(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表における配列番号４乃至９のいずれかで示されるアミノ酸配列を含んでなる、ヒトインターフェロンαのサブタイプα８の変異蛋白質。
【請求項２】
請求項１に記載の変異蛋白質とポリエチレングリコールとが結合した生理活性複合体。
【請求項３】
請求項１に記載の変異蛋白質及び請求項２に記載の生理活性複合体から選ばれる１種又は２種以上を含んでなる感受性疾患剤。
【請求項４】
抗腫瘍剤、抗ウイルス剤又は抗アレルギー剤としての請求項３に記載の感受性疾患剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は新規なインターフェロンα変異蛋白質に関するものであり、とりわけ、ヒトインターフェロンαサブタイプα８の変異蛋白質、及び、それを含んでなる感受性疾患剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒトのインターフェロンα（以下、「ＩＦＮα」と称することもある）のサブタイプα８（以下、単に「ＩＦＮα８」と称することもある。）は、医薬品として認可されているサブタイプα２ａおよびα２ｂ（以下、それぞれ、「ＩＦＮα２ａ」及び「ＩＦＮα２ｂ」と称することもある）などの他のサブタイプのＩＦＮαよりも優れた活性を有するという報告がなされている。例えば、フォスター・ジー・アール（Ｆｏｓｔｅｒ  ＧＲ）、ロドリグエス・オー（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  Ｏ）、ゴーゼ・エフ（Ｇｈｏｕｚｅ  Ｆ）、シュルテ−フローリンデ・イー（Ｓｃｈｕｌｔｅ−Ｆｒｏｈｌｉｎｄｅ  Ｅ）、テスタ・ディー（Ｔｅｓｔａ  Ｄ）、リアオ・エム・ジェイ（Ｌｉａｏ  ＭＪ）、スターク・ジー・アール（Ｓｔａｒｋ  ＧＲ）、リードビーター・エル（Ｌｅａｄｂｅａｔｅｒ  Ｌ）、トーマス・エイチ・シー（Ｔｈｏｍａｓ  ＨＣ）、ジャーナル・オブ・インターフェロン・アンド・サイトカイン・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  &  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１６巻、第１２号、１０２７乃至１０３３頁、１９９６年によれば、ＩＦＮα８は他のサブタイプのＩＦＮαよりも、極めて高い抗ウイルス活性を示し、さらに、ヤナイ・ワイ（Ｙａｎａｉ  Ｙ）、ホリエ・エス（Ｈｏｒｉｅ  Ｓ）、ヤマモト・ケイ（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｋ）、ヤマウチ・エイチ（Ｙａｍａｕｃｈｉ  Ｈ）、イケガミ・エイチ（Ｉｋｅｇａｍｉ  Ｈ）、クリモト・エム（Ｋｕｒｉｍｏｔｏ  Ｍ）、キタムラ・ティー（Ｋｉｔａｍｕｒａ  Ｔ）、ジャーナル・オブ・インターフェロン・アンド・サイトカイン・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  &  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２１巻、第１２号、１，１２９乃至１，１３６頁、２００１年によれば、ＩＦＮα８は他のＩＦＮαサブタイプよりも、腎臓癌に対して優れた抗腫瘍活性を示す。【０００３】
しかしながら、これらの報告は、ＩＦＮα８が、他のサブタイプのＩＦＮαよりも活性が優れていることを示しているものの、インビトロの実験系でのみの結果に基づくものであり、ＩＦＮα８と他のサブタイプのＩＦＮαとの活性における差はさほど顕著でない。よって、従来のＩＦＮα製剤やＩＦＮα８よりもさらに高い活性を有するＩＦＮα変異蛋白質を取得できれば、ＩＦＮαの用途拡大が期待できる。
【発明の開示】
【０００４】
斯かる状況に鑑み、この発明は、従来のＩＦＮαよりも抗ウイルス作用及び抗腫瘍作用に優れるＩＦＮα変異蛋白質を有効成分とする感受性疾患剤を提供することを課題とするものである。
【０００５】
本発明者が鋭意研究したところ、配列表における配列番号１乃至３のいずれかに示されるＩＦＮα８のアミノ酸配列のうち、１４５番目のアルギニン残基をイソロイシン残基、ロイシン残基又はバリン残基に、１４６番目のアラニン残基をアスパラギン残基又はセリン残基に、及び、１４９番目のメチオニン残基をチロシン残基に変換したＩＦＮα変異蛋白質は、野性型のＩＦＮα８よりも顕著に活性が高いことを見い出した。また、上記のＩＦＮα変異蛋白質のアミノ酸配列における１又は２以上のリジン残基を他のアミノ酸残基に変換して作製されたリジン変換変異蛋白質は、水溶性高分子とを結合して生理活性複合体とした場合、従来の水溶性の高分子と結合しているＩＦＮα製剤と比較して、極めて高い活性を有していることを見い出し、本発明を完成するにいたった。
【０００６】
すなわち、この発明は、配列表における配列番号１乃至３のいずれかに示されるヒトインターフェロンαのサブタイプα８のアミノ酸配列において、１４５番目のアルギニン残基をロイシン残基、イソロイシン残基又はバリン残基に、１４６番目のアラニン残基をアスパラギン残基又はセリン残基に、及び、１４９番目のメチオニン残基がチロシン残基に変換されたアミノ酸配列を含んでなる変異蛋白質、及びそれを有効成分として含んでなる感受性疾患剤を提供することによって前記課題を解決するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
この発明で用いられるＩＦＮα変異蛋白質は、野性型のＩＦＮα８、すなわち、ＩＦＮα８ａ（配列表における配列番号１）、ＩＦＮα８ｂ（配列表における配列番号２）及びＩＦＮα８ｃ（配列表における配列番号３）のうちのいずれかのアミノ酸配列において、１又は２以上のアミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に変換して、ＩＦＮα活性を増強させたＩＦＮα変異蛋白質である。本発明に用いられるＩＦＮα変異蛋白質は、常法の遺伝子工学の手法により得ることができる。例えば、ＩＦＮα８のアミノ酸配列において目的のアミノ酸残基をランダムなアミノ酸残基に変換するために、ＩＦＮα８のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ中の該当するアミノ酸コドンに、ＮＮＳ配列を適用し、常法のオリゴＤＮＡ合成技術、ＰＣＲ技術、ＤＮＡライゲーション技術などを駆使して、目的のアミノ酸残基がランダムなアミノ酸残基に変換された変異蛋白質を発現したライブラリーを得る。次に、ファージディスプレー法などにより蛋白質を発現させ、ＩＦＮαに対する抗体、受容体蛋白質を用いるパニング法、酵素免疫法、バイオアッセイ法などを組み合わせてスクリーニングすることによって、ＩＦＮα８よりもさらに活性が増強されたＩＦＮα変異蛋白質を得ることができる。ＩＦＮα変異蛋白質の選別に当たっては、ファージディスプレー法は網羅的に変異蛋白質の候補をスクリーニングできるので、極めて有用な手段である。【０００８】
本発明で用いられるＩＦＮα変異蛋白質は、ピエーラー・ジェイ（Ｐｉｅｈｌｅｒ，Ｊ）（ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２７５巻、第５１号、４０４２５乃至４０４３３頁、２０００年）等の報告に基づき、ＩＦＮα８のアミノ酸配列の中で、ＩＦＮα受容体タイプ２との結合に関与するといわれるアミノ酸残基、すなわち、３０、３３、１４５、１４６、１４９及び１５０番目のアミノ酸残基をランダムなアミノ酸残基に変換し、上述の遺伝子工学的な手法により、網羅的に変異体を作製して好適な変異蛋白質をスクリーニングした結果、上記のアミノ酸残基のうち、１４５番目のアルギニン残基をイソロイシン残基、ロイシン残基あるいはバリン残基に、１４６番目のアラニン残基をアスパラギン残基又はセリン残基に、及び１４９番目のメチオニン残基をチロシン残基に変換されたものである。１４５、１４６及び１４９番目のアミノ酸残基を上記のごとく変換したＩＦＮα変異蛋白質は、ＩＦＮα活性が著しく向上しており、本発明のＩＦＮα変異蛋白質として有利に用いられる。【０００９】
一方、既述のとおり、ＩＦＮα製剤は体内での安定性に劣るため、水溶性高分子を結合した生理活性複合体にして、生体に投与するのが有利な場合がある。しかしながら、ＩＦＮαは、水溶性高分子と結合した場合、立体障害などにより活性を損ねてしまう結合位置を有する可能性がある。そこで、ＩＦＮα変異蛋白質の水溶性高分子の結合位置を、活性を損ねない位置に限定した変異蛋白質が、本発明において有利に用いられる。具体的に説明すると、水溶性高分子を蛋白質の遊離アミノ基に結合するという手法を採用する場合、蛋白質における水溶性の高分子との結合位置は、Ｎ末端あるいはリジン残基のうちから選択される。そこで、１又は２以上のリジン残基を他のアミノ酸残基に変換した変異蛋白質（以後、本明細書ではこのような変異体を「リジン変換変異蛋白質」と呼ぶ。）は、適切な結合位置に水溶性の高分子との結合位置を限定することが可能である。本発明のＩＦＮα変異蛋白質の場合、３１、４６、５０、７１、１２２、１３４、１３５、１６０、１６３及び１６５番目の位置にリジン残基を有しており、これらの位置をランダムなアミノ酸残基に置換し、上述の遺伝子工学的な手法により、活性を保持したリジン変換変異蛋白質をスクリーニングすることにより、水溶性の高分子との結合に適したリジン変換変異蛋白質を得ることができる。本発明者等は、本発明のＩＦＮα変異蛋白質のすべてのリジン残基を他のアミノ酸残基に変換した場合、水溶性の高分子との結合効率が極めて低下するため、リジン変換変異蛋白質においては、少なくとも一つのリジン残基を保存しておくのが望ましいこと、及び、その保存すべきリジン残基としては、３１及び１３４番目のリジン残基のいずれか１つであるのが好ましいという知見を得た。したがって、本発明におけるリジン変換変異蛋白質においては、３１及び１３４番目のリジン残基のいずれかを保存し、それ以外リジン残基の全てが他のアミノ酸残基に変換されたリジン変換変異蛋白質を作製するのが好ましく、このように作製されたリジン変換変異蛋白質は、水溶性高分子と結合しても活性が消失することなく、本発明において有利に用いられる。例えば、本発明で用いられるＩＦＮα変異蛋白質としては、配列表における配列番号４乃至９のアミノ酸配列（それぞれ、配列表における配列番号１０乃至１５の塩基配列に対応）のいずれかを含んでなるもの挙げられる。これらを表1に示す。『ＭＵＴ１』は、野性型ＩＦＮα８ｂのアミノ酸配列において、１４５番目のアルギニン残基をロイシン残基に、１４６番目のアラニン残基をアスパラギン残基に、及び、１４９番目のメチオニン残基をチロシン残基に変換された変異蛋白質であり、『ＭＵＴ２』は、野性型ＩＦＮα８ｂのアミノ酸配列において、１４５番目のアルギニン残基をイソロイシン残基に、１４６番目のアラニン残基をセリン残基に、及び、１４９番目のメチオニン残基をチロシン残基に変換された変異蛋白質であり、『ＭＵＴ３』は、野性型ＩＦＮα８ｂのアミノ酸配列において、１４５番目のアルギニン残基をロイシン残基に、１４６番目のアラニン残基をセリン残基に、及び、１４９番目のメチオニン残基をチロシン残基に変換された変異蛋白質であり、『ＭＵＴ４』は、野性型ＩＦＮα８ｂのアミノ酸配列において１４５番目のアルギニン残基をバリン残基に、１４６番目のアラニン残基をアスパラギン残基に、及び、１４９番目のメチオニン残基をチロシン残基に変換された変異蛋白質である。また、『ＭＵＴ２Ｋ３１』は、『ＭＵＴ２』のアミノ酸配列において、３１番目のリジン残基以外の全てのリジン残基を他のアミノ酸に変換されたリジン変換変異蛋白質であり、『ＭＵＴ２Ｋ１３４』は、『ＭＵＴ２』のアミノ酸配列において、１３４番目のリジン残基以外の全てのリジン残基を他のアミノ酸に変換されたリジン変換変異蛋白質である。【００１０】
表１
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【００１１】
この発明のＩＦＮα変異蛋白質は、斯くして得られたＤＮＡを、必要に応じて、ＰＣＲ反応によって増幅した後、プラスミドベクターなどを介して大腸菌などの宿主へ導入して形質転換し、得られる形質転換体から目的とする蛋白質を産生するクローンを選別し、それを培養することによって所望量を得ることができる。形質転換体の培養物から蛋白質を採取するには、培養物へ、例えば、透析、塩析、濾過、濃縮、遠心分離、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ゲル電気泳動、等電点電気泳動などの蛋白質を精製するための汎用の方法を適用すればよく、必要に応じて、これらの方法は適宜組み合わせて用いられる。本発明で用いられるＩＦＮα変異蛋白質の比活性としては、常法の、ＦＬ細胞−シンドビスウイルス系によるバイオアッセイ法を適用した場合、通常、２．５×１０８ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上、好ましくは３×１０８ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上、さらに好ましくは３．５×１０８ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上である。また、ヒト結腸癌由来のＬＳ１７４Ｔ細胞と水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を用いたバイオアッセイ法は、ＩＦＮα８やその変異蛋白質を高感度で検出することができ、本発明のＩＦＮα変異蛋白質の活性の評価に有利であり、この方法によりＩＦＮα変異蛋白質の比活性を算出した場合、通常、５×１０８ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上、好ましくは、１×１０９ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上、さらに好ましくは６×１０９ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上である。【００１２】
この発明のＩＦＮα変異蛋白質と人為的に結合せしめる水溶性の高分子としては、実質的に水溶性であって、とりわけ、生体にとって無害かつ抗原となり難い非蛋白質性のものが好ましい。具体的には、例えば、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロピレングリコールなどの単独重合体、エチレングリコールとビニルアルコール、プロピレングリコールなどとの共重合体又はそれらの誘導体などの合成高分子や、エルシナン、デキストラン、ヒドロキシエチルセルロース、プルラン、メチルセルロースなどの天然高分子が挙げられ、このうち、分子量が揃った調製物を入手し易い点で、ポリエチレングリコールの単独重合体、ポリエチレングリコールと他の水溶性の高分子との共重合体及びそれらの誘導体が好ましい。なお、水溶性の高分子の分子量は、平均分子量として、通常、５００乃至２００，０００ダルトン、好ましくは、１，０００乃至８０，０００ダルトンの範囲で加減し、分子量が不均一である場合には、蛋白質への結合反応に先だって、例えば、分別沈澱、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの汎用の方法によって分画する。水溶性の高分子の種類やＩＦＮα変異蛋白質の最終用途にもよるけれども、水溶性の高分子の分子量が上記範囲を下回ると体内動態を改善し難くなり、逆に、上記範囲を上回ると、複合体の生理活性が低下しすぎて、医薬品としての作用を消失することがある。【００１３】
ＩＦＮα変異蛋白質に斯かる水溶性の高分子を結合せしめるには、遊離のアミノ基へ特異的に反応して共有結合を形成する試薬により別途活性化させておいた水溶性の高分子を当該蛋白質に反応させるか、あるいは、遊離のアミノ基へ特異的に反応する官能基を有する多官能基試薬により、当該蛋白質と水溶性の高分子とを架橋すればよい。反応方法としては、国際特許公開ＷＯ９５／１３０９０号明細書に記載されている方法に準じて行うことができる。また、斯界において汎用される方法、例えば、特開昭６２−２８９５２２号公報などに記載されたエステル結合法、アミド結合法などを用いてもよい。蛋白質部分と水溶性の高分子との間に形成される結合は、安定な共有結合が形成されるアミド結合法によるものが好ましい。【００１４】
反応方法にもよるけれども、反応開始時における蛋白質と水溶性の高分子との割合は、モル比で１：０．１乃至１：１００、好ましくは、１：０．５乃至１：５０、最も好ましくは、１：１乃至１：１０の範囲で加減する。一般に、この範囲を下回ると結合反応効率が低下し、反対に、この範囲を上回ると結合反応が早すぎて、蛋白質に結合する水溶性の高分子の分子数の制御が困難になる。いずれにしても、反応と反応後の精製の効率を低下させることとなり、通常、上記の範囲で加減するのが望ましい。反応の際の温度、ｐＨ及び反応時間は、ＩＦＮα変異蛋白質が失活したり分解し難く、かつ、望ましくない副反応が最小になるように設定され、具体的には、反応温度を０乃至１００℃、好ましくは、４乃至４０℃、ｐＨを０．１乃至１２、好ましくは、ｐＨ５乃至１０とし、０．１乃至５０時間、好ましくは、１０時間以内に反応が完結するように設定する。斯くして得られた生理活性複合体は、ＩＦＮα変異蛋白質を精製する場合と同様の方法によって精製することができ、最終使用形態に応じて、例えば、濃縮、塩析、遠心分離、凍結乾燥などの方法により液状又は固状とする。【００１５】
また、ＩＦＮα変異蛋白質に結合させる水溶性の高分子の分子数は、１分子のＩＦＮα変異蛋白質に、通常、１分子以上、好ましくは１乃至２分子、より好ましいのは１分子である。また、本発明のＩＦＮα変異蛋白質を生理活性複合体とした時の比活性は、ＦＬ細胞−シンドビスウイルス系で測定した場合、３×１０６ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上、好ましくは１×１０７ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上、さらに好ましくは２×１０７ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上である。また、ヒト結腸癌由来のＬＳ１７４Ｔ細胞／ＶＳＶ系で測定した場合の比活性は、通常、２×１０７ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上、好ましくは、４×１０７ＩＵ／ｍｇ蛋白質以上である。【００１６】
この発明のＩＦＮα変異蛋白質又はそれと水溶性の高分子とが結合した生理活性複合体は、感受性疾患を治療又は予防するための感受性疾患剤として極めて有用である。この発明でいう感受性疾患とは、この発明の感受性疾患剤を単独で投与するか、あるいは、他の薬剤とともに投与することによって治療又は予防し得る疾患全般を意味し、個々の疾患としては、例えば、結腸癌、直腸癌、胃癌、腎癌、甲状腺癌、舌癌、膀胱癌、絨毛癌、肝癌、子宮癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、卵巣腫瘍、睾丸腫瘍、骨肉腫、膵臓癌、副腎腫、甲状腺腫、脳腫瘍、悪性黒色腫、菌状息肉症などの固形腫瘍、白血病、リンパ腫などの血液系腫瘍、さらには、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＡＩＤＳ、ＳＡＲＳなどのウイルス性疾患、クラミジアなどの細菌感染症、アレルギー、リューマチなどの免疫疾患などが挙げられる。したがって、この発明の感受性疾患剤は、斯かる疾患を治療・予防するための、例えば、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗感染症剤、免疫疾患剤などとして多種多様な用途を有することとなる。【００１７】
適用対象となる感受性疾患の種類や症状にもよるけれども、この発明の感受性疾患剤は、投与経路に応じて、１回当たりの用量として、本発明の感受性疾患剤を０．２５ｎｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは、２．５ｎｇ乃至４００μｇ／ｋｇ体重を投与し、用途に応じて、エキス剤、エリキシル剤、下気道吸入剤、カプセル剤、顆粒剤、眼科用徐放剤、丸剤、眼軟膏剤、口腔粘膜貼付剤、懸濁剤、乳剤、硬膏剤、座剤、散剤、錠剤、シロップ剤、浸漬剤、煎剤、注射剤、チンキ剤、点眼剤、点耳剤、点鼻剤、トローチ剤、軟膏剤、パップ剤、芳香水剤、鼻用噴霧剤、リニメント剤、リモナーデ剤、流エキス剤、ローション剤などの形態のものに調製することができる。【００１８】
この発明の感受性疾患剤は、いわゆる、投薬単位形態の薬剤をも包含するものとし、その投薬単位形態の薬剤とは、本発明の感受性疾患剤を、例えば、１回当たりの用量又はその整数倍（４倍まで）若しくは約数（１／４０まで）に相当する量を含んでなり、投薬に適する物理的に分離した一体の剤型にある薬剤を意味する。このような投薬単位形態の薬剤としては、例えば、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、座剤、散剤、錠剤、注射剤、パップ剤などが挙げられる。【００１９】
この発明の感受性疾患剤は、有効成分として、本発明のＩＦＮα変異蛋白質及び／又はそれらに水溶性の高分子を結合させた生理活性複合体を含んでなるものである。また、ＩＦＮα８を含む野性型のＩＦＮαと組み合わせて用いることもできる。また、例えば、賦形剤、軟膏基剤、溶解剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、乳化剤などの薬剤一般に汎用される適宜の調剤用薬を配合することを妨げない。また、この発明の目的を逸脱しない範囲で、例えば、外皮用殺菌消毒剤、創傷保護剤、消炎剤などの外皮用薬、ビタミンＡ剤、ビタミンＢ剤、ビタミンＣ剤、ビタミンＤ剤、ビタミンＥ剤、ビタミンＫ剤などのビタミン剤、カルシウム剤、無機質製剤、糖類剤、有機酸製剤、蛋白アミノ酸製剤、臓器製剤などの滋養強壮薬、クロロフィル製剤、色素製剤などの細胞賦活用薬、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍性抗生物質製剤、抗腫瘍性植物成分製剤などの抗腫瘍薬、抗ヒスタミン剤などのアレルギー用薬、抗結核剤、合成抗菌剤、抗ウイルス剤などの化学療法剤、さらには、ホルモン剤、抗生物質製剤、生物学的製剤などの薬剤を１又は複数配合してもよい。【００２０】
さらに、この発明の感受性疾患剤は、免疫助成剤として、例えば、アクチノマイシンＤ、アセグラトン、イホスファミド、ウベニメクス、エトポシド、エノシタビン、塩酸アクラルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸イリノテカン、塩酸エピルビシン、塩酸ゲムシタビン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、塩酸ニムスチン、塩酸ピラルビシン、塩酸ファドゾール水和物、塩酸ブレオマイシン、塩酸ブロカルバジン、塩酸ミトキサントロン、カルボコン、カルボプラチン、カルモフール、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン、クレスチン、酢酸メドロキシプロゲストロン、シクロホスファミド、シスプラチン、シゾフィラン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、ジノスタンチンスチマラマー、酒石酸ビノレルビン、ソブゾキサン、ダカルバジン、チオテパ、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメスタット・オタスタットカリウム、ドキシフルリジン、ドセタキセル水和物、トレチノイン、ネオカルチノスタチン、ネダプラチン、バクリタキセル、ビカルタミド、ピシバニール、ヒドロキシカルバミド、ブスルファン、フルオロウラシル、フルタミド、ベントスタチン、ポルフィマーナトリウム、マイトマイシンＣ、ミトブリニトール、メトトレキセート、メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、硫酸ブレオマイシン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ペプロマイシン、レンチナンなどの抗腫瘍薬と組み合わせて用いることができる。このように、この発明のＩＦＮα変異蛋白質を免疫助成剤としても機能させるときには、いずれか一方のみでは容易に達成できない、相乗的に高い抗腫瘍効果が得られる。しかも、斯かる併用は、抗腫瘍薬の用量を低減でき、その結果として、抗腫瘍薬による副作用を著明に軽減し得る実益がある。【００２１】
この発明の感受性疾患剤は、経口経路で適用しても非経口経路で適用しても感受性疾患の治療・予防に効果を発揮する。感受性疾患の種類や症状にもよるけれども、具体的には、例えば、患者の症状や適用後の経過を観察しながら、この発明のＩＦＮα変異蛋白質を含んでなる製剤を、０．０１乃至１，０００μｇ／ｋｇ体重／日、好ましくは、０．１乃至１００μｇ／体重／日の投与量で、必要に応じて、複数回に分けて１乃至７回／週の頻度で１週間乃至１年間に亙って経口経路で適用するか、あるいは、皮内、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、直腸内、腹腔内などの非経口経路により適用する。この発明のＩＦＮα変異蛋白質を水溶性高分子と結合して作製した生理活性複合体は、安定であって、血液中のプロテアーゼなどによって分解され難く、しかも、生体における滞留時間が野性型のＩＦＮα８より有意に長く、投与経路によっては１０倍以上にも達することから、同一の感受性疾患に対して同一の経路で適用する場合、投与量を有意に少なくすることができ、その結果として、正常細胞に対する細胞障害性などに起因する副作用を最小限とする実益がある。【００２２】
以下、この発明の実施の形態につき、実験に基づいて説明する。【００２３】
実験１：ＩＦＮα変異蛋白質の取得
実験１−１：ファージライブラリーの作製
ＩＦＮα８ｂのアミノ酸配列（配列表における配列番号２）において、３０、３３、１４５、１４６、１４９及び１５０番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に変換し、ＩＦＮα活性が上昇したＩＦＮα変異蛋白質の取得を試みた。すなわち、常法にしたがって、ヒトリンパ芽球由来株化細胞ＢＡＬＬ−１（ＪＣＲＢ００７１：ジャパニーズ・コレクション・オブ・リサーチ・バイオリソーシス）から染色体ＤＮＡを採取し、これを鋳型として、配列表における配列番号１６（制限酵素ＮｄｅＩ切断部位、開始コドン、及びＩＦＮα８の５´末端付近の塩基配列を有する）及び配列番号１７（制限酵素ＢａｍＨＩ切断部位、終止コドン、ＩＦＮα８の３´末端付近の塩基配列を有する）で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、常法のＰＣＲ法により、プライマー配列に特異的なＤＮＡを増幅した後、制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより消化した。これを、Ｔ７プロモーター領域、Ｔ７ターミネーター領域、アンピシリン耐性遺伝子領域及びＣｏｌＥ１・Ｏｒｉ領域を有するプラスミドベクター（商品名『ｐＥＴ−３ａ』、EMDバイオサイエンス社販売（米国））へ、その上記制限酵素部位に導入した。ＩＦＮα８をコードするＤＮＡ領域を常法のＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列表の配列番号１８の塩基配列が解読され、ＩＦＮα８ｂをコードするＤＮＡであることが判明した。これを鋳型にして、配列番号１９（３０及び３３番目のアミノ酸のコドンをＮＮＳに変換するためのプライマー）と配列番号２０（１４５、１４６、１４９及び１５０番目のアミノ酸のコドンをＮＮＳに変換するためのプライマー）により常法にしたがいＰＣＲを行い、さらに、得られたＰＣＲ産物を鋳型にして配列番号２１（５´末端側に制限酵素ＮｃｏＩ切断部位を付加するためのプライマー）及び配列番号２２（３´末端側に制限酵素ＮｏｔＩ切断部位を付加するためのプライマー）により常法にしたがいＰＣＲを行なった。これにより、ＩＦＮα８のアミノ酸配列において、３０、３３、１４５、１４６、１４９及び１５０番目のアミノ酸残基のコドンがランダムなコドンに変換した配列表における配列番号２３で表されるＤＮＡを得た。このＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩで消化したファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅ（アマシャムバイオサイエンス株式会社販売（東京、日本））に、常法によりライゲーション反応により組み込んだ。これを常法のエレクトロポーレーション法にて導入した大腸菌ＴＧ−１を２％（ｗ／ｖ）グルコース及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ＹＴ培地中で培養し、吸収波長６００ｎｍでの吸光度が０．５以上になった時点で、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７（インビトロジェン株式会社販売（東京、日本））を培地１ｍｌ当たり１×１０９ｐｆｕ加え、３７℃で１時間振盪培養した後、遠心分離して沈澱部を採取し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ＹＴ培地で懸濁し、３７℃で６時間振盪培養した。遠心分離によりファージを含む上清を採取し、常法のポリエチレングリコール沈澱法によりファージを回収し、ファージライブラリーとした。【００２４】
実験１−２：ＩＦＮα受容体タイプ２（ＩＦＮＡＲ２）を用いたパニング法によるファージクローンの選択
ＩＦＮＡＲ２アイソフォーム３（ＳＷＩＳＳ−ＰＬＯＴ  Ｎｏ．Ｐ４８５５１）の細胞外ドメインとヒト免疫グロブリンＧのＦｃ領域との融合蛋白質（配列表における配列番号２４）を、常法により培養動物細胞を用いた一過性発現系により調製し、あらかじめ抗Ｆｃ抗体を壁面に付着させたポリスチレン製イムノチューブ（商品名『マキシソープ』、ナルジェヌンク株式会社販売（東京、日本））に固定化した。このチューブに実験１−１で得たファージを適量添加し、４℃で２時間静置した後、０．０５％（ｖ／ｖ）ツイーン２０を含むリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、さらに、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。この後、ＩＦＮＡＲ２に結合したファージ蛋白質を０．１Ｍ塩酸水溶液により溶出させ、別の容器に採取した後、塩酸溶液の半分量の１Ｍトリス（ｐＨ８．０）を加えて中性とした。採取したファージを大腸菌ＴＧ−１に感染させ、その大腸菌を２％（ｗ／ｖ）グルコース及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ＹＴ培地中で培養した後、実験１−１と同様にしてヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を添加して、菌体からファージを放出させた。このパニング操作を２回繰り返して得られたファージクローンを、大腸菌ＴＧ−１に感染させ、２％（ｗ／ｖ）グルコース及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ＹＴプレートに播き、３７℃で１０時間培養した後、コロニーを採取することにより単離し、常法にしたがい菌内のファージ由来のプラスミドを採取し、常法のＤＮＡシーケンス法により塩基配列を解読した。その結果、表２に示す１２種の変異体を選別した。【００２５】
表２
0004815356.tif 000003
【００２６】
実験１−３：変異蛋白質の製造
表２の１２種類の変異蛋白質をコードするＤＮＡを、実験１−１の方法に準じて、配列番号１６及び配列番号１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて、常法のＰＣＲ法により、プライマー配列に特異的なＤＮＡを増幅した後、制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより消化した。これを、Ｔ７プロモーター領域、Ｔ７ターミネーター領域、アンピシリン耐性遺伝子領域及びＣｏｌＥ１・Ｏｒｉ領域を有するプラスミドベクター（商品名『ｐＥＴ−３ａ』、EMDバイオサイエンス社販売（米国））へ、その上記制限酵素部位に導入した。これを、このプラスミドを大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３株へ導入し、野性型ＩＦＮα８又は各変異蛋白質の産生用の大腸菌を得た。これを常法により、Ｔ−ブロス培地で培養し、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体を、ＴＥＳ緩衝液（２０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭエチレンジアミン４酢酸及び０．５Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０）にて２回洗浄後、０．２ｍｇ／ｍｌリゾチームを含むＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）に加え、常法にしたがい超音波処理し、遠心分離し、ＩＦＮα８を含む残さを回収した。これを１％（ｗ／ｖ）トリトンエックス−１００を含むＴＥＳ緩衝液に加え、攪拌後に遠心分離して上清を除く操作を３回行い、得られた沈澱物を８Ｍグアニジン塩酸塩及び５０ｍＭジチオスレイトールを含む、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）に加え、遮光下で室温で１６時間攪拌し、遠心分離して、上清を回収した。これに１００倍量の１Ｍトリス、０．９（ｗ／ｖ）％塩化ナトリウム、０．４ＭＬ−アルギニン塩酸塩、２．５ｍＭ還元型グルタチオン、０．５ｍＭ酸化型グルタチオン、０．０５（ｗ／ｖ）％ツイーン２０に少量ずつ徐々に攪拌しつつ加えた後、４℃で１６時間静置した。これを４倍量の０．１（ｗ／ｖ）％ウシ血清アルブミンを含むリン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．２）に加え、ｐＨを６．５乃至７．５に調整した後、常法にしたがって、陰イオン交換カラムクロマトグラフィー（商品名『ポロスＤＥＡＥ』、パーセプティブバイオシステムズ社販売（米国））によりＩＦＮα活性を有するフラクションを採取した。これをさらに、ゲル濾過クロマトグラフィー（商品名『Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５』、アマシャムバイオサイエンス株式会社販売（東京、日本））によりＩＦＮα活性を有するフラクションを採取し、野性型ＩＦＮα８及び各変異蛋白質を得た。【００２７】
実験１−４：抗ウイルス活性
実験１−３で得られた野性型ＩＦＮα８及び１２種の変異蛋白質の抗ウイルス活性を測定した。抗ウイルス活性は、標準物質としてヒトＩＦＮα国際標準品を用い、かつ、ＦＬ細胞及びシンドビスウイルスを用いる常法のアッセイ系、又は、前記ＦＬ細胞でのバイオアッセイ法に準じたヒト結腸癌由来ＬＳ１７４Ｔ細胞（東北大学加齢医学研究所  ＴＫＧ０４０６）及びＶＳＶを用いるバイオアッセイの２通りの方法で、それぞれについての比活性を測定した。なお、コントロールとして、組換え型ＩＦＮα２製剤（商品名『イントロンＡ』、シェリング・プラウ株式会社販売（大阪、日本））及びコンセンサスＩＦＮα製剤（商品名『アドバフェロン』、アステラス製薬株式会社販売（東京、日本））を用いた。また、各アッセイ値から、野性型ＩＦＮα８の活性を１００とした相対値を算出した。その結果を表３に示す。【００２８】
表３
0004815356.tif 000004
【００２９】
表３に示すとおり、変異体Ｎｏ．１乃至７の変異蛋白質は、ＦＬ／シンドビス系及びＬＳ１７４Ｔ／ＶＳＶ系のバイオアッセイにおいて、野性型ＩＦＮα８よりも抗ウイルス活性が高く、特に、ＬＳ１７４Ｔ／ＶＳＶ系のバイオアッセイにおいて顕著であり、約２乃至１２倍の活性を有していた。【００３０】
実験１−５：細胞増殖抑制活性
上記の変異蛋白質のうち、変異体Ｎｏ．１、２、３又は４の変異蛋白質について、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、ジャパニーズ・コレクション・オブ・リサーチ・バイオリソーシス（ＪＣＲＢ）、ジャーマン・コレクション・オブ・ミクロオルガニズムズ・アンド・セル・カルチャーズ（ＤＳＭＺ）又は東北大学加齢医学研究所（ＩＤＡＣ）から入手した、ヒトＢ細胞由来Ｄａｕｄｉ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２１３）、ヒト慢性骨髄白血病由来Ｕ９３７細胞（ＪＣＲＢ  ＪＣＲＢ９０２１）、ヒトＴ細胞由来Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−１５２）、ヒト肝癌由来ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞（ＪＣＲＢ  ＪＣＲＢ０４０６）、ヒト結腸癌由来ＬＳ１７４Ｔ細胞（ＩＤＡＣ  ＴＫＧ０４０６）、ヒト肺癌由来ＥＢＣ−１細胞（ＪＣＲＢ  ＪＣＲＢ０８２０）、ヒト胃癌由来ＭＫＮ１細胞（ＪＣＲＢ  ＪＣＲＢ０２５２）、ヒト腎癌由来ＡＣＨＮ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６１１）、ＶＭＲＣ−ＲＣＷ細胞（ＪＣＲＢ  ＪＣＲＢ０８１３）、Ａ４９８細胞（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ５５）又はＣａｋｉ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ４６）、又はヒト膀胱癌由来ＨＴ１１９７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１４７３）のいずれかに対する細胞増殖抑制活性を求めた。１０（ｖ／ｖ）％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地に、８×１０３乃至２×１０５個／ｍｌの濃度で各細胞株を播種し、これに、実験１−４におけるウイルス感染阻止活性値を指標にして、４０ｐｇ乃至１０μｇ／ｍｌの範囲で、上記変異体４種をそれぞれ段階希釈して加え、３７℃、５％炭酸ガス雰囲気下で７２乃至１２０時間培養した。これらを常法に従い、『セルカウンティングキット−８』（和光純薬工業株式会社販売（大阪、日本））を用いて生細胞数を計測し、その計測データから、増殖を半分にまで抑制するために必要な濃度（ＩＣ５０）を算出した。また、コントロールとして、実験１−４と同様に、実験１−３で得た野性型ＩＦＮα８、又は、市販のＩＦＮα２製剤又はコンセンサスＩＦＮα製剤を用いた。結果を表４に示す。【００３１】
表４
0004815356.tif 000005
表中、「−」は測定を行なっていないことを示す。【００３２】
表４に示すとおり、変異体Ｎｏ．１、２、３及び４の変異蛋白質は、野性型ＩＦＮα８よりも、多岐の細胞株に対して強い増殖抑制活性を示すことが判明した。また、組換え型ＩＦＮα２製剤及びコンセンサスＩＦＮα製剤と比較しても、変異体Ｎｏ．１、２、３及び４の変異蛋白質は、いずれの細胞株に対しても細胞増殖抑制活性が高かった。これらの結果は、明らかに、変異体Ｎｏ．１、２、３及び４の変異蛋白質が、野性型ＩＦＮα８や従来のＩＦＮα製剤よりも優れた生物活性を有していることを示している。【００３３】
実験２：ＩＦＮα変異蛋白質のリジン変換変異蛋白質の作製
実験２−１：ファージライブラリーの作製
水溶性高分子との結合位置を限定するために、ＩＦＮα変異蛋白質のリジン残基を他のアミノ酸に置換した、リジン変換変異蛋白質の作製を試みた。すなわち、実験１−２により得られた変異体Ｎｏ．２（『ＭＵＴ２』）の変異蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号１１）を鋳型にして、配列表における配列番号２５（４６、５０及び７１番目のリジン残基をランダムなアミノ酸残基に変換するためのプライマー）と配列番号２６（１２２、１３４及び１３５番目のリジン残基をランダムなアミノ酸配列に変換するためのプライマー）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせによりＰＣＲを行ない、増幅されたＤＮＡを鋳型にして、さらに、配列表における配列番号２７（３１番目のリジン残基をランダムなアミノ酸残基に変換するためのプライマー）と配列番号２８（１６０、１６３及び１６５番目のリジン残基をランダムなアミノ酸配列に変換するためのプライマー）の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせによりＰＣＲを行なった。上記の操作により、ＩＦＮα変異蛋白質『ＭＵＴ２』の１０箇所のリジン残基がランダムなアミノ酸残基のコドン（ＮＮＳ）に変換された配列表における配列番号２９の塩基配列のＤＮＡを得た。このＤＮＡを、常法にしたがい、ファージミドベクターｐＣＡＮＴＡＢ  ５Ｅに組み込んで、ファージライブラリーを作製し、さらに、常法のエレクトロポーレーション法により、大腸菌ＴＧ−１に導入した。得られた大腸菌を２％（ｗ／ｖ）グルコースを含む２ＹＴ培地に懸濁し、３７℃で１時間振盪培養した後、２％（ｗ／ｖ）グルコース及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢプレートに播き、１６時間培養した。プレートに出現したすべての大腸菌コロニーを採取し、２％（ｗ／ｖ）グルコース及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ＹＴ培地に懸濁し、３７℃で振盪培養を行った後、濁度が０．５の時点で、ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を加え、３７℃で１時間振盪培養した後、遠心分離により菌体を集め、培地を５０μｇ／ｍｌカナマイシン及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ＹＴ培地に交換した後、３７℃で７時間振盪培養してファージを産生させ、ファージライブラリーを得た。これらを、実験１−２と同様にして、ＩＦＮＡＲ２とヒト免疫グロブリンＧのＦｃ領域との融合蛋白質（配列表における配列番号２４）を結合させたポリエチレン製イムノチューブを用いるパニング法でスクリーニングした結果、３１番目のリジン残基のみが他のアミノ酸残基に変換されなかったリジン変換変異蛋白質『ＭＵＴ２Ｋ３１』（配列表における配列番号８）、及び、１３４番目のリジン残基のみが他のアミノ酸残基に変換されなかったリジン変換変異蛋白質『ＭＵＴ２Ｋ１３４』（配列表における配列番号９）が得られた。これらは、ＩＦＮα変異蛋白質『ＭＵＴ２』（配列表における配列番号５）のアミノ酸配列において、３１及び１３４番目のリジン残基のいずれかと、それらリジン残基以外の全てのリジン残基を他のアミノ酸残基に変換されたリジン変換変異蛋白質である。【００３４】
実験２−２：リジン変換変異体の製造
上記で得られた２種のリジン変換変異蛋白質は、実験１−３の方法にしたがって、大腸菌により発現させた。ただし、鋳型として『ＭＵＴ２Ｋ３１』をコードするＤＮＡ（配列表における配列番号１４）又は『ＭＵＴ２Ｋ１３４』をコードするＤＮＡ（配列表における配列番号１５）を、プライマーとして配列表における配列番号１６と配列番号３０の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列表における配列番号１６と配列番号３１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。【００３５】
実験２−３：抗ウイルス活性
得られたリジン変換変異蛋白質の抗ウイルス活性を実験１−４と同様にして測定した。なお、対照として、野性型ＩＦＮα８又は実験１−３で作製したＩＦＮα変異蛋白質『ＭＵＴ２』を用い、その相対活性を算出した。その結果を表５に示す。【００３６】
表５
0004815356.tif 000006
【００３７】
さらに、実験１−５に準じて、Ｕ９３７細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、ＥＢＣ−１細胞、ＭＫＮ１細胞、ＡＣＨＮ細胞、ＶＭＲＣ−ＲＣＷ細胞、Ａ４９８細胞、Ｃａｋｉ−１細胞、又はＨＴ１１９７に対する細胞増殖抑制活性測定し、実験１−５と同様にして、ＩＣ５０を求めた。その結果を表６に示す。【００３８】
表６
0004815356.tif 000007
【００３９】
表５及び表６に示すとおり、ＩＦＮα変異蛋白質のリジン変換変異蛋白質である『ＭＵＴ２Ｋ３１』と『ＭＵＴ２Ｋ１３４』は、もとの変異蛋白質『ＭＵＴ２』と比べると、抗ウイルス活性及び細胞増殖抑制活性が減少するものの、野性型ＩＦＮα８と比べて、高い抗ウイルス活性及び細胞増殖抑制活性を保持していた。【００４０】
実験３：リジン変換変異蛋白質と水溶性高分子との生理活性複合体
実験３−１：生理活性複合体の製造
実験２−２の方法で得られたリジン変換変異蛋白質又は実験１−３で得られた野性型ＩＦＮα８に、分子量２０ｋＤａのポリエチレングリコールを結合させた。すなわち、野性型ＩＦＮα８、ＩＦＮα変異蛋白質『ＭＵＴ２Ｋ３１』又は『ＭＵＴ２Ｋ１３４』をホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）に濃度０．１乃至５ｍｇ／ｍｌになるように溶解した後、水溶性の高分子としてモノメトキシＮ−サクシンイミジルプロピオネートにより活性化させたポリエチレングリコール（ｍ−ＰＥＧ−ＳＰＡ）、をモル比で蛋白質の３乃至８倍になるように加え、７℃で２時間反応させた。次いで、反応混合物へε−アミノカプロン酸をモル比で水溶性の高分子の１０倍量加え、暫時静置して反応を停止させた後、反応混合物を陰イオン交換クロマトカラム（商品名『Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ』、アマシャムバイオサイエンス株式会社販売（東京、日本））によりＨＰＬＣ分画して蛋白質に結合していないポリエチレングリコールを除去した。さらにゲル濾過クロマトカラム（商品名『Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００』、アマシャムバイオサイエンス株式会社販売（東京、日本））を用いてＨＰＬＣにより分画し、１分子のＩＦＮα８又はＩＦＮα変異体に１分子のポリエチレングリコールが結合してなる生理活性複合体を採取した。【００４１】
実験３−２：熱安定性
実験３−１で得た生理活性複合体をそれぞれ、５（ｖ／ｖ）％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地で１０，０００ＩＵ／ｍｌの濃度に調製し、下記表７に示す温度で３０分間加熱処理を行った。遠心分離後、培地上清を回収し、それらをＦＬ細胞及びシンドビスウイルスを用いたアッセイ系に供し、残存する抗ウイルス活性を測定し、加熱前の抗ウイルス活性に対する百分率（残存活性率）を下記数式１により求めた。結果を表７に示す。【００４２】
数式１
残存活性率（％）＝
（加熱後のウイルス感染阻止活性／加熱前のウイルス感染阻止活性）×１００【００４３】
表７
0004815356.tif 000008
【００４４】
表７に示すとおり、ポリエチレングリコールと結合した『ＭＵＴ２Ｋ３１』又は『ＭＵＴ２Ｋ１３４』は、６０℃で処理した後にも６９％又は８４％の活性を保持しており、ポリエチレングリコールと結合した野性型ＩＦＮα８よりも安定性に優れることが判明した。【００４５】
実験３−３：リジン変換変異蛋白質と水溶性高分子との生理活性複合体の生物作用
実験１−４に準じて抗ウイルス活性を、実験１−５に準じて細胞増殖抑制活性を調べた。対照としてＩＦＮα２ａに４０ｋＤａのポリエチレングリコールが結合している市販のＩＦＮα製剤（商品名『ペガシス』、中外製薬株式会社販売（東京、日本））を用いた。抗ウイルス活性の結果を表８に、細胞増殖抑制活性の結果を表９に示す。【００４６】
表８
0004815356.tif 000009
【００４７】
表９
0004815356.tif 000010
【００４８】
表８及び表９に示すとおり、『ＭＵＴ２Ｋ３１』又は『ＭＵＴ２Ｋ１３４』にポリエチレングリコールを結合して作製した生理活性複合体は、市販のポリエチレングリコールを結合したＩＦＮα２ａ製剤よりも、著しく高い抗ウイルス活性及び細胞増殖抑制活性を有していた。【００４９】
実験４：急性毒性
常法にしたがって、８週齢の雄性マウス（体重２０乃至２５ｇ）に、実験１−３で得られたＩＦＮα変異蛋白質『ＭＵＴ１』、『ＭＵＴ２』、『ＭＵＴ３』又は『ＭＵＴ４』、実験２−２で得られたＩＦＮα変異蛋白質『ＭＵＴ２』のリジン変換変異蛋白質『ＭＵＴ２Ｋ３１』又は『ＭＵＴ２Ｋ１３４』、又は、実験３−１で得られた『ＭＵＴ２Ｋ３１』又は『ＭＵＴ２Ｋ１３４』に１分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体のうちのいずれかを、経皮、経口又は腹腔経路で注射投与したところ、生理活性複合体のＬＤ５０は、いずれの投与経路においても１ｍｇ／ｋｇ体重以上であった。このことは、この発明の生理活性複合体がヒトへの投与を前提とする医薬品として、又は医薬品に配合して用いることが安全であることを物語っている。【００５０】
以下、実施例で本発明の詳細を説明する。
実施例１【００５１】
＜液剤＞
安定剤として１％（ｗ／ｖ）人血清アルブミンを含む生理食塩水に、実験１−３で得られたＩＦＮα変異蛋白質『ＭＵＴ１』、『ＭＵＴ２』、『ＭＵＴ３』又は『ＭＵＴ４』、実験２−２で得られたＩＦＮα変異蛋白質『ＭＵＴ２』のリジン変換変異蛋白質『ＭＵＴ２Ｋ３１』又は『ＭＵＴ２Ｋ１３４』、又は、実験３−１で得られた『ＭＵＴ２Ｋ３１』又は『ＭＵＴ２Ｋ１３４』に１分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体のうちのいずれかを１ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、常法にしたがって精密濾過して滅菌して液剤を得た。【００５２】
本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療又は予防するための注射剤、点眼剤又は点鼻剤として有用である。
実施例２【００５３】
＜乾燥注射剤＞
安定剤として１％（ｗ／ｖ）精製ゼラチンを含む生理食塩水１００ｍｌに、実験１−３で得られたＩＦＮα変異蛋白質『ＭＵＴ１』、『ＭＵＴ２』、『ＭＵＴ３』又は『ＭＵＴ４』、実験２−２で得られたＩＦＮα変異蛋白質『ＭＵＴ２』のリジン変換変異蛋白質『ＭＵＴ２Ｋ３１』又は『ＭＵＴ２Ｋ１３４』、又は、実験３−１で得られた『ＭＵＴ２Ｋ３１』又は『ＭＵＴ２Ｋ１３４』に１分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体のうちのいずれかを１００ｍｇ溶解し、常法にしたがって精密濾過により滅菌し、バイアル瓶に１ｍｌずつ分注し、凍結乾燥させた後、密栓して乾燥注射剤を得た。【００５４】
本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療又は予防するための乾燥注射剤として有用である。
実施例３【００５５】
＜軟膏剤＞
滅菌蒸留水にカルボキシビニルポリマー（商品名『ハイビスワコー』、和光純薬工業株式会社販売（大阪、日本））と、パイロジェンを除去した高純度トレハロース（登録商標『トレハ』、株式会社林原商事販売（岡山、日本））とをそれぞれ１．４％（ｗ／ｖ）及び２．０％（ｗ／ｖ）になるように溶解した後、実験１−３で得られたＩＦＮα変異蛋白質『ＭＵＴ１』、『ＭＵＴ２』、『ＭＵＴ３』又は『ＭＵＴ４』、実験２−２で得られたＩＦＮα変異蛋白質『ＭＵＴ２』のリジン変換変異蛋白質『ＭＵＴ２Ｋ３１』又は『ＭＵＴ２Ｋ１３４』、又は、実験３−１で得られた『ＭＵＴ２Ｋ３１』又は『ＭＵＴ２Ｋ１３４』に１分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体のうちのいずれかの適量を均一に混合し、ｐＨ７．２に調製して、１ｇ当り生理活性複合体を約５μｇ含むペースト状物を得た。【００５６】
延展性と安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療又は予防するための軟膏剤として有用である。
実施例４【００５７】
＜錠剤＞
無水結晶性α−マルトース粉末（登録商標『ファイントース』、株式会社林原商事販売（
岡山、日本））に、実験１−３で得られたＩＦＮα変異蛋白質『ＭＵＴ１』、『ＭＵＴ２』、『ＭＵＴ３』又は『ＭＵＴ４』、実験２−２で得られたＩＦＮα変異蛋白質『ＭＵＴ２』のリジン変換変異蛋白質『ＭＵＴ２Ｋ３１』又は『ＭＵＴ２Ｋ１３４』、又は、実験３−１で得られた『ＭＵＴ２Ｋ３１』又は『ＭＵＴ２Ｋ１３４』に１分子のポリエチレングリコールが結合した生理活性複合体のうちのいずれかの適量を均一に混合し、得られた混合物を常法により打錠して製品１錠（約２００ｍｇ）当り生理活性複合体を約１μｇ含む錠剤を得た。【００５８】
摂取性、安定性に優れた本品は、悪性腫瘍、ウイルス性疾患、細菌感染症及び免疫疾患をはじめとする感受性疾患を治療又は予防するための錠剤として有用である。
産業上の利用可能性【００５９】
以上説明したとおり、本発明のＩＦＮα変異蛋白質は、従来のＩＦＮα製剤と比較して著しく活性が高く、また、水溶性の高分子と結合させて生理活性複合体とした場合、体内動態に優れ、注射投与しても、血中で高濃度状態が長時間持続する。したがって、本発明によれば、従来のＩＦＮαを有効成分とする感受性疾患剤よりも、抗ウイルス作用及び抗腫瘍作用に優れた感受性疾患剤を提供することができ、医薬品の分野において、例えば、抗腫瘍剤、抗ウイルス疾患剤、抗感染症剤、免疫疾患剤などとして多種多様の用途を有する。
【配列表】
0004815356000001.app