(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄微小環境から潜伏性癌細胞微小転移への生存シグナル伝達を破壊して、骨髄微小環境の潜伏性癌細胞微小転移を、化学療法、生物学的療法、または放射線療法に対して感作するための組成物の調製のための、α５β１インテグリンの細胞外マトリクスへの結合を阻害することができる、インテグリンα５ブロッキング抗体、α５β１インテグリンブロッキングペプチド、またはフィブロネクチン特異的ブロッキングペプチドの使用。
【請求項２】
前記癌が転移性癌である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記癌が乳癌または前立腺癌である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
α５β１インテグリンの細胞外マトリクスへの結合を阻害することができる、インテグリンα５ブロッキング抗体、α５β１インテグリンブロッキングペプチド、またはフィブロネクチン特異的ブロッキングペプチドを含有することを特徴とする、骨髄微小環境から潜伏性癌細胞微小転移への生存シグナル伝達を破壊して、骨髄微小環境の潜伏性癌細胞微小転移を、化学療法、生物学的療法、または放射線療法に対して感作するための組成物。
【請求項５】
前記癌が転移性癌である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記癌が乳癌または前立腺癌である、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
さらに受容可能なキャリアを含む請求項４〜６のいずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
化学療法、生物学的療法、または放射線療法の前またはこれらと同時に投与される、請求項４〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
α５β１インテグリンの細胞外マトリクスへの結合を阻害することができる、インテグリンα５ブロッキング抗体、α５β１インテグリンブロッキングペプチド、またはフィブロネクチン特異的ブロッキングペプチドを含有することを特徴とする、骨髄微小環境の潜伏性癌細胞微小転移の再発を阻止するための組成物。
【請求項１０】
α５β１インテグリンの細胞外マトリクスへの結合を阻害することができる、インテグリンα５ブロッキング抗体、α５β１インテグリンブロッキングペプチド、またはフィブロネクチン特異的ブロッキングペプチドが、骨髄微小環境から潜伏性癌細胞微小転移への生存シグナル伝達を破壊して、骨髄微小環境の潜伏性癌細胞微小転移を、化学療法、生物学的療法、または放射線療法に対して感作する請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
前記癌が転移性癌である、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記癌が乳癌または前立腺癌である、請求項９〜１１のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１３】
さらに受容可能なキャリアを含む請求項９〜１２のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１４】
化学療法、生物学的療法、または放射線療法の前またはこれらと同時に投与される、請求項９〜１３のいずれか１項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、２００２年７月１６日に出願された、同時係属中の米国仮出願番号６０／３９６，４８２号の優先権を主張する。この出願の開示は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。出願人は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、この出願の利益を主張する。
【０００２】
（政府の権利の条項）
本発明に至った研究は、少なくとも一部、米軍助成金番号ＤＡＭＤ１７−０１−Ｃ−０３４３による援助を受けた。従って、政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、概して、腫瘍学、癌転移、および細胞増殖の分野に関する。特に、本発明は、細胞生存経路の特定の要素を妨害し、次いで、従来法の癌治療（化学療法および放射線療法を含む）の改善された効果を可能にする方法の同定に関する。より詳細には、本発明は、癌または過剰増殖障害の処置に対する化学療法または放射線療法に対して感作するための前処理、またはこれらを強化するための同時処置のための、キナーゼまたは転写インヒビターの使用に関する。本発明はまた、癌または過剰増殖障害を処置するためのα５インテグリンの発現および／またはＡｋｔのリン酸化をダウンレギュレートするための、キナーゼまたは転写インヒビターの使用を提供する。α５またはβ１インテグリンに特異的なブロッキング抗体もまた、癌または過剰増殖障害の処置のための化学療法または放射線療法に対する感作のための前処置における使用、またはこれらと同時に使用することが想定される。化学療法または放射線療法に対して感作するためまたはこれらを強化するためにフィブロネクチン結合ブロッキングペプチドを用いる癌または過剰増殖障害の処置方法もまた、本発明によって想定されている。さらに、本発明は、Ａｋｔの発現またはリン酸化を低減するためのレチノイドの使用方法および癌または過剰増殖障害の処置方法に関する。本発明はまた、癌または過剰増殖障害の処置のための、本発明の因子を含む薬学的組成物または本発明の因子を用いる方法を提供する。本発明に従って癌または過剰増殖障害を処置するのに使用するための新規の因子を同定するスクリーニング方法もまた、開示される。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
乳癌細胞は、疾患の早期に骨髄に転移する（Ｂｒａｕｎ，Ｓ．，ら（２０００）Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｄ．３４２、５２５−５３３）。ほとんどの転移細胞は、骨髄微小環境に到達した際に死滅するが、ある程度十分に分化した生存細胞は、何年もの間、潜伏した状態で留まり得るかまたは生存性を失うことなく成長停止し得る（Ｂｏｙｃｅ，Ｂ．Ｆ．，ら（１９９９）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  ６，３３３−３４７；Ｃｈａｎｇ．Ｊ．，ら（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １７，３０５８−３０６３）。これらは死から保護された状態であり、実際、これらを根絶するために特別に施される、数回のアジュバント化学療法を生き延びる（Ｂｒａｕｎ，Ｓ．，ら（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃ．１８，８０−８６）。骨髄微小環境における潜伏乳癌の潜伏（すなわち、長期間生存する成長停止）を誘導し、化学療法から細胞を保護する因子および機構は、大部分が未知のままである。しかし、骨髄微小環境における種々の増殖因子および細胞性インテグリンのリガンドが、転移性細胞の運命に影響し得る。これらの因子は、細胞の挙動に対して、十分に確立された効果（造血幹細胞の保護を含む）を有する（Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ，Ｒ．Ｅ．（１９９７）Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １０，４２９−４４４；Ｋｎａａｎ−Ｓｈａｎｚｅｒ，Ｓ．ら（１９９９）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２７、１４４０−１４５０）。
【０００５】
骨髄支質は、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ−１）、および塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）のような増殖因子の豊富な供給源である。乳管の分化に関与する因子であるＦＧＦ−２は、種々の比較的分化した乳癌細胞において増殖停止を誘導する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、潜伏性癌細胞の増殖停止および長期の生存を担う因子の同定、ならびに関与する機構のさらなる理解について、さらなる必要性が存在する。関与する因子が同定されれば、単独治療（ｓｔａｎｄ−ａｌｏｎｅ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）として使用され得る、または癌もしくは過剰増殖障害を処置するための治療の他の標準的な形式（例えば、化学療法または放射線療法）に付随する治療として使用され得る新規の治療が、開発され得る。本発明は、この対処されていない必要性に取り組む。
【０００７】
本発明の他の利点は、以下の例示の図面と組み合わせて、以下の詳細な説明から明らかとなる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
癌の微小転移巣および骨髄における他の過剰増殖障害由来の悪性細胞が、長期間の間、生存性を失うことなく潜伏し続けることは公知である。細胞が、化学療法または放射線療法を含む標準的な治療形式に耐性であることは、この増殖停止状態において起こる。この潜伏を誘導する因子は、現在までに知られていない。従って、本発明の目的は、この潜伏を担う因子を同定すること、ならびに癌および他の過剰増殖障害の処置のための新規の治療レジメンを同定し、使用し、そしてスクリーニングするためにこれらの因子を使用することである。
【０００９】
本発明の第１の局面は、癌または過剰増殖障害の処置において化学療法に対して感作するためまたは化学療法を強化するための、前処置または同時処置としてのキナーゼまたは転写インヒビターの同定および使用を提供する。好ましい実施形態において、本発明によって同定される因子は、ＭＡＰキナーゼ、Ｒｈｏキナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、および／またはＰＫＣキナーゼのインヒビターである。
【００１０】
別の好ましい実施形態において、キナーゼまたは転写インヒビターは、癌および／または過剰増殖障害を処置するために使用される。別の好ましい実施形態において、キナーゼまたは転写インヒビターは、乳癌を処置するために使用される。さらに別の好ましい実施形態において、キナーゼまたは転写インヒビターは、転移性乳癌を処置するために使用される。
【００１１】
本発明の第２の局面において、キナーゼまたは転写インヒビターは、α５またはβ１インテグリンの発現をダウンレギュレートするために使用される。
【００１２】
本発明の第３の局面において、キナーゼまたは転写インヒビターはＡｋｔの発現および／またはリン酸化を低減し、そして癌または過剰増殖障害の処置にために使用される。
【００１３】
本発明の第４の局面は、癌または過剰増殖障害の処置において化学療法もしくは放射線療法に対して感作するためまたは化学療法もしくは放射線療法を強化するための、前処置または同時処置としてのインテグリンα５またはβ１に対する抗体の使用を提供する。
【００１４】
好ましい実施形態において、転移性癌または他の過剰増殖障害を処置するために抗体が使用される。別の好ましい実施形態において、乳癌を処置するために抗体が使用される。さらに別の好ましい実施形態において、転移性乳癌を処置するために抗体が使用される。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得る。これらは単鎖抗体であり得る。これらはキメラ抗体であり得る。これらは、Ｆａｂフラグメントまたはそれらの可溶性成分であり得る。これらはヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。これらは、他の動物（ウマ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、ウサギ、およびモルモットが挙げられるがこれらに限定されない）において生成され得る。
【００１５】
本発明の第５の局面は、癌または過剰増殖障害の処置において化学療法もしくは放射線療法に対して感作するためまたは化学療法もしくは放射線療法を強化するための、前処置または同時処置としての、フィブロネクチン結合ブロッキングペプチドの使用を提供する。
【００１６】
好ましい実施形態において、フィブロネクチン結合ブロッキングペプチドは、乳癌を処置するのに使用される。さらに別の好ましい実施形態において、フィブロネクチン結合ブロッキングペプチドは、転移性乳癌を処置するのに使用される。
【００１７】
本発明の第６の局面は、Ａｋｔの発現またはリン酸化を減少させるためのレチノイドの使用および癌または過剰増殖障害の処置を提供する。
【００１８】
好ましい実施形態において、レチノイドは、転移性癌または他の過剰増殖障害を処置するのに使用される。別の好ましい実施形態において、レチノイドは、乳癌を処置するのに使用される。さらに別の好ましい実施形態において、レチノイドは、転移性乳癌を処置するのに使用される。
【００１９】
本発明の第７の局面は、細胞増殖により特徴付けられる疾患または障害に罹患した哺乳動物において、細胞増殖を阻害する方法を提供する。この方法は、化学療法または放射線療法の前にまたはそれらと同時に、有効量のキナーゼまたは転写インヒビターを投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、キナーゼインヒビターは、ＬＹ２９４００２、ＵＯ  １２６、ＡＧ８２、Ｙ２７６３２、ＳＢ２０３５８０、ＰＤ１６９３１６、ＰＤ９８０５９、Ｒ０３１８２２０、またはＣ３トランスフェラーゼインヒビターからなる群より選択される。
【００２０】
別の好ましい実施形態において、細胞増殖により特徴づけられる疾患または障害は、癌または過剰増殖障害である。別の好ましい実施形態において、癌は転移性癌である。別の好ましい実施形態において、癌は乳癌である。さらに別の好ましい実施形態において、乳癌は転移している。
【００２１】
なおさらに好ましい実施形態において、キナーゼまたは転写インヒビターは、α５インテグリンの発現またはＡｋｔのリン酸化をダウンレギュレートし、それを必要とする哺乳動物において、化学療法または放射線療法に対して感作するかまたはそれらを強化する。
【００２２】
本発明の第８の局面は、癌細胞中の微小環境からの生存シグナル伝達を破壊する方法を提供する。この妨害は、哺乳動物における癌微小転移巣および過剰増殖障害の化学療法、生物学的治療、または放射線療法に対して細胞を感作する。好ましい実施形態において、インテグリンは、α５および／またはβ１インテグリンであり、細胞外マトリクスタンパク質はフィブロネクチンである。別の好ましい実施形態において、癌は乳癌または前立腺癌である。さらに別の好ましい実施形態において、この方法は、インテグリンに特異的な抗体またはそのインテグリンと細胞外マトリクスとの相互作用を妨害するブロッキングペプチドまたは改変ペプチドを投与する工程を包含する。なおさらに好ましい実施形態において、この方法は、オールトランス（ａｌｌ  ｔｒａｎｓ）レチノイン酸またはレチノイン酸誘導体を投与する工程を包含する。なおさらなる実施形態は、転写インヒビターによって細胞表面インテグリンの発現を低減する工程、または微小環境タンパク質によるインテグリンの結合によって開始される生存シグナル伝達をブロックする工程を包含する。最も好ましい実施形態は、キナーゼインヒビターによる処置を提供する。このインヒビターは、ＭＡＰキナーゼ、Ｒｈｏキナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、およびＰＫＣキナーゼからなる群より選択される。最も好ましいインヒビターは、ＬＹ２９４００２、ＵＯ  １２６、ＡＧ８２、Ｙ２７６３２、ＳＢ２０３５８０、ＰＤ１６９３１６、ＰＤ９８０５９、Ｒ０３１８２２０、および3トランスフェラーゼインヒビターからなる群より選択される。
【００２３】
本発明の第９の局面は、哺乳動物における過剰増殖障害を処置する方法を提供する。この方法は、インテグリンと細胞外マトリクスの結合をブロックし得る因子を投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、インテグリンは、α５および／またはβ１であり、マトリクスはフィブロネクチンである。
【００２４】
本発明の第１０の局面は、過剰増殖障害を処置するための組成物の調製のための、因子の使用を提供する。この因子は、α５および／またはβ１インテグリンの発現およびそれらの細胞外マトリクスへの結合をダウンレギュレートし得る。
【００２５】
本発明の第１１の局面は、キナーゼもしくは転写インヒビター、および薬学的に受容可能なキャリアを含むか、または抗体、ブロッキングペプチド、もしくは改変ペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００２６】
他の目的および利点は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲を見れば明らかである。本明細書中で引用されている全ての参考文献は、それらの全体が本明細書中に援用されている。
【００２７】
（詳細な説明）
本発明の方法および処置法が記載される前に、本発明は、記載される特定の方法および実験条件に限定されず、このような方法および条件は変更され得ることが理解される。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のみのためであり、限定することを意図しないことがまた理解される。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲においてのみ限定される。
【００２８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示していない限り、複数の参照を含む。従って、例えば、「方法」に対する参照は、１つ以上の方法、および／または本明細書中に記載、かつ／もしくは本開示を読んだ際に当業者に明らかとなるであろうタイプの工程等を包含する。
【００２９】
そうでないことが定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるのと類似または同等のいかなる方法および材料も、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が、ここに記載されている。本明細書中で言及される全ての刊行物は、本明細書中に参考として援用される。
【００３０】
（定義）
本明細書中で使用される用語は、当業者に認識され公知である意味を有するが、利便上および完全性のために、特定の用語およびそれらの意味を、以下に示す。
【００３１】
「因子」は、薬学的組成物および診断組成物を調製するのに使用され得る全ての物質をいい、また、化合物、核酸、ポリペプチド、フラグメント、アイソフォーム、改変体、もしくはこのような目的のために（全て、本発明に従う目的である）独立して使用され得る他の物質であり得る。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、エピトープ決定基に結合し得るインタクトな分子およびそのフラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２）を含む。本発明のタンパク質に結合する抗体は、キャリア分子に結合された抗原を免疫することで目的の小ペプチドを含むインタクトなポリペプチドまたはフラグメントを用いて調製され得る。一般的に使用される、ペプチドに化学的に結合するキャリアとしては、ウシ血清アルブミンおよびサイログロブリンが挙げられる。次いで、この結合したペプチドは、動物（例えば、マウス、ラット、またはウサギ）を免疫するのに使用される。この抗体は、「キメラ抗体」であり得る。キメラ抗体とは、異なる部分が異なる動物種に由来する分子（例えば、ヒト免疫グロブリン定常領域およびマウスｍＡｂ由来の可変領域を有する抗体）のことをいう（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら，米国特許第４，８１６，５６７号；およびＢｏｓｓら，米国特許第４，８１６，３９７号を参照のこと）。抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。抗体は、単鎖抗体であり得る。抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、またはウマにおいて調製され得る。
【００３３】
本明細書中で使用される「アナログ」は、所望の活性および本発明の治療効果（例えば、細胞増殖を阻害すること、ならびに癌または過剰増殖障害を有する哺乳動物の処置のための化学療法または放射線療法に対して感作することまたはそれらを強化すること）を有する（しかし、必ずしも好ましい実施形態の配列と類似または同一の配列を含む必要はない）化学化合物、ヌクレオチド、タンパク質、またはポリペプチドと類似または同一の活性または機能を有するか、または本発明の因子と類似または同一の構造を有する化学化合物、ヌクレオチド、タンパク質、またはポリペプチドをいう。本明細書中で使用される場合、核酸もしくはヌクレオチド配列、またはタンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の基準の少なくとも１つを満たす場合、所望の活性を有する核酸、ヌクレオチド、またはタンパク質もしくはポリペプチドの配列と「類似」する：（ａ）核酸、ヌクレオチド、タンパク質、またはポリペプチドが、本明細書中に記載される所望の活性を有する核酸、ヌクレオチド、タンパク質またはポリペプチドの配列と、少なくとも３０％（より好ましくは、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）同一である配列を有すること；（ｂ）ポリペプチドが、ＡＡＰＩの少なくとも５アミノ酸残基（より好ましくは、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１５アミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも２５アミノ酸残基、少なくとも４０アミノ酸残基、少なくとも５０アミノ酸残基、少なくとも６０アミノ酸残基、少なくとも７０アミノ酸残基、少なくとも８０アミノ酸残基、少なくとも９０アミノ酸残基、少なくとも１００アミノ酸残基、少なくとも１２５アミノ酸残基、または少なくとも１５０アミノ酸残基）をコードするヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされること；または（ｃ）ポリペプチドが、所望の治療効果を有する本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と少なくとも３０％（より好ましくは、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）同一のヌクレオチド配列によりコードされること。本明細書中で使用される場合、本発明の好ましい実施形態と「類似の構造」を有するポリペプチドは、好ましい実施形態と類似の二次構造、三次構造、または四次構造を有するポリペプチドをいう。ポリペプチドの構造は、当業者に公知の方法（Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴、および結晶電子顕微鏡検査が挙げられるがこれらに限定されない）により決定され得る。
【００３４】
「誘導体」は、アミノ酸残基の置換、欠失、もしくは付加の導入により変更された親タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列を含むタンパク質またはポリペプチド、あるいはヌクレオチドの置換、欠失、付加、または変異のいずれかの導入により改変された核酸またはヌクレオチドをいう。誘導核酸、ヌクレオチド、タンパク質、またはポリペプチドは、親ポリペプチドと類似または同一の機能を有する。誘導体はまた、活性な親化合物と機能的に等価であるが構造が異なり得る、化学的に合成された有機分子をいい得る。誘導体はまた、生物利用性（ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）、吸着性を増大するか、または毒性を減少させるよう化学的に変更された、化学的に類似する化合物をいい得る。
【００３５】
「フラグメント」は、親タンパク質もしくはポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５アミノ酸残基（好ましくは、少なくとも１０アミノ酸残基、少なくとも１５アミノ酸残基、少なくとも２０アミノ酸残基、少なくとも２５アミノ酸残基、少なくとも４０アミノ酸残基、少なくとも５０アミノ酸残基、少なくとも６０アミノ酸残基、少なくとも７０アミノ酸残基、少なくとも８０アミノ酸残基、少なくとも９０アミノ酸残基、少なくとも１００アミノ酸残基、少なくとも１２５アミノ酸残基、少なくとも１５０アミノ酸残基、少なくとも１７５アミノ酸残基、少なくとも２００アミノ酸残基、または少なくとも２５０アミノ酸残基）のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはポリペプチドか、または親核酸のヌクレオチド配列の少なくとも１０塩基対（好ましくは、少なくとも２０塩基対、少なくとも３０塩基対、少なくとも４０塩基対、少なくとも５０塩基対、少なくとも１００塩基対、少なくとも２００塩基対）のヌクレオチド配列を含む核酸のいずれかをいう。任意の所定のフラグメントは、親核酸またはタンパク質もしくはポリペプチドの機能的活性を有する場合も有さない場合もある。
【００３６】
「治療有効量」は、癌もしくは過剰増殖障害または本発明の組成物による治療が企図される他の関連状態に関連する症状を減少または防止するのに十分な量である。
【００３７】
「処置」は、治療、阻止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、および予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）をいい、特に、予防（阻止）、あるいは無気力（虚弱）もしくは倦怠感の発症の程度もしくは可能性または患者が発症した場合の状態もしくは事象を治癒もしくは低減するためのいずれかのための、患者に対する医薬の投与または医療手順の実施をいう。
【００３８】
「併用療法」は、癌または過剰増殖障害の処置のための本発明の様式において、他の活性因子または処置様式と共に本発明の因子を使用することをいう。これらの他の因子または処置としては、他の抗癌薬（例えば、種々の癌を処置するのに標準的に使用される抗癌薬）のような薬物、放射線療法、抗ウイルス薬、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症化合物、疼痛を処置または緩和するのに有用な他の因子、増殖因子、サイトカイン、またはコロニー刺激因子が挙げられ得る。本発明の因子とこれらの他の治療または処置様式との組み合わせ使用は同時使用であり得るか、または本発明の因子が他の治療または処置様式の前または後に与えられ得るように、２つの処置は分離され得る。
【００３９】
「局所投与」は、苦痛、障害、または知覚される疼痛の部位またはその近傍における非全身経路による直接投与を意味する。
【００４０】
「遅延放出処方物」は、治療有効量の薬物または他の活性因子（例えば、ポリペプチドまたは合成化合物）を長期間にわたり放出するよう設計された処方物をいい、その結果、所望の治療効果を達成するのに必要とされる処置数が減少される。本発明において、遅延放出処方物は、細胞増殖を阻害すること、および腫瘍量または癌もしくは過剰増殖障害の転移能を減少することに関して、所望の効果を達成するのに必要とされる処置数を減少する。
【００４１】
用語「クローン化能」は、単一の細胞が、細胞クラスターに分裂および増殖する能力をいう。これは、身体中の転移性癌細胞の特徴である。研究室では、これは、組織培養ディッシュ中または懸濁物中に提供される支持体上の多くの要因（生存性、細胞の健康状態、損傷、および分裂する能力が挙げられる）を反映する。
【００４２】
「ＥＧＦ」は上皮増殖因子（細胞表面レセプターに結合し、細胞に、分裂、這回（ｃｒａｗｌ）、および生存するよう通知するシグナルを開始するタンパク質）である。
【００４３】
「ＩＧＦ」は、インシュリン様増殖因子（インシュリン様増殖因子レセプターに結合し、細胞に、細胞型に依存して、細胞分裂生存からの種々の機能を発揮するよう通知するシグナルを開始するタンパク質）である。
【００４４】
「ＦＧＦ−２」は、塩基性線維芽細胞増殖因子である線維芽細胞増殖因子２（異なる細胞に異なる機能を発揮するよう通知する種々のシグナルを開始する細胞表面レセプターに結合する）である。乳癌において、ＦＧＦ−２は、分化因子として作用し得、増殖および運動を阻害する。
【００４５】
用語「過剰増殖障害」は、細胞の異常な増殖から生じる疾患をいう。これらとしては、癌、悪性前状態、および炎症状態（例えば、慢性関節リウマチまたは乾癬のような状態）が挙げられ得る。
【００４６】
「インテグリン」は、内因性の細胞表面タンパク質である。それらは、細胞外マトリクスの成分（例えば、フィブロネクチン）と結合することにより細胞接着を媒介する。この接着プロセスは、細胞が生存および再生する能力と緊密に結び付く。多くの異なるインテグリンが発見されており、そのほとんどは、類似の構造的特徴を有する（例えば、それらは、ヘテロ二量体膜貫通タンパク質であり、αサブユニットおよびβサブユニットを含む）。ほとんどの細胞上の主要なフィブロネクチンレセプターは、α５β１インテグリンである。このインテグリンは、フィブロネクチン分子のＲＧＤ部位と相互作用する。
【００４７】
キナーゼは、リン酸基を別のタンパク質に移す酵素として作用するタンパク質である。「キナーゼインヒビター」は、このようなタンパク質の作用をブロックする。
【００４８】
「転写インヒビター」は、ＤＮＡテンプレートからのメッセンジャーＲＮＡ合成を妨害する化学物質または生物学的物質である。
【００４９】
「ＡＴＲＡ」は、オールトランスレチノイン酸（それらのレチノイドリガンドに結合した場合、転写因子として作用する核レセプター（レチノイン酸レセプターおよびレチノイドＸレセプターと呼ばれる）に結合することにより作用する化合物（レチノイドと呼ばれるファミリーのメンバーをいう。ＡＴＲＡは、細胞増殖を阻害し、細胞死を誘導し、そして乳癌細胞において化学療法剤を強化する。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、用語「改変ペプチド」は、タンパク質に結合し、その活性（例えば、細胞表面レセプター）を調節し得るペプチドをいうのに使用され得る。改変ペプチドは、例えば、結合を調節（増加または減少）する特徴、ペプチドの半減期を変更する特徴、腎臓のクリアランスを減少する特徴、または吸着を改善する特徴を有し得る。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸」および特定のアミノ酸に対する任意の参照は、天然に存在するタンパク質新生アミノ酸および天然に存在しないアミノ酸（例えば、アミノ酸アナログ）を含むことが意味される。当業者は、この定義が、そうでないことが特別に示されていない限り、天然に存在するタンパク質新生性の（Ｄ）または（Ｌ）アミノ酸、化学改変アミノ酸（アミノ酸アナログ（例えば、ペニシルアミン（３−メルカプト−Ｄ−バリン）））、天然に存在する非タンパク質新生アミノ酸（例えば、ノルロイシン）およびアミノ酸の特徴である当該分野で公知の特性を有する化学合成された化合物を含むことを認識する。本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質新生」は、そのアミノ酸が、細胞中にて周知の代謝経路を通じてタンパク質に組み込まれ得ることを示す。
【００５２】
本発明のペプチドに（Ｌ）−アミノ酸を含めるか（Ｄ）−アミノ酸を含めるかの選択は、一部、そのペプチドの所望の特定に依存する。例えば、１つ以上の（Ｄ）−アミノ酸の組み込みは、インビトロまたはインビボにおいて、そのペプチドに対して増加した安定性を与え得る。１つ以上の（Ｄ）−アミノ酸の組み込みはまた、例えば、本明細書中に記載される結合アッセイまたは当該分野で周知の他の方法を用いて決定される場合に、そのペプチドの結合活性を増加または減少させ得る。いくつかの場合、例えば、被験体に投与するためのペプチドを設計する際に、活性を短期間保持するペプチドを設計することが望ましい。これらの場合、そのペプチドにおいて１つ以上の（Ｌ）−アミノ酸を組み込むことで、被験体における内因性のペプチダーゼが、そのペプチドをインビボで消化することを可能にし、それによって、活性ペプチドの被験体への暴露を制限できる。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸等価物」は、天然に存在するアミノ酸の構造とは異なるが、そのアミノ酸の構造を実質的に有し、その結果、生物学的活性を保持するペプチドにおいて置換され得る化合物をいう。従って、例えば、アミノ酸等価物としては、側鎖改変または置換を有するアミノ酸が挙げられ得、関連する有機酸、アミド等も挙げられる。用語「アミノ酸」は、アミノ酸等価物を含むことが意図される。用語「残基」は、アミノ酸およびアミノ酸等価物の両方をいう。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」は、その最も広い意味で使用され、ペプチドの所望の機能的活性を保持しつつ、アミノ酸等価物または他の非アミノ基を含む化合物をいう。ペプチド等価物は、１つ以上のアミノ酸が、関連する有機酸（例えば、ＰＡＢＡ）、アミノ酸等と置換されることにより、または側鎖もしくは官能基の置換もしくは改変により、従来のペプチドと異なり得る。
【００５５】
その生物学的機能を破壊することなく、ペプチドに対して限定的な改変がなされ得ることが理解されるべきである。従って、その活性を完全に破壊しない本発明のペプチドの改変は、このような化合物クレームの定義の中に含まれる。改変としては、例えば、アミノ酸残基の付加、欠失、または置換、アミノ酸構造または機能を模倣する化合物との置換、およびアミノ基またはアセチル基のような化学部分の付加が挙げられ得る。改変は、意図的でも偶発的でもあり得、組成の改変でも構造の改変でもあり得る。
【００５６】
本発明のペプチドまたは「改変ペプチド」による標的化に関して想定される代表的な細胞表面レセプターは、インテグリンレセプターファミリーのメンバーである。本発明の１つの実施形態において、「改変ペプチド」は、インテグリンレセプター活性（インテグリン発現細胞が細胞外マトリクスタンパク質および周辺細胞に結合する能力が挙げられるがこれに限定されない）を阻害するのに使用され得る。インテグリン結合／活性を阻害し得る改変ペプチドは、米国特許第５，５３６，８１４号；同第５，６２７，２６３号；同第５，９１２，２３４号；同第５，９２２，６７６号；同第５，９８１，４７８号；同第５，９１２，２３４号；および同第６，１７７，５４２号に記載されている。これら各々の全ての内容は、その全体が、参考として本明細書中に援用されている。
【００５７】
レチノイドは、４つのイソプレノイド単位からなる、ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ様式で連結された化合物の１つのクラスである。全てのレチノイドは、外見上、５つの炭素−炭素二重結合および非環式部分の末端に官能基を含む単環式親化合物から誘導され得る。レチノイドの誘導体は、当業者に公知の手段によって生成され得、レチノイド誘導体に、よりよい治療上有効性が与えられる。レチノイド誘導体は、例えば、アルデヒド誘導体、カルボン酸誘導体、置換誘導体、水素化誘導体であり得、また、レチノイド誘導体は、骨格炭化水素の機能的置換によって誘導され得る。例えば、過剰増殖細胞をより特異的に標的化するレチノイド誘導体が、生成され得る。本明細書中で使用される場合、用語「レチノイド誘導体」はまた、レチノイド活性を有するが、必ずしもレチノイドレセプターを通じて作用しない化合物または因子をいうのにも使用され得る。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、用語「生物学的療法」は、癌細胞の数および／または癌に関連する症状を低減するために施される処理に対する被験体または患者の応答を増強するよう設計された治療レジメンをいう。一般的には、「生物学的療法」は、種々のサイトカイン（増殖因子、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、およびインターロイキンが挙げられるがこれらに限定されない）の使用を含む。
【００５９】
本明細書中で使用される場合、用語「感作」または「感作する」は、被験体または細胞を、治療レジメンの効果に対してより感受性を与えるよう被験体を処置することをいう。多くの感作因子が、例えば、被験体から癌を根絶するために設計された治療様式に対するよりよい感受性を癌細胞に与えることが特徴付けられている。このような感作因子は、以前に、例えば、米国特許第５，４３６，３３７号に記載されている。この文献の全内容は、本明細書中に参考として援用されている。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、表現「微小環境からの生存シグナル伝達を破壊する」は、インテグリンとそれらのリガンドとの間の相互作用が限定または減少された状況をいう。このような相互作用は、抗体またはペプチドを用いて物理的にブロックされ得る；または転写阻害を介してインテグリンの細胞表面発現レベルを減少することによるか、または微小環境におけるタンパク質によるインテグリンレセプターの連結により開始される生存シグナル伝達をブロックすることにより防止され得る。
【００６１】
（全体的な説明）
本発明は、骨髄における転移した乳癌細胞上でのインテグリンα５およびβ１の増加した発現が、骨髄におけるマトリクスタンパク質からの生存シグナルを伝達するという新しい発見に関するものである。インテグリンのフィブロネクチンへの連結は、インテグリンにより媒介される細胞死シグナル伝達を妨害し、そして細胞生存シグナル伝達を開始する。これによって、乳癌患者において化学療法からの潜伏性の保護が誘導され、最終的には再発することとなる。本発明は、これらのインテグリンの発現を阻害し、生存経路の特定のエレメントを妨害する方法を提供する。これによって、従来の化学療法または放射線療法が、骨髄に残存する細胞を死滅させ、再発およびその細胞による最終的な耐性および過剰増殖障害（例えば、乳癌または前立腺癌であるがこれらに限定されない）に罹患した患者の死を回避するために利用可能となる。α５およびβ１の過剰発現は、図１において実証されているようなキナーゼまたは転写インヒビターの使用を通じてダウンレギュレートされる。
【００６２】
図１のスキームは、骨髄における転移性細胞の運命、および生存および化学耐性（ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を維持する上での、フィブロネクチンのそのインテグリンレセプターα５β１を通じた連結の効果を実証している。これらのインテグリンの合成を減少させることによるこの相互作用の破壊またはそれらのリガンドとの相互作用の破壊により、この細胞は、化学療法に対して感受性となり、細胞死を引き起こす。
【００６３】
本発明において、ＦＧＦ−２が、十分に分化した微小転移性乳癌細胞においてより分化した潜伏性の状態を開始するという概念を指示する証拠が提供される。これは、細胞周期の停止およびインテグリンレパートリーの変化を含む。線維芽細胞および内皮細胞においてＦＧＦ−２によりアップレギュレートされた、不適切に連結されたインテグリン（例えばα５β１）を有する細胞は、おそらくリガンドの不適合性に起因して、細胞死を引き起こす。生存シグナル伝達を開始し得る骨髄支質の成分であるフィブロネクチンによるインテグリンα５β１の連結（Ｍａｔｔｅｒ，Ｍ．ＬおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．（２００１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，２７７５７−２７７６３；Ｌｅｅ，Ｊ．Ｗ．およびＪｕｌｉａｎｏ，Ｒ．Ｌ．（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  １１，１９７３−１９８７）は、ＦＧＦ−２応答性細胞の生存を促進する。
【００６４】
特に、本発明は、癌細胞における微小環境からの生存シグナル伝達を破壊するための方法に関する。この破壊により、細胞は、哺乳動物における癌転移および過剰増殖障害の化学療法、生物学的療法、または放射線療法に対して感作される。この方法は、微小環境の細胞外マトリクスタンパク質とインテグリンとの相互作用をブロックする工程を包含する。好ましい実施形態は、α５および／またはβ１インテグリンを含み、そして好ましい細胞外マトリクスタンパク質はフィブロネクチンである。本発明は、原発性腫瘍、腫瘍転移、微小転移巣、および過剰増殖障害を処置することに関する。さらに好ましい実施形態は、乳癌または前立腺癌を処置することである。
【００６５】
さらに好ましい実施形態は、細胞外マトリクスとインテグリンとの相互作用を破壊するインテグリンまたはブロッキングペプチドまたは改変ペプチドに特異的な抗体の投与を包含する。なおさらに好ましい実施形態は、オールトランスレチノイン酸またはレチノイン酸誘導体の投与を包含する。なおさらに好ましい実施形態は、転写インヒビターにより細胞表面インテグリンの発現を減少させる工程を包含する。この方法はまた、キナーゼインヒビターにより処置を包含し、ここで、キナーゼは、ＭＥＰ／ＭＡＰキナーゼ、ｐ３８、ＲｈｏＡ、Ｒｈｏキナーゼ、ＰＩ３キナーゼ、ＰＫＣ、およびＰＫＡからなる群より選択される。この方法はさらに、微小環境タンパク質によるインテグリンの連結により開始される生存シグナル伝達をブロッキングする工程を包含する。この方法はまた、Ｙ２９４００２、ＵＯ１２６、ＡＧ８２、Ｙ２７６３２、ＳＢ２０３５８０、ＰＤ１６９３１６、ＰＤ９８０５９、Ｒ０３１８２２０、およびＣ３トランスフェラーゼインヒビターからなる群より選択されるインヒビターの使用を包含する。
【００６６】
従って、原発性癌、転移性癌、微小転移巣、および過剰増殖障害を処置する方法が、本発明により包含される。併用療法もまた、他の標準的な形態の化学療法、放射線療法、および生物学的治療、ならびに他の抗新生物レジメンと共に想定される。本発明において記載される療法は、他の抗新生物処置様式の付属療法（ａｄｊｕｎｃｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）として使用され得ることが想定される。
【００６７】
乳癌の潜伏を誘導する際に骨髄微小環境に関連する種々の支質タンパク質および増殖因子の役割を、乳癌細胞株のパネルを用いて研究した。
【００６８】
骨髄微小環境における乳癌細胞の増殖停止を誘導する上でのＦＧＦ−２の潜在的な役割を試験するために、ＦＧＦ−２の存在下、支質タンパク質上でのＭＣＦ−７、Ｔ−４７Ｄ、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞のクローン化能を測定した。クローン化能は、単一の細胞が複数の細胞のクラスターに増殖する能力であり、これは、悪性細胞の転移性増殖の特徴（ｈａｌｌｍａｒｋ）である。ＦＧＦ−２の存在（ＥＧＦではなく）は、比較的十分分化したＭＣＦ−７およびＴ−４７Ｄ細胞のクローン化増殖を有意にブロックしたが、高度に脱分化（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）した攻撃性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対する効果は有さなかった。ＦＧＦ−２により停止された細胞は、コラーゲン−１およびラミニン−１上で生存できなかったが、フィブロネクチン上では数日間生存した。
【００６９】
増殖停止細胞の長期生存の分子的基礎を研究するため、ＦＧＦ−２の存在下で３日間および５日間、フィブロネクチン上で潜伏していた乳癌細胞における種々のインテグリンの発現レベルと、フィブロネクチン上で活発に増殖していた細胞における種々のインテグリンの発現レベルとの間で比較を行った。マイクロアレイ分析は、フィブロネクチンレセプターであるインテグリンα５の増加した発現レベルを示した。ウェスタンブロットは、ＦＧＦ−２が、インテグリンα５およびβ１の両方（これらは、一緒に、ＭＣＦ−７細胞およびＴ−４７Ｄ細胞において、それらの天然の対状態でフィブロネクチンレセプターを構成する）の増加した発現を誘導したが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における構成的なインテグリンα５の高発現に対して効果がなかったことを実証した。フィブロネクチン上でのＦＧＦ−２処置細胞の増殖におけるブロックは、細胞を抗インテグリンα５抗体で前処理することによりさらに顕著になった。このことは、骨髄における潜伏性乳癌細胞の生存を支持する上でのフィブロネクチンの役割を強く示唆している。インテグリンα５およびβ１の発現をダウンレギュレートした、フィブロネクチンとそれらのインテグリンレセプターとの相互作用を破壊するブロッキングペプチドはまた、ＦＧＦ−２の存在下で、細胞へのフィブロネクチン結合の生存効果を逆転させた。ＦＧＦ−２はまた、生存シグナル伝達に関与するキナーゼＡｋｔのリン酸化を誘導した。オールトランスレチノイン酸は、ＥＧＦにより誘導されるＡｋｔリン酸化を逆転することができ、逆転したＦＧＦ−２誘導性の増加は、総Ａｋｔおよびリン酸化Ａｋｔを増加させる。このことは、これらの細胞における生存を破壊するさらなる機構を示唆している。
【００７０】
（治療的徴候）
化学療法または放射線療法に対して潜伏細胞または転移細胞を感作するための前処置としての、キナーゼまたは転写インヒビターまたは抗体またはブロッキングペプチドまたは改変ペプチドの投与。このインヒビターは、注射、経口、液状、錠剤、または座剤が挙げられるがこれらに限定されない種々の方法において投与され得る。
【００７１】
（薬学的組成物および投与方法）
本発明はまた、本発明の方法において使用される薬学的組成物を提供する。このような組成物は、治療有効量の本発明の因子および薬学的に受容可能なキャリアを含む。特定の実施形態において、用語「薬学的に受容可能」は、動物、より詳細にはヒトにおける使用について、国家または州政府の管理機関によって承認されていること、または米国薬局方または他の一般的に認識されている薬局方に列挙されていることを意味する。用語「キャリア」は、治療剤と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいう。このような薬学的キャリアは、滅菌液（例えば、水および油（石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源のもの（例えば、ピーナツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など）が挙げられる））であり得る。水は、薬学的組成物が静脈内投与される場合に好ましいキャリアである。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体キャリアとして用いられ得る（特に、注射溶液のために）。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、粉末脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望の場合、この組成物はまた、微量の湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤を含み得る。
【００７２】
治療因子は、ポリペプチドであろうと、アナログであろうと、活性フラグメント含有組成物であろうと、有機低分子であろうと、種々の経路（例えば、静脈内、筋内、皮下を含めて、単回用量の注射によって）により、従来法で投与される。本発明の治療組成物を参照して使用される、用語「単回用量」は、ヒト用の単位用量として適切な物理的に別個の単位であって、各々の単位が、必要とされる希釈剤（すなわち、キャリアまたはビヒクル）と共に所望の治療効果を生じるよう計算された所定量の活性物質を含むものをいう。
【００７３】
この組成物は、投薬処方物と適合する様式で、かつ治療有効量で投与される。投与されるべき量は、処置される被験体、活性成分を利用する被験体の免疫系の能力、および望まれる結合能力の阻害または中和の程度に依存する。投与のために必要とされる活性成分の正確な量は、医師の判断に依存し、各個人に特有である。初期投与およびその後の注射に適切なレジメンもまた変化し得るが、初期投与、その後の注射または他の投与による間隔を空けた反復投与によって類型化される。
【００７４】
これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳化物、錠剤、ピル剤、カプセル剤、粉末、徐放処方物などの形態をとり得る。この組成物は、従来の結合剤およびキャリア（例えば、トリグリセリド）と共に、座薬として処方され得る。経口処方物は、標準的なキャリア（例えば、薬学等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなど）を含み得る。適切な薬学的キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」に記載されている。このような組成物は、治療有効量の化合物を、好ましくは、精製された形態で、適切な量のキャリアと共に含み、被験体への適切な投与のための形態を提供する。この処方物は、投与様式に適しているはずである。
【００７５】
本発明の化合物は、中性形態または塩形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩としては、遊離アミノ基によって形成されるもの（例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるもの）および遊離カルボキシル基によって形成されるもの（例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるもの）が挙げられる。
【００７６】
損傷部位、標的細胞、組織、または器官への組成物の投与は、ピルまたはカプセルまたは液状処方物または懸濁物として経口投与により得る。経粘膜経路、舌下経路、経鼻経路、直腸経路、または経皮経路を通じて投与され得る。非経口的投与はまた、静脈内注射、または筋内、皮内、もしくは皮下を通じてであり得る。本発明が考慮する疾患または状態の性質に起因して、投与経路はまた、座薬を通じた送達を伴い得る。このことは特に、患者の飲み込む能力が損なわれる状態において当てはまる。
【００７７】
植物組成物または抽出物は、リポソーム処方物として提供され得る。リポソーム送達は、種々の適用について、他の化合物の薬学的送達系として使用され得る。例えば、Ｌａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３；Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９），Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ編，Ｌｉｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）を参照のこと。多くの適切なリポソーム処方物が当業者に公知であり、本発明の目的で用いられ得る。例えば、米国特許第５，１９０，７６２号を参照のこと。
【００７８】
さらなる局面において、リポソームは、血液脳関門を通過し得、静脈投与または経口投与を可能にする。血液脳関門を通過するための多くのストラテジー（分子の疎水性の増加させること；結合体として、血液脳関門におけるレセプターに標的化されたキャリア（例えば、トランスフェリン）に分子を導入すること等が挙げられるがこれらに限定されない）が利用可能である。
【００７９】
植物組成物または抽出物の経皮送達もまた企図される。薬物の経皮投与についての種々の多くの方法（例えば、経皮パッチを介する方法）が、当該分野で公知である。投与の経皮経路は、皮膚浸透性増強剤の使用により増強され得ることが容易に理解される。
【００８０】
制御放出経口処方物が望ましくあり得る。植物組成物または抽出物は、分散または浸出機構のいずれかによる放出を可能にする不活性マトリクス（例えば、ガム）に組み込まれ得る。ゆっくりと変性するマトリクスもまた、この処方物中に組み込まれ得る。いくつかの腸溶性コーティングもまた、遅延放出効果を有する。この治療剤の制御放出の別の形態は、Ｏｒｏｓ治療システム（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）に基づく方法による。すなわち、薬物は、水が浸入し、浸透圧効果により単一の小さな口を通じて薬物を押し出す半透膜で囲まれる。
【００８１】
肺送達もまた、処置のために使用され得る。本発明の実施において使用することが企図されているのは、治療製品の肺送達のために設計された広範な機械的デバイス（噴霧器、定用量吸入器、および粉末吸入器が挙げられるがこれらに限定されない）である。これらは全て、当業者になじみのものである。送達デバイスの構築に関して、当該分野で公知の任意の形態のエアロゾル適用（スプレーボトル、噴霧器、液体処方物の微粒子化エアロゾル適用またはポンプエアロゾル適用、および乾燥粉末処方物のエアロゾル適用が挙げられるがこれらに限定されない）が、本発明の実施において使用され得る。
【００８２】
眼内および鼻内送達が、本発明の方法において使用され得る。鼻内送達は、本発明の薬学的組成物が、治療製品を鼻に投与した後直接（その製品を肺に堆積させる必要なく）、血流移動することを可能にする。鼻内送達用処方物としては、デキストランまたはシクロデキストリンを含む処方物が挙げられる。鼻内投与について、有用なデバイスは、定用量噴霧器が取り付けられた、小さく硬いボトルである。１つの実施形態において、定用量は、本発明の溶液の薬学的組成物を規定された容量のチャンバ（このチャンバは、エアロゾル適用するよう寸法決めされた開口部、およびチャンバ中の液体が圧縮された際に噴霧を形成することによってエアロゾル処方物を有する）に引き込むことにより送達される。チャンバは、本発明の薬学的組成物を投与するために圧縮される。特定の実施形態において、チャンバは、ピストン配置である。このようなデバイスは市販されている。
【００８３】
本発明の組成物および抽出物もまた、経粘膜送達に適している。特に、この組成物および抽出物は、増強された酵素活性を有する胃液または他の体液中に存在するプロテアーゼによる分解に感受性の因子の舌下送達、頬側送達、または直腸送達に特に適している。さらに、経粘膜送達系は、低い経口バイオアベイラビリティを有する因子のために使用され得る。本発明の組成物は、溶媒、任意のヒドロゲル、および粘膜を通じた輸送を増強する因子を含むキャリア中に溶解または分散された植物抽出物を含む。この溶媒は、本発明のこのような処方において有用であることが当該分野で公知の非毒性アルコールであり得、エタノール、イソプロパノール、ステアリルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および類似の溶解特性を有する他の溶媒が挙げられるがこれらに限定されない。当該分野で公知の他のこのような溶媒は、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎおよびＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎにより発行された「Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」（１９８６）、ならびにＲ．Ｌ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ編、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕｍｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｎｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８０）において見出され得る。
【００８４】
本発明の組成物または薬学的に受容可能なその塩を投与するのに適した任意の経粘膜調製物が使用され得る。特に、この混合物は、当該分野で周知の従来技術を用いて処方され得る、経口、鼻内、または直腸腔において使用可能な任意の調製物である。好ましい調製物は、経口、鼻内、または直腸腔において使用可能な調製物である。例えば、この調製物は、頬側錠剤、舌下錠剤、および薬物を溶解または分解し、患者の口に送達する同様の調製物であり得る。噴霧器またはドロップは、鼻腔に薬物を送達するために使用され得る。座薬は、直腸粘膜に混合物を送達するために使用され得る。この調製物は、持続放出様式で薬物を送達してもしなくてもよい。
【００８５】
本発明の組成物の送達についての特定の実施形態は、粘膜接着調製物である。粘膜接着調製物は、インタクトな粘膜と接触した際に、所望の治療効果または栄養効果を誘導するのに十分な期間、粘膜に接着する調製物である。この調製物は、例えば、ＷＯ９６／０９８２９に記載されるような、半透性組成物であり得る。この調製物は、例えば、ＷＯ９６／３００１３に記載されるような、粘膜接着マトリクスを含む錠剤、粉末、ゲル、またはフィルムであり得る。この混合物は、粘膜に接着するシロップとして調製され得る。
【００８６】
適切な粘膜接着剤としては、当該分野で周知の接着剤（例えば、ポリアクリル酸（好ましくは、約４５０，０００〜約４，０００，０００の間の分子量を有するポリアクリル酸）、例えば、ＣａｒｂｏｐｏｌＴＭ  ９３４Ｐ、カルボキシメチルセルロース（ＮａＣＭＣ）ナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、または例えばＭｅｔｈｏｃｅｌＴＭ  Ｋ１００、およびヒドロキシプロピルセルロース）が挙げられる。
【００８７】
本発明の成分の送達はまた、バンドエイド、パッチ、デバイス、および本発明の成分を含み、粘膜表面に接着する任意の同様のデバイスを用いて達成され得る。適切な経粘膜パッチは、例えば、ＷＯ９３／２３０１１および米国特許第５，１２２，１２７号に記載されている。これらの文献の両方は、本明細書中に参考として援用されている。このパッチは、薬物／粘膜接点の大きさに比例して、混合物を送達するよう設計される。従って、送達速度は、接触面の大きさを変更することにより調節され得る。本発明の成分の送達に最も適するパッチは、裏層（ｂａｃｋｉｎｇ）を含み得、このような裏層は、本発明の成分のパッチからの漏出のためのバリアとして機能する。裏層は、このようなパッチにおいて使用される従来物質のいずれか（ポリエチレン、エチル−酢酸ビニルコポリマー、ポリウレタンなどが挙げられるがこれらに限定されない）であり得る。それ自体は粘膜接着性でないマトリクスから製造されたパッチにおいて、本発明の成分を含有するマトリクスは、粘膜接着成分（例えば、上記の粘膜接着剤）と組み合わされ得、その結果、このパッチは、粘膜表面に保持され得る。このようなパッチは、当業者に周知の方法により調製され得る。
【００８８】
本発明に従って有用な調製物は、他の成分（例えば、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、可溶化ビヒクル、芳香剤、色素など）を含み得る。いくつかの例において、この調製物に粘膜浸透増強剤を組み込むことが、望ましくあり得る。適切な浸透性増強剤としては、アニオン性界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム）、カチオン性界面活性剤（例えば、塩化パルミトイルＤＬカミチン、塩化セチルピリジニウム）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン９−ラウリルエーテル、モノラウリル酸グリセリル、ポリオキシアルキレン、ポリオキシエチレン２０セチルエーテル）、脂質（例えば、オレイン酸）、胆汁酸塩（例えば、グルコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム）、および関連化合物が挙げられる。
【００８９】
本発明の組成物および抽出物の投与は、単独で、または本発明によって企図される種々の医学的状態を処置するのに有効な他の化合物と組み合わせられ得る。また、本発明の組成物および処方物は、処置の間の患者の快適さを向上させる種々の鎮痛剤、麻酔剤、または抗不安剤と共に投与され得る。
【００９０】
本明細書中に記載される本発明の組成物は、液状形態であり得る。液体は、噴霧、ペースト、ゲル、または液体ドロップとして送達され得る。所望の一貫性は、１つ以上のヒドロゲル（水を吸着して種々の粘性を有する物質を生成する物質）を添加することにより達成される。使用に適したヒドロゲルは、当該分野で周知である。例えば、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎおよびＴｈｅ  Ｐａｒｍａｃｕｉｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｒｅａｔ  Ｂｒｉｔａｉｎによって発行されたＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（１９８６）、ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｇｕｍｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｎｓ、Ｒ．Ｌ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９８０）を参照のこと。
【００９１】
この組成物において使用するのに適切なヒドロゲルとしては、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、およびポリアクリル酸が挙げられるがこれらに限定されない。好ましいヒドロゲルは、セルロースエーテル（例えば、ヒドロキシアルキルセルロース）である。この組成物において使用されるヒドロキシセルロースの濃度は、使用される特定の粘度等級および、最終製品において所望される粘度に依存する。多くの他のヒドロゲルが、当該分野で公知であり、当業者は、本発明において使用するのに適した最も適切なヒドロゲルを容易に確認し得る。
【００９２】
本発明において有用な粘膜輸送増強剤は、本発明の因子が粘膜を通過し患者の血流に輸送されるのを促進する。粘膜輸送増強剤はまた、米国特許第５，２８４，６５７号（本明細書中で参考として援用する）に記載されるように、当該分野で公知である。これらの因子は、揮発性油もしくは不揮発性油からなる群より、または非毒性の薬学的に受容可能な無機酸および有機酸から選択され得る。揮発性油または不揮発性油としては、ペパーミント油、スペアミント油、メントール、ユーカリ油、シナモン油、ショウガ油、ウイキョウ油、イノンド油などが挙げられ得る。本発明にとって有用な適切な無機酸または有機酸としては、塩酸、リン酸、芳香族および脂肪族モノカルボン酸またはジカルボン酸（例えば、酢酸、クエン酸、乳酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、安息香酸、サリチル酸、および同様の特徴を有する他の酸）が挙げられるがこれらに限定されない。用語、芳香族は、ベンゼンに特徴的な６員環系を有する任意の酸である。用語「脂肪族」酸は、直鎖または分枝鎖の飽和または不飽和炭化水素骨格を有する任意の酸である。
【００９３】
他の適切な輸送増強剤としては、アニオン性界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム）、カチオン性界面活性剤（例えば、塩化パルミトイルＤＬカミチン、塩化セチルピリジニウム）、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン９−ラウリルエーテル、モノラウリン酸グリセリル、ポリオキシアルキレン、ポリオキシエチレン２０セチルエーテル）、脂質（例えば、オレイン酸）、胆汁酸塩（例えば、グリコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム）、および関連化合物が挙げられる。
【００９４】
本発明の組成物および抽出物が経口粘膜に投与される場合、好ましいｐＨは、ｐＨ３〜ｐＨ７の範囲であるはずであり、必要な調節は、当該分野で一般的に公知の、薬学的に受容可能な非毒性緩衝系を用いてなされる。
【００９５】
局所送達のために、本発明の因子の溶液（５０μＭ〜５ｍＭの間の濃度）を含む、水、緩衝水溶液、もしくは他の薬学的に受容可能なキャリア中、または水相および疎水性相のエマルジョンを含むヒドロゲル、ローション、またはクリームが使用される。好ましい濃度は、約１ｍＭである。このために、アスコルビン酸もしくはその塩、または他の成分、またはこれらの組み合わせが添加され得、美容的に受容可能な処方物が作製される。金属は、最小限に維持されるべきである。好ましくは、経口、非経口、または好ましくは局所投与のために、リポソームへのカプセル化により処方され得る。
【００９６】
本発明は、本明細書中に記載される治療有効量の少なくとも１つの因子を被験体に投与する工程を包含する処置方法を提供する。１つの実施形態において、この化合物は、実質的に精製されている（例えば、その効果を制限するかまたは望ましくない副作用を生成する物質を含まない）。好ましくは、被験体は動物である。動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、哺乳動物であり、最も好ましくは、ヒトである。１つの特定の実施形態において、非ヒト哺乳動物が被験体である。別の特定の実施形態において、ヒト哺乳動物が被験体である。
【００９７】
癌および過剰増殖障害の処置に最適な本発明の因子の量は、本明細書に基づき、標準的な臨床技術により決定され得る。さらに、必要に応じて、インビトロアッセイが、最適な用量範囲を同定するのを補助するために使用され得る。この処方物において用いられる正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重篤度に依存し、そして医師の判断および各被験体の状況に従って決定されるべきである。しかし、静脈内投与のための適切な用量範囲は、一般的には、約２０〜５００μｇ活性化合物／ｋｇ体重である。鼻内投与のための適切な用量範囲は、一般的には、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。効果的な用量は、インビトロまたは動物モデル試験系から得た用量応答曲線から推定され得る。
【００９８】
（処置グループ）
本発明の因子の投与が有効な治療レジメンである被験体は、好ましくは、ヒトであるが、任意の動物であり得る。従って、当業者に容易に理解され得るように、本発明の方法および薬学的組成物は、特に、任意の動物、特に、哺乳動物への投与に適しており、動物として、ペット用動物（例えば、ネコまたはイヌ）被験体、家畜用動物（例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、およびブタが挙げられるがこれらに限定されない）被験体、野生動物（野生であろうが動物園で飼育されていようが）、研究用動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコなど）、鳥類（例えば、ニワトリ、七面鳥、鳴き鳥など）が挙げられるがこれらに限定されない（すなわち、獣医学的用途のため）。
【００９９】
さらに、この因子の投与は、癌または過剰増殖障害の同定時またはその後に、単独、または、癌もしくは過剰増殖障害を有する患者において症状を改善するため、または腫瘍負荷を減少するため、または免疫細胞の数もしくは活性を増強するために有益であることが公知の他の因子と組み合わせて与えられ得る。
【０１００】
１つの実施形態において、本発明の方法による処置に適した被験体は、癌または過剰増殖障害に罹患していると決定された被験体である。この決定は、当該分野で公知の方法により臨床的になされ得る。
【実施例】
【０１０１】
以下の実施例は、本発明を例示することを意図しており、それを限定することを意図していない。
【０１０２】
（実施例１．ＦＧＦ−２は十分に分化した乳癌細胞の単一細胞増殖を阻害する）
ＦＧＦ−２と共にインキュベートしたＭＣＦ−７およびＴ−４７Ｄ細胞は、ラミニン、コラーゲンＩ、およびコラーゲンＩＶのコーティングプレートおよび非コーティングプレート上の組織培養物におけるコロニーアッセイにおけるクローン化能を顕著に減少させた。（図２、３、４、および１２）。ＦＧＦ−２の存在下で形成したクローンを、８細胞段階で停止させた。ＦＧＦ−２は、高度に脱分化したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖に対して効果を有さなかった。ＥＦＧは３つ全ての細胞型において効果を有さず、ネガティブコントロールとして使用した。
【０１０３】
（実施例２．ＦＧＦ−２は、細胞インテグリン（インテグリンα５を含む）の発現を誘導し、分化した単一乳癌細胞の増殖を制限する）
十分に分化した細胞をＦＧＦ−２と共にインキュベートして、非連結状態で発現された場合に細胞死に寄与する種々の細胞接着分子（α５、α６、β１、およびβ３を含む）の遺伝子の発現を誘導する（図５、６、ならびに表１および２）。図６は、プラスチック組織培養ディッシュまたはフィブロネクチンコーティングディッシュのいずれかで増殖したＭＣＦ−７細胞およびＴ−４７Ｄ細胞におけるインテグリンα５発現の誘導を実証するウェスタンブロットである。インテグリンα５発現の増加を、５日までアッセイしたところ、持続していた。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるインテグリンα５の基底高レベルに対する効果は実証されていない。
【０１０４】
（実施例３．フィブロネクチンによるレスキュー）
ＦＧＦ−２によるクローン化の阻害は、フィブロネクチンコーティングプレート上での細胞のインキュベーションによりレスキューされ得る（図２Ｂ、４、８、９、１５、および１６）。ＦＧＦ−２で処理したＭＣＦ−７細胞におけるコロニーの保護は、１５日まで、フィブロネクチン上でのインキュベーションによって持続された（図８）。フィブロネクチンは、インテグリンα５β１に対するリガンドであり、コラーゲンＩおよびＩＶはそうではない。これらのデータは、非連結インテグリンα５β１と、インテグリンα５β１に対する特定のリガンドを提供することによる増殖およびクローン化能のレスキューとの間の関係を示唆している。
【０１０５】
（実施例４．フィブロネクチンは、潜在的にＰＩ３Ｋ経路を通じて、ＦＧＦ−２により停止した細胞の長期間の生存を支持する）
インテグリンα５に対する抗体は、ＦＧＦ−２で処理した場合としなかった場合の両方において、フィブロネクチン上でのＭＣＦ−７細胞のクローン化能を阻害する（図７）。インテグリンα３に対する抗体を、ネガティブコントロールとして使用した。ＦＧＦ−２の存在下、フィブロネクチン上でのインテグリンα５による生存シグナル伝達についての潜在的な機構を提供するため、フィブロネクチンの存在下でのＦＧＦ−２によるＡｋｔのリン酸化を決定する初期実験を実施した。図１０は、ＦＧＦ−２が、ＭＣＦ−７およびＴ−４７ＤにおいてＡｋｔのリン酸化を誘導したことを実証している。リン酸化は、アッセイの５日間持続した。しかし、高度に脱分化したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、構成的に高レベルのインテグリンα５およびホスホ−Ａｋｔを発現する。このことは、これらの分子と、フィブロネクチン上でのそれらの無限増殖能を結び付けている。
【０１０６】
（実施例５．フィブロネクチン／インテグリンα５β１相互作用の破壊は、細胞死からの保護を逆転し得る）
本発明者らのデータは、骨髄微小環境における支質タンパク質（例えば、フィブロネクチン）が、骨髄微小環境における生理学的因子により誘導される細胞死から、および外来毒素（例えば、化学療法または放射線療法）からの転移性癌細胞の保護を提供することを示唆している。インテグリンα５（図７）およびβ１（実験進行中）に対するブロッキング抗体、フィブロネクチン結合部位に対するペプチド（図８、９、および１４）、インテグリンα５もしくはβ１に対するアンチセンスリン酸化オリゴヌクレオチド、または用量依存様式でのインテグリンα５もしくはβ１、他の転写インヒビター、またはレチノイドのダウンレギュレーションによるフィブロネクチン／インテグリンα５β１の間の相互作用を破壊する能力は、フィブロネクチン／インテグリンα５β１相互作用により開始される生存シグナルの破壊を生じ得、それによって、化学療法および放射線療法または他の生物学的療法により媒介される細胞死に対して感受性となる。このアプローチは、微小環境においてフィブロネクチンへの連結から生存保護を受ける骨髄において非周期的であり潜伏している十分に分化した細胞、およびこれもまた構成的にアップレギュレートされたインテグリンα５を通じたフィブロネクチンとの相互作用からの生存シグナル伝達を受け取る骨髄において活発に増殖している高度に脱分化した細胞の両方を感作し得る。
【０１０７】
（実施例６．ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル経路の破壊は、乳癌コロニー増殖に対するフィブロネクチンによる支持を破壊し得る）
ＦＧＦ−２により誘導されるＡｋｔのリン酸化は、多くの方法で（インテグリンα５およびβ１の発現をダウンレギュレートすることによりフィブロネクチンとインテグリンα５β１の相互作用を破壊することによって、他の転写因子インヒビター、レチノイド、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、インテグリンα５、β１またはフィブロネクチンに対するブロッキング抗体との相互作用の破壊によって、またはＰＩ３ＫもしくはＡｋｔの活性化を阻害するキナーゼインヒビターによって）、破壊され得る。Ａｋｔ阻害の例を、図１１（ウェスタンブロットによって実証されるように、ＡＴＲＡと共にＭＣＦ−７細胞をインキュベートすることによって、ＡｋｔのＥＧＦ媒介リン酸化が逆転している）、ならびに図１５および１６（ＡｋｔおよびＰＩ３Ｋの阻害、Ａｋｔの上流の活性化は、潜伏クローンの生存を阻害している）に示す。このアプローチはまた、インテグリンα５β１とフィブロネクチンとの相互作用により開始される、ＰＩ３Ｋ経路を通じた転移部位の乳癌細胞への破壊的生存シグナル伝達についての機構のアレイを提供する。シグナル伝達経路、キナーゼ、およびＧＴＰａｓｅの破壊は、これらの細胞における生存を支持し得る癌細胞におけるフィブロネクチンとインテグリンα５およびβ１の相互作用により開始されるシグナル伝達を破壊し得る。Ｒｈｐ、Ｒｈｏキナーゼ、およびＭＥＰ／ＭＡｐキナーゼ、ｐ３８、ＰＫＣ、およびＰＫＡのインヒビターを用いて実施し、フィブロネクチン上での潜伏クローンの生存を生じた例を記す（図１７ＡおよびＢ）。
【０１０８】
（材料および方法）
（細胞培養）
ＭＣＦ−７細胞、ＳＫ−Ｂｒ−３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、ＰＣ−３細胞、およびＬＮＣａＰ細胞を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。細胞を、フェノールレッド１５ｍｇ／ｌ、２ｍＭグルタミン、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）およびペニシリン５０ユニット／ｍｌおよびストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｃａｌａｂａｓａｓ，Ｃａ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）中で培養した。１，０００〜１０，０００細胞を、図の説明に記載される細胞型または実験条件に基づき、市販の組織培養用コーティングのみ（コーティングなし）、または２０ｇフィブロネクチン、ラミニンＩ、コラーゲンＩ、またはコラーゲンＩＶでコーティングした２４ウェル組織培養プレート上でインキュベートした。培地を除去し、図の説明に記載されるような異なる培養日数の後に、クリスタルバイオレットを用いて細胞を染色した後、コロニーを１００倍で手作業で計数した。増殖の動力学を、以前のように１、図に示される日数のトリプシン処理細胞を用いる２％トリパンブルー計数を用いて、実施した。
【０１０９】
組み換えヒトＦＧＦ−２およびＥＧＦを、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮから購入した。ＡＳＴＲＡを、Ｓｉｇｍａから購入した。インテグリンα５またはインテグリンα３に対する中和マウスモノクローナル抗体を、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）から購入した。フィブロネクチンブロッキングペプチドＧＲＧＤＳＰおよびコントロールペプチドを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）から購入した。
【０１１０】
（ウェスタンブロット）
細胞を回収し、溶解物を記載されるようにして２調製し、そして以前のようにして３分析した。
【０１１１】
（遺伝子チップマイクロアレイ分析）
ＭＣＦ−７細胞を、フィブロネクチン２０μｇをコーティングした組織培養ディッシュ上、ＦＧＦ−２  １０ｎｇ／ｍｌの存在下および非存在下で、５日間インキュベートした。Ｎｏｎｒａｄ  ＧＥＡｒｒａｙ  Ｑシリーズキットとして提供される溶液を用いてメッセンジャーＲＮＡを調製し、Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  ａｎｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｉｐ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｆｉｎｄｅｒ  ｃｈｉｐ（Ｓｕｐｅｒ  Ａｒｒａｙ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いて分析した。
【０１１２】
（表１．Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  ａｎｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ＧＥ  Ａｒｒａｙ  Ｑシリーズ）
（フィブロネクチン上、５日間で、ＦＧＦ−２により大規模にアップレギュレートされた遺伝子発現）
（チップ上の位置番号：遺伝子）
１    ：  Ｍｅｔｈ１−ディスインテグリン様およびトロンボスポンジン１型モチーフ
を有するメタロプロテアーゼ（レプロリジン型）、１
７    ：  Ｅ−カドヘリン  −  カドヘリン１、１型（上皮）
１２  ：  コラーゲンＩＶ型α２
１３  ：  ホモサピエンスシスタチンＣ（アミロイド脈管障害および脳卒中）、ＣＳＴ３
２３  ：  ＤＣＣ−結腸直腸癌腫において欠失
３６  ：  インテグリンα５（フィブロネクチンレセプター、αポリペプチド）
３７  ：  インテグリンα６サブユニット
４７  ：  インテグリンβ３（糖タンパク質ＩＩＩａ、抗原ＣＤ６１）
５６  ：  ＭＵＣ−１８  −  ホモサピエンスＭＩＣＡ遺伝子、対立遺伝子ＭＵＣ−１８
６２  ：  ＭＴ１−ＭＭＰ  −  膜型マトリクスメタロプロテアーゼ１の
ホモサピエンスｍＲＮＡ、ＭＭＰ１４
６９  ：  ＭＭＰ−２６  −  ホモサピエンスマトリクスメタロプロテアーゼ−２６
ｍＲＮＡ
７４  ：  ＮＣＡＭ１−神経細胞接着分子１
７６  ：  ＰＥＣＡＭ１−ホモサピエンス血小板／内皮細胞接着分子（ＣＤ３１抗原）
８０  ：  ＥＬＡＭ−１／Ｅ−セレクチンヒト内皮白血球接着分子ｍＲＮＡ
８５  ：  ＰＡＩ−１  −  プラスミノゲンアクチベーターインヒビター、１型
９４  ：  ＴＭＰＲＳＳ＄−膜貫通プロテアーゼ、セリン４
（フィブロネクチン上、５日間で、ＦＧＦ−２により小規模であるが有意な量アップレギュレートされた遺伝子発現）
（チップ上の位置番号：遺伝子）
２０  ：  カテプシンＤ−（リソソームアスパルチルプロテアーゼ）
２１  ：  カテプシンＧ−（ＣＴＳＧ）ホモサピエンス
２６  ：  フィブロネクチン１
３３  ：  インテグリンα２ｂ−血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体のＩＩｂ、
抗原ＣＤ４１Ｂ
３４  ：  インテグリンα３−抗原ＣＤ４９Ｃ、ＶＬＡ−３レセプターの
α３サブユニット
４０  ：  インテグリンα９
４４  ：  インテグリンαＸ−抗原ＣＤ１１Ｃ（ｐ１５０）、αポリペプチド
４８  ：  インテグリンβ４
５７  ：  ＭＭＰ−１  −  マトリクスメタロプロテアーゼ１（間質コラゲナーゼ）
５９  ：  ストロメリシン−３、ヒト
６１  ：  ＭＭＰ−１３  −  マトリクスメタロプロテアーゼ１３（コラゲナーゼ３）
６３  ：  ＭＭＰ−１５  −  マトリクスメタロプロテアーゼ１５（膜挿入）
６４  ：  ＭＭＰ−１６  −  マトリクスメタロプロテアーゼ１６（膜挿入）
６５  ：  ＭＭＰ−１７  −  マトリクスメタロプロテアーゼ１７（膜挿入）
６６  ：  ＭＭＰ−２  −  マトリクスメタロプロテアーゼ２（ゲラチナーゼＡ、
７２ｋＤゲラチナーゼ、７２ｋＤ  ＩＶ型コラゲナーゼ）
６８  ：  ＭＭＰ−２４  −  マトリクスメタロプロテアーゼ２４（膜挿入）
７５  ：  ＮＲＣＡＭ−神経細胞接着分子
８６  ：  ＳＰＡＲＣ−ホモサピエンス分泌タンパク質、酸性システインリッチ
（オステオネクチン）
９６  ：  ビトロネクチン−血清拡散因子、ソマトメディンＢ、補体Ｓタンパク質
（表２．Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｆｉｎｄｅｒ  ＧＥ  Ａｒｒａｙ  Ｑシリーズ）
（フィブロネクチン上、５日間で、ＦＧＦ−２により小規模であるが有意な量アップレギュレートされた遺伝子発現）
（チップ上の位置番号：遺伝子）
１６  ：  ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１−サイクリン依存性キナーゼインヒビター１Ａ
（ｐ２１、Ｃｉｐ１）
（フィブロネクチン上、５日間で、ＦＧＦ−２により大規模にアップレギュレートされた遺伝子発現）
（チップ上の位置番号：遺伝子）
１４  ：  ＣＤＣ５−Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ５
１９  ：  ｐ１６ＩＮＫ４−サイクリン依存性キナーゼインヒビター２Ａ
（黒色腫、ｐ１６、ＣＤＫ４を阻害する）
（フィブロネクチン上、５日間で、ＦＧＦ−２により小規模であるが有意な量アップレギュレートされた遺伝子発現）
（チップ上の位置番号：遺伝子）
３０  ：  ＥＧＲ１−早期増殖応答１
３１  ：  ＥＮ１−波形縁ホモログ１
３２  ：  ＦＡＳＮ−脂肪酸シンターゼ
４１  ：  Ｈｏｘａ−１  −  ホモサピエンスホメオボックスＡ１
４２  ：  Ｈｏｘｂ−１  −  ホモサピエンスホメオボックスＢ１
４４  ：  Ｈｓｐ２７−熱ショック２７ｋＤタンパク質
４５  ：  Ｈｓｐ９０（ＣＤｗ５２）−９００ｋＤａ熱ショックタンパク質
のヒトｍＲＮＡ
【０１１３】
【表１】
0004667873.tif 000002
【０１１４】
＊外酵素Ｃ３トランスフェラーゼは、アスパルギン残基４１上のＲｈｏタンパク質を特異的にリボシル化するＡＤＰリボシルトランスフェラーゼであり、Ｒｈｏファミリーの他のメンバー（例えば、Ｃｄｃ４２およびＲａｃ１）には極めて低い親和性を有する。ＡＤＰリボシル化は、ＲｈｏのＧＴＰａｓｅ活性に影響を及ぼさないようであり、むしろ、このタンパク質の下流機能をブロックするようである。Ｒｈｏのリボシル化は、Ｒｈｏを効果的に不活性化し、従って、Ｃ３トランスフェラーゼは、Ｒｈｏ活性の研究において非常に有用なタンパク質である。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】骨髄に転移する乳癌細胞は、骨髄支質におけるＦＧＦ−２の沈着により停止される。ＦＧＦ−２は、インテグリンα５およびβ１の過剰発現を誘導し、インテグリン媒介死（ＩＭＤ）と呼ばれるプロセスにより、非結合または不適切に結合したインテグリンを通じて大量の細胞死を導く。支質におけるフィブロネクチンによる生存細胞に対するα５β１の接着および適切な結合はＩＭＤを妨害し、ＰＩ３Ｋを通じて生存シグナル伝達を開始する。これにより、非サイクル細胞が停止し、サイトトキシンにより誘導される細胞死から保護される。インテグリン−フィブロネクチン相互作用の破壊は、生存シグナル伝達を中断し、ＩＭＤを開始する。これにより、転移性細胞が、化学療法に対して感受性になる。
【図２】ＦＧＦ−２阻害乳癌細胞に対するフィブロネクチンの生存効果。３〜９日の種々の期間、ＭＣＦ−７細胞を、コラーゲンＩ（Ａ）またはフィブロネクチンもしくはラミニンＩ（Ｂ）でコーティングした２４ウェルプレート上、１０００細胞／ウェルの濃度でインキュベートし、クリスタルバイオレットで染色し、そして写真を撮影した。（Ａ）コロニーをコラーゲンＩコーティングディッシュ中で培養することで、２つのコントロール列において時間と共に、および１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ処理で増加したクローン化が、ならびにＦＧＦ−２  １０ｎｇ／ｍｌによるクローン化のほぼ完全な消滅が実証された。実験は、少なくとも２度行い、同様の結果を得た。（Ｂ）同様の細胞消滅を、ラミニンＩコーティングプレートにおいて観察したが、フィブロネクチン上でのインキュベーションは、少数の非増殖細胞の生存しか生じなかった。ここに示されているのは、コロニーウェル中の代表的な５日コロニーおよびＦＧＦ−２  １０ｎｇ／ｍｌを含有するウェルにおける損傷したクローン化である。
【図３】ＦＧＦ−２は、ＭＣＦ−７細胞のクローン化を阻害するが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対しては効果を有さない。１０００個のＭＣＦ−７またはＭＤＡ−２３１細胞／ウェルを、１０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）または上皮増殖因子（ＥＧＦ）の存在下および非存在下で、２４ウェル組織培養プレート中でインキュベートした。５日間のインキュベーションの後、プレートをクリスタルバイオレッドで染色し、Ａ）２９±２細胞およびＢ）８±２細胞からなるクローンを計数した。Ｃ）１０，０００個のＴ−４７Ｄ細胞／ウェルを、１０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−２）または上皮増殖因子（ＥＧＦ）の存在下および非存在下、フィブロネクチンでコーティングした２４ウェル組織培養プレート中でインキュベートした。３日後にプレートをクリスタルバイオレッドで染色し、そして８個以上の細胞からなるクローンを計数した。
【図４】ＦＧＦ−２の存在下でのＭＦＣ−７細胞のクローニング効率。ＦＧＦ−２  １０ｎｇ／ｍｌと共に種々の基質を含む６ウェル組織培養ディッシュにて、二連で、１ウェルあたり５，０００個のＭＣＦ−７細胞をインキュベートした。５、１０、および１５日間のインキュベーションの後クリスタルバイオレットでプレートを染色した後に、８個以上の細胞のコロニーを計数した。フィブロネクチン上でのインキュベーションは、アッセイ１５日目までの間、これらの細胞株のクローン化能を保存し続けた。
【図５】フィブロネクチンコーティング組織培養ディッシュ上で、５日間、ＦＧＦ−２の存在下および非存在下でインキュベートしたＭＣＦ−７細胞のＮｏｎｒａｄ  ＧＥＡｒｒａｙ  Ｑシリーズジーンチップマイクロアレイ分析。ＦＧＦ−２  １０ｎｇ／ｍｌの存在下および非存在下、フィブロネクチン２０μｇでコーティングした組織培養ディッシュ上で５日間インキュベートしたＭＣＦ−７細胞のジーンチップマイクロアレイ分析。ＦＧＦ−２処理集団に残した細胞は、コントロール細胞の約１／３であった。Ａ）Ｎｏｎｒａｄ  ＧＥＡｒｒａｙ  Ｑ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｉｐ（Ｓｕｐｅｒ  Ａｒｒａｙ，Ｂｉｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）。矢印は、生存集団において増加したインテグリンα５（実線）およびα６（点線）のｍＲＮＡを指す。囲みは、ＧＡＰＤＨ、シクロフィリンＡ、リボソームＬ２３、およびβアクチン（ポジティブコントロール）ならびにＰＵＣ１８プラスミドＤＮＡおよびブランク（ネガティブコントロール）からなる２つのチップ上のコントロール遺伝子ｃＤＮＡの周囲に描かれている。Ｂ）Ｎｏｎｒａｄ  ＧＥＡｒｒａｙ  Ｑ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｆｉｎｄｅｒ  ｃｈｉｐ（Ｓｕｐｅｒ  Ａｒｒａｙ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）。矢印は、フィブロネクチンに対するＦＧＦ−２処理により発現がダウンレギュレートされるｐ１６ＩＮＫ４遺伝子を指す。チップ右側の数字は、各列最も右のメンバーｃＤＮＡの番号を示す。
【０１１６】
５日間のフィブロネクチンコーティングプレートに対するＦＧＦ−２処理に起因する遺伝子発現の変化を、２つのチップ上の以下の遺伝子にて観察した。これらは、表１および表２に示される。
【図６】ＦＧＦ−２は、インテグリンの発現を調節する。Ａ）フィブロネクチンコーティングプレート上で３または５日間、ＦＧＦ−２の存在下または非存在下でインキュベートしたＭＣＦ−７細胞におけるインテグリンα５およびβ１  ｍＲＮＡのジーンチップ分析。ＧＡＰＤＨおよびアクチンｍＲＮＡ標準に対して正規化した濃度計定量を示す。Ｂ）組織培養ディッシュまたはフィブロネクチンコーティングディッシュ上で３日間、ＦＧＦ−２の存在下または非存在下でインキュベートした細胞からのインテグリンα５のウェスタンブロット。Ｃ）カバースリップ上、ＦＧＦ−２  １０ｎｇ／ｍｌの存在下または非存在下、２４時間のＴ−４７Ｄ細胞におけるインテグリンα５の間接的免疫蛍光。Ｄ）ＦＧＦ−２の存在下または非存在下、３日間インキュベートしたＭＣＦ−６およびＴ−４７Ｄ細胞におけるインテグリンα２、α３、α４、α６、β１、β３、およびβ４のウェスタンブロット。
【図７】フィブロネクチン上でのＭＣＦ−７細胞のインテグリンα５依存性クローン化生存。インテグリンα５またはインテグリンα３に対する中和マウスモノクローナル抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）２μｇの存在下または非存在下で、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２含有および非含有５ウェル組織培養ディッシュ上で、１ウェルあたり５，０００個のＭＣＦ−７細胞をインキュベートした（四連）。細胞を５日間培養し、クリスタルバイオレットで染色し、そして８±２細胞のクローンを計数した。
【図８】フィブロネクチン特異的ブロッキングペプチドは、フィブロネクチン上でのクローン化を選択的に阻害する。１０３個のＭＣＦ−７（およびＴ−４７Ｄ、示さず）細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２と共に、フィブロネクチンの存在下または非存在下でインキュベートした。フィブロネクチンブロッキングペプチドＧＲＧＤＳＰ  １ｎｇ／ｍｌ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を、３日後に添加し、４、８、および１２個の細胞のコロニーを６日後に計数した。ブロッキングペプチドは、フィブロネクチン上でコロニーを阻害したのみであり、プラスチック上では阻害しなかった。
【図９】インテグリンα５β１の連結は、十分に分化した乳癌細胞における細胞死からの特異的保護を提供する。Ａ）ＭＣＦ−７細胞（およびＴ−４７Ｄ細胞、示さず）を、種々のコーティングプレート上でＦＧＦ−２と共にインキュベートした。３日後にブロッキングペプチドを添加した。第６日に、１０細胞以下のコロニーをクリスタルバイオレットで染色し、計数した。Ｂ）Ｔ−４７Ｄ細胞を、フィブロネクチンコーティングプレート上で、ＦＧＦ−２と共にインキュベートし、３日後にブロッキングペプチドを添加した。細胞を、抗インテグリンα５抗体およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄタグ二次抗体で２４時間後にプローブし、ＴＵＮＥＬ−ＦＩＴＣによりアッセイした。
【図１０】フィブロネクチン上でのＦＧＦ−２による持続的なＡｋｔリン酸化の誘導。フィブロネクチンコーティングプレート上で、ＦＧＦ−２と共に、最大５日間インキュベートしたＭＣＦ−７、Ｔ−４７Ｄ、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞由来の溶解物のウェスタンブロットを、ホスホ−Ａｋｔまたは総Ａｋｔに対する抗体を用いて染色した。ブロットは、ＭＣＦ−７およびＴ−４７Ｄ細胞においてＦＧＦ−２によるＡｋｔの持続的なリン酸化を示すが、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における構成的なＡｋｔリン酸化に対する効果は示していない。総Ａｋｔレベルに対する効果は示されなかった。染色した膜を、ローディングコントロールとして使用した。
【図１１】オールトランスレチノイン酸は、ＥＧＦにより媒介されるＡｋｔのリン酸化を鈍らせる。ＭＣＦ−７細胞を、ＥＧＦ  １００ｎｇ／ｍｌで１０分間処理し、その２時間後、ＡＴＲＡ  １０−７Ｍまたはコントロール培地でさらに２４時間処理した。溶解物のウェスタンブロットを、抗ホスホ−Ａｋｔ  ａｂで染色した。
【図１２】組織培養物中の十分に分化した乳癌細胞および分化の乏しい乳癌細胞のクローン化能に対するＥＧＦおよびＦＧＦ−２の効果。ＭＣＦ−７およびＴ−４７Ｄ（１，０００細胞／ウェル）およびＭＤＡ  ＭＢ−２３１（２００細胞／ウェル）を、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦまたはＦＧＦ−２の存在下または非存在下で６日間、２４ウェルプレートにてインキュベートし、クリスタルバイオレットで染色し、そして２９個以上の活性な増殖細胞を有するコロニー（黒棒）または１０個以下の、十分に拡散した増殖停止細胞を有するコロニー（斜線棒）を計数した。
【図１３Ａ】支質タンパク質への乳癌細胞の接着。ＭＣＦ−７細胞およびＴ−４７Ｄ細胞の両方を、組織培養プレート（Ａ）またはフィブロネクチンコーティングプレート（Ｂ）上、ＦＧＦ−２の存在下または非存在下で培養し、細胞解離溶液で剥がし、ＰＢＳで洗浄し、そして計数した。細胞を、インテグリンに対するブロッキングモノクローナル抗体またはマウスＩｇＧ  ２μｇ／ｍｌと共に、３７℃で３０分間インキュベートし、そして５０，０００個の細胞を、３７℃で４５分間、２４ウェルの種々のコーティング組織培養プレート上でインキュベートした。接着した細胞を、クリスタルバイオレットで染色し、抽出した色素のＡ６００を、記載されるようにして測定した。結果は、両方の細胞について類似していた。示されているのは、Ｔ−４７Ｄ細胞（Ａ）およびＭＣＦ−７細胞（Ｂ）についてのデータである。インテグリンに対する抗体は、ＦＧＦ−２処理細胞におけるフィブロネクチンへの接着を７５％ブロックしたが、未処理細胞の接着は、１／３のみを阻害した。α２に対するブロッキング抗体は、ＦＧＦ−２処理細胞および未処理細胞の両方において等しく、コラーゲンおよびラミニンへの接着を減少させた。コラーゲンへの接着は、フィブロネクチンへの接着を上回っていたが、潜伏性クローンの生存を補助しなかった。これらの接着コントロールは、これらのデータが、非特異的接着に起因する効果だけでなく、潜伏細胞におけるフィブロネクチンへの結合に起因する特異的な生存効果と一致することを実証した。
【図１３Ｂ】支質タンパク質への乳癌細胞の接着。ＭＣＦ−７細胞およびＴ−４７Ｄ細胞の両方を、組織培養プレート（Ａ）またはフィブロネクチンコーティングプレート（Ｂ）上、ＦＧＦ−２の存在下または非存在下で培養し、細胞解離溶液で剥がし、ＰＢＳで洗浄し、そして計数した。細胞を、インテグリンに対するブロッキングモノクローナル抗体またはマウスＩｇＧ  ２μｇ／ｍｌと共に、３７℃で３０分間インキュベートし、そして５０，０００個の細胞を、３７℃で４５分間、２４ウェルの種々のコーティング組織培養プレート上でインキュベートした。接着した細胞を、クリスタルバイオレットで染色し、抽出した色素のＡ６００を、記載されるようにして測定した。結果は、両方の細胞について類似していた。示されているのは、Ｔ−４７Ｄ細胞（Ａ）およびＭＣＦ−７細胞（Ｂ）についてのデータである。インテグリンに対する抗体は、ＦＧＦ−２処理細胞におけるフィブロネクチンへの接着を７５％ブロックしたが、未処理細胞の接着は、１／３のみを阻害した。α２に対するブロッキング抗体は、ＦＧＦ−２処理細胞および未処理細胞の両方において等しく、コラーゲンおよびラミニンへの接着を減少させた。コラーゲンへの接着は、フィブロネクチンへの接着を上回っていたが、潜伏性クローンの生存を補助しなかった。これらの接着コントロールは、これらのデータが、非特異的接着に起因する効果だけでなく、潜伏細胞におけるフィブロネクチンへの結合に起因する特異的な生存効果と一致することを実証した。
【図１４】支質は、十分に分化したＴ−４７Ｄ乳癌細胞の増殖を制限する。Ａ）５００個／ウェルのＴ−４７Ｄ細胞またはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を接種した２４ウェルプレート中のコンフルエントな支質培養物を、６日間培養した。Ｂ）６日後のＭＣＦ−７細胞の主要な単一細胞の状態を実証する、支質共培養におけるＭＣＦ−７細胞のサイトケラチン１９免疫蛍光（赤色）染色（バックグラウンドは青色）。Ｃ）組み換えＦＧＦ−２を含有する支質細胞溶解物（１００μｇ）ならびに１８ｋＤ、２２ｋＤ、２２．５ｋＤ、および２４ｋＤのＦＧＦ−２異性体を発現するベクターでトランスフェクトしたＴ−４７Ｄ細胞からの溶解物のウェスタンブロット。Ｄ）ＭＣＦ−７細胞を、２４ウェルプレート上の支質単層上に接種した（１，０００細胞／ウェル）。３日後にブロッキングペプチドを添加した。６日後に、プレートを、抗サイトケラチン１９抗体および西洋ワサビペルオキシダーゼタグ二次抗体で染色し、発色させ、そして１０個以下の細胞のコロニーを計数した。
【図１５】Ａｋｔインヒビターは、フィブロネクチンにより促進される、潜伏性乳癌細胞クローンの生存を減少させる。ＭＣＦ−７細胞およびＴ−４７Ｄ細胞を、３日間、フィブロネクチン上でＦＧＦ−２と共にインキュベートし、培地を交換し、そして種々の濃度のインヒビターおよび新しいＦＧＦ−２を補充し、そしてさらに３日間インキュベートした。１０個以下の細胞のコロニーを、クリスタルバイオレット染色後に計数した。データを、組織培養コーティングプラスチックディッシュ上のコロニー数からの％変化としてプロットする。
【図１６】ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）インヒビターＬＹ２９４００２は、フィブロネクチンにより促進される、潜伏性乳癌細胞クローンの生存を減少させる。ＭＣＦ−７細胞およびＴ−４７Ｄ細胞を、３日間、フィブロネクチン上でＦＧＦ−２と共にインキュベートし、培地を交換し、そして異なる濃度のインヒビターおよび新しいＦＧＦ−２を補充し、そしてさらに３日間インキュベートした。１０個以下の細胞のコロニーを、クリスタルバイオレット染色後に計数した。
【図１７】キナーゼインヒビターによる潜伏性クローンの生存阻害。Ａ）ＭＣＦ−７細胞（およびＴ−４７Ｄ細胞、示さず）ならびにＢ）Ｔ−４７Ｄ細胞を、３日間、フィブロネクチン上でＦＧＦ−２と共にインキュベートし、培地を交換し、異なる濃度の種々のキナーゼインヒビターおよび小ＧＴＰａｓｅインヒビターおよび新しいＦＧＦ−２を補充し、そしてさらに３日間インキュベートした。コントロール細胞を、インヒビターと共に使用される溶媒についてのコントロールとしての１０μＭのＤＭＳＯ中でインキュベートした。１０個以下の細胞のコロニーを、クリスタルバイオレット染色後に計数した。データを、組織培養物コーティングプラスチックディッシュ上のコロニー数からの％変化としてプロットする。このデータは、多くのシグナル伝達経路を排除することによる潜伏クローンの有意な阻害を実証している。Ｃ）使用したインヒビターを以下に示す： インヒビター                    標的                              ＥＤ５０ＵＯ１２６                      ＭＥＫ１                            ７２ｎＭ                                ＭＥＫ２                            ５８ｎＭＡＧ８２                        ＦＡＫ                                ７μＭＹ２７６３２                    Ｒｈｏキナーゼ                    １４０ｎＭＳＢ２０３５８０                ｐ３８                            ６００ｎＭＰＤ１６９３１６                ｐ３８                              ８９ｎＭＰＤ９８０５９                  ＭＥＫ                                ２μＭＲＯ３１８２２０                プロテインキナーゼＣ                １０ｎＭ                                プロテインキナーゼＡ              ９００ｎＭＣ３トランスフェラーゼ          ＲｈｏＡ                    ２〜５μｇ／ｍｌインヒビター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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