(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フリーラジカルの過剰産生から細胞を保護するための医薬組成物であって、
前記組成物は、親油性酸化防止剤及び親水性酸化防止剤を含み並びに許容しうる担体を適宜含み、
前記親油性酸化防止剤が、
a)５〜２０部のビタミンＥ、
b)１〜１５部のβ−カロテン及び、
c)リコペルシコン・エスキュレンタムの抽出物の形態にある１〜４部のリコペン
からなる混合物であり、かつ
前記該親水性酸化防止剤が、
d)２〜６０部のビタミンＣ及び、
e)１〜３０部のヴィティス・ヴィニヘラ抽出物
からなる混合物であることを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記組成物がセレンを更に含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記親油性酸化防止剤がビタミンＥアセテート又はビタミンＥスクシネートを含んでいる、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
前記親水性酸化防止剤がビタミンＣのナトリウム塩を含んでいる、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が亜セレン酸ナトリウム又はセレン酵母を含んでいる、請求項２記載の組成物。
【請求項６】
前記担体が天然植物油、完全に又は部分的に水素化した植物油、レシチン、植物ホスファチド及び天然ワックスからなる群より選ばれる、請求項１記載の組成物。
【請求項７】
前記担体がダイズ油、完全に又は部分的に水素化したダイズ油、ナタネ油、ピーナッツ油、ダイズレシチン、ダイズホスファチド、卵レシチン及び蜜蝋からなる群より選ばれる、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
軟ゼラチン若しくは硬ゼラチンカプセル、錠剤、コーティング錠、坐剤又は経皮形態で投与される、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
フリーラジカルの過剰産生から細胞を保護するための医薬組成物であって、
該組成物が、親油性酸化防止剤及び親水性酸化防止剤を含み並びに許容しうる担体を適宜含み、
該親油性酸化防止剤がビタミンＥ、β−カロテン及びリコペルシコン・エスキュレンタムの抽出物からなる混合物であり、
該親水性酸化防止剤がビタミンＣ及びヴィティス・ヴィニヘラ抽出物からなる混合物である
ことを特徴とする医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は細胞保護を改善する新規な方法であって、植物ヴィティス・ヴィニヘラ（Vitis vinifera）及びリコペルシコン・エスキュレンタム（Lycopersicon esculentum）の抽出物とビタミンＣ、ビタミンＥ、β−カロチン及びセレンとの組合せの投与を利用した方法、並びに、老化、動脈硬化症及び癌等のフリーラジカルの過剰産生に関連する病状を治療又は予防するための前記組合せの使用に関する。
先行技術の説明
酸化防止剤は身体成分をフリーラジカルによる損傷から保護するために作用する（Harman D.; Holliday R. 及び M. Meydany - Editor, "Towards Prolongation of healthy life span", Annals of the New York Academy of Sciences, Vol. 854, 1998, New York; Stahlin H.B., "The Impact of Antioxidants on Chronic Disease in Ageing and Old Age", Int. J. Vitamin. Nutr. Res. 69, 146-149, 1999）。
酸化防止剤の摂取量の増加が冠動脈疾患及び幾つかの腫瘍の臨床的発現を制限するという知見を幾つかの疫学的研究が支持している（Comstock GW; Alberg AJ; Huang HY, Wu K.; Burke AE; Hoffman SC; Norkus EP; Gross M.; Cutler RG; Morris JS; Spate VL; Helzlsouer KJ, "The risk of developing lung cancer associated with antioxidants in the blood: ascorbic acid, carotenoids, alpha-tocopherol, selenium, and total peroxyl radical absorbing capacity", Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 6, 907-916, 1997）。酸化防止剤の食事摂取量が高い個体は長い平均寿命を有するだろう。
環境的及び栄養学的因子により誘導される個々の条件、環境ストレス及び酸化的ストレスは、防御能力が異なる広範囲の個体に影響を及ぼす。
一般論として、非常に良好なバランスのとれた防御機構をもつ個体は慢性病を免れるが、全体的な老化過程には最終的に屈するだろう。しかしながら、重要な系が十分に保護されておらず、損傷した状態になる場合が多いだろう。この過程の結果は慢性病として臨床的に診断されるだろう。
【０００２】
したがって、酸化的ストレスに対する身体防御における重要な要素としての酸化防止剤は、特定の病気に対する保護機能だけでなく一般的な老化防止特性を有する。慢性病の結果は老齢者の能力障害の主原因の中に存在しているので、適切な酸化防止的防御による第一次予防は、「老化防止」機能だけでなく、より重要な特定の慢性病予防機能を有する。しかしながら、これは一生の重要な保護機構であること、すなわち老化関連慢性病の一次予防は幼いときに開始して一生涯にわたって続ける必要があることが明らかになった。
酸化防止剤と慢性病との関係はおそらく循環器病において最も調査されている。血漿中酸化防止剤濃度と冠状動脈性心臓病の罹患率及び死亡率との間の強力な逆比例関係が実証されている。このデータの分析により、異なる抗酸化ビタミンの寄与を定量化することが許容された。これらの結果にしたがうと、ビタミンＥの十分な摂取が最も重要であり、続いてビタミンＣ及びカロテンの摂取が重要である。
全体的に非常に良好なビタミンＥ状態にある集団の分析において、ビタミンＣ及びβ−カロテンの強力な効果が観察された。ビタミン機能を有しない食物由来のその他の酸化防止剤、例えばフラボノイド、ポリフェノール又はリコペンは非常に重要な酸化防止機能を有することが周知である（Fuhrman B.; Ben-Yaish L.; Attias J.; Hayek T.; Avaram M., "Tomato lycopene and beta-carotene inhibit low-density lipoprotein oxidation and this effect depends on the lipoprotein vitamin E content", Nutr Metab Cardiovasc Dis 7, 433-443, 1997; Pastori M.; Pfander H.; Boscoboinik D.; Azzi A., "Lycopene in association with alpha-tocopherol inhibits at physiological concentrations proliferation of prostate carcinoma cells", Biochem Biophys Res Commun 250 (3), 582-585, 1998; Boehm F.; Edge R.; McGarvey DJ; Truscott TG, "Beta-carotene with vitamins E and C offers synergistic cell protection against Nox", FEBS Lett 436, 387-389, 1998; Watkins T.R. - Editor, "Wine, Nutritional and Therapeutic Benefits", American Chemical Society Symposium Series 661, 1997, Washington DC）。
【０００３】
成人期後期及び老齢期初期において、癌は早死の主な原因である。大多数の癌は、環境因子が組織の特定の遺伝的資質を増殖障害にとって高リスクな状態で攻撃した結果である。果実及び野菜の摂取量が低いこと及び抗酸化ビタミンの血漿中濃度が低いことが有意に高い癌罹患率及び死亡率と関連していることを疫学的証拠は実証している。このことは胃腸癌及び肺癌についても当てはまる。しかし、前立腺癌及び乳癌については当てはまらない。
腫瘍形成過程は事象の高度に複雑な結果である。潜在的に危険な多数の変異が連続的に起こる。これらの遺伝子変化が初期防御及び修復機構を免れた場合、変質した細胞はその他の防御機構により排除されなければならない。一つの重要な機構はアポトーシス過程である。増殖段階の前駆細胞（committed cell）は酸化防止剤により身体自体の免疫及びアポトーシス防御機構から保護される。このことは、なぜ酸化防止剤が乳癌組織で高濃度に発生するかを説明するだろう。果実及び野菜が豊富でありかつ酸化防止剤の種類が多様な食事を生涯を通して多く摂取することが晩年における悪性障害のリスクを実質的かつ有意に低下させることについて疑いはない。
原発性変性脳病及び脳血管障害に関連する病気は老年者の能力障害の主な原因である。自律性の喪失、依存症並びに個人及び社会に対する高い社会的費用は脳機能障害の結果である。個人の平均寿命における印象的な利益（impressive gain）は、老齢者の精神的機能の喪失により影が薄くなる。それ故、精神障害を導く障害を予防及び治療することが、現代のヘルスケアシステムの主要な挑戦として明らかになってきた。以前の実験では、異なる慢性病を導く循環系又は特定の神経系の障害により重ね合わされる老化関連機能変化の組合せが観察される。
細胞の完全性及び機能の維持における酸化防止剤の重要性を考慮すると、酸化防止剤（ビタミンＥ、カロテン、ビタミンＣ）及び食物に由来するその他の微量栄養素（例えばポリフェノール、フラボノイド、リコペン）は血管系の病気のリスクを低下させ、酸化的ストレスからニューロンを保護してニューロンの機能を維持するだろう。高齢者についての幾つかの疫学的研究が酸化防止剤と認知能力との間の関係を明らかにした。
【０００４】
その他の疫学的データは赤ワインが心臓病による死亡率を低下させること、いわゆるフレンチ・パラドックスを示している。１９７８年から１９８３年の間に東フランスの３４０１４名の男性に対して行われた分析は、ワインの中程度の摂取（２〜５杯のワイン）と、全てを原因とする死亡率の２４〜３１％の低下とが関連することを示した（Renaud S.C.ら, "Alcohol and Mortality in Middle-Aged Men from Eastern France", Epidemiology 9, 184-188, 1998）。
単一の酸化防止剤化合物について多数の研究が行われてきたが、植物ヴィティス・ヴィニヘラ（ブドウ）抽出物及び植物リコペルシコン・エスキュレンタム（トマト）抽出物等の天然起源酸化防止物質とビタミンＣ、ビタミンＥ、β−カロチン及びセレンとの組合せを投与したときの薬理効果は全く研究されていなかった。
イスラエル特許出願ＩＬ１２１１１２（１９９７年６月１９日）は、リコペン及びビタミンＥを含む相乗的混合物並びにＬＤＬ酸化予防における当該混合物の使用を記載している。更にその出願人は、リコペンによるＬＤＬ保護がβ−カロテンによる保護を凌ぐとする結果を科学論文で発表した。しかしながら、その効果は高含量のビタミンＥを用いたＬＤＬのみについての選択的なものであり、カロテノイドがビタミンＥとの組合せで存在するときには増強された（Fuhrman B.; Ben-Yaish L.; Attias J.; Hayek T.; Avaram M., loc. cit.）。
米国特許第５，６４８，３７７号（１９９７年７月1５日）はリコペンとヴィティス・ヴィニヘラ抽出物との組合せ関するものであり、当該組合せが相乗的酸化防止効果を奏することを示している。
【０００５】
発明の概要
本発明の対象は、植物ヴィティス・ヴィニヘラ及びリコペルシコン・エスキュレンタムの抽出物とビタミンＣ、ビタミンＥ、β−カロテン、適宜セレンとの組合せの投与が相乗的な態様で細胞保護を増強させたという驚くべき知見にある。前記物質の組合せによる細胞保護の改善はヴィティス・ヴィニヘラ抽出物とリコペンとの組合せ（米国特許第５，６４８，３７７号）又はビタミンＥとリコペンとの組合せ（イスラエル特許出願ＩＬ１２１１１２）による改善よりも統計学的に大きいことを本明細書記載の実験結果は示している。
したがって本発明はフリーラジカルの過剰産生により引き起こされる病気から細胞を保護するための改善された方法であって、親油性酸化防止剤及び親水性酸化防止剤の相乗量（synergistic amount）並びに任意の許容しうる担体を含む組成物の保護的有効量又は治療学的有効量を投与する工程を含み、前記改善において前記親油性酸化防止剤がビタミンＥ、β−カロテン及びリコペルシコン・エスキュレンタム抽出物から本質的になる混合物であり、前記親水性酸化防止剤がビタミンＣ及びヴィティス・ヴィニヘラ抽出物から本質的になる混合物であることを特徴とする方法に関する。
別の側面において、本発明はフリーラジカルの過剰産生により引き起こされる病気を患う対象を治療する方法であって、本発明の組成物の治療学的有効量を投与する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
更なる側面において、本発明は炎症を患う対象を治療する方法を提供する。
別の側面において、本発明の方法はアテローム性動脈硬化症を患う対象の治療に適用可能である。
更に別の側面において、本発明の方法は対象中でフリーラジカルにより誘導される変異原性活性（mutagenic activity）を防止する方法を提供する。
更に別の側面において、本発明の方法は腫瘍を患う対象の治療に有用である。
【０００６】
発明の詳細な説明
好ましい態様において、本発明はビタミンＥ、β−カロテン、リコペルシコン・エスキュレンタム抽出物、ビタミンＣ、ヴィティス・ヴィニヘラ抽出物及びセレン化合物を投与する工程を含んでいる。好ましいセレン化合物は亜セレン酸ナトリウム又はセレン酵母（selenium yeast）である。
前述又は後述する用語「リコペルシコン・エスキュレンタム抽出物」にはリコペンの希釈組成物が含まれる。前記のリコペンは植物、藻類、菌類若しくは遺伝子修飾生物から抽出する又は合成により得ることができるだろう。好ましくはトマトの乾燥表皮の抽出物を直接利用する。
前述又は後述する用語「ヴィティス・ヴィニヘラ抽出物」にはプロシアンドリック（procyandolic）オリゴマーの希釈組成物が含まれる。好ましくはレッドバイン（red vine）種子の抽出物が直接的に利用される。
別の好ましい態様において、本発明の方法は、
（ａ）５〜２０部、好ましくは７．５〜１５部のビタミンＥ、特にビタミンＥアセテート又はビタミンＥスクシネート、
（ｂ）１〜１５部、好ましくは２〜１０部のβ−カロテン、
（ｃ）１〜４部、好ましくは１．５〜３部のトマト乾燥外皮から得られるリコペルシコン・エスキュレンタム抽出物、
（ｄ）２〜６０部、好ましくは５〜５０部のビタミンＣ、特にビタミンＣのナトリウム塩、及び
（ｅ）１〜３０部、好ましくは１．１〜２５部のヴィティス・ヴィニヘラ抽出物、特にレッドバイン種子から得られる抽出物
の投与を含んでいる。
【０００７】
好ましくは親油性酸化防止剤及び親水性酸化防止剤は医薬的に許容しうる担体の存在下で投与される。Remington: the science and practice of pharmacy. 19th ed. Easton : Mack Publ., 1995に適切な賦形剤が例示されている。
最も好ましい担体は天然植物油、完全に又は部分的に水素化した植物油、特にダイズ油、完全に又は部分的に水素化したダイズ油、ナタネ油、ピーナッツ油、レシチン、特にダイズレシチン、卵レシチン、植物ホスファチド、特にダイズホスファチド、及び天然ワックス、特に蜜蝋からなる群より選ばれる。
本発明の組成物は固形物又は溶液として製剤化されるだろう。固形製剤は注射前溶液調製物用であってもよい。好ましくは本発明の組成物は軟ゼラチンカプセル若しくは硬ゼラチンカプセル、錠剤、コーティング錠、坐剤又は経皮形態で投与される。投与量は、患者の体重及び健康状態、根本的な病気の性質、適用する化合物の治療濃度域、溶解性などの因子にしたがい調節されるだろう。投与量を適切に調節することは当業者の知識の範囲内にある。
したがって本発明の更なる側面は、少なくとも部分的にフリーラジカルの過剰産生を起こしている病的状態、例えば老化、炎症、アテローム性動脈硬化症又は癌を患う対象を治療するための医薬組成物の製造における本発明の組成物の使用である。更なる本発明の側面は炎症、アテローム性動脈硬化症又は癌を予防及び／又は治療する方法であって、本発明の医薬組成物の有効量を患者へ投与する工程を含むことを特徴とする方法である。
本研究の目的は、ＵＶＢ誘導性損傷に対しての、ヴィティス・ヴィニヘラの抽出物、リコペルシコン・エスキュレンタム、ビタミンＣ、ビタミンＥ及びβ−カロテンの組合せによる保護効果並びに各成分間の協同的相互作用の存在をラット赤血球において最初に評価し、次いで内在性酵素による酸化防止的防御をセレンが増強する能力をケラチノサイト細胞系で評価することであった。
詳述すると、以下の研究を行った。
ａ）大量のＵＶＢ線量（１．５〜７．０Ｊ／ｃｍ2）により誘導される溶血の阻止に対するヴィティス・ヴィニヘラ抽出物、リコペルシコン・エスキュレンタム抽出物、ビタミンＣ、ビタミンＥ及びβ−カロテンの組合せ（以降、「活性成分の組合せ」と称する）の容量依存的能力；
ｂ）溶血及び赤血球膜における脂質過酸化を阻害することについての親油性酸化防止剤の混合物（リコペルシコン・エスキュレンタム抽出物、β−カロテン＋ビタミンＥアセテート）の容量依存的能力；
ｃ）溶血及び赤血球膜における脂質過酸化を阻害することについての親水性酸化防止剤の混合物（ヴィティス・ヴィニヘラ抽出物及びビタミンＣ）の容量依存的能力；
ｄ）溶血及び赤血球膜における脂質過酸化に対する前記親油性及び親水性酸化防止剤の組合せによる保護効果；
ｅ）細胞系（ケラチノサイト）におけるセレン放出に対するセレン酵母の能力、すなわち物理的細胞傷害剤（ＵＶＢ）又は化学的細胞傷害剤（クメンヒドロペルオキシド）により誘導される酸化的ストレスに対するグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＳＨ−ＰＸ）活性及び細胞耐性の誘導。
【０００８】
以下の実施例には特定の試薬及び反応条件の概要が記載されているけれども、本発明の範囲に包含される修飾を行うことができることを当業者は理解するだろう。したがって、以下の実施例は本発明を更に説明することを意図するものであって、本発明を限定することを意図するものではない。
実施例
材料及び方法
化学薬品
使用した有機溶媒は分析用グレードであった（Carlo Erba, Milan, Italy）。活性成分（ヴィティス・ヴィニヘラ抽出物、リコペルシコン・エスキュレンタム抽出物、β−カロテン、リコペン、ｄ，ｌ−αトコフェロールアセテート、アスコルビン酸、セレン酵母）はPharmaton SA, CH 6934 Bioggio, Switzerlandにより提供されたものであった。クメンヒドロペルオキシド（ＣｕＯＯＨ）、チオバルビツール酸（ＴＢＡ）、ＥＤＴＡ、亜セレン酸ナトリウム（Ｎａ2ＳｅＯ3）、アジ化ナトリウム（ＮａＮ3）、ピルビン酸ナトリウム、２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦＨ−ＤＡ）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ、Ｌ−グルタミン、ペニシリンストレプトマイシン溶液はSigma(Trimital, Milan, Italy)から購入した。ウシ胎児血清及びリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）はHyclone (Belbio, Milan, Italy)から購入した。Ｈ2Ｏ2（３０％ｖ／ｖ）はFluka (Trimital, Milan, Italy)から購入した。ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、ＧＳＨ及びＧＳＨレダクターゼはBoehringer Mannheim Italy (Milan, Italy)から購入した。
装置
分光光度的研究及び蛍光定量的研究はコンピュータ支援Perkin Elmer Lambda 16分光光度計及びコンピュータ支援Perkin Elmer LS50B発光分光計（Perkin Elmer, Monza, Italy）において行った。
【０００９】
赤血球（ＲＢＣ）へのＵＶＢ照射
雄のウィスターラット（Charles River, Calco, Italy）由来の赤血球を単離し、白血球及び血小板から洗い出し、リン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ））中に懸濁し、４℃で保存し、４日後までに使用した。実験について、赤血球懸濁液のアリコートをストックから出し、１０００×ｇで５分間遠心分離し、０．１ｍｌのペレットをＰＢＳで５０ｍｌに希釈し、１％赤血球懸濁液（約１５×１０7細胞／ｍｌ）を得た。
ＲＢＣ懸濁液の５０ｍｌのアリコートを、波長＞２９０ｎｍの励起光を通すパイレックス（登録商標）ガラス製の皿（直径１４ｃｍ）に置き、異なる時間間隔でＵＶＢ照射に暴露した。阻害剤をＲＢＣ懸濁液へ添加したとき、３７℃で３０分間のプレインキュベーション期間を適用した。ＵＶＢ照射は、２８０〜３２０ｎｍの連続スペクトル（ピーク発光波長３１２ｎｍ）を発光する２つのPhilips TL20W/12蛍光管（Sara s.r.l., Castellanza, Italy）の平行列を用いて行った。細胞照射部位（ＵＶＢ源から２５ｃｍ）におけるフルエンス率は０．８５ｍＷ／ｃｍ2であった。Vilber Lourmat VLX-3W ラジオメーター (ＵＶＢプローブ、３１２ｎｍ)により測定した使用ＵＶＢ線量は１．５〜７．０Ｊ／ｃｍ2（暴露時間３０〜１５０分）であった。
ＵＶＢに誘導された溶血
照射後、ＲＢＣ懸濁液の２ｍｌのアリコートを緩衝食塩水で１：５に希釈し、３０分間隔で１８０分間、７１０ｎｍで比濁法を用いて溶血を測定した。溶血の百分率は、出力５０％で５秒間超音波処理したＲＢＣ懸濁液中で測定された吸光度値を溶血１００％と設定して決定した。５回の測定値の平均値を計算に使用した。
【００１０】
ケラチノサイト
ＮＣＴＣ２５４４ヒトケラチノサイト細胞系（Flow Laboratories, Irvine, UK）を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び抗生物質（１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）を補充したＤＭＥＭ中、３７℃で培養した。加湿５％ＣＯ2雰囲気中３７℃で培養物を維持した。実験について、細胞を５×１０4／ｃｍ2の密度で撒き、８０〜９０％のコンフルエンスになるまで２ｃｍ2の細胞プラスチック製培養皿中で培養した。トリパンブルー排除アッセイ及びＬＤＨ漏出の測定により細胞の生存度を測定した。標準としてウシ血清アルブミンを使用した改変ローリー法によりタンパク質の定量を行った。
グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＳＨ−ＰＸ）活性
増殖細胞を亜セレン酸ナトリウム（５０ｎＭ、５００ｎＭ）又はセレン酵母（３．９５μｇ／ｍｌ又は３９．５μｇ／ｍｌ。それぞれ５０ｎＭ及び５００ｎＭのＳｅに対応する）で処理し、９０％のコンフルエンスまでインキュベートした（４８時間）。照射前に、予め暖めたＰＢＳで細胞を３回洗浄し、ＰＢＳの存在下でＵＶＢ（５０ｍＪ／ｃｍ2）に暴露した。照射後、ＰＢＳを血清−フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ（Ｋ−ＤＭＥＭ）で置き換え、２４時間インキュベートした（偽−対照細胞をＵＶ暴露のない同一手順に付した）。培地を廃棄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液１ｍｌの中へ穏やかに擦り取ることにより細胞を取り出し、超音波処理により溶解させた。ＮＡＤＰＨの消失速度を３４０ｎｍにおける吸光度の低下を恒温（３７℃）分光光度計でモニターすることにより、ＧＰＸ活性について細胞懸濁液（０．１ｍｌのアリコート）を分析した。６．２２×１０3ｃｍ-1ｍ-1のモル吸光係数を使用してＧＰＸ活性を計算し、ｍＵ／ｍｇタンパク質の単位で表現した。ここで、１Ｕの酵素とは、３７℃で１分間当たりに消費された基質のμｍ数又は生成した生成物のμｍ数で表現される。
【００１１】
ＣＵＯＯＨにより誘導される酸化的ストレス
酸化感受性蛍光プローブＤＣＦを使用して細胞生存度及びペルオキシド含量を測定することにより、ＣｕＯＯＨにより誘導される細胞内酸化的ストレス及びセレン酵母による保護効果を決定した。増殖細胞を亜セレン酸ナトリウム（５０ｎＭ又は５００ｎＭ）又はセレン酵母（３．９５μｇ／ｍｌ又は３９．５μｇ／ｍｌ。それぞれ５０ｎＭ及び５００ｎＭのＳｅに対応する）で処理し、９０％のコンフルエンスまでインキュベートした（４８時間）。ＤＣＦＨ−ＤＡのストック溶液（３．３４ｍＭ）をエタノール中で調製し、窒素でパージし、５００μｌのアリコートとして−２０℃で保存した。予め暖めたＰＢＳで細胞の単層を洗浄し、ＰＢＳ中の１０μＭ  ＤＣＦＨ−ＤＡと共に３７℃下で３０分間インキュベートした。その後培地を廃棄し、予め暖めたＰＢＳで細胞の単層を３回洗浄して取り込まれなかったＤＣＦＨ−ＤＡを除去し、次いで０．５ｍＭ  ＣｕＯＯＨを含むＫ−ＤＭＥＭと共にインキュベートした。偽−対照細胞をＣｕＯＯＨ暴露を除く同一の手順に付した。インキュベーション２４時間後に培地を廃棄し、３ｍｌのＰＢＳへ穏やかに擦り取ることにより細胞を取り出した。次いでマグネチックスターラを備えた１ｍｌ恒温蛍光キュベット（２５℃）へ細胞懸濁液を移し、プローブの蛍光強度（λexc５０２ｎｍ、λem５２０ｎｍ、バンド幅５ｎｍ）の増加を記録した。全ての観察時間における蛍光強度値はタンパク質含量と相関（６回の測定値の平均値±Ｓ．Ｄ）し、対照（偽−対照細胞）に関する蛍光の増加の％として表現した。
統計分析
結果を５回の独立した測定値の平均値±Ｓ．Ｄとして表現した。データを一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で分析し、続いてグループ間の統計学的有意性についてはチューキー試験により分析し、不対サンプルについてはスチューデントｔ−検定（両側）により分析した。ｐ＜０．０５のときに差異は有意であるとした。Ｐｒｉｓｍソフトウェア・パッケージ（GraphPad Software Inc., San Diego CA, USA）を使用して統計分析を行った。
【００１２】
実施例１：細胞モデルとしての赤血球
活性成分の組合せによる保護効果
増加するＵＶＢ線量へのラットＲＢＣの暴露は、図１に示される典型的な溶血曲線を与えた。すなわち、溶血過程は６０分間の照射（約３Ｊ／ｃｍ2のＵＶＢ線量に相当する）から始まり（８．５±３．２％）、９０分間（８７．２±６．３％）〜１２０分間（９８．７±４．４％）の間にプラトーに達した。活性成分の組合せについてのサンプルは、ＰＢＳとの混合及びボルテックスにより調製した。得られた均一な懸濁液をＰＢＳ中で更に希釈して終濃度を０．１〜１０μｇ／ｍｌの範囲とした。照射していないＲＢＣを、活性成分の組合せが存在する好気的条件下でインキュベートしたとき、３時間以内に有意な溶血は観察されなかった。照射前にＲＢＣ懸濁液へ添加された活性成分の組合せは顕著かつ用量依存的にＵＶＢ誘導性溶血からＲＢＣを保護した（図１）。最小有効濃度は０．１μｇ／ｍｌであった。５μｇ／ｍｌにおいて、溶血過程は３０分遅延し、１２０分間の照射後でも溶血の割合はわずか３４．５±５．５％であった。最大濃度（１０μｇ／ｍｌ）では、１５０分間のＵＶＢ照射（７Ｊ／ｃｍ2）までＲＢＣの完全性が維持された。１２０分間の時点で計算したＩＣ50値は４μｇ／ｍｌであった。
【００１３】
実施例２：組合せにおける親油性酸化防止剤及び親水性酸化防止剤の組合せによる保護効果
ＵＶＢ誘導性溶血に対しての活性成分の組合せによる保護効果をもっと理解するために、親油性酸化防止剤（ビタミンＥアセテート＋β−カロテン＋リコペルシコン・エスキュレンタム抽出物）及び親水性酸化防止剤（ビタミンＣ＋ヴィティス・ヴィニヘラ抽出物）の混合物をラジカルスカベンジャー能力について調査した。
ビタミンＥアセテート、β−カロテン及びリコペルシコン・エスキュレンタム抽出物のストック溶液を、自動酸化を防止するためにＮ2雰囲気下かつ赤色光の下、ＴＨＦ中で調製し、−２０℃で１週間まで保存した。各酸化防止剤の安定性をＵＶ分光法により毎日チェックした。活性成分の組合せ中に存在する各酸化防止剤間の同一割当（ration）を維持するために、７．０４ｍｇ／ｍｌのビタミンＥアセテート、１．６４ｍｇ／ｍｌのβ−カロテン及び０．８８ｍｇ／ｍｌのリコペンに相当するリコペルシコン・エスキュレンタム抽出物の混合ストック溶液を、ＴＨＦを用いた希釈により調製した。連続希釈物を作成して、ＲＢＣ懸濁液中の終濃度（全親油性酸化防止剤）が１．２、２．４、４．８、９．６μｇ／ｍｌである混合親油性酸化防止剤の検量線用溶液（working solution）を得た。全ての実験においてＴＨＦ濃度は常に０．１％（ｖ／ｖ）であった。
同様のアプローチを親水性酸化防止剤についても使用した。すなわち、ビタミンＣ（６．７２ｍｇ／ｍｌ）及びヴィティス・ヴィニヘラ抽出物（２．８ｍｇ／ｍｌ）の混合ストック溶液をＰＢＳ中で調製し、連続希釈物を作成して、ＲＢＣ懸濁液中の濃度（全親水性酸化防止剤）が０．５８、１．１６、２．３２、４．６４、９．２８μｇ／ｍｌである混合親水性酸化防止剤の検量線用溶液を得た。
図２及び３に示されるように、活性成分の組合せにおける親油性画分及び親水性画分は共に容量依存的態様でＵＶＢ誘導性溶血を防止することができる（ただし、その効力は異なる）。親水性混合物による大きな活性は主にヴィティス・ヴィニヘラ抽出物の存在によるものである。ヴィティス・ヴィニヘラ抽出物は強力な鎖切断性酸化防止剤であること（Maffei Facino R.; Carini M.; Aldini G.; Bombardelli E.; Morazzoni P.; Morelli R.; Free radicals scavenging action and anti-enzyme activities of Procyanidines from Vitis vinifera - A mechanism for their capillary protective action; Arzneim. Forsch./ Drug Res., 44, 592-601, 1994）及びリサイクル機構（水素転移反応）により内在性ビタミンＥをＵＶＢ誘導性消費から保護することが異なるインビトロ実験モデルにおいて示されている。
【００１４】
実施例３：組合せにおける親油性酸化防止剤と親水性酸化防止剤との間の協同的酸化防止相互作用
組合せにおける親油性酸化防止剤と親水性酸化防止剤との間の協同的酸化防止相互作用を、１２０分間の照射で約２０〜３０％の阻害を与える検量線用混合溶液濃度：２．４μｇ／ｍｌの親油性酸化防止剤（ビタミンＥアセテート１．７６μｇ／ｍｌ、β−カロテン０．４１μｇ／ｍｌ、リコペン０．２２μｇ／ｍｌ）及び０．５８μｇ／ｍｌの親水性酸化防止剤（ビタミンＣ  ０．４μｇ／ｍｌ、ヴィティス・ヴィニヘラ抽出物０．１８μｇ／ｍｌ）を使用して研究した。結果を図４及び図５に示す。これらの条件下において、双方の混合物の溶血速度は類似していたが、親水性酸化防止剤の方が親油性酸化防止剤よりもわずかに阻害活性が高かった（１２０分間における阻害で２０％対１４％）。酸化防止剤を組み合わせたとき、溶血速度は著しく遅くなり、ＲＢＣの完全性は９０分間まで維持された。１２０分の時点において、阻害割合（５５±２．５％）は、個々の酸化防止剤混合物について観察された阻害％の合計（計算値３３．８％）を遙かに超えていた。このことは相乗的相互作用を示している。親油性／親水性酸化防止剤の典型的な組合せ（ヴィティス・ヴィニヘラ抽出物＋リコペン）により誘発される保護効果は、親水性成分の組合せについて観察された効果と有意には異ならなかった。一方、ビタミンＥ（１．７６μｇ／ｍｌ）とリコペン（０．２２μｇ／ｍｌ）との連関（association）による溶血の阻害割合は、親油性成分の組合せについて観察された割合よりも有意に低かった（７．１％対１４％）（図５）。
実施例４：細胞増殖及び細胞生存度に対するセレン酵母補充の効果
培養ケラチノサイトにおいて、亜セレン酸ナトリウム又はセレン酵母ははっきりとした増殖刺激活性を全く有しなかった。ＬＤＨ漏出により決定した細胞生存度は常に９５％をこえており、偽対照細胞に関して５０ｎＭ及び５００ｎＭのＳｅ用量で有意に異ならなかった（図６）。
【００１５】
実施例５：ＧＳＨ−ＰＸ活性に対するセレン酵母補充の効果
図７は、対照細胞におけるセレン酵母又は亜セレン酸ナトリウム補充（等モルのＳｅ用量）の効果を示している。亜セレン酸ナトリウムを用いたとき、最大のＧＳＨ−ＰＸ活性誘導は５０ｎＭにて見出された（対照（２８．３１±５．８７ｍＵ／ｍｇタンパク質）に対して３．３６５倍（９１．４４±１０．３７ｍＵ／ｍｇタンパク質）の増加）。しかし、濃度５００ｎＭにおいて更なる増加は観察されなかった。セレン酵母は低濃度ではＧＳＨ−ＰＸ誘導剤としての効力は弱い（２．４４倍の増加。６３．０５±５．５１ｍＵ／ｍｇタンパク質）。しかし、濃度３９．５μｇ／ｍｌ（５００ｎＭのＳｅ投与量に相当）において、酵素活性の増加は等モル量の亜セレン酸ナトリウムを用いて観察された増加量に匹敵した（９０．１１±１０．３５ｍＵ／ｍｇタンパク質）。これらの結果は、酵素の活性化のためにセレン酵母が用量依存的にセレンを放出していることを明確に実証している。
ＵＶＢ照射（５０ｍＪ／ｃｍ2）に対して暴露したケラチノサイトにおいてもＧＳＨ−ＰＸ活性が測定された。セレン酵母又は亜セレン酸ナトリウムにより誘導された酵素誘導の程度は対照細胞と比較して有意に増強された（図８）。このことは、酸化剤不均衡条件下でもセレンが依然として活性であることを示している。
実施例６：ＣｕＯＯＨ誘導性細胞死に対するセレン酵母補充の効果
クメンヒドロペルオキシドはフリーラジカル反応の強力なプロモーターである。ケラチノサイトと５００μＭ  ＣｕＯＯＨとのインキュベーションでは、暴露２４時間後に８０％を超える細胞死が起こった（図９）。セレン酵母補充細胞において、細胞死は顕著かつ用量依存的に抑制された。最小用量（３．９５μｇ／ｍｌ）における細胞生存度は６４±１．３％であり、最大Ｓｅ用量（３９．５μｇ／ｍｌ（５００ｎＭのＳｅに相当））では対照細胞（９０±１．２％）と有意に異ならなかった。５０ｎＭの亜セレン酸ナトリウムにより与えられる保護は細胞生存度がほぼ完全に回復したのでわずかに大きかった
【００１６】
実施例７：細胞内ＣｕＯＯＨ誘導性酸化的ストレスに対するセレン酵母補充の効果
感度の高い蛍光定量的ＤＣＦアッセイにより細胞内酸化的ストレスを測定した。アッセイは、非極性かつ非蛍光性であるＤＣＦＨ−ＤＡが細胞膜を通して拡散する能力又はサイトゾル性エラスターゼにより脱アセチル化されて極性かつ非蛍光性のジクロロジヒドロフルオレセイン（ＤＣＦＨ）を形成する能力に基づいている。これは、ＣｕＯＯＨにより生成した活性酸素種との反応によりサイトゾル内にトラップされ、蛍光性誘導体ジクロロフルオレセイン（ＤＣＦ）の形成を引き起こす。
ケラチノサイトと５００μＭ  ＣｕＯＯＨとのインキュベーションはＤＣＦの有意な蓄積（２４時間後に最大。７倍の増加）を引き起こした。このことは、サイトゾルコンパートメントにおける酸化的破裂の伝搬を確証している（図１０）。セレン酵母による細胞の前処理は酸化的損傷（insult）を相殺した。なぜなら、低用量（３．９５μｇ／ｍｌ）においてＤＣＦ形成の６０％の減少が観察され、３９．５μｇ／ｍｌ（５５０ｎＭ  Ｓｅ）においてほぼ完全な保護が観察されたからである。亜セレン酸ナトリウムは最低用量（５０ｎＭ）においてＤＣＦ形成を完全に阻害する。
これらの実施例の結果は、本発明の対象である親油性酸化防止剤と親水性酸化防止剤との連関がＵＶＢの酸化的攻撃に対する最適な細胞保護を与えることを示している。換言すると、活性成分の組合せにより得られる高程度の保護を説明する、酸化防止剤間の相乗的相互作用が存在する。
フリーラジカル及び活性酸素種（ＲＯＳ）は脂質及び水溶性細胞コンパートメントの両方で生成するので、本発明の対象であり、かつ、脂質及び水性環境下で分配する（partition）ことができる、活性成分の組合せとしての酸化防止剤防御システムは細胞保護に高度に適している。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、ＵＶＢ誘導性溶血に対する活性成分の組合せによる用量依存的保護効果を示している（実施例１）。
【図２】  図２は、ＵＶＢ誘導性溶血に対する、活性成分の組合せの親油性成分による用量依存的保護効果を示している（実施例２）。
【図３】  図３は、ＵＶＢ誘導性溶血に対する、活性成分の組合せの親水性成分による用量依存的保護効果を示している（実施例２）。
【図４】  図４は、ＵＶＢ誘導性溶血、すなわち活性成分の組合せにおける親油性成分と親水性成分との間の協同的酸化防止相互作用を示している（実施例３）。
【図５】  図５は、１２０分間の照射により誘導したＲＢＳ溶血に対する活性成分の組合せの保護効果を示している（実施例３）。
【図６】  図６は、ケラチノサイトの生存度に対するセレン酵母及び亜セレン酸ナトリウム補充の効果を示している（実施例４）。
【図７】  図７は、ケラチノサイトのグルタチオンペルオキシダーゼ活性に対するセレン酵母及び亜セレン酸ナトリウム補充の効果を示している（実施例５）。
以下の略語を図７〜１０において使用した。
酵母（Ｌ）  セレン酵母（３．９５μｇ／ｍｌ）：５０ｎＭのＳｅ
酵母（Ｈ）  セレン酵母（３９．５μｇ／ｍｌ）：５００ｎＭのＳｅ
亜セレン酸塩（Ｌ）  Ｎａ2ＳｅＯ3  ５０ｎＭ
亜セレン酸塩（Ｈ）  Ｎａ2ＳｅＯ3  ５００ｎＭ
【図８】  図８は、ＵＶＢ照射（５０ｍＪ／ｃｍ2）に暴露したケラチノサイトにおけるグルタチオンペルオキシダーゼ活性に対するセレン酵母及び亜セレン酸ナトリウム補充の効果を示している（実施例５）。
【図９】  図９は、クメンヒドロペルオキシド（ＣｕＯＯＨ）誘導性細胞死に対するセレン酵母又は亜セレン酸ナトリウム補充の効果を示している（実施例６）。
【図１０】  図１０は、ＣｕＯＯＨ誘導性細胞内酸化的ストレス（ＤＣＦ形成）に対するセレン酵母又は亜セレン酸ナトリウム補充の効果を示している（実施例７）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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