(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚角質層の採取物から調製した脂質試料を、液体クロマトグラフ−質量分析法で分離検出し、その検出データを多段マスクロマトグラムで解析することによりセラミド分子の網羅的な組成情報を得、得られたセラミド分子の網羅的な組成情報と肌質とを関連づけ、
被験者の皮膚角質層の採取物から調製した脂質試料を液体クロマトグラフ−質量分析法で分離検出し、その検出データを多段マスクロマトグラムで解析することにより、皮膚角質層に含まれるセラミド分子の網羅的な組成情報を求め、得られたセラミド分子の網羅的な組成情報から、前記関連づけに基づき、被験者の肌質を評価する肌質評価方法であって、セラミド分子のタイプ別の相対量と肌質とを関連づける肌質評価方法。
【請求項２】
皮膚角質層の採取物から調製した脂質試料を、液体クロマトグラフ−質量分析法で分離検出し、その検出データを多段マスクロマトグラムで解析することによりセラミド分子の網羅的な組成情報を得、得られたセラミド分子の網羅的な組成情報と肌質とを関連づけ、
被験者の皮膚角質層の採取物から調製した脂質試料を液体クロマトグラフ−質量分析法で分離検出し、その検出データを多段マスクロマトグラムで解析することにより、皮膚角質層に含まれるセラミド分子の網羅的な組成情報を求め、得られたセラミド分子の網羅的な組成情報から、前記関連づけに基づき、被験者の肌質を評価する肌質評価方法であって、セラミド分子の総炭素数別の相対量と肌質を関連づける肌質評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフ−質量分析法を用いて得られた、皮膚角質層中の脂質分子、特にセラミド分子の種類や量などの組成情報に基づいて、肌質を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、機器計測により肌質を評価する方法としては、皮膚角質層中のインターロイキン及びインターロイキン１レセプターアンタゴニストの存在量を指標とする方法（特許文献１）や、皮膚角質層中の神経成長因子（ＮＧＦ）や神経栄養因子（ＮＴ−４）の存在量を指標とする方法が知られている（特許文献２）。
【０００３】
一方、皮膚角質層の脂質は肌のバリアー機能や保水機能に関与することが知られており、肌質に大きな影響を与える成分であることがわかっている。なお、ここで脂質とは、長鎖脂肪酸あるいは炭化水素鎖を有する生物由来の分子をいい、脂肪酸、グリセリド、ワックスエステル、スフィンゴ脂質、リン脂質、コレステロール等が含まれる。中でも、スフィンゴ脂質の一種であるセラミドは、これらの機能に大きく関与する脂質であり、ある種のセラミドの低減は、アトピー性皮膚炎等の肌トラブルと関連のあることがわかっている。従って、皮膚角質層の脂質、特にセラミドを詳細に解析し、種類や量の組成情報を得ることができれば、肌質を正確に評価することが可能になるものと期待される。
【０００４】
生体試料に含まれる脂質の解析方法としては、従来からシリカゲルプレートを利用した薄層クロマトグラフ法が多用されてきた。薄層クロマトグラフを用いた脂質の解析法によれば、脂質をクラス別あるいはタイプ別に解析することが可能であるが、脂質分子別の情報を得ることは困難であった。近年、この薄層クロマトグラフ法の欠点を克服した方法として、脂質を順相液体クロマトグラフで分離し、それをエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）でイオン化し、さらに質量分析装置で検出して、脂質分子の化学構造を同定する手法が報告されている（特許文献３）。
【０００５】
【特許文献１】特開平１０−２１６１０６号公報
【特許文献２】特開２００４−２８６９８号公報
【特許文献３】特開２００３−２８８４９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、特許文献３の手法では、トータルイオンクロマトグラム（ＴＩＣ）上の任意のピークのマススペクトルを解析して脂質の化学構造を同定するため、皮膚角質層中に含まれる種々の脂質分子、特にセラミド分子を網羅的に解析することは困難であり、かつ微量成分の存在も認知され難いため、皮膚角質層中の脂質分子、特にセラミド分子を詳細に解析することにより肌質を正確に評価する方法としては利用できない。
【０００７】
このような課題に対し、本発明は、皮膚角質層に含まれる脂質分子、特にセラミド分子を網羅的に解析し、微量成分まで認知できるようにし、その結果得られたセラミド分子の種類や量などの組成情報に基づいて、肌質を評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、皮膚角質層の採取試料から調製した脂質試料を液体クロマトグラフで分離し、質量分析装置でイオン化して検出し、質量分析装置から出力されるデータを、保持時間と質量数／電荷（ｍ／ｚ）とイオン強度の３軸に展開した多段マスクロマトグラムにより解析すると、皮膚角質層に含まれる脂質分子、特にセラミド分子を網羅的に解析し、かつ微量成分まで認知でき、さらに、こうして得られる脂質分子の組成情報と肌質とを関連づけておくと、その関連づけに基づいて被験者の肌質を評価できることを見出した。
【０００９】
即ち、本発明は、皮膚角質層の採取物から調製した脂質試料を、液体クロマトグラフ−質量分析法で分離検出し、その検出データを多段マスクロマトグラムで解析することにより脂質分子の組成情報を得、得られた脂質分子の組成情報と肌質とを関連づけ、
被験者の皮膚角質層の採取物から調製した脂質試料を液体クロマトグラフ−質量分析法で分離検出し、その検出データを多段マスクロマトグラムで解析することにより、皮膚角質層に含まれる脂質分子の組成情報を求め、得られた脂質分子の組成情報から、前記関連づけに基づき、被験者の肌質を評価する肌質評価方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の肌質評価方法によれば、微量成分を含めて皮膚角質層中の脂質分子を網羅的に解析して得られる脂質分子、特にセラミド分子の組成情報に基づいて肌質を評価するので、肌質を適確に評価することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、図面を参照しつつ、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
図１は、本発明の肌質評価方法で使用する、セラミド分子の解析システムの一例のブロック図である。このシステム１は、液体クロマトグラフ１０、イオン化促進液送液装置２０、質量分析装置３０及び演算装置４０からなっている。
【００１３】
液体クロマトグラフ１０は、２種の溶離液ａ、ｂを送液する高圧グラジエントポンプ１１ａ、１１ｂ、脂質試料溶液ｄを導入するオートインジェクター１２、ガードカラム１３及び分離カラム１４を備えている。
【００１４】
ここで、脂質試料溶液ｄとしては、皮膚角質層の採取物から抽出等により調製したセラミドを含む試料溶液を使用する。
【００１５】
皮膚角質層の採取方法としては、被験者に対する危険性が低く、負担が少ない方法が好ましい。このような採取方法としては、例えば、テープによる剥離方法(テープストリッピング法)を挙げることができる。
【００１６】
テープで剥離した皮膚角質層の採取物から、セラミドを含む脂質試料溶液ｄを調製する方法としては、セラミドの溶解性が高く、かつテープが溶解し難い溶媒を用いて、採取物からセラミドを抽出することが好ましい。このような溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール等をあげることができる。
【００１７】
一方、溶離液ａ、ｂとしては、これらが良好に混合し、セラミドを適度に保持してタイプ別に分離することが可能であり、不揮発性の酸や塩を高濃度に含まないものが好ましい。溶離液ａ、ｂの組み合わせ例としては、例えば、溶離液ａをヘキサン/イソプロパノールの混合液とし、溶離液ｂをヘキサン／イソプロパノール／水の混合液とすることができる。
【００１８】
ガードカラム１３は、分離カラム１４の保護のために必要に応じて設けられるもので、分離カラム１４と同一の充填剤が充填される。ガードカラム１３及び分離カラム１４の充填剤としては、例えば、シリカゲル、又はジオール基、ＣＮ基、ＮＨ２基を結合したシリカゲル等の高極性カラムを用いることができる。
【００１９】
液体クロマトグラフ１０を以上のように構成することにより、セラミドを含む脂質を、極性の違いに基づいて分離することができる。
【００２０】
質量分析装置３０は、イオン化装置３１と質量分離検出装置３２からなる。
【００２１】
イオン化装置３１でのイオン化の方法としては、感度の点からエレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）が好ましいが、この他、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）や大気圧光イオン化法（ＡＰＰＩ）等も用いることもできる。
【００２２】
質量分離検出装置３２は、イオン化装置３１で生成したイオンを、ｍ／ｚごとに分離し、検出する。質量分離検出装置３２としては、四重極（Ｑ）型質量分析計、イオントラップ（ＩＴ）型質量分析計等の質量分析計、Ｑ−ＴＯＦ型、ＩＴ−ＴＯＦ型等のハイブリッド型質量分析計、あるいはトリプル四重極型等のタンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）を用いることができる。
【００２３】
イオン化促進液送液装置２０は、イオン化促進液ｃを送液するためのポンプ２１と、分離カラム１４からの溶離液と混合するためのティーコネクター２２を備えている。
【００２４】
イオン化促進液ｃは、ティーコネクターを介して、分離カラム１４からの溶離液と混合される。混合された溶液はイオン化装置３１に送られ、イオン化される。
【００２５】
なお、イオン化促進液ｃは、ヘキサンのような低極性溶媒を溶離液として用いた場合に、ＥＳＩで十分なイオン化効率が得られ難いのを改善するために用いられる。イオン化促進液ｃとしては、溶離液と良好に混合し、溶離液をイオン化させるのに適した表面張力、粘性、イオン生成能、溶媒和力等の性質を有するものを適宜選択する。例えば、ヘキサンを溶離液とした場合に、イオン化促進液ｃとしては、イソプロパノール、エタノール、メタノール等の極性溶媒が使用される。
【００２６】
イオン化促進液ｃには、正イオンモードで[Ｍ＋Ｈ]＋や[Ｍ＋Ｈ−Ｈ2Ｏ]＋が高感度に検出され、負イオンモードで［Ｍ−Ｈ］−や[Ｍ＋ＨＣＯＯ] −が高感度に検出されるように、ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム等の塩を添加することができる。この他、イオン化促進液ｃには、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸等の揮発性の酸を添加してもよい。
【００２７】
なお、以上の液体クロマトグラフ１０及び質量分析装置３０としては、これらが一体になった市販の液体クロマトグラフ−質量分析装置を使用することができる。
【００２８】
演算装置４０は、液体クロマトグラフ１０における保持時間と、質量分析装置３０で検出されたｍ／ｚ及びイオン強度を、３軸に展開して多段マスクロマトグラムを形成する演算手段を有する。
【００２９】
本発明の肌質評価方法では、質量分析装置３０で検出した全てのデータを、保持時間とｍ／ｚとイオン強度の３軸に展開した、図２に示すような多段マスクロマトグラムを形成する。
【００３０】
多段マスクロマトグラムの形成により、全てのセラミド分子を網羅的に捉えることが可能となり、同属体や微量成分の認知が容易になるので、保持時間とｍ／ｚの情報から、個々のセラミド分子を容易に同定することが可能となる。
【００３１】
さらに、本発明の肌質評価方法では、セラミド分子の化学構造を同定するため、予め、複数のセラミド分子について、保持時間とｍ／ｚを対応させたデータベースを構築しておくことが好ましい。このデータベースに基づいて、任意の脂質試料の多段マスクロマトグラムから該脂質試料に含まれるセラミド分子を迅速に同定することが可能となる。
【００３２】
また、本発明の肌質評価方法では、質量分析装置３０にて選択イオンモニタリング法を行うことにより、複数の特定セラミド分子を高感度に検出することもできる。選択イオンモニタリング法による検出データについても、図２と同様な多段マスクロマトグラムを形成することができ、複数の特定セラミド分子を網羅的に捉えることが可能となる。
【００３３】
図２は、実際に皮膚角質層の採取物から調製した脂質試料を上述のシステム１で解析した多段マスクロマトグラムの一例である。同図に示すように、この多段マスクロマトグラムによれば、脂質試料溶液ｄに１１タイプのセラミドが含まれており、さらに、これらのセラミドの炭素数が異なる同属体も判別でき、脂質試料溶液ｄに含まれる種々のセラミド分子を網羅的に同定できることがわかる。なお、同図は正イオンモードにおける測定結果のみを示しているが、セラミドのタイプによって観測されるイオン種が異なり、［Ｍ＋Ｈ］＋が観測されやすいものと、[Ｍ＋Ｈ−Ｈ2Ｏ]＋が観測されやすいものとが存在するため、負イオンモードにおける測定結果も合わせて解析することが好ましい。
【００３４】
セラミドの解析においては、各セラミド分子のピーク面積を比較するだけでも定量的な取り扱いが可能であるが、より正確に定量的な取り扱いをするために、脂質試料溶液ｄに内部標準物質を添加し、内部標準物質のピーク面積に対する各セラミド分子のピーク面積比を求めることが好ましい。より好ましくは、全セラミド分子の標準品を準備して、その絶対検量線から絶対量を算出することである。内部標準物質を用いる場合、皮膚角質層中にほとんど存在しないセラミド分子を用いることが好ましく、例えば、Ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｙｌ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅを使用する。
【００３５】
なお、各セラミド分子の相対量を求める際には、剥離された角質層の面積、角質層の重量、タンパク量、細胞数等を測定し、これらのいずれかの値で除することにより、規格化することが好ましい。
【００３６】
本発明の肌質評価方法では、以上のようにして解析される脂質試料中のセラミド分子の種類や量等の組成情報を、脂質試料の元となった被験者の肌質（普通肌、乾燥肌、脂性肌等）と関連づけておく。そして、評価対象となる被験者について、脂質試料中のセラミド分子の組成情報を同様の解析方法で求め、得られた組成情報から前記関連づけに基づいて当該被験者の肌質を評価する。
【００３７】
本発明の肌質評価方法では、セラミド以外の脂質も同時に解析し、前記と同様に関連づけ、それに基づいて肌質を評価してもよい。例えば、セラミドを含むスフィンゴ脂質標準品の混合試料は、正イオンモードにおいて、図３に示す多段マスクロマトグラムのように解析される。図中、Ａ〜Ｄはセラミド、ＥとＦは糖セラミド、Ｇ〜Ｉはスフィンゴイド、Ｊはスフィンゴミエリンである。
【００３８】
さらに、本発明の肌質評価方法では、使用する関連づけにおいて、皮膚角質層に含まれる脂質分子の網羅的な組成情報に加えて、皮膚の性状（経皮水分蒸散量、水分量、外観等）も参照できるようにすることが好ましい。これにより、肌質をより正確に評価することが可能となる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例及び比較例により、本発明をさらに具体的に説明する。
【００４０】
実施例
（１）皮膚角質層の採取
普通肌（経皮水分蒸散量が１０μg／ｃｍ２／ｈｒ以下）、及び、乾燥肌（経皮水分蒸散量が３０μg／ｃｍ２／ｈｒ以上）の被験者の前腕屈側部にテープを押し付け、角質層を剥離した。それぞれのテープを半分に切り分け、一方をセラミド分子の解析に供し、もう一方をタンパクの定量（ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ）に供した。
【００４１】
（２）脂質分子の抽出
（１）で角質層を採取したテープに、Ｎ−ｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｙｌ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅを含むメタノールを加え、超音波を照射することにより脂質を抽出した。
【００４２】
（３）セラミドの粗分画と試料溶液の調製
（２）のメタノール抽出液を窒素気流下で乾固し、これにクロロホルム／メタノール＝９９．５／０．５（ｖ／ｖ）を加えて溶解し、固相抽出用シリカゲルカートリッジに適用した。クロロホルム／メタノール＝９９．５／０．５（ｖ／ｖ）を十分に適用した後、クロロホルム／メタノール＝９５／５（ｖ／ｖ）を適用し、その溶出液を得た。
この溶出液を窒素気流下で乾固した後、ヘキサン／イソプロパノール／ギ酸＝９５／５／０．１（ｖ／ｖ／ｖ）を加えて溶解し、試料溶液とした。
【００４３】
（４）セラミドの分析条件
（４−１）液体クロマトグラフ−質量分析装置
液体クロマトグラフと質量分析装置が一体になった分析システムとして、横河アナリティカルシステムズ社、アジレント １１００シリーズ ＬＣ／ＭＳＤを使用した。
【００４４】
（４−２）カラム、分離条件
カラム及び分離条件は次の通りとした。
分離カラム：ジーエルサイエンス社、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＳＩＬ  １００Ａ−３、１．５ｍｍφ×１５０ｍｍ（３μｍ）
ガードカラム：ジーエルサイエンス社、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ  ＳＩＬ  １００Ａ−３、１．５ｍｍφ×１０ｍｍ（３μｍ）
溶離液ａ：ヘキサン／イソプロパノール／ギ酸＝９５／５／０．１（ｖ／ｖ／ｖ）
溶離液ｂ：ヘキサン／イソプロパノール／５０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム水溶液＝２５／６５／１０（ｖ／ｖ／ｖ）
グラジエント条件：表１
【００４５】
【表１】
0004821970.tif 000002
【００４６】
（４−３）イオン化促進液
次のイオン化促進液を使用した。
イオン化促進液：イソプロパノール／５ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウムメタノール溶液＝５０／５０（ｖ／ｖ）
イオン化促進液流速：０．１ｍＬ／分
【００４７】
（４−４）質量分析装置における分析条件
イオン化法：ＥＳＩ
極性：正イオン
測定質量範囲：２５０〜１５００
フラグメンター電圧：１５０Ｖ
Ｖｃａｐ電圧：３５００Ｖ
ネブライザー圧力：２０ｐｓｉｇ
乾燥ガス温度：３００℃
乾燥ガス流量：８Ｌ／分
【００４８】
（５）データ解析
得られたデータを、保持時間とｍ／ｚとイオン強度の３軸を有する多段マスクロマトグラムに展開した。その後、保持時間とｍ／ｚの情報からなるセラミド分子のデータベースを利用して各ピークを同定した。そして、各セラミド分子のピーク面積を求め、内部標準物質に対するピーク面積比を算出し、さらにタンパク量で除することにより、単位タンパク量当たりの各セラミド分子の相対量を算出した。
【００４９】
図４に、普通肌の代表的な多段マスクロマトグラムを示し、図５に乾燥肌の代表的な多段マスクロマトグラムを示す。普通肌においては、図４に示すように、１０タイプのセラミドを検出することができた。一方、乾燥肌においても、図５に示すように、１０タイプのセラミドが検出されたが、そのプロファイルは普通肌（図４）と異なっていた。
【００５０】
図６に、セラミドのタイプ別の相対量を示す。同図の結果から、普通肌と乾燥肌のセラミドのタイプ組成は大きく異なることが明確となった。
【００５１】
図７に、セラミドＮＳの総炭素数（鎖長）別の相対量を示す。同図の結果から、乾燥肌では、総炭素数の大きい（鎖長の長い）セラミド分子が少なく、総炭素数の小さい（鎖長の短い）セラミド分子が多いことが明確となった。なお、図７と同様の傾向は、セラミドＮＤＳ、ＮＨ、ＡＳでも認められた。
【００５２】
比較例
実施例１で得られたデータを、公知のＴＩＣを用いた方法により表示したものを図８に示す。図８において、セラミドの溶出時間帯は５分から２０分であるが、ＴＩＣにおいて、保持時間に基づいてセラミドのピークを特定することが困難であることは明白であった。
【００５３】
また、図９に、セラミドが溶出する５分から２０分の保持時間帯の平均マススペクトルを示すが、極めて複雑なマススペクトルであるが故に、個々のセラミド分子を特定することが困難であり、微量のセラミド分子を定量することも困難であることは明白であった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明の肌質評価方法は、皮膚角質層中の脂質分子、特に、セラミド分子の組成情報に基づき、個人毎の肌質を評価できるため、個人の特性に応じた化粧品を選定する上で、また肌質改善の化粧品を開発していく上で、有効に利用していくことができる。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】皮膚角質層中の脂質の解析に使用するシステムのブロック図である。
【図２】皮膚角質層に含まれるセラミドの多段マスクロマトグラムの一例である。
【図３】セラミドを含むスフィンゴ脂質標準品の混合試料の多段マスクロマトグラムである。
【図４】実施例による普通肌のセラミドの多段マスクロマトグラムである。
【図５】実施例による乾燥肌のセラミドの多段マスクロマトグラムである。
【図６】セラミドのタイプ別の相対量のグラフである。
【図７】セラミドＮＳの総炭素数（鎖長）別の相対量のグラフである。
【図８】ＴＩＣとして表示した実施例１のデータである。
【図９】図８においてセラミドが溶出する保持時間帯（５〜２０分）の平均マススペクトルである。
【符号の説明】
【００５６】
１    皮膚角質層中の脂質の解析を実施するシステム
１０    液体クロマトグラフ
１１ａ、１１ｂ    高圧グラジエントポンプ
１２    オートインジェクター
１３    ガードカラム
１４    分離カラム
２０    イオン化促進液送液装置
２１    ポンプ
２２    ティーコネクター
３０    質量分析装置
３１    イオン化装置
３２    質量分離検出装置
４０    演算装置
ａ、ｂ  溶離液
ｃ      イオン化促進液
ｄ      脂質試料溶液
ＥＯＳ：Ｎ−（ω−ＯＨ−ａｃｙｌ）ａｃｙｌ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ
ＥＯＰ：Ｎ−（ω−ＯＨ−ａｃｙｌ）ａｃｙｌ−ｐｙｔｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ
ＥＯＨ：Ｎ−（ω−ＯＨ−ａｃｙｌ）ａｃｙｌ−６−ＯＨ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ
ＮＤＳ：Ｎ−ａｃｙｌ−ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ
ＮＳ：Ｎ−ａｃｙｌ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ
ＮＰ：Ｎ−ａｃｙｌ−ｐｙｔｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ
ＮＨ：Ｎ−ａｃｙｌ−６−ＯＨ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ
ＡＤＳ：Ｎ−（α−ＯＨ−ａｃｙｌ）−ｄｉｈｙｄｒｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ
ＡＳ：Ｎ−（α−ＯＨ−ａｃｙｌ）−ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ
ＡＰ：Ｎ−（α−ＯＨ−ａｃｙｌ）−ｐｙｔｏｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ
ＡＨ：Ｎ−（α−ＯＨ−ａｃｙｌ）−６−ＯＨ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ
【図１】
0004821970.tif 000003
【図２】
0004821970.tif 000004
【図３】
0004821970.tif 000005
【図４】
0004821970.tif 000006
【図５】
0004821970.tif 000007
【図６】
0004821970.tif 000008
【図７】
0004821970.tif 000009
【図８】
0004821970.tif 000010
【図９】
0004821970.tif 000011