(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
好熱性生物においてグリセロールから１，３−プロパンジオールに変換する方法であって、
ＡＴＣＣの命名ＰＴＡ−５８４として寄託されたカロラマトール  ビテルビエンシス（Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒ  ｖｉｔｅｒｂｉｅｎｓｉｓ）である、グリセロールを１，３−プロパンジオールに発酵する好熱性生物を用意し；そして
１，３−プロパンジオールが生産されるような条件下で上記好熱性生物を培養すること
からなる、上記方法。
【請求項２】
好熱性生物により生産された１，３−プロパンジオールを回収する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
１，３−プロパンジオールをポリマーに重合する工程をさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ポリマーがポリ（１，３−プロパンジオールテレフタレート）である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＡＴＣＣの命名ＰＴＡ−５８４として寄託されたカロラマトール ビテルビエンシスの単離された培養物又は細胞。
【請求項６】
ＡＴＣＣの命名ＰＴＡ−５８４として寄託された生物の子孫である、請求項５記載の単離された培養物又は細胞。
【請求項７】
温度安定性グリセロール発酵酵素をコードするポリヌクレオチド配列をクローン化する方法であって、
上記コーディングポリヌクレオチド配列を、ＡＴＣＣの命名ＰＴＡ−５８４として寄託されたカロラマトール  ビテルビエンシス（Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒ  ｖｉｔｅｒｂｉｅｎｓｉｓ）から単離し；
公知のグリセロール発酵酵素遺伝子の一部に相同なポリヌクレオチドプローブを、好熱性生物を含み得る環境サンプルからのポリヌクレオチド分子にハイブリダイズさせ；そして
上記プローブに結合するポリヌクレオチド配列を単離すること
からなる上記方法。
【請求項８】
第２のポリヌクレオチドプローブを用いたポリメラーゼ鎖反応を用いることにより上記ポリヌクレオチドプローブに結合するポリヌクレオチド配列を増幅する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ポリヌクレオチドプローブが公知のｄｎａＢ遺伝子の一部に相同である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ｄｎａＢ遺伝子がクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）由来である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも一つのポリヌクレオチドプローブが配列番号：１、配列番号：２、配列番号：５及び配列番号：６からなる群から選択される、請求項７または８記載の方法。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドプローブ及び第二のポリヌクレオチドプローブが配列番号：１及び配列番号：２である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ポリヌクレオチドプローブ及び第二のポリヌクレオチドプローブが配列番号：５及び配列番号：６である、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
温度安定性グリセロール発酵酵素をコードするポリヌクレオチド配列をクローン化する方法であって、
上記コーディングポリヌクレオチド配列を、ＡＴＣＣの命名ＰＴＡ−５８４として寄託されたカロラマトール  ビテルビエンシス（Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒ  ｖｉｔｅｒｂｉｅｎｓｉｓ）から単離し；
グリセロール上では嫌気性において成長できない標的生物を、好熱性生物からのＤＮＡを用いて形質転換し；そして
グリセロール上でのそれらの嫌気性成長によりグリセロールを１，３−プロパンジオールに発酵させる酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含む、それら形質転換された標的細胞を同定すること
からなる上記方法。
【請求項１５】
グリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵を触媒するＡＴＣＣの命名ＰＴＡ−５８４として寄託されたカロラマトール  ビテルビエンシス（Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒ  ｖｉｔｅｒｂｉｅｎｓｉｓ）である好熱性生物を単離する方法であって、
主要炭素源としてグリセロールを含む培地中で好熱性生物を含むサンプルをインキュベートし；そして
グリセロールを１，３−プロパンジオールに発酵させる少なくとも一つの好熱性生物を単離すること
からなる上記方法。
【請求項１６】
サンプルを約４０℃から約１００℃の範囲の温度にてインキュベートする、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
サンプルを嫌気性条件下でインキュベートする、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
約５０℃から約１００℃の間の温度を有する天然源からサンプルを得る、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
好熱性生物により１，３−プロパンジオールの生産を検出する工程をさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
好熱性生物により酢酸塩の生産を測定する工程をさらに含む、請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．技術分野
本発明は１，３−プロパンジオール生産のための改良された方法および試薬に関している。特に、本発明はグリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵を触媒できる新規好熱性生物および熱安定性酵素を提供する。本発明はまた、そのような好熱性生物を単離する方法、そのような酵素をコードするポリヌクレオチドをクローニングする方法、そのような酵素をコードしているポリヌクレオチド、および１，３−プロパンジオール製造のためにそのような酵素および生物を使用する方法にも関している。
【０００２】
２．背景技術
１，３−プロパンジオールはポリエステル繊維の生産およびポリウレタンおよび環状化合物の製造に使用されるモノマーである。
種々の１，３−プロパンジオール合成経路が知られている。例えば、１，３−プロパンジオールは：（１）ホスフィン、水、一酸化炭素、水素および酸の存在下、触媒上でのエチレンオキサイドの変換により；（２）アクロレインの触媒的液相水和、続いての還元により；または（３）一酸化炭素および水素存在下、周期律表のＶＩＩＩ族からの原子を持っている触媒上で炭化水素（例えば、グリセロール）を反応させることにより合成できる。しかしながら、伝統的化学合成法は費用がかかり、環境汚染物質を含んでいる一連の廃棄物を発生し、理想とはほど遠い。より費用がかからず、およびより環境に優しい、１，３−プロパンジオールを生産する別の方法および試薬を開発することが望まれている。
【０００３】
別の方法は、インビボ（即ち、微生物内で）またはインビトロでグリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵を触媒する酵素を使用することである。例えば、ＷＯ９８／２１３３９、ＷＯ９８／２１３４１および米国特許第５，８２１，０９２、５，２５４，４６７、５，６３３，３６２および５，６８６，２７６号を参照されたい。グリセロールから１，３−プロパンジオールを生産できる細菌株は、例えば、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ（Ｋｒｅｂｓｉｅｌｌａ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）およびペロバクター（Ｐｅｌｏｂａｃｔｅｒ）の群で発見されている。これらの細菌は２工程酵素触媒反応によりグリセロールを１，３−プロパンジオールへ変換する。第一の工程において、脱水酵素がグリセロールの３−ヒドロキシ−プロピオンアルデヒド（３−ＨＰ）および水への変換を触媒する（式１）。第二の工程において、３−ＨＰはＮＡＤ+−連結酸化還元酵素により１，３−プロパンジオールへ還元される（式２）。
【０００４】
グリセロール  →  ３−ＨＰ  ＋  Ｈ2Ｏ      （式１）
３ＨＰ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+→１，３−プロパンジオール＋ＮＡＤ+（式２）
１，３−プロパンジオールはさらに代謝されず、その結果、高濃度で培地中に蓄積できる。全体の反応は、還元型ｂ−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）への酸化を生じる。
【０００５】
グリセロールの１，３−プロパンジオールへの生物変換反応は一般的に、グリセロールを唯一の炭素源として使用し、および他の外因性の還元的に等価な受容体不在での嫌気的条件下で実施される。いくつかの細菌株において、例えば、シトロバクター、クロストリジウムおよびクレブシエラのある種の株、グリセロールのための平行経路が働き、それは最初に、ＮＡＤ+−（またはＮＡＤＰ+−）連結グリセロール脱水素酵素によるグリセロールのジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）への酸化を含んでいる（式３）。ＤＨＡはＤＨＡキナーゼによるジヒドロキシアセトンホスフェート（ＤＨＡＰ）へのリン酸化（式４）後、生合成に、およびＡＴＰ発生を支えるため（例えば、解糖を経て）に利用可能となる。
【０００６】
グリセロール＋ＮＡＤ+→ＤＨＡ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ+          （式３）
ＤＨＡ  ＋  ＡＴＰ  →  ＤＨＡＰ  ＋  ＡＤＰ          （式４）
１，３−プロパンジオール経路と対照的に、この経路は細胞に炭素およびエネルギーを提供し、ＮＡＤＨを消費するよりもむしろ生成する。
【０００７】
クレブシエラ ニューモニエ（ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびシトロバクター フロインディイ（ｆｒｅｕｎｄｉｉ）において、グリセロール脱水酵素（ｄｈａＢＣＥ）、１，３−プロパンジオール酸化還元酵素（ｄｈａＴ）、グリセロール脱水素酵素（ｄｈａＤ）およびジヒドロキシアセトンキナーゼ（ｄｈａＫ）の機能的連結活性をコードしている遺伝子はｄｈａレギュロン中に見いだされている。シトロバクターおよびクレブシエラからのｄｈａレギュロンは大腸菌で発現されており、グリセロールを１，３−プロパンジオールへ変換することが示されている（Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：３５４１−４６（１９９１）；Ｓｅｙｆｒｉｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂａｃｔ．１７８：５７９３−９６（１９９６）；Ｔｏｂｉｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２３５２−２２３５７（１９９６））。
【０００８】
１，３−プロパンジオールを生産するための生物的方法および試薬の使用に内在する潜在的利点のゆえ、優れた特性で、グリセロールおよび他の炭素基質を１，３−プロパンジオールに変換できる新規微生物および酵素を開発および同定する必要性が存在する。本発明は優れた微生物および酵素、ならびに他の優れた微生物および酵素を同定する方法を提供することによりそのような要求を満足させる。
【０００９】
３．発明の要約
本発明は１，３−プロパンジオール生産のための改良された方法および試薬に関している。特に、本発明はグリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵を触媒できる新規好熱性生物および熱安定性酵素を提供する。本発明はまた、そのような好熱性生物を単離する方法、そのような酵素をコードするポリヌクレオチドをクローニングする方法、そのような酵素をコードしているポリヌクレオチド、および１，３−プロパンジオール製造のためにそのような酵素および生物を使用する方法にも関している。
【００１０】
一つの様相において、本発明は好熱性生物中でグリセロールを１，３−プロパンジオールに変換するための方法を提供する、該方法は：グリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵させる好熱性生物を提供し；および１，３−プロパンジオールが生成されるような条件下で該好熱性生物を培養することから成っている。好適な態様において、本方法はさらに該好熱性生物により生成された１，３−プロパンジオールを集める工程を含んでいる。別の好適な態様において、好熱性生物はカロラマトール ビテルビエンシス（Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒ ｖｉｔｅｒｂｉｅｎｓｉｓ）であり、ＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として寄託されている微生物に由来する好熱性生物が特に好適である。
【００１１】
本発明はさらに、グリセロールから１，３−プロパンジオールを生産する方法を提供し、該方法は：グリセロールを熱安定性脱水酵素とインキュベートし、それによりグリセロールを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへ変換し、および３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドを１，３−プロパンジオールへ還元することから成っている。好適な態様において、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの１，３−プロパンジオールへの還元は熱安定性１，３−プロパンジオール酸化還元酵素により触媒される。別の好適な態様において、該方法はさらに１，３−プロパンジオールを集める工程を含んでいる。さらに別の好適な態様において、熱安定性脱水酵素はカロラマトール ビテルビエンシスのような好熱性生物に由来し、ＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として寄託されている微生物に由来する好熱性生物が特に好適である。
【００１２】
さらに別の本発明の様相は、Ｃ．ビテルビエンシスに由来する単離された熱安定性グリセロール発酵酵素を提供し、ここでＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として寄託されている微生物に由来する熱安定性グリセロール発酵酵素が特に好適である。特に好適な態様において、熱安定性グリセロール発酵酵素はグリセロール脱水酵素のような脱水酵素、または１，３−プロパンジオール酸化還元酵素のようなＮＡＤ+−連結酸化還元酵素である。本発明はさらにＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素に相同的である単離された熱安定性グリセロール発酵酵素を提供する。
【００１３】
本発明でさらに提供されるのは、Ｃ．ビテルビエンシスの単離された培養物または細胞である。非制限的実施態様において、培養物または細胞のゲノムはＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として寄託されている微生物のゲノムと少なくとも８５％同一であり、好適にはＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として寄託されている微生物のゲノムと９０％同一であり、より好適にはＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として寄託されている微生物のゲノムと９５％同一であり、最も好適にはＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として寄託されている微生物のゲノムと９９％同一である。別の非制限的実施態様において、培養物または細胞の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列はＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として寄託されている微生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と少なくとも９５％同一であり、好適にはＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として寄託されている微生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と少なくとも９８％同一である。
【００１４】
別の様相において、本発明は熱安定性グリセロール発酵酵素をコードするポリヌクレオチド配列のクローニング法を提供し、該方法は：既知のグリセロール発酵酵素の一部と相同的なポリヌクレオチドプローブを、好熱性生物を含んでいると予想される環境試料からのポリヌクレオチド分子とハイブリダイズさせ；および少なくとも一つのポリヌクレオチドプローブを結合するポリヌクレオチド配列を単離することから成っている。非制限的態様において、該方法はポリヌクレオチドプローブを結合するポリヌクレオチド配列を増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応を使用する。好適な態様において、熱安定性グリセロール発酵酵素はグリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵させると同定された好熱性生物から誘導され、Ｃ．ビテルビエンシスが特に好適である。別の好適な態様において、ポリヌクレオチドプローブは既知のｄｈａＢ遺伝子の一部と相同的であり、クレブシエラからのｄｈａＢ遺伝子と相同的なプローブが特に好適である。
【００１５】
本発明はさらに、熱安定性グリセロール発酵酵素をコードするポリヌクレオチド配列のクローニング法を提供し、該方法は：グリセロール上で嫌気的には増殖できない標的生物を好熱性生物からのＤＮＡで形質転換し；およびグリセロール上での嫌気的増殖により、グリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵させる酵素をコードしているポリヌクレオチド配列を含む形質転換された標的生物を同定することから成っている。非制限的態様において、熱安定性グリセロール発酵酵素はＣ．ビテルビエンシスのように、グリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵させると同定された好熱性生物から誘導され、ＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として寄託されている微生物に由来する好熱性生物が特に好適である。
【００１６】
本発明のさらに別の様相は、グリセロールの１，３−プロパンジオールへの発酵を触媒する好熱性生物を単離する方法を提供し、該方法は：好熱性生物を含んでいる試料を、主たる炭素源としてグリセロールを含んでいる培地中でインキュベートし；およびグリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵させる少なくとも一つの好熱性生物を単離することから成っている。非制限的態様において、試料は約４０℃から約１００℃の範囲の温度および／または嫌気的条件下でインキュベートする。別の非制限的態様において、試料は室温から約１００℃、より好適には約５０℃から約１００℃の間の温度を持つ天然起源物から得られる。好適な態様において、本方法はさらに好熱性生物による１，３−プロパンジオールおよび／またはアセテートの生成を検出する工程を含んでいる。
【００１７】
５．発明の詳細な説明
好熱性生物とは、ほとんどの他の生物（例えば、中温）は生存することができない、高められた温度で生存および増殖できる生物である。この異常な高温に対する弾力性は、一部、これらの生物が生命の生物学的反応を触媒するために熱安定性酵素を使用しているためである。熱安定性酵素は好熱性生物が代謝反応を高められた温度で触媒することを可能にする。そのような生物は室温環境から単離することもできるが、例えば、温泉、熱通風口およびローンドロマット流出物を含む高温環境からより有望に単離される。好熱性細菌および酵素の異常な熱安定性は、経済的に価値がある生物変換反応を、中温生物および酵素を使用して達成できるより高い温度で触媒することを可能にする。多くの場合、好熱性細菌は発酵過程においてインビボで所望の反応を触媒するために使用される。もしくは、熱安定性酵素はインビトロまたは“無細胞”生物変換反応で触媒させるために、典型的には反応の制御および反応生成物の回収を容易にするために固定化されている酵素として使用できる。
【００１８】
高められた温度で生物変換反応を実施することにより多くの利点が達成できる。化学反応の場合のように、反応の温度を高くするにつれて、酵素的触媒反応の速度が一般的に劇的に増加する。工業的生物変換反応が進行する速度を速くすることから明白な効率恩恵が誘導される。加えて、ほとんどの可能性のある夾雑生物が生存できない高い温度で反応を行うことにより、反応媒質の微生物夾雑を防止することが可能である。
【００１９】
高温で生物変換反応を触媒させるために好熱性生物を使用する別の利点は、いくつかの場合、高温は反応媒質からの所望の生成物の分離および単離を容易にする。例えば、米国特許第５，１８２，１９９号は反応媒質からのエタノールの分離を容易にするための、熱安定性酵素および高温発酵の使用を開示している。
【００２０】
高温に対して安定性であることを超えて、熱安定性酵素はまた、通常酵素を不活性化する別の条件および基質に対する高められた安定性を持っていることも一般的に観察されている。熱安定性酵素はまた、中温生物に由来する酵素よりも長い保存期間を持っている傾向がある。本発明は１，３−プロパンジオールの酵素触媒生産のための改良された方法および試薬を提供する。本発明の一部は、最初の、グリセロールの１，３−プロパンジオールへの発酵を触媒できる好熱性生物および熱安定性酵素を提供する。これらの生物および酵素の一つの新規な特徴は、従来同定された１，３−プロパンジオール産生生物および酵素が急速に不活性化される、高められた温度において、生存可能および触媒的に活性のまま残っているそれらの能力である。本発明の方法および組成物は高められた温度でグリセロールを１，３−プロパンジオールへ生物的に変換するために使用でき、それにより従来説明された方法、特に低温で実施される方法に対して著しい利点を提供する。本発明はさらに、グリセロールから１，３−プロパンジオールを生成できる好熱性生物を同定する方法、ならびに、この変換を触媒する熱安定性酵素をコードするポリヌクレオチドのクローニング法も含んでいる。
【００２１】
５．１  高められた温度でグリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵できる好熱性生物、およびそのような生物の単離
一つの態様において、本発明は高められた温度でグリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵できる好熱性生物を提供する。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語“好熱性生物”とは高温で、好適には５０℃より高い温度で、より好適には６０℃より高い温度で、さらにより好適には７０℃より高い温度で、最も好適には８５℃より高い温度で増殖できる生物を指している。８５℃より高い温度で増殖できる生物は高好熱性生物と呼ばれている。好熱性生物の例は、例えば、原核微生物真性細菌および古細菌間で発見できる。そのような生物は、温泉、火山地域および潜水艦熱通風口のような熱い環境に住んでおり、そこから単離できる。加えて、好熱性生物は室温で供給源から単離できる。
【００２３】
本発明の好適な態様において、高められた温度でグリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵できる好熱性生物はカロラマトール ビテルビエンシスの株である。Ｃ．ビテルビエンシスはグリセロールを１，３−プロパンジオールおよびアセテートへ発酵できる好熱性細菌の種である。Ｃ．ビテルビエンシスは本明細書では以下のような同定特性を持っている細菌種として定義される：該種は（１）好熱性であり；（２）グリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵でき；および（３）ＡＴＣＣ名称ＰＴＡ−５８４として寄託されているＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５T株型と“実質的なゲノム配列同一性”を共有している。
【００２４】
本発明の非制限的実施態様において、種Ｃ．ビテルビエンシスのメンバーはまたＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５T株型の以下の同定特性も共有している。ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５T細胞は直径が０．４から０．６μｍの、まっすぐなまたはわずかに湾曲した杆菌である。細胞は単独で存在し、グラム染色陽性である。ｐＨ６．０での増殖するための温度範囲は３３−６４℃であり、至適温度は５８℃である。増殖のためのｐＨ25C範囲は５．０から７．６、至適には６．０−６．５である。グリセロール、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、スクロース、セレビオース、ラクトース、デンプンおよび酵母抽出物で増殖が観察される。この株はキシロース、アラビノース、アセテート、ラクテート、ホルメート、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、ｎ−ブタノール、プロピオナート、アセトン、スクシネート、エチレングリコール、１，２−プロパンジオール、フェノールおよびベンゾエートを認められるほど発酵させない。Ｈ2：ＣＯ2存在下、自己栄養条件下では増殖は認められない。グリセロールの発酵から主有機生成物としてアセテートおよび１，３−プロパンジオールが得られ、増殖の間に著しい量のＨ2が発生される。増殖はアンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、リファンピシンおよびカナマイシンで阻害される（すべて１００μｇ／ｍｌで）。ストレプトマイシンまたはテトラサイクリンは同量で増殖を遅らせる。ＨＰＬＣで決定された株ＤＮＡのＧ＋Ｃ含量は３２モル％である。
【００２５】
種Ｃ．ビテルビエンシスの推定メンバーを同定するため、用語“実質的なゲノム配列同一性”とは：ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５T株型のゲノム配列と生物のゲノム配列が少なくとも９０％の同一性、好適には少なくとも９５％の同一性、およびより好適には少なくとも９９％の同一性であるか；またはＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５T株型の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列と生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列が少なくとも９０％の同一性、好適には少なくとも９５％の同一性、およびより好適には少なくとも９９％の同一性であることを指している。
【００２６】
実質的な配列同一性は推定Ｃ．ビテルビエンシスおよびＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tの全ゲノム配列を比較することにより決定できる。もしくは、実質的な配列同一性は推定Ｃ．ビテルビエンシスおよびＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tの１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列を比較することにより決定できる。ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tおよび推定Ｃ．ビテルビエンシスゲノムのすべてまたは一部の配列、特に生物の１６Ｓ  ｒＤＮＡの配列、は当業者にはよく知られている通常の核酸配列決定技術により決定できる（例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ  ｅｔ．ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（１９８９）およびＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，編，１９８９）を参照されたい）。続いて、当業者にはよく知られている配列比較法を使用して配列が比較できる。例えば、Ｗｏｒｌｄ−Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ上のｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．から入手可能なＢＬＡＳＴコンピュータープログラム、バージョン２．０を使用して、パーセント同一性が計算できる。ＢＬＡＳＴの説明は、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）を参照されたい。
【００２７】
特別な態様において、本発明はそのゲノムが低ストリンジェンシー条件下でＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５T株型のゲノムへハイブリダイズ可能で、グリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵ができる好熱性微生物を提供する。別の好適な態様において、本発明はその１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列が低ストリンジェンシー条件下でＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５T株型の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列へハイブリダイズ可能な、グリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵ができる好熱性微生物を提供する。低ストリンジェンシーのそのような条件を使用する方法は以下のようであろう（Ｓｈｉｌｏ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６７８９−６７９２（１９８１）もまた参照されたい）：ＤＮＡを含んでいるフィルターは  ３５％ホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＣ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＰＶＰ、０．１％フィコール、１％ＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含んでいる溶液中、４０℃で６時間前処理する。ハイブリダイゼーションは下記の変更を加えた同じ溶液中で実施する：０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫酸デキストランおよび５−２０ｘ１０6ｃｐｍ32Ｐ−標識プローブを使用する。フィルターはハイブリダイゼーション混合物中、４０℃で１８−２０時間インキュベートし、次に２Ｘ  ＳＳＣ、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳを含んでいる溶液中、５５℃で１．５時間洗浄する。洗浄溶液を新しい溶液に置き換え、さらに６０℃で１．５時間洗浄する。フィルターは吸い取って乾燥し、オートラジオグラフィーのために暴露する。必要に応じ、フィルターは６５−６８℃で３回目の洗浄を行い、フィルムに暴露する。低ストリンジェンシーの他の条件は当業者にはよく知られている（例えば、交差−種ハイブリダイゼーションで用いるような）。
【００２８】
別の特別な態様において、本発明はそのゲノムが中程度のストリンジェンシー条件下でＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５T株型のゲノムへハイブリダイズ可能な、グリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵ができる好熱性微生物を提供する。好適な態様において、本発明はその１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列が中程度のストリンジェンシー条件下でＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５T株型の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列へハイブリダイズ可能な、グリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵ができる好熱性微生物を提供する。中程度のストリンジェンシーのそのような条件を使用する方法は以下のようであろう：ＤＮＡを含んでいるフィルターは６Ｘ  ＳＳＣ、５Ｘデンハート溶液、０．５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含んでいる溶液中、５５℃で６時間前処理する。ハイブリダイゼーションは同じ溶液中で実施し、および５−２０ｘ１０6ｃｐｍ32Ｐ−標識プローブを使用する。フィルターはハイブリダイゼーション混合物中、５５℃で１８−２０時間インキュベートし、次に１Ｘ  ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含んでいる溶液中、６０℃で３０分間洗浄する。フィルターは吸い取って乾燥し、オートラジオグラフィーのために暴露する。中程度のストリンジェンシーの他の条件は本分野ではよく知られている。フィルターの洗浄は２Ｘ  ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含んでいる溶液中、３７℃で１時間行う。
【００２９】
別の特別な態様において、本発明はそのゲノムが高ストリンジェンシー条件下でＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５T株型のゲノムへハイブリダイズ可能な、グリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵ができる好熱性微生物を提供する。好適な態様において、本発明はその１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列が高ストリンジェンシー条件下でＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５T株型の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列へハイブリダイズ可能な、グリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵ができる好熱性微生物を提供する。高ストリンジェンシーのそのような条件を使用する方法は以下のようであろう：ＤＮＡを含んでいるフィルターは５Ｘ  ＳＳＣ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．０２％ＢＳＡおよび５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡから成る緩衝液中、６０℃で８時間から一夜、前ハイブリダイゼーションを実施する。フィルターは１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび５−２０ｘ１０6ｃｐｍ32Ｐ−標識プローブを含んでいる前ハイブリダイゼーション混合液中、６５℃で４８時間ハイブリダイズする。フィルターの洗浄は２Ｘ  ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％フィコールおよび０．０１％ＢＳＡを含んでいる溶液中、３７℃で１時間行う。続いて０．１Ｘ  ＳＳＣ中、５０℃で４５分間洗浄洗浄した後にオートラジオグラフィーを行う。使用されるであろう高ストリンジェンシーの他の条件は本分野ではよく知られている。
【００３０】
種Ｃ．ビテルビエンシスはさらにＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５T株型の子孫を含んでおり、ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５T株型に関して改変された遺伝子型および／または表現型を持っている子孫を含んでいる。表現型および／または遺伝子型は方向付けられたおよび無作為の突然変異発生の結果を含んでいる突然変異により改変できる。本発明は１，３−プロパンジオールの産生を促進するように特異的に設計された単一または多突然変異を持っている細胞を提供する。例えば、基質または生成物抑制に抵抗性である様式でグリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵できる変異株を意図することが本発明で特に有用であろう。
【００３１】
変異体を作り出す方法は普通であり、本分野ではよく知られている。例えば、野生型細胞は、放射線または化学的突然変異誘発剤のような種々の因子へ暴露でき、所望の表現型でスクリーニングされる。放射線照射により突然変異を作り出す場合、紫外（ＵＶ）またはイオン化放射線が使用できる。放射線または化学薬品を使用して変異体を作り出す特異的方法は本分野では十分に証明されている。例えば、Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第二版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，またはＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７−３４（１９９２）（本明細書に組み入れられる）を参照されたい。突然変異発生処理に続いて、所望の表現型を持っている変異体は種々の方法により選択される。無作為スクリーニングが最も普通であり、突然変異誘発された細胞は所望の特質で選択される。変異体選択の方法は高度に開発されており、工業微生物学の分野ではよく知られている。例えば、Ｂｒｏｃｋ、前記文献、を参照されたい。
【００３２】
本発明はさらに、グリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵できる培養好熱性生物を単離および維持するための方法に関している。そのような生物は本発明の態様の実施に有用であり、例えば、それらは高められた温度でグリセロールを１，３−プロパンジオールへ生物学的に変換するために使用でき、またはそれらはグリセロールを発酵する熱安定性酵素またはそれをコードしているポリヌクレオチド源として使用できる。
【００３３】
細菌培養物の維持および増殖に適した材料および方法は、例えば、ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥＲＡＬ  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬＯＧＹ（Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，編），Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．またはＢｒｏｃｋ，前記文献、に見ることができる。細菌細胞の維持および増殖に使用される試薬および材料は商業的供給会社、例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓ．）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍｉｃｈ．）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ  Ｍｄ．）またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）から得ることができる。
【００３４】
本発明の好熱性生物（例えば、Ｃ．ビテルビエンシス）は好熱性生物の増殖を導く任意の環境、例えば、熱通気口、温泉または土壌および水およびそれらの周りの堆積物またはローンドロマット流出物、から単離できる。例えば、堆積物、水またはそれらの混合物から成る試料が興味を引く環境から集められる。試料から単離された生物増殖の至適状態の指標として、採取地点でのｐＨおよび温度を決定することが望ましい。試料は次に基本増殖培地、好適にはグリセロールが唯一のまたは主たる炭素源である培地に接種するために使用される。典型的には、約１０％（ｗ／ｖ）の最終濃度で基本培地に試料が接種される。培地のｐＨは好適には採取地点のｐＨとほとんど同じであるべきである。もしくは、異なったｐＨ増殖依存性を持っている生物を選択するため、異なったｐＨの多数の基本増殖培地へ接種できる。増菌培養物は次に高温で、好適には少なくとも約５０℃で、より好適には少なくとも約６０℃で、および最も好適には少なくとも約７５℃でインキュベートされ、好適には嫌気的または微好気的環境で実施される。増殖している好熱性生物のためのガイダンスは例えば、ＴＨＥＲＭＯＰＨＩＬＥＳ：ＧＥＮＥＲＡＬ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＡＮＤ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｔ．Ｄ．Ｂｒｏｃｋ，編，（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．），第４章，Ｗｅｉｇｅｌ，Ｊ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｔｈｒｍｏｐｈｉｌｅｓ”，ｐｐ．１７−３７に見ることができる。
【００３５】
増菌培養が炭素源としてグリセロールを利用できることが観察された場合、均質培養物は培養物の希釈系列を調製することにより単離でき、軟寒天オーバーレイ（例えば、０．８％寒天を含んでいる基本培地）を使用して固形基本培地（例えば、１．５％寒天）上に該系列をプレーティングし、選び出し、同一の組成の液体培地中で単一コロニーを継代培養し、１，３−プロパンジオールおよび／またはアセテートの形成を検査する。１，３−プロパンジオールは培地を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析にかけることにより直接的に同定できる。例えば、発酵培地は、０．０１Ｎ硫酸の移動相をイソクラクティック様式で使用する分析用イオン交換カラムで分析できる。もしくは、１，３−プロパンジオールは、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）およびガスクロマトグラフィー−質量分光法（ＧＣ−ＭＳ）を含む（これらに制限されるわけではない）他の適当な分析技術を使用して同定できる。
【００３６】
グリセロールを１，３−プロパンジオールに変換できることが観察された好熱性生物株は本分野で知られている培養維持および保存技術を使用して培養物として維持できる。これらの方法には短期間保存のための冷蔵、より長い保存のための液体窒素中での凍結、および細胞を脱水する凍結乾燥が含まれる。保存法の選択は培養物の性質、利用可能な設備に依存する。凍結が使用される場合、凍結および融解の速度は、凍結間に形成される氷の結晶は膜を破壊できるので、微生物の生存を確実にするため注意深く制御されなければならない。グリセロールはしばしば氷の結晶による損傷を防止し、凍結培養物が融解される場合に生存可能な微生物を回復させる能力を確実にするための“アンチフリーズ”剤として用いられる。
【００３７】
５．２  高められた温度で１，３−プロパンジオールを産生できる熱安定性酵素
一つの態様において、本発明は高められた温度でグリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵工程を触媒する酵素を提供し、本明細書では熱安定性グリセロール発酵酵素と称される。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語“熱安定性グリセロール発酵酵素”とはグリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵における少なくとも一つの反応工程を触媒し、それは“熱安定性”である、即ち、高温、好適には５０℃より高い温度で、より好適には６０℃より高い温度で、さらにより好適には７０℃より高い温度で、および最も好適には８５℃より高い温度で安定でありおよび活性である。与えられた温度で、もし酵素が少なくとも５分間、好適には少なくとも３０分間、より好適には少なくとも１時間、さらにより好適には少なくとも８時間、および最も好適には少なくとも２４時間またはそれ以上その温度に暴露された後にその本来の触媒活性の５０％保持できるとしたら、酵素は“熱安定性”である。多くの例において、熱安定性酵素はまた類似の機能的特性を共有する非熱安定性酵素よりも、より長い保存寿命も持っており、物理的撹拌または有機溶媒への暴露のような変性条件に対してより安定である。
【００３９】
好適な態様において、本発明はＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素を提供する。好適な、しかし非制限的である実施態様において、本発明はＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性脱水酵素を提供する。別の好適な、しかし非制限的である実施態様において、本発明はＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性１，３−プロパンジオール酸化還元酵素を提供する。本発明の特に好適な実施態様において、熱安定性グリセロール発酵酵素は株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tに由来する。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語“脱水酵素”とは、グリセロール分子の生成物３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドへの変換を触媒できる酵素を指している。脱水酵素の特別の例はグリセロール脱水酵素およびジオール脱水酵素、即ち、各々グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの好ましい基質を持っている脱水酵素である。
【００４１】
用語“１，３−プロパンジオール酸化還元酵素”とはＮＡＤＨの随伴性酸化を伴って、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒドの１，３−プロパンジオールへの変換を触媒できる酵素を指している。
【００４２】
グリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵における反応工程を触媒する能力は、酵素の活性をアッセイすることにより決定できる。グリセロール発酵活性は当業者にはよく知られている技術を使用してアッセイできる。例えば、脱水酵素の活性をアッセイする方法はＰｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２４５：３９８−４１（１９９７），Ｈｏｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂａｃｔ．１４３：１４５８−６５（１９８０），およびＭａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６４：２１−２８（１９９８）、（本明細書に全体が組み入れられる）に説明されている。１，３−プロパンジオール酸化還元酵素活性をアッセイする方法は、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．．Ｊ．  ｏｆ  Ｂａｃｔ．１６９：２０５０−５４（１９８７）（本明細書に全体が組み入れられる）に説明されている。酵素活性は例えば、Ｈｏｎｄａらにより説明されているように、トルエン処理細胞を使用してその場所で決定できる。グリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵における反応工程を触媒する能力はまた、通常はグリセロールを発酵できない宿主細胞中で酵素を発現させ、酵素の発現が細胞のグリセロール発酵を可能にしたかどうかをアッセイすることによっても決定できる。
【００４３】
本発明の目的のため、熱安定性１，３−プロパンジオール産生酵素は、もし（ａ）それがＣ．ビテルビエンシスまたはＣ．ビテルビエンシスの特定の株により内因的に発現され、またはそのアミノ酸配列がＣ．ビテルビエンシスまたはＣ．ビテルビエンシスの特定の株に存在するポリヌクレオチドコード配列によりコードされている、および（ｂ）それが本発明の実施に有用である、であればＣ．ビテルビエンシスまたはＣ．ビテルビエンシスの特定の株に“由来”している。本明細書で使用される場合、もし酵素が熱安定性グリセロール発酵酵素であり（即ち、グリセロールから１，３−プロパンジオールへの発酵における少なくとも一つの反応工程を触媒する酵素）、および高温、好適には５０℃より高い温度で、より好適には６０℃より高い温度で、さらにより好適には７０℃より高い温度で、および最も好適には８５℃より高い温度で安定でありおよび活性であれば、酵素は“本発明の実施に有用”である。
【００４４】
本発明はさらに、Ｃ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素と相同的である酵素も提供する。本発明の目的には、もし（ａ）中程度のストリンジェンシー条件下、即ち、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、６５℃でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、および０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、４２℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ｐ．２．１０．３）、Ｃ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素をコードするポリヌクレオチドの相補体へハイブリダイズするポリヌクレオチドコード配列によりそのアミノ酸配列がコードされ；および（ｂ）それが本発明の実施に有用である、であれば酵素はＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素と“相同的”である。好適な態様において、相同的酵素は、高度にストリンジェントな条件下、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ4、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、６５℃でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、および０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６８℃での洗浄（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、前記文献）、Ｃ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素をコードするポリヌクレオチドの相補体へハイブリダイズするポリヌクレオチドコード配列によりコードされており、本発明の実施に有用である。
【００４５】
Ｃ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素と相同的である酵素は、種々の形をとることができる。本発明のいくつかの態様において、相同的酵素はＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素からの変異体であり、一つまたはそれ以上のアミノ酸残基が異なったアミノ酸残基で置換されており、本発明の実施に有用な酵素を生じている。突然変異は保存的であってもよく、そこではアミノ酸残基は、酸性度、極性または側鎖のかさ高さのような同様の機能的および構造的特性を共有する別のアミノ酸残基置換されている。突然変異は非保存的であってもよく、そこでは置換されたアミノ酸残基の機能的および／または構造的特性は保存されていない。いくつかの場合、Ｃ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素からの変異体は天然の酵素と比較すると、改変された触媒能力、安定性またはｐＨまたは温度至適性のような改変された機能的特性を持っているであろう。そのような変異体は、Ｃ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素と相同的である限り、本発明の範囲内に含まれている。
【００４６】
酵素の変異体形は当業者にはよく知られている種々の技術により発生できる。これらの技術の多くは米国特許第５，８３０，６９６号（本明細書に全体が組み入れられる）に概説されており、それは熱安定性酵素の方向付けられた発生を説明している。もしくは、変異体酵素は無作為に作製でき、または生物中で自発的に発生する。
【００４７】
さらに、Ｃ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素と相同的である酵素は、天然のＣ．ビテルビエンシス酵素の欠失変異体または端切断変異体でもよい。そのような酵素形の使用はある場合には望ましく、例えば、欠失または端切断は対応する天然の酵素と比較して安定性が促進されおよび精製が容易である。
【００４８】
本発明はさらにＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素のキメラ形であるＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素と相同的である酵素を提供する（即ち、蛋白質融合）。例えば、キメラは酵素の安定性を改良し、または精製を容易にするため（例えば、イオン交換、金属キレート、基質親和性またはイムノアフィニティーマトリックスと会合できる部分の包含）に有用であろう。好適な態様において、本発明はセルロースのような固形支持体へ共有結合で結合された相同的酵素を提供する。
【００４９】
さらに、本発明はＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素と相同的である酵素を提供し、それは異なった微生物（好適には好熱性微生物）に由来する。そのような酵素の例は、異なった種からの遺伝子によりコードされた酵素として定義される熱安定性グリセロール発酵酵素“同族体”であり、ここで該遺伝子は当業者により、約８０％より高いヌクレオチド配列同一性の程度に基づいてＣ．ビテルビエンシスグリセロール発酵酵素同族体と認められる。配列同一性は前に説明したようなＢＬＡＳＴプログラムを使用して決定できる。
【００５０】
一つの態様において、本発明は単離された熱安定性グリセロール発酵酵素を提供し、ここで用語“単離された”とは、酵素が少なくとも部分的に純粋であること、即ち、酵素の重量パーセントが、調製試料中の他の物質と比較して、天然に観察されるであろうよりは高い調製試料が提供されることを示している。好適な態様において、本発明は夾雑している蛋白質の重量で少なくとも９０％純粋、およびより好適には夾雑している蛋白質の重量で少なくとも９５％純粋である単離された熱安定性グリセロール発酵酵素を提供する。
【００５１】
前記酵素の調製および単離に有用な材料および方法は以下に説明される。一つの態様において本発明の酵素は好熱性生物、特に該酵素を内因的に発現するのＣ．ビテルビエンシス株から単離される。もしくは、本発明の酵素は、酵素をコードしているポリヌクレオチド配列を適した宿主細胞内へ導入し、コードされた遺伝子産物を発現することにより組換え的に産生できる。本発明の酵素はまたインビトロ翻訳、または化学合成技術によっても製造できる。
【００５２】
５．３  グリセロールを１，３−プロパンジオールへ変換する熱安定性酵素をコードしているポリヌクレオチドのクローニング法
本発明は熱安定性グリセロール発酵酵素またはその断片をコードしているポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドの同定、単離およびクローニングのための方法を提供する。これらの方法は、好熱性生物に由来するポリヌクレオチドコーディング配列または好熱性生物を提供し、熱安定性グリセロール発酵酵素をコードしているポリヌクレオチド配列またはその断片のスクリーニングを含んでいる。試料は種々の形をとることができ、当業者には既知の種々の異なった技術で調製される。同様に、試料のスクリーニングは多くの適した技術を使用して達成でき、そのいくつかの非制限的例は以下に説明されている。
【００５３】
本明細書に開示されているポリヌクレオチド分子およびオリゴヌクレオチド分子の生成および操作は当業者には普通のことであり、とりわけ、ＳＡＭＢＲＯＯＫ  ｅｔ．ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，編，１９８９）；ＰＣＲ  ＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ．ａｌ．，編，１９９５）；およびＰＣＲ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｅｒｌｉｃｈ編，１９９２）（これらはすべて本明細書に組み入れられる）に説明されている組換え技術に従って実施できる。
【００５４】
本発明のいくつかの態様において、グリセロール発酵酵素をコードしていると信じられているヌクレオチド配列を持つプローブ、またはその一部に相当するプローブ（類）で試料がスクリーニングされる。プローブ配列は既知のグリセロール発酵酵素のアミノ酸配列またはそのいくつかの配列、またはそのよう酵素をコードしているポリヌクレオチド配列に基づくことができる。例えば、ＣＲＥＩＧＨＴＯＮ，ＰＲＯＴＥＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ（１９８３）に説明されているアミノ酸配列決定技術を使用してグリセロール発酵酵素の一部のアミノ酸配列が決定でき、その情報が縮重プローブの組を発生させるために使用される。本発明の好適な態様において、試料はＣ．ビテルビエンシスのような好熱性生物に由来する脱水酵素または酸化還元酵素をコードしている配列に基づいたプローブ（類）を使用してスクリーニングされる。もしくは、プローブはｄｈａＢＣＥまたはｄｈａＴ遺伝子（各々グリセロール脱水酵素および酸化還元酵素をコードしている）のような非好熱性生物（例えば、Ｋ．パステウリアヌム（ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、Ｃ．フロインディイ（ｆｒｅｕｎｄｉｉ）またはＣ．パステウリアヌム（ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ））に由来するグリセロール発酵酵素−コーディング遺伝子に基づくこともできる。ｄｈａＢＣＥ遺伝子のヌクレオチド配列は文献に報告されている（例えば、Ｍａｃｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ：Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １６４：２１−２８（１９９８）（Ｃ．パステウリアヌム）；Ｓｅｙｆｒｉｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７８：５７９３−９６（１９９６）（Ｃ．フロインディイ）；およびＴｏｂｉｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２３５２−５７（１９９６）（Ｋ．パステウリアヌム）を参照されたい）。ｄｈａＴ遺伝子のヌクレオチド配列も報告されている（例えば、Ｌｕｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１５４：３３７−４５（１９９７）（Ｃ．パステウリアヌム）；およびＤａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：２１５１−５６（１９９５）（Ｃ．フロインディイ）を参照されたい）。本発明により提供される特異的プローブにはＫ．パステウリアヌムのｄｈａＢ遺伝子に基づいたプライマー対が含まれ（例えば、ｄｈａＢ１５’（配列番号：１）；ｄｈａＢ１３’（配列番号：２）；ｄｈａＢ２５’（配列番号：３）；ｄｈａＢ２３’（配列番号：４）；ｄｈａＢ３５’（配列番号：５）；およびｄｈａＢ３３’（配列番号：６）での例示的実施態様により以下に説明されるように）、それらはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるグリセロール発酵酵素−コーディングポリヌクレオチドまたはその断片の増幅に特に有用である。そのようなプライマー対は、問題とする生物からのグリセロール発酵酵素−コーディングポリヌクレオチドのセグメントの増幅に使用でき、それは順に、同一のまたは異なった生物からの完全長コード配列の同定およびクローニングに使用できる。プローブは例えば、ｃＤＮＡライブラリー中の相同的配列を同定するために標識��きる。もしくは、プローブは、プライマーにより認識された配列に隣接するポリヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーとして使用できる（特にＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによる）。特に、問題とする配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから、単離された生物から、または環境試料から、以下により詳細に説明するように増幅できる。
【００５５】
本発明の一つの態様において、スクリーニングされるべき試料は好熱性生命を導く環境から集められた水、土壌または泥試料のような好熱性生物を含んでいることが疑われる環境試料である。典型的には、試料中に存在する核酸が相補的プローブ（例えば、ＰＣＲプライマー）との相互作用に利用できように環境試料が調製されるであろう。グリセロール発酵酵素−コーディング化ポリヌクレオチドまたはその断片は、前記のようにプローブとハイブリダイズするその能力で認識できる。
【００５６】
環境試料から本発明のポリヌクレオチドを単離およびクローニングする好適な方法はＰＣＲによるものである。この技術は相同的酵素または同様の活性を持つ酵素をコードしているポリヌクレオチド間の配列相同性を利用する。本方法は、環境試料からの相同的ポリヌクレオチド配列またはその断片を増幅するために、既知のグリセロール発酵酵素−コーディングポリヌクレオチドまたはその断片に基づいたプライマー組を用いる。相同的ポリヌクレオチドは、本分野でよく知られている通常のＰＣＲ方法論を使用し、試料中のＤＮＡから、特に試料中の微生物のゲノムＤＮＡから増幅できる。もしくは、相同的ポリヌクレオチドは、試料中のＲＮＡ、特にｍＲＮＡまたは全ＲＮＡから、ＲＮＡの第一鎖ｃＤＮＡコピーを合成し、ＰＣＲによりｃＤＮＡを増幅することにより（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）増幅できる。当業者には既知の技術を使用して、反応のアニーリング条件を調整して相同性の望まれるレベルでのプライマーのハイブリダイゼーションが可能であり、それにより、プライマーが基づいている配列とより多いまたはより少ない相同性を共有する配列の増幅が可能である。この方法は完全グリセロール発酵酵素−コーディングオープンリ−ディングフレーム（“ＯＲＦ”）またはその断片の単離を可能にする。グリセロール発酵酵素−コーディングＯＲＦの一つまたはそれ以上の断片がクローン化でき、完全ＯＲＦを生成するように一緒にスプライスできる。増幅されたグリセロール発酵酵素−コーディングＯＲＦは次に、本発明の種々の態様での実施においてコードされたグリセロール発酵酵素を発現するために使用できる。例えば、配列は宿主細胞内へ導入でき、それにより宿主細胞がグリセロールを発酵するのを可能にする。もしくは、発現された酵素は無細胞発酵のような応用のために精製できる。もしくは、ＯＲＦ配列はそれ自身、新規熱安定性グリセロール発酵酵素−コーディング配列のさらなる検出および単離のための新規プライマーおよびプローブを設計するために使用できる。
【００５７】
本発明の別の態様において、試料はポリヌクレオチドライブラリー、好適には好熱性生物、特にグリセロールから１，３−プロパンジオールの発酵ができることが知られている生物から調製されたゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーである。分子生物学技術およびどのようにｃＤＮＡライブラリーおよびゲノムライブラリーを作製するかについての一般的バックグラウンドについては、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，前記文献；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前記文献；および米国特許第５，６５０，１４８号を参照されたい。ライブラリーは、前記のように、適切な標識プローブと共に核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング技術を使用してスクリーニングできる。適したスクリーニング技術は、とりわけ、Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０（１９７７）（バクテリオファージライブラリー）およびＣｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２：３９６１−６５（１９７５）（プラスミドライブラリー）（これらの報文は本明細書に組み入れられる）に示されている。
【００５８】
本発明のさらに別の態様において、試料は単離された生物または複数の生物、または単離された生物または複数の生物から発生されたポリヌクレオチドライブラリーを含んでおり、それらからＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲを使用して本発明のポリヌクレオチドが増幅できる。好適には、使用した単離された生物または複数の生物は好熱性であり、グリセロールを発酵できる。
【００５９】
本発明の一つの態様において、発現ライブラリーが構築され、それはライブラリーのポリヌクレオチド構築物によりコードされている遺伝子産物の発現を方向付けできる。
【００６０】
本発明の特に好適な態様において、発現ライブラリーは、グリセロールの発酵中の工程を触媒する遺伝子産物をコードする能力でその構築物を試験することにより機能的にスクリーニングされる。好適な態様において、通常はグリセロールの１，３−プロパンジオールへの発酵ができない生物が、前記のようなＤＮＡライブラリー、好適にはグリセロールを発酵できることが知られている好熱性生物から調製されたライブラリーの構築物で形質転換される。形質転換された生物は次に、グリセロール上の嫌気的増殖による、グリセロールから１，３−プロパンジオールへ発酵させる能力でスクリーニングされる。形質転換された微生物は１，３−プロパンジオールおよび／またはアセテートの産生でスクリーニングできる。グリセロール上で嫌気的に増殖する、また１，３−プロパンジオールおよび／またはアセテートを産生する能力は、生物を形質転換するために使用されたライブラリー構築物が、グリセロールの発酵に必要とされる酵素活性を提供できる酵素をコードしていることを示している。ライブラリー構築物は続いて標準技術によりクローン化および特徴付けでき、および本発明の種々の様相での実施に使用できる。
【００６１】
上記の機能的クローニング戦略で形質転換された微生物は、グリセロールを発酵する能力が本来欠けているものか、または突然変異（例えば、グリセロール発酵に必要とされる遺伝子の一つにおけるヌル突然変異）の結果としてグリセロールを発酵する能力を失った微生物であろう。そのような突然変異は本分野ではよく知られている技術を使用して生物内で遺伝子操作できる。微生物は好熱性であろうが、必ずしもそうでなくてもよい。単一の酵素活性の導入によりグリセロールを発酵する能力が回復できるように、試験生物は一つを除き、すべてのグリセロール発酵に必要とされる酵素活性を持っているものが好適である。
【００６２】
もしくは、発現された遺伝子産物は、グリセロール発酵酵素に対して高められた抗体と共に標準技術を使用して免疫学的にスクリーニングできる。そのようなスクリーニング技術については、例えば、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，編，１９８８）を参照されたい。
【００６３】
５．４  グリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵できる組換え生物
本発明はまた、一つまたはそれ以上の外因性（即ち、異種）熱安定性グリセロール発酵酵素を発現するように遺伝子操作された組換え生物も提供する。本文脈で使用される場合、用語“外因性”とは酵素が異種ポリヌクレオチドコーディング配列によりコードされていること、即ち、ポリヌクレオチド配列は宿主生物にとっては天然または内因性ではないことを示している。好適な態様において、組換え生物はＣ．ビテルビエンシスに由来する熱安定性グリセロール発酵酵素またはそのような酵素に相同的である酵素を発現するように遺伝子操作される。特に好適な態様において組換え生物はＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５TのようなＣ．ビテルビエンシスの株に由来する脱水酵素または１，３−プロパンジオール酸化還元酵素を発現するように遺伝子操作される。
【００６４】
本発明の組換え生物は本発明の種々の様相での実施において有用であろう。例えば、組換え生物はグリセロールから１，３−プロパンジオールへ生物的に変換する過程での触媒として使用できる。別の非制限的態様において、組換え生物は熱安定性グリセロール発酵酵素源として働くことができ、それは当業者にはなじみの深い蛋白質精製技術を使用して単離できる。
【００６５】
本発明は、熱安定性グリセロール発酵酵素またはその断片をコードしているポリヌクレオチド配列のクローニング、形質転換および発現のために適した種々のベクターおよび形質転換および発現カセットを提供する。適したベクターは、宿主微生物および生じた組換え微生物の意図される使用に両立するものであろう。例えば、適したベクターはプラスミド、ウイルス（バクテリオファージＴ７またはＭ１３由来ファージ）またはコスミドから誘導できる。そのようなベクターを得るおよび使用するプロトコールは本分野で知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ．ａｌ．，前記文献、を参照されたい。
【００６６】
典型的にはベクターまたはカセットは関連する遺伝子の転写および翻訳を方向付ける配列、選択可能マーカー、および自己複製または染色体組み込みを可能にする配列を含んでいる。適したベクターは転写開始制御を含んでいるコード配列の５’領域および転写停止を制御するコード配列の３’領域を含んでいる。好適な態様において、調節領域は形質転換された宿主細胞とは異種の遺伝子から誘導される。
【００６７】
本発明の組換えベクター、特に発現ベクターは、好適にはコード配列がコード配列の転写および翻訳に必要とされる一つまたはそれ以上の調節要素と作動可能なように結び付けられるように構築される。本明細書で使用する場合、用語“調節要素”は誘導可能および誘導不可能プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよびポリヌクレオチドコーディング配列の発現を駆動および／または調節するための本分野で知られているその他の要素を含んでいるが、これらに限定されるものではない。また、ここで使用される場合、コード配列は一つまたはそれ以上の調節要素と“作動可能なように結合”されており、ここで調節要素はコード配列の転写またはそのｍＲＮＡの翻訳、またはそれら両方を有効に調節または可能にする。
【００６８】
これらのベクターの調節要素はその長さおよび特異性が変更できる。利用された宿主／ベクター系に依存して、多くの適した転写および翻訳要素が使用できる。細菌のための転写調節領域またはプロモーターの非制限的例には、β−ｇａｌプロモーター、Ｔ７プロモーター、ＴＡＣプロモーター、ラムダ左および右プロモーター、ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター、およびｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターが含まれる。
【００６９】
組換え蛋白質を発現する一般的方法は、Ｒ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：５３７−５６６（１９９０）に例示されるように、本分野ではよく知られている。随意に、異種配列は望ましい特性（例えば、安定化または発現された組換え産物の単純化された精製）を与えるＮ末端同定ペプチドを含む融合蛋白質をコードできる。
【００７０】
グリセロール発酵酵素を宿主細胞の分泌経路内へ方向付けるため、発現ベクター中に分泌シグナル配列を提供してもよい。分泌シグナル配列はグリセロール発酵酵素をコードしているポリヌクレオチド配列に正しい読み枠で連結される。分泌シグナル配列は通常コード配列の５’側に位置されている。分泌シグナル配列は普通、宿主生物により分泌された蛋白質と会合する。
【００７１】
適した形質転換または発現ベクターが構築されたら、例えば、カルシウム透過化細胞、エレクトロポレーション、プロトプラスト形質転換または組換えファージウイルスを使用するトランスフェクションのような既知の方法を使用し、適した宿主細胞を形質転換するために使用できる。適した発現宿主には大腸菌、枯草菌、鼠チフス菌およびバチルス、シュードモナス、ストレプトミセスおよびスタフィロコッカス属内の種々の種が含まれるが、選択によっては他のものを使用してもよい。
【００７２】
好適な態様において、本発明は一つまたはそれ以上の外因性熱安定性グリセロール発酵酵素を発現するように遺伝子操作された好熱性組換え微生物を提供する。そのような微生物は以下に説明するようにグリセロールから１，３−プロパンジオールへの生物的変換に特に有用である。好熱性微生物の例には、バチルス、テルムス、スルフォロブス、テルモアエロバクター、テルモブラキウムおよびカロラモトール属のメンバーが含まれる。
【００７３】
選択された熱微生物は好適には補因子アデノシル−コバラミン（補酵素Ｂ12）を産生できるであろう。必要なら、Ｂ12合成酵素が微生物に導入できおよび／または培地にビタミンＢ12を補給してもよい。
【００７４】
５．５  熱安定性グリセロール発酵酵素の単離法
本発明は熱安定性グリセロール発酵酵素を調製および単離するために方法を提供する。好適な態様において、酵素は実質的に純粋な形で提供される。非制限的態様において、酵素は天然の熱安定性グリセロール発酵酵素を発現する好熱性微生物から単離される。別の非制限的態様において、酵素は、熱安定性グリセロール発酵酵素をコードする外因性ポリヌクレオチドを発現するように遺伝子操作された組換え生物から単離される。もしくは、本発明の熱安定性酵素は、例えば、ＣＲＥＩＧＨＴＯＮ、前記文献に説明されているように、通常の液体または固相ペプチド合成を使用して製造できる。
【００７５】
問題とする熱安定性グリセロール発酵酵素を発現している宿主細胞は典型的には、本分野で既知の方法を使用して、酵素の産生に適した栄養培地中で培養される。例えば、細胞は酵素の発現および／または単離を可能にする、適した培地および条件で実施され、振盪フラスコ培養、実験室または工業的発酵漕での小規模または大規模発酵（連続、バッチ、フェド−バッチまたは固体状態発酵を含んで）により培養される。適した栄養培地は本分野で既知の方法を使用し、典型的には炭素および窒素源および無機塩を含んでいる。適した培地は商業的供給会社から入手可能であり、または公表されている組成物に従って調製してもよい（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ）。
【００７６】
使用された宿主細胞および発現ベクターの性質に依存して、酵素は細胞質中に保持されるか、しばしば不溶性顆粒として（封入対として知られている）、または細菌分泌配列により細胞周辺腔へ方向付けられる。前者の場合、細胞は溶解され、顆粒は回収されおよび変性され、その後酵素は変性剤を希釈することにより再び折りたたまれる。後者の場合、細胞周辺腔の内容物を放出させるために細胞を破壊し（例えば、超音波または浸透圧ショックにより）および酵素を回収することにより細胞周辺腔から酵素が回収される。もし酵素が栄養培地内へ分泌されるとしたら、酵素は培地から直接回収できる。
【００７７】
細胞により産生された酵素は次に、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、溶解度差（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）または電気泳動的方法（例えば、分取等電集束法（ＩＥＦ）を含む（しかしこれらに限定されるわけではない）本分野で知られている通常の技術により回収できる（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ（Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ編，１９８９）；ＳＣＯＰＥＳ，ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ（１９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．前記文献；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ．ａｌ．前記文献、を参照されたい）。
【００７８】
好適な態様において、迅速なアフィニティー精製を容易にする融合要素を含んでいる融合蛋白質として酵素が精製される。有益な精製融合要素にはヒスチジンおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグが含まれる。プロテアーゼ認識部位（例えば、トロンビンまたは因子Ｘａ認識部位）を融合要素からの所望の蛋白質産物切断を可能にするために含ませることができる。遺伝子融合発現系の構築に有用なベクターは商業的に入手可能である、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）。
【００７９】
グリセロール発酵酵素を単離するために有用な特異的蛋白質精製プロトコールは文献に記載されている（例えば、Ｓｅｙｆｒｉｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂａｃｔ．１７８：５７９３−９６（１９９６）（グリセロール脱水酵素）；Ｔｏｂｉｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂａｃｔ．１８１：４１１０−１３（１９９６）（グリセロール脱水酵素）；およびＪｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｏｆ  Ｂａｃｔ．１６９：２０５０−５４（１９８７）（１，３−プロパンジオール酸化還元酵素）を参照されたい）。例えば、Ｓｅｙｆｒｉｅｄ  ｅｔ  ａｌ．はグリセロール脱水酵素精製のためのアフィニティーマトリックスとしてビタミンＢ12−アガロース樹脂の使用を記載している。
５．６生物によりグリセロールを１，３−プロパンジオールに変換する方法
本発明は、生物によりグリセロールを１，３−プロパンジオールへ変換する方法を提供する。本明細書に使用される、グリセロールを１，３−プロパンジオールに変換する「生物による」方法は、微生物の構成物としてか、または細胞を含まない酵素触媒による反応系の何れかにおいて、生物触媒、例えばグリセロール発酵酵素を用いる方法である。特に、本発明は、好熱性生物および／または高温安定性酵素により触媒される高温において実施可能な生物による慣用の方法を提供する。好ましい態様において、上記方法は、５０℃より高い温度において、より好ましくは６０℃より高い温度において実施され、そしてグリセロールを１，３−プロパンジオールへ発酵させることができる好熱性微生物を用いる。
【００８０】
非限定の態様において、上記のプロセスは、グリセロールの１，３−プロパンジオールへの発酵における全ての反応工程を触媒するのに十分な高温安定性グリセロール発酵酵素、例えば１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ及び／又はジオールデヒドロゲナーゼの完全な成分を天然で発現する好熱性微生物を用いる。特に好ましい態様において、Ｃ．ビテルビエンシスの株、例えば株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tを生物触媒として用いる。
【００８１】
別の態様において、上記プロセスは、一つまたは複数の外因性の温度安定性グリセロール発酵酵素を発現するように遺伝子操作された、組換え微生物、好ましくは好熱性組換え微生物を用いる、好熱性微生物の例は、属バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、スルフォロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、サーモブラキウム（Ｔｈｅｒｍｏｂｒａｃｈｉｕｍ）、およびカロラマトール（Ｃａｌｏｒａｍａｔｏｒ）のメンバーを含む。このコンテクストにおいて使用される場合の用語「外因性（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ）」は、酵素が異種ポリヌクレオチドコード配列、即ち好熱性宿主生物にとって天然ではないかまたは内因性ではないポリヌクレオチドによりコードされる酵素を示す。好ましい態様において、異種ポリヌクレオチド配列は、Ｃ．ビテルビエンシス由来の温度安定性グリセロール発酵酵素、またはそのような酵素に相同な酵素をコードする。特に好ましい態様において、上記異種ポリヌクレオチド配列はＣ．ビテルビエンシスの株に由来する。
【００８２】
任意に、本発明のプロセスにおいて使用される好熱性微生物は共因子アデノシル−コバラミン（補酵素Ｂ12）を生産することができる。必要ならば、Ｂ12合成遺伝子を上記微生物により導入し、そして／または培地にＢ12を追加することができる。
【００８３】
本発明は、本発明の好熱性生物を使用したグリセロールの１，３−プロパンジオールへの生物による変換のための発酵プロセスを提供する。発酵条件は、コストと利便性と、生産収量および効率を釣り合わせて、最適化するべきである。市販の発酵プロセスの開発は、段階的な様式において起こるのが典型的であり、最初に小さなフラスコを用い、次に小さな発酵器（１０ガロン以下）、中間のサイズの発酵器（数百ガロンまで）、そして最後に大きなスケールの発酵器（数千ガロン）を用いる。生産の各工程において、開発条件を調節することにより、最少のコストにて最大の収量を生じさせる。培地の有機及び無機の組成、並びにｐＨ、温度、及び酸素濃度が生産プロセスの効率を最大にするために変更される主要な因子である。バッチプロセスにおいてさえ、発酵の間に条件をしばしば変更することにより、最大生産収量を達成し、そして発酵プロセスの間に条件を監視することにより、必要不可欠なパラメーターが許容限界範囲内に留まることを確実にする。反応チャンバーおよび基質溶液は、生産プロセスにおいて使用される微生物株の添加前に安定化するべきである。低温において発酵させる場合、反応物の微生物汚染物による感染が、生産物を生産するのに用いられた株の競合による置き換えを容易に導くことができ、明らかに有害な結果をもたらす。本発明の重要な利点は、好熱性生物および／または高温安定性酵素を用いることにより、もっとも有力な汚染物が生存できない高温において反応を行えることである。
【００８４】
発酵培地の組成は、微生物の成長および所望の生産物の発酵を支えるのに必須の栄養を含まなければならない。必須の栄養は、炭素、窒素及びリンの源を含む。特定の栄養源の選択は、経済性根拠並びに生物学上の根拠を基になされる。発酵プロセスの性質に依存して、未加工の成分全てを発酵の最初に加えてよいか、またはプロセスを通じて栄養を徐々に微生物に給餌してよい。
【００８５】
反応のｐＨは実質上発酵に影響し得る。所望の生産物を形成させることに関与する酵素は全て、最大活性のための最適ｐＨ範囲および活性が保持される限定されたｐＨ範囲を有する。発酵器中の生物の早い成長は、反応培地のｐＨを急速に変え得る。例えば、酸、例えば、酢酸の蓄積は、非緩衝培地のｐＨが急激に低下することを導き、所望の発酵精製物の生産を阻害または停止させる。そのような変化を防ぐため、発酵培地は緩衝させられることにより、ｐＨの変化を低下させるべきである。さらに、反応溶液のｐＨは通常は連続して監視して、酸または塩基を必要に応じて加えることにより受容可能な寛容限度内に維持する。株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tを用いる発酵プロセスにおいては、培地のｐＨを約５．０と７．８の間、好ましくは約ｐＨ６．０と６．５の間に維持するべきである。
【００８６】
反応の温度は生産物の最終収量を達成するために、注意深く制御されるべきである。加熱したコイルを用いることにより、上昇温度を維持し、それにより生産物の形成の最適な速度を達成し、そして微生物の汚染物による感染を阻害することができる。加熱したコイルは発酵チャンバーの定期的な滅菌のために使用することもできる。発酵は、微生物の活性および生存性に一致させて、あらゆる温度にて実施することができる。好ましい態様において、本発明は、少なくとも４０℃の温度、好ましくは少なくとも５０℃の温度、そしてもっとも好ましくは６０℃またはそれ以上の温度にて実施される。株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tを用いる発酵プロセスにおいては、温度を３３から６４℃の間、好ましくは５０から６４℃の間、そしてもっとも好ましくは５７から６４℃の間に維持するべきである。
【００８７】
その栄養のパラメーターおよび環境のパラメーターに加えて、発酵プロセスは、ブロスを含むフラスコに微生物培養物を接種するのと類似である、バッチプロセスとしてデザインしてよく、あるいは、恒成分培養槽のそれと類似である、連続フロープロセスとしてデザインしてよい。プロセスのデザインの選択は、所望の生産物の生産並びに回収の両者の経済性に依存する。バッチプロセスに比較して、フロースルー発酵器は不所望の生物によりより汚染しやすく、特に発酵が中間の温度において実施される場合に、素早い制御を保持することを難しくさせ得る。フロースルーデザインは、しかしながら、商業上の流通のために一定の率にて回収できる製品の連続供給を生じる利点を有する。それらの究極の性質により、バッチプロセスは、発酵を開始するために重大なスタートアップ時間、発酵生産物が蓄積することを可能にするインキュベーション時間、および生産物が消費された培地および微生物の細胞から分離される期間の回収時間を必要とする。
【００８８】
本発明の別の態様においては、上記プロセスを使用することにより、グリセロール以外の発酵可能な炭素基質の１，３−プロパンジオールへの変換を可能にする。非限定態様において、発酵可能な炭素基質、例えばモノサッカライド、例えばグルコースまたはポリサッカライドをグリセロールに変換できる好熱性微生物は、グリセロールを１，３−プロパンジオールに変換するのに必要な温度安定性１，３−プロパンジオール生産酵素の補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を微生物に組換え導入することにより、１，３−プロパンジオールを生産できるように、操作され得る。これらの酵素は、グリセロールを１，３−プロパンジオールに変換することができる好熱性生物、例えばＣ．ビテルビエンシスに由来することができる。グリセロールを発酵して１，３−プロパンジオールにするのに必要な酵素活性を非好熱性生物に組換え操作する技術は、引用によりその全体が取り込まれる米国特許第５，６８６，２７６号に記載される。
【００８９】
あるいは、本発明の組換え微生物を操作することにより、グリセロール以外の炭素源を１，３−プロパンジオールに発酵させることができる。そのような生物の使用は、特に、安価な炭素源、例えばグルコース又は発酵可能なポリサッカライドからの１，３−プロパンジオールの生産に有利であり得る。例えば、グリセロールを１，３−プロパンジオールに発酵させることができる微生物を操作して、解糖中間体、例えばジヒドロキシアセトンリン酸をグリセロールに変換し、それにより、非グリセロール源由来の炭素の発酵経路への導入を可能にすることができる。引用によりその全体が取り込まれるＷＯ９８／２１３４０は、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子及びグリセロール−３−リン酸ホスファターゼ酵素をコードする遺伝子の何れか又は両方を含む発現カセットを用いて適当な宿主細胞を形質転換することにより、組換え生物からグリセロールを生産する方法を記載する。そのような生物は、単純な糖、例えばグルコースをグリセロールに発酵させることができる。これらの生物、又は実際にこれらの酵素又は別のグリセロール合成経路の酵素を生産するように遺伝学上操作されたあらゆる生物は、本発明の組成物及び方法を用いてグリセロールから１，３−プロパンジオールへのさらに先への発酵のために宿主細胞として使用することができる。さらに、ＷＯ９８／２１３３９は、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−ホスファターゼ、グリセロールデヒドロゲナーゼ及び１，３−プロパンジオールオキシドレダクターゼをコードする遺伝子を発現するように操作され、そしてそれによりグルコース及び他の糖を１，３−プロパンジオールに変換できる組換え微生物を記載する。即ち、この戦略は、グリセロール、ジヒドロキシアセトン、Ｃ3化合物へ、グリセロールの酸化状態において変換され得るか（例えば、グリセロール３−リン酸）、又はＣ3化合物へジヒドロキシアセトンの酸化状態において変換され得る（例えば、ジヒドロキシアセトンリン酸又はグリセルアルデヒド３−リン酸）あらゆる炭素基質から１，３−プロパンジオールを生産させることを当業者に振り向けることができる（例えば、ＷＯ９８／２１３３９を参照）。
【００９０】
本発明の別の態様において、使用された組換え好熱性生物は、グリセロール発酵酵素の不活性化を抑圧することができる蛋白質を発現するか、又は増強されたレベルにおいて発現するように、操作することができる。例えば、引用によりその全体が取り込まれるＷＯ９８／２１３４１に記載された技術は、グリセロールデヒドロゲナーゼの基質媒介不活性化を逆転することができる酵素の発現を導入するために使用できる。
【００９１】
本発明のプロセスは、１，３−プロパンジオールに変換される炭素基質、好ましくは単独又は第１級の炭素源を含む培地中で実施される。適切な炭素源に加えて、発酵培地は、適切なミネラル、塩、共因子、バッファー及び当業者に知られた、培養物の成長並びに１，３−プロパンジオールの生産に必要な酵素活性の増進に適切である他の成分を含まなければならない。特別な注意がＣｏ（ＩＩ）塩及び／又はビタミンＢ12又はそれらの前駆体に払われるべきである。グリセロールから１，３−プロパンジオールへのＣ．ビテルビエンシスによる変換における使用のための適切な培地の特定の非限定例は、以下に実施例に提供される。
【００９２】
本発明のプロセスは、好気性又は微好気性条件が好ましい場合に、好気性又は嫌気性条件下で実施することができる。特に好ましい態様においては、上記プロセスを窒素又はアルゴン雰囲気下、例えば８０：２０の比のＮ2／ＣＯ2下で実施される。成長培地からの酸素と反応して除去する化学物質も添加してよい。例えば、チオグリコール酸ナトリウムは遊離酸素と反応して、溶液からそれを除去する。同様に、アミノ酸システイン及びスルフィドリル基を含む他の化合物も、成長培地からの分子酸素を除去するために使用できる。流体培地に関しては、窒素を培地中に泡立たせることにより、空気及び酸素の痕跡を除去してよく、その後、培養容器をきつく封印して酸素が再度侵入することを防ぐ。
【００９３】
さらに、嫌気性培養チャンバーを用いることにより、酸素を雰囲気から除去してよい。嫌気性チャンバーの共通の形態は、例えば、ガスパックシステムは、水素を生成し、触媒として酸素のチャンバー内で反応して水を生成する。二酸化炭素もこのシステムにおいて生じ、酸素から水への変換により奪われたガスの容積を置き換える。
【００９４】
１，３−プロパンジオールは、中圧から高圧の液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析に培地を供することにより直接同定してよい。例えば、発酵培地を、アイソクラチック様式において０．０１Ｎの硫酸の流動相を用いた分析用イオン交換カラム上で分析することができる。あるいは、１，３−プロパンジオールは、限定ではないがガスクロマトグラフィー（ＧＣ）及びガスクロマトグラフィー−質量分光分析（ＧＣ−ＭＳ）を含む他の適切な分析技術を用いて同定することができる。
【００９５】
１，３−プロパンジオールは、蒸留、遠心分離、濾過、及びクロマトグラフィー分離を含む当業者に知られた技術を使用して発酵培地から精製することができる。例えば、プロパンジオールは、反応混合物を有機溶剤を用いた抽出、蒸留及びカラムクロマトグラフィーに供することにより、細胞培地から得ることができ、引用によりその全体が取り込まれる米国特許第５，３５６，８１２号に記載されるとおりである。このプロセスのための特に良好な有機溶剤はシクロヘキサンであり、米国特許第５，００８，４７３号に記載されるとおりである。
【００９６】
あるいは、１，３−プロパンジオールを、固相支持体、例えばセルロースに吸着又は結合させた酵素及び／又は微生物細胞を用いる発酵系において生産することができる。結合し、即ち固定化された酵素は固相表面触媒として作用する。反応基質、例えばグリセロールを含む溶液を、次に上記固相表面を横切るように通過させる。温度、ｐＨ及び酸素濃度を最適レベルに設定することにより、変換の最大率を達成する。この種のプロセスは、所望の形質転換が単一の代謝工程、例えばグリセロールから１，３−プロパンジオールの形成における中間体への変換又はそのような中間体から１，３−プロパンジオールへの変換を含む場合に、特に適している。上記プロセスは、最初の基質を所望の生産物へ変換するために複数の酵素活性が必要な場合に、より複雑である。通常、上記のプロセスの培地は触媒作用に必要なあらゆる補助的な因子、例えば酵素の補酵素（例えば、ビタミンＢ12）及び還元する均等物を含まなければならない。所望の生産物は、前記の技術を用いて発酵罰から精製することができる。そのような固定化系を用いる場合、酵素活性を保持して酵素の不活性化又は損失を最少にすることが必須である。細胞を含まない酵素よりむしろ全細胞がそのような固定化系において用いられる場合、プロセスの間に微生物の生存を保持することが重要である。固定化細胞を用いるこのプロセスは必要な成長基質を加えることを含む。
【００９７】
本発明によるプロセスは、グリセロールを、実質上化学量論的に１，３−プロパンジオールに変換することができる。１，３−プロパンジオールの収量は、しばしば、３モルのグリセロール２モルの１，３−プロパンジオールの桁である。本コンテクストにおいては少なくとも８０％、そして好ましくは少なくとも９５％のグリセロール消費を意味することが実質上理解される。
【００９８】
本発明の方法及び組成物により生産された１，３−プロパンジオールはポリエステル及びフィルムの生産に有用である。例えば、ポリ（１，３−プロピレンテレフタレート）（ＰＰＴ）は１，３−プロパンジオールを出発物質としてＷｈｉｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｓｏｎにより合成された。ＰＰＴの物理特性は一般に市販されているポリエステルポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）の特性よりも優る。ＰＰＴを合成する他のプロセスは、例えば引用によりその全体が取り込まれる米国特許第５，３４０，９０９号及び米国特許第５，８７２，２０４号に記載される。他のポリマーも合成できる。
【００９９】
以下の実施例は本発明を例示するために提供されるのであり、限定するためではない。
【０１００】
６  実施例：Ｃ．ビテルビエンシス種の株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tの単離
６．１  材料と方法
６．１．１  生物の源
株は、イタリアのＶｉｔｅｒｂｏ付近のＢａｇｎａｃｃｉｏ  Ｓｐｒｉｎｇエリアの新鮮な水から１９９７年に回収された混合された堆積物／水サンプルから単離した。サンプリング点における温度は６３℃であり、そしてｐＨは６．６−６．７であった。条件は、引用によりその全体が取り込まれるＣａｎｇａｎｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：９−１９（１９９５）に完全に記載される。
培地と培養
【０１０１】
６．１．２  培地と培養
富裕化、単離及び培養のために使用された基本培地は、Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡＮＵＡＬ  ＯＦ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＢＩＯＴＥＣＧＮＯＬＯＧＹ（Ｄｅｍａｉｎ  ａｎｄ  Ｓｏｌｏｍｏｎ編纂、１８９６）に記載されたとおりに、Ｎ2／ＣＯ2（８０：２０）ガス相下でＨｕｎｇａｔｅ技術により製造した。基本培地は（脱イオン水リットルあたり）、０．５ｇ（ＮＨ4）2ＳＯ4，０．５ｇ  ＮＨ4Ｃｌ，２．０ｇ  ＫＨ2ＰＯ4，０．０４ｇ  ＭｇＣｌ2＊６Ｈ2Ｏ，０．０４ｇ  ＣａＣｌ2＊２Ｈ2Ｏ，４．２ｇ  ＮａＨＣＯ3，０．１３ｇ  Ｎａ2Ｓ：９Ｈ2Ｏ，０．１３ｇ  システイン−ＨＣｌ，０．３ｇ酵母抽出物、０．００１ｇレサズリン、３．０ｇグリセロール、２ｍｌビタミン溶液（Ｗｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３８：２８８２−８６（１９６３）に記載された）及び１ｍｌ痕跡元素溶液を含んだ。痕跡元素溶液は（ｍｍｏｌ／ｌ）：２．０  （ＮＨ4）2Ｆｅ（ＳＯ4）2＊６Ｈ2Ｏ，１．０  ＣｏＣｌ2＊６Ｈ2Ｏ，１．０  （ＮＨ4）2Ｎｉ（ＳＯ4）2＊６Ｈ2Ｏ，０．１  ＮａＭｏＯ4＊２Ｈ2Ｏ，０．１  Ｎａ2ＷＯ4＊２Ｈ2Ｏ，０．５  ＺｎＳＯ4＊７Ｈ2Ｏ，０．０１  ＣｕＣｌ2＊２Ｈ2Ｏ，０．５  Ｎａ2ＳｅＯ3，０．１  Ｈ3ＢＯ3，０．５  ＭｎＣｌ2＊４Ｈ2Ｏ及び０．０１  ＡｌＫ（ＳＯ4）2＊１２Ｈ2Ｏを含んだ。ｐＨは６．０に調節した（２５℃において）。栄養強化された純粋な培養物を１０ｍｌ培地中でＨｕｎｇａｔｅチューブ中にてＮ2／ＣＯ2（８０：２０）雰囲気下で通常は成長させた。全てのインキュベーションは他に指示しない限り６０℃においてであった。
【０１０２】
６．１．３  成長の測定
細菌の成長は６００ｎｍの波長における光学密度の増加を測地することにより測定した（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  ２１，Ｂａｕｓｈ  ＆  Ｌｏｍｂ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）。
【０１０３】
６．１．４
成長のためのｐＨ範囲の測定に関しては、ｐＨを２５℃においてモデル８１５ＭＰ  ｐＨメーター（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ）を用いて測定した。成長のための温度範囲は温度勾配インキュベーター（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｈｅｍｉａ，Ｎ．Ｙ．）を用いて振盪しながら（１５ｓｐｍ）塩基性培地中でｐＨ25C６．０において測定した。
【０１０４】
６．１．５  基質の利用
生物が異なる基質を利用する能力を、グリセロールの代わりに、オートクレーブ又はフィルター滅菌した基質を追加した塩基性培地を用いて試験した。培養物は２週間インキュベートして、光学密度を測定することにより成長を監視した。
【０１０５】
６．１．６  電子受容体
異なる電子受容体の可能な用途はグリセロール（３ｇ／ｌ）を基質として含む塩基性培地中で研究した。異なる電子受容体はオートクレーブしたストック溶液から加えた。電子受容体の使用（１０ｍＭ）は、亜硝酸塩生成物（窒素に関して）、硫化物生成物（硫酸及び元素イオウに関して）又は色の変化（ＡＱＤＳ）の測定により関しした。
【０１０６】
６．１．７  抗生物質感受性
抗生物質に対する感受性は、対数成長期の培養物を、１００ｇ／ｍｌのフィルター滅菌抗生物質を含む新規な塩基性培地へ移すことにより決定した。培養物を２週間インキュベートした。
【０１０７】
６．１．８  顕微鏡
日常的な試験は光学顕微鏡（モデルＰＭ  １０ＡＤ，Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ、フェーズコントラスト構成部分を備えた）を用いて実施した。極めて薄い切片に使用されるサンプルは、Ｓｐｕｒｒ，Ｊ．Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃ．Ｒｅｓ．２６：３１−４３（１９６９）に記載されたとおりに、染色後のために酢酸ウラニル及びクエン酸鉛を使用することにより調製した。グラム染色はＨｕｃｈｅｒの方法により実施した（Ｄｏｅｓｔｃｈ  ｉｎ  Ｍａｎｕａｌ  ＯＦ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＧＥＮＥＲＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，編纂、１９８１））。
【０１０８】
６．１．９  分析技術
グリセロール、グルコース、短鎖有機酸及びアルコールの測定は、Ｓｖｅｔｌｉｔｓｈｎｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．，Ｓｙｓｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４６：１１３１−１１３７（１９９６）において以前に記載されたとおりに、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により実施した。分子水素はガスクロマトグラフィーにより分析した（Ｓｖｅｔｌｉｔｓｈｎｙｉ  ｅｔ  ａｌ．）。窒素の生産は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍの酵素分析キット（カタログ番号９０５６０８）を用いて測定した。硫化物はＣｏｒｄ−Ｒｕｗｉｓｃｈ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．４：３３−３６（１９８５）の方法により測定した。
【０１０９】
６．１．１０  ＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量
ＤＮＡを単離して、ＱＩＡＧＥＮゲノムＤＮＡ精製プロトコルを用いて製造者の指示に従い精製した。ＤＮＡを酵素消化して、ヌクレオシドをＨＰＬＣにより分離することによりグアニンプラスシトシン（Ｇ＋Ｃ）含有量をＷｈｉｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｓｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７：２３５−２４０（１９８６）及びＭｅｓｂａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３９：１５９−１６７（１９８９）に記載されるとおりに測定した。
【０１１０】
６．１．１１  １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列決定及び系統発生分析
ゲノムＤＮＡの抽出、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ増幅及び精製されたＰＣＲ産物の配列決定はＲａｉｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４６：２８−９６（１９９６）に記載されたとおりに実施した。配列反応の生成物はエタノール沈殿により精製し、そしてモデル３１０Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）により電気泳動した。この研究において得られた１６ＳのｒＲＮＡの遺伝子配列を、ｅ２編纂者Ｍａｉｄａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７：１７１−１７３（１９９９）を用いて公共のデータベースから利用可能な、予め決定された低Ｇ＋Ｃグラム陽性配列に対して並置した。ＤＮＡＤＩＳＴ及びＮＥＩＧＨＢＯＲを含むＰＨＹＬＩＰパッケージのプログラムを系統発生分析に用いた（Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ（１９９３），ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｐａｃｋａｇｅ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．５．１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｓｅａｔｔｌｅ）。Ｊｕｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＭＥＴＡＢＯＬＩＳＭ（Ｍｕｎｒｏ，編纂、１９６９）の方法を進化の距離の計算に用いた。系図のトポロジーを１０００ブーストストラップデータセット及びＰＨＹＬＩＰパッケージＦｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，前記のプログラムＳＥＱＢＯＯＴ，ＤＮＡＤＩＳＴ及びＣＯＮＳＥＮＳＥを用いて再度分析した。
【０１１１】
６．１．１２  核酸配列加盟番号
この研究において決定した１６ＳのｒＲＮＡ遺伝子配列をＧｅｎＢａｎｋに加盟番号ＡＦ１８１８４８にて寄託した。系統発生分析において使用された参照用１６Ｓ  ｒＲＮＡの遺伝子配列の加盟番号及び株名は以下のとおりである。
【０１１２】
【表１】
0004694746.tif 000002
【０１１３】
６．２    結果
６．２．１  富裕及び単離
グリセロールを含む塩基性培地に約１０％（ｗ／ｖ）のサンプルを接種し、そして６０℃においてインキュベートした。さらに、ｐＨ７．０及びｐＨ９．０を示す同じ組成の培地にサンプル（１０％（ｗ／ｖ）各々）を接種した。ｐＨ６．０においてのみ、グリセロールを利用した富裕化培養物が得られた。次の移し替え（１０％  ｖ／ｖ）の後で、この富裕化培養物の連続希釈を調製して固形塩基性培地（１．５％寒天）にソフトアガー重層を用いてプレートしたが、０．８％寒天を含む塩基性培地からなった。単一コロニーを複数拾い上げ、同じ組成の流体培地中に継代培養し、そして１，３−プロパンジオールの形成をＨＰＬＣにより測定した。次のプレーティングのため、上記手法を数回、塩基性培地並びにＫｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｍ．９９：８１−８８（１９８１）に記載された規定された複合培地を用いて繰り返した。流体培地上での成長は、培養物を撹拌しながらインキュベートした場合に大きく増加した。コロニーを６０℃にて振盪する流体塩基性培地に移し替えた後、グリセロール発酵培養物を得たところ、純粋と考えられ、株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tと命名した。
【０１１４】
６．２．２  コロニーと細胞の形態
塩基性培地を含むプレート上において、コロニーが７−１０日後に出現した。プレート上での成長に適合させたら、新たなプレート上での次のストリークは２−３日後にコロニーを生じさせた。上記コロニーを均一に丸く、白色であり、そして１．０から１．５ｍｍの直径であった。株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tの細胞は直線からやや曲がった桿菌であり、０．４から０．６ｍｍの直径であり、そして２．０から３．０ｍｍの長さであった。細胞はほとんど単一で生じた。運動性の指標は光学顕微鏡を用いて得られなかった。陰性染色後に実施した電子顕微鏡分析は、異なる成長段階からの細胞を用いて、鞭毛の存在を明らかにはしなかった。胞子の出現はあらゆる成長段階において観察されなかった。
【０１１５】
６．２．３  グラム染色反応及びグラムの種類
初期対数成長期にのみ上記細胞はグラム陽性染色された。株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tの極めて薄い切片は、薄いペプチドグリカンを明らかにしたことから、即ち上記生物はグラム陽性であると見なされた、Ｗｉｅｇｅｌ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，４７：６５１−５６（１９９７）。この置き換えはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ−Ｂａｃｉｌｌｕｓ中に生物を入れた１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列決定データと一致する。ペプチドグリカンに加えて、他の外層が観察され、Ｓ相を表すかもしれないが、しかしながらＥＭマイクログラフは何の幾何学上の列も明らかにし損なった。
【０１１６】
６．２．４  温度とｐＨの範囲
株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tの成長のためのｐＨ25C６．０における温度範囲は３３から６４℃であり、最適なのは５８℃であった（図１）。６７℃において又は３３℃未満では成長が観察されなかった。上記株は５．０から７．８のｐＨ25Cにおいて成長したが最適ｐＨ25Cは６．０から６．５であった（図２）。ｐＨ25C４．７及びｐＨ25C８．０においては成長が観察されなかった。最適条件下でのもっとも短い倍加時間は２．８時間であった。
【０１１７】
６．２．５  基質の利用と発酵生成物
利用された基質は、グリセロール、グルコース、フルクトース、シュークロース、セロビオース、ラルトース、ガラクトース、マンノース（２０ｍＭ）、デンプン及び酵母抽出物（５ｇ／ｌ）を含んだ。株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tは、キシロース、アラビノース、酢酸塩、乳酸塩、ギ酸塩、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノール、ｎ−ブタノール、プロピオネート、アセトン、琥珀酸塩、エチレングリコール、１，２−プロパンジオール、フェノール、安息香酸塩及びＨ2／ＣＯ2を使用しなかった。
【０１１８】
表１に示すとおり、グリセロールの発酵は酢酸塩及び１，３−プロパンジオールを有機代謝産物としてのみ生成した。Ｃ1−Ｃ3アルコール、１，３−プロパンジオール以外のジオール又は酢酸以外の有機酸は測定可能な量にて検出されなかった。顕著な量のＨ2がこれらの培養物中で生成した。
【０１１９】
得られた発酵パターンは以下の式に従うグリセロールの変換を示唆する：３グリセロール＝２  １，３−プロパンジオール＋酢酸塩＋ＣＯ2＋Ｈ2。
６．２．６  電子受容体
基質としてのグリセロールの存在下で、株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tは、硝酸塩（１０ｍＭ）、非晶質酸化Ｆｅ（ＩＩＩ）（９０ｍＭ）、９，１０−アントラキノン−２，６−亜硫酸（ＡＱＤＳ）、硫酸塩（１０ｍＭ）、又は沈殿したか又は昇華したＳｏ（３０ｍＭ）を還元しなかった。１，３−プロパンジオールの生産は、これらの電子受容体のいずれの存在下でも影響されなかった。株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tはガス相においてＯ2（２０％  ｖ／ｖ）により成長できなかった。
【０１２０】
６．２．７  抗生物質感受性
アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、リファンピシン及びカナマイシンは１００ｍｇ／ｍｌの培地濃度にて完全に成長を阻害した。同じ濃度のストレプトマイシン及びテトラサイクリンの添加は成長の遅延をもたらした。
【０１２１】
６．２．８  ＤＮＡ塩基組成
ゲノムＤＮＡのＧ＋Ｃ含有量は３２モル％であった（ＨＰＬＣ）。
６．２．９  １６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列組成
１４８０ヌクレオチド長からなる株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tのほとんど完全な１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列が決定された。二つのデータセットを系統発生分析に使用した。一つのセットのデータは、この研究において決定された配列及び低Ｇ＋Ｃグラム陽性細菌からの選抜された参照配列を含んだが、該データセットの二つは新規な配列と、カロラマトール及びサーモブラキウム属の５種に関するデータベース中の利用可能な配列を含んだ。９８位と１４６９位の間の１２０６の不明瞭なヌクレオチドを含むデータセットの一つに基づいた系統発生分析（Ｅ．ｃｏｌｉ位置、Ｂｒｏｓｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：４８０１−４８０５（１９７８））は、以前に記載されたカロラマトール及びサーモブラキウム属の放散内の異なる系列として共に群がる新規な単離物を示した（図３）。株株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tは、以前に記載されたカロラマトール及びサーモブラキウム属の種と９１．７から９４．１％の１６Ｓ  ｒＲＮＡ９遺伝配列類似性及びデータセットの一つに含まれて（図３）において示された他の分類群の配列に８３．４から８７．１％の間の類似性を共有する。新規な単離物と他の５つのカロラマトール及びサーモブラキウム種の単離物の配列を含み、且つ３８位と１４６９位の間に１３９３の不明瞭なヌクレオチド（Ｅ．コリ（ｃｏｌｉ）位置、Ｂｒｏｓｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ，前記）を含む第２のデータセットを使用して、この群の分類群の間の二つ一組の類似性の値を計算した。株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tと以前に記載された分類群の間の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列類似性は９１．３から９３．７％の範囲であった。カロラマトール／サーモブラキウム群内では、もっとも高い配列類似性の値（９３．７％）が、株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tとサーモブラキウム セレレ（Ｔｈｅｒｍｏｂｒａｃｈｉｕｍ ｃｅｌｅｒｅ）の間に見いだされた。図５において回収されたブランチに基づく独力の分析は、明らかに、カロラマトール／サーモブラキウム群と、この群のＣｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｗｉｓｓ  Ｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．４４：８１２−８２６（１９９４）により定義された属クロストリジウムの群Ｉに対する関係を指示する。
【０１２２】
系統発生分析（図３）から明らかなとおり、上記株は、系統発生樹のグラムタイプ陽性バチルス−クロストリジウムのブランチ内の異なる群からのサーモブラキウム セレレ及びカロラマトール種に近縁である。これらの４つの種は、好熱性、有機従属栄養性嫌気性細菌であり、低Ｇ＋Ｃ含有量を示し、株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tにも同じく適用される。表２は、この群に見いだされた５つの種の形態学上及び生理学上の特性の比較を示す。
【０１２３】
【表２】
0004694746.tif 000003
【０１２４】
【表３】
0004694746.tif 000004
【０１２５】
７  実施例：株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５TのｄｈａＢ−様遺伝子の検出
７．１  材料と方法
陽性対照として、Ｋ．ニューモニエのｄｈａＢ遺伝子を用いたＰＣＲ法により株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tを特性決定した。４セットのプライマーを用いた：（ａ）ｄｈａＢ１，
ｄｈａＢ１  ５’ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＡＴＧ  ＡＡＡ  ＡＧＡ  ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＣＧ（配列番号：１）及びｄｈａＢ１  ３’ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＴ  ＴＡＴ  ＴＣＡ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＴＣＡ  ＧＧ（配列番号：２）からなる；
（ｂ）ｄｈａＢ２，
ｄｈａＢ２  ５’ＧＧＡ  ＡＴＡ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＡＴＧ  ＣＡＡ  ＣＡＧ  ＡＣＡ  ＡＣＣ  Ｃ（配列番号：３）及びｄｈａＢ２  ３’ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＴ  ＣＡＣ  ＴＣＣ  ＣＴＴ  ＡＣＴ  ＡＡＧ  ＴＣＧ（配列番号：４）からなる；
（ｃ）ｄｈａＢ３，
ｄｈａＢ３  ５’ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＡＧ  ＡＴＣ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＡＴＧ  ＡＧＣ  ＧＡＧ  ＡＡＡ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  Ｃ（配列番号：５）及びｄｈａＢ３  ３’ＧＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＴ  ＴＡＧ  ＣＴＴ  ＣＣＴ  ＴＴＡ  ＣＧＣ  ＡＧＣ（配列番号：６）からなる；及び
（ｄ）ｄｈａＸ，
ｄｈａＸ  ５’ＡＧＧ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＧＴ  ＣＧＡ  ＡＴＣ  ＣＣＴ  Ａ（配列番号：７）及びｄｈａＸ  ３’ＧＡＴ  ＡＣＧ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＴＴＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＧＧＣ  ＣＡＧ  ＴＡＧ  ＣＡＧ（配列番号：８）。全てのプライマーは、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬから購入した。ＰＣＲ反応は、Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＰＣＲチューブ（Ｍｏｌｃｕｌａｒ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．）内で、１００μｌのＰＣＲ反応試薬を用いて実施した。ＰＣＲ反応物の各１００μｌは、２ｕｌの細菌培養物、２０ｕｌの１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ，１０ｕｌの１０Ｘ  ＰＣＲバッファー（１００ｍＭ  ＫＣＬ，１００ｍＭ  （ＮＨ4）2ＳＯ4，２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＣＬ（ｐＨ８．７５），２０ｍＭ  ＭｇＳＯ4，１％  Ｔｒｉｔｏｎ，１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）−［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ］、３ｕｌの各２つの反対のプライマーセット（１０  Ｏ．Ｄ．／ｕｌ）、及び１ｕｌのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／ｕｌ）−［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ］を含む。ＰＣＲ増幅は、自動化温度ＭｉｎｉＣｙｃｌｅｒ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、良好な条件を試験するために３つの異なるアニーリング温度において実施した。最終条件は以下のとおりである：変性（９４Ｃ，１．５分）、低ストリンジェンシーアニーリング（３７Ｃ，１．５分）、及び伸長合成（７２Ｃ，２．５分）の５つの初期循環。初期循環の後、高いアニーリングストリンジェンシーにおける追加の２５循環を実施した：変性（９４Ｃ，１．５分）、アニーリング（５５Ｃ，１．５分）、及び伸長合成（７２Ｃ，２．５分）。１０μｌの１０Ｘ  ＤＮＡ負荷染料を各サンプルに加え、そして１５μｌのＰＣＲ生成物をアガロースゲル上で電気泳動した。
【０１２６】
７．２  結果
陽性対照は予測されたとおり正確なバンドを提供する。未知の微生物は、ｄｈａＢ１及びｄｈａＢ３と同じサイズの弱いＤＮＡバンドを示したが、ｄｈａＢ２及びｄｈａＸ上には示さなかった。上記弱いバンドは低い相同性のＰＣＲプライマーと標的遺伝子によるかもしれない。これらの結果は、株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５TがＫ．ニューモニエにおいてｄｈａＢとして同じか又は類似の機能を担うｄｈａＢ−様遺伝子を有するかもしれないことを示唆した。
【０１２７】
８  実施例：株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tグリセロールデヒドロゲナーゼのインビトロ測定
株ＪＷ／ＭＳ−ＶＳ５Tのトルエン標的化細胞がグリセロールを３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド（３−ＨＰＡ）に、そして１，２−プロパンジオールをプロピオンアルデヒドに変換する能力を試験した。
【０１２８】
８．１  材料と方法
６８℃において、０．５ｇ／ｌ酵母抽出物及び３ｇ／ｌグリセロールを追加したミネラル塩培地、ｐＨ６．８中で、細胞を嫌気成長させた。細胞を嫌気にて回収して、窒素下で−７０℃に保存した。
【０１２９】
凍結細胞を解凍して嫌気条件下でグローブボックス中でトルエン処理した。トルエン処理は以下の工程からなった：（ａ）１ｍｌの５０ｍＭ  ＫＰＯ4ｐＨ８．０中で細胞を洗浄する；（ｂ）エッペンドルフ５４１５Ｃチューブ中での１４，０００ＲＰＭにおいて細胞を６分間回転する；（ｃ）１．５ｍｌの５０ｍＭ  ＫＰＯ4ｐＨ８．０中で細胞を洗浄する；（ｄ）エッペンドルフ５４１５Ｃチューブ中での１４，０００ＲＰＭにおいて細胞を再び６分間回転する；（ｅ）２ｍｌの５０ｍＭ  ＫＰＯ4ｐＨ８．０に細胞を溶解する；（ｆ）２０μｌのトルエンを加える；（ｇ）１５分間激しく振盪する；（ｈ）エッペンドルフ５４１５Ｃチューブ中での１４，０００ＲＰＭにおいて細胞を１０分間回転する；（ｉ）２ｍｌの５０ｍＭ  ＫＰＯ4ｐＨ８．０中で細胞を洗浄する；（ｊ）エッペンドルフ５４１５Ｃチューブ中での１４，０００ＲＰＭにおいて細胞を６分間回転する；（ｋ）工程（ｉ）及び（ｊ）を繰り返す；（ｌ）トルエン処理された細胞を５０ｍＭ  ＫＰＯ4ｐＨ８．０中に溶解する；（ｍ）溶解した細胞能力を吸光度を６００ｎｍにおいて測定する；そして（ｎ）細胞を−７０℃において保存する。
【０１３０】
反応混合物は、１．０ｍｌ中に、１５ｍＭ  ＫＰＯ4，ｐＨ８．０；０．２５Ｍ  ＫＣｌ；２００ｍＭグリセロール又は１，２−プロパンジオール；トルエン処理された細胞、０．３８  ＯＤ６００；及び１２μＭ  補酵素Ｂ12を含んだ。反応物を６０℃において嫌気性にてインキュベートして、図４に示された時間にサンプルを取り出した。１００μｌのサンプルを、５０μｌのメチルベンジルチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）溶液（３７５ｍＭグリシン−ＨＣｌ  ｐＨ２．７中に６ｍｇ／ｍｌ）に加え、そして１００℃において３分間加熱し、氷の上で３０秒間冷却し、そして１４Ｋ  ＲＰＭにおける５分間の遠心分離により清浄化した。
【０１３１】
清浄化した上清は、次に、以下のＣ8−逆相ＨＰＬＣ系上での生成物の検出により分析した：（ａ）カラムは１５  ｘ  ４．６ｃｍのＳｕｐｅｌｃｏ，Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ−８−ＤＢ，３μＭ粒子サイズであった；（ｂ）溶剤Ａは０．１％のＴＦＡであった；（ｃ）溶剤Ｂは９０％アセトニトリル、０．０８％  ＴＦＡであった；（ｄ）勾配は（時間［分］／％Ｂ）：０／０、７／４５、１７／６５、２２／１００、２４／１００、２５／０、３０／０であった；（ｅ）注入容量は２０μｌであった；（ｆ）注入器の引き抜く速度は８３３．３μｌ／分であった；（ｇ）検出は５００ｎｍの参照を用いて３０５ｎｍにおいてであった；そして（ｈ）バンドの幅はサンプル波長に関して４０及び参照波長に関して８０であった。この系を用いて、３−ＨＰＡの保持時間は８．７分、そしてプロピオンアルデヒドは１０．７分であった。
【０１３２】
８．２  結果
グリセロールから３−ＨＰＡ及び１，２−プロパンジオールからプロピオンアルデヒドへの６０℃における変換の時間経過を図４に示す。結果は、グリセロールデヒドロゲナーゼが上記生物の成長温度である６０℃において活性化されることを示す。上記酵素はグリセロールにより不活性化されるが、１，２−プロパンジオールによっては不活性化されない。類似の不活性化は他のグリセロールデヒドロゲナーゼに関する文献において報告されていた。しかしながら、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ由来のグリセロールデヒドロゲナーゼは６０℃において不活性である。事実、６０℃において活性なグリセロールデヒドロゲナーゼは報告されていない。
【０１３３】
９  生物の寄託及び配列表の簡単な記載
Ｃ．ビテルビエンシス種の株ＪＷ／ＭＳ−Ｖ５５Tは、１９９９年８月２７日にＡＴＣＣに、特許手続きのための微生物の寄託の国際承認のブダペスト条約の権限の下に寄託され、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−５８４と命名された。「ＡＴＣＣ」は１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ  ２０８５２  ＵＳＡに位置するアメリカンタイプカルチャーコレクション国際寄託機関を意味する。上記の名称は寄託物質の加盟番号である。
【０１３４】
株ＪＷ／ＭＳ−Ｖ５５Tの１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースに加盟番号ＡＦ１８１８４８にて寄託された。
【０１３５】
均等物
上に書かれた明細書は、当業者に発明を実施可能とさせるのに十分である。事実、分子生物学、生物工学の分野又は関連分野の当業者に明らかな発明を実施するために上に記載された手段の様々な修飾が特許請求の範囲の範囲内で修飾されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、株ＪＷ／ＭＳ−Ｖ５５Tの成長に対する温度の効果を示し、ｔｄ＝倍加時間である。
【図２】  図２は、株ＪＷ／ＭＳ−Ｖ５５Tの成長に対するｐＨ25Cの効果を示し、ｔｄ＝倍加時間である。
【図３】  図３は、ＪＷ／ＭＳ−Ｖ５５T及び近縁の株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列の比較に基づく根絶された系統発生系統樹を示す。隣の系統樹は距離マトリックスから構築した。１０００のデータセットの分析からの独力の値（パーセンテージとして表現された）が枝分かれする点において示される。スケールバーは１００ヌクレオチドあたり５ヌクレオチドの痴漢を表す。
【図４】  図４は、嫌気性にてトルエン処理されたＪＷ／ＭＳ−Ｖ５５T細胞の嫌気条件下、６０℃における、グリセロールから３−ＨＰＡへの変換の時間経過アッセイを示す。
【図５】  図５は、嫌気性にてトルエン処理されたＪＷ／ＭＳ−Ｖ５５T細胞の嫌気条件下、６０℃における、１，２−プロパンジオールからプロピオンアルデヒドへの変換の時間経過アッセイを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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