(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母の転写プロモーター活性を有するＤＮＡ断片であって、配列番号１に記載されるＤＮＡ配列の全部、またはその３’側末を含む一部の配列であって少なくとも配列番号１のＤＮＡ配列の３’末から650bpまでのＤＮＡ配列（配列番号６）を含む配列、または配列番号１に記載されるＤＮＡ配列の全部または前記３’側末を含む一部の配列と相補的な配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるＤＮＡ配列であって当該全部または一部の配列の転写プロモーター活性を保持する配列を有する、ＤＮＡ断片。
【請求項２】
当該ＤＮＡ配列の一部が、少なくとも配列番号１のＤＮＡ配列の３’末から820bpまでのＤＮＡ配列（配列番号５）を含む配列である、請求項１ に記載のＤＮＡ断片。
【請求項３】
当該ＤＮＡ配列の一部が、少なくとも配列番号１のＤＮＡ配列の３’末から950bpまでのＤＮＡ配列（配列番号４）を含む配列である、請求項１または２に記載のＤＮＡ断片。
【請求項４】
当該ＤＮＡ配列の一部が、少なくとも配列番号１のＤＮＡ配列の３’末から1100bpまでのＤＮＡ配列（配列番号３）を含む配列である、請求項１から３のいずれかに記載のＤＮＡ断片。
【請求項５】
当該ＤＮＡ配列の一部が、少なくとも配列番号１のＤＮＡ配列の３’末から1258bpまでのＤＮＡ配列（配列番号２）を含む配列である、請求項１から４のいずれかに記載のＤＮＡ断片。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のＤＮＡ断片と、その下流に外来タンパク質をコードする遺伝子とを含んでなる組換えＤＮＡ断片。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えＤＮＡ断片を含む発現プラスミド。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えＤＮＡ断片または請求項７に記載の発現プラスミドによって形質転換された宿主細胞。
【請求項９】
宿主細胞が酵母である、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の宿主細胞を培養し、ついで培養物から外来タンパク質を回収することを含む、外来タンパク質の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な酵母プロモーターに関する。より具体的には、転写プロモーター活性をもつ新規なＤＮＡ配列、この配列を含む発現ベクター、および組換えタンパク質、例えば異種タンパク質生産のためのその使用に関する。また、本発明は、このＤＮＡ配列を含む組換え細胞にも関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子工学の技術を酵母に応用することにより、医薬品や食品などの有用タンパク質を大量に生産する酵母株の作出が試みられている。異種タンパク質を生産するため、それに対応する異種遺伝子をサッカロミセス属の酵母、特にサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae、以下、「S. cerevisiae」と略記する）に導入する技術は知られている。S. cerevisiae細胞内で異種遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む）を発現させる時、その上流に酵母内で発現可能な「プロモーター」を連結させることが必要である。【０００３】
プロモーターとしては目的とするタンパク質を酵母内で大量に発現させることが望まれており、現在までいくつかの強力なプロモーターが見出されている。例えば、S. cerevisiaeのプロモーターとして、強い発現量を示すことが知られている３−ホスホグリセレートキナーゼ（PGK1）遺伝子のプロモーター（非特許文献１）や翻訳伸長因子（TEF1）のプロモーター（非特許文献２）などが、酵母での異種遺伝子の発現に使用されている。【０００４】
【非特許文献１】Ogdenら、1986, Mol. Cell. Biol., 6(12)、p. 4335-4343
【非特許文献２】Cottrelleら、1985, J. Biological Chemistry, 260(5), p. 3090-3096
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、酵母を宿主とする異種遺伝子発現系において利用可能な従来のプロモーターよりさらに強力なプロモーターを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、S. cerevisiaeの遺伝子発現状況について鋭意検討をした結果、S. cerevisiae染色体から強力なプロモーターを含むＤＮＡ断片を取得することに成功し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は、酵母の転写プロモーター活性を有するＤＮＡ断片であって、配列番号１に記載されるＤＮＡ配列の全部またはその３’側末を含む一部の配列、または配列番号１に記載されるＤＮＡ配列の全部またはその３’側末を含む一部の配列と相補的な配列にハイブリダイズしうるＤＮＡ配列であって当該全部または一部の配列の転写プロモーター活性を保持する配列を有する、ＤＮＡ断片に関する。本発明はまた、前記ＤＮＡ配列と、その下流に位置する外来遺伝子とを含んで構成される発現プラスミドに関する。さらに、本発明は、前記発現プラスミドによる形質転換により取得された形質転換体に関する。さらにまた、本発明は、前記形質転換体を培養し、ついで培養物から外来タンパク質を回収することを特徴とする外来タンパク質の生産方法に関する。【０００８】
すなわち、本発明は、下記のＡ）〜Ｋ）の発明を含むものである。
Ａ）酵母の転写プロモーター活性を有するＤＮＡ断片であって、配列番号１に記載されるＤＮＡ配列の全部またはその３’側末を含む一部の配列、または配列番号１に記載されるＤＮＡ配列の全部またはその３’側末を含む一部の配列と相補的な配列にハイブリダイズしうるＤＮＡ配列であって当該全部または一部の配列の転写プロモーター活性を保持する配列を有する、ＤＮＡ断片。【０００９】
Ｂ）当該ＤＮＡ配列の一部が、少なくとも配列番号１のＤＮＡ配列の３’末から650bpまでのＤＮＡ配列（配列番号６；配列番号１のＤＮＡ配列中、751番目から1400番目に相当）を含む配列である、上記Ａ）に記載のＤＮＡ断片。【００１０】
Ｃ）当該ＤＮＡ配列の一部が、少なくとも配列番号１のＤＮＡ配列の３’末から820bpまでのＤＮＡ配列（配列番号５；配列番号１のＤＮＡ配列中、581番目から1400番目に相当）を含む配列である、上記Ａ）またはＢ）に記載のＤＮＡ断片。【００１１】
Ｄ）当該ＤＮＡ配列の一部が、少なくとも配列番号１のＤＮＡ配列の３’末から950bpまでのＤＮＡ配列（配列番号４；配列番号１のＤＮＡ配列中、451番目から1400番目に相当）を含む配列である、上記Ａ）〜Ｃ）のいずれかに記載のＤＮＡ断片。【００１２】
Ｅ）当該ＤＮＡ配列の一部が、少なくとも配列番号１のＤＮＡ配列の３’末から1100bpまでのＤＮＡ配列（配列番号３；配列番号１のＤＮＡ配列中、301番目から1400番目に相当）を含む配列である、上記Ａ）〜Ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ断片。【００１３】
Ｆ）当該ＤＮＡ配列の一部が、少なくとも配列番号１のＤＮＡ配列の３’末から1258bpまでのＤＮＡ配列（配列番号２；配列番号１のＤＮＡ配列中、143番目から1400番目に相当）を含む配列である、上記Ａ）〜Ｅ）のいずれかに記載のＤＮＡ断片。【００１４】
Ｇ）上記Ａ）〜Ｆ）のいずれかに記載のＤＮＡ断片と、その下流に外来タンパク質をコードする遺伝子とを含んでなる組換えＤＮＡ断片。【００１５】
Ｈ）上記Ｇ）に記載の組換えＤＮＡ断片を含む発現プラスミド。【００１６】
Ｉ）上記Ｇ）に記載の組換えＤＮＡ断片または上記Ｈ）に記載の発現プラスミドによって形質転換された宿主細胞。【００１７】
Ｊ）宿主細胞が酵母である、上記Ｉ）に記載の宿主細胞。【００１８】
Ｋ）上記Ｉ）またはＪ）に記載の宿主細胞を培養し、ついで培養物から外来タンパク質を回収することを含む、外来タンパク質の生産方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によるＤＮＡ断片は酵母内での高いプロモーター活性を有する配列を含んでいる。従って、本発明によるＤＮＡ断片を外来遺伝子とともに連結したプラスミドを宿主、とりわけ酵母に導入することによって、外来遺伝子を高発現レベルで発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】プラスミドpKHA030の構築図。
【図１−２】プラスミドpKHA030の構築図（続き）。
【００２１】
【図２】NCE102プロモーターを断片化した際の各領域を示す図。
【００２２】
【図３】NCE102プロモーターと他のプロモーターを用いたrHSA発現量に関するロケット免疫電気泳動の結果を示す図。
【００２３】
【図４】NCE102プロモーターと他のプロモーターのHSA-mRNA量比を示す図。
【００２４】
【図５】NCE102プロモーター断片化によるHSA-mRNA量比を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡ断片は配列番号１に示したＤＮＡ配列の全部またはその３’側末を含む一部の配列で表される。このＤＮＡ断片は酵母においてNCE102遺伝子の読み枠の上流に位置し、プロモーター領域を含むものである。【００２６】
本発明によるプロモーター活性を有するＤＮＡ断片は、配列番号１で表される配列に加えて、少なくとも配列番号１のＤＮＡ配列の３’末から650bpまでのＤＮＡ配列（配列番号６）を含む配列である。さらに好ましくは、本発明によるプロモーター活性を有するＤＮＡ断片は、少なくとも配列番号１のＤＮＡ配列の３’末から820bpまでのＤＮＡ配列（配列番号５）を含む配列である。【００２７】
さらに、本発明によるプロモーター活性を有するＤＮＡ断片としては、配列番号１に記載されるＤＮＡ配列またはその３’側末を含む一部の配列と相補的な配列にハイブリダイズしうるＤＮＡ配列であって当該全部または一部の配列の転写プロモーター活性を保持する配列も含まれる。このような配列には、配列番号１の全部またはその３’側末を含む一部の配列中の塩基のいずれかについて欠失、置換、および付加、並びにこれらの組み合わせが存在するが、そのプロモーター活性を保持する配列も包含される意味に解釈されるべきである。【００２８】
本明細書において「ハイブリダイズしうるＤＮＡ配列」とはストリンジェントな条件下においてハイブリダイズしうるＤＮＡ配列を意味する。【００２９】
なお、本明細書において「プロモーター」とは、宿主細胞中で構造遺伝子に連結したとき、その構造遺伝子に関して、そのプロモーターが存在しない条件下の転写、翻訳、もしくは、ｍＲＮＡの安定性を増大させる任意のＤＮＡ配列を意味する。また、「外来遺伝子」とは、その遺伝子が特定生物に由来するか否かを問わず、自然界では特定のプロモーターと機能的に共存していない任意の遺伝子を意味する。さらに、本明細書では、「ＤＮＡ」、「遺伝子」、および「遺伝子ＤＮＡ」という用語を実質的に同義のものとして用いることとする。【００３０】
本発明の上記酵母プロモーターを含むＤＮＡ断片は慣用されている核酸合成の手法により全合成することができる。【００３１】
本発明によるプロモーターを含むＤＮＡ断片の下流に連結した外来遺伝子（以下、「プロモーター連結外来遺伝子」ということがある）を酵母に導入することにより、外来遺伝子の発現が本発明によるプロモーターによって制御されている酵母を取得することができる。【００３２】
このプロモーター連結外来遺伝子を酵母に導入する方法としては、例えばHinnenら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929-1933, 1978）の文献に記載された方法を用いることができる。具体的には、プロモーター連結外来遺伝子をベクターに組み込んでこれを酵母に導入する方法、直接酵母に導入する方法等が挙げられる。【００３３】
本発明によれば、プロモーター遺伝子を含むＤＮＡ断片と、その下流に位置する外来遺伝子とを連結してなるＤＮＡ断片を含むＤＮＡがベクターに連結された発現プラスミドが提供される。【００３４】
発現プラスミド構築のために用いられるベクターとしては、例えばHinnenらの文献に記載されている酵母の２μm ＤＮＡを基本としたベクター、また一般的な酵母用のベクターであるYRp系（酵母染色体のARS配列を複製起点とする酵母用マルチコピーベクター）、YEp系（酵母の２μm ＤＮＡの複製起点を持つマルチコピーベクター）、YCp系（酵母染色体のARS配列を複製起点として持ち、かつ酵母染色体のセントロメアのＤＮＡ配列を持つ酵母用シングルコピーベクター）、YIp系（酵母の複製起点を持たない酵母染色体組み込み用ベクター）などを挙げることができる。【００３５】
連結される外来遺伝子は特に限定されるものではないが、例えば、ヒト血清アルブミン（以下、「ｒＨＳＡ」と略記することがある）遺伝子などを用いることができる。連結される外来遺伝子はそれにコードされている遺伝子産物の発現を目的とすることに限定されず、アンチセンスＲＮＡによる発現制御もその目的に含まれる。【００３６】
発現プラスミドには、形質転換体選択のためのマーカー遺伝子（例えば、LEU2遺伝子）、形質転換する宿主の種類に応じたターミネーター（例えば、ADH1遺伝子のターミネーター）などを連結することができる。【００３７】
発現プラスミドによる宿主酵母の形質転換法としては、例えば電気穿孔法が挙げられるが、これに限定されるものではない。【００３８】
発現プラスミドによって形質転換される宿主酵母としては、例えばS. cerevisiaeが挙げられるが、これに限定されるものではない。【００３９】
また、本発明による形質転換体を培養することによって、外来タンパク質を発現させ、当該外来タンパク質を製造することができる。発現することができる外来タンパク質としては、例えばヒト血清アルブミン、免疫グロブリンなどの医療分野で有用な物質などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。【００４０】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はそれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
《実施例１：プロモーターのクローニングとrHSA発現プラスミドの構築》
S. cerevisiae S288C株ゲノムＤＮＡを鋳型、合成ＤＮＡ（HA023）：ATAGCGGCCGCAGAATGCAATGCGGCTTTTGTTTG（配列番号１１）および合成ＤＮＡ（HA024）：TATGGGATTATATTGTTATTAGGTATGCTTTGAGA（配列番号１２）をプライマーとして、Pwo DNAポリメラーゼ（ロッシュ社）を用いたＰＣＲ（1st PCR）を行った。1st PCRは、94℃で15秒間、47℃で30秒間、72℃で45秒間の3ステップからなるサイクルを30回繰り返し、最後に72℃で5分間保温する条件で行った。この1st PCRにより、アガロースゲル電気泳動上約0.83kbpの大きさと考えられる位置に確認される1st PCR産物を切り出した。【００４２】
合成ＤＮＡ（HA005）：ATGAAGTGGGTTTTCATCGTCTCCATTTTGTTCTTGTTCTCCTCTGCTTACTCTA（配列番号１３）と合成ＤＮＡ（HA006）：GATCTAGAGTAAGCAGAGGAGAACAAGAACAAAATGGAGACGATGAAAACCCACTTCAT（配列番号１４）を混合し、96℃で10分間保温した後、室温まで冷却しアニーリングを行った。【００４３】
アニーリングを行った合成ＤＮＡリンカーHA005/HA006と1st PCR産物を平滑末端にてライゲーションし、次いで、このライゲーション反応液を鋳型、合成ＤＮＡ（HA030）：ATCCAAAGATCTAGAGTAAGCAGAGGAGAACAAGAAC（配列番号１５）および合成ＤＮＡ（HA039）：AAGGAAAAAAGCGGCCGCAGAATGCAATGCGGCTTTTGTTTG（配列番号１６）をプライマーとするＰＣＲ（2nd PCR）を行った。2nd PCRは、94℃で15秒間、53℃で30秒間、72℃で45秒間の3ステップからなるサイクルを30回繰り返し、最後に72℃で2分間保温する条件で行った。この2nd PCRにより、アガロースゲル電気泳動上約0.83kbpの大きさと考えられる位置に確認される2nd PCR産物を切り出した。【００４４】
精製2nd PCR産物を制限酵素NotIおよびBglIIで消化し、アガロースゲル電気泳動上約0.90kbpの大きさと考えられる位置に確認される消化反応産物を切り出した。【００４５】
この消化反応産物を、rHSA発現プラスミドpDB2244（ＷＯ００／４４７７２号公報）から誘導されたrHSA発現プラスミドpDB2305のPRB1プロモーターを含むNotI-BglII領域と置換することで、新規ｒＨＳＡ発現プラスミドpKHA030を得た。【００４６】
上述した本発明のプロモーターのクローニングとrHSA発現プラスミドの構築について図１に示した。【００４７】
《実施例２：プロモーターの塩基配列の決定》
実施例１でクローニングした領域の塩基配列は、pKHA030を鋳型、CEQ DTCS-Quick Start Kit（ベックマンコールター社）を用いたＰＣＲを行い、CEQ2000XL塩基配列読み取り装置（ベックマンコールター社）を用いて、サンガーの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467, 1977）に従って決定した。【００４８】
《実施例３：プロモーター領域の改変》
本発明者らは、酵母S. cerevisiae S288C株ゲノムＤＮＡにおける本発明のプロモーター領域（820bp）よりさらに580bpを加えた5'上流まで範囲を取り、この1400bpを5'上流側から断片化することを試みた。ここで、ゲノムＤＮＡ上での本発明プロモーターの遺伝子産物翻訳が始まる地点（AUGコドンのA）をゼロ点とし、これより上流に位置するプロモーター領域（820bp）を-820bpとする（配列番号５；配列番号１のＤＮＡ配列中、581番目から1400番目に相当）。以下の各ＤＮＡ断片の調製を実施例１及び実施例２に示した方法と同様に行い（図２）、rHSA発現プラスミド（表１）をそれぞれ構築した：-1400bp（配列番号１のＤＮＡ配列；1番目から1400番目に相当）；-1258bp（配列番号２；配列番号１のＤＮＡ配列中、143番目から1400番目に相当）；-1100bp（配列番号３；配列番号１のＤＮＡ配列中、301番目から1400番目に相当）；-950bp（配列番号４；配列番号１のＤＮＡ配列中、451番目から1400番目に相当）；-650bp（配列番号６；配列番号１のＤＮＡ配列中、751番目から1400番目に相当）；-500bp（配列番号７；配列番号１のＤＮＡ配列中、901番目から1400番目に相当）；-350bp（配列番号８；配列番号１のＤＮＡ配列中、1051番目から1400番目に相当）；-200bp（配列番号９；配列番号１のＤＮＡ配列中、1201番目から1400番目に相当）；-50bp（配列番号１０；配列番号１のＤＮＡ配列中、1351番目から1400番目に相当）及び-0bp。【００４９】
【表１】
0004819683.tif 000002
【００５０】
《実施例４：酵母形質転換体の取得》
プラスミドpKHA030、および、実施例３にて構築したrHSA発現プラスミドを、Hinnenらの文献に記載の方法によって、S. cerevisiae株（cir0 ａ，leu2-3，leu2-112，can1，pra1，yap3，hsp150）に導入した。形質転換体を、ロイシンを欠いている緩衝最小寒天培地（アミノ酸・硫酸アンモニウム不含0.15％(w/v)酵母ニトロゲンベース、0.5％(w/v)硫酸アンモニウム、36mMクエン酸、126mMリン酸水素二ナトリウム、pH6.5、２％(w/v)スクロース、および１％(w/v)バクトアガー）上で選択した。【００５１】
《実施例５：rHSA分泌発現量の評価》
得られた形質転換体を緩衝最小液体培地（アミノ酸・硫酸アンモニウム不含0.15％(w/v)酵母ニトロゲンベース、0.5％(w/v)硫酸アンモニウム、36mMクエン酸、126mMリン酸水素二ナトリウム、pH6.5、2％(w/v)スクロース）10mLを含む50mLフラスコで30℃、200rpmで96時間培養し、rHSA発現量をロケット免疫電気泳動にて評価した。まず、培養液(N=5)の遠心分離を行い、それぞれ上清を回収した。これらの上清4μLを抗ヒトアルブミン抗体(シグマ社)を含む1.0％（w/v）アガロースゲルに供給し、電気泳動を行った。泳動後のゲルをクーマシーブリリアントブルー(R-250)で染色し、得られたロケット様のピークの高さから各培養上清中のrHSA濃度を比較した。【００５２】
図３に示すように、NCE102プロモーター（-820bp）を含むプラスミドpKHA030を導入した酵母のrHSA発現量は、PGK1プロモーター、TEF1プロモーターを含むプラスミドを導入した酵母のrHSA発現量より明らかに多かった。【００５３】
《実施例６：HSA-mRNA転写量の評価》
実施例４にて得られた形質転換体を緩衝最小液体培地（アミノ酸・硫酸アンモニウム不含0.15％(w/v)酵母ニトロゲンベース、0.5％(w/v)硫酸アンモニウム、36mMクエン酸、126mMリン酸水素二ナトリウム、pH6.5、2％(w/v)スクロース）10mLを含む50mLフラスコで30℃、200rpmで培養し、72時間後の酵母菌体を回収した。回収した菌体からRNeasy Mini Kit（キアゲン社）を用いて全ＲＮＡを抽出し、同時にDNase処理も行った。【００５４】
抽出した全ＲＮＡを鋳型とし、HSA遺伝子検出用の合成ＤＮＡ（HA045）：GTCCGAAGTCGCTCACAGATTCAA（配列番号１７）と合成ＤＮＡ（HA046）：GCAGATTCGTCAGCAACACAAGTC（配列番号１８）またはPGK1遺伝子検出用の合成ＤＮＡ（HA062）：GCGTGTCTTCATCAGAGTTGACTTC（配列番号１９）と合成ＤＮＡ（HA063）：CCAAGTGAGAAGCCAAGACAACGTA（配列番号２０）、QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit（キアゲン社）を用いて、ライトサイクラーシステム（ロッシュ社）による各プロモーターの転写活性を比較した。まず、50℃で20分間保温することで逆転写反応を行い、96℃で15分間の熱変性を行った。続けて、94℃で15秒間、53℃で20秒間、72℃で10秒間の3ステップからなるサイクルを40回繰り返し、HA045/HA046により増幅するHSA遺伝子断片と、HA062/HA063により増幅するPGK1遺伝子断片の増幅量を測定した。ここで、各サンプルにおけるHSA-cDNA量およびPGK1-cDNA量の絶対値は両者それぞれのmRNA量に等しいと仮定した。各プロモーターの転写活性は、HSA-mRNA量/PGK1-mRNA量の比（以下、「HSA-mRNA量比」と略記する）をとることで数値化した。【００５５】
NCE102プロモーター（-820bp）を含むプラスミドpKHA030を導入した酵母のHSA-mRNA量比は、PGK1プロモーター、TEF1プロモーターを含むプラスミドを導入した酵母のHSA-mRNA量比より、明らかに高かった（図４）。【００５６】
また、NCE102プロモーターを断片化した場合は、図５に示すようにHSA-mRNA量比が変化し、-650bp（配列番号６；配列番号１のＤＮＡ配列中、751番目から1400番目に相当）より長い領域を用いた時にHSA-mRNA量比が高かった。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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