(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクシニアウイルス接種家兎皮膚抽出液を有効成分とし、腫瘍壊死因子およびインターフェロン−γの産生亢進を伴う網膜剥離、炎症性腸疾患および穿孔性腹膜炎からなる群のいずれかの疾患を治療するためのサイトカイン調節剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ワクシニアウイルス接種家兎皮膚抽出液を有効成分とするサイトカイン調節剤を提供するものである。
【０００２】
【従来の技術】
サイトカインは、免疫担当細胞をはじめとする種々の細胞から産生され、極めて微量で細胞間相互作用に不可欠の生物活性を有する糖蛋白であり、リンパ球から産生されるサイトカインはリンフォカイン、単球・マクロファージ系細胞から産生されるサイトカインはモノカインとも称される。サイトカインの生物活性には、正の調節機構と負の調節機構の両方が存在し、正常状態では調節機構がバランスよく作動し相互にネットワークを組み生体の恒常性を担っている。
【０００３】
しかし、このバランスが崩れると、サイトカイン産生異常が出現したり、または種々の疾患の形成、増悪の原因となる。例えば、産生された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）に対する負の調節機構（制御機構）が十分機能しない場合、ＴＮＦ−αはサイトカインネットワークを介して、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）等のさまざまな他の炎症性サイトカインの産生を促進し、産生されたサイントカインが再びＴＮＦ−αの産生を促進するといった連鎖反応により、炎症の悪循環を生じさせ、ついには骨、軟骨等での組織が破壊され、自己免疫疾患である関節リウマチ等につながるといわれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
現在、さまざまな疾患において、病態の形成、増悪及び疼痛に関与するサイトカインが判明してきており、そのため、サイトカインを疾患の診断や治療の判定に応用する研究や、更に進んで、過剰なサイトカインの産生またはその活性の抑制、不足・欠乏サイトカインの補充、産生促進等を新たな治療法とする研究が盛んである。
【０００５】
種々のサイトカインのうち、トランスフォーミンググロウスファクター−β（ＴＧＦ−β）は、線維芽細胞の増殖因子として見出されたサイトカインであるが、遺伝子工学的に造り出されたＴＧＦ−β１欠損マウスにおいて、多臓器における多発性炎症または多臓器不全が発症すること（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３５９：６９３，１９９２）、及び、骨芽細胞の増殖、細胞外基質合成基質分泌の促進、基質分解酵素産生の阻害、各種組織の肉芽形成、線維化促進作用及び細胞分化作用に基づく創傷または熱傷等の組織損傷修復作用、接着因子の発現促進作用に基づく網膜剥離に対する治療作用、過剰な免疫反応の抑制作用、Ｔリンパ球細胞群をＴｈ２細胞群へシフトさせる作用等が観察されている。更に、最近では、重症動脈硬化症では血清中の活性型ＴＧＦ−βレベルの著しい低下が認められ（ネイチャー  メディシン（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１：７４，１９９５）、動脈硬化症の形成、増悪にもＴＧＦ−βレベルの低下が関与していると推察されている。このＴＧＦ−βの生物活性の作用機序としては、ＴＧＦ−βが上皮由来の細胞、血管内皮細胞、リンパ球、その他の造血系細胞に対して強い細胞増殖抑制作用を示すること、これら細胞由来のサイトカインの産生を抑制することが重要視されている。
【０００６】
また、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、免疫担当細胞であるＴリンパ球のＴｈ１とＴｈ２からなる細胞群のうち、おもにＴｈ２細胞群から産生されるサイトカインで、腸管系における免疫機構の制御作用、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞、抗体産生細胞、肥満細胞に対する促進的作用、Ｔｈ１細胞やマクロファージに対する抑制的作用、Ｔｈ１細胞由来サイトカインであるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）及びマクロファージ由来のサイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６等の産生を抑制することが知られている。これらＴＮＦ−αとＩＬ−１は、その産生機序または生物活性がよく重複しあうサイトカインとして知られており、また、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６は、ヒトの潰瘍性大腸炎やクローン病等の炎症性腸疾患、穿孔性腹膜炎、グラム陰性菌等による敗血症からの予後不良等の疾患の形成、増悪に深く関与しているといわれている。そして、ヒトの潰瘍性大腸炎やクローン病ではＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６の産生を抑制するＩＬ−１０の血清中レベルが有意に低下していること（臨床免疫、２７，１６：９７，１９９５）、ＩＬ−１０遺伝子欠損マウスでは自己免疫性腸疾患が確実に発症すること（セル（Ｃｅｌｌ），７５：２６３，１９９３）、ＩＬ−１０がこれらサイトカインに起因した疼痛をおさえること（ブリティッシュ  ジャーナル  オブ  ファーマコロジー（Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．），１１５：６８４，１９９５）等の報告から、ＩＬ−１０産生の促進は、これらマクロファージ系細胞及びＴｈ１細胞から産生されるサイトカインの過剰が誘因となって、発症、増悪経過をたどる疾患に有用であることが明らかにされている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、有効成分名がワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液と称される医薬品原薬に、上皮由来細胞、血管内皮細胞、リンパ球、その他の造血系細胞に対する強い細胞増殖抑制作用、これら細胞に由来する炎症性または細胞障害性等のサイトカインの産生を抑制するＴＧＦ−βの産生を促進し、また、マクロファージ系細胞またはＴｈ１細胞由来のサイトカインの産生あるいは活性を抑制する作用をもつＩＬ−１０の産生を促進し、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの産生を抑制する活性が存在することを知見し、本発明を完成した。
【０００８】
ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液は、例えば医療薬日本医薬品集１９９７年１０月版第１７１０頁に記載されている既知の物質であり、これを有効成分とした製剤は、免疫調整、抗アレルギー、鎮痛および鎮静剤、特にストレス状態にある神経組織に対し特異的に作用する薬剤として、その含有量は力価を示す「単位」で表されるか、または当該「単位」と実質的に同等とされている「ノイロトロピン単位」で表され、医療用薬剤として市販されている（以下、「単位」に統一して記す）。しかし、これまで、サイトカインであるＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αに対する調節作用は全く知られていなかった。
【０００９】
本発明にかかるワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液の投与量は、疾患の種類や患者個人の感受性、調節すべきサイトカインのレベルによって異なるが、１〜６０単位／日の範囲で増減が可能であり、また、投与に際しては、適した有機または無機の固体または液体賦形剤のような医薬用担体と混合して投与することができる。通常は３〜３２単位／日、好ましくは３．６〜１６単位／日を、１日に１回または２〜４回に分けて、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与または経口投与する。
【００１０】
以下に実施例を示して本発明を詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。尚、特に説明がない限り、「抽出液」は本発明のワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液を意味する。
【００１１】
【実施例１】
８〜１５週令の（Ｃ５７ＢＬ／６  Ｘ  ＤＢＡ／２）Ｆ１雌マウスに、本発明のワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液（抽出液）  １２．５単位／ｋｇを単回腹腔内投与した場合と、３日間連日腹腔内投与した場合の、投与後２４時間目にマウスを脱血し血清を採取した。対照群のマウスには、投与した抽出液と同一容量の注射用生理食塩液を投与した。各群３匹のマウス使用。血清を採取したマウスと同一マウスより脾臓を採取し、直ちに定法により全ＲＮＡを抽出精製し−８０℃に保存し、逆転写反応−ポリメラーゼチェインリアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）用サンプルとした。各々のマウス脾臓ＲＮＡ１μｇにＴＧＦ−β１遺伝子特異的下流プライマーを加え、逆転写酵素を作用させてｃＤＮＡを合成した後、上流プライマーを更に添加し、耐熱性ＤＮＡ合成酵素を用いてｃＤＮＡを増幅した。各サンプルのｃＤＮＡを２％寒天ゲル電気泳動により分画し、５２５塩基対のバンドの濃度をデンシトメーターにより測定した。同様に、各サンプルのＲＮＡより内部標準としてグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）遺伝子についても逆転写反応によりｃＤＮＡを合成後、ｃＤＮＡを増幅した。寒天ゲル電気泳動により分画した９８３塩基対のＧ３ＰＤＨバンドの濃度を、デンシトメーターにより測定した後、各サンプルにつきＴＧＦ−β１バンドとＧ３ＰＤＨバンドの濃度比を算出した。
【００１２】
その結果として、２％寒天ゲル電気泳動により分画した各サンプルのＴＧＦ−β１バンドは抽出液投与群のｃＤＮＡ産物のバンドの方が、対照群に比較し濃いバンドを示し、抽出液投与によりＴＧＦ−β１遺伝子転写が促進された。デンシトメーター測定によるＴＧＦ−β１バンドとＧ３ＰＤＨバンドの濃度比の平均値は、抽出液投与群は約０．９であり、対照群は約０．７で、抽出液投与群の平均値が対照群の平均値より高い値を示した（第１図）。異なる日時に、再度同様の抽出液腹腔投与実験を繰り返し、ワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液腹腔内投与が、ＴＧＦ−β１遺伝子転写を統計学的に有意（ｐ〈０．０１）に促進することを確認した（第２図）。
【００１３】
【図１】
【００１４】
【図２】
【００１５】
【実施例２】
８〜１５週令の（Ｃ５７ＢＬ／６  Ｘ  ＤＢＡ／２）Ｆ１雌マウス２匹に、本発明のワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液（抽出液）１２．５単位／ｋｇを、１日１回３日間連日腹腔内投与した。２４時間後に脾臓を採取し、細胞を４８時間培養した。対照群のマウス２匹には、投与した抽出液と同一容量の注射用生理食塩液を同様に投与した。培養上清を回収し、ＴＧＦ−βの生物活性をミンク肺線維芽細胞の増殖抑制活性として、１匹よりのサンプルを２回定量し、その平均値を算出した。あるいは脾臓を採取後、脾細胞を単離し、コンカナバリンＡと共に２４時間培養後、培養上清を採取した。脾細胞培養上清中の活性型ＴＧＦ−β蛋白量を、サンドイッチ固相酵素免疫（ＥＬＩＳＡ）測定法により決定した。
【００１６】
抽出液投与により、ＴＧＦ−βの遺伝子転写促進ばかりでなく、ＴＧＦ−βの蛋白産生も促進されることが確認された。なお本生物活性測定法は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３の全ＴＧＦ−β活性を検出するものであるので、ＴＧＦ−β１ばかりでなく抽出液投与のＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３産生への影響も推定できることを意味する。生物活性とＴＧＦ−β蛋白量との相関性を示す検量線は遺伝子組み換え型ヒトＴＧＦ−β１を用いて作成した。また活性型ＴＧＦ−βの測定には、培養上清をそのままサンプルとして用い、全ＴＧＦ−βの測定は、培養上清を塩酸で処理して潜在型ＴＧＦ−βを活性型に変換させて行った。本実験の抽出液投与群では、活性型ＴＧＦ−βは  ９０７，７ｐｇ／ｍｌ、全ＴＧＦ−βは  １２２６．４  ｐｇ／ｍｌであったのに対し、対照群では各々１３５．５  ｐｇ／ｍｌ、６３９．６  ｐｇ／ｍｌであった（第３図）。このように抽出液投与は、脾細胞よりの活性型及び潜在型の両方のＴＧＦ−β産生を促進した。
【００１７】
【図３】
【００１８】
【実施例３】
８〜１５週令の（Ｃ５７ＢＬ／６  Ｘ  ＤＢＡ／２）Ｆ１雌マウスに、本発明のワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液（抽出液）２５単位／ｋｇを腹腔内に１回注射するのとほぼ同時に、コンカナバリンＡ６．２５ｍｇ／ｋｇあるいは注射用生理食塩液を皮内注射した。投与後３日目に各マウスより血液を採取し、血清を分離して被検サンプルとした。サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用い、検量線の作成には遺伝子組み換え型ヒトＴＧＦ−β１を使用して血清中の活性型ＴＧＦ−β１蛋白量を測定した結果、コンカナバリンＡを投与されなかった群では、抽出液投与群の血清中の活性型ＴＧＦ−β１は８．７６ｎｇ／ｍｌ、対照群では７．１２ｎｇ／ｍｌであり、コンカナバリンＡ投与群では、抽出液投与マウス血清中の活性型ＴＧＦ−β１は７．８６ｎｇ／ｍｌ、対照群では７．０５ｎｇ／ｍｌであった（第４図）。このように抽出液投与により、コンカナバリンＡ同時投与の有無に係わらず、血清ＴＧＦ−βレベルが統計学的に有意に上昇した（ｐ〈０．０５）。また、コンカナバリンＡ同時投与は、血清中のＴＧＦ−βレベルには影響を及ぼさなかった。
【００１９】
【図４】
【００２０】
【実施例４】
８〜１５週令の（Ｃ５７ＢＬ／６  Ｘ  ＤＢＡ／２）Ｆ１雌マウスに、本発明のワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液（抽出液）１２．５単位／ｋｇを１日１回３日間連続腹腔内投与し、２４時間後に脾臓を採取し、直ちに定法により全ＲＮＡを抽出精製し、−８０℃に保存後、ＲＴ−ＰＣＲのサンプルとした。対照群のマウスには、抽出液と同一容量の注射用生理食塩液を投与した。各群３匹のマウスを使用。各々のマウス脾臓ＲＮＡ１μｇにＩＬ−１０遺伝子特異的下流プライマーを加え、逆転写酵素を作用させてｃＤＮＡを合成した後、上流プライマーを更に添加し耐熱性ＤＮＡ合成酵素を用いてｃＤＮＡを増幅した。同様に、各サンプルの全ＲＮＡより内部標準としてＧ３ＰＤＨ遺伝子についても、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した後、ｃＤＮＡを増幅した。各サンプルのｃＤＮＡを２％寒天ゲル電気泳動により分画し、ＩＬ−１０の４２１  塩基対バンドの濃度をデンシトメーターにより測定した。ＩＬ−１０及びＧ３ＰＤＨのＲＴ−ＰＣＲ反応後のｃＤＮＡ産物の２％寒天ゲル電気泳動写真で、抽出液投与群（レーン４、５、６）のｃＤＮＡ産物の方が、対照群（レーン１、２、３）より濃いバンドを示した。デンシトメーターによりバンド濃度を測定した後、各サンプルにつきＩＬ−１０バンドとＧ３ＰＤＨバンドの濃度を比較した結果、対照群のバンド濃度比平均値を１．０としたとき、抽出液投与群の平均値は２．６２で、抽出液投与により、ＩＬ−１０遺伝子転写が有意（ｐ〈０．０１）に促進されていた（第５図）。
【００２１】
【図５】
【００２２】
【実施例５】
本発明のワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液（抽出液）  １２．５単位／ｋｇ単回投与によるＩＬ−１０遺伝子転写促進確認実験。
各群２匹のマウスを用いて、投与回数を単回投与とした以外は実施例４の実験と同様の操作にて、脾臓ｍＲＮＡ１μｇよりＩＬ−１０遺伝子についてＲＴ−ＰＣＲを行い、遺伝子転写レベルを生理食塩液対照群と比較した結果、無処置群のＩＬ−１０とＧ３ＰＤＨバンド濃度比を１．０としたとき、生理食塩液投与群１．３１、抽出液投与群２．２９で、３回投与に比べて程度は低かったが、単回投与でもＩＬ−１０遺伝子転写促進傾向が認められた（第６図）。
【００２３】
【図６】
【００２４】
【実施例６】
本発明のワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液（抽出液）１０、２５、５０単位／ｋｇを（Ｃ５７ＢＬ／６  Ｘ  ＤＢＡ／２）Ｆ１雌マウスに、３日間に５回腹腔内投与後、１６時間後に脾臓を採取して、脾細胞を単離し、コンカナバリンＡ  ３．０μｇ／ｍｌ存在下で４３時間培養し、培養上清中のＩＬ−１０をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により定量した。１群５匹使用。検量線の作成には、遺伝子組み換え型マウスＩＬ−１０を用いた。抽出液投与群の脾細胞培養上清中に含まれるＩＬ−１０蛋白量は、１０単位／ｋｇ投与群で１２９．０ｐｇ／ｍｌ、２５単位／ｋｇ投与群で１３１．１ｐｇ／ｍｌ、５０単位／ｋｇ投与群で１６３．６ｐｇ／ｍｌであり、抽出液投与のいずれの群でも脾細胞培養上清中のＩＬ−１０蛋白濃度が、無処置群１０７．５ｐｇ／ｍｌ、あるいは注射用生理食塩液投与群１１２．３ｐｇ／ｍｌのＩＬ−１０蛋白濃度に比較し、有意（ｐ〈０．０５、あるいはｐ〈０．０１）に上昇した（第７図）。
【００２５】
【図７】
【００２６】
【実施例７】
（Ｃ５７ＢＬ／６  Ｘ  ＤＢＡ／２）Ｆ１雌マウスに、本発明のワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液（抽出液）６．２５、１２．５単位／ｋｇを、１日１回３日間連続腹腔内投与した。対照群のマウスには注射用生理食塩液、また抑制陽性対照群としてデキサメタゾン２ｍｇ／ｋｇ／回を同様に投与した。最後の投与より約２４時間目に脾臓を採取し、脾細胞をコンカナバリンＡ２．５μｇ／ｍｌ存在下で２４時間培養し、培養上清中のＩＦＮ−γをサンドイッチＥＬＩＳＡ法により定量した。検量線の作成には、遺伝子組み換え型マウスＩＦＮ−γを用いた。抽出液投与は用量依存的にマウス脾細胞のＩＦＮ−γ産生量を減少させ、１２．５単位／ｋｇで、デキサメタゾン投与群の１．７８ｎｇ／ｍｌと同程度の１．９４ｎｇ／ｍｌまで、ＩＦＮ−γ産生量を抑制した（第８図）。
【００２７】
【図８】
【００２８】
【実施例８】
（Ｃ５７ＢＬ／６  Ｘ  ＤＢＡ／２）Ｆ１雌マウスに、本発明のワクシニアウイルス接種家兎炎症皮膚抽出液（抽出液）１２．５単位／ｋｇを、１日１回３日間連続腹腔内投与した。対照群のマウスには注射用生理食塩液、また抑制陽性対照群としてデキサメタゾン２ｍｇ／ｋｇを同様に投与した。最後の投与より約２４時間目に脾臓を採取し、脾細胞を大腸菌由来エンドトキシン（Ｅ．ｃｏｌｉ  ０２６：Ｂ６）１０／μｇ／ｍｌ存在下で２時間培養し、培養上清中のＴＮＦ−αをサンドイッチＥＬＩＳＡ法により定量した。検量線の作成には、遺伝子組み換え型マウスＴＮＦ−αを用いた。抽出液投与群での脾細胞のＴＮＦ−α産生は、デキサメタゾン投与群と同程度まで抑制された（第９図）。
【００２９】
【図９】
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１におけるＲＴ−ＰＣＲ反応後のＴＧＦ−β１及びＧ３ＰＤＨのｃＤＮＡの電気泳動後のバンドの濃度比を示すグラフである。
【図２】実施例１と同様の実験を異なる日時に行った実験で、ＴＧＦ−β１とＧ３ＰＤＨの電気泳動後のバンドの濃度比を示すグラフである。
【図３】実施例２におけるマウスの脾細胞培養上清中の活性型ＴＧＦ−β活性及び全ＴＧＦ−β活性を示すグラフである。
【図４】実施例３におけるサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定したマウスの血清中の活性型ＴＧＦ−β１を測定した結果を示すグラフである。
【図５】実施例４におけるＲＴ−ＰＣＲ反応後のＩＬ−１０及びＧ３ＰＤＨのｃＤＮＡの電気泳動後のバンドの濃度比を示すグラフである。
【図６】実施例４と同様の実験を異なる日時に行った実験で、ＩＬ−１０とＧ３ＰＤＨバンドの電気泳動後のバンドの濃度比を示すグラフである。
【図７】実施例６におけるマウスの脾細胞のコンカナバリンＡ刺激培養上清中のＩＬ−１０蛋白量をサンドイッチＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示すグラフである。
【図８】実施例７におけるマウス脾細胞のコンカナバリンＡ刺激培養上清中のＩＦＮ−γ濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法測定により測定した結果を示すグラフである。
【図９】実施例８におけるマウス脾細胞の大腸菌由来エンドトキシン刺激培養上清中のＴＮＦ−α濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法測定により測定した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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