(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾前の初期構造を有するヌクレオチド鎖と、ウラシル塩基、５−ヒドロキシウラシル塩基、５，６−ジヒドロキシウラシル塩基または５−フルオロウラシル塩基を有するヌクレオチドとを、緩衝剤成分として４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸、２−モルホリノエタンスルホン酸、あるいは３，３−ジメチルグルタル酸を含有する緩衝液に入れた反応混合液中に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、前記修飾前の初期構造を有するヌクレオチド鎖を修飾する所望の修飾物質、およびコバルト以外の２価金属カチオンを共存させて、前記修飾前の初期構造を有するヌクレオチド鎖の３´末端に、前記の塩基を有するヌクレオチドを付加するとともに、付加されたヌクレオチドの配列を分解して前記ヌクレオチド鎖の３´末端にアルデヒド基を形成し、前記アルデヒド基が形成されたヌクレオチド鎖の３´末端を直接に前記修飾物質で修飾するヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項２】
活性化因子が、マンガンイオンあるいはマグネシウムイオンである請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項３】
付加するヌクレオチドが２´−デオキシウリジン５´−一リン酸である請求項１または２に記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項４】
修飾物質が−ＮＨ２を有している請求項１〜３のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項５】
修飾物質が、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化する物質である請求項１〜４のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項６】
修飾物質が、蛍光性物質、ビタミン、脂質、アミノ酸、オリゴペプチド、タンパク質または、生体外因性物質である請求項１〜５のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項７】
修飾物質が、ヌクレオチド鎖を基板に結合させるために介在させる物質である請求項１〜６のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項８】
修飾物質が、アミノ基とチオール基とを有する化合物である請求項１〜３、および５〜７のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項９】
修飾物質が、アミノ基と加水分解によりシラノール基を形成するアルコキシシリル基を有する化合物である請求項１〜３、および５〜８のいずれかに記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項１０】
修飾前の初期構造を有するヌクレオチド鎖と、ウラシル塩基、５−ヒドロキシウラシル塩基、５，６−ジヒドロキシウラシル塩基または５−フルオロウラシル塩基を有するヌクレオチドと、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼと、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼと、前記ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより付加された前記の塩基を有するヌクレオチドが前記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼにより分解されることで前記修飾前の初期構造を有するヌクレオチド鎖の３´末端に形成されるアルデヒド基に対して結合能を有する修飾物質を混合する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【請求項１１】
修飾前の初期構造を有する塩基配列を有するヌクレオチド鎖が入った緩衝液に２´−デオキシウリジン５´−三リン酸と、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよびその活性化因子であるコバルト以外の２価金属カチオンと、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼとを混合し、この反応混合液を加熱処理あるいはアルカリ処理した後、当該処理した反応混合液にＨ２Ｎ−を有する修飾物質を混合する請求項１記載のヌクレオチド鎖修飾方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヌクレオチド鎖修飾方法に関するものであり、特にヌクレオチド鎖の３´末端を修飾物質で直接的に修飾して、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化、固定化する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、遺伝子解析においては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸等のヌクレオチド鎖をラベル化、標識化するための修飾物質として放射性同位元素が採用されてきたが、半減期による取扱期間の制限、取扱場所の制限、被爆の問題、廃棄の問題等があるため、その利用は減少傾向にある。近年では、放射性同位元素に代替する修飾物質として、フルオレセイン等の蛍光物質あるいはビオチン等が汎用されるようになっている。
【０００３】
ヌクレオチド鎖の５´末端を修飾する方法として、５´末端のリン酸基を官能基として化学的な架橋縮合反応により修飾物質で修飾する方法が提案されている（例えば、非特許文献１〜２（後に列挙する。以下、同様））。またヌクレオチド鎖の化学合成の際に修飾物質を付与したリン酸基を導入することでヌクレオチド鎖を修飾する方法も提案され（例えば、特許文献１〜４及び非特許文献３〜４）、ヌクレオチド鎖の化学合成の自動化にも対応可能であることから、繁用されている。
【０００４】
しかしながら、５´末端を修飾する上記の方法では、ヌクレオチド鎖１分子に対して修飾物質１分子でしか修飾できず、架橋縮合反応にも長時間を要する。ヌクレオチド鎖の化学合成の際に修飾する方法に関しては、化学合成は最大ヌクレオチド数１３０まで可能であるとされているのであるが、その合成方法は１ヌクレオチドずつ積層重合していくのであり、１回の積層重合効率は最大でも９９％であるため、合成するヌクレオチド数が大きくなるほど合成収率が低下し、充分な収量を獲得するためにはヌクレオチド数を制限する必要がある（例えば、非特許文献５）。さらに、遺伝子を検出する際にはアルカリホスファターゼを利用した発色あるいは発光反応が高感度であるため繁用されているのであるが（例えば非特許文献６〜７）、アルカリホスファターゼはヌクレオチド鎖の５´末端の脱リン酸化反応を引き起こす性質を有しているので、修飾物質をヌクレオチド鎖から解離させてしまうことになり、５´末端を修飾したヌクレオチド鎖に対してはアルカリホスファターゼを利用することができない。
【０００５】
５´末端を修飾する方法の他に、ヌクレオチド鎖の複製反応、転写反応を利用して、予め修飾物質で修飾したヌクレオチドを取り込むことで、修飾物質で修飾したヌクレオチド鎖を獲得する方法も提案されている。複製反応では、従来からの放射性同位元素によるラベル化、標識化で採用されているニックトランスレーション法、ランダムプライマー法、プライマー伸張法などが例示されており、放射性同位元素に代えて、予め修飾物質で修飾処理を施したデオキシリボヌクレオチド５´−三リン酸をＤＮＡポリメラーゼの複製反応を利用して取り込み、転写反応では、予め修飾物質で修飾処理を施したリボヌクレオチド５´−三リン酸をＲＮＡポリメラーゼの転写反応を利用して取り込む（例えば特許文献５〜８および非特許文献６、８〜９）。これらの修飾方法は、操作の簡便、ヌクレオチド鎖の高い修飾量、修飾物質の安定性、アルカリホスファターゼにより修飾物質が解離しない、という利点を有しているため、遺伝子解析に好適な方法として繁用されている。さらにこれらの修飾方法は、ポリメラーゼ連鎖反応、いわゆるＰＣＲ法あるいはＲＮＡ増幅反応と併用して、遺伝子の増幅反応とラベル化、標識化反応とを同時に実現できるため（例えば、非特許文献１０〜１２）、ＤＮＡマイクロアレイに総称される遺伝子の網羅解析（例えば、特許文献９〜１０および非特許文献１３〜１５）に繁用されている。
【０００６】
しかし上記の複製反応や転写反応による修飾方法は、予め修飾物質で修飾したヌクレオチド、すなわち擬似のヌクレオチド、を取り込ませる方法であることから、本来のヌクレオチドに比べて取り込み効率が悪く、ＰＣＲ法を併用した場合も本来のヌクレオチドに比べて増幅効率が悪く（例えば、特許文献８および非特許文献１６）、修飾物質の取り込み量もヌクレオチド鎖１分子あたり１２〜２５分子とランダムであり（例えば、非特許文献１７）、修飾量の再現性に問題がある。またヌクレオチド鎖内に修飾物質を付与するので、遺伝子解析のハイブリダイゼーションの際に、つまりヌクレオチド鎖の二本鎖形成の際に、修飾物質による立体障害は避けられない。さらに予め修飾物質で修飾したヌクレオチドの合成は煩雑であり、誰にでも容易に合成できるものではなく（例えば、非特許文献８、１８）、結果として修飾物質の種類が限定される。
【０００７】
他の修飾方法として、上記の複製反応あるいは転写反応を利用した修飾方法のように鋳型となるヌクレオチド鎖を必要とするのでなく、鋳型がない場合に、ヌクレオチドの付加反応によってヌクレオチド鎖を修飾する方法もある。たとえば、ヌクレオチド鎖の３´末端に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを利用して、予め修飾物質で修飾処理を施したデオキシリボヌクレオチド５´−三リン酸あるいはジデオキシリボヌクレオチド５´−三リン酸をテーリングさせる方法（例えば、非特許文献１９〜２１）や、ＲＮＡリガーゼを利用して、予め修飾物質で修飾処理を施したデオキシリボヌクレオチド−３´，５´−ビスホスフェートあるいはリボヌクレオチド−３´，５´−ビスホスフェートをテーリングさせる方法（例えば、特許文献１１および非特許文献２２）がある。これらの内、ジデオキシリボヌクレオチド５´−三リン酸をテーリングさせる方法、あるいはリボヌクレオチド−３´，５´−ビスホスフェートをテーリングさせる方法は、ヌクレオチド鎖１分子に対して修飾物質１分子のみ修飾可能であるが、予め修飾物質で修飾したデオキシリボヌクレオチド５´−三リン酸をテーリングさせる方法は、ヌクレオチド鎖１分子に対し多分子の修飾物質で修飾可能である。
【０００８】
しかしこのように予め修飾物質で修飾したデオキシリボヌクレオチド三リン酸をテーリングさせる方法は、修飾したヌクレオチドの付加数が反応条件によってランダムになり、また不要なヌクレオチド配列も形成することになるので、遺伝子解析のハイブリダイゼーションの際にミスマッチの要因ともなる。また上記の複製反応あるいは転写反応を利用した修飾方法でも説明したように、予め修飾物質で修飾したヌクレオチドは誰にでも容易に合成できるものではなく、結果として修飾物質の種類が限定される。
【０００９】
ヌクレオチド鎖の３´末端に修飾物質を導入することは、上記のテーリングだけでなく、化学合成法によっても可能であり、その場合には不要なヌクレオチド配列は形成されない。しかし化学合成法について既述した収量やヌクレオチド鎖長の制限の問題を回避することはできない。
【００１０】
ヌクレオチド鎖の修飾は、ラベル化、標識化のためだけでなく、ヌクレオチド鎖を基板に固定化するためにも行なわれている。固定化用の基板としては従来、疎水性および正電荷を有するように加工した、ニトロセルロース、ナイロン、フッ化ポリビニリデン等の基板が利用されていて、ヌクレオチド鎖と基板との疎水結合、および、ヌクレオチド鎖のリン酸基（負に帯電）と正電荷を帯びた基板との静電結合によって、ヌクレオチド鎖が基板に固定化されていた。
【００１１】
この固定化方法では、ヌクレオチド鎖長が長くなるにしたがってヌクレオチド鎖１分子当たりの基板占有率が高くなるため、基板単位面積当たりの固定化量が少なくなり、基板に固定化したヌクレオチド鎖が解離するなどの問題が起こる。そこで、官能基を持った修飾物質でヌクレオチド鎖の末端を修飾する一方で、基板表面に前記官能基に対する結合基を形成しておき、修飾物質の官能基と基板表面の結合基とを架橋縮合させることで、ヌクレオチド鎖を基板表面に共有結合により固定化する方法が採用されている（例えば、特許文献１２〜１５および非特許文献２３）。従来の疎水結合および静電結合に比べて安定かつ強固にヌクレオチド鎖を固定化できる方法である。官能基−結合基の組み合わせとしては、アミノ基−カルボキシル基、アミノ基−イソチオシアネート基、アミノ基−アルデヒド基、アミノ基−スクシンイミド基、アミノ基―エポキシ基などが利用されている。
【００１２】
しかし官能基を有する修飾物質でヌクレオチド鎖の５´末端を修飾する場合には、リン酸基を介することになり、上述の問題、すなわち、ホスファターゼによりヌクレオチド鎖が解離してしまうため発光反応による検出は困難であるという問題が起こる。官能基を有する修飾物質でヌクレオチド鎖の３´末端を修飾する場合も、上述の問題、すなわち、化学合成により合成可能でかつ充分な収量を獲得するためにはヌクレオチド鎖長が制限されるという問題が起こる。
【００１３】
以上のヌクレオチド鎖のラベル化、標識化、固定化における問題を解決するものとして、ヌクレオチド鎖の３´末端部を直接的に修飾物質で修飾する方法がある（特許文献１６参照）。この方法は、ヌクレオチド鎖の３´側にウラシル塩基を有するヌクレオチドを２つ以上付加し、付加したヌクレオチドをウラシルＤＮＡグリコシダーゼで分解して３´末端にアルデヒド基を形成し、このアルデヒド基と修飾物質が持つアミノ基との反応で共有結合を生じさせることにより、ヌクレオチド鎖の３´末端を直接に修飾物質で修飾するというものである。
【特許文献１】
特許1651975号公報
【特許文献２】
特許1706289号公報
【特許文献３】
特許1780550号公報
【特許文献４】
特許1845794号公報
【特許文献５】
特許1972288号公報
【特許文献６】
特許2131226号公報
【特許文献７】
特許2625095号公報
【特許文献８】
特開昭61-115094号公報
【特許文献９】
特許3272365号公報
【特許文献１０】
特表2002-538836号公報
【特許文献１１】
特開平5-331185号公報
【特許文献１２】
特開2000-63154号公報
【特許文献１３】
特開2001-66304号公報
【特許文献１４】
特開2003-161731号公報
【特許文献１５】
特表2003-526078号公報
【特許文献１６】
特開2003-246794号公報
【非特許文献１】
Chu B.C.Fら、Nucleic Acids Res.、11巻、6513頁、1983年
【非特許文献２】
Chollet A.ら、Nucleic Acids Res.、13巻、1529頁、1985年
【非特許文献３】
Alves A.M.ら、Tetrahedron Letters、30巻、3089頁、1989年
【非特許文献４】
Cocuzza A.J.、Tetrahedron Letters、30巻、6287頁、1989年
【非特許文献５】
シグマアルドリッチ社ウェブサイト掲載、オリゴプロダクトガイド、（http://www.sigmaaldrich.com/sigma/general%20information/oligo_brochure.pdf）、2006年3月8日アクセス；日本特許庁ウェブサイト、資料室、その他参考情報、標準技術集、核酸の増幅及び検出、1-1プローブ・プライマーとして適した配列の選択方法、（http://www.jpo.go.jp/shiryou/s_sonota/hyoujun_gijutsu/kakusan/0001.html）2006年3月8日アクセス
【非特許文献６】
Leary J.J.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、80巻、4045頁、1983年
【非特許文献７】
Bronstein I.ら、Methods Enzymol.、217巻、398頁、1993年
【非特許文献８】
Langer P.R.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78巻、6633頁、1981年
【非特許文献９】
Murasugi A.ら、DNA、3巻、269頁、1984年
【非特許文献１０】
Van Gelder R.N.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87巻、1663頁、1990年
【非特許文献１１】
Reid T.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89巻、1388頁、1992年
【非特許文献１２】
Baugh L.R.ら、Nucleic Acids Res.、29巻、e29頁、2001年
【非特許文献１３】
Schena M.ら、Science、270巻、467頁、1995年
【非特許文献１４】
Schalon D.ら、Genome Res.、6巻、639頁、1996年
【非特許文献１５】
核酸マイクロアレイ特集、Nature Genet.、21巻 Supplement、1月、1999年
【非特許文献１６】
Yu H.ら、Nucleic Acids Res.、22巻、3226頁、1994年
【非特許文献１７】
GE Healthcare Bio-Sciences社ウェブサイト掲載Microarray Handbook（http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/(FileDownload)?OpenAgent&docid=4956BB2BCEE26001C1256EB40044AB0F&file=63004849.pdf）、2006年2月6日アクセス
【非特許文献１８】
Dale R.M.Kら、Biochemistry、14巻、2447頁、1975年
【非特許文献１９】
Riley L.K.ら、DNA、5巻、337頁、1986年
【非特許文献２０】
trainor G.L.ら、Nucleic Acids Res.、16巻、11846頁、1988年
【非特許文献２１】
Schmitz G.G.ら、Anal.Biochem.、192巻、222頁、1991年
【非特許文献２２】
Richardson R.W.ら、Nucleic Acids Res.、11巻、1983年
【非特許文献２３】
Guo Z.ら、Nucleic Acids Res.、22巻、5456頁、1994年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上述したように、ヌクレオチド鎖の修飾方法には様々な方法が提案されているが、それぞれに一長一短があり、利用者は用途に応じて修飾方法を取捨選択しなければならないという負担がある。もう一度簡単に説明すると、ヌクレオチド鎖の５´末端をリン酸基を介して修飾する方法は、安定性に問題があり、ヌクレオチド鎖の化学合成の際に５´末端あるいは３´末端に修飾処理を施す方法は、ヌクレオチド鎖長の制限および収量に問題がある。複製反応あるいは転写反応を利用する方法は、ヌクレオチド鎖を当初より蛍光物質などの修飾物質でラベル化、標識化することに用途が限定され、その複製効率および転写効率にも問題がある。予め修飾物質で修飾したヌクレオチドを付加するテーリング法は、不要なヌクレオチド配列を形成してしまう。ヌクレオチド鎖を基板に固定化するためには、基板表面の結合基との間に共有結合を生じる官能基を有する修飾物質でヌクレオチド鎖を修飾することが望ましいのであるが、その修飾の際も上記の問題は免れない。
【００１５】
特許文献１０記載の方法は、ヌクレオチド鎖の鎖長に関係なく、ヌクレオチド鎖の３´側を直接的に任意の修飾物質で修飾することが可能であるが、付加反応と分解反応と修飾反応のそれぞれで、反応条件の変更およびエタノール沈殿などによる試料の回収をしなければならず、修飾反応までを終了するのに１０時間以上も要していた。
【００１６】
本発明は上記問題を解決するもので、ヌクレオチド鎖の３´末端を直接的に修飾物質で修飾するに際し、反応条件の変更を最小限にし、所要時間を短縮することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題を解決するために、本発明のヌクレオチド鎖修飾方法は、修飾前の初期構造を有するヌクレオチド鎖と、ウラシル塩基、５−ヒドロキシウラシル塩基、５，６−ジヒドロキシウラシル塩基または５−フルオロウラシル塩基を有するヌクレオチドとを、緩衝剤成分として４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸、２−モルホリノエタンスルホン酸、あるいは３，３−ジメチルグルタル酸を含有する緩衝液に入れた反応混合液中に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、前記修飾前の初期構造を有するヌクレオチド鎖を修飾する所望の修飾物質、およびコバルト以外の２価金属カチオンを共存させて、前記修飾前の初期構造を有するヌクレオチド鎖の３´末端に、前記の塩基を有するヌクレオチドを付加するとともに、付加されたヌクレオチドの配列を分解して前記ヌクレオチド鎖の３´末端にアルデヒド基を形成し、前記アルデヒド基が形成されたヌクレオチド鎖の３´末端を直接に前記修飾物質で修飾することを特徴とする。混合液中の反応産物等を途中で分離することなく一連の反応を行って、ヌクレオチド鎖を修飾物質で直接に修飾するもので、操作の簡便化、短時間化を実現することができ、ヌクレオチド鎖長にも関わらないため、利便性が高い。
【００１８】
修飾前の初期構造を有するヌクレオチド鎖と、ウラシル塩基、５−ヒドロキシウラシル塩基、５，６−ジヒドロキシウラシル塩基または５−フルオロウラシル塩基を有するヌクレオチドと、修飾物質と、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよびウラシルＤＮＡグリコシラーゼを最初から混合して、付加反応と分解反応と修飾反応とを並行して生じさせてもよいし；修飾前の初期構造を有するヌクレオチド鎖と、ウラシル塩基、５−ヒドロキシウラシル塩基、５，６−ジヒドロキシウラシル塩基または５−フルオロウラシル塩基を有するヌクレオチドとターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよびウラシルＤＮＡグリコシラーゼとを混合して付加反応と分解反応とを並行して生じさせ、分解反応後の混合液に修飾物質を加えて修飾反応を生じさせてもよい。
【００１９】
付加反応を触媒する酵素を活性化する活性化因子として、修飾物質の修飾反応を阻害しない活性化因子であるコバルト以外の２価金属カチオンを添加することを特徴とする。反応混合液は３段階の反応における反応阻害因子を含まない組成とすることが望ましいからである。
【００２０】
反応混合液に、付加反応を触媒する酵素の反応活性を穏和にする緩衝剤成分を含有させることを特徴とする。ヌクレオチド鎖の３´末端に特定の塩基を有するヌクレオチドが過度に付加することを防止し、付加したヌクレオチドの配列を分解する後続の分解反応の進行を容易にするためである。
【００２１】
活性化因子としてコバルトイオン以外の２価金属カチオンであれば、修飾物質が上記の基を有している場合も沈殿を防止することができる。コバルトイオン以外の２価金属カチオンとしては、マンガンイオンあるいはマグネシウムイオンを好適に使用できる。
【００２２】
緩衝剤成分としては、４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸、２−モルホリノエタンスルホン酸、あるいは３，３−ジメチルグルタル酸であることが必要である。
【００２３】
付加するヌクレオチドの特定の塩基は、本来の（天然の）ヌクレオチド鎖を構成するヌクレオチドには含まれない塩基、つまり、ウラシル塩基、５−ヒドロキシウラシル塩基、５，６−ジヒドロキシウラシル塩基または５−フルオロウラシル塩基であることが必要である。このような特定塩基を有するヌクレオチドであれば、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼが作用した際に、修飾対象のヌクレオチド鎖そのものは初期の状態を維持することが可能である。
【００２４】
分解酵素としてウラシルＤＮＡグリコシラーゼを使用する必要がある。このことにより、付加したヌクレオチドの配列において、塩基の脱離、デオキシリボースの開環および３´位のリン酸基の解離が起こり、ヌクレオチド鎖の３´末端にアルデヒド基が形成される。
【００２５】
修飾物質は、−ＮＨ２を有する物質であってよい。修飾物質に存在する−ＮＨ２は、アルデヒド基等と特別な触媒反応を利用しなくとも自発的に架橋結合反応が進行するからである。たとえば、アルデヒドと−ＮＨ２との間でシッフ塩基を形成する。
【００２６】
修飾物質は、ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化する物質であってよい。かかる修飾物質は、蛍光性物質、ビタミン、脂質、アミノ酸、オリゴペプチド、タンパク質、または生体外因性物質であってよい。
【００２７】
修飾物質は、ヌクレオチド鎖を基板に結合させるために介在させる物質であってよい。かかる修飾物質は、アミノ基とチオール基とを有する化合物であってよい。また、アミノ基と加水分解によりシラノール基を形成するアルコキシシリル基とを有する化合物であってよい。
【００２８】
具体的には、本発明のヌクレオチド鎖修飾方法においては、修飾前の初期構造を有するヌクレオチド鎖と、ウラシル塩基、５−ヒドロキシウラシル塩基、５，６−ジヒドロキシウラシル塩基または５−フルオロウラシル塩基を有するヌクレオチドと、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼと、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼと、前記ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼにより付加された前記の塩基を有するヌクレオチドが前記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼにより分解されることで前記修飾前の初期構造を有するヌクレオチド鎖の３´末端に形成されるアルデヒド基に対して結合能を有する修飾物質とを混合することができる。
【００２９】
また、修飾前の初期構造を有する塩基配列を有するヌクレオチド鎖が入った緩衝液に２´−デオキシウリジン５´−三リン酸と、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよびその活性化因子であるコバルト以外の２価金属カチオンと、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼとを混合し、この反応混合液を加熱処理あるいはアルカリ処理した後、当該処理した反応混合液にＨ２Ｎ−を有する修飾物質を混合することができる。
【００３０】
本発明のヌクレオチド鎖修飾方法によれば、ヌクレオチド鎖を本来の状態を保持して、つまり余分なヌクレオチドを追加することなく、簡便に、短時間で、所望の修飾物質で修飾することができる。ヌクレオチド鎖が１本鎖であるか２本鎖であるかにも関わらない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて説明する。
まず、本発明のヌクレオチド鎖修飾方法の原理を図１を参照して説明する。図中のＸは、アデニン、グアニン、チミン、シトシンの内の任意の塩基を表し、Ｕはウラシル塩基を表す。ｎは任意の自然数を表し、ｍは０または任意の自然数を表す。
【００３２】
任意の塩基配列を有するヌクレオチド鎖（Ｉ）を入れた緩衝液に、次式
【００３３】
【化１】
0004823310.tif 000002
【００３４】
で示される２´−デオキシウリジン５´−三リン酸（以下、ｄＵＴＰと略す）と、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（以下、ＴｄＴと略す）と、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（以下、ＵＤＧと略す）と、ＴｄＴを活性化する活性化因子とを混合する。活性化因子としては、２価カチオンであるマグネシウムイオンあるいはマンガンイオンの使用が望ましい。
【００３５】
このことにより、ＴｄＴのポリメラーゼ作用によって、ヌクレオチド鎖（Ｉ）の３´末端に、次式
【００３６】
【化２】
0004823310.tif 000003
【００３７】
で示される２´−デオキシウリジン５´−一リン酸（以下、ｄＵＭＰと略す）が少なくとも２つ以上、直鎖状に連鎖的にテーリングされて、ヌクレオチド鎖（II）が生成する。それと同時に、ＵＤＧの作用によって、テーリングされたｄＵＭＰのウラシル塩基が解離されるとともに、デオキシリボースのグリコシド結合が加水分解されて、アルデヒド基を持ったヌクレオチド鎖（III）が生成する。酵素ＴｄＴと酵素ＵＤＧとを共存させておくことで、ＴｄＴによってｄＵＭＰをテーリングさせつつ、テーリングしたｄＵＭＰをＵＤＧによって直ちに分解する反応に移行させることができるのである。
【００３８】
次に、生成したヌクレオチド鎖（III）を含んだ反応混合液を９０〜１００℃で５〜１５分間加熱処理するか、あるいは反応混合液中に水酸化ナトリウム溶液あるいは、水酸化カリウム溶液などの強アルカリ溶液を滴下するアルカリ処理を施す。このことにより、分解されたテーリング部分が解離されて、出発物質であるヌクレオチド鎖（Ｉ）の３´末端に直接にアルデヒド基が形成されたヌクレオチド鎖（IV）が得られる。
【００３９】
最後に、ヌクレオチド鎖（IV）を含んだ反応混合液にＨ２Ｎ−を有する修飾物質（図中のＹは修飾物質を構成している化合物、分子、あるいは物質の残部を表す）を混合する。このことにより、修飾物質に存在する−ＮＨ２とヌクレオチド鎖の３´末端に形成したアルデヒド基とが特別な触媒反応なしに自発的に架橋結合反応が進行し、−ＮＨ２とアルデヒド基の間でシッフ塩基が形成され、３´末端を修飾物質で直接的に修飾した、余分なヌクレオチドを含んでいないヌクレオチド鎖（Ｖ）が得られる。
【００４０】
なお、上述したＴｄＴの活性化因子としては、従来、コバルトイオンが繁用されているのであるが、コバルトイオンは、このようにヌクレオチド鎖を修飾する−ＮＨ２を有する修飾物質と不溶性の沈殿物を形成することが認められるため本発明においては避けることが必要である。
【００４１】
本発明においてＴｄＴの活性化因子として好適に用いられる前出のマグネシウムイオンやマンガンイオンは、修飾物質と不溶性の沈殿物を形成することがない。マグネシウムイオンやマンガンイオンは、コバルトイオンに比較して酵素活性化能が低いのであるが、むしろこのようなイオンを採用することで、ＴｄＴによるｄＵＭＰのテーリング量を制限できるため、ヌクレオチド鎖にテーリングしたｄＵＭＰを基質とするＵＤＧによる反応進行を容易にすること、つまりＵＤＧにより基質を迅速に消化することが可能となる。ｄＵＭＰは、修飾対象のヌクレオチド鎖に対し、少なくとも２つ以上、直鎖状に連鎖的にテーリングすることで、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼの基質として作用することが可能となる。
【００４２】
以上のようにして、反応混合液中の成分や反応産物を分離することなく一連の反応を行って、ヌクレオチド鎖の３´末端を修飾物質で直接的に修飾することができ、操作の簡易化、短時間化を実現できる。
【００４３】
従来法と比較すると、本発明のヌクレオチド鎖修飾方法は、複製反応あるいは転写反応を利用して修飾物質の取り込む方法ではないため、取り込み反応のように修飾物質の修飾量がヌクレオチド鎖の鎖長さに依存することはない。また架橋縮合反応による５´末端を修飾する方法（例えば、Nucleic Acids Res. 13巻 1529頁 1985年）に比べ、修飾時間が大幅に短縮可能である。さらにヌクレオチド鎖の化学合成の際に５´末端に同時に修飾する方法に比べても、化学合成で課題となるヌクレオチド鎖の鎖長、すなわちヌクレオチド数の制限（合成収率）の問題を回避することが可能である。これらのことにより、ヌクレオチド鎖のラベル化、標識化、固定化等を要する遺伝子解析などに有用である。
【００４４】
ヌクレオチド鎖の主鎖（３´末端以外の部分）に修飾物質が存在しないので、遺伝子解析に当たり、修飾したヌクレオチド鎖とその標的ヌクレオチド鎖の間で二本鎖を形成する際も、修飾物質による二本鎖形成の立体障害の発生を回避することが可能である。
【００４５】
目的とするヌクレオチド鎖が化学合成可能な数十ヌクレオチド鎖長のものであれば、予め特定の塩基の配列を有するヌクレオチド鎖を合成しておくことで、第１段階の反応（ヌクレオチド鎖（Ｉ）→ヌクレオチド鎖（II）を省略することも可能である。
【００４６】
ヌクレオチド鎖をラベル化、標識化する目的では、たとえば図２に示すように、ヌクレオチド鎖（IV）に、修飾物質として繁用されているビオチンの末端にアミノオキシ基を形成したＮ−アミノオキシメチル カルボニルヒドラジノ−Ｄ−ビオチン（Ａ）（以下、アミノオキシビオチンと略す）を反応させると、ヌクレオチド鎖（Ｖ）として、３´末端に直接的にビオチンが結合したものを得ることができる。このようにビオチン標識したヌクレオチド鎖は、ハイブリダイゼーションなどの遺伝子解析のためのプローブあるいはターゲットとして好適に利用できる。
【００４７】
ヌクレオチド鎖を固定化する目的では、たとえば図３に示すように、３´末端にアルデヒド基を持ったヌクレオチド鎖（IV）に対して、アミノ基を有するチオール、たとえば８−アミノ−１−オクタンチオール（Ｂ）を反応させることにより、アルデヒド基とアミノ基との間で縮合を生ぜしめて、ヌクレオチド鎖の３´末端に直接的に８−アミノ−１−オクタンチオール（残基）が結合した修飾ヌクレオチド鎖（Ｖ）を得る。
【００４８】
そして、このチオール基を持ったヌクレオチド鎖（Ｖ）を金などの貴金属の基板（Ｃ）に滴下などの方法で接触させることにより、チオール基と貴金属との強固な共有結合を形成させて、ヌクレオチド鎖（Ｖ）を基板（Ｃ）に固定化することができる。このようにすることにより、貴金属を基板として利用する電気化学的測定法、水晶発振子マイクロバランス法、表面プラズモン共鳴法等の測定法を遺伝子解析に利用することが可能となる。
【００４９】
貴金属などの金属基板あるいは、金属薄膜を形成したガラスあるいはプラスチックの支持体を利用する場合には、金属基板あるいは金属薄膜との結合性を有するチオール基およびヌクレオチド鎖との結合性を有する―ＮＨ２の両者が存在する８−アミノ−１−オクタンチオールなどのアミノアルカンチオールを修飾物質として用いることができる。
【００５０】
また、ガラス基板を利用する場合には、ガラスとの結合性を有するシラノール基を加水分解により生ずるメトキシシリル基あるいはエトキシシリル基などのアルコキシシリル基およびヌクレオチド鎖との結合性を有する―ＮＨ２の両者が存在するガンマ−アミノプロピルトリエトキシシランなどのシランカップリング化合物を修飾物質として用いることができる。
【００５１】
以上、ウラシル塩基を有するｄＵＭＰをテーリングさせ、ＵＤＧを作用させて分解する例について説明してきたが、以下の表１に挙げたような、ウラシル塩基、５−ヒドロキシウラシル塩基、５，６−ジヒドロキシウラシル塩基または５−フルオロウラシル塩基を有するヌクレオチドを用いてもよい。
【００５２】
より具体的に例示すると、上述したウラシルはシトシンの４位の炭素に存在するアミノ基が脱アミノ化し、カルボニル基に変異したものである（塩基の符号付けは国際純正・応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）の基準による。）。
【００５３】
これらのヌクレオチドのテーリングと同ヌクレオチドに特異的に作用するウラシルＤＮＡグリコシラーゼとを組み合わせても、修飾反応前の期のヌクレオチド鎖の構造および構成を保持した状態でヌクレオチド鎖の３´末端にアルデヒド基を形成することができ、アルデヒド基に対する結合基（−ＮＨ２基など）を持った修飾物質で直接的に修飾可能である。
【００５４】
【表１】
0004823310.tif 000004
【００５５】
修飾物質は、ヌクレオチド鎖に形成されるアルデヒド基に対する結合基を有していればよく、Ｈ２Ｎ−を含んだ基、たとえばアミノ基（Ｈ２Ｎ−）、ヒドラジノ基（Ｈ２ＮＨＮ−）あるいはアミノオキシ基（Ｈ２ＮＯ−）等が適宜に利用可能である。
【００５６】
ラベル化、標識化のための修飾物質としては、上述したアミノオキシビオチン（ビタミン）の他に、アミノオキシ基を有する蛍光物質であるフルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５に代表されるシアニン系化合物、あるいは非蛍光性のジゴギシゲニン等を用いることができる。蛍光性物質でヌクレオチド鎖を修飾すると、遺伝子解析、とりわけFluorescence in situ Hybridization （ＦＩＳＨ法）に有用となる。なおビオチンはビタミン、ジゴギシゲニンは脂質の一例である。
【００５７】
アミノ酸、オリゴペプチド、タンパク質もアミノ基を有するため使用可能である。アミノ酸の内、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンは、蛍光性を有するため好適に使用できる。蛍光性を有しないアミノ酸やペプチド等も、側鎖にフルオレセイン等（以下、標識化合物）を結合させることで使用可能である。
【００５８】
ペプチドはそれを構成するアミノ酸の数に応じた側鎖が存在するため、複数の標識化合物を結合させることが可能となる。例えば、リシンが３つ連鎖したトリリシンには側鎖にアミノ基が３つ存在するため、カルボキシル基、スクシンイミド基等を有する標識化合物を任意に合計３つ修飾することが可能となる。
【００５９】
タンパク質として例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、有色性、蛍光性を有するフィコエリスリン、トランスフェリン、ヘモグロビン、緑色蛍光タンパク、青色蛍光タンパク、エクオリン等を使用可能である。
【００６０】
ペプチド（タンパク質を含む）に限らず、アミノ基を有するアルキル、アリル、シクロアルカン、芳香族、糖類等の炭化水素類を標識化合物で修飾した物質を修飾物質として用いて、ヌクレオチド鎖を修飾することも可能である。
【００６１】
その他、表面にアミノ基を形成させた金コロイド、銀コロイド等の貴金属コロイド、磁性微粒子、ポリスチレンビーズ等の高分子微粒子に代表される微粒子など生体外因性物質も、ヌクレオチド鎖の修飾物質として使用可能である。
【００６２】
基板への結合に用いる修飾物質は、ヌクレオチド鎖に形成したアルデヒド基に対する結合基と基板に対する結合基とを有していればよく、たとえばアミノ基とチオール基とを有する化合物であれば、特に限定なく使用することができる。上述のアミノアルカンチオールはその具体例である。アミノ基・チオール基間の炭化水素残基は、直鎖状、分岐鎖状、シクロ環状、アリル鎖状、芳香環状等、種々の形態であってよく、その炭素数、アミノ基の位置等、変更可能である。
【００６３】
基板は、水晶発振子マイクロバランス法や表面プラズモン共鳴法等では金基板が汎用されるが、これに限定されず、金の他に、白金、銀などの貴金属、銅、パラジウム、インジウム、ニッケル、鉄、アルミニウム、及びそれらの合金等も使用される。
【００６４】
修飾物質として、アミノ基を有するシランカップリング化合物を使用してもよく、それにより、ガラス、シリコン、シリカ、アルミナ、マイカ、及びポリスチレン、ナイロン、エポキシ等の高分子樹脂等の基板にヌクレオチド鎖を固定化することが可能となり、従来からの様々な遺伝子解析手法にも適用可能となる。
【００６５】
シランカップリング化合物は、アミノ基とアルコキシシリル基（たとえばメトキシシリル基、エトキシシリル基など）とを有する化合物であれば、アルカンチオールと同様に、構造等に特に制限なく使用可能である。使用可能なシランカップリング化合物はたとえば、ガンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−ベータ（アミノエチル）−ガンマ−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−ベータ（アミノエチル）−ガンマ−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−ベータ（アミノエチル）−ガンマ−アミノプロピルトリエトキシシラン、ガンマ−アミノプロピルトリメトキシシラン等である。
【００６６】
本来はアミノ基やアミノオキシ基やヒドラジン基を有しない物質も、これらの結合基を有する適当なスペーサーを介することで、ヌクレオチド鎖を修飾可能となる。たとえばカルボキシル基を有する物質は、スペーサーとして、１，２−ジアミノエタン、１，６−ジアミノヘキサン等のジアミノ構造を有する物質を介在させることで、ヌクレオチド鎖を修飾可能となる。さらには、シアノ基を有する物質、あるいはＧｒｉｇｎａｒｄ試薬の様にハロゲン化マグネシウムを有する物質も、修飾物質として使用可能である。
【００６７】
以下、具体的な実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００６８】
修飾対象のヌクレオチド鎖として、ヌクレオチド数２５の１本鎖化学合成オリゴデオキシヌクレオチド（Sigma-Aldrich Japan 社に合成を委託）を用いた。このヌクレオチド鎖の塩基配列は、５´末端からＣＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧＡＡＣＣＴＣＣＣであり、ヒト骨格筋ミオシン重鎖１のＤＮＡ塩基配列５７８６〜５８１０位（米国国立バイオテクノロジーインフォメーションセンターのＧｅｎＢａｎｋ、インターネットウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）、アクセッション番号：NM_005963、2004年2月現在）の配列に対して相補的な塩基配列である。Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃはそれぞれ、アデニン、グアニン、チミン、シトシンを表す。
【００６９】
上記のヌクレオチド鎖２．５μＭ、ＴｄＴ（Fermentas社製）１ｕ（単位）／μｌ、ＵＤＧ（New England BioLabs社製）０．２ｕ／μｌ、ｄＵＴＰ１ｍＭ、塩化マグネシウム２ｍＭ（それぞれの最終濃度）を、５０ｍＭ  ４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に混和し（全量５０μｌ）、３７℃で２時間反応させ、１００℃で１５分間加熱処理した。次いでアミノオキシビオチン(同仁化学研究所製)を２ｍＭになるように添加し、同反応混液を修飾対象のヌクレオチド鎖が２μＭになるよう希釈した後、３７℃で１時間反応させた。塩化マグネシウムはＴｄＴの活性化因子として２価金属カチオンが要求されるため添加するものである。
【００７０】
このヌクレオチド修飾プロセスを７Ｍ尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Molecular Cloning 第2版  11．23頁 1989年）により追跡した。７Ｍ尿素および５％グリセリン含有１５％ポリアクリルアミド、緩衝液として、８９ｍＭトリス−ホウ酸、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸ナトリウムを用いた。ヌクレオチド鎖の検出は、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Invitrogen社製）染色で実施した。結果を図４に示す。
【００７１】
レーン１は分子量マーカー（Promega社製）、レーン２は未処理のヌクレオチド鎖、レーン３は３７℃で２時間の反応後のヌクレオチド鎖、レーン４は１００℃で１５分間の加熱処理後のヌクレオチド鎖、レーン５はビオチンでの修飾処理後のヌクレオチド鎖、の電気泳動パターンをそれぞれ示している。
【００７２】
レーン１の分子量マーカーは、１０ｎｔ〜１００ｎｔ（１０ｎｔ間隔毎、１０ｎｔはヌクレオチド数１０を示す。）のヌクレオチド鎖を含むもので、図中の矢印は、１００ｎｔ、８０ｎｔ、５０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔおよび１０ｎｔの電気泳動移動位置をそれぞれ示している。レーン２に示す未処理のヌクレオチド鎖は２５ｎｔである。
【００７３】
レーン３において、ヌクレオチド鎖は２７〜３０ｎｔ程度となっている。ＴｄＴとＵＤＧとを反応混液中に共存させたことにより、ヌクレオチド鎖へのｄＵＭＰのテーリング反応と、テーリングしたｄＵＭＰの分解反応とが逐次に進行したことを示している。
【００７４】
レーン４において、ヌクレオチド鎖長が２５ｎｔに回復している。ＵＤＧによって分解されたｄＵＭＰが加熱処理で解離したことを示している。
レーン５において、レーン２やレーン４のヌクレオチド鎖に比べて、ヌクレオチド鎖の移動度が遅くなっている。この結果は、ヌクレオチド鎖の５´末端をビオチンで直接修飾した場合に電気泳動の移動度が遅くなる（例えば、Chollet A. ら  Nucleic Acids Res. 13巻 1529頁 1985年など）ことから、ヌクレオチド鎖がビオチンで修飾されたことを示すものと解される。ｄＵＭＰの解離に伴ってヌクレオチド鎖の３´末端にアルデヒド基が形成されていて、そのアルデヒド基とアミノオキシ基とが反応して、特別な触媒を必要としなくとも自発的に架橋結合反応が進行し、−ＮＨ２の一種であるアミノオキシ基とアルデヒド基の間でシッフの塩基が形成することで、ヌクレオチド鎖の３´末端が直接的にビオチンで修飾されたことによる。
【００７５】
以上の実施例１に示したヌクレオチド鎖の塩基配列の構成、鎖長、修飾物質の種類、反応条件、反応組成（緩衝液等）は、本発明の例示にすぎず、これらに限定されることなく任意に改変可能である。
【比較例１】
【００７６】
ヌクレオチド鎖を２．５μＭ（最終濃度、以下同様）、ＴｄＴを１ｕ／μｌ、ＵＤＧを０．２ｕ／μｌ、ｄＵＴＰを１ｍＭにて混合するのは実施例１と同様であるが、予めアミノオキシビオチン１ｍＭを添加し、ＴｄＴの活性化因子として塩化コバルト２ｍＭを用いて、０．１Ｍカコジル酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）の緩衝下で、３７℃にて３０分間保持した。
【００７７】
このヌクレオチド修飾プロセスを実施例１と同様にして７モル尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により追跡した。結果を図５に示す。
レーン１は実施例１と同様の分子量マーカーであり、レーン１の横に付した矢印は、１００ｎｔ、５０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔおよび１０ｎｔの電気泳動移動位置をそれぞれ示している。
【００７８】
レーン２は未処理のヌクレオチド鎖を示し、レーン３は修飾処理を施したヌクレオチド鎖を示している。
レーン２およびレーン３に示されたヌクレオチド鎖間では、電気泳動移動度の相違は認められない。レーン３のヌクレオチド鎖はビオチンで修飾されなかったこと、つまりＴｄＴのテーリング反応は生じなかったことを示すものである。
【００７９】
次に、ヌクレオチド鎖、付加するヌクレオチド、酵素を加えずに、修飾物質としてアミノオキシビオチンを用いて、活性化因子および緩衝液との組み合わせについて、適否を調べた。結果を以下の表２に示す。
【００８０】
【表２】
0004823310.tif 000005
【００８１】
緩衝液として、上記のカコジル酸カリウムを用いたときも、実施例１で使用した４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸−水酸化カリウムなどを用いたときも、活性化因子として、塩化マグネシウムあるいは塩化マンガンとアミノオキシビオチンを共存させても沈殿は生じず、塩化コバルトを共存させると褐色の沈殿が生じた。コバルトイオンとアミノオキシビオチンのアミノ基とが反応して不溶性錯体が形成されるためと考えられる。
【００８２】
この結果は、活性化因子としてコバルトイオンを採用する場合には、ヌクレオチド鎖の３´末端にアルデヒド基などの官能基を形成した後に、そのヌクレオチド鎖をエタノール沈殿あるいはその他の方法によりコバルトイオンから分離する必要があり、直ちに修飾物質による修飾反応に移行することは困難であることを意味する。
【００８３】
これに対し、マクネシウムイオンあるいはマンガンイオンを採用する場合には、−ＮＨ２を有する修飾物質との反応による不溶性の沈殿物が生じない。そのため、ヌクレオチド鎖の３´末端にアルデヒド基などの官能基を形成した後に、エタノール沈殿などによるヌクレオチド鎖の回収操作あるいはゲルろ過などによる反応混液組成の置換操作をすることなく、その同一の反応混液中に修飾物質を混和して直ちに修飾反応へと移行することが可能である。
【比較例２】
【００８４】
以下に示す活性化因子を含んだ各種の緩衝液（全量５０μｌ）を使用すること以外は、実施例１と同様にして、ヌクレオチド鎖にｄＵＭＰをテーリングさせた。
緩衝液１：２ｍＭ塩化マグネシウムを含んだ、５０ｍＭ  ４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）（以下、マグネシウム含有スルホン酸緩衝液という）
緩衝液２：２ｍＭ塩化マンガンを含んだ、５０ｍＭ  ４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）（以下、マンガン含有スルホン酸緩衝液という）
緩衝液３：２ｍＭ塩化コバルトを含んだ、０．１Ｍカコジル酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）（以下、コバルト含有カコジル酸緩衝液という）
各緩衝液を用いた反応混液の３０分毎の経時変化（３０分、６０分、９０分、１２０分）を、実施例１と同様にして、７モル尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により追跡した。結果を図６に示す。
【００８５】
レーン１は実施例１と同様の分子量マーカーであり、レーン１の横に付した矢印は、１００ｎｔ、５０ｎｔ、３０ｎｔ、２０ｎｔおよび１０ｎｔの電気泳動移動位置をそれぞれ示している。レーン２は未処理のヌクレオチド鎖を示している。
【００８６】
レーン３〜６はそれぞれ、マグネシウム含有スルホン酸緩衝液を用いたときのヌクレオチド鎖の経時変化（３０分、６０分、９０分、１２０分）を示し、
レーン７〜１０はそれぞれ、マンガン含有スルホン酸緩衝液を用いたときのヌクレオチド鎖の経時変化（３０分、６０分、９０分、１２０分）を示し、
レーン１１〜１４はそれぞれ、コバルト含有カコジル酸緩衝液を用いたときのヌクレオチド鎖の経時変化（３０分、６０分、９０分、１２０分）を示している。
【００８７】
図６に示すとおり、ｄＵＭＰのテーリング反応効率は、コバルト含有カコジル酸緩衝液を用いた場合に最も高く、マンガン含有スルホン酸緩衝液を用いた場合がそれに続き、マグネシウム含有スルホン酸緩衝液を用いた場合が最も低い。従来より、ＴｄＴの反応にはコバルトイオン―カコジル酸緩衝液の組み合わせが最も反応活性が高いことが示されており（例えば、Bollum F.J.著 The Enzymes 10巻 145頁 1974年 Academic Press）、それに一致する結果である。
【００８８】
しかし本発明方法のようにヌクレオチド鎖の３´末端にアルデヒド基等の官能基を形成する目的であれば、むしろＴｄＴの反応効率が低い方が、後続反応となるＵＤＧでの分解反応のための基質量が少なくなるため望ましい。ｄＵＭＰのようなヌクレオチドが過度に付加することを防止し、付加したヌクレオチドを分解する後続反応の進行を容易とするためである。
【００８９】
このため、コバルトイオン―カコジル酸緩衝液の組み合わせは、ＴｄＴの反応効率の観点から、またコバルトイオンが修飾物質を沈殿させる要因であるという観点から、さらにはカコジル酸自体がヒ素化合物であるという観点から、避けるのが望ましい。
【００９０】
したがって、付加反応を触媒する酵素としてＴｄＴを使用する場合には、その活性化因子としてコバルトイオン以外の２価金属カチオン、たとえばマンガンイオンあるいはマグネシウムイオンを使用するのが望ましく、それにより修飾物質の沈殿を防止することができる。またＴｄＴの反応活性を穏和にする緩衝剤成分、たとえば４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸を使用するのが望ましい。２−モルホリノエタンスルホン酸などのグッドの緩衝剤、あるいは３，３−ジメチルグルタル酸などを使用してもよい。
【００９１】
これらの緩衝剤は、その化学構造にアミノ基を有しないため、緩衝剤として汎用される２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール（通称トリス）のような−ＮＨ２を有する緩衝剤により生じる修飾反応の阻害を回避することが可能となる。
【００９２】
以上の実施例においては、ｄＵＭＰのテーリング反応を例にとって、ＴｄＴに対する酵素活性化能があまり良好でない活性化因子と、反応を穏和に進行させる緩衝液成分との組み合わせを例示したが、本発明に用いられる緩衝液成分とＴｄＴ活性化因子との組み合わせはこれに限定されるものでない。表１に示した塩基を有する２´−デオキシヌクレオチド５´−一リン酸のテーリング反応において、テーリング反応の進行が穏和な緩衝液成分とコバルトイオンを除くＴｄＴ活性化因子の組み合わせが適宜、採用可能である。
【００９３】
また、化学合成あるいは複製反応により獲得されるヌクレオチド鎖には、天然のヌクレオチドには存在しない表１に示した塩基を有するヌクレオチドをその配列中に形成することがある。たとえば、ヌクレオチド鎖の複製反応の際にそのヌクレオチド鎖の塩基配列中にグアニンやシトシンが多数存在する場合、グアニンを有するヌクレオチドを複製反応で取り込ませることは複製効率低下の要因となるため、グアニンの代わりにヒポキサンチンを有するヌクレオチドを利用する（例えば、Nucleic Acids Res. 21巻 4427頁 1993年）。このように複製反応により獲得されたヌクレオチド鎖には、その配列中にヒポキサンチンが存在することになり、本発明のヌクレオチド鎖修飾方法で例示したヒポキサンチンを有するヌクレオチドをテーリングすると、修飾対象のヌクレオチド鎖も後続の分解反応により分解されることになる。このような場合は、ヒポキサンチン以外の塩基を有するヌクレオチドを適宜選択し、テーリング反応すればよい。後続の分解反応に利用するＤＮＡグリコシラーゼあるいはＤＮＡ修復酵素は、その基質となる塩基を有するヌクレオチドに特異性を有しているため、修飾対象のヌクレオチド鎖の分解を回避することが可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明のヌクレオチド鎖修飾方法は、修飾対象のヌクレオチド鎖の３´末端を、ヌクレオチド鎖の鎖長に関わらずまたヌクレオチド鎖の本来の状態を保持して、任意の修飾物質で定量的に安定的に、かつ、簡便に短時間で修飾することが可能なので、ヌクレオチド鎖のラベル化、標識化、固定化等を要する遺伝子解析などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のヌクレオチド鎖修飾方法の原理を示す反応模式図
【図２】図１の反応を利用してヌクレオチド鎖をラベル化、標識化する過程を示す反応模式図
【図３】図１の反応を利用してヌクレオチド鎖を貴金属基板に固定化する過程を示す反応模式図
【図４】本発明のヌクレオチド鎖修飾方法の各反応過程での反応状況を示すポリアクリルアミドゲル電気泳動図
【図５】本発明のヌクレオチド鎖修飾方法における酵素活性化因子の影響を示すポリアクリルアミドゲル電気泳動図
【図６】本発明のヌクレオチド鎖修飾方法におけるテーリング反応での酵素活性化因子と緩衝剤成分の影響を示すポリアクリルアミドゲル電気泳動図
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110>  MATSUSHITA ELECTRIC INDUSTRIAL CO., LTD
<120>  Method for modifying nucleotides
<130>  2892080059
<150>  JP2006-156731
<151>  2006-06-06
<160>  1
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  25
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  chemical synthesized oligodeoxynucleotide
<220>
<221>  misc_feature
<223>  complementary sequence for human adult myosin heavy chain 1 in
the region 5810 to 5786
<300>
<308>  NM_005963
<309>  2004-02-02
<313>  (5786)..(5810)
<400>  1
cttatgattt ttgtgtgaac ctccc                                           25
【図１】
0004823310.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
0004823310000001.app