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ａ２は、ハロゲン原子を示す。）
【化４１】
0004777373.tif 000025
（ただし、式ＶＩＩＩ中、Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ａ２は、ハロゲン原子を示す。）
【化４２】
0004777373.tif 000026
（ただし、式ＩＸ中、Yは、O、SまたはNHを示し、
Zは、YがOまたはSであるときNH2を示、YがNHであるときは水素原子を示し、
Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ａ２は、ハロゲン原子を示す。）
【化４３】
0004777373.tif 000027
（ただし、式Ｘ中、Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ａ２は、ハロゲン原子を示す。）
で表される基を有する核酸類（ただし、核酸類には、核酸及びペプチド核酸が含まれる）と、
次の式ＶＩＩ：
Ｒ３−Ｂ（ＯＨ）２          （ＶＩＩ）  
（ただし、式ＶＩＩ中、Ｒ３は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、又はアルコキシカルボニル基を示す。）
で表される化合物とを、
金属触媒、塩基性物質、溶媒の存在下で、マイクロウェーブにより加熱して、反応させる工程、
を含む、光応答性核酸類の製造方法にある。
【００２２】
本発明は、上記方法を使用することにより、
工程（ａ）によって製造される光応答性核酸類として、次の式ＸＩ、式ＸＩＩ、式ＸＩＩＩ、又は式ＸＩＶ：
【化４４】
0004777373.tif 000028
（ただし、式ＸＩ中、Xは、O、SまたはNHを示し、
Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
【化４５】
0004777373.tif 000029
（ただし、式ＸＩＩ中、Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
【化４６】
0004777373.tif 000030
（ただし、式ＸＩＩＩ中、Yは、O、SまたはNHを示し、
Zは、YがOまたはSであるときNH2を示、YがNHであるときは水素原子を示し、
Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
【化４７】
0004777373.tif 000031
（ただし、式ＸＩＶ中、Ｒ１は、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基を示し、
Ｒ２は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示す。）
で表される基（ただし、式ＸＩで表される基は式Ｉ及び式ＩＩで表される基の反応から、式ＸＩＩで表される基は式ＩＩＩ及び式ＩＩで表される基の反応から、式ＸＩＩＩで表される基は式ＩＶ及び式ＩＩで表される基の反応から、式ＸＩＶで表される基は式Ｖ及び式ＩＩで表される基の反応から、それぞれ製造される）を含む光応答性核酸類を、製造する方法にあり、
及び、工程（ｂ）によって製造される光応答性核酸類として、次の式ＸＶ、式ＸＶＩ、式ＸＶＩＩ、又は式ＸＶＩＩＩ：
【化４８】
0004777373.tif 000032
（ただし、式ＸＶ中、Xは、O、SまたはNHを示し、
Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ｒ３は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、又はアルコキシカルボニル基を示す。）
【化４９】
0004777373.tif 000033
（ただし、式ＸＶＩ中、Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ｒ３は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、又はアルコキシカルボニル基を示す。）
【化５０】
0004777373.tif 000034
（ただし、式ＸＶＩＩ中、Yは、O、SまたはNHを示し、
Zは、YがOまたはSであるときNH2を示、YがNHであるときは水素原子を示し、
Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ｒ３は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、又はアルコキシカルボニル基を示す。）
【化５１】
0004777373.tif 000035
（ただし、式ＸＶＩＩＩ中、Ｒ４は、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基を示し、
Ｒ３は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、又はアルコキシカルボニル基を示す。）
で表される基（ただし、式ＸＶで表される基は式ＶＩ及び式ＶＩＩで表される基の反応から、式ＸＶＩで表される基は式ＶＩＩＩ及び式ＶＩＩで表される基の反応から、式ＸＶＩＩで表される基は式ＩＸ及び式ＶＩＩで表される基の反応から、式ＸＶＩＩＩで表される基は式Ｘ及び式ＶＩＩで表される基の反応から、それぞれ製造される）を含む光応答性核酸類を、製造する方法にある。
【００２３】
本発明の工程（ａ）における反応は、いわゆるヘック反応（溝呂木・ヘック反応）に基づくものであり、従来のヘック反応から飛躍的な時間短縮と収率向上を達成し、さらに従来不可能であった修飾核酸オリゴマーのポスト合成を可能にしたものである。
【００２４】
また、本発明の工程（ｂ）における反応は、いわゆる鈴木カップリング（鈴木・宮浦カップリング）に基づくものであり、従来の鈴木カップリングからから飛躍的な時間短縮と収率向上を達成し、さらに従来不可能であった修飾核酸オリゴマーのポスト合成を可能にしたものである。
【００２５】
従って、本発明の工程（ａ）及び工程（ｂ）における反応は、本発明で特に示す他には、従来のヘック反応、及び鈴木カップリングで使用可能な条件及び化合物（官能基）を同様に使用することができる。
【００２６】
Ｒ１は、ヘック反応で上記のように使用可能な基であれば使用することができるが、本発明において、一般に、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、アルコキシカルボニル基、又は、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基とすることができ、好ましくは水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、Ｃ２〜Ｃ６のアルコキシカルボニル基とすることができる。アルコキシカルボニル基としては、一般にＣ２〜Ｃ６、好ましくはＣ２〜Ｃ４のアルコキシカルボニル基を使用することができ、具体的にはメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基を例示することができ、特にメトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基が好ましい。置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基は、置換若しくは無置換の複素環式化合物の一価基であってもよい。
【００２７】
Ｒ２は、ヘック反応で上記のように使用可能な基であれば使用することができるが、本発明において、一般に、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基とすることができ、好ましくは水素原子、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ３のアシル基とすることができる。
【００２８】
Ｒ３は、鈴木カップリングで上記のように使用可能な基であれば使用することができるが、本発明において、一般に、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、又はアルコキシカルボニル基とすることができ、好ましくは置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基、水素原子、シアノ基、カルボキサミド基、Ｃ２〜Ｃ６のアルコキシカルボニル基とすることができる。アルコキシカルボニル基としては、一般にＣ２〜Ｃ６、好ましくはＣ２〜Ｃ４のアルコキシカルボニル基を使用することができ、具体的にはメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、ブトキシカルボニル基を例示することができ、特にメトキシカルボニル基及びエトキシカルボニル基が好ましい。置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基は、置換若しくは無置換の複素環式化合物の一価基であってもよい。鈴木カップリングにおけるＲ３基は、かさが大きく、大きな平面構造を有する基であっても、高い効率で使用することができる。すなわち、鈴木カップリングにおけるＲ３基として導入すれば、ヘック反応におけるＲ１基よりもより大きな基、特に大きな平面構造を有する基を好適に導入することができる。
【００２９】
Ｒ４は、鈴木カップリングで上記のように使用可能な基であれば使用することができるが、本発明において、一般に、水素原子、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ６のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ６のアシル基とすることができ、好ましくは水素原子、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基、シアノ基、又はＣ１〜Ｃ３のアシル基とすることができる。
【００３０】
好適な実施の態様において、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基は、一般に１〜１０個、好ましくは１〜８個、さらに好ましくは１〜６個、さらに好ましくは１〜４個、特に好ましくは１〜３個の範囲にある環を含んでおり、これらは、複素環式化合物の一価基であってもよい。
【００３１】
好適な実施の態様において、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基は、一般には４〜８員環、好ましくは４〜７員環、さらに好ましくは４〜６員環、さらに好ましくは５〜６員環から形成されており、これらは、複素環式化合物の一価基であってもよい。
【００３２】
好適な実施の態様において、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基は、５〜６員環を、１〜３個含み、１個以上の環が複素環である化合物の一価基が使用される。
【００３３】
好適な実施の態様において、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基として、ベンゼン、ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、アセナフチレン、フルオレン、フェナレン、フェナントレン、及びアントラセンの一価基を例示することができる。
【００３４】
好適な実施の態様において、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基として、例えば、フラン、ベンゾフラン、イソベンゾフラン、チオフェン、ベンゾチオフェン、イソベンゾチオフェン、ピロール、ベンゾピロール、及びイソベンゾピロールの一価基を例示することができる。
【００３５】
好適な実施の態様において、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基として、フラン−２−イル、フラン−３−イル、ベンゾフラン−２-イル、ベンゾフラン−３−イル、イソベンゾフラン−１−イル、イソベンゾフラン−３−イル、チオフェン−２−イル、チオフェン−３−イル、ベンゾチオフェン−２-イル、ベンゾチオフェン−３−イル、イソベンゾチオフェン−１−イル、イソベンゾチオフェンン−３−イル、ピロール−２−イル、ピロール−３−イル、ベンゾピロール−２-イル、ベンゾピロール−３−イル、イソベンゾピロール−１−イル、イソベンゾピロール−３−イルを例示することができる。好ましい実施の態様において、置換若しくは無置換の芳香族化合物の一価基として、フラン−２−イル、ベンゾフラン−２-イル、チオフェン−２−イル、ベンゾチオフェン−２-イル、ピロール−２−イル、及びベンゾピロール−２-イルを例示することができる。
【００３６】
Ａ１は、ハロゲン原子であり、具体的には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を挙げることができる。好適な態様において、Ａ１のハロゲン原子として、臭素原子、及びヨウ素原子を挙げることができ、特に好ましくはヨウ素原子を挙げることができる。
【００３７】
Ａ２は、ハロゲン原子であり、具体的には、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を挙げることができる。好適な態様において、Ａ２のハロゲン原子として、臭素原子、及びヨウ素原子を挙げることができ、特に好ましくは臭素原子を挙げることができる。
【００３８】
工程（ａ）及び工程（ｂ）は、金属触媒、塩基性物質、溶媒の存在下で、マイクロウェーブにより加熱して行われる。
【００３９】
本発明では、このようなマイクロウェーブを使用した加熱により、反応時間の短縮と収率の向上を同時に達成している。
【００４０】
マイクロウェーブによる加熱は、一般に、７０〜１４０℃、好ましくは７５〜１２５℃、さらに好ましくは８０〜１２０℃、さらに好ましくは８０〜１１０℃の範囲の温度となるように行われる。マイクロウェーブによる加熱時間は、上記温度で、一般に、１〜３０分、好ましくは２〜２０分、さらに好ましくは３〜２０分、さらに好ましくは３〜１０分の範囲の時間で行われる。マイクロウェーブによる加熱は、２回、又は３回以上に分けて行うこともできる。マイクロウェーブに使用されるマグネトロン周波数は、上記温度及び時間を達成することができるものであれば使用することができるが、一般に、２．４５ＧＨｚの周波数を使用することができる。マイクロウェーブに使用される出力は、上記温度及び時間を達成することができるものであれば使用することができる。
【００４１】
金属触媒は、ヘック反応及び鈴木カップリングに使用できる金属触媒を使用することができるが、特にパラジウム錯体触媒が好ましい。好適に使用可能なパラジウム錯体触媒としては、例えば、ＰｄＣｌ４触媒、Ｐｄ（ＯＡｃ）２触媒等を挙げることができる。
【００４２】
溶媒は、ヘック反応及び鈴木カップリングに使用できる溶媒を使用することができるが、特に非プロトン性極性溶媒が好ましい。好適に使用可能な非プロトン性極性溶媒としては、例えば、アセトン、アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド(N,N-Dimethylformamide)（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド(Dimethyl sulfoxide)（ＤＭＳＯ）を挙げることができ、好ましくはＤＭＦ、及びＤＭＳＯを使用することができる。これらの非プロトン性極性溶媒には、水を添加して使用することもできる。
【００４３】
塩基性物質としては、ヘック反応及び鈴木カップリングに使用できる塩基性物質を使用することができる。好適に使用可能な塩基性物質として、例えば、トリアルキルアミンを挙げることができる。トリアルキルアミンとしては、一般にＣ１〜Ｃ６のアルキル基を有するトリアルキルアミン、好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルキル基を有するトリアルキルアミン、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ４のアルキル基を有するトリアルキルアミンを挙げることができる。好適な実施の態様において、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、トリブチルアミンを使用することができ、好ましくはトリエチルアミン及びトリブチルアミンを使用することができる。
【００４４】
本発明の好適な実施の態様において、工程（ａ）及び工程（ｂ）は、金属触媒、塩基性物質、溶媒、及び反応活性化物質の存在下で、マイクロウェーブにより加熱して行われる。このような反応活性化物質の存在下でマイクロウェーブ加熱することによって、工程（ａ）及び工程（ｂ）の反応を、特に好適におこなうことができる。
【００４５】
本発明で使用可能な反応活性化物質として、カルボン酸塩水溶液を挙げることができる。カルボン酸塩としては、Ｃ１〜Ｃ３のカルボン酸の塩、好ましくは酢酸の塩を使用することができる。カルボン酸塩としては、アルカリ金属塩、好ましくはナトリウム塩又はカリウム塩、特に好ましくはナトリウム塩を使用することができる。
【００４６】
カルボン酸塩水溶液は、好ましくはｐＨ４．５〜６．０の範囲、さらに好ましくはｐＨ５．０〜５．５の範囲にある緩衝液であることが好ましい。このような緩衝液は、水に溶解したカルボン酸塩にさらにカルボン酸を滴下して作製することができる。
【００４７】
本発明の好ましい態様において、塩基性物質と反応活性化物質とを兼ねて、カルボン酸塩水溶液を使用することができる。
【実施例】
【００４８】
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明する。本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４９】
［５−ヨード−２’−デオキシウリジン（ＩＵ）からの光応答性化合物合成］
マイクロ波を用いた効率的加熱による短時間、高収率な光応答性化合物の合成を行った。このとき式１に示す様にビニル基を有する基質を複数種類試した。
【化５２】
0004777373.tif 000036
【００５０】
［実施例１］
（１）５−カルボメトキシビニル−２’−デオキシウリジン（ＣＶＵ）の合成
式（１）に従い図１に示す化合物（ＣＶＵ）の合成を行った。窒素雰囲気下でパラジウム（ＩＩ）アセテート(13.4 mg, 0.06 mmol)をＤＭＦ（500μl）に溶かし込み、そこへ粉末のままの５−ヨード−２’−デオキシウリジン（200 mg, 0.56 mmol）を加え懸濁させた。更にトリブチルアミン（130μl, 0.56 mmol）、メチルアクリレート（120μl, 1.12 mmol）を加えた。試薬添加後、マイクロウェーブ照射により１００℃まで加熱して４分間反応させた。反応終了後のサンプルをろ過し、パラジウム粉を取り除き、エバポレーターにて溶媒を除去した。シリカゲルカラムを用いて精製を行った。展開溶媒をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９５：５から９：１に変化させて白色固体の生成物（162 mg, 0.52 mmol, 92%）を得た。1H NMRの分析結果から図１に示す化合物である５−カルボメトキシビニル−２’−デオキシウリジン（ＣＶＵ）と同定した。
1H NMR (DMSO 300 MHz) δ11.6 (br. s, 1H, 3NH); 8.42 (s, 1H, H-C(6)); 7.38 (d, 1H, J=16.2 Hz, CH=CH); 6.86 (d, 1H, J=16.2 Hz, CH=CH); 6.14 (t, 1H, J=6.3, H-C(1')) ; 5.26 (d, 1H J= 4.2 Hz, 3'-OH); 5.17(t, 1H, J= 5.4 Hz, 5'-OH); 4.26 (m, 1H, H-C(3')); 3.81 (dd, 1H, J= 6.6, 3.3 Hz, H-C(4')); 3.69 (s, 3H, OMe); 3.63-3.59 (m, 2H, H-C(5')); 2.21-2.16 (m, 2H, H-C(2')).                    
HRMS (MALDI) cald. for C13H17N2O7 [(M+H)+]: 313.104, found: 313.333.
【００５１】
［実施例２］
（２）５−カルバモイルビニル−２’−デオキシウリジン（ＣＭＶＵ）の合成
式（１）に従い図２に示す化合物（ＣＭＶＵ）の合成を行った。窒素雰囲気下でパラジウム（ＩＩ）アセテート（13.4 mg, 0.06 mmol）をＤＭＦ（500μl）に溶かし込み、そこへ粉末のままの５−ヨード−２’−デオキシウリジン（200 mg, 0.56 mmol）を加え懸濁させた。更にトリブチルアミン（130μl, 0.56 mmol）、アクリルアミド（100 mg, 1.40 mmol）を加えた。試薬添加後、マイクロウェーブ照射により１００℃まで加熱して４分間反応させた。反応終了後のサンプルをろ過し、パラジウム粉を取り除き、エバポレーターにて溶媒を除去した。ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１：１の溶媒で洗浄し白色個体（141 mg, 0.48 mmol, 85%）を得た。1H NMRの分析結果から図２に示す化合物である５−カルバモイルビニル−２’−デオキシウリジン（ＣＭＶＵ）と同定した。
1H NMR (DMSO 300 MHz) δ11.5 (br. s, 1H, 3NH); 8.28 (s, 1H, H-C(6); 7.50 (br. s, 1H, NH2); 6.91 (br. ｓ，1H，NH2); 7.12 (d, 1H, J=15.6 Hz, CH=CH); 6.97 (d, 1H, J=15.6 Hz, CH=CH); 6.14 (t, 1H, J=6.3, H-C(1')); 5.25 (d, 1H, J=4.2 Hz, 3'-OH); 5.16 (t, 1H, J=5.1 Hz, 5'-0H); 4.26 (m, 1H, H-C(3')); 3.81 (m, 1H, H-C(4')); 3.66-3.59 (m, 2H, H-C(5'); 2.21-2.09 (m, 2H, H-C(2')).
HRMS (MALDI) cald. for C12H15N3O6Na [(M+Na)+]: 320.086, found: 320.502.
【００５２】
［実施例３］
（３）５−シアノビニル−２’−デオキシウリジン（ＣＮＶＵ）の合成
式（１）に従い図３に示す化合物（ＣＮＶＵ）の合成を行った。窒素雰囲気下でパラジウム（ＩＩ）アセテート（13.4 mg, 0.06 mmol）をＤＭＦ（500μl）に溶かし込み、そこへ粉末のままの５−ヨード−２’−デオキシウリジン（200 mg, 0.56 mmol）を加え懸濁させた。更にトリブチルアミン（130μl, 0.56 mmol）、アクリロニトリル（91μl, 1.40 mmol）を加えた。試薬添加後、マイクロウェーブ照射により１００℃まで加熱して４分間反応させた。反応終了後のサンプルをろ過し、パラジウム粉を取り除き、エバポレーターにて溶媒を除去した。シリカゲルカラムを用いて精製を行った。展開溶媒をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９５：５から９：１に変化させて白色固体の生成物（82 mg, 0.31 mmol, 54%）を得た。1H NMRの分析結果から図３に示す化合物である５−カルボメトキシビニル−２’−デオキシウリジン（ＣＮＶＵ）と同定した。
1H NMR (DMSO 300 MHz) δ11.7 (br. s, 1H, 3NH); 8.35 (s, 1H, H-C(6)); 7.23 (d, 1H, J=16.2 Hz, CH=CH); 6.52 (d, 1H, J=16.2 Hz, CH=CH); 6.10 (t, 1H, J=6.0, H-C(1')); 5.27 (d, 1H, J=4.2 Hz, 3'-OH); 5.11 (t, 1H, J=5.4 Hz, 5'-OH); 4.25 (m, 1H, H-C(3')); 3.82 (dd, 1H, J=7.2, 3.6 Hz, H-C(4')); 3.68-3.57 (m,2H, H-C(5')); 2.20-2.15 (m, 2H, H-C(2')).
HRMS (MALDI) cald. for C12H13N3O6Na [(M+Na)+]: 302.075, found: 302.067.
【００５３】
［実施例４］
（４）５−ビニル−２’−デオキシウリジン（ＶＵ）の合成
式（１）に従い図１に示す化合物（ＶＵ）の合成を行った。窒素雰囲気下でパラジウム（ＩＩ）アセテート（13.4 mg, 0.06 mmol）をＤＭＦ（500μl）に溶かし込み、そこへ粉末のままの５−ヨード−２’−デオキシウリジン（200 mg, 0.56 mmol）を加え懸濁させた。更にトリブチルアミン（130μl, 0.56 mmol）、メチルアクリレート（1.04 ml, 11.3 mmol）を加えた。試薬添加後、マイクロウェーブ照射により１００℃まで加熱して２０分間反応させた。反応終了後のサンプルをろ過し、パラジウム粉を取り除き、エバポレーターにて溶媒を除去した。シリカゲルカラムを用いて精製を行った。展開溶媒をＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝９５：５から９：１に変化させて白色固体の生成物（80 mg, 0.31 mmol, 56%）を得た。1H NMRの分析結果から図４に示す化合物である５−ビニル−２’−デオキシウリジン（ＶＵ）と同定した。
1H NMR (DMSO 300 MHz) δ11.4 (br. s, 1H, 3NH); 8.11 (s, 1H, H-C(6)); 6.36 (dd, 1H, J=17.7, 11.5 Hz, CH=CH); 6.15 (t, 1H, J=6.3, H-C(1')); 5.82-5.78 (m, 1H, vinyl cis); 5.26-5.09 (m, 3H, vinyl trans, 3'-OH, 5'-OH); 4.25 (t, 1H, J=4.0 Hz, H-C(3')); 3.79-3.78 (m, 1H, H-C(4')); 3.65-3.54 (m, 2H, H-C(5')); 2.18- 2.10 (m,2H, H-C(2')).
HRMS (MALDI) cald. for C11H14N2O5Na [(M+Na)+]: 277.080, found:277.066.
【００５４】
［まとめ１］
上記実施例１〜４による反応の収率及び反応時間と各合成において従来の方法によって行った場合（比較例１〜４）の収率と反応時間とを、次の表１にまとめて示す。
【化５３】
0004777373.tif 000037
【表１】
0004777373.tif 000038
【００５５】
本発明によれば、従来法に比べて反応時間は最大７５分の１にまで短縮され、収率は最大３０％向上していた。また、従来法での合成は副反応が極めて多かったが、本発明によればこれも極めて低減されていた。
【００５６】
［５−ヨード−２’−デオキシウリジン（ＩＵ）を含むオリゴデキシヌクレオチド（ＯＤＮ）からの光応答性核酸合成］
５−ヨード−２’−デオキシウリジン（ＩＵ）を含むオリゴデキシヌクレオチド（ＯＤＮ）から光応答性核酸合成のポスト合成を行った。
【００５７】
［ＩＵを含むＯＤＮの合成］
ＯＤＮ１（ＩＵ）（5'-IUTTTTT-3'）またはＯＤＮ２（ＩＵ）（5'-IUGCGTGA-3'）はABI 3400 DNA合成機を用いて合成した。アンモニア水溶液によるサポートからの切り出しを行わず、ＣＰＧとして得た。
【００５８】
［実施例５］
［５−シアノビニル−２’−デオキシウリジン（ＣＮＶＵ）含有ＯＤＮのポスト合成］
式（２）に従い５−シアノビニル−２’−デオキシウリジン（ＣＮＶＵ）含有ＯＤＮのポスト合成を進めた。
【化５４】
0004777373.tif 000039
ＯＤＮ１（ＩＵ）−ＣＰＧ（2 mg, approximately 100 nmol loading）に０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（180μl, pH=5.2）を加えた後、アクリロニトリル（12 mg, 226μmol）のＤＭＦ溶液（180μl）とNa2PdCl4（5.8 mg, 20μmol）とＤＭＦ溶液（180μl）を加えて、マイクロウェーブを用いて反応溶液を80℃で１０分間加熱した。上澄み溶液を除去した後、ＤＭＦで４回（250μl×４）洗浄した。反応混合物に新たに０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（180μl, pH=5.2）を加えた後、アクリロニトリル（12 mg, 226μmol）のＤＭＦ溶液（180μl）とNa2PdCl4（5.8 mg, 20μmol）とＤＭＦ溶液（180μl）を加えて、マイクロウェーブを用いて反応溶液を８０℃で１０分間加熱した。上澄み溶液を除去した後、ＤＭＦで４回（250μl×４）洗浄した。アンモニア水溶液（300μl）を用いて室温で１２時間インキュベートしてサポートからの切り出しをした。SpeedVacを用いてアンモニアを除去した後、HPLC分析をした（図５）。HPLC conditions (elution with a solvent mixture of 50 mM ammonium formate, pH 7.0, linear gradient over 30 min from 3% to 20% acetonitrile, detection at 300 nm).ＯＤＮ１（ＣＮＶＵ）由来のピークを分取してMALDI-TOF-MSを測定した。
calcd. for ODN1(CNVU):[(M+H)+] 1801.22, found 1801.46.
MALDI-TOF-MSの分析結果から、ＯＤＮのポスト合成に成功したことを確認した。
【００５９】
［実施例６］
［５−カルバモイルビニル−２’−デオキシウリジン（ＣＶＵ）含有ＯＤＮのポスト合成］
式（３）に従い５−カルバモイルビニル−２’−デオキシウリジン（ＣＶＵ）を進めた。
【化５５】
0004777373.tif 000040
ＯＤＮ２（ＩＵ）−ＣＰＧ （2 mg, approximately 100 nmol loading）に０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（180μl, pH=5.2）を加えた後、メチルアクリレート（19.5 mg, 226μmol）のＤＭＦ溶液（180μl）とNa2PdCl4（5.8 mg, 20μmol）とＤＭＦ溶液（180μl）を加えて、マイクロウェーブを用いて反応溶液を８０℃で１０分間加熱した。上澄み溶液を除去した後、ＤＭＦで４回（500μlx４）洗浄した。反応混合物に新たに同様の操作を行い、上澄み溶液を除去した後、ＤＭＦで４回（500μl×４）洗浄して、Ｈ２０で４回（500μl×４）洗浄した。反応混合物に対してアンモニア水溶液（500μl）を用いて５５℃で１０時間インキュベートしてサポートからの切り出しをした。SpeedVacを用いてアンモニアを除去した後、HPLC分析をした（図６）。HPLC conditions (elution with a solvent mixture of 50 mM ammonium formate, pH 7.0, linear gradient over 30 min from 3% to 20% acetonitrile, detection at 320 nm). ＯＤＮ２（ＣＶＵ）由来のピークを分取してMALDI-TOF-MSを測定した。
calcd. for ODN2(CVU):[(M+H)+] 2192.47, found 2192.51.
MALDI-TOF-MSの分析結果から、Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔを含むＯＤＮに対してもポスト合成に成功したことを確認した。
【００６０】
［５−ブロモビニル−２’−デオキシウリジン（ＢｒＶＵ）を含むオリゴデキシヌクレオチド（ＯＤＮ）からの光応答性核酸合成］
［実施例７］
［５−ビニルフラン−２’−デオキシウリジン含有ＯＤＮのポスト合成］
式（４）に従い５−ビニルフラン−２’−デオキシウリジン含有ＯＤＮのポスト合成を進めた。
【化５６】
0004777373.tif 000041
ＯＤＮ（ＢｒＶＵ）−ＣＰＧ（2 mg, approximately 100 nmol loading）にＤＭＦ (150μL)と2-furan boronic acid（44.8 mg, 400μmol）とPdCl2(PPh3)2（14.0 mg, 20μmol）とtriethyl amine（100μL）を順に加えた後、マイクロウェーブを用いて反応溶液を１００℃１０分間加熱した。上澄み溶液を除去し、ＤＭＦ（500μLx４）で洗浄した後、水（500μLx４）で洗浄した後、澄み溶液と洗浄水溶液を混合した。反応後のＣＰＧにアンモニア水溶液（500μL）を加えて６５℃で４時間インキュベートしてサポートからの切り出しをした。 SpeedVacを用いてアンモニアを除去した後、ＨＰＬＣ分析をした（図７）。 HPLC conditions (elution with a solvent mixture of 50 mM ammonium formate, pH 7.0, linear gradient over 30 min from 3% to 20% acetonitrile, detection at 350 nm).
MALDI-TOF MSによる質量分析を行ったところ、目的産物であるＯＤＮ(ＶＦＵ)の質量に一致する値を得た。
calcd. for ODN(VFU):[(M+H)+] 1902.30, found 1902.85
【００６１】
［実施例８］
［５−ビニルベンゾフラン−２’−デオキシウリジン含有ＯＤＮのポスト合成］
５−ビニルベンゾフラン−２’−デオキシウリジン含有ＯＤＮのポスト合成を進めた。
ＯＤＮ（ＢｒＶＵ）−ＣＰＧ（2 mg, approximately 100 nmol loading）にＤＭＦ（150μL）と2-benzofuran boronic acid（64.8 mg, 400μmol）とPdCl2(PPh3)2（14.0 mg, 20μmol）とtriethyl amine（100μL）を順に加えた後、マイクロウェーブを用いて反応溶液を１００℃で１０分間加熱した。上澄み溶液を除去し、ＤＭＦ（500μLx４）で洗浄した後、水（500μLx４）で洗浄した後、澄み溶液と洗浄水溶液を混合した。反応後のＣＰＧにアンモニア水溶液（500μL）を加えて６５℃で４時間インキュベートしてサポートからの切り出しをした。SpeedVacを用いてアンモニアを除去した後、ＨＰＬＣ分析をした（図８）。
９は以前に合成したＶＢＦＵ含有ＯＤＮを標品としてＨＰＬＣ分析しものであるクルードの状態でMALDI-TOF MSによる質量分析を行ったところ、目的産物であるＯＤＮ（ＶＢＦＵ）の質量に一致する値を得た。
calcd. for ODN(VBFU):[(M+H)+] 1952.36, found 1952.05
【００６２】
［実施例９］
［５−ビニルチオフェン−２’−デオキシウリジン含有ＯＤＮのポスト合成］
式（４）に従い５−ビニルチオフェン−２’−デオキシウリジン含有ＯＤＮのポスト合成を進めた。
ＯＤＮ（ＢｒＶＵ）−ＣＰＧ（2 mg, approximately 100 nmol loading）にＤＭＦ（150μL）と2-thiophen boronic acid （51.2 mg, 400μmol）とPdCl2(PPh3)2（14.0 mg, 20μmol）とtri-ethyl amine（100μＬ）を順に加えた後、マイクロウェーブを用いて反応溶液を１００℃で１０分間加熱した。上澄み溶液を除去し、ＤＭＦ（500μLx４）で洗浄した後、水（500μLx４）で洗浄した後、澄み溶液と洗浄水溶液を混合した。反応後のＣＰＧにアンモニア水溶液（500μＬ）を加えて６５℃で４時間インキュベートしてサポートからの切り出しをした。SpeedVacを用いてアンモニアを除去した後、ＨＰＬＣを用いて精製した。
MALDI-TOF MSによる質量分析を行ったところ、目的産物である5-vinylthiophen-dU含有ＯＤＮ（ＶＴＵ）の質量に一致する値を得た。
calcd. for ODN(VTU):[(M+H)+] 1916.33, found 1916.77
【００６３】
［実施例１０］
［５−ビニルベンゾチオフェン−２’−デオキシウリジン含有ＯＤＮのポスト合成］
式（４）に従い５−ビニルベンゾチオフェン−２’−デオキシウリジン含有ＯＤＮのポスト合成を進めた。
ＯＤＮ（ＢｒＶＵ）−ＣＰＧ（2 mg, approximately 100 nmol loading）にＤＭＦ（150μL）と2-tbenzothiophen boronic acid（71.2 mg, 400μmol）とPdCl2(PPh3)2（14.0 mg, 20μmol）とtriethyl amine（100μＬ）を順に加えた後、マイクロウェーブを用いて反応溶液を１００℃で１０分間加熱した。上澄み溶液を除去し、ＤＭＦ（500μLx４）で洗浄した後、水（500μLx４）で洗浄した後、澄み溶液と洗浄水溶液を混合した。反応後のＣＰＧにアンモニア水溶液（500μＬ）を加えて６５℃で４時間インキュベートしてサポートからの切り出しをした。SpeedVacを用いてアンモニアを除去した後、ＨＰＬＣを用いて精製した。
MALDI-TOF MSによる質量分析を行ったところ、目的産物である5-vinylthiophen-dU含有ＯＤＮ（ＶＴＵ）の質量に一致する値を得た。
calcd. for ODN(VBFU):[(M+H)+] 1967.34, found 1967.20
【００６４】
［まとめ２］
上記実施例５〜１０のポスト合成法によれば、種々の光応答性核酸の合成を、わずか１日以内で行うことができた。一方で、従来のフォスホアミダイト法による光応答性核酸の合成によれば、いずれの光応答性核酸も、その都度１週間程度の合成の日数を要した。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１はＣＶＵの構造式を示す図である。
【図２】図２はＣＭＶＵの構造式を示す図である。
【図３】図３はＣＮＶＵの構造式を示す図である。
【図４】図４はＶＵの構造式を示す図である。
【図５】図５はＨＰＬＣチャートを示す図である。
【図６】図６はＨＰＬＣチャートを示す図である。
【図７】図７はＨＰＬＣチャートを示す図である。
【図８】図８はＨＰＬＣチャートを示す図である。
【図１】
0004777373.tif 000047
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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