(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析を用いて試料のアミノ酸配列又は塩基配列を同定するための構造解析システムであって、
a)試料のＭＳ分析を実行してＭＳマススペクトルを取得するとともに、該ＭＳマススペクトルに現れる同位体ピーク群の中から、一部のピークを選択して該ピークに対応したイオンをプリカーサイオンとしてＭＳ／ＭＳ分析を実行してＭＳ／ＭＳマススペクトルを取得する質量分析手段と、
b)前記質量分析手段により得られたＭＳ／ＭＳマススペクトルに現れる同位体ピーク群を、各同位体ピーク群に含まれる複数のピークの強度比に基づいてその元となったプリカーサイオンに含まれる主同位体以外の同位体の個数を推定することにより、該個数に１対１で対応した複数のクラスにクラス分けし、該クラス毎に同位体ピーク群内のモノアイソトピックピークを決定し、少なくともそのモノアイソトピックピークの質量電荷比を挙げたピークリストを作成するピークリスト作成手段と、
c)前記ピークリスト作成手段によって作成されたピークリストを基に試料のアミノ酸配列又は塩基配列を同定する配列同定手段と、
を備えることを特徴とする構造解析システム。
【請求項２】
前記試料はペプチド混合物であって、該ペプチド混合物のアミノ酸配列を同定するものであることを特徴とする請求項１に記載の構造解析システム。
【請求項３】
前記質量分析手段は、ペプチド混合物のＭＳ分析によって得られた同位体ピーク群の中から、単一のピークを選択してＭＳ／ＭＳ分析を行うことを特徴とする請求項２に記載の構造解析システム。
【請求項４】
前記単一のピークとして、ペプチド混合物のＭＳ分析によって得られた同位体ピーク群の中で最大のイオン強度を有するピークを選択することを特徴とする請求項３に記載の構造解析システム。
【請求項５】
前記質量分析手段は、三次元四重極イオントラップを備えた質量分析装置であって、該イオントラップの内部でプリカーサイオンの開裂を行うものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の構造解析システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析を利用して各種試料の構造を解析するシステムに関し、具体的には、例えばペプチド混合物を含む試料を質量分析し、得られたデータを基に各ペプチドのアミノ酸配列を決定するのに好適な構造解析システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ポストゲノム研究としてタンパク質の構造や機能の解析が急速に進められている。このようなタンパク質の構造・機能解析手法の一つとして、質量分析装置を用いたタンパク質の発現解析や一次構造解析が広く行われるようになってきており、四重極型イオントラップ（Quadrupole Ion Trap：ＱＩＴ）や衝突誘起分解（Collision Induced Dissociation：ＣＩＤ）などによって特定のピークに対応するイオンの捕捉と開裂を行う、いわゆるＭＳ／ＭＳ分析（又はＭＳｎ分析）が威力を発揮している。一般にＭＳ／ＭＳ分析では、まず、分析対象物から特定の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有するイオンをプリカーサイオンとして選別し、該プリカーサイオンをＣＩＤによって開裂させる。その後、開裂によって生成したイオン（プロダクトイオン）を質量分析することによって、目的とするイオンの質量や化学構造についての情報を取得することができる。
【０００３】
上記のようなＭＳ／ＭＳ（又はＭＳｎ）分析を利用してタンパク質のアミノ酸配列の同定を行う場合には、まず、タンパク質を適当な酵素で消化してペプチド断片の混合物としてから、該ペプチド混合物を質量分析（ＭＳ分析）に供する。このとき、各ペプチドを構成する、炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）等の元素には質量の異なる安定同位体が存在するため、同一のアミノ酸配列から成るペプチドであっても、その同位体組成の違いによって質量電荷比の異なる複数のピークがマススペクトル上に出現する。該複数のピークは、天然存在比が最大の同位体のみで構成されたイオン（主イオン又はモノアイソトピックイオンという）のピークと、それ以外の同位体を含むイオン（同位体イオン）のピークとから成り、これらは１[Ｄａ]間隔で並んだ複数本のピークから成るピーク群を形成する。本発明ではこれを同位体ピーク群と呼ぶ。マススペクトル上での同位体ピーク群の一例を図７に示す。
【０００４】
続いて、上記のようなペプチド混合物の質量分析データ（ＭＳマススペクトルデータ）の中から、単一のペプチドに由来する一組の同位体ピーク群をプリカーサイオンとして選択し、該プリカーサイオンを開裂させることで得られたイオン（プロダクトイオン）を質量分析（ＭＳ／ＭＳ分析）する。
【０００５】
このようにして得られたＭＳ／ＭＳ分析によるマススペクトルパターンや、上記ＭＳ分析によるマススペクトルパターンをデータベース検索に供することによって、被検ペプチドのアミノ酸配列を同定することができる。また、これらのマススペクトルパターンをデノボ（De Novo)シーケンスと呼ばれるコンピュータソフトウェアを用いて数理的に解析することで、各ペプチドのアミノ酸配列を推定することもできる。
【０００６】
従来、上記のような手法によるアミノ酸配列の同定を行う際に、ＭＳ分析によるマススペクトル上で異なるペプチドに由来する同位体ピーク群が近接していた場合には、所望のペプチド由来のピークに対応するイオンと共に該ピークに近接した他のペプチド由来のピークに対応したイオンがプリカーサイオンとして選択されてしまい、正確な同定を行うことができなかった。これに対し、近年の高質量分離能イオントラップ技術の発展に伴い、１[Ｄａ]間隔で現れる同位体ピーク群の中から単一のピークに対応するイオンを選択してプリカーサイオンとすることが可能となったため、異なるペプチド由来の同位体ピーク群の一部が重なり合っているような場合であっても、その中から各ペプチドに由来するピークに対応するイオンを個別に選択してＭＳ／ＭＳ分析を行うことで、各ペプチドの分離・同定を的確に行うことができるようになった（例えば非特許文献１参照）。
【０００７】
しかしながら、異なるペプチド由来の同位体ピーク群の重なりが大きい場合には、上述のように同位体ピーク群の中から単一ピークを選択してそれに対応するイオンのＭＳ／ＭＳ分析を行っても、もともとその単一ピーク自体が複数種類のペプチドに由来するイオンが混在した状態から得られたものであるため、ＭＳ／ＭＳマススペクトルの解釈が複雑になり、正確なアミノ酸配列の同定を行うことができないという問題があった。
【０００８】
こうした問題を解決するために、本願発明者は非特許文献２において、ＭＳ／ＭＳ分析により得られたマススペクトル上の同位体ピーク群を、各同位体ピーク群を構成するピークの数に応じてクラス分けし、各クラス毎にピークの質量電荷比を集めたピークリストを作成して、このピークリストに基づいてアミノ酸配列の同定を行うという手法を提案している。この手法によれば、従来よりも個々のペプチドの同定精度の向上が期待できる。
【０００９】
しかしながら、こうした方法によっても次のような問題がある。即ち、或る１組の同位体ピーク群を構成する複数個のピークにおいては、選択したプリカーサイオンに含まれる同位体の個数が多くＭＳ／ＭＳピーク群の質量電荷比が大きくなるほど、高質量電荷比のイオンに対応するピークに比べて低質量電荷比のイオンに対応するピークの強度が相対的に小さくなる傾向にある。そのため、相対的に低い質量電荷比のピークの強度が小さ過ぎ、測定ノイズに埋もれてしまって明確にピークとして検出することが困難になる場合がある。こうした場合、同位体ピーク群を構成するピーク本数を正確に把握できず、誤ったクラス分けを行うおそれがある。
【００１０】
いま一例として、図８に、ＭＳ分析で得られた質量電荷比１０４６から始まるピーク群或いはその一部をプリカーサイオンとして選択してＭＳ／ＭＳ分析した結果の一部、具体的には質量電荷比９３２近傍のマススペクトルの拡大図を示す。この図８において（ａ）〜（ｄ）は、質量電荷比１０４６〜１０４８のピーク群（all）、質量電荷比１０４６のピーク１本のみ、質量電荷比１０４７のピーク１本のみ、質量電荷比１０４８のピーク１本のみ、に対応するイオンをそれぞれプリカーサイオンとして選択してＭＳ／ＭＳ分析を実行して得たスペクトルを示している。このとき、ＭＳ／ＭＳマススペクトルに出現するピークの本数は、実際にはプリカーサイオンに含まれる同位体の数に応じて（ｂ）では１本、（ｃ）では２本、（ｄ）では３本となっている筈である。しかしながら、（ｄ）において、質量電荷比１０４８のピークに対応するイオンをプリカーサイオンとして選択して実行されたＭＳ／ＭＳ分析によるマススペクトルの同位体ピーク群では、質量電荷比が最も小さな（ｍ／ｚ＝９３２）ピークの強度が殆ど測定ノイズと同程度のレベルしかなく、実質的にこれをピークとして検出することは困難である。その結果、例えばこの結果を見ても、ピーク数が２であるか３であるかを明確に区別するのは困難である。
【００１１】
【非特許文献１】ハイペップ研究所沖縄ラボ設立記念コンファレンス配付資料、2005年2月19日、島津製作所
【非特許文献２】梶原、岩本、「ピーク・クラシフィケイション・イン・ＭＳ／ＭＳ・ユージング・ハイ・プリカーサ・リゾリューション・イオン・トラップ (Peak Classification in MS/MS Using High Precursor Resolution Ion Trap)」、53rd ASMS Conference、WP345 (2005)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
即ち、上記のような従来の方法では、ＭＳ／ＭＳマススペクトル上に現れる各同位体ピーク群を、その同位体ピーク群を構成する複数のピークの本数に応じてクラス分けしようとしても、そのピーク自体の正確な把握が困難であるためにクラス分けの精度を保つのが難しく、その結果、アミノ酸配列の同定の精度が低下するおそれがある。
【００１３】
本発明はこうした課題を解決するために成されたものであり、例えば複数のペプチドに由来する同位体ピーク群が重なり合っている場合であって、しかも、その同位体ピーク群の中の或る同位体ピーク群又はその一部をプリカーサイオンとして選択してＭＳ／ＭＳ分析を行った際に現れるピークの強度が小さいような場合であっても、各ペプチドのアミノ酸配列を高い精度で同定することのできる構造解析システムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題を解決するために成された本発明に係る構造解析システムは、質量分析を用いて試料のアミノ酸配列又は塩基配列を同定するための構造解析システムであって、
質量分析を用いて試料のアミノ酸配列又は塩基配列を同定するための構造解析システムであって、
a)試料のＭＳ分析を実行してＭＳマススペクトルを取得するとともに、該ＭＳマススペクトルに現れる同位体ピーク群の中から、一部のピークを選択して該ピークに対応したイオンをプリカーサイオンとしてＭＳ／ＭＳ分析を実行してＭＳ／ＭＳマススペクトルを取得する質量分析手段と、
b)前記質量分析手段により得られたＭＳ／ＭＳマススペクトルに現れる同位体ピーク群を、各同位体ピーク群に含まれる複数のピークの強度比に基づいてその元となったプリカーサイオンに含まれる主同位体以外の同位体の個数を推定することにより、該個数に１対１で対応した複数のクラスにクラス分けし、該クラス毎に同位体ピーク群内のモノアイソトピックピークを決定し、少なくともそのモノアイソトピックピークの質量電荷比を挙げたピークリストを作成するピークリスト作成手段と、
c)前記ピークリスト作成手段によって作成されたピークリストを基に試料のアミノ酸配列又は塩基配列を同定する配列同定手段と、
を備えることを特徴としている。
【００１５】
本発明において「試料」は生体に由来する生体試料や人工的に合成された試料など各種のものとすることができるが、典型的な一例として、試料はペプチド混合物であって、本発明は該ペプチド混合物のアミノ酸配列を同定するための構造解析システムとすることができる。
【００１６】
また本発明において「ＭＳ／ＭＳ分析」とは、所定のプリカーサイオンを開裂させ、得られたイオン（プロダクトイオン）を質量電荷比に基づいて分離・検出することを指し、１回の開裂を行うＭＳ／ＭＳ分析のみならず、目的分子を複数回開裂させる、いわゆるＭＳｎ分析をも含むものとする。
【００１７】
また、上記質量分析手段における「一部のピーク」としては、複数本のピークを選択するようにしてもよいが、データの解析を容易にするため、同位体ピーク群の中から単一のピークを選択してＭＳ／ＭＳ分析を行うようにすることが望ましい。さらにまた、好ましくは、該単一のピークとしてＭＳ分析で得られた同位体ピーク群の中でイオン強度が最大のものを選択するようにするとよい。
【００１８】
また「質量分析手段」はとくにその形態や方式を問わないが、典型的な一例として、三次元四重極イオントラップを備えた質量分析装置であって、該イオントラップの内部でプリカーサイオンの開裂を行うものとすることができる。特に単一ピークを選択してＭＳ／ＭＳ分析を実行するためには、高い分離能でプリカーサイオンを選択してＭＳ／ＭＳ分析（又はＭＳｎ分析）を行うことが可能な質量分析装置である必要があるが、三次元四重極イオントラップと飛行時間型質量分離部とを組み合わせたＩＴ−ＴＯＦ型の構成はこうした条件に適合する。また、質量分析装置のイオン源はマトリックス支援レーザー脱離イオン化（Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization：ＭＡＬＤＩ）法による試料のイオン化を行うものとするとよい。或いは、シリコン上脱離イオン化法（Desorption/Ionization on (porous）Silicon：ＤＩＯＳ）などの公知の表面支援レーザー脱離イオン化法（Surface Assisted Laser Desorption/Ionization：ＳＡＬＤＩ）や、その他の公知のレーザーイオン化法を利用してもよい。
【００１９】
また、「配列同定手段」は、ピークリスト作成手段によって作成されたピークリストに基づいて、それらのピークが由来する試料の配列、例えばペプチドのアミノ酸配列を同定するものである。ピークリストからアミノ酸配列を同定する方法としては、例えば、ピークリストをデータベースと照会することでスペクトルパターンの一致する既知ペプチドを検索する方法や、各ピークリストを数理的に解析することで、そのアミノ酸配列を推定する方法など、周知の各種の方法を用いることができる。
【発明の効果】
【００２０】
上記質量分析手段による同位体ピーク群の一部のみをプリカーサイオンとしたＭＳ／ＭＳ分析では、該プリカーサイオンの開裂によって生じたプロダクトイオンの同位体ピーク群を構成するピークの本数は、該プリカーサイオンに含まれていた主同位体以外の同位体の個数の最大値によって制限される。但し、場合によっては同位体ピーク群を構成する一部のピークの強度が非常に小さく、明確にはピークとして認識されにくい場合がある。そこで、本発明に係る構造解析システムにおいて、ピークリスト作成手段は、上記質量分析手段によるＭＳ／ＭＳマススペクトル上に現れる複数組の同位体ピーク群のそれぞれについて、各同位体ピーク群を構成する複数のピークの強度比に基づいてそのＭＳ／ＭＳ分析の元となったプリカーサイオンに含まれる主同位体以外の同位体の個数を推定することでクラス分けする。
【００２１】
具体的には、例えば、プリカーサイオンの元素組成を推定した上でその中に所定個数（１個、２個、…）の同位体が含まれると仮定し、その仮定の下でＭＳ／ＭＳ分析で得られる同位体ピーク群に含まれるピークに対応する元素組成を推定し、各ピークの強度比を計算する。即ちこれは上記主同位体以外の同位体の個数の仮定の下での理論的な強度比である。そして、実測のＭＳ／ＭＳマススペクトル上に現れる同位体ピーク群におけるピークの強度比と上記理論的な強度比を比較し、一致しているとみなせる場合には、その同位体ピーク群をその仮定した主同位体以外の同位体の個数のクラスに振り分ける。こうして各同位体ピーク群を各クラスに分類して、各クラス毎にピークの質量電荷比を情報とするピークリストを作成する。
【００２２】
同位体ピーク群のクラス分けにピーク強度比を利用しているため、例えば或る同位体ピーク群を構成する複数のピークの中で質量電荷比が最も小さなピークの強度が非常に小さく、明確にピークが存在すると識別しにくいような場合でも、ピーク強度比に基づいてその質量電荷比に対応するピークの強度がもともと小さいことが判明しているので、この同位体ピーク群を正確にクラス分けすることが可能となる。
【００２３】
本発明に係る構造解析システムによれば、例えばペプチド混合物をＭＳ分析したＭＳマススペクトルにおいて、異なるペプチドに由来する同位体ピーク群が重なり合っている場合でも、選択したプリカーサイオンに含まれる主同位体以外の同位体の個数に基づいて、ＭＳ／ＭＳマススペクトル上に現れる個々のペプチドに由来する同位体ピーク群を正確に分類することができる。これにより、正確なピークリストをアミノ酸配列や塩基配列の同定のために供することができるので、アミノ酸配列や塩基配列を従来よりも高い精度で同定することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明に係る構造解析システムの一実施例として、ペプチド混合物のアミノ酸配列を同定するためのシステムを例示して説明する。
【００２５】
図１は本実施例に係る構造解析システムの概略構成図である。本実施例の構造解析システムは、大きく分けて質量分析部１０と制御／処理部２０とから成る。質量分析部１０は、ＭＡＬＤＩ法によってペプチド混合物を含む試料をイオン化するイオン化部１１と、所定の質量電荷比を有するイオンをプリカーサイオンとして選択すると共に、該プリカーサイオンを開裂させてプロダクトイオンを生成する三次元四重極型のイオントラップ部１２と、イオンを質量電荷比に基づいて時間方向に分離する飛行時間型の質量分離部１３と、分離されたイオンを順次検出するイオン検出器１４とを備えている。
【００２６】
制御／処理部２０は、質量分析部１０の各部を制御する制御部２１と、イオン検出器１４により得られる検出信号を処理してマススペクトル（ＭＳマススペクトル、ＭＳ／ＭＳマススペクトル）を作成するＭＳデータ処理部２２と、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳマススペクトルデータを処理することによりピークリストを作成するピークリスト作成部２３と、該ピークリストに基づいてアミノ酸配列の同定処理を行う配列同定処理部２４と、同定の際に使用される同定用データベース２５とから成る。配列同定処理部２４は例えばＭＡＳＣＯＴ（Matrix Science社製）等の検索エンジンを含み、公共のゲノムデータベースやタンパク質データベース等を同定用データベース２５として同定処理を行うものとすることができる。また、De Novoシーケンスなどのソフトウエアを用いて数理的にアミノ酸配列を同定する処理を行うものであってもよい。なお、制御／処理部２０の機能は、パーソナルコンピュータに搭載した所定のソフトウエアを実行することにより実現することができる。
【００２７】
以下、本実施例の構造解析システムを用いてペプチド混合物のアミノ酸配列を同定する際の全体的な手順について、図２のフローチャートに基づいて説明する。
【００２８】
まず、制御部２１の制御の下に、ペプチド混合物を含む試料に対し質量分析部１０によりＭＳ分析を実行する（ステップＳ１）。これにより、ＭＳデータ処理部２２では、横軸を質量電荷比、縦軸を強度とするＭＳマススペクトルが作成される。このＭＳマススペクトルには、それぞれ異なるペプチドに由来する複数の同位体ピーク群が現れる。いま、図４に示すように、得られたＭＳマススペクトルにおいて、質量電荷比が４０００[Ｄａ]であるペプチドＡ由来の同位体ピーク群と、質量電荷比が４００１[Ｄａ]であるペプチドＢ由来の同位体ピーク群とが重なり合っているとする。
【００２９】
次に、例えば同位体ピーク群の中から最も強度が大きいピークに対応するイオンをプリカーサイオンとして選択する（ステップＳ２）。例えば図４の例では、ペプチドＡの４番目のピークと、ペプチドＢの３番目のピークが重なり合った、質量電荷比４００３[Ｄａ]のピーク（４００３[Ｄａ]）をプリカーサイオンとして選択する。
【００３０】
そして、制御部２１の制御の下に、質量分析部１０は上記プリカーサイオンとして選択されたイオンのＭＳ／ＭＳ分析を実行する（ステップＳ３）。即ち、イオントラップ部１２によってプリカーサイオンが選択された上で開裂され、該プリカーサイオンの開裂によって生じたプロダクトイオンが質量分離部１３で分離してイオン検出器１４により検出される。そして、ＭＳデータ処理部２２ではＭＳ／ＭＳマススペクトルが作成される。
【００３１】
ステップＳ２でプリカーサイオンとして選択された上記ＭＳマススペクトル上のピーク（４００３[Ｄａ]）は、ペプチドＡの主イオンのピーク（４０００[Ｄａ]）よりも質量電荷比が３[Ｄａ]大きいものであるため、該ピークに含まれるペプチドＡの同位体イオンには、主同位体以外の同位体が最大で３つ含まれていることになる。同様に該ピークはペプチドＢの主イオンのピーク（４００１[Ｄａ]）よりも質量電荷比が２[Ｄａ]大きいものであるため、該ピークに含まれるペプチドＢの同位体イオンには主同位体以外の同位体が最大で２つ含まれることになる。したがって、該ピークの開裂によって生じるペプチドＡ由来のプロダクトイオンには、それぞれ０〜３個の主同位体以外の同位体が含まれることになるため、ペプチドＡ由来のプロダクトイオンは、ＭＳ／ＭＳマススペクトル上において４本のピークから成る同位体ピーク群（四連ピーク）を形成する筈である。同様に、ペプチドＢ由来のプロダクトイオンには、それぞれ０〜２個の主同位体以外の同位体が含まれることになるため、ペプチドＢ由来のプロダクトイオンは、ＭＳ／ＭＳマススペクトル上において３本のピークから成る同位体ピーク群（三連ピーク）を形成する筈である。
【００３２】
次に、上記ＭＳ／ＭＳマススペクトルにおいて、所定値以上の強度を持つピークを含み、１[Ｄａ]毎にピークが現れるピーク群を同位体ピーク群とみなして抽出する（ステップＳ４）。先にプリカーサイオンとして選択したピークが、異なるペプチド由来のピークが重なり合ったものである場合に、該プリカーサイオンに含まれる主同位体以外の同位体の最大数が各ペプチド間で異なってさえいれば、該プリカーサイオンから生じるプロダクトイオンは、ＭＳ／ＭＳマススペクトル上でペプチド毎にピーク数が異なる同位体ピーク群を形成する。したがって、原則的には、ピーク本数の違いに基づいてＭＳ／ＭＳマススペクトル上の同位体ピーク群をクラス分けすれば、各クラスには、それぞれ同一ペプチドに由来するプロダクトイオンの同位体ピーク群のみが含まれることになる。
【００３３】
ところが、実際には、前述したようにピーク強度がかなり小さいものが含まれている可能性があり、そうした場合にはピークの有無を確定的に判断できないため、ピークの本数だけでは正確なクラス分けができない。そこでここでは、同位体ピーク群に含まれる複数のピークの強度比を利用することで強度が小さなピークも確実に識別した上で、プリカーサイオンに含まれる主同位体以外の同位体の個数を推定してそれに基づくクラス分けを行う（ステップＳ５）。なお、具体的な方法は後述する。
【００３４】
クラス分けがなされたならば、各クラスのＭＳ／ＭＳマススペクトルにおいて、所定のアルゴリズムに従って同位体ピーク群内のモノアイソトピックピーク（天然存在比が最大の同位体から構成されるイオンのピーク）を決定し、その質量電荷比等を記載したピークリストを作成する（ステップＳ６）。
【００３５】
以上により、ペプチドＡに関するピークリストＬａと、ペプチドＢに関するピークリストＬｂとが得られるので、各ピークリストＬａ、Ｌｂを配列同定処理部２４に引き渡す。配列同定処理部２４は各ピークリストＬａ、Ｌｂについてデータベースの検索、或いはDe Novoシーケンス等によるＭＳ／ＭＳマススペクトルパターンの数理的解析処理を実行することにより、ペプチドＡ及びペプチドＢのアミノ酸配列を同定する（ステップＳ７）。
【００３６】
続いて、上記ステップＳ５の処理を図３のフローチャートに従ってより詳細に説明する。まず選択されたプリカーサイオンの元素組成を推定する（ステップＳ１１）。そして初期値として変数ｎを１にセットし（ステップＳ１２）、プリカーサイオンに主同位体以外の同位体がｎ個、つまり当初は１個含まれるものと仮定する（ステップＳ１３）。その仮定の下でＭＳ／ＭＳ分析により得られるピークの組成を推定し、ＭＳ／ＭＳマススペクトルに現れる同位体ピーク群の各ピークの強度比を理論的に計算する（ステップＳ１４）。
【００３７】
いま図５に示すような、４個のピークＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４から成る同位体ピーク群を想定すると、ピーク強度比とは各ピークＰ１〜Ｐ４の強度Ｕ１〜Ｕ４の比Ｕ１：Ｕ２：Ｕ３：Ｕ４であり、後述のような比較のためには最大強度（この場合にはＵ４）を１として他を規格化して表せばよい。即ち、強度比はＵ１／Ｕ４：Ｕ２／Ｕ４：Ｕ３／Ｕ４：１となる。それから、その求まった理論計算による強度比と、実測によるＭＳ／ＭＳマススペクトル上の上記同位体ピーク群の各ピーク強度比との相関を示す相関値Ｔｎを計算する（ステップＳ１５）。ピーク強度比の相似性が高いほど高い相関値を示す。
【００３８】
次に変数ｎが或る既定値Ｎに一致したか否かを判定する（ステップＳ１６）。既定値Ｎはプリカーサイオンに含まれる主同位体以外の同位体の個数の最大値を制限する値であり、例えばプリカーサイオンが１個、２個又は３個の主同位体以外の同位体を含むことを想定する場合にはＮ＝３と設定しておく。そして、変数ｎがＮに達していなければｎに１を加算したものを新たなｎとし（ステップＳ１７）、ステップＳ１３に戻る。一方、ステップＳ１６において変数ｎがＮに達していれば、それまでに算出した相関値Ｔ１〜ＴＮの中で値が最大であるものを最大値Ｔmaxとして抽出する（ステップＳ１８）。そして、この最大値Ｔmaxが或る閾値以上であるか否かを判定する（ステップＳ１９）。
【００３９】
最大値Ｔmaxが閾値を超えなければ、たとえ最大値Ｔmaxであっても実測によるピーク強度比が理論計算によるピーク強度比に類似しているとは結論付けることができない。そこで、ステップＳ１９でＮＯの場合には、その同位体ピーク群を、主同位体以外の同位体を含まないプリカーサ由来のピークリストのクラスに分類する（ステップＳ２１）。これに対し、ステップＳ１９でＹＥＳの場合には、その同位体ピーク群を、最大値Ｔmaxを与える主同位体以外の同位体の個数を含むプリカーサ由来のピークリストのクラスに分類する（ステップＳ２０）。即ち、例えばプリカーサイオンに主同位体以外の同位体が２個含まれていた（ｎ＝２）と仮定したときに計算されたピーク強度比に対する相関値Ｔ２がＴmaxであって且つＴmaxが閾値以上であった場合には、ＭＳ／ＭＳマススペクトルにおけるこの同位体ピーク群を同位体を２個を含むプリカーサイオン由来のクラスに分類する。
【００４０】
上記図３により説明した処理の具体例を挙げる。いま、ここではアンジオテンシンII（AngiotensinII：アミノ酸配列＝[ＤＲＶＹＩＨＰＦ］、質量電荷比＝１０４６．５[Ｄａ]）を解析する場合を例示する。ここで質量電荷比１０４７．２０[Ｄａ]であるピークに対応するイオンをプリカーサイオンとして選択するものとする。
【００４１】
同位体ピーク強度比を算出するためには、プリカーサイオンを構成する元素組成の推定が必要である。観測ピークの質量電荷比から構成元素を推定するために、センコらが提案した（Michel W. Senko et.al,「デターミネイション・オブ・モノアイソトピック・マシズ・アンド・イオン・ポピュレイションズ・フォー・ラージ・バイオモレキュルズ・フロム・リゾルブド・アイソトピック・ディストリビューションズ (Determination of monoisotopic masses and ion populations for large biomolecules from resolved isotopic distributions）」、Journal of American Soc. Mass Spectom., 6, pp.229-233,(1995)参照）アベレージネ（Averagine）モデルを利用することができる。Averagineモデルはタンパク質データベースの統計解析よりアミノ酸の平均組成を求めたもので、Ｃ４．９３８４Ｈ７．７５８３Ｎ１．３５７７Ｏ１．４７７３Ｓ０．０４１７をユニットアミノ酸配列とする。このユニットはモノアイソトピックの元素質量で計算すると１１１．０５４３[Ｄａ]となる。例えば１０００[Ｄａ]における同位体ピーク群を計算するため使用する元素組成は９．００４６（＝１０００／１１１．０５４３）ユニットのAveragineモデルの構成元素数を四捨五入により整数化した後（Ｃ４４Ｈ７０Ｎ１２Ｏ１３、質量電荷比＝９７４．５１８５[Ｄａ]）、与えられた質量値に近付けるべくＨの数を適宜増減させて求める（Ｃ４４Ｈ９５Ｎ１２Ｏ１３、質量電荷比＝９９９．７１４２[Ｄａ]）。
【００４２】
上記Averagineモデルを用いると、プリカーサイオンの質量電荷比（１０４７．２０[Ｄａ]）から推定される元素組成はＣ５０Ｈ７１Ｎ１３Ｏ１２となる。いまプリカーサイオンによるピークがＭＳマススペクトルにおける２番目の同位体ピークであると仮定すると、プリカーサイオンには主同位体以外の同位体が１個含まれる（つまりｎ＝１）ことになる。したがって、この仮定の下では、このプリカーサイオンを開裂して得られるプロダクトイオンの元素組成は、１２Ｃ４９１３Ｃ１Ｈ７１Ｎ１３Ｏ１２、Ｃ５０１Ｈ７０２Ｈ１Ｎ１３Ｏ１２、Ｃ５０Ｈ７１１４Ｎ１２１５Ｎ１Ｏ１２、又は、Ｃ５０Ｈ７１Ｎ１３１６Ｏ１１１７Ｏ１、のいずれかであると考えられる。このとき、周知の二項定理によりこれら各分子の強度比を求めると、Ｃ５０Ｈ７１Ｎ１３Ｏ１２の強度０．５８４０（＝（０．９８９３）５０）に対し、１２Ｃ４９１３Ｃ１Ｈ７１Ｎ１３Ｏ１２ の強度は０．３１５８（＝５０（０．９８９３）４９×０．０１０７）となり、Ｃ５０Ｈ７１Ｎ１３Ｏ１２の強度を１とすれば１２Ｃ４９１３Ｃ１Ｈ７１Ｎ１３Ｏ１２ の強度は０．５４０８となる。
【００４３】
同様にして他の分子の強度比も求めると、
Ｃ５０１Ｈ７０２Ｈ１Ｎ１３Ｏ１２：０．０１０５０（＝７１（０．９９９８５）７０×０．０００１５／（０．９９９８５）７１）
Ｃ５０Ｈ７１１４Ｎ１２１５Ｎ１Ｏ１２：０．０４８０（＝１３（０．９９６３２）１２×０．００３６８／（０．９９６３２）１３）
Ｃ５０Ｈ７１Ｎ１３１６Ｏ１１１７Ｏ１：０．００４６（＝１２（０．９９７５７）１１×０．０００３８３／（０．９９７５７）１２） 
となる。
【００４４】
Averagineモデルを用いると、実測により得られたＭＳ／ＭＳマススペクトル上での同位体ピーク群の質量電荷比９３１．９[Ｄａ]から推定される元素組成はＣ４６Ｈ６６Ｎ１３Ｏ９となる。いま上記１２Ｃ４９１３Ｃ１Ｈ７１Ｎ１３Ｏ１２の元素組成のプリカーサイオンが開裂して元素組成がＣ４６Ｈ６６Ｎ１３Ｏ９とあるプロダクトイオンが生成したものと仮定すると、プロダクトイオンが主同位体以外の同位体を含まない確率は、５０個の炭素（Ｃ）の中で４６個を選択する際に主同位体以外の同位体でない４９個の中から４６個を選択する確率であるから、４９／５０×４８／４９×…×４／５、書き直すと４９Ｃ４６／５０Ｃ４６となる。したがって、１２Ｃ４９１３Ｃ１Ｈ７１Ｎ１３Ｏ１２由来のモノアイソトピックイオンのピーク強度は（４９Ｃ４６／５０Ｃ４６）×０．５４０８となる。同様にして他の分子由来のモノアイソトピックイオンのピーク強度を計算すると、このプロダクトイオンのモノアイソトピックピーク強度は次の式で計算できる。
（４９Ｃ４６／５０Ｃ４６）×０．５４０８＋（７０Ｃ６６／７１Ｃ６６）×０．０１０５＋（１２Ｃ１２／１３Ｃ１２）×０．０４８＋（１１Ｃ９／１２Ｃ９）×０．００４６＝（４／５０）×０．５４０８＋（５／７１）×０．０１０５＋（１／１３）×０．０４８＋（３／１２）×０．００４６＝０．０４８８
また同様の考え方で、主同位体以外の同位体を１個含むプロダクトイオンのピーク強度は次の式で計算できる。
｛１−（４／５０）｝×０．５４０８＋｛１−（５／７１）｝×０．０１０５＋｛１−（１／１３）｝×０．０４８＋｛１−（３／１２）｝×０．００４６＝０．５５５１
【００４５】
したがって、主同位体以外の同位体を１個含む（つまりｎ＝１）イオンをプリカーサイオンとしてＭＳ／ＭＳ分析を行ったと仮定すると、質量電荷比９３１．９[Ｄａ]におけるＭＳ／ＭＳマススペクトル上の同位体ピーク群の強度比は０．０４８８：０．５５５１、即ち０．０８７９：１となる。これがプリカーサイオンに１個の主同位体以外の同位体を含むと仮定したときの理論的なピーク強度比である。
【００４６】
同様にして主同位体以外の同位体を２個含む（つまりｎ＝２）イオンをプリカーサイオンとしてＭＳ／ＭＳ分析を行ったと仮定すると、質量電荷比９３１．９[Ｄａ]におけるＭＳ／ＭＳマススペクトル上の同位体ピーク群の強度比は０．０４１０：０．１６０２：１となる。これがプリカーサイオンに２個の主同位体以外の同位体を含むと仮定したときの理論的なピーク強度比である。
【００４７】
いま前述の図８（ｃ）及び（ｄ）に示した同位体ピーク群を最大ピーク強度を１として描き直すと図６（ａ）及び（ｂ）に示すようになる。この図６（ａ）において質量電荷比１[Ｄａ]の間隔で現れる２本のピークのピーク強度比は、プリカーサイオンが主同位体以外の同位体を１個含むと仮定した場合の理論的なピーク強度比によく一致している。一方、図６（ｂ）において質量電荷比１[Ｄａ]の間隔で現れる３本のピークのピーク強度比は、プリカーサイオンが主同位体以外の同位体を２個含むと仮定した場合の理論的なピーク強度比によく一致している。したがって、ピーク強度が小さくて殆ど測定ノイズに埋もれてしまうようなレベルであっても、各同位体ピーク群を正確にクラス分けしてピークリストを作成することができる。
【００４８】
なお、上述したようなピーク強度比に基づいたクラス分けの手法を利用することにより、例えば２本のピークから成る同位体ピーク群が抽出された場合に、モノアイソトピックイオンをプリカーサイオンとするプロダクトイオンに基づくピークが２本あるのか、或いは、同位体を１個含むイオンをプリカーサイオンとするプロダクトイオンに基づく２本のピークがあるのか、つまり擬似的な同位体ピーク群であるのか否かを判別することも可能である。
【００４９】
また、上述の方法を応用することにより、以下のように同定の信頼性を上げることができる。即ち、質量電荷比がＭ[Ｄａ]であるピークを先頭とする同位体ピーク群において、２番目（＝Ｍ＋１[Ｄａ]）、３番目（＝Ｍ＋２[Ｄａ]）の単一ピークに対応するイオンをそれぞれプリカーサイオンとしてＭＳ／ＭＳ分析を実行する。３番目のピークに対応するイオンをプリカーサイオンとして実行したＭＳ／ＭＳ分析からは、上述のクラス分けを利用して作成したプリカーサイオンに主同位体以外の同位体を２個含むと仮定したピークリストから、質量電荷比がＭ[Ｄａ]であるペプチドを同定することができる。２番目のピークに対応するイオンをプリカーサイオンとして実行したＭＳ／ＭＳ分析では、プリカーサイオンに主同位体以外の同位体を１個含むと仮定したピークリストから、質量電荷比がＭ[Ｄａ]であるペプチドを同定できる。３番目或いは２番目のピークに対応するイオンをプリカーサイオンとしたＭＳ／ＭＳ分析により、同じＭ[Ｄａ]のペプチドが同定できれば、このペプチドの同定信頼度は高いと考えることができる。このように、複数のＭＳ／ＭＳ分析を利用し、同一のペプチドの同定を試みることができる。
【００５０】
また、上記実施例は本発明の一例にすぎず、本発明の趣旨の範囲で適宜変更、修正、追加を行っても本願特許請求の範囲に包含されることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本発明の一実施例である構造解析システムの概略構成図。
【図２】本実施例の構造解析システムを用いてペプチド混合物のアミノ酸配列を同定する際の全体的な手順を示すフローチャート。
【図３】本実施例の構造解析システムにおけるＭＳ／ＭＳマススペクトル上の同位体ピーク群をクラス分けする際のフローチャート。
【図４】ＭＳマススペクトル上で異なるペプチド由来の同位体ピーク群が重なり合っている状態を示す図。
【図５】同位体ピーク群を構成するピークの強度比を説明するための図。
【図６】図８（ｃ）及び（ｄ）に示した同位体ピーク群を最大ピーク強度を１として描き直した図。
【図７】ＭＳマススペクトル上での同位体ピーク群の一例を示す図。
【図８】ＭＳ分析で得られた同位体ピーク群の一部をプリカーサイオンとして選択してＭＳ／ＭＳ分析した結果の一部を示す図。
【符号の説明】
【００５２】
１０…質量分析部
１１…イオン化部
１２…イオントラップ部
１３…質量分離部
１４…イオン検出器
２０…制御／処理部
２１…制御部
２２…ＭＳデータ処理部
２３…ピークリスト作成部
２４…配列同定処理部
２５…同定用データベース（ＤＢ）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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