(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カチオン性官能基を有する物質、水酸基を有する物質及び磁性を有する物質を含有する水溶性のカチオン性磁気微粒子の水溶液とリン脂質ベシクルを含む液とを混和して、カチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクルの水溶性の結合体を形成する工程と、マスキング剤を混和する工程を含むことを特徴とするリン脂質ベシクルの分離方法。
【請求項２】
ポリオールとカチオン性官能基を有する物質を構造中に有する水溶性のカチオン性磁気微粒子とリン脂質ベシクルを含む液体とを混和して、カチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクルの水溶性の結合体とする吸着工程、該結合体を凝集剤と混和して、カチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル−凝集剤の水に不溶性の複合体とする凝集工程、磁気分離、遠心分離及びろ過分離から選ばれる少なくとも一つの方法により該複合体のペレットを形成して上澄を取り除く分離工程、並びに、該ペレットを液に分散させる再分散工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のリン脂質ベシクルの分離方法。
【請求項３】
ポリオールとカチオン性官能基を有する物質を構造中に有する水溶性のカチオン性磁気微粒子とリン脂質ベシクルを含む液体とを混和して、カチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクルの水溶性の結合体とする吸着工程、該結合体をマスキング剤を含む水溶液と混和して、カチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル−マスキング剤の水溶性の結合体を形成させるマスキング工程、該結合体を凝集剤と混和して、カチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル−マスキング剤−凝集剤の水に不溶性の複合体とする凝集工程、磁気分離、遠心分離及び過分離から選ばれる少なくとも一つの方法により該複合体のペレットを形成して上澄を取り除く分離工程、並びに、該ペレットを液に分散させる再分散工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のリン脂質ベシクルの分離方法。
【請求項４】
カチオン性官能基を有する物質、水酸基を有する物質及び磁性を有する物質を含有する水溶性のカチオン性磁気微粒子とウィルスを含む液とを混和して、カチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクルの水溶性の結合体を形成する工程およびマスキング剤を混和する工程を含むことを特徴とするウィルスの検出方法。
【請求項５】
水溶性のデキストランマグネタイトを過ヨウ素酸塩により処理し、アルデヒドを有するデキストランマグネタイトとした後、カチオン性官能基を有する物質である平均分子量１８００のポリエチレンイミンと還元的アミノ化により共有結合させて得られる水溶性のカチオン性磁気微粒子を、ウィルスを含む血清または血漿と混和して、カチオン性磁気微粒子／ウィルスの水溶性の結合体とする工程、該結合体を平均分子量２５０００のポリアクリル酸水溶液と混和して、カチオン性磁気微粒子／ウィルス／ポリアクリル酸の水溶性の結合体を形成させる工程、さらに該結合体を分子量６０００〜８０００のポリエチレングリコール水溶液と混和して、カチオン性磁気微粒子／ウィルス／ポリアクリル酸／ポリエチレングリコールの水に不溶性の複合体とする工程、磁気回収により該複合体のペレットを形成して上澄を取り除く工程、ペレットを核酸増幅反応液に分散させる工程、加熱によりウィルスを破壊しウィルスの核酸を放出させる工程、核酸増幅反応（PCR、ICAN）によりウィルス核酸を増幅する工程を含むことを特徴とする請求項４に記載のウィルスの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性カチオン性磁気微粒子及びそれを用いたリン脂質膜を有する物体（以下、リン脂質ベシクルという）の分離方法または検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血中ウィルスの診断において、抗体ビーズを用いたラテックス凝集法が知られている。この方法では、血中ウィルスの表層に存在するタンパクに対するモノクロナール抗体またはポリクロナール抗体を固定したラテックス磁気ビーズなどの担体を血中ウィルスの存在が予想される血液サンプルと混和する。血液サンプルに血中ウィルスが存在しない場合、ラテックス磁気ビーズは分散した状態を維持するが、血中ウィルスが存在する場合には、血中ウィルスの膜タンパクと上記抗体が相互吸着し、血中ウィルスとラテックス磁気ビーズが凝集を形成するため、ウィルスの有無を目視で確認できる。
【０００３】
しかしながら、血液サンプルはタンパク、多糖類、低分子など、種々の成分を含んでおり、サンプルごとにその成分比も大きく変動することが知られている。血液サンプルの中のある種の成分が多い場合は、検出結果が偽陽性、または偽陰性となる場合が知られており、通常は偽陰性を出さず偽陽性となるように設計した診断系が作成される。ＨＩＶなどの診断では、血中ウィルス量もしくは抗体量の操作が簡便で多サンプルを迅速に処理できるラテックス凝集法もしくはクロマト法がまず用いられるが、これらの診断方法の偽陽性率は、０．３％程度あり、上記診断により陽性と判断された場合には、さらに他の方法による診断を行い、偽陽性でないことを確認する必要がある。また、ウィルス感染直後には血中ウィルス量またはウィルスに対する抗体量が非常に少なく検出できない期間（この期間をウィンドウ期間という。）が長いという問題があり、被験者が感染したと思われる時期から短期のうちに上記診断を行った場合には、血中ウィルス量または抗体量が増加する一定時期後に再度検査を行う必要がある。
【０００４】
ウィンドウ期間を短縮する方法として、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）を利用する方法が開発されている。この方法は、ウィルスに由来する核酸のうち、該ウィルスに特異的な断片を２〜３２倍程度まで増幅した後、ＤＮＡ断片量の定量を行い、ＰＣＲに用いたウィルス量を逆算することで高感度検出を行うものである。ウィルスに由来する核酸がＲＮＡである場合は、逆転写反応を行い、該ＲＮＡと相補的なＤＮＡを合成した後ＰＣＲを行うことで、ウィルスの検出が可能となる。これらの技術は当業者にとってよく知られた技術である。
しかしながら、PCRによる診断は上記のラテックス凝集法などの検査と比較し、非常に高感度であるが、血中のある種の成分がＰＣＲ反応を阻害するなどの問題が発生するため、血液サンプルの前処理が煩雑となり、処理時間も長くなる問題がある。
【０００５】
このような問題を解決する手法として、サンプル中に存在するPCR阻害物質を中和する試薬を添加することで、特に前処理なく核酸を増幅させる方法が開発されている。しかしながら、サンプル中のPCR阻害物質が中和試薬に対して過剰である場合には定量的な結果は得られないため、水性二相分離などの操作を行いPCR阻害物質をある程度低減させた後に、中和試薬で処理する方法が取られる。
【０００６】
また、阻害物質を除去する安価なウィルスの粗精製方法として、陰イオン交換樹脂を用いる方法が知られている（たとえば、特許文献１参照）。この方法によれば、培養からのＡ型肝炎ウィルス物質を細胞溶解および遠心分離の後に、ゲルろ過を行い、得られた溶離液をジエチルアミノエチルが導入されたセルロースからなる陰イオン交換樹脂に通してウィルスを吸着させ阻害物質を除去した後、ウィルスを溶離させることでウィルスの粗精製物が得られる。
【０００７】
一方、磁気ビーズを用いたウィルス検出法が知られている（例えば、特許文献２参照）。この方法では、ウィルス破砕液をカチオン性磁気微粒子で処理し、ウィルス核酸を直接磁気ビーズに吸着させて、検出阻害物質の除去を行い、後に核酸を放出させるという手法を採用している。
【特許文献１】特開平７−１７７８８２号公報
【特許文献２】特表２００４−５２３２３８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記のサンプル中に存在するPCR阻害物質を中和する試薬を添加する方法の場合には、サンプルによっては、PCR阻害物質の影響や、加熱によるウィルスの破壊を阻害する物質が中和剤よりも多く残存する場合が考えられ、特にウィルス量が少ないサンプルにおいて、偽陰性の診断結果をもたらすという問題がある。また、上記の特許文献１に記載される陰イオン交換樹脂を用いる方法は、安価であるものの、操作が煩雑であり、多サンプルの処理に向かないという課題がある。
【０００９】
また、ウィルス以外にも、人体に悪影響を及ぼす感染性の細菌類は多く知られており、症状としては結核や性感染症が例示される。これらの細菌は、粘膜もしくは傷などから感染し、生体中で増殖する。これら細菌を検査対象とする場合は血液、または痰、尿など感染部を通る排泄物、もしくは感染部位の洗浄液または拭い取り物をサンプルとして診断を行う。また、これらの細菌に対する抗体も生体内で生産されるため、血液中の抗体量を測定し、間接的に細菌の感染を診断する方法もあるが、これらの診断においても、上記ウィルスの濃縮の場合と同様、サンプル中の各種成分による検出の阻害が起こるため、診断に際して、サンプルの前処理が重要であり、前処理が適切でない場合では、偽陰性の診断結果をもたらす可能性がある。
【００１０】
別の問題点として、上記の診断のための前処理として、超遠心分離操作を必要とする場合があるが、この工程は自動化が極めて困難である。自動化に際しての超遠心分離操作の問題を解決する手段として、磁気ビーズを用いる方法がある。
【００１１】
一方、上記の特許文献２に記載される磁気ビーズを用いたウィルス検出法では、使用される磁気微粒子は磁気分離を容易にするため粒子径が１ミクロン程度と大きく、数分で沈降するため、自動化に際しては、攪拌処理などの操作によりなるべく均一に磁気微粒子を分散させる必要があるなど、自動装置の機構が複雑になる問題がある。また、磁気微粒子と核酸を直接結合させており、核酸がある程度不可逆に吸着されていることが予想され、また、核酸が遊離の条件に置かれる時間が長いことから、汚染や分解の心配があるなど、問題がある。
【００１２】
本発明は従来技術の上記課題のいずれかを解決するものであり、特に、ウィルス、細菌などの脂質ベシクル膜の分離又は検出において、検出を阻害する原因物質を簡便かつ短時間の処理で低減させることのできる新規物質及びそれを用いた分離又は検出方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは種々検討の結果、均一条件でリン脂質ベシクルを捕捉しうるカチオン性官能基が導入された水溶性のカチオン性磁気微粒子を、リン脂質ベシクルを含む液と混和することで、サンプル中で均一に分散するリン脂質ベシクル−カチオン性磁気微粒子結合体を形成させ、さらに、該水溶性カチオン性磁気微粒子と混和させることで分子コンプレックスを生じさせる凝集剤を加えることにより水不溶性の複合体を形成させて、水性二相分配させることで、上記課題が有効に解決されることを見出したものである。上記工程において、さらに、上記水溶性のカチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル結合体を含むサンプルにマスキング剤を作用させ、サンプル中で均一に分散するウィルス−カチオン性磁気微粒子複合体−マスキング剤の結合体（マスク体）を形成させる工程を含むことが好ましい。
【００１４】
すなわち、本発明では、上記のリン脂質ベシクル−カチオン性磁気微粒子を含む水溶性の結合体（又はマスク体）に凝集剤を加えて、結合体（又はマスク体）を凝集体（水不溶性の複合体）にさせる工程、凝集体を磁石分離操作により回収してペレット（凝集体ペレット）とし、阻害物質を含む上澄を除去する工程、凝集体ペレットを水又はバッファーに再分散させる工程を順次行うことにより容易にウィルスを分離することができ、これにより、ウィルス診断の阻害物質低減を達成でき、診断の精度を向上させることができる。
また、本発明は、リン脂質ベシクルの検出のための前処理を自動化することができる。
【００１５】
すなわち、本発明は下記の構成よりなるものである。
［１］  カチオン性官能基を有する物質、水酸基を有する物質および磁性を有する物質を共有結合または物理吸着により複合化させた水溶性のカチオン性磁気微粒子。［１］のカチオン性磁気微粒子おいて、水溶液中で正電荷を有することが好ましく、また、平均粒子径が３００ｎｍ以下であることが好ましい。
［２］  磁性を有する物質が、金属、金属酸化物およびラテックス磁気ビーズから選択される少なくとも１種より選ばれる物質であり、水酸基を有する物質がポリオール構造を有する物質であり、カチオン性官能基を有する物質が1級アミノ基、2級アミノ基、3級アミノ基、4級アンモニウム基またはグアニジノ基から選択される少なくとも１種より選ばれる官能基を有する物質であることを特徴とする前記［１］項に記載のカチオン性磁気微粒子。［１］のカチオン性磁気微粒子おいて、ポリオール構造を有する物質が、ポリサッカライド、ポリサッカライド誘導体または水酸基を有する重合性単量体を組成物として重合したポリオールであることが好ましい。
【００１６】
［３］  磁性を有する物質が、マグネタイト、マグヘマイト、ヘマタイト、ゲーサイトおよびラテックス磁気ビーズから選択される少なくとも１種であり、水酸基を有する物質がデキストラン、デキストリン、セルロース、アガロース、澱粉、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアセチルセルロース、ジエチルアミノエチルセルロース、ヒドロキシアセチルセルロース、プルラン、アミロース、ゼラチン、アラビノースガラクタン、ポリビニルアルコール、ポリアリルアルコールから選択される少なくとも１種のポリオールもしくはビニルアルコール、アリルアルコール、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリセロール−モノ（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレート、３−ヒドロキシブチルアクリレート、３−ヒドロキシプロピルアクリレートおよび２−ヒドロキシ−２−メチルプロピルアクリレートから選択される少なくとも１種を重合性単量体組成物の成分として重合したポリオールであり、カチオン性官能基を有する物質が、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリグアニジン、ポリ（N、N−ジメチルアミノエチル（メタ）アクリルアミド）、ポリ（N、N−ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド）、ポリアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、ジエチルアミノエチルクロリド塩酸塩、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、トリス（アミノエチル）アミン、アジリジン塩酸塩、アミノプロピルトリエトキシシランまたはアミノエチルアミノプロピルトリエトキシシランから選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする前記［１］項または前記［２］項に記載のカチオン性磁気微粒子。
【００１７】
［４］  カチオン性官能基を有する物質が、ポリエチレンイミンまたはポリリジンから選ばれる少なくとも1種であり、水酸基を有する物質がデキストランまたはポリビニルアルコールから選ばれる少なくとも1種であり、磁性を有する物質がマグネタイト、マグヘマイトから選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする前記［１］〜［３］項のいずれか記載のカチオン性磁気微粒子。また、前記カチオン性磁気微粒子において、水酸基を有する物質により磁性を有する物質が被覆された構造に、カチオン性官能基を有する物質が導入されていることを特徴とするカチオン性磁性微粒子が利用できる。また、前記カチオン性磁気微粒子において、ポリオールと金属イオンを含む酸性の水溶液をアルカリ性にすることによって得られる水酸基を有する物質により磁性を有する物質が被覆された構造に、カチオン性官能基を有する物質が導入されていることを特徴とするカチオン性磁性微粒子が利用できる。また、前記カチオン性磁気微粒子において、デキストランと塩化鉄を含む酸性の水溶液にアンモニアを添加して得られるデキストラン被覆マグネタイトを過ヨウ素酸ナトリウムで処理して得られるアルデヒドを有するデキストラン被覆マグネタイトに、ポリエチレンイミンを還元的アミノ化法により導入して得られることを特徴とする水溶性のカチオン性磁性微粒子が利用できる。また、前記カチオン性磁気微粒子において、ポリビニルアルコールと塩化鉄を含む酸性の水溶液にアンモニアを添加して得られるデキストラン被覆マグネタイトをエピクロロヒドリンで処理して得られるグリシジル基を有するポリビニルアルコール被覆マグネタイトに、ポリリジンを反応させて得られることを特徴とする水溶性のカチオン性磁性微粒子が利用できる。
【００１８】
［５］  前記［１］〜［４］項のいずれかに記載の水溶性のカチオン性磁気微粒子と、リン脂質膜を有する物体（以下、リン脂質ベシクルという）とを結合してなる水溶性のカチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル結合体。
【００１９】
［６］  リン脂質ベシクルが、ウィルス、細菌、菌又は真菌であることを特徴とする前記［５］項に記載の結合体。更に、前記［５］項において、下記の態様が好ましい。すなわち、前記［５］項において、リン脂質ベシクルが、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、HIV、パピローマウイルス、呼吸器合胞体ウィルス、灰白髄炎ウィルス、ポックスウイルス、ハシカウイルス、アルボウイルス、コクサッキーウイルス、ヘルペスウイルス、ハンタウイルス、肝炎ウィルス、ライム病ウィルス、ムンプスウイルス又はロタウイルスであることを特徴とする結合体。また、前記［５］項において、リン脂質ベシクルが、リン脂質ベシクルが、ナイセリア属、好気菌属、シュードモナス属、ポルフィロモナス属、サルモネラ菌属、エシェリキア属、パスツレラ属、赤痢菌属、バシラス属、ヘリバクター属、コリネバクテリア属、クロストリジウム属、放線菌属、エルシニア属、ブドウ球菌属、ボードテラ属、ブルセラ属、ビブリオ属、連鎖球菌属に属する細菌であることを特徴とする結合体。また、前記［５］項において、リン脂質ベシクルが、Ｂ型肝炎ウィルスであることを特徴とする結合体。また、前記［５］項において、リン脂質ベシクルが、人体液、動物体液、副鼻腔拭い取り物の懸濁液、局部拭い取り物の懸濁液、尿、唾、痰、糞便の懸濁液、河川水、水道水の群から選ばれる少なくとも一つの液に含有されて供給されることを特徴とする結合体。また、前記［５］項において、リン脂質ベシクルが、アミノ酸、オリゴペプチド、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、プロテオグリカン、単糖類、オリゴ糖類、多糖類、リポ多糖類、脂肪酸、エイコサノイド、脂質、トリグリセリド、リン脂質、糖脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、DNA分子、RNA分子、単糖類、オリゴ糖類、又は多糖類から選ばれる少なくとも一つを内部に含むことを特徴とする結合体。
【００２０】
［７］  前記［５］〜［６］項のいずれかに記載の水溶性のカチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル結合体とマスキング剤とを結合してなる水溶性のカチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル−マスキング剤の結合体。
［８］  マスキング剤が、カルボン酸、リン酸、硫酸、及びホウ酸の群から選ばれる少なくとも1種の酸構造を含む物質およびそれらの塩であることを特徴とする前記［７］項に記載の結合体。また、前記［７］項において、マスキング剤が、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリカルボキシメチルスチレン、ヒアルロン酸、α−ポリグルタミン酸、ω−ポリグルタミン酸、ジェラン、カルボシキメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、ポリリン酸、ポリ（リン酸糖）、核酸、リン酸、クエン酸、ポリスチリル硫酸、デキストラン硫酸、ポリスチリルホウ酸から選ばれる少なくとも一つのマスキング剤から選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする結合体が利用できる。また、前記［７］項において、マスキング剤が、ポリ（メタ）アクリル酸である。また、前記［７］項において、マスキング剤が、平均分子量１００００〜５００００のポリ（メタ）アクリル酸であることを特徴とする結合体が利用できる。
【００２１】
［９］  前記［５］〜［６］項のいずれかに記載の水溶性のカチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル結合体と凝集剤とを結合してなる、水に不溶なカチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル−凝集剤の複合体。
［１０］  前記［７］〜［８］項のいずれかに記載の水溶性のカチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル−マスキング剤の結合体と凝集剤とを結合してなる、水に不溶なカチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル−マスキング剤−凝集剤の複合体。
【００２２】
［１１］  凝集剤が、ポリエーテルであることを特徴とする前記［９］項または前記［１０］項に記載の複合体。
［１２］  凝集剤が、主鎖にポリアルキレングリコール構造を有する物質、側鎖にポリアルキレングリコール構造を有する物質、主鎖にポリグリセリン構造を有する物質からなる群より選ばれる少なくとも1種であることを特徴とする前記［９］項または前記［１０］項に記載の複合体。また、前記［９］項または前記［１０］項において、凝集剤が、ポリエチレングリコールであることを特徴とする複合体が利用できる。また、前記［９］項または前記［１０］項において、凝集剤が、平均分子量２０００〜２００００のポリエチレングリコールであることを特徴とする複合体が利用できる。また、前記［９］〜［１２］項のいずれかに記載の水に不溶なカチオン性磁性微粒子−リン脂質ベシクル−凝集剤の複合体を、磁気分離法、遠心分離法、ろ過分離法の群から選ばれる少なくとも1種の方法を用いて液から分離して得られることを特徴とする複合体のペレットが利用できる。また、上記記載の複合体のペレットを再分散させたことを特徴とする水溶液が利用できる。
【００２３】
［１３］  デキストランが被覆されたマグネタイトとポリエチレンイミンとを複合化させた水溶性のカチオン性磁気微粒子、及びウィルスを含む液体を混和して得られるカチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクルの水溶性の結合体と、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリカルボキシメチルスチレン、ヒアルロン酸、α−ポリグルタミン酸、ω−ポリグルタミン酸、ジェラン、カルボシキメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、ポリリン酸、ポリ（リン酸糖）、核酸、リン酸、クエン酸、ポリスチリル硫酸、デキストラン硫酸、ポリスチリルホウ酸の群から選ばれる少なくとも１種のマスキング剤を含む水溶液とを混和して形成されたカチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル−マスキング剤の水溶性の結合体、並びにポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールランダムコポリマー及びポリエチレングリコールポリプロピレングリコールブロックコポリマー、もしくはポリメトキシエトキシ（メタ）アクリレート、ポリ（ジエチレングリコール−（メタ）アクリレート−メチルエーテル）、ポリ（トリエチレングリコール−（メタ）アクリレート−メチルエーテル）、ポリ（テトラエチレングリコール−（メタ）アクリレート−メチルエーテル）、ポリ（ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート）、およびこれらのランダムおよびブロックコポリマー、もしくは、ポリ（グリセリン−２−エチルエーテル）、ポリ（グリセリン−２−ジエチレングリコールメチルエーテル）、ポリ（グリセリン−２−トリエチレングリコールメチルエーテル）、ポリ（グリセリン−２−テトラエチレングリコールメチルエーテル）、ポリ（グリセリン−２−ポリエチレングリコールエーテル）、ポリ（グリセリン−２−ポリプロピレングリコールエーテル）、ポリ（グリセリン−２−ポリエチレングリコールエーテル）（グリセリン−２−ポリプロピレングリコールエーテル）コポリマーから選ばれる少なくとも1種の凝集剤を含む水溶液を混和して形成される、前記［１２］項に記載の、水に不溶性のカチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル−マスキング剤−凝集剤の複合体。
【００２４】
［１４］  平均分子量３０００〜１０００００のデキストランが被覆されたマグネタイトと平均分子量６００〜１００００のポリエチレンイミンとを複合化させた水溶性のカチオン性磁気微粒子、及び、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、HIV、パピローマウイルス、呼吸器合胞体ウィルス、灰白髄炎ウィルス、ポックスウイルス、ハシカウイルス、アルボウイルス、コクサッキーウイルス、ヘルペスウイルス、ハンタウイルス、肝炎ウィルス、ライム病ウィルス、ムンプスウイルス又はロタウイルスの群から選ばれる少なくとも一つのウィルスを含む液体を混和して得られるカチオン性磁気微粒子−ウィルスの水溶性の結合体と、平均分子量１００００〜５００００のポリ（メタ）アクリル酸およびその塩を含む水溶液とを混和して形成されたカチオン性磁気微粒子−ウィルス−ポリ（メタ）アクリル酸およびその塩の水溶性の結合体、並びに、平均分子量２０００〜２００００のポリエチレングリコールの水溶液を混和して形成される、前記［１２］項に記載の、水に不溶性のカチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル−マスキング剤−凝集剤の複合体。
【００２５】
また、前記［１２］項において、平均分子量１００００〜４００００のデキストランによりマグネタイトが被覆された水溶性の磁性微粒子と平均分子量１８００〜１００００のポリエチレンイミンとを複合化させた水溶性のカチオン性磁性微粒子、及び、菌、細菌及びウィルスの群から選ばれる少なくとも一つのリン脂質ベシクルを含む液体を混和して得られるカチオン性磁性微粒子−リン脂質ベシクルの水溶性の結合体と、平均分子量２５０００〜５００００のポリ（メタ）アクリル酸を含む水溶液とを混和して形成されたカチオン性磁性微粒子−リン脂質ベシクル−マスキング剤の水溶性の結合体、並びに、平均分子量５０００〜１００００のポリエチレングリコールを混和して形成される、水に不溶性の、カチオン性磁性微粒子−リン脂質ベシクル−マスキング剤−凝集剤の複合体が利用できる。また、前記［１２］項において、平均分子量４００００のデキストランによりマグネタイトが被覆された水溶性の磁性微粒子と平均分子量１８００のポリエチレンイミンとを複合化させた水溶性のカチオン性磁性微粒子、及び、菌、細菌及びウィルスの群から選ばれる少なくとも一つのリン脂質ベシクルを含む液体を混和して得られるカチオン性磁性微粒子−リン脂質ベシクルの水溶性の結合体と、平均分子量２５０００のポリ（メタ）アクリル酸を含む水溶液とを混和して形成されたカチオン性磁性微粒子−リン脂質ベシクル−マスキング剤の水溶性の結合体、並びに、平均分子量６０００〜８０００のポリエチレングリコールを混和して形成される、水に不溶性の、カチオン性磁性微粒子−リン脂質ベシクル−マスキング剤−凝集剤の複合体が利用できる。また、前記［１２］項において、平均分子量４００００のデキストランによりマグネタイトが被覆された水溶性の磁性微粒子と平均分子量１８００のポリエチレンイミンとを複合化させた水溶性のカチオン性磁性微粒子、及び、細菌及びウィルスの群から選ばれる少なくとも一つのリン脂質ベシクルを含む液体を混和して得られるカチオン性磁性微粒子−リン脂質ベシクルの水溶性の結合体と、平均分子量２５０００のポリ（メタ）アクリル酸を含む水溶液とを混和して形成されたカチオン性磁性微粒子−リン脂質ベシクル−マスキング剤の水溶性の結合体、並びに、平均分子量８０００のポリエチレングリコールを混和して形成される、水に不溶性の、カチオン性磁性微粒子−リン脂質ベシクル−マスキング剤−凝集剤の複合体が利用できる。また、前記［１２］項において、平均分子量４００００のデキストランによりマグネタイトが被覆された水溶性の磁性微粒子と平均分子量１８００のポリエチレンイミンとを複合化させた水溶性のカチオン性磁性微粒子、及び、B型肝炎ウィルスを含む液体を混和して得られるカチオン性磁性微粒子−リン脂質ベシクルの水溶性の結合体と、平均分子量２５０００のポリ（メタ）アクリル酸を含む水溶液とを混和して形成されたカチオン性磁性微粒子−リン脂質ベシクル−マスキング剤の水溶性の結合体、並びに、平均分子量８０００のポリエチレングリコールを混和して形成される、水に不溶性の、カチオン性磁性微粒子−リン脂質ベシクル−マスキング剤−凝集剤の複合体が利用できる。
【００２６】
［１５］  カチオン性官能基を有する物質、水酸基を有する物質及び磁性を有する物質を含有する水溶性のカチオン性磁気微粒子の水溶液とリン脂質ベシクルを含む液とを混和して、カチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクルの水溶性の結合体を形成する工程を含むことを特徴とするリン脂質ベシクルの分離方法。
［１６］  前期リン脂質ベシクルの分離において、マスキング剤とを混和する工程を含むことを特徴とする前記［１５］項に記載のリン脂質ベシクルの分離方法。
【００２７】
［１７］  ポリオールとカチオン性官能基を有する物質を構造中に有する水溶性のカチオン性磁気微粒子とリン脂質ベシクルを含む液体とを混和して、カチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクルの水溶性の結合体とする吸着工程、該結合体を凝集剤と混和して、カチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル−凝集剤の水に不溶性の複合体とする凝集工程、磁気分離、遠心分離及びろ過分離から選ばれる少なくとも一つの方法により該複合体のペレットを形成して上澄を取り除く分離工程、並びに、該ペレットを液に分散させる再分散工程を含むことを特徴とする前記［１５］項または前記［１６］項に記載のリン脂質ベシクルの分離方法。また、前記［１７］項において、工程の順に操作を行うことを特徴とするリン脂質ベシクルの分離方法が利用できる。
【００２８】
［１８］  ポリオールとカチオン性官能基を有する物質を構造中に有する水溶性のカチオン性磁気微粒子とリン脂質ベシクルを含む液体とを混和して、カチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクルの水溶性の結合体とする吸着工程、該結合体をマスキング剤を含む水溶液と混和して、カチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル−マスキング剤の水溶性の結合体を形成させるマスキング工程、該結合体を凝集剤と混和して、カチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル−マスキング剤−凝集剤の水に不溶性の複合体とする凝集工程、磁気分離、遠心分離及び過分離から選ばれる少なくとも一つの方法により該複合体のペレットを形成して上澄を取り除く分離工程、並びに、該ペレットを液に分散させる再分散工程を含むことを特徴とする前記［１５］項または前記［１６］項に記載のリン脂質ベシクルの分離方法。また、前記［１８］項において、工程の順に操作を行うことを特徴とするリン脂質ベシクルの分離方法が利用できる。
【００２９】
［１９］  カチオン性官能基を有する物質、水酸基を有する物質及び磁性を有する物質を含有する水溶性のカチオン性磁気微粒子とウィルスを含む液とを混和して、カチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクルの水溶性の結合体を形成する工程を含むことを特徴とするウィルスの検出方法。
【００３０】
［２０］  水溶性のデキストランマグネタイトを過ヨウ素酸塩により処理し、アルデヒドを有するデキストランマグネタイトとした後、カチオン性官能基を有する物質である平均分子量１800のポリエチレンイミンと還元的アミノ化により共有結合させて得られる水溶性のカチオン性磁気微粒子を、ウィルスを含む血清または血漿と混和して、カチオン性磁気微粒子−ウィルスの水溶性の結合体とする工程、該結合体を平均分子量２５０００のポリアクリル酸水溶液と混和して、カチオン性磁気微粒子−ウィルス−ポリアクリル酸の水溶性の結合体を形成させる工程、さらに該結合体を分子量６０００〜８０００のポリエチレングリコール水溶液と混和して、カチオン性磁気微粒子−ウィルス−ポリアクリル酸−ポリエチレングリコールの水に不溶性の複合体とする工程、磁気回収により該複合体のペレットを形成して上澄を取り除く工程、ペレットを核酸増幅反応液に分散させる工程、加熱によりウィルスを破壊しウィルスの核酸を放出させる工程、核酸増幅反応（PCR、ICAN）によりウィルス核酸を増幅する工程を含むことを特徴とする前記［１９］項に記載のウィルスの検出方法。
【００３１】
また、前記［１９］項において、水溶性のデキストランマグネタイトを過ヨウ素酸により処理し、アルデヒドを有するデキストランマグネタイトとした後、ポリカチオンである平均分子量６００〜７００００のポリエチレンイミンと還元的アミノ化により共有結合により結合させて水溶性のカチオン性磁性微粒子を形成する工程、該カチオン性磁性微粒子をウィルスを含む血清と混和して、カチオン性磁性微粒子−ウィルスの水溶性の結合体とする工程、該結合体を平均分子量５０００〜１０００００のポリ（メタ）アクリル酸水溶液と混和して、カチオン性磁性微粒子−ウィルス−ポリ（メタ）アクリル酸の水溶性の結合体を形成させる工程、該結合体を分子量２０００〜２００００のポリエチレングリコール水溶液と混和して、カチオン性磁性微粒子−ウィルス−ポリ（メタ）アクリル酸−ポリエチレングリコールの水に不溶性の複合体とする工程、並びに、磁気回収により複合体のペレットを形成して上澄を取り除く工程を含むことを特徴とするウィルスの検出方法が利用できる。また、前記［１９］項において、水溶性のデキストランマグネタイトとポリエチレンイミンを共有結合させた水溶性のカチオン性磁性微粒子とウィルスを含む血液成分とを混和して、カチオン性磁性微粒子−ウィルスの水溶性の結合体を形成させる工程、該結合体をポリアクリル酸水溶液と混和してカチオン性磁性微粒子−ウィルス−ポリアクリル酸の水溶性の結合体を形成させる工程、さらに該結合体をポリエチレングリコール水溶液と混和して、カチオン性磁性微粒子−ウィルス−ポリアクリル酸−ポリエチレングリコールの水に不溶性の複合体とする工程、磁気回収により該複合体のペレットを形成して上澄を取り除く工程、ペレットを液に分散させる工程、並びに、ウィルスを破壊しウィルスのエンベロープタンパク、カプシドタンパク、核酸を放出させる工程を含むことを特徴とするＢ型肝炎ウィルスの検出方法が利用できる。また、前記［１９］項において、水溶性のデキストランマグネタイトを過ヨウ素酸により処理し、アルデヒドを有するデキストランマグネタイトとした後、ポリカチオンである平均分子量１８００のポリエチレンイミンと還元的アミノ化により共有結合させて水溶性のカチオン性磁性微粒子を形成する工程、該微粒子をB型肝炎ウィルスを含む血清と混和して、カチオン性磁性微粒子−B型肝炎ウィルスの水溶性の結合体とする工程、該結合体を平均分子量２５０００のポリアクリル酸水溶液と混和して、カチオン性磁性微粒子−B型肝炎ウィルス−ポリアクリル酸の水溶性の結合体を形成させる工程、さらに該結合体を分子量６０００のポリエチレングリコール水溶液と混和して、カチオン性磁性微粒子−B型肝炎ウィルス−ポリアクリル酸−ポリエチレングリコールの水に不溶性の複合体とする工程、磁気回収により該複合体のペレットを形成して上澄を取り除く工程、ペレットをPCR反応液に分散させる工程、加熱によりB型肝炎ウィルスを破壊し、並びに、B型肝炎ウィルスのエンベロープタンパク、カプシドタンパク、核酸を放出させる工程を含むことを特徴とするＢ型肝炎ウィルスの検出方法が利用できる。
【００３２】
ここで、核酸がDNA又はRNAであることが好ましい。また、これらに記載の方法を経ることにより得られるウィルスのＤＮＡを核酸増幅反応により増幅させることを特徴とするウィルスの検出方法が利用できる。また、これらに記載の方法を経ることにより得られたウィルスのエンベロープタンパクを用いる検出方法が利用できる。また、これらに記載の方法を経ることにより得られたウィルスのカプシドタンパクを用いる検出方法が利用できる。また、磁気分離機構を備えた装置による、これらのいずれかに記載の水溶性のカチオン性磁気微粒子、マスキング剤、凝集剤を用いたウィルス核酸の回収および検出方法が利用できる。
【００３３】
本発明における用語「カチオン性官能基」とは、水などのプロトン性溶媒中で正に帯電する官能基を意味し、例えば、1級アミノ基、2級アミノ基、3級アミノ基、4級アンモニウム基、イミノ基を有する構造が例示される。
【００３４】
本発明における用語「磁気成分」とは、外部磁場に応答して磁気回収可能な成分であり、ニッケル、コバルト、鉄などの金属、フェライトなどの金属酸化物、金属または金属酸化物をポリスチレンなどの高分子中に分散させたラテックス磁気ビーズが例示される。ある程度小さい（１００ｎｍ程度）「磁気成分」は外部磁場に応答しないように観察されるが、これは、ブラウン運動の影響による揺らぎが外部磁場に対する応答よりも大きいためである。
【００３５】
本発明における用語「酸構造」とは、水などのプロトン性溶液中で負に帯電する構造を意味し、カルボン酸、リン酸、硫酸、ホウ酸の構造が例示され、「アニオン構造」とも言い換えられる。
【００３６】
本発明における用語「マスキング剤」とは、水溶性のカチオン性磁性微粒子の負電荷を中和可能な構造を有する物質であって、「酸構造」またはその塩を構造中に含む物質である。
【００３７】
本発明における用語「凝集剤」とは、水溶性のカチオン性磁性微粒子または水溶性のカチオン性磁性微粒子−マスキング剤の結合体と混和することで、これら物質を水に不溶な凝集へと変化させる機能を有する物質であり、ポリエチレングリコールなどのポリエーテル構造を有する物質が例示される。また、水と任意の割合で混和し均一溶液とすることが可能な有機溶媒であるメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉ−プロパノールなどのアルコール化合物、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン化合物、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどのアミド化合物、ジメチルスルホキシド、１，４−もしくは１，３−ジオキサンも、凝集剤として好ましく使用することができる。
【００３８】
本発明における用語「リン脂質ベシクル」は、リン脂質二重膜により覆われた構造物を意味し、動物細胞、植物細胞、菌、真菌、ウィルスが例示される。
【００３９】
本発明における用語「ペレット」は、懸濁液に対して、遠心分離などの操作を行い、懸濁液中の浮遊物を一所に濃縮した塊を意味する。磁気分離の操作により、磁気成分を一所に濃縮した塊も「ペレット」と定義する。
【００４０】
本発明における用語「水性二相分配」は、２種の物質、たとえばポリビニルアルコールとポリエチレングリコールの水溶液を混和することで、形成される固体層と水溶液層それぞれの層への第３成分の分配係数の違いを利用し、有機溶媒を使用することなしに第３成分を抽出する方法である。
【発明の効果】
【００４１】
本発明によればウィルス等の脂質ベシクルを迅速に分離（濃縮、粗精製）することができ、ウィルス破壊阻害、ＰＣＲ阻害、ラテックス凝集阻害等を抑えた良好な検出（診断）結果を得ることができる。また、本発明によれば、上記操作を自動化することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下、本発明を更に詳述する。
本発明の水溶性のカチオン性磁気微粒子は、カチオン性官能基を有する物質、水酸基を有する物質及び磁性を有する物質（これを磁気成分ということもある。）を含有することからなる。その含有形態は特に限定されないが、水酸基を有する物質−磁気成分の複合体である磁気微粒子にカチオン性官能基を有する物質（水溶液中でカチオン性を示す官能基を有する物質）が導入されていることが好ましい。本発明の水溶性の磁気微粒子は、水酸基を有する物質がポリオール構造を有することが好ましい。
【００４３】
水酸基を有する物質は構造中にポリオール構造を有する高分子であることが望ましい。
ポリオールとしては、デキストラン、デキストリン、セルロース、アガロース、澱粉、ジェラン等のポリサッカライド類、カルボキシメチルセルロース、ジエチルアミノセルロース、ヒドロキシアセチルセルロース、ヒドロキシアセチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、ジエチルアミノエチルセルロース、ジエチルアミノエチルデキストラン等のポリサッカライド誘導体、ポリビニルアルコール、ポリアリルアルコールなどの合成ポリオール、重合性単量体として、アリルアルコール、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリセロール−モノ（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド等の水酸基を有する重合性単量体の少なくとも１種を重合成分として含有する重合体、酢酸エステル型、トリメチルシリルエーテル型、ｔ−ブトキシカルボニルオキシ型の保護された水酸基を有するビニルアルコールを含む重合性単量体の少なくとも１種を重合成分として含有する重合体から水酸基の保護を除去して得られるポリビニルアルコールランダムコポリマーなどを挙げることができる。これらのポリオールは１種単独または２種以上組み合わせて使用することができる。
【００４４】
なかでも、ポリサッカライド類またはポリサッカライド誘導体等の糖骨格を含有する中性のポリマーが好ましい。具体的には、水性二相分配用の相を形成する作用を有するものであればよく、グルコース骨格などの糖骨格を含有する水溶性ポリマーであって、例えば澱粉、より好ましくは、デキストランが挙げられる。デキストランとしては、実験により最適な質量平均分子量を持つものを選んで使用することができ、例えば質量平均分子量10,000〜100,000のもの、質量平均分子量60,000〜600,000のもの、さらには質量平均分子量67,300〜500,900のものが挙げられ、例えばシグマ社などから入手できる。
【００４５】
水溶性の磁気微粒子において、水酸基を有する物質−磁気成分複合体に含有される磁気成分は、たとえば磁気微粒子であり、磁性金属微粒子、磁性酸化物微粒子などを挙げることができる。これらの磁気微粒子は、必要に応じて、希土類元素や遷移金属元素を含有していても良い。磁性金属微粒子としては、たとえば、Ｆｅ−Ｃｏ、Ｆｅ−Ｎｉ、Ｆｅ−Ａｌ、Ｆｅ−Ｎｉ−Ａｌ、Ｆｅ−Ｃｏ−Ｎｉ、Ｆｅ−Ｎｉ−Ａｌ−Ｚｎ、Ｆｅ−Ａｌ−Ｓｉなどの金属微粒子を挙げることができる。磁性酸化物微粒子として、ＦｅＯｘ（４／３≦ｘ≦３／２）で表される酸化鉄（フェライト）型の強磁気微粒子、Ｆｅの一部がＮｉ、Ｃｏで一部置換されたフェライトを挙げることができる。より具体的には、磁気微粒子の素材として、マグネタイト、酸化ニッケル、フェライト、コバルト鉄酸化物、バリウムフェライト、炭素鋼、タングステン鋼、ＫＳ鋼、希土類コバルト磁石、マグヘマイト、ヘマタイト、ゲーサイト等の微粒子を挙げることができる。なかでも、マグネタイト、マグヘマイト、ヘマタイトおよびゲーサイトが好ましく利用できる。これらの磁気微粒子の形状は、球状、針状、紡錘状、無定形のいずれでもよい。
【００４６】
上記磁気微粒子は水酸基を有する物質、カチオン性官能基を有する物質を導入するための準備として表面処理を施しても良い。表面処理は、シラン系カップリング処理、チタン系カップリング処理、リン酸系カップリング処理、塩酸、硫酸などによる酸処理、水酸化ナトリウムなどによるアルカリ処理などの処理を行うことができる。
【００４７】
磁気微粒子の沈降物が確認できるまでの時間が３０秒程度の短時間でも良い場合、平均粒子径は１ｎｍ〜１０μｍである。上記磁気微粒子は水溶液中で均一に分散し、長時間において、沈降物が発生しないことが好ましく、平均粒子径は、１ｎｍ〜３００ｎｍであることが好ましい。
また、上記磁気微粒子がポリスチレンやポリメチルアクリレートのようなラテックスにより表面を被覆された磁気成分、ラテックスビーズ中に上記磁気微粒子が分散された磁気成分（これらをラテックス磁気ビーズという。）であってもよい。このラテックス磁気ビーズの平均粒子径は、２０ｎｍ〜３００ｎｍであることが好ましい。
【００４８】
水酸基を有する物質−磁気成分の複合体に関して、上記ポリオールと上記磁気成分の複合化様式としては、物理的な吸着や共有結合形成を挙げることができる。
また、水酸基を有する物質−磁気成分の複合体は、ポリオールを含む鉄イオン水溶液にアンモニア、水酸化ナトリウムなどのアルカリを添加する共沈法により得られる、ポリオールにより被覆されたフェライト微粒子を用いても良い（たとえば、特開平６−９２６４０号公報参照）。より具体的には、例えば米国特許第４４５２７７３号に記載されているように、デキストラン５０質量％水溶液（１０ｍｌ）中に、塩化第二鉄・六水和物（１．５１ｇ）および塩化第一鉄・四水和物（０．６４ｇ）混合水溶液（１０ｍｌ）を加えて撹拌し、６０〜６５℃に水浴中で７．４（Ｖ−Ｖ）％アンモニア水溶液をｐＨ１０〜１１程度になるように滴下しながら加熱し、１５分反応させる方法により得ることができる。
【００４９】
本発明で用いる水溶性のカチオン性磁気微粒子に関して、上記の方法で調製した水溶性の磁気微粒子とカチオン性官能基を有する物質の複合化様式としては、物理的な吸着や共有結合を挙げることができる。
より具体的には、デキストラン被覆磁気微粒子水溶液（１質量％、１００ｍL）に過ヨウ素酸ナトリウム（１０ｍｇ）を作用させて、50℃で5時間反応させてアルデヒド基を有するデキストラン被覆磁気微粒子とした後、ポリエチレンイミン（M.W.＝１８００、１ｇ）を超純水（９ｇ）に溶解させた水溶液を加えて14時間攪拌してイミン結合によりポリエチレンイミンが結合したデキストラン被覆を形成し、さらに水素化ホウ素ナトリウム（１０ｍｇ）を超純水（１ｍL）に溶解させた水溶液加えて２４時間攪拌することによりイミン結合をアミン結合に変換する方法で、ポリエチレンイミン導入デキストラン被覆磁気微粒子を得ることができる。
【００５０】
他の方法として、磁気微粒子とグリシジルオキシプロピルトリエトキシシランを反応させたり、ポリビニルアルコール被覆磁気微粒子をアルカリ性条件においてエピクロロヒドリンと反応させることにより得られるグリシジル基を有する磁気微粒子水溶液（１質量％、１０ｍL）とε−ポリリジン（１００ｍｇ）を混和し、２４時間攪拌することにより、ポリリジン導入磁気微粒子を得ることができる。
【００５１】
また、カチオン性磁気微粒子は、磁気微粒子上の水酸基にN,N−ジエチルアミノエチルクロリド塩酸塩（DEAE-Cｌ・HCｌ）などのアミン導入試薬を反応させることによっても得られる。より具体的には、デキストラン被覆磁気微粒子水溶液（１質量％、１０ｍL）にDEAE-Cｌ・HCｌ（１００ｍｇ）、１N水酸化ナトリウム水溶液（１ｍL）を加え、２４時間反応させることにより、DEAE導入デキストラン被覆磁気微粒子水溶液が得られる。
【００５２】
本発明で用いる水溶性のカチオン性磁気微粒子に求められる性状として、カチオン性磁気微粒子が正電荷を有することが好ましい。水溶性のカチオン性磁気微粒子の電荷は、ζ電位として測定でき、たとえば、ＥＬＳ−８００（大塚電子製）などが測定装置として使用できる。カチオン性磁気微粒子のζ電位は、好ましくは０ｅＶ以上であり、より好ましくは＋5ｅＶ以上であり、さらに好ましくは＋１５ｅＶ以上であり、最も好ましくは＋３０ｅＶ以上である。定性的な性状確認方法として、カチオン性磁気微粒子の水溶液をCMセルロファインC-500-sf（商品名：チッソ製）と混和して攪拌することで液が褐色から無色透明に変化するのを確認する方法をとることができる。
【００５３】
本発明で用いる水溶性のカチオン性磁気微粒子に求められる好ましい性状として、磁気微粒子の平均粒子径が１ｎｍ〜１０００ｎｍであることが挙げられ、好ましくは1〜５００nm、より好ましくは１０〜３００nm、さらに好ましくは３０〜１５０ｎｍである。
【００５４】
本発明で用いる水溶性のカチオン性磁気微粒子に求められる好ましい性状として、ウィルス捕捉操作に際して、均一分散していることが挙げられる。水溶性のカチオン性磁気微粒子の水溶液に凝集が発生した場合は、攪拌処理、超音波処理、加熱処理により、再分散して使用することができる。磁性を有する水酸基を有する物質は、上記操作後、１分以上水溶液として安定に均一分散し、凝集、沈殿を生じないことが望ましく、好ましくは、２週間以上、さらに好ましくは６ヶ月以上の期間、凝集、沈殿を生じないことが好ましい。
この経時変化は、たとえば、透明なサンプル瓶に磁性を有する水酸基を有する物質の水溶液を添加し、通常は、常温、好ましくは４℃から３７℃の温度条件で静置し、一定期間ごとに沈査の発生を目視するか、もしくは１０秒以内の磁気回収操作を行うことによって確認できる。
【００５５】
水溶性のカチオン性磁気微粒子が水溶液中で均一分散している場合では、磁気回収操作を行っても、該水溶液は磁性流体として挙動し、好ましくは磁気回収できない。一方、沈査が発生している場合は、上記条件で即座に沈査が回収されることから、確認は容易に行える。このような操作により、水溶性のカチオン性磁気微粒子の経時変化を確認することができる。
【００５６】
本発明では、ウィルスを回収するためにカチオン性官能基を有する物質を用いた磁気微粒子を用いていることが好ましいが、特に限定されず、脂質ベシクルのエンベロープタンパクを認識する種々の抗体を結合させた磁気微粒子を適宜使用することができる。
【００５７】
本発明においては水溶性のカチオン性磁気微粒子を回収可能とするための手法として、磁気微粒子のポリオールと分子コンプレックスを形成し、凝集体を形成する凝集剤が使用される。
本発明において凝集剤とは、上記水溶性の磁気微粒子と分子コンプレックスを形成可能な物質であり、たとえば、ポリアルキレングリコール構造を有する物質が挙げられ、具体的にはポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール−ランダムコポリマー、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコール−ブロックコポリマーが挙げられる。
【００５８】
また、本発明の他の実施形態として、ポリメトキシエトキシ（メタ）アクリレート、ポリ（ジエチレングリコール−（メタ）アクリレート−メチルエーテル）、ポリ（トリエチレングリコール−（メタ）アクリレート−メチルエーテル）、ポリ（テトラエチレングリコール−（メタ）アクリレート−メチルエーテル）、ポリ（ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート）、およびこれらのランダムおよびブロックコポリマー、もしくは、ポリ（グリセリン−２−エチルエーテル）、ポリ（グリセリン−２−ジエチレングリコールメチルエーテル）、ポリ（グリセリン−２−トリエチレングリコールメチルエーテル）、ポリ（グリセリン−２−テトラエチレングリコールメチルエーテル）、ポリ（グリセリン−２−ポリエチレングリコールエーテル）、ポリ（グリセリン−２−ポリプロピレングリコールエーテル）、ポリ（グリセリン−２−ポリエチレングリコールエーテル）（グリセリン−２−ポリプロピレングリコールエーテル）コポリマーを凝集剤として挙げることができる。
【００５９】
なかでも、「ポリアルキレングリコール」としては、水性二相分配用の相を形成する作用を有するものであればよく、より親水性ポリマーあるいはより疎水性ポリマーと組み合わせることにより、分配用の相を形成することが知られたものが挙げられる。該ポリアルキレングリコールは、水溶性のもので、実験により最適なものを決定し、それを選んで使用することができ、好ましくはポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール、より好ましくは、ポリエチレングリコールである。該ポリエチレングリコールは、実験により最適な分子量を持つものを選んで使用することができ、例えばおおよそ200〜25,000の範囲の数平均分子量を持つもの、好ましくは約3,000〜20,000、より好ましくは約6,000〜15,000、さらに好ましくは約8,000〜10,000の範囲の数平均分子量を持つものが挙げられ、例えばシグマ社、和光純薬社などから入手できる。
【００６０】
凝集剤は粉末のまま使用することもできるが、水溶液として用いることが好ましく、この場合の凝集剤濃度は好ましくは３０質量％以下である。この濃度以上では、粘度が高くなりすぎるなど、扱いが難しくなり、とくに少量を分取する際に大きな問題となる。水酸基を有する物質との凝集体を形成するために、凝集剤濃度を上げる必要があるなど、凝集剤を粉末として使用する必要がある場合には、水から凍結乾燥して得られた粉末を利用することが望ましい。
【００６１】
本発明における凝集剤は、水溶性のカチオン性磁気微粒子もしくはカチオン性磁気微粒子を含む水溶性の複合体と混和することで、水に不溶な磁気応答性を有する凝集を形成させる機能を有する物質を指し、特に上記物質群に限定されない。
【００６２】
本発明において、マスキング剤は、カルボン酸、硫酸、リン酸またはホウ酸から選択される、酸性官能基を有する物質が挙げられ、具体的には、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリカルボキシメチルスチレン、ヒアルロン酸、α−ポリグルタミン酸、ω−ポリグルタミン酸、ジェラン、カルボシキメチルセルロース、カルボキシメチルデキストラン、ポリリン酸、ポリ（リン酸糖）、核酸、リン酸、クエン酸、硫酸デキストラン、ポリスチリル硫酸、ポリスチリルホウ酸を挙げることができ、好ましくはポリ（メタ）アクリル酸、核酸、ポリリン酸であり、より好ましくは平均分子量１００００〜１０００００のポリ（メタ）アクリル酸であり、更に好ましくは平均分子量２５０００〜５００００のポリ（メタ）アクリル酸である。
【００６３】
本発明におけるマスキング剤は、カチオン性磁気微粒子表面に存在するアミノ基とイオンコンプレックスを形成することで、磁気微粒子の正電荷を中和するか、もしくは負電荷をもつ磁気微粒子へと変換することができ、マスキング剤は中和剤、または表面改質剤とも呼ぶことができる。このような機能を有する物質をマスキング剤として使用でき、上記物質群に特に限定されない。
【００６４】
本発明において、カチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクルの水溶性の結合体は、カチオン性磁気微粒子とリン脂質ベシクルを含む液を混和することによって形成することができる。本発明に使用できる混和方法として、マグネティックスターラーによる攪拌、メカニカルスターラーによる攪拌、ボルテックスミキサーによる混和、タッピングによる混和、ピペッティングによる混和などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。攪拌に必要な時間は、攪拌方法にもよるが、ボルテックスミキサーを用いて１．５ｍLスクリューキャップチューブ内に存在する６０μLの液を攪拌した場合、１０００ｒｐｍで10秒以上、好ましくは２０秒以上、より好ましくは３０秒以上である。
【００６５】
本発明において、カチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル−凝集剤の水に不溶な複合体は、水溶性のカチオン性磁気微粒子とリン脂質ベシクルを含む液に凝集剤を加え、適切な方法で混和することによって形成することができる。本発明に使用できる混和方法として、マグネティックスターラーによる攪拌、メカニカルスターラーによる攪拌、ボルテックスミキサーによる混和、タッピングによる混和、ピペッティングによる混和などが挙げられるが、特にこれらの操作に限定されない。攪拌に必要な時間は、攪拌方法にもよるが、ボルテックスミキサーを用いて１．５ｍLスクリューキャップチューブ内に存在する８０μLの液を攪拌した場合、１０００ｒｐｍで10秒以上、好ましくは２０秒以上、より好ましくは３０秒以上である。
【００６６】
カチオン性磁気微粒子とリン脂質ベシクルおよび凝集剤との混合液に対して、凝集剤の添加量は、乾燥質量で０．１〜２０質量％程度が良好である。特に好ましくは、凝集剤が４〜１０質量％の場合である。この操作は室温で行ってもよいが、必要に応じて氷冷下で行ってもよい。
【００６７】
本発明において、カチオン性磁気微粒子−リン脂質ベシクル−凝集剤の複合体の液からの分離は、磁気分離によるペレット化、遠心分離操作と上澄除去によるペレット化、濾過分離操作による液体除去によるペレット化等を挙げることができる。この操作は室温で行ってもよいが、必要に応じて氷冷下で行ってもよい。
【００６８】
また、上記操作により得られた磁気ペレットは、生理食塩水を含むバッファーに再分散させた後、抗体を固定化したラテックス磁気ビーズを用いてラテックス凝集操作に付すことができる。
【００６９】
リン脂質ベシクルが血中ウィルスである場合は、下記の方法により粗精製することができる。
本発明において、カチオン性磁気微粒子−ウィルスの水溶性の複合体は、カチオン性磁気微粒子とウィルスを含む血漿もしくは血清を混和することによって形成される。本発明に使用できる混和方法として、マグネティックスターラーによる攪拌、メカニカルスターラーによる攪拌、ボルテックスミキサーによる混和、タッピングによる混和、ピペッティングによる混和などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。攪拌に必要な時間は、攪拌方法にもよるが、ボルテックスミキサーを用いて１．５ｍLスクリューキャップチューブ内に存在する１２０μLの液を攪拌した場合、１０００ｒｐｍで10秒以上、好ましくは２０秒以上、より好ましくは３０秒以上である。
【００７０】
本発明において、カチオン性磁気微粒子−ウィルス−マスキング剤の水溶性の複合体は、カチオン性磁気微粒子と、血漿もしくは血清などのウィルスを含む液と、マスキング剤とを含む水溶液を混和することによって形成される。本発明に使用できる混和方法として、マグネティックスターラーによる攪拌、メカニカルスターラーによる攪拌、ボルテックスミキサーによる混和、タッピングによる混和、ピペッティングによる混和などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。攪拌に必要な時間は、磁気微粒子量、マスキング剤量、血漿または血清中に含まれるアニオン性物質の量、および攪拌方法にもよるが、ボルテックスミキサーを用いて１．５ｍLスクリューキャップチューブ内に存在する１２０μLの液を攪拌した場合、１０００ｒｐｍで６０秒以上、好ましくは６０秒以上、より好ましくは１２０秒以上である。
【００７１】
本発明において、水に不溶なカチオン性磁気微粒子−ウィルス−マスキング剤−凝集剤の複合体は、カチオン性磁気微粒子−ウィルス−マスキング剤の水溶性の結合体と凝集剤の水溶液とを加え、適切な方法で混和することによって形成される。本発明に使用できる混和方法として、マグネティックスターラーによる攪拌、メカニカルスターラーによる攪拌、ボルテックスミキサーによる混和、タッピングによる混和、ピペッティングによる混和などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。攪拌に必要な時間は、攪拌方法にもよるが、ボルテックスミキサーを用いて１．５ｍLスクリューキャップチューブ内に存在する８０μLの液を攪拌した場合、１０００ｒｐｍで10秒以上、好ましくは２０秒以上、より好ましくは３０秒以上である。
【００７２】
血漿又は血清、磁気微粒子および凝集剤の混合液に対して、凝集剤の添加量は、乾燥重量で０．１〜１０％程度が良好である。特に好ましくは、凝集剤が４〜１０質量％の場合である。この操作は室温で行ってもよいが、必要に応じて氷冷下で行ってもよい。
【００７３】
本発明において、得られた複合体（「凝集体」とも称する）の回収は、磁気分離によるペレット化、遠心分離操作と上澄除去によるペレット化、濾過分離操作による液体除去によるペレット化等を挙げることができる。この操作は室温で行ってもよいが、必要に応じて氷冷下で行ってもよい。
【００７４】
本発明において、凝集体の磁気分離は、磁気分離条件に付される凝集体懸濁液を入れた容器の側面に磁石を配することが望ましい。ここで、容器とは、エッペンドルフチューブ、スクリューキャップチューブ、PCRチューブなどである。また、ピペットのチップのような、液の出し入れが簡便にできる、底部に液抜き口のついた構造でもよい。本発明の他の実施形態として、凝集体懸濁液を入れた容器内に、磁石を直接、もしくは磁石が懸濁液に触れないように被覆した構造物を液中に浸漬し、磁気回収してもよい。
【００７５】
磁気回収は、磁気微粒子に由来する茶褐色着色が磁気分離上澄から確認できなくなった時点で終了とする。凝集体の懸濁液に対して、乾燥重量換算で０．０６質量％の磁気微粒子が含まれている場合、磁気回収に必要な時間はおおよそ５分以内である。凝集体を含む液中に含まれる磁気微粒子の量をふやすことで、磁気回収に要する時間は短縮が可能である。また、磁気分離される距離を短くすることで、具体的には、幅の狭い容器に対して容器側面から磁石による磁気分離を行うことで、磁気回収に要する時間を短縮することができる。
【００７６】
本発明の他の実施形態として、上記の底部に液の出し入れが可能な孔を有する容器を用いて、磁気分離を行いながら、液を抜き出すことにより、磁気分離と同時に上澄を除去することが可能である。
本発明において、凝集体の除去は上記のように、磁気分離を行いながら、上澄を除去してもよいし、また、凝集体のペレットを形成した後、ピペットなどを用いてペレットを吸い込まないように注意深く上澄の除去を行ってもよい。この時、上澄除去操作は磁気分離の条件のまま行うことが望ましく、上澄除去後、ペレットから漏れ出す液も除去することが望ましい。
【００７７】
上記操作により得られた磁気ペレットは、たとえば、アンプダイレクト（商品名：島津製作所製）に再分散させた後、PCR反応液と混和し、核酸増幅を行うことができる。また、本発明の他の実施形態として、当業者が通常おこないうる方法、たとえば、グアニジン塩酸塩などのカオトロピック塩の水溶液に再分散させてウィルスを破壊処理した後、グラスフィルターもしくはシリカビーズなどのシラノール構造を表面に有する担体に接触させ、核酸の吸着を行い、担体からの溶出操作を行い、PCR反応液と混和して、核酸増幅を行うこともできる。
【００７８】
また、上記操作により得られた磁気ペレットは、生理食塩水を含むバッファーに再分散させた後、抗体を固定化したラテックス磁気ビーズを用いてラテックス凝集操作に付すことができる。
【００７９】
以下に、B型肝炎ウィルスとポリエチレンイミン導入デキストラン被覆磁気微粒子の組み合わせにおける本発明のウィルス回収について、手動で行う方法の一例を更に具体的に詳述する。
【００８０】
１）デキストラン存在下で２価および３価の塩化鉄水溶液を混和し、アンモニアを添加することで水に均一分散するデキストラン被覆磁気微粒子を調製する。
２）デキストラン被覆磁気微粒子に過ヨウ素酸ナトリウムを反応させ、アルデヒド基を有するデキストラン被覆磁気微粒子とし、ポリエチレンイミンを混和してイミン結合により結合したポリエチレンイミン導入デキストラン被覆磁気微粒子を調製し、水素化ホウ素ナトリウムを加えてイミン結合をアミン結合へと還元して、ポリエチレンイミン導入デキストラン被覆磁気微粒子を調製する。
【００８１】
３）B型肝炎ウィルスに感染していると予想される被験者の血漿または血清と、ポリエチレンイミン導入デキストラン被覆磁気微粒子を混和し、30秒攪拌する。
４）ポリアクリル酸水溶液を加えて、2分攪拌する。
５）ポリエチレングリコール水溶液を加えて、30秒攪拌する。
【００８２】
６）ネオジ磁石を用いて、磁気分離を行い、ペレットを形成させる。
７）ピペットを用いて、上澄を除去する。
８）アンプダイレクト（島津製作所）を加え、攪拌し、ペレットを均一に分散させる。
９）ヒートブロック（ＴＩＴＥＣ製）を用いて、９５℃、５分間加熱する。
１０）アンプリコアHBM（ロシュ・ダイアグノスティクス社）の核酸増幅試薬と混和し、アンプリコアＨＢＭ手順書に記載の方法でサーマルサイクラーの設定を行い、核酸を増幅させる。
１１）アンプリコアHBM手順書に記載の方法に従い、検出を行う。
【００８３】
以下に、B型肝炎ウィルスとポリエチレンイミン導入デキストラン被覆磁気微粒子の組み合わせにおける本発明のウィルス回収について、自動で行う方法の一例を更に具体的に詳述する。
【００８４】
１）自動核酸抽出装置ＭＰ１２（プレシジョンシステムサイエンス製）の磁石ユニットの磁石ユニットを取り外し、４（ｍｍ）＊４（ｍｍ）＊８（ｍｍ）のネオジ磁石を７段重ねた２８（ｍｍ）＊４（ｍｍ）＊８（ｍｍ）の磁石が１３連装備された磁石ユニットに換装する。
２）ＭＰ１２の反応トレー２列目にポリエチレンイミン導入デキストラン被覆磁気微粒子を入れる。
３）ＭＰ１２の反応トレー３列目にポリアクリル酸水溶液を入れる。
４）ＭＰ１２の反応トレー４列目に凝集用ポリエチレングリコール水溶液を入れる。
５）ＭＰ１２の反応トレー４列目に洗浄用ポリエチレングリコール水溶液を入れる。
６）ＭＰ１２の反応トレー６列目にアンプダイレクト（商品名：島津製作所製）を入れる。
【００８５】
７）ＭＰ１２に２）〜５）の液を入れた反応トレー、Ｂ型肝炎ウィルスを含むと予想される血漿もしくは血清の入った１．５ｍＬスクリューキャップチューブ、Ｂ−Ｆ分離用チップを装備する。
８）B型肝炎ウィルスに感染していると予想される被験者の血漿または血清と、ポリエチレンイミン導入デキストラン被覆磁気微粒子を混和し、６０秒ピペッティングする。
９）ポリアクリル酸水溶液を加えて、2分ピペッティングする。
１０）凝集用ポリエチレングリコール水溶液を加えて、６０秒ピペッティングする。
【００８６】
１１）チップ中で磁気分離を行い、ペレットを形成させる。
１２）ペレットと分離した液を、チップから吐出、除去する。
１３）洗浄用ポリエチレングリコール水溶液を吸引し、吐出する。
１４）アンプダイレクト（島津製作所）を吸引し、ピペッティングし、ペレットを均一に分散させる。
１５）１０５℃に設定したＭＰ１２のヒートブロックにペレット分散液を移し、８分間加熱する。
１６）加熱処理した液を反応トレー１列目に移す。
１７）アンプリコアHBM（ロシュ・ダイアグノスティクス社）の核酸増幅試薬と混和し、アンプリコアＨＢＭ手順書に記載の方法でサーマルサイクラーの設定を行い、核酸を増幅させる。
１８）アンプリコアHBM手順書に記載の方法に従い、検出を行う。
【実施例】
【００８７】
以下に本発明を実施例により例証するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
検討に用いた試薬のうち、下記のものは以下のようにして調製した。
【００８８】
（ポリエチレングリコール水溶液の調製）
マグネティックスターラーバーを装備した１５０ｍＬガラス瓶に、ポリエチレングリコール（６ＫＤａ、２．５ｇ）、超純水（９７．５ｇ）、ジエチルピロカーボネート（０．１ｍＬ）を加えた後、蓋を閉めて室温で一昼夜攪拌した。１２０℃４０分の条件でオートクレーブ滅菌した。
【００８９】
（塩化鉄水溶液の調製）
マグネティックスターラーバーを装備した５００ｍＬのビーカーに塩化第二鉄・六水和物（８１．９ｇ） および塩化第一鉄・四水和物（２９．８ｇ）、超純水（１８８．３ｇ）を入れ、窒素をバブリングしながら室温で２時間攪拌して均一に溶解させた。得られた溶液を減圧下吸引濾過し、得られた黄褐色液を３００ｍＬにメスアップした。なお、超純水は、ミリポア製Ｄｉｒｅｃｔ−Ｑ（商品名）を使用して調製した。
【００９０】
（アルデヒド基導入デキストランマグネタイトの調製）
メカニカルスターラー、還流塔、窒素ラインを装備した２Ｌ３つ口フラスコにデキストラン（和光純薬製、４０ＫＤａ）の５．０質量％水溶液（１Ｌ）を入れ、攪拌下６５℃に加熱した。上記塩化鉄水溶液（１００ｍＬ）を滴下し、滴下終了後１０分間攪拌した後、ｐＨ１０〜１１程度になるように２８質量％アンモニア水溶液を滴下しながら、３０分間攪拌した。この溶液を減圧下吸引濾過し、得られた濾液の一部（１００ｍＬ）に対して、イオン交換水（５Ｌ）を用いた透析操作を、３時間を４度と１２時間を１度とを１サイクルとして、２サイクル行った。この操作で平均粒子径が１０２±１５．４ｎｍの、デキストランが固定された磁気微粒子が得られた。
【００９１】
アルデヒド基を有するデキストラン被覆マグネタイトを調製するために、メカニカルスターラー、還流塔、窒素ラインを装備した５００ｍＬ３つ口フラスコに上記方法で調製したデキストラン被覆マグネタイト水溶液（４００ｍＬ）を加え、過ヨウ素酸ナトリウム（４０ｍｇ）を超純水（１０ｍＬ）に溶解させたものを添加し、５０℃で５時間攪拌を行い、室温へ冷却した。
この磁気微粒子は特に精製せずに次の反応に用いた。平均粒子径は１１０±１５．７ｎｍであった。
【００９２】
（ε−ポリリジン導入デキストラン被覆マグネタイトの調製）
ε−ポリリジンを導入したデキストラン被覆マグネタイトを調製するために、メカニカルスターラー、還流塔、窒素ラインを装備した２００ｍＬ３つ口フラスコに上記方法で調製したアルデヒド基導入デキストラン被覆マグネタイト水溶液（１００ｍＬ）を加え、２０℃でε−ポリリジン（１ｇ）を超純水（９ｇ）に溶解させた液を添加し、１４時間攪拌した。別途、８ｍＬ試験管に水素化ホウ素ナトリウム（２０ｍｇ）を超純水（１ｍＬ）に溶解させた発泡液を上記型フラスコに添加した。２０ｍＬナス型フラスコに綿詮で蓋をし、２４時間攪拌した。この溶液を減圧下吸引濾過し、得られた濾液に対して、イオン交換水（５Ｌ）を用いた透析操作を、３時間を４度と１２時間を１度とを１サイクルとして、２サイクル行った。この操作で得られた粒子の平均粒子径は１１２±３７．６ｎｍであった。
【００９３】
（ポリエチレンイミン１８００導入デキストラン被覆マグネタイトの調製）
ポリエチレンイミンを導入したデキストラン被覆マグネタイトを調製するために、メカニカルスターラー、還流塔、窒素ラインを装備した２００ｍＬ３つ口フラスコに上記方法で調製したアルデヒド基導入デキストラン被覆マグネタイト水溶液（１００ｍＬ）を加え、２０℃でポリエチレンイミン（M.W.＝１８００、１ｇ）を超純水（９ｇ）に溶解させた液を添加し、１４時間攪拌した。
別途、８ｍＬ試験管に水素化ホウ素ナトリウム（２０ｍｇ）を超純水（１ｍＬ）に溶解させた発泡液を上記型フラスコに添加した。２０ｍＬナス型フラスコに綿詮で蓋をし、２４時間攪拌した。
この溶液を減圧下吸引濾過し、得られた濾液に対して、イオン交換水（５Ｌ）を用いた透析操作を、３時間を４度と１２時間を１度とを１サイクルとして、２サイクル行った。この操作で得られた粒子の平均粒子径は１１８±２１．５ｎｍであった。
【００９４】
（ポリエチレンイミン１００００導入デキストラン被覆マグネタイトの調製）
ポリエチレンイミンを導入したデキストラン被覆マグネタイトを調製するために、メカニカルスターラー、還流塔、窒素ラインを装備した２００ｍＬ３つ口フラスコに上記方法で調製したアルデヒド基導入デキストラン被覆マグネタイト水溶液（１００ｍＬ）を加え、２０℃でポリエチレンイミン（M.W.＝１００００、１ｇ）を超純水（９ｇ）に溶解させた液を添加し、１４時間攪拌した。  別途、８ｍＬ試験管に水素化ホウ素ナトリウム（２０ｍｇ）を超純水（１ｍＬ）に溶解させた発泡液を上記型フラスコに添加した。２０ｍＬナス型フラスコに綿詮で蓋をし、２４時間攪拌した。
この溶液を減圧下吸引濾過し、得られた濾液に対して、イオン交換水（５Ｌ）を用いた透析操作を、３時間を４度と１２時間を１度とを１サイクルとして、２サイクル行った。この操作で得られた粒子の平均粒子径は１１８±２１．５ｎｍであった。
【００９５】
（マスキング剤１：ポリアクリル酸２５００を用いたマスキング剤の調製）
マグネティックスターラーバーを装備した１５０ｍＬガラス瓶に、ポリアクリル酸（M.W.＝２５０００、２５０ｍｇ）、超純水（９９．７５ｇ）、ジエチルピロカーボネート（０．１ｍＬ）を加えた後、蓋を閉めて室温で一昼夜攪拌した。１２０℃４０分の条件でオートクレーブ滅菌した。
【００９６】
（マスキング剤２：ポリアクリル酸５０００を用いたマスキング剤の調製）
マグネティックスターラーバーを装備した１５０ｍＬガラス瓶に、ポリアクリル酸（M.W.＝５００００、２５０ｍｇ）、超純水（９９．７５ｇ）、ジエチルピロカーボネート（０．１ｍＬ）を加えた後、蓋を閉めて室温で一昼夜攪拌した。１２０℃４０分の条件でオートクレーブ滅菌した。
【００９７】
（臨床検体−HBV陽性人正常血漿）
B型肝炎患者から採血した血液を処理し、HBV陽性人正常血漿としたサンプル４１検体を作成した。
【００９８】
（直線性試験用−HBV陽性人正常血漿−１０５Cｏｐｉｅｓ−ｍL）
１０６Cｏｐｉｅｓ−ｍLのB型肝炎ウィルスを含む人正常血漿（３００μL、アンプリコアHBMを用いてB型肝炎量を確認した）を、B型肝炎ウィルス陰性人正常血漿（２７００μL）と混和し、ボルテックスミキサーを用いて１０秒間攪拌を行い、１０５Cｏｐｉｅｓ−ｍLのB型肝炎ウィルスを含む人正常血漿とした。
【００９９】
（直線性試験用−HBV陽性人正常血漿−１０４Cｏｐｉｅｓ−ｍL）
上記で調製した１０５Cｏｐｉｅｓ−ｍLのB型肝炎ウィルスを含む人正常血漿（３００μL）を、B型肝炎ウィルス陰性人正常血漿（２７００μL）と混和し、ボルテックスミキサーを用いて１０秒間攪拌を行い、１０４Cｏｐｉｅｓ−ｍLのB型肝炎ウィルスを含む人正常血漿とした。
【０１００】
（直線性試験用−HBV陽性人正常血漿−１０３Cｏｐｉｅｓ−ｍL）
上記で調整した１０４Cｏｐｉｅｓ−ｍLのB型肝炎ウィルスを含む人正常血漿（３００μL）を、B型肝炎ウィルス陰性人正常血漿（２７００μL）と混和し、ボルテックスミキサーを用いて１０秒間攪拌を行い、１０３Cｏｐｉｅｓ−ｍLのB型肝炎ウィルスを含む人正常血漿とした。
【０１０１】
（直線性試験用−HBV陽性人正常血漿−１０２Cｏｐｉｅｓ−ｍL）
上記で調整した１０３Cｏｐｉｅｓ−ｍLのB型肝炎ウィルスを含む人正常血漿（３００μL）を、B型肝炎ウィルス陰性人正常血漿（２７００μL）と混和し、ボルテックスミキサーを用いて１０秒間攪拌を行い、１０２Cｏｐｉｅｓ−ｍLのB型肝炎ウィルスを含む人正常血漿とした。
【０１０２】
（干渉試験用−ビリルビンＣ添加HBV陽性人正常血清−１０３．９５Cｏｐｉｅｓ−ｍL）
干渉チェックＡプラスのビリルビンＣのサンプル（１８３ｍｇ−ｄＬ、シスメックス製）を超純粋２ｍＬに溶解させたもの（２００μＬ）と、１０４Cｏｐｉｅｓ−ｍLのＢ型肝炎ウィルスを含む人正常血清（１８００μＬ）とを混和し、ボルテックスミキサーを用いて攪拌し、ビリルビンＣ（１８３ｍｇ−Ｌ）添加HBV陽性（１０３．９５ｃｏｐｉｅｓ−ｍL）人正常血清を調製した。
【０１０３】
（干渉試験用−ビリルビンＦ添加HBV陽性人正常血清−１０３．９５Cｏｐｉｅｓ−ｍL）
干渉チェックＡプラスのビリルビンＦのサンプル（１９３ｍｇ−ｄＬ、シスメックス製）を超純粋２ｍＬに溶解させたもの（２００μＬ）と、１０４Cｏｐｉｅｓ−ｍLのＢ型肝炎ウィルスを含む人正常血清（１８００μＬ）とを混和し、ボルテックスミキサーを用いて攪拌し、ビリルビンＦ（１９３ｍｇ−Ｌ）添加HBV陽性（１０３．９５ｃｏｐｉｅｓ−ｍL）人正常血清を調製した。
【０１０４】
（干渉試験用−溶血ヘモグロビン添加HBV陽性人正常血清−１０３．９５Cｏｐｉｅｓ−ｍL）
干渉チェックＡプラスの溶血ヘモグロビンのサンプル（４８４０ｍｇ−ｄＬ、シスメックス製）を超純粋２ｍＬに溶解させたもの（２００μＬ）と、１０４Cｏｐｉｅｓ−ｍLのＢ型肝炎ウィルスを含む人正常血清（１８００μＬ）とを混和し、ボルテックスミキサーを用いて攪拌し、溶血ヘモグロビン（４８４０ｍｇ−Ｌ）添加HBV陽性（１０３．９５ｃｏｐｉｅｓ−ｍL）人正常血清を調整した。
【０１０５】
（干渉試験用−乳び添加HBV陽性人正常血清−１０３．９５Cｏｐｉｅｓ−ｍL）
干渉チェックＡプラスの乳びのサンプル（１８４００度、シスメックス製）を超純粋２ｍＬに溶解させたもの（２００μＬ）、と、１０４Cｏｐｉｅｓ−ｍLのＢ型肝炎ウィルスを含む人正常血清（１８００μＬ）とを混和し、ボルテックスミキサーを用いて攪拌し、乳び（１８４０度）添加HBV陽性（１０３．９５ｃｏｐｉｅｓ−ｍL）人正常血清を調整した。
【０１０６】
（比較例１）
１．５ｍＬスクリューキャップチューブにHBV陽性人正常血漿（５０μＬ）とＳｏｌ−Ａ（２５μＬ）を加え、ボルテックスミキサーを用いて３０秒間攪拌し、検体を白濁させた。高速遠心分離機を用いて、１５０００ｒｐｍ、５分間の条件でスクリューキャップチューブ底部にペレットを形成させた。上澄をピペットを用いて注意深く除去し、得られたペレットにアンプダイレクト（島津製作所製、５０μＬ）を加え、ボルテックスミキサーを用いて３０秒攪拌して、ペレットを分散させた。スクリューキャップチューブを９５℃に設定したヒートブロック（タイテック製、１．５ｍＬスクリューキャップチューブ用）に設置し、５分間加熱し、室温に戻した。２００μLのＰＣＲチューブに上記加熱処理液（２５μＬ）とアンプリコアＨＢＭ（ロシュ・ダイアグノスティクス製）のＰＣＲ反応液（MMX、７５μＬ）を混和し、軽くタッピングすることにより混和し、サーマルサイクラー（９６００R、ロシュ・ダイアグノスティクス製）を用いて、核酸増幅反応を行った。サーマルサイクラーの運転は、下記の条件で行った。
【０１０７】
ホールド    ・・・    ５０℃で２分
ホールド    ・・・    ９６℃で５分
サイクル１〜３０・・・９６℃で２０秒、５８℃で２０秒、７２℃で３０秒
ホールド    ・・・    ７２℃で１０分
ホールド    ・・・    ７２℃保持
【０１０８】
得られた核酸増幅物は、アンプリコアＨＢＭに付属のアビジンプレートとハイブリダイズ試薬各種を説明書きに従って使用した。この際、マイクロプレートウォッシャーとして、コロンブス２（ロシュダイアグノスティックス製）を使用した。検出は、アンプリコアHBM専用プレートリーダー（NJ-2300、ロシュ・ダイアグノスティクス製）を用いて行った。
【０１０９】
実施例１
１．５ｍＬスクリューキャップチューブにHBV陽性人正常血漿（５０μＬ）と磁気ビーズ水溶液（１０μＬ）を加え、ボルテックスミキサーを用いて３０秒攪拌した。ここにマスキング剤１（２０μＬ）を加え、ボルテックスミキサーを用いて２分間攪拌した。ここに凝集剤（４０μＬ）を加え、ボルテックスミキサーを用いて３０秒攪拌し、凝集体を形成させた。ネオジ磁石、５分間の条件で磁気分離を行い、スクリューキャップチューブ側面にペレットを形成させた。上澄をピペットを用いて注意深く除去し、得られたペレットにアンプダイレクト（島津製作所製、５０μＬ）を加え、ボルテックスミキサーを用いて３０秒攪拌して、ペレットを均一に分散させた。スクリューキャップチューブを９５℃に設定したヒートブロック（タイテック製、１．５ｍＬスクリューキャップチューブ用）に設置し、５分間加熱し、室温に戻した。２００μLのＰＣＲチューブに上記加熱処理液（２５μＬ）とアンプリコアＨＢＭ（ロシュ・ダイアグノスティクス製）のＰＣＲ反応液（MMX、７５μＬ）を混和し、軽くタッピングすることにより混和し、サーマルサイクラー（９６００R、ロシュ・ダイアグノスティクス製）を用いて、核酸増幅反応を行った。サーマルサイクラーの運転は、下記の条件で行った。
【０１１０】
ホールド    ・・・    ５０℃で２分
ホールド    ・・・    ９６℃で５分
サイクル１〜３０・・・９６℃で２０秒、５８℃で２０秒、７２℃で３０秒
ホールド    ・・・    ７２℃で１０分
ホールド    ・・・    ７２℃保持
【０１１１】
得られた核酸増幅物は、アンプリコアＨＢＭに付属のアビジンプレートとハイブリダイズ試薬各種を説明書きに従って使用した。この際、マイクロプレートウォッシャーとして、コロンブス２（ロシュダイアグノスティックス製）を使用した。検出は、アンプリコアHBM専用プレートリーダー（NJ-2300、ロシュダイアグノスティクス製）を用いて行った。
【０１１２】
＜直線性試験＞
各ウィルス量の検体を実施例１および比較例１の方法でそれぞれＮ＝２で測定した。
これらの結果を表１，表２，及び図１〜図３に示す。
【０１１３】
【表１】
0004670583.tif 000002
【０１１４】
【表２】
0004670583.tif 000003
【０１１５】
＜各種干渉物質を添加した人正常血清を用いた実施例１と比較例１による検出＞
干渉物質を添加した人正常血清を、実施例１および比較例１の方法により処理を行った。
実施例１および比較例１の両方法でビリルビン・F、ビリルビン・C、溶血ヘモグロビン、乳びそれぞれの干渉物質を添加したHBV１０３．９５ｃｏｐｉｅｓ−ｍＬの人正常血清の処理を行った。両方法ともに干渉物質添加によって検出感度が低下することは無く、同等の検出結果が得られた。
【０１１６】
＜臨床検体を用いた実施例１と比較例１の各方法による検出結果＞
臨床検体４９検体に対して、実施例１と比較例１の各手法により処理を行った。これらの結果を表３及び図４に示す。
検出結果に関して、１とあるものはキットの検出限界以下、９とあるものはキットの検出限界以上であることを示す。
比較例１および実施例１の両方法で比較的相関が取れている領域において、両方法で検出範囲内の領域（B2）に検出された検体は３０検体、両方法ともに検出限界以上の領域（C3）に検出された検体は４検体、両方法ともに検出限界以下の領域（A1）に検出された検体は７検体であった。また、比較例１および実施例１の方法で特に相関がとれていないと判断された検体は、比較例１の方法において検出範囲内、実施例１の方法において検出限界以上の領域（C2）に検出された検体は４検体、比較例１の方法において検出限界以下、実施例１の方法において検出範囲内の領域（B1）に検出された検体は７検体であった。
【０１１７】
このうち、比較例１の方法において検出限界以下、実施例１の方法において検出範囲内の領域（B1）に検出された７検体は、比較例１の方法では陰性、実施例１の方法では陽性と判断されており、比較例１の方法によって偽陰性の検出結果が得られていることを示す。
以上より、実施例１の方法は、比較例１の方法と比較し、高い効率でB型肝炎ウィルスのDNA抽出が可能であることを示す。
【０１１８】
【表３】
0004670583.tif 000004
【０１１９】
（自動核酸抽出機の磁石ユニット作成）
自動核酸抽出装置ＭＰ１２（プレシジョンシステムサイエンス製）の磁石ユニットと換装可能な図５の設計図に示す磁石ユニットを作成し、ＭＰ１２に装備した。最小構成単位となる磁石は４（ｍｍ）＊４（ｍｍ）＊８（ｍｍ）磁石角型（株式会社二六製作所製）を使用した。
【０１２０】
実施例２
（ポリエチレンイミン導入デキストラン被覆磁気微粒子によるＢ型肝炎ウィルスの回収）
１）自動核酸抽出装置ＭＰ１２（プレシジョンシステムサイエンス製）の磁石ユニットを取り外し、４（ｍｍ）＊４（ｍｍ）＊８（ｍｍ）のネオジ磁石角型（株式会社ニ六製作所製）を７段重ねた２８（ｍｍ）＊４（ｍｍ）＊８（ｍｍ）の磁石が１３連装備された磁石ユニットに換装した。
２）ＭＰ１２の反応トレー２列目にポリエチレンイミン導入デキストラン被覆磁気微粒子（０．７５質量％、１０μＬ）を入れた。
３）ＭＰ１２の反応トレー３列目に０．２５％ポリアクリル酸生理食塩水溶液（２０μＬ）を入れた。
４）ＭＰ１２の反応トレー４列目に凝集用ポリエチレングリコール水溶液（４０μＬ）を入れた。
５）ＭＰ１２の反応トレー５列目に洗浄用ポリエチレングリコール水溶液（１５０μＬ）を入れた。
６）ＭＰ１２の反応トレー６列目にアンプダイレクト（商品名：島津製作所製、５０μＬ）を入れた。
【０１２１】
７）ＭＰ１２に２）〜６）の液を入れた反応トレー、Ｂ型肝炎ウィルスを含むと予想される血漿もしくは血清の入った１．５ｍＬスクリューキャップチューブ、Ｂ−Ｆ分離用チップを装備させた。
８）B型肝炎ウィルスに感染していると予想される被験者の血漿または血清（５０μＬ）を吸引させ、トレー2列目のポリエチレンイミン導入デキストラン被覆磁気微粒子水溶液と混和し、６０秒ピペッティングし、ピペットの液切りを行わせた。
９）トレー3列目のポリアクリル酸水溶液を吸引させ、トレー2列目の液に加えて、2分ピペッティングさせた。
１０）トレー4列目の凝集用ポリエチレングリコール水溶液吸引させ、トレー2列目の液に加えて、６0秒ピペッティングさせた。
【０１２２】
１１）トレー２の液を１５０μＬ吸引させ、チップをＢ−Ｆ分離位置に移動させた後、磁石ユニットをＢ−Ｆ分離位置に移動させて、チップ中で磁気分離を5分行い、ペレットを形成させる。
１２）ペレットと分離した液をチップから吐出、除去させ、磁石ユニットをもとの位置に戻させた。
１３）トレー5列目の洗浄用ポリエチレングリコール水溶液を吸引させ、さらに空気を５０μＬ吸引させた。磁石ユニットをＢ−Ｆ分離位置に移動させてから液を吐出させ、磁石ユニットをもとの位置にもどした。
１４）アンプダイレクト（島津製作所）を吸引し、ピペッティングし、ペレットを均一に分散させた。
１５）１０５℃に設定したＭＰ１２のヒートブロックにペレット分散液を移し、10μＬのピペッティングを行いながら８分間加熱させた。
１６）加熱処理した液を反応トレー１列目に移させ、ＭＰ１２からトレーを外した。
１７）アンプリコアHBM（ロシュ・ダイアグノスティクス製）の核酸増幅試薬と混和し、アンプリコアＨＢＭ手順書に記載の方法でサーマルサイクラーの設定（実施例１と同様の条件）を行い、核酸を増幅させた。
１８）アンプリコアHBM手順書に記載の方法に従い、検出（実施例１と同様の条件）を行った。
【０１２３】
＜実施例２と比較例１の各方法による検出結果＞
自動核酸抽出装置MP12を用いた実施例２によるB型肝炎ウィルスのDNA抽出および比較例１の遠心分離法によるDNA抽出法それぞれに対して、ウィルス検出量−添加量の直線性試験を実施した。結果を図６〜図８に示す。自動化された実施例２の方法によっても、比較例１と同等の検出感度を得られることを確認した。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】ウィルス添加量と検出量の直線性確認試験を結果を示すグラフである。
【図２】ウィルス添加量と内部標準アンプリコンの吸光度の結果を示すグラフである。
【図３】ウィルス添加量とウィルスDNAアンプリコンの吸光度の結果を示すグラフである。
【図４】実施例１及び比較例１の各手法による検出値を比較するグラフである。
【図５】自動検出装置を模式的に表す図である。
【図６】ウィルス添加量とウィルス検出量の比較結果を示すグラフである。
【図７】ウィルス添加量と内部標準ＤＮＡアンプリコンの吸光度を比較するグラフである。
【図８】ウィルス添加量とウィルスＤＮＡアンプリコンの吸光度を比較するグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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