(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチプレックスPCR用の各プライマーについて、以下の工程(a)〜(c)を行うことを特徴とする、マルチプレックスPCR用人工陽性対照DNA群の作製法。
(a)入手可能な配列が既知のDNAであって、マルチプレックスPCRの対象とされる微生物種と近縁もしくは同一種の微生物のDNAでないものにおいて、塩基数50〜2000の間で任意の塩基数を有する領域を、各プライマーの人工陽性対照DNAに用いる当該領域が互いに重複しないように選択する工程、
(b)マルチプレックスPCR用フォワードプライマーの３’側に、工程(a)で選択した領域の５’末端の10〜30塩基を結合させてなる人工陽性対照作製用フォワードプライマーと、マルチプレックスPCR用リバースプライマーの３’側に、工程(a)で選択した領域の３’末端の10〜30塩基の相補的配列を結合させてなる人工陽性対照作製用リバースプライマーと、からなる人工陽性対照作製用プライマー対を合成する工程、および、
(c)前記入手可能な配列が既知のDNAを鋳型とし、工程(b)で合成した人工陽性対照作製用プライマー対を用いてPCR反応を行って得られる増幅産物である人工陽性対照DNAを作製する工程
【請求項２】
請求項１に記載の方法により作製されたマルチプレックスPCR用人工陽性対照DNA群を同一反応液中でPCR反応に供することを特徴とする、マルチプレックスPCR用プライマーの反応性を確認する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マルチプレックスPCR用人工陽性対照DNA群の作製法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物の菌種を同定するために用いられるPCR法では、PCR反応の信頼性を保証するために、菌種特異的プライマー対により正常に増幅反応が起こることを確認しなければならない。そのため、従来は、検査対象とする菌のDNAを陽性対照とするPCR反応によって、プライマー対の反応性検査が行われていた。
多数のPCRプライマー対を単一の反応系で混合するマルチプレックスPCR法（例えば特許文献１参照）では、複数の菌種を一斉に検査できる利点がある。しかし、各プライマー対の反応を確認するためには、対応する個々の菌種の数だけ陽性対照DNA用の反応チューブ数が必要とされ、試験点数が多くなるという問題点が残る。
また、陽性対照（検査対象とする菌のDNA）を複数混合してPCR反応に供している例（例えば非特許文献１、２参照）もある。
しかしながら、マルチプレックスPCR法において、人工陽性対照を使用した例は未だ報告がない。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−３４１２１号公報
【非特許文献１】J. Appl. Microbiol. 2004; 97(2): 384-394
【非特許文献２】Mol. Cell. Probes 2005; 19(5): 314-322
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、従来、微生物種同定用プライマー対の反応性検査における陽性対照としては、検査対象とする微生物自体のDNAが用いられていた。
しかしながら、PCR反応を行う際、操作上のミスによりサンプルDNAに陽性対照DNAが混入した場合は、サンプルが本来は陰性であるにもかかわらず、陽性と誤判定されるおそれがあった。
また、各プライマー対の増幅産物の長さが類似しているため、複数のプライマー対を同時に検査する場合には、電気泳動によりそれぞれのバンドが明確に分離しないという問題もあった。
【０００５】
したがって、本発明では、誤判定を防止でき、かつ、任意の塩基数を有しているため、それぞれの陽性対照のバンドが明確に区別でき、全てのプライマー対の反応性を１反応系で確認できるマルチプレックスPCR用人工陽性対照DNAの作製方法を提供することを目的とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、任意の塩基数を有する人工陽性対照DNAを用いることにより、複数のプライマー対の反応性を１反応系で確認できることを見出した。さらに、λファージDNAなど容易に入手可能な汎用のDNAを利用して、そのような人工陽性対照DNAを簡便に作製できる方法を開発した。
本発明者らは、これらの知見に基づいて本発明を完成させるに至ったのである。
【０００７】
すなわち、請求項１に係る本発明は、マルチプレックスPCR用の各プライマーについて、以下の工程(a)〜(c)を行うことを特徴とする、マルチプレックスPCR用人工陽性対照DNA群の作製法である。
(a)入手可能な配列が既知のDNAであって、マルチプレックスPCRの対象とされる微生物種と近縁もしくは同一種の微生物のDNAでないものにおいて、塩基数50〜2000の間で任意の塩基数を有する領域を、各プライマーの人工陽性対照DNAに用いる当該領域が互いに重複しないように選択する工程、
(b)マルチプレックスPCR用フォワードプライマーの３’側に、工程(a)で選択した領域の５’末端の10〜30塩基を結合させてなる人工陽性対照作製用フォワードプライマーと、マルチプレックスPCR用リバースプライマーの３’側に、工程(a)で選択した領域の３’末端の10〜30塩基の相補的配列を結合させてなる人工陽性対照作製用リバースプライマーと、からなる人工陽性対照作製用プライマー対を合成する工程、および、
(c)前記入手可能な配列が既知のDNAを鋳型とし、工程(b)で合成した人工陽性対照作製用プライマー対を用いてPCR反応を行って得られる増幅産物である人工陽性対照DNAを作製する工程
請求項２に係る本発明は、請求項１に記載の方法により作製されたマルチプレックスPCR用人工陽性対照DNA群を同一反応液中でPCR反応に供することを特徴とする、マルチプレックスPCR用プライマーの反応性を確認する方法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、任意の塩基数を有する人工陽性対照DNAを用いるため、それぞれの陽性対照のバンドが明確に区別でき、配合されたすべてのプライマーの増幅反応を１反応系で確認することが可能となる。このことにより、試験法の簡易化、誤操作の防止、試験費用の低減につながる。
また、本発明によれば、万一サンプルDNAに陽性対照が混入した場合でも、サンプルと陽性対照の増幅産物の長さが異なるため、誤判定を防ぐことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
請求項１に記載の本発明は、マルチプレックスPCR用人工陽性対照DNA群の作製法である。
本発明においてマルチプレックスPCR用人工陽性対照DNAとは、２種以上のプライマー対を１反応系で使用してPCR反応を行うマルチプレックスPCR法において、各プライマー対の反応性を確認するために用いられる人工の陽性対照DNAである。
なお、本発明において用いられるマルチプレックスPCR用プライマーは、どのようなものであっても良い。
【００１０】
請求項１に記載の本発明では、はじめに、入手可能な配列が既知のDNAにおいて、塩基数50〜2000の間で任意の塩基数を有する領域を選択する工程(a)を行う。
本発明において、入手可能な配列が既知のDNAとしては、例えばAccession No.：V00636, J02459, M17233, X00906としてGen Bankに登録されている公知の塩基配列を有するλファージDNAや、φX174ファージDNA（Accession No.NC-001422）などを用いることができるが、これに限定されない。ただし、サンプルDNAに陽性対照DNAが混入した場合に起こる擬陽性を防ぐため、マルチプレックスPCR法の対象とされる微生物種と近縁もしくは同一種の微生物のDNAを用いることは好ましくない。
【００１１】
上記の入手可能な配列が既知のDNAにおいて、本発明の人工陽性対照DNAに用いる領域を任意に選択する。
その際、PCR反応後の電気泳動結果において、各プライマー対によるPCR増幅産物のバンドが分離して見えるように、他のプライマー対に対する前記領域の塩基数と全く異なるようにすることが好ましい。
また、前記領域の塩基数は50〜2000塩基の範囲であることが好ましい。マルチプレックスPCR用プライマーの塩基数（通常10〜30塩基程度）を考慮すると、増幅産物の塩基数として少なくとも50塩基は必要である。一方、2000塩基を超えるとPCR反応に時間がかかり、実用的ではない。
なお、入手可能な配列が既知のDNAにおいて、人工陽性対照DNAに用いる領域は互いに重複していないことが望ましい。なぜなら、人工陽性対照同士で非特異的な増幅反応が起こる可能性があるからである。
【００１２】
請求項１に記載の本発明では、次に、マルチプレックスPCR用フォワードプライマーの３’側に、工程(a)で選択した領域の５’末端の10〜30塩基を結合させてなる人工陽性対照作製用フォワードプライマーと、マルチプレックスPCR用リバースプライマーの３’側に、工程(a)で選択した領域の３’末端の10〜30塩基の相補的配列を結合させてなる人工陽性対照作製用リバースプライマーと、からなる人工陽性対照作製用プライマー対を合成する工程(b)を行う。
【００１３】
本発明では、PCR反応によって人工陽性対照DNAを作製する。そのため、前記領域の両端のDNA配列に基いて設計した配列を、マルチプレックスPCR用プライマー対に結合させてなる人工陽性対照作製用プライマー対を合成する。
人工陽性対照作製用プライマー対は、フォワードプライマーとリバースプライマーからなる。これらはいずれも、マルチプレックスPCR用プライマーを５’側に、前記領域の５’末端又は３’末端のDNA配列に基いて設計した配列を３’側に有する。
【００１４】
すなわち、本発明の人工陽性対照作製用フォワードプライマーは、マルチプレックスPCR用フォワードプライマーの３’側に、前記領域の５’末端のDNA配列を結合させてなる。この際、前記領域の５’末端のDNA配列の塩基数は10〜30塩基、好ましくは15〜25塩基とすることが好ましい。
また、本発明の人工陽性対照作製用リバースプライマーは、マルチプレックスPCR用リバースプライマーの３’側に、前記領域の３’末端に相補的なDNA配列を結合させてなる。この際、前記領域の３’末端のDNA配列の塩基数は10〜30塩基、好ましくは15〜25塩基とすることが好ましい。
上記において、前記領域の５’末端又は３’末端のDNA配列に基く配列の塩基数が好ましい範囲未満である場合は、人工陽性対照作製用プライマーが前記領域に特異的に結合することができない。また、当該塩基数が好ましい範囲を超えた場合は、プライマー合成のコストが高くなり、実用的でない。
上記のようにして得られた人工陽性対照作製用プライマー対は、前記領域の両端のDNA配列に基いて設計された部分によって、入手可能な配列が既知のDNAにおける前記領域に特異的に結合することができる。
【００１５】
請求項１に記載の本発明では、続いて、前記入手可能な配列が既知のDNAを鋳型とし、工程(b)で合成した人工陽性対照作製用プライマー対を用いてPCR反応を行って得られる増幅産物である人工陽性対照DNAを作製する工程(c)を行う。
上記したように、上記工程(b)で得られた人工陽性対照作製用プライマー対は、上記工程(a)で選択した領域の両端のDNA配列に基いて設計された部分によって、入手可能な配列が既知のDNAにおける前記領域に特異的に結合することができる。
したがって、本工程のPCR反応により、前記領域において、５’末端にマルチプレックスPCR用フォワードプライマーが、３’末端にマルチプレックスPCR用リバースプライマーの相補的配列が、それぞれ付加されたDNA配列が増幅産物（人工陽性対照DNA）として得られる。
このようにして得られた本発明の人工陽性対照DNAを、対応するマルチプレックスPCR用プライマー対の反応性検査に用いると、所望の塩基数を有する人工陽性対照DNAが増幅され、例えば電気泳動法で増幅産物のバンドの有無を調べることにより、プライマー対の反応性を確認することができる。
なお、本発明の人工陽性対照DNAは、通常の核酸精製法により精製して用いることが好ましい。
【００１６】
請求項１に記載の本発明では、マルチプレックスPCR用の各プライマー対について、それぞれ個別に上記工程(a)〜(c)の操作を行って、人工陽性対照DNAを作製する。
各プライマー対に対応する人工陽性対照DNAは、それぞれ適当な濃度に希釈して混合液として、マルチプレックスPCR法に用いることにより、全てのプライマー対について一斉に反応性を確認することができる。
このとき、各プライマー対に対応するPCR増幅産物の分子量は互いに全く異なるように設定しているため、電気泳動結果において全てのバンドを明瞭に区別することができる。
また、本発明の人工陽性対照DNAは、菌種の同定に利用する増幅領域とは異なる塩基数を有するため、PCR反応液の調製の際などに万一サンプルDNAに陽性対照が混入した場合でも、誤判定が起こることがない。
【００１７】
請求項２に記載の本発明は、請求項１に記載の方法により作製されたマルチプレックスPCR用人工陽性対照DNA群を同一反応液中でPCR反応に供することを特徴とする、マルチプレックスPCR用プライマーの反応性を確認する方法である。
本発明において、PCR反応は常法により行うことができ、反応液組成、使用酵素、反応条件等は適宜設定することができる。
【実施例】
【００１８】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１９】
＜実施例１＞
ビール製造において有害である下記のLactobacillus属乳酸菌6菌種を検出同定するマルチプレックスPCR法を構築した。Lactobacillus brevis、 L. lindneri、 L. paracollinoides、 L. casei、L. coryniformis及び L. plantarumの16SrRNA遺伝子及びITS領域の公知塩基配列をもとに、表１に示すプライマーを設計した。なお、各プライマー対において、上段にフォワードプライマーを、下段にリバースプライマーを記載した。
【００２０】
【表１】
0004819545.tif 000002
【００２１】
これらのプライマーを0.1μMから10μMの範囲の最終濃度となるように、PerfectShotTM Ex Taq（Loading dye mix）（タカラバイオ社）と混合したものを乳酸菌マルチプレックスPCR反応液とした。これを用いたPCR検査の結果、それぞれの供試菌株で特異的に感度良く反応することを確認した。
【００２２】
次に、λファージDNA（タカラバイオ社）の公知の塩基配列（配列表の配列番号９、Accession No.：V00636, J02459, M17233, X00906）の任意の領域に、人工陽性対照DNAに用いる領域を表１に記載の各菌種ごとに選定した。そして、各菌種について、フォワードプライマーの３’側に、上記で選択した領域の５’末端の約２０塩基を結合させた人工陽性対照作製用フォワードプライマーを、リバースプライマーの３’側に、上記で選択した領域の３’末端の約２０塩基の相補的配列を結合させた人工陽性対照作製用リバースプライマーを、それぞれ設計した。
各菌種に対応するマルチプレックスPCR用プライマー名と、それに対応する人工陽性対照作製用プライマー名を表２に示した。また、人工陽性対照作製用プライマーの配列を表３に示した（下線は表１のマルチプレックスPCR用プライマー配列部分を示す）。表２中、上段にフォワードプライマーを、下段にリバースプライマーを記載した。
【００２３】
【表２】
0004819545.tif 000003
【００２４】
【表３】
0004819545.tif 000004
【００２５】
上記の人工陽性対照作製用プライマーを用いて、λファージDNA（タカラバイオ社）の希釈溶液を鋳型としたPCR反応を、菌種ごとに行った。PCR反応は、タカラバイオ社のPerfectShotＴＭ Ex Taqを用いて表４の反応液組成で行った。反応にはApplied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を用いて、表５の反応条件により実施した。
【００２６】
【表４】
0004819545.tif 000005
【００２７】
【表５】
0004819545.tif 000006
【００２８】
それぞれの菌種に対応する人工陽性対照作製用プライマー対から得られたPCR反応増幅産物を、QIAquick PCR Purification Kit（キアゲン社）を用いて、キットに添付のプロトコールに従い精製した。精製されたDNA溶液を分光光度計NanoDrop（登録商標） ND-1000（NanoDrop社）の核酸測定モードで測定し、核酸濃度が30ng/μlになるように滅菌蒸留水で調整し、人工陽性対照溶液とした。
各プライマー対を用いた際の人工陽性対照溶液に含まれるPCR反応増幅産物の推定塩基対を、表６に示した。
【００２９】
【表６】
0004819545.tif 000007
【００３０】
対象とする乳酸菌６菌種のそれぞれに対応する人工陽性対照溶液を上記のように作製し、100-5000倍の範囲で希釈したものを混合し、人工陽性対照DNA混合液とした。
上記した乳酸菌マルチプレックスPCR反応液45μlに、人工陽性対照DNA混合液5μlを加え、表７に示すPCR反応条件でPCR反応を行った。反応にはApplied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を用いた。
【００３１】
【表７】
0004819545.tif 000008
【００３２】
上記のPCR反応により得られた反応液5μlを、アガロース・ゲル電気泳動（2％ W/V in TAEバッファー（組成：1LあたりTris4.8g, 酢酸1.14ml, 0.5mM EDTA(pH8.0)）に供した(100V、30分間)。電気泳動後、サイバーグリーンにより30分間染色した。アガロースはシグマ社のA-9539を用い、TAEバッファーはナカライテスク社のものを用いた。また、サイバーグリーン染色液は、BMA社のSYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain 10μlを、100mlのTAEバッファーに添加して作製した。
電気泳動写真を図１に示した。泳動パターンから、６つの異なる分子量の増幅断片が明瞭に検出された。これらの増幅断片の分子量は、表５の推定塩基対と一致することから、すべてのプライマーの反応性を確認することができた。
【００３３】
＜実施例２＞
ビール製造における有害菌であるPectinatus属２菌種を検出するマルチプレックスPCR法を構築した。Pectinatus frisingensis及びP. cerevisiiphilusの16SrRNA遺伝子及びITS領域の公知塩基配列をもとに、表８に示すプライマーを設計した。なお、各プライマー対において、上段にフォワードプライマーを、下段にリバースプライマーを記載した。
【００３４】
【表８】
0004819545.tif 000009
【００３５】
これらのプライマーを、0.1μMから10μMの範囲の最終濃度となるようにPerfectShotＴＭ Ex Taq（Loading dye mix）（タカラバイオ社）と混合したものを、Pectinatus属菌マルチプレックスPCR反応液とした。これを用いたPCR検査の結果、それぞれの供試菌株で特異的に感度良く反応することを確認した。
【００３６】
次に、λファージDNA（タカラバイオ社）の公知の塩基配列（配列表の配列番号９）の任意の領域（具体的には図２において□で囲まれた部分）に、人工陽性対照DNAに用いる領域を表８に記載の各菌種ごとに選定した。
そして、各菌種について、フォワードプライマーの３’側に、上記で選択した領域の５’末端の約２０塩基を結合させた人工陽性対照作製用フォワードプライマーを、リバースプライマーの３’側に、上記で選択した領域の３’末端の約２０塩基の相補的配列を結合させた人工陽性対照作製用リバースプライマーを、それぞれ設計した。
各菌種に対応するマルチプレックスPCR用プライマー名と、それに対応する人工陽性対照作製用プライマー名を表９に示した。また、人工陽性対照作製用プライマーの配列を表１０に示した（下線は表８のマルチプレックスPCR用プライマー配列部分を示す）。表９中、上段にフォワードプライマーを、下段にリバースプライマーを記載した。
尚、図２は、λファージDNA配列（Accession No.：V00636, J02459, M17233, X00906）上での各人工陽性対照DNAに用いる領域（□で囲まれた部分）および各人工陽性対照作製用プライマーの位置（下線部分）を示す。
【００３７】
【表９】
0004819545.tif 000010
【００３８】
【表１０】
0004819545.tif 000011
【００３９】
上記の人工陽性対照作製用プライマーを用いて、λファージDNA（タカラバイオ社）の希釈溶液を鋳型としたPCR反応を、菌種ごとに行った。PCR反応は、タカラバイオ社のPerfectShotＴＭ Ex Taqを用いて表４の反応液組成で行った。反応にはApplied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を用いて、表５の反応条件により実施した。
それぞれの菌種に対応する人工陽性対照作製用プライマー対から得られたPCR反応増幅産物を、実施例１と同様の方法で精製及び調製を行い、Pectinatus属2菌種に対する人工陽性対照溶液を作製した。
各人工陽性対照溶液に含まれるPCR反応増幅産物の推定塩基対を表１１に示した。
【００４０】
【表１１】
0004819545.tif 000012
【００４１】
得られた人工陽性対照溶液（30ng/μl）をそれぞれ100-5000倍の範囲で希釈して混合し、人工陽性対照DNA混合液とした。
上記したPectinatus属菌マルチプレックスPCR反応液45μlに、人工陽性対照DNA混合液5μlを加え、表７に示すPCR反応条件でPCR反応を行った。反応にはApplied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を用いた。
電気泳動写真を図１に示した。泳動パターンから、２つの異なる分子量の増幅断片が明瞭に検出された。これらの増幅断片の分子量は、表１１の推定塩基対と一致することから、すべてのプライマーの反応性を確認することができた。
【００４２】
＜実施例３＞
実施例１及び２と同様に、ビール製造において有害である球菌、Pediococcus属３菌種およびMegasphaera属１菌種（Pediococcus claussenii、P. damnosus、P. inopinatus、及びMegasphaera cerevisiae）を検出するためのマルチプレックスPCR法の構築を行い、人工陽性対照DNA混合溶液を作製した。
各菌種に対して設計したマルチプレックスPCR用プライマーの配列を表１２に、マルチプレックスPCR用プライマーに対応する人工陽性対照作製用プライマー名を表１３に、また、人工陽性対照作製用プライマーの配列を表１４に示した（下線は表１２のマルチプレックスPCR用プライマー配列部分を示す）。
【００４３】
【表１２】
0004819545.tif 000013
【００４４】
【表１３】
0004819545.tif 000014
【００４５】
【表１４】
0004819545.tif 000015
【００４６】
上記の人工陽性対照作製用プライマーを用いて、λファージDNA（タカラバイオ社）の希釈溶液を鋳型としたPCR反応を、菌種ごとに行った。PCR反応は、タカラバイオ社のPerfectShotＴＭ Ex Taqを用いて表４の反応液組成で行った。反応にはApplied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を用いて、表５の反応条件により実施した。
それぞれの菌種に対応する人工陽性対照作製用プライマー対から得られたPCR反応増幅産物を、実施例１と同様の方法で精製及び調製を行い、球菌４菌種に対する人工陽性対照溶液を作製した。
各人工陽性対照溶液に含まれるPCR反応増幅産物の推定塩基対を表１５に示した。
【００４７】
【表１５】
0004819545.tif 000016
【００４８】
得られた人工陽性対照溶液（30ng/μl）をそれぞれ100-5000倍の範囲で希釈して混合し、人工陽性対照DNA混合液とした。
表１２のプライマーを、0.1μMから10μMの範囲の最終濃度となるようにPerfectShotＴＭ Ex Taq（Loading dye mix）（タカラバイオ社）と混合した球菌マルチプレックスPCR反応液45μlに、人工陽性対照DNA混合液5μlを加え、表７に示すPCR反応条件でPCR反応を行った。反応にはApplied Biosystems社のGeneAmp PCR System 9700を用いた。
電気泳動写真を図３に示した。泳動パターンから、３つの異なる分子量の増幅断片が明瞭に検出された。これらの増幅断片の分子量は、表１５の推定塩基対と一致することから、すべてのプライマーの反応性を確認することができた。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】実施例１、２における人工陽性対照DNA混合液を用いたPCR反応の結果を示す電気泳動結果を示す図である。
【図２】λファージDNA配列上における実施例２の人工陽性対照DNAに用いる領域（□で囲んだ部分）および人工陽性対照作製用プライマーの位置（下線部分）を示す図である。
【図３】実施例３における人工陽性対照DNA混合液を用いたPCR反応の結果を示す電気泳動結果を示す図である。
【図２】
0004819545.tif 000017
【図１】
0004819545.tif 000018
【図３】
0004819545.tif 000019
【配列表】
0004819545000001.app