(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化１で表されるＬ−リジン残基を有する両性高分子物質からなる抗血栓剤。
【化１】
0004694114.tif 000008
（前式中、XはＨ、ＣＨ3基あるいはＣＨ2ＣＨ3基を意味する。）
【請求項２】
下記化２で表されるＬ−リジン残基を有する両性高分子物質からなる抗血栓剤。
【化２】
0004694114.tif 000009
（前式中、XはＨ、ＣＨ3基あるいはＣＨ2ＣＨ3基を意味する。）
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗血栓剤を、高分子材料を基材とする医療器具の生体と接触する表面に固定したことを特徴とする医療器具。
【請求項４】
化１あるいは化２で表される両性高分子物質の前駆体モノマーを医療用器具の基材表面で重合することによって請求項１または２に記載の抗血栓剤を前記医療用器具の基板表面に固定したものであることを特徴とする請求項３記載の医療用器具。
【請求項５】
ε−アミノ基ならびにカルボキシル基を保護基で保護したアミノ酸Ｌ−リジンをメタクリル酸クロリドと反応させて得た前駆体モノマーを重合し該重合後に前記保護基を除去して製造することを特徴とする下記化３で示されるリジン残基を有する両性高分子物質の製造方法。
【化３】
0004694114.tif 000010
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗血栓性に優れたＬ−リジン残基を有する両性高分子物質、該高分子物質からなる抗血栓剤、及び該抗血栓剤を固定した医療用器具に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、合成高分子材料は人工臓器、カテーテルをはじめとする医療用材料に広く用いられている。その代表的なものは、医療用高分子材料としてはポリエステル、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン等の疎水性高分子や、ポリビニルアルコール、ポリエーテルウレタン、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル、ポリアクリルアミド、セルロース等の親水性材料である。これら従来の材料の大部分は、主にその物理的、機械的特性に着目され、使用されている。
【０００３】
一方、医療技術の進歩に伴って、生体組織や血液と材料が接触する機会は増加しており、材料の生体親和性が大きな関心時となってきている。材料表面での血液凝固の防止に関しては、従来ヘパリンに代表される抗血液凝固剤の連続投与が行なわれてきたが、最近では、脂質代謝異常、出血時間の延長、血小板の減少、アレルギー反応といった長期にわたるヘパリン投与の影響が問題になってきている。これらの問題を解消するため、ヘパリンを必要としないあるいは使用量を低減させることのできる、抗血栓性を備えた血液接触材料の開発が望まれている。
【０００４】
これら血液接触材料の開発を目的として、従来から医療用器具の血液と接触する表面に高分子を基材とした、抗血栓性を有する表面修飾を施す方式が実施されている。それらの修飾は主として、表面に物理的・化学的特徴を有する高分子材料をコーティングし、血液の凝固を最小限に抑制する方法と表面に抗血栓性物質を含浸付着させた高分子材料をコーティングし、そこから抗血栓性物質を徐放させる方法に大別される。前者に関する方法として、例えば特許文献１、特許文献２及び特許文献３が挙げられる。
【０００５】
特許文献１では、合成高分子中に血液適合性に優れるホスホリルコリン基、ならびに親水性と架橋性に優れるラクタム基を有する単量体単位やＮ−アルキル（メタ）アクリルアミド単位を含む合成高分子が物理的・化学的処理で容易に不溶化され、血液適合性に優れた材料となることに着目したものである。血小板の粘着、凝集、血漿タンパク質の付着を抑制する効果のある２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）共重合体が長時間にわたって表面に保持されて血液の付着を最小限に抑制する効果が示されている。
【０００６】
特許文献２では、炭素数２〜１０のオレフィンモノマー及び炭素数４〜１５のジエンモノマーからなる群の中から選ばれる少なくとも一種のモノマーから誘導された繰り返し単位を有する少なくとも一種のポリマー１００重量部と、造核剤０．００３〜１．０重量部とからなる組成物を含有する材料がその表面に結晶領域と非結晶領域とからなるミクロ相分離構造を有し、もしくは吸着してもその脱着が容易という特徴に着目したものである。特許文献１同様、血液の付着を最小限に抑制する効果が示されている。
【０００７】
特許文献３は、リン酸カルシウムとチタンを主成分とする生体適合性多孔質結晶化ガラスにウロキナーゼや組織プラスミノーゲン活性化因子（以下、ｔ−ＰＡと省略する）などの線溶酵素を固定化することで、生体適合性に優れ、かつ血液中のプラスミノーゲンを連続的にプラスミンに変換しうる機能が付与された血栓溶解能を有する生体適合性材料に関する発明である。
【０００８】
後者に関する方法としては、例えば特許文献４が挙げられる。これは、（２Ｒ，４Ｒ）−４−メチル−１−［Ｎ２−（（ＲＳ）−３−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロ−８−キノリンスルホニル）−Ｌ−アルギニル］−２−ピペリジンカルボン酸水和物（以下、アルガトロバン＜抗血栓剤として臨床的に用いられている。ヘパリンやウロキナーゼなどの抗血栓性物質とは異なり、アルコール等の有機溶剤に溶解する＞と記す）を２種以上の混合溶液で溶解して高分子基材に塗布する事により、表面からアルガトロバンが徐々に放出されることに着目したものである。
【０００９】
以上に述べた血液接触材料は血栓溶解性能を含む、安定した抗血栓性を発揮できる安価な材料という観点からは十分ではない。また、ウロキナーゼは人尿、ｔ−ＰＡはヒトの子宮や血管壁などにごくわずかしかないことから、利用に関して高価で量産することも難しい。
【００１０】
【特許文献１】特開平７−２８４５２８号
【特許文献２】特開平１０−９９４２６号
【特許文献３】特開平７−１０１８２８号
【特許文献４】特開２０００−０６０９６０号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、血栓溶解性能を含む、安定した抗血栓性を発揮するリジン残基を有する両性高分子物質、該リジン残基を有する両性高分子物質からなる抗血栓性剤、及該抗血栓性剤をその表面に固定した医療用器具を提供する事を目的としている。一般に、血液と接触した材料表面には、アルブミン、フィブリノーゲンといった血漿タンパク質が吸着し、これらタンパク質は、吸着により二次構造が変化する。この二次構造の変化により、さらなるタンパク質の吸着が促され、その結果、材料表面には多重のタンパク質吸着層が形成される。このような多重タンパク質吸着層が形成されると、これと接触する血小板が活性化され、最終的には血液を凝固させる。
【００１２】
血液の凝固は血液凝固系反応の活性化によって不溶性のフィブリンが形成される。凝固系には血液が接触して開始される内因系と、組織因子が血液内に流入して凝固因子と結合して開始される外因系があるが、いずれも最終的には、血液中のプロトロンビンから活性化された酵素トロンビンによって形成される。また、形成された血栓は血栓線溶系（血栓溶解）によって分解されるが、その基本原理は酵素プラスミンによるフィブリンの分解である。プラスミンは血中では前駆体プラスミノーゲンとして存在し、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）やウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベータといったプラスミノーゲン活性化因子によって活性化され、プラスミンとなり、フィブリンを分解する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、合成高分子による抗血栓性材料に関わる一連の研究の結果、生体に無毒で安価なアミノ酸基を有する両性電解質の合成高分子、すなわち下記化１あるいは化２で示されるＬ−リジン残基を有する両性高分子物質は血漿タンパク質の吸着を抑制する機能及び血液凝固を抑制する機能を有し、さらには化２で示されるＬ−リジン残基を有する両性高分子物質は前記各機能に加えて血栓溶解性能を併せ有することを見出し、本発明に到達することができた。なお、本発明において抗血栓性とは、上述のような機能を奏することができるものを指す。
【００１４】
【化１】
0004694114.tif 000002
（前式中、×はＨ、ＣＨ3基あるいはＣＨ2ＣＨ3基を意味する。）
【００１５】
【化２】
0004694114.tif 000003
（前式中、×はＨ、ＣＨ3基あるいはＣＨ2ＣＨ3基を意味する。）
【００１６】
本発明のＬ−リジン残基を有する両性高分子物質は、例えば以下の製造方法によって製造することができる。
アミノ酸Ｌ−リジンのεアミノ基ならびにカルボキシル基を保護した原料をクロロホルム溶媒中でトリエチルアミン（ＴＥＡ）を触媒として、メタクリル酸クロリドと反応させ、反応液を濃縮、洗浄、乾燥させ、濾過、濃縮後、石油エーテル：ジクロロメタンの混合溶媒を用いて精製して前駆体モノマーを調製した。この前駆体モノマーを２、２’アゾビスイソ酪酸ジメチルエステルと共にテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶かし、凍結−脱気−窒素置換を行い、減圧下でフリーラジカル重合した後、熱ヘキサンで洗浄し、トリフルオロ酢酸水溶液と反応させ、反応液を濃縮した後にジエチルエーテルで洗浄して溶液を得、該溶液を中和した後に半透膜を用いて透析し、凍結乾燥させて下記化３で示されるＬ−リジン残基を有する両性高分子物質［以下、Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ）とも言う］を製造することができた。
【００１７】
【化３】
0004694114.tif 000004
【００１８】
アミノ酸Ｌ−リジンのαアミノ基ならびにカルボキシル基を保護した原料をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶媒中でトリエチルアミン（ＴＥＡ）を触媒として、メタクリル酸クロリドと反応させ、反応液を濾過して減圧濃縮した後、ヘキサンで洗浄して前駆体モノマー（固形物）を調製した。この前駆体モノマーを２、２′アゾビスイソ酪酸ジメチルエステルと共にエチルアルコールに溶かし、凍結−脱気−窒素置換を行い減圧下でフリーラジカル重合した後、熱ヘキサンで洗浄し、水酸化ナトリウム水溶液と反応させ、反応液を中和した後に半透膜を用いて透析し、凍結乾燥させて下記化４で示されるＬ−リジン残基を有する両性高分子物質〔以下、Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ）とも言う〕を製造することができた。
【００１９】
【化４】
0004694114.tif 000005
【発明の効果】
【００２０】
従来、ヘパリン等の抗凝固剤やウロキナーゼ等の血栓溶解剤は知られている。しかしながら、これらは副作用が有ったり、その合成、精製あるいは単離が困難で有ったり、さらには医療用器具を構成する基材の表面に耐久性良く固定することが困難である等の問題が有った。これに対して本発明の前記化１あるいは化２で示されるＬ−リジン残基を有する両性高分子物質からなる抗血栓性剤は、血漿タンパク質吸着抑制、血液凝固阻害、及び血栓溶解性を併せ有する人体に副作用の無い剤で、血液に接触する医療用器具に広く応用が可能である。また前記化１あるいは化２で示される高分子自体も簡単な合成法で合成でき、得られた高分子の分離及び精製も簡単なので安価に入手可能である。さらには該高分子からなる抗血栓性剤は例えば下記実施例２で示すように前駆体モノマーを医療用器具を構成する基材上で重合させることにより、簡単にかつ優れた耐久性で基材の表面に固定することができる。したがって、本発明の抗血栓性剤並びに高分子材料を基材とする医療器具の生体と接触する表面に本発明の抗血栓性剤を固定した医療器具は経済性・安全性のみならず市場性にも優れている。
【実施例１】
【００２１】
以下、実施例をＰ（α−ＬｙｓＭＡ）及びＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）に基づいて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２２】
アミノ酸Ｌ−リジンのεアミノ基をtBu基ならびにカルボキシル基をBoc基で保護した原料をクロロホルム中溶媒中でトリエチルアミン（ＴＥＡ）を触媒とし、メタクリル酸クロライドと反応させ、反応液を濃縮した後、１％塩酸および水で数回洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させ、反応液をろ過した後、濃縮して得た固体を石油エーテル：ジクロロメタン（５０：５０ｖｏｌ％）の混合溶媒を用いてカラムクロマトグラフィーで精製し、白色の個体を得る。得られた白色個体と２、２'アゾビス酪酸ジメチルエステルをガラス製重合管の中でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶かし、液体窒素中で凍結−脱気−窒素置換を数回行い、減圧下で密封し、６０℃、２０時間フリーラジカル重合した後、多量の熱ヘキサンで洗浄し、白色固体を得る。得られた白色固体をトリフルオロ酢酸水溶液で、５０℃、１２時間反応させた後、反応液を濃縮し、ジエチルエーテルで洗浄する。溶液を水酸化ナトリウム水溶液あるいは塩酸で中和した後、アセチルセルロース製半透膜を用いて透析し、凍結乾燥させて両性電解質のＰ（α−ＬｙｓＭＡ）を製造することができた。この製造方法を図１に示す。
【００２３】
アミノ酸Ｌ−リジンのαアミノ基をAc基ならびにカルボキシル基をMe基で保護した原料をＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド溶媒中でトリエチルアミン（ＴＥＡ）を触媒とし、メタクリル酸クロライドと反応させ、反応液をろ過して減圧濃縮した後、ヘキサンで洗浄を繰り返し、白色の固体を得る。得られた白色固体と２、２'−アゾビス酪酸ジメチルエステルをガラス製重合管の中でエチルアルコールに溶かし、液体窒素中で凍結−脱気−窒素置換を数回行い、減圧下で密封し、６０℃、２０時間フリーラジカル重合した後、多量の熱ヘキサンで洗浄し、白色固体を得る。得られた白色固体を２Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶かし、室温で１２時間反応させた後、反応液を塩酸または水酸化ナトリウム水溶液で中和し、アセチルセルロース製半透膜を用いて透析し、凍結乾燥させて両性電解質のＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）を製造することができた。この製造方法を図１に示す。
【００２４】
前記Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ）の製造行程で得られた前駆体モノマーの構造をＮＭＲならびに元素分析から確認した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．４［ｓ、９Ｈ、−Ｃ（ＣＨ３）３］、１．４５［ｓ、９Ｈ、−Ｃ（ＣＨ３）３］、１．５［ｓ、２Ｈ、−ＣＨ２−］、１．７［ｄ、２Ｈ、−ＣＨ２−］、１．９［ｄ、２Ｈ、−ＣＨ２−］、２．０［ｓ、３Ｈ、−ＣＨ３］、３．１［ｄ、２Ｈ、−ＣＨ２−］、４．５［ｓ、１Ｈ、−ＣＨ＜］、５．３［ｓ、１Ｈ、−ＮＨ−］、５．４、５．８［ｓ、２Ｈ、＝ＣＨ２］、元素分析：Ｃ１９Ｎ２Ｈ３４として、計算値Ｃ：Ｎ：Ｈ＝６１．６１％：７．６０％：９．１９％、実測値Ｃ：Ｎ：Ｈ＝６２．２８％：７．４６％：９．４３％
前記確認データから、前記前駆体モノマーは下記化５で示される構造を有することが確認された。
【００２５】
【化５】
0004694114.tif 000006
【００２６】
前記Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ）の製造行程で得られた前駆体モノマーの構造をＮＭＲならびに元素分析から確認した。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：１．４［ｓ、２Ｈ、―ＣＨ２−］、１．６［ｓ、２Ｈ、−ＣＨ２−］、１．８［ｄ、２Ｈ、−ＣＨ２−］、１．９［ｓ、３Ｈ、−ＣＨ３］、２．０［ｓ、３Ｈ、−ＣＨ３］、３．３［ｄ、２Ｈ、−ＣＨ２−］、３．７５［ｓ、３Ｈ、−ＣＨ３］、４．５［ｓ、１Ｈ、−ＣＨ＜］、５．４、５．８［ｓ、２Ｈ、＝ＣＨ２］、６．１［ｓ、１Ｈ、−ＮＨ−］、６．５［ｓ、１Ｈ、−ＣＯＮＨ−］、元素分析：Ｃ１９Ｎ２Ｈ３４として、計算値Ｃ：Ｎ：Ｈ＝５７．７９％：８．１４％：１０．３７％、実測値Ｃ：Ｎ：Ｈ＝５７．１０％：８．３２％：１０．６３％
前記確認データから、前記前駆体モノマーは下記化６で示される構造を有することが確認された。
【００２７】
【化６】
0004694114.tif 000007
【００２８】
Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ）ならびにＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）がポリマー材料となったことは、1Ｈ−ＮＭＲより二重結合のピークが消失したことから確認した。また、Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ）ならびにＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）の保護基が除去されたことは、1Ｈ−ＮＭＲならびに13Ｃ−ＮＭＲより確認した。Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ）ならびにＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）が両性電解質構造になっていることを酸塩基適定法による等電点測定から確認した（図２）。図２において、●はＰ（α−ＬｙｓＭＡ）の測定結果、また■はＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）の測定結果を示す。
【実施例２】
【００２９】
アルゴンプラズマ−後ポスト重合法で医療用材料である合成樹脂の基材表面への化１あるいは２で示されるリジン残基を有する両性高分子物質の固定化を実施した。プラズマ照射装置のセパラブルフラスコの底に任意の大きさに調整した基材を置き、アルゴンの流量を調節して圧力を１．３パスカルとする。高周波の負荷には容量負荷型を用い、セパラブルフラスコに巻きつけた銅板２ヶ所に高周波電源（日本電子製ＪＲＦ−３００型）（周波数は１３．５６ＭＨｚ）を前記化５あるいは６で示されるリジン残基を有する両性高分子物質の前駆体モノマーを含むテトラヒドロフラン１０ｍｌと基材を入れる。重合管は液体窒素浴で凍結−脱気を繰り返し溶存酸素を取り除いた後、減圧下で密封し、６０℃で振り混ぜながら所定時間ポスト重合する。ポスト重合後の基材を多量のテトラヒドロフランに２４時間侵漬し、テトラヒドロフランで洗浄した後２４時間真空乾燥させて化１あるいは２で示されるリジン残基を有する両性高分子物質をグラフト化した基材を得る。
【００３０】
本発明の抗血栓性剤を固定化する医療用機器の基材は公知の医療用材料である合成樹脂等の高分子材料であれば問題ない。表面に官能基を有していない材料であっても、表面処理によって本発明の高分子を固定化することができる。このような医療用材料としては、例えば、ポリウレタンやポリ塩化ビニル製でできたカテーテルや血液パック等、ポリテトラフルオロエチレン製でできた人工臓器等、ポリプロピレン等のポリオレフィンでできた注射器等、ナイロン等のポリアミド類で製造された人工血管等が挙げられる。
【００３１】
上記の抗血栓剤の性医療用機器の基材への固定は公知の方法によって行なうことができるが、特にプラズマ処理を用いた固定は、医療用機器を短時間で大量に処理することができ、さらにガス中で処理を行なうために清潔を保つことができ好ましい。
【実施例３】
【００３２】
一般に、血液と接触した材料表面にはアルブミン、フィブリノーゲンといった血漿タンパク質が吸着・変性し、血小板が活性化されることで、血液は凝固する。そこで、血漿タンパク質を用いた蛍光測定を行い前記リジン残基を有する両性高分子物質の存在下における血漿タンパク質の吸着を定量的に測定した。測定に使用する血漿タンパク質として血液中のアルブミン、γーグロブリン、フィブリノーゲン、プラスミン、プラスミノーゲンを用いた。また、比較物質として生体適合性が知られるポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧ）を用いた場合及び前記血漿タンパク質もＰＥＧも用いない場合についても同様に試験を行なった。この試験は前記血漿タンパク質と前記リジン残基を有する両性高分子物質を同濃度として行なった。その結果を図３〜７に示す。蛍光強度の減少は、材料とタンパク質との吸着または変性を示す。
【００３３】
図３は血漿タンパク質アルブミンの蛍光測定、図４は血漿タンパク質γ−グロブリンの蛍光測定、図５は血漿タンパク質フィブリノーゲンの蛍光測定、図６は血漿タンパク質プラスミンの蛍光測定及び図７は血漿タンパク質プラスミノーゲンの蛍光測定の結果である。各図は時間経過と３５０ｎｍ付近の最大蛍光強度をプロットしたものであり、蛍光強度の減少は材料とタンパク質との吸着または変性を示す。各図においてＰ（α−ＬｙｓＭＡ）及びＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）を使用した場合には蛍光強度の減少は蛍光波長がシフトしていなかったことから、タンパク質の変性認められなかった。またアルブミン、γーグロブリン、フィブリノーゲン、プラスミンをやや吸着させたが、その吸着量はＰＥＧとそれほど変わらなかった。またＰ（α−ＬｙｓＭＡ）はプラスミノーゲンとのみ、相互作用を示した。なお、図３〜７において、■は基材に何も固定しない場合（ｎｏｎｅ）、□はＰ（α−ＬｙｓＭＡ）を基材に固定した場合、○ＰはＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）を基材に固定した場合及び●はＰＥＧを基材に吸着させた場合の試験結果をそれぞれ示す。
【００３４】
血栓溶解作用に大きく関与しているプラスミノーゲンとリジン残基を有する両性高分子物質との相互作用を生体分子間相互作用解析装置（以下、ＩＡｓｙｓと省略する）を用いて評価した。化学的に固定化したプラスミノーゲン表面に測定開始から２分後、プラスミノーゲン固定化表面に所定濃度のリジン残基を有する両性高分子物質を添加し、光の共鳴角の変化を追跡することで、リアルタイムに相互作用を解析し、時間経過に伴う光の共鳴角の変化をプロットした。リジン残基を有する両性高分子物質の添加における曲線はプラスミノーゲンとの特異的な相互作用を示す。その結果を図８に示す。
【００３５】
本発明のリジン残基を有する両性高分子物質が血漿タンパク質の吸着を抑制した理由として、該両性高分子物質の構造が挙げられる。通常、人工材料と生体成分が接触したらまず血漿タンパク質の吸着作用が進むが、本発明のリジン残基を有する両性高分子物質は血液と接触する生体膜のリン脂質表面と同様に両性電解質構造をもつ合成高分子であるため、生体成分にとって人工材料だと認識されにくい、ステルス性の材料だと考えられる。
【実施例４】
【００３６】
本発明のリジン残基を有する両性高分子物質の血液凝固に関する影響を検討するため、発色性合成基質を用いたトロンビン活性を定量的に検討した。実験方法は以下の通りである。所定濃度のトロンビンと本発明のリジン残基を有する両性高分子物質を添加し１０分間攪拌した後、トロンビンを特異的に認識して発色性を示す基質Ｓ−２２３８を添加してＳ−２２３８から遊離するｐ−ニトロアニリンの吸光度を蛍光マイクロプレートリーダを用いて１２０分追跡し、時間の経過に伴うｐ−ニトロアニリンの吸光度の変化をプロットした。得られた曲線の傾きの減少は、血液凝固活性の阻害を示す。結果を図９に示す。■は何も添加しない場合（ｎｏｎｅ）、▲はＰ（α−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合、●はＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合試験結果をそれぞれ示す。
【００３７】
血栓の主要成分はフィブリノーゲンから活性化されて形成されるフィブリンである。そこで、リジンメタクリルアミド[Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ）及びＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）]のフィブリン形成における影響を検討した。実験方法は以下の通りである。所定濃度のトロンビンとリジン残基を有する両性高分子物質を添加し１０分間攪拌した後、フィブリノーゲンを添加して形成されるフィブリンの濁度変化を蛍光マイクロプレートリーダを用いて１２０分追跡し、時間経過とフィブリン形成に伴う濁度変化をプロットした。得られた曲線の傾きの減少は、血液凝固活性の阻害を示す。結果を図１０に示す。■は基材に何も添加しない場合（ｎｏｎｅ）、▲はＰ（α−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合、●はＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合試験結果をそれぞれ示す。
【００３８】
トロンビン活性阻害におけるＰ（α−ＬｙｓＭＡ）及びＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）の添加効果を酵素反応速度論的に検討した。結果を図１１に示す。同図においては、基質濃度の逆数と反応速度の逆数をプロットしている。Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ）及びＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）の存在下において凝固因子トロンビンがその活性を抑制されたのは、生体高分子ヒルジンのトロンビン活性抑制に例えられる。ヒルジンはヒルジンが有するＮ末端あるいはＣ末端がトロンビンと結合する。特に、Ｃ末端部位がトロンビンのフィブリノーゲン結合部位と同じであることで、血液凝固を抑制している。また、トロンビン活性阻害におけるリＰ（α−ＬｙｓＭＡ）及びＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）の添加効果を酵素反応速度論的に検討した結果。Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ）及びＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）はトロンビンの活性を反競合的に阻害した。従ってＰ（α−ＬｙｓＭＡ）及びＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）はトロンビンの血液凝固活性部位と直接的に相互作用することで、フィブリノーゲンとトロンビンの結合を阻害し、血液凝固を抑制していると考える。■は基材に何も添加しない場合（ｎｏｎｅ）、▲はＰ（α−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合、●はＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合試験結果をそれぞれ示す。
【実施例５】
【００３９】
Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ）及びＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）の血栓溶解性における影響を検討するために、発色性合成基質を用いたプラスミン活性を定量的に検討した。実験方法は以下の通りである。所定濃度のプラスミンと高分子を添加し１０分間攪拌した後、基質Ｓ−２２５１を添加してＳ−２２５１から遊離するｐ−ニトロアニリンの吸光度を蛍光マイクロプレートリーダを用いて１２０分追跡し、時間の経過に伴うｐ−ニトロアニリンの吸光度の変化をプロットした。得られた曲線の傾きの増大は、酵素活性の増大を示す。結果を図１２に示す。■は基材に何も添加しない場合（ｎｏｎｅ）、▲はＰ（α−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合、●はＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合試験結果をそれぞれ示す。
【００４０】
血中濃度のフィブリノーゲンとトロンビンを４０分間反応させて人工的にフィブリンを作製し、このフィブリンにＰ（α−ＬｙｓＭＡ）あるいはＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）およびプラスミンを添加し、フィブリン分解によって生じる濁度の変化を２４０分追跡した。プラスミン添加後の濁度の低下が大きいほど、フィブリン分解を促進していることを示す。結果を図１３に示す。■は基材に何も添加しない場合（ｎｏｎｅ）、▲はＰ（α−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合、●はＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合試験結果をそれぞれ示す。
【００４１】
Ｓ−２２５１を用いたプラスミノーゲン／ｔ−ＰＡ活性を定量的に検討した。実験方法は以下の通りである。プラスミノーゲンおよびＰ（α−ＬｙｓＭＡ）及びＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）を添加して１０分間攪拌した後、Ｓ−２２５１およびｔ−ＰＡを加え、ｐ−ニトロアニリンの吸光度を蛍光マイクロプレートリーダを用いて２４０分追跡した。得られた曲線の傾きの増大は、酵素活性の増大を示す。結果を図１４に示す。■は基材に何も添加しない場合（ｎｏｎｅ）、▲はＰ（α−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合、●はＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合試験結果をそれぞれ示す。
【００４２】
人工的に作製したフィブリンを用いてプラスミノーゲン／ｔ−ＰＡ活性を測定した。人工的に作製したフィブリンにＰ（α−ＬｙｓＭＡ）あるいはＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）およびプラスミノーゲンを添加し、１０分間攪拌した後、ｔ−ＰＡを加えてフィブリン分解によって生じる濁度の変化を２４０分追跡した。ｔ−ＰＡ添加後に得られた直線の傾きが大きいほど、プラスミノーゲン／ｔ−ＰＡ活性におけるフィブリン分解を促進していることを示す。結果を図１５に示す。■は基材に何も添加しない場合（ｎｏｎｅ）、▲はＰ（α−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合、●はＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合試験結果をそれぞれ示す。
【００４３】
プラスミン反応系におけるリジンメタクリルアミド[Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ）及びＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）の添加効果を酵素反応速度論から検討した。結果を図１６に示す。基質濃度の逆数を横軸に、反応速度の逆数を縦軸にプロットし、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ
Ｐｌｏｔから評価した。■は基材に何も添加しない場合（ｎｏｎｅ）、▲はＰ（α−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合、●はＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合試験結果をそれぞれ示す。
【００４４】
プラスミノーゲン／ｔ−ＰＡ反応系における高分子の添加効果を酵素反応速度論から検討した。結果を図１７に示す。■は基材に何も添加しない場合（ｎｏｎｅ）、▲はＰ（α−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合、●はＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合試験結果をそれぞれ示す。基質濃度の逆数を横軸に、反応速度の逆数を縦軸にプロットし、Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ
Ｐｌｏｔから評価した。■は基材に何も添加しない場合（ｎｏｎｅ）、▲はＰ（α−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合、●はＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）を添加した場合試験結果をそれぞれ示す。
【００４５】
以下に、本発明のＰ（α−ＬｙｓＭＡ）が血液中のプラスミノーゲンと特異的に相互作用を示して、血栓溶解性を増大させたメカニズムを示す。
血中に存在するプラスミノーゲンにはフィブリンが有するアミノ酸Ｌ−リジンのεアミノ基を特異的に認識する部位（リジン結合部位）があり、プラスミノーゲンはそのリジン結合部位を介してフィブリンと結合し、血栓溶解性を示す。また、フィブリン上で血栓溶解作用が起こる時、プラスミンはプラスミン阻害因子であるα２−プラスミンインヒビターとの結合部位であるリジン結合部位がフィブリンによって占拠されているため、血栓溶解作用の阻害を受けることなくフィブリンを分解することができる。したがって、前記Ｐ（α−ＬｙｓＭＡ）はＬ−リジンのεアミノ基とカルボキシル基がフリーの状態となっているため、プラスミノーゲンのリジン結合部位と特異的に相互作用を示し血栓溶解性を増大させているが、Ｐ（ε−ＬｙｓＭＡ）はＬ−リジンのαアミノ基とカルボキシル基がフリーの状態となっているため、プラスミノーゲンのリジン結合部位と特異的に相互作用を示さず、血栓溶解性には直接影響を与えないと考える。
【００４６】
また、前記の各試験結果はＰ（α−ＬｙｓＭＡ）及びＰ（ε−ＬｙｓＭＡ）について行なったが、前記の化１および化２において、Ｘが例えば、Ｈ、−ＣＨ２ＣＨ３等の構造であっても、抗血栓性における同様の性能を示すと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明のリジン残基を有する両性高分子物質の製造法を示す図である。
【図２】酸塩基適定法による高分子組成物の等電点測定の測定結果を示す図である。
【図３】血漿タンパク質アルブミンの蛍光測定の結果を示す図である。
【図４】血漿タンパク質γ−グロブリンの蛍光測定の結果を示す図である。
【図５】血漿タンパク質フィブリノーゲンの蛍光測定の結果を示す図である。
【図６】血漿タンパク質プラスミンの蛍光測定の結果を示す図である。
【図７】血漿タンパク質プラスミノーゲンの蛍光測定の結果を示す図である。
【図８】ＩＡｓｙｓ測定による分子間相互作用解析の結果を示す図である。
【図９】基質Ｓ−２２３８を用いたトロンビン活性阻害評価の結果を示す図である。
【図１０】本発明の高分子組成物のフィブリン形成阻害試験の結果を示す図である。
【図１１】基質Ｓ−２２３８を用いたトロンビン活性阻害の速度論的解析の結果を示す図である。
【図１２】基質Ｓ−２２５１を用いたプラスミン活性評価の結果を示す図である。
【図１３】プラスミン活性による人工フィブリンの分解を濁度変化の追跡によって評価した。
【図１４】基質Ｓ−２２５１を用いたプラスミノーゲン／ｔ−ＰＡ活性評価を示す図である。
【図１５】プラスミノーゲン／ｔ−ＰＡ活性における人工フィブリンの分解を濁度変化の追跡によって評価した評価の結果を示す図である。
【図１６】プラスミン活性における酵素反応速度論的解析の結果を示す図である。
【図１７】プラスミノーゲン／ｔ−ＰＡ活性における酵素反応速度論的解析の結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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