(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種および同種のプロモーターに正のビタミンD3応答性を付与する活性を有する、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）配列番号：１の3014位から3057位までに記載の塩基配列からなるDNA。
（ｂ）（ａ）に記載のDNAの塩基配列において1若しくは２の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入されている塩基配列からなるDNA。
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のDNAの塩基配列を３〜５回の繰返し配列として含むDNA。
【請求項２】
請求項１の（ｂ）または（ｃ）に記載のDNAを含むベクター。
【請求項３】
請求項１の（ｂ）または（ｃ）に記載のDNAの下流にレポーター遺伝子が機能的に結合している、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
請求項２または３に記載のベクターを含む細胞。
【請求項５】
p27Kip1遺伝子の発現を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項３に記載のベクターが導入された細胞に、被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該細胞内におけるレポーター活性を検出する工程、および
（ｃ）被検試料の非存在下で検出した場合（対照）と比較して、該レポーター活性を増加または低下させる化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項６】
p27Kip1遺伝子の発現を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）  被検試料の存在下、ヒトp27Kip1遺伝子の5'調節領域に存在するCCAATボックス配列を含む、以下の（i）または（ii）のDNA：
（i）配列番号：１の3014位から3057位までに記載の塩基配列からなるDNAの塩基配列において1若しくは２の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入されている塩基配列からなるDNA；または
（ii）配列番号：１の3014位から3057位までに記載の塩基配列からなるDNA若しくは前記（i）に記載のDNAの塩基配列を３〜５回の繰返し配列として含むDNA、
を含むDNAに、NF-Yタンパク質を接触させる工程、
（ｂ）  該DNAとNF-Yタンパク質との結合を検出する工程、および
（ｃ）  被検試料の非存在下で検出した場合（対照）と比較して、該DNAとNF-Yタンパク質との結合を増強または減弱させる活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項７】
p27Kip1遺伝子の発現を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）  被検試料の存在下、ヒトp27Kip1遺伝子の5'調節領域に存在するSp1配列を含む、以下の（i）または（ii）のDNA：
（i）配列番号：１の3014位から3057位までに記載の塩基配列からなるDNAの塩基配列において1若しくは２の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入されている塩基配列からなるDNA；または
（ii）配列番号：１の3014位から3057位までに記載の塩基配列からなるDNA若しくは前記（i）に記載のDNAの塩基配列を３〜５回の繰返し配列として含むDNA、
を含むDNAに、Sp1タンパク質を接触させる工程、
（ｂ）  該DNAとSp1タンパク質との結合を検出する工程、および
（ｃ）  被検試料の非存在下で検出した場合（対照）と比較して、該DNAとSp1タンパク質との結合を増強または減弱させる活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
【請求項８】
工程（ｂ）における検出が、ゲルシフト解析により行なわれる、請求項６または７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、p27Kip1遺伝子の5'調節領域に存在するビタミンD3応答配列、および該配列を利用した薬剤のスクリーニング方法に関する。
背景技術
p27Kip1は複数のサイクリン依存性キナーゼ（cdk）のインヒビターであり、in vitroおよびin vivoにおける細胞周期の厳密な調節に必須であると考えられている。p27Kip1の変異はヒトの腫瘍にはあまり見られない（Ponce-Castaneda, M.V. et al. (1995) Cancer Res., 55, 1211-1214）が、ヒトの腫瘍においてしばしばp27Kip1蛋白質のレベルが異常に低いことが観察されており、この蛋白質の発現の減少は、乳癌（Porter, P.L. et al. (1997) Nat. Med., 3, 222-225; Loda, M. et al. (1997) Nat. Med., 3, 231-234）、肺癌（Esposito, V. et al. (1997) Cancer Res., 57, 3381-3385）、前立腺癌（Yang, R.M. et al. (1998) J. Urol., 159, 941-945）、および胃癌（Yasui, W. et al. (1997) Jpn. J. Cancer Res., 88. 625-629）の患者の生存率の低さとよく相関している。さらに、最近になりp27Kip1は腫瘍の抑制に関してハプロ-インサフィシェント（haplo-insufficient）であることが示された（Fero, M.L. et al. (1998) Nature, 396, 177-180）。これは、１つのアレルが不活性化したり、蛋白質発現がある程度減少しただけで、腫瘍形成を起こす傾向が強まることを意味する。癌治療のための重要な戦略の１つは、腫瘍抑制蛋白質群の発現を回復させることだと考えられるが、このために、p27Kip1は有用な分子である可能性がある。最近の研究から、神経芽細胞種を甲状腺ホルモンでインキュベートしたり、胚性カルシノーマをレチノイン酸で、または胃癌細胞をインターフェロンβでインキュベートすると、p27Kip1 mRNAが上昇することが示されている（Perez-Juste, G. and Aranda, A., (1999) J. Biol. Chem., 274, 5026-5031; Kawasaki, H. et al. (1998) Nature, 393, 284-289; Kuniyasu, H. et al. (1997) Cell Growth Differ., 8, 47-52）。これらの実験系では、p27Kip1転写を上昇させると、p27Kip1蛋白質レベルのみならずp27Kip1蛋白質の安定性までもが上昇することから、p27Kip1の転写調節はより一般的な重要性を持っていると予想される。それにも関わらず、p27Kip1転写の調節機構はほとんどわかっていない。これを解明するため、本発明者らは以前、ヒトp27Kip1遺伝子のプロモーターをクローニングし、転写開始点に対し-774から-435の位置がプロモーター活性に必須であることを示している（Minami, S. et al. (1997) FEBS Lett., 411, 1-6; 特開平11-137251）。
ところで、1,25-ジヒドロキシビタミンD3 は、無機ホメオスタシスの主要なレギュレーターであるだけでなく、単芽球細胞や骨芽細胞を含むいくつかの細胞型における分化の強力なモジュレーターでもある（Minghetti, P.P. and Norman, A.W., (1988) FASEB J., 2, 3043-3053）。最近の研究により、cdkインヒビターであるp2lCip1およびp27Kip1が、ビタミンD3が誘導する骨髄性白血球細胞株U937の分化を促進する分子スイッチとして機能することが明らかとなった。この過程の初期段階でこれらの遺伝子は、ビタミンD3によって、転写レベルと転写後レベルの両方で調節されている（Liu, M. et al. (1996) Genes Dev., 10, 142-153）。ビタミンD3 は、主には、調節DNA結合性転写因子（regulatable DNA-binding transcription factor）であるビタミンD受容体（VDR）（Evans, R.M., (1988) Science, 240, 889-895）を介して、そのシグナルを核に直接伝達し、分化においてリガンドが誘導する作用は、VDRにより標的遺伝子が直接活性化されることによって開始される。実際、ビタミンD3はp21Cip1の転写を、プロモーター内の機能的ビタミンD応答配列（VDRE）を介して、VDR依存的に誘導する（Liu, M. et al. (1996) Genes Dev., 10, 142-153）。p27Kip1転写の調節メカニズムを明らかにすることは、ビタミンD3作用の分子メカニズムを理解し、単球／マクロファージ分化の初期過程を理解するために欠くことができないばかりでなく、p27Kip1遺伝子の発現制御による腫瘍抑制方法の開発にとっても極めて重要である。p27Kip1の発現に関しては、転写後調節は活発に研究されているにもかかわらず（Pagano, M. et al. (1995) Science, 269, 682-685; Vlach, J. et al. (1997) EMBO J., 16, 5334-5344; Tomoda, K. et al. (1999) Nature, 398, 160-165）、p27Kip1遺伝子の転写調節についてはほとんど解明されていない。
発明の開示
本発明は、p27Kip1遺伝子の5'調節領域に存在するビタミンD3応答配列、および該配列を利用したp27Kip1遺伝子の発現を調節する薬剤のスクリーニング方法を提供する。
p27Kip1の転写制御のメカニズムをより詳細に解明するため、本発明者らはヒトp27Kip1遺伝子の5'調節領域の配列要素の解析を行った。
具体的には、まず、5'欠失変異体を用いたプロモーター解析を行ない、p27Kip1遺伝子の5'上流-549位から-511位までの39bpの領域が最大のプロモーター活性を得るために必須であることを明らかにした（図１）。また、点変異解析により、この領域内のSp1配列（GGGCGG）とCCAATボックスがプロモーター活性の調節に機能していることを明らかにした（図２）。特に、CCAATボックスはp27Kip1プロモーターの基本的な転写活性の誘導に必須であった。p27Kip1プロモーターのCCAATボックスを含むオリゴヌクレオチドを用いたゲルシフトアッセイにより、これに結合する転写因子の検索を行ったところ、転写因子NF-Yが、p27Kip1プロモーターのCCAATボックスに結合することが判明した（図３、４）。さらに、NF-Y転写因子のドミナントネガティブ型との共発現により、NF-YはCCAATボックスを介して、p27Kip1の転写を直接調節していることが示された（図５）。
本発明者らは、さらに、p27Kip1プロモーターに見出された転写調節に重要なこれらの配列が、ビタミンD3によるp27Kip1の転写調節にも関わっている可能性を検証した。ヒトp27Kip1遺伝子の翻訳開始部位の5'側上流の3.6kbの領域内には、はっきりとしたVDRE（5'-RGKTCANNNRGKTCA-3'）を発見することはできなかった。このことは、p27Kip1 が、p2lCip1（Liu, M. et al. (1996) Genes Dev., 10, 142-153）、c-fos（Schrader, M. et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun., 230, 646-651）、およびオステオカルシン（Demay, M.B. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 369-373）のような他のビタミンD3 標的遺伝子とは異なるメカニズムによって調節されることを示唆している。そこで、本発明者らは、VDR/VDREが直接関与していないビタミンD3 作用の新しい経路の可能性を考え、ビタミンD3 によるp27Kip1 転写の正の調節に必要な配列を同定と、ビタミンD3 による分化誘導の初期の新規メカニズムを明らかにすることを目的にp27Kip1プロモーターをさらに解析した。
ヒトp27Kip1遺伝子の3.6キロベース（kb）の5'側隣接領域について、ルシフェラーゼレポーター構築物を作製し、これをU937細胞に一過性にトランスフェクトし、該5'側隣接領域の転写活性を調べたところ、この転写活性は、ビタミンD3 により誘導されることが判明した（図６）。欠失および変異解析により、p27Kip1 遺伝子発現を誘導するためには、GGGCGG配列（-543/-538）とCCAAT配列（-522/-518）の両方が必要であった（図７）。驚くべきことに、これらの両配列を含む44bpの領域（-555位からー512位）は、p27Kip1プロモーター以外の異種プロモーターに対しても、ビタミンD3 に対する正の応答をもたらすのに必要十分であった（図８）。
ゲルシフトアッセイから、Sp1がSp1配列（GGGCGG）に結合し、NF-YがCCAATボックス配列に結合することが判明した（図９〜１３）。これらの転写因子の役割と一致するように、ビタミンD3による処理は、これらの因子の各配列に対するDNA結合活性を刺激し（図１４）、NF-Yサブユニットの１つの変化を誘導した（図１５、１６）。ビタミンD3は、U937細胞の分化の初期段階において、ビタミンDレセプターではなく、Sp1およびNF-Yが関与する転写調節機構により、p27Kip1 遺伝子の転写を刺激すると考えられた。
これまでに、VDRを必要としないビタミンD3 依存的な転写の「抑制」については報告されているが（Ezura, Y. et al. (1997) J. Biol. Chem., 272, 29865-29872; Alroy, I. et al. (1995) Mol. Cell. Biol., 15, 5789-5799）、本発明は、ビタミンD3 が誘導する、VDRを直接必要しない転写の分子メカニズムを初めて説明するものである。
p27Kip1は腫瘍抑制蛋白質群の発現を回復させる点で、癌治療の戦略を開発するための重要なターゲットになり得る（Fero, M.L. et al. (1998) Nature, 396, 177-180）。本発明により、p27Kip1遺伝子の5'上流に存在するビタミンD3応答配列が明らかになり、さらに該配列とNF-YやSp1との相互作用が明かになったことで、p27Kip1遺伝子の転写を調節する薬剤を開発するための有用な系が提供された。これにより、新しい遺伝子調節化学治療（gene-regulating chemotherapy）や遺伝子調節化学予防（gene-regulating chemoprevention）の開発が可能になるものと期待される（Sakai, T., (1996) Jpn. J. Hyg., 50, 1036-1046）。
本発明は、以上のような知見に基づいてなされたものであり、p27Kip1遺伝子の5'調節領域に存在するビタミンD3応答配列および該配列を利用した薬剤の新規なスクリーニング方法を提供するものである。
本発明は、より具体的には、
（１）  異種および同種のプロモーターに正のビタミンD3応答性を付与する活性を有する、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNA、
（ａ）配列番号：１の3014位から3057位までに記載の塩基配列からなるDNA。
（ｂ）（ａ）に記載のDNAに対応するヒト以外の生物のDNA。
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のDNAの塩基配列において1若しくは複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入されている塩基配列からなるDNA。
（２）  （１）に記載のDNAを含むベクター、
（３）  （１）に記載のDNAの下流にレポーター遺伝子が機能的に結合している、（２に記載のベクター、
（４）  （２）または（３）に記載のベクターを含む細胞、
（５）  p27Kip1遺伝子の発現を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）（３）に記載のベクターが導入された細胞に、被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該細胞内におけるレポーター活性を検出する工程、および
（ｃ）被検試料の非存在下で検出した場合（対照）と比較して、該レポーター活性を増加または低下させる化合物を選択する工程、を含む方法、
（６）  p27Kip1遺伝子の発現を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）  被検試料の存在下、ヒトp27Kip1遺伝子の5'調節領域に存在するCCAATボックス配列を含むDNA領域または該DNA領域に対応するヒト以外の生物のDNA領域を含むDNAに、NF-Yタンパク質を接触させる工程、
（ｂ）  該DNAとNF-Yタンパク質との結合を検出する工程、および
（ｃ）  被検試料の非存在下で検出した場合（対照）と比較して、該DNAとNF-Yタンパク質との結合を増強または減弱させる活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
（７）  p27Kip1遺伝子の発現を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）  被検試料の存在下、ヒトp27Kip1遺伝子の5'調節領域に存在するSp1配列を含むDNA領域または該DNA領域に対応するヒト以外の生物のDNA領域を含むDNAに、Sp1タンパク質を接触させる工程、
（ｂ）  該DNAとSp1タンパク質との結合を検出する工程、および
（ｃ）  被検試料の非存在下で検出した場合（対照）と比較して、該DNAとSp1タンパク質との結合を増強または減弱させる活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
（８）  工程（ｂ）における検出が、ゲルシフト解析により行なわれる、（６）または（７）に記載の方法、
（９）  ビタミンD3またはその誘導体を有効成分とする、ヒトp27Kip1遺伝子の5'調節領域に存在するCCAATボックス配列またはこれに対応するヒト以外の生物のCCAATボックス配列とNF-Yタンパク質との結合を増強するための薬剤、
（１０）  ビタミンD3またはその誘導体を有効成分とする、p27Kip1遺伝子の5'調節領域に存在するSp1配列またはこれに対応するヒト以外の生物のSp1配列とSp1タンパク質との結合を増強するための薬剤、を提供する。
本発明は、p27Kip1遺伝子の5'調節領域に存在するビタミンD3応答配列を提供する。本発明者等は、p27Kip1遺伝子の5'調節領域の欠失および変異解析により、該領域に存在するSp1配列およびCCAATボックス配列がビタミンD3に応答したプロモーター活性に必要であり、しかも、驚くべきことに、これら配列を含む領域が、異種プロモーターに対してもビタミンD3に対する正の応答をもたらすことを明らかにした。従って、本発明は、p27Kip1遺伝子の5'調節領域に存在する異種および同種のプロモーターに正のビタミンD3応答性を付与する活性を有するDNAを提供する。本発明のビタミンD3応答配列のこのような特性から、例えば、ある機能遺伝子を本発明のビタミンD3応答配列を含む異種または同種のプロモーター下に挿入することで、ビタミンD3依存的に機能蛋白質を発現させることができる。このことは、特に、遺伝子治療などへの応用において有効である。
本発明のビタミンD3応答配列は、より具体的には、ヒトp27Kip1遺伝子の5'上流-555から-512位の塩基配列からなるDNA（配列番号：１の3014位から3057位）を含む。また、異種および同種のプロモーターに正のビタミンD3応答性を付与する活性を有する限り、該DNAに対応するヒト以外の生物のDNAも、本発明に含まれる。ヒト以外の生物としては、例えば、マウスなどの哺乳動物が挙げられるが、これらに制限されない（マウスp27Kip1遺伝子の5'上流域については文献（Biochim Biophys Acta 1997 Sep 12;1353(3):307-317）参照）。
また、異種および同種のプロモーターに正のビタミンD3応答性を付与する活性を有する限り、ヒトおよび他の生物のビタミンD3応答配列において、1若しくは複数の塩基が置換、欠失、付加、および／または挿入されているDNAも本発明に含まれる。実際に、本発明において、Sp1-2配列に変異が導入されたビタミンD3応答配列が高い活性を保持することが見出されている（実施例４、図８）。一方、Sp1-1配列やCCAATボックス配列への変異の導入は、活性が消失し得るため、好ましくない。
本発明のビタミンD3応答配列は、p27Kip1遺伝子の発現を調節する化合物のスクリーニングに好適に利用し得る。従って、本発明は、また、ビタミンD3応答配列を利用した、p27Kip1遺伝子の発現を調節する化合物のスクリーニング方法を提供する。本発明のビタミンD3応答配列を利用したスクリーニングは、p27Kip1プロモーターの長い領域を利用したスクリーニングに比して、例えば、NF-YやSp1に作用する化合物（ビタミンD3誘導体を含む）を特異的にスクリーニングすることに有効である。このことは、副作用の少ない医薬品開発の上で非常に重要な利点である。
本発明のスクリーニング方法の１つの態様は、本発明のビタミンD3応答配列を含むレポーター構築物を利用した方法であり、より具体的には、
（ａ）本発明のビタミンD3応答配列の下流にレポーター遺伝子が機能的に結合されたベクターが導入された細胞に、被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該細胞内におけるレポーター活性を検出する工程、および
（ｃ）被検試料の非存在下で検出した場合（対照）と比較して、該レポーター活性を増加または低下させる化合物を選択する工程、を含む方法である。
本発明のスクリーニング方法においては、まず、本発明のビタミンD3応答配列の下流に機能的に結合されたレポーター遺伝子を含むベクターを構築する。ここで「機能的に結合された」とは、本発明のビタミンD3応答配列の活性化に応答して、その下流に結合されたレポーター遺伝子が発現しうるように、該ビタミンD3応答配列とレポーター遺伝子が結合していることを指す。このようなレポーター遺伝子の発現を保証するためには、本発明のビタミンD3応答配列を含むp27Kip1プロモーター領域を用いることもできるが、異種プロモーターを本発明のビタミンD3応答配列とレポーター遺伝子の間に挿入して利用することもできる。異種プロモーターとしては、それ自体でビタミンD3応答性を示さず、本発明のビタミンD3応答配列の制御下でビタミンD3応答性を示すものであれば、特に制限はなく、例えば、SV40初期プロモーターやTKプロモーターなどの最小プロモーターを好適に用いることができる。ビタミンD3応答配列に結合するNF-YやSp-1と基本転写因子とが相互作用するために必要な距離は基本転写因子に応じて異なるため、本発明のビタミンD3応答配列を異種プロモーターに適用する場合には、必要に応じて繰り返し配列としてベクターに用いることが好ましい。通常は、本発明のビタミンD3応答配列を3〜5回の繰り返し配列として調製し、その中から最も反応性の高いものを選択して、ベクターに用いればよい。
また、本発明のスクリーニングに用いるレポーター遺伝子としては、その発現を検出しうるものであれば特に制限はなく、例えば、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、分泌型アルカリフォスファターゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子などを用いることができる。
こうして構築したベクターは細胞に導入し、この細胞に被検試料を接触させる。ベクターを導入する細胞としては、ビタミンD3刺激に応答して導入されたベクター上のレポーター遺伝子を発現させ得る細胞であれば特に制限はない。医薬品候補化合物をスクリーニングする目的の場合には、ベクターを導入する細胞は、ヒトを含む哺乳動物細胞であることが好ましい。例えば、哺乳動物細胞としてはU937細胞を好適に用いることができるが、これに制限されない。実験手法によっては、酵母や大腸菌などを用いることも考えられる。
細胞へのベクターの導入は、例えば、エレクトロポーレーション法、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソーム法、リポフェクションなどの当業者に公知の方法で行うことが可能である。
本発明のスクリーニング方法においては、こうして作製された細胞に被検試料を接触させ、レポーター活性を検出する。被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物などが挙げられる。p27Kip1遺伝子の発現を抑制する化合物をスクリーニングする場合には、被検試料に加えて、ビタミンD3を細胞に接触させてもよい。レポーター活性の検出は、レポーター遺伝子の種類に応じて当業者に公知の方法で行なうことができる。
その結果、被検試料を接触させない細胞におけるレポーター活性（対照）と比較して、レポーター活性を増加させる化合物を選択することにより、p27Kip1遺伝子の発現を促進する化合物をスクリーニングすることができ、一方、対照と比較してレポーター活性を低下させる化合物を選択することにより、p27Kip1遺伝子の発現を抑制する化合物をスクリーニングすることができる。
本発明者等は、また、ゲルシフトアッセイにより、NF-Yタンパク質が本発明のビタミンD3応答配列中のCCAATボックス配列に、Sp1タンパク質が本発明のビタミンD3応答配列中のSp1-1配列に結合することを明らかにした（実施例２、５）。さらに、ビタミンD3が誘導するp27Kip1の転写には、Sp1タンパク質とNF-Yタンパク質の両方が必要であることを明らかにした（実施例３）。本発明者らは、かかる知見に基づき、本発明のビタミンD3応答配列中に存在するCCAATボックス配列とNF-Yタンパク質との結合、あるいはSp1配列（Sp1-1配列）とSp-1タンパク質との結合を指標に、p27Kip1遺伝子の発現を調節する化合物をスクリーニングする方法を想到するに至った。
従って、本発明のp27Kip1遺伝子の発現を調節する化合物をスクリーニングする方法の他の態様は、
（ａ）  被検試料の存在下、本発明のビタミンD3応答配列に存在するCCAATボックス配列を含むDNA領域または該DNA領域に対応するヒト以外の生物のDNA領域を含むDNAに、NF-Yタンパク質を接触させる工程、（ｂ）  該DNAとNF-Yタンパク質との結合を検出する工程、および（ｃ）  被検試料の非存在下で検出した場合（対照）と比較して、該DNAとNF-Yタンパク質との結合を増強または減弱させる活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、並びに、
（ａ）  被検試料の存在下、本発明のビタミンD3応答配列に存在するSp1配列を含むDNA領域または該DNA領域に対応するヒト以外の生物のDNA領域を含むDNAに、Sp1タンパク質を接触させる工程、（ｂ）  該DNAとSp1タンパク質との結合を検出する工程、および（ｃ）  被検試料の非存在下で検出した場合（対照）と比較して、該DNAとSp1タンパク質との結合を増強または減弱させる活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法である。
具体的な手法としては、例えば、Sp-1配列あるいはCCAATボックス配列を基に作製したDNAプローブをアッセイプレートに結合させ、これに被検試料の存在下でリコンビナントSp-1あるいはNF-Yを作用させ、両者の結合を抗体などにより検出し、被検試料の非存在下で検出した場合と比較して、該結合を変化させる化合物を選択すればよい。逆に、リコンビナント蛋白質をアッセイプレートに結合させ、これに被検試料の存在下でDNAプローブを作用させてもよい。
また、One-hybrid法を用いることもできる。即ち、Sp-1配列と該配列に機能的に結合したレポーター遺伝子を含むベクターおよびSp-1発現ベクター、またはCCAATボックス配列と該配列に機能的に結合したレポーター遺伝子を含むベクターおよびNF-Y発現ベクターを、動物細胞、酵母、大腸菌などの細胞に組み込み、これに被検試料を接触させてレポーター活性を検出し、被検試料の非存在下で検出した場合と比較して、該レポーター活性を増強または減弱させる化合物を選択すればよい。
本発明のスクリーニングにより単離される化合物には、医療への応用が考えられる。p27タンパク質はサイクリン／cdkを阻害して細胞増殖を停止させることが知られているため、p27Kip1遺伝子の発現を促進する化合物は、例えば、悪性腫瘍、動脈硬化、あるいはバルーン冠動脈拡張手術後の血管内皮細胞増殖による再狭窄などの細胞増殖性疾患の治療などに、一方、p27Kip1遺伝子の発現を抑制する化合物は、例えば、再生不良性貧血、肝硬変、創傷治癒などの細胞増殖を必要とする疾患の治療などに有効であると考えられる。
なお、p27Kip1のmRNAが、U937細胞においてビタミンD3により誘導されることついては、すでに報告が存在する（Liu, M. et al. (1996) Genes Dev., 10, 142-153）が、本発明者等は、実際に、上記レポーター構築物を利用したスクリーニング系、並びにCCAATボックス配列とNF-Yタンパク質との結合およびSp1配列（Sp1-1配列）とSp-1タンパク質との結合を指標としたスクリーニング系において、ビタミンD3が正に作用することを明らかにした（実施例３から６）。これら事実は、本発明のスクリーニング系が、p27Kip1遺伝子の発現を調節する化合物のスクリーニングに有効であることを示すものである。
また、ビタミンD3が、p27Kip1遺伝子の5'上流に存在するビタミンD3応答配列中のCCAATボックス配列とNF-Yタンパク質との結合およびSp1配列（Sp1-1配列）とSp1タンパク質との結合を増強するという本発明者等により見出された新事実は、ビタミンD3あるいはその誘導体がこれら結合の促進剤として利用しうることを示すものである。従って、本発明は、また、ビタミンD3またはその誘導体を有効成分とする、p27Kip1遺伝子の5'調節領域に存在するCCAATボックス配列とNF-Yタンパク質との結合を増強するための薬剤、およびビタミンD3またはその誘導体を有効成分とする、p27Kip1遺伝子の5'調節領域に存在するSp1配列とSp1タンパク質との結合を増強するための薬剤を提供する。
本発明における「薬剤」には、試薬および医薬の双方が含まれる。
本発明の薬剤の有効成分の「ビタミンD3誘導体」としては、一般式（Ｉ）
0004828070.tif 000002
〔式中、R1 は-O-R2 、-S-R2 、-CH2 -R2 または-CH＝R2 （ここでR2 は1以上の水酸基で置換されていてもよい炭素数1から10の鎖状炭化水素基を示す）を示し、R3 は水素原子または水酸基を示す〕で表される化合物である。
このようなビタミンD3誘導体としては、特公平3-74656号公報、国際公開WO94/14766号公報、国際公開WO95/27697号公報、特表平4-506965号公報、特表平4-503669号公報、特開昭61-267549号公報などに記載のものが挙げられる。
一般式（Ｉ）において、水酸基で置換されていてもよい炭素数1から10の鎖状炭化水素基における鎖状炭化水素基とは、直鎖でも分岐鎖状でもよく、また、1つまたは複数の二重結合、三重結合などの不飽和結合を含んでいてもよい。不飽和結合としては二重結合が好ましい。炭素数1から10の鎖状炭化水素基上には不飽和結合の数を含まないか、または1つの二重結合を含む基が好ましい。
水酸基で置換されていてもよい炭素数1から10の鎖状炭化水素基の、鎖状炭化水素基部分のうち、不飽和結合を含まないものの例としては、たとえばメチル基、エチル基、n-プロピル基、I-プロピル基、n-ブチル基、I-ブチル基、s-ブチル基、t-ブチル基のほか、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デカニル基などが挙げられる。好ましくは、3-メチルブチル基、3-エチルペンチル基、4-メチルペンチル基、3-（n-プロピル）ヘキシル基、4-エチルヘキシル基、5-メチルヘキシル基、6-メチルヘプチル基、5-エチルヘプチル基、4-（n-プロピル）ヘプチル基などがあげられさらに好ましくは、3-メチルブチル基、3-エチルペンチル基、4-メチルペンチル基、4-エチルヘキシル基などがあげられる。最も好ましいものとして3-メチルブチル基があげられる。
また、鎖状炭化水素基は水酸基で置換されていてもいなくてもよく、水酸基で置換されている場合における水酸基の数の例としては、たとえば1，2，3，などがあげられ、好ましくは1または2であり、さらに好ましくは1である。
1以上の水酸基で置換されている炭素数1から10のアルキル基の例としては、3-ヒドロキシ-3-メチルブチル基、2-ヒドロキシ-3-メチルブチル基、4-ヒドロキシ-3-メチルブチル基、2，3-ジヒドロキシ-3-メチルブチル基、2，4-ジヒドロキシ-3-メチルブチル基、3，4-ジヒドロキシ-3-メチルブチル基、3-ヒドロキシ-3-エチルペンチル基、2-ヒドロキシ-3-エチルペンチル基、4-ヒドロキシ-3-エチルペンチル基、2，3-ジヒドロキシ-3-エチルペンチル基、2，4-ジヒドロキシ-3-エチルペンチル基、3，4-ジヒドロキシ-3-エチルペンチル基、4-ヒドロキシ-4-メチルペンチル基、3-ヒドロキシ-4-メチルペンチル基、5-ヒドロキシ-4-メチルペンチル基、3，4-ジヒドロキシ-4-メチルペンチル基、3，5-ジヒドロキシ-4-メチルペンチル基、4，5-ジヒドロキシ-4-メチルペンチル基、3-ヒドロキシ-3-（n-プロピル）ヘキシル基、4-ヒドロキシ-3-（n-プロピル）ヘキシル基、2-ヒドロキシ-3-（n-プロピル）ヘキシル基、2，3-ジヒドロキシ-3-（n-プロピル）ヘキシル基、3，4-ジヒドロキシ-3-（n-プロピル）ヘキシル基、2，4-ジヒドロキシ-3-（n-プロピル）ヘキシル基、3-ヒドロキシ-4-エチルヘキシル基、4-ヒドロキシ-4-エチルヘキシル基、5-ヒドロキシ-4-エチルヘキシル基、3，4-ジヒドロキシ-4-エチルヘキシル基、3，5-ジヒドロキシ-4-エチルヘキシル基、4，5-ジヒドロキシ-4-エチルヘキシル基、4-ヒドロキシ-5-メチルヘキシル基、5-ヒドロキシ-5-メチルヘキシル基、6-ヒドロキシ-5-メチルヘキシル基、4，5-ジヒドロキシ-5-メチルヘキシル基、4，6-ジヒドロキシ-5-メチルヘキシル基、5，6-ジヒドロキシ-5-メチルヘキシル基、5-ヒドロキシ-6-メチルヘプチル基、6-ヒドロキシ-6-メチルヘプチル基、7-ヒドロキシ-6-メチルヘプチル基、5，6-ジヒドロキシ-6-メチルヘプチル基、5，7-ジヒドロキシ-6-メチルヘプチル基、6，7-ジヒドロキシ-6-メチルヘプチル基、4-ヒドロキシ-5-エチルヘプチル基、5-ヒドロキシ-5-エチルヘプチル基、6-ヒドロキシ-5-エチルヘプチル基、4，5-ジヒドロキシ-5-エチルヘプチル基、4，6-ジヒドロキシ-5-エチルヘプチル基、5，6-ジヒドロキシ-5-エチルヘプチル基、3-ヒドロキシ-4-（n-プロピル）ヘプチル基、4-ヒドロキシ-4-（n-プロピル）ヘプチル基、5-ヒドロキシ-4-（n-プロピル）ヘプチル基、3，4-ジヒドロキシ-4-（n-プロピル）ヘプチル基、3，5-ジヒドロキシ-4-（n-プロピル）ヘプチル基、4，5-ジヒドロキシ-4-（n-プロピル）ヘプチル基などがあげられ、好ましくは3-ヒドロキシ-3-メチルブチル基、2-ヒドロキシ-3-メチルブチル基、2，3-ジヒドロキシ-3-メチルブチル基、3，4-ジヒドロキシ-3-メチルブチル基、3-ヒドロキシ-3-エチルペンチル基、2，3-ジヒドロキシ-3-エチルペンチル基、3，4-ジヒドロキシ-3-エチルペンチル基、4-ヒドロキシ-4-メチルペンチル基、3，4-ジヒドロキシ-4-メチルペンチル基、4，5-ジヒドロキシ-4-メチルペンチル基、4-ヒドロキシ-4-エチルヘキシル基などがあげられ、さらに好ましくは、3-ヒドロキシ-3-メチルブチル基、3-ヒドロキシ-3-エチルペンチル基、4-ヒドロキシ-4-メチルペンチル基などがあげられる。最も好ましいものとしては3-ヒドロキシ-3-メチルブチル基があげられる。
また、鎖状炭化水素基のうち不飽和結合を含むものの例としては、上記飽和炭化水素基の1つまたは複数の、好ましくは1つの結合が、不飽和結合、好ましくは二重結合となっているものがあげられる。不飽和結合を含む鎖状炭化水素基の特に好ましい例としては、＝CH-CH＝CH-CH（CH2CH3）2があげられ、水酸基で置換されているものとしては、＝CH-CH＝CH-C（CH2CH3)2 OHがあげられる。また、一般式（Ｉ）において、R3 は水酸基であることがより好ましい。
本発明のスクリーニングにより単離し得るp27Kip1遺伝子の発現を調節する化合物（ビタミンD3を含む）をヒトや他の哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、タンパク質や単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。
例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80（TM）、HCO-50と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がDNAによりコードされうるものであれば、該DNAを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
本発明の薬剤の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重60kgとして）においては、1日あたり約0.1から100mg、好ましくは約1.0から50mg、より好ましくは約1.0から20mgである。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重60kgとして）においては、1日あたり約0.01から30mg、好ましくは約0.1から20mg、より好ましくは約0.1から10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量、あるいは体表面積あたりに換算した量を投与することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例および参考例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、ヒト子宮頸癌細胞株C33A、ヒト骨肉種細胞株U2OS、およびヒト骨肉種細胞株MG63は、10％ウシ胎仔血清（FBS）を含むダルベッコ改変イーグル培地で維持し、37℃、5% CO2 を含む湿大気中で培養した。ヒトの骨髄性単球細胞株U937（埼玉がんセンター研究所のY. Honma博士より寄贈）は、10％(v/v)のウシ胎仔血清を含むRPMI 1640中で、5％ CO２ 大気中で培養した。単球分化の誘導は、細胞を1,25-ジヒドロキシビタミンD3 （和光、東京、日本）の存在下で培養することで行った。
以下にプラスミド構築および変異導入について記載する。ヒトp27Kip1−ルシフェラーゼ融合プラスミド p27PF、およびその欠失変異体 p27ApaI、p27AfiII、および p27SacIIは以前記載した（Minami, S. et al. (1997) FEBS Lett., 411, 1-6）。他の欠失変異体 p27No.1、p27No.2、p27No.12、および p27MB-435はKilo-sequence Deletion Kit（Takara）を用いたMungbean-Exonuclease III システムにより作製した。これらは、pGL2 Basic Vector（Promega）のXhoI切断部位にサブクローニングすることによって作製した。
p27PFの点変異を持つプラスミド（p27mSp1-1、p27mSp1-2、およびp27mCTF）は、Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）を用いた部位特異的変異導入（Landt, O. et al. (1990) Gene, 96, 125-128）により作製した。用いたオリゴヌクレオチドの片鎖の配列を、変異箇所に下線を付けて示す：p27mSp1-1, 5'-CAGCCTCGGCGGGATGGCTCCCGCCG-3'（配列番号：２）; p27mSp1-2, 5'-CGGGGCGGCTCCTACCGCCGCAACCAATG-3'（配列番号：３）; p27mCTF, 5'-GCCGCCGCAACCTTTGGATCTCCTCC-3'（配列番号：４）。望ましくない変異を避けるため、これら３つの変異体の-774/-12に相当する各ApaI-HindIII断片を、ApaIとHindIIIで切断したp27PFにサブクローニングし直した。作製したすべての構築物は制限酵素解析とシークエンスにより確認した。
さらに、p27Kip1 プロモーターの特定の配列が4回タンデムに繰り返したコピーを最小プロモーターに融合させた構築物を作製した。ヒトp27Kip1 プロモーターの-555/-512領域に相当する44bpの配列と、その両端にリンカー部位（下記に小文字で示す）を含む52bpの２本鎖DNA断片を、2つのオリゴヌクレオチドから作製した。上側鎖（5'-agggAGCCTCGGCGGGGCGGCTCCCGCCGCCGCAACCAATGGATCTCC-3'）（配列番号：５）および下側鎖（5'-ccctGGAGATCCATTGGTTGCGGCGGCGGGAGCCGCCCCGCCGCCGAGGCT-3'）（配列番号：６）をアニーリングさせ、ライゲーションし、平滑末端化してPicaGene Promoter Vector 2（日本ジーン、東京、日本）のSV40初期プロモーターの上流のSmaI切断部位に順方向または逆方向にサブクローニングし、各々、PGPV2[-555/-512wild]4 およびPGPV2[R-555/-512wild]4 を作製した。同様に、３種類の変異を導入した44bpの2本鎖のオリゴヌクレオチドも同じベクターに挿入し、変異構築物PGPV2[-555/-512mSp1-1]4 、PGPV2[-555/-512mSp1-2]4 、PGPV2[-555/-512mCTF]4 を作製した（表１を参照のこと）。以下に実施例３〜６で用いたオリゴヌクレオチドを示す。
0004828070.tif 000003
表中、Sp1およびNF-Yのコンセンサス配列は太字で表した。変異させた配列は下線で示した。また、オリゴマーの末端のリンカー配列は小文字で表した。
[実施例１]  p27Kip1 プロモーターのシス配列の同定
ヒトp27Kip1 プロモーター活性に必要なシス配列を同定するため、-774から-435の間を段階的に欠失させた変異体を上記の通り作製し、C33A、MG63、およびU2OS細胞に一過的にトランスフェクトした。C33AとU2OSは、それぞれp53およびRB遺伝子に変異を起こしている細胞と変異を起こしていない細胞の代表として用いた。MG63細胞は、p53遺伝子は再編成を受けているが、RB遺伝子はインタクトな細胞の代表として用いた。
C33A細胞（3×105細胞）、MG63細胞（3×105細胞）およびU2OS細胞（3×105細胞）を直径6cmの組織培養ディッシュに撒き、24時間後、レポータープラスミド 2μg、およびアクチンプロモーターにより発現するβガラクトシダーゼを含むプラスミド pACTβ-gal 1μgをリン酸カルシウム共沈殿法（Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）により細胞に共トランスフェクトした。48時間および24時間後に、以前記載したように（Brasier, A.R. et al. (1989) Biotechniques, 7, 1116-1122）して細胞を回収し、抽出物を調節後、ルシフェラーゼアッセイを行った。各細胞溶解物のルシフェラーゼ活性を測定し、細胞溶解物中のβガラクトシダーゼ活性でノーマライズした。すべてのトランスフェクションアッセイは３連で行った。各実験は少なくとも２回繰り返した。
図１に示したように、C33A細胞において、-549までの欠失（p27No.2）はプロモーター活性に有意な変化を起こさなかったが、-511までの欠失（p27No.12）はプロモーター活性を顕著に低下させた。U2OS細胞およびMG63細胞においても同様の結果が得られた（データ省略）。これらの結果は、-549から下流に調節配列が存在していることを示しており、特に-511までの欠失によりプロモーター活性が劇的に低下したことは、-549と-511の間の領域（転写開始点から-112および-74の間）に、基本的プロモーター活性に必要な配列が含まれていることを示唆している。
この39bp領域の配列には２つのコンセンサスSp1結合部位と１つのCCAAT box（CTF部位）が含まれている。本発明者らは、この２つのSp1部位をSp1-1とSp1-2と名付けた（図２）。この２つのSp1部位とCCAAT boxが p27Kip1 の転写調節に関与しているのかを調べるため、全プロモーターを有するp27PFの各Sp1部位またはCCAATボックスに変異を入れたプラスミド（それぞれp27mSp1-1、p27mSp1-2、p27mCTF）を上記の通り作製した（図２）。これらの構築物をC33A、MG63、およびU2OS細胞に上記の通り一過的にトランスフェクトし、そのルシフェラーゼ活性を測定した。図２に示したように、すべての細胞株において、CCAATボックス中の2bpの変異はp27PFのプロモーター活性を有意に低下させた。さらに、Sp1-2部位の変異は影響を与えなかったが、Sp1-1部位の変異は、U2OS細胞でのp27PFのプロモーター活性を有意に低下させた（図２下パネル）。C33AおよびMG63細胞では、Sp1-1部位の変異によるプロモーター活性の低下はU2OS細胞ほどではなかった(図２；MG63のデータは省略）。この結果は、CCAAT boxはp27Kip1遺伝子の基本的なプロモーター活性を最大化するために必須であり、Sp1-1部位は細胞株に依存したプロモーター活性に必要であることを示している。
[実施例２]  p27Kip1プロモーターにトランスに作用する因子の同定
CCAAT boxに相互作用するトランスに働く因子(群)を同定するため、CCAAT boxを含むヒトp27Kip1プロモーターの-530から-510までのオリゴヌクレオチド（WT-530/-510）を32Pでラベルし、EMSA（ゲルシフトアッセイ）を行った。
核抽出物をAndrews & Faller（Andrews, N.C. and Faller, D.V. (1991) Nucleic Acids Res., 19, 2499）の方法により調製した。ゲルシフトアッセイの反応液（最終20μl）は、20mM Tris-HCl (pH8.0), 50mM NaCl, 1mM DTT, 1mM EDTA, 10% glycerol, 0.05% Nonidet P-40, 5μg ウシ血清アルブミン(BSA), 2μg poly(dI-dC), および 5μg 核抽出物を含む。室温で5分プレインキュベートした後、プローブDNA（約 2ng, 20,000cpm）を反応液に加え、20分室温で結合させた。産物は、5％ポリアクリルアミド−ビスアクリルアミド（29:1）, 0.5×TBEの非変性ゲルで10V/cmで120分泳動した。後述の実験で用いた転写因子特異的に結合するオリゴヌクレオチドも含め、これらのアッセイで用いたオリゴヌクレオチドの片鎖の配列を、変異箇所に下線を付けて示す：WT-530/-510, 5'-CTAGCGCCGCAACCAATGGATCTCC-3'（配列番号：７）; MUT-530/-510, 5'-CTAGCGCCGCAACCTTTGGATCTCC-3'（配列番号：８）; NF-I, 5'-CTAGTTTTGGATTGAAGCCAATATGATAA-3'（配列番号：９）（Jones, K.A. et al. (1987) Cell, 48, 79-89）; NF-Y, 5'-ACTTTTAACCAATCAGAAAAATCTAG-3'（配列番号：１０）（Dorn, A. et al. (1987) Cell, 50, 863-872）; CP2, 5'-CTAGTGACCAGTTCCAGCCACTCTTTA-3'（配列番号：１１）（Chodosh, L.A. et al. (1988) Cell, 53, 11-24）。競合アッセイは、核抽出物を加える前に図示した量の適当な競合DNAを結合反応液に加え、混合することにより行った。後述のスーパーシフト実験では、プローブDNAを加える前に、NF-YBに対する抗体（IgG分画）またはC/EBPαに対する抗体（sc-7204X; Santa Cruz）を、核蛋白質を含むインキュベーション混合液に加えた。NF-YBに対する抗体はR. Mantovani博士より寄贈されたものを用いた。
プローブをC33A細胞の核抽出物とインキュベートすると、3本のシフトしたバンドが観察された。その中で、最も移動度の遅い複合体だけは、過剰量の標識していないWT-530/-510でコンピートアウトされ、CCAATをCCTTTに変異させたMUT-530/510ではコンピートアウトされなかった。このことは、核蛋白質(群)が、WT-530/-510プローブのCCAAT配列に特異的に結合し得ることを示唆している。
CCAAT配列は、NF-Y（CPI)、NF1（CTF）、CP2、およびC/EBPを含む様々な核蛋白質と相互作用することが示されている（Dorn, A. et al. (1987) Cell, 50, 863-872; Chodosh, L.A. et al. (1988) Cell, 53, 11-24; Hooft van Huijsduijnen, R.A. et al. (1987) Nucleic Acids Res., 15, 7265-7282; Maity, S.N. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5378-5382; Mahoney, C.W. et al. (1992) J. Biol. Chem., 267, 19396-19403）。どの核蛋白質が-524/-519 CCAATボックスに結合するのかを調べるため、これらの転写因子のいずれかに特異的に結合することが報告されているCCAAT配列を持つオリゴヌクレオチドを用いて、競合EMSAを行った（Jones, K.A. et al. (1987) Cell, 48, 79-89; Dorn, A. et al. (1987) Cell, 50, 863-872; Chodosh, L.A. et al. (1988) Cell, 53, 11-24; Graves, B.J. et al. (1986) Cell, 44, 565-576）。図３に示したように、WT-530/-510プローブへの因子の結合は、NF-Y結合部位を持つオリゴヌクレオチド（NF-Y, レーン7および8）の過剰量により、WT-530/-510プローブ(レーン3および4）の過剰量と同程度の競合を受けることが判明した。その一方で、NF1やCP2結合部位を持つオリゴヌクレオチドは効率よく競合することはなかった（図３, レーン5, 6, 9, および10）。それに加え、NF-Yプローブを使ってゲルシフトを起こさせた場合、過剰量のWT-530/-510およびNF-Yプローブにより競合を受けたが、MUT-530/-510プローブでは競合を受けなかった（データ省略）。これらの結果は、ユビキタスな転写因子であるNF-Yが、p27Kip1プロモーターのCCAAT boxに結合し得ることを示唆している。
WT-530/-510プローブに結合する因子がNF-Yであるのかを確かめるため、抗体を用いたスーパーシフト実験を行った。NF-Yは３つのサブユニット、NF-YA、NF-YB、およびNF-YCよりなるので、抗体としてNF-YのBサブユニットに対する抗体（Mantovani, R. et al. (1992) EMBO J., 11, 3315-3322; Huang, L. et al. (1994) J. Virol., 68, 2108-2117; Liu, Q. et al. (1998) Circ. Res., 82, 251-260）を用い、C/EBPαに対する抗体（Landschulz, W.H. et al. (1988) Genes Dev., 2, 786-800）を陰性対照として使用した。図４に示したように、抗NF-YB抗体存在下で複合体はスーパーシフトを起こしたが、抗C/EBP抗体では起こさなかった（レーン2-5）。このことから、p27Kip1プロモーターのCCAAT boxにNF-Yが結合することが実証された。
p27Kip1の転写調節にNF-Yが関与していることを確認するため、ドミナントネガティブのNF-YA変異体の発現プラスミド（pNF-YA29）（Liu, Q. et al. (1998) Circ. Res., 82, 251-260; Mantovani, R. et al. (1994) J. Biol. Chem., 269, 20340-20346; Jackson, S.M. et al. (1995) J. Biol. Chem., 270, 21445-21448）またはその親プラスミド（pSG5）と共にp27PFまたはp27mCTFをコトランスフェクトした。ドミナントネガティブNF-YA発現プラスミド（pNF-YA29）はミラノ大学のR. Mantovani博士より寄贈されたものを用いた。図５に示したように、p27PFのルシフェラーゼ活性は、pNF-YA29のコトランスフェクションにより約70％に減少した。この結果は、NF-Yがp27Kip1の転写を、p27Kip1プロモーターのCCAAT boxを介して、少なくとも部分的に調節していることを示唆している。
[実施例３]  p27Kip1プロモーターにおけるビタミンD3応答配列
p27Kip1およびp21Cip1は、ビタミンD3によって転写誘導されることが報告されている（Liu, M. et al. (1996) Genes Dev., 10, 142-153）。更に、本発明者らは、ビタミンD3処理したU937細胞でp27Kip1 mRNAが誘導され、これは24時から48時までの間にピーク（0時間に比べておよそ4倍）に達する一方で、p21Cip1 mRNAはより早く誘導されることを見出した。このことは、p21Cip1 転写の場合とは異なり、VDR/VDRE非依存的な様式でビタミンD3 がp27Kip1 の転写を調節していることを示唆している。p27Kip1の遺伝子発現の調節メカニズムを調べるために、本発明者らはまず、p27Kip1遺伝子のプロモーターの転写活性に対するビタミンD3の作用を調べた。すなわち、野生型p27Kip1プロモーター−ルシフェラーゼ融合プラスミドであるp27PFに対するビタミンD3の作用を、一過性のトランスフェクションにより試験した。
U937細胞へのトランスフェクションは文献（Pahl, H.L. et al. (1991) Exp. Hematol., 19, 1038-1041）に記載されたように行った。簡単に述べると、細胞に対し250V、960μF（BioRad Gene Pulser: BioRad）の条件で電気穿孔を行い、氷上で15分間インキュベートした後、20mlのあらかじめ暖めておいた10％FBS含有RPMI 1640中に移し、2つの培地へ均等に分割した。これらを1×10-7 M ビタミンD3（1,25-ジヒドロキシビタミンD3；以降の実施例３から６で用いるビタミンD3は「1,25-ジヒドロキシビタミンD3」を示す）または10μLの溶媒（エタノール）のいずれかと共にインキュベートした。処理後40時間で細胞を回収し、抽出物を調製後、デュアル・ルシフェラーゼレポーターアッセイ（Promega）を説明書に従って用いて、ルシフェラーゼアッセイを行った。全てのトランスフェクションは、pGL2 Basic VectorまたはPicaGene Promoter Vector 2を参照試料として含めた。トランスフェクション効率を標準化するために、レニラ（renilla;ウミシイタケ）のルシフェラーゼ発現プラスミド（pRL-TK, Promega）2μgをこれらのトランスフェクションに含めて行った。レポータールシフェラーゼ活性を、pGL2 Basic VectorまたはPicaGene Promoter Vector 2に相当する試料で測定した本来の活性を差し引くことによって算出し、その後pRL-TKの活性によって測定したトランスフェクション効率によりノーマライズした。
ビタミンD3に40時間曝させた後では、p27PFプラスミドのルシフェラーゼ活性は、溶媒で処理した対照のおよそ3〜4倍に増加した（図６）。この結果は、本発明者らにより行われたノーザン分析によるp27Kip1発現に対するビタミンD3の作用に関する知見に一致しており、この3.6kbプロモーター断片が、p27Kip1遺伝子のビタミンD3に対する応答にとって必要十分であることを示している。次に、この3.6kb断片のどの特定領域がビタミンD3に応答するかを決定しようとした。この目的のために、一連のp27Kip1プロモーターの5'側欠失構築物を試験した。図６に示されたように、-549位（翻訳開始部位に対して）までの欠失は、ビタミンD3 に対する応答の顕著な変化を生じず、-511までの欠失によってこの応答が完全に失われた一方で、-311までの欠失は、ビタミンD3の非存在下においても、ある程度のプロモーター活性が認められた。これらの結果は、潜在的なビタミンD3調節配列が、-549と-511の間に存在すると考えられることを示している。
-549と-511の間の領域には、2個のSp1部位（-544と-534）、ならびにCCAATボックス（-522）が互いに近接して存在し、これらはヒトとマウスのp27Kip1プロモーター間で保存されている（Minami, S. et al. (1997) FEBS Lett., 411, 1-6; Zhang, Y. and Lin, S.C. (1997) Biochem. Biophys. Acta., 1353, 307-317）。前述のように、本明細書においては、2個の上流側のSp1部位をSp1-1およびSp1-2と称する（図７）。これら2個のSp1部位とCCAATボックスがビタミンD3による活性化に関与しているかどうかを決定するために、Sp1-1部位、Sp1-2部位、またはCCAATボックスに変異を持つ一連のp27PF変異体（それぞれ、p27mSp1-1、p27mSp1-2、およびp27mCTF）を用いた実験を行った（図７）。図７に示したように、ビタミンD3に対する応答は、p27mSp1-1とp27mCTFを用いた場合に失われたが、p27mSp1-2では失われなかった。他方で、全ての変異体が、ビタミンD3の非存在下においてもある程度のプロモーター活性を保持していた。従って、本発明者らは、少なくともSp1-1とCCAATボックスの両方がビタミンD3応答配列であり、Sp1-2部位はビタミンD3による活性化に関与していないと結論した。
[実施例４]  Sp1-1部位およびCCAATボックスを含む-555/-512の44bpの調節配列は、異種プロモーターにビタミンD3に対する応答性を付与する
-555の下流側に互いに近接して位置しているSp1-1部位とCCAATボックスを介したビタミンD3の調節を調べるために、Sp1-1部位、Sp1-2部位、またはCCAATボックスをそのまま持つか、または変異をさせた-555/-512に相当する配列の4回のタンデムなコピーを、PicaGene Promoter Vector 2内のSV40初期プロモーターの上流に順方向（PGPV2[-555/-512wild]4 、PGPV2[-555/-512mSp1-1]4 、PGPV2[-555/-512mSp1-2]4 、およびPGPV2[-555/-512mCTF]4 ）、または逆方向（PGPV2[R-555/-512wild]4 ）に挿入したプラスミドを上記のように構築した（図８）。図８に示したように、p27Kip1プロモーターの-555と-512の間に相当する44bp断片の4個のコピーは、U937細胞へ一過性にトランスフェクトすることにより、SV40初期プロモーターに顕著なビタミンD3に対する応答性を方向依存的に付与したが、同じ断片が１コピー存在するだけでは、ビタミンD3に対して応答しなかった。Sp1-1またはCCAATボックスのいずれかに導入された変異（各々、PGPV2[-555/-512mSp1-1]4 、PGPV2[-555/-512mCTF]4 ）は、ビタミンD3によるあらゆる刺激効果を失わせたが、一方でSp1-2部位に変異を有する構築物（PGPV2[-555/-512mSp1-2]4 ）のルシフェラーゼ活性は、p27PFおよびPGPV2[-555/-512wild]4 と同様に、ビタミンD3によって活性化された。本発明者らは、翻訳開始部位に対して-555〜-512の間の領域（転写開始部位に対して-118〜-75の間）が、p27Kip1 遺伝子のビタミンD3が誘導する転写にとって十分であると結論した。更に、この領域のSp1-1部位とCCAATボックスは両方共、ビタミンD3応答配列であり、ビタミンD3により誘導されるp27Kip1遺伝子の転写に必要であった。
[実施例５]  ビタミンD3 応答配列と相互作用する核蛋白質の同定
ビタミンD3 応答配列に結合する核因子を同定するために、-555から-512のオリゴヌクレオチドセットを、ゲルシフトアッセイ用のプローブとして用いた（-555/-512wild、表１を参照のこと）。ビタミンD3で36時間処理したU937細胞から核抽出物を調製し、ゲルシフトアッセイを下記のように行った。
U937細胞の核抽出物を、AndrewおよびFallerの方法（Andrews, N.C. and Faller, D.V. (1991) Nucleic Acids Res., 19, 2499）に従って調製した。細胞は、抽出前に1×10-7 M ビタミンD3または溶媒のいずれかにより36時間処理した。ゲルシフトアッセイは、Oritaらの方法（Orita, T. et al. (1997) J. Biol. Chem., 272, 23216-23223）に従って行った。ゲルシフトアッセイ用反応混合液（最終容量25μL）は、20mM Tris-HCl (pH 8.0)、100mM KCl、10％グリセロール、1μgポリ(dI-dC)、および核抽出物 2μgを含む。この混合物を23℃で15分間プレインキュベートした後、プローブDNA（約0.5ng、10,000cpm）を添加し、結合反応を23℃で20分間行わせた。その後得られた生成物を、4％アクリルアミド−ビスアクリルアミド（29:1）、0.5×TBE未変性ゲル上で、10V/cmで150分間電気泳動することによって分離した。競合分析は、核抽出物を添加する前に、結合反応液に対し記載した量の適当な競合DNAを混合することにより行った。スーパーシフト実験で用いたSp1（sc-59X; Santa Cruz）、Sp3（sc-644X; Santa Cruz）、およびC/EBPα（sc-7204X; Santa Cruz）に対する抗体は商業的に購入した。NF-YA、-YB、および-YC（IgG分画）に対する抗体は、T. Orita博士とS. Nagata博士（大阪大学医学部）から供与された。これらの抗体は、プローブDNAを添加する前に、核蛋白質を含むインキュベーション混合液に添加した。
図９に示したように、オリゴヌクレオチド-555/-512wildは、遅れて泳動される主要な１本のバンドを生じ（レーン1）、これは、過剰量の非標識のオリゴヌクレオチドによって競合的に除去された（レーン2および3）。核因子(群)に結合する配列の位置を決定するために、Sp1-1、Sp1-2、またはCCAATボックスに点変異を有する一連のオリゴヌクレオチド（各々、-555/-512mSp1-1、-555/-512mSp1-2、および-555/-512mCTF）、Sp1部位またはCCAATボックスについて野生型または変異した配列を有するオリゴヌクレオチド（Sp1wild、Sp1mt、およびNF-Ywild）、ならびに-534から-512（-534/-511）のオリゴヌクレオチドを競合物質として用いた。レーン4〜17に示したように、遅れて泳動されるバンドは、-555/-512mSp1-1、Sp1mt、NF-Ywild、または-534/-512wildの添加によっては競合されないことから、Sp1ファミリー蛋白質(群)はSp1-1部位に結合することが示された。この遅れたバンドがSp1とSp3のどちらの結合によるのかを調べるため、核抽出物を抗Sp1抗体または抗Sp3抗体でプレインキュベートしてバンドをスーパーシフトさせ、ゲルシフトアッセイを行った（Nakano, K. et al. (1997) J. Biol. Chem., 272, 22199-22206）。図１０に示したように、抗Sp1抗体存在下で複合体はスーパーシフトしたが、抗Sp3抗体ではスーパーシフトは起こらなかった。従って、U937細胞において、p27Kip1 プロモーターのビタミンD3 調節領域のSp1-1部位には、Sp1が結合すると結論される。
更に本発明者らは、CCAATボックスを有するが、Sp1-1およびSp1-2部位は有さない-534〜-512の間の配列について解析した。この領域のオリゴヌクレオチドのセットを用いて、ゲルシフトアッセイを行った。図１１に示したように、遅れて泳動される１本の主要なバンドが検出され、これは過剰量の非標識野生型オリゴヌクレオチド（-534/-512wild）で競合されたが、CCAATボックスに変異を有するもの（-534/-512mCTF）では競合されなかった（レーン1〜5）。このことは、核因子(群)はp27Kip1 プロモーターのCCAATボックスに結合することを示している。これまでに、NF-Y、C/EBP、CBP、およびNF-Iを含むいくつかの異なる転写因子が、CCAAT配列に結合できることが報告されている（Dorn, A. et al. (1987) Cell, 50, 863-872; Graves, B.J. et al. (1986) Cell, 44, 565-576; Hooft van Huijsduijnen, R.A. et al., (1987) Nucleic Acids Res., 15, 7265-7282; Chodosh, L.A. et al. (1988) Cell, 53, 11-24）。
p27Kip1プロモーターの調節領域のCCAATボックスに、どの転写因子が結合するかを明らかにするために、NF-Y、C/EBPα、またはNF-Iに高い親和性で結合することが報告されているCCAAT配列を有する非標識オリゴヌクレオチド（各々、NF-Ywild、C/EBP-αwild、およびNF-Iwild）を用いて競合実験を行った。図１１に示したように、遅れたバンドは、NF-Ywildの添加によって競合されたが、NF-IwildやC/EBP-αwildでは競合されなかった。このことは、NF-YがこのCTF部位に結合することを示唆している。
この結果を確認するために、抗NF-Y抗体を用いてスーパーシフトアッセイを行った。NF-Yは３つのサブユニット、NF-YA、NF-YB、およびNF-YCで構成されている。そこで、抗NF-YA、抗NF-YB、および抗NF-YC抗体（Orita, T. et al. (1997) J. Biol. Chem., 272, 23216-23223; Mantovani, R. et al. (1992) EMBO J., 11, 3315-3322）、ならびに抗C/EBP-α抗体を使用してスーパーシフト実験を行った。図１２に示したように、抗NF-YA、抗NF-YB、または抗NF-YC抗体の存在下において、この複合体のスーパーシフトが起こった。抗C/EBP-α抗体の添加は、この複合体に影響を及ぼさなかった。これらの結果から、三量体NF-Yがp27Kip1プロモーターの調節領域のCCAATボックスに結合することが実証された。
NF-Yが、-534/-512wild配列のCCAATボックスに結合するのみならず、-555/-512wild配列のこの部位にも結合することを証明するために、再度、Sp1-1、Sp1-2、またはCTF部位に変異を有したり有さなかったりする-555から-512のオリゴヌクレオチドを競合物質として用いて実験を行った。同じ目的のために、-555/-512wildプローブと核蛋白質の複合体の形成に対する、抗NF-YA、抗NF-YB、または抗NF-YC抗体の添加の影響をゲルシフトアッセイにより調べた。抗NF-YA、抗NF-YB、または抗NF-YC抗体の添加は、-555/-512wildと核蛋白質の複合体には影響を及ぼさなかった。しかしながら、図１１に示したように、プローブ-534/-512wildへのNF-Yの結合Yは、-555/-512wild、-555/-512mSp1-1、および-555/-512mSp1-2によって、-534/-512wildよりも効果は小さいものの競合された。一方、-534/-512wildへのNF-Yの結合は、-555/-512mCTFによっては影響を受けなかった。これらの結果は、NF-Yが、-534/-512wildのCCAATボックスに加え、-555/-512wildのこの部位にも結合することを示している。従って、Sp1およびNF-Yは、それぞれ、Sp1-1部位およびCCAATボックスに結合し、これらの配列はp27Kip1遺伝子のビタミンD3により誘導される転写に必要な調節配列であると結論される。
p27Kip1のビタミンD3により誘導される転写へのNF-Yの関与を更に確認するために、p27PFまたはp27mCTFを、ドミナントネガティブNF-YA変異体発現プラスミド（pNF-YA29）（Mantovani, R. et al. (1994) J. Biol. Chem., 269, 20340-20346）と共にコトランスフェクトした。図１３に示したように、pNF-YA29は、ビタミンD3が誘導するp27PFからのルシフェラーゼ活性を、用量依存的に抑制したが、p27mCTFでは抑制されなかった。この結果は、NF-Yが、ビタミンD3によるp27Kip1 転写のアップレギュレーションを、そのプロモーターのCTF部位を介して媒介したことを直接実証するものである。
[実施例６]  ビタミンD3処理後のSp1およびNF-Yサブユニットの解析
前述の結果は、Sp1およびNF-Yが、p27Kip1遺伝子のビタミンD3が誘導する転写における必須のレギュレーターであることを強く示唆している。Sp1とNF-Yがp27Kip1遺伝子の転写を調節するメカニズムを調べるために、p27Kip1プロモーターへのSp1およびNF-Yの結合が、ビタミンD3処理後に変化するかどうかを、実施例５と同様のゲルシフトアッセイを用いて調べた。ビタミンD3または溶媒単独のいずれかで36時間処理したU937細胞から核抽出物を調製した。プローブとして、-555/-5l2wildオリゴヌクレオチド、もしくは-534/-512wildオリゴヌクレオチドを用いて、各々、Sp1およびNF-Yを検出した。図１４に示したように、Sp1およびNF-Yの結合活性は、ビタミンD3処理後に顕著に上昇することが観察された。無関係の転写因子であるNF-IのDNA結合活性はビタミンD3処理によって変化しなかったので、ビタミンD3処理は、Sp1とNF-Yのp27Kip1プロモーターへの結合を特異的に刺激すると結論された。
Sp1とNF-Yサブユニットの蛋白質レベルを分析するために、異なる時間10-7 MのビタミンD3または溶媒単独で処理したU937細胞を回収した。ここから、以下のように全細胞抽出物を調製し、これらの蛋白質の量をウェスタンブロッティングにより解析した。
ビタミンD3処理後、回収した細胞（3×107）を冷PBSで2回洗浄し、150μLの溶解バッファー（50mM Tris-HCl [pH 7.9]、150mM NaCl、0.1% SDS、0.5% デオキシコール酸、1% Nonidet P-40、10% グリセロール、0.2mM PMSF、および10μg/ml アプロチニン）に再懸濁した。これに穏やかな超音波処理を施し、全細胞抽出物として使用した。抽出物（1×106 細胞から）を、12％SDS-PAGEで泳動し、ポリビニリデン・ジフルオリド膜（PVDF膜; Millipore）上にブロットした。これらの膜を、一次抗体と共にインキュベートし、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体と共にインキュベートした。生成した免疫複合体は、増強化学発光システム（ECL; Amersham）を用いて可視化した。NF-YA、-YB、および-YCに対する抗体、ならびにSp1に対する抗体（sc-59; Santa Cruz）は、各々、ブロッキングバッファー（PBS中の3％粉ミルク）中に1:1000および1:200に希釈して用いた。
図１５に示したように、Sp1のレベルは、ビタミンD3処理後12時間から18時間までわずかに上昇し、36時間以降のSp1レベルは低下し、ほとんど検出不能となった。Sp1レベルの上昇は、ビタミンD3処理後のp27Kip1 mRNAの増加前に生じた。興味深いことに、ヒトp27Kip1プロモーターのSp1-1部位へのSp1の結合の顕著な増加が認められる場合においても、Sp1蛋白質のレベルは、ビタミンD3処理および溶媒処理した細胞の間では、36時間後にほとんど差がなかった（図１４）。これらの結果は、リン酸化（Jackson, S.P. et al. (1990) Cell, 63, 155-165）やグリコシル化（Jackson, S.P. and Tjian, R., (1988) Cell, 55, 125-133）のようなSp1の翻訳後調節が、Sp1蛋白質のわずかな誘導と組合わされて、ビタミンD3によるp27Kip1転写のアップレギュレーションに寄与していることを示している。他方で、本発明者らが以前記載したように、NF-YAには選択的スプライシング（differential sp1icing）により生じたと考えられる2本のバンド（36kDaと39kDa）が認められた（図１５）（Orita, T. et al. (1997) J. Biol. Chem., 272, 23216-23223; Li, X.Y. et al. (1992) J. Biol. Chem., 267, 8984-8990; Ishimaru, F. et al. (1997) Blood, 89, 4136-4145）。驚いたことに、NF-YAの39kDa型のレベルは、ビタミンD3処理後12時間から48時間まで低下した。この変化がNF-YA mRNAのlong form（長鎖形）の減少に起因することを確認するために、これら2種のアイソフォームにおいて保存されている領域に位置するプライマーF1およびRを用いて、NF-YA mRNAのRT-PCR解析を行った。
NF-YA mRNAのRT-PCRは以下のようにして行った。10-7 MビタミンD3または溶媒のいずれかで異なる時間処理したU937細胞から、TRIZOLTM（Gibco-BRL）／クロロホルム法により全RNAを調製した。RNA PCR Kit Ver.2.1（Takara、東京、日本）を用いてRT-PCRを行った。NF-YA-shortおよびNF-YA--longのための順方向（F）および逆方向（R）プライマーは、AATAGTTCGACAGAGCAGATTG（プライマーF1）（配列番号：１２）、CCTCCTGATTGGGTTTCGGAGT（プライマーF2）（配列番号：１３）、およびGGGGTTAGGACACTCGGATGAT（プライマーR）（配列番号：１４）である。G3PDHのための順方向プライマーはACCACAGTCCATGCCTCA（配列番号：１５）であり、逆方向プライマーはTCCACCACCCTGTTGCTGTA（配列番号：１６）である。全RNA 1μgを用いてRT-PCRを行った。PCRは、NF-YAサブユニットを検出するためには25サイクル、G3PDH検出には20サイクル行った。PCR産物は３％アガロースゲル上で電気泳動した。NF-YA用のプライマーは、2種の異なるアイソフォームを同時に検出するように設計し、これら2種のアイソフォームに保存された領域に位置している（Li, X.Y. et al. (1992) J. Biol. Chem., 267, 8984-8990）。
図１６に示したように、RT-PCRにより２本のバンドが得られ、これらはNF-YA mRNAの2種のアイソフォームに由来することが制限酵素解析により判明した（データ省略）。予想されたように、NF-YAのlong formは、ビタミンD3処理細胞において徐々に減少した。別のPCRプライマーの組合わせ（プライマーF2およびR）を用いた場合にも同じ結果を得た。これらの結果は、39kDaのNF-YA蛋白質のバンドの減少が、NF-YAのmRNAの減少の結果であり、蛋白質修飾の結果でないことを示唆している。この高分子量型NF-YAの減少は、ビタミンD3処理後、p27Kip1 mRNAの増加前に認められた。ビタミンD3処理および溶媒処理した細胞の間で、NF-YBおよびNF-YCのレベルに有意な違いは認められなかった（図１５）。以上のことから、これらの結果は、NF-Yが、高分子量型NF-YAの減少を介して、p27Kip1 転写の調節においてビタミンD3のメディエーターとして作用していることを示している。
産業上の利用の可能性
本発明によりp27Kip1遺伝子の5'調節領域に存在するビタミンD3応答配列が提供された。本発明のビタミンD3応答配列は、任意の遺伝子をビタミンD3依存的に発現させることに用いることができる他、p27Kip1 遺伝子の発現を調節する薬剤のスクリーニングにも利用することができる。本発明のビタミンD3応答配列を利用したスクリーニングにおいては、p27Kip1プロモーターの長い領域を利用したスクリーニングに比して、特異性の高い薬剤のスクリーニングが可能である。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> CHUGAI RESEARCH INSTITUTE FOR MOLECULAR MEDICINE, INC.
SAKAI Toshiyuki
<120> Vitamin D3 Response Elements within a 5'-flanking region of p27/Kip
1 gene and the method of screening chemicals using them
<130> C2-115PCT
<140>
<141>
<150> JP   2000-17809
<151> 2000-01-21
<160> 16
<170> PatentIn Ver. 2.0
<210> 1
<211>
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ctcgaggaag gactgaaact gtgtgcttgc ggtgggaggg gcagctgggc aaggaaccgt     60
gaaccttcgc agaaacattt ggggctgcag aacttgggtg agagcgctgc atctgggagc    120
tggcgacgct ggcggcttgc tcattcaccc catctgaaca cttgtctatg acacaggtgt    180
tttctcttaa gttattttgg tctttgcctc tctcctcagg ttgtgaagat tacagaaatc    240
tgggatggct tatgggacgc ttctcagccc taagtaggaa aacagcagtg aaaatggcaa    300
ccaaaacatc acgcaggact gggggttttg gggaaacagc tcactttaga gcagtgcagt    360
gtagagcttt ccgtcttcta ccagggtcca cctttaacac tgtttatctg aaaattttcc    420
ccctggctta ctcgcttgca gctgcccact ttgcagaagg atggcgctct gatctctacg    480
ctccctgttc cttcagggac tccatagtat tttttttcac gcgtcgtcgc tactacagca    540
gacgcctgcg ttctcattat ttgctgtaca gatctccggt gccttgactg taaacaaaac    600
actttagatc attgtgaggt cgatgtaagc acagcctttc tgctggcagc cagacttctt    660
aaggtggtgt gactgtgact tgcttacttt tcgagatcaa caacaacaaa gcgacaaaat    720
ggtgctccta catattagtt gaaagattca gcatgtgaag gggatcgaag tgtttatttt    780
ccacttccat ataagacatg aattccatga gtaaaatcaa cttctgtggc aaggtgaact    840
actctagaat gtctccattt acatacatgt ggtagtttgg atgtttatgc atatggatag    900
atgcacatat atagagttcc tgtgttgtct agcaattgtt ttaaaatttg gacaattatc    960
taatttctag ggtaaggtat aaattatggt agggaggcct accctaattt tcctgttcct   1020
tttcccccag tctgcagtcc aataaattga cagccttaaa agtagaaaaa ctaaagagga   1080
tgagacctct tgcttgatcc taggtgaatt cttttctgtc agttaggtag gaagtcctga   1140
cttgaaaact agttctgggc actgccccct ttactgttct ctgggtatca acccctgtcc   1200
ttcaatttta gttgaactag tggatggtga taccacaggc tcaagacagc tgcatttaaa   1260
tatcagtgac cacaggccac atcaaggaaa catctgcagg caacccaggg cctgggaagg   1320
agccatttca gtcacttgta agacagcagg acctgcagac tacagcacaa tcaaactcag   1380
acaaaaccct gaaccagtga gaaccattag gaaggaaagg aacagaaaat gaaccaacct   1440
gagtgttagg agacttgcat ctagtcctga ctccggtacc aaccgaatgc atgtccctgg   1500
acaggaaacc tctctgagtc tcgatttcct ccgtggtaaa aaggagaggg ttaaaccaca   1560
gggtcccgag ggtcccttcc agctgtcaca ttctggagcg tatgagatga ggtaggcaca   1620
caaagtggac aagatgtggc taagaaaaca agctacacat caagctcatc tgtagcatag   1680
gtgcttaaga aaactttgct gctgtgtaat attagaacgg aaggttggtt tccagtaaaa   1740
tgcattaact ttggctcaaa ccaagatgat gggtaccggg catgggggtg gggaggcagt   1800
tgaagatcca ctgagctttg tctcagggca gccctgctca tcgtcctact ttaccttcca   1860
ccacggtgct caagcccaca ctgagagaga aatttccagc tgcaaaaggg agaagagaaa   1920
cgctggaata ctagtatcgg acgttaggac atggttgtgg tgttttaaaa atcatttcat   1980
catctggagt ttgaccccga ggggagtatt ttcacccttc agccctctga aagcattcac   2040
tagcatctga atattgttct gagtttgttg gagcagtgaa atctggtgag agagaagggt   2100
ggaggaagga aggagctgtt gtatttggcg gctggactca ggtagaggaa actgctacaa   2160
tcccgggaaa gaacagaaaa gtagaaaggg acgagttccc acacgcagcc aatgtccatg   2220
gccttaactg tgcttgggaa ggaagatcct gggccagggg tgtaccctcg tttttcaaaa   2280
actaaacgtg tctgagacag ctacaaagtt tattaaggga cttgagagac tagagttttt   2340
tgtttttttt ttttaatctt gagttccttt cttattttca ttgagggaga gcttgagttc   2400
atgataagtg ccgcgtctac tcctggctaa tttctaaaag aaagacgttc gctttggctt   2460
cttccctagg cccccagcct ccccagggat ggcagaaact tctgggttaa ggctgagcga   2520
accattgccc actgcctcca ccagccccca gcaaaggcac gccggcgggg gggcgcccag   2580
cccccccagc aaacgctccg cggcctcccc cgcagaccac gaggtggggg ccgctgggga   2640
gggccgagct gggggcagct cgccaccccg gctcctagcg agctgccggc gaccttcgcg   2700
gtcctctggt ccaggtcccg gcttcccggg agaggagcgg gagggaggtc ggggcttagg   2760
cgccgctgcg aacccgccaa cgcagcgccg ggccccgaac ctcaggcccc gccccaggtt   2820
cccggccgtt tggctagttt gtttgtctta attttaattt ctccgaggcc agccagagca   2880
ggtttgttgg cagcagtacc cctccagcag tcacgcgacc agccaatctc ccggcggcgc   2940
tcggggaggc ggcgcgctcg ggaacgaggg gaggtggcgg aaccgcgccg gggccacctt   3000
aaggccgcgc tcgccagcct cggcggggcg gctcccgccg ccgcaaccaa tggatctcct   3060
cctctgttta aatagactcg ccgtgtcaat cattttcttc ttcgtcagcc tcccttccac   3120
cgccatattg ggccactaaa aaaagggggc tcgtcttttc ggggtgtttt tctccccctc   3180
ccctgtcccc gcttgctcac ggctctgcga ctccgacgcc ggcaaggttt ggagagcggc   3240
tgggttcgcg ggaccgcggg cttgcacccg cccagactcg gacgggcttt gccaccctct   3300
ccgcttgcct ggtcccctct cctctccgcc ctcccgctcg ccagtccatt tgatcagcgg   3360
agactcggcg gccgggccgg ggcttccccg cagcccctgc gcgctcctag agctcgggcc   3420
gtggctcgtc ggggtctgtg tcttttggct ccgagggcag tcgctgggct tccgagaggg   3480
ggttcgggcc gcgtaggggc gctttgtttt gttcggtttt gtttttttga gagtgcgaga   3540
gaggcggtcg tgcagacccg ggagaaag                                      3568
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Description of Artificial Sequence: Artificially
synthesized oligonucleotide sequence
<400> 2
cagcctcggc gggatggctc ccgccg                                          26
<210> 3
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Artificially
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<400> 3
cggggcggct cctaccgccg caaccaatg                                       29
<210> 4
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Artificially
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gccgccgcaa cctttggatc tcctcc                                          26
<210> 5
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Artificially
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<400> 5
agggagcctc ggcggggcgg ctcccgccgc cgcaaccaat ggatctcc                  48
<210> 6
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Artificially
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<400> 6
ccctggagat ccattggttg cggcggcggg agccgccccg ccgccgaggc t              51
<210> 7
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Artificially
synthesized oligonucleotide sequence
<400> 7
ctagcgccgc aaccaatgga tctcc                                           25
<210> 8
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<400> 8
ctagcgccgc aacctttgga tctcc                                           25
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Artificially
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ctagttttgg attgaagcca atatgataa                                       29
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<223> Description of Artificial Sequence: Artificially
synthesized oligonucleotide sequence
<400> 10
acttttaacc aatcagaaaa atctag                                          26
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Artificially
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ctagtgacca gttccagcca ctcttta                                         27
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Artificially
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AATAGTTCGA CAGAGCAGAT TG                                              22
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Artificially
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CCTCCTGATT GGGTTTCGGA GT                                              22
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Artificially
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<400> 14
GGGGTTAGGA CACTCGGATG AT                                              22
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<223> Description of Artificial Sequence: Artificially
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<400> 15
ACCACAGTCC ATGCCTCA                                                   18
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<213> Artificial Sequence
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<223> Description of Artificial Sequence: Artificially
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<400> 16
TCCACCACCC TGTTGCTGTA                                                 20
【図面の簡単な説明】
図１は、５’欠失変異がＣ３３Ａ細胞においてヒトｐ２７Ｋｉｐ１遺伝子のプロモーター活性に与える影響を示す図である。ｐ２７Ｋｉｐ１遺伝子のプロモーター領域の５’欠失変異体をルシフェラーゼ遺伝子の融合させた。２μｇの各プラスミドを１μｇのｐＡＣＴβ−ｇａｌと共に、一過的にＣ３３Ａ細胞にトランスフェクトし、４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。細胞抽出物中のルシフェラーゼ活性を、本文に記載のように決定した。各構築物は左側に模式的に示した。データは平均で表されている（バーは標準誤差）（ｎ＝３）。
図２は、Ｃ３３ＡおよびＵ２０Ｓ細胞におけるｐ２７Ｋｉｐ１遺伝子の基本的なプロモーター活性に必要なシス配列を同定するための変異解析を示す図である。左に示した３つの変異体は、大文字で表した変異以外は野生型ｐ２７ＰＦと同一である。２μｇの各プラスミドを、１μｇのｐＡＣＴβ−ｇａｌを共にＣ３３ＡまたはＵ２０Ｓ細胞に一過的にトランスフェクトし、４８時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。データは平均で表されている（バーは標準誤差）（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５。
図３は、ｐ２７Ｋｉｐ１遺伝子のＣＣＡＡＴ  ｂｏｘへのＣ３３Ａ細胞の核蛋白質の結合と競合分析を示す写真である。電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）をＣ３３Ａ細胞の核抽出物の存在下で行った。−５３０から−５１０（ＷＴ−５３０／−５１０）の間のＣＣＡＡＴ  ｂｏｘを含むオリゴヌクレオチドのセットをプローブとして用いた。３２ＰラベルしたＷＴ−５３０／−５１０を、各ＣＣＡＡＴ結合蛋白質に結合できる様々な非標識オリゴヌクレオチドの非存在下（−）（レーン１および２）、１００倍または１０００倍の存在下で、核抽出物とインキュベートした。ＣＣＡＡＴ  ｂｏｘ結合蛋白質（群）を含む、移動度が低下した特異的なバンドを左に示した。
図４は、抗体によるスーパーシフトアッセイを示す写真である。ＷＴ−５３０／−５１０をプローブに用いた。核抽出物を、抗ＮＦ−ＹＢ抗体（レーン２−５）または抗Ｃ／ＥＢＰα抗体（レーン６および７）の存在下または非存在下（−）（レーン１）、３２ＰラベルしたＷＴ−５３０／−５１０とインキュベートした。移動度が低下したバンドとスーパーシフトを起こしたバンドを左に示した。
図５は、ドミナントネガティブＮＦ−ＹＡ発現プラスミド（ｐＮＦ−ＹＡ２９）は、ｐ２７Ｋｉｐ１プロモーター活性をＣＣＡＡＴ  ｂｏｘを介して抑制することを示す図である。４μｇのｐ２７ＰＦまたはｐ２７ｍＣＴＦを、１μｇのドミナントネガティブＮＦ−ＹＡ発現プラスミド（ｐＮＦ−ＹＡ２９）またはその親発現ベクター（ｐＳＧ５）を共に、Ｃ３３Ａ細胞に共トランスフェクトした。２４時間後にルシフェラーゼ活性を分析した。データは平均で表されている（バーは標準誤差）（ｎ＝３）。＊Ｐ＜０．０５。
図６は、一連の５’側欠失におけるヒトｐ２７Ｋｉｐ１プロモーター活性に対するビタミンＤ３の作用を示す図である。各構築プラスミド１８μｇを、ｐＲＬ−ＴＫ  ２μｇと共にＵ９３７細胞に一過性にトランスフェクトし、１０−７ＭビタミンＤ３で４０時間処理後にルシフェラーゼ活性を測定した。相対的ルシフェラーゼ活性は、ビタミンＤ３非存在下でのｐ２７ＰＦの値に対する百分率として示した。データは平均で示した（バーは標準偏差を示す）（ｎ＝３）。＊，ｐ＜０．０１：＊＊，ｐ＜０．０５。
図７は、ｐ２７Ｋｉｐ１プロモーターにおけるビタミンＤ３応答部位を同定するための変異解折を示す図である。左側に示した３種の異なる変異体は、太字で示した変異以外は、ｐ２７ＰＦ野生型と同じである。各構築プラスミド１８μｇを、ｐＲＬ−ＴＫ  ２μｇと共にＵ９３７細胞に一過性にトランスフェクトした。１０−７ＭビタミンＤ３で４０時間処理後にルシフェラーゼ活性を測定し、ビタミンＤ３未処理のｐ２７ＰＦと比較した。データは平均で示した（バーは標準偏差を示す）（ｎ＝３）。＊，ｐ＜０．０１
図８は、Ｓｐ１−１部位およびＣＣＡＡＴボックスを含む−５５５／−５１２の間の４４ｂｐ調節配列の４つのタンデムリピートは、異種のプロモーターにビタミンＤ３に対する応答を付与することを示す図である。５種の構築物、ＰＧＰＶ２［−５５５／−５１２ｗｉｌｄ］４、ＰＧＰＶ２［−５５５／−５１２ｍＳｐ１−１］４、ＰＧＰＶ２［−５５５／−５１２ｍＳｐ１−２］４、ＰＧＰＶ２［−５５５／−５１２ｍＣＴＦ］４、およびＰＧＰＶ２［Ｒ−５５５／−５１２ｗｉｌｄ］４を、本文に記したように作製した。各構築プラスミド１８μｇを、ｐＲＬ−ＴＫ  ２μｇと共にＵ９３７細胞に一過性にトランスフェクトし、１０−７ＭビタミンＤ３で４０時間処理後に、ルシフェラーゼ活性を測定し、ビタミンＤ３未処理のｐ２７ＰＦと比較した。データは平均で示した（バーは標準偏差を示す）（ｎ＝３）。＊，ｐ＜０．０１；＊＊，ｐ＜０．０３
図９は、ビタミンＤ３処理したＵ９３７細胞から調製した核抽出物でゲルシフトアッセイを行った結果を示す写真である。−５５５と−５１２の間のＳｐ１−１およびＣＴＦ部位を含むオリゴヌクレオチドのセット（−５５５／−５１２ｗｉｌｄ）をプローブとして用いた。核抽出物を、３２Ｐ標識−５５５／−５１２ｗｉｌｄと共に、様々な非標識オリゴヌクレオチドの１５倍または４５倍量存在下、もしくは非存在下（−）（レーン１）でインキュベートした。
図１０は、Ｓｐ１は、ビタミンＤ３応答配列の１つであるＳｐ１−１部位と相互作用することができることを示す写真である。抗Ｓｐ１抗体および抗Ｓｐ３抗体の複合体形成に対する作用。抗Ｓｐ１抗体（レーン２）または抗Ｓｐ３抗体（レーン３）存在下、もしくは、非存在下（レーン１）で複合体を形成させた。
図１１は、ビタミンＤ３処理したＵ９３７細胞から調製した核抽出物でゲルシフトアッセイを行った結果を示す写真である。−５３４と−５１２の間のＣＴＦ部位を含むオリゴヌクレオチドのセット（−５３４／−５１２ｗｉｌｄ）をプローブとして用いた。核抽出物を、３２Ｐ標識−５３４／−５１２ｗｉｌｄと共に、様々な非標識オリゴヌクレオチドの１５倍または４５倍量存在下、もしくは非存在下（−）で（レーン１）でインキュベートした。
図１２は、ＮＦ−Ｙは、別のビタミンＤ３応答配列であるＣＴＦ部位と相互作用することができることを示す写真である。抗ＮＦ−Ｙ抗体および抗Ｃ／ＥＢＰ−α抗体の複合体形成に対する作用。抗ＮＦ−ＹＡ、抗ＮＦ−ＹＢ、もしくは抗ＮＦ−ＹＣ抗体（レーン２〜４）、または抗Ｃ／ＥＢＰ−α抗体（レーン５）の存在下、もしくは非存在下（レーン１）で複合体を形成させた。
図１３は、ドミナント−ネガティブＮＦ−ＹＡ発現プラスミド（ｐＮＦ−ＹＡ２９）は、ｐ２７プロモーターのビタミンＤ３応答性を抑制することを示す図である。ｐ２７ＰＦまたはｐ２７ｍＣＴＦ  ９μｇを、様々な量のドミナント−ネガティブＮＦ−ＹＡ発現プラスミド（ｐＮＦ−ＹＡ２９）とｐＲＬ−ＴＫ  ２μｇと共に、Ｕ９３７細胞にコトランスフェクトした。１０−７ＭビタミンＤ３で４０時間処理後に、ルシフェラーゼ活性を測定し、ビタミンＤ３未処理のｐ２７ＰＦと比較した。データは平均で示した（バーは標準偏差を示す）（ｎ＝３）。＊，ｐ＜０．０１
図１４は、ビタミンＤ３処理後のｐ２７Ｋｉｐ１プロモーターに対するＳｐ１−およびＮＦ−Ｙ結合活性の変化を示す写真である。核抽出物を、３６時間ビタミンＤ３処理または溶媒（エタノール）処理したＵ９３７細胞のいずれかから調製した。各核抽出物２μｇを、−５５５／−５１２ｗｉｌｄプローブ（レーン１−３）、−５３４／−５１２ｗｉｌｄプローブ（レーン４〜６）、またはＮＦ−Ｉ  ｗｉｌｄプローブ（レーン７〜１２）のいずれかと共にインキュベートし、各々、Ｓｐ１、ＮＦ−Ｙ、およびＮＦ−１を検出した。
図１５は、ビタミンＤ３処理後のＳｐ１およびＮＦ−Ｙサブユニットの変化を示す写真である。全細胞抽出物を、ビタミンＤ３処理後記載した時点でＵ９３７細胞から調製した。抽出物を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、その後抗Ｓｐ１抗体、または抗ＮＦ−ＹＡ、抗ＮＦ−ＹＢ、抗ＮＦ−ＹＣ抗体によりウェスタンブロット法を行った。
図１６は、ビタミンＤ３処理後のＳｐ１およびＮＦ−Ｙサブユニットの変化を示す写真である。全ＲＮＡを、ビタミンＤ３処理後記載した時点でＵ９３７細胞から調製した。ＲＴ−ＰＣＲを、様々なＰＣＲプライマーの組合せを用いて行った。プライマーＦ１およびＲ（上パネル）；プライマーＦ２およびＲ（中パネル）；プライマーＧ３ＰＤＨ（下パネル）。
【図１】
0004828070.tif 000004
【図２】
0004828070.tif 000005
【図３】
0004828070.tif 000006
【図４】
0004828070.tif 000007
【図５】
0004828070.tif 000008
【図６】
0004828070.tif 000009
【図７】
0004828070.tif 000010
【図８】
0004828070.tif 000011
【図９】
0004828070.tif 000012
【図１０】
0004828070.tif 000013
【図１１】
0004828070.tif 000014
【図１２】
0004828070.tif 000015
【図１３】
0004828070.tif 000016
【図１４】
0004828070.tif 000017
【図１５】
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【図１６】
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