(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ペトロセリン酸および／またはその誘導体から選択された第一脂質と；
（ｂ）リノール酸、共役リノール酸、共役リノール酸（ｃ９，ｔ１１）、共役リノール酸（ｔ１０，ｃ１２）、共役リノール酸（ｔ９，ｔ１１）および共役リノール酸（ｃ９，ｔ１１とｔ１０，ｃ１２との５０：５０混合物）からなる群から選択される第二脂質と；
（ｃ）皮膚科学的に許容されるビヒクルとを含んで成る、局所用組成物であって、
但し、前記組成物は、ウイキョウ抽出物も月見草油も含まないこととし、
前記ペトロセリン酸の誘導体は、該酸のエステル、アミド、塩、アルファヒドロキシ誘導体およびベータヒドロキシ誘導体からなる群から選択される、前記局所用組成物。
【請求項２】
第二脂質が遊離非共役形態であることを特徴とする、請求項１に記載の局所用組成物。
【請求項３】
組成物が、第一脂質成分を含む第一組成物と、第二脂質成分を含む第二組成物から成る独立の２つの組成物を含むキットの形態で提供されることを特徴とする、請求項１または２に記載の局所用組成物。
【請求項４】
皺、たるみ、乾燥肌、老化肌および／または光損傷肌の治療／予防；皮膚のコラーゲンレベルの向上／維持、皮膚のデコリンレベルの向上／維持、組織修復の増強；皮膚の肌理、滑らかさおよび／または引き締めの改善；から選択された少なくとも１つの美容的皮膚保護効果を与える化粧方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の局所用組成物を皮膚に塗布することから成る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ヒトの皮膚に塗布する局所用組成物、及び、皮膚の状態及び外観を改善するための該組成物の使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
皮膚は、皮膚科学的異常、苛酷な環境（風、空調及び中央暖房）、または、正常な老化過程（加齢老化）などによって劣化し、また、日光照射（光老化）はこのような皮膚の劣化を加速する。近年では、皮膚の外観及び状態を改善する、特に、皺肌、老化肌及び／または光損傷肌の目に見える徴候を消去、軽減または予防する化粧組成物及び化粧方法に対する要望が非常に大きくなっている。
【０００３】
小じわ、皺、たるみ、色素沈着及び老人斑のような皮膚の加齢老化及び光老化の目に見える徴候を消去したり、治療したりまたはその進行を妨げたりする“老化防止”化粧品に対する消費者の要望は増大の一途を辿っている。
【０００４】
主要なマトリックス皮膚タンパク質であるコラーゲンが皮膚に引張強度（張り）を与えることは公知である。また、老化肌及び／または光損傷肌では皮膚中のコラーゲンのレベルが有意に低下していることも当業界で公知である。多くの研究は、皮膚中のＩ型コラーゲンのレベルが加齢に伴って及び／または光損傷の増加に伴って低下することを証明した（例えば、Ｌａｖｋｅｒ，Ｒ．Ｊ．Ｉｎｖ．Ｄｅｒｍ．（１９７９），７３，７９−６６；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．ｍｅｄ．（１９９３）３２９，５３０−５３５）。従って、皮膚のコラーゲンレベルの低下は皺及び弛みの原因となる皮膚の引張強度の低下に関連する。
【０００５】
レチノイン酸が強力な老化防止有効成分であり、光損傷肌の真皮修復を誘発することは当業界で公知である。レチノイン酸による皮膚の局所処理後に、皮膚に新しいコラーゲンが沈積及び合成されることによって皺の消滅及び真皮の修復が生じることは証明されている（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．ｍｅｄ．（１９９３）３２９，５３０−５３５）。レチノイン酸を使用して皮膚のコラーゲンレベルを向上させることによって真皮マトリックスを強化すると、老化防止／真皮修復という効果が得られることは広く承認されている。
【０００６】
Ｊ０５２７１０４６は、リノール酸、アラキドン酸のような１８−２２個の炭素と２個以上の不飽和結合とを有している不飽和脂肪酸とポリフェノールとを含有する皮膚組成物を記載している。この組成物は皮膚の美白に有用である。
【０００７】
ペトロセリン酸に富む油を皮膚保護組成物中に湿潤剤として使用することは欧州特許公開ＥＰ  Ａ  ０７０９０８４に記載されている。
【０００８】
頭髪トリートメント用の化粧配合物にペトロセリン酸のような脂肪酸を使用することは公知である。欧州特許公開ＥＰ−Ａ−１１６４３９は、ふけ及び痒みを軽減し頭髪の成長を刺激するためにペトロセリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸及びアラキドン酸のような脂肪酸を含むヘアトニックを記載している。
欧州特許公開ＥＰ−Ａ−０６１５７５３は、ジホモ−ガンマ−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸から成り、喫煙の悪影響を軽減するために喫煙者に好適に使用され得る外用組成物を記載している。
欧州特許公開ＥＰ−Ａ−０８８８７７３は、皮膚及び粘膜の炎症を治療するために外用塗布または口腔内塗布する化粧組成物にペトロセリン酸を使用することを記載している。
ＸＰ−００２１５２３３１は、化粧品に使用するための、パルミチン酸、ペトロセリン酸、オレイン酸及びリノール酸を含む油を記載している。
フランス特許公開ＦＲ−Ａ−２６４８３４７は、アルファ−リノール酸、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸を含有し得る化粧組成物を記載している。
欧州特許公開ＥＰ−Ａ−０３０４６０３は、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸のようなポリ不飽和脂肪酸を含む外用投与用化粧組成物を記載している。
英国特許公開ＧＢ−Ａ−２２０２１４６は、セレン含有藻類とエイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸のようなポリ不飽和脂肪酸とを含む皮膚再生用化粧組成物を記載している。
欧州特許公開ＥＰ−Ａ−０６４０５８１は、ドコサヘキサエン酸またはその誘導体の鹸化生成物を含む真皮栄養物質を含む化粧組成物を記載している。
フランス特許公開ＦＲ−Ａ−０６５９７５５は、α−及びγ−リノレン酸、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸のような脂肪酸のリン脂質誘導体を含む皮膚科学的化粧組成物を記載している。
国際特許公開ＷＯ−Ａ−９９／４７１１０は、皮膚の状態及び外観を改善する外用組成物の製造にペトロセリン酸を使用することを記載している。
国際特許公開ＷＯ−Ａ−００／１５１７９は、アルファヒドロキシ酸とペトロセリン酸とを含む組成物を記載している。
ＸＰ−００２１５２３２は、乾癬患者を治療するためのエチルエイコサペンタノエートとエチルドコサヘキサノエートとの濃縮混合物を記載している。
【０００９】
本発明の発明者らは、小じわ、皺、たるみ、色素沈着及び老人斑のような加齢老化または光老化を生じている正常なしかし美容的には望ましくない皮膚状態の有効な治療及び予防が、２種類の脂質成分の特定の組合せから成る化粧組成物を皮膚に塗布することによって得られることを知見した。。
【００１０】
上記に検討した技術は、ペトロセリン酸またはドコサヘキサエン酸から選択された第一脂質成分と第二脂質成分との特定の相乗的組合せを開示していない。また、このような特定の組合せを老化皮膚の治療に使用することも開示していない。
【００１１】
（発明の概要）
本発明の第一の目的は、（ａ）ペトロセリン酸及び／またはドコサエキサエン酸及び／またはそれらの誘導体から選択された第一脂質と、
（ｂ）ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体のサブタイプアルファのアクチベーター（ＰＰＡＲαアクチベーター）及び／またはその誘導体及び／またはその混合物から成る第二脂質と、
（ｃ）皮膚科学的に許容されるビヒクルとから成る局所用組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の第二の目的は、皺、たるみ、乾燥肌、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚のコラーゲン沈積の増進、皮膚のデコリン産生の増進、組織修復の増強；皮膚の肌理、滑らかさ及び／または引き締めの改善；から選択された少なくとも１つの皮膚保護効果を与える化粧方法であって、上記の局所用組成物を皮膚に塗布することから成る方法を提供することである。
【００１３】
本発明はまた、皺、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚のコラーゲン沈積の増進、皮膚のデコリン産生の増進、組織修復の増強；皮膚の肌理、滑らかさ及び／または引き締めの改善；から選択された少なくとも１つの皮膚保護効果を与えるための、本発明の組成物の使用を包含する。
【００１４】
本発明のまた別の目的は、皺、たるみ、老化肌及び／または光損傷肌の治療／予防；皮膚のコラーゲン沈積の増進、皮膚のデコリン産生の増進、組織修復の増強；皮膚の肌理、滑らかさ及び／または引き締めの改善；から選択された少なくとも１つの美容的皮膚保護効果を提供する局所用化粧組成物中に、ペトロセリン酸及び／またはドコサエキサエン酸及び／またはそれらの誘導体から選択された第一脂質と、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体のサブタイプアルファのアクチベーター及び／またはその誘導体及び／またはその混合物から成る第二脂質との組合せ使用を提案することである。
【００１５】
従って、本発明の組成物、方法及び使用は老化防止効果を提供し、その結果として、滑らかで撓やかな皮膚の発生が促され、同時に、皮膚の弾力性が改善され皺及び老化肌の出現が減少または遅延され、また、肌の色が改善される。外観、肌理及び状態が、特に輝き及び透明性について全般的に改善され、皮膚が全体的に若々しい外観を得る。
【００１６】
本文中に使用された“治療する”という用語は、上述の正常なしかし望ましくない皮膚状態を軽減したり、その進行を妨げたり及び／または予防することをその範囲内に包含する。小じわ、皺及び／またはたるみのような明らかな老化の徴候の進行が妨げられるかまたは抑制される。皺の予防または抑制、皮膚の撓やかさ、引き締め、滑らかさ、柔軟性及び弾力性の増加によって、全般的に皮膚の質が強化されその外観及び肌理が改善される。本発明の組成物、方法及び使用は、皺がある状態、老化した状態及び／または光損傷された状態に既に陥っている皮膚を治療するためにも、または、正常な老化／光老化過程に起因する上述の望ましくない変化を予防または抑制する目的で若い皮膚を治療するためにも有効であろう。
【００１７】
（詳細な説明）
ペトロセリン酸及びドコサヘキサエン酸
ペトロセリン酸（本文中で以後ＰＡと呼ぶ）は、式ＣＨ３（ＣＨ２）１０ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）４ＣＯＯＨを有するモノ不飽和長鎖（Ｃ１８）脂肪酸である。
【００１８】
ドコサヘキサエン酸（本文中で以後ＤＨＡと呼ぶ）は、式ＣＨ３（ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ）６ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨを有するポリ不飽和長鎖（Ｃ２２）脂肪酸である。
【００１９】
本発明はまた、ペトロセリン酸／ドコサヘキサエン酸部分を含む遊離酸の誘導体を包含する。好ましい誘導体は、酸のカルボキシル基の置換から誘導された誘導体、例えばエステル（例えば、トリグリセリドエステル、モノグリセリドエステル、ジグリセリドエステル、ホスホエステル）、アミド（例えば、セラミド誘導体）、塩（例えば、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩）；及び／または、Ｃ１８／Ｃ２２炭素鎖の置換から誘導された誘導体、例えばアルファヒドロキシ誘導体及び／またはベータヒドロキシ誘導体である。
【００２０】
トリグリセリドエステル誘導体の場合、グリセロール主鎖のＰＡ／ＤＨＡ置換基の全ての位置異性体が包含される。トリグリセリドは少なくとも１つのＰＡ／ＤＨＡ部分を含有しなければならない。例えば、グリセロール主鎖の３個のエステル化可能な位置のうちで、１位及び２位はＰＡ／ＤＨＡによってエステル化され３位は別の脂質によってエステル化されているか、あるいは、グリセロール主鎖の１位及び３位がＰＡ／ＤＨＡによってエステル化され、２位が別の脂質によってエステル化されている。
【００２１】
従って、ペトロセリン酸トリグリセリドに富む油もまた本発明に使用するために適当である。このような油は市販されており、パセリ種油、ニンジン種油、ウイキョウ実油、パースニップ種油、コリアンダー種油、チャービル種油、キャラウェイ植物の油、セロリ種油などがある。
【００２２】
ＤＨＡトリグリセリドに富む油も本発明に使用するために適当である。このような油は市販されており、魚油及びそれらの濃縮物がある。
【００２３】
本明細書中で“ペトロセリン酸”もしくは“ＰＡ”または“ドコサヘキサエン酸”もしくは“ＤＨＡ”なる用語が使用されている場合には常に、ＰＡ／ＤＨＡ部分を含有するそれらの誘導体が包含されることを理解されたい。“ＰＡ／ＤＨＡ”部分なる用語は、ＰＡ／ＤＨＡ誘導体の（１個または複数の）ＰＡ／ＤＨＡ脂肪アシル部分を表す。
【００２４】
本発明に従って使用されるべきＰＡ及びＤＨＡは局所用組成物中に有効量で存在する。通常は、有効成分の総量が組成物の０．０００１−５０重量％の範囲になる量で存在する。より好ましくは、この量は、０．０１−１０重量％であり、最小コストで最大効果を得るために最も好ましくは０．１−５重量％である。第一脂質がＤＨＡまたはＤＨＡ誘導体のとき、潜在的な悪臭の問題を回避するために、この脂質は好ましくは３重量％未満のレベルで存在する。
【００２５】
サブタイプαのペルオキシソーム増殖剤活性化受容体の脂質アクチベーター
本出願中の“サブタイプαのペルオキシソーム増殖剤活性化受容体の脂質アクチベーター”または“ＰＰＡＲαアクチベーター”なる用語は、核受容体ＰＰＡＲαを活性化する脂質を意味する。
【００２６】
ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体は、異なる組織分布の３つのサブタイプα、β、γを有する公知の核ホルモン受容体のファミリーである。ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体のサブタイプα（本文中では以後ＰＰＡＲαで表す）は皮膚に存在している。リノール酸のようなＰＰＡＲαの脂質アクチベーターは当業界で公知である。これらはｉｎ  ｖｉｔｒｏで皮膚の上皮障壁の発達を加速することが証明された（Ｈａｎｌｅｙら（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖ．１００，７０５−７１２）。しかしながら、老化防止用のトリートメント化粧品を提供するために化粧組成物中にＰＰＡＲαアクチベーターを使用することが当業界で開示または示唆されたことはない。
【００２７】
ＰＰＡＲ活性化を証明しこれによってＰＰＡＲの脂質アクチベーターを同定し得ると広く承認されている確立された方法はリポーター遺伝子アッセイである。従って、ＰＰＡＲαのアクチベーターである脂質は、実施例１で概略的に後述するリポーター遺伝子アッセイ中でルシフェラーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（本文中では以後ＣＡＴで表す）の発現を惹起する化合物として当業者によって容易に同定できる。完全プロトコルはＫｌｉｅｗｅｒら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ，３５８，７７１−７７４に示されている。
【００２８】
従って、脂質化合物がこのｉｎ  ｖｉｔｒｏリポーター遺伝子アッセイに合格したとき、即ち、実施例１で概略的に後述するリポーター遺伝子アッセイでルシフェラーゼまたはＣＡＴの発現が生じた場合、該脂質化合物は、本文中に特に記載されていなくても脂質ＰＰＡＲαアクチベーターに包含される。本発明の好ましい実施態様において、脂質ＰＰＡＲαアクチベーターは、リポーター遺伝子の活性化をバックグラウンドレベルの少なくとも２倍以上に加速する化合物である。このような化合物はより効果的な老化防止剤である。
【００２９】
リポーター遺伝子アッセイテストに応える脂質ＰＰＡＲαアクチベーターの例は、好ましくは分枝状であるかまたは直鎖状であるならば好ましくは誘導体化された（例えばヒドロキシ基によって）Ｃ１０−Ｃ１８飽和脂肪酸、Ｃ１０−Ｃ２０モノ不飽和脂肪酸、及び、Ｃ１０−Ｃ２２ポリ不飽和脂肪酸である。
【００３０】
脂肪酸は直鎖状または分枝状でよく、飽和または不飽和でよく、また、置換、例えばアルファヒドロキシ誘導体またはベータヒドロキシ誘導体のようにヒドロキシル化されていてもよい。これらの酸のいずれかの対応するアルコール、トリグリセリド及びリン脂質も本発明での使用に適している。好ましい誘導体は、酸のカルボキシル基の置換から誘導される誘導体、例えば、エステル（例えば、トリグリセリドエステル、モノグリセリドエステル、ジグリセリドエステル、ホスホエステル）、アミド（例えば、セラミド誘導体）、塩（例えばアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩、アンモニウム塩）である。トリグリセリドエステル誘導体の場合、グリセロール主鎖の位置異性体の全部が包含される。
【００３１】
従って、脂肪酸トリグリセリドに富む油も本発明での使用に適している。このような油は市販されており、コリアンダー種子（ペトロセリン酸に富む）、パセリ種油（ペトロセリン酸に富む）、マツヨイグサ油（ガンマリノレン酸に富む）、ルリヂシャ種油（ガンマリノレン酸に富む）、シェーバター（オレイン酸及びリノール酸に富む）、魚油及びそれらの濃縮物（ＤＨＡ及びＥＰＡに富む）、アブラナ油（エルカ酸に富む）、亜麻仁油（アルファリノレン酸に富む）、アーモンド油（オレイン酸に富む）及び綿実油（リノール酸に富む）などがある。
【００３２】
本発明による好ましいＰＰＡＲαアクチベーターは、１２−ヒドロキシステアリン酸、シスパリナリン酸、トランス−７−オクタデセン酸、シス５，８，１１，１４，１７エイコサペンタン酸、シス−４，７，１０，１３，１６，１９ドコサヘキサン酸、共役リノール酸（ｃ９，ｔ１１）、コロンビン酸、リノレンエライジン酸、リシノライジン酸、ステアリドン酸、２−ヒドロキシステアリン酸、アルファ−リノレン酸、アラキドン酸、シス−１１，１４−エイコサジエン酸、共役リノール（ｔ１０，ｃ１２）、共役リノール酸（ｔ９，ｔ１１）、共役リノール酸（ｃ９，ｔ１１とｔ１０，ｃ１２との５０：５０混合物）、コリアンダー酸、リノールエライジン酸、モノペトロセリン酸、ペトロセリン酸、リシノール酸、ステアロル酸、ニオイヒバ（ｔｈｕｊａ）エキス及びトランスバクセン酸である。
【００３３】
別の適当な好ましいＰＰＡＲαアクチベーターは、シス−１１，１４，１７エイコサトリエン酸、シス−５エイコセン酸、シス−８，１１，１４エイコサトリエン酸、ヘキサデカトリエン酸、パルミトレインン酸、ペトロソエライジン酸、トランストランスファルネソール、シス１３，１６ドコサジエン酸、シスバクセン酸、シス−１１エイコサン酸、シス−１３，１６，１９ドコサトリエン酸、シス−１３−オクタデセン酸、シス−１５−オクタデカン酸、シス−７，１０，１３，１６ドコサテトラエン酸、エライジン酸、ガンマ−リノレン酸、ゲラン酸、ゲラニルゲラン酸、リノール酸、オレイン酸、ペトロセリニルアルコール、フィタン酸、ピノレン酸、トランス−１３−オクタデセン酸、トリデシルサリチル酸（ＴＤＳ）などである。
【００３４】
別の適当な種類のＰＰＡＲαアクチベーターは、ビオカニンＡ（ムラサキツメクサの植物エストロゲン）、Ｃｈｒｏｍｏｌａｅｎａ  ｏｄｏｒａｔａエキス、ザクロのケン化可能な加水分解性エキス、ｂｕｇｌｏｓｓｏｉｄｅｓ（ステアリドン植物エキス）及びｚａｎｔｈａｌｅｎｅ（Ｓｉｃｈｕａｎコショウのエキス）のような植物エキスである。
【００３５】
本発明のペトロセリン酸及び／またはＤＨＡ（またはその誘導体）に組合せたときに優れた老化防止効果を示すという理由で特に好ましい脂質は、リノール酸、共役リノール酸、リノレン酸、エイコサテトラエン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）（ＤＨＡは本発明組成物の第一脂質がＰＡまたはその誘導体のときに限る）のようなポリ不飽和脂肪酸、ペトロセリン酸（ＰＡは本発明の第一脂質がＤＨＡまたはその誘導体のときに限る）、エライジン酸、オレイン酸、エルカ酸のようなモノ不飽和脂肪酸、ヘキサデカン二酸のような二酸から選択される。
【００３６】
また、本発明組成物中に存在するＰＰＡＲαアクチベーターが理想的には“活性”形態で存在すること、即ち、エステル化されていないことを理解されたい。従って、油のような天然の材料ソースを上記に記載したが、本発明組成物に使用されるＰＰＡＲαアクチベーターは好ましくは、アクチベーターがエステル化した形態の原料ではなく、非エステル化ＰＰＡＲαアクチベーターに富む原料ソースまたはエステル化形態が加水分解された脂肪酸を遊離している原料ソースである。
【００３７】
第二脂質成分は本発明組成物中に組成物の０．０００１−５０重量％の量で使用される。より好ましくはこの量は、０．０１−１０重量％であり、最小コストで最大効果を得るために最も好ましくは０．１−５重量％である。
【００３８】
皮膚科学的に許容されるビヒクル
本発明に従って使用される組成物はまた、有効成分の希釈剤、分散剤または担体として作用する皮膚科学的／美容的に許容されるビヒクルを含む。ビヒクルは、水、液体状または固体状の皮膚緩和薬、シリコーン油、乳化剤、溶媒、保湿剤、増粘剤、粉末、噴射剤などのような皮膚保護製品に常用の材料を含み得る。
【００３９】
ビヒクルは一般的に組成物の５−９９．９重量％、好ましくは２５−８０重量％を形成し、別の化粧品添加物が存在しないときは、組成物のバランスを形成し得る。
【００４０】
任意の皮膚有効物質及び化粧品添加物
有効成分以外に、日光遮断剤、別の皮膚美白剤、日焼け剤のようなその他の特定の皮膚有効物質を含有させてもよい。また、ビヒクルが更に、抗酸化剤、香料、乳白剤、保存剤、着色剤及び緩衝剤のような添加剤を含有してもよい。
【００４１】
製品の調製、形態、使用及び包装
本発明方法に使用される局所用組成物を調製するために、常用の皮膚保護製品の調製方法を使用し得る。一般には皮膚科学的／美容的に許容される担体に有効成分を慣用の方法で混和させる。適当な方法としては、組成物に含有させるべき水または別の溶媒もしくは液体の一部に有効成分を先ず溶解または分散させる。好ましい組成物は水中油型または油中水型または水中油中水型エマルジョンである。
【００４２】
組成物は、クリーム、ジェルまたはローション、カプセル、などのような慣用の皮膚保護製品の形態でよい。組成物はまた、所謂“濯ぎ落とし（ｗａｓｈ−ｏｆｆ）型”製品、例えば、浴用またはシャワー用ジェルでもよい。これらのジェルは場合によっては、濯ぎ中に有効成分が皮膚に付着することを促進するデリバリーシステムを含んでいる。最も好ましくは製品が“塗り置き（ｌｅａｖｅ−ｏｎ）型”製品、即ち、皮膚に塗布され塗布直後に濯ぎ段階を予定する必要がない製品である。
【００４３】
組成物は、慣用の例えばジャー、ボトル、チューブ、ロール−ボールなどに任意の適当な方法で包装され得る。また、本発明組成物を同時にまたは順次に皮膚に塗布される２つの独立組成物のキットとして包装するように設計してもよい。第一の組成物はペトロセリン酸及び／またはＤＨＡから成る第一脂質成分を含有し、第二の組成物は本発明の第二脂質成分化合物を含有している。
【００４４】
本発明組成物はまた、カプセル、錠剤などのような経口摂取に適した形態に製品化してもよい。
【００４５】
本発明方法は、治療を要する皮膚に対して１日１回またはそれ以上の回数で行うとよい。皮膚の状態、本発明方法に使用した有効成分の濃度、組成物の使用量及び組成物の塗布頻度などに依存して通常は３−６カ月後に皮膚外観の改善が明らかになる。一般的に、例えば０．１−５ｍｌという少量の局所用組成物を適当な容器またはアプリケーターから皮膚に塗布し、手または指または適当なデバイスを使用して皮膚に塗り延ばすか及び／または擦り込む。組成物が“塗り置き型”製品または“濯ぎ落とし型”製品のいずれの形態に製品化されているかに応じて任意に濯ぎ段階が続く。
【００４６】
本発明がより容易に理解できるように、以下の実施例を単なる代表例として示す。
【００４７】
実施例
実施例１
ＰＰＡＲアルファを活性化する脂質の同定アッセイ
ＰＰＡＲ活性を証明しこれによってＰＰＡＲのアクチベーターを同定し得ると一般に承認されている確立された方法はリポーター遺伝子アッセイである。そのプロトコルはＫｌｉｅｗｅｒら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ，３５８，７７１−７７４に概説されている。
【００４８】
このアッセイは、低レベルの内因性ＰＰＡＲ発現を示す細胞系（例えば、ＣＯＳまたはＣＶ−１）に対して行う。これらの細胞をマルチウェルフォーマットで平板培養し、４種類の哺乳類発現プラスミドに同時にトランスフェクトする。これらのプラスミドは以下の物質の１つをコードするＤＮＡを含んでいる：
（ａ）問題のＰＰＡＲ、この場合はＰＰＡＲサブタイプα
（ｂ）レチノイドＸ受容体（本文中では以後ＲＸＲで表す）、皮膚の場合にはＲＸＲサブタイプα
（ｃ）そのプロモーターにＰＰＡＲ応答要素が挿入されたルシフェラーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のようなリポーター遺伝子
（ｄ）ＰＰＡＲ活性化に応答性でないβ−ガラクトシダーゼのような構成的に発現されたリポーター遺伝子。
【００４９】
トランスフェクトしたＲＸＲ／ＰＰＡＲ複合体の外因性試薬による活性化は、ＰＰＡＲ応答性リポーター遺伝子（ルシフェラーゼまたはＣＡＴ）の発現を測定することによって決定される。これは、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはＣＡＴ酵素アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）のような市販のキットを使用して測定される。ＰＰＡＲ応答性でないリポーター遺伝子の発現をβ−ガラクトシダーゼ酵素アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）のような市販のキットを使用して同様に測定し、トランスフェクションの効率を測定しこれによってアッセイを標準化するための対照として使用する。
【００５０】
この方法で、ルシフェラーゼまたはＣＡＴを発現させる外因性脂質、好ましくはルシフェラーゼまたはＣＡＴの発現を最低でも２倍に増加させる外因性脂質をＰＰＡＲαを活性化する脂質として容易に同定できる。
【００５１】
実施例２
この実施例は本発明の有効成分の老化防止効果を証明する。
【００５２】
ヒト真皮線維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉ合成の測定手順
真皮線維芽細胞ならし培地の調製
原発性ヒト包皮の継代２（Ｐ２）の線維芽細胞を１２−ウェルのプレートに１００００細胞／ｃｍ２で播種し、１０％ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改質イーグル培地（ＤＭＥＭ）に入れて５％二酸化炭素及び４％酸素雰囲気中で２４時間維持した。この時間の経過後、細胞を無血清ＤＭＥＭで洗浄し、次いで新しい無血清ＤＭＥＭ培地中で更に６０時間インキュベートした。次に線維芽細胞単層を無血清ＤＭＥＭで再度洗浄した。三重複試験の形態で、最終容量０．４ｍｌ／ウェルの新しい無血清ＤＭＥＭ中で被検試薬とビヒクル対照とを細胞に添加し、更に２４時間インキュベートした。
【００５３】
この線維芽細胞ならし培地を直ちに分析するかまたは液体窒素中で急冷凍し後で分析するために−７０℃で保存した。次に細胞をカウントし、次いでドット−ブロット分析から得られたデータを細胞数に標準化した。
【００５４】
真皮線維芽細胞ならし培地中のプロコラーゲン−Ｉのドット−ブロットアッセイ
ビヒクル（対照として）または被検試薬で処理した真皮線維芽細胞ならし培地のサンプルに、２０ｍＭのジチオトレイトール（２００ｍＭの予製液を１：１０に希釈）及び０．１％のドデシル硫酸ナトリウム（１０％の予製液を１：１００に希釈）を補充し、十分に混合し、次いで７５℃で２分間インキュベートした。
【００５５】
アッセイ標準は、上述のように、１７５ｃｍ２のフラスコ中に１００００細胞／ｃｍ２で播種し無血清ＤＭＥＭ中に維持することによって線維芽細胞から調製した正味の線維芽細胞ならし培地の系列希釈によって作製した。次いで、Ｂｉｏ−Ｒａｄの９６−ウェルＢｉｏ−Ｄｏｔ装置を製造業者の説明書に記載された通りに使用し、三重複試験の形態で、予め湿らせたＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ転移膜シートにアッセイサンプルを塗布した。１ウェルあたり約２００μｌの培地を塗布した。培地を重力下で膜濾過（３０分間）した後、膜をＰＢＳ（２００μｌ）で２回洗浄した。これらのＰＢＳ洗浄液を重力下で膜濾過した（２×１５分）。
【００５６】
次に、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ装置を真空マニホルドに連結し、第三及び最終のＰＢＳ洗浄を吸引下で実施した。装置を分解し、膜を取り出し、必要に応じて速やかに裁断し、ブロッキングバッファに入れて４℃で一夜維持した。プロコラーゲン−Ｉ分析用に調製した膜を、ＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）粉末脱脂ドライミルク／０．０５％トゥイーン２０でブロックした。翌日、膜を１：１００００の希釈度のヒトのプロコラーゲン−Ｉに対する第一抗体（ＭＡＢ１９１２；ラットモノクローナル；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔ．Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）によって室温で２時間プローブした。次に膜をＴＢＳ／０．０５％トゥイーン２０で洗浄し（３×５分間）、次いで必要に応じて１：１０００の希釈度の１２５Ｉ−コンジュゲート抗−ラットフラグメント（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と共に室温で１時間インキュベートした。この後に、ＩｍｍｏｂｉｌｏｎストリップをＴＢＳ／トゥイーン２０で再度洗浄した後（３×５分間）、室温で風乾した。
【００５７】
乾燥した膜をセロファンに包み、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ貯蔵リン光体スクリーン（ｓｔｏｒａｇｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｓｃｒｅｅｎ）に１６−１８時間露光した。この時間の経過後、露光したスクリーンをＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭソフトウェアを使用してホスホアイメージング装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ  ＳＦ）で走査した。ドットの強度をＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＭ中の定量ツールを使用しコンピューター支援イメージ解析によって評価し、細胞数に標準化し、プロコラーゲン−Ｉ合成に対する種々の被検試薬の効果をビヒクル処理対照の１００任意単位の値に比較して判定した。
【００５８】
試験
以下の表１は、ヒト真皮線維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉの合成に対するペトロセリン酸／ＤＨＡとリノール酸との組合せの相乗効果、及び、有効成分の使用量を示す。結果を標準化するために、被検物質の効果を、ビヒクル処理対照の１００任意単位の値に比較して判定した。本発明の範囲外の脂質の組合せ、即ちオレイン酸とリノール酸との組合せによって比較試験を行った。試験に使用した試薬の濃度は細胞生存率に全く影響を与えなかった。
【００５９】
【表１】
0004828062.tif 000002
【００６０】
表１の結果は、ペトロセリン酸またはＤＨＡと脂質ＰＰＡＲアルファアクチベーターとの組合せ（本発明の範囲内の組合せ）が公知の老化防止マーカーであるヒト真皮線維芽細胞中のプロコラーゲン−Ｉの合成を驚異的な相乗効果で増進させることを示す。対照的に、オレイン酸（ペトロセリン酸に構造的に近似した脂質）と脂質ＰＰＡＲアルファアクチベーターとの組合せ（本発明の範囲外の組合せ）はこのような相乗効果を示さない。
【００６１】
皮膚中のプロコラーゲン−Ｉのレベルの向上または維持は、皺の消滅及び光損傷皮膚の真皮修復のような多くの皮膚老化防止効果に関連する。
【００６２】
実施例３
以下の配合物は、本発明の方法及び使用に好適な水中油型クリームを表す。示されたパーセンテージは組成物の重量％である。
【００６３】
【表２】
0004828062.tif 000003
＊Ｂｒｉｊ  ５６はセチルアルコールＰＯＥ（１０）である。
Ａｌｆｏｌ  １６ＲＤはセチルアルコールである。
【００６４】
実施例４
上記の実施例３の組成物のペトロセリン酸（トリグリセリド）をＮＵ  Ｃｈｅｃｋ  Ｐｒｅｐ製のＤＨＡ（トリグリセリド）で置換する。
【００６５】
実施例５
以下の配合物は本発明のエマルジョンクリームを表す。
【００６６】
【表３】
0004828062.tif 000004
0004828062.tif 000005
【００６７】
実施例６
上記実施例５の組成物のコリアンダー種油をＲｏｓｓ製の魚油で置換する。
【００６８】
上記の局所用組成物は、正常な老化過程で滑らかさ及び引き締めを失った正常な皮膚に塗布されたとき、または、このような望ましくない変化を予防したりその進行を妨げる助けとして若い皮膚に塗布されたときに、皺肌、老化肌、光損傷肌の外観を改善するために有効なトリートメント化粧品を提供する。