(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オンコスタチンＭアンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、疼痛を処置するための薬学的組成物であって、
ここで、該オンコスタチンＭアンタゴニストが抗オンコスタチンＭレセプター抗体、および、抗オンコスタチンＭ抗体からなる群から選択される、
薬学的組成物。
【請求項２】
前記オンコスタチンＭアンタゴニストが抗オンコスタチンＭレセプター抗体である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記抗オンコスタチンＭレセプター抗体が、サポリン、ジフテリアトキシン、リシン、およびヘルペスチミジンキナーゼからなる群から選択される細胞毒素と結合体を形成している、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記オンコスタチンＭアンタゴニストが、投与された部位における局所濃度が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの量になるように含有される、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記疼痛が、以下からなる群から選択される、請求項１に記載の薬学的組成物：炎症性疼痛、神経因性疼痛、および癌性疼痛。
【請求項６】
非ステロイド性消炎鎮痛薬および麻薬のうち少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
インドメタシン、アスピリン、サリチル酸ナトリウム、アセトアミノフェン、モルヒネ、フェンタニル、アルフェンタニル、スフェンタニル、レミフェンタニル、および［Ｄ−Ａｌａ２，ＭｅＰｈｅ４，Ｇｌｙ−ｏｌ５］−エンケファリンのうち少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
疼痛を処置するための医薬の製造における、オンコスタチンＭアンタゴニストの使用であって、
ここで、該オンコスタチンＭアンタゴニストが抗オンコスタチンＭレセプター抗体、および、抗オンコスタチンＭ抗体からなる群から選択される、
使用。
【請求項９】
前記オンコスタチンＭアンタゴニストが抗オンコスタチンＭレセプター抗体である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記抗オンコスタチンＭレセプター抗体が、サポリン、ジフテリアトキシン、リシン、およびヘルペスチミジンキナーゼからなる群から選択される細胞毒素と結合体を形成している、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記オンコスタチンＭアンタゴニストが投与された部位における局所濃度が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの量になるように前記医薬中に含有される、請求項８に記載の使用。
【請求項１２】
前記疼痛が、以下からなる群から選択される、請求項８に記載の使用：炎症性疼痛、神経因性疼痛、および癌性疼痛。
【請求項１３】
請求項１に記載の薬学的組成物を含む、疼痛を処置するためのキット。
【請求項１４】
前記オンコスタチンＭアンタゴニストが抗オンコスタチンＭレセプター抗体である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記抗オンコスタチンＭレセプター抗体が、サポリン、ジフテリアトキシン、リシン、およびヘルペスチミジンキナーゼからなる群から選択される細胞毒素と結合体を形成している、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記オンコスタチンＭアンタゴニストが投与された部位における局所濃度が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの量になるように前記薬学的組成物中に含有される、請求項１３に記載のキット。
【請求項１７】
前記疼痛が、以下からなる群から選択される、請求項１３に記載のキット：炎症性疼痛、神経因性疼痛、および癌性疼痛。
【請求項１８】
非ステロイド性消炎鎮痛薬および麻薬の少なくとも１つをさらに含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１９】
インドメタシン、アスピリン、サリチル酸ナトリウム、アセトアミノフェン、モルヒネ、フェンタニル、アルフェンタニル、スフェンタニル、レミフェンタニル、および［Ｄ−Ａｌａ２，ＭｅＰｈｅ４，Ｇｌｙ−ｏｌ５］−エンケファリンのうち少なくとも１つをさらに含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項２０】
オンコスタチンＭまたはオンコスタチンＭホモログの少なくとも１つと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、疼痛を処置するための薬学的組成物であって、
ここで、オンコスタチンＭホモログは、配列番号４、６または８に記載の核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされ、そしてオンコスタチンＭ活性を有するポリペプチドであって、ここで、オンコスタチンＭ活性は、多能性造血前駆細胞の増殖促進活性、内皮細胞クラスターの形成促進活性、肝細胞分化促進活性、新生児のセルトリ細胞の増殖促進活性、肝細胞からの急性期タンパク質の産生誘導活性、ＴＩＭＰ１の発現誘導活性、および肝再生促進活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性である、薬学的組成物。
【請求項２１】
オンコスタチンＭまたはオンコスタチンＭホモログが、投与された部位における局所濃度が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの量になるように含有される、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記疼痛が、以下からなる群から選択される、請求項２０に記載の薬学的組成物：炎症性疼痛、神経因性疼痛、および癌性疼痛。
【請求項２３】
非ステロイド性消炎鎮痛薬および麻薬のうち少なくとも１つをさらに含む、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
インドメタシン、アスピリン、サリチル酸ナトリウム、アセトアミノフェン、モルヒネ、フェンタニル、アルフェンタニル、スフェンタニル、レミフェンタニル、および［Ｄ−Ａｌａ２，ＭｅＰｈｅ４，Ｇｌｙ−ｏｌ５］−エンケファリンのうち少なくとも１つをさらに含む、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
皮下投与または筋肉内投与に適するように処方される、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
前記疼痛が、以下からなる群から選択される、請求項２０に記載の薬学的組成物：炎症性疼痛、神経因性疼痛、および癌性疼痛。
【請求項２７】
非ステロイド性消炎鎮痛薬および麻薬のうち少なくとも１つをさらに含む、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
インドメタシン、アスピリン、サリチル酸ナトリウム、アセトアミノフェン、モルヒネ、フェンタニル、アルフェンタニル、スフェンタニル、レミフェンタニル、および［Ｄ−Ａｌａ２，ＭｅＰｈｅ４，Ｇｌｙ−ｏｌ５］−エンケファリンのうち少なくとも１つをさらに含む、請求項２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
疼痛を処置するための医薬の製造における、オンコスタチンＭまたはオンコスタチンＭホモログの使用。
【請求項３０】
請求項２０に記載の薬学的組成物を含む、疼痛を処置するためのキット。
【請求項３１】
疼痛を処置するための薬学的組成物であって、該組成物は、
（ａ）オンコスタチンＭ遺伝子またはオンコスタチンＭホモログ遺伝子を含む遺伝子導入ベクターであって、
ここで、オンコスタチンＭホモログは、配列番号４、６または８に記載の核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされ、そしてオンコスタチンＭ活性を有するポリペプチドであって、ここで、オンコスタチンＭ活性は、多能性造血前駆細胞の増殖促進活性、内皮細胞クラスターの形成促進活性、肝細胞分化促進活性、新生児のセルトリ細胞の増殖促進活性、肝細胞からの急性期タンパク質の産生誘導活性、ＴＩＭＰ１の発現誘導活性、および肝再生促進活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性である、遺伝子導入ベクター、
および
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア
を含む、疼痛を処置するための薬学的組成物。
【請求項３２】
前記遺伝子導入ベクターが、以下からなる群から選択されるウイルス由来である、請求項３１に記載の薬学的組成物：レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルス。
【請求項３３】
前記遺伝子導入ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、またはレンチウイルス由来である、請求項３２に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
遺伝子導入ベクターがレトロウイルス由来である、請求項３３に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、疼痛を処置するための薬物の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
（オンコスタチンＭおよびそのレセプター）
オンコスタチンＭは、１９８０年代後半にヒトのＡ３７５メラノーマ細胞の増殖を抑制する因子として発見され、癌の阻害因子という意味で名づけられた。ヒトオンコスタチンＭ遺伝子の単離によって、オンコスタチンＭがインターロイキン６（ＩＬ−６）ファミリーに属し、活性においても、構造においても特に白血病抑制因（ＬＩＦ）に類似していることが明らかとなった。しかし、その後、長い間マウスのオンコスタチンＭをコードする遺伝子が同定されなかったことなどから、ＬＩＦ類似のサイトカインという以上には理解が進まなかった。その後、サイトカインのシグナル伝達機構の解析の結果、サイトカイン刺激で活性化される転写因子ＳＴＡＴ５により制御される遺伝子の同定の結果、マウスオンコスタチンＭのｃＤＮＡがクローニング（配列番号４）され、オンコスタチンＭの解析が進んだ。オンコスタチンＭ遺伝子のプロモーター領域には、ＳＴＡＴ５の結合配列が存在し、オンコスタチンＭ遺伝子の発現はサイトカイン刺激によってＳＴＡＴ５を介して誘導されることが示された。オンコスタチンＭの示す生理活性は多種多様であり、胚形成、炎症反応、造血、肝臓発生に関与することが知られており、細胞種によって、増殖促進、増殖抑制、分化誘導などの活性を示す。
【０００３】
オンコスタチンＭレセプターは、ｇｐ１３０分子とオンコスタチンＭレセプターβ鎖（ＯＳＭＲβ）とのヘテロ二量体である。これに対して、オンコスタチンＭと同様にＩＬ−６ファミリーに属するＬＩＦのレセプターは、ｇｐ１３０分子と白血病抑制因レセプターβ鎖（ＬＩＦＲβ）とのヘテロ二量体である。これらβ鎖は、リガンドとの結合、およびシグナル伝達に必須であり、ｇｐ１３０分子に相当する長さの細胞内ドメインを有する。
【０００４】
近年、オンコスタチンＭ特異的生物学的活性（例えば、多能性造血前駆細胞の増殖、および内皮細胞クラスターの形成、肝細胞の分化、および新生児のセルトリ細胞の増殖）が、オンコスタチンＭレセプターβ鎖を媒介することが報告された。
【０００５】
本発明者らは、以前にオンコスタチンＭレセプターβ鎖が、胚形成の間および、成体マウス内の神経系を含む種々の器官において発現していることを示した。（Ｔａｍｕｒａら、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １１５：１２７−１３１（２００２）；Ｔａｍｕｒａら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １１９（２００３）９９１−９９７；Ｔａｍｕｒａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７：２２８７−２２９８（２００３））。脊髄神経節（ＤＲＧ）では、オンコスタチンＭレセプターβ鎖は、ペプチド作動性の侵害受容性ニューロンにおいて発現することが示された。このペプチド作動性の侵害受容性ニューロンは、バニロイド（ｖａｎｉｌｌｏｉｄ）レセプター（ＶＲ１）およびＰ２Ｘ３プリン作動性（ｐｕｒｉｎｅｒｇｉｃ）レセプターの両方を発現した。（Ｔａｍｕｒａら、Ｅ．Ｊ．Ｎｅｕｏｒｏｓｃｉ、１７、２２８７−２２９８（２００３））。しかし、オンコスタチンＭレセプターβ鎖と疼痛との関連は、教示も示唆もされていない。
【０００６】
（神経因性疼痛）
疼痛は、急性痛、炎症性疼痛、および神経因性疼痛に大別される。中でも、神経因性疼痛は、慢性に経過し、非常に難治性の疾患である。鎮痛薬としては現在、非ステロイド性消炎鎮痛薬（ｎｏｎ−ｓｔｅｒｏｉｄａｌ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇｓ：ＮＳＡＩＤｓ）および麻薬（オピオイド）が使用されているが、神経因性疼痛は、これらの薬剤に対する抵抗性を示す。神経性疼痛におけるアロディニア（触覚刺激で誘発される痛みの現象）は持続的であり、脊髄におけるアロディニアの維持には、グルタミン酸レセプター（特にＮＭＤＡレセプター）、グルタミン酸トランスポーター、ＮＯ（一酸化窒素）、およびプロスタグランジン（特に、ＰＧＥ２、およびＰＧＦ２α）が関与すると考えられている（南敏明、土居ゆみ、村谷忠利、西村渉、西澤幹雄、伊藤誠二：  痛覚伝達に対する脊髄でのプロスタグランジンの役割、緒方宣邦、柿木隆介編集、『痛みの基礎と臨床、真興交易医書出版部』、１３８ー１４９ページ、２００３年）。
【０００７】
神経性疼痛における過敏反応と関連する神経線維として、カプサイシンに非感受性であり、グルタミン酸を伝達物質として、そしてプロスタグラジンＩ２アゴニストなどが作用する神経線維としてＩＩＩ型神経線維が提唱されている（植田弘師、井上誠：  モルヒネ耐性とモルヒネ非感受性神経因性疼痛、緒方宣邦、柿木隆介編集、『痛みの基礎と臨床、真興交易医書出版部』、１５２ー１６５ページ、２００３年）、神経因性疼痛を処置するための、抵抗性を示さない薬剤は、未だ開発されていない。また、神経因性疼痛以外の疼痛（例えば、急性痛、炎症性疼痛、癌性疼痛）を処置するための薬剤の開発も、未だ不十分である。例えば、癌性疼痛についてはモルヒネが第一選択であり、初期はよく効くが、しばらくするときかなくなり（耐性）、幻覚などの中枢神経症状を呈してくる。そのため、種々の疼痛に対する効果的な薬剤の開発が望まれている。
【０００８】
疼痛は、脊髄神経節（ＤＲＧ）を経由して、その信号が伝達する。そのため、例えば、ＤＲＧを経由する神経を除去するか、またはシグナルを遮断することによって、疼痛の処置が可能であると考えられる。しかし、物理的に疼痛に関与する神経のみを除去することは、困難である。一方、ＩＢ４は、ＤＲＧの４０％の神経で発現するマーカーであることから、ＩＢ４発現神経細胞を特異的に除去することによって、痛感を緩和する方法が提唱されている（非特許文献６）。しかし、ＤＲＧ神経細胞には、ｃ−ｒｅｔ＋神経細胞とｔｒｋＡ＋神経細胞があるが、ＩＢ４は、もっぱらｃ−ｒｅｔ＋神経細胞に発現し、しかも全ＤＲＧ神経細胞の４０％もの神経細胞がＩＢ４＋であることから、ＩＢ４の発現を指標にすることは、必要以上にＤＲＧ神経細胞を除去する結果を招きかねず、しかも、除去する細胞が偏った集団の神経細胞であることから、その副作用が懸念される。
【非特許文献１】Ｔａｍｕｒａら、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １１５：１２７−１３１（２００２）
【非特許文献２】Ｔａｍｕｒａら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １１９（２００３）９９１−９９７
【非特許文献３】Ｔａｍｕｒａら、Ｅ．Ｊ．Ｎｅｕｏｒｏｓｃｉ．、１７、２２８７−２２９８（２００３）
【非特許文献４】南敏明、土居ゆみ、村谷忠利、西村渉、西澤幹雄、伊藤誠二：  痛覚伝達に対する脊髄でのプロスタグランジンの役割、緒方宣邦、柿木隆介編集、『痛みの基礎と臨床、真興交易医書出版部』、１３８ー１４９ページ、２００３年
【非特許文献５】植田弘師、井上誠：  モルヒネ耐性とモルヒネ非感受性神経因性疼痛、緒方宣邦、柿木隆介編集、『痛みの基礎と臨床、真興交易医書出版部』、１５２ー１６５ページ、２００３年
【非特許文献６】Ｖｕｌｃｈａｎｏｖａら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．１０８、Ｎｏ．１、１４３〜１５５頁、２００１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
このように、当該分野において、疼痛、特に抵抗性の疼痛（例えば、癌性疼痛、神経因性疼痛、および炎症性疼痛など）を処置するための薬物への需要が高まっている。本発明は、このような需要に応えることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、本発明者らが上記課題を鋭意検討した結果、意外にもオンコスタチンＭレセプターを発現する細胞において、オンコスタチンＭによってトリガーされる反応を阻害・抑制することによって、疼痛応答が抑制されることを見出したことによって一部完成された。さらに、驚くべきことに、中枢神経系に対して抹消神経側にオンコスタチンＭを投与することによっても、疼痛応答が抑制されることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
したがって、本発明は、以下を提供する。
１．オンコスタチンＭアンタゴニストおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、疼痛を処置するための薬学的組成物。
２．オンコスタチンＭアンタゴニストが以下からなる群から選択される、項目１に記載の薬学的組成物：
抗オンコスタチンＭ抗体、抗オンコスタチンＭレセプター抗体、オンコスタチンＭレセプターフラグメント、オンコスタチンＭレセプターの少なくとも一部を含む融合タンパク質、抗ｇｐ１３０抗体、およびオンコスタチンＭ変異体。
３．オンコスタチンＭアンタゴニストが抗オンコスタチンＭレセプター抗体である、項目２に記載の薬学的組成物。
４．前記抗オンコスタチンＭレセプター抗体が細胞毒素と結合体を形成している、項目３に記載の薬学的組成物。
５．前記細胞毒素が、サポリン、ジフテリアトキシン、リシン、およびヘルペスチミジンキナーゼからなる群から選択される、項目４に記載の薬学的組成物。
６．オンコスタチンＭアンタゴニストが、投与された部位における局所濃度が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの量になるように含有される、項目１に記載の薬学的組成物。
７．さらに、細胞毒素と結合体化した抗オンコスタチンＭアンタゴニスト抗体を含む、項目１に記載の薬学的組成物。
８．前記疼痛が、以下からなる群から選択される、項目１に記載の薬学的組成物：炎症性疼痛、神経因性疼痛、および癌性疼痛。
９．非ステロイド性消炎鎮痛薬および麻薬のうち少なくとも１つをさらに含む、項目１に記載の薬学的組成物。
１０．インドメタシン、アスピリン、サリチル酸ナトリウム、アセトアミノフェン、モルヒネ、フェンタニル、アルフェンタニル、スフェンタニル、レミフェンタニル、および［Ｄ−Ａｌａ２，ＭｅＰｈｅ４，Ｇｌｙ−ｏｌ５］−エンケファリンのうち少なくとも１つをさらに含む、項目１に記載の薬学的組成物。
１１．疼痛を処置するための医薬の製造における、オンコスタチンＭアンタゴニストの使用。
１２．オンコスタチンＭアンタゴニストが以下からなる群から選択される、項目１１に記載の使用：
抗オンコスタチンＭ抗体、抗オンコスタチンＭレセプター抗体、オンコスタチンＭレセプターフラグメント、オンコスタチンＭレセプターの少なくとも一部を含む融合タンパク質、抗ｇｐ１３０抗体、およびオンコスタチンＭ変異体。
１３．オンコスタチンＭアンタゴニストが抗オンコスタチンＭレセプター抗体である、項目１２に記載の使用。
１４．前記抗オンコスタチンＭレセプター抗体が細胞毒素と結合体を形成している、項目１３に記載の使用。
１５．前記細胞毒素が、サポリン、ジフテリアトキシン、リシン、およびヘルペスチミジンキナーゼからなる群から選択される、項目１４に記載の使用。
１６．オンコスタチンＭアンタゴニストが投与された部位における局所濃度が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの量になるように前記医薬中に含有される、項目１１に記載の使用。
１７．さらに、細胞毒素と結合体化した抗オンコスタチンＭアンタゴニスト抗体の使用を含む、項目１１に記載の使用。
１８．前記疼痛が、以下からなる群から選択される、項目１１に記載の使用：炎症性疼痛、神経因性疼痛、および癌性疼痛。
１９．項目１に記載の薬学的組成物を含む、疼痛を処置するためのキット。
２０．オンコスタチンＭアンタゴニストが以下からなる群から選択される、項目１９に記載のキット：
抗オンコスタチンＭ抗体、抗オンコスタチンＭレセプター抗体、オンコスタチンＭレセプターフラグメント、オンコスタチンＭレセプターの少なくとも一部を含む融合タンパク質、抗ｇｐ１３０抗体、およびオンコスタチンＭ変異体。
２１．オンコスタチンＭアンタゴニストが抗オンコスタチンＭレセプター抗体である、項目２０に記載のキット。
２２．前記抗オンコスタチンＭレセプター抗体が細胞毒素と結合体を形成している、項目２１に記載のキット。
２３．前記細胞毒素が、サポリン、ジフテリアトキシン、リシン、およびヘルペスチミジンキナーゼからなる群から選択される、項目２２に記載のキット。
２４．オンコスタチンＭアンタゴニストが投与された部位における局所濃度が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの量になるように前記薬学的組成物中に含有される、項目１９に記載のキット。
２５．さらに、細胞毒素と結合体化した抗オンコスタチンＭアンタゴニスト抗体を含む、項目１９に記載のキット。
２６．前記疼痛が、以下からなる群から選択される、項目１９に記載のキット：炎症性疼痛、神経因性疼痛、および癌性疼痛。
２７．非ステロイド性消炎鎮痛薬および麻薬の少なくとも１つをさらに含む、項目１９に記載のキット。
２８．インドメタシン、アスピリン、サリチル酸ナトリウム、アセトアミノフェン、モルヒネ、フェンタニル、アルフェンタニル、スフェンタニル、レミフェンタニル、および［Ｄ−Ａｌａ２，ＭｅＰｈｅ４，Ｇｌｙ−ｏｌ５］−エンケファリンのうち少なくとも１つをさらに含む、項目２７に記載のキット。
２９．疼痛を処置するための薬学的組成物であって、該組成物は、
（ａ）遺伝子導入ベクターであって、オンコスタチンＭレセプターβ鎖遺伝子の制御領域および該制御領域と作動可能に連結された細胞障害遺伝子とを含むベクター、および
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア
を含む、疼痛を処置するための薬学的組成物。
３０．前記オンコスタチンＭレセプターβ鎖遺伝子の制御領域が、該遺伝子のプロモーター領域由来である、項目２９に記載の薬学的組成物。
３１．前記プロモーターの配列が、配列番号１に記載の配列からなる配列である、項目３０に記載の薬学的組成物。
３２．前記遺伝子導入ベクターが、以下からなる群から選択されるウイルス由来である、項目２９に記載の薬学的組成物：レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルス。
３３．前記遺伝子導入ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、またはレンチウイルス由来である、項目３２に記載の薬学的組成物。
３４．遺伝子導入ベクターがレトロウイルス由来である、項目３２に記載の薬学的組成物。
３５．前記細胞障害遺伝子が、以下からなる群から選択される遺伝子由来である、項目２９に記載の薬学的組成物：ジフテリアトキシン、リシン、およびヘルペスチミジンキナーゼ。
３６．前記疼痛が、以下からなる群から選択される、項目２９に記載の薬学的組成物：炎症性疼痛、神経因性疼痛、および癌性疼痛。
３７．非ステロイド性消炎鎮痛薬および麻薬のうち少なくとも１つをさらに含む、項目２９に記載の薬学的組成物。
３８．インドメタシン、アスピリン、サリチル酸ナトリウム、アセトアミノフェン、モルヒネ、フェンタニル、アルフェンタニル、スフェンタニル、レミフェンタニル、および［Ｄ−Ａｌａ２，ＭｅＰｈｅ４，Ｇｌｙ−ｏｌ５］−エンケファリンのうち少なくとも１つをさらに含む、項目２９に記載の薬学的組成物。
３９．疼痛を処置するための医薬の製造における、遺伝子導入ベクターの使用であって、該ベクターはオンコスタチンＭレセプターβ鎖遺伝子の制御領域および該制御領域と作動可能に連結された細胞障害遺伝子とを含む、使用。
４０．前記オンコスタチンＭレセプターβ鎖遺伝子の制御領域が、該遺伝子のプロモーター領域由来である、項目３９に記載の使用。
４１．前記プロモーターの配列が、配列番号１に記載の配列からなる配列である、項目４０に記載の使用。
４２．前記遺伝子導入ベクターが、以下からなる群から選択されるウイルス由来である、項目３９に記載の使用：レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルス。
４３．前記遺伝子導入ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、またはレンチウイルス由来である、項目４２に記載の使用。
４４．前記遺伝子導入ベクターが、レトロウイルス由来である、項目４２に記載の使用。
４５．前記細胞障害遺伝子が、以下からなる群から選択される遺伝子由来である、項目３９に記載の使用：ジフテリアトキシン、リシン、およびヘルペスチミジンキナーゼ。
４６．前記疼痛が、以下からなる群から選択される、項目３９に記載の使用：炎症性疼痛、神経因性疼痛、および癌性疼痛。
４７．項目２９に記載の薬学的組成物を含む、疼痛を処置するためのキット。
４８．前記オンコスタチンＭレセプターβ鎖遺伝子の制御領域が、該遺伝子のプロモーター領域由来である、項目４７に記載のキット。
４９．前記プロモーターの配列が、配列番号１に記載の配列からなる配列である、項目４８に記載のキット。
５０．前記遺伝子導入ベクターが、以下からなる群から選択されるウイルス由来である、項目４７に記載のキット：レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルス。
５１．前記遺伝子導入ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、またはレンチウイルス由来である、項目５０に記載のキット。
５２．前記遺伝子導入ベクターが、レトロウイルス由来である、項目５０に記載のキット。
５３．前記細胞障害遺伝子が、以下からなる群から選択される遺伝子由来である、項目４７に記載のキット：ジフテリアトキシン、リシン、およびヘルペスチミジンキナーゼ。
５４．前記疼痛が、以下からなる群から選択される、項目４７に記載のキット：炎症性疼痛、神経因性疼痛、および癌性疼痛。
５５．非ステロイド性消炎鎮痛薬および麻薬のうち少なくとも１つをさらに含む、項目４７に記載のキット。
５６．インドメタシン、アスピリン、サリチル酸ナトリウム、アセトアミノフェン、モルヒネ、フェンタニル、アルフェンタニル、スフェンタニル、レミフェンタニル、および［Ｄ−Ａｌａ２，ＭｅＰｈｅ４，Ｇｌｙ−ｏｌ５］−エンケファリンのうち少なくとも１つをさらに含む、項目４７に記載のキット。
５７．オンコスタチンＭまたはオンコスタチンＭホモログの少なくとも１つと、薬学的に受容可能なキャリアとを含む、疼痛を処置するための薬学的組成物であって、
ここで、オンコスタチンＭホモログは、配列番号４、６または８に記載の核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされ、そしてオンコスタチンＭ活性を有するポリペプチドであって、ここで、オンコスタチンＭ活性は、多能性造血前駆細胞の増殖促進活性、内皮細胞クラスターの形成促進活性、肝細胞分化促進活性、新生児のセルトリ細胞の増殖促進活性、肝細胞からの急性期タンパク質の産生誘導活性、ＴＩＭＰ１の発現誘導活性、および肝再生促進活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性である、薬学的組成物。
５８．オンコスタチンＭまたはオンコスタチンＭホモログが、投与された部位における局所濃度が０．１〜１００ｍｇ／ｍｌの量になるように含有される、項目５７に記載の薬学的組成物。
５９．前記疼痛が、以下からなる群から選択される、項目５７に記載の薬学的組成物：炎症性疼痛、神経因性疼痛、および癌性疼痛。
６０．非ステロイド性消炎鎮痛薬および麻薬のうち少なくとも１つをさらに含む、項目５７に記載の薬学的組成物。
６１．インドメタシン、アスピリン、サリチル酸ナトリウム、アセトアミノフェン、モルヒネ、フェンタニル、アルフェンタニル、スフェンタニル、レミフェンタニル、および［Ｄ−Ａｌａ２，ＭｅＰｈｅ４，Ｇｌｙ−ｏｌ５］−エンケファリンのうち少なくとも１つをさらに含む、項目５７に記載の薬学的組成物。
６２．皮下投与または筋肉内投与に適するように処方される、項目５７に記載の薬学的組成物。
６３．前記疼痛が、以下からなる群から選択される、項目５７に記載の薬学的組成物：炎症性疼痛、神経因性疼痛、および癌性疼痛。
６４．非ステロイド性消炎鎮痛薬および麻薬のうち少なくとも１つをさらに含む、項目５７に記載の薬学的組成物。
６５．インドメタシン、アスピリン、サリチル酸ナトリウム、アセトアミノフェン、モルヒネ、フェンタニル、アルフェンタニル、スフェンタニル、レミフェンタニル、および［Ｄ−Ａｌａ２，ＭｅＰｈｅ４，Ｇｌｙ−ｏｌ５］−エンケファリンのうち少なくとも１つをさらに含む、項目５７に記載の薬学的組成物。
６６．疼痛を処置するための医薬の製造における、オンコスタチンＭまたはオンコスタチンＭホモログの使用。
６７．項目５７に記載の薬学的組成物を含む、疼痛を処置するためのキット。
６８．疼痛を処置するための薬学的組成物であって、該組成物は、
（ａ）オンコスタチンＭ遺伝子またはオンコスタチンＭホモログ遺伝子を含む遺伝子導入ベクターであって、
ここで、オンコスタチンＭホモログは、配列番号４、６または８に記載の核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされ、そしてオンコスタチンＭ活性を有するポリペプチドであって、ここで、オンコスタチンＭ活性は、多能性造血前駆細胞の増殖促進活性、内皮細胞クラスターの形成促進活性、肝細胞分化促進活性、新生児のセルトリ細胞の増殖促進活性、肝細胞からの急性期タンパク質の産生誘導活性、ＴＩＭＰ１の発現誘導活性、および肝再生促進活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性である、遺伝子導入ベクター、
および
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア
を含む、疼痛を処置するための薬学的組成物。
６９．前記遺伝子導入ベクターが、以下からなる群から選択されるウイルス由来である、項目６８に記載の薬学的組成物：レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルス。
７０．前記遺伝子導入ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、またはレンチウイルス由来である、項目６９に記載の薬学的組成物。
７１．遺伝子導入ベクターがレトロウイルス由来である、項目７０に記載の薬学的組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の薬学的組成物は、疼痛、特に抵抗性の疼痛（例えば、癌性疼痛、神経因性疼痛、および炎症性疼痛など）を処置し得るという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１４】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００１５】
本明細書において使用される場合、「オンコスタチンＭ」とは、特に言及しない限り、配列番号４の核酸配列によってコードされるマウスタンパク質、配列番号６の核酸配列によってコードされるヒトタンパク質、配列番号８の核酸配列によってコードされるラットタンパク質、ならびにそのタンパク質のホモログ、およびオルソログ、ならびにこれらタンパク質、ホモログ、およびオルソログの、改変体、および対立遺伝子変異体の全てを言う。
【００１６】
本明細書において使用される場合、「オンコスタチンＭホモログ」とは、例えば、配列番号４、６または８に記載の核酸とストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸によってコードされるタンパク質であって、少なくとも１つのオンコスタチンＭ活性を有するポリペプチドをいうか、または、天然のオンコスタチンＭのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸残基が欠失、付加、置換したアミノ酸配列を有し、かつ少なくとも１つのオンコスタチンＭ活性を有するポリペプチドをいう。オンコスタチンＭ活性としては、多能性造血前駆細胞の増殖促進活性、内皮細胞クラスターの形成促進活性、肝細胞分化促進活性、新生児のセルトリ細胞の増殖促進活性、肝細胞からの急性期タンパク質の産生誘導活性、ＴＩＭＰ１の発現誘導活性、肝再生促進活性、正常な乳房上皮細胞および正常な胸部上皮細胞の増殖阻害活性、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫細胞およびミエローマ細胞およびプラズマ細胞腫細胞の増殖促進活性、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）依存性経路を介した皮膚の線維芽細胞を刺激する活性、ＡＧＭ由来細胞の初代培養における内皮様細胞の増殖刺激活性、肝細胞癌および肝実質細胞における急性期タンパク質（ＡＰＰ）合成を刺激する活性、培養内皮細胞においてＩＬ−６の産生を刺激する活性、ＨｅｐＧ２細胞においてＩＬ−６レセプターの産生を刺激する活性、滑膜線維芽細胞および肺線維芽細胞においてＩＬ−８およびＧＭ−ＣＳＦのＩＬ−１性誘導発現の阻害活性、ヒト内皮細胞におけるケモカイン・増殖関連サイトカインαおよびβｍＲＮＡの誘導活性、ヒト内皮細胞におけるＰセレクチンおよびＥセレクチンの長期発現誘導活性、内皮細胞による細胞間接着分子（ＩＣＡＭ−１）およびＶＣＡＭ−１の発現を誘導する活性、ヒト肺細胞および滑膜起源の線維芽細胞においてＴＭＩＰ−１発現を増加する活性、培養ヒト滑膜管壁細胞においてＴＭＩＰ−１発現を増加する活性、培養ヒト滑膜管壁細胞においてＩＬ−１β誘導性ＴＭＩＰ−３発現を阻害する活性、星状細胞においてＭＭＰ−１およびＭＭＰ−３の発現を増強する活性、線維芽細胞においてＭＭＰ−１およびＭＭＰ−９の発現を増強する活性、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞においてＴＩＭＰ−１  ｍＲＮＡを刺激する活性、肺由来の上皮細胞においてα１−アンチキモトリプシン合成を刺激する活性、肺由来の上皮細胞においてα１−アンチキモトリプシンのレベルを上方制御する活性、ＨｅｐＧ２細胞において低比重リポ蛋白レセプターおよびプロテインＳの発現を上方制御する活性、ヒト肝実質細胞において転写レベルでＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ４（シトクロムＰ４５０のアイソザイム）の発現を下方制御する活性、コラーゲンｍＲＮＡの誘導することなく肝星細胞のコラーゲン産生を増加する活性、Ｋ−Ｒａｓを介して肝実質細胞のＥカドヘリンに基づく細胞接着形成の増強する活性、ＳＴＡＴ３を介して胎児肝実質細胞におけるＤ１サイクリンおよびＤ２サイクリンの発現を下方制御する活性、再生した肝臓の成熟した肝実質細胞においてＤサイクリンの発現を上方制御する活性、胎児肝臓においてＣＤ４５陽性の造血細胞の発現を誘導する活性、マウスＡＧＭ細胞の初代培養における内皮様細胞の増殖刺激活性、および骨髄増殖性の表現型を誘導する活性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
本明細書において使用する場合、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、最も高いＴｍ値に相当する(例えば、50%ホルムアミド、５×または６×SSC)ハイブリダイゼーション条件である。核酸配列のＴｍの決定方法は、周知である。
【００１８】
本明細書において使用される場合、「アンタゴニスト」とは、ある生体作用物質（例えば、オンコスタチンＭのようなリガンド）のレセプターへの結合に拮抗的に働き、それ自身はそのレセプターを介した生理作用を現わさない因子をいう。拮抗薬、遮断剤（ブロッカー）、阻害剤（インヒビター）などもこのアンタゴニストに包含される。抗オンコスタチンＭレセプター抗体、抗オンコスタチンＭレセプター抗体もまた、オンコスタチンＭのアンタゴニストとして作用し得る。
【００１９】
本明細書において使用される場合、「オンコスタチンＭアンタゴニスト」とは、オンコスタチンＭのオンコスタチンＭレセプターに対する結合に拮抗的に働くが、それ自体は、オンコスタチンＭ様の作用をしない物質をいう。オンコスタチンＭアンタゴニストとしては、以下に列挙する種々の周知の物質が存在するが、これらに限定されない：抗オンコスタチンＭ抗体、抗オンコスタチンＭレセプター抗体、オンコスタチンＭレセプターフラグメント、オンコスタチンＭレセプターの少なくとも一部を含む融合タンパク質、抗ｇｐ１３０抗体、およびオンコスタチンＭ変異体。
【００２０】
本明細書において使用する場合、「抗体」とは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体、ヒトおよびキメラ抗体を含み、そして、ファージ外皮もしくは細胞表面タンパク質に融合した抗体または抗体フラグメント、および当該分野で公知である本明細書中に記載の他の抗体を含む、抗原と特異的に結合するポリペプチドをいう。本明細書の抗体とは、化学的に改変された（例えば、グリコシル化など）抗体、およびトキシンのような他のタンパク質（例えば、ジフテリアトキシン、およびリシン）と融合体化した抗体をも含む。本発明の抗体は、少なくとも約106、107、108、109または1010Ｍ-1の、抗原に対する特異的結合親和性を示し得、そしてこれはポリクローナル、モノクローナル、組換えまたは他の産物であり得る。本発明の抗体を産生するための抗原として使用し得るポリペプチドとしては、オンコスタチンＭ、オンコスタチンＭレセプター、オンコスタチンＭレセプター、もしくはｇｐ１３０、またはこれらの変異体、あるいはこれらポリペプチドのフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明において、種々の市販の抗体を使用することができる。例えば、抗マウスオンコスタチンＭ抗体（Ｒ＆Ｄ社；カタログ番号ＡＦ−４９５−ＮＡ）、または抗ヒトオンコスタチンＭ抗体（Ｒ＆Ｄ社；カタログ番号ＡＦ−２９５−ＮＡ、またはＭＡＢ２９５）、あるいは、抗マウスオンコスタチンＭレセプターβ抗体（Ｒ＆Ｄ社；カタログ番号ＡＦ６６２）、または抗マウスオンコスタチンＭレセプターβ／Ｆｃ  キメラ抗体（Ｒ＆Ｄ社；カタログ番号６６２−ＯＲ−１００）を、本発明のオンコスタチンＭアンタゴニストとして使用することができる。また、以下に記載する種々の周知の手法を用いて、本発明のオンコスタチンＭアンタゴニストとして使用可能な抗体を調製することができる。
【００２２】
抗体の産生については、ヤギ、ヒツジ、ウシ、モルモット、ウサギ、ラットまたはマウスのような宿主を、抗原タンパク質または免疫原性特性を保持するその任意の部位、フラグメントまたはオリゴペプチドでの注射によって免疫化し得る。抗体誘導のための抗原ポリペプチドの選択において、生物学的活性を保持する必要はない；しかし、タンパク質フラグメントまたはオリゴペプチドは、免疫原性、および好ましくは抗原性でなければならない。免疫原性は、ポリペプチドおよびアジュバントを動物（例えば、ウサギ）に注射し、そして注射したポリペプチドに対して指向する抗体の出現をアッセイすることにより測定し得る（例えば、HarlowおよびLane,ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, COLD SPRING HARBOR LABORATORY, New York (1988)参照。すべての目的のために本明細書中に全部が参考として援用される）。特異的抗体を誘導するために使用されるペプチドは、典型的には、少なくとも５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも10個のアミノ酸から成るアミノ酸配列を有する。通常、それらは、天然のタンパク質のアミノ酸配列の全てまたは隣接部分を模倣するか、またはそれと実質的な配列同一性を有する。抗原タンパク質アミノ酸の短い領域は、キーホールリンペットヘモシアニン、およびキメラ分子に対して産生された抗体のような別のタンパク質の領域に融合され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫学的反応を増大し得る。
【００２３】
抗原は、動物に適した方法によって決定された様式で免疫系に対して提示される。これらのおよび他のパラメーターは、一般に、免疫学者に周知である。典型的には、注射は肉趾、筋肉内、皮内、リンパ節周辺または腹腔内に投与する。アフィニティー精製を含む日常的な方法によって、宿主によって産生された免疫グロブリンを沈殿し、単離し、精製し得る。
【００２４】
本発明に従って、オンコスタチンＭレセプターを発現する細胞を特異的に除去するために、細胞毒素と結合体化した抗オンコスタチンＭレセプター抗体を用いることができる。あるいは、本発明に従って、オンコスタチンＭレセプターを発現する細胞を特異的に除去するために、抗オンコスタチンＭレセプター抗体に結合する二次抗体であって、細胞毒素と結合体化した抗体を用いることができる。そのような二次抗体は、例えば、抗オンコスタチンＭレセプター抗体がラット由来の抗体である場合には、ラット抗体のＦｃ部分を特異的に認識する抗体である。例えば、細胞毒素であるサポリンと結合体化した抗体は、市販されている（フナコシ株式会社、東京）。
【００２５】
Ａ）モノクローナル抗体：
抗原タンパク質およびペプチドに対するモノクローナル抗体は、培養中の連続する細胞株による、抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いる本発明の方法に従って調製し得る。これらは、KoehlerおよびMilstein(Nature 256:495 [1975])によって最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosborら,1983,Immunol.Today 4:72；Coteら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:2026)、およびEBVハイブリドーマ技術（Coleら,MONOCLONALANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R Liss Inc., New York, NY, 77-96頁[1985])を含むがこれらに限定されない。
【００２６】
ある実施態様において、適切な動物を選択し、適切な免疫化プロトコルを続けて行う。非ヒトモノクローナル抗体（例えば、ネズミ、ウサギ、ウマ）の産生は周知であり、そして例えば、抗原またはそのフラグメントを含有する調製物で動物を免疫化することによって達成し得る。ある方法において、適切な時間の後、動物の脾臓を切り出し、個々の脾臓細胞を、典型的には、適切な選択条件下で不死化骨髄腫細胞に融合する。その後、細胞をクローンに分離し、各クローン（例えば、ハイブリドーマ）の上清を、抗原の所望の領域に対して特異的な適切な抗体の産生につき試験する。抗体を産生する技術は当該分野で周知である。例えば、Godingら,MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (第2版)Acad. Press, N.Y.およびHarlowおよびLane(前出)を参照のこと（そのそれぞれにつき、その全部は全ての目的で本明細書に援用される）。他の適切な技術は、抗原性ポリペプチドに対する、あるいは、ファージまたは同様のベクターにおける抗体のライブラリーの選択に対するリンパ球のインビトロ暴露を含む。
【００２７】
Ｂ）ヒト抗体：
本発明の別の局面において、抗原ポリペプチドに対するヒト抗体が提供される。ヒト免疫系のエレメントを有するトランスジェニック動物を用いて（例えば、米国特許第5,569,825号および第5,545,806号参照、これらの両方は全目的のためそれらの全部が本明細書中に参考として援用される）、あるいはヒト末梢血液細胞を用いて（Casaliら,1986,Science 234:476)、既知の抗原に対するヒトモノクローナル抗体をまた作成し得る。いくつか
のヒト抗体は、競合結合実験によって、あるいは特定のマウス抗体と同一のエピトープ特異性を有するように選択される。
【００２８】
別の実施態様において、抗原ポリペプチドに対するヒト抗体は、Huseら, 1989, Science 246:1275（本明細書中に参考として援用される）によって概説されている一般的なプロトコルに従って、ヒトＢ細胞由来のDNAライブラリーをスクリーニングすることにより生産し得る。抗原ポリペプチドに結合する抗体を選択する。次いで、このような抗体（または結合フラグメント）をコードする配列をクローン化し、そして増幅する。Huseによって記載されているプロトコルは、しばしばファージティスプレイ技術とともに使用される。
【００２９】
Ｃ）ヒト化もしくはキメラ抗体：
本発明はまた、キメラ、ヒト様またはヒト化されて、それらの標的に対するそれらの親和性を低下させることなく、それらの潜在的抗原性を低下させた抗体を提供する。キメラ、ヒト様およびヒト化抗体の調製は当該分野で記載されている（例えば、米国特許第5,585,089号および第5,530,101号；Queenら,1989,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,86:10029;およびVerhoeyanら, 1988, Science 239:1534を参照;その全部は全目的のために本明細書中に参考として援用される。ヒト化免疫グロブリンは、実質的にヒト免疫グロブリン由来の可変フレームワーク領域（アクセプター免疫グロブリンという）および実質的に非ヒト（例えば、マウス）免疫グロブリン由来の相補性決定領域（ドナー免疫グロブリンという）を有する。もし存在すれば、定常領域は実質的にヒト免疫グロブリン由来である。
【００３０】
ヒト患者への投与のようないくつかの適用において、本発明のヒト化（ならびにヒト）抗体は、ネズミまたは他の種由来の抗体よりも優れたいくつかの利点を提供する：（１）ヒト免疫系は、ヒト化抗体のフレームワークまたは定常領域を外来性のものとして認識するはずがなく、従って、このような注射された抗体に対する抗体応答は、全体的に外来性のマウス抗体または部分的に外来性のキメラ抗体に対して、より低いはずである；（２）ヒト化抗体のエフェクター部分はヒト由来であるため、ヒト免疫系の他の部分とより良好に相互作用し得る；および（３）注射されたヒト化抗体は、天然に生じるヒト抗体と実質的に等しい半減期を有し、他の種の抗体よりも少量で、より低い頻度の用量を可能とする。前述のことから示されるように、抗体を含む薬学的組成物は疼痛を処置するために使用され得る。
【００３１】
Ｄ）ファージディスプレイ：
本発明はまた、ファージディスプレイ法（例えば、Dowerら, WO91/17271およびMcCaffertyら, WO92/01047；およびVaughanら,1996,Nature Biotechnology,14:309；その全部は全目的のために本明細書中に参考として援用される）によって生産された抗体を提供する。これらの方法において、ファージのライブラリーが生産される。ここで、メンバーはそれらの外表面上に異なる抗体を提示する。抗体は、通常、FvまたはFabフラグメントとし
て提示される。所望の特異性を有する抗体を表示するファージは、抗原ポリペプチドに対する親和性の豊富さによって選択される。
【００３２】
ファージディスプレイ法の変形において、選択されたネズミ抗体の結合特異性を有するヒト化抗体が生産され得る。この方法において、選択されたネズミ抗体の重鎖または軽鎖可変領域のいずれかを出発物質として用いる。もし、例えば、軽鎖可変領域が出発物質として選択される場合、メンバーが同一の軽鎖可変領域（すなわち、ネズミ出発物質）および異なる重鎖可変領域を示すファージライブラリーが構築される。重鎖可変領域は、再編成されたヒト重鎖可変領域のライブラリーから得られる。抗原ポリペプチドに対する強力な特異的結合を示すファージ（例えば、少なくとも108Ｍ-1および好ましくは少なくとも109Ｍ-1）が選択される。次いで、このファージ由来のヒト重鎖可変領域は、さらなるファージライブラリーを構築するための出発物質として働く。このライブラリーにおいて、各ファージは同一の重鎖可変領域（すなわち、最初のディスプレイライブラリーから同定された領域）、および異なる軽鎖可変領域を表示する。軽鎖可変領域は、再編成されたヒト可変軽鎖領域のライブラリーから得られる。再度、強力な特異的結合を示すファージが選択される。これらのファージは完全な抗体の可変領域を表示する。これらの抗体は、通常、ネズミ出発物質と同一または同様のエピトープ特異性を有する。
【００３３】
Ｅ）ハイブリッド抗体：
本発明はまた、抗原ポリペプチドに対する抗体の特異性を共有するが、第２の部位にも特異的に結合し得るハイブリッド抗体を提供する。このようなハイブリッド抗体において、一方の重鎖および軽鎖対は、通常、第１の抗原に反応性の抗体由来であり、他の対は第２の抗原に反応性の抗体由来である。この結果、多機能価の特性、すなわち、少なくとも２つの異なるエピトープに同時に結合する能力が得られる。このようなハイブリッドは、各成分抗体を生産するハイブリドーマの融合によって、あるいは組換え技術によって形成され得る。このようなハイブリッドは化合物（すなわち、薬物）をオンコスタチンＭまたはオンコスタチンＭレセプターを発現する細胞に運搬するために使用され得る（すなわち、細胞傷害薬剤が特異的に送達される）。
【００３４】
本発明の免疫グロブリンをまた、他の遺伝子由来の機能的領域（例えば、酵素）に融合させて、有用な特性を有する融合タンパク質（例えば、イムノトキシン）を生産し得る。
【００３５】
Ｆ）一般：
本発明の抗体は任意のイディオタイプ、例えば、IgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEであり得、IgG、IgAおよびIgMがしばしば好ましい。ヒト化抗体は１より多いクラスまたはイソタイプ由来の配列を含み得る。
【００３６】
本発明の別の実施態様において、上述のインタクトな抗体のフラグメントが提供される。典型的には、これらのフラグメントは、それらが由来するインタクトな抗体と抗原ポリペプチドへの特異的結合について競合し得、少なくとも106、107、108、109Ｍ-1、または1010Ｍ-1の親和性で結合し得る。抗体フラグメントは別々の重鎖、軽鎖、Fab、Fab’、(ab’)2、Fabc、およびFvを含む。フラグメントは、インタクトな免疫グロブリンの酵素的
または化学的分離によって生じ得る。例えば、F(ab’)2フラグメントは、HarlowおよびLane（前出）に記載されたような標準的な方法を用い、pH3.0〜3.5においてペプシンでタンパク消化することによってIgG分子から得ることができる。Fabフラグメントは、限定的還元によってF(ab’)2フラグメントから、あるいは還元剤の存在下でのパパインでの消化によって全抗体から得ることができる（一般には、Paul,W.編,FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY第2版 Raven Press, N.Y., 1989, 第7章を参照，その全部はすべての目的のために参考として援用される）。フラグメントはまた、組換えDNA技術によって産生され得る。選択されたフラグメントをコードする核酸のセグメントは、制限酵素での全長コード配列の消化によって、あるいはデノボ合成によって産生される。フラグメントはしばしば、ファージ外皮融合タンパク質の形態で発現される。
【００３７】
上述の免疫グロブリンの多くは、結合特異性あるいはエフェクター機能の損失、または結合親和性の過剰な低下（すなわち、約106Ｍ-1未満または約107Ｍ-1未満）の欠失なしに、可変および定常領域双方において、重要でないアミノ酸置換、付加または欠失を受けることができる。通常、このような改変を取り入んだ免疫グロブリンは、それらが由来する参照免疫グロブリンに対して実質的な配列同一性を示す。それが由来する参照免疫グロブリンと比較して同一の特異性および増加した親和性を有する、変異免疫グロブリンを選択し得る。ファージディスプレイ技術はこのような免疫グロブリンを選択するための有用な技術を供する。例えば、Dowerら,WO91/17271McCattertyら, WO 92/01047；およびHuse, WO 92/06204を参照のこと。
【００３８】
本発明の抗体は、修飾を施しても施さなくても使用し得る。しばしば、抗体は、検出可能な標識に共有結合的または非共有結合的のいずれかで結合することによって標識される。
【００３９】
本発明の抗体は、周知の方法を用いて精製し得る。本発明の全抗体、それらのダイマー、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む当該分野の標準的な手順に従って、本発明の方法および試薬を用いて精製し得る（一般には、Scopes,PROTEIN PURIFICATION; PRINCIPLES ANDPRACTICE 第3版,(Springer-Verlag, N.Y., 1993)を参照)。少なくとも約90〜95％、または98〜99％さえの、またはそれを以上の均一性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましい。
【００４０】
本発明のポリペプチドを製造する方法としては、例えば、そのポリペプチドを産生する初代培養細胞または株化細胞を培養し、培養上清などから単離または精製することによりそのポリペプチドを得る方法が挙げられる。あるいは、遺伝子操作手法を利用して、そのポリペプチドをコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組み込み、これを用いて発現宿主を形質転換し、この形質転換細胞の培養上清または細胞抽出物から組換えポリペプチドを得ることができる。上記宿主細胞は、生理活性を保持するポリペプチドを発現するものであれば、特に限定されず、従来から遺伝子操作において利用される各種の宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、動物細胞など）を用いることが可能である。このようにして得られた細胞に由来するポリペプチドは、天然型のポリペプチドと実質的に同一の作用を有する限り、アミノ酸配列中の１以上のアミノ酸が置換、付加および／または欠失していてもよく、糖鎖が置換、付加および／または欠失していてもよい。
【００４１】
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
【００４２】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  １５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【００４３】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【００４４】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４５】
本明細書において、用語「変異体」と「改変体」とは互換可能に使用され得る。変異体または改変体とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、本発明のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
【００４６】
「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。
【００４７】
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
【００４８】
本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログが付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
【００４９】
本明細書において使用されるポリペプチドの核酸形態は、そのポリペプチドのタンパク質形態を発現し得る核酸分子をいう。上述のようにその核酸の配列の一部が欠失または他の塩基により置換されていてもよく、あるいは他の核酸配列が一部挿入されていてもよい。あるいは、５’末端および／または３’末端に他の核酸が結合していてもよい。また、ポリペプチドをコードする遺伝子をストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、そのポリペプチドと実質的に同一の機能を有するポリペプチドをコードする核酸分子でもよい。このような遺伝子は、当該分野において公知であり、本発明において利用することができる。
【００５０】
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
【００５１】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００５２】
本明細書において使用される場合、「アゴニスト」とは、ある生体作用物質（リガンド）のレセプターに結合し、その物質のもつ作用と同じ(あるいは類似の)作用を現わす因子をいう。
【００５３】
本明細書において使用される場合、「レセプター」とは、１個以上のリガンドと可逆的、かつ特異的に複合体化する１個以上の結合ドメインを備える生物学的な構造であって、ここで、この複合体化は生物学的な構造を有する。
【００５４】
本発明において使用される場合、「オンコスタチンＭレセプター」とは、オンコスタチンＭと可逆的かつ特異的に結合するポリペプチドであって、特に言及しない限り、配列番号１０の核酸配列によってコードされるマウスタンパク質、配列番号１２の核酸配列によってコードされるヒトタンパク質、配列番号１４の核酸配列によってコードされるラットタンパク質、ならびにそのタンパク質のホモログ、およびオルソログ、ならびにこれらタンパク質、ホモログ、およびオルソログの、改変体、および対立遺伝子変異体の全てを言う。
【００５５】
本明細書において使用される用語「リガンド」とは、特異的なレセプターに対する結合パートナーである。リガンドは、レセプターに対する内因性のリガンドであるか、またはその代わりに、薬剤、薬剤候補、もしくは薬理学的手段のようなレセプターに対する合成リガンドであり得る。
【００５６】
本明細書において使用される場合、「オンコスタチンＭレセプター」とは、オンコスタチンＭに特異的に結合するレセプターをいう。代表的なオンコスタチンＭレセプターは、ｇｐ１３０分子とオンコスタチンＭレセプターβ鎖（ＯＳＭＲβ）とのヘテロ二量体である。
【００５７】
一般に痛覚は、身体部分に傷害・炎症などの強い侵害があるとにき生じる感覚である。しかし、痛覚を引き起こすためには、必ずしも傷害・炎症は必須ではなく、傷害も炎症もない場合であっても、同様の感覚を生じることがある。従って、本明細書において使用される場合、用語「疼痛」は、傷害・炎症などの強い侵害によって生じる痛覚、ならびにそれらの強い侵害によって生じる痛覚と同様の感覚ではあるが、傷害・炎症などの強い侵害を伴わずに生じる痛覚をいう。疼痛は、急性痛、炎症性疼痛、および神経因性疼痛に大別される。
【００５８】
本明細書において使用される場合、「神経因性疼痛」とは、急性の外的な刺激（例えば、熱刺激、化学的刺激、または機械的刺激）によることなく、また生体内の炎症も伴わない疼痛であり、例えば、神経細胞の異常、欠陥などによって生じる疼痛である。
【００５９】
本明細書において使用される場合、予防または処置上「有効な量」とは、予防、または処置（もしくは治療）において、医療上有効であると認められる程度の量をいう。このような量は、当該分野において周知の技法を用いて当業者が種々のパラメータを参酌しながら決定することができる。
【００６０】
本明細書において使用される場合、「鎮痛薬」とは、疼痛を処置して痛覚を低減するための薬剤をいう。本発明の薬学的組成物は、鎮痛薬として作用する。
【００６１】
本明細書において使用される場合、「遺伝子治療」とは、外来遺伝子を生体内に導入することによって行われる治療をいう。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入」とは、生体内またはインビトロにおいて、標的細胞内に、天然、合成または組換えの所望の遺伝子または遺伝子断片を、導入された遺伝子がその機能を維持するように、導入することをいう。本発明において導入される遺伝子または遺伝子断片は、特定の配列を有するＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの合成アナログである核酸を包含する。また、本明細書において使用される場合、遺伝子導入、トランスフェクション、およびトランスフェクトは、互換可能に使用される。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」は互換可能に使用される。「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。「遺伝子導入ベクター」および「遺伝子ベクター」としては、ウイルス由来のベクターが挙げられるが、これらに限定されない。代表的なウイルス由来のベクターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：レトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレンチウイルス。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「外来遺伝子」とは、遺伝子導入ベクター内に含まれ、遺伝子導入ベクターによって遺伝子が導入される宿主細胞以外の起源の核酸をいう。本発明の１つの局面において、この外来遺伝子は、遺伝子導入ベクターによって導入された遺伝子が発現するために適切な調節配列（例えば、転写に必要なプロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリＡ付加シグナル、ならびに翻訳に必要なリボゾーム結合部位、開始コドン、終止コドンなど）と作動可能に連結される。本発明の別の局面において、外来遺伝子は、この外来遺伝子の発現のための調節配列を含まない。本発明のさらなる局面において、外来遺伝子は、オリゴヌクレオチドまたはデコイ核酸である。
【００６５】
遺伝子導入ベクター内に含まれる外来遺伝子は、代表的にはＤＮＡまたはＲＮＡの核酸分子であるが、導入される核酸分子は、核酸アナログ分子を含んでもよい。遺伝子導入ベクター内に含まれる分子種は、単一の遺伝子分子種であっても、複数の異なる遺伝子分子種であってもよい。
【００６６】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。
【００６７】
本明細書において、核酸分子の「断片（フラグメント）」とは、参照核酸分子の全長よりも短く、本発明の薬学的組成物の製造に充分な長さを有するポリヌクレオチドをいう。したがって、本明細書におけるフラグメントは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【００６８】
本明細書において使用される場合、「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
【００６９】
本明細書において「生物学的活性」は、「機能的性質」と互換可能に用いられる。本明細書において、「生物学的活性」および「機能的性質」とは、ある因子（例えば、核酸）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が増殖因子をコードする遺伝子である場合、その機能的性質は、その増殖因子を宿主細胞内で発現させ、好ましくは、その発現によって細胞の増殖を促進することを包含する。例えば、ある因子が酵素をコードする遺伝子である場合、その機能的性質は、その酵素活性を宿主細胞内で発現させ、好ましくは、その酵素活性が検出可能になることを包含する。別の例では、ある因子がリガンドをコードする遺伝子である場合、そのリガンドが対応するレセプターへ結合するリガンドの発現させ、好ましくは、そのリガンドの発現によって、そのリガンドに対応するレセプターを有する細胞を変化させることを包含する。
【００７０】
本明細書において使用される場合、遺伝子の「制御領域」とは、遺伝子の発現を制御する領域をいう。代表的な制御領域としては、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリＡ付加シグナル、ならびに翻訳に必要なリボゾーム結合部位、開始コドン、終止コドンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
本明細書において使用される場合、遺伝子の「プロモーター」とは、そのプロモーターと作動可能に連結された遺伝子の転写を開始し得る核酸配列をいう。本発明において、細胞障害遺伝子と連結するプロモーターとして好ましいプロモーターは、ヒトオンコスタチンＭレセプターβ鎖遺伝子プロモーター配列（配列番号１）、マウスオンコスタチンＭレセプターβ鎖遺伝子プロモーター配列（配列番号２）、ラットオンコスタチンＭレセプターβ鎖遺伝子プロモーター配列（配列番号３）、またはこれらプロモーター配列のフラグメントであって、作動可能に連結された遺伝子をオンコスタチンＭレセプターβ鎖同様の組織特異的様式において発現するフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
本明細書において使用される場合、「細胞障害遺伝子」とは、宿主哺乳動物細胞内において発現した場合に、その宿主哺乳動物細胞を示すさせる遺伝子をいう。細胞障害遺伝子としては、例えば、以下の種々の遺伝子が周知である：ジフテリアトキシン、リシン、およびヘルペスチミジンキナーゼ。なお、ヘルペスチミジンキナーゼは、カンシクロビル存在下で、細胞障害遺伝子として作用する。
【００７３】
本明細書において使用される場合、「キット」とは、複数の容器、および製造業者の指示書を含み、そして各々の容器が、本発明の薬学的組成物、その他の薬剤、およびキャリアを含む製品をいう。
【００７４】
本明細書において使用される場合、「被検体」とは、本発明の薬学的組成物が投与される対象であり、ヒト、マウス、ウシ、ニワトリなどの動物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬のような農薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、賦形剤および／または薬学的アジュバント。
【００７６】
本明細書において「細胞毒素」とは、細胞に適用した場合に、細胞の増殖を阻害、抑制、および／または遅延するか、ならびに／あるいは細胞を死滅させる因子をいう。種々の毒素が公知であり、例えば、サポリン、ジフテリアトキシン、リシン、およびヘルペスチミジンキナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明の処置方法において使用される薬剤の種類および量は、本発明の方法によって得られた情報（例えば、疾患に関する情報）を元に、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、投与される被検体の部位の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明のモニタリング方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。疾患状態をモニタリングする頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）のモニタリングが挙げられる。１週間−１ヶ月に１回のモニタリングを、経過を見ながら施すことが好ましい。
【００７８】
必要に応じて、本発明の治療では、２種類以上の薬剤が使用され得る。２種類以上の薬剤を使用する場合、類似の性質または由来の物質を使用してもよく、異なる性質または由来の薬剤を使用してもよい。このような２種類以上の薬剤を投与する方法のための疾患レベルに関する情報も、本発明の方法によって入手することができる。
【００７９】
（レトロウイルスベクターの調製および使用）
レトロウイルスは、外来の遺伝子挿入のためのベクターとして用いられている。そして、この使用の一般的なパラメーターは、現在全くよく理解されている：レトロウイルスは、タンパク外被の内部に閉じ込められた一本鎖ＲＮＡゲノムから成る。５’末端から３’末端に読むそのゲノム自体は、以下を含む。これらは、キャップ、５’翻訳領域、「ψ」と命名されたＲＮＡ区分すなわちパッケージ部位（このＲＮＡ区分は、タンパク中に包装され得るＲＮＡに必要である）、そしていくつかのタンパク−−そのレトロウイルスの核タンパク（ｇａｇ）のためのコード配列：ＤＮＡの翻訳（ｐｏｌ）からなる中間段階を促進する逆転写酵素および頭殻タンパク（ｅｎｖ）のウイルス性外被、およびいくつかの３’非翻訳配列によって行われる全ての領域である。３つのウイルスタンパクは、ウイルスゲノムの感染に必要である。このパッケージング部位は、添加した感染性ウイルスを生産するのに必要である。
【００８０】
レトロウイルスは、そのタンパクをコードするＲＮＡ領域の２重鎖ｃＤＮＡコピーを含む「プロウイルス」段階を経験する。しかしながら、この段階では、その転写されない３’領域および５’領域は、このタンパクをコードするｃＤＮＡのいずれかの末端にて、長い末端繰り返し配列（ＬＴＲ）を含むべく修飾される。この長い末端繰り返し配列は、ＤＮＡの転写を生じる適当なプロモーター配列およびエンハンサー配列だけでなく、このコード部分に関して、作動可能な位置にて転写を終了させる配列を供給する。
【００８１】
普通の感染では、プロウイルスの２重鎖ｃＤＮＡは、宿主細胞のゲノムの中に吸収され得る。そして、これらの効果から、ＲＮＡゲノムを含む追加のウイルス粒子の生産物は、そのタンパクカプセルにパッケージされた。行われるこの手順では、このプロウイルス中にψパッケージ部位が存在することは、重大である。
【００８２】
レトロウイルスのタンパクをコードする配列は、その修飾されたウイルスが宿主細胞に感染するとき、そのウイルスの発現系を使用するように、所望のタンパクに対する配列と置き換えられることが、他にもあった。例えば、米国特許４，４０５，７１２号およびＬａｎｇ（前述）を参照のこと。しかしながら，これを達成するには，この修飾されたウイルスゲノムは，頭殻タンパクを合成し得、かつ外来ＤＮＡのＲＮＡ転写をパッケージし得るヘルパーウイルスを必要とする。
それゆえ、遺伝子治療のためには、プロウイルスＤＮＡ形は、適当なベクターの中に挿入され、複写され、そしてヘルパーウイルスの援助をうけてウイルス外被にパッケージされる。一般的な総説としては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４）２２６：４０１−４０９：Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．，「Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、ｉｎ  ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ，  Ｖｏｌ２，Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，２ｄ  ｅｄ，（１９８５），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照のこと。
【００８３】
遺伝子治療の研究に対して最も一般的に用いられるレトロウイルスは、ネズミ科の肉腫ウイルス（ＭＳＶ）またはモロニーネズミ科の白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）である（Ｍａｎｎ．Ｒ．ら，Ｃｅｌｌ（１９８３）３３：１５３  −１５９）。これらのレトロウイルスのプロウイルス形は、単離され、そして増幅のためにほぼ標準的な細胞のクローニングベクターに挿入される。パッケージ部位に沿ったプロウイルスの挿入（これは、コントロール配列を含む長い末端繰り返し配列に隣接するｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖをコードしているｍＲＮＡを含む）は、このタンパクをコードするＲＮＡを含む領域を所望の外来遺伝子に置き換えるように扱われる。このＤＮＡが、完全なウイルス、またはパッケージ部位のみが欠けている欠損ウイルスで感染された宿主細胞にトランスフェクトされるなら、修飾されたプロウイルスから合成されるＲＮＡは、そのとき、他の細胞に再感染するためのウイルス粒子にパッケージされる。このことにより、感染によって、所望の活性成分または薬剤をコードするＤＮＡを細胞に導入するための作用機構が供給される。
【００８４】
これに着手するのに２つの方法がある。一つの方法では、修飾されたプロウイルスＤＮＡは、その細胞中に共存する修飾されていないウイルスからの感染に耐える細胞にトランスフェクトされる。正常なウイルスベクターは、パッケージする材料を合成し、そして、修飾されたプロウイルスによって生成するｍＲＮＡのいくつかは、正常なビリオンに類似の方法で、パッケージされる。次いで、これはタンパクの生産のために、標的細胞に感染させるべく用いられ得る。しかしながら、これらの集められたウイルス外被に加えて、再パッケージされた正常ウイルスもある数で存在するだろう。このウイルスは、「供給物運搬用」ウイルスから分離されないなら、ビリオン生産過程の生成物に感染された宿主細胞にて、さらにウイルス感染を簡単に引き起こすだろう。
【００８５】
もっと有用な方法では、所望の遺伝子を含むプロウイルスのクローニングベクターは、欠損ウイルス外被を生産するように、遺伝コード的に修飾された細胞をトランスフェクトするのに用いられる（この欠損ウイルス外被は、実際には、空の供給運搬物である）。これらの細胞は、ψパッケージ部位を欠いている変異体レトロウイルスのプロウイルス型の統合によって得られる。そして、いくつかのこのような細胞系列は、それらを求める全ての技術に利用できる。ψ−１またはψ−２と命名されたこれら２つの系列は、Ｍａｎｎ．Ｒら、Ｃｅｌｌ（１９８３）３３：１５９−１５９に、広範囲に記述されている。これは、ＭｏＭＬＶプロウイルス挿入物を含むプラスミドを用いて、宿主ＮＩＨ−３Ｔ３繊維芽細胞をトランスフェクトすることにより作られる。この挿入物からは、ψパッケージ部位が削除されている。このψ−２細胞は、一世代の中で固有のウイルスのウイルス外被に相当する細胞あたり、いくらかの空のウイルス外被を明らかに生産する。これらの細胞が、外来遺伝子位とパッケージ部位（ψ）の両方を含んでいるプロウイルスのＤＮＡでトランスフェクトされるとき、それらは、修飾されたウイルスを産むように、外来遺伝子を含むプロウイルスＤＮＡからこれらの空の外被に、ｍＲＮＡの転写物をパッケージする。この修飾されたウイルスは、普通はＭｏＭＬＶに対する宿主である（この場合ではネジミ科の動物の）細胞を感染させる、しかしながら、この組み換え体（修飾されたウイルス）は、それが「感染させる」細胞中にさらに修飾されたビリオン（または他の）ビリオンの産生の引き起こし得ない点で欠損があることは注目されるべきである。この組み換え体は、「感染された」細胞において、この遺伝子がコードするタンパクの産生を引き起こし得る。しかし、その感染は、追加のビリオンが全く生産されないので、付加的な細胞を広げることができない。
【００８６】
人間に対する薬剤の調製のために、ψ２よりも有用であるのは、ψ−ＡＭ系列である。この系列は、Ｃｏｎｅ，Ｒ．Ｄ．，ら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８４）８１：６３４９−６３５３から得られる。これらの系列は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞をトランスフェクトすることによっても得られる。しかし、ｐＭＡＶ−ψ−と命名されるベクターを用いねばならない。このベクターも、ψパッケージング部位を欠く欠損プロウイルスの挿入物を含む。しかし、ｐＭＡＶ−ψ−は、ＭｏＭＬＶのｇａｇ−ｐｏｌ配列をコードするハイブリッドであり、そして外被配列は、両性のウイルス４０７０Ａに由来する。これらの細胞系列によって生産された空の頭殻は、偽ウイルスを生産するような共トランスフェクトされ修飾されたプロウイルスＤＮＡのＲＮＡ転写物をパッケージする。この偽ウイルスは、人間、野ネズミおよびハツカネズミの細胞を認識し感染させる。
【００８７】
（界面活性剤を用いる不活性化ＨＶＪエンベロープベクターの調製および使用）
ウイルスベクターの一例として、ＨＶＪエンベロープベクターの調製方法が公知である（特開２００１−２８６２８２）以下にその概略を示す。
【００８８】
（１：ＨＶＪの増殖）
ＨＶＪは鶏の受精卵への種ウイルスの接種により増殖されたものが一般に使用され得るが、サル、ヒトなどの培養細胞、培養組織へのウイルスの持続感染系（トリプシンなどの加水分解酵素を培養液中に添加）を利用して増殖させたもの、クローニングされたウイルスゲノムを培養細胞に感染させ持続感染をおこさせて増殖させたもの、全てが利用可能である。
【００８９】
ＨＶＪの増殖は、以下のように行う。
【００９０】
ＨＶＪの種ウイルスを、ＳＰＦ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）の受精卵を使って増殖させ分離・精製したＨＶＪ（Ｚ種）を細胞保存用チューブに分注し、１０％  ＤＭＳＯを加えて液体窒素中に保存し、調製する。
【００９１】
受精直後のニワトリ卵を入荷し、インキュベーター（ＳＨＯＷＡ−ＦＵＲＡＮＫＩ  Ｐ−０３型；約３００鶏卵収容）にいれ、３６．５℃，湿度４０％以上の条件で１０〜１４日飼育する。暗室中で、検卵器（電球の光が口径約１．５ｃｍの窓を通して出るようになっているもの）を用いて、胚の生存及び気室と漿尿膜を確認し、漿尿膜の約５ｍｍ上方に鉛筆でウイルス注入箇所の記しをつける（太い血管を除いた場所を選定する）。ポリペプトン溶液（１％ポリペプトン、０．２％  ＮａＣｌを混合し、１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７．２に調整してオートクレーブ滅菌し、４℃保存したもの）で種ウイルス（液体窒素からとりだしたもの）を５００倍に希釈し、４℃においた。卵をイソジン及びアルコールで消毒し、ウイルス注入箇所に千枚通しで小孔をあけ、希釈した種ウイルス０．ｌｍｌを２６ゲージの針付き１ｍｌシリンジを用いて、漿尿腔内に入るように注入する。溶かしたパラフィン（融点５０〜５２℃）をパスツールピペットを用いて孔の上に置きこれをふさぐ。卵をインキュベーターにいれ、３６．５℃、湿度４０％以上の条件で３日飼育した。次に、接種卵を一晩４℃におく。翌日、卵の気室部分をピンセットで割り、１８ゲージの針を付けた１０ｍｌシリンジを漿尿膜の中にいれて、漿尿液を吸引し、滅菌ボトルに集め、４℃に保存する。
【００９２】
（２：ＨＶＪの精製）
ＨＶＪは、遠心分離による精製方法、カラムによる精製方法、または当該分野において公知のその他の精製方法によって、精製され得る。
（２．１：遠心分離による精製方法）
手短には、増殖させたウイルス液を回収し低速遠心で培養液や漿尿液中の組織・細胞片を除去した。その上清を高速遠心（２７，５００×ｇ，３０分間）とショ糖密度勾配（３０〜６０％ｗ／ｖ）を利用した超遠心（６２，８００×ｇ，９０分間）により精製する。精製の間にウイルスをできるだけ穏和に扱い、４℃で保存することに注意すべきである。
【００９３】
以下の方法によってＨＶＪを精製する。
【００９４】
ＨＶＪ含有漿尿液（ＨＶＪ含有のニワトリ卵の漿尿液を集め４℃にて保存）の約１００ｍ１を広ロの駒込ピペットで５０ｍｌの遠心チューブ２本に入れ（Ｓａｅｋｉ，Ｙ．，およびＫａｎｅｄａ，Ｙ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ（ＨＶＪ−１ｉｐｏｓｏｍｅｓ）ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ，ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｈａｎｄｂｏｏｋ（第２版）Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ編（Ａｃａｄｃｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ）第４巻、１２７〜１３５，１９９８を参照のこと）、低速遠心機で３０００ｒｐｍ，１０分、４℃で遠心し（ブレーキはオフ）、卵の組織片を除去する。
【００９５】
遠心後、上清を３５ｍｌ遠心チューブ４本（高速遠心用）に分注し、アングルローターで２７，０００ｇ，３０分遠心する（アクセル、ブレーキはオン）。上清を除き、沈殿にＢＳＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１３７ｍＭ  ＮａＣ１、５．４ｍＭ  ＫＣ１；オートクレーブし、４℃保存）（ＢＳＳのかわりにＰＢＳでも可能）をチューブ当たり約５ｍｌ加え、そのまま４℃で一晩静置した。広ロの駒込ピペットでゆるやかにピペッテイングして沈殿をほぐし１本のチューブに集め、同様にアングルローターで２７，０００ｇ、３０分遠心する。上清をのぞき沈殿にＢＳＳ約１０ｍｌを加え、同様に４℃で一晩静置した。広ロの駒込ピペットでゆるやかにピペッテイングして沈殿をほぐし、低速遠心機で３０００ｒｐｍ，１０分、４℃で遠心し（ブレーキはオフ）、除ききれなかった組織片やウイルスの凝集塊をのぞく。上清を新しい滅菌済みチューブに入れ精製ウイルスとして４℃で保存する。
【００９６】
このウイルス液０．ｌｍｌにＢＳＳを０．９ｍｌ加え、分光光度計で５４０ｎｍの吸収を測定し、ウイルス力価を赤血球凝集活性（ＨＡＵ）に換算する。５４０ｎｍの吸収値１がほぼ１５，０００ＨＡＵに相当した。ＨＡＵは融合活性とほぼ比例すると考えられる。また実際にニワトリ赤血球液（０．５％）を用いて、赤血球凝集活性を測定してもよい（動物細胞利用実用化マニュアル、ＲＥＡＬＩＺＥ  ＩＮＣ．（内田、大石、古沢編集）Ｐ２５９〜２６８、１９８４を参照のこと）。
【００９７】
さらにショ糖密度勾配を用いたＨＶＪの精製も必要に応じて行い得る。具体的には、ウイルス懸濁液を６０％、３０％のショ糖溶液（オートクレーブ滅菌）を重層した遠心チューブにのせ、６２，８００×ｇで１２０分間密度勾配遠心を行う。遠心後、６０％ショ糖溶液層上にみられるバンドを回収する。回収したウイルス懸濁液をＢＳＳもしくはＰＢＳを外液として４℃で透析を一晩行い、ショ糖を除去する。すぐに使用しない場合は、ウイルス懸濁液にグリセロール（オートクレーブ滅菌）と０．５Ｍ  ＥＤＴＡ液（オートクレーブ滅菌）をそれぞれ最終濃度が１０％と２〜１０ｍＭになるように加えて−８０℃で穏やかに凍結し、最終的に液体窒素中で保存する（凍結保存はグリセロ一ルと０．５Ｍ  ＥＤＴＡ液の代わりに１０ｍＭ  ＤＭＳＯでも可能）。
（２．２：カラムおよび限外濾過による精製方法）
遠心分離による精製方法に代えて、カラムによるＨＶＪの精製も本発明に適用可能である。
【００９８】
手短には、分子量カットオフが５０，０００のフィルターによる限外濾過による濃縮（約１０倍）とイオン交換クロマトグラフィー（０．３Ｍ〜ｌＭ  ＮａＣｌ）による溶出を用いて精製する。
【００９９】
具体的には、本実施例において、以下の方法を使用して、ＨＶＪをカラムによって精製する。
【０１００】
漿尿液を採集した後、８０μｍ〜１０μｍのメンブランフィルターにてろ過した。０．００６〜０．００８％  β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）（最終濃度）を漿尿液に加え（４℃、１時間）、ＨＶＪを不活性化する。漿尿液を３７℃、２時間インキュベートすることによって、ＢＰＬを不活性化する。
【０１０１】
５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｎｅｅｄｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法により約１０倍濃縮する。緩衝液として、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２％マンニトール、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ７．５）を用いる。ＨＡＵアッセイにより、ほぼ１００％のＨＶＪ回収率であり優れた結果がえられる。
【０１０２】
ＱＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（アマシャムファルマシアバイオテクＫＫ、Ｔｏｋｙｏ）によるカラムクロマトグラフィー法（緩衝液：２０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２〜１Ｍ  ＮａＣｌ）でＨＶＪを精製する。一般に、回収率は４０〜５０％であり、純度は９９％以上である。
【０１０３】
５００ＫＭＷＣＯ（Ａ／Ｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたタンジェンシャルフロー限外ろ過法によりＨＶＪの画分を濃縮する。
【０１０４】
（３：ＨＶＪの不活性化）
ＨＶＪの不活性化が必要な場合、以下に記載するように、紫外線照射またはアルキル化剤処理により行う。
【０１０５】
（３．１：紫外線照射法）
ＨＶＪ懸濁液１ｍｌを３０ｍｍ径のシャーレにとり、９９または１９８ミリジュール／ｃｍ２を照射した。ガンマー線照射も利用可能である（５〜２０グレイ）が完全な不活性化がおこらない。
【０１０６】
（３．２：アルキル化剤による処理）
使用直前に、１０ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ中に０．０１％  β−プロピオラクトンの調製をした。作業中は低温下に保ち素早く作業を行う。
【０１０７】
精製直後のＨＶＪの懸濁液に最終０．０１％になるようにβ−プロピオラクトンを添加し、氷上で６０分間でインキュベートした。その後２時間、３７℃でインキュベートする。エッペンドルフチューブにチューブあたり１０，０００ＨＡＵ分ずつ分注し、１５，０００ｒｐｍ，１５分遠心し、沈殿を−２０℃で保存する。上記の不活性化法によらず、沈殿を−２０℃で保存せず、そのまま界面活性剤処理によりＤＮＡを取り込ませ、ベクターを作成することも可能である。
【０１０８】
（４：ＨＶＪエンベロープベクターの作成）
保存してあったＨＶＪに外来ＤＮＡ２００〜８００μｇを含む溶液９２μｌを加えてピペッティングでよく懸濁する。この溶液は、−２０℃で、少なくとも、３ヶ月保存可能である。ＨＶＪとの混合前にＤＮＡに硫酸プロタミンを添加すると、発現効率が２倍以上増強する。
【０１０９】
この混合液を氷上に１分間置き、オクチルグルコシド（１０％）を８μｌ加えて１５秒氷上でチューブを振盪し、４５秒氷上に静置した。界面活性剤での処理時間は、１〜５分間が好ましい。オクチルグルコシド以外に、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸）、ＮＰ−４０（ノニルフェノキシポリエトキシエタノール）などの界面活性剤も使用し得る。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ＮＰ−４０およびＣＨＡＰＳの好ましい最終濃度は、それぞれ、０．２４〜０．８０％、０．０４〜０．１２％および１．２〜２．０％である。
【０１１０】
冷ＢＳＳを１ｍｌ添加し、すぐに１５，０００ｒｐｍで１５分遠心した。生じた沈殿にＰＢＳまたは生理食塩水などを３００μｌ加えて、ボルテックス、ピペッティングで懸濁する。懸濁液は直接遺伝子導入に使用することも、−２０℃で保存後に遺伝子導入に使用することも可能である。このＨＶＪエンベロープベクターは、少なくとも２ヶ月間の保存後、同程度の遺伝子導入効率を維持し得る。
【０１１１】
（遺伝子治療）
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０１１２】
遺伝子治療に使用される核酸構築物は、周知の遺伝子導入ベクターを用いて局所的にまたは全身的にのいずれかで投与され得る。そのような核酸構築物がタンパク質のコード配列を包含する場合、そのタンパク質の発現は、内因性の哺乳類のプロモーターまたは異種のプロモーターの使用により誘導され得る。コード配列の発現は、構成的であり得るか、または調節され得る。
【０１１３】
種々の周知の遺伝子導入ベクターを遺伝子治療のための組成物として使用する場合、ベクターの投与は、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）または生理食塩水などに懸濁したベクター懸濁液の局所（例えば、癌組織内、肝臓内、筋肉内および脳内など）への直接注入か、または血管内（例えば、動脈内、静脈内および門脈内）への投与によりなされる。
【０１１４】
１つの実施態様において、遺伝子導入ベクターは、一般には、この遺伝子導入ベクターを単位用量注入可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で、薬学的に受容可能なキャリア（すなわち、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そして処方物の他の成分と適合性であるもの）とを混合することによって処方され得る。例えば、処方物は、好ましくは、酸化剤および遺伝子導入ベクターにとって有害であることが公知である他の化合物を含まない。
【０１１５】
キャリアは、等張性および化学的安定性を増強する物質のような微量の添加物を適宜含む。このような物質は、使用された投薬量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、コハク酸、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、またはイムノグロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニン）；単糖、二糖および他の炭水化物（セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；対イオン（例えば、ナトリウム）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート、ポロキサマー）、またはＰＥＧを含み得る。
【０１１６】
遺伝子導入ベクターを含む薬学的組成物は、代表的には、単位または多用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルにおいて、水溶液として貯蔵され得る。
【０１１７】
遺伝子導入ベクターを含む薬学的組成物は医療実施基準（ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）に一致した様式で、個々の患者の臨床状態（例えば、予防または処置されるべき状態）、遺伝子導入ベクターを含む組成物の送達部位、標的組織、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮しつつ処方され、そして投与される。
【０１１８】
例えば、マウスにＨＶＪ（センダイウイルス）遺伝子ベクターを投与する場合、マウス一匹あたり、２０〜２０，０００ＨＡＵ相当の、好ましくは６０〜６，０００ＨＡＵ相当の、より好ましくは２００〜２，０００ＨＡＵ相当の遺伝子ベクターが投与される。投与される遺伝子ベクター中に含有される外来遺伝子の量は、マウス一匹あたり、０．１〜１００μｇ、好ましくは０．３〜３０μｇ、より好ましくは１〜１０μｇである。
【０１１９】
また、ヒトににＨＶＪ（センダイウイルス）遺伝子ベクターを投与する場合、被験体あたり、４００〜４００，０００ＨＡＵ相当の、好ましくは１，２００〜１２０，０００ＨＡＵ相当の、より好ましくは４，０００〜４０，０００ＨＡＵ相当の遺伝子ベクターが投与される。投与される遺伝子ベクター中に含有される外来遺伝子の量は、被験体あたり、２〜２，０００μｇ、好ましくは６〜６００μｇ、より好ましくは２０〜２００μｇである。
【０１２０】
（一般的手法）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法、糖鎖科学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ＮＹ，１０１５８（２０００）；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ  ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２３０、２４２、２４７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１２１】
（処方）
本発明はまた、有効量の治療剤の被験体への投与による、疾患または障害（例えば、感染症）の処置および／または予防の方法を提供する。治療剤は、薬学的に受容可能なキャリア型（例えば、滅菌キャリア）と組み合せた、本発明の組成物を意味する。
【０１２２】
治療剤を、個々の患者の臨床状態（特に、治療剤単独処置の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画および当業者に公知の他の因子を考慮に入れ、医療実施基準（ＧＭＰ＝ｇｏｏｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）を遵守する方式で処方および投薬する。従って、本明細書において目的とする「有効量」は、このような考慮を行って決定される。
【０１２３】
一般的提案として、用量当り、非経口的に投与される治療剤の合計薬学的有効量は、患者体重の、約１μｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあるが、上記のようにこれは治療的裁量に委ねられる。さらに好ましくは、本発明の細胞生理活性物質について、この用量は、少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくはヒトに対して約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日と約１ｍｇ／ｋｇ／日との間である。連続投与する場合、代表的には、治療剤を約１μｇ／ｋｇ／時間〜約５０μｇ／ｋｇ／時間の投薬速度で１日に１〜４回の注射かまたは連続皮下注入（例えばミニポンプを用いる）のいずれかにより投与する。静脈内用バッグ溶液もまた使用し得る。変化を観察するために必要な処置期間および応答が生じる処置後の間隔は、所望の効果に応じて変化するようである。
【０１２４】
治療剤を、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与し得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の処方補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０１２５】
本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療剤の適切な例は、経口的、直腸内、非経口的、槽内（ｉｎｔｒａｃｉｓｔｅｍａｌｌｙ）、膣内、腹腔内、局所的（粉剤、軟膏、ゲル、点滴剤、または経皮パッチによるなど）、口内あるいは経口または鼻腔スプレーとして投与され得る。「薬学的に受容可能なキャリア」とは、非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、被包材または任意の型の処方補助剤をいう。本明細書で用いる用語「非経口的」とは、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内の注射および注入を含む投与の様式をいう。
【０１２６】
本発明の治療剤はまた、徐放性システムにより適切に投与される。徐放性治療剤の適切な例は、適切なポリマー物質（例えば、成形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透過性ポリマーマトリックス）、適切な疎水性物質（例えば、許容品質油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、および貧可溶性誘導体（例えば、貧可溶性塩）を包含する。
【０１２７】
徐放性マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：  １６７−２７７（１９８１）、およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、同書）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）が挙げられる。
【０１２８】
徐放性治療剤はまた、リポソームに包括された本発明の治療剤を包含する（一般に、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３１７−３２７頁および３５３−３６５（１９８９）を参照のこと）。治療剤を含有するリポソームは、それ自体が公知である方法により調製され得る：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出  願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号ならびにＥＰ第１０２，３２４号。通常、リポソームは、小さな（約２００〜８００Å）ユニラメラ型であり、そこでは、脂質含有量は、約３０モル％コレステロールよりも多く、選択された割合が、最適治療剤のために調整される。
【０１２９】
なおさらなる実施態様において、本発明の治療剤は、ポンプにより送達される（Ｌａｎｇｅｒ、前出；Ｓｅｆｔｏｎ、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照のこと）。
【０１３０】
他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））による総説において議論される。
【０１３１】
非経口投与のために、１つの実施態様において、一般に、治療剤は、それを所望の程度の純度で、薬学的に受容可能なキャリア、すなわち用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、かつ処方物の他の成分と適合するものと、単位投薬量の注射可能な形態（溶液、懸濁液または乳濁液）で混合することにより処方される。例えば、この処方物は、好ましくは、酸化、および治療剤に対して有害であることが知られている他の化合物を含まない。
【０１３２】
一般に、治療剤を液体キャリアまたは微細分割固体キャリアあるいはその両方と均一および緊密に接触させて処方物を調製する。次に、必要であれば、生成物を所望の処方物に成形する。好ましくは、キャリアは、非経口的キャリア、より好ましくはレシピエントの血液と等張である溶液である。このようなキャリアビヒクルの例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液が挙げられる。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性ビヒクルもまた、リポソームと同様に本明細書において有用である。
【０１３３】
キャリアは、等張性および化学安定性を高める物質のような微量の添加剤を適切に含有する。このような物質は、用いる投薬量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、このような物質としては、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸および他の有機酸またはその塩類のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド（例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースまたはその誘導体、ブドウ糖、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような対イオン；および／またはポリソルベート、ポロキサマーもしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１３４】
治療剤は、代表的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、約３〜８のｐＨで、このようなビヒクル中に処方される。前記の特定の賦形剤、キャリアまたは安定化剤を使用することにより、塩が形成されることが理解される。
【０１３５】
治療的投与に用いられるべき任意の薬剤は、有効成分としてのウイルス以外の生物・ウイルスを含まない状態、すなわち、無菌状態であり得る。滅菌濾過膜（例えば０．２ミクロンメンブレン）で濾過することにより無菌状態は容易に達成される。一般に、治療剤は、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下用注射針で穿刺可能なストッパー付の静脈内用溶液バッグまたはバイアルに配置される。
【０１３６】
治療剤は、通常、単位用量または複数用量容器、例えば、密封アンプルまたはバイアルに、水溶液または再構成するための凍結乾燥処方物として貯蔵される。凍結乾燥処方物の例として、１０ｍｌのバイアルに、滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）治療剤水溶液５ｍｌを充填し、そして得られる混合物を凍結乾燥する。凍結乾燥した治療剤を、注射用静菌水を用いて再構成して注入溶液を調製する。
【０１３７】
本発明はまた、本発明の治療剤の１つ以上の成分を満たした一つ以上の容器を備える薬学的パックまたはキットを提供する。医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関が定めた形式の通知が、このような容器に付属し得、この通知は、ヒトへの投与に対する製造、使用または販売に関する政府機関による承認を表す。さらに、治療剤を他の治療用化合物と組み合わせて使用し得る。
【０１３８】
本発明の治療剤は、単独または他の治療剤と組合わせて投与され得る。組合わせは、例えば、混合物として同時に；同時にまたは並行してだが別々に；あるいは経時的のいずれかで投与され得る。これは、組み合わされた薬剤が、治療用混合物として共に投与されるという提示、およびまた、組み合わされた薬剤が、別々にしかし同時に、例えば、同じ個体に別々の静脈ラインを通じて投与される手順を含む。「組み合わせて」の投与は、一番目、続いて二番目に与えられる化合物または薬剤のうち１つの別々の投与をさらに含む。
【０１３９】
特定の実施態様において、本発明の薬学的組成物は、非ステロイド性消炎鎮痛薬および／または麻薬との組み合わせで投与される。
【０１４０】
さらなる実施態様において、本発明の治療剤は、単独または抗炎症剤と組合わせて投与される。本発明の治療剤とともに投与され得る抗炎症剤としては、グルココルチコイドおよび非ステロイド抗炎症剤、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリール酪酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン（ａｍｉｘｅｔｒｉｎｅ）、ベンダザック、ベンジドアミン、ブコローム、ジフェンピラミド、ジタゾール、エモル  ファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン、オキサセプロール、パラニリン、ペリゾキサル、ピフオキシム、プロキアゾン、プロキサゾール、およびテニダップが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４１】
さらなる実施形態において、本発明の治療剤は、他の治療レジメまたは予防レジメ（例えば、放射線治療）と組合わせて投与される。
【０１４２】
以下に実施例等により本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【０１４３】
（実施例１：オンコスタチンＭ−／−マウスにおけるニューロンの発生および疼痛挙動）
（組織の調製）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ種のマウス胚（１１．５日目、１４．５日目、および１７．５日目の胚）、雌性新生児マウス（０日齢、７日齢、および１４日齢）、および雌性成体マウス（８週齢）を用いた（Ｎｉｈｏｎ  ＳＬＣ、浜松市）。胚を帝王切開によって取り出し、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を含む氷冷した０．１Ｍのリン酸緩衝液（ＰＢ）に浸漬し、４℃で一晩放置した。新生児マウスおよび成体マウスを、氷冷０．８５％ＮａＣｌで心臓から灌流した。その後、免疫組織染色化学染色をする場合には、氷冷Ｚａｍｂｏｎｉ固定液（２％  ＰＦＡ、０．１Ｍ  ＰＢ中の０．２％ピクリン酸、ｐＨ７．４）で灌流し、インサイチュハイブリダイゼーションをする場合には、０．１Ｍリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％ＰＦＡを用いて灌流した。すべての灌流による固定化は、ジエチルエーテルによる深い麻酔を行ったマウスを用いて行った。ＤＲＧ（Ｌ４／Ｌ５）および脊髄を迅速に取り出し、その後、４℃で３時間、後固定し、最後に０．１Ｍ  ＰＢＳ中の２０％スクロースを用いて灌流した。組織をＯ．Ｃ．Ｔ．培地（Ｍｉｌｅｓ社、Ｅｌｋｈａｒｔ、米国インディアナ州）に包埋し、そしてドライアイス上のｎ−ヘキサン内で迅速に凍結して、−８０℃で保存した。
【０１４４】
全ての動物実験は、和歌山県立医科大学の動物実験ガイドラインおよび日本国政府の動物飼育に関する通達に従い、和歌山県立医科大学動物実験委員会の管理のもとで行った。全ての実験は、使用する動物数および動物が受ける苦痛を最小限にするように行われた。
【０１４５】
（ＲＮＡプローブの調製）
マウス由来のオンコスタチンＭレセプターβ鎖遺伝子の２７５ｂｐのＡｓｐ７１８−ＸｈｏＩ  ｃＤＮＡフラグメント（コード領域）を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ＋（−）ベクターに連結した。アンチセンスプローブを調製するために、この連結したベクターを、Ａｓｐ７１８で切断した。センスプローブを調製するために、この連結したベクターを、ＸｈｏＩで切断した。アンチセンスプローブの調製のためにはＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用い、インビトロでの転写を行った。センスプローブの調製のためにはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用い、インビトロでの転写を行った。プローブ調製の際には、［α−３５Ｓ］ＵＴＰを放射性標識のために用いた。
【０１４６】
（インサイチュハイブリダイゼーション分析）
インサイチュハイブリダイゼーションを、Ｔａｍｕｒａら、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １１５：１２７−１３１（２００２）；Ｔａｍｕｒａら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １１９（２００３）９９１−９９７に記載のように行った。簡単にその実験を以下に記載する。
【０１４７】
凍結した切片をクリオスタットを用いて６μｍの厚さに切断した。センスおよびアンチセンスの３５Ｓ−標識したｃＲＮＡプローブを用いて、５５℃で１６時間ハイブリダイゼーションした後、スライドをＫｏｄａｋ  ＮＴＢ−２液体エマルジョン（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、米国ニューヨーク州）に浸漬した。浸漬したオートラジオグラムを、１４日後に現像し、固定した。切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて対比染色し、そして明視野顕微鏡および暗視野顕微鏡（ＸＦ−ＷＦＬ、ニコン、東京）を用いて観察した。
【０１４８】
（免疫組織化学的手法）
免疫組織化学染色を、Ｔａｍｕｒａら、Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  １１５：１２７−１３１（２００２）；Ｔａｍｕｒａら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １１９（２００３）９９１−９９７に記載のように行った。スライドにマウントした、ＤＲＧ（Ｌ４／Ｌ５）由来の６μｍのクリオスタット組織切片、およびマウス脊髄の２０μｍ切片を、免疫組織化学的手法によって処理した。切片を、１０％の健常なロバ血清を含む０．１ＭのＰＢＳ中で、室温（ＲＴ）にて１時間、プレインキュベーションを行い、次に、一次抗体溶液（０．５％
ウシ胎児血清アルブミン（ＢＳＡ）、および０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む溶液）中で、４℃で一晩インキュベートした。一次抗体を、以下の希釈で使用した；ヤギ抗オンコスタチンＭレセプターβ鎖抗体  １：５０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、米国カリフォルニア州）；ウサギ抗ＶＲ１抗体  １：５００（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、米国カリフォルニア州）；ウサギ抗ＣＧＲＰ抗体  １：１０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、米国イリノイ州）；ウサギ抗ＴｒｋＡ抗体  １：１００（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ、米国ニューヨーク州）；ウサギ抗ｃ−Ｒｅｔ抗体  １：１００（Ｔａｍｕｒａら、Ｔａｍｕｒａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７：２２８７−２２９８（２００３））；モルモット抗Ｐ２Ｘ３抗体  １：１０００（Ｎｅｕｒｏｍｉｃｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、米国ニューヨーク州）。翌日、切片を、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む０．１Ｍ  ＰＢＳで洗浄し、そしてＣｙ２−／Ｃｙ３−結合体化二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、米国ペンシルベニア州）（２％の正常なマウスの血清、および０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１：４００倍希釈した抗体）とともに、室温で１時間インキュベートした。アビジン−ビオチン複合体法のために、一次血清とのインキュベーションの後、切片を、ビオチン化したロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ
ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社；０．５％  ＢＳＡおよび０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液中で１：４００に希釈して使用）とともに、室温で１時間インキュベートした。０．１Ｍ  ＰＢＳで洗浄した後、切片を７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸結合体化ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社；０．１Ｍ  ＰＢＳ中）とともに室温で１時間インキュベートした。免疫蛍光イメージを、Ｎｉｋｏｎ  ＶＦＭ顕微鏡を、蛍光アッタチメントを用いて、得た。
【０１４９】
（定量アッセイ）
立体解析学的な細胞計数のために、４匹の灌流したマウス由来のＬ４／Ｌ５  ＤＲＧを、プールし、そして切片化のために処理した。ＤＲＧ全体を、６μｍの連続切片とし、そしてＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、Ｅｕｇｅｎｅ、米国オレゴン州）を１：５００に希釈したものを用いて２０分間、または４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリドを用いて５分間、二次抗体とのインキュベーション後に、核染色のために染色した。染色後、各切片のカラーデジタル化イメージを、カラー３ＣＣＤカメラ（Ｃ５８１０、浜松フォトニクス、浜松市）を備えたエピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｅ８００、Ｎｉｋｏｎ）を用いて得た。蛍光標識した細胞の数を、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェア（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、米国カリフォルニア州）を用いて、観察者−ブラインド条件下で計数した。
【０１５０】
脊髄神経節（ＤＲＧ）ニューロン全体について、およびＶＲ１標識ニューロンまたはＰ２Ｘ３標識ニューロン全体について、ＮｅｕｒｏＴｒａｃｅを用いて偏りのない推定値を得るために、物理的解剖器具の原理を用いて、切片内のニューロンを計数した（Ｃｏｇｇｅｓｈａｌｌ、（１９９２）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：９−１３）。手短には、各ＤＲＧにおいて、隣接する切片の対を比較した（参照切片、および索引切片）。この切片の測定した領域内において、参照切片内に、明確に可視的な核（単一の核および複数の核）を有するニューロンのみを計数し、次にニューロンの密度［細胞数／（測定された面積×切片の厚さ）］を計算した。各ＤＲＧについて、１から１０の間のランダムに選択した切片から開始して、１０番目毎の切片を分析した。
【０１５１】
ニューロンによって覆われる断面積を、ＤＲＧについて測定し（ＮＩＨイメージ、バージョン１．６１）、ニューロンによって占められる各神経節の容積（μｍ３×１０６）を測定した面積、切片の厚さ、および各神経節を含む切片の総数から推定した。次に、ＤＲＧ内の、ＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ染色したニューロンの総数、およびＶＲ１標識ニューロンまたはＰ２Ｘ３標識ニューロンの数を、総ＤＲＧ容量にニューロンの密度を掛けることによって、決定した（Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎら、Ａｃｔａ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｃａｎｄ．９６：３７９−３９４）。
【０１５２】
細胞のサイズを測定するために、コンピュータのマウスを用いて手動で細胞の輪郭を描き、そして輪郭を描いた細胞のプロファイルの断面積をＮＩＨイメージ（１．６１）を用いて定量した。次に、サイズ−頻度のヒストグラムを計数したニューロンから作成した。示される値は、平均±標準誤差である。全ての統計学的分析を、スチューデントのｔ−検定を用いて行った。ｐ＜０．０５の場合に有意であるとした。
【０１５３】
（オンコスタチンＭ遺伝子座のジーンターゲッティング）
マウスオンコスタチンＭ  ｃＤＮＡにハイブリダイズするゲノムクローンを、λファージ１２９／Ｓｖマウスゲノムライブラリーから得て、そのクローンを、ＢａｍＨＩ、ＭｂｏＩ、ＢｇｌＩＩ、またはＳａｕ３ＡＩを用いて部分消化した。ターゲッティングベクターを、選択した１５．８ｋｂクローン（マウスオンコスタチンＭ遺伝子座全体を含む）をｐＪＭＭ４プラスミド（ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターによって駆動されるネオマイシン耐性カセットを含む）中にクローニングすることによって構築した。ジーンターゲッティング用のベクターを、内在性のエクソンＩＩおよびエクソンＩＩＩのコード領域、ならびに介在するイントロンを、ＰＧＫＮｅｏ遺伝子で置換し、診断用のＸｂａＩ部位およびＳｐｈＩ部位をゲノムの遺伝子座に導入するように、設計した。
【０１５４】
サザン分析および／またはＰＣＲを用いて、後代の遺伝子型決定を行った。サザン分析のために、ゲノムＤＮＡをＳｐｈＩを用いて消化し、そして５’外部プローブ（６００ｂｐ長）を用いてハイブリダイズした。野生型対立遺伝子を、９ｋｂのバンドとして検出した。一方、変異型対立遺伝子は、７ｋｂのバンドを生じた。ＰＣＲによる遺伝子型決定のために、２セットのプライマーを、同一の反応混合物中で使用した。野生型オンコスタチンＭ遺伝子座の４２０ｂｐのフラグメントを増幅するために、プライマーＯＳＭｓ（ＣＡＡ  ＧＧＧ  ＡＡＣ  ＣＣＧ  ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＣＴＧ：配列番号１６）およびプライマーＯＳＭａ（ＴＧＡ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＴＴＧ  ＴＧＴ  ＣＡＴ  ＣＡＧ：配列番号１７）を使用した。５８５ｂｐのフラグメントをターゲッティングされた遺伝子座内のＮｅｏ遺伝子より増幅するために、プライマーＮＥＯｓ（ＧＡＡ  ＣＡＡ  ＧＡＴ  ＧＧＡ  ＴＴＧ  ＣＡＣ  ＧＣＡ  Ｇ：配列番号１８）、およびプライマーＮＥＯａ（ＣＣＡ  ＴＧＡ  ＴＡＴ  ＴＣＧ  ＧＣＡ  ＡＧＣ  ＡＧ：配列番号１９）を使用した。ＰＣＲ条件は、９５℃  ２分間、ならびに９４℃  ３０秒間、５９℃  １分間、および７２℃  １分間を３０サイクル、そして７２℃  １０分間の伸長であった。
【０１５５】
ＯＳＭ＋／−雄性マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６雌性マウスに対して、少なくとも６世代戻し交配し、オンコスタチンＭ欠損マウスを、ほとんど同遺伝子系のバックグラウンドとした。ヘテロ接合異種交配によって生じたＯＳＭ＋／＋およびＯＳＭ−／−同腹子マウスを、全ての実験に使用した。
【０１５６】
（行動試験）
これらの実験は、和歌山県立医科大学動物実験委員会の認可を得て行った。
【０１５７】
化学的疼痛は、カプサイシン、α，β−メチレンＡＴＰ（αβ−ｍｅＡＴＰ）、およびホルマリン試験によって評価した（ＤｉｃｋｅｎｓｏｎおよびＳｕｌｌｉｖａｎ、（１９８７）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．８３：２０７−２１１；Ｃａｏら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：３９０−３９４）；Ｃａｔｅｒｉｎａら、（２０００）Ｓｃｉｅｃｎｃｅ  ２８８：３０６−３１３；Ｔｓｕｄａら、（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１５：１４４４−１４５０）。試験の前４日間、毎日２時間、マウスを試験プラットホームに順化させた。試験を行なう日、マウスを１時間、試験プラットホームに配置し、その後各試験において、１０μｌのカプサイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１０ｍｌの生理食塩水／１０％  エタノール／０．５  Ｔｗｅｅｎ  ８０中に１〜５ｍｇ）、１０μｌのαβ−ｍｅＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１０μｍｏｌ／ｌ）、および１０μｌの５％ホルマリンを、左足の足底表面に投与した。注入された足を舐めるか、または持ち上げるかのいずれかの時間を記録した。ホットプレートアッセイ（Ｃａｏら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：３９０−３９４；Ｃａｔｅｒｉｎａら、（２０００）Ｓｃｉｅｃｎｃｅ  ２８８：３０６−３１３）において、マウスを、最初に４５℃に設定したホットプレート装置に２分間慣らせた。その後、マウスをホットプレート（４８℃〜５８℃）上に配置し、そして後足を舐めるまで、またはジャンプするまでの応答潜伏時間を記録した。５２℃のホットプレートについてカットオフ時間は６０秒であり、５８℃のホットプレートについてカットオフ時間は３０秒であった。機械的な感度を、尾部ピンチ試験（ｔａｉｌ  ｐｉｎｃｈ  ｔｅｓｔ）（Ｃａｏら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：３９０−３９４）によって評価した。本発明者らは、激しい機械的刺激に対する応答の潜伏時間を、尾部に適用したクリップによって測定した。内臓の刺激に対する応答を、０．６％酢酸（５ｍｌ／ｋｇ）（炎症を伴う内蔵の疼痛）、またはＭｇＳＯ４（１２０ｍｇ／ｋｇ）（炎症を伴わない内臓の疼痛）の腹腔内注入後の腹部伸展の数として評価した。伸展応答の頻度を、酢酸について２０分間、ＭｇＳＯ４について５分間計数した。運動機能を、ローターロッドトレッドミル（Ｕｇｏ  Ｂａｓｉｌｅ、Ｃｏｍｅｒｉｏ、Ｉｔａｌｙ）を用いて評価した。最初に、マウスを、４ｒｐｍのスピードで３分間、回転するロッドの上を歩くように訓練した。試験のために、スピードを４ｒｐｍに設定し、その後、４０ｒｐｍに加速した。加速開始後、マウスが落ちるまでの時間を記録した。
【０１５８】
（結果）
（ＤＲＧニューロンの発生におけるオンコスタチンＭレセプターβ鎖の発現パターン）
ＤＲＧニューロンの発生におけるオンコスタチンＭレセプターβ鎖の発現パターンを試験するために、発生段階（１４．５日目の胚〜出生後１４日）の少数のＤＲＧを用いてハイブリダイゼーションを行って、オンコスタチンＭレセプターβ鎖のｍＲＮＡのニューロンおける発現を同定した。オンコスタチンＭレセプターβ鎖のｍＲＮＡは、胚の段階でのＤＲＧでは、いずれの細胞においても発現していなかった（データ示さず）。オンコスタチンＭレセプターβ鎖のｍＲＮＡは、出生後１０日目において初めて、少数の細胞において検出され、少しずつ増加し、そして出生後１４日目において、成体での発現レベルに達する（図１）。
【０１５９】
（成体オンコスタチンＭ−／−マウスにおける疼痛ＤＲＧニューロンの減少）
マウスＤＲＧの発生におけるオンコスタチンＭの役割を見出すために、本発明者らは、オンコスタチンＭ欠損マウスを用いた。オンコスタチンＭ−／−マウス（ＯＳＭ−／−マウスとも記載する）は、正常に発生し、そして、その発生の間のいかなる時点においても、マウスの大きさ、または体重に関して、＋／＋同腹子または＋／−同腹子を区別することができなかった（データ示さず）。成体マウスにおいて、総ＤＲＧニューロンのおよそ１３％がオンコスタチンＭレセプターβ鎖陽性の小型ニューロンであり、この小サイズニューロンは、ＶＲ１およびＰ２Ｘ３を発現した。感覚ニューロンマーカーについての免疫組織化学染色は、ＶＲ１陽性（ＯＳＭ＋／＋、４６．８±１．４％；ＯＳＭ−／−、２４．０±１．０％；ｐ＜０．００１）ＤＲＧニューロン、およびＰ２Ｘ３陽性（ＯＳＭ＋／＋、５６．３±０．９％；ＯＳＭ−／−、４６．５±１．２％；ｐ＜０．００１）ＤＲＧニューロンが、成体のオンコスタチンＭ−／−のＤＲＧにおいて、有意に減少したことを示した（図２）。ＴｒｋＡ陽性ニューロンおよびｃ−Ｒｅｔ陽性ニューロンについては、優位な変化が観察されなかった。ＣＧＲＰ陽性ＤＲＧニューロンの変化もまた、成体オンコスタチンＭ−／−マウスにおいて観察されなかった（図２）。さらに、総ニューロン、ＶＲ１陽性ニューロン、およびＰ２Ｘ３陽性ニューロンのサイズ−頻度分析は、オンコスタチンＭ−／−マウスのＤＲＧにおけるＶＲ１およびＰ２Ｘ３を発現する小サイズニューロンの減少を示した（図３）。
【０１６０】
全てのオンコスタチンＭレセプターβ鎖陽性ニューロンは、ＶＲ１／Ｐ２Ｘ３陽性であった。ＶＲ１およびＰ２Ｘ３二重免疫蛍光染色によって、オンコスタチンＭ−／−マウス内のＤＲＧにおけるＶＲ１／Ｐ２Ｘ３二重陽性ニューロンの有意な減少が明らかとなった（図４、矢印；ＯＳＭ＋／＋、２６．４±１．８％；ＯＳＭ−／−、７．８±１．３％；ｐ＜０．０１）。さらに、オンコスタチンＭレセプターβ鎖陽性ＤＲＧニューロンもまた、オンコスタチンＭ−／−マウスにおいて減少していた（ＯＳＭ＋／＋、１５．２±１．８％；ＯＳＭ−／−、７．６±０．６％；ｐ＜０．０３）。このことは、ＶＲ１／Ｐ２Ｘ３／オンコスタチンＭレセプターβ鎖三重陽性ニューロンの減少を示す。
【０１６１】
成体オンコスタチンＭ−／−マウスの、腰椎脊髄において、ＶＲ１およびＰ２Ｘ３がどの層に局在するのかを決定するために、本発明者らは、ＶＲ１およびＰ２Ｘ３についての二重−免疫蛍光染色を行った。ＶＲ１（図５、緑色）およびＰ２Ｘ３（図５、赤色）を発現する一次求心性線維は、それぞれ、Ｉ層−ＩＩ層内、およびＩＩ層の内部（ＩＩｉ層）に分布することが公知である。図５に示すように、オンコスタチンＭ−／−マウスの脊髄のＩＩｉ層内において、ＶＲ１／Ｐ２Ｘ３二重陽性繊維はほとんど検出できなかった（黄色）。これは、オンコスタチンＭ＋／＋マウスの脊髄のＩＩｉ層内においてＶＲ１／Ｐ２Ｘ３二重陽性繊維が検出されたことと、対照的である。
【０１６２】
（成体オンコスタチンＭ−／−マウスにおける疼痛感受性の欠損）
オンコスタチンＭ−／−マウスは、運動の共調における欠陥を、全く示さなかった。ローターロッド試験を用いた保持時間は、オンコスタチンＭ＋／＋マウス（ＯＳＭ＋／＋マウスとも記載する）について９８±．１秒であり、オンコスタチンＭ−／−マウスについては１０４±４．７秒であった（グループあたりｎ＝６）。
【０１６３】
侵害受容機能を実験的に評価するために、本発明者らは、成体オンコスタチンＭ−／−マウスについて、挙動のバッテリー試験を行った（図６）。最初に、カプサイシン、αβ−ｍｅＡＴＰ、およびホルマリンを含む化学的刺激に対する疼痛応答を評価した。なぜなら、ＶＲ１陽性ニューロンおよびＰ２Ｘ３陽性ニューロンは、図３および４に示されるように減少したからである。本発明における上記結果から予測されたように、カプサイシン刺激を行った場合、オンコスタチンＭ＋／＋マウスおよびオンコスタチンＭ＋／−マウス（ＯＳＭ＋／−マウスとも記載する）は、足を旺盛に舐めた。しかし、オンコスタチンＭ−／−マウスの場合は、カプサイシンに対する挙動の応答が、有意に減少した（図６ＡおよびＢ）。さらに、αβ−ｍｅＡＴＰ（図６Ｃ）またはホルマリン（図６Ｄ）の後足への注入によって生じた疼痛挙動（舐める）もまた、オンコスタチンＭ−／−マウスにおいて有意に減少した。
【０１６４】
次に、オンコスタチンＭ＋／＋マウスおよびオンコスタチンＭ＋／−マウスにおける熱応答挙動を比較した。なぜなら、ＶＲ１は、有害な熱についてのセンサーであることが公知であるからである（Ｃａｏら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：３９０−３９４）。急な熱刺激に対する応答の潜伏時間を、５２℃および５８℃のホットプレートを用いて測定した。５２℃および５８℃の両方において、オンコスタチンＭ−／−マウスは、オンコスタチンＭ＋／＋マウスと比較して、有意により長い応答潜伏時間を示した（図６Ｅ）。さらに、より強烈な機械的刺激（尾部のクリップ）に対する応答の潜伏時間もまた、オンコスタチンＭ−／−マウスにおいて有意に長くなっていた（図６Ｆ）。
【０１６５】
オンコスタチンＭ−／−マウスにおける疼痛応答の減少が、他の組織に対する有害な刺激の場合にも同様に生じるのか調べるために、ＭｇＳＯ４の腹腔内注射（炎症とは独立して、即時型の内臓の疼痛応答（腹部の苦悶）を生じる）および酢酸の腹腔内注射（炎症反応に対して二次的な疼痛を誘導する）による、急性の内臓疼痛挙動を評価した。オンコスタチンＭ−／−マウスは、内臓の疼痛の両試験において、野生型と比較して、腹部苦悶の数が顕著に減少した（図６ＧおよびＨ）。
【０１６６】
従って、挙動における急性侵害受容の閾値が、オンコスタチンＭの非存在によって顕著に影響を受けた。
【０１６７】
（考察）
ＬＩＦレセプターβ鎖は、神経系の種々の細胞において発現していたが、ＬＩＦ−／−マウスにおいて、神経系の発生異常は報告されていない。ＬＩＦ−／−マウスは、未分化胚芽細胞の着床異常、出生後の成長遅延、ならびに造血および胸腺細胞増殖の欠陥に起因する雌性生殖不能を示した（Ｅｓｃａｒｙら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：３６１−３６４）。オンコスタチンＭ−／−マウスにおいて、ＶＲ１／Ｐ２Ｘ３−二重陽性ニューロンが、顕著に減少した。この結果は、オンコスタチンＭのオンコスタチンＭレセプターへの結合が、ＶＲ１／Ｐ２Ｘ３−二重陽性ニューロンの正常な量の発生に必須であることを示す。従って、オンコスタチンＭのアンタゴニストを生体に投与することによっても、ＶＲ１／Ｐ２Ｘ３−二重陽性ニューロンを顕著に減少させることができる。
【０１６８】
オンコスタチンＭ欠損がＶＲ１／Ｐ２Ｘ３−二重陽性ニューロンの顕著な減少を生じる正確なメカニズムは明らかでないが、以下の可能性が考慮される。１つは、オンコスタチンＭがＶＲ１およびＰ２Ｘ３の発現を調節するという可能性である。ＤＲＧにおけるＶＲ１およびＰ２Ｘ３の発現が、抹消での炎症によって増加することが報告されている（Ｊｉら、（２００２）Ｎｅｕｒｏｎ  ３６：５７−６８；ＸｕおよびＨｕａｎｇ、（２００２）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２２：９３−１０２）。さらに、オンコスタチンＭは、局所的な炎症に関与する、活性化Ｔ細胞、マクロファージ、多形核好中球、および好酸球によって産生される（Ｍｏｄｕｒら、（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：１５８−１６８；Ｇｒｅｎｉｅｒら、（１９９９）Ｂｌｏｏｄ  ９３：１４１３−１４２１；Ｗａｌｌａｃｅら、（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２２４７−５５５５；Ｔａｍｕｒａら、（２００２）Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２２５：３２７−３３１）。これらの知見は、オンコスタチンＭが侵害受容ニューロンにおけるＶＲ１およびＰ２Ｘ３の発現を制御することを示唆する。別の可能性は、オンコスタチンＭが侵害受容ニューロンの特定の一部に対する生後の生存因子として作用し得るというものである。実際に、総ＤＲＧニューロンに対する小サイズニューロンの割合は、オンコスタチンＭ−／−マウスにおいて顕著に減少していた。なお、オンコスタチンＭ欠損がＶＲ１／Ｐ２Ｘ３−二重陽性ニューロンの顕著な減少を生じる正確なメカニズムが不明であっても、本明細書に記載される実験結果は、オンコスタチンＭのアンタゴニストを生体に投与することによって、ＶＲ１／Ｐ２Ｘ３−二重陽性ニューロンを顕著に減少させることができることを示す。
【０１６９】
組織学的結果と一致して、本明細書に記載の実験結果は、オンコスタチンＭ−／−マウスが、急性の熱疼痛、化学的疼痛、および内臓の疼痛のモデルにおいて、有害応答が顕著に減少されたことを実証した。この結果は、オンコスタチンＭが、急性疼痛に対する有害応答に必要であり、オンコスタチンＭレセプターに対するオンコスタチンＭ刺激が減少した場合に、急性疼痛に対する有害応答が顕著に減少することを示す。従って、オンコスタチンＭのアンタゴニストを含む薬剤を用いて、疼痛を処置することができる。
【０１７０】
さらに、疼痛処置効果は、オンコスタチンＭのアンタゴニストを用いてオンコスタチンＭによるオンコスタチンＭレセプターへの刺激の遮断によってもたらされるのみならず、オンコスタチンＭレセプターを発現する細胞を選択的に除去することによってももたらされる。なぜなら、オンコスタチンＭレセプターを発現する細胞を選択的に除去することは、オンコスタチンＭ刺激による生理作用をもたらさないという点で、オンコスタチンＭ−／−と同様であるからである。
【０１７１】
興味深いことに、機械的疼痛に対する応答の減少もまた、オンコスタチンＭ−／−マウスにおいて観察された。これに対して、ＶＲ１−／−マウスまたはＰ２Ｘ３−／−マウスは、機械的疼痛にたいして正常に応答した（Ｃａｔｅｒｉｎａら、（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：３０６−３１３；Ｓｏｕｓｌｏｖａら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：１０１５−１０１７）。この結果を説明する正確なメカニズムは不明であるが、この結果は、オンコスタチンＭによる刺激の減少またはオンコスタチンＭレセプター発現細胞の減少によって、機械的刺激に対する応答もまた同様に減少することができることを示す。
【０１７２】
上記の本明細書に示される結果は、有害な刺激を検出する神経経路のアセンブリの生後の段階において、オンコスタチンＭが重要な役割を担うことを示す。さらに、これらの結果は、オンコスタチンＭのアンタゴニストを、オンコスタチンＭレセプターβ鎖陽性ニューロンを標的とした鎮痛剤として用いることができることを示す。
【０１７３】
（実施例２：オンコスタチンＭアンタゴニストによる疼痛の処置）
実施例１の結果から、オンコスタチンＭアンタゴニストを用いて疼痛を処置することができることが示された。このことを確認するために、実際にマウスをオンコスタチンＭアンタゴニストを投与して、マウスにおける疼痛挙動の変化を調べる。
【０１７４】
（オンコスタチンＭアンタゴニストの調製）
本実施例において用いるオンコスタチンＭアンタゴニストとして、抗オンコスタチンＭ抗体、または抗オンコスタチンＭレセプター抗体を選択する。使用する抗体の量は、抗体の親和性に依存して変化するが、通常１〜１０００μｇ／ｍｌの濃度の抗体溶液を用いる。この抗体溶液を、リン酸緩衝生理食塩水に溶解し、５〜２０μｌをマウスの皮下または髄腔内に投与する。
【０１７５】
（オンコスタチンＭアンタゴニストによる疼痛感受性の低下）
オンコスタチンＭアンタゴニストを投与されるマウスが、運動の共調における欠陥を、全く示さないことを確認する。このことを、ローターロッド試験を用いる保持時間によって確認する。
【０１７６】
侵害受容機能を実験的に評価するために、本発明者らは、オンコスタチンＭアンタゴニスト投与マウスについて、挙動のバッテリー試験を行う。次に、オンコスタチンＭアンタゴニスト投与マウスと非投与マウスの両方において、カプサイシン、αβ−ｍｅＡＴＰ、およびホルマリンを含む化学的刺激に対する疼痛応答を評価する。本発明における上記結果から予測されるように、カプサイシン刺激を行う場合、オンコスタチンＭアンタゴニスト投与を受けないマウスは、足を旺盛に舐めるが、オンコスタチンＭアンタゴニスト投与を受けるマウスは、足を舐める頻度が低下する。このことは、オンコスタチンＭアンタゴニスト投与マウスにおいて、カプサイシンに対する挙動の応答が有意に減少することを示す。さらに、αβ−ｍｅＡＴＰまたはホルマリンを用いた場合にも、カプサイシンの場合と同様の結果が得られる。
【０１７７】
次に、オンコスタチンアンタゴニストの投与を受けるマウスと受けないマウスにおける熱応答挙動を比較する。具体的には、急な熱刺激に対する応答の潜伏時間を、５２℃および５８℃のホットプレートを用いて測定する。５２℃および５８℃の両方において、オンコスタチンＭアンタゴニストの投与を受けるマウスが、投与を受けないマウスと比較して、有意により長い応答潜伏時間を示す。さらに、より強烈な機械的刺激（尾部のクリップ）に対する応答の潜伏時間もまた、オンコスタチンＭアンタゴニストの投与を受けるマウスにおいて有意に長くなる。
【０１７８】
このことは、挙動における急性侵害受容の閾値が、オンコスタチンＭアンタゴニストの投与によって顕著に影響を受けることも示す。
【０１７９】
（実施例３：オンコスタチンＭレセプター発現細胞の選択的除去による疼痛の処置）
実施例１の結果から、オンコスタチンＭレセプター発現細胞の減少によって疼痛を処置することができることが示された。このことを確認するために、実際にマウスに遺伝子治療を行い、オンコスタチンＭレセプター発現細胞を選択的に除去し、マウスにおける疼痛挙動の変化を調べる。
【０１８０】
本実施例においては、オンコスタチンＭレセプター発現細胞を選択的に除去するために、ヒトオンコスタチンＭレセプターβ鎖遺伝子のプロモーターの下流に、細胞傷害性遺伝子であるジフテリアトキシン遺伝子を連結し、複製欠損レトロウイルスベクターに連結して組換えレトロウイルスベクターを構築し、オンコスタチンＭレセプターβ鎖を発現している細胞でその細胞障害遺伝子を特異的に発現させ、その細胞を死滅させる。
【０１８１】
（オンコスタチンＭレセプター発現細胞を選択的に除去するための遺伝子治療ベクターの構築）
細胞障害遺伝子をオンコスタチンＭレセプターβ鎖を発現する細胞において特異的に発現させるためのプロモーター領域として、配列番号１のヒトオンコスタチンＭレセプターβ鎖遺伝子プロモーター配列を用いる。このプロモーター配列と連結する細胞傷害性遺伝子として、ジフテリアトキシン遺伝子を用いる。
【０１８２】
（パッケージング細胞のトランスフェクションによる遺伝子治療ベクターの調製）
パッケージング細胞のトランスフェクションによるウイルスベクター調製の具体的手法は、例えば、「実験医学別冊、注目のバイオ実験シリーズ、必ず上手くいく遺伝子導入と発現解析プロトコール、仲嶋一範・北村義浩編、羊土社」および「実験医学別冊、改訂第４版、新遺伝子工学ハンドブック、村松正實・山本雅編、羊土社」に記載される。具体的には、以下のとおりである。
【０１８３】
パッケージング細胞として、ＰＬＡＴ−Ｅ細胞を用いる。ＰＬＡＴ−Ｅ細胞をＰＢＳによって静かに洗浄し、２ｍｌのＰＢＳ（０．１％トリプシン、１ｍＭ  ＥＤＴＡ添加）を加え、３７℃で１０分間放置する。細胞をやさしくはがし、ＤＭＥＭ（＋１０％  ＦＣＳ）溶液にサスペンジョンする。１５００ｒｐｍで５分間遠心し、細胞ペレットを丁寧にサスペンドして、６０ｍｍ培養皿に２×１０６個の細胞を播種する。１２〜１６時間後、１００μｌのＤＭＥＭに３μｇのＤＮＡとＦｕＧｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ社）９μｌを入れてよく混ぜる。室温に５分間放置後、ＤＮＡ溶液をＰＬＡ−Ｅ細胞を培養している培養皿に滴下して軽く混ぜる。２４時間の培養後、培養液を静かに交換し、さらに２４時間の培養後、上清を集め、４℃で１５００ｒｐｍ５分間遠心し、上清を再度４℃３０００ｒｐｍ５分間遠心し、その上清をウイルスストック溶液とする。
【０１８４】
（遺伝子治療ベクターの投与）
上記の遺伝子治療ベクターストックを、５〜２０ｍｌ、マウスの皮下または髄腔内に投与する。投与の１〜２週間後、実施例１に記載の行動試験と同一の試験を行う。
【０１８５】
（レトロウイルスベクターによるオンコスタチンＭレセプターβ鎖発現ニューロンの減少）
実施例１と同様の手法を用いて、オンコスタチンＭレセプターβ鎖の発現パターンを試験する。マウス脳を用いてハイブリダイゼーションを行い、オンコスタチンＭレセプターβ鎖のｍＲＮＡのニューロンおける発現を同定する。レトロウイルスベクターを導入したマウスにおいて脳全体におけるオンコスタチンＭレセプターβ鎖のｍＲＮＡが、減少する。このことは、レトロウイルスベクターの導入によって、オンコスタチンＭレセプター発現細胞が選択的に除去され、オンコスタチンＭレセプターβ鎖を発現する細胞の割合が減少することを示す。
【０１８６】
（オンコスタチンＭレセプター発現細胞の選択的除去による疼痛感受性の低下）
レトロウイルスベクターを投与されるマウスが、運動の共調における欠陥を、全く示さないことを確認する。このことを、ローターロッド試験を用いる保持時間によって確認する。
【０１８７】
侵害受容機能を実験的に評価するために、本発明者らは、レトロウイルスベクター投与マウスについて、挙動のバッテリー試験を行う。次に、レトロウイルスベクター投与マウスと非投与マウスの両方において、カプサイシン、αβ−ｍｅＡＴＰ、およびホルマリンを含む化学的刺激に対する疼痛応答を評価する。本発明における上記結果から予測されるように、カプサイシン刺激を行った場合、オンコスタチンＭアンタゴニスト投与を受けないマウスは、足を旺盛に舐めるが、オンコスタチンＭアンタゴニスト投与を受けるマウスは、足を舐める頻度が低下する。このことは、オンコスタチンＭアンタゴニスト投与マウスにおいて、カプサイシンに対する挙動の応答が有意に減少することを示す。さらに、αβ−ｍｅＡＴＰまたはホルマリンを用いた場合にも、カプサイシンの場合と同様の結果が得られる。
【０１８８】
次に、レトロウイルスベクターの投与を受けるマウスと受けないマウスにおける熱応答挙動を比較する。具体的には、急な熱刺激に対する応答の潜伏時間を、５２℃および５８℃のホットプレートを用いて測定する。５２℃および５８℃の両方において、レトロウイルスベクターの投与を受けるマウスが、投与を受けないマウスと比較して、有意により長い応答潜伏時間を示す。さらに、より強烈な機械的刺激（尾部のクリップ）に対する応答の潜伏時間もまた、レトロウイルスベクターの投与を受けるマウスにおいて有意に長くなる。
【０１８９】
このことは、挙動における急性侵害受容の閾値が、レトロウイルスベクターの投与によって顕著に影響を受けることも示す。
【０１９０】
（実施例４：オンコスタチンＭレセプター発現細胞の選択的除去による疼痛の処置）
実施例１の結果から、疼痛に関連する神経を減少することによって、疼痛を緩和・治癒することは可能であることが示された。そこで、次に、神経因性疼痛モデルマウスにおいて、疼痛に関連する神経を減少することによる処置効果を確認した。
【０１９１】
神経因性疼痛モデルマウスとして、マウスの第５腰髄神経を絹糸で結紮することにより、アロディニアを惹起する神経因性疼痛モデル（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｉｎｊｕｒｙ；  ＣＣＩモデル）を作成した。アロディニアが惹起されたときに後根神経節のニューロンに誘導されるといわれているＡＴＦ３の発現を免疫組織染色により検討した（図７、上段）。正常のＣ５７ＢＬ／６マウスでは非手術側の後根神経節のニューロンにはＡＴＦ３の発現はほとんどみられなかったが、手術側の後根神経節のニューロンには非常に多数のＡＴＦ３の発現がみられた。さらに、行動学的にアロディニアを検討するために、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験を行ったところ（図７、下段）、逃避行動を開始する際にかけられた力（グラム）が著しく減少した（左側：手術側での結果）。このことから、このモデルにより組織学的、行動学的にアロディニアが惹起されていることが確認された。
【０１９２】
次に、ＣＣＩモデルにおける脊髄での変化を検討した。ミクログリアのマーカーであるＩｂａ１に対する抗体で免疫染色を行ったところ、手術側の脊髄後角でミクログリアの増加を認め（図８、上段）、さらにオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）に対する抗体で免疫染色を行ったところ、同じく手術側の脊髄後角で染色性の増加を認めた（図８、下段）。このことから、ＣＣＩモデルでは、Ｉｂａ１およびオンコスタチンＭの発現の増加が確認された。
【０１９３】
次に、オンコスタチンＭレセプターの対立遺伝子の両方を欠損する欠損（ＯＳＭＲＫＯ）マウスでＣＣＩモデルを作成し、脊髄での変化を検討したところ、ミクログリアのマーカーであるＩｂａ１に対する抗体で免疫染色から、手術側（ＣＣＩモデル側）の脊髄後角でミクログリアの増加を認め、さらにオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）に対する抗体での免疫染色から、同じく手術側の脊髄後角で染色性の増加を認めた（図９、上段）。ところが、行動学的にアロディニアを検討するために、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験を行ったところ（図９、下段）、手術側の足底を刺激したときと非手術側の足底を刺激したときの、逃避行動を開始するのに必要な力（グラム）および逃避行動までの反応潜時には差は認められず、行動学的にアロディニアは抑制されていた。これらの事実から、オンコスタチンＭレセプター陽性ニューロンの欠損により神経因性疼痛の一種であるアロディニアが抑制されたことを示す。このことは、オンコスタチンＭレセプター陽性ニューロンを減少させることによって、神経因性疼痛を処置できることを示す。
【０１９４】
そこで、次にオンコスタチンＭレセプターの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体を作成し、抗オンコスタチンＭレセプター抗体による効果を確認した。得られた５種類の抗オンコスタチンＭレセプターラット抗体をカクテル（タンパク質量で５マイクログラム）にし、これをサポリン結合抗ラットイムノグロブリン抗体（３．６マイクログラム）と混合し、マウスの皮下に投与した。その結果、オンコスタチンＭレセプター陽性ニューロンの減少を認めた（図１０）。
【０１９５】
これらのことから、抗オンコスタチンＭレセプター抗体の投与は、オンコスタチンＭレセプター陽性ニューロンの減少をもたらし、そしてオンコスタチンＭレセプター陽性ニューロンの減少によって神経因性疼痛（アロディニア）が処置される。従って、抗オンコスタチンＭレセプター抗体によって、疼痛が処置できることが実証された。
【０１９６】
（実施例５：オンコスタチンＭの投与による疼痛の処置）
アロディニアの発症メカニズムの一つとして、後根神経節のニューロンの神経突起の脊髄での異常伸展が考えられる。この異常進展は、脊髄で本来産生されるべき神経突起の誘因物質の産生に異常が生じる結果であると考えられている。しかし、具体的に実証されてはいない。
【０１９７】
ＣＣＩモデルの脊髄においてオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）に対する抗体で免疫染色を行ったところ、手術側の脊髄後角で染色性の増加を認めた（図８、下段）ことから、アロディニアの発症メカニズムに関与する神経突起の誘因物質のひとつがオンコスタチンＭである可能性が推定された。オンコスタチンＭが神経突起の誘引物質であるならば、オンコスタチンＭによって、神経突起の発芽の制御（例えば、抑制）が可能となる。この抑制のための方法として髄腔内にオンコスタチンＭの中和抗体を注入するか、後根神経節のニューロンの神経突起の末梢側に高濃度のオンコスタチンＭを注入し、末梢側でのオンコスタチンＭの濃度を上げるということが想定される。前者が比較的一般であるが、臨床応用を考えたとき、患者への侵襲がおおきいという点もある。そこで、ＣＣＩモデル作成３日後に、高濃度のオンコスタチンＭ（２５０マイクログラム／１０マイクロリッター）をマウスの坐骨神経周辺の筋肉内に注射した。その結果、注射の２日後にはアロディニアが抑制されていた（図１１）。この結果は、本発明以前には、全く予測され得なかったものである。
【０１９８】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１９９】
本願発明の組成物によって、疼痛、特に、癌性疼痛、神経因性疼痛、および炎症性疼痛などのような治療抵抗性の疼痛を処置することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】図１は、発生中の各段階（ＰＮ０＝出生後０日目；ＰＮ７＝出生後７日目；ＰＮ１４＝出生後１４日目；および成体）におけるＤＲＧ中の、オンコスタチンＭレセプターβ鎖遺伝子ｍＲＮＡを検出するインサイチュハイブリダイゼーションの結果を示す。
【図２】図２は、オンコスタチンＭ−／−マウス内のＤＲＧにおける感覚ニューロンマーカーの発現について、オンコスタチンＭ＋／＋マウス、およびオンコスタチンＭ−／−マウスについて、成体腰部ＤＲＧでの一連の切片を示す。スケールバーは、１００μｍである。
【図３】図３は、総ＤＲＧニューロン（Ａ）、ＶＲ１−陽性ＤＲＧニューロン（Ｂ）、およびＰ２Ｘ３陽性ＤＲＧニューロン（Ｃ）の横断面の面積の分布を示す、サイズ−頻度ヒストグラムである。これらニューロンは、４匹のオンコスタチンＭ＋／＋マウスおよびオンコスタチンＭ−／−マウスから調製された。小サイズニューロン（＜３００μｍ２）以外に、２つの遺伝型の間で、有意な差は確認されなかった。＊、Ｐ＜０．０５、ｎ＝４。
【図４】図４は、オンコスタチンＭ＋／＋マウス（左パネル）、オンコスタチンＭ−／−マウス（右パネル）の成体ＤＲＧ中の、ＶＲ１およびＰ２Ｘ３二重免疫蛍光染色の結果である。結合されたイメージ中のＶＲ１／Ｐ２Ｘ３−二重陽性細胞（矢印）が有意に減少している。スケールバーは、１００μｍである。
【図５】図５は、オンコスタチンＭ＋／＋成体マウス（左パネル）、オンコスタチンＭ−／−成体マウス（右パネル）の背骨中の、ＶＲ１およびＰ２Ｘ３二重免疫蛍光染色の結果である。オンコスタチンＭ＋／＋マウスにおいて、強い二重免疫反応性（黄色）が、背骨のＩＩ層の内部に局在していた。しかし、オンコスタチンＭ−／−マウスでは、背骨の二重免疫染色は、ほとんど観察されなかった。スケールバーは、２００μｍである。
【図６】図６は、オンコスタチンＭ−／−マウスにおける侵害受容刺激に対する感受性の減少を示す結果である。（Ａ〜Ｄ）化学的侵害受容試験。（Ａ）カプサイシン（１．０μｇ；ｎ＝６）の足底内部注入に対する応答における、舐める動作の遅延が、野生型マウス（白棒）およびヘテロ接合型マウス（斜線を付けた棒）と比較して、変異型マウス（黒棒）において有意に減少していた；最後の２群は、異ならない。（Ｂ）図中に示された用量のカプサイシンに対する応答における、舐める動作の遅延（ｎ＝５）。（Ｃ）αβ−ｍｅＡＴＰに対する応答における、舐める動作の遅延（ｎ＝６）。（Ｄ）ホルマリンの皮下注入後に、後足を舐めた累積時間（ｎ＝６）。フェーズＩ、注入後０−１０分；フェーズＩＩ、注入後１５−５０分。（Ｅ）ホットプレートアッセイにおける、舐める動作またはジャンプの潜伏時間。（Ｆ）尾部のクリップによる急性の機械的刺激に対する応答の潜伏時間。（Ｇ、Ｈ）ＭｇＳＯ４の腹腔内注射（Ｇ）または酢酸の腹腔内注射（Ｈ）によって生じた内臓疼痛応答（苦悶）（野生型および変異型の両方について、ｎ＝８〜９）。ＮＳ＝有意な結果がない；＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０２；＊＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図７】図７上段の写真は、ＡＴＦ３の発現を免疫組織染色により検討した写真である。左側は、手術を受けた側の後根神経節のニューロン、右側は、手術を受けなかった側の後根神経節のニューロンである。図７の下段のグラフは、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験の結果である。縦軸は、逃避行動を開始した際に、足底に加えられた刺激をグラムで示したものである。Ｌｔは、ＣＣＩモデルである左足の結果を示し、Ｒｔは、コントロールである右足の結果を示す。
【図８】図８上段の写真は、ＣＣＩモデルにおける抗Ｉｂａ１抗体で免疫染色の結果を示す。図８下段の写真は、ＣＣＩモデルにおける抗オンコスタチンＭ抗体で免疫染色の結果を示す。
【図９】図９上段の写真は、オンコスタチンＭレセプター遺伝子ノックアウトマウスから作成したＣＣＩモデルにおける抗Ｉｂａ１抗体で免疫染色の結果を示す。図９中段の写真は、オンコスタチンＭレセプター遺伝子ノックアウトマウスから作成したＣＣＩモデルにおける抗オンコスタチンＭ抗体で免疫染色の結果を示す。図９下段のグラフは、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験の結果である。縦軸は、逃避行動を開始した際に、足底に加えられた刺激をグラムで示したものである。Ｌｔは、ＣＣＩモデルである左足の結果を示し、Ｒｔは、コントロールである右足の結果を示す。
【図１０】図１０上段の写真は、抗オンコスタチンＭラット抗体と、サポリン結合抗ラットイムノグロブリン抗体とを投与した場合の、オンコスタチンＭレセプター陽性細胞の染色結果である。図１０下段の写真は、抗オンコスタチンＭラット抗体と、サポリン結合抗ラットイムノグロブリン抗体とを投与しなかった場合の、オンコスタチンＭレセプター陽性細胞の染色結果である。Ｌｔは、ＣＣＩモデルである左足の結果を示し、Ｒｔは、コントロールである右足の結果を示す。
【図１１】ＣＣＩモデルに対して、オンコスタチンＭを筋肉内注射した結果を示す。グラフは、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ試験の結果である。縦軸は、逃避行動を開始した際に、足底に加えられた刺激をグラムで示したものである。
【配列表フリーテキスト】
【０２０１】
配列番号１＝ヒトオンコスタチンＭレセプターβ鎖遺伝子プロモーター配列
配列番号２＝マウスオンコスタチンＭレセプターβ鎖遺伝子プロモーター配列
配列番号３＝ラットオンコスタチンＭレセプターβ鎖遺伝子プロモーター配列
配列番号４＝マウスオンコスタチンＭのｃＤＮＡ配列
配列番号５＝マウスオンコスタチンＭのアミノ酸配列
配列番号６＝ヒトオンコスタチンＭのｃＤＮＡ配列
配列番号７＝ヒトオンコスタチンＭのアミノ酸配列
配列番号８＝ラットオンコスタチンＭのｃＤＮＡ配列
配列番号９＝ラットオンコスタチンＭのアミノ酸配列
配列番号１０＝マウスオンコスタチンＭレセプターのｃＤＮＡ配列
配列番号１１＝マウスオンコスタチンＭレセプターのアミノ酸配列
配列番号１２＝ヒトオンコスタチンＭレセプターのｃＤＮＡ配列
配列番号１３＝ヒトオンコスタチンＭレセプターのアミノ酸配列
配列番号１４＝ラットオンコスタチンＭレセプターのｃＤＮＡ配列
配列番号１５＝ラットオンコスタチンＭレセプターのアミノ酸配列
配列番号１６＝プライマーＯＳＭｓ
配列番号１７＝プライマーＯＳＭａ
配列番号１８＝プライマーＮＥＯｓ
配列番号１９＝プライマーＮＥＯａ
【図３】
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【図８】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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