(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも四つ以上の開口部を有したウエルを整列して配置したウエルプレートと、
少なくとも二つの流出入孔と、この流出入孔間に二つ以上の第一の貫通孔とをそれぞれ設けて前記ウエルプレートの下面に結合されたチッププレートと、
前記チッププレートの第一の貫通孔の内部に埋め込まれた少なくとも一つの第二の貫通孔を有した細胞電気生理センサと、
前記チッププレートの流出入孔、第一の貫通孔をそれぞれ連結する少なくとも一つの直線状の溝を有して、前記チッププレートの下面に結合された溝プレートにより構成され、
前記チッププレートに設けた一方の流出入孔から前記溝に第一の溶液を流入させ、
前記第一の貫通孔と連結したウエルから細胞を含む第二の溶液を流入し、前記細胞電気生理センサの第二の貫通孔に細胞を密着させることによって、細胞の電気生理現象を少なくとも二種類の電極で測定する細胞電気生理センサアレイ。
【請求項２】
チッププレートに電極取り出し孔を設け、この電極取り出し孔が前記溝プレートに設けた溝と連結するようにした請求項１に記載の細胞電気生理センサアレイ。
【請求項３】
二種類の電極をチッププレートの同一面に配置した請求項１に記載の細胞電気生理センサアレイ。
【請求項４】
二種類の電極を前記電極取り出し孔と前記第一の貫通孔にそれぞれ配置し、電極取り出し孔に配置した電極より前記溝に流入させた第一の溶液と電気的に接続し、第一の貫通孔に配置した電極より前記第一の貫通孔に流入させた第二の溶液と電気的に接続することで、電位を測定する請求項３に記載の細胞電気生理センサアレイ。
【請求項５】
二種類の電極の一つは前記電極取り出し孔の内部に導電性接着剤を充填して電極取り出し孔を封止した請求項４に記載の細胞電気生理センサアレイ。
【請求項６】
少なくとも四つ以上の開口部を有したウエルを一定間隔で整列して配置した熱可塑性樹脂からなるウエルプレートを作製する工程と、
このウエルプレートの各ウエルの開口部の下面に、
少なくとも二つの流出入孔と、この流出入孔間に二つ以上の第一の貫通孔とをそれぞれ設けた熱可塑性樹脂からなるチッププレートを結合する工程と、
少なくとも一つの第二の貫通孔を有した細胞電気生理センサを前記第一の貫通孔の内部に配置して前記細胞電気生理センサとチッププレートの間に隙間がないように封止する工程と、
前記チッププレートの流出入孔、第一の貫通孔をそれぞれ連結する少なくとも一つの直線状の溝を有した熱可塑性樹脂からなる溝プレートを前記チッププレートの下面に結合する工程と、
を有した細胞電気生理センサアレイの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の活動によって発生する物理化学的変化を測定するために用いられる細胞内電位あるいは細胞外電位等の細胞電気生理現象を測定するための細胞電気生理センサアレイおよびその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、電気生理学におけるパッチクランプ法は、細胞膜に存在するイオンチャンネル機能を測定する方法として知られており、このパッチクランプ法によってイオンチャンネルの様々な機能が解明されてきた。そして、イオンチャンネルの働きは細胞学において重要な関心ごとであり、これは薬剤の開発にも応用されている。
【０００３】
しかし、一方でパッチクランプ法は測定技術に微細なマイクロピペットを１個の細胞に高い精度で挿入するという極めて高い能力を必要としているため、熟練作業者が必要であり、高いスループットで測定を必要とする場合には適切な方法でない。
【０００４】
このため、微細加工技術を利用した平板型プローブの開発がなされており、これらは個々の細胞についてマイクロピペットの挿入を必要としない自動化システムに適している。
【０００５】
例えば、２つの領域を分離するキャリアに穴を有し、このキャリアの上下に設置した電極によって電界を発生させることで細胞を穴に効率よく保持し、上下の電極間で電気的測定を行うことで細胞の電気生理的測定を可能にしたり（特許文献１参照）、平板のデバイスに複数の貫通孔を設け、ここに接着した細胞の連続層を含み、電極で電位依存性のイオンチャンネル活性を測定する技術などが開示されている（特許文献２参照）。
【０００６】
また、基板に複数設けたキャビティの内部にそれぞれ設けたマイクロエレメントと、このマイクロエレメントにつながる流路を減圧することにより細胞をマイクロエレメントに引きつけて、細胞の電気生理現象を測定する技術（特許文献３参照）、基板の平面部に穴を設け、基板に基準電極および測定電極が一体化されていることにより、細胞の電気生理現象を測定する技術（特許文献４参照）、一つのチャネルが貫通している表面に、細胞の下面から吸引して位置決めした後、圧力差を増大させて細胞の下面一部を破裂させることにより、液体中に含まれる細胞の測定を行う方法（特許文献５参照）について開示している。
【０００７】
さらに、使用時に物体がオリフィスをシールし、これによって電気的に絶縁された第一および第二の空洞部が形成されるように構成し、第一および第二の空洞部にそれぞれ設置された電極間のインピーダンスの変化によって、媒体中の物体の電気的測定を行う装置（特許文献６参照）について開示している。
【０００８】
また、基板の上に設けられた細胞保持手段を供えたウエルと、このウエルの電気信号を検出する測定用電極と、基準電極とを備えた細胞外電位測定用デバイスによって細胞外電位を測定する技術（特許文献７参照）を開示している。
【０００９】
ＳｉＯ2のメンブレンの内部に設けた２．５μｍの穴に、ヒト培養細胞株の一種であるＨＥＫ２９３細胞を保持させて高い密着性を確保して高精度に細胞外電位を測定する技術（非特許文献１参照）を開示しており、これは平板に作成された貫通孔はガラスピペットにおける先端穴と同様の役割を果たし、高精度な細胞の電気生理現象を記録できるとともに、平板の裏面側からの吸引などの方法により細胞が自動的に引きつけられ、細胞を容易に保持できるという利点を有している。
【００１０】
また、オリフィスに物体をシールさせて、これによって電気的に絶縁された空洞間の電極インピーダンスを測定することによって、物体の状態変化を検出する装置について開示されており、物体が置かれている液体環境を迅速に除去・交換するために液体供給毛細管と液体吸引毛細管を備えた液体供給手段についても開示している（特許文献８参照）。
【特許文献１】特表２００２−５０８５１６号公報
【特許文献２】特表２００２−５１８６７８号公報
【特許文献３】米国特許第６３１５９４０号明細書
【特許文献４】特表２００３−５１１６６８号公報
【特許文献５】特表２００３−５１１６９９号公報
【特許文献６】特表２００３−５２７５８１号公報
【特許文献７】国際公開第０２／０５５６５３号パンフレット
【特許文献８】特表２００３−５２７５８１号公報
【非特許文献１】Ｔ．Ｓｏｒｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｉｃｒｏ  Ｔｏｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ２００４，Ｐ５２１〜５２２（２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、前記従来における細胞電気生理センサの主な目的は細胞の電気生理現象を従来のパッチクランプ法で使われるガラス微細プローブを用いることなく簡便に計測することであり、この細胞電気生理センサを用いることによって計測手続きが簡便化できるが、さらに一度にたくさんの測定処理を行うことができる構造に関する記述はほとんどなく、効率的な構造については知られていない。
【００１２】
本発明は前記従来の課題を解決するもので、細胞電気生理センサをアレイ状に配置した効率的な細胞電気生理センサの構造を実現することによって一括して測定ができる細胞電気生理センサアレイおよびその製造方法を実現するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記従来の課題を解決するために、本発明は、複数のウエルを有したウエルプレートと、複数の第一の貫通孔と２種類の電極を有したチッププレートと、複数の溝を有した溝プレートとを有し、前記チッププレートと前記溝プレートが張り合わされることで、複数の第一の貫通孔が同一の溝内部で連結するように形成されるとともに、内部に第二の貫通孔を有した薄板を備えた細胞電気生理センサを前記第一の貫通孔の内部に埋め込んだ構成としたものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の細胞電気生理センサアレイおよびその製造方法は、使用に際して、一括して効率的な測定を可能にするとともに量産性に優れた製造方法を実現するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（実施の形態１）
以下、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサアレイおよびその製造方法について、図面を参照しながら説明する。
【００１６】
図１は本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサアレイの構造を説明するための断面図であり、図２は図１におけるＡ部の拡大断面図、図３および図４は図１におけるＢ部の拡大断面図である。
【００１７】
図１〜図４において、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサアレイは複数のウエル５ａ，５ｂ，５ｃ，５ｄ，５ｅを有したウエルプレート１と、複数の第一の貫通孔６ａ，６ｂ、複数の流出入孔７ａ，７ｂおよび、一つの電極取り出し孔８を一直線上に所定のピッチで並ぶように構成しており、さらに、第一の電極９および第二の電極１０をその一面側に有したチッププレート２と、直線上の溝１４を有した溝プレート３からなり、さらに細胞電気生理センサ４を第一の貫通孔６ａ，６ｂの内部に埋め込み、第二の電極１０の一端を電極取り出し孔８に埋め込んだ構成としている。また、第一の貫通孔６ａ，６ｂ、流出入孔７ａ，７ｂおよび電極取り出し孔８は、それぞれ各ウエル５ｃ，５ｄ，５ａ，５ｅ，５ｂの下面にある開口部の内方に配置しており、さらに直線で並んだ第一の貫通孔６ａ，６ｂ、流出入孔７ａ，７ｂおよび、電極取り出し孔８の下面には直線の溝１４を配置した構成としている。そして、前記ウエルプレート１、チッププレート２および溝プレート３は互いに接合しており、これによって第一の貫通孔６ａ，６ｂは溝プレート３の溝１４によって連結した構造としている。つまり、細胞電気生理センサ４の下面は溝１４によって構成された領域として外部から仕切られている。
【００１８】
ここで、第一の電極９および第二の電極１０はクロム、チタン、銅、金、白金、銀および塩化銀からなる電極材料から選択される少なくとも一つを含む電極で構成することが好ましく、さらにチッププレート２の同一面に前記二種類の電極９，１０を形成することが好ましい。
【００１９】
特に、銅は後に述べる熱可塑性樹脂に密着性よく付着することを確認しており、銀および塩化銀は後に述べる電解液との電気接触抵抗を軽減することが可能である。
【００２０】
また、好ましくは電極取り出し孔８の内部には第二の電極１０の一端と接続されるように銀・塩化銀が微粒子状態で混合された導電性接着剤である電極ペースト１１を埋め込んでいる。これによって、電極取り出し孔８を確実に塞ぐことができ、溝１４は外部から遮断される。
【００２１】
このような構成とすることによって、電極取り出し孔８を完全に塞ぐことによって溝１４を流れる細胞内液１５の気泡の発生を抑制することができるとともに、細胞内液１５と電極ペースト１１を介して第二の電極１０へと電気的に接続することができることから一面に電極９，１０を形成することによってプローブなどとの接触を容易にするとともに生産性に優れた構造を実現することができる。
【００２２】
また、図２に示すように導電性接着剤である電極ペースト１１が溝１４側に露出しているので、溝１４の内部に蓄積される電解液の電位状態を測定することができる。
【００２３】
また、好ましくは本実施の形態１のように２種類の電極、つまり第一の電極９と第二の電極１０はチッププレート２の一面にのみ形成している。これによって、すべての電極の引き出しパターンはウエルプレート１とチッププレート２の間に埋め込まれることになり、電極の保護に有効である。さらに、同じ面にこれらの電極を形成していることから、外部装置への接続が容易になるという利点も有している。
【００２４】
そして、ウエルプレート１、チッププレート２、溝プレート３はすべて熱可塑性樹脂で形成している。そして、これらの熱可塑性樹脂は、ポリカーボネート樹脂、ポリエチレン樹脂、オレフィンポリマ、ポリメタクリル酸メチルアセテート樹脂、のいずれか、またはこれらの組み合わせを用いることが好ましい。さらに、環状オレフィンポリマ、線状オレフィンポリマ、またはこれらが共重合した環状オレフィンコポリマ、およびポリエチレンからなる材料から選択される少なくとも一つの樹脂を含むことがより好ましい。
【００２５】
また、図４に示すように細胞電気生理センサ４の薄板１３の内部には第二の貫通孔１２を形成しており、この第二の貫通孔１２は極めて小さく、少なくとも直径５μｍ以下となっている。
【００２６】
次に、以上説明したような構成を有する細胞電気生理センサアレイを用いて、細胞の電気生理現象を測定する方法について説明する。
【００２７】
図５〜図７は本発明の細胞電気生理センサアレイの使用例を示す断面図であり、図８は図７の要部拡大断面図である。
【００２８】
まず、図５に示すように、流出入孔７ａから細胞内液１５を投入して、細胞内液１５が流出入孔７ｂへ到達するまで溝１４の内部を細胞内液１５で満たす。なお、ここで細胞内液１５とはほ乳類筋細胞の場合、代表的にはＫ＋イオンが１５５ｍＭ、Ｎａ＋イオンが１２ｍＭ程度、Ｃｌ−イオンが４．２ｍＭ程度添加された電解液であり、後に述べる細胞外液１６とは、Ｋ＋イオンが４ｍＭ程度、Ｎａ＋イオンが１４５ｍＭ程度、Ｃｌ−イオンが１２３ｍＭ程度添加された電解液である。
【００２９】
次に、図６に示すようにウエル５ｃ，５ｄの内部に細胞外液１６を投入した状態で、第一の電極９と第二の電極１０との電気抵抗を測定すると、１００ｋΩ〜１０ＭΩ程度の抵抗値を観測することができる。
【００３０】
これは細胞電気生理センサ４の薄板１３の内部に設けた第二の貫通孔１２に電解液である細胞内液１５あるいは細胞外液１６が浸透し、細胞外液１６はウエル５ｃ，５ｄの内部で第一の電極９と接触し、細胞内液１５は溝１４の内部の電極取り出し孔８において導電性接着剤である電極ペースト１１と接触することで電気回路を構成しているからである。
【００３１】
次に、図７に示すようにウエル５ｃ，５ｄの内部へ細胞１７を投入して、流出入孔７ａあるいは７ｂから吸引を行うと、ウエル５ｃ，５ｄの内部の細胞１７は細胞外液１６とともに第二の貫通孔１２へ引きつけられる。
【００３２】
そして、図８に示すように細胞１７が第二の貫通孔１２を完全に塞ぐように密着すると、細胞外液１６と細胞内液１５の電気抵抗は大きくなり、通常１００ＭΩ以上、好ましくは１ＧΩ以上の抵抗値となる。このように、電気抵抗が大きくなった状態では、細胞１７の内部へ流れ込む、あるいは流れ出すイオンの数がわずかであっても、高精度に細胞１７の内外を流れるイオンの動きを測定できるようになる。これが細胞１７の電気生理現象であるイオンチャネルの測定である。
【００３３】
本実施の形態１における細胞電気生理センサアレイは、前記イオンチャネルを測定できる細胞電気生理センサ４を複数備えているので、同時に効率的な測定を行うことができる。
【００３４】
なお、本実施の形態１の説明では細胞電気生理センサ４は２つだけについて説明したが、さらに多くの細胞電気生理センサ４を備えていてもよく、好ましくは１２×８列の９６個、もしくは２４×１６列の３８４個、もしくは４８×３２列の１５３６個のウエル５を備えており、この中に細胞電気生理センサ４を配置することがよい。図９、図１０および図１１は２４×１６列の３８４個のウエル５が並んだウエルプレート１を用いた細胞電気生理センサアレイの一例である分解斜視図、上面図および断面図である。図９では、２４×１６列の３８４個の配列でウエル５が並んでおり、このうち、細胞電気生理センサ４は図１０に示すように、列番号Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ，Ｊ，Ｋ，Ｌにおける行番号３〜２２においてウエル５を合計で１６０個配置し、行番号１および行番号２４のウエル５を流出入孔７ａ，７ｂと接続し、行番号２もしくは行番号２３のウエル５を電極取り出し孔８とそれぞれ接続している。
【００３５】
このように格子状に細胞電気生理センサ４を並べることによって、細胞内液１５を流す溝１４が直線で効率的に配置できる。さらに前記ウエル５の配列は他の多くの関連装置（たとえば複数の種類の薬剤を作るアッセイ工程、細胞を分ける分注工程等）で一般に使われる配列なので、分注ロボットなどが兼用できる汎用性も有している。このことは、薬剤をスクリーニングする関連工程との連携を効率よくする重要な要素である。
【００３６】
以上、本実施の形態１で示した構成とすることで、複数の細胞電気生理センサ４と、細胞外液１６や刺激薬剤及び細胞１７を投与・蓄積できるウエル５と、細胞内液１５を流入させる溝１４と、細胞外液１６に設置された第一の電極９と、細胞内液１５と接続された電極ペースト１１および第二の電極１０が一体化されることと、同一面上に全てを構成することによって測定のためのプローブなどを上面で行うことが可能となることによって、効率の良い測定を一括して行うことが可能となる細胞電気生理センサアレイを実現することができる。
【００３７】
このように、第二の電極１０をチッププレート２の同一面に形成することによって、電極パターンを片面にまとめて形成することによって生産性の高い細胞電気生理センサアレイを実現することができる。
【００３８】
また、細胞電気生理センサ４はシリコン、ガラス等の無機材料で構成されており、通常これら無機材料に薄板１３および第二の貫通孔１２を精度良く加工するには高価な装置が必要なので、全てをこの構造で作製すると細胞電気生理センサ４の価格は高くなってしまうが、本発明のように、安価な熱可塑性樹脂で形成されたチッププレート２において、高精度な加工が必要な細胞電気生理センサ４を第一の貫通孔６ａ，６ｂの内部に埋め込むことによって、細胞電気生理センサ４が複数構成されていたとしても、安価な細胞電気生理センサアレイを提供できる。
【００３９】
さらに本発明で示したような樹脂材料を選択することで、ウエルプレート１、チッププレート２、溝プレート３は接着剤を使うことなしに、互いに強固に接合できる熱溶着や溶剤溶着を用いることができるという製造上の利点を有する。
【００４０】
次に、本発明の細胞電気生理センサアレイを製造する方法について図面を用いて説明する。
【００４１】
図１２〜図１５は、本発明の実施の形態１における細胞電気生理センサアレイを製造する様子を示す断面図である。
【００４２】
まず、図１２に示すようにウエルプレート１を所定の配置でウエル５が構成されるように形成する。通常、この工程は樹脂材料を用いたときには射出成型を用いることが効率が良く、熱可塑性樹脂を加熱しながら射出することで所望の形状を得る。
【００４３】
一方、図１３に示すように２つの液体の流出入孔７ａ，７ｂ、２つの第一の貫通孔６ａ，６ｂ、および電極取り出し孔８を直線的に並べた配列とし、さらに同一の面上に第一の電極９、第二の電極１０を形成したチッププレート２を作製する。なお、これらの電極９，１０の形成方法、第一の貫通孔６ａ，６ｂの形成方法は本発明の構成要件ではないので、詳細な説明を省く。
【００４４】
ここで、前記チッププレート２はウエルプレート１と同じ熱可塑性樹脂材料であることが好ましく、より効果的にはポリカーボネート樹脂（ＰＣ）、ポリエチレン樹脂（ＰＥ）、オレフィンポリマ、ポリメタクリル酸メチルアセテート樹脂（ＰＭＭＡ）のいずれか、またはこれらの組み合わせを用いることである。これらの樹脂材料は材料どうしでの固溶性が高く、相互に貼り合わせが容易である。また、後ほど述べるが、材料に透明性を付与することが容易である。
【００４５】
これらの構成によって、図１４に示すように次の工程において、ウエルプレート１にチッププレート２を貼り付けることが容易にできるようになる。このとき、貼り付ける方法としては、樹脂材料の貼り合わせ面にレーザ光線を照射して、貼り合わせ面を溶着させて固着させることが容易にできる。そして、この方法を実現するためには、少なくとも片側の樹脂材料がレーザ光線に対して透明性を有しており、さらに２つの樹脂材料が同じであるか、相互に固溶するものであることが望ましい。好ましくは環状オレフィンポリマ、線状オレフィンポリマ、またはこれらが重合した環状オレフィンコポリマ、またはポリエチレンからなる樹脂材料から選択されることが好ましい。この場合には、これら樹脂材料において、相互に貼り合わせたときの密着力が高いばかりでなく、特に環状オレフィンコポリマの場合は耐熱性が向上し、酸・アルカリなどへの耐薬剤性も増すという利点を有している。
【００４６】
なお、このとき、本実施の形態１ではチッププレート２の一面に第一の電極９および第二の電極１０を構成しているが、前記工程において接合面をレーザ光線によって溶着させると、これらの電極９，１０はウエルプレート１とチッププレート２の間に埋め込まれることになり、これらの電極９，１０の表面を必要な場所以外は液体に触れることなく保護することができる。
【００４７】
次に、図１５に示すように、電極取り出し孔８に銀・塩化銀からなる電極ペースト１１を埋め込み、第二の電極１０の一端に接続する。
【００４８】
次に、図１６に示すように、第一の貫通孔６ａ，６ｂの内部に細胞電気生理センサ４を埋め込み、周囲を接着剤１８でシールする（図８参照）。
【００４９】
次に、図１７に示すように溝１４を形成した溝プレート３をウエルプレート１とチッププレート２を貼り合わせた方法と同じ手段によって貼り合わせることにより、図１８に示す細胞電気生理センサアレイを得る。このため、溝プレート３の材料はチッププレート２と同材料かこれと固溶する樹脂材料であることが望ましい。なお、溝プレート３に溝１４を形成する方法はウエルプレート１と同様に、射出成型によって作製することが可能である。
【００５０】
なお、ウエルプレート１、チッププレート２および溝プレート３を貼り合わせる方法は前記の他に、貼り合わせ面に非極性有機溶剤を塗布することによって貼り合わせ面を貼り合わせることもできる。
【００５１】
例えば、これら樹脂材料が環状オレフィンコポリマの場合には、非極性有機溶剤として代表的にはトルエンを含有した溶剤を塗布することで、前記樹脂材料が固溶し、固着させることができる。この場合には、貼り合わせ面に熱が発生することがないので、貼り合わせ面に熱に弱い電極などの電子回路を埋め込む必要があるときに有効である。
【００５２】
以上、説明してきたような製造方法によって、複数の細胞電気生理センサ４が効率よく配置された細胞電気生理センサアレイを作製することができる。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
以上のように、本発明にかかる細胞電気生理センサアレイおよびその製造方法は、複数の細胞電気特性の測定処理を同時に行うことができるので高速で薬理判定を行う、薬品スクリーニング等の測定器に用いられる。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】本発明の細胞電気生理センサアレイの断面図
【図２】同要部拡大断面図
【図３】同要部拡大断面図
【図４】同要部拡大断面図
【図５】本発明の細胞センサアレイの使用方法を説明する断面図
【図６】同断面図
【図７】同断面図
【図８】同要部拡大断面図
【図９】本発明の細胞電気生理センサアレイの一例を示す分解斜視図
【図１０】同上面図
【図１１】同断面図
【図１２】本発明の細胞センサアレイの製造方法を説明するための断面図
【図１３】同断面図
【図１４】同断面図
【図１５】同断面図
【図１６】同断面図
【図１７】同断面図
【図１８】同断面図
【符号の説明】
【００５５】
１  ウエルプレート
２  チッププレート
３  溝プレート
４  細胞電気生理センサ
５，５ａ，５ｂ，５ｃ，５ｄ，５ｅ  ウエル
６ａ，６ｂ  第一の貫通孔
７ａ，７ｂ  流出入孔
８  電極取り出し孔
９  第一の電極
１０  第二の電極
１１  電極ペースト
１２  第二の貫通孔
１３  薄板
１４  溝
１５  細胞内液
１６  細胞外液
１７  細胞
１８  接着剤
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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