(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化プロテインＣ(以下ＡＰＣと称することがある)を含有することを特徴とする、アナンダマイド(以下ＡＮＡと称することがある)及び２−アラキドニルグリセロール(以下２−ＡＧと称することがある)より選択される内因性大麻物質の産生抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】
本願発明は、医療用医薬品の分野に属する血漿蛋白質の新たな用途に関する。詳細には、内因性大麻物質の過剰反応によって惹き起こされる様々な障害に対する医薬品に関する。さらに詳細には、活性化プロテインＣ(以下ＡＰＣと称することがある)を主たる有効成分として含有する、アナンダマイド(以下ＡＮＡと称することがある)及び／または２−アラキドニルグリセロール(以下２−ＡＧと称することがある)等内因性大麻物質の産生を抑制し、当該内因性大麻物質によって惹起される様々な障害の予防・治療剤を提供し得る内因性大麻物質の産生抑制剤に関する。
【従来の技術並びに発明が解決しようとする課題】
【０００２】
アナンダマイドおよび２−アラキドニルグリセロールは、内因性カンナビノイド(内因性大麻物質(マリファナ))の一種である。大麻は多彩な生理作用を有していることは周知の事実であるが、その生理活性成分はカンナビノイド(Δ９−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−ｃａｎｎａｂｉｎｏｌ)と呼ばれる。当該カンナビノイドは主として中枢神経系に発現しているＣＢ１受容体やその他の細胞に発現しているＣＢ２受容体を介して多彩な生理作用を発揮するが、この大麻受容体のＣＢ１、ＣＢ２に結合する内因性の大麻様物質がＡＮＡと２−ＡＧである。ＡＮＡは、人工的には脂質成分のアラキドニルフォスファチジルエタノールアミンをフォスフォリパーゼ−Ｄで加水分解することにより、また、２−ＡＧはフォスファチヂルイノシトール２リン酸を出発材料にし、フォスフォリパーゼ−Ｃにより加水分解され形成されるジアシルグリセロール(ＤＡＧ)を更にＤＡＧリパーゼで処理することによって合成できる。
【０００３】
ＡＮＡや２−ＡＧはその受容体と結合すると神経系、免疫系、止血系で多彩な生理作用を発揮する。脳では海馬に豊富に受容体があり、短期記憶障害を惹き起こす。その他神経系の作用としては多幸感、緊張緩和、幻覚、睡眠、離人感、痛覚抑制、眼圧低下、制吐、抗痙攣作用などである。また、神経細胞のアポトーシスを惹起するとの報告もある。免疫系に対しては一定量を越すと抑制的に作用し、止血系では血小板凝集の抑制作用が知られている。
エンドトキシンショックでは血圧低下が起こるが、この原因物質が何かについては明確な結論を得ていない。炎症性サイトカイン(ＩＬ−１、ＴＮＦ−α)や一酸化窒素(ＮＯ)がその候補として挙げられているが、それらの抗体やインヒビターが治療効果を奏していないことから、別な未知の因子の存在が想定されていた。この様な中、ラットの系でＬＰＳにより刺激されたマクロファージからＡＮＡが、血小板から２−ＡＧ が放出され、これがエンドトキシン性低血圧の真の原因メディエーターであるという論文が発表され、内因性カンナビノイドがエンドトキシ・ショックの低血圧のメディエーターの最有力候補として躍りでてきた(ＦＡＳＥＢ Ｊ.,１２: １０３５−１０４４, １９９８)。このように、内因性カンナビノイドの過剰発現は様々な障害につながることから、その過剰発現を制御する薬剤の開発が望まれていた。
【０００４】
【問題を解決するための手段、発明の構成】
そこで、本願発明者らは内因性カンナビノイドの過剰発現を制御する薬剤を開発すべく鋭意研究した結果、驚くべきことに、従来試みられることのなかったＡＰＣに内因性カンナビノイドの産生抑制作用があることを見出し、この知見に基づいて本願発明を完成するに至った。
【０００５】
ＡＰＣは血中ではその前駆体のＰＣとして循環しているが、一旦凝固系が作動しトロンビンが形成されると、ＰＣは活性化されセリンプロテアーゼ活性を有するＡＰＣに変換される。ＡＰＣは、細胞膜リン脂質上で、血液凝固系の活性化第Ｖ因子や第VIII因子を選択的に限定分解し失活化させ、強力な抗凝固作用を発揮する(Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ,ｖｏｌ.１６,ｐ.５８２４−５８３１,１９７７；Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ.,ｖｏｌ.２５８,ｐ.１９１４−１９２０,１９８２)。また、ＡＰＣは血管内皮細胞あるいは血小板由来の組織プラスミノーゲン・アクチベーター・インヒビター(ＰＡＩ)を中和することにより(Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ,ｖｏｌ.８２,ｐ.１１２１−１１２５,１９８５)、また抗線溶因子のＴＡＦＩ(Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ)の活性化を抑制することにより、線溶系の亢進に関与していると考えられている(Ｂｌｏｏｄ,ｖｏｌ.８８,ｐ.２０９３−２１００,１９９６)。さらに、ＡＰＣは敗血症モデルにおいても有効性が示されていること(Ｊ.Ｃｌｉｎ.Ｉｎｖｅｓｔ.,ｖｏｌ.７９,ｐ.９１８−９２５,１９８７)、また白血球からのサイトカイン産生を抑制する作用も有することから(Ａｍ.Ｊ.Ｐｈｙｓｉｏｌ.,ｐ.Ｌ１９７−Ｌ２０２,１９９７)、ＡＰＣは抗炎症作用を有することが示唆されている。
【０００６】
本願発明に使用されるＡＰＣを製造する方法は特に限定されるものではないが、例えばヒト血液より分離した、あるいは遺伝子組換え技術により得られたＰＣを活性化する方法、ヒト血液よりＡＰＣを分離する方法、あるいは遺伝子組換え技術により直接ＡＰＣを調製する方法などによって製造することができる。ＰＣからＡＰＣへの活性化の方法には特に制約はなく、例えばヒトやウシなどの血液より分離したトロンビンにより活性化する方法、あるいは合成ペプチドにより活性化する方法などにより実施できる。
【０００７】
血液由来のＡＰＣの製法としては、以下の方法が挙げられる。例えば、ヒト血漿から抗ＰＣ抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製されたＰＣを、ヒトトロンビンで活性化した後、陽イオンクロマトグラフィーを用いて精製する方法(Ｂｌｏｏｄ,ｖｏｌ.６３,ｐ.１１５−１２１,１９８４)あるいはＫｉｓｉｅｌによる、ヒト血漿からクエン酸Ｂａ吸着・溶出、硫安分画、ＤＥＡＥ−セファデックスカラムクロマトグラフィー、デキストラン硫酸アガロースクロマトグラフィー及びポリアクリルアミドゲル電気泳動の工程により精製して得られたＰＣを活性化してＡＰＣとする方法(Ｊ.Ｃｌｉｎ.Ｉｎｖｅｓｔ.,ｖｏｌ.６４,ｐ.７６１−７６９,１９７９)、あるいは市販のＰＣを含有する血液凝固製剤を出発材料にして抗ＰＣ抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製されたＰＣを活性化してＡＰＣとする方法(Ｊ.Ｃｌｉｎ.Ｉｎｖｅｓｔ.,ｖｏｌ.７９,ｐ.９１８−９２５,１９８７)などがある。
【０００８】
また、遺伝子組換え技術を用いてＡＰＣを調製する方法としては、例えば特開昭６１−２０５４８７号、特開平１−２３３８号あるいは特開平１−８５０８４号などに記載された方法などがある。
【０００９】
上述の方法で調製されたＡＰＣの活性を最大限に維持するために、本願発明のＡＰＣは新鮮であるか、４℃で保存する場合には保存後約５日以内のものが好ましい。あるいは本願発明のＡＰＣは好適な安定化剤と共に凍結乾燥して保存することができるし、さらには、ＡＰＣ溶液を凍結し保存することも可能である。本願発明では、有効成分としてのＡＰＣと公知の適当な賦形剤を組み合わせ、公知の方法で本願発明の内因性大麻物質であるアナンダマイドの産生抑制作剤とすることが出来る。
【００１０】
今回の実施例に使用した血液由来のＡＰＣ は、マウスでの単回静脈内投与試験、反復静脈内投与試験、一般薬理試験(ビーグル犬を用いた呼吸循環系に及ぼす影響)、ウイルス不活化試験などによりその安全性が確認されている。更に汎発性血管内血液凝固症候群(ＤＩＣ)を適応症とした臨床試験も実施されておりヒトでの安全性も確認されている。以下、実施例に沿って本願発明を更に詳細に説明するが、この実施例は本願発明の範囲を何ら限定するものではない。
【００１１】
【実施例】
実施例１
(ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験でのＡＰＣによるＡＮＡ産生抑制効果)
ウシ胎児血清を含むＤＭＥ培地で培養したマウスのマクロファージ様細胞のＲＡＷ２６４.７細胞を用い、ＡＰＣのＡＮＡ産生抑制効果を試験した。培養細胞に各種濃度(０〜１００μｇ/ｍｌ)のＡＰＣを加え１時間インキュベーション後、１００μｇ/ｍｌのＬＰＳを添加し更に２時間インキュベーションしたときに産生される培地中のＡＮＡ量を逆相クロマトグラフィーにより定量した。ＬＰＳ刺激によりＲＡＷ２６４.７細胞から産生されるＡＮＡの産生が、添加したＡＰＣ濃度依存的に抑制された(図１)。
【００１２】
実施例２
(ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験でのＡＰＣによる２−ＡＧ産生抑制効果)
ヒトおよびブタ多血小板血漿(Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ Ｒｉｃｈ Ｐｌａｓｍａ：ＰＲＰ)に０〜１００μｇ/ｍｌの種々の濃度のＡＰＣを加え１時間インキュベーション後、１００μｇ/ｍｌのＬＰＳを添加し更に２時間インキュベーションした。遠心し血小板を除去後、残った血漿中の２−ＡＧ量を逆相クロマトグラフィーにより定量した。
ＬＰＳ刺激によりヒトおよびブタ血小板から惹起される２−ＡＧ産生をＡＰＣは濃度依存的に抑制した(図２)。
【００１３】
実施例３
(ｉｎ ｖｉｖｏ試験でのＡＰＣによるＡＮＡおよび２−ＡＧ産生抑制効果)
ラットに２ｍｇ/ｋｇ/時間のＡＰＣあるいは生理食塩水を１時間持続投与後、１ｍｇ/ｋｇ/時間のＬＰＳを３時間にわたって持続投与した時産生される血清中のＡＮＡおよび２−ＡＧ量をＬＰＳ投与１.５時間後、３時間後で、逆相クロマトグラフィーにより定量した。ラット血清中のＡＮＡおよび２−ＡＧ量はＡＰＣ投与群において有意に低下していた(図３)。
【図面の簡単な説明】
【図１】  ＬＰＳで活性化されたＲＡＷ２６４.７細胞(マウスのマクロファージ様細胞)からのＡＮＡ産生をＡＰＣが濃度依存的に抑制することを示す図である。
【図２】  ＬＰＳ で刺激したブタおよびヒト血小板からの２−ＡＧ産生をＡＰＣが濃度依存的に抑制することを示す図である。
【図３】  ＬＰＳを投与した時上昇するラット血清中のＡＮＡおよび２−ＡＧ濃度をＡＰＣが低下させることを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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