(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サブユニット内及びサブユニット間のジスルフィド結合を有する多量体蛋白質に由来するサブユニットペプチドを製造する方法であって、以下のステップを含む方法；
（ａ）前記多量体蛋白質に由来するサブユニットペプチドを、蛋白質変性剤を用いて溶液中で変性させ、チオール基と反応する官能基を有するポリオキシアルキルポリエーテルの存在下で、前記溶液から変性剤を除き、サブユニットペプチドの巻き戻しを行うステップと、
（ｂ）前記溶液からポリオキシアルキルポリエーテルが結合したサブユニットペプチドを単離するステップ。
【請求項２】
ステップ（ｂ）で単離されるサブユニットペプチドが抗原性が低下したものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多量体蛋白質が二量体である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記チオール基と反応する官能基を有するポリオキシアルキルポリエーテルが、マレイミド基を有するポリエチレングリコールである請求項１〜３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記多量体蛋白質に由来するサブユニットペプチドが、遺伝子組換え蛋白質である請求項１〜４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記多量体蛋白質に由来するサブユニットペプチドを還元条件下で変性させることを特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
多量体蛋白質の生理活性が、該多量体蛋白質を構成するサブユニットペプチドに依存し、かつ、ポリオキシアルキルポリエーテルが結合したサブユニットペプチドが前記生理活性を有する請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
ポリオキシアルキルポリエーテルが結合したサブユニットペプチドが、多量体蛋白質の生理活性を阻害する活性を有する請求項１〜７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
サブユニットペプチドのシステイン残基のうち、本来多量体蛋白質のサブユニット間のジスルフィド結合の形成に関与するシステイン残基にポリオキシアルキルポリエーテルが結合することを特徴とする請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ポリオキシアルキルポリエーテルが結合したサブユニットペプチドが、多量体蛋白質中の同サブユニット内のジスルフィド結合と同一のジスルフィド結合を有する請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｂ）で単離されるサブユニットペプチドが、配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、同アミノ酸配列においてアミノ酸番号８１のシステイン残基にポリオキシアルキルポリエーテルが結合したペプチド又はその誘導体である、請求項１〜１０の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、サブユニット内及びサブユニット間のジスルフィド結合を有する多量体蛋白質に由来するサブユニットペプチドを製造する方法、並びに、その方法により製造され得るサブユニットペプチドに関する。
背景技術
生物の生命活動には種々の生理活性を持つ蛋白質が必要である。これら生理活性蛋白質の多くは分子内にジスルフィド結合を持ち、また多くは同種あるいは異種のペプチド鎖よりなる二量体等の多量体として存在し、ペプチド鎖間にジスルフィド結合を形成した状態に生合成される。多くの二量体として存在する生理活性蛋白質は、二量体であることが生物学的な活性発現に必須であるが、二量体であることを必ずしも必須としない蛋白質も知られている。
例えば、二量体であることが生理活性発現に必須なものの例としては、ＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）等が挙げられ、その生理活性発現には二量体の各ペプチド鎖が、同様に二量体よりなる受容体の各ペプチド鎖に結合することが必要であり、実質的に二量体であることが必須である（Ｃ．Ｈ．Ｈｅｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｒｅｇｕｌ．，１，５５５−５６６，１９９０）。
しかし、二量体の生理活性蛋白質の中には、一つのペプチド鎖（サブユニット）に受容体への結合活性、酵素活性等が存在し、他のペプチド鎖は、その蛋白質の安定性、溶解性、生合成過程等に重要であると考えられるものも知られており、実質的な生理活性発現には単一のサブユニットのみが必須であることがある。例えばアクチビン（ａｃｔｉｖｉｎ）は、生体中では同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）あるいは異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）として存在しているが、単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）でもその受容体に対する結合活性が報告されており、生物学的な活性も数％程度は保持していることが報告されている（Ｐ．Ｈｕｓｋｅｎ−Ｈｉｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２６９，１９３８０−１９３８４，１９９４）。また、昆虫に存在し、生理作用を果たしているＰＴＴＨ（ｐｒｏｔｈｏｒａｃｉｃｏｔｒｏｐｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅ）は、やはり生体内では同種二量体として存在しているが、その単量体にも約５０％の生物学的な活性が保存されていることが報告されている（Ｊ．Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３，５９１２−５９１９，１９９４）。また、イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ）も二量体であるが、単量体にしても抗原に対する結合性が保持されることが知られている（Ｇ．Ｍ．Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，１９５０，１９６８）。
以上述べたように、生体内で生理活性を示す二量体の蛋白質の単量体には、単量体においても生理活性を持つものがあり、また単量体では生理活性を示さない蛋白質の単量体でも、その受容体に結合するものもある。従って、二量体として存在する蛋白質を単量体として得た場合、その蛋白質を、生理作用を持つ蛋白質として、あるいは生理作用は持たないが受容体に結合し本来の生理活性蛋白質の結合を阻害することにより、本来の生理活性蛋白質の生理作用を阻害する蛋白質として利用できることが考えられる。
また、異なる動物種が生産する蛋白質が、他の動物種に対して生理活性を示す場合も数多く知られている。例えばヒル唾液より単離される蛋白質ヒルジン（ｈｉｒｕｄｉｎ）は、血中の凝固因子であるトロンビンに結合し、そのプロテアーゼ活性を阻害することが知られており、また蛇毒由来の蛋白質として血小板の受容体に結合し血小板凝集を阻害するディスインテグリン（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）、ＣＨＨ−Ｂ等の蛋白質が知られている。この様な異種蛋白質のうち、ＣＨＨ−Ｂは血小板膜上の糖蛋白質である糖タンパク質Ｉｂ（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｂ（ＧＰＩｂ））に結合し、血小板凝集を阻害する蛋白質であるが、ＣＨＨ−Ｂは異種二量体であり、その単量体にも異種二量体と同等のＧＰＩｂに対する結合活性及び血小板凝集阻害活性が保持されていることが報告されている（Ｎ．Ｆｕｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ  ９５／０８５７３）。
すなわち、二量体として生合成される、上記に述べてきた様な生理活性蛋白質の単量体は、作用蛋白質（ａｇｏｎｉｓｔ）／作用阻害蛋白質（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）として利用可能であり、種々の疾患の治療薬として有用であると考えられる。
しかし、本来二量体として生合成され生体内に存在する蛋白質を単量体として、安定、かつ少なくとも生物活性を示す程度に立体構造を保った形で得ることにおいては、大きく２つの問題点が考えられる。
１点目は、単量体を調製することが難しい点である。本来二量体として存在する蛋白質を単量体として得る方法として大きく２つの方法が広く行われている。二量体蛋白質を部分的に還元してサブユニット間のジスルフィド結合のみを切断した後、新たに生じた遊離のチオール基をブロックする方法と、分子生物学的にサブユニット間のジスルフィド結合に関わるシステイン残基をアラニン残基あるいはセリン残基に置換した後、動物細胞などを用いた蛋白質系を用いて生産させる方法である。前者の方法は、前述した蛋白質の中ではＰＴＴＨ、ＣＨＨ−Ｂ及びＩｇＧについて行われており、後者の方法はａｃｔｉｖｉｎ及びＣＨＨ−Ｂについて行われている。前者の方法では蛋白質によってサブユニット間のジスルフィド結合のみを切断する条件設定が難しく、活性を保持した形で単量体を得た例は多くない。また、後者の方法では、サブユニット間のジスルフィド結合に関与するシステイン残基があらかじめ同定されていなければならず、さらに得られた遺伝子に点変異を入れなければならず、方法として繁雑である。
問題点の２点目は、抗原性の発現の可能性があることである。生体内で二量体として存在している蛋白質を単量体とした場合、本来分子の内側に存在していた領域が外側に露出するために異種蛋白質として認識され、抗原性を示す可能性が考えられる。前述した単量体の調製法の１つ目の方法である還元後にチオール基をブロッキングする方法では、このほかにブロッキングに用いた化合物が抗原性を示すことが考えられる。また、２つ目の変異を入れる方法では、変異したアミノ酸を含む部分構造による抗原性も考えられる。また、異なる動物種由来の蛋白質も一般的に抗原性を持ち、単量体にしたものについても同様の抗原性発現が問題となる。
一方、蛋白質の抗原性の低下は、ポリエチレングリコール化を行えば成しうることは広く知られており（バイオコンジュゲート医薬品、続医薬品の開発  臨時増刊、稲田、谷本編、廣川書店、１９９３、Ａ．Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２，３５７８−３５８１，１９９７）、特にポリエチレングリコールの蛋白質に対しての結合個数及び結合位置をより限定するために、システイン残基の遊離のチオール基に結合する官能基を有するポリエチレングリコールを用いる方法も数多く報告されている（Ｇ．Ｎ．Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ  ９８／３２００３、Ｇ．Ｎ．Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ  ９４／１２２１９、Ｒ．Ｊ．Ｇｏｏｄｓｏｎ，ＵＳＰ  ５，２０６，３４４，Ｌ．Ｇ．Ａｒｍｅｓ  ＷＯ９２／１６２２１）。しかし、いずれも蛋白質の一部に人為的にシステイン残基を挿入あるいは置換する方法であり、本来二量体を形成するサブユニットに人為的なアミノ酸置換を行わずに遊離のチオール基にポリエチレングリコールを結合させることによって有用な蛋白質を得た報告はない。
発明の開示
本発明は上記観点からなされたものであり、二量体等の多量体として本来存在する蛋白質のうち、生物学的活性をもつサブユニットを単量体として容易に得、かつ、同時にその抗原性を低下させる方法を提供することを課題とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。その結果、多量体蛋白質を構成するサブユニットを蛋白質変性剤を用いて変性させ、該変性剤を除去することによってサブユニットの巻き戻しを行う際に、システイン残基に結合する官能基を有するポリエチレングリコールの存在下で巻き戻しを行うと、サブユニット本来の活性を維持し、かつ、抗原性が低下した単量体ペプチドが得られることを見い出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）サブユニット内及びサブユニット間のジスルフィド結合を有する多量体蛋白質に由来するサブユニットペプチドを製造する方法であって、以下のステップを含む方法；
（ａ）前記多量体蛋白質又はそのサブユニットペプチドを、蛋白質変性剤を用いて溶液中で変性させ、チオール基と反応する官能基を有するポリオキシアルキルポリエーテルの存在下で、前記溶液から変性剤を除き、サブユニットペプチドの巻き戻しを行うステップと、
（ｂ）前記溶液からポリオキシアルキルポリエーテルが結合したサブユニットペプチドを単離するステップ。
（２）ステップ（ｂ）で単離されるサブユニットペプチドが抗原性が低下したものである前記（１）の方法。
（３）前記多量体蛋白質が二量体である（１）の方法。
（４）前記チオール基と反応する官能基を有するポリオキシアルキルポリエーテルが、マレイミド基を有するポリエチレングリコールである（１）の方法。
（５）前記多量体蛋白質に由来するサブユニットペプチドが、遺伝子組換え蛋白質である（１）の方法。
（６）前記多量体蛋白質又はそのサブユニットペプチドを還元条件下で変性させることを特徴とする（１）の方法。
（７）多量体蛋白質の生理活性が、該多量体蛋白質を構成するサブユニットペプチドに依存し、かつ、ポリオキシアルキルポリエーテルが結合したサブユニットペプチドが前記生理活性を有する（１）の方法。
（８）ポリオキシアルキルポリエーテルが結合したサブユニットペプチドが、多量体蛋白質の生理活性を阻害する活性を有する（１）の方法。
（９）サブユニットペプチドのシステイン残基のうち、本来多量体蛋白質のサブユニット間のジスルフィド結合の形成に関与するシステイン残基にポリオキシアルキルポリエーテルが結合することを特徴とする（１）の方法。
（１０）ポリオキシアルキルポリエーテルが結合したサブユニットペプチドが、多量体蛋白質中の同サブユニット内のジスルフィド結合と同一のジスルフィド結合を有する前記（１）の方法。
（１１）サブユニット内及びサブユニット間のジスルフィド結合を有する多量体ペプチドに由来するサブユニットペプチドであって、
サブユニットペプチドのシステイン残基のうち、本来多量体蛋白質のサブユニット間のジスルフィド結合の形成に関与するシステイン残基にポリオキシアルキルポリエーテルが結合し、抗原性が低下したサブユニットペプチド。
（１２）前記多量体蛋白質が、蛇毒に由来するフォンビルブラント因子の血小板結合を阻害する活性を有する二量体ペプチドである（１１）のサブユニットペプチド。
（１３）前記蛇毒がクロタルス・ホリダス・ホリダスの蛇毒である（１２）のサブユニットペプチド。
（１４）抗血栓活性を示す（１２）のサブユニットペプチド。
（１５）配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、同アミノ酸配列においてアミノ酸番号８１のシステイン残基にポリオキシアルキルポリエーテルが結合したペプチド又はその誘導体である（１４）のサブユニットペプチド。
発明を実施するための最良の形態
＜１＞本発明のサブユニットペプチドの製造法
本発明の方法は、サブユニット内及びサブユニット間のジスルフィド結合を有する多量体蛋白質に由来し、好ましくは抗原性が低下したサブユニットペプチドを製造する方法である。
本発明に用いられる多量体蛋白質は、２又はそれ以上のペプチドのサブユニットからなり、少なくとも一つのサブユニットのペプチド鎖内にジスルフィド結合を有し、かつ、サブユニット間にジスルフィド結合を有するものである。
また、前記多量体蛋白質としては、多量体蛋白質の生理活性が、該多量体蛋白質を構成するサブユニットペプチドに依存するものが挙げられる。また、前記多量体蛋白質は、その生理活性が、本発明の方法により得られるポリオキシアルキルポリエーテルが結合したサブユニットペプチドにより阻害されるものであってもよい。例えば、実施例に示した本発明のサブユニットペプチドの一例であるＡＳ１０５１−ＰＥＧは、同サブユニットペプチドが由来する蛇毒由来の二量体ペプチドであるＣＨＨ−Ｂと同様の抗血小板作用を有する。また、前記ＡＳ１０５１−ＰＥＧは、それが由来する二量体ペプチドであるＣＨＨ−Ｂと同様に血小板の糖タンパク質との結合活性を有し、ＣＨＨ−Ｂの結合を阻害する。尚、ＡＳ１０５１では、ＣＨＨ−Ｂが持つ血小板減少作用が著しく低下しているが、このように性質が変化するものであっても、目的とする生理活性を保持するものであれば差し支えない。
本発明の方法は、上記のような多量体蛋白質を構成するサブユニットペプチドのうち、ペプチド鎖内にジスルフィド結合を有するサブユニットペプチドであって、前記生理活性又は該生理活性を阻害する活性を有し、好ましくは抗原性が低下したサブユニットペプチドを得る方法である。
ここで、「抗原性が低下した」とは、本発明の方法により得られるサブユニットペプチドの抗原性が、従来の方法によって多量体蛋白質から得られるサブユニットペプチドが有する抗原性に比べて低下したことをいう。従来の方法とは、例えば、多量体蛋白質を還元剤を用いて還元した後に、遊離のチオール基をアルキル化剤を用いてアルキル化することにより単量体を得る方法、あるいは、サブユニット間のジスルフィド結合に関与するシステイン残基が他のアミノ酸残基に置換されたサブユニットペプチドを、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。
本発明を適用することができる多量体蛋白質としては、２又はそれ以上のペプチドのサブユニットからなり、少なくとも一つのサブユニットのペプチド鎖内にジスルフィド結合を有し、かつ、サブユニット間にジスルフィド結合を有するものであれば特に制限されないが、例えばクロタルス・ホリダス・ホリダス（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ｈｏｒｒｉｄｕｓ  ｈｏｒｒｉｄｕｓ）、セラステス・セラステス（Ｃｅｒａｓｔｅｓ  ｃｅｒａｓｔｅｓ）、ビペラ・パレスチナ（Ｖｉｐｅｒａ  ｐａｌｅｓｔｉｎａｅ）、エキス・カリナタス（Ｅｃｈｉｓ  ｃａｒｉｎａｔｕｓ）、トリメレスラス・アルボラブリス（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ  ａｌｂｏｌａｂｒｉｓ）、トリメレスラス・フラボビリディス（Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ  ｆｌａｂｏｖｉｒｉｄｉｓ）、ナジャ・ハジェ（Ｎａｊａ  ｈａｊｅ）、ナジャ・ニベア（Ｎａｊａ  ｎｉｖｅａ）、クロタルス・アドマンテウス（Ｃｒｏｔａｒｕｓ  ａｄｍａｎｔｅｕｓ）等の蛇毒に含まれる血小板膜上の糖タンパク質Ｉｂ結合活性を持つ多量体蛋白質、あるいは増殖因子、サイトカイン等の生理活性蛋白質（Ｒ．Ｍ．Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ，ＷＯ  ９２／０８４７２）が挙げられる。
本発明の方法においては、蛇毒などの天然物から得られる多量体蛋白質をそのまま用いてもよいし、多量体蛋白質から分離されたサブユニットペプチドを用いることもできる。サブユニットペプチドとしては、多量体蛋白質を構成するサブユニットのうち、生理活性を担うサブユニットペプチドか、あるいは多量体蛋白質の生理活性を阻害する活性を有するサブユニットペプチドを用いる。本発明にいうサブユニットペプチドとは、特記しない限りこのようなサブユニットペプチドを意味する。さらに、サブユニットペプチドは、それをコードするＤＮＡを用いて遺伝子組換え技術により製造した組換えタンパク質であってもよい。
目的のサブユニットペプチドをコードするＤＮＡをクローニングにすることは、そのサブユニットペプチドのアミノ酸配列の全長あるいは一部が明らかであれば、通常の遺伝子クローニングと同様にして行うことができる。例えば、目的とする遺伝子は、既知の塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて得ることもでき、同様にして作製したプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーションを行うことにより取得することもできる。また、目的の遺伝子が寄託機関に寄託されている場合は、寄託されている遺伝子を入手することによっても可能である。また、遺伝子の全塩基配列が既知である場合、化学的に合成することも可能である。多量体を構成するサブユニットペプチドのうち、目的とするサブユニットペプチドが特定できない場合には、それぞれのサブユニットペプチドをコードする遺伝子をクローニングすればよい。
目的サブユニットペプチドをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換え技術により組換えタンパク質として製造することは、通常有用タンパク質の製造に用いられる方法と同様にして行うことができる。すなわち、目的サブユニットペプチドをコードする遺伝子を、適当なプロモーターを含むベクターに挿入し、得られる組換えベクターで大腸菌等の宿主を形質転換し、形質転換体を培養して前記遺伝子を発現させればよい。宿主としては、例えば大腸菌、枯草菌、酵母等が挙げられる。また、プロモーターは、用いる宿主で機能するものであればよく、例としてはｌａｃ、ｔｒｐ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｒｅｃＡ、Ｔ７（新生化学実験講座１、タンパク質、ＶＩ合成及び発現、日本生化学会編、ｐ１６６、安枝、松井、１９９２年、東京化学同人刊）、ＰＧＫ、ＡＤＨ１、ＧＰＤ、ＭＦα１、ＳＵＣ２、ＰＨＯ５、ＧＡＬ１、ＧＡＬ４（新生化学実験講座１、タンパク質、ＶＩ合成及び発現、日本生化学会編、ｐ２１５、酒井ら、１９９２年、東京化学同人刊）等が挙げられる。
発現の形態は、直接目的サブユニットペプチドそのものを発現させても良く、他の蛋白質との融合蛋白質として発現させてもよい。また封入体として菌体内に蓄積させても良く、可溶型として菌体内に蓄積させてもよく、あるいは菌体外に分泌させてもよい。融合蛋白質としては、マルトース結合蛋白質（Ｍａｌｔｏｓｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｇｌｕｔａｔｉｏｎｅ  Ｓ−Ｔｒａｎｆｅｒａｓｅ）、ヒスチジン−タグ（Ｈｉｓ−Ｔａｇ）等との融合蛋白質が挙げられる。
尚、本来多量体として存在する蛋白質のサブユニットペプチドは、サブユニット内のジスルフィド結合には関与しないシステイン残基を持ち、また本来他のサブユニットペプチドと結合している疎水性に富む部分構造を表面に有する可能性が高く、サブユニットペプチド単独では溶液での安定性や溶解性が悪い場合が多いと考えられる。サブユニット内のジスルフィド結合には関与しないシステイン残基が存在することによる安定性の悪さは、従来の方法のように、本来サブユニット間のジスルフィド結合に関与するシステイン残基をアラニン、セリン等のチオール基を持たない適当なアミノ酸残基に置換すれば回避できるが、そのためには本来サブユニット間のジスルフィド結合に関与するシステイン残基を特定する必要がある。また前記システイン残基が特定されている場合であっても、遺伝子にアミノ酸置換を起こす変異を導入する必要があり、その操作は繁雑である。
一方、本発明の方法によれば、サブユニットペプチドをコードする遺伝子をそのまま発現させればよく、サブユニットペプチド単独では溶解性や安定性が悪い場合、該サブユニットペプチドを封入体又は不溶化蛋白質として得ても差し支えない。
本発明においては、上記のような多量体蛋白質又はそのサブユニットペプチドから、前記（ａ）及び（ｂ）のステップによりサブユニットペプチドを得る。以下、各ステップについて説明する。
（１）ステップ（ａ）
はじめに、多量体蛋白質又はそのサブユニットペプチドを、蛋白質変性剤を用いて溶液中で変性させる。続いて、チオール基と反応する官能基を有するポリオキシアルキルポリエーテルの存在下で、前記溶液から変性剤を除き、サブユニットペプチドの巻き戻しを行う。
溶液の溶媒は一般には水である。蛋白質変性剤としては、可逆的に蛋白質を変性することができるものであれば特に制限されないが、塩酸グアニジン、尿素等が挙げられる。蛋白質変性剤濃度は、該蛋白質が溶解すればいかなる濃度でも良いが、例えば１Ｍから飽和濃度の間などが用いることができ、好ましくは２Ｍから８Ｍの間が用いられる。溶液のｐＨはいかなる値でも可能であるが、好ましくはジスルフィド結合の掛かり換えと、後述するポリエチレングリコールのチオール基への結合が起こりやすい７から１２の間が用いられる。また溶液の温度はいかなる温度でも構わないが、好ましくは０℃から４０℃の間が用いられる。また反応時間は適宜選択される。変性は、還元条件下及び非還元条件下のいずれで行ってもよい。
多量体又はサブユニットペプチドのジスルフィド結合を、還元剤を用いてあらかじめ切断しておいても良いが、これは必須ではない。また、巻き戻し過程に先立ってグルタチオン等のシステイン残基を含む物質、ジチオスレイトール等の還元剤、蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）等の酵素などを添加することも可能である。
多量体蛋白質又はそのサブユニットに、サブユニット間のジスルフィド結合が存在する場合や本来のものとは異なるサブユニット内のジスルフィド結合が存在する場合には、変性を還元条件下で行うことが好ましい。本発明において、還元条件とは、システイン残基を含む物質、還元剤、蛋白質ジスルフィドイソメラーゼ等の存在下のように、ジスルフィド結合の切断が促進される条件を意味する。還元条件下にすることにより、ジスルフィド結合の切断が促進されることによって、巻き戻し過程における、チオール基と反応する官能基を有するポリオキシアルキルポリエーテルとの反応が促進される。多量体蛋白質の変性の場合には、サブユニット間のジスルフィド結合の切断が促進されるため、還元条件下で行うことが特に好ましい。
次に、チオール基と反応する官能基を有するポリオキシアルキルポリエーテルの存在下で、変性したサブユニットペプチドを含む溶液から変性剤を除く。溶液から変性剤を除くことは、例えば透析によって行うことができる。
チオール基と反応する官能基としては、代表的にはマレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）基（Ｒ．Ｊ．Ｇｏｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８，３４３，１９９０）、オルトピリジルジスルフィド（ｏｒｔｈｏｐｙｒｉｄｙｌ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ）基（Ｍ．Ｙｏｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１６４，１２３４，１９８９）、ビニルスルフォン（ｖｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｅ）基（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．Ｉｔｅｍ  Ｎｏ．Ｍ−ＶＳ−５０００）等が挙げられるが、優先的にチオール基と結合する官能基であれば良い。また、ポリオキシアルキルポリエーテルとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリヒドロキシエチルグリセロール、デキストラン、炭水化物ポリマー等が挙げられる。分子量はいかなる大きさでも構わないが、得られるサブユニットペプチドの溶解性向上、抗原性低下あるいはサブユニットペプチドとの反応性を考えると１０００から１００万の範囲が好ましく、２０００〜５万の範囲がより好ましい。
上記のようなポリオキシアルキルポリエーテルは、変性に先立って溶液中に加えてもよく、多量体蛋白質又はサブユニットペプチドを変性させた後に加えてもよく、変性剤を除く前に加えてもよい。通常は、多量体蛋白質又はサブユニットペプチドを変性剤で変性させた後に、前記ポリオキシアルキルポリエーテルを加えて一定時間反応させ、その後に変性剤を溶液から除くことが好ましい。ポリオキシアルキルポリエーテルの量としては、反応する蛋白質量に対して等モル比以上であることが好ましい。
変性中又は変性後にチオール基と反応する官能基を有するポリオキシアルキルポリエーテルと反応させることによって、サブユニットペプチドのシステイン残基にポリオキシアルキルポリエーテルが結合する。
上記のようにして溶液から変性剤を除くと、変性したサブユニットペプチドの巻き戻しが起こり、サブユニットペプチドが由来する多量体蛋白質の生理活性と同じ生理活性活性、又は同生理活性を阻害する活性を有するサブユニットペプチドが得られる。
変性したサブユニットペプチドを含む溶液から変性剤を除くステップの前に、自然酸化（空気酸化）を行い、サブユニット内のジスルフィド結合を形成させ、その後にチオール基と反応する官能基を有するポリオキシアルキルポリエーテルを添加することにより、ポリオキシアルキルポリエーテル基を、本来多量体蛋白質のサブユニット間のジスルフィド結合の形成に関与するシステイン残基に、選択的に結合させることを効率的に行うことができる。
（２）ステップ（ｂ）
上記のようにして生成されるポリオキシアルキルポリエーテルが結合したサブユニットペプチドを、溶液から単離する。この操作は、通常の蛋白質の精製に用いられる操作、すなわちイオン交換、ゲル濾過、逆相等の一般的に用いられるクロマトグラフィー、電気泳動、塩析等の沈殿操作、脱塩操作、濃縮操作等を組み合わせて行うことができる。
上記操作により、目的とするサブユニットペプチドと、ポリオキシアルキルポリエーテルとを分離することができる。また、原料として多量体蛋白質を用いた場合は、目的とするサブユニットペプチドと他のサブユニットペプチドとを分離することができる。例えば、サブユニットペプチドのシステイン残基のうち、本来多量体蛋白質のサブユニット間のジスルフィド結合の形成に関与するシステイン残基にポリオキシアルキルポリエーテルが結合し、抗原性が低下したサブユニットペプチドと、他のサブユニットペプチドとを分離することができる。
サブユニットペプチドに結合するポリオキシアルキルポリエーテルの結合位置は、多量体蛋白質においてサブユニット間のジスルフィド結合を形成しているシステイン残基であることが望ましいが、該ジスルフィド結合の様式が決定されていない場合は、特定のチオール基に結合していて、目的とする活性を持ち、溶液中で安定に存在し、好ましくは抗原性が低下するものであればよい。また、サブユニット内の他のジスルフィド結合は、本来の多量体中のサブユニット内のジスルフィド結合と同様であることが望ましいが、実質的に生理活性を持つ範囲であれば、異なっていてもよい。また、サブユニット内の本来のジスルフィド結合が決定されていない場合は、生理活性を持つ単一の分子として特定できる、溶液中で安定に存在するものであればよい。また、一分子あたりに結合するポリオキシアルキルポリエーテル分子数は、本来の二量体蛋白質においてサブユニット間のジスルフィド結合を形成しているシステイン残基の個数と同一であることが望ましいが、その個数が決定されていない場合は、得られた単量体ポリオキシアルキルポリエーテル化蛋白質が生理活性を持ち、単一の分子として特定でき、かつ、溶液中で安定に存在するような個数であればよい。
また、得られた単量体ポリオキシアルキルポリエーテル化サブユニットペプチドの抗原性の低下は、ポリオキシアルキルポリエーテル化していないサブユニットペプチド、あるいは本来の多量体蛋白質においてサブユニット間のジスルフィド結合を形成しているシステイン残基を他のチオール基を持たないアミノ酸に置換したサブユニットペプチドに比べ、実質的に抗原性が低下していればよい。上記のようなポリオキシアルキルポリエーテル化していないサブユニットペプチドの抗原性に関する知見が得られていない場合には、得られたポリオキシアルキルポリエーテル化サブユニットペプチドを、免疫に必要な最低限の回数動物に投与後、再投与した際に抗原抗体反応に起因する生物学的及び生化学的な反応が起こらないものであればよい。
さらに、本発明の方法により得られるポリオキシアルキルポリエーテル化サブユニットペプチドの血中安定性は、ポリオキシアルキルポリエーテル化を行わない場合に比べ向上することが期待される。
後記実施例では、クロタルス・ホリダス・ホリダス由来の蛇毒に含まれる二量体ペプチドであるＣＨＨ−Ｂを構成するサブユニットペプチド（αサブユニット）について、本発明の方法を適用した例を示した。ＣＨＨ−Ｂは、血小板膜糖蛋白質である糖タンパク質Ｉｂ（ＧＰＩｂ）に結合する。糖タンパク質Ｉｂは、血中蛋白質フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）と結合することによって血栓形成に関与することが知られている（Ｊ．Ｐ．Ｃｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，８７，５８６−５９６，１９７６、Ｋ  Ｊ．Ｃｌｅｍｅｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，７８，２６６−２７０，１９９７）。さらに、ＣＨＨ−Ｂのα鎖にＧＰＩｂ結合部位が存在することが見出され、α鎖のみを取り出したＡＳ１０５１に抗血栓活性が存在することが報告されている（Ｎ．Ｆｕｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ  ９５／０８５７３）。Ｎ．Ｆｕｋｕｃｈｉら（ＷＯ  ９５／０８５７３）は、ＡＳ１０５１の調製法として、ＣＨＨ−Ｂからの部分的還元とグルタチオンによる遊離のチオール基の保護を含む方法を報告している。さらに、ＡＳ１０５１をコードする遺伝子をクローニングし、ＣＨＨ−Ｂ中のサブユニット間のジスルフィド結合に関与するシステイン残基を特定し、そのシステイン残基がアラニン残基に置換された変異型ＡＳ１０５１（ＡＳ１０５１−Ａｌａ）を大腸菌で発現させる方法等を報告している。
しかし、前記特許明細書では、ＣＨＨ−Ｂより部分還元により得たサブユニットペプチド、あるいは変異型ＡＳ１０５１を用いた活性のデータは報告されているが、大腸菌で生産された野生型ＡＳ１０５１の安定性については触れられておらず、サブユニット内のジスルフィド結合に関与しない余分なシステイン残基を持つこのサブユニットペプチドの安定性、及び、巻き戻し過程における効率は低いと考えられた。また、同明細書では動物を用いた抗血栓活性の評価は行っているが、その抗原性については触れられていない。そこでまず、大腸菌を用いて製造したＡＳ１０５１の安定性と、安定であると考えられるアラニン置換体（ＡＳ１０５１−Ａｌａ）の動物投与における抗原性について検討を行った。
その結果、ＡＳ１０５１及びＡＳ１０５１−Ａｌａについて同様の条件で変性及び巻き戻しを行ったところ、ＡＳ１０５１の溶解性が非常に低いことが確認された。また、ＡＳ１０５１−Ａｌａについて、モルモットを用いた反復投与を行ったところ、抗原性に基づくと考えられる血小板減少が確認された。一方、本発明の方法により得られたポリエチレングリコール化されたアミノ酸置換されていないＡＳ１０５１は、溶解性が高く、血小板減少も観察されなかった。
＜２＞本発明のペプチド
本発明のペプチドは、サブユニット内及びサブユニット間のジスルフィド結合を有する多量体蛋白質に由来するサブユニットペプチドであって、サブユニットペプチドのシステイン残基のうち、本来多量体蛋白質のサブユニット間のジスルフィド結合の形成に関与するシステイン残基にポリオキシアルキルポリエーテルが結合し、抗原性が低下したサブユニットペプチドである。このようなサブユニットペプチドは、例えば上記の本発明の方法により得られる。
本発明のサブユニットペプチドとして具体的には、前記多量体蛋白質が、クロタルス・ホリダス・ホリダスの蛇毒に由来する、フォンビルブラント因子の血小板への結合を阻害する活性を有する二量体ペプチドであるものが挙げられる。さらに具体的には、配列番号１に示すアミノ酸配列を有し、同アミノ酸配列においてアミノ酸番号８１のシステイン残基にポリオキシアルキルポリエーテルが結合したペプチド又はその誘導体が挙げられる。前記誘導体としては、前記のアミノ酸番号８１のシステイン残基以外の位置において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含み、かつ、抗血栓性を有するペプチドが挙げられる。
上記のようなペプチドは、本来の二量体蛋白質であるＣＨＨ−Ｂ、あるいはそのαサブユニットの単量体ペプチドであるＡＳ１０５１と同様の血小板凝集阻害活性を保持し、かつ緩衝液等の溶液における高い溶解性を有し、ポリエーテル化されていないＡＳ１０５１が抗原性を示すのに対し、抗原性が非常に低いという優良な性質を有する。
＜３＞本発明のペプチドの用途
本発明の方法により得られたサブユニットペプチドのうち、実質的に本来の多量体蛋白質と同様の生物学的作用を持つものは、その作用のターゲットに対する作用物質として医薬品としての利用が可能である。また、本発明の方法により得られたサブユニットペプチドのうち、例えば本来の多量体蛋白質とその受容体との結合を阻害する等の機作により、多量体蛋白質の生物学的作用を阻害する生理活性を持つものも、その作用のターゲットに対する阻害物質として医薬品としての利用が可能である。
具体的には、前記のポリエチレングリコール化されたＡＳ１０５１は、ＣＨＨ−Ｂ及びＡＳ１０５１と同様の血小板凝集阻害活性を保持し、さらに動物投与における抗原性が見られないことから、抗血栓薬として利用することができる。
医薬組成物において、本発明のペプチドは、そのままの形態でも良く、薬学的に許容される塩であっもよい。これらは１種または２種以上の混合物として使用することもできる。また、他の有効成分を有していても良い。さらに、通常製剤に用いるその他の材料、例えば血清アルブミン等の蛋白質、緩衝剤、浸透圧調整のための塩、担体、賦型剤等の成分を配合しても良い。
剤型としては錠剤、カプセル剤、細粒剤、シロップ剤、坐剤、軟膏剤、注射剤、点眼剤等を挙げることができる。これらのうちで注射剤が好ましい。また、投与方法は静脈内投与、皮下投与、筋肉投与、経口投与、点眼投与、経腸投与等のいずれの方法であっても良いがこれらのうちで静脈内投与、皮下投与、筋肉投与等が好ましい。
動物あるいはヒトに投与する際の投与量は、例えばポリエチレングリコール化ＡＳ１０５１の場合には、同ペプチドの量として、通常０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲で所期の効果が期待でき、この範囲で最も優れた薬効が得られる量を選択できる。
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
実施例１  ＣＨＨ−Ｂα鎖蛋白質の遺伝子クローニング
ＣＨＨ−Ｂα鎖蛋白質の遺伝子クローニングは、Ｎ．Ｆｕｋｕｃｈｉらの方法（ＷＯ  ９５／０８５７３）にしたがって行った。詳細には、以下に示す手順で行った。
＜１＞クロタルス・ホリダス・ホリダスのｃＤＮＡライブラリーの作製
（１）クロタルス・ホリダス・ホリダスからのｍＲＮＡの抽出
クロタルス・ホリダス・ホリダスの毒腺を摘出し、直ちに液体窒素にて凍結し、使用時まで保存した。この毒腺１．７ｇをＲＮＡ抽出液（４Ｍ  塩酸グアニジウムイソチオシアネート、０．１Ｍ  トリス塩酸（ｐＨ７．５）、１％β−メルカプトエタノール、０．１％ラウリルザルコシルナトリウム塩）２０ｍｌ中でポリトロンホモジナイザー（キネマティカ社製）を用い破砕した。この破砕液を１００００×Ｇで１０分間遠心分離し、不溶物を取り除いた後、上清を超遠心分離チューブ中の等量の密度平衡化緩衝液（４Ｍ  塩化セシウム、１０ｍＭ  エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム、ｐＨ７．５）に重層し、３００００ｒｐｍ、１８時間、２０℃で遠心分離し、全ＲＮＡ６００μｇを分離した。
全ＲＮＡからのｍＲＮＡの調製は、ＰＯＬＹ（Ａ）Ｑｕｉｋ  ｍＲＮＡ抽出キット（ストラタジーン社製）を用い、キットのプロトコールに従って行った。即ち、取得された全ＲＮＡのうち５００μｇをオリゴｄＴカラムに吸着させ、高塩緩衝液２００μｌで２回、低塩緩衝液２００μｌで３回カラムを洗浄後、６５℃、２００μｌの溶出緩衝液を４回カラムを通過させることにより、ｍＲＮＡ（１０μｇ）を分離精製した。
（２）ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡの合成は、ＴｉｍｅＳａｖｏｒ  ＤＮＡ合成キット（ファルマシア社製）を用い、キットのプロトコールに従って行った。即ち、精製したｍＲＮＡ３μｇに、ランダムヘキサマープライマー０．３μｇ、１ｍＭ  ジチオスレイトール、逆転写酵素を含むファーストストランド反応液を混合し、３７℃で１時間反応させてファーストストランドを合成した。
この反応液を大腸菌ＲＮａｓｅＨ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼを含むセカンドストランド反応液に混合し、１２℃で３０分、２２℃で１時間反応させてｃＤＮＡを合成した。さらに６５℃で１０分インキュベートした後、反応液をフェノール／クロロホルム処理し、酵素を失活させた。次にキット添付のゲル濾過スパンカラムを用い、４００×Ｇで２分間遠心分離することにより未反応のプライマーを除去し、二本鎖ｃＤＮＡ（３μｇ）を得た。
（３）ｃＤＮＡライブラリーの作製
上記で得られた二本鎖ｃＤＮＡの両端に、ＴｉｍｅＳａｖｏｒＤＮＡキットに添付のＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプターを、キットのプロトコールに従って連結した。即ち、ｃＤＮＡ３μｇ、ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプター３μｌ、ポリエチレングリコール緩衝液３０μｌ、ＡＴＰ溶液１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１μｌを混合し、１６℃で１時間連結反応を行った。更に反応液を６５℃で１０分インキュベートして酵素活性を失活させた後、ＡＴＰ溶液１．５μｌ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１μｌを加え、３７℃で３０分反応させ、アダプターの５’末端のリン酸化を行った。この後、反応液を６５℃で１０分インキュベートし、さらにフェノール／クロロホルム処理を行って酵素活性を失活させた。次にキット添付のゲル濾過スピンカラムを用い、反応液を４００×Ｇで２分遠心分離することにより未反応のアダプターを除去した。
アダプターを両末端に連結したｃＤＮＡを、ラムダファージベクターλＺＡＰＩＩ（ストラタジーン社製）のＥｃｏＲＩ部位に連結して、組換えファージＤＮＡを作製した。即ち、アダプターを連結したｃＤＮＡ４００ｎｇに対し、λＺＡＰＩＩ／ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰアーム１μｇ、連結緩衝液（１００ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．６）、２５ｍＭ  塩化マグネシウム、３００ｍＭ  塩化ナトリウム）を添加し、さらにＴ４ＤＮＡリガーゼを含む酵素液Ｂ液（宝酒造（株）製  ライゲーションキット）を等量添加し、２６℃で１０分連結反応を行った。
上記のようにして得られた組換えファージＤＮＡのパッケージングは、パッケージングキットＧＩＧＡＰＡＣＫＩＩ  ＧＯＬＤ（ストラタジーン社製）を用い、キットのプロトコールに従って行った。即ち、上記のｃＤＮＡを連結したλＺＡＰＩＩアームＤＮＡ  ３μｇとキットのパッケージング抽出液を混合し、２２℃で２時間反応させることによりパッケージングを行った。この反応液に５００μｌのファージ希釈液（０．５８％  塩化ナトリウム、０．２％  硫酸マグネシウム、５０ｍＭ  トリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．０１％  ゼラチン）を添加した。
得られた組換えファージのタイターをチェックした後、ファージのパッケージング反応液の半量を用い、受容菌として大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）を用いてファージライブラリーを作製した。即ち、直径１５０ｍｍのプラーク形成培地（バクトトリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％、硫酸マグネシウム１ｍＭ、マルトース０．２％）１０枚に、１プレート当たり２０，０００プラークになるように、ファージ希釈液で希釈したファージと受容菌をプレーティングし、３７℃で１２時間培養して、組換えファージのライブラリーを得た。
＜２＞目的遺伝子単離のためのプローブＤＮＡの取得
（１）ＲＴ−ＰＣＲ法による目的遺伝子部分断片の増幅
クロタルス・ホリダス・ホリダスからの全ＲＮＡを材料として、ＲＴ−ＰＣＲ法によりフォンビルブラント因子の血小板結合阻害ペプチドをコードするＤＮＡ断片の増幅を行った。
配列番号１に記載のペプチドのアミノ酸配列（Ｎ．Ｆｕｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、前述）をもとに、コドンの縮重の少ない箇所をえらび、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）用のプライマーを作製した。プライマーはバイオロジカ社に依託して化学合成した。これらのプライマーの塩基配列を配列表配列番号２、３に示す。但し、配列番号２において、３番目及び６番目のヌクレオチドはＡ及びＧの、１２番目のヌクレオチドはＴ、Ｃ、Ａ及びＧの混合物である。また、配列番号３において、３番目のヌクレオチドはＴ、Ｃ、Ａ及びＧの、６番目及び１５番目のヌクレオチドはＴ及びＣの、９番目のヌクレオチドはＡ及びＧの混合物である。
前記と同様にして調製したクロタルス・ホリダス・ホリダスの全ＲＮＡに対し、上記プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。ファーストストランドの合成は全ＲＮＡ５μｇに対し、逆転写酵素ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩ（ＧＩＢＣＯ社製）２．５μｌ、酵素液に添付のファーストストランド緩衝液２０μｌ、０．１Ｍ  ジチオスレイトール１０μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌを混合し、４２℃で１時間反応させてファーストストランドを合成した。反応液を９５℃で５分インキュベートして逆転写酵素を失活させた。次にこのファーストストランドを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。即ちファーストストランド反応液５μｌ、ＰＣＲ反応緩衝液１０μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ、プライマー各８００ｐｍｏｌ、Ｔａｑポリメラーゼ１０ｕを混合し、ＤＮＡサーマルサイクラー（パーキンエルマー社製）を用い、９５℃０．５分、５２℃１分、７２℃２分を１サイクルとして２５サイクルの反応を行った。
このＰＣＲ反応液を２％アガロースゲル電気泳動に供し、増幅ＤＮＡを解析した。その結果、約３００塩基対の位置にＤＮＡのバンドが観察された。
（２）増幅断片の塩基配列決定
上記のようにして増幅されたＤＮＡ断片を、ｐＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）クローニングキット（ストラタジーン社製）を用い、キットのプロトコールに従ってプラスミドにサブクローニングした。即ち、ＰＣＲ反応液に、ライゲーション緩衝液、１ｍＭ  ＡＴＰ、ベクターとしてｐＣＲｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン社製）１０ｎｇ、制限酵素ＳｒｆＩを５ｕｎｉｔｓ、及びＴ４ＤＮＡリガーゼを添加混合し、２５℃で１時間連結反応を行った後、反応液を６５℃で１０分インキュベートしリガーゼを失活させた。この反応物を用いて、コンピテントセル法によりＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを形質転換し、Ｌ−Ａｐプレート（バクトトリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％、アンピシリンナトリウム１００μｇ／ｍｌ）にプレーティングして３７℃で１８時間培養した。コロニーを形成した菌体をプレートから分離し、その一部を液体培養し、アルカリ法（モレキュラークローニング２版  Ｖｏｌ．１  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ編）によりプラスミドの調製を行った。このプラスミドをｐＣＨＡｐｒｏｂｅと命名した。
ｐＣＨＡｐｒｏｂｅのクローニング断片の塩基配列を、ＤＮＡシーケンサーＡ３７３（アプライドバイオシステムズ社製）を使用し、プライマーとしてＭ１３Ｍ４あるいはＭ１３ｒｅｖｅｒｓｅ（宝酒造（株）製）を用い、同シーケンサーの使用法に従ってｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ法により解析した。その結果、クローニングされたＤＮＡ断片は２７２塩基対からなり、配列番号４に示す塩基配列を有していた。この配列をアミノ酸に翻訳してみたところ、求めるペプチドの一部に相当し、得られたクローニング断片が目的ペプチドＣＨＨ−Ｂα鎖蛋白質のサブユニット（ＡＳ１０５１）をコードする遺伝子の一部であることが証明できた。
（３）プローブの標識
ｐＣＨＡｐｒｏｂｅを、クローニングされた挿入断片の両端に存在する制限酵素ＳａｃＩ、ＢａｍＨＩで切断し、２％アガロースゲル電気泳動により３４０塩基対の大きさのＤＮＡ断片を分離し、ＤＮＡ回収キット（タカラＥＡＳＹＴＲＡＰ：宝酒造社製）を用い、キットのプロトコールに従ってＤＮＡを回収した。このＤＮＡ２５ｎｇを、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ及びランダムプライマーラベリングキット（宝酒造社製）を用い、ラジオアイソトープラベルした。ラベル反応液から、ゲル濾過Ｎｉｃｋカラム（ファルマシア社製）を用いて未反応の［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを除去し、ラベル化プローブを得た。
＜３＞プラークハイブリダイゼーションによる目的遺伝子の取得
ｃＤＮＡファージライブラリーからＡＳ１０５１ペプチドの全長をコードする遺伝子を、上記プローブを用いたプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。
前記のようにしてλＺＡＰＩＩｃＤＮＡファージライブラリーのプラークを形成させたプレートから、ナイロンフィルターハイボンドＮ（アマシャム社製）に、フィルター添付の説明書に従ってプラークを転写させた。このフィルターをアルカリ処理してファージを溶解した後、８０℃で２時間ベーキングすることによりファージＤＮＡをフィルターに固定した。
このフィルターを、３２Ｐラベル化プローブ１×１０６ｃｐｍ／ｍｌと、５×ＳＳＰＥ緩衝液（２０×ＳＳＰＣ：３．６Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．７、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ二ナトリウム）、３０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液：２％ウシ血清アルブミン、２％フィコール４００、２％ポリビニルピロリドン）、及び０．５％ＳＤＳを含む溶液中で、３７℃で１６時間ハイブリダイズさせた。この後、フィルターを６×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ：３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ中で室温にて２回、さらに２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で５０℃にて２回洗浄し、フィルターに非特異的に結合したプローブを除去した。このフィルターをＸ線フィルムＨＰ２０（フジフィルム（株）製）に−８０℃で２４時間露光させた。ファージプレートから、フィルムの陽性スポットに相当する位置のクローンを単離し、一次スクリーニング陽性クローンとした。同様のスクリーニング作業を繰り返し、単一プラークを形成する陽性クローンを取得した。
得られた陽性クローンのλＺＡＰＩＩｃＤＮＡファージに、ヘルパーファージＥｘＡｓｓｉｓｔ（ストラタジーン社製）を感染させ、非アンバーサプレッサー大腸菌であるＳＯＬＲセル（ストラタジーン社製）に感染させることにより、ｃＤＮＡ断片がプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（ストラタジーン社製）のＥｃｏＲＩ部位に挿入されたプラスミドを保持する大腸菌を得た。この菌体からアルカリＳＤＳ法にてプラスミドを調製し、ＤＮＡシーケンサーＡ３７３（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、挿入断片の塩基配列を決定した。
その結果、４つの陽性クローンが求めるペプチドをコードする塩基配列を有しており、それぞれを保持しているプラスミドをｐＣＨＡ１、ｐＣＨＡ２、ｐＣＨＡ３及びｐＣＨＡ４と命名した。なおｐＣＨＡ１を保持するＥ．ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１／ｐＣＨＡ１（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＪ１３０２３）は、平成６年８月１２日より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、ＦＥＲＭ  ＢＰ−４７８１の受託番号のもとでブダペスト条約に基づき国際寄託されている。上記のようにしてクローニングされたＡＳ１０５１ペプチドをコードする遺伝子の塩基配列を、配列表配列番号５に、この遺伝子によってコードされるペプチドのアミノ酸配列を配列番号６に示す。尚、この遺伝子は、翻訳開始アミノ酸であるメチオニン以下２３アミノ酸からなる典型的な分泌シグナルを有している。
実施例２  ＣＨＨ−Ｂα鎖蛋白質（ＡＳ１０５１）の大腸菌による発現系の構築
＜１＞野生型ＣＨＨ−Ｂα鎖蛋白質の発現系の構築
変異を入れないＣＨＨ−Ｂα鎖蛋白質（ＡＳ１０５１−ＷＴ）の大腸菌による発現系の構築は、実施例１で得られた遺伝子を用いて以下の通り行った。クローニングした遺伝子を用い、大腸菌発現生産用ベクターを構築した。
ＡＳ１０５１ペプチドをコードする遺伝子（シグナルペプチドを除く）を発現ベクターに組み込むため、ＰＣＲ法により増幅するためのＤＮＡプライマーを合成した。その際、５’末端側のプライマーとしては、増幅断片の５’末端にＮｃｏＩ部位を持たせるように、ＮｃｏＩ認識配列を含むプライマー（ＡＳＢＮ：配列番号７）を用いた。また、このプライマーは５’末端側にＡＳ１０５１ペプチドのＮ末端アミノ酸のアスパラギン酸のコドンの前に翻訳開始コドンである塩基配列ＡＴＧ（配列番号７においてヌクレオチド番号１０〜１２）を有している。尚、この開始コドンは、ＮｃｏＩ認識配列（配列番号７においてヌクレオチド番号８〜１３）と重複している。一方、３’側のプライマーとしてはＨｉｎｄＩＩＩ認識配列を含むプライマーを用いた（配列番号８、ＨｉｎｄＩＩＩ認識配列はヌクレオチド番号４〜９）。
上記プライマーを用いたＰＣＲ反応により、ＡＳ１０５１ペプチドをコードする遺伝子を増幅した。ＰＣＲ反応は、９４℃１５秒、３５℃１分、７２℃２分を１サイクルとし、２５サイクル繰り返した。ＰＣＲ反応液をフェノール／クロロホルム処理してＴａｑポリメラーゼを失活させ、増幅された４００塩基対からなるＤＮＡ断片をエタノール沈殿法により精製した後、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。このＤＮＡ断片と、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造社製）をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した。得られたプラスミドを用いてコンピテントセル法にてＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン含有プレートにて３７℃、１６時間培養し形質転換体を得た。
生育した形質転換体からアルカリＳＤＳ法にてプラスミドを調製した。Ｍ１３Ｍ４プライマーとＭ１３ＲＶプライマー（ともに宝酒造社製）を用い、３７７ＰＲＩＳＭ  ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列を決定することにより、目的のプラスミドが構築されていることを確認した。作製したプラスミドをｐＵＣＡＳＢＮＨと命名した。ｐＵＣＡＳＢＮＨを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にて４００塩基対のＤＮＡを分離精製した。このＤＮＡを発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＡ（インビトロゲン社製）を制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したものとライゲーションキットを用いて連結した。得られたプラスミドを用いてコンピテントセル法にてＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン含有プレートにて３７℃、１６時間培養し形質転換体を得た。この様に作製した発現ベクターをｐＴｒｃＡＳＷＴと命名した。以上のプラスミドの構築過程を図１に示す。
＜２＞変異型ＣＨＨ−Ｂα鎖蛋白質の発現系の構築
８１番目のシステイン残基をアラニン残基に変異した蛋白質（ＡＳ１０５１−Ａｌａ）の大腸菌による発現系の構築は、以下の通り行った。ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ版）に記載の部位特異的塩基配列変異法により、ＡＳ１０５１ペプチドのジスルフィド結合に関与していないシステイン残基（配列番号１において第８１番目のシステイン残基）をアラニンに置換するようにＡＳ１０５１遺伝子に変異を導入した。ｐＣＨＡ１を鋳型にプライマーＡＳＢＮ（配列番号７）と新たに合成したプライマーＡＳＡｌａＲ（配列番号９）を用い、あるいはプライマーＡＳＨ（配列番号８）と新たに合成したＡＳＡｌａＦ（配列番号１０）を用いＰＣＲ反応を行った。それぞれの反応生成物をアガロースゲル電気泳動に供し、ゲルから増幅ＤＮＡ断片を抽出した。これらのＤＮＡを鋳型にプライマーＡＳＢＮとＡＳＨを用い、２回目のＰＣＲ反応を行い、変異遺伝子を作製した。
ＰＣＲ増幅ＤＮＡを制限酵素で消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、ゲルから４００ｂｐのＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した。このＤＮＡ断片と、制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造社製）をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結した。得られたプラスミドを用いてコンピテントセル法にてＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン含有プレートにて３７℃、１６時間培養し形質転換体を得た。
生育した形質転換体からアルカリＳＤＳ法にてプラスミドを調製した。Ｍ１３Ｍ４プライマーとＭ１３ＲＶプライマー（ともに宝酒造社製）を用い、３７７ＰＲＩＳＭ  ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマー社製）を用いて塩基配列を決定することにより、目的のプラスミドが構築されていることを確認した。作製したプラスミドをｐＵＣＡＳＡｌａと命名した。ｐＵＣＡＳＡｌａを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にて４００塩基対のＤＮＡを分離精製した。このＤＮＡを発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＡ（インビトロゲン社製）を制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化したものとライゲーションキットを用いて連結した。得られたプラスミドを用いてコンピテントセル法にてＥ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を形質転換し、アンピシリン含有プレートにて３７℃、１６時間培養し形質転換体を得た。この様に作製した発現ベクターをｐＴｒｃＡＳＡｌａと命名した。以上のプラスミドの構築過程を図２に示す。
実施例３  ＡＳ１０５１−ＷＴ及びＡＳ１０５１−ＡｌａのＥ．ｃｏｌｉによる生産ならびにＡＳ１０５１−ＷＴ及びＡＳ１０５１−Ａｌａの巻き戻しによる活性体の取得
＜１＞ＡＳ１０５１−ＷＴ及びＡＳ１０５１−Ａｌａの封入体の調製
ＡＳ１０５１−ＷＴ及びＡＳ１０５１−Ａｌａのそれぞれの発現ベクターｐＴｒｃＡＳＷＴ及びｐＴｒｃＡＳＡｌａをそれぞれ保有する形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９を、坂口フラスコを用いてＬ−ｂｒｏｔｈ（バクトトリプトン１％、酵母エキス０．５％、塩化ナトリウム０．５％、アンピシリンナトリウム１００μｇ／ｍｌ）中、３７℃にて培養し、濁度が０．５に達したときにＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）を１０ｍＭになるように添加し、さらに３７℃で４時間培養を行った。菌体を遠心分離により回収、洗浄後、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ溶液に菌体を懸濁しリゾチームを加えて室温で１時間静置した。菌体の懸濁液を超音波破砕機（２００Ｗ、５分）を用いて破砕し、破砕液を遠心分離することにより封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）を沈殿として得た。
＜２＞ＡＳ１０５１−ＷＴ及びＡＳ１０５１−Ａｌａの巻き戻しによる活性体の取得
得られた封入体を、７Ｍ塩酸グアニジン及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解した後、２．５倍量の蒸留水を加え、４℃で一晩静置した。溶液をＳｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒ１（Ｓｐｅｃｔｒａ社製）を用いた透析膜を用いて、０．９％食塩水に対して透析を行い、塩酸グアニジンを除いた。ＡＳ１０５１−ＷＴ及びＡＳ１０５１−Ａｌａそれぞれの透析前後の溶液を逆相カラム（Ｐｅｇａｓｉｌ  ＯＤＳ３００、センシュー科学社製）を用いて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分画した結果を図３に示した。図３中、ａ）は透析前、ｂ）は透析後である。ＡＳ１０５１−Ａｌａは、塩酸グアニジンを除去しても安定であるが、ＡＳ１０５１−ＷＴは透析による塩酸グアニジンの除去により、巻き戻しにより得られた蛋白質が不溶化することが分かった。
ＡＳ１０５１−Ａｌａの透析後の溶液は、１／９容の０．５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）を加えた後、ＣＭ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓ（２．６ｘ４０ｃｍ）を用いたイオン交換カラムに吸着させ、溶出液Ａ（５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５））及び溶出液Ｂ（０．５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．４））を用いて溶出させた。溶出条件は、Ａ：Ｂ＝７５：２５の溶液で２０分溶出させた後、Ａ：Ｂ＝７５：２５からＡ：Ｂ＝５０：５０へのリニアグラジエント（３０分）で溶出するというものであった。こうして、精製されたＡＳ１０５１−Ａｌａを含む溶出画分を得た。
実施例４  ＡＳ１０５１−Ａｌａのモルモットに対する抗原性試験
８１番目のシステイン残基をアラニン残基に変異したＡＳ１０５１蛋白質（ＡＳ１０５１−Ａｌａ）の、モルモットに対する抗原性を確認するための試験は以下のように行った。なお、タンパク質量の定量は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いたマイクロアッセイ法により、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をスタンダードとして行った。
Ｈａｒｔｌｅｙ系モルモット（雌、体重２００〜２５０ｇ）を用い、耳介静脈よりＡＳ１０５１−Ａｌａ（３００μｇ／ｋｇ）あるいは生理的食塩水を隔日で３回投与した。投与用量は１ｍｌ／ｋｇで行い、ともにｎ＝１０で行った。３回目の投与から３週間後、各投与群を二分しそれぞれにＡＳ１０５１−Ａｌａ（３００μｇ／ｋｇ）（ｎ＝５ずつ）あるいは生理食塩水（ｎ＝５ずつ）を投与し、約２０分後にエーテル麻酔下において開腹し、２３Ｇ注射針を用いて腹部大動脈より８ｍｌ採血（０．３８％クエン酸ナトリウム添加）した。採血した血液中の血小板数を、自動血球計測装置（Ｓｙｓｍｅｘ  Ｅ−２０００、東亜医用電子社製）を用いて測定した。結果を図４に示す。前投与及び最終投与がともにＡＳ１０５１−Ａｌａである群（ＡＳ／ＡＳ群）のみに血小板の著しい減少が見られた。前投与が生理食塩水で最終投与がＡＳ１０５１−Ａｌａである群（ｓａｌｉｎｅ／ＡＳ群）では、血小板数がコントロール群（前投与及び最終投与ともに食塩水（ｓａｌｉｎｅ／ｓａｌｉｎｅ群））と差がなかったことから、ＡＳ／ＡＳ群で見られた血小板減少が、前投与によって与えられたＡＳ１０５１−Ａｌａの抗原性に起因するものであると考えられた。
さらに採血した血液から、遠心分離（４℃、２７００ｒｐｍ、１０分）によって血漿を分離し、ＡＳ１０５１−Ａｌａに対する抗体の存在をＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法を用いて測定した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートの各ウェルにＡＳ１０５１−Ａｌａ（１μｇ／ｍｌ）あるいは緩衝液のみを５０μｌ加え、４℃で一晩放置し、コーティングを行った後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｄ  ｓａｌｉｎｅ）で３回洗浄し、５％スキムミルクを溶かしたＰＢＳ（１５０μｌ）を加えてブロッキングを行った。さらに３回洗浄を行った後、採取したモルモット血漿５０μｌを加え、３７℃で１時間放置後、３回洗浄し、アルカリフォスファターゼ標識ウサギ抗モルモットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ｚｙｍｅｄ社製）を希釈バッファー（０．０５Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．１）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０２％  ＮａＮ３、１％ウシ血清アルブミン）で５００倍に希釈した溶液を５０μｌ加え、３７℃で１時間放置した。各ウェルを３回洗浄後、１ｍｇ／ｍｌの発色基質（ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）溶液（１Ｍジエタノールアミン（ｐＨ９．８）／０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を加え、適当時間反応後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。図５に、ＡＳ／ｓａｌｉｎｅ群とｓａｌｉｎｅ／ｓａｌｉｎｅ群のＡＳ１０５１−Ａｌａコーティング（ＡＳ１０５１）及び非コーティング（Ｎｏｎｅ）のウェルにおける吸光度を示した。その結果、ＡＳ／ｓａｌｉｎｅ群では、ＡＳ１０５１−Ａｌａに結合する抗体の存在が示された。
実施例５  ＡＳ１０５１のポリエチレングリコール化蛋白質（ＡＳ１０５１−ＰＥＧ）の調製
（１）分子量５０００のＰＥＧ化試薬を用いた方法
本発明のポリエチレングリコール化蛋白質（ＡＳ１０５１−ＰＥＧ）の調製は以下に示す方法により行った。実施例３と同様にしてＥ．ｃｏｌｉを用いて調製したＡＳ１０５１−ＷＴの封入体を、７Ｍ塩酸グアニジン及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解した後、２．５倍量の蒸留水を加え、４℃で一晩静置した。
さらに、この溶液に０．２ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにマレイミド基を持つ分子量約５０００のポリエチレングリコール化試薬（Ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＥＧ−ｍａｌ，ＭＷ５０００、Ｉｔｅｍ  Ｎｏ．：Ｍ−ＭＡＬ−５０００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）を添加し、３時間室温で静置した。この溶液を、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒ１（Ｓｐｅｃｔｒａ社製）を用いた透析膜を用いて、蒸留水に対して透析を行い、塩酸グアニジンを除いた。透析後の溶液は１／９容の０．５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）を加えた後、ＣＭ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｓ（２．６×４０ｃｍ）を用いたイオン交換カラムに吸着させ、溶出液Ａ（５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５））及び溶出液Ｂ（０．５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．４））を用いて溶出させた。溶出条件は、Ａ：Ｂ＝８０：２０からＡ：Ｂ＝７０：３０へのリニアグラジエント（２０分）で溶出させた後、Ａ：Ｂ＝７０：３０からＡ：Ｂ＝５５：４５へのリニアグラジエント（３０分）で溶出するというものであった。こうして、精製されたＡＳ１０５１−ＰＥＧを含む溶出画分を得た。
（２）分子量２００００のＰＥＧ化試薬を用いた方法
本発明の分子量２００００のポリエチレングリコール化試薬（Ｍｅｔｈｏｘｙ−ＰＥＧ−ｍａｌ，ＭＷ２００００、Ｉｔｅｍ  Ｎｏ．：Ｍ−ＭＡＬ−２００００、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社製）を用いたＡＳ１０５１のポリエチレングリコール化蛋白質（ＡＳ１０５１−ＰＥＧ２００００）の調製は以下のように行った。実施例３と同様にしてＥ．ｃｏｌｉを用いて調製したＡＳ１０５１−ＷＴの封入体を、７Ｍ塩酸グアニジン及び１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．５Ｍ  トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に溶解した後、２．５倍量の蒸留水を加え、４℃で一晩放置した。
さらに、この溶液に０．８ｍｇ／ｍｌになるようにマレイミド基を持つ上述の分子量２００００のポリエチレングリコール化試薬を添加し、３時間室温で静置した。この溶液をＳｐｅｃｔｒａ  Ｐｏｒ  １（Ｓｐｅｃｔｒａ社製）を用いた透析膜を用いて、生理食塩水に対して透析を行い、塩酸グアニジンを除いた後、ＴＳＫ−ｇｅｌ  ＣＭ−５ＰＷ（０．７５×７．５ｃｍ）を用いたイオン交換カラムに吸着させ、溶出液Ａ（５０ｍＭ  酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５））及び溶出液Ｂ（０．５Ｍ  酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ６．４））を用いて溶出させた。溶出条件はＡ：Ｂ＝１００：０からＡ：Ｂ＝４０：６０へのリニアグラジエント（２０分）で溶出させた後、Ａ：Ｂ＝４０：６０からＡ：Ｂ＝０：１００へのリニアグラジエント（５分）で溶出するというものであった。こうして、精製されたＡＳ１０５１−ＰＥＧ２００００を含む溶出画分を得た。
実施例６  ＡＳ１０５１−ＰＥＧの構造
得られたＡＳ１０５１−ＰＥＧの分子量は、ＳＤＳ電気泳動によりポリエチレングリコール化されていない前述のＡＳ１０５１−Ａｌａ（１５Ｋｄａ）に比べ、約１０Ｋｄａ大きい２５Ｋｄａであった。ポリエチレングリコールはＳＤＳ電気泳動においては、水和により本来の分子量の２倍の大きさとして観察されることから、１分子のＡＳ１０５１−ＰＥＧに１分子のポリエチレングリコール（分子量約５０００）が結合していることが確かめられた。また、ＡＳ１０５１−ＰＥＧ２００００の分子量は、ＡＳ１０５１−Ａｌａに比べ、約４０Ｋｄａ大きい５５Ｋｄａであり、ＡＳ１０５１−ＰＥＧと同様に１分子のＡＳ１０５１−ＰＥＧ２００００に１分子のポリエチレングリコール（分子量約２００００）が結合していることが確かめられた。
次に、ＡＳ１０５１−ＰＥＧ中のポリエチレングリコールの結合位置とその他のシステイン残基のジスルフィド結合様式の決定を、以下のように行った。ＡＳ１０５１−ＰＥＧ（１００μｇ）を２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）中でリジルエンドペプチダーゼ（５μｇ、和光純薬社製）によって３７℃で５時間消化を行い、逆相カラム（Ｖｙｄａｃ  ２１８ＴＰ５４、Ｖｙｄａｃ社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーを用いて分取した。溶出は、０．１％トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、ＴＦＡ）を含む水／アセトニトリルのリニアグラジエント（０→５０％アセトニトリル／１０分、５０→１００％アセトニトリル／５分）により行った。こうして、リジルエンドペプチダーゼで消化されたペプチド鎖をピーク１〜６として分取した（図６）。
各ペプチド鎖のアミノ酸配列分析は、プロテインシークエンサーｍｏｄｅ１４７６Ａ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。ピーク３は鎖内に２残基システイン残基を含むことから、両システイン残基同士がジスルフィド結合を形成していると結論した。また、ピーク５はシステイン残基を１残基含む２本のペプチド鎖と、システイン残基を２残基含む１本のペプチド鎖がジスルフィド結合によって結合した、合計３本のペプチド鎖より成るものであった。このピーク５のペプチド鎖を、さらに１０ｍＭ炭酸アンモニウム緩衝液中でＶ８プロテアーゼ（５μｇ、和光純薬社製）によって２５℃で２４時間消化を行い、逆相カラム（Ｐｅｇａｓｉｌ  ＯＤＳ−ＩＩ、センシュー科学社製）を用いた高速液体クロマトグラフィーを用いて分取した。溶出は、０．１％トリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ、ＴＦＡ）を含む水／アセトニトリルのリニアグラジエント（０→５０％アセトニトリル／２０分）により行った。こうしてＶ８プロテアーゼで消化されたペプチド鎖を分取し、アミノ酸配列分析を行った。
その結果、ポリエチレングリコール鎖は配列番号１のアミノ酸番号８１番目に対応するシステイン残基に結合していること、及び、図６に示したようなジスルフィド結合をピーク５のペプチドが有することが判明した。以上の様に決定されたＡＳ１０５１−ＰＥＧのジスルフィド結合様式は、報告されているＡＳ１０５１（Ｎ．Ｆｕｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、ＷＯ  ９５／０８５７３）、あるいは他の類似の蛇毒由来蛋白質と同様であった。
実施例７  ＡＳ１０５１−ＰＥＧのインビトロにおける活性
＜１＞血小板凝集に対するＡＳ１０５１−ＰＥＧの阻害活性の測定
実施例５で得られたＡＳ１０５１−ＰＥＧの血小板凝集に対する阻害活性の測定は、以下の方法で行った。まず、静脈より採血したヒト血液に０．３８％クエン酸ナトリウムを加えた後、１０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離を行い、多血小板血漿を得た。ＡＳ１０５１−ＰＥＧ及びＡＳ１０５１−Ａｌａの血小板凝集阻害活性は、血小板凝集測定装置（ＨＥＭＡ  ＴＲＡＣＥＲ  ８０１、二光バイオサイエンス社製）によって測定した。１００μｌの多血小板血漿にあらかじめ被験サンプルを加え、３７℃で２分間撹拌、インキュベートした後、１／１０容の１０倍濃度の凝集惹起物質を加え、８分間血小板凝集の様子を観察した。凝集惹起物質として、リストセチン（１．２ｍｇ／ｍｌ、シグマ社製）、コラーゲン（１０μｇ／ｍｌ、エムシーメディカル社製）、アデノシン二リン酸（１０μＭ、エムシーメディカル社製）を用いた。図７に示した通り、ＡＳ１０５１−Ａｌａに比べＡＳ１０５１−ＰＥＧのリストセチン凝集阻害活性は若干強かった。また、ＡＳ１０５１−Ａｌａ及びＡＳ１０５１−ＰＥＧはともにコラーゲンによる凝集及びアデノシン二リン酸による凝集を阻害しなかった。
＜２＞血小板に対するフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）結合阻害活性の測定
ＡＳ１０５１−Ａｌａ及びＡＳ１０５１−ＰＥＧの血小板とｖＷＦとの結合に対する阻害を、固定化血小板と１２５Ｉラベル化フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）を用いて調べた。
１２５Ｉラベル化ｖＷＦを、以下の方法により調製した。１２５Ｉラベル化を行うチューブは、予めＩｏｄｏｇｅｎ（Ｐｉｅａｒｃｅ社製、０．５ｍｇ／ｍｌ）のジクロロメタン溶液１．５ｍｌを加えた後、窒素気流下で溶媒を除去し、Ｉｏｄｏｇｅｎの固相化を行った。ゲル濾過により得た高分子量ｖＷＦ（０．１９ｍｇ／１．５ｍｌ）をＩｏｄｏｇｅｎを固相化したチューブに入れ、Ｎａ１２５Ｉ、１８．５Ｍｂｑを加えて室温で２分間反応させた後、あらかじめウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングし洗浄したＰＤ１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）カラムにアプライし、ＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）で溶出を行った。溶出液は、０．５ｍｌずつフラクション分取し、各フラクションの１２５Ｉ比活性をガンマカウンターＰａｃｋａｒｄ  Ｍｕｌｔｉ  Ｐｒｉａｓ  ４を用いて測定した。１２５Ｉ−ｖＷＦを多く含むフラクションを集め、数本に分割した後、使用まで−８０℃で保存した。
ボトロセチンの精製は以下のように行った。ボトロプス・ジャララカ（Ｂｏｔｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａ）の粗毒凍結乾燥品（Ｓｉｇｍａ社製、Ｖ−５６２５）１ｇを２０ｍｌの０．９％食塩水に溶解後、遠心分離により不溶物を除き、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５（φ５×９０ｃｍ）カラムを用いたゲル濾過を行った（展開溶液：０．９％食塩水、流速：４ｍｌ／分）。１５ｍｌずつフラクション分取し、活性画分（フラクションＮｏ．４９〜５８、１５０ｍｌ）を集め、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を１／１０容加えた後、ＤＥＡＥ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ６５０Ｍ（φ１６×３００ｍｍ）に吸着させ、ＮａＣｌの濃度勾配（０．１５Ｍ／２００分、０．１５Ｍ→０．４Ｍ／４００分、流速：０．５ｍｌ／分）で溶出した。活性画分（５７０〜６３０分、３０ｍｌ）を集め、精製ボトロセチンを得た。
固定化血小板の調製は以下の様に行った。１／１０容の３．８％クエン酸ナトリウムを添加した、健常人より採血した新鮮血液を９００ｒｐｍで１５分間遠心して得たヒト多血小板血漿（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ：ＰＲＰ）に、これと同容の、２％パラホルムアルデヒドを溶解した２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を含む０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液を加え、４℃で一晩静置保存した。保存後、遠心分離により血小板を回収し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を含む０．１５Ｍ塩化ナトリウム水溶液で２回洗浄した。洗浄後、同溶液に固定化血小板を懸濁し、保存した。
アッセイを行う９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  ＨＶ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、０．４５μＭ）は、予め１％ＢＳＡ／ＴＢＳ（１００μｌ）を各ウェルに加え、数時間静置することによりフィルターのブロッキングを行った。前述の固定化血小板懸濁液をＴＢＳで１０倍に希釈した懸濁液２０μｌ、被験サンプルを５μｌ加え、さらに０．８μｇ／ｍｌのボトロセチン（上記）、あるいは２．４ｍｇ／ｍｌのリストセチン（Ｓｉｇｍａ社製）を含む１２５Ｉ−ｖＷＦ溶液（約８００，０００ｃｐｍ）２０μｌを加えて、３０分静置した。吸引によりウェル中の溶液を濾過した後、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳ（１００μｌ）を加え、さらに吸引することにより洗浄を行った。上記洗浄後の９６ウェルフィルタープレートからパンチ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、型番ＭＡＰＫ  ８９６  ＯＢ）を用いてフィルターを離脱し、６ｍｌ容ポリスチレンチューブに分注して、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｍｕｌｔｉ  Ｐｒｉａｓ  ４を用いて１２５Ｉの放射線量を測定した。
以上の結果、図８に示したように、ＡＳ１０５１−Ａｌａに比べＡＳ１０５１−ＰＥＧの固定化血小板に対するリストセチン及びボトロセチンにより惹起されるｖＷＦ結合阻害活性は若干弱いものの、ほぼ同等であることが確かめられた。また、ＡＳ１０５１−ＰＥＧ２００００も、いずれの方法においてもＡＳ１０５１−ＰＥＧとほぼ同一の活性を有していた。
実施例８  ＡＳ１０５１−ＰＥＧのモルモットに対する抗原性試験
実施例６（１）に記載のポリエチレングリコール化蛋白質（ＡＳ１０５１−ＰＥＧ、ＰＥＧ部分の分子量が５０００のもの）とＡＳ１０５１−Ａｌａのモルモットに対する抗原性を比較するための試験は、実施例４に示した方法と同様にして行った。タンパク質量の定量はＡＳ１０５１−Ａｌａについては実施例４と同様に行い、ＡＳ１０５１−ＰＥＧについては逆相ＨＰＬＣによる２８０ｎｍの溶出ピーク面積を、ＡＳ１０５１−Ａｌａと比較することにより行い、同じ面積を同じタンパク質量とした。ＡＳ１０５１−Ａｌａ及びＡＳ１０５１−ＰＥＧの投与量は、いずれの投与においても２００μｇ／ｋｇとし、ＡＳ−Ａｌａ群（ＡＳ１０５１−Ａｌａの前投与３回、ＡＳ１０５１−Ａｌａの最終投与）、ＡＳ−ＰＥＧ群（ＡＳ１０５１−ＰＥＧの前投与３回、ＡＳ１０５１−ＰＥＧの最終投与）、及びｓａｌｉｎｅ群（生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）の前投与３回、生理食塩水の最終投与）の３群に分け、ｎ＝４（ＡＳ−ＰＥＧ群はｎ＝３）で実験を行った。その結果、図９に示したように、ＡＳ−ＰＥＧ群はｓａｌｉｎｅ群に比べて血小板数の差が見られず、ＡＳ−Ａｌａ群ではＡＳ−ＰＥＧ群及びｓａｌｉｎｅ群に比べ有意に血小板の減少が認められた。この血小板減少は実施例４で示した様に、抗原性に由来するものと考えられることから、本結果はＡＳ１０５１−ＰＥＧはＡＳ１０５１−Ａｌａに対して、明らかに抗原性が低下したことを示す。
産業上の利用の可能性
本発明により、多量体蛋白質に由来するペプチドを、従来の方法に比べて溶解性及び安定性に優れ、かつ抗原性が低下した形態で製造することができる。
【配列表】
0004670150.tif 000002
0004670150.tif 000003
0004670150.tif 000004
0004670150.tif 000005
0004670150.tif 000006
【図面の簡単な説明】
図１は、野生型ＡＳ１０５１（ＡＳ１０５１−ＷＴ）を発現するベクターｐＴｒｃＡＳＷＴの構築過程を示す図。
図２は、システイン残基がアラニン残基に置換された変異型ＡＳ１０５１（ＡＳ１０５１−Ａｌａ）を発現するベクターｐＴｒｃＡＳＡｌａの構築過程を示す図。
図３は、巻き戻し後のＡＳ１０５１−ＷＴ及びＡＳ１０５１−Ａｌａの透析前（ａ）及び透析後（ｂ）の試料を逆相ＨＰＬＣで分析した結果を示す図。横軸は時間を、縦軸は吸光度（２１６ｎｍ）、すなわち溶解蛋白質量を示す。
図４は、ＡＳ１０５１−Ａｌａのモルモット反復投与後の血小板数を示す図。
図５は、ＡＳ１０５１−Ａｌａのモルモット反復投与後の血漿中の抗ＡＳ１０５１−Ａｌａ抗体の検出結果を示す図。
図６は、ポリエチレングリコール化されたＡＳ１０５１（ＡＳ１０５１−ＰＥＧ）のリジルエンドペプチダーゼ消化後の逆相液体クロマトグラム。
図７は、ＡＳ１０５１−Ａｌａ及びＡＳ１０５１−ＰＥＧのリストセチン凝集阻害活性を示す図。
図８は、ＡＳ１０５１−Ａｌａ及びＡＳ１０５１−ＰＥＧの固定化血小板−ｖＷＦ結合阻害活性を示す図。
図９は、ＡＳ１０５１−Ａｌａ及びＡＳ１０５１−ＰＥＧのモルモット反復投与後の血小板数を示す図。
【図１】
0004670150.tif 000007
【図２】
0004670150.tif 000008
【図３】
0004670150.tif 000009
【図４】
0004670150.tif 000010
【図５】
0004670150.tif 000011
【図６】
0004670150.tif 000012
【図７】
0004670150.tif 000013
【図８】
0004670150.tif 000014
【図９】
0004670150.tif 000015