(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
あらゆる立体異性体および互変体の形の式
【化１】
0004750993.tif 000008
の化合物、ならびにその製薬上許容できる塩、エステルおよびエーテル。
【請求項２】
微生物の Amycolatopsis 種、ＳＴ101170（ＤＳＭ 12216）を、炭素源および窒素源を含有する栄養媒体中で好気性条件下で培養し、続いて慣用の方法で単離しそして精製することにより得ることができるあらゆる立体異性体および互変体の形の分子式Ｃ65Ｈ115ＮＯ18を有する化合物、ならびにその製薬上許容できる塩。
【請求項３】
微生物の Amycolatopsis 種、ＳＴ101170（ＤＳＭ 12216）を、炭素源および窒素源を含有する栄養媒体中で好気性条件下で培養し、続いて慣用の方法で単離しそして精製することからなる、請求項１または２に記載の化合物の製造方法。
【請求項４】
得られる化合物を薬理学的に許容できる塩、エステル、またはエーテルに転化することをさらに包含する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
医薬品として使用するための、請求項１または２に記載の化合物、あるいはその製薬上許容できる塩、エステル、またはエーテル。
【請求項６】
有効量の請求項１または２に記載の化合物、および／またはその製薬上許容できる塩、エステル、またはエーテルと、製薬上許容できる担体とを含む医薬品組成物。
【請求項７】
抗生物質として使用するための請求項１または２に記載の化合物、あるいはその製薬上許容できる塩、エステル、またはエーテル。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は微生物の Amycolatopsis 種、ＳＴ101170（ＤＳＭ 12216）の培養によって得ることができるアミコマイシンと称する化合物ならびにこれの医薬品として許容できる塩および誘導体に関する。さらに本発明はアミコマイシンの製造方法、アミコマイシンおよびその医薬品として許容できる塩および誘導体の医薬品としての使用、特に抗生物質としての使用に関しまたアミコマイシンまたはその医薬品として許容できる塩または誘導体を含有する医薬品組成物に関する。
【０００２】
メチシリン耐性 Staphylococcus aureus（ＭＲＳＡ）感染は怪我および火傷のようないくつかの感染性の状態で優勢を占めることが知られている。グリコペプチド類に属するバンコマイシンおよびテイコプラニンはＭＲＳＡ感染の治療のために臨床的に使用するただ２つの抗生物質である。しかしながら、バンコマイシン耐性およびテイコプラニン耐性の株が最近出現したため、これらの感染は脅威的また致死的になっている。従って、これらのバンコマイシン耐性およびテイコプラニン耐性の株に対して活性を有する構造的に異なる種類の化合物を求めて精力的な探索が始まっている。例えば環状チオペプチドのメチルスルホマイシンＩがバンコマイシン耐性およびテイコプラニン耐性の株に対する抗生物質活性剤としてすでに記載されている［１９９６年７月１１日受理のＥＰ−Ａ−０８１８５３９］。
【０００３】
アミコマイシンと称される新規な化合物は抗生活性を有することが現在分かっている。従って、本発明は式
【化２】
0004750993.tif 000002
の化合物に関し、またあらゆる立体異性体および互変体の形のものを含む、エステル、エーテルおよび他の明らかな化学的等価物のような医薬品として許容できる塩およびその誘導体に関する。アミコマイシンは高度に酸素化されたＣ45−側鎖を有する特徴的な４量体酸部分を有する。これは分子式Ｃ65Ｈ15ＮＯ18を有し、また微生物の Amycolatopsis 種のＳＴ101170（ＤＳＭ 12216）を炭素源および窒素源を含有する栄養媒体中で好気性条件下で培養し、続いて慣用的な方法で単離しそして純化することにより得ることができる。微生物のＳＴ101170 は、Actinomycetales 目、Amycolatopsis 属に属し、また German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) Braunschweig, Deutschland に１９９８年６月４日に預託されており、そしてＤＳＭ番号１２２１６が付与されている。
【０００４】
本発明は amycolatopsis 種のＳＴ101170、その突然変異体および変異体から、１つまたはそれ以上の炭素源および１つまたはそれ以上の窒素源を含有しまた場合によっては無機栄養塩および／または痕跡量の元素を含有する栄養媒体中でアミコマイシンと称される化合物を好気性条件下で製造し、続いて慣用的な方法でこの化合物を単離しそして精製する方法をさらに提供する。
【０００５】
微生物ＳＴ101170 の突然変異体および変異体は、本発明の化合物を合成することもできる。このような突然変異体は、物理的方法例えば、紫外線またはＸ線によるような照射またはエチルメチルアンスルホネート（ＥＭＳ）、２−ヒドロキシ−４−メトキシ−ベンソフェノン（ＭＯＢ）またはＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグァニジン（ＭＮＮＧ）のような化学的な突然変異誘発物質によって既知の方法でつくられることができる。
【０００６】
本発明の化合物を製造できる好適な突然変異体および変異体のスクリーニングは、例えば、特にバンコマイシン耐性株に対する抗バクテリア作用を試験することにより、培養ブロス中に蓄積された活性化合物の生物学的活性を測定して確認することができる（下記の表２参照）。
【０００７】
好気性発酵に好適である好ましい炭素源は、同化可能な炭水化物および糖アルコール、例えばグルコース、ラクトースまたはＤ−マンニットそしてまた麦芽エキスのような炭水化物を含有する天然産物である。好適な窒素源は例えばアミノ酸、ペプチドおよびタンパク質であって、ペプトンまたはトリプシンのようなそれらの分解生成物を含むもの、肉エキス、粉砕した種子例えばトウモロコシ、ホワイトビーンズ、大豆または綿の植物体、アルコール製造からの蒸留残留物、ミートミール（meat meal）および酵母エキスであるが、アンモニウム塩および硝酸塩もそうである。栄養溶液が含有することができる好適な無機塩は例えばアルカリ金属またはアルカリ土類金属、鉄、亜鉛、コバルトまたはマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩または燐酸塩である。
【０００８】
アミコマイシンの生成は例えば、澱粉（可溶性）約０.５〜５％、好ましくは１〜２％、グルコース約０.５〜５％、好ましくは１〜３％、グリセリン約０.５〜５％、好ましくは１〜２％、コーンスティープ（corn steep）液約０.１〜０.５％、好ましくは０.２〜０.３％、ペプトン約０.２〜１％、好ましくは０.４〜０.６％、酵母エキス約０.１〜０.５％、好ましくは０.２〜０.４％、塩化ナトリウム０.０５〜０.２％、好ましくは０.１〜０.２％、そしてＣａＣＯ3約０.１〜０.５％、好ましくは０.２〜０.３％を含有する栄養媒体中で特によく進行する。これらの量は栄養媒体全体の重量を基準とする。
【０００９】
ＳＴ101170 の培養は例えば、浸漬フラスコまたは実験室用発酵器内に震盪または撹拌しつつ浸漬し、場合によっては空気または酸素を導入して好気的に実施される。発酵による培養は例えば、いろいろな体積の滅菌された広口瓶または丸底フラスコ内で、ガラス発酵器またはＶ2Ａ−鋼タンク内で実施されることができる。
【００１０】
ＳＴ101170 の培養は約２０〜約３５℃の間の温度、好ましくは約２５〜約３０℃の温度で、また４〜１０、好ましくは６〜８のｐＨで実施されることができる。これらの条件下では、微生物は一般に２０〜２００時間、好ましくは２４〜１５０時間の期間にわたって培養される。
【００１１】
培養はいくつかの段階で実施されるのが有利である。最初に１つまたはそれ以上の前培養基が液体栄養媒体中で調製されることができる。次に、実際の製造媒体である主培養基が例えば体積比１：１０で前培養基によって接種される。前培養基は例えば、栄養媒体に胞子化された菌糸体を接種しそして約２０〜約１２０時間、好ましくは２４〜９０時間増殖させることにより得られる。胞子化された菌糸体は例えば、酵母−麦芽寒天またはジャガイモ−デキストロース寒天のような固形物または液体の栄養媒体上で、微生物を約１〜約４０日、好ましくは５〜１２日増殖させることにより得ることができる。
【００１２】
発酵のおよびアミコマイシン生成の過程は、培養ブロスの生物学的活性をバイオアッセイで測定することによる、または薄層クロマトグラフィー（ＤＣ）もしくは高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のようなクロマトグラフィー法によるような当業者に知られた方法によってモニターすることができる。
【００１３】
アミコマイシン化合物は培養基の濾液中にそしてまた菌糸体中に存在する。しかしながら、主な量は菌糸体中に通常存在する。化合物は既知の分離技術を用いて単離されることができる。従って、化合物は例えば濾過または遠心分離によって培養基の濾液から回収されることができる。濾液は１−ブタノール、エチルアセテート、クロロホルム、ジクロロメタンなど、好ましくはブタノールまたはエチルアセテートのような水不混合性の溶媒で抽出されることができる。
【００１４】
活性物質はメタノール、アセトン、アセトニトリル、ｎ−プロパノールまたはイソプロパノール、好ましくはメタノールまたはアセトンのような水混合性溶媒、あるいはｔ−ブタノール、エチルアセテート、クロロホルム、ジクロロメタノールなど、好ましくはブタノールまたはエチルアセテートのような水不混合性溶媒での抽出によって菌糸体から回収されることもできる。
【００１５】
培養基濾液の抽出は広いｐＨ範囲で実施されることができる。しかしながら、ｐＨが好ましくは４〜９である中性または弱酸性の媒体中で抽出を実施するのが好ましい。有機抽出物は真空下で濃縮されそして乾燥されることができ、活性的な粗製物質が得られる。
【００１６】
アミコマイシン化合物の単離または精製は、天然化合物の化学的、物理的および生物学的特性を考慮しつつ既知の方法で実施されてよい。
本発明に従うアミコマイシンの単離方法の１つは、それ自体知られた方法での溶液分配である。
【００１７】
アミコマイシンの別な精製方法は Dianon(登録商標) HP-20（Mitubishi Casei Corp, Tokyo）のような吸着樹脂、Amberlite(登録商標) XAD 7（Rohm and Haas，USA）、Amberchrom(登録商標) CG（Toso Haas，Philadelphia，USA）または類似の樹脂上のクロマトグラフィーによる。分離は広いｐＨ範囲で実施されることができる。ｐＨの範囲は１〜９、一層好ましくは２〜８である。やはり好適であるのは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）との関連で一般に公表されているような多くの逆相支持体例えばＲＰ8およびＲＰ18である。化合物の本発明によるべつに可能な精製は、シリカゲル、またはＡｌ2Ｏ3（アルミナ）またはその他のようないわゆる正相クロマトグラフィー支持体をそれ自体知られた方法で使用することからなる。このためにジクロロメタン、クロロホルム、メタノール、エチルアセテート、アセトン、石油エーテルまたはこれらに組み合わせのような多くの溶出液が好適である。ｐＨは例えば、トリエチルアミンの添加によって変更されることができる。
【００１８】
アミコマイシン化合物を単離する別な方法は、Fractogel(登録商標) TSK HW-40、Sephadex(登録商標) LH-20 およびその他のような分子篩をそれ自体知られた方法で使用することである。さらに、アミコマイシン化合物を粗製物質から結晶化によって回収することも可能である。このために好適なのは、例えば無水のまたは水が添加された有機溶媒およびその混合物である。
【００１９】
本発明による化合物の単離および精製のための追加的な方法は、好ましくは７〜１０のｐＨ範囲で陰イオン交換体を使用することおよび好ましくは３〜６のｐＨ範囲で陽イオン交換体を使用することである。この目的に特に好適なのは、有機溶媒が添加されている緩衝溶液を使用することである。
【００２０】
さらに、水、メタノール、エタノール、ブタノール、イソプロパノール、アセトン、ジクロロメタン、エチルアセテートまたは石油エーテルのような２つまたはそれ以上の溶媒からなる２相溶出剤系を使用する向流クロマトグラフィーが可能な精製方法である。
【００２１】
アミコマイシン化合物またはその化学的誘導体は、当業者に知られた方法によって対応する薬理学的に許容できる塩に転化されることができる。
本発明の薬理学的に許容できる塩は、Remington's Pharmaceutical Sciences(17版、1418ページ、(1985)）中に記載されているような無機または有機の塩である。可能な塩はアルカリ金属塩、アンモニウム塩、アルカリ土類金属塩、生理学的に許容できるアミンとの塩、およびＨＣｌ、ＨＢｒ、Ｈ2ＳＯ4、マレイン酸およびフマル酸のような無機または有機の酸との塩である。
【００２２】
本発明の化合物の明らかな化学的等価物は、化学的な差異は僅かであるが同一または類似の活性を有する化合物あるいは温和な条件下で本発明の化合物に転化されうる化合物である。明らかな化学的等価物の例はエステル、エーテル、アミノ誘導体、本発明の化合物のまたはそれとに錯体または付加物である。
【００２３】
エステルは例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のような反応剤の存在でアミコマイシンをカルボン酸と反応させることにより、または化合物を酸塩化物のようなアシル化剤で処理することにより製造されることができる。エーテルは例えば、塩基性条件下でのアルキル化剤との反応によってアミコマイシンから製造されることができる。
【００２４】
エステルおよびエーテルの他の製造方法は文献例えば Advanced Organic Synthesis, 4th Edition, J. March, John Wiley & Sons., 1992 中に示されている。
【００２５】
化学的等価物は４量体酸誘導体にとって典型的である金属イオン例えばＬａ3+、Ｓｍ3+、Ｅｕ3+、Ｇｄ3+のような遷移金属との安定な錯体であってよく、また文献（K. Tanaka et al., Chem. Pharm. Bull. 1979, 27, 1901. K. Matsuo, Chem. Pharm. Bull. 1980, 28, 2494）中に示されている方法によって製造されることができる。
【００２６】
アルキル側鎖の二重結合は、文献例えば P.N. Rylander,“Hydrogenation Mathods", Academic Press, New York (1985), Chpt. 2 中に示される方法によって還元されることができ、あるいは H.O. House によって“Modern Synthetic Reactions", W.A. Benjymin, Inc., New York (1972), pp 446-452 中に記載されている方法によって水添ハロゲン化されることができる。ヒドロキシル化誘導体は文献例えば Chem. Rev. 1980, 80, 187 中に記載されているように二重結合をＯｓＯ4のような反応剤と反応させることにより製造されることができる。
【００２７】
誘導体は Advanced Organic Synthesis, 4th Edition, J. March, John Wiley & Sons., 1992 中に記載されているように例えばＭＣＰＢＡによる酸化によって二重結合をエポキシドに転化することによっても生成されることができる。
【００２８】
本発明のアミコマイシン化合物の物理化学的特性そしてまた分光学的特性は以下のとおりである。
外  観：無色固体、メタノール、ＤＭＳＯ、ピリジン中に可溶
分子式：Ｃ65Ｈ115ＮＯ18
ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）：
カラム：Purospher Star RP.18e (Merck), 55×4mm, 3μm
溶出剤：ＣＨ3ＣＮ／0.01％ Ｈ3ＰＯ4（85％）
勾  配：時間（分）    0.00    3.00    5.00    6.00    10.00
％ＣＨ3ＣＮ   5.0     95.0    95.0    5.0     5.0
流  量：２ml／分
温  度：４０℃
検  出：210nm，254, 280, 320, 380
ｔR：２．６７分
分子量：1198.64 Da
ＨＲ-ＦＡＢ-ＭＳ：1220.801187 [Ｍ＋Ｎa]+
1Ｈ- および 13Ｃ-ＮＭＲ：表１参照
ＵＶ／ＶＩＳ：ＭｅＯＨ，max(log)＝229nm (3.29), 281 (3.16)
【００２９】
【表１】
0004750993.tif 000003
【００３０】
【表２】
0004750993.tif 000004
【００３１】
【表３】
0004750993.tif 000005
註：
（ｂ）ブロードシグナル
（ｃ）これらのシグナルは可視的でない。Ｃ６０およびＣ６９のみがＨＭＳＱスペクトルによって特定されることができた。
【００３２】
アミコマイシンは、特に例えば Staphylo- および Enterococcen のようなグラム陽性バクテリアに対する並外れた抗バクテリア活性を有する。広範囲のバクテリアに対するアミコマイシンの最小阻止濃度を表２に示す。特にこれらの株は問題の株つまり現存する抗生物質への耐性を獲得してきた微生物であることが最近ますます実証されている。他の抗生物質に対するこの化合物の優位性は例えば、E．faecalis、E．faecium または E.gallinarium のようなマンコマイシン耐性およびテイコプラニン耐性の株の阻止において示される。
【００３３】
【表４】
0004750993.tif 000006
【００３４】
アミコマイシンならびにその医薬品として許容できる塩および誘導体は、それ自体でまたは相互の混合物として、そして非経口的投与または他の投与方式を可能とする医薬品組成物の形で、動物好ましくは哺乳動物にそして特にヒトに医薬品として投与されることができる。従って、本発明は医薬品として使用するためのアミコマイシンおよびその医薬品として許容できる塩および誘導体にも関し、また抗バクテリア活性を有する薬物を製造するためにアミコマイシンならびにその医薬品として許容できる塩および誘導体を使用することも関する。本発明は、医薬品として許容できる担持体とともに、アミコマイシンそして／あるいはその医薬品として許容できる１つまたはそれ以上の塩および／または誘導体を有効量含有する医薬品組成物にさらに関する。
【００３５】
アミコマイシンは腸管経由（経口経路）、非経口的（静脈内または筋肉内）、直腸経由または局部的（局所的）に投与されることができる。活性化合物を医薬品として許容できる１つまたはそれ以上の補助剤および／または賦形剤と混合し、そして混合物を投与に好適な溶液、粉末（錠剤、マイクロカプセルを含めてカプセル）、軟膏（クリームまたはゲル）、リポソーム調合剤、脂質複合物、コロイド分散液または座薬のような適切な医薬品形態に転換することにより、アミコマイシンまたはその医薬品として許容できる塩もしくは誘導体を他の医薬活性物質とともに含有する医薬品組成物を製造することができる。
【００３６】
この種の処方物にとって可能な補助剤および／または賦形剤は医薬品として慣用される液体または固体の充填剤およびエクステンダー、溶媒、乳化剤、潤滑剤、香味矯正剤、着色剤および／または緩衝物質である。
【００３７】
慣例的であるように、生薬処方物および投与方法そしてまた特定の症例において好適な用量範囲は、処置すべき種にそしてそれぞれの症状または疾病の状態に依存し、また技術上知られた方法を用いて最適化されることができる。例としては、体重約７５kgについて０.００１〜１０mg、好ましくは０.１〜５mg、一層好ましくは１.０mgの用量が好適であろう。用量は所望の効果を生むのに少なくとも十分でなければならない。
以下は本発明に関する例示的な実施例であるが、本発明の範囲を限定するものではない。
【００３８】
実施例１
接種材料の調製
滅菌された３００mlの Erlenmeyer フラスコ中の栄養溶液（酵母エキス４ｇ／Ｌ、可溶性澱粉１５ｇ／Ｌ、Ｋ2ＨＰＯ4 １ｇ／Ｌ、１０００mlになるまで水で満たされたＭｇＳＯ4×７Ｈ2Ｏ ０.５ｇ／Ｌ、滅菌前のｐＨ７.０）１００mlに Amycolatopsis sp.（ＤＳＭ12216）株を接種しそして２８℃および１８０rpmで回転式震盪機上で５日間培養した。引き続いてこの培養基１.５mlを９９％グリセリン１.５mlで希釈しそして２０℃で保管した。
【００３９】
実施例２
エルレンマイヤーフラスコ中での Amycolatopsis sp.、ＳＴ101170（ＤＳＭ 12216）培養基または前培養基の調製
次の栄養媒体：  澱粉溶液１０ｇ／Ｌ、グルコース１０ｇ／Ｌ、９９％グリセリン１０ｇ／Ｌ、コーンスティープ液体または液２.５ｇ／Ｌ、ペプトン５ｇ／Ｌ、酵母エキス２ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ １ｇ／ＬおよびＣａＣＯ3 ３ｇ／Ｌが１００ml入った滅菌されたエルレンマイヤーフラスコに、増殖された培養基（同じ栄養溶液であるが２％の寒天を含む）のループ１つ分、またはグリセリン培養基（実施例１参照）１mlを接種し、そして震盪器上で１８０rpmおよび２８℃で培養した。アミコマイシン化合物の生成は７２時間後に最大に達した。
【００４０】
７２時間経過した深部培養基（実施例１で震盪培養について述べた方法に従って調製されたが、次の媒体：グルコース１５ｇ／Ｌ、大豆ミール１５ｇ／Ｌ、ＣａＣＯ3 ３ｇ／ＬおよびＮａＣｌ ５ｇ／Ｌを含有し、ｐＨは７.５）は、接種量１０％で１０Ｌおよび２００Ｌの発酵器に接種するのに十分であった。
【００４１】
実施例３
アミコマイシン化合物の調製
２００Ｌの発酵器を以下のパラメータで操作した。
栄養媒体：澱粉                  １０ｇ／Ｌ
グルコース            １０ｇ／Ｌ
９９％グリセリン      １０ｇ／Ｌ
コーンスティープ液    ２.５ｇ／Ｌ
ペプトン              ５ｇ／Ｌ
酵母エキス            ２ｇ／Ｌ
ＮａＣｌ              ７ｇ／Ｌ
ＣａＣｏ3             ３ｇ／Ｌ
ｐＨ７.２（滅菌前）
接種材料：発酵器容量の１０％
培養時間：６０〜８０時間
培養温度：２８℃
撹    拌：５０rpm
曝    気：１５０Ｌ／分
エタノール性ポリオール溶液１〜２mlを添加することにより、泡沫の形成を抑えることは可能であった。６９時間後に生成が最大に達した。
【００４２】
実施例４
アミコマイシン化合物の単離
実施例３から得た培養溶液２００Ｌを遠心分離しそして菌糸体をメタノールで徹底的に抽出した。メタノール抽出物を約１：１０の比率にまで濃縮して無色の沈殿をえ、これを濾過して取り除いた。濾液中にアミコマイシン物質がもはや検出されなくなる（ＨＰＬＣ）この手順を反復した。残留物を凍結乾燥し、引き続いてＨＰＬＣによって精製した：
【００４３】
１．カラム：Fractogel TSK-HW 40(登録商標)（４Ｌ、５００×１００mm）
溶出剤：ＭｅＯＨ
流量：２０ml／分
検出：２０４および２３６nm
アミコマイシンが富化された画分が１２５分後に溶出した。ＨＰＬＣ（条件は上記のとおり）を基準にして画分をプールした。所望の化合物を含むプールされた活性画分を真空濃縮しそして凍結乾燥した。
【００４４】
２．カラム：Silica Gel 60 (Merck); Erimatech (300×20mm, 100ml)
溶出剤：A) CH2Cl2      B) CH2Cl2：MeOH 9：1      c) MeOH
勾  配：
【表５】
0004750993.tif 000007
流  量：２５ml／分
検  出：２３６および２８８nm
【００４５】
アミコマイシン活性化合物は４２分後に溶出した。ＨＰＬＣ（条件は上記のとおり）に基づく画分をプールした。所望の化合物を含むプールされた活性画分を真空濃縮しそして凍結乾燥した。
【００４６】
３．カラム：Fractogel TSK-HW 40(登録商標)（１Ｌ、５００×５０mm）
溶出剤：ＭｅＯＨ
流  量：５ml／分
検  出：２０４および２３６nm
アミコマイシン活性化合物は１１２分後に溶出した。
上記の方法に従って、２００Ｌの発酵ブロスからアミコマイシン１１０mgを回収することができた。