(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップからなることを特徴とする醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法。
１）対数増殖後期或いはそれ以降の酵母を調製するステップ、
２）被検原料サンプルの水抽出高分子画分を調製するステップ、
３）１）のステップで調製した酵母と、２）のステップで調製した高分子画分を、バッフアー液中で混合、懸濁するステップ、
４）３）ステップで混合、懸濁した酵母の沈降度合いを測定するステップ。
【請求項２】
１）のステップにおいて調製した酵母が、酵母を培養し、対数増殖後期或いはそれ以降の酵母を回収したものであるか、或いは、該回収した酵母を更に凍結保存したものであるかを特徴とする請求項１記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法。
【請求項３】
回収した酵母を、ＥＤＴＡで洗浄することを特徴とする請求項２記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法。
【請求項４】
２）のステップの高分子画分が、被検原料サンプルの水抽出液をエタノール沈殿することによって調製した高分子画分であるか、或いは、被検原料サンプルの水抽出液を透析、限外濾過、ゲル濾過により分離した高分子画分であるかを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法。
【請求項５】
２）のステップの高分子画分が、被検原料サンプルの糖化液から調製された高分子画分であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法。
【請求項６】
２）のステップの水抽出高分子画分の調製に際して、抽出中に被検原料サンプルを酵素処理することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法。
【請求項７】
３）のステップのバッフアー液として、酢酸バッフアー−ＣａＣｌ２を用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法。
【請求項８】
４）のステップの酵母の沈降度合いを、ＯＤ６００を用いた光学密度の測定により行うことを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法。
【請求項９】
４）のステップの酵母の沈降度合いの測定に際して、３）のステップで混合、懸濁した試験系を、１５分間以上静置し、該静置した試験系を再度混合、懸濁し、該試験系をＯＤ６００を用いて光学密度の継時的な変化を測定することを特徴とする請求項８記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法。
【請求項１０】
３）のステップで混合、懸濁した試験系を、３０分間以上静置することを特徴とする請求項９記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法。
【請求項１１】
４）のステップの酵母の沈降度合いの測定に際して、２）のステップにおける被検原料サンプルの代わりに、水或いは非早期凝集原料をサンプルとして用い、該サンプルについて測定したＯＤ６００を用いた光学密度の継時的な変化をコントロールとして、被検原料サンプルについて測定したＯＤ６００を用いた光学密度を比較することにより、被検原料サンプルについての相対的な酵母の沈降度合いを測定することを特徴とする請求項８〜１０のいずれか記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法。
【請求項１２】
４）のステップの酵母の沈降度合いの測定に際して、３）のステップで混合、懸濁した試験系を、１５分間以上静置し、該静置した試験系を再度混合、懸濁し、該試験系をＯＤ６００を用いて光学密度の継時的な変化を測定する代わりに、２分間以上静置した後のＯＤ６００による光学密度を測定することにより酵母の沈降度合いを測定することを特徴とする請求項８記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法。
【請求項１３】
被検原料サンプルが、大麦、麦芽、又は製麦途中の大麦であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法。
【請求項１４】
被検原料サンプルの水抽出高分子画分が、麦芽粉砕物を３０秒間以上、水で抽出した抽出液の高分子画分であるか、又は、大麦粉砕物或いは製麦途中の大麦粉砕物を１５分間以上水で抽出した抽出液の高分子画分であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか記載の、醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法を用いることを特徴とする、醸造用原料の酵母早期凝集性の迅速判定法。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか記載の、醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法を用い、麦芽原料、製造途中の麦芽、又は製造麦芽の早期凝集性を判定することにより、麦芽製造工程を管理することを特徴とする、醸造用原料の酵母早期凝集性の迅速判定法を用いた麦芽の製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか記載の、醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法を用い、醸造原料の早期凝集性を判定することにより、用いる醸造原料の選択、調整を行うことを特徴とする、発酵アルコール飲料の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビールや発泡酒、或いはウィスキーなどの発酵麦芽飲料等の製造に用いられる醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法、及び、該測定法を用いた醸造原料の酵母早期凝集性の迅速判定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビールや発泡酒、或いはウィスキーなどの発酵麦芽飲料等の醸造においては、酵母による主発酵の終了時に、酵母が適度に凝集沈降する。この凝集沈降により酵母の回収が可能となる。もし、主発酵の終了時に、酵母が適度に凝集沈降しなければ、酵母の回収量が不足し、逆に凝集沈降しすぎれば発酵が進まず問題となる。この酵母の凝集は、発酵の終期になりエキスが少なくなると酵母がお互いに塊となって起こるが、この凝集により酵母は培養液より底に沈降する。この酵母自体の凝集には酵母細胞表層のレクチン様タンパク質と酵母マンナンのマンノース糖鎖の結合の関与等が報告されている（Appl. Microbiol. Biotechnol 23:197-205,2003）。【０００３】
このように発酵麦芽飲料等の醸造において、正常な発酵工程においては、酵母の凝集沈降は酵母による主発酵の終了時に、発酵液のエキスが少なくなった時点に適度に起こるが、この酵母の凝集沈降について「早期凝集現象」と呼ばれる現象が観察されることが報告されている。この「早期凝集現象」とは、酵母による発酵工程、特に発酵後期に、酵母の資化可能な糖分がまだ発酵液中に残っているにもかかわらず、酵母が凝集して沈降してしまう現象のことをいい、この早期凝集現象により、酵母が凝集・沈降してしまうと発酵の進行が停止してしまう。したがって、この現象が見られると、発酵が不十分となり、製造された製品が規格外のものとなり、発酵麦芽飲料等の醸造において、大きな損害を蒙ることにもなる。【０００４】
この発酵麦芽飲料等の醸造の発酵工程における酵母の早期凝集現象という問題を解決すべく、その原因の解明について多くの研究が行われ、報告されており、その結果、この早期凝集現象は、原料麦に由来し、麦芽中に含まれる高分子酸性多糖類が原因であることが明らかにされている。そして、この早期凝集現象を引き起こす因子が、製麦工程において生成される場合と、原料麦中にもともと存在している場合があることが解っている（J. Inst. Brew.,97,359-366, 1991;日本農芸化学会誌、71、381,1997；特開平１０−１７９１９０号公報）。従来より、大麦を原料とする発酵麦芽飲料等の醸造においては、発酵工程における早期凝集現象を避けるために、麦芽、大麦の早期凝集性の有無を確認して、早期凝集現象を引き起こさない大麦麦芽を選別し、用いることが行われてきた。【０００５】
麦芽、大麦等の早期凝集性の有無を確認するためには、従来の方法としては、発酵試験による方法が採用されてきた（K.Morimoto,et.al.,Rept. Res. Lab. Kirin Brewery Co.,ltd.,18,63,1975）。発酵試験は実際の醸造のスケールを小規模にした試験であり、麦汁の調製に１日、発酵の進行状況から麦芽、大麦中の早期凝集因子の有無を確認するのに８日間程度必要とした。更に、製麦前の麦類の場合は、製麦及び麦汁の調製に７日程度必要としたことから、合わせて半月程度の期間が、早期凝集因子の有無の確認のために必要とされた。【０００６】
この早期凝集性の有無を確認するための発酵試験の期間を短縮するために、被検原料麦に酵素を添加して原料麦を酵素処理し、得られた酵素処理物又は酵素処理物から分離された高分子画分を合成麦汁に添加して発酵試験原料とし、４８時間後の発酵試験原料の濁度を測定することにより原料麦中の早期凝集性因子の有無を判定する方法が開発された（特開平１０−１７９１９０号公報）。この方法により、早期凝集因子の有無の確認のための期間が大幅に短縮されたが、しかし、まだ４８時間の発酵試験の時間が必要であり、更に、この方法も発酵試験による方法であるために、発酵設備等の設備が必要となる。また、早期凝集性の有無を確認するために、発酵試験を行わない方法が記載された文献（Proc. Congr. Eur. Brew. Conv.28: 397-406, 2001）もあるが、正確に、かつ定量性をもって測定する系にはなっていない。したがって、発酵麦芽飲料等の醸造に際して、醸造原料の早期凝集因子の有無を確認するために、より簡便で、短期間に測定が可能な方法が開発されることが望まれていた。【０００７】
【特許文献１】特開平１０−１７９１９０号公報。
【非特許文献１】Appl. Microbiol. Biotechnol 23:197-205,2003。
【非特許文献２】K.Morimoto,et.al.,Rept. Res. Lab. Kirin Brewery Ｃo.  ,ltd.,18,63,1975。
【非特許文献３】J. Inst. Brew.,97,359-366, 1991。
【非特許文献４】日本農芸化学会誌、71、381，1997。
【非特許文献５】Proc. Congr. Eur. Brew. Conv.28:397-406, 2001。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、ビールや発泡酒、或いはウィスキーなどの発酵麦芽飲料等の製造に用いられる醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法、及び、該測定法を用いた醸造原料の酵母早期凝集性の迅速判定法を提供すること、特に、従来法のような発酵工程を経ることなく、短期間にかつ簡便に、醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子を測定する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、対数増殖後期或いはそれ以降の酵母を調製し、該酵母と、麦や麦芽等の被検原料サンプルの水抽出高分子画分とを、バッフアー液中で混合、懸濁し、該混合、懸濁した酵母の沈降度合いを測定することにより、従来法のような発酵工程を経ることなく、醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子を極めて短時間に測定することが可能であることを見い出し、本発明を完成するに至った。本発明の酵母早期凝集因子の測定法においては、酵母を培養して対数増殖後期或いはそれ以降の酵母を調製して用いる必要があるが、該酵母は予め培養したものを凍結保存しておくことも可能であり、早期凝集因子の測定に際して迅速な対応をとることが可能である。【００１０】
また、本発明の測定法を行うには、被検原料サンプルの水抽出高分子画分を調製することが必要であるが、該画分は醸造原料を水抽出した後、エタノール沈殿法或いは透析、限外濾過、ゲル濾過法等の高分子画分を分離する方法により、容易に調製することができる。更に、本発明の方法においては、酵母の沈降度合いを測定するのに、ＯＤ６００を用いた光学密度の測定法のような簡便かつ平易な手段で、正確に測定することが可能であり、本発明の測定法全体を簡便かつ迅速な酵母早期凝集因子の測定法とすることができる。本発明の早期凝集因子の測定法は、醸造に用いられる大麦や麦芽だけでなく、それ以外の原料穀物、或いはエキス等、全ての醸造原料の早期凝集因子の測定に適用することができる。【００１１】
すなわち具体的には本発明は、以下のステップからなることを特徴とする醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法。
１）対数増殖後期或いはそれ以降の酵母を調製するステップ、
２）被検原料サンプルの水抽出高分子画分を調製するステップ、
３）１）のステップで調製した酵母と、２）のステップで調製した高分子画分を、バッフアー液中で混合、懸濁するステップ、
４）３）ステップで混合、懸濁した酵母の沈降度合いを測定するステップ（請求項１）や、１）のステップにおいて調製した酵母が、酵母を培養し、対数増殖後期或いはそれ以降の酵母を回収したものであるか、或いは、該回収した酵母を更に凍結保存したものであるかを特徴とする請求項１記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法（請求項２）や、回収した酵母を、ＥＤＴＡで洗浄することを特徴とする請求項２記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法（請求項３）や、２）のステップの高分子画分が、被検原料サンプルの水抽出液をエタノール沈殿することによって調製した高分子画分であるか、或いは、被検原料サンプルの水抽出液を透析、限外濾過、ゲル濾過により分離した高分子画分であるかを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法（請求項４）や、２）のステップの高分子画分が、被検原料サンプルの糖化液から調製された高分子画分であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法（請求項５）や、２）のステップの水抽出高分子画分の調製に際して、抽出中に被検原料サンプルを酵素処理することを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法（請求項６）や、３）のステップのバッフアー液として、酢酸バッフアー−ＣａＣｌ２を用いることを特徴とする請求項１〜６のいずれか記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法（請求項７）や、４）のステップの酵母の沈降度合いを、ＯＤ６００を用いた光学密度の測定により行うことを特徴とする請求項１〜７のいずれか記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法（請求項８）や、４）のステップの酵母の沈降度合いの測定に際して、３）のステップで混合、懸濁した試験系を、１５分間以上静置し、該静置した試験系を再度混合、懸濁し、該試験系をＯＤ６００を用いて光学密度の継時的な変化を測定することを特徴とする請求項８記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法（請求項９）や、３）のステップで混合、懸濁した試験系を、３０分間以上静置することを特徴とする請求項９記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法（請求項１０）や、４）のステップの酵母の沈降度合いの測定に際して、２）のステップにおける被検原料サンプルの代わりに、水或いは非早期凝集原料をサンプルとして用い、該サンプルについて測定したＯＤ６００を用いた光学密度の継時的な変化をコントロールとして、被検原料サンプルについて測定したＯＤ６００を用いた光学密度を比較することにより、被検原料サンプルについての相対的な酵母の沈降度合いを測定することを特徴とする請求項８〜１０のいずれか記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法（請求項１１）や、４）のステップの酵母の沈降度合いの測定に際して、３）のステップで混合、懸濁した試験系を、１５分間以上静置し、該静置した試験系を再度混合、懸濁し、該試験系をＯＤ６００を用いて光学密度の継時的な変化を測定する代わりに、２分間以上静置した後のＯＤ６００による光学密度を測定することにより酵母の沈降度合いを測定することを特徴とする請求項８記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法（請求項１２）や、被検原料サンプルが、大麦、麦芽、又は製麦途中の大麦であることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法（請求項１３）や、被検原料サンプルの水抽出高分子画分が、麦芽粉砕物を３０秒間以上、水で抽出した抽出液の高分子画分であるか、又は、大麦粉砕物或いは製麦途中の大麦粉砕物を１５分間以上水で抽出した抽出液の高分子画分であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法（請求項１４）や、請求項１〜１４のいずれか記載の、醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法を用いることを特徴とする、醸造用原料の酵母早期凝集性の迅速判定法（請求項１５）からなる。
また、請求項１〜１４のいずれか記載の、醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法を用い、麦芽原料、製造途中の麦芽、又は製造麦芽の早期凝集性を判定することにより、麦芽製造工程を管理することを特徴とする、醸造用原料の酵母早期凝集性の迅速判定法を用いた麦芽の製造方法（請求項１６）や、請求項１〜１４のいずれか記載の、醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法を用い、醸造原料の早期凝集性を判定することにより、用いる醸造原料の選択、調整を行うことを特徴とする、発酵アルコール飲料の製造方法（請求項１７）からなる。  
【発明の効果】
【００１２】
ビールや発泡酒、或いはウイスキーのような発酵麦芽飲料等の醸造の発酵工程において発生する酵母の早期凝集現象は、それらの製品の品質に重大な影響を及ぼす。したがって、発酵麦芽飲料等の醸造に際して、醸造に用いる原料の早期凝集因子の有無を測定し、該原料の早期凝集性を判定し、原料の選択や調製に反映することは極めて重要なことである。本発明の酵母早期凝集因子の迅速測定法によれば、発酵麦芽飲料等の醸造に際して、醸造に用いる原料の早期凝集因子の有無を、従来法のような発酵法によらず、簡便な手段で、迅速かつ正確に測定することが可能であり、例えば、醸造に用いられる大麦や麦芽のような醸造原料の早期凝集因子の有無を約３時間というような短い時間で、正確かつ再現性よく測定・判定することが可能となる。したがって、発酵麦芽飲料等の醸造に際して用いる、醸造原料の早期凝集性の実用的な測定・判定方法として極めて有用なものである。【００１３】
また、本発明の迅速測定法は、麦芽、或いは製麦前の大麦はもとより、収穫直後の大麦、又は製麦途中の大麦、或いは、醸造に用いられるその他の穀類やエキス等における早期凝集因子の測定に適用することができ、簡便、迅速、かつ確実な方法として、広くこれらの醸造原料における早期凝集因子の有無の判定に用いることが可能なものである。更に、本発明の測定法は、少量のサンプルで測定が可能であることから、発酵麦芽飲料等の醸造に際して、簡便に用いることができると共に、精度の良い実用的な測定・判定方法として提供されるものである。また、本発明の早期凝集因子の測定法は、各々の原料ごとに早期凝集因子の測定を正確に把握することができるものであるから、各々の原料ごとの早期凝集性の判定が可能であり、また、極少量の早期凝集因子の活性も測定することが可能であることから、それぞれの醸造原料における分割された画分ごとの早期凝集因子の測定も可能であり、その早期凝集因子の精製や特定に効果的に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の醸造原料中に含まれる酵母早期凝集因子の迅速測定法は、以下のステップからなる。
１）対数増殖後期或いはそれ以降の酵母を調製するステップ、
２）被検原料サンプルの水抽出高分子画分を調製するステップ、
３）１）のステップで調製した酵母と、２）のステップで調製した高分子画分を、バッフアー液中で混合、懸濁するステップ、
４）３）ステップで混合、懸濁した酵母の沈降度合いを測定するステップ。【００１５】
該本発明の測定法における、１）のステップにおいて、対数増殖後期或いはそれ以降の酵母を調製するには、醸造に用いられる酵母を通常用いられる酵母用培地で培養し、酵母の増殖曲線を作成し、対数増殖後期或いはそれ以降に達した酵母（通常、８℃の培養温度で、４〜５日）を、遠心分離等により分離、回収する。回収した酵母は、例えば、０．１Ｍ  ＥＤＴＡのようなキレート化合物溶液で洗浄しておくのが望ましい。該回収した酵母は、例えば、１５％グリセロール溶液により、−８０℃で凍結保存した酵母のように、予め培養、回収した酵母を凍結保存して、１）のステップの酵母として調製しておくことができる。【００１６】
本発明の測定法における、２）のステップにおいて、被検原料サンプルの水抽出高分子画分を調製するには、大麦や麦芽等の被検原料サンプルを必要により粉砕処理し、水抽出、或いは通常の糖化を行う。被検原料サンプルの水抽出を行うに際しては、特開平１０−１７９１９０号公報に記載された方法に従い、被検原料サンプルをα−アミラーゼ、β−アミラーゼ、β−グルカナーゼ、プロテアーゼ等の添加によって酵素処理を行うことができる。被検原料サンプルの水抽出高分子画分を調製するに際して水抽出液から、高分子画分を分離するには、エタノール沈殿法、例えば、水抽出液に終濃度５０％にエタノールを添加し、沈殿を遠心分離により回収する方法、或いは、透析、限外濾過、ゲル濾過法等によって、分画、回収する方法等によって、分離、回収することができる。【００１７】
本発明の測定法における、３）のステップにおいて、１）のステップで調製した酵母と、２）のステップで調製した高分子画分を、バッフアー液中で混合、懸濁するには、該バッフアー液として、例えば、５０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ４〜４．５）−０．１％ＣａＣｌ２のような液を用いることができる。【００１８】
本発明の測定法における、４）のステップにおいて、３）ステップで混合、懸濁した酵母の沈降度合いを測定するには、ＯＤ６００を用いた光学密度の測定により行うことができる。該光学密度の測定に際しては、３）のステップで混合、懸濁した試験系を、１５分間以上静置し、該静置した試験系を再度混合、懸濁し、該試験系をＯＤ６００を用いて光学密度の継時的な変化を測定することにより行うことができる。該光学密度の測定に際して、更に、酵母の沈降度合いをシャープにするために、３）のステップで混合、懸濁した試験系を、３０分間以上静置するのが好ましい。【００１９】
本発明の測定法における、４）のステップの酵母の沈降度合いの測定に際しては、２）のステップにおける被検原料サンプルの代わりに、水或いは非早期凝集原料をサンプルとして用い、該サンプルについて測定したＯＤ６００を用いた光学密度の継時的な変化をコントロールとして、被検原料サンプルについて測定したＯＤ６００を用いた光学密度の測定値を比較することにより、被検原料サンプルについての相対的な酵母の沈降度合いを測定することができる。また、４）のステップの酵母の沈降度合いの測定に際して、３）のステップで混合、懸濁した試験系を、１５分間以上静置し、該静置した試験系を再度混合、懸濁し、該試験系をＯＤ６００を用いて光学密度の継時的な変化を測定する代わりに、２分間以上静置した後のＯＤ６００による光学密度を測定することにより酵母の沈降度合いを測定することができる。【００２０】
本発明の測定法は、醸造原料として用いられる大麦、麦芽、又は製麦途中の大麦についての簡便かつ迅速な、しかも確実な酵母早期凝集因子の測定法として有利に用いることができ、更に、醸造に用いられるその他の穀類やエキス等にも、同様に、簡便、迅速、かつ確実な早期凝集因子の測定法として適用することができる。本発明の早期凝集因子の測定法は、各々の醸造原料ごとに早期凝集因子の有無を測定することが可能であり、各々の醸造原料ごとの早期凝集性の判定が可能である。各々の醸造原料に含まれる早期凝集因子は、麦芽の場合は、麦芽粉砕物を３０秒間以上、水で抽出した抽出液の高分子画分として抽出され、大麦粉砕物或いは製麦途中の大麦の場合は、該原料の粉砕物を１５分間以上水で抽出した抽出液の高分子画分として抽出される。したがって、該高分子画分について、本発明の方法を適用すれば、該醸造原料における早期凝集因子の有無を判定することができる。【００２１】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２２】
［実験方法］
１）酵母の培養
ＹＥＰＧ培地（１％  Yeast Extract、２％  Bacto pepton、７．５％  Maltose、２．５％  Glucose）で、２０℃静置培養で３日間培養した前培養液を、あらかじめ８℃に冷却しておいたＹＥＰＧ培地（通常は２５０ｍｌ容メディウムビンに培地１００ｍｌ）に１．５％濃度で添加し、スターラーで攪拌しながら８℃で培養した。培養時、経時的にＯＤ６００を測定し、酵母の増殖曲線を作成し、対数増殖期、増殖曲線がねはじめた対数増殖後期（培養開始４日目）、定常期初期のそれぞれの酵母を用いた。【００２３】
２）試験用酵母の調製
培養の終了した酵母を、３０００ｒｐｍ、５分間（４℃）の遠心により回収した。回収した酵母は、冷水により懸濁洗浄し同様に遠心により回収し、冷却した１００ｍＭ  ＥＤＴＡ(ｐＨ８．０)によって懸濁洗浄２回、冷水による懸濁洗浄２回行い、２０ｍｌの冷水に懸濁させた。酵母液を１／２００希釈し、ＯＤ６００を測定することにより酵母濃度を測定した。また、冷水による洗浄を２回行った後、１５％のグリセロール液に懸濁し、同様に酵母液のＯＤ６００を測定することにより酵母濃度を測定した後、−８０℃で凍結させた。【００２４】
３）麦汁エタノール沈物画分の調製
麦芽１０ｇ或いは５０ｇを粗粉砕し、もろみ濃度１：６で調整したコングレス麦汁（４５℃：３０分→１℃／１分→７０℃：６０分後、ろ過）を遠沈管に移し、終濃度５０％にエタノールを添加した。８０００ｒｐｍ、１０分間(４℃)の遠心により沈殿を回収し、２０ｍｌ／５０ｇ麦芽（４ｍｌ／１０ｇ麦芽）の熱水で懸濁させた。懸濁液を５０ｍｌ容チューブに移し、水で２５ｍｌ／５０ｇ麦芽
（５ｍｌ／１０ｇ麦芽）にfill upし、８０００ｒｐｍ、１０分間（２０℃）の遠心により不要物を取り除き、上清をそれぞれの測定サンプルとした。
測定の際のコントロールとして、非早期凝集（以下、非早凝という）、及び早期凝集（以下、早凝という）麦芽から同様に調製した麦汁のエタノール沈物画分を用いた。【００２５】
４）大麦、および製麦途中大麦からの酵素調製液エタノール沈物画分の調製
大麦からの酵素調製液は、特開平１０−１７９１９０号公報に記載された方法に従い、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、β-グルカナーゼ、プロテアーゼ添加により行った。エタノール沈物画分の調製は、上記３）と同様に行った。測定の際のコントロールとして、非早凝、及び早凝大麦から同様に調製した酵素調製液のエタノール沈物画分を用いた。【００２６】
５）麦芽、大麦からの水抽出液エタノール沈殿画分の調製
麦芽、あるいは大麦粉砕物５ｇをチューブに取り、３０ｍｌの水を加え、３０秒、５分、１５分、３０分間それぞれ振盪した。所定の時間振盪後、７０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、上清を回収後、終濃度５０％にエタノールを添加した。８０００ｒｐｍ、１０分(４℃)の遠心により沈殿を回収し、２．５ｍｌの熱水で懸濁させた。８０００ｒｐｍ、１０分間（２０℃）の遠心により不要物を取り除き、上清をそれぞれの測定サンプルとした。測定の際のコントロールとして、非早凝、及び早凝麦芽、大麦から同様に調製した水抽出液のエタノール沈物画分を用いた。【００２７】
６）麦汁中の早凝誘発物質（早凝因子）の精製、及び精製した早凝因子のゲルろ過分画
早凝因子の精製を以下の工程で行った。
早凝麦汁によって発酵した回収酵母より、水、０．１Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ  ＮａＣｌによって順次溶出した。早凝活性を持った０．１Ｍ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ溶出画分を、ＤＥＡＥ−Sephadex  Ａ２５クロマトグラフィーにより分画した。活性画分を、再度ＤＥＡＥ−Sephadex  Ａ２５クロマトグラフィーにより最分画した。最分画による活性画分をフェノール／クロロホルム処理によりタンパク質を除去し、精製早凝因子を取得した。精製早凝因子の分子量を測定するために、BioGel  Ｐ１００によるゲルろ過を行った。糖量の測定は、定法であるフェノール硫酸法により行った。【００２８】
７）活性測定
分光光度計に使用するプラスティックキュベット（１０×１０×４５ｍｍ）に、
１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）    ：１．５ｍｌ
各種サンプル                              ：０．４ｍｌ
５０％塩化カルシュウム                    ：６μｌ
酵母液                                    ：２）で測定したＯＤ６００値から３になるように計算
水                                        ：全量で３ｍｌになるように調整
のように調製し、パラフィルムで上部をシールし、決めた回数（通常は４０回）上下に激しく混合した後、５分、１５分、３０分、６０分間、室温で放置した。所定の時間放置後、沈降した酵母凝集物を爪ではじいて分散させ、測定に供したすべてのサンプルを同時に、緩やかに上下に決めた回数（通常４回）混合させ、１分ごとに５分間、あるいは、２分後にＯＤ６００により濁度を測定した。２分後に測定したＯＤ６００値は、サンプルの代わりに水を添加した際のＯＤ６００値（ブランク）を１とした際の比で表した。
【実施例２】
【００２９】
（酵母の増殖ステージの違いによる活性測定結果）
実施例１の方法１）で記した酵母の増殖曲線、及び非早凝、早凝麦芽からの麦汁のエタノール沈殿画分をサンプルとして、増殖ステージの違う酵母を用いて活性測定を行った結果を図１に示した。なお、実施例１の方法７）で記した混合、懸濁後の放置時間は３０分で行った。図１から解るように、増殖曲線がねはじめた対数増殖後期以降の酵母を用いることにより、早凝性をほぼ同等に評価できることが解った。一方、対数増殖期の酵母を用いた際は、早凝性が評価できないことが解った。以上の結果を踏まえ、以後の実験は、対数増殖後期に入った酵母を用いて実験を行うことにした。
【実施例３】
【００３０】
（１５％グリセロール溶液により、−８０℃で凍結保存した酵母を用いた活性測定結果）
実施例１の方法２）で示した、１５％グリセロール溶液により凍結保存した酵母を融解し、非早凝、早凝麦芽からの麦汁のエタノール沈殿画分をサンプルとして活性測定を行った結果を図２に示した。なお、実施例１の方法７）で記した混合、懸濁後の放置時間は３０分で行った。図２から解るように、測定に用いる酵母は、１５％グリセロール中での凍結保存により、培養後すぐに調製した酵母と同様な結果が得られることが解った。
【実施例４】
【００３１】
（活性測定時の静置時間の違いによる結果）
正常、早凝麦芽からの麦汁のエタノール沈殿画分を用いて、実施例１の方法７）で記した混合、懸濁後の放置時間の違いによる活性測定結果の比較を図３に示した。図３から解るように、３０分以上の放置時間により、安定した早凝性の評価ができることが解った。なお、１５分の放置でも早凝性はある程度測定できることも解った。以上の結果を踏まえ、以後の実験における活性測定の際の混合、懸濁後の放置時間は３０分とした。
【実施例５】
【００３２】
（麦芽からの麦汁を用いた活性の測定）
非早凝、早凝麦芽からの麦汁のエタノール沈殿画分を用いて、実施例１の方法７）で述べたＯＤ６００による濁度の経時的な変化を図４に示した。早凝麦汁エタノール沈殿物添加区（早凝区）は、非早凝区と比較して明らかに酵母の沈降による濁度の減少が速い事が解った。キュベット試験によって沈降した酵母を顕鏡した結果を図５に示した。早凝区は非早凝区に比べ酵母が大きな塊となっており、沈降速度が速くなったことが裏付けられた。また、両区ともに沈降は２分後には終了し、少なくとも５分後まではＯＤ６００が、ほぼ一定の値に維持されることがわかった。このことから、混合後２〜５分の一定になったＯＤ６００値によって測定することができることが解った。混合後２分後における早凝区のＯＤ６００の値を、非早凝区の値の比として求めた結果を図６に示した。この結果から、混合後２分後の測定で、早凝性が判定できることが解った。
【実施例６】
【００３３】
（大麦からの酵素処理液を用いた活性の測定）
非早凝、早凝大麦からの酵素処理液の、エタノール沈殿画分を用いて、実施例１の方法７）で述べた２分後のＯＤ６００による濁度を、早凝区の非早凝区に対する比として現した結果を図７に示した。この結果から、混合後２分後の測定で、早凝性が判定できることが解った。
【実施例７】
【００３４】
（麦芽、大麦の水抽出液を用いた活性の測定）
早凝麦芽、及び早凝大麦の粉砕物を、水により、３０秒、５、１５、３０分間、それぞれ浸透し、その抽出液のエタノール沈殿画分をサンプルとして、実施例１の方法７）で述べた２分後のＯＤ６００による濁度を、ブランクでの濁度の比としてもとめた結果を、図８に示した。また、非早凝、早凝麦芽、及び非早凝、早凝大麦の粉砕物を、水により３０分間、それぞれ浸透し、その抽出液のエタノール沈殿画分をサンプルとして、実施例１の方法７）で述べた２分後のＯＤ６００による濁度を、早凝区の非早凝区に対する比として現した結果を図６、７に示した。それらの結果から、麦芽の水抽出エタノール沈殿画分においては、３０秒で大方が抽出され、５分間以上でほぼ全量が抽出されるので、５分間以上の抽出によって、早凝性の測定ができることが解った。また、大麦粉砕物の水抽出エタノール沈殿画分においては、１５分で大方が抽出され、３０分間以上でほぼ全量が抽出されるので、３０分間以上の抽出によって、早凝性の測定ができることが解った。
【実施例８】
【００３５】
（製麦途中サンプルの酵素処理液を用いた活性の測定）
早凝麦芽になった製麦区、及び非早凝麦芽を調製した製麦区の麦おろし直後から４日目まで、１日ごとにサンプリングし、それらサンプルを乾燥、粉砕し、水により３０分間抽出し、抽出液のエタノール沈殿画分を用いた本法による測定結果を、図９に示した。非早凝製麦区では４日間を通して活性は認められず、早凝因子は生成されていないことが示された。一方、早凝麦芽生成区では、発芽１日目に活性が認められ、２日目にはすでに仕上がり麦芽並みの活性、つまり早凝因子の生成が認められた。以上のことから、製麦途中のサンプルの早凝因子量をモニターするための系としても、本法は有用であることが示された。
【実施例９】
【００３６】
（早凝因子の精製工程における分画物を用いた活性測定結果）
実施例１の方法６）で示した、早凝因子精製工程中の、一回目のＤＥＡＥ−Sephadex  Ａ２５クロマトグラフィーによる分画結果を図１０に示した。この分画により、素通り（図中ＯＭと記載）を含めて、１１の糖のピークに分画された。
上記１１のピークをサンプルとした、本法による測定結果を図１１に示した。活性測定は、実施例１の方法７）に記載した反応系中のサンプルを、画分と水であわせて０．４ｍｌにして行った。図１１から解るように、図１０で示したピークの中で、図中で「５」と記載したピークに特異的に活性が認められた。以上の結果から、本法は、早凝因子の精製工程に利用できることが示された。
【実施例１０】
【００３７】
（精製早凝因子の、ゲルろ過分画物の活性測定）
実施例１の方法６）で記載された工程により精製された早凝因子を、BioGel  Ｐ１００によるゲルろ過を行った際の分画結果と、各画分の糖量１μg相当をサンプルとした、本法による測定結果を図１２に示した。図１２から解るように、供した糖は対称性をもった一つのピークとして分画され、精製された多糖であることが解った。精製糖のピークに、本法で測定した早凝性が認められ、精製物が早凝因子であることが示された。以上の結果から、本法は、１μgという極少量の早凝因子の早凝活性も測定できる系であることが示された。
【実施例１１】
【００３８】
（麦芽水抽出液及びエタノール沈殿による高分子画分をサンプルとした測定比較）
［実験方法］
早凝、及び非早凝麦芽９ｇに０．０５ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）１５ｍｌを加え、スターラーで１時間攪拌した。攪拌後、抽出液をろ紙濾過し、更に、濾液を０．４５μｍのフィルターを通し測定サンプルとした。サンプル液３００μｌ（麦芽０．１８ｇ相当分の抽出液）を用いて実施例１の７）に記載した活性測定法を用いて測定を行った。なお、比較として実施例１の３）に記載した早凝、及び非早凝麦汁からのエタノール沈殿の懸濁液９０μｌ（麦芽０．１８ｇ相当分）、及び、７）で記した通りの４００μｌ（麦芽０．８相当分）をサンプルとして同時に活性を測定した。【００３９】
（結果）
上記方法により、早凝、非早凝麦芽を用いて水抽出液、及びエタノール沈殿による高分子画分をサンプルとして活性を測定した結果を、図１３に示した。麦芽０．１８ｇ相当量の水抽出物をサンプルとした際、早凝区は、コントロール（水添加）区や非早凝区と測定値にほとんど差異は認められなかった（図１３の丸数字３）。一方、麦汁エタ沈物をサンプルとした際、麦芽０．１８ｇ相当量を添加した区において、早凝区は、コントロール（水添加）区や非早凝区に比べて濁度は低く、早凝活性はある程度測定できることがわかった（図１３の丸数字２）。また、麦芽０．８ｇ相当量を添加した区においては、その濁度差はより顕著となることが解った（図１３の丸数字１）。以上の結果から、抽出サンプルをエタノール沈殿等により高分子画分を取得しサンプルとすることによって、測定の精度が上昇すること、及び麦芽０．１８ｇ相当量よりも麦芽０．８ｇ相当量のサンプルを用いた方が、より測定の精度が上昇することが解った。
【実施例１２】
【００４０】
（活性測定に用いる酢酸ナトリウムバッファーの至適濃度の検討）
［実験方法］
終濃度０．０５、０．５、５、５０、５００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）により、実施例１の７）で示した方法により、早凝、及び非早凝麦芽からのエタノール沈殿の懸濁液を用いて活性を測定した。【００４１】
（結果）
活性の測定結果を、図１４に示した。この結果から解るように、測定結果は添加する酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）の濃度に大きく依存することが解った。５０ｍＭバッファー区において、早凝、非早凝の測定値の差が最も大きく、つまり最も精度の高い測定が行われることが解った。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明の実施例において、培養酵母のステージと早期凝集活性の測定結果の関係を示す図である。
【図２】本発明の実施例において、培養調製時の酵母と凍結保存した酵母を用いた場合の早期凝集活性を測定比較した結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例において、早期凝集活性測定時の混合、懸濁後の放置時間による早期凝集活性の測定結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例において、早期凝集麦汁及び非早期凝集麦汁を用いた試験における継時的濁度変化について示す図である。
【図５】本発明の実施例において、早期凝集麦汁及び非早期凝集麦汁を用いた試験における、キュベット内で沈降した酵母の写真撮影の結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例において、早期凝集麦芽及び非早期凝集麦芽について、エタノール沈殿を用いた場合の早期凝集活性について試験した結果を示す図である。
【図７】本発明の実施例において、早期凝集大麦及び非早期凝集大麦について、エタノール沈殿を用いた場合の早期凝集活性について試験した結果を示す図である。
【図８】本発明の実施例において、早期凝集麦芽及び早期凝集大麦粉砕物について、水抽出時間と早期凝集因子の抽出との関係について試験した結果を示す図である。
【図９】本発明の実施例において、早期凝集麦芽及び非早期凝集麦芽について、製麦途中のサンプルを用いて早期凝集活性を測定した試験の結果を示す図である。
【図１０】本発明の実施例において、麦汁をＤＥＡＥ−Sephadex  A25クロマトグラフィーを用いて分画した結果の各ピークを示す図である。
【図１１】本発明の実施例において、麦汁をＤＥＡＥ−Sephadex  A25クロマトグラフィーを用いて分画した結果の各ピークについて、早期凝集活性の試験をした結果を示す図である。
【図１２】本発明の実施例において、麦汁をＤＥＡＥ−Sephadex  A25クロマトグラフィーを用いて分画した早期凝集因子を、更に、BioGel  Ｐ１００によりゲル濾過を行った分画結果と、該画分の糖量１μｇ相当をサンプルとした早期凝集活性の測定結果を示す図である。
【図１３】本発明の実施例において、麦芽水抽出液及びエタノール沈殿による高分子画分をサンプルとした測定比較の結果を示す図である。
【図１４】本発明の実施例において、活性測定に用いる酢酸ナトリウムバッファーの至適濃度の検討を行った結果を示す図である。
【００４３】
0004612548.tif 000002
【図１】
0004612548.tif 000003
【図２】
0004612548.tif 000004
【図３】
0004612548.tif 000005
【図４】
0004612548.tif 000006
【図５】
0004612548.tif 000007
【図６】
0004612548.tif 000008
【図７】
0004612548.tif 000009
【図８】
0004612548.tif 000010
【図９】
0004612548.tif 000011
【図１０】
0004612548.tif 000012
【図１１】
0004612548.tif 000013
【図１２】
0004612548.tif 000014
【図１３】
0004612548.tif 000015
【図１４】
0004612548.tif 000016