(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リゾムコール属、アルカリゲネス属、リゾプス属及びサーモマイセス属由来のリパーゼからなる群から選ばれる1,3-特異性リパーゼと牛乳又は牛乳由来のクリ−ムの固形分を含有する造粒物であるリパーゼ粉末であって、前記リパーゼ粉体が、
(a)前記1,3-特異性リパーゼを含有するリパーゼ含有水溶液に前記牛乳又は牛乳由来のクリームを添加し、ｐＨ６〜７.５のリパーゼ含有水溶液の混合物を得る工程であって、前記牛乳又は牛乳由来のクリームの固形分が前記リパーゼ含有水溶液の固形分質量の０．３〜５倍の量となるように添加する工程、及び
(b)前記ｐＨ６〜７.５のリパーゼ含有水溶液の混合物をスプレードライ、フリーズドライ又は溶剤沈澱する工程、
を含む方法により得られることを特徴とするリパーゼ粉末。
【請求項２】
1,3-特異性リパーゼが、リゾムコール  ミーヘイ（Rhizomucor miehei）由来の1,3-特異性リパーゼである請求項１記載のリパーゼ粉末。
【請求項３】
水分含量が１０質量％以下である請求項１又は２記載のリパーゼ粉末。
【請求項４】
リパーゼ粉末の90質量％以上が粒径1〜100μｍである請求項１〜３のいずれか１項記載のリパーゼ粉末。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載のリパーゼ粉末が油脂に浸漬又は浸潤されているリパーゼ組成物。
【請求項６】
(a)リゾムコール属、アルカリゲネス属、リゾプス属及びサーモマイセス属由来のリパーゼからなる群から選ばれる1,3-特異性リパーゼを含有するリパーゼ含有水溶液に牛乳又は牛乳由来のクリームを添加し、ｐＨ６〜７.５のリパーゼ含有水溶液の混合物を得る工程であって、前記牛乳又は牛乳由来のクリームの固形分が前記リパーゼ含有水溶液の固形分質量の０．３〜５倍の量となるように添加する工程、及び
(b)前記ｐＨ６〜７.５のリパーゼ含有水溶液の混合物をスプレードライ、フリーズドライ又は溶剤沈澱する工程、
を含むことを特徴とするリパーゼ粉末の製造方法。
【請求項７】
前記牛乳又は牛乳由来のクリームを添加する前のリパーゼ含有水溶液が、菌体を除去したリパーゼ培養液、またはその精製培養液である請求項６記載の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項記載のリパーゼ粉末を含有するエステル交換又はエステル化用リパーゼ。
【請求項９】
請求項８記載のエステル交換用リパーゼを用いることを特徴とする油脂のエステル交換方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、各種エステル化反応、エステル交換反応などに好適に使用することができるリパーゼ粉末、その製造方法、リパーゼ粉末が油脂に浸漬又は浸潤されてなるリパーゼ組成物、該リパーゼ粉末を用いる油脂のエステル交換方法などに関するものである。【０００２】（発明の背景）
リパーゼは、脂肪酸などの各種カルボン酸とモノアルコールや多価アルコールなどのアルコール類とのエステル化反応、複数のカルボン酸エステル間のエステル交換反応などに幅広く使用されている。このうち、エステル交換反応は動植物油脂類の改質をはじめ、各種脂肪酸のエステル、糖エステルやステロイドの製造法として重要な技術である。これらの反応の触媒として、油脂加水分解酵素であるリパーゼを用いると、室温ないし約７０℃程度の温和な条件下でエステル交換反応を行うことができ、従来の化学反応に比べ、副反応の抑制やエネルギーコストが低減化されるだけでなく、触媒としてのリパーゼが天然物であることから安全性も高い。また、その基質特異性や位置特異性により目的物を効率良く生産することができる。ところが、リパーゼ粉末をそのままエステル交換反応に用いても活性が十分に発現しないばかりか、元来が水溶性のリパーゼを油性原料中に均一に分散させることは困難であり、その回収も困難である。このため、従来はリパーゼを何らかの担体、たとえば陰イオン交換樹脂（特許文献１）、フェノール吸着樹脂（特許文献２）、疎水性担体（特許文献３）、陽イオン交換樹脂（特許文献４）、キレート樹脂（特許文献５）等に固定化してエステル化やエステル交換反応などに用いることが一般的である。【０００３】  このように、従来はリパーゼを固定化してエステル交換反応に用いていたが、かかる固定化リパーゼは固定化処理による本来のリパーゼ活性の損失を伴うだけでなく、多孔性担体を用いた場合は細孔に原料や生成物が詰まり、結果としてエステル交換率の低下を招いていた。さらに、従来の固定化リパーゼを用いたエステル交換反応においては、担体が保持する水分が反応系に持ち込まれるため、副反応、たとえば油脂類のエステル交換反応におけるジグリセリドやモノグリセリドの生成等を避けることは困難であった。
このような状況に鑑み、リパーゼ粉末を用いる各種技術が開発されている。例えば、不活性有機溶媒の存在下または非存在下、エステル交換反応時に分散リパーゼ粉末粒子の９０％以上を１〜１００μｍの範囲の粒径に保つように、エステルを含有する原料にリパーゼ粉末を分散させてエステル交換反応を行う方法が提案されている（特許文献６）。又、リン脂質および脂溶性ビタミンを含む酵素溶液を乾燥してえた酵素粉末を用いることが提案されている（特許文献７）。
しかしながら、さらにリパーゼ活性及び安定性が向上したリパーゼ粉末が求められている。【０００４】
【特許文献１】特開昭６０−９８９８４号公報
【特許文献２】特開昭６１−２０２６８８号公報
【特許文献３】特開平２−１３８９８６号公報
【特許文献４】特開平３−６１４８５号公報
【特許文献５】特開平１−２６２７９５号公報
【特許文献６】特許第２６６８１８７号公報
【特許文献７】特開２０００−１０６８７３号公報
【発明の開示】
【０００５】  本発明は、リパーゼ活性及び安定性が向上したリパーゼ粉末を提供することを目的とする。
本発明は、又、１，３選択性が向上したリパーゼ粉末を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末を油脂に浸漬又は浸潤されてなるリパーゼ組成物を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末の製造方法を提供することを目的とする。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末を用いる油脂のエステル交換方法を提供することを目的とする。
本発明のこれらの目的及び他の目的は、以下の記載から明らかとなるであろう。
【０００６】  本発明は、リパーゼを獣乳の固形分を用いて造粒し、粉末状にすると、リパーゼ活性及び安定性が各段に向上すること、及びリパーゼが１，３特異性リパーゼの場合には、その１，３選択性が各段に向上するとの知見に基づいてなされたのである。
すなわち、本発明は、リパーゼと獣乳の固形分を含有する造粒物であることを特徴とするリパーゼ粉末を提供する。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末が油脂に浸漬又は浸潤されているリパーゼ組成物を提供する。
本発明は、又、リパーゼ含有水溶液に獣乳又は獣乳由来のクリームを添加し、スプレードライ、フリーズドライ又は溶剤沈澱することを特徴とするリパーゼ粉末の製造方法を提供する。
本発明は、又、上記リパーゼ粉末を含有するエステル交換用又はエステル化用リパーゼを提供する。
本発明は、又、エステル交換用リパーゼを用いることを特徴とする油脂のエステル交換方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】  本発明で用いるリパーゼとしては、リポプロテインリパーゼ、モノアシルグリセロリパーゼ、ジアシルグリセロリパーゼ、トリアシルグリセロリパーゼ、ガラクトリパーゼ、フォスフォリパーゼ等が挙げられる。これらのうち、トリアシルグリセロリパーゼが好ましい。
これらのリパーゼを産生する微生物としては、細菌、酵母、糸状菌、放線菌等特に限定されるものではないが、シュードモナス属（Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．）、アスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）、エスチエリシア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、マイコトルラ属（Ｍｉｃｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐ．）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｕｍ  ｓｐ．）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｕｍ  ｓｐ．）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、クロストリデイウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、キャンデイダ属（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）、ジオトリカム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）、サッカロマイコプシス属（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）、ノカルデイア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐ．）、フザリウム属（Ｆｕｚａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．）、フィコマイセス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓｅ  ｓｐ．）、プチニア属（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｐ．）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓｅ  ｓｐ．）、サーモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）などが挙げられる。
本発明では、これらのうち、１，３−特異性リパーゼが好ましく、特に、リゾムコール属及びアルカリゲネス属由来の１，３−特異性リパーゼが好ましく、さらにリゾムコール属のＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ及びアルカリゲネス属のＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．由来の１，３−特異性リパーゼが好ましい。尚、従来、リゾムコール  ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）は、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．）として扱われていた場合もある。
本発明では、又、リゾプス属及びサーモマイセス属由来の１，３−特異性リパーゼが好ましく、特に、リゾプス  オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）及びサーモマイセス  ラヌゲノウス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｅｎｏｕｓｕ）由来の１，３−特異性リパーゼが好ましい。【０００８】  本発明で用いる獣乳としては、牛乳、山羊乳などがあげられる。これらのうち、牛乳が好ましく、特に、獣乳の固形分としては、牛乳又は牛乳由来のクリ−ムの固形分が好ましい。
リパーゼと獣乳の割合は、種々の割合とすることができるが、獣乳の固形分で、リパーゼ質量の０．１〜２０倍の量とするのが好ましく、１〜２０倍の量とするのがより好ましい。
本発明のリパーゼ粉末は、リパーゼと獣乳の固形分を含有することを必須とするが、これ以外に、リパーゼの培地成分などを含有することができる。
本発明のリパーゼ粉末は、水分含量が１０質量％以下であるのが好ましく、特に、６．５〜８．５質量％であるのが好ましい。
本発明のリパーゼ粉末の粒径は任意とすることができるが、リパーゼ粉末の９０質量％以上が粒径１〜１００μｍであるのが好ましい。平均粒径は２０〜８０μｍが好ましく、より好ましくは２０〜５０μｍである。又、リパーゼ粉末の粒径は球状であるのが好ましい。
リパーゼ粉末の粒径は、例えば、ＨＯＲＩＢＡ社の粒度分布測定装置（ＬＡ−５００）を用いて測定することができる。【０００９】  本発明のリパーゼ粉末は、例えば、リパーゼ含有水溶液に獣乳又は獣乳由来のクリームを添加し、スプレードライ、フリーズドライ又は溶剤沈澱した後乾燥する方法により得ることができる。ここで、溶剤沈澱法で用いる溶剤として、例えば、エタノール、アセトン、メタノール、イソプロピルアルコール、及びヘキサン等が挙げられ、これらの混合溶剤も使用することができる。その中でもリパーゼ粉末の活性をより高めるために、エタノール又はアセトンを用いることが好ましい。また、溶剤沈澱した後の乾燥は、例えば、減圧乾燥により行うことができる。
ここで、リパーゼ含有水溶液としては、菌体を除去したリパーゼ培養液、精製培養液、これらから得たリパーゼ粉末を再度水に溶解・分散させたもの、市販のリパーゼ粉末を再度水に溶解・分散させたもの、市販の液状リパーゼ等が挙げられる。さらに、リパーゼ活性をより高めるために塩類等の低分子成分を除去したものがより好ましく、また、粉末性状をより高めるために糖等の低分子成分を除去したものがより好ましい。
リパーゼ培養液としては、例えば、大豆粉、ペプトン、コーン・ステープ・リカー、Ｋ２ＨＰＯ４、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ等含有する水溶液があげられる。これらの濃度としては、大豆粉０．１〜２０質量％、好ましくは１．０〜１０質量％、ペプトン０．１〜３０質量％、好ましくは０．５〜１０質量％、コーン・ステープ・リカー０．１〜３０質量％、好ましくは０．５〜１０質量％、Ｋ２ＨＰＯ４０．０１〜２０質量％、好ましくは０．１〜５質量％である。又、（ＮＨ４）２ＳＯ４は０．０１〜２０質量％、好ましくは０．０５〜５質量％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏは０．０１〜２０質量％、好ましくは０．０５〜５質量％である。培養条件は、培養温度は１０〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃、通気量は０．１〜２．０ＶＶＭ、好ましくは０．１〜１．５ＶＶＭ、攪拌回転数は１００〜８００ｒｐｍ、好ましくは２００〜４００ｒｐｍ、ｐＨは３．０〜１０．０、好ましくは４．０〜９．５に制御するのがよい。【００１０】  菌体の分離は、遠心分離、膜濾過などで行うのが好ましい。また、塩類や糖等の低分子成分の除去は、ＵＦ膜処理により行うことができる。具体的には、ＵＦ膜処理を行い、リパーゼを含有する水溶液を１／２量の体積に濃縮後、濃縮液と同量のリン酸バッファーを添加するという操作を１〜５回繰り返すことにより、低分子成分を除去したリパーゼ含有水溶液を得ることができる。
遠心分離は２００〜２０，０００×ｇ、膜濾過はＭＦ膜、フィルタープレスなどで圧力を３．０ｋｇ／ｍ２以下にコントロールするのが好ましい。菌体内酵素の場合は、ホモジナイザー、ワーリングブレンダー、超音波破砕、フレンチプレス、ボールミル等で細胞破砕し、遠心分離、膜濾過などで細胞残さを除去することが好ましい。ホモジナイザーの攪拌回転数は５００〜３０，０００ｒｐｍ、好ましくは１，０００〜１５，０００ｒｐｍ、ワーリングブレンダーの回転数は５００〜１０，０００ｒｐｍ、好ましくは１，０００〜５，０００ｒｐｍである。攪拌時間は０．５〜１０分、好ましくは１〜５分がよい。超音波破砕は１〜５０ＫＨｚ、好ましくは１０〜２０ＫＨｚの条件で行うのが良い。ボールミルは直径０．１〜０．５ｍｍ程度のガラス製小球を用いるのがよい。
本発明では、リパーゼ含有水溶液としては、固形分として５〜３０質量％含むものを用いるのが好ましい。【００１１】  添加する獣乳又は獣乳由来のクリームは、その固形分で、リパーゼ含有水溶液の固形分質量の０．１〜２０倍の量であるのが好ましく、０．３〜１０倍の量であるのがより好ましく、０．３〜５倍の量が最も好ましい。
ここで、リパーゼ含有水溶液中の固形分濃度、及び獣乳又は獣乳由来のクリーム中の固形分濃度は、例えば、糖度計（（株）シー・アイ・エス社製  ＢＲＸ−２４２）を用いてＢｒｉｘ．％として求めることができる。
獣乳又は獣乳由来のクリームを添加した後、リパーゼ含有水溶液のｐＨを６〜７．５に調整するのが好ましい。特にｐＨを７．０以下に、さらにｐＨを６．５〜７．０の範囲となるように調整するのが好ましい。ｐＨ調整は、スプレードライなどの乾燥工程の直前に行うのが好ましいが、その前のいずれかの工程において行ってもよく、乾燥工程の直前のｐＨが上記範囲内となるように、予めリパーゼ含有水溶液のｐＨを調整しておいてもよい。ｐＨ調整には、各種アルカリ剤や酸を用いることができるが、水酸化ナトリウムなどアルカリ金属水酸化物を用いるのが好ましい。
又、乾燥工程前の途中の工程において、リパーゼ含有水溶液を濃縮してもよい。濃縮方法は、特に限定されるものではないが、エバポレーター、フラッシュエバポレーター、ＵＦ膜濃縮、ＭＦ膜濃縮、無機塩類による塩析、溶剤による沈殿法、イオン交換セルロース等による吸着法、吸水性ゲルによる吸水法等があげられる。好ましくはＵＦ膜濃縮、エバポレーターがよい。ＵＦ膜濃縮用モジュールとしては、分画分子量３，０００〜１００，０００、好ましくは６，０００〜５０，０００の平膜または中空糸膜、材質はポリアクリルニトリル系、ポリスルフォン系などが好ましい。【００１２】  スプレードライは、例えば、ノズル向流式、デイスク向流式、ノズル並流式、デイスク並流式等の噴霧乾燥機を用いて行うのがよい。好ましくはデイスク並流式が良く、アトマイザー回転数は４，０００〜２０，０００ｒｐｍ、加熱は入口温度１００〜２００℃、出口温度４０〜１００℃で制御してスプレードライするのが好ましい。
又、フリーズドライ（凍結乾燥）も好ましく、例えば、ラボサイズの少量用凍結乾燥機、棚段式凍結乾燥により行うのが好ましい。さらに、減圧乾燥により調製することもできる。
このようにして調製されたリパーゼ粉末はそのまま使用することができるが、油脂に浸漬又は浸潤させたリパーゼ組成物として用いるのが取り扱い性の点から好ましい。ここで、リパーゼ組成物中の油脂の質量は、リパーゼ粉末に対し０．１〜２０倍であるのが好ましく、１〜２０倍であるのがより好ましい。【００１３】  このリパーゼ組成物は、スプレードライなどにより製造されたリパーゼ粉末に油脂を添加し、スターラーやスリーワンモーター等で均一に攪拌する方法やスプレードライヤーの粉末回収部に予め油脂を添加しておき、回収後に均一に攪拌し、濾過により過剰の油脂を除去する方法により容易に得ることができる。
リパーゼ粉末に含浸させる油脂としては、特に限定されず、菜種油、大豆油、ハイオレイックヒマワリ油、オリーブ油、サフラワー油、コーン油、ヤシ油、ゴマ油などの植物油、トリオレイン（グリセリン  トリオレエート）、トリカプリリン（グリセリン  トリオクタノエート）、トリアセチン（グリセリン  トリアセテート）、トリブチリン（グリセリン  トリブチレート）などのトリアシルグリセロール、脂肪酸エステル、ステロールエステルなどの１種又は２種以上の混合物があげられる。
リパーゼが、１，３−特異性リパーゼである場合、特に、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ又はＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．由来のリパーゼである場合には、本発明によると１，３−選択性が極めて高くなるので、該リパーゼ粉末をエステル交換用リパーゼ又はエステル化用リパーゼとして好適に使用することができる。そして、このリパーゼ粉末を用い、常法により、油脂などのエステル交換反応、油脂と脂肪酸エステルとのエステル交換反応、アルコリシスやアシドリシスのエステル交換反応、又はグリセリンと脂肪酸とのエステル化反応を効率的に行うことができる。【００１４】  本発明によれば、リパーゼ活性及び安定性が向上したリパーゼ粉末が提供される。又、リパーゼが１，３特異性リパーゼの場合には、その１，３選択性が各段に向上し、原料トリグリセリド２位の脂肪酸残基を極めて高い割合で、エステル交換製品中に保持することができる。
次に本発明を実施例により詳細に説明する。
【実施例】
【００１５】［実施例１］
水溶液にリパーゼが溶解・分散した形態にあるノボザイムズ  ジャパン（株）社製のＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ由来の液状リパーゼ（商品名Ｐａｌａｔａｓｅ２００００Ｌ）を、ＵＦモジュール（旭化成工業（株）社製ＳＩＰ−００１３）を用いて低分子成分を除去してリパーゼ含有水溶液１（固形分濃度２０．１質量％）を得た。詳しくは、液状リパーゼ（パラターゼ２００００Ｌ）を氷冷下でＵＦ膜処理を行い、１／２量の体積に濃縮後、濃縮液と同量のｐＨ７の０．０１Ｍリン酸バッファーを添加した。得られた溶液について、同じようにＵＦ膜処理後リン酸バッファーを添加する操作を２回繰り返した後、さらにＵＦ膜処理をし、得られたリパーゼ濃縮液をリパーゼ含有水溶液１とした。
このリパーゼ含有水溶液１、２０ｍｌに対して、牛乳（小岩井乳業（株）社製小岩井牛乳おいしさしたて：固形分濃度１２．９質量％）２０ｍｌを添加した。このようにして得られた溶液のｐＨを水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ６．８〜６．９に調整した。
リパーゼ濃縮液（＝リパーゼ含有水溶液１）：牛乳の体積比は、１：１であり、牛乳の固形分は、リパーゼ含有水溶液１の固形分質量の０．６４倍の量であった。
この液を、スプレードライヤー（ＳＤ−１０００型：東京理化器械（株）社製）を用い、入口温度１３０℃、乾燥空気量０．７〜１．１ｍ３／ｍｉｎ、噴霧圧力１１〜１２ｋｐａの条件下噴霧し、リパーゼ粉末を得た。リパーゼ粉末粒子の形状は球状で、リパーゼ粉末の９０質量％以上が粒径１〜１００μｍの範囲内にあり、平均粒径は７．６μｍであった。粒径は、ＨＯＲＩＢＡ社の粒度分布測定装置（ＬＡ−５００）を用いて測定した。
尚、リパーゼ含有水溶液中の固形分濃度及び牛乳の固形分濃度は、以下の方法により求めた。
糖度計（（株）シー・アイ・エス社製  ＢＲＸ−２４２）を用いてＢｒｉｘ．％として求めた。【００１６】［実施例２］
実施例１で得られたリパーゼ濃縮液に、濃縮液と同量の水を添加し、リパーゼ含有水溶液２（リパーゼ濃縮液：水の体積比は１：１）を得た。以下、実施例１のリパーゼ含有水溶液１をリパーゼ含有水溶液２に代えた以外は、実施例１と同様にしてリパーゼ粉末を得た。リパーゼ濃縮液：水：牛乳の体積比は、０．５：０．５：１であり、牛乳の固形分は、リパーゼ含有水溶液（ＵＦ）の固形分質量の１．０５倍の量であった。【００１７】［実施例３］
実施例１で得られたリパーゼ濃縮液に、濃縮液と同量のｐＨ７の０．０１Ｍリン酸バッファーを添加し、リパーゼ含有水溶液３（リパーゼ濃縮液：バッファーの体積比は１：１）を得た。以下、実施例１のリパーゼ含有水溶液１をリパーゼ含有水溶液３に代えた以外は、実施例１と同様にしてリパーゼ粉末を得た。リパーゼ濃縮液：リン酸バッファー：牛乳の体積比は、０．５：０．５：１であり、牛乳の固形分は、リパーゼ含有水溶液の固形分質量の１．０３倍の量であった。【００１８】［実施例４］
実施例１で得られたリパーゼ濃縮液に、濃縮液と同量のｐＨ８の０．０１Ｍリン酸バッファーを添加し、リパーゼ含有水溶液４（リパーゼ濃縮液：バッファーの体積比は１：１）を得た。このリパーゼ含有水溶液４、２０ｍｌに対して、牛乳（小岩井乳業（株）社製小岩井牛乳おいしさしたて：固形分濃度１２．９質量％）１０ｍｌを添加した。このようにして得られた溶液のｐＨを水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ６．８〜６．９に調整した。
リパーゼ濃縮液：リン酸バッファー：牛乳の体積比は、０．５：０．５：０．５であり、牛乳の固形分は、リパーゼ含有水溶液の固形分質量の０．５２倍の量であった。
以下、実施例１と同様にしてリパーゼ粉末を得た。【００１９】［実施例５］
実施例１で得られたリパーゼ濃縮液に、濃縮液と同量のｐＨ８の０．０１Ｍリン酸バッファーを添加し、リパーゼ含有水溶液５（リパーゼ濃縮液：バッファーの体積比は１：１）を得た。このリパーゼ含有水溶液５、２０ｍｌに対して、生クリーム（商品名：北海道純正クリーム３５、高梨乳業（株）製、固形分濃度４３質量％）を２ｍｌ添加した。このようにして得られた溶液のｐＨを水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ６．８〜６．９に調整した。
リパーゼ濃縮液：リン酸バッファー：生クリームの体積比は、０．５：０．５：０．１であり、生クリームの固形分は、リパーゼ含有水溶液の固形分質量の０．３４倍の量であった。
以下、実施例１と同様にしてリパーゼ粉末を得た。【００２０】［実施例６］
実施例１で得られたリパーゼ濃縮液に、濃縮液と同量のｐＨ８の０．０１Ｍリン酸バッファーを添加し、リパーゼ含有水溶液６（リパーゼ濃縮液：バッファーの体積比は１：１）を得た。このリパーゼ含有水溶液６、２０ｍｌに対して、ジャージー牛乳（阿蘇小国ジャージー４．５牛乳：阿蘇農業共同組合製、固形分濃度１３．２質量％）２０ｍｌを添加した。このようにして得られた溶液のｐＨを水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ６．８〜６．９に調整した。
リパーゼ濃縮液：リン酸バッファー：牛乳の体積比は、０．５：０．５：１であり、牛乳の固形分は、リパーゼ含有水溶液の固形分質量の１．０６倍の量であった。以下、実施例１と同様にしてリパーゼ粉末を得た。【００２１】［実施例７］
粉末化の方法としてスプレードライを行う代わりに、フリーズドライを行った以外は、実施例１と同様にしてリパーゼ粉末を得た。フリーズドライは、ｐＨが６．８〜６．９に調整されたリパーゼ含有水溶液をナスフラスコに入れ、ドライアイスメタノールで凍結後、東京理化器械（株）社製のフリーズドライヤー（ＦＤＵ−８３０）を用い、０．１５Ｔｏｒｒで１〜２日凍結乾燥を行った。乾燥後、乳鉢で軽く粉砕しリパーゼ粉末を得た。【００２２】比較例１
牛乳を添加しない以外は実施例３と同様にしてリパーゼ粉末を得た。リパーゼ濃縮液：リン酸バッファーの体積比は１：１であった。
このようにして得られたリパーゼ粉末のリパーゼ活性を以下の方法により測定した。結果を表−１に示す。
リパーゼ活性
トリオレインとトリカプリリンを１：１（ｗ）の割合で混合した油に、粉末リパーゼを添加し６０℃で反応させた。経時的に１０μｌをサンプリングし、ヘキサン１．５ｍｌで希釈後、粉末リパーゼをろ過した溶液をガスクロサンプルとした。ガスクロ（カラム：ＤＢ−１ｈｔ）で分析し下式より反応率を求めた。ガスクロ条件は、カラム温度：初期１５０℃、昇温１５℃／ｍｉｎ．、最終３７０℃であり、これ以外の条件は、下記の１．３−選択性試験におけると同様である。
反応率（％）＝｛Ｃ３４ａｒｅａ／（Ｃ２４ａｒｅａ＋Ｃ３４ａｒｅａ）｝×１００
式中、Ｃ２４はトリカプリリン、Ｃ３４はトリカプリリンの１つの脂肪酸が１８に置き換わったものを示し、ａｒｅａはそれらのエリア面積である。
各時間における反応率に基づき解析ソフト（Ｏｒｉｊｉｎ  ｖｅｒ．６．１）により反応速度定数Ｋ値を求めた。リパーゼ活性は、比較例１のＫ値を１００とした時の相対活性で表した。【００２３】
0004828418.tif 000002
表中、ｂｆ（７）は、ｐＨ７の０．０１Ｍリン酸バッファー、ｂｆ（８）は、ｐＨ８の０．０１Ｍリン酸バッファーを示す。又、実施例７以外は、スプレードライを行った。
表−１の結果から明らかなように、本発明によるとリパーゼの酵素活性が各段に向上することがわかる。
次に、実施例１、実施例７及び比較例１のリパーゼ粉末の１，３−選択性を以下の方法で測定した。【００２４】１，３−選択性の測定方法
反応基質としてＧＲＹＣＥＲＹＬ−１，３−ＰＡＬＭＩＴＡＴＥ−２−ＯＬＥＡＴＥ（ＰＯＰ）１ｍｏｌ及びＯＣＴＡＮＯＩＣ  ＥＴＨＹＬ（Ｃ８Ｅｔ）３ｍｏｌを用い、酵素活性に応じて基質の０．５〜５ｗ％となるようにリパーゼ粉末を添加し、６０℃で反応を行い、経時的にサンプリングしヘキサンで希釈した。このサンプルをＧＣ分析し以下の式により１・３位（Ｃ１６：０Ｅｔ）と２位（Ｃ１８：１Ｅｔ）の反応率を求めた。
Ｃ１６：０Ｅｔ（％）＝｛Ｃ１６：０Ｅｔ  ａｒｉａ／（Ｃ１６Ｅｔ＋Ｃ１８：１Ｅｔ  ａｒｅａ＋Ｃ８Ｅｔ  ａｒｅａ）｝×１００
Ｃ１８：１Ｅｔ（％）＝｛Ｃ１８：１Ｅｔ  ａｒｅａ／（Ｃ１６Ｅｔ＋Ｃ１８：１Ｅｔ  ａｒｅａ＋Ｃ８Ｅｔ  ａｒｅａ）｝×１００
各時間における各々の反応率から解析ソフト（ｏｒｉｊｉｎ  ｖｅｒ．６．１）により反応速度定数Ｋを求めた。この時の最終反応率の値は可変とする。２位の反応性を１とした時の１，３位の反応性を求めた。
＜ＧＣ条件＞
カラム    ：ＤＢ−１ｈｔ  ５ｍ
注入量  ：１μｌ
キャリアガス：ヘリウム
気化室温度：３６０℃
検出器温度：３７０℃
カラム温度：初期５０℃、昇温１５℃／ｍｉｎ、最終３７０℃【００２５】  結果を表−２に示す。
0004828418.tif 000003
表−２の結果から、本発明によると１，３−特異性リパーゼの１，３−選択性が各段に向上することがわかる。
次に、実施例１及び比較例１で得られたそれぞれのリパーゼ粉末の安定性を次の方法で試験した。【００２６】安定性試験方法
トリカプリリン５ｇ、トリオレイン５ｇ、６０℃で反応を２４時間〜７２時間行い、各バッチの初期活性の低下度合いをプロットして延べ反応時間と活性の低下度合いから半減期を算出した。
その結果、実施例１で得られたリパーゼ粉末の半減期は９１３時間であり、比較例１で得られたリパーゼ粉末の半減期は２３４時間であったので、本発明のリパーゼ粉末によれば、安定性が２倍以上向上することがわかる。【００２７】［実施例８］
名糖産業社製の粉末リパーゼ（商品名リパーゼＱＬ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．由来）を水に懸濁してリパーゼ含有水溶液（固形分濃度２．０質量％）を得た。このリパーゼ含有水溶液２０ｍｌに対して、牛乳（小岩井乳業（株）社製小岩井牛乳おいしさしたて：固形分濃度１２．９質量％）２ｍｌを添加した。リパーゼ含有水溶液：牛乳の体積比は１０：１であり、牛乳の固形分は、リパーゼ含有水溶液の固形分質量の０．６５倍の量であった。このようにして得られた溶液のｐＨを水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ６．８〜６．９に調整した。
この液を、スプレードライヤー（ＳＤ−１０００型：東京理化器械（株）社製）を用い、噴出し口温度１３０℃、乾燥空気量０．７〜１．１ｍ３／ｍｉｎ、噴霧圧力１１〜１２ｋｐａの条件下噴霧し、リパーゼ粉末を得た。リパーゼ粉末粒子の形状は球状で、リパーゼ粉末の９０質量％以上が粒径１〜１００μｍの範囲内であり、平均粒径は３５μｍであった。粒径は、ＨＯＲＩＢＡ社の粒度分布測定装置（ＬＡ−５００）を用いて測定した。【００２８】比較例２
牛乳を添加しない以外は、実施例８と同様にしてスプレードライすることによりリパーゼ粉末を得た。
これらのリパーゼ粉末のリパーゼ活性を測定し、比較例１のリパーゼ粉末の活性を１００とした時の相対値として表した。結果をまとめて表−３に示す。【００２９】
0004828418.tif 000004
表−３の結果から、本発明によれば、リパーゼ活性が約２倍向上することがわかる。【００３０】［実施例９］
実施例１で得られたリパーゼ粉末に、５倍量の菜種油を加えて、菜種油にリパーゼ粉末を含浸させ、濾過により過剰の油脂を除去し、リパーゼ粉末／菜種油の質量％が５５／４５であるリパーゼ組成物を調製した。【００３１】比較例３
天野エンザイム（株）社製のＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来の粉末（凍結乾燥）リパーゼ（リパーゼＤ「アマノ」）を５質量％濃度で水に再懸濁し、スプレードライヤー（ＳＤ−１０００型：東京理科器械（株）社製）を用い、入口温度１３０℃、乾燥空気量０．７〜１．１ｍ３／ｍｉｎ．、噴霧圧力１１〜１２Ｋｐａの条件下噴霧し、リパーゼ粉末を得た。【００３２】［実施例１０］
比較例３と同様の粉末（凍結乾燥）リパーゼ（リパーゼＤ「アマノ」）を５質量％濃度で水に再懸濁し、このリパーゼ溶液５ｍｌに対して、牛乳（明治乳業（株）社製、明治おいしい牛乳：固形分濃度１２．９質量％）１０ｍｌを添加した。スプレードライヤー（ＳＤ−１０００型：東京理科器械（株）社製）を用い、入口温度１３０℃、乾燥空気量０．７〜１．１ｍ３／ｍｉｎ．、噴霧圧力１１〜１２Ｋｐａの条件下噴霧し、リパーゼ粉末を得た。【００３３】［実施例１１］
比較例３と同様の粉末（凍結乾燥）リパーゼ（リパーゼＤ「アマノ」）を５質量％濃度で水に再懸濁した。このリパーゼ溶液５ｍｌに対して、牛乳（明治乳業（株）社製、明治おいしい牛乳：固形分濃度１２．９質量％）１０ｍｌを添加した。このリパーゼ溶液を、予め０℃以下に冷却したエタノール１５０ｍｌに徐々に添加し沈殿物を得た。得られた沈殿物を遠心分離機（ベックマン社製：ＧＳ−６ＫＲ）３０００ｒｐｍ．１０ｍｉｎ．で回収後、乾燥機（東京理科器械（株）社製：ＦＤＵ−８３０）で１６〜２０時間、減圧乾燥しリパーゼ粉末を得た。
これらのリパーゼ粉末の活性を測定し比較例３のリパーゼ粉末の活性を１００とした時の相対値として表した。結果をまとめて表−４に示す。【００３４】
0004828418.tif 000005
0004828418.tif 000006
表−４の結果から、本発明によれば、リパーゼ活性が格段に向上することがわかる。【００３５】比較例４
天野エンザイム（株）社製のＲｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来の粉末リパーゼ（リパーゼＦ−ＡＰ１５）を１５質量％濃度で水に再懸濁し、スプレードライヤー（ＳＤ−１０００型：東京理科器械（株）社製）を用い、入口温度１３０℃、乾燥空気量０．７〜１．１ｍ３／ｍｉｎ．、噴霧圧力１１〜１２Ｋｐａの条件下噴霧し、リパーゼ粉末を得た。【００３６】［実施例１２］
比較例４と同様の粉末リパーゼ（リパーゼＦ−ＡＰ１５）を１５質量％濃度で水に再懸濁し、このリパーゼ溶液１０ｍｌに対して、牛乳（明治乳業（株）社製、明治おいしい牛乳：固形分濃度１２．９質量％）１０ｍｌを添加した。スプレードライヤー（ＳＤ−１０００型：東京理科器械（株）社製）を用い、入口温度１３０℃、乾燥空気量０．７〜１．１ｍ３／ｍｉｎ．、噴霧圧力１１〜１２Ｋｐａの条件下噴霧し、リパーゼ粉末を得た。
これらのリパーゼ粉末の活性を測定し、比較例４のリパーゼ粉末の活性を１００とした時の相対値として表した。結果をまとめて表−５に示す。【００３７】
0004828418.tif 000007
表−５の結果から、本発明によれば、リパーゼ活性が格段に向上することがわかる。【００３８】比較例５
ノボザイムズ  ジャパン（株）社製のＴｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｅｎｏｕｓｕ由来の液状リパーゼ（商品名Ｌｉｐｏｚｙｍｅ  Ｔｌ  １００Ｌ）をスプレードライヤー（ＳＤ−１０００型：東京理科器械（株）社製）を用い、入口温度１３０℃、乾燥空気量０．７〜１．１ｍ３／ｍｉｎ．、噴霧圧力１１〜１２Ｋｐａの条件下噴霧し、リパーゼ粉末を得た。【００３９】［実施例１３］
比較例５と同様の液状リパーゼ（商品名Ｌｉｐｏｚｙｍｅ  Ｔｌ  １００Ｌ）１ｍｌに対して、牛乳（明治乳業（株）社製、明治おいしい牛乳：固形分濃度１２．９質量％）１０ｍｌを添加した。このリパーゼ液をスプレードライヤー（ＳＤ−１０００型：東京理科器械（株）社製）を用い、入口温度１３０℃、乾燥空気量０．７〜１．１ｍ３／ｍｉｎ．、噴霧圧力１１〜１２Ｋｐａの条件下噴霧し、リパーゼ粉末を得た。【００４０】比較例６
比較例５と同様の液状リパーゼ（商品名Ｌｉｐｏｚｙｍｅ  Ｔｌ  １００Ｌ）を１０ｍｌ用い、予め０℃以下に冷却したエタノール６０ｍｌに徐々に添加し沈殿物を得た。得られた沈殿物を遠心分離機（ベックマン社製：ＧＳ−６ＫＲ）３０００ｒｐｍ．３ｍｉｎ．で回収後、乾燥機（東京理科器械（株）社製：ＦＤＵ−８３０）で１６〜１８時間、減圧乾燥しリパーゼ粉末を得た。【００４１】［実施例１４］
比較例５と同様の液状リパーゼ（商品名Ｌｉｐｏｚｙｍｅ  Ｔｌ  １００Ｌ）１ｍｌに対して、牛乳（明治乳業（株）社製、明治おいしい牛乳：固形分濃度１２．９質量％）１０ｍｌを添加した。このリパーゼ液を予め０℃以下に冷却したエタノール６０ｍｌに徐々に添加し沈殿物を得た。得られた沈殿物を遠心分離機（ベックマン社製：ＧＳ−６ＫＲ）３０００ｒｐｍ．３ｍｉｎ．で回収後、乾燥機（東京理科器械（株）社製：ＦＤＵ−８３０）で１６〜２０時間、減圧乾燥しリパーゼ粉末を得た。
これらのリパーゼ粉末の活性を測定し、比較例５のリパーゼ粉末の活性を１００とした時の相対値として表した。結果をまとめて表−６に示す。【００４２】
0004828418.tif 000008
表−６の結果から、本発明によれば、リパーゼ活性が格段に向上することがわかる。