(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６２のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする塩基配列を含む単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号６１および配列番号６３から選択される少なくとも一つの配列を含む単離された核酸分子。
【請求項３】
配列番号６２のアミノ酸配列を含む単離されたタンパク質。
【請求項４】
非ヒト動物がアレルギー性皮膚炎に罹患しやすいかどうか、またはアレルギー性皮膚炎であるかどうかを試験するためのアッセイキットであって：
（ａ）少なくとも１つの単離された外部寄生生物唾液タンパク質であって、配列番号６２のアミノ酸配列を含む外部寄生生物唾液タンパク質を含有する処方剤と；
（ｂ）前記動物がアレルギー性皮膚炎に罹患しやすいかどうか、またはアレルギー性皮膚炎であるかどうかを決定するための手段であって、アレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物またはアレルギー性皮膚炎である動物を同定するために、前記処方剤を使用することを具備する手段と
を具備するキット。
【請求項５】
非ヒト動物がアレルギー性皮膚炎に罹患しやすいかどうか、またはアレルギー性皮膚炎であるかどうかを同定するための方法であって：
（ａ）少なくとも１つの単離された外部寄生生物唾液タンパク質であって、配列番号６２のアミノ酸配列を含む外部寄生生物唾液タンパク質を含有する処方剤を、前記動物の所与の部位に投与すること；及び
（ｂ）前記処方剤の投与によって得られる反応と、対照溶液の投与によって得られる反応とを比較し、前記処方剤に対する前記反応が、陽性対照溶液に対する前記反応と少なくとも同じ大きさである場合に、前記動物はアレルギー性皮膚炎に罹患しやすいか、またはアレルギー性皮膚炎であると決定され、前記処方剤に対する前記反応が、陰性対照溶液に対する前記反応とほぼ同じ大きさである場合に、前記動物はアレルギー性皮膚炎に罹患しやすくないか、またはアレルギー性皮膚炎ではないと決定されること
を具備する方法。
【請求項６】
アレルギー性皮膚炎に罹患しやすい非ヒト動物またはアレルギー性皮膚炎である非ヒト動物を、前記動物中にアレルギー性皮膚炎を示す抗体が存在することを測定することによって同定する方法であって：
（ａ）少なくとも１つの単離された外部寄生生物唾液タンパク質であって、配列番号６２のアミノ酸配列を含む外部寄生生物唾液タンパク質を含有する処方剤と前記動物からの体液とを、前記処方剤と前記体液中の（存在する場合には）前記抗体との間で免疫複合体を形成するのに十分な条件下で、接触させること；及び
（ｂ）形成された免疫複合体の量を測定し、前記免疫複合体の形成が、前記動物がアレルギー性皮膚炎に罹患しやすいか、またはアレルギー性皮膚炎であることを示すこと
を具備する方法。
【請求項７】
翻訳調節配列と機能的に作用するように結合された、請求項１または２記載の核酸分子を含む組換え分子。
【請求項８】
請求項１または２に記載の核酸分子を含む組換えウイルス。
【請求項９】
請求項１または２記載の核酸分子を含む組換え細胞であって、前記核酸分子を発現することができる組換え細胞。
【請求項１０】
請求項３に記載のタンパク質と選択的に結合する単離された抗体。
【請求項１１】
請求項４に記載の発明であって、前記手段が以下の（ａ）および（ｂ）を含む皮膚試験を具備する発明：
（ａ）前記動物の所与の部位に前記処方剤を投与し、前記動物の異なる部位に、陽性対照溶液および陰性対照溶液からなる群から選択される対照溶液を投与すること；及び
（ｂ）前記処方剤の投与によって得られる反応と、前記対照溶液の投与によって得られる反応とを比較し、前記処方剤に対する前記反応が、前記陽性対照溶液に対する前記反応と少なくとも同じ大きさである場合に、前記動物はアレルギー性皮膚炎に罹患しやすいか、またはアレルギー性皮膚炎であると決定され、前記処方剤に対する前記反応が、前記陰性対照溶液に対する前記反応とほぼ同じ大きさである場合に、前記動物はアレルギー性皮膚炎に罹患しやすくないか、またはアレルギー性皮膚炎ではないと決定されること。
【請求項１２】
前記陽性対照がヒスタミンを含有し、前記陰性対照が生理食塩液を含有する請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
請求項４に記載の発明であって、前記手段が、前記動物のアレルギー性皮膚炎を示す抗体の存在を測定するための方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）を含む方法を具備する発明：
（ａ）前記処方剤と前記動物からの体液を、前記処方剤と前記体液中の（存在する場合には）前記抗体との間で免疫複合体を形成するのに十分な条件下で、接触させることと；
（ｂ）形成される免疫複合体の量を測定し、前記免疫複合体の形成が、前記動物がアレルギー性皮膚炎に罹患しやすいか、またはアレルギー性皮膚炎であることを示すこと。
【請求項１４】
前記処方剤が基板に固定される請求項４に記載のキット。
【請求項１５】
前記抗体が免疫グロブリンＩｇＥ抗体を含む請求項６に記載の方法。
【請求項１６】
前記陽性対照がヒスタミンを含有し、前記陰性対照が生理食塩液を含有する請求項１１に記載のキット。
【請求項１７】
前記処方剤が基板に固定される請求項６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が免疫グロブリンＩｇＥ抗体を含む請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、新規産物および外部寄生生物唾液タンパク質を単離するための方法と、動物のアレルギー性皮膚炎を検出および／または治療するための新規産物および方法とに関する。
発明の背景
外部寄生生物、特にノミにかまれると動物に過敏性応答を生じることがある。特に、ノミにかまれることに対する過敏性応答はノミアレルギー性皮膚炎（ＦＡＤ）と呼ばれる疾患を発現する。過敏症は、過去にある種の化合物に暴露された経験のある動物が、その後の暴露の結果その化合物に対してアレルギー応答を示す変性された反応状態をいう。過敏性応答には、即時型過敏症および遅延型過敏症、特にＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型過敏症（参考文献として全体が組み入れられている、Ｊａｎｅｗａｙらの、イムノバイオロジー（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ）、ガーランド出版（Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、ニューヨーク、１９９４年に詳細に記載される）が含まれる。
本明細書において、即時型および／または遅延型過敏症症状を誘発する外来化合物をアレルゲンと呼ぶ。「アレルゲン」という用語は主にアレルギー応答を生じさせうる外来化合物をいう。この用語は、特に即時型および／または遅延型過敏症症状を誘発することができる外来化合物に関しては、「抗原」という用語と交換可能に使用することができる。動物のアレルゲンに対する感受性に影響を与える因子には、遺伝的成分および／またはアレルゲンへの環境的な暴露が含まれる。動物が過敏性を示すアレルゲンを反復注射することによって、動物をアレルゲンに対して脱感作することができる。
ＦＡＤは即時型および遅延型過敏症の両者を発現することができる（Ｊａｎｅｗａｙら、上述に詳細に記載されている）。ＦＡＤの効果的な治療は、達成が不可能ではないにしても、困難であった。ノミ流行地域では、ＦＡＤはネコおよびイヌの約１５％を冒しており、その頻度は年々増加している。地理的領域では、効果的なノミの制御は、全ての動物の治療を必要とする。研究者達が提案した１つの治療法はノミアレルゲンを使用して動物を脱感作することを含む。しかしながら、このような治療法にはノミアレルゲンの信頼でき、明確に定められた製剤が必要である。
本発明の新規処方剤が発見されるまでは、ＦＡＤの原因となるノミアレルゲンは明確に規定されていなかった。全ノミ抗原製剤がＦＡＤ動物の診断および脱感作に使用されている（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉら、１９６０年、２１４−２２２ページ、エクスペリメンタル  パラジトロジー（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｉｇｙ）、１０巻；  Ｋｅｅｐら、１９６７年、４２５−４２６ページ、オーストラリアン  ベテリナリー  ジャーナル（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ）、４３巻；  Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９７８年、４１４−４２３ページ、Ｎｏｒｄ．  Ｖｅｔ−Ｍｅｄ、３０巻；Ｖａｎ  Ｗｉｎｋｌｅ、１９８１年、３４３−３５４ページ、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ａｎｉｍａｌ  Ｈｏｓｐ．  Ａｓｓｏｃ．、１７巻；  Ｈａｌｉｗｅｌｌら、１９８７年、２０３−２１３ページ、ベテリナリー  イムノロジー  アンド  イムノパソロジー（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）、１５巻；  Ｇｒｅｅｎｅら、１９９３年、６９−７４年、パラジット  イムノロジー（Ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ））；Ｏｐｄｅｂｅｅｋらによる国際公開公報第９３／１８７８８号；  Ｖａｎ  Ｗｉｎｋｌｅ、３４３−３５４ページ、１９８１年、Ｊ．  Ａｍ．  Ａｎｉｍ．  Ｈｏｓｐ．  Ａｓｓｏｃ．、３２巻。しかしながら、入手可能な市販の全ノミ抽出物は予測不可能なので、有用性が限定される。
過去の研究者は、ノミ唾液中に含有される産物がＦＡＤに関与する可能性があることを示唆しており、このような産物を単離する方法も示唆している；Ｂｅｎｊａｍｉｎｉら、１９６３年、１４３−１５４ページ、エイクスペリメンタル  パラジトロジー（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｉｇｙ）、１３巻；Ｙｏｕｎｇら、１９６３年、１５５−１６６ページ、エクスペリメンタルパラジトロジー（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ）１３、１３巻；Ｍｉｃｈａｅｌｉら、１９６５年、１６２−１７０ページ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、９５巻；およびＭｉｃｈａｅｌｉら、１９９６年、４０２−４０６ページ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９７巻。しかしながら、これらの研究者達はノミ唾液アレルギー因子を分子量６キロダルトン（ｋＤ）より小さいハプテンであると特徴付けている。それらがタンパク質でないことは、強酸（例えば、６Ｎ塩酸）または熱に暴露したとき、分解されないという結果によっても裏付けられる。特定の低分子量アレルギー因子のなかには、高蛍光芳香族画分であると特徴づけられるものもある（Ｙｏｕｎｇら、上述）。加えて、これらの研究者による研究は、アレルゲン性であるためには、このような因子が、口腔内分泌物を採取するために使用されるコラーゲンまたは膜の一部のようなアジュバントおよび／または担体と結合される必要があることを示している。さらに、ノミ唾液因子を採取するために記載される方法は困難で、予測不可能であった。その上、これらの方法で単離される因子は、一般にノミ、培養媒体またはノミに給餌するために使用される皮膚をベースとした膜由来の材料によって汚染されていた。
従って、動物において過敏性応答を誘発することができるノミ唾液アレルゲンをより明確に同定する必要がある。加えて、ＦＡＤに罹患しやすい動物またはＦＡＤである動物を脱感作するために有用な、予測可能で高価でないアレルゲン製剤を提供する、実質的に純粋なノミ唾液アレルゲンを採取する方法を開発する必要性がある。
発明の概要
本発明の一態様は、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７６を包含する核酸配列、並びに配列番号７８および配列番号８７からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を包含するノミ唾液遺伝子を含有する遺伝子と、緊縮条件下にてハイブリダイズする単離核酸分子である。
本発明はまた、配列番号５３、配列番号６２、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８および配列番号８７を含むアミノ酸配列を包含するタンパク質をコードする核酸配列を有する核酸分子と、緊縮ハイブリダイゼーション条件下にてハイブリダイズする核酸分子を包含する。
本発明の別の態様は、配列番号５３、配列番号６２、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８および配列番号８７を含むアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする核酸配列を有する核酸分子と、緊縮ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子によりコードされる単離タンパク質を包含する。
また、本発明には、本発明の核酸分子を有する組換え分子および細胞が包含される。
本発明の別の側面は、外部寄生生物タンパク質またはミメトープと選択的に結合することができる抗体を包含する。
本発明のさらに別の態様は、少なくとも１つの単離外部寄生生物唾液タンパク質を含有する処方剤を含有するアレルギー性皮膚炎を治療するための治療用組成物であって、前記外部寄生生物唾液タンパク質が、アミノ酸配列の少なくとも１つの部分を含有し、前記部分が、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７６を含有する核酸配列、並びに配列番号７８および配列番号８７からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を有する核酸分子と、緊縮ハイブリダイゼーション条件下にてハイブリダイズする核酸分子によりコードされるものである。本発明の好ましい治療用組成物はまた、賦形剤、アジュバントおよび／または担体を包含する。また、本発明には、アレルギー性皮膚炎に対して宿主動物を脱感作する方法が包含される。この方法は、動物に本発明の治療用組成物を投与するステップを包含する。
本発明の他の態様は、インビボまたはインビトロ方法を使用してアレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物またはアレルギー性皮膚炎である動物を同定する方法を含む。一態様において、アレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物またはアレルギー性皮膚炎である動物は：（ａ）前記動物の所与の部位に、配列番号５３、配列番号６２、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８および配列番号８７を含むアミノ酸配列を含む少なくとも１つの単離外部寄生生物唾液タンパク質を含有する処方剤を投与することと；（ｂ）この処方剤の投与によって得られる反応と、対照溶液の投与によって得られる反応とを比較することを具備し、この処方剤に対する反応が、陽性対照溶液に対する反応と少なくとも同じ大きさである場合に、該動物がアレルギー性皮膚炎に罹患しやすい、またはアレルギー性皮膚炎であると決定され、この処方剤に対する反応が、陰性対照溶液に対する反応とほぼ同じ大きさである場合に、該動物がアレルギー性皮膚炎に罹患しやすくない、またはアレルギー性皮膚炎ではないと決定される、方法によって、インビボにて同定される。
別の態様において、アレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物またはアレルギー性皮膚炎である動物は：（ａ）配列番号５３、配列番号６２、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８および配列番号８７を含むアミノ酸配列を含有する少なくとも１つの単離外部寄生生物唾液タンパク質を含有する処方剤と動物の体液を、存在する場合には体液中の抗体との免疫複合体を形成するのに十分な条件下で接触させることと；（ｂ）形成される免疫複合体の量を測定することとを具備し、免疫複合体の形成が、該動物がアレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物またはアレルギー性皮膚炎であることを示す、方法を使用して、動物中でのアレルギー性皮膚炎を示す抗体の存在を測定することによってインビトロで同定される。
本発明はさらに、動物がアレルギー性皮膚炎に罹患しやすいかどうか、またはアレルギー性皮膚炎であるかどうかを試験するためのアッセイキットであって：（ａ）配列番号５３、配列番号６２、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８および配列番号８７を含むアミノ酸配列を含有する少なくとも１つの単離外部寄生生物唾液タンパク質を含有する処方剤と；（ｂ）この処方剤を使用してアレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物またはアレルギー性皮膚炎である動物を同定することを具備する、動物がアレルギー性皮膚炎に罹患しやすいか、またはアレルギー性皮膚炎であるかどうかを同定するための手段とを含むアッセイキットに関する。
発明の詳細な説明
本発明は、外部寄生生物に対する動物のアレルギー性皮膚炎を診断および治療するための新規産物および方法を含む。
本発明によると、外部寄生生物は、宿主動物の皮膚に接触し、宿主動物の皮膚を介して摂餌する外部の生きた寄生生物である。外部寄生生物は、宿主動物上で生存する寄生生物および摂餌のために一時的に動物に接触する寄生生物を含む。また、本発明によると、外部寄生生物の唾液は、外部寄生生物が温度差に応答して摂餌を試みるとき外部寄生生物の口から放出される物質をいう。外部寄生生物の唾液は外部寄生生物唾液産物を含む。
本発明の一態様は、アレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物またはアレルギー性皮膚炎である（すなわち、アレルギー性皮膚炎に罹患している）動物を診断および／または治療するために使用することができる外部寄生生物唾液産物を含有する処方剤である。本発明の外部寄生生物唾液産物を使用して診断および／または治療する好ましい種類のアレルギー性皮膚炎は、ノミアレルギー性皮膚炎、サシバエ属（Culicoides）アレルギー性皮膚炎および蚊アレルギー性皮膚炎を含む。本発明の外部寄生生物唾液産物を使用して診断および／または治療する好ましい種類のアレルギー性皮膚炎はノミアレルギー性皮膚炎である。本明細書において使用される、アレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物は、アレルギー性皮膚炎を発症する遺伝的素因を有する動物、および／または抗原の再暴露が、例えば動物を観察することによって、または動物による抗原に対する抗体産生を測定することによって認識されうるアレルギー症状を生じるような様式で抗原で特発された動物をいう。このように、アレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物は、不顕性アレルギー性皮膚炎である動物を含んでもよい。不顕性アレルギー性皮膚炎は、動物を観察するだけではアレルギー症状が検出できない（すなわち、疾患の明示するものには、罹患した動物内に、抗外部寄生生物唾液タンパク質抗体の存在が含まれるが、皮膚炎は呈していない）状態をいう。例えば、不顕性アレルギー性皮膚炎は、以下に詳細に記載するように、本発明のインビボまたはインビトロアッセイを使用して検出することができる。以下に詳細に記載するように、アレルギー性皮膚炎である動物に関しての記載は、動物を観察するだけによって、および／または本発明のインビボまたはインビトロアッセイを使用することによって検出することができるアレルギー症状を呈示する動物を含む。
本発明の一態様は、１つ以上の単離外部寄生生物唾液タンパク質を含む処方剤である。本発明によると、単離タンパク質は、自然環境から取り出されたタンパク質である。単離外部寄生生物唾液タンパク質は、例えば、天然原料由来で得られても、組換えＤＮＡ技法を使用することによって産生されても、または化学的に合成されてもよい。本明細書で使用される、単離外部寄生生物唾液タンパク質は、全長の外部寄生生物唾液タンパク質であっても、アミノ酸が欠失した（例えば、ペプチドのような、切断された形態のタンパク質）、挿入された、逆方向にされた、置換されたおよび／または誘導体化された（例えば、グリコシル化、ホスホリル化、アセチル化、ミリスチル化、プレニル化、パルミチン化、アミド化および／またはグリコシルホスファチジルイノシトール付加）外部寄生生物唾液タンパク質のような、このようなタンパク質の任意の相同体であってもよい。外部寄生生物唾液タンパク質の相同体は、この相同体をコードする核酸配列が、緊縮条件下にて、天然の外部寄生生物唾液タンパク質をコードする核酸分子に（すなわち、核酸分子と）ハイブリダイズすることができるほど十分に、天然の外部寄生生物唾液タンパク質アミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を有するタンパク質である（すなわち、天然の外部寄生生物唾液タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸配列の相補鎖）。本発明の任意の核酸配列の核酸配列相補鎖は、配列が引用される鎖に相補的な（すなわち、鎖と完全な２本鎖を形成することができる）核酸鎖の核酸配列をいう。配列番号で表される１本鎖について核酸配列が決定されている本発明の２本鎖核酸分子も、その配列番号の相補鎖である配列を有する相補鎖を含有することが注目されるべきである。このように、２本鎖であっても、１本鎖であってもよい、本発明の核酸分子は、本明細書に記載する所定の配列番号と、および／または本明細書に記載されても、されていなくてもよい、その配列番号の相補鎖と、緊縮ハイブリダイゼーション条件下にて安定なハイブリッドを形成する核酸分子を含む。相補的配列を推論する方法は当業者に周知である。
本明細書で使用する、緊縮ハイブリダイゼーション条件は、オリゴヌクレオチドを含む核酸分子を使用して類似した核酸分子を同定する標準的なハイブリダイゼーション条件をいう。このような標準的な条件は、例えば本明細書に参照文献として全体が組み入れられる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら著、モレキュラークローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリング  ハーバーラボラトリーズ出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｓ  Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記文献に記載されている。緊縮ハイブリダイゼーション条件により、典型的には、ハイブリダイゼーション反応のプローブに使用した核酸分子と少なくとも約７０％核酸配列が同一である核酸分子を単離することが可能になる。３０％以下のヌクレオチドのミスマッチを可能にするハイブリダイゼーションを達成する適切なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件を計算する式は、例えば本明細書に参照文献として全体が組み入れられる、Ｍｅｉｎｋｏｔｈら、１９８４年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８、２６７−２８４；Ｍｅｉｎｋｏｔｈら、上記文献に開示される。
本発明の最小サイズのタンパク質相同体は、対応する天然タンパク質をコードする核酸分子の相補鎖と安定なハイブリッドを形成することができる核酸分子によってコードされるのに十分なサイズである。このように、このようなタンパク質相同体をコードする核酸分子のサイズは、核酸組成および核酸分子と相補配列との相同性の割合、並びにハイブリダイゼーション条件自体（例えば、温度、塩濃度、およびホルムアミド濃度）に依存する。このような核酸分子の最小サイズは、典型的には核酸分子がＧＣが豊富である場合には、鎖長が少なくとも約１２乃至約１５ヌクレオチドで、ＡＴが豊富である場合には、鎖長が少なくとも約１５乃至約１７塩基である。このように、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質相同体をコードするために使用される核酸分子の最小サイズは鎖長が約１２乃至約１８である。核酸分子が遺伝子の一部、遺伝子全体または複数の遺伝子またはそれらの一部を含みうる、このような核酸分子の最大サイズに関しては、実際上の制限以外の制限はない。同様に、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質相同体の最小サイズは鎖長が約４乃至約６アミノ酸であるが、好ましいサイズは、このようなタンパク質の全長、多価性（すなわち、１よりも多いドメインを有する融合タンパク質であって、その各々が１官能性を有するもの。）または官能性部分が望ましいかどうかに依存する。
外部寄生生物唾液タンパク質相同体は、外部寄生生物唾液タンパク質をコードする天然の遺伝子の対立遺伝子変異の結果であってもよい。天然の遺伝子は、天然に最も頻繁に見いだされる遺伝子の形態をいう。外部寄生生物唾液タンパク質相同体は、ランダムまたは標的突然変異に影響を与える、例えば古典的な技法または組換えＤＮＡ技法を使用した、タンパク質をコードする遺伝子の直接改変（これに限定されない。）を含む当分野で公知の技法を使用して産生されてもよい。
相同体を含む、本発明の好ましい外部寄生生物唾液タンパク質は、外部寄生生物に咬まれることによって生じるアレルギー性皮膚炎を検出および／または治療することができる。好ましい外部寄生生物唾液タンパク質の相同体は、天然の外部寄生生物唾液タンパク質相対物に対する過敏性応答を誘発することができる少なくとも１つのエピトープを含む。外部寄生生物唾液タンパク質相同体はまた、天然形態のタンパク質に対して動物を過敏症にすることができるエピトープを含む。外部寄生生物唾液タンパク質相同体がアレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物またはアレルギー性皮膚炎である動物の過敏性を検出および／または治療する（すなわち、例えば脱感作によって免疫調節または調節する）能力は、当業者に周知の技法を使用して試験することができる。このような技法は、以下に詳細に記載する皮膚試験および免疫吸着アッセイを含む。本発明の追加の好ましい外部寄生生物唾液タンパク質は、外部寄生生物の摂餌および生存に重要な活性を含む他の活性を有する。
一態様において、本発明の処方剤は単離外部寄生生物唾液タンパク質の少なくとも１部を有するタンパク質を含む。本発明によると、「外部寄生生物唾液タンパク質の少なくとも一部」は、緊縮条件下にて本発明の全長の外部寄生生物唾液タンパク質をコードする核酸とハイブリダイズすることができる核酸分子によってコードされる外部寄生生物唾液タンパク質の一部をいう。外部寄生生物唾液タンパク質の好ましい部分は、外部寄生生物に咬まれることによって生じるアレルギー性皮膚炎を検出および／または治療するために有用である。追加の好ましい部分はノミの摂餌および生存に重要な活性を有する。本発明の外部寄生生物唾液タンパク質の部分の好適なサイズは本発明の唾液タンパク質の相同体について開示されたものと同様である。
当業者にあきらかなように、本発明は全ての外部寄生生物に適用することが意図されている。本発明の処方剤はいかなる外部寄生生物の唾液産物を包含していてもよい。唾液産物（タンパク質を包含する）を単離するため、および／または組換えまたは合成により産生することができるタンパク質を同定するための、本発明の好ましい外部寄生生物はクモ類、昆虫およびヒルを包含する。唾液産物を得るためのさらに好ましい外部寄生生物は、ノミ；マダニ科のマダニ類（例えば、マダニ属（Ｉｘｏｄｅｓ）およびキララマダニ属（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ））およびヒメダニ科のヒメダニ類（例えば、パーカーカズキダニ（Ｏ．ｐａｒｋｅｒｉ）およびオリニソドロス  ツリカタ（Ｏ．ｔｕｒｉｃａｔａ）などのカズキダニ属（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ））を含むダニ；ユスリカ（例えば、サシバエ属（Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ））、カ、スナバエ、黒バエ、ウマバエ（アブ）、ツノバエ（ｈｏｒｎ  ｆｌｉｅｓ）、メクラアブ、ツェツェバエ、サシバエ、ハエ幼虫症を発症するハエおよびブヨなどのハエ；アリ；クモ；シラミ；ダニおよびシャーガズ病を媒介するものを含むナンキンムシおよびオオサシガメのようなナンキンムシを包含する。さらに好ましい外部寄生生物唾液産物は、ノミ、カ、ユスリカ、スナバエ、クロバエ、ダニおよびロドニウス（Ｒｈｏｄｎｉｕｓ）由来のものを包含し、ノミ、カおよびサシバエ由来の産物がさらにより好ましい。
本発明の特に好ましい処方剤はノミ唾液産物を含む。好ましいノミ唾液産物は、イヌノミ属（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ）、ネズミノミ属（Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ）、ヒトノミ属（Ｐｕｌｅｘ）、スナノミ属（Ｔｕｎｇａ）、ヨーロッパネズミノミ属（Ｎｏｓｏｐｓｙｌｌｕｓ）、ディアマナス属（Ｄｉａｍａｎｕｓ）、クトプシラス属（Ｃｔｏｐｓｙｌｌｕｓ）および鶏砂ノミ属（Ｅｃｈｉｄｎｏｐｈａｇａ）由来のものを包含し、イヌノミ（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｃａｎｉｓ）およびネコノミ（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｆｅｌｉｓ）由来の唾液産物がさらにより好ましい。例示目的のために、以下の態様の多くはノミ唾液タンパク質について考察している。このようなノミ唾液タンパク質の考察は、いかなる様式においても、本発明の範囲を限定する意図のものではない。
別の態様において、本発明の処方剤は、以下の配列：配列番号５３、配列番号６２、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８および配列番号８７および／または本明細書に開示する他の配列の１つの少なくとも一部を有する外部寄生生物唾液タンパク質相同体の少なくとも一部を包含する。
一態様において、本発明の処方剤は配列表で同定されるアミノ酸配列の１つの少なくとも一部分を有する（すなわち、含有する）少なくとも１つの単離タンパク質を包含し、さらに特に、配列番号５３、配列番号６２、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８および配列番号８７からなる群から選択されるアミノ酸配列を包含する。
本発明の外部寄生生物唾液タンパク質は、全長のタンパク質、ハイブリッドタンパク質、融合タンパク質、多価タンパク質および以下のアミノ酸配列：配列番号５３、配列番号６２、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８および配列番号８７および／または本明細書に開示するタンパク質の配列の１つの少なくとも一部分を有するタンパク質の少なくとも一部の切断相同体またはタンパク質分解産物であるタンパク質を包含するが、これらに限定されないことが認識されるべきである。本明細書に使用されるハイブリッドタンパク質という用語は、２つの異なるタンパク質から産生される１つのタンパク質をいう。
前述の配列番号は実施例に開示する方法によって推定されるアミノ酸配列を示す。アミノ酸の配列決定技術は全く間違いがないわけではないので、前述の配列番号は、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質のみかけのアミノ酸配列を示すのみとする。また、配列決定されるタンパク質はノミの集団由来のものであったので、前述の配列番号に見られる変異も、少なくとも一部には対立遺伝子変異によるものであるかもしれない。
本発明によると、本発明の処方剤は、翻訳後修飾を受けたノミ唾液タンパク質を含有しうる。このような修飾には、例えばグリコシル化が包含されていてもよい。グリコシル化はＮ−結合および／またはＯ−結合オリゴ糖の付加を包含していてもよい。本発明のタンパク質の翻訳後修飾は、即時型または遅延型過敏症応答においてそのタンパク質に対するアレルギー応答を誘発するエピトープの能力に寄与しうることが認識されるべきである。
本発明の別の態様は、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質をコードする外部寄生生物唾液タンパク質遺伝子と、緊縮条件下にてハイブリダイズすることができる単離核酸分子である。本発明によると、単離核酸分子は天然の環境から取り出された（すなわち、人による操作が加えられた）核酸分子である。このように、「単離された」は、核酸分子が精製された程度を反映していない。単離された核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡもしくはＲＮＡの誘導物を含有していてもよい。
本発明の単離核酸分子は、遺伝子全体（すなわち、完全な遺伝子）として、またはその遺伝子と安定なハイブリッドを形成することができるその一部として天然原料から得られてもよい。本明細書で使用される、実在物（entity）「の少なくとも一部」という句は、実在物の機能の側面を有するのに少なくとも十分なその実在物の量をいう。例えば、本明細書で使用される、核酸配列の少なくとも一部は、緊縮ハイブリダイゼーション条件下にて、対応する遺伝子と安定なハイブリッドを形成することができる核酸配列の量である。本発明の単離核酸分子はまた、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）または化学合成を使用して産生することができる。単離外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子は、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質をコードする核酸分子の能力または緊縮条件下で天然の核酸分子単離物と安定なハイブリッドを形成する核酸分子の能力をこのような修飾が実質的に妨害しない方法で、核酸が挿入、欠失、置換および／または逆方向化された天然の対立遺伝子変異体および修飾された核酸分子（これらに限定されない。）を含む天然の核酸分子およびその相同体を包含する。
本発明の単離核酸分子は、本発明の少なくとも１つの外部寄生生物唾液タンパク質をコードする核酸配列を含有していてもよく、このようなタンパク質の例は本明細書に開示されている。「核酸分子」という句は主に物理的な核酸分子を言い、「核酸配列」という句は主に核酸分子のヌクレオチドの配列を言うが、特に外部寄生生物唾液タンパク質をコードすることができる核酸分子または核酸配列に関しては、この２つの句は交換可能に使用することができる。これまでに開示されたように、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質は、領域、その一部および他の外部寄生生物唾液タンパク質相同体をコードする全長の外部寄生生物唾液タンパク質を包含するが、これらに限定されない。
本発明の外部寄生生物唾液タンパク質はポリプロテインをコードする全長の核酸配列によってコードされ得ることが認識されるべきである。ポリプロテインは、翻訳後に唾液中に見いだされる複数のタンパク質にプロセッシングされうる。本明細書で使用される外部寄生生物唾液タンパク質遺伝子は、その遺伝子によってコードされる外部寄生生物唾液タンパク質の産生を調節する調節領域（これらに限定されないが、転写、翻訳または翻訳後調節領域など）並びにコード領域自体などの天然の外部寄生生物唾液タンパク質遺伝子に関係する全ての核酸配列を包含する。本発明の核酸分子は単離された天然外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子であっても、その相同体であってもよい。本発明の核酸分子は１つ以上の調節領域、全長もしくは部分的なコード領域またはそれらの組み合わせを包含していてもよい。本発明の外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子の最小サイズは、緊縮ハイブリダイゼーション条件下で対応する天然遺伝子と安定なハイブリッドを形成することができる最小サイズである。
外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子の相同体は当業者に周知の多数の方法を使用して産生することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上述）。例えば、核酸分子は、特定部位の突然変異誘発のような古典的な突然変異誘発技法および組換えＤＮＡ技法、突然変異を誘発するための化学的な核酸分子の処理、核酸断片の制限酵素切断、核酸断片のライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅法および／または核酸配列の選択領域の突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成および核酸分子混合物を「構築する」混合群のライゲーション並びにそれらの組み合わせ（これらに限定されない。）を包含する多種の技法を使用して調節することができる。核酸分子相同体は、核酸によってコードされるタンパク質の機能に関してスクリーニングすることにより（例えば、アレルギー性皮膚炎である動物においてアレルギー応答を誘発する相同体の能力または抗凝固剤として作用する相同体の能力）、および／または緊縮条件下にて単離外部寄生生物唾液タンパク質核酸とハイブリダイゼーションすることにより、修飾後の核酸混合物から選択することができる。
本発明の一態様は、以下のアミノ酸配列：配列番号１の１つ以上の少なくとも一部分を有するタンパク質をコードする外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子、並びにこれらの配列のいずれかの相補物またはその相同体である。このような好ましい核酸分子はそのコード鎖および／または相補鎖とハイブリダイズすることができる。
本発明の好ましい核酸分子は、緊縮条件下にて、かかるノミ唾液タンパク質の少なくとも一部分をコードする核酸分子またはその相同体のコード鎖および／またはコード鎖に相補的な鎖とハイブリダイズすることができる。特に好ましい核酸配列は、以下のアミノ酸配列：配列番号５３、配列番号６２、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８および／または配列番号８７の１つ以上の少なくとも一部分をコードする核酸配列と、少なくとも約６５パーセント相同性を有し、好ましくは少なくとも約７５パーセント相同性を有し、さらに好ましくは少なくとも約８５パーセント相同性を有し、さらにより好ましくは少なくとも約９５パーセント相同性を有する核酸配列である。
このような核酸分子は、全長のタンパク質、ハイブリッドタンパク質、融合タンパク質、多価タンパク質または切断（truncation）断片をコードする全長の遺伝子および／または核酸分子であってもよい。本発明のさらに好ましい核酸分子は、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７６で示される核酸配列と、配列番号７８または配列番号８７のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または本明細書に開示される他の配列を有する単離核酸分子を含有する。
配列番号５２はノミ唾液タンパク質ｆｓｐＧ５（ｎｆｓｐＧ５595と示す）をコードする約５９５個のヌクレオチドのみかけの遺伝子を含有する核酸配列であり、配列番号５３で示す約９０個のアミノ酸のタンパク質（ＰｆｓｐＧ５90と示す）をコードする。ｆｓｐＧ５の全翻訳産物はみかけ上約７１個のアミノ酸であり、配列番号５６と示す。配列番号６１はノミ唾液タンパク質ｆｓｐＩ（ｎｆｓｐＩ1007と示す）をコードする約１００７個のヌクレオチドのみかけの遺伝子を含有する核酸配列であり、配列番号６２で示す約１５５個のアミノ酸のタンパク質（ＰｆｓｐＩ155と示す）をコードする。配列番号６４はノミ唾液タンパク質ｆｓｐＮ５（ｎｆｓｐＮ５1205と示す）をコードする約１２０５個のヌクレオチドのみかけの遺伝子を含有する核酸配列であり、配列番号６５で示す約３５３個のアミノ酸のタンパク質（ＰｆｓｐＮ５353と示す）をコードする。配列番号７１はｆｓｐＮ６ノミ唾液タンパク質（ｎｆｓｐＮ６406と示す）をコードする約４０６個のヌクレオチドのみかけの遺伝子を含む核酸配列であり、配列番号７２で示す約１３５個のアミノ酸のタンパク質（ＰｆｓｐＮ６135と示す）をコードする。配列番号７４はｆｓｐＪノミ唾液タンパク質をコードする約４２０個のヌクレオチドのみかけの遺伝子を含有する核酸配列であり、配列番号７５で示す約７２個のアミノ酸のタンパク質をコードする。
本発明の外部寄生生物唾液タンパク質の核酸分子を知ることにより、当業者は、その核酸分子のコピーを作成することが可能になるだけでなく、外部寄生生物唾液タンパク質コード遺伝子の別の部分を含む核酸分子（例えば、翻訳開始部位および／または転写および／または翻訳調節領域を含む核酸分子）、および／または外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子相同体を得ることができる。本発明の外部寄生生物唾液タンパク質のアミノ酸配列の一部を知ることにより、当業者は、かかる外部寄生生物唾液タンパク質をコードする核酸配列をクロニングすることができる。加えて、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質と結合する抗体を用いて適当な発現ライブラリーをスクリーニングすること；本発明のオリゴヌクレオチドプローブを使用して適当なライブラリーまたはＤＮＡをスクリーニングする従来のクローニング技法；および本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを使用した適当なライブラリー、またはＲＮＡもしくはＤＮＡのＰＣＲ増幅（ゲノムおよび／またはｃＤＮＡライブラリーを使用してもよい）を包含する種々の方法で望ましい外部寄生生物唾液タンパク質の核酸分子を得ることができる。ノミ唾液タンパク質の核酸分子を単離するために、好ましいｃＤＮＡライブラリーは、未給餌全ノミ、給餌全ノミ、給餌ノミ中腸、未給餌ノミ中腸およびノミ唾液腺から作成されるｃＤＮＡライブラリーを包含する。遺伝子をクローニングして、増幅する技法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、上記文献に開示されている。実施例の部は本発明のノミ唾液タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列の単離の実施例を包含する。
本発明はまた、以下のアミノ酸配列：配列番号５３、配列番号６２、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８および配列番号８７の１つ以上の少なくとも一部分をコードする、本発明の他の、好ましくはより長鎖の核酸分子の相補領域、またはその相同体と緊縮条件下にてハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドである核酸分子を包含し、このようなオリゴヌクレオチドは２本鎖核酸分子のコード鎖または非コード鎖とハイブリダイズすることができる。ある種の好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号５２、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６４、配列番号７１、配列番号７４で示される核酸分子、配列番号７８または、配列番号８７のアミノ酸配列をコードする核酸配列、またはそれらの相補体にハイブリダイズすることができる。
本発明のオリゴヌクレオチドはＲＮＡ、ＤＮＡまたはどちらかの誘導体であってもよい。このようなオリゴヌクレオチドの最小サイズは、所定のオリゴヌクレオチドと本発明の別の核酸分子の相補的配列との安定なハイブリッドを形成するために必要なサイズである。最小サイズの特徴を本明細書に開示する。オリゴヌクレオチドのサイズは、本発明によってオリゴヌクレオチドを使用するために十分でなければならない。本発明のオリゴヌクレオチドは、別の核酸分子を同定するためのプローブ、核酸分子を増幅または伸長するためのプライマーまたは例えば外部寄生生物による唾液タンパク質の発現を阻止するための治療的用途（これらに限定されない。）を包含する種々の用途に使用することができる。このような治療的用途は、例えばアンチセンス技法、三重らせん形成技法、リボザイム技法および／またはＲＮＡ医薬をベースとした技法におけるこのようなオリゴヌクレオチドの使用を包含する。
従って、本発明は、１以上のこのような技法を用いて外部寄生生物唾液タンパク質の酸性を妨害するこのようなオリゴヌクレオチドおよび方法を包含する。
本発明はまた、核酸分子を宿主細胞内に搬送することができる任意のベクターに挿入される、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子を包含した、組換えベクターを包含する。このようなベクターは、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子に隣接して、天然には見だされない核酸分子である異種核酸配列を含有する。ベクターは原核細胞または真核細胞のＲＮＡまたはＤＮＡであってもよく、一般にウィルスまたはプラスミドである。本発明の外部寄生生物唾液タンパク質核酸分子のクローニング、配列決定および／またはその他の操作に組換えベクターを使用することができる。本明細書において組換え分子と呼ばれ、以下により詳細に記載される、１つの種類の組換えベクターを本発明の核酸分子の発現に使用することができる。好ましい組換えベクターは形質転換細胞中で複製することができる。
本発明の組換えベクターに含有させるための好ましい核酸分子は、以下のアミノ酸配列：配列番号５３、配列番号６２、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８および配列番号８７、または本明細書に開示される他の配列の１つ以上の少なくとも一部分をコードする核酸分子もしくはその相同体、並びに、配列番号５２、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６４、配列番号７１、配列番号７４で示される核酸配列、配列番号７８もしくは配列番号８７をコードする核酸配列または本明細書に開示される他の配列の少なくとも一部分を含む核酸分子もしくはその相補体である。組換えベクターに含有させるためのさらに好ましい配列は、ｎｆｓｐＧ５595、ｎｆｓｐＧ５270、ｎｆｓｐＧ５213、ｎｆｓｐＩ1007、ｎｆｓｐＮ５1205、ｎｆｓｐＮ５1059、ｎｆｓｐＮ６406およびｎｆｓｐＪ420を包含する。
本発明の好ましい組換え分子は、その産生法が実施例の部に詳細に記載されるｐＣｒｏ−ｎｆｓｐＧ５213およびｐＣｒｏ−ｎｆｓｐＩ474を包含する。
一態様において、本発明の単離外部寄生生物唾液タンパク質は、タンパク質を産生するために効果的な条件下にてタンパク質を発現することができる細胞を培養し、そのタンパク質を回収することによって産生される。培養するために好ましい細胞は、外部寄生生物唾液タンパク質を発現することができる組換え細胞、本発明の１つ以上の核酸分子で宿主細胞を形質転換することによって産生される組換え細胞である。核酸分子の細胞へのトランスホーメーションは、核酸分子を挿入することができる任意の方法によって達成することができる。形質転換技法は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着およびプロトプラスト融合を包含するが、これらに限定されない。組換え細胞は１細胞のままであっても、増殖して組織、器官または多細胞生物を形成してもよい。本発明のトランスホーメーションされた核酸分子は、発現される能力が維持される方法で、染色体外に維持されてもよいし、形質転換された（すなわち、組換え）細胞の染色体内の１つ以上の部位に組み込まれてもよい。宿主細胞を形質転換する好ましい核酸分子は、本発明の組換えベクターに組み込まれるために本明細書に開示されるようなものである１つ以上の核酸分子を包含する。
形質転換するのに好適な宿主細胞は、形質転換された任意の細胞、および導入された外部寄生生物唾液タンパク質を発現することができる任意の細胞を包含する。従って、このような細胞は、本発明の少なくとも１つの核酸分子で形質転換された後に本発明の外部寄生生物唾液タンパク質を産生することができる。宿主細胞は形質転換されていない細胞であっても、少なくとも１つの核酸分子ですでに形質転換されている細胞であってもよい。本発明の好適な宿主細胞は、細菌細胞、真菌細胞（酵母を含む）、昆虫細胞、動物細胞および植物細胞でありうる。好ましい宿主細胞は細菌細胞、昆虫細胞およびほ乳類細胞を含み、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ．）および昆虫細胞（例えば、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ））が特に好ましい。
組換え細胞は、好ましくは、各々が１つ以上の転写調節配列を含有する発現ベクターに機能的に作用するように結合された本発明の１つ以上の核酸分子を含有する１つ以上の組換え分子で宿主細胞を形質転換することによって、産生される。機能的に作用するように結合されるという句は、拡散分子を宿主細胞内にトランスホーメーションするとき、該分子が発現され得るような方法で該核酸分子を発現ベクター内に挿入することをいう。本明細書で使用される発現ベクターは、宿主細胞を形質転換し、特定の核酸分子の発現に影響を与えることができるＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターである。好ましくは、発現ベクターはまた、宿主細胞内で複製することができる。発現ベクターは原核細胞または真核細胞のいずれかであってもよく、一般にウィルスまたはプラスミドである。本発明の発現ベクターは、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、動物細胞および／または植物細胞を包含した、本発明の組換え細胞中で機能する（すなわち、遺伝子発現する）任意のベクターを包含する。このように、本発明の核酸分子は、プロモーター、オペレーター、レプレッサー、エンハンサー、停止配列、複製起点および組換え細胞と和合性であり、本発明の核酸分子の発現を調節する他の調節配列のような調節配列を含有する発現ベクターに機能的に作用するように結合することができる。本明細書で使用される転写調節配列は、転写開始、伸長および停止を調節することができる配列を包含する。特に重要な転写調節配列は、プロモーター、オペレーターおよびレプレッサー配列などの転写開始を調節する配列である。好適な転写調節配列は、本発明の組換え細胞の少なくとも１つにおいて機能することができる任意の転写調節配列を包含する。種々のこのような転写調節配列は当業者に公知である。好ましい転写調節配列は、細菌細胞、酵母細胞、ぜん虫細胞、昆虫細胞およびほ乳類細胞中で機能する、ｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、ｏｘｙ−ｐｒｏ、ｏｍｐ／ｌｐｐ、ｒｒｎＢ、バクテリオファージラムダ（λ）（λｐＬおよびλｐＲおよびこのようなプロモーターを包含する融合物など）、バクテリオファージＴ７、Ｔ７ｌａｃ、バクテリオファージ  Ｔ３、バクテリオファージ  ＳＰ６、バクテリオファージ  ＳＰ０１、メタロチオネイン、アルファ交配因子、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）アルコールオキシダーゼ、アルファウィルスサブゲノムプロモーター（シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウィルスサブゲノムプロモーターなど）、バキュロウィルス、ヘリオシス  ゼア（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｚｅａ）昆虫ウィルス、ワクシニアウィルス、ヘルペスウィルス、ポックスウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス  ４０、レトロウィルスアクチン、レトロウィルス性ロングターミナルリピート、ラウス（Ｒｏｕｓ）肉腫ウィルス、熱ショック、ホスフェートおよびニトレート転写調節配列並びに原核細胞または真核細胞内の遺伝子発現を調節することができる他の配列のようなもの（これらに限定されない。）を包含する。追加の好適な転写調節配列には、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、並びにリンフォカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンにより誘導されるプロモーター）が包含される。本発明の転写調節配列にはまた、外部寄生生物唾液タンパク質をコードするＤＮＡ配列と天然に結合した天然に存在する転写調節配列が包含されていてもよい。
本発明の発現ベクターはまた、発現された外部寄生生物唾液タンパク質が、タンパク質を産生する細胞から分泌されることを可能にする分泌シグナル（例えば、シグナルセグメント核酸配列）を包含していてもよい。好適なシグナルセグメントは、外部寄生生物唾液タンパク質シグナルまたは融合タンパク質を含む本発明の外部寄生生物唾液タンパク質の分泌を生じることができる任意の異質シグナルセグメントを包含する。好ましいシグナルセグメントには、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、組織適合性およびウィルスエンベロープグリコプロテインシグナルセグメントが包含されるが、これに限定されない。
配列番号の発現ベクターはまた、融合タンパク質として本発明の挿入核酸分子を発現する融合配列を含有する。本発明の外部寄生生物核酸分子の一部としての融合配列の挿入は、この核酸分子によってコードされるタンパク質の産生、貯蔵および／または使用を増大することができる。さらに、融合セグメントは、アフィニティークロマトグラフィーを使用して得られた融合タンパク質の精製を可能にするなどのように、外部寄生生物唾液タンパク質を簡単に精製するための手段として機能することができる。好適な融合セグメントは、望ましい機能（例えば、安定性の増加および／または精製手段）を有する任意のサイズのドメインでありうる。１つ以上の融合セグメントを使用することは本発明の範囲内である。融合セグメントは外部寄生生物唾液タンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシ末端と結合することができる。融合セグメントと外部寄生生物唾液タンパク質との結合は、外部寄生生物唾液タンパク質の直接の回収を可能にする切断を受けやすいように構築されうる。融合タンパク質は好ましくは、外部寄生生物唾液タンパク質のカルボキシ末端および／またはアミノ末端のどちらかに結合した融合セグメントを含むタンパク質をコードする融合核酸配列で形質転換した組換え細胞を培養することによって産生される。
本発明の組換え分子は、形質転換された細胞内での核酸分子の発現を効果的に調節することができる任意の転写調節配列の少なくとも１つに機能的に作用するように結合される上述の任意の核酸分子の少なくとも１つを含有しうる分子である。好ましい組換え分子は、本発明の組換えベクターに含ませるために本明細書に開示される１つ以上の核酸分子を包含する。
本発明の組換え細胞は、本発明の任意の核酸分子の少なくとも１つで形質転換した任意の細胞を包含する。好ましい組換え細胞は、以下のアミノ酸配列：配列番号５３、配列番号６２、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８および配列番号８７または本明細書に開示される他の配列の１つ以上の少なくとも一部を有するタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸分子またはその相同体、並びに配列番号５２、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６４、配列番号７１、配列番号７４で示される核酸配列、配列番号７８もしくは配列番号８７をコードする核酸配列または本明細書に開示する他の配列を包含する核酸分子またはその相補体で形質転換した細胞である。特に好ましい組換え細胞には、上記の核酸分子の少なくとも１つで形質転換した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が包含される。本発明の好ましい組換え細胞には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）：ｐＣｒｏ−ｎｆｓｐＧ５213：および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）：ｐＣｒｏ−ｎｆｓｐＩ474が包含される。
組換え細胞ＤＮＡ技法を使用することにより、例えば宿主細胞内の核酸分子のコピー数、それらの核酸分子が転写される効率、得られる転写物が翻訳される効率および翻訳後調節の効率を操作することによって、トランスホーメーションされた核酸分子の発現を改善することができることは当業者に認識されるだろう。本発明の核酸分子の発現を増加するために有用な組換え細胞技法には、核酸分子と高コピー数プラスミドとの結合、１つ以上の宿主細胞染色体への核酸分子の組込み、ベクター安定配列のプラスミドへの付加、転写調節シグナルの置換または修飾（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）、翻訳調節シグナルの置換または修飾（例えば、リボソーム結合部位、シャイン−ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列、宿主細胞のコドンの使用に対応するための、本発明の核酸分子の修飾、転写物を不安定化する配列の欠失および発酵中の組換えタンパク質産生から組換え細胞増殖を一時的に分離する調節シグナル（これらに限定されない。）の使用が包含される。本発明の発現された組換えタンパク質の活性は、得られたタンパク質を断片化、修飾または誘導体化することによって改良することができる。
本発明によると、組換え細胞を使用して、このようなタンパク質を産生するのに効果的な条件下にてこのような細胞を培養し、タンパク質を回収することによって、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質を産生することができる。タンパク質を産生するための効果的な条件には、タンパク質の産生を可能にする適当な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が包含されるが、これらに限定されない。適切、即ち効果的な培地は、本発明の細胞が培養されるとき、外部寄生生物唾液タンパク質を産生することができる任意の培地をいう。このような培地は、典型的には、同化可能な炭水化物、窒素およびリン酸塩源、並びに適当な塩、鉱物、金属およびビタミンのような他の栄養素を含有する水溶性培地である。培地は複合栄養物を含有してもよく、または規定された最小培地であってもよい。
本発明の細胞は、バッチ、給餌−バッチ、細胞リサイクルおよび連続発酵槽（これらに限定されない。）を包含する従来の発酵バイオリアクター中で培養され得る。培養はまた、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイター皿およびペトリプレートで実施されてもよい。培養は、組換え細胞に適当な温度、ｐＨおよび酸素含量で実施される。このような培養条件は、通常の当業者の専門技術内である。
産生に使用するベクターおよび宿主系に応じて、得られた外部寄生生物唾液タンパク質は組換え細胞内に残存してもよく；発酵培地中に分泌されてもよく；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞周辺腔などの細胞膜間の空間に分泌されてもよく；または、細胞膜またはウィルス膜の外側表面に保持されてもよい。「タンパク質を回収する」という句は、単純にタンパク質を含有する発酵培地全体を採取することを言い、分離または精製の追加のステップを含意する必要はない。本発明の外部寄生生物唾液タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび溶解度差（これらに限定されない。）のような種々の標準的なタンパク質精製技法を使用して精製することができる。
外部寄生生物唾液タンパク質は好ましくは「実質的に純粋な」形態で回収される。本明細書で使用される「実質的に純粋な」は、治療用組成物または診断用としてタンパク質を効果的に使用することを可能にする純度をいう。例えば、本発明の組換え細胞から単離された外部寄生生物唾液タンパク質の用量を投与した動物は、このタンパク質に混合された不純物による実質的な毒性作用を示してはいけない。
実質的に汚染物質を含有しない外部寄生生物唾液は、本発明の唾液採取装置（Ｆｒａｎｋらによる、国際公開公報第９６／１１，２７１号に開示される；この公報は参考として本明細書に全体が組み入れられる）を使用して採取され得る。本発明の好ましいチャンバーの内径は好ましくは約７．５ｃｍである。本発明の採取手段のサイズは、好ましくは７．５ｃｍのチャンバーの開放端より大きく、採取手段のサイズはさらに好ましくは約８ｃｍである。
本発明によると、外部寄生生物唾液産物は、採取手段と塩化ナトリウム、アルコールおよびトリスを含有するトリス緩衝液とを接触させることによって、採取手段（関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号に記載されている）から抽出され得る。さらに好ましい抽出緩衝液は、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、５％ＩＰＡおよび２０ｍＭトリス、ｐＨ約８．０乃至ｐＨ約８．３を含む。トリス緩衝液を使用して、採取手段からタンパク質および他の産物を溶出するために好適な抽出時間は、実施例に詳細に記載される。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂を使用して濃縮することによって、本発明の採取手段から抽出された唾液タンパク質のさらなる濃縮を実施してもよい。好適なＨＩＣ樹脂は、高塩濃度でタンパク質と結合する任意の樹脂を包含する。好ましいＨＩＣ樹脂は、例えばブチル−、オクチル−およびフェニル−基質接合樹脂を包含する。さらに好ましい樹脂はフェニル−セファロース樹脂を包含する。好ましい態様において、トリス緩衝液に含有される本発明のノミ唾液タンパク質抽出物をＨＩＣ樹脂と接触させて、ノミ唾液タンパク質を樹脂に結合させてもよい。
本発明によると、「ミメトープ」は、本発明の単離外部寄生生物唾液タンパク質がその機能を実行する能力（例えば、抗凝固、抗補体、血管拡張、プロテアーゼ、酸性ホスファターゼ、またはアレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物もしくはアレルギー性皮膚炎である動物の過敏性を検出および／または治療すること）を模倣することができる任意の化合物をいう。ミメトープは、分解を受けにくくするように調節されているが、望ましい活性を依然として保持するペプチドであってもよい。ミメトープの他の例には、炭水化物系化合物、脂質系化合物、核酸系化合物、天然有機化合物、合成有機化合物、抗イディオタイプ抗体および／または触媒抗体、またはそれらの断片が包含されるが、これらに限定されない。本発明のミメトープはまた、アレルギー活性および／または抗原活性を有する外部寄生生物唾液タンパク質の非タンパク質部分を包含していてもよい（例えば、外部寄生生物唾液タンパク質と結合した炭水化物部分）。ミメトープは、例えば、外部寄生生物が摂餌する能力を変化させることができる化合物、または外部寄生生物に咬まれることにより生ずるアレルギー性皮膚炎を検出および／または治療することができる化合物について合成化合物のライブラリーをスクリーニングすることによって、得ることができる。ミメトープはまた、合理的な医薬設計により得ることができる。合理的な医薬設計手順において、本発明の化合物の３次元構造を、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）またはＸ線結晶構造解析によって解析することができる。次いで３次元構造を使用して、例えば、コンピュータモデリングによって可能なミメトープの構造を予測することができる。次いで予測されたミメトープの構造を、例えば化学合成、組換えＤＮＡ技術によって産生することによって、または天然の原料（例えば、植物、動物、細菌および真菌）からミメトープを単離することによって産生することができる。
本発明の一態様は、動物が外部寄生生物唾液産物に過敏性であるかどうかを検出することができるインビボ試験である。本発明のインビボ試験を最初に使用して、動物が外部寄生生物唾液産物に過敏性であるかどうかを測定し、次いで動物が特定の外部寄生生物唾液成分、特に外部寄生生物唾液タンパク質に過敏性であるかどうか測定することができる。本発明のインビボ過敏性試験は、アレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物またはアレルギー性皮膚炎である動物を同定するために特に有用である。本発明のインビボ過敏性試験は、ＦＡＤに罹患しやすい動物またはＦＡＤである動物を同定するためにさらに特に有用である。本発明の好適なインビボ過敏性試験は、少なくとも１つの外部寄生生物唾液産物またはそのミメトープを含有する有効量の処方剤を投与（例えば、皮内注射または表皮スクラッチ法）を含む皮膚試験であってもよいが、これらに限定されない。本発明の皮膚試験を実施するための方法は当業者に周知で、本明細書に簡単に開示されている。
インビボ皮膚試験に使用する好適な処方剤は、本発明の１つ以上の単離外部寄生生物唾液タンパク質を含有する。
本発明の皮膚試験に使用するための外部寄生生物唾液タンパク質の好適な量は、試験に使用される産物のアレルゲン性および産物が搬送される部位に応じて広範に変化してもよい。本発明の皮膚試験に使用するための外部寄生生物唾液タンパク質の好適な量は、この産物に対するアレルギー反応によって生じる検出可能な膨疹または硬結（硬化）などの反応を形成することができる量を含有する。本発明の皮膚試験に使用するための外部寄生生物唾液タンパク質の好ましい量は、約１ナノグラム（ｎｇ）乃至約５００マイクログラム（μｇ）の範囲の外部寄生生物唾液タンパク質で、さらに好ましくは約５ｎｇ乃至約３００μｇの範囲の外部寄生生物唾液タンパク質であり、よりさらに好ましくは約１０ｎｇ乃至約５０μｇの範囲の外部寄生生物唾液タンパク質である。この量は投与されるタンパク質のアレルゲン性に応じて変化することが当業者に理解されるべきである。
本発明によると、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質を、免疫強化物質（例えば、以下に詳細に記載される本発明のキャリアまたはアジュバント）と組み合わせてもよい。しかしながら、本発明の新規側面は、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質は免疫強化物質が存在しなくても過敏性応答を誘導することができるということである。
本発明の皮膚試験はさらに、動物に対照溶液を投与することを具備する。対照溶液は陰性対照溶液および／または陽性対照溶液を含有していてもよい。本発明の陽性対照溶液は、動物に投与したとき、過敏性応答を誘導することが知られている少なくとも１つの化合物の有効量を含有する。陽性対照として使用するための好ましい化合物は、ヒスタミンを含むが、これに限定されない。本発明の陰性対照溶液は、動物に投与したとき、過敏性応答を誘発しないことが知られている溶液を含む。このように、陰性対照溶液は、生理食塩液などの、特に過敏性応答を誘発することができない化合物を含有する溶液または単に処方剤を調製するために使用される緩衝液を含んでもよい。好ましい陰性対照溶液の例はフェノレート化リン酸緩衝液生理食塩液（ノースカロライナ州レノイアのグリーアラボラトリーズ社（Ｇｒｅｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）製）である。
本発明の１つ以上の処方剤に対する動物の過敏性は、１つ以上の実験試料および対照試料を動物に投与することによって生ずる反応（例えば、膨疹サイズ、硬結または硬化；当業者に公知の技法を使用する）を測定し、実験試料に対する反応と１つ以上の対照溶液を投与することによって生じる反応とを比較することにより評価され得る。皮内注射のための好ましい装置は個別注射器を包含する。スクラッチ法のための好ましい装置は、一度に多数の試料の投与を可能にする装置を包含する。動物の過敏性は、本発明の処方剤の投与によって生じる反応が、陰性対照の投与によって生じる反応より大きいかどうかを測定することによって、および／または処方剤の投与によって生じる反応が、陽性対照溶液の投与によって生じる反応と少なくともほぼ同じサイズであるかどうかを測定することによって、評価され得る。このように、実験試料が、動物に陽性対照を投与することによって生ずる膨疹のサイズと同じか、または大きい反応を生ずる場合には、その動物は実験試料に対して過敏性である。逆に、実験試料が、動物に陰性試料を投与することによって生じる反応と同様の反応を生じる場合には、その動物は実験試料に対して過敏性でない。
動物の過敏性を評価するための好ましい膨疹のサイズは、直径が約１６ｍｍ乃至約８ｍｍの範囲で、さらに好ましくは約１５ｍｍ乃至約９ｍｍの範囲であり、よりさらに好ましくは、約１４ｍｍ乃至約１０ｍｍの範囲である。
好ましくは、動物が本発明の処方剤に対して即時型過敏性応答を示す能力または示さない能力は、試料投与の約２分乃至約３０分後に、好ましくは試料投与の約１０分乃至２５分後に、よりさらに好ましくは試料投与の約１５分後に膨疹サイズを測定することによって測定される。
好ましくは、動物が本発明の処方剤に対して遅延型過敏性応答を示す能力または示さない能力は、試料投与の約１８時間乃至約３０分後に、さらに好ましくは試料投与の約２０時間乃至約２８時間後に、よりさらに好ましくは試料投与の約２４時間後に硬結および／または紅斑を測定することによって、測定される。遅延型過敏性応答はまた、当業者に公知の技法を使用して、上記に直接規定する期間の間に投与部位の細胞の浸潤の程度を測定するなどの他の技法を使用しても測定され得る。
好ましい態様において、本発明の皮膚試験は、本発明の少なくとも１つのノミ唾液タンパク質を含有する処方剤の有効量を動物の所定の部位に皮内注射することと、同じ動物の異なる部位に対照溶液の有効量を皮内注射することとを具備する。多数の部位に同時に複数の試料を搬送することができ、好ましくは多数の処方剤を同時に評価することができる装置を使用することは、当業者の範囲内である。１つの好ましい処方剤は、本発明によって採取されるノミ唾液産物を含有する。また、１つ以上の組換えによって産生されるノミ唾液タンパク質を含有する処方剤も好ましい。
本発明の皮膚試験に使用するための好適なノミ唾液タンパク質は、本明細書の配列番号表に掲載されるアミノ酸配列またはその相同体を有するタンパク質を包含する。好ましい陽性対照試料はヒスタミンを含有する試料であってもよい。好ましい陰性対照試料は希釈剤を含有する試料であってもよい。
本発明の皮膚試験を使用する、外部寄生生物唾液タンパク質に対する感受性を試験するのに好適で、好ましい動物は本明細書に開示される。本明細書の皮膚試験を用いて試験する特に好ましい動物には、イヌ、ネコおよびウマが包含され、イヌとネコがよりさらに好ましい。
本発明の別の態様は、抗体であると推定される物質を含有する溶液と外部寄生生物唾液タンパク質を含有する溶液とを、免疫複合体が形成されて、検出され得るような方法で接触させることによって、本発明の１つ以上の外部寄生生物唾液タンパク質と結合することができる抗体の存在を検出できるインビトロの免疫吸着試験である。従って、本発明のインビトロ免疫吸着試験は、動物が過去に外部寄生生物唾液抗原に暴露された経験があり、従って外部寄生生物唾液抗原に対してさらに暴露されると過敏症を示す可能性があるということを示すことによって、アレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物またはアレルギー性皮膚炎である動物を同定するために特に有用である。
本発明によると、本発明のインビトロ過敏性試験は、（ａ）本発明の処方剤と動物の体液とを、処方剤と、存在する場合には体液中の抗体との間に免疫複合体を形成するために十分な条件下にて接触させることと；および、（ｂ）形成された免疫複合体の量を測定することとを具備し、複合体の形成が、動物がアレルギー性皮膚炎に罹患しやすいか、またはアレルギー性皮膚炎であることを示す免疫吸着試験であありうる、これに限定されない。免疫吸着試験は、体液中のＩｇＥ抗体を検出し、それによって動物の即時型過敏症を示すために特に有用である。形成された免疫複合体の量を測定することは、検出様式に応じて分離するステップを包含していてもよい。免疫吸着アッセイは種々のプロトコールであってもよく、当業者によって設定されてもよい。
本発明の好ましい免疫吸着試験は、固体基板の１つ以上の部分に本発明の１つ以上の外部寄生生物唾液タンパク質またはそのミメトープの好適な量を被覆し、その（または別の）固体基板の１つ以上の他の部分に本発明の陽性対照および／または陰性対照の好適な量を被覆する第１のステップを具備する。本発明の好ましい固体基板には、ＥＬＩＳＡプレート、ディップスティック、ラジオイムノアッセイプレート、アガロースビーズ、プラスチックビーズ、イムノブロット膜および紙（これらに限定されない。）が包含され；さらに好ましい固体基板には、ＥＬＩＳＡプレート、ディップスティック、またはラジオイムノアッセイプレートが包含され、ＥＬＩＳＡプレートおよびディップスティックがよりさらに好ましい。本明細書に使用されるディップスティックは抗体を結合することができる表面を有する任意の固体材料をいい、このような固体材料は、試験管内に挿入された場合にスティック様形状を有する。本発明のインビトロ過敏性試験に使用するための好適で、好ましいノミ唾液タンパク質は、本発明の皮膚試験に開示されるようなものである。
本発明の好ましいインビトロ過敏性試験の第２のステップは、被覆基板とアレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物またはアレルギー性皮膚炎である動物の血清、血漿または全血とを、外部寄生生物唾液産物と結合することができる体液中に含有される抗体が、基板に結合させたこのような産物と結合して、免疫複合体を形成するできるような方法で接触させるステップを具備する。次いで過剰な体液および抗体を基板から洗い流す。体液中のＩｇＥ抗体を測定することができる好ましい態様において、体液中に存在する他のアイソタイプの免疫グロブリンおよび／またはアルブミンなどの他のタンパク質の少なくとも一部を除去するために、体液を前処理してもよい。このような除去には、体液とＩｇＧ抗体を除去するためのプロテインＧのような物質とを接触させること、および／または体液を例えばコンカナバリン−Ａ（Ｃｏｎ−Ａ）に暴露することによって体液の他の成分からＩｇＥ抗体を親和性精製することが包含されるが、これらに限定されない。
本発明の好ましいインビトロ過敏性試験の第３のステップは、基板に結合させた免疫複合体と、免疫複合体に結合することができる二次抗体などの化合物または外部寄生生物に対してアレルギーを示す動物によって産生されるアレルギー関連抗体の重鎖に結合することができる他の化合物とを、その化合物が免疫複合体と結合できるような方法で接触させるステップを具備する。好ましい結合化合物には、ＩｇＥ抗体の重鎖に結合することができる二次抗体およびＦｃＲの１本鎖（例えば、εＦｃＲのα鎖）を包含した、ＩｇＥ抗体に結合するＦｃ受容体（ＦｃＲ）（すなわち、εＦｃＲ）、並びに膜貫通領域を含有する、または含有しない切断形態が含まれるが、これらに限定されない。好ましい試験動物は本明細書に開示されている。免疫複合体と結合することができる化合物は、通常、体液の抗体に結合する化合物の量を測定することを可能にする標識物で標識される。このような標識には、放射性標識、基質と接触すると呈色反応を生じることができる酵素、蛍光標識、化学発光標識、クロモフォリック（Chromophoric）標識または別の化合物によって結合され得る化合物が包含されるが、これらに限定されない。好ましい標識には、フルオレセイン、ラジオアイソトープ、アルカリホスファターゼ、ビオチン、アビジンまたはペルオキシダーゼが包含されるが、これらには限定されない。
本発明の好ましいインビトロ過敏性試験第４のステップは、当業者に公知な技法を使用して、固体基板に結合させた検出可能な標識の量を測定するステップを具備する。基質に結合する体液由来の抗体の量を、二次抗体または他の結合化合物の１つ以上の層を使用して測定することができることは本発明の範囲内である。例えば、未標識二次抗体を血清抗体と結合させ、次いでこの未標識二次抗体を標識三次抗体によって結合することができる。
過敏性の動物は、体液試料を使用した免疫複合体形成量と対照試料を使用した免疫複合体形成量とを比較することによって同定される。免疫複合体は抗体およびそのリガンド（すなわち、抗原）を含む複合体をいう。このように、免疫複合体は陽性対照試料を使用したとき形成し、陰性対照試料を使用したとき形成しない。このように、体液試料が、陽性対照試料を使用した免疫複合体形成と等しいまたはそれより大きい免疫複合体形成を起こした場合には、体液を採取した動物は基板に結合された外部寄生生物唾液産物に対して過敏性である。逆に、体液試料が陰性対照試料を使用した免疫複合体形成と同様の免疫複合体形成を起こした場合には、体液を採取した動物は基板に結合された外部寄生生物唾液産物に対して過敏性ではない。
本発明のインビトロ過敏性試験の好ましい態様は：（ａ）ＦＳ−１、ＦＳ−２、ＦＳ−３および／または１つ以上のノミ唾液タンパク質（関連出願の国際公開公報第９６／１１，２７１号に開示される）を包含する、ノミ唾液抽出物の好適な量（１９９６年４月１８日に公開された、Ｆｒａｎｋらによる関連出願の国際公開公報第９６／１１，２７１号に開示される）を被覆したＥＬＩＳＡプレートと、アレルギー性皮膚炎の罹患しやすさについて試験する動物の血清、血漿または全血とを接触させるステップと；（ｂ）（ｉ）プレートと、ＩｇＥまたはεＦｃ受容体のような、このような免疫複合体と結合することができる他の化合物と特異的に結合する抗体とを接触させることと、（ｉｉ）このような抗体または他の化合物が結合されるかどうかを測定することによって、このような免疫複合体の存在を検定することにより、免疫複合体がステップ（ａ）で形成されるかどうかを同定するステップとを具備する。特定の態様の引用は、ＩｇＥを結合する化合物を基板に塗布し；次いで、基板に血清、血漿または全血を接触させ；本発明のノミ唾液抽出物または他と結合する能力によって、ＩｇＥと化合物との結合を検出するプロトコールを含む種々の他の免疫アッセイプロトコールの使用を除外するものではないということが注意されるべきである。
本発明の一態様はアレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物またはアレルギー性皮膚炎である動物を同定するために有用なキットである。本明細書で使用される、疑わしい動物は試験される動物である。本発明のキットは、動物がアレルギー性皮膚炎に罹患しやすいか、アレルギー性皮膚炎であるかどうかを測定するためであって、アレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物またはアレルギー性皮膚炎である動物を同定するために使用される本発明の処方剤と手段とを具備する。動物がアレルギー性皮膚炎に罹患しやすいか、またはアレルギー性皮膚炎であるかどうかを測定するための手段は、上記に詳細に記載した本発明のインビボまたはインビトロ過敏性試験を包含しうる。本発明のキットはさらに、本明細書に開示されるものなどの少なくとも１つの対照溶液を含有する。
本発明の好ましいキットは、免疫アッセイを実施するために有用な要素を具備する。本発明のキットは１つ以上の実験試料（すなわち、本発明の処方剤）と１つ以上の予め充填されたディップスティックまたはＥＬＩＳＡプレートに結合する１つ以上の対照試料と、試験される動物の体液に含有される抗体とディップスティックまたはＥＬＩＳＡプレートに結合されたタンパク質との免疫複合体形成を検出するために必要な手段（例えば、標識された二次抗体または他の結合化合物および上で詳細に記載されたこのような標識物質を解析するために必要な任意の溶液）を含有していてもよい。キットが本発明の処方剤だけを含むことと検出手段が別の方法で提供され得ることは本発明の範囲内である。
本発明の別の好ましいキットは、皮膚試験を実施するために有用な要素を具備する。本発明のキットは、１つ以上の実験試料および／または１つ以上の対照試料を含有する少なくとも１つの予め充填された針付き注射器を具備しうる。
２つ以上の異なるインビボおよび／またはインビトロ試験が診断目的のためのの組み合わせに使用しうることは本発明の範囲内である。例えば、外部寄生生物唾液タンパク質に対する動物の即時型過敏性は、動物の体液中の外部寄生生物唾液アレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体を検出することができるインビトロ免疫吸着試験を使用して試験され得る。外部寄生生物唾液タンパク質に対して遅延型過敏性を示すほとんどの動物はまた、このアレルゲンに対して即時型過敏性を示すが、このアレルゲンに対して遅延型過敏性を示す少数の動物はこのアレルゲンに対して即時型過敏性を示さない。このような場合には、ＩｇＥ特異的なインビトロ試験の陰性結果により、本発明のインビボ試験を使用して外部寄生生物唾液アレルゲンに対する動物の遅延型過敏性を試験することができる。
本発明の別の側面は、本発明の処方剤を用いて、アレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物またはアレルギー性皮膚炎である動物を治療することを包含する。本発明によると、治療という用語は、外部寄生生物にかまれることに対する動物による過敏性応答の調節をいってもよい。調節は、例えば動物の過敏性応答に関与する細胞の免疫調節または唾液酵素の抗凝固作用を阻害し、それによって動物の真皮を貫通して摂餌する節足動物の能力を妨害することにより、動物の過敏性応答に関与する細胞を調節するか、または外部寄生生物がアレルゲンを動物に導入する能力を変更することを包含しうる。免疫調節は、典型的には、免疫応答（例えば、抗体、抗原、主要組織適合（ＭＨＣ）およびＭＨＣ分子と共反応性の分子）に関与する分子の活性を調節することを包含しうる。特に、免疫調節は、過敏性応答に関与する細胞の炎症応答、免疫抑制および免疫寛容化を起こす抗原：抗体相互作用の調節をいう。免疫抑制は、例えば免疫応答に関与する特定の細胞を殺すことによって、免疫応答を阻害することをいう。免疫寛容化は、免疫応答に関与する特定の細胞をアネルギー化する（抗原に対するＴ細胞の反応性を低下させる）ことによって免疫応答を阻害することをいう。動物を治療する好適で、好ましい外部寄生生物は本明細書に開示されている。本発明の特に好ましい処方剤を使用してＦＡＤを治療する。
本発明の一態様は、効果的な方法で動物に投与するとき、外部寄生生物に咬まれたことによって伝播されるアレルギー成分に対するその後の暴露の結果、動物による過敏性応答を遮断する（すなわち、低下または実質的に予防する）ように、動物の免疫応答を免疫調節する（すなわち、動物を免疫調節する）ための有用な治療用組成物である。このような治療用組成物は、外部寄生生物唾液産物に過敏性であることが公知である動物および外部寄生生物唾液産物に対する過敏性応を起こしやすい動物を免疫調節するために有用である。
本発明の一態様は、本発明の外部寄生生物唾液タンパク質に対する免疫応答を阻止することができる脱感作化合物を含有する治療用組成物である。このような脱感作化合物には、遮断化合物、寛容原性物質および／または抑制性化合物包含される。遮断化合物は炎症応答を起こすことができる抗原：抗体相互作用を調節することができる化合物を包含し、寛容原性物質は動物を免疫寛容化することができる化合物であり、抑制性化合物は動物を免疫抑制できる。本発明の脱感作化合物は可溶性であっても、膜結合性であってもよい。膜結合性脱感作化合物は、細胞、リポソーム、平板膜、蝸牛殻またはミセルを含むバイオメンブレンと結合させられてもよい。本発明の可溶性脱感作化合物は：（１）肥満細胞のＩｇＥ：抗原が媒介する脱顆粒を遮断することによるＩ型過敏性反応を阻止するために；（２）細胞の補体破壊に到るＩｇＧ：抗原複合体形成を遮断することによるＩＩＩ型過敏性反応を阻止するために；および（３）マクロファージによるサイトカイン分泌のヘルパーＴ細胞刺激を遮断することによるＩＶ型過敏性反応を阻止するために有用である。本発明の膜結合脱感作化合物は：（１）細胞の補体破壊に到る細胞表面のＩｇＧ：抗原複合体形成を遮断することによるＩＩ型過敏性反応を阻止するために；（２）免疫細胞のＩｇＧが調節するシグナル伝達を遮断することによるＩＩ型過敏性反応を阻止するために；および（３）抗原結合細胞のＴ細胞障害性細胞による溶菌を遮断することによるＩＶ型過敏性反応を阻止するために有用である。
本発明の脱感作化合物はまた、外部寄生生物唾液産物に対する過敏性応答に関与する特殊な細胞を脱感作化合物の標的とすることができるリガンド分子と共有結合させてもよい。脱感作化合物と結合する適切なリガンドには、例えば免疫グロブリン分子の少なくとも一部分、サイトカイン、レクチン、異種アレルゲン、ＣＤ８分子、ＣＤ４分子または主要組織適合性分子（例えば、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子）が含まれる。脱感作化合物と結合する免疫グロブリンの好まし部分は免疫細胞特異的表面分子と結合することができる可変領域と、免疫細胞のＦｃ受容体と結合することができる定常領域、特にＩｇＥ定常領域を包含する。好ましいＣＤ８分子はＣＤ８のβ鎖の少なくとも細胞外機能領域を含有する。好ましいＣＤ４分子はＣＤ４の少なくとも細胞外機能領域を含有する。免疫細胞は、免疫応答に関与する細胞、特にＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子を有する細胞をいう。好ましい免疫細胞は、抗原呈示細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞を包含する。
一態様において、本発明の治療用組成物は本発明の外部寄生生物唾液産物またはそのミメトープを含有する。好ましい治療用組成物は、本発明の外部寄生生物唾液抽出物または少なくとも１つの外部寄生生物唾液産物（好ましくはタンパク質）またはそのミメトープを含有する。
ノミアレルギー性皮膚炎を治療するための本発明の好適な治療用組成物は、ノミ唾液抽出物（関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号に開示されるものなど）および少なくとも１つのノミ唾液タンパク質またはそのミメトープを含有する他の処方剤を包含する。好ましい治療用組成物はＦＳ−１、ＦＳ−２および／またはＦＳ−３（関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号に開示されるものなど）並びにＦＳ−１、ＦＳ−２および／またはＦＳ−３から単離することができる少なくとも１つのノミ唾液タンパク質の少なくとも一部分を含有する。このように、治療用組成物として使用するための好ましい処方剤は、ＦＳ−１、ＦＳ−２、ＦＳ−３および／または配列番号５３、配列番号６２、配列番号６５、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７８および配列番号８７を含有するアミノ酸配列を有するタンパク質の１つ以上の少なくとも一部分を包含する。
別の態様において、治療用組成物は好適な賦形剤と結合した本発明の外部寄生生物産物を含有しうる。本発明の治療用組成物は、治療する動物が寛容化を起こしうる賦形剤中で処方されてもよい。好ましい賦形剤は、細胞が刺激され、免疫応答を開始または増大するように、動物のアレルギー応答に関与する細胞によって結合され得る形態に本発明の産物を維持することができる。このような賦形剤の例には、水、生理食塩液、リンゲル液、デキストロース液、ハンクス液および他の生理学的平衡塩水溶液が包含される。固定油、ゴマ油、オレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような非水溶性基剤を使用してもよい。他の有用な処方剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの増粘剤を含有する懸濁液を包含する。賦形剤は、等張性および化学的安定性を増大する物質のような添加剤の少量を含有してもよい。緩衝液の例には、リン酸緩衝液、炭酸水素緩衝液およびトリス緩衝液が包含され、保存剤の例にはチメロサール、ｍ−またはｏ−クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが包含される。標準的な処方剤は注射用液状物であっても、注射用の懸濁液または溶液として好適な液状物で服用させられ得る固形物であってもよい。従って、液状ではない処方剤では、賦形剤は投与前に水または生理食塩液を添加することができるデキストロース、ヒト血清アルブミン、保存剤等を含有していてもよい。
別の態様において、本発明の唾液産物の利点は、投与のためにアジュバントおよび／または担体を必要としないということであるが、本発明の治療用組成物は担体またはアジュバントを含有していてもよい。アジュバントは、典型的には、特異抗原に対する動物の免疫応答を一般に増大する物質である。好適なアジュバントには、サイトカイン、ケモカインおよびサイトカインおよびケモカインの産生を誘導する化合物（例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子［ＧＭ−ＣＳＦ］、マクロファージコロニー刺激因子［Ｍ−ＣＳＦ］、顆粒球コロニー刺激因子［Ｇ−ＣＳＦ］、コロニー刺激因子［ＣＳＦ］、エリスロポイエチン［ＥＰＯ］、インターロイキン−２［ＩＬ−２］、インターロイキン−３［ＩＬ−３］、インターロイキン−５［ＩＬ−５］、インターロイキン−６［ＩＬ−６］、インターロイキン−７［ＩＬ−７］、インターロイキン−８［ＩＬ−８］、インターロイキン−１０［ＩＬ−１０］、インターロイキン−１２［ＩＬ−１２］、γ−インターフェロン［ＩＦＮ−γ］、γ−インターフェロン誘導因子［ＩＧＩＦ］、βトランスフォーミング成長因子、ＲＡＮＴＥＳ［活性化の結果調節されて、発現され、おそらく分泌される正常なＴ細胞］、マクロファージ炎症性タンパク質［例えば、ＭＩＰＩαおよびＭＩＰＩβ］、およびリーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）伸長開始因子［ＬｅＩＦ］；細菌成分（例えば、内毒素、特に超抗原、外毒素および細胞壁成分）；アルミニウムをベースとした塩；カルシウムをベースとした塩；シリカ；ポリヌクレオチド；トキソイド；血清タンパク質、ウィルス外殻タンパク質；ブロックコポリマーアジュバント（例えば、ハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）のタイターマックス（Ｔｉｔｅｒｍａｘ）TMアジュバント［バクセル（Ｖａｘｃｅｌ）TM、ジョージア州のノルクロス社（Ｉｎｃ．Ｎｏｒｃｒｏｓｓ）］、リビ（Ｒｉｂｉ）アジュバント［モンタナ州ハミルトンのリビイムノケムリサーチ社（Ｒｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｎｃ．）］；並びにサポニンおよびそれらの誘導体（例えば、クィルＡ（ＱｕｉｌＡ）［デンマークのスーパーフォスバイオセクター社（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ  Ａ／Ｓ）］が包含されるが、これらに限定されない。本発明のタンパク質アジュバントは、本明細書に記載する方法を使用してタンパク質またはこのようなタンハク質をコードする核酸分子の形態で搬送され得る。
担体は、一般に治療する動物中で治療用組成物の半減期を延長する化合物である。好適な担体には、ポリマー放出制御処方剤、生分解性埋込物、リポソーム、細菌、ウィルス、油、エステルおよびグリコールが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書の一態様は、本発明の治療用組成物を動物の血流に徐々に放出することができる放出制御処方剤である。好適な放出制御処方剤には、生体適合性（生分解性を含む）ポリマー、他のポリマーマトリックス、カプセル、マイクロカプセル、微粒子、ボーラス製剤、浸透圧ポンプ、拡散装置、リポソーム、脂質球、および経皮搬送システムが含まれるが、これらに限定されない。本発明の他の放出制御処方剤は、動物に投与すると、in situで、固体またはゲルを形成する液状物を包含する。
本発明はまた、組換えウィルス粒子治療用組成物を包含する。このような組成物は、ウィルスの外殻にパッケージングされ、投与後に動物内で発現されうる本発明の組換え分子を包含する。好ましくは、組換え分子はパッケージング欠損である。αウィルス、ポックスウィルス、アデノウィルス、ヘルペスウィルス、およびレトロウィルス（これらに限定されない。）を包含するが、これらに限定されない多数の組換えウィルスを使用することができる。好ましい組換えウィルス粒子は、αウィルス（シンドビスウィルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）など）、ヘルペスウィルスおよびポックスウィルス系のものである。組換えウィルス粒子ワクチンを製造する方法とそれを使用する方法は、発明の名称「組換えウィルス粒子ワクチン（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ）」で、１９９３年２月８日に出願された、米国特許出願番号第０８／０１５／４１４号、１９９３年１１月３０日に公布された、Ｅｓｐｏｓｉｔｅらによる米国特許第５，２６６，３１３号および発明の名称「組換えイヌヘルペスウィルス（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）で、１９９６年１月１５日に出願されたＨａａｎｅｓらの米国特許出願番号第０８／６０２，０１０号に開示されている。この節に参照されているこの特許および特許出願の各々は参照文献として本明細書に全体が組み入れられている。
本発明の組換えウィルス粒子治療用組成物を動物に投与すると、免疫された動物内の細胞に感染し、外部寄生生物に咬まれることによるアレルギー性皮膚炎から動物を保護することができる保護タンパク質またはＲＮＡ核酸分子を産生させる。例えば、本発明の１つ以上の外部寄生生物唾液タンパク質をコードする核酸分子を含む組換えウィルス粒子を、外部寄生生物唾液アレルゲンに対して動物が寛容性を生ずるプロトコールに従って投与する。
一態様によると、本発明の核酸分子は、裸の（すなわち、ウィルス外殻または細胞膜にパッケージングされない）核酸ワクチン（例えば、Ｗｏｌｆｆら、１９９０年、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４７、１４６５−１４６８ページに教示されるような裸のＤＮＡまたはＲＮＡ分子のような）として動物に搬送されることができる。本発明の裸の核酸ワクチンは本発明の核酸分子を含み、好ましくは複製能を有するか、または増殖能を有する本発明の組換え分子を好ましくは含む。本発明の裸の核酸ワクチンは、例えばジシストロン組換え分子の形態の、本発明の１つ以上の核酸分子を含有する。好ましい裸の拡散ワクチンには、ウィルスゲノムの少なくとも一部分を包含する（すなわち、ウィルスベクター）。好ましいウィルスベクターには、αウィルス、ポックスウィルス、アデノウィルス、ヘルペスウィルスおよびレトロウィルス系のウィルスが含有され、αウィルス（シンドビスウィルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）またはセムリキウィルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ  ｖｉｒｕｓ）など）、種特異的ヘルペスウィルスおよび種特異的ポックスウィルスが特に好ましい。タンパク質の産生に好適であると開示されるものを含む任意の好適な転写調節配列を使用してもよい。特に好ましい転写調節配列には、サイトメガロウィルス中間初期（好ましくはイントロン−Ａと合わせて）、ラウス肉腫（Ｒｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ）ロングターミナルリピートおよび組織特異的転写調節配列、並びにウィルスベクターが使用される場合には、ウィルスベクターに内在する転写調節配列が包含される。「強い」ポリ（Ａ）配列の組み入れも好ましい。
本発明の裸の核酸ワクチンは種々の方法で投与されてもよく、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経皮投与、鼻腔内投与および経口投与が好ましい。一態様の例は１９９５年３月２日に公開された、国際公開公報第９５／０５８５３号に開示されている。裸の核酸ワクチンの好ましい１回投与量は、当業者により決定され得るように、投与経路および／または搬送方法に依存して約１ナノグラム（ｎｇ）乃至約１００μｇの範囲である。好適な搬送方法には、例えば注射、点滴剤、噴霧剤、経口および／または局所適用を含む。本発明の裸のＤＮＡは水性賦形剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩液）単独または担体（例えば、脂質をベースとした基剤）に含有されてもよい。
本発明の治療用組成物は、タンパク質を分解させない従来の方法（例えば、ろ過）によって滅菌されても、および／または凍結乾燥されてもよい。
本発明の治療用組成物は、本明細書に記載される外部寄生生物の侵襲を生じやすいいかなる動物に投与されてもよい。本発明の治療用組成物を効果的な方法で投与するための許容できるプロトコールは、個々の投与サイズ、投与数、投与頻度および投与方法に応じて変更することができる。このようなプロトコールの決定は当業者によって実行されてもよい。効果的な投与量は外部寄生生物唾液アレルゲンに対する過敏性から動物を治療することができる投与量をいう。効果的な投与量は、例えば使用する治療用組成物、組成物が誘導された節足動物および受容動物のサイズと種類に応じて変更することができる。外部寄生生物唾液アレルゲンに対して動物を免疫調節する効果的な投与量は、外部寄生生物唾液アレルゲンに対する動物の過敏性応答を軽減することができる期間にわたって投与される投与量を包含する。例えば、第１の寛容用量は、過敏症動物に投与されたとき、最小過敏性応答を生じる本発明の治療用組成物の量を含有していてもよい。第２の寛容用量は第１の用量より多い量の同治療用組成物を含有していてもよい。有効寛容用量は、動物が外部寄生生物に咬まれることによる過敏性応答を生じないように、動物を寛容するために必要な治療用組成物の漸増濃度を含有していてもよい。動物を脱感作する効果的な用量は、外部寄生生物に咬まれることに対する過敏性応答から動物を遮断するほどの濃度の本発明の治療用組成物を含有していてもよい。効果的な脱感作用量は、過敏症動物に投与されたとき、最小の過敏性応答を生じる濃度の治療用組成物を含有する反復投与を含有していてもよい。
好適な１回量は、好適な期間にわたって１回以上投与されたとき、外部寄生生物唾液アレルゲンに対する過敏性から動物を治療することができる用量である。例えば、外部寄生生物唾液産物またはミメトープ治療用組成物の好ましい１回量は、約０．５ｎｇ乃至約１ｇの治療用組成物／動物の体重キログラムである。治療用組成物によるさらなる治療が、最初の投与の約１時間乃至１年後に投与されてもよい。治療用組成物によるさらなる治療は、好ましくは、動物が外部寄生生物に対する過敏性応答から保護されないときに投与される。特定の投与量および投与計画は、上記に考察したパラメーターに基づいて、当業者によって開発されてもよい。投与の様式には、皮下経路、皮内経路、静脈内経路、鼻腔経路、経口経路、経皮経路および筋肉内経路が包含されうるが、これらに限定されない。
本発明の治療用組成物は外部寄生生物に咬まれることに対する動物の過敏性を調節することができる他の化合物と合わせて使用され得る。例えば、動物は、過敏性応答に関与する細胞の機能を調節することができる化合物、全身的薬剤または抗炎症剤（例えば、抗ヒスタミン剤、抗ステロイド剤、抗炎症剤およびＩｇＥからＩｇＧへ免疫グロブリンの重鎖のクラススイッチを駆動する薬剤）のようなアレルギー反応を低下する化合物で治療され得る。過敏性応答に関与する細胞の機能を調節するために有用な好適な化合物には、抗ヒスタミン剤、クロモリンナトリウム、テオフィリン、シクロスポリンＡ、アドレナリン、コルチゾン、細胞のシグナル伝達を調節することができる化合物、アデノシン３’，５’−サイクリックホスフェート（ｃＡＭＰ）活性を調節することができる化合物、およびＩｇＥもしくはＩｇＥ特異的Ｆｃ受容体由来のペプチド、ＩｇＥもしくはＩｇＥ特異的Ｆｃ受容体由来のペプチドに特異的な抗体、またはＩｇＥとＦｃ受容体との結合を遮断することができる抗体（これらに限定されない。）のようなＩｇＥを遮断する化合物が包含される。
本発明の別の側面は、本発明の処方剤を使用して、アレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物またはアレルギー性皮膚炎である動物に対する治療を処方するための方法を包含する。ノミアレルギー性皮膚炎の治療を処方するための好ましい方法は、例えば：（１）本発明の少なくとも１つのノミ唾液抗原またはそのミメトープを含有する処方剤の有効量を動物の１つの部位に皮内注射することと（好適で、好ましい処方剤は本明細書に開示されている）；（２）対照溶液の有効量を動物の第２の部位に皮内注射することと；（３）処方剤の注射によって生じる膨疹のサイズと、対照溶液の注射によって生じる膨疹のサイズとを測定して、比較することによって、動物がノミアレルギー性皮膚炎であるかどうかを評価することと；および（４）ノミアレルギー性皮膚炎の治療を処方することとを具備する。
ノミアレルギー性皮膚炎の治療を処方するための別の好ましい方法は：（１）治療する予定の動物から得た体液試料の第１の部分と、少なくとも１つのノミ唾液抗原またはそのミメトープを含有する処方剤の有効量とを接触させて（好適で、好ましい処方剤は本明細書に開示されている）、第１の免疫複合体溶液を形成することと；（２）陽性対照抗体を接触させて、第２の免疫複合体溶液を形成することと；（３）第１および第２の免疫複合体溶液中の免疫複合体形成量を測定して比較することと；および（４）ノミアレルギー性皮膚炎の治療を処方することとを具備する。本明細書に開示される外部寄生生物唾液産物処方剤を使用して、他の外部寄生生物によって生じるアレルギーの治療を処方するために同様の方法が使用されてもよいことは注目されるべきである。
本発明の別の態様は、本発明の処方剤を使用して、アレルギー性皮膚炎に罹患しやすい動物またはアレルギー性皮膚炎である動物を監視するための方法を含む。本発明のインビボおよびインビトロ試験を使用して、アレルギー性皮膚炎の任意の治療前後に、アレルギー性皮膚炎について動物を試験することができる。ノミアレルギー性皮膚炎の治療を監視する好ましい方法（他の外部寄生生物アレルギーの治療を監視するように適合されてもよい）は：（１）少なくとも１つのノミ唾液タンパク質またはそのミメトープを含有する処方剤の有効量を動物の１つの部位に皮内注射することと（好適で、好ましい処方剤は本明細書に開示されている）；（２）動物の第２の部位に対照溶液の有効量を皮内注射することと；および（３）処方剤の注射によって生じる膨疹のサイズと対照溶液の注射によって生じる膨疹のサイズとを測定して比較することによって、動物がノミ唾液抗原に脱感作されているかどうかを決定することとを具備する。
ノミアレルギー性皮膚炎の治療を監視するための別の好ましい方法（他の外部寄生生物アレルギーの治療を監視するように適合されてもよい）は：（１）少なくとも１つのノミ唾液タンパク質またはそのミメトープを含有する処方剤の有効量を治療する予定の動物から得た体液試料の第１の部分と接触させて（好適で、好ましい処方剤は本明細書に開示されている）、第１の免疫複合体溶液を形成することと；（２）陽性対照抗体を接触させて、第２の免疫複合体溶液を形成することと；（３）第１および第２の免疫複合体溶液中の免疫複合体形成量を測定して比較するすることによって、動物がノミ唾液抗原に対して脱感作されているかどうかを決定することとを具備する。
本発明はまた、外部寄生生物唾液タンパク質またはそのミメトープと選択的に結合することができる抗体を包含する。このような抗体は本明細書において抗外部寄生生物唾液タンパク質抗体と呼ばれる。本明細書に使用される「選択的に結合する」は、このような抗体が外部寄生生物唾液タンパク質およびそのミメトープと優先的に結合する能力をいう。特に、本発明はノミ唾液タンパク質と選択的に結合することができる抗体を包含する。結合は、免疫ブロットアッセイ、免疫沈降アッセイ、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、免疫蛍光抗体アッセイおよび免疫電子顕微鏡を含む当業者に周知の種々の方法を使用して測定され得る；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記文献参照。
本発明の抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。本発明の抗体は、抗体を得るために使用したタンパク質のエピトープまたはミメトープの少なくとも１つと選択的に結合することができる、１本鎖抗体を含めた抗体断片および遺伝的に工作された抗体のような機能的等価体を包含する。好ましくは、本発明の抗体は、本発明のノミ唾液産物に対する、約１０3Ｍ-1乃至約１０12Ｍ-1の単一部位結合親和性を有する。
本発明の抗体を産生するための好ましい方法は、外部寄生生物唾液タンパク質またはそのミメトープの有効量を動物に投与して抗体を産生することと、抗体を回収することとを具備する。規定されたタンパク質またはミメトープに対して生じる抗体は、治療用組成物に使用された場合に、診断アッセイの妨害または副作用を生じる可能性のある他の物質に対する抗体で実質的に汚染されていないので、このような抗体は有利となりうる。
本発明の抗体は、本発明の範囲内である種々の可能性のある用途を有する。例えば、このような抗体は、（ａ）アレルギー性皮膚炎から動物を保護するために、動物を受動的に免疫するワクチンとして、（ｂ）試験キットの陽性対照として、および／または（ｃ）タンパク質と他の不純物の混合物から望ましい外部寄生生物唾液タンパク質を回収する手段として使用され得る。
以下の実施例は例示目的のために提供されており、本発明の範囲を限定する意図のものではない。
実施例
この実施例は、当業者に公知であると考えられる多数の生物学、微生物学、免疫学および生化学的技法を包含することが注目されるべきである。このような技法の開示は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、上記文献、Ｂｏｒｏｖｓｋｙ、Ａｒｃｈ．Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ａｎｄ  Ｐｈｙｓ．、７：１８７−２１０、１９８８年および関連する文献に見出すことができる。１９９６年４月１８日に公開された、関連出願の国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例１乃至１６およびそこに引用される配列番号は本明細書の参照文献として全体が本明細書に組み入れられている。
実施例  １
この実施例はＦＳ−１抽出物由来の別の単離唾液タンパク質およびＤＥ−８１フィルターから溶出された追加の単離唾液タンパク質のアミノ酸配列解析について記載する。
ＦＳ−１ノミ唾液抽出物およびＤＥ−８１フィルターから溶出されたノミ唾液産物を、関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例２に記載する技法を使用して採取した。標準的な精製技法（例えば、Ｃ４逆相クロマトグラフィー；ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動およびブロッティング；および／またはフロースルー電気泳動）を使用して、ピークＭからいくつかのタンパク質を単離し、関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例４に記載するように部分アミノ酸配列を決定した。部分的なＮ−末端アミノ酸配列決定は、ピークＭがｆｄｐＪ、ｆｓｐＬおよびｆｓｐＮタンパク質（関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例４に記載するように）並びにｆｓｐＭ（Ｇ）、ｆｓｐＭ（Ｈ）、ｆｓｐＭ（Ｉ）、ｆｓｐＭ（Ｊ）、ｆｓｐＭ（Ｋ）、ｆｓｐＭ（Ｌ）およびｆｓｐＭ（Ｍ）を含有することを示した。分子量約３７ｋＤを有するノミ唾液タンパク質ｆｓｐＭ（Ｇ）は、配列番号１で示される、ＭＲＧＮＨＶＦＬＥＤＧＭＡＤＭＴＧＧＱＱＭＧＲＤＬＹのＮ−末端部分アミノ酸配列を有した。分子量約３４ｋＤを有するノミ唾液タンパク質ｆｓｐＭ（Ｈ）は、配列番号２で示される、ＫＹＲＮ（Ｙ／Ｄ）ＸＴＮＤＰＱＹのＮ−末端部分アミノ酸配列を有した。約１０ｋＤの分子量を有するノミ唾液タンパク質ｆｓｐＭ（Ｉ）は、配列番号３で示されるＥＩＫＲＮＤＲＥＰＧＮＬＳＫＩＲＴＶＭＤＫＶＩＫＱＴＱのＮ−末端部分アミノ酸配列を有した。分子量約２５ｋＤを有するノミ唾液タンパク質ｆｓｐＭ（Ｊ）は、配列番号４で示される、ＬＫＤＮＤＩＹ（Ａ／Ｈ）（Ａ／Ｈ）ＲＤＩＮＥＩＬＲＶＬＤＰＳＫのＮ−末端部分アミノ酸配列を有した。分子量約３０ｋＤを有するノミ唾液タンパク質ｆｓｐＭ（Ｋ）は、配列番号５で示される、ＮＹＧＲＶＱＩＥＤＹＴＸＳＮＨＫＤＸＥＥＫＤＱＩＮＧＬのＮ−末端部分アミノ酸配列を有した。分子量約３７ｋＤを有するノミ唾液タンパク質ｆｓｐＭ（Ｌ）は、配列番号６で示される、ＫＹＲＮＸＹＴＮＤＰＱＬＫＬＬＤＥＧのＮ−末端部分アミノ酸配列を有した。ノミ唾液タンパク質ｆｓｐＭ（Ｍ）をピークＭから回収し、関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例４に開示されるようにアミノ酸配列解析が実施された。分子量約３１ｋＤを有するノミ唾液タンパク質ｆｓｐ（Ｍ）は、配列番号７で示される、ＹＦＮＤＱＩＫＳＶＭＥＰＸＶＦＫＹＰＸＡＸＬのＮ−末端部分アミノ酸配列を有した。ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）の相同性調査は、既知のアミノ酸配列とｆｓｐＭ（Ｇ）、ｆｓｐＭ（Ｈ）、ｆｓｐＭ（Ｉ）、ｆｓｐＭ（Ｊ）、ｆｓｐＭ（Ｋ）、ｆｓｐＭ（Ｌ）およびｆｓｐＭ（Ｍ）について決定されたものとの間には十分な相同性はないことを明らかにした。
実施例  ２
この実施例は、ｆｓｐＧノミ唾液タンパク質の少なくとも一部分をコードする核酸分子の単離について記載する。この実施例はまた、細菌によるｆｓｐＧタンパク質の発現について記載する。
Ａ．  ｆｓｐＧ４核酸分子の単離
ｆｓｐＧ２の部分的Ｎ−末端アミノ酸配列（すなわち、関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の配列番号２９）を使用して、配列番号８で示される核酸配列５’ＴＧＲ  ＴＴＴ  ＣＣＷ  ＡＴＲ  ＡＡＲ  ＴＣＴ  ＴＣ  ３’を有する縮退アンチセンスプライマーＧ２−２を合成した。プライマーＧ２−２をＭ１３逆方向プライマー（関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例７に記載する配列番号４０）を組み合わせて使用して、標準的な方法を使用して、関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例６Ａにおいて先に説明したような唾液腺ｃＤＮＡ発現ライブラリーのｆｓｐＧ４遺伝子の５’−末端部分をＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物は、１％アガロースゲル上で可視化したとき、約２２５−ｂｐであった。２２５−ｂｐ  ＰＣＲ断片のヌクレオチド配列が得られ、ｎｆｓｐＧ４225と命名され、配列番号９と表される。
ｎｆｓｐＧ４225の核酸配列を使用して、配列番号１０で示される核酸配列５’ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＧＣＡ  ＣＧＡ  ＧＴＧ  ３’を有するセンスプライマーＧ５を合成した。プライマーＧ５をＭ１３ユニバーサルプライマー（関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例６に記載される配列番号１９）と組み合わせて使用して、上記のように、関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例６Ａにおいて先に説明した唾液腺ｃＤＮＡ発現ライブラリーのｆｓｐＧ４遺伝子の３’−末端部分をＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物は、ｎｆｓｐＧ４610と示され、１％アガロースゲル上で可視化したとき、約６１０−ｂｐであった。６１０−ｂｐ  ＰＣＲ断片のヌクレオチド配列が得られ、その５６５個のヌクレオチドは配列番号１１と表される。核酸配列配列番号１１を含む核酸分子は本明細書においてｎｆｓｐＧ４565と呼ばれる。配列番号１１の翻訳は、核酸分子ｎｆｓｐＧ４565は本明細書においてＰｆｓｐＧ４90と呼ばれる約９０個のアミノ酸の全長のｆｓｐＧ部分をコードすることを示唆し、配列番号１１のほぼヌクレオチド４５乃至ほぼヌクレオチド４７の範囲にある開始コドンと、ほぼヌクレオチド３１５乃至ほぼヌクレオチド３１７の範囲にある停止コドンとを有する読み取り枠と推定される。停止コドンを除いたこの読み取り枠は、本明細書において配列番号１３で表される、本発明の核酸分子ｎｆｓｐＧ４270を包含する。ＰｆｓｐＧ４90は本明細書において配列番号１２と示される。配列番号１２の残基２０〜４２は、配列番号１２の残基３７がリジンではなくグルタミン酸である以外は、関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の配列番号２９（ｆｓｐＧ２のＮ−末端部分的アミノ酸配列）と同じであると思われる。また、配列番号１２の残基３８〜５７は、関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の配列番号３０（ｆｓｐＧ３のＮ−末端部分的アミノ酸配列）と同じであると思われる。このような類似性はノミ唾液のｆｓｐＧタンパク質のファミリーの可能性を裏付ける。
配列番号１１の解析は、この配列は、アミノ酸約１９個のリーダーセグメントとそれに次ぐ、成熟タンパク質とを包含することを示唆する。リーダー配列はみかけ上切断されて、ＰｆｓｐＧ４71と呼ばれ、配列番号１２で示される成熟タンパク質を形成する。ＰｆｓｐＧ４71は、計算分子量が７５３６ダルトンで、計算ＰＩが約９．０である。ＰｆｓｐＧ４90は、計算分子量が９６５７ダルトンで、計算ＰＩが約９．２６である。ジーンバンクの相同性調査は、配列番号１１または配列番号１２と既知の核酸配列または既知のアミノ酸配列との間には、それぞれ十分な相同性はないことを示した。
Ｂ．  発現
ｎｆｓｐＧ４の約２１６−ｂｐのＤＮＡ断片を、核酸分子ｎｆｓｐＧ４から、プライマーＧ７、配列番号１５（太字のＢａｍＨＩ部位）と示される核酸配列５’ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＧＴＣ  ＡＡＡ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＴＧ  ３’を有するセンスプライマーおよびプライマーＧ８、配列番号１６で示される、核酸配列５’ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＧＧＴ  ＴＡＴ  ＴＣＧ  ＣＡＡ  ＴＡＡ  ＣＡＧ  Ｔ  ３’（太字のＥｃｏＲＩ部位）を有するアンチセンスプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。ｎｆｓｐＧ４216で示される、ＰＣＲ産物、約２１６個のヌクレオチドの断片をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化して、ゲルで精製し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩですでに消化してある発現ベクターＰＲ／Ｔ2ｏｒｉ／Ｓ１０ＨＩＳ−ＲＳＥＴ−Ａ９（関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例１６に記載するように）にサブクローニングして、組換え分子ｐＨｉｓ−ｎｆｓｐＧ４216を産生した。
組換え分子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換して、組換え細胞Ｅ．ｃｏｌｉ：ｐＨｉｓ−ｎｆｓｐＧ４216を形成した。この組換え細胞を培養し、関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例１１Ａに記載するように、融合タンパク質ＰＨＩＳ−ｆｓｐＧ４72を産生するように誘導した。関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例１１Ａに記載するように、Ｔ７  Ｔａｇモノクローナル抗体を使用して免疫ブロット分析によって組換え融合タンパク質を検出した。
実施例  ３
この実施例は、ノミ唾液タンパク質ｆｓｐＭ（Ａ）、ｆｓｐＭ（Ｂ）、ｆｓｐＭ（Ｃ）、ｆｓｐＭ（Ｄ）、ｆｓｐＭ（Ｅ）およびｆｓｐＭ（Ｆ）の少なくとも一部分をコードする核酸配列の単離について記載する。
Ａ．  ｎｆｓｐＭ（Ａ）897およびｎｆｓｐＭ（Ｂ）2706
ノミ唾液腺ｃＤＮＡライブラリー（関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例６に記載するように調製される）を、関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例８に記載するノミ唾液抽出物のＨＰＬＣ分離のピークＭ２のタンパク質で免疫したウサギから採取した抗血清で免疫スクリーニングした。免疫スクリーニングを、関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例１２に記載するように実施した。
ｎｆｓｐＭ（Ａ）897と命名するｎｆｓｐＭ核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号１７と示す。配列番号１７の翻訳は、核酸分子ｎｆｓｐＭ（Ａ）897は、本明細書においてＰｆｓｐＭ（Ａ）157と呼ばれる約１５７個のアミノ酸の全長のｆｓｐＭ部分をコードすることを示唆し、配列番号１７のほぼヌクレオチド９７乃至ほぼヌクレオチド９９の開始コドンと配列番号１７のほぼヌクレオチド５６８乃至ほぼヌクレオチド５７０の停止コドンとを有する読み取り枠と推定される。停止コドンを除いたこの読み取り枠は、本明細書において配列番号１９で表される、本発明の核酸分子ｎｆｓｐＭ（Ａ）471を含有する。ＰｆｓｐＭ（Ａ）157のアミノ酸配列は配列番号１８と示される。ＰｆｓｐＭ（Ａ）157は、計算分子量が１８，２９１．６８ダルトンで、計算ＰＩが約１０．３である。ジーンバンクの相同性調査は、配列番号１７または配列番号１８と既知の核酸配列または既知のアミノ酸配列との間には、それぞれ十分な相同性はないことを示した。
ｎｆｓｐＭ（Ｂ）2706と命名する別のｎｆｓｐＭ核酸分子のヌクレオチド配列を配列番号２０と示す。配列番号２０の翻訳は、核酸分子ｎｆｓｐＭ（Ｂ）2706は、本明細書においてＰｆｓｐＭ（Ｂ）900と呼ばれる約９００個のアミノ酸の全長のｆｓｐＭ部分をコードすることを示唆し、配列番号２０のほぼヌクレオチド５乃至ほぼヌクレオチド７の開始コドンを有する読み取り枠と推定される。ＰｆｓｐＭ（Ｂ）900のアミノ酸配列は配列番号２１と示される。ＰｆｓｐＭ（Ｂ）900は、計算分子量が１０４，６４７ダルトンで、計算ＰＩが約５．８である。
それぞれｎｆｓｐＭ（Ｂ）2706核酸分子およびＰｆｓｐＭ（Ｂ）900タンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列を、ジーンバンクの相同性調査を使用して、既知の核酸配列およびアミノ酸配列と比較した。配列番号２１はＲｈｏＡ−結合αキナーゼ（ＲＯＫ）のアミノ酸配列と類似していることが見出された。配列番号２１とＲＯＫアミノ酸配列との連続類似部の最も高度に保存された領域は、配列番号２１のアミノ酸ほぼ３２乃至アミノ酸ほぼ３５１とＲＯＫのアミノ酸ほぼ１乃至アミノ酸ほぼ９００の範囲で、この２つの領域間には約７５％の同一性がある。ＲＯＫキナーゼのほぼ３２６乃至ほぼ１２８５のアミノ酸をコードする核酸配列と、ｎｆｓｐＭ（Ｂ）2706のほぼ９８乃至ほぼ１０７５のヌクレオチドに及ぶ対応する領域を比較することにより、これらの領域は約７１％の同一性であることが示される。
Ｂ．ｎｆｓｐＭ（Ｃ）414およびｎｆｓｐＭ（Ｄ）273
ノミ唾液腺ｃＤＮＡライブラリー（関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例６に記載するように調製する）を関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例３に記載するノミ唾液抽出物のＨＰＬＣ分離のピークＭ１の部分で免疫したウサギから採取した抗血清で免疫スクリーニングした（すなわち、ｆｓｐＭ１タンパク質）。免疫スクリーニングを、関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例１２に記載するように実施した。
ｎｆｓｐＭ（Ｃ）414と命名するｎｆｓｐＭ核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号２２と示す。配列番号２２の翻訳は、核酸分子ｎｆｓｐＭ（Ｃ）414が、本明細書においてＰｆｓｐＭ（Ｃ）137と呼ばれる約１３７個のアミノ酸の全長でないｆｓｐＭ部分をコードすることを示唆し、配列番号２２のほぼヌクレオチド２乃至ほぼヌクレオチド４におよぶ第１の残基と推定される。ＰｆｓｐＭ（Ｃ）137のアミノ酸配列は配列番号２３と示される。ＰｆｓｐＭ（Ｃ）137は、計算分子量が１４，４５２ダルトンで、計算ＰＩが約２．８１である。ジーンバンクの相同性調査は、配列番号２２または配列番号２３と既知の核酸配列または既知のアミノ酸配列との間には、それぞれ十分な相同性はないことを示した。
ｎｆｓｐＭ（Ｄ）273と命名する別のｎｆｓｐＭ核酸分子のヌクレオチド配列を配列番号２４と示す。配列番号２４の翻訳は、核酸分子ｎｆｓｐＭ（Ｄ）273は、本明細書においてＰｆｓｐＭ（Ｄ）90と呼ばれる約９０個のアミノ酸の全長でないｆｓｐＭ部分をコードすることを示唆し、配列番号２４のほぼヌクレオチド３乃至ほぼヌクレオチド５におよぶ第１の残基と推定される。ＰｆｓｐＭ（Ｄ）90のアミノ酸配列は配列番号２５と示される。ＰｆｓｐＭ（Ｄ）90は、計算分子量が９，５０３ダルトンで、計算ＰＩが約３．０１である。配列番号２４および配列番号２５はそれぞれ配列番号２２および配列番号２３と実質的に類似していると思われ、ノミ唾液中のｆｓｐＭタンパク質ファミリーを示唆している。
Ｃ．ｎｆｓｐＭ（Ｅ）1704およびｎｆｓｐＭ（Ｆ）1758
ノミ唾液腺ｃＤＮＡライブラリー（関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例６に記載するように調製する）を関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例３に記載するノミ唾液抽出物のＨＰＬＣ分離のピークＭ２の部分で免疫したウサギから採取した抗血清で免疫スクリーニングした（すなわち、ｆｓｐＭ２タンパク質）。免疫スクリーニングを、関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例１２に記載するように実施した。
ｎｆｓｐＭ（Ｅ）1704と命名する別のｎｆｓｐＭ核酸分子のヌクレオチド配列は配列番号２６と示す。配列番号２６の翻訳は、核酸分子ｎｆｓｐＭ（Ｅ）1704は、本明細書においてＰｆｓｐＭ（Ｅ）461と呼ばれる約４６１個のアミノ酸の全長でのｆｓｐＭ部分をコードすることを示唆し、配列番号２６のほぼヌクレオチド２４乃至ほぼヌクレオチド２６の第１の残基と、配列番号２６のヌクレオチド１４０７乃至ヌクレオチド１４０９におよぶ停止コドンと推定される。停止コドンを除いたこの読み取り枠は本明細書において配列番号２８で示される、本発明の核酸分子ｎｆｓｐＭ（Ｅ）1383を含有する。ＰｆｓｐＭ（Ｅ）461のアミノ酸配列は配列番号２７と示される。ＰｆｓｐＭ（Ｅ）461は、計算分子量が５４，１３９ダルトンで、計算ＰＩが約７．００である。ジーンバンクの相同性調査は、配列番号２６または配列番号２８と既知の核酸配列または既知のアミノ酸配列との間には、それぞれ十分な相同性はないことを示した。
ｎｆｓｐＭ（Ｆ）1758と命名する別のｎｆｓｐＭ核酸分子のヌクレオチド配列を配列番号２９と示す。配列番号２９の翻訳は、核酸分子ｎｆｓｐＭ（Ｆ）1758は、本明細書においてＰｆｓｐＭ（Ｆ）586と呼ばれる約５８６個のアミノ酸の全長でないｆｓｐＭ部分をコードすることを示唆し、配列番号２９のほぼヌクレオチド１乃至ほぼヌクレオチド３におよぶ開始コドンと推定される。ＰｆｓｐＭ（Ｆ）586のアミノ酸配列は配列番号３０と示される。ＰｆｓｐＭ（Ｆ）586は、計算分子量が６６，５４７ダルトンで、計算ＰＩが約４．８０である。ジーンバンクの相同性調査は、それぞれ配列番号２９または配列番号３０と、既知の核酸配列または既知のアミノ酸配列との間には十分な相同性は示さなかった。
実施例４
この実施例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のｆｓｐＭタンパク質の発現について明らかにする。
ノミ唾液タンパク質ＰＨＩＳ−ＰｆｓｐＭ（Ｄ）90融合タンパク質を以下の方法で産生した。ｎｆｓｐＭ（Ｄ）305と呼ばれる約３０５−ｂｐのＤＮＡ断片をｎｆｓｐＭ（Ｄ）293（配列番号３１で示される）から単離し、ＢａｍＨ１およびＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼでｎｆｓｐＭ（Ｄ）含有プラスミドを消化することによって、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドにサブクローニングした。消化産物をゲルで精製し、ＢａｍＨ１およびＸｈｏＩで消化しておいた発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢにサブクローニングし、脱リン酸化した。ｐＨｉｓ−ｎｆｓｐＭ（Ｄ）305と呼ばれる、得られた組換え分子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１受容能力細胞（メリーランド州ゲイセルスブルグのギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ社製）にトランスホーメーションして、組換え細胞大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）：ｐＨｉｓ−ｎｆｓｐＭ（Ｄ）305を形成した。組換え細胞を培養し、関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例１１Ａに記載する条件を使用してｎｆｓｐＭ305の発現を誘導した。組換えＰＨｉｓ−ｎｆｓｐＭ（Ｄ）305融合タンパク質の融合部分に対するＴ７  ｔａｇモノクローナル抗体を使用した、組換え細胞大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）：ｐＨｉｓ−ｎｆｓｐＭ（Ｄ）305溶菌物の免疫ブロット分析は、適当なサイズ、すなわち約１５，８５１ｋＤタンパク質部分を同定した。
実施例  ５
この実施例はノミ唾液タンパク質ｆｓｐＮ（Ｃ）、ｆｓｐＮ（Ｄ）、ｆｓｐＮ（Ｅ）、ｆｓｐＮ（Ｆ）、ｆｓｐＮ（Ｇ）、ｆｓｐＮ（Ｈ）、ｆｓｐＮ（Ｉ）、ｆｓｐＮ（Ｋ）、ｆｓｐＮ（Ｌ）、ｆｓｐＮ（Ｍ）、ｆｓｐＮ（Ｎ）およびｆｓｐＮ（Ｏ）の少なくとも一部分をコードする核酸配列の単離について記載する。
Ａ．  ＩｇＥに富む抗血清の調製
人工的に感作したイヌＣＱＱ２（関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例８に記載されている）から血清を得た。約１０ｍｌの抗血清をプロテインＧ−セファロース（５ｍｌ）と４℃にて終夜インキュベーションした。
Ｂ．  ＩｇＥに富む抗血清を用いた免疫スクリーニング
約２．４ｍｌの大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＸＬ１  ブルー、Ｏ．Ｄ．６００＝０．５）を、ノミ唾液腺ＺＡＰ−ｃＤＮＡライブラリー（１．８×１０７ｐｆｕ／ｍｌ）のファージの６．４８×１０５ｐｆｕと、３７℃にて１５分間インキュベーションし、１２個のルリア−ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地寒天プレート（１５０ｍｍ）で培養した。この平板を３７℃にて終夜インキュベーションした。次いで、各平板にＩＰＴＧ（１０ｍＭ）処理ニトロセルロースフィルターを３７℃にて約４時間積層した。次いでフィルターを除去し、ＴＢＳＴ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％ツイーン−２０）で洗浄した。フィルターを５％乾燥ミルクのＴＢＳＴ溶液で室温にて２時間ブロックした。次いで異なるフィルターを先ずＩｇＥに富むＣＱＱ２抗血清またはイヌ糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａｉｍｍｉｔｉｓ）を感染させたイヌから得た抗血清とともに４℃にて終夜インキュベーションし、次いでモノクローナル抗イヌＩｇＥ抗体（Ｄ−９；ウィスコンシン州マジソンのウィスコンシン大学、獣医学教室のＤｒ．Ｄ．Ｊ．ＤｅＢｏｅｒの研究室より寄贈）とインキュベーションし、次いでワサビペルオキシダーゼ（ペンシルバニア州ウェストグローブのジャクソンイムノリザーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）社製）に接合させたロバ抗マウスＩｇＧ抗体と各段階で、室温にて２時間インキュベーションした。フィルターの全てをインキュベーションごとにＴＢＳＴ（３×１５分／洗浄）で洗浄した。次いでフィルターの全てをＴＢＳでの最後の洗浄で処理した。フィルターを１／１／０．１容量比の展開溶液（カークガード＆ペリーラボラトリーズ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）製のＴＢＳペルオキシダーゼ基質／ＴＢＳペルオキシダーゼ溶液／ＴＢＳ膜エンハンサー）に浸漬して、呈色反応を生ずることにより、免疫複合体のプラークを同定した。１８個のプラークを同定し、さらに上記と同じ免疫スクリーニング条件下にてプラークを精製した。
Ｃ．ｎｆｓｐＮ（Ｃ）335、ｎｆｓｐＮ（Ｄ）396、ｎｆｓｐＮ（Ｅ）285、ｎｆｓｐＮ（Ｆ）228、ｎｆｓｐＮ（Ｇ）339、ｎｆｓｐＮ（Ｇ）493
精製したクローンの１つのプラークを単離し、ＳＭファージ緩衝液（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、０．５８％ＮａＣｌ、０．２％ＭｇＣｌ2・７Ｈ2Ｏおよび０．０１％ゼラチン）中に保存した。エクスアシスト（ＥｘＡｓｓｉｓｔ）TM／エスオーエルアール（ＳＯＬＲ）TMシステム（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社）を使用して各陽性クローンからのＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔファージミドのインビボ除去を調製した。Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドをプラスミドミディキット（クイアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）社）によって精製し、ＮａＯＨ（０．４Ｎ）で３７℃にて１５分間変性した。変性したプラスミドをエタノールで沈殿し、核酸配列を得た。
ｎｆｓｐＮ（Ｃ）335と命名したｎｆｓｐＮ核酸分子のヌクレオチド配列を配列番号３２と示す。ジーンバンクの相同性調査は、配列番号３２とリボソームタンパク質Ｓ６との間に若干の類似性があることを示した。
ｎｆｓｐＮ（Ｄ）396と命名した別のｎｆｓｐＮ核酸分子のヌクレオチド配列を配列番号３３と示す。ジーンバンクの相同性調査は、配列番号３３とエリスロポイエチンとの間に若干の類似性があることを示した。
ｎｆｓｐＮ（Ｅ）285と命名した別のｎｆｓｐＮ核酸分子のヌクレオチド配列を配列番号３４と示す。ジーンバンクの相同性調査は、配列番号３４とグルタミン酸に富むタンパク質または熱ショックタンパク質ＨＳＰ８１との間に若干の類似性があることを示した。
ｎｆｓｐＮ（Ｆ）228と命名した別のｎｆｓｐＮ核酸分子のヌクレオチド配列を配列番号３５と示した。
本明細書においてｎｆｓｐＮ（Ｇ）と示される、別のｎｆｓｐＮ核酸分子の部分の核酸配列を得た。ｎｆｓｐＮ（Ｇ）339と命名したｎｆｓｐＮ（Ｇ）の５’部分を示す核酸分子を配列番号３６と示す。配列番号３６の翻訳は、核酸分子ｎｆｓｐＮ（Ｇ）339が、本明細書においてＰｆｓｐＮ（Ｇ）113と言われる約１１３個のアミノ酸の全長でないｆｓｐＮ（Ｇ）タンパク質をコードするすることを示し、配列番号３６のほぼヌクレオチド１乃至ほぼヌクレオチド３に及ぶ第１の残基と推定される。ＰｆｓｐＮ（Ｇ）113のアミノ酸配列は配列番号３７と示される。
ｎｆｓｐＮ（Ｇ）493と命名されるｎｆｓｐＮ（Ｇ）の３’部分を示す核酸分子を配列番号３８と示す。配列番号３８の翻訳は、核酸分子ｎｆｓｐＮ（Ｇ）493は、本明細書においてＰｆｓｐＮ（Ｇ）130と言われる約１３０個のアミノ酸の全長でないｆｓｐＮ（Ｇ）タンパク質をコードするすることを示し、配列番号３８のほぼヌクレオチド１乃至ほぼヌクレオチド３に及ぶ第１の残基と配列番号３８のほぼヌクレオチド３９１乃至ほぼヌクレオチド３９３に及ぶ停止コドンと推定される。ＰｆｓｐＮ（Ｇ）130のアミノ酸配列は配列番号３９と示される。ジーンバンクの相同性調査は、配列番号３６と配列番号３８とビテロゲニンとの間には若干の類似性があることを示した。
ｎｆｓｐＮ（Ｈ）306と命名される別のｎｆｓｐＮのヌクレオチド配列を配列番号４０と示す。
ｎｆｓｐＮ（Ｉ）490と命名される別のｎｆｓｐＮのヌクレオチド配列を配列番号４１と示す。
ｎｆｓｐＮ（Ｊ）616と命名される別のｎｆｓｐＮのヌクレオチド配列を配列番号４２と示す。
ｎｆｓｐＮ（Ｋ）475と命名される別のｎｆｓｐＮのヌクレオチド配列を配列番号４３と示す。
ｎｆｓｐＮ（Ｌ）295と命名される別のｎｆｓｐＮのヌクレオチド配列を配列番号４４と示す。
ｎｆｓｐＮ（Ｍ）372と命名される別のｎｆｓｐＮのヌクレオチド配列を配列番号４５と示す。
本明細書においてｎｆｓｐＮ（Ｎ）と示される別のｎｆｓｐＮ核酸分子の部分の核酸配列を得た。ｎｆｓｐＮ（Ｎ）252と命名されるｎｆｓｐＮ（Ｎ）の５’部分を示す核酸分子を配列番号４６と示す。ｎｆｓｐＮ（Ｎ）613と命名するｎｆｓｐＮ（Ｎ）の３’部分を示す核酸分子を配列番号４７と示す。
本明細書においてｎｆｓｐＮ（Ｏ）と示される別のｎｆｓｐＮ核酸分子の部分の核酸配列を得た。ｎｆｓｐＮ（Ｏ）538と命名されるｎｆｓｐＮ（Ｏ）の５’部分を示す核酸分子を配列番号４８と示す。配列番号４８の翻訳は、核酸分子ｎｆｓｐＮ（Ｏ）538は、本明細書においてＰｆｓｐＮ（Ｏ）178と言われる約１７８個のアミノ酸の全長でないｆｓｐＮ（Ｏ）タンパク質をコードするすることを示し、配列番号４８のほぼヌクレオチド１乃至ほぼヌクレオチド３に及ぶ第１の残基と推定される。ＰｆｓｐＮ（Ｎ）178のアミノ酸配列は配列番号４９と示さす。
ｎｆｓｐＮ（Ｏ）432と命名されるｎｆｓｐＮ（Ｏ）の３’部分を示す核酸分子を配列番号５０と示される。配列番号５０の翻訳は、核酸分子ｎｆｓｐＮ（Ｏ）432は、本明細書においてＰｆｓｐＮ（Ｏ）129と言われる約１２９個のアミノ酸の全長でないｆｓｐＮ（Ｏ）タンパク質をコードするすることを示し、配列番号５０のほぼヌクレオチド１乃至ほぼヌクレオチド３に及ぶ第１の残基と配列番号５０のほぼヌクレオチド３８８乃至ほぼヌクレオチド３９０に及ぶ停止コドンと推定される。ＰｆｓｐＮ（Ｎ）129のアミノ酸配列は配列番号５１と示される。
実施例  ６
この実施例は、ＣＱＱ２乃至ｆｓｐＮのＩｇＥに富む抗血清の特異性を確認する研究について記載する。
３つの別のペトリ皿（１００ｍｍ）に、プレートあたり３００マイクロリッターの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＸＬ１ブルー、Ｏ．Ｄ．６００＝５００）を重層した。１８個の単離ファージクローンの各々の１滴（約１００ｐｆｕ／滴）を各プレートに滴下した（１８ファージクローン／プレート）。上記の実施例５に記載した方法を使用して、プレートをインキュベーションし、フィルターを持ち上げ、このフィルターを、ＣＱＱ２のＩｇＥに富む抗血清、イヌ糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ）を感染させたイヌの抗血清およびピークＮのノミ唾液産物を注射したウサギの抗血清を用いて免疫スクリーニングを行った（関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例３に記載するように）。
実験結果は、ＩｇＥに富むＣＱＱ抗血清およびピークＮ特異的ノミ唾液産物に特異的な抗血清ともに、イヌ糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ  ｉｍｍｉｔｉｓ）を感染させたイヌの抗血清よりかなり良好に精製したファージクローン産物と結合することを示す。
実施例  ７
この実施例は、ｆｓｐＧノミ唾液タンパク質をコードする核酸分子の単離について記載する。この実施例はまた、細菌によるｆｓｐＧタンパク質の発現について記載する。
ｎｆｓｐＧ４610のヌクレオチドを含有する32Ｐで標識したＤＮＡプローブ（実施例２に記載するような）を使用して、標準的なハイブリダイゼーション技法を使用することにより、ノミ唾液腺ｃＤＮＡライブラリー（関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例６に記載するように）をスクリーニングした。本明細書に配列番号５２と示されるコード鎖の核酸配列を有するｎｆｓｐＧ５595と本明細書で参照される約５９５個のヌクレオチド挿入物を有するクローンを単離した。配列番号５２の翻訳は、核酸分子ｎｆｓｐＧ５595は、アミノ酸配列配列番号５３を有する、本明細書においてＰｆｓｐＧ５90と参照される約９０個のアミノ酸の全長のノミ唾液タンパク質をコードすることを示し、配列番号５３のほぼヌクレオチド４６乃至ほぼヌクレオチド４８に及ぶ開始コドンと配列番号５２のほぼヌクレオチド３１６乃至ほぼヌクレオチド３１８に及ぶ停止コドンと推定される。配列番号５２の相補鎖は本明細書において配列番号５４と表される。ＰｆｓｐＧ５90をコードするコード領域は、配列番号５５で表される核酸配列を有するコード鎖と核酸配列配列番号５７を有する相補鎖を有する核酸分子ｎｆｓｐＧ５270で表される。ＰｆｓｐＧ５90のアミノ酸配列（すなわち、配列番号５３）は、ＰｆｓｐＧ５90が、推定分子量約９．６ｋＤで、推定ｐＩ約９．２８を有すると予測された。
配列番号５３の解析は、ほぼアミノ酸１乃至ほぼアミノ酸１９まで及ぶアミノ酸の伸長によってコードされるシグナルペプチドの存在を示唆する。ＰｆｓｐＧ５71として本明細書に示される提案された成熟タンパク質は、配列番号５９と本明細書において表される約７１個のアミノ酸を含む。配列番号５８の相補鎖は配列番号６０で表される。アミノ酸配列ＰｆｓｐＧ５71（すなわち、配列番号５９）は、ＰｆｓｐＧ５71が推定分子量約７．４８ｋＤで、推定ｐＩ約８．２８であると予測する。
アミノ酸配列は５３とジーンバンクに報告されているアミノ酸配列と比較すると、配列番号５３は最も高い相同性、すなわち配列番号５３とネコノミ（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｆｅｌｉｓ）ノミ唾液タンパク質ＦＳ−Ｈ前駆体（ジーンバンク寄託番号第Ｕ６３５４４）との間の同一性が約３８％であることが示される。核酸配列配列番号５２とジーンバンクに報告されている核酸配列とを比較すると、配列番号５２は最も高い相同性、すなわち配列番号５２とネコノミ（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｆｅｌｉｓ）ノミ唾液タンパク質ＦＳ−Ｈ前駆体（ジーンバンク寄託番号第Ｕ６３５４４）との間の同一性が約６３％であることが示される。
ノミ唾液タンパク質ＰｆｓｐＧ５71は、以下の方法で産生された。本明細書においてｎｆｓｐＧ５213と参照される約２１３ｂｐの核酸分子（みかけ上成熟したノミ唾液タンパク質をコードするするように設計されている）を、ヌクレオチド配列５’Ａ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＣＣＧ  ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  Ｇ−３’を有するセンスプライマーＧ７（太字で示すＢａｍＨＩを含む；配列番号７９で示す）と、ヌクレオチド配列５’ＣＣ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＧ  ＴＴＡ  ＴＴＣ  ＧＣＡ  ＡＴＡ  ＡＣＡ  ＧＴ−３’を有するアンチセンスプライマーＧ８（太字で示すＥｃｏＲＩを含む；配列番号８０で示す）とを使用してｎｆｓｐＧ５595からＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物ｎｆｓｐＧ５213をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲルで精製し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化しておいた発現ベクターｌａｍｂｄａＰR／Ｔ2ｏｒｉ／Ｓ１０ＨＩＳ−ＲＳＥＴ−Ａ９にサブクローニングし、脱リン酸化した。本明細書においてｐＣｒｏ−ｎｆｓｐＧ５213と参照される、得られた組換え分子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ−２１受容能力細胞（ウィスコンシン州マジソンのノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製）にトランスホーメーションし、組換え細胞大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）：ｐＣｒｏ−ｎｆｓｐＧ５213を形成した。この組換え細胞を培養して、関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号に記載されるように誘導した。Ｔ７抗体を使用した、このタンパク質の免疫ブロット分析は、誘導した試料中の約１２ｋＤのタンパク質の発現を示したが、誘導しなかった試料中では発現を示さなかった。
実施例  ８
この実施例はｆｓｐＩノミ唾液タンパク質をコードする核酸配列のさらなる配列決定について記載する。この実施例はまた、細菌によるｆｓｐＩタンパク質の発現についても記載する。
関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例６に記載される、ｎｆｓｐＩ573と示される核酸分子を、標準的なヌクレオチド配列決定方法を使用してさらに配列決定した。核酸分子を、本明細書においてｎｆｓｐＩ1007と参照される約１００７個のヌクレオチドについて同定し、そのコード鎖を本明細書において配列番号６１と示す。配列番号６１の翻訳は、配列番号６１が、アミノ酸配列配列番号６２を有する本明細書においてＰｆｓｐＩ155と参照される約１５５個のアミノ酸の全長ではないノミ唾液タンパク質をコードすることを示し、配列番号６１のほぼヌクレオチド１乃至ほぼヌクレオチド３に及ぶ第１のコードと配列番号６１のほぼヌクレオチド４６６乃至ほぼヌクレオチド４６８に及ぶ停止コドンと推定される。配列番号６１の相補物は本明細書において配列番号６３で表される。
ノミ唾液タンパク質ＰｆｓｐＩ158は以下の方法で産生された。本明細書においてｎｆｓｐＩ474と参照される約４７４−ｂｐ核酸分子（みかけ上成熟したノミ唾液タンパク質をコードするように設計されている）を、
0004694657.tif 000002
（太字で示したＢａｍＨＩ−部位およびイタリック体で示す３つのアミノ酸、Ｇｌｕ−Ａｓｐ−イソロイシンをコードする核酸配列を含有する；配列番号８１で示す）を有するセンスプライマーＩ１と核酸配列５’ＣＣＧ  ＧＡＡ  ＴＴＣ  ＴＴＡ  ＴＴＴ  ＡＴＴ  ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＴＣＧ  ＡＣＡ  ＡＴＡ  ＡＣＡ  ＡＡＡ  ＧＴＴ  ＴＣＣ−３’（太字で示すＥｃｏＲＩを含む；配列番号８２で示す）を有するアンチセンスプライマー１２を使用して、ｎｆｓｐＩ1007からＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物ｎｆｓｐＩ474は、３つのアミノ酸をコードするプライマーＩ１に導入される核酸配列を含有し、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化され、ゲルで精製され、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化しておいた発現ベクターｌａｍｂｄａＰR／Ｔ2ｏｒｉ／Ｓ１０ＨＩＳ−ＲＳＥＴ−Ａ９にサブクローニングし、脱リン酸化した。本明細書においてｐＣｒｏ−ｎｆｓｐＩ474と参照される、得られた組換え分子を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ−２１受容能力細胞（ウィスコンシン州マジソンのノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製）にトランスホーメーションし、組換え細胞大腸菌（Ｅ．ｃｏＩｉ）：ｐＣｒｏ−ｎｆｓｐＩ474を形成した。この組換え細胞を培養して、関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号に記載される方法を使用して、タンパク質産物を分離した。Ｔ７抗体を使用した、このタンパク質の免疫ブロット分析は、誘導した試料中の約３０ｋＤのタンパク質の発現を示したが、誘導しなかった試料中では発現を示さなかった。
実施例  ９
この実施例は、ｆｓｐＮノミ唾液タンパク質をコードする核酸分子の単離について記載する。
ｎｆｓｐＮ（Ｂ）612（関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の配列番号５２）のヌクレオチドを含むＤＮＡプローブを32Ｐで標識し、これを使用して、標準的なハイブリダイゼーション技法を使用することによりノミ唾液腺ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。本明細書において配列番号６４と示されるコード鎖の核酸配列を有する、本明細書においてｎｆｓｐＮ５1205と参照される約１２０５個のヌクレオチドの挿入物を有するクローンを単離した。配列番号６４の翻訳は、核酸分子ｎｆｓｐＮ５1205は、アミノ酸配列配列番号６５を有する、本明細書においてＰｆｓｐＮ５353と参照される約３５３個のアミノ酸の全長ではないノミ唾液タンパク質をコードすることを示し、開始コドンが配列番号６４のほぼヌクレオチド４乃至ほぼヌクレオチド６に及び、停止コドンが配列番号６４のほぼヌクレオチド１０６０乃至ほぼヌクレオチド１０６２に及ぶ読み取り枠と推定される。配列番号６４の相補物は本明細書において配列番号６６によって表される。ＰｆｓｐＮ５353をコードするコード領域は、配列番号６７で表される核酸配列を有するコード鎖と核酸配列配列番号６９を有する相補鎖を有する、核酸分子ｎｆｓｐＮ５1059で表される。ＰｆｓｐＮ５353のアミノ酸配列（すなわち、配列番号６５）は、ＰｆｓｐＮ５353が推定分子量約３９．７ｋＤで、推定ｐＩ約９．４５を有することを予測した。
アミノ酸配列配列番号６５とジーンバンクに報告されているアミノ酸配列との比較は、配列番号６５は最も高い相同性、すなわち配列番号６５とヒト前立腺酸性フォスファターゼ前駆体タンパク質（ジーンバンク寄託番号第Ｐ１５３０９）との間の同一性は約３２％であることを示す。ジーンバンクの相同性調査は、配列番号６４と既知の核酸配列との間には十分な相同性はないことを示した。
実施例１０
この実施例は、ノミアレルギー性皮膚炎の臨床症状を有するイヌから単離されたＩｇＥ抗体を使用して同定されたｆｓｐＮノミ唾液タンパク質をコードする核酸分子の単離について記載する。
ノミアレルギー性皮膚炎（ＦＡＤ）を有することが公知の多数の原料から血清プール（プール＃４と呼ぶ）を採取した。プール＃４血清を使用して、以下のように、ＦＡＤイヌ血清中のＩｇＥ抗体と特異的に結合するノミ唾液抗原を同定した。デュラポア（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）▲Ｒ▼膜ではなく、カルボキシメチルカチオン交換（ＣＭ）膜（ニューハンプシャー州キーンのシュレイシャー  アンド  シュール（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｕｌｌ）社製）を使用した以外は、関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例１および２に記載する一般的な方法を使用して、ノミ唾液抽出物を採取した。また、２．５Ｍ  ＮａＣｌ、５％イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）及び２０ｍＭトリス、ｐＨ８．０からなる緩衝液に膜を接触させることによって、ノミ唾液抽出物を膜から溶出した。膜は室温で終夜溶出させた。関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例２に記載される一般的な方法を使用した高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、ノミ唾液抽出物を分離した。ＨＰＬＣ画分に含有されるタンパク質を１６％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。次いでゲル上のタンパク質を、標準的なウェスタンブロット技法を使用して、インモビロン  Ｐ（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｐ）TMフィルターにブロットした。次いで、ブロット上のタンパク質に結合したＩｇＥ抗体を以下のように検出した。最初に、ブロットを標準的なハイブリダイゼーション技法を使用して、プール＃４血清の約１：２００希釈液とともにインキュベーションし、洗浄し、次いで標準的なウェスタンブロット技法を使用して、ビオチン化したヒトＦｃ  Ｒアルファ鎖タンパク質の１４５μｇ／ミリリッター溶液の約１：５００希釈液とインキュベーションした。洗浄後、ブロットをアルカリホスファターゼに結合したストレプトアビジン（ミズーリ州セントルイスのシグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）の約１：５，０００希釈液とインキュベーションした。次いで、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（メリーランド州ゲイザーズバーグのギブコ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）社製）の約１０ミリリッターをブロットに添加し、バンドが見えるまで室温でインキュベーションし、次いでブロットを水で洗浄して反応を停止した。画分３４、３７、３８、４７、４９、５１、５２および５３を含有する試料にタンパク質のバンドが検出された。
当業者に公知の標準的な手法を使用して、画分５２を含有する試料中に同定された約４０ｋＤのタンパク質バンド中に含有されるタンパク質について、アミノ（Ｎ−）末端のアミノ酸配列決定を実施した（例えば、Ｇｅｉｓｏｗら、１９８９年、プロテインシークエンシング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）中：プラクティカル  アプローチ（Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）、ＪＢＣ  ＦｉｎｄｌａｙおよびＭＪ  Ｇｅｉｓｏｗ（編）アイアールエル出版（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、８５−９８ページ；Ｈｅｗｉｃｋら、１９８１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６巻、７９９０−７９９７ページ参照）。このタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列は、Ｘ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｘ  Ｇｌｎであると決定された（本明細書において配列番号７０と示す；「Ｘ」は任意のアミノ酸残基を示す）。
配列番号７０を使用して合成オリゴヌクレオチドプライマーを設計し、これを使用して、以下のように配列番号７０をコードする核酸分子を単離した。ヌクレオチド配列５’ＡＡＡ  ＴＴＴ  ＧＴＡ（Ｔ）  ＴＴＴ  ＧＴＡ（Ｔ）  ＡＴＧ  ＧＴＡ（Ｔ）  ＡＡＡ  ＧＧＡ（Ｔ）  ＣＣＡ（Ｔ）  ＧＡＴ  ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＧＣ−３’（配列番号８３で示す）を有するセンスプライマー１を、Ｍ１３順方向ユニバーサル標準プライマー５’ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’（配列番号８４で示す）と合わせて使用して、実施例９で上述したノミ唾液腺ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ産物を産生した。標準的な技法を使用してＰＣＲ増幅を実施した。得られたＰＣＲ増幅産物は約４０６ヌクレオチドの断片であり、本明細書においてｎｆｓｐＮ６406と示される。このＰＣＲ産物をインビトローゲン社（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）のＴＡＴＭクローニングベクターにクローニングし（インビトローゲン社（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．）が提供する手法）、標準的な技法を使用してＤＮＡ塩基配列解析を実施した。
ｎｆｓｐＮ６406のコード鎖の核酸配列は本明細書において配列番号７１と示される。配列番号７１の翻訳は、核酸分子ｎｆｓｐＮ６406が、アミノ酸配列配列番号７２を有する、本明細書においてｎｆｓｐＮ６135と参照される約１３５個のアミノ酸の全長ではないノミ唾液タンパク質をコードすることを示し、配列番号７１のほぼヌクレオチド１乃至ほぼヌクレオチド３に及ぶ第１のコドンと配列番号７１のほぼヌクレオチド４０３乃至ほぼヌクレオチド４０５に及ぶ停止コドンとが推定される。配列番号７１の相補物は本明細書において配列番号７３で表される。
ジーンバンクの相同性調査は、アミノ酸配列配列番号７２と核酸配列配列番号７１と周知のアミノ酸配列または核酸配列との間にはそれぞれ十分な相同性がないことを示した。
実施例１１
この実施例は、ｆｓｐＪノミ唾液タンパク質をコードする核酸分子の単離について記載する。
変性オリゴヌクレオチドプライマーを、ｆｓｐＪ（関連する国際公開公報ＷＯ  ９６／１１，７０６の実施例４に開示されるもの）に対して導き出されたアミノ酸配列からデザインし、以下のようにｆｓｐＪ各散文詩を単離するために使用した。関連する国際公開公報ＷＯ  ９６／１１，７０６の配列番号８の約７から約２６の残基に及ぶｆｓｐＪの領域に対応する２種類の合成オリゴヌクレオチドを合成した。プライマー１、即ち関連する国際公開公報ＷＯ  ９６／１１，７０６の配列番号８の残基約７から約１６のアミノ酸残基に対応する「センス」プライマーは、核酸配列５’ＣＡＴ  ＧＡＡ  ＣＣＡ（Ｔ）  ＧＧＡ（Ｔ）  ＡＡＴ  ＡＣＡ（Ｔ）  ＣＧＡ（Ｔ）  ＡＡＡ（Ｔ）  ＡＴＡ（Ｃ／Ｔ）  Ａ（Ｃ）Ｇ３’（本明細書で配列番号８４と示す。）を有する。プライマー２、即ち関連する国際公開公報ＷＯ  ９６／１１，７０６の配列番号８の残基約１７から約２６のアミノ酸残基に対応する「センス」プライマーは、核酸配列５’ＧＡＡ  ＧＴＡ（Ｔ）  ＡＴＧ  ＧＡＣ（Ｔ）  ＡＡＡ  ＴＴＡ（Ｇ）  ＡＧＡ（Ｇ）  ＣＡＡ（Ｇ）  ＧＣ  ３’（本明細書で配列番号８６と示す。）を有する。
実施例９で先に説明したノミ唾液腺ｃＤＮＡライブラリー由来のフラグメントのＰＣＲ増幅を、標準的技法を用いて行った。ＰＣＲ増幅産物を、プライマー１及びＭ１３プライマー（配列番号８５で示した。）の組み合わせを用いて生じさせた。得られたＰＣＲ産物を、プライマー２及びＴ７標準プライマー５’ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＴＡＧ  ＧＧＣ  ３’（配列番号８８で示す。）を用いてネステッドＰＣＲ増幅に使用した。得られたＰＣＲ産物、即ち約４２０個のヌクレオチドのフラグメントを本明細書でｎｆｓｐＪ420で示した。該ＰＣＲ産物をインビトロゲン社（InVitrogen, Corp.）ＴＭTMクローニングベクター（インビトロゲン社により提供されるプロデューサー）にクローニングし、標準的技法を用いてＤＮＡ配列解析にかけた。
ｎｆｓｐＪ420のコーディング鎖の核酸配列は、配列番号７４として本明細書中に示した。配列番号７４の翻訳は、核酸分子ｎｆｓｐＪ420が、ＰｆｓＪ72と本明細書で参照する約７２個のアミノ酸の全長でないノミ唾液タンパク質をコードすることを示唆し、配列番号７４の核酸約１から核酸約３に及ぶ第一コドン及び配列番号７４の核酸約２１４から核酸約２１６に及ぶ停止コドンを推定した。配列番号７４の相補体を、本明細書で配列番号７６で表した。
ジーンバンクの相同性調査は、アミノ酸配列配列番号７５と核酸配列配列番号７４と公知のアミノ酸配列または核酸配列との間にはそれぞれ十分な相同性がないことを示した。
実施例１２
この実施例は、単離され、ＨＰＬＣで精製されたｆｓｐＮ７ノミ唾液タンパク質について記載する。
実施例１０に記載するノミ唾液抽出物に特異的に応答するＴ細胞クローン（ＦＳ−特異的Ｔ細胞）を刺激する能力について、実施例１０で説明したノミ唾液タンパク質の画分を試験した。免疫学の最新のプロトコール（Ｃｕｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、１巻、１３章［３．１３．２］Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、ウィリー  インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）出版、１９９３年に記載される方法などの標準的な方法を使用してＴ細胞の活性化を実施した。簡単に説明すると、約１０４個のＦＳ−１−特異的Ｔ細胞（クローンＣＰＯ２−７；関連出願である国際公開公報第９６／１１，２７１号の実施例８に記載するイヌＣＰＯ２から単離される）を、９６ウェル組織培養プレートの個々のウェルに、約２×１０４個の自己抗原呈示細胞（イヌＣＰＯ２からフィコール濃度勾配によって単離される）および約１００単位／組換えヒトインターロイキン−２（プロロイキン（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ）▲Ｒ▼；カリフォルニア州エメリービルのカイロン社（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｉｎｃ．）製）の１ミリリッターの存在下で添加した。ＨＰＬＣで分離した各タンパク質画分の約１マイクロリッターを、３つの同じウェルの各々に添加した。セルを約４乃至約６日間インキュベーションした。インキュベーション終了の約１６時間前に、約１μＣｉの三重水素で標識したチミジン（イリノイ州アーリントンハイツのアマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｃ．）製）を各ウェルに添加した。次いで、細胞を採取し、細胞タンパク質内に取り込まれたトリチウムの量を測定した。結果は、ｆｓｐＮタンパク質を含有するＨＰＬＣ画分（５１画分）に含有されるタンパク質はＦＳ−特異的Ｔ細胞を刺激したことを示した。
当業者に公知な標準的な方法（例えば、Ｇｅｉｓｏｗら、上述；Ｈｅｗｉｃｋら、１９８１年、上述を参照）を使用して、５１画分に含有されるタンパク質について、アミノ（Ｎ−）末端アミノ酸配列解析を実施した。このバンドのＮ−末端部分アミノ酸配列は、Ａｓｎ  Ａｓｐ  Ｌｙｓ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ａｓｐ  Ｈｉｓ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｃｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ（本明細書において配列番号７８で示される）であることが決定した。
実施例  １３
この実施例は、単離されて、ＨＰＬＣで精製されたｆｓｐＭ２ノミ唾液タンパク質のアミノ酸配列解析について記載する。
実施例１０に上述する４７画分に含有されるタンパク質を１６％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。約３４ｋＤの主要なバンドを同定した。当業者に公知の標準的な方法（例えば、Ｇｅｉｓｏｗら、上述；Ｈｅｗｉｃｋら、１９８１年、上述を参照）を使用して、約３４ｋＤに含有されるタンパク質について、アミノ（Ｎ−）末端アミノ酸配列解析を実施した。このバンドのＮ−末端部分アミノ酸配列は、Ｔｙｒ  Ｐｈｅ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｍｅｔ  Ｖａｌ  Ｐｈｅ  Ｌｙｓ  Ｔｙｒ  Ｐｒｏ  Ｔｙｒ（本明細書において配列番号８７で示される）であることが決定した。
配列表
以下の配列表は３７ＣＦＲ§１．８２１に基づき提出されるものである。コンピューターで読み取り可能な形態による写しもまたここに提出する。
出願人は、３７ＣＦＲ§１．８２１（ｆ）に基づき、配列認識番号１〜８８の書面の内容と、ここに提出されるコンピューター読み取り可能な写しの内容とが同一であることを断言する。
（１）一般情報：
（i）出願人：フランク，グレン  Ｒ．
ウー  ハンター，シャーリー
ウォレンフェルズ，リンダ
（ii）発明の名称：新規な外部寄生生物唾液タンパク質
および同タンパク質を収集する装置
（iii）配列の数：８８
（iv）通信宛先：
（A）名宛人：シェリダン  ロス  Ｐ．Ｃ．
（B）通り：１７００リンカン・ストリート，スイート３５００
（C）市：デンバー
（D）州：コロラド
（E）国：アメリカ合衆国
（F）郵便番号：８０２０３
（v）コンピュータ読取り可能な形態：
（A）媒体タイプ：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣコンパチブル
（C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウエア：Patent In リリース ＃1.0，バージョン＃1.30
（vi）現在の出願データ：
（A）出願番号：
（B）出願日：
（C）分類：
（viii）アトニー／エージェント情報：
（A）氏名：コーネル，ギャリー  Ｊ．
（B）登録番号：３２，０２０
（C）参照／ドケット番号：２６１８−１７−Ｃ４
（ix）電信情報：
（A）電話：３０３／８６３−９７００
（B）テレファックス：３０３／８６３−０２２３
（２）配列認識番号：１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：１：
0004694657.tif 000003
（２）配列認識番号：２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１２アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：Ｘａａ＝ＴｙｒまたはＡｓｐ
（B）存在位置：５
（xi）配列の記載：配列認識番号：２：
0004694657.tif 000004
（２）配列認識番号：３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：３：
0004694657.tif 000005
（２）配列認識番号：４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２３アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：Ｘａａ＝ＡｌａまたはＨｉｓ
（B）存在位置：８
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：Ｘａａ＝ＡｌａまたはＨｉｓ
（B）存在位置：９
（xi）配列の記載：配列認識番号：４：
0004694657.tif 000006
（２）配列認識番号：５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：５：
0004694657.tif 000007
（２）配列認識番号：６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１８アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：６：
0004694657.tif 000008
（２）配列認識番号：７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２２アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：７：
0004694657.tif 000009
（２）配列認識番号：８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ｍｉｓｃ特性
（B）存在位置：１．．２０
（D）他の情報：／ラベル＝プライマー
（xi）配列の記載：配列認識番号：８：
0004694657.tif 000010
（２）配列認識番号：９のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２２５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：９：
0004694657.tif 000011
（２）配列認識番号：１０のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ｍｉｓｃ特性
（B）存在位置：１．．１５
（D）他の情報：／ラベル＝プライマー
（xi）配列の記載：配列認識番号：１０：
0004694657.tif 000012
（２）配列認識番号：１１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５６５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：４５．．３１４
（xi）配列の記載：配列認識番号：１１：
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（２）配列認識番号：１２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：９０アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：１２：
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（２）配列認識番号：１３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．２７０
（xi）配列の記載：配列認識番号：１３：
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（２）配列認識番号：１４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：９０アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：１４：
0004694657.tif 000016
（２）配列認識番号：１５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ｍｉｓｃ特性
（B）存在位置：１．．２６
（D）他の情報：／ラベル＝プライマー
（xi）配列の記載：配列認識番号：１５：
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（２）配列認識番号：１６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ｍｉｓｃ特性
（B）存在位置：１．．２８
（D）他の情報：／ラベル＝プライマー
（xi）配列の記載：配列認識番号：１６：
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（２）配列認識番号：１７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：８９７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：９７．．５６８
（xi）配列の記載：配列認識番号：１７：
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（２）配列認識番号：１８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１５７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：１８：
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（２）配列認識番号：１９のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４７１塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列認識番号：１９：
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（２）配列認識番号：２０のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７０６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：５．．２７０６
（xi）配列の記載：配列認識番号：２０：
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（２）配列認識番号：２１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：９００アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：２１：
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（２）配列認識番号：２２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４１４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：３．．４１４
（xi）配列の記載：配列認識番号：２２：
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（２）配列認識番号：２３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１３７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
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（２）配列認識番号：２４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：３．．２７３
（xi）配列の記載：配列認識番号：２４：
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（２）配列認識番号：２５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：９０アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
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（２）配列認識番号：２６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１７０４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：２４．．１４０６
（xi）配列の記載：配列認識番号：２６：
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（２）配列認識番号：２７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４６１アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：２７：
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（２）配列認識番号：２８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１３８３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一体鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列認識番号：２８：
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（２）配列認識番号：２９のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１７５８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．１７５８
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：Ｗ＝ＡまたはＴ
（B）存在位置：１１３６
（xi）配列の記載：配列認識番号：２９：
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（２）配列認識番号：３０のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５８６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：３０：
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（２）配列認識番号：３１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２９３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列認識番号：３１：
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（２）配列認識番号：３２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３３５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列認識番号：３２：
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（２）配列認識番号：３３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３９６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列認識番号：３３：
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（２）配列認識番号：３４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２８５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列認識番号：３４：
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（２）配列認識番号：３５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２２８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列認識番号：３５：
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（２）配列認識番号：３６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３３９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．３３９
（xi）配列の記載：配列認識番号：３６：
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（２）配列認識番号：３７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１１３アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：３７：
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（２）配列認識番号：３８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４９３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．３９０
（xi）配列の記載：配列認識番号：３８：
0004694657.tif 000053
（２）配列認識番号：３９のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１３０アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：３９：
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（２）配列認識番号：４０のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３０６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列認識番号：４０：
0004694657.tif 000055
（２）配列認識番号：４１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４９０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列認識番号：４１：
0004694657.tif 000056
（２）配列認識番号：４２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：６１６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列認識番号：４２：
0004694657.tif 000057
（２）配列認識番号：４３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４７５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列認識番号：４３：
0004694657.tif 000058
（２）配列認識番号：４４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２９５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列認識番号：４４：
0004694657.tif 000059
（２）配列認識番号：４５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３７２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列認識番号：４５：
0004694657.tif 000060
（２）配列認識番号：４６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２５２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列認識番号：４６：
0004694657.tif 000061
（２）配列認識番号：４７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：６１３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（xi）配列の記載：配列認識番号：４７：
0004694657.tif 000062
（２）配列認識番号：４８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５３８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：３．．５３８
（xi）配列の記載：配列認識番号：４８：
0004694657.tif 000063
（２）配列認識番号：４９のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１７８アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：４９：
0004694657.tif 000064
（２）配列認識番号：５０のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４３２塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．３８８
（xi）配列の記載：配列認識番号：５０：
0004694657.tif 000065
（２）配列認識番号：５１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１２９アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：５１：
0004694657.tif 000066
（２）配列認識番号：５２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５９５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：４７．．３１５
（xi）配列の記載：配列認識番号：５２：
0004694657.tif 000067
（２）配列認識番号：５３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：８９アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：５３：
0004694657.tif 000068
（２）配列認識番号：５４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５９５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：５４：
0004694657.tif 000069
（２）配列認識番号：５５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．２７０
（xi）配列の記載：配列認識番号：５５：
0004694657.tif 000070
（２）配列認識番号：５６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：９０アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：５６：
0004694657.tif 000071
（２）配列認識番号：５７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２７０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：５７：
0004694657.tif 000072
（２）配列認識番号：５８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２１３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．２１３
（xi）配列の記載：配列認識番号：５８：
0004694657.tif 000073
（２）配列認識番号：５９のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：７１アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：５９：
0004694657.tif 000074
（２）配列認識番号：６０のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２１３塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：６０：
0004694657.tif 000075
（２）配列認識番号：６１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１００７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．４６５
（xi）配列の記載：配列認識番号：６１：
0004694657.tif 000076
（２）配列認識番号：６２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１５５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：６２：
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（２）配列認識番号：６３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１００７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：６３：
0004694657.tif 000078
（２）配列認識番号：６４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１２０５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：４．．１０６２
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（２）配列認識番号：６５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３５３アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：６５：
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（２）配列認識番号：６６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１２０５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：６６：
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（２）配列認識番号：６７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１０５９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．１０５９
（xi）配列の記載：配列認識番号：６７：
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（２）配列認識番号：６８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３５３アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：６８：
0004694657.tif 000085
（２）配列認識番号：６９のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１０５９塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：６９：
0004694657.tif 000086
（２）配列認識番号：７０のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：７０：
0004694657.tif 000087
（２）配列認識番号：７１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４０６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．４０５
（xi）配列の記載：配列認識番号：７１：
0004694657.tif 000088
（２）配列認識番号：７２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１３５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：７２：
0004694657.tif 000089
（２）配列認識番号：７３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４０７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：７３：
0004694657.tif 000090
（２）配列認識番号：７４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４２０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ｃＤＮＡ
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ＣＤＳ
（B）存在位置：１．．２１６
（xi）配列の記載：配列認識番号：７４：
0004694657.tif 000091
（２）配列認識番号：７５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：７２アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：タンパク
（xi）配列の記載：配列認識番号：７５：
0004694657.tif 000092
（２）配列認識番号：７６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４２０塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（xi）配列の記載：配列認識番号：７６：
0004694657.tif 000093
（２）配列認識番号：７７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：７１アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：７７：
0004694657.tif 000094
（２）配列認識番号：７８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（xi）配列の記載：配列認識番号：７８：
0004694657.tif 000095
（２）配列認識番号：７９のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ｍｉｓｃ特性
（B）存在位置：１．．２６
（D）他の情報：／ラベル＝プライマー
（xi）配列の記載：配列認識番号：７９：
0004694657.tif 000096
（２）配列認識番号：８０のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２８塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ｍｉｓｃ特性
（B）存在位置：１．．２８
（D）他の情報：／ラベル＝プライマー
（xi）配列の記載：配列認識番号：８０：
0004694657.tif 000097
（２）配列認識番号：８１のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：５４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ｍｉｓｃ特性
（B）存在位置：１．．５４
（D）他の情報：／ラベル＝プライマー
（xi）配列の記載：配列認識番号：８１：
0004694657.tif 000098
（２）配列認識番号：８２のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４５塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ｍｉｓｃ特性
（B）存在位置：１．．４５
（D）他の情報：／ラベル＝プライマー
（xi）配列の記載：配列認識番号：８２：
0004694657.tif 000099
（２）配列認識番号：８３のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：４６塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ｍｉｓｃ特性
（B）存在位置：１．．４６
（D）他の情報：／ラベル＝プライマー
（xi）配列の記載：配列認識番号：８３：
0004694657.tif 000100
（２）配列認識番号：８４のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ｍｉｓｃ特性
（B）存在位置：１．．３７
（D）他の情報：／ラベル＝プライマー
（xi）配列の記載：配列認識番号：８４：
0004694657.tif 000101
（２）配列認識番号：８５のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１７塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ｍｉｓｃ特性
（B）存在位置：１．．１７
（D）他の情報：／ラベル＝プライマー
（xi）配列の記載：配列認識番号：８５：
0004694657.tif 000102
（２）配列認識番号：８６のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：３１塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ｍｉｓｃ特性
（B）存在位置：１．．３１
（D）他の情報：／ラベル＝プライマー
（xi）配列の記載：配列認識番号：８６：
0004694657.tif 000103
（２）配列認識番号：８７のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：１９アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ペプチド
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ペプチド
（B）存在位置：１．．１９
（D）他の情報：／ラベル＝プライマー
（xi）配列の記載：配列認識番号：８７：
0004694657.tif 000104
（２）配列認識番号：８８のための情報：
（i）配列特性：
（A）長さ：２４塩基対
（B）型：核酸
（C）鎖の数：一本鎖
（D）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）
（ix）配列の特徴：
（A）名称／記号：ｍｉｓｃ特性
（B）存在位置：１．．２４
（D）他の情報：／ラベル＝プライマー
（xi）配列の記載：配列認識番号：８８：
0004694657.tif 000105
本発明の種々の態様を詳細に記載したが、これらの態様の変更および適性化が加えられることは当業者に明らかである。しかしながら、そのような変更および適性化は、以下の請求項の範囲に記載される本発明の範囲内にあることが明確に理解されるべきである。