(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管閉塞性障害および動脈血栓性塞栓障害のヒト患者を治療するための医薬組成物であって、活性成分として用量０．０１ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ〜０．０５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの活性化プロテインＣのみを連続注入で該患者に投与するための医薬組成物。
【請求項２】
血管閉塞性障害または血栓性塞栓障害が血栓性発作である請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
該患者に活性成分として０．０１ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ〜０．０３ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの活性化プロテインＣのみを投与するための請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
該患者に活性成分として０．０２４ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの活性化プロテインＣのみを投与するための請求項３記載の医薬組成物。
【請求項５】
活性化プロテインＣがヒト活性化プロテインＣである請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
活性化プロテインＣが１２時間〜３６時間の連続注入で投与される請求項１記載の医薬組成物。
【請求項７】
活性化プロテインＣが２４時間の連続注入で投与される請求項６記載の医薬組成物。
【請求項８】
活性化プロテインＣがヒト活性化プロテインＣである請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
活性成分として０．０２４ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの活性化プロテインＣのみを投与するための請求項８記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、医療技術、特に活性化プロテインＣによる血管障害の治療に関する。
発明の背景
プロテインＣは、セリンプロテアーゼであり、凝固カスケードにおいてＶaおよびVIIIa因子を失活させることにより恒常性の制御において役割を果たす天然の抗凝固薬である。ヒトプロテインＣは、in vivoでは主として肝臓において４６１アミノ酸の１本鎖ポリペプチドとして生成される。この前駆体分子は、１）４２アミノ酸のシグナル配列を開裂させ、２）１本鎖チモーゲンの１５５位のリジン残基と１５６位のアルギニン残基が蛋白分解により除去され、該分子の２本鎖形（すなわち、１５５アミノ酸残基の軽鎖が、２６２アミノ酸残基のセリンプロテアーゼ含有重鎖とジスルフィド架橋を介して結合）を形成し、３）該軽鎖の最初の４２アミノ酸中のクラスターとなった９個のグルタミン酸残基がビタミンＫ依存性にカルボキシル化して９個のγ−カルボキシグルタミン酸残基を生じ、４）４部位で炭化水素が結合（１つは軽鎖中、３つは重鎖中）することを含む多様な翻訳後修飾を受ける。重鎖は、Ａｓｐ２５７、Ｈｉｓ２１１、およびＳｅｒ３６０のよく確立されたセリンプロテアーゼ三つ組残基を含む。最後に、循環２本鎖チモーゲンは、in vivoにおいて、カルシウムイオンの存在下、リン脂質表面でトロンビンにより活性化される。活性化は重鎖のＮ−末端のドデカペプチドを除去することにより生じ、酵素活性を有する活性化プロテインＣ（ａＰＣ）が生じる。
他のタンパク質とともに、プロテインＣはおそらく血液凝固の最も重要な下方調節物質（down-regulator）として機能する。すなわち、プロテインＣ酵素系が主要な生理学的抗凝固機序であることを意味する。
凝固系は、チモーゲンの活性セリンプロテアーゼへの逐次活性化により、最終的に酵素トロンビンを生成し、これにより限定蛋白分解を介して血漿フィブリノーゲンを不溶性ゲルのフィブリンに変換することを含む連鎖反応として最もよく考察されている。凝固カスケードにおける２つの鍵となる出来事は、凝固ＩＸａ因子による凝固Ｘ因子の凝固Ｘａ因子への変換、および凝固Ｘａ因子によるプロトロンビンのトロンビンへの変換である。これら反応はいずれも、細胞表面、最も顕著には血小板表面で生じる。これら反応にはいずれも補助因子が必要である。この系における主な補助因子、ＶおよびVIII因子は比較的不活性な前駆体として循環しているが、トロンビンの最初の数分子が形成されると、トロンビンはフィードバックして、限定蛋白分解を介して該補助因子を活性化する。活性化ＶａおよびVIIIa補助因子はともに、プロトロンビンのトロンビンへの変換と、Ｘ因子のＸａ因子への変換を約５オーダー（order）促進する。活性化プロテインＣは、それが加水分解し、不可逆的に破壊する２つの血漿タンパク質基質を圧倒的に好む。これら血漿タンパク質基質は凝固ＶａおよびVIIIa補助因子の活性化形である。活性化プロテインＣは不活性前駆体、凝固ＶおよびVIII因子を最小限しか分解しない。イヌにおいて活性化プロテインＣは、主な生理学的繊維素溶解酵素の組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）の循環レベルを急激に増加させることがわかっている。活性化プロテインＣはin vitroにおいてヒト全血中のフィブリンの分解を増強することが示されている。したがって、活性化プロテインＣはヒトにおけるin vivoの繊維素溶解に対する重要な補助物質であるといえる。
今日、血栓性発作（卒中）を含む血管閉塞に利用できる有効な治療法はほどんどない。発作発現から３時間以内に投与する、ｔＰＡを用いる治療は、最近ＦＤＡにより承認された。ヘパリンまたは経口抗凝固剤のいずれかを用いる発作の治療は、時として有効であるが、梗塞を起こした脳領域に出血をもたらす危険性が高い。
ヒヒ（baboon）モデルにおける血栓性閉塞または血栓性塞栓症の治療に組換えａＰＣ（ｒ−ａＰＣ）を使用することが、Griffinらの米国特許第5084274号に記載されている。Griffinは、血栓性閉塞を治療するための０．２ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ〜１．１ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの範囲の用量レベルをクレームした。しかしながら、出願人は、これら用量レベルがｒ−ａＰＣの毒性レベルよりかなり高い範囲にあることをみいだした。例えば、非ヒト霊長類における前臨床毒性試験は、ｒ−ａＰＣの９６時間注入の安全性が約０．０５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの最高用量に限られることを示している。したがって、Griffinらが開示した最低用量レベル、すなわち、０．２ｍｇ／ｋｇ／ｈｒは、出願人がヒトについて確立した毒性用量より４倍高いレベルである。すなわち、Griffinが開示した最低用量レベルは梗塞を生じた脳領域に出血を起こすことにより、発作に伴う神経学的欠損を悪化させる危険性が高いであろう。したがって、Griffinらの開示を考慮しても、依然として、ａＰＣによるヒトの動脈血栓形成の有効な療法を確認する必要がある。
先の研究者らの開示に反して、出願人はｒ−ａＰＣを用いる低用量療法のみが血栓性発作の治療に有用であることを発見した。ａＰＣの投与は、微小血管および大血管を閉塞させる動脈血栓の局所的広がりを抑制することにより、発作によって生じる神経学的欠損を減少させる。
発明の要約
本発明は、血管閉塞性障害および動脈血栓性塞栓障害のヒト患者の治療方法であって、用量約０．０１ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの活性化プロテインＣを該患者に投与することを含む方法を提供する。
本発明は、用量約０．０１ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒを投与するのに適した活性化プロテインＣを約５ｍｇ〜約２０ｍｇ含む単位用量容器を含む、連続注入による投与に適した単位用量剤形も提供する。
発明の詳細な説明
本明細書に開示し、クレームしているように、本発明の目的において、下記の用語は以下に定義する通りである。
ａＰＣすなわち活性化プロテインＣは、組換えまたは血漿由来のプロテインＣを表す。ａＰＣにはヒトプロテインＣが含まれ、好ましいが、ａＰＣにはプロテインＣの蛋白分解活性、アミド分解活性、エステル分解活性、および生物（抗凝固またはプロフィブリノリティック）活性を有する他の種または誘導体も含まれる。プロテインＣ誘導体の例は、Gerlitzら、米国特許第5453373号、およびFosterら、米国特許第5516650号（これらの内容は本明細書の一部を構成する）に開示されている。
ＡＰＴＴ − 活性化部分トロンボプラスチン時間。
ＡＵ − アミド分解単位。
ＨＰＣ − ヒトプロテインＣチモーゲン。
ＭＥＡ − ２−アミノエタノール。
ｔＰＡ − 組織プラスミノーゲンアクチベーター。
ｒ−ＨＰＣ − 組換えヒトプロテインＣチモーゲン。
ｒ−ａＰＣ − 当業者によく知られ、Yan、米国特許第4981952号、およびCottingham、WO97/20043（これらの内容は本明細書の一部を構成する）に記載の技術により、in vitroもしくはin vivoでプロテインＣチモーゲンを活性化するか、または例えば、チモーゲンとしてヒト腎２９３細胞からの分泌を含む、原核細胞、真核細胞、またはトランスジェニック動物由来のプロテインＣの活性化形を直接分泌させ、次いで精製し、活性化することにより製造される組換え活性化プロテインＣ。
連続的注入 − 血管内への溶液の導入が、ある特定の期間、実質的にとぎれずに連続していること。
ボーラス注射 − 約１２０分間までの時間をかけて限定された量（ボーラスと呼ぶ）の薬剤を注射すること。
投与に適した − 治療剤として投与するのに適した、好ましくは凍結乾燥ａＰＣから調製された製剤または溶液。
チモーゲン − 蛋白分解酵素の酵素的に不活性な前駆体。本明細書で用いているプロテインＣチモーゲンとは、分泌された、不活性形の１本鎖または２本鎖のプロテインＣをいう。
出願人は、非ヒト類人猿における前臨床毒性試験が、ｒ−ａＰＣの９６時間注入の安全性が最高用量約０．０５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒに限定されることを示していることをみいだした。これらデータは、先行技術からは予期できないことである。事実、以前の前臨床および臨床試験に基づいたヒトに対するｒ−ａＰＣの用量レベルは、上記毒性試験で確立された毒性範囲より高い。
本発明は、血管閉塞性障害および動脈血栓性塞栓障害のヒト患者の治療方法であって、用量約０．０１ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの活性化プロテインＣを該患者に投与することを含む方法を提供する。低用量レベルの活性化プロテインＣの投与は、高用量レベルに関連するであろう付随する出血の問題を伴わずに血栓性発作を治療するのに有用である。さらに、本発明は、ヒト臨床試験に組換えヒトタンパク質Ｃ（ｒ−ａＰＣ）を用いるｒ−ａＰＣの血漿中濃度の測定について示している（実施例１）。
本発明は、イヌの閉塞性冠動脈血栓症モデルにおける完全閉塞冠動脈の再還流に対するｒ−ａＰＣの静脈内投与の効果も示している（実施例２）。驚くべきことに、コントロールの動物６頭ではまったく血管の再還流がみられなかったのに対し、ｒ−ａＰＣで処理した動物６頭中５頭に血管の再還流がみられた。
本発明は、血栓性発作、末梢動脈血栓症、心臓または末梢動脈由来の塞栓、急性心筋梗塞、および冠動脈疾患を含む血管閉塞性障害または動脈血栓塞栓性障害の、活性化プロテインＣによる治療に関する。
ａＰＣは、医薬的に有用な組成物を製造するための知られた方法に従って製剤化することができる。ａＰＣは、約１〜約４８時間の連続注入に適した用量を注射することにより、有効な形で血流中に確実に供給されるように非経口的に投与されるのが好ましい。より好ましくは、ａＰＣの適切な用量は約４〜約３６時間の連続注入により投与されよう。さらにより好ましくは、ａＰＣの適切な用量は、約１２〜約２４時間の連続注入により投与されよう。より好ましくは、適切な用量のａＰＣは約２４時間の連続注入により投与されよう。ａＰＣの投与は発作の診断後できるだけ速やかに開始されよう。
投与されるａＰＣの量は、約２０ｍｇ／７０ｋｇ／２４ｈｒ〜約８４ｍｇ／７０ｋｇ／２４ｈｒと等価な約０．０１ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒである。用量レベルは２４時間あたりのある特定の量として確定されるが、これは用量レベルを明示するものであって、必ずしも２４時間注入に限定するものではなく、種々の時間、例えば、約１時間〜約４８時間の連続注入を含んでいてよいことを当業者は認識するであろう。より好ましくは、ａＰＣの投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ〜約０．０４ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ（約２０ｍｇ／７０ｋｇ／２４ｈｒ〜約６７ｍｇ／７０ｋｇ／２４ｈｒ）である。より好ましいａＰＣの投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ〜約０．０３ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ（約２０ｍｇ／７０ｋｇ／２４ｈｒ〜約５０ｍｇ／７０ｋｇ／２４ｈｒ）であろう。ａＰＣの最も好ましい投与量は、約０．０２４ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ（約４０ｍｇ／７０ｋｇ／２４ｈｒ）である。
あるいはまた、ａＰＣは、約５分〜約３０分間にわたりボーラス注射として１時間あたり適切な用量の部分が注射され、次いで、適切な用量が約２３時間〜約４７時間の連続注入により投与されることにより、２４時間〜４８時間にわたって適切な用量が投与されることになる。
先に示したように、上記ａＰＣの用量レベルはGriffinらの示したものとは大きく異なる。Griffinは血栓性閉塞を治療するために０．２ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ〜１．１ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの範囲の用量レベルをクレームした。これに対して、本明細書でクレームしている用量レベルは、この用量の１０分の１と等価、すなわち、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ〜約０．０５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの範囲である。血栓性閉塞において投与すべきａＰＣの最も好ましい用量レベルは、本明細書に記載のごとく約０．０２４ｍｇ／ｋｇ／ｈｒであろう。本明細書に示した０．０２４ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの最も好ましい用量レベルはGriffinがクレームした最も低い用量レベルより８倍低く、Griffinがクレームした最も高い用量レベルより４４倍低い。
製造例１
ヒトプロテインＣの製造
組換えヒトプロテインＣ（ｒＨＰＣ）は、Yanの、米国特許第4981952号（この内容は本明細書の一部を構成する）に記載されているような当業者によく知られた技術によりヒト腎２９３細胞を用いて製造される。ヒトプロテインＣをコードしている遺伝子は、Bangらの、米国特許第4775624号（この内容は本明細書の一部を構成する）に開示され、クレームされている。２９３細胞中でヒトプロテインＣを発現させるのに用いるプラスミドはBangら、米国特許第4992373号（この内容は本明細書の一部を構成する）に開示されたプラスミドｐＬＰＣであった。プラスミドｐＬＰＣの構築は、欧州特許公開公報第0445939号、およびGrinnellら（1987）、Bio/Technology 5:1189-1192（この内容は本明細書の一部を構成する）にも記載されている。簡単には、該プラスミドを２９３細胞にトランスフェクトし、次いで、安定な形質転換体を同定し、継代培養し、無血清培地で増殖させる。発酵後、精密ろ過により無細胞培地を得た。
Yanの、米国特許第4981952号（この内容は本明細書の一部を構成する）の技術を適合させることにより培養液からヒトプロテインＣを分離した。不純物を除いた培地をＥＤＴＡの４ｍＭ溶液とし、次いで、陰イオン交換樹脂（Fast-FlowQ,Pharmacia）に吸着させた。４カラム容量の２０ｍＭトリス、２００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）、および２カラム容量の２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで、結合した組換えヒトプロテインＣチモーゲンを２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ2（ｐＨ７．４）で溶出した。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で判断した溶出タンパク質の純度は溶出後９５％以上であった。
該タンパク質のさらなる精製は、該タンパク質溶液をＮａＣｌの３Ｍ溶液とし、次いで２０ｍＭトリス、３Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ2（ｐＨ７．４）で平衡化した疎水性相互作用樹脂（Toropearl Phenyl 650M,TosoHaas）に吸着させた。ＣａＣｌ2を含まない平衡緩衝液２カラム容量で洗浄した後、組換えヒトプロテインＣを２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）で溶出した。
残留カルシウムを除去して活性化するために溶出タンパク質を調製した。組換えヒトプロテインＣを金属アフィニティカラム（Chelex-100,Bio-Rad）に通してカルシウムを除去し、再度陰イオン交換体（fast Flow Q,Pharmacia）に結合させた。これら両カラムを直列に配列し、２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ６．５）で平衡化した。タンパク質を流した後、Cheles-100カラムを同じ緩衝液１カラム容量で洗浄し、次いで、それをつながりから外した。陰イオン交換カラムを平衡緩衝液３カラム容量で洗浄し、次いで、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−アセテート（ｐＨ６．５）で溶出した。組換えヒトプロテインＣおよび組換え活性化プロテインＣ溶液のタンパク質濃度の吸光度をＵＶ２８０ｎｍで測定した（それぞれ、Ｅ0.1%＝１．８５または１．９５）。
製造例２
組換えヒトプロテインＣの活性化
ウシトロンビンを、４℃で、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）の存在下で、活性化CH-Sepharose 4B（Pharmacia）とカップリングさせた。カップリング反応はトロンビン約５０００単位／ｍＬ樹脂を用いてカラムにすでに充填した樹脂上で行った。トロンビン溶液をカラムに約３時間循環させ、次いでＭＥＡを０．６ｍＬ／Ｌ循環溶液の濃度に加えた。ＭＥＡ含有溶液をさらに１０〜１２時間循環させて、樹脂上の非反応アミンが確実に完全にブロックされるようにした。ブロッキング後、トロンビンがカップリングした樹脂を１０カラム容量の１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス（ｐＨ６．５）で洗浄して非特異的に結合したタンパク質をすべて除去し、活性化緩衝液で平衡化し、次いで活性化反応に用いた。
精製ｒＨＰＣをＥＤＴＡの５ｍＭ溶液とし（あらゆる残留カルシウムをキレート化するために）、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）または２０ｍＭトリス−アセテート（ｐＨ６．５）で２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。本物質を３７℃で５０ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）または２０ｍＭトリス−アセテート（ｐＨ６．５）を用いて平衡化したトロンビンカラムに通した。流速を、ｒＨＰＣとトロンビン樹脂の接触時間が約２０分間となるように調整した。排出液を回収し、速やかにそのアミド分解活性をアッセイした。該物質がａＰＣの確立された標準品と比べて比活性（アミド分解）がないときは、ｒＨＰＣが完全に活性化されるようにトロンビンカラムを再生した。次いで、該物質を上記２０ｍＭ緩衝液（ｐＨが７．４〜６．０のどこかの）で１：１に希釈し（自己分解を防ぐにはより低いｐＨが好ましい）、次の加工工程を待つ間、ａＰＣを低濃度に維持した。
浸出したトロンビンのａＰＣ物質からの除去は、ａＰＣを、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む活性化緩衝液（２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、または好ましくは、２０ｍＭトリス−アセテート（ｐＨ６．５））で平衡化した陰イオン交換樹脂（Fast Flow Q,Pharmacia）と結合させることにより達成される。トロンビンをカラムに通し、２０ｍＭ平衡緩衝液の２〜６カラム容量で洗浄中に溶出する。結合ａＰＣを５ｍＭトリス−アセテート（ｐＨ６．５）または２０ｍＭトリス（ｐｈ７．４）中の０．４Ｍ ＮａＣｌを用いる階段勾配により溶出した。より高容量でカラムを洗浄することにより、ドデカペプチドのより完全な除去が促された。このカラムから溶出した物質を凍結溶液中（−２０℃）または凍結乾燥粉末として保存した。
ａＰＣのアミド分解活性（ＡＵ）は、Beckman DU-7400ジョードアレイ分光光度計を用い、Kabi Vitrumから購入した合成基質H-D-Phe-Pip-Arg-p-ニトロアニリド（Ｓ−２２３８）からのｐ−ニトロアニリンの放出により測定した。活性化プロテインＣ  １単位を、４０５ｎｍにおけるｐ−ニトロアニリンに対する吸光係数９６２０Ｍ-1ｃｍ-1を用い、２５℃、ｐＨ７．４で１分間にｐ−ニトロアニリン１μｍｏｌを放出させるのに必要な酵素の量と定義した。
活性化プロテインＣの抗凝固活性は活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）凝固アッセイにおける凝固時間の延長を測定することにより決定された。標準曲線は、希釈緩衝液（１ｍｇ／ｍＬラジオイムノアッセイグレードＢＳＡ、２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ＮａＮ3）中で、プロテインＣの濃度範囲１２５−１０００ｎｇ／ｍＬで作製し、試料はこの濃度範囲内の数希釈に調製した。各試料キュベットに、冷ウマ血漿５０μＬ、および再構成した活性化部分トロンボプラスチン時間試薬（ＡＰＴＴ試薬、Sigma）５０μＬを加え、３７℃で５分間インキュベーションした。インキュベーション後、各キュベットに適切な試料または標準品５０μＬを加えた。試料または標準品の代わりに希釈緩衝液を用いて基礎凝固時間を決定した。各試料または標準品に３７℃の３０ｍＭ ＣａＣｌ2５０μＬを加えた時にフィブロメーター（CoA Screener Hemostasis Analyzer,American Labor）のタイマーをスタートさせた。試料中の活性化プロテインＣ濃度は標準曲線の直線回帰方程式から計算した。本明細書で報告した凝固時間は、標準曲線試料を含め、最低３回反復した平均である。
上記説明により当業者は血栓性発作の治療に利用するａＰＣを製造することができる。
実施例１
ａＣＰのヒト血漿レベル
ヒト患者６人に対し、ａＰＣを１ｍｇ／ｍ2／ｈｒまたは約０．０２５ｍｇ／ｋｇ／ｈｒで、２４時間にわたりｉ．ｖ．注入した。投与したａＰＣは、水２ｍＬで再構成し、ｐＨ６．５に調整したａＰＣ １０ｍｇ、５ｍＭトリス酢酸緩衝液、および１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む凍結乾燥製剤であった。
ａＰＣの血漿濃度はイムノキャプチャーアミド分解アッセイを用いて測定した。クエン酸抗凝固剤、およびａＰＣの可逆的インヒビターであるベンズアミジンの存在下で血液を回収した。マイクロタイタープレートに固定したａＰＣ特異的ネズミモノクローナル抗体、Ｃ３により血漿から酵素を捕捉した。洗浄によりインヒビターを除去し、オリゴペプチド色素産生基質を用いてアミド分解活性またはａＰＣを測定した。３７℃で１６〜２０ｈインキュベーションした後、４０５ｎｍで吸光度を測定し、重点直線曲線適合アルゴリズムによりデータを分析した。ａＰＣ濃度は０−１００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲の標準曲線から推定した。アッセイの定量限界は１．０ｎｇ／ｍＬであった。ａＰＣ用量レベルおよび血漿濃度を約２４時間で測定した。血漿範囲は２ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ以下である。好ましい血漿範囲は約２０ｎｇ／ｍＬ〜８０ｎｇ／ｍＬである。最も好ましい血漿範囲は約３０ｎｇ／ｍＬ〜約６０ｎｇ／ｍＬであり、約５０ｎｇ／ｍＬがさらにより好ましい。このように、０．０２４ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの用量が、２４時間で、高用量レベルに付随する出血の問題を伴わずに血栓性発作を治療するのに最も好ましい血漿濃度５０ｎｇ／ｍＬを生じる。
実施例２
イヌの閉塞性冠動脈血栓症モデルにおける再還流の誘導
イヌ１２頭（１７−２２ｋｇ、雄雌いずれか、Butler Farms）をペントバルビタールナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）で麻酔し、部屋の空気で換気した。血圧測定、薬剤投与、および血液サンプリングのため、それぞれ頸動脈、大腿静脈、および頚静脈にカニューレを取り付けた。左開胸術を行い、心臓を心膜クレードル中に浮遊させ、左回旋冠動脈（ＬＣＣＡ）の２ｃｍ断片を、第一主斜（main diagonal）分岐の近位で単離した。冠状動脈血流量を測定し、血管損傷を生じ、致命的な狭窄をもたらすため、ＬＣＣＡにそれぞれ、電磁石流量プローブ、刺激電極、および外部オクルダー（occluder）を取り付けた。血管損傷は、血管の内膜側に刺激電極（陰極）を接触させて取り付け、陰極を１００μＡ d.c.の電流で刺激することにより生じさせた（回路は皮下部位に陽極を置くことにより完成した）。損傷電流を６０分間続け、次いで血管が閉塞するしないに関わらず電流を止めた。血管は血管損傷開始から約６０分間で完全閉塞に達した。完全血管閉塞の３０分後（３０分間の冠動脈血流量がゼロ（０）となった）、ａＰＣ ２．０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒまたはトリス緩衝液（ｐＨ７．４、ビークル群）２０ｍＬの連続的静脈内注入を２時間行った。標本の追跡を、ＬＣＣＡ損傷の開始時点から始めて４時間行った。動脈血圧、心拍数、および冠動脈血流量を求め、分析した。実験を通して種々の時点で血液試料を得、全血凝固時間（Hemochron 801）を測定し、歯肉テンプレート出血時間をSimplate II出血時間装置を用いて測定した。血漿プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（ＰＡＩ−１）を測定するため、実験を通して二組目の血液試料（クエン酸化）を回収した。血漿ＰＡＩ−１レベルは、IMUBIND（登録商標）血漿ＰＡＩ−１ ＥＬＩＳＡキット（American Diagnostica）を用いて測定した。すべてのデータ（平均±ＳＥＭで示す）について、一重ＡＮＯＶＡを用いて統計的に差があるかを分析し、次いで、ｐ＜０．０５のレベルの有意性についてStudent-Neuman-Keuls分析を行った。再還流および開通性の発生率について、Fisher’s Exact検定を用いｐ＜０．０５のレベルで分析した。
ａＰＣ ２.０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒの連続注入により２時間の薬剤注入終了までにＡＰＴＴ全血凝固時間に６倍の増加がみられた（表１）。試験終了までにＡＰＴＴは正常値に戻り始めた。トロンビン凝固時間やテンプレート出血時間には認め得る影響はなかった。結果を表１に示す。
0004680329.tif 000002
ビークル群に用いる投与計画はトリス緩衝生理食塩水２０ｍＬの２時間注入であり、ａＰＣ（２．０ｍｇ／ｋｇ／ｈｒ ｘ ２ｈ）投与は完全血管閉塞後３０分に開始した。
＊ ビークル群に対するレベルｐ＜０．０５の統計的差を示す。各値は平均±ＳＥＭを示す。
表２は完全閉塞冠動脈の再還流に対するａＰＣの静脈内投与の影響を示す。冠動脈の完全血栓性閉塞までの時間は、ビークル処理およびａＰＣ処理の２群間で、それぞれ６６±７および６２±６分と同様であった。ビークル投与群の血管６本では再還流がみられなかったの対し、ａＰＣ処理群の血管６本のうち５本で再還流がみられ、ａＰＣ処置群における再還流までの時間は１２８±１７分であった。ａＰＣ処置群における冠動脈血流量は、対応するビークル処置群より有意に大きく、ａＰＣ処置群では再還流期間中に１３．７±２．７ｍＬ／分、および血流容積は１０６９±６２３ｍＬ（これはこの群の血栓症前の冠動脈流量の約６０〜７０％の回復を示す）。ａＰＣに曝露した血管５本のうち３本は４時間実験の終了時に依然として開放していた。このように、データは、ａＰＣがイヌモデルにおける閉塞性冠動脈血栓症の治療に有効であることを示す。
0004680329.tif 000003
各試験を通して得られた血液試料から、ａＰＣの静脈内注入とプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（ＰＡＩ−１）の循環レベルに有意な相関があることがわかった。ａＰＣの静脈内注入の終了までに、血漿ＰＡＩ−１レベルは８０％低下した。ａＰＣの注入を中止すると血漿ＰＡＩ−１レベルは注入前のレベルに戻り始めた。
このイヌモデルにおけるこれら用量レベルはヒトについてクレームした用量レベルより高いようであるが、出願人は、イヌのヒト活性化プロテインＣに対する感受性が特に低いことをみいだしており、したがって、クレームした用量レベルはヒトでは適切である。