(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体成分中に存在する可溶性の肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子−１（可溶性ＨＡＩ−１）を認識し、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８０２２であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を用いて、肝細胞癌又は膵臓癌の疑いのある被検者又は被検動物から採取された血液又はその分画物もしくは処理物あるいは血漿又は血清中の可溶性ＨＡＩ−１を免疫学的方法により測定することを特徴とする、可溶性ＨＡＩ−１の定量測定法。
【請求項２】
生体成分中に存在する可溶性ＨＡＩ−１を認識し、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８０２２であるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を含み、肝細胞癌又は膵臓癌の疑いのある被検者又は被検動物から採取された血液又はその分画物もしくは処理物あるいは血漿又は血清中の可溶性ＨＡＩ−１を検出または定量的に測定するためのキット。
【請求項３】
可溶性ＨＡＩ−１の検出または測定を、免疫染色によって行うことを特徴とする請求項２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子−１（ＨＡＩ−１）に対する定量測定用抗体またはモノクローナル抗体、その使用方法および測定キットに関する。またＨＡＩ−１を指標にした疾患状態の患者、特に臓器炎症、腎炎、癌、肝疾患、血液疾患、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞または血栓症に関する検出および測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子−１（以下「ＨＡＩ−１」と略す）は、肝細胞増殖因子活性化因子の制御因子として、またクニッツ型セリンプロテアーゼインヒビターの一種として知られている（下村ら、J.Biol.Chem.,272:6370-6376(1997)）。ＨＡＩ−１は、細胞膜貫通部分を有する蛋白質とされており、分子量は約６６０００（電気泳動法）と報告されている（下村ら、J.Biol.Chem.,126:821-828(1999)）。ＨＡＩ−１は、ＭＫＮ４５等のＨＡＩ−１を産生する培養細胞の培養上清中に、細胞膜貫通部分が無い状態で存在することが知られている。これらの可溶性のＨＡＩ−１には、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分子量約５８０００の分子と約４８０００の分子と約４００００の分子と約３９０００の分子が報告されており、「solubule forms of HAI」（本発明においてはこれらを「可溶性ＨＡＩ−１」と呼ぶ）と呼ばれている（下村ら、J.Biochem.,126:821-828(1999)）。
【０００３】
ＨＡＩ−１については、肝細胞増殖因子活性化因子〔肝細胞増殖因子（Hepatocyte Growth Factor；以下「ＨＧＦ」と略す）（仲ら、J.Biol.Chem.,267:20114-20119(1992)）に作用して、これを特異的に限定分解して活性化する因子（下村ら、Cytotechnology, 8:219-229(1992)）：以下「ＨＧＦＡ」と略す〕の活性を阻害する作用等のプロテアーゼインヒビター作用が知られている。  ＨＡＩ−１に対する抗体としては、マウスモノクローナル抗体Ｃ７６−１８と１Ｎ７（下村ら、特開平１１−２９５３０９：Ｃ７６−１８、片岡ら、J. Histochem. Cytochem., 47:673-682(1999):１Ｎ７）が知られているが、この抗体を用いた組織染色では、正常人の膵臓、肝臓、小腸、子宮でＨＡＩ−１が発現していることが判明している。また、肝臓癌の患者でも前記抗体を用いた組織染色が行われており、ＨＡＩ−１が発現していることが調べられている（片岡ら、Cancer research, 60, 6148-6159, 2000）。しかしながら、ヒトの病態におけるＨＡＩ−１の役割、機能に関しては解っていなかった。更に、血液等の生体成分中の可溶性ＨＡＩ−１濃度と病態の関連に関しては判っていなかった。
【０００４】
可溶性ＨＡＩ−１の血中濃度等の生体成分中濃度と病態の関連を解析するには、ヒト組織、体液、尿または血液中などの生体成分中に存在する可溶性ＨＡＩ−１を定量的に測定する必要がある。そして、可溶性ＨＡＩ−１を定量的に測定するためには、可溶性ＨＡＩ−１を認識する高親和性抗体、特に望ましくは高親和性モノクローナル抗体の取得が不可欠である。
【０００５】
ＨＡＩ−１に対する抗体としては、マウスモノクローナル抗体Ｃ７６−１８と１Ｎ７（下村ら、特開平１１−２９５３０９：Ｃ７６−１８、片岡ら、J. Histochem. Cytochem., 47:673-682(1999):１Ｎ７）が知られている。しかしながら、可溶性ＨＡＩ−１を定量的に測定するのに適した性質を有する抗可溶性ＨＡＩ−１抗体は知られておらず、さらにはヒト血液などの生体成分中に存在する可溶性ＨＡＩ−１を検出、又は定量測定する方法や、そのためのキットは存在しない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、可溶性ＨＡＩ−１を認識する高親和性抗体を用いて可溶性ＨＡＩ−１を検出する方法、定量測定する方法、並びに可溶性ＨＡＩ−１が関与する疾病の検出および定量測定方法及びキットを提供することを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
前述のＨＡＩ−１に対するマウスモノクローナル抗体Ｃ７６−１８と１Ｎ７（下村ら、特開平１１−２９５３０９：Ｃ７６−１８、片岡ら、J. Histochem. Cytochem., 47:673-682(1999):１Ｎ７）は、生体成分中の可溶性ＨＡＩ−１を定量測定するには適していない。実際にこれらの既存抗体を入手し、可溶性ＨＡＩ−１の測定系を構築しようとしても、血液中の可溶性ＨＡＩ−１濃度を測定できる系は構築できなかった。この理由としては、以下の事が考えられる。既存の抗体は細胞表面上のＨＡＩ−１は認識できるが、血液や尿などの生体成分中に存在しているような可溶性ＨＡＩ−１を認識できない、もしくは既存の抗体はＨＡＩ−１に対する親和性が低く生体成分中の可溶性ＨＡＩ−１と十分に結合できない等が考えられる。実際に既存抗体のＨＡＩ−１に対する解離定数を測定すると、それぞれＣ７６−１８：Ｋｄ＝１．４８×１０-9Ｍ、１Ｎ７：Ｋｄ＝１．６８×１０-8Ｍであり、ヒトの生体成分中の可溶性ＨＡＩ−１濃度測定するには不十分な親和性しか有していなかった。
【０００８】
一方、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、可溶性ＨＡＩ−１に対する高親和性のマウスモノクローナル抗体を得ることに成功した。本発明者らの可溶性ＨＡＩ−１に対する高親和性のマウスモノクローナル抗体：ＨＡＩ−１Ａ−１−１−３−４は抗原抗体反応の解離定数がＫｄ＝２．６７×１０-10Ｍと従来の物より親和性が格段に高く、ヒトの生体成分中の可溶性ＨＡＩ−１濃度を測定するには十分な親和性を有しており、同抗体を用いることにより定量系の構築に成功した。さらに、本発明の抗体はヒト病態における可溶性ＨＡＩ−１濃度と各種ヒト疾患との関連を解析するにたる親和性を有していることもわかった。
【０００９】
そこで本発明者らは、ヒト病態における可溶性ＨＡＩ−１血中濃度と各種ヒト疾患との関連を解析するため、高親和性抗体ＨＡＩ−１Ａ−１−１−３−４を用いることにより、ヒト血中におけるＨＡＩ−１の高感度定量系の構築を試みた。可溶性ＨＡＩ−１に対するマウスモノクローナル抗体：ＨＡＩ−１Ａ−１−１−３−４とウサギポリクローナル抗体を用い、２抗体サンドイッチ法を用いた酵素標識抗体測定系（enzyme-linked immunosorbent assay；以下「ＥＬＩＳＡ測定系」と略す）を構築し、健常人や臓器疾患をはじめとする種々の疾患患者の血液（血漿または血清）に対して、可溶性ＨＡＩ−１濃度の測定をした。
【００１０】
その結果、本発明の可溶性ＨＡＩ−１特異的高感度測定方法およびそのキットを使用することにより、可溶性ＨＡＩ−１の健常人の血中濃度域をはじめて明らかにし、糸球体腎炎をはじめとする臓器障害の患者や癌患者、血栓症患者の血液中に存在する可溶性ＨＡＩ−１量が著しく増加することをはじめて見いだした。
本発明は、上記知見からなされたものであり、その要旨は以下のとおりである。
【００１１】
（１）可溶性の肝細胞増殖因子活性化因子阻害因子−１（可溶性ＨＡＩ−１）を認識し、定量的に結合する抗体。
（２）前記可溶性ＨＡＩ−１は、還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により測定される分子量が約約３９０００〜５８０００ダルトンである(1)に記載の抗体。
（３）可溶性ＨＡＩ−１に対する解離定数が、２×１０-9Ｍ以下である(1)１又は(2)に記載の抗体。
（４）モノクローナル抗体である(1)〜(3)のいずれかに記載の抗体。
（５）受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０２２であるハイブリドーマにより産生される(4)に記載のモノクローナル抗体。
（６）(4)に記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞系。
（７）受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０２２である(6)に記載のハイブリドーマ細胞系。
（８）(1)〜(5)のいずれかに記載の抗体の１種又は複数種を用いて、可溶性ＨＡＩ−１を免疫学的方法により測定することを特徴とする、可溶性ＨＡＩ−１の定量測定法。
（９）可溶性ＨＡＩ−１を測定する検体が、疾患の疑いのある被検者または被検動物から採取された生体成分である(8)に記載の方法。
（１０）前記疾患が、臓器炎症、腎炎、癌、肝疾患、血液疾患、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞または血栓症である(9)に記載の方法。
（１１）前記疾患が、肝細胞癌又は膵臓癌である(9)に記載の方法。
（１２）疾患の疑いのある被検者から採取された生体成分中の可溶性ＨＡＩ−１を検出または測定することを特徴とする疾患の検出方法。
（１３）前記疾患が、臓器炎症、腎炎、癌、肝疾患、血液疾患、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞または血栓症である(12)に記載の方法。
（１４）前記疾患が、肝細胞癌又は膵臓癌である(12)の方法。
（１５）前記生体成分が血液又はその分画物もしくは処理物であることを特徴とする(9)又は(12)に記載の方法。
（１６）前記生体成分が血漿または血清である(9)又は(12)に記載の方法。
（１７）前記生体成分が尿である(9)又は(12)に記載の方法。
（１８）(1)に記載の抗体の１種又は複数種を含み、可溶性ＨＡＩ−１を検出または定量的に測定するためのキット。
（１９）臓器炎症、腎炎、癌、肝疾患、血液疾患、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞または血栓症の診断に用いられる(18)に記載のキット。
（２０）疾患の疑いのある患者から採取された生体成分中の可溶性ＨＡＩ−１を測定することを特徴とする(18)に記載のキット。
（２１）可溶性ＨＡＩ−１の検出または測定を、免疫染色によって行うことを特徴とする(18)に記載のキット。
【００１２】
本明細書において、可溶性ＨＡＩ−１を認識するモノクローナル抗体を、「可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性モノクローナル抗体」、可溶性ＨＡＩ−１を認識するポリクローナル抗体を、「可溶性ＨＡＩ−１特異的ポリクローナル抗体」ということがある。さらに、これらを総称して、「可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体」ということがある。また、「可溶性ＨＡＩ−１を認識する」とは、抗原抗体反応により可溶性ＨＡＩ−１に結合することをいう。尚、本発明の可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体が、全長ＨＡＩ−１に結合すると否とは問わない。
【００１３】
また、「定量的に結合する」とは、本発明の可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体と可溶性ＨＡＩ−１との結合を、可溶性ＨＡＩ−１の濃度に相関して検出することが可能であることをいい、具体的には、可溶性ＨＡＩ−１を酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、イムノブロッティング法、イムノクロマト法、ラテックス凝集法などの免疫学的方法により定量することが可能な程度の結合が可能であることをいう。例えば、１０ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ以上、より好ましくは０．５ｎｇ／ｍｌ以上の可溶性ＨＡＩ−１の定量が可能が抗体は、本発明の可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体である。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
【００１５】
＜１＞可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体作製用の免疫抗原およびスクリーニング抗原
免疫抗原に使用するＨＡＩ−１は、ＨＡＩ−１全長でもよく、可溶性ＨＡＩ−１すなわちＨＡＩ−１の細胞外ドメイン又はその一部のペプチドであってもよい。可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体を効率よく取得するためには、可溶性ＨＡＩ−１又はその一部のペプチドを用いることが好ましい。尚、免疫抗原とモノクローナル抗体のスクリーニング等に使用するＨＡＩ−１の少なくとも一方は、可溶性ＨＡＩ−１又はその一部のペプチドであることが好ましい。
【００１６】
可溶性ＨＡＩ−１としては、例えば、下村らの方法（J.Biol.Chem.,272:6370-6376(1997))  に従い、ＨＡＩ−１を産生する培養細胞、例えばＭＫＮ４５の培養上清を精製したものを使用することが可能である。また特開平9-95497（米国特許第6,225,081）に記載されているＨＡＩ−１ ｃＤＮＡを使用して大腸菌などの微生物、昆虫細胞、酵母、動物細胞および動物を使用した組換え蛋白質であるＨＡＩ−１も利用可能である。さらにはＨＡＩ−１の部分配列を化学合成により作製したペプチドも利用することが可能である。
【００１７】
特に、ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体を取得するためには、高純度のＨＡＩ−１を調製することが好ましい。このような目的から、ここで使用するＨＡＩ−１としては、ＨＡＩ−１ ｃＤＮＡを使用した組換え蛋白質が望ましい。例えば、特開平9-95497に記載されているＨＡＩ−１をコードするＨＡＩ−１ ｃＤＮＡを使用し、その全長または一部を適当な発現ベクターに挿入し、これを大腸菌などの微生物、昆虫細胞、酵母、動物細胞または動物に導入し、さらにＨＡＩ−１を発現しているこれらの遺伝子導入細胞の培養上清または細胞内画分、組織、体液より精製操作を実施して、組換え蛋白質であるＨＡＩ−１を得ることが可能である。上記ｃＤＮＡを発現させる宿主として適切な動物細胞、例えばＣＨＯ細胞を用いた場合は、可溶性ＨＡＩ−１が培養上清中に遊離する。また、宿主として微生物細胞を用いる場合は、ＨＡＩ−１ ｃＤＮＡのうち細胞外ドメインをコードする領域を発現させてもよい。さらに、必要に応じて適当な分泌シグナルを用いてもよい。
【００１８】
また細胞系を使用することなく、Rapid Translation System RTS500（Roshe Diagnostics社）などを使用した試験管内での転写・翻訳システムを用いて、目的とするＨＡＩ−１を作製することも可能である。
【００１９】
具体的な例としては、特開平9-95497に記載されているＨＡＩ−１ｃＤＮＡを動物細胞発現ベクターのプロモーター下流に挿入した発現ベクターを用い、これらの発現ベクターを動物細胞に導入後、そのＨＡＩ−１ ｃＤＮＡを発現している細胞を選択して、その培養上清から精製することにより組換え蛋白質である可溶性ＨＡＩ−１を得ることが可能である。可溶性ＨＡＩ−１の精製は、ＨＰＬＣを使用したゲル濾過またはアフィニティークロマトグラフィー等、通常の蛋白質の精製法にしたがって行うことができる。
【００２０】
精製純度の高い可溶性ＨＡＩ−１は、免疫原として重要であるだけでなく、可溶性ＨＡＩ−１特異的ポリクローナル抗体をアフィニテイー精製により選別したり、可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性モノクローナル抗体をスクリーニングする際に、極めて重要な材料となる。また、定量測定時の標準品可溶性ＨＡＩ−１としても重要である。
【００２１】
＜２＞可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性モノクローナル抗体の作製
ＨＡＩ−１特異的高親和性モノクローナル抗体を取得するには、免疫用抗原として、前述したＨＡＩ−１、好ましくは可溶性ＨＡＩ−１を用い、通常行われる免疫学的方法を実施すればよい。
【００２２】
免疫に使用する動物は特に限定されないが、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ等はいずれも使用できる。免疫用抗原の動物への接種は、皮下、筋肉内、腹腔内に完全フロイントアジュバントや不完全フロイトアジュバントと免疫用抗原をよく混和して行う。接種は、２週間から５週間ごとに実施し、接種した抗原に対する免疫動物の抗体価が充分に上昇し（高親和性抗体の場合はELISA法にて好ましくは１００万倍希釈以上の力価がある事）、かつ一定期間以上（高親和性抗体の場合は好ましくは２ヶ月以上）続ける。この後、十分に抗体価が上昇した免疫動物に対して抗原のみの静脈注射を行い、その３日後に抗体産生細胞を含むと考えられる脾臓もしくはリンパ節を採取し、この脾臓細胞またはリンパ細胞を腫瘍細胞と細胞融合させる。この後、細胞融合して不死化した抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を単離する。ここで使用する腫瘍細胞は、一般的に免疫を行った動物から調製される脾臓細胞もしくはリンパ細胞と同一種であることが望ましいが、異種動物間のものでも可能である。
【００２３】
腫瘍細胞の例として、p3（p3/x63-Ag8）, P3U1, NS-1, MPC-11, SP2/0, FO, x63.6.5.3, S194, R210等の骨髄腫細胞が使用される。細胞融合は一般に行われている方法、例えば「単クローン抗体実験マニュアル」（講談社サイエンティフィック  1987年出版）に従って実施すればよい。細胞融合は、融合させる細胞を懸濁した融合培地に細胞融合促進剤を加えることに実施することができる。細胞融合促進剤としては、センダイウイルスや平均分子量1000-6000のポリエチレングリコールなどが挙げられる。この際、更に融合効率を高めるために、ジメチルスルホキシド等の補助剤やＩＬ−６等のサイトカインを融合培地に添加することも出来る。免疫を行った脾臓細胞もしくはリンパ細胞に対する腫瘍細胞の混合比は、例えば腫瘍細胞に対し、脾臓細胞もしくはリンパ細胞を約１倍から１０倍程度用いればよい。
【００２４】
上記の融合培地としてはERDF培地、RPMI-1640培地、MEM培地等の通常の各種培地を使用することが出来、融合時は通常、牛胎児血清（ＦＢＳ）等の血清を培地から抜いておくのがよい。融合は、上記の免疫を行った脾臓細胞もしくはリンパ細胞と腫瘍細胞との所定量を上記の培地内でよく混合し、予め３７℃程度に加温しておいたポリエチレングリコール溶液を２０％から５０％程度加え、好ましくは３０℃から３７℃で１分から１０分程度反応させることによって実施する。以降、適当な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去する操作を繰り返す。
【００２５】
目的とするハイブリドーマは、通常の選択培地、例えばＨＡＴ培地（ヒポキチンサン、アミノプテリン及びチミジンを含む培地）で培養する。このＨＡＴ培地での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（未融合細胞等）が死滅するのに充分な時間、通常では数日から数週間行えばよい。可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性モノクローナル抗体を取得する際、技術的に重要な点がそのスクリーニングである。可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性モノクローナル抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングは、前述した方法により得た可溶性ＨＡＩ−１などの材料を用い、種々の免疫化学的方法で解析することにより可能となる。例えば可溶性ＨＡＩ−１をスクリーニング用抗原として用い、これらのスクリーニング用抗原とハイブリドーマ培養上清中に分泌されるモノクローナル抗体との結合を、ＥＬＩＳＡ法などの酵素免疫測法、またはウエスタンブロッティング法などで解析して、目的とするハイブリドーマを選択することが出来る。
【００２６】
具体的には、可溶性ＨＡＩ−１をスクリーニングプレートなどに付着させ、ＢＳＡ等でブロッキングしたものに対して、上記ハイブリドーマの培養上清を添加して、可溶性ＨＡＩ−１を認識する抗体を分泌しているハイブリドーマを選別する。例えば、選択するハイブリドーマの培養上清を可溶性ＨＡＩ−１が付着したＥＬＩＳＡ法用のプレートに添加して反応させ、十分な洗浄操作後、標識抗マウスＩｇＧポリクローナル抗体を添加してさらに反応させる。洗浄操作後に標識の検出を行い、可溶性ＨＡＩ−１を付着したプレートに反応性がある培養上清を有するハイブリドーマを選択する。標識としては、後述する各種酵素、蛍光物質、化学発光物質、ラジオアイソトープ、ビオチンまたはアビジン等が用いられる。
【００２７】
上記のスクリーニングにより、可溶性ＨＡＩ−１を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが得られる。一方、この様なハイブリドーマをスクリーニングする際、前述した部分配列ペプチドと反応することを指標としても良い。この様な方法で選択されたハイブリドーマが産生する抗体に関しては、さらに可溶性ＨＡＩ−１に反応することを確認すると良い。
【００２８】
尚、可溶性ＨＡＩ−１としては、分子量約５８０００の分子と約４８０００の分子と約４００００の分子と、約３９０００の分子が報告されているが、本発明のＨＡＩ−１特異的高親和性モノクローナル抗体は、分子量に関わらず細胞膜膜貫通部分を持たない可溶性ＨＡＩ−１に対して高親和性を有する抗体であれば特に制限されない。しかし、前記のいずれの分子量の可溶性ＨＡＩ−１にも結合することが好ましい。
【００２９】
本発明の可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性モノクローナル抗体は、可溶性ＨＡＩ−１に対する解離定数が２×１０-9Ｍ以下、好ましくは１×１０-9Ｍ以下、より好ましくは５×１０-10Ｍ以下であることが望ましい。
上記のような可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンとして具体的には、実施例に記載するＨＡＩ−１Ａ−１−１−３−４が挙げられる。ＨＡＩ−１Ａ−１−１−３−４以外にも、本発明の可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、本明細書の記載、及び当業者によく知られた方法を用いることによって、容易に取得することができる。
【００３０】
得られたハイブブリドーマは、限界希釈法によりクローニングすることにより、単一のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを得ることが出来る。このハイブリドーマクローンは、あらかじめＦＢＳ中に含まれるウシ抗体（ＩｇＧ）を除いたＦＢＳを１〜５％程度加えた培地または無血清用培地を用いて培養を行い、得られた培養上清を目的のモノクローナル抗体を精製する原料とする。一方、得られたハイブリドーマクローンをあらかじめプリステンを投与したBalb/CマウスまたはBalb/c(nu/nu)マウスの腹腔内に移植し、１０日から１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、目的のモノクローナル抗体を精製する原料としてもよい。モノクローナル抗体を精製する方法は、通常の免疫グロブリン精製法を用いれば良く、例えば、硫安分画法、ポリエチレン分画法、エタノール分画法、陰イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧが結合したアフィニティークロマトグラフィー等により実施することが出来る。
【００３１】
＜３＞可溶性ＨＡＩ−１特異的ポリクローナル抗体の作製
可溶性ＨＡＩ−１特異的ポリクローナル抗体は、ＨＡＩ−１、好ましくは可溶性ＨＡＩ−１又はその一部のペプチドを免疫用抗原として用い、得られた免疫動物由来のポリクローナル抗体に対し、可溶性ＨＡＩ−１を認識する抗体を精製する操作を実施すれば取得することが可能である。また、ポリクローナル抗体を取得する免疫用抗原として、前述したＨＡＩ−１の部分配列ペプチドとキャリアーの融合体も使用可能である。
【００３２】
免疫に使用する動物は特に限定されないが、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ等はいずれも使用できる。免疫用抗原の動物への接種は皮下、筋肉内、腹腔内に完全フロイントアジュバントや不完全フロイトアジュバントとよく混和して行う。接種は２週間から５週間ごとに実施し、接種した抗原に対する免疫動物の抗体価が充分に上昇するまで続ける。この後、免疫動物に対して抗原のみの静脈注射を行い、その３日後から５日後に抗血清を取得する。
【００３３】
取得した抗血清からポリクローナル抗体を精製する方法は、通常の免疫グロブリン精製法を用いれば良く、例えば、硫安分画法、ポリエチレン分画法、エタノール分画法、陰イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡまたはプロテインＧが結合したアフィニティークロマトグラフィー等により実施することが出来る。
【００３４】
可溶性ＨＡＩ−１特異的ポリクローナル抗体を取得するための精製操作とは、可溶性ＨＡＩ−１を認識するポリクローナル抗体を分画または精製可能な方法であればいずれでも良く、例えばイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気遊動法、免疫電気遊動法等が挙げられる。具体的な方法の一つとして、可溶性ＨＡＩ−１を固定化した樹脂を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィーが挙げられる。例えば、前述の方法で得られたポリクローナル抗体を材料にして、可溶性ＨＡＩ−１を固定化した樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーを実施する。この方法により、可溶性ＨＡＩ−１に結合した吸着画分に存在するポリクローナル抗体を回収する。
【００３５】
これらの方法により、可溶性ＨＡＩ−１特異的ポリクローナル抗体を得ることが出来る。また、このアフィニティークロマトグラフィーの方法として、可溶性ＨＡＩ−１の部分配列ペプチドを利用することも可能である。ペプチドを固定化した樹脂は、可溶性ＨＡＩ−１特異的ポリクローナル抗体を精製するアフィニティークロマトグラフィー用の固定化用担体として使用することが出来る。
【００３６】
ポリクローナル抗体においては、厳密な意味での解離定数は存在しないが、モノクローナル抗体と同様の手法、例えば後記実施例４に示した方法で、可溶性ＨＡＩ−１に対する解離定数に類似した数値を得ることができる。本発明の可溶性ＨＡＩ−１特異的ポリクローナル抗体は、そのようにして測定される値が、２×１０-9Ｍ以下、好ましくは１×１０-9Ｍ以下、より好ましくは５×１０-10Ｍ以下であることが望ましい。
【００３７】
＜４＞可溶性ＨＡＩ−１を特異的に定量測定する方法
本方法は、可溶性本発明のＨＡＩ−１特異的高親和性抗体を使用して、可溶性ＨＡＩ−１を定量的に測定する方法である。本方法は、生体試料中のＨＡＩ−１を定量する様々な診断方法、測定方法、アッセイ方法に用いることが可能である。その方法としては、可溶性ＨＡＩ−１を定量する目的であれば特に限定されない。例えば、可溶性ＨＡＩ−１を特異的に検出する組織染色法法や免疫沈降法、可溶性ＨＡＩ−１を特異的に測定する競合的結合アッセイ方法、または直接的または間接的サンドイッチアッセイ法、２抗体サンドイッチアッセイ法などが挙げられる。また検出方法としては、酵素イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、イムノブロッティング法、イムノクロマト法、ラテックス凝集法などが挙げられる。
【００３８】
イムノブロッティングの応用例としては、可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体をマイクロアレイやチップに添加もしくは固定したものも含まれる。また可溶性ＨＡＩ−１特異的高抗体を蛍光ラベル化し、蛍光偏向解消法、蛍光相関分散法を用いて可溶性ＨＡＩ−１との相互作用を検出することも可能である。表面プラズモン共鳴装置を利用して可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体と、可溶性ＨＡＩ−１との相互作用を測定することも可能である。例えば、この抗体をセンサーチップ上に結合させた後、このチップをとりつけた表面プラズモン共鳴装置に可溶性ＨＡＩ−１を含む生体試料を流し、応答シグナルの時間変化を追跡することにより、生体成分中の可溶性ＨＡＩ−１を定量することが可能である。
【００３９】
可溶性ＨＡＩ−１を特異的に測定する方法で使用される抗体、例えばＨＡＩ−１特異的高親和性抗体は、そのまま用いてもよいし、定法であるパパイン処理によって得られるＦａｂもしくはペプシン処理によって得られるＦ（ａｂ'）2またはＦ（ａｂ'）の形態を持った抗体を用いても良い。また可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体の断片も、本発明に含まれる。例えば、可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体のＨ鎖とＬ鎖の両可変ドメイン内の相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域などを含む断片がこれに含まれる。
【００４０】
生体成分中の可溶性ＨＡＩ−１を定量する２抗体サンドイッチアッセイ法とは、例えば、可溶性ＨＡＩ−１を特異的に測定する方法であって、（１）可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体の一種または複数を含むものからなる試薬を、検体中の可溶性ＨＡＩ−１と反応させ、免疫反応物を生成させる工程、（２）免疫反応物を分離した後、免疫反応物中の可溶性ＨＡＩ−１を認識する標識抗体と反応させる工程、及び（３）免疫反応物に結合した標識抗体を測定する工程を含む方法、または、
可溶性ＨＡＩ−１を特異的に測定する方法であって、（１）可溶性ＨＡＩ−１と可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体の一種または複数を第一次抗体として含むものからなる試薬を、検体中の可溶性ＨＡＩ−１と反応させ、免疫反応物を生成させる工程、（２）免疫反応物を分離した後、免疫反応物中の可溶性ＨＡＩ−１を認識する第二次抗体と反応させ、免疫反応物を生成させる工程、（３）免疫反応物を分離した後、免疫反応物中の第二次抗体を認識する標識抗体を反応させる工程、及び（４）免疫反応物に結合した標識抗体を測定する工程を含む方法、が挙げられる。
【００４１】
具体的には、マイクロタイターウェルやマイクロ磁気ビーズなどの固相に対して可溶性ＨＡＩ−１特異的ポリクローナル抗体又は可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性モノクローナル抗体を、定法により一次抗体として固相化する。次に、この固相表面の過剰な蛋白質結合部位を、ウシ血清アルブミン、スキムミルクまたはゼラチン等でブロッキングする。この後、可溶性ＨＡＩ−１を含む生体成分を添加して固相上で免疫反応物を形成させた後に洗浄する。次に可溶性ＨＡＩ−１を認識する標識ポリクローナル抗体または標識モノクローナル抗体を二次抗体として添加して反応させる。この際、一次抗体としてモノクローナル抗体を用いた場合は、一次抗体とエピトープが異なる可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性モノクローナル抗体を標識したものを二次抗体として使用しても良い。さらに洗浄後、標識抗体量を測定することにより、生体成分中の可溶性ＨＡＩ−１量を測定することが出来る。
【００４２】
ここで使用するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の標識とは、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼなどの酵素でもよいし、フルオレッセイン誘導体やローダミン誘導体などの蛍光物質でもよい。またユーロピウムもしくはユーロピウム錯体などの時間分解蛍光測定が可能な希土類もしくは希土類錯体であってもよい。さらに、アクリジニウムエステル等の化学発光物質であってもよいし、125Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐなどのラジオアイソトープでもよい。すなわち、発色、蛍光、時間分解蛍光、化学発光、電気化学発光、放射活性を測定する方法を用いて生体成分中の可溶性ＨＡＩ−１量を定量することが本発明に含まれる。また、二次抗体をビオチン化標識し、アビジンと複合体を形成しているアルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、フルオレッセイン誘導体、ローダミン誘導体、希土類錯体、アクリジニウムエステル等の化学発光物質、125Ｉ、3Ｈ、14Ｃ、32Ｐなどのラジオアイソトープを検出することも本発明に含まれる。
【００４３】
＜５＞可溶性ＨＡＩ−１を特異的に定量測定または染色するキット
可溶性ＨＡＩ−１特異的測定キットまたは可溶性ＨＡＩ−１特異的染色キットとは、可溶性ＨＡＩ−１を測定または検出することを特徴とする、疾患の診断キットである。可溶性ＨＡＩ−１を測定することにより、疾患状態にある患者、例えば糸球体腎炎、腎炎、肝炎、膵臓炎、肺炎、腸炎、胃炎をはじめとする臓器障害の患者、癌患者、肝疾患の患者、血液疾患の患者、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞などをはじめとする血栓症の患者の診断が可能であることが本発明により初めて判明した。したがって、可溶性ＨＡＩ−１を測定または検出することにより、前記のような各種疾患を検出することができる。本発明においては、疾患を診断する目的の可溶性ＨＡＩ−１特異的測定キットであるならば、そのキットを構成する材料、方法には限定されない。
【００４４】
具体的には、例えば、電気遊動法、ＨＰＬＣ法、各種カラムクロマトグラフィー法、各種アレー、チップ、表面プラズモン共鳴装置等を用い、可溶性ＨＡＩ−１を測定または検出することにより、疾患を診断するキットなどが挙げられる。より具体的には、抗体を用いた免疫学的方法により可溶性ＨＡＩ−１を測定または検出するキットが挙げられる。抗体としては、前記の可溶性ＨＡＩ−１を認識する抗体の少なくとも一つ以上が用いられる。
【００４５】
例えば、本発明のキットが２抗体サンドイッチアッセイ法によるものである場合には、
可溶性ＨＡＩ−１を特異的に測定するキットであって、（１）可溶性ＨＡＩ−１と可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体の一種または複数を含むものからなる試薬を検体中の可溶性ＨＡＩ−１と反応させ、免疫反応物を生成させる工程、（２）免疫反応物を分離した後、免疫反応物中の可溶性ＨＡＩ−１を認識する標識抗体と反応させる工程、及び（３）免疫反応物に結合した標識抗体を測定する工程を含んだキット、または、
可溶性ＨＡＩ−１を特異的に測定するキットであって、（１）可溶性ＨＡＩ−１と可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体の一種または複数を第一次抗体として含むものからなる試薬を検体中の可溶性ＨＡＩ−１と反応させ、免疫反応物を生成させる工程、（２）免疫反応物を分離した後、免疫反応物中の可溶性ＨＡＩ−１を認識する第二次抗体と反応させ、免疫反応物を生成させる工程、（３）免疫反応物を分離した後、免疫反応物中の第二次抗体を認識する標識抗体を反応させる工程、及び（４）免疫反応物に結合した標識抗体を測定する工程を含んだキット、が挙げられる。
【００４６】
このキットは、少なくとも可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性モノクローナル抗体又は可溶性ＨＡＩ−１特異的ポリクローナル抗体を含み、さらに、可溶性ＨＡＩ−１を検出または測定する操作に必要な構成要素が含まれていてもよい。その構成要素の例として、標準蛋白質としての可溶性ＨＡＩ−１、酵素および基質等が挙げられる。キットに含まれるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、酵素などの標識物質が結合した状態でもよいし、これらの抗体を認識する標識抗体が含まれていてもよい。また適切な各種緩衝液、抗原希釈液、反応希釈液、基質溶液、反応停止液等が含まれていてもよい。本キットにはラベルが付き、可溶性ＨＡＩ−１検出および定量に必要な材料が封入された容器が含まれていてもよい。適した容器としては、例えばガラス、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ナイロン、テフロン(du Pont社の登録商標)などの各種プラスチックを材質とした容器が挙げられる。キットには、好ましくは、上述した可溶性ＨＡＩ−１を検出または測定するのに必要な材料、容器とともに、可溶性ＨＡＩ−１を検出または測定する方法が記載された説明書が含まれる。
【００４７】
＜６＞ヒト疾患に関する可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体とその使用法
本発明による可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体を使用した方法、キットを用いることにより、疾患状態にある患者から採取された生体成分中の可溶性ＨＡＩ−１を検出することが出来、また定量することも可能である。可溶性ＨＡＩ−１を検出する生体材料は特に限定されず、組織、血清、血漿、尿、漿液、髄液、組織の抽出液等、いずれの生体材料も適切な前処理を行うことによって適応可能である。疾患状態にある患者の生体材料中に存在する可溶性ＨＡＩ−１を検出または定量することにより、その疾患の診断、予知、経過を判断することが可能である。疾患の例として、糸球体腎炎、腎炎、肝炎、膵臓炎、肺炎、腸炎、胃炎などをはじめとする臓器炎症、癌、肝疾患、血液疾患、心筋梗塞、狭心症、脳梗塞などをはじめとする血栓症などが挙げられる。
【００４８】
特に腎炎の例としては、メサンギウム増殖性腎症、IgA腎症、膜性増殖性腎炎、膜性腎症、巣状糸球体硬化症、急性腎不全、溶連菌感染後急性糸球体腎炎、慢性・急性間質性腎炎、ネフローゼ症候群などが挙げられる。また狭心症、心筋梗塞の例としては安定労作時狭心症、不安定狭心症、急性心筋梗塞、陳旧性心筋梗塞、安定狭心症が挙げられ、冠動脈インターベンション施行患者、経食道心エコー施行患者、下肢動脈バイパス手術施行患者、大動脈バルーンパンピング施行患者、急性大動脈解離患者などの疾患状況、予後を知ることも可能である。また、癌の例としては肝細胞癌又は膵臓癌などが挙げられる。
【００４９】
また可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体は、可溶性ＨＡＩ−１の活性を特異的に抑制する効果が期待できるため、可溶性ＨＡＩ−１により引き起こされる疾患の治療薬として使用することが期待される。
【００５０】
例えば、可溶性ＨＡＩ−１は不活性型ＨＧＦＡに作用してこれを活性化するのを阻害する性質を有している。このため可溶性ＨＡＩ−１の阻害活性を抑制する抗体は、生体中で出現する活性型ＨＧＦＡ量を増加し、さらには活性型ＨＧＦの増加を引き起こす、活性型ＨＧＦは血管新生因子の一種であるので（ＨＧＦの分子医学（１９９８年出版）メディカルレビュー社）、動脈硬化などの血管障害の治療薬、予防薬として使用することが可能である。この目的で使用する抗体は、遺伝子工学的手法を使用してヒト化しておくと良い。抗体のヒト化は、例えば特表平11-506327などに記載されている当業者によく知られた方法によって実施することができる。
また、患者の生体成分中の可溶性ＨＡＩ−１を測定することにより、投薬の効果判定を行い、治療方針を決めることも可能である。ある疾患に対して効果があるとされている薬剤でも、効果に個人差があり、患者によっては効果がなかったり、また副作用が出たりする事がある。従って、薬剤の投与前及び投与後に可溶性HAI-1を測定することにより、個々の患者に対する薬剤の効果及び副作用を確認することが出来、今後もその薬剤を投与して治療すべきか否かの指針とすることができる。
【００５１】
【実施例】
以下に実施例を挙げ本発明を具体的に説明するが, 本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５２】
【実施例１】
可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性モノクローナル抗体の作製
免疫抗原、スクリーニング抗原、及び可溶性ＨＡＩ−１測定系における標準可溶性ＨＡＩ−１として用いた可溶性ＨＡＩ−１は、ＨＡＩ−１のcDNAを利用した組み換えＣＨＯ細胞により発現、分泌させ、カラムクロマトグラフィー操作により精製することによって、取得した。
【００５３】
可溶性ＨＡＩ−１  100μgを含む溶液を、同容量のフロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバントとともに、Balb/cマウスの皮内および皮下に４週間間隔で３回投与した。マウスの血清中に可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体が産生していることを確認後、３０μgの可溶性ＨＡＩ−１を含む溶液を尾静脈内に投与した。３日後に脾臓を取り出し、「単クローン抗体実験マニュアル」（講談社サイエンティフィック1987年出版）に従い、ポリエチエングリコール1500を使用して、脾臓細胞をミエローマ細胞P3U1と細胞融合させ、96ウェルプレートに注入後ＨＡＴ培地を添加して１４日間の培養を行った。
【００５４】
この後、可溶性ＨＡＩ−１に対して特異的なモノクローナル抗体を培地中に産生するハイブリドーマの選別を行った。すなわち可溶性ＨＡＩ−１を固相化し、ＢＳＡでブロッキングをおこなった可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性抗体スクリーニング用ＥＬＩＳＡプレートに対して、選択するハイブリドーマの培養上清を添加し、培養上清に存在するモノクローナル抗体の反応性を解析した。スクリーニング用ＥＬＩＳＡプレートに対し、選択するハイブリドーマの培養上清を100μl/ウェルにて添加した後１時間以上反応させた。
【００５５】
この後、0.05% Tween20を含むPBS(-)液（以下「PBST液」と略す）を用いて十分な洗浄を行ない、HRP（西洋わさびペルオキシターゼ）標識ヤギ抗マウスIgG・Fcポリクローナル抗体（ＩＣＮ社）１μg/mlおよび１％ BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。PBST液で充分に洗浄操作を行った後、0.4mg/mlオルトフェニレンジアミン（OPD、Sigma社 P-9029）および0.015〜0.03%過酸化水素溶液を含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH5.0）を添加して室温にて反応させ、発色を行なった。この後１Ｎ H2SO4溶液を添加して反応を止め、測定波長490nm、リファレンス波長650nmにて測定を行なった。
【００５６】
次に、得られた可溶性ＨＡＩ−１に対して反応する各ハイブリドーマは、限界希釈法による３回のクローニング操作後、培養上製を回収してプロテインＡが結合したアフィニティークロマトグラフィー（アマシャムファルマシアバイオテク製）により、モノクローナル抗体の精製を行った。
【００５７】
上記のようにしてクローニングしたハイブリドーマクローンの一株を、ＨＡＩ−１Ａ−１−１−３−４と命名した。ＨＡＩ−１Ａ−１−１−３−４は、平成１３年１０月１９日より、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１８５６５の受託番号で寄託され、２００２年４月１７日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８０２２が付与されている。
【００５８】
【実施例２】
可溶性ＨＡＩ−１に対するポリクローナル抗体およびその標識体の作製
可溶性ＨＡＩ−１に対するポリクローナル抗体は、以下のようにして調製した。可溶性ＨＡＩ−１ 100μgを含む溶液と、同容量のフロイント完全アジュバントもしくはフロイント不完全アジュバントを等量ずつ混合したものを抗原として、ウサギ皮下へ２週間間隔で７回投与した。血清中に抗体が産生していることを確認後、さらに10μgの抗原を脈内に投与し、５日後に抗血清を取得た。さらに硫安沈殿操作後、プロテインＡカラムを使用した精製操作により、抗可溶性ＨＡＩ−１ポリクローナル抗体を取得した。この後、得られた抗可溶性ＨＡＩ−１ポリクローナル抗体をビオチン標識することにより、ビオチン標識抗可溶性ＨＡＩ−１ポリクローナル抗体を調製した。
【００５９】
【実施例３】
可溶性ＨＡＩ−１定量測定系の構築
実施例１で作製したハイブリドーマクローンＨＡＩ−１Ａ−１−１−３−４のモノクローナル抗体と既存のノクローナル抗体Ｃ７６−１８と１Ｎ７を一次抗体として使用した。各モノクローナル抗体を20μg/mlの濃度になるように0.05M炭酸−重炭酸緩衝液（pH9.6）に溶解し、50μl/ウェルにて９６ウェルプレートへ添加し、４℃にて一昼夜（12時間程度以上）または37℃にて２時間以上おいた。この一次抗体付着プレートより一次抗体溶液を除いた後、1% BSAを含むPBS(-)を250〜300μl/ウェルずつ添加し、４℃にて一昼夜（12時間程度）または37℃にて２時間以上おくことによりブロッキング操作を行った。このプレートからブロッキング溶液を除き、0.15M NaCl, 0.05% Tween20, 1% BSA, 20mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）に溶解された種々の濃度（０、 ０．６２５、１．２５、２．５０、５．００、１０．０、 ２０．０、４０．０ ng/ml）の可溶性ＨＡＩ−１を５0μｌずつ添加し、室温にて１時間反応させた。
【００６０】
この後、500mM NaCl, 0.05% Tween 20, 20mM Tris-HCl pH7.5を組成とする洗浄液を使用して十分な洗浄を行なった後、実施例３で作製したビオチン標識抗可溶性ＨＡＩ−１ポリクローナル抗体１０μg/mlおよび１％BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加し、室温にて１時間反応させた。
【００６１】
次に上記の洗浄液を使用して十分な洗浄を行ない、HRP標識ストレプトアビジン（アマシャムファルマシアバイオテク、コードRPN1231）を２０００倍希釈した１％ BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。洗浄液液で充分に洗浄操作を行った後、0.4mg/mlオルトフェニレンジアミン（OPD、Sigma社 P-9029）および0.015〜0.03%過酸化水素溶液を含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH5.0）を100μl/ウェルずつ添加して室温にて反応させ、発色を行なった。
【００６２】
この後、１Ｎ H2SO4溶液を100μl/ウェルずつ添加して反応を止め、測定波長490nm、リファレンス波長650nmにて測定を行なった。この結果を図１に示す。図１Ａは可溶性ＨＡＩ−１の濃度、0〜40ng/mlの範囲で記載した。図１Ｂは図１Ａに記した可溶性ＨＡＩ−１の濃度のうち、0〜2.5ng/mlの範囲を拡大して示した。本発明で得られたハイブリドーマクローンＨＡＩ−１Ａ−１−１−３−４のみ、反応曲線が濃度依存的に得られ、他の既存抗体Ｃ７６−１８と１Ｎ７では反応性がみられなかった。
【００６３】
【実施例４】
ＨＡＩ−１特異的高親和性モノクローナル抗体の解離定数測定実施例１にて作製・精製された可溶性ＨＡＩ−１特異的高親和性モノクローナル抗体のうち、ハイブリドーマクローンＨＡＩ−１Ａ−１−１−３−４由来のモノクローナル抗体と既存の抗体Ｃ７６−１８と１Ｎ７について解離定数を測定した。可溶性ＨＡＩ−１を固相化し、ＢＳＡでブロッキングをおこなった可溶性ＨＡＩ−１固相化プレートに対して各抗体それぞれ、濃度を変えて添加し、反応を平衡状態に達するまで十分にさせた（２時間以上）。
【００６４】
この後、0.05% Tween20を含むPBS(-)液（以下「PBST液」と略す）を用いて十分な洗浄を行ない、HRP（西洋わさびペルオキシターゼ）標識ヤギ抗マウスIgG・Fcポリクローナル抗体（ＩＣＮ社）１μg/mlおよび１％ BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。PBST液で充分に洗浄操作を行った後、0.4mg/mlオルトフェニレンジアミン（OPD、Sigma社 P-9029）および0.015〜0.03%過酸化水素溶液を含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH5.0）を添加して室温にて反応させ、発色を行なった。
【００６５】
この後、１Ｎ H2SO4溶液を添加して反応を止め、測定波長490nm、リファレンス波長650nmにて測定を行なった。測定結果よりスキャチャードプロットを行い、解離定数を求めた。結果を表１に示す。本発明で得られたモノクローナル抗体が最も解離定数の小さい、すなわち親和性が高い結果が得られた。
【００６６】
【表１】
0004803943.tif 000002
【００６７】
【実施例５】
健常人血液中おけるＨＡＩ−１量の測定
実施例３で作製した可溶性ＨＡＩ−１特異的高感度測定系を用いて、健常人５６人の血清中の可溶性ＨＡＩ−１を測定した。健常人血清は採取後に凍結して保存され、本実験の直前に解凍して使用した。まず実施例３で作製した一次抗体付着後にブロッキング操作を行った９６ウェルプレートに対し、あらかじめ0.15M NaCl, 0.05% Tween20, １% BSA, 20mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.5を50μlずつウェルに添加し、さらに健常人の血清または標準可溶性ＨＡＩ−１（０、 ０．６２５、２．５、１０、 ４０ ng/ml）を50μlずつ添加した。この後、室温にて１時間反応させ、500mM NaCl, 0.05% Tween 20, 20mM Tris-HCl（pH7.5）を組成とする洗浄液を使用して十分な洗浄を行なった後、実施例３で作製したビオチン標識抗可溶性ＨＡＩ−１ポリクローナル抗体１０μg/mlおよび１％BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加し、室温にて１時間反応させた。次に上記の洗浄液を使用して十分な洗浄を行ない、HRP標識ストレプトアビジン（アマシャムファルマシアバイオテク、コードRPN1231）を２０００倍希釈した１％ BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。
【００６８】
洗浄液液で充分に洗浄操作を行った後、0.4mg/mlオルトフェニレンジアミン（OPD、Sigma社 P-9029）および0.015〜0.03%過酸化水素溶液を含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH5.0）を100μl/ウェルずつ添加して室温にて反応させ、発色を行なった。この後１Ｎ H2SO4溶液を100μl/ウェルずつ添加して反応を止め、測定波長490nm、リファレンス波長650nmにて測定を行なった。この後、標準可溶性ＨＡＩ−１濃度とその発色量による検量線を作製し、健常人血清中の濃度を算出した。この結果を図２に示す。健常人血清（検体数56）においては、0ng/mlから13.5ng/mlまでの範囲を示し、平均は7.5ng/mlであった。
【００６９】
【実施例６】
各種ヒト疾患患者血液中におけるＨＡＩ−１量の測定
実施例３で作製したＨＡＩ−１特異的測定系を用い、実施例５の方法に従って各種ヒト疾患患者血清中の可溶性ＨＡＩ−１を測定した。患者数は、各疾患毎に５例とした。各血清は採取後に凍結して保存され、本実験の直前に解凍して使用した。その結果を表２に示す。腎炎、肝炎、膵炎、肺癌、肝臓癌、心筋梗塞、脳梗塞、肝細胞癌、膵臓癌の患者血液中には、健常人（検体数56、平均値7.5ng/ml）と比較して可溶性ＨＡＩ−１の濃度が高値であることが判った。
【００７０】
【表２】
0004803943.tif 000003
【００７１】
【発明の効果】
本発明により、可溶性ＨＡＩ−１に特異的に結合するモノクローナル及びポリクローナル抗体が提供される。本発明の抗体は、可溶性ＨＡＩ−１の特異的かつ高感度な測定、検出に用いることができる。
【００７２】
本発明の可溶性ＨＡＩ−１の測定法は、可溶性ＨＡＩ−１の血中濃度に反映される各種疾患の診断に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＨＡＩ−１測定系における標準ＨＡＩ−１と各モノクローナル抗体との反応性を示した図である。ＡはＨＡＩ−１の濃度、0〜40ng/mlの範囲で記載、ＢはＡに記したＨＡＩ−１の濃度のうち、0〜2.5ng /mlの範囲を拡大して示した。◆はＨＡＩ−１Ａ−１−１−３−４、□はＣ７６−１８、三角は１Ｎ７を示す。
【図２】  健常人血清中におけるＨＡＩ−１量のヒストグラムを示した図である。
【図１】
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【図２】
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